(57)【要約】  レジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに特異的なプライマー、試料調製のための捕捉プローブ、及び検出プローブを含有する、増幅オリゴマーとして用いうる核酸配列としての組成物を開示する。開示した組成物を使用し、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列若しくは１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡをインビトロ核酸増幅させて検出可能な増幅生成物を製造することを含む方法で、試料中のレジオネラ・ニューモフィラの存在を検出する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｐｈｉｌａ）を検出する方法であって、以下の：
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡであるレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製する工程；
配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを、試料と混合する工程；
核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び核酸前駆物質を供給する工程で、第１及び第２増幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する増幅用混合物を調製する工程；
レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸にハイブリダイズした少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端を、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び鋳型としてのレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を用いてインビトロで延長して増幅生成物を製造する工程；そして
増幅生成物を検出する工程で、試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することの指標とする工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
検出する工程で、増幅生成物を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、６２、６３、６４及び６５からなる群から選択される検出プローブオリゴマーに特異的にハイブリダイズさせる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を試料から捕捉する試料処理工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試料処理工程で配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列を含む捕捉プローブオリゴマーを用いるが、前記標的特異的配列は場合により３’テール配列に共有結合している、請求項３記載の方法。
【請求項５】
混合する工程に、配列番号２９と配列番号３１、配列番号２８と配列番号３１、配列番号２９と配列番号３３、配列番号２８と配列番号３３、配列番号４１と配列番号４６、配列番号４１と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配列番号５４と配列番号５５、配列番号５１と配列番号４３、配列番号５２と配列番号４３、配列番号５１と配列番号４５、配列番号５２と配列番号４５、配列番号６０と配列番号５８及び配列番号５６、配列番号６０と配列番号５９及び配列番号５６、配列番号６０と配列番号５８及び配列番号５７、配列番号６０と配列番号５９及び配列番号５７、配列番号６１と配列番号５８及び配列番号５６、配列番号６１と配列番号５９及び配列番号５６、配列番号６１と配列番号５８及び配列番号５７、並びに配列番号６１と配列番号５９及び配列番号５７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
混合する工程に、配列番号２９と配列番号３１、配列番号２８と配列番号３１、配列番号４１と配列番号４６、配列番号４１と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配列番号５４と配列番号５５、配列番号５２と配列番号４３、及び配列番号５２と配列番号４５からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
インビトロでの増幅を用いてレジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを検出するための組成物であって、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組合わせたものを含む、前記組成物。
【請求項８】
さらに、標的特異的配列に共有結合した３’テール配列を場合により備えた、配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１の捕捉プローブオリゴマーを含む、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
さらに、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、６２、６３、６４及び６５からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーを含む、請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
さらに、配列番号５、１３、１５及び２１からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーを含む、請求項７記載の組成物。
【請求項１１】
試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出する方法であって、以下の：
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡであるレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製する工程；
配列番号６９、７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び８３からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを、試料と混合する工程；
核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び核酸前駆物質を供給する工程で、第１及び第２増幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する増幅用混合物を調製する工程；
レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸にハイブリダイズした少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端を、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び鋳型としてのレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を用いてインビトロで延長して増幅生成物を製造する工程；そして
増幅生成物を検出して、試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することの指標とする工程；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
検出する工程で、増幅生成物を、配列番号７２、８８及び８９からなる群から選択される検出プローブオリゴマーに特異的にハイブリダイズさせる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を試料から捕捉する試料処理工程を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
試料処理工程に、配列番号７３からなる標的特異的配列を含む捕捉プローブオリゴマーを用いるが、標的特異的配列は場合により３’テール配列に共有結合している、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
混合する工程に、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８４、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８４、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８４、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８４、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８５、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８５、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８５、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８５、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８６、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８６、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８６、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８６、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８７、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８７、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８７、及び配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
混合する工程に、配列番号７９と配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列番号８４及び配列番号８７；並びに配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
インビトロでの増幅を用いてレジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを検出するための組成物であって、配列番号６９、７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び８３からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを含む、前記組成物。
【請求項１８】
組成物が、配列番号７９と配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列番号８４及び配列番号８７；並びに配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせである、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
さらに、標的特異的配列に共有結合した３’テール配列を場合により備えた、配列番号７３からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１の捕捉プローブオリゴマーを含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
さらに、配列番号７２、８８及び８９からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーを含む、請求項１７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
［０００１］  本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  １１９（ｅ）に基づき、米国仮特許出願第６０／７２７，８８３（２００５年１０月１７日出願）及び６０／７３５，７０９（２００５年１１月９日出願）に基づく優先権を主張し、これらを共に援用する。
【０００２】
発明の分野
［０００２］  本発明は、分子生物学的方法を用いて試料中の細菌の存在を検出することに関し、特にレジオネラ・ニューモフィラ（在郷軍人病菌）（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）核酸配列を増幅し、増幅した核酸配列を検出することにより、試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出することに関する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］  １つの属レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）からなるレジオネラ科（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｅ）は、湿潤環境で淡水産原虫の細胞内寄生菌として見出された偏好性グラム陰性菌である（Fields, et al., 2002, Clin. Microbiol. Rev. 15(3): 506-526）。レジオネラ科の菌は、その細菌を含有する水又はエアロゾルを感受性宿主が吸入又は吸引した場合、哺乳動物細胞内で増殖してヒトの呼吸器疾患を誘発する可能性がある。少なくとも４８種のレジオネラ属菌が知られているが、レジオネラ・ニューモフィラは肺炎を伴う重篤な多臓器系疾患をもたらすレジオネラ症の大部分の報告症例に関与しており、他の大部分のレジオネラ症の症例はレジオネラ・ボゼマニイ（Ｌ．ｂｏｚｅｍａｎｉｉ）、レジオネラ・デュモフィイ（Ｌ．ｄｕｍｏｆｆｉｉ）、レジオネラ・ロングビーチェ（Ｌ．ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ）及びレジオネラ・ミクダデイ（Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉ）が原因である。
【０００４】
［０００４］  レジオネラ菌は多数の検体タイプから多様な方法で検出できる。気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）又は肺生検の検体から得られる細菌を特殊な緩衝化木炭酵母エキス培地（ＢＣＹＥ）で培養するのは感受性が高く正確であるが、最大回収率を得るために最高２週間のインキュベーション、続いてコロニー形態検査、グラム染色及び血清学的検査、例えばイムノアッセイの組合わせによる細菌同定が必要である。培養していない臨床検体中のレジオネラ菌を免疫蛍光法又はラジオイムノアッセイ法で直接検出することはできるが、当該試験法の感受性はより低い場合が多い。レジオネラ症は尿中のレジオネラ・ニューモフィラ血清グループ１の可溶性多糖抗原を間接検出して診断できるが、当該アッセイ法は血清変換に遅延時間を要し、診断有用性に限界があり、環境試験に用いても検出できない。ＤＮＡプローブ又は核酸増幅とＤＮＡプローブの組合わせを用いてレジオネラ・ニューモフィラのｍｉｐ遺伝子を含めたレジオネラ菌遺伝子配列を検出する分子診断試験法が開発された。当該方法では、多様な検体中のレジオネラ菌由来の核酸の存在が、多様な特異度及び感度で検出される。しかし、該試験法の多くが労力集約的であって実施に少なくとも１日を要し、擬陽性結果を生じる汚染を受けやすい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
［０００５］  レジオネラ菌は水生環境及び湿潤環境、例えば溜め池や冷却塔の水中で長期間にわたって生存及び持久できるので、院外感染又は院内感染の原因となる可能性がある。したがって、感染源を正確に検出し、排除して感染を阻止できるように、環境試料中のレジオネラ菌、特にレジオネラ・ニューモフィラを検出するための迅速で感度の高い正確な方法が求められている。感染者を速やかに処置して罹病、死亡及び感染拡大を制限できるように、ヒトのレジオネラ・ニューモフィラ感染を迅速かつ正確に検出できる方法も求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
［０００６］  レジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ ｒＲＮＡ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ又はそれらをコードするＤＮＡに含まれる標的配列を増幅及び検出することにより、環境試料又は感染したヒトから得た生物検体を含めた試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出する方法を開示する。本明細書に開示する特異的なプライマー及びプローブを用いて、本発明方法によりレジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ及び／又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列中の標的配列を増幅し、増幅生成物を検出する。ある態様では増幅工程中に特異的増幅生成物の発現をモニターし、一方、他の態様では増幅工程後に増幅生成物を検出する。ある方法態様は、内部対照又は検量体、例えば非レジオネラ菌配列の検出を含む。
【０００７】
［０００７］  試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出するための、下記の工程を含む方法を開示する：１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡであるレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製し、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを、試料と混合し、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び核酸前駆物質を供給して、第１及び第２増幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する増幅用混合物を調製し、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸にハイブリダイズした少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端を、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び鋳型としてのレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を用いてインビトロで延長して増幅生成物を製造し、そして増幅生成物を検出して、試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することの指標とする。ある態様では、検出する工程で、増幅生成物を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、６２、６３、６４及び６５から選択される検出プローブオリゴマーに特異的にハイブリダイズさせる。ある態様は、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を試料から捕捉する試料処理工程をも含み、これは好ましくは、配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列を含む捕捉プローブオリゴマーを用いることにより行われ、標的特異的配列は３’テール配列に共有結合していてもよい。ある態様では、混合工程に、配列番号２９と配列番号３１、配列番号２８と配列番号３１、配列番号２９と配列番号３３、配列番号２８と配列番号３３、配列番号４１と配列番号４６、配列番号４１と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配列番号５４と配列番号５５、配列番号５１と配列番号４３、配列番号５２と配列番号４３、配列番号５１と配列番号４５、配列番号５２と配列番号４５、配列番号６０と配列番号５８及び配列番号５６、配列番号６０と配列番号５９及び配列番号５６、配列番号６０と配列番号５８及び配列番号５７、配列番号６０と配列番号５９及び配列番号５７、配列番号６１と配列番号５８及び配列番号５６、配列番号６１と配列番号５９及び配列番号５６、配列番号６１と配列番号５８及び配列番号５７、並びに配列番号６１と配列番号５９及び配列番号５７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる。ある好ましい態様では、混合工程に、配列番号２９と配列番号３１、配列番号２８と配列番号３１、配列番号４１と配列番号４６、配列番号４１と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配列番号５４と配列番号５５、配列番号５２と配列番��４３、及び配列番号５２と配列番号４５からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる。
【０００８】
［０００８］  配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを含む、インビトロでの増幅を用いてレジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを検出するための組成物を開示する。この組成物は、配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１の捕捉プローブオリゴマーをも含むことができ、標的特異的配列は場合により３’テール配列と結合していてもよい。この組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、６２、６３、６４及び６５からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーをも含むことができる。好ましい態様は、配列番号５、１３、１５及び２１からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーを含む。そのような組成物の好ましい態様はキットの形で提供され、これは場合により、核酸の増幅及び／又は検出に使用される他の試薬を含むことができる。
【０００９】
［０００９］  試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出するための、下記の工程を含む方法を開示する：２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡであるレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製し、配列番号６９、７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び８３からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを、試料と混合し、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び核酸前駆物質を供給して、第１及び第２増幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する増幅用混合物を調製し、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸にハイブリダイズした少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端を、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び鋳型としてのレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を用いてインビトロで延長して増幅生成物を製造し、そして増幅生成物を検出して、試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することの指標とする。ある態様では、検出する工程で、増幅生成物を、配列番号７２、８８及び８９からなる群から選択される検出プローブオリゴマーに特異的にハイブリダイズさせる。他の態様は、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を試料から捕捉する試料処理工程をも含むことができ、これは好ましくは、配列番号７３からなる標的特異的配列を含む捕捉プローブオリゴマーを用いることにより行われ、標的特異的配列は場合により３’テール配列に共有結合していてもよい。ある態様では、混合工程に、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８４、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８４、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８４、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８４、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８５、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８５、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８５、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８５、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８６、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８６、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８６、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８６、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８７、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８７、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８７、及び配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる。好ましい態様には、混合工程に、配列番号７９と配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列番号８４及び配列番号８７；並びに配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる態様が含まれる。
【００１０】
［０００１０］  配列番号６９、７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び８３からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを含む、インビトロでの増幅を用いてレジオネラ・ニューモフィラの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを検出するための組成物を開示する。好ましい態様では、組成物は配列番号７９と配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列番号８４及び配列番号８７；並びに配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせである。ある態様は、配列番号７３からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１の捕捉プローブオリゴマーをも含み、標的特異的配列は３’テール配列に共有結合していてもよい。ある態様の組成物は、配列番号７２、８８及び８９からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーをも含む。そのような組成物の好ましい態様はキットの形で提供され、これは場合により、核酸の増幅及び／又は検出に使用される他の試薬を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
詳細な記述
［０００１１］  レジオネラ・ニューモフィラ核酸を検出することにより環境試料又は生物試料中のレジオネラ・ニューモフィラの存在を高感度で特異的に検出する方法を開示する。この方法は、１６Ｓ又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の核酸増幅を実施し、一般に増幅生成物に特異的にハイブリダイズして試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することを指示するシグナルを発する核酸プローブを用いて増幅生成物を検出することを含む。増幅工程には、試料を１６Ｓ又は２３Ｓ ｒＲＮＡ中の標的配列に対して特異的な１以上の増幅オリゴマーと接触させて、試料中にレジオネラ・ニューモフィラｒＲＮＡが存在する場合には増幅生成物を製造する工程が含まれる。増幅によって、増幅オリゴマー（プライマー）からレジオネラ・ニューモフィラ鋳型鎖を用いて配列を延長する少なくとも１種類の核酸ポリメラーゼにより、標的配列又はその相補配列の追加コピーが合成される。増幅生成物を検出するための好ましい態様には、増幅生成物を、増幅配列に対して特異的な少なくとも１種類のプローブ、例えば標的配列に含まれる配列であって一対の増幅オリゴマーにより囲まれた配列と接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を用いる。検出する工程は、増幅反応が終了した後に実施でき、あるいは増幅反応と同時に実施できる（「リアルタイム」という場合もある）。好ましい態様では、均一反応で検出されるプローブを用いる検出する工程により増幅生成物を検出する。すなわち、ハイブリダイズしたプローブの検出に、ハイブリダイズしていないプローブを混合物から除去する必要がない（例えば米国特許第５，６３９，６０４号及び第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら）。増幅工程の終了時付近又は終了時に増幅生成物を検出する好ましい態様では、線状プローブは増幅生成物にハイブリダイズして、プローブが増幅配列にハイブリダイズしたことを指示するシグナルを発する。リアルタイム検出を用いる好ましい態様では、プローブは、プローブが増幅生成物に結合した場合に検出シグナルを発するレポーター部分を含むヘアピン構造プローブであることが好ましい。例えば、ヘアピンプローブは、プローブの一端に結合したレポーター部分又は標識、例えば発蛍光団（「Ｆ」）及びヘアピン構造の他端に結合した相互作用化合物、例えばクエンチャー（「Ｑ」）を含んでもよく、ヘアピン構造が「閉鎖」配置で増幅生成物にハイブリダイズしていない場合にはシグナルの発生が阻害され、これに対しプローブが増幅生成物中の相補配列にハイブリダイズしてプローブが「開放」配置に変換された場合にはシグナルが発せられる。ヘアピン構造プローブの例としては、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）、分子トーチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｒｃｈ）又はハイブリダイゼーションスイッチプローブその他の形態があげられる（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；米国特許第５，９２５，５１７号及び第６，１５０，０９７号、Ｔｙａｇｉら；米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；米国特許出願公開第１１／１７３，９１５��、Ｂｅｃｋｅｒら；並びに米国特許出願公開第２００６−０１９４２４０号Ａ１、Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら）。
【００１２】
［０００１２］  本明細書の開示内容の理解の一助として、本明細書中で用いる用語を若干以下に記載する。別途記載しない限り、本明細書中で用いる科学用語及び技術用語は、技術文献、例えばDictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第2版 (Singleton et al, 1994, John Wiley & Sons,ニューヨーク州ニューヨーク）、The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial,ニューヨーク州ニューヨーク）、又はDorland’s Illustrated Medical Dictionary, 第30版(2003, W.B. Saunders, Elsevier Inc.,ペンシルベニア州フィラデルフィア）に基づいて当業者が一般に理解しているものと同じ意味で用いられる。別途記載しない限り、本明細書中で使用又は意図する技術は分子生物学の分野で周知の標準法である。
【００１３】
［０００１３］  「試料」には、レジオネラ菌又はその成分、例えば核酸又は核酸断片を含有しうる、いかなる検体も含まれる。試料は環境源、例えば水、土壌、汚泥、壊死組織片、水性流体の容器由来のバイオフィルム、空中粒子又はエアロゾルなどから得ることができ、これには処理済み試料、例えば環境試料をフィルターに導通することにより、遠心分離により、又は媒体、マトリックス若しくは支持体に吸着させることにより得られたものを含めてもよい。「生物試料」には、レジオネラ菌又はそれに由来する標的核酸を含有しうる生存又は死亡した哺乳類（ヒトを含む）から得られるいかなる組織又は材料、例えば呼吸器又は滲出物、例えば気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）又は肺生検の検体、喀痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、消化器、尿、滲出物、又は他の体液も含まれる。試料を処理して物理的又は機械的に凝塊又は細胞を破壊し、核酸を含めた細胞内成分を溶液中へ放出させることができ、この溶液は他の成分、例えば酵素、緩衝剤、塩類、界面活性剤などを含有してもよい。
【００１４】
［０００１４］  「核酸」は、窒素複素環式の塩基又は塩基類似体を含むヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含み、これらがホスホジエステル結合又は他の結合により連結してポリヌクレオチドを形成した、多量体化合物をいう。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー、及びその類似体が含まれる。核酸の「主鎖」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）結合（国際公開第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、又はその組合わせのうち１以上を含む多様な結合で構成されてもよい。核酸の糖部分は、リボース若しくはデオキシリボースか、あるいは既知の置換、例えば２’メトキシ置換及び２’ハライド置換（例えば２’−Ｆ）がある類似化合物であってもよい。窒素塩基は、一般的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えばイノシン；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al.編, 第11版, 1992）、プリン又はピリミジン塩基の誘導体、例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−若しくはアザ−プリン、デアザ−若しくはアザ−ピリミジン、５又は６位に置換基をもつピリミジン塩基、２、６及び／又は８位に変更又は交換された置換基をもつプリン塩基、例えば２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジンピリミジン類及びＯ４−アルキル−ピリミジン類、並びにピラゾロ化合物、例えば非置換又は３−置換ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン（米国特許第５，３７８，８２５号、第６，９４９，３６７号及び国際公開第９３／１３１２１号）であってもよい。核酸は、主鎖が１以上の残基について窒素塩基を含まない「非塩基」位置を含んでもよい（米国特許第５，５８５，４８１）。核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡにみられる一般的な糖、塩基及び結合のみを含むか、あるいは一般的な構成要素及び置換（例えば、２’メトキシ主鎖により連結した一般的な塩基、又は一般的な塩基と１種類以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）を含んでもよい。核酸には「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）、すなわちＲＮＡ模倣糖配置でロックされた二環式フラノース単位を含む１以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体も含まれ、これは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める（Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42); 13233-41）。インビトロで核酸を合成する方法は当技術分野で周知である。
【００１５】
［０００１５］  互換性がある用語「オリゴマー」及び「オリゴヌクレオチド」は、一般に１，０００未満のヌクレオチド（ｎｔ）を含む核酸をいい、下限約２〜５ｎｔ及び上限約５００〜９００ｎｔである範囲のポリマーを含む。好ましいオリゴマーの大きさは下限約５〜１５ｎｔ及び上限約５０〜６００ｎｔの範囲にあり、特に好ましい態様は下限約１０〜２０ｎｔ及び上限約２２〜１００ｎｔの範囲にある。好ましいオリゴマーは、周知のいずれかの酵素法又は化学的方法により合成され、クロマトグラフィー等の標準法で精製される。
【００１６】
［０００１６］  「増幅オリゴマー」は、標的核酸又はその相補配列にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴマーの一例としては、鋳型核酸にハイブリダイズし、増幅プロセスでポリメラーゼにより延長される３’ヒドロキシル末端を含む、「プライマー」である。他の例としては、増幅に関与し、又は増幅を促進するが、３’遮断末端をもつためポリメラーゼにより延長されないオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴマーの大きさとして好ましい範囲としては、長さが約１０〜約６０ｎｔであって、標的核酸配列（又はその相補配列）のある領域に相補的な少なくとも約１０の連続塩基、より好ましくは少なくとも１２の連続塩基があるものが含まれる。当該連続塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは約１００％、相補的である。増幅オリゴマーは、場合により修飾ヌクレオチド若しくは類似体又は場合により追加配列を含んでもよく、これらは増幅反応に関与するが、標的又は鋳型配列に相補的でないか、又は含まれないか、又は相補的である。例えば「プロモータープライマー」は５’側プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドであり、この配列は標的核酸に対して相補的ではなく、プライマーの標的相補的配列に隣接又は近接する。当業者であれば、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５’側プロモーター配列を含み、したがってプロモーター−プライマーとして機能するように修飾しうること、またプロモーター−プライマーがそのプロモーター配列に関係なくプライマーとして機能しうること、すなわちこのオリゴヌクレオチドをそのプロモーター配列の除去又はプロモーター配列を含まない合成により修飾することができることを理解するであろう。「プロモータープロバイダー（ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｐｒｏｖｉｄｅｒ）」という増幅オリゴマーは重合の鋳型として用いられるプロモーター配列を含むが、このオリゴヌクレオチドはその３’末端（遮断されているため、ポリメラーゼ活性による延長には用いられない）からは延長されない。
【００１７】
［０００１７］  「増幅」は、多数コピーの標的核酸配列若しくはその断片又はその相補配列を得るためのいずれか既知のインビトロでの方法をいう。「断片」の増幅は、例えば標的核酸の内部位置にハイブリダイズしてそこから重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを用いて、完全な標的核酸又はその相補配列より少ない核酸を含む増幅核酸を製造することをいう。既知の増幅法としては、例えばレプリカーゼ介在増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び転写介在又は転写関連増幅があげられる。レプリカーゼ介在増幅には、自己複製ＲＮＡ分子、及びレプリカーゼ、例えばＱＢ−レプリカーゼを用いる（例えば米国特許第４，７８６，６００号、Ｋｒａｍｅｒら）。ＰＣＲ増幅には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対及びサーマルサイクリングを用いて、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖又はｃＤＮＡから、多数コピーを合成する（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓら）。ＬＣＲ増幅には４種類以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用し、多数サイクルのハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性を用いて、標的及びその相補鎖を増幅する（例えば米国特許第５，４２７，９３０号、Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら；米国特許第５，５１６，６６３号、Ｂａｃｋｍａｎら）。ＳＤＡには、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含むプライマー及び標的配列を含む半修飾二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断するエンドヌクレアーゼを使用し、これにより一連のプライマー延長工程及び鎖置換工程で増幅が行われる（例えば米国特許第５，４２２，２５２号、Ｗａｌｋｅｒら；米国特許第５，５４７，８６１号、Ｎａｄｅａｕら；米国特許第５，６４８，２１１号、Ｆｒａｉｓｅｒら）。
【００１８】
［０００１８］  「転写関連増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「転写介在増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（ＴＭＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を製造するいかなるタイプの核酸増幅をもいう。当該方法は、一般にＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸基質（ｄＮＴＰ及びｒＮＴＰ）、及びプロモーター配列を含む鋳型相補的オリゴヌクレオチドを使用し、場合により１種類以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。転写関連増幅の変法は当技術分野で周知である（例えば米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎら；米国特許第５，４３７，９９０号、Ｂｕｒｇら；国際公開第８８／０１３０２号及び国際公開第８８／１０３１５号、Ｇｉｎｇｅｒａｓら；米国特許第５，１３０，２３８号、Ｍａｌｅｋら；米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号、Ｕｒｄｅａら；国際公開第９５／０３４３０号、Ｒｙｄｅｒら；並びに米国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１、Ｂｅｃｋｅｒらに詳述）。ＫａｃｉａｎらのＴＭＡ法及び単一プライマー型の転写随伴法（米国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１、Ｂｅｃｋｅｒら）は、本明細書に開示するレジオネラ菌標的配列の検出に用いるための転写関連増幅法の好ましい態様である。好ましい態様を当該増幅反応で説明するが、当業者であればプライマー（１以上）からポリメラーゼで配列を延長する他の増幅法に本明細書に開示する増幅オリゴマーを容易に用いうることを認識するであろう。
【００１９】
［０００１９］  「プローブ」は、ハイブリダイゼーションしうる条件下で、核酸、好ましくは増幅核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズして、標的配列又は増幅核酸を検出することができる核酸オリゴマーをいう。検出は直接（すなわち、その標的配列に直接ハイブリダイズしたプローブ）又は間接（すなわち、その標的に中間分子構造体を介して結合したプローブ）のいずれであってもよい。プローブの「標的配列」とは一般に、より大きな配列（例えば増幅配列のサブセット）内の小配列であって、プローブの少なくとも一部に標準塩基対合によりハイブリダイズするものをいう。プローブは、標的特異的配列及びプローブの三次元配置に関与する他の配列を含んでもよい（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；並びに米国特許出願公開第２００６−００６８４１７号Ａ１、Ｂｅｃｋｅｒらに記載）。
【００２０】
［０００２０］  「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基間の水素結合により他の配列にハイブリダイズしうる連続配列を意味し、これは配列中の各位置で標準塩基対合（例えばＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ対合）により相補的であってもよく、あるいは標準水素結合による相補的塩基ではない１以上の位置（非塩基位置を含む）を含んでもよい。連続塩基は、オリゴマーを特異的にハイブリダイズさせることを意図する配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約１００％相補的である。「十分に相補的」である配列は、その配列が完全に相補的ではない場合ですら、選択されたハイブリダイゼーション条件下で核酸オリゴマーがその標的配列に安定にハイブリダイズするのを可能にする。適当なハイブリダイゼーション条件は当技術分野で周知であり、塩基配列組成に基づいて容易に推定できるか又はルーティン試験を用いて判定できる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，1989), §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51及び11.47-11.57、特に§§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47及び11.55-11.57）。
【００２１】
［０００２１］  「試料の調製」は、試料中に存在するレジオネラ菌核酸をその後増幅及び検出するのために試料を調製するいずれかの工程又は方法をいう。試料の調製は、より多量の試料又は実質的に水性の混合物から成分を濃縮するいずれか既知の方法を含んでもよい；例えば、空気試料から空中粒子を又は水試料から微生物を濾過又は捕捉することによる。試料の調製は、細胞成分を溶解し、例えば濾過又は遠心分離により細胞屑を除去することを含んでよく、核酸オリゴマーを用いて標的核酸を他の試料成分から選択的に捕捉することを含んでよい。
【００２２】
［０００２２］  「捕捉プローブ」又は「捕捉オリゴマー」は、標的配列と固定化オリゴマーを塩基対ハイブリダイゼーションにより結合させて標的配列を選択的に捕捉する少なくとも１の核酸オリゴマーをいう。好ましい態様の捕捉プローブは、２つの結合領域、すなわち標的配列結合領域及び固定化プローブ結合領域を、通常は同一オリゴマー上に含むが、当該２領域は１以上のリンカーで結合させた、異なるオリゴマー上にあってもよい。例えば第１オリゴマーは固定化プローブ結合領域を含み、第２オリゴマーは標的配列結合領域を含んでよく、当該２つの異なるオリゴマーが２配列を結合して機能性単位にするリンカーにより結合される。
【００２３】
［０００２３］  「固定化プローブ」又は「固定化核酸」は、捕捉オリゴマーを固定化支持体に直接又は間接的に結合させる核酸をいう。好ましい固定化プローブは、支持体に結合したオリゴマーであって、試料中の結合していない物質から結合した標的配列を分離することを促進する。支持体には、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属で作製した、マトリックス、及び溶液中の自由粒子等の既知の材料を含めてよく、好ましい態様は磁気付着性粒子である。好ましい支持体は単分散磁性球体（例えば均一サイズ±５％）であり、これに固定化プローブが直接（共有結合、キレート形成又はイオン性相互作用により）又は間接的に（１以上のリンカーにより）結合するが、その場合、プローブと支持体の結合又は相互作用はハイブリダイゼーション条件で安定である。
【００２４】
［０００２４］  「分離」又は「精製」は、試料等の混合物の１以上の成分を１以上の他の成分から除去又は分離することを意味する。試料成分には一般に水性の混合物（溶液相）中の標的核酸が含まれ、この混合物は細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質及び他の核酸を含有しうる。分離又は精製により、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは約９５％の標的核酸が他の混合物成分から分離される。
【００２５】
［０００２５］  「標識」は、検出されるか又は検出可能なシグナルを発する分子部分又は化合物をいう。標識は核酸プローブに直接又は間接的に結合させることができる。直接標識化は標識をプローブに連結させる結合又は相互作用により行うことができ、これには共有結合又は非共有相互作用、例えば水素結合、疎水性及びイオン性相互作用、又はキレート若しくは配位錯体の形成が含まれる。間接標識化は架橋部分又はリンカー（例えば抗体又は追加オリゴマー）を用いて行うことができ、これは直接又は間接的に標識され、検出可能なシグナルを増幅する場合がある。標識には、放射性核種、リガンド（例えばビオチン、アビジン）、酵素、酵素基質、反応性基、発色団（例えば検出可能な色を付与する色素、粒子又はビーズ）、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性の標識）又は発蛍光団等の検出可能ないずれかの部分が含まれる。好ましい標識には、均一反応で検出可能なシグナルを発する「均一検出可能な標識」が含まれ、この場合、混合物中の結合した標識プローブが、安定性又は異なる分解性のような、結合していない標識プローブのものと異なる検出可能な変化（例えば米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら）を示す。好ましい標識には化学発光性化合物、好ましくは標準的ＡＥ及びその誘導体を含むアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号及び第５，６３９，６０４号に記載）。標識を核酸に結合させる合成方法及び標識からのシグナルを検出する方法は周知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー,1989),１０章；米国特許第５，６５８，７３７号、第５，６５６，２０７号、第５，５４７，８４２号、第５，２８３，１７４号及び第４，５８１，３３３号）。
【００２６】
［０００２６］  レジオネラ菌の核酸、具体的にはレジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅及び検出する方法を開示する。レジオネラ・ニューモフィラの標的配列１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ又はその相補配列、あるいは１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを特異的に認識する、特定のオリゴヌクレオチド配列を開示する。そのオリゴヌクレオチドは増幅オリゴマー、例えばプライマー、プロモータープライマー、遮断オリゴマー、及びプロモータープロバイダーオリゴマーとして機能でき、その機能は既知である（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号及び第５，８２４，５１８号、並びに名国特許出願公開２００６−００４６２６５Ａ１に開示）。他の態様は、増幅したレジオネラ・ニューモフィラ配列を検出するためのプローブとして機能できる。
【００２７】
［０００２７］  転写介在増幅（ＴＭＡ）を用いる増幅法は、本明細書に概説する工程を含む（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号及び第５，８２４，５１８号に詳述）。増幅すべき配列を含む標的核酸は、一本鎖核酸（例えばｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡ）として提示され、あるいは常法により、例えば温度及び／又は化学的に二本鎖核酸を融解して一本鎖標的核酸にして一本鎖にされる。プロモータープライマーが標的核酸中のプロモータープライマーの標的配列を特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）活性をもつ酵素が標的鎖を鋳型として用いてプロモータープライマーの３’末端を延長し、標的配列のｃＤＮＡが作製されてＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の形態になる。ＲＮアーゼ酵素活性（例えばＲＮアーゼＨ）によりこのＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖が消化され、ｃＤＮＡ鎖上のプロモータープライマー末端から下流にある第２プライマーの標的配列に第２プライマーが特異的に結合する。ＲＴが第１ｃＤＮＡを鋳型として用いて第２プライマーの３’末端を延長して新たなＤＮＡ鎖が合成され、機能性プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡが作製される。次いでプロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼが転写を開始して、多数のＲＮＡ転写体、例えばその反応における最初の標的鎖の約１００〜１０００の増幅コピー（「アンプリコン」）が製造される。各アンプリコン中の第２プライマーの標的配列に第２プライマーが特異的に結合すると、増幅が継続し、ＲＴがアンプリコンのＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを作製して、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖が製造される。反応物中のＲＮアーゼがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からアンプリコンＲＮＡを消化し、新たに合成されたＤＮＡ中のプロモータープライマーの相補配列にプロモータープライマーが特異的に結合する。ＲＴがプロモータープライマーの３’末端を延長して機能性プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作製し、これにＲＮＡポリメラーゼが結合して、最初の標的鎖に相補的な追加アンプリコンを転写する。当該自触媒反応により、増幅反応が完了するまでにさらに多数のアンプリコンが反復作製され、試料中に存在していた標的配列が約１０億倍増幅される。増幅中に、すなわちリアルタイム又は増幅反応が完了した時点で、増幅生成物中の標的配列に特異的に結合するプローブを用いて増幅生成物を検出することができる。結合プしたローブから検出されるシグナルは、その試料中に標的核酸が存在する指標となる。
【００２８】
［０００２８］  本明細書に概説する他の転写関連増幅法は、１種類のプライマー及び１種類以上の追加の増幅オリゴマーを用いて転写体（アンプリコン）を作製することによりインビトロで核酸を増幅し、これは試料中に標的核酸が存在することの指標となる（米国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１、Ｂｅｃｋｅｒらに詳述）。要約すると、この単一プライマー法には、プライマー又は「プライミングオリゴマー」、自身の３’末端からの合成延長を阻止するように修飾された（一般に３’−遮断部分を含有させることによる）「プロモータープロバイダー」オリゴマー、及び場合により、標的鎖からのｃＤＮＡの延長を終止させる結合分子（例えば３’−遮断されたエキステンダーオリゴマー）を用いる。この方法には、標的配列を含む標的ＲＮＡをプライマー及び場合により結合分子と結合させる工程が含まれる。プライマーが標的鎖の３’末端にハイブリダイズし、酵素ＲＴ活性によりプライマーの３’からのプライマー延長が開始してｃＤＮＡが製造され、この新たな鎖と標的鎖の二本鎖（ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖）が作製される。３’−遮断オリゴマーなどの結合分子が反応に含まれると、これは増幅すべき標的配列の５’末端の隣で標的鎖に結合する。プライマーがＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性により延長されてｃＤＮＡ鎖が製造される際、プライマー延長生成反応が標的鎖上の結合分子に到達した時点で重合が停止し、こうして標的鎖上の結合分子の位置によりｃＤＮＡの３’末端が決定され、ｃＤＮＡの３’末端は標的配列の５’末端に相補的となる。このＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を、例えばＲＮＡ鎖のＲＮアーゼＨ分解によるか又は一般的な鎖分離法により分離する。次いでプロモータープロバイダーオリゴマーがｃＤＮＡ鎖の３’末端付近にハイブリダイズする。プロモータープロバイダーオリゴマーは、５’側プロモーター配列、ｃＤＮＡの３’側領域の配列に相補的な３’側領域及びプロモータープロバイダーオリゴマーの３’末端からのＤＮＡ合成開始を阻止するための遮断部分を含む修飾された３’末端を含む。プロモータープロバイダーオリゴマーとｃＤＮＡ鎖からなる二本鎖において、プロモーターオリゴマーを鋳型として用いてｃＤＮＡの３’末端がＲＴ酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性により延長されてプロモーター配列がｃＤＮＡに付加され、機能性二本鎖プロモーターが作製される。次いで、この機能性プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合し、ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ転写体を転写する。当該転写体は、最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一である。増幅されたＲＮＡ転写体は、次いでプライマーを結合し、さらにｃＤＮＡを製造するための鋳型として用いられることにより、増幅プロセスの基質として用いられる。この方法で、試料中に最初に存在していた標的核酸から最終的に多数のアンプリコンが製造され、すなわち、標的配列の多数コピーが作製される。結合分子を含まない態様のこの方法では、プライマーから作製されたｃＤＮＡの３’末端は不定であるが、他の工程は前記と同様に進行する。
【００２９】
［０００２９］  増幅生成物の検出は、多様な方法で達成できる。増幅核酸をある表面と会合させて、電気シグナル等の検出可能な物理的変化を発生させることができる。増幅核酸をマトリックス内又はマトリックス上に濃縮し、濃縮核酸又は会合した色素（例えば挿入剤、例えば臭化エチジウム又はサイバーグリーン（ｃｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ））からのシグナルを検出することにより検出できる。溶液中の核酸は、溶液相中の色素会合の増加を検出することにより検出できる。好ましい態様では、増幅生成物中の配列に対して相補的な核酸プローブであって、検出可能なシグナルを発するプローブ：増幅生成物複合体を形成するものを検出する（例えば米国特許第５，４２４，４１３号及び第５，４５１，５０３号、Ｈｏｇａｎら；並びに第５，８４９，４８１号、Ｕｒｄｅａら）。増幅生成物と特異的に会合する直接又は間接標識プローブが、試料中に標的核酸が存在することを指示する検出可能なシグナルを発する。例えば、標的核酸であるレジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡが試料に含まれると、増幅生成物はレジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ中の標的配列又はその相補配列を含有しており、このプローブは増幅生成物の標的配列に直接又は間接的に結合して、試料中に標的核酸が存在することを指示するシグナルを発する。
【００３０】
［０００３０］  増幅生成物配列に特異的にハイブリダイズする好ましいプローブ態様は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡのヌクレオチド混合物のオリゴマーであってもよく、これらは修飾された主鎖をもつもの、例えば１以上の２’−メトキシ置換ＲＮＡ基を含む合成オリゴヌクレオチドとして合成されてもよい。増幅したレジオネラ菌ｒＲＮＡ配列を検出するためのプローブは、標識されておらず間接的に（例えば検出される他の結合パートナーに結合することにより）検出されてもよく、あるいは検出可能なシグナルを発する標識で標識されていてもよい。好ましい態様は、検出可能な光シグナルを発する標識化合物、例えば均一混合物中で検出される発蛍光団又は発光性化合物を含む。プローブは１より多い標識及び／又は１より多いタイプの標識を含むことができ、あるいは検出は各プローブが検出可能なシグナルを発する化合物で標識されたプローブ混合物を用いたものであってもよい（例えば米国特許第６，１８０，３４０号及び第６，３５０，５７９号）。多様な既知の手段のいずれか、例えば共有結合、キレート形成及びイオン性相互作用により標識をプローブに結合させることができるが、好ましい態様では標識をオリゴヌクレオチドに共有結合させる。プローブは、実質的に線状のオリゴヌクレオチド、すなわち分子内結合により保持された配置をもたないものであってもよく、あるいは機能性配置構造、すなわち分子内ハイブリダイゼーションにより互いに保持されたヘアピン構造プローブにみられるような配置を含むこともできる。好ましい態様の線状オリゴマーは、一般に化学発光性標識、好ましくはＡＥ化合物を含む。
【００３１】
［０００３１］  ヘアピンプローブは、好ましくは多様な異なるタイプの相互作用性標識で標識され、一方の相互作用メンバーは通常はプローブの５’末端に結合し、他方の相互作用メンバーは通常はプローブの３’末端に結合している。そのような相互作用メンバーには、しばしばレポーター色素／クエンチャー対、発光体／クエンチャー対、発光体／付加物対、フォレスター（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ）エネルギー伝達対、又は色素二量体というものが含まれる。発光体／クエンチャー対は、１種類以上の発光性標識、例えば化学発光性又は蛍光性の標識と、１種類以上のクエンチャーから構成されうる。好ましい態様では、特定の第１波長又は波長範囲で光を吸収し、第２発光波長又は波長範囲で光を発する発蛍光団（「Ｆ」）でヘアピンプローブの一端を標識し、他端をクエンチャー（「Ｑ」）で標識する；Ｑは、発蛍光団と近接している際には、励起されたＦから発せられるシグナルを部分的又は完全に減衰させる。そのようなヘアピンプローブを蛍光体／クエンチャー（Ｆ／Ｑ）対で標識されたということができる。発蛍光団は周知の化合物であり、例えばアクリジン、フルオレセイン、スルホローダミン１０１、ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノアフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、エオシン、ボディピイ（Ｂｏｄｉｐｙ）及びルシファーイエロー（ｌｕｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ）を含む（Tyagi et al., Nature Biotechnology 16: 49-53, 1998）。クエンチャーは周知であり、例えば４−（４’−ジメチル−アミノ−フェニルアキソ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、タリウム、セシウム、及びｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロミドを含む。種々のＦ／Ｑ組合わせが知られ、多くの組合わせが互いに機能しうる；例えばＤＡＢＣＹＬとフルオレセイン、ローダミン又はＥＤＡＮＳ。ヘアピンプローブのための標識の他の組合わせには、レポーター色素、例えばＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標）を、クエンチャー、例えばＴＡＭＲＡ（商標）又は非蛍光性クエンチャーと組み合わせたものが含まれる。機能性Ｆ／Ｑ組合わせはルーティン試験を用いて既知の方法で決定できる。
【００３２】
［０００３２］  好ましい態様のヘアピンプローブは「分子トーチ」であり、これは試料中に標的レジオネラ菌配列が存在することの指標となる増幅生成物を増幅工程後に検出する。分子トーチは下記のものを含む：（１）標的配列にハイブリダイズして開放配置を生じる標的検出手段；（２）標的配列の不存在下で標的検出手段にハイブリダイズして閉鎖配置を生じるトーチ閉鎖手段；及び（３）標的検出手段とトーチ閉鎖手段を連結する連結手段（米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号に詳述）。開放配置のトーチプローブは増幅した標的配列が存在することを指示する検出可能なシグナルを発し、一方、閉鎖配置は開放配置のものと識別できるある量のシグナルを発するが、これは標的配列が存在しないことの指標となる。他の好ましいヘアピンプローブ態様は「分子ビーコン」であり、これはヘアピン配列の一方のアーム上の標識、他方のアーム上のクエンチャー、及びこれら２つのアームを連結するループ領域を含む（米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号に詳述）。そのヘアピンプローブを用いる方法は当技術分野で周知である。
【００３３】
［０００３３］  核酸ポリメラーゼで延長されないオリゴマーは、増幅反応中でのオリゴマーの酵素介在延長を阻止するために３’ＯＨを置換する遮断基を含む。増幅に際して存在する、遮断された増幅オリゴマー及び／又は遮断された検出プローブ（リアルタイム検出で）は好ましくは３’ＯＨがないが、３’末端又はその付近に位置する１以上の遮断基を含む。遮断基はオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合するか又は３’末端付近、好ましくは３’末端の５残基以内に位置し、ポリメラーゼがオリゴマーに結合するのを制限するのに十分なほど大きい。アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド、及びコルジセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）等の多種多様な化学基を遮断部分として用いうる。
【００３４】
［０００３４］  レジオネラ・ニューモフィラ配列を検出するための好ましい方法には、分子トーチ又は分子ビーコン等ヘアピンプローブを用いる転写関連増幅を用いる。プローブを増幅前に添加しておけば、試薬をさらに添加せずに検出を行えるからである。増幅した標的配列にプローブが早期に結合するのを阻止するために、例えばヘアピンプローブのハイブリダイズしたアーム（例えば、分子トーチの標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメイン複合体）のＴｍが増幅反応温度より高くなるようにプローブを設計することができる。増幅期間後に混合物を加熱し、トーチプローブのアームを開放して標的結合ドメインが増幅生成物中の標的配列にハイブリダイズできるようにする。次いで溶液を冷却して、増幅生成物に結合していないプローブを閉鎖すると、これにより標識／クエンチャー（Ｆ／Ｑ）対が閉鎖し、増幅した標的配列にハイブリダイズしたプローブからのシグナルを均一反応において検出することができる。例えば、Ｆ／Ｑ標識ヘアピンプローブを含有する混合物を適当な励起光で照射し、発生するシグナルを測定する。
【００３５】
［０００３５］  他の態様では、増幅中に増幅生成物がプローブの標的結合ドメインに優先的にハイブリダイズするようにヘアピン検出プローブを設計し、これにより、増幅の進行に伴いヘアピンが閉鎖配置から開放配置に変化する。増幅反応混合物を増幅反応中で間隔をおいて照射して、開放プローブから発せられるシグナルを増幅中、すなわちリアルタイムで検出する。
【００３６】
［０００３６］  レジオネラ菌配列の増幅のための試料の調製には、試料に含有される有機体を他の試料成分から分離及び／又は濃縮すること、例えば空気、水その他のタイプの試料から粒状物質を濾過することが含まれる場合がある。試料の調製には、細胞を化学的、物理的及び／又は酵素により破壊して、レジオネラ菌１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含めた細胞内容物を放出させることが含まれる場合もある。試料の調製には、標的核酸を他の試料成分から特異的又は非特異的に分離するための標的捕捉工程が含まれる場合がある。非特異的な標的調製法は、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈殿させるか、核酸を支持体に付着させ、支持体を洗浄して他の試料成分を除去するか、あるいは他の手段を用いて他の成分を含有する混合物からレジオネラ菌核酸を含めた核酸を物理的に分離することができる。他の非特異的な標的調製法は、レジオネラ菌１６Ｓ又は２３Ｓ ｒＲＮＡを含めたＲＮＡを、試料中のＤＮＡから選択的に分離することができる。
【００３７】
［０００３７］  好ましい態様では、レジオネラ菌標的配列に特異的な捕捉オリゴマーにレジオネラ菌核酸を特異的にハイブリダイズさせて標的配列：捕捉プローブ複合体を形成し、これを試料成分から分離して、レジオネラ菌ｒＲＮＡ又はｒＲＮＡをコードするＤＮＡを他の試料成分から選択的に分離する。特異的な標的捕捉の好ましい態様では、レジオネラ菌標的：捕捉プローブ複合体を固定化プローブに結合させて、標的：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を形成し、これを試料から分離し、場合により洗浄して非標的試料成分を除去する。捕捉プローブは、１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ中又は１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中のレジオネラ菌標的配列に特異的に結合する配列を含み、かつ捕捉プローブをその標的配列が結合した状態で支持体（例えばマトリックス又は粒子）に付着させる特異的結合パートナーをも含み、これにより標的配列を試料成分から分離するのが容易になる。好ましい態様では、捕捉プローブの特異的結合パートナーは、レジオネラ菌標的配列に対して相補的ではなく、支持体に結合している固定化プローブ上の相補配列にハイブリダイズする、３’テール配列である。好ましい３’テール配列は、支持体に結合している相補的な固定化配列（例えばポリ−Ｔ）に結合する実質的にホモポリマー状の１０〜４０ｎｔ配列（例えばＡ１０〜Ａ４０）である。標的捕捉は、通常はテール配列：固定化プローブ配列二本鎖のＴｍより高い温度のハイブリダイゼーション条件下でレジオネラ菌標的核酸に特異的にハイブリダイズする捕捉オリゴマーを含有する溶液相混合物中で行われる。次いで捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調整して、レジオネラ菌標的：捕捉プローブ複合体を捕捉して支持体上の複合体全体を他の試料成分から分離する。レジオネラ菌標的配列を含む複合体が付着した支持体を洗浄して、他の試料成分をさらに除去することができる。好ましい支持体は粒子、例えば常磁性ビーズであり、したがって捕捉したレジオネラ菌標的配列を含有する複合体を含む粒子を洗浄溶液に懸濁し、洗浄溶液から磁気引力で回収することができる。他の態様では、捕捉プローブはレジオネラ菌標的配列を含めた試料中の核酸に非特異的に結合してもよく、次いで捕捉プローブ：核酸複合体を支持体に付着させ、支持体に捕捉された複合体を分離する同様な工程を実施する。標的の捕捉がレジオネラ菌標的配列に特異的又は非特異的のいずれであっても、捕捉された核酸を次いで意図するレジオネラ菌標的配列に特異的なインビトロでの増幅により処理する。操作工程の数を制限するために、支持体に捕捉されている複合体中のレジオネラ菌標的配列を増幅試薬と混合してレジオネラ菌標的核酸を増幅させることができる。あるいはプライマーを標的捕捉反応混合物に含有させてもよく、これにより標的捕捉に際してレジオネラ菌特異的プライマーと標的配列をハイブリダイズさせ、捕捉された複合体中で共に試料から分離することができる。
【００３８】
［０００３８］  レジオネラ菌核酸を検出するためのアッセイ法は、場合によりレジオネラ菌ではない内部対照（ＩＣ）核酸を含んでもよく、これはＩＣ配列に特異的な増幅オリゴマー及び検出オリゴマーを用いて、同一アッセイ混合物中で増幅及び検出される。ＩＣ配列が増幅され、増幅されたＩＣ配列からのシグナルが検出されると、意図する標的レジオネラ菌核酸についてシグナルが得られない場合に（例えばレジオネラ・ニューモフィラについて陰性結果を示す試料）、そのアッセイでアッセイ試薬、条件及び操作工程が適正に使用及び実施されたことの証明となる。定量結果を得たい場合、ＩＣをアッセイの内部検量物質として用いうる。すなわち、ＩＣの増幅及び検出から得られるシグナルを用い、増幅したレジオネラ菌標的配列について得たシグナルに基づき、試料中のレジオネラ菌核酸量を定量するためのアルゴリズムに用いるパラメーターを設定する。好ましいＩＣの態様は、天然源に由来するランダム化配列である（例えばランダムに再配列したＨＩＶ配列）。好ましいＩＣは、天然源から単離したＲＮＡ転写体又は例えばクローニングしたランダム化配列から転写体を作製してインビトロ合成したものであってもよく、これによりアッセイに含有されるＩＣのコピー数を正確に測定できる。ＩＣ標的配列に対するプライマー及びプローブは、いずれか周知の方法を用いて設計及び合成される。ただし、そのプライマー及びプローブは、レジオネラ菌標的配列の増幅及び検出に用いるものと実質的に同じアッセイ条件でＩＣ標的配列の増幅及び増幅したＩＣ配列の検出について機能し、かつアッセイに際してＩＣ成分はレジオネラ菌標的配列の増幅及び検出に用いる成分を妨げない。標的捕捉に基づく精製工程を含む好ましい態様では、ＩＣ標的に特異的な標的捕捉プローブを標的捕捉工程に含有させ、ＩＣはすべてのアッセイ工程で、意図するレジオネラ菌被分析体に用いるものと同じ条件で処理される。
【００３９】
［０００３９］  レジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の増幅及び検出
［０００４０］  レジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列（１６Ｓ ｒＲＮＡ、及び１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む）中の標的配列を増幅及び検出するために、既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を比較し、レジオネラ・ニューモフィラ単離株に共通であるが好ましくはレジオネラ属の他の種又は他の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と完全には同一でない配列を選択して、増幅オリゴマー及び検出プローブとして作用するオリゴマーを設計した。レジオネラ属の種（レジオネラ・アニサ（Ｌ．ａｎｉｓａ）、レジオネラ・ベリアルデンシス（Ｌ．ｂｅｌｉａｒｄｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ブリミンガミエンシス（Ｌ．ｂｒｉｍｉｎｇｈａｍｉｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ボゼマニイ、レジオネラ・ブルネンシス（Ｌ．ｂｒｕｎｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ブサネンシス（Ｌ．ｂｕｓａｎｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・チェリイ（Ｌ．ｃｈｅｒｒｉｉ）、レジオネラ・シンシナチエンシス（Ｌ．ｃｉｎｃｉｎａｔｉｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・デュモフィイ、レジオネラ・エリスラ（Ｌ．ｅｒｙｔｈｒａ）、レジオネラ・フィーレイィ（Ｌ．ｆｅｅｌｅｉｉ）、レジオネラ・グレシレンシス（Ｌ．ｇｒｅｓｉｌｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・グラチアナ（Ｌ．ｇｒａｔｉａｎａ）、レジオネラ・ハッケリエ（Ｌ．ｈａｃｋｅｌｉａｅ）、レジオネラ・ジャメストウニエンシス（Ｌ．ｊａｍｅｓｔｏｗｎｉｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ジョルダンシス（Ｌ．ｊｏｒｄａｎｓｉｓ）、レジオネラ・リチクム（Ｌ．ｌｙｔｉｃｕｍ）、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・モラビカ（Ｌ．ｍｏｒａｖｉｃａ）、レジオネラ・オークリッジネシス（Ｌ．ｏａｋｒｉｄｇｅｎｅｓｉｓ）、レジオネラ・パリシエンシス（Ｌ．ｐａｒｉｓｉｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ・クアテイレンシス（Ｌ．ｑｕａｔｅｉｒｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ルブリルセンス（Ｌ．ｒｕｂｒｉｌｕｃｅｎｓ）、レジオネラ・サンチクルシス（Ｌ．ｓａｎｔｉｃｒｕｃｉｓ）、レジオネラ・セイントヘレンシ（Ｌ．ｓａｉｎｔｈｅｌｅｎｓｉ）、レジオネラ・シェイクスピアレイ（Ｌ．ｓｈａｋｅｓｐｅａｒｅｉ）、レジオネラ・スピリテンシス（Ｌ．ｓｐｉｒｉｔｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ステイジェルワルチイ（Ｌ．ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｔｉｉ）、レジオネラ・タウリネシス（Ｌ．ｔａｕｒｉｎｅｓｉｓ）、レジオネラ・ワズワーシイ（Ｌ．ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ））、並びに他の細菌種（大腸菌、緑膿菌、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、ボルデテラ・パラペルタス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、コリネバクテリウム・ゼローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（偽結核菌）（Ｃ．  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ���）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びインフルエンザ菌）の既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列（ｒＲＮＡ又は遺伝子）を用いて配列比較を実施した。特異的オリゴクレオチド配列を選択し、インビトロで合成し、標準実験法を用いてそのオリゴヌクレオチドのＴｍ及び相補的標的配列（合成又は細菌から精製したｒＲＮＡ配列）とのハイブリダイゼーション特性を測定することによりオリゴヌクレオチドを特性分析した。種々の組み合わせの増幅オリゴマーを、合成１６Ｓ ＲＮＡ標的配列又は培養増殖させた多様なレジオネラ属菌種から精製した１６Ｓ ｒＲＮＡである鋳型と共に増幅反応に用いて、選択したオリゴマーをさらに試験して、選択した増幅オリゴマーの使用による標的配列増幅の相対効率を判定した。一般に、標識プローブオリゴマーを増幅生成物に結合させて増幅生成物の量の指標となるシグナルの相対量を検出することにより増幅反応の増幅生成物を検出して、種々の組み合わせのオリゴマーの効率をモニターした。一般に、増幅効率の初期試験のために、ＡＥ化合物で標識した線状検出プローブを増幅生成物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないプローブ中のＡＥ標識を選択的に分解してハイブリダイズしているプローブからのシグナルを検出するハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）により検出した（実質的に米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号及び第５，８２４，４７５号の記載に従う）。
【００４０】
［０００４１］  レジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列について選択した好ましい態様の増幅オリゴマーを表１に示す。増幅オリゴマーには、プライマー、プロモータープライマー、及び／又はプロモータープロバイダープライマーとして機能しうるものが含まれる。後の２つについては、プロモーター配列を表１に小文字で示す。若干のオリゴマー態様は、対応するプロモータープライマー又はプロモータープロバイダーオリゴマーの標的特異的配列のみを含む。例えば配列番号３０は、５’側プロモーター配列を含む配列番号３１に含まれる標的特異的配列と同一の標的特異的配列である。当業者であれば、表１に挙げた標的特異的配列は、場合により既知のいずれかのプロモーター配列の３’末端に結合して、選択したプロモーター配列に適当なＲＮＡポリメラーゼと共にプロモータープライマー又はプロモータープロバイダーとして機能しうることを認識するであろう。好ましい態様には、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに対して特異的なプロモーター配列（例えば配列番号９０、９１又は９２）が含まれる。増幅オリゴマーの好ましい態様は、ＤＮＡ塩基とＲＮＡ塩基の混合物、及び２’メトキシＲＮＡ基を含むことができ、例えば配列番号５６及び５７のオリゴマーは、ＲＮＡ塩基、及び５’末端から最初の４つの位置に２’メトキシ結合を含んでもよい。増幅オリゴマーの態様は、オリゴマーを単一プライマー型の転写関連増幅反応において遮断分子又はプロモータープロバイダーオリゴマーとして機能するのに最適なものにするために、３’遮断されたオリゴマーの合成により修飾されてもよい。３’遮断オリゴマーの好ましい態様には、３’末端又はその付近に遮断されたＣを含む配列番号５８、５９、６０及び６１のオリゴマーが含まれる。
【００４１】
【表１】
2009511086.tif 000002
【００４２】
【表２】
2009511086.tif 000003
【００４３】
［０００４２］  １６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの増幅生成物を検出するために選択した検出プローブの好ましい態様を表２に示す。好ましい態様の線状検出プローブは、リンカーによりプローブオリゴマーに結合した化学発光性ＡＥ化合物で標識される（実質的に米国特許第５，５８５，４８１号及び米国特許第５，６３９，６０４号、特に１０欄６行−１１欄３行及び例８に従う）。好ましい標識位置の例は、プローブオリゴマーの中央領域、及びＡ：Ｔ塩基対合領域付近、オリゴマーの３’又は５’末端、並びに目的の標的配列ではない既知配列との不適正塩基対合部位又はその付近である。そのようなＡＥ標識オリゴマーの好ましい態様には、下記の位置にリンカーがあるものが含まれる：配列番号６のｎｔ４とｎｔ５の間、配列番号２及び１４のｎｔ５とｎｔ６の間、配列番号１４のｎｔ６とｎｔ７の間、配列番号７及び１８のｎｔ７とｎｔ８の間、配列番号１３及び１４のｎｔ８とｎｔ９の間、配列番号２、１１、２４、２６及び２７のｎｔ９とｎｔ１０の間、配列番号４、１２、１５及び１６のｎｔ１０とｎｔ１１の間、配列番号２５のｎｔ１１とｎｔ１２の間、配列番号７及び１８のｎｔ１２とｎｔ１３の間、配列番号７、１０、１７及び２３のｎｔ１３とｎｔ１４の間、配列番号１、２、３、１６、２１及び２２のｎｔ１４とｎｔ１５の間、配列番号９及び１５のｎｔ１５とｎｔ１６の間、配列番号５、８、１３及び１４のｎｔ１６とｎｔ１７の間、配列番号１１のｎｔ１７とｎｔ１８の間、配列番号６のｎｔ１８とｎｔ１９の間、並びに配列番号１０、１３及び１４のｎｔ１９とｎｔ２０の間である。標識されておらず、標識された検出プローブが標的に結合するのを容易にする他の１種類以上のヘルパープローブと共に、検出プローブを用いうる（米国特許第５，０３０，５５７号、Ｈｏｇａｎら）。ヘルパープローブの好ましい態様には、配列番号１９及び２０のものが含まれる。他の検出プローブ態様は、プローブ配列の分子内ハイブリダイゼーションによりヘアピン構造を形成するオリゴマーであり、そのうち好ましい態様は配列番号６２、６３、６４及び６５のものである。好ましいヘアピンプローブオリゴマーは、配列の一端に蛍光標識を結合させ、他端にクエンチャー化合物を結合させた状態で合成される。ヘアピンプローブの態様は、５’側発蛍光団と３’側クエンチャーで、例えば５’側フルオレセイン標識と３’側ＤＡＢＣＹＬクエンチャーで標識することができる。ある態様のヘアピンオリゴマーは、配列内の選択した位置に非ヌクレオチドリンカー部分を含む；例えば、下記に位置する非塩基９−炭素（「Ｃ９」）リンカーを含むオリゴマー：配列番号６２のｎｔ５とｎｔ６の間又はｎｔ２０とｎｔ２１の間、配列番号６３のｎｔ５とｎｔ６の間又はｎｔ２３とｎｔ２４の間、配列番号６４のｎｔ２３とｎｔ２４の間、及び配列番号６５のｎｔ２５とｎｔ２６の間である。
【００４４】
【表３】
2009511086.tif 000004
【００４５】
【表４】
2009511086.tif 000005
【００４６】
［０００４３］  レジオネラ菌１６Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸を他の試料成分から分離するための試料調製に用いる捕捉プローブオリゴマーの態様には、
【００４７】
【化１】
2009511086.tif 000006
【００４８】
の標的特異的配列を含むものが含まれる。捕捉プローブの好ましい態様は、標的特異的配列に共有結合した結合パートナーとして作用する３’テール領域を含む。結合パートナーは、標的核酸と捕捉プローブからなるハイブリダイゼーション複合体を、支持体上の固定化プローブに結合させる。配列番号６６、６７及び６８の標的特異的配列を含む捕捉プローブの好ましい態様は、実質的にホモポリマー配列、例えばｄＴ３Ａ３０配列からなる３’テール領域をさらに含む。
【００４９】
［０００４４］  本明細書中の実施例に記載する標的捕捉、増幅及び検出の工程に用いる試薬には、下記のうち１以上が含まれる：試料輸送溶液：１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、及び３％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ｐＨ６．７。細胞溶解用緩衝液：７９０のｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２３０ｍＭのコハク酸、１０％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、及び６８０ｍＭのＬｉＯＨ。検体希釈用緩衝液：３００ｍＭのＨＥＰＥＳ、３％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、４４ｍＭのＬｉＣｌ、１２０ｍＭのＬｉＯＨ、４０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４。標的捕捉試薬：２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３１０ｍＭのＬｉＯＨ、１．８８ＭのＬｉＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．４、及び２５０μｇ／ｍｌの常磁性粒子（０．７〜１．０５μの粒子、ＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）ＭＧ−ＣＭ、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．、インディアナ州インディアナポリス）に（ｄＴ）１４オリゴマーが共有結合したもの。洗浄用緩衝液：（標的捕捉用）１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６．５ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、及び０．１％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５。増幅試薬：他の反応成分（例えば試料又は検体希釈用の緩衝液）と混合して混合物を調製するための、下記のものを含有する濃厚混合物：４７．６ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、２．５％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、５４．８ｍＭのＫＣｌ、２３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＮａＯＨ、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭのｒＡＴＰ、１．３５ｍＭのｒＣＴＰ、１．３５ｍＭのＵＴＰ、８．８５ｍＭのｒＧＴＰ、０．２６ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５％ｖ／ｖのグリセロール、２．９％のトレハロース、０．２２５％のエタノール、０．０７５％のメチルパラベン、０．０１５％のプロピルパラベン、及び０．００２％のフェノールレッド、ｐＨ７．５−７．６。増幅オリゴマー（プライマー、プロモータープライマー、遮断オリゴマー、又はプロモータープロバイダーオリゴマー）及び場合によりプローブは、増幅試薬中において、又は別個に、反応混合物に添加することができる。ＴＭＡ反応における酵素；反応当たり約９０Ｕ／μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）及び約２０Ｕ／μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（１ＵのＲＴが３７℃で２００〜４００μＭのオリゴｄＴ−プライムドポリＡ鋳型を用いて１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを１０分で取り込み、１ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが３７℃でＤＮＡ鋳型中のＴ７プロモーターを用いて１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡ中に１時間で取り込む）。プローブ試薬：ＡＥ標識した検出プローブ用：１００ｍＭのコハク酸リチウム、０．１〜３％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、１０ｍＭのメルカプトエタンスルホネート、及び場合により３％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン。ハイブリダイゼーション試薬：核酸へのＡＥ標識プローブ結合用：１００ｍＭのコハク酸、２％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、１０��ｍＭのＬｉＯＨ、１５ｍＭのアルドリチオール−２（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２）、１．２ＭのＬｉＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び３．０％（ｖ／ｖ）のエタノール、ｐＨ４．７。選択試薬：結合していない検出プローブ上のＡＥ標識を優先的に加水分解するためのもの：６００ｍＭのホウ酸、１８２．５ｍＭのＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）のオクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ｐＨ８．５。ＡＥ標識から化学発光応答を発生させるための検出試薬は、検出試薬Ｉ（１ｍＭの硝酸及び３２ｍＭのＨ２Ｏ２）、及びｐＨを中和するための検出試薬ＩＩ（１．５Ｍ  ＮａＯＨ）からなっていた（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号及び第５，６５８，７３７号）。試薬の添加及び混合の工程はすべて手動で、又は手動工程と自動化工程の組合わせにより、又は完全自動化システムにより実施できる。ＴＭＡを用いる増幅法は、実質的に米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号に開示された方法を用いる。単一プライマー型の転写関連増幅を用いる増幅法は、実質的に米国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）に開示された方法を用いる。ＡＥ標識プローブの使用、及び標的配列を含むハイブリダイゼーション複合体を検出するためのシグナル検出は、実質的に米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号及び第５，６５８，７３７号に開示された方法を用いる。ヘアピンプローブの使用方法は、米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号に開示されている。
【実施例】
【００５０】
［０００４５］  試料が約１００コピーの１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列を含有する場合、種々の組合わせの当該増幅オリゴマー及びＡＥ標識した検出プローブを用いて検出可能な化学発光シグナルを発生させることにより、レジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ配列が特異的に検出された。本発明方法の好ましい態様を実施例１〜４に示す。
【００５１】
［０００４６］  実施例１：レジオネラ・ニューモフィラの標的配列の特異的な増幅及び検出
［０００４７］  レジオネラ・ニューモフィラ及びレジオネラ・ワズワーシイに由来する１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の既知数のインビトロ転写体を、同一の条件及び増幅オリゴマー組合わせを用いるＴＭＡ反応で別個に増幅させ、増幅生成物を同一プローブ（配列番号１３をｎｔ１６と１７の間でＡＥ標識）により検出した。要約すると、レジオネラ・ニューモフィラ又はレジオネラ・ワズワーシイの１６Ｓ ｒＲＮＡインビトロ転写体１００、１０００、１００００又は１０００００コピーを検体希釈用緩衝液中で混合することにより、検体を調製した。検体を増幅試薬及び増幅オリゴマー（増幅オリゴマーの組合わせ：配列番号４１と４６、又は４１と５５、又は５４と４６、又は５４と５５）と混合し、実質的に米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）に詳述された方法を用いるＴＭＡ反応において増幅させた。要約すると、増幅試薬、標的核酸、及び増幅オリゴマー（反応当たり１５ｐｍｏｌの各オリゴマーの組合わせ）を含有する反応混合物（約０．０８ｍｌ）を混合し、シリコーン油（０．２ｍｌ）で覆って蒸発を防ぎ、６２℃で１０分間、次いで４２℃で５分間、インキュベートした。次いで酵素試薬（０．０２５ｍｌ；ＭＭＬＶ−ＲＴ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有）を添加し、反応混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。増幅の後、増幅生成物の検出には、標識した配列番号１３の検出プローブオリゴマー（反応当たり０．１ｐｍｏｌ、０．１ｍｌのプローブ試薬中、ハイブリダイズした標識プローブから約５，０００，０００相対光単位（ＲＬＵ）の検出範囲の検出可能な最大シグナルを発するように予め定めた量）を増幅混合物と混合することを伴っていた。プローブと増幅配列の混合物をインキュベートして検出プローブを増幅生成物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブから発せられる化学発光シグナルを実質的に米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，６０４号の記載に従って検出した。要約すると、プローブと増幅配列の混合物を６２℃で２０分間インキュベートし、次いで室温で約５分間冷却し、選択試薬（０．２５ｍｌ）を添加し、混合し、６２℃で１０分間、続いて室温で１５分間インキュベートして、結合していないプローブ上の標識を加水分解した。検出試薬Ｉを添加し、インキュベートし、検出試薬ＩＩを添加することにより、結合したプローブ上のＡＥから化学発光シグナルを発生させ、ルミノメーター（例えばＬＥＡＤＥＲ（登録商標）、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてシグナル（ＲＬＵ）を測定した。当該アッセイの結果を、それぞれの増幅オリゴマー組合わせについて実施した２回のアッセイに関する平均ＲＬＵとして表３に示す。すべての場合、陰性対照（すなわち、標的コピー数ゼロの検体を用いて同一様式で実施した反応）は１９９６〜２５７９ＲＬＵのバックグラウンドシグナルを発した。当該結果は、配列番号４１と４６、又は４１と５５、又は４６と５４、又は５５と５４の増幅オリゴマー組合わせが、増幅生成物にハイブリダイズした配列番号１３のＡＥ標識プローブからのシグナルにより検出して、ＴＭＡ反応においてわ���か１０Ｏコピーのレジオネラ・ニューモフィラ由来１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列を増幅できたことを示す。これに対し、レジオネラ・ワズワーシイ１６Ｓ ｒＲＮＡを用いた場合、同一の条件並びに増幅オリゴマー組合わせ及び検出プローブを用いて、一般に陰性結果が得られた。高いコピー数のレジオネラ・ワズワーシイ１６Ｓ ｒＲＮＡ（１００００〜１０００００）を含有する反応のみがバックグラウンドより高いシグナルを発した。
【００５２】
【表５】
2009511086.tif 000007
【００５３】
配列番号５１と４３、又は５２と４３、又は５１と４５、又は５２と４５（各プライマーを反応当たり１５ｐｍｏｌで使用）の増幅オリゴマー組合わせ、及びＡＥ標識した配列番号２１の検出プローブを用いて、同様なアッセイを実施した。ＴＭＡ増幅及び化学発光検出の工程を、実質的に前記に従い、鋳型核酸としてレジオネラ・ニューモフィラ又はレジオネラ・ワズワーシイの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のインビトロ転写体を反応当たり１０、１００、１０００、１００００及び１０００００コピーで用いて実施した。配列番号５２と４３の増幅オリゴマー組合わせは、１００００及び１０００００コピーのレジオネラ・ニューモフィラの標的を信頼性をもって検出し（それぞれ、３１，４３７及び２，２０６，１０２の平均ＲＬＵ）、同一コピー数のレジオネラ・ワズワーシイの標的を検出しなかった（それぞれ、７，１５２及び７，４３７の平均ＲＬＵ）。配列番号５２と４５の増幅オリゴマー組合わせは、１０００、１００００及び１０００００コピーのレジオネラ・ニューモフィラの標的を信頼性をもって検出し（それぞれ、１４８，８６９、８７４，７４８及び４，０９９，６８２の平均ＲＬＵ）、同一コピー数のレジオネラ・ワズワーシイの標的を検出しなかった（それぞれ、１２，０４５、７，８６８及び２０，４８２の平均ＲＬＵ）。他の増幅オリゴマー組合わせでは、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列について信頼性のある陽性シグナルを発しなかった。
【００５４】
［０００４８］  実施例２：レジオネラ・ニューモフィラの標的配列の特異的な増幅及び検出
［０００４９］  実質的に実施例１の記載に従い、配列番号５４と５５の増幅オリゴマー（反応当たりそれぞれ１５ｐｍｏｌ）、及びＡＥ標識した配列番号１３の検出プローブ（反応当たり１００ｆｍｏｌ）を用い、標的核酸として下記の培養細菌からの全ＲＮＡ精製抽出物を用いて、同様なＴＭＡ反応を実施した：レジオネラ・ニューモフィラの３株、レジオネラ属の他の種（レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・スピリテンシス、及びレジオネラ・ワズワーシイ）、及びレジオネラ属以外の種（肺炎杆菌、ボルデテラ・パラペルタッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、及びボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌））。全ＲＮＡを標準法により精製してＲＮＡを可逆的に支持体に結合させ（例えばＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ製品についての製造業者による記載に従う）、精製ＲＮＡを標準蛍光測定法により定量した。各ＲＮＡ標的を各供給源につき個別に四重試料を用いたアッセイで試験した。同一条件を用い、ただしレジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の既知量のインビトロ転写体を用いて、実施例１の記載に従って陽性対照を増幅させた。陽性対照を、反応当たり１００コピー以上を検出する二重反応によりアッセイした（検出した平均ＲＬＵ：１００コピーにつき１，５０４，９９８ＲＬＵ、１０００コピーにつき４，７５４，７７６、１００００コピーにつき５，１３６，９５３、及び１０００００コピーにつき５，２６７，７１３）。陰性対照は標的核酸を含有しない反応混合物であり、２０４１及び２０９５ＲＬＵのバックグラウンドシグナルを発した。種々の標的からの全ＲＮＡについての当該アッセイの結果（平均ＲＬＵ）を表４に示す。当該結果は、この方法がレジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列を特異的に増幅及び検出し、レジオネラ属の他の種又はレジオネラ属以外の一般的な細菌に由来する他の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有意には増幅及び／又は検出しないことを示す。このアッセイ法は、反応当たり１０ｆｇのレジオネラ・ニューモフィラ精製ｒＲＮＡから増幅した１６Ｓ ｒＲＮＡ標的からのシグナルを検出したが、同一条件で反応当たり１０ｆｇ又は反応当たり１００ｆｇのレジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・スピリテンシス、レジオネラ・ワズワーシイ、肺炎杆菌、ボルデテラ・パラペルタッシス、及びボルデテラ・ブロンキセプチカからの精製ｒＲＮＡを試験した場合は陰性結果が得られた。
【００５５】
【表６】
2009511086.tif 000008
【００５６】
［０００５０］  実施例３：レジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列の増幅及び検出
［０００５１］  異なる増幅オリゴマー組合わせ：配列番号２９と３１、又は２８と３１、又は２９と３３、又は２８と３３（それぞれ、反応当たり１５ｐｍｏｌ）を用いた以外は実質的に実施例１の記載に従い、レジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡインビトロ転写体を増幅の標的として用いてＴＭＡ反応を実施した。実質的に実施例１の記載に従い、ただしＡＥ標識した配列番号５のプローブを用いて増幅生成物を検出した。すべての増幅オリゴマー組合わせで１０００コピー以上の標的核酸が検出され、コピー数がさらに低いの標的も検出できる可能性はあったが、陰性対照試験（標的核酸を添加しない）で検出された比較的高いバックグラウンドによりシグナルが隠蔽された。当該組合わせのうち、配列番号２９と３１、及び配列番号２８と３１のオリゴマーが、レジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を検出したアッセイにおいて最良の性能を示した。
【００５７】
［０００５２］  実施例４：レジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の標的の捕捉、増幅及び検出
［０００５３］  ここに提示するこの方法は、増幅工程の前に試料から標的核酸を精製することを含んでいた。実質的に米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号の記載に従って、標的捕捉により標的精製を行った。要約すると、既知量の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸（試料当たり１、１０、１００及び１００００コピーのインビトロ転写体、全容量０．４ｍｌの試料輸送溶液中）を含有する試料を調製し、配列番号６６又は配列番号６７にｄＴ３Ａ３０テールを共有結合させた標的捕捉オリゴマー（アッセイ当たり２．５ｐｍｏｌ）、及びポリｄＴオリゴマーを共有結合させた磁性粒子と混合した。混合物をまず６０℃で３０分間、次いで室温で３０分間インキュベートして、レジオネラ菌ＲＮＡが粒子に捕捉されたハイブリダイゼーション複合体を形成した。容器の外側に磁界を１０分間付与し、次いで溶液相を吸引して他の試料成分を除去することにより、レジオネラ菌ＲＮＡを捕捉した磁性粒子を分離し、ハイブリダイゼーション複合体が付着した粒子を続けて２回洗浄した（室温の洗浄溶液それぞれ１ｍｌで、洗浄溶液を磁性粒子から吸引除去して）。レジオネラ菌標的核酸を含むハイブリダイゼーション複合体が付着した粒子を、配列番号５４と５５の増幅オリゴマー（アッセイ当たり、それぞれ１５ｐｍｏｌ）を含有する増幅試薬に懸濁し、実質的に実施例１の記載に従ってＴＭＡ反応を実施した。次いでＡＥ標識した配列番号１５のプローブ（アッセイ当たり０．１ｐｍｏｌ）を用いて増幅生成物を検出し、実質的に実施例１の記載に従って化学発光シグナルを検出した。各条件について二重試料を調製してアッセイし、検出した平均ＲＬＵとして報告した結果を表５に示す。陰性対照を同様に、ただし標的ＲＮＡを含有させずに処理し、１４８５〜１６４０ＲＬＵのバックグラウンドが得られた。表５の結果は、増幅及び検出と標的捕捉を組み合わせると反応当たりわずか１コピーのレジオネラ菌標的を検出できたことを示す。ただし、低いコピー数（１〜１０コピー）の試料については１００コピー以上を含有する試料の場合より二重試料間の結果の変動が大きかった。
【００５８】
【表７】
2009511086.tif 000009
【００５９】
［０００５４］  前記に従い、同一の標的捕捉プローブ、増幅プライマー及び検出プローブを用い、ただしレジオネラ・ニューモフィラ血清グループ１、レジオネラ・ニューモフィラ血清グループ７９９、レジオネラ・ロングビーチェ、大腸菌、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の培養物から実施例２の記載に従って調製した標的ＲＮＡを用いるアッセイにおいて、同様な実験を実施した。結果は、このアッセイが血清グループ１及び７９９の両方のレジオネラ・ニューモフィラを特異的に検出する（４．９〜５．３×１０６ＲＬＵを検出）が、他の細菌から単離した他のいずれの標的核酸についても陽性シグナルを検出しない（すべて１０，０００ＲＬＵ未満、通常は約２０００ＲＬＵのバックグラウンドレベルで）ことを示した。
【００６０】
［０００５５］  レジオネラ・ニューモフィラの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の増幅及び検出
［０００５６］  レジオネラ・ニューモフィラの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（２３Ｓ ｒＲＮＡ、又は２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む）中にある配列を増幅及び検出するために、既知の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を比較し、レジオネラ・ニューモフィラ単離株に共通であるけれども好ましくはレジオネラ属の他の種又は他の細菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列と完全には同一でない配列を選択することにより、増幅オリゴマー及び検出プローブとして作用するオリゴマーを設計した。レジオネラ属の種（レジオネラ・アニサ、レジオネラ・ブリミンガミエンシス、レジオネラ・ボゼマニイ、レジオネラ・チェリイ、レジオネラ・デュモフィイ、レジオネラ・ゴルマニイ（Ｌ．ｇｏｒｍａｎｉｉ）、レジオネラ・ハッケリエ、レジオネラ・イスラエレンシス（Ｌ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ジャメストウニエンシス、レジオネラ・ジョルダンシス、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・オークリッジネシス、レジオネラ・パリシエンシス、レジオネラ・ニューモフィラ、レジオネラ・ルブリルセンス、レジオネラ・サンチクルシス、レジオネラ・セイントヘレンシ、及びレジオネラ・ワズワーシイ）及び他の細菌種（アシネトバクター・カルコエセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏｅｃｅｔｉｃｕｓ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・ジェルゴビエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｒｇｏｖｉａｅ）、緑膿菌、シュードモナス・アルカリゲネス、シュードモナス・セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・マルトフィリア（Ｐ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、プロテウス・ミラボリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｏｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナス・スタッツェリ、コリネバクテリウム・ダイバーサス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（偽結核菌）、肺炎杆菌、鼻硬腫菌（Ｋ．ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸炎菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ソネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、及び腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））の既知の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列（ＲＮＡ又は遺伝子）を用いて配列比較を実施した。特異的配列を選択し、インビトロで合成し、標準実験法を用いてそのオリゴヌクレオチドのＴｍ及び相補的標的配列（合成したもの、又は細菌から精製したｒＲＮＡ配列）とのハイブリダイゼーション特性を測定してレジオネラ・ニューモフィラ用オリゴマーを特性分析した。種々の組み合わせの増幅オリゴマーを、合成２３Ｓ  ＲＮＡ標的配列又は培養増殖した多様なレジオネラ属菌種から精製した２３Ｓ ｒＲＮＡと共に増幅反応に用いて、２３Ｓ ｒＲＮＡ標的配列の増幅効率を判定することに���り、選択したレジオネラ・ニューモフィラ用オリゴマー配列をさらに試験した。一般に、標識プローブを増幅生成物に結合させて増幅生成物の量の指標となるシグナルの相対量を検出することにより反応の増幅生成物を検出することによって、種々の組み合わせの増幅オリゴマーの相対効率を測定した。通常は、増幅効率の初期試験は、増幅生成物にハイブリダイズしたＡＥ標識した線状検出プローブを用いて増幅生成物を検出することを伴い、ハイブリダイズしていないプローブ中のＡＥを選択的に分解してハイブリダイズしたプローブからのシグナルを検出するＨＰＡ法により検出を行った（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号及び第５，８２４，４７５号の記載に従う）。
【００６１】
［０００５７］  ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的配列について選択した増幅オリゴマーを表６に示す。表中、プロモータープライマー及びプロモータープロバイダーオリゴマー中のプロモーター配列には小文字を用いた。表６に対応するプロモータープライマー中のものと同一の標的特異的配列からなるオリゴマーをあげる（例えば配列番号７１の標的特異的配列は、配列番号７５〜７７の３つのプロモータープライマー中に含まれる）。分子増幅法の当業者であればいかなる既知のプロモーター配列も標的特異的配列の５’末端に結合した標的特異的配列を合成しうることを認識するであろう。好ましい態様には、配列番号９０、９１及び９２に示す、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーターが含まれる。
【００６２】
【表８】
2009511086.tif 000010
【００６３】
［０００５８］  表６に示す増幅オリゴマーの組合わせを用いて作製した２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の増幅生成物に特異的なプローブには、
【００６４】
【化２】
2009511086.tif 000011
【００６５】
のものが含まれる。配列番号７２の好ましい態様の検出プローブを、ヌクレオチド６と７、８と９、又は１２と１３の間の位置で非ヌクレオチドリンカーによりこのオリゴマーに結合したＡＥ標識で標識する。配列番号８８及び８９の好ましい態様のプローブは、５’側−発蛍光団（例えばフルオレセイン）、３’側−クエンチャー（例えばＤＡＢＣＹＬ）、及びヌクレオチド５と６の間の非塩基部分（例えばＣ９）を含む。
【００６６】
［０００５９］  レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸を他の試料成分から分離するための試料調製に用いる捕捉プローブの態様には、２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡにハイブリダイズする
【００６７】
【化３】
2009511086.tif 000012
【００６８】
の標的特異的配列を含むものが含まれる。好ましい捕捉プローブ態様は、配列番号７３の標的特異的配列に共有結合した、例えば配列番号７３の３’末端に結合したｄＴ３Ａ３０の３’テール配列を含み、これはレジオネラ菌標的核酸と捕捉プローブからなるハイブリダイゼーション複合体を支持体上の固定化プローブに結合させる結合パートナーとして機能する。
【００６９】
［０００６０］  表６にあげたものから種々の増幅オリゴマー組合わせを作り、レジオネラ・ニューモフィラ及び他の細菌から単離した全ＲＮＡ又は２３Ｓ ｒＲＮＡを標的核酸として用いる前記の単一プライマー型の転写関連増幅において試験した。発蛍光団（５’側−フルオレセイン）及び３’側−クエンチャー（ＤＡＢＣＹＬ）で標識したヘアピンプローブ（分子トーチ又は分子ビーコンプローブ）を用い、プローブが増幅配列に結合した際に発せられる蛍光を検出することにより、増幅生成物を検出した。当該アッセイにより、レジオネラ・ニューモフィラ配列が反応当たり１０−１０Ｍコピーの感度で特異的に増幅及び検出された。
【００７０】
［０００６１］  実施例５：レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的配列の増幅及び検出
［０００６２］  増幅反応中に増幅生成物にハイブリダイズするプローブを用いて、レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的配列の増幅及び検出をリアルタイムで証明した。実質的に米国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１に詳述された単一プライマー型の転写関連増幅法を用い、選択した幾つかの増幅オリゴマーを用いて行うことにより、増幅を実施した。試験した増幅オリゴマーの組合わせには下記のものが含まれた：（１）配列番号８７のプライマーと、配列番号７９のプロモータープロバイダー及び配列番号８５の遮断オリゴマー、又は（２）配列番号８７のプライマーと、配列番号７５のプロモータープロバイダー及び配列番号８４の遮断オリゴマー。レジオネラ・ニューモフィラの標的ＲＮＡ及び増幅試薬を含有する増幅反応物（全容量０．０６０ｍｌ）中で、実質的にＴＭＡ反応に関する記載に従い、プロモータープロバイダーオリゴマー（反応当たり１２ｐｍｏｌ）、プライマーオリゴマー（反応当たり１２ｐｍｏｌ）、及び遮断オリゴマー（反応当たり０．８ｐｍｏｌ）、並びに配列番号８９のヘアピンプローブ（分子トーチ）を用いて各アッセイを実施した。増幅オリゴマー、標的及び増幅試薬を含有する（ただし酵素を含まない）反応混合物を覆って蒸発を防ぎ、９５℃で５分間、次いで４２℃で２分間インキュベートし、次いで酵素（１０μｌ容量）を添加し、反応物を混合し、４２℃で３０分間インキュベートし、酵素添加後の増幅反応に際して３０秒毎に蛍光を測定した。当該試験の結果は、両方の組合わせの増幅オリゴマーとも良好な性能を示し、ヘアピンプローブは増幅開始後、一般に予定した第１５回〜第２５回の間隔で検出可能なシグナルを発することを示した。このアッセイで１００コピー以上の標的核酸が検出された。
【００７１】
［０００６３］  レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的を配列番号８７のプライマーオリゴマー、配列番号７５のプロモータープロバイダーオリゴマー、及び配列番号８４又は８５の遮断オリゴマーの組合わせと共に用いて、同様な試験を実施した。配列番号８８のヘアピンプローブを用いて増幅生成物を検出した。当該試験の結果は、配列番号８８のプローブが１０３コピー以上の標的核酸を検出することを示した。
【００７２】
［０００６４］  当該試験により測定するレジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的のリアルタイム検出に好ましい増幅オリゴマーの組合わせには、配列番号７５、８４及び８７が含まれていた。レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡを増幅及び検出するための好ましい方法は、実質的にレジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡの捕捉について前記に延べたものと同様に実施し、ただし２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に特異的な標的捕捉オリゴマー、例えば配列番号７３を含むオリゴマーを用いる標的捕捉工程をも含む。好ましい方法には、標的特異的配列中に２’メトキシＲＮＡ基を含み、かつ３’テール配列、例えばｄＴ３Ａ３０に共有結合させて合成した、配列番号７３の捕捉プローブを用いる。当該アッセイ法を用いて、０．１ｍｌにつき約６×１０５細胞から得たＲＮＡを試験した場合、レジオネラ・ニューモフィラ血清グループ１〜１４（ＡＴＣＣ寄託番号３３１５２、２２１５４、２２１５５、３３１５６、３３２１５、３３８２３、３５０９６、３５２８９、４３２８３、４３１３０、４３２９０、４３７３６、及び４３７０３）が陽性検出された。しかし、レジオネラ属の１４種（レジオネラ・ニューモフィラ以外の菌種）及びレジオネラ属以外の２８種の細菌から同様な試料を調製して試験した場合、交差反応性はみられなかった。試験したレジオネラ・ニューモフィラ以外の菌種には、レジオネラ・フィーレイ（Ｌ．ｆｅｅｌｅｉ）、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ワズワーシイ、レジオネラ・デュモフィイ、レジオネラ・ハッケリエ、レジオネラ・オークリッジエンシス（Ｌ．ｏａｋｒｉｄｇｅｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・バーミンガメンシス（Ｌ．ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ジャメストウネンシス（Ｌ．ｊａｍｅｓｔｗｎｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ヨルダニス（Ｌ．ｊｏｒｄａｎｉｓ）、レジオネラ・ルブリルセンス、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・パリシエンシス、レジオネラ・ゴルマンディイ（Ｌ．ｇｏｒｍａｎｄｉｉ）及びレジオネラ・ボゼマニイが含まれていた。試験したレジオネラ属以外の細菌には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドベランス（Ｐ．ａｃｉｄｏｖｅｒａｎｓ）、シュードモナス・アルカリゲネス、緑膿菌、シュードモナス・メドシナ（Ｐ．ｍｅｄｏｃｉｎａ）、アシネトバクター・カルコアセチカス、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎杆菌、ミクロコッカス・カタラリス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｅｒｒｈｏｅａｅ）、大腸菌、モラクセラ・オビス（ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｏｖｉｓ）、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌（Ｈ．  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎ���）、ストレプトコッカス・ピロゲネ（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コリネバクテリウム・アクアティクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ゼローシス、及びコリネバクテリウム・ストリアトゥム（Ｃ．ｓｔｒｉａｔｕｍ）が含まれていた。
【配列表】
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【国際調査報告】
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