(57)【要約】  薬剤としての、モノマーＴＧＦ−βまたはそのフラグメントあるいは誘導体の使用を提供する。これらの薬剤は、好ましくは、モノマーＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体を含む。提供される該薬剤は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害、上皮再生の促進、または線維症の予防および／または治療において使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤としての使用のための、ＴＧＦ−βモノマー、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体。
【請求項２】
薬剤としての使用のための、ＴＧＦ−β３モノマー、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体。
【請求項３】
前記ＴＧＦ−βモノマーは、約１２ｋＤａの分子量を有する、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害における使用のための薬剤の調製における、請求項２または請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ＴＧＦ−β３モノマー、またはフラグメントあるいは誘導体は、配列識別番号３を有する野生型ＴＧＦ−β３モノマー、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体である、請求項２から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記創傷は、皮膚創傷である、請求項４または請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記創傷は、眼創傷である、請求項４または請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記創傷は、急性創傷である、請求項４から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記創傷は、火傷である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記創傷は、慢性創傷である、請求項４から７のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
上皮再生の促進における使用のための薬剤の調製における、請求項２または請求項３に記載の使用。
【請求項１２】
前記上皮は、表皮を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記上皮は、目の上皮を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
線維症の予防および／または治療における使用のための薬剤の調製における、請求項２または請求項３に記載の使用。
【請求項１５】
前記線維症は、肺線維症、肝線維症、強皮症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎臓線維症、眼線維症、および子宮線維症から成る群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記モノマー、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体は、０．７８ｐＭから０．７８ｍＭの濃度で提供される、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記薬剤は、約５から７のｐＨを有する、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記薬剤は、実質的にアルコールを含まない、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記ＴＧＦ−βモノマー、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体は、
（ｉ）２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）またはその機能的アナログと、
（ｉｉ）低分子量スルフヒドリル／ジスルフィドレドックスシステムと、
を含む溶液へ、可溶化された変性モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメントあるいは誘導体）を加えるステップと、前記溶液中の前記ＴＧＦ−βを、生物活性モノマーＴＧＦ−βが形成されるまで培養するステップと、を含む方法によって、その生物活性型へ混合される、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
創傷治癒を加速、方法および／または瘢痕化を阻害する方法であって、かかる治療を必要とする患者へ、モノマーＴＧＦ−βまたはその生物活性フラグメントあるいは誘導体の治療有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
前記ＴＧＦ−β３モノマー、またはフラグメントは、配列識別番号３を有する野生型ＴＧＦ−β３モノマー、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記創傷は、皮膚創傷である、請求項２０または請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記創傷は、眼創傷である、請求項２０または請求項２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、新規薬剤の提供に関する。好適な実施形態において、本発明は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減、または阻害における使用に適した薬剤を提供する。本発明は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減、あるいは阻害の方法をさらに提供する。
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、多様な生物活性を有するサイトカインのファミリーである。ＴＧＦ−βファミリーは、５つのアイソフォーム、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５を含む。
ＴＧＦ−βは、多くの異なる治療状況で有用性を持つ。ＴＧＦ−βの治療可能性の結果として、ＴＧＦ−βファミリー、特にＴＧＦ−βｓ１−３のメンバーの薬学的応用に非常に関心がある。
【０００３】
ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３はすべて、創傷治癒反応の調節において、重要な役割を果たすことは既知である。ＴＧＦ−β活性は、創傷治癒の速度と、さらに治癒の結果として生じる瘢痕化の範囲に影響する可能性がある。
ＴＧＦ−β１は、強皮症、血管形成障害、腎疾患、骨粗しょう症、骨疾患、糸級体腎炎および腎疾患の予防および／または治療において使用されている。
【０００４】
ＴＧＦ−β２は、神経膠腫、非小細胞肺癌、膵臓腫瘍、固体腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、加齢性黄斑変性症、眼外傷、骨粗しょう症、網膜症、潰瘍、上皮性悪性腫瘍、口内炎および強皮症の治療に使用することができる。
ＴＧＦ−β３は、線維症、肺線維症、肝硬変、強皮症、血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨誘導および軟骨誘導、体外受精、口腔粘膜炎、腎疾患の治療において、瘢痕化の予防、軽減、または阻害、および中枢神経系における神経再接続の強化、眼手術（レーシック手術またはレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）など）の合併症または眼底の瘢痕化（増殖性硝子体網膜症に関連する瘢痕化など）を予防、軽減または阻害する際に使用することができる。
【０００５】
ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、２つのペプチド鎖を含むダイマーの形で、自然に存在する。活性化ＴＧＦ−ダイマーは、約２５．４ｋＤａの分子量を有する。活性化ＴＧＦ−βダイマーフラグメントは、疎水性相互作用、およびイオン相互作用によって安定化され、それらはサブユニット間ジスルフィド架橋によって、さら強化される。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの生物活性、そしていかなる治療活性も、活性ダイマーのみによって誘発されるということが、一般的に認められる。
上記を考慮して、ＴＧＦ−βファミリーメンバーの治療的特性を活用することができる薬剤を提供することの根強い必要性が存在するということが、認識されるだろう。しかしながら、ＴＧＦ−βファミリーメンバーを含む医薬組成物に対する、このよく認識された要求に関わらず、治療的利用のためのＴＧＦ−βの製造に関する多くの認知された問題が存在する。
【０００６】
治療薬としてのＴＧＦ−βの利用の最も不利益な点の１つは、原核生物ホストを使用して生物学的（および治療的）活性タンパク質ダイマーを生成するために、生物活性ダイマー型に対する強化再生が必要とされることである。ダイマー形成は、製造予定を著しく拡大することができる。このことは、さらに、すべてのＴＧＦ−βの治療的利用を限定することに関して、重要な意味を持つ。
【０００７】
ＴＧＦ−βを含む先行技術の医薬組成物に関連する、少なくとも幾つかの問題を未然に防ぎ、または軽減することが本発明の目的である。特に、これらのタンパク質の生物活性ダイマーを生成するために使用される時間的強化製造方法の使用に関連する問題を未然に防ぎ、または軽減することが、本発明の特定の実施形態の目的である。
【０００８】
本発明の第１の側面において、薬剤としての使用のための、ＴＧＦ−βモノマー、またはその生物活性フラグメントが提供される。
本発明は、モノマーＴＧＦ−βは、以前は、ダイマーＴＧＦ−βタンパク質によってのみ提供されると考えられていた生物活性を使用することができるという、発明者の非常に驚くべき発見に基づく。本発見は、選択されたＴＧＦ−βの生物学的特性を活用することのできる効果的な薬剤におけるモノマーＴＧＦ−βの利用を可能とする。本発明から直ぐに分かるように、つまり本発明は、適した薬剤の製造に関連する時間と費用を軽減させることにより、ＴＧＦ−βが治療的に利用され得る実用化を非常に拡大する。
【０００９】
本発明者は、本発明による薬剤の利点は任意のモノマーＴＧＦ−βアイソフォームを含む薬剤によって提供することができると考える。従って、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−βの参照は、ＴＧＦ−β１、２、３、４および５のようなＴＧＦ−βアイソフォームの任意の生物活性モノマー型を含むように解釈することができる。本発明の薬剤における使用に適した好ましいモノマーは、野生型ＴＧＦ−βモノマー（任意の所望のアイソフォームを含む）である。好ましくは、本発明に従う利用に適したモノマーＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３から成る群から選択される。さらに好ましくは、モノマーＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β３であり、本発明の第２の側面において、薬剤としての使用のためのＴＧＦ−β３モノマー、またはその生物活性フラグメントが提供される。本発明によって使用されるＴＧＦ−βモノマーは、ヒトＴＧＦ−βモノマーであることが好ましい。本発明によって薬剤に提供されるＴＧＦ−βは、実質的に完全にモノマー型で存在することが好ましい。本発明の薬剤または方法での使用に適したモノマーＴＧＦは、好ましくは、約１２ｋＤａの分子量さらに具体的には、約１２．５ｋＤａの分子量を有する。
ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３アイソフォームのヒト型のアミノ酸残基配列は、それぞれ配列識別番号１、２および３として示され、いかなるこれらの配列を含むモノマーＴＧＦ−β、またはいかなるこれらの配列の生物活性フラグメントは、本発明に従よる使用のための好ましいモノマーを構成する。モノマーＴＧＦ−β３（配列識別番号３）は、本発明の様々な側面による使用のための特に好ましいモノマーを構成する。
【００１０】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書におけるモノマーＴＧＦ−β（特定のアイソフォームの参照を含む）への参照は、さらにそのようなモノマーＴＧＦ−βの生物活性フラグメントおよび誘導体を包含するように解釈されるべきである。配列識別番号１から３から誘導される生物活性フラグメントは、本発明の薬剤における使用のための好ましいフラグメントを表し、特定の好ましいフラグメントを構成する配列識別番号３から誘導される生物活性フラグメントを伴う。好ましい生物活性フラグメントは、選択されたＴＧＦ−βアイソフォームの受容体結合部分を含むことができる。
本発明の薬剤または方法において利用することのできるモノマーＴＧＦ−βの適した誘導体は、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）の治療的効果のあるペプチド誘導体、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）の活性基を含む、またはモノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）の活性基に基づく治療的効果のあるフラグメントあるいは誘導体、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）の治療的効果のあるペプトイド誘導体、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）の治療的効果のあるＤ−アミノ酸誘導体、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）に基づく治療的効果のあるペプチド模倣薬、ＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）の治療的効果のあるペプチド類似体、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）に基づく治療的効果のある擬ペプチド、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）に基づく治療的効果のあるレトロインバーソ型ペプチド、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）に基づく治療的効果のあるデプシペプチド誘導体、モノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）に基づく治療的効果のある−ペプチド誘導体、およびモノマーＴＧＦ−β（またはそのフラグメント）に基づく治療的効果のあるレトロペプトイド誘導体を含む。
【００１１】
本発明者は、ヒトＴＧＦ−β３のモノマー型は、例えば、線維症、強皮症、血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨誘導および軟骨誘導、体外受精、口腔粘膜炎、腎疾患の治療に関して、瘢痕化の予防、軽減または阻害に関して、末梢神経系および中枢神経系における神経再接続の強化神経再接続に関して、眼手術（レーシック手術またはレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）など）の合併症の予防、軽減、または阻害に関して、口唇裂および口蓋裂の治療に関して、瘢痕化の予防、軽減または阻害に関して、および腱ならびに靭帯の促進治癒に関して、ダイマーＴＧＦ−β３と同様の方法で使用することができるということを発見した。ＴＧＦ−β３のモノマー型もまた、上皮損傷の部位において上皮再生を促進することができる。
本発明の発見は、さらに、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２のモノマー型は、これらの増殖因子のダイマー型に関連するすべての治療活性を使用することができるということをも示す。
【００１２】
本発明の文脈における「生物活性」は、好ましくは、生体内で測定される。本発明者は、先行技術に公開された発見に従って、ＴＧＦ−βのモノマー型は、生体外での方法によって評価される際、一般的に生物活性を示さないということを発見した。しかしながら、先行技術の信念とは正反対に、本発明者は、非常に驚くべきことに、ＴＧＦ−βのモノマー型は生体内での生物活性および治療活性を使用することができるといことを発見した。したがって、モノマーＴＧＦ−β、またはそのフラグメントあるいは誘導体に関して、本発明による生物活性を認めるために、モノマーＴＧＦ−βは生体外および生体内の両方で測定することのできる生物活性を使用する必要性が必ずしもあるわけではないが、単に生体外または生体内のいずれかで測定することのできる生物活性、および好ましくは生体内で測定される活性を示すということが認識されるだろう。
好適には、本発明の第１の側面による使用に適したモノマーＴＧＦ−βの生物活性は、特定のＴＧＦ−βのダイマーの既知の生物活性を参照して測定することができる。好適な実施形態において、生物活性は、モノマー（配列識別番号３のモノマーなど）の創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害の能力を参照して計測することができる。
【００１３】
前節を考慮して、本発明の第１または第２の側面による薬剤は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害における使用に特に適しているということが認識されるだろう。さらに、本発明の第１または第２の側面による薬剤は、再上皮化の促進においても特に適している。
【００１４】
実際には、本発明の第３の側面において、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害における使用のための薬剤の調製において、ＴＧＦ−β３モノマー、またはその生物活性フラグメントの使用が提供される。
【００１５】
本発明の第４の側面において、上皮再生の促進における使用のための薬剤の調製において、ＴＧＦ−β３モノマー、またはその生物活性フラグメントの使用が提供される。
【００１６】
本発明の第５の側面において、線維症の予防および／または治療での使用のための薬剤の調製においてＴＧＦβ３モノマー、またはその生物活性フラグメントの使用が提供される。そのような薬剤を使用して予防および／または治療することのできる好ましい線維症は、肺線維症、肝線維症、強皮症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎臓線維症および子宮線維症から成る群から選択することができる。
【００１７】
さらに、本発明の第６の側面において、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害の方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする患者へモノマーＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントの治療有効量を投与するステップを含む。
【００１８】
本発明の第７の側面において、上皮再生を促進する方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする患者へモノマーＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントの治療有効量を投与するステップを含む。
【００１９】
本発明の第８の側面において、線維症を予防および／または治療する方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする患者へモノマーＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントの治療有効量を投与するステップを含む。そのような方法を使用して予防および／または治療することのできる好ましい線維症は、肺線維症、肝線維症、強皮症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎臓線維症および子宮線維症から成る群から選択することができる。
【００２０】
本発明の目的で、モノマーＴＧＦ−βまたはそのフラグメントの治療有効量は、下記の要求される事項をもたらすのに十分な量である。
ｉ）創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害
ｉｉ）上皮再生の促進
ｉｉｉ）線維症の予防および／または治療
必要とされ得る創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害、または上皮再生、または線維症の予防あるいは軽減の範囲は、その患者のケアに責任を持つ臨床医に明らかとなり、実際にその臨床医によって直ぐに判断されるだろう。創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害、または上皮再生の促進、または線維症の予防あるいは軽減の範囲の適した評価は、臨床医によって判断され、本明細書に記載される提案された測定方法に準拠することができる。
【００２１】
本発明による使用のための適したモノマーＴＧＦ−βおよび好ましいモノマーＴＧＦ−βは、本明細書に記載されるすべての考慮を参照して選択することができる。
瘢痕化の予防、軽減あるいは阻害を伴う創傷治癒の加速、または線維症（例、肺線維症、肝硬変、強皮症、糸級体腎炎、または同様のもの）の予防または治療をもたらすことを条件とする場合、一般的には、モノマーＴＧＦ−β３または適した生物活性フラグメントを使用することが好ましいだろう。
モノマーＴＧＦ−β３の使用は特に顕著な利点を有しているが、その他のＴＧＦ−βアイソフォームのモノマー型を含む薬剤もまた大きな価値を有する。
【００２２】
例えば、モノマーＴＧＦ−β１、またはその生物活性フラグメントを含む薬剤は、慢性非治癒創傷（例、静脈潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、血管形成障害、腎疾患、骨粗しょう症、骨疾患、糸級体腎炎および腎疾患）の予防および／または治療で使用することができる。一例として、局所的に投与された野生型ダイマーＴＧＦ−β１は、動物モデルにおいて、骨成長および骨再生の強力な促進剤であることを示した。さらには、ＴＧＦ−β１の投与は、特には、脳（脳梗塞後）、および心臓（冠状動脈閉塞後）において、虚血再環流損傷から組織を保護することを示した。
モノマーＴＧＦ−β２またはその生物活性フラグメントを含む薬剤は、神経膠腫、非小細胞肺癌、膵臓腫瘍、固体腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、加齢性黄斑変性症、眼外傷、骨粗しょう症、網膜症、潰瘍、上皮性悪性腫瘍、口内炎および強皮症の治療で使用することができる。一例として、野生型ダイマーＴＧＦ−β２の局所適用は、静脈鬱血に関連する慢性的な脚の潰瘍の閉鎖を加速させるための２つの臨床試験で示され、動物モデルにおける組み換え型ヒトＴＧＦ−β２の局所投与は、骨の再成長および再生を促進することを示した。
【００２３】
モノマーＴＧＦ−β３、またはその生物活性フラグメントを含む薬剤は、創傷（潰瘍などの慢性創傷を含む）、強皮症、線維症（例、肺線維症、肝硬変、腎臓線維症など）、血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨誘導および軟骨誘導、体外受精、口腔粘膜炎および腎疾患の治療に使用することができる。一例として、野生型ダイマーＴＧＦ−β３の局所適用は、動物モデルおよび臨床モデルにおいて、慢性的非治癒褥瘡の治癒速度を加速させ、口腔粘膜炎の発生率、重症度、および持続時間を軽減させ、癌治療の間の放射線治療および化学療法によりもたらされる、幹細胞への損傷から生じる放射線胃腸症候群の副作用を軽減させるということを示した。本発明者の発見は、モノマーＴＧＦ−β３は、すべてのこれらの状況において、ダイマーＴＧＦ−β３の既知の治療活性をもたらすために使用することができるということを示す。
創傷の治癒を加速させるための本発明の特定の方法および薬剤（配列識別番号３に示されるＴＧＦ−βモノマーの利用など）は、直ぐに、治療された創傷によって示される特性を参照して認められる、および／または測定される。本発明の目的で、「治療された創傷」は、本発明の薬剤の治療有効量を投与された創傷、または本発明の方法によって治療を受けた創傷であると見なすことができる。
【００２４】
治療された創傷の治癒の加速は、対照創傷と比較して、上皮化の加速した速度によって表すことができる。つまり、本発明の方法および薬剤は、それ以外の場合よりも、創傷面積を網羅する機能性上皮層のより早い再形成を促進する。
別の方法として、または追加として、治療された創傷の治癒の加速は、比較時点で、対照創傷と比較して、軽減した幅によって示すことができる。当然のことながら、創傷幅のこの軽減は、比較的早い速度の創傷閉鎖（閉鎖される創傷の幅がより少なく存在するため）を確証し、治癒反応を加速させるそのような薬剤の能力を示すものである。縮小した創傷は、より大きい瘢痕よりも審美的に好ましい縮小した瘢痕を結果としてもたらすことができる。
【００２５】
従って、本発明の状況における加速した創傷治癒は、対照の治療された創傷または治療されていない創傷に生じる治癒速度と比較して、治療された創傷の治癒速度のすべての増加を包含するように解釈されるべきである。好ましくは、創傷治癒の加速は、治療された創傷と対照創傷で得られた再上皮化の速度の比較、または比較時点での治療された創傷と対照創傷の相対幅の比較のいずれかに関して評価することができる。さらに好ましくは、加速した創傷治癒は、比較時点で対照創傷と比較して、再上皮化の増加した速度および創傷幅の軽減の両方を含んで、定義することができる。
好ましくは、加速した創傷治癒の促進は、対照創傷または治療された創傷に生じる治癒速度よりも、少なくとも５％、１０％、２０％または３０％早い創傷治癒の速度を生じることができる。さらに好ましくは、加速した創傷治癒の促進は、対照創傷の治癒よりも、少なくとも４０％、５０％または６０％早い治癒速度を生じることができる。加速した創傷治癒の促進は、対照創傷に生じる治癒速度よりも少なくとも７０％、８０％、または９０％早い治癒速度を生じることがさらに好ましく、加速した創傷治癒の促進は、対照創傷に生じる速度よりも少なくとも１００％早い治癒速度を生じることが最も好ましい。
【００２６】
通常の創傷治癒反応の不適切な不全、遅延または遅滞を特徴とする、またはそれらを少なくとも部分的に特徴とする広範囲の創傷治癒障害が存在する。加速した創傷治癒を促進するための本発明の特定の方法および薬剤の能力は、つまり、そのような障害の予防または治療における有用性である。
本発明の特定の方法および薬剤は、誘導される再上皮化反応の促進（それにより創傷が閉鎖する速度を増加する）によって創傷治癒の加速をもたらすことができるので、本発明のこれらの方法および薬剤は、それ以外の方法では再上皮化の不全、遅延または障害になりがちである患者の創傷の治療に特に有益であるということが認識されるだろう。例えば、古い皮膚創傷は、新しい個々の皮膚創傷よりも、より活発性のない再上皮化反応を示すということは周知である。創傷治癒が再上皮化遅延または再上皮化不全に関連するその他の病状または障害も多く存在する。例えば、糖尿病を患う患者、ポリファーマシー（例、加齢の結果として生じる）を伴う患者、更年期後の女性、圧損傷（例、対麻痺）を引き起こしやすい患者、静脈疾患を伴う患者、医学的に肥満症の患者、化学療法を受けている患者、放射線治療を受けている患者、ステロイド治療をいけている患者、または免疫障害を持つ患者はすべて、再上皮化不全を伴う創傷治癒に苦しむ場合がある。多くのそのような事例において、適正な再上皮化反応の欠損は、創傷部位での感染を進行させる一因であり、次に、潰瘍などの慢性創傷の形成の一因となる場合がある。従って、当然のことながら、そのような患者は、特に、本発明の適した方法、または薬剤の利益を受ける可能性が高い。
【００２７】
慢性創傷は、おそらく、創傷治癒反応の遅延に関連する障害の最も重要な例である。創傷は、適切な（従来の）治療処置を受ける際、形成の８週間以内にいかなる治癒傾向も示さない場合に、慢性的であると定義される場合がある。慢性創傷の既知の例としては、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍および褥瘡性潰瘍が挙げられるが慢性創傷は、他には、常に通常の急性損傷から生じる場合がある。典型的な慢性創傷は、創傷部位の感染、不適切な創傷治療の結果として、または静脈性血管障害、動脈性血管障害、または代謝性血管障害、圧力、放射線障害、または腫瘍により引き起こされる進行性組織破壊の結果として生じる場合がある。
当然のことながら、創傷治癒を加速させることのできる本発明の方法および薬剤は、その治癒を促進するために、既存の慢性創傷の治療において使用することができる。そのような方法および薬剤は、慢性創傷の再上皮化を促進することができ、それにより、障害の治癒および閉鎖をもたらすことができる。本発明の好適な方法および薬剤（配列識別番号３を含むモノマーＴＧＦ−βを使用するものなど）も、創傷治癒によって瘢痕化を阻害することができる。そのような状況において瘢痕化の予防は、慢性創傷は、一般的に患者の身体の比較的に広い部分に拡大するため、特に有益であることができる。
【００２８】
既存の慢性創傷の治療におけるその使用に加えて、またはそれとは別として、本発明の適切な方法および薬剤は、慢性創傷に発展する創傷治癒不全に成りやすい患者の急性創傷を予防するために使用することができる。本発明の適切な方法および薬剤は、損傷部位の上皮被膜を促進することができるため、それらは、治療された創傷が感染する可能性を軽減させることができる。同様に、この再上皮化の促進は、糖尿病または静脈疾患などのその他の病状の結果として生じる慢性的な使用において有益であることができる。
本発明の方法および薬剤から、特に利益を得ることのできるさらなる患者の群は、免疫システムが低下した患者の群である（例、化学療法または放射線療法を受けた患者、またはＨＩＶに感染した患者）。創傷を受けた後に通常の炎症反応を開始することができない可能性のある免疫障害を持つ患者の創傷は、不十分な治癒結果を伴う傾向にあることが周知である。そのような患者は、本発明の適切な方法および薬剤を伴う治療から利益を得ることができる。
【００２９】
瘢痕化の予防、軽減、または阻害と同時に、加速された創傷治癒を促進するための、配列識別番号３を含むモノマーＴＧＦ−βを使用する、本発明の薬剤および方法の性能は、一般的な臨床状況においても役立つ。これらのさらなる利益の例は、下記のような、第１次癒合、第２次癒合または第３次癒合による創傷の治癒を参照して考慮されることができる。
本発明の目的において、第１次癒合による治癒は、外科的方法（縫合、接着性シート、またはステープルなど）による創傷の相対する縁の閉鎖に関連すると見なすことができる。第１次癒合による治癒は、典型的に、外科的切開またはその他のきれいな創傷において使用され、最小範囲の組織欠損を伴う。当業者は、本発明による適した薬剤または方法（配列識別番号３を含むモノマーを利用したものなど）は、創傷幅を軽減させることが可能であるため、相対する縁の結合を促進し、つまりは、第１次癒合による創傷治癒において有益であることができるということを理解するだろう。さらに、そのような方法または薬剤は、（さらに以下に記されるように）そのような治癒に生じ得る瘢痕化の予防、軽減または阻害をもたらす可能性がある。本発明者は、本方法での治療は治療された創傷から形成される瘢痕の巨視的外観および微視的外観の両方に影響を及ぼす可能性があり、巨視的には、瘢痕は目立たなく周囲の皮膚になじむことができ、微視的には、瘢痕はより通常の皮膚構造の再生を示すことができる、と考える。
【００３０】
本発明の目的において、第２次癒合による治癒は、直接の外科的介入なく、創傷治癒過程よって、創傷の閉鎖を構成すると考えられる。第２次癒合によって治癒される創傷は、継続的なケア（例、傷口に包帯を巻くことおよび包帯を巻きなおすこと、さらに、適した薬剤を塗布すること）をしなければならない場合があるが、肉芽組織形成および創傷の閉鎖を生じる再上皮化の自然な過程である。当然のことながら、本発明の好適な薬剤および方法（配列識別番号３を含むモノマーを使用したものなど）は対照創傷に生じるものに比べて、再上皮化の速度を上げ、その後に生じる瘢痕化を減らすことができるので、第２次癒合による創傷治癒の促進において有効である。
第３次癒合による治癒は、少なくとも部分的に肉芽組織形成および再上皮化を可能にするために事前に開いたままにされていた創傷の外科的縫合を含むと考えられる。第１次癒合または第２次癒合による治癒における使用に適用させる本発明の好適な方法および薬剤の特性は、第３次癒合による創傷治癒を促進するための状況においても有益である。
瘢痕化を阻害すると同時に、再上皮化を促進（それらの加速した創傷治癒の促進）するための、配列識別番号３を含むモノマーを使用した本発明の好適な方法および薬剤の使用は、移植手順を伴う創傷の治療においても特に効果的である。本発明における該方法および薬剤を使用した治療は、移植供与部位（瘢痕形成を予防し、軽減させ、または阻害する一方で機能性上皮層の回復を助けることのできる部位）、および被移植部位（加速された治癒は移植された組織の統合を促進する一方、治療の抗瘢痕化効果が瘢痕形成を阻害する部位）の両方において有益である。本発明者は、本発明の方法および薬剤は皮膚、人工皮膚、または代用皮膚を使用した移植の状況に利益を与えると考える。
【００３１】
本発明者は、配列識別番号３を含むモノマーを使用した本発明の方法および薬剤は、創傷前、または創傷がすでに形成されてから投与された場合のいずれにおいても、瘢痕化の阻害を伴い加速した創傷治癒を促進することができるということを発見した。
本発明者は、配列識別番号３を含むものなどのモノマーＴＧＦ−β３を利用した本発明の方法または薬剤は、上皮再生を促進することができるということを発見した。本発明の範囲内の上皮再生の促進とは、対照の治療された上皮または治療されていない上皮に生じる再生と比較して、上皮再生の速度のいかなる上昇をも包含すると理解されることができる。
【００３２】
本発明による適した方法または薬剤を使用して得られた上皮再生の速度は、当技術分野において既知の任意の適した上皮再生のモデルを使用して、対照の治療された上皮または治療されていない上皮に生じる速度と容易に比較することができる。例えば、既知の範囲を有する実験的上皮損傷の部位が再生する速度は、ＴＯＭＬＩＮＳＯＮ  ＡＮＤ  ＦＥＲＧＵＳＯＮ（２００３）、ＤＡＶＩＤＳＯＮ  ＥＴ  ＡＬ．（１９９１）、およびＰＡＤＤＯＣＫ  ＥＴ  ＡＬ．（２００３）に記載されるようなマウス、ラット、ラビット、またはブタにおける既知の生体内モデルを使用して比較することができる。
いかなる仮説にも拘束されるものではないが、本発明者は、ＴＧＦ−β３のモノマー型によって得られた上皮再生の促進はモノマーの上皮細胞移動の促進によって媒介されると考える。上皮細胞（促進された移動）は、それにより、再集合し、治療なしに生じるときよりもより早く損傷した上皮を再生することができる。
【００３３】
当然のことながら、配列識別番号３を含むモノマーを使用した上皮再生の促進は、再上皮化反応が低下する、阻害される、遅滞する、または不全である状況下で効果的な再上皮化を誘導するために使用することができる。上皮再生の促進は、また、上皮損傷に苦しむ患者において、不全な上皮再生反応または通常の上皮再生反応の速度を加速するように影響することもできる。
身体の再上皮化反応が不全となり得る多くの状況が存在する。例えば、皮膚での再上皮化不全は、天疱瘡、ヘーリーヘーリー病（家族性良性天疱瘡））、中毒性表皮剥離症（ＴＥＮ）／中毒性表皮壊死症、表皮水疱症、皮膚リーシュマニア症および光線性角化症などの病状に関連する。肺の再上皮化不全は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または間質性肺炎に関連する可能性がある。目の再上皮化不全は、部分的な輪舞幹細胞の不全または角膜びらんのような病状に関連する可能性がある。胃腸管または結腸の再上皮化不全は、慢性裂肛（肛門裂創）、潰瘍性大腸炎またはクローン病、およびその他の炎症性腸疾患などの病状に関連する可能性がある。
【００３４】
上述のように、本発明による特定の方法または薬剤（特に、配列識別番号３を含むモノマーを使用するもの）は、瘢痕化を予防すること、軽減させること、または阻害することができる。瘢痕化の阻害は、皮膚、目、神経、腱、靭帯、筋肉、および口腔（唇および口蓋を含む）、さらには内臓器官（肝臓、心臓、脳、腹腔、骨盤腔、胸腔、消化器および生殖組織など）を含む、すべての人体の部位において、およびすべての組織または臓器において影響することができる。皮膚において、治療は瘢痕の巨視的外観および微視的外観を改善することができ、巨視的には、瘢痕は目立たなく周囲の皮膚になじむことができ、微視的には、瘢痕内のコラーゲン繊維は、周辺皮膚におけるものとより類似した形態および組織を有することができる。本発明の範囲内の瘢痕の予防、軽減または阻害は、対照の治療された創傷または治療されていない創傷（本明細書の別の場所に定義される）に生じる瘢痕化の程度と比較した瘢痕化の予防、軽減または阻害のいかなる低程度も包含すると理解されるべきである。文脈上他の意味に解すべき場合を除き、瘢痕化の「予防」、「軽減」または「阻害」への言及は、すべて抗瘢痕化活性において見られる同等のメカニズムとして得られることができる。
本発明の方法および薬剤を使用して得られる皮膚瘢痕化予防、軽減または阻害は、治療されていない瘢痕の外観と比較して、治療された瘢痕の微視的外観、またはより好ましくは巨視的外観のいずれかを参照して、評価および／または測定することができる。より好ましくは、瘢痕化の予防、軽減または阻害は、治療された瘢痕の巨視的外観および微視的外観の両方を参照して評価することができる。本発明の目的のため、「治療された瘢痕」は、治療された創傷の治癒時に形成される瘢痕であると定義することができるが、その一方、「治療されていない瘢痕」は、治療されていない創傷、またはプラシ−ポあるいは標準のケアによって治療された創傷の治癒時に形成される瘢痕であると定義することができる。適した比較瘢痕は、好ましくは、瘢痕年齢、部位、大きさおよび患者に基づいて、治療された瘢痕に適合することができる。
【００３５】
治療された創傷から得られる瘢痕の巨視的外観を考慮する際、瘢痕化の範囲、つまり得られた瘢痕化におけるすべての予防、阻害または軽減の規模は、パラメータの数字のいずれかを参照して評価することができる。
瘢痕の巨視的評価に適切なパラメータは下記の点を含んでもよい。
ｉ）瘢痕の色。上記指摘したように、瘢痕は、周辺の皮膚に対して典型的に低色素沈着または高色素沈着である場合がある。瘢痕化の阻害または軽減は、治療された瘢痕の色素沈着の方が、治療されていない瘢痕の色素沈着より、瘢痕がない皮膚に酷似する場合、認められる場合がある。同様に瘢痕は周辺の皮膚より赤い場合もある。この場合には、治療されていない瘢痕に比較して、治療された瘢痕の発赤がより早く、またはより完全に、または周辺の皮膚の外観に、より酷似するように薄くなる場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
ｉｉ）瘢痕の高さ。瘢痕は、周辺の皮膚に比較して典型的に盛り上がる、または窪む場合がある。治療された瘢痕の高さが、治療されていない瘢痕より、瘢痕のない皮膚の高さにより酷似する（つまり、盛り上がらず、窪んでもいない）場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
ｉｉｉ）瘢痕の表面質感。瘢痕は、周辺皮膚より比較的に滑らかな表面（「光っている」外観の瘢痕を生じて）、または周辺皮膚より粗い表面を有する場合がある。治療された瘢痕の表面質感が、治療されていない瘢痕の表面質感より、瘢痕のない皮膚に酷似する場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
ｉｖ）瘢痕の硬さ。瘢痕の構成および構造が異常なので、瘢痕を囲む無傷の皮膚より硬いのが通常である。この場合は、治療された瘢痕の硬さが、治療されていない瘢痕の硬さより、瘢痕のない皮膚に酷似する場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
好ましくは、治療された瘢痕は、上記瘢痕の巨視的評価に適切なパラメータの少なくとも１つに対して評価する際に、瘢痕化の予防、阻害または軽減が認められる。また、治療された瘢痕は、より好ましくは、瘢痕の巨視的評価に適切なパラメータの少なくとも２つに対して瘢痕化の予防、阻害または軽減が認められ、さらに好ましくは少なくとも３つとし、最も好ましくはこれらのパラメータの４つすべてとする。瘢痕化において全体的な評価は、例えば視覚アナログ尺度またはデジタル評価尺度を使用して行ってもよい。
【００３６】
瘢痕の微視的評価に適切なパラメータは、下記の点を含んでもよい。
ｉ）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）繊維の厚さ。瘢痕は典型的に周辺の皮膚より薄いＥＣＭ繊維を含む。この特性は、ケロイド瘢痕および肥厚性瘢痕の場合に、さらに顕著である。治療された瘢痕の厚さが、治療されていない瘢痕にある繊維の厚さより、瘢痕のない皮膚にあるＥＣＭ繊維の厚さに酷似する場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
ｉｉ）ＥＣＭ繊維の配向。瘢痕中のＥＣＭ繊維は、瘢痕のない皮膚にある物（「バスケットウィーヴ」とよく言われる任意の配列を有する物）より、高い程度の相互整列を示す傾向がある。ケロイド瘢痕および肥厚性瘢痕のような病的瘢痕のＥＣＭは、さらに異常な配向を示す場合があり、頻繁にＥＣＭ分子の大きい「渦」または「カプセル」を形成する。従って、治療された瘢痕にあるＥＣＭ繊維の配向が、治療されていない瘢痕にある該繊維の配向より、瘢痕のない皮膚にあるＥＣＭ繊維の配向に酷似する場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
ｉｉｉ）瘢痕のＥＣＭ構成。瘢痕にあるＥＣＭ分子の構成は、通常の皮膚との違いから、瘢痕中のＥＣＭに存在するエラスチンの量の軽減を示す。従って、治療された瘢痕の真皮にあるＥＣＭ繊維の構成が、治療されていない瘢痕にある構成より、瘢痕のない皮膚にあるそのような繊維の構成に酷似する場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
ｉｖ）瘢痕の細胞性。瘢痕は、瘢痕のない皮膚より比較的に少なく細胞を含む傾向がある。従って当然のことながら、治療された瘢痕の細胞性が、治療されていない瘢痕の細胞性より、瘢痕のない皮膚の細胞性に酷似する場合、瘢痕化の阻害または軽減を認める場合がある。
好ましくは、治療された瘢痕は、上記瘢痕の微視的評価に適切なパラメータの少なくとも１つに対して評価する際に、瘢痕化の予防、阻害または軽減が認められる。また治療された瘢痕は、より好ましくは、瘢痕の微視的評価に適切なパラメータの少なくとも２つに対して瘢痕化の予防、阻害または軽減を認め、さらに好ましくは少なくとも３つとし、最も好ましくはこれらのパラメータの４つすべてとする。
【００３７】
治療された創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害は、下記の業務において使用される適切なパラメータに対して評価することができる。
ｉ）瘢痕の巨視的臨床評価、特に対象患者の皮膚にある瘢痕の評価
ｉｉ）瘢痕の写真画像の評価
ｉｉｉ）シリコーン型または瘢痕のシリコーン型から作られたギプス包帯の評価
ｉｖ）瘢痕の微視的評価、例えば、瘢痕の微視的構造の組織学的分析による評価
当然のことながら、そのような適切なパラメータの１つ以上の向上により、治療された創傷の瘢痕化の予防、軽減および阻害が示され、また複数のパラメータに対して評価された予防、軽減または阻害の場合、これらのパラメータを異なる評価スキームから組み合わせることが出来る（例えば、巨視的評価に使用された少なくとも１つのパラメータおよび巨視的評価に使用された少なくとも１つのパラメータにおける軽減、阻害または向上）。
瘢痕化の予防、軽減または阻害は、１つ以上のパラメータの向上により認められる場合があり、選択されたパラメータに対して治療された瘢痕が、治療されていない瘢痕または対照瘢痕より、瘢痕のない皮膚に酷似することを示す。
【００３８】
瘢痕の臨床測定および評価に適切なパラメータは、Ｂｅａｕｓａｎｇら（１９９８）およびｖａｎ  Ｚｕｉｊｌｅｎら（２００２）が説明したものを含めて、様々な測定または評価に基づいて選択してもよい。
典型的に、適切なパラメータは下記の点を含んでもよい。
１．視覚アナログ尺度（ＶＡＳ）の瘢痕点数に対する評価
瘢痕化の予防、軽減または阻害は、対照瘢痕に比較すると、治療された瘢痕のＶＡＳ点数軽減により認められる場合がある。瘢痕評価に使用する適切なＶＡＳはＢｅａｕｓａｎｇら（１９９８）が説明した方法に基づいたものであってもよい。
【００３９】
２．瘢痕の高さ、瘢痕の幅、瘢痕の周囲、瘢痕の面積または瘢痕の容積
瘢痕の高さおよび幅は、対照患者の皮膚で直接に測定できる、例えばカリパスのような手動測定機器を使用できる。瘢痕の幅、周囲および面積は、対照患者の皮膚で直接に測定できるか、または瘢痕の写真の画像分析により測定できる。当業者には、他にも、シリコーン型、超音波、光学的３次元外形測定および高解像度磁気共鳴画像を含めて、適切なパラメータを調査するために使用することのできる非侵襲的な方法および機器が周知である。
瘢痕化の予防、軽減または阻害は、治療されていない瘢痕に比較すると、治療された瘢痕の高さ、幅、面積または体積、あるいはそれらのいかなる組み合わせの軽減により認められる場合がある。
３．瘢痕のない周辺の皮膚に比較された瘢痕の外観および／または色
治療された瘢痕の外観または色は、瘢痕のない周辺の皮膚に比較することができ、（もしあれば）その違いと、治療されていない瘢痕および瘢痕のない皮膚の外観および色の違いを比較することができる。そのような比較は、それぞれの瘢痕および瘢痕のない皮膚の視覚的評価に基づいて行うことができる。瘢痕の外観は、瘢痕が瘢痕のない皮膚より白いか黒いかに対して比較することができる。瘢痕および皮膚のそれぞれの色は、互いに完璧に一致する場合、わずか一致しない場合、明らかに一致しない場合、または全く一致しない場合、がある。
【００４０】
視覚的評価の代わりに、またはそれに加えて、瘢痕および瘢痕のない皮膚の色素沈着および皮膚の発赤（瘢痕または皮膚にある血管性の程度の指標となる場合がある）に関するデータを提供できる、幾つかの非侵襲的な測色機器がある。そのような機器の例として、Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃｈｒｏｎａｍｅｔｅｒ  ＣＲ−２００／３００、Ｌａｂｓｃａｎ  ６００、Ｄｒ．Ｌａｎｇｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｏｕｒ、Ｄｅｒｍａ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、レーザードップラー流量計およびＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＳＩＡ）スコープが挙げられる。
瘢痕化の予防、軽減または阻害は、治療された瘢痕および瘢痕のない皮膚の外観または色の違いが、治療されていない瘢痕および瘢痕のない皮膚の違いより低い程度であることにより認められる場合がある。
【００４１】
４．瘢痕の変形および機械的性能
瘢痕変形は瘢痕および瘢痕のない皮膚の視覚的な比較により評価することができる。適切な比較は、選択された瘢痕が、変形なし、わずかな変形、中程度の変形または重度の変形を引き起こすとして分類してもよい。
瘢痕の機械的性能は、吸引、圧力、捻転、張力および音響学に基づいた幾つかの非侵襲的な方法および機器を使用し評価することができる。瘢痕の機械的性能を評価するために使用することのできる既存の機器の適切な例として、Ｉｎｄｅｎｔｏｍｅｔｅｒ、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ、Ｒｅｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ、Ｖｉｓｃｏ−ｅｌａｓｔｉｃ皮膚分析、Ｄｅｒｍａｆｌｅｘ、Ｄｕｒｏｍｅｔｅｒ、Ｄｅｒｍａｌ  Ｔｏｒｑｕｅ  ＭｅｔｅｒおよびＥｌａｓｔｏｍｅｔｅｒが挙げられる。
瘢痕化の予防、軽減または阻害は、治療された瘢痕が引き起こす変形を治療されていない瘢痕が引き起こす変形と比較した際の軽減により認めることができる。また、当然のことながら、瘢痕化の予防、軽減または阻害は、瘢痕のない皮膚の機械的性能が、治療されていない瘢痕より治療された瘢痕の方によりよく類似することによって認められる場合がある。
【００４２】
５．瘢痕輪郭および瘢痕質感
瘢痕輪郭は、視覚的評価により調査してもよい。そのような評価において検討すべき適切なパラメータは、瘢痕が周辺皮膚に対して同一平面になっているかどうか、わずかに盛り上がっているか、わずかに窪んでいるか、肥厚性瘢痕か、またはケロイド瘢痕かどうか、を含む。瘢痕の質感は、瘢痕の外観に対して評価してもよく、またこれは、瘢痕のない皮膚に比較すると瘢痕が、例えば、つやがあるかどうか、または外観が粗いか滑らかかに関する視覚的評価により行ってもよい。
瘢痕質感は、瘢痕が瘢痕のない皮膚（通常の質感）と同一の質感を有するか、わずか感じられるか、きついか、または硬いかに対してさらに評価してもよい。また瘢痕の質感はＨａｍｉｌｔｏｎ尺度（Ｃｒｏｗｅら，１９９８に説明した）に対して評価してもよい。
上記の手法に加えて、瘢痕輪郭および／または質感を評価するために光学的または機械的な方法を使用する幾つかの非侵襲的な外形測定機器がある。そのような評価は対象の身体に対して、または、例えば、瘢痕のシリコーン型、またはその型から作られたギプス包帯に対して行ってもよい。
瘢痕の予防、軽減または阻害は、治療された瘢痕が、治療されていない瘢痕よりも、瘢痕のない皮膚に類似する瘢痕外形および質感を有する場合、認められる場合がある。
【００４３】
写真による評価
独立した非専門家委員会
治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の写真による評価は、標準化し較正した瘢痕の写真を使用し、独立した非専門家の評価委員会により行われてもよい。瘢痕は、Ｂｅａｕｓａｎｇら（１９９８）が説明した方法に基づいた視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）を使用し、分類順位データ（例えば、任意の治療された瘢痕は、治療されていない瘢痕に比較すると「よりよい」、「より悪い」または「変わらない」である）および定量的データを提供するために、独立した専門家委員会により評価されてもよい。このデータの取得において、本出願者の同時出願中の特許出願に記載の適切なソフトウェアおよび／または電子システムを使用してもよい。
【００４４】
専門家委員会
さらに、治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の写真による評価は、評価の対象になる瘢痕の標準化し較正した写真を使用し、専門家評価委員会により行われてもよい。専門家委員会は、好ましくは形成外科医や適切の分野を得意とする科学者のような適切な当業者から構成されてもよい。
そのような評価は、上記のようにか、または選択した治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の画像の時間経過を比較することに対して分類データを提供する場合がある。
行うべき適切な評価は下記の業務を含んでもよい。
【００４５】
最適な瘢痕の特定。これは本発明の目的において周辺皮膚に最も酷似している瘢痕であると見なされてもよい。一度最適な瘢痕を特定したら、瘢痕間の違いの程度を検討することができる（例えば、瘢痕間の違いがわずかなのか明らかなのか）。さらに検討できるパラメータは、瘢痕間の違いを検知できる瘢痕化後の最も早い時間、瘢痕間の違いが最も明らかである瘢痕化後の時間（あるいはその代わりに、評価された最後の時点の後に違いが続ける所見）、またより適切な瘢痕が一貫してより適切になっているかどうかを検討することを含む。
１つの瘢痕がもう１つの瘢痕より一貫して赤いのか、また発赤が検討している時点に渡って薄くなっていくか（あるいは最後の時点の後に続けるか）、またその場合は瘢痕化後に何時に薄くなるかを検討してもよい。専門家委員会は、瘢痕化後に発赤の違いが何時に検知できるようになるか、また瘢痕化後に発赤の違いが何時にもっとも明らかであるかを検討する場合もある。
【００４６】
専門家委員会は治療された瘢痕または治療されていない瘢痕のうち１つが一貫してもう１つより白いか、瘢痕のない皮膚より白いかも検討してもよい。白色度の違いを検知できる場合、その違いを検知できる瘢痕化後の時間、その違いがもっとも明らかである時間およびその違いがなくなる時間を検討する場合がある。
さらに専門家委員会に評価される場合があるパラメータは、治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の質感である。治療された瘢痕および治療されていない瘢痕を比較する際に、専門家委員会は、どの瘢痕が最良な皮膚質感を有するか、存在するいかなる違いも検知できる瘢痕化後のもっとも早い時間、いかなる違いでも瘢痕化後のもっとも明らかである時間、およびいかなる違いでも瘢痕化後になくなる時間を検討する場合がある。
治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の比較では、どの瘢痕が最も狭いか、どの瘢痕が最も短いかをさらに評価できる。瘢痕の形状および瘢痕周囲が周辺皮膚から区別できる程度も検討してもよい。上記の視覚的評価および色の評価と同様に、色素沈着過度の有無、程度および位置を検討することもある。
【００４７】
上記のように、治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の性質を比較する方法の１つは、微視的評価である。瘢痕性質の微視的評価は、典型的に、瘢痕の組織学的切片を使用し、行ってもよい。瘢痕を微視的に評価し測定する過程は、下記の適切なパラメータに基づいた分類データを考慮する場合がある。
１．表皮復元。特に乳頭間隆起の復元の程度および復元された表皮の厚さに注目を払う場合がある。
２．血管新生および炎症。存在する血管の数、存在する血管の大きさおよび存在する炎症のいかなる程度もの評価を含めて炎症の証拠を検討する場合がある。
３．コラーゲン組織。コラーゲン組織を評価する際は、瘢痕にあるコラーゲン繊維の配向、その繊維の密度および真皮乳頭層ならびに真皮網状層にあるコラーゲン繊維の厚さを参照してもよい。
４．真皮乳頭層および真皮網状層におけるコラーゲン組織の視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）評価も、瘢痕性質の有用な指標を提供する場合がある。
５．瘢痕の微視的な性質を評価する際に考慮されるその他の特性は、瘢痕のない周辺皮膚に対して瘢痕の隆起および陥凹、また通常表皮接触面で瘢痕の突起および可視性を含む。
６．明らかに上記すべての評価では、治療された瘢痕が、対照、の治療されていない瘢痕またはその他適切な比較瘢痕と比較すると、より良いか、より悪いか、変わらないかという指標を提供できる瘢痕順位データを生成できるようになる。
【００４８】
分類データに加えて、定量的データ（好ましくは上記パラメータに関連するもの）を、適切な可視化手法とともに画像分析を使用し生成することができる。瘢痕性質を評価する際に使用できる適切な可視化手法の例としては、特定の組織学染色または免疫のラベルが挙げられ、存在する染色またはラベルの程度は画像分析によって定量的に判定できる。
定量データは下記のパラメータに対して有用に、また直ぐに、生成できる。
１．瘢痕の幅、高さ、隆起、体積および面積
２．上皮の厚さおよび網羅（例えば瘢痕に存在する表皮の面積または創傷の表皮網羅割合）
３．血管の数、大きさ、面積（つまり断面面積）および位置
４．存在する炎症細胞の炎症程度、数、位置および集団／種類
５．コラーゲン組織、コラーゲン繊維の厚さ、コラーゲン繊維の密度
【００４９】
瘢痕化の予防、軽減または阻害は、治療された瘢痕が、対照瘢痕または治療されていない瘢痕（またはその他適切な比較できるもの）より、瘢痕のない皮膚に酷似しているように上記パラメータのいずれかにおける変化により認められる場合がある。
上記の評価およびパラメータは、動物およびヒトにおいて、対照のプラシーボまたは標準医療治療と比較して、ペプチドの効果または本発明の薬剤の比較に適切である。適切な統計試験は、結果の意味を調査するために、様々な治療から生成されたデータセットを分析するために使用できる。
【００５０】
好ましくは、瘢痕化の予防、軽減または阻害は２つ以上のパラメータに対して認められることができる。より好ましくは、瘢痕化の予防、軽減または阻害は、臨床的なパラメータ（つまり対象で認められた）および写真パラメータの両方を参照して例証されてもよい。さらに好ましくは、瘢痕化の予防、軽減または阻害は臨床的なパラメータ、写真パラメータ、また微視的評価パラメータ（例えば組織学パラメータ）に対して認められることができる。もっとも好ましくは、瘢痕化の予防、軽減または阻害は臨床的なＶＡＳ点数、外部非専門家委員会のＶＡＳ点数と順位（写真画像から）、および真皮網状層の微視的ＶＡＳ点数に対して認められることができる。
本発明の適切な方法および薬剤を使用することは、そのように治療された創傷部位の美容上の外観において迅速な向上をもたらすことができる。特に創傷を身体の目立つ部位で形成する際は、幾つかの臨床的な状況において美容的な側面を考慮することが重要である。そのため、形成された瘢痕の美容上の外見を向上することが望まれた部位で瘢痕化の阻害（加速された創傷治癒との組み合わせが好ましい）は、本発明の好適な実施形態となる。
【００５１】
美容上の影響に加えて、皮膚の瘢痕化は、そのような瘢痕化にかかっている者を悩ます幾つかの有害効果を引き起こす。例えば、皮膚瘢痕化は、特に収縮瘢痕の場合（例えば肥厚性瘢痕）および／または関節を渡って瘢痕を形成する状況において、物理的かつ機械的な機能の軽減に関連する。この場合においては、瘢痕のない皮膚と異なって、瘢痕のある皮膚の変更された機械的な性質および瘢痕収縮の効果は、非常に制限されたその影響を受ける関節の動き（関節動作）をもたらす場合がある。従って本発明の適切な薬剤および方法を身体の関節を網羅する創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害に使用すること（また、好ましくはそのような創傷の治癒を加速すること）は好適な実施形態である。別の好適な実施形態においては、本発明の適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または収縮瘢痕を形成する危険性が高い創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害を行うことに使用することができる。
瘢痕形成の程度、およびそれに伴いその瘢痕が引き起こしうる美容上の障害またはその他の障害の程度は、創傷が形成される部位の張力のような要因から影響を受ける場合がある。例えば、比較的に高い張力の皮膚（例えば胸を渡っている皮膚、または張力線に関連する皮膚）が、他の身体部位に比較してより重大な瘢痕を形成する傾向があることは周知である。従って、好適な実施形態において、本発明の適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または高い皮膚張力の部位に位置する創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害を行うことに使用することができる。瘢痕修正において、軽減張力の状態をもたらす、創傷および瘢痕の再配向を可能にする手術法が多い。おそらく最も知られたのは、「Ｚ−ｐｌａｓｔｙ」であり、そこで張力線を回転することを可能にするために２つのＶ字型の皮膚の弁が転置される。従ってより好適な実施形態においては、本発明でそのような薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または、外観を損なう瘢痕の修正手術の際に創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害を行うことに使用することができる。
【００５２】
病的な瘢痕化は、比較的に重大な通常の瘢痕化の結果として発生するものより、より顕著で有害な効果をもたらす場合がある。病的な瘢痕の通常の例は、肥厚性瘢痕およびケロイド瘢痕を含む。ある一定の創傷種類またはある一定の者は病的瘢痕形成が起こりやすいことが周知である。例えばアフロカリビアン人、日本人または蒙古人種の者または病的な瘢痕化の家族歴がある者が肥厚性瘢痕またはケロイド瘢痕の形成に対して危険性が高いと見なしてもよい。子供の創傷、特に子供の火傷は、より多くの肥厚性瘢痕形成にも関連する。従って、本発明の好適な実施形態においては、適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または病的な瘢痕形成の危険性が高い創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害を行うことに使用することができる。
既に病的な瘢痕化にかかっている者はさらに過度な瘢痕形成が起こりやすいが、多くの場合は肥厚性瘢痕またはケロイド瘢痕に対して修正手術が臨床的に必要であり、それに伴い間接的で病的な瘢痕形成の危険性がある。従って、本発明でさらに好適な実施形態においては、適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または病的な瘢痕の修正手術により生じた創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害を行うことに使用することができる。
【００５３】
火傷から生じた創傷（本発明では熱い液体または気体が関与する熱湯熱傷を含むとも捉えられる）はそれを患う者の広い面積に渡って広がることが周知である。従って火傷は、患者の身体の大部分を渡って瘢痕形成を発生する場合があり、それで形成された瘢痕が美容的に大事な部位（例えば顔、首、腕または手）または機械的に重要な部位（特に関節を網羅する部位または関節を囲む部位）を網羅する危険性が高くなる。熱い液体に起因する火傷は、よく子供が負うものであり（例えば、鍋、やかん等を落とす結果として）、子供の身体は比較的に小さいため、身体の面積の大部分を渡って幅広い損害を引き起こすことは確率が特に高い。本発明でさらに好適な実施形態においては、適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または火傷により生じた創傷の瘢痕化の予防、軽減または阻害を行うことに使用することができる。
上記のように、火傷に対して創傷の治癒は、多くの場合、例えば肥厚性瘢痕の形成といった、有害な瘢痕化結果に関連する。火傷が比較的大きいことによる更なる結果としては、機能する上皮層がないために生じる、火傷が感染および乾燥のような合併症にかかりやすい。上記のことを考慮すると、当然なことながら、本発明の適切な方法および薬剤は、創傷の結果として起こる瘢痕化の程度を軽減することおよび／または機能する上皮バリアの再構築を加速することを目的にし、火傷の治療に使用することができる。
【００５４】
本発明者は配列識別番号３を含むようなモノマーを使用する本発明の方法および薬剤が再上皮化を促進できると判明した。従ってそのような方法および薬剤は、上皮層への損傷に関与する全ての損傷の治療において特に効果的である。そのような損傷は、表皮が損傷を受けた皮膚の損傷に例示されるがそれに限定されない。しかし当然のことながら本発明における該方法および薬剤は上皮が損傷を受けた他の種類の創傷にも適用できる（例えば呼吸上皮、消化上皮または内蔵組織あるいは器官を囲む上皮（例えば腹膜の上皮））。
腹膜（内臓器官の上皮および／または体腔の内部）が関与する創傷の治癒は、多くの場合に癒着を生じる。そのような癒着は多くの場合に婦人科または腸の組織が関与する手術の結果である。本発明者は、本発明の方法および薬剤（配列識別番号３を含む適したモノマーを使用したもの）が瘢痕化を軽減しながら腹膜の再生を加速できることは、腹膜の部位が互いに不適切に接着することを減少することによって癒着の発生を軽減する場合があると考える。従って、腸の癒着または婦人科癒着の形成を防ぐために本発明における該方法および薬剤を使用することは、本発明の好適な実施形態である。実に腹膜が関与するいかなる創傷の治癒においても、本発明における該方法および薬剤を使用することは、好適な実施形態である。
【００５５】
本発明の方法または薬剤を、例えば、創傷が存在しないが瘢痕または慢性の創傷が形成される部位で予防的に使用してもよい。例として、本発明による薬剤は選択的手当（例えば手術）の結果として創傷を受ける部位、またはより高い危険性の創傷があると考えられる部位に投与することができる。好ましくは、創傷を受ける時前後、または創傷形成の直前（例えば創傷を受ける前に６時間以内の期間）に本発明の薬剤をかかる部位に投与してもよく、または該薬剤は創傷を受ける前により早い時点で投与してもよい（例えば創傷形成の前に４８時間以内）。当業者は創傷形成の前に最も好ましい投与時間が、選択された薬剤の製剤および投与経路、投与する薬剤の投与量、形成する創傷の大きさおよび性質、そして患者の生物学的状態（患者の年齢、健康および治癒中の合併症または有害瘢痕化が起こりやすいかのような要因を考慮して判定してもよい）を含めて幾つかの要因を考慮して判定されることが分かる。本発明による方法および薬剤を予防的に使用することは、本発明の好適な実施形態であり、手術による創傷の場合に創傷治癒の加速を促進することおよび／または瘢痕化の予防、軽減または阻害には、特に好ましい。
本発明の方法および薬剤は、創傷形成の後に投与する場合にも創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害を促進することができる。好ましくはそのような投与を創傷形成後にできるだけ早く行うが、本発明の活性剤は完全治癒までいつでも創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減および阻害を促進することができる（つまり、創傷が既に部分的に治癒した場合でも本発明の方法および薬剤は、残っている治癒されていない部分に対して、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減および阻害を促進することに使用できる）。当然のことながら、本発明の方法および薬剤が創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減および阻害を促進できる「期間」は、関連する創傷の性質に依存する（起きた損傷および創傷面積の広さを含む）。従って大きい創傷の場合は、本発明の方法および薬剤は治癒反応において比較的に遅く投与してもよいが、それでも創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減および阻害を促進することができる。例えば、本発明の方法および薬剤は、好ましくは創傷形成後に２４時間以内に投与されるが、創傷を受ける後に１０日以内、またはそれ以上に投与するとしても創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減および阻害を促進することができる。
【００５６】
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減および阻害を促進するために本発明の方法および薬剤は１回以上投与してもよい。例えば、該薬剤の治療的に効果的な投与量で、完全治癒までに何回も創傷に投与してもよい。例としては、創傷形成後に少なくとも最初３日間に本発明の薬剤は、毎日または１日に２回、創傷に投与してもよい。本発明者は、１回目は創傷形成の前に投与し、創傷形成後に２回目を投与する、本発明の薬剤の２回のレジームを含む投与計画は創傷形成を軽減するには特に効果的であることを判明した。好ましくは、そのようなレジームは創傷形成の直後の最初の投与および創傷後２４時間後の２回目の投与を含むことができる。
最も好ましくは、本発明の方法および薬剤は創傷形成の前およびその後と両方に投与してもよい。本発明者は、創傷形成の直前に本発明の薬剤を投与して、その後、創傷形成後の数日の間に毎日該活性剤を投与することは、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減および阻害を促進するには特に効果的であることを判明した。
【００５７】
本明細書においては、「活性剤」または「本発明の活性剤」とは、生物学的または治療適に効果のあるモノマーＴＧＦ−βを意味する。そのような活性剤は、好ましくは、野生型モノマーＴＧＦ−βであり、より好ましくは、好ましい例は配列識別番号３に記されるモノマーを含む、創傷治癒の加速および／または瘢痕化阻害を促進することのできるモノマーＴＧＦ−βであってもよい。当然のことながら全てのそのような活性剤は本発明に従って薬剤に組み込まれてもよく、本発明の方法および用途に使用してもよい。
当然のことながら創傷に本発明の薬剤を投与すべき投与量は、該薬剤に存在する活性剤の生物学的な活動およびそのバイオアベイラビリティのような幾つかの要因に依存して、またそれは、他の要因も考慮しながら、活性剤の性質および薬剤の投与法に依存する。薬剤の適切で治療的な投与量を判定するには、その他下記の要因を含んでもよい。
Ａ）治療されている対象における活性剤の半減期．
Ｂ）治療する特定の病状（例えば急性の創傷または慢性の創傷）
Ｃ）対象の年齢
【００５８】
投与の頻度は、特に治療されている対象における選択された活性剤の半減期、上記の要因からも影響を受ける。
一般的に、本発明による薬剤が既存の創傷を治療するに使用される場合、該薬剤は創傷を受けた直後に投与すべきである（あるいは、身体内部部位のような直ぐに明らかではない創傷の場合、創傷を診断した直後とする）。本発明による方法または薬剤を使用する治療は、医師が満足するまで、治癒過程の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害まで続くべきである。
【００５９】
投与の頻度は使用された活性剤の生物学的半減期に依存する。典型的に本発明の活性剤を含有するクリームまたは軟膏は、創傷における活性剤の濃度を、治療効果を生じる適切な程度に維持するように、対象組織に投与するべきである。これは毎日、または１日に何度も投与することが必要となる場合がある。
本発明の薬剤は、創傷治癒の促進および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害という望ましい効果を達成できるいかなる適切な経路でも投与してもよいが、好ましくは、該薬剤を創傷部位に局所的に投与する。
【００６０】
本発明者は、創傷治癒の促進および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害を、創傷部位に注射することによって本発明の活性剤を投与することによって、実施できることを判明した。例えば、真皮創傷の場合、本発明の活性剤を皮内注射により投与してもよい。従って本発明による好ましい薬剤は、本発明の活性剤の注射できる溶液を含む（例えば上皮損傷の部位または損傷を受けそうな部位の周囲に注射するもの）。本発明において本実施形態に使用するための適切な製剤は、下記の通りである。
その代わりに、またはそれに加えて、本発明の薬剤は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害を促進するために、局所的な形態に投与してもよい。そのような投与は創傷部位に対して最初の、および／またはその後の治療の一環として実施してもよい。
【００６１】
本発明者は、創傷治癒加速の促進および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害が創傷に（あるいは、予防的な投与の場合、創傷を形成する組織または部位に）本発明の活性剤を局所的に投与することによって特に向上されることを判明した。
本発明の活性剤を含有する組成物または薬剤は、特に使い方により、幾つかの形態が可能である。従って、例えば、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、粉末またはエアロゾルの形態が可能である。そのような組成物は全て創傷に局所的に投与することに適切であり、それは治療が必要となる対象（ヒトまたは動物）に対して本発明の活性剤を投与する好ましい手段である。
【００６２】
本発明の活性剤は、創傷または上皮損傷を治療するその他の部位を網羅するに使用できる滅菌包帯またはパッチの形で提供してもよい。
当然のことながら、本発明の活性剤を含む組成物の運搬体は、患者によく耐えられて、創傷に放出することを可能にするものであればよい。そのような運搬体は、好ましくは生物分解性、生物溶解性、生物吸収性および／または非炎症性のものである。
【００６３】
本発明の活性剤を含む薬剤および組成物は、幾つかの用途に使用することができる。従って、例えば、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害を促進するために組成物は、創傷の中に、および／または創傷の周囲に投与してもよい。組成物を「既存」の創傷に投与する場合、薬学的に許容される運搬体は比較的に「マイルド」なものであり、つまり、生体適合性、生物分解性、生物溶解性、および非炎症性のものである。
本発明の活性剤またはそのような活性剤をコード化する核酸（以下、さらに説明するように）は、持続放出または遅延放出の装置に組み込まれる場合がある。該装置は、例えば、皮膚の上に置くまたは皮膚の下に挿入することができ、そこで活性剤または核酸は数日間、数週間または数ヶ月まで放出される場合がある。該装置は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害を長期的に促進する必要となる患者（慢性の創傷を患う患者等）に対して特に有用である場合がある。該装置は、通常は頻繁的な投与（例えば、他の経路を介して少なくとも毎日の投与）が必要となる活性剤または核酸の投与に使用された際は特に有利である。
【００６４】
本発明の活性剤の毎日投与量は一回の投与として与えられる（例えば、局所製剤の毎日投与または毎日の注射）。その代わりに、本発明の活性剤は１日に２回以上の投与が必要となる場合がある。さらにその代わりに、持続放出装置を使用し、複数の投与量を投与する必要なしに患者に本発明の活性剤の最適な投与量を与えることができる。
一実施形態において、本発明の活性剤を投与する薬学的な運搬体は液体であってもよく、適切な薬学的な組成物は溶液の形態である。別の実施形態においては、薬学的に許容される運搬体は固体であり、適切な薬学的な組成物は粉末または錠剤の形態である。さらに別の実施形態においては本発明の活性剤は、薬学的に許容される経皮貼布の一環として製剤される。
【００６５】
個体運搬体は、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、充填剤、流動促進剤、圧縮剤、結合剤または錠剤崩壊剤として動作し得る１つ以上の物質を含んでもよく、封入材料であってもよい。粉末においては、運搬体は、詳細に分けた本発明の活性剤と混合する詳細に分けた固体である。錠剤においては、本発明の活性剤が適切な割合で必要な圧縮特性を有する運搬体と混合され望ましい形状および大きさで圧縮される。粉末および錠剤は、好ましくは９９％まで本発明の活性剤を含む。適切な個体運搬体は、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチンセルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。
液体運搬体は溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル剤および圧縮された組成物を調製するために使用する場合がある。本発明の活性剤は、水、有機溶剤、双方の混合物または薬学的に許容される油脂の中に溶解または懸濁してもよい。液体運搬体はその他の適切な薬学的添加物を含んでもよく、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定剤または浸透圧調節剤を含んでもよい。経口および非経口投与用の液体運搬体の適切な例は、水（部分的に上記のような添加物を含む、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム溶液）、アルコール（１価アルコールおよび多価アルコールを含む、例えばグリコール）およびその誘導体、および油（例えばヤシ油およびラッカセイ油）である。本発明の薬剤または方法は、ＴＧＦ−β３などのモノマーＴＧＦ−βがアルコールのない状態で提供される製剤を使用することが、一般的に好ましい場合がある。そのようなアルコールを含まない製剤は、その比較的に「マイルド」な性質により、創傷部位（または創傷が形成され得る部位）での使用に特に好ましい。非経口投与においては、運搬体はオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような脂肪酸エステルであってもよい。滅菌液体運搬体は、非経口投与用の滅菌液体組成物には有用である。圧縮組成物の液体運搬体は、ハロゲン化炭化水素またはその他の薬学的に許容される推進材であってもよい。
【００６６】
滅菌溶液または懸濁剤である液体薬学的組成物は、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹膜内、皮内、基質内（角膜）または皮下の注射により活用することができる。滅菌溶液は静脈内投与も可能である。本発明の活性剤は、滅菌水、食塩水またはその他適切な滅菌注射可能な媒体を使用し投与時に溶解または懸濁される滅菌固体組成物として調製してもよい。運搬体は結合剤、懸濁化剤、潤滑剤および防腐剤の必要な物と不活性の物と双方とも含むことを目的にする。
本発明の活性剤を経口で投与することが望ましい場合、当然のことながら選択された活性剤は、好ましくは分解への抵抗が高い程度にある活性剤である。例えば、本発明の活性剤は消化管中に分解率を減少するように保護される場合がある（例えば、上記の手法を使用する）。
【００６７】
本発明の活性物からなる組成物は、角膜において創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害を促進するには適切である。角膜の創傷は偶発的な事故（上記のように）または手術（例えば角膜のレーザー手術）によって生じた眼の外傷の結果である場合がある。この場合は、本発明の好ましい薬剤は点眼薬の形態であってもよい。
本発明の活性剤は様々な「内部」創傷（つまり、外部の表面よりも身体の内部に起こる創傷）において使用してもよい。従って、例えば本発明による薬剤は肺またはその他呼吸上皮で生じる創傷に使用するように吸入剤として製剤されてもよい。
【００６８】
薬学業界で通常に使用された既知の過程（例えば生体内実験、臨床試験等）は、本発明の活性剤を含む組成物の特定の製剤および該組成物の投与のための正確な治療計画（例えば活性剤の毎日の投与量および投与の頻度）を確立のため使用してもよい。
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を促進できる本発明による薬剤の適切な毎日の投与量は、創傷を受けた組織の性質、治療する創傷の面積および／または深さ、創傷の重大性および病的な瘢痕または慢性の創傷形成が起こりやすい要因の有無を含めて（但しそれに限定されない）様々な要因に依存する。
【００６９】
例として、１回の治療における創傷または上皮損傷の部位に投与される活性剤の量は、好ましくは創傷のリニアｃｍまたは上皮損傷のｃｍ２につき５０〜２００ｎｇであり（注射による投与の場合）、または創傷のリニアｃｍまたは上皮損傷のｃｍ２につき１００〜３００ｎｇである（局所投与の場合）。
例として、創傷または上皮損傷の部位に毎日投与される活性剤の好ましい量は、創傷のリニアｃｍまたは上皮損傷のｃｍ２につき約５０ｎｇであり（注射投与の場合）、または創傷のリニアｃｍまたは上皮損傷のｃｍ２につき約１００ｎｇである（局所投与の場合）。
【００７０】
例として、創傷または上皮損傷の部位に注射により投与される活性剤の総量は、毎日１回、３日間までに投与し、それで創傷のリニアＣＭまたは上皮損傷のＣＭ２につき１５０ｎｇの総量を与えるという条件で、好ましくは、創傷のリニアｃｍまたは上皮損傷のｃｍ２につき約５０ｎｇ／１００μＬである。
急性創傷または上皮損傷の部位への局所投与の場合、毎日１回、３日間までに投与し、それで創傷のリニアＣＭまたは上皮損傷のＣＭ２につき３００ｎｇの総量を与えるという条件で、好ましくは創傷のリニアＣＭまたは上皮損傷のＣＭ２につき１００ｎｇである。
【００７１】
上記のことから反れることなく、創傷およびその他上皮損傷の部位の治療に必要となる本発明による薬剤の投与量は、典型的に２４時間あたり創傷または皮膚損傷のリニアセンチメートルにつきｌｐｇ〜ｌｍｇの範囲に入っているが、上記の要因に対応するためこの数字は上または下に変更されてもよい。活性剤は好ましくは活性剤溶液の１ｐｇ／１００μＬ〜１ｍｇ／１００μＬという形態により与えられ、２４時間の期間に創傷または皮膚損傷のリニアセンチメートルにつき該溶液の１００μＬを投与する。
より好ましくは、該活性剤は１０ｐｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬの溶液として投与され、２４時間の期間に創傷または皮膚損傷のリニアセンチメートルにつき該溶液の１００μＬを投与する。
【００７２】
最も好ましくは、該活性剤は１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬの溶液として投与され、２４時間の期間に創傷または皮膚損傷のリニアセンチメートルにつき該溶液の１００μＬを投与する。
一般的に、本発明の活性剤を含む組成物は、創傷に投与すると活性剤の濃度が創傷または上皮損傷のリニアセンチメートルにつき０．７９ｐＭ〜０．７９ｍＭになるように製剤すべきである。好ましくは該活性剤はリニアセンチメートルにつき７．９ｐＭ〜０．０７９ｍＭの濃度で与えられる。
【００７３】
本発明の活性剤（例えば配列識別番号３のペプチド）は０．７９ｐＭ〜０．７９ｍＭの濃度で投与してもよい。好ましくは本発明の活性剤は７．９ｐＭ〜０．０７９ｍＭの濃度で投与してもよい。最も好ましくは本発明の活性剤は０．７９ｎＭ〜０．７９μＭの濃度で投与してもよい。
単純に例として本発明の活性剤（例えば、配列識別番号３のペプチド）の１０ｐｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬを含む注射可能な溶液は、皮内注射として投与し創傷周囲のリニアｃｍにつき１００μＬを投与した場合、皮膚創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害を促進することに適切である。
【００７４】
配列識別番号３のモノマーペプチドの場合、創傷への投与において好ましい投与量は約１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬであり、創傷周囲のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬが投与される。
本発明の活性剤は単独治療（例えば本発明の薬剤しか使用しない）として創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害を促進するために使用してもよい。その代わりに、本発明の方法および薬剤は創傷治癒または瘢痕化阻害を促進するため、その他の化合物または治療と組み合わせて使用してもよい。そのような治療組み合わせの部分として使用できる適切な治療は当業者に周知である。
【００７５】
本発明者は、本発明による薬剤、および特には配列識別番号３のペプチドを含むものは砂糖の存在下で有利に製剤することができるということを発見した。この砂糖は還元糖または非還元糖および／またはリン酸塩またはホスホン酸塩の誘導体であってもよい。そのような砂糖の例は、マルトース、マンノース、トレハロース、アラビノース、マンニトール、スクロース、フルクトース、Ｄ形グルコースおよびグルコースからなる群から選択してもよいがそれらに限定されない。好ましい砂糖はマルトースおよびトレハロースからなる群から選択してもよい。本発明の薬剤、特に本発明の本実施形態によるものは、好ましくはｐＨ５からｐＨ７を有してもよい。
当然のことながら、モノマーＴＧＦ−βペプチドはその分子をコード化する核酸配列の細胞発現が関与する手法により投与する有利な活性剤であってもよい。そのような細胞発現方法は、長期間に渡ってそのペプチドの治療効果が必要となる医療用途には特に適切である（例えば、創傷治癒反応の不全を生じないように、ある一定の期間に渡って増やすことが望ましい場合）。特に好ましくは、細胞発現により投与するＴＧＦ−βモノマーは配列識別番号３により確定されたペプチドを含む。
【００７６】
創傷のような組織へ本発明のペプチド活性剤を投与する多くの既知の方法は、ペプチド活性剤は生体内に短い半減期を有する場合があるため、数日間でも治療部位で本発明の活性剤の水準を維持するのが困難であるという不利がある。活性剤の半減期が短いことは下記の点を含めて幾つかの理由がある。
（ｉ）プロテアーゼ等による分解
（ｉｉ）結合タンパク質によるクリアランス
（ｉｉｉ）細胞外マトリックス分子による活性作用の結合および阻害
さらに、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減または阻害を促進するに使用される活性剤は、適切な運搬体中に投与する必要があり、多くの場合に活性剤および運搬体を含む組成物として提供される。上記のように、そのような運搬体は好ましくは、非炎症性、生物適合性、生物吸収性のものであり活性剤（保存中または使用中）の分解または無効を引き起こさない。しかしながら治療する創傷のある組織へ活性剤を送達するための適切な運搬体を提供することが困難である場合が多い。
【００７７】
これらの問題を防ぐまたは減らす便利な方法は遺伝子治療により治療する領域に本発明の活性剤の治療有効量を与えることである。
遺伝子コードの縮重により、本発明に基づく使用に適した核酸配列コード剤は、その機能的変異体を提供するために、それによってコード化される生成物の配列に実質的に影響を与えることなく、変化または変更されてもよいことは明らかである。配列認識番号１から３に定義されるペプチドをコード化するために使用してもよい、考えられる核酸の配列は、当業者に容易に明らかとなり、適した例は、配列認識番号の４から７としてそれぞれ提供される。
【００７８】
遺伝子治療運搬系は、創傷で、ほとんどの従来の運搬系より長期間に渡り、本発明の活性剤の持続レベルを達成するために、非常に適している。創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害を促進するために適した本発明の活性剤は、本発明の第９の側面に開示されるＤＮＡ分子で変換された創傷部位の細胞から、継続的に発現されてもよい。従って、本発明の活性剤が生体内で非常に短い半減期を有するとしても、活性剤の治療有効量は、治療される組織から継続的に発現されてもよい。
さらに、運搬系を、創傷に接触する軟膏またはクリームなどに要求される従来の賦形薬を必要とすることなく、ＤＮＡ分子（および、従って本発明の活性剤）を提供するために使用してもよい。
【００７９】
適した遺伝子治療運搬系は、好ましくは、配列認識番号１から３を備える群により定義されるペプチドを生成するために（運搬系が患者に投与される際に）発現することができるＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子は、組み換えベクターを形成するために、適したベクターの中に包含されてもよい。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミッド、またはファージであってもよい。そのような組み換えベクターは、適したＤＮＡ分子で細胞を変換するための本発明の遺伝子治療運搬系において、非常に有用である。
また組み換えベクターは、その他の機能要素を含んでもよい。例えば、組み換えベクターは、ベクターが細胞の核を自発的に複製するように設計されてもよい。この場合、ＤＮＡの複製を誘発する要素が組み換えベクター内に要求される場合がある。あるいは、組み換えベクターは、ベクターおよび組み換えＤＮＡ分子を細胞のゲノムに組み込むように設計されてもよい。この場合、標的組み込み傾向のある（例えば、相同組み換えによって）ＤＮＡ配列が好ましい。また組み換えベクターは、クローンプロセスにおける選択可能な指標として使用される場合がある遺伝子のＤＮＡコーディングを有してもよい。
【００８０】
また組み換えベクターは、要求に応じて、遺伝子の発現を制御するプロモータまたはレギュレータをさらに含んでもよい。
ＤＮＡ分子は、（必ずしもというわけではないが）治療を受けている対象の細胞のＤＮＡに組み込まれる１つであってもよい。未分化細胞は、安定して変換され、遺伝子組み換えされた娘細胞の生成を誘導してもよい。この場合、例えば、特定の転写調節因子、遺伝子活性剤、またはより好ましくは誘導プロモータを用いる対象内の発現調節が要求され、具体的に創傷で発見されるシグナルを受けて、遺伝子を転写する。あるいは、運搬系は、治療を受けている対象内の分化した細胞の不安定または一時的な変換を行うように設計されてもよい。この場合、形質転換細胞が死ぬ、またはタンパク質の発現を停止する際（理想的には、瘢痕化の低減と同時に創傷治癒の加速の促進が効果をもたらす際）、ＤＮＡ分子の発現が停止するため、発現調節は、それほど重要でない場合がある。
【００８１】
運搬系は、ベクターに組み込まれることなく、対象にＤＮＡ分子を提供してもよい。例えば、ＤＮＡ分子は、リポソームまたはウイルス粒子内に組み込まれてもよい。あるいは、適した方法、例えば、直接エンドサイトーシス摂取により、「裸の」ＤＮＡ分子が対象の細胞に挿入されてもよい。
ＤＮＡ分子は、トランスフェクション、感染、顕微注入、細胞融合、原形質融合、または高速弾道衝撃により、治療を受ける対象の細胞に移行されてもよい。例えば、コーティングされた金粒子、ＤＮＡ分子を含むリポソーム、ウイルスのベクター（例えば、アデノウイルス）による弾道トランスフェクション、および局所または注射により、直接創傷にプラスミドＤＮＡを塗布することによって直接ＤＮＡ摂取を提供する方法（例えば、エンドサイトーシス）により移行してもよい。
【００８２】
本発明の活性剤の細胞の発現は、創傷の周辺の無傷の領域の縁部の細胞によって、または治療のために創傷に移植された細胞（例えば、創傷治癒反応に関係する培養内生または外生細胞）による場合がある。
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、低減、あるいは阻害を促進するために治療的に導入される細胞は、それらが本発明の活性剤のレベルの向上を発現し、そして創傷した領域に導入されるように、生体外で操作されてもよい。そのような細胞は、好ましくは、創傷治癒の促進に使用される人工皮膚または代替皮膚の調合または製造に使用するための生体外で培養された細胞である。いずれの適した細胞を使用することができることが理解し得るが、より好ましくは、細胞は、自己細胞であってよい。
【００８３】
従って、本発明の第１７の側面において、本発明の活性剤を発現するために誘発される細胞を含む薬剤が提供される。そのような細胞は、好ましくは、モノマーＴＧＦ−β３を発現してもよい。
本発明の活性剤の細胞の発現の誘発は、本発明に基づく使用に適した活性剤の発現を生じる核酸の細胞に組み込む方法により、影響を及ぼす場合がある。
【００８４】
本発明は、以下の実験手順および研究、ならびに添付図面を参照して、例証としてさらに記載する。
重要なアミノ酸または核酸配列に関する情報は、（ＴＧＦ−βアイソフォームの全長ペプチドをコード化するＤＮＡ分子配列および野生型ＴＧＦ−β３の活性フラグメントをコード化するＤＮＡと同様に、本発明に基づく使用に適したヒトＴＧＦ−βアイソフォームの活性フラグメントのアミノ酸配列、および本発明に基づく使用に適したヒトＴＧＦ−βアイソフォームをコード化するｃＤＮＡの作成に使用されるプライマーのＤＮＡ配列を含む）セクション「配列情報」に提供する。
【実施例】
【００８５】
手順および例
１．ＴＧＦ−βモノマータンパク質の生成、リフォールディング、および精製方法
１．１  ヌクレオチド配列
全長ＴＧＦ−βタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を配列認識番号４から６として示す。全長ＴＧＦ−βタンパク質は、活性フラグメント（通常テキストで示す）と同様に、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）からなる。野生型ＴＧＦ−β３活性フラグメントをコード化するヌクレオチド配列を配列認識番号７で示す。
１．２  ｃＤＮＡ作成
ヒト切開創傷からの総ＲＮＡ（創傷後５日目に採取）を「ＤＮＡ−Ｆｒｅｅ」（ＡＭＢＩＯＮ）で処理し、いかなる汚染ＤＮＡを除去する。総ＲＮＡをテンプレートとして使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により３つの哺乳類ＴＧＦ−βアイソフォーム、すなわち、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のそれぞれに対するｃＤＮＡを作成した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＱＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔの１−Ｓｔｅｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを調製した。１マイクログラムのＲＮＡを、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＱＲＴ−ＰＣＲバッファ、０．２ｍＭのＤＮＴＰＳ、３．５ｍＭのＭＧＣＬ２、１μＬのＳＴＲＡＴＡＳＣＲＩＰＴ逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニット、０．４ｍＭのセンスプライマー（図１）、０．４ｍＭのセンスプライマー（配列情報に示す）を含む５０ｍＬの溶液に添加した。反応物をサーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）に置き、４５℃で３０分間、９５℃で１０分間、そして９５℃４０サイクルを３０秒間、６５℃で１分間、および７２℃で１分間の条件下で実行した。７２℃の最終工程は１０分間。ＰＣＲ試料に２％（Ｗ／Ｗ）のアガロースゲルを実行し、結合サイズを検証し、ＷＩＺＡＲＤ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。
【００８６】
１．３  プラスミドの構成
ｐＢＲ３２２ベクターから使用したｐＥＴ−３Ｄベクターを抽出し、ＬａｃＵＶ５制御下のＴ７プロモータおよびアンピシリン耐性標識遺伝子を含有させる。
３つのＴＧＦ−（ＳアイソフォームｃＤＮＡフラグメント（セクション１．２で作成された）を、ｐＥＴ−３ｄベクターにＮｃｏ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位（５′−３′のそれぞれ）サブクローニングした。結果として生じる連結反応は、ＸＬ１０Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと変化し、コロニーＰＣＲ分析を実施して、挿入部分を含むクローンを見つけた。最終クローンを成長させ、Ｑｉａｐｒｅｐ（登録商標）ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、プラスミドＤＮＡを水中に抽出した。プラスミドを配列し、Ｔ７プロモータプライマー（５′−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３′およびＴ７ターミネータプライマー（５′−ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ−３′）を使用して検証した。
１．４  変換およびクローニング
（セクション１．３からの）各ＴＧＦ−βアイソフォームに対してコードする１０ｍＬ（１ｍＬ当り５０ｎｇ）のプラスミドＤＮＡを１ｍＬの低温（４℃）コンピテントｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  ＳｉｎｇｌｅｓＴＭ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に添加した。２０分後、４２℃の水浴で３０秒間培養することにより、細胞に熱ショックを与えた。１００μＬのＰＳＩ媒体を細胞／プラスミド混合物に加え、３７℃で９０分間振盪した。５０μＬおよび１００μＬのアリコートを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（Ｓｉｇｍａ）の上に置き、３７℃で１８時間培養した。単一コロニーを培養し、冷凍細胞ストックを作成し、−８０℃で保存した。正確な変換を検証するために、細胞からプラスミドＤＮＡを分析した。
【００８７】
１．５  発現
（セクション１．４からの）各ＴＧＦ−βアイソフォームで形質変換した冷凍変換Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞のアンプルを回収し、１００ｍＬのＬＢ媒体および１００ΜＧ／ｍＬのアンピシリンを含むバッフル付三角フラスコに植菌した。振盪しながら３７℃で一晩、フラスコを培養した。５ｍＬのこの一晩培養物を２リットルの三角フラスコ（５００ｍＬのＬＢ媒体／アンピシリン）に加え、振盪しながら３７℃で培養した。２ｍＬの培養液試料を１時間ごとに取り出し、増殖およびＴＧＦ−βアイソフォーム発現（誘発後）を監視した。増殖は、波長６００ｎｍでの分光光度計上の吸光度を測定することによって測定した。吸光度０．６Ａｂｓが測定された時、最終濃度１ｍＭにイソプロピルβ−Ｄ−ＴＨＩＯＧＡＬＣＴＯＰＹＲＡＮＯＳ認識Ｅ（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ）の添加によりＴＧＦ−βアイソフォームを発現するように細胞を誘発した。培養物をさらに４時間培養した。０．５ｍＬの培養液試料を遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｂｉｏｆｕｇｅで１０、０００ＲＰＭで１０分間）で沈殿し、上澄みを廃棄した。沈殿物を５０μＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動（ＰＡＧＥ）試料バッファに再懸濁し、９５℃の水浴で１０分間加熱した。１０ｍＬの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに入れた。（１９８６年、Ａ．Ｔ  Ａｎｄｒｅｗｓに記載されるように）、Ｈｏｅｆｅｒ（登録商標）ＭＩＧＨＴＹ  ＳＭＡＬＬ  ＳＥ２４５ＤＵＡＬ  ＧＥＬ  ＣＡＳＴＥＲ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー・ブルー染色を実行した。ゲルは、厚さ１ｍｍで１５％（ｖ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを含んでいた。
１．６  細胞の採取および封入体の単離
４３１５ロータを有するＨｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔｉｎａ  ４６Ｒ遠心分離機で、４℃で５０００ｇ、１０分間遠心分離することによって、セクション１．５からの細胞を沈殿した。４℃で、各不溶性（封入体）ＴＧＦ−βアイソフォームの細胞破壊および再生を実行した。細胞を５０ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ８．３を、Ｓａｎｊｏ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０を使用する超音波処理によって破壊した。２％（ｗ／ｗ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を懸濁液に加え、１時間撹拌した。懸濁液を１２，０００ｇ、４０分間遠心分離した。１５，０００ｇ、４０分間遠心分離する前に、室温で５０ｍＬの１００ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＬ、１０ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．３に沈殿物を再懸濁した。
【００８８】
１．７  封入体の可溶化
セクション１．６からの沈殿物を４０ｍＬの８Ｍ  Ｕｒｅａ  １％（ｗ／ｗ）ＤＬ−Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）に再懸濁し、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｄｉａｘ  ９００ホモジナイザー中で破壊した。懸濁液をカバーし、１時間撹拌して封入体を溶解性にし、ＴＧＦ−βアイソフォームをそれらの変形モノマー型に減少させた。その後、４℃で懸濁液を１２，０００ｇ、３０分間遠心分離した。上澄みを透析し、バッファを８Ｍの尿素（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）から１０％（ｖ／ｖ）の酢酸に交換した。バッファが１０％（ｖ／ｖ）の酢酸に交換される際、８Ｍ尿素中に溶解できるＥ．ｃｏｌｉタンパク質を溶液から沈殿させる。１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）を懸濁液に添加し、カバーし、３０分間撹拌して、緩衝交換中にＴＧＦ−βモノマー間で形成される場合があるいかなるジスルフィド結合を低下した。可溶性タンパク質と不可用性タンパク質を分離するために、懸濁液を遠心分離した。尿素の可溶化および緩衝交換工程から試料を取り出し（酢酸溶解性および非溶解性物質）、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。
１．８  限外濾過
セクション１．７の１０％（ｖ／ｖ）の酢酸物質を、Ｖｉｖｏｆｌｏｗ５０（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上の１０ｋＤａの薄膜で限外濾過した。この目的は、１０％（ｖ／ｖ）の酢酸懸濁液を３ｍＬまで削減し、低分子量タンパク質（＜１０ｋＤａ）を除去することであった。
【００８９】
１．９  リフォールディングおよび精製
可溶化したＴＧＦ−β１、２、および３タンパク質を、最初に限外濾過により濃縮し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに通した。ＴＧＦ−βタンパク質を含むＳＥＣの分留を集め、凍結乾燥した。凍結乾燥したモノマーＴＧＦ−β１、２、および３を、最終濃度である１０ｍｇ／ｍＬが達成されるまで、１０ｍＭのＤＴＴを含む８Ｍの尿素に可溶化した。ＴＧＦ−β１、２、および３タンパク質溶液を滴下により添加し、一方、溶液（１Ｍ３−（−ピリジノ）−ｌ−プロパンスルホン酸（ＮＤＳＢ−２０１）、２０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）、２％（ｗ／ｖ）の３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、１ＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｗ／ｖ）の還元グリタチオン（ＧＳＨ、Ｓｉｇｍａ）、０．０５ＭのＴｒｉｚｍａ（登録商標）Ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ９．３）を、最終濃度である０．２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１、２、および３が達成されるまで、撹拌してリフォールディングした。濃縮ＮａＯＨ／ＨＣｌを使用して、ｐＨを９．２〜９．４の範囲に維持することが重要である。モノマータンパク質が酸化できるようにするために、穴のあいたパラフィルムで溶液をカバーし、８℃で撹拌した。１４４時間後、溶液１５，０００ｇを４０分間遠心分離し、形成された沈殿物を除去し、氷酢酸でｐＨをｐＨ３．５に調節した。
１．１０  リフォールドされたモノマータンパク質の精製
その後、結果として生じるリフォールドされたＴＧＦ−β物質を、標準クロマトグラフィー技術を使用してさらに精製し、特性付けの前に、続いて限外濾過により、関連する分留（すなわち、モノマーＴＧＦ−β３タンパク質）を濃縮した。
【００９０】
２  モノマーＴＧＦ−βタンパク質の生体活性の特性付けおよび評価のための生体外ならびに生体内方法論
ＴＧＦ−βモノマータンパク質を特性付けし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、アミノ酸配列分析（ＬＣＭＳによる）、生体内生物活性アッセイ（以下に記載される、ラットモデルの皮膚創傷治癒および瘢痕化を使用する）を含む多数の方法により、生物活性を評価した。
【００９１】
２．１  ＴＧＦ−β３モノマーの生体外特性付け
２．１．１  精製モノマーＴＧＦ−β３の非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
２．１．１．１  方法
精製野生型ＴＧＦ−β３モノマーをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、純度および分子量を測定した。３μｇの精製ＴＧＦ−β３モノマー（還元および非還元）、および３μｇのダイマーＴＧＦ−β３陽性対照（還元および非還元）、および１０μＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ  １２分子量標準をポリアクリルアミドゲル（１０％〜２０％（ｖ／ｖ）のアクリルアミド勾配）に置いた。電気泳動が完了後、ゲルをクマシー・ブルーで染色した。
２．１．１．２  結果
非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図１に示し、ダイマーＴＧＦ−β３がゲル上で予測位置（還元試料においては、〜１３ｋＤａ、非還元試料においては、２５ｋＤａ）に至ったことを示す。還元および非還元試料において、モノマーＴＧＦ−βは、ゲル上で予測位置、〜１３ｋＤａ（理論上１２．５ｋＤａ）に至った。タンパク質のおよそ１μｇの検出感度を有するクマシー・ブルー染色では、さらなるタンパク質結合は検出されなかった。
２．１．２  アミノ酸配列分析
２．１．２．１  方法
５０マイクロリットルの精製モノマーＴＧＦ−β３試料を真空乾燥し、そして、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３および１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを含む溶液２０μｌに再懸濁した。シークエンシンググレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μｇを、供給される再懸濁液バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ）キット１０μｌに再懸濁し、トリプシン濃度を２μｇ／μｌにした。そして、これを５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３および１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルで希釈し、最終トリプシン濃度０．２μｇ／μＬにした。トリプシンをモノマーＴＧＦ−β３と１：２０（ｗ／ｗ）の比率で添加することにより、消化を一晩実施した。最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）までギ酸（Ｆｌｕｋａ）を添加することにより、消化を抑制した。そして、試料を１ｐｍｏｌｅ／μｌに希釈し、そしてナノフローＲＰ−ＬＣＭＳ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｑ−ＴｏＦ２とオンラインのＤｉｏｎｅｘ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）のプロセスで、ペプチドを分析した。５％のアセトニトリルから５５％のアセトニトリル（Ｒｏｍｉｌ）の４５分の勾配を利用して、７５μｍのＣ１８カラム（ＬＣ  ｐａｃｋｉｎｇｓ）に対してクロマトグラフィーを実施した。ＭＳ分析は、データ依存分析形式をとり、ＬＣから溶出するペプチドイオンのｍ／ｚを測定し、ＭＳＭＳ分析に適したイオンを選択し、配列情報をレンダリングするために、フラグメントペプチドイオンに対して、衝突誘発分解を採用した。
２．１．２．２  結果
アミノ酸配列分析により、ＴＧＦ−β３「野生型」モノマーは、予測されるアミノ酸配列（配列認識番号３に対応する）を有することが確認された。
【００９２】
２．２  ＴＧＦ−β３モノマーの生物活性の生体内評価
文献のデータは、ＴＧＦ−β３を含むダイマーＴＧＦ−βが創傷または損傷後の皮膚治癒を加速し、瘢痕化を軽減することを示す（Ｓｈａｈ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）。以下の実施例は、成人雄ラットの切開創傷治癒（創傷後３日間）ならびに瘢痕化（創傷後７０日間）におけるモノマーＴＧＦ−β３の生物学的活性を調査した。
【００９３】
２．２．１  モノマー「野生型」および変異ＴＧＦ−β３タンパク質の創傷治癒における作用（切開創傷３日目）
２．２．１．１  方法
雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）をハロタンで麻酔し、それらの背中を剃った。図２に示されるように、独自の標準テンプレートを使用し、皮膚マーキングインクで創傷位置に印を付けた。０．２５Ｍの麦芽糖（Ｓｉｇｍａ）、０．００２％（ｖ／ｖ）の酢酸、および０．３３％（ｖ／ｖ）のイソプロピルアルコールを含む無菌賦形剤バッファに、図３の表に概説される濃度に試料を希釈する。すべての試料は、濾過により、無菌の内毒素フリーにした。各治療グループに４匹のラットを使用した。各治療グループ（図３）の試料１００μＬを印を付けた創傷位置ＡおよびＢに皮内注射した（未治療−「未投与」ラットを除く）。創傷位置ＡおよびＢに、１１番の手術用メスで長さ１ｃｍの全層切開を行った。すべての動物を別々に檻に入れた。２４時間後、動物に２回目の試料の投与を行った。３日後、創傷の写真を撮り、巨視的ビジュアルアナログ採点法（Ｂｅａｕｓａｎｇ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８から変更）を使用して分析した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ／Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ試験を使用して、データの統計分析を行った。ｐ＜０．０５の数値は、有効だとみなす。
２．２．１．２  結果
３日後に巨視的ＶＡＳ法を使用して、切開創傷を調べた（図４参照）。この１０点等級において、０点は、創傷がかなり治癒したことを示し、１０点は、創傷がほとんど治癒していないことを示す。データは、５０ｎｇ／１００μＬまたは１００ｎｇ／１００μＬの野生型モノマーＴＧＦ−β３を用いる治療は、未治療（未投与対照）およびプラセボ治療の両方と比較し、ＶＡＳ点数を減少する（すなわち、創傷の巨視的外観を改善する）ことを示す。１００ｎｇ／１００μＬの投与を伴う治療は、未治療（未投与対照）と比較し、大幅（ｐ＜０．０１）に損傷の外観を改善した。モノマー野生型ＴＧＦ−βは、ダイマー形態よりも優れた作用を示すことは、驚きである。
【００９４】
２．２．２  モノマー「野生型」ＴＧＦ−β３タンパク質の瘢痕化における作用（切開創傷７０日目）
２．２．２．１  方法
雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）をハロタンで麻酔し、それらの背中を剃った。図５に示されるように、標準テンプレートを使用し、皮膚マーキングインクで創傷位置に印を付けた。０．２５Ｍの麦芽糖（Ｓｉｇｍａ）、０．００２％（ｖ／ｖ）の酢酸、および０．３３％（ｖ／ｖ）のイソプロピルアルコールを含む無菌賦形剤バッファに、図５の表に概説される濃度に試料を希釈する。すべての試料は、濾過により、無菌の内毒素フリーにした。各治療グループに４匹のラットを使用した。各治療グループ（図５）の試料１００μＬを印を付けた創傷位置ＡおよびＢに皮内注射した（未治療−「未投与」ラットを除く）。創傷位置ＡおよびＢに、１１番の手術用メスで長さ１ｃｍの全層切開を行った。すべての動物を別々に檻に入れた。２４時間後、動物に２回目の試料の投与を行った。７０日後、瘢痕の写真を撮り、巨視的ビジュアルアナログ採点法（Ｂｅａｕｓａｎｇ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９８から変更）を使用して分析した。上記に記載されるように生成された瘢痕の巨視的外観の例示的な例を図７に示す。
巨視的分析後、組織学的評価のためにワックスブロックに加工する前に、創傷を摘出し、１０％の酸緩衝生理食塩水中に置いた。ワックスブロックを５μｍの連続切片に切断し、スライドに置いた。スライドをＭａｓｓｏｎｓトリクロムで染色し、分析した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ／Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ試験を使用して、データの統計分析を行った。ｐ＜０．０５の数値は、有効だとみなす。上記に記載されるように生成された瘢痕の巨視的外観の例示的な例を図８に示す。
２．２．２．２  巨視的ＶＡＳを使用した７０日目の切開創傷の評価
７０日後に微視的ＶＡＳ法を使用して、切開創傷を調べた。１０点はひどい瘢痕を示し、０点は、正常な皮膚を示す。創傷７０日目のＶＡＳ分析は、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３（投与量５０ｎｇ／１００μＬおよび１００ｎｇ／１００μＬ）は、プラセボ治療および投薬されていない創傷と比較し、瘢痕化を軽減したことを示す。これは、モノマー「野生型」ＴＧＦ−β３（投与量５０ｎｇ／１００μＬおよび１００ｎｇ／１００μＬ）は、プラセボ治療および投薬されていない創傷と比較し、瘢痕化を軽減したことを示す。投与量１００ｎｇ／１００μＬに対して、この軽減は、プラセボ治療創傷と比較し、統計的に有意である（ｐ＜０．０１）。
ダイマーＴＧＦ−β３の５０ｎｇ／１００μＬは、プラセボ治療および未投与の創傷と比較し、瘢痕化を軽減した。この軽減は、プラセボ治療創傷と比較し、統計的に有意である（ｐ＜０．０１）。
【００９５】
３．  生物活性モノマーの生成に好ましい条件の開発
発明者は、適切にフォールドされた生物活性ＴＧＦ−βモノマーを作成する方法の改善の有無を調査した。以下の実施例は、ＴＧＦ−β３のモノマーをリフォールディングするための本発明の方法の適用を示す。
リフォールディング試薬を選別するために研究を計画した（３．１２参照）。そして適切にリフォールドされたモノマーを精製する方法を調査した（３．１３）。
これらの研究により、発明者は、生物学的に適切にフォールドされたＴＧＦ−βモノマーを作成する方法の改善は、可溶化された、鎖がほどけた状態のモノマー成長因子を、
（ｉ）２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）またはその機能的アナログ、と、
（ｉｉ）低分子量スルフヒドリル／ジスルフィドレドックスシステム、とを含む溶液に添加するステップを備える方法に従うことで、確立できる可能性があることに気づいた。
【００９６】
実験：
３．１  ｃＤＮＡ作成
ヒト切開創傷からの総ＲＮＡ（創傷後５日目に採取）をＤＮＡ−Ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、いかなる汚染ＤＮＡを除去した。総ＲＮＡをテンプレートとして使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＧＦ−β３  ｃＤＮＡを作成した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＱＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔの１−Ｓｔｅｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを調製した。１マイクログラムのＲＮＡを、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＱＲＴ−ＰＣＲバッファ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｌμＬのＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニット、０．４μＭのセンスプライマー（５′ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＧＣ  ３′）、０．４μＭのセンスプライマー（５′−ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  Ｃ  ３′）を含む５０μＬの溶液に添加した。反応物をサーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）に置き、４５℃で３０分間、９５℃で１０分間、そして９５℃で３０秒間を４０サイクル、６５℃を１分間、および７２℃を１分間の条件下で実行した。７２℃の最終工程は１０分間。ＰＣＲ試料を２％（ｗ／ｗ）のアガロースゲル上で進行させ、結合サイズを検証し、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。
【００９７】
３．２  ベクタークローニングおよびホスト細胞変換
ｐＢＲ３２２ベクターからｐＥＴ−２４ｄベクターを抽出し、ＬａｃＵＶ５制御下のＴ７プロモータおよびカナマイシン耐性標識遺伝子を含有させる。
ＴＧＦ−β３ｃＤＮＡフラグメント（セクション１．１で作成した）を、０．７５μＬのＮｃｏ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、０．７５μＬのＢａｍＨｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を１ＸのＢａｍＨ１バッファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、１５μＬの反応物（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ、Ｎｏｖａｇｅｎ）に３７℃で４時間消化した。同一の方法で、１マイクロリットルのｐＥＴ−２４ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）を消化した。消化したｃＤＮＡおよび大きなプラスミドフラグメントを、アガロースゲル精製し、ＳｐｉｎＰｒｅｐゲルＤＮＡ抽出キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）により回収した。
精製ｃＤＮＡおよびプラスミドフラグメントをＴ４リガーゼキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して結紮した。結紮ｃＤＮＡ／プラスミドをＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）変換キット）に変換した。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬｕｒｉａ培養液（ＬＢ）寒天プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にめっきすることによって、形質転換細胞を選択した。制限消化および／または発現のために、適したクローンを選択した。
【００９８】
３．３  生成物発現のためのクローンスクリーニング
クローンを反強度の「Ｔｅｒｒｉｆｉｃ培養液」（６ｇ／Ｌのフィトンペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１２ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２ｇ／Ｌのグリセロール（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、１．１６ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、６．２５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、ＱＳの蒸留水で１リットルにした）の振盪フラスコ培養物内で成長させ、１ｍＭのイソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＪＪＰＴＧ）を用いて、ＯＤ６００が０．６５から０．８５の間で指数増殖期を誘発した。ＩＰＴＧ添加の３時間後に誘発後試料を取り出し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、生成物の誘発および発現を分析した。クローン１〜４誘発前／後試料のアリコートおよびＭａｒｋ１２分子量標準（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ−分子量の範囲２．５〜２００ｋＤａ）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、１．０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、１２０ミリアンペア、２００ボルトでおよそ４０〜５０分間で進行させ、そしてクマシー・ブルーで染色した。６から１４．４ｋＤａの間の大きさのタンパク質（すなわち、ＴＧＦ−β３モノマー）が、これらの培養物のそれぞれに誘発され（図９参照）、クローン２は最高量のＴＧＦ−β３タンパク質を発現する。
【００９９】
３．４  冷凍細胞ストック
クローン１〜４を振盪フラスコ内の半強度のＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液内でＯＤ６００およそ１まで成長させ、グリセロールを２０％（ｖ／ｖ）まで添加することによって、グリセロールストックとして保存した。１．２ｍＬの培養液を１２×２ｍＬのクライオバイタル（０．３ｍＬのグリセロールを含んだ）に等分し、−７０℃で保存した。
【０１００】
３．５  ＴＧＦ−ベータ３遺伝子の配列確認
グリセロールを添加する前に、冷凍細胞ストックに使用した培養物の試料を取り出し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを使用するプラスミドの単離に使用した。単離したプラスミドを配列し、Ｔ７プロモータプライマー（５′−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３′およびＴ７ターミネータプライマー（５′−ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ−３′）を使用して検証した。
【０１０１】
３．６  種培養
クローン２が高量のＴＧＦ−ベータ３タンパク質を発現したため、冷凍ストックのアンプル（セクション３．４より）を回復させ、５００ｍＬのＨｙＳｏｙ媒体（１２ｇ／ＬのＨｙ−Ｓｏｙ（Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、２４ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、および１０ｇ／Ｌのグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、ならびに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した、２リットルのバッフルＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに接種した。フラスコを振盪しながら３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートし、ＯＤ５５０を測定するために、定期的に抽出した。培養物のＯＤが３．２１ＬＶｍＬに達した時（７時間後）、細胞培養液を使用して、１５０Ｌの発酵槽（可動範囲１００Ｌ）に種をまいた。
【０１０２】
３．７  発酵
９００ミリリットルの細胞培養液（セクション３．６の）を使用して、９０Ｌのバッチ培養媒体（０．６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＫＨ２ＨＰＯ４、１．２５ｇ／ＬのＮＨ４ＳＯ４、１２ｇ／ＬのＨＹ−Ｓｏｙ、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、および１０ｇ／Ｌのグリセロール）を含む、１５０Ｌの発酵槽（ＷＨＥ）に植菌した。発酵作業パラメータを以下のように制御する。温度設定：３７℃、ｐＨ設定点：７．０（４Ｎ水酸化アンモニウムおよび４Ｎリン酸を使用して維持した）、および溶存酸素（ＤＯ）を初期１００％に調節した。容器の上部圧力は７ｐｓｉであり、撹拌および空気流量は、毎分、培地容量毎に対して、１つの空気量（ｖｖｍまたはｓｌｐｍ）で、それぞれ２００〜４００ｒｐｍであった。発酵設定点パラメータを以下の優先事項に従いながら調節し、ＤＯが２０％を上回るように維持した。撹拌（最大４００ｒｐｍ）、通気（最大１．５ｖｖｍ）、酸素補給（最大３３．３Ｉｐｍ）、および背圧（最大１２ｐｓｉ）。プルロニックＬ−６１（２５％ｖ／ｖ）で泡立ちを制御した。培養物のＯＤが１０Ｕ／ｍＬに達した時、流量４５ｍＬ／分でグリセロールの供給（５０％ｖ／ｖ）を開始した。ＯＤが４０Ｕ／ｍＬに達したとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭで添加することにより、細胞を誘発した。
【０１０３】
３．８  収穫
誘発の４時間後、発酵槽を１０℃まで冷却し、空気流量および撹拌を０．３ｖｖｍおよび１００ｒｐｍまでそれぞれ下げた。泡およびｐＨ制御を終了し、背圧を３ｐｓｉに調節した。Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  ＣＳＡ８連続遠心分離機による１０℃での連続遠心分離により、培養物を収穫する。遠心分離機を１５，０００ｒｐｍ、流量毎分３リットルで運転し、細胞スラリーを回収した。
【０１０４】
３．９  細胞溶解およびＩＢ回収
発酵細胞ペースト（セクション３．８の）を溶解バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｚｍａＢａｓｅ（Ｔｒｉｓ）、３．７ｇ／Ｌのエチレンジアミノテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、５８．４４ｇ／ＬのＮａＣｌ、および１０ｇ／ＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０１）で１：５に希釈し、手持ち型ホモジナイザーを使用して再懸濁した。再懸濁細胞ペーストを高圧ホモジナイザー（パラメータ：圧力１０，０００ｐｓｉｇ、４５０ｍＬ／分、および温度１５℃）に２回通過させた。そして、均質化した細胞溶解物を、４℃で５，０００ｘｇを２０分間、遠心分離した（バケット遠心分離機、固定角ロータ）。不溶性（封入体）ＴＧＦ−β３を残し、上澄みを廃棄した。手持ち型ホモジナイザーを使用して、封入体（ＩＢ）ペレットを洗浄バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｓおよび３．７２ｇ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、遠心分離した（４℃、５，０００ｘｇ、２０分間）。
【０１０５】
３．１０  封入体の可溶化
セクション３．９の堆積物を可溶化バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｓ、１５．４ｇ／ＬのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および３６０．４ｇ／Ｌの尿素、ｐＨ８．０）で１：１０に希釈し、手持ち型ホモジナイザーを使用して再懸濁した。懸濁液をカバーし、室温で６０〜７５分間撹拌し、封入体を可溶化し、ＴＧＦ−β３をそのモノマー形態に還元した。２回目の６０〜７５分間の培養の前に、再懸濁したペレットのｐＨを、ＮａＯＨ／酢酸でｐＨ９．４〜９．６に調節した。
【０１０６】
３．１１  浄化／限外濾過およびディアフィルトレーション
セクション３．１０の可溶化した物質を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で浄化し、濃縮し、ディアフィルトレーションを行った。予め調整された浄化ＴＦＦ薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  １０００ｋＤａ、再生セルロース、スクリーンＶ）を用いて、初期浄化および濃度を達成した。浄化したＴＧＦ−β３は、透過物内に集められた。限外濾過／ディアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ５ｋＤａ、再生セルロース、スクリーンＣ）に切り替え、そして６ディアボリュームの可溶化バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｓ、１５．４ｇ／ＬのＤＴＴ、および３６０．４ｇ／Ｌの尿素、ｐＨ９．５）内でＴＧＦ−β３を洗浄した。
【０１０７】
３．１２  リフォールドスクリーニングマトリックス１
３．１２．１  方法論
セクション１．１２の浄化物質内のＴＧＦ−β３タンパク質の容量を、ＲＣ  ＤＣＴＭタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシー・ブルー染色、およびデンシトメトリーを併用して使用し、定量化した。ＴＧＦ−ベータ３物質を一連のリフォールディングバッファ（表１および２参照）に希釈した。６日間に渡り、毎日１ｍＬの試料を取り出し、非還元状態の下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。試料のアリコートおよびＭａｒｋ１２分子量標準（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ−分子量の範囲２．５〜２００ｋＤａ）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、１．０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、１２０ミリアンペア、２００ボルトでおよそ４０〜５０分間進行させた。そしてタンパク質試料を、Ｎｏｖｅｘブロッティング装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、電気泳動によりニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳、１％（ｖ／ｖ）のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ）で膜をブロックした。膜を洗浄（ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）し、１次抗体（１：５００でＰＢＳおよび０．１（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０に希釈されたＡｎｔｉ−ＴＧＦ−β３、ＭＡＢ６４３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））内で１時間培養した。１次抗体を用いる培養に続き、ニトロセルロースを洗浄バッファ（ＰＢＳ、１％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄した。そしてニトロセルロースを、２次抗体（ＰＢＳで１：２０００に希釈したアルカリ・ホスファターゼ（Ａｂｅａｍ  ＰＯ３９７）に接合したヤギ抗マウス抗体、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）内で、さらに１時間培養した。アルカリ・ホスファターゼ用Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により発現する前に、膜を再度洗浄（ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）した。ＭＡＢ６４３抗体は、正確にリフォール度されたモノマーおよびダイマーＴＧＦ−ベータ３種を検出する。
【０１０８】
３．１２．２  結果
５０の異なる実験条件の下、ＴＧＦ−β３のリフォールディング試験で得られた結果を表１および２にまとめる。
発明者は、以下に記載される条件（すなわち、実験条件１２、１９、３６、３７、４２、４３、および４４）は、適切にリフォールドされたダイマーＴＧＦ−ベータ３を生成することを立証した。
１．  ０．７Ｍの２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、０．４ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験条件１２）。
２．  ３０ｍＭのタウロデオキシコール酸、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験条件１９）。
３．  １ＭのＮＤＳＢ−２０１、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験手順３６）。
４．  ０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験手順３７）。
５．  ３０ｍＭのタウロデオキシコール酸と１ＭのＮＤＳＢ−２０１、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験手順４２）。
６．  ３０ｍＭのタウロデオキシコール酸と０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験手順４３）。
７．  ３０ｍＭのタウロデオキシコール酸、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、２ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５（実験条件４４）。
例証として、図１０は、実験条件１２の効果を示す。
【０１０９】
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2009543757.tif 000003
2009543757.tif 000004
【０１１０】
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2009543757.tif 000006
2009543757.tif 000007
【０１１１】
３．１３  限外濾過／疎水相互作用クロマトグラフィー
選択されるリフォールディング溶液を限外濾過（薄膜は、フラットシートＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ５ｋＤａ、０．１ｍ２、再生セルロース、スクリーンであった）により、５フォールドに濃縮した。そして、希釈バッファ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、２６４．２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１００ｇ／Ｌの酢酸、および２１０．７ｇ／Ｌの塩酸アルギニン、ｐＨ３．３）で１：１に希釈する前に、氷酢酸を使用して、濃縮したリフォールディング物質のｐＨを２．５〜２．８のｐＨに調節した。４カラム容量のバッファＡ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１３２．１４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、および１００ｇ／Ｌの酢酸、ｐＨ３．３）で、ブチルセファロース４ファーストフローカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ベッドの高さ１６ｃｍ）を平衡化した。リフォールディング物質を、ブチルセファロースカラムに装填する前に、０．２２μＭの薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルタ）で、流量１００ｃｍ／時（手順全体を通してこの流量を使用した）で濾過した。カラムを、４カラム容量のバッファＡで洗浄した。バッファＢ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１００ｇ／Ｌの酢酸、および３００ｇ／Ｌのエタノール、ｐＨ３．３）を使用して、ＴＧＦ−ベータ３タンパク質をカラムから流出させた。モノマータンパク質の分離前に、モノマーおよびダイマーの両方の型のＴＧＦ−β３タンパク質を含む第１のピークがまとめられた（図１１参照）。
【０１１２】
配列情報
ＴＧＦ−β１（配列認識番号１）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ
ＴＧＦ−β２（配列認識番号２）
ＡＬＤＡＡＹＣＦＲＮＶＱＤＮＣＣＬＲＰＬＹＩＤＦＫＲＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＮＡＮＦＣＡＧＡＣＰＹＬＷＳＳＤＴＱＨＳＲＶＬＳＬＹＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＳＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＱＬＳＮＭＩＶＫＳＣＫＣＳ
ＴＧＦ−β３（配列認識番号３）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＷＫＳＣＫＣＳ
【０１１３】
活性フラグメント（通常テキストで示す）と同様に、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）を示す、全長ＴＧＦ−β１（配列認識番号４）をコード化するＤＮＡ
2009543757.tif 000008
【０１１４】
活性フラグメント（通常テキストで示す）と同様に、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）を示す、全長ＴＧＦ−β２（配列認識番号５）をコード化するＤＮＡ
2009543757.tif 000009
【０１１５】
活性フラグメント（通常テキストで示す）と同様に、シグナルペプチド（イタリック体で示す）、プロペプチド（太字で示す）を示す、全長ＴＧＦ−β３（配列認識番号６）をコード化するＤＮＡ
2009543757.tif 000010
【０１１６】
配列認識番号７−野生型ヒトＴＧＦ−β３の活性フラグメントをコード化するＤＮＡ
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣＡＴＣ  ＣＴＧＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＴＡＧＣ
【０１１７】
ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、およびＴＧＦ−ベータ３のｃＤＮＡ作成のためのセンスおよびアンチセンスプライマー：
ＴＧＦ−ベータ１
センスプライマー−５′ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ３′
アンチセンスプライマー−３′ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ５′
ＴＧＦ−ベータ２
センスプライマー−５′ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＡＴＴ
アンチセンスプライマー−３′ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣ  Ｇ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＴＴ  Ｇ  ５′
ＴＧＦ−ベータ３
センスプライマー−５′ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＧＣ  ３′
アンチセンスプライマー−５′ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  Ｃ  ３′
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】双方の還元および非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＴＧＦ−β３のモノマーおよびダイマー型の比較結果を示す。
【図２】実験ラット上の切開創傷の位置決めに使用されるテンプレートを設定する。
【図３】実験動物の創傷部位に投与した治療を要約する。
【図４】創傷してから３日後の、モノマーまたはダイマーＴＧＦ−β３で治療した実験的創傷の外観の評価結果を示す。
【図５】実験動物の創傷部位に投与した治療を要約する。
【図６】創傷してから７０日後の、モノマーまたはダイマーＴＧＦ−β３で治療した実験的創傷の外観の評価結果を示す。
【図７Ａ】創傷してから７０日後の、実験的創傷の外観を示す代表的な巨視的画像を示す。
【図７Ｂ】創傷してから７０日後の、実験的創傷の外観を示す代表的な巨視的画像を示す。
【図８Ａ】創傷してから７０日後の、実験的創傷の構造を示す代表的な巨視的画像を示す。
【図８Ｂ】創傷してから７０日後の、実験的創傷の構造を示す代表的な巨視的画像を示す。
【図９】形質変換に成功したホスト細胞によるＴＧＦ−β３モノマーの生成を示す。
【図１０】実験タンパク質のリフォールディング条件下で、ダイマーおよびモノマーＴＧＦ−β３の作成を示す。
【図１１】は、限外濾過／疎水相互作用クロマトグラフィーによるＴＧＦ−β３タンパク質の単離を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2009543757.tif 000019
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2009543757.tif 000022
【図１１】
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【国際調査報告】
2009543757.tif 000024
2009543757.tif 000025
2009543757.tif 000026