(57)【要約】  本明細書は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素；かかる改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子；およびかかる改変クロストリジウム毒素を製造する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）クロストリジウム毒素中毒過程の酵素標的改変工程を実行することができるクロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｂ）クロストリジウム毒素中毒過程の転位置工程を実行することができるクロストリジウム毒素転位置ドメイン；
ｃ）クロストリジウム毒素中毒過程の転位置工程を促進することができる転位置促進ドメイン；
ｄ）非クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することができ、そして、クロストリジウム毒素中毒過程の細胞結合工程を実行することができる、変化されたターゲティングドメイン；および
ｅ）プロテアーゼ切断部位
を含む改変クロストリジウム毒素。
【請求項２】
改変クロストリジウム毒素が、アミノからカルボキシルへ以下の順番：
１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位促進ドメインおよび変化されたターゲティングドメイン、
２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化されたターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン、
３）変化されたターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメイン、
４）変化されたターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン、
５）クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化されたターゲティングドメイン、または
６）クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化されたターゲティングドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメイン
の、直線上の単一ポリペプチドを含む、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項３】
転位置促進ドメインが、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインである、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項４】
転位置促進ドメインが、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインである、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項５】
変化されたターゲティングドメインが、オピオイド、メラノコルチン、ガラニン、タキキニン、コレシストキニン、ニューロペプチドＹ関連、キニンペプチド、ＰＡＲペプチド、コルチコトロピン放出ホルモン、チロトロピン放出ホルモンおよびソマトスタチンからなる群から選択される、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項６】
オピオイドが、エンケファリン、ＢＡＭ２２ペプチド、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチンまたはヘモルフィンである、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項７】
メラノコルチンが、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、β−メラノサイト刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）、γ−メラノサイト刺激ホルモン（γ−ＭＳＨ）、アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、コルチコトロピン様媒介ペプチド（corticotropin-like intermediary peptide）（ＣＬＩＰ）、β−リポトロピン（β−ＬＰＨ）またはγ−リポトロピン（γ−ＬＰＨ）である、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項８】
ガラニンが、ガラニンまたはガラニンメッセージ関連ペプチド（galanin message-associated peptide）（ＧＭＡＰ）からなる群から選択される、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項９】
ガラニンが、クロモガラニンＡペプチド、クロモガラニンＢペプチドまたはクロモガラニンＣペプチドである、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１０】
タキキニンペプチドが、サブスタンスＰ、ニューロペプチドＫ（ＮＰＫ）、ニューロペプチドガンマ、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、ヘモキニンおよびエンドキニンである、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１１】
コレシストキニンペプチドが、コレシストキニン５８、コレシストキニン３９、コレシストキニン３３、コレシストキニン１２またはコレシストキニン８である、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１２】
ニューロペプチドＹ関連ペプチドが、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、膵臓ペプチド（ＰＰ）または膵臓イコサペプチド（ＰＩＰ）である、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１３】
キニンペプチドが、ブラジキニン、カリジン、desArg9ブラジキニンまたはdesArg10ブラジキニンである、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１４】
ＰＡＲペプチドが、ＰＡＲ１ペプチド、ＰＡＲ２ペプチド、ＰＡＲ３ペプチドまたはＰＡＲ４ペプチドである、請求項５に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１５】
プロテアーゼ切断部位が、内因性のクロストリジウム毒素２鎖ループプロテアーゼ切断部位または外因性切断部位である、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１６】
請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド分子が発現ベクターを含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】
細胞内で改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子であって、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を発現させる工程を含む、改変クロストリジウム毒素の製造方法。
【請求項１９】
以下の工程：
ａ）改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子であって、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を細胞内に導入すること；および、
ｂ）該ポリヌクレオチド分子によりコードされる改変クロストリジウム毒素を発現させること、を含む、改変クロストリジウム毒素を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本非仮出願は、35 U.S.C.§119(e)に従って2006年7月11日出願の米国仮出願第60/807,059号からの優先権を主張し、これはその内容全体を引用により本明細書に含める。
【０００２】
本出願において引用するすべての特許および刊行物はその内容全体を引用により本明細書に含める。
【背景技術】
【０００３】
クロストリジウム毒素、例えば、ボツリヌス神経毒(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/G、ならびに破傷風(Tetanus)神経毒 (TeNT)が神経伝達を阻害する能力は、多種多様な治療および美容用途に用いられており、例えば、William J. Lipham、COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack、Inc.、2004)を参照されたい。医薬組成物として市販されているクロストリジウム毒素としては、BoNT/A 調製物、例えば、BOTOX（登録商標）(Allergan、Inc.、Irvine、CA)、Dysport（登録商標）/Reloxin（登録商標）、(Beaufour Ipsen、Porton Down、England)、Linurase（登録商標） (Prollenium、Inc.、Ontario、Canada)、Neuronox（登録商標） (Medy-Toc.、Ochang-myeon、South Korea) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products、China)およびXeomin（登録商標） (Merz Pharmaceuticals、GmbH.、Frankfurt、Germany);ならびにBoNT/B 調製物、例えば、MyoBloc（商標）/NeuroBloc（商標） (Elan Pharmaceuticals、San Francisco、CA)が挙げられる。一例として、BOTOX（登録商標） は以下の適応症のために１以上の国で現在認可されている: アカラシア、成人性痙縮、裂肛、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、痙性斜頚、本態性振戦、眉間のしわまたは運動過多の顔のしわ、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の運動亢進、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス性障害、鼻から唇へのしわ、攣縮性発声障害、斜視および VII 神経障害。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
クロストリジウム毒素処置は、シナプス間隙へ該神経伝達物質を分泌するために使用される開口分泌過程を中断することによって、神経伝達物質の放出を阻害する。医薬業界では、知覚性疾患、例えば様々な種類の慢性痛、ならびに非神経性不全、例えば膵炎などを処置するために、現行の筋弛緩薬の用途を超えるクロストリジウム毒素治療の使用を広めるための強い要望がある。クロストリジウム毒素治療を広めるのに行われている１つのアプローチは、改変された毒素が非クロストリジウム毒素標的細胞に対して変化した細胞ターゲティング能力を有するようにクロストリジウム毒素を改変することに関する。該再標的化能力は、クロストリジウム毒素の天然のターゲティングドメインを、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対して選択的な結合活性を示すターゲティングドメインで置換することにより、達成される。ターゲティングドメインに対するかかる改変は、非クロストリジウム毒素標的細胞（再標的化）に存在する非クロストリジウム毒素受容体（標的受容体）に選択的に結合できる改変毒素をもたらす。非クロストリジウム毒素標的細胞に対して、変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素は、標的受容体に結合し、細胞質に移行して、非クロストリジウム毒素標的細胞のＳＮＡＲＥ複合体に対するタンパク質分解効果を発揮出来る。
【０００５】
非クロストリジウム毒素標的細胞に対して変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素の非限定的な例は、例えば、Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 米国特許第 5,989,545 号(Nov. 23, 1999); Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, 米国特許第 6,461,617 号(Oct. 8, 2002); Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 米国特許第6,632,440号(Oct. 14, 2003); Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, 米国特許第 6,843,998 号(Jan. 18, 2005); Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 米国特許公報第2002/0037833号(Mar. 28, 2002); Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, 米国特許公報第2003/0180289号(Sep. 25, 2003); J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, WO 2001/014570 (Mar. 1, 2001); Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 国際特許出願第WO 2005/023309号(Mar. 17, 2005); および Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 米国特許出願番号第11/376,696号(Mar. 15, 2006)に記載されている。クロストリジウム毒素受容体と関連した治療的効果を再標的化する能力は、クロストリジウム毒素治療方法を使用し得る治療的用途の数を大きく広げる。非限定的な例として、感覚ニューロンを再標的化した改変クロストリジウム毒素は、様々な種類の慢性痛、例えば痛覚過敏および異痛、神経因性疼痛および炎症性痛覚等を処置する際に有用である。例えば、Foster, 上掲, (1999); および Donovan, 上掲, (2002); および Stephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components, 米国特許第 7,022,329号 (Apr. 4, 2006) を参照されたい。別の非限定的な例示として、膵臓細胞に再標的化した改変クロストリジウム毒素は、膵炎を処置する際に有用である。例えば、Steward, 上掲, (2005)を参照されたい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、現行のクロストリジウム毒素治療方法により提供される利点を発揮することが出来る治療的用途の数を大きく広げる新規なクロストリジウム毒素を提供する。これら改変クロストリジウム毒素は、部分的には、改変毒素からの軽鎖が標的細胞の細胞質に転位置し、その標的SNARE基質を酵素的に改変するプロセスを増強する転位置促進ドメインを含む。したがって、本明細書に開示する転位置促進ドメインを含む、非クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素、例えば、Foster, 上掲, (1999), Dolly, 上掲, (2001), Donovan, 上掲, (2002), Shone, 上掲, (2002), Foster, 上掲, (2003), Quinn, 上掲, (2003), Foster, 上掲, (2005), Steward, 上掲, (2005) および Steward, 上掲, (2006)に開示のものは、非クロストリジウム毒素標的細胞での増強した能力を示す。これらおよび関連する利点は、様々な臨床、治療および美容用途、例えば、神経筋障害、神経障害、眼障害、疼痛、筋肉損傷、頭痛、心血管疾患、精神神経障害、内分泌障害、癌、耳障害および運動過多による顔のしわ、ならびに、非クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化したテーゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素の個体への投与が有益な効果を与えうるその他の障害の治療にとって有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図1は、中枢および末梢神経細胞における神経伝達物質放出およびクロストリジウム毒素中毒の現在のパラダイムの模式図を示す。図1Aは、中枢および末梢神経細胞の神経伝達物質放出機構の模式図を示す。放出プロセスは２工程を含むものとして記載できる: 1)小胞ドッキング、神経伝達物質分子を含む小胞の小胞に結合したSNARE タンパク質が、細胞膜に位置する膜に結合した SNARE タンパク質と結合する;および、2) 神経伝達物質放出、ここで、小胞が細胞膜と融合し、神経伝達物質分子がエキソサイトーシスされる。図1Bは、中枢および末梢神経細胞における破傷風およびボツリヌス毒素活性についての中毒機構の模式図を示す。この中毒プロセスは、４工程を含むものとして記載できる: 1) 受容体結合、ここで、クロストリジウム毒素がクロストリジウム受容体に結合し、中毒プロセスを開始する; 2) 複合体インターナリゼーション、ここで毒素結合の後毒素受容体複合体を含む小胞が細胞内にエンドサイトーシスされる; 3) 軽鎖転位置、ここで複数の事象の結果、活性軽鎖の細胞質への放出が起こる; および 4) 酵素による標的改変、ここで、クロストリジウム毒素の活性軽鎖が、その標的SNARE基質、例えば、SNAP-25、VAMPまたはシンタキシンをタンパク分解により切断し、それにより小胞ドッキングおよび神経伝達物質放出が阻止される。
【０００８】
【図２】図2は、天然クロストリジウム毒素のドメイン編成を示す。一本鎖形態は、酵素ドメイン、転位置ドメイン、HCN 転位置促進ドメインおよびHCC ターゲティングドメインを含むアミノからカルボキシルへの直鎖状編成を示す。転位置および酵素ドメインの間に位置する二本鎖ループ領域を二重SSブラケットによって示す。この領域は、天然プロテアーゼ、例えば、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼまたは環境中にて生じた天然プロテアーゼによるタンパク分解切断時に、一本鎖形態の毒素を二本鎖形態に変換する内因性二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。上記のように、一本鎖形態、HCC ターゲティングドメインはβ-三葉型ドメインを含み、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にてα-フォールド、β4/β5 ヘアピンターン、β-フォールド、β8/β9 ヘアピンターンおよびγ-フォールドを含む。
【０００９】
【図３】図3は、酵素ドメインを含む軽鎖 (LC)、転位置ドメインを含む重鎖 HN ドメイン、転位置促進ドメインを含む重鎖 HCN ドメインおよびターゲティングドメインを含む重鎖 HCC ドメインのモジュールの三次元構造を示すBoNT/Aのリボン模式図を示す。
【００１０】
【図４】図4は、改変毒素のアミノ末端に位置する増強した転位置能力および変化した増強したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素を示す。図4Aは、アミノからカルボキシル直鎖状編成にて、変化したターゲティングドメイン、転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび酵素ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は、転位置促進および酵素ドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態に変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、ターゲティングおよび転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進および酵素ドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。図4Bは、アミノからカルボキシル直鎖状編成にて変化したターゲティングドメイン、酵素ドメイン、転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は酵素および転位置ドメインの間に位置している。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態に変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、ターゲティングおよび酵素ドメイン、酵素および転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。
【００１１】
【図５】図5は、その他の２つのドメインの間に位置する増強した転位置能力および変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素を示す。図5Aは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて、酵素ドメイン、変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は、酵素およびターゲティングドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位でありうる。スペーサーが、酵素およびターゲティングドメイン、ターゲティングおよび転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメインの間またはそれらのあらゆる組合せに位置していてもよい。図5Bは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は転位置促進およびターゲティングドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位はクロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位でありうる。スペーサーが、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進およびターゲティングドメイン、ターゲティングおよび酵素ドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。
【００１２】
【図６】図6は、改変毒素のカルボキシル末端に位置する増強した転位置能力および変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素を示す。図6Aは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて酵素ドメイン、転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示す。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は酵素および転位置ドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、酵素および転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進およびターゲティングドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。図6Bは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示す。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は転位置促進および酵素ドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進および酵素ドメイン、酵素およびターゲティングドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。
【００１３】
【図７】図7は、転位置促進ドメインを含むHCN ドメインの境界領域を示すBoNT/Aのリボン模式図を示す。図7Aは、アミノ-末端境界領域を示す。 図7Bは、カルボキシル-末端境界領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・テタニ（破傷風菌）、クロストリジウム・ブラチイおよびクロストリジウム・ブチリクムにより生産されるクロストリジウム毒素は、ヒトおよびその他の哺乳類の治療および美容処置に非常に広く用いられている。クロストリジウム・ボツリヌスの株は、抗原的に異なるタイプの７種のボツリヌス毒素 (BoNT)を生産し、それらはヒト(BoNT/A、/B、/Eおよび/F)、動物(BoNT/C1および/D)におけるボツリヌス中毒大流行の調査によって同定されたか、あるいは土壌から単離された(BoNT/G)。７つのすべてのボツリヌス毒素(BoNT)血清型は、類似の構造および薬理特性を有するが、それぞれはまた異質な細菌学的特徴を示す。一方、破傷風毒素 (TeNT)は、クロストリジウム・テタニ（破傷風菌）の均一な群により生産される。２つの別の種のクロストリジウムである、クロストリジウム・ブラチイおよびクロストリジウム・ブチリクムもそれぞれ、BoNT/FおよびBoNT/Eと類似の毒素を生産する。
【００１５】
クロストリジウム毒素は、互いにおよそ35%のアミノ酸同一性を有し、同じ機能的ドメイン編成および全体構造を共有する。クロストリジウム毒素はそれぞれおよそ 150 kDaの一本鎖ポリペプチドとして翻訳され、それは次いで天然プロテアーゼ、例えば、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼまたは環境中に生じた天然プロテアーゼによりジスルフィドループ内でタンパク分解切断により切断される(図2を参照されたい)。この翻訳後プロセシングにより、およそ 50 kDaの軽鎖 (LC)およびおよそ 100 kDaの重鎖 (HC)が一つのジスルフィド結合および非共有相互作用によって一緒になって含まれる二本鎖分子が生じる。成熟二本鎖分子は３つの機能的に異なるドメインを含むと広く考えられている: 1)神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的化する亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含むLC に位置する酵素ドメイン(表1); 2)細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのLCの放出を促進する重鎖のアミノ-末端半分(HN ドメイン)に含まれる転位置ドメイン(表1);および 3)標的細胞の表面に位置する受容体複合体への毒素の結合活性および結合特異性を決定する重鎖のカルボキシル-末端半分(HC ドメイン)内にある結合ドメイン(表1)、例えば、Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); John A. Chaddock and P. M. H. Marks, Clostridial Neurotoxins:  Structure-Function Led Design of New Therapeutics, 63(5) Cell. Mol. Life Sci. 540-551 (2006); and Keith Foster et al., Re-engineering the Target Specificity of Clostridial Neurotoxins - A Route To Novel Therapeutics, 9(2-3) Neurotox Res. 101-107 (2006).を参照されたい。
表1. クロストリジウム毒素参照配列および領域
【表１】
2009543558.tif 000002
【００１６】
クロストリジウム毒素の結合、転位置および酵素活性はすべて、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する、全体としての細胞中毒機構を行うために必要であり、かかる機構は血清型またはサブタイプにかかわらず類似である。現在のパラダイムでは、中毒機構は少なくとも４工程を含むとして説明される: 1) 受容体結合、2) 複合体インターナリゼーション、3) 軽鎖転位置、および、4) 酵素による標的改変 (図1参照)。このプロセスは、クロストリジウム毒素のHC ドメインが、標的細胞の細胞膜表面に位置する毒素-特異的受容体に結合すると開始する。受容体複合体の結合特異性は、部分的には、それぞれのクロストリジウム毒素受容体複合体を異なるように構成すると考えられるガングリオシドおよびタンパク質受容体の特定の組合せによって達成されると考えられている。いったん結合すると、毒素受容体複合体はエンドサイトーシスによりインターナライズされ、インターナライズされた小胞は特定の細胞内経路へと選別される。HN ドメインにより媒介され、さらにHCN ドメインにより促進されると現在では考えられている転位置工程は、小胞区画の酸性化によりトリガーされるようである。このプロセスは、疎水性を上昇させ、毒素の重鎖からの軽鎖の分離を促進する２つの重要な pH-依存的構造再編成を開始させるようである。いったん活性化されると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが細胞内小胞から細胞質ゾルへと放出され、ここでそれは特異的に神経伝達物質放出装置の３つの既知のコア成分の１つを標的化するようである。これらのコアタンパク質、小胞-結合膜タンパク質 (VAMP)/シナプトブレビン、25 kDaのシナプトソーム関連タンパク質 (SNAP-25)およびシンタキシンは、シナプス小胞ドッキングおよび神経終末での融合に必要であり、可溶性 N-エチルマレイミド-感受性 因子-付着タンパク質-受容体 (SNARE) ファミリーのメンバーを構成する。BoNT/AおよびBoNT/EはSNAP-25をカルボキシル末端領域にて切断し、それぞれ９または２６のアミノ酸セグメントを放出し、BoNT/C1もSNAP 25をカルボキシル末端付近で切断する。ボツリヌス血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F およびBoNT/G、および破傷風毒素は、VAMPの保存された中央部分に対して作用し、VAMPのアミノ末端部分を細胞質ゾルへと放出する。 BoNT/C1はシンタキシンを細胞質ゾル膜表面の近くの単一の部位にて切断する。シナプスの SNAREの選択的タンパク分解は、インビボでクロストリジウム毒素により起こる神経伝達物質放出の遮断の原因である。クロストリジウム毒素のSNARE タンパク質標的は様々な非神経細胞タイプにおけるエキソサイトーシスに共通である; これら細胞において、神経細胞におけるように、軽鎖ペプチダーゼ活性がエキソサイトーシスを阻害する、例えば、Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); and Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).を参照されたい。
【００１７】
BoNT/A、BoNT/BおよびTeNTのHC ドメインの三次元結晶構造は、クロストリジウム神経毒の３つの機能的ドメインが構造的に異なることを示す（図３参照）。軽鎖のHEXXH コンセンサスモチーフが、チャンネルによって接近可能なタンパク質表面上の深い裂に位置する触媒部位の四面体亜鉛結合ポケットを形成する。HNおよびHC ドメインの構造は主にβ-シートトポロジーからなり、それらは１つのα-ヘリックスによって連結されている。円柱状形状のHN ドメインは２つの長い両親媒性 α-ヘリックスを含み、それらはいくつかのウイルスタンパク質にみられるコイルドコイルモチーフと類似している。HN ドメインはまた、「転位置ベルト」と称される構造化されていない長いループを形成し、それは活性部位の触媒-結合ポケットへの亜鉛原子の接近を妨げる軽鎖の大きく負に荷電した裂のまわりを包んでいる。HC ドメインは機能を示すほぼ同じサイズの２つの異なる構造特徴を含む。一方はHCN ドメインと称され、HC ドメインのアミノ半分に位置する。HCN ドメインはβ-バレル、ジェリー・ロール(jelly-roll)フォールドを形成する。HCC ドメインはHC ドメインを構成するもう一方のドメインである。このカルボキシル-末端ドメインは、多くの糖結合タンパク質、例えば、血清アミロイド P、シアリダーゼ、cryia、殺虫性 ∂-内毒素およびレクチンにみられる炭水化物結合部分に類似した３つの異なる炭水化物結合領域を形成する改変されたβ-三葉型ドメインを含む。生化学研究により HCC ドメインのβ-三葉型ドメイン構造は、細胞表面上のクロストリジウム毒素受容体の特定の炭水化物を含有する成分への結合を媒介するようであることが示されており、例えば、Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000). を参照されたい。HC ドメインはHN ドメインから離れるよう傾いており、表面ループを露出しており、結合のためにそれらを接近可能としている。軽鎖とHC ドメインとの間には接触は起こらない。
【００１８】
本発明者らはHCC ドメインのみが受容体結合に寄与していることを知っている。というのは、β-三葉型ドメインはこのドメインに制限されているからである。構造的β-三葉型ドメインを含むタンパク質は、サイトカイン、MIR ドメインタンパク質、リシン B-様レクチン、アグルチニン、ダイズ トリプシンインヒビター様タンパク質、アクチン-架橋タンパク質、LAG-1 タンパク質およびAbfB ドメインタンパク質を含む少なくとも８つのスーパーファミリーへと組織化される多様な群のタンパク質を表し、例えば、C. A. Orengo et al., Protein Superfamilies and Domain Superfolds, 372 Nature 631-634 (1994); and Alexey G. Murzin et al., SCOP: A Structural Classification of Proteins Database for the Investigation of Sequences and Structures, 247(4) J. Mol. Biol. 536-540 (1995).を参照されたい。多様な細胞での役割を有する一方、これらスーパーファミリーのメンバーは、機構的にβ-三葉型ドメインを介したタンパク質-タンパク質結合を介して機能する。特に興味深いのは、これらのメンバーの多くが受容体相互作用に特異的に関与しているという事実であり、例えば、サイトカインスーパーファミリーメンバーである、線維芽細胞増殖因子(FGF)およびインターロイキン-1 (IL-1);リシン B-様レクチン;アグルチニン; およびSTI-様メンバーである Kunitz インヒビターおよびクロストリジウム神経毒が含まれる。 HCC ドメインのみが、中毒の細胞結合工程を媒介するということは、クロストリジウム毒素の受容体結合活性を破壊する突然変異がHCC ドメインに限られているという知見によってさらに支持され、例えば、Andreas Rummel et al., The HCC-Domain of Botulinum Neurotoxins A and B Exhibits a Singular Ganglioside Binding Site Displaying Serotype Specific Carbohydrate Interaction, 51(3) Mol. Microbiol. 631-643 (2004).を参照されたい。
【００１９】
HCC ドメインは、クロストリジウム毒素のその受容体との選択的結合に必要であるだけでなく、十分でもあるため、本発明者らは、クロストリジウム毒素のHCN ドメインの主な機能は、中毒プロセスの細胞結合工程ではなく転位置工程に関与していると推定した。というのは、HCN ドメインの欠損は、中毒効率を低下させるようであるからである。例えば、サブスタンスPターゲティングドメインを含む改変BoNT/Aは、その対応する標的細胞を中毒させることにおいて非効率的であった。この改変毒素において、BoNT/A HCC ドメインとBoNT/A HCN ドメインとの両方を含む完全なBoNT/A HC ドメインを、サブスタンスPターゲティングドメインで置換した。同様に、本発明者らは、完全なBoNT/A HC ドメインが外来性ターゲティングドメインで置換されたその他のいくつかの改変クロストリジウム毒素が中毒能力の低下を示すことを決定した。したがって、HCN ドメインは以下の理由から転位置促進機能を有する：1) HCC ドメインは主に、中毒プロセスの受容体結合工程を媒介する; 2) HCN ドメインを欠損する改変クロストリジウム毒素は、かかる改変毒素がそのSNARE 基質のタンパク分解の低下を示すことから明らかなように、細胞質への転位置能力の低下を示す; および、3) LC ドメインは毒素の酵素活性を媒介する。HCN ドメインの正確な転位置促進機構は現在理解されていないが、HCN ドメインは、1)エンドソームの孔の形成に関与している可能性があり; 2)孔の小胞膜への挿入を媒介している可能性があり; 3)エンドソーム膜を横切るLCの送達を補助している可能性があり、および/または 4)転位置ドメインとの関係においてターゲティングドメインの適当な配向を促進する構造的足場またはスペーサーとして働いている可能性がある。この最後の点において、HCN ドメインは、リガンドの受容体による結合に続いて膜への挿入のために転位置ドメインを適切に提示することを促進するために転位置ドメインを配向させる役割をしているのであろう。転位置工程におけるHCN ドメインのこの新規な役割は、クロストリジウム毒素 HCN ドメインは中毒プロセスの細胞結合工程に必須の役割を果たしているという広く受け入れられていた概念に反するものである。
【００２０】
したがって、本発明は、1)増強した転位置能力; および2)天然クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化したターゲティング能力を示す、改変クロストリジウム毒素を開示する。増強した転位置能力は、例えば、クロストリジウム毒素のHCN 領域を含む転位置促進ドメインによって媒介される。HCN ドメインは、転位置工程におけるインターナライズされた細胞内小胞から標的細胞の細胞質への軽鎖の放出をHN ドメインが 媒介するプロセスを増強する。増強した転位置能力は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素においてクロストリジウム毒素 HCN ドメインを含めるまたは維持することによって得られる。天然クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化したターゲティング能力は、クロストリジウム毒素の改変HCC ターゲティングドメインを含む変化したターゲティングドメインによって媒介される。HCC ドメインは主に、標的細胞表面に位置する受容体複合体への毒素の結合活性および結合特異性を決定する。変化したターゲティング活性は、クロストリジウム毒素の天然のHCC ターゲティングドメインを、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合ドメインにより置換することにより達成される。
【００２１】
従って、増強した転位置能力を有する改変クロストリジウム毒素は、より低い用量要件のため、治療標的ではない領域への毒素の望ましくない分散を低減し、それにより、クロストリジウム毒素の望ましくない位置への拡散に伴う望ましくない副作用を低減または予防するであろう。さらに、変化した結合活性は、現行のクロストリジウム毒素治療方法により提供される利点を利用出来る治療用途の数を大きく広げる新規のクロストリジウム毒素を提供するであろう。
【００２２】
したがって、本発明の側面は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素を提供し、ここで、改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合活性を示す。軽鎖が細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来るあらゆる転位置促進ドメインが、本発明の側面に実施に有用であると考えられ、これらに限定されないが、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよびエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが挙げられる。同様に、多数の変化したターゲティングドメインが想定され、これらに限定されないが、以下が挙げられる：オピオイド、メラノコルチンペプチド、ガラニン、グラニン、タキキニンペプチド、コレシストキニン、ニューロペプチドＴ関連ペプチド、カイニンペプチド、ＰＡＲペプチド、コルチコトロピン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよびソマトスタチン。本明細書の改変クロストリジウム毒素中の変化したターゲティングドメインの位置は、毒素のアミノ末端、酵素および転位置ドメインの間または毒素のカルボキシル末端に位置してもよいことも想定される。したがって、本明細書に開示される改変クロストリジウム毒素は、アミノからカルボキシルへのドメイン編成として例えば以下を含みうる：変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメイン; 変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン;クロストリジウム毒素酵素ドメイン、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン;クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメイン;クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび増強したターゲティングドメイン;ならびにクロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン。
【００２３】
本発明の別の側面は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を提供し、ここで、改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対して結合活性を示す。本明細書に開示されたあらゆる改変クロストリジウム毒素はポリヌクレオチド分子によってコードされると想定される。
【００２４】
本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、該方法は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞中で発現させる工程を含み、ここで改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対して結合活性を示す。本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、該方法は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトを細胞に導入する工程、ここで改変クロストリジウム毒素は非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合活性を示し、および発現コンストラクトを細胞中で発現させる工程を含む。
【００２５】
本発明の側面は部分的には改変クロストリジウム毒素を提供する。本明細書において用いる場合、「改変クロストリジウム毒素」という用語は、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する全細胞機構を実行することが出来るあらゆるポリペプチドを意味し、低または高親和性受容体複合体へのクロストリジウム毒素の結合、毒素のインターナリゼーション、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質への転位置およびクロストリジウム毒素基質の酵素的改変が含まれる。本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、改変クロストリジウム毒素が、軽鎖が改変毒素から標的細胞の細胞質へと転位置するプロセスを増強する転位置促進ドメインを含み、改変クロストリジウム毒素がクロストリジウム毒素にみられる天然結合ドメインの細胞結合活性を欠いているという事実によって、天然クロストリジウム毒素から区別される。そうではなく、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、標的細胞の表面に位置する非クロストリジウム毒素受容体に対する改変クロストリジウム毒素の結合活性を決定する変化したターゲティングドメインを含む。定義によると、天然クロストリジウム毒素は変化したターゲティングドメインを欠いている。改変クロストリジウム毒素の例は、例えば、Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 米国特許第 5,989,545号(Nov. 23, 1999); Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, 米国特許第 6,461,617号(Oct. 8, 2002); Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 米国特許第 6,632,440号(Oct. 14, 2003); Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, 米国特許第 6,843,998号(Jan. 18, 2005); Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 米国特許公開第 2002/0037833号(Mar. 28, 2002); Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, 米国特許公開第 2003/0180289号(Sep. 25, 2003); J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, WO 2001/014570 (Mar. 1, 2001); Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 国際特許公開第WO 2005/023309 (Mar. 17, 2005); および Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 米国特許出願番号11/376,696号(Mar. 15, 2006)に記載されている。例えば、Foster, 上掲, (1999), Dolly, 上掲, (2001), Donovan, 上掲, (2002), Shone, 上掲, (2002), Foster, supar, (2003), Quinn, 上掲, (2003), Foster, 上掲, (2005), Steward, 上掲, (2005) および Steward, 上掲, (2006)、に記載のあらゆる改変クロストリジウム毒素をさらに改変して、本明細書に開示のように転位置促進ドメインを含めることができる。
【００２６】
本発明の側面は、部分的には、クロストリジウム毒素酵素ドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素酵素ドメイン」という用語は、中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来るあらゆるクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。したがって、クロストリジウム毒素酵素ドメインは特異的に、クロストリジウム毒素基質を標的化し、クロストリジウム毒素基質、例えば、SNARE タンパク質、例えば、SNAP-25 基質、VAMP 基質およびシンタキシン基質のタンパク分解切断が含まれる。クロストリジウム毒素酵素ドメインの非限定的な例としては、例えば、クロストリジウム毒素軽鎖領域、例えば、BoNT/A 軽鎖領域、BoNT/B 軽鎖領域、BoNT/C1 軽鎖領域、BoNT/D 軽鎖領域、BoNT/E 軽鎖領域、BoNT/F 軽鎖領域、BoNT/G 軽鎖領域、およびTeNT 軽鎖領域が挙げられる。
【００２７】
クロストリジウム毒素酵素ドメインとしては、これらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームおよびクロストリジウム毒素軽鎖サブタイプ; 非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素軽鎖キメラ、その活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列(表1参照)の対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素軽鎖を意味し、参照配列の対応する領域に対してパーセント同一性にて記載できるものをいう。明示的に示さない限り、本明細書に開示するすべてのクロストリジウム毒素軽鎖変異体は、中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来る。非限定的な例として、配列番号1 のアミノ酸1-448を含むBoNT/A 軽鎖変異体は、配列番号1のアミノ酸領域 1-448と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号2のアミノ酸1-441を含むBoNT/B 軽鎖変異体は、配列番号2のアミノ酸領域 1-441と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号3のアミノ酸1-449を含むBoNT/C1 軽鎖変異体は、配列番号3のアミノ酸領域 1-449と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号4 のアミノ酸1-445を含むBoNT/D 軽鎖変異体は、配列番号4のアミノ酸 領域 1-445と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号5のアミノ酸1-422を含むBoNT/E 軽鎖変異体は、配列番号5のアミノ酸 領域 1-422と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号6のアミノ酸1-439を含むBoNT/F 軽鎖変異体は、配列番号6のアミノ酸 領域 1-439と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号7のアミノ酸 1-446を含むBoNT/G 軽鎖変異体は、配列番号7のアミノ酸領域 1-446と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;および、配列番号8のアミノ酸1-457を含むTeNT 軽鎖変異体は、配列番号8のアミノ酸 領域 1-457と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【００２９】
クロストリジウム毒素の各血清型において、そのアミノ酸配列、そしてかかるタンパク質をコードする核酸においていくらか相違する天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体が存在し得ることが当業者に認識されている。例えば、現在４つのBoNT/A サブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 および BoNT/A4が存在し、特定の軽鎖 サブタイプは別のBoNT/A 軽鎖 サブタイプと比較した場合におよそ 95%のアミノ酸同一性を示す。本明細書において用いる場合、「天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、天然プロセスにより生産されるあらゆるクロストリジウム毒素軽鎖を意味し、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されたクロストリジウム毒素軽鎖アイソフォーム、自然突然変異により生産されたクロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームおよび、クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプが挙げられる。天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同じようにして機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖の代わりとなりうる。天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸または１００以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から、少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【００３０】
天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例は、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォーム、例えば、BoNT/A 軽鎖アイソフォーム、BoNT/B 軽鎖アイソフォーム、BoNT/C1 軽鎖アイソフォーム、BoNT/D 軽鎖アイソフォーム、BoNT/E 軽鎖アイソフォーム、BoNT/F 軽鎖アイソフォーム、BoNT/G 軽鎖アイソフォーム、およびTeNT 軽鎖アイソフォームである。クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームは、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームが基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わることができる。
【００３１】
天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体の別の非限定的な例は、クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプ、例えば、サブタイプ BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 および BoNT/A4からの軽鎖;サブタイプ BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B 二価(bivalent)およびBoNT/B タンパク非分解性(nonproteolytic)からの軽鎖;サブタイプ BoNT/C1-1およびBoNT/C1-2からの軽鎖;サブタイプ BoNT/E1、BoNT/E2 および BoNT/E3からの軽鎖;およびサブタイプ BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3 およびBoNT/F4からの軽鎖である。クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプは、クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプが基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わることができる。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、ヒトの操作の助けを借りて生産されたあらゆるクロストリジウム毒素軽鎖を意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作によって生産されたクロストリジウム毒素軽鎖、および化学合成によって生産されたクロストリジウム毒素軽鎖が挙げられる。非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素軽鎖 キメラ変異体および活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片が挙げられる。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素軽鎖配列 (表1)からの元のアミノ酸のものと類似の少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸 アナログによって少なくとも１つの アミノ酸が置換されたクロストリジウム毒素軽鎖を意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わることが出来る。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸または５００以上のアミノ酸が、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から置換している可能性がある。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体はまた、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から、少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、および保存的 TeNT 軽鎖変異体が挙げられる。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、1) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から欠失している; 2) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖 が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に付加している; または 3) 少なくとも１つの アミノ酸が参照クロストリジウム毒素軽鎖配列からの元のアミノ酸のものと類似の性質を共有していないアミノ酸またはアミノ酸アナログによって置換されている(表1)、クロストリジウム毒素軽鎖を意味する。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体 が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において、参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わりうる。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から欠失している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に付加している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸または５００以上のアミノ酸が、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から置換している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体はまた、少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から置換している可能性があり、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または 95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、および非保存的 TeNT 軽鎖変異体が挙げられる。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素軽鎖 キメラ」という用語は、少なくともクロストリジウム毒素軽鎖の一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表1の参照クロストリジウム毒素軽鎖とは異なる少なくとも１つの 性質を有する毒素軽鎖を形成しているポリペプチドを意味し、ただし、このクロストリジウム毒素軽鎖 キメラは依然として神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的化することができるものであり、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構全体を実行することに寄与することができるものである。かかるクロストリジウム毒素軽鎖キメラは例えば、Lance E. Steward et al., Leucine-based Motif and Clostridial Toxins, 米国特許出願公開2003/0027752 (Feb. 6, 2003); Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, 米国特許出願公開2003/0219462 (Nov. 27, 2003); and Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, 米国特許出願公開2004/0220386 (Nov. 4, 2004）に記載されている。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片」という用語は、本発明の側面において有用であり得る軽鎖を含むあらゆる様々なクロストリジウム毒素断片を意味するが、ただし、かかる軽鎖断片は、神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的化できるものであり、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体を実行することに寄与できるものである。クロストリジウム毒素の軽鎖はおよそ 420-460 アミノ酸の長さであり、酵素ドメインを含む(表1)。研究により、クロストリジウム毒素軽鎖の全長は、酵素ドメインの酵素活性に必要ではないことが示された。非限定的な例として、BoNT/A 軽鎖の最初の８のアミノ酸(配列番号1の残基1-8)は、酵素活性に必要ではない。別の非限定的な例として、TeNT 軽鎖の最初の８の アミノ酸(配列番号8の残基1-8)は、酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は活性に必要ではない。非限定的な例として、BoNT/A 軽鎖の最後の 32 アミノ酸 (配列番号1の残基 417-448)は酵素活性に必要ではない。別の非限定的な例として、TeNT 軽鎖の最後の 31 アミノ酸 (配列番号8の残基427-457)は酵素活性に必要ではない。したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 350 アミノ酸、少なくとも 375 アミノ酸、少なくとも 400 アミノ酸、少なくとも 425 アミノ酸および少なくとも 450 アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 350 アミノ酸、多くとも 375 アミノ酸、多くとも 400 アミノ酸、多くとも 425 アミノ酸および多くとも 450 アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。
【００３７】
様々な配列アラインメント方法のいずれを用いて天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体および非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル(global)方法、ローカル(local)方法およびハイブリッド方法、例えば、セグメントアプローチ方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。
【００３８】
グローバル方法では、分子の最初から最後まで配列をアラインし、個々の残基対のスコアを足すことにより、およびギャップペナルティを課すことにより最良のアラインメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、CLUSTAL W、例えばJulie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994);および反復リファインメント(iterative refinement)が挙げられ、例えばOsamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996）を参照されたい。
【００３９】
ローカル方法では、入力配列のすべてによって共有される１以上の保存モチーフを同定することによって配列をアラインする。非限定的な方法としては、例えば、Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)参照; Gibbs sampling、例えばC. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993) 参照; Align-M、例えばIvo Van Walle et al．， Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences， 20(9) Bioinformatics，:1428-1435 (2004) 参照、が挙げられる。
【００４０】
ハイブリッド方法は、グローバルおよびローカルアラインメント方法の両方の機能的側面を組み合わせたものである。非限定的な方法としては、例えば、セグメント-対-セグメント比較、例えば、Burkhard Morgenstern et al., Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based 0n Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996)参照; T-Coffee、例えばCedric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000)参照; MUSCLE、例えばRobert C. Edgar, MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004)参照；および DIALIGN-T、例えばAmarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005)参照、が挙げられる。
【００４１】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームまたはクロストリジウム毒素軽鎖サブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素 キメラ 軽鎖、活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００４２】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは BoNT/A 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/A 軽鎖は配列番号1のアミノ酸 1-448を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、天然 BoNT/A 軽鎖変異体、例えば、BoNT/A アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/A サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1の天然 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、例えば、配列番号1のBoNT/A アイソフォームのアミノ酸1-448または配列番号1のBoNT/A サブタイプのアミノ酸1-448を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、非天然 BoNT/A 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、BoNT/A キメラ 軽鎖、活性のBoNT/A 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1の非天然 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、例えば、配列番号1の保存的 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、配列番号1の非保存的 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、配列番号1の活性のBoNT/A 軽鎖断片のアミノ酸1-448、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００４３】
この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、例えば、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、例えば、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４４】
この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、 BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば 少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４５】
この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４６】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/B 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/B 軽鎖は配列番号2のアミノ酸1-441を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、天然 BoNT/B 軽鎖変異体、例えば、BoNT/B アイソフォームからの軽鎖または BoNT/B サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2の天然 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、例えば、配列番号2のBoNT/B アイソフォームのアミノ酸1-441 または配列番号2のBoNT/B サブタイプのアミノ酸1-441を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、非天然 BoNT/B 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、BoNT/B キメラ 軽鎖、活性のBoNT/B 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、 BoNT/B 軽鎖は、配列番号2の非天然 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、例えば、配列番号2の保存的 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、配列番号2の非保存的 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、配列番号2の活性のBoNT/B 軽鎖断片のアミノ酸1-441、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００４７】
この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、例えば、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、例えば、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド を含む。 
【００４８】
この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４９】
この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５０】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/C1 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/C1 軽鎖は配列番号3のアミノ酸1-449を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、天然 BoNT/C1 軽鎖変異体、例えば、BoNT/C1 アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/C1 サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3の天然 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、例えば、配列番号3のBoNT/C1 アイソフォームのアミノ酸1-449または配列番号3のBoNT/C1 サブタイプのアミノ酸1-449を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、非天然 BoNT/C1 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、BoNT/C1 キメラ 軽鎖、活性のBoNT/C1 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3の非天然 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、例えば、配列番号3の保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、配列番号3の非保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、配列番号3の活性のBoNT/C1 軽鎖断片のアミノ酸1-449、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００５１】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、例えば、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449 と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、例えば、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449 と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５２】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチド を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチド を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５４】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/D 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/D 軽鎖は配列番号4のアミノ酸1-445を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、天然 BoNT/D 軽鎖変異体、例えば、BoNT/D アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/D サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4の天然 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、例えば、配列番号4のBoNT/D アイソフォームのアミノ酸1-445または配列番号4のBoNT/D サブタイプのアミノ酸1-445を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、非天然 BoNT/D 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、BoNT/D キメラ 軽鎖、活性のBoNT/D 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4の非天然 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、例えば、配列番号4の保存的 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、配列番号4の非保存的 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、配列番号4の活性のBoNT/D 軽鎖断片のアミノ酸1-445、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００５５】
この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、例えば、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、例えば、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５６】
この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５７】
この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５８】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは BoNT/E 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/E 軽鎖は配列番号5のアミノ酸1-422を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、天然 BoNT/E 軽鎖変異体、例えば BoNT/E アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/E サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5の天然 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、例えば、配列番号5のBoNT/E アイソフォームのアミノ酸1-422または配列番号5のBoNT/E サブタイプのアミノ酸1-422を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、非天然 BoNT/E 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、BoNT/E キメラ 軽鎖、活性のBoNT/E 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5の非天然 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、例えば、配列番号5の保存的 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、配列番号5の非保存的 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、配列番号5の活性のBoNT/E 軽鎖断片のアミノ酸1-422、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００５９】
この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、例えば、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、例えば、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６０】
この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６１】
この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６２】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/F 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/F 軽鎖は配列番号6のアミノ酸1-439を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、天然 BoNT/F 軽鎖変異体、例えば、BoNT/F アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/F サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6の天然 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、例えば、配列番号6のBoNT/F アイソフォームのアミノ酸1-439 または配列番号6のBoNT/F サブタイプのアミノ酸1-439を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、非天然 BoNT/F 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、BoNT/F キメラ 軽鎖、活性のBoNT/F 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6の非天然 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、例えば、配列番号6の保存的 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、配列番号6の非保存的 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、配列番号6の活性のBoNT/F 軽鎖断片のアミノ酸1-439またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００６３】
この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、例えば、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、例えば、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６４】
この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６５】
この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６６】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/G 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、天然 BoNT/G 軽鎖変異体、例えば、BoNT/G アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/G サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7の天然 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、例えば、配列番号7のBoNT/G アイソフォームのアミノ酸1-446または配列番号7のBoNT/G サブタイプのアミノ酸1-446を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、非天然 BoNT/G 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、BoNT/G キメラ 軽鎖、活性のBoNT/G 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7の非天然 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、例えば、配列番号7の保存的 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、配列番号7の非保存的 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、配列番号7の活性のBoNT/G 軽鎖断片のアミノ酸1-446、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００６７】
この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、例えば、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、例えば、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。 
【００６８】
この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６９】
この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００７０】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはTeNT 軽鎖を含む。この態様の側面において、TeNT 軽鎖は配列番号8のアミノ酸1-457を含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、天然 TeNT 軽鎖変異体、例えば、TeNT アイソフォームからの軽鎖またはTeNT サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8の天然 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、例えば、配列番号8のTeNT アイソフォームのアミノ酸1-457または配列番号8のTeNT サブタイプのアミノ酸1-457を含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、非天然 TeNT 軽鎖変異体、例えば、保存的 TeNT 軽鎖変異体、非保存的 TeNT 軽鎖変異体、TeNT キメラ 軽鎖、活性のTeNT 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8の非天然 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、例えば、配列番号8の保存的 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、配列番号8の非保存的 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、配列番号8の活性のTeNT 軽鎖断片のアミノ酸1-457、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００７１】
この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、例えば、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 85％のアミノ酸同一性 、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、例えば、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００７２】
この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００７３】
この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００７４】
本発明の側面は、部分的には、クロストリジウム毒素転位置ドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素転位置ドメイン」という用語は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来るあらゆるクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。したがって、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、クロストリジウム毒素軽鎖の膜を横切る運動を促進し、クロストリジウム毒素軽鎖の膜を介する細胞内小胞から細胞の細胞質への運動を包含する。クロストリジウム毒素転位置ドメインの非限定的な例としては、例えば、クロストリジウム毒素 HN 領域 例えば、BoNT/A HN 領域、BoNT/B HN 領域、BoNT/C1 HN 領域、BoNT/D HN 領域、BoNT/E HN 領域、BoNT/F HN 領域、BoNT/G HN 領域、およびTeNT HN 領域が挙げられる。
【００７５】
クロストリジウム毒素転位置ドメインとしては、これらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプ; 非天然クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、クロストリジウム毒素 HN 領域キメラ、その活性のクロストリジウム毒素 HN 領域 断片、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【００７６】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列 (表1参照)の対応する領域から少なくとも１つの アミノ酸変化を有し、その参照配列の対応する領域に対してパーセント同一性において記載できるクロストリジウム毒素 HN 領域を意味する。明示的に示さない限り、本明細書に開示されるすべてのクロストリジウム毒素 HN 領域 変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来る。非限定的な例として、配列番号1のアミノ酸449-873を含むBoNT/A HN 領域 変異体は、配列番号1のアミノ酸領域449-873と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号2のアミノ酸442-860を含むBoNT/B HN 領域 変異体は、配列番号2のアミノ酸 領域 442-860と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号3のアミノ酸450-868を含むBoNT/C1 HN 領域 変異体は、配列番号3のアミノ酸 領域 450-868と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号4のアミノ酸446-864を含むBoNT/D HN 領域 変異体は、配列番号4のアミノ酸 領域 446-864と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号5のアミノ酸423-847を含むBoNT/E HN 領域変異体は、配列番号5のアミノ酸領域 423-847と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号6のアミノ酸440-866を含むBoNT/F HN 領域変異体は、配列番号6のアミノ酸領域 440-866と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号7のアミノ酸447-865を含むBoNT/G HN 領域変異体は、配列番号7の アミノ酸領域 447-865と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; および配列番号8のアミノ酸458-881を含むTeNT HN 領域変異体は、配列番号8のアミノ酸領域 458-881と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【００７７】
クロストリジウム毒素の各血清型のなかに、アミノ酸配列において、およびかかるタンパク質をコードする核酸においてもなんらか相違する天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が存在しうることが当業者に認識されている。例えば、現在では４つのBoNT/A サブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3およびBoNT/A4が存在し、これらは別のBoNT/A HN 領域サブタイプと比較しておよそ 87％のアミノ酸同一性を示す特定のHN 領域サブタイプを有する。本明細書において用いる場合、「天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、天然プロセスによって生産されたあらゆるクロストリジウム毒素 HN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォーム、自然突然変異によって生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプが挙げられる。天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることができる。天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸 または１００以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【００７８】
天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォーム、例えば、BoNT/A HN 領域アイソフォーム、BoNT/B HN 領域アイソフォーム、BoNT/C1 HN 領域アイソフォーム、BoNT/D HN 領域アイソフォーム、BoNT/E HN 領域アイソフォーム、BoNT/F HN 領域アイソフォーム、BoNT/G HN 領域アイソフォーム、およびTeNT HN 領域アイソフォームである。クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォーム は、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームが基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。
【００７９】
天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の別の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプ、例えば、サブタイプ BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 およびBoNT/A4からのHN 領域；サブタイプ BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B 二価およびBoNT/B タンパク非分解性からのHN 領域サブタイプ BoNT/C1-1 およびBoNT/C1-2からのHN 領域；サブタイプ BoNT/E1、BoNT/E2およびBoNT/E3からのHN 領域;および、サブタイプ BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3およびBoNT/F4からのHN 領域である。クロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプ は、クロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプが基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。
【００８０】
本明細書において用いる場合、「非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、ヒト 操作の助けによって生産されたあらゆるクロストリジウム毒素 HN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域および化学合成により生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域が挙げられる。非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、クロストリジウム毒素 HN 領域キメラ変異体 および活性のクロストリジウム毒素 HN 領域断片が挙げられる。 
【００８１】
本明細書において用いる場合、「保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素 HN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸と類似の少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸 アナログによって少なくとも１つの アミノ酸が置換されたクロストリジウム毒素 HN 領域を意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体 は、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸または５００以上のアミノ酸置換している可能性がある。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 BoNT/A HN 領域変異体、保存的 BoNT/B HN 領域変異体、保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、保存的 BoNT/D HN 領域変異体、保存的 BoNT/E HN 領域変異体、保存的 BoNT/F HN 領域変異体、保存的 BoNT/G HN 領域変異体、および保存的 TeNT HN 領域変異体が挙げられる。
【００８２】
本明細書において用いる場合、「非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、1)非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも１つの アミノ酸が欠失している; 2)非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも１つの アミノ酸が付加している; または3) 少なくとも１つの アミノ酸が参照クロストリジウム毒素 HN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸と類似のいかなる性質も共有しない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログによって置換されている、クロストリジウム毒素 HN 領域を意味する。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体 は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体 は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸欠失している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸付加している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸または５００以上のアミノ酸置換している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能背があり、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 BoNT/A HN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HN 領域変異体、および非保存的 TeNT HN 領域変異体が挙げられる。
【００８３】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HN 領域キメラ」という用語は、少なくとも クロストリジウム毒素 HN 領域の一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表1の参照クロストリジウム毒素 HN 領域とは異なる少なくとも１つの性質を有する毒素 HN 領域を形成するポリペプチドを意味し、ただしこのクロストリジウム毒素 HN 領域キメラは、神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的にターゲティングすることが依然として出来、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体を実施することに寄与できるものである。
【００８４】
本明細書において用いる場合、「活性のクロストリジウム毒素 HN 領域断片」という用語は、本発明の側面に有用であり得るHN 領域を含むあらゆる様々なクロストリジウム毒素断片を意味し、ただしこれらの活性の断片は、LC の細胞内小胞から標的細胞の細胞質への放出を促進することができ、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行に寄与することができるものである。クロストリジウム毒素の重鎖からのHN 領域はおよそ 410-430 アミノ酸の長さであり、転位置ドメインを含む(表1)。研究によりクロストリジウム毒素 重鎖からのHN 領域の全長が、転位置ドメインの転位置活性に必要であるわけではないことが示された。したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 350 アミノ酸、少なくとも 375 アミノ酸、少なくとも 400 アミノ酸および少なくとも 425 アミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム毒素 HN 領域を含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 350 アミノ酸、多くとも 375 アミノ酸、多くとも 400 アミノ酸および多くとも 425 アミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム毒素 HN 領域を含みうる。
【００８５】
様々な 配列 アラインメント 方法のいずれを用いて天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体および非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル 方法、ローカル 方法およびハイブリッド 方法、例えば、セグメント アプローチ 方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは、当業者の範囲内で本教示から常套の手順である。
【００８６】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素転位置ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームまたはクロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、クロストリジウム毒素 キメラ HN 領域、活性のクロストリジウム毒素 HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００８７】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは BoNT/A HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、天然 BoNT/A HN 領域変異体、例えば、BoNT/A アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/A サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1の天然 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、例えば、配列番号1のBoNT/A アイソフォームのアミノ酸449-873または配列番号1のBoNT/A サブタイプのアミノ酸449-873を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、非天然 BoNT/A HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/A HN 領域変異体、非保存的 BoNT/A HN 領域変異体、BoNT/A キメラ HN 領域、活性のBoNT/A HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1の非天然 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、例えば、配列番号1の保存的 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、配列番号1の非保存的 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、配列番号1の活性のBoNT/A HN 領域断片のアミノ酸449-873、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００８８】
この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８９】
この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸449-873に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９０】
この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９１】
別の態様において、a クロストリジウム毒素転位置ドメインは、BoNT/B HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/B HN 領域は配列番号2のアミノ酸442-860を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、天然 BoNT/B HN 領域変異体、例えば、BoNT/B アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/B サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2の天然 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、例えば、配列番号2のBoNT/B アイソフォームのアミノ酸442-860または配列番号2のBoNT/B サブタイプのアミノ酸442-860を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、非天然 BoNT/B HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/B HN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HN 領域変異体、BoNT/B キメラ HN 領域、活性のBoNT/B HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2の非天然 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、例えば、配列番号2の保存的 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、配列番号2の非保存的 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、配列番号2の活性のBoNT/B HN 領域断片のアミノ酸442-860、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００９２】
この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860 と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９３】
この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９４】
この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９５】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/C1 HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、天然 BoNT/C1 HN 領域変異体、例えば、BoNT/C1 アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/C1 サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3の天然 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868、例えば、配列番号3のBoNT/C1 アイソフォームのアミノ酸450-868または配列番号3のBoNT/C1 サブタイプのアミノ酸450-868を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、非天然 BoNT/C1 HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、BoNT/C1 キメラ HN 領域、活性のBoNT/C1 HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は配列番号3の非天然 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868 、例えば、配列番号3の保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868、配列番号3の非保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868、配列番号3の活性のBoNT/C1 HN 領域断片のアミノ酸450-868、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００９６】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９７】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９８】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９９】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは BoNT/D HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/D HN 領域は配列番号4のアミノ酸446-864を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、天然 BoNT/D HN 領域変異体、例えば、BoNT/D アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/D サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は配列番号4の天然 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、例えば、配列番号4のBoNT/D アイソフォームのアミノ酸446-864または配列番号4のBoNT/D サブタイプのアミノ酸446-864を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、非天然 BoNT/D HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/D HN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HN 領域変異体、BoNT/D キメラ HN 領域、活性のBoNT/D HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4の非天然 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、例えば、配列番号4の保存的 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、配列番号4の非保存的 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、配列番号4の活性のBoNT/D HN 領域断片のアミノ酸446-864、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１００】
この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０１】
この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸446-864に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０２】
この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０３】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/E HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5のアミノ酸423-847を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、天然 BoNT/E HN 領域変異体、例えば、BoNT/E アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/E サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5の天然 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、例えば、配列番号5のBoNT/E アイソフォームのアミノ酸423-847 または配列番号5のBoNT/E サブタイプのアミノ酸423-847を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、非天然 BoNT/E HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/E HN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HN 領域変異体、BoNT/E キメラ HN 領域、活性のBoNT/E HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5の非天然 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、例えば、配列番号5の保存的 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、配列番号5の非保存的 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、配列番号5の活性のBoNT/E HN 領域断片のアミノ酸423-847、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１０４】
この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０５】
この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸423-847に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０６】
この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０７】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/F HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/F HN 領域は配列番号6のアミノ酸440-866を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、天然 BoNT/F HN 領域変異体、例えば、BoNT/F アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/F サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6の天然 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、例えば、配列番号6のBoNT/F アイソフォームのアミノ酸440-866または配列番号6のBoNT/F サブタイプのアミノ酸440-866を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、非天然 BoNT/F HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/F HN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HN 領域変異体、BoNT/F キメラ HN 領域、活性のBoNT/F HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6の非天然 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、例えば、配列番号6の保存的 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、配列番号6の非保存的 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、配列番号6の活性のBoNT/F HN 領域断片のアミノ酸440-866、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１０８】
この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０９】
この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１０】
この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１１】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/G HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/G HN 領域は配列番号7のアミノ酸447-865を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、天然 BoNT/G HN 領域変異体、例えば、BoNT/G アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/G サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7の天然 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、例えば、配列番号7のBoNT/G アイソフォームのアミノ酸447-865または配列番号7のBoNT/G サブタイプのアミノ酸447-865を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、非天然 BoNT/G HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/G HN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HN 領域変異体、BoNT/G キメラ HN 領域、活性のBoNT/G HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7の非天然 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、例えば、配列番号7の保存的 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、配列番号7の非保存的 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、配列番号7の活性のBoNT/G HN 領域断片のアミノ酸447-865、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１１２】
この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。 
【０１１３】
この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１４】
この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１５】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはTeNT HN 領域を含む。この態様の側面において、TeNT HN 領域は配列番号8のアミノ酸458-881を含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、天然 TeNT HN 領域変異体、例えば、TeNT アイソフォームからのHN 領域またはTeNT サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8の天然 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、例えば、配列番号8のTeNT アイソフォームのアミノ酸458-881または配列番号8のTeNT サブタイプのアミノ酸458-881を含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、非天然 TeNT HN 領域変異体、例えば、保存的 TeNT HN 領域変異体、非保存的 TeNT HN 領域変異体、TeNT キメラ HN 領域、活性のTeNT HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8の非天然 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、例えば、配列番号8の保存的 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、配列番号8の非保存的 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、配列番号8の活性のTeNT HN 領域断片のアミノ酸458-881、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１１６】
この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１１７】
この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１８】
この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１９】
本発明の側面は、部分的には、転位置促進ドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「転位置促進ドメイン」という用語は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来るあらゆるポリペプチドを意味する。したがって、転位置促進ドメインは、クロストリジウム毒素軽鎖が膜を横切る運動においてクロストリジウム毒素転位置ドメインを補助し、細胞内小胞の膜を介する細胞の細胞質へのクロストリジウム毒素軽鎖の運動を包含する。転位置促進ドメインの非限定的な例は、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、例えば、クロストリジウム毒素 HCN 領域、例えば、BoNT/A HCN 領域、BoNT/B HCN 領域、BoNT/C1 HCN 領域、BoNT/D HCN 領域、BoNT/E HCN 領域、BoNT/F HCN 領域、BoNT/G HCN 領域、およびTeNT HCN 領域である。転位置促進ドメインの別の非限定的な例は、エンベロープを持ったウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、アルファウイルス、ベシクロウイルス、レスピロウイルス、モルビリウイルス、アブラウイルス、ヘニパウイルス、メタニューモウイルスおよび泡沫状ウイルスにみられるウイルス融合ペプチドドメインである。
【０１２０】
したがって、一つの態様において、転位置促進ドメインは、クロストリジウム毒素軽鎖が膜を横切る運動においてクロストリジウム毒素転位置ドメインを支援する。この態様の側面において、転位置促進ドメインは、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、少なくとも 10％、少なくとも 20％、少なくとも 30％、少なくとも 40％、少なくとも 50％、少なくとも 60％、少なくとも 70％、少なくとも 80％、少なくとも 90％ または少なくとも 100％上昇させることにより、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において、クロストリジウム毒素転位置ドメインを支援する。この態様の別の側面において、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、少なくとも ２倍、少なくとも ３倍、少なくとも ４倍、少なくとも ５倍、少なくとも １０倍または少なくとも ２０倍上昇させることによって、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置ドメインを支援する。この態様のさらに別の側面において、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、多くとも 10％、多くとも 20％、多くとも 30％、多くとも 40％、多くとも 50％、多くとも 60％、多くとも 70％、多くとも 80％、多くとも 90％または多くとも 100％上昇させることによって、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置ドメインを支援する。この態様の別の側面において、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、多くとも ２倍、多くとも ３倍、多くとも ４倍、多くとも ５倍、多くとも １０倍または多くとも ２０倍上昇させることによって、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において、転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置ドメインを支援する。
【０１２１】
クロストリジウム毒素「転位置促進ドメイン」には、これらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプ; 非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、クロストリジウム毒素 HCN 領域キメラ、その活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せが含まれる。
【０１２２】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列(表1参照)の対応する領域から少なくとも１つの アミノ酸変化を有し、参照配列の対応する領域に対してパーセント同一性にて記載することが出来るクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味する。明示的に示さない限り、本明細書に開示されるすべてのクロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することができる。非限定的な例として、配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A HCN 領域変異体は、配列番号1のアミノ酸領域 874-1110と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号2のアミノ酸861-1097を含むBoNT/B HCN 領域変異体は、配列番号2のアミノ酸領域 861-1097と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号3のアミノ酸869-1111を含むBoNT/C1 HCN 領域変異体は、配列番号3のアミノ酸領域 869-1111と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号4のアミノ酸865-1098を含む BoNT/D HCN 領域変異体は、配列番号4のアミノ酸領域 865-1098と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号5のアミノ酸848-1085を含む BoNT/E HCN 領域変異体は、配列番号5のアミノ酸領域 848-1085 と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号6のアミノ酸867-1105を含むBoNT/F HCN 領域変異体は、配列番号6のアミノ酸領域 867-1105と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号7のアミノ酸866-1105 を含むBoNT/G HCN 領域変異体は、配列番号7のアミノ酸領域 866-1105と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; および配列番号8のアミノ酸882-1127を含むTeNT HCN 領域変異体は、配列番号8のアミノ酸領域 882-1127と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【０１２３】
クロストリジウム毒素の各血清型のなかで、そのアミノ酸配列およびかかるタンパク質をコードする核酸においていくらか相違する天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が存在しうることが当業者に認識されている。例えば、現在４つのBoNT/A サブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 および BoNT/A4が存在し、別のBoNT/A HCN 領域サブタイプと比較した場合およそ 87％のアミノ酸同一性を示す特異的 HCN 領域サブタイプを有する。本明細書において用いる場合、「天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、天然プロセスにより生産されるあらゆるクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されるクロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォーム、自然突然変異により生産されるクロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプが挙げられる。天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸または５０以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【０１２４】
天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォーム、例えば、BoNT/A HCN 領域アイソフォーム、BoNT/B HCN 領域アイソフォーム、BoNT/C1 HCN 領域アイソフォーム、BoNT/D HCN 領域アイソフォーム、BoNT/E HCN 領域アイソフォーム、BoNT/F HCN 領域アイソフォーム、BoNT/G HCN 領域アイソフォーム、およびTeNT HCN 領域アイソフォームである。クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームは、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームが基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。 
【０１２５】
天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の別の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプ、例えば、サブタイプ BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 およびBoNT/A4からのHCN 領域;サブタイプ BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B 二価 および BoNT/B タンパク非分解性からのHCN 領域;サブタイプ BoNT/C1-1 およびBoNT/C1-2からのHCN 領域;サブタイプ BoNT/E1、BoNT/E2 およびBoNT/E3 HCN 領域; およびサブタイプ BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3およびBoNT/F4からのHCN 領域である。クロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプは、クロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプが基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。
【０１２６】
本明細書において用いる場合、「非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、ヒト 操作の助けにより生産されたあらゆるクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されたクロストリジウム毒素 HCN 領域および化学合成により生産されたクロストリジウム毒素 HCN 領域が挙げられる。非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、クロストリジウム毒素 HCN 領域キメラ変異体および活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片が挙げられる。 
【０１２７】
本明細書において用いる場合、「保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素 HCN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸のものと類似する少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸アナログによって少なくとも１つの アミノ酸が置換されたクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域 と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸または１００以上のアミノ酸置換している可能性がある。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、および保存的 TeNT HCN 領域変異体が挙げられる。
【０１２８】
本明細書において用いる場合、「非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、 1) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から欠失している; 2) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に付加されている;または 3) 少なくとも１つの アミノ酸が参照クロストリジウム毒素 HCN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸のものと類似のいかなる性質も共有していない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより置換されている、クロストリジウム毒素 HCN 領域を意味する。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体 は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸欠失している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸付加されている可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸または１００以上のアミノ酸置換している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体はまた、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、および非保存的 TeNT HCN 領域変異体が挙げられる。
【０１２９】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HCN 領域キメラ」という用語は、少なくともクロストリジウム毒素 HCN 領域の一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表1の参照クロストリジウム毒素 HCN 領域とは異なる少なくとも１つの性質を有する毒素 HCN 領域を形成するポリペプチドを意味し、ただしこのクロストリジウム毒素 HCN 領域キメラは依然としてLCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程を促進することが出来、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行において寄与しうるものである。
【０１３０】
本明細書において用いる場合、「活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片」という用語は、本発明の側面に有用であり得るHCN 領域を含むあらゆる様々なクロストリジウム毒素断片を意味し、ただし、これらの活性の断片はLCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することができ、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行において寄与することができるものである。クロストリジウム毒素の重鎖からのHCNドメインはおよそ 230-250 アミノ酸の長さであり、転位置ドメインを含む(表1)。さらに、クロストリジウム毒素 HCN 領域の境界を規定する特定のアミノ酸位置が同定されているが(表1)、機能的境界は決定的ではないということが当該技術分野において周知である。例えば、すべての天然クロストリジウム毒素についてのHCN ドメインのアミノ末端はHN ドメイン (転位置ドメイン)である。BoNT/Aの構造の調査において、ランダムコイルリンカー領域が HN および HCN ドメインの間の境界を形成している(図7A参照)。BoNT/A HN ドメインはアミノ酸 N859からI873を含むα-ヘリックスにて終わっているようである。α-ヘリックスに続いて、HCN ドメインへと導くランダムコイル (I873からI878)が存在し、ここでβ-シートが位置I878にて開始している。上記残基は決定された二次構造の最初または最後において境界を規定するが、ランダムコイル 領域およびそれがつなげるドメインの一方または両方における残基の間に有意な相互作用(即ち、疎水性、H-結合など)がないことを意味するものではない。したがって、最小限、BoNT/A HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 Y869 から L879に存在するいずれかのアミノ酸を含みうる。同様の分析が、BoNT/B HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は最小限、アミノ酸領域 Y856からL866に存在するいずれかのアミノ酸でありうることを示している; BoNT/C1 HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸はアミノ酸領域 Y864から L874に存在するいずれかのアミノ酸でありうる; BoNT/D HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 Y860から L870に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/E HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 F843からL853に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/F HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 L862からL872に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/G HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸はアミノ酸領域 Y861から L871に存在するいずれかのアミノ酸でありうる;そして、TeNT HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 I877から L887に存在するいずれかのアミノ酸であり得る。
【０１３１】
同様に、すべての天然クロストリジウム毒素のHCN ドメインのカルボキシル-末端部分(即ち、HCNおよび HCC ドメインの間の融合点)はある範囲のアミノ酸を含む。秩序だった二次構造の最初または最後としてのBoNT/A HCN ドメインの境界の規定において、HCN ドメインはα-ヘリックスのQ1091にて終わっている可能性があり、HCC ドメインはβ-鎖のK1109から開始している可能性がある(図7B参照)。これら２つのドメインに介在するアミノ酸配列は、より長いランダムコイルを含むが、これはランダムコイルが構造的に重要ではないことを意味するわけではない。実際、このランダムコイルは、HCN および HCC ドメインの両方と大きな相互作用を有する (即ち、疎水性およびH-結合)。したがって、最小限、BoNT/A HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 D1089からY1111に存在するいずれかのアミノ酸を含みうる。同様の分析が、最小限、BoNT/B HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸はアミノ酸領域 K1076からY1098に存在するいずれかのアミノ酸であることを示している; BoNT/C1 HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 N1090から Y1112に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/D HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 E1077から Y1099に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/E HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 S1064からY1086に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/F HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 S1084から Y1106に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/G HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 W1084から Y1106に存在するいずれかのアミノ酸であり得る;および、TeNT HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 T1106から Y1128に存在するいずれかのアミノ酸であり得る。
【０１３２】
したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 200 アミノ酸、少なくとも 225 アミノ酸、少なくとも 250 アミノ酸および少なくとも 275 アミノ酸の長さを有する転位置促進ドメインを含むクロストリジウム毒素 HCN 領域を含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 200 アミノ酸、多くとも 225 アミノ酸、多くとも 250 アミノ酸および多くとも 275 アミノ酸の長さを有する転位置促進ドメインを含むクロストリジウム毒素 HCN 領域を含みうる。
【０１３３】
様々な配列アラインメント方法のいずれを用いて天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体および非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル 方法、ローカル 方法およびハイブリッド 方法、例えば、セグメント アプローチ 方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは、当業者の範囲内で、本教示から常套の手順である。
【０１３４】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームまたはクロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、クロストリジウム毒素 キメラ HCN 領域、活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１３５】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、BoNT/A HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、天然 BoNT/A HCN 領域変異体、例えば、BoNT/A アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/A サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1の天然 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、例えば、配列番号1のBoNT/A アイソフォームのアミノ酸874-1110または配列番号1のBoNT/A サブタイプのアミノ酸874-1110 を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、非天然 BoNT/A HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、BoNT/A キメラ HCN 領域、活性のBoNT/A HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1の非天然 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、例えば、配列番号1の保存的 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、配列番号1の非保存的 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、配列番号1の活性のBoNT/A HCN 領域断片のアミノ酸874-1110、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１３６】
この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３７】
この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１３８】
この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１３９】
別の態様において、a クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはBoNT/B HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/B HCN 領域は配列番号2のアミノ酸861-1097を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、天然 BoNT/B HCN 領域変異体、例えば、BoNT/B アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/B サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2の天然 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、例えば、配列番号2のBoNT/B アイソフォームのアミノ酸861-1097または配列番号2のBoNT/B サブタイプのアミノ酸861-1097を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、非天然 BoNT/B HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、BoNT/B キメラ HCN 領域、活性のBoNT/B HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2の非天然 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、例えば、配列番号2の保存的 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、配列番号2の非保存的 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、配列番号2の活性のBoNT/B HCN 領域断片のアミノ酸861-1097、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１４０】
この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４１】
この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４２】
この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４３】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはBoNT/C1 HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は配列番号3のアミノ酸869-1111を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体、例えば、BoNT/C1 アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/C1 サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3の天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、例えば、配列番号3のBoNT/C1 アイソフォームのアミノ酸869-1111または配列番号3のBoNT/C1 サブタイプのアミノ酸869-1111を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、非天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、BoNT/C1 キメラ HCN 領域、活性のBoNT/C1 HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3の非天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、例えば、配列番号3の保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、配列番号3の非保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、配列番号3の活性のBoNT/C1 HCN 領域断片のアミノ酸869-1111、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１４４】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４５】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４６】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４７】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはBoNT/D HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/D HCN 領域は配列番号4のアミノ酸865-1098を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は天然 BoNT/D HCN 領域変異体、例えば、BoNT/D アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/D サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、配列番号4の天然 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、例えば、配列番号4のBoNT/D アイソフォームのアミノ酸865-1098または配列番号4のBoNT/D サブタイプのアミノ酸865-1098 を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は非天然 BoNT/D HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、BoNT/D キメラ HCN 領域、活性のBoNT/D HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、配列番号4の非天然 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、例えば、配列番号4の保存的 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、配列番号4の非保存的 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、配列番号4の活性のBoNT/D HCN 領域断片のアミノ酸865-1098、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１４８】
この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４９】
この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５０】
この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５１】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはBoNT/E HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/E HCN 領域は配列番号5のアミノ酸848-1085を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、天然 BoNT/E HCN 領域変異体、例えば、BoNT/E アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/E サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、配列番号5の天然 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、例えば、配列番号5のBoNT/E アイソフォームのアミノ酸848-1085 または配列番号5のBoNT/E サブタイプのアミノ酸848-1085を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、非天然 BoNT/E HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、BoNT/E キメラ HCN 領域、活性のBoNT/E HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は配列番号5の非天然 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、例えば、配列番号5の保存的 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、配列番号5の非保存的 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、配列番号5の活性のBoNT/E HCN 領域断片のアミノ酸848-1085、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１５２】
この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５３】
この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５４】
この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５５】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはBoNT/F HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/F HCN 領域は配列番号6のアミノ酸867-1105を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、天然 BoNT/F HCN 領域変異体、例えば、BoNT/F アイソフォーム からの HCN 領域またはBoNT/F サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、配列番号6の天然 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、例えば、配列番号6のBoNT/F アイソフォームのアミノ酸867-1105または配列番号6のBoNT/F サブタイプのアミノ酸867-1105を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、非天然 BoNT/F HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、BoNT/F キメラ HCN 領域、活性のBoNT/F HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、配列番号6の非天然 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、例えば、配列番号6の保存的 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、配列番号6の非保存的 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、配列番号6の活性のBoNT/F HCN 領域断片のアミノ酸867-1105、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１５６】
この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５７】
この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５８】
この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５９】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは BoNT/G HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/G HCN 領域は配列番号7のアミノ酸866-1105を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は天然 BoNT/G HCN 領域変異体、例えば、BoNT/G アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/G サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、配列番号7の天然 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、例えば、配列番号7のBoNT/G アイソフォームのアミノ酸866-1105または配列番号7のBoNT/G サブタイプのアミノ酸866-1105を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、非天然 BoNT/G HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、BoNT/G キメラ HCN 領域、活性のBoNT/G HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、配列番号7の非天然 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、例えば、配列番号7の保存的 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、配列番号7の非保存的 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、配列番号7の活性のBoNT/G HCN 領域断片のアミノ酸866-1105、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１６０】
この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６１】
この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１６２】
この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１６３】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはTeNT HCN 領域を含む。この態様の側面において、TeNT HCN 領域は配列番号8のアミノ酸882-1127を含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、天然 TeNT HCN 領域変異体、例えば、TeNT アイソフォームからの HCN 領域またはTeNT サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、配列番号8の天然 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、例えば、配列番号8のTeNT アイソフォームのアミノ酸882-1127 または配列番号8のTeNT サブタイプのアミノ酸882-1127を含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、非天然 TeNT HCN 領域変異体、例えば、保存的 TeNT HCN 領域変異体、非保存的 TeNT HCN 領域変異体、TeNT キメラ HCN 領域、活性のTeNT HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、配列番号8の非天然 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、例えば、配列番号8の保存的 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、配列番号8の非保存的 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、配列番号8の活性のTeNT HCN 領域断片のアミノ酸882-1127、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１６４】
この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６５】
この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１６６】
この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１６７】
エンベロープを持ったウイルスの膜の細胞膜への融合は、宿主細胞の細胞質へのウイルスカプセルの放出において必須の工程である。この融合事象は、ウイルス膜に位置するウイルス糖タンパク質に存在する融合ペプチド セグメントによって媒介され、pH-依存的またはpH-非依存的プロセスのいずれかを伴い、例えば、Frederick M. Hughson, Structural Characterization of Viral Fusion Proteins, 5(3) Curr. Biol. 265-274 (1995); Trudy G. Morrison, Structure and Function of a Paramyxovirus Fusion Protein, 1614(1) Biochim. Biophys. Acta. 73-84; David J. Schibli and Winfried Weissenhorn, Class I and Class II Viral Fusion Protein Structures Reveal Similar Principles in Membrane Fusion, 21(6) Mol. Membr. Biol. 361-371 (2004) を参照されたい。融合ペプチドドメインは、ウイルスカプセルの細胞膜への挿入において補助する疎水性のおよそ 20-30 アミノ酸のグリシンリッチペプチドを含む。したがって、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインは転位置促進ドメインとして有用であり得る。
【０１６８】
エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインとしては、これらに限定されないが、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームおよびエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプ; 非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン キメラ、その活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン 断片、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【０１６９】
本明細書において用いる場合、「エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列の対応する領域から少なくとも１つの アミノ酸変化を有し、その参照配列の対応する領域に対するパーセント同一性において記載できるエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味する。明示的に示さない限り、本明細書に開示するすべてのクロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来る。非限定的な例として、配列番号194を含むインフルエンザウイルス A 融合ペプチドドメイン変異体は、配列番号194と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号199を含むセムリキ森林ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号199と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号201を含む東部ウマ脳炎ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号201と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号209を含むベネズエラウマ脳炎ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は、配列番号209と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号226を含む水疱性口内炎ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号226と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号237を含むセンダイウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号237と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号244を含むイヌジステンパーウイルス融合ペプチドドメイン変異体は、配列番号244と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号254を含むニューカッスル病ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号254と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;そして配列番号267を含むヘンドラウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号267と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【０１７０】
各エンベロープを持ったウイルスについて、そのアミノ酸配列およびかかるタンパク質をコードする核酸においていくらか異なる天然 融合ペプチドドメイン変異体が存在しうることが当業者に認識されている。例えば、インフルエンザAウイルス 赤血球凝集素に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも５の 天然変異体が知られている(配列番号194 から配列番号198);東部ウマ脳炎ウイルス E1 タンパク質に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも６の 天然変異体が知られている(配列番号201から配列番号206); ベネズエラウマ脳炎ウイルス E1 タンパク質に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも８の 天然変異体が知られている(配列番号209から 配列番号216);水疱性口内炎ウイルス (VSV) 糖タンパク質 Gに存在する融合ペプチドドメインの少なくとも７の 天然変異体が知られている(配列番号226から配列番号232); および、ニューカッスル病ウイルス F タンパク質 に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも１１の 天然変異体が知られている(配列番号254から配列番号264)。本明細書において用いる場合、「エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、天然プロセスによって生産されるあらゆるエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味し、例えば、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォーム、自然突然変異により生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームおよびエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプが挙げられる。天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体 は、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において、参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸または１０以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体はまた、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも 2 の連続するアミノ酸、少なくとも 3 の連続するアミノ酸、少なくとも 4 の連続するアミノ酸、または少なくとも 5 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【０１７１】
天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォーム、例えば、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、アルファウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、レスピロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、モルビリウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、アブラウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームおよび泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームである。エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォーム は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。
【０１７２】
天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプ、例えば、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、アルファウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、レスピロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、モルビリウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、アブラウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ および泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインサブタイプである。エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプ は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。
【０１７３】
本明細書において用いる場合、「非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、ヒト操作の助けにより生産されたあらゆるエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインおよび化学合成により生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが挙げられる。非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例としては、 例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラ変異体および活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片が挙げられる。
【０１７４】
本明細書において用いる場合、「保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン配列からの元のアミノ酸と類似の少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより少なくとも１つのアミノ酸が置換されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的 性質など、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸または１０以上のアミノ酸置換している可能性がある。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体はまた、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも 2 の連続するアミノ酸、少なくとも 3 の連続するアミノ酸、少なくとも 4 の連続するアミノ酸、または少なくとも 5 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体および保存的 泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン変異体が挙げられる。
【０１７５】
本明細書において用いる場合、「非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、1)非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも１つの アミノ酸が欠失している; 2)非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも１つの アミノ酸が付加されている; または、 3)参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン配列からの元のアミノ酸のものと類似のいかなる性質も共有しない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより少なくとも１つの アミノ酸 が置換されている、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味する。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体 は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸または５以上のアミノ酸が欠失している可能性がある。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン に対して１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸または５以上のアミノ酸が付加されている可能性がある。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸または１０以上のアミノ酸が置換している可能性がある。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体 はまた、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも 2 の連続するアミノ酸、少なくとも 3 の連続するアミノ酸、少なくとも 4 の連続するアミノ酸、または少なくとも 5 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体および非保存的 泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン変異体が挙げられる。
【０１７６】
本明細書において用いる場合、「エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラ」という用語は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインの少なくとも一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインとは異なる少なくとも１つの 性質を有するエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを形成する、ポリペプチドを意味し、ただし、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラは依然としてLCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行に寄与することが出来るものである。
【０１７７】
本明細書において用いる場合、「活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片」という用語は、LCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来、したがって、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行に寄与することが出来るあらゆる様々な エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片を意味する。エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインはおよそ 15-30 アミノ酸の長さである。したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 10 アミノ酸、少なくとも 15 アミノ酸、少なくとも 20 アミノ酸および少なくとも 25 アミノ酸の長さを有する活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片を含む転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 10 アミノ酸、多くとも 15 アミノ酸、多くとも 20 アミノ酸および多くとも 25 アミノ酸の長さを有する活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片を含む転位置促進ドメインを含みうる。
【０１７８】
様々な 配列 アラインメント 方法のいずれを用いて、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体および非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル方法、ローカル方法およびハイブリッド 方法、例えば、セグメント アプローチ 方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは当業者の範囲内であり、本教示から常套の手順である。
【０１７９】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含むクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームまたはエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラ、活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１８０】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198の天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198のインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198のインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198の非天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198の保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198の非保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198の活性のインフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１８１】
この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８２】
この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８３】
この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 または配列番号198に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８４】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはアルファウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、天然 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、アルファウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはアルファウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225の天然 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225のアルファウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225のアルファウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、アルファウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の アルファウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225の非天然アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225の保存的ア���ファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225の非保存的アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225の活性の アルファウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１８５】
この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197または配列番号198と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と少なくとも 90％のアミノ酸同一性 または配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８６】
この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225 に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204���配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８７】
この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 または配列番号225に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８８】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはベシクロウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはベシクロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236の天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236のベシクロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236のベシクロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236の非天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236の保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236の非保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236の活性の ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１８９】
この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９０】
この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９１】
この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 または配列番号236に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９２】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはレスピロウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、レスピロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはレスピロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243の天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243のレスピロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243のレスピロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、レスピロウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の レスピロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243の非天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243の保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243の非保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243の活性の レスピロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１９３】
この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９４】
この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９５】
この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 または配列番号243に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９６】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、モルビリウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、モルビリウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはモルビリウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253の天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253のモルビリウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253のモルビリウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、モルビリウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の モルビリウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253の非天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253の保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253の非保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253の活性の モルビリウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１９７】
この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９８】
この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９９】
この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 または配列番号253に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２００】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、アブラウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、アブラウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはアブラウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266の天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266の、アブラウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266のアブラウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、アブラウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の アブラウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266の非天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266の保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266の非保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266の活性の アブラウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０２０１】
この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２０２】
この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２０３】
この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 または配列番号266に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２０４】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはヘニパウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはヘニパウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号267 または配列番号268の天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号267 または配列番号268のヘニパウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号267 または配列番号268のヘニパウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号267 または配列番号268の非天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号267 または配列番号268の保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号267 または配列番号268の非保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号267 または配列番号268の活性の ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０２０５】
この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号267 または配列番号268と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号267 または配列番号268と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号267 または配列番号268と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２０６】
この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 
【０２０７】
この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号267 または配列番号268に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２０８】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはメタニューモウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、配列番号269の天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号269のメタニューモウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号269のメタニューモウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、非天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、配列番号269の非天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号269の保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号269の非保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号269の活性の メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０２０９】
この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号269と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号269と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号269と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号269と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号269と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号269と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号269と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号269と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号269と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号269と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１０】
この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 
【０２１１】
この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号269に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 
【０２１２】
本発明の側面は、部分的には変化したターゲティングドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「変化したターゲティングドメイン」という用語は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することが出来、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒させる全体のインターナリゼーション 機構を開始することが出来るあらゆるポリペプチドを意味する。本明細書において用いる場合、「選択的に」という用語は、高度に好ましい活性または作用を有することを意味する。本明細書において用いる場合、「選択的に結合する」という用語は、分子が生理条件下で、または生理条件下に実質的に近いインビトロ条件で、その他の非標的受容体と比較して統計的に有意に大きい程度でその標的受容体に結合することが出来ることを意味する。したがって、本明細書の変化したターゲティングドメインに対する言及において、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する変化したターゲティングドメインの差別的な結合が存在する。
【０２１３】
本明細書に開示する変化したターゲティングドメインは、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の、クロストリジウム毒素標的細胞の表面に位置する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合活性を促進する。本明細書において用いる場合、「結合活性」という用語は、１つの分子が、少なくとも１つの分子間または分子内力、例えば、これらに限定されないが、共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用等、またはそれらのあらゆる組合せを介して別の分子と直接的または間接的に接触することを意味する。「結合した」および「結合する」は、結合について考えられる用語である。
【０２１４】
本明細書において用いる場合、「結合親和性」という用語は、特定の受容体に対して分子の結合活性がいかに強いかを意味する。一般に、高い結合親和性は、結合ドメインとその受容体とのより大きい分子間力に起因し、一方低い結合親和性は、リガンドとその受容体とのより小さい分子間力を伴う。高い結合親和性は、低い結合親和性の場合よりもその受容体結合部位における結合ドメインについてのより長い滞留時間を伴う。したがって、高い結合親和性を有する分子は、受容体の結合部位を最大に占有し、生理応答を引き起こすのに必要な分子の濃度がより低いことを意味する。逆に、低い結合親和性は、受容体の受容体結合部位が最大に占有され、最大の生理応答が達成される前に必要な分子の濃度が比較的高いことを意味する。したがって、高い結合親和性に起因する上昇した結合活性を有する改変クロストリジウム毒素は、毒素のより低用量の投与を可能にし、それにより、毒素の非標的化領域への分散に伴う望ましくない 副作用を低下または予防する。
【０２１５】
本明細書において用いる場合、「結合特異性」という用語は、１つの特定の受容体に対して分子の結合活性がどの程度特異的であるかを意味する。一般に、高い結合特異性は１つの特定の受容体または受容体の亜群とのより独占的な相互作用をもたらし、一方低い結合特異性は、より大きい群の受容体とのより乱れた相互作用をもたらす。したがって、高い結合特異性を有する分子は、分子が特定の受容体の結合部位を占有し、生理応答を惹起することを意味する。逆に、低い結合特異性は、分子が多くの受容体の結合部位を占有し多数の生理応答を惹起することを意味する。したがって、高い結合特異性に起因する上昇した結合活性を有する改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム毒素標的細胞のある亜群に存在する非クロストリジウム毒素受容体のみを標的化し、それによりすべての非クロストリジウム毒素標的細胞の標的化に伴う副作用が低減される。
【０２１６】
その変化したターゲィング活性に加えて、本明細書の開示される天然のターゲティングドメインの変化したターゲットドメインとの置換は、改変毒素が免疫原性応答を誘発する可能性を減少するというさらなる利点を有する。HCC ターゲティングドメインにみられる領域には、抗BoNT/A中和抗体が結合する（例えば、M. Zouhair Atassi et al.、Mapping of the Antibody-binding Regions on Botulinum Neurotoxin H-chain Domain 855-1296 with Anti-toxin Antibodies from Three Host Species、15 J. PROT. CHEM. 691-700、(1996); M. Zouhair Atassi & Behzod Z. Dolimbek、Mapping of the Antibody-binding Profile on Botulinum Neurotoxin A HN-domain (residues 449-859) with Anti-toxin Antibodies from Four Host Species. Antigenic Profile of the Entire H-chain of Botulinum Neurotoxin A、23(1) PROTEIN J. 39-52、(2004)を参照）。それゆえ、1) クロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインが不在; 2) ヒト由来の変化したターゲティングドメインはそれがヒトポリペプチドであるためおそらく患者において免疫原性応答を誘発しない、との理由から、このターゲティングドメインの除去により免疫原性応答の可能性が減少する。
【０２１７】
本明細書において用いる場合、用語「非クロストリジウム毒素標的細胞」は、天然クロストリジウム毒素により中毒がおこりうる天然の細胞（限定はされないが、以下が含まれる：運動神経; 感覚神経; 自律神経;例えば、交感神経および副交感神経; および非神経細胞、例えば、下垂体前葉細胞；副腎細胞、例えば、副腎髄質クロム親和性細胞；膵臓細胞、例えば、膵腺房細胞、膵臓β細胞；卵巣細胞；腎臓細胞、例えば、内部髄質集合管（inner medullary collecting duct）（IMCD）細胞；胃細胞、例えば、クロム親和性細胞；血液細胞、例えば、赤血球、白血球、血小板、好中球、好酸球、肥満細胞；上皮細胞、例えば、；線維芽細胞；甲状腺細胞；軟骨細胞；筋肉細胞；肝細胞；腺細胞、例えば、下垂体細胞、クロム親和性細胞）ではない細胞を意味する。
【０２１８】
非クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対して結合活性を示す変化したターゲティングドメインはいずれも本発明の側面の実施に使用可能であると想定され、それには、限定はされないが、感覚神経、自律神経または非神経細胞上に存在する受容体に選択的に結合するポリペプチドが含まれる。本発明の側面の実施に有用な変化したターゲティングドメインとして有用なポリペプチドには、限定はされないが、以下が含まれる：オピオイドペプチド、例えば、エンケファリン、ウシ副腎髄質−２２（ＢＡＭ２２）ペプチド、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチンまたはヘモルフィン；メラノコルチンペプチド、例えば、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、β−メラノサイト刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）、γ−メラノサイト刺激ホルモン（γ−ＭＳＨ）、アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、コルチコトロピン様媒介ペプチド（Corticotropin-like intermediary peptide）（ＣＬＩＰ）、β−リポトロピン（β−ＬＰＨ）およびγ−リポトロピン（γ−ＬＰＨ）；ガラニン（galanin）、例えば、ガラニンおよびガラニンメッセージ関連ペプチド（galanin message-associated peptide）（ＧＭＡＰ）；グラニン（granin）、例えば、β-グラニン、バソスタチン（vasostatin）、クロモスタチン（chromostatin）、パンクレアスタチン（pancreastatin）、ＷＥ−１４、カテスタチン（catestatin）、パラスタチン（parastatin）、およびＧＥ−２５のようなクロモグラニンＡペプチド（chromogranin A peptide）、ＧＡＷＫペプチド、副腎髄質ペプチドおよびセクレトリチン（secretolytin）のようなクロモグラニンＢ（セクレトグラニンＩ（secretogranin I））ペプチド、およびセクレトニューリン（secretoneurin）、ＥＭ６６およびマンセリン（manserin）のようなクロモグラニンＣ（セクレトグラニンＩＩ）ペプチド；タキキニンペプチド、例えば、サブスタンスＰ、ニューロペプチドＫ（ＮＰＫ）、ニューロペプチドγ（ＮＰガンマ）、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ；サブスタンスＫ、ニューロキニンアルファ、ニューロメディン（neuromedin）Ｌ）、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ヘモキニンおよびエンドキニン；コレシストキニン、例えば、コレシストキニン５８、コレシストキニン３９、コレシストキニン３３、コレシストキニン１２およびコレシストキニン８；ニューロペプチドＹ関連ペプチド、例えば、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、膵臓ペプチド（pancreatic peptide）（ＰＰ）およびパンクレアティックイコサペプチド（pancreatic icosapeptide）（ＰＩＰ）；キニンペプチド、例えば、ブラジキニン、カリダン（kallidn）、desArg9 ブラジキニンおよびdesArg10 ブラジキニン；プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）ペプチド、例えば、ＰＡＲ１ペプチド、ＰＡＲ２ペプチド、ＰＡＲ３ペプチドおよびＰＡＲ４ペプチド；コルチコトロピン放出ホルモン；チロトロピン放出ホルモン（thyrotropin-releasing hormone）；ソマトスタチン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；およびインターロイキン−１（ＩＬ１）。
【０２１９】
変化したターゲティングドメインには、限定はされないが、天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、変化したターゲティングドメインのアイソフォーム; 非天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、キメラの変化したターゲティングドメイン、活性なそれらの変化したターゲティングドメインの断片、またはそれらいずれかの組合せ、が含まれる。
【０２２０】
本明細書において用いる場合、用語「変異体」は、変化したターゲティングドメインの変異体の説明に使用する場合、天然であっても非天然であっても、開示される参照配列の対応領域からの少なくとも1のアミノ酸変化を有し、かつその参照配列の対応領域との同一性の割合で説明可能な、変化したターゲティングドメインを意味する。特記なき限り、本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの変異体はいずれも、非クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合可能であり、全内部移行機構を開始させ、それにより本明細書に開示される改変クロストリジウム毒素による非クロストリジウム毒素標的細胞の中毒がおこる。非限定的な例として、配列番号:17由来のエンドルフィン−β改変体は、配列番号:17に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:21由来のダイモルフィンＡ（dymorphin A）改変体は、配列番号:21に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:52由来のノシセプチン改変体は、配列番号:52に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:72由来のガラニン改変体は、配列番号:72に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:83由来の副腎髄質ペプチド改変体は、配列番号:83に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:88由来のサブスタンスＰ改変体は、配列番号:88に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:97由来のエンドキニン改変体は、配列番号:97に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:100由来のＣＣＫ改変体は、配列番号:100に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:116由来のＮＰＹ改変体は、配列番号:116に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る；配列番号:118由来のＰＰ改変体は、配列番号:118に比較して少なくとも１個のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有し得る。
【０２２１】
当業者であれば、そのアミノ酸配列が、またそのタンパク質をコードする核酸がある程度相違する、天然の変化したターゲティングドメインの変異体が存在しうることを認識する。本明細書において用いる場合、用語「天然の変化したターゲティングドメインの変異体」は、天然のプロセスにより産生されるあらゆる変化したターゲティングドメインを意味し、限定はされないが、選択的にスプライシングされた転写物から産生される変化したターゲティングドメインのアイソフォーム、自然突然変異により産生される変化したターゲティングドメインのアイソフォーム、および変化したターゲティングドメインのサブタイプが含まれる。天然の変化したターゲティングドメインの変異体は、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。天然の変化したターゲティングドメインの変異体は、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸、20以上のアミノ酸、30以上のアミノ酸、40以上のアミノ酸、50以上のアミノ酸または100以上のアミノ酸が置換されうる。天然の変化したターゲティングドメインの変異体はまた、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、少なくとも5の連続するアミノ酸、少なくとも10の連続するアミノ酸、少なくとも15の連続するアミノ酸、少なくとも20の連続するアミノ酸、または少なくとも25の連続するアミノ酸が置換され、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに対して、少なくとも50%のアミノ酸同一性、65%のアミノ酸同一性、75%のアミノ酸同一性、85%のアミノ酸同一性、または95%のアミノ酸同一性を有しうる。
【０２２２】
天然の変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例は、変化したターゲティングドメインのアイソフォーム、例えば、オピオイドペプチド、メラノコルチンペプチド、ガラニン、グラニン、タキキニンペプチド、コレシストキニン、ニューロペプチドＹ関連ペプチド、キニンペプチド、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）ペプチド、コルチコトロピン放出ホルモン、チロトロピン放出ホルモンおよびソマトスタチンである。変化したターゲティングドメインのアイソフォームは、その変化したターゲティングドメインのアイソフォームの基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。
【０２２３】
本明細書において用いる場合、用語「非天然の変化したターゲティングドメインの変異体」は、人為的操作により産生される変化したターゲティングドメインを意味し、限定はされないが、ランダム変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により産生される変化したターゲティングドメイン、および化学合成により産生される変化したターゲティングドメインが含まれる。非天然の変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例には、例えば、保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、変化したターゲティングドメインのキメラ変異体および活性な変化したターゲティングドメインの断片が含まれる。
【０２２４】
本明細書において用いる場合、用語「保存的な変化したターゲティングドメインの変異体」は、参照の変化したターゲティングドメインの配列のもとのアミノ酸と類似する少なくとも1の性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより置換された少なくとも1のアミノ酸を有する変化したターゲティングドメインを意味する。性質の例には、限定はされないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが含まれる。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、例えば、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸、20以上のアミノ酸、30以上のアミノ酸、40以上のアミノ酸、50以上のアミノ酸、100以上のアミノ酸、200以上のアミノ酸、300以上のアミノ酸、400以上の、または500以上のアミノ酸が置換されていてよい。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体はまた、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、少なくとも5の連続するアミノ酸、少なくとも10の連続するアミノ酸、少なくとも15の連続するアミノ酸、少なくとも20の連続するアミノ酸、または少なくとも25の連続するアミノ酸が置換され、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに対して、少なくとも50%のアミノ酸同一性、65%のアミノ酸同一性、75%のアミノ酸同一性、85%のアミノ酸同一性または95%のアミノ酸同一性を有しうる。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例には、例えば、保存的オピオイドペプチド変異体、保存的メラノコルチンペプチド変異体、保存的ガラニン変異体、保存的グラニン変異体、保存的タキキニンペプチド変異体、保存的コレシストキニン変異体、保存的ニューロペプチドＹ関連ペプチド変異体、保存的キニンペプチド変異体、保存的ＰＡＲペプチド変異体、保存的コルチコトロピン放出ホルモン変異体、保存的チロトロピン放出ホルモン変異体および保存的ソマトスタチン変異体が含まれる。
【０２２５】
本明細書において用いる場合、用語「非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体」は、1)その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから少なくとも1のアミノ酸が欠失している; 2) その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに少なくとも1のアミノ酸が付加されている; または3) 少なくとも1のアミノ酸が参照の変化したターゲティングドメインの配列のもとのアミノ酸と類似する性質を共有しない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより置換されている、変化したターゲティングドメインを意味する。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、および10以上のアミノ酸が欠失されうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、および10以上のアミノ酸が付加されうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸、20以上のアミノ酸、30以上のアミノ酸、40以上のアミノ酸、50以上のアミノ酸、100以上のアミノ酸、200以上のアミノ酸、300以上のアミノ酸、400以上の、または500以上のアミノ酸が置換されうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体はまた、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、少なくとも5の連続するアミノ酸、少なくとも10の連続するアミノ酸、少なくとも15の連続するアミノ酸、少なくとも20の連続するアミノ酸、または少なくとも25の連続するアミノ酸が置換され、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに対して少なくとも50%のアミノ酸同一性、65%のアミノ酸同一性、75%のアミノ酸同一性、85%のアミノ酸同一性または95%のアミノ酸同一性を有しうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例には、例えば、非保存的オピオイドペプチド変異体、非保存的メラノコルチンペプチド変異体、非保存的ガラニン変異体、非保存的グラニン変異体、非保存的タキキニンペプチド変異体、非保存的コレシストキニン変異体、非保存的ニューロペプチドＹ関連ペプチド変異���、非保存的キニンペプチド変異体、非保存的ＰＡＲペプチド変異体、非保存的コルチコトロピン放出ホルモン変異体、非保存的チロトロピン放出ホルモン変異体および非保存的ソマトスタチン変異体が含まれる。
【０２２６】
本明細書において用いる場合、用語「キメラの変化したターゲティングドメイン」は、ある変化したターゲティングドメインの少なくとも一部と、少なくとも1の他のポリペプチドの少なくとも一部とを含み、参照の変化したターゲティングドメインと少なくとも1の性質が異なる変化したターゲティングドメインを形成するポリペプチドを意味し、但しこのキメラの変化したターゲティングドメインがやはりクロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合可能であり、全内部移行機構を開始し、それにより改変クロストリジウム毒素による標的細胞の中毒がおこることを条件とする。
【０２２７】
本明細書において用いる場合、用語「活性な変化したターゲティングドメインの断片」は、本発明の側面において有用でありうる様々な変化したターゲティングドメインの断片を意味し、但しこれらの活性な断片がやはりクロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合可能であり、全内部移行機構を開始し、それにより改変クロストリジウム毒素による標的細胞の中毒がおこることを条件とする。すなわち、この態様の側面は、例えば、少なくとも5のアミノ酸、少なくとも10のアミノ酸、少なくとも20のアミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも350アミノ酸、少なくとも400アミノ酸および少なくとも450アミノ酸の長さを含む変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面は、例えば、最大5アミノ酸、最大10アミノ酸、最大20アミノ酸、最大30アミノ酸、最大40アミノ酸、最大50アミノ酸、最大100アミノ酸、最大150アミノ酸、最大200アミノ酸、最大250アミノ酸、最大300アミノ酸、最大350アミノ酸、最大400アミノ酸および最大450アミノ酸の長さを含む変化したターゲティングドメインを含みうる。
【０２２８】
様々な配列比較方法はいずれも天然の変化したターゲティングドメインの変異体および非天然の変化したターゲティングドメインの変異体の同一性の割合の決定に使用可能であり、限定はされないが、グローバル方法、ローカル方法、ハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法が含まれる。同一性の割合を決定するプロトコールは、当業者にとって、また本明細書の教示から、ルーチンな作業である。
【０２２９】
すなわち、ある態様において、本明細書に開示される改変クロストリジウム毒素は、変化したターゲティングドメインを含む。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは、天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、変化したターゲティングドメインのアイソフォームまたは変化したターゲティングドメインのサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素の変化したターゲティングドメインは、非天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、キメラの変化したターゲティングドメイン、活性な変化したターゲティングドメインの断片、またはそれらのいずれかの組合せを含む。
【０２３０】
本明細書で開示される改変されたターゲティングドメインの一例は、例えば、オピオイドペプチド、例えば、エンケファリン、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチンまたはヘモルフィンである。よって、実施例において、改変されたターゲティングドメインは、オピオイドペプチド由来である。
【０２３１】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むオピオイドペプチドは、エンケファリンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、Met-エンケファリンMRGLまたはMet-エンケファリンMRF由来である。この態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、配列番号: 9, 配列番号: 10, 配列番号: 11または配列番号: 12である。
【０２３２】
この発明の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
【０２３３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２３４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、少なくとも１、２または３の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、多くとも１、２または３の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、少なくとも１、２または３の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、多くとも１、２または３の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、少なくとも１、２または３の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、例えば、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11または配列番号:12に比較して、多くとも１、２または３の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２３５】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むオピオイドペプチドは、ウシ副腎皮質-22（BAM22）ペプチドである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むBAM22ペプチドは、BAM22ペプチド(1-12)、BAM22ペプチド(6-22)、BAM22ペプチド(8-22)またはBAM22ペプチド(1-22)由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むBAM22ペプチドは、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22を含む。
【０２３６】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも90%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも95%のアミノ酸同一性、を有する。
【０２３７】
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも90%のアミノ酸同一性、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも95%のアミノ酸同一性、を有する。
【０２３８】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。この態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２３９】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。この態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号:172のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号:173のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：174のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：175のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；配列番号：176のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22；または配列番号：177のアミノ酸1-12、アミノ酸6-22、アミノ酸8-22またはアミノ酸1-22と多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２４０】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むオピオイドペプチドはエンドモルフィンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、エンドモルフィン１またはエンドモルフィン２由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、配列番号：13または配列番号：14である。
【０２４１】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または 配列番号: 14と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号: 13または 配列番号: 14と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様のさらに他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または 配列番号: 14と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 13または 配列番号: 14と多くとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号: 13または 配列番号: 14と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２４２】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、少なくとも１、２または３の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、多くとも１、２または３の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２４３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、少なくとも１、２または３の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、多くとも１、２または３の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、少なくとも１、２または３の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、多くとも１、２または３の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、少なくとも１、２または３の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 13または配列番号: 14に比較して、多くとも１、２または３の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２４４】
更なる実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むオピオイドペプチドはエンドルフィンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、エンドルフィン−α、ネオエンドルフィン（neoendorphin）−α、エンドルフィン−β、ネオエンドルフィン−βまたはエンドルフィン−γ由来である。この実施態様の更なる側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンケファリンは、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20である。
【０２４５】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様のさらに他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドモルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と多くとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２４６】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２４７】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むエンドルフィンは、例えば、配列番号: 15、配列番号: 16、配列番号: 17、配列番号: 18、配列番号: 19または配列番号: 20と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２４８】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むオピオイドペプチドはダイノルフィンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＢ（ロイモルフィン（leumorphin））またはリモルフィン（rimorphin）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、配列番号: 21、配列番号: 22、配列番号: 23、配列番号: 24、配列番号: 25、配列番号: 26、配列番号: 27、配列番号: 28、配列番号: 29、配列番号: 30、配列番号: 31、配列番号: 32、配列番号: 33、配列番号: 34、配列番号: 35、配列番号: 36、配列番号: 37、配列番号: 38、配列番号: 39、配列番号: 40、配列番号: 41、配列番号: 42、配列番号: 43、配列番号: 44、配列番号: 45、配列番号: 46、配列番号: 47、配列番号: 48、配列番号: 49、配列番号: 50または配列番号: 51である。
【０２４９】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と多くとも90%のアミノ酸同一性、または、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２５０】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２５１】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 21、配列番号: 30または配列番号: 46と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２５２】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むオピオイドペプチドはノシセプチンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むノシセプチンは、ノシセプチンＲＫ、ノシセプチン、ニューロペプチド１、ニューロペプチド２またはニューロペプチド３由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むノシセプチンは、配列番号: 52、配列番号: 53、配列番号: 54、配列番号: 55、配列番号: 56、配列番号: 57、配列番号: 58、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61である。
【０２５３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むノシセプチンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と少なくとも90%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むノシセプチンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と多くとも90%のアミノ酸同一性、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２５４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２５５】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むダイノルフィンは、例えば、配列番号: 52、配列番号: 59、配列番号: 60または配列番号: 61と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２５６】
本明細書において開示される改変されたターゲティングドメインの他の例としては、例えば、メラノコルチンペプチド、例えば、メラノサイト刺激ホルモン、アドレノコルチコトロピン、コルチコトロピン様媒介ペプチドまたはリポトロピンである。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、メラノコルチンペプチド由来である。
【０２５７】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノコルチンペプチドは、メラノサイト刺激ホルモンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、β−メラノサイト刺激ホルモン（β−ＭＳＨ）、γ−メラノサイト刺激ホルモン（γ−ＭＳＨ）由来である。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64である。
【０２５８】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と少なくとも90%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むノシセプチンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と多くとも90%のアミノ酸同一性、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２５９】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２６０】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノサイト刺激ホルモンは、例えば、配列番号: 62、配列番号: 63または配列番号: 64と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２６１】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノコルチンペプチドは、アドレノコルチコトロピンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）またはコルチコトロピン様媒介ペプチド（ＣＬＩＰ）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、配列番号: 65または配列番号: 66である。
【０２６２】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号: 65または配列番号: 66と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 65または配列番号: 66と多くとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号: 65または配列番号: 66と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２６３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２６４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むアドレノコルチコトロピンは、例えば、配列番号: 65または配列番号: 66と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２６５】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノコルチンペプチドは、リポトロピンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、β−リポトロピン（β−ＬＰＨ）またはγ−リポトロピン（γ−ＬＰＨ）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、配列番号: 67または配列番号: 68である。
【０２６６】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 67または配列番号: 68と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 67または配列番号: 68と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 67または配列番号: 68と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２６７】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる側面において、、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる側面において、、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２６８】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる側面において、、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる側面において、、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むリポトロピンは、例えば、配列番号: 67または配列番号: 68と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２６９】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むメラノコルチンペプチドは、メラノコルチンペプチド由来のニューロペプチドである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71である。
【０２７０】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２７１】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２７２】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチド由来のメラノコルチンペプチドは、例えば、配列番号: 69、配列番号: 70または配列番号: 71に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２７３】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドはガラニンである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、ガラニンまたはガラニンメッセージ−関連ペプチド（Galanin message-associated peptide）（ＧＭＡＰ）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、配列番号: 72または配列番号: 73である。
【０２７４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 72または配列番号: 73と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 72または配列番号: 73と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 72または配列番号: 73と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２７５】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２７６】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むガラニンは、例えば、配列番号: 72または配列番号: 73に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２７７】
本明細書で開示される改変されたターゲティングドメインの他の例は、例えば、グラニンペプチド（granin peptide）、例えば、クロモグラニンＡ（chromogranin Ａ）、クロモグラニンＢ（セクレトグラニンＩ）またはクロモグラニンＣ（セクレトグラニンＩＩ）である。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、グラニンペプチド由来である。
【０２７８】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むグラニンペプチドは、クロモグラニンＡペプチドである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、β−グラニン、バソスタチン、クロモスタチン、パンクレアスタチン、ＷＥ−１４、カテスタチン（catestatin）、パラスタチンまたはＧＥ−２５由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81である。
【０２７９】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２８０】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続なアミノ酸付加を有する。
【０２８１】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＡペプチドは、例えば、配列番号: 74、配列番号: 75、配列番号: 76、配列番号: 77、配列番号: 78、配列番号: 79、配列番号: 80または配列番号: 81と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続なアミノ酸付加を有する。
【０２８２】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むグラニンペプチドは、クロモグラニンＢペプチドである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、ＧＡＷＫペプチド、副腎髄質ペプチド（adrenomedullary peptide）またはセクレトリチン（secretolytin）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86である。
【０２８３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２８４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２８５】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＢペプチドは、例えば、配列番号: 82、配列番号: 83、配列番号: 84、配列番号: 85または配列番号: 86と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２８６】
他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインを含むグラニンペプチドは、クロモグラニンＣペプチドである。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、セクレトニューリン（secretoneurin）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、配列番号: 87である。
【０２８７】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 87と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 87と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 87と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２８８】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸付加を有する。
【０２８９】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むクロモグラニンＣペプチドは、例えば、配列番号: 87に比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸付加を有する。
【０２９０】
本明細書に開示される改変されたターゲティングドメインの他の例は、例えば、タキキニンペプチド、例えば、サブスタンスＰ、ニューロペプチドＫ（ＮＰＫ）、ニューロペプチドガンマ（ＮＰガンマ）、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ；サブスタンスＫ、ニューロキニンアルファ、ニューロメジンＬ（neuromedin L））、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ヘモキニン（hemokinin）またはエンドキニン（endokinin）である。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、タキキニンペプチド由来である。
【０２９１】
この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、サブスタンスＰ、ニューロペプチドＫ（ＮＰＫ）、ニューロペプチドガンマ（ＮＰガンマ）、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ；サブスタンスＫ、ニューロキニンアルファ、ニューロメジンＬ（neuromedin L））、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ヘモキニン（hemokinin）またはエンドキニン（endokinin）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99である。
【０２９２】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２９３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２９４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むタキキニンペプチドは、例えば、配列番号: 88、配列番号: 89、配列番号: 90、配列番号: 91、配列番号: 92、配列番号: 93、配列番号: 94、配列番号: 95、配列番号: 96、配列番号: 97、配列番号: 98または配列番号: 99と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２９５】
本明細書で開示される改変されたターゲティングドメインの他の例は、例えば、コレシストキニンペプチド、例えば、コレシストキニン５８、コレシストキニン３９、コレシストキニン３３、コレシストキニン１２またはコレシストキニン８である。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、コレシストキニンペプチド由来である。
【０２９６】
この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、コレシストキニン５８、コレシストキニン３９、コレシストキニン３３、コレシストキニン１２またはコレシストキニン８由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115である。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115のアミノ酸20-58を含む。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115のアミノ酸26-58を含む。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、配列番号: 100、配列番号: 110または配列番号: 114のアミノ酸47-58を含む。この実施態様の更なる側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、配列番号: 100のアミノ酸51-58を含む。
【０２９７】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０２９８】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０２９９】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 106、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114または配列番号: 115と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３００】
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０３０１】
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３０２】
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸20-58または配列番号: 100のアミノ酸26-58と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３０３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０３０４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、少なくとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、多くとも１、２、３または４の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３０５】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、少なくとも１、２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、多くとも１、２、３または４の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、少なくとも１、２、３または４の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、多くとも１、２、３または４の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、少なくとも１、２、３または４の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むコレシストキニンペプチドは、例えば、配列番号: 100のアミノ酸47-58または配列番号: 100のアミノ酸51-58と比較して、多くとも１、２、３または４の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３０６】
本明細書で開示される改変されたターゲティングドメインの他の例は、例えば、ニューロペプチドＹ関連ペプチド、例えば、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、パンクレアティックペプチド（pancreatic peptide）（ＰＰ）またはパンクレアティックイコサペプチド（pancreatic icosapeptide）（ＰＩＰ）である。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインはニューロペプチドＹ関連ペプチド由来である。
【０３０７】
この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、パンクレアティックペプチド（pancreatic peptide）（ＰＰ）またはパンクレアティックイコサペプチド（pancreatic icosapeptide）（ＰＩＰ）由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120である。
【０３０８】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０３０９】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３１０】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むニューロペプチドＹ関連ペプチドは、例えば、配列番号: 116、配列番号: 117、配列番号: 118、配列番号: 119または配列番号: 120と比較して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３１１】
本明細書で開示される改変されたターゲティングドメインの他の例は、例えば、コルチコトロピン放出ホルモン、チロトロピン放出ホルモン（thyrotropin-releasing hormine）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）またはインターロイキン−１（ＩＬ−１）である。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、コルチコトロピン放出ホルモン由来である。他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、チロトロピン放出ホルモン由来である。他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、ソマトスタチン由来である。他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、ＬＩＦ由来である。他の実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、ＩＬ１由来である。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187である。
【０３１２】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 178、配列番号: 183または配列番号: 184と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０３１３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３１４】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むペプチドは、例えば、配列番号: 121、配列番号: 122、配列番号: 123、配列番号: 124、配列番号: 186または配列番号: 187と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３１５】
本明細書に開示された改変されたターゲティングドメインの他の例は、キニンペプチド、例えば、ブラジキニン、カリジン（kallidin）、desArg9ブラジキニンおよびdesArg10ブラジキニンである。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインはキニンペプチド由来である。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、ブラジキニン、カリジン（kallidin）、desArg9ブラジキニンおよびdesArg10ブラジキニン由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181を含む。
【０３１６】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０３１７】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の非連続アミノ酸付加を有する。
【０３１８】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸付加を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むキニンペプチドは、例えば、配列番号: 178、配列番号: 179、配列番号: 180または配列番号: 181と比較して、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の連続アミノ酸付加を有する。
【０３１９】
本明細書で開示される改変されたターゲティングドメインの他の例は、ＰＡＲペプチド、例えば、ＰＡＲ１ペプチド、ＰＡＲ２ペプチド、ＰＡＲ３ペプチドおよびＰＡＲ４ペプチドである。よって、実施態様において、改変されたターゲティングドメインは、ＰＡＲペプチド由来である。この実施態様の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、ＰＡＲ１ペプチド、ＰＡＲ２ペプチド、ＰＡＲ３ペプチドまたはＰＡＲ４ペプチド由来である。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64またはアミノ酸 1-64；
配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59またはアミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60またはアミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70またはアミノ酸 1-70を含む。
【０３２０】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０３２１】
この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と多くとも70%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と多くとも75%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と多くとも80%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と多くとも85%のアミノ酸同一性、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と多くとも90%のアミノ酸同一性または配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と多くとも95%のアミノ酸同一性を有する。
【０３２２】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、多くとも１、２、３、４または５の非連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３２３】
この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸置換を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸欠失を有する。この実施態様の更に他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70と比較して、少なくとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。この実施態様の更なる他の側面において、改変されたターゲティングドメインを含むＰＡＲペプチドは、例えば、配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミ��酸 1-70と比較して、多くとも１、２、３、４または５の連続的なアミノ酸付加を有する。
【０３２４】
本明細書において開示する変化したターゲティングドメインは、天然クロストリジウム毒素にみられるクロストリジウム毒素ターゲティングドメインの結合活性を置換する。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素ターゲティングドメイン」という用語は、「クロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域」または「クロストリジウム毒素 HCC 領域」と同義であり、中毒プロセスの細胞結合工程、例えば、クロストリジウム毒素の標的細胞の細胞膜表面に位置するクロストリジウム毒素-特異的受容体への結合を実行することができるあらゆる天然クロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。結合活性の置換は、例えば、完全なクロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインの変化したターゲティングドメインによる置換;クロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインの部分の変化したターゲティングドメインによる置換、ただし、残っているクロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインの部分はそのクロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することが出来ない; および変化したターゲティングドメインとクロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインを含むクロストリジウム毒素との作動可能な連結、ただし、クロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインはそのクロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することが出来ないように変化されている、によって達成することが出来ると考えられる。
【０３２５】
BoNT/A、BoNT/BおよびTeNTのHC ドメインの三次元結晶構造は、クロストリジウム神経毒の３つの機能的ドメインが構造的に異なることを示す。軽鎖のHEXXH コンセンサスモチーフは、チャンネルによって接近可能なタンパク質表面上の深い裂(deep cleft)に位置する触媒部位の四面体亜鉛結合ポケットを形成する。HNおよびHC ドメインの構造は１つのα-ヘリックスによって連結しているβ-シートトポロジーから主に構成される。円柱形状の HN ドメインはいくつかのウイルスタンパク質にみられるコイルドコイルモチーフに類似する２つの長い両親媒性 α-ヘリックスを含む。HN ドメインはまた、活性部位の触媒結合ポケットへの亜鉛原子の接近を阻止する軽鎖の大きく負に荷電した裂を包む、「転位置ベルト」と称される長い構造化されていないループを形成する。HC ドメインは、機能を示すおおむね同じサイズの２つの異なる構造的特徴を含む。HCN ドメインと称される第一の構造は、HC ドメインのアミノ側半分に位置している。HCN ドメインはβ-バレル、ジェリー・ロール(jelly-roll) フォールドを形成する。HCC ドメインは、 HC ドメインを構成する第２のドメインである。このカルボキシル末端ドメインは、多くの糖結合タンパク質、例えば、血清アミロイド P、シアリダーゼ、cryia、殺虫性 ∂-内毒素およびレクチンにおいてみられる炭水化物結合部分に類似する３つの異なる炭水化物結合領域を形成する改変されたβ-三葉型ドメインを含む。生化学的研究により、HCC ドメインのβ-三葉型ドメイン構造は、細胞表面上のクロストリジウム毒素受容体の特定の炭水化物含有成分への結合を媒介するようであるということが示されており、例えば、Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000)を参照されたい。HC ドメインはHN ドメインから離れるよう傾いており、表面ループを露出させ、それらを結合のために接近可能にしている。軽鎖とHC ドメインとの接触は起こらない。
【０３２６】
構造的β-三葉型ドメインを含むタンパク質は多様な群のタンパク質を表し、例えば、C. A. Orengo et al., Protein Superfamilies and Domain Superfolds, 372 Nature 631-634 (1994)を参照されたい。β-三葉型ドメインは、特徴的な偽-三回軸対称を示す３つのβ-ヘアピン構造によって一端にて閉じた６本鎖β-バレルを含む。この三回対称の単量体構造的単位は、逆平行β-シートの対として構築される４つのβ-シートを含むβ-三葉型フォールドと称される。これらβ-三葉型フォールドのそれぞれをβ-ヘアピンターンが分かつ。それゆえ、直線状の様式で、β-三葉型ドメインは、第１のβ-三葉型フォールドの４つのβ-シート、β-ヘアピンターン、第２のβ-三葉型フォールドの４つのβ-シート、第２のβ-ヘアピンターン、第２のβ-三葉型フォールドの４つのβ-シートを含む。第１のヘアピンターンはβ-三葉型ドメインの第４および第５のβ-シートの間に位置しているので、それはβ4/β5 β-ヘアピンターンと称される。同様に、第２のヘアピンターンはβ-三葉型ドメインの第８および第９のβ-シートの間に位置しているので、それはβ8/β9 β-ヘアピンターンと称される。
【０３２７】
β-三葉型フォールドを含むタンパク質に典型的であるように、クロストリジウム毒素の間のHCC ドメインの全体的なアミノ酸配列同一性は低い。しかし、結合活性に必須の鍵となる残基は構造分析および突然変異誘発実験により同定されており、例えば、Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000); およびAndreas Rummel et al., The HCC-Domain of Botulinum Neurotoxins A and B Exhibits a Singular Ganglioside Binding Site Displaying Serotype Specific Carbohydrate Interaction, 51(3) Mol. Microbiol. 631-643 (2004)を参照されたい。さらに、研究により、β4/β5およびβ8/β9 β-ヘアピンターンがβ-三葉型ドメインにおいて観察される正しい偽-三回軸対称を付与することにおいて重要であること、およびこれらターンはβ-三葉型ドメインの安定性に重要であることが解明されており、例えば、Stephen R. Brych et al., Structure and Stability Effects of Mutations Designed to Increase the Primary Sequence Symmetry Within the Core Region of a β-trefoil, 10 Protein Sci. 2587-2599 (2001)； Jaewon Kim et al．，Alternative Type I and I’ Turn Conformations in the β8/β9 β-hairpin of Human Acidic Fibroblast Growth Factor, 11 Protein Sci. 459-466 (2002); Jaewon Kim et al., Sequence swapping Does Not Result in Conformation Swapping for the β4/β5 and β8/β9 β-hairpin Turns in Human Acidic Fibroblast Growth Factor, 14 Protein Sci. 351-359 (2005)を参照されたい。様々なクロストリジウム毒素にみられるβ-三葉型ドメインを構成するアミノ酸配列を表2に示す。
表2.クロストリジウム毒素のβ-三葉型ドメイン
【表２】
2009543558.tif 000003
【０３２８】
したがって、ある態様において、HCC 領域を含むクロストリジウム毒素ターゲティングドメインは本明細書に開示される増強した結合ドメインにより置換されうる。この態様の側面において、BoNT/A HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/B HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/C1 HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/D HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/E HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/F HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/G HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、TeNT HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよい。
【０３２９】
この態様の側面において、BoNT/A HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/B HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/C1 HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/D HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/E HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/F HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/G HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、TeNT HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよい。この態様の別の側面において、配列番号1のアミノ酸 1092-1296を含むBoNT/A HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号2のアミノ酸 1079-1291を含むBoNT/B HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号3のアミノ酸 1093-1291を含むBoNT/C1 HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号4のアミノ酸 1080-1276を含むBoNT/D HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号5のアミノ酸 1067-1252を含むBoNT/E HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号6のアミノ酸 1087-1274を含むBoNT/F HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号7のアミノ酸 1087-1297を含むBoNT/G HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号8のアミノ酸 1109-1315を含むTeNT HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよい。
【０３３０】
別の態様において、本明細書において開示する変化した結合ドメインは、そのクロストリジウム毒素受容体に選択的に結合できなくなるよう変化したクロストリジウム毒素ターゲティングドメインを含むクロストリジウム毒素に作動可能に連結している。本明細書において用いる場合、クロストリジウム毒素ターゲティングドメインに言及する場合の「変化した」という用語は、ドメインがそのクロストリジウム毒素受容体にもはや選択的に結合することが出来ないようにクロストリジウム毒素ターゲティングドメインの結合活性を排除または低減するように改変された天然クロストリジウム毒素ターゲティングドメインを意味する。定義によると、変化したクロストリジウム毒素ターゲティングドメインは、開示された参照配列 (表1参照)の対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、その参照配列の対応する領域に対するパーセント同一性において記載することが出来る。非限定的な例として、配列番号1のアミノ酸 1111-1296を含む改変された BoNT/A HCC 領域は、配列番号1のアミノ酸領域 1111-1296と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号2のアミノ酸 1098-1291を含む改変された BoNT/B HCC 領域は、配列番号2のアミノ酸領域 1098-1291と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号3のアミノ酸 1112-1291を含む改変された BoNT/C1 HCC 領域は、配列番号3のアミノ酸領域 1112-1291と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号4のアミノ酸 1099-1276を含む改変された BoNT/D HCC 領域は、配列番号4のアミノ酸領域 1099-1276と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号5のアミノ酸 1086-1252を含む改変された BoNT/E HCC 領域は、配列番号5のアミノ酸領域 1086-1252と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号6のアミノ酸 1106-1274を含む改変された BoNT/F HCC 領域は、配列番号6のアミノ酸領域 1106-1274と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号7のアミノ酸 1106-1297を含む改変された BoNT/G HCC 領域は、配列番号7のアミノ酸領域 1106-1297と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;および、配列番号8のアミノ酸 1128-1315を含む改変された TeNT HCC 領域は、配列番号8のアミノ酸領域 1128-1315と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【０３３１】
この態様の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 90％のアミノ酸同一性またはその参照配列と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列と多くとも 70％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 75％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 80％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 85％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 90％のアミノ酸同一性またはその参照配列と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３３２】
この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、または200の非連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０３３３】
この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０３３４】
本発明の別の側面において、変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素は、部分的には、二本鎖ループ領域内に位置するプロテアーゼ切断部位を含む。本明細書において用いる場合、「二本鎖ループ領域」という用語は、一本鎖形態のクロストリジウム毒素を二本鎖形態へと変換するのに用いられるプロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム毒素のアミノ酸配列を意味する。クロストリジウム毒素 二本鎖ループ領域の非限定的な例としては、配列番号1のアミノ酸430-454を含むBoNT/Aの二本鎖ループ領域;配列番号2のアミノ酸437-446を含むBoNT/Bの二本鎖ループ領域;配列番号3のアミノ酸437-453を含むBoNT/C1の二本鎖ループ領域;配列番号4のアミノ酸437-450を含むBoNT/Dの二本鎖ループ領域;配列番号5のアミノ酸412-426を含むBoNT/Eの二本鎖ループ領域;配列番号6のアミノ酸429-445を含むBoNT/Fの二本鎖ループ領域;配列番号7のアミノ酸436-450を含むBoNT/Gの二本鎖ループ領域;および配列番号8のアミノ酸439-467 を含むTeNT の二本鎖ループ領域が挙げられる(表3)。
【０３３５】
表3. クロストリジウム毒素の二本鎖ループ領域
【表３】
2009543558.tif 000004
示したアミノ酸配列は以下の通り:BoNT/A、配列番号1の残基325-462; BoNT/B、配列番号2の残基332-454; BoNT/C1、配列番号3の残基334-463; BoNT/D、配列番号4の残基334-458; BoNT/E、配列番号5の残基311-434; BoNT/F、配列番号6の残基328-453; BoNT/G、配列番号7の残基331-458;およびTeNT、配列番号8の残基334-474。星印(*)は、クロストリジウム毒素プロテアーゼによって切断されるペプチド結合を示す。
【０３３６】
あらゆるすべての プロテアーゼ切断部位を、クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態から二本鎖形態へ変換するために利用することが出来ると考えられ、例えば、これらに限定されないが、内因性二本鎖ループプロテアーゼ切断部位および外来性プロテアーゼ切断部位が挙げられる。プロテアーゼ切断部位の位置および種類は、特定のターゲティングドメインが遊離のアミノ-末端またはカルボキシル-末端アミノ酸を必要とするために重要であり得る。例えば、ターゲティングドメインが２つのその他のドメインの間に位置する場合、例えば、図5参照、プロテアーゼ切断部位の選択のための基準は、その部位を切断するプロテアーゼにより平滑切断(flush cut)が生じて、ターゲティングドメインのその受容体への選択的結合に必要な変化したターゲティングドメインの遊離のアミノ-末端またはカルボキシル-末端に曝露されるか否かであり得る。プロテアーゼ切断部位の選択および配置は当該技術分野において周知である。
【０３３７】
本明細書において用いる場合、「内因性二本鎖ループプロテアーゼ切断部位」という用語は、「天然二本鎖ループプロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然クロストリジウム毒素の二本鎖ループ領域内にみられる天然プロテアーゼ切断部位を意味し、例えばこれらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位変異体、例えば、クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位アイソフォームおよびクロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位サブタイプが挙げられる。内因性プロテアーゼ切断部位の非限定的な例としては、例えば、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位およびTeNT二本鎖ループプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【０３３８】
上記のように、クロストリジウム毒素はおよそ 150 kDaの一本鎖ポリペプチドとして翻訳され、次いで天然プロテアーゼによりジスルフィドループ内にてタンパク分解切断により切断される。この翻訳後プロセシングにより、およそ 50 kDaの軽鎖 (LC)およびおよそ 100 kDaの重鎖 (HC)が一つのジスルフィド結合および非共有相互作用によって一緒になって含まれる二本鎖分子が生じる。プロテアーゼの同一性は現在知られていないが、多くのクロストリジウム毒素についての二本鎖ループプロテアーゼ切断部位が提案されている。BoNTにおいて、K448-A449での切断はBoNT/Aの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K441-A442での切断はBoNT/Bの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K449-T450での切断はBoNT/C1の一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; R445-D446 での切断はBoNT/Dの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; R422-K423での切断はBoNT/Eの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K439-A440 での切断はBoNT/Fの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する;および、 K446-S447での切断はBoNT/Gの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する。TeNTの一本鎖ポリペプチド形態のA457-S458でのタンパク分解切断の結果、二本鎖形態が得られる。かかる二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は改変クロストリジウム毒素にインフレームに作動可能に連結されて融合タンパク質とされる。
【０３３９】
しかし、二本鎖ループ内の付加的な切断部位も切断されるようであり、失われる小さいペプチド断片の生成をもたらすことに注意されたい。非限定的な例として、BoNT/A 一本鎖ポリペプチドの切断は、最終的には二本鎖ループ内の１０アミノ酸断片の欠失をもたらす。したがってBoNTにおいて、S441-L442での切断はBoNT/Aの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; G444-I445での切断はBoNT/Bの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; S445-L446 での切断はBoNT/C1の一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K442-N443 での切断はBoNT/Dの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K419-G420での切断は BoNT/Eの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K423-S424 での切断はBoNT/Eの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K436-G437での切断はBoNT/Fの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; T444-G445での切断はBoNT/Gの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; および、E448-Q449での切断はBoNT/Gの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する。
【０３４０】
したがって、一つの態様において、内因性クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含むプロテアーゼ切断部位は、一本鎖毒素を二本鎖形態へと変換するのに用いられる。この態様の側面において、タンパク分解切断による二本鎖形態への変換は、例えば、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位 またはTeNT 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む部位から起こる。
【０３４１】
この態様の別の側面において、タンパク分解切断による二本鎖形態への変換は、例えば、配列番号1のアミノ酸430-454を含むBoNT/Aの二本鎖ループ領域;配列番号2のアミノ酸437-446を含むBoNT/Bの二本鎖ループ領域;配列番号3のアミノ酸437-453を含むBoNT/C1の二本鎖ループ領域;配列番号4のアミノ酸437-450を含むBoNT/Dの二本鎖ループ領域;配列番号5のアミノ酸412-426を含むBoNT/Eの二本鎖ループ領域;配列番号6のアミノ酸429-445を含むBoNT/Fの二本鎖ループ領域;配列番号7のアミノ酸436-450を含むBoNT/Gの二本鎖ループ領域;または、配列番号8のアミノ酸439-467を含むTeNTの二本鎖ループ領域を含む部位から起こる。
【０３４２】
外来性プロテアーゼ切断部位もまた、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換するのに利用できると考えられる。本明細書において用いる場合、「外来性プロテアーゼ切断部位」という用語は、「非天然プロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然クロストリジウム毒素からの二本鎖ループ領域に通常は存在しないプロテアーゼ切断部位を意味する。外来性プロテアーゼ切断部位の非限定的な例としては、例えば、エンテロキナーゼ切断部位 (表4);トロンビン切断部位 (表4);因子 Xa 切断部位 (表4); ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位 (表4);タバコエッチウイルス (TEV) プロテアーゼ切断部位 (表4);ジペプチジル アミノペプチダーゼ 切断部位;低分子ユビキチン様修飾因子 (SUMO)/ユビキチン様 タンパク質-1(ULP-1) プロテアーゼ切断部位、例えば、MADSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGK EMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG (配列番号142);およびクロストリジウム毒素基質切断部位が挙げられる。
【０３４３】
上記のように、クロストリジウム毒素はタンパク分解切断によって一本鎖ポリペプチド形態から二本鎖分子へと変換される。天然プロテアーゼは現在知られていないが、切断は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基の間の二本鎖ループ領域内で起こる(表3参照)。内因性プロテアーゼ切断部位の外来性プロテアーゼ切断部位による置換により、毒素の二本鎖ループ領域を切断するのに用いられる天然プロテアーゼを生産しない生物において発現された場合の、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の切断が可能となる。同様に、二本鎖ループ領域内への外来性プロテアーゼ切断部位の付加はまた、毒素の二本鎖ループ領域を切断するに使用される天然プロテアーゼを生産しない生物において発現された場合の、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の切断を可能とする。
【０３４４】
表4.  外来性プロテアーゼ切断部位
【表４】
2009543558.tif 000005
星印(*)は、示されたプロテアーゼによって切断されるペプチド結合を示す。
【０３４５】
あらゆるすべての長さの外来性プロテアーゼ切断部位が本発明の側面に有用であり得ると考えられるが、ただし、かかる外来性プロテアーゼ切断部位はそのそれぞれの プロテアーゼによって切断されうるものである。したがって、この態様の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さ または少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さ または多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
【０３４６】
この態様の側面において、二本鎖ループ領域を改変して、天然プロテアーゼ切断部位を外来性プロテアーゼ切断部位に置換することができる。このタイプの改変において、天然プロテアーゼ切断部位は作動不能とされ、したがってそのプロテアーゼによって切断することができない。外来性プロテアーゼ切断部位のみがその対応する外来性プロテアーゼによって切断されうる。このタイプの改変において、外来性プロテアーゼ部位は改変クロストリジウム毒素に作動可能にインフレームに融合タンパク質として連結され、部位はそのそれぞれの 外来性プロテアーゼによって切断することができる。非限定的な例として、二本鎖ループ領域において外来性プロテアーゼ切断部位を含む一本鎖改変BoNT/Aはそのそれぞれの 外来性プロテアーゼによって切断されて毒素の二本鎖形態を生じることが出来る。
【０３４７】
この態様の別の側面において、二本鎖ループ領域を改変して天然プロテアーゼ切断部位に加えて外来性プロテアーゼ切断部位を含めることも出来る。このタイプの改変において、両方の切断部位が改変クロストリジウム毒素に作動可能に融合タンパク質としてインフレームに連結され両方の部位がそれらそれぞれの プロテアーゼによって切断されうる。非限定的な例として、天然 BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位および外来性プロテアーゼ切断部位の両方を含む二本鎖ループを含む一本鎖改変BoNT/Aは、天然二本鎖ループプロテアーゼ、または適当な 外来性プロテアーゼのいずれかによって切断されて毒素の二本鎖形態を生じることが出来る。
【０３４８】
天然プロテアーゼ切断部位は、天然二本鎖ループプロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する少なくとも２つのアミノ酸の変化によって作動不能にされうる。より徹底的な変化もなすことができるが、ただし、二本鎖ループ領域の２つのシステイン残基をインタクトに維持し、依然としてジスルフィド架橋を形成できるようにする。アミノ酸変化の非限定的な例としては、アミノ酸の欠失または元のアミノ酸の異なるアミノ酸による置換が挙げられる。したがって、一つの態様において、天然プロテアーゼ切断部位は天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸の変化によって作動不能にされる。この態様の別の側面において、天然プロテアーゼ切断部位は、例えば、天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも３つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも４つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも５つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも６つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも７つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも８つのアミノ酸; 天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも９つのアミノ酸; 天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも１０のアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも 15のアミノ酸; または天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも 20のアミノ酸の変化によって作動不能にされる。
【０３４９】
この態様のさらに別の側面において、天然二本鎖プロテアーゼ切断部位は、例えば、天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも３つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも４つのアミノ酸; 天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも５つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも６つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも７つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも８つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも９つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも１０のアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも 15のアミノ酸; または天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも 20のアミノ酸の変化によって作動不能にされる。
【０３５０】
一つの態様において、外来性プロテアーゼ切断部位は改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置する。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は外来性プロテアーゼ切断部位を含み、それは、例えば、ウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位、ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位、SUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位、トロンビン プロテアーゼ切断部位 または因子 Xa プロテアーゼ切断部位を含む。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０３５１】
この態様の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するウシ エンテロキナーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号125を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、ウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０３５２】
この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するタバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134 または配列番号135を含む 改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するタバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、タバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０３５３】
この態様のさらに別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140 または配列番号141を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０３５４】
この態様のさらに別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するSUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号142を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するSUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、SUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０３５５】
この態様のさらなる側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するトロンビン プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156 または配列番号157を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するトロンビン プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、トロンビン プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０３５６】
この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置する凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号158 または配列番号159を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置する凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０３５７】
別の態様において、外来性プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素基質切断部位」という用語は、隣接または非隣接認識要素またはその両方とともに、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に好適な条件下でクロストリジウム毒素によるその裂けやすい結合での検出可能な タンパク分解に十分な裂けやすい結合を意味する。定義によると、クロストリジウム毒素基質切断部位は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に好適な条件下で少なくとも１つの クロストリジウム毒素による切断に感受性である。クロストリジウム毒素基質切断部位の非限定的な例は、例えば、Lance E. Steward et al., Self-Activating Clostridial Toxins,米国特許出願 60/718,616 (Sep、19、2005) に開示されている。 
【０３５８】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに任意に１以上の付加的な成分を含んでいてもよいと理解される。任意の成分の非限定的な例として、改変クロストリジウム毒素はさらに、可動性スペーサーを含む可動性領域を含みうる。可動性スペーサーの非限定的な例としては、例えば、G-スペーサー GGGGS (配列番号160) またはA-スペーサー EAAAK (配列番号161) が挙げられる。可動性スペーサーを含む可動性領域は、ポリペプチドの特徴、特質または性質を最適化するためにポリペプチド 領域の長さを調節するために用いることが出来る。かかる可動性領域は融合タンパク質として改変クロストリジウム毒素にインフレームに作動可能に連結している。非限定的な例として、１以上の 可動性スペーサーをタンデムに含むポリペプチド 領域 を、プロテアーゼ切断部位をより良好に曝露するために用いることが出来、それにより、プロテアーゼによるその部位の切断が促進される。別の非限定的な例として、１以上の 可動性スペーサーをタンデムに含むポリペプチド 領域は、変化したターゲティングドメインをよりよく提示するために用いることが出来、それにより、変化したターゲティングドメインのその受容体との結合が促進される。
【０３５９】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに、可動性スペーサーを含む可動性領域を含みうる。別の態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに、複数の 可動性スペーサーをタンデムに含む可動性領域を含みうる。この態様の側面において、可動性領域は、タンデムに、例えば、少なくとも 1 のG-スペーサー、少なくとも 2のG-スペーサー、少なくとも 3のG-スペーサー、少なくとも 4のG-スペーサー または少なくとも 5のG-スペーサーを含みうる。この態様の別の側面において、可動性領域はタンデムに、例えば、多くとも 1の G-スペーサー、多くとも 2のG-スペーサー、多くとも 3のG-スペーサー、多くとも 4のG-スペーサー または多くとも 5のG-スペーサーを含みうる。この態様のさらに別の側面において、可動性領域はタンデムに、例えば、少なくとも 1のA-スペーサー、少なくとも 2のA-スペーサー、少なくとも 3のA-スペーサー、少なくとも 4のA-スペーサー または少なくとも 5のA-スペーサーを含みうる。この態様のさらに別の側面において、可動性領域はタンデムに、例えば、多くとも 1のA-スペーサー、多くとも 2のA-スペーサー、多くとも 3のA-スペーサー、多くとも 4のA-スペーサー または多くとも 5のA-スペーサーを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は１コピー以上の同じ可動性スペーサー、１コピー以上の異なる可動性スペーサー領域、またはそれらのあらゆる組合せを含む可動性領域を含みうる。
【０３６０】
この態様の側面において、可動性スペーサーを含む改変クロストリジウム毒素は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTであり得る。
【０３６１】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はあらゆるすべての位置にて可動性スペーサーを含みうると考えられるが、ただし、改変クロストリジウム毒素は中毒プロセスを実行することができるものである。この態様の側面において、可動性スペーサーは、例えば、酵素ドメインおよび転位置ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、酵素ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、G-スペーサーは、例えば、酵素ドメインおよび転位置ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、酵素ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、A-スペーサーは、例えば、酵素ドメインおよび転位置ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、酵素ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【０３６２】
この態様の別の側面において、可動性スペーサーは、例えば、変化したターゲティングドメインおよび転位置ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、G-スペーサーは、例えば、変化したターゲティングドメインおよび転位置ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、A-スペーサーは、例えば、変化したターゲティングドメインおよび転位置ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【０３６３】
この態様のさらに別の側面において、可動性スペーサーは、例えば、転位置ドメインおよび酵素ドメイン、転位置ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、G-スペーサーは、例えば、転位置ドメインおよび酵素ドメイン、転位置ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、A-スペーサーは、例えば、転位置ドメインおよび酵素ドメイン、転位置ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に 位置する。
【０３６４】
任意の成分の別の非限定的な例として、改変クロストリジウム毒素はさらにエピトープ結合領域を含みうる。エピトープ結合領域は多種多様な手順に利用でき、例えば、タンパク質 精製およびタンパク質 可視化が含まれる。かかるエピトープ結合領域は改変クロストリジウム毒素に融合タンパク質としてインフレームに作動可能に連結している。エピトープ結合領域の非限定的な例としては、例えば、FLAG,Express（商標） (配列番号162)、ヒト インフルエンザウイルス 赤血球凝集素 (HA) (配列番号163)、ヒト p62c-Myc タンパク質 (c MYC) (配列番号164)、水疱性口内炎ウイルス 糖タンパク質 (VSV-G) (配列番号165)、サブスタンスP  (配列番号166)、単純ヘルペスウイルス (HSV)の糖タンパク質-D 前駆体 (配列番号167)、V5 (配列番号168)、AU1 (配列番号169) およびAU5 (配列番号170); 親和性-結合、例えば、ポリヒスチジン (HIS) (配列番号171)、ストレプトアビジン 結合 ペプチド (strep)、およびビオチンまたはビオチン化 配列; ペプチド-結合領域、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼのグルタチオン 結合ドメイン、カルモジュリン 結合 タンパク質のカルモジュリン 結合ドメインおよびマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインが挙げられる。適当な結合ペプチドを選択、製造および使用するための特定のプロトコールの非限定的な例は、例えば、Epitope Tagging, pp. 17.90-17.93 (Sambrook and Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001); Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998); および Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998) に記載されている。さらに、結合 ペプチドならびによく特徴決定された 試薬、条件およびプロトコールの非限定的な例は市販の供給源から容易に入手可能であり、これらに限定されないが、BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA; BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA; Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA; QIAGEN、Inc.、Valencia、CA; およびStratagene、La Jolla、CAが挙げられる。これらのプロトコールは当業者の技術範囲内であって本教示から常套の手順である。
【０３６５】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらにエピトープ結合領域を含みうる。別の態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに複数の エピトープ結合領域を含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、少なくとも１つのエピトープ結合領域、少なくとも２つのエピトープ結合領域、少なくとも３つのエピトープ結合領域、少なくとも４つのエピトープ結合領域 または少なくとも５つのエピトープ結合領域を含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、多くとも１つのエピトープ結合領域、多くとも２つのエピトープ結合領域、多くとも３つのエピトープ結合領域、多くとも４つのエピトープ結合領域 または多くとも５つのエピトープ結合領域を含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、１コピー以上の同じエピトープ結合領域、１コピー以上の異なるエピトープ結合領域、またはそれらのあらゆる組合せを含みうる。
【０３６６】
エピトープ結合領域の位置は様々な位置であり得、例えば、これらに限定されないが、改変クロストリジウム毒素のアミノ末端、改変クロストリジウム毒素の内部、または改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端が挙げられる。したがって、一つの態様において、エピトープ結合領域は改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置する。かかる位置において、開始メチオニンをエピトープ結合領域の前に配置すべきである。さらに、開始メチオニンを含む別のポリペプチドの アミノ末端 に作動可能に連結したポリペプチドを付加すると、元のメチオニン 残基が欠失されうることが当該技術分野において知られている。これは付加されたポリペプチドが新しい開始メチオニンを含むことおよび元の開始メチオニンが融合タンパク質の最適の発現を低下させうることという事実に起因する。この態様の側面において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置するエピトープ結合領域は、例えば、FLAG,Express（商標） エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルス 赤血球凝集素 (HA) エピトープ結合領域、ヒト p62c-Myc タンパク質 (c MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス 糖タンパク質 (VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンスP  エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス (HSV) エピトープ結合領域の糖タンパク質-D 前駆体、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジン エピトープ結合領域、ストレプトアビジン 結合 ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン-S-トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン またはマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。 
【０３６７】
別の態様において、エピトープ結合領域は改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置する。この態様の側面において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置するエピトープ結合領域は、例えば、FLAG,Express（商標） エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルス 赤血球凝集素 (HA) エピトープ結合領域、ヒト p62c-Myc タンパク質 (c MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス 糖タンパク質 (VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンスP  エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス (HSV) エピトープ結合領域の糖タンパク質-D 前駆体、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジン エピトープ結合領域、ストレプトアビジン 結合 ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン-S-トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメインまたはマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。
【０３６８】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はあらゆるすべての位置にて変化したターゲティングドメインを含みうると考えられ、 ただしその改変クロストリジウム毒素は中毒プロセスを実行することができるものである。非限定的な例として、改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に増強したターゲティングドメインを位置させること(図4参照);改変クロストリジウム毒素のクロストリジウム毒素酵素ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置ドメインの間に増強したターゲティングドメインを位置させること (図5参照); および改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に増強したターゲティングドメインを位置させること(図6参照)が挙げられる。天然クロストリジウム毒素の酵素ドメインは、ネイティブな開始メチオニンを含む。したがって、酵素ドメインがアミノ-末端位置にないドメイン編成においては、開始メチオニンを含むアミノ酸配列をアミノ-末端 ドメインの前に位置させるべきである。同様に、アミノ-末端 位置に変化したターゲティングドメインがある場合、開始メチオニン およびプロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を、変化したターゲティングドメインが遊離のアミノ-末端を要求する状況においては、作動可能に連結させるとよく、例えば、Shengwen Li et al., Degradable Clostridial Toxins,国際特許出願公開 WO 2006/026780 (Mar. 9、2006) を参照されたい。さらに、開始メチオニンを含む別のポリペプチドのアミノ末端に作動可能に連結したポリペプチドを付加する場合、元のメチオニン 残基が欠失されうることが当該技術分野において知られている。
【０３６９】
したがって、一つの態様において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。
【０３７０】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。
【０３７１】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。
【０３７２】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。
【０３７３】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。
【０３７４】
本発明の側面は部分的には、改変クロストリジウム毒素を提供する。本明細書に開示するクロストリジウム毒素改変の非限定的な例としては、例えば、変化したターゲティングドメインの付加、プロテアーゼ切断部位の付加、酵素、転位置および結合ドメインの再編成およびスペーサー 領域の付加が挙げられる。かかるすべての改変は、改変クロストリジウム毒素が細胞を中毒させる能力に実質的に影響を与えないことが理解される。本明細書において用いる場合、「実質的に影響を与えない」という用語は、改変クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する細胞機構の全体を実行することが出来ることを意味し、かかる細胞機構には、クロストリジウム毒素の低または高親和性 受容体複合体への結合、毒素受容体複合体のインターナリゼーション、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質への転位置およびクロストリジウム毒素基質の酵素的改変が含まれる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 10％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 20％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 30％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 40％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 50％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 60％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 70％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 80％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 90％毒性であり または天然クロストリジウム毒素の少なくとも 95%毒性である。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、天然クロストリジウム毒素の多くとも 10％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 20％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 30％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 40％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 50％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 60％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 70％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 80％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 90％毒性であり または天然クロストリジウム毒素の多くとも 95%毒性である。
【０３７５】
本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書に開示するあらゆるすべての 改変クロストリジウム毒素はポリヌクレオチド分子によりコードされうると考えられる。
【０３７６】
本発明の側面は、部分的にはポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド分子」という用語は、「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのあらゆる長さのポリマー形態を意味する。本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードしうるあらゆるすべての ポリヌクレオチド分子が有用であり得ると考えられ、例えば、これらに限定されないが 天然および非天然 DNA 分子および天然および非天然 RNA 分子が挙げられる。天然および非天然 DNA 分子の非限定的な例としては、 一本鎖 DNA 分子、二本鎖 DNA 分子、ゲノム DNA 分子、cDNA 分子、ベクターコンストラクト、例えば、プラスミド コンストラクト、ファージミド コンストラクト、バクテリオファージ コンストラクト、レトロウイルス コンストラクトおよび人工染色体 コンストラクトが挙げられる。天然および非天然 RNA 分子の非限定的な例としては、一本鎖 RNA、二本鎖 RNAおよびmRNAが挙げられる。
【０３７７】
したがって、一つの態様において、ポリヌクレオチド分子は本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードする。
【０３７８】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示するクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォームまたはクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体または活性のクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメイン、TeNT 酵素ドメイン、またはその活性の断片を含む。
【０３７９】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示するクロストリジウム毒素転位置ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素転位置ドメインアイソフォームまたはクロストリジウム毒素転位置ドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体または活性のクロストリジウム毒素転位置ドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 転位置ドメイン、BoNT/B 転位置ドメイン、BoNT/C1 転位置ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置ドメイン、BoNT/F 転位置ドメイン、BoNT/G 転位置ドメイン、TeNT 転位置ドメイン、またはその活性の断片を含む。
【０３８０】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示する転位置促進ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインアイソフォームまたはクロストリジウム毒素転位置促進ドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体または活性のクロストリジウム毒素転位置促進ドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 転位置促進ドメイン、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメイン、TeNT 転位置促進ドメイン、またはその活性の断片を含む。この態様のさらに別の側面において、転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームまたはエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体または活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン、アルファウイルス融合ペプチドドメイン、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン、アブラウイルス融合ペプチドドメイン、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン、メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン、泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン、またはその活性の断片を含む。
【０３８１】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドを含む。この態様の側面において、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、天然変異体、例えばアイソフォームまたはサブタイプなどを含む。この態様の別の側面において、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然変異体、例えば保存的変異体、非保存的変異体または活性の断片、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。この態様の別の側面において、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、オピオイドペプチド、例えばエンケファリン、ウシ副腎髄質-22 (BAM22) ペプチド、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチンまたはヘモルフィン; メラノコルチンペプチド、例えばα-メラニン細胞刺激ホルモン (α-MSH)、β-メラニン細胞刺激ホルモン (β-MSH)、γ-メラニン細胞刺激ホルモン (γ-MSH)、副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、コルチコトロピン様中葉ペプチド (CLIP)、β-リポトロピン (β-LPH) およびγ-リポトロピン (γ-LPH); ガラニン、例えばガラニンおよびガラニンメッセージ関連ペプチド (GMAP); グラニン、例えばβ-グラニン、バソスタチン 、クロモスタチン、パンクレアスタチン、WE-14、カテスタチン、パラスタチンおよびGE-25のようなクロモグラニン A ペプチド、GAWK ペプチド、副腎髄質ペプチドおよびセクレトリチンのようなクロモグラニン B (セクレトグラニン I) ペプチド、および、セクレトニューリン、EM66およびマンセリンのようなクロモグラニン C (セクレトグラニン II) ペプチド; タキキニンペプチド、例えばサブスタンス P、ニューロペプチド K (NPK)、ニューロペプチドガンマ (NP ガンマ)、ニューロキニン A (NKA); サブスタンス K、ニューロキニンアルファ、ニューロメジン L、ニューロキニン B (NKB)、ヘモキニンおよびエンドキニン; コレシストキニン、例えばコレシストキニン 58、コレシストキニン 39、コレシストキニン 33、コレシストキニン 12およびコレシストキニン 8; ニューロペプチド Y 関連ペプチド、例えばニューロペプチド Y (NPY)、ペプチド YY (PYY)、膵臓ペプチド (PP) および膵臓イコサペプチド (PIP); キニンペプチド、例えばブラジキニン、カリジン (kallidan)、desArg9 ブラジキニンおよび desArg10 ブラジキニン; プロテアーゼ活性化受容体 (PAR) ペプチド、例えばPAR1 ペプチド、PAR2 ペプチド、PAR3 ペプチドおよびPAR4 ペプチド; コルチコトロピン放出ホルモン; 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン; ソマトスタチン; 白血病抑制因子 (LIF); および、インターロイキン-1 ( IL1)を含む。
【０３８２】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示するプロテアーゼ切断部位を含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位を含む。この態様の側面において、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位 またはTeNT 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は外来性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位を含む。この態様の側面において、外来性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、ウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位、ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位、SUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位、トロンビン プロテアーゼ切断部位、凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位またはクロストリジウム毒素基質切断部位、例えば、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位 またはTeNT 基質切断部位であり得る。
【０３８３】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示する可動性スペーサーを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、可動性スペーサーをコードするポリヌクレオチド分子は、G-スペーサー、A-スペーサー またはそれらのあらゆる組合せを含みうる。
【０３８４】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作るために必要でありうるよく確立された分子生物学技術には、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、核酸ライゲーション、細菌形質転換、核酸精製、核酸配列決定および組換えに基づく技術を含む手順が含まれ、これらは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作るために必要な特定のプロトコールの非限定的な例は、例えば、MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 前掲, (2001);およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004) に記載されている。さらに、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作るのに有用な様々な市販品が広く入手可能である。これらのプロトコールは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。
【０３８５】
本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、かかる方法は、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞中で発現させる工程を含む。本発明の別の側面は本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、かかる方法は、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトを細胞に導入する工程および発現コンストラクトを細胞中で発現させる工程を含む。
【０３８６】
本明細書に開示する方法は、部分的には、改変クロストリジウム毒素を含む。本明細書に開示するあらゆるすべての改変クロストリジウム毒素は、本明細書に開示する方法を用いて生産することが出来ると考えられる。また、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードするあらゆるすべての ポリヌクレオチド分子は、本明細書に開示する方法を用いる本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の生産において有用であり得ると考えられる。
【０３８７】
本明細書に開示する方法は、部分的には、発現コンストラクトを含む。発現コンストラクトは、細胞または細胞非含有抽出物におけるポリヌクレオチド分子の発現に有用な発現ベクターに作動可能に連結した本明細書に開示するポリヌクレオチド分子を含む。多種多様な発現ベクターを改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の発現に利用でき、例えば、これらに限定されないが、ウイルス発現ベクター;原核発現ベクター; 真核発現ベクター、例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターおよび哺乳類発現ベクター; および細胞非含有抽出物発現ベクターが挙げられる。さらにこれら方法の側面の実行に有用な発現ベクターには、構成的、組織-特異的、細胞-特異的または誘導可能プロモーター要素、エンハンサー 要素またはその両方の制御下で改変クロストリジウム毒素を発現するものが含まれうることが理解される。発現ベクター、ならびにかかる発現ベクターからの発現コンストラクトの製造および使用のためによく確立された試薬および条件の非限定的な例は市販の供給源から容易に入手可能なものであり、例えば、これらに限定されないが、BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA; BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA; Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA; EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI; QIAGEN、Inc.、Valencia、CA;およびStratagene、La Jolla、CAが挙げられる。適当な発現ベクターの選択、製造および使用は当業者の技術範囲内であり本教示から常套の手順である。
【０３８８】
したがって、この態様の側面には、これらに限定されないが、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結したウイルス 発現ベクター;改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した原核 発現ベクター;改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した酵母発現ベクター;改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した昆虫発現ベクター; および改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した哺乳類発現ベクターが含まれる。この態様の別の側面には、これらに限定されないが、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した細胞非含有抽出物発現ベクターを含む細胞非含有抽出物を用いて本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を発現させるのに好適な発現コンストラクトが含まれる。
【０３８９】
本明細書に開示する方法は、部分的には細胞を含む。あらゆるすべての 細胞が利用できると考えられる。したがって、この態様の側面は、これらに限定されないが、原核細胞、例えば、これらに限定されないが、好気性、微好気性、カプノフィリック(capnophilic)、通性、嫌気性、グラム陰性およびグラム陽性細菌細胞の株、 例えば、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacteroides fragilis、Clostridia perfringens、Clostridia difficile、Caulobacter crescentus、Lactococcus lactis、Methylobacterium extorquens、Neisseria meningirulls、Neisseria meningitidis、Pseudomonas fluorescens および Salmonella typhimurium由来のもの; および真核細胞、例えば、これらに限定されないが、酵母株、例えば、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia angusta、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiaeおよびYarrowia lipolytica由来のもの; 昆虫細胞および昆虫由来の細胞株、例えば、Spodoptera frugiperda、Trichoplusia ni、Drosophila melanogaster および Manduca sexta由来のもの; および哺乳類細胞および哺乳類細胞由来の細胞株、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒト由来のものを含む。 細胞株はAmerican Type Culture Collection, European Collection of Cell Culturesおよび German Collection of Microorganisms and Cell Culturesから得ることが出来る。適当な細胞株の選択、製造および使用の特定のプロトコールの非限定的な例はは、例えば、INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 前掲, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002); およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 前掲(2004) に記載されている。これらプロトコールは、当業者の技術範囲内であり、本教示から常套の手順である。
【０３９０】
本明細書に開示する方法は、部分的には、細胞にポリヌクレオチド分子を導入することを含む。細胞に導入されたポリヌクレオチド分子はその細胞によって一過性または安定に維持されうる。安定に維持されたポリヌクレオチド分子は染色体外にあって自律的に複製するものであってもよいし、細胞の染色体物質に組み込まれて非自律的に複製するものであってもよい。本明細書に開示するポリヌクレオチド分子を細胞に導入するためにあらゆるすべての方法を用いることが出来ると考えられる。核酸分子を細胞に導入するために有用な方法としては、これらに限定されないが、化学物質媒介トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム-媒介、ジエチル-アミノエチル (DEAE) デキストラン-媒介、脂質-媒介、ポリエチレンイミン (PEI)-媒介、ポリリシン-媒介およびポリブレン-媒介トランスフェクション; 物理的媒介トランスフェクション、例えば、遺伝子銃送達、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーション;およびウイルス-媒介トランスフェクション、例えば、レトロウイルス-媒介トランスフェクションが挙げられ、例えば、Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001)を参照されたい。当業者であれば、細胞に発現コンストラクトを導入する特定の方法の選択は、部分的には、細胞が一過性に発現コンストラクトを含むか否かあるいは細胞が安定に発現コンストラクトを含むか否かに依存することを理解している。これらプロトコールは当業者の技術範囲内であり本教示から常套の手順である。
【０３９１】
この態様の側面において、トランスフェクションと称される化学物質媒介法を用いて改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が細胞に導入される。トランスフェクションの化学物質媒介法において、化学物質は核酸と複合体を形成し、それが細胞へのその取り込みを促進する。かかる化学物質としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウム-媒介、例えば、Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004)を参照されたい; ジエチル-アミノエチル (DEAE) デキストラン-媒介、脂質-媒介、カチオン性ポリマー-媒介、例えばポリエチレンイミン (PEI)-媒介およびポリリシン-媒介およびポリブレン-媒介、例えば、Chun Zhang et al., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004)を参照されたい、が挙げられる。かかる化学物質媒介送達系は標準的方法を用いて調製することが出来るし、市販されており、例えば、CellPhect Transfection Kit (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran, (Stratagene、Inc.、La Jolla、CA); Lipofectamine（商標） ransfection Reagent (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA); ExGen 500 Transfection kit (Fermentas、Inc.、Hanover、MD)、および SuperFectおよびEffectene Transfection Kits (Qiagen、Inc.、Valencia、CA) を参照されたい。
【０３９２】
この態様の別の側面において、物理的媒介法を用いて改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が細胞に導入される。物理的技術としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、遺伝子銃およびマイクロインジェクションが挙げられる。遺伝子銃およびマイクロインジェクション技術は、核酸分子を細胞に導入するために細胞壁を穿孔するものであり、例えば、Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997);およびJohn O’Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004)を参照されたい。電気的透過法とも称されるエレクトロポレーションは、短い高電位の電気パルスを用いて膜に核酸分子が入る一過性の孔を作るものであり、すべての細胞タイプの安定および一過性のトランスフェクションに有効に利用でき、例えば、M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004);およびOliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004) を参照されたい。
【０３９３】
この態様の別の側面において、形質導入と称されるウイルス-媒介法を用いて改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が細胞に導入される。一過性の形質導入のウイルス-媒介法において、ウイルス 粒子が感染して宿主細胞中で複製するプロセスが操作されて、この機構が核酸分子を細胞に導入するために利用される。ウイルス-媒介法は多種多様なウイルスから開発されており、例えば、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴 ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルスおよびバキュロウイルスが挙げられ、例えば、Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); およびMaurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); および A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)を参照されたい。
【０３９４】
エンベロープを持たない二本鎖 DNA ウイルスであるアデノウイルスは、アデノウイルスが約 36 kbの比較的大きいポリヌクレオチド分子を扱い、高い力価で生産され、多種多様な分裂および非分裂細胞の両方に効率的に感染することができるため、しばしば哺乳類細胞 形質導入のために選択されており、例えば、Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); および Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001) を参照されたい。アデノウイルスに基づく系を用いる形質導入は、核酸分子が宿主細胞染色体へと組み込まれるのではなく、細胞核におけるエピソームから担持されるため長期のタンパク質発現を支持するものではない。アデノウイルスベクター系およびかかるベクターをどのように使用するかについての特定のプロトコールは、例えば、ViraPower（商標）Adenoviral Expression System (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) およびViraPower（商標）Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002);および AdEasy（商標）Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA)および AdEasy（商標）Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.に開示されている。
【０３９５】
核酸分子送達はまた、一本鎖 RNA レトロウイルス、例えば、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを使用することもできる。レトロウイルス-媒介形質導入はしばしば100％に近い形質導入効率をもたらし、感染効率 (MOI)を変化させることによってプロウイルス コピー数を容易に制御でき、一過性または安定に細胞を形質導入するために利用することが出来、例えば、Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004);および Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)を参照されたい。レトロウイルス 粒子はタンパク質キャプシドにパッケージされたRNA ゲノム、およびキャプシドの周囲の脂質エンベロープからなる。レトロウイルスは、そのRNAを細胞質に逆転写酵素とともに注入することによって宿主細胞に感染する。RNA テンプレートは次いで逆転写されて線状二本鎖 cDNAとなり、宿主細胞 ゲノムに組み込まれることによりそれ自身で複製する。ウイルス粒子は垂直 (親細胞から娘細胞へとプロウイルスを介して) および水平 (細胞から細胞へとウイルス粒子を介して)の両方にて伝播する。この複製戦略により、目的核酸分子が宿主細胞の染色体に安定に組み込まれるため長期の永続的な発現が可能となり、それによってタンパク質の長期の発現が可能となる。例えば、動物研究により、様々な組織へと注入されたレンチウイルス ベクターが、1年を超える持続的なタンパク質 発現をもたらしたことが示されており、例えば、Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996)を参照されたい。オンコレトロウイルス由来ベクター系、例えば、モロニーマウス白血病 (MoMLV)は広く使用されており、様々な種類の非分裂細胞に感染する。レンチウイルスは多くの種類の細胞タイプに感染することもでき、例えば分裂および非分裂細胞が挙げられ、そして高度に特異的な細胞の標的化を可能とする複雑なエンベロープタンパク質を有している。 
【０３９６】
レトロウイルス ベクターおよびかかるベクターをどのように使用するかについての特定のプロトコールは、例えば、米国特許 Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters,米国特許第5,464,758号(Nov. 7、1995)および Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression,米国特許第5,814,618号(Sep. 29、1998) David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same,米国特許第5,514,578号(May 7、1996) およびDavid S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor,米国特許 6,245,531 (Jun. 12、2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations,米国特許第5,364,791号(Nov. 15、1994)、Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy,米国特許第5,874,534号(Feb. 23、1999)および Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy,米国特許第5,935,934号(Aug. 10、1999) に開示されている。さらに、かかるウイルス送達系は標準的方法により調製することが出来、市販されており、例えば、BD（商標） Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) およびBD（商標） Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (Mar. 14, 2003), GeneSwitch（商標） System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) およびGeneSwitch（商標）System A Mifepristone-Regulated Expression System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov. 4, 2002); ViraPower（商標） Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)および ViraPower（商標） Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec. 8, 2003); および Complete Control（登録商標） Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) および Complete Control（登録商標） Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005eを参照されたい。
【０３９７】
本明細書に開示する方法は、部分的には、ポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素を発現させることを含む。様々な発現系のいずれも本明細書に開示するポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素を発現させるために有用であり得ると考えられ、例えば、これらに限定されないが、細胞に基づく系および無細胞発現系が挙げられる。細胞に基づく系としては、これらに限定されないが、ウイルス発現系、原核発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳類発現系が挙げられる。無細胞系としては、これらに限定されないが、コムギ胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物および大腸菌抽出物が挙げられ、一般に本明細書に開示する方法と同等である。発現系を用いるポリヌクレオチド分子の発現は、あらゆる様々な特性を含み得、例えば、これらに限定されないが、誘導可能発現、非誘導可能発現、構成的発現、ウイルス-媒介発現、安定に-組み込まれた発現、および一過性の発現が挙げられる。よく特徴決定されたベクター、試薬、条件および細胞を含む発現系はよく確立されており、市販の供給源から容易に入手可能であり、例えば、これらに限定されないが、Ambion、Inc. Austin、TX; BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA; BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA; Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA; QIAGEN、Inc.、Valencia、CA; Roche Applied Science、Indianapolis、IN; および Stratagene、La Jolla、CAが挙げられる。適当な異種発現系の選択および使用の非限定的な例は、例えば、PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); および Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001)に記載されている。これらのプロトコールは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。
【０３９８】
様々な細胞に基づく発現手順が、本明細書に開示するポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素の発現に有用である。例としては例えば、これらに限定されないが、ウイルス発現系、原核発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳類発現系が挙げられる。ウイルス発現系としては、これらに限定されないが、ViraPower（商標） Lentiviral (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、Adenoviral Expression Systems (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、AdEasy（商標）XL Adenoviral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA)およびViraPort（登録商標） Retroviral Gene Expression System (Stratagene、La Jolla、CA)が挙げられる。原核発現系の非限定的な例としては、Champion（商標） pET Expression System (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)、TriEx（商標） Bacterial Expression System (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)、QIAexpress（登録商標） Expression System (QIAGEN、Inc.)、およびAffinity（登録商標） Protein Expression and Purification System (Stratagene、La Jolla、CA)が挙げられる。酵母発現系としては、これらに限定されないが、EasySelect（商標） Pichia Expression Kit (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、YES-Echo（商標） Expression Vector Kits (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA ) およびSpECTRA（商標）S. pombe Expression System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)が挙げられる。バキュロウイルス発現系の非限定的な例としては、BaculoDirect（商標） (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、Bac-to-Bac（登録商標） (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、および BD BaculoGold（商標） (BD Biosciences-Pharmigen、San Diego、CA)が挙げられる。昆虫発現系としては、これらに限定されないが、Drosophila Expression System (DES（登録商標）) (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、InsectSelect（商標） System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA) およびInsectDirec（商標）System (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)が挙げられる。哺乳類発現系の非限定的な例としては、例えば、T-REx（商標） (Tetracycline-Regulated Expression) System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、Flp-In（商標） T-REx（商標） System  (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、pcDNA（商標） system (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、pSecTag2 system (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、 Exchanger（登録商標） System、InterPlay（商標） Mammalian TAP System (Stratagene、La Jolla、CA)、Complete Control（登録商標） Inducible Mammalian Expression System (Stratagene、La Jolla、CA) およびLacSwitch（登録商標） II Inducible Mammalian Expression System (Stratagene、La Jolla、CA)が挙げられる。
【０３９９】
本明細書に開示するポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素を発現させる別の手順は、無細胞発現系、例えば、これらに限定されないが、原核 抽出物および真核抽出物を用いる。原核細胞抽出物の非限定的な例としては、RTS 100 E. coli HY Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)、ActivePro In Vitro Translation Kit (Ambion, Inc., Austin, TX)、EcoPro（商標）System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)およびExpressway（商標） Plus Expression System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)が挙げられる。真核細胞抽出物としては、これらに限定されないが、RTS 100 Wheat Germ CECF Kit (Roche Applied Science、Indianapolis、IN)、TnT（登録商標） Coupled Wheat Germ Extract Systems (Promega Corp.、Madison、WI)、Wheat Germ IVT（商標） Kit (Ambion、Inc.、Austin、TX)、Retic Lysate IVT（商標） Kit (Ambion、Inc.、Austin、TX)、PROTEINscript（登録商標） II System (Ambion、Inc.、Austin、TX)およびTnT（登録商標） Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega Corp.、Madison、WI)が挙げられる。
【０４００】
本発明のその他の側面は以下に説明されうる:
【０４０１】
1.以下を含む改変されたクロストリジウム毒素:
a)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することができるクロストリジウム毒素酵素ドメイン;
b)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することができるクロストリジウム毒素転位置ドメイン; 
c)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することができる転位置促進ドメイン; 
d)非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することができ、クロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することができる変化したターゲティングドメイン;および、
e)プロテアーゼ切断部位
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は一本鎖形態の改変されたクロストリジウム毒素を二本鎖形態へと変換する。
【０４０２】
2.改変されたクロストリジウム毒素が、１つのポリペプチドのアミノからカルボキシルへの直線状の順序で、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４０３】
3.改変されたクロストリジウム毒素が、１つのポリペプチドのアミノからカルボキシルへの直線状の順序で、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４０４】
4.改変されたクロストリジウム毒素が、１つのポリペプチドのアミノからカルボキシルへの直線状の順序で、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４０５】
5.改変されたクロストリジウム毒素が、１つのポリペプチドのアミノからカルボキシルへの直線状の順序で、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４０６】
6.改変されたクロストリジウム毒素が、１つのポリペプチドのアミノからカルボキシルへの直線状の順序で、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４０７】
7.改変されたクロストリジウム毒素が、１つのポリペプチドのアミノからカルボキシルへの直線状の順序で、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４０８】
8.クロストリジウム毒素酵素ドメインが、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメインおよびTeNT 酵素ドメインからなる群から選択される1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４０９】
9.クロストリジウム毒素転位置ドメインが、BoNT/A 転位置ドメイン、BoNT/B 転位置ドメイン、BoNT/C1 転位置ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置ドメイン、BoNT/F 転位置ドメイン、BoNT/G 転位置ドメインおよびTeNT 転位置ドメインからなる群から選択される1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１０】
10.転位置促進ドメインがクロストリジウム毒素転位置促進ドメインである1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１１】
11.クロストリジウム毒素転位置促進ドメインが、BoNT/A 転位置促進ドメイン、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメインからなる群から選択される10による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１２】
12.クロストリジウム毒素転位置促進ドメインが、配列番号1のアミノ酸 874-1110、配列番号2のアミノ酸 861-1097、配列番号3のアミノ酸 869-1111、配列番号4のアミノ酸 865-1098、配列番号5のアミノ酸 848-1085、配列番号6のアミノ酸 867-1105、配列番号7のアミノ酸 866-1105および配列番号8のアミノ酸 882-1127からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む10による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１３】
13.クロストリジウム毒素転位置促進ドメインが、BoNT/A 転位置促進ドメイン、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメインからなる群から選択される10による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１４】
14. 転位置促進ドメインがエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインである1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１５】
15.エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン、アルファウイルス融合ペプチドドメイン、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン、アブラウイルス融合ペプチドドメイン、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインおよび泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインからなる群から選択される14による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１６】
16.インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインが、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197 および配列番号198からなる群から選択される15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１７】
17.アルファウイルス融合ペプチドドメインが、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、配列番号224 および配列番号225からなる群から選択される15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１８】
18.ベシクロウイルス融合ペプチドドメインが、配列番号226、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235 および配列番号236からなる群から選択される15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４１９】
19.レスピロウイルス融合ペプチドドメインが、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242 および配列番号243からなる群から選択される15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２０】
20.モルビリウイルス融合ペプチドドメインが、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252 および配列番号253からなる群から選択される15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２１】
21.アブラウイルス融合ペプチドドメインが、配列番号254、配列番号255、配列番号256、配列番号257、配列番号258、配列番号259、配列番号260、配列番号261、配列番号262、配列番号263、配列番号264、配列番号265 および配列番号266からなる群から選択される15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２２】
22. ヘニパウイルス融合ペプチドドメインが、配列番号267 および配列番号268からなる群から選択される15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２３】
23.メタニューモウイルス融合ペプチドドメインが配列番号269である15による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２４】
24.変化したターゲティングドメインが、オピオイド、メラノコルチン、ガラニン、グラニン、タキキニン、コレシストキニン、神経ペプチドY関連、キニンペプチド、PARペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよびソマトスタチンからなる群から選択される1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２５】
25.変化したターゲティングドメインがエンケファリン、BAM22 ペプチド、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチンおよびヘモルフィン(hemorphin) からなる群から選択されるオピオイドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２６】
26.変化したターゲティングドメインがLeu-エンケファリン、Met-エンケファリン、Met-エンケファリン MRGLおよびMet-エンケファリン MRFからなる群から選択されるエンケファリンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２７】
27.変化したターゲティングドメインが配列番号9、配列番号10、配列番号11 および配列番号12 からなる群から選択されるエンケファリンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２８】
28.変化したターゲティングドメインがBAM22 ペプチド (1-12)、BAM22 ペプチド (6-22)、BAM22 ペプチド (8-22)またはBAM22 ペプチド (1-22) からなる群から選択されるBAM22 ペプチドを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４２９】
29.変化したターゲティングドメインが配列番号172のアミノ酸 1-12、配列番号172のアミノ酸 6-22、配列番号172のアミノ酸 8-22、配列番号172のアミノ酸 1-22、配列番号173のアミノ酸 1-12、配列番号173のアミノ酸 6-22、配列番号173のアミノ酸 8-22、配列番号173のアミノ酸 1-22、配列番号174のアミノ酸 1-12、配列番号174のアミノ酸 6-22、配列番号174のアミノ酸 8-22、配列番号174のアミノ酸 1-22、配列番号175のアミノ酸 1-12、配列番号175のアミノ酸 6-22、配列番号175のアミノ酸 8-22、配列番号175のアミノ酸 1-22、配列番号176のアミノ酸 1-12、配列番号176のアミノ酸 6-22、配列番号176のアミノ酸 8-22、配列番号176のアミノ酸 1-22、配列番号177のアミノ酸 1-12、配列番号177のアミノ酸 6-22、配列番号177のアミノ酸 8-22 および配列番号177のアミノ酸 1-22からなる群から選択されるBAM22 ペプチドを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３０】
30.変化したターゲティングドメインがエンドモルフィン-1およびエンドモルフィン-2からなる群から選択されるエンドモルフィンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３１】
31.変化したターゲティングドメインが配列番号13 および配列番号14からなる群から選択されるエンドモルフィンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３２】
32.変化したターゲティングドメインがエンドルフィン-α、ネオエンドルフィン-α、エンドルフィン-β、ネオエンドルフィン-βまたはエンドルフィン-γからなる群から選択されるエンドルフィンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３３】
33.変化したターゲティングドメインが配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19 および配列番号20からなる群から選択されるエンドルフィンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３４】
34.変化したターゲティングドメインがダイノルフィン A、ダイノルフィン B およびリモルフィン(rimorphin) からなる群から選択されるダイノルフィンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３５】
35.変化したターゲティングドメインが配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50 および配列番号51からなる群から選択されるダイノルフィンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３６】
36.変化したターゲティングドメインがノシセプチン RK、ノシセプチン、神経ペプチド 1、神経ペプチド 2または神経ペプチド 3からなる群から選択されるノシセプチンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３７】
37.変化したターゲティングドメインが配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60 および配列番号61からなる群から選択されるノシセプチンを含む25による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３８】
38.変化したターゲティングドメインがα-メラニン細胞刺激ホルモン (α-MSH)、β-メラニン細胞刺激ホルモン (β-MSH)、γ-メラニン細胞刺激ホルモン (γ-MSH)、副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、副腎皮質刺激ホルモン-様中間ペプチド (CLIP)、β-リポトロピン (β-LPH)およびγ-リポトロピン (γ-LPH) からなる群から選択されるメラノコルチンを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４３９】
39.変化したターゲティングドメインが配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70 および配列番号71からなる群から選択されるメラノコルチンを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４０】
40.変化したターゲティングドメインがガラニンおよびガラニンメッセージ関連(message-associated)ペプチド (GMAP) からなる群から選択されるガラニンを含む11による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４１】
41.変化したターゲティングドメインが配列番号72 および配列番号73からなる群から選択されるガラニンを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４２】
42.変化したターゲティングドメインがクロモグラニン A ペプチド、クロモグラニン B ペプチドおよびクロモグラニン C ペプチドからなる群から選択されるグラニン(grainin)を含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４３】
43.変化したターゲティングドメインがβ-グラニン、バソスタチン(vasostatin)、クロモスタチン、パンクレアスタチン、WE-14、カテスタチン、パラスタチン(parastatin)およびGE-25からなる群から選択されるクロモグラニン A ペプチドを含む42による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４４】
44.変化したターゲティングドメインが配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80 および配列番号81からなる群から選択されるクロモグラニン A ペプチドを含む42による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４５】
45.変化したターゲティングドメインがGAWK ペプチド、副腎髄質ペプチドおよびセクレトリチン(secretolytin)からなる群から選択されるクロモグラニン B ペプチドを含む42による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４６】
46.変化したターゲティングドメインが配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85 および配列番号86からなる群から選択されるクロモグラニン B ペプチドを含む42による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４７】
47.変化したターゲティングドメインがセクレトネウリン(secretoneurin)、EM66およびマンセリン(manserin)であるクロモグラニン C ペプチドを含む42による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４８】
48.変化したターゲティングドメインが配列番号87であるクロモグラニン C ペプチドを含む42による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４４９】
49.変化したターゲティングドメインがサブスタンスP、神経ペプチド K (NPK)、神経ペプチドガンマ、ニューロキニン A、ニューロキニン B、ヘモキニンおよびエンドキニンからなる群から選択されるタキキニン ペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５０】
50.変化したターゲティングドメインが配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98 および配列番号99からなる群から選択されるタキキニン ペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５１】
51.変化したターゲティングドメインがコレシストキニン 58、コレシストキニン 39、コレシストキニン 33、コレシストキニン 12およびコレシストキニン 8からなる群から選択されるコレシストキニンペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５２】
52.変化したターゲティングドメインが配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114 または配列番号115からなる群から選択されるコレシストキニン 58 ペプチドを含む51による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５３】
53.変化したターゲティングドメインが配列番号100のアミノ酸 20-58、配列番号101のアミノ酸 20-58、配列番号102のアミノ酸 20-58、配列番号103のアミノ酸 20-58、配列番号104のアミノ酸 20-58、配列番号105のアミノ酸 20-58、配列番号107のアミノ酸 20-58、配列番号108のアミノ酸 20-58、配列番号109のアミノ酸 20-58、配列番号110のアミノ酸 20-58、配列番号111のアミノ酸 20-58、配列番号112のアミノ酸 20-58、配列番号113、配列番号114のアミノ酸 20-58または配列番号115のアミノ酸 20-58からなる群から選択されるコレシストキニン 39 ペプチドを含む51による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５４】
54.変化したターゲティングドメインが配列番号100のアミノ酸 26-58、配列番号101のアミノ酸 26-58、配列番号102のアミノ酸 26-58、配列番号103のアミノ酸 26-58、配列番号104のアミノ酸 26-58、配列番号105のアミノ酸 26-58、配列番号107のアミノ酸 26-58、配列番号108のアミノ酸 26-58、配列番号109のアミノ酸 26-58、配列番号110のアミノ酸 26-58、配列番号111のアミノ酸 26-58、配列番号112のアミノ酸 26-58、配列番号113のアミノ酸 26-58、配列番号114のアミノ酸 26-58 および配列番号115のアミノ酸 26-58からなる群から選択されるコレシストキニン 33 ペプチドを含む51による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５５】
55.変化したターゲティングドメインが配列番号100のアミノ酸 47-58、配列番号110 のアミノ酸 47-58 および配列番号114のアミノ酸 47-58からなる群から選択されるコレシストキニン 12 ペプチドを含む51による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５６】
56.変化したターゲティングドメインが配列番号100のアミノ酸 51-58であるコレシストキニン 8 ペプチドを含む51による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５７】
57.変化したターゲティングドメインが神経ペプチド Y (NPY)、ペプチド YY (PYY)、膵臓ペプチド (PP)および膵臓 イコサペプチド (PIP) からなる群から選択される神経ペプチドY関連 ペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５８】
58.変化したターゲティングドメインが配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119 および配列番号120からなる群から選択される神経ペプチドY関連 ペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４５９】
59.変化したターゲティングドメインがブラジキニン、カリジン、desArg9 ブラジキニンおよびdesArg10 ブラジキニンからなる群から選択されるキニンペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６０】
60.変化したターゲティングドメインが配列番号178、配列番号179、配列番号180 および配列番号181からなる群から選択されるキニンペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６１】
61.変化したターゲティングドメインがPAR1 ペプチド、PAR2 ペプチド、PAR3 ペプチドおよびPAR4 ペプチドからなる群から選択されるPARペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６２】
62.変化したターゲティングドメインが配列番号182、配列番号283、配列番号184 および配列番号185、配列番号182のアミノ酸 42-47、配列番号182のアミノ酸 42-55、配列番号182のアミノ酸 29-64、配列番号182のアミノ酸 1-64、配列番号183のアミノ酸 35-40、配列番号183のアミノ酸 35-48、配列番号183のアミノ酸 24-59、配列番号183のアミノ酸 1-59、配列番号184のアミノ酸 39-44、配列番号184のアミノ酸 39-52、配列番号184のアミノ酸 26-60、配列番号184のアミノ酸 1-60、配列番号185のアミノ酸 48-53、配列番号185のアミノ酸 48-61、配列番号185のアミノ酸 35-70 および配列番号185のアミノ酸 1-70からなる群から選択されるPARペプチドを含む24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６３】
63.変化したターゲティングドメインが、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号186 および配列番号187からなる群から選択される24による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６４】
64.プロテアーゼ切断部位が内在性クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位または外来性切断部位である1による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６５】
65.内在性クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位が、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位およびTeNT 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される64による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６６】
66.外来性 プロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼ切断部位、トロンビン切断部位、因子Xa 切断部位、ヒトライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ジペプチジルアミノペプチダーゼ切断部位、低分子ユビキチン様修飾因子 (SUMO)/ユビキチン様タンパク質-1(ULP-1) プロテアーゼ切断部位、およびクロストリジウム毒素基質切断部位からなる群から選択される 64による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６７】
67.クロストリジウム毒素基質切断部位が、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位およびTeNT 基質切断部位からなる群から選択される66による改変されたクロストリジウム毒素。
【０４６８】
68.以下を含む改変されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子:
a)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することができるクロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子;
b)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することができるクロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
c)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することができる転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
d)クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することができ、クロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することができる変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子;および
e) プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子、
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は一本鎖形態の改変されたクロストリジウム毒素を二本鎖形態へと変換する。
【０４６９】
69.ポリヌクレオチド分子が請求項 1-7のいずれかの改変されたクロストリジウム毒素をコードする68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７０】
70.クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子がBoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメインおよびTeNT 酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択される68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７１】
71.クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子がBoNT/A 転位置ドメイン、BoNT/B 転位置ドメイン、BoNT/C1 転位置ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置ドメイン、BoNT/F 転位置ドメイン、BoNT/G 転位置ドメインおよびTeNT 転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択される68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７２】
72.転位置促進ドメインがクロストリジウム毒素転位置促進ドメインである68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７３】
73.クロストリジウム毒素転位置促進ドメインが、BoNT/A 転位置促進ドメイン、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメインからなる群から選択される72によるポリヌクレオチド分子。
【０４７４】
74.転位置促進ドメイン がエンベロープを持ったウイルスの 融合ペプチドドメインである68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７５】
75.エンベロープを持ったウイルスの 融合ペプチドドメインが、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン、アルファウイルス融合ペプチドドメイン、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン、アブラウイルス融合ペプチドドメイン、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインおよび泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインからなる群から選択される74によるポリヌクレオチド分子。
【０４７６】
76.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子が、オピオイド、メラノコルチン、ガラニン、グラニン、タキキニン、コレシストキニン、神経ペプチドY関連、キニンペプチド、PARペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよびソマトスタチンをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択される68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７７】
77.ポリヌクレオチド分子がエンケファリン、BAM22 ペプチド、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチンおよびヘモルフィンからなる群から選択されるオピオイドを含む変化したターゲティングドメインをコードする68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７８】
78.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がα-メラニン細胞刺激ホルモン (α-MSH)、β-メラニン細胞刺激ホルモン (β-MSH)、γ-メラニン細胞刺激ホルモン (γ-MSH)、副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、副腎皮質刺激ホルモン-様中間 ペプチド (CLIP)、β-リポトロピン (β-LPH)およびγ-リポトロピン (γ-LPH) をコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるメラノコルチンを含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４７９】
79.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がガラニンおよびガラニン メッセージ関連 ペプチド (GMAP) をコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるガラニンを含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４８０】
80.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がクロモグラニン A ペプチド、クロモグラニン B ペプチドおよびクロモグラニン C ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるグラニン(grainin) を含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４８１】
81.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がβ-グラニン、バソスタチン、クロモスタチン、パンクレアスタチン、WE-14、カテスタチン、パラスタチンおよびGE-25をコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるクロモグラニン A ペプチドを含む80によるポリヌクレオチド分子。
【０４８２】
82.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がGAWK ペプチド、副腎髄質ペプチドおよびセクレトリチンをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるクロモグラニン B ペプチドを含む80によるポリヌクレオチド分子。
【０４８３】
83.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がセクレトネウリンをコードするポリヌクレオチド分子であるクロモグラニン C ペプチドを含む80によるポリヌクレオチド分子。
【０４８４】
84.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がサブスタンスP、神経ペプチド K (NPK)、神経ペプチドガンマ、ニューロキニン A、ニューロキニン B、ヘモキニンおよびエンドキニンをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるタキキニンペプチドを含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４８５】
85.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がコレシストキニン 58、コレシストキニン 39、コレシストキニン 33、コレシストキニン 12およびコレシストキニン 8をコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるコレシストキニン ペプチドを含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４８６】
86.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子が神経ペプチド Y (NPY)、ペプチド YY (PYY)、膵臓ペプチド (PP) および膵臓イコサペプチド (PIP) をコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択される神経ペプチドY関連 ペプチドを含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４８７】
87.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がブラジキニン、カリジン、desArg9 ブラジキニンおよびdesArg10 ブラジキニンをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるキニンペプチドを含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４８８】
88.変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子がPAR1、PAR2、PAR3 およびPAR4をコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択されるPARペプチドを含む68によるポリヌクレオチド分子。
【０４８９】
89.細胞において改変されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を発現させる工程を含む改変されたクロストリジウム毒素の生産方法であって、該ポリヌクレオチド分子が以下を含む方法:
a)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することができるクロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子;
b)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することができるクロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
c)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することができる転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
d)クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することができ、クロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することができる変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子;および
e)プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子、
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は一本鎖形態の改変されたクロストリジウム毒素を二本鎖形態へと変換する。
【０４９０】
90.ポリヌクレオチド分子が69のポリヌクレオチド分子のいずれかである89による方法。
【０４９１】
91.以下の工程を含む改変されたクロストリジウム毒素の生産方法:
a) 細胞に改変されたクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を導入する工程、該ポリヌクレオチド分子は以下を含む:
i)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することができるクロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子;
ii)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することができるクロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
iii)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することができる転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
iv) クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することができ、クロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することができる変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子;および、
v) プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子、
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は一本鎖形態の改変されたクロストリジウム毒素を二本鎖形態へと変換する、
b)該ポリヌクレオチド分子によってコードされる改変されたクロストリジウム毒素を発現させる工程。
【０４９２】
92.ポリヌクレオチド分子が69のポリヌクレオチド分子のいずれかである91による方法。
【実施例】
【０４９３】
以下の非限定的な実施例は、開示された態様のより完全な理解を助けるために例示的な目的でのみ提供されるものであり、本明細書に開示されるいかなる態様も限定する意図はない。
【０４９４】
実施例１
転位置促進ドメインおよびアミノ末端に存在する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の構築
本実施例は、本明細書に開示される、転位置促進ドメインを含み、かつ変化したターゲティングドメインがその改変毒素のアミノ末端に位置する改変クロストリジウム毒素の製造方法を説明する。
【０４９５】
1a.ターゲティング−転位置−転位置促進−酵素ドメインの構成
BoNT/A-AP4A- Nociceptin (配列番号: 188)に基づくポリヌクレオチド分子を、標準的手順を用いて合成する(BlueHeron（登録商標） Biotechnology、Bothell、WA)。本ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296を、配列番号：52のノシセプチン-RKターゲティングドメインと置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図4Aの全体的ドメイン配置を有する。ノシセプチン-RKターゲティングドメインに加えて、変化されたターゲティングドメインが、さらに、そのアミノ末端、エンテロキナーゼ切断部位中で終わるＰＡＲ１リーダー配列を含む。この部位の切断によりノシセプチンノシセプチン-RKターゲティングドメインの最初のアミノ酸が露出する。20〜50 塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的 ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、互いにライゲーションし、全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクターのSmaI 部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-AP4A- Nociceptinを作成する。合成したポリヌクレオチド分子を Big Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機 (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定により確証する。
【０４９６】
所望の場合、最適化したBoNT/A-AP4A-Nociceptin (配列番号: 188)に基づくポリヌクレオチド分子を合成して大腸菌株における発現を向上させることが出来る。BoNT/A-AP4A-Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子は以下のように改変できる： 1)大腸菌株のネイティブなポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む; 2)大腸菌株にみられるネイティブなポリヌクレオチド分子の平均G+C含量により近く一致するG+C含量を含む; 3)ポリヌクレオチド分子内にみられるポリモノヌクレオチド領域を低減させる; および/または 4)ポリヌクレオチド分子内にみられる内部制御または構造部位を排除する、例えば、Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際公開 WO 2006/011966 (Feb. 2、2006) ; Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際公開 WO 2006/017749 (Feb. 16、2006) を参照されたい。いったん配列最適化が完了すると、20〜50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、これを互いにライゲーションして全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクター のSmaI 部位にクローニングしてpUCBHB1/BoNT/A-AP4A- Nociceptinを作成する。合成したポリヌクレオチド分子をBig Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いた配列決定により確証する。所望の場合、異なる生物、例えば、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０４９７】
類似のクローニング戦略を用いて、以下についてpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：BoNT/B-AP4A-Nociceptin、配列番号2のアミノ酸 1098-1291が配列番号: 52と置換された改変BoNT/B; BoNT/C1-AP4A-Nociceptin、配列番号3のアミノ酸 1112-1291が配列番号: 52と置換された改変BoNT/C1; BoNT/D-AP4A-Nociceptin、配列番号4のアミノ酸 1099-1276が配列番号: 52と置換された改変BoNT/D; BoNT/E-AP4A-Nociceptin、配列番号5のアミノ酸 1086-1252が配列番号: 52と置換された改変BoNT/E; BoNT/F-AP4A-Nociceptin、配列番号6のアミノ酸 1106-1274が配列番号: 52と置換された改変BoNT/F; BoNT/G-AP4A-Nociceptin、配列番号7のアミノ酸 1106-1297が配列番号: 52と置換された改変BoNT/G; およびTeNT-AP4A-Nociceptin、配列番号8のアミノ酸 1128-1315が配列番号: 52と置換された改変TeNT。
【０４９８】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、クロストリジウム毒素のHCC ターゲティングドメインを、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインと置換した、改変クロストリジウム毒素-AP4Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；並びに、配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０４９９】
pET29/BoNT/A-AP4A-Nociceptinを構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-AP4A- Nociceptin コンストラクトを、1) BoNT/A-AP4A- Nociceptinのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結可能とする、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手順を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化したpET29 ベクターにサブクローニングしてpET29/BoNT/A-AP4A- Nociceptinを得る。ライゲーション混合物を化学的コンピテント大腸菌 DH5α 細胞 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に熱ショック方法を用いて形質転換し、50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート(pH 7.0)に播き、37℃インキュベーターに入れて一晩培養する。発現コンストラクトを含む細菌をカナマイシン耐性コロニーとして同定する。候補コンストラクトをアルカリ法のプラスミド少量調製手順を用いて単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析してインサートの存在と配向を判定する。このクローニング戦略により、BoNT/A-AP4A- Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０５００】
類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-AP4A- Nociceptin 毒素、例えば、BoNT/B-AP4A-Nociceptin、BoNT/C1-AP4A-Nociceptin、BoNT/D-AP4A-Nociceptin、BoNT/E-AP4A-Nociceptin、BoNT/F-AP4A-Nociceptin、BoNT/G-AP4A-NociceptinまたはTeNT-AP4A-Nociceptinについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素-AP4Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；並びに、配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５０１】
BoNT/A 転位置促進ドメインを別のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインで置換したBoNT/A-AP4A-Nociceptinを構築するために、BoNT/Bの転位置促進ドメインをBoNT/A-AP4A-Nociceptinにオーバーラップする末端によるスプライシング-ポリメラーゼ連鎖反応 (SOE-PCR) 手順を用いて導入し、例えば、R. M. Horton et al., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989);およびR. M. Horton, PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 (1995) を参照されたい。BoNT/B (配列番号2)のアミノ酸859-1097をコードする領域を含む核酸断片をSOE-PCRにより作動可能に連結し、BoNT/A-AP4A-GRPPの配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を置換し、pCR2.1 ベクターにTOPO（登録商標） TA クローニング方法 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いてサブクローニングする。これら反応に用いるフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、次のサブクローニング工程に有用な特有の制限酵素部位を含むよう設計する。その結果得られるコンストラクトを1)改変BoNT/A-AP4A-GRPPをコードする全オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結させることを可能にする制限酵素で消化する。その結果得られる制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、Inc.、Valencia、CA)により精製し、T4 DNA リガーゼ 手順を用いてpET29 ベクターにサブクローニングする。このクローニング戦略によりBoNT/B 転位置促進ドメインを含むBoNT/A-AP4A-NociceptinをコードするpET29 発現コンストラクトが得られた。
【０５０２】
類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、例えば以下と置換した、BoNT/A-AP4A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する： 配列番号3のBoNT/C1のアミノ酸 869-1111を含む転位置促進ドメイン;  配列番号4のBoNT/Dのアミノ酸 865-1098を含む転位置促進ドメイン; 配列番号5のBoNT/Eのアミノ酸 846-1058を含む転位置促進ドメイン; 配列番号6のBoNT/Fのアミノ酸 867-1105を含む転位置促進ドメイン; 配列番号7のBoNT/Gのアミノ酸 866-1105を含む転位置促進ドメイン; または配列番号8のTeNTのアミノ酸 882-1127を含む転位置促進ドメイン。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含む転位置促進ドメイン、例えば配列番号194−配列番号269、に置換したBoNT/A-AP4A-Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する。
【０５０３】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-AP4A-Nociceptin、BoNT/C1-AP4A-Nociceptin、BoNT/D-AP4A-Nociceptin、BoNT/E-AP4A-Nociceptin、BoNT/F-AP4A-Nociceptin、BoNT/G-AP4A-Nociceptin、TeNT-AP4A-Nociceptin、および例えば以下を含む上記の改変クロストリジウム毒素-AP4Aをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号: 9から配列番号: 51、配列番号: 53から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184、および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70。
【０５０４】
1b.ターゲティング-酵素-転位置-転位置促進ドメインの構成
実施例 1aに記載のように、BoNT/A-AP4B-Nociceptin (配列番号:189)に基づくポリヌクレオチド分子を合成し、UCBHB1 ベクターにクローン化する。このポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296をNociceptin-RKターゲティングドメインである配列番号:52と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図4Bの全体的ドメイン配置を有する。Nociceptin-RKターゲティングドメインに加えて、変化したターゲティングドメインは、さらに、そのアミノ末端で、エンテロキナーゼ切断部位中でコードするPAR1リーダー配列を含む。この部位での切断の結果、Nociceptin-RKターゲティングドメインの最初のアミノ酸が露出する。上記のように、所望の場合、異なる生物、例えば、細菌、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０５０５】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する、改変BoNT/A-AP4Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
さらに、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下のいずれか１つを含む変化したターゲティングドメインを含むために、改変クロストリジウム毒素-AP4B、例えばBoNT/B-AP4B、BoNT/C1-AP4B、BoNT/D-AP4B、BoNT/E-AP4B、BoNT/F-AP4B、BoNT/G-AP4B、またはTeNT-AP4Bを作製する：配列番号: 9から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184、または配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70。
【０５０６】
pET29/BoNT/A-AP4B-Nociceptinを構築するため、実施例 1aに記載のように、類似のクローニング戦略を用いる。このクローニング戦略により、BoNT/A-AP4B-Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-AP4B-Nociceptin毒素、例えば、BoNT/B-AP4B- Nociceptin、BoNT/C1-AP4B- Nociceptin、BoNT/D-AP4B- Nociceptin、BoNT/E-AP4B- Nociceptin、BoNT/F-AP4B- Nociceptin、BoNT/G-AP4B- Nociceptin、またはTeNT-AP4B- Nociceptinについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-AP4Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５０７】
BoNT/A 転位置促進ドメインが他のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインと置換されたBoNT/A-AP4B-Nociceptinを構築するため、実施例 1aに記載のように、SOE-PCRを用いる類似のクローニング戦略を使用する。このクローニング戦略により、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメイン、ならびにエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含む転位置促進ドメイン、例えば配列番号:194−配列番号:269、を含むBoNT/A-AP4B-NociceptinをコードするpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０５０８】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-AP4B- Nociceptin、BoNT/C1-AP4B- Nociceptin、BoNT/D-AP4B- Nociceptin、BoNT/E-AP4B- Nociceptin、BoNT/F-AP4B- Nociceptin、BoNT/G-AP4B- Nociceptin、TeNT-AP4B- Nociceptin、および例えば以下を含む上記の改変クロストリジウム毒素-AP4Bをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 71、配列番号:183または配列番号:184および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70。
【０５０９】
実施例２
転位置促進ドメインおよび中央に存在する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の構築
本実施例は、本明細書に開示される、転位置促進ドメインを含み、かつ変化したターゲティングドメインがその改変毒素の２つの他のドメインの間に位置する改変クロストリジウム毒素の製造方法を説明する。
【０５１０】
2a.酵素-ターゲティング-転位置-転位置促進ドメインの構成
BoNT/A-CP5A- Nociceptin (配列番号:190)に基づくポリヌクレオチド分子を、標準的手順を用いて合成する(BlueHeron（登録商標） Biotechnology、Bothell、WA)。本ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296を、Nociceptin-RKターゲティングドメインである配列番号52と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図5Aの全体的ドメイン配置を有する。二本鎖毒素の形成に使用したエンテロキナーゼ切断部位の切断はまた、Nociceptin-RKターゲティングドメインの第１のアミノ酸を露出する。20〜50 塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的 ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、互いにライゲーションし、全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクターのSmaI 部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-CP5A- Nociceptinを作成する。合成したポリヌクレオチド分子を Big Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機 (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定により確証する。
【０５１１】
所望の場合、発現を最適化したBoNT/A-CP5A- Nociceptin (配列番号:190)に基づくポリヌクレオチド分子を合成して大腸菌株における発現を向上させることが出来る。BoNT/A-CP5A- Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子は以下のように改変できる： 1)大腸菌株のネイティブなポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む; 2)大腸菌株にみられるネイティブなポリヌクレオチド分子の平均G+C含量により近く一致するG+C含量を含む; 3)ポリヌクレオチド分子内にみられるポリモノヌクレオチド領域を低減させる; および/または 4)ポリヌクレオチド分子内にみられる内部制御または構造部位を排除する、例えば、Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際公開 WO 2006/011966 (Feb. 2、2006) ; Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際公開 WO 2006/017749 (Feb. 16、2006) を参照されたい。いったん配列最適化が完了すると、20〜50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、これを互いにライゲーションして全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクター のSmaI 部位にクローニングしてpUCBHB1/BoNT/A-CP5A- Nociceptinを作成する。合成したポリヌクレオチド分子をBig Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (CP5Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機(CP5Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いた配列決定により確証する。所望の場合、異なる生物、例えば、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０５１２】
類似のクローニング戦略を用いて、以下についてpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：BoNT/B-CP5A- Nociceptin、配列番号2のアミノ酸 1098-1291が配列番号52と置換された改変BoNT/B; BoNT/C1-CP5A- Nociceptin、配列番号3のアミノ酸 1112-1291が配列番号52と置換された改変BoNT/C1; BoNT/D-CP5A- Nociceptin、配列番号4のアミノ酸 1099-1276が配列番号52と置換された改変BoNT/D; BoNT/E-CP5A- Nociceptin、配列番号5のアミノ酸 1086-1252が配列番号52と置換された改変BoNT/E; BoNT/F-CP5A- Nociceptin、配列番号6のアミノ酸 1106-1274が配列番号52と置換された改変BoNT/F; BoNT/G-CP5A- Nociceptin、配列番号7のアミノ酸 1106-1297が配列番号52と置換された改変BoNT/G; およびTeNT-CP5A- Nociceptin、配列番号8のアミノ酸 1128-1315が配列番号52と置換された改変TeNT。
【０５１３】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する、改変クロストリジウム毒素-CP5Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５１４】
pET29/BoNT/A-CP5A-Nociceptinを構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-CP5A- Nociceptin コンストラクトを、1) BoNT/A-CP5A- Nociceptinのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結可能とする、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手順を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化したpET29 ベクターにサブクローニングしてpET29/BoNT/A-CP5A- Nociceptinを得る。ライゲーション混合物を化学的コンピテント大腸菌 DH5α 細胞 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に熱ショック方法を用いて形質転換し、50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート(pH 7.0)に播き、37℃インキュベーターに入れて一晩培養する。発現コンストラクトを含む細菌をカナマイシン耐性コロニーとして同定する。候補コンストラクトをアルカリ法のプラスミド少量調製手順を用いて単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析してインサートの存在と配向を判定する。このクローニング戦略により、BoNT/A-CP5A- Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０５１５】
類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-CP5A- Nociceptin 毒素、例えばBoNT/B-CP5A- Nociceptin、BoNT/C1-CP5A- Nociceptin、BoNT/D-CP5A- Nociceptin、BoNT/E-CP5A- Nociceptin、BoNT/F-CP5A- Nociceptin、BoNT/G-CP5A- Nociceptin、またはTeNT-CP5A- Nociceptinについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-CP5Aコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５１６】
BoNT/A 転位置促進ドメインを別のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインで置換したBoNT/A-CP5A- Nociceptinを構築するために、BoNT/Bの転位置促進ドメインをBoNT/A-CP5A- Nociceptinにオーバーラップする末端によるスプライシング-ポリメラーゼ連鎖反応 (SOE-PCR) 手順を用いて導入し、例えば、R. M. Horton et al., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989);およびR. M. Horton, PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 (1995) を参照されたい。BoNT/B (配列番号2)のアミノ酸859-1097をコードする領域を含む核酸断片をSOE-PCRにより作動可能に連結し、BoNT/A-CP5A- Nociceptinの配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を置換し、pCR2.1 ベクターにTOPO（登録商標） TA クローニング方法 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いてサブクローニングする。これら反応に用いるフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、次のサブクローニング工程に有用な特有の制限酵素部位を含むよう設計する。その結果得られるコンストラクトを1)改変BoNT/A-CP5A- Nociceptinをコードする全オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結させることを可能にする制限酵素で消化する。その結果得られる制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、Inc.、Valencia、CA)により精製し、T4 DNA リガーゼ 手順を用いてpET29 ベクターにサブクローニングする。このクローニング戦略によりBoNT/B 転位置促進ドメインを含むBoNT/A-CP5A- NociceptinをコードするpET29 発現コンストラクトが得られた。
【０５１７】
類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、例えば以下と置換した、BoNT/A-CP5A- Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する： 配列番号3のBoNT/C1のアミノ酸 869-1111を含む転位置促進ドメイン;  配列番号4のBoNT/Dのアミノ酸 865-1098を含む転位置促進ドメイン; 配列番号5のBoNT/Eのアミノ酸 846-1058を含む転位置促進ドメイン; 配列番号6のBoNT/Fのアミノ酸 867-1105を含む転位置促進ドメイン; 配列番号7のBoNT/Gのアミノ酸 866-1105を含む転位置促進ドメイン; または配列番号8のTeNTのアミノ酸 882-1127を含む転位置促進ドメイン。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含む転位置促進ドメイン、例えば配列番号194−配列番号269、に置換したBoNT/A-CP5A- Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する。
【０５１８】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-CP5A- Nociceptin、BoNT/C1-CP5A- Nociceptin、BoNT/D-CP5A- Nociceptin、BoNT/E-CP5A- Nociceptin、BoNT/F-CP5A- Nociceptin、BoNT/G-CP5A- Nociceptin、TeNT-CP5A- Nociceptin、および例えば以下を含む上記の改変クロストリジウム毒素-CP5Aをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 71、配列番号:183または配列番号:184および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70。
【０５１９】
2b. 転位置-転位置促進-ターゲティング-酵素ドメインの構成
実施例 1aに記載のように、BoNT/A-CP5B- Nociceptin (配列番号:191)に基づくポリヌクレオチド分子を合成し、UCBHB1 ベクターにクローン化する。このポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296をNociceptin-RKターゲティングドメインである配列番号52と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図5Bの全体的ドメイン配置を有する。二本鎖毒素の形成に使用したエンテロキナーゼ切断部位の切断はまた、GRPP ターゲティングドメインの第１のアミノ酸を露出する。上記のように、所望の場合、異なる生物、例えば、細菌、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０５２０】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する、改変クロストリジウム毒素-CP5Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 180のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 181のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；配列番号: 182のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸 1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
さらに、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下のいずれか１つを含む変化したターゲティングドメインを含むために、改変クロストリジウム毒素-CP5B、例えばBoNT/B-CP5B、BoNT/C1-CP5B、BoNT/D-CP5B、BoNT/E-CP5B、BoNT/F-CP5B、BoNT/G-CP5B、またはTeNT-CP5Bを作製する：配列番号: 9から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184、または配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70。
【０５２１】
pET29/BoNT/A-CP5B- Nociceptinを構築するため、実施例 1aに記載のように、類似のクローニング戦略を用いる。このクローニング戦略により、BoNT/A-CP5B- Nociceptinをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-CP5B- Nociceptin毒素、例えば、BoNT/B-CP5B- Nociceptin、BoNT/C1-CP5B- Nociceptin、BoNT/D-CP5B- Nociceptin、BoNT/E-CP5B- Nociceptin、BoNT/F-CP5B- Nociceptin、BoNT/G-CP5B- Nociceptin、またはTeNT-CP5B- Nociceptinについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-CP5Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 61および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70のような、遊離のアミノ末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５２２】
BoNT/A 転位置促進ドメインが他のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインと置換されたBoNT/A-CP5B- Nociceptinを構築するため、実施例 1aに記載のように、SOE-PCRを用いる類似のクローニング戦略を使用する。このクローニング戦略により、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメイン、ならびにエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含む転位置促進ドメイン、例えば配列番号194−配列番号269、を含むBoNT/A-CP5B- NociceptinをコードするpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０５２３】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-CP5B- Nociceptin、BoNT/C1-CP5B- Nociceptin、BoNT/D-CP5B- Nociceptin、BoNT/E-CP5B- Nociceptin、BoNT/F-CP5B- Nociceptin、BoNT/G-CP5B- Nociceptin、TeNT-CP5B- Nociceptin、および例えば以下を含む上記の改変クロストリジウム毒素-CP5Bをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号: 9から配列番号: 51または配列番号: 53から配列番号: 71、配列番号:183または配列番号:184および配列番号: 172のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 173のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 174のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 175のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 176のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22または配列番号: 177のアミノ酸 1-12、アミノ酸 6-22、アミノ酸 8-22 または アミノ酸 1-22；配列番号: 182のアミノ酸 42-47、アミノ酸 42-55、アミノ酸 29-64 または アミノ酸 1-64；配列番号: 183のアミノ酸 35-40、アミノ酸 35-48、アミノ酸 24-59 または アミノ酸 1-59；配列番号: 184のアミノ酸 39-44、アミノ酸 39-52、アミノ酸 26-60 または アミノ酸 1-60；または配列番号: 185のアミノ酸 48-53、アミノ酸 48-61、アミノ酸 35-70 または アミノ酸1-70。
【０５２４】
実施例３
転位置促進ドメインおよびカルボキシ末端に存在する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の構築
本実施例は、本明細書に開示される、転位置促進ドメインを含み、かつ変化したターゲティングドメインがその改変毒素のカルボキシ末端に位置する改変クロストリジウム毒素の製造方法を説明する。
【０５２５】
3a.酵素-転位置-転位置促進-ターゲティングドメインの構成
BoNT/A-XP6A-Galanin (配列番号:192)に基づくポリヌクレオチド分子を、標準的手順を用いて合成する(BlueHeron（登録商標） Biotechnology、Bothell、WA)。本ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296を、Galanin ターゲティングドメインである配列番号72と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図6Aの全体的ドメイン配置を有する。20〜50 塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的 ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、互いにライゲーションし、全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクターのSmaI 部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-XP6A- Galaninを作成する。合成したポリヌクレオチド分子を Big Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機 (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定により確証する。
【０５２６】
所望の場合、発現を最適化したBoNT/A-XP6A- Galanin (配列番号:192)に基づくポリヌクレオチド分子を合成して大腸菌株における発現を向上させることが出来る。BoNT/A-XP6A- Galaninをコードするポリヌクレオチド分子は以下のように改変できる： 1)大腸菌株のネイティブなポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む; 2)大腸菌株にみられるネイティブなポリヌクレオチド分子の平均G+C含量により近く一致するG+C含量を含む; 3)ポリヌクレオチド分子内にみられるポリモノヌクレオチド領域を低減させる; および/または 4)ポリヌクレオチド分子内にみられる内部制御または構造部位を排除する、例えば、Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際公開 WO 2006/011966 (Feb. 2、2006) ; Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際公開 WO 2006/017749 (Feb. 16、2006) を参照されたい。いったん配列最適化が完了すると、20〜50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、これを互いにライゲーションして全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクター のSmaI 部位にクローニングしてpUCBHB1/BoNT/A-XP6A- Galaninを作成する。合成したポリヌクレオチド分子をBig Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いた配列決定により確証する。所望の場合、異なる生物、例えば、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０５２７】
類似のクローニング戦略を用いて、以下についてpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：BoNT/B-XP6A- Galanin、配列番号2のアミノ酸 1098-1291が配列番号72と置換された改変BoNT/B; BoNT/C1-XP6A- Galanin、配列番号3のアミノ酸 1112-1291が配列番号72と置換された改変BoNT/C1; BoNT/D-XP6A- Galanin、配列番号4のアミノ酸 1099-1276が配列番号72と置換された改変BoNT/D; BoNT/E-XP6A- Galanin、配列番号5のアミノ酸 1086-1252が配列番号72と置換された改変BoNT/E; BoNT/F-XP6A- Galanin、配列番号6のアミノ酸 1106-1274が配列番号72と置換された改変BoNT/F; BoNT/G-XP6A- Galanin、配列番号7のアミノ酸 1106-1297が配列番号72と置換された改変BoNT/G; およびTeNT-XP6A- Galanin、配列番号8のアミノ酸 1128-1315が配列番号72と置換された改変TeNT。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-XP6Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 88から配列番号: 115および配列番号: 178から配列番号: 181および配列番号: 178から配列番号: 181、並びに、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114 または 配列番号: 115のアミノ酸 26-58; 配列番号: 100、配列番号: 110または 配列番号: 114のアミノ酸 47-58；または配列番号: 100のアミノ酸 51-58のような遊離のカルボキシル末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５２８】
pET29/BoNT/A-XP6A- Galaninを構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-XP6A- Galanin コンストラクトを、1) BoNT/A-XP6A- Galaninのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結可能とする、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手順を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化したpET29 ベクターにサブクローニングしてpET29/BoNT/A-XP6A- Galaninを得る。ライゲーション混合物を化学的コンピテント大腸菌 DH5α 細胞 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に熱ショック方法を用いて形質転換し、50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート(pH 7.0)に播き、37℃インキュベーターに入れて一晩培養する。発現コンストラクトを含む細菌をカナマイシン耐性コロニーとして同定する。候補コンストラクトをアルカリ法のプラスミド少量調製手順を用いて単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析してインサートの存在と配向を判定する。このクローニング戦略により、BoNT/A-XP6A- Galaninをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０５２９】
類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-XP6A- Galanin 毒素、例えばBoNT/B-XP6A- Galanin、BoNT/C1-XP6A- Galanin、BoNT/D-XP6A- Galanin、BoNT/E-XP6A- Galanin、BoNT/F-XP6A- Galanin、BoNT/G-XP6A- Galanin、またはTeNT-XP6A- Galaninについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-XP6Aコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 88から配列番号: 115および配列番号: 178から配列番号: 181および配列番号: 178から配列番号: 181、並びに、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114 または 配列番号: 115のアミノ酸 26-58; 配列番号: 100、配列番号: 110または 配列番号: 114のアミノ酸 47-58；または配列番号: 100のアミノ酸 51-58のような遊離のカルボキシル末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５３０】
BoNT/A 転位置促進ドメインを別のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインで置換したBoNT/A-XP6A- Galaninを構築するために、上記のように、BoNT/Bの転位置促進ドメインをBoNT/A-XP6A- Galaninにオーバーラップする末端によるスプライシング-ポリメラーゼ連鎖反応 (SOE-PCR) 手順を用いて導入し、例えば、R. M. Horton et al., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989);およびR. M. Horton, PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 (1995) を参照されたい。BoNT/B (配列番号2)のアミノ酸859-1097をコードする領域を含む核酸断片をSOE-PCRにより作動可能に連結し、BoNT/A-XP6A- Galaninの配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を置換し、pCR2.1 ベクターにTOPO（登録商標） TA クローニング方法 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いてサブクローニングする。これら反応に用いるフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、次のサブクローニング工程に有用な特有の制限酵素部位を含むよう設計する。その結果得られるコンストラクトを1)改変BoNT/A-XP6A- Galaninをコードする全オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結させることを可能にする制限酵素で消化する。その結果得られる制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、Inc.、Valencia、CA)により精製し、T4 DNA リガーゼ 手順を用いてpET29 ベクターにサブクローニングする。このクローニング戦略によりBoNT/B 転位置促進ドメインを含むBoNT/A-XP6A- GalaninをコードするpET29 発現コンストラクトが得られた。
【０５３１】
類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、例えば以下と置換した、BoNT/A-XP6A- Galaninをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する： 配列番号3のBoNT/C1のアミノ酸 869-1111を含む転位置促進ドメイン;  配列番号4のBoNT/Dのアミノ酸 865-1098を含む転位置促進ドメイン; 配列番号5のBoNT/Eのアミノ酸 846-1058を含む転位置促進ドメイン; 配列番号6のBoNT/Fのアミノ酸 867-1105を含む転位置促進ドメイン; 配列番号7のBoNT/Gのアミノ酸 866-1105を含む転位置促進ドメイン; または配列番号8のTeNTのアミノ酸 882-1127を含む転位置促進ドメイン。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含む転位置促進ドメイン、例えば配列番号194−配列番号269、に置換したBoNT/A-XP6A- Galaninをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する。
【０５３２】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-XP6A- Galanin、BoNT/C1-XP6A- Galanin、BoNT/D-XP6A- Galanin、BoNT/E-XP6A- Galanin、BoNT/F-XP6A- Galanin、BoNT/G-XP6A- Galanin、TeNT-XP6A- Galanin、および例えば以下を含む上記の改変クロストリジウム毒素-XP6Aをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 88から配列番号: 115および配列番号: 178から配列番号: 181および配列番号: 178から配列番号: 181、並びに、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114 または 配列番号: 115のアミノ酸 26-58; 配列番号: 100、配列番号: 110または 配列番号: 114のアミノ酸 47-58；または配列番号: 100のアミノ酸 51-58。
【０５３３】
3b. 転位置-転位置促進-酵素-ターゲティングドメインの構成
実施例 1aに記載のように、BoNT/A-XP6B- Galanin (配列番号:193)に基づくポリヌクレオチド分子を合成し、UCBHB1 ベクターにクローン化する。このポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296をGalaninターゲティングドメインである配列番号72と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図6Bの全体的ドメイン配置を有する。上記のように、所望の場合、異なる生物、例えば、細菌、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０５３４】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する改変BoNT/A-XP6Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 88から配列番号: 115および配列番号: 178から配列番号: 181および配列番号: 178から配列番号: 181、並びに、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114 または 配列番号: 115のアミノ酸 26-58; 配列番号: 100、配列番号: 110または 配列番号: 114のアミノ酸 47-58；または配列番号: 100のアミノ酸 51-58のような遊離のカルボキシル末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
さらに、類似のクローニング戦略を用いて、以下のいずれか１つを含む変化したターゲティングドメインを含むために、改変クロストリジウム毒素-XP6B、例えばBoNT/B-XP6B、BoNT/C1-XP6B、BoNT/D-XP6B、BoNT/E-XP6B、BoNT/F-XP6B、BoNT/G-XP6B、またはTeNT-XP6Bを作製する：配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 88から配列番号: 115および配列番号: 178から配列番号: 181および配列番号: 178から配列番号: 181、並びに、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114 または 配列番号: 115のアミノ酸 26-58; 配列番号: 100、配列番号: 110または 配列番号: 114のアミノ酸 47-58；または配列番号: 100のアミノ酸 51-58。
非仮出願18049(BOT)Steward, L.E>ら、増強された転位置能力および非クロストリジウム毒素標的細胞のための変化した標的活性を有する改変クロストリジウム毒素。
【０５３５】
pET29/BoNT/A-XP6B- Galaninを構築するため、実施例 1aに記載のように、類似のクローニング戦略を用いる。このクローニング戦略により、BoNT/A-XP6B- Galaninをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-XP6B- Galanin毒素、例えば、BoNT/B-XP6B- Galanin、BoNT/C1-XP6B- Galanin、BoNT/D-XP6B- Galanin、BoNT/E-XP6B- Galanin、BoNT/F-XP6B- Galanin、BoNT/G-XP6B- Galanin、またはTeNT-XP6B- Galaninについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-XP6Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：変化したターゲティングドメイン、配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 88から配列番号: 115および配列番号: 178から配列番号: 181および配列番号: 178から配列番号: 181、並びに、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114 または 配列番号: 115のアミノ酸 26-58; 配列番号: 100、配列番号: 110または 配列番号: 114のアミノ酸 47-58；または配列番号: 100のアミノ酸 51-58のような遊離のカルボキシル末端アミノ酸を要求する変化したターゲティングドメイン。
【０５３６】
BoNT/A 転位置促進ドメインが他のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインと置換されたBoNT/A-XP6B- Galaninを構築するため、実施例 1aに記載のように、SOE-PCRを用いる類似のクローニング戦略を使用する。このクローニング戦略により、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメイン、ならびにエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含む転位置促進ドメイン、例えば配列番号194−配列番号269、を含むBoNT/A-XP6B- GalaninをコードするpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０５３７】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-XP6B- Galanin、BoNT/C1-XP6B- Galanin、BoNT/D-XP6B- Galanin、BoNT/E-XP6B- Galanin、BoNT/F-XP6B- Galanin、BoNT/G-XP6B- Galanin、TeNT-XP6B- Galanin、および例えば以下を含む上記の改変クロストリジウム毒素-XP6Bをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号: 62から配列番号: 71、配列番号: 183または配列番号: 184；および配列番号: 88から配列番号: 115および配列番号: 178から配列番号: 181および配列番号: 178から配列番号: 181、並びに、配列番号: 100、配列番号: 101、配列番号: 102、配列番号: 103、配列番号: 104、配列番号: 105、配列番号: 107、配列番号: 108、配列番号: 109、配列番号: 110、配列番号: 111、配列番号: 112、配列番号: 113、配列番号: 114 または 配列番号: 115のアミノ酸 26-58; 配列番号: 100、配列番号: 110または 配列番号: 114のアミノ酸 47-58；または配列番号: 100のアミノ酸 51-58。
実施例 4
細菌細胞における改変クロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素のいずれかの細菌細胞における発現に有用な手順を示す。
【０５３８】
発現コンストラクト、例えば、実施例1-5におけるいずれかの発現コンストラクトを、熱ショック形質転換プロトコールを用いて化学的コンピテント大腸菌 BL21 (DE3) 細胞(Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に導入する。熱ショック反応物を50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート (pH 7.0)に播き、37 ℃インキュベーターに入れ一晩培養する。発現コンストラクトを含む形質転換大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを用いて50 μg/mL のカナマイシンを含む3.0 mLのPA-0.5G 培地を含むバッフル付フラスコに接種し、これを37℃ インキュベーターに入れ、250 rpmで振盪しながら一晩培養する。その結果得られる一晩出発培養物を用いて50 μg/mL のカナマイシンを含むZYP-5052 自己誘導培地を含む3 L バッフル付フラスコに1:1000希釈にて接種する。培養体積は約 600 mL (20％ フラスコ体積)から約 750 mL (25% フラスコ体積)の範囲であった。これらの培養物を250 rpmで振盪する37 ℃ インキュベーターでおよそ 5.5時間培養し、次いで250 rpm で振盪する16 ℃インキュベーターに移し、一晩発現させる。細胞を遠心分離 (4,000 rpm、4 ℃、20-30分間)により収集し、すぐに用いるか、または必要時まで-80℃で乾燥保存する。
【０５３９】
実施例 5
改変クロストリジウム毒素の精製および定量
以下の実施例は、本明細書に開示するいずれかの改変クロストリジウム毒素の精製および定量に有用な方法を示す。
【０５４０】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー (IMAC) タンパク質精製のために、実施例 4に記載のように改変クロストリジウム毒素の発現に用いた大腸菌 BL21 (DE3) 細胞 ペレットを、カラム結合バッファー (25 mM N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 10 mM イミダゾール; 2x Protease Inhibitor Cocktail Set III (EMD Biosciences-Calbiochem、San Diego CA); 5 ユニット/mLのBenzonase (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI); 0.1% (v/v) Triton-X（登録商標） 100、4-オクチルフェノール ポリエトキシラート; 10％ (v/v) グリセロール)に再懸濁し、次いで冷却オークリッジ型遠心管に移す。細胞懸濁液を氷上で超音波処理して(10 秒の10-12 パルス、40％ 振幅、60 秒の冷却間隔、Branson Digital Sonifier)細胞を溶解し、次いで遠心分離して(16,000 rpm、4 ℃、20分間) 可溶化液を清澄にする。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムを2.5-5.0 mL のTALON（商標） SuperFlow Co2+ アフィニティー樹脂 (BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA)を充填した20 mL Econo-Pac カラム支持体 (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いて調製し、これを5 カラム体積の脱イオン化蒸留水で、次いで5 カラム体積のカラム結合バッファーですすぐことにより平衡化する。清澄にした可溶化液をゆっくりと平衡化したカラムに重力流により(およそ 0.25-0.3 mL/分)アプライする。カラムを次いで 5 カラム体積のカラム洗浄バッファー (N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 10 mM イミダゾール; 0.1% (v/v) Triton-X（登録商標） 100、4-オクチルフェノール ポリエトキシラート; 10％ (v/v) グリセロール)により洗浄する。改変クロストリジウム毒素は 20-30 mL のカラム溶出バッファー(25 mM N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 500 mM イミダゾール; 0.1% (v/v) Triton-X（登録商標） 100、4-オクチルフェノール ポリエトキシラート; 10％ (v/v) グリセロール) にて溶出され、およそ１２の1 mL フラクションに回収する。各溶出フラクションに含まれる改変クロストリジウム毒素の量をBradford 色素アッセイにより判定する。この手順において、各1.0 mL フラクションの20 μL アリコットを200 μLのBio-Rad Protein Reagent (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)と合わせ、脱イオン化蒸留水で1対4に希釈し、 次いで比色シグナルの強度を分光光度計を用いて測定する。最もシグナルが強い５つのフラクションを溶出ピークとみなし、一緒に合わせる。全タンパク質収量をプールしたピーク溶出フラクションの全タンパク質濃度をウシガンマグロブリンを標準(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)として用いて評価することによって判定する。  
【０５４１】
FPLC 脱塩 カラムを用いた改変クロストリジウム毒素の精製のために、HiPrep（商標） 26/10 サイズ排除 カラム (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ) を80 mLの4 ℃ カラム バッファー (50 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5)で前平衡化する。カラムを平衡化した後、改変クロストリジウム毒素サンプルを4 ℃ カラムバッファーの均一濃度移動相および流速10 mL/分のサイズ排除 カラムに BioLogic DuoFlow クロマトグラフィーシステム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いてアプライする。脱塩した改変クロストリジウム毒素サンプルをおよそ 7-12 mLの単一のフラクションとして回収する。
【０５４２】
FPLC イオン交換カラムを用いる改変クロストリジウム毒素の精製のために、IMAC カラムからの溶出後に脱塩された改変クロストリジウム毒素サンプルを1 mL Q1（商標） 陰イオン交換カラム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)にBioLogic DuoFlow クロマトグラフィーシステム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いてアプライする。サンプルを 4 ℃ カラムバッファー (50 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5)中でカラムにアプライし、4 ℃ 溶出バッファー (50 mM リン酸ナトリウム、1 M 塩化ナトリウム、pH 6.5)の以下の直線勾配にて溶出する: 工程 1、5.0 mLの5% 溶出バッファー、流速1 mL/分; 工程 2、20.0 mLの5-30％ 溶出バッファー、流速1 mL/分; 工程 3、2.0 mLの50％ 溶出バッファー、流速1.0 mL/分; 工程 4、4.0 mLの100％ 溶出バッファー、流速1.0 mL/分; および工程 5、5.0 mLの0％ 溶出バッファー、流速1.0 mL/分。カラムからの改変クロストリジウム毒素の溶出を280、260、および214 nmにてモニターし、280 nmにて最小閾値 (0.01 au)を上回る吸収を示すピークを回収する。ほとんどの改変クロストリジウム毒素は塩化ナトリウム 濃度およそ 100から200 mMにて溶出する。改変クロストリジウム毒素の平均総収量はBradford アッセイにより判定する。
【０５４３】
改変クロストリジウム毒素の発現をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。上記の手順を用いて精製したサンプルを2x LDS サンプルバッファー (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA) に添加し、NuPAGE（登録商標） Novex 4-12% Bis-Tris プレキャストポリアクリルアミドゲル (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA) を用いて変性還元条件にてMOPS ポリアクリルアミドゲル 電気泳動により分離する。ゲルをSYPRO（登録商標） Ruby (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA) で染色し、分離したポリペプチドを改変クロストリジウム毒素発現レベルの定量のためにFluor-S MAX MultiImager (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いて画像化する。改変クロストリジウム毒素のサイズおよび量をMagicMark（商標） タンパク質分子量標準(Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に対する比較により判定する。
【０５４４】
改変クロストリジウム毒素の発現はまた、ウェスタンブロット分析によっても分析する。上記の手順を用いて精製したタンパク質サンプルを 2x LDS サンプルバッファー (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に添加し、NuPAGE（登録商標） Novex 4-12% Bis-Tris プレキャストポリアクリルアミドゲル(Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いる変性還元条件でのMOPS ポリアクリルアミドゲル 電気泳動により分離する。分離したポリペプチドをTrans-Blot（登録商標） SD 半乾燥 電気泳動トランスファーセル装置 (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いてゲルからポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)にウェスタンブロッティングによりトランスファーする。PVDF 膜を、25 mM Tris-緩衝食塩水 (25 mM 2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール塩酸 (Tris-HCl)(pH 7.4)、137 mM 塩化ナトリウム、2.7 mM 塩化カリウム)、0.1% TWEEN-20（登録商標）、ポリオキシエチレン (20) ソルビタンモノラウリエート、2% ウシ 血清アルブミン、5% 脱脂粉乳を含む溶液中で室温で2時間インキュベートすることによりブロッキングする。ブロッキングした膜を、適当な一次抗体をプローブとして含むTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）(25 mM Tris-緩衝食塩水、0.1% TWEEN-20（登録商標）、ポリオキシエチレン (20) ソルビタンモノラウリエート) 中で4 ℃で一晩インキュベートする。一次抗体によりプローブされたブロットをTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）で３回それぞれ15 分洗浄する。洗浄した膜を二次抗体としてセイヨウワサビペルオキシダーゼに接合した適当な免疫グロブリン G 抗体を含むTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）中で室温で2時間インキュベートする。二次抗体によりプローブされたブロットをTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）で３回それぞれ15 分洗浄する。標識された改変クロストリジウム毒素のシグナル検出はECL Plus（商標） Western Blot Detection System (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ) を用いて可視化し、Typhoon 9410 Variable Mode Imager (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)により画像化して改変クロストリジウム毒素発現レベルを定量する。
【０５４５】
本発明の側面を開示された態様に言及して記載してきたが当業者であれば、開示された特定の実施例は単にこれらの側面を例示するものであり、本発明を限定するものではないことを容易に理解するであろう。様々な改変を本発明の精神を逸脱することなく行うことが出来る。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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