(57)【要約】腫瘍抗原は、特定のまたは共通の腫瘍タイプとして分類することができる。テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）は、最初の真正な共通の腫瘍抗原である。ヒトＴＲＴ（ｈＴＲＴ）の９マーのペプチドのいくつかは、ヒトにおいて最も一般的な（〜５０％）のＨＬＡタイプであるＨＬＡ−Ａ２に関して同定されているが、残りのＨＬＡタイプのペプチドに関する情報はほとんどない。本明細書に記載されているように、多段階アプローチは、免疫原候補として、一団のＨＬＡ−Ｂ７の９マーのペプチドを選択し、特徴付けるために採用された。具体的には、いくつかのアルゴリズムに基づく予測、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスのインビボでの免疫、ヒト血中リンパ球のインビトロでの免疫、インビボでのプロセッシングおよびスーパータイプ結合は、ｈＴＲＴにおけるＨＬＡ−Ｂ７制限エピトープを同定するために採用された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導するための組成物であって、長さにして９〜１２個のアミノ酸残基である少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ７制限ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ペプチドを含む組成物。
【請求項２】
前記ＨＬＡ−Ｂ７が、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０３、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０５、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０８、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０２、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、ＨＬＡ−Ｂ＊７８０１、およびＨＬＡ−Ｂ＊０８０１からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＨＬＡ−Ｂ７がＨＬＡ−Ｂ＊０７０２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＴＲＴペプチドが、配列番号３（ｐ２７７）、配列番号４（ｐ３４２）、配列番号６（ｐ４６４）、配列番号８（ｐ１１０７）、および配列番号９（ｐ１１２３）からなる群から選択される配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＴＲＴペプチドが、配列番号９（ｐ１１２３）として記載される配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ヘルパーペプチドをさらに含み、前記ＴＲＴペプチドが該ヘルパーペプチドに結合しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
生理学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記担体が哺乳動物細胞である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＴＲＴペプチドが、ＨＬＡ−Ｂ７への結合を強めるための修飾を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＴＲＴペプチドが合成ペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ヒトＴＲＴおよびＨＬＡ−Ｂ７を発現する標的細胞に対してＣＴＬ応答を誘導するかまたは高める方法であって、ＨＬＡ−Ｂ７を発現している白血球を回収し；ＨＬＡ−Ｂ７制限ヒトＴＲＴペプチドを含む請求項１に記載の組成物で該白血球をパルスし；ヒトＴＲＴおよびＨＬＡ−Ｂ７を発現している標的細胞と該パルスされた白血球とを接触させることを含む方法。
【請求項１３】
前記接触がインビトロで達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触がインビボで達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＬＡクラスＩ制限ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ）アルゴリズムを用いて、カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＨＬＡクラスＩモチーフに対応し、少なくとも９個のアミノ酸残基を含む全長ＴＲＴタンパク質配列中のヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ペプチド配列を同定し；
ｂ）参照ペプチドと比較して、ＨＬＡクラスＩ結合または安定化を測定することによって、該ＴＲＴペプチド配列のＨＬＡクラスＩ結合を試験し；
ｃ）ＨＬＡクラスＩ陽性の被験体のＴＲＴペプチド反応性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：ＣＴＬ）の誘導を測定することによって、該ＴＲＴペプチド配列の免疫原性を評価する
ことを含む方法。
【請求項１６】
前記ＨＬＡクラスＩ陽性の被験体が、前記工程ｃ）の評価前に、ヒトＴＲＴワクチンで免疫される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒトＴＲＴワクチンがヒトＴＲＴ  ＤＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒトＴＲＴワクチンが、ヒトＴＲＴを発現するように操作された組換え微生物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＬＡクラスＩがＨＬＡ−Ｂ７である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＬＡクラスＩ結合が、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２結合、並びにＨＬＡ−Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０３、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０５、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０８、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０２、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、ＨＬＡ−Ｂ＊７８０１、およびＨＬＡ−Ｂ＊０８０１結合の１以上を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＬＡクラスＩが、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ａ１、およびＨＬＡ−Ｂ２７からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＬＡクラスＩ陽性の被験体がトランスジェニックマウスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導するための組成物であって、長さにして９〜１２個のアミノ酸残基である少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ制限ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）ペプチドを含み、該ｈＴＲＴペプチドは、１以上のＨＬＡ−Ａ３制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ２４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ｂ４４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ１制限ｈＴＲＴペプチド、およびＨＬＡ−Ｂ２７制限ｈＴＲＴを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのグラント番号ＲＯ１ＣＡ０８４０６２および５Ｔ３２ＧＭ００８６６６−０７、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｎｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎグラント番号９９７８８９２による政府の支援により部分的になされた。よって、米国合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌の免疫療法およびその試験に関する。特に、本発明は、ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素ペプチド（複数）を提示する細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導するための組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、免疫原性のヒト・テロメラーゼ逆転写酵素ペプチド（複数）を同定するための手段を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
テロメラーゼは、テロメアＤＮＡのＲＮＡ依存的な合成を媒介するリボヌクレオタンパク質である（非特許文献１）。一定なテロメアの長さの維持は、染色体の安定性を保証し、細胞を加齢から防ぎ、不死性を与える（非特許文献２−４）。インビトロ試験により、正常な線維芽細胞において、ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ｈＴＲＴ）の長期間の異所性発現は、不死化に十分であり（非特許文献５）、２つの癌遺伝子（ＳＶ４０Ｔ抗原およびＲａｓ）とともにｈＴＲＴの発現は、正常なヒト上皮細胞株および線維芽細胞株において腫瘍変換を促進することが示されている（非特許文献６）。このようにして、テロメラーゼそれ自体は発癌性ではないが、前癌性細胞を連続して増殖させ、不死化とさせることによって、腫瘍形成において直接的な役割を果たす。
【０００４】
ヒト癌細胞の試験により、様々な組織学的な起源およびタイプの腫瘍において、著しく高い発現（＞８５％）のテロメラーゼ活性が示されている（非特許文献７、８）。対照的に、正常な組織では、テロメラーゼ活性をほとんど示さないかまたは全く示さない（非特許文献８、９）。このため、ｈＴＲＴは、原型の共通の腫瘍抗原であると考えられている（非特許文献１０）。今日まで、多数のインビトロ試験が公表され、ｈＴＲＴペプチドを用いて、ＣＤ８  Ｔ細胞前駆体を増殖させ、ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）において細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：ＣＴＬ）を生じさせ得ることが示されている（非特許文献１１−１５）。さらにまた、いくつかのフェーズ１の試行が完了し、特定のＣＤ８  Ｔ細胞応答が癌患者においてインビボ（非特許文献１６−１９）で誘導し得ることを明らかにしている。
【０００５】
Ｔリンパ球は、主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＨＬＡ）の仲介分子を通じて抗原を認識し、多形のシステムは数百個の分子から構成されている（「ＭＨＣ制限」）。ＣＤ８  Ｔ細胞は、抗原ペプチドが細胞内で処理され、内因性経路を通じて細胞表面に運び出された後、全ての細胞の表面で発現されているＭＨＣクラスＩ分子を通じて提示された抗原を認識する（非特許文献２０）。正常な環境下では、ＭＨＣクラスＩ分子は、広範囲なペプチド、主に内因性タンパク質のプロセッシング産生物を提示する。微生物病原体による感染または腫瘍形質転換により、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）のＭＨＣ分子と複合化されると、ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化し、ＣＴＬ応答を誘導することができるペプチドが生じる。しかしながら、ＭＨＣシステムは、ヒト個体群の中で非常に多形であるため、抗原ペプチドの免疫原性は、各ＨＬＡ分子に関して試験されることが必要である。代替であって、より単純なアプローチは、大きなスーパータイプのファミリーに分類されたＨＬＡ対立遺伝子に関して抗原ペプチドを試験することである（非特許文献２１）。ＨＬＡスーパータイプは、複数のＨＬＡ分子（スーパーモチーフ）に結合するペプチドの能力によって定義されている。特定のＨＬＡスーパーモチーフを有するペプチドに結合するＨＬＡ対立遺伝子変異体は、ＨＬＡスーパータイプと呼ばれる。ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプには、Ｂ＊０７０２、Ｂ＊３５０１−０３、Ｂ＊５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊０７０３−０５、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊５５０１−０２、Ｂ＊５６０１−０２、Ｂ＊６７０１およびＢ＊７８０１対立遺伝子が含まれる。これらのＨＬＡ分子は、２位のＰに対するペプチド結合特異性、Ｃ末端位置の疎水性脂肪族残基（Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、もしくはＶ）または芳香族残基（Ｆ、Ｗ、もしくはＹ）を共有している（非特許文献２２）。
【０００６】
今日まで、免疫原性ｈＴＲＴペプチドに関する具体的な情報は、１つのＭＨＣ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）に限定され、それぞれＨＬＡ−Ａ３タイプ（非特許文献１３）およびＨＬＡ−Ａ２４タイプ（非特許文献２３）に関する最初のレポートだけである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、ヒト個体群において最も頻度が高いが（９５％のＨＬＡ−Ａ２タイプ自体が白人個体群の約５０％において発現されている（非特許文献２４−２６））、同様に大部分のヒト個体群に対する抗原性ペプチドが同定される必要がある。本明細書に示された取り組みの目的は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２分子によって制限された免疫原性ｈＴＲＴペプチドを同定することであり、このＨＬＡ−Ｂ＊０７０２分子は、白人個体群の約８．６％を占めるＨＬＡ−Ｂ７タイプの中で最も一般的な対立遺伝子である（非特許文献２７）。
【非特許文献１】Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，  １９９２．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６１：１１３．
【非特許文献２】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１．
【非特許文献３】Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｃｅｌｌ  ９０：７８５．
【非特許文献４】Ｂｏｄｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３４９．
【非特許文献５】Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：１１５．
【非特許文献６】Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．  Ｎａｔｕｒｅ  ４００：４６４．
【非特許文献７】Ｓｈａｙ  ａｎｄ  Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ，  １９９７．  Ｅｕｒ  Ｊ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３３：７８７．
【非特許文献８】Ｋｉｍ，  １９９７．  Ｅｕｒ  Ｊ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３３：７８１．
【非特許文献９】Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９５５．
【非特許文献１０】Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  ２７：８７．
【非特許文献１１】Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：６７３．
【非特許文献１２】Ｍｉｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：４７９６．
【非特許文献１３】Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：３３４３．
【非特許文献１４】Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：１２２７５．
【非特許文献１５】Ａｍａｒｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２５：２１１．
【非特許文献１６】Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：８２８．
【非特許文献１７】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：２１２７．
【非特許文献１８】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：３７９８．
【非特許文献１９】Ｚａｎｅｔｔｉ，  ２００３．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４：３０１．
【非特許文献２０】Ｙｅｗｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｉｎｋ，  １９９２．  Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５２：１．
【非特許文献２１】Ｓｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｉｄｎｅｙ，  １９９９．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０：２０１．
【非特許文献２２】Ｓｉｄｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：３４８０．
【非特許文献２３】Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｂｌｏｏｄ，  ９７：２９０３．
【非特許文献２４】Ｌｅｅ，  １９９０．  Ｉｎ  Ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊ．  Ｌｅｅ，  ｅｄ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．  １４１．
【非特許文献２５】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２．  Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３：１６３．
【非特許文献２６】Ｋｒａｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４５：２２３．
【非特許文献２７】Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、癌の免疫療法およびその試験に関する。特に、本発明は、ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）ペプチド（複数）を提示する細胞に細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導するための組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、最も頻繁に発現されている主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩタイプおよびサブタイプによって提示された免疫原性ｈＴＲＴペプチドを同定するための組成物および方法を提供する。具体的には、ある態様では、本発明は、少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ｂ７制限ｈＴＲＴペプチドを含む組成物および方法を提供する。更なる態様では、ＨＬＡ−Ａ３制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ２制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ２４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ｂ４４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ１制限ｈＴＲＴペプチド、およびＨＬＡ−Ｂ２７制限ｈＴＲＴペプチドの１以上を含む組成物および方法が提供される。
【０００８】
なお更なる態様では、本発明は、免疫グロブリン分子に挿入されたＨＬＡクラスＩ制限ｈＴＲＴエピトープを有する免疫グロブリン分子（例えば、重鎖または軽鎖可変領域の一部として発現されたｈＴＲＴエピトープを含む組換え抗体）を含む方法および組成物を提供する。抗原化した抗体の生産に関する教示は、例えばＺａｎｅｔｔｉらによる米国特許第５，６５８，７６２号、同第５，５８３，２０２号、および同第５，５０８，３８６号（全体として参照により本明細書中に援用される）に見出すことができる。
【０００９】
さらに、ある態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２制限ｈＴＲＴペプチドである第１ＨＬＡクラスＩ制限ｈＴＲＴペプチド、並びにＨＬＡ−Ｂ７制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ３制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ２４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ｂ４４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ１制限ｈＴＲＴペプチド、およびＨＬＡ−Ｂ２７制限ｈＴＲＴペプチドの１以上を含む第２ＨＬＡクラスＩ制限ｈＴＲＴペプチドを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導する方法および組成物を提供する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ｈＴＲＴペプチドに関する教示は、例えばＺａｎｅｔｔｉによる米国特許出願公開第２００４００８６５１８号、ＮａｄｌｅｒらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／２５８１３号（ともに全体として参照により本明細書中に援用される）に見出すことができる。ある態様では、ＨＬＡ−Ａ２制限ｈＴＲＴペプチドは、ｐ５４０（ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ、配列番号１０として記載される）およびｐ８６５（ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ、配列番号１１として記載される）からなる群から選択される。なお更なる態様では、ＨＬＡ−Ａ２制限ｈＴＲＴペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合親和性を増加する修飾（例えば、ｐ５７２Ｙ、ＹＬＦＦＹＲＫＳＶ、配列番号１２として記載される）を含む。ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（複数）に関する更なる教示は、ＨＬＡ−Ａ２に対するそれらの結合親和性を増加させるための修飾の有無に関わらずに、Ｍｉｎｅｖら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：４７９６−４８０１，２０００；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９：１２２７５−１２２８０，２００２（ともに全体として参照により本明細書中に援用される）に見出すことができる。
【００１０】
具体的には、本発明は、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導するための組成物を提供し、該組成物は、長さにして９〜１２個のアミノ酸残基（例えば、９、１０、１１または１２残基）の少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ７制限ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ペプチドを含む。ある態様では、ＨＬＡ−Ｂ７は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０３、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０５、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０８、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０２、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、ＨＬＡ−Ｂ＊７８０１、およびＨＬＡ−Ｂ＊０８０１からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様では、前記少なくとも１つのＴＲＴペプチドは、配列番号３（ｐ２７７）、配列番号４（ｐ３４２）、配列番号６（ｐ４６４）、配列番号８（ｐ１１０７）、および配列番号９（ｐ１１２３）からなる群から選択される配列からなる。更なる態様では、前記組成物もまたヘルパーペプチドを含み、このＴＲＴペプチドは該ヘルパーペプチドに結合しない。典型的な態様では、前記ヘルパーペプチドは、Ｂ型肝炎コア抗原の１２８〜１４０残基（ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ、配列番号１３として記載される）に対応する。なお更なる態様では、前記組成物もまたアジュバントを含む。ある態様では、前記組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含み、好ましい態様では、該担体は哺乳動物細胞（例えば、細胞表面上でＨＬＡクラスＩ分子に結合したＴＲＴペプチドを有する樹状細胞、Ｂリンパ球またはマクロファージなどの抗原提示細胞）である。また、ＴＲＴペプチドがＨＬＡ−Ｂ７への結合を高めるような修飾を含む組成物も提供される。ある態様では、この修飾は、チロシンによるＴＲＴの９マー（ｎｏｎａｍｅｒ）の第１残基の置換である）。いくつかの好ましい態様では、前記ＴＲＴペプチドは合成ペプチドである。
【００１１】
さらに、本発明は、ヒトＴＲＴおよびＨＬＡ−Ｂ７を発現している標的細胞に対するＣＴＬ応答を誘導するかまたは高める方法を提供し、該方法は、ＨＬＡ−Ｂ７を発現している白血球を回収し；長さにして９〜１２個のアミノ酸残基（例えば、９、１０、１１または１２残基）のＨＬＡ−Ｂ７制限ヒトＴＲＴペプチドを含む組成物で該白血球をパルスし；ヒトＴＲＴおよびＨＬＡ−Ｂ７を発現している標的細胞と該パルスされた白血球とを接触させることを含む。ある態様では、前記接触はインビトロまたはエクスビボで達成され、代替の態様では、該接触はインビボで達成される。ある態様では、ＨＬＡ−Ｂ７は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０３、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０５、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０８、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０２、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、ＨＬＡ−Ｂ＊７８０１、およびＨＬＡ−Ｂ＊０８０１からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様では、前記少なくとも１つのＴＲＴペプチドは、配列番号３（ｐ２７７）、配列番号４（ｐ３４２）、配列番号６（ｐ４６４）、配列番号８（ｐ１１０７）、および配列番号９（ｐ１１２３）からなる群から選択される配列からなる。
【００１２】
さらに、本発明は、ＨＬＡクラスＩ制限ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ペプチドをスクリーニングする方法を提供し、該方法は、ａ）標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＨＬＡクラスＩモチーフに対応し、少なくとも９個のアミノ酸残基を含む全長のＴＲＴタンパク質配列にヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ペプチド配列を同定するためのアルゴリズムを用いること；ｂ）参照ペプチドと比較して、ＨＬＡクラスＩ結合または安定化を測定することによって、該ＴＲＴペプチド配列のＨＬＡクラスＩ結合を試験すること；ｃ）ＨＬＡクラスＩ陽性の被験体のＴＲＴペプチド反応性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導を測定することによって、該ＴＲＴペプチド配列の免疫原性を評価することを含む。ある態様では、ＨＬＡクラスＩ陽性の被験体は、前記工程ｃ）の評価前に、候補ヒトＴＲＴワクチン（例えば、免疫原性組成物）で免疫された。いくつかの好ましい態様では、ヒトＴＲＴワクチンは、ヒトＴＲＴ  ＤＮＡを含む。他の好ましい態様では、ヒトＴＲＴワクチンは、ヒトＴＲＴを発現するように操作された組換え微生物を含む。更なる態様では、ヒトＴＲＴワクチンは、長さにして９〜１２個のアミノ酸残基（例えば、９、１０、１１または１２残基）でのＴＲＴペプチドを含み、ある態様では、リポソームを用いて調合される。好ましい方法では、ＨＬＡクラスＩはＨＬＡ−Ｂ７であり、特に好ましい態様では、ＨＬＡ−Ｂ７結合は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２結合、並びに１以上のＨＬＡ−Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０３、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０５、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０８、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０２、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、ＨＬＡ−Ｂ＊７８０１、およびＨＬＡ−Ｂ＊０８０１結合を含む。代替の態様では、ＨＬＡクラスＩは、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ｂ２７からなる群から選択される。ある態様では、ＨＬＡクラスＩ陽性の被験体は、トランスジェニックマウスである。
【００１３】
また、本発明によって、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導するための組成物が提供され、該組成物は、長さにして９〜１２個のアミノ酸残基の少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ制限ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）ペプチドを含み、該ｈＴＲＴペプチドは、１以上のＨＬＡ−Ａ３制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ２４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ｂ４４制限ｈＴＲＴペプチド、ＨＬＡ−Ａ１制限ｈＴＲＴペプチド、およびＨＬＡ−Ｂ２７制限ｈＴＲＴを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義
本発明の理解を容易にするために、多数の用語および句は下記のように定義される：
本明細書中で使用するとき、用語「精製した」および「単離した」は、天然の環境から取り出されるかまたは分離される分子（ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド）または生物を意味する。「実質的に精製された」分子または生物は、自然に関連する他の成分を少なくとも５０％含まず、好ましくは少なくとも７５％含まず、より好ましくは少なくとも９０％含まず、最も好ましくは少なくとも９５％含まない。
【００１５】
用語「野生型」は、自然に存在している供給源から単離した場合、遺伝子、遺伝子産物または生物の特徴を有する遺伝子、遺伝子産物または生物を意味する。野生型遺伝子または生物は、１つの個体群において最も頻繁に観察され、したがって、その遺伝子または生物の「正常」または「野生型」形態を任意に示すものである。
【００１６】
対照的に、用語「修飾した」、「突然変異体」、および「改変体」は、野生型遺伝子、遺伝子産物または生物と比較した場合、配列および／または機能的特性における修飾（即ち、変更した特徴）を示す遺伝子、遺伝子産物または生物を意味する。自然に存在している突然変異体は単離可能であることは留意されたい；これらは、野生型遺伝子、遺伝子産物または生物と比較した場合、変更された特徴を有するといった事実によって同定される。
【００１７】
本明細書中で使用するとき、用語「免疫応答」は、抗原に応答して被験体の免疫系の反応性を意味する。哺乳動物では、これは、抗体産生、細胞を媒介した免疫性の誘導、および／または補体活性化を伴う場合がある。好ましい態様では、免疫応答なる用語には、限定されないが、「細胞傷害性Ｔリンパ球応答」、「リンパ球増殖応答」、「サイトカイン応答」、および「抗体応答」の１以上が含まれる。
【００１８】
特定の好ましい態様では、免疫応答には、ＨＬＡクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂおよび／またはＨＬＡ−Ｃ）との関連でｈＴＲＴエピトープを提示する細胞に本質的に特異的であるＣＴＬの誘導が含まれる。ある態様では、ｈＴＲＴエピトープを提示する細胞は、ｈＴＲＴを発現するＨＬＡクラスＩ陽性細胞、または配列番号２として記載される配列からなるｈＴＲＴタンパク質のペプチド（例えば、長さにして９〜２９個のアミノ酸、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸であり、限定されないが、表ＩおよびＶＩ−ＸＩＸにおける本明細書に開示されているペプチドが含まれる）でパルスしたＨＬＡクラスＩ陽性細胞である。特に好ましい態様では、ｈＴＲＴエピトープを提示する細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手されるｈＴＲＴ陽性ヒト腫瘍細胞株（例えば、メラノーマ、前立腺、乳房、結腸、肺など）である。腫瘍細胞によるｈＴＲＴの発現は、インタージェン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）（ニューヨーク州パーチェス（Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ））のＰＣＲベースのＴＲＡＰＥＺＥアッセイなどの当該技術分野において承認されている方法を用いて測定される。ｔＴＲＴ陽性標的細胞の細胞傷害性は、５０：１のＥ：Ｔ比で５１Ｃｒ標識放出アッセイで測定される。ある態様では、腫瘍細胞株は、アッセイ前に１００ユニット／ｍｌインターフェロン−ガンマとともにインキュベートされる。
【００１９】
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、本明細書中で使用するとき、１個のＴ細胞受容体に結合するためのＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子によって提示される抗原決定基を意味する。Ｔ細胞エピトープは、少なくとも７個のアミノ酸残基を含む線状エピトープである。本発明のある態様では、Ｔ細胞エピトープなる用語には、細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば、一般にはＣＤ８＋）の表面上でＴ細胞受容体に結合するためのＭＨＣクラスＩ分子によって提示される抗原断片であるＣＴＬエピトープが含まれ、他の態様では、Ｔ細胞エピトープなる用語には、ヘルパーＴ細胞（例えば、一般にはＣＤ４＋）の表面上でＴ細胞受容体に結合するためのＭＨＣクラスＩＩによって提示される抗原断片であるＴｈエピトープが含まれる。
【００２０】
用語「対象とするエピトープに特異的」とは、免疫応答に言及すると、対照ペプチド（例えば、無関係な抗原）を提示している細胞に対する免疫応答のレベルと比較して、対象とするエピトープを提示している細胞（例えば、ｐ２７７、ｐ１１２３、ｐ５４０、ｐ８６５などのｈＴＲＴ  ＣＴＬエピトープ）に対する免疫応答のレベルの増加を意味する。
【００２１】
用語「ワクチン」は、本明細書中で使用するとき、免疫応答を誘導することを目的として、被験体に投与される免疫原性組成物を意味する。この用語には、癌の発生から被験体を保護し、および／または癌患者における腫瘍もしくは悪性細胞を根絶する、未だに実証されていない候補の予防的および治療的な癌ワクチンが含まれる。
【００２２】
用語「アジュバント」とは、本明細書中で使用するとき、抗原とともに注射されると、その抗原に対する免疫応答を非特異的に高める任意の化合物を意味する。典型的なアジュバントには、限定されないが、フロイント不完全アジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ＩＦＡ）、アルミニウム系アジュバント類（例えば、ＡＩＯＨ、ＡＩＰＯ４など）、およびモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ７２０が含まれる。
【００２３】
用語「賦形剤」、「担体」および「ビヒクル」は、本明細書中で使用するとき、医薬物質（例えば、ｈＴＲＴペプチド）が懸濁されている、通常は不活性な補助物質を意味する。典型的な担体には、液体担体（例えば、水、生理食塩水、培養液、水性デキストロース、およびグリコール類）、および固体担体（例えば、スターチ、グルコース、ラクトース、スクロース、およびデキストラン類に例示される糖質、アスコルビン酸およびグルタチオンに例示される抗酸化剤、並びに加水分解されたタンパク質）が含まれる。
【００２４】
用語「対照」とは、実験の被験体または試料の比較の根拠を与える被験体または試料をいう。例えば、対照となる被験体または試料の使用により、実験手法の有効性に関する決定が可能となる。ある態様では、用語「対照の被験体」とは、模擬処理（例えば、アジュバントのみ）を受け入れる動物または細胞を意味する。
【００２５】
本明細書中で使用するとき、用語「ＴＲＴ」、「ＴＥＲＴ」および「テロメラーゼ逆転写酵素」は、真核細胞が分裂した後、染色体の終端にテロメアを付加する該細胞のテロメラーゼ酵素の触媒サブユニットを意味する。特に、用語「ヒトＴＲＴ」および「ｈＴＲＴ」は、配列番号１に記載される核酸配列（図６）によってコードされる、配列番号２に記載されるヒトのタンパク質（図７）をいう。
【００２６】
発明の説明
各ＨＬＡタイプに対してｈＴＲＴの免疫原性成分を定義することは、骨の折れる仕事であるが、ヒト個体群の最も広範な分類における腫瘍細胞上のｔＴＲＴを標的とするための免疫療法を開発するためには必要な工程である。従来、本実験室（１２、１４）および他の実験室（１１）では、最も頻出のＨＬＡタイプであるＨＬＡ−Ａ２に対する免疫原性ペプチドが同定された。これらの試験の結果は、ヒトが、インビトロでの免疫によって増殖され得る、高親和性および低親和性ｈＴＲＴペプチドの両方に対する残りのＣＤ８  Ｔ細胞レパートリーを有していることであった（１２、１４、１６）。ｈＴＲＴ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞前駆体は、進行癌を患っている患者に存続することが報告されている（１２、１４、１５）。ここで、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ７に制限された免疫原性ｈＴＲＴペプチドの同定および特徴付けに系統的な努力を展開した。本試験の結果は、一連の全般的な考察をもたらす。
【００２７】
ここで用いられた従来のアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ｂ７タイプに対して免疫原性ｈＴＲＴペプチドの全体的に不十分な予測因子であることが証明された。以前に、本発明者らは、本明細書で試験されたものと類似した免疫原性に対する所望の基準を満たすＨＬＡ−Ａ２制限ｈＴＲＴペプチドを予測し、選択する手段としてＢＩＭＡＳを用いて成功した。対照的に、ＢＩＭＡＳは、ＨＬＡ−Ｂ７免疫原性ペプチドを概して予測できなかった。例えば、ｐ４４４は、ＢＩＭＡＳによれば最良の（ｔｏｐ）ペプチドであるが、インビボでは、ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスでは免疫原性でなく、ヒトＰＢＭＣに対してはインビトロでは弱い免疫原性であり、完全長のｈＴＲＴ  ｐＤＮＡで免疫したＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスでは外見上プロセッシングを受けなかった。予想通り、ＨＬＡ−Ｂ７分子に対するｐ４４４の実際の結合親和力も弱く、そのため、予測された親和性、実際の親和力および免疫原性機能の間での不一致が指摘された。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、免疫原性が弱い２つのペプチド（ｐ９６６およびｐ４６４）を予測しなかったが、同時に、試験した残りの５個のペプチドの中で免疫原性ペプチドと非免疫原性ペプチドとの間を区別しなかった。最後に、プロテアソーム開裂の基づく予測因子は、有用でないことが判明した。例えば、プロセッシングおよび免疫原性についての最大に予測された可能性を有する２つのペプチドは、ある場合（ｐ９６６）では非免疫原性であり、他の場合（ｐ３４２）では弱い免疫原性であることが分かった。しかしながら、このアルゴリズムは、ｐ２７７を予測した。まとめると、ペプチドの初期選択を導くために用いられた３つのアルゴリズムのうちどれもそれ自体、免疫原性に関する必要条件を満たすペプチドを識別することはできなかった。
【００２８】
インビトロの免疫試験は、調べた大部分（７個のうち５個）のペプチドの特異性に関して、残りのＣＤ８  Ｔ細胞レパートリーが存在するという結論を支持する。これらのペプチドもＨＬＡ−Ｂ７分子に対して良好な結合親和力を有するので、本所見は、ＨＬＡ−Ｂ７に制限されたｈＴＲＴ  ＣＤ８  Ｔ細胞クローン型の胸腺陰性選択（中心的な寛容）は発生しないかまたはごく限られた程度で発生したことを示す。免疫学的アジュバント中のペプチドを用いたインビボでの免疫に対するＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスの応答は、同様に免疫されたＨＬＡ−Ａ２  Ｔｇマウスよりも即効的であり強力であった（１２、１４、３９）。それは、あたかも、少なくともｈＴＲＴに関して、ＨＬＡ−Ｂ７／ペプチド複合体が高い免疫原性であるかのようである。同様に、高免疫性は、ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスがインフルエンザウイルスペプチドで免疫された試験において示された（２８）。
【００２９】
スーパータイプ結合試験は、免疫原性ペプチドの選択において優れた最終のチェックポイントであることが証明された。例えば、ｐ１１２３、並びにそれ程ではないｐ２７７およびｐ１１０７は、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプの様々な対立遺伝子に結合した。まとめて考えてみると、本発明者らの試験の結果は、候補となる免疫原性ペプチドが少なくとも２つの一般的な基準；ＨＬＡ−Ｂ７分子との良好な親和力相互作用および良好なスーパータイプ結合を満足する必要があることを示す。また、免疫原性における付加的な因子としてＴＣＲを用いて、ＭＨＣ／ペプチド複合体間の相互作用の性質を考慮することが必要である。第２の特徴に関して、本発明者らのデータは、スーパータイプ結合ペプチドは優先的にプロセッシングを受け、抗原プロセッシングに関連したトランスポーター（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＴＡＰ）複合体の分子との相互作用に関して選択的な利点を有することを示す（１４、４４、４５）。それでもなお、メカニズム（単数または複数）の理解は、本発明を生産し、使用するために必要ではなく、本発明が任意の特定のメカニズムに限定されることは意図されない。
【００３０】
結論として、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ７に制限された、いくつかの免疫原性ｈＴＲＴペプチドの良好な同定を示した。本発明者らは、この同定が多段階アプローチを必要とし、マウスとヒトの両方のＰＢＭＣを用いた、一連のインビトロおよびインビボの工程を伴うことを示す。これは、潜在的な臨床使用のための免疫原性ペプチドの選択が、一連のチェックポイントおよび経験論全体の要素に当てはまることを意味する。今日まで、このような系統的なアプローチは、ＨＬＡ−Ａ２（１０）、現在はＨＬＡ−Ｂ７ペプチドの同定を可能にし、免疫原性の特徴付けは、癌患者の免疫療法におけるそれらの使用を正当化した。ともに、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ７は、白人個体群の約６０％を占める。この試験において同定されたペプチドのいくつかのスーパータイプ結合を考慮すれば、民族性に関わらずに７０％を超える範囲を達成し得る。したがって、ヒト個体群の完全な範囲については、その個体群の残りの３０〜４０％を占める対立遺伝子に関する免疫原性ペプチドはなお本明細書に従ったものと同じストラテジーを系統的に用いて同定することが必要である。
【実施例】
【００３１】
実験
下記の実施例は、本発明のある種の好ましい態様および局面を示し、さらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとして構成されるべきでない。続く実験の開示では、下記の省略形が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；Ｕ（ユニット）、ｍＵ（ミリユニット）；ｍｉｎ．（分）；ｓｅｃ．（秒）；％（パーセント）；ｋｂ（キロベース）；ｂｐ（塩基対）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＴＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）；ＷＴ（野生型）；Ｔｇ（トランスジェニック）；ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；Ｔｈ（ヘルパーＴ細胞）；ＭＨＣ（主要組織適合複合体）；ｍＡｂ（モノクローナル抗体）、ＡＰＣ（抗原提示細胞）；およびＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）。
【００３２】
材料および方法
マウス。ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスは、キメラＨＬＡ−Ｂ７／Ｈ２−ＤｂＭＨＣクラスＩ分子を発現し、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにあり、以前に記載されている（２８）。マウスは、元々は、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ）（パリ、フランス）で生成された。コロニーを培養し、カリフォルニア大学の生態動物園、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）（カリフォルニア州ラ・ホイヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））で特殊な無菌状態で維持された。全ての実験手法は、承認されたプロトコール、および実験動物の世話および使用（Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に関する国立衛生研究所のガイド（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ）に従って行われた。
【００３３】
細胞株。ヒトＴ２−Ｂ７形質転換体およびマウスＲＭＡ−Ｂ７形質転換体菌株は、前述（２８、２９）したＨＬＡ−Ｂ＊０７０２対立遺伝子を用いて形質転換した。エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）で形質転換されたＢリンパ芽球様（ＨＬＡ−Ａ２／Ｂ７）ＪＹ細胞は、Ｄｒ．Ａｎｔｏｎｅｌｌａ  Ｖｉｔｉｅｌｌｏ（ＰＲＩ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ、カリフォルニア州ラ・ホイヤ）から入手した。
【００３４】
ヒト血液細胞。ＨＬＡ−Ｂ７＋正常ドナー由来の軟膜をサンディエゴ・ブラッド・バンク（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。前立腺癌の患者は、血液学腫瘍学部門を通じて募集され、静脈穿刺から血液を得た。ＨＬＡ−Ｂ７陽性は、フローサイトメトリーによって評価された。実験は、承認された施設内治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ：ＩＲＢ）プロトコールに従って行った。
【００３５】
ペプチドおよびモノクローナル抗体。全ての合成ペプチドは、オハイオ州立大学のペプチド合成コア施設（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（オハイオ州コロンバス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ））から購入した。ＨＬＡ−Ｂ７に対するモノクローナル抗体であるＢＢ７．１は、アメリカン・ティッシュ・タイプ・コレクション（バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））から購入した。使用した他の抗体は、フルオレセイン・イソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＦＩＴＣ）結合のマウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ８ベータ（ｍＡｂ５３−６．７）およびフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）結合のマウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、およびＦＩＴＣ結合のヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ペンシルバニア州ウェストグローブ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））であった。
【００３６】
予測アルゴリズム。下記の予測アルゴリズムを用いた：（Ａ）非常に有利および不利な優性アンカー残基および補助アンカー残基に基づき、係数に準じたペプチドをスコアするＢＩＭＡＳアルゴリズム（３０）（ｔｈｒ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ ｂｉｎｄ／を介してアクセスする）。（Ｂ）既知のＴ細胞エピトープおよびＭＨＣリガンドに基づき（３１、３２）（ｗｗｗ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／ｕｎｉ／ｋｘｉ／を介してアクセスする）、該アンカーおよび補助アンカー位置でアミノ酸を考慮して、１０ポイントを示す理想的なアンカー残基を有するアミノ酸、−１と３ポイントを占める結合における負の効果を有することに関するアミノ酸を与える蓄積的（正または負の）効果によるペプチドをスコアするＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズム。（Ｃ）酵母およびヒトの２０Ｓプロテアソームによる基質タンパク質の開裂に関するコンピュータに基づく理論モデルであるＰＡＰｒｏＣ（プロテアソーム開裂のための予測データベース（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ））。ＰＡＰｒｏＣは、アミノ酸配列の開裂性（アミノ酸当たりの切断）、および個々の開裂（位置および推測された長さ）を予測する。具体的には、本発明者らは、エノラーゼおよびオボアルブミンのヒト赤血球のプロテアソーム開裂に基づいて、タイプＩＩＩモデルを使用した（３３、３４）（ｗｗｗ．ｐａｐｒｏｃ．ｄｅ／を介してアクセスする）。
【００３７】
ＭＨＣ結合アッセイ。相対的親和力測定。ＨＬＡ  Ｂ７に対するｈＴＲＴペプチドの相対的親和力は、前述（１４）される参照ペプチドと比較して、Ｔ２−Ｂ７細胞上のＭＨＣ安定化アッセイを用いて測定された。結果は、相対的親和力の値として表わされ、参照ペプチドによる最大結合の２０％に到達するのに必要な試験ペプチドの濃度の比であり、それにより、この値が低くなるにつれて結合が強化する。
【００３８】
スーパータイプ分析。精製したＨＬＡ  Ｂ７−スーパータイプ分子（Ｂ＊０７０２、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１）およびＢ＊０８０１に対するペプチドの結合親和性を測定するための定量的アッセイは、放射線標識した標準ペプチドの結合の阻害に基づき、前述（２２、３５）のように行った。簡潔に説明すると、１〜１０ｎＭの放射線標識したペプチドは、１〜３μＭのヒト・ベータ２−ミクログロブリン（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州サンディエゴ）およびプロテアーゼ阻害剤のカクテルの存在下で、１マイクロＭ〜１ｎＭの精製したＭＨＣとともに室温で同時にインキュベートした。２日間のインキュベーション後、放射線標識したペプチドによる、対応するＭＨＣクラスＩ分子への結合は、Ｗ６／３２抗体で被覆したＧｒｅｉｎｅｒ  Ｌｕｍｉｔｒａｃ  ６００マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ，フロリダ州ロングウッド（Ｌｏｎｇｗｏｏｄ，ＦＬ））上でＭＨＣ／ペプチド複合体を捕捉し、ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）を用いて、１分当たりの結合カウント（ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ：ｃｐｍ）を測定することによって決定した。結果は、放射線標識した参照ペプチドの結合の５０％阻害を生じさせるペプチドの濃度として表わされる。ペプチドは、典型的には、１００，０００倍の投薬範囲をカバーする６種類の濃度であって、３以上の独立したアッセイで試験した。利用される条件下で、［標識」＜［ＭＨＣ］およびＩＣ５０≧［ＭＨＣ］である場合、測定されたＩＣ５０値は、真のＫｄ値の妥当な近似値である。
【００３９】
インビトロ免疫手法。表ＩＩＩおよび図３に示される実験では、免疫は、９６ウェルプレートで行った。簡潔に説明すると、２×１０５個の照射（６０００ｒａｄ）されたヒトＰＢＭＣは、１００マイクログラム／ｍｌのペプチドとともに、１００マイクロリットルの完全なヒト培地（１０％の熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭのグルタミン、５０マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシン、および５０マイクログラム／ｍｌのペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を含む９６（フラット）ウェルプレートに撒いた。患者１人当たり、１２ウェル／ペプチドをプレーティングした。次に、１００マイクロリットルの完全なヒト培地中の２×１０５個のＰＢＭＣを各ウェルに添加した。４日後、１００マイクロリットルの培地は、８０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む１００マイクロリットルの新鮮な完全なヒト培地と交換された。６〜７日で、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、ウェルを２つに分けた。１０〜１１日で、マイクロ細胞毒性アッセイを行った。図４および５に示される実験では、ヒトＰＢＭＣは、前述（１２）されるようにＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下で、インビトロで２４ウェルプレートにおいて、自家性の照射されたペプチドでパルスされた付着細胞とともに刺激された。再刺激後の４〜５日で、エフェクターＣＴＬは、標準５１Ｃｒ放出アッセイで試験された。
【００４０】
インビボ免疫手法。ペプチド免疫。ＨＬＡ  Ｂ７トランスジェニックマウス（２８）は、前述（１２）されるように、フロイント不完全アジュバント中のＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質のＩ−ＡｂＭＨＣクラスＩＩヘルパーペプチド１２８−１４０の１２０マイクログラムとともに、１００マイクログラムのｈＴＲＴペプチドを用いて、尾の付け根にｓ．ｃ．注射された。長期のＣＴＬ菌株は、１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール、５０マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシン、および５０マイクログラム／ペニシリンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（完全培地）であって、４０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を添加された該培地中で照射されペプチドでパルスされた同系脾臓細胞を用いて毎週の再刺激により培養され維持された。
【００４１】
ＤＮＡ免疫。ＣＭＶプロモータの制御下で発現されるｈＴＲＴをコードするＤＮＡベクターは、内毒素を含まない条件下にあるプラスミドＧｉｇａ  Ｋｉｔカラム（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）上で精製した。麻酔したＨＬＡ−Ｂ＊０７０２トランスジェニックマウスは、ＤＮＡ注射の５〜６日前に、各脛骨筋内に５０マイクロリットルの心臓毒素を注射された。ワクチン接種に関しては、５０マイクロリットルのＤＮＡ（ＰＢＳ中、１マイクログラム／ミクロリットル）は、０日と１４日に前処理された筋肉のそれぞれに注射された。１０日後、個々のマウスの脾臓細胞は、別々に、各関連ペプチド（１０マイクログラム／ｍｌ）で６日間、別々に再刺激された。エフェクターＣＴＬ細胞は、試験ペプチドまたは対照ペプチド（ＨＬＡ−Ｂ７に制限されたＣＭＶ  ｐ６５由来のＲ１０ＴＶ）でパルスされたＲＭＡ−Ｂ７細胞（ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２をトランスフェクトされたＲＭＡ細胞）を用いて、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験された。特異的溶菌％は下記に示される通りである。インビボでの免疫手法は、それぞれ、カリフォルニア大学、サンディエゴ、またはパスツール研究所で承認させた動物プロトコールに従って行った。
【００４２】
ＣＴＬアッセイ。マウスとヒトの両方のＣＴＬは、前述（１４）されるように行った５１Ｃｒ放出アッセイにより検出された。簡単に説明すると、ＨＬＡ−Ｂ７＋抗原提示細胞（ＲＭＡ−Ｂ７またはＴ２−Ｂ７細胞）は、１００マイクロ−ＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））を用いて１時間標識した。洗浄した細胞（５×１０３個／ウェル）は、９６ウェルプレート中で、１００マイクロリットル／ウェルで、各ペプチド（１０マイクログラム／ｍｌ以下の濃度）および１００マイクロリットルのＣＴＬエフェクター細胞（種々のＥ：Ｔ比）を含むＲＰＭＩ培地と混合された。このプレートは、３７℃（５％ＣＯ２）で４〜５時間インキュベートされた。上清を回収し、Ｗａｌｌａｃ  １４７０  Ｗｉｚａｒｄ  Ｇａｍｍａ  ｃｏｕｎｔｅｒでカウントした。溶菌率は、１００（ｃｐｍｅｘｐ−ｃｐｍｓｐｏｎｔ）／（ｃｐｍｍａｘ−ｃｐｍｓｐｏｎｔ）として計算された。
【００４３】
ＦＡＣＳ分析。インビトロで増殖したＣＴＬの表現型の特徴は、ＦＡＣＳ分析によって決定された。簡単に説明すると、刺激後の６〜７日で、細胞（０．５×１０６）は、０．１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中のＦＩＴＣ結合のマウス抗ヒトＣＤ８ｍＡｂおよびＰＥ結合のマウス抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ（２マイクログラム／ｍｌ）とともに、４℃で３０分間インキュベートされた。ヒトＰＢＭＣの分類に関しては、細胞は、１０マイクロｌのＢＢ７．１マウスＢ細胞ハイブリドーマ上清を２０分間、４℃でインキュベートされ、次にＦＩＴＣ結合したウサギ抗マウスＩＧＧ抗体とともに３０分のインキュベートを行った。試料は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））で分析された。１０万の事象を回収し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて分析した。
【００４４】
結果
予測アルゴリズムによるペプチドの選択
候補ペプチドの数を扱いやすい集団（ｐａｎｅｌ）に限定するために、本発明者らは、２つの予測アルゴリズムであるＢＩＭＡＳおよびＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いた。これらを別々に用いて、ＨＬＡ−Ｂ７タイプの大部分のメンバーを占めるＨＬＡ−Ｂ＊０７０２対立遺伝子に関する９個のアミノ酸ペプチドを予測した（２７）。ＢＩＭＡＳは、全体の結合特徴に基づくＨＬＡ結合および標準アンカー残基を予測し、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、結合特徴がマトリックスベータベースとして自然に存在しているＭＨＣリガンドから推定されるペプチドを予測する。全長タンパク質のプロテアソーム開裂を予測するＰＡＰｒｏＣ（プロテアソーム開裂のための予測データベース）を用いて、開裂可能性を定義した。
【００４５】
本発明者らは、最初に、前記２つのアルゴリズムのいずれかまたはそれらの両方において予測された高いスコアを有する１０個の９マーのペプチドを選択し、７個のペプチドを合成した（表Ｉ）。これらのペプチドは、ＢＩＭＡＳおよびＳＹＦＰＥＩＴＨＩの両方によって一致した予測に基づいて選択された。これらの７個のペプチドのうち３個だけは、ＢＩＭＡＳを用いて１８０を超えるスコアを有し、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いると、２つを除いて２３のスコアであった。興味深いことに、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いて予測できなかったこれらの２個のペプチドは、ＢＩＭＡＳを用いると、中でも最良のスコアであった。
【００４６】
表Ｉ．ｈＴＲＴペプチドに結合するＨＬＡ−Ｂ７の予測
【００４７】
【表１】
2009523817.tif 000002
ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２の結合親和性は、ＢＩＭＡＳおよびＳＹＦＰＥＩＴＨＩによって予測され、前者については、標準アンカー残基を有する９マーのペプチドに対する最小の数値は１８０であり、後者では２０である。プロテアソーム開裂による全長（１１３２個のアミノ酸）のｈＴＲＴの中で予測された９マーのＣ末端プロテアソーム開裂（ＰＡＰｒｏＣ）。予測されたプロテアソーム開裂の強度は、適宜、０（開裂なしについて）、Ｘ、ＸＸおよびＸＸＸ（開裂強度について）としてスコアされる。
ＮＰ＝予測されない
次に、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ７（ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２）についての実際の結合親和力を評価した。２つの独立したアッセイを用いた：フローサイトメトリーによるＴ２−Ｂ７細胞上の結合安定化アッセイ（１２）、および固定された精製ＨＬＡ−Ｂ７分子上の競合的固相放射免疫アッセイ（３５）。表ＩＩに示されるように、７個のペプチドのうち５個（ｐ２７７、ｐ３４２、ｐ４６４、ｐ１１０７およびｐ１１２３）は、高い結合親和力を示した。結合が弱い２個のペプチド（ｐ４４４およびｐ９６６）は、ＢＩＭＡＳによって予測された良好な３個のペプチドに含まれた。利用された２つのタイプの結合アッセイ間で優れた一致が見られた。
【００４８】
表ＩＩ．ＨＬＡ−Ｂ７に対する予測されたｈＴＲＴペプチドの相対的親和力
【００４９】
【表２】
2009523817.tif 000003
ａ相対的親和力は、Ｔ２−Ｂ７上のＭＨＣ安定化アッセイによって試験された。
ｂＩＣ５０は、競合的固相放射免疫アッセイによって計算された。
ダッシュは、ＩＣ５０＞５０，０００ｎＭを示す。
【００５０】
ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスのインビボ免疫
ペプチドのそれぞれに対して免疫原性を与え、この特性を結合特徴および予測アルゴリズムのスコアと関連付けるために、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスを免疫した（２８）。免疫後１０〜１１日で、マウスを屠殺し、脾臓を回収し、脾細胞をＬＰＳ／デキストランで活性化したＡＰＣとともに培養し、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。示されるように、７個のペプチドのうち５個だけが、インビトロでの再刺激の第３サイクル後でさえ意味のある特異的なＣＴＬ応答を生じさせた（図１）。全ての免疫原性ペプチドは、第１のインビトロ再刺激からの応答を誘導し、この応答は、続く抗原再刺激のラウンドにより増加した。免疫原性ペプチドの２つに対するＣＴＬの例は、図２に示される。記されるように、ペプチドでパルスされたＲＭＡ−Ｂ７標的細胞の溶菌は、インビトロ再刺激の各ラウンドで増加した。ペプチドでパルスされなかったＲＭＡ−Ｂ７細胞では溶菌は起こらなかった。したがって、このインビボの結果は、ＨＬＡ−Ｂ７結合親和力の実際の測定と合わせると、９マーのｈＴＲＴペプチドの２つのグループを識別した。１つのグループ（ｐ２７７、ｐ３４２、ｐ４６４、ｐ１１０７およびｐ１１２３）は、インビトロでの高い結合性とインビボでの良好な免疫原性の両方を示した。他のグループ（ｐ４４４およびｐ９６６）は、弱い結合性および弱い免疫原性を示した。
【００５１】
正常ドナー由来のヒトＰＢＭＣのインビトロ免疫
選択されたペプチド候補の免疫原性、およびヒトＰＢＭＣにおける前駆体ＣＤ８  Ｔ細胞を増殖させるペプチドの能力をさらに評価するために下記の実験を行った。８人のＨＬＡ−Ｂ７＋正常ドナー由来のＰＢＭＣを小スケールのインビトロ免疫アッセイ（９６ウェルプレートアッセイ）でスクリーニングし、それぞれ個々のペプチドに対する応答レベルを測定した。このスクリーニング工程の累積データは、表ＩＩＩに示される。示されるように、これらのペプチドに対する応答は、８人のドナーで変化していた。全体として、２個のペプチド（ｐ２７７およびｐ１１２３）は、被験体の大部分において強い応答を生じさせた。３個のペプチド（ｐ３４２、ｐ４６４およびｐ１１０７）は、強い応答を誘導したが、僅かな例においてだけである。顕著には、ｐ４４４もまた、ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスでは、インビボにおいて弱い免疫原性であり、このマイクロＣＴＬアッセイにおいて弱い免疫原性を示した。ｐ９６６に対する応答は、ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスにおいて度重なる負の結果のために試験されなかった。したがって、このインビトロアッセイの結果は、ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスではインビボにおいて同定されたペプチドを越える免疫原性ペプチドの範囲を狭めた。このタイプの分析の代表的な結果は図３に示され、１２ウェルの各々においてＣＴＬの誘導およびそれらの特異性を示す。示されるように、ペプチド当たりの正のウェル数、並びにそれ自身がペプチドごとに変化した溶菌率においてかなりの変動がある。各ペプチドに対する応答におけるこのバリエーションは、ペプチドの固有の特徴（例えば、その親和力）であるか、または特に、使用したアッセイのフォーマットを考慮して、ドナーでのそのペプチドに対するＣＤ８  Ｔ細胞前駆体の頻度のバリエーションのいずれかに関連し得る。
【００５２】
表ＩＩＩ．ＨＬＡ−Ｂ７制限ｈＴＲＴペプチドを用いた正常ドナーのＰＢＭＣの免疫後のインビトロでのＣＴＬ応答
【００５３】
【表３】
2009523817.tif 000004
ＨＬＡ−Ｂ７＋の正常な血液ドナー由来のＰＢＭＣは、９６ウェルプレートアッセイにおいて候補ペプチドでパルスされ（材料および方法に記載される）、１０〜１１日にペプチドでパルスされたＴ２−Ｂ７の溶菌について試験した。ミクロ５１Ｃｒ放出アッセイは、材料および方法に記載されるように行った。応答者は、＞５０％特異的ＣＴＬ溶菌であると考えられた。ＣＴＬアッセイは、約１０：１のＥ：Ｔ比で行った。ＮＤ＝試験していない。
【００５４】
インビボでのプロセッシング
次に、本発明者らは、種々の候補ペプチドの中でどれがプロセッシングを受け、全長ｈＴＲＴから提示されるのかを確かめた。この目的を達成するために、本発明者らは、ｈＴＲＴプラスミドＤＮＡでＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスを免疫した。マウスを２４日に屠殺し、脾細胞は、下記のペプチド：ｐ２７７、ｐ３４２、ｐ４４４、ｐ４６４、ｐ１１０７およびｐ１１２３のそれぞれを用いてインビトロで再刺激された。表ＩＶに示されるように、全部ではないがいくつかのペプチドは、インビボでプロセッシングされ、提示された。３個のペプチド（ｐ２７７、ｐ１１０７およびｐ１１２３）は、他のペプチドよりも大きなＣＴＬ応答を生じさせ、ＡＰＣの表面に提示されると、優先的にプロセッシングされ、および／またはより良好な免疫原性となることを意味する。残りの３つのペプチド（ｐ３４２、ｐ４４４、ｐ４６４）は、あるとしても僅かな免疫原性であった。この分析に基づいて、最初の７個のペプチドのうち３個だけがインビボでプロセッシングされ、効率的に提示されたようである。興味深いことに、本発明者らは、３個の最も免疫原性であるペプチドのうち、１個（ｐ２７７）だけがＰＡＰｒｏＣによって予測されたが、他の２個（ｐ１１０７およびｐ１１２３）は提示されなかったことを見出した（表Ｉ）。したがって、ＰＡＰｒｏＣアルゴリズムを用いた選択は、それ自体では、インビボで開裂され、免疫原性となるｈＴＲＴペプチドを予測することはできなかった。
【００５５】
表ＩＶ．ＨＬＡ−Ｂ７  ＴｇマウスにおけるｈＴＲＴペプチドのインビボでのプロセッシングおよび免疫原性
【００５６】
【表４】
2009523817.tif 000005
ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスは、ＣＭＶプロモータ下の全長ｈＴＲＴをコードするｐＤＮＡで免疫された。５１Ｃｒ放出アッセイは、それぞれのペプチドを用いたインビトロでの再刺激の６日後に行った。＞１０％の特異的溶菌が観察された場合に、マウスは応答個体であると考えられた。試験は、ＲＭＡ−Ｂ７標的細胞を用いて、６０：１のＥ：Ｔ比で二重で行った。
【００５７】
スーパータイプ分析
ＨＬＡ分子は、ヒト個体群の全体をカバーするために用いることができるペプチドの同定に対して問題を提起するように非常に多形である。しかしながら、ＨＬＡ対立遺伝子は、スーパータイプと称される相対的に少数のグループに一まとめにすることができる（２１）。ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプには、１０個の対立遺伝子が含まれる（２２）。ここで、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプの１０個のメンバーのうち５個（Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１）およびＢ＊０８０１と結合する選択されたｈＴＲＴペプチドの能力について該ペプチドを試験することに決めた。Ｂ＊０８０１対立遺伝子は、Ｂ＊０７０２と結合特性を共通にするが、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプの正式な部分ではない。この分析は、スーパータイプ結合に基づく推定のＨＬＡ−Ｂ７免疫原の選択をさらに狭めるという目的を有していた（表Ｖ）。１個のペプチド（ｐ１１２３）だけは、試験された全ての対立遺伝子に対して測定可能な親和力を有した。別のペプチド（ｐ１１０７）は、５つの対立遺伝子のうち３つに高親和力で結合した。２つの追加のペプチド（ｐ２７７およびｐ３４２）は、中間的な親和力で４つの対立遺伝子に結合した。残りのペプチド（ｐ４４４、ｐ４６４およびｐ９６６）は、ほとんどＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ結合を示さなかった。したがって、インビボにおける免疫原性およびプロセッシングに関して上述したインビトロおよびインビボのスクリーニングプロセスを通じて保持されたペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ結合物として最高にランクされるようである。これは、スーパータイプ分析が、選択プロセスを精錬する極めて重要な工程であることを示す。
【００５８】
表Ｖ．ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ結合アッセイ
【００５９】
【表５】
2009523817.tif 000006
ダッシュは、ＩＣ５０＞５００００ｎＭを示す。
【００６０】
ｐ１１２３に対するヒトＣＴＬの特徴付け
免疫原性全体に対して最高の特徴を有するペプチド（ｐ１１２３）に対する応答をより良く特徴付けるために、２人のＨＬＡ−Ｂ７＋正常な血液ドナーおよび１人の癌患者由来のＰＢＭＣを用いて、新たなインビトロ免疫実験を行った。これらの実験は、従来のインビトロ免疫アッセイを用いて行った（１２）。インビトロでの再刺激の繰り返しのラウンド後、ｐ１１２３でパルスしたＴ２−Ｂ７標的細胞を特異的に死滅される高効率なＣＴＬを誘導した（図４Ａ）。これらのＣＴＬは、ＣＤ３／ＣＤ８二重陽性のＴ細胞（８０％）に示した（図４Ｂ）。したがって、ｐ１１２３は、ＣＤ８  Ｔ細胞前駆体を増殖させ、ＣＴＬに成長した。同様のアプローチは、前立腺癌の患者由来のＰＢＭＣを用いて行った。また、繰り返しの再刺激後、本発明者らは、ｐ１１２３でパルスしたＴ２−Ｂ７標的細胞を死滅させたＣＴＬを増殖させることができた（図４Ｃ）。両方の正常な血液ドナーに観察された誘導の効率を比較すると、癌患者において誘導されたＣＴＬは効果が小さかった。活性は、ＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３／ＣＤ８＋リンパ球の二重陽性Ｔ細胞（７５％）によって媒介されるようであった。総合してみると、これらのデータは、ｐ１１２３に対するＣＤ８  Ｔ細胞前駆体は、正常なＣＤ８  Ｔ細胞レパートリーに存在し、癌発生後に存続することを確認した。
【００６１】
最後に、ｐ１１２３に対するＣＴＬが、抗原プロセッシングタンパク質と関連したトランスポーター（ＴＡＰ）のコンピテント／ｈＴＲＴ陽性細胞を溶菌させることができた。この目的を達成するために、本発明者らは、ｈＴＲＴに対して非常に陽性である（未発表データ）ＪＹ（ＨＬＡ−Ａ２＋／Ｂ７＋ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様ヒト細胞株）を用いた。また、ｐ１１２３でパルスされたＴ２−Ｂ７標的細胞を効率的に死滅させた正常なドナー由来のＣＴＬは、いかなるペプチドパルスもない場合に、ＪＹ細胞を死滅させ（図５）、これは、ｐ１１２３が、内因性のｈＴＲＴから自然にプロセッシングを受け、ＨＬＡ−Ｂ７／ｐ１１２３複合体が、ペプチド免疫によって誘導されたＣＴＬにより認識されるように細胞表面で提示されることを示唆している。
【００６２】
ｍＣＴＬ菌株はヒト細胞を認識する
ヒト細胞におけるｐ１１２３の内因性プロセッシングおよび提示をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ペプチド（ｐ１１２３）でパルスされたヒト標的細胞（Ｔ２−Ｂ７）に対する高い溶菌活性を有する、ｐ１１２３に特異的なｍＣＴＬ菌株を用いた（図８Ａ）。２つのＨＬＡ−Ｂ７＋ヒト・リンパ芽球様細胞であるＴ１−Ｂ７およびＢＣｌ−Ｂ７を用いた。ｐ１１２３でパルスされたＴＡＰ欠損Ｔ２−Ｂ７細胞は、ｍＣＴＬによる溶菌に非常に感受性であるが、パルスされていないＴＡＰコンピテントｈＴＲＴ＋ＨＬＡ−Ｂ７＋ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様ヒト細胞株であるＴ１−Ｂ７およびＢＣｌ−Ｂ７は感受性ではなかった。これは、マウスＣＤ８コレセプター分子とヒトＭＨＣとの低親和性相互作用が、ペプチドでパルスされたＴ２−Ｂ７細胞上の豊富なＭＨＣ−ペプチド複合体によって補填され得ることを示す。
【００６３】
代替のアプローチとして、本発明者らは、Ｔ１−Ｂ７およびＢＣｌ−Ｂ７細胞の存在下で、ｐ１１２３に特異的なｍＣＴＬ菌株における細胞内合成のＩＦＮ−γを試験し、ｐ１１２３の特異的な認識は、ＩＦＮ−ガンマ合成を生じさせると判断した。これは、細胞内染色を測定することによって評価された。図８Ｂに示されるように、Ｔ１−Ｂ７およびＢＣｌ−Ｂ７リンパ芽球様細胞との一晩の接触により、ＣＤ８／ＩＦＮ−ガンマの二重陽性細胞における増加を生じさせた。これは、ｐ１１２３でパルスされた対照のＴ２−Ｂ７細胞（正の対照）とともにインキュベートされたＣＤ８／ＩＦＮ−ガンマの二重陽性ＣＴＬの割合と相違してほんの僅かであった。したがって、これは、ヒト細胞においては、内因性プロセッシングおよびｈＴＲＴ  ｐ１１２３の提示を確証する。
【００６４】
上記明細書に言及された全ての刊行物および特許は、参照により本明細書中に援用される。本発明の記載された方法および組成物の様々な修飾およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明確となる。本発明は特定の好ましい態様に関連して記載されているが、主張される本発明は、このような特定の態様に過度に制限されるべきでないことは理解しなければならない。実際に、当業者に自明である、本発明を実施するための記載された形態の種々の修飾は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００６５】
【表６】
2009523817.tif 000007
【００６６】
【表７】
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【００６７】
【表８】
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【００６８】
【表９】
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【００６９】
【表１０】
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【００７０】
【表１１】
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【００７１】
【数１】
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【００７２】
【数２】
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【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１．ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスにおけるｐ２７７、ｐ３４２、ｐ４４４、ｐ４６４、ｐ９６６、ｐ１１０７およびｐ１１２３に対するインビボでのＣＴＬ応答。ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスは、ＩＦＡに含まれる１００マイクログラムの単一のｈＴＲＴペプチド、および１２０マイクログラムのＨＢＶヘルパーペプチドを用いてワクチン接種された。免疫してから１０日後、ペプチドおよび新鮮な放射線照射した同系のＡＰＣを用いてインビトロで脾臓リンパ球を再刺激した。再刺激は週１回ベースで行なった。標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイは、標的として同種のｈＴＲＴペプチドでパルスされ、Ｅ：Ｔ比が２５：１であるＲＭＡ−Ｂ７細胞を用いて、インビトロでの再刺激後５日で行なった。結果は、応答したマウスのみの平均した特異的溶菌±標準偏差として表され、その数は各パネルに示されている。試験は、二重で行った。
【図２】図２．ｐ２７７およびｐ１１２３を用いた免疫によってインビボで誘導したＣＴＬ応答の例。ＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇで免疫したマウスの脾臓リンパ球は、週１回ベースで、同種のｈＴＲＴペプチドを用いて、インビトロで再刺激した。標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイは、指示されたＥ：Ｔ比で、標的としてペプチドでパルスされたかまたはパルスされていないＲＭＡ−Ｂ７細胞を用いて行なった。ＣＴＬアッセイは、インビトロでの再刺激の１ラウンド（ａとｂ）、２ラウンド（ｃとｄ）、および３ラウンド（ｅとｆ）後に行なった。
【図３】図３．正常ドナーのＰＢＭＣを用いた小スケールのインビトロでの免疫アッセイにおけるＣＴＬ誘導の例。ＨＬＡ−Ｂ＋ヒトＰＢＭＣは、９６ウェルプレートアッセイでインビトロにおいて免疫し、１０〜１１日にペプチドでパルスされたＴ２−Ｂ７の特異的溶菌について試験した。ミクロＣＴＬアッセイは、材料および方法に記載されているように行なった。ｐ４４４を有する培養物以外の全ての培養物は、同じドナー由来のＰＢＭＣとともに設置された。
【図４】図４．インビトロでの免疫によって生じたヒトＣＴＬの特徴付け。２人のＨＬＡ−Ｂ７＋正常ドナーのＰＢＭＣの１つ、および前立腺癌の被験体の例。インビトロでの免疫は、従来の方法（１２）を用いて行なった。（Ａ）正常ドナーのＰＢＭＣに生じたＣＴＬによるｐ１１２３でパルスしたＴ２−Ｂ７細胞の特異的溶菌。ＣＴＬは、相同ペプチドを用いた５サイクルのインビトロでの再刺激後に試験した。（Ｂ）パネルＡに示されているＣＴＬの抗ＣＤ３および抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた表面の表現型分析。二重陽性細胞の割合を示す。（Ｃ）前立腺癌の被験体のＰＢＭＣに生じたＣＴＬによるｐ１１２３でパルスしたＴ２−Ｂ７細胞の特異的溶菌。ＣＴＬは、相同ペプチドを用いた７サイクルのインビトロでの再刺激後に試験した。（Ｄ）相同ペプチドを用いた５サイクルのインビトロでの再刺激後に、パネルＣに示される同じ被験体由来のＣＴＬの抗ＣＤ３および抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた表面の表現型分析。ＡおよびＢに示される実験は、様々な時間で調べた２人の正常なドナーからの一連の類似データの代表例である。
【図５】図５．ｐ１１２３は、ＪＹリンパ芽球様細胞において内因的にプロセッシングを受ける。ＨＬＡ−Ｂ７＋ヒト正常ドナーのＰＢＭＣ由来のＣＴＬは、ｐ１１２３（Ａ）、またはＪＹ細胞（Ｂ）でパルスしたＴ２−Ｂ７細胞の４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験された。示されたＥ：Ｔ比で二重に試験を行った。ＣＴＬは、相同ペプチドを用いた４サイクルのインビトロでの再刺激後に用いられた。試験は二重でなされた。
【図６−１】図６．ｈＴＲＴの核酸配列（配列番号１）を示す。
【図６−２】図６．ｈＴＲＴの核酸配列（配列番号１）を示す。
【図７】図７．ｈＴＲＴのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図８】図８．ｐ１１２３に特異的なマウスＣＴＬ（ｍＣＴＬ）は、ｈＴＲＴ＋ヒト標的細胞（Ｔ１−Ｂ７およびＢＣ１−Ｂ７）を認識する。ｍＣＴＬ株は、ｐ１１２３で免疫したＨＬＡ−Ｂ７  Ｔｇマウスから増殖させ、インビトロで５回再刺激した。（Ａ）４時間の５１Ｃｒ放出アッセイは、ｐ１１２３でパルスしたまたはパルスしていない標的細胞としてヒトＴ２−Ｂ７を用いてｍＣＴＬで行なった。（Ｂ）Ｔ１−Ｂ７、ＢＣ１−Ｂ７リンパ芽球様細胞、並びにｐ１１２３（陽性対照）およびｐ４６４（陰性対照）でパルスしたＴ２−Ｂ７とともに一晩のインキュベートによるｍＣＴＬの細胞内ＩＦＮ−ガンマ染色。試験は、２回繰り返し、同じような結果であった。
【図１】
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【図２】
2009523817.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月6日(2008.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009523817000001.app
【国際調査報告】
2009523817.tif 000024
2009523817.tif 000025