(57)【要約】  コーヒー植物のフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが開示される。こうしたポリヌクレオチド及びポリペプチドをコーヒー豆の風味、芳香、及び他の特徴の操作に、並びにコーヒー植物における病原体、草食動物及び昆虫による攻撃への耐性の操作に使用するための方法も開示される。【選択図】  なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、トランスケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンレダクターゼ、カルコンイソメラーゼ、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ、ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ、ロイコアントシアニジンレダクターゼ及びアントシアニジンレダクターゼから選択されるフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素をコードするコード配列を有する、コーヒー（コーヒーノキ属種）から単離された核酸分子。
【請求項２】
前記コード配列がフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号２０と８５．２％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号２０を含むアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号２１と８３．９％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号２２と８２．６％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号２２を含むアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記コード配列が配列番号１、配列番号２又は配列番号３を含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記コード配列がトランスケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記トランスケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼが、配列番号２３と８９．９％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記トランスケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼが、配列番号２３を含むアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記コード配列が配列番号４を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記コード配列が４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼが、配列番号２４と８１．１％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼが、配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼが、配列番号２５と８１．９％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼが、配列番号２５を含むアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼが、配列番号２６と８１％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼが、配列番号２６を含むアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記コード配列が配列番号５、配列番号６又は配列番号７を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記コード配列がカルコンシンターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記カルコンシンターゼが、配列番号２７と９０．５％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記カルコンシンターゼが、配列番号２７を含むアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
前記コード配列が配列番号８を含む、請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項２６】
前記コード配列がカルコンレダクターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２７】
前記カルコンレダクターゼが、配列番号２８と６０．７％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
前記カルコンレダクターゼが、配列番号２８を含むアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
前記カルコンレダクターゼが、配列番号２９と６１．６％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項３０】
前記カルコンレダクターゼが、配列番号２９を含むアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記カルコンレダクターゼが、配列番号３０と６１．３％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記カルコンレダクターゼが、配列番号３０を含むアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記コード配列が配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記コード配列がカルコンイソメラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３５】
前記カルコンイソメラーゼが、配列番号３１と６３．４％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
前記カルコンイソメラーゼが、配列番号３１を含むアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項３７】
前記カルコンイソメラーゼが、配列番号３２と６４．３％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３８】
前記カルコンイソメラーゼが、配列番号３２を含むアミノ酸配列を有する、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記コード配列が配列番号１２又は配列番号１３を含む、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項４０】
前記コード配列がフラバノン３−ヒドロキシラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記フラバノン３−ヒドロキシラーゼが、配列番号３３と８２．４％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記フラバノン３−ヒドロキシラーゼが、配列番号３３を含むアミノ酸配列を有する、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４３】
前記コード配列が配列番号１４を含む、請求項４０に記載の核酸分子。
【請求項４４】
前記コード配列がフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４５】
前記フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼが、配列番号３４と６７．８％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４４に記載の核酸分子。
【請求項４６】
前記フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼが、配列番号３４を含むアミノ酸配列を有する、請求項４５に記載の核酸分子。
【請求項４７】
前記コード配列が配列番号１５を含む、請求項４４に記載の核酸分子。
【請求項４８】
前記コード配列がジヒドロフラボノール−４−レダクターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４９】
前記ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼが、配列番号３５と６７．６％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４８に記載の核酸分子。
【請求項５０】
前記ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼが、配列番号３５を含むアミノ酸配列を有する、請求項４９に記載の核酸分子。
【請求項５１】
前記コード配列が配列番号１６を含む、請求項４８に記載の核酸分子。
【請求項５２】
前記コード配列がロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５３】
前記ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼが、配列番号３６と７３．１％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項５４】
前記ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼが、配列番号３６を含むアミノ酸配列を有する、請求項５３に記載の核酸分子。
【請求項５５】
前記コード配列が配列番号１７を含む、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項５６】
前記コード配列がロイコアントシアニジンレダクターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５７】
前記ロイコアントシアニジンレダクターゼが、配列番号３７と５９．９％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項５６に記載の核酸分子。
【請求項５８】
前記ロイコアントシアニジンレダクターゼが、配列番号３７を含むアミノ酸配列を有する、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項５９】
前記コード配列が配列番号１８を含む、請求項５６に記載の核酸分子。
【請求項６０】
前記コード配列がアントシアニジンレダクターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６１】
前記アントシアニジンレダクターゼが、配列番号３８と７７．４％超同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６０に記載の核酸分子。
【請求項６２】
前記アントシアニジンレダクターゼが、配列番号３８を含むアミノ酸配列を有する、請求項６１に記載の核酸分子。
【請求項６３】
前記コード配列が配列番号１９を含む、請求項６０に記載の核酸分子。
【請求項６４】
前記コード配列が遺伝子のオープンリーディングフレームである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６５】
請求項６４に記載の遺伝子の転写によって生成されたｍＲＮＡ分子。
【請求項６６】
請求項６５に記載のｍＲＮＡ分子の逆転写によって生成されたｃＤＮＡ分子。
【請求項６７】
請求項１に記載の核酸分子のセグメントと相補的である８から１００塩基長のオリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
請求項１に記載の核酸分子のコード配列を含むベクター。
【請求項６９】
プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスのベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである、請求項６８に記載のベクター。
【請求項７０】
前記核酸分子のコード配列が構成的プロモーターと作動可能に連結している、請求項６９に記載のベクター。
【請求項７１】
前記核酸分子のコード配列が誘導性プロモーターと作動可能に連結している、請求項６９に記載のベクター。
【請求項７２】
前記核酸分子のコード配列が組織特異的プロモーターと作動可能に連結している、請求項６９に記載のベクター。
【請求項７３】
前記組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項７２に記載のベクター。
【請求項７４】
前記種子特異的プロモーターがコーヒー種子特異的プロモーターである、請求項７３に記載のベクター。
【請求項７５】
請求項６９に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７６】
植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項７５に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、エンバク、モロコシ、アルファルファ、クローバー、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオ、オオブドウホオズキ、ジャガイモ、コショウ、ナス、テンサイ、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、デルフィニウム、ペチュニア、ヒャクニチソウ及び芝草からなる植物の群から選択される植物細胞である、請求項７６に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
請求項７７に記載の植物細胞から作出された稔性植物。
【請求項７９】
コーヒー豆の風味又は芳香を調節する方法であって、コーヒー種子内の１種又は複数のフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素の生成又は活性を調節することを含み、フェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、トランスケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンレダクターゼ、カルコンイソメラーゼ、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ、ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ、ロイコアントシアニジンレダクターゼ及びアントシアニジンレダクターゼから選択される方法。
【請求項８０】
１種又は複数のフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素の生成又は活性を増大させることを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
コーヒー種子内の１種又は複数の内在性のフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素遺伝子の発現を増大させることを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
フェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素コード導入遺伝子を植物に導入することを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
１種又は複数のフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素の生成又は活性を低下させることを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
フェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路酵素コード遺伝子の１種又は複数の発現を抑制する核酸分子をコーヒーに導入することを含む、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、農業バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、フラボノイド合成を司る酵素をコードするコーヒー植物由来のポリヌクレオチド、並びにこうしたポリヌクレオチド及びポリペプチドをコーヒー豆の風味、芳香及び他の特徴の遺伝子調節及び操作に使用するための方法を特徴とする。
【０００２】
［発明の背景］
本明細書を通じて特許、公開出願及び学術論文を含めた様々な刊行物が引用される。こうした刊行物はそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書内で十分に記載されていない引用は本明細書の末尾に認められよう。
【０００３】
コーヒーの芳香及び風味は、コーヒーの品種及び銘柄に対する消費者の嗜好における重要な要素である。コーヒー特有の芳香及び風味は、豆の焙煎の際に起こる、風味前駆体が関与した複雑に連続する化学反応（メイラード反応）によって生じる。風味前駆体としては、緑色のコーヒー豆中に存在する化合物及び生体分子がある。現在までに、８００を超える化学物質及び生体分子が、コーヒーの風味及び芳香に寄与するものとして同定されている。（Ｆｌａｍｅｎｔ，Ｉ．，２００２“Ｃｏｆｆｅｅ  Ｆｌａｖｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  Ｕ．Ｋ．）。コーヒー消費者はますます洗練されつつあるので、消費者の嗜好に合わせるために芳香及び風味が向上したコーヒーを生産することが望ましい。芳香及び風味はどちらもコーヒー製品に化学的手段を介して人工的に付与することができる。例えば、米国特許第４，０７２，７６１号明細書（芳香）及び米国特許第３，９６２，３２１号明細書（風味）を参照されたい。しかし、現在までに、多糖類、タンパク質、色素、脂質などの天然のコーヒー粒成分がコーヒーの芳香及び風味に与える影響に関する情報はほとんどない。１つの手法は、既存の生殖質から優れた風味特性を有する品種を選抜することである。この手法の不利な点は、最高品質の品種が、収量に乏しい、病害及び環境ストレスへの耐性が低いなどの重大な負の農業形質をも頻繁に有することである。異なる産業形質及び農業形質を有する品種同士を交雑し、その子孫を高い品質と優れた農業生産力の両方についてスクリーニングする育種試験から新たな品種を選抜することも可能である。しかし、この後者の手法は、多大な時間を要し、１回の交雑実験及び３度の生育期にわたる選抜に最低７〜８年かかる。したがって、コーヒーの品質を高めるための代替手法は、分子生物学の技術を使用して、コーヒー豆に自然に見出される、風味及び芳香に関与するこうした要素を増強することか、又はコーヒー豆に自然には存在しない、芳香及び風味を増強する要素を付加することと考えられる。こうした目的の達成には遺伝子工学が特に適している。例えば、異なるコーヒー種由来のコーヒータンパク質を交換することができる。代替方法としては、コーヒーの風味に正に寄与する、自然に存在するコーヒータンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することもできる。反対に、コーヒーの風味に負に寄与する、自然に存在するコーヒータンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することもできる。
【０００４】
異なる品種及び起源に由来するコーヒーは、同じようにして緑色粒試料を焙煎し加工しても風味性及び芳香性の著しい差異を示す。この質の違いは、粒試料内の化学的、物理的差異の現れであり、これは主として生育及び加工条件の違いから生じ、母系植物と粒の両方の遺伝的背景の違いからも生じる。化学組成のレベルでは、風味性の少なくとも一部は、異なる品種由来の粒と関連して存在する糖、酸、フェノール類、カフェインなどの少量の代謝産物のレベルの差異と関連付けることができる。まだ十分に特徴付けられてない他の風味分子及び風味前駆体分子が存在することが認められている。さらに、粒内の構造的差異もコーヒーの品質の違いに寄与する可能性が高い。コーヒーの品質と関係があるコーヒー粒中の新たな成分を見出す１つの手法は、異なる品質特性を有する異なる品種において粒試料の成熟の際に差次的に発現する遺伝子及びタンパク質を研究することである。同様に、風味分子及び風味前駆分子の生合成に関与する遺伝子及びタンパク質を研究することもできる。
【０００５】
フラボノイドは、遍在する植物二次代謝産物の大きな群を形成し、このクラスは現在までに４０００を超える分子が同定されている（Ｂｏｖｙ他（２００２）及びＹｉｌｍａｚ他（２００４））。フラボノイドは、フェニルアラニンから初期フェニルプロパノイド経路を経て合成されたｐ−クマロイル−ＣｏＡと、クエン酸回路によって生成されたマロニル−ＣｏＡの３分子との縮合によって誘導される。（Ｄｉｘｏｎ他（１９９９）；Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ（２００２）；及びＤｉｘｏｎ（２００５））。植物の正常な機能性及び生存に種々のフラボノイド代謝産物が様々な形で寄与している。例えば、花に存在する赤、青及び紫のアントシアニン色素は、受粉のために昆虫を引き寄せることにそれが関与することによって植物の生殖に関係する。（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ（２００２））。他のフラボノイド、褐色のプロアントシアニジン色素（縮合型タンニンとも称される）は、抗菌性を有すると考えられ、したがって、微生物抵抗性に寄与すると提案されている。（Ｓｉｖａｋｕｍａｒａｎ他（２００４）；及びＣｏｓ他（２００５））。フラボノイドのさらに別の群、イソフラボンは、主にマメ科植物で合成され、植物・微生物間相互作用に関与する。（Ｄｉｘｏｎ（２００５））。例えば、イソフラボンは、マメ科植物の根から持続的に分泌され、ダイゼインなどの分子が、根粒形成する根粒菌属細菌の根粒形成関連遺伝子を誘導することが示されている。（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他（２００４））。
【０００６】
近年、フラボノイドを含有する植物性食品とヒトの健康との間の関係に焦点を当てる研究が増えつつある。この分野への学究的及び応用的関心はいずれも、広く消費されている植物性食品にはフラボノイド／フェノール化合物が比較的豊富に含まれているものもあるという事実によって、またこうした食品を大量に消費する人の方が循環器疾患及び癌などのある重大な健康上の問題のリスクが低いらしいという事実によって刺激されている。（Ｂａｚｚａｎｏ他（２００２）；Ｃｌｉｆｆｏｒｄ（２００４）；Ｃｏｓ他（２００５）；及びＧｏ他（２００５））。ヒト及び動物の健康にとってのフラボノイドの重要性は、フラボノイドが哺乳動物細胞内での特異的な機能相互作用を有し得ることを示唆する詳細な実験データによって裏付けられる。例えば、ケンフェロール、ケルセチンなどのフラボノールの抗酸化特性により、酸化ストレスに対してある防御がなされることが広く示されている。（Ｓｕｇｉｈａｒａ他（１９９９）；及びＤｕｔｈｉｅ他（２０００））。高血圧ラットにおいてフラボノイドのケルセチンを毎日経口投与すると、降圧作用と抗酸化作用がどちらもあることが示されている。（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｕｒａ他（２００５））。
【０００７】
現在、ブラックチョコレートに存在するフラボノイドが集中的に研究されており、最近の研究で、フラボノイドが豊富に含まれるブラックチョコレートを摂取すると、おそらく、フラボノイドの１種又は複数が一酸化窒素のバイオアベイラビリティを向上することができるため、血圧を降下させる可能性があることが示された。（Ｇｒａｓｓｉ他（２００５））。レスベルトロルは、現在関心が高い別のフラボノイド関連分子である。このファイトアレキシンは、ブドウ及び他の食物で見出されており、発癌化学予防物質として活性があり（Ｊａｎｇ他（１９９７））、Ｓｉｒ−２様タンパク質（サーチュイン）を活性化できることにより老化を遅延させる潜在的可能性を有することが認められている。（Ｗｏｏｄ他（２００４））。ダイズに存在するイソフラボノイドのような他のフラボノイドの食餌による高摂取も癌のレベルの低減と関連付けられており（Ｓｅｔｃｈｅｌｌ他（１９９９））、イソフラボンのゲニステインの食餌による摂取は、ラットの乳癌に対する感受性を低減することが示されており（Ｌａｍａｒｔｉｎｉｅｒｅ他（２００２）、また雌性マウスにおいてエストロゲン欠乏によって引き起こされる骨量減少を阻止することに寄与する。（Ｉｓｈｉｍｉ他（１９９９））。
【０００８】
重要なフラボノイド前駆体ｐ−クマリル−ＣｏＡをもたらす植物フェニルプロパノイド経路の初期段階が数種の植物において説明されている（図１Ａ；Ｄｉｘｏｎ他（１９９５）；及びＷｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ（２００２）。フェニルプロパノイド経路の第一段階は、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によるフェニルアラニンからケイ皮酸への脱アミノ化である。シロイヌナズナにおいて４種の異なるＰＡＬ遺伝子が特徴付けられており、これらは２つの異なる群に分類されると考えられている。（Ｒａｅｓ他（２００３））。植物の一次代謝経路と二次代謝経路の主要な分岐点と予想される通り、様々なＰＡＬアイソフォームの発現及び活性が複雑な調節制御の下にある。（Ｄｉｘｏｎ他（１９９５）；及びＲｏｈｄｅ他（２００４））。この経路の次の酵素は、タンパク質トランスケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ；ＣＹＰ７３Ａ５）である。シロイヌナズナにおいてこのＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼの遺伝子が１つだけ見出されているが、他の一部の植物では２つの異なるクラスに分類される２種以上のＣ４Ｈ遺伝子が存在し得る。（Ｒａｅｓ他（２００３））。次の段階であるｐ−クマリル−ＣｏＡの生成は、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）によって行われる。シロイヌナズナゲノムに少なくとも４種の４ＣＬ遺伝子及び９種の４ＣＬ様遺伝子が存在する。（Ｒａｅｓ他（２００３））。ｐ−クマリルＣｏＡを形成することに加えて、シロイヌナズナ由来の特徴付けられた４ＣＬタンパク質、並びにダイズ由来の特徴付けられた４ＣＬタンパク質は、コーヒー酸及びフェルラ酸のＣｏＡエステルを異なる効率で形成できることが認められ、シロイヌナズナのＡｔ４ＣＬ４タンパク質及びダイズのＧｍ４ＣＬ１タンパク質は、５−ヒドロキシフェルラ酸及びシナピン酸のＣｏＡエステルを形成できることも認められた。（Ｈｕ他（１９９８）；Ｌｉｎｄｅｒｍａｙｒ他（２００２）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ他（２００３）；及びＨａｍｂｅｒｇｅｒ他（２００４））。
【０００９】
コアフラボノイド合成経路に関して最近多くの総説が公表されており（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ（２００２）及びＤｉｘｏｎ（２００５）、図１Ｂでこの経路に対する現在の理解を図式的に概説する。（Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ（２００２）、及びＸｉｅ他（２００４））。この経路の第一段階は、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）によって触媒されるが、ｐ−クマリルＣｏＡと３分子のマロニルＣｏＡとの縮合によってテトラヒドロキシカルコン（ナリンゲニンカルコン）が形成される。一部の植物、特にマメ科植物では酵素カルコンレダクターゼ（ＣＨＲ）が存在することもある（図１Ｂ）。この酵素は、ＣＨＳ多段階反応の中間体に作用すると考えられており、ＣＨＳ／ＣＨＲ共役反応によりカルコン（４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン）及びデオキシカルコン（４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン）が得られると提案されている。（Ｂｏｍａｔｉ他（２００５））。次いで、こうしたＣＨＳ／ＣＨＲ生成物は、草食動物及び病原体による攻撃に応答して生成されることが多い一群のファイトアレキシンの前駆体、及び窒素固定根粒菌属細菌による共生根粒形成に関与するＣＨＲ誘導生成物の合成のための前駆体である。（Ｄｉｘｏｎ他（１９９９））。
【００１０】
コアフラボノイド経路において、ＣＨＳの生成物（ナリンゲニンカルコン）は、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）によって（２Ｓ）−５，７，４’−トリヒドロキシフラバノン（ナリンゲニン）に転換される。２種類のＣＨＩが発見されており、Ｉ型は植物界に遍在するが、ＩＩ型ＣＨＩはより広い基質範囲を有し、マメ科植物で最も頻繁に見出されているようである。（Ｒａｌｓｔｏｎ他（２００５））。この経路における次の反応は、Ｃ環のＣ３位でのヒドロキシル基の付加によって２，３−ジヒドロケンフェロール（ＤＨＫ）を形成し、Ｆ３ｂｅｔａＨ、２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される。（Ｄｉｘｏｎ他（１９９９）；Ｗｅｌｌｍａｎ他（２００４）；及びＤｉｘｏｎ（２００５））。図１Ｂに示される通り、ＤＨＫはさらに、Ｐ４５０依存性酵素Ｆ３’Ｈ及びＦ３’５’ＨによってＢ環の３’位及び５’位でヒドロキシル化して、それぞれ２，３−ジヒドロケルセチン（ＤＨＱ）及び２，３ジヒドロミリセチン（ＤＨＭ）を形成することができる。ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（ＤＦＲ）は、次の反応、すなわちＤＨＫ、ＤＨＱ及びＤＨＭ（Ｆ３Ｈファミリーの酵素によって合成される）のＣ環の４位でのヒドロキシル基の付加を触媒して、それぞれロイコペラルゴニジン、ロイコシアニジン又はロイコデレフィニジンを生じる。しかし、植物のＤＦＲタンパク質の中には、一水酸化ＤＨＫを受け入れないものがあり、したがってこうした植物は、下流の関連生成物を生成することができない可能性がある。（Ｊｏｈｎｓｏｎ他（２００１））。シロイヌナズナ、トマトなどの植物においてＤＦＲ遺伝子が１つだけ見出されており、興味深いことに、数種のＤＦＲ遺伝子を有する植物では、こうした遺伝子のうち１つだけが活性タンパク質を生成すると考えられている。（Ｘｉｅ他（２００４））。ＤＦＲの生成物は、アントシアニン及び縮合型タンニンの合成のための重要な前駆体であり、草食動物による攻撃により植物におけるＤＦＲの発現が誘導されることが注目される。さらに、この誘導は、草食動物からの植物の保護と関係付けられている一群の分子、縮合型タンニンの合成の増大を伴う。（Ｐｅｔｅｒｓ他（２００２））。ＤＦＲのすぐ下流で、酵素アントシアニジンシンターゼ（ＡＮＳ；ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ）が、様々なＤＦＲ生成物から（すなわち、ロイコアントシアニンから）アントシアニジンを形成することができ、続いてこうしたＡＮＳ生成物はグリコシル化してアントシアニンを形成することができる。さらに、ロイコアントシアニジンレダクターゼ（ＬＡＲ）がロイコアントシアニジンを変換して２，３−トランス−フラバン−３−オール（カテキン）を形成することもできる。関連する２，３−シス−フラバン−３−オール（エピカテキン）は、ＡＮＳと、ＮＡＤＰＨを使用してアントシアニジンを還元するアントシアニジンレダクターゼ（ＡＮＲ）との作用を介して形成される。（Ｘｉｅｔ他（２００３））。最後に、トランス−及びシス−フラバン−３−オールのモノマーから縮合型タンニンの形成を司る最終段階（複数可）については現在ほとんど知られていない。
【００１１】
フラボノイド及び関連グリコシル化誘導体は、植物成分から製造された飲料に風味の点で大きく寄与することがよく知られている。例えば、柑橘類グレープフルーツは、フラバノン（フラバノン−７−ネオヘスペリドシド）の存在に部分的に起因する苦味を有することが知られているが、それとは対照的に、無味のフラボノン−７−ルチノシドのみを有するオレンジは、一般に苦味が少ない。（Ｆｒｙｄｍａｎ  Ａ他（２００４）。同様に、ブドウのフラボノイド及び関連分子は、様々なワインの渋味及び苦味特性に大きく寄与することがよく知られている（Ｍｏｎａｇａｓ  Ｍ他（２００５））。最後に、果汁及び茶などの他の飲料は、アントシアニジンを、こうした飲料の風味及び渋味に大きく寄与するレベルで含有する。（Ｄｉｘｏｎ  Ｒ他（２００５ｂ）；及びＬｅｓｓｃｈａｅｖｅ  Ｉ他（２００５））。アントシアニジンは、フラボノイド経路によって生成された分子のモノマー、オリゴマー及びポリマーである。したがって、上記知見を考慮すると、前駆体のレベル及び／又は分子プロファイルを変更することにより、又は出発植物材料における最終生成物の重合レベル及びプロファイルを変更することにより、こうした原材料から作製された飲料の風味及び渋味プロファイルが変更可能なはずであると予想することができる。
【００１２】
現在、緑色の、又は焙煎したコーヒー粒中のフラボノイドの存在や、こうした分子又はその誘導体がコーヒーの風味に寄与するかどうかに関して公表された情報はほとんどない。しかし、最近のある報告で、焙煎したコーヒー中にフラボノイドが存在することが示唆されている。（Ｙｅｎ他（２００５））。しかし、こうした研究者によって使用されたフラボノイド含有量を求める方法は、広範総フラボノイド方法であり、したがって、焙煎したコーヒーにおけるこの広範な種類の分子の人為的に増長させた測定を提供できるはずであることが注目されている。したがって、コーヒー粒及び焙煎した産物の両方に存在するフラボノイドを調べるためのより詳細な研究が必要とされる。最近、コーヒーチェリーの果実部分（果皮）に存在するフラボノイドを扱い始めた１つの研究が実施されている。熟したアラビカ種コーヒーのチェリー果実は、３種類の主要なフラボノイド：フラバン−３−オール（モノマー及びプロシアニジン）、フラボノール及びアントシアニジンを含有することが認められている。（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｃｏｒｏｎｅｌ他（２００４））。こうした化合物が、知られている役割を他の植物で果たせば、コーヒーフラボノイドがまた、ＵＶ及び酸化関連ストレスから果実組織を保護すること、及び微生物及び昆虫による攻撃からチェリーを保護することに関与すると仮定することができる。ヒトの食餌においてフラボノイドは健康上有益であり、こうした分子は農学的にも有益である（草食動物／病原体及びストレス耐性）ので、コーヒーのフラボノイド経路を調べることは興味深い。
【００１３】
これまでの論述から、初期フェニルプロパノイド及びフラボノイドの生合成を司るタンパク質の生成を遺伝的に調節することによりコーヒー粒中のフラボノイド含有量を調節すれば、このような遺伝子改変されたコーヒー豆から製造されたコーヒー飲料及びコーヒー製品の芳香及び風味を増強するのに極めて有用となることが理解されよう。また、コーヒー豆のフラボノイド含有量の増大及び／又はフラボノイドプロファイルの改変は、このようなコーヒー豆から製造されたコーヒー飲料及び製品の消費者の健康及び健康状態全般に正に寄与することもできる。さらに、コーヒー植物におけるフラボノイド含有量を調節することは、紫外線、酸化、微生物又は昆虫によるストレス又は損傷からのコーヒー果実の保護と関係付けられる。したがって、初期フェニルプロパノイド及びフラボノイドの生合成に関与するコーヒーから遺伝子及び酵素を同定し、単離し、利用する必要がある。
【００１４】
［発明の概要］
本明細書に記載の本発明は、コーヒー植物のフラボノイド生合成をもたらす経路の酵素をコードする遺伝子、そのコードポリペプチド、並びにこうしたポリヌクレオチド及びポリペプチドをコーヒー豆の風味、芳香及び他の特徴の遺伝子調節及び操作に使用するための方法を特徴とする。
【００１５】
本発明の一態様は、フラボノイド経路酵素をコードするコード配列を有する、コーヒー（コーヒーノキ属種）から単離された核酸分子を特徴とする。一実施形態では、この酵素は、配列番号２０と少なくとも８５．２％同一であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２１と少なくとも８３．９％同一であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２２と少なくとも８２．６％同一であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２３と少なくとも８９．９％同一であるトランスケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２４と少なくとも８１．１％同一である４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２５と少なくとも８１．９％同一である４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼである。別の実施形態では、この酵素は、配列番号２６と少なくとも８１％同一である４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２７と少なくとも９０．５％同一であるカルコンシンターゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２８と少なくとも６０．７％同一であるカルコンレダクターゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号２９と少なくとも６１．６％同一であるカルコンレダクターゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３０と少なくとも６１．３％同一であるカルコンレダクターゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３１と少なくとも６３．４％同一であるカルコンイソメラーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３２と少なくとも６４．３％同一であるカルコンイソメラーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３３と少なくとも８２．４％同一であるフラバノン３−ヒドロキシラーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３４と少なくとも６７．８％同一であるフラバノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３５と少なくとも６７．６％同一であるジヒドロフラボノール−４−レダクターゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３６と少なくとも７３．１％同一であるロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３７と少なくとも５９．９％同一であるロイコアントシアニジンレダクターゼである。別の実施形態では、酵素は、配列番号３８と少なくとも７７．４％同一であるアントシアニジンレダクターゼである。
【００１６】
ある実施形態では、核酸分子は、コード配列を含むオープンリーディングフレームを有する遺伝子である。或いは、核酸分子は、この遺伝子の転写によって生成されたｍＲＮＡ分子、又はｍＲＮＡ分子の逆転写によって生成されたｃＤＮＡ分子を含むことができる。本発明はまた、前記核酸分子のセグメントと相補的である８から１００塩基長のオリゴヌクレオチドを特徴とする。
【００１７】
本発明の別の態様は、上記フラボノイド経路酵素コード核酸分子を含むベクターを特徴とする。ある実施形態では、このベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスのベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである。ある実施形態では、ベクターは、構成的プロモーターと作動可能に連結している核酸分子のコード配列を含有する。他の実施形態では、このコード配列は、誘導性プロモーターと作動可能に連結している。他の実施形態では、核酸分子のコード配列は、種子特異的プロモーター、好ましくはコーヒー種子特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターと作動可能に連結している。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、前記ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、植物、細菌、真菌、昆虫又は哺乳動物の細胞であってよい。ある実施形態では、宿主細胞は、コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、エンバク、モロコシ、アルファルファ、クローバー、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオ、トマト、オオブドウホオズキ、ジャガイモ、コショウ、ナス、テンサイ、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、デルフィニウム、ヒャクニチソウ及び芝草のいずれか１つから選択される植物細胞である。本発明はまた、形質転換された植物細胞を再生することによって作出された稔性トランスジェニック植物を特徴とする。具体的な実施形態では、稔性トランスジェニック植物は、コーヒーノキ属種である。
【００１９】
本発明の別の態様は、コーヒー豆の風味又は芳香を調節する方法を特徴とする。この方法は、コーヒー種子内の１種又は複数のフラボノイド経路酵素の生成を調節することを含む。一部の実施形態では、この方法は、例えば、コーヒー種子内の１種又は複数の内在性のフラボノイド経路酵素コード遺伝子の発現を増大させることにより、又はフラボノイド経路酵素コード導入遺伝子を植物に導入することにより、１種又は複数のフラボノイド経路酵素の生成を増大させることを含む。他の実施形態では、この方法は、例えば、フラボノイド経路酵素コード遺伝子の１種又は複数の発現を抑制する核酸分子をコーヒーに導入することにより、１種又は複数のフラボノイド経路酵素の生成を減少させることを含む。
【００２０】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の図面、詳細な説明及び実施例を参照することによって理解されよう。
【００２１】
［例示的実施形態の詳細な説明］
定義：
本明細書及び特許請求の範囲全体にわたり、本発明の生体分子及び他の態様に関する種々の用語が使用される。
【００２２】
用語「フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路」は、植物、より具体的には、コーヒー植物のフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成に関与するポリペプチドを指す。この用語は、その経路にある各タンパク質のそれぞれの特異的な作用機序を包含し、フェニルプロパノイド経路の初期段階におけるフラボノイド前駆体の酵素的生成を含む。このポリペプチドには、限定することなく、本明細書で例示されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（「ＰＡＬ」）、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ（「Ｃ４Ｈ」）、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（「４ＣＬ」）、カルコンシンターゼ（「ＣＨＳ」）、カルコンイソメラーゼ（「ＣＨＩ」）、カルコンレダクターゼ（「ＣＨＲ」）、フラボン３−ヒドロキシラーゼ（「Ｆ３Ｈ」）、ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ（「ＤＦＲ」）、アントシアニジンレダクターゼ（「ＡＮＲ」）、及びロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼとも称されるアントシアニジンシンターゼ（「ＡＮＳ」）が含まれる。
【００２３】
「単離された」は、「人の手によって」自然の状態から改変されたことを意味する。ある組成物又は物質が自然界に存在する場合、それがその本来の環境から変化するか若しくは取り出されるか又はその両方が起こると、それは「単離された」ことになる。例えば、生きている植物又は動物に自然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その自然の状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書でこの用語が使用される通り「単離された」ものである。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」は、「核酸分子」とも称され、一般に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡであっても、修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、限定することなく、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ又は複数の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性が、又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、及びイノシンなどの希な塩基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡに種々の修飾を施すことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見出される化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、並びにウイルス及び細胞に特有の化学的な形のＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドと称されることが多い比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００２５】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結した２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーとよく称される短鎖と、タンパク質と一般に称される長鎖のどちらをも指す。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされた２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの自然の過程、又は当技術分野で周知の化学修飾技法のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。このような修飾は、基礎的な教科書及びより詳細なモノグラフ、並びに膨大な研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどんな箇所でも起こり得る。所与のポリペプチドのいくつかの部位で、同じ種類の修飾が同じ又は様々な程度で存在し得ることが理解されよう。また、所与のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含むこともある。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状であっても、分枝を伴う又は伴わない環状であってもよい。環状ポリペプチド、分枝ポリペプチド及び分枝環状ポリペプチドは、自然の翻訳後の過程から生じたものであっても、合成的方法によって作製してもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介による付加、及びユビキチン化が含まれる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３及びＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，１−１２頁  ｉｎ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ他，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６及びＲａｔｔａｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２を参照されたい。
【００２６】
「変異体」は、この用語を本明細書で使用する場合、それぞれ標準のポリヌクレオチド又はポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の標準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化により、標準のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化してもしなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べる通り、標準の配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらし得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の標準のポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、標準のポリペプチドと変異体の配列が全体的に極めて類似し、多くの領域で同一であるように違いは限定される。変異体と標準のポリペプチドは、１つ又は複数の置換、付加又は欠失の任意の組合せによりアミノ酸配列が異なることがある。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体など自然に存在するものであっても、自然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの自然に存在しない変異体は、突然変異誘発技法又は直接合成によって作製することができる。
【００２７】
突然変異植物に関して、用語「ヌル突然変異体」又は「機能喪失突然変異体」は、遺伝子産物を非機能的にするか又はほとんど欠如させる突然変異を有する生物又はゲノムＤＮＡ配列を示すのに使用される。このような突然変異は、遺伝子のコード領域及び／又は調節領域中で起こることがあり、個々の残基の変化、又は核酸の領域の挿入若しくは欠失であることもある。こうした突然変異は、タンパク質を非機能的にするか又はほとんど欠如させるように、遺伝子及び／又はコードタンパク質を調節又は制御することができる他の遺伝子のコード領域及び／又は調節領域中で起こることもある。
【００２８】
用語「実質的に同じ」は、タンパク質の性質（すなわち、タンパク質の構造、安定特性、基質特異性及び／又は生物活性）に実質的には影響を及ぼさない配列変異を有する核酸又はアミノ酸配列を指す。特に核酸配列に関して、用語「実質的に同じ」は、コード領域、及び発現を支配する保存配列を指すものとし、同じアミノ酸をコードする縮重コドン、又はコードポリペプチドにおいて保存的置換アミノ酸をコードする代替コドンを主に指す。アミノ酸配列に関して、用語「実質的に同じ」は一般に、構造又は機能の決定に関与しないポリペプチドの領域中の保存的置換及び／又は変異を指す。
【００２９】
用語「〜パーセント同一である」及び「〜パーセント類似する」も、本明細書ではアミノ酸配列間及び核酸配列間の比較において使用する。アミノ酸配列に言及する場合、「同一性」又は「〜パーセント同一である」は、配列解析プログラムによって比較したアミノ酸配列中で同一アミノ酸と一致した、対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。「〜パーセント類似する」とは、同一又は保存アミノ酸と一致した、対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。保存アミノ酸は、あるアミノ酸を別のアミノ酸と交換しても生じたタンパク質の三次構造が認め得るほどには変化しないように、構造が異なるが物理的特性が類似するものである。保存的置換は、Ｔａｙｌｏｒ（１９８６，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９：２０５）で定義されている。核酸分子に言及する場合、「〜パーセント同一である」は、配列解析プログラムにより同一ヌクレオチドと一致した、対象核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。
【００３０】
「同一性」及び「類似性」は、既知の方法によって容易に計算することができる。核酸配列及びアミノ酸配列は、核酸又はアミノ酸の類似する配列をアラインメントし、それによって違いを明らかにするコンピュータプログラムを使用して比較することができる。好ましい方法では、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）及びこれに使用されるパラメーターを用い、ＤＮＡｓｔａｒシステム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ゲノムＤＮＡ配列の配列断片をアラインメントする。しかし、任意の標準的なアラインメントソフトウェアの使用により、同等のアラインメント及び類似性／同一性の評価を得ることができる。例えば、ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ第９．１版、及びそのプログラムにより使用されるデフォルトパラメーター（ギャップ生成ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）を使用して、配列同一性及び類似性を比較することもできる。
【００３１】
本明細書では、「抗体」には、Ｆａｂ又は他のイムノグロブリン発現ライブラリーの産物を含めて、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体及びヒト化抗体、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）が含まれる。抗体に関して、用語「免疫学的に特異的な」又は「特異的な」は、対象のタンパク質の１種又は複数のエピトープと結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識せずそれと結合しない抗体を指す。抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは、当技術分野で周知であり日常的に実施されている。このようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗ他（編），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００３２】
用語「実質的に純粋な」は、対象の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０〜６０重量％含む調製物を指す。より好ましくは、調製物は、対象の化合物を少なくとも７５重量％含み、最も好ましくは９０〜９９重量％含む。純度は、対象の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【００３３】
一本鎖核酸分子に関して、用語「特異的にハイブリダイズする」は、当技術分野で一般に使用される所定の条件下でこのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子間の結合を指す（「実質的に相補的な」と称されることもある）。特に、この用語は、オリゴヌクレオチドと、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指し、オリゴヌクレオチドと、相補的でない配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションの実質的除外を指す。
【００３４】
「コード配列」又は「コード領域」は、配列が発現する場合にアミノ酸又はポリペプチドなどの遺伝子産物を産生するのに必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン又は５’若しくは３’非翻訳領域）を含んでもよく、又はこのような介在非翻訳配列を欠いてもよい（例えば、ｃＤＮＡなどの場合）。
【００３５】
「イントロン」は、タンパク質合成に関係する情報をコードしない、核酸中のポリヌクレオチド配列を指す。このような配列はｍＲＮＡには転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される前に除去される。
【００３６】
用語「作動可能に連結した」又は「作動可能に挿入された」は、コード配列の発現に必要な調節配列を、コード配列の発現が可能となるようにコード配列に対して適切な位置で核酸分子中に置くことを意味する。一例として、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写又は発現を制御することができる場合、そのコード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンスの方向でプロモーター又は調節配列と作動可能に連結することができる。用語「作動可能に連結した」は、発現ベクター中の他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に適用されることもある。
【００３７】
転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞中でのコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。
【００３８】
用語「プロモーター」、「プロモーター領域」又は「プロモーター配列」は一般に、遺伝子の転写調節領域を指し、これはコード領域の５’側又は３’側で、又はコード領域内、又はイントロン内に見出すことができる。典型的には、プロモーターは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位とその３’末端で結合し、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基又はエレメントを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（好都合には、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって定義される）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（共通配列）がある。
【００３９】
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスなどのレプリコンであり、これに、別の核酸セグメントの複製又は発現を引き起こすようにこのセグメントを作動可能に挿入することができる。
【００４０】
用語「核酸構築物」又は「ＤＮＡ構築物」は、適切な調節配列と作動可能に連結され、細胞を形質転換するためのベクター中に挿入された１種又は複数のコード配列を指すのに使用することもある。この用語は、用語「形質転換用ＤＮＡ」又は「導入遺伝子」と互換的に使用することができる。このような核酸構築物は、対象の遺伝子産物のコード配列を、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子と一緒に含有することもできる。
【００４１】
「マーカー遺伝子」又は「選択マーカー遺伝子」は、そのコードされた遺伝子産物が、その遺伝子を含有する細胞をその遺伝子を含有しない細胞の中から選択することができる特徴を有する遺伝子である。遺伝子工学に使用されるベクターは典型的に、１種又は複数の選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子の種類には、（１）抗生物質耐性遺伝子、（２）除草剤抵抗性又は除草剤耐性遺伝子、及び（３）形質転換された細胞が、そうでなければ細胞が産生することができない必須の成分、通常アミノ酸を合成するのを可能にする、代謝又は栄養要求性マーカー遺伝子が含まれる。
【００４２】
「レポーター遺伝子」もマーカー遺伝子の一種である。これは典型的に、標準的な実験手段（例えば、酵素活性、蛍光）によってアッセイ可能な又は検出可能な遺伝子産物をコードする。
【００４３】
遺伝子についての「発現する」、「発現された」又は「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。この過程は、遺伝子からｍＲＮＡへの転写、次いでｍＲＮＡから１種又は複数のポリペプチドへの翻訳を伴い、自然に存在するすべての翻訳後修飾を包含する。
【００４４】
「内因性」は、特定の生物内で自然に見出すことができる任意の構成成分、例えば、遺伝子若しくは核酸、又はポリペプチドを指す。
【００４５】
核酸構築物の「異種」領域は、より大きい分子内にある、自然界ではこのより大きい分子と一緒に存在していない、核酸分子の同定可能なセグメント（又は複数のセグメント）である。したがって、この異種領域が遺伝子を含む場合、遺伝子は通常、供給源の生物のゲノム中ではゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接する。別の例として、異種領域は、コード配列自体が自然界では見出されない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、又は天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異又は自然に存在する突然変異事象からは、ここで定義したＤＮＡの異種領域は生じない。上記で定義した用語「ＤＮＡ構築物」も、異種領域、特に細胞の形質転換に使用するために構築されたものを指すのに使用される。
【００４６】
外因性又は異種ＤＮＡが細胞内に導入されている場合、細胞はこのようなＤＮＡによって「形質転換」又は「トランスフェクト」されている。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれ（共有結合し）てもそうでなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞では、形質転換用ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームのエレメント上に維持することもできる。真核細胞に関して、安定形質転換細胞は、形質転換用ＤＮＡが染色体中に組み込まれ、その結果それが染色体複製により娘細胞に遺伝する細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質転換用ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる細胞系又はクローンを樹立できることによって実証される。「クローン」は、単一細胞、又は有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多世代にわたって安定して増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００４７】
「粒」、「種子」又は「豆」は、別の顕花植物に発達することができるこのような植物の再生単位を指す。本明細書では、特にコーヒー植物に関してこの用語は同義的且つ互換的に使用される。
【００４８】
本明細書では、用語「植物」は、全植物体、植物器官（例えば、葉、茎、シュート、根）、種子、花粉、植物細胞、植物細胞小器官及びその子孫への言及を含む。トランスジェニック植物の部分は、トランスジェニック植物又はその子孫に由来する、例えば、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚並びに花、茎、種子、花粉、果実、葉又は根を含むことが本発明の範囲内で理解されよう。
【００４９】
説明：
その態様の１つでは、本発明は、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路に関与する種々のタンパク質をコードするコーヒー由来の核酸分子を特徴とする。フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする核酸分子の代表例は、幼葉からと、発達の様々な段階で採取したチェリーの粒及び果皮組織から単離されたＲＮＡを用いて作製されたコフィア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ）（ロブスタ）のいくつかのｃＤＮＡライブラリーの４７，０００を超える発現配列タグ（ＥＳＴ）のデータベースから同定された。重複するＥＳＴを同定し、完全又は部分的コード配列のいずれかを含むユニジーン（コンティグ）へとクラスター化した。ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）の重複を除いたタンパク質データベースに対する個々の各配列のＢＬＡＳＴ検索を実施することによりユニジーン配列に注釈を付けた。
【００５０】
公開データベースからの生化学的に特徴付けられたタンパク質配列を使用したコーヒーＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ検索から、コーヒー植物のフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路のいくつかの重要な酵素に相当する遺伝子配列が明らかとなった。こうした配列の一部については完全オープンリーディングフレームを得、他のいくつかの配列については部分的オープンリーディングフレームを得た。場合によっては、部分的コード配列データを実験の出発点として使用して、５’ＲＡＣＥ又はゲノムウォーキング法のいずれかにより完全コード配列を単離した。このｃＤＮＡ及びそのコードタンパク質を下記の通り称する。
【００５１】
【表１】
2009511071.tif 000003
【００５２】
コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）及びコフィア・カネフォラ由来の、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路の重要な段階を触媒するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを本明細書で記載及び例示するが、本発明は、下記の目的でＣ．アラビカ及びＣ．カネフォラのポリヌクレオチド及びタンパク質と互換的に使用するのに十分に類似した他のコーヒーノキ属種由来の核酸及びコードタンパク質を包含するものとする。したがって、「フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成する」ポリペプチド及びタンパク質という用語を本明細書で使用する場合、この用語は、本明細書に記載の一般的な物理的、生化学的且つ機能的特徴を有するすべてのコーヒーノキ属タンパク質、並びにそれをコードするポリヌクレオチドを包含するものとする。
【００５３】
その配列の点から考慮すると、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドには、Ｃ．アラビカ及びＣ．カネフォラの異なる品種で見出される可能性が高い配列番号１〜１９の対立遺伝子変異体及び自然突然変異体、並びに異なるコーヒー種で見出される可能性が高い配列番号１〜１９の相同体が含まれる。このような変異体及び相同体は、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のある違いを有すると予想されるので、本発明は、配列番号２０〜３８のいずれか１つと少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％又は７０％、より好ましくは少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％又は８０％、さらに好ましくは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、またさらに好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、最も好ましくは９６％、９７％、９８％及び９９％以上の同一性を有し、配列番号１〜１９のいずれか１つと同等の範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質の間で存在する可能性が高い自然の配列変異、並びに異なるコーヒー品種及び種のそれをコードする遺伝子があるので、当業者であれば、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの固有の特性を依然として維持しながらこのレベルの変異を見出すことを予測するであろう。このような予測は、１つには、コードタンパク質の性質を認め得るほどに変化させない遺伝暗号の縮重並びに保存的アミノ酸配列変異の既知の進化的成功に起因する。したがって、このような変異体及び相同体は、互いに実質的には同じであるとみなされ、本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子に関連する遺伝子調節配列は実用性があり、本発明の範囲内とみなされる。任意のコーヒー種由来のフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及び他の遺伝子調節配列は、以下に記載の方法によって得ることができ、本発明に従って利用することもできる。フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現の組織特異性及び時間的特異性を支配するプロモーター及び調節エレメントを使用して、数ある有用性の中でこのような改変を含むコーヒー豆から製造されるコーヒー製品の風味及び芳香を増強する目標に向けて、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質の発現を促進、変更又は改変することができる。
【００５５】
下記の節では、本発明の実施に関与する一般的な手順を記載する。特定の物質について述べる限り、それは単に例示の目的に過ぎず、本発明を限定するものではない。別段の定めがない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）又はＡｕｓｕｂｅｌ他（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（２００５）に記載のものなど一般的な生化学及び分子生物学的手順を使用する。
【００５６】
核酸分子、タンパク質及び抗体：
本発明の核酸分子は、２つの一般的な方法によって調製することができる。（１）核酸分子は、適切なヌクレオチド三リン酸から合成することができ、又は（２）核酸分子は、生物学的供給源から単離することもできる。どちらの方法も、当技術分野で周知のプロトコールを利用する。
【００５７】
配列番号１〜１９を有するｃＤＮＡなどヌクレオチド配列情報が利用できることから、オリゴヌクレオチド合成により本発明の単離された核酸分子の調製が可能となる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又は類似の装置で使用されるホスホラミダイト法によって調製することができる。得られる構築物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など当技術分野で知られている方法に従って精製することができる。本発明のＤＮＡ分子などの長い二本鎖ポリヌクレオチドは、現在のオリゴヌクレオチド合成法には元々サイズ限界があるので、段階的に合成しなければならない。したがって、長い二本鎖分子は、例えば、適切な相補性を有するいくつかのより小さいセグメントとして合成することができる。このようにして作製された相補的セグメント同士を、各セグメントが隣接するセグメントの結合に適した付着末端を有するようにアニーリングすることができる。隣接するセグメント同士を、ＤＮＡリガーゼの存在下で付着末端をアニーリングすることによって連結して、長い二本鎖分子全体を構築することができる。次いで、このように構築された合成ＤＮＡ分子を適切なベクター中にクローニングし、増幅することができる。
【００５８】
本発明によれば、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のコード領域及び／又は調節領域の一部又は全部との適切なレベルの配列相同性を有する核酸は、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用することによって同定することができる。上記の戦略がゲノム配列に適用されると、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のコード配列の単離が可能となることに加え、調節配列がそれ自体適当なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相同性を有することができなくても、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子に関連するプロモーター及び他の遺伝子調節配列の単離も可能となることは当業者に理解されるであろう。
【００５９】
典型的な例示として、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム及び５０％以下のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を使用するＳａｍｂｒｏｏｋ他の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは３７〜４２℃で少なくとも６時間実施される。ハイブリダイゼーション後、フィルターを下記の通りに洗浄する：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分、（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分、（３）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間、（４）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３０分毎に溶液を交換しながら４５〜５５℃で２時間。
【００６０】
特定の配列相同性を有する核酸分子間でのハイブリダイゼーションを実現するのに必要となるストリンジェンシー条件を計算するある一般式（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中の塩基対数
【００６１】
上記の式の例示として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドと、ＧＣ含量４２％及び平均プローブサイズ２００塩基を使用すると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％低下する毎に１〜１．５℃低下する。したがって、標的が、約７５％を超える配列同一性を有する場合、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用すると観察される。上記のハイブリダイゼーション及び洗浄溶液を用いて、一実施形態では、ハイブリダイゼーションは３７℃、最終洗浄は４２℃で行い、別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃、最終洗浄は５０℃で行い、さらに別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃、最終洗浄は６５℃で行う。高ストリンジェンシーの条件は、上記のハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１０分間の最終洗浄を含む。
【００６２】
本発明の核酸は、好都合な任意のクローニングベクター中のＤＮＡとして維持することができる。好ましい実施形態では、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）やｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などのプラスミドクローニング／発現ベクター中でクローンを維持し、このベクターはすべて、適当な大腸菌宿主細胞中で増殖させることができる。
【００６３】
本発明の核酸分子にはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片が含まれ、これらは一本鎖、二本鎖であっても、さらには三本鎖であってもよい。したがって、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は例えばＰＣＲ増幅により植物組織の試験試料中でｍＲＮＡを検出するのに、或いはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳時又はその前の、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現の正又は負の調節にプローブとして有用である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをこのようなアッセイのプローブとして利用することができる方法には、それだけには限定されないが、（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション、及び（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＲＴ−ＰＣＲを含む）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの様々な種類の増幅反応が含まれる。
【００６４】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、既知の方法に従って種々の形で調製することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕで産生される場合、ポリペプチドは、適切な供給源、例えば、種子、果皮又は他の植物体部分から精製することもできる。
【００６５】
或いは、ポリペプチドをコードする核酸分子が利用できることにより、当技術分野で知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現方法を使用したタンパク質の産生が可能となる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用のｐＳＰ６４又はｐＳＰ６５などの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクター中にｃＤＮＡ又は遺伝子をクローニングし、続いてコムギ胚芽又はウサギ網状赤血球などの適当な無細胞翻訳系で無細胞翻訳を行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系は、例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから市販されている。
【００６６】
好ましい実施形態によれば、適切な原核生物系又は真核生物系での発現により、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成する大量のポリペプチドを産生することができる。例えば、配列番号１〜１９を有するｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子の一部又は全部を、細菌細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）又は酵母細胞（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）中での発現に適合されたプラスミドベクター、又は昆虫細胞中での発現用のバキュロウイルスベクター中に挿入することができる。このようなベクターは、宿主細胞中でのＤＮＡの発現を可能にするように位置している、宿主細胞中でのＤＮＡの発現に必要な調節エレメントを含む。発現に必要とされるこのような調節エレメントには、プロモーター配列、転写開始配列、及び場合によってはエンハンサー配列が含まれる。
【００６７】
組換え原核生物系又は真核生物系での遺伝子発現によって産生された、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドは、当技術分野で知られている方法に従って精製することができる。好ましい実施形態では、市販の発現／分泌系を使用し、それにより組換えタンパク質が発現し、その後宿主細胞から分泌して、その周囲媒質から容易に精製することができる。発現／分泌ベクターを使用しない場合、代替手法は、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用などの親和性分離により組換えタンパク質を精製することを伴う。このような方法は当業者によって一般に使用される。
【００６８】
上記の方法によって調製された、本発明のフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドは、標準的な手順に従って分析することができる。
【００６９】
既知の方法に従って、コーヒーから精製され、又は組換えにより産生されたフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドを使用して、本明細書で定義したポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又は抗体の断片若しくは抗体誘導体を生成することができる。本発明のフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドの断片を認識しこれと結合する抗体も企図され、ただし、この抗体は、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドに特異的である。例えば、タンパク質の分析、又はサザン分析及びクローニング分析（下記参照）から、クローニングされた遺伝子が多重遺伝子族に属することが示唆される場合、タンパク質の非保存的領域と対応する合成ペプチドに対して作製されたメンバー特異的抗体を生成することができる。
【００７０】
本明細書に記載のいずれかの目的のための本発明の抗体を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。通常、このようなキットは、抗体が免疫特異的である対照抗原を含む。
【００７１】
フラボノイドは、ヒトの健康及び健康状態の多くの局面においてある役割を果たす。フラボノイドは、強力な抗酸化物質であることが実証されており（Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ，Ｃ１９９１）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＤＬの酸化を抑制することが示されており（ＤｅＷｈａｌｌｅｙ，ＣＶ他１９９０；Ｆｒａｎｋｅｌ，ＥＮ他１９９３；及びＹａｎ，ＬＪ他１９９５）、降圧性であり（Ｄｕａｒｔｅ，Ｊ他２００２）、抗炎症性である可能性もある（Ｙｏｓｈｏｉｍｏｔｏ他１９８３；及びＨｕａｎｇ，ＭＴ他１９９１）。さらに、食事性フラボノイドは、冠動脈心疾患の死亡率のリスクを低下させ（Ｈｅｒｔｏｇ，ＭＧ他１９９３）、ある種の癌に対して保護的である可能性があることが証拠から示唆される。（Ｙａｎｇ，ＣＳ他１９９８；Ｙａｍａｎｅ，Ｔ他１９９６；Ｇｕｐｔａ，Ｓ他２００１；Ｙａｍａｇｉｓｈｉ，Ｍ他２００２；及びＨｅｒｔｏｇ，ＭＧ他１９９４）。フラボノイドに帰される健康上の利点のこの列挙は、例示的であるが網羅的でないものとし、現在は不明である、フラボノイドに帰される多くの他の有益な健康への効果があることが推定される。したがって、本明細書で記載及び例示されるフェニルプロパノイド及びフラボノイドの生合成経路を構成するコーヒーポリペプチドは、多様な食物、健康及び健康状態への適用で有用性が見出されることが期待される。例えば、フェニルプロパノイド及びフラボノイドの生合成経路を構成するコーヒーポリペプチド又はそのそれぞれのフラボノイド産物を栄養補助食品として利用することができる。さらに、フラボノイドの抗酸化特性は、食品や化粧品にも有利となることが判明する可能性がある。
【００７２】
フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドの上記適用の１つ又は複数は、本明細書に記載のフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが利用できることを活用して、組換え生物を使用して（例えば、酵母ピシア・パストリス（Ｐｉｃｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）若しくは食物適合性のラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又は植物細胞中で）相当な量の純粋なタンパク質を生成し、次いで抗酸化能、降圧能、免疫増殖能、化学保護又は化学療法能などについての新たな又は確立されているアッセイでタンパク質を試験することによって追求することができる。当技術分野で確立又は開発された適当な手段に従い、こうしたタンパク質によって生成されたフラボノイドを使用して類似の試験を実施することもできる。特定の精製タンパク質、又はこのようなタンパク質によって生成されたフラボノイド産物が特に有用であることが認められた場合、天然型のこうしたタンパク質及びそのフラボノイド産物は、コーヒー粒若しくは他の植物体部分、又はこうしたフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路酵素が多く含まれる他の植物の組織及び器官から単離することもできる。
【００７３】
ベクター、細胞、組織及び植物：
本発明によれば、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド、又はセンス若しくはアンチセンス方向のその相同体、類似体若しくは変異体、或いは細胞特異的又は組織特異的プロモーター及び他の調節配列の制御下にあるレポーター遺伝子及び他の構築物を含有する、トランスジェニック宿主細胞を産生するためのベクター及びキットも特徴とする。適当な宿主細胞には、それだけには限定されないが、植物細胞、細菌細胞、酵母及び他の真菌細胞、昆虫細胞並びに哺乳動物細胞が含まれる。こうした多様な宿主細胞を形質転換するためのベクターは当業者に周知である。このベクターには、それだけには限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに他の細菌、酵母及びウイルスのベクターが含まれる。典型的には、トランスジェニック宿主細胞を産生するためのキットは、１つ又は複数の適切なベクター及びベクターを使用してトランスジェニック細胞を産生するための使用説明書を含有する。キットは、いくつか例を挙げると、細胞を培養するための培地、細胞の形質転換を行うための試薬、及びトランスジェニック細胞を遺伝子発現について試験するための試薬などの１つ又は複数の追加の構成要素をさらに含むこともできる。
【００７４】
本発明は、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子の１コピー若しくは複数コピー、又はフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成する植物の内因性ポリペプチドの産生又は機能を阻害する核酸配列を含むトランスジェニック植物を含む。これは、以下に記載する天然又は組換えの調節配列のいずれかによって制御される、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドのコード配列の全部の一部、又はＲＮＡを含めたその突然変異体、アンチセンス若しくは変異体を含む導入遺伝子で植物細胞を形質転換することによって達成される。限定することなく、Ｃ．アベオクタエ（Ｃ．ａｂｅｏｋｕｔａｅ）、Ｃ．アラビカ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）、Ｃ．アーノルディアナ（Ｃ．ａｒｎｏｌｄｉａｎａ）、Ｃ．アルベミエンシス（Ｃ．ａｒｕｗｅｍｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ベンガレンシス（Ｃ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、Ｃ．カネフォラ、Ｃ．コンゲンシス（Ｃ．ｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｃ．デベブレイ（Ｃ．ｄｅｗｅｖｒｅｉ）、Ｃ．エキサルサ（Ｃ．ｅｘｃｅｌｓａ）、Ｃ．ユーゲニオイデス（Ｃ．ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）及びＣ．ヘテロカリクス（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｃａｌｙｘ）、Ｃ．カパカタ（Ｃ．ｋａｐａｋａｔａ）、Ｃ．カシアナ（Ｃ．ｋｈａｓｉａｎａ）、Ｃ．リベリカ（Ｃ．ｌｉｂｅｒｉｃａ）、Ｃ．モルンドウ（Ｃ．ｍｏｌｏｕｎｄｏｕ）、Ｃ．ラセモサ（Ｃ．ｒａｓｅｍｏｓａ）、Ｃ．サルバトリクス（Ｃ．ｓａｌｖａｔｒｉｘ）、Ｃ．セシフローラ（Ｃ．ｓｅｓｓｉｆｌｏｒａ）、Ｃ．ステノフィラ（Ｃ．ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、Ｃ．トラベンコレンシス（Ｃ．ｔｒａｖｅｎｃｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ウィッチアナ（Ｃ．ｗｉｇｈｔｉａｎａ）及びＣ．ザングエバリエ（Ｃ．ｚａｎｇｕｅｂａｒｉａｅ）を含めたコーヒー種由来のトランスジェニック植物が好ましい。任意の種のトランスジェニック植物も本発明に含まれ、こうした植物には、それだけには限定されないが、タバコ、シロイヌナズナ及び他の「実験に適した」種、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、エンバク、モロコシ、アルファルファ、クローバーなどの禾穀類、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオなどの油産生植物、トマト、オオブドウホオズキ、ジャガイモ、コショウ、ナス、テンサイ、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメなどの野菜、アスター、ベゴニア、キク、デルフィニウム、ペチュニア、ヒャクニチソウ、芝生、芝草などの園芸植物が含まれる。
【００７５】
当業者に知られている標準的な植物形質転換法を使用して、トランスジェニック植物を作出することができる。こうした方法には、それだけには限定されないが、アグロバクテリウムベクター、プロトプラストのポリエチレングリコール処理、微粒子銃ＤＮＡ送達、ＵＶレーザーマイクロビーム、ジェミニウイルスベクター又は他の植物ウイルスベクター、プロトプラストのリン酸カルシウム処理、単離プロトプラスト体のエレクトロポレーション、形質転換用ＤＮＡで被覆したマイクロビーズを有する溶液中での細胞懸濁物の撹拌、形質転換用ＤＮＡで被覆したケイ素繊維を有する溶液中での細胞懸濁物の撹拌、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームによって媒介されるＤＮＡ取り込みなどが含まれる。このような方法は当技術分野で公表されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，編，１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ＆Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，編，１９８９）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｖｅｒｍａ，編，１９９３）；及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｌｉｇａ，Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ＆Ｖａｒｎｅｒ，編，１９９４）を参照されたい。
【００７６】
形質転換の方法は、形質転換する対象の植物によって決まる。双子葉植物種の形質転換にはアグロバクテリウムベクターを使用することが多い。アグロバクテリウムバイナリーベクターには、それだけには限定されないが、ＢＩＮ１９及びその誘導体、ｐＢＩベクターシリーズ、並びにバイナリーベクターｐＧＡ４８２、ｐＧＡ４９２、ｐＬＨ７０００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＹ２３４３３０）、並びにｐＣＡＭＢＩＡベクター（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｓｖａｂ＆Ｍａｌｉｇａ，（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：９８９−９９４によって構築されたｐＰＺＰベクターに由来し、ＣＡＭＢＩＡ、ＧＰＯ  Ｂｏｘ  ３２００、Ｃａｎｂｅｒｒａ  ＡＣＴ  ２６０１、オーストラリアから又はワールドワイドウェブＣＡＭＢＩＡ．ｏｒｇを介して入手可能である）のうちの任意の適当なものが含まれる。単子葉植物種の形質転換には、形質転換用ＤＮＡで被覆した粒子及び形質転換用ＤＮＡで被覆したケイ素繊維を用いた微粒子銃によるボンバードメントが核の形質転換に有用であることが多い。或いは、イネ、トウモロコシ及び種々の他の単子葉植物種の形質転換には、アグロバクテリウム「スーパーバイナリー」ベクターを使用することに成功している。
【００７７】
選択された植物を形質転換するためのＤＮＡ構築物は、適切な５’調節配列（例えば、プロモーター及び翻訳調節配列）及び３’調節配列（例えば、ターミネーター）と作動可能に連結した対象のコード配列を含む。好ましい実施形態では、その天然の５’及び３’調節エレメントの制御下にある、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするコード配列が利用される。他の実施形態では、コード配列と調節配列を交換して（例えば、ＣｃＦ３Ｈプロモーターと作動可能に連結したＣｃＤＦＲコード配列）、例えば、風味、芳香又は他の特徴において表現型を改良するために形質転換された植物の種子のタンパク質含有量を変更する。
【００７８】
代替の実施形態では、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター又はゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの強力な構成的プロモーター下に遺伝子のコード領域が置かれる。本発明での使用に企図される他の構成的プロモーターには、それだけには限定されないが、Ｔ−ＤＮＡマンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーターが含まれる。他の実施形態では、強力な単子葉植物プロモーター、例えば、トウモロコシユビキチンプロモーター、イネアクチンプロモーター又はイネチューブリンプロモーターが使用される（Ｊｅｏｎ他，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１２３：１００５−１４，２０００）。
【００７９】
誘導性プロモーター下でフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドを発現するコード配列を有するトランスジェニック植物が本発明の範囲内にあることも企図される。誘導性植物プロモーターには、ほんのいくつか例を挙げると、テトラサイクリンリプレッサー／オペレーター制御プロモーター、熱ショック遺伝子プロモーター、ストレス（例えば、傷害）誘導性プロモーター、防御反応性遺伝子プロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害誘導性遺伝子プロモーター（例えば、ヒドロキシプロリンリッチ細胞壁タンパク質遺伝子）、化学誘導性遺伝子プロモーター（例えば、硝酸レダクターゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子など）及び暗所誘導性遺伝子プロモーター（例えば、アスパラギンシンターゼ遺伝子）が含まれる。
【００８０】
組織特異的及び発達特異的プロモーターも本発明での使用に企図される。種子特異的プロモーターの非限定的な例には、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導性メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）及びｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）（米国特許出願第０９／３７７，６４８号明細書）、マメβ−ファゼオリン、ナピン、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２及びグロブリン１、ダイズ１１Ｓレグミン（Ｂａｕｍｌｅｉｎ他，１９９２）及びＣ．カネフォラ１１Ｓ種子貯蔵タンパク質（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ他，１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：２７３−２８２）が含まれる。ｅｎｄ１及びｅｎｄ２遺伝子由来の種子優先的プロモーターが開示されている国際公開第００／１２７３３号パンフレットも参照されたい。それだけには限定されないが、所有者共通の同時係属のＰＣＴ出願番号ＵＳ２００６／０２６１２１に記載のオレオシン遺伝子プロモーター、所有者共通の同時係属のＰＣＴ出願番号ＵＳ２００６／０２６２３４に記載のデハイドリン遺伝子プロモーター、及び所有者共通の同時係属のＰＣＴ出願番号ＵＳ２００６／３４４０２に記載の９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ遺伝子プロモーターを含めて、他のコーヒーノキ属種子特異的プロモーターを利用することもできる。他の組織特異的プロモーターの例には、それだけには限定されないが、光合成組織での発現用のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子プロモーター（例えば、Ｍａｒｒａｃｉｎｉ他，２００３に記載されているコーヒー小サブユニットプロモーター）又はクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子プロモーター；及び根での発現が所望される場合の根特異的グルタミンシンターゼ遺伝子プロモーターが含まれる。
【００８１】
コード領域はまた、適切な３’調節配列と作動可能に連結している。天然の３’調節配列が使用されない実施形態では、ノパリンシンターゼポリアデニル化領域を使用することができる。他の有用な３’調節領域には、それだけには限定されないが、オクトピンシンターゼポリアデニル化領域が含まれる。
【００８２】
適切な調節エレメントの制御下にある選択されたコード領域は、カナマイシン耐性などの核薬物耐性マーカーと作動可能に連結している。他の有用な選択マーカー系には、抗生物質若しくは除草剤耐性（例えば、ハイグロマイシン、スルホニル尿素、ホスフィノスリシン又はグリホサートに対する耐性）を付与する遺伝子、又は選択的増殖を付与する遺伝子（例えば、マンノース上での植物細胞の増殖を可能にするホスホマンノースイソメラーゼ）が含まれる。選択マーカー遺伝子には、限定することなく、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）やハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子など抗生物質耐性をコードする遺伝子、並びにグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ及び／又はグリホサートオキシドレダカターゼ（ＧＯＸ）、ブロモキシニルに対する耐性のブロモキシニルニトリラーゼ（ＢＸＮ）、イミダゾリノンに対する耐性のＡＨＡＳ遺伝子、スルホニル尿素耐性遺伝子、２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性遺伝子など除草性化合物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。
【００８３】
ある実施形態では、本発明によって包含されるプロモーター及び他の発現調節配列は、レポーター遺伝子と作動可能に連結している。本発明での使用に企図されるレポーター遺伝子には、それだけには限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ハナギンチャクオレンジ蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、（α−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃＺ及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、β−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）又はホタル若しくは細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする遺伝子が含まれる。本発明の実施に伴う標準的な手順の多くと同様に、当業者であれば、マーカー又はレポーターの機能を果たすことができる追加の配列を認識するであろう。
【００８４】
細胞宿主中での遺伝子発現を増強するための追加の配列修飾が当技術分野で知られている。こうした修飾には、過剰のポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復配列をコードする配列、及び遺伝子発現にとって有害である可能性がある他の十分に特徴付けられたこのような配列の除去が含まれる。或いは、必要に応じて、コード配列のＧ／Ｃ含量を、コーヒー植物細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することによって計算される、所与のコーヒー植物細胞宿主の平均のレベルに調整することもできる。また、可能であれば、コード配列を修飾して、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避する。遺伝子発現を増強する他の代替法は、５’リーダー配列を使用することである。翻訳リーダー配列は当技術分野で周知であり、これには、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（オメガ）のシス作用誘導体（オメガ’）、ブロムモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス及びカブラ黄色モザイクウイルス由来の５’リーダー配列が含まれる。
【００８５】
植物を形質転換し、その後導入遺伝子産物の存在、導入遺伝子をコードするｍＲＮＡ、又は導入遺伝子の発現に伴う表現型の変化を含めた１つ又は複数の特性についてスクリーニングした。発現の量、並びに形質転換植物中での導入遺伝子の発現の組織特異的及び時間特異的パターンが、核ゲノム中にそれが挿入された位置に応じて変わり得ることが認識されるべきである。このような位置の効果は当技術分野で周知である。この理由から、いくつかの核形質転換体を再生し、導入遺伝子の発現について試験すべきである。
【００８６】
方法：
本発明の核酸及びポリペプチドは多くの方法のいずれか１つで使用することができ、この方法により、コーヒー植物でタンパク質産物を発現させて、その結果このタンパク質が、病原体及び草食動物又は昆虫による攻撃からコーヒー植物を保護する上で、またタンパク質を発現しているコーヒー植物の豆から最終的に製造されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は芳香を増強する上である役割を果たすことができる。同様に、本発明のポリペプチドは多くの方法のいずれか１つで使用することができ、この方法により、ポリペプチドから合成されるフェニルプロパノイド、フラボノイド及び他のこのようなファイトケミカル生成物が、病原体及び草食動物又は昆虫による攻撃からコーヒー植物を保護する上で、またフェニルプロパノイド及びフラボノイドを含有するコーヒー植物の豆から最終的に製造されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は芳香を増強する上である役割を果たすことができる。
【００８７】
病原体、草食動物及び昆虫による攻撃からの植物の保護に関しては、少なくとも一部のフラボノイド及び一部のフラボノイド二次代謝産物が、防御応答の一部としてある種の植物において増大したレベルで生成され、又は攻撃に対する受動的耐性においてある役割を果たすことを示唆する証拠が増えつつある。（Ｌａｈｔｉｎｅｎ，Ｍ他（２００４）；Ｏｎｙｉｌａｇｈａ，ＪＣ他（２００４）；Ｋｏｔｋａｒ，ＨＭ他（２００２）；Ｌａｔｔａｎｚｉｏ，Ｖ他（２０００），及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ＡＢ他（１９９８））。したがって、植物においてフェニルプロパノイド及びフラボノイドの生合成経路を構成するポリペプチドの産生を操作できることにより、又はさらには本発明のポリヌクレオチド及びタンパク質を使用してこのような遺伝子発現をモニタリングできることにより、病原体、草食動物又は昆虫による攻撃に対するコーヒー植物の反応の試験及び操作が可能となる。この知見により、病害又は草食動物若しくは昆虫による破壊に対してより十分に備えられた改変コーヒー植物の作出が可能となる。
【００８８】
焙煎コーヒー粒の風味及び芳香に関しては、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドが、タンパク質それ自体又はそれが生成するフェニルプロパノイド若しくはフラボノイドなどの生成物の含有量により、焙煎の際に起こるメイラード反応によるコーヒーの風味の生成に対してある影響を及ぼすことが予想される。タンパク質、特にタンパク質分解産物（ペプチド及びアミノ酸）が重要な一群の風味前駆体となる（Ｓｐａｎｉｅｒ他，２００４）。したがって、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するタンパク質など比較的豊富なタンパク質が、コーヒーの焙煎の際に起こる風味生成反応にいくぶん寄与することが予想できる。このような寄与は、コーヒー豆中のタンパク質それ自体の濃度、又はこのタンパク質から最終的に生成されるフェニルプロパノイド若しくはフラボノイドの濃度に由来する可能性がある。本明細書に記載の方法に従って、本発明のポリヌクレオチドにより、フェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドのタンパク質発現プロファイルを（例えば、マーカーによって支援される育種により）モニタリング又は操作することができる。
【００８９】
したがって、本発明の一態様は、植物、好ましくはコーヒーのフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドのプロファイルを改変するための方法を特徴とし、この方法は、植物のフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路を構成する１種又は複数のポリペプチドの量又は活性を増大又は低下させるステップを含む。例えば、本発明の一実施形態では、その固有の発現制御配列の制御下にあるフェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を使用して、植物においてこのポリペプチドの産生を増大させる目的で植物を形質転換する。或いは、フェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドのコード領域を構成的又は誘導性プロモーターなどの異種発現制御領域と作動可能に連結する。
【００９０】
機能喪失（ヌル）突然変異植物体は、作製するか又は現在利用可能な植物突然変異体の集団から選抜することができる。本明細書に記載の方法の１つ又は複数を利用して、フェニルプロパノイド又はフラボノイド生合成経路を構成する特定のポリペプチドを過剰発現又は過小発現する突然変異体について突然変異植物体集団をスクリーニングできることも当業者には理解されよう。化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、及びトランスポゾン若しくはＴ−ＤＮＡの挿入、又はゲノム中の標的誘導局所損傷（ＴＩＬＬＩＮＧ、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ他，２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５（２）：６３０−６３６；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ＆Ｈａｕｇｈｎ，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．８（２）：２１１−２１５を参照）により突然変異体集団を作製することができる。突然変異体集団を作製する方法は当技術分野で周知である。
【００９１】
本発明の核酸を使用して、種々の植物種でフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成する突然変異ポリペプチドを同定することができる。トランスポゾン挿入系統が入手可能であるトウモロコシ又はシロイヌナズナなどの種では、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子中の挿入について系統がスクリーニングされるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。次いで、育種により、分断化された遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性である植物系統を作出することができる。
【００９２】
突然変異誘発技法によって作製されたヌル突然変異体で認められるものと類似した表現型を示すように植物を工学的に改変することもできる。フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成する選択された突然変異型ポリペプチドを発現させて「ドミナントネガティブ効果」を引き起こすことにより、トランスジェニックヌル突然変異体を作製することができる。任意の一機構に本発明を限定するものではないが、この突然変異タンパク質は、タンパク質又は他の細胞因子との相互作用において野生型タンパク質と競合する。この種の「ドミナントネガティブ」効果の例は、昆虫系と脊椎動物系のどちらについても周知である（Ｒａｄｋｅ他，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４５：１６３−１７１；Ｋｏｌｃｈ他，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：４２６−４２８）。
【００９３】
「転写後遺伝子サイレンシング」によりフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することによって、別の種類のトランスジェニックヌル突然変異体を作製することができる。下方制御の標的とされる種由来の遺伝子又はその断片を利用して、コードタンパク質の生成を制御することができる。完全長アンチセンス分子をこの目的に使用することができる。或いは、翻訳にとって決定的に重要なｍＲＮＡの特定の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用することもできる。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるアンチセンス分子の使用は当技術分野で知られている。転写時にアンチセンスＲＮＡ配列を生成するＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換することによりアンチセンス分子をｉｎ  ｓｉｔｕで提供することができる。このような構築物は、完全長の又は部分的なアンチセンス配列が生成されるように設計することができる。大量のｄｓＲＮＡが生成されるように、遺伝子コード配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡをどちらも導入遺伝子によって過剰発現させることにより、この遺伝子サイレンシング効果を増強することができる（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他，１９９８，ＰＮＡＳ  ９５：１３９５９−１３９６４を参照されたい）。これに関して、少なくとも１種のイントロンの一部又は全部と対応する配列を含有するｄｓＲＮＡが特に有効であることが見出されている。一実施形態では、導入遺伝子により、コード配列アンチセンス鎖の一部又は全部が発現される。別の実施形態では、導入遺伝子により、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドのコード配列の一部又は全部のハイブリダイズ用センス及びアンチセンス鎖が発現される。
【００９４】
別の実施形態では、植物系に現在利用可能である多様な他の転写後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）技法の使用によりフェニルプロパノイド及びフラボノイド遺伝子をサイレンシングすることができる。ＲＮＡサイレンシングは、ＲＮａｓｅＨ系の酵素（「ダイサー」又は「ダイサー様」）により二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を２１〜２８ヌクレオチドの短鎖断片にプロセシングすることを伴う。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）である切断産物は、配列特異的に遺伝子発現を調節するタンパク質エフェクター複合体中に組み込まれる（植物のＲＮＡサイレンシングの総説については、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，２００４，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７２：６５−７３；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３５６−３６３；Ｈｅｒｒ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３２：９４６−９５１を参照されたい）
【００９５】
低分子干渉ＲＮＡは、化学的に合成するか、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び増幅し、次いで細胞中に送達することができる。送達は、マイクロインジェクション（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ他，２００２）、化学的トランスフェクション（Ａｇｒａｗａｌ  Ｎ他，２００３）、エレクトロポレーション若しくはカチオン性リポソームによって媒介されるトランスフェクション（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ他，２００２；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ他，２００２）又は当業者によって認識される当技術分野で利用可能な任意の他の手段によるものであってよい。或いは、ｓｉＲＮＡは、例えばプラスミドを用いて対象の細胞中にｓｉＲＮＡのＤＮＡ鋳型を挿入することにより細胞内で発現させることもでき（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ他，２００２）、特異的に標的として細胞を選択することもできる。植物に低分子干渉ＲＮＡを導入することに成功している。（Ｋｌａｈｒｅ  Ｕ他，２００２）。
【００９６】
本発明におけるＲＮＡサイレンシングの好ましい方法は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。任意の一般的手段により、特定の所望のｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターが標的細胞中に送達される。細胞中に入ると、ＤＮＡ配列はＲＮＡ分子へと継続的に転写され、このＲＮＡ分子は折り重なり、分子内塩基対形成を介してヘアピン構造を形成する。こうしたヘアピン構造は、細胞によりプロセシングされると、ｓｉＲＮＡ分子に相当するものとなり、所望のタンパク質のＲＮＡサイレンシングを媒介するために細胞によって使用される。上記のＨｏｒｉｇｕｃｈｉ，２００４に植物におけるＲＮＡサイレンシングに特に有用な種々の構築物が記載されている。典型的には、このような構築物は、プロモーター、「センス」方向のサイレンシングされる標的遺伝子の配列、スペーサー、標的遺伝子配列のアンチセンス及びターミネーターを含む。
【００９７】
「コサプレッション」の技法により、さらに別の種類の合成ヌル突然変異体を作製することもできる（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ他，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６（６）：６５１−６５９）。抑制の標的とされる内因性遺伝子の１コピーで植物細胞が形質転換される。多くの場合、これは、天然の遺伝子並びに導入遺伝子の完全な抑制をもたらす。一実施形態では、対象の植物種由来の、フェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子が単離され、これを使用して同じ種の細胞が形質転換される。
【００９８】
本発明によれば、上記の方法のいずれかによって作出された突然変異又はトランスジェニック植物も特徴とする。好ましくは、この植物は稔性であり、これにより育種目的に有用である。したがって、上記の望ましい表現型の１つ又は複数を示す突然変異又はトランスジェニック植物は、植物育種に使用することができ、又は農業若しくは園芸への適用で直接使用することもできる。これらは、色素及び光合成に関連するコーヒー種子の風味、芳香及び他の特色におけるフェニルプロパノイド及びフラボノイド生合成経路を構成するポリペプチドの関与をさらに解明するための研究ツールとしても有用となる。増強された又は組み合わせられた表現型を有する植物を作出するために、１種の導入遺伝子又は特定の突然変異を含有する植物を、相補的な導入遺伝子又は遺伝子型を含有する植物と交雑することもできる。
【００９９】
本発明はまた、種子優先的又は種子特異的に、植物において任意の選択された異種遺伝子産物を産生するための組成物及び方法も特徴とする。対象のコード配列を種子特異的コーヒープロモーター又は他の適切な調節配列の制御下に置いて、種子特異的キメラ遺伝子が作製される。本明細書に記載の又は当技術分野で周知の形質転換法のいずれかによりキメラ遺伝子は植物細胞中に導入される。こうしたキメラ遺伝子及び方法を使用して、それだけには限定されないが、（１）上記で列挙したＧＦＰ又はＧＵＳなどの検出可能な遺伝子産物；（２）農業又は園芸上の利点を付与する遺伝子産物、例えば、その酵素活性により微量栄養素（例えば、β−カロテンとしても知られるプロビタミンＡ）又は抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、オメガ脂肪酸、リコペン、イソプレン、テルペン）が産生される遺伝子産物；又は（３）例えば、Ｍｏｕｒｇｕｅｓ他，（１９９８），ＴｉｂＴｅｃｈ  １６：２０３−２１０に記載されている、病原体又は害虫を防除する遺伝子産物、又は植物種子に対して保護的であるか又は病原体に対して有害であることが知られている他の遺伝子産物を含めた、対象の多様な遺伝子産物を植物において産生することができる。
【０１００】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例示するために述べられる。この実施例は、本発明を例示するものであり、限定するものではない。
【０１０１】
実施例１
以下の実施例のための材料及び方法
植物材料。Ｔｏｕｒｓにおいて温室条件下（２５℃、７０ＲＨ）で生育した、コフィア・アラビカＬ．カツーラ（Ｃａｔｕｒｒａ）品種Ｔ−２３０８から発達の様々な段階にある新鮮に収穫される根、幼葉、茎、花及び果実を収穫し、コフィア・カネフォラＢＰ４０９変種から幼葉組織を収穫した。コフィア・カネフォラＢＰ４０９由来の他のすべての組織は、インドネシアの東ジャワの畑で生育された。発達段階は以下の通り定義される：小緑色果実（ＳＧ）、大緑色果実（ＬＧ）、黄色果実（Ｙ）及び赤色果実（Ｒ）。新鮮組織を、液体窒素中で迅速に凍結させ、次いでＲＮＡ抽出に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０２】
ＲＮＡ調製。前述したコフィア・アラビカ（Ｔ２３０８）及びコフィア・カネフォラ（ＢＰ４０９）の種々の組織から全ＲＮＡを抽出した（Ｒｏｇｅｒｓ他１９９９）。小緑色（ＳＧ）、大緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）の段階からのコーヒーチェリーの場合、まずこれらを果皮組織と粒組織に分け、次いでＲＮＡを上記の通り抽出した。
【０１０３】
ｃＤＮＡ調製。ｃＤＮＡ調製の４つの異なる方法を実施した。
【０１０４】
方法１：１μｇの全ＲＮＡ及び５０ｎｇのオリゴｄＴ（１８）（Ｓｉｇｍａ）をＤＥＰＣ処理水に溶解させた（最終容量１２μＬ）。続いて、この混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、次いで氷上で急冷した。次に、４μＬの５×ファーストストランドバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、２μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μＬのｄＮＴＰ混合液（それぞれ１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。反応混合物を４２℃で２分間インキュベートした後、１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲｎａｓｅＨ−リバーストランスクリプターゼ（２００Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。酵素添加後、反応物を２５℃で１０分間、次いで４２℃で５０分間インキュベートし、続いて７０℃で１０分間加熱することにより酵素を不活性化した。次いで、作製したｃＤＮＡ試料を滅菌水中で１０倍希釈し、−２０℃で保存した。次いで、このｃＤＮＡを、以下で概説する種々の実験で述べられる通り様々な希釈で使用した。
【０１０５】
方法２：１μｇの全ＲＮＡ試料（表１）及び８７０ｎｇのオリゴｄＴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）をＤＥＰＣ処理水で最終容量１３μＬとなるように作製した。この混合物を６５℃で５分間インキュベートして核酸を変性させ、次いでこの試料を氷上に置いた。次に、４μＬの５×バッファーのトランスクリプターＲＴ反応バッファー（Ｒｏｃｈｅ）、１０Ｕのリボヌクレアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ）、最終濃度１ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）及び１０Ｕのトランスクリプターリバーストランスクリプターゼ（２０Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ）を添加した。２０μＬの最終反応混合物をボルテックスによって混合し、短時間だけ遠心分離した。次いで、反応物を５５℃で５０分間インキュベートした。次いで、反応混合物に１ＵのＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、この試料を−２０℃で保存した。
【０１０６】
ｃＤＮＡ調製のための方法３は、異なるプライマーを使用し、プライミング段階のために８７０ｎｇのオリゴｄＴの代わりに３０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマー（Ｇｅｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ）（表１及び表３参照）を用いた以外は方法２と同一である。次いで、この試料を−２０℃で保存した。
【０１０７】
ｃＤＮＡ調製のための方法４は、Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓキット用の５’ＲＡＣＥ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるファーストストランドｃＤＮＡ合成法に関する製造元のプロトコールに厳密に従った。手短に言えば、１μｇの全ＲＮＡ試料（表１）及び１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマー（表１及び表３）をＤＥＰＣ処理水で最終容量１５．５μＬとなるように希釈した。この混合物を７０℃で１０分間インキュベートして核酸を変性させ、次いでこの試料を１分間氷上に置き、遠心分離した。次に、２．５μＬの１０×ＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μＬのｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＥＰＣ処理水で最終容量２４μＬとなるように添加した。こうした反応混合物を４２℃で１分間インキュベートした後、１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲｎａｓｅＨ−リバーストランスクリプターゼ（２００Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。酵素添加後、反応物を４２℃で５０分間インキュベートし、続いて７０℃で１５分間加熱することにより酵素を不活性化した。次いで、チューブを短時間だけ遠心分離し、次いで反応物に１μＬのＲＮａｓｅ混合物を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、この試料を−２０℃で保存した。
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
５’ＲＡＣＥ反応（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）。５’ＲＡＣＥ反応は、Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ用の５’ＲＡＣＥ系のためのキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載の製造元のプロトコールに厳密に従って実施した。まず、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元によって提供された説明書に従って使用してこの実験で使用されるｃＤＮＡ調製物を精製することにより、取り込まれなかったどんなヌクレオチドも除去した（これらはｄＣテイリング反応で干渉する恐れがあるので）。精製後、ｃＤＮＡを５０μＬの滅菌水中に回収し、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲに使用するまで−２０℃で保存した。表１に各反応に使用した特定のｃＤＮＡを挙げる。５’ＲＡＣＥ実験はすべて、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．精製した特定の各ｃＤＮＡのＴｄＴテイリングから始まる。ポリｄＣテイリング反応を以下の通り進行させた。２５μＬの反応物を５μＬの精製ｃＤＮＡ、１１．５μＬのＤＥＰＣ処理水、５μＬの５×ＴｄＴテイリングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２．５μＬの２ｍＭ  ｄＣＴＰで準備した。次いで、この反応物を９４℃で３分間インキュベートし、氷上で冷却した。次いで、１μＬのＴｄＴを添加し、反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。６５℃で１０分間加熱することにより反応を終結させ、再び氷上に置いた。
【０１１０】
第１ラウンドの５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ１反応は、以下の通り最終容量５０μＬ中で実施した：５μＬのテイルされた各ｃＤＮＡ、５μＬの１０×Ｔａｑポリメラーゼバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅバッファー）、４００ｎＭの遺伝子特異的プライマー１（表２及び表４）及びアブリッジドアンカープライマー（ＡＡＰ）（表４）、１μＬのｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。第１ラウンドのＰＣＲサイクル条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、表２に具体的に挙げる温度で１分３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長を４５又は５５サイクル行う（表２）。追加の最終伸長段階を７２℃で７分間実施した。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色によって分析した。
【０１１１】
第２ラウンドのＰＣＲ反応は、以下の通り最終容量５０μＬの体積中で実施した：５μＬの１％希釈ＰＣＲ１（第１ラウンド）産物；５μＬの１０×Ｔａｑポリメラーゼバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅバッファー）、２００ｎＭの遺伝子特異的プライマー２（表２及び表４）及びアブリッジドユニバーサル増幅プライマー（ＡＵＡＰ）、（表４）、１μＬのｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。反応プロトコールは、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、表２に具体的に挙げる温度で１分３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３分間の伸長を４５、５０又は５５サイクル行う（表２）。追加の最終伸長段階を７２℃で７分間実施した。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色によって分析した。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
ＤＮＡ塩基配列決定。Ｑｉａｇｅｎキットを製造元によって提供された説明書に従って使用してプラスミドＤＮＡを精製した。ジデオキシターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ他，１９７７）を使用したＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、独国）によりプラスミドＤＮＡ及びＰＣＲ産物の配列を決定した。場合によっては、５’ＲＡＣＥ及びゲノムウォーキング実験から生成される固有のＰＣＲ断片を精製又はクローニングせずにＰＣＲ増幅反応の場合と同じプライマーを使用して直接的に配列を決定した。Ｌａｓｅｒ  Ｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用してコンピュータ解析を実施した。公開ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける配列との相同性を、様々なＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他１９９０）を使用して確認した。
【０１１６】
ノーザンブロット法。コフィア・アラビカ（Ｔ２３０８）の種々の組織から全ＲＮＡを記載の通り（Ｒｏｇｅｒｓ他１９９９）抽出した。小緑色（ＳＧ）、大緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）の段階からのコーヒーチェリーの場合、まずこれらを果皮組織と粒組織に分け、次いでＲＮＡをそれぞれから抽出した。
【０１１７】
合計５μｇのＲＮＡをホルムアルデヒドを含有する１．２％（ｗ／ｖ）変性用ＲＮＡゲルで泳動した。各植物組織由来の全ＲＮＡ試料を７μＬの「ＲＮＡサンプルローディングバッファー」（エチジウムブロマイドなし、Ｓｉｇｍａ）の存在下で６５℃で１５分間加熱し、次いですぐに氷上に２分間置いた後、１．２％ＲＮＡゲル中に添加した。このゲルを６０ボルトで５時間泳動した。次いで、ゲルを１０×ＳＳＣ中に２０分間２回浸した。ゲル中のＲＮＡを毛管移動により１０×ＳＳＣ中で「ポジティブＴＭメンブレン」（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）に一晩転写し、ブロットを８０℃で３０分間加熱することによりＲＮＡを固定した。（Ｐ３２）ｄＣＴＰの存在下で「Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（商標）ＩＩランダムプライムラベリングシステム」キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してプローブを作製した。ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、４０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ及び５×デンハルト溶液）中でハイブリダイゼーションを６５℃で２４時間実施した。次いで、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ［ｗ／ｖ］及び１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ［ｗ／ｖ］を使用してメンブレンを６５℃で各洗浄３０分間２回洗浄した。
【０１１８】
使用したプローブを、Ｔ７（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’）（配列番号１１０）プライマー及びＴ３（５’ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ３’）（配列番号１１１）プライマー並びに対応するクローンを用いたＰＣＲ増幅後に得られた適切な３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＰＣＲ断片とハイブリダイズさせた。
【０１１９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。コフィア・アラビカ及びコフィア・カネフォラの種々の組織からＲＮＡを抽出し、上記の方法１に従ってｃＤＮＡを調製した。次いで、作製したｃＤＮＡ試料を１０倍希釈し、希釈材料の１μＬ試料を以下の反応条件（最終容量５０μＬ）下で半定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用した：１×ＰＣＲ反応バッファー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、２％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）、それぞれ６００ｎＭの遺伝子特異的プライマー（表５）、２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）。サイクリングプロトコールは以下の通りである：９４℃で２分間；続いて９４℃で１分間、６０℃で１分３０秒間及び７２℃で１分間を２７、３０又は３５サイクル（サイクル数は図１７に記載）。追加の最終段階として伸長を７２℃で７分間実施した。１５μＬのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色によって分析した。ＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したオリゴヌクレオチド（ＣｃＣＨＳ、ＣｃＣＨＩ、ＣｃＣＨＩ様又はＧＯＳ２特異的プライマー）及び得られたＰＣＲ産物の長さを表５に挙げる。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）実験。こうした実験に使用したｃＤＮＡを上記の方法１に従って調製した。ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲを製造元（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の推奨の通り実施した。すべての反応物は、１×ＴａｑＭａｎバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ、並びに０．６２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼを含有していた。フォワード及びリバースそれぞれ８００ｎＭの遺伝子特異的プライマー及び２００ｎＭ  ＴａｑＭａｎプローブを使用してＰＣＲを実施した。プライマーエクスプレスソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してプライマー及びプローブを設計した（表６）。反応混合物を５０℃で２分間及び９５℃１０分間インキュベートし、続いて９５℃で１５秒間／６０℃で１分間の増幅を４０サイクル行った。
【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
試料をＧｅｎｅＡｍｐ７５００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量した。相対定量法を使用して、参照として構成的に発現されるリボソームタンパク質ｒｐｌ３９を使用し、転写物レベルの定量を実施した。相対定量法を使用するためには、特に定義されたプライマー及びプローブセットを使用して、遺伝子配列の増幅効率が参照配列（ｒｐｌ３９  ｃＤＮＡ配列）の増幅効率とほぼ同等であることを示すことが必要であった。この相対的同等性を決定するために、適切なｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドＤＮＡを１／１０００、１／１０，０００、１／１００，０００及び１／１，０００，０００に希釈し、上記のＱ−ＰＣＲ条件を使用して曲線の勾配Ｃｔ＝ｆ（Ｌｏｇ  ＤＮＡ量）を各プラスミド／プライマー／ＴａｑＭａｎプローブセットについて計算した。３．３２に近い勾配の曲線を示すプラスミド／プライマー／ＴａｑＭａｎプローブセットは１００％の効率を表し、許容できると考えられる。使用したプラスミド／プライマー／ＴａｑＭａｎプローブセット（表６）すべてがＣｔ＝ｆ（Ｌｏｇ  ＤＮＡ量）について許容できる値を示した。
【０１２４】
プライマーアシストゲノムウォーキングを使用したＣｃＰＡＬ２、Ｃａ４ＣＬ２及びＣｃ４ＣＬ２の５’コード配列の単離。Ｔｏｕｒｓで温室から収穫したＣ．アラビカＴ２３０８及びＣ．カネフォラＢＰ４０９の新鮮葉からＣｒｏｕｚｉｌｌａｔ他，（１９９６）の方法を使用して全ゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーアシストウォーキングは、ユニバーサルＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造元のプロトコールに従って使用して実施した。制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩ、ＳｔｕＩで消化し、次いでユニバーサルＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒアダプターに平滑末端ライゲーションしたＣ．アラビカＴ２３０８及びＣ．カネフォラＢＰ４０９のゲノムＤＮＡから、ここで使用される８つのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒライブラリーを構築した。ゲノムＤＮＡの消化及びＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒアダプターのライゲーション反応は、キットユーザマニュアルに従って実施した。
【０１２５】
次いで、ＰＡＬ２−ＧＳＰ遺伝子特異的プライマー（ＰＡＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ１及びＰＡＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ２（配列番号１４３、１４４））又は４ＣＬ２−ＧＳＰの遺伝子特異的プライマー（４ＣＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ１及び４ＣＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ２（配列番号１４５、１４６））（表７）を使用したＰＣＲ反応の鋳型として８つのライブラリーを使用した。ＰＣＲ反応混合物は、最終容量５０μＬ中で１μＬのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒライブラリー鋳型、５μＬの１０×ＰＣＲバッファー（ＬＡバッファーＩＩ  Ｍｇ＋＋含有）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、４００ｎＭの各プライマー（ＡＰ１及びＰＡＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ１又は４ＣＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ１のいずれか）及び０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有していた。第１ラウンドのＰＣＲには、以下の条件を使用した：９４℃で２分間の変性後、最初の７サイクルは９４℃で２５秒間、及び７２℃で３分間のアニーリング／伸長を実施した。さらに３１サイクルは、９４℃で２５秒間、並びに６７℃で３分間のアニーリング及び伸長を実施した。追加の最終段階として伸長を６７℃で７分間行った。第２のＰＣＲ反応は、ＤＮＡ基質が、１／５０に希釈された１μＬの第１の増幅反応物である以外は、上記第１ラウンドの通り正確に準備した。ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りであった：９４℃で２５秒間の変性及び７２℃で３分間のアニーリング／伸長を５サイクル。さらに２５サイクルは、９４℃で２５秒間、続いて６７℃のアニーリング／伸長温度で３分間実施した。追加の最終段階として伸長を６７℃で７分間実施した。得られたＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１２６】
３種のＰＣＲ産物を得て、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングした。第１のＰＣＲ産物は、Ｃ．カネフォラＢＰ４０９／ＤｒａＩ消化ライブラリーから得られ（得られた配列をＧＷ１＿ＣｃＰＡＬ２（配列番号４４）と称した）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ中にクローニングしてプラスミドｐＭＬ１８を作製した。第２のＰＣＲ産物は、Ｃ．カネフォラＢＰ４０９／ＥｃｏＲＶ消化ライブラリーから得られ（得られた配列をＧＷ１＿Ｃｃ４ＣＬ２と称した）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ中にクローニングしてプラスミドｐＭＬ２１を作製した。第３のＰＣＲ産物は、Ｃ．アラビカＴ２３０８／ＳｔｕＩ消化ライブラリーから得られ（得られた配列をＧＷ１＿Ｃａ４ＣＬ２と称した）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ中にクローニングしてプラスミドｐＭＬ２２を作製した。
【０１２７】
【表８】
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【０１２８】
遺伝子特異的プライマーを使用したコフィア・アラビカＣａＰＡＬ１及びＣａＰＡＬ３の完全ＯＲＦを含有するｃＤＮＡの単離。データベースに存在する既存のカネフォラｃＤＮＡ配列（ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３）（配列番号３９）及び５’ＲＡＣＥから得られた新たな５’カネフォラ配列（Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ１）（配列番号４０）を使用して、ＣａＰＡＬ１（ｐＭＬ８）の完全ＯＲＦ配列（配列番号１）を増幅するように、５’及び３’ＵＴＲ配列の２種の特異的プライマーを設計した。ＣａＰＡＬ３（ｐＭＬ１４）の完全ＯＲＦ配列（配列番号２）、データベースに存在するｃＤＮＡ配列（ｐｃｃｃｐ１６ｌ１）（配列番号４５）、及びｐｃｃｃｐ１６ｌ１及びＲａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ３配列（配列番号４５、４６）と高い類似性を有するコフィア・カネフォラＰＡＬ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ４６０２０３）（配列番号４７）の公開された配列の５’領域を増幅することは、この遺伝子の５’及び３’ＵＴＲ配列の２つ特異的プライマーを設計するのに役立った。完全ＯＲＦ配列を単離するのに使用したｃＤＮＡは表８に述べ、各ＰＣＲ反応のための特異的プライマーの配列は表９に示す。
【０１２９】
ＰＣＲ反応を以下の通り５０μＬの反応物中で実施した：コフィア・アラビカＴ２３０８由来の５μＬのｃＤＮＡ（表８）、５μＬの１０×ＰＣＲバッファー（Ｌａ  ＰＣＲバッファーＩＩ  Ｍｇ＋＋含有）、６００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、及び０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。９４℃で２分間変性させた後、増幅は以下のプロトコールに従って実施した：９４℃で１分間の変性、指定のアニーリング温度（表８）で１分間、及び７２℃で２分間の伸長を４０サイクル。追加の最終段階として伸長を７２℃で７分間実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色によって分析した。次いで、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングを使用して期待されるサイズの断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ中にクローニングした。
【０１３０】
製造元によって提供された説明書に従う配列決定用のキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。次いで、クローニングされた挿入断片の配列を決定した。
【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
遺伝子特異的プライマーを使用した、コフィア・カネフォラ及びコフィア・アラビカ由来の４ＣＬ２の完全ＯＲＦを含有するｃＤＮＡの単離。データベースに存在する既存の４ＣＬ  ｃＤＮＡ配列及びプライマーアシストゲノムウォーキング実験から得られた新たな５’配列を使用して、コフィア・アラビカ及びコフィア・カネフォラ由来の完全ＯＲＦ配列（表８）を増幅するように、コーヒー４ＣＬ２遺伝子の５’及び３’ＵＴＲ配列の２種の遺伝子特異的プライマーを設計した（表８及び表９）増幅産物は、Ｃａ４ＣＬ２（ｐＧＣ１）（アラビカ種）（配列番号５）及びＣｃ４ＣＬ２（ｐＧＣ３）（カネフォラ種）（配列番号６）であった。完全ＯＲＦを単離するのに使用したｃＤＮＡは表８に述べ、各ＰＣＲ反応のための特異的プライマーの配列は表９に示す。
【０１３３】
Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応を以下の通り５０μＬの反応物中で実施した：３μＬのｃＤＮＡ（表８）、５μＬの１０×ＰＣＲバッファー（Ｌａ  ＰＣＲバッファーＩＩ  Ｍｇ＋＋含有）、３００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、及び０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。９４℃で２分間変性させた後、増幅反応は以下の通り実施した：９４℃で１分間、アニーリング温度（表８に述べる）で１分間、及び７２℃で２分３０秒間の伸長を２５サイクル。追加の最終段階として伸長を７２℃で７分間実施した。
【０１３４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色によって分析した。次いで、配列決定用のＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元によって提供された説明書に従って使用して、期待されるサイズの断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ中にクローニングした。次いで、クローニングされた挿入断片の配列を決定した。
【０１３５】
【表１０】
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【０１３６】
実施例２
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードするコーヒーノキ属ｃＤＮＡクローンの単離及び特徴付け
コーヒーフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたＰＡＬタンパク質のタンパク質配列、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）ＰＡＬ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６８９３８、Ａｐｐｅｒｔ他、１９９４）（配列番号５４）及びトウモロコシ（Ｚｅａ  Ｍａｙｓ）ＰＡＬ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ４０１３７、Ｒｏｓｌｅｒ他、１９９７）（配列番号５０）を、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として使用した。パセリＰＡＬ１タンパク質配列による第１の検索で、比較的高いレベルの相同性を示す３つのユニジーン：＃１２１０１８（ｅ値＝０）、＃１２０３７０（ｅ値＝ｅ−１２３）及び＃１１９７７８（ｅ値＝ｅ−１１６）が発見された。トウモロコシのＰＡＬ１による第２の検索で、同じ３つのユニジーン：＃１２１０１８（ｅ値＝０）、＃１２０３７０（ｅ値＝９ｅ−８５）及び＃１１９７７８（ｅ値＝ｅ−８１）が発見された。
【０１３７】
コフィア・アラビカＣａＰＡＬ１（完全ＯＲＦ）。植物ＰＡＬタンパク質と高い類似性を有することが認められた第１のユニジーンは、ユニジーン＃１２１０１８であった。このユニジーンのうちの最長のｃＤＮＡ（ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３）（配列番号３９）を２２週全チェリーライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３の挿入断片（配列番号３９）は１６３７ｂｐの長さであり、４７０アミノ酸の部分タンパク質配列をコードすることが見出された。完全長パセリタンパク質は７１６アミノ酸長であるので、ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３（配列番号３９）によってコードされるコーヒーＰＡＬがＮ末端で２４６アミノ酸にわたり欠失していると想定された。この遺伝子の欠失した５’コード領域を見出すために、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの確立した技法に使用するために特異的プライマーをｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３（配列番号３９）の５’末端の配列から設計した。
【０１３８】
Ｃ．カネフォラ（ＢＰ−４０９）の花ＲＮＡ及び上記実施例１に記載の方法３によって調製されたｃＤＮＡを使用して約１０５０ｂｐの固有の断片を得た。プライマー及びＲＡＣＥ  ＰＣＲ１条件は表１〜４及び実施例１に述べる。特異的ＰＣＲ増幅プライマーＰＡＬ１−ＧＳＰ１及び追加のプライマー（５’ＧＴＧＣＣＴＴＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣ３’）（配列番号１５３）を使用して直接的に（精製なしで）、得られたＰＣＲ断片の配列を決定した。得られた配列（Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ１）（配列番号４０）は１０３７ｂｐの長さであり、予想された通りｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３（配列番号３９）の配列の５’末端と重複していた（図２、１４０ｂｐの重複配列）。
【０１３９】
このＣ．カネフォラ配列（Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ１）（配列番号４０）及びｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３の挿入断片（配列番号３９）は、コーヒーＣａＰＡＬ１の完全ＯＲＦ配列を特異的に増幅することができる２つの新たなプライマーの設計を可能にした。方法１によって作製された、Ｃ．アラビカ（Ｔ２３０８）粒（黄色段階：表８及び表９参照）のＲＮＡ由来のｃＤＮＡを使用し、実施例１及び表８に述べた後のＰＣＲ条件に従って、完全ＯＲＦの増幅を実施した。この実験で、ＣａＰＡＬ１（配列番号２０）のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を含有したプラスミドｐＭＬ８（図２Ａ及び図２Ｂ）を作製した。ｐＭＬ８挿入断片（配列番号１）の配列解析から、このｃＤＮＡは２３４４ｂｐの長さであり、７７．１０ｋＤａの推定分子量を有する７１１アミノ酸のポリペプチド（配列番号２０）をコードした２１３６ｂｐの完全ＯＲＦを有することが示唆された。
【０１４０】
図５Ａに、ｐＭＬ８（ＣａＰＡＬ１）によってコードされる完全ＯＲＦ（配列番号１）と、公開データバンクで利用可能な２つの完全コフィア・カネフォラＰＡＬタンパク質配列、ＣｃＰＡＬ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ３２８６６）（配列番号４８）及びＣｃＰＡＬ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ３２８６７）（配列番号４９）とのアライメントが示される。こうしたデータから、ＣａＰＡＬ１（配列番号２０）は、完全長コフィア・カネフォラＣｃＰＡＬ１配列及びＣｃＰＡＬ２配列（配列番号４８、４９）とアミノ酸のレベルで８３．１％及び７４．３％の同一性を有することが実証され、これによりＣａＰＡＬ１は新たな固有のコーヒーＰＡＬ配列であることが示される。さらに、コフィア・アラビカ由来の２つの部分ＰＡＬ配列がＮＣＢＩデータベースに存在した（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ２７６５４及びＡＡＦ２７６５５）。
【０１４１】
ＣａＰＡＬ１（ｐＭＬ８）（配列番号１）と、生化学的に特徴付けられたＰＡＬタンパク質とのアライメント（図５Ｂ）から、新たに単離されたＣａＰＡＬ１コーヒー配列は、トウモロコシＰＡＬ１（配列番号５０）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＡＬ１、ＰＡＬ２、ＰＡＬ４（配列番号５１、５２、５３）及びパセリＰＡＬ１、ＰＡＬ２配列及びＰＡＬ３配列（配列番号５４、５５、５６）とそれぞれ６７．９％、８１．６％、８０．３％、８０％、８５％、８４．８％及び８５．２％の同一性を示すことが示される。こうしたデータから、コーヒーＰＡＬタンパク質としてｐＭＬ８の新たに発見されたＯＲＦのアノテーションが確認された（図５Ｂ）。このアライメントから、ここで提示されるＣａＰＡＬ１配列（配列番号２０）がタンパク質レベルで、単離された部分ＣａＰＡＬ２（以下に記載）及びｐＭＬ１４に含まれる完全ＣａＰＡＬ３（配列番号２）（以下に記載）と６９．８％及び８３．１％の同一性を共有することも示される。
【０１４２】
コフィア・カネフォラＣｃＰＡＬ２（部分ＯＲＦ）。植物ＰＡＬタンパク質と高い類似性を有することが認められた第２のコーヒーユニジーン配列は、ユニジーン＃１１９７７８であった。このＥＳＴのオリジナルデータベースＥＳＴ配列を使用したので、このユニジーンのうちの最長ｃＤＮＡ（ｐｃｃｃｌ２５ｃ１３）をライブラリーから回復することは不可能であった。その次に長いＥＳＴクローンｐｃｃｃｐ１９ｋ７を単離し、その配列を決定した。Ｓｅｑｍａｎソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して、ｐｃｃｃｌ２５ｃ１３の８４０ｂｐのＥＳＴ（配列番号４２）及びｐｃｃｃｐ１９ｋ７に含まれる６７３ｂｐのｃＤＮＡ（配列番号４１）をアラインメントした。得られた連続する配列から、２つの配列が４３１ｂｐの重複領域にわたり同一であることが示され、それによりこららの両方が同じｃＤＮＡに属することが確認された（図３）。
【０１４３】
こうした２つの配列のコンティグから生じた固有の配列の長さは、１０８２ｂｐの長さであり、２６１アミノ酸の部分ＯＲＦ配列をコードすることが見出された。完全長パセリＰＡＬ１タンパク質は７１６アミノ酸長であるので、このコーヒーｃＤＮＡがＮ末端で４５４アミノ酸にわたり欠失していると想定された。このコーヒーＰＡＬの５’末端を単離するために、まず５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応のための特異的プライマーを設計した。上記の実施例１に記載のｃＤＮＡ合成方法２に従ってＣ．カネフォラ（ＢＰ−４０９）の果皮ＲＮＡ（混合したすべての段階、表１）から調製されたｃＤＮＡ、プライマーＰＡＬ２−ＧＳＰ１及びＰＡＬ２−ＧＳＰ２（配列番号１０４、１０５）（表１〜４）並びに実施例１及び表２に記載のＲＡＣＥ  ＰＣＲ条件を使用して、約４００ｂｐの固有の断片を得た。この断片の増幅に使用される特異的プライマーＰＡＬ２−ＧＳＰ２（配列番号１０５）を使用して、精製なしでこのＰＣＲ断片の配列を決定した。得られた配列（Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ２）（配列番号４３）は４０６ｂｐの長さであり、予想された通り配列ｃｃｃｌ２５ｃ１３（配列番号４２）の５’末端と重複していた（図３Ｂ、６３ｂｐの重複配列）。
【０１４４】
新たに単離されたＣ．カネフォラ５’末端配列（Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ２）（配列番号４３）は依然として５’末端を欠失していたので、８つのライブラリーに対してゲノムウォーカー実験を実施して５’配列の回復を試みた。こうした実験では、Ｃ．カネフォラＲａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ２配列（配列番号４３）の５’末端から設計したプライマーＰＡＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ１及びＰＡＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ２（配列番号１４３、１４４）（表７）を使用し、実施例１に記載のプライマーアシストゲノムウォーキングＰＣＲ条件に従って実施した。Ｃ．カネフォラＢＰ４０９／ＤｒａＩ消化ライブラリーから約２１００塩基対（ゲル中での長さによる推定）の固有のＰＣＲ断片を得、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、Ｔ３及びＴ７ユニバーサルプライマー及び２つの遺伝子特異的内部プライマーを使用してその配列を決定した。得られたこのプラスミドをｐＭＬ１８と称し、挿入配列（ＧＷ１＿ＣｃＰＡＬ２）（配列番号４４）は２１１８ｂｐの長さであり、配列Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ２（配列番号４３）と６７ｂｐだけ重複することが見出された（図３Ａ）。
【０１４５】
Ｓｅｑｍａｎソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して図３Ａに述べた種々のカネフォラＰＡＬ２配列をアラインメントした。このアライメントから、重複領域において１００％の同一性があることが示され（図３Ｂ）、これはこうした配列が同じ遺伝子に由来することを意味する。作製された完全な３４７６ｂｐのコンティグに関連する遺伝子をＣｃＰＡＬ２（配列番号３）と名付けた。ＣｃＰＡＬ２連続配列中の最長ＯＲＦは、ゲノム配列ＧＷ１＿ＣｃＰＡＬ２（配列番号４４）の最初の１４２９ｂｐが大きなイントロンに関連付けられたので、１７５２ｂｐ（１４３０〜３１８１位）であることが見出された。ＣｃＰＡＬ２コンティグ配列の部分ＯＲＦは、５８３ａａの部分タンパク質をコードしていた。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｗを使用した、この５８３アミノ酸ＯＲＦと完全長パセリＰＡＬ１タンパク質（配列番号５４）（７１６ａａ）とのアライメントに基づくと（図５Ｂ）、ＣｃＰＡＬ２（配列番号３）のコーヒーｃＤＮＡは部分的であり、そのＯＲＦがＮ末端で１３４アミノ酸にわたり欠失していると想定される。追加の５’ＲＡＣＥ又は追加のプライマーアシストゲノムウォーク操作で、ＣｃＰＡＬ２（配列番号３）遺伝子の欠失した５’コード配列が単離されることが予想される。
【０１４６】
部分ＣｃＰＡＬ２タンパク質配列（配列番号２２）と、ＮＣＢＩデータバンクで利用可能な２つのコフィア・カネフォラＰＡＬ配列、及びここで記載されている２つの他のコーヒーＰＡＬ配列とのアライメントから、ＣｃＰＡＬ２（配列番号２２）は固有のコーヒーＰＡＬであることが示される（図５Ａ）。このアライメントからの同一性スコアから、部分ＣｃＰＡＬ２タンパク質配列（配列番号２２）が、公けに利用可能な完全長コフィア・カネフォラＰＡＬ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ３２８６６）（配列番号４８）及びＰＡＬ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ３２８６７）（配列番号４９）配列と８５．２％及び８５．２％、並びにここに記載のＣａＰＡＬ１（配列番号２０）と６９．８％及びＣａＰＡＬ３（配列番号２１）と８５．１％の同一性を有することが示される。
【０１４７】
別のアライメントから（図示せず）、ＣｃＰＡＬ２タンパク質配列（配列番号２２）がまた、コフィア・アラビカから公けに利用可能な２つの部分ＰＡＬ（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ２７６５４及びＡＡＦ２７６５５）と、３つすべての配列に共通する領域にわたり８４．５％及び８３．８％の同一性を共有することが明らかになった。こうしたデータから、ＣｃＰＡＬ２の新たに発見された部分ＯＲＦが新たなコーヒーＰＡＬタンパク質配列を表すことが確認される。
【０１４８】
図５Ｂに、部分ＣｃＰＡＬ２タンパク質配列と、生化学的に特徴付けられたいくつかのＰＡＬタンパク質と、ここで提示される２つの他のコーヒーＰＡＬ配列との間の別のアライメントを示す。新たに発見された部分ＣｃＰＡＬ２配列は、トウモロコシＰＡＬ１（配列番号５０）、シロイヌナズナＰＡＬ１、ＰＡＬ２、ＰＡＬ４（配列番号５１、５２、５３）、及びパセリＰＡＬ１、ＰＡＬ２及びＰＡＬ３（配列番号５４、５５、５６）配列とそれぞれ６９．６％、８１．６％、８１．５％、８２％、８３．５％、８３．４％及び８３．９％の同一性を示す。このアライメントデータから、ＣｃＰＡＬ２の部分ＯＲＦがコーヒーＰＡＬタンパク質配列を表すという論拠が強く裏付けられる。このことから、ＣｃＰＡＬ２（配列番号２２）が、ここで提示される新たなＣａＰＡＬ１（配列番号２０）及びＣａＰＡＬ３（配列番号２１）と異なる遺伝子産物であり、こうした配列と６９．８％及び８５．１％の同一性を示すことも明らかに示される。
【０１４９】
コフィア・アラビカＣａＰＡＬ３（完全ＯＲＦ）。植物ＰＡＬタンパク質と高い類似性を有することが認められた第３のコーヒーユニジーン配列は、ユニジーン＃１２０３７０であった。このユニジーンのうちの最長のｃＤＮＡ（ｐｃｃｃｐ１６ｌ１）（配列番号４５）を単離し、その配列を決定した。クローンｐｃｃｃｐ１６ｌ１の挿入断片（配列番号４５）は１０６０ｂｐの長さであり、２６１アミノ酸の部分ＯＲＦ配列をコードすることが見出された。完全長パセリタンパク質は７１６アミノ酸長であるので、ｐｃｃｃｐ１６ｌ１（配列番号４５）によってコードされるコーヒーＰＡＬがＮ末端で４５５アミノ酸にわたり欠失していると想定された。欠失した５’末端を回復するために、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲに使用するための特異的プライマーを設計した。
【０１５０】
ｃＤＮＡ合成方法４に従ってＣ．カネフォラ（ＢＰ−４０９）の果皮ＲＮＡ（混合したすべての段階、表１）からｃＤＮＡを調製した。表１〜４及び実施例１に記載のプライマー及びＰＣＲ条件を使用して、約４００ｂｐの断片を得た。この断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、その配列を決定した。得られたプラスミド（ｐＭＬ１９）は３７７ｂｐの挿入配列（Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ３）（配列番号４６）を有していた。予想された通り、ｐＭＬ１９の挿入断片は、ｐｃｃｃｐ１６ｌ１（配列番号４５）の配列の５’末端と重複していたが（図４、１０７ｂｐの重複配列）、配列Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ３（配列番号４６）は依然としてコーヒーＰＡＬ３配列（配列番号２）のコード配列の５’末端を欠失していた。
【０１５１】
ｐｃｃｃｐ１６ｌ１（配列番号４５）とＲＡＣＥ断片Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ３（配列番号４６）からの１３３０ｂｐのコンティグを、公開されているコフィア・カネフォラＰＡＬ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ３２８６６）（配列番号４８）とアラインメントした場合、こうした３つの配列はほぼ同一であり、共通する領域にわたり９９．２％の同一性を示すことが判明した。この事実から、公開されているコフィア・カネフォラＰＡＬ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ３２８６６）（配列番号４８）を使用して、この遺伝子に対する５’特異的プライマー及びｐｃｃｃｐ１６ｌ１プラスミド中の配列からの３’特異的プライマーを設計することによりコーヒーＰＡＬ３の完全ＯＲＦを増幅することができる。方法１によりＣ．アラビカ（Ｔ２３０８）粒（黄色段階、表８及び表９参照）のＲＮＡから作製されたｃＤＮＡを使用し、実施例１及び表８に記載のＰＣＲ条件に従ったこの実験の結果、プラスミドｐＭＬ１４に含まれるｃＤＮＡ配列ＣａＰＡＬ３（配列番号２）が生成された（図４Ａ及び図４Ｂ）。ｐＭＬ１４挿入断片（配列番号２）の配列解析から、このｃＤＮＡは２３１８ｂｐの長さであり、７７．９３ｋＤａの推定分子量を有する７１７アミノ酸のポリペプチド（配列番号２０）をコードする２１５４ｂｐの完全ＯＲＦを有することが示唆された。
【０１５２】
図５Ａのアライメントから、ＣａＰＡＬ３（ｐＭＬ１４）（配列番号２）の配列は、ここで提示される新たなコーヒーＰＡＬ配列ＣａＰＡＬ１（配列番号１）及びＣｃＰＡＬ２（配列番号３）と異なる（それぞれ８３．１％及び８５．１％）ことが実証される。しかし、このアライメントから、ＣａＰＡＬ３（配列番号２）は、コフィア・カネフォラのＰＡＬ１及びＰＡＬ２とほとんど同一である（両クローンは極めて類似した配列を有し、したがって対立遺伝子であると考えられる）ことも確認される。この知見から、ＣａＰＡＬ３（配列番号２）が実際にコーヒーＰＡＬ３遺伝子の潜在的にアラビカと特異的な新たな対立遺伝子であることが示唆される。３つすべての配列がコーヒーノキ属ＰＡＬ３遺伝子の対立遺伝子であると考えられる。すでに記載した２つの他の部分アラビカＰＡＬタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ２７６５４及びＡＡＦ２７６５５）は、ＣａＰＡＬ３配列（配列番号２１）と、（公けに利用可能な配列と共通する領域にわたり）それぞれ９９．３％及び９５．９％同一であり、これらはＣａＰＡＬ３産物の対立遺伝子であることが示される。完全ＣａＰＡＬ３タンパク質配列（配列番号２１）と生化学的に特徴付けられたいくつかのＰＡＬタンパク質配列とのアライメントも実施した（図５Ｂ）。このアライメントから、ＣａＰＡＬ３コーヒー配列が植物ＰＡＬタンパク質と高い類似性を有し、トウモロコシＰＡＬ１（配列番号５０）、シロイヌナズナＰＡＬ１、ＰＡＬ２、ＰＡＬ４（配列番号５１、５２、５３）並びにパセリＰＡＬ１、ＰＡＬ２及びＰＡＬ３（配列番号５４、５５、５６）配列とそれぞれ６７．６％、８０．２％、８０．３％、７９．６％、８２％、８１．７％及び８２．６％の同一性を示すことが実証される。この知見から、この配列がＰＡＬタンパク質をコードするという先の主張が確認される。
【０１５３】
実施例３
ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（ＣｃＣ４Ｈ）をコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローンの単離及び特徴付け
コフィア・カネフォラＣｃＣ４Ｈ（完全ＯＲＦ）。コーヒーケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）をコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたＣ４Ｈをコードする２つのタンパク質配列、ＡｔＣ４Ｈ（シロイヌナズナ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃ＢＡＡ２４３５５、Ｍｉｚｕｔａｎｉ他，１９９７）（配列番号５７）及びＰｂＣ４Ｈ（バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃ＡＡＧ５０２３１、Ｒｏ他，２００１）（配列番号５８）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。
【０１５４】
シロイヌナズナＡｔＣ４Ｈタンパク質配列を使用して、唯一のユニジーン（＃１２４５５０）が、極めて高いレベルの同一性（％同一性＝７７％、ｅ値＝０、スコア＝７８５）を示すことが見出された。他のヒットは、潜在的にＣ４Ｈをコードするにはあまりにも低いＡｔＣ４Ｈとの同一性パーセントを示した（≦２９％同一性、ｅ値≧３ｅ−５２、スコア≦２００）。
【０１５５】
バルサムポプラ由来のＰｂＣ４Ｈ（配列番号５８）による第２の検索で、同じ最良のヒット＃１２４５５０（ｅ値＝０、スコア＝８６９）が発見された。次いで、Ｃ４Ｈの完全コード配列をコードすると思われたユニジーン＃１２４５５０の５’末端を表す最長のｃＤＮＡ（ｐｃｃｃｌ２７ｈ２２）を葉ライブラリーから単離し、その配列を決定し、ＣｃＣ４Ｈ（配列番号４）と名付けた。ｐｃｃｃｌ２７ｈ２２の挿入断片は１６６８ｂｐの長さであり、１５１８ｂｐのＯＲＦ（コード）配列をコードすることが判明した。推定タンパク質配列（配列番号２３）は、５８．０５ｋＤａの推定分子量を有する５０５アミノ酸のタンパク質を示す。
【０１５６】
ｐｃｃｃｌ２７ｈ２２のタンパク質配列（配列番号２３）と、シロイヌナズナ由来のＣ４Ｈタンパク質配列（配列番号５７）、バルサムポプラ（配列番号５８）及びＭｓＣ４Ｈ（アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３７１１４）（配列番号１５８）とのアライメントから、ｐｃｃｃｌ２７ｈ２２コードタンパク質（ＣｃＣ４Ｈ）（配列番号２３）は、こうしたタンパク質配列とそれぞれ８５％、８５．８％及び８９．９％の同一性を共有することが実証された（図６）。このアライメントデータから、ｐｃｃｃｌ２７ｈ２２プラスミドは、Ｃ．カネフォラのケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ（ＣｃＣ４Ｈ）（配列番号２３）をコードする完全長ｃＤＮＡ（配列番号４）を含有することが示唆される。ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、ｐｃｃｃｌ２７ｈ２２に含まれる完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）と、シロイヌナズナ（Ｄ７８５９６）及びバルサムポプラ（ＡＦ３０２４９５）由来のＣ４Ｈ配列の完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）とのアライメントを実施した。このアライメントから、ｐｃｃｃｌ２７ｈ２２に含まれるＣｃＣ４Ｈ  ＤＮＡ配列（配列番号４）は、ＤＮＡレベルでそれぞれの公開されているＤＮＡ配列と７１％及び７５．６％の同一性を共有することが実証される。この解析では、完全ＤＮＡコード配列をアラインメントした（すなわち、５’ＵＴＲ、完全ＯＲＦ、及び３’ＵＴＲ配列が含まれていた）。
【０１５７】
実施例４
４−クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（Ｃｃ４ＣＬ１、Ｃｃ４ＣＬ２及びＣａ４ＣＬ２）をコードするコーヒーノキ属ｃＤＮＡクローンの単離及び特徴付け
コフィア・カネフォラＣｃ４ＣＬ１コンセンサス配列（部分ＯＲＦ）。コーヒー４−クマル酸：コエンザイムＡリガーゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられた４ＣＬ活性をコードする２つのタンパク質配列：Ｎｔ４ＣＬ１、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号０２４１４５、Ｌｅｅ他，１９９６）（配列番号６７）及びＡｔ４ＣＬ１、シロイヌナズナ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ４２５２４、Ｅｈｔｉｎｇ他，１９９９）（配列番号６３）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。タバコ由来の４ＣＬ１タンパク質配列による第１の検索で、Ｎｔ４ＣＬ１（配列番号６７）と高レベルの相同性を示す３つのユニジーン；＃１１９６７０（ｅ値＝ｅ−１５１）、＃１２８５８１（ｅ値＝ｅ−１０２）及び＃１２３０９８（ｅ値＝ｅ−１０１）が明らかになった。シロイヌナズナ由来の４ＣＬ１配列（配列番号６３）による第２の検索で、同じ３つのユニジーン＃１１９６７０（ｅ値＝ｅ−１３２）、＃１２８５８１（ｅ値＝２ｅ−７１）及び＃１２３０９８（ｅ値＝２ｅ−８６）が発見された。
【０１５８】
４ＣＬの部分コード配列をコードするユニジーン＃１１９６７０（ｐｃｃｃｐ２７ｄ２１）（配列番号５９）の５’末端を表す最長のｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｐ２７ｄ２１の挿入断片（配列番号５９）は１１２４ｂｐの長さであり、３１６アミノ酸の部分ＯＲＦをコードすることが見出された。完全長タバコタンパク質（配列番号６７）は５４７アミノ酸長であるので、ｐｃｃｐ２７ｄ２１（配列番号５９）に含まれるｃＤＮＡによってコードされるコーヒー４ＣＬは、Ｎ末端で２３１アミノ酸にわたり欠失していると想定された。
【０１５９】
欠失した５’末端を回復するために、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの確立した技法に使用するための特異的プライマーを設計した。上記の実施例１に記載の方法３により、混合したすべての段階（表１）（小緑色、大緑色、黄色及び赤色）のＣ．カネフォラ（ＢＰ−４０９）果皮組織からｃＤＮＡを調製した。表１〜４及び実施例１に記載のプライマー及びＰＣＲ条件を使用して、約３５０ｂｐの（ゲル中での長さによる推定）固有の断片を得て、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（配列決定用のＴＯＰＯ  ＴＡ  クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にクローニングし、ユニバーサルプライマーＴ３を使用してその配列を決定した。得られた配列（Ｒａｃｅ１＿Ｃｃ４ＣＬ１）（配列番号６０）は３３５ｂｐの長さであり、予想された通りｐｃｃｃｐ２７ｄ２１（配列番号５９）の配列の５’末端と重複していたが（図７、５５ｂｐの重複配列）、新たに単離したＲａｃｅ１＿Ｃｃ４ＣＬ１（配列番号６０）は依然としてこの遺伝子の完全５’末端を含有していなかった。
【０１６０】
Ｒａｃｅ１＿Ｃｃ４ＣＬ１（配列番号６０）とｐｃｃｃｐ２７ｄ２１（配列番号５９）に含まれる配列とのアライメントから生じたコンセンサス配列は、１４０４ｂｐの長さであり、Ｃｃ４ＣＬ１（配列番号６）と称した。Ｃｃ４ＣＬ１（配列番号６）に存在する最長のＯＲＦは１２３０ｂｐの長さであり、４０９アミノ酸の部分タンパク質配列（配列番号２５）をコードすることが見出された。タバコ４ＣＬ１の長さに基づいて、完全長Ｃｃ４ＣＬ１を得るためにＮ末端でさらに１３９ａａを回復しなければならない可能性が高い。追加の５’ＲＡＣＥ又は追加のプライマーアシストゲノムウォーカーを使用してＣｃ４ＣＬ１配列の欠失した完全５’末端を単離されよう。
【０１６１】
部分Ｃｃ４ＣＬ１タンパク質配列（配列番号２５）とＧｅｎＢａｎｋで利用可能なシロイヌナズナ及びタバコ由来の生化学的に特徴付けられた４ＣＬ配列（配列番号６３、６７）との多重アライメントを行った（図９）。このアライメントから、ＢＬＡＳＴを使用したこのコーヒー配列の最初のアノテーション、すなわちＣｃ４ＣＬ１（配列番号６）の部分ＯＲＦがコーヒー４ＣＬタンパク質（配列番号２５）をコードすることが確認された。このアライメントから、部分Ｃｃ４ＣＬ１配列（配列番号２５）とＮｔ４ＣＬ２タンパク質配列との間に８１．９％の同一性があることが示される。
【０１６２】
コフィア・アラビカＣａ４ＣＬ２（完全ＯＲＦ）及びコフィア・カネフォラＣｃ４ＣＬ２（完全ＯＲＦ）。４ＣＬの部分コード配列をコードするユニジーン＃１２３０９８（ｐｃｃｃｓ３０ｗ１６ｎ１４）の５’末端を表す最長のｃＤＮＡを３０週粒ライブラリー（開花の３０週間後）から単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｓ３０ｗ１６ｎ１４の挿入断片は９４６ｂｐの長さであり、２１７アミノ酸の部分ＯＲＦ配列をコードすることが見出された。さらなる配列解析から、ユニジーン＃１２８５８１（シングルトンｐｃｃｃｌ２４ｉ２１）及びユニジーン＃１２３０９８の配列が実際に同じ遺伝子に属するはずであると提案された。完全に配列を決定したプラスミドｐｃｃｃｌ２４ｉ２１（挿入断片の長さが１７７８ｂｐである）とｐｃｃｃｓ３０ｗ１６ｎ１４配列との次のアライメントから、両方のプラスミドの配列が集合して単一のコンティグ配列を構築するはずであると確認された。
【０１６３】
こうしたプラスミドに含まれるＯＲＦ領域をコードするＤＮＡ配列間のアライメントから、タンパク質配列は重複領域において９８．９％同一であり、その違いは一塩基多型によるものであることが示される。この結果から、プラスミドｐｃｃｃｌ２４ｉ２１及びｐｃｃｃｓ３０ｗ１６ｎ１４に含まれる配列は、Ｃｃ４ＣＬ２と称される同じ遺伝子の２つの対立遺伝子を表すことが示唆される。
【０１６４】
他の植物４ＣＬタンパク質との配列比較に基づくと、ｐｃｃｃｌ２４ｉ２１のＯＲＦはＮ末端で約４４アミノ酸欠失していることが判明した。ｐｃｃｃｌ２４ｉ２１の挿入断片の５’末端配列を使用して、この遺伝子の欠失した５’末端を単離するために実施例１に記載のＰＣＲ条件に従ったプライマーアシストゲノムウォーキングのための特異的プライマーを設計した（プライマー４ＣＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ１及び４ＣＬ２−ＧＷ−ＧＳＰ２（配列番号１４５、１４６）、表７）。
【０１６５】
Ｃ．カネフォラＢＰ４０９／ＥｃｏＲＶ消化ライブラリーから約１１００塩基対の（ゲル中での長さによる推定）固有のＰＣＲ断片を得た（得られた配列をＧＷ１＿Ｃｃ４ＣＬ２と称した）（配列番号６２）。Ｃ．アラビカＴ２３０８／ＳｔｕＩ消化ライブラリーから約１５５０塩基対の（ゲル中での長さによる推定）第２の固有のＰＣＲ断片を得た（得られた配列をＧＷ１＿Ｃａ４ＣＬ２と称した）（配列番号６１）。次いで、こうした２つの断片（ＧＷ１＿Ｃｃ４ＣＬ２及びＧＷ１＿Ｃａ４ＣＬ２）（配列番号６２、６１）をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、その配列を決定した。断片ＧＷ１＿Ｃｃ４ＣＬ２（配列番号６２）は１１０２ｂｐの長さであり、ｐｃｃｃｌ２４ｉ２１に含まれる配列と５７９ｂｐにわたり重複していた（図８）。第２の断片ＧＷ１＿Ｃａ４ＣＬ２（配列番号６１）は１５４７ｂｐの長さであり、ｐｃｃｃｌ２４ｉ２１に含まれる配列と５７１ｂｐにわたり重複していた（図８）。ＧＷ１＿Ｃａ４ＣＬ２（配列番号６１）において４ＣＬ２開始コドン（ＡＴＧ）の上流にある８００ｂｐにわたるＤＮＡ配列が回復した。この上流配列は、４ＣＬ２遺伝子の５’ＵＴＲ配列、並びにこの遺伝子のプロモーター配列の重要な部分を含む。新たに単離されたこうした５’末端４ＣＬ配列及びｃＤＮＡ  ｐｃｃｃｌ２４ｉ２１の配列により、コーヒー４ＣＬ２の完全ＯＲＦを特異的に増幅することができる２つの新たなプライマー（表８及び表９参照）の設計が可能となった。
【０１６６】
方法１によりＣ．アラビカ（Ｔ２３０８）の果皮ＲＮＡ（黄色段階：表８参照）から作製されたｃＤＮＡ、並びに実施例１及び表８及び表９に記載のプライマー及びＰＣＲ条件を使用して、その配列をＣａ４ＣＬ２（配列番号５）と名付けた１７７１ｂｐの断片を含有するｐＧＣ１と名付けたプラスミドを作製した（図８Ａ及び図８Ｂ）。配列解析から、ｐＧＣ１は、５９．４ｋＤａの概算分子量を有する５４１アミノ酸のポリペプチド（配列番号２４）をコードした１６２６ｂｐの完全ＯＲＦを含むことが示唆された。
【０１６７】
方法１によりＣ．カネフォラ（ＢＰ４０９）の果皮ＲＮＡ（黄色段階：表８参照）から作製されたｃＤＮＡ、並びに実施例１及び表８及び表９に記載のプライマー及びＰＣＲ条件を使用して、その配列をＣｃ４ＣＬ−２（配列番号７）と称する１７７１ｂｐの長さの挿入断片を含有するｐＧＣ３と名付けたプラスミドを作製した（図８Ａ及び図８Ｂ）。配列解析から、ｐＧＣ３は、５９．５ｋＤａの概算分子量を有する５４１アミノ酸のポリペプチド（配列番号２６）をコードした１６２６ｂｐの完全ＯＲＦ含むことが示唆された。
【０１６８】
次いで、手動で最適化されたアライメントを、ｐＧＣ１（Ｃａ４ＣＬ２）及びｐＧＣ３（Ｃｃ４ＣＬ２）（配列番号５、７）によってコードされるタンパク質配列（配列番号２４、２６）と、ＧｅｎＢａｎｋから利用可能なシロイヌナズナ及びタバコ由来の生化学的に特徴付けられた４ＣＬ配列との間で実施した（図９）。このアライメントから、２つのコーヒー配列及び他のデータベース４ＣＬ配列について５４．３％から８１．１％の間の同一性レベルであることが示される。アラビカ配列とカネフォラ配列の間の同一性は９８．３％であることが判明し、これによりこうした配列が、同じコーヒー４ＣＬ遺伝子（すなわち、４ＣＬ２）の対立遺伝子であるという論拠が裏付けられた。多重アライメントから、Ｃａ４ＣＬ２とＮｔ４ＣＬ１の間のタンパク質配列で８１．１％の同一性、及びＣｃ４ＣＬ２とＮｔ４ＣＬ１の間のタンパク質配列で８１％の同一性があることも示される。さらに、多重アライメントから、Ｃａ４ＣＬ２（配列番号２４）とＣｃ４ＣＬ１（配列番号２５）の間、及びＣｃ４ＣＬ２（配列番号２６）とＣｃ４ＣＬ１（配列番号２５）の間のタンパク質で７７．８％の同一性があることが示されるので、このアライメントから、Ｃａ４ＣＬ２及びＣｃ４ＣＬ２（配列番号５、７）は、上記のＣｃ４ＣＬ１タンパク質と異なるタンパク質をコードすることが示される。
【０１６９】
実施例５
カルコンシンターゼ（ＣｃＣＨＳ）をコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローンの単離及び特徴付け
カルコンシンターゼをコードするコーヒーｃＤＮＡを見出すために、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）をコードする２つのタンパク質配列：ＨａＣＨＳ、ヒペリカム・アンドロサエマム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ａｎｄｒｏｓａｅｍｕｍ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ３０２９５（配列番号６９）；及びＬｅＣＨＳ、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ３８９８１（配列番号７０）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。ヒペリカム・アンドロサエマムＨａＣＨＳタンパク質配列を使用して、唯一のユニジーン（＃１２３８８９）が、極めて高いレベルの同一性（％同一性＝９０％、ｅ値＝０、スコア＝７２３）を示すことが見出された。トマトＬｅＣＨＳ由来のＰｂＣ４Ｈによる第２の検索で、同じ最良のヒット＃１２３８８９（％同一性＝９１％、ｅ値＝０、スコア＝７２１）が発見された。
【０１７０】
ユニジーン＃１２３８８９（ｐｃｃｃｐ８ｊ１０）（配列番号９７）の５’末端を表すｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｐ８ｊ１０の挿入断片（配列番号９７）は１３９７ｂｐの長さであり、１１７６ｂｐの完全ＯＲＦ配列をコードすることが見出され、これをＣｃＣＨＳ（配列番号８）と名付けた。この推定タンパク質配列は、４２．９２ｋＤａの推定分子量を有する３９１アミノ酸のタンパク質（配列番号２７）をコードする。ｐｃｃｃｐ８ｊ１０（配列番号９７）によってコードされる推定タンパク質配列（配列番号２７）と、ヒペリカム・アンドロサエマム及びとトマト（配列番号６９、７０）由来の極めて関連するＣＨＳタンパク質配列、及びブドウ属由来の関連する特徴付けられたスチルベンシンターゼＶＳＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ１９８８７）（配列番号７１）、及びストローブマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｓｔｒｏｂｅｓ）由来のＰｓＳＴＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ８７０１３）（配列番号７２）との多重アライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ）から、ＣｃＣＨＳがこうしたタンパク質配列とそれぞれ９０％、９０．５％、７５．７％及び７０．８％の同一性を共有することが実証され（図１０）、ｐｃｃｃｐ８ｊ１０（配列番号９７）がＶＳＳタンパク質ではなくＣＨＳタンパク質をコードするという論拠が裏付けられる。
【０１７１】
ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、ｐｃｃｃｐ８ｊ１０（配列番号９７）に含まれる完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）と、ヒペリカム・アンドロサエマム（ＡＦ３１５３４５）及びトマト（Ｘ５５１９５）由来のＣＨＳ配列の完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）とのアライメントを実施した。このアライメントから、ｐｃｃｃｐ８ｊ１０（配列番号９７）に含まれるＣｃＣＨＳ完全コード配列は、ＤＮＡレベルでそれぞれの公開のＤＮＡ配列と７２．８％及び７０．２％の同一性を共有することが実証される。この解析では、完全ＤＮＡコード配列をアラインメントした（すなわち、５’ＵＴＲ、完全ＯＲＦ及び３’ＵＴＲ配列が含まれていた）。
【０１７２】
実施例６
カルコンレダクターゼ（ＣｃＣＨＲ１、ＣｃＣＨＲ２Ａ及びＣｃＣＨＲ２Ｂ）をコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローンの単離及び特徴付け
カルコンレダクターゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、カルコンレダクターゼ（ＣＨＲ）をコードする２つのタンパク質配列：ＳｒＣＨＲ、セスバニア・ロストラータ（Ｓｅｓｂａｎｉａ  ｒｏｓｔｒａｔａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ１１２２６（配列番号７３）；及びＰｌＣＨＲ、タイワンクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  Ｍｏｎｔａｎａ）ロバタ（ｌｏｂａｔａ）変種、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ１２５２９（配列番号７４）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。（Ｊｏｕｎｇ他（２００３））。セスバニア・ロストラータ由来のＳｒＣＨＲタンパク質配列を使用して、高レベルの相同性を有する３つのユニジーン：ユニジーン＃１２５２６０（ｅ値＝ｅ−１１８）、＃１２５２５６（ｅ値＝ｅ−１１６）及び＃１２５２５７（ｅ値＝３ｅ−９４）が発見された。タイワンクズロバタ変種由来のＰｌＣＨＲによる第２の検索で、同じ３つのユニジーン：＃１２５２５６（ｅ値＝２ｅ−８４）、＃１２５２６０（ｅ値＝４ｅ−８３）、＃１２５２５７（ｅ値＝１ｅ−６６）が発見された。
【０１７３】
コフィア・カネフォラＣｃＣＨＲ１（完全ＯＲＦ）。ユニジーン＃１２５２５６（ｐｃｃｃｐ２４ｅ９）の５’末端を表すｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｐ２４ｅ９の挿入断片は１２７１ｂｐの長さであり、９７２ｂｐの完全ＯＲＦ配列をコードすることが見出され、これをＣｃＣＨＲ１（配列番号９）と名付けた。この推定タンパク質配列は、３６．０２ｋＤａの推定分子量を有する３２３アミノ酸のタンパク質（配列番号２８）を示す。ｐｃｃｃｐ２４ｅ９によってコードされる推定タンパク質配列と、ＣＨＲタンパク質配列、セスバニア・ロストラータ由来のＳｒＣＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ１１２２６）（配列番号７３）、タイワンクズロバタ変種由来のＰｌＣＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ１２５２９）（配列番号７４）、及びアルファルファ由来のＭｓＣＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１５５５（配列番号７５）、利用可能な生化学及び結晶学情報Ｂｏｍａｔｉ他（２００５ｂ））との手動で最適化されたアライメントを実施した。このアライメントから、ＣｃＣＨＲ１タンパク質（配列番号２８）は、上記のタンパク質配列ＳｒＣＨＲ、ＰｌＣＨＲ及びＭｓＣＨＲ（配列番号７３、７４、７５）とそれぞれ６０．７％及び４８．９％及び４８．３％の同一性を共有することが実証され（図１１）、Ｃ．カネフォラカルコンレダクターゼとしてのｐｃｃｃｐ２４ｄ９の最初のアノテーションが裏付けられた。
【０１７４】
コフィア・カネフォラＣｃＣＨＲ２Ａ及びＣｃＣＨＲ２Ｂ（完全ＯＲＦ）。コーヒーＣＨＲをコードすると考えられるユニジーン＃１２５２５７（ｐｃｃｃｌ２８ｋ６）の５’末端を表す最長のｃＤＮＡを葉ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｌ２８ｋ６の挿入断片は１２０５ｂｐの長さであり、９７２ｂｐのほぼ完全なＯＲＦ配列をコードすることが見出された（最初のＭＥＴだけが欠失していると考えられる）。この配列はＣｃＣＨＲ１（配列番号８）と異なるので、ＣｃＣＨＲ２Ａ（配列番号１０）と称した。この推定タンパク質配列は、３６．１１ｋＤａの推定分子量を有する３２３アミノ酸のポリペプチド（配列番号２９）である。図１１は、ｐｃｃｃｌ２８ｋ６（ＣｃＣＨＲ２Ａ）（配列番号１０）によってコードされる推定タンパク質配列（配列番号２９）と、コフィア・カネフォラ由来のＣｃＣＨＲ１タンパク質（上記の配列番号２８）並びにＣＨＲタンパク質配列、セスバニア・ロストラータ由来のＳｒＣＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ１１２２６）（配列番号７３）、タイワンクズロバタ変種由来のＰｌＣＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ１２５２９；Ｊｏｕｎｇ他（２００３）によって特徴付けられる活性（配列番号７４）及びアルファルファ由来のＭｓＣＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１５５５）（配列番号７５）とのアライメントを示す。このアライメントから、ｐｃｃｃｌ２８ｋ６によってコードされるタンパク質は、タンパク質配列ＳｒＣＨＲ、ＰｌＣＨＲ及びＭｓＣＨＲ（配列番号７３、７４、７５）とそれぞれ６１．６％、４９．８％及び４９．２％の同一性を共有することが示される。このアライメントから、ｐｃｃｃｌ２８ｋ６のＯＲＦは、ほぼ完全で、Ｎ末端のアミノ酸（ｍｅｔ）だけを欠失し、したがってこのｍｅｔの付加により、完全長とみなすことができることも示唆される。ＣｃＣＨＲ２Ａタンパク質配列（配列番号２９）は、図１１に提示される公けに利用可能なＣＨＲ配列よりもＣｃＣＨＲ１（７９．５％）との方が高い同一性を示すことが認められる。
【０１７５】
ユニジーン＃１２５２６０（ｐｃｃｃｌ２６ｆ１８）の５’末端を表す最長のｃＤＮＡを葉ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｌ２６ｆ１８の挿入断片は、１３７７ｂｐの長さであることが見出され、２４ｂｐの著しく短い１つの挿入を、そうでなければ完全であるＯＲＦ中に含有することも見出された。この２４ｂｐの挿入はインフレームではなく、この配列からスプライスされると完全なＯＲＦをもたらすので、イントロン配列であると考えられている。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのスプライシング後に作製されたＯＲＦは、９８７ｂｐの長さであり、３６．７３ｋＤａ推定分子量を有する３２８アミノ酸のタンパク質配列をコードする。
【０１７６】
ＣｌｕｓｔａｌＷを使用した、ｐｃｃｃｌ２６ｆ１８のスプライスされた挿入ＤＮＡ配列と、ｐｃｃｃｌ２８ｋ６の挿入ＤＮＡ配列（ＣｃＣＨＲ２Ａ）（配列番号１０）とのアライメントから、こうした２つの配列は９９．１％の同一性を示し、したがっておそらく対立遺伝子であることが明らかになった。したがって、ｐｃｃｃｌ２６ｆ１８をＣｃＣＨＲ２Ｂ（配列番号１１）と称した。このアライメントから、１２０７ｂｐの重複配列内で、ＯＲＦ配列中に単一ヌクレオチドの違いが９個だけ存在し、ｐｃｃｃｌ２６ｆ１８（配列番号１１）の３’ＵＴＲ中に単一ヌクレオチドの違いが２個だけと２塩基対の挿入とが存在することも示される。
【０１７７】
図１１は、ｐｃｃｃｌ２６ｆ１８（ＣｃＣＨＲ２Ｂ）（配列番号１１）によってコードされるタンパク質配列（配列番号３０）と、コフィア・カネフォラ由来のＣｃＣＨＲ１（配列番号２８）及びＣｃＣＨＲ２Ａ（配列番号２９）タンパク質配列（上記）並びにＣＨＲタンパク質配列ＳｒＣＨＲ、ＰｌＣＨＲ及びＭｓＣＨＲ（配列番号７３、７４、７５）とのアライメントを示す。このアライメントから、ＣｃＣＨＲ２Ｂ（配列番号３０）タンパク質は、ＳｒＣＨＲ、ＰｌＣＨＲ及びＭｓＣＨＲ（配列番号７３、７４、７５）タンパク質配列とそれぞれ６１．３％、４８．９％及び４８．３％の同一性を共有することが実証され、Ｃ．カネフォラカルコンレダクターゼとしてのｐｃｃｃｌ２６ｆ１８の最初のアノテーションが裏付けられる。この多重アライメントから、ＣｃＣＨＲ２Ｂ（配列番号３０）タンパク質は、ＣｃＣＨＲ１（配列番号２８）及びＣｃＣＨＲ２Ａ（配列番号２９）とそれぞれ７９．５％及び９７．３％の同一性を有することも示される。ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、ｐｃｃｃｐ２４ｅ９に含まれる完全コードＤＮＡ配列ＣｃＣＨＲ１（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（配列番号９）、ｐｃｃｃｌ２８ｋ６に含まれる部分コードＤＮＡ配列ＣｃＣＨＲ２Ａ（部分ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（配列番号１０）、及びｐｃｃｃｌ２６ｆ１８に含まれる完全ＣｃＣＨＲ２Ｂ（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−イントロン−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（配列番号１１）を、セスバニア・ロストラータ（ＡＪ２２３２９１）、タイワンクズロバタ変種（ＡＦ４６２６３２）及びアルファルファ（Ｕ１３９２４）由来の公開されているカルコンレダクターゼ完全ＤＮＡコード配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）とアラインメントした。このアライメントから、ＣｃＣＨＲ２Ａ（配列番号１０）とＣｃＣＨＲ２Ｂ（配列番号１１）の間で９９．１％の同一性があることが示され、したがってこれらの配列が同じ遺伝子の対立遺伝子であるという仮定が裏付けられる。ＣｃＣＨＲ２Ｂ（配列番号１１）のＯＲＦ中に、このアライメントの他のすべての配列には欠けている独特の２４ｂｐの挿入が存在することが認められることは興味深い。この挿入配列の意義はいまだ判明していない。ＣｃＣＨＲ１（配列番号９）及びＣｃＣＨＲ２Ｂ（配列番号１１）の完全コード配列は、８０．５％の同一性を共有し、このアライメントから、これらの配列が２種の異なる遺伝子であることが確認され得る。公開されている配列と比較すると、ＣｃＣＨＲ１は、ＳｒＣＨＲ、ＰｌＣＨＲ及びＭｓＣＨＲとＤＮＡレベルでそれぞれ５８．４％、４５．２％及び４７．４％の同一性を示す。ＣｃＣＨＲ２Ｂは、セスバニア・ロストラータ、タイワンクズロバタ変種及びアルファルファ由来の完全ＤＮＡ配列とそれぞれ５４．９％、４３％及び４５．５％の同一性を共有する。
【０１７８】
実施例７
カルコンイソメラーゼをコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン（ＣｃＣＨＩ）の単離及び特徴付け
カルコンイソメラーゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたカルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）をコードする２つのタンパク質配列（ＧｍＣＨＩ−２、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）Ｉ型ＣＨＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ９４３６０、（Ｒａｌｓｔｏｎ他（２００５ｂ））（配列番号７８）；及びＬｊＣＨＩ−１、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＩＩ型ＣＨＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＣ５３９８３（Ｓｈｉｍａｄａ他（２００３））（配列番号７７））が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。ダイズ由来のＧｍＣＨＩ−２タンパク質配列を使用して２つのユニジーンが見出された。第１のユニジーン＃１２４２１６は、第２のユニジーン＃１２４６３５（ｅ値＝４ｅ−１８）よりも高いレベルの同一性を示した（ｅ値＝２ｅ−６５）。ミヤコグサ由来のＬｊＣＨＩ−１タンパク質配列（配列番号７６）による第２の検索で、同じ２つのユニジーンが発見され、ユニジーン＃１２４２１６は、第２のユニジーン＃１２４６３５（ｅ値＝２ｅ−１６）よりも高いレベルの同一性を示した（ｅ値＝２ｅ−５３）。
【０１７９】
コフィア・カネフォラＣｃＣＨＩ（完全ＯＲＦ）。ユニジーン＃１２４２１６（ｐｃｃｃｐ２２ｋ１８）の５’末端に相当する最長のｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、その配列を決定した。このクローンの挿入断片（配列番号１２）は９２６ｂｐの長さであり、７８０ｂｐの完全ＯＲＦ配列をコードすることが見出された。このＯＲＦによってコードされる推定タンパク質配列（配列番号３１）は、２７．８８ｋＤａの推定分子量を有する２５９アミノ酸（配列番号３１）であり、この配列をＣｃＣＨＩ（配列番号３１）と称した。ｐｃｃｃｐ２２ｋ１８（ＣｃＣＨＩ）（配列番号１２）によってコードされる推定タンパク質配列（配列番号３１）と、公開されているデータバンクで利用可能なＣＨＩタンパク質配列、ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｘ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のｐＨＣＨＩ（ＰＩＲ  ＩＤ：ＩＳＰＪＡ１）（配列番号７６）、ミヤコグサ由来のＬｊＣＨＩ−２（Ｉ型ＣＨＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＣ５３９８４）（配列番号７７）、及びダイズ由来のＧｍＣＨＩ−２（Ｉ型ＣＨＩ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ９４３６０）（配列番号７８）（図１２Ａ）との手動で最適化されたアライメントを実施した。
【０１８０】
このアライメントから、ＣｃＣＨＩタンパク質（配列番号３１）は、Ｉ型ＣＨＩタンパク質配列ＰｈＣＨＩ、ＬｊＣＨＩ−２及びＧｍＣＨＩ−２（配列番号７６、７７、７８）とそれぞれ６２．５％、６３．４％及び５７．７％の同一性を共有することが実証され、Ｃ．カネフォラカルコンイソメラーゼとしてのｐｃｃｃｐ２２ｋ１８（配列番号１２）によってコードされるポリペプチド（配列番号３１）のアノテーションが裏付けられる。最適アライメントを使用したＣｃＣＨＩ（配列番号３１）とデータベース上の十分に特徴付けられたＩ型及びＩＩ型ＣＨＩタンパク質配列との比較から、ＣｃＣＨＩはＩＩ型ＣＨＩ配列よりもＩ型ＣＨＩに類似していることが明らかになった。
【０１８１】
ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、ｐｃｃｃｐ２２ｋ１８に含まれる完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）と、ダイズ由来の完全コードＤＮＡ配列ＧｍＣＨＩ−２（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（ＡＹ５９５４１５）とのアライメントを実施した。このアライメントから、ｐｃｃｃｐ２２ｋ１８に含まれるＣｃＣＨＩ完全コード配列はＤＮＡ配列ＧｍＣＨＩ−２と５７．２％の同一性を共有することが実証される。
【０１８２】
コフィア・カネフォラＣｃＣＨＩ様タンパク質（完全ＯＲＦ）。ユニジーン＃１２４６３５（ｐｃｃｃｐ１２ｏ１５）由来の最長の５’末端クローンのうちの１つを果皮ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｐ１２ｏ１５の挿入断片（配列番号１３）は１０７３ｂｐの長さであり、６４２ｂｐの完全ＯＲＦをコードすることが見出された。この推定タンパク質配列（配列番号３２）は、２３．８２ｋＤａの推定分子量を有する２１３アミノ酸のタンパク質であり、この配列をＣｃＣＨＩ様（配列番号３２）と称した。ｐｃｃｃｐ１２ｏ１５（配列番号１３）によってコードされる推定タンパク質配列（配列番号３２）と、完全長ＣＨＩタンパク質配列、ダイズ由来のＧｍＣＨＩ−４Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ９４３６２）（配列番号７９）及びダイズ由来のＧｍＣＨＩ−１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ９４３５８）（配列番号８０）との最適化されたアライメントを実施した（図１２Ｂ）。このアライメントから、ＣｃＣＨＩ様（配列番号３２）は、ＧｍＣＨＩ−４Ａ（配列番号７９）と６４．３％の同一性及びＧｍＣＨＩ−１Ａ（配列番号８０）と２９．１％の同一性を共有することが示される。
【０１８３】
ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、ｐｃｃｃｐ１２ｏ１５に含まれる完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（配列番号１３）を、ダイズ由来の完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）ＧｍＣＨＩ−４Ａ（ＡＹ５９５４１７）及びＧｍＣＨＩ−１Ａ（ＡＹ５９５４１３）とアラインメントした。このアライメントから、ＣｃＣＨＩ様配列は、ＧｍＣＨＩ−４Ａ及びＧｍＣＨＩ−１ＡとＤＮＡレベルでそれぞれ５５．８％及び４５．２％の同一性を共有することが示される。したがって、ＣｃＣＨＩ様完全コード配列は、ＧｍＣＨＩ−１ＡよりもＧｍＣＨＩ−４Ａに類似している。ＣｃＣＨＩ様完全タンパク質は、ＧｍＣＨＩ−４Ａとタンパク質レベルで６４．３％の同一性を共有するが、そのそれぞれのＤＮＡ配列は、より低いレベルの同一性を共有する（５５．８％）ことが認められることも興味深い。それとは対照的に、ＣｃＣＨＩ様完全タンパク質は、ＧｍＣＨＩ−１Ａとタンパク質レベルで２９．１％の同一性を共有するが、そのそれぞれのＤＮＡ配列は、より高いレベルの同一性を有する（４５．２％）。
【０１８４】
実施例８
フラバノン３−ヒドロキシラーゼをコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン（ＣｃＦ３Ｈ）の単離及び特徴付け
フラバノン３−ヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、部分的に特徴付けられたフラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）をコードする２つのタンパク質配列（ＡｔＦ３Ｈ；シロイヌナズナ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃ＡＡＣ６８５８４、Ｗｉｓｓｍａｎ他，（１９９８）で作られたノックアウト突然変異体；及びＧｍＦ３Ｈ、ダイズ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃ＡＡＴ９４３６５）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。ダイズ由来のＧｍＦ３Ｈタンパク質配列を使用して、唯一のユニジーン（＃１２３８０８）が高レベルの同一性を示す（ｅ値＝ｅ−１４２）ことが見出された。シロイヌナズナ由来のＡｔＦ３Ｈタンパク質配列による第２の検索で、同じ最良のユニジーンヒット＃１２３８０８（ｅ値＝ｅ−１４５）が発見された。
【０１８５】
ユニジーン＃１２３８０８（ｐｃｃｃｐ５ｌ２０）の５’末端に相当するｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｐ５ｌ２０の挿入断片は１２８６ｂｐの長さであり、１０９２ｂｐの完全ＯＲＦ（配列番号１４）をコードすることが見出された。この配列をＣｃＦ３Ｈ（配列番号１４）と称した。この推定ＯＲＦは、４０．８８ｋＤａの推定分子量を有する３６３アミノ酸のタンパク質（配列番号３３）をコードする。ｐｃｃｃｐ５ｌ２０（配列番号１４）によってコードされる推定タンパク質配列（配列番号３３）と、上記のダイズ及びシロイヌナズナ由来のＦ３Ｈタンパク質配列とのアライメントを行った。このアライメントから、ｐｃｃｃｐ５ｌ２０のＣｃＦ３Ｈタンパク質配列は、こうしたタンパク質配列とそれぞれ８２．４％及び８１．８％の同一性を有することが実証され（図１３Ａ）、コーヒーフラバノン３−ヒドロキシラーゼとしてのｐｃｃｃｐ５ｌ２０（配列番号１４）のアノテーションが裏付けられる。
【０１８６】
ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア）を使用して、ｐｃｃｃｐ５ｌ２０に含まれる完全ＣｃＦ３ＨコードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）と、ダイズ由来のＧｍＦ３Ｈの完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（ＡＹ５９５４２０）とのアライメントを実施した。このアライメントから、ＣｃＦ３Ｈ完全コード配列は、公開されているＧｍＦ３Ｈの完全コードＤＮＡ配列と７０．１％の同一性を共有することが実証される。
【０１８７】
実施例９
フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼをコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン（ＣｃＦ３’５’Ｈ）の単離及び特徴付け
コーヒーフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’５’Ｈ）をコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたフラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼをコードする２つのタンパク質配列：ＣｒＦ３’５’Ｈ（ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ０９８５０（配列番号８３）、Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ他（１９９９）によって特徴付けられる酵素活性）；及びＧｔＦ３’５’Ｈ（ホソバエゾリンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｔｒｉｆｌｏｒａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９６５８１（配列番号８４）、Ｔａｎａｋａ他（１９９６）によって特徴付けられる酵素活性）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。ニチニチソウ由来のＣｒＦ３’５’Ｈタンパク質配列を使用して、唯一のユニジーン（＃１３０４８２）が有意な相同性（６０％超の同一性）を示すことが見出された。ホソバエゾリンドウ由来のＧｔＦ３’５’Ｈタンパク質配列による第２の検索で、同じユニジーンヒット＃１３０４８２（５８％超の同一性）が発見された。
【０１８８】
ユニジーン＃１３０４８２（ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ２３ｎ１８）（配列番号１５）に相当する単一のｃＤＮＡを２２週全チェリーライブラリーから単離し、その配列を完全に決定した。ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ２３ｎ１８（配列番号１５）について得られた配列は１３５０ｂｐの長さであり、部分ＯＲＦを含有する。この配列中に２つの独特の特徴を認めることができる。第一に、このｃＤＮＡの最初の７８ｂｐ（５’末端）は、イントロン配列を含有すると考えられる。これは、この配列が相同タンパク質と一致せず、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に相同体を有していないからである。第二に、主な（部分）ＯＲＦが、このＯＲＦにおける中断をもたらす終止コドンを含有する。この終止コドンは、このｃＤＮＡクローンの生成の際に誘発された突然変異（ＴＧＡ）によるものであると考えられる。提案されたこの解釈は、配列のこの領域を再度増幅することによって今後立証され、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる欠失した５’配列の回復と同時に行うこともできる。現在の配列では、このＴＧＡは配列中のＴＧＮによって置換される。
【０１８９】
ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ２３ｎ１８（配列番号１５）の部分ＯＲＦは５５２ｂｐの長さであり、１８３アミノ酸のポリペプチド配列（配列番号３４）をコードする。この配列をＣｃＦ３’５’Ｈ（配列番号１５）と称した。ＣｒＦ３’５’Ｈの完全ＯＲＦ（５１２ａａ）とのアライメントに基づいて、ＣｃＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｎ末端で３３１アミノ酸にわたり欠失していると想定された。ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ２３ｎ１８（ＣｃＦ３’５’Ｈ）（配列番号１５）における１８３アミノ酸のＯＲＦと、ニチニチソウ（ＣｒＦ３’５’Ｈ）（配列番号８３）及びホソバエゾリンドウ（ＧｔＦ３’５’Ｈ）（配列番号８４）由来のＦ３’５’Ｈタンパク質配列の同じ領域とのアライメントから（図１３Ｂ）、このコーヒーＯＲＦは、ＣｒＦ３’５’Ｈ及びＧｔＦ３’５’Ｈタンパク質配列とそれぞれ６７．８％及び６０．７％の同一性を共有するので、コーヒーのＦ３’５’Ｈに相当することが強く示唆される。これと比べて、ＣｒＦ３’５’Ｈ及びＧｔＦ３’５’Ｈの完全ＯＲＦは７４％同一である。この部分配列により、ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ２３ｎ１８（配列番号１５）のＤＮＡから特異的ＤＮＡプライマーを生成し、こうしたプライマーを５’ＲＡＣＥ及びプライマーアシストゲノムウォーキングの周知の技法において使用して、ＣｃＦ３’５’Ｈのコード配列の残りの部分のクローニングが可能となる。
【０１９０】
実施例１０
ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼをコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン（ＣｃＤＦＲ）の単離及び特徴付け
コーヒージヒドロフラボノール−４−レダクターゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（ＤＦＲ）をコードする２つのタンパク質配列：タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）由来のＭｔＤＦＲ１及びＭｔＤＦＲ２（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ２７０１４及びＡＡＲ２７０１５（配列番号）Ｘｉｅ他（２００４）によって特徴付けられた活性）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。タルウマゴヤシ由来のＭｔＤＦＲ１タンパク質配列を使用して、唯一のユニジーン（＃１２２８９７）が高レベルの同一性（ｅ値＝ｅ−１３３）を示すことが見出された。タルウマゴヤシ由来のＭｔＤＦＲ２タンパク質配列による第２の検索で、同じ最良のユニジーンヒット＃１２２８９７（ｅ値＝ｅ−１３７）が発見された。
【０１９１】
ユニジーン＃１２２８９７（ｐｃｃｃｐ５ｌ１５）に相当する最長のｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｐ５ｌ１５の挿入断片（配列番号１６）は１３９８ｂｐの長さであり、１１１０ｂｐのＯＲＦ配列をコードすることが見出された。この配列をＣｃＤＦＲ（配列番号１６）と称した。推定ポリペプチド（配列番号３５）は３６９アミノ酸長であり、４０．９１ｋＤａの推定分子量を有する。ｐｃｃｃｐ５ｌ１５（配列番号１６）によってコードされるタンパク質配列（配列番号３５）と、タルウマゴヤシ由来のタンパク質配列ＭｔＤＦＲ１及びＭｔＤＦＲ２（それぞれ＃ＡＡＲ２７０１４及び＃ＡＡＲ２７０１５、（配列番号８５、８６））とのアライメントから、ｐｃｃｃｐ５ｌ１５（ＣｃＤＦＲ）（配列番号１６）によってコードされるポリペプチド（配列番号３５）は、こうしたタンパク質配列とそれぞれ６５．２％及び６７．６％の同一性を共有することが実証される（図１４）。このアライメントデータから、ｐｃｃｃｐ５ｌ１５プラスミドは、Ｃ．カネフォラジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（ＣｃＤＦＲ）をコードする完全長ｃＤＮＡを含有することが示唆される。
【０１９２】
ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、ｐｃｃｃｐ５ｌ１５に含まれるＣｃＤＦＲの完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）をタルウマゴヤシ由来のＭｔＤＦＲ１の完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（ＡＹ３８９３４６）とアラインメントした。ＣｃＤＦＲとＭｔＤＦＲ１は５９．４％同一である。
【０１９３】
実施例１１
ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼをコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡ（ＣｃＬＤＯＸ）の単離及び特徴付け
コーヒーロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたシソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）由来のＬＤＯＸ（アントシアニジンシンターゼ（ＡＮＳ）としても知られる）をコードするタンパク質配列ＰｆＡＮＳが、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った（ＰｆＡＮＳ、シソ由来、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃Ｏ０４２７４（配列番号８８）、Ｓａｉｔｏ他（１９９９）によって特徴付けられた活性）。ＰｆＡＮＳタンパク質配列を使用して、２つのユニジーン；ユニジーン＃１３１５７７（ｅ値＝２ｅ−７３）及びユニジーン＃１２２１１６（ｅ値＝７ｅ−４６）が有意な相同性を示すことが見出された。
【０１９４】
コフィア・カネフォラＣｃＬＤＯＸ（完全ＯＲＦ）。ユニジーン＃１３１５７７（ｐｃｃｃｌ２１ｂ２１）に相当する単一のｃＤＮＡを葉ライブラリーから単離し、その配列を決定した。ｐｃｃｃｌ２１ｂ２１の挿入断片（配列番号１７）は、１４３０ｂｐの長さであり、１１２８ｂｐの完全ＯＲＦ配列をコードすることが見出された。この配列をＣｃＬＤＯＸ（配列番号１７）と呼んだ。この推定タンパク質配列は、４２．５２ｋＤａの推定分子量を有する３７５アミノ酸のタンパク質（配列番号３６）である。
【０１９５】
図１５Ａは、ｐｃｃｃｌ２１ｂ２１（ＣｃＬＤＯＸ）（配列番号１７）によってコードされるタンパク質配列（配列番号３６）と、シロイヌナズナ由来のＡｔＬＤＯＸ（＃ＣＡＤ９１９９４）（配列番号８７）、シソ由来のＰｆＡＮＳ（＃Ｏ０４２７４）（配列番号８８）、フォルシシア・インテルメディア（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ×  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）由来のＦｉＡＮＳ（＃ＣＡＡ７３０９４）（配列番号８９）及びアサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ）由来のＩｎＡＮＳ（ＢＡＢ７１８１０）（配列番号９０）のタンパク質配列との最適化されたアライメントを示す。このアライメントから、ＣｃＬＤＯＸタンパク質（配列番号３６）は、こうしたタンパク質配列（配列番号８７、８８、８９、９０）とそれぞれ６９．３％、７０．７％、７２．３％及び７３．１％の同一性を共有することが実証される。このアライメントデータから、ｐｃｃｃｌ２１ｂ２１プラスミドは、Ｃ．カネフォラロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ（ＣｃＬＤＯＸ）（配列番号３６）をコードする完全長ｃＤＮＡ（配列番号１７）を含有することが示唆される。
【０１９６】
ユニジーン＃１２２１１６（ｐｃｃｃｐ１４ｉ２４、果皮ライブラリー）に相当するシングルトンｃＤＮＡの配列を得ると、この配列は、ｐｃｃｃｌ２１ｂ２１の挿入配列がアセンブルして５８８ｂｐの重複領域を有する固有のコンティグを構築するはずであることが認められた。この重複領域中に単一ヌクレオチドの違いが２つだけ認められ、それは３’ＵＴＲ中に局在していた。こうした知見に基づいて、こうした２つのｃＤＮＡは、ＣｃＬＤＯＸの対立遺伝子配列に相当すると結論付けられた。ｐｃｃｃｐ１４ｉ２４の挿入断片は６５９ｂｐの長さであり、１０６アミノ酸をコードする３２１ｂｐの部分ＯＲＦを含有する。
【０１９７】
ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用して、ｐｃｃｃｌ２１ｂ２１に含まれる完全コードＤＮＡ配列ＣｃＬＤＯＸ（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）をシソ由来のＰｆＡＮＳの完全コードＤＮＡ配列（５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ）（ＡＢ００３７７９）とアラインメントした。このアライメントから、ＣｃＬＤＯＸと、十分に特徴付けられた公開されているシソ由来の配列との間で６５．５％の同一性があることが示される。
【０１９８】
実施例１２
ロイコアントシアニジンレダクターゼをコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン（ＣｃＬＡＲ）の単離及び特徴付け
コーヒーロイコアントシアニジンレダクターゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたロイコアントシアニジンレダクターゼ（ＬＡＲ）をコードするタンパク質配列：ＤｕＬＡＲ（デスモディウム・アンシナタム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ７９３４１；Ｔａｎｎｅｒ他（２００３）によって特徴付けられた活性）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。タンパク質配列ＤｕＬＡＲを使用して、１つのユニジーン＃１３２４２９が高レベルの相同性（ｅ値＝３ｅ−４５）を示すことが見出された。現在、ユニジーン＃１３２４２９（ｐｃｃｃｌ２１ｅ８）に相当するシングルトンｃＤＮＡの唯一の配列データは、Ｎｅｓｔｌｅ／ＣｏｒｎｅｌｌデータベースにおけるＥＳＴＤＮＡ配列である。ｐｃｃｃｌ２１ｅ８の挿入断片の利用可能な配列は６４８ｂｐの長さであり、ＯＲＦのＮ末端の領域をコードする。この部分ＯＲＦは５６１ｂｐの長さであり、１８７アミノ酸をコードする。この配列をＣｃＬＡＲと称した。
【０１９９】
図１５Ｂは、ｐｃｃｃｌ２１ｅ８（ＣｃＬＡＲ）（配列番号１８）によってコードされる利用可能なタンパク質配列（配列番号３７）と、完全タンパク質配列、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のＶｖＬＡＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＩ２６３０９）（配列番号９１）、ネビキミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｓ）由来のＬｕＬＡＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＵ４５３９２）（配列番号９２）、及びデスモディウム・アンシナタム由来のＤｕＬＡＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ８４Ｖ８３）（配列番号９３）とのアライメントを示す。このアライメントから、ｐｃｃｃｌ２１ｅ８（ＣｃＬＡＲ）（配列番号１８）の利用可能なタンパク質配列（配列番号３７）はタンパク質の５’領域を表し、前述のタンパク質配列とそれぞれ５９．９％、５５．６％及び５４％の同一性を共有することが実証される。このアライメントデータから、プラスミドｐｃｃｃｌ２１ｅ８（配列番号１８）はＣ．カネフォラロイコアントシアニジンレダクターゼ（ＣｃＬＡＲ）（配列番号３７）を表し、潜在的にこの遺伝子の完全ｃＤＮＡをコードすることが示唆される。
【０２００】
実施例１３
アントシアニンレダクターゼをコードするコフィア・カネフォラｃＤＮＡクローン（ＣｃＡＮＲ）の単離及び特徴付け
コーヒーアントシアニジンレダクターゼをコードするｃＤＮＡを見出すために、生化学的に特徴付けられたタルウマゴヤシ由来のアントシアニジンレダクターゼをコードするタンパク質配列：ＭｔＡＮＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＡＡＮ７７７３５、Ｘｉｅ他（２００３ｂ）によって特徴付けられた活性）が、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として役立った。ウマゴヤシ属のＡＮＲタンパク質はＢＡＮ遺伝子によってコードされる。
【０２０１】
タルウマゴヤシ由来のＭｔＡＮＲタンパク質配列を検索クエリーとして使用して、唯一のユニジーン（＃１２２８５１）が高レベルの相同性（ｅ値＝ｅ−１０８）を示すことが見出された。現在、ユニジーン＃１２２８５１（ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１４ｇ７）に相当する最長のｃＤＮＡの唯一の配列データは、Ｎｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌデータベースにおける全チェリーライブラリー由来のＥＳＴＤＮＡ配列である。Ｃｏｒｎｅｌｌデータベース由来のｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１４ｇ７の挿入断片の利用可能な配列データは１０４８ｂｐの長さであり、１０１４ｂｐの完全ＯＲＦ配列をコードすることが見出された。この推定タンパク質（配列番号３８）は、約３６．３３ｋＤａの推定分子量を有する３３７アミノ酸長である。この配列をＣｃＡＮＲ（配列番号３８）と称した。
【０２０２】
ＣｃＡＮＲタンパク質配列（配列番号３８）を、タンパク質配列、ＭｔＡＮＲ（タルウマゴヤシ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ７７７３５）（配列番号９４）、ＡｔＡＮＲ（シロイヌナズナ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ２３８５９（配列番号９５）、ＡｔＢＡＮ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９２９１２）によってコードされる、Ｘｉｅ他（２００３ｃ）によって特徴付けられた活性）；及びＣＳＬＡＲ（チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ６８７７３）（配列番号９６）とアラインメントした。このアライメントから、コーヒーＡＮＲタンパク質（ｐｃｃｃｌ２１ｅ８、ＣｃＡＮＲ）（配列番号３８）は、他のＡＮＲタンパク質配列とそれぞれ７１．５％、６３．２％及び７７．４％の同一性を共有することが示された（図１５ｃ）。このアライメントデータから、ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１４ｇ７（配列番号１９）プラスミドはＣ．カネフォラアントシアニジンレダクターゼ（ＣｃＡＮＲ）（配列番号３８）をコードすることが示唆される。
【０２０３】
ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア）を使用して、ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１４ｇ７に含まれる完全ＯＲＦ  ＤＮＡ配列を、十分に特徴付けられたアントシアニジンレダクターゼＭｔＡＮＲ及びＡｔＡＮＲをコードするタルウマゴヤシ由来のＭｔＢＡＮ（ＡＹ１８４２４３）及びシロイヌナズナ由来のＡｔＢＡＮ（ＡＦ０９２９１２）の完全ＯＲＦＤＮＡ配列とアラインメントした。このアライメントから、コーヒーｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１４ｇ７  ＯＲＦは、それぞれの公開されているＤＮＡ配列ＭｔＢＡＮ及びＡｔＢＡＮとＤＮＡレベルで７１．８％及び６３．４％の同一性を有することが示される。
【０２０４】
実施例１４
コフィア・アラビカの粒、果皮及び他の組織におけるＣＨＳ、ＣＨＩ、ＤＦＲ及びＦ３Ｈの発現のノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析
ＣＨＳ、ＣＨＩ、ＤＦＲ及びＦ３Ｈ遺伝子の発現のノーザンブロット分析を図１６に示す。提示したデータから、ＣＨＳ遺伝子は、後期の果皮（黄色及び赤色段階）で最も強く発現され、花及び葉で弱く発現され、根及び茎で極めて弱く発現されることが示唆される。
【０２０５】
ノーザンブロッティングによりＣＨＳ発現はどの段階の粒においても、又は根及び茎において検出されなかった。ＲＴ−ＰＣＲを使用することにより、茎及び根における発現を除きこの発現パターンを確認した（図１７）。ノーザンブロッティングにより、ＣＨＩは果皮発達の後期段階でのみ発現されることが認められた。ノーザンブロッティングにより、根、茎、葉、初期の果皮組織において、又はどの粒試料においてもＣＨＩ発現は検出されなかった。しかし、より感度の高いＲＴ−ＰＣＲ技法を使用すると、葉、茎及び根において低レベルのＣＨＩ転写物を検出することができた。ＲＴ−ＰＣＲによる結果から、粒発達の最後の３段階においてもＣＨＩが極めて弱く発現され得ることが示唆される。
【０２０６】
ＲＴ−ＰＣＲによりＣＨＩ様遺伝子の発現も分析した（図１７）。この実験から、ＣＨＩ様遺伝子は、根、茎、葉、後期の果皮（黄色及び赤色）において弱く、粒発達の最初の３段階（小緑色、大緑色及び黄色）においておそらく極めて弱く発現されることが示された。初期の果皮（小及び大緑色）又は赤色粒試料においては発現が認められなかった。
【０２０７】
ノーザンブロッティングにより、ＤＦＲ遺伝子についてＣＨＩと類似した発現パターンが認められ、すなわち、果皮発達／成熟の後期段階で高レベルのＤＦＲ転写物が検出され、他の組織では発現が検出されなかった。ノーザンブロット分析から、Ｆ３Ｈ遺伝子も後期の果皮発達／成熟段階で極めて強く発現することが示される。ＣＨＩ及びＤＦＲとは違って、花においてＦ３Ｈの極めて高レベルの発現が認められ、粒のすべての段階、果皮の初期の２段階（小緑色及び大緑色）、並びに根、茎及び葉においてもより低いが有意なレベルのＦ３Ｈの発現が検出された。
【０２０８】
実施例１５
初期フェニルプロパノイド及びフラボノイド遺伝子の発現
特定のユニジーンに関連するＥＳＴの数から、各ライブラリー（各組織）における関連遺伝子の発現レベルが推定される。したがって、上記で検討したフェニルプロパノイド及びフラボノイド遺伝子の様々なユニジーン内のＥＳＴの数を調査すると、こうした遺伝子の発現の概要を得ることができる。表１０に、本明細書で検討したすべてのユニジーン及びこうしたユニジーンの各ライブラリーにおけるＥＳＴの数を示す。
【０２０９】
【表１１】
2009511071.tif 000013
【０２１０】
ＰＡＬ１、ＰＡＬ２及びＰＡＬ３の発現。全体として、表１０のデータから、３種のＰＡＬ遺伝子のうちＣｃＰＡＬ１が最も強く発現することができ、小緑色チェリー全体（粒及び果皮）で最も高度に発現されることが示唆される。こうした３種の遺伝子発現についてより正確なデータを得るために、各遺伝子について特異的プライマー及びＴＡＱＭＡＮプローブセット（表６）を調製し、これを使用してアラビカ種及びロブスタ種のいくつかの様々なコーヒー組織における各ＰＡＬ遺伝子転写物レベルを測定した。（図１８）。こうした実験に使用した様々なｃＤＮＡは、上記実施例１に記載の通りアラビカ種（Ｔ２３０８）及びロブスタ種（ＢＰ４０９）コーヒーチェリーの根、茎、葉、花、並びに発達の４つ異なる段階に単離した粒及び果皮組織から単離したＲＮＡを用いて方法１によって調製した。各組織試料についてのＲＱ値は、この試料の転写物レベルをこの組織におけるｒｐｌ３９転写物レベルに対して正規化することによって求めた。
【０２１１】
ＰＡＬ１の発現は、試験した４つすべての段階の粒で極めて低く、このレベルは、ロブスタ種（０．０３）に比べてアラビカ種（０．２８）でＰＡＬ１のレベルがより高いようである成熟した赤色段階を除き、アラビカ種とロブスタ種で類似している（ＲＱ値０．０２〜０．０５）。果皮では、ＰＡＬ１はアラビカ種と比べてロブスタ種でより高度に発現されると考えられ、ロブスタ種の果皮における転写物レベルは大緑色段階でピークに達し（ロブスタ種のＲＱ０．５１）、その後わずかに低下するようである。アラビカ種及びロブスタ種のいずれの根（アラビカ種ＲＱ０．２０及びロブスタ種ＲＱ０．１１）及び茎（アラビカ種ＲＱ０．０９及びロブスタ種ＲＱ０．２３）においても比較的低レベルのＰＡＬ１転写物が認められた。興味深いことに、葉組織ではＰＡＬ１発現が極めて有意な差を示し、アラビカ種で認められたＲＱは０．７３であるが、ロブスタ種のＲＱは０．０４しかなかった。花においてもＰＡＬ１転写物レベルの大きな差が認められ、アラビカ種はロブスタ種のＲＱ（０．８９）よりもはるかに高いＲＱ（１６．３３）を示す。
【０２１２】
ＰＡＬ２についてのＴＡＱＭＡＮ発現データから、アラビカ種とロブスタ種の両方の試験したすべての段階の粒では、ここで示される実験で使用した小緑色アラビカ粒よりも初期の段階であることが知られている小緑色ロブスタ粒を除き、この遺伝子の転写物はほとんど検出できないことが示される。（Ｈｉｎｎｉｇｅｒ他、投稿中；同時係属の米国仮出願第６０／６９６，８９０号明細書）。それとは対照的に、ＰＡＬ２は、大緑色段階からのチェリー果皮で明らかに発現されており、ロブスタ種の大緑色及び赤色段階ではアラビカ種よりも高いレベルの発現を示す。ＰＡＬ２は、ロブスタ種の小緑色段階の果皮でも高度に発現されるが（ＲＱ４．０９）、発達が制限されたこの段階のアラビカ種組織の果皮では発現が検出されない。この発現の差は、ロブスタ種の小緑色粒試料のより初期の発達段階と一致している。
【０２１３】
小緑色段階のロブスタ種の果皮における高レベルのＰＡＬ２発現（ＲＱ４．０９）は、この遺伝子の発現がこの時期に、またその直後に起こる果皮組織の有意な増大にとって重要となり得ることを示唆する。ロブスタ種の根ではＰＡＬ２の発現は検出されず（アラビカ種の根では低発現）、ロブスタ種及びアラビカ種の茎組織では検出されなかった。アラビカ種の葉及び花組織では比較的高レベルでＰＡＬ２転写物が検出されたが、ロブスタ種のこうした組織では検出されなかった。
【０２１４】
ＰＡＬ３についてのＴＡＱＭＡＮデータから、この遺伝子は粒では比較的低レベルで発現されることが示される（ロブスタ種大緑色粒のＲＱ０．０９）（図１８）。ロブスタ種のより未熟な小緑色粒は、アラビカ種の小緑色粒と比べてより高いレベルの発現を示す（ＲＱ０．８１対ＲＱ０．０４）。アラビカ種の成熟粒は、ロブスタ種の成熟粒よりも高いレベルのＰＡＬ３発現を有する（ＲＱ０．７２対ＲＱ０．１６）。果皮では、小緑色及び大緑色段階におけるアラビカ種のＰＡＬ３発現は極めて低いが、最後の２つの段階でいくぶん増大する。それとは対照的に、ロブスタ種におけるＰＡＬ３の発現レベルは低いが、こうしたレベルは調査したすべての発達段階でより類似しているようである。茎では、ロブスタ種におけるＰＡＬ３発現は比較的高いが（ＲＱ０．２４）、アラビカ種では比較的極めて低かった（ＲＱ０．０３）。それとは対照的に、葉では、アラビカ種におけるＰＡＬ３のレベルはロブスタ種より高かった（ＲＱ２．５７対ＲＱ０．０３）。花試料では、アラビカ種はロブスタ種に対して多少より高いレベルのＰＡＬ３転写物が認められた。３種のＰＡＬ遺伝子のそれぞれがアラビカ種及びロブスタ種の葉及び花試料において様々なレベルで発現される事実から、こうした２つの組織では様々な発達段階で発現され、その発現は課された環境ストレスに依存して別々に制御され得ることが示唆される。
【０２１５】
Ｃ４Ｈの発現。Ｃ４ＨについてのＥＳＴの数から、この遺伝子は調査したすべての組織（葉、種子、果皮；表１０）で発現されることが示唆される。この知見は、この遺伝子についてのＴＡＱＭＡＮアッセイを使用して確認された（図１８）。ロブスタ種の粒では、小緑色段階におけるＣ４Ｈの転写物は低く（ＲＱ＝０．４０）、その後成熟した粒段階で次第に極めて低いレベルに低下するようである（ＲＱ＝０．０３）。アラビカ種の粒では、Ｃ４Ｈの転写物は一般に、特に成熟した赤色段階でロブスタ種の粒よりも多い。１つの例外は、アラビカ種／ロブスタ種のレベルが比較的類似しているようである黄色段階である。アラビカ種の果皮では、すべての段階で比較的類似したレベルのＣ４Ｈ転写物が認められる。それとは対照的に、ロブスタ種の果皮の異なる段階でＣ４Ｈ転写物レベルがより多様であり、小緑色及び大緑色段階では、アラビカ種の大緑色果皮よりも有意に高いレベルのＣ４Ｈ転写物を有する。アラビカ種の黄色及び成熟（赤色）果皮では、Ｃ４Ｈ転写物のレベルがロブスタ種試料で見られるものとはるかに類似している。アラビカ種とロブスタ種の根においても類似したレベルのＣ４Ｈ転写物が認められるが、茎ではロブスタ種においてアラビカ種と比べて有意により高いレベルのＣ４Ｈ転写物が存在する。葉及び花試料では、アラビカ種試料においてロブスタ種試料と比べてより高いレベルのＣ４Ｈ転写物が認められる。
【０２１６】
４ＣＬ１及び４ＣＬ２の発現。４ＣＬユニジーンについてのＥＳＴの数から、こうした２つの遺伝子は少なくとも一部のロブスタ種組織において比較的類似したレベルで発現されることが示唆される。こうした遺伝子の発現に関するより多く情報を求めて、各遺伝子に特異的なＴＡＱＭＡＮアッセイが開発された。図１８に、こうした２つの遺伝子について得られたＱＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【０２１７】
ロブスタ種では４ＣＬ１転写物が、多少より高いレベルの転写物が検出された大緑色段階（ＲＱ０．０８）及び黄色段階（ＲＱ０．０４）の果皮、並びに有意なレベルの４ＣＬ１発現が検出されなかった根及び葉を除き、ほぼすべての組織において比較的低レベルで検出された。ＴＡＱＭＡＮプローブの４ＣＬ１セットを使用して、アラビカ種の根（ＲＱ０．０１）だけで４ＣＬ１発現が低レベルで検出された。少なくとも１つのアラビカ種試料で発現を検出することができる事実から、この４ＣＬ１対立遺伝子はアラビカ種のゲノム中に存在するが、この遺伝子の発現は、ここで提示したロブスタ品種とアラビカ品種の間で極めて異なることが示唆される。
【０２１８】
４ＣＬ２について得られたＱＲＴ−ＰＣＲの結果から、この遺伝子はロブスタ種で多様な発現パターンを示し、小緑色粒（０．０１）、根（０．０１）、茎（０．０７）及び葉試料（０．０６）ではほぼ検出不可能なレベルであることが示される（図１８）。ロブスタ種における大緑色粒（０．５９）、赤色（成熟）粒（０．６５）、並びに大緑色（０．６５）、黄色（０．９５）及び赤色（０．８８）果皮では多少より高いレベルで認められる。それとは対照的に、黄色粒（０．１２）及び花（０．１９）では転写物レベルはより低い。ロブスタ種における小緑色果皮組織で、急激に上昇した４ＣＬ２発現が検出され（ＲＱ＝３．４９）、これは、こうしたチェリーが、この実験に使用した視覚的に比較可能なアラビカ種チェリーよりも初期の発達段階である事実と関連付けることができる（ロブスタ種の小緑色チェリーでは内乳特異的転写物を欠くことによって示唆される。同時係属の米国仮出願第６０／６９６，４４５号明細書を参照されたい）。一部のアラビカ種組織では、４ＣＬ２の発現はロブスタ種で認められるものと比較的類似している。例えば、４ＣＬ２発現は、アラビカ種の大緑色（０．１９）、黄色（０．２３）及び赤色（０．３８）粒試料、並びにアラボイカ種の黄色（０．２７）及び赤色（ＲＱ０．２７）果皮試料では同様に低いレベルで検出され、茎試料（ＲＱ＝０．１１４）では極めて低いレベルで検出される。しかし、ロブスタ種とは対照的に、アラビカ種の小緑色果皮（０．０２）（アラビカ種の大緑色果皮とほぼ等しい）では４ＣＬ２発現がわずかに検出され、アラビカ種試料の葉（ＲＱ１．８６）及び花（ＲＱ４．８４）ではロブスタ種試料と比べて４ＣＬ２の発現が有意により高い。
【０２１９】
実施例１６
大腸菌におけるＣａ４ＣＬ２及びＣｃ４ＣＬ２タンパク質の産生
Ｃａ４ＣＬ２及びＣｃ４ＣＬ２  ｃＤＮＡｓ（配列番号）を使用して機能的Ｃａ４ＣＬ２及びＣｃ４ＣＬ２タンパク質（配列番号）を産生できることを検証するために、こうしたｃＤＮＡのＯＲＦを大腸菌発現ベクター中にクローニングし、過剰発現させた。
【０２２０】
ｐＧＣ１及びｐＧＣ３によってコードされるタンパク質Ｃａ４ＣＬ２及びＣｃ４ＣＬ２（配列番号）を過剰発現させるために、ＰＣＲを使用してＯＲＦ配列を発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。このクローニング反応を促進するために、ＰＣＲ（表１１にプライマー及びＰＣＲ条件を示す）によって末端に制限部位を付加した。ＡＴＧコドンのすぐ５’側にＢｇｌＩＩ部位を作製し、終止コドンのすぐ下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加した。ＰＣＲ反応を以下の５０μｌの反応液中で実施した：２μＬのｐＧＣ１又はｐＧＣ３プラスミド（５０倍希釈）、５μＬ  １０×ＰＣＲバッファー（Ｌａ  ＰＣＲバッファーＩＩ  Ｍｇ＋＋含有）、３００ｎＭの各遺伝子特異的プライマー（表１１）、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、及び０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。９４℃で５分間の変性後、増幅は９４℃で１分間、５５℃で１分間（表１１）及び７２℃で２分３０秒間の伸長の２５サイクルからなっていた。追加の最終の段階として伸長を７２℃で７分間実施した。生成された特異的ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、製造元のプロトコールに従いＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅキットを使用して抽出し、ＤＮＡを最終容量１２μＬとした。次いで、５マイクロリットルの各精製ＰＣＲ産物を適切なバッファー中で５ユニットのＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて３７℃で一晩消化した。プラスミドｐＥＴ２８ａ＋も同一の条件下でＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した（ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで適合性部位が作製される）。その後、消化産物をアガロースゲルで精製し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅキットを使用して抽出した。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して１μＬの各消化産物を１μＬの消化プラスミドｐＥＴ２８ａ＋と１６℃で一晩ライゲートさせた。次いで、製造元プロトコールに従いＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬの各ライゲーション混合物で形質転換した。適切な挿入断片を有するものについてのコロニーのスクリーニングを、ＯＲＦをクローニングするのに使用した同じプライマーを使用してＰＣＲによって実施した。次いで、選択されたプラスミドを精製し、４ＣＬ２挿入断片の配列を決定した。Ｃａ４ＣＬ２配列含むｐＥＴ２８ａ＋プラスミドをｐＧＣ５と称し、Ｃｃ４ＣＬ２配列を含むｐＥＴ２８ａ＋プラスミドをｐＧＣ８と称した。最後に、製造元のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って発現コンピテント細胞Ｂｌ２１ＡＩをｐＧＣ５又はｐＧＣ８で形質転換してタンパク質を産生した。
【０２２１】
タンパク質発現のために、Ｃａ４ＣＬ２又はＣｃ４ＣＬ２のいずれかを含む各組換えＢ１１２ＡＩ細胞の前培養物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で一晩増殖させた。次いで、１ミリリットルの各前培養物を使用して２つの培養物（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有する５０ｍＬのＬＢ培地）を接種し、ＯＤ６００ｎｍが０．６に到達するまで細胞を増殖させた。次いで、１．５ｍＭのＩＰＴＧ及び０．２％のＬ−アラビノースを用いて発現の誘発を実施し、この培養物を３７℃でさらに４時間増殖させた。ＩＰＴＧによる誘発に供しない形質転換された各系統の対照培養物も樹立した。誘発処理後、細胞をペレット状にし、次いで４ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、３００ｍＭ  Ｎａｃｌ、１０％グリセリン、１％トリトンＸ１００、イミダゾール２０ｍＭ）に再懸濁させた。３サイクルの凍結／解凍（−１８０℃／４２℃）及び超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ８８１５５）１分間によって溶解を実施した。溶解した細胞を遠心分離し（３０分間１０，０００ｇ）、上清をＮｉ−Ｎｔａ培地（Ｎｉ−Ｎｔａ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ）に加え１時間置いた。次いで、この培地をクロマトグラフィーカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、次いで４ｍＬの洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．９、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセリン）で２回洗浄した。０．５ｍＬ溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．９、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセリン、２５０ｍＭイミダゾール）の５つの別々の画分中でＨｉｓタグ付きタンパク質を溶出した。対象のタンパク質バンドを含有する画分をプールした後、Ｓｌｉｄｅ  Ａ  ｌｙｓｅｒ３．５Ｋカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、プールされた画分を４Ｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５  ２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセリンに対して一晩透析した。組換えタンパク質の産生及びその精製を行った後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅ  ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分析した。
【０２２２】
図１９に結果を示す。図に示す通り、組換え過剰発現ベクターｐＧＣ５及びｐＧＣ８の両方で、対応する細菌培養物をＩＰＴＧによる誘発に供すると、期待されるサイズのタンパク質が産生された。組換えタンパク質のサイズをゲル（図１９Ａ）から、融合タンパク質Ｈｉｓタグ−Ｃａ４ＣＬ２及びＨｉｓタグ−Ｃｃ４ＣＬ２（約６２．７ｋＤａ）の推定のサイズと近似する値である６０から６５ｋＤａの間と測定した。
【０２２３】
【表１２】
2009511071.tif 000014
【０２２４】
参考文献：
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Ｆｒｙｄｍａｎ  Ａ，  Ｗｅｉｓｓｈａｕｓ  Ｏ，  Ｂａｒ−Ｐｅｌｅｄ  Ｍ，  Ｈｕｈｍａｎ  Ｄ，  Ｓｕｍｎｅｒ  Ｌ，  Ｍａｒｉｎ  Ｆ，  Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ  Ｅ，  Ｆｌｕｈｒ  Ｒ，  Ｇｒｅｓｓｅｌ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｅｙａｌ  Ｙ．  （２００４）  Ｃｉｔｒｕｓ  ｆｒｕｉｔ  ｂｉｔｔｅｒ  ｆｌａｖｏｒｓ：  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  Ｃｍ１，２ＲｈａＴ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  １，２  ｒｈａｍｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  ａ  ｋｅｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｔｔｅｒ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４０：８８−１００．
Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｕｒａ  ＭＦ，  Ｇａｌｉｓｔｅｏ  Ｍ，  Ｖｉｌｌａｒ  ＩＣ，  Ｂｅｒｍｅｊｏ  Ａ，  Ｚａｒｚｕｅｌｏ  Ａ，  Ｖａｒｇａｓ  Ｆ，  Ｄｕａｒｔｅ  Ｊ  （２００５）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｅｎｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０：  １４７−１５５．
Ｇｏ  Ｍ，  Ｗｕ  Ｘ，  Ｌｉｕ  Ｘ  （２００５）  Ｃｈａｌｃｏｎｅｓ：  ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １２：  ４８１−４９９．
Ｇｒａｓｓｉ  Ｄ，  Ｌｉｐｐｉ  Ｃ，  Ｎｅｃｏｚｉｏｎｅ  Ｓ，  Ｄｅｓｉｄｅｒｉ  Ｇ，  Ｆｅｒｒｉ  Ｃ  （２００５）  Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄａｒｋ  ｃｈｏｃｏｌａｔｅ  ｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｐｅｒｓｏｎｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ８１：  ６１１−６１４．
Ｇｕｐｔａ  Ｓ，  Ｈａｓｔａｋ  Ｋ，  Ａｈｍａｄ  Ｎ，  Ｌｅｗｉｎ  ＪＳ，  Ｍｕｋｈｔａｒ  Ｈ  （２００１）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ＴＲＡＭＰ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９８：１０３５０−１０３５５．
Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ  Ｂ，  Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ  Ｋ  （２００４）  Ｔｈｅ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ  ：  ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ｏｎｅ  ｒａｒｅ，  ｓｉｎａｐａｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｒｅｅ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ｏｆ  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：  ２２０９−２２１４．
Ｈｅｒｔｏｇ  ＭＧ，  Ｆｅｓｋｅｎｓ  ＥＪ，  Ｈｏｍｍｎａ  ＰＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｄｉｅｔａｒｙ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｔｈｅ  Ｚｕｔｐｈｅｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｓｔｕｄｙ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３４２：１００７−１０１１．
Ｈｅｒｔｏｇ  ＭＧ，  Ｆｅｓｋｅｎｓ  ＥＪ，  Ｈｏｍｍｎａ  ＰＣ，  Ｋａｔａｎ  ＭＢ，  Ｋｒｏｍｈｏｕｔ  Ｄ  （１９９４）  Ｄｉｅｔａｒｙ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｚｕｔｐｈｅｎ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｓｔｕｄｙ．  Ｎｕｔｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２２：１７５−１８４．
Ｈｕ  Ｗ，  Ｋａｗａｏｋａ  Ａ，  Ｔｓａｉ  Ｃ，  Ｌｕｎｇ  Ｊ，  Ｏｓａｋａｂｅ  Ｋ，  Ｅｂｉｎｕｍａ  Ｈ．，  Ｃｈｉａｎｇ  Ｖ  （１９９８）  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａｓｐｅｎ  （Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５：  ５４０７−５４１２．
Ｈｕａｎｇ  ＭＴ，  Ｌｙｓｚ  Ｔ，  Ｆｅｒｒａｒｏ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：８１３−８１９．
Ｉｓｈｉｍｉ  Ｙ，  Ｍｉｙａｕｒａ  Ｃ，  Ｏｈｍｕｒａ  Ｍ，  Ｏｎｏｅ  Ｙ，  Ｓａｔｏ  Ｔ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｙ，  Ｉｔｏ  Ｍ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｓｕｄａ  Ｔ，  Ｉｋｅｇａｍｉ  Ｓ  （１９９９）  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，  ａ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ，  ｏｎ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １４０：  １８９３−１９００．
Ｊａｎｇ  Ｍ，  Ｃａｉ  Ｌ，  Ｕｄｅａｎｉ  Ｇ，  Ｓｌｏｗｉｎｇ  Ｋ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ，  Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｃ，  Ｆｏｎｇ  Ｈ，  Ｆｅｒｎｓｗｏｒｔｈ  Ｎ，  Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  Ｄ，  Ｍｅｈｔａ  Ｒ，  Ｍｏｏｎ  Ｒ，  Ｐｅｚｚｕｔｏ  Ｊ  （１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｐｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：  ２１８−２２０．
Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＥＴ，  Ｒｙｕ  Ｓ，  Ｙｉ  ＨＫ，  Ｓｈｉｎ  Ｂ，  Ｃｈｅｏｎｇ  Ｈ，  Ｃｈｏｉ  Ｇ  （２００１）  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ  ４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２５：  ３２５−３３３．
Ｊｏｕｎｇ  ＪＹ，  Ｋａｓｔｈｕｒｉ  ＧＭ，  Ｐａｒｋ  ＪＹ，  Ｋａｎｇ  ＷＪ，  Ｋｉｍ  ＨＳ，  Ｙｏｏｎ  ＢＳ，  Ｊｏｕｎｇ  Ｈ，  Ｊｅｏｎ  ＪＨ  （２００３）  Ａｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｏｆ  Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．  ｌｏｂａｔａ  ａｌｔｅｒｓ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  ａｎｄ  ５’−ｄｅｏｘｙｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０３：３２６−３３１
Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ  Ｍ，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｇ，  Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ  Ｅ，  Ｌｕｔｚ  Ｖ，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｊ  （１９９９）  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ：  ｃＤＮＡ，  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １９：１８３−１９３
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ，  Ｎａｃｉｒｉ−Ｇｒａｖｅｎ  Ｙ，  Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ  ＷＪ，  Ｐｅｒｒｅｔ  Ｘ  （２００４）  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｓｈｉｆｔｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｄ−ｂｏｘ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＧＲ２３４．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５１：  ３３５−３４７．
Ｋｏｔｋａｒ  ＨＭ，  Ｍｅｎｄｋｉ  ＰＳ，  Ｓａｄａｎ  ＳＶ，  Ｊｈａ  ＳＲ，  Ｕｐａｓａｎｉ  ＳＭ，  Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ  ＶＬ．  （２００２）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｏｆ  Ａｎｎｏｎａ  ｓｑｕａｍｏｓａ．  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ．  Ｓｃｉ．  ５８：３３−７．
Ｌａｈｔｉｎｅｎ  Ｍ，  Ｓａｌｍｉｎｅｎ  ＪＰ，  Ｋａｐａｒｉ  Ｌ，  Ｌｅｍｐａ  Ｋ，  Ｏｓｓｉｐｏｖ  Ｖ，  Ｓｉｎｋｋｏｎｅｎ  Ｊ，  Ｖａｌｋａｍａ  Ｅ，  Ｈａｕｋｉｏｊａ  Ｅ，  Ｐｉｈｌａｊａ  Ｋ．  （２００４）  Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ａｇｌｙｃｏｎｅｓ  ｏｆ  Ｂｅｔｕｌａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ  ｌｅａｖｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆｉｒｓｔ  ｉｎｓｔａｒ  Ｅｐｉｒｒｉｔａ  ａｕｔｕｍｎａｔａ  ｌａｒｖａｅ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｃｏｌ．  ３０：２２５７−６８．
Ｌａｍａｒｔｉｎｉｅｒｅ  Ｃ，  Ｃｏｔｒｏｎｅｏ  Ｍ，  Ｆｒｉｔｚ  Ｗ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｍｅｎｔｏｒ−Ｍａｒｃｅｌ  Ｒ，  Ｅｌｇａｖｉｓｈ  Ａ  （２００２）  Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：  ｔｉｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １３２：  ５５２Ｓ−５５８Ｓ．
Ｌａｔｔａｎｚｉｏ  Ｖ，  Ａｒｐａｉａ  Ｓ，  Ｃａｒｄｉｎａｌｉ  Ａ，  Ｄｉ  Ｖｅｎｅｒｅ  Ｄ，  Ｌｉｎｓａｌａｔａ  Ｖ．    （２０００）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｖｉｇｎａ  ｔｏ  ａｐｈｉｄｓ．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ４８：５３１６−２０．
Ｌｅｅ  Ｄ，  Ｄｏｕｇｌａｓ  ＣＪ  （１９９６）  Ｔｗｏ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ａ  ｔｏｂａｃｃｏ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｌｉｇａｓｅ  （４ＣＬ）  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．  ｃＤＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｇｅｎｅ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２：１９３−２０５．
Ｌｅｓｓｃｈａｅｖｅ  Ｉ  ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ  Ａ．  （２００５）  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ：  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ．    Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ８１（１  Ｓｕｐｐｌ）：３００Ｓ−３３５Ｓ．
Ｌｉｎｄｅｒｍａｙｒ  Ｃ，  Ｍｏｌｌｅｒｓ  Ｂ，  Ｆｌｉｅｇｍａｎｎ  Ｊ，  Ｕｈｌｍａｎｎ  Ａ，  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  Ｆ，  Ｍｅｉｍｂｅｒｇ  Ｈ，  Ｅｂｅｌ  Ｊ  （２００２）  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ａ  ｓｏｙｂｅａｎ  （Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｌ．）  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ  ：  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｌｉｇａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  −  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９：  １３０４−１３１５．
Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ  Ｐ．，  Ｄｅｓｈａｙｅｓ  Ａ．，  Ｐｅｔｉａｒｄ  Ｖ．  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ  Ｗ．Ｊ．  （１９９９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  １１Ｓ  ｓｅｅｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３７：２７３−２８２．
Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ  Ｐ，  Ｃｏｕｒｊａｕｌｔ  Ｃ，  Ｃａｉｌｌｅｔ  Ｖ，  Ｌａｕｓａｎｎｅ  Ｆ，  ＬｅＰａｇｅ  Ｂ，  Ｒｏｇｅｒｓ  Ｗ，  Ｔｅｓｓｅｒｅａｕ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｄｅｓｈａｙｅｓ  Ａ．  （２００３）  Ｒｕｂｉｓｃｏ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ：  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ．    Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４１：１７−２５．
Ｍｏｎａｇａｓ  Ｍ，  Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ  Ｂ，  ａｎｄ  Ｇｏｍｅｚ−Ｃｏｒｄｏｖｅｓ  Ｃ，  （２００５）  Ｕｐｄａｔｅｄ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｗｉｎｅ．  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｎｕｔｒ．  ４５：８５−１１８．

Ｏｎｙｉｌａｇｈａ  ＪＣ，  Ｌａｚｏｒｋｏ  Ｊ，  Ｇｒｕｂｅｒ  ＭＹ，  Ｓｏｒｏｋａ  ＪＪ，  Ｅｒｌａｎｄｓｏｎ  ＭＡ．  （２００４）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｏｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｕｃｉｆｅｒ  ｐｅｓｔ  Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ  Ｗａｌｋｅｒ．    Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｃｏｌ．  ３０：１０９−２４．
Ｐｅｔｅｒｓ  ＤＪ，  Ｃｏｎｓｔａｂｅｌ  ＣＰ  （２００２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｒｂｉｖｏｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｔａｎｎｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｒｅｍｂｌｉｎｇ  ａｓｐｅｎ  （Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３２：  ７０１−７１２．
Ｒａｅｓ  Ｊ，  Ｒｏｈｄｅ  Ａ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＪＨ，  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｐｅｅｒ  Ｙ，  Ｂｏｅｒｊａｎ  Ｗ  （２００３）  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３３：  １０５１−１０７１
Ｒａｌｓｔｏｎ  Ｌ，  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｓ，  Ｍａｔｓｕｎｏ  Ｍ，  Ｙｕ  Ｏ  （２００５）  Ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ａｎｄ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３７：  １３７５−１３８８．
Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｃｏｒｏｎｅｌ  Ｍ，  Ｍａｒｎｅｔ  Ｎ，  Ｋｏｌｌｉ  Ｖ，  Ｒｏｕｓｓｏｓ  Ｓ，  Ｇｕｙｏｔ  Ｓ，  Ａｕｇｏｒ  Ｃ  （２００４）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ  ｉｎ  ｃｏｆｆｅｅ  ｐｕｌｐ  （Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）  ｂｙ  ｔｈｉｏｌｙｓｉｓ−ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ５２：  １３４４−１３４９．
Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ  Ｃ  （２００１）  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ８：７９７−８０７．
Ｒｏｇｅｒｓ  Ｊ．，  Ｍｉｃｈａｕｘ  Ｓ．，  Ｂａｓｔｉｎ  Ｍ．，  Ｂｕｃｈｅｌｉ  Ｐ．  （１９９９）  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｇａｒｓ，  ｓｕｇａｒ  ａｌｃｏｈｏｌｓ，  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ，  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｇｒａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｒｏｂｕｓｔａ  （Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ）  ａｎｄ  Ａｒａｂｉｃａ  （Ｃ．  ａｒａｂｉｃａ）  ｃｏｆｆｅｅｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １４９：  １１５−１２３．
Ｒｏｈｄｅ  Ａ，  Ｍｏｒｒｅｅｌ  Ｋ，  Ｒａｌｐｈ  Ｊ，  Ｇｏｅｍｉｎｎｅ  Ｇ，  Ｈｏｓｔｙｎ  Ｖ，  Ｄｅ  Ｒｙｃｋｅ  Ｒ，  Ｋｕｓｈｎｉｒ  Ｓ，  Ｖａｎ  Ｄｏｏｒｓｓｅｌａｅｒｅ  Ｊ，  Ｊｏｓｅｌｅａｕ  ＪＰ，  Ｖｕｙｌｓｔｅｋｅ  Ｍ，  Ｖａｎ  Ｄｒｉｅｓｓｃｈｅ  Ｇ，  Ｖａｎ  Ｂｅｅｕｍｅｎ  Ｊ，  Ｍｅｓｓｅｎｓ  Ｅ，  Ｂｏｅｒｊａｎ  Ｗ  （２００４）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｌ１  ａｎｄ  ｐａｌ２  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆａｒ−ｒｅａｃｈｉｎｇ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：  ２７４９−２７７１．
Ｓａｉｔｏ  Ｋ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｇｏｎｇ  Ｚ，  Ｔａｎａｋａ  Ｙ，  Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｍ  （１９９９）  Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｓ  ａ  ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ａ  ｒｅｄ  ｆｏｒｍａ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １７：１８１−１８９
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｋ，  Ｈｏｖｅｌ  Ｋ，  Ｗｉｔｚｅｌ  Ｋ，  Ｈａｍｂｅｒｇｅｒ  Ｂ，  Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ  Ｄ，  Ｋｏｍｂｒｉｎｋ  Ｅ，  Ｓｔｕｉｂｌｅ  ＨＰ  （２００３）  Ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ  ：  ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：  ８６０１−８６０６．
Ｓｅｔｃｈｅｌｌ  Ｋ，  Ｃａｓｓｉｄｙ  Ａ  （１９９９）  Ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ：  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １２９：  ７５８Ｓ−７６７Ｓ．
Ｓｈｉｍａｄａ  Ｎ，  Ａｏｋｉ  Ｔ，  Ｓａｔｏ  Ｓ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｔａｂａｔａ  Ｓ，  Ａｙａｂｅ  Ｓ  （２００３）  Ａ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｌｅｇｕｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ５−ｄｅｏｘｙ（ｉｓｏ）ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３１：  ９４１−９５１
Ｓｉｖａｋｕｍａｒａｎ  Ｓ，  Ｍｏｌａｎ  Ａ，  Ｍｅａｇｈｅｒ  Ｌ，  Ｋｏｌｂ  Ｂ，  Ｆｏｏ  Ｌ，  Ｌａｎｅ  Ｇ，  Ａｔｔｗｏｏｄ  Ｇ，  Ｆｒａｓｅｒ  Ｋ，  Ｔａｖｅｎｄａｌｅ  Ｍ  （２００４）  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｄ．  ｒｅｃｔｕｍ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｕｍｅｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ６５：  ２４８５−２４９７．
Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ｎ，  Ａｒａｋａｗａ  Ｔ，  Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｍ，  Ｆｕｒｏｎｏ  Ｋ  （１９９９）  Ａｎｔｉ−  ａｎｄ  ｐｒｏ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｏｎ  ｍｅｔａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｌｏａｄｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２７：  １３１３−１３２３．
Ｔａｎａｋａ  Ｙ，  Ｙｏｎｅｋｕｒａ  Ｋ，  Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｍ，  Ｆｕｋｕｉ  Ｙ，  Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｈ，  Ａｓｈｉｋａｒｉ  Ｔ，  Ｋｕｓｕｍｉ  Ｔ  （１９９６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｔｉａｎａ  ｔｒｉｆｌｏｒａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：７１１−７１６
Ｔａｎｎｅｒ  ＧＪ，  Ｆｒａｎｃｋｉ  ＫＴ，  Ａｂｒａｈａｍｓ  Ｓ，  Ｗａｔｓｏｎ  ＪＭ，  Ｌａｒｋｉｎ  ＰＪ，  Ａｓｈｔｏｎ  ＡＲ  （２００３）  Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｇｕｍｅ  ｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃＤＮＡ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：  ３１６４７−３１６５６
Ｗｅｌｌｍａｎｎ  Ｆ，  Ｍａｔｅｒｎ  Ｕ，  Ｌｕｋａｃｉｎ  Ｒ  （２００４）  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｔｕｎｉａ  ｆｌａｖａｎｏｎｅ  ３  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５６１：  １４９−１５４．
Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ  Ｂ  （２００２）  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ５：  ２１８−２２３．
Ｗｏｏｄ  ＪＧ，  Ｒｏｇｉｎａ  Ｂ，  Ｌａｖｕ  Ｓ，  Ｈｏｗｉｔｚ  Ｋ，  Ｈｅｌｆａｎｄ  ＳＬ，  Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｄ，  Ｔａｔａｒ  Ｍ  （２００４）  Ｓｉｒｔｕｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｄｅｌａｙ  ａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｔａｚｏａｎｓ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １３４：  ３５１８Ｓ−３５１９Ｓ．
Ｘｉｅ  ＤＹ，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬＡ，  Ｃｏｏｐｅｒ  ＪＤ，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｄ，  Ｐａｉｖａ  ＮＬ  （２００４）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３４：  ９７９−９９４．
Ｘｉｅ  ＤＹ，  Ｓｈａｒｍａ  ＳＢ，  Ｐａｉｖａ  ＮＬ，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｄ，  Ｄｉｘｏｎ  ＲＡ  （２００３）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＢＡＮＹＵＬＳ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：  ３９６−３９９．
Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｍ，  Ｎａｔｓｕｍｅ  Ｍ，  Ｏｓａｋａｂｅ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｃａｏ  ｌｉｑｕｏｒ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｏｎ  ＰｈＩＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｆｅｍａｌｅ  ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  １８５：１２３−１３０．
Ｙａｍａｎｅ  Ｔ，  Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｈ，  Ｋｉｋｕｏｋａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｆｏｒ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７７（８  Ｓｕｐｐｌ）：１６６２−１６６７．
Ｙａｎ  ＬＪ，  Ｄｒｏｙ−Ｌｅｆａｉｘ  ＭＴ，  Ｐａｃｋｅｒ  Ｌ  （１９９５）  Ｇｉｎｋｏ  ｂｉｌｏｂａ  ｅｘｔｒａｃｔ  （ＥＧｂ  ７６１）  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｐｐｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２１２：３６０−３６６．
Ｙａｎｇ  ＣＳ，  Ｙａｎｇ  ＧＹ，  Ｌａｎｄａｕ  ＪＭ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  Ｌｉａｏ  Ｊ．  （１９９８）  Ｔｅａ  ａｎｄ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｅｌｌ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｅｘｐ．  Ｌｕｎｇ  Ｒｅｓ．  ２：６２９−６３９
Ｙｅｎ  Ｗ−Ｊ，  Ｗａｎｇ  Ｂ−Ｓ，  Ｃｈａｎｇ  Ｌ−Ｗ，  Ｄｕｈ  Ｐ−Ｄ  （２００５）  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｏａｓｔｅｄ  ｃｏｆｆｅｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ５３：  ２６５８−２６６３．
Ｙｉｌｍａｚ  Ｙ，  Ｔｏｌｅｄｏ  ＲＴ  （２００４）  Ｈｅａｌｔｈ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒａｐｅ  ｓｅｅｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：  ４２２−４３３．
Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｆｕｒｒｋａｗａ  Ｍ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：  Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ  ５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １１６：６１２−６１８．
Ｙｕ  Ｏ，  Ｊｕｎｇ  Ｗ，  Ｓｈｉ  Ｊ，  Ｃｒｏｅｓ  Ｒ，  Ｆａｄｅｒ  Ｇ，  ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ  Ｂ，  Ｏｄｅｌｌ  Ｊ  （２０００）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｄｉａｄｚｅｉｎ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｌｅｇｕｍｅ  ｄｉｃｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｏｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２４：  ７８１−７９４
【０２２５】
配列表
【表１３】
2009511071.tif 000015
【０２２６】
【表１４】
2009511071.tif 000016
【０２２７】
【表１５】
2009511071.tif 000017
【０２２８】
【表１６】
2009511071.tif 000018
【０２２９】
【表１７】
2009511071.tif 000019
【０２３０】
【表１８】
2009511071.tif 000020
【０２３１】
【表１９】
2009511071.tif 000021
【０２３２】
【表２０】
2009511071.tif 000022
【０２３３】
【表２１】
2009511071.tif 000023
【０２３４】
【表２２】
2009511071.tif 000024
【０２３５】
【表２３】
2009511071.tif 000025
【０２３６】
【表２４】
2009511071.tif 000026
【０２３７】
【表２５】
2009511071.tif 000027
【０２３８】
【表２６】
2009511071.tif 000028
【０２３９】
【表２７】
2009511071.tif 000029
【０２４０】
【表２８】
2009511071.tif 000030
【０２４１】
【表２９】
2009511071.tif 000031
【０２４２】
【表３０】
2009511071.tif 000032
【０２４３】
【表３１】
2009511071.tif 000033
【０２４４】
【表３２】
2009511071.tif 000034
【０２４５】
【表３３】
2009511071.tif 000035
【０２４６】
【表３４】
2009511071.tif 000036
【０２４７】
【表３５】
2009511071.tif 000037
【０２４８】
【表３６】
2009511071.tif 000038
【０２４９】
【表３７】
2009511071.tif 000039
【０２５０】
【表３８】
2009511071.tif 000040
【０２５１】
【表３９】
2009511071.tif 000041
【０２５２】
【表４０】
2009511071.tif 000042
【０２５３】
本発明は、これまで記載及び例示した実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲内で変更及び改変することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１ａ】初期フェニルプロパノイド及びフラボノイド経路の概略図である。Ａ）一般的なフェニルプロパノイド代謝。この経路の初期の部分は、記載の３種の酵素の活性に依存する。ＰＡＬ、フェニルアラニンリアーゼ；Ｃ４Ｈ、ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ；及び４ＣＬ、４−クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ。Ｂ）植物フラボノイド経路（Ｘｉｅ他（２００４）から引用、ＣＨＳ、カルコンシンターゼ；ＣＨＩ、カルコンイソメラーゼ；Ｆ３Ｈ、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’Ｈ、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’，５’Ｈ、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ；ＤＦＲ、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ；ＡＮＳ、アントシアニジンシンターゼ（ＬＤＯＸ、ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼとしても知られる）；ＧＴ、アントシアニジングルコシルトランスフェラーゼ；ＬＡＲ、ロイコアントシアニジンレダクターゼ。ＡＮＲ、アントシアニジンレダクターゼ（ＢＡＮ、すなわちＢＡＮＹＵＬＳタンパク質とも呼ばれる）；ＣＨＲ、カルコンレダクターゼ（ＣＨＳ／ＣＨＲは一緒に作用してデオキシカルコンとも呼ばれる４，２’，４’−トリヒドロキシカルコンを生成すると考えられている、Ｂｏｍａｔｉ他、２００５）。テトラヒドロキシカルコン（４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン）及びトリヒドロキシカルコン（４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン）は、それぞれカルコン及びデオキシカルコンとしても知られる。ナリンゲニン構造のＡ〜Ｃは、３種のフラボノイド環に割り当てられた標準的な呼称を示す。アントシアニジンの３−Ｏ−グルコシル化でＧＴによりアントシアニンが形成された後、追加のグリコシル化、メチル化及びアシル化によりアントシアニンがさらに修飾されることもある。
【図１ｂ】初期フェニルプロパノイド及びフラボノイド経路の概略図である。Ａ）一般的なフェニルプロパノイド代謝。この経路の初期の部分は、記載の３種の酵素の活性に依存する。ＰＡＬ、フェニルアラニンリアーゼ；Ｃ４Ｈ、ケイ皮酸−４−ヒドロキシラーゼ；及び４ＣＬ、４−クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ。Ｂ）植物フラボノイド経路（Ｘｉｅ他（２００４）から引用、ＣＨＳ、カルコンシンターゼ；ＣＨＩ、カルコンイソメラーゼ；Ｆ３Ｈ、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’Ｈ、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’，５’Ｈ、フラボノイド３’，５’−ヒドロキシラーゼ；ＤＦＲ、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ；ＡＮＳ、アントシアニジンシンターゼ（ＬＤＯＸ、ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼとしても知られる）；ＧＴ、アントシアニジングルコシルトランスフェラーゼ；ＬＡＲ、ロイコアントシアニジンレダクターゼ。ＡＮＲ、アントシアニジンレダクターゼ（ＢＡＮ、すなわちＢＡＮＹＵＬＳタンパク質とも呼ばれる）；ＣＨＲ、カルコンレダクターゼ（ＣＨＳ／ＣＨＲは一緒に作用してデオキシカルコンとも呼ばれる４，２’，４’−トリヒドロキシカルコンを生成すると考えられている、Ｂｏｍａｔｉ他、２００５）。テトラヒドロキシカルコン（４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン）及びトリヒドロキシカルコン（４，２’，４’−トリヒドロキシカルコン）は、それぞれカルコン及びデオキシカルコンとしても知られる。ナリンゲニン構造のＡ〜Ｃは、３種のフラボノイド環に割り当てられた標準的な呼称を示す。アントシアニジンの３−Ｏ−グルコシル化でＧＴによりアントシアニンが形成された後、追加のグリコシル化、メチル化及びアシル化によりアントシアニンがさらに修飾されることもある。
【図２ａ】コフィア・アラビカ由来のＣａＰＡＬ１の完全ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）完全タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はそれぞれ黒色棒線及び黒色細線として示される。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及び終止（ＴＧＡ）コドンを示す。Ｂ）ｐＭＬ８の挿入配列（配列番号１）をｃＤＮＡ配列ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３（配列番号３９）及びＲａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ１（配列番号４０）とアラインメントした。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラム（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して行い、手動で最適化した。灰色で示した核酸はｐＭＬ８（ＣａＰＡＬ１）挿入配列（配列番号１）と一致する。
【図２ｂ】コフィア・アラビカ由来のＣａＰＡＬ１の完全ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）完全タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はそれぞれ黒色棒線及び黒色細線として示される。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及び終止（ＴＧＡ）コドンを示す。Ｂ）ｐＭＬ８の挿入配列（配列番号１）をｃＤＮＡ配列ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１８ｎ３（配列番号３９）及びＲａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ１（配列番号４０）とアラインメントした。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラム（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して行い、手動で最適化した。灰色で示した核酸はｐＭＬ８（ＣａＰＡＬ１）挿入配列（配列番号１）と一致する。
【図３ａ】コフィア・カネフォラ由来のＣｃＰＡＬ２の部分ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）Ｃ．カネフォラＣｃＰＡＬ２（配列番号３）のコンセンサス配列のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏでの作製。部分タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、３’非翻訳領域は黒色細線として示され、灰色棒線はイントロンと考えられるゲノム配列を表す。Ｂ）ｐｃｃｃｐ１９ｋ７の挿入配列（配列番号４１）及びクローンｃｃｃｌ２５ｃ１３の部分挿入配列（配列番号４２）をｃＤＮＡ配列Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ２（配列番号４３）及びゲノム配列ＧＷ１＿ＣｃＰＡＬ２（配列番号４４）とアラインメントしてＣｃＰＡＬ２（配列番号３）のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏの部分配列を作製した。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。
【図３ｂ】コフィア・カネフォラ由来のＣｃＰＡＬ２の部分ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）Ｃ．カネフォラＣｃＰＡＬ２（配列番号３）のコンセンサス配列のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏでの作製。部分タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、３’非翻訳領域は黒色細線として示され、灰色棒線はイントロンと考えられるゲノム配列を表す。Ｂ）ｐｃｃｃｐ１９ｋ７の挿入配列（配列番号４１）及びクローンｃｃｃｌ２５ｃ１３の部分挿入配列（配列番号４２）をｃＤＮＡ配列Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ２（配列番号４３）及びゲノム配列ＧＷ１＿ＣｃＰＡＬ２（配列番号４４）とアラインメントしてＣｃＰＡＬ２（配列番号３）のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏの部分配列を作製した。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。
【図４ａ】コフィア・アラビカ由来のＣａＰＡＬ３（配列番号２）の完全ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）完全タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はそれぞれ黒色棒線及び黒色細線として示される。Ｂ）ｐＭＬ１４の挿入配列（配列番号２）をｃＤＮＡ配列ｐｃｃｃｐ１６ｌ１（配列番号４５）、Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ３（配列番号４６）及びコフィア・カネフォラＰＡＬ１  ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４６０２０３）（配列番号４７）とアラインメントした。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。灰色で示した核酸はｐＭＬ１４（ＣａＰＡＬ３）挿入配列（配列番号２）と一致する。
【図４ｂ】コフィア・アラビカ由来のＣａＰＡＬ３（配列番号２）の完全ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）完全タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はそれぞれ黒色棒線及び黒色細線として示される。Ｂ）ｐＭＬ１４の挿入配列（配列番号２）をｃＤＮＡ配列ｐｃｃｃｐ１６ｌ１（配列番号４５）、Ｒａｃｅ１＿ＣｃＰＡＬ３（配列番号４６）及びコフィア・カネフォラＰＡＬ１  ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４６０２０３）（配列番号４７）とアラインメントした。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。灰色で示した核酸はｐＭＬ１４（ＣａＰＡＬ３）挿入配列（配列番号２）と一致する。
【図５ａ】新たなＰＡＬ配列と公開データベース中のＰＡＬ配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）タンパク質配列ＣａＰＡＬ１（ｐＭＬ８）、ＣｃＰＡＬ２（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏアセンブリ、部分）及びＣａＰＡＬ３（ｐＭＬ１４）（配列番号：２０、２１）と他のコーヒーノキ属ＰＡＬ配列とのアライメント。ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用してアライメントを実施した。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＣｃＰＡＬ１  ＡＡＮ３２８６６（コフィア・カネフォラ、ＡＡＮ３２８６６、完全タンパク質）（配列番号４８）、ＣｃＰＡＬ２  ＡＡＮ３２８６７  ＣｃＰＡＬ２（コフィア・カネフォラ、ＡＡＮ３２８６７、完全タンパク質）（配列番号４９）。Ｂ）ＣａＰＡＬ１（ｐＭＬ８）（配列番号２０）、ＣｃＰＡＬ２（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏアセンブリ、部分）（配列番号２２）及びＣａＰＡＬ３（ｐＭＬ１４）（配列番号２１）と他のＰＡＬタンパク質配列とのタンパク質配列アライメント。ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗを用いてアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＺｍＰＡＬ１（トウモロコシ、ＡＡＬ４０１３７）（配列番号５０）、ＡｔＰＡＬ１（シロイヌナズナ、ＡＡＰ５９４３８、Ｃｏｃｈｒａｎｅ他、２００４）（配列番号５１）、ＡｔＰＡＬ２（シロイヌナズナ、ＡＡＰ５９４３９、Ｃｏｃｈｒａｎｅ他、２００４）（配列番号５２）、ＡｔＰＡＬ４（シロイヌナズナ、ＡＡＰ５９４４０、Ｃｏｃｈｒａｎｅ他、２００４）（配列番号５３）、ＰｃＰＡＬ１（パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ＣＡＡ６８９３８）（配列番号５４）、ＰｃＰＡＬ２（パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ＣＡＡ５７０５６）（配列番号５５）及びＰｃＰＡＬ３（パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ＣＡＡ５７０５７）（配列番号５６）。
【図５ｂ】新たなＰＡＬ配列と公開データベース中のＰＡＬ配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）タンパク質配列ＣａＰＡＬ１（ｐＭＬ８）、ＣｃＰＡＬ２（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏアセンブリ、部分）及びＣａＰＡＬ３（ｐＭＬ１４）（配列番号：２０、２１）と他のコーヒーノキ属ＰＡＬ配列とのアライメント。ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアＣｌｕｓｔａｌＷ法を使用してアライメントを実施した。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＣｃＰＡＬ１  ＡＡＮ３２８６６（コフィア・カネフォラ、ＡＡＮ３２８６６、完全タンパク質）（配列番号４８）、ＣｃＰＡＬ２  ＡＡＮ３２８６７  ＣｃＰＡＬ２（コフィア・カネフォラ、ＡＡＮ３２８６７、完全タンパク質）（配列番号４９）。Ｂ）ＣａＰＡＬ１（ｐＭＬ８）（配列番号２０）、ＣｃＰＡＬ２（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏアセンブリ、部分）（配列番号２２）及びＣａＰＡＬ３（ｐＭＬ１４）（配列番号２１）と他のＰＡＬタンパク質配列とのタンパク質配列アライメント。ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗを用いてアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＺｍＰＡＬ１（トウモロコシ、ＡＡＬ４０１３７）（配列番号５０）、ＡｔＰＡＬ１（シロイヌナズナ、ＡＡＰ５９４３８、Ｃｏｃｈｒａｎｅ他、２００４）（配列番号５１）、ＡｔＰＡＬ２（シロイヌナズナ、ＡＡＰ５９４３９、Ｃｏｃｈｒａｎｅ他、２００４）（配列番号５２）、ＡｔＰＡＬ４（シロイヌナズナ、ＡＡＰ５９４４０、Ｃｏｃｈｒａｎｅ他、２００４）（配列番号５３）、ＰｃＰＡＬ１（パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ＣＡＡ６８９３８）（配列番号５４）、ＰｃＰＡＬ２（パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ＣＡＡ５７０５６）（配列番号５５）及びＰｃＰＡＬ３（パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、ＣＡＡ５７０５７）（配列番号５６）。
【図６】ＣｃＣ４Ｈと植物Ｃ４Ｈタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用して、ＣｃＣ４Ｈ（配列番号４）によってコードされるタンパク質配列（配列番号２３）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＣ４Ｈタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＡｔＣ４Ｈ（シロイヌナズナ、ＢＡＡ２４３５５）（配列番号５７）、ＭｓＣ４Ｈ（アルファルファ、Ｐ３７１１４）（配列番号１５８）、ＰｂＣ４Ｈ（バルサムポプラ、ＡＡＧ５０２３１）（配列番号５８）。
【図７ａ】コフィア・カネフォラ由来のＣｃ４ＣＬ１の部分ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）Ｃ．カネフォラ由来のＣｃ４ＣＬ１のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏでアセンブルした部分配列の作製。部分タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、３’非翻訳領域は黒色細線として示される。Ｂ）ｐｃｃｃｐ２７ｄ２１の挿入配列（配列番号５９）をｃＤＮＡ配列Ｒａｃｅ１＿Ｃｃ４ＣＬ１（配列番号６０）とアラインメントしてＣｃ４ＣＬ１（配列番号６）のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ部分配列を作製した。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。
【図７ｂ】コフィア・カネフォラ由来のＣｃ４ＣＬ１の部分ＯＲＦの特徴付けを示す図である。Ａ）Ｃ．カネフォラ由来のＣｃ４ＣＬ１のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏでアセンブルした部分配列の作製。部分タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、３’非翻訳領域は黒色細線として示される。Ｂ）ｐｃｃｃｐ２７ｄ２１の挿入配列（配列番号５９）をｃＤＮＡ配列Ｒａｃｅ１＿Ｃｃ４ＣＬ１（配列番号６０）とアラインメントしてＣｃ４ＣＬ１（配列番号６）のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ部分配列を作製した。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。
【図８ａ】コフィア・アラビカ由来のＣａ４ＣＬ２（配列番号５）及びコフィア・カネフォラ由来のＣｃ４ＣＬ２（配列番号７）の完全ＯＲＦの単離及び特徴付けを示す図である。Ａ）Ｃ．アラビカ及びＣ．カネフォラの両方に由来する４ＣＬ２（配列番号５、７）の完全ＯＲＦ配列を含む２つのｃＤＮＡの単離。完全タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、３’非翻訳領域は黒色細線として示され、灰色棒線はＣｃ４ＣＬ２及びＣａ４ＣＬ２のＯＲＦの５’側（翻訳開始コドンＡＴＧの上流）ゲノム配列を表す。プロモーターと５’ＵＴＲの境界はまだ定められていない。Ｂ）ｐｃｃｃｌ２４ｉ２１のｃＤＮＡ配列並びにゲノム配列ＧＷ１＿Ｃａ４ＣＬ２（配列番号６１）及びＧＷ１＿Ｃｃ４ＣＬ２（配列番号６２）をｐＧＣ１（Ｃａ４ＣＬ２）（配列番号５）及びｐＧＣ３（Ｃｃ４ＣＬ２）（配列番号７）の挿入断片とアラインメントした。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。
【図８ｂ】コフィア・アラビカ由来のＣａ４ＣＬ２（配列番号５）及びコフィア・カネフォラ由来のＣｃ４ＣＬ２（配列番号７）の完全ＯＲＦの単離及び特徴付けを示す図である。Ａ）Ｃ．アラビカ及びＣ．カネフォラの両方に由来する４ＣＬ２（配列番号５、７）の完全ＯＲＦ配列を含む２つのｃＤＮＡの単離。完全タンパク質コード領域は網掛け棒線として示され、３’非翻訳領域は黒色細線として示され、灰色棒線はＣｃ４ＣＬ２及びＣａ４ＣＬ２のＯＲＦの５’側（翻訳開始コドンＡＴＧの上流）ゲノム配列を表す。プロモーターと５’ＵＴＲの境界はまだ定められていない。Ｂ）ｐｃｃｃｌ２４ｉ２１のｃＤＮＡ配列並びにゲノム配列ＧＷ１＿Ｃａ４ＣＬ２（配列番号６１）及びＧＷ１＿Ｃｃ４ＣＬ２（配列番号６２）をｐＧＣ１（Ｃａ４ＣＬ２）（配列番号５）及びｐＧＣ３（Ｃｃ４ＣＬ２）（配列番号７）の挿入断片とアラインメントした。アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用して行い、手動で最適化した。
【図９】コーヒーＣｃ４ＣＬ１（部分）、Ｃｃ４ＣＬ２（ｐＧＣ３）及びＣａ４ＣＬ２（ｐＧＣ１）タンパク質配列と他の植物４ＣＬ配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用して、コーヒー４ＣＬタンパク質配列（Ｃｃ４ＣＬ１、Ｃｃ４ＣＬ２（ｐＧＣ３中）；及びＣａ４ＣＬ２（ｐＧＣ１中）（配列番号２５、２６、２４）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他の４ＣＬタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す：Ａｔ４ＣＬ１（シロイヌナズナ、Ｑ４２５２４）（配列番号６３）、Ａｔ４ＣＬ２（シロイヌナズナ、ＮＰ＿１８８７６１．１）（配列番号６４）、Ａｔ４ＣＬ３（シロイヌナズナ、Ｑ９Ｓ７７７）（配列番号６５）、Ａｔ４ＣＬ４（シロイヌナズナ、ＡＡＭ１９９４９）（配列番号６６）、Ｎｔ４ＣＬ１  （タバコ、Ｏ２４１４５）（配列番号６７）、Ｎｔ４ＣＬ２（タバコ、Ｔ０３７８９）（配列番号６８）。囲み領域はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ他，（２００３）によるアライメントにおいて提案され示されている。青色の囲みは２つの保存ペプチドモチーフを示す。緑色の囲みは、４ＣＬ基質特異性として機能すると提案されている１２アミノ酸残基を示す。
【図１０】ＣｃＣＨＳと植物カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）及びスチルベンシンターゼタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＣＨＳ（配列番号８）によってコードされるタンパク質（配列番号２７）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＣＨＳタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）配列：ＨａＣＨＳ（ヒペリカム・アンドロサエマム、ＡＡＧ３０２９５）（配列番号６９）及びＬｅＣＨＳ（トマト、ＣＡＡ３８９８１）（配列番号７０）。スチルベンシンターゼ（ＳＳ又はＳＴＳ）：ＶＳＳ（ブドウ属、ＡＡＢ１９８８７）（配列番号７１）及びＰｓＳＴＳ（ストローブマツ、ＣＡＡ８７０１３）（配列番号７２）。
【図１１】ＣｃＣＨＲ１、ＣｃＣＨＲ２Ａ及びＣｃＣＨＲ２Ｂと他の植物ＣＨＲタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおいて、ＣｃＣＨＲ１、ＣｃＣＨＲ２Ａ及びＣｃＣＨＲ２Ｂ（配列番号９、１０、１１）によってコードされる推定タンパク質（配列番号２８、２９、３０）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＣＨＲタンパク質との手動で最適化されたアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＳｒＣＨＲ（セスバニア・ロストラータ、ＣＡＡ１１２２６）（配列番号７３）、ＰｌＣＨＲ（タイワンクズロバタ変種、ＡＡＭ１２５２９）（配列番号７４）及びＭｓＣＨＲ（アルファルファ、ＡＡＢ４１５５５）（配列番号７５）。
【図１２ａ】ＣｃＣＨＩと植物ＣＨＩタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＣＨＩ（配列番号１２）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３１）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＣＨＩタンパク質との手動で最適化されたアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＰｈＣＨＩ（ツクバネアサガオ、ＰＩＲ  ＩＤ  ＩＳＰＪＡ１）（配列番号７６）、ＬｊＣＨＩ−２（ミヤコグサ、ＢＡＣ５３９８４  Ｉ型ＣＨＩ）（配列番号７７）及びＧｍＣＨＩ−２（ダイズ、ＡＡＴ９４３６０、Ｉ型ＣＨＩ）（配列番号７８）。Ｂ）ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＣＨＩ様（配列番号１３）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３２）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＣＨＩタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＧｍＣＨＩ−４Ａ（ダイズ、ＡＡＴ９４３６２）（配列番号７９）及びＧｍＣＨＩ−１Ａ（ダイズ、ＡＡＴ９４３５８、ＩＩ型ＣＨＩ）（配列番号８０）。
【図１２ｂ】ＣｃＣＨＩと植物ＣＨＩタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＣＨＩ（配列番号１２）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３１）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＣＨＩタンパク質との手動で最適化されたアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＰｈＣＨＩ（ツクバネアサガオ、ＰＩＲ  ＩＤ  ＩＳＰＪＡ１）（配列番号７６）、ＬｊＣＨＩ−２（ミヤコグサ、ＢＡＣ５３９８４  Ｉ型ＣＨＩ）（配列番号７７）及びＧｍＣＨＩ−２（ダイズ、ＡＡＴ９４３６０、Ｉ型ＣＨＩ）（配列番号７８）。Ｂ）ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアにおけるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＣＨＩ様（配列番号１３）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３２）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＣＨＩタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＧｍＣＨＩ−４Ａ（ダイズ、ＡＡＴ９４３６２）（配列番号７９）及びＧｍＣＨＩ−１Ａ（ダイズ、ＡＡＴ９４３５８、ＩＩ型ＣＨＩ）（配列番号８０）。
【図１３ａ】ＣｃＦ３Ｈと植物Ｆ３Ｈタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して、ＣｃＦ３Ｈ（配列番号１４）によってコードされるタンパク質（配列番号３３）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＦ３Ｈタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＡｔＦ３Ｈ（シロイヌナズナ、ＡＡＣ６８５８４）（配列番号８１）、ＧｍＦ３Ｈ（ダイズ、ＡＡＴ９４３６５）（配列番号８２）。Ｂ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＦ３’５’Ｈ（配列番号１５）によってコードされる推定部分タンパク質（配列番号３４）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な同じ領域にわたる生化学的に特徴付けられたＦ３’５’Ｈタンパク質とアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＣｒＦ３’５’Ｈ（ニチニチソウ、ＣＡＡ０９８５０）（配列番号８３）及びＧｔＦ３’５’Ｈ（ホソバエゾリンドウ、Ｑ９６５８１）（配列番号８４）。
【図１３ｂ】ＣｃＦ３Ｈと植物Ｆ３Ｈタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して、ＣｃＦ３Ｈ（配列番号１４）によってコードされるタンパク質（配列番号３３）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＦ３Ｈタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＡｔＦ３Ｈ（シロイヌナズナ、ＡＡＣ６８５８４）（配列番号８１）、ＧｍＦ３Ｈ（ダイズ、ＡＡＴ９４３６５）（配列番号８２）。Ｂ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＦ３’５’Ｈ（配列番号１５）によってコードされる推定部分タンパク質（配列番号３４）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な同じ領域にわたる生化学的に特徴付けられたＦ３’５’Ｈタンパク質とアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＣｒＦ３’５’Ｈ（ニチニチソウ、ＣＡＡ０９８５０）（配列番号８３）及びＧｔＦ３’５’Ｈ（ホソバエゾリンドウ、Ｑ９６５８１）（配列番号８４）。
【図１４】ＣｃＤＦＲと植物ＤＦＲタンパク質配列とのタンパク質配列アライメントを示す図である。ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  パッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して、ＣｃＤＦＲ（配列番号１６）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３５）と、ＮＣＢＩデータベースで利用可能なタルウマゴヤシ由来の生化学的に特徴付けられたＤＦＲタンパク質、ＭｔＤＲＦ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ２７０１４）（配列番号８５）及びＭｔＤＦＲ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ２７０１５）（配列番号８６）との手動で最適化されたアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。
【図１５ａ】タンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＬＤＯＸ（配列番号１７）によってコードされるタンパク質（配列番号３６）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＬＤＯＸ（ＡＮＳ）タンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＡｔＬＤＯＸ（シロイヌナズナ、ＣＡＤ９１９９４）（配列番号８７）、ＰｆＡＮＳ（シソ、Ｏ０４２７４）（配列番号８８）、ＦｉＡＮＳ（フォルシシア・インテルメディア、ＣＡＡ７３０９４）（配列番号８９）、ＩｎＡＮＳ（アサガオ、ＢＡＢ７１８１０）（配列番号９０）。Ｂ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＬＡＲ（配列番号１８）によってコードされるタンパク質（配列番号３７）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＬＡＲタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＶｖＬＡＲ（ブドウ、ＣＡＩ２６３０９）（配列番号９１）、ＬｕＬＡＲ（ミヤコグサ、ＡＡＵ４５３９２）（配列番号９２）、ＤｕＬＡＲ（デスモディウム・アンシナタム、Ｑ８４Ｖ８３）（配列番号９３）。ｃ）ＣｃＡＮＲ（配列番号３８）と植物アントシアニジン及びロイコアントシアニジンレダクターゼタンパク質配列とのタンパク質配列アライメント。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＡＮＲ（配列番号１９）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３８）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のアントシアニジン及びロイコアントシアニジンレダクターゼタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＭｔＡＮＲ（タルウマゴヤシ、ＡＡＮ７７７３５）（配列番号９４）、ＡｔＡＮＲ（シロイヌナズナ、ＡＡＦ２３８５９  Ｘｉｅ他（２００３））（配列番号９５）及びＣｓＬＡＲ（チャノキ、ＡＡＴ６８７７３）（配列番号９６）。ＣｓＬＡＲは、現在ＬＡＲタンパク質としてアノテートされている事実にもかかわらず、この明らかに特徴付けられていないタンパク質のアライメントから、ＡＮＲ様活性を有し、ＬＡＲタンパク質ではないことが強く示唆される。
【図１５ｂ】タンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＬＤＯＸ（配列番号１７）によってコードされるタンパク質（配列番号３６）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＬＤＯＸ（ＡＮＳ）タンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＡｔＬＤＯＸ（シロイヌナズナ、ＣＡＤ９１９９４）（配列番号８７）、ＰｆＡＮＳ（シソ、Ｏ０４２７４）（配列番号８８）、ＦｉＡＮＳ（フォルシシア・インテルメディア、ＣＡＡ７３０９４）（配列番号８９）、ＩｎＡＮＳ（アサガオ、ＢＡＢ７１８１０）（配列番号９０）。Ｂ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＬＡＲ（配列番号１８）によってコードされるタンパク質（配列番号３７）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＬＡＲタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＶｖＬＡＲ（ブドウ、ＣＡＩ２６３０９）（配列番号９１）、ＬｕＬＡＲ（ミヤコグサ、ＡＡＵ４５３９２）（配列番号９２）、ＤｕＬＡＲ（デスモディウム・アンシナタム、Ｑ８４Ｖ８３）（配列番号９３）。ｃ）ＣｃＡＮＲ（配列番号３８）と植物アントシアニジン及びロイコアントシアニジンレダクターゼタンパク質配列とのタンパク質配列アライメント。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＡＮＲ（配列番号１９）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３８）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のアントシアニジン及びロイコアントシアニジンレダクターゼタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＭｔＡＮＲ（タルウマゴヤシ、ＡＡＮ７７７３５）（配列番号９４）、ＡｔＡＮＲ（シロイヌナズナ、ＡＡＦ２３８５９  Ｘｉｅ他（２００３））（配列番号９５）及びＣｓＬＡＲ（チャノキ、ＡＡＴ６８７７３）（配列番号９６）。ＣｓＬＡＲは、現在ＬＡＲタンパク質としてアノテートされている事実にもかかわらず、この明らかに特徴付けられていないタンパク質のアライメントから、ＡＮＲ様活性を有し、ＬＡＲタンパク質ではないことが強く示唆される。
【図１５ｃ】タンパク質配列アライメントを示す図である。Ａ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＬＤＯＸ（配列番号１７）によってコードされるタンパク質（配列番号３６）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＬＤＯＸ（ＡＮＳ）タンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＡｔＬＤＯＸ（シロイヌナズナ、ＣＡＤ９１９９４）（配列番号８７）、ＰｆＡＮＳ（シソ、Ｏ０４２７４）（配列番号８８）、ＦｉＡＮＳ（フォルシシア・インテルメディア、ＣＡＡ７３０９４）（配列番号８９）、ＩｎＡＮＳ（アサガオ、ＢＡＢ７１８１０）（配列番号９０）。Ｂ）ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＬＡＲ（配列番号１８）によってコードされるタンパク質（配列番号３７）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のＬＡＲタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＶｖＬＡＲ（ブドウ、ＣＡＩ２６３０９）（配列番号９１）、ＬｕＬＡＲ（ミヤコグサ、ＡＡＵ４５３９２）（配列番号９２）、ＤｕＬＡＲ（デスモディウム・アンシナタム、Ｑ８４Ｖ８３）（配列番号９３）。ｃ）ＣｃＡＮＲ（配列番号３８）と植物アントシアニジン及びロイコアントシアニジンレダクターゼタンパク質配列とのタンパク質配列アライメント。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、ＣｃＡＮＲ（配列番号１９）によってコードされる推定タンパク質（配列番号３８）とＮＣＢＩデータベースで利用可能な他のアントシアニジン及びロイコアントシアニジンレダクターゼタンパク質とのアライメントを行った。灰色で示したアミノ酸は全体としてこの位置の配列の大部分で保存されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を括弧内に示す。ＭｔＡＮＲ（タルウマゴヤシ、ＡＡＮ７７７３５）（配列番号９４）、ＡｔＡＮＲ（シロイヌナズナ、ＡＡＦ２３８５９  Ｘｉｅ他（２００３））（配列番号９５）及びＣｓＬＡＲ（チャノキ、ＡＡＴ６８７７３）（配列番号９６）。ＣｓＬＡＲは、現在ＬＡＲタンパク質としてアノテートされている事実にもかかわらず、この明らかに特徴付けられていないタンパク質のアライメントから、ＡＮＲ様活性を有し、ＬＡＲタンパク質ではないことが強く示唆される。
【図１６】コフィア・アラビカＴ２３０８におけるコーヒー豆成熟の際の植物体全体のＣＨＳ、ＣＨＩ、ＤＦＲ及びＦ３Ｈ発現のＲＮＡブロット分析を示す図である。根（Ｒ）、茎（Ｓｔ）、葉（Ｌ）、花（Ｆ）及び４つの様々な成熟段階、小緑色（ＳＧ）、大緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫したコーヒー豆由来の約５μｇのＲＮＡを変性用アガロースゲルで分離した。各成熟段階について、コーヒーチェリーを果皮（Ｐ）及び粒（Ｇ）に分けた。左に示されるＣｃＣＨＳ（ｃｃｃｐ８ｊ１０クローン）（配列番号８又は９７）又はＣｃＣＨＩ（ｃｃｃｐ２２ｋ１８クローン）（配列番号１２）又はＣｃＤＦＲ（ｃｃｃｐ５ｌ１５クローン）（配列番号１６）又はＣｃＦ３Ｈ（ｃｃｃｐ５ｌ２０クローン）（配列番号１４）プローブのいずれかでメンブレンをプローブした。ｒＲＮＡ  ２５Ｓのエチジウムブロマイド染色を示すゲルの１つの写真から、各レーンに等しい量のＲＮＡが添加されたことが実証される。すべてのブロットについて類似の結果が得られた（データは示さず）。
【図１７】蓄積コフィア・アラビカＴ２３０８におけるコーヒー豆成熟の際の根、茎及び葉のフラボノイド代謝に関与するＣＨＳ、ＣＨＩ及びＣＨＩ様遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲによる比較を示す図である。根（Ｒ）、茎（Ｓｔ）、葉（Ｌ）並びに４つの成熟段階：小緑色（ＳＧ）、大緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）の種子（Ｓ）及び果皮（Ｐ）から単離した１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。ＣｃＣＨＳ、ＣｃＣＨＩ、ＣｃＣＨＩ様及びＧＯＳ２の遺伝子特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
【図１８】Ｃ．カネフォラ（ロブスタ種、ＢＰ４０９）及びＣ．アラビカ（アラビカ種、Ｔ２３０８）におけるＰＡＬ１、ＰＡＬ２、ＰＡＬ３、Ｃ４Ｈ、４ＣＬ１及び４ＣＬ２（配列番号１〜７）の定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した組織特異的発現プロファイルを示す図である。根、茎、花、葉及び４つの様々な成熟段階：小緑色（ＳＧ）、大緑色（ＬＧ）、黄色（Ｙ）及び赤色（Ｒ）で収穫したチェリーの粒（ｇ）及び果皮（ｐ）から全ＲＮＡを単離した。各組織試料についてのＲＱ値は、この試料の転写物レベルをこの組織におけるｒｐｌ３９転写物レベルに対して正規化することによって求めた。示されたデータは、３回の増幅反応によって得られた平均値を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１９】クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ１２％において実施したＣａ４ＣＬ２（ｐＧＣ５）（配列番号２４）及びＣｃ４ＣＬ２（ｐＧＣ８）（配列番号２６）の発現（Ａ）及び精製（Ｂ及びＣ）の分析を示す図である。Ａ−レーン：１．ｐＧＣ５による非誘発Ｂｌ２１組換え細胞の粗抽出物、２．ｐＧＣ５による誘発Ｂｌ２１組換え細胞の粗抽出物、３．ｐＧＣ８による非誘発Ｂｌ２１組換え細胞の粗抽出物、４．ｐＧＣ８による誘発Ｂｌ２１組換え細胞の粗抽出物。Ｂ−レーン：１．カラム精製の第１の洗浄、２〜５．Ｃａ４ＣＬ２についての逐次溶出の画分。Ｃ−レーン：１．カラム精製の第１の洗浄、２〜５．Ｃｃ４ＣＬ２についての逐次溶出の画分。ＭＷ：分子量マーカー（Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏｒａｄ＃１６１−０３６２））。
【図１ａ】
2009511071.tif 000043
【図１ｂ】
2009511071.tif 000044
【図２ａ】
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【図２ｂ−１】
2009511071.tif 000046
【図２ｂ−２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ−１】
2009511071.tif 000049
【図３ｂ−２】
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【図３ｂ−３】
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【図３ｂ−４】
2009511071.tif 000052
【図４ａ】
2009511071.tif 000053
【図４ｂ−１】
2009511071.tif 000054
【図４ｂ−２】
2009511071.tif 000055
【図４ｂ−３】
2009511071.tif 000056
【図５ａ】
2009511071.tif 000057
【図５ｂ−１】
2009511071.tif 000058
【図５ｂ−２】
2009511071.tif 000059
【図６】
2009511071.tif 000060
【図７ａ】
2009511071.tif 000061
【図７ｂ】
2009511071.tif 000062
【図８ａ】
2009511071.tif 000063
【図８ｂ−１】
2009511071.tif 000064
【図８ｂ−２】
2009511071.tif 000065
【図８ｂ−３】
2009511071.tif 000066
【図８ｂ−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
2009511071.tif 000069
【図１０】
2009511071.tif 000070
【図１１】
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【図１２ａ】
2009511071.tif 000072
【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
2009511071.tif 000076
【図１５ａ】
2009511071.tif 000077
【図１５ｂ】
2009511071.tif 000078
【図１５ｃ】
2009511071.tif 000079
【図１６】
2009511071.tif 000080
【図１７】
2009511071.tif 000081
【図１８】
2009511071.tif 000082
【図１９】
2009511071.tif 000083
【配列表】
2009511071000001.app
【国際調査報告】
2009511071.tif 000084
2009511071.tif 000085
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