(57)【要約】  炎症の処置を必要とする対象において炎症を処置する方法が提供される。その方法は、対象に治療有効量のＣＣＬ２を投与し、それによって炎症を処置することを含む。また、炎症の処置のための、ＣＣＬ２を含む医薬組成物および単位投薬形態が提供される。本発明の好ましい実施形態よれば、処置される炎症はアレルギーまたは自己免疫疾患と関連し、このような自己免疫疾患としては、例えば、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症の処置を必要とする対象において炎症を処置する方法であって、対象に治療有効量のＣＣＬ２を投与し、それによって炎症を処置することを含む方法。
【請求項２】
対象はヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療有効量は、キログラム体重／日あたり１ｎｇ〜１μｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療有効量は、ＣＣＬ２の上昇した濃度と関連する望ましくない副作用を避けるように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療有効量は、細胞遊走または細胞ホーミングを阻害するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞はＣＣＲ２発現細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は免疫細胞または癌細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
炎症はＣＣＲ２／ＣＣＬ依存性細胞遊走または細胞ホーミングと関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞遊走または細胞ホーミングは、Ｔ細胞遊走またはＴ細胞ホーミングを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
炎症はアレルギーと関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アレルギーは喘息である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
炎症は自己免疫疾患と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患は慢性関節リウマチである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記自己免疫疾患は大腸炎である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
炎症は、癌、自己免疫、過敏症、糖尿病、感染、関連する移植およびアレルギーからなる群から選択される病状と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
有効成分としてＣＣＬ２を含み、さらに医薬的に許容され得るキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
炎症を処置するために特定された医薬の製造のためのＣＣＬ２の使用。
【請求項１８】
ＣＣＬ２を含む単位投薬形態。
【請求項１９】
１ｎｇ〜２００μｇのＣＣＬ２を含む、請求項１８に記載の単位投薬形態。
【請求項２０】
経口単位投薬形態である、請求項１８に記載の単位投薬形態。
【請求項２１】
注入可能なまたは吸入される単位投薬形態である、請求項１８に記載の単位投薬形態。
【請求項２２】
細胞遊走を調節する方法であって、細胞遊走を阻害するように選択された量のＣＣＬ２を含む培地と細胞を接触させ、それによって細胞遊走を調節することを含む方法。
【請求項２３】
細胞はＣＣＲ２発現細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞は免疫細胞または癌細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地は、細胞遊走促進剤をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＣＬ２を含む医薬組成物、および例えばアレルギーおよび自己免疫疾患に関連する炎症の処置のためにその医薬組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、喘息および自己免疫疾患に関連する炎症の処置に関してより詳細に本明細書において記載されるが、本発明がＣＣＲ２／ＣＣＬ２依存性細胞遊走に関連するいかなる病状の処置にも適用可能であることは理解されるべきである。
【０００３】
異種抗原に対する身体の監視は、免疫系の重要な機能である。抗原認識の重要な部分は、高内皮性小静脈（ＨＥＶ）と呼ばれるリンパ器官の特定の領域に位置する血管の特殊化した内壁を横切る血流からのリンパ節内外へのＢ細胞およびＴ細胞の絶え間ない遊走である。この遊走は、抗原の認識および免疫反応の開始に欠くことができない、抗原と適切なＢ細胞およびＴ細胞との遭遇の確率を高める。リンパ節におけるホーミングおよび細胞遊走の概説については、ｖｏｎ  ＡｄｒｉａｎおよびＭｅｍｐｅｌ［Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３：８６７−８７６（２００３）］を参照のこと。
【０００４】
Ｔ細胞は、膜受容体およびそれらのリガンドを通しての種々の細胞型との細胞／細胞接触相互作用に加えて可溶性媒介物質の生成によって、炎症の開始および持続において重要な役割を果たす。一部のＴ細胞は、ホーミング分子の独特のパターンを示し、別個の標的組織への優先的な動員のために器官特異的細胞と相互作用する。実際、化学誘引物質および細胞活性化物質は特に、炎症を起こした組織への好中球トラフィッキングならびに慢性炎症の中心へのリンパ球ホーミングの原因である。
【０００５】
免疫系の特定の機能不全は、リンパ球および好酸球が肺の気道壁に浸潤するときに生じ、最終的には喘息を引き起こす。この気管支気道の慢性炎症疾患は、気道の閉塞および喘鳴の間欠的な発作によって特徴付けられる。特定の症状としては、変化しやすい気流の閉塞、気道の過応答性（ＡＨＲ）および気道炎症が挙げられる。喘息は機能不全を原因とするが、Ｔリンパ球、特にＴｈ２パターンのサイトカインを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞がこの疾患の病因に顕著な影響を有し、一方Ｔヘルパー１細胞がアレルギー性の気道炎症および粘液生成を調節することが示唆されている［Ｃｏｈｎ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１３０９（１９９９）］。
【０００６】
喘息に対する現在の処置としては、症状の即時軽減をもたらすが疾患を治療しないβ２アドレナリン受容体アゴニストに基づく苦痛軽減の気管支拡張剤、および抗炎症処置に基づく長期の治療が挙げられる。しかしながら、喘息の処置は、大半の場合において生涯続き、多くの医薬または頻繁な医薬の投与を必要とする点で不満足なままである。これは、その不便さまたは医薬の長期使用に関連する副作用の増加のために、対象による処置の放棄または誤用のいずれかをもたらし、しばしば薬物耐性の危険を増大するのみならず患者の生活の質をも危うくする。βアゴニストの長期使用はまた、頻脈（速い心臓の鼓動）、骨格筋の震え、低カリウム血症、乳酸の増加、頭痛、および高血糖症を含む著しい副作用を伴う。
【０００７】
免疫系の他の機能不全は、免疫細胞が身体自身の細胞および組織を攻撃するときに起こり、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えば大腸炎））を生じる。慢性関節リウマチは、関節の慢性的な炎症性の自己免疫疾患である。ＲＡの原因は現在不明であるが、いったん誘発されると、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫応答が滑膜の炎症を引き起こす。ＲＡはまた、皮膚、血管、心臓、肺および筋肉を含む全身の関節以外の組織に影響する全身性疾患でもある。現在、慢性関節リウマチに対して知られている治療法は存在せず、処置の主な目的は、関節の炎症および痛みを低減させること、関節機能を最大化すること、ならびに関節の破壊および変形を予防することである。
【０００８】
ＩＢＤ、主にクローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、胃腸管に影響する自己免疫炎症状態である。ＩＢＤは現在、粘膜のＴリンパ球、特にＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によって引き起こされると考えられている［Ｎｅｕｒａｔｈ，ＡＧＡＨ  ２００３，２：ｏｐ０１９］。ＩＢＤの現在の処置としては、抗炎症剤および免疫抑制剤（ステロイドベースのものを含み、以下にさらに説明される）が挙げられる。しかしながら、これらの処置は満足できないままであり、ＩＢＤは多くの医薬の服用、そして時には頻繁な医薬の服用を必要とする生涯続く疾患のままである。
【０００９】
特に喘息の処置のための、そして一般に自己免疫疾患のための抗炎症剤としては、吸入または経口のいずれかによって摂取され、ともに副作用を伴うステロイドベースの医薬が挙げられる。副作用としては、吸入投薬において、声がしゃがれることおよび喉がヒリヒリすること（通常、菌の感染を伴う）が挙げられ、そして長期の使用または経口投与に伴うより深刻な危険としては、副腎機能および（特に、子供の成長遅延をもたらす）成長ホルモン生成の消失、感染のしやすさの増大、遅い治癒、（脚の腫脹、血圧の上昇、体重の増大、および心臓疾患をもたらす）塩類の鬱滞、震え、眼疾患（特に緑内障および白内障）のかかりやすさの増大、挫傷しやすくなる皮膚の薄化（紫斑病）、骨の細化（骨粗鬆症）などが挙げられる。
【００１０】
ロイコトリエン修飾因子での抗炎症処置は、それが明白な副作用を伴わない点で有利であると考えられたが、これらの薬物の効果は議論の余地がある。ロイコトリエン修飾因子は、喘息および自己免疫状態において典型的に起こり、かつ特定の一部の患者のみに限定されていると考えられる炎症カスケードの特定の部分を遮断する。さらに、他の処置と同様に、これらは予防薬として摂取されることが必要であり、不十分または非効率な自己投与はそれらの効率をさらに低減する。
【００１１】
他の喘息治療は、ヒスタミンの放出を妨げるクロモリンナトリウムおよびネドクロミルナトリウムのようなマスト細胞阻害剤に基づく。しかしながら、これらの薬物は効力が強くなく、重篤な症状または既に現れている症状を軽減せず、一日に４回摂取されることが必要とされ、そして一ヶ月の期間の後にのみ効果が現れ始める。
【００１２】
従って、喘息、慢性関節リウマチおよびＩＢＤは、望ましくない副作用と共に薬物の不都合な使用を伴う生涯続く処置を必要とする慢性疾患のままである。
【００１３】
喘息を含む炎症状態に対する従来の研究は、リンパ節（ＬＮ）または炎症の部位への白血球の動員に焦点を置いていた。しかしながら、これらの部位への細胞のホーミングを消極的に制御するかまたは防止し、それによって特定のリンパ組織および末梢組織で免疫応答の微調整に寄与する分子機構についてはほとんど知られていない。
【００１４】
最近、リンパ節へのＢ細胞のホーミングを消極的に調節する二つの経路が特徴付けられた。未成熟なＢ細胞は、細胞外マトリクスへのＢ細胞自身のインテグリン媒介接着をダウンレギュレートすることができ、それによって非脾臓部位内へのそれらの遊走を抑制することが見出された［Ｆｌａｉｓｈｏｎ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１３８１（２０００）］。この阻害は、二つの独立した経路によって媒介されている。第一の経路は、未成熟なＢ細胞によるＩＦＮ−γの分泌に関係し、それは、その受容体と相互作用し、Ｂ細胞のインテグリン媒介接着および遊走を促進するために必要とされる細胞骨格の再配列の阻害を引き起こす。第二の経路は、ケモカイン受容体、ＣＣＲ２によって調節される。ＣＣＲ２欠損マウスで行われた分析において、ＣＣＲ２がＩＦＮ−γの消極的な調節とは独立してリンパ節への未成熟なＢ細胞のホーミングをダウンレギュレートすることが見出された。これは、ＳＤＦ−１刺激に対する応答としての細胞骨格の再配列および未成熟なＣＣＲ２−／−Ｂ細胞遊走の増大によって、およびＬＮへのＣＣＲ２−／−Ｂ細胞ホーミングの増大によって決定された。ＣＣＲ２は通常、マウスの未成熟なＢ細胞上で発現され、その発現は成熟段階への分化の後にダウンレギュレートされる［Ｆｌａｉｓｈｏｎ，Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０４：９３３．（２００４）］。
【００１５】
ＣＣＬ２（マクロファージ化学走化タンパク質１またはＭＣＰ−Ｉとも呼ばれる）は、炎症時に特に高度に発現され、かつリンパ球化学誘因物質と同様に強力な単球である。ＣＣＬ２は、回転する単球上のＣＣＲ２を活性化し、インテグリン媒介拘束を誘発する。ＣＣＬ２はまた、最も強力なヒスタミン誘導因子のうちの１つである。
【００１６】
ＣＣＬ２／ＣＣＲ２相互作用の研究および医療適用の大半は、癌［例えば、ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：Ｓｉｃａ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）１６４（２）：７３３−８）］、炎症性疾患［例えば、ｈｕｍａｎ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ：Ｓｅｇｅｒｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１１：２２３１−２２４２（２０００）］および自己免疫反応［例えば、ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｒｏｌｅ  ＣＣＬ２  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｐｌａｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｅｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＡＨＲ（ａｉｒｗａｙｓ  ｈｙｐｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：２１６０−２１６７（１９９９）］の処置に対する可能なモダリティーとしてＣＣＬ２／ＣＣＲ２機能をダウンレギュレートすることを提案する。
【００１７】
米国特許出願第２００５０２３２９２３号、同第２００５００５８６３９号、同第２００５００５４６６８号、同第２００４０１３８１７１号、同第２００４００４７８６０号、同第２００２０１０６３５５号および同第２００２００９９０５４号は、ＣＣＬ２／ＣＣＲ２相互作用を拮抗させることによって種々の疾患を処置するために提案された教示の多くの例のうちのごく一部である。ＣＣＬ２／ＣＣＲ２相互作用の拮抗の潜在的な治療価値は、例えば喘息を処置することにおいて利用された。オボアルブミン抗原投与されたマウスにおける中和抗体でのＣＣＬ２の隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）は、気道過敏性および炎症の顕著な減少をもたらした［Ｊｏｓｅ−Ａｎｇｅｌ  Ｇｏｎｚａｌｏ，ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８，１８８，１５７］。別の研究において、ＭＣＰ−１−／−マウスは、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）の虫卵での抗原投与に対する応答の減少を示した［Ｂａｏ  Ｌｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８，１８７，６０１］。
【００１８】
従って、現在まで、ＣＣＬ２の投与による炎症性疾患の処置は一度も提案されてこなかった。
【００１９】
従って、上記の制限が無い、ＣＣＬ２を含む医薬組成物、および炎症を処置するためにそれを使用する方法に対する広く認識された必要性が存在する。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の１つの側面によれば、炎症の処置を必要とする対象において炎症を処置する方法であって、対象に治療有効量のＣＣＬ２を投与し、それによって炎症を処置することを含む方法が提供される。
【００２１】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、対象はヒト対象である。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、治療有効量はキログラム体重／日あたり１ｎｇ〜１μｇである。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、治療有効量はＣＣＬ２の上昇した濃度と関連する望ましくない副作用を避けるように選択される。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、治療有効量は細胞遊走または細胞ホーミングを阻害するように選択される。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞はＣＣＲ２発現細胞である。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞は免疫細胞または癌細胞である。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、炎症はＣＣＲ２／ＣＣＬ２依存性細胞遊走または細胞ホーミングと関連する。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞遊走または細胞ホーミングは、Ｔ細胞遊走またはＴ細胞ホーミングを含む。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、炎症はアレルギーと関連する。
【００３０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、アレルギーは喘息である。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、炎症は自己免疫疾患と関連する。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、自己免疫疾患は慢性関節リウマチである。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、自己免疫疾患は炎症性腸疾患である。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、炎症は、癌、自己免疫、過敏症、糖尿病、感染、関連する移植およびアレルギーからなる群から選択される病状と関連する。
【００３５】
本発明の別の側面によれば、有効成分としてＣＣＬ２を含み、さらに医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００３６】
本発明のさらに別の側面によれば、炎症を処置するために特定された医薬の製造のためのＣＣＬ２の使用が提供される。
【００３７】
本発明のさらに別の側面によれば、ＣＣＬ２を含む単位投薬形態が提供される。
【００３８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、単位投薬形態は１ｎｇ〜２００μｇのＣＣＬ２を含む。
【００３９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、単位投薬形態は経口単位投薬形態である。
【００４０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、単位投薬形態は注入可能な単位投薬形態または吸入される単位投薬形態である。
【００４１】
本発明のさらに別の側面によれば、細胞遊走を調節する方法であって、細胞遊走を阻害するように選択された一定量のＣＣＬ２を含む培地と細胞を接触させ、それによって細胞遊走を調節することを含む方法が提供される。
【００４２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞はＣＣＲ２発現細胞である。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞は免疫細胞または癌細胞である。
【００４４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、培地は細胞遊走促進剤をさらに含む。
【００４５】
本発明は、ＣＣＬ２を含む医薬組成物、およびアレルギーと関連するような炎症を処置するためにそれを使用する方法を提供することによって、現在知られている構成の欠点に対処することに成功している。
【００４６】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４７】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１ａ〜ｂは、ナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞におけるＣＣＲ２の発現を示すＰＣＲ画像である。図１ａは、示されるように、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞から生成されたＣＣＲ２およびコントロール遺伝子（ＨＰＲＴ）の発現を示す。図１ｂは、ナイーブＣＤ４＋細胞およびそこから偏らせられた（ｓｋｅｗｅｄ）Ｔｈ１集団またはＴｈ２集団から生成されたＣＣＲ２の発現を示す。提示された結果は３つの異なる実験を表す。ナイーブＴ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞集団から偏らせられたＴｈ１およびＴｈ２と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞群におけるＣＣＲ２のより高い発現に注目されたい。
【図２】図２ａ〜ｅは、ナイーブＴ細胞の細胞骨格の再配列および遊走に対するＣＣＬ２の阻害効果を示す棒グラフである。図２ａおよび図２ｂは、トランスウェル遊走アッセイの結果を示す。培地またはＣＣＬ２で前処理されたナイーブＴ細胞は、ＣＸＣＬ１２（図２ａ）またはＳＬＣ（ＣＣＬ２１、図２ｂ）の存在下でトランスウェルプレートの上部ウェルに入れられた。３時間後、下部チャンバにおいて見出された遊走細胞の数がＦＡＣＳ分析によって評価された。３つの異なる実験からの結果が、上部チャンバに投入された細胞の数に対する下部チャンバにおける遊走細胞の数である遊走百分率割合で示された。図２ｃ〜ｅは、細胞骨格の再配列に対するＣＣＬ２の影響を示す。ナイーブＴ細胞は、ＣＣＬ２（０．１ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下でＣＸＣＬ１２（図２ｃ）またはＳＬＣ（ＣＣＬ２１、図２ｄ）で刺激された。ナイーブＴ細胞は、Ｒａｎｔｅｓ、Ｍｉｐｌβ、Ｅｏｔｏｘｉｎ、またはＣＸＣＬ１２（０．１ｎｇ／ｍｌ、図２ｅ）の存在下または不在下でＣＣＬ２１（０．４ｍｇ／ｍｌ）で刺激された。その後、細胞は固定および浸透処理され、それらの細胞内ＦアクチンがＦＩＴＣファロイジンで染色された。重合されたアクチンの変化がＦＡＣＳによって分析された。これらの３つの異なる実験からの結果が、ケモカイン刺激から生じるアクチン重合（百分率割合）の増加として示される。
【図３】図３は、ＥＲＫリン酸化のＣＣＬ２阻害を示す図表である。ナイーブＴ細胞は、ＣＣＬ２で３０分間前処理され、次いで、ＣＣＬ２１によって３０秒または６０秒間刺激され、細胞は洗浄され、溶解され、そして（実施例１に詳述されるように）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。タンパク質は、ニトリセルロース膜に電気移動され、抗リン−ＥＲＫと反応されられた後に、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウスと反応させられるか、またはポリクローナル抗チューブリンと反応されられた後に、ペルオキシダーゼ抗ウサギと反応されられた。
【図４】図４ａ〜ｂは、ＬＮへのナイーブＴ細胞のホーミングを示す棒グラフである。ＣＣＬ２有りまたはＣＣＬ２無しでインキュベートされ、蛍光色素ＣＦＤＡ−ＳＥで標識された等量のＴ細胞が、マウスに注射された。３時間後、末梢リンパ節（ＰＬＮ、図４ａ）または脾臓（図４ｂ）が回収され、ＦＩＴＣ陽性集団がＦＡＣＳによって分析された。提示された結果は４つの異なる実験の代表値である。
【図５】図５ａ〜ｇは、ＣＣＬ２によるマウスＰＬＮにおけるＨＥＶ壁に対するインテグリンが媒介するリンパ球の強固な接着の阻害を示す図表である。図５ａは、低倍率（５倍）での生体内顕微鏡写真およびその代表的な腸骨下部ＬＮのスケッチである。ＬＮ静脈血は、ＬＯＶ（序列Ｉ、ＩＩの小静脈、および序列ＩＩＩの小静脈のいくつか）およびＨＥＶ（序列ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶの小静脈）を介して浅腹壁静脈のリンパ外側枝内に流れ出る。図５ｂは、腸骨下部ＬＮの小静脈ツリー（ｖｅｎｕｌａｒ  ｔｒｅｅ）におけるカルセイン標識ナイーブコントロールまたはＣＣＬ２処理リンパ球の回転画分を示し、図５ｃ〜ｅはそれらの固着画分を示す。リンパ球は、ＣＣＬ２（１ｎｇ／ｍｌ、３０秒間）で前処理されたか、または未処理のままであり、そして大腿動脈に注射された。回転画分は、１００×回転細胞の数／固着細胞の数によって計算される。固着画分は、１００×（１０秒以上、３０秒以上または１分以上）拘束された細胞の数／回転細胞の数によって計算される。データは、マウス（ｎ＝３匹の動物が分析された）あたり３〜５個の小静脈の平均±ＳＥＭである。図５ｆ〜ｇは、ＰＬＮ小静脈ツリーにおいて拘束されたリンパ球の生体内顕微鏡写真（１０倍）を示す。ＰＬＮ小静脈におけるＣＣＬ２処理リンパ球（図５ｆ）またはコントロールリンパ球（図５ｇ）の蓄積は、蛍光的に標識された細胞の静脈注射の３０分後に分析された。
【図６】図６ａ〜ｄは、低用量ＣＣＬ２がどのようにしてＣＣＬ２１によるＬＦＡ−１またはＶＬＡ−４の急速な活性化を妨げずに拘束後の接着強化を損なうかを示すグラフである。図６ａおよび６ｃは、各々単独でコーティングされたか、あるいは０．５ｄｙｎ／ｃｍ２および０．７５ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力でそれぞれ熱不活性ＣＣＬ２１または機能的ＣＣＬ２１で共固定された、ＩＣＡＭ−１（図６ａ）またはＶＣＡＭ−１（図６ｃ）と相互作用する（インタクトのまたはＣＣＬ２前処理された）ヒトＴ細胞間の接着係留（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｔｅｔｈｅｒ）の頻度および強度を示す。図６ｂおよび６ｄは、２分間蓄積された（インタクトのまたはＣＣＬ２前処理された）ヒトＴ細胞を示し、示された時点について、高い剪断応力（５ｄｙｎ／ｃｍ２）の継続的な適用によるそれらの接着持続性（分離に耐える能力）が評価された。ＩＣＡＭ−１（図６ｂ）またはＶＣＡＭ−１（図６ｄ）の結果は、低い剪断流（ｓｈｅａｒ  ｆｌｏｗ）で最初に蓄積された細胞の％として示される。
【図７】図７ａ〜ｅは、エフェクターＴ細胞上でのＣＣＲ２発現および生体外でのエフェクターＴ細胞遊走のＣＣＬ２阻害を示す図表である。図７ａは、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞集団を示す。ＲＮＡが単離され、ＣＣＬ２、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３またはＨＰＲＴのｍＲＮＡレベルが分析された。図７ｂ〜ｃは、ＣＣＬ２１（０．４ｍｇ／ｍｌ、図７ｂ）またはＣＸＣＬ１２（０．１ｎｇ／ｍｌ、図７ｃ）で、ＣＣＬ２（０．１ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で１５秒間刺激され、固定および浸透処理され、そしてそれらの細胞内ＦアクチンがＦＩＴＣファロイジンで染色された、エフェクター（Ｔｈ１）細胞を示す。重合されたアクチンの変化がＦＡＣＳによって分析された。アクチン重合の百分率割合の増加は、［ケモカイン刺激の存在下でのアクチン重合−ケモカイン無しのアクチン重合］／ケモカイン無しのアクチン重合として計算された。図７ｄ〜ｅは、ＣＸＣＬ１２（０．１ｍｇ／ｍｌ、図７ｄ）またはＣＣＬ２１（０．４ｍｇ／ｍｌ、図７ｅ）で、ＣＣＬ２（０．１ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で１５秒間刺激され、固定および浸透処理され、そしてそれらの細胞内ＦアクチンがＦＩＴＣファロイジンで染色された、エフェクター（Ｔｈ２）細胞を示す。重合されたアクチンの変化がＦＡＣＳによって分析された。アクチン重合の百分率割合の増加は、［ケモカイン刺激の存在下でのアクチン重合−ケモカイン無しのアクチン重合］／ケモカイン無しのアクチン重合として計算された。提示される結果は３つの異なる実験の代表値である。
【図８】図８ａ〜ｅは、マウス喘息モデルにおけるＣＣＬ２によるアレルギー応答の阻害を示す図表である。図８ａは、１５日目の気道応答性について分析されたコントロールマウス（ＰＢＳ処置）、ＯＶＡ抗原刺激マウス（ＯＶＡ）およびＣＣＬ２（６０ｎｇ）を腹腔内注射されたＯＶＡ抗原刺激マウスを示す。示される値はΔＰｅｎｎを表し、それは後期抗原投与または初期抗原投与の後のＰｅｎｎ測定値から抗原投与前のＰｅｎｎ測定値を引くことによって計算された。ベース線のＰｅｎｎレベルは、ＰＢＳ処置コントロールマウス、ＯＶＡ抗原刺激マウス、およびＣＣＬ２で処置されたＯＶＡ抗原刺激マウス間で同等であった。結果は、処置あたり９匹の動物の平均を表す。図８ｂ〜ｄは、ＣＣＬ２処置マウスの肺の組織構造を示す。コントロール（ＰＢＳ、図８ｂ）、ＯＶＡ抗原刺激（ＯＶＡ、図８ｃ）およびＣＣＬ２で処置されたＯＶＡ抗原刺激（ＣＣＬ２、図８ｄ）の組織学的特徴が示される。主に好酸球およびリンパ球からなる多形性の気管支周囲および血管周囲の浸潤物が、ＯＶＡ抗原刺激マウス（図８ｃ）由来の肺組織においてのみ見られ、ＰＢＳ抗原刺激またはＣＣＬ２処置マウスにおいては見られないことに注目されたい。図８ｅは、コントロール（ＰＢＳ処置）マウス、ＯＶＡ抗原刺激（ＯＶＡ）マウスおよびＯＶＡ抗原刺激かつＣＣＬ２注射された（ＣＣＬ２）マウスにおける、病理学者によって１〜４の炎症スコアが与えられた気管支周囲および血管周囲の炎症性浸潤物を示す。グラフは、９匹の動物のスコアを表す。
【図９】図９は、ラットモデルにおけるＣＣＬ２によるアジュバント関節炎（ＡＡ）の阻害を示すグラフである。ＡＡは実施例６において記載されるようにラットにおいて誘発され、低用量ＣＣＬ２またはＰＢＳでの処置によって分類された。関節の炎症、赤み、および変形の度合いに基づいて、０〜４の相対的スコアが各肢に与えられた；従って、個々の動物に対して最大の考えられうるスコアは１６であった。グラフは、１日おきに測定された９匹の動物の疾患スコアを表す。
【図１０】図１０は、マウスモデルにおけるＣＣＬ２によるＴＮＢＳ大腸炎の阻害を示すグラフである。ＴＮＢＳ大腸炎は、実施例６において記載されるようにマウスにおいて誘発され、以下のように投薬法によって分類された：０日目（ＴＮＢＳ誘発直後）〜６日目までの異なるＣＣＬ２濃度（３０ｎｇ、６０ｎｇまたは１８０ｎｇ）での毎日の腹腔内注射。コントロール群は、ＰＢＳのみで、またはデキサメタゾン（Ｄｅｘａ）で毎日腹腔内注射され、あるいは未処置のままの負のコントロールであった。大腸は、Ｗａｌｌａｃｅ基準に従って（充血、腸管の肥厚および潰瘍形成の範囲のような炎症を反映する基準に基づいて０〜１６の点数で）病変について顕微鏡的に評価された。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、ＣＣＬ２を含む医薬組成物、およびアレルギーに関連するような炎症の処置のためにそれを使用する方法の発明である。
【００５０】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００５１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００５２】
単球化学誘因タンパク質（ＭＣＰ−１）とも呼ばれるＣＣＬ２は、単球および記憶Ｔ細胞を特異的に誘引することがよく知られている。その発現は、細胞遊走によって特徴付けられる種々の疾患において起こり、炎症性疾患におけるその本質的な役割についての実質的な生物学的証拠および遺伝学的証拠が存在する。多くの研究は、炎症性疾患（例えば、アレルギーおよび癌。背景技術の節を参照のこと）の処置のためにＣＣＬ２／ＣＣＲ２を拮抗させることを提案する。
【００５３】
しかしながら、現在まで、炎症の処置のためにＣＣＬ２を使用することが提案されたことは一度も無かった。
【００５４】
本発明を実施に移す際に、本発明者らは驚くべきことに、（ＣＣＬ２の阻害よりもむしろ）ＣＣＬ２の低用量の投与がＴ細胞遊走を効果的に低減するために使用されることができ、従って炎症の処置のために使用されることができることを発見した。
【００５５】
本明細書中下記においておよび以下の実施例の節において示されるように、本発明者らは、低レベルのＣＣＬ２が、生体外でナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の細胞骨格の再配列および遊走を特異的にダウンレギュレートすること（実施例１および５）、そして生体内でリンパ節へのＴ細胞ホーミングを阻害すること（実施例２）を示した。さらに、ＣＣＬ２処置は、Ｔ細胞を、ＶＣＡＭ−１に対するＣＣＬ２１誘発ＶＬＡ−４依存性接着の強化に欠けるものにする（実施例３）。特に、ＣＣＬ２前処理は、回転、およびインテグリンを媒介とする拘束の最も初期の事象に影響せず、むしろマウス末梢リンパ節におけるインテグリン依存性リンパ球のＨＥＶ壁に対する強固な接着およびＨＥＶ壁を横切る管外遊出を阻害する後期の段階に影響を及ぼした（実施例３）。その結果はさらに、ＣＣＬ２での前処理が、Ｔ細胞の接着の強化を発現できなくし、従って、Ｔ細胞が高剪断応力に連続的さらされたときにそれらのインテグリンリガンドから容易に分離されることを示した（実施例４）。生体内モデルは、ＣＣＬ２が、喘息、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患（大腸炎、実施例６）において劇的な抗炎症効果を有することを示した。
【００５６】
これらの結果は、炎症の処置のためのＣＣＬ２ポリペプチドの使用を初めて支持する。
【００５７】
従って、本発明の１つの側面によれば、炎症の処置を必要とする対象において炎症を処置する方法が提供される。その方法は、治療有効量のＣＣＬ２ポリペプチドを対象に投与し、それによって炎症を処置することを含む。
【００５８】
本明細書中において使用される用語「必要とする対象」は、本発明の処置モダリティーの恩恵を受けることができる哺乳動物、特にヒト対象を示す。好ましくは、対象は炎症と関連しない病状に罹患していない。
【００５９】
本明細書中で使用される用語「処置する」は、炎症の有害な影響を防止し、治療し、逆転させ、弱め、緩和し、最小限にし、抑制し、または、停止させることを示す。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「炎症」は、ＣＣＲ２を発現する細胞の遊走が炎症の開始または進行に寄与する炎症性応答を含むいかなる病状をも示す。好ましくは、炎症はアレルギー、喘息、ＩＢＤ（例えば、大腸炎）または慢性関節リウマチと関連する。
【００６１】
炎症性応答を含む多くの疾患および状態が、本明細書中上記に記載される方法論を使用して処置されることができる。このような疾患および状態の例が下に要約される。
【００６２】
炎症性疾患−この疾患としては、慢性の炎症性疾患および急性の炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
過敏症に関連する炎症性疾患
過敏症の例としては、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時過敏症、抗体媒介過敏症、免疫複合体媒介過敏症、Ｔリンパ球媒介過敏症およびＤＴＨが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
Ｉ型過敏症または即時過敏症、例えば、喘息など。
【００６５】
ＩＩ型過敏症としては、リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、慢性関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；１５（３）：７９１）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００１；３（３）：１８９）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１７（１−２）：４９）、硬化症、全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｍａｒ；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ  ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９９  Ｊｕｎ；１６９：１０７）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓の自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  １９９６  Ｏｃｔ；３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０００  Ｊｕｎ；２９（２）：３３９）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．およびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ  １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、自己免疫性生殖疾患、卵巣疾患、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  Ｊａｎ  １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．およびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１８（１−２）：８３）、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｍａｙ；７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症疾患、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症、腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症���Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００  Ｊａｎ；１５６（１）：２３）、神経障害、異常免疫性神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １９９９；５０：４１９）；ニューロミオトニー、後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９８  Ｍａｙ  １３；８４１：４８２）、心臓血管疾患、心臓血管の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）、肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ａｕｇ  ２５；１１２（１５−１６）：６６０）；抗第ＶＩＩＩ因子の自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）；血管炎、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００  Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）；抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９；１４（４）：１７１）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アドレナリン作動性受容体抗体（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９  Ｊｕｎ  １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ．１９９９  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９９８  Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００  Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ  ２０００  Ｊａｎ  １６；１３８（２）：１２２）、筋組織の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．ら、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）；平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  １９９９  Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；３３（２）：３２６）および原発性胆汁性肝硬変（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９  Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）��挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
ＩＶ型過敏症またはＴ細胞媒介過敏症としては、リウマチ様疾患、慢性関節リウマチ（Ｔｉｓｃｈ  Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：４３７）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｄａｔｔａ  ＳＫ．、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７（９）：５９１）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｓａｋａｔａ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３  Ｍａｒ；９２（１）：７７）、卵巣疾患（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９７  Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）、多腺性症候群、自己免疫性多腺性症候群、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９９１  Ｍａｒ  １；７７（５）：１１２７）、神経学的疾患、自己免疫性神経学的疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９４  Ｍａｙ；５７（５）：５４４）、重症筋無力症（Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０  Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、スティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：３９８８）、心臓血管疾患、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １５；９８（８）：１７０９）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １９９６  Ｍａｙ  １５；８７（１０）：４２４５）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１１（１）：９）、溶血性貧血（Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．ら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９７  Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、肝炎、慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９０  Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６  Ｎｏｖ；９１（５）：５５１）、腎疾患、腎臓の自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９０  Ａｕｇ；１（２）：１４０）、結合組織疾患、耳疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４  Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、内耳の疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７  Ｄｅｃ  ２９；８３０：２６６）、皮膚疾患、皮膚病、真皮の疾患、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
遅発型過敏症の例としては、接触性皮膚炎および薬疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
Ｔリンパ球媒介過敏症型の例としては、ヘルパーＴリンパ球および細胞障害性Ｔリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
ヘルパーＴリンパ球媒介過敏症の例としては、Ｔｈ１リンパ球媒介過敏症およびＴｈ２リンパ球媒介過敏症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
自己免疫疾患
自己免疫疾患としては、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
自己免疫性による心臓血管疾患の例としては、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ａｕｇ  ２５；１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子による自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００  Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘導の心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ  １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ．１９９９  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １９９６  Ｍａｙ  １５；８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９９８  Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．ら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９７  Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １５；９８（８）：１７０９）、および、抗ヘルパーＴリンパ球による自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８；１１（１）：９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
自己免疫によるリウマチ様疾患の例としては、慢性関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ  Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：４３７）および強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００１；３（３）：１８９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
自己免疫による腺疾患の例としては、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴス病、甲状腺炎、突発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣の自己免疫性、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が挙げられるが、これらに限定されない。疾患としては、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  １９９６  Ｏｃｔ；３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０００  Ｊｕｎ；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３  Ｍａｒ；９２（１）：７７）、突発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．およびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ  １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）およびＩ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１９９１  Ｍａｒ  １；７７（５）：１１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
自己免疫による胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００  Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ  ２０００  Ｊａｎ  １６；１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
自己免疫による皮膚疾患の例としては、自己免疫による水疱性の皮膚疾患（例えば、尋常性天疱瘡、水疱性天疱瘡および落葉状天疱瘡など、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
自己免疫による肝疾患の例としては、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９０  Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）  １９９６  Ｎｏｖ；９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；３３（２）：３２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
自己免疫による神経学的疾患の例としては、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  Ｊａｎ  １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．およびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０  Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｍａｙ；７（３）：１９１）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）；腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性の小脳萎縮症およびスティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ  ２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：３９８８）；腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００  Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；異常免疫による神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １９９９；５０：４１９）；後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９８  Ｍａｙ  １３；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９４  Ｍａｙ；５７（５）：５４４）および神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
自己免疫による筋疾患の例としては、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．ら、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）、および、平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  １９９９  Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
自己免疫による腎疾患の例としては、腎炎、および、自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９０  Ａｕｇ；１（２）：１４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）が挙げられるが、これに限定されない。
【００８１】
自己免疫による結合組織疾患の例としては、耳の疾患、自己免疫による耳の疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４  Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、および、内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７  Ｄｅｃ  ２９；８３０：２６６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
自己免疫全身性疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｍａｒ；６（２）：１５６；Ｃｈａｎ  ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９９  Ｊｕｎ；１６９：１０７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
感染性疾患
感染性疾患の例としては、慢性の感染性疾患、亜急性の感染性疾患、急性の感染性疾患、ウイルス疾患、細菌疾患、原虫疾患、寄生虫疾患、真菌疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
移植片拒絶疾患
移植片の移植に関連する疾患の例としては、移植片拒絶、慢性の移植片拒絶、亜急性の移植片拒絶、超急性の移植片拒絶、急性の移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
アレルギー性疾患
アレルギー性疾患の例としては、喘息、皮疹、じんま疹、花粉アレルギー、ほこり・ダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー、動物鱗屑アレルギー、刺毛植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
癌性疾患
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。癌性疾患の具体的な例としては、骨髄性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、成熟に伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、増大した好塩基球を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球性白血球、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病など；悪性リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など；リンパ性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病など；骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、慢性腺腫など；腺癌、例えば、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、肉腫、脂肪肉腫、粘液様肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング肉腫などが挙げられ、他の癌には、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、中皮腫、乳癌、皮膚癌、前立腺癌および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書中上記で述べたように、本発明のこの側面の方法は、治療有効量のＣＣＬ２を対象に投与し、それによって炎症を処置することによって行われる。
【００８８】
本明細書中に使用される用語「ＣＣＬ２」は、哺乳動物（例えば、ヒト）ＣＣＬ２タンパク質（ポリぺプチドと交換可能に用いられる）、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２９８２またはＮＰ＿００２９７３に記載されるようなＣＣＬ２タンパク質の模倣物を示す。ＣＣＬ２は、組換えＤＮＡ技術または固相技術を用いて合成されることができる。ＣＣＬ２はまた、市販されている（例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）。本発明のＣＣＬ２は臨床適用のために使用されるので、それは、好ましくは滅菌されているか、または有りうる汚染因子を除去される（例えば、細菌がフィルターによって除去される）ことができる。
【００８９】
本発明のＣＣＬ２は、それ自体で、または、ＣＣＬ２が好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物において対象に投与されることができる。
【００９０】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分（ＣＣＬ２）の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００９１】
本明細書中で使用される用語「有効成分」は、意図される生物学的効果を担うＣＣＬ２を示す。
【００９２】
以降、交換可能に使用されることができる表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、しかも投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【００９３】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００９４】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に完全に組み込まれる。
【００９５】
好適な投与経路としては、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が挙げられることができる。
【００９６】
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
【００９７】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【００９８】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【００９９】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１００】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０１０１】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１０２】
経口使用され得る医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１０３】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１０４】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１０５】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１０６】
非経口投与される医薬組成物としては、水溶性形態の活性調製物の水溶液が挙げられる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１０７】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１０９】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物としては、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が挙げられる。より具体的には、「治療有効量」は、治療されている対象の疾患の症状（例えば、アレルギー）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、治療されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（例えば、ＣＣＬ２）の量を意味する。本発明のＣＣＬ２の治療有効量は、ＣＣＲ２依存性の細胞遊走または細胞ホーミングを少なくとも部分的に阻害するように選択される。
【０１１０】
治療有効量の決定は、特に、本明細書中に与えられる詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１１】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイおよび細胞培養アッセイ（例えば、本明細書中以下にさらに記載されるような遊走アッセイ）から最初に推定されることができる。例えば、投与量は、望ましい濃度または力価を達成するために動物モデル（以下の実施例の節において示されるような動物モデル。アレルギーの他のモデルとしては、例えば、化合物４８／８０によって誘発される結膜炎および皮膚アレルギーが挙げられる。ＰＣＴ  ＷＯ  ００／７８３４６を参照のこと）において決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１１２】
薬物および栄養補助食品を製造するための１ｋｇあたりの質量での投与量の計算は、ＦＤＡによって公開されるような、体表面積に基づく動物投与量のヒト等価投与量（ＨＥＤ）への変換に基づいて行われることができる［Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ，ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｆｅ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ；ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｂｅｒ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｈｔｍ］。下記の表１を参照のこと。
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【０１１３】
従って、上記表１によれば、マウスに与えられた有効投与量は、実施例の節の実施例２において記載されるように１日あたり６０ｎｇのＣＣＬ２であった。従って、本発明の有効投与量は、（マウス重量：２５グラムに対して）２．４μｇ  ＣＣＬ２／Ｋｇ体重であった。従って、マウス体重が１１〜３４グラムの範囲であることを考慮し、かつ標準のヒト重量が７０ｋｇであると仮定されることを考慮すると、ＨＥＤは、マウスに与えられた投与量に０．０８１を掛け算することによって達成され、０．２μｇ／Ｋｇ体重となる。従って、標準的なヒト重量は５０〜１００Ｋｇの範囲であるので、与えられるであろう投与量は１日あたり１０〜２０μｇのＣＣＬ２である。標準範囲外の重量については、ＨＥＤは、式：ＨＥＤ＝（動物投与量（ｍｇ／Ｋｇ））×［（動物重量（Ｋｇ））／（ヒト重量（Ｋｇ）］０．３３によって計算されることができる。
【０１１４】
あるいは、計算は血液量に関して行われることもでき［Ｂｕｓｓｉ  ＳおよびＭｏｒｉｓｅｔｔｉ  Ａ．、Ｓａｆｅｔｙ  ｍａｒｇｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔｓ  Ａｒｈ  Ｈｉｇ  Ｒａｄａ  Ｔｏｋｓｉｋｏｌ  ５６：１５７−１６０，（２００５）を参照のこと］、その場合、平均的なマウス血液量は２〜４ｍｌであり、平均的なヒト血液量は５Ｌである。本発明においてマウスに与えられた有効投与量は６０ｎｇ／２〜５ｍｌ＝１５〜３０μｇ／Ｌ血液量であるので、ヒトに投与される有効ＣＣＬ２投与量は、１日あたり７５〜１５０μｇになるであろう。子供および動物に対する投与量は、それに応じて計算されることができる［Ｂｕｓｓｉ  ＳおよびＭｏｒｉｓｅｔｔｉ  Ａ．、Ｓａｆｅｔｙ  ｍａｒｇｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔｓ  Ａｒｈ  Ｈｉｇ  Ｒａｄａ  Ｔｏｋｓｉｋｏｌ  ２００５；５６：１５７−１６０，２００４］。
【０１１５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、生体外での標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外での細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ，Ｅ．ら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ｐ．１参照のこと）。
【０１１６】
投薬量および投薬間隔は、生物学的効果を誘発または抑制するのに十分な有効成分の血漿レベルまたは脳レベル（すなわち、最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節されることができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、生体外でのデータから推定されることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体の特性および投与経路に依存する。検出アッセイは、血漿濃度を測定するために使用されることができる。
【０１１７】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１１８】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている患者、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１１９】
本発明によれば、ＣＣＬ２は、本発明に従って炎症を処置するために、１日につき体重１ｋｇあたり、約１ｎｇ〜１００μｇ、約１０ｎｇ〜１００μｇ、約１００ｎｇ〜１００μｇ、約１００ｎｇ〜３００ｎｇ、約１μｇ〜１００μｇ、約１ｎｇ〜５０ｎｇ、約１ｎｇ〜２００ｎｇ、約１ｎｇ〜３００ｎｇ、約１ｎｇ〜５００ｎｇまたは約１ｎｇ〜１μｇのレベルで投与されるが、これらに限定されない。
【０１２０】
上記にかかわらず、ＣＣＬ２は、ＣＣＬ２の上昇した濃度に関連する望ましくない副作用（例えば、免疫応答のアップレギュレート）を避けるように選択された量で投与される。
【０１２１】
本発明のＣＣＬ２は、例えば経口投与または直腸投与のための、あるいは注射のための投薬単位において配合されることができる。このような投薬単位は、例えば、１日につき体重１ｋｇあたり、約１ｎｇ〜１００μｇ、約１ｎｇ〜２００μｇ、約１０ｎｇ〜１００μｇ、約１００ｎｇ〜１００μｇ、約１００ｎｇ〜３００ｎｇ、約１μｇ〜１００μｇ、約１ｎｇ〜５０ｎｇ、約１ｎｇ〜２００ｎｇ、約１ｎｇ〜３００ｎｇ、約１ｎｇ〜５００ｎｇまたは約１ｎｇ〜１μｇのＣＣＬ２を含むことができる。
【０１２２】
本発明の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。医薬的に許容され得るキャリア中に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記にさらに詳述されるように、調製され、適切な容器に入れられ、示される状態の処置についてラベル書きされることができる。
【０１２３】
本発明の知見は、遊走調節因子を同定するためおよび細胞型（攻撃性／侵襲性）を分析するために利用されるような、種々の培養物アッセイにおいて使用されることができる重要な抗遊走因子としてＣＣＬ２を位置づける。
【０１２４】
従って、本発明の別の側面によれば、細胞遊走を調節する方法が提供される。その方法は、細胞遊走を阻害するように選択された一定量のＣＣＬ２を含む培地と細胞を接触させ、それによって細胞遊走を調節することによって行われる。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、細胞は、ＣＣＲ２を発現するいかなる細胞をも示す（例えば、癌細胞、Ｔ細胞のような免疫細胞）。
【０１２６】
本発明のこの側面の方法は、以下の実施例の節において記載されるような、好ましくは高スループット分析のために小型化された、遊走チャンバにおいて実行されることができる。細胞は、自動検出（ＣＣＤカメラ）に適合することができる顕微鏡によって視覚化されることができる。
【０１２７】
ＣＣＬ２は、細胞増殖に好適な培地中に入れられることができる。
【０１２８】
遊走促進因子は、同じチャンバか、または並列チャンバに入れられることができ、コントロールとして役立つことができる（例えば、ＳＤＦ）。
【０１２９】
従って、本発明は、細胞遊走をダウンレギュレートするための新規なツールであるＣＣＬ２を初めて提供する。本明細書中において効果的に示されるように、ＣＣＬ２は、アレルギーと関連するような炎症を阻害するために使用されることができる。
【０１３０】
本明細書中において使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１３１】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１３２】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１３３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験手順には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎ��  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１３４】
実施例１
低レベルのＣＣＬ２は、生体外でのナイーブＴ細胞の細胞骨格の再配列および遊走をダウンレギュレートする
Ｔ細胞のインテグリン媒介接着および遊走におけるＣＣＲ２／ＣＣＬ２相互作用の役割、および、それらが生体内でのリンパ節（ＬＮ）および炎症部位へのＴ細胞のホーミングを調節できるかどうかを決定するために、Ｔ細胞におけるＣＣＲ２の発現がＰＣＲによって測定された。Ｔ細胞の遊走および細胞骨格の再配列に対するＣＣＬ２の効果は、トランスウェル遊走アッセイおよびアクチン重合アッセイによって測定された。
【０１３５】
材料および実験手順
動物−６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｌｂ／ｃマウスが使用された。動物に対する全ての処置は、イスラエル、レホヴォトのＷｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅにおけるＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認証された。
【０１３６】
Ｔ細胞ソーティング−既に記載されるようにして［Ｓｈａｃｈａｒ  Ｉ．およびＦｌａｖｅｌｌ  Ｒ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１０６（１９９６）］、脾臓および脾臓細胞がマウスから得られた。Ｔ細胞は、製造元のプロトコルに従って、ＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して富化された。脾臓細胞は、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）と共にインキュベートされ、ＣＤ４５陰性細胞が回収された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して精製された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して富化された。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を得るために、Ｔ細胞富化集団は、上清からのＴｈ１細胞の回収のためにコンカナバリンＡ（２５０μｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，スイス）およびＩＬ−１２（３．５ｎｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）と共に９６時間インキュベートされるか、または、上清からのＴｈ２細胞の回収のためにＩＬ−４（１０３ユニット／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）と共にインキュベートされた。
【０１３７】
ＲＮＡの単離および逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）−全ＲＮＡは、Ｔｒｉ試薬キット（ＭＲＣ）を使用して細胞から単離された。逆転写は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して行われた。異なるＴ細胞集団においてＣＣＲ２の発現を検出するために、ＰＣＲは、ＣＤ８＋、ナイーブＣＤ４＋、あるいはＣＤ４＋細胞のＴｈ１またはＴｈ２集団からのｃＤＮＡテンプレート上で、ＣＣＲ２に特異的なプライマー（順方向プライマー−５’−ＡＴＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣ−３’、配列番号１；逆方向プライマー−５’−ＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＴ−３’、配列番号２）および陽性コントロールとしてヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に特異的なプライマー（順方向プライマー−５’−ＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＧＧＣＴ−３’、配列番号３；逆方向プライマー−５’−ＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧ−３’、配列番号４）を使用して実施された。
【０１３８】
Ｔ細胞の刺激−既に記載されるようにして［Ｆｌａｉｓｈｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：４６７０１−４６７０６］、細胞刺激を行った。簡潔に言うと、１×１０７個のＴ細胞が、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する１ｍｌのＤＭＥＭ細胞培地に懸濁された。次に、０．１ｎｇ／ｍｌのＣＣＬ２（ＣｙｔｏＬａｂ）が各チューブに添加され、チューブはすぐに３７℃に３０分間置かれた。刺激の直後に、細胞は、洗浄され、本明細書中下記に記載されるように取り扱われた。
【０１３９】
細胞抽出物の調製−刺激された細胞は、プロテアーゼ阻害剤（１０ｍｇ／ｍｌ  ロイペプチン；１０ｍｇ／ｍｌ  アプロチニン；１０ｍｇ／ｍｌ  ペプスタチン；１０ｍｇ／ｍｌ  キモスタチン（Ｒｏｃｈｅ）；１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）；および２０ｍＭ  Ｎ−エチルメラミド（Ｎ−ｅｔｈｅｙｌ−ｍｅｌａｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ））の存在下で、２５ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）；２ｍＭ  バナジウム酸塩；７５ｍＭ  糖リン酸（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ７．２）；２ｍＭ  ＥＤＴＡ；２ｍＭ  ＥＧＴＡ；１０ｍＭ  ＮａＰＰｉ；および０．５％  ＮＰ−４０を含有する溶解緩衝液中に溶解された。
【０１４０】
ＥＲＫ検出−細胞溶解物は、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された。タンパク質はニトロセルロース膜に電気移動され、抗リン特異的細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）１または２（イスラエル、レホヴォト、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲｏｎｙ  Ｓｅｇｅｒ博士より寄贈）と反応させた後に、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）と反応させられるか、またはポリクローナル抗チューブリンと反応させた後に、ペルオキシダーゼ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）と反応させられた。
【０１４１】
トランスウェル遊走アッセイ−走化性は、既に記載されているような［Ｆｌａｉｓｈｏｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６７０１（２００１）］トランスウェルチャンバを使用してアッセイされた。ナイーブＴ細胞は、ＣＣＬ２（０．１ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の有りまたは無しでＲＰＭＩ培地で３０分間懸濁され、その後２４ウェルのトランスウェルプレートの上部チャンバに入れられ、下部チャンバに入れられたＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）または二次リンパ系組織ケモカイン（ＳＬＣ，ＣＣＬ２１，０．４ｍｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の方へと遊走させられた。３時間後に、下部チャンバにおいて見出された遊走細胞の数が、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ）によって評価された。アッセイは３回繰り返され、結果は上部チャンバに投入された細胞の数に対する下部チャンバにおける遊走細胞の数である遊走百分率割合として分析された。
【０１４２】
細胞骨格の再配列−Ｔ細胞は、ＣＣＬ２（０．１ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で３０分間予備インキュベートされ、次いで、ＣＸＣＬ１２（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ  ＮＪ）、ＳＬＣ（ＣＣＬ２１，０．４ｍｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、Ｒａｎｔｅｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＭＩＰ−ｌβ（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、またはＥｏｔｏｘｉｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のいずれかで１５秒間刺激された。次いで、細胞は、既に記載されるようにして［Ｆｌａｉｓｈｏｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６７０１（２００１）］、パラホルムアルデヒドで直ちに固定され、浸透処理され、それらの細胞内Ｆ−アクチンがＦＩＴＣファロイジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色され、次いで、それらの細胞骨格の状態を決定するためにフローサイトメトリーによって分析された。
【０１４３】
結果
ＣＣＲ２は、ナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞上で発現される−Ｔ細胞亜集団におけるＣＣＲ２転写の分析が行われた。結果は、ＣＣＲ２のｍＲＮＡがナイーブＴ細胞において現れ、その発現がＣＤ８＋Ｔ細胞集団に比べてＣＤ４＋Ｔ細胞集団において劇的に高かったことを示す（図１ａ）。Ｔｈ１またはＴｈ２集団のいずれかへと偏らせられたＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＣＲ２転写を示したが、低いレベルであった（図１ｂ）。そのことは、エフェクターＴ細胞が、より低いレベルのＣＣＲ２を発現することを示唆する。
【０１４４】
ＣＣＬ２は、生体外でのナイーブＴ細胞の遊走を阻害する−ＣＣＬ２がＴ細胞のホーミングを調節しているかどうか決定するために、Ｔ細胞遊走に対するＣＣＬ２の阻害効果が、ケモカインであるＣＸＣＬ１２またはＳＬＣに対するナイーブＴ細胞の遊走応答のトランスウェルアッセイ分析によって試験された。二次リンパ系組織ケモカイン（ＳＬＣ、ＣＣＬ２１）は、ＬＮにおいて高内皮性小静脈（ＨＥＶ）によって高レベルで発現され、ＬＮへのＴ細胞の動員において機能する［Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：２０９８．（１９９９）］。ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）は、種々の細胞および組織によって構成的に発現され、Ｔ細胞に対する高効率かつ強力な化学誘引物質として役立つ。結果は、低レベルのＣＣＬ２がＣＸＣＬ１２（図２ａ）およびＣＣＬ２１（図２ｂ）の方へのナイーブＴ細胞の遊走を約４０〜５０％阻害したことを示す。これらの結果は、低レベルのＣＣＬ２がＴ細胞遊走を阻害するのに十分であることを示す。
【０１４５】
ＣＣＬ２は、アクチン重合を特異的にダウンレギュレートする−インテグリン媒介遊走のための必要条件には、アクチン重合の割合の増大、およびアクチンベースの細胞骨格の広範囲な再編成がある。
【０１４６】
ＣＣＬ２がＴ細胞の細胞骨格の再配列を調節するかどうか決定するために、ナイーブＴ細胞のアクチン重合が追跡された。図２ｃ〜ｄにおいて示されるように、ＣＸＣＬ１２（図２ｃ）刺激またはＣＣＬ２１（図２ｄ）刺激は、アクチン重合を実際に誘導し、それはＣＣＬ２で前処理された細胞において約４０〜５０％阻害された。
【０１４７】
（ｐＭ濃度での）さらなるケモカインがＴ細胞の細胞骨格の再配列に対して阻害効果を有するかどうかを評価するために、ナイーブＴ細胞のアクチン重合が種々のケモカインに供された後に追跡された。図２ｅに示されるように、低レベルのＲａｎｔｅｓ、Ｍｉｐ１β、ＥｏｔｏｘｉｎまたはＣＸＣＬ１２は、ナイーブＴ細胞のアクチン重合に対して阻害効果を全く有さなかった。
【０１４８】
本発明者らは、未成熟なＢ細胞がＣＣＬ２で前処理されたときに、ＥＲＫ１／２の活性化が阻害されたことを既に示した［Ｆｌａｉｓｈｏｎら、Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０４：９３３−９４１］。従って、本発明者らは、ＣＣＬ２がＴ細胞においても同様にＥＲＫリン酸化を阻害したかどうかを決定することを望んだ。図３において見られるように、ＣＣＬ２１はＥＲＫ１／２のリン酸化を誘導した。この活性化は、ＣＣＬ２で前処理された細胞において阻害された。従って、ＣＣＬ２は、ＥＲＫ１／２に関わるシグナル伝達カスケードを調節し、細胞骨格の再配列および遊走の阻害をもたらす。
【０１４９】
総合すると、これらの結果は、ＣＣＲ２／ＣＣＬ２相互作用がＴ細胞のインテグリン媒介接着および遊走を制御することを示唆する。ＣＣＬ２は、Ｔ細胞のＥＲＫ１／２に関わるシグナル伝達経路におけるアクチンを重合する能力をダウンレギュレートすることによって、Ｔ細胞の遊走を阻害することが示された。
【０１５０】
実施例２
ＣＣＬ２は、リンパ節へのナイーブＴ細胞ホーミングを阻害する
生体外でのＴリンパ球の、ＣＣＬ２１およびＣＸＣＬ１２ケモカインが誘発した遊走に対するＣＣＬ２の強力な阻害効果は、このサイトカインが、生体内でのナイーブＴ細胞遊走およびリンパ節（ＬＮ）へのホーミングをも妨げることが可能であり、従って、抗炎症化合物として役立つことを示唆した。ナイーブＴ細胞のホーミングに対するＣＣＬ２の生体内効果を決定するために、末梢リンパ節（ＰＬＮ）内へのＴ細胞侵入が分析された。
【０１５１】
材料および実験手順
動物−本明細書上記の実施例１に詳述される通りである。
【０１５２】
生体内での細胞の追跡−ＣＣＬ２（０．１ｎｇ／ｍｌ  ＲＰＭＩ）の存在下または不在下で３０分間予備インキュベートされたＴ細胞は、洗浄され、５ｍＭの蛍光色素ＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）で１５分間室温で標識された。その後、等量（０．３３×１０７）のＣＣＬ２で処理された細胞または処理されていない細胞が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射された。３時間後、ＬＮおよび脾臓が回収され、ＦＩＴＣ陽性集団がＦＡＣＳによって分析された。ＬＮおよび脾臓から回収された標識された細胞の割合は、４つの異なる実験（各群において１０匹のマウス）において既に記載されるようにして測定された［Ｆｌａｉｓｈｏｎ，Ｌ．Ｒ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１３８１（２０００）］。
【０１５３】
結果
（ＰＢＳで処理された）コントロール集団と比較して、ＬＮへのＣＣＬ２処理されたナイーブＴ細胞のホーミングにおいて５０％の劇的な減少があった（図４ａ）。興味深いことに、脾臓に対するこれらのＴ細胞の遊走において差異は無かった（図４ｂ）。脾臓へのリンパ球の侵入は、インテグリン活性化が要求されない方法であると最近まで認識されていたが［Ｓａｉｔｏ  Ｓ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）６３：３０５；Ｋｒａａｌ  Ｇ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９５）１４７：７６３；Ｎｏｌｔｅ  Ｍ．Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）１０６：２９９］、最近の結果は、インテグリン活性化が白脾髄への成熟Ｂ細胞の侵入においても役割を果たすことを示した［Ｌｏ  Ｃ．Ｇ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００３）１９７：３５３］。しかしながら、単一インテグリン（例えば、ＬＦＡ−１）の阻害は、リンパ節へのＴ細胞およびＢ細胞のホーミングの劇的な阻害をもたらすが、それは白脾髄へのリンパ球の侵入に対する小さな効果でしかなく、二重のインテグリンの阻害のみが白脾髄へのリンパ球の侵入を阻害できた［Ｌｏ  Ｃ．Ｇ．，前出］。従って、結論として、ＣＣＬ２は、おそらくケモカインが誘導したインテグリン媒介接着および遊走に対するその抑制効果のために、生体内でのＬＮへのナイーブＴ細胞の遊走を阻害する。
【０１５４】
実施例３
ＣＣＬ２は、マウスの末梢リンパ節における高内皮性小静脈壁に対するＬＦＡ−１インテグリンが媒介するリンパ球の強固な接着を阻害する
より生理学的な設定において（実施例２に記載される）生体外での知見を確認するために、すなわち末梢リンパ節（ＰＬＮ）における高内皮性小静脈（ＨＥＶ）を通るリンパ球遊走およびホーミングに対する低用量ＣＣＬ２の効果を確認するために、微小循環が生体内顕微鏡法（ＩＶＭ）によって利用された。
【０１５５】
材料および実験手順
動物−５〜７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスが、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランス）から購入された。マウスは、特定の無菌動物施設において飼育および交配された。実験は、動物の取扱いに関するフランスの手順指針に従って行なわれた。
【０１５６】
マウス腸骨下部ＬＮの生体内顕微鏡法−マウスは、１ｍｇ／ｍｌのキシラジンおよび５ｍｇ／ｍｌのケタミンの腹腔内注射によって麻酔された。右大腿動脈にカテーテルが入れられた。左腸骨下部ＬＮが、既に記載されるようにして［Ｃａｒｒｉｅｒｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００５）６５：１１６３９−１１６４８；Ｍ’Ｒｉｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．（２００３）１９８：１３０１−１３１２］ＩＶＭのために準備され、マウスは次いで、液浸対物レンズ（ＨＣＸ  ＡＰＯ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＡ，Ｒｕｅｉｌ−Ｍａｌｍａｉｓｏｎ，フランス）を備えた特別注文による生体内ビデオ顕微鏡設備（ＩＮＭ  １００；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＡ，Ｒｕｅｉｌ−Ｍａｌｍａｉｓｏｎ，フランス）に移された。ＬＮ微小循環における蛍光事象は、視覚化され、シリコン増倍型ターゲットカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｍａｓｓｙ，フランス）によって記録され、ＤＶＣＡＭビデオテープ（ＤＳＲ−１１  Ｓｏｎｙ，ＩＥＣ−ＡＳＶ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，フランス）に保存された。
【０１５７】
ＬＮ血管内皮とのナイーブリンパ球の相互作用を視覚化するために、腸骨下部のＬＮ、腋窩のＬＮ、上腕のＬＮ、および腸間膜のＬＮのコントロールＣ５７ＢＬ／６プールの単一Ｔ細胞およびＢ細胞懸濁液から得られたナイーブリンパ球が、ＣＣＬ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｌｌｅ，フランス；１ｎｇ／ｍｌ、３０分間、３７℃）の存在下または不在下でインキュベートされ、カルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス；０．２５μＭ、５分間、３７℃）によって蛍光的に標識され、次いで、右大腿動脈に注射された。ＬＮ小静脈における細胞挙動が、既に記載されるようにして［Ｃａｒｒｉｅｒｅら、前出；Ｍ’Ｒｉｎｉら、前出］評価された。回転画分は、小静脈あたりの全流入細胞中の血管の内側に沿って回転した細胞の百分率割合として測定された。固着画分は、回転する細胞内の少なくとも１０秒間または１分間強固に接着した細胞の百分率割合として測定された。
【０１５８】
結果
正常なマウス腸骨下部ＬＮのこれまでのＩＶＭ観察は、ＬＮ小静脈ツリーが５つまでの枝分かれ序列からなることを確立し［Ｃａｒｒｉｅｒｅら、前出；Ｍ’Ｒｉｎｉら、前出；ｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（１９９６）３：２８７−３００］、ここで下位小静脈（ＬＯＶ）は、門部における大きな集合小静脈（序列Ｉ）および髄における上流の分岐（序列ＩＩおよび序列ＩＩＩのうちのいくつか）を含む。高位の分岐（序列ＩＩＩの大半および序列ＩＶおよびＶの小静脈の全て）は、ＬＮ毛細血管に直接的に接続され、かつＬＮの皮質下および副皮質の方へと流れるＨＥＶである（図５ａ）。ＬＯＶ（序列ＩＩ）およびＨＥＶ（序列ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ）におけるコントロールリンパ球およびＣＣＬ２処理リンパ球の挙動（例えば、回転、固着）の分析が行なわれた。結果から明らかなように、低用量ＣＣＬ２での処理は、リンパ球がＨＥＶにおいてＬ−セレクチン媒介回転を受ける能力を顕著には変更しなかった（図５ｂ）。同様に、ＨＥＶ内での回転後少なくとも１０秒間留まったナイーブリンパ球（１０秒間の固着画分）の百分率割合は、コントロールリンパ球およびＣＣＬ２処理リンパ球と同等であり（図５ｃ）、これはＣＣＬ２前処理が、生体内でのＣＣＬ２１が誘発したインテグリン媒介拘束の初期事象に影響しなかったことを示す。しかしながら、低用量ＣＣＬ２で処理されたリンパ球は、分離する前にＨＥＶ壁において数秒間のみ拘束されたままであり、従って、コントロールリンパ球と比較した場合に、それらの初期拘束後に３０秒間または１分間（それぞれ図５ｄおよび５ｅ）接着したままである細胞の百分率割合の猛烈な低減を導く。ＣＣＬ２処理されたリンパ球がＨＥＶに接着しながらもそれらが受ける持続的な力による分離に耐える能力をこのように損なうことは、蛍光細胞の注射の３０分後に、ＰＬＮ小静脈ツリー内の強固に結合したリンパ球の数の著しい低減をもたらした（図５ｆおよび５ｇ）。ＨＥＶ標的血管上の初期集積後に数分間接着し続ける重要な能力がなければ、リンパ球は、これらの血管から管外に遊出できないだろう。従って、低用量のＣＣＬ２は、マウスＰＬＮ微小循環においてＨＥＶ壁へのインテグリン依存性のリンパ球の強固な接着およびＨＥＶ壁を通り抜ける管外遊出を阻害した。成熟Ｂ細胞がＣＣＲ２を発現しないこと［Ｆｌａｉｓｈｏｎ  Ｌら、前出］を考慮すれば、観察された劇的なダウンレギュレーションが主としてＴ細胞集団のダウンレギュレーションであると考えられる。
【０１５９】
実施例４
ＣＣＬ２は、共固定されるＣＣＬ２１によって誘発される、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１に対するＴリンパ球の拘束後のインテグリン依存性接着強化を阻害する
リンパ球遊走に対するＣＣＬ２の阻害効果についてのさらなる機械的データを提供し、そしてその所見をヒトＴ細胞に拡大するために、精製された成分でのフローチャンバアッセイによって分析が生体外で行われた。
【０１６０】
材料および実験手順
層流接着アッセイ−精製されたＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１−Ｆｃ（共にＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入）が、既に記載されるようにして［Ｇｒａｂｏｖｓｋｙら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．（２０００）１９２：４９５−５０６；Ｓｉｇａｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：４４２−４５２］ポリスチレンプレート上にＣＣＬ２１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の有りまたは無しでコーティングされた。ポリスチレンプレートは各々、既に記載されるようにして［Ｆｅｉｇｅｌｓｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：１３８９１−１３９０１］フローチャンバの下部壁上に集められた。全てのフロー実験は、３７℃で行われた。細胞は、カチオン不含Ｈ／Ｈ培地で洗浄され、結合培地（１ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を補充したＨ／Ｈ培地）中に再懸濁され、低い剪断応力（０．５〜０．７５ｄｙｎ／ｃｍ２）で２分間フローチャンバを通して灌流された。係留（ｔｅｔｈｅｒｓ）は、もし細胞が基板に短い時間（＜２秒間）接着するならば移動または回転と定義され、もしすぐに拘束され、連続的な流れのうち少なくとも５秒間静止したままであるならば拘束と定義された。異なって前処理された細胞内での接着カテゴリーの頻度は、既に記載されるようにして［Ｇｒａｂｏｖｓｋｙら、前出］、基板上を即時に流れる細胞の百分率割合として決定された。分離に対する耐性を経時的に評価するために、蓄積された細胞は、５ｄｙｎ／ｃｍ２の剪断応力に５分間供された。示された時点で、結合したままの細胞の数は、アッセイの最初の２分間において元々蓄積されたＴ細胞集団に対して表現された。ＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１に対する細胞係留（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｅｔｈｅｒｓ）の９０％以上が、ＶＬＡ−４またはＬＦＡ−１ブロッカーのそれぞれで細胞を前処理することによってブロックされた。
【０１６１】
結果
分析は、低用量ＣＣＬ２へのヒトＴリンパ球の短い暴露が、２つの主要なＴ細胞インテグリンであるＬＦＡ−１およびＶＬＡ−４が表面結合ＣＣＬ２１からのその場のシグナルによって活性化される能力を損ないうるかどうかを試験するために確立された。ＣＣＬ２１は、ＩＣＡＭ−１またはＶＣＡＭ−１のいずれかと共固定されるときに、Ｇｉが媒介する強いＬＦＡ−１またはＶＬＡ−４媒介リンパ球接着のそれぞれを、剪断流条件下で誘発する［Ｇｒａｂｏｖｓｋｙら、前出］。
【０１６２】
ＣＣＬ２処理されたＴ細胞がＣＣＬ２１の存在下でＬＦＡ−１およびＶＬＡ−４リガンドであるＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の両方とそれぞれ相互作用する正常な能力から明らかなように、ヒトＴ細胞のＣＣＬ２処理は、表面結合ＣＣＬ２１によるリンパ球上のＬＦＡ−１またはＶＬＡ−４活性化を妨げなかった（図６ａおよび６ｃ）。それにもかかわらず、いったんＣＣＬ２１シグナルに応答して、正常に捕捉され、これらのリガンド上に拘束されると、ＣＣＬ２前処理されたＴ細胞は接着強化を発展できず、高剪断応力に連続的にさらされたときにそれらのインテグリンリガンドから容易に分離される（図６ｂおよび６ｄ）。低用量ＣＸＣＬ１２でのＴリンパ球の同様の前処理は、同一の条件下でインテグリン媒介拘束およびその後の接着の強化の両方を保持した（図６ａ〜ｄ）。
【０１６３】
総合すると、これらの結果は、低用量のＣＣＬ２が、その場のＣＣＬ２１による初期のＬＦＡ−１およびＶＬＡ−４活性化に影響を及ぼすことなく、拘束工程後のこのケモカインによって誘発される重要な細胞骨格の再配列を妨げることを示した。これらの再配列無しに、ＣＣＬ２１シグナルに応答してＬＦＡ−１およびＶＬＡ−４リガンドの両方の上に蓄積した正常に拘束されたＴ細胞は、剪断力の長期の適用に供されたとき、これらの接着表面に対してその後の接着強化を発展させることができない。
【０１６４】
実施例５
ＣＣＬ２は、エフェクターＴ細胞の細胞骨格の再配列およびトランスウェル遊走を阻害する
エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＣＲ２転写、およびエフェクターＴ細胞の細胞骨格の再配列および遊走に対するＣＣＬ２の阻害効果が分析された。
【０１６５】
材料および実験手順
Ｔ細胞ソーティング−既に記載されるようにして［Ｓｈａｃｈａｒ  Ｉ．およびＦｌａｖｅｌｌ  Ｒ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１０６（１９９６）］脾臓および脾臓細胞がマウスから得られた。製造元のプロトコルに従って、Ｔ細胞は、ＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して富化された。脾臓細胞は、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）と共にインキュベートされ、ＣＤ４５陰性細胞が回収された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して富化された。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を得るために、Ｔ細胞富化集団は、上清からのＴｈ１細胞の回収のためにコンカナバリンＡ（２５０μｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，スイス）およびＩＬ−１２（３．５ｎｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）と共に９６時間インキュベートされ、または、上清からのＴｈ２細胞の回収のためにＩＬ−４（１０３ユニット／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）と共に９６時間インキュベートされた。
【０１６６】
ＲＮＡの単離および逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）−全ＲＮＡは、Ｔｒｉ試薬キット（ＭＲＣ）を使用して細胞から単離された。逆転写は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して行われた。異なるＴ細胞集団においてＣＣＲ２の発現を検出するために、ＰＣＲは、ＣＤ４＋細胞のＴｈ１またはＴｈ２集団からのｃＤＮＡテンプレート上で、ＣＣＲ２に特異的なプライマー（順方向プライマー：５’−ＡＴＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＣ−３’、配列番号１；逆方向プライマー：５’−ＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＴ−３’、配列番号２）および陽性コントロールとしてヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に特異的なプライマー（順方向プライマー：５’−ＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＧＧＣＴ−３’、配列番号３；逆方向プライマー：５’−ＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧ−３’、配列番号４）、Ｔ−ｂｅｔに特異的なプライマー（順方向プライマー：５’−ＴＴＣＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＣＧ−３’、配列番号５；逆方向プライマー：５’−ＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＧＧＴＡＡＡＡＡＣ−３’、配列番号６）およびＧＡＴＡ−３に特異的なプライマー（順方向プライマー：５’−ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧ−３’、配列番号７；逆方向プライマー：５’−ＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣ−３’、配列番号８）を使用してＰＣＲが実施された。
【０１６７】
細胞骨格の再配列−Ｔ細胞は、ＣＣＬ２（０．１ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で３０分間予備インキュベートされ、次いで、ＣＸＣＬ１２（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ  ＮＪ）またはＳＬＣ（ＣＣＬ２１，０．４ｍｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）のいずれかで１５秒間刺激された。次いで、細胞は、既に記載されるようにして［Ｆｌａｉｓｈｏｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６７０１（２００１）］、パラホルムアルデヒドで直ちに固定され、浸透処理され、それらの細胞内Ｆ−アクチンがＦＩＴＣファロイジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色され、次いで、それらの細胞骨格の状態を決定するためにフローサイトメトリーによって分析された。
【０１６８】
結果
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１集団またはＴｈ２集団のいずれかへと偏らせられた。両集団は、ＣＣＲ２を転写することが見出され、一方、転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ−３はそれぞれ、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞における優先的な発現を示した（図７Ａ）。
【０１６９】
さらに、低用量のＣＣＬ２は、ＣＣＬ２１（図７ｂおよび７ｄ）またはＣＸＣＬ１２（図７ｃおよび７ｅ）が誘導したエフェクター細胞の細胞骨格の再配列およびトランスウェル遊走をダウンレギュレートし（データは示されていない）、ｐＭレベルのＣＣＬ２がナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の遊走を消極的に制御することを示す。従って、低用量ＣＣＬ２は、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびナイーブＴ細胞の接着および遊走に対して同様の阻害効果を示す。
【０１７０】
実施例６
ＣＣＬ２は、生体内で抗炎症性の役割を果たす
生体外および生体内でのＴリンパ球のケモカイン誘発遊走およびインテグリン依存性接着に対するＣＣＬ２の強力な阻害効果は、このサイトカインが抗炎症性の化合物として役立ちうることを示唆した。ＣＣＬ２の抗炎症効果を生体内で決定するために、マウス喘息モデル、慢性関節リウマチラットモデル、および炎症性腸疾患マウスモデルが行われた。
【０１７１】
材料および実験手順
動物−６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂ／ｃマウスが使用された。メスのＬｅｗｉｓラットが、Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて無菌条件下で飼育および維持された。動物に対する全ての処置は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認証された。
【０１７２】
オボアルブミン（ＯＶＡ）感作、抗原投与、およびＣＣＬ２での処置−ＯＶＡ感作および抗原投与が、既に記載されるプロトコル［Ｆｌａｉｓｈｏｎ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ：Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ  １６８：３７０７（２００２）］に従って行われた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（平均９匹のマウス／群）は、３００μｌのＰＢＳ中で２ｍｇの水酸化アルミニウム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と混合された１００μｇの鶏の卵オボアルブミン（ＯＶＡ；Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）での腹腔内注射によってＯＶＡについて感作された（コントロール群マウスはＰＢＳのみで注射された）。注射は、最初の感作後、０、７および１４、１５日目に与えられ、その後、動物は、２０分間超音波ネブライザー（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｌ，ＰＡ）によって投与される、ＰＢＳ中の４％ＯＶＡを吸入することによって５日間毎日（１５日目〜１９日目）抗原投与され、一方、コントロール群はＰＢＳのみで抗原投与された。
【０１７３】
ＯＶＡによって注射および抗原投与された群のうちの１つは、ＯＶＡ吸入の初日（１５日目）から５日間、各吸入の前に２０分間、３００μｌのＰＢＳでさらに腹腔内注射され、別の群は、マウスＣＣＬ２（１日あたり動物１匹につき６０ｎｇのＣＣＬ２）でさらに注射された。ＰＢＳ処置されたコントロール群は、ＰＢＳ抗原投与およびＰＢＳ注射された。１８日目、吸入の２時間後に、マウスは０．２ｍｌのケタミン／キサラジンの腹腔内注射で麻酔され、呼息中に体積変動記録ボックスにおいて測定された、高まった呼吸休止（Ｐｅｎｈ）、最大呼気流量と最大吸気流量の比率の関数、および呼気のタイミングの関数を計算することによって気道の過応答性（ＡＨＲ）が決定された。ΔＰｅｎｈは、抗原投与後のＰｅｎｈ測定値から抗原投与前のコントロールＰｅｎｈ測定値を引くことによって計算された。ベース線のＰｅｎｈレベルは、ＰＢＳ処置コントロール、ＯＶＡ抗原刺激マウス、および１５日目にＣＣＬ２で処置したＯＶＡ抗原刺激マウスの間で同等であった。１９日目、マウスは最後の吸入の２時間後に犠牲にされた。
【０１７４】
肺の組織学−ＯＶＡ感作および抗原投与アッセイに関与するマウスからの肺が、膨張するまで１ｍｌの１０％ホルマリンで膨らまされた。パラフィン切片のためのサンプルは、１０％ホルマリンに漬けられ、４８時間固定された。組織は、次いで、パラフィンに包埋され、２〜３μｍ切片が調製された。ヘマトキシリン／エオシン染色切片が、光学顕微鏡によって調べられた。各群において９匹の動物からの肺スライドの、目隠し評価およびスコア付け（スコア範囲：１〜４；リンパ球浸潤および気管支壁厚に基づく）が病理学者によって与えられた。
【０１７５】
アジュバント関節炎（ＡＡ）誘導、評価およびＣＣＬ２での処置−ＡＡは、ラット１匹あたり１ｍｇの熱殺菌されたＭｔ株Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ）を使用して、既に記載されるようにして［Ｋａｎｎａｎ，Ｔｈｅｏｒ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｄｅｌ．（２００５）２：１７］誘導された。各実験群およびコントロール群は、少なくとも８匹のラットを含んでいた。ＡＡ誘導の日は０日目とされ、疾患の重篤度は各々の動物における全ての四肢の直接観察によって評価された。実験手順を知らされていない観察者が、疾患の臨床的徴候についてＡＡをスコア付けした。０〜４の相対スコアが、関節の炎症、赤み、および変形の度合いに基づいて、各肢に割り当てられた。個々の動物について最大の考えられうるスコアは１６であった［Ｋａｎｎａｎ，、前出］。
【０１７６】
ＡＡ誘導の直後に、ラットは、毎日（０日目〜５日目）、低用量ＣＣＬ２（３００μｌのＰＢＳ中に２４０ｎｇ）を注射される群か、またはコントロールとしてＰＢＳを注射される群の２つの群に分けられた。誘導後１０日目から開始して、疾患は本明細書中上記に記載されるようにスコア付けされた。
【０１７７】
結果は、各群における全ての動物についての２つの値の間の差の平均±ＳＥＭとして表された。実験は少なくとも３回繰り返され、同様の結果を生じた。
【０１７８】
ＴＮＢＳ大腸炎モデルおよびＣＣＬ２での処置−ＴＮＢＳ大腸炎は、既に記載されるようにして誘導された［Ｏｈｋａｗａｒａら（２００２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２３：２５６］。簡単に言うと、マウスは、８５％ケタミンおよび１５％キシラジンを含有する混合物（２０ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注射（マウス１匹あたり３５μｌ）によって麻酔された。次に、１００μｌのＴＮＢＳ［４５容量％のＴＮＢＳ溶液（トリニトロベンゼン硫酸；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合された５０％エタノールの５５容量％］が、給餌針に取り付けられた１ｍｌシリンジによって結腸の管腔に注入された。処置されたマウスは、毎日計量され、直腸出血および下痢のような臨床的症状について視覚的に検査された。
【０１７９】
ＴＮＢＳマウスは、６群に分けられた。ＣＣＬ２群（各群において１０匹のマウス）は、０日目（ＴＮＢＳ誘導の直後）から６日目まで、２００μｌのＰＢＳ中の異なるＣＣＬ２濃度（３０ｎｇ、６０ｎｇまたは１８０ｎｇ）で毎日腹腔内注射された。コントロール群（各群において１０匹のマウス）は、毎日２００μｌのＰＢＳのみで腹腔内注射された。さらに、５匹のマウスが、デキサメタゾンで毎日腹腔内注射され；そして１匹のマウスは処置されずに将来の組織学および計量のための陰性コントロールとして役立たせた。
【０１８０】
大腸炎の巨視的評価および組織学的評価−実験手順を知らされていない観察者が、疾患の臨床的徴候について大腸炎をスコア付けした。結腸は、巨視的に調べられ（×５倍率）、Ｗａｌｌａｃｅ基準に従って巨視的な病変を評価した。Ｗａｌｌａｃｅスコアは、充血、腸管の肥厚および潰瘍形成の範囲のような炎症を反映する基準に基づいて０〜１６のスコアで巨視的な結腸病変をランク付けする。結腸は縦に切断され、将来の組織学のために４％パラホルムアルデヒド中に固定された。
【０１８１】
統計学的分析−対にされたサンプルの統計学的な比較のために、スチューデントＴの両側検定が使用された。差異は、Ｐ＜０．０５（＊）、Ｐ＜０．０１（＊＊）またはＰ＜０．００１（＊＊＊）のときに統計的に有意であると考えられた。データは、平均値±ＳＥＭで表される。
【０１８２】
結果
ＣＣＬ２は、喘息モデルにおいて抗炎症性の役割を果たす−アレルギー性の気道応答性に対するＣＣＬ２の考えられうる抗炎症効果を調べるために、ＯＶＡ感作、およびＣＣＬ２の腹腔内注射に対するその応答を使用し、オボアルブミン（ＯＶＡ）吸入の初日から開始する処置アッセイが行われた。麻酔された、自発的に呼吸するマウスの気道応答性は、ＯＶＡ吸入後５日目に評価された。図８ａに示されるように、ＯＶＡ抗原投与マウスは、抗原投与に対するその気道応答性を有意に増大した。しかしながら、（ＰＢＳを抗原投与された）コントロールマウスにおいて、またはＣＣＬ２で処置されたＯＶＡ抗原投与マウスにおいては、気道の過応答性は観察されなかった。
【０１８３】
ＯＶＡ処置マウスからの肺組織の組織病理学的な検査（図８ｂ〜ｄ）（図中の小さな紫色の点は組織に浸潤する細胞である）は、主に好酸球およびリンパ球からなる多形性気管支周囲浸潤物および血管周囲浸潤物を現し（喘息マウス、図８ｃ）、それはコントロールのＰＢＳ抗原投与マウス（コントロールマウス  図８ｂ）またはＣＣＬ２処置マウス（ＣＣＬ２処置マウス  図８ｄ）においては見出されなかった。さらに、気管支周囲および血管周囲の炎症性浸潤物は、マウスがさらされてきた異なる処置を知らされていない病理学者によって１〜４の範囲の炎症性スコアを与えられた（図８ｅ）。ＯＶＡ処置マウスにおける気管支周囲の炎症性浸潤物は、コントロール動物と比較して有意に増大したが、ＯＶＡおよびＣＣＬ２処置マウスの肺における組織学的変化はわずかに検出できる程度であり、炎症性浸潤物は有意に低減された。
【０１８４】
ＣＣＬ２は、ＡＡにおいて抗炎症性の役割を果たす−ヒトの慢性関節リウマチのいくつかの特徴を模倣する実験的自己免疫疾患［Ｋａｎｎａｎ、前出］であるアジュバント関節炎（ＡＡ）に対するＣＣＬ２の考えられうる抗炎症効果を調べるために、ＣＣＬ２がＡＡ誘導ラットに投与された。図９において示されるように、低容量ＣＣＬ２の注射は、炎症の重篤度を低減することによって疾患の発症を有意に阻害した。
【０１８５】
ＣＣＬ２は、大腸炎において抗炎症性の役割を果たす−炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対するＣＣＬ２の考えられうる抗炎症効果を調べるために、ＩＢＤについての動物モデルであるＴＮＢＳ大腸炎の誘導後に、ＣＣＬ２がマウスに投与された。本明細書中下記の表２および図１０において明確に示されるように、ＣＣＬ２は、下痢の減少および結腸短縮の減少によってみられるように炎症の重篤度を低減することによって疾患を有意に阻害した。
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【０１８６】
総合すると、生体内の研究は、主要なヒトの炎症性疾患のうちの３つである慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患および喘息の動物モデルにおいて、ＣＣＬ２が有意な抗炎症活性を表すことを示す。
【０１８７】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１８８】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０１８９】
配列番号１〜８は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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