(57)【要約】  本発明は、以下の一般式（Ｉａ）および（Ｉｂ）のペプチドおよびペプチド誘導体ならびに、特に、これらのペプチドを含有する抗炎症薬に関する。【化１】2009527503.tif 000008
2009527503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式ＩａおよびＩｂで示されるペプチドおよびペプチド誘導体ならびにその生理学的に許容される塩。
【化１】
2009527503.tif 000006
［式中、
Ｘ１〜Ｘ１６は、２０種の遺伝的にコードされるアミノ酸のうち１種を表し、
Ｘ１７は、残基ＯＲ１を表し、ここで、Ｒ１＝水素または（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル）であり、
あるいは、残基ＮＲ２Ｒ３を表し、Ｒ２およびＲ３は同一であるか、もしくは異なっており、水素もしくは（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルであり、
あるいは、残基−ＰＥＧ５−６０Ｋ−ＣＯ−ＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ４およびＲ５は同一であるか、もしくは異なっており、水素もしくは（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルであり、
あるいは、残基ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＰＥＧ５−６０Ｋを表し、ここで、Ｙは酸素原子またはＮＨ基であってもよく、
あるいは、残基ＮＨ−Ｙ−Ｚ−ＰＥＧ５−６０Ｋを表し、ここで、Ｙは化学結合、またはＳ、Ｃ、ＫもしくはＲの群に由来する遺伝的にコードされるアミノ酸を表し、Ｚは、それを介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−残基が結合しているスペーサーを表す］
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１４が、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＭまたはＡを表し、
Ｘ２、Ｘ６、Ｘ７が、ＥまたはＤを表し、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ１１が、ＲまたはＫを表し、
Ｘ８、Ｘ１２が、Ａ、Ｇ、ＳまたはＬを表し、
Ｘ１３が、Ｉ、ＬまたはＶを表し、ここで、
Ｘ１５、Ｘ１６が、Ｇ、Ａ、ＳまたはＣを表し、
ここで、Ｘ１７が、請求項１においてと同一の意味を有する、
一般式ＩａおよびＩｂの請求項１に記載されるペプチドおよびペプチド誘導体ならびにその生理学的に許容される塩。
【請求項３】
次式ＩＩａおよびＩＩｂで示されるペプチドおよびペプチド誘導体ならびにその生理学的に許容される塩。
【化２】
2009527503.tif 000007
［式中、Ｘ１７は、請求項１において式Ｉについて示されるものと同一の意味を有する］
【請求項４】
Ｘ１７が、ＮＨ２または
ＮＲ２Ｒ３を表し、Ｒ２およびＲ３が同一であるか、もしくは異なっており、水素もしくは（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルを表し、あるいは、残基−ＰＥＧ５−３０Ｋ−ＣＯ−ＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ４およびＲ５が同一であるか、もしくは異なっており、水素もしくは（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルを表し、
あるいは、残基ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＰＥＧ５−３０Ｋを表し、ここで、Ｙが酸素原子またはＮＨ基を表し、
あるいは、残基Ｃ（ＮＲ２Ｒ３）−（Ｓ−スクシンイミド）−（ＰＥＧ５−４０Ｋ）を表し、スクシンイミド残基が、Ｃ原子３を介してシステイン残基の硫黄原子と結合している、請求項３に記載の式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）の化合物ならびにその生理学的に許容される塩。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド誘導体を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドおよびペプチド誘導体に、それらの製造に、ならびに治療上および／または予防上使用可能な薬物を調製するためのそれらの使用に、およびこのような医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＰ１５８６５８６には、抗炎症作用を有するフィブリンの配列に由来するペプチドの使用が記載されている。
【０００３】
前記の作用は、フィブリンおよびその分解の際に生じるフィブリン断片が、Ｂβ鎖の新しいＮ末端を介して内皮細胞と、またＡα鎖の配列を介して血流中の細胞と結合し、それによってこれらの細胞の組織への付着と遊出（transmigration）を導くという事実に基づくものであり得る。フィブリンおよびフィブリン断片の、内皮細胞に対する結合パートナーは、周辺の内皮細胞間の接着結合部においてもっぱら発現される、タンパク質血管内皮（ＶＥ）カドヘリンである。本発明のペプチドは、この相互作用を遮断し、それによって、血液細胞の遊出に対抗する。しかし、血中白血球による感染に対する自然防御は、有害な影響を受けない。したがって、同様の成分、例えば、顆粒球、リンパ球および単球は、影響を受けないままであり、その結果、自然防御プロセスは維持される。
【０００４】
フィブリノーゲンは、肝臓で産生され、この形では、生物学的には不活性であり、通常、血中に、約３ｇ／ｌという濃度で提供される。酵素前駆体プロトロンビンのタンパク質分解による切断の結果トロンビンが形成され、これがフィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡおよびＢを切断する。このようにして、フィブリノーゲンは、生物学的に活性な形に変換される。フィブリンおよびフィブリン切断産物が生じる。
【０００５】
トロンビンは、血液凝固が活性化される場合、すなわち、組織に損傷を有する、炎症を起こしている、外傷または変性が発生している場合には常に形成される。トロンビンによって媒介されるフィブリンの形成は、基本的に、血管系に引き起こされた、なんらかの欠損を迅速に密閉することを目的とした保護プロセスである。しかし、フィブリンの形成はまた、発症プロセスでもある。心筋梗塞の誘因としてのフィブリン血栓の出現は、人間医学における最重要問題の1つである。
【０００６】
一方で、組織における病原微生物または腫瘍細胞に対する防御のために望まれるプロセスであり、他方、それ自体が、組織に対して行われる損傷を誘導または延長するプロセスである、血流から組織への炎症細胞の血管外遊出の際にフィブリンが果たす役割は、今までのところ、少しも調べられていないか、または十分な程度には調べられていない。フィブリンは、Ｂβの配列によってＢβの新しいＮ末端を介して内皮細胞と、配列Ａαによって血流中の細胞と結合し、それによって、細胞の組織への接着および遊出を導く。
【０００７】
本発明のペプチドまたはタンパク質は、血流に由来する細胞の、血管壁の内皮細胞への接着および／またはそれに続く、血液から組織への遊出を防ぐことができる。
【０００８】
ＷＯ９２／１６２２１には、例えば、メトキシ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、長鎖ポリマーと共有結合しているポリペプチドが記載されている。ポリペプチドの、このようなポリマーとの結合は、これらのポリペプチドの生物学的半減期の延長をもたらし、その腎排出を遅延させることが多い。これらの特性の概要は、デイビス(Davis)ら、ポリメリック・マテリアルズ・ファルマシューティカルズ・フォー・バイオメディカル・ユーズ(Polymeric Materials Pharmaceuticals for Biomedical Use)、４４１〜４５１頁（１９８０）に見ることができる。ＰＥＧ基の付加は、この作用を、ＰＥＧ付加ペプチドの分子量に比例して発揮するが、これは特定の大きさの分子までは、グロミュラー(glomular)濾過速度は分子量に反比例するからである。
【０００９】
ＷＯ０４／１０１６００にはまた、新規ポリ（エチレングリコール）修飾化合物およびその使用が、特に、エリスロポエチン受容体を活性化する修飾されたペプチドに重点を置いて記載されている。
【００１０】
ペプチドおよびタンパク質ＰＥＧ残基の共有結合修飾のさらなる例として、インターロイキン（クナウフ(Knauf)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)１９８８、２６３、１５０６４；ツツミ(Tsutumi)ら、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(Journal of Controlled Release)１９９５、３３、４４７）、インターフェロン(キタ(Kita)ら、ドラッグ・デリバリー・リサーチ(Drug Delivery Research)１９９０、６  １５７）およびカタラーゼ(アブコウスキ(Abuchowski)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)１９９７、２５２、３５８２）がある。先行技術の概要は、レディー、アナルス・オブ・ファルマセラピー(Annals of Pharmacotherapy)２０００、３４、９１５に見ることができる。
【００１１】
生物学的半減期の延長は、ペプチドの種々の治療的使用にとって有利である。これは特に、活性な薬剤の長期間にわたる投与が必要とされる慢性疾患の場合に当てはまる。このような必要がある場合、このことは患者コンプライアンスを改善させ得るが、これは活性な薬剤の1日１回の適用が、例えば、連続注入よりもより容易に受け入れられるからである。共有結合修飾による分子量の増大とは別に、ポリペプチドの残留性の延長は、タンパク質分解酵素（例えば、エキソプロテアーゼまたはエンドプロテアーゼまたはペプチダーゼ）によるそれらの分解が妨げられるように、それらを修飾することによっても得ることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
種々の例を用いて、未修飾のペプチドと比較して薬力学的作用に対する重大な影響を防ぐよう、各ペプチドの適当な修飾をカスタマイズすることが必要であるということが示されている。これに関連して、以下を参照することができる：カルシトニン(リー(Lee)らファーマシューティカル・リサーチ(Pharmaceutical Research)１９９９、１６、８１３）、増殖ホルモン放出ホルモン(エスポシト(Esposito)ら、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Advanced Drug Delivery Reviews)、２００３、５５、１２７９）、グルカゴン様ペプチド1(リー(Lee)ら、バイオコンジュゲート・リサーチ(Bioconjugate Research)２００５、１６、３７７）ならびに増殖ホルモン受容体アンタゴニストペグビソマント(ロス(Ross)ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム(Jouranl of Clinical Endocrinology and Metabolism)２００１、８６、１７１６）。カリセチ(Caliceti)およびベロネーゼ(Veronese)による総説(アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Advanced Drug Delivery Reviews)２００３、５５  １２６１）ならびにハリス(Harris)およびチェス(Chess)による総説(ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー(Nature Reviews Drug Discovery)２００３、２、２１４）には、ペプチドまたはタンパク質−ＰＥＧ−コンジュゲートを設計する場合に、有効なペプチド−ＰＥＧ−コンジュゲートを得るよう、元の物質の構造、ペプチドおよびポリマーの分子量、コンジュゲートされるポリマー鎖の数ならびにリンカー化学を考慮することが必要であると論じられている。
【００１３】
驚くべきことに、今では、天然フィブリン配列のうち１個またはいくつかのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されているＢβ（１５−４２）フィブリン断片の鎖に由来するペプチド、ならびにペプチド配列のＣ末端で修飾された誘導体もまた、強力な抗炎症作用を有するということがわかった。同じことがペプチドおよびその修飾がプロテアーゼまたはペプチダーゼによるその破壊を防ぐペプチド誘導体ならびにＢβ（１５−４２）フィブリン断片の基本配列に由来するペプチド−ＰＥＧ−コンジュゲートにも当てはまる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、配列のうち１個またはいくつかのアミノ酸が、遺伝的にコードされるか、遺伝的にコードされないアミノ酸またはペプチドミメティックによって置換されている、Ｂβ（１５−４２）フィブリン断片の鎖に由来する修飾ペプチドに関する。それらは遊離ペプチドとして存在する場合もあるし、Ｃ末端誘導体および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリマーに結合されているものとして存在する場合もあり、抗炎症作用および／または内皮安定化作用を有する。例えば、エステルまたはアミドは、Ｃ末端誘導体として考慮され得る。
【００１５】
本発明の化合物は、１箇所またはいくつかの箇所において、温血動物のフィブリンの天然配列と比較してアミノ酸の保存的置換を有し得る。保存的置換とは、同様の化学構造および極性の側鎖によって置き換えられる、それぞれのアミノ酸の側鎖と定義され、側鎖は遺伝的にコードされるか、遺伝的にコードされないアミノ酸に由来する。類似の側鎖を有するこの種のアミノ酸のファミリーは、当技術分野では公知である。それらは、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アスパルタミックアシッド(aspartamic acid)、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。このような側鎖の保存的置換は、非必須位置で実施され得ることが好ましい。これに関連して、配列中の必須位置とは、関連アミノ酸の側鎖が、生物学的作用にとって重要であるものである。
【００１６】
したがって、本発明は、以下の一般式ＩａおよびＩｂ
【化１】
2009527503.tif 000003
［式中、
Ｘ１〜Ｘ１５は、２０種の遺伝的にコードされるアミノ酸のうち１種を表し、
Ｘ１７は、残基ＯＲ１を表し、ここで、Ｒ１＝水素または（Ｃ１−Ｃ１０−アルキル）であり、
あるいは、残基ＮＲ２Ｒ３を表し、Ｒ２およびＲ３は同一であるか、もしくは異なっており、水素もしくは（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルであり、
あるいは、残基−ＰＥＧ５−６０Ｋ−ＣＯ−ＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ４およびＲ５は同一であるか、もしくは異なっており、水素、（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルであり
あるいは、残基ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＰＥＧ５−６０Ｋを表し、ここで、Ｙは、やはり酸素原子またはＮＨ基であってもよく、
あるいは、残基ＮＨ−Ｙ−Ｚ−ＰＥＧ５−６０Ｋを表し、ここで、Ｙは化学結合、またはＳ、Ｃ、ＫもしくはＲの群の中に由来する遺伝的にコードされるアミノ酸を表し、Ｚは、それを介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−残基が結合しているスペーサーを表す］で示されるペプチドおよびペプチド誘導体ならびにその生理学的に許容される塩に関する。
【００１７】
好ましい発明対象は、
Ｘ１、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１４が、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＭまたはＡを表し、
Ｘ２、Ｘ６、Ｘ７が、ＥまたはＤを表し、
Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ１１が、ＲまたはＫを表し、
Ｘ８、Ｘ１２が、Ａ、Ｇ、ＳまたはＬを表し、
Ｘ１３が、Ｉ、ＬまたはＶを表し、
Ｘ１５が、Ｇ、Ａ、ＳまたはＣを表し、
ここで、Ｘ１７が上記で定義のとおりである、
一般式Ｉのペプチドおよびペプチド誘導体ならびにその生理学的に許容される塩である。
【００１８】
特に好ましい発明対象は、次式ＩＩａおよびＩＩｂ、
【化２】
2009527503.tif 000004
［式中、Ｘ１７は、式Ｉについて上記で定義のとおりである］で示されるペプチドおよびペプチド誘導体ならびにその生理学的に許容される塩である。
【００１９】
最も高度に好ましい発明対象は、
Ｘ１７が、ＮＨ２またはＮＲ２Ｒ３を表し、Ｒ２およびＲ３が同一であるか、もしくは異なっており、水素もしくは（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルであり、あるいは、残基−ＰＥＧ５−３０Ｋ−ＣＯ−ＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ４およびＲ５が同一であるか、もしくは異なっており、水素もしくは（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルであり、
あるいは、残基ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ−ＣＯ−Ｙ−ＰＥＧ５−３０Ｋを表し、ここで、Ｙが酸素原子またはＮＨ基であってもよく、
あるいは、残基Ｃ（ＮＲ２Ｒ３）−（Ｓ−スクシンイミド）−（ＰＥＧ５−４０Ｋ）を表し、スクシンイミド残基が、Ｃ原子３を介してシステイン残基の硫黄原子と結合している、式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）の化合物ならびにその生理学的に許容される塩である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
上記の式ＩおよびＩＩにおいて、以下の文字は、タンパク質およびペプチドについての一般的な注釈に従ってアミノ酸残基を表す：フェニルアラニンはＦ、ロイシンはＬ、イソロイシンはＩ、メチオニンはＭ、バリンはＶ、セリンはＳ、プロリンはＰ、トレオニンはＴ、アラニンはＡ、チロシンはＹ、ヒスチジンはＨ、グルタミンはＱ、アスパラギンはＮ、リジンはＫ、アスパラギン酸はＤ、グルタミン酸はＥ，システインはＣ、トリプトファンはＷ、アルギニンはＲ、グリシンはＧである。
【００２１】
式Ｉの化合物中のアミノ酸残基は、そのＤまたはＬ立体配置のいずれかで存在し得る。
【００２２】
用語ペプチドとは、アミド結合を介して結合している、これらのアミノ酸のポリマーを指す。
【００２３】
「生理学的に許容される」とは、その付加が、ヒトに用いられる場合に望ましくない作用を有さない酸または塩基を用いて塩が形成されていることを意味する。米国薬局方または任意のその他の一般的に認識される薬局方において、その使用が温血動物、特に、ヒトに関して使用するために列挙される酸または塩基を含む塩が好ましい。
【００２４】
ＰＥＧは、５，０００〜６０，０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコール残基を表し、この分子量は最大の分子量分布であり、その結果、混合物の個々の成分はより高いまたはより低い分子量を有し得る。
【００２５】
発明対象はさらに、適した酸化剤を用い、以下の一般構造式ＩＩＩａおよびＩＩＩｂ
【化３】
2009527503.tif 000005
で示される単量体ペプチドまたはペプチド誘導体を反応させて、一般構造式（Ｉ）の化合物を形成することを特徴とする、一般式（Ｉ）のペプチドおよびペプチド誘導体の製造方法である。このような適した酸化剤は、例えば、適した触媒を用いるか用いない、ヨウ素、過酸化水素、有機過酸化物、ペルオキソ二硫酸ナトリウムまたは大気中の酸素であり得る。
【００２６】
本発明の物質および医薬を製造するための本発明の物質の使用は、白血球(white blood cells)（白血球(leukocytes)）の組織損傷作用に起因するか、または血管を裏打ちする内皮細胞層の完全性および完全な生理学的整合性が損なわれている疾患の治療のための医薬の製造にとって特に重要である。
【００２７】
この群に属する疾患として、例えば、コラゲノーゼス(collagenoses)、リウマチ性疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、乾癬および乾癬性関節リウマチおよび感染後／傍感染性疾患ならびに移植片対宿主反応によって引き起こされる疾患のような自己免疫に関連するものがある。この医薬が、白血球の組織への移動を遮断するので、治癒効果が起こる。したがって、白血球は血流中に残り、組織にとって有害な自己反応作用を引き起こすことができない。本発明の物質のこの作用は、ショック状態の治療にとって、特に、グラム陽性病原菌またはグラム陰性病原菌の感染ならびにウイルス感染によって引き起こされる敗血病性ショックおよび重篤な損傷または細菌もしくはウイルス感染による大出血によって引き起こされる出血性ショックの場合にさらに重要である。
【００２８】
本発明の物質は、通常、用語「全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）」、「急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）」および臓器または多臓器不全でそれぞれ記載できる状況において使用してもよい。
【００２９】
臓器移植の拒絶反応の治療および／または予防のための医薬に関しては、この医薬が血流からドナー臓器への白血球の遊走を防ぎ、そのため、ドナー臓器が、これらの白血球および／または白血球によって形成され、放出される産物によって破壊され得ないために治癒効果がある。
【００３０】
動脈硬化症の治療および／または予防のための医薬に関しては、この医薬が白血球の組織壁への遊走、ひいては、組織壁の細胞の活性化を遮断するので治癒および／または予防効果がある。したがって、動脈硬化症の進行は、最小化されるか、または停止され、起因する動脈硬化性プラークの進展（progredience)が阻害され、ひいては、動脈硬化症を収まらせる。
【００３１】
術後の、または薬剤によって誘導された血液の再供給後の、例えば、心感染症、卒中、血管手術、心臓パイパス術および臓器移植後の再灌流外傷の治療および／または予防のための医薬に関しては、この医薬が、リンパ球、好中球および単球の血管壁への遊走を阻害するので治癒および／または予防効果がある。再灌流外傷は、血液の再供給の際の血管の細胞の酸素／アシドーシスの欠乏によって引き起こされ、血管の活性化および／または損傷をもたらす。このため、リンパ球、好中球および単球が血管壁に付着し、その中に遊走する。血管壁におけるリンパ球、好中球および単球の付着および遊走を遮断することは、その後の、血管への永久的な損傷を引き起こす炎症反応を伴うことなく、低酸素／アシドーシス誘導性損傷を軽減させる。本発明の化合物の内皮細胞安定化作用が、さらに、浮腫の形成ならびに個々の血管を介して供給される臓器に対する任意のさらなる損傷を防ぐ。
【００３２】
代謝疾患または加齢プロセスの結果としての動脈硬化症の治療および／または予防のための医薬に関しては、この医薬が、リンパ球および単球の血管壁への遊走を阻害し、ひいては、起因する動脈硬化性プラークの進展（progredience)を阻害するので治癒および／または予防効果がある。
【００３３】
本発明の医薬はまた、別の薬物の輸送のために使用してもよい。本発明の薬物は、内皮細胞上の表面分子と特異的に結合する。したがって、それと結合している薬物は、その他の部位で副作用を有するという何らかの危険を伴うことなく、高濃度で内皮細胞に送達され得る。本明細書に列挙され得る実施例は、内皮細胞に特異的に運ばれ、抗血管新生作用を有し得る、細胞の分裂を阻害する物質の使用である。内皮細胞の増殖を妨げ、ひいては、血管新生を妨げることによって腫瘍増殖が遮断されるので、これが、腫瘍患者において治癒効果をもたらす。本発明の化合物は、それ自体、抗血管新生作用を生み出すこともできるが、これは、それらが、その内皮安定化作用のために、内皮細胞が増殖表現型に変化するのを妨げ、ひいては、新規毛細血管の形成を妨げるからである。したがって、それらはそれ自体、すべての種類の腫瘍疾患の治療ならびに腫瘍転移の予防および／または治療に適している。
【００３４】
式（Ｉ）の本発明の化合物は、薬剤アジュバントおよび添加剤と一緒になって、医薬品に製剤してもよく、これもまた発明対象である。このような製剤を調製するために、治療上有効な用量のペプチドまたはペプチド誘導体を、薬理学的に許容される希釈剤、安定化剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントまたは担体と混合し、適した治療形にする。このような調製は、例えば、種々のｐＨおよびイオン強度の種々のバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）の希釈を含む。これらの製剤は、活性薬剤の生物学的有効性および代謝挙動に影響を及ぼし得る。
【００３５】
本発明の医薬品は、経口的に、非経口的に（筋内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に）、経皮的にまたは適した生物学的に分解可能なポリマー（例えば、ポリラクテートまたはポリグリコレート）の侵食性インプラントで投与してもよい。
【００３６】
本発明の化合物の特許請求される使用の生物学的作用および適用性は、例えば、ヒト臍帯内皮細胞の培養物を、「Ｎ末端ジスルフィドノットタンパク質ＩＩ」（ＮＤＳＫ−ＩＩ）で、またはトロンビンで刺激した後に顕微鏡によって調べるアッセイにおいて調べることができる。内皮細胞の刺激は、密集している細胞層中の細胞間にギャップの形成を引き起こす。本発明の化合物での処理は、これらのギャップの形成を妨げる可能性があり、すでに形成されたギャップを上手く閉じる。この作用は、本発明の化合物が生物を通じて有する、内皮に対する保護作用ゆえに予測される。本発明の化合物は、細胞の溶液（bath solution）中０．０１ｎＭ〜１ｍＭの濃度範囲で、好ましくは、１ｎＭ〜０．１ｍＭの範囲で作用を発揮する。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性は、例えば、げっ歯類における急性肺臓炎のモデルを用いて確立してもよい。このためには、例えば、Ｃ５７ブラックマウスを以下のとおり処理する：動物に、１００ｎｇ／ｋｇ  ＬＰＳという鼻腔内用量を投与し、ＬＰＳ投与の直後にマウスに本発明の薬剤（１００μｌ  ＮａＣｌに溶解した）を腹腔内投与し、ＬＰＳの投与の６０分後に第２の用量を投与する。対照動物は、１００ｎｇ／ｋｇ  ＬＰＳを鼻腔内投与し、ならびに生理食塩水を投与するのみとする。ＬＰＳ適用の６時間後、すべての群を気管支肺胞上皮洗浄に付し、肺を摘出した。洗浄液から得た、好中球（ＰＭＮ）の数を調べた。本発明の化合物は、０．００１ｍｇ／体重１ｋｇ〜５００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の用量で有効であり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が好ましい。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的作用を確立するためのさらなる可能性は、敗血症ショックに伴う、盲腸の結紮および穿刺によって引き起こされる急性腹膜炎によるマウスの死亡率の低下または完全抑制である。本発明の化合物は、０．００１〜５００ｍｇ／体重1ｋｇの範囲の用量で、好ましくは、０．１〜５０ｍｇ／体重１ｇの範囲の用量で、この死亡率の低下を引き起こす。
【００３９】
以下の実施例は、実施例に限定するものではないが、本発明を例示するよう働く。
本発明のペプチドの一般的な調製および精製
上記のペプチド誘導体の調製および精製は、通常、文献にも記載されるように（例えば、Ｅ．アサートン(Atherton)、Ｒ．Ｃ．シェパード(Sheppard)による「ソリッド・フェーズ・ペプチド・シンセシズ−ア・プラクティカル・アプローチ(solid phase peptide synthesis-A practical approach)」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ  １９８９）、市販のバッチペプチドシンセサイザーを用いて、酸に不安定な樹脂支持体でのＦＭＯＣ−戦略によって行われる。官能基側鎖が、酸に感受性の保護基によって保護されているＮ−α−ＦＭＯＣ−保護誘導体を、アミノ酸成分として用いる。特に断りのない限り、精製は、水／アセトニトリル勾配およびイオン対試薬として０．１％ＴＦＡを用いるＲＰ−クロマトグラフィーによって実施する。
【実施例１】
【００４０】
（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）２  Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ２５ホモ二量体シスチンペプチド
実施例１と同様に、単量体ペプチドを合成し、樹脂担体として、０．２１ｍｍｏｌ／ｇの負荷のテンタゲル(Tentagel)Ｓ−ＰＨＢ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＦＭＯＣ、（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いる。さらなるアミノ酸として、ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、（Ｏｒｐｅｇｅｎ）を用いる。単量体ペプチドを、逆相クロマトグラフィーによって精製すると、（４１ｍｇ）の精製されたペプチドが還元型で得られる。Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ  ３０８３．６ｍ／ｚ（ｍ．ｉ．）。
【００４１】
ホモ二量体の形成は、分子間ジスルフィド結合を形成することによって起こる。ジスルフィドは、希釈原理に従って、希アルカリ溶液（ｐＨ７．５〜８．０）中で大気中の酸素による酸化によって選択的に形成される。反応は、分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によってモニターする。０．５％ＴＦＡを添加することによって反応を停止し、凍結乾燥を再生した後、対称ホモ二量体生成物（２８ｍｇ）のＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行う、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ  ６１６５．２ｍ／ｚ（ｍ．ｉ．）。
【実施例２】
【００４２】
（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）２  Ｃｙｓ２４−Ｃｙｓ２４ホモ二量体シスチンペプチド
単量体ペプチドを、実施例１と同様に合成し、樹脂担体として、０．２１ｍｍｏｌ／ｇの負荷のテンタゲル(Tentagel)Ｓ−ＰＨＢ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＦＭＯＣ、（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いる。さらなるアミノ酸として、ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、（Ｏｒｐｅｇｅｎ）を用いる。単量体ペプチドを、実施例１においてと同様に精製すると、（４１ｍｇ）の精製されたペプチドが還元型で得られる。Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ３０８３．６ｍ／ｚ（ｍ．ｉ．）。
【００４３】
ホモ二量体の形成は、分子間ジスルフィド結合を形成することによって起こる。これについては、ジスルフィドは、希釈原理に従って、希アルカリ溶液（ｐＨ７．５〜８．０）中で大気中の酸素による酸化によって選択的に形成される。反応は、分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によってモニターする。０．５％ＴＦＡを添加することによって反応を停止し、凍結乾燥を再生した後、対称ホモ二量体生成物（２８ｍｇ）のＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行う、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ６１６５．２ｍ／ｚ（ｍ．ｉ．）。
【実施例３】
【００４４】
（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＮＨ２）２  Ｃｙｓ２５−Ｃｙｓ２５ホモ二量体シスチンペプチドアミド
ペプチド配列が、カルボジイミド／ＨＯＢｔ法に従って段階的に構築される市販のペプチド合成装置（ＰＳＭＭ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ））に、０．２４ｍｍｏｌ／ｇという負荷の１００ｍｇのテンタゲル(Tentagel)−Ｓ−ＲＡＭ（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を入れる。
【００４５】
５倍等モル過剰のジ−イソプロピ−カルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ−イソプロピ−エチルアミン（ＤＩＰＥＡ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を添加することによってＦＭＯＣ−アミノ酸誘導体を予め活性化し、それらを反応容器に移した後、樹脂支持体と３０分間混合する。洗浄ステップは、９００μｌのＤＭＦを５回添加し、１分間完全に混合することによって実施する。切断ステップは、３×９００μｌの、ＤＭＦ中３０％ピペリジンを添加し、４分間完全に混合することによって実施する。
【００４６】
個々の反応および洗浄溶液の除去は、溶液を反応容器のボトムフリットを通すことによって達成する。
【００４７】
アミノ酸誘導体ＦＭＯＣ−Ａｌａ、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｐ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、ＦＭＯＣ−Ｉｌｅ、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）およびＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（Ｏｒｐｅｇｅｎ）を用いる。
【００４８】
さらなるアミノ酸として、ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、（Ｏｒｐｅｇｅｎ）を用いる。
【００４９】
合成が完了した時点で、ペプチド樹脂を乾燥する。続いて、トリフルオロ酢酸／ＴＩＳ／ＥＤＴ／水（９５：２：２：１容積）を用い、室温で２時間処理することによって、ペプチドアミドを切断する。溶液の濾過、濃縮および氷冷ジエチルエーテルの添加による沈殿によって、粗生成物（７５ｍｇ）が固体として得られる。
【００５０】
このペプチドを、５〜６０％アセトニトリルの勾配を含む０．１％ＴＦＡ中、流速１２ｍｌ／分で４０分間のＫｒｏｍａｓｉｌ  ＲＰ−１８  ２５０−２０、１０μｍでのＲＰ−ＨＰＬＣおよび２１５ｎｍでのＵＶ検出器による溶出液の評価によって精製する。個々の画分の純度は、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析によって調べる。
【実施例４】
【００５１】
（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＮＨ２）２  Ｃｙｓ２４−Ｃｙｓ２４ホモ二量体シスチン−ペプチドアミド
この化合物は、実施例３と同様に調製するが、ペプチド結合の配列は適宜変更される。
【国際調査報告】
2009527503.tif 000009
2009527503.tif 000010
2009527503.tif 000011