(57)【要約】  本発明は、アジポネクチンレセプターの可溶性Ｃ末端フラグメントおよび疾患の診断および管理におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から得られた生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントの存在または不存在についてアッセイする工程を含む、被験体におけるアジポネクチンレセプターのフラグメント化を検出するための方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＣ末端フラグメントが担体タンパク質に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体タンパク質がアジポネクチンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントを抗体により検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
担体タンパク質に結合した少なくとも１つのＣ末端フラグメントを抗体により検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
生物学的流体中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントの存在についてアッセイする工程が、前記サンプルをアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントに対して特異的な結合剤と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
結合剤が抗体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗体をレポーター分子で標識する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生物学的流体中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントの存在についてアッセイする工程が、第１結合剤に対して特異的な第２結合剤と前記サンプルを接触させることを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
第２結合剤が抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第２結合剤をレポーター分子で標識する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、前記生物学的流体中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントの存在についてアッセイする工程が、前記少なくとも１つのアジポネクチンレセプターフラグメントに結合した担体タンパク質に対して特異的な結合剤と前記サンプルを接触させることを含み、そして該方法が、担体タンパク質が前記少なくとも１つのアジポネクチンレセプターフラグメントに結合しているかどうかを決定するための工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記体液が血漿または全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液が尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルを決定し、そして該少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルをアジポネクチンレセプターの発現のレベルと相関させる工程を含む、被験体におけるアジポネクチンレセプターの発現のレベルを検出する方法。
【請求項１６】
生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルを決定し、そして該少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルをアジポネクチンの発現のレベルと相関させる工程を含む、被験体におけるアジポネクチンの発現のレベルを検出する方法。
【請求項１７】
被験体における脂肪細胞インバランスにより特徴付けられた状態の進行、状態の発症または状態の処置の効力を決定するための方法であって、被験体から得られた体液サンプル中に存在するアジポネクチンレセプターの少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントのレベルを決定し、そして該レベルを、前記状態の進行、状態の発症または状態の処置の効力と相関させることを含む、方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントが担体タンパク質に結合している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントが結合していない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
被験体から得られた生物学的サンプル中のアジポネクチンのレベルを決定し、そして該アジポネクチンのレベルを前記状態の進行、状態の発症または状態の処置の効力と相関させることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
被験体から得られた生物学的サンプル中のビクニンのレベルを決定し、そして該ビクニンのレベルを前記状態の進行、状態の発症または状態の処置の効力と相関させることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
被験体から得られた生物学的サンプル中のＣ反応性タンパク質のレベルを決定し、そして該Ｃ反応性タンパク質のレベルを前記状態の進行、状態の発症または状態の処置の効力と相関させることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
被験体から得られた生物学的サンプル中の白血球のレベルを決定し、そして該白血球のレベルを前記状態の進行、状態の発症または状態の処置の効力と相関させることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
被験体から得られた生物学的サンプル中のＣペプチドのレベルを決定し、そして該Ｃペプチドのレベルを前記状態の進行、状態の発症または状態の処置の効力と相関させることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
脂肪細胞インバランスにより特徴付けられた状態の発症を決定するための、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
脂肪細胞インバランスにより特徴付けられた状態の進行を決定するための、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
脂肪細胞インバランスにより特徴付けられた状態の処置の効力を決定するための、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
処置がＰＰＡＲγアゴニストの投与である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記状態がメタボリック症候群である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記状態が血管閉塞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
前記状態が１型糖尿病または２型糖尿病である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記状態が動脈硬化症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
前記状態が心臓血管疾患である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
心臓血管疾患が、うっ血性心不全、急性心筋梗塞、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症または虚血である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記状態がインスリン抵抗性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３６】
被験体から得られた生物学的流体サンプル中に存在するアジポネクチンレセプターの少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントのレベルを決定し、そして該レベルを心臓血管疾患の発生の可能性と相関させることを含む、動脈硬化症を有する被験体が心臓血管疾患を発生しそうであるかどうかを決定するための方法。
【請求項３７】
心臓血管疾患がうっ血性心不全、急性心筋梗塞または虚血である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本願は、２００５年１２月７日に出願されたU.S.Provisional Application No.60/748,305の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、アジポネクチンレセプターの可溶性Ｃ末端フラグメントならびに障害の診断および処理におけるそれらの使用に関する。
【０００３】
発明の背景
慢性炎症を伴う肥満は、大きくかつ増えている集団を有する。この集団は、明らかに高い心臓血管のリスクおよび糖尿病のリスクを有し、そしてしばしばインスリン抵抗性を伴うメタボリック症候群を発生する。最近、アジポネクチンおよび他のアジポカインが、グルコース代謝をコントロールする脂肪細胞ホルモンとして発見された。脂肪細胞のタイプおよびロケーションの両方とも重要である。肥満は、アジポネクチンを血液中に分泌して脂肪およびグルコースの筋肉細胞代謝を助けるさらなる脂肪細胞を産生する。いくらかの過剰体重の患者はインスリン抵抗性となる。この場合に、脂肪細胞は、アジポネクチンを産生することを停止する。血液中のアジポネクチンのレベルは、肥満、インスリン抵抗性および２型糖尿病の状態（conditions）下で減少する。これらのおよび他の疾患状態（disease states）の予後について被験体のアジポネクチンレベルを測定するための方法が存在する。しかしながら、アジポネクチンレベルの測定は、疾患の弱いインディケーターであることが証明された。異常な脂肪細胞活性と関連した疾患状態を監視するためのより良好な方法に対するニーズが存在する。本発明は、このニーズおよび他のニーズを提供する。
【０００４】
要約
本発明者等は、アジポネクチンレセプターのＣ末端フラグメントが体液中に可溶性でありそして検出されうることを発見した。したがって、本発明は、とりわけ、前記フラグメント、それらを検出する方法、それらの使用方法およびそれらに結合することができる抗体を提供する。
【０００５】
被験体から得られた生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターのフラグメント化を検出するための方法は、アジポネクチンレセプターの少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントの存在または不存在についてアッセイする工程を含むことができる。ある態様では、生物学的サンプル中のＣ末端フラグメントの総濃度を決定する。
【０００６】
被験体におけるアジポネクチンレセプターの発現のレベルを検出するための方法が本発明で提供される。これらの方法は、生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルを決定し、そしてＣ末端フラグメントのレベルをアジポネクチンレセプターの発現のレベルと相関させる工程を含むことができる。ある態様では、生物学的サンプル中のＣ末端フラグメントの総濃度を決定する。
【０００７】
被験体におけるアジポネクチンの発現のレベルを検出するための方法が本発明で提供される。これらの方法は、生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルを決定しそしてＣ末端フラグメントのレベルをアジポネクチンの発現のレベルと相関させる工程を含むことができる。ある態様では、生物学的サンプル中のＣ末端フラグメントの総濃度を決定する。
【０００８】
状態（condition）の進行、状態の発症、即ち診断、または処置の効力、即ち、特定の薬物による治療に対する個体の応答性を決定するための方法が、本発明により包含される。好ましくは、状態は、アジポネクチンレセプターの異常なフラグメント化パターンと関連した状態であろう。これらの方法は、生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルを決定しそしてＣ末端フラグメントのレベルを、前記状態の進行、状態の発症または処置の効力と相関させる工程を含むことができる。ある態様では、生物学的サンプル中のＣ末端フラグメントの総濃度を決定する。
【０００９】
本発明の方法において、アジポネクチンレセプターの１つ以上の（即ち、少なくとも１つの）可溶性Ｃ末端フラグメントを検出することができる。例えば、ＡｄｉｐｏＲ１および／またはＡｄｉｐｏＲ２のフラグメント１〜２２の任意の組み合わせを検出することができる。ある態様では、ＡｄｉｐｏＲ１および／またはＡｄｉｐｏＲ２のフラグメント１〜２２を検出し、そしてそれらの質量により識別することができる。したがって、本発明は、例えば約２kDaの質量を含む、例えば約１kDa〜約３kDaの質量を有するフラグメント（例えば、配列番号３、１２〜２２、２５および３４〜４４により示されるフラグメント）、または例えば約３．９kDaの質量を含む約３．５〜約４．２kDaの質量を有するフラグメント（例えば、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４および２６〜３３により示されるフラグメント）のレベルを決定するための方法を提供する。これらのサイズのフラグメントは、典型的にはモノマーとして存在する。本発明は、例えば約４kDaの質量を含む例えば約２kDa〜約６kDaの質量、または例えば７．８kDaの質量を含む例えば約７kDa〜約８．４kDaの質量を有するフラグメントのレベルを決定するための方法も提供する。これらのサイズのフラグメントは、典型的には二量体として存在する。
【００１０】
本発明の方法において、アジポネクチンレセプターの１つ以上の可溶性Ｃ末端フラグメント（例えば配列番号１〜４４）は、担体タンパク質（carrier protein）に結合しているとき検出されうる。例えば、ＡｄｉｐｏＲ１および／またはＡｄｉｐｏＲ２のフラグメント１〜２２の任意の組み合わせは、担体タンパク質に結合しているとき検出されうる。したがって、ある態様において、本発明は、約４．５〜６．９、７〜８．２、９〜１１、１３〜１５、１７〜１９、２７〜２９または３０〜３４kDaの質量を有するフラグメントのレベルを決定する方法を提供する。ある態様において、担体タンパク質は、アジポネクチンフラグメントを含むアジポネクチンである。ある態様では、結合したアジポネクチンとの組み合わさったアジポネクチンレセプターフラグメントは、約３〜５、４〜８、７〜１１、１３〜１７、２２〜２６または２８〜３２kDaの質量を有する。本発明はこれらのフラグメントを検出する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、配列番号１〜４４の配列を有するフラグメントと実質的に同じであるポリペプチドおよびこれらのフラグメントに相当する核酸配列も提供する。本発明で与えられたアジポネクチンレセプターのＣ末端フラグメントの少なくとも１つに特異的に結合する抗体も含まれる。
【００１２】
本発明は、本明細書に記載のフラグメントの少なくとも１つを検出するための手段と、場合によりキットの結果の使用および解釈のためのインストラクションを含む、本明細書に記載の障害のいずれかを有する個体のための処置ストラテジーを決定するのに使用するためのキットを提供する。キットは、例えば、個体から生物学的サンプルを得るための手段を含むこともできる。
【００１３】
具体的態様の詳細な説明
Ｉ．緒言
本発明者等は、アジポネクチンレセプターのＣ末端フラグメントが体液中に可溶性でありそして検出されうるということを発見した。更に、本発明者等は、体液中のアジポネクチンレセプターのある可溶性フラグメントの存在または不存在は疾患を予測することそして体液中の総可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントのレベル、即ち濃度は疾患を予測するということを観察した。
【００１４】
本明細書に記載の発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムに限定されず、これらはもちろん変わりうることは理解されるべきである。本明細書で使用された用語は特定の態様を説明するだけの目的のためであり、そして限定であることを意図しないことも理解されるべきである。本明細書および特許請求の範囲で使用された、単数形態は、特記しない限り複数の言及を含む。したがって、例えば、「細胞」という言及は、２つ以上の細胞の組み合わせ、等を含む。
【００１５】
量、時間の期間等などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用された用語「約」は、特定された値からの±２０％または±１０％、更に好ましくは±５％、更に好ましくは±１％、なお更に好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は開示された方法を行うのに適切である。
【００１６】
ＩＩ．アジポネクチンレセプターおよびそのフラグメント
アジポネクチンレセプターは、Yamauchi et al.,（Nature, 2003, 423(6491), 762-9）により最初に記載された膜貫通レセプターでありそしていくつかのタイプを有する。３つのアジポネクチンレセプタータイプ、アジポネクチンレセプター１（ＡｄｉｐｏＲ１とも呼ばれる）、アジポネクチンレセプター２（ＡｄｉｐｏＲ２とも呼ばれる）およびアジポネクチンレセプター３（ＡｄｉｐｏＲ３とも呼ばれる）が同定された。アジポネクチンレセプターは、アジポネクチン、筋肉および肝臓における脂質およびグルコース代謝において重要な役割を演じる脂肪細胞由来の因子、に特異的に結合しそしてアジポネクチンによりモデュレーションされる。
【００１７】
ヒトアジポネクチンレセプター１および２の核酸およびアミノ酸配列は公共データベース（例えば、Genbank accession Numbers NM_015999、AK222503、AK025085、AK222503、NM_024551、Q96A54およびQ86V24）においてアクセス可能でありそしてそこで提供される。ヒトアジポネクチンレセプター３の核酸およびアミノ酸配列は、U. S. Publication No. 20050032166に与えられており、このU.S. Publication No. 20050032166においては、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。本明細書で使用された用語アジポネクチンレセプターは本明細書に記載の配列を有するアジポネクチンレセプターを包含するのみならず、例えば、アジポネクチンレセプターの天然に存在するトランケーションされた形態、天然に存在する変異体形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）、保存的に改変された変異体および天然に存在するアレル変異体も含むことは理解されるであろう。
【００１８】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするこれらの核酸を指すか、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく記載された対応するコドンのいずれかに変えられうる。このような核酸変異体は、「サイレント変異」であり、これは保存的に改変された変異の１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレント変異も表現する。当業者は、核酸における各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）は、機能的に同じ分子を生じるように改変されうることを当業者は認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、実際のプローブ配列に関してではなくて、発現産物に関して各記載された配列に事実上含まれる。
【００１９】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列における単一アミノ酸または少ない百分率のアミノ酸を変えるか、付加するかまたは欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、その変化が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合に、「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的置換表は当技術分野で周知である。このような保存的に改変された変異体は、本発明の多形変異体、種間ホモログおよびアレルのほかに更にあり、そしてこれらを排除しない。
【００２０】
下記の８つのグループは、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins(1984)参照）。
【００２１】
特定の核酸配列は、「スプライス変異体」も暗黙のうちに包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス変異体によりコードされた任意のタンパク質を暗黙の内に包含する。「スプライス変異体」は、名前が暗示するとおり、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写の後に、最初の核酸転写物は、異なる（選択的）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされうる。スプライス変異体の産生のための機構は、変わるが、エキソンの選択的スプライシングを含む。リードスルー転写による同じ核酸に由来する他のポリペプチドも、この定義により包含される。スプライス産物のリコンビナント形態を含むスプライシング反応の任意の産物は、この定義に含まれる。
【００２２】
語句「アジポネクチンレセプターの可溶性Ｃ末端フラグメント」は、アジポネクチンレセプターから外れ（break off）かつ体液に可溶性であるアジポネクチンレセプターのＣ末端からのフラグメントを指す。例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、腹水等を含む種々の体液が、本発明の方法を実施する際に使用されうる。
【００２３】
アジポネクチンは、インスリン感受性化性、抗アテローム性および抗炎症性を有する脂肪細胞により分泌されるホルモンとして当技術分野で知られている。アジポネクチンのレベルは、肥満、インスリン抵抗性および糖尿病を含むある状態下に減少する。アジポネクチンの活性は、そのレセプターにより媒介される。アジポネクチンは、完全長としてまたはより小さい球状フラグメントとして存在することができる。アジポネクチンには４つの異なる領域がある。第１は、細胞の外側への分泌のためのホルモンをターゲティングする短いシグナル配列であり、第２は、種間で変動する短い領域であり；第３はコラーゲン性タンパク質に対する類似性を有する領域であり；そして最後は球状ドメインである。アジポネクチンの予測されたモノマー質量は、約１７〜約３３kDaの範囲を有する２６kDaである。アジポネクチンのオリゴマー形成は、内部システイン残基により媒介されるジスルフィド結合形成に依存する。アジポネクチンは、血漿中に広範囲のマルチマー複合体において存在し、そしてそのコラーゲンドメインを介して組み合わさって３つの主要なオリゴマー形態：低分子量形態、中分子量形態および高分子量形態を生成する。エラスターゼおよびトリプシンなどのセリンプロテアーゼはアジポネクチンを切断するための多数の部位を有する。約１６kDaの平均分子量の球状アジポネクチンの遊離が、患者において起こることが知られている。残りの非球状アジポネクチンは１０kDaの平均分子量を有する。トリプシン型セリンプロテアーゼによるアジポネクチンの切断は例えばアミノ酸１０１で起こることができて、１６．５kDa球状アジポネクチンを生じさせるかまたは、エラスターゼ型セリンプロテアーゼによるアジポネクチンの切断は、アミノ酸１０８で起こることができて、１５．８kDa球状アジポネクチンを生じさせる。約１７．８kDa〜約９．７kDaの球状アジポネクチンの質量範囲をもたらすアミノ酸８８〜１０８における多数の潜在的切断部位がある。非球状アジポネクチンの追加のプロテアーゼ切断は３kDaという小さなフラグメントを産生することができる。
【００２４】
理論により束縛されることを望まないが、アジポネクチンレセプターのＣ末端テイルは完全長アジポネクチンを捕捉するために作用すると考えられる。この結合は、アジポネクチンタンパク質の非球状部分とアジポネクチンレセプターのアジポネクチンテイル結合ドメインとで起こると考えられる。プロテアーゼによる切断後、非球状アジポネクチンはアジポネクチンレセプターのＣ末端領域に結合していると考えられる。遊離した球状アジポネクチンは、レセプター上の他の領域と相互作用して更なる活性化を引き起こすと考えられる。非球状アジポネクチンの不在下では、Ｃ末端への結合は起こらないと考えられる。
【００２５】
本発明者等は、アジポネクチンレセプターのＣ末端部分がレセプターからフラグメント化しそして体液中に存在していることを発見した。非球状アジポネクチンの存在またはレベルはアジポネクチンレセプターのＣ末端のフラグメント化パターンに影響を与えることができる。本発明者等は、体液中のアジポネクチンレセプター１および２フラグメントを検出した。アジポネクチンレセプターが生物学的流体中に検出されることができそして疾患状態の信頼性のあるかつ実際的なインディケーターを与えるという観察および結論は、アジポネクチンレセプターが内在性膜タンパク質であることを考えると、特に驚くべきことである。あるフラグメントが疾患において存在しない傾向がありそしてレセプターフラグメントの総数または総濃度の増加が疾患状態において起こるということも、アジポネクチンレベルが疾患と共に減少することを考えるとやはり驚くべきことである。
【００２６】
本発明は、とりわけ、ＡｄｉｐｏＲ１のアジポネクチンレセプターフラグメント１〜２２（配列番号１〜２２）を提供する。ＡｄｉｐｏＲ１のフラグメント１は、ＡｄｉｐｏＲ１上のアミノ酸３６１〜３７５に対応する３４個のアミノ酸を有する。アミノ酸１〜１４はセリンプロテアーゼ切断ドメインであり；アミノ酸１５〜２２はａｄｉｐｏＲ２様ドメインであり；そしてアミノ酸２３〜３４はアジポネクチン結合ドメインである。ＡｄｉｐｏＲ１のフラグメント１の配列は、
【表１】
2009518653.tif 000002
である。このフラグメントは、任意のアミノ酸において、特にセリンプロテアーゼ切断ドメイン、ａｄｉｐｏＲ１様ドメインまたはアジポネクチン結合ドメイン内の任意のアミノ酸において更にフラグメント化されうる。体液中に存在するある重要なフラグメントは、
【表２】
2009518653.tif 000003
の配列を有するフラグメント２および
【表３】
2009518653.tif 000004
の配列を有するフラグメント３であるが、少なくとも下記のフラグメント：
【表４】
2009518653.tif 000005
が見出されうる。
【００２７】
本発明は、とりわけ、ＡｄｉｐｏＲ２のアジポネクチンレセプターフラグメント１〜２２（配列番号２３〜４４）を提供する。ＡｄｉｐｏＲ２のフラグメント１は、ＡｄｉｐｏＲ２上のアミノ酸３５３〜３８６に対応する３４個のアミノ酸を有する。アミノ酸１〜１４はセリンプロテアーゼ切断ドメインであり；アミノ酸１５〜２２はａｄｉｐｏＲ２様ドメインであり；そしてアミノ酸２３〜３４はアジポネクチン結合ドメインである。ＡｄｉｐｏＲ２のフラグメント１の配列は、
【表５】
2009518653.tif 000006
である。このフラグメントは、任意のアミノ酸において、特にセリンプロテアーゼ切断ドメイン、ａｄｉｐｏＲ２様ドメインまたはアジポネクチン結合ドメイン内の任意のアミノ酸において更にフラグメント化されうる。体液中に存在する重要なフラグメントは、
【表６】
2009518653.tif 000007
の配列を有するフラグメント２および
【表７】
2009518653.tif 000008
の配列を有するフラグメント３であるが、少なくとも下記のフラグメント：
【表８】
2009518653.tif 000009
が見出されうる。
【００２８】
ある場合には、身体中に存在するアジポネクチンレセプターは、本明細書に記載のような正確な配列を持たないが、天然に存在する変異体形態として存在する。例えば、アジポネクチンレセプターは、機能を損失しないでそれらのアミノ酸少なくとも５％までまたは１０％まですら置換することができる。したがって、配列番号１〜４４における少なくとも２つのアミノ酸を他のアミノ酸で置換することができる。したがって、本発明は、ＡｄｉｐｏＲ１およびＡｄｉｐｏＲ２のフラグメント１〜２２を包含するのみならず、本明細書に記載のフラグメントに対して実質的同一性を有するフラグメントも包含する。実質的な同一性は、フラグメントに対して約７５％または８０％または８０％より高い同一性を有するものとして本明細書で記載される。したがって、フラグメントは、配列番号１〜４４に対して約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、または約９８％の同一性を有することができる。
【００２９】
百分率同一性は、比較ウインドーで２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定されうるが、その際比較ウインドーにおけるポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのための参照配列（即ち付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（即ちギャップ）を含むことができる。百分率は、同一アミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、比較ウインドーにおいてマッチした位置の数を位置の総数により割り、そしてその結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより計算される。同一性は、当技術分野で知られている種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを使用して評価される。このようなアルゴリズムおよびプログラムは、ＴＢＬＡＳＴＩＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＦＡＳＴＤＢを含むがそれらに限定されず、その開示はそのまま参照により組み込まれる。
【表９】
2009518653.tif 000010
【００３０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で相互に交換可能に使用されてアミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３１】
本明細書で使用された用語「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも約１０塩基または塩基対のポリマー形態のヌクレオチドであって、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変された形態を意味しそして一本鎖または二本鎖形態のＤＮＡを含むことを意味する。
【００３２】
本明細書で記載されたアジポネクチンレセプターフラグメントは、フラグメントのＣ末端付近に存在するシステインアミノ酸（配列番号１および１６の位置２８）を介して二量体化することができる。したがって、これらのフラグメントは、二量体とした体液中に存在することができる。
【００３３】
配列番号１〜４４に存在するアミノ酸のいくつかは、翻訳後修飾のための潜在的部位である。例えば、フラグメントに存在するグリシン（配列番号１および２３の位置２６）は、潜在的Ｎ−ミリストイル化部位であり、アルギニン（配列番号１および２３の位置２１）は潜在的Ｎ−グリカン部位でありそしてセリン（配列番号１および２３の位置１５）は潜在的Ｏ−グリカン部位である。したがって、フラグメントは翻訳後の修飾により追加の質量を有することができる。
【００３４】
本発明の１つの局面は、本明細書に記載されたフラグメントの提供である。したがって、本発明は、配列番号１〜４４に対して実質的同一性を有する単離されたフラグメントを提供する。単離されたフラグメントは、生物学的ソースから精製されたまたはリコンビナント方法もしくは合成方法により調製された単離されたフラグメントである。そのようにする方法は当技術分野で周知であり、したがって本明細書では述べない。
【００３５】
本発明の他の局面は、生物学的流体サンプルにおける本明細書に記載のフラグメントの検出である。
【００３６】
本発明者等は、膜貫通レセプターであるアジポネクチンレセプターのフラグメントが、生物学的流体におけるレセプターのＣ末端領域の存在についてアッセイすることにより生物学的流体サンプルにおいて検出されうることを発見した。
【００３７】
生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルを決定し、そして該少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルをコントロールサンプル中の同じフラグメントのレベルと比較することにより、組織におけるアジポネクチンレセプターの発現のレベルが決定されうることも発見された。
【００３８】
生物学的流体サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルを決定し、そして該少なくとも１つのＣ末端フラグメントのレベルをコントロールサンプル中の同じフラグメントのレベルと比較することにより、被験体におけるアジポネクチンの発現のレベルが決定されうることも発見された。
【００３９】
アジポネクチンレセプターのフラグメントは、罹患した個体および非罹患個体の体液中に見出されうる。しかしながら、アジポネクチンの存在またはレベルは、アジポネクチンレセプターのＣ末端のフラグメント化パターンに影響を与えることができる。被験体におけるアジポネクチンのレベルおよびタイプは、被験体に存在するアジポネクチンレセプターのレベルに影響を与えることもできる。
【００４０】
本発明者等は、完全長アジポネクチンの正常なレベルを有する正常な（即ち非罹患の）被験体において、より大きなアジポネクチンレセプターフラグメント、即ち長さが２５〜３４アミノ酸であるフラグメント（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４、および／または２６〜３３）が生物学的流体中に見出されることを発見した。これらのフラグメントは、典型的には結合していない。これらのより大きなフラグメントの多くは、アジポネクチン関連疾患に罹患している被験体において存在しないかまたは有意により低いレベルで存在する（即ち、フラグメントは、非罹患患者におけるよりは２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍低いレベルまたは１００倍より多く低いレベルで罹患患者において存在する）。結合していないフラグメントとは、担体タンパク質、即ちアジポネクチンに結合していないフラグメントを意味する。
【００４１】
本発明者等は、罹患被験体において、より小さいアジポネクチンフラグメント、即ち、長さが約１３〜２４アミノ酸であるフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２５および／または３４〜４４）が生物学的流体中に見出されることを発見した。これらのフラグメントは、結合していることができ、または結合していないことができる。これらのフラグメントは、正常な被験体においても見出されるが、一般に罹患被験体におけると同じレベルでは見出されない（即ち、フラグメントは非罹患患者におけるよりは、１．５倍、２倍、２．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍多いレベルで罹患患者において存在する）。
【００４２】
本発明者等は、正常な被験体と罹患被験体の両方において、アジポネクチンに結合したＣ末端アジポネクチンレセプターフラグメントが観察されることを見出した。これらの結合したレセプターフラグメントは、より大きいフラグメントまたはより小さいフラグメントであることができる。多くの場合に、これらのフラグメントは部分的にフラグメント化されていようが完全長であろうが、アジポネクチンの非球状部分に結合された。結合したアジポネクチンレセプターフラグメントのレベルは疾患を有する被験体において増加する。
【００４３】
したがって、非結合フラグメントおよび結合したフラグメントならびにより小さいフラグメントおよびより大きいフラグメントの存在またはレベルを使用して、個体におけるアジポネクチンおよびアジポネクチンレセプターの発現のレベルならびに個体における疾患状態を決定することができる。
【００４４】
ＩＩＩ．アジポネクチンレセプターの可溶性Ｃ末端フラグメントの検出
本発明は、体液中のアジポネクチンレセプター少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントの存在または不存在についてアッセイするためおよび／または体液中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントのレベルを決定するための方法を提供する。語句「レベルを決定する」は、サンプルにおけるアナライトの存在または不存在を検出することまたは、相対的もしくは絶対的に量を定量することを意味する。相対的量は、例えば高い、中くらいまたは低い、であることができる。絶対的量は、シグナルの測定された強度、またはこのシグナル強度のマイクログラム/mlなどの他の定量的フォーマットへの変換で示すことができる。
【００４５】
Ｃ末端フラグメントは、任意の適当な方法により検出することができる。使用することができる検出パラダイムは、例えば、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー法）、原子間力顕微鏡およびラジオ周波数法、例えば多重極性共鳴分光法（multipolar resonance spectrometry）を含む。光学的方法は、例えば、比色法、電子インピーダンス分光法（electron impedance spectroscopy）、顕微鏡法、共焦点および非共焦点の、蛍光の検出、ルミネッセンス、化学発光、吸光度、反射率、透過率および複屈折、または屈折率（例えば表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共鳴ミラー法、グレーティングカップラーウエーブガイド法またはインターフェロメトリー）を含む。
【００４６】
ある好ましい態様において、アジポネクチンレセプターの少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントの存在または不存在を含む発現のレベルは、イムノアッセイによりアッセイされる。その最も広い文脈において、「イムノアッセイ」は、試験サンプルを、ターゲットに対して特異的な１つ以上の免疫相互作用性分子と、それに結合するのに十分な時間および条件下に、インキュベーションしそして該結合を検出することを含むことを当業者は承知している。本明細書で使用された用語「ターゲット」は、プローブが結合するようにデザインされたアナライトを指す。抗体を試験サンプルとインキュベーションするための条件は、アッセイで使用されるフォーマット、使用される検出法およびアッセイで使用される抗体分子のタイプおよび性質に依存して変わる。当業者は、市販の免疫学的アッセイフォーマット、例えばラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法（immuno-tubimetric）、免疫比ろう法（immunonephrometric）、磁性免疫粒子分離、免疫クロマトグラフィー、免疫マイクロ流体、免疫遠心、拡散をベースとするオクタロニー法、ロケットゲル免疫電気泳動またはin situイムノアッセイは本発明の目的に容易に適応させることができることを、当業者は認識するであろう。
【００４７】
イムノアッセイは、試験サンプル中のアジポネクチンレセプターの少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントの定量において有用であり、特に該少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントが非罹患個体において検出可能な正常なレベルと比較して変わっているかどうかを決定するのに有用である。結果として、このようなイムノアッセイは、患者が疾患または疾患への素因を有しうるかどうかを決定するのに特に使用される。イムノアッセイは、例えば疾患進行の監視または治療介入に対する応答の監視における使用などの他の用途も有することができる。本明細書に記載の発明は、それらの実施のために前記イムノアッセイを必要とする免疫相互作用分子および診断アッセイのすべてのこのような使用にまで広がる。
【００４８】
例示のみを目的として、ある態様において、フラグメントに対して生じた抗体を固体基材上に固定化して第１複合体を形成しそして患者からの生物学的試験サンプルを結合した分子と接触させる。抗体−第２複合体の形成を可能とするのに十分な時間の期間、適当な期間のインキュベーションの後に、検出可能なシグナルを産生することができるレポーター分子で標識された第２抗体を次いで加えそしてインキュベーションして第３複合体の形成のための十分な時間を可能とする。非反応物質を洗浄除去し、そして第３複合体の存在を、レポーター分子により産生されたシグナルの観察により決定する。結果は、可視シグナルの簡単な観察により定性することができ、または既知の量のハプテンを含有するコントロールサンプルとの比較により定量されうる。このアッセイの変異は、サンプルと標識された抗体の両方を結合した抗体に同時に加える同時アッセイ、または標識された抗体と試験されるべきサンプルを最初に一緒にし、インキュベーションし、次いで結合した抗体同時に加えるリバースアッセイを含む。これらの技術は当業者に周知でありそして変異の可能性は容易に明らかであろう。
【００４９】
本明細書で使用された「レポーター分子」とは、その化学的性質により、抗原−結合抗体の検出を可能とする分析により同定可能なシグナルを生成する分子を意味する。検出は、定性的または定量的であることができる。このタイプのアッセイにおいて最もよく使用されるレポーター分子は、着色したラテックス粒子、金属粒子、酵素、蛍光団または放射性核種含有分子（即ち放射性同位元素）である。
【００５０】
固体基材は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最もよく使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、カセット、チューブ、ビーズ、ディスクまたはマイクロプレートまたはイムノアッセイを行うために適当な任意の他の表面の形態にあることができる。結合方法は当技術分野で周知でありそして一般に分子を不溶性担体に架橋共有結合させるかまたは物理的に吸着させることからなる。
【００５１】
例えば、競合および非競合イムノアッセイフォーマット、抗原捕捉アッセイおよび二抗体サンドイッチアッセイを含む種々のイムノアッセイフォーマットを、本発明の方法において使用することができる（Self and Cook, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65(1996)）。抗原捕捉アッセイにおいては、抗体を固相に結合させ、そして可溶性アジポネクチンレセプターＣ末端フラグメントが抗体により結合されるようにサンプルを加える。抗体は、可溶性Ｃ末端フラグメントの１つまたは２つまたは２つより多くに対して特異的であることができる。非結合タンパク質を洗浄により除去した後、所望により、例えばラジオアッセイ（Farlow and Lane, Antibodies A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory: New Yorl, 1988）を使用して、結合した抗原の量を定量することができる。イムノアッセイは、抗体過剰の条件下にまたは抗原競合として行って抗原の量を定量することができ、かくして可溶性アジポネクチンレセプターＣ末端フラグメントのレベルを決定することができる。
【００５２】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）は、本発明のある方法において有用でありうる。酵素イムノアッセイの場合には、酵素を、一般に、グルタルアルデヒドまたはパーイオデートによって第２抗体にコンジュゲーションされる。しかしながら、容易に認識されるとおり、当業者に利用可能な広い種類の異なるコンジュゲーション技術が存在する。よく使用される酵素は、とりわけ、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。特異的酵素と使用されるべき基質は、対応する酵素により加水分解されると、検出可能な色変化を生成するように選ばれる。例えば蛍光性産物を生じる、蛍光発生性基質を使用することも可能である。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼまたはウレアーゼなどの酵素は、例えば、本発明の方法における使用のための抗アジポネクチンレセプターＣ末端フラグメントまたは二次抗体に連結させることができる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、４５０nmで検出されうる過酸化水素の存在下に可溶性産物を生じる発色原性基質テトラメチルペンジジン（ＴＭＢ）と共に使用されうる。他の便利な酵素を連結させたシステムは、例えば発色原性基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートと共に使用されて４０５nmで容易に検出可能な可溶性産物を生じることができるアルカリホスファターゼ検出システムを含む。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出システムは、例えば、発色原性基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共に使用されて、４１０nmで検出可能な可溶性産物を生じることができ、またはウレアーゼ検出システムは、例えば、尿素−ブロモクレゾールパープル（Sigma immunochemicals. St. Louis. Mo.）などの基質と共に使用することができる。有用な酵素結合させた一次抗体および二次抗体は、Jackson Immuno-Research（West Grove, Pa）などの多数の商業的ソースから得ることができる。
【００５３】
ある態様において、可溶性Ｃ末端フラグメントは、化学発光検出を使用して検出しそして測定することができる。例えば、ある態様において、アジポネクチンレセプターＣ末端フラグメント特異的抗体を使用して生物学的サンプル中に存在するフラグメントを捕捉し、そして特異的抗体に対して特異的なかつ化学発光標識により標識された抗体を使用してサンプル中に存在するフラグメントを検出する。任意の化学発光標識および検出システムを本方法において使用することができる。化学発光二次抗体は、Amershamなどの種々のソースから商業的に得られうる。化学発光二次抗体を検出する方法は当技術分野で知られておりそして詳細に本明細書で論議しない。
【００５４】
蛍光検出も、本発明のある方法においてアジポネクチンレセプターフラグメントを検出するために有用でありうる。有用な蛍光色素は、例えば、ＤＡＰＩ、フルオロセイン、ランタニド金属、Hoechst33258、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびリサミン（lissamine）である。フルオレセインまたはローダミンで標識されたα２−ＭＧ−、ＨＡ−、ＴＩＭＰ−１−またはＹＫＬ−４０−特異的結合剤、例えば、抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１または抗ＹＫＬ−４０抗体またはフルオレセインもしくはローダミンで標識された二次抗体は、本発明において有用でありうる。有用な蛍光性抗体は、例えば、更に下記するとおりTago Immunologicals（Burlingame, Calif）から商業的に得られうる。蛍光化合物は、それらの結合能力を変えることなく抗体に化学的にカップリングさせることができる。特定の波長の光による照明により活性化されるとき、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸収し、分子の励起状態を誘導し、次いで光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を遊離する。
【００５５】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）も、本発明のある方法において有用でありうる。このようなアッセイは、当技術分野で周知である。ラジオイムノアッセイは、例えば、１２５Ｉで標識された一次または二次抗体により行うことができる（Harlow and Lane, supra. 1988）。
【００５６】
検出可能な試薬からのシグナルは、例えば、発色性基質からの色を検出するための分光光度計；放射能を検出するための放射能計数器、例えば125Ｉの検出のためのγ計数器；ある波長の光の存在下に蛍光を検出するための蛍光光度計を使用して解析することができる。酵素結合アッセイが使用される場合には、可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントの量の定量分析は、製造者のインストラクションに従ってEMAX Microplate Reader（Molecular Devices; Menlo Park, Calif）などの分光光度計を使用して行うことができる。本発明のアッセイは、所望ならば自動化されうるかまたはロボットにより行われ得、そして多数のサンプルからのシグナルを同時に検出することができる。
【００５７】
本発明の方法は、所望により自動化されうる、毛細管電気泳動をベースとするイムノアッセイ（ＣＥＩＡ）の使用も包含する。イムノアッセイは、例えば、Schmalzing and Nashabeh, Electrophoresis 18:2184-93(1997), およびBao, J Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-80(1997)に記載のレーザー誘導蛍光と共同して使用することもできる。フローインジェクションリポソームイムノアッセイなどのリポソームイムノアッセイおよびリポソームイムノセンサを使用して可溶性Ｃ末端アジポネクチンを検出しそして本発明のある方法に従ってＣ末端アジポネクチンフラグメントのレベルを決定するのに使用することもできる（Rongen et al., J. Immunol. Methods 204:105-133(1997)）。
【００５８】
本発明のある方法においてサンドイッチ酵素イムノアッセイも有用でありうる。二抗体サンドイッチアッセイにおいて、第１の抗体を固体支持体に結合させそして抗原を第１抗体に結合させる。可溶性Ｃ末端アジポネクチンフラグメントの量は、それに結合する第２抗体の量を測定することにより定量されうる。
【００５９】
本発明の方法において可溶性Ｃ末端アジポネクチンフラグメントのレベルを決定するのに定量的ウエスタンブロッティングを使用することもできる。ウエスタンブロットは、スキャニングデンシトメトリーなどの周知の方法により定量されうる。例として、タンパク質サンプルは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥLaemmliゲル上で電気泳動される。一次マウスモノクローナル抗体をブロットと反応させそして抗体結合は予備スロットブロット実験を使用して線状であることが確認される。ヤギ抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼカップルド抗体（BioRad）を二次抗体として使用しそしてシグナル検出は、例えば、製造者のインストラクションに従ってルネッサンス化学発光キット（New England Nuclear, Boston, Mass）による化学発光を使用して行なわれる。ブロットのオーラジオグラフをスキャニングデンシトメトリーを使用して解析し（Molecular Dynamics: Sunnyvale, Calif）そしてポジティブコントロールに対して正規化する。値は、例えば、ポジティブコントロールに対する実際の値間の比として報告される（デンシトメトリーインデックス）。このような方法は、例えば、Parra et al., J. Vasc. Surg. 28:669-675(1998)に記載のとおり当技術分野で周知である。
【００６０】
アジポネクチンレセプターフラグメントのレベルは、タンパク質マイクロアレイを使用して決定することもできる。臨床サンプル中のタンパク質のレベルを検出するように適合されうるタンパク質マイクロアレイを産生する方法は、当技術分野に記載されている（例えば、Xiano et al. (2005) Mol Cell Endocrinol; 230(1-2): 95-10; Protein Microarrays(2004) Mark Schena(Ed) Jone & Bartlett Publishers, Inc.参照）。U.S.Patent Pub. 2003/0153013は、膜上でタンパク質マイクロアレイにおいて抗体を固定化しそして、タンパク質に結合してタンパク質複合体を形成することができる検出タンパク質とマイクロアレイを接触させることによりタンパク質、例えば抗原または抗体を検出する方法を記載する。同様に、US Patent Pub. 2004/0038428は、タンパク質マイクロアレイを構築する方法を記載している。
【００６１】
ある好ましい態様では、バイオチップによりサンプルを解析する。バイオチップは、一般に固体基材を含み、そして一般に平面状表面を有し、該平面状表面に捕捉剤（吸着剤またはアフィニティー剤とも呼ばれる）が結合されている。しばしば、バイオチップの表面は、複数のアドレス可能なロケーションを有しており、該ロケーションの各々はそこに捕捉剤を結合されている。
【００６２】
タンパク質バイオチップは、ペプチドの捕捉に適合したバイオチップである。多くのタンパク質バイオチップが当技術分野で記載されている。これらは、例えば、Ciphergen Biosystems, Inc.(Fremont,CA). Packard BioScience Company (Meriden CT), Zymox(Hayward, CA), Phylos(Lexington, NA)および Biacire(Uppsala, Sweden)により産生されたタンパク質バイオチップを含む。このようなタンパク質バイオチップの例は、下記の特許または公開特許出願：U.S.Patent No. 6,225,047; PCT International Publication No. WO 99/51773; U.S.Patent No. 6,329,209, PCT International Publication No. WO 00/56934およびU.S.Patent No. 5,242,828,に記載されており、これらはそのままでおよびすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
本発明での使用のために、アッセイ方法は、固体基材上にＣ末端アジポネクチンレセプターフラグメントを捕捉することを包含することができる。典型的には、それらは、抗体、特にイムノアッセイで使用される抗体などの生物特異的捕捉試薬を使用して捕捉されるであろう。生物特異的捕捉試薬は、例えば、少なくとも１０−9M、１０−10M、１０−11M、または１０−12Mのアフィニティーでターゲットアナライトに結合するこれらの分子を含む。これらの分子は、クロマトグラフィー物質などの非特異的方法により捕捉されることもできる。
【００６４】
本発明のある態様において、アジポネクチンレセプターの少なくとも１つのＣ末端フラグメントは、質量分析法により検出されるであろう。質量分析計の例は、飛行時間型、磁気セクター、４重極フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電気セクターアナライザーおよびこれらのハイブリッドである。
【００６５】
本発明で使用するための好ましい質量分析法は、例えば、Hutchens and YipへのU.S.Patents No. 5,719,060およびNo. 6,225,047に記載された「表面増強レーザー脱離イオン化」または「ＳＥＬＤＩ」であり、それらの各々は、そのままでおよびすべての目的のために参照により本明細書に組みこまれる。これは、アナライトが、質量分析計のプローブ界面にかみ合う（engages）ＳＥＬＤＩプローブの表面に捕捉される、脱離／イオン化気相イオン分析法（例えば、レーザー脱離／イオン化質量分析法）の方法を指す。
【００６６】
ＳＥＬＤＩの１つのバージョンは「アフィニティー質量分析法」と呼ばれる。このバージョンは、吸着表面を含むプローブ（「アフィニティー質量分析法プローブ」の使用を包含する。この文脈において、「プローブ」は、プローブ界面にかみ合いそしてイオン化および質量分析計への導入のためのイオン化エネルギーにアナライトを提示するように適応した装置を指す。プローブは、典型的には、サンプル提示表面を有する柔軟性または硬質の固体基材を含み、サンプル提示表面でアナライトはイオン化エネルギーのソースに提示される。
【００６７】
ＳＥＬＤＩの他のバージョンは、プローブ表面に結合したエネルギー吸収分子を含むプローブ（「ＳＥＮＤプローブ」）の使用を含む表面増強ニート脱離（Surface-Enhanced Neat Desorption）（「ＳＥＮＤ」）である。語句「エネルギー吸収分子」（ＥＡＭ）は、レーザー脱離／イオン化ソースからエネルギーを吸収することができ、従って、それと接触しているアナライト分子の脱離およびイオン化に寄与することができる分子を示す。ＥＡＭの種類は、しばしば「マトリックス」と呼ばれるＭＡＬＤＩにおいて使用される分子を含みそしてケイヒ酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ）、シアノ−ヒドロキシ−ケイヒ酸（ＣＨＣＡ）およびジヒドロキシ安息香酸、フェルル酸およびヒドロキシアセトフェノン誘導体により例示される。ある態様においては、エネルギー吸収分子は、線状ポリマーまたは架橋したポリマー、例えばポリメタクリレートに組み込まれる。例えば、組成物は、シアノ−４−メタクリロイルオキシケイヒ酸とアクリレートのコポリマーであることができる。他の態様においては、組成物は、シアノ−４−メタクリロイルオキシケイヒ酸、アクリレートおよび３−（トリ−エトキシ）シリルプロピルメタクリレートのコポリマーである。他の態様においては、組成物は、シアノ−４−メタクリロイルオキシケイヒ酸とオクタデシルメタクリレート（Ｃ１８ＳＥＮＤ）のコポリマーである。ＳＥＮＤは更にU.S.Patent No. 6,124,137に記載されており、これはそのままそしてすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
「選択性表面」は、ＳＥＬＤＩ分析のためにフラグメントを捕捉するのに使用されうる。選択性表面は、表面に結合された「結合部分」または「捕捉試薬」とも呼ばれる「吸着剤」を有する。「吸着剤」、または「捕捉試薬」または「結合部分」は、アナライトに結合することができる任意の物質であることができる。捕捉試薬は、選択性表面の基材に直接結合させることができ、または基材は、例えば共有結合または配位共有結合を形成する反応により、捕捉試薬に結合することができる「反応性部分」を有する「反応性表面」であることができる。エポキシドおよびカルボジイミダゾールは、抗体または細胞レセプターなどのポリペプチド捕捉試薬に共有結合により結合するための有用な反応性部分である。ニトリロ酢酸およびイミノジ酢酸は、ヒスチジン含有ペプチドと非共有結合的に相互作用する金属イオンに結合するためのキレート化剤として機能する有用な反応性部分である。
【００６９】
ある態様においては、Ｃ末端アジポネクチンレセプターフラグメントを捕捉するのに使用される吸着剤は、二重特異的捕捉試薬を含む。「二重特異的吸着剤」は、少なくとも１０−9M、１０−10M、１０−11M、または１０−12Mのアフィニティーでアナライトに結合する吸着剤を指す。好ましい二重特異的捕捉試薬は、抗体またはその結合性フラグメントである。これは、インタクトな免疫グロブリンおよび当技術分野で周知のそれらの変異体および部分、例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメントおよびｓｃＦｖタンパク質を含む。他の二重特異的捕捉試薬は、アフィボデイ（affibodies）を含む（Affiboddy, Teknikringen 30, floor 6, Box 700 04, Stockholm SE-10044, Sweden, US Pat No: 5,831,012; Surface Logix, Inc., 50 Sokdiers Field Place, Brighton, MA 02135 and Hodneland, C. D, et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. 99:5048-5052も参照）。
【００７０】
本発明のフラグメントは、クロマトグラフィー吸着剤上に捕捉されうる。「クロマトグラフィー吸着剤」は、典型的にクロマトグラフィーで使用される吸着剤物質を指す。クロマトグラフィー吸着剤は、例えば、ニトロセルロース膜、イオン交換物質、金属キレート化剤（例えば、ニトリロ酢酸またはイミノジ酢酸）、固定化された金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、染料、簡単な生物分子（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖および脂肪酸）および混合様式吸着剤（例えば、疎水性吸引／静電的反発吸着剤）を含む。
【００７１】
ある態様においては、吸着剤を有する基材を、存在しうるターゲットアナライトを吸着剤に結合させるのに十分な時間の期間、サンプル、例えば患者血清と接触させる。インキュベーション期間の後に、基材を洗浄して結合しなかった物質を除去する。任意の適当な洗浄溶液を使用することができ；好ましくは水性溶液を使用する。分子が結合したままでいる程度は、洗浄のストリンジェンシーを調節することにより操作することができる。洗浄溶液の溶離特性は、例えば、pH、イオン強度、疎水性、カオトロピズム（chaotropism）の程度、洗剤強度および温度に依存することができる。プローブがＳＥＡＣおよびＳＥＮＤの性質の両方を有さないならば、エネルギー吸収分子は、結合したターゲットアナライトを有する基材に適用される。
【００７２】
基材に結合した生物分子は、飛行時間型質量分析計などの気相イオン分光計において検出されうる。ターゲットアナライトを、レーザーなどのイオン化ソースによりイオン化することができ、発生したイオンをイオン光学アセンブリーにより集め、次いで質量分析機は通過イオンを分散させそして分析する。次いで検出器は検出されたイオンの情報を質量対電荷比に転換する。ターゲットアナライトの検出は、典型的にはシグナル強度の検出を包含するであろう。したがって、ターゲットアナライトの量および質量を決定することができる。
【００７３】
他の質量分析法においては、ターゲットアナライトは、ターゲットアナライトに結合するクロマトグラフィー的性質を有するクロマトグラフィー樹脂、例えば抗体（１つまたは複数）上に最初に捕捉されうる。この例では、これは、Ｃ末端アジポネクチンレセプターフラグメントに結合する抗体を含む免疫クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。結合していない物質は、樹脂から洗浄されうる。次いでターゲットアナライトを樹脂から溶離することができる。最後に、溶離されたターゲットアナライトをＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩにより検出することができる。
【００７４】
飛行時間型質量分析法によるアナライトの分析は、飛行時間スペクトルを発生する。最終的に解析された飛行時間スペクトルは、典型的にはサンプルに対するイオン化エネルギーの単一パルスからのシグナルを表すのではなくて、むしろ多数のパルスからのシグナルの輪を表す。これは、ノイズを減少させそしてダイナミックレンジを増加させるるこの飛行時間データは次いでデータプロセッシングに付される。
【００７５】
ターゲットアナライトの脱離および検出により発生したデータを、プログラム可能なディジタルコンピューターの使用により解析することができる。コンピュータープログラムは、データを解析して検出されたタンパク質の数、および場合により検出された各ターゲットアナライトについてのシグナル強度および決定された分子質量を示す。データ解析は、ターゲットアナライトのシグナルの強度を決定しそして所定の統計的分布から逸脱するデータを除去する工程を含むことができる。例えば、観察されたピークは、ある参照に対する各ピークの高さを計算することにより正規化されうる。該参照は、機器および化学品、例えばスケールにおいてゼロとして設定されるエネルギー吸収分子、により発生したバックグラウンドノイズであることができる。
【００７６】
解析は、一般に、アナライトからのシグナルを表すスペクトルのピークの同定を包含する。ピーク選択は視覚によりなされうるが、ピークの検出を自動化することができるソフトウエアが利用可能である。一般に、このソフトウエアは、選ばれた閾値より高いシグナル対ノイズ比を有するシグナルを同定しそしてピークシグナルの重心でピークの質量をラベリングすることにより機能する。１つの有用な用途においては、多くのスペクトルを比較して、質量スペクトルのある選ばれた百分率において存在する同じピークを同定する。このソフトウエアの１つのバージョンは、規定された質量範囲内の種々のスペクトルにおいて出現するすべてのピークをクラスターリングし、そして質量（M/Z）クラスターの中点付近にあるピークのすべてに質量（Ｍ／Ｚ）を割り当てる。
【００７７】
データを解析するために使用されたソフトウエアは、シグナルが本発明に従うターゲットアナライトに対応するシグナルにおけるピークを表すがどうかを決定するためにシグナルの解析にアルゴリズムを適用するコードを含むことができる。このソフトウエアは、観察されたターゲットアナライトピークに関するデータを分類樹（classification tree）またはＡＮＮ解析に供して、心臓血管疾患状態を示すターゲットアナライトピークまたはターゲットアナライトピークの組み合わせが存在するかどうかを決定することもできる。データの解析は、サンプルの質量分光分析から直接または間接に得られる種々のパラメーターに「合わせられる（“keyed”）」ことができる。これらのパラメーターは、１つ以上のピークの存在または不存在、ピークもしくはピークの群の形状、１つ以上のピークの高さ、１つ以上のピークの高さの対数およびピーク高さデータの他の計算処理（arithmetic manipulations）を含むが、それらに限定されない。
【００７８】
ＩＶ．抗体
本発明は、更に、アジポネクチンレセプターのＣ末端フラグメントに特異的に結合する抗体を提供する。ペプチドを選択するために結合特異性を有する抗体を作成する方法は当技術分野で周知である。例えば、このような抗体は、ターゲット分子で動物を免疫感作させ、抗体を発生させそして抗体を試験して特定の抗体がターゲット分子に結合するかどうかを同定することにより選択されうる。ターゲット分子と結合する抗体を選択することができる。例えば、これらの分子に対するモノクローナル抗体を発生させることができる。
【００７９】
語句「・・・に特異的に結合する」は、他の生物学的製剤（biologics）の異種の集団（heterogeneous population）の存在下にターゲットの存在を決定する結合反応を指す。したがって、指示されたアッセイ条件下に、特定された結合領域は、特定のターゲットに優先的に結合しそして試験サンプル中に存在する他の成分に有意な量で結合しない。このような条件下のターゲットへの特異的結合は、特定のターゲットに対するその特異性について選択される結合部分を必要としうる。種々のアッセイフォーマットを使用して、特定のアナライトと特異的に反応性の結合領域を選択することができる。典型的には、特異的反応または選択性反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、そして更に典型的には、バックグラウンドの１０倍より高い。
【００８０】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして特定的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、二重特異性抗体、ダイアボディ（diabodies）、キメラ抗体、一本鎖抗体およびヒト化抗体ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ）（それらが所望の生物学的活性を示す限り）を包含する。抗体は、生物学的アッセイに使用するために標識されることができて（例えば、放射性同位元素標識、蛍光標識）、抗体の検出を助けることができる。
【００８１】
抗体は、生物学的アッセイに使用するために標識され／レポーター分子にコンジュゲーションされ得て（例えば放射性同位元素標識、蛍光標識）本明細書に記載のフラグメントの検出を助けることができる。
【００８２】
本明細書で使用された用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち集団を構成する個々の抗体は、少量で存在することができる可能な天然に存在する突然変異体を除いては同じである。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して指向され、高度に特異的である。更に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を含む普通の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して指向される。それらの特異性のほかに、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されないハイブリドーマ培養により合成されるという点で有利である。この修飾句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の性質を示し、いずれかの特定の方法による産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler, et al., Nature, 256: 495, 1975により最初に記載されたハイブリドーマ法により作成されうるか、またはリコンビナントＤＮＡ法（例えば、U.S.Pat. No. 4,816,567, Cabilly, et al.参照）により作成されうる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson, et al., 624-628, 1991; Marks, et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991,に記載の技術を使用してファージ抗体ライブラリー から単離することもできる。
【００８３】
本明細書においてモノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同じまたは相同性であるが、鎖（１つまたは複数）の残部は、他の種に由来する抗体または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同じまたは相同性である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにこのような抗体のフラグメント（それらが所望の生物学的活性を示す限り）を含む（Cabilly, et al., supra, Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855, 1984）。
【００８４】
モノクローナル抗体は、当業者にはよく知られている種々の技術により得ることができる。簡単にいえば、所望の抗原で免疫感作された動物からの脾臓細胞を普通に骨髄腫細胞との融合により不死化させる（Kohler, et al., Eur. J. Immunol, 6: 511-519,1976）。不死化の別の方法は、エプスタインバールウイルス、癌遺伝子またはレトロウイルスによるトランスフォーメーションまたは当技術分野で周知の他の方法を含む。単一の不死化された細胞から生じるコロニーを抗原に対する所望の特異性およびアフィニティーの抗体の産生についてスクリーニングし、そしてこのような細胞により産生されるモノクローナル抗体の収率を、脊椎動物ホストの腹腔内への注射を含む種々の技術により増強させることができる。あるいは、Huse, et al., Science, 246: 1275-1281, 1989により略述された一般的プロトコールに従ってヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりモノクローナル抗体またはその結合性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
【００８５】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を集め、そしてイムノアッセイ、例えば、固体支持体上に固定化された免疫原によるイムノアッセイにおいて免疫原タンパク質に対して力価を測定した。典型的には、１０４以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択しそして競合的結合イムノアッセイを使用して、それらの交差反応性について試験する。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．１mMのＫｄ、更に通常少なくとも約１μMのＫｄ、好ましくは少なくとも約０．１μMまたはそれより良好なＫｄ、そして最も好ましくは０．０１μMまたはそれより良好なＫｄで通常結合するであろう。
【００８６】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合性サブ配列）である。多くは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてもインポートされＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能を更に精密にしそして最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的すべてを含み、該可変ドメインにおいては、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的すべては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当しそしてＦＲ領域のすべてまたは実質的すべては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むであろう。更なる詳細については、Jones, et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann, et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992参照。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心のある抗原でマカクザル（macaque monkeys）を免疫感作することにより産生された抗体に由来する、Primatized（商標）抗体を含む。
【００８７】
本明細書に記載されたフラグメントの一部を含む多数の免疫原を使用してフラグメントと特異的に反応性の抗体を産生することができる。例えば、本発明のフラグメントは当技術分野で知られている技術を使用して単離されうる。リコンビナントタンパク質は、上記した真核細胞または原核細胞において発現され得、そして一般に上記したとおりに精製されうる。リコンビナントタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための好ましい免疫原である。あるいは、本明細書に開示された配列に由来しそして担体タンパク質にコンジュゲーションされた配列に由来する合成ペプチドを、免疫原として使用することができる。天然に存在するタンパク質は、純粋な形態または不純物を含む形態で使用することもできる。次いで産生物を、抗体を産生することができる動物に注射する。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、イムノアッセイにおいてその後に使用してタンパク質を測定するために発生させることができる。
【００８８】
ポリクローナル抗体の産生の方法は、当業者に知られている。同系交配系（inbred strain）のマウス（例えばＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギをフロイントアジュバントなどの標準アジュバントおよび標準免疫感作プロトコールを使用してタンパク質で免疫感作させる。免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、試験出血を採取しそしてβサブユニットに対する反応性の力価を決定することにより監視する。免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られるとき、血液を動物から集めそして抗血清を調製する。タンパク質に対して反応性の抗体を濃縮するための抗血清の更なる分画（fractionation）を、所望ならば行なうことができる（Harlow & Lane. supra参照）。
【００８９】
更なる態様では、抗体または抗体フラグメントは、それぞれファージライブラリーを使用してマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載するMcCafferty, et al., Nature, 348: 552-554, 1990: Clackson, et al., Nature, 352: 624-628, 1991; Marks, et al., J. Mol.Biol., 222: 581-597, 1991に記載の技術を使用して発生させた抗体ファージライブラリーから単離することができる。その後の刊行物は、鎖シャフリング（chain shuffling）による高アフィニティー（nM範囲）ヒト抗体の産生（Mark, et al., Bio Technology, 10:779-783, 1992）ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するためのストラテジーとしてコンビナトリアル感染およびin vivo組み換え（Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266, 1993）を説明する。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替法である。
【００９０】
ある態様において、抗体は、Ｃ末端アジポネクチンレセプターの１つのフラグメントと他のものとを識別するように選ばれ、即ち、同じアッセイ条件下に１つの形態に特異的に結合するが他の形態には結合しない抗体が選ばれる。
【００９１】
したがって、本発明は、配列番号１を有するアジポネクチンレセプターフラグメントのエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。ある態様において、抗体は、アジポネクチン結合ドメインの外側にある配列番号１の領域に特異的に結合するであろう、即ち、抗体は、配列番号１の残基１〜２２内のエピトープに特異的に結合するであろう。ある態様では、抗体は、残基１〜１４、２〜１４、２〜１４、３〜１４、４〜１４、５〜１４、６〜１４、７〜１４、８〜１４、９〜１４、１０〜１４、１４〜２２内のエピトープまたは配列番号１の残基２３〜３４内のエピトープに特異的に結合するであろう。ある態様では、抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２の１つに存在するエピトープに結合するであろう。ある態様では、抗体は、アジポネクチン結合ドメインの外側にある配列番号１〜１２の領域に特異的に結合するであろう。
【００９２】
本発明は、配列番号２３を有するアジポネクチンレセプターフラグメントのエピトープに特異的に結合する抗体も提供する。ある態様では、抗体は、アジポネクチン結合ドメインの外側にある配列番号２３の領域に特異的に結合するであろう、即ち、抗体は、配列番号２３の残基１〜２２内のエピトープに特異的に結合するであろう。ある態様では、抗体は、配列番号２３の残基１〜１４、２〜１４、２〜１４、３〜１４、４〜１４、５〜１４、６〜１４、７〜１４、８〜１４、９〜１４、１０〜１４、１４〜２２内のエピトープまたは配列番号２３の残基２３〜３４内のエピトープに特異的に結合するであろう。ある態様では、抗体は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４の１つに存在するエピトープに結合するであろう。ある態様では、抗体は、アジポネクチン結合ドメインの外側にある配列番号２３〜４４の領域に特異的に結合するであろう。
【００９３】
Ｖ．アジポネクチンレセプターフラグメントの疾患状態との相関
本明細書に記載の方法のあるものについて、少なくとも１つの可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントのレベルが、診断または予後の情報が所望される異なる患者サンプルにおいて決定されて、プロファイルを与える。特定のサンプルのプロファイルは、本質的にサンプルの状態の「フィンガープリント」である。正常な状態は、疾患状態から区別されることができ、そして疾患状態の範囲内で、異なる予後状態（例えば、良好または劣悪な長期生存の見込み）が決定されうる。診断は、患者サンプルを既知のプロファイルと比較することにより行なわれうるかまたは確認されうる。疾患進行期間中の異なる時間に可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントの発生を評価することにより、疾患の段階および起こりそうな予後を決定することができる。
【００９４】
診断試験の原理は、処理の結果と特定の臨床パラメーターとの相関である。この相関は、臨床パラメーターにより区別される２つ以上のグループ間の比較を必然的に伴う。臨床パラメーターは、例えば、疾患の存在もしくは不存在、疾患のリスク、疾患の段階、疾患の重篤度、疾患の種類または疾患の処置に対する応答であることができる。したがって、診断は、この相関を使用して被験体の状態を定性して、臨床パラメーターに関する被験体の状態を分類または診断し、この診断／分類の確実性は、試験で使用された兆候または症候の分類力または分離力（splitting power）に関係している。
【００９５】
可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントを定性または定量するための本明細書に記載の方法は、とりわけ、病理学的状態、疾患への素因、治療監視、リスク層別化と相関されうる情報を与える。
【００９６】
本方法は、状態を診断し、ある薬物が所望の効果を有するかどうかを評価し、そして予後を決定するのに特に有用である。本方法は、疾患の早期の検出および処置プロトコールの最適化のために使用することができる。好ましくは、状態、即ち、疾患状態は、アジポネクチンレセプターの異常なフラグメント化パターンと関連した疾患状態であろう。
【００９７】
本明細書での使用について、「状態を診断する」は、被験体が、特定された状態を有する増加した可能性（likelihood）を有するか有さないかを決定することを指す。状態を診断するのに使用される試験、例えば、本明細書に記載のアッセイは、ある場合には、独力では状態を診断することができないことがあるが、他の試験と組み合わせて使用して状態を診断する。したがって、「状態を診断する」は、状態の診断を助ける任意の方法を含むことも意味する。
【００９８】
ある態様では、本発明は、患者における疾患状態の進行を監視するための方法を提供する。この方法は、典型的には、患者からの第１生物学的サンプル、好ましくは尿、血漿、血清および／または全血サンプルを提供し、第１の時点で第１生物学的サンプル中の少なくとも１つの可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントを測定し、患者からの第２生物学的サンプルを提供し、第２時点で第２生物学的サンプル中の可溶性レセプターフラグメントを測定しそしてアジポネクチンレセプターフラグメントの量の変化に基づいてまたはコントロール集団からの測定値に対する比較に基づいて患者における疾患状態の進行を決定する工程を含む。時間と共に患者サンプル中の可溶性レセプターフラグメントを測定することにより、臨床医は、疾患状態が悪化したかまたは改善したかどうかを決定することができるであろう。したがって、臨床医は処置を適切に特殊な要求に合わせるためにこれらの測定値を利用することができる。少なくとも１つの可溶性Ｃ末端フラグメントのレベルを決定することを含む疾患状態の進行を監視するための方法は、疾患状態の進行を監視するための他の試験と組み合わせることができる。
【００９９】
脂肪細胞インバランスを有する被験体は、血液中のアジポネクチンレセプターフラグメントの、正常な被験体が有するパターンとは異なるパターンを有することを、本発明者等は発見した。したがって、本発明は、被験体からの体液サンプルにおける少なくとも１つのアジポネクチンレセプターフラグメントのレベルを決定することにより、被験体が脂肪細胞インバランスを有するかどうかを決定する方法を提供する。
【０１００】
例えば、被験体が脂肪細胞インバランスを有するかどうかを決定するために、本明細書に記載のフラグメントのレベルを決定することができる。ある態様では、あるフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸であり（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４および２６〜３３）そして一般に結合していないフラグメントの不存在または非常に低いレベルに過ぎない存在は、脂肪細胞インバランスを有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な脂肪細胞バランスを示すであろう。ある態様では、あるより小さなフラグメント、即ち、長さが１３〜２４アミノ酸である結合していないフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２５および３４〜４４）の増加した量の存在は、脂肪細胞インバランスを有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な脂肪細胞バランスを示すであろう。アジポネクチンレセプターフラグメントの増加した総レベル、即ち、アジポネクチンレセプターフラグメントの総濃度、の存在は、脂肪細胞インバランスを有するそれぞれの可能性を示すであろう。
【０１０１】
アジポネクチンの血液レベルが減少するにつれて、疾患を有する患者の百分率は増加する。約４．０μg/mlより少ないアジポネクチンの血液レベルを有する患者においては、メタボリック症候群と診断された患者の数は、著しく増加しそして冠動脈疾患のリスクも増加する。例えば、約４．０μg/mL以下のアジポネクチンの血液レベルを有する被験体は、４．０μg/mLより高いアジポネクチンの血液レベルを有する被験体と比較して冠動脈疾患を有する増加した可能性を有する（オッズ比は男性および女性で３．０より大きく、または男性で１．７より大きく、そして女性で１０より大きい）。用語アジポネクチンは、完全長のモノマー、球状および非球状部分ならびにアジポネクチンのオリゴマーを含む測定された全アジポネクチンを指す。閾値は、個々の形態を測定することができる特異的アッセイのために調節されうる。
【０１０２】
異なる時点で被験体から得られた生物学的流体サンプル中のこれらのフラグメントのレベルを測定することにより、脂肪細胞インバランスが改善されているかまたは悪化しているかどうかを決定することができる。同様に、治療介入の前後にこれらのフラグメントのレベルを測定することにより、治療が有効であるかどうかを決定することができる。
【０１０３】
アジポネクチンは、例えば肥満、インスリン抵抗性、二型糖尿病、メタボリック症候群、脂質異常症，心臓血管疾患および高血圧を含む多数の疾患状態に関与するアジポサイトである。本明細書での使用について、低アジポネクチン血症を有する被験体は、正常な被験体と比較して減少した血漿アジポネクチン濃度を有する。低アジポネクチン血症を有する被験体は、本方法を使用して同定されうる。本方法は、低アジポネクチン血症の発症、低アジポネクチン血症の進行および／または被験体における低アジポネクチン血症の処置の効力を決定するのに使用することができる。同様に、本方法は、低アジポネクチン血症により特徴付けられた状態の発症、低アジポネクチン血症により特徴付けられた状態の進行、および／または被験体における低アジポネクチン血症により特徴付けられた状態の処置の効力を決定するのに使用することができる。
【０１０４】
例えば、被験体が低アジポネクチン血症を有するかどうかを決定するために、本明細書に記載のフラグメントのレベルを決定することができる。ある態様では、あるフラグメント、即ち、長さが約１３〜２４アミノ酸である一般に結合していないフラグメント（即ち配列番号３、１２〜２２、２５および／または３４〜４４）の増加したレベルの不存在または存在は、低アジポネクチン血症を有する増加した可能性を示すであろう。ある態様では、あるより大きいフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸である一般に結合していないフラグメント（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４および２６〜３３）の減少した量の存在は、低アジポネクチン血症を有する増加した可能性を示すであろう。担体タンパク質、即ちアジポネクチンに結合していないかまたは結合している総アジポネクチンレセプターフラグメントの増加したレベルの存在は、一般に低アジポネクチン血症を有するそれぞれの可能性を示すであろう。
【０１０５】
異なる時点で被験体から採取された生物学的流体サンプル中のこれらのフラグメントのレベルを測定することにより、低アジポネクチン血症が改善されているかまたは悪化しているかを決定することができる。同様に、治療介入の前後にこれらのフラグメントのレベルを測定することにより、治療が有効であるかどうかを決定することができる。
【０１０６】
インスリンが脂肪細胞にアジポネクチンを産生させるとき、正常なインスリン感受性が生じる。完全長アジポネクチンは、典型的にはＬＭＷ、ＭＭＷおよびＨＭＷ形態と呼ばれるマルチマーに凝集する。アジポネクチンは、肝臓でアジポネクチンレセプター２と相互作用しそして筋肉でアジポネクチンレセプター１と相互作用して、グルコース産生を停止させそして解糖および脂肪酸酸化を引き起こす。アジポネクチンレセプター１は球状アジポネクチンと呼ばれるアジポネクチンの切断した形態と反応し、これに対してアジポネクチンレセプター２は完全長アジポネクチンに反応する。球状アジポネクチンは、血液エラスターゼの作用により生成することが他の人々により最近示された。
【０１０７】
脂肪細胞が肥大しそしてインスリンに応答してより少ないアジポネクチンを産生するとき、インスリン抵抗性が起こる。この状態において、細胞はよりアポトーシス性となりそして細胞はゆっくりと分裂する。結果として血漿アジポネクチンレベルは減少する。インスリンレベルは、細胞により多くのアジポネクチンを遊離させようとして上昇する。しかしながら、インスリン抵抗性が悪化するにつれて、より多くのインスリンおよびより少ないアジポネクチンが産生される。より少ないアジポネクチンは、筋肉においてより少ない解糖および脂肪酸酸化をもたらしそして肝臓グルコース産生が停止するのを阻止する。
【０１０８】
本明細書での使用について、インスリン抵抗性は、血流からのグルコースの処分の速度（rate of disposal）（例えば、筋肉、脂肪および肝臓などのインスリン感受性組織への）により評価されるin vivoでのインスリンの生物学的作用の個体における減少をさす。
【０１０９】
糖尿病は、欠陥のあるインスリン分泌および／または作用により慢性高血糖症として定義される。この疾患の主要な分類は、通常自己免疫プロセスにより膵臓β細胞破壊を伴うＩ型と、インスリンの損なわれた生理学的有効性、即ちインスリン抵抗性を伴うＩＩ型である。糖尿病は、しばしばランダムなまたは空腹時血漿グルコースの決定の使用による高血糖症の証明により、または経口グルコース耐性試験（oral glucose tolerance test）により最初に診断される。グルコース耐性試験はインスリン抵抗性を測定しない。
【０１１０】
一旦糖尿病が診断されると、インスリンおよびＣペプチドについてのアッセイを使用してＩ型糖尿病とＩＩ型糖尿病を区別することができ、そしてＩＩ型糖尿病の中でも、食事および運動パターンの変化により処理されうるＩＩ型糖尿病からインスリン処置を必要とするＩＩ型糖尿病を区別することができる。食事および運動パターンの変化のみで処理されうる境界症例からインスリン処置を必要とするＩＩ型糖尿病を区別することは困難である。
【０１１１】
インスリンは、膵臓β細胞により遊離されて、グルコースの細胞取り込みを促進しそして内在性グルコースを抑制することにより血中グルコースレベルを減少させるポリペプチドホルモンである。インスリンの直接の前駆体は、プロインスリン（分子量９kDa）、３つのジスルフイド橋を有する８６アミノ酸からなる単一鎖ポリペプチドである。タンパク質分解切断は、２つのジスルフイド橋により接合された２つの鎖における５１アミノ酸からなるインスリン（分子量、６kDa）および連結ペプチド（Ｃペプチド：分子量３kDa）、３１アミノ酸を含有する単一ポリペプチド鎖、を産生する。次いで等モル量のインスリンとＣペプチドが循環系に分泌される。循環しているＣペプチド濃度は、Ｃペプチドのはるかに長い半減期の結果としてインスリンの濃度より約５〜１０倍高い。したがって、Ｃペプチは身体の自然のインスリン産生の目安でありそして静脈内合成インスリンの存在において測定されうる。
【０１１２】
インスリン抵抗性の測定のためのゴールドスタンダードは、血中グルコースレベルを維持するためにインスリン注入速度（ＩＩＲ）により調節されるグルコース注入速度（ＧＩＲ）を測定するためのグルコースクランプ法（Ｍ値）である。第２のよく知られた測定は、空腹時グルコースおよびインスリン（ＨＯＭＡ−ＩＲ）である。アジポネクチンの血中レベルと相関したＭ値（グルコースクランプ法により決定された、ゴールドスタンダード）は、アジポネクチンがインスリン抵抗性のインディケーターでありうることを示すことが報告された。追加の相関は、アジポネクチンにより訂正された空腹時グルコースおよびインスリン血中レベルの測定である（ＦＢＳ×ＦＩＲＩ／ＡＮＤ）（空腹時血中グルコース×空腹時インスリンレベル／アジポネクチン）。
【０１１３】
本方法を使用してインスリン抵抗性を有する被験体を同定することができる。更に本方法を使用して糖尿病被験体におけるインスリン抵抗性の重篤度を決定しそして適切な処置を推奨することができる。
【０１１４】
例えば、被験体がインスリン抵抗性を有するかどうかを決定するために、本明細書に記載のフラグメントのレベルを決定することができる。ある態様では、あるフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸でありそして一般に結合していないフラグメント（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４、および／または２６〜３３）の減少したレベルの不存在または存在は、インスリン抵抗性を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。ある態様では、あるより小さいフラグメント、即ち、長さが１３〜２４アミノ酸である結合していないフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２５、および／または３４〜４４）の増加したレベルの存在は、インスリン抵抗性を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。担体タンパク質、即ちアジポネクチンに（結合したまたは結合していない）アジポネクチンレセプターフラグメントの総濃度の増加は、一般にインスリン抵抗性を有する増加した可能性を示す。
【０１１５】
異なる時点で被験体から採取された生物学的流体サンプル中のこれらのフラグメントのレベルを測定することにより、インスリン抵抗性が改善されているかまたは悪化しているかを決定することができる。同様に、治療介入の前後にこれらのフラグメントのレベルを測定することにより、治療が有効であるかどうかを決定することができる。
【０１１６】
メタボリック症候群は、減少した血漿アジポネクチンレベルと関連しておりそして本発明の方法を使用して監視されうる。症候群Ｘとしても知られているメタボリック症候群は、体重過大患者および肥満患者および２型糖尿病を有する患者における過剰の心臓血管疾患罹病率の責を負わせられる危険因子の集まりである。
【０１１７】
世界保健機関（World Health Organization）およびNational Cholesterol Education Program-Adult Tretment Patent（NCEP-ATPIII）は、メタボリック症候群に対する診断基準を示した。本発明における使用について、メタボリック症候群は、下記したＷＨＯ診断基準により定義される（Darwin Deen, American Family Physician, 69(12)(2004)2875-2882）。
【０１１８】
【表１０】
2009518653.tif 000011
【０１１９】
本発明者等は、体液中の可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントのレベルが被験体におけるメタボリック症候群のインディケーターであることを見出した。したがって、本方法は、メタボリック症候群を有する被験体を同定するのに使用することができる。これらの方法は、メタボリック症候群を同定するための他の診断基準のいずれか１つと組み合わせて使用することができる。
【０１２０】
例えば、被験体がメタボリック症候群を有するかどうかを決定するために、本明細書に記載のフラグメントのレベルを決定することができる。ある態様では、あるフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸であり（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４、および／または２６〜３３）そして一般に結合していないフラグメントの減少したレベルの不存在または存在は、メタボリック症候群を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。ある態様では、あるより小さいフラグメント、即ち、長さが１３〜２４アミノ酸であるフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２５、および／または３４〜４４）の増加した量の存在は、メタボリック症候群を有する増加した可能性を示すであろう。担体タンパク質、即ちアジポネクチンに結合していないかまたは結合しているアジポネクチンレセプターフラグメントの総濃度の増加は、一般にメタボリック症候群を有する増加した可能性を示す。
【０１２１】
急性冠症候群（ＡＣＳ）は、心臓に対する虚血性発作から生じる冠障害の群に適用された。急性冠症候群は、心臓の状態（cardiac condition）を伴うかまたは伴わない血管造影評価により６０％より高い血管閉塞（vascular blockage）として定義される。
【０１２２】
本発明者等は、体液中の可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントのレベルが被験体における血管閉塞のインディケーターであることを見出した。したがって、本方法は、血管閉塞を有する被験体を同定するのに使用することができる。これらの方法は、血管閉塞を同定するための他の診断基準のいずれか１つと組み合わせて使用することができる。
【０１２３】
例えば、被験体が血管閉塞を有するかどうかを決定するために、本明細書に記載のフラグメントのレベルを決定することができる。ある態様では、あるフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸でありそして一般に結合していないフラグメント（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４、および／または２６〜３３）の減少したレベルの不存在または存在は、血管閉塞を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。ある態様では、あるより小さいフラグメント、即ち、長さが１３〜２４アミノ酸であるフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２５、および／または３４〜４４）の増加した量の存在は、血管閉塞を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。担体タンパク質、即ちアジポネクチンに結合していないかまたは結合しているアジポネクチンレセプターフラグメントの総濃度の増加は、一般に血管閉塞を有する増加した可能性を示す。
【０１２４】
心臓血管疾患状態（cardiovascular disease condition）としても知られた心臓の状態は、一般に冠動脈性心疾患（coronary heart disease）（心筋梗塞および狭心症を更に含む）または冠動脈疾患（coronary artery disesase）、発作、先天性心不全およびうっ血性心不全、先天性心不全、および高血圧を含むがそれらに限定されない心臓血管不全から生じる疾患を意味する。冠動脈性心疾患は心筋梗塞および狭心症も含む。心臓血管疾患は、一般に心臓または他のターゲット器官への血液の供給障害により特徴付けられる。「心不全」は、心臓が、代謝組織の要求に対して必要な速度で血液を押し出さない、心臓機能の異常を指す。心不全は、虚血性、先天性、リウマチまたは特発性形態を含む多数の因子により引き起こされうる。
【０１２５】
冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）は、冠状動脈の内壁の厚化により引き起こされる。アテローム性動脈硬化症と呼ばれるこの厚化は、血液が流れることができる空間を狭くして、心臓への酸素および栄養の供給を減少させそしてときには完全に遮断する。アテローム性動脈硬化症は、通常、人が血中のコレステロールの高いレベルを有するときに起こる。血中で循環しているコレステロールおよび脂肪は動脈の壁に蓄積する。この蓄積は、動脈を狭くしそして血液の流れを遅くするかまたは遮断することがある。血中のコレステロールのレベルが高いとき、動脈壁にそれが付着する可能性が高くなる。このプロセスは、幼少期およびティーンエイジの年齢期間中に大抵の人々において始まり、そして年を取るにつれて悪化する。
【０１２６】
うっ血性心不全または（ＣＨＦ）は、次第に十分な拍出量（時間と共に心臓により押し出される血液の容積）を供給することができなくなり、酸素化された血液を末梢組織に送ることができなくなる進行性病理学的状態である。ＣＨＦが進行するにつれて、構造的および血行力学的損傷が起こる。これらの損傷は種々の表示を有するが、１つの特徴的症候は、心室肥大である。ＣＨＦは多数の種々の心臓障害のよく知られた最終結果である。
【０１２７】
心筋梗塞は、一般に、しばしば層をなした冠状動脈血栓症（superimposed coronary thrombosis）を伴う、冠状動脈のアテローム性動脈硬化症から生じる。それは２つの主要なタイプ：心筋壊死が心室壁の全厚さに及ぶ経壁的梗塞、および壊死が、心室壁から心外膜まで途中ずっと及ぶことなく、心内膜下（subendocardium）、壁内心筋層（intramural myocardium）またはその両方に及ぶ心内膜下（非経壁的）梗塞に分けられうる。心筋梗塞は、心臓の損傷を受けたゾーンと健康なゾーンにおいて血行力学的効果の変化および構造の変化を引き起こすことが知られている。したがって、例えば、心筋梗塞は、心臓の最大心拍出量および１回拍出量を減少させる。間隙において起こるＤＮＡ合成の刺激ならびに冒されていない心臓の区域のコラーゲンの形成の増加も心筋梗塞と関連している。
【０１２８】
狭心症は、心臓のある部分が十分な血液を受けないときに起こる胸部における反復する痛みまたは不快感である。それは、心臓に血液を運ぶ血管が狭くなるときおよびアテローム性動脈硬化症により閉塞されるとき起こる冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）のよく知られた症候である。
【０１２９】
本方法によるこれらの疾患のすべての診断および監視は、本発明により包含される。
【０１３０】
例えば、体液中の可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントのレベルが、被験体、特に動脈硬化症に既に罹患している被験体がうっ血性心不全、心筋梗塞または虚血を発生するかまたは有する可能性があるかどうかを示すことを、本発明者等は発見した。したがって、本方法は、うっ血性心不全、心筋梗塞または虚血を有する被験体を同定するのに使用することができる。これらの方法は、これらの状態を同定するための他の診断基準のいずれか１つと組み合わせて使用することができる。
【０１３１】
例えば、被験体がうっ血性心不全、心筋梗塞または虚血を有するかまたは発生する可能性があるかどうかを決定するために、本明細書に記載のフラグメントのレベルを決定することができる。ある態様では、あるフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸であり（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４、および／または２６〜３３）そして一般に結合していないフラグメントの減少したレベルの不存在または存在は、うっ血性心不全、心筋梗塞または虚血を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。ある態様では、あるより小さいフラグメント、即ち、長さが１３〜２４アミノ酸である結合していないフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２５、および／または３４〜４４）の増加した量の存在は、うっ血性心不全、心筋梗塞または虚血を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。担体タンパク質、即ちアジポネクチンに結合していないかまたは結合しているアジポネクチンレセプターフラグメントの総濃度の増加は、一般にうっ血性心不全、心筋梗塞または虚血を有する増加した可能性を示す。
【０１３２】
同様に、本方法は、高血圧、肥満、脂肪血症または炎症を有する被験体を同定するのに使用することができる。これらの方法は、これらの状態を同定するための他の診断基準のいずれか１つと組み合わせて使用することができる。これらの状態のすべてにおいて、ある態様では、あるフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸であり（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４、および／または２６〜３３）そして一般に結合していないフラグメントの減少したレベルの不存在または存在は、上記状態を有する増加した可能性を示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。ある態様では、特定の小さいフラグメント、即ち、長さが１３〜２４アミノ酸である結合していないフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２４、および／または３４〜４４）の増加した量の存在は、上記状態を有することを示すであろう。反対に、これらのフラグメントの正常なレベルの存在は、正常な状態を示すであろう。担体タンパク質、即ちアジポネクチンに結合していないかまたは結合しているアジポネクチンレセプターフラグメントの総濃度の増加は、一般に上記状態を有する増加した可能性を示す。
【０１３３】
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つのフラグメントの特異的測定を使用する診断、予後および治療方法を提供する。本方法は、最初にアジポネクチンレセプターフラグメントの測定を与え、次いでこの測定を疾患状態と相関させることを包含する。測定を相関させることにより、問題の特定の臨床的パラメーターに関して被験体の状態を定性することができる。好ましい態様では、測定は、上記したアフィニティー質量分析法によりなされる。
【０１３４】
状態を正確に予測するための診断試験の力は、アッセイの敏感度、アッセイの特異度および受診者動作特性（「ＲＯＣ」）曲線下の面積として普通は測定される。敏感度は、陽性であることが試験により予測される真の陽性の百分率であり、特異度は、陰性であることが試験により予測される真の陰性の百分率である。ＲＯＣ曲線は、１−特異度の関数として試験の敏感度を与える。ＲＯＣ曲線下の面積が大きければ大きいほど、試験の予測値はより強力である。試験の有用性の他の有用な目安は、陽性予測値および陰性予測値である。陽性予測値は、陽性として試験する実際の陽性の百分率である。陰性予測値は、陰性として試験する実際の陰性の百分率である。
【０１３５】
本明細書に記載のフラグメントは、個々にまたは組み合わせにおいて疾患状態の決定を助けるのに有用である。ある態様では、最初に、選ばれたバイオマーカー、即ち、特定のフラグメントを本明細書に記載の方法を使用して被験体サンプルにおいて測定する、例えばＳＥＬＤＩバイオチップ上で捕捉し、次いで質量分析法により検出する。次いで、測定値を、１つの診断パラメーターを他の診断パラメーターから区別する、例えば陽性インスリン抵抗性パラメーターを陰性インスリン抵抗性パラメーターから区別する、診断量またはカットオフと比較する。診断量は、それより上または下で被験体は特定の疾患を有するとして分類されるバイオマーカーの測定された量を表す。例えば、フラグメントが疾患状態において正常と比較してアップレギュレーションされるならば、診断カットオフより高い測定された量は疾患の診断を与える。あるいは、バイオマーカーが疾患においてダウンレギュレーションされるならば、診断カットオフより低い測定された量は疾患の診断を与える。当技術分野でよく理解されているとおり、アッセイにおいて使用される特定の診断カットオフを調節することにより、診断医の選択に依存して診断アッセイの敏感度または特異度を増加させることができる。
【０１３６】
ある態様では、フラグメントの量を定量することなく特定のフラグメントの単なる存在または不存在のみが有用でありそして疾患、即ちインスリン抵抗性の確かな診断（probabale diagnosis）と相関させることができる。したがって、被験体におけるこれらのマーカーのそれぞれ、検出された存在または不存在は、被験体がインスリン抵抗性を有するより高い確率を有することを示すことができる。
【０１３７】
疾患状態を定性する方法のある態様では、本方法は、状態に基づく被験体処置を管理することを更に含む。このような管理は、疾患状態を決定した後医師または臨床医の活動を記載する。例えば、医師が疾患の診断をするならば、ある処置方法が続くであろう。例えば、多くの人々について、心臓血管心疾患がライフスタイルの変化および投薬により管理される。重篤な心臓血管心疾患を有する他の人々は手術を必要とすることがある。いずれにせよ、心臓血管心疾患が発生すると、生涯にわたる管理を必要とする。あるいは、冠動脈性心疾患または他の心臓血管疾患状態がないという診断では、その後処置は行なわれないことがある。診断試験が冠動脈性心疾患状態に関して結論のでない結果を与えるならば、更なる試験が必要とされうる。
【０１３８】
個々のバイオマーカーは有用な診断マーカーであるが、バイオマーカーの組み合わせが単一のマーカーのみよりも大きい特定の状態の予測値を与えることができることが見出された。特定的には、サンプル中の複数のマーカーの検出は、真の陽性診断および真の陰性診断の百分率を増加させることができ、そして偽陽性または偽陰性診断の百分率を減少させることができる。したがって、ある態様では、本方法は本明細書に記載の複数のフラグメントを検出することを包含する。
【０１３９】
したがって、１つの局面において、本発明は、関心のある臨床パラメーターと相関するアジポネクチンレセプターフラグメントのパターンを発見するための方法を提供する。
【０１４０】
ある態様では、本発明は、第１の生物学的サンプル、好ましくは尿および／または血漿サンプルを提供し、第１の時点で第１生物学的サンプル中の少なくとも１つの可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントの量を測定し、患者からの第２生物学的サンプルを提供し、第２の時点で第２生物学的サンプル中の前記フラグメントを測定し、フラグメントの量の変化に基づいてまたはコントロール集団との比較に基づいて患者における応答を決定する工程を含む、治療に対する応答を測定するための方法を提供する。被験体は、陽性応答者、不十分な応答者（poor responder）または非応答者であることができる。本発明での使用について、陽性応答者は、処置に対して陽性に応答する被験体、即ち、症候の緩和、寛解、減少、または状態を患者に対してより高く許容性とすること；変性または減退の速度を遅くすること；変性の最終点での衰弱をより少なくすることまたは患者の物理的または精神的安寧を改善することなどの任意の客観的または主観的パラメーターを含む状態の改善の成功を経験する被験体である。陽性応答者は、生物学的活性剤のいかなる毒性もしくは有害な副作用よりも治療的に有利な効果が臨床期間に勝っている応答者である。非応答者は、処置に応答しない被験体または満足なレベルに応答しない被験体である。不十分な応答者は、処置に応答するが、陽性応答者のレベルで応答しない被験体である。
【０１４１】
疾患状態が、インスリン抵抗性であるかまたは糖尿病もしくはメタボリック症候群などのインスリン抵抗性に関係した他の状態であるある態様では、治療処置は、一般に有効量の１つ以上のインスリン増感薬剤を投与する工程を含む。インスリン増感薬剤は当技術分野で知られておりそして、例えば、チアゾリジンジオン（ＴＺＤとも呼ばれる）などのＰＰＡＲアゴニスト；または選択的ＰＰＡＲγモデュレーター（ＳＰＰＡＲＭ’ｓ）としても知られているＰＰＡＲγ部分アゴニスト、ＰＰＡＲα−γデュアル部分アゴニスト（選択的ＰＰＡＲα−γデュアル選択性モデュレーター）およびＰＰＡＲパンアゴニストを含む。ＴＺＤ構造を有するＰＰＡＲγアゴニストは、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、バラグリタゾン、イサグリタゾン、トログリタゾン、ネトグリタゾン、ＭＣＣ−５５５およびＢＲＬ−４９６５３を含む。そのいくらかはＴＺＤ構造を有する他のＰＰＡＲγアゴニストは、ＣＬＸ−０９２１、５−ＢＴＺＤ、ＧＷ−０２０７、ＬＧ−１００６４１、ＬＹ−３００５１２、ＮＮ−２３４４、ＬＹ８１８、ＧＷ−６７７９５４、ＧＷ−７２８２およびＴ−１３１を含む。αおよびγアゴニズムの両方を示すＰＰＡＲα／γデュアルアゴニストは、２型糖尿病を処置しそして脂質を減少させるのに使用することができる。ＰＰＡＲα／γアゴニストは、ＫＲＰ−２９７（ＭＫ−０７６７）、ムラグリタザール（ＢＭＳ−２９８５８５）、ファルグリタザール、ラガグリタザール、テサグリタザール（ＡＺ−２４２）、ＪＴ−５０１、ＧＷ−２５７０、ＧＩ−２６２５７９、ＣＬＸ−０９４０、ＧＷ−１５３６、ＧＷ１９２９、ＧＷ２４３３、Ｌ−７９６４４９、ＬＲ−９０、ＳＢ−２１９９９４、ＬＹ−５７８、ＬＹ−４６５５６０８、ＬＳＮ−８６２、ＬＹ−５１０９２９およびＬＹ−９２９を含む。
【０１４２】
本明細書に記載の方法は、患者が、例えばビグアニド（例えばメトホルミン）；スルホニル尿素；スルホニル尿素以外の他の化学的種類のインスリン分泌促進薬、例えばメグリチニド；インスリン（皮下もしくは筋肉内注射用に処方されるか、または経口、頬側または鼻などの注射の必要を回避するための処方で処方されうる）；ＤＰ−ＩＶ阻害剤；ＰＴＰ−１Ｂ阻害剤；ＧＬＰ−Ｉアナログ；グリコゲンホスホリラーゼ阻害剤；グルカゴンレセプターアンタゴニスト；ヒドロキシステロールデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ−１）阻害剤；グルコキナーゼアクチベーター；またはＴＺＤもしくは非ＴＺＤＰＰＡＲγアゴニスト；またはその処置の任意の組み合わせを含む、２型糖尿病またはインスリン抵抗性を処置するのに使用される任意の薬物による処置に対する応答者でありそうかどうかを決定するのに使用することができる。
【０１４３】
本明細書に記載の方法は、患者が、２型糖尿病またはインスリン抵抗性も有する肥満患者における肥満を処置するのに使用されうる任意の薬物であって、例えばイブトラミン、オルリスタット、フェンテルミン、Ｍｃ４ｒＩアゴニスト、カンナビノイドレセプター１（ＣＢ−１）アンタゴニスト／インバースアゴニスト、３３アドレナリン作動性アゴニスト；またはＴＺＤもしくは非ＴＺＤＰＰＡＲγアゴニスト；またはそれらの処置の任意の組み合わせを含む薬物による処置に対する応答者でありそうかどうかを決定するのに使用することができる。
【０１４４】
本明細書に記載の方法は、患者が、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（ロバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、リバスタチン、ピタバスタチン、ＺＤ−４５２２および他のスタチン）；ナイアシン；コレステロール吸収阻害剤（エゼチミベ）；ＣＥＴＰ阻害剤（トルセトラピブ）；ＰＰＡＲαアゴニスト（フェノフィブレート、ゲムフィブリゾール、クロフィブレート、またはベンザフィブレート）；ＡＣＡＴ阻害剤（アバシミベ）；抗酸化剤（プロブコル）；または胆汁酸金属イオン封鎖剤（コレスチラミン）またはＴＺＤもしくは非ＴＺＤＰＰＡＲγアゴニスト；またはその処置の任意の組み合わせを含む、総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールを減少させおよび／またはＨＤＬコレステロールを上昇させるのに使用される任意の薬物による処置に対する応答者であるかどうかを決定するのに使用することができる。
【０１４５】
ある態様では、アジポネクチンレセプターフラグメントのレベルは、処置が始まる前に決定され、次いでフラグメントのレベルまたはパターンの変化が処置に対して患者が応答するがどうかを反映するのに十分に長い時間処置が進行した後に決定される。処置が進行した後、治療に対する有望な応答者でありそうな患者は、増加したレベルのあるフラグメント、即ち、長さが２５〜３４アミノ酸であり（即ち、配列番号１、２、４〜１１、２３、２４、および／または２６〜３３）そして一般に結合していないフラグメントおよび減少した量のあるより小さいフラグメント、即ち、長さが１３〜２４アミノ酸である結合していないフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜２２、２４、および／または３４〜４４）を有するであろう。ある態様では、その差は処置が始まって後４週間以内に、好ましくは処置が始まって後２週間以内に、最も好ましくは処置が始まって後１週間以内に観察されるであろう。
【０１４６】
ＶＩ．追加のバイオマーカー
ある態様では、１つ以上の追加のマーカーの評価を組み合わせて、アジポネクチンレセプターフラグメント単独の測定から得られた分析の予測値と比較して分析の予測値を増加させる。例えば、疾患状態の１つ以上のマーカー、即ち、脂肪細胞インバランス、インスリン抵抗性、糖尿病、メタボリック症候群、急性冠症候群（即ち、血管閉塞）、心臓血管心疾患、発作、先天性心不全、うっ血性心不全、高血圧、狭心症、心筋梗塞、虚血、アテローム性動脈硬化症、肥満、脂肪血症、または炎症を、アジポネクチンレセプターフラグメントと共に測定して上記した方法の予測値を増強することができる。本方法と組み合わせて使用されうるバイオマーカーは、例えば、脂肪細胞因子、例えばアジポネクチン、レプチン、ビスフアチン、クロソ（klotho）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＤＤＰＩＶ、レジスチン、グレリン、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、Ｓｉｒｔ１、ＰＰＡＲアゴニスト、ＡＲＮＴ（アリール炭化水素レセプター核トランスロケーター）、ＨＩＦＩＢ、Ｃ−ペプチド、Ｈｏｘａ２、インスリンまたはグルコース（それらのフラグメント、ペプチドおよび変異体を含む）および／または炎症マーカー、例えば、ＲＢＦ−４、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、レジスチン、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＡＩ−１、ビクニン、自己免疫因子、グルタミン酸に対する自己抗体、Ｉｓｌｅｔ細胞自己抗体、インスリン自己抗体、ＩＬ−２に対する自己抗体、ＩＡ−２に対する自己抗体、インクレチンおよび他の自己免疫因子およびそのフラグメント、ペプチドまたは変異体を含む。
【０１４７】
本明細書に記載の方法を、疾患の診断、疾患の進行の決定または疾患の処置の効力の決定を助ける任意の他の試験と組み合わせて使用することができる。
【０１４８】
ある態様では、アジポネクチンレベルも被験体において測定されるであろう。アジポネクチンを測定しそしてアジポネクチンレベルを疾患状態と相関させる方法は、当技術分野で知られており、例えばU.S. Patent No. 6,461,821、U.S.Patent Publication Nos. Us20050054005およびUS20050048565およびInternational Publication Numbers WO2004086040, WO2005046734, WO2005038457およびWO2004022596参照。これらの各々はそのままそしてすべての目的のために本明細書に組み込まれる。本明細書での使用について、用語アジポネクチンは、アジポネクチン活性を有するその変異体を含む。ある態様では、総アジポネクチンの量、低分子アジポネクチンの量、高分子量のアジポネクチンの量またはこれらの数間の比は、本発明の方法と組み合わせて使用されるであろう。したがって、本方法は、被験体からの生物学的サンプル中のアジポネクチンのレベル（総アジポネクチン、高分子量アジポネクチン、低分子量アジポネクチンまたは他の形態のアジポネクチン（それらのフラグメントおよび変異体を含む））を測定し、そしてその量を疾患状態の存在、疾患の進行、または処置の効力と相関させる工程を含むことができる。アジポネクチンの減少した量は、疾患を示しそして高分子量アジポネクチン対総アジポネクチンまたは低分子量アジポネクチンのより小さな比は疾患を示す。
【０１４９】
ある態様では、被験体においてレプチンレベルを測定する。その変異体を含むレプチンを測定し、そしてレプチンレベルを疾患状態と相関させる方法は当技術分野で知られている。（例えば、Gorden and Gavrilova, Current Opinion in Pharmacolgy, (2003)3:655-659参照、これはそのままそしてすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５０】
ある態様では、脳ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ）レベルを測定して血管閉塞および心臓血管疾患の進行の診断を助けることができる。ＢＮＰレベルを測定しそしてそれらを疾患状態と相関させる方法は当技術分野で知られている。例えば、Frank Peacock, Cleveland Clinic Journal of Medicine(2002), 69(3)243-251参照。これはそのままおよびすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
本方法は、炎症および過度の炎症により特徴付けられたある疾患を有する被験体を同定するのに使用することができる。これらの方法は、被験体における炎症のレベルを決定する既知の方法と組み合わせて使用することができる。
【０１５２】
ある態様では、被験体におけるビクニンおよび／またはウリスタチンレベルを測定する。ビクニンは、インター−α−トリプシンインヒビタータンパク質の阻害性軽鎖を表す。それは炎症性疾患を有する患者の尿中で上昇することが知られているプロテアーゼ阻害剤でありそして急性期タンパク質と考えられる。本明細書での使用について、用語ビクニンは、ビクニン活性を有するその変異体を含む。ウリスタチンはバクテリアもしくはウイルス感染を有する大部分の患者および炎症性障害を有する多くの患者において増加する、尿中に存在するトリプシンインヒビターである。その変異体を含むビクニンまたはウリスタチンを測定し、そしてビクニンまたはウリスタチンレベルを疾患状態と相関させる方法は、当技術分野で知られている。ウリスタチンは、バクテリアもしくはウイルス感染を有する大部分の患者において増加しそして炎症性障害を有する多くの患者において増加する、尿中に存在するトリプシンインヒビターである（Pugia and Lott, Clin. Chem Lab Med 2005 43(1):1-16, International Publication No. WO200504022、これらの各々はそのままそしてすべての目的のために参照により本明細書組み込まれる）。
【０１５３】
ある態様では、被験体においてＣ反応性タンパク質レベルを測定することができる。その変異体を含むＣ反応性タンパク質を測定しそしてＣ反応性タンパク質レベルを疾患状態と相関させる方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｃ反応性タンパクは、急性炎症または感染のエピソード期間中血清中に存在する。約１mg/dLのＣＲＰレベルは、ＣＲＰについては通常高いと考えられ、そして最も多くの感染および炎症は１０mg/dLより高いＣＲＰレベルをもたらす。本明細書での使用について、用語Ｃ反応性タンパク質は、Ｃ反応性タンパク質活性を有するその変異体を含む。（Pugia and Lott, Clin. Chem Lab Med 2005 43(1):1-16、これはそのままそしてすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５４】
ある態様では、白血球計数を本明細書に記載の方法と組み合わせて行なうことができる。白血球を測定しそして白血球レベルを疾患状態と相関させる方法は当技術分野で知られている。白血球（ＷＢＣ）計数または血液中の白血球の測定は、身体全体にわたる炎症を反映する信頼性のあるそして広く使用されるマーカーである。ＷＢＣ計数は、心臓血管疾患、高血圧および糖尿病を含む他の慢性状態とも関連している。
【０１５５】
ある態様では、被験体において空腹時グルコース、グルコース耐性測定および／またはインスリンおよびグルカゴン刺激Ｃペプチドレベル（insulin and glucagon-stimulated C-peptide levels）を測定する。その変異体を含むインスリンおよびＣペプチドを測定しそしてインスリンおよびＣペプチドレベルを疾患状態と相関させる方法は当技術分野で知られている。例えば、約１．８ng/mLよりより高いグルカゴン刺激性Ｃペプチドレベルは、インスリン処置なしで管理されうる２型糖尿病を同定することが報告された。典型的には、３．０ng/mLは、インスリン過剰血症またはインスリン抵抗性を示す上限として使用される。対照的に、約０．５ng/mLより低いレベルは、低インスリン血症によりインスリン処置を必要とする１型患者を同定すると報告されている。正常な成人の正常な参照範囲は０．５〜２ng/mLである。
【０１５６】
１つ以上のマーカーがアジポネクチンレセプターフラグメントと組み合わせて使用されて分析の予測値を増加させる態様において、被験体からの同じ生物学的サンプルにおいてまたは同じタイプもしくは異なるタイプであることができる他の生物学的サンプルにおいて、追加のマーカーレベルを測定することができる。例えば、アジポネクチンレセプターフラグメントのレベルを血漿のサンプルにおいて測定することができ、追加のマーカーのレベルを、被験体からの、血漿の同じサンプル、血漿の異なるサンプルまたは血清もしくは尿のサンプルにおいて測定することができる。
【０１５７】
ＶＩＩ．追加の疾患状態
アジポネクチンは身体における多くのプロセスおよび経路に関与している。したがって、アジポネクチンレセプターフラグメントのフラグメント化パターンの検出を使用して、多くの疾患状態の発症を決定し、多くの疾患状態の進行を監視しおよび／または多くの疾患状態に対する薬物処置の効力を決定することができる。特に、可溶性アジポネクチンレセプターフラグメントの検出は、多くの疾患状態の発症を決定し、多くの疾患状態の進行を監視しおよび／または多くの疾患状態に対する薬物処置の効力を決定するための他の診断方法およびツールと組み合わせて使用することができる。細胞の血管形成性トランスフォーメーション、アテローム形成性トランスフォーメーションおよびマクロファージトランスフォーメーションと関連させられうる。アジポネクチンレセプター１は、脂肪酸により活性化されるＬＸＲ核内レセプターへの結合によりアップレギュレーションされ、そしてＬＸＲレセプターはマクロファージトランスフォーメーションに不可欠である。アジポネクチンレセプター１発現は単球トランスフォーメーション期間中増加することも示された。
【０１５８】
したがって、炎症性疾患、即ち、身体組織の炎症を引き起こし、次いで急性もしくは慢性炎症性状態を生じる、免疫系または組織の細胞メディエイタまたは非細胞メディエイタによりトリガーされる疾患を、本方法を使用して検出しそして監視することができる。このような疾患の例は、例えば、タイプＩ〜ＩＶの過敏症、例えば喘息、アトピー性疾患、アレルギー性鼻炎もしくは結膜炎、唇の血管浮腫、遺伝性血管浮腫、抗レセプター過敏症反応および自己免疫疾患、ハシモト甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、重症筋無力症、グレーブ病およびレイノー病、慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、サルコイドーシス、尿路感染、ＩｇＡ腎症、糸球体腎炎、急性もしくは慢性ホスト移植片反応を含む。
【０１５９】
本方法を使用して癌を検出しそして監視することができる。癌は、細胞のコントロールされていない異常な増殖、罹患した細胞の局所的に広がるかまたは血流およびリンパ系を通して身体の他の部分に広がる（即ち転移する）能力、ならびに多数の特徴的な構造的および／または分子的特徴のいずれかにより特徴付けられる多数の疾患のいずれかを指す。用語癌は、女性生殖器官の癌（卵巣癌、頚部癌（cervical cancer）および子宮癌を含むがそれらに限定されない）；肺癌；乳癌；腎細胞癌；ホジキンリンパ腫、；非ホジキンリンパ腫；尿生殖器系の癌（腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、および尿道癌を含むがそれらに限定されない）；頭部および頸部癌；肝臓癌；胃腸系の癌（胃癌、食道癌、小腸癌または結腸癌を含むがそれらに限定されない）；胆管の癌；膵臓癌；男性生殖系の癌（精巣癌を含むがそれに限定されない）；妊娠栄養膜疾患（Gestational trophoblastic disease）；内分泌系の癌（甲状腺癌、傍甲状腺癌、副腎癌、カルチノイド腫瘍、インスリノーマおよび原始神経外胚葉腫瘍（PNET tumors）を含むがそれらに限定されない）；肉腫（ユーイング肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫を含むがそれらに限定されない）；中皮腫；皮膚の癌；メラノーマ；中枢神経系の癌；小児科学的癌；ならびに造血系の癌（すべての形態の白血病、脊髄形成異常症候群、骨髄増殖性障害および多発性骨髄腫を含むがそれらに限定されない）を含むがそれらに限定されない。
【０１６０】
ＶＩＩＩ．キット
上記したまたは上記に示唆された用途に使用するために、本発明によりキットも提供される。このようなキットは、例えば、ストリップ、カセット、マイクロ流体チップ、バイアル、チューブ等のような１つ以上の容器手段を密閉して受け入れるように区画化されているキャリアー手段を含むことができ、該容器手段の各々はこの方法において使用されるべき別々のエレメントの１つを含む。例えば、容器手段の１つは、検出可能に標識されるまたは標識されうるプローブを含むことができる。このようなプローブは、可溶性Ｃ末端レセプターフラグメントに対して特異的な抗体またはポリヌクレオチドであることができる。
【０１６１】
更に、キットは、本発明の方法の実施のための指令（即ちプロトコール）を含有するインストラクション資料を含むことができる。インストラクション資料は典型的には書かれたもしくは印刷された資料を含むが、それらはこのようなものに限定されない。このようなインストラクションを記憶しそしてエンドユーザーにそれらを伝達することができる任意の媒体が、本発明により考慮される。このような媒体は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ等）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）等を含むがそれらに限定されない。このような媒体は、このようなインストラクション資料を与えるインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
【０１６２】
キットは、例えば、個体から生物学的サンプルを得るための手段を含むこともできる。個体からの生物学的サンプルを得るための手段は当技術分野で周知であり、例えば、カテーテル、注射器等でありそして本明細書では詳細に説明しない。
【０１６３】
本発明を実施するための特定の局面の下記の例示的態様は、説明する目的でのみ与えられ、そしていずれにせよ本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１６４】
実施例
実施例１  糖尿病個体におけるＣ末端フラグメントの検出
１６０人の患者を病歴により評価した。５０人は、糖尿病の病歴を持たず、またはメタボリックリスク因子（脂質、高血圧、肥満）はＷＨＯの定義に従うメタボリック症候群として診断されなかった。６９人は１型または２型の糖尿病の病歴を有していた。インスリン抵抗性は、すべての患者においてグルコース測定、ＣペプチドおよびヘモグロビンＡ１ｃにより更に評価された。
【０１６５】
アジポネクチン、Ｃペプチド、インスリン、およびＨＭＷアジポネクチンを市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。ＨｂＡ１ｃをＤＣＡ２０００＋機器（DCA2000＋instrument）（Bayer）で測定しそしてグルコースをＹＳＩにより測定した。下記のＡｄｉｐｏＲ１  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、結合していようと結合しいなかろうとすべてのＣ末端フラグメントを測定した。
【０１６６】
Ｃ末端フラグメントＡｄｉｐｏＲ１のＥＬＩＳＡアッセイのための物質は、マイクロタイタープレート（Costar PN 3690, 高い結合性）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（Pierce Product Number 28376）、アジポネクチンレセプター１（ＡｄｉｐｏＲ１）ペプチド（ペプチド１６〜３４）（Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Product Number 001-44）、ＴＢＳ中のスーパーブロック（Super Block in TBS）（Pierce Product Number37535）、TBS/TW−0.05％ Tween 20を含有するトリス緩衝生理食塩水（Tween 20 - Pierce Product Number P8341）、ウサギ抗ＡｄｉｐｏＲ１抗体（Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Product Number G-001-44）、ＡＬＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma Product Number A 3687）、１−Ｓｔｅｐ  ＰＮＰＰ（Pierce Product Number 37621）および２N ＮａＯＨを含んでいた。
【０１６７】
試薬を下記のとおり調製した。ＡｄｉｐｏＲ１ペプチド（Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Product Number 001-44）のストック溶液を指令されたとおり０．１％ＴＦＡを含有する６０％アセトニトリル１００uL中の溶解された１００ugペプチドにより調製した。これを更に希釈し、この１．０mg/mL溶液をナノ純度の水で１０mLに希釈し、１０ug/mLストック溶液を目指した。この溶液をアリクォート化し、５００uL／バイアルを−７０℃で冷凍保存した。ＴＢＳ中のＡｄｉｐｏＡ１ペプチド０．１０ug/mLを使用してプレートをコーティングしそして１０ug/mLのＴＢＳ（上記）中のＡｄｉｐｏＲペプチド１００uLをＴＢＳ９９００uLに加えそしてよく混合することにより調製した。ウサギ抗ＡｄｉｐｏＲ１（Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Product Number G-001-44）のストック溶液を、指示されたとおりナノ純度水２００uL中の溶解された２００uG抗体により調製した。これにより１．０mg/mL抗体溶液が作成される。５０uLアリクォートに分けそして−７０℃で冷凍保存する。スーパーブロッカー中の６．０ug/mLウサギ抗ＡｄｉｐｏＲ１の溶液は、スーパーブロッカー２９８２uLにストック抗ＡｄｉｐｏＲ１、１８．０uLを加えそしてよく混合することにより作成された。スーパーブロッカー中のウサギ抗ＡｄｉｐｏＲ１、３．７５ug/mLの溶液（血漿サンプルを５倍希釈するのに使用される：他の希釈率では濃度を変える）は、スーパーブロッカー１５，０００uLにストック抗ＡｄｉｐｏＲ１（Ｃ）５６．２５uLを加えそしてよく混合することにより作成された。ＡＬＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧの１／２０００希釈物は、スーパーブロッカー１５．０mLにＡＬＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma, Product Number A 3687）７．５uLを加えそしてよく混合することにより作成された。
【０１６８】
標準液（caliblators）の調製は、３．０ug/mLウサギ抗ＡｄｉｐｏＲ１を含有するスーパーブロッカー中のＡｄｉｐｏＲ１ペプチドを使用して５．０、２．５、１．２５、６．２５、０．３１２、０．１５６、０．０７８および０ug/mLのＡｄｉｐｏＲ１ペプチド濃度を達成することにより行なわれた。
【０１６９】
ＡｄｉｐｏＲ１  ＥＬＩＳＡアッセイのための方法は、マイクロタイタープレートをＴＢＳ中の１０ug/mLＡｄｉｐｏＲ１ペプチド５０uL／ウエルでコーティングし、そして最小７２時間４℃で保存し、冷蔵庫からコーティングされたマイクロタイタープレートを取り出し、プレートを空にしそして２００uL／ウエルＴＢＳで３回洗浄することにより行なわれた。次いで各ウエルにスーパーブロッカーバッファー（Pierce PN 37535）１５０uLを加えそしてプレートを２５℃で３０分間振とうした。プレートを空にしそしてＴＢＳ／ＴＷで５回洗浄した。次いで５０００、２５００、１２５０、６２５、３１２、１５６、７８および０ng/mL  ＡｄｉｐｏＲ１ペプチドを含有する調製された標準液を添加し、またはブロッカーバッファーで５倍希釈されたサンプルを添加した。すべてのサンプルおよび標準液は、ウサギ抗ＡｄｉｐｏＲ１、３．０ug/mLを含有していた。サンプルおよまたは標準液を５０uL／ウエルで加えそして冷蔵庫中で５℃で一夜インキュベーションした。次いでプレートを空にしそしてＴＢＳ／ＴＷで５回洗浄した。
【０１７０】
スーパーブロッカー中のＡＬＰ−のヤギ抗ウサギＩｇＧの１／２０００希釈物をＥＬＩＳＡテンプレートにおけるすべてのウエルに５０uL／ウエルで加えた。ジッターバーグシェーカー（Jitterburg Shaker）でシェーカー設定#２で２５℃で２時間インキュベーションした。プレートを空にしそしてＴＢＳ／ＴＷで５回洗浄した。1-Step PNPP（Pierce PN 37621）５０uLを各ウエルに加えた。プレートをジッターバーグシェーカーで２５℃で３０分間インキュベーションした。２N ＮａＯＨ２５uLを各ウエルに加えて酵素反応を停止した。プレートを少なくとも５分間放置した後に４０５nmで読み取る。標準曲線に対する標準液データの適合及び未知数の計算、（単一相指数崩壊（single phase exponential decay）が通常最善の適合を与える）を行なってサンプルにおける値を計算した。
【０１７１】
アジポネクチンは、２型値糖尿病では減少する。アジポネクチンは、１型糖尿病では不変であった。アジポネクチンは、２型と比較して、正常なコントロールおよび１型患者においてより高かった（表２参照）。アジポネクチンはＨｂＡ１ｃと共に減少し次いで増加した。すべての差は小さくそして１．４より低いＴ値であまり有意ではない（＜８０％有意の確率）。アジポネクチン差はＢＭＩ（ボディマスインデックス）を予測しない。
【０１７２】
ＨＭＷアジポネクチン／総計の比の使用は、集団における差を改善しそしてアジポネクチンで見られた同じ傾向を維持する。この比は、疾患と共に増加する。ＨＭＷ／総アジポネクチンは、高いＨｂＡ１ｃで減少する（表３参照）。１型診断は、高いＨＭＷ／総アジポネクチンとの相関が２型診断よりも低かった。しかしながら、１型糖尿病診断は正常なコントロールよりも高い比を与える。
【０１７３】
可溶性Ｃ末端ＡｄｉｐｏＲ１の総レベルは、糖尿病病理（例えば、２型糖尿病またはインスリン抵抗性）で増加する。これらの差は、アジポネクチンまたはＨＭＷ比の場合よりもはるかに高く有意である（Ｔ値＞３．８、＞９９．９％有意の確率）（表４参照）。驚くべきことに、ＡｄｉｐｏＲ１は、１型糖尿病で増加し、これはレセプターが１型にも関係していることを示す。これらの患者は脂肪細胞インバランスに罹患していることも予想されるが、β細胞損傷を有することも予想される。ＡｄｉｐｏＲ１は、より高いＨｂＡ１ｃで、アジポネクチンよりも多く増加する。全体として、ＡｄｉｐｏＲ１は、アジポネクチンおよびＨＭＷ比よりも敏感度が高い。数学的関係におけるＡｄｉｐｏＲ１とアジポネクチンの組み合わせは、糖尿病病理を予測するのにアジポネクチン単独よりも良好であった。数学的関係におけるＡｄｉｐｏＲ１とＣペプチドの組み合わせは、糖尿病病理を予測するのにＣペプチド単独よりも良好であった。
【０１７４】
【表１１】
2009518653.tif 000012
【表１２】
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【表１３】
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【０１７５】
実施例２  メタボリック症候群および他の心臓血管障害および冠動脈障害（coronary disorders）を有する個体におけるＣ末端フラグメントの検出
他のグループの１８８人の患者は、種々の診断試験および血管造影像により心臓血管の状態およびリスクについて完全に特徴付けられた。正常者（ｎ＝１１３）は、メタボリック症候群、糖尿病、急性冠症候群（ＡＣＳ）、ＡＭＩまたはＣＨＦのない正常者と考えられた。１８８人のグループの範囲外の患者は、メタボリック症候群、炎症性マーカー、ＡＣＳ、ＡＭＩおよびＣＨＦ、高血圧、肥満、脂血症、炎症性応答および抗炎症性応答について罹患グループに入れられた。急性冠症候群は、急性心臓状態（acute cardiac condition）を伴うかもしくは伴わないで血管造影像評価により＞６０％の閉塞として定義される。メタボリック症候群は、インスリン抵抗性またはＷＨＯ定義により２つより多くのメタボリックリスク因子により定義された。メタボリックリスク因子は、高血圧、脂血症および肥満を含む。肥満は、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）により評価された。高血圧は、血圧または投薬により評価された。脂血症は、脂質比または脂質低下投薬により評価された。炎症は、白血球計数またはＣＲＰによるアクセスであった。抗炎症状態は血液および尿における尿中トリプシンインヒビターについてのイムノアッセイによるアクセスであった（ビクニンおよびウリスタチンイムノアッセイ測定）。すべての患者は、病歴および投薬により追加的に評価され、したがって罹患グループに特徴付けられた。
【０１７６】
アジポネクチンおよびＨＭＷアジポネクチンは、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定された。心臓マーカーは、Ｃｅｎｔａｕｒ機器（Bayer）を使用して測定された。実施例１に記載のＡｄｉｐｏＲ１  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、結合していようと結合していなかろうとすべてのＣ末端フラグメントを測定した。
【０１７７】
アジポネクチンはＡＳＣおよびメタボリック症候群と共に減少するが、値の有意性は、９９．９％確実（99.9％certain）について予測されたよりも低かった（表５参照）。アジポネクチンは、ＣＨＦおよびＭＩと共に増加した。これは評価を妨害するであろう。アジポネクチンはまた、炎症状態とは大して相関しなかった。
【０１７８】
血清中の可溶性ＡｄｉｐｏＲ１の総レベルは、ＡＳＣおよびメタボリック症候群と共に増加し、そして値の有意性は高度に有意であり（９９．９％確実）そしてアジポネクチンについて観察された有意性よりもはるかに高く有意であった（表６参照）。驚くべきことにＡｄｉｐｏＲ１は、状態がより急性になるにつれてそして炎症性および抗炎症性応答が増加するにつれて増加する。ＡｄｉｐｏＲ１は更にメタボリック症候群を予測した。可溶性ＡｄｉｐｏＲ１は、尿および血漿中にも見出されてメタボリック症候群と相関した。
【０１７９】
【表１４】
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【表１５】
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【０１８０】
実施例３  生化学的経路の解明
脂肪細胞がアジポネクチンを産生することを引き起こすとき、正常なインスリン感受性が得られる。完全長アジポネクチンは、凝集して、典型的にはＬＭＷ、ＭＭＷおよびＨＭＷ形態と呼ばれるマルチマーとなる。アジポネクチンは、肝臓におけるアジポネクチンレセプター２および筋肉におけるアジポネクチンレセプター１と相互作用してグルコース産生を停止させそして解糖および脂肪酸化を引き起こす。アジポネクチンレセプター１は球状アジポネクチンと呼ばれる切断した形態のアジポネクチンと反応し、これに対してアジポネクチンレセプター２は完全長アジポネクチンと反応する。球状アジポネクチンは、血液エラスターゼの作用により形成されることが他の人々により最近示された。
【０１８１】
インスリン抵抗性は、脂肪細胞が肥大するときに起こり、そしてインスリンに応答してアジポネクチンをより少なく産生させる。この状態において、細胞はよりアポートーシス性となりそして細胞分裂は遅くなる。結果として、血漿アジポネクチンレベルは減少する。インスリンレベルは、細胞により多くのインスリンを遊離させようとして上昇する。しかしながら、インスリン抵抗性が悪化するにつれて、より多くのインスリンおよびより少ないアジポネクチンが産生される。より少ないアジポネクチンは筋肉においてより少ない解糖および脂肪酸化をもたらし、そして肝臓グルコース産生か停止するのを阻止する。
【０１８２】
炎症性エラスターゼおよび白血球は糖尿病患者において有意に上昇することが確認された。文献の概観は、人工インスリンおよび合成インスリンの両方とも糖尿病において白血球を増加させるということを認めている。エラスターゼは炎症において増加するにつれて、より高い百分率の球状アジポネクチンが産生される。マルチマーの欠如は、肝臓に対するより低い作用を引き起こす。抗炎症性プロテアーゼインヒビター（ＵｒｉおよびＢｉｋ）は糖尿病において有意に上昇することが確認された。これらのインヒビターは、エラスターゼにより形成され、そして我々の細胞モデルにおいて正常な細胞系における肥大アポトーシスを誘導することが最近示された。
【０１８３】
エラスターゼ曝露後のレセプターフラグメントは、患者サンプルにおける可溶性フラグメントの形成のための機構として提唱された。これはＡｄｉｐｏＲ１Ｃ末端のためのポリクローナル抗体および患者サンプルによりアフィニティー質量分析法を使用して試験された。
【０１８４】
ＡｄｉｐｏＲ１は、３４、２８〜２９、１９〜１８、１５〜１３、９．５〜９．０、７．９、６．６、６．５、５．２、４．０〜３．８および１〜２kDaの質量で血液中にあることが質量スペクトルにより確認された。このデータは、１）ＡｄｉｐｏＲ１フラグメントは患者およびコントロールにおいて見出され、２）ＡｄｉｐｏＲ１フラグメントが二量体を形成しそして３）ＡｄｉｐｏＲ１フラグメントはアジポネクチンに結合されることを確認した。最後のものは、アジポネクチンに対するポリクローナル抗体によりアフィニティー質量分析法を反復することにより証明された。
【０１８５】
インスリン抵抗性期間中マルチマーアジポネクチンの欠如が、患者と正常者間のフラグメント化パターンの差の潜在的原因に対して更に提唱された。実際に、３．９および７．８質量形態の消失は、糖尿病において起こったが、すべての正常者においては在した。下記データにおいて、すべての５人の患者は３９０１および７８１４Da質量（グラフデータ参照）を有していた。したがって、異なる質量は、結合のためのマルチマーが利用可能であるとき、タンパク質分解切断部位の曝露によるものであると考えられた。
【０１８６】
実施例４  モノクローナル抗体の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウスを合成ＡｄｉｐｏＲ１ペプチド免疫原組成物１００μg／マウスにより免疫感作させた。１ヶ月後に、眼出血を各マウスから採取しそして免疫原に対するＥＬＩＳＡにより力価を決定して免疫応答を評価した。最善の応答を示すマウスを、免疫原１００μg／マウスの注射により追加免疫した。４日後、マウスを殺しそしてその脾臓を、Kohler and Milstein, Nature 256:495(1975)の方法に従う融合のために使用した。脾細胞をＳＰ２−０  Ａｇ１４骨髄腫細胞と、脾細胞対骨髄腫細胞５：１の比でＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を使用して融合させ、そして５０％ＰＥＧ／ＨＡＴ成長培地を使用して９６ウエルプレート中にブレートした。３７℃で７〜１０日のインキュベーションの後に、融合培養物をＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択法を利用して３〜４日毎に供給し、次いでＨＡＴ成長培地でサブ培養することにより成長について監視した。
【０１８７】
２〜３週間後、ハイブリドーマコロニー成長を有するウエルをＥＬＩＳＡにより試験して、どの成長がペプチドに対する抗体免疫応答を生じたかを決定した。９６ウエルプレート培養物を１ug/mLコーティングされたプレートでウリスタチンペプチドで試験した。２〜８℃で一夜プレートをコーティングした後、すべてのプレートを洗浄しそしてブロックした。次いで細胞培養物上清を室温で１時間１００μl／ウエルで適用した。プレートを洗浄した後、１：２０００希釈率でヤギ抗マウスＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼを、１００uL／ウエルで１時間適用した。プレートを再び洗浄し、次いでＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）基質を加えそしSpectra Maxプレートリーダーで４９０nmで読み取った。
【０１８８】
陽性の応答を与えるコロニーを更なるエキスパンションのために２４ウエルプレートに移しそして再試験して陽性の結果を証明した。コロニー試験陽性を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有するＩｓｏｃｏｖｅの改変されたダルベッコの培地（ＩＭＤＭ）中で６ウエルプレートにおいて更にエキスパンションさせた。エキスパンション後に、コロニーを−７０℃で凍結させ、次いで長期保存のために液体窒素中に移した。精製されたペプチドを使用するＥＬＩＳＡ結果に基づいて、種々のクローンをＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ中で更にエキスパンションさせそして凍結させた。
【０１８９】
実施例５  ＳＥＬＤＩによるモノクローナル抗体の特徴付け
患者サンプル中の特異的ＡｄｉｐｏＲ１フラグメントを測定する方法は、モノクローナル抗体を使用して行なわれそしてウサギポリクローナル抗体をチップ表面のＡｄｉｐｏＲ標準および患者の血漿に関して試験した。ＳＥＬＤＩ  ＰＢＳＩＩ飛行時間型質量分光計（Ciphergan, Fremont, California）での表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）分析により結合を評価して、抗体に結合しているタンパク質について質量対電荷比（ｍ／ｚ）を決定した。患者からの１０の血漿標本を更に試験した：５人の患者は糖尿病について陽性であり；５人の患者は糖尿病について陰性であった。結合は、標準インキュベーション法を使用して２つのタイプの表面（ＰＳ２０およびＲＳ１００）で測定された。各質量測定のシグナルをバックグラウンドノイズと比較してシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を得た。１０より大きいＳ／Ｎ比を有する質量のみを受け入れた。
【０１９０】
ＳＥＬＤＩ法は下記のとおりであった：５０ミリモル／L ＮａＨＣＯ３（pH８．０）３μlをタンパク質チップ上の各スポットに加えそしてプレート（即ち、バイオプロセッサー）で覆って、サンプルウエルを形成し、次いで各スポットに１μLの抗体（１mg/mL）を添加しそしてコントロールされた湿度の室で振とうさせながら２時間室温でインキュベーションした。その時の各スポットからの溶液を５μLの洗浄バッファー（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ洗剤）で２回洗浄した。結合しなかった部位を、２mg/mL ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）または１モル／L エタノールアミン５μLでブロックした。室温でインキュベーションした後、ＢＳＡまたはエタノールアミンを捨て、そしてスポットを洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ）５μLで２回洗浄した。ＰＢＳ５μLを各スポットに加えそしてチップをバイオプロセッサーに入れた。追加のＰＢＳ１０μLおよび試験されるべきサンプル１０μL（またはコントロールとしてＰＢＳ）を各ウエルに加え、次いでシールされたウエルを４℃で１８時間振とうした。次いでウエルを洗浄バッファーおよびＰＢＳで洗浄しそして再び室温で２分間振とうした。ウエルをシナピン酸で飽和された脱イオン水３００μLで２回すすぎ；これは抗体に結合したタンパク質のプロトン化期間中エネルギー吸収性分子として役立つ。抗体をチップの表面に結合させる。抗体結合標本を含有するチップを、製造者の指示に従ってＳＥＬＤＩ質量分光計を使用して結合質量について分析した。
【０１９１】
実施例６  糖尿病における可溶性Ｃ末端フラグメント
表６は、７８１２のアジポネクチンレセプターフラグメント質量の検出について５人の正常な患者および同じ質量を有していない５人の糖尿病患者についての多重決定の結果を示す。同様な分離が３９０１の質量について見出された。これらの２つの質量は、正常な被験体に存在するが、本明細書で与えられた疾患状態を有する被験体においては存在しないかまたは非常に低いレベル、即ち減少したレベルで存在する。
【０１９２】
【表１６】
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【０１９３】
表７は、４．５〜６．９、７〜８．２、９〜１１、１３〜１５、１７〜１９、２７〜２９または３０〜３４の質量を有するアジポネクチンレセプターフラグメントの検出のための５人の正常な患者および糖尿病患者ならびに同じ質量を持たない５人の糖尿病患者について多重決定の結果を示す。
【０１９４】
【表１７】
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【０１９５】
実施例７  セリンプロテアーゼ
トリプシンファミリーセリンプロテアーゼは、炎症期間中増加し、そしてトリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、プラスミン、補体ｄ、トロンビンおよび因子Ｉｘａ、Ｘａ、ＸＩａおよびＸＩＩａを含む。すべては、Ａｒｇ−ＸａａまたはＬｙｓ−Ｘａａを切断するトリプターゼ一次アフィニティーを有する。免疫細胞により遊離される追加のトリプシンファミリーセリンプロテアーゼは、エラスターゼ、グランザイム（Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｍ）、トリプターゼ２およびマスト細胞プロテアーゼ１を含む。カテプシンＧ、プロテイナーゼ３、アズロシジンおよびマイコロバスチン（mycolobastin）を含む重要なエラスターゼホモログは、Ｖａｌ−Ｘａａ＞Ａｌａ−Ｘａａ切断アフィニティーを有する。グランザイムＡおよびＫは、トリプターゼ切断アフィニティーを有する。グランザイムＢはＡｓｐ−Ｘａａに対するアスパーゼ切断アフィニティーを有する。グランザイムＭはＭｅｔ−Ｘａａ、またはＬｅｕ−Ｘａａに対するメターゼ切断アフィニティーを有する。グランザイムＨおよびマスト細胞プロテアーゼ１は、Ｐｈｅ−Ｘａａ、Ｔｙｒ−ＸａａまたはＴｒｐ−Ｘａａを切断するためのキマーゼ切断アフィニティーを有する。
【０１９６】
アジポネクチンおよびアジポネクチンレセプターフラグメントのフラグメント化パターンの解析は、炎症性プロテアーゼの例としてトリプシンおよびエラスターゼを使用して決定された。長さが２９〜３４アミノ酸であるフラグメント（即ち、配列番号１、２、４〜１１、１６、１７および／または１９〜２６）は、エラスターゼ切断により予測された。長さが２０〜２５アミノ酸であるフラグメント（即ち、配列番号３、１２〜１５、１８および／または２７〜３０）を、一般的トリプシンファミリーセリンプロテアーゼまたはグランザイムにより予測された。
【０１９７】
実施例８  敏感度及び特異度の設定
サンプルを正常と異常とに分ける。結果をすべてについて補正しそして観察されたＡｄｉｐｏＲ１値を割り当てられたＡｄｉｐｏＲ１閾値に対して判定する。閾値は、それより下ではすべての結果が正常と考えられそしてそれより上では結果は陽性であると考えられる値である。閾値は、低い数から高い数まで変わりそして結果の予測値は、見出された真の陽性、偽陽性、真の陽性および偽陰性の数を使用して計算される。敏感度（ＴＰ／ＴＰ＋ＦＰ）および特異度（ＴＮ／ＴＮ＋ＦＮ）は試験され各閾値について計算された。最も高い敏感度および特異度を有する閾値は、最善の予測値（１００％が理想的であろう）を与える。
【０１９８】
実施例９  アジポネクチンレセプターフラグメント閾値
下記のものは、実施例１に示された患者および方法を使用して閾値を設定する例である。下記表において、閾値より上ではＡｄｉｐｏＲ１の結果が陽性と考えられる閾値は、１５〜２１ug/mLで変わる。この例では、より高い値は陽性であると考えられる。真の陰性または診断された糖尿病なしの正しく同定された患者の数は、偽陽性、偽陰性、および真の陽性の数と共に計算される。理想的には、アッセイは、偽陽性を持たないかまたは１００％特異度を有しそして偽陰性を持たないかまたは１００％敏感度を有するであろう。データから分かりうるとおり、１５の閾値は敏感度についてより良好であるが、２１の閾値は特異度についてより良好である。閾値および範囲は、検出されたフラグメントおよび使用された分析方法に依存する。この実施例では、全アッセイ範囲は、５〜３０ug/mLまたは約６Ｘであった。したがって、濃度単位および範囲は、検出されたフラグメントおよび使用された分析方法と共に変わった（ＳＥＬＤＩ対ＥＬＩＳＡ）。例えば、実施例６および表７で試験されたフラグメントでは、正常と糖尿病との差はしばしば１００Ｘであった。予想されるとおり、１つの特異的フラグメントについての濃度は、すべてのフラグメントの濃度より低かった。使用されたサンプルのタイプ、尿、血漿または血清であるかどうかもフラグメントの濃度に影響を与えた。尿および血清は、血漿より約１０倍低いフラグメント濃度を有していた。アッセイ及びフラグメントが一旦選ばれると、閾値は、示された方法を使用して所望される臨床的一致を最善に達成するように調節される。
【０１９９】
【表１８】
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【０２００】
実施例１０  脂肪細胞インバランスアッセイのためのパネルの使用
下記は、ＡｄｉｐｏＲ１結果と関連した追加のバイオマーカーを使用して糖尿病障害の予測を改善する例である。糖尿病患者および正常な患者ならびに実施例１で示された方法を使用する。下表において、３つのアナライトをそれらの糖尿病を検出する能力について比較する。使用された閾値は匹敵するＴＮを与えた。予測されるとおり、ＡＤＩＰＯＲ１は、他のアナライトよりもより多くの真の陽性を検出した。
【０２０１】
【表１９】
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【０２０２】
６９人の糖尿病患者の２５人は１型であった。アナライトを１型糖尿病について陽性とする能力についても比較した。２５人の１型糖尿病患者の４人のみが異常に低いアジポネクチンを有していた。Ｃペプチドは、２つの閾値を使用し、１つは異常に低いレベルでありそして、１つは異常に高いレベルであつた。異常に低いＣペプチドはインスリンの欠如を示しそして予測されるとおり２５人のＩ型糖尿病患者のうち２３人は異常に低いＣペプチドを有していた。Ｉ型糖尿病患者はＡｄｉｐｏＲ１フラグメントもしばしば有していた。少数のＩ型糖尿病患者は、異常に高いＣペプチドを有していた。
【０２０３】
これらのアナライトは、異なる患者を検出する。これは病理学における差により説明されそうである。何故ならば、各アナライトは、インバランスの異なる部分を測定するからである。例えば、Ｃペプチドに影響を与えるインスリンの欠如は島細胞によるものであり、これに対してアジポネクチンの欠如は脂肪細胞がホルモンを産生しないことによるものであるということが考えられる。この例におけるＡｄｉｐｏＲ１フラグメントの存在は、筋肉細胞が過度の使用からレセプターをシェディングすること（Shedding）によるものであると考えられる。
【０２０４】
このデータは、アナライトの組み合わせが一緒になって、いずれか１つのみよりも良好でありうることを証明する。下表において、最も簡単な関係は、陽性が結果が異常であることを意味するパネルのいずれか１つを考慮することにより試験される。したがって、すべてのアナライトは、正常な結果と考えられるためには陰性でなければならない。上記したとおり、閾値は最善の結果を達成するために調節される。
【０２０５】
【表２０】
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【０２０６】
真の陽性の最も高い数は、Ｃペプチド、アジポネクチンおよびＡｄｉｐｏＲ１の組み合わせた使用で得られた。真の陰性の最も高い数は、ＣペプチドとＡｄｉｐｏＲ１の組み合わせた使用で得られ、またはＣペプチド、アジポネクチンおよびＡｄｉｐｏＲ１の使用により得られた。両場合に、真の陰性の数は、ＡｄｉｐｏＲ１に匹敵していた。
【０２０７】
実施例１１  ＣＡＤ患者の血漿における可溶性アジポネクチンレセプター１レベル
下記は、ＡｄｉｐｏＲ１結果と関係した追加のバイオマーカーを使用して心臓血管障害の予測を改善する例である。心臓血管障害および正常な患者および実施例２に示された方法を使用する。罹患患者は、血管造影像によるＡＣＳを有する患者またはメタボリック症候群の定義をかなえることによる高いリスクを有する患者であった。ＡＭＩおよびＣＨＦなどの予め存在する心臓血管状態を有する患者は排除された。何故ならば、ＴｎＩまたはＢＮＰアッセイまたは他の診断評価により診断が既になされているからである。
【０２０８】
アジポネクチンレセプター１可溶性Ｃ末端フラグメントは、実施例１に示されたとおりＥＬＩＳＡにより測定された。結果は、血管閉塞の程度とよく相関していた（表１１）。心臓血管障害のリスクは、前（pro）および抗炎症性応答のための追加のマーカーおよびアジポネクチンによっても評価された。前および抗炎症性応答のためのアナライトをａｄｉｐｏｒ１と比較した。異常なＡｄｉｐｏＲ結果は、血管閉塞を有する患者においてアジポネクチン、ウリスタチン、ビクニン、ＷＢＣまたはＣＲＰよりも多く存在しそうであった。より高い敏感度は、アテローム性動脈硬化症による血管閉塞についてのアジポネクチンレセプター１の診断相関を支持する。
【０２０９】
【表２１】
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【０２１０】
前および抗炎症性応答ならびに脂肪細胞マーカーのパネルの使用を、心臓血管障害を検出するそれらの能力について比較した。真の陽性の最も高い数はビクニン、ウリスタチン、ＣＲＰ、ＷＢＣ、アジポネクチンおよびＡｄｉｐｏＲ１の組み合わせた使用で得られた。真の陰性の最も高い数は、アジポネクチンとＡｄｉｐｏＲ１の組み合わせた使用で得られた。
【０２１１】
各列挙された範囲は、範囲のすべての組み合わせおよびサブ組み合わせならびにその仲に含有された特定の数字を含む。
【０２１２】
この明細書で引用されたすべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願がすべての目的のために参照により組み込まれることが特定的におよび個々に示されているかのように、すべての目的のためにそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
前記発明は理解を明確にする目的で例示および実施例としていくらか詳細に記載されたけれども、特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくある変化および修飾がそれに対してなされることは本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかであろう。
【０２１４】
【表２２】
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【０２１５】
【表２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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