(57)【要約】  本発明は、結合パートナー標識、及び非特異的結合標識を使用する分離のないアッセイ方法であって、前記結合パートナー標識又は非特異的結合標識からのシグナルが結合事象において測定され、以下：    ａ）２又はそれ超の結合パートナー、並びに少なくとも１つの当該結合パートナーに吸収される及び／又は共有結合する直接発光結合パートナー標識；そして    ｂ）前記非特異的結合標識、ここで、以下：        ｉ）当該非特異的結合標識は前記結合パートナー標識のシグナルに影響を与えることができ；若しくは、        ｉｉ）前記結合パートナー標識は当該非特異的結合標識のシグナルに影響を与えることができる；の使用を含み、ここで、少なくとも１つの他の前記結合パートナーは移動性結合パートナーであり、少なくとも１つの前記結合パートナーは標識されたリガンドである、上記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合パートナー標識、及び非特異的結合標識を使用する分離のないアッセイ方法であって、前記結合パートナー標識又は非特異的結合標識からのシグナルが結合事象において測定され、以下の：
ａ）２又はそれ超の結合パートナー、並びに少なくとも１つの当該結合パートナーに吸収される及び／又は共有結合する直接発光標識；そして
ｂ）前記非特異的結合標識、ここで：
ｉ）前記非特異的結合標識は前記結合パートナー標識のシグナルに影響を与えることができ；若しくは、
ｉｉ）前記結合パートナー標識は前記非特異的結合標識のシグナルに影響を与えることができる；
の使用を含み、ここで、少なくとも１つの前記結合パートナーが移動性結合パートナーであり、少なくとも１つの他の前記結合パートナーが標識されたリガンドである、上記方法。
【請求項２】
前記方法が非競合アッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、前記移動性結合パートナーに結合することが期待される競合結合パートナーも含む競合アッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合パートナーの標識が、標識対のドナー又はアクセプターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記非特異的結合標識が、消光剤、促進剤、ドナー−アクセプター標識対のアクセプター又はドナー−アクセプター標識対のドナーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記移動性結合パートナーに結合される前記標識されたリガンドのシグナルが、促進剤又は消光剤を各々別々に添加することにより、促進又は消され、当該移動性結合パートナーへの結合を可能とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記移動性結合パートナーに結合及び非結合の両方である前記標識されたリガンドのシグナルが、促進剤の添加により促進され、前記標識されたリガンドに結合し得る又は前記標識されたリガンドと相互作用し得る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記結合パートナーの直接的発光標識が前記標識対のドナーであり、非特異的結合標識が消光剤、好ましくは溶解性消光剤である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記標識対が共鳴エネルギー移動標識対である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識対が、発光共鳴エネルギー移動標識対であり、前記ドナーがランタニド・キレートである、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的結合標識を使用して、基質の濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を例証するために本明細書中に使用される刊行物及び他の材料、及び特に、その実施に関するさらなる詳細を提供するための態様は、参照することにより本願明細書中に援用される。
【０００３】
薬剤及び集団スクリーニングは、改良された治療及び医療に対する研究及び診断の重要な部分となる。過去２０年間、バイオテクノロジーは、疾患過程に詳細な実態を提供すること、及びに薬物標的の数を増大することより医薬産業を変えてきている。多数の化合物ライブラリーのためのハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）は、どれが早期薬物候補の見込みをもたらすのかを明らかとする。理論上、豊富な新たな疾患データ、及びＨＴＳプログラムからヒットした豊富な早期アッセイは、市場により多くの薬物をもたらすべきである。しかしながら、実際には、医薬産業は、潜在性を利益に転換させられないでおり、わずかな有望化合物について開発を成功させている。例えば標的分子スクリーニングにおけるリードをつかむ際の競争力を有するために、素早い、効率的な、費用効率の良い、及び単純なスクリーニング技術が必要である。
【０００４】
多くの分離のない方法が、創薬における超ハイスループット・スクリーニングの要求を満たすために開発されている：シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、増幅発光近接均質アッセイ（ＡＬＰＨＡ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、均質時間分解蛍光アッセイ（ＨＴＲＦ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、ランタニド蛍光エネルギー転写アッセイ（ＬＡＮＣＥ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、蛍光偏光及び相関アッセイである。様々な技術の印象的なリストは、放射性シンチレーション、蛍光偏光又は相関及び時間分解蛍光ベースの方法を含む。他の分離のない方法も、洗浄のないアッセイ設備においてサンプル物質の検出において認識され、使用される。二光子励起、蛍光相互相関、及びフローサイトメトリーアッセイシステムが、かかる方法の例である。
【０００５】
その方法論は、高特異性及び親和性を有する着目の物質を認識する抗体の如き、特異的結合物質の使用による。当該方法は、競合アッセイフォーマット又は物質が開裂され検出要素を分離しシグナルを産生する開裂アッセイにおいて使用され得る。サンドイッチ型アッセイシステムは、検出原理が距離に依存するという事実のせいで、共鳴エネルギー移動技術（ＲＥＴ）においてしばしば実施困難である。かかる距離は、サンドイッチ型アッセイにおいて、ドナーとアクセプター要素を十分なシグナルを産生するのに十分近く保つのには通常、長すぎる。さらに、多くの技術は、異なる標識剤を有する異なる結合パートナーの標識を必要とする、このことは、極端に厄介で、且つ高価である。
【０００６】
多くのアッセイ技術に関するバックグラウンド問題を低減するために、多くの技術が開発されている。ＲＥＴアッセイにおいて、ドナーとアクセプターの低減された又は非存在のスペクトルの重なりが提唱されている（ＵＳ６，２４５，５１４、ＵＳ５，９９８，１４６）。アッセイシステムにおけるバックグラウンド・シグナルを低減する効果的な方法は、非結合反応基質に対する高特異的で高親和性の標識された捕獲プローブの使用である。第１特異的結合パートナーを反応に供し、その後、非結合の結合パートナーに対する高特異性かつ高親和性捕獲消光要素を使用して、マスキングを実施する（ＵＳ２００４/０２５３５９３、ＵＳ４，２５６，８３４、ＵＳ４，４０４，３６６）。
【０００７】
高親和性相互作用の親和力は１×１０７Ｍ−１超と考えられ、そして低親和性相互作用は１×１０７Ｍ−１未満と考えられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００２，１７５，１２１）。粒子担体に依存する光学低減方法が多くある。これらの方法において、特異的シグナルはかかる粒子上に発現する。次いで、検出を、かかる粒子を含む少量で実施する。その結果、バックグラウンド・シグナルは、粒子を検出容量に分類し、検出容量の大きさを注意深く選択することにより、劇的に低減され得る（ＵＳ６，１７７，２７７、ＵＳ５，９８１，１８０、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９７：４３；１７４９−５６、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０００：７２；５６１８−２４、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９９：２７１；１４３−５１）。
【０００８】
染料との組み合わせにおける表面及び光学低減方法もまた調査されている。この方法において、非結合の標識された結合パートナーは、非特異的染料を使用して消光される。特異的シグナルは、固定された（通常基本的に平面の）固体表面上で発現され、消光成分は、表面付近から溶液に向かってスタートしかかる溶液中のシグナルを低減するために使用される。かかる消光成分は、かかる溶液中の光浸透性を限定するために使用される。当該消光分子は、励起光が固定された固体表面を通過して溶液中に向かい、そしてかかる励起光に向かうシグナルがかかる固定された固体表面を通って測定されるように、かかる光浸透深の厚みを縮小させるために使用される。かかる方法は、溶液中の溶解染料分子と組み合わせて、固定された固体表面、及び非常に特異的な検出形状を必要とする。かかる方法は、固相の分離のないアッセイフォーマットにおいて実施する。
【０００９】
Ｗｉｎｋｌｅｒは、蛍光色素のタンパク質相互作用を研究していて、分離のない蛍光検出を得るために溶液ベースの消光メカニズムを使用している（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９：８；２５８６）。かかる捜査は、蛍光色素とタンパク質の相互作用を研究するために実施されている。使用された方法論は、アッセイ目的に好適ではない。Ｊｅｎｋｉｎｓらは、ＤＮＡルテニウム挿入化合物がＤＮＡに非特異的にどの程度結合するのかを示している（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２：３１；１０８０９）。非結合挿入化合物は、Ｆｅ（ＣＮ）６４−を使用して溶液中で消光される。挿入は、核酸ハイブリダイゼーション後、非特異的相互作用を通じて生じる。担体分子に前もって結合すること、この場合核酸ストランドの１つに結合することがなければ、核酸ストランドが挿入化合物で標識されることはなく、それ故、かかる挿入化合物は非特異的結合剤と考えられる。
【００１０】
ＡＬＰＨＡ、ＨＴＲＦ、ＬＡＮＣＥ、及び蛍光相関アッセイの如き上記方法の多くは、小分子アッセイフォーマットであるが、かかる方法は、全細胞をアッセイするために開発するのは非常に厄介又は不可能である。その距離依存性又は焦点制限は、当該方法論の使用を限定する。蛍光偏光は、通常、サンプル物質の１ｎＭ濃度超の全細胞アッセイのために使用され得る。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の目的及び概要
本発明の目的は、分離のないアッセイ方法を提供することである。
【００１２】
本発明は、結合パートナー標識、及び非特異的結合標識を使用する分離のないアッセイ方法であって、前記結合パートナー標識又は非特異的結合標識からのシグナルが結合事象において測定され、以下の：
ａ）２又はそれ超の結合パートナー、並びに少なくとも１つの当該結合パートナーに吸収される及び／又は共有結合する直接発光標識；そして
ｂ）前記非特異的結合標識、ここで：
ｉ）前記非特異的結合標識は前記結合パートナー標識のシグナルに影響を与えることができ；若しくは、
ｉｉ）前記結合パートナー標識は前記非特異的結合標識のシグナルに影響を与えることができる；
の使用を含み、ここで、少なくとも１つの前記結合パートナーは移動性結合パートナーであり、少なくとも１つの他の前記結合パートナーは標識されたリガンドである、上記方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
定義、及び好ましい態様
標識された捕捉分子が、特に非結合ドナー標識されたリガンドに対して、蛍光バックグラウンドを低減するために使用されることが知られている。当該低減は、共鳴エネルギー移動原則に基づく。さらに、標識が励起され、放出が、固定された通常本質的に平面の固体表面を通じて、溶液中の消光剤との組み合わせで測定される方法は、蛍光バックグラウンド・シグナルを低減するために使用される。さらに、蛍光色素を核酸鎖の間に挿入し、二本鎖核酸間に結合できない残りの挿入化合物をイオン化合物を使用して溶液中で消光する方法が知られている。当該挿入化合物は、いずれかの核酸鎖に前もって結合することなしに、非特異的に挿入される。原則は、結合前にＤＮＡハイブリダイゼーションを必要とする。
【００１４】
化学発光が検出原理として利用され、非保護分子化合物が消光される方法が知られる。化学発光は、化学反応がシグナル産生のための必須ステップである検出原理として、測定される。それ故、検出原理は、直接的な発光化合物又は蛍光色素と非常に異なるシグナル産生メカニズムである。消光検出原理がタンパク質アッセイのメカニズムに適用される先行技術はない。本発明は、バックグラウンド・シグナルをうまく低減するために溶液中の移動性結合パートナーと共に、非特異的に結合する標識分子、及び分離のないアッセイ原理を利用する。本発明は、標識された高特異的捕捉分子をバックグラウンド・シグナルを低減するために使用しないこと、消光分子を使用する固定固体表面における光侵入度の低減を利用しないこと、移動性結合パートナーとの反応又は相互作用の前に標識をプローブ化合物（結合パートナー標識）に結合すること、及び使用する標識が直接発光することについて、先行技術と異なる。
【００１５】
以下の方法は、本発明に適用され得るアッセイ方法の例である。
【００１６】
いずれかの光励起発光方法が本発明に関して使用され得る。蛍光色素は、直接的に発光すべきである。蛍光色素は、光励起発光化合物、基質、タンパク質、ポリマー、粒子、イオン又は分子である。発光は、少なくとも慣習的な蛍光、リン光、ゲート型蛍光（時間分解蛍光）、及びＪＰ．ＬａｋｏｗｉｃｚによるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ｏｒ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１年から始まり複数巻刊行されている）のトピックスに記載される方法に関するいずれかの直接発光形態を含むと理解されるべきである。それ故、化学発光、及び生物発光は、本発明の原則に関して機能できないと考えられ、なぜならその方法は直接発光の原理を利用しないからである。本発明は、直接発光の消光、及び／又は促進を適用する方法に関する。
【００１７】
用語「共鳴エネルギー移動」は、ドナー化合物がアクセプター化合物と接近している方法に関する。このことは、ドナーからアクセプターへ、そしてシグナルがドナー又はアクセプターを通じて測定される検出スキームへ導くエネルギーの流れを産生する。かかる方法は、例えばドナー染料がダウン又はアップ転換染料となり得る発光共鳴エネルギー移動システムにおいて、よく知られる。ドナーが励起され、近接原理の結果として、アクセプター染料が当該ドナー化合物により励起され、シグナルが当該アクセプター化合物の発光波長で検出される。蛍光、リン光、時間分解蛍光、生物発光、及び発光共鳴エネルギー移動の如き多くの共鳴エネルギー移動方法がある。共鳴エネルギー移動は、シグナル産生方法、あるいはシグナルを消す方法として理解され得る。消光の場合、染料又は金属の如きいずれかの要素がシグナルを消すために使用され得る。かかる場合、通常、ドナー分子の発光波長が検出される。
【００１８】
時間分解蛍光測定法において使用される典型的な金属キレート剤又は錯化剤又はリガンドは、３−（２−チエノリ）−１,１,１−トリフルオロアセトン、３−ベンゾイル−１,１,１−トリフルオロアセトン、コプロポルフィリン、ポルフィリン、３−ナフトイル−１,１,１−トリフルオロアセトン、２,２−ジメチル−４−ペルフルオロブチオイル−３−ブタノン、２,２'−ジピリジル、フェナントロリン、サリチル酸、フェナントロリンカルボン酸、アミノフェナントロリン、ジフェニルフェナントロリン、ジメチルフェナントロリン、ビピリジルカルボン酸、アザ・クラウン・エーテル、トリオクチルホスフィンオキシド、アザクリプタンド、ジベンゾイルメタン、ジナフトイルメタン、ジビフェノイルメタン、ベンゾイルアセトナト、フェニルアゾジベンゾイルメタン、ジチエニルプロパンジオン、４,４’−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、トリス（６，６，７，７，８，８，８，−ヘプタフルオロ−２，２−ジメチルオクタン−３，５−ジオン、（アルキルオキシフェニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸、及びそれらの誘導体である。金属イオンは、例えば、ランタニド又はルテニウムイオンとなり得る（Ｓｅｌｖｉｎ  Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．２０００:７；７３０；Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｔ．Ｄｉｓｃｕｓｓ．Ｆａｒａｄａｙ  Ｓｏｃ．１９５９：２７；７;Ｌａｔｖａ  Ｍ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ，１９９７；Ｍｕｋｋａｌａ  Ｖ．−Ｍ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ，１９９３；Ｗｏｈｒｌｅ  Ｄ．ａｎｄ  Ｐｏｍｏｑａｉｌｏ  Ａ．Ｄ．Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ,Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００３)。
【００１９】
本明細書中の用語「発光酸素チャネリング免疫アッセイ」は、一重項酸素宿主とアクセプターが互いに接近するときに光誘起一重項酸素をその宿主化合物又は物質からアクセプター化合物又は物質に移動させる方法をいう。通常、その方法においては、粒子ドナーとアクセプターを使用する（Ｕｌｌｍａｎ  Ｅ．Ｆ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９６：４２；１５１８）。
【００２０】
シンチレーション近接アッセイは、放射性標識が物質に近接し、放射性発光を検出可能シグナルの光又は他の型に変化させ得るいずれかの方法に関する。当該物質は粒子又は固体支持体となり得る（Ｈａｒｔ  Ｈ．Ｅ．ら，ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７９:１６；２６５、Ｂｏｓｗｏｒｔｈ  Ｎら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９：３４１：１６７）。
【００２１】
二光子励起は少量の検出用量に頼る方法である。少量は、分離のないアッセイフォーマットを可能とする周囲媒体から検出範囲を定める。当該方法において、染められた物質は、着目のサンプル物質の濃度を検出する固相粒子に結合する（Ｈａｎｎｉｎｅｎ  Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０００：１８；５４８）。
【００２２】
コインシデンスアッセイフォーマットは、２つの異なって染色された粒子が例えば抗体でコーティングされるアッセイ概念である。検体分子が２つの異なって染色された粒子を一緒に結合するので、その検体の存在は、少量で、両方の染色された粒子を検出することにより測定される。例えば、二光子励起は、検出用量を低減するために、いずれの物理的分離なしで周囲媒体から２つの粒子複合体を分離するために使用され得る。当該方法は、唯一の染められた粒子を使用する、あるいは染められた粒子が全く使用されない概念も可能とする。かかる粒子は、溶解性染色物質と置換され得る（Ｈｅｉｎｚｅ  Ｋ．Ｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｊ．２００２：８３；１６７１，Ｈｅｉｎｚｅ  Ｋ．Ｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２００４：８６；５０６）。
【００２３】
蛍光偏光アッセイは、染色された分子の偏光特性が、他の分子との接触により変えられる方法をいう。小さな染色された分子が媒体中を自由に動き回転するとき、低い偏光値が測定される、なぜならば、動きと回転が速く生じるからである。その小さな染色された分子が粒子の如きより大きな分子に結合したら、その偏光は変化され、より大きな偏光値が測定される（Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｈ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.２００４：２６１；１６１）。
【００２４】
蛍光相関分光学的アッセイは、粒子及び染色された物質を使用して構築される。染色された物質が粒子と接触させられたとき、その蛍光変動パターンは変化し、自由に変動する染色された物質のものからのシグナルの変化を導く。当該方法は粒子を必要としない。タンパク質又は細胞又は他のより大きな分子又は分子複合体も利用され得る（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  Ｏ．ら，Ｒｅｐ．Ｐｒｏｇ．ＰｈｙＳ．２００２：６５；２５１）。
【００２５】
フローサイトメトリーアッセイは、粒子又は細胞が固体支持体として使用され、染色された物質が当該粒子又は細胞の表面に接触する、分離のないアッセイフォーマットである。その後、染色された物質の程度が、フローサイトメトリーシステムを通じて検出される。使用される粒子は、各粒子を特定するために、通常、蛍光色素で標識される（Ｆｕｌｔｏｎ  ＲＪ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９７：４３；１７４９）。
【００２６】
酵素ベースアッセイは、酵素又は物質が化合物又は粒子又は固体支持体上に接触しているアッセイフォーマットに関する。溶解性物質又は酵素は、その結合パートナーと反応し検出可能なシグナルを産生する。
【００２７】
電子ベース方法は、電子を放出又は受取ることのできる基を使用して構築され得る。例えば、ルテニウム複合体で標識された物質はサンプル物質と競合可能となる。当該標識された物質が電極に近接するとき、ルテニウム複合体が酸化還元サイクルを被るので、光が産生される。他の例では、ランタニドキレート標識された物質がサンプル物質と競合可能となる。当該標識された物質が電極に近接するとき、光が産生される（Ｋｅｎｔｅｎ  Ｊ．Ｈ．Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  生体分子ｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ，１９９２；１７５，Ｋｎｉｇｈｔ  Ａ．Ｗ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９：１８；４７）。
【００２８】
散乱材料は、金又は銀粒子の如き粒子をいい、表面増強ラマン散乱物質といわれるとき、例えば、シアニン染料の如き発光分子でコーティングされた金又は銀粒子をいう。かかる散乱物質は、非特異的に、サンプル物質を認識するために使用され得る（Ｎｉ  Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９：７１；４９０３，Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００：９７；９９６）。
【００２９】
伝導金属粒子は、通常、共鳴効果を有する。これらの共鳴効果は、測定可能なシグナルを得るために本発明に関して利用され得る。例えば、銀又は金ナノ粒子の共鳴効果は、当該粒子表面に接近する蛍光色素の発光シグナルを強化するために使用され得る。サンプル物質は、表面に近づいたとき又は表面に吸収されたときに、このシグナルに影響を及ぼす（Ｇｅｄｄｅｓ  ＣＤ．ら，J．Ｆｌｕｏｒ．２００２：１２；１２１）。
【００３０】
吸収性物質方法は、エネルギーを吸収できる分子に基づく。結合による吸収特性における変化が検出される。当該方法論は、非結合吸収性物質の吸収特性に影響を及ぼすことにより、さらに改良され得る。
【００３１】
移動性結合パートナーは、例えば、抗体；細胞；細胞上の受容体；いずれかの受容体、細菌；ウイルス；細胞の、ウイルスの、細菌の、リポソームの又は媒体の表面物質又はタンパク質；溶液中を移動できる固相；重合物質；小胞；リポソーム；核酸；いずれかの糖質化合物；小分子；ハプテン；タンパク質；電解液；基質；抗原；あるいは酵素となり得る。上記の移動性結合パートナーのリストは、非限定的なものである。この結合パートナーについての特性は、それが可動性又は可動性固相に固定されていることである。移動性結合パートナーは、溶液又は気体中で動くことのできる存在として理解されるべきである。
【００３２】
標識されたリガンドは、標識を有し、移動性結合パートナーに直接又は他の結合パートナーを通じて結合できるリガンドをいう。当該標識されたリガンドのリガンドは、例えば、抗体；細胞；細胞上の受容体；いずれかの受容体；細菌；ウイルス；細胞、ウイルス、細菌、リポソーム、若しくは小胞の表面物質又はタンパク質；溶液中で移動可能な固相；重合物質；いずれかの炭水化物；核酸；小分子；ハプトン；タンパク質；電解質；基質；抗原；あるいは酵素となり得る。標識されたリガンドのリストは、上記例に制限されるわけではない。
【００３３】
非特異的な結合標識は、分子、生体分子、固体粒子又は固体表面に結合する標識のような標識を含むと理解されるべきである。それ故、非特異的に結合する標識は、溶解形態、懸濁形態、若しくは固体形態となり得る。この要素の標識は、標識されたリガンドの標識に影響を与える能力を有するだろう、あるいは、当該標識されたリガンドの標識は、非特異的に結合する標識に影響を与える能力を有するだろう。
【００３４】
用語「非特異的な結合」は、この要素が移動性パートナーに、標識されたリガンドに、若しくは競合結合パートナーに全く結合しないこと；あるいは当該結合が移動性結合パートナー、標識されたリガンド、若しくは競合結合パートナーに対して低親和性を有することを意味する。当該非特異的結合標識の濃度は、通常、０．１ｎＭ〜１Ｍ、好ましくは１０ｎＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは１００ｎＭ〜１ｍＭ、若しくはさらにより好ましくは１〜１００μＭである。当該非特異的結合標識は、例えば、抗体；細胞；細胞上の受容体；いずれかの受容体；細菌；ウイルス；細胞、ウイルス、細菌、リポソーム、若しくは小胞の表面基質又はタンパク質；溶液中を移動できる固相；重合物質；いずれかの炭水化物；核酸；小分子；ハプテン；タンパク質；電解質；基質；抗原；あるいは、酵素に結合され得る。非特異的結合標識を有する結合剤のリストは、上記の例に限定されない。
【００３５】
競合結合パートナーは、例えば、抗体；細胞；細胞上の受容体；いずれかの受容体；細菌；ウイルス；細胞、ウイルス、細菌、リポソーム、若しくは小胞の表面基質又はタンパク質；溶液中を移動できる固相；重合物質；いずれかの炭水化物；核酸；小分子；タンパク質；電解質；基質；抗原；あるいは、酵素となり得る。当該競合結合パートナーのリストは、上記の例に限定されない。
【００３６】
前記結合パートナー標識は、結合パートナーの少なくとも１つに吸収又は共有結合する標識として理解されるべきである。この標識の結合パートナーは、移動性結合パートナー、標識されたリガンド又は競合結合パートナーとなり得る。
【００３７】
前記結合パートナーは、いずれかの結合要素又は物質として理解されるべきである。かかる結合パートナーは、例えば、移動性結合パートナー、標識されたリガンド、競合結合パートナー、若しくは他の結合要素と相互作用するいずれかの結合要素又は物質となり得る。
【００３８】
非特異性は、以下のように決定される。非特異的結合標識は、標識されたリガンドへの特異的結合剤を含まない。例えば、抗体は、抗原又は抗原群に、高親和性で特異的に結合する。かかる結合事象は特異的とみなされる。か特異的結合剤は、リガンドや当該リガンドの類似体、及び当該リガンドと非常に似た構造体を、高親和性（通常、１０７Ｍ−１超）で認識する。特異的結合剤は、それらのリガンド、リガンド類似体、及びリガンドと非常に良く似た構造体に対して、高い選択性を有する。
【００３９】
「サンプル」は、当該サンプル物質又はサンプル物質群が分析されるべき一定量をいう。「サンプル」は、担体の如き又は担体を有する物質又は物質群からなり得る。
【００４０】
「サンプル物質」は、分析されるべき物質又は物質群、すなわち、サンプル物質又は物質群をいう。当該サンプルは、単一物質のみを含む、サンプル物質は、最大直径１００，０００ｎｍ以下のものとなり得る。当該サンプル物質は、有機又は無機物質、凝集体、小胞、リポソーム、粒子又は染色された粒子、抗体；細胞；細胞上の受容体；いずれかの受容体；細菌；ウイルス；細胞、ウイルス、細菌、リポソーム、若しくは小胞表面の物質又はタンパク質；溶液中移動可能な固相；重合物質；いずれかの炭水化物；核酸；小分子；ハプテン；タンパク質；電解質；基質；抗原；あるいは酵素の如きいずれかの形態となり得る。非特異的結合標識を有する結合剤のリストは、上記の例に限定されない。
【００４１】
あるいは、前記サンプル物質は、上述の物質の混合物となり得る。さらに、当該サンプル物質は、断片型又は非断片型となり得、ここで例えば、細胞の如きより大きな単位は、部分的又は全体的に上記単位の断片又は一部に分けられる。当該サンプル物質は、ウイルス、細菌、細胞、小胞、リポソーム、粒子、ポリマー又は他の物質の如き構造物の表面上の生体分子ともなり得る。当該分析されるべきサンプル物質は、発光、若しくは色群、酵素のための基質の如き単一の要素を本質的に含み得るか、例えば発光タンパク質、もしくは粒子となり得る。当該サンプル物質は、例えば、移動性結合パートナー、標識されたリガンド、競合結合パートナー、あるいは他の結合要素と相互作用するいずれかの結合要素又は物質となり得る。好ましくは、当該サンプル物質は、競合結合パートナーである。
【００４２】
分離のないアッセイフォーマットは、反応溶液が固相から物理的に分離しないアッセイフォーマットである。分離のない方法は、全反応、及び／又は検出の容器又はシステム内における反応溶液の希釈及び反応溶液の移動を考慮するが、溶液と固相の物理的分離は考慮しない。
【００４３】
本発明に関する方法は、非競合アッセイとなり得る。
【００４４】
本発明の好ましい態様は、移動性結合パートナーに結合すると期待される競合結合パートナーを通常含む、競合アッセイである。
【００４５】
結合パートナーの標識は、好ましくは、標識対のドナー又はアクセプターである。
【００４６】
非特異的結合標識は、好ましくは、消光剤、促進剤、ドナー−アクセプター標識対のアクセプター、あるいはドナー−アクセプター標識対のドナーである。
【００４７】
移動性結合パートナーに結合される標識されたリガンドのシグナルは、好ましくは、各々当該移動性結合パートナーに結合することができる個々の促進剤又は消光剤を添加することにより促進又は消光される。
【００４８】
移動性結合パートナーに結合する及び結合しない標識されたリガンドのシグナルは、好ましくは、当該標識されたリガンドに結合又は相互作用し得る促進剤を添加することにより促進される。
【００４９】
結合パートナーの直接発光標識は、好ましくは、標識対のドナーであり、非特異的結合標識は、好ましくは消光剤、より好ましくは溶解性消光剤である。
【００５０】
前記標識対は、共鳴エネルギー移動標識対となり得、好ましくは、発光共鳴エネルギー移動標識対であり、前記ドナーは、好ましくは、ランタニド又はルテニウムキレートである。
【００５１】
本発明は、異なる検出方法において共通の特徴を含む。それ故、本発明の方法は、様々な方法に適用され得る。例えば、単純な受容体−リガンドアッセイにおいて、リガンド（標識されたリガンド）は蛍光色素で標識される。かかる場合、標識特異的受容体（移動性結合パートナー）は、標識されるかもしれないし又はされないかもしれない。前記移動性結合パートナー、及び標識された標識されたリガンドは、反応可能とされる。結合事象からのシグナルを得るために、消光剤分子（非特異的結合標識）を、受容体リガンド結合剤の添加前、添加後又は同時に溶液に添加する。非結合蛍光色素標識リガンドと非特異的結合消光剤標識分子の間に消光が生じる。通常は、非結合蛍光色素標識リガンドに対する標識された高特異的捕捉分子はバックグラウンド・シグナルを低減するためには使用されず、蛍光色素は吸着又は共有親和力の使用を通じてリガンドに直接的に接着される。本発明は、バックグラウンド・シグナルを低減するために、溶液中の消光分子と組み合わせて固定固体表面を使用することには関しないことに留意すべきである。
【００５２】
消光分子を使用する本発明の態様は、発光酸素チャネリング免疫アッセイ、二光子励起アッセイ、同時アッセイ、蛍光偏光アッセイ、蛍光相関分光学的アッセイ、及びフローサイトメトリーアッセイにおいて使用され得る。あるいは、発光は、発光促進物質を使用して溶液中で増大され得、あるいは発光は発光共鳴エネルギー移動原則を使用して変化され得る。
【００５３】
単純な受容体−リガンド結合アッセイの代わりに、競合アッセイが本発明の方法を使用して実施され得る。競合結合パートナー、移動性結合パートナー、及び標識されたリガンドを、任意の順序で、非特異的結合標識と共に混合する。当該競合結合パートナーは、移動性結合パートナーの結合部位について、標識されたリガンドと競合する。非結合標識リガンドのシグナルは、非特異的結合標識により変えられる。それ故、前記競合結合パートナーの濃度を測定し得る。
【００５４】
好ましい態様において、本発明は、免疫アッセイ、受容体−リガンドアッセイ、酵素−基質反応、核酸検出システム又は結合パートナーを有するいずれかの試験システムにおけるサンプル物質の濃度を測定するために使用され得る。当該アッセイは、競合又は非競合となり得る。核酸アッセイシステムは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーション・アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応と続くハイブリダイゼーション・アッセイとの組み合わせ、あるいは伸長、開裂又はライゲーション方法に依存し得る。
【００５５】
本発明の好ましい態様において、前記アッセイ要素は、反応容器の中に乾燥され得、そしてサンプル物質を含むかもしれないし含まないかもしれない溶液の添加により懸濁され得る。
【００５６】
前記結合パートナーのいずれかを標識し得る。例えば、競合ＲＥＴアッセイにおいて、リガンド又は受容体は、ドナー又はアクセプターにより標識され得る。さらに、アッセイシステムは、多重エネルギー又は電子移動プロセスを被る多重染料、ドナー又はアクセプター分子を含み得る。それ故、複数の標識分子は、結合パートナー及びリガンドに結合され得る。これは、例えば、結合パートナーがドナー又はアクセプター分子、及びアクセプター又はドナー分子を有するリガンドの各々により標識される発光共鳴エネルギー移動アッセイの場合である（図７）。
【００５７】
通常は、標識の１つは直接的発光である。非特異的結合標識は、これらの励起、及び／又は発光経路に影響を与え得る。結合パートナーは、吸着、及び／又は共有親和力戦略を使用して標識により標識されるべきである。多重挿入化合物は、核酸二重鎖と相互作用し得る。かかるアッセイスキームにおいて、通常、吸着、及び／又は共有親和力を使用して核酸鎖は標識されない。挿入化合物は鎖間で非特異的に結合し、その結果、それは構造特異的であり、鎖間に結合できるためにその構造の形成を必要とする。より多くの挿入化合物が核酸鎖に結合され得るので、いずれの鎖も標識しないことが有利となる。
【００５８】
本発明の方法は、細胞、細菌、ウイルス、ポリマー、凝集体、抗体、受容体、リガンド、核酸、小分子、溶液中移動可能な固相、ポリマー、炭水化物、基質、酵素、ハプテン、電解質又はタンパク質、並びにウイルス、細菌又は細胞の内部、若しくは表面の受容体、リガンド、核酸、小分子、炭水化物、ポリマー、抗体、基質、ハプテン、電解質又はタンパク質の如きサンプル物質を測定するために適用され得る。事実、最先端の方法におけるウイルス、細菌又は細胞の表面要素の測定に関する問題は、本発明に従って回避され得る。例えば、ＲＥＴベースアッセイにおいて、ドナーとアクセプター分子の両方は、互いに数ナノメーターの距離内で結合しなければならない。このことは困難な問題となり得、ウイルス、細菌又は細胞上で達成するのはさらに不可能かもしれない。本発明によれば、単一標識戦略及び非特異的結合標識を使用して、ウイルス、細菌又は細胞をアッセイし得る。分析されるサンプル物質は、発光又は色素群、酵素のための基質の如き単一要素を本質的に含み得；あるいはサンプル物質は、例えば発光タンパク質となり得る。
【００５９】
好ましい態様において、非特異的結合標識は、溶解性標識、粒子標識、粒子又はタンパク質の如き担体と混合された標識、２又はそれ超の標識の組み合わせ、発光タンパク質の如き生体分子標識、有機標識、無機標識、イオン又は非イオン化合物、あるいは上述の標識の組み合わせとなり得る。さらに、非特異的結合標識は、表面又は表面の一部となり得る。上記非特異的結合標識は、シグナルを低減、保持又は促進するために、標識されたリガンド、若しくはいずれかの標識された結合パートナーに関係し得る。非特異的結合標識の影響を受けるシグナルは、各々、非特異的結合標識に結合又は相互作用できるシグナル低減剤又は促進剤を添加することにより、さらに低減又は促進され得る。
【００６０】
あるいは、上記非特異的結合標識は、シグナルを低減、維持又は促進するために、例えば励起光に向けられ得る。例えば、ＲＥＴアッセイにおいて、非特異的消光剤分子は、シグナルを低減するために、ドナー及び／又はアクセプターの励起及び発光の光の波長に向けられ得る。あるいは、非特異的結合標識は、結合した及び／又は非結合の標識リガンドに向けられ得る。例えば、競合ＲＥＴアッセイにおいて、非特異的結合消光剤分子は、標識された小分子又は標識された受容体分子の発光シグナルを低減し得る。例えば、競合ＲＥＴアッセイにおいて、非特異的結合消光剤分子は、標識された小分子又は標識された受容体分子の発光シグナルを低減し得る。
【００６１】
シグナル消光剤（全ての又は一部の消光）又は促進剤は、例えば、いずれかの蛍光色素、吸収剤、発光タンパク質、非標識結合パートナー、イオン若しくは非イオン化合物、いずれかの光／エネルギー、電子又は酸素吸収群となり得るか、あるいはいずれかの蛍光色素、吸収剤、発光タンパク質、非標識結合パートナー、イオン若しくは非イオン化合物、いずれかの光／エネルギー、電子、放射能又は酸素吸収群を含む凝集体又は粒子となり得る。代替物は、使用される方法に依存する。標識されたリガンド又は標識された結合パートナーと非特異的結合標識との相互作用は、存在しないか、物理的又は化学的なものである。通常、標識された高特異的捕捉生体分子は使用されない。
【００６２】
他の態様において、リガンドの標識は、シグナル産生前の化学又は生物化学的反応の必要性なしに、直接的に測定可能なシグナルを産生できるいずれかの化合物となり得る、例えば、存続期間の短い又は存続期間の長い蛍光色素、発光タンパク質の如き生体分子標識、光吸収物質、基質、電子放出又は受取物質、一重項酸素放出又は受取り物質である。このことは使用される方法に依存する。
【００６３】
他の態様において、標識されたリガンドのシグナルは、その結合パートナー、移動性結合パートナーとの結合に影響され得る。当該シグナルは、標識されたリガンド、及び結合パートナーに依存して増大又は低減され得る。例えば、標識された小分子は、受容体に結合する。結合により、当該標識された小分子のシグナルは増大する。このことは、例えば、前記標識された小分子の近くの消光水分子の数の減少の結果、あるいは他の影響の結果となり得る。
【００６４】
他の態様において、非結合標識物質のシグナルは、特異的又は非特異的結合パートナーとの相互作用の影響を受け得る。当該シグナルは、標識されたリガンド、及び特異的又は非特異的な結合パートナーに依存して増大又は低減され得る。例えば、競合アッセイにおいて、非結合標識小分子は、さらなる特異的又は非特異的結合パートナーと相互作用する。結合により、当該標識された小分子のシグナルは増大する。さらに、非特異的結合標識分子の添加により、さらに特異的又は非特異的結合パートナーに結合する非結合標識小分子が影響を受ける。
【００６５】
図４において、細胞はかかる非特異的結合パートナーとして作用する、なぜならば、非結合標識された小分子の発光シグナルは細胞の添加により増大するからである。このことは、結合パートナーの数を減少することを可能とし、当該試験システムの検出限界を改良する。特異的又は非特異的結合パートナーは、例えば、抗体；細胞；細胞上の受容体；いずれかの受容体；細菌；ウイルス；ウイルス又は細菌の表面物質又はタンパク質；溶液中で移動可能な固相；重合物質；いずれかの炭水化物；核酸；小分子；ハプテン；タンパク質；電解質；基質；抗原；あるいは酵素となり得る。
【００６６】
他の態様において、標識されたリガンドは、受容体に結合することにより、上記非特異的結合標識から保護され、当該アッセイのシグナル対バックグラウンド比率を改良する。例えば、標識された小分子は、自由な非結合形態におけるよりも受容体に結合した方が、上記非特異的結合標識に与える影響が少ない。このことは、シグナル対バックグラウンド比を増大する反応に他の特異的又は非特異的結合剤を添加することによりさらに改良され得る。例えば、標識されたタンパク質は受容体に結合する。他の受容体は、標識されたタンパク質−受容体複合体に結合するために使用され、溶液中の非特異的結合標識により消光される当該標識されたタンパク質を保護する。この文脈における受容体は、例えば、抗体；細胞；細胞上の受容体；いずれかの受容体；細菌；ウイルス；ウイルス又は細菌の表面物質又はタンパク質；溶液中で移動可能な固相；重合物質；いずれかの炭水化物；核酸；小分子；ハプテン；タンパク質；電解質；基質；抗原；あるいは酵素となり得る。
【００６７】
本発明において利用されるアッセイにおいて、アッセイ過程の順序は、選択可能であり、最適シグナル対バックグラウンド比率を得るために変えられる。いずれのアッセイ過程の順序も選択され得る。例えば、サンプル物質、及び標識された小分子は、受容体への競合及び結合を可能とされ、その後、非特異的結合標識を添加し、シグナルを検出する。本発明に関して、全要素を同時に又は任意の順序で添加することにより、同様のアッセイを実施し得る。
【００６８】
他の態様に関して、本発明の方法は、細胞、ウイルス又は細菌の数を計算するために使用され得る。
【００６９】
他の態様において、本発明の方法は、サンプル物質の濃度、電荷又は単位サイズを測定する手順と組み合わせて使用され得る。当該手順において、サンプル、及び標識物質は固相と接触させ、ここで、当該固相への当該標識物質の近接はシグナルを産生する能力を有する。シグナル産生は、例えば標識されたリガンドが当該固相に近づくとき、あるいは、例えばサンプル物質及び標識されたリガンドが当該固相表面の近くで競合可能であるときに生じる。当該固相表面の近接における発光化合物の固相表面に近づくことは発光シグナルを増大又は低減させ、あるいは、発光エネルギーが発光化合物と当該固相間で移動される。上記方法は、本発明に関する濃度、電荷又は単位サイズの測定のためのシグナルを産生するために使用され得る。
【００７０】
好ましくは、本発明は、競合若しくは非競合形態、好ましくは競合形態で、濃度、電荷、若しくは単位サイズを測定する上記手順との組み合わせで、サンプル物質若しくは物質群、またはサンプル物質若しくは物質群の濃度の存在を測定するため、細胞、ウイルス若しくは細菌の数を計算するため、またはその濃度、電荷、若しくは単位サイズを測定するために使用される。
【００７１】
本発明の方法は、溶液又は気体、好ましくは溶液中で適用され得る。
【００７２】
他の好ましい態様において、本発明の方法は、リアルタイムでサンプル分子の存在を検出するために使用され得る。
【００７３】
本発明の方法は、複合的な機器の状況にて使用され得る。サンプル物質が光で励起されなければならないときはいつでも、異なる構成を、当該物質の濃度を成功裏に測定するために使用し得る。かかる測定構成の光源は、例えば、ハロゲン、キセノン、タングステン、水素若しくは重水素放電管又はレーザー、あるいは発光ダイオードの如き半導体光源となり得る。検出器は、例えば、光ダイオードの如き光電子放出、光電子増倍管又は半導体検出器となり得る。かかる検出構造は、測定器の一面の光源、及びもう一面の検出器を有することにより実施され得る。かかる光源及び検出器は、おそらくそれらの間に角度を有する。しばしば使用される構成は、エピ構成（１８０度の角度を有する）である。フィルター、単色光分光器、プリズム又は回折格子の如きよく知られた方法は、異なる光学的配置に好適な励起及び発光波長を選択するために使用され得る。
【００７４】
他の態様において、かかるシグナルは、反応後、及び反応成分を乾燥後、検出され得る。かかるシグナルは、インキュベート後すぐに、通常、溶液中で検出される。本発明に関して、シグナル対バックグラウンド比は、反応後反応成分を乾燥することによりさらに改良され得る。
【００７５】
本発明に関する方法は、生物学、生物化学、化学、医学、診断法、法医学、軍、食品業界、紙及びパルプ業界、並びに化粧品業界の如き多くの様々な分野において、サンプル物質を測定するために使用され得る。当該適用分野のリストは、一例であり非制限的なものである。
【００７６】
本発明の有用性
本発明は、いくつかの有用性を提供し得る。本発明は、着目のサンプル濃度を測定するための非常に単純な方法を提供し得る。例えば、通常、サンプル、標識されたリガンド、移動性結合パートナー、及び非特異的結合標識を混合し、シグナルを短時間、観測する。当該方法は、最新の方法に反して、唯一の結合パートナーの標識を必要とする。さらに、シグナルを溶液中で検出し、移動しない固体表面上での特異的生体分子のカップリングを必要としない。かかる方法は、核酸、及び免疫アッセイ、並びにウイルス、細菌又は細胞に適用され得る。特に、細胞における受容体研究は、最新の方法が表面埋め込みタンパク質を測定するためにほとんど適用されないので、当該方法を興味深いものとする。かかる方法は細胞ベースのアッセイ、並びに慣習的な免疫アッセイに使用され得るので、典型的な最新方法と比較して多用な技術が増大した。さらに、当該方法の検出感度は、通常、細胞表面上で受容体濃度を測定できる慣習的な蛍光偏光アッセイを使用するときよりも優れている。
【００７７】
本発明は、以下の非制限的な実施例により例証されるだろう。
【実施例】
【００７８】
実施例１
エストラジオール特異的抗体を使用する競合エストラジオールアッセイ
マイクロタイターウェルにおいて、５０μＬのアッセイバッファー中のエストラジオールを異なる濃度で添加した。その後、３ｍＭエストラジオール抗体溶液の５０μＬを添加し、そして１０分間継続して反応に供した。１．２５ｎＭの濃度でユーロピウム（ＩＩＩ）標識されたエストラジオールを５０μＬのアッセイバッファーに添加した。２分間インキュベートし、５０μＬの非特異的マラカイトグリーン標識溶液を１５μＭ濃度で添加した。２分のインキュベーション後、ユーロピウムシグナルを業務用Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩマイクロタイタープレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して観測した。非結合ユーロピウム（ＩＩＩ）標識されたエストラジールのシグナルを大いに消光したが、結合ユーロピウム（ＩＩＩ）標識されたエストラジールのシグナルはほとんど影響を受けなかった。励起及び発光の波長は、各々３４０ｎｍと６１５ｎｍであり、遅延時間及び猶予時間は両方とも４００μｓだった。
【００７９】
実施例２
エストラジオール特異的抗体、およびＨｅＬａ細胞を使用する競合エストラジオールアッセイ
マイクロタイターウェルにおいて、５０μＬのアッセイバッファー中のエストラジオールを異なる濃度で添加した。その後、５μＬの３０ｍＭエストラジール抗体溶液と４５μＬの１００００個のＨｅＬａ細胞を添加し、１０分間継続して反応に供した。１．２５ｎＭの濃度でユーロピウム（ＩＩＩ）標識されたエストラジオールを５０μＬのアッセイバッファーに添加した。２分間インキュベートし、５０μＬの非特異的マラカイトグリーン標識溶液を１５μＭ濃度で添加した。２分のインキュベーション後、ユーロピウムシグナルを業務用Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩマイクロタイタープレートリーダーを使用して観測した。励起及び発光の波長は、各々３４０ｎｍと６１５ｎｍであり、遅延時間及び猶予時間は両方とも４００μｓだった（図４参照のこと）。
【００８０】
本発明の方法が、様々な態様に組み入れられることは明らかであり、そのほんのいくつかを本明細書中に開示した。他の態様が存在し、その態様が本発明の本質から逸脱しないことは、本分野における当業者にとって明らかだろう。それ故、本明細書中に開示された態様は例証に過ぎず、制限するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、非特異的消光分子を使用する最新方法を示す。図１Ａは、単一標識アプローチを使用して固体固定平面上で実施されるサンドイッチ型免疫アッセイを示す。励起光が方向付けられ、そして放出光が当該平面固体表面を通して測定される。表面に結合した標識、及び非結合の標識の発光は区別され得ない。図１Ｂは、溶液中にさらなる非特異的消光分子を使用して実施される同じサンドイッチ型アッセイを示す。発光はその溶液中では消光され、表面に結合した標識、及び非結合の標識の発光が区別され得る。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、本発明に関する発光消光アッセイを示す。図２Ａは、標識されたリガンドが細胞上の受容体とどのように反応するのかを示す。消光剤の添加により、非結合の標識されたリガンドの発光は消される。結合標識されたリガンドと非結合のものとの発光は、溶液中で区別され得る。図２Ｂは、競合結合パートナーが受容体結合部位とどのように競合するのかを示す。当該競合結合の濃度が増大するにつれて、測定される発光シグナルは低減される、というのは、標識されたリガンドの発光が溶液中では消されるからである。
【図３】図３は、ユーロピウム（ＩＩＩ）標識、及びマラカイトグリーンのスペクトルを示す。マラカイトグリーンは、ユーロピウム（ＩＩＩ）標識の放射波長とマラカイトグリーンの吸収との重複は重要となり、ユーロピウム（ＩＩＩ）標識の発光シグナルの強力な消光剤である。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、ユーロピウム（ＩＩＩ）標識エストラジオール、及びエストラジオール抗体を使用する、エストラジオール（各セットのバーの左から右の順番にて：エストラジオール０ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１００ｎＭ）の競合アッセイを示す。異なる数のＨｅＬａ細胞を、結合パートナーとインキュベートした。マラカイトグリーンを、溶液中の非結合ユーロピウム（ＩＩＩ）標識エストラジールの発光シグナルを消すために使用した。図４Ａは当該発光シグナルを示し、図４Ｂは当該アッセイの正規化発光シグナルを示す。
【図５】図５は、本発明に関する発光共鳴エネルギーアッセイを示す。ドナー標識されたリガンドは細胞上の受容体と反応する。溶解性アクセプターの添加により、非結合のドナー標識されたリガンドの発光共鳴エネルギー移動シグナルを得る。溶液中の発光共鳴エネルギー移動シグナルの増大は、受容体の数と相関する。
【図６】図６は、本発明に関する発光促進アッセイを示す。標識されたリガンドは細胞上の受容体と反応する。溶解性促進剤分子の添加により、非結合の標識されたリガンドの発光シグナルが増大される。
【図７】図７は、本発明に関する他の発光共鳴エネルギーアッセイを示す。ドナー標識された受容体は、アクセプター標識されたリガンドと反応する。溶解性消光剤分子の添加により、非結合のドナー、及び／又はアクセプター分子由来のバックグラウンド・シグナルが、消光され、アッセイのシグナル対バックグラウンド比を改善する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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