(57)【要約】  本発明は、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換する能力（すなわちアラキドン酸［２０：４、ＡＲＡ］からエイコサペンタエン酸［２０：５、ＥＰＡ］への変換）を有するΔ１７デサチュラーゼに関する。Δ１７デサチュラーゼをコードする単離された核酸断片およびこのような断片を含んでなる組み換えコンストラクト、ならびにこれらのΔ１７デサチュラーゼを植物および油性酵母中で使用して長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を製造する方法が開示される。
2009534032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．）配列番号３および配列番号７よりなる群から選択されたΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離されたヌクレオチド配列、または
ｂ．）（ａ）に完全に相補的である単離されたヌクレオチド配列
よりなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号４で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
少なくとも１６８個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化された、配列番号２で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項４】
少なくとも１６０個のコドンがヤロウィア中での発現のためにコドン最適化された、配列番号６で記載されるΔ１７デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項５】
適切な制御配列と作動的に結合する、請求項１に記載の単離された核酸分子を含むキメラ遺伝子。
【請求項６】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、形質転換されたヤロウィア種。
【請求項７】
ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ  ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される、請求項６に記載の形質転換されたヤロウィア種。
【請求項８】
ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）アラキドン酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてアラキドン酸がエイコサペンタエン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収する工程と
を含む、エイコサペンタエン酸を製造する方法。
【請求項９】
ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）ジホモ−γ−リノレン酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてジホモ−γ−リノレン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収する工程と
を含む、エイコサテトラエン酸を製造する方法。
【請求項１０】
ａ）ｉ）１）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
２）クラスタルＷ法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択された、二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）リノール酸源
とを含む宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてリノール酸がα−リノレン酸に変換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程と
を含む、α−リノレン酸を製造する方法。
【請求項１１】
単離された核酸分子が、配列番号２、４、および６よりなる群から選択されたアミノ酸配列を有するΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
ａ．）単離された核酸分子が、配列番号３および配列番号７よりなる群から選択された核酸配列を有し、
ｂ．）宿主細胞がヤロウィア・リポリティカである、
請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、藻類、細菌、酵母、卵菌綱、および真菌よりなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種よりなる群から選択された真菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酵母が油性酵母である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
油性酵母が、ヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスよりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヤロウィアが、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ＃７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される、請求項に１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／７９３５７５号明細書の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、生物工学の分野にある。より具体的には、本発明は、Δ１７脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片の同定、および長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造におけるこれらのデサチュラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＰＵＦＡの重要性には議論の余地がない。例えば特定のＰＵＦＡは健康な細胞の重要な生物学的構成要素であり、哺乳類では新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できず、その代わりに食餌中で得なくてはならず、またはリノール酸（ＬＡ、１８：２  ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３  ω−３）のさらなる不飽和化および延長によって送達されなくてはならない「必須」脂肪酸として、リン脂質またはトリアシルグリセロールなどの形態であってもよい細胞の原形質膜の構成物として、（特に発達中の幼児の脳における）適切な発達、組織形成および修復のために必要なものとして、哺乳類における重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイド前駆物質（例えばプロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン）として認識される。さらに長鎖ω−３ＰＵＦＡの大量摂取は、心臓血管保護効果をもたらす（ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６頁（１９７５年）、ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２（８０８１）：１１７〜１１９頁（１９７８年７月１５日）、シモカワ（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ），Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８頁（２００１年）、フォンシャッキー（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ），Ｃ．およびダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９頁（２００１年））。ならびに、その他の多数の研究が、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの投与によって得られる、多様な症状および疾患（例えば喘息、乾癬、湿疹、糖尿病、癌）に対する多岐にわたる健康上の利点を実証している。
【０００４】
植物、藻類、真菌、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が、商業的ＰＵＦＡ生産の手段として調査されている。遺伝子操作は、いくつかの宿主の天然能力（本来ＬＡおよびＡＬＡ脂肪酸生成に限定されるものでさえ）を実質的に改変して、アラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４ω−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５ω−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６ω−３）の高レベル生成をもたらすことができることを実証している。ω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成が天然能力または組み換え技術の結果であろうとなかろうと、どちらの戦略もω−６ＰＵＦＡのそれらのω−３対応物への変換を必要とするかもしれない。具体的にはΔ１５デサチュラーゼがＬＡからＡＬＡへの変換の役割を担うのに対し、（いくつかのΔ１７デサチュラーゼはまた、基質としてジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ；２０：３ω−６）を使用してエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ；２０：４ω−３）も生成できるが）Δ１７デサチュラーゼはＡＲＡからＥＰＡへの変換の役割を担う。これらの酵素はどちらもΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路（主に藻類、コケ、真菌、線形動物、およびヒトに見られ、γ−リノール酸（ＧＬＡ；１８：３ω−６）および／またはステアリドン酸（ＳＴＡ；１８：４ω−３）の生成によって特徴づけられる）、およびΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路（鞭毛虫種などのいくつかの生物中で機能し、エイコサジエン酸（ＥＤＡ；２０：２ω−６）および／またはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ；２０：３ω−３）の生成によって特徴づけられる）に関与する（図１）。
【０００５】
効果的にω−３脂肪酸合成を可能にするΔ１７デサチュラーゼが果たす役割に基づいて、様々な起源からこれらの酵素を同定して性質決定するかなりの努力がなされている。しかしほんのわずかなΔ１７デサチュラーゼだけが、現在知られている。具体的には米国特許出願公開第２００３／０１９０７３３号明細書が、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）からのΔ１７デサチュラーゼの単離（ｕｓｏａｌｔｉｏｎ）および特性決定について述べている（ジェンバンク登録番号ＡＹ３７３８２３もまた参照されたい）。国際公開第２００５／０８３０５３号パンフレットがフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）「ω３デサチュラーゼ」の配列を提供する（ジェンバンク登録番号ＣＡＪ３０８７０もまた参照されたい）一方、国際公開第２００６／１００２４１号パンフレットはフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）「ω３デサチュラーゼ」の配列を提供し、それらはどちらもΔ１７デサチュラーゼをコードするようである。また仮特許出願第６０／８５５１７７を有する同一所有者の同時係属出願は、（ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）からのΔ１７デサチュラーゼのアミノ酸および核酸配列を開示している。したがってω−３脂肪酸生産で使用するために、多様な宿主生物中での異種性発現に適した、Δ１７デサチュラーゼをコードするさらに別の遺伝子の同定および単離に対する必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
出願人らは、卵菌綱、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）およびフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）からΔ１７デサチュラーゼをコードする遺伝子を単離することにより、既述の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Δ１７デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新しい遺伝子コンストラクト、およびＰＵＦＡおよび特にω−３脂肪酸を生成するための植物および酵母におけるそれらの使用に関する。
【０００８】
したがって本発明は、
ａ．）配列番号３および配列番号７よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼをコードする単離されたヌクレオチド配列、または
ｂ．）（ａ）に完全に相補的な単離されたヌクレオチド配列
よりなる群から選択される単離された核酸分子を提供する。
【０００９】
別の実施態様では本発明は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中での発現のためにコドン最適化された本発明の遺伝子コンストラクトを提供する。さらに本発明は、ω−３脂肪酸の発現および生成のための本発明の遺伝子コンストラクトで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００１０】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）ｉ）１）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）アラキドン酸源
とを含んでなる宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてアラキドン酸がエイコサペンタエン酸に転換される条件下で、ステップ（ａ）の宿主細胞を生育させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサペンタエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサペンタエン酸を製造する方法を提供する。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）ｉ）１）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
２）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
３）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）ジホモ−γ−リノレン酸源
とを含んでなる宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてジホモ−γ−リノレン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の宿主細胞を生育させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を製造する方法を提供する。
【００１２】
別の実施態様では本発明は、
ａ）ｉ）１）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
２）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｉｉ）リノール酸源
とを含んでなる宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてリノール酸がα−リノレン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の宿主細胞を生育させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のα−リノレン酸を回収するステップと
を含んでなる、α−リノレン酸を製造する方法を提供する。
【００１３】
生物学的寄託
以下の生体物質が１０８０１ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、以下の命名、登録番号、および寄託日を有する。
【００１４】
【表１】
2009534032.tif 000003
【００１５】
上に列挙した生体物質は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って寄託された。列挙した寄託物は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００１６】
本発明は、本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明からより完全に理解できる。
【００１７】
配列一覧
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１８】
配列番号１〜４０は、表１で同定される遺伝子、タンパク質またはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００１９】
【表２】
2009534032.tif 000004
【００２０】
【表３】
2009534032.tif 000005
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本願明細書で引用した全ての特許、特許出願、および公報は、その内容全体を参照によって組み込んだものとする。これは具体的には、以下の出願人らの譲受人の同時係属出願を含む。米国特許第７，１２５，６７２号明細書、米国特許第７，１８９，５５９号明細書、米国特許第７，１９２，７６２号明細書、米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書、および米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書（２００４年５月６日出願）、米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書（２００４年６月１６日出願）、米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書（２００４年７月１日出願）、米国特許出願第１０／９８５２５４号明細書および米国特許出願第１０／９８５６９１号明細書（２００４年１１月１０日出願）、米国特許出願第１０／９８７５４８号明細書（２００４年１１月１２日出願）、米国特許出願第１１／０２４５４５号明細書および米国特許出願第１１／０２４５４４号明細書（２００４年１２月２９日出願）、米国特許出願第１１／１６６９９３号明細書（２００５年６月２４日出願）、米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書（２００５年７月１８日出願）、米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書（２００５年７月２０日出願）、米国特許出願第１１／１９０７５０号明細書（２００５年７月２７日出願）、米国特許出願第１１／１９８９７５号明細書（２００５年８月８日出願）、米国特許出願第１１／２２５３５４号明細書（２００５年９月１３日出願）、米国特許出願第１１／２５３８８２号明細書（２００５年１０月１９日出願）、米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（２００５年１１月１日出願）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（２００５年１１月２日出願）、米国仮特許出願第６０／７９５８１０号明細書（２００６年４月２８日出願）、米国仮特許出願第６０／７９３５７５号明細書（２００６年４月２０日出願）、米国仮特許出願第６０／７９６６３７号明細書（２００６年５月２日出願）、米国仮特許出願第６０／８０１１７２号明細書および米国仮特許出願第６０／８０１１１９号明細書（２００６年５月１７日出願）、米国仮特許出願第６０／８５３５６３号明細書（２００６年１０月２３日出願）、米国仮特許出願第６０／８５５１７７号明細書（２００６年１０月３０日出願）、米国特許出願第１１／６０１５６３号明細書および米国特許出願第１１／６０１５６４号明細書（２００６年１１月１６日出願）、米国特許出願第１１／６３５２５８号明細書（２００６年１２月７日出願）および米国特許出願第１１／６１３４２０号明細書（２００６年１２月２０日出願）。
【００２２】
主題発明に従って、出願人らは、健康的なＰＵＦＡを生成するための生化学的経路操作のために使用してもよい、新しい卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）Δ１７デサチュラーゼ、および該酵素をコードする遺伝子を同定する。したがって主題発明には多くの用途がある。本願明細書で開示される方法によって作られるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食事代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を予防しまたは治療するために使用できる。代案としては、通常の使用において受容者が所望量の食事補給を受け入れるように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリン中に、純化されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品中に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、製薬用途（ヒトまたは獣医）のために使用してもよい。
【００２３】
組み換え手段によって生成されるＰＵＦＡをヒトまたは動物に補給することは、添加ＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝子孫のレベル増大をもたらすことができる。例えばＥＰＡによる処置は、ＥＰＡのみでなく、エイコサノイドなどのＥＰＡの下流生成物（すなわちプロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）のレベル増大もまたもたらす。複雑な調節機序は、このような機序を防止、調節または克服して、個体において特定ＰＵＦＡの所望のレベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡ抱合体を添加することを望ましくする。
【００２４】
定義
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
【００２５】
ここでの用法では「発明」または「本発明」と言う用語は、本特許請求の範囲および本願明細書で述べられる本発明の全ての態様および実施態様を指すことが意図され、いかなる特定の実施態様または態様にも限定されない。
【００２６】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は単純な表記体系「Ｘ：Ｙ」で表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素（Ｃ）原子総数であり、Ｙは二重結合数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）、および「オメガ−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）」対「オメガ−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）の違いについて、さらに詳しくは国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで規定される。
【００２７】
本開示においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表２に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００２８】
【表４】
2009534032.tif 000006
【００２９】
「トリアシルグリセロール」、「油」、および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子とエステル化する３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す（そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される）。このような油は、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞中でのＴＡＧ合成を指す。「微生物油」または「単細胞油」とは、微生物がそれらの生涯において天然に産生する油である。
【００３０】
「総脂質および油画分中のパーセント（％）ＰＵＦＡ」とは、これらの画分中の全脂肪酸に対するＰＵＦＡのパーセントを指す。「全脂質画分」または「脂質画分」という用語は、どちらも油性生物中の全脂質（すなわち中性および極性）の合計を指すので、ホスファチジルコリン（ＰＣ）画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）画分、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油）画分内に位置する脂質を含む。しかし「脂質」および「油」という用語は、本明細書全体で同義的に使用される。
【００３１】
「代謝経路」または「生合成経路」は、生化学的意味において、細胞内で起きて酵素によって触媒され、細胞によって使用されまたは保存される代謝産物の形成、または別の代謝経路の開始（流束発生ステップと称される）のどちらかを達成する一連の化学反応と見なすことができる。これらの経路の多くは複雑であり、開始物質を所望の正確な化学構造を有する生成物に成形する段階を追った改変を伴う。
【００３２】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡに転換する代謝過程を指す。この過程は、文献で詳しく述べられる（例えば国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。簡単に述べると、この過程は、小胞体膜中に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素（すなわち「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」）による、炭素原子の添加を通じた炭素鎖延長、および二重結合付加を通じた分子不飽和化を伴う。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼをはじめとする、ＰＵＦＡ生合成に関与するいずれかの酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）を指す。
【００３３】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、ＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。代表的な経路を図１に示し、様々な中間体を経由するオレイン酸のＤＨＡへの変換を提供して、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の原料からどのように生成できるかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。ω−３脂肪酸のみを発生させる部分をここでω−３脂肪酸生合成経路と称する一方、ω−６脂肪酸のみを発生させる部分はここでω−６脂肪酸生合成経路と称する。
【００３４】
「機能性」という用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落で挙げた全ての遺伝子が必要とされることを暗示しないものとする。
【００３５】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、対象とする脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本願明細書全体を通じたω参照システムの使用にもかかわらず、デルタシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで興味深いのは、１．）ＥＤＡからＤＧＬＡへのおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼ、２．）ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、３．）ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、４．）ＤＰＡからＤＨＡへの変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、５．）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、６．）ＬＡからＡＬＡへのおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、および７．）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼである。
【００３６】
ここで特に興味深いのは、分子のカルボキシル−末端から数えて１７番目と１８番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化する、Δ１７デサチュラーゼであり、それは例えばＡＲＡからＥＰＡ（そして場合によりＤＧＬＡからＥＴＡ）への変換を触媒する。当該技術分野で、Δ１７デサチュラーゼ（そしてまたΔ１５デサチュラーゼ）は、また時としてω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換する能力（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡへのまたはＤＧＬＡからＥＴＡへのおよびＡＲＡからＥＰＡへの変換）に基づいて「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称される。
【００３７】
いくつかのデサチュラーゼは、２つ以上の基質に対する活性を有する。この能力に基づいて、これらの酵素は、それらのデサチュラーゼ活性について「単機能性」または「二機能性」のどちらかとしてさらに分類できる。いくつかの実施態様では、適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼの遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定することで、脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが最も望ましい。
【００３８】
より具体的には、Δ１７デサチュラーゼは、ここで単機能性または二機能性Δ１７デサチュラーゼ活性を有する脂肪酸デサチュラーゼと定義され、Δ１７デサチュラーゼ活性はＡＲＡからＥＰＡへのおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換である。「単機能性Δ１７デサチュラーゼ」、「単機能性Δ１７デサチュラーゼ活性」または「排他的Δ１７デサチュラーゼ活性」という用語は、ＡＲＡからＥＰＡにおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡに変換できるが、ＬＡからＡＬＡには変換できないΔ１７デサチュラーゼを指す。対照的に「二機能性Δ１７デサチュラーゼ」、「二機能性Δ１７デサチュラーゼ活性」または「一次Δ１７デサチュラーゼ活性」は、ＡＲＡからＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡを優先的に変換するが、さらにＬＡからＡＬＡに変換する限られた能力を有するΔ１７デサチュラーゼを指す（したがって主としてΔ１７デサチュラーゼ活性、および限られたΔ１５デサチュラーゼ活性を示す）。
【００３９】
Δ１７デサチュラーゼは、Δ１７およびΔ１５不飽和化以外の、この分類には関連性がない特異性を有することができることに留意すべきである。単機能性と二機能性Δ１７デサチュラーゼの間の区別は実用的なものであって、絶対的でないことにもまた留意すべきである。例えば同一酵素がその発現レベルまたは生育条件次第で、単機能性または二機能性Δ１７デサチュラーゼ活性のどちらを持って機能してもよい。
【００４０】
ここでの目的で、「ＰｓＤ１７」という用語は、配列番号１によってコードされる、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）から単離されたΔ１７デサチュラーゼ（配列番号２）を指す。対照的に「ＰｓＤ１７Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）由来の合成Δ１７デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号３および４）。ここで述べられる分析に基づいて、ＰｓＤ１７およびＰｓＤ１７Ｓはさらに二機能性Δ１７デサチュラーゼに分類される。
【００４１】
同様に「ＰｒＤ１７」という用語は、配列番号５によってコードされる、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）から単離されたΔ１７デサチュラーゼ（配列番号６）を指す。対照的に、「ＰｒＤ１７Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）由来の合成Δ１７デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号７および６）。ここで述べられる分析に基づいて、ＰｒＤ１７およびＰｒＤ１７Ｓは、さらに単機能性Δ１７デサチュラーゼに分類される。
【００４２】
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って評価される。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００。式中、「生成物」には、直接生成物およびそれに由来する経路中の全生成物が含まれる。
【００４３】
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を延長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成できるポリペプチドを指す。この延長過程は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられているように、脂肪酸シンターゼと関連している多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん広いが、鎖長および不飽和の程度とタイプの双方によって区別される。例えばＣ１４／１６エロンガーゼはＣ１４基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ１８／２０エロンガーゼ（同義的に使用できる用語としてΔ６エロンガーゼとしてもまた知られている）はＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質（例えばＥＰＡ）を利用する。同様にしてΔ９エロンガーゼはまた、それぞれＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換も触媒できる。いくつかのエロンガーゼは幅広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できてもよいことに留意することが重要である（例えばＣ１６／１８エロンガーゼおよびａＣ１８／２０エロンガーゼの双方として作用する）。
【００４４】
「卵菌綱」という用語は、水生菌類およびべと病として一般に知られている一群の従属栄養生物を指す。それらは繊維状原生生物であり、周囲の水や土壌からそれらの食物を吸収しなくてはならず、または食べるために別の生物の身体に侵入するかもしれない。したがって卵菌綱は、腐敗物の分解と再循環に重要な役割を果たす。フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）は、５９の異なる種を含んでなる卵菌綱（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）の属である。卵菌綱は収束進化を通じて真菌との類似性を有するが、それらは（以前考えられていたように）真菌でない。そうではなく卵菌綱はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界の一部であり、その結果、植物、真菌、および動物とは異なる。珪藻および黄藻類および褐藻類（例えば昆布）もまた、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界に含まれる。
【００４５】
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）、「真菌脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。「油性酵母菌」と言う用語は、油を生成できる酵母菌として分類される微生物を指す。一般に油性微生物の細胞油またはＴＡＧ含量はＳ字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。油性微生物が約２５％を超えるその乾燥細胞重量を油として蓄積するのは珍しくない。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
【００４６】
ここでの用法では「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」は同義的に使用されて、一本鎖または二本鎖で、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００４７】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される（参照によってその内容全体を本願明細書に援用する）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェントな条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（近縁の生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを含む。
【００４８】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。核酸がハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、プローブの長さなどの要因次第で、温度および洗浄液の塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識する。
【００４９】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、特定の卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔｅ）タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に既知の目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【００５０】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含む。
【００５１】
「相同性」、および「相同的」という用語は、ここで区別なく使用される。これらは、その中において１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の変更も指す。したがって当業者によって理解されるように、本発明は具体的な例示的配列を超えるものを包含する。
【００５２】
さらに当業者は、本発明によって包含される相同的な核酸配列が、中程度にストリンジェントな条件下（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）において、ここで例示される配列と、またはここで開示される核酸配列のいずれかの機能的同等物であるここで開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によってもまた定義されることを認識する。
【００５３】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００５４】
ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが、生体外で構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立された手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらの構成単位をライゲーションしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
【００５５】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【００５６】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適した制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は次を含んでも良い。プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造。
【００５７】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来しても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプ中で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００５８】
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列、およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。
【００５９】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシング由来のＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それに由来する二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５０，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【００６０】
「作動的に結合した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能による影響を受けるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、それはそのコード配列と作動的に結合する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合できる。
【００６１】
「発現」という用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。
【００６２】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチド、すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドがそれから除去されたものを指す。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物、すなわちプレまたはプロペプチドが依然として存在するものを指す。プレまたはプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよい（が、これに限定されるものではない）。
【００６３】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす核酸分子の宿主生物中への転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【００６４】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に結合または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【００６５】
当該技術分野で知られている「％同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野で「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ（１９８８年）、２）「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノム・プロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９９３年）、３）「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第一部、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ（１９９４年）、４）「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」フォン・ハインェ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ），Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９８７年）、５）「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ（１９９１年）で述べられているものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算できる。
【００６６】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。アラインメントおよび同一性百分率の計算は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのレーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは「クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメント」を使用して実施され、これは「クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｖ法のアラインメント」をはじめとするアルゴリズムのいくつかの変種を包含して、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｖとラベルされたアラインメント法に相当し（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ），Ｄ．Ｇ．ら、（１９９２年）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１頁で述べられている）、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲインコーポレーテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのレーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）プログラムにある。多重アラインメントでは、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用した、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸ではこれらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。
【００６７】
クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｖプログラムを使用したアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。さらに「クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ法のアラインメント」を利用でき、これはクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗとラベルされたアラインメント法に相当し（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ），Ｄ．Ｇ．ら、（１９９２年）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１頁で述べられている）、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲインコーポレーテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのレーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）ｖ６．１プログラムにある。多重アラインメントのデフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｖプログラムを使用したアラインメント後、同プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。
【００６８】
「ＢＬＡＳＴＮ法のアラインメント」は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するアルゴリズムである。
【００６９】
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者はよく理解している。適切な核酸断片（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片である。確かに本発明について述べるのに、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの７０％〜１００％のあらゆる整数のアミノ酸同一性が有用かもしれない。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする
【００７０】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲインコーポレーテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）ミシガン州アンアーバーのジーンコーズ社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０頁、編集者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【００７１】
ここで使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）（下文においてマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら、「現代分子生物学プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７年）で述べられている。
【００７２】
概説：脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応えて誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸（１６：０）の新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成をもたらすこのプロセスについては、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで詳細に述べられる。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である（図１）。
【００７３】
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）アシルトランスフェラーゼによる１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ、２．）アシルトランスフェラーゼによる第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じ、３．）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じ、４．）アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。
【００７４】
オメガ脂肪酸の生合成
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素を必要とする。しかし図１に示され下で述べられるように、特定ω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路があることが多い。
【００７５】
具体的には全ての経路は、Δ１２デサチュラーゼによる、オレイン酸から第１のω−６脂肪酸であるＬＡへの最初の変換を必要とする。次に「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」を使用して、ω−６脂肪酸が次のようにして形成される。（１）Δ６デサチュラーゼによってＬＡがＧＬＡに転換され、（２）Ｃ１８／２０エロンガーゼによってＧＬＡがＤＧＬＡに転換され、３）Δ５デサチュラーゼによってＤＧＬＡがＡＲＡに転換される。代案としては次のようにして、ω−３脂肪酸形成のために「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」を利用することができる。（１）Δ１５デサチュラーゼによってＬＡが第１のω−３脂肪酸であるＡＬＡに転換され、（２）Δ６デサチュラーゼによってＡＬＡがＳＴＡに転換され、（３）Ｃ１８／２０エロンガーゼによってＳＴＡがＥＴＡに転換され、（４）Δ５デサチュラーゼによってＥＴＡがＥＰＡに転換され、（５）Ｃ２０／２２エロンガーゼによってＥＰＡがＤＰＡに転換され、（６）Δ４デサチュラーゼによってＤＰＡがＤＨＡに転換される。場合により、ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に転換されてもよい。例えばΔ１７デサチュラーゼ活性によって、ＥＴＡおよびＥＰＡがそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
【００７６】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成のための代案の経路は、Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼを利用する。より具体的には、ＬＡおよびＡＬＡは、Δ９エロンガーゼによってそれぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡに変換されもよく、次にΔ８デサチュラーゼがＥＤＡをＤＧＬＡに、および／またはＥＴｒＡをＥＴＡに変換する。
【００７７】
ω−３／ω−６脂肪酸の生成のために特定の宿主生物中に発現することが必要とされる特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質の可用性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、卵菌綱（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考慮事項としては以下が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、および／または４．）ポリペプチドが必要とする補助因子。発現したポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを有する（より詳しくは国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットを参照されたい）。
【００７８】
追加的実施態様では、特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって所望の脂肪酸生合成を最適化するのに際し、各酵素の変換効率の考慮もまた有益である。
【００７９】
上のそれぞれの考慮を念頭に、公的に入手可能な文献（例えばジェンバンク）、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ）を有する候補遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、特定宿主生物に導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にしまたは増強するのに適する。
【００８０】
Δ１７デサチュラーゼの同定
フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）およびＰ．ラモルム（ｒａｍｏｒｕｍ）の双方から単離されて本願明細書で述べられる、本発明のΔ１７デサチュラーゼの配列は、最初カリフォルニア州ウォールナットクリークの米国エネルギー省共同ゲノム研究所（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）（Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ））によって報告された。しかし配列は知られていたが、Δ１７デサチュラーゼとしてのそれらの機能は、本願明細書で研究成果が述べられる以前には解明されていなかったことに留意すべきである。出願人らが初めて、これらのポリペプチドの特異的Δ１７デサチュラーゼ活性を認識した。
【００８１】
これらの配列の正確な活性の探究において、ＪＧＩデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索する上で、Ｐ．インフェスタンス（ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）デサチュラーゼ（「ＰｉＤ１７」；配列番号９）をクエリーとして使用した。これは２種のＰｉＤ１７相同体、具体的にはここで「ＰｓＤ１７」と称されるＰ．ソジャ（ｓｏｊａｅ）相同体（配列番号１および２）、およびここで「ＰｒＤ１７」と称されるＰ．ラモルム（ｒａｍｏｒｕｍ）相同体（配列番号５および６）の同定をもたらす。
【００８２】
コドン最適化を通じて、代案の宿主において使用するために、野生型ＰｓＤ１７およびＰｒＤ１７デサチュラーゼを改変して各酵素の発現を最適化することが望ましかった。宿主が好むコドンの使用は、ポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できる。一般に、タンパク質中のコドン使用頻度を調べ（好ましくは最大量で発現するもの）、どのコドンが最大頻度で使用されるのかを判定することで、対象とする特定の宿主種内で宿主が好むコドンを判定できる。引き続いて宿主種中で好まれるコドンを使用して、例えばデサチュラーゼ活性を有する、対象とするポリペプチドのためのコード配列の全体または一部を合成できる。
【００８３】
下の表３に示すように、野生型ＰｓＤ１７およびＰｒＤ１７デサチュラーゼをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化した。
【００８４】
【表５】
2009534032.tif 000007
【００８５】
当業者はここでの教示を使用して、野生型ＰｓＤ１７およびＰｒＤ１７配列に基づいて、代案の宿主（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）以外の）中での最適発現に適した、様々なその他のコドン最適化Δ１７デサチュラーゼを作り出すことができる。したがって本発明は、野生型ＰｓＤ１７およびＰｒＤ１７（すなわちそれぞれ配列番号２および６によってコードされる）由来のあらゆるコドン最適化Δ１７デサチュラーゼに関する。これとしては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、合成Δ１７デサチュラーゼタンパク質（すなわちそれぞれ配列番号４および６で記載されるＰｓＤ１７ＳおよびＰｒＤ１７Ｓ）をコードする、配列番号３および７で記載されるヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
より具体的には、ＰｓＤ１７Ｓヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公共データベースとの比較からは、最も類似した既知の配列（すなわち国際公開第２００５／０８３０５３号パンフレットのフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）「ω３デサチュラーゼ」；ジェンバンク登録番号ＣＡＪ３０８７０もまた参照されたい）が、ここで報告される、クラスタルＷアラインメントアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲからのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）、前出）を使用した３６１個のアミノ酸長にわたるＰｓＤ１７Ｓ（配列番号４）のアミノ酸配列と、約９１．４％同じであることが明らかにされる。対照的にＰ．インフェスタンス（ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）「ω３デサチュラーゼ」とＰｓＤ１７（配列番号２）のアミノ酸配列の間には、９０．９％の同一性があった。
【００８７】
ＰｒＤ１７Ｓヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公共データベースとの比較からは、最も類似した既知の配列（すなわちＰ．インフェスタンス（ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）「ω３デサチュラーゼ」、前出）が、ここで報告される、クラスタルＷアラインメントアルゴリズム（前出）を使用した３６１個のアミノ酸長にわたるＰｒＤ１７Ｓ（配列番号６）のアミノ酸配列と、約８９．５％同じであることが明らかにされる。
【００８８】
本発明の文脈で、好ましいアミノ酸断片は、ここでＰｓＤ１７ＳおよびＰｒＤ１７Ｓ配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、少なくとも約８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９５％同一の配列が最も好ましい。本ＯＲＦに対応する好ましいＰｓＤ１７ＳおよびＰｒＤ１７Ｓをコードする核酸配列は、活性タンパク質をコードするものであり、それぞれここで報告されるＰｓＤ１７ＳおよびＰｒＤ１７Ｓ核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、少なくとも８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９５％同一の配列が最も好ましい。
【００８９】
上述の卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔｅ）ポリペプチドの同定に際し、適切な宿主（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中への形質転換、および宿主脂肪酸プロフィールに対するその効果の判定によって、各コドン最適化された脂肪酸デサチュラーゼの特異性を判定した（実施例５、８、および１２）。予測されたようにＰｓＤ１７ＳおよびＰｒＤ１７Ｓは、酵素がＡＲＡからＥＰＡへの変換を触媒できるように、どちらもΔ１７デサチュラーゼ活性を有した。具体的には、ＰｓＤ１７ＳのＡＲＡからＥＰＡへの変換効率が４０％および９８％であった（２つの異なるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における異なる生育条件下での判定に基づく）のに対し、ＰｒＤ１７ＳのＡＲＡからＥＰＡへの変換効率は４９％であった。変換効率は以下の式に従って評価された。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００。式中、「生成物」には、直接生成物およびそれに由来する経路中の全生成物が含まれる。
【００９０】
しかし意外にも、ＰｓＤ１７Ｓが限られたΔ１５デサチュラーゼ活性をさらに有した（すなわちＬＡからＡＬＡへの変換効率は１５％であった）のに対し、ＰｒＤ１７Ｓは有さなかった（すなわちＬＡからＡＬＡへの変換効率は１％未満であった）。したがってフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）デサチュラーゼがここで二機能性Δ１７デサチュラーゼと定義されるのに対し、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）デサチュラーゼはここで単機能性Δ１７デサチュラーゼと定義される。
【００９１】
相同体の同定および単離
配列分析ソフトウェアを使用して、本デサチュラーゼ配列（すなわちＰｓＤ１７、ＰｒＤ１７、ＰｓＤ１７Ｓ、ＰｒＤ１７Ｓ）またはその部分のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌綱または植物種中で、Δ１７デサチュラーゼ相同体を検索してよい。一般には、このようなコンピューターソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の改変に相同性の程度を割り当てて同様の配列をマッチする。
【００９２】
代案としてはΔ１７デサチュラーゼ相同体の同定のために、本デサチュラーゼ配列またはその部分のいずれかをハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、対象とする遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよいが、典型的に約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域の特定塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【００９３】
ハイブリダイゼーション法については、良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい（塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウム）。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）添加できる。
【００９４】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）核酸ＤＮＡ断片、および場合により約０．５〜２％重量／体積のグリシンも含まれる。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、（例えば硫酸デキストランなどの）陰イオン糖類ポリマーをはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤を含めてもよい。
【００９５】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
【００９６】
さらに別の実施態様では、ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼ核酸断片（または同定されたそのあらゆる相同体）のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌綱または植物種から、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書のポリメラーゼ連鎖反）（ＰＣＲ）；タボール（Ｔａｂｏｒ），Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２、１０７４頁（１９８５年）のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；または（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２頁（１９９２年）の連鎖置換増幅（ＳＤＡ）］、および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【００９７】
例えば本願明細書で述べられるΔ１７デサチュラーゼに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、本核酸断片の全てまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の酵母菌または卵菌類からライブラリーをスクリーニングして直接単離できる（ＥＰＡ［またはその誘導体］を産生する酵母または真菌が好ましい）。本核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインおよび合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。さらに当業者に既知の方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特異的プライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【００９８】
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は当該技術分野で一般的であり、よく知られている。（Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、「ヒトにおける遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」よりテイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「遺伝的障害診断における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」（１９８６年）３３〜５０頁、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．編、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」よりライクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ），Ｗ．、「ＰＣＲプロトコール：最近の方法と応用（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（１９９３年）第１５巻、３１〜３９頁、ヒューマナ（Ｈｕｍａｎａ）：ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
【００９９】
一般に本配列の２本の短い断片をＰＣＲプロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。またクローンされた核酸断片ライブラリーに対して、１つのプライマーの配列が本核酸断片に由来し、別のプライマーの配列が真核生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する、ＰＣＲを実施してもよい。
【０１００】
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８頁（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、本配列からデザインできる。メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））から市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステムを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３頁（１９８９年）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７頁（１９８９年））。
【０１０１】
別の実施態様では、新しい改善された脂肪酸デサチュラーゼを作り出すために、ここで述べられるいずれのΔ１７デサチュラーゼ核酸断片（または同定されるそのいずれの相同体）を使用してもよい。当該技術分野でよく知られているように、生体外変異誘発および選択、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャフリング」法またはその他の手段を使用して、天然のデサチュラーゼ遺伝子の突然変異を得ることができる。代案としては改善された脂肪酸がドメイン交換によって合成されてもよく、そこではここで述べられるΔ１７デサチュラーゼ核酸断片のいずれかからの機能性ドメインが代案のデサチュラーゼ遺伝子中の機能性ドメインと交換され、それによって新しいタンパク質がもたらされる。
【０１０２】
様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の生成方法
ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子（すなわちＰｓＤ１７、ＰｒＤ１７、ＰｓＤ１７Ｓ、ＰｒＤ１７Ｓまたはその他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）の導入は、適切なプロモーター制御下において、形質転換された宿主生物体中でそれぞれＥＰＡの生成増大をもたらすことが期待される。したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちＥＰＡ）に転換されるように、脂肪酸基質（すなわちＡＲＡ）をここで述べられるデサチュラーゼ（例えばＰｓＤ１７、ＰｒＤ１７、ＰｓＤ１７Ｓ、ＰｒＤ１７Ｓ）に曝すステップを含んでなる、ＰＵＦＡの直接的生成方法を包含する。
【０１０３】
より具体的には、本発明の目的は、
ａ．）ｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
ｉｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
ｉｉｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択されるΔ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｂ）ＡＲＡ源
を含んでなる宿主細胞（例えば油性酵母）中でＥＰＡを製造する方法を提供することであり、
宿主細胞を、Δ１７デサチュラーゼ遺伝子が発現してＡＲＡがＥＰＡに変換されるような条件下で生育させ、ＥＰＡは場合により回収する。
【０１０４】
当業者は、Δ１７デサチュラーゼの広い基質範囲が、ジホモ−γ−リノレン酸からエイコサテトラエン酸への変換のための酵素の使用を可能にすることを認識するであろう。したがって本発明は、
ａ．）ｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、
ｉｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｉｉｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも８９．５％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｂ．）ジホモ−γ−リノレン酸源
とを宿主細胞に提供するステップと、
ｃ．）Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸分子が発現されてジホモ−γ−リノレン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）のヌクレオチド分子を含んでなる宿主細胞を生育させるステップと、
ｄ．）場合によりステップ（ｃ）のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を製造する方法を提供する。
【０１０５】
フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）Δ１７デサチュラーゼの二機能性に基づいた代案の実施態様では、本発明の目的は、
ａ．）ｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９０．９％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
ｉｉ．）クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアラインメントに基づいて、配列番号４で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較すると少なくとも９１．４％の同一性を有する、Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子
よりなる群から選択される二機能性Δ１７デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子と、
ｂ）ＬＡ源
とを含んでなる宿主細胞（例えば油性酵母）中で、ＡＬＡを製造する方法を提供することであり、
宿主細胞を、二機能性Δ１７デサチュラーゼ遺伝子が発現してＬＡがＡＬＡに変換されるような条件下で生育させ、ＡＬＡは場合により回収する。
【０１０６】
代案としては、ここで述べられる各Δ１７デサチュラーゼ遺伝子およびその対応する酵素生成物を、ω−３脂肪酸を生成するために間接的に使用できる（国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット参照）。ω−３／ω−６ＰＵＦＡの間接的生成は、中間ステップまたは経路中間体の手段を通じて、脂肪酸基質が所望の脂肪酸生成物に間接的に転換する場合に起きる。したがってここで述べられるΔ１７デサチュラーゼ（例えばＰｓＤ１７、ＰｒＤ１７、ＰｓＤ１７Ｓ、ＰｒＤ１７Ｓまたはその他の突然変異酵素、コドン最適化酵素またはそれらの相同体）をＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ）をコードする追加的遺伝子と併せて発現して、より高いレベルのより鎖長の長いω−３脂肪酸（例えばＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）の生成をもたらしてもよいことが考察された。特定発現カセット内に含まれる特定遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望最終産物に左右される。
【０１０７】
代案の実施態様では、ここで述べられる完全な配列、これらの完全な配列の相補体、これらの配列のかなりの部分、それに由来するコドン最適化デサチュラーゼ、およびそれらと実質的に相同的な配列に基づいて、宿主生物の天然Δ１７デサチュラーゼを中断することが有用かもしれない。例えば宿主生物における標的を定めたΔ１７デサチュラーゼ（そして場合によりΔ１５デサチュラーゼ）の中断は、ω−３脂肪酸を合成する能力低下を有する突然変異株を生じる。この突然変異株は、「純粋な」ω−６脂肪酸（ω−３脂肪酸の同時合成なし）を生成するために有用であるかもしれない。
【０１０８】
発現システム、カセット、およびベクター
本願明細書で述べられる本配列の遺伝子および遺伝子生成物は、異種の宿主細胞の細胞中で発現されてもよい。組み換え宿主中での発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体を生成するために、または宿主を使用して従来可能でなかった新しい生成物を合成するのに宿主に既存のＰＵＦＡ経路を調節するために有用かもしれない。
【０１０９】
外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する、発現システムおよび発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本配列の遺伝子生成物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な宿主細胞に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１１０】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当該技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生成物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域（例えばプロモーター）、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域（すなわちターミネーター）を含んでなる。双方の制御領域が形質転換された宿主細胞の遺伝子由来であることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
【０１１１】
所望の宿主細胞中で、本ＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一時的または安定様式で達成できる。一時的発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｉｔｉｖｅ）プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するための好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに相当する米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書を参照されたい）。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象とするＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
【０１１２】
終結領域は、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域に、または異なる遺伝子に由来することができる。多数の終結領域が知られており、（それらが由来するのと同一および異なる属および種の双方で使用した際に）多様な宿主において満足に機能する。終結領域は、通常特定の特性のためと言うよりも便宜的に選択される。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１１３】
当業者は認識しているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは確証されない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされる遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム内に組み込まれるかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終的細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率およびタンパク質の正しい折りたたみ、５．）宿主細胞内のｍＲＮＡおよびクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの改変は、ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼの発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
【０１１４】
宿主細胞の形質転換
適切な宿主細胞中での発現に適したポリペプチドをコードするＤＮＡがひとたび得られたら、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、またはそれを宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム中で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座での遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めれば、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１１５】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターは異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０１１６】
対象とする遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に対象とする遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
【０１１７】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組み換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび国際公開第２００５／００３３１０号パンフレットで述べられるようにして、様々な選択技術によって同定できる。
【０１１８】
形質転換に続いて、本Δ１７デサチュラーゼ（そして場合により、宿主細胞内で同時発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
【０１１９】
ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
本Δ１７デサチュラーゼの配列の知識は、様々な宿主細胞中でのω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作するために有用であろう。これは直接にＰＵＦＡ生合成経路内での代謝エンジニアリング、または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に与える経路の追加的操作を必要とするかもしれない。望ましい生化学的経路をアップレギュレートし、望ましくない生化学的経路をダウンレギュレートするのに有用な方法は、当業者にはよく知られている。例えばエネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子中断によって排除し、またはその他の手段（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）によってダウンレギュレートしてもよい。
【０１２０】
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路内の操作の詳細な考察（およびその関連技術）は、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書］、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書］でそれぞれ示され、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路中の望ましい操作（およびその関連技術）についても同様である。
【０１２１】
Δ１７デサチュラーゼの組み換え発現のための好ましい宿主
本遺伝子および核酸断片の発現のための宿主細胞としては、広範な温度およびｐＨで、単純または複合糖質、脂肪酸，有機酸、油、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する宿主が挙げられる。出願人らの譲受人のニーズに基づいて、本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌（および特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中での発現のために単離された。しかし転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母菌、藻類、卵菌類および／または糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主になることが考察される。
【０１２２】
好ましい宿主は、油性酵母菌などの油性生物体である。これらの油性生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、油は細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。
【０１２３】
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ）Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ）Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９頁（２００２年））。
【０１２４】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥＰＡおよびＤＨＡのエンジニアリングのために適用できる特定の教示は、それぞれ米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書で提供される。油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中でのΔ１７デサチュラーゼを含んでなる発現ベクターの合成および形質転換のための詳細な手段は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットで提供される。この酵母中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主のゲノム中への線状ＤＮＡの組み込みによる。ゲノム中の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であることができる［例えばＵｒａ３遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ジェンバンク登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ジェンバンク登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（国際公開第２００４／１０４１６７号パンフレット）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号Ｚ５００２０）および／またはＬｉｐ２遺伝子遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＡＪ０１２６３２）中への］。
【０１２５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地に生育する能力である。代案の実施態様では、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物、「５−ＦＯＡ」）が、酵母Ｕｒａ−突然変異体の選択のために使用される。化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒である。したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ），Ｐ．Ｌ．およびフィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ），Ｓ．、「酵母２−ハイブリッド・システム（Ｙｅａｓｔ  ２−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第７巻、１０９〜１４７頁、１９９７年）。
【０１２６】
その他の好ましい微生物宿主としては、油性の細菌、藻類、卵菌綱、およびその他の真菌が挙げられ、この幅広い微生物宿主郡中で特に興味深いのはω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物である。したがって例えば誘導性プロモーターまたは調節プロモーター制御下にある本Δ１７デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによる、（商業的にＡＲＡの生成のために使用される）モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）の形質転換は、さらに多量のＥＰＡを合成できる形質転換生物を生じるかもしれない。Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）の形質転換法については、マッケンジー（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：４６５５頁（２０００年）で述べられている。同様にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物の形質転換法について米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示されている。
【０１２７】
代案の好ましい実施態様では、本発明は、ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼで形質転換するための多様な植物宿主を提供する。このように形質転換される植物は単子葉植物または双子葉植物であることができ、好ましくはそれらは油性として同定されたクラスの植物（例えば油料種子植物）に属する。好ましい油料種子植物宿主の例としてはダイズ（グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）およびソヤ（Ｓｏｊａ）種）、コーン（ジー・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、亜麻（リナム（Ｌｉｎｕｍ）種）、アブラナ（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種）、月見草、カノーラ、トウモロコシ、ベニバナ（カルタムス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）種）、およびヒマワリ（ヘリアンタス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）種）が挙げられるが、これに限定されるものではない。油料種子植物における脂肪酸デサチュラーゼの過剰発現手段（例えば発現カセット構築、形質転換、選択など）については、国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレットで述べられている。
【０１２８】
ここで述べられるΔ１７デサチュラーゼの発現のために、どの特定の宿主が選択されようとも、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るためには、複数の形質転換体をスクリーンしなくてはならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロチェク（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウエスタンおよび／またはエライサ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析を伴ってもよい。
【０１２９】
ω脂肪酸生成のための発酵過程
形質転換された宿主細胞は、キメラデサチュラーゼ遺伝子の発現を最適化する条件下で生育させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に、最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））で、または生育に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベース）上で生育させる。
【０１３０】
本発明における発酵培地は適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで教示されている。本発明で利用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は糖、グリセロール、および／または脂肪酸である。最も好ましいのはグルコースおよび／または１０〜２２個の炭素を含有する脂肪酸である。
【０１３１】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性宿主の生育と、ＰＵＦＡ生成に必須の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＦｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌ）」より、ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら、６１〜９７頁（１９９２年）。
【０１３２】
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、形質転換宿主細胞の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１３３】
典型的に油性酵母菌細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＰＵＦＡ生成には、二段階発酵過程が必要である。このアプローチについては国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられ、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、供給バッチ、および連続）および成育中の考察事項についても同様に述べられる。
【実施例】
【０１３４】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、発明の好ましい実施態様を示しながら、あくまで例示のために提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その趣旨と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および改変を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。
【０１３５】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）による出版、ニュージャージー州ホーボーケン（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）（１９８７年）で述べられる。
【０１３６】
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられている。フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ），Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、「バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
【０１３７】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施した（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出）。ＤＮＡ配列は、ベクターとインサート特異的プライマーとの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上で生成した。遺伝的配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲインコーポレーテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。
【０１３８】
特に断りのない限り、ＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年）およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））を検索を実施して、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非冗長ジェンバンクＣＤＳ翻訳、３次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンク由来配列、スイスＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に含まれる配列に対する類似性を有する単離配列を同定した。配列を全ての読み枠で翻訳し、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ），Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２頁（１９９３年））を使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる全ての公的に入手できるタンパク質配列との類似性について比較した。クエリー配列がそれに対して最も高い類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴ比較の結果を％同一性、％類似性、および期待値に従って報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率として定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一のまたは保存されたアミノ酸の百分率として定義される。「期待値」は、この大きさのデータベース検索で期待される、絶対的に偶然の特定スコアでのマッチ数を明記して、マッチの統計学的有意さを推定する。
【０１３９】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１４０】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、通常ＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で２８℃で生育させた。
【０１４１】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りチェン（Ｃｈｅｎ），Ｄ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、０．１２５ｍＬの２Ｍ  ＤＴＴ、および５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
【０１４２】
形質転換体の選択のためには、一般に最少培地（「ＭＭ」）を使用した。ＭＭの組成は以下のとおり。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１。必要に応じてロイシン、リジンおよび／またはウラシルのサプリメントを最終濃度０．０１％に添加した（それによってそれぞれ２０ｇ／Ｌの寒天で調製される「ＭＭＬｅ」、「ＭＭＬｙｓ」、および「ＭＭＵ」選択培地を生成した）。
【０１４３】
代案としては、次を含んでなる５−フルオロオロチン酸（「ＦＯＡ」、また５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物とも）選択培地上で形質転換体を選択した。ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌのウラシル、７５ｍｇ／Ｌのウリジン、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からの９００ｍｇ／Ｌ  ＦＯＡ、および２０ｇ／Ｌの寒天。
【０１４４】
高グルコース培地（「ＨＧＭ」）を次のように調製した。６．３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２７ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、および８０ｇ／Ｌ  グルコース（ｐＨ７．５）。
【０１４５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、ブライ（Ｂｌｉｇｈ），Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ），Ｗ．Ｊ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７頁（１９５９年）で述べられるように、細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ），Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ），Ｉ．、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、引き続きヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）からの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１４６】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
【０１４７】
実施例１
Δ１７デサチュラーゼをコードするフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）遺伝子の同定
カリフォルニア州ウォールナットクリークの米国エネルギー省共同ゲノム研究所（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）（Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ））はフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）ゲノム（推定ゲノムサイズ９５Ｍｂｐ）のバージョン１．０を作り出した。このゲノム配列は、全ゲノムショットガンストラテジーを使用して生成され、全部で１９，２７６個の遺伝子モデルを含んでなる。
【０１４８】
フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）のΔ１７デサチュラーゼのアミノ酸配列（ジェンバンク登録番号ＣＡＪ３０８７０；ここで「ＰｉＤ１７」と称し、配列番号９に相当する）をクエリー配列として使用して、ＪＧＩのフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）データベースに対して、ＴＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴタンパク質対翻訳ヌクレオチド）検索を行った（ＪＧＩから入手できるデフォルトパラメーターを使用）。足場１７：３３８１４８〜３３９１６７上に位置する１個のＰ．ソジャ（ｓｏｊａｅ）ＯＲＦが、ＰｉＤ１７と高度な相同性を有することが分かった（すなわち期待値０で９１．８％の同一性および９５．６％の類似性）。この相同性に基づいて、Ｐ．ソジャ（ｓｏｊａｅ）ＯＲＦをΔ１７デサチュラーゼとして仮に同定し、「ＰｓＤ１７」と称した。ＰｓＤ１７（配列番号１）の１０９２ｂｐのＤＮＡ配列をデータベースから検索すると、それは長さが３６３個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号２）をコードすることが分かった。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）プログラム）を使用したアミノ酸のアラインメントは、ＰｉＤ１７とＰｓＤ１７の間に９０．９％の同一性があったことを示し、対照的にヌクレオチド配列は８６．６％のみの同一性を有した。
【０１４９】
ＰｓＤ１７（配列番号２）をクエリー配列として使用してタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ検索を行うことで、「ｎｒ」データベース（一般方法参照）中に含まれる全ての公的に入手可能なタンパク質配列に対するＰｓＤ１７の配列相同性もまた判定した。この分析に基づいて、ＰｓＤ１７はサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）のω３脂肪酸デサチュラーゼ（ジェンバンク登録番号ＡＡＲ２０４４４）と最も高い相同性を有することが分かった。具体的にはＰｓＤ１７は、ジェンバンク登録番号ＡＡＲ２０４４４のアミノ酸配列と、期待値７Ｅ−１１７で６０％の同一性および７４％類似性を有した。さらにＰｓＤ１７は、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ＃２９４１３の脂肪酸デサチュラーゼのアミノ酸配列（ジェンバンク登録番号ＡＢＡ２３８０９）と、期待値４Ｅ−５７で３９％の同一性および５７％の類似性を有した。
【０１５０】
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」）の合成
米国特許第７，１２５，６７２号明細書で述べられているのと類似の様式で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子のコドン使用頻度を最適化した。具体的には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のコドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡの安定法則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ），Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ  ２６５（１〜２）：１１〜２３頁（２００１年））に従って、ＰｓＤ１７のコード配列（配列番号１および２）に基づいて、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」と称する、配列番号３および４）をデザインした。翻訳開始部位の修正に加えて、１０９２ｂｐのコード領域の１７５ｂｐ（１６，０％）を修正し、１６８個のコドン（４６．２％）を最適化した。ＧＣ含量は、野性型遺伝子（すなわちＰｓＤ１７）内の６５．１％から、合成遺伝子（すなわちＰｓＤ１７Ｓ）内の５４．５％に低下した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をＰｓＤ１７Ｓ（配列番号３）の翻訳開始コドン周辺、および停止コドン後にそれぞれ組み込んだ。図２は、ＰｓＤ１７とＰｓＤ１７Ｓのヌクレオチド配列の比較を示す。アミノ酸レベルでは、野性型ＰｓＤ１７と比較してＰｓＤ１７Ｓは３番目および４番目のアミノ酸を欠いており、したがってＰｓＤ１７Ｓの全長は３６１個のアミノ酸（配列番号４）であった。デザインされたＰｓＤ１７Ｓ遺伝子はニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト・コーポレーション（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））によって合成され、ｐＵＣ５７（ジェンバンク登録番号Ｙ１４８３７）中にクローンされて、ｐＰｓＤ１７Ｓ（配列番号１０；図３Ａ）を生じさせた。
【０１５１】
実施例３
コンストラクトｐＦｍＰｓＤ１７Ｓの発生
本実施例は、キメラのＦＢＡＩＮｍ：：ＰｓＤ１７Ｓ：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＦｍＰｓＤ１７Ｓの構築について述べる。プラスミドｐＦｍＰｓＤ１７Ｓ（配列番号１３；図３Ｄ）は、プラスミドｐＫＵＮＦ１−ＫＥＡ、ｐＤＭＷ２１４、およびｐＰｓＤ１７Ｓからの断片を使用して、三元ライゲーションによって構築された。プラスミドｐＦｍＰｓＤ１７Ｓを利用して、下記の実施例５で述べるようにＰｓＤ１７Ｓの機能性発現を試験した。
【０１５２】
プラスミドｐＫＵＮＦ１−ＫＥＡ
ｐＫＵＮＦ１−ＫＥＡ（配列番号１１；図３Ｂ）は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：Ｅ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる。このキメラ遺伝子内の「ＦＢＡＩＮｍ」プロモーターは（国際公開第０５／０４９８０５号パンフレット；また図３Ｂで「Ｆｂａ１＋イントロン」としても同定されている）「ＦＢＡＩＮ」プロモーター由来の合成プロモーターを指し、ＦＢＡＩＮプロモーターは、発現に必要なｆｂａ１遺伝子によってコードされるフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の５’上流非翻訳領域と、ｆｂａ１遺伝子のイントロンを有する５’コード領域の一部とを指す。ＦＢＡＩＮｍプロモーターはＦＢＡＩＮから改変され、ＦＢＡＩＮｍはＦＢＡＩＮプロモーターのＡＴＧ翻訳開始コドンとイントロンの間に５２ｂｐの欠失があり（それによってＮ−末端の２２個のアミノ酸のみを含む）、イントロン後の新しい翻訳コンセンサスモチーフを有する。さらにＦＢＡＩＮプロモーターは発現する遺伝子コード領域と縮合した際に、融合タンパク質を生じる一方、ＦＢＡＩＮｍプロモーターはこのような融合タンパク質を生じない。
【０１５３】
表４はプラスミドｐＫＵＮＦ１−ＫＥＡの構成要素を要約する。
【０１５４】
【表６】
2009534032.tif 000008
【０１５５】
プラスミドｐＤＭＷ２１４
ｐＤＭＷ２１４（配列番号１２；図３Ｃ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の双方の中で複製するシャトルプラスミドである。それは次の構成要素を含有した。
【０１５６】
【表７】
2009534032.tif 000009
【０１５７】
プラスミドｐＦｍＰｓＤ１７Ｓの最終構築
プラスミドｐＫＵＮＦ１−ＫＥＡ（図３Ｂ；ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含んでなる）のＰｍｅＩ／ＮｃｏＩ断片、およびプラスミドｐＰｓＤ１７Ｓ（図３Ａ；合成Δ１７デサチュラーゼ遺伝子ＰｓＤ１７Ｓを含んでなる）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を一方向性に使用して、ｐＤＭＷ２１４（図３Ｃ）のＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片を置き換えた。これはキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＰｓＤ１７Ｓ：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなる、ｐＦｍＰｓＤ１７Ｓ（配列番号１３；図３Ｄ）の発生をもたらした。したがってｐＦｍＰｓＤ１７Ｓの構成要素は、下の表６で述べられるようであった。
【０１５８】
【表８】
2009534032.tif 000010
【０１５９】
実施例４
Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を通じて総脂質の約１１％のＡＲＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株の発生
本実施例は、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現を通じて総脂質に対して１１％のＡＲＡを生成できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来のＹ２０４７株の構築について述べる（図４Ａ）。Ｙ２０４７は、ブダペスト条約の取り決めの元に寄託されており、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７１８６を有する。さらにＹ２０４７の構築については、ここで参照によって援用する同時係属米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書で述べられている。
【０１６０】
Ｙ２０４７株の発生には、最初にＭ４株（８％のＤＧＬＡを生成する）の構築を必要とする。
【０１６１】
総脂質の約８％のＤＧＬＡを生成するためのＭ４株の発生
コンストラクトｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅ（図４Ｂ；配列番号１４）を発生させて４個のキメラ遺伝子（Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、および２個のＣ１８／２０エロンガーゼを含んでなる）を野性型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子座に組み込み、それによってＤＧＬＡの生成を可能にした。ｐＫＵ
ＮＦ１２Ｔ６Ｅプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
【０１６２】
【表９】
2009534032.tif 000011
【０１６３】
一般方法に従ってｐＫＵＮＦ１２Ｔ６ＥプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に野性型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＦＯＡ選択培地プレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＵ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＵプレート上に生育できたが、ＭＭプレート上には生育できなかったコロニーをＵｒａ−株として選択した。次にＵｒａ−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＵに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１６４】
ＧＣ分析は、ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅの４個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中にＤＧＬＡの存在を示したが、野性型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株では示されなかった。選択された３２個のＵｒａ−株のほとんどが総脂質の約６％のＤＧＬＡを生成した。総脂質の約８％のＤＧＬＡを生成した２株（すなわちＭ４株および１３−８）があった。
【０１６５】
総脂質の約１１％ＡＲＡを生成するＹ２０４７株の発生
コンストラクトｐＤＭＷ２７１（図４Ｃ；配列番号１７）を発生させて、３個のΔ５キメラ遺伝をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｍ４株のＬｅｕ２遺伝子に組み込んだ。表８で述べられるように、プラスミドｐＤＭＷ２７１は以下の構成要素を含有した。
【０１６６】
【表１０】
2009534032.tif 000012
【０１６７】
一般方法に従ってプラスミドｐＤＭＷ２７１をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＭ４株に形質転換した。形質転換に続いて、細胞をＭＭＬｅプレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭＬｅプレートの上で生育した個々のコロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｅプレート上に画線培養した。ＭＭＬｅプレート上では生育できたが、ＭＭプレート上では生育できなかったコロニーをＬｅｕ２−株として選択した。次にＬｅｕ２−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅ培地に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１６８】
ＧＣ分析はｐＤＭＷ２７１形質転換体中のＡＲＡの存在を示したが、親Ｍ４株中には示されなかった。具体的には、ｐＤＭＷ２７１がある４８個の選択されたＬｅｕ２−形質転換体中に、改変されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の総脂質の５％未満のＡＲＡを生成した３５株、６〜８％のＡＲＡを生成した１２株、および総脂質の約１１％のＡＲＡを生成した１株があった。１１％のＡＲＡを生成した株を「Ｙ２０４７」と命名した。
【０１６９】
実施例５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株におけるコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」）の発現
一般方法で述べられるように、プラスミドｐＦｍＰｓＤ１７Ｓ（図３Ｄ；実施例３）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株（実施例４）に形質転換した。形質転換細胞をＭＭ選択培地プレート上に播種し、２〜３日間３０℃に保った。ＭＭプレート上に生育した８個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を３０℃の３ｍｌの液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１７０】
ＧＣ結果は、全８個の形質転換体において、生成した総脂質の約３％のＡＲＡおよび２％のＥＰＡがあったことを示した。これらの８株中でＰｓＤ１７ＳがＡＲＡをＥＰＡに変換する変換効率は、平均率で約４０％であった。変換効率は次の式に従って測定された。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００。式中、「生成物」には、直接生成物およびそれに由来する経路中の全生成物が含まれる。したがってこの実験データは、Ｐ．ソジャ（ｓｏｊａｅ）由来のコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（配列番号３）が、ＡＲＡをＥＰＡに効率的に不飽和化したことを実証する。
【０１７１】
実施例６
コンストラクトｐＺＰ３−Ｐ７Ｕの発生
本実施例は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムのＰｏｘ３遺伝子座（ジェンバンク登録番号ＸＰ＿５０３２４４）に組み込むようにデザインされた、キメラのＹＡＴ：：ＰｓＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺＰ３−Ｐ７Ｕの構築について述べる。下記の実施例８で述べられるように、プラスミドｐＺＰ３−Ｐ７Ｕを利用してＰｓＤ１７Ｓの機能性発現を試験した。ｐＺＰ３−Ｐ７Ｕの構成要素は、下の表９で述べられるようであった。
【０１７２】
【表１１】
2009534032.tif 000013
【０１７３】
実施例７
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を通じて総脂質の約１２％のＡＲＡを生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株の発生
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路（図６Ａ）の発現を通じて、総脂質に対して約１２％のＡＲＡを生成できるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来のＹ４０７０株の構築について述べる。Ｙ４０７０株を利用して、下記の実施例８のＰｓＤ１７Ｓおよび実施例１２のＰｒＤ１７Ｓの機能性発現を試験した。
【０１７４】
Ｙ４０７０株の発生には、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律性変異からのＦＯＡ抵抗性突然変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−フェノタイプで１７％のＥＤＡを生成する）、Ｙ４００１Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプで１７％のＥＤＡを生成する）、Ｙ４０３６株（Ｌｅｕ−フェノタイプで１８％のＤＧＬＡを生成する）、およびＹ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプで１８％のＤＧＬＡを生成する）の構築が必要であった。
【０１７５】
Ｙ２２２４株の発生
Ｙ２２２４株を次の様式で単離した。ＹＰＤ寒天プレート（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）からのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２細胞を２５０ｍｇ／Ｌの５−ＦＯＡ（ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を含有するＭＭプレート（各７５ｍｇ／Ｌのウラシルおよびウリジン、６．７ｇ／Ｌ硫酸アンモニア添加ＹＮＢ、アミノ酸無添加、および２０ｇ／Ｌグルコース）上に画線培養した。プレートを２８℃でインキュベートし、得られたコロニーの内４つを２００ｍｇ／ｍＬ  ５−ＦＯＡ含有ＭＭプレート上、およびウラシルおよびウリジンを欠くＭＭプレート上に別々にパッチして、ウラシルＵｒａ３栄養要求性を確認した。
【０１７６】
総脂質の約１７％のＥＤＡを生成するＹ４００１株の発生
コンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３（図６Ｂ）の組み込みを通じて、Ｙ４００１株を作り出した。４個のキメラ遺伝子（すなわちΔ１２デサチュラーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、および２個のΔ９エロンガーゼ）を含んでなるこのコンストラクトをＹ２２２４株のＬｅｕ２遺伝子座に組み込み、それによってＥＤＡの生成を可能にした。
【０１７７】
コンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３は、表１０に示す構成要素を含有した。
【０１７８】
【表１２】
2009534032.tif 000014
【０１７９】
一般方法に従って、プラスミドｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株（すなわちＡＴＣＣ＃２０３６２Ｕｒａ３−）の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕ培地プレート上に播種して３０℃に２〜３日間保った。コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｅｕ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕプレート上では生育できたが、ＭＭプレートでは生育できなかったコロニーをＬｅｕ−株として選択した。次にＬｅｕ−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅｕに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１８０】
ＧＣ分析は、ｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３の４個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中のＥＤＡの存在を示したが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２２２４対照株中には示されなかった。選択された３６個のＬｅｕ−株のほとんどは総脂質の約１２〜１６．９％のＥＤＡを生成した。総脂質の約１７．４％、１７％、および１７．５％のＥＤＡを生成した３株（すなわち株＃１１、＃３０、および＃３４）があり、それらをそれぞれＹ４００１、Ｙ４００２、およびＹ４００３株と称した。
【０１８１】
総脂質の約１７％ＥＤＡを生成するためのＹ４００１Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）の発生
Ｙ４００１株において、プラスミドｐＹ１１６中でのＣｒｅリコンビナーゼ酵素の一時的な発現を通じてＹ４００１Ｕ株を作り出し（図６Ｃ）、Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプを生成した。コンストラクトｐＹ１１６は次の構成要素を含有した。
【０１８２】
【表１３】
2009534032.tif 000015
【０１８３】
一般方法に従って、新鮮に生育させたＹ４００１細胞の形質転換のためにプラスミドｐＹ１１６を使用した。形質転換体細胞を２８０μｇ／ｍＬスルホニル尿素を含有するＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート（ロイシン添加ＭＭＵ）上に播種して、３０℃に３〜４日間保った。４個のコロニーを拾って３０℃の３ｍＬの液体ＹＰＤ培地に接種し、２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪した。培養を液体ＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ培地で１：５０，０００に希釈し、１００μＬを新しいＹＰＤプレート上に播種して３０℃に２日間保った。コロニーを拾ってＭＭＬｅｕおよびＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート上では生育できたが、ＭＭＬｅｕプレートでは生育できなかったコロニーを選択し、ＧＣによって分析してＣ２０：２（ＥＤＡ）の存在を確認した。Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプを有する１株は総脂質の約１７％のＥＤＡを生成し、Ｙ４００１Ｕと称された。
【０１８４】
総脂質の約１８％のＤＧＬＡを生成するためのＹ４０３６株の発生
コンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９（図７Ａ；配列番号２８）を発生させて、４個のキメラ遺伝子（１個のΔ１２デサチュラーゼ、１個のΔ９エロンガーゼ、および２個の突然変異Δ８デサチュラーゼを含んでなる）をＹ４００１Ｕ１株のΔ１２遺伝子座に組み込み、それによってＤＧＬＡの生成を可能にした。コンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９は以下の構成要素を含有した。
【０１８５】
【表１４】
2009534032.tif 000016
【０１８６】
一般方法に従って、ｐＫＯ２ＵＦ８２８９プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ４００１Ｕ１株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕプレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。コロニーを拾ってＭＭＬｅｕ選択プレート上において３０℃で２日間画線培養した。次にこれらの細胞を３０℃の液体ＭＭＬｅｕに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１８７】
ＧＣ分析は、ｐＫＯ２ＵＦ８２８９の４キメラ遺伝子を含有する形質転換体中のＤＧＬＡの存在を示したが、親Ｙ４００１Ｕ１株中には示さなかった。選択された９６株のほとんどは、総脂質の７〜１３％のＤＧＬＡを生成した。総脂質の約１５％、１３．８％、１８．２％、１３．１％、１５．６％、および１３．９％のＤＧＬＡを生成した６株（すなわち＃３２、＃４２、＃６０、＃６８、＃７２、および＃９４）があった。これらの６株をそれぞれＹ４０３４、Ｙ４０３５、Ｙ４０３６、Ｙ４０３７、Ｙ４０３８、およびＹ４０３９と称した。
【０１８８】
総脂質の約１８％のＤＧＬＡを生成するためのＹ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ３−）の発生
コンストラクトｐＹ１１６（図６Ｃ；配列番号２７）を利用して、Ｙ４０３６株中で一時的にＣｒｅリコンビナーゼ酵素を発現した。これはゲノムからＬｏｘＰに挟まれたＵｒａ３遺伝子を放出した。
【０１８９】
一般方法に従って、プラスミドｐＹ１１６を使用してＹ４０３６株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート（ロイシン添加ＭＭＵ）上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート上で生育した個々のコロニーを拾ってＹＰＤ液体培地に画線培養し、３０℃および２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪してｐＹ１１６プラスミドをキュアリングした。生育した培養物をＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ  ｕプレート上に画線培養した。３０℃で２日後、個々のコロニーをＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ、ＭＭＵ、およびＭＭＬｅｕプレート上に再度画線培養した。ＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ上では生育できたがＭＭＵまたはＭＭＬｅｕプレート上では生育できなかったコロニーを選択した。Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプがあるこれらの株の１つをＹ４０３６Ｕ（Ｕｒａ−、Ｌｅｕ−）と称した。
【０１９０】
総脂質の約１２％のＡＲＡを生成するためのＹ４０７０株の発生
コンストラクトｐＺＫＳＬ−５５５Ｒ（図７Ｂ；配列番号３２）を発生させ、３個のΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ４０３６Ｕ株のＬｙｓ遺伝子座に組み込み、それによってＡＲＡの生成を可能にした。ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒプラスミドは次の構成要素を含有した。
【０１９１】
【表１５】
2009534032.tif 000017
【０１９２】
一般方法に従って、ｐＺＫＳＬ−５５５ＲプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ４０３６Ｕ株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕＬｙｓプレート（リジン添加ＭＭＬｅｕ）上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。次に単一コロニーをＭＭＬｅｕＬｙｓプレート上に再度画線培養し、次に３０℃の液体ＭＭＬｅｕＬｙｓに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１９３】
ＧＣ分析はｐＺＫＳＬ−５５５Ｒの３個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中のＡＲＡの存在を示したが、親Ｙ４０３６株中には示されなかった。選択された９６株のほとんどは総脂質の約１０％のＡＲＡを生成した。総脂質の約１１．７％、１１．８％、１１．９％、および１１．７％のＡＲＡを生成した４株（すなわち＃５７、＃５８、＃６９、および＃７５）があった。これらの４株をそれぞれＹ４０６８、Ｙ４０６９、Ｙ４０７０、およびＹ４０７１と称する。さらなる分析は、ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒの３個のキメラ遺伝子が、Ｙ４０６８、Ｙ４０６９、Ｙ４０７０、およびＹ４０７１株のＬｙｓ５部位に組み込まれなかったことを示した。全ての株はＬｙｓ＋フェノタイプを有した。
【０１９４】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に関してＹ４０７０株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＧＰＤ：：Ｆ．Ｄ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ：：Ｆ．Ｄ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、Ｅｘｐ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＷＴ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴであった。
【０１９５】
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株におけるコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」）の発現
一般方法に従ってプラスミドｐＺＰ３−Ｐ７Ｕ（図５；実施例６）をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株を形質転換するのに使用した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭプレート上で生育した１２個の形質転換体を拾って新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したら、これらの株を３０℃の３ｍＬ液体ＭＭに個々に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、高グルコース培地に再懸濁して、次に３０℃で５日間生育させて、２５０ｒｐｍ／分で振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０１９６】
ＧＣ結果を下の表１４に示す。脂肪酸は、１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ（１８：２）、ＡＬＡ、ＥＤＡ（２０：２）、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ（２０：３）、ＥＴＡ、およびＥＰＡと同定され、それぞれの組成は総脂肪酸の％として表される。「Δ１７活性」は以下の式に従って計算され、ＥＰＡへの％基質変換を表す。（［ＥＰＡ］／［ＡＲＡ＋ＥＰＡ］）×１００。「Δ１５活性」は以下の式に従って計算され、ＡＬＡへの％基質変換を表す。（［ＡＬＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ］）×１００。
【０１９７】
【表１６】
2009534032.tif 000018
【０１９８】
ＧＣ結果は、１２個の形質転換体中で平均で総脂質の０．３％のＡＲＡおよび１１．５
％のＥＰＡが生成されたことを実証した。これらの１２株中でＰｓＤ１７ＳがＡＲＡをＥＰＡに変換する変換効率は、平均率で約９８％であった。変換効率は次の式に従って測定された。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００。式中、「生成物」には、直接生成物およびそれに由来する経路中の全生成物が含まれる。したがってこの実験データは、Ｐ．ソジャ（ｓｏｊａｅ）由来のコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（配列番号３）が、ＡＲＡをＥＰＡに効率的に不飽和化したことを実証する。
【０１９９】
平均で総脂質の５％のＡＬＡおよび２９．１％のＬＡもまた、１２個の形質転換体中で生成された。これらの１２株中でＰｓＤ１７ＳがＬＡをＡＬＡに変換する変換効率は、平均率で約１５％であった。さらに全１２株中でＥｔｒＡおよびＥＴＡも生成され、ＰｓＤ１７がＥＤＡをＥｔｒＡに、ＤＧＬＡをＥＴＡに変換できるかもしれないことが示唆された。しかしＹ４０７０株中のΔ９エロンガーゼはＡＬＡをＥｔｒＡに、Δ８デサチュラーゼはＥｔｒＡをＥＴＡに変換し得るので、これらの２つの場合の変換効率を計算することは困難である。
【０２００】
ＰｓＤ１７がΔ１７およびΔ１５デサチュラーゼ活性の双方を有したことは明らかであり、したがってここで定義される二機能性デサチュラーゼとして機能する。
【０２０１】
実施例９
Δ１７デサチュラーゼをコードするフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）遺伝子の同定
カリフォルニア州ウォールナットクリークの米国エネルギー省共同ゲノム研究所（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）（Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ））はフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）ゲノム（推定ゲノムサイズ６５Ｍｂｐ）のバージョン１．０を作り出した。このゲノム配列は、全ゲノムショットガンストラテジーを使用して生成され、全部で１６，０６６個の遺伝子モデルを含んでなる。
【０２０２】
実施例１で述べられるのと類似した様式で、ＰｉＤ１７（配列番号９）のアミノ酸配列をクエリー配列として使用し、ＪＧＩのフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）データベースに対してＴＢＬＡＳＴＮ検索を実施した（ＪＧＩから入手できるデフォルトパラメーターを使用）。
【０２０３】
２個のＯＲＦが、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）のゲノム配列中のＰｉＤ１７と高度な相同性を有することが分かった。具体的にはＯＲＦ８０２２２は、期待値０で配列番号９と８９％の同一性および９４％の類似性を有する。同様にＯＲＦ４８７９０は、期待値６Ｅ−４４で配列番号９と４０％までの同一性および６１％の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｔｉｔｙ）を有する。これらの結果に基づいて、ＯＲＦ８０２２２をΔ１７デサチュラーゼと仮に同定し、「ＰｒＤ１７」と称した。
【０２０４】
ＰｒＤ１７（配列番号５）の１０８６ｂｐのＤＮＡ配列をデータベースから検索すると、それは長さが３６１個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号６）をコードすることが分かった。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアからのメガライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）（商標）プログラム）を使用したアミノ酸のアラインメントは、ＰｉＤ１７とＰｒＤ１７の間に８９．５％の同一性があったことを示し、対照的にヌクレオチド配列は８５．７％の同一性のみを有した。
【０２０５】
次にＰｒＤ１７（配列番号６）をクエリー配列として使用してタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ検索を行うことで、「ｎｒ」データベース（一般方法参照）中に含まれる全ての公的に入手可能なタンパク質配列に対するＰｒＤ１７の配列相同性もまた判定した。最高度の類似性を示した配列はサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）のω−３脂肪酸デサチュラーゼ（ジェンバンク登録番号ＡＡＲ２０４４４）であり、期待値Ｅ−１２４で５９％の同一性および７４％の類似性を有した。さらにＰｒＤ１７はアナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ＃２９４１３の脂肪酸デサチュラーゼのアミノ酸配列（ジェンバンク登録番号ＡＢＡ２３８０９）と、期待値６Ｅ−６１で３８％の同一性および５７％の類似性を有した。
【０２０６】
実施例１０
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」）の合成
実施例２で述べられたのと類似の様式で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子のコドン使用頻度を最適化した。具体的には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のコドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡの安定法則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ），Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｇｅｎｅ  ２６５（１〜２）：１１〜２３頁（２００１年））に従って、ＰｒＤ１７のコード配列（配列番号５および６）に基づいて、コドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」と称する、配列番号７）をデザインした。翻訳開始部位の修正に加えて、１０８６ｂｐのコード領域の１６８ｂｐ（１５．５％）を修正し、１６０個のコドン（４４．２％）を最適化した。ＧＣ含量は、野性型遺伝子（すなわちＰｒＤ１７）内の６４．４％から、合成遺伝子（すなわちＰｒＤ１７Ｓ）内の５４．５％に低下した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をＰｒＤ１７Ｓ（配列番号７）の翻訳開始コドン周辺、および停止コドン後にそれぞれ組み込んだ。図８は、ＰｒＤ１７およびＰｒＤ１７Ｓのヌクレオチド配列の比較を示す。コドン最適化遺伝子内の改変は、いずれもタンパク質（配列番号６）をコードするアミノ酸配列を変化させなかった。デザインされたＰｒＤ１７Ｓ遺伝子はニュージャージー州ピスカタウェイのジェンスクリプト・コーポレーション（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））によって合成され、ｐＵＣ５７（ジェンバンク登録番号Ｙ１４８３７）中にクローンされて、ｐＰｒＤ１７Ｓ（図９Ａ；配列番号３８）を生じた。
【０２０７】
実施例１１
コンストラクトｐＺｕＦＰｒＤ１７Ｓの発生
本実施例は、キメラのＦＢＡＩＮ：：ＰｒＤ１７Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺｕＦＰｒＤ１７Ｓ（図９Ｂ）の構築について述べる。プラスミドｐＺｕＦＰｒＤ１７Ｓを利用して、下記の実施例１２で述べられるようにＰｒＤ１７Ｓの機能性発現を試験した。
【０２０８】
具体的には、プラスミドｐＰｒＤ１７ＳのＰｒＤ１７Ｓコード領域を含有するＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を使用して、ｐＺｕＦ１７（図９Ｃ；配列番号３９）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置き換え、プラスミドｐＺｕＦＰｒＤ１７Ｓを構築した。したがってｐＺｕＦＰｒＤ１７Ｓの構成要素は、下の表１５で述べられるようである。
【０２０９】
【表１７】
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【０２１０】
実施例１２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株におけるコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子ＰｒＤ１７Ｓの発現
一般方法で述べられるようにして、プラスミドｐＺｕＦＰｒＤ１７Ｓ（図９Ｂ；実施例１１）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株（実施例８）に形質転換した。形質転換細胞をＭＭ選択培地プレート上に播種し、２〜３日間３０℃に保った。ＭＭプレート上に生育した１０個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を３０℃の３ｍｌの液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、高グルコース培地に再懸濁し、次に３０℃で５日間生育させて２５０ｒｐｍ／分で振盪した。遠心分離によって細胞を収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製して、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ＧＣで分析した。
【０２１１】
ＧＣ結果を下の表１６に示す。脂肪酸は１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ（１８：２）、ＡＬＡ、ＥＤＡ（２０：２）、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ（２０：３）、ＥＴＡ、およびＥＰＡと同定されて、それぞれの組成は総脂肪酸の％として表される。「Δ１７活性」は以下の式に従って計算され、ＥＰＡへの％基質変換を表す。（［ＥＰＡ］／［ＡＲＡ＋ＥＰＡ］）×１００。「Δ１５活性」は以下の式に従って計算され、ＡＬＡへの％基質変換を表す。（［ＡＬＡ］／［ＬＡ＋ＡＬＡ］）×１００。
【０２１２】
【表１８】
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【０２１３】
表１６は、１０個の形質転換体中で平均で総脂質の７．５％のＡＲＡおよび７．２％の
ＥＰＡが生成されたことを示した。これらの１０株中でＰｒＤ１７ＳがＡＲＡをＥＰＡに変換する変換効率は、平均率で約４９％であった。変換効率は実施例８で述べられるようにして測定された。したがってこの実験的データは、Ｐ．ラモルム（ｒａｍｏｒｕｍ）由来のコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（配列番号５）が、ＡＲＡをＥＰＡに効率的に不飽和化することを実証した。
【０２１４】
１０個の形質転換体中で、平均で総脂質の０．４％のＡＬＡおよび３９．６％のＬＡ（Ｃ１８：２）が生成された。これらの１０株中でＰｒＤ１７ＳがＬＡをＡＬＡに変換する変換効率は、平均率で約１％のみであった。
【０２１５】
したがってＰｒＤ１７Ｓは、ここでＡＲＡからＥＰＡへの変換を触媒する単機能性Δ１７デサチュラーゼとして同定される。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示する。
【図２Ａ】フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７」と称される；配列番号１）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」と称される；配列番号３）とのＤＮＡ配列の比較を示す。
【図２Ｂ】フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７」と称される；配列番号１）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」と称される；配列番号３）とのＤＮＡ配列の比較を示す。
【図２Ｃ】フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｓＤ１７」と称される；配列番号１）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｓＤ１７Ｓ」と称される；配列番号３）とのＤＮＡ配列の比較を示す。
【図３Ａ】ｐＰｓＤ１７Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図３Ｂ】ｐＫＵＮＦ１−ＫＥＡのプラスミドマップを提供する。
【図３Ｃ】ｐＤＭＷ２１４のプラスミドマップを提供する。
【図３Ｄ】ｐＦｍＰｓ１７Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図４Ａ】総脂質画分中に１１％のＡＲＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株の開発を図示する。
【図４Ｂ】ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅのプラスミドマップを提供する。
【図４Ｃ】ｐＤＭＷ２７１のプラスミドマップを提供する。
【図５】ｐＺＰ３−Ｐ７Ｕのプラスミドマップを提供する。
【図６Ａ】総脂質画分中に１２％のＡＲＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０７０株の開発を図示する。
【図６Ｂ】ｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３のプラスミドマップを提供する。
【図６Ｃ】ｐＹ１１６のプラスミドマップを提供する。
【図７】（Ａ）ｐＫＯ２ＵＦ８２８９および（Ｂ）ｐＺＫＳＬ−５５５Ｒのプラスミドマップを提供する。
【図８Ａ】フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７」と称される；配列番号５）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」と称される；配列番号７）とのＤＮＡアラインメントを示す。
【図８Ｂ】フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７」と称される；配列番号５）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」と称される；配列番号７）とのＤＮＡアラインメントを示す。
【図８Ｃ】フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｒＤ１７」と称される；配列番号５）と、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（「ＰｒＤ１７Ｓ」と称される；配列番号７）とのＤＮＡアラインメントを示す。
【図９Ａ】ｐＰｒＤ１７Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図９Ｂ】ｐＺＵＦＰｒＤ１７Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図９Ｃ】ｐＺＵＦ１７のプラスミドマップを提供する。
【図１】
2009534032.tif 000021
【図２Ａ】
2009534032.tif 000022
【図２Ｂ】
2009534032.tif 000023
【図２Ｃ】
2009534032.tif 000024
【図３Ａ】
2009534032.tif 000025
【図３Ｂ】
2009534032.tif 000026
【図３Ｃ】
2009534032.tif 000027
【図３Ｄ】
2009534032.tif 000028
【図４Ａ】
2009534032.tif 000029
【図４Ｂ】
2009534032.tif 000030
【図４Ｃ】
2009534032.tif 000031
【図５】
2009534032.tif 000032
【図６Ａ】
2009534032.tif 000033
【図６Ｂ】
2009534032.tif 000034
【図６Ｃ】
2009534032.tif 000035
【図７】
2009534032.tif 000036
【図８Ａ】
2009534032.tif 000037
【図８Ｂ】
2009534032.tif 000038
【図８Ｃ】
2009534032.tif 000039
【図９Ａ】
2009534032.tif 000040
【図９Ｂ】
2009534032.tif 000041
【図９Ｃ】
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【配列表】
2009534032000001.app
【国際調査報告】
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