(57)【要約】  ex vivoで単離される前駆脂肪細胞を培養する方法が記載され、前記方法は、前駆脂肪細胞を三次元支持マトリックス中に導入する工程、支持マトリックス中において細胞をin vitroで脂肪細胞に分化させる工程を含む。前記マトリックスはコラーゲンマトリックスであってよい。前記方法を使用して、幹細胞の成長を調査してよく、または刺激に対する脂肪細胞の反応を調査してよい。前記方法は、in vivoにおける特性に類似した生物学的特性を有する脂肪細胞を、in vitroで生育させる系を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞をin vitroで培養する方法であって、
ex vivoの前駆脂肪細胞を、三次元支持マトリックス中に導入する工程；および
前記支持マトリックス中において前記前駆脂肪細胞をin vitroで脂肪細胞に分化させる工程
を含む方法。
【請求項２】
前記マトリックスがコラーゲンマトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マトリックスがI型コラーゲンマトリックスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックスがヒドロゲル型物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マトリックスに前駆脂肪細胞を導入する工程が、液体形状のマトリックス前駆体中に前駆脂肪細胞を播種すること、および前記マトリックス前駆体を凝固させて前記マトリックスを形成させることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記マトリックスに導入するために、脂肪組織から前駆脂肪細胞を単離する工程をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単離工程が、コラーゲナーゼで脂肪組織を消化すること、および脂肪組織の他の成分から前駆脂肪細胞を分離することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化させるために、1つまたは複数の分化因子を前記マトリックス中に導入する工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記前駆脂肪細胞の導入と同時に、前記分化因子を導入する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
液体形状のマトリックス前駆体中に前記分化因子を導入し、前記前駆体を凝固させて前記マトリックスを形成させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記分化因子を含む溶液と前記マトリックスを接触させることにより、前記マトリックス中に前記分化因子を導入する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記分化因子が、グルコース、サイクリックAMP誘導剤、グルココルチコイドまたはグルココルチコイドアナログ、インスリンまたはインスリンアナログ、ならびにPPARγアゴニストまたはRXRアゴニストのそれぞれを含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分化因子が、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、およびインスリンのそれぞれを含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マトリックス中の前記分化因子を、他の培地と交換する工程をさらに含む、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
追加の細胞型が前記マトリックス中に導入されてよい、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記追加の細胞型が内皮細胞を含まない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マトリックスから、分化した脂肪細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
その中に脂肪細胞が位置し、ex vivoの前駆脂肪細胞が前記マトリックス中においてin vitroで分化することにより前記脂肪細胞が取得される、三次元支持マトリックス。
【請求項１９】
前記マトリックスが内皮細胞を含まない、請求項１８に記載のマトリックス。
【請求項２０】
刺激に対する脂肪細胞の反応を調査する方法であって、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法に従って脂肪細胞をin vitroで培養する工程；前記マトリックス中で前記脂肪細胞に刺激を導入する工程；および前記刺激に対する前記脂肪細胞の前記反応を測定する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記刺激が、薬物、薬物候補、小分子、生物活性分子、ペプチド、ペプチドフラグメント、脂肪酸、核酸、成長因子、および分化因子を含む群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記脂肪細胞の前記反応を測定する前記工程が、前記刺激にさらされた前記脂肪細胞と、同じ方法で培養され、前記刺激にさらされていない脂肪細胞とを比較することを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
脂肪細胞と他の細胞型との相互作用を調査する方法であって、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法に従って脂肪細胞をin vitroで培養する工程；前記マトリックス中に他の細胞型を導入する工程；および前記他の細胞型と前記脂肪細胞の相互作用を測定する工程を含む、方法。
【請求項２４】
脂肪細胞と他の細胞型との相互作用を調査する方法であって、前記マトリックスが他の細胞型を含み、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法に従って脂肪細胞をin vitroで培養する工程；および前記他の細胞型と前記脂肪細胞の相互作用を測定する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記他の細胞型が内皮細胞ではない、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
幹細胞の成長を調査する方法であって、前記マトリックスが1つまたは複数の幹細胞を含み、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法に従って脂肪細胞をin vitroで培養する工程を含む、方法。
【請求項２７】
幹細胞の生育を調査する方法であって、その中に前駆脂肪細胞が位置する三次元支持マトリックス中に、1つまたは複数の幹細胞を導入する工程；前記前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる工程；および前記幹細胞を成長または分化させる工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記マトリックスが他の細胞型を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞を培養するための三次元細胞培養系に関する。本発明はまた、脂肪細胞を培養するため、および細胞培養中の前駆脂肪細胞(preadipocytes)より脂肪細胞を取得するための方法にも関する。さらに本発明の範囲は脂肪細胞と他の細胞型との相互作用を評価するため、および環境刺激に対する脂肪細胞の反応を評価するための方法に関する。これにより、細胞と組織との相互作用に関わる機構をより多く理解することができ、このことは肥満、糖尿病、炎症および関連疾患の分野に関連する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、脂肪組織は主にそれ以外には不活性である貯蔵要素であるとみなされてきた。その機能的重要性は近年になってようやく明らかになってきた。現在、脂肪細胞は、他の細胞型とのある範囲での相互作用、ならびに種々の因子の生産および分泌に関わることが知られている。脂肪組織は、心臓、心膜、血管周囲組織及び腎周囲組織、ならびに骨髄を含む種々の組織と関わっている。脂肪組織はリンパ組織にも関わり、脂肪細胞はリンパ細胞と相互作用することが知られている。脂肪細胞は、種々のサイトカインおよびケモカインを分泌し、体重の制御に関わり、ならびに糖尿病および炎症においてある役割を果たしていると考えられている。
【０００３】
脂肪細胞は巨大で脆弱な細胞であり、分析の間完全であることを維持することが困難である。脂肪細胞が破裂すると、脂肪内容物を放出し、水ベースの生化学アッセイを妨げる可能性がある。破壊を最小化する脂肪細胞の操作には、相当な専門技術が必要とされる。
【０００４】
脂肪細胞を培養する初期の仕事は、組織片の外植片を培養するか、または不死化細胞系統を作り出すかのいずれかに焦点がおかれてきた。両方の方法に欠点がある：すぐに壊死し、分析を実行するとことができる時間が制限される、ならびに、細胞系統がin vivoの脂肪細胞の構造および機能特性を失う。脂肪細胞はまた、ex vivoで単離され、単層で生育する。再び、これらの細胞が二次元で増殖するにつれ、「通常の」構造及び機能を失い、さらに脂肪細胞が完全に成熟する（巨大な油滴を含む）につれ、それらの濃度は、単層から離れて遊離し、失われ、分析を妨げるようになる。浮かびやすく低い濃度は、脂肪細胞が、遠心分離のような伝統的な方法に適していないことを意味する。さらに最近、ex vivo成熟脂肪細胞を、コラーゲンゲル中で内皮細胞と共培養する三次元培養系が報告されている(Aoki et al, 2003, Cell Struct Funct 28, 55)。この論文は、それらの培養の寿命、また生化学分析に対する培養脂肪細胞の適性について報告していない。さらに前記共培養は種々の数の前駆脂肪細胞を含み、それは著者らに不利な点とみなされた。さらに、培養中に内皮細胞が存在することが、脂肪細胞の成育、および前駆脂肪細胞より脂肪細胞が成長するために必須であるとAokiらは報告している。
【０００５】
WO 2005/121316には、支持マトリックスの表面上で脂肪細胞または前駆脂肪細胞を培養することが記載されている；前記マトリックスは、二次元細胞基質として作用している。前記マトリックス中で、前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化したことは開示されていない。
【０００６】
WO 2004/035102には、細かい泡構造を有する粒子中で前駆脂肪細胞を培養し、これらの粒子を体内に注入することが記載されている。前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化したことは開示されておらず、三次元支持マトリックス中におけるin vitro培養は言及されていない。Hemmrich et al, Differentiation, Vol 73, 2005, pp 28-35には、三次元培養系における脂肪細胞のin vitro分化が記載されている。
【０００７】
Patel et al, Tissue Engineer, Vol 11, 2005, pp 1498-1505には、細胞足場(scaffold )系における前駆脂肪細胞の培養が記載されている。脂肪細胞への分化は見られず、細胞死または細胞増殖のみが見られた。Hilliou et al, Exp Cell Res, Vol 177, 1988, pp 372-381では、3T3前駆脂肪細胞系統の培養が議論されている。
【０００８】
Von Helmburg et al, Biomaterials, Vol 22, 2001, pp429-438には、コラーゲンの方向性凝固および凍結乾燥により生成されたコラーゲンスポンジ中の前駆脂肪細胞の培養が記載されている。この文献には、支持マトリックス中におけるin vitroでの前駆脂肪細胞の培養および前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化は開示されていない。
【０００９】
Kuberka et al, Int J Artificial Organs, Vol 25, 2002, pp 67-73には、Von Helmburgが使用したものに類似のコラーゲンスポンジを作り出したことが記載されているが、スポンジ中における前駆脂肪細胞の培養は記載されていない。
【００１０】
このように、三次元支持マトリックス中におけるex vivo前駆脂肪細胞の培養、およびそれに続く前駆脂肪細胞のin vitroにおける脂肪細胞への分化は、当業者は誰も開示していない。本発明は、先行技術の問題点を、少なくとも部分的に克服することを意図して、新規培養系および方法を開発した。in vivoにおける脂肪細胞に類似した生物学的特性を有する脂肪細胞を、安定基質中in vitroで生育することができ、それにより細胞学的、生化学的、および分子的分析に適するようになる系を、発明者は提供する。体内環境とそっくりにまねるように前記培養系を作ることができる。これにより以前は不可能であった方法により、脂肪細胞と他の細胞型との相互作用を生体外で研究することができるようになる。例えば、幹細胞研究に適用してよい。生体内の幹細胞は、脂肪細胞を含む微小環境中に生存し、増殖することがしばしばある。しかし、伝統的に培養することが困難であったことから、幹細胞培養系から脂肪細胞は除かれることが多かった。発明者の3Dモデルを使用して、in vivoの環境に、よりそっくりに模倣した環境にある脂肪細胞と他の細胞を提供し、それにより幹細胞の増殖および分化によりよい条件を与えることができる。
【特許文献１】WO 2005/121316
【特許文献２】WO 2004/035102
【特許文献３】US Patent 6,153,432
【非特許文献１】Aoki et al, 2003, Cell Struct Funct 28, 55
【非特許文献２】Hemmrich et al, Differentiation, Vol 73, 2005, pp 28-35
【非特許文献３】Patel et al, Tissue Engineer, Vol 11, 2005, pp 1498-1505,
【非特許文献４】Hilliou et al, Exp Cell Res, Vol 177, 1988, pp 372-381
【非特許文献５】Von Helmburg et al, Biomaterials, Vol 22, 2001, pp429-438
【非特許文献６】Kuberka et al, Int J Artificial Organs, Vol 25, 2002, pp 67-73
【非特許文献７】Cabrera et al., 2001, Diabetes. 2001 Aug; 50(8): 1883-90
【非特許文献８】the Animals (Scientific Procedures) Act, 1986
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の最初の態様により、脂肪細胞をin vitroで培養する方法が提供され、前記方法は、
三次元支持マトリックス中に前駆脂肪細胞を導入する工程、および
支持マトリックス中で前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる工程
を含む。
【００１２】
そうして本発明により、脆弱な脂肪細胞を取り扱う、および操作する際の問題点を軽減するように、マトリックス中で脂肪細胞を生育させる。さらに、成熟脂肪細胞が単層からはなれて浮かばないように、前記三次元マトリックスは、マトリックス中に成熟脂肪細胞を保持する。前記三次元マトリックスはまた、細胞の形態および機能が「通常の」細胞によく類似するように、脂肪細胞の天然環境によく類似した、脂肪細胞の環境を提供する。好ましくは、前記マトリックスはコラーゲンマトリックスを含む。I型コラーゲンが好ましく、ゼラチン（変性I型コラーゲン）の形態で提供されてよい。あるいは、II型コラーゲンを使用してよい。他の物質を代わりに使用してよいと発明者は考えるが、I型コラーゲンが最も好ましい。しかし、他の物質は、コラーゲンの使用よりも満足できない結果をもたらすかもしれない。前記マトリックスの目的は、培養細胞の三次元支持マトリックスを提供することであり、より小さい細胞の移動を許容するが、より大きい成熟細胞の移動を妨げる一方で、培養培地、成長因子、および他の小分子がマトリックスを通じて拡散することを許容する。いかなる適切な物質をマトリックスに使用してよいが、ここで名前を挙げる物質が好ましい。使用してよいと発明者が考える物質の例は、アルギネートまたはアガロースのようなヒドロゲル型物質を含む。他の適切なマトリックスは、脂肪組織から抽出されるマトリゲル(RTM)または細胞外マトリックス(ECM)を含んでよい。
【００１３】
マトリックスに前駆脂肪細胞を導入する工程は、液体形状のマトリックス前駆体中に前駆脂肪細胞を播種すること、およびマトリックス前駆体を凝固させてマトリックスを形成することを含んでよい。固体化は、マトリックス前駆体の重合などを含んでよい。
【００１４】
前記方法はさらに、マトリックスに導入する前駆脂肪細胞を、脂肪組織から単離する工程を含んでよい。そのような単離のための技術は既知であり、例えば、脂肪組織を、例えばコラーゲナーゼで消化すること、および他の成分から、例えば濾過または遠心分離により前駆脂肪細胞を分離することを含んでよい。
【００１５】
前記方法はさらに、前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化させるために、1つまたは複数の分化因子をマトリックスに導入する工程を含んでよい。前駆脂肪細胞の導入と同時、またはその前、またはそれに続いて、前記分化因子を導入してよい。液体形状のマトリックス前駆体中に前記因子を導入してよく、前記前駆体を凝固させてマトリックスを形成させてよい。あるいは、例えば前記マトリックスを前記因子を含む溶液と接触させることにより、前記マトリックス中に前記因子を導入してよい。
【００１６】
適切な分化因子は当業者に既知であり、例えば、その内容が参照してここに取り込まれる米国特許 6,153,432号で引用されているものを含んでよい。特に好ましい分化因子は、グルコース、サイクリックAMP誘導剤、グルココルチコイドまたはグルココルチコイドアナログ、インスリンまたはインスリンアナログ、ならびにPPARγアゴニストまたはRXRアゴニストをそれぞれ含む。最も好ましい分化因子は、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、およびインスリンとをそれぞれ含む。
【００１７】
前記方法はさらに、前記マトリックス中の前記分化因子を他の培地と交換する工程を含む。例えば、前駆脂肪細胞が分化を行った後に、標準成長培地（例えばMEMα培地）で前記マトリックスを洗浄してよい。
【００１８】
追加の細胞型が前記マトリックス中に導入されてよい；前駆脂肪細胞と同時に、脂肪細胞への分化後、または前駆脂肪細胞の導入前に、これらの細胞を導入してよい。追加の細胞型は、内皮細胞を含まないことが好ましい。
【００１９】
前記方法は、前記マトリックスから分化した脂肪細胞を放出する工程を含んでよい。これは、例えば、マトリックスを消化（例えば、マトリックスがコラーゲンならコラーゲナーゼを使用する）し、その後脂肪細胞を回収することにより実行されてよい。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、マトリックスが内皮細胞を含まず、その中に前駆脂肪細胞が位置する三次元支持マトリックスが提供される。前記マトリックスはさらに、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を促進する、1つまたは複数の分化因子を含んでよい。
【００２１】
本発明はまた、その中に脂肪細胞が位置する三次元支持マトリックスを提供し、マトリックス中で前駆脂肪細胞が分化することにより前記脂肪細胞が取得される。前記マトリックスはまた内皮細胞を含まないことが好ましい。
【００２２】
本発明によればまた、刺激に対する脂肪細胞の反応を調査する方法も提供し、前記方法は、ここで記載される方法：
マトリックス中で脂肪細胞に刺激を導入する；および
刺激に対する脂肪細胞の反応を測定する
に従って、脂肪細胞をin vitroで培養することを含む。
【００２３】
適切な刺激は、薬物、薬物候補、小分子、生物活性分子、ペプチド、ペプチドフラグメント、脂肪酸、核酸、成長因子、分化因子などを含む。脂肪細胞の反応を測定する工程は、刺激にさらされた脂肪細胞と、同じ方法で培養されて刺激にさらされていない脂肪細胞とを比較することを含んでよい。
【００２４】
本発明はまた、脂肪細胞と他の細胞型との相互作用を調査する方法を提供し、前記方法は、ここで記載される方法：
マトリックス中に他の細胞型を導入する；および
他の細胞型と脂肪細胞の相互作用を測定する
に従って、脂肪細胞をin vitroで培養することを含む。あるいは、前記方法は、マトリックスが他の細胞型を含み、他の細胞型と脂肪細胞の相互作用を測定する、ここで記載される方法に従って、脂肪細胞をin vitroで培養することを含む。これらの方法のいずれか、または両方で、他の細胞型は内皮細胞ではないことが好ましい。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、幹細胞の成長を調査する方法を提供し、前記方法は、その中に脂肪細胞が位置する三次元支持マトリックス中に1つまたは複数の幹細胞を導入する；および前記幹細胞を成長または分化させることを含む。前記方法は、その代わりに、マトリックスが1つまたは複数の幹細胞を含む、ここで記載される方法に従って、脂肪細胞をin vitroで培養することを含んでよい。さらなる変形として、前記方法は、その中に前駆脂肪細胞が位置する三次元支持マトリックス中に1つまたは複数の幹細胞を導入する；前記前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる；および前記幹細胞を成長または分化させることを含んでよい。幹細胞であれ、他の細胞であれ、他の細胞型もまたマトリックス中に存在してよい。これが、in vivo環境をよりよく模倣する助けとなってよい；例えば、骨細胞を使用して、骨髄を模倣してよい。
【００２６】
ここに記載される方法のいずれかまたは全てに対して、脂肪細胞の活性または相互作用を、当業者に既知の技術；例えば、免疫染色、マトリックス中の生体分子の検出、またはマトリックスから周辺培地に分泌される分子の検出を使用して観察してよい。
【００２７】
本発明のこれら、および他の態様が、図１を参照のみの目的で例として記載されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
発明の詳細な記載
ラットから単離された前駆脂肪細胞を生育させ、分化させることができる三次元組織培養系が開発されてきた。この方法で生成される成熟脂肪細胞は、in vivoおよびex vivoにおける脂肪細胞により示される特性と類似し、二次元培養で生育させた脂肪細胞により提示される特性とは異なる、形態学的および生化学的特性を示す。発明者の3D系で培養させた脂肪細胞は、数週間の間生存能力を保持し、短期および長期間、機能を研究することができる。
【００２９】
この系により、伝統的な二次元培養系よりも、生きた動物により関連する微小環境が提供される。
【００３０】
この系の適用分野が複数あり、以下を含むが、それに限定されない：
１．脂肪細胞を単独で培養し、生物活性分子および治療薬剤を含む環境刺激に対する脂肪細胞の反応を研究するために使用することができる。
２．脂肪細胞と他の細胞型との相互作用を研究するために使用することができる。
３．幹細胞が成長する微小環境を模倣するために使用することができる。
４．脂肪細胞に関する分野において、研究および開発のために必要な動物の数を減少させることに役立つ。
【００３１】
Cabreraら(Diabetes. 2001 Aug;50(8): 1883-90)から改変した方法に従って、貯蔵脂肪より前駆脂肪細胞を単離する。手順はコラーゲナーゼ処理および濾過を含み、最初の組織1gあたり3 - 4 x105個のオーダーの細胞が得られた。24ウェル組織培養プレートの培養培地中にある、I型コラーゲンから作られる三次元ゲル中に、前記前駆脂肪細胞を播種する。これらの条件下で、コラーゲンゲルは容器の壁に結合された状態となり、収縮は最小化される。ゲルがセットされる際に、前記前駆脂肪細胞は3Dゲルマトリックス中に懸濁される。Cabreraら(2001)に記載された分化培地を使用して、前駆脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化が誘導される。細胞が分化を開始すると、培養培地を最適保持条件に変えることができ、必要であれば、他の型の細胞をゲル中に導入することができる。小さな細胞はゲルの周辺を移動することができ（大きさが巨大であるため、成熟脂肪細胞は移動できない）、お互いにおよび脂肪細胞との構造的および機能的関係を確立することができる。
【００３２】
他の細胞と一緒に、または他の細胞無しに、免疫化学および顕微鏡により、または脂肪細胞が培養培地中に分泌する分子を生化学的に分析することにより、in situで脂肪細胞を研究することができる。あるいは、細胞を、コラーゲナーゼ処理により放出し、収集し、分子的分析にかけることができる。
【発明の効果】
【００３３】
＜実施例＞
方法
前駆脂肪細胞の単離
the Animals (Scientific Procedures) Act, 1986に従って、動物を室内で飼育し、維持した。メス生体（7-9ヶ月齢）スプラーグ・ドーリー(Sprague Dawley)ラット(200g-300g)を、スケジュール１法により屠殺した。左右の膝窩貯蔵脂肪を、解剖して取り出した。Cabreraおよび共同研究者により記載された方法 (Cabreraら、2001)を改変して、脂肪組織より前駆脂肪細胞を単離し、分化させた。方法改変は、消化のためにII型コラーゲナーゼ5ml(ウシ血清アルブミンを10%有するHanksバランス塩溶液中4mg/ml) (Sigma-Aldrich Company Ltd, UK)を37°Cで30分間使用することを含み、200μm細胞濾過器を使用して、破片を除去し、前駆脂肪細胞を含む脂肪組織より、混合細胞を単離した。リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドを含まず、熱不活化ウシ胎仔血清(HI-FBS) (Gibco, Invitrogen Ltd, UK)、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン(P/S) 140U/mlを補填され、glutaMAX-I (Gibco, Invitrogen Ltd, UK)を含む最小必須培地アルファ(MEM-α)で、単離した細胞を培養した。2D培養中の（Oil Red O染色により評価される）分化により判断して、単離細胞の60%から70%は前駆脂肪細胞であった。
【００３４】
単離後の細胞生存能力
フローサイトメトリーまたはトリパンブルー排除により評価して、単離細胞のおよそ80%は生存可能であった。
【００３５】
三次元コラーゲンゲル培養系
コラーゲンは氷上で、ラット尾I型コラーゲン(First Link Ltd, UK)1.8mg/ml、MEM x 10(Gibco, Invitrogen Ltd, UK)5% 、および(FBS 5% および P/S 140U/mlを含む)MEM-α 5%から構成された。pHの変化を示す色の変化（黄色から深いピンクに）が観測されるまで、滅菌濾過したNaOH溶液を1mol/l単位で、ゲル混合物に添加した。1 x 105生存可能細胞を含むアリコートを、コラーゲン1ml中に播種し、コラーゲンゲルを容易に除去できるようにウェルの底部に13mmガラスカバースリップ(Alana Ecology, UK)を含む、24ウェルプレート中に設置した。ゲルは、5% CO2および95%空気の加湿インキュベーター中、37℃で15分から20分間設置されるようにした。ゲルを設置した際、MEM-α培地1 mlをウェルごとに重ね(overlay)、培養物をインキュベーター中で維持した。播種から3時間以内に、以下に記載するように分化が誘導された。
【００３６】
前駆脂肪細胞の分化
イソブチルメチルキサンチン(0.5 mmol/l)、デキサメタゾン(0.25 μmol/l)、およびインスリン(10 μg/ml)で補填されたMEM-αを添加することにより、分化を誘導した。48時間後、前記分化培地を除去し、インスリン10 μg/mlで補填された(FBS 5% および P/S 140U/mlを含む)MEM-αと置換した。2日おきに、毎回培地の50%を交換して、培養物を再補填した。形態的特徴および標準方法(Bancroft, John and Stevens, 1990)による分化細胞のOil red O染色により評価して、14日目に細胞は分化したとみなされた。Nikon Microphot-FX顕微鏡(Nikon UK limited, Kingston upon Thames, UK)を使用して、細胞を観察した。
【００３７】
実験結果
結果を図１に示す。分化開始後0日目、7日目、14日目の3D培養の位相差像が与えられる。細胞内に油滴が蓄積することにより分化の印となる。プロトコールにより、前駆脂肪細胞が、三次元培養中で形態学的に正常にみえる脂肪細胞に分化したことを見ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】分化開始後0日目、7日目、14日目の3D培養の位相差像を表す。細胞内に油滴が蓄積することにより分化の印となる。
【図１】
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【国際調査報告】
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2009532054.tif 000006
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