(57)【要約】  本発明は、鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）に対するキメラワクチン抗原について述べる。前記ワクチン抗原は、細胞免疫系だけでなく、体液性免疫系も刺激するタンパク質分子に結合したウイルスサブユニットを基にする。本キメラ抗原は、本発明の基盤を構成するキメラ分子の正確な三次元的折りたたみ（ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ）を保証する発現系において生産することができる。前記キメラ抗原を含むワクチン組成物は、高い赤血球凝集素阻害抗体価を刺激する、鳥類及びワクチン接種された哺乳動物の両方に強力で早期の免疫反応、及びウイルス抗原に対する強力な特異的細胞反応を誘発する。キメラ抗原、及び得られたワクチン組成物も、予防的使用のためのワクチンとして、ヒト及び動物衛生の分野に適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥インフルエンザウイルスエンベロープ由来のＨＡタンパク質の細胞外セグメント及びＣＤ１５４分子の細胞外セグメントを含むことを特徴とする、鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原。
【請求項２】
トリ（配列番号６）、ブタ（配列番号８）又はヒト（配列番号４）由来のＣＤ１５４分子の細胞外セグメントのアミノ酸配列を本質的に含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項３】
ウイルスサブタイプＨ５（配列番号２）、Ｈ７（配列番号９）及びＨ９（配列番号１０）由来のＨＡの細胞外セグメントのアミノ酸配列を本質的に含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項４】
組換え法、合成法又は化学的共役によって得られる、請求項１に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項５】
遺伝子改変した哺乳動物のミルクから得られる、請求項１に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項６】
乳腺の直接遺伝形質転換によって非トランスジェニック哺乳動物のミルクから得られる、請求項５に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項７】
乳腺の直接遺伝形質転換がアデノウイルスベクター形質導入を使用することによって実施される、請求項６に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項８】
トランスジェニック哺乳動物のミルクから得られる、請求項５に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項９】
遺伝子改変の酵母菌から得られる、請求項４に記載のキメラワクチン抗原。
【請求項１０】
請求項１から９までに記載のキメラ抗原を含むことを特徴とする、鳥類及び哺乳動物における鳥インフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を生じさせることが可能なワクチン組成物。
【請求項１１】
トリ、ブタ及びヒトにおいて鳥インフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を生じさせることが可能な、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
全身又は粘膜経路によって動物に予防的に投与することができる、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの医学及び獣医学の分野の、特に、鳥類及び哺乳動物の両方において、鳥インフルエンザウイルスに対する強力で早期の免疫反応を発生させる体液性免疫系及び細胞免疫系の両方を高める共刺激分子と結合した、鳥インフルエンザウイルスのウイルスサブユニットを含む新規なキメラ抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
鳥インフルエンザ（ＡＩ）は、世界的に分布している呼吸器疾患である。接触感染性が高い本疾患は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウだけでなく、多種多様な家禽及び野鳥に影響を及ぼす可能性がある。すべての鳥類の種が、感染を起こしやすく、渡りをする水鳥種が、本疾患を引き起こすウイルスの主要な自然宿主である可能性がある。
【０００３】
家禽類における鳥インフルエンザウイルス感染は、その病原性レベルが高いか低いかによって区別される２つの疾患型を引き起こす。「病原性の低い」形態は、見過ごされる可能性があり、一般に、軽度の症状だけを生じさせる（硬い羽、産卵の減少など）。それにもかかわらず、病原性の高い形態は、家禽内でより急速に伝播する。この形態は、４８時間の期間に、９０〜１００％までに達する可能性のある死亡率を有する、いくつかの内部器官を攻撃する疾患を引き起こす可能性がある。
【０００４】
鳥インフルエンザの原因であるウイルスは、オートミクソビリダエ（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属する。インフルエンザウイルスは、その抗原性の差異に基づいて、Ａ、Ｂ及びＣ型に分けられる。その遺伝物質は、セグメントに分かれた負極性のリボ核酸（ＲＮＡ）である。インフルエンザウイルスＡ及びＢは、８つのセグメントを持ち、一方、インフルエンザウイルスＣは、７つのセグメントのみ持つ。ウイルスゲノムがセグメントに分かれるという事実は、原型とは異なる特性を有するウイルスを生み出す遺伝的組換えを支持する（Ｃａｐｕａ；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（２００４）「鳥インフルエンザ：最近の発生（Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」、Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．３３：３９３−４０４）。
【０００５】
ウイルスエンベロープは、２つの主要な糖タンパク質の血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む。ＨＡタンパク質は、細胞受容体への結合タンパク質であり、ウイルスの標的細胞への侵入のために重要な、ウイルスエンベロープと細胞膜との結合を媒介する。本タンパク質は、中和抗体の反応を誘発する。ＨＡタンパク質上の突然変異は、伸展のより大きい又はより小さい抗原変異株を生じさせる。ＮＡタンパク質は、細胞からのウイルスの放出を助けて宿主細胞のシアル酸を切断し、粘液を分解し、ウイルスの組織へのアクセスを容易にする。また、鳥インフルエンザウイルスのＮＡも、抗原変化を受ける。
【０００６】
通常、鳥インフルエンザのウイルスは、家禽及びブタ以外の他の種に感染しない。鳥インフルエンザウイルスによるヒト感染症の最初の症例は、１９９７年に香港で記録され、このとき、Ｈ５Ｎ１株が１８名に対して急性呼吸疾患を引き起こし、このうち６名が死亡した。これら個々の感染は、同一の菌株により発生した香港におけるトリ集団に対する病原性の高い鳥インフルエンザの流行と同時に起きた。２００３年２月、香港において、鳥インフルエンザＨ５Ｎ１の集団発生により、最近、南中国を旅行したある家族のうちの１名が死亡したとき、新しい警戒が発令された。家族の別の小児がこの旅行中に死亡したが、この男児の死因は不明である。
【０００７】
最近、ＡＩの別の２種のウイルス株がヒトにおいて疾患を引き起こしている。１９９９年に香港において、小児でＡＩ  Ｈ９Ｎ２の軽症２例が出現し、２００３年１２月中旬に別の症例が報告された。一般に、家禽においてＨ９Ｎ２サブタイプは、病原性は高くない。それにもかかわらず、病原性の高いＨ９Ｎ２鳥インフルエンザウイルスは、２００３年２月にオランダにおいて始まり、２カ月後に獣医師１名の死亡、及び別の８３名では軽度疾患を引き起こした。
【０００８】
１９９７年から現在まで、ヒトに感染可能な鳥インフルエンザの集団発生が、より頻繁に発生しており、ウイルスがアジア及びヨーロッパから多数の国を通して広がっている。そのときまで、Ｈ５Ｎ１株は、ヒトにおけるインフルエンザの主要な原因因子であった。２００５年１０月までに、Ｈ５Ｎ１に感染した２００名が報告されており、死亡率は約５５％であった。アジア及びヨーロッパの１３の国が影響を受け、１億２，０００万羽を超えるトリが死亡又は隔離されている。
【０００９】
ＡＩの集団発生の各々は、通常、億単位のトリの屠殺及び衛生管理規則の採用に至り、このことは概して大きな経済的損失を意味する。家禽における鳥インフルエンザの集団発生中に、感染したトリ、又はそのようなトリの分泌物及び排泄物に汚染した表面に接触したヒトが接触感染するリスクが存在する。トリ間の感染の伝播は、ヒトの直接感染の機会を増加させる。より多くのヒトが感染すれば、時間と共にリスクも増加し、ヒトが鳥インフルエンザ株及びヒトインフルエンザ株に感染すれば、新規なサブタイプの出現の「混合レシピエント」の役目を果たす可能性がある。ヒトインフルエンザウイルスの十分な遺伝子を有するこの新しいサブタイプは、ヒトからヒトへ容易に感染する可能性があり、１９１８年に生じ、２，５００万人から５，０００万人が死亡した「スペイン風邪」として知られる汎流行を生じさせたＨ１Ｎ１の変異株のような、完全に伝播性の汎流行株に形質転換することになる。
【００１０】
最優先課題は、家禽集団間の汎流行のさらなる蔓延を食い止めることである。この戦略は、ウイルスへのヒトの曝露の機会を減少させるために有効である。現在流行しているインフルエンザウイルスの菌株に対して有効なワクチンを、感染したトリへの曝露のリスクの高いヒトへのワクチン接種に使用することによって、鳥インフルエンザ株及びヒトインフルエンザ株によるヒト感染を生じる可能性を減少させることが可能であり、このようにして、両方のウイルス株の間の遺伝子交換が生じるリスクを減少させる。
【００１１】
今日、ヒトだけでなく、トリにおいても本疾患を予防するための、インフルエンザに対するワクチンの生産の手順は、ニワトリの胚でのウイルス増殖に基づいている。続いて、この方法によって生産されたウイルスを、化学的に不活性化し、半精製する。それにもかかわらず、そのような技術では、起こり得る汎流行の危機に対応することはできない。この手順を通して、ワクチンの開発及び生産は、数カ月かかる。
【００１２】
潜在的菌株の同定後、適切な増殖特性を得るために、増殖性の高い菌株による吸収が必要である。さらに、最近の動物間流行病の原因であるＨ５株が、ヒトの数例の感染例と関連し、ワクチン生産で使用されるニワトリ胚で致死性となることはより重要である。これらワクチンの生産は、病原株の操作をさらに意味する。このため、結果としてのプロセスの増強及び危機の場合におけるスケールアップを実施するための困難により、安全条件ＢＬ３の下での作業が必要である。
【００１３】
卵に対して急性アレルギーのヒトが、インフルエンザに対するワクチン製剤の残留する卵タンパク質により、過敏症の即時反応を起こす可能性があることが実証されている。１９７６年、ブタインフルエンザに対するワクチンが、ギラン−バレー症候群の頻度の増加に結びついた（Ｓｃｈｏｎｂｅｒｇｅｒら、（１９７９）「米国の全米免疫接種プログラムにおけるワクチン接種後の症候群（Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）」、１９７７−１９７７，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏ，１１０−１０５−２３）。現在まで、他の菌株からの以降のワクチン調製物による本疾患の発生増加は観察されていない。
【００１４】
培養細胞に基づくウイルスの生産は、ニワトリの胚における生産システムと交換するための魅力的な代替法として登場した。そのような戦略は、培養細胞におけるインフルエンザウイルスの生産とそれに続くウイルスの精製ステップを意味している。この手順の利点として、１）培養細胞は操作が容易で、短期間で拡大する、２）これらのシステムで生産されたインフルエンザワクチンは、第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験で評価されており、安全で、少なくともニワトリの胚で生産されたワクチンと同等に有効であることが実証されている（Ｂｒａｎｄｓら、（１９９９）「Ｉｎｆｌｕｖａｃ：インフルエンザワクチンをベースとした安全なマディンダービーイヌ腎細胞培養（Ｉｎｆｌｕｖａｃ：ａ  ｓａｆｅ  Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ．９８：９３−１００；Ｐｅｒｃｈｅｓｏｎら、（１９９９）「哺乳動物の細胞又は発育鶏卵において増殖された新規な分離インフルエンザＢウイルスワクチンの反応原性及び免疫原性について研究した第Ｉ相ランダム化対照臨床試験（Ａ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｓｐｌｉｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｇｇｓ）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４４７２−７）。それにもかかわらず、本戦略は、依然として高収率を可能にする再吸収されたウイルスを必要とする限界を持つ。また、本プロセスは、ウイルス遺伝子に細胞系の特定の突然変異を導入する可能性があり、これらは原則として、結果として潜在的にワクチンの効果を低下させるＨＡタンパク質の構造的及び抗原的変化を特徴とする変異株の選択につながる可能性がある（Ｍｅｉｋｌｅｊｏｈｎら、（１９８７）「インフルエンザウイルスワクチンの抗原性の変動及び有効性（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｒｉｆｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１３８：６１８−２４；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、（１９８５）「卵での増殖に対するインフルエンザＢウイルスの適応に伴う血球凝集素の変化（Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｅｇｇｓ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４３：１６６−７４；Ｓｃｈｉｌｄら、（１９８３）「インフルエンザウイルス抗原変異株の宿主−細胞選択に関するエビデンス（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｏｓｔ−ｃｅｌｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：７０６−９）。さらなる限界には以下が含まれる、１）病原性ウイルスの生産及び操作は、高能力の施設を要求する；２）通常は、細胞培養に基づく生産システムは、費用がかかり、技術的に厳しい。
【００１５】
インフルエンザウイルスに対する保護は、異なる１５のサブタイプが存在するＨＡタンパク質、またより小さな尺度では記録された９つのサブタイプが存在するＮＡタンパク質に対する免疫反応の結果である（Ｓｕａｒｅｚ，Ｓｃｈｕｌｔｚ（２０００）「鳥インフルエンザウイルスの免疫学：概説（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ）」、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２６９−２８３；Ｓｗａｙｎｅ，Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ，（２００３）、「インフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」、Ｓａｉｆ，Ｙ．Ｍ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｆａｄｌｙ，Ａ．Ｍ．，Ｇｌｉｓｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，ＭｃＤｏｕｇａｌｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｓｗａｙｎｅ，Ｄ．Ｅ編、「家禽の疾患（Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ）」、第１１版Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｅｓ，ＩＡ，１３５−１６０ページ）。核タンパク質又は基質タンパク質などの内部タンパク質に対する免疫反応は、本分野に対する保護を保証するには十分ではない。実際に、保護は、ワクチンに含まれるＨＡに特有のサブタイプによって提供される。
【００１６】
鳥インフルエンザに対するワクチンは、生ウイルスベクターへのＨＡ遺伝子の挿入及びその後の家禽免疫接種におけるこれら組換えベクターの使用を通して生産されている。生組換えウイルスベクターワクチンの使用は、以下のようないくつかの利点を持つ、１）これらは、体液だけでなく、細胞の反応を誘発することが可能な生ワクチンである、２）これらは、小型のニワトリにおいて投与し、早期の保護を誘発することができる。例えば、家禽ポックスウイルスをベースとした組換え体を、１日齢のトリに投与し、１週間後にマレック病に対する早期の防御を誘発させることができる（Ａｒｒｉｏｌａら、（１９９９）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｉａｓ  ｄｅ  ｃａｍｐｏ  ｅｎ  ｅｌ  ｕｓｏ  ｄｅ  ｖａｃｕｎｏｓ  ｃｏｎｔｒａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａｖｉａｒ．Ｉｎ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｃｕｒｓｏ  ｄｅ  Ｅｎｆｅｒｍｅｄａｄｅｓ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｉａｓ  ｄｅ  ｌａｓ  Ａｖｅｓ，Ａｓｏｃｉａｃｉｏｎ  Ｎａｃｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｅｓｐｅｃｉａｌｉｓｔａｓ  ｅｎ  Ｃｉｅｎｃｉａｓ  Ａｖｉｃｏｌａｓ：３−１３）。この種のワクチンは、ワクチン接種がされたトリと感染したトリの区別を容易にする。なぜならば、鳥インフルエンザウイルスに共通の核タンパク質又は基質のような抗原に対する抗体を誘発しないためである。それにもかかわらず、これらのワクチンは、十分に複製されない可能性があるという欠点を有し、これによりそのワクチン機能を中和することが可能である、組換えウイルスベクターに対する抗体をすでに有するトリにおいて、不完全な防御免疫を誘発する（Ｌｙｓｃｈｏｗら、（２００１）。「血球凝集素（Ｈ５）遺伝子を発現している伝染性喉頭気管炎ウイルス組換え体を用いた生ウイルスワクチン接種による致死性Ａ鳥インフルエンザウイルス感染症からのニワトリの保護（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  Ａ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｖｅ−ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（Ｈ５）ｇｅｎｅ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：４２４９−４２５９；Ｓｗａｙｎｅら、（２０００）「鶏痘ワクチンで予備免疫したニワトリにおけるインフルエンザに対する一貫した保護を提供するための鳥インフルエンザ血球凝集素遺伝子を含む組換え鶏痘ウイルスワクチンの失敗（Ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｗｌ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｐｒｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｏｗｌ  ｐｏｘ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．４４：１３２−１３７）。組換えウイルスベクターを若齢のニワトリで使用すると、母体由来抗体の効果は、使用されたウイルスベクターの種類及び移行した母体由来抗体のレベルによって変動する可能���がある。生組換えベクター使用の別の限界は、宿主の範囲が制限され（例えば、伝染性喉頭気管炎は、ガチョウでは複製されない）、結果的には、これらのワクチンが、有効性が実証されている種に制限されるということである。
【００１７】
インフルエンザに対する有効なワクチン候補の出現は、起こり得る汎流行時に、迅速な反応を保証する著明な変化を必要とする。主に組換えＨＡの使用に基づくサブユニットワクチンの使用は、この戦略が病原性ウイルスの操作を含まず、結果として、この生産が特別な安全条件を必要としないので、魅力的な代替となる。ＨＡに対する抗体は、本ウイルスを中和することが可能で、インフルエンザによる感染に対する自然免疫の基盤を成す（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  １９９２）「ワクチンにおける『インフルエンザワクチン』：免疫学的問題に対する新しいアプローチ（“Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ）」Ｒｏｎａｌｄ  Ｗ．Ｅｌｌｉｓ編、１２９−１５０ページ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）。ＨＡは、斜方晶形態のウイルスエンベロープに存在する。各モノマーは、１つのジスルフィド架橋によって結合したＨＡ１及びＨＡ２の２つの鎖として存在する。ＨＡは、約８５ｋＤａの分子量を有し、その後ＨＡ１及びＨＡ２に分かれるグリコシル化前駆体ポリペプチドとして宿主細胞において産生される。ＨＡ分子の抗原変異株は、インフルエンザの集団発生及び免疫接種後の感染の制限的制御に関与する。
【００１８】
現在まで、インフルエンザに対するサブユニットの潜在的ワクチンとして、組換えＨＡの生産がバキュロウイルス発現系により実施される方法が記載されている（Ｓｍｉｔｈら、ＵＳ５８５８３６８；Ｓｍｉｔｈら、ＵＳ６２４５５３２）。昆虫の細胞で生産されるＨＡが、ヒト（第Ｉ相及び第ＩＩ相の臨床試験において）及び家禽において評価され、両方の場合において、この安全性が実証されている。しかし、この種のワクチンは、主に、誘発することが可能な中和抗体の力価が弱いために、あまり良好な結果は得られなかった。ワクチン抗原として、ＨＡ単独では、赤血球凝集反応に関する抗体阻害物質の低い力価、及び細胞反応の低下に反映する抗原性が非常に低い。抗原性が低いため、本抗原によって有効に免疫反応を誘発するためには、高用量の投与、及びしばしば複数回の再投与が必要である。これらの不便性のため、及び鳥インフルエンザに対する有効なワクチンの需要に応えるために、非常に大量の生産が、培養細胞に基づくあらゆる生産システムに関連するその後の費用と共に必要とされる。これらの限界に加えて、計画実施の複雑さ及び１単位で免疫化される動物数が何万にも達する可能性のある家禽での複数用量の投与に関連する追加費用も念頭に置く必要がある。
【００１９】
したがって、鳥インフルエンザの予防における重要な問題は、ワクチン接種後に強力で早期の免疫反応を産生することが可能で、同時に、費用／良好な有益性の関係を可能にするサブユニットワクチンが、現在まで存在しないことである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、鳥インフルエンザウイルスエンベロープ由来のＨＡの細胞外セグメント及びＣＤ１５４分子の細胞外セグメントを含むことを特徴とする、鳥インフルエンザウイルスに対する当該のワクチンのキメラ抗原を提供することで、前述の問題を解決する。そのようなキメラタンパク質は、哺乳動物及び鳥類を鳥インフルエンザウイルス感染から保護する早期の免疫反応を誘発する。そのようなワクチン抗原の獲得は、卵での増殖を必要とはせず、生産物として、有害な免疫反応の少ない、より純粋なワクチンを提供する。そのうえ、ウイルスの不活性化又は本ウイルスの膜成分の抽出を必要とせず、抗原エピトープの変性及びその中の化学反応物質の残留物により引き起こされるヒトにおけるワクチンの安全性に関連した他の不都合を避ける。さらに、卵の非存在下で生産されるインフルエンザワクチンは、卵による適応及び継代中に生じる不均一性を避ける。このことは、高い有効性につながるインフルエンザの汎流行株によりよく適合するワクチンに結びつく。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施形態において、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いたＨＡの分泌変異体（ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ）を使用する。ＨＡの分泌変異体は、好ましくは、インフルエンザウイルスに対する高い力価の中和抗体の獲得を保証する免疫系の刺激配列（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に結合している（分子アジュバント）。
【００２２】
好ましい実施形態において、キメラワクチン抗原は、本質的に、それぞれ配列同定（配列ＩＤ）番号６、配列番号８及び配列番号４に記載された配列で同定されるトリ、ブタ又はヒト起源のＣＤ１５４分子の細胞外セグメントのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の実施形態において、キメラワクチン抗原は、本質的にウイルスサブタイプＨ５（配列番号２）、Ｈ７（配列番号９）及びＨ９（配列番号１０）のＨＡの細胞外セグメントのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明の文脈において、「本質的に」という用語は、キメラ抗原の一部であるアミノ酸配列が番号付けされた配列と高いレベルの相同性を有するが、この抗原の高い変動性により、鳥インフルエンザウイルスのＨＡ由来のいずれのアミノ酸配列も、本発明の目的のキメラ抗原の一部である可能性があることを指す。そのようなキメラ抗原は、流行性Ａサブタイプ（Ｈ５Ｎ１）、サブタイプＨ９Ｎ１、ウイルスサブタイプＨ７の分離株、ヒトに感染させるタイプＢ、並びに他の哺乳動物及び鳥類の種を感染させるインフルエンザウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の目的のために、キメラ抗原を、組換え、合成又は化学的共役法により得ることができる。ＨＡをコードする配列を、従来技術の逆転写及びその後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作成し得る。しかし、本発明の実施形態において、ＨＡをコードする配列は、病原性ウイルスに対する作業で必要とされる特別な安全条件下での作業の必要なしに、相当に短い期間で当該の配列を得ることを保証する完全な合成物である。
【００２６】
また、合成配列の使用は、所望の発現系に従ってコドン使用頻度の最適化を可能にする。同様の方法において、ＨＡの合成遺伝子のデザインは、その抗原性を増加させる目的で、タンパク質の一次構造の変化に翻訳される正確な突然変異の取り込みを可能にする。
【００２７】
好ましい実施形態で、キメラ抗原は、Ｃ末端配列が、９８％より高い純度レベルで、組換えタンパク質の精製を促進する６つのヒスチジンのペプチドを融合している、サブユニットＨＡ１及びＨＡ２によって構成されたヘテロ二量体である。次に、ヒスチジンの尾部のＣ末端で、４つの反復単位のＧｌｙ４Ｓｅｒ（４Ｇ４Ｓ）によって構成されたスペーサーペプチドが融合している。スペーサーペプチド配列のＣ末端で、分子アジュバントとしてのＣＤ１５４分子の細胞外ドメインが融合している。ＨＡとＣＤ１５４分子の間に位置するペプチド４Ｇ４Ｓは、正確な三次元的構造を得るために、両方の分子に十分な立体的自由を与えることを意図している。
【００２８】
本発明の目的のキメラ分子ＨＡ−ＣＤ１５４は、３つのポリペプチドＨＡ−ＣＤ１５４の非共有結合によって構成された三量体であることができる。使用する発現系の依存において、各モノマーＨＡ−ＣＤ１５４は、結合してヘテロ二量体ＨＡ１−ＨＡ２／ＣＤ１５４の三量体に一致することができるヘテロ二量体分子を生成する２つの分子（ＨＡ１及びＨＡ２／ＣＤ１５４）に分かれる可能性がある。ＣＤ１５４細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列は、これら分子の三量体形成を決定する。本発明の目的のワクチン抗原の三量体構造は、免疫系のプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＣＤ４０受容体とキメラ分子の相互作用のために非常に重要である。
【００２９】
一旦、血流に放出されると、本発明のワクチン抗原は、特に、免疫系のＡＰＣ細胞表面のＣＤ４０受容体と相互作用する。ＣＤ４０受容体との相互作用の後、キメラ分子ＨＡ−ＣＤ１５４はＡＰＣ細胞によって内部に取り入れられ、次に処理され、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩのコンテクストに示される。同時に、このキメラタンパク質の樹状細胞（ＤＣ）への結合は、活性化（ＣＤ８０及びＣＤ８６）及びＤＣ上にあるＣＣＲ−７ケモカイン受容体の二次的シグナルのレベルの増加を誘発し、このことにより、ＨＡを取り込んだＤＣの局所リンパ節への移行を引き起こす。これらのイベントは、免疫化された動物の脾臓においてＨＡ−特異的ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の濃度増加を誘発する。
【００３０】
また、キメラタンパク質ＨＡ−ＣＤ１５４は、特にＢ細胞と相互作用することが可能である。Ｂ細胞表面のＩｇＭの分子とＨＡとの最初の相互作用は、抗原特異的Ｂ細胞の表面の受容体ＣＤ４０とキメラ分子のＣＤ１５４の部分との相互作用を促進する。Ｂ細胞におけるこの刺激は、キメラ分子の内在化、その処理及びＭＨＣクラスＩＩコンテクストにおける提示を誘発する。これらのイベントは、Ｔリンパ球ＣＤ４＋の活性化、及びその後の２型ヘルパーＴ細胞の反応の活性化をもたらし、これによりＢ細胞での免疫グロブリンのクラススイッチ、その成熟及び増殖を誘発する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、キメラワクチン抗原を、遺伝子改変した哺乳動物のミルクから得る。本発明の目的のワクチン抗原を、好ましくは授乳過程中の哺乳動物のミルクにおいて生産する。この目的で、所望のタンパク質をコードした配列が、乳腺に特異的なプロモーターの制御下で挿入されたトランスジェニック動物のミルクにおいて、又はアデノウイルスベクターを使用することによる非トランスジェニック動物の乳腺上皮の直接的形質転換を通して生産を実施することができる。
【００３２】
別の好ましい実施形態において、ＣＤ１５４分子の細胞外ドメインに融合したＨＡに基づくキメラ抗原を、遺伝子改変された酵母菌の培養、又はコーディング遺伝子を含むアデノウイルスベクターで形質導入した哺乳動物の細胞培養において生産した。
【００３３】
また、前述のキメラ抗原を含む鳥類及び哺乳動物におけるインフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を引き起こすことが可能なワクチン組成物も本発明の目的である。本発明の特定の実施形態において、そのようなワクチン組成物は、トリ、ブタ及びヒトにおいてインフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を引き起こす。ワクチン組成物を、予防の形で、全身又は粘膜経路によりヒトを含む動物に投与することができる。そのような組成物を用いたワクチン接種を通して、インフルエンザウイルスの感染に関係した莫大な人的、物質的及び経済的損失が避けられる。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）
ウイルスＡ／ベトナム／１２０３／２００４、並びにヒト、ブタ及びニワトリＣＤ１５４分子由来の血球凝集素の細胞外ドメインをコードする遺伝子断片の獲得。
極めて病原性の高いウイルスＡ／ベトナム／１２０３／２００４に由来するＨＡ分子のコード配列を、化学的に合成した。一次タンパク質配列を、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のデータベースより入手した（アクセス番号ＡＹ８１８１３５）。合成は、配列番号１として記載された配列で同定された配列のヒマラヤ山羊（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）での発現のために最適化されたコドン使用頻度を使用することにより実施した。合成遺伝子は、タンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを除外したアミノ酸１から５３７までのＨＡのアミノ酸配列をコードする（配列番号２）。遺伝子合成の間に、さらなる制限部位ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩを、コーディング配列の５’末端に組み込んだ。翻訳効率を増加させる目的で、コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列を、開始コドンの直前に組み込んだ。ＨＡコード断片の３’末端を、以下の順序で組み込んだ：ＮｈｅＩ制限部位、６ヒスチジン断片のコード断片、制限部位ＥｃｏＲＩ、終止コドン及び制限部位ＥｃｏＲＶ。
【００３５】
また、ヒト、ブタ及びニワトリＣＤ１５４分子の細胞外ドメインのコード配列も、化学的に合成した。合成を、ＮＣＢＩデータベースから参考文献ＡＪ２４３４３５（セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）に関する）、ＡＢ０４０４４３（イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）に関する）及びＸ６７８７８（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に関する）に従って実施した。ヒマラヤ山羊における発現のために最適化されたコドン使用頻度を、ニワトリＣＤ１５４（配列番号５）及びブタＣＤ１５４（配列番号７）分子の合成のために使用した。ヒトＣＤ１５４（配列番号３）のコドン使用頻度は変更しなかった。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの４つの反復単位によって構成されたペプチドをコードするセグメントを、これらの立体的自由度を確実にする目的で、３つの分子のアミノ酸末端に組み込んだ。
【００３６】
制限部位ＥｃｏＲＩを、ＣＤ１５４分子の細胞外ドメインのコード断片の５’末端に組み込んだ。ＳａｌＩ制限部位を、３’末端（終止コドンの直後）に組み込んだ。合成ヌクレオチド配列から得られたポリペプチドは、配列番号６（セキショクヤケイに関する）、配列番号８（イノシシに関する）及び配列番号４（ヒトに関する）として記載された配列で同定されるように見える。
【００３７】
（実施例２）
血球凝集素発現カセットの構築。
ＨＡの人工遺伝子は、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで消化し、次に前もって同じ酵素で消化した発現ベクターｐＡＥＣ−ＳＰＴ（Ｈｅｒｒｅｒａら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：５４８−５５１）に挿入した。得られたベクターを、ｐＨＡと名づけた。ベクターｐＨＡを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ＨＡの終止コドンの直前のヒスチジン尾部の後で切断する）及びエンドヌクレアーゼＳａｌＩ（ベクターｐＨＡからＨＡの３’末端の複数のクローン部位を切断する）で消化した。ＣＤ１５４遺伝子を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩを用いて、ＧｅｎｅＡｒｔより供給されたプラスミドベクターから除去し、ベクターｐＨＡにクローン化した。これらのクローニングから、３つの哺乳動物細胞発現ベクターを生成した：ｐＨＡ−ＣＤｐ（ニワトリのＣＤ１５４のドメインを含む）、ｐＨＡ−ＣＤｃ（ブタのＣＤ１５４のドメインを含む）、ｐＨＡ−ＣＤｈ（ヒトのＣＤ１５４のドメインを含む）。すべての場合で、ＨＡのキメラ遺伝子は、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｅａｒｌｙ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｐＣＭＶ）の制御下であった。
【００３８】
（実施例３）
ＨＡ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（ΔＥ１ΔＥ３）の構築。
複製欠損アデノウイルスベクターを、ＡｄＥａｓｙシステムを基に構築した（Ｔｏｎｇ−Ｃｈｕａｎ  Ｈら、（１９９８）「組換えアデノウイルスを作成するための簡略システム（Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９５：２５０９−２５１４）。プラスミドｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶを、トランスファーベクターとして使用した。ＡｄＥａｓｙに基づくシステムは、組換えアデノウイルス構造の迅速及び単純な代替を構成する。ＨＡ並びにＣＤ１５４分子のヒト、ブタ及びニワトリ変異体の細胞外ドメインに融合したＨＡのコード配列を、エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ及びＳａｌＩで除去し、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターのＸｈｏＩ部位にクローン化した。得られたベクター（ｐｔｒａｃｋ−ＨＡ、ｐｔｒａｃｋ−ＨＡＣＤｐ、ｐｔｒａｃｋ−ＨＡＣＤｈ、ｐｔｒａｃｋ−ＨＡＣＤｃ）を、ＰｍｅＩ消化によって直線化し、ｐＡｄＥａｓｙベクターで菌種ＢＪ５１８３に共電気穿孔した。感染性ビリオンを得るために、組換えウイルスのゲノムを、エンドヌクレアーゼＰａｃＩで消化し、ＨＥＫ−２９３細胞系に形質移入した。４種のウイルスベクター：Ａｄ−ＨＡ、Ａｄ−ＨＡＣＤｐ、Ａｄ−ＨＡＣＤｈ及びＡｄＨＡＣＤｃを作成した。すべてのベクターを、ＨＥＫ−２９３細胞系において、５×１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）の力価に達するまで増幅した。生産されたウイルスを、ＣｓＣｌ中で二回、遠心分離によって精製し、貯蔵緩衝液に対して透析し（１０ｍＭトリスｐＨ８．０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％サクロース（Ｓａｃａｒｏｓｅ））、その後の使用のために−７０℃で保存した。
【００３９】
（実施例４）
ヤギ乳腺上皮の直接導入：
使用したヤギは、授乳期間の３カ月目で、１日当たり平均１．３リットルのミルクを出した。０日目、動物に、処置中のストレスを減らすために、ジアゼパム１０ｍｇの用量を筋肉内経路で投与した。槽の大部分のミルクを除くために、動物から多量に搾乳し、乳腺を、３７℃の食塩水を用いた注入によって２回すすぎ、その後搾乳した。すべての注入は、蠕動ポンプにつないだカテーテルを使用して、乳頭管（ｎｉｐｐｌｅ’ｓ  ｃｈａｎｎｅｌ）を直接通して実施した。注入は、ゆっくりと実施し、一方、同時に、注入されている乳房にマッサージを行った。
【００４０】
ヤギでは、乳房が２つの独立した半分に分かれている可能性がある。ＥＧＴＡ３０ｍＭを補充し、１０９ＣＦＵ／ｍｌのウイルス負荷を含むＰＢＳ溶液を、各乳腺に注入した。乳房の各半分に注入した容量は、乳房の容量によってさまざまであった（平均して、乳房の媒質で６００ｍｌ）。注入後、溶液が管及び槽の全体に達して均一的に分布することを促進するために、乳房にマッサージを行った。翌日、注入した溶液を、搾乳により除去した。槽及び乳管に残る最大量のアデノウイルスベクターを取り除く目的で、再度、乳腺をＰＢＳ注入によってすすいだ。
【００４１】
注入した動物からのミルクの採取を、注入の４８時間後に開始し、手指による搾乳により実施した。１日２回搾乳を行い、１回は朝に、もう１回は午後の終わりに実施した。大部分の採取したミルクは、以降のタンパク質の精製のために−７０℃で保存した一方、少量の試料は、バッチごとのＨＡ変異体の内容物を検出及び定量化するために使用した。
【００４２】
ミルクのＨＡ変異体の検出を以下のように実施した。分離緩衝液の４容量を（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）、１５０μｌのミルク試料に加え、氷上で３０分間インキュベートした後、試料を４℃、１５，０００ｇで３０分間遠心した。血清画分を回収し、タンパク質１０μｌを７％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。タンパク質を、ニトロセルロースフィルターへ移し、ＨＡの存在を、ニワトリ高度免疫血清を使用することによって検出した。ホースラディシュペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）に共役したマウス抗ニワトリ抗体を、二次抗体として使用した。免疫反応バンドを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈの強化化学ルミネセンス（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ；ＥＣＬ）によって視覚化した（図１）。ＨＡの変異体は、大部分はポリペプチド鎖（ＨＡ０及びＨＡ０−ＣＤ１５４）の形態で生産したが、両方の分子において、ドメインＨＡ１の存在も観察することができる。
【００４３】
ＨＡ変異体の定量化を、ＣＩＧＢにより開発されたＨ５特異的ＥＬＩＳＡにより実施した。Ｅ１ΔＥ３アデノウイルスベクターを注入した動物において、ＨＡの変異体を、注入の１１日後まで検出し、ＨＡ、ＨＡＣＤｐ、ＨＡＣＤｈ及びＨＡＣＤｃタンパク質の採取の最初の７日間における平均発現が、それぞれ０．９４ｇ／Ｌ、０．８６ｇ／Ｌ、０．７８ｇ／Ｌ、０．８７ｇ／Ｌであった。
【００４４】
（実施例５）
メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターの構築。
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターｐＰＳ１０を、制限エンドヌクレアーゼＮａｅＩで酵素的に消化し、次に末端脱リン酸化及びＨＡ、ＨＡＣＤｐ、ＨＡＣＤｈ及びＨＡＣＤｃコード遺伝子のさらなる挿入のためにアルカリリン酸塩で処理した。
【００４５】
タンパク質ＨＡ、ＨＡＣＤｐ、ＨＡＣＤｈ及びＨＡＣＤｃのコード配列を、エンドヌクレアーゼＢｃｌＩ（切断部位は、ＨＡの分泌ペプチドの直後で見られる）及びＳｍａＩ（切断部位は、停止コドンの直後で見られる）を用いた消化によって除去した。得られた末端を、先端をブラント（平滑）化させるためにクレノウポリメラーゼで処理し、次に各バンドをｐＰＳ１０ベクターにクローン化し、ｐＰＳ−ＨＡ、ｐＰＳ−ＨＡＣＤｐ、ｐＰＳ−ＨＡＣＤｈ及びｐＰＳ−ＨＡＣＤｃ酵母菌発現ベクターを得た。すべての場合で、ＨＡの異なる変異体のコード配列は、アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ１）の制御下であり、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＳｕｃ２由来の分泌ペプチドに融合した。
【００４６】
形質変換の前に、プラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩを用いた消化によって開環した。Ｐ．パストリスの菌株ＭＰ３６を、電気穿孔法によって発現ベクターｐＰＳ−ＨＡ、ｐＰＳ−ＨＡＣＤｐ、ｐＰＳ−ＨＡＣＤｈ及びｐＰＳ−ＨＡＣＤｃで形質転換した。そのような菌株は、形質転換後、表現型Ｈｉｓ＋を得る栄養要求性変異体ｈｉｓ３である。
【００４７】
ドットブロット法によって同定された形質転換クローンを、サザンブロット法により解析し、表現型ＭｕｔＳ（メタノールの使用が低い）及びＨｉｓ＋と対応する、組換えプラスミドの発現カセットに対するＰ．パストリスの遺伝子ＡＯＸ１の置換によって組込みが生じたことを判定した。ＡＯＸ１の遺伝子置換は、ベクターとゲノムの間のＡＯＸ１及び３’ＡＯＸ１のプロモーター領域の交差によって生じる。
【００４８】
これらの交差のため、遺伝子ＡＯＸ１のコード領域の欠失が生じる。表現型ＭｕｔＳによる組換え株は、遺伝子ＡＯＸ２でのオキシダーゼアルコール（ＡＯＸ）の生産を修復するが、メタノールに関するこの増殖率は低い。
【００４９】
ＨＡの異なる変異体をコードする遺伝子は、メタノールを通して誘導性であるプロモーターＡＯＸ１の制御下にある。Ｐ．パストリスは、低レベルの自身のタンパク質のみ分泌し、その培地はタンパク質の補充を必要としない、したがって、分泌される異種タンパク質が培地の総タンパク質の大部分を構成すること（８０％まで）が予期できる。組換え抗原の生産は、５Ｌ発酵槽で培地へのメタノールの添加及び培地のｐＨを８．０に維持することによって実施した。図２で示すように、Ｐ．パストリスで生産されたＨＡの大部分は、グリコシル化され、培地に分泌された。
【００５０】
（実施例６）
ＨＡ、ＨＡＣＤｐ、ＨＡＣＤｈ及びＨＡＣＤｃ抗原の精製。
ヤギミルク由来のＨＡ、ＨＡＣＤｈ、ＨＡＣＤｈ及びＨＡＣＤｃの精製のために、脂肪を４℃、１０，０００ｒｐｍでの３０分間の遠心によって除去した。無脂肪乳を、緩衝液トリスＨＣｌ  ｐＨ８．０、ＣａＣｌ２  １０ｍＭに希釈１：５（ｖ／ｖ）した。４℃で１時間後、カゼインを１０，０００での２０分間の遠心によって沈降させた。
【００５１】
抗原をそれぞれ含むミルク血清を、５μＭ、０．８μＭ及び２μＭのフィルターのガラスプレフィルターでの連続的濾過によって清澄化した。清澄化した血清を、リン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０、１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で透析濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡセファロースカラムにローディングした。イミダゾール５０ｍＭによる洗浄ステップを実施し、組換えタンパク質を、リン酸緩衝液中２００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【００５２】
Ｐ．パストリスで生産された抗原ＨＡ、ＨＡＣＤｐ、ＨＡＣＤｈ及びＨＡＣＤｃの精製については、一旦、発酵を終了し、細胞を遠心で培地から分離した。組換え抗原を含む媒体を、５μＭ、０．８μＭ及び２μＭのフィルターにおける連続的濾過によって清澄化した。残りの精製は、ミルクから抗原を精製することに従った処置と同様の方法で実施した。
【００５３】
（実施例７）
ニワトリでのＨＡ及びＨＡＣＤワクチン抗原に基づくワクチン組成物の免疫原性の評価。
免疫接種：本試験で使用したＨＡ及びＨＡＣＤｐ抗原を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定分析によって測定可能である、９８％を超える純度まで非変性法によって精製した。タンパク質の同一性は、質量分析法によるアミノ酸分析、及びＨ５に対して高度免疫血清を使用する「ウエスタンブロット法」によって確認した。両方の抗原を、油アジュバントモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ７２０で調合した。免疫接種のために、３週齢のニワトリを使用した。使用される用量に従って、各１０羽の８群を作成した。群の４羽に、抗原ＨＡを基にした調合物を投与し、一方、別の４羽にＨＡＣＤｐを基にした調合物を投与した。動物を、最終調合物２００μｌで群ごとに抗原１μｇ、３μｇ、６μｇ又は１２μｇの皮下投与によって免疫化した。１ｍｌのシリンジに結合した１８Ｇ針を免疫接種のために使用した。抗体を投与しないプラセボ群を、本試験に組み入れた。血清学的反応の分析のための血液試料を、ワクチン接種の２８日後に採取した。
【００５４】
赤血球凝集反応阻害及びＥＬＩＳＡ：赤血球凝集反応アッセイ（ＩＨＡ）の阻害のために、血清をＵ底マイクロタイタープレートに連続的に希釈した（最初の希釈１：２）。不活性ウイルス抗原Ａ／ベトナム／１２０３／２００４の血球凝集素４単位（前もってニワトリ赤血球の０．５％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）懸濁液に対して滴定によって測定した）を各ウェルに加えた。混合物を室温で１時間インキュベートし、一旦この時間が経過すると、ＰＢＳ中０．５％のニワトリ赤血球の同容量を各ウェルに加えた。赤血球凝集反応の力価阻害物質（ｔｉｔｅｒｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）を３０分後に読み取った。Ｈ５に対して特異的な抗体をＥＬＩＳＡによって決定した。プレートを、ＡｄＨＡベクターに感染させた細胞培養から生産及び精製したＨＡタンパク質の０．５μｇ／ウェルで被覆した。ＥＬＩＳＡによって得られた力価を、同様の方法で希釈した陰性試料より、平均＋標準偏差の２倍、優れた光学濃度を提供する高い希釈として表した。
【００５５】
サイトカイン発現アッセイ：ＨＡ又はＨＡＣＤｐの６μｇで免疫化したニワトリの脾臓を、ワクチン接種の３０日後に無菌的に収集した。均一な細胞懸濁液を得るために、脾臓を小さな断片に切断し、１２０μＭの穴径のスチールフィルターに通した。細胞を、１，０００で１０分間遠心して収集し、ＰＢＳに懸濁した。細胞懸濁液を、１：１（ｖ／ｖ）の関係でヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）カラム１０８３（Ｓｉｇｍａ）にゆっくりと加え、１，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。単核細胞を、インターフェーズリング（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｒｉｎｇ）で収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０媒質のミリリットル当たり、１×１０７の濃度に調整した。細胞を、ウェル当たり５×１０６細胞の割合で２４ウェルプレートに播種した。
【００５６】
リンパ球増殖アッセイを実施するために、細胞をＣＯ２  ５％下の４１℃で１８時間、１μｇ／ｍｌの濃度のタンパク質ＨＡの添加によって刺激した。陰性対照として、プラセボでワクチン接種したニワトリの脾臓の細胞を採取した。陽性対照として、コンカナバリン（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎｅ）Ａ（ＣｏｎＡ）でインキュベートした脾臓細胞を使用した。培養物を１８時間後に収集し、サイトカイン遺伝子の導入を評価するために総リボ核酸（ＲＮＡ）を精製した。総ＲＮＡを、トリリエイジェント（Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｓｉｇｍａ）法を使用することによって精製した。ＲＮＡの試料は、水に懸濁し、２６０ｎｍで分光測定によって定量化した。
【００５７】
インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及びグリセルアルデヒド−ホスホデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のＲＮＡメッセンジャーの相対レベルを測定する目的で、１９９１年のＳｖｅｔｉｃ及び共同研究者（Ｓｖｅｔｉｃ，Ａら、（１９９１）、「インビボでのマウスＩｇＤ抗体に対するヤギ抗体による一次免疫化後のサイトカイン遺伝子発現（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＤ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２３９１−２３９７）の記載のように、逆転写アッセイ及びさらなるＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を３回実施した。ＲＮＡを、製造者の指示に従って逆転写システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３回逆転写した。予備研究で、分析するすべての遺伝子に対して、ＰＣＲの各サイクルで増幅したＤＮＡ量のプロフィールを作成した。使用したサイクル数は、増幅曲線の指数領域内で選択した。サイクルの最適数は、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γでは３５、ＧＡＰＤＨでは２８であった。
【００５８】
陽性対照細胞（Ｃｏｎ  Ａでインキュベートした）及び陰性対照細胞（プラセボ群から誘導及び非刺激）の両方を、各試験に組み入れた。構成遺伝子ＧＡＰＤＨを、各ＰＣＲで増幅し、当該の遺伝子を評価する前に、各反応に対する最初の相補ＤＮＡの同様な量を保証するために使用した。
【００５９】
ＰＣＲの後、最終反応物１５μｌを、２％アガロースゲル電気泳動法によって分析し、濃度測定分析によって半定量化した。バンドの輝度を、画像解析「コダック１Ｄ（Ｋｏｄａｋ  １Ｄ）」の計算プログラムを使用して測定した。結果は、当該のバンドにおけるピクセルの輝度値の平均として、及び構成遺伝子ＧＡＰＤＨに対して得た輝度に関するこの値の平均として推定した遺伝子の相対的発現として報告した。
【００６０】
ニワトリで得られた結果は、ワクチン抗原ＨＡ及びＨＡＣＤｐを含む油中水型調合物（ｗａｔｅｒ  ｉｎ  ｏｉｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）が、ワクチン接種した動物に対して体液性免疫反応及び細胞免疫反応を誘発したことを示している。両方の場合で、免疫反応は、使用した用量に依存していた（図３Ａ）。ＨＡ又はＨＡＣＤｐの６μｇでワクチン接種した動物における赤血球凝集反応の抗体阻害物質の動態は、ワクチン接種後の第４週において、キメラ抗原ＨＡＣＤｐがＨＡ抗原でワクチン接種された動物において発生したＩＨＡ抗体の反応より約１０倍高い反応を誘発できることを示した（図３Ｂ）。また、末梢血の単核細胞を抗原ＨＡに曝露させると、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の非常に顕著な発現が、キメラ抗原ＨＡＣＤｐでワクチン接種される動物で観察された（表１）。この結果は、ＣＤ１５４のＨＡへの融合が、特にＨＡ分子に対して、細胞レベルで強い反応を誘発することが可能であることを示している。
【００６１】
表１：細胞媒介免疫反応
【表１】
2009528305.tif 000002
インビトロの生産におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の相対的レベルは、本群におけるすべての動物の算術平均として示す。
【００６２】
（実施例８）
ＨＡ及びＨＡＣＤｈ抗原に基づくワクチン組成物のヒトにおける免疫原性。
ＨＡ及びＨＡＣＤｈタンパク質を含むワクチン組成物の安全性、反応原性及び免疫原性について、ヒトにおける臨床試験で評価した。両方のタンパク質を、９８．５％より高い純度レベルで得て、水酸化アルミニウムに吸着させて調合した。選択基準として、過去６カ月にいかなるワクチン接種も受けておらず、いかなるインフルエンザ症状も示していない２５歳から４０歳の健常な男性を採用した。各８名の６つの実験群を、投与する抗原の用量（２５μｇ、５０μｇ又は１００μｇ）及び抗原のタイプ（ＨＡ又はＨＡＣＤｈ）を基に作成した。０週時に、すべてのボランティアに免疫化し、４週間後に２回目の免疫接種を行った。投与は、組成物０．５ｍｌの筋内注射によって行われた。
【００６３】
血液試料を、ワクチン接種時、及び２週間の間隔で以降の３週間に採取した。赤血球凝集反応の抗体阻害物質のレベル測定のために、血清試料を、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）由来のレセプター破壊酵素で処理し、続いて非特異的阻害物質の不活化のために６５℃で加熱した。ウイルスＡ抗原／ベトナム／１２０３／２００４に対する赤血球凝集反応を阻害する抗体を、０．５％ニワトリ赤血球を使用したマイクロタイトレーションの標準アッセイにより測定した。
【００６４】
ウイルスＡ／ベトナム／１２０３／２００４由来のＨ５タンパク質に対して特異的なＩｇＧ免疫グロブリンレベルを、ＥＬＩＳＡによって評価した。プレートは、細胞培養で生産したＨＡタンパク質で被覆した。次に、各血清の連続的希釈を実施した。よく洗浄した後、ウサギで生産し、ＨＲＰと複合化した抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに加えた。発色は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで実施した。ＥＬＩＳＡの力価は、抗原を含むウェルの光学濃度が抗原のない対応するウェルの少なくとも２倍である高い希釈として表した。
【００６５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコールアイソパック（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｉｓｏｐａｑｕｅ）勾配（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．オハイオ州Ａｕｒｏｒａ）の分離によって単離し、免疫学的アッセイのために凍結保存した。解凍した後、製造業者の指示に従って、ＰＢＭＣをＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のために使用した。簡単に述べると、プレートを、捕獲抗体で終夜被覆した。２つの洗浄ステップの後、プレートを、ＲＰＭＩ−１６４０媒質で１時間ブロックした。すべてのウェルにＨＡ抗原を加え、５×１０５の細胞を播種した。培養物を、５％ＣＯ２、３７℃で、４８時間インキュベートした。細胞を、デカンタントし、プレートを、ビオチンと複合化した抗インターフェロン抗体で２時間インキュベートした。２つの洗浄ステップの後、ＨＲＰと複合化したアビジンを、各ウェルに加えた。発色は、基質として３−アミノ−９−エチルカルバゾールを含む溶液を使用して実施した。結果は、ＨＡ及びＨＡＣＤｈ組換え抗原を含むワクチンが、局所の有害反応を生じさせないことを示した。
【００６６】
ＨＡＣＤｈキメラタンパク質で免疫化されたボランティアと同様に、ＨＡで免疫化されたボランティアでは、細胞免疫反応及び体液性免疫反応は、投与したタンパク質の用量と比例して増加した。それにもかかわらず、ＨＡとＨＡＣＤｈ変異体との比較は、キメラタンパク質が、ＨＡの等価用量に対して４．２倍高い体液性反応（図４）、及びＨＡの等価用量によって生じる反応より５．２倍高い細胞反応を誘発することが可能であることを示した。
【００６７】
（実施例９）
ＨＡ及びＨＡＣＤｃ抗原に基づくワクチン組成物のブタにおける免疫原性。
体重が１８〜２０ｋｇのランドレース種ブタを使用した。動物を、評価する抗原及び用量によって６つの実験群に割り付けた。ブタ８頭を、実験群当たり使用した。ＨＡ及びＨＡＣＤｃに関して、２０μｇ、４０μｇ及び８０μｇの用量を評価した。両方のワクチン抗原を、油中水型乳濁液として調合し、２ｍｌの用量で頚筋に対する注射によって接種した。アジュバント及びリン酸塩食塩液１：１（ｖ／ｖ）によって構成されたプラセボを、同様な方法で接種した。
【００６８】
血液試料を、ワクチン接種の時点、及び続く３カ月間で７日ごとに採取した。ＩＨＡの抗体価を測定する前に、血清試料を、非特異的阻害物質を不活性化するためにコレラ菌由来のレセプター破壊酵素で処理した。ＩＨＡの抗体価は、０．５％ニワトリ赤血球を使用したマイクロタイトレーションの標準アッセイにより測定した。細胞レベルでの免疫反応を、ＨＡ抗原で刺激したＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２のＲＮＡレベルの相対的推定によって評価した。
【００６９】
免疫化した動物において、正常な臨床パラメータの変化は観察されなかった。このことは、ワクチン組成物に対する有害反応が存在しないことを示唆する。組換え抗原ＨＡ及びＨＡＣＤｃを含むワクチンが、局部特性の極めてわずかな有害反応しか引き起こさないという結果を示した。両群において、ＩＨＡ抗体価での用量依存、並びにＨＡ抗原の存在下においてサイトカインを増殖及び産生させる細胞の能力として表される細胞反応が観察された。ＨＡＣＤｃキメラ抗原で免疫化された群では、体液だけでなく細胞レベルで免疫反応の著しい増強が観察された。そのようなタンパク質は、ＩＨＡにおいて抗体の力価を、ＨＡの対応する用量によって生じた力価より２．５倍高く誘発することができた。また、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２発現レベルに関連した細胞反応能力は、ＨＡＣＤｃキメラ抗原で免疫化された動物では、ＨＡの同等量で免疫化されたブタのものと比較して、それぞれ４．５及び６倍高かった。
【００７０】
（実施例１０）
鳥インフルエンザウイルスの異なるサブタイプ由来の血球凝集素に基づくキメラ抗原の発現。
コードヌクレオチド配列を、ＨＡ細胞外ドメインに関して鳥インフルエンザウイルスＡ／オランダ／３３／０３（Ｈ７Ｎ７）（配列番号９）及びＡ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）（配列番号１０）から合成した。
【００７１】
両方の遺伝子をヒマラヤ山羊における発現に最適なコドン使用頻度を使用することによってデザインし、制限部位ＸｈｏＩ（５’）及びＥｃｏＲＩ（３’）に隣接させた。両方の遺伝子を、ブタＣＤ１５４分子の細胞外ドメインを含むアデノウイルストランスファーベクターｐＡｄｔｒａｃｋに直接クローン化した。得られた組換えクローンを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞系に形質移入し、７２時間後、キメラ分子の発現を培地で検出した。両方の融合タンパク質は、主に三量体として発現し、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の１回のステップによって培地から精製することができた。
【００７２】
ウイルスＡ／オランダ／３３／０３（Ｈ７Ｎ７）及びウイルスＡ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）由来のＨＡのキメラ変異体を含むアデノウイルストランスファーベクターを、ｐＡｄＥａｓｙプラスミドベクターに含まれるアデノウイルスゲノム内に相同的組換えによって組み込み、そこから、両方のタンパク質を含むアデノウイルスを生成及び増幅させた。
【００７３】
ＣＤ１５４の細胞外ドメインに融合した前述の分離株由来のＨＡを、ヤギミルクにおいて高濃度で生産した。この戦略は、合成遺伝子が利用できる時期から５５日より短い期間でＨＡのキメラ変異体の数グラムを生産することを可能にした。
【００７４】
両方のキメラ抗原の精製後、ブタでの免疫原性実験を、油中水型調合物で、２ｍｌの用量での頚筋に対する筋肉注射によって投与した動物当たり２０μｇの一定量を使用して実施した。有害反応は、観察されなかった。血清学的解析は、両方のタンパク質が、ワクチン接種後の最初の２８日以内に、１：８００より高いＩＨＡ抗体価に達する強力な体液性免疫反応を誘発することができることを示した。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】それぞれＡｄＨＡ及びＡｄＨＡＣＤｐアデノウイルスベクターで形質導入したヤギのミルクにおけるＨＡ及びＨＡＣＤｐ抗原の発現。アデノウイルス形質導入の５日後のミルク血清試料に存在するタンパク質を、還元条件（●）又は非還元条件（Δ）下で７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。抗原ＨＡ及びＨＡＣＤｐの免疫同定を、Ｈ５Ｎ３株に対する過免疫のニワトリ血清を用いた「ウエスタンブロット法」によって実施した。
【図２】表現型ＭｕｔＳを示す組換えＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンの発現解析。培地に存在する所望のタンパク質のウエスタンブロット。レーン１：ＨＡ；レーン２：ＨＡＣＤｈ；レーン３：非形質転換ＭＰ３６；レーン４：分子量マーカー。
【図３】ワクチン接種したニワトリにおける変異体ＨＡとＨＡＣＤｐとの免疫反応の比較。（Ａ）各１０羽のニワトリの８つの実験群を抽出し、この群に、ＨＡ又はＨＡＣＤｐの１、３、６又は１２μｇの固有用量を皮下投与した。ワクチン接種の２８日後、赤血球凝集反応の抗体阻害物質の力価を測定した。この結果を、各群について算術平均＋／−標準偏差として表す。（Ｂ）ＨＡ及びＨＡＣＤｐの６μｇでワクチン接種したニワトリにおける赤血球凝集反応の抗体阻害物質の動態。データは、各試料抽出での群の全動物の算術平均として表す。
【図４】ＩＨＡ抗体の動態。ワクチンを、矢印によって示される週に投与した。不連続線は、１：８０の力価を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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