(57)【要約】  本発明は、少なくとも3つの核酸部分配列を含む核酸配列によって表される核酸分子に関し、各核酸部分配列は、上皮ナトリウムチャネルのサブユニットをコードし、各核酸部分配列は別の配列に対して頭-尾の立体配置に配置されている。本発明は、サブユニットを発現することができる本発明の核酸配列を含む細胞、および上皮ナトリウムチャネルのサブユニットの潜在的モジュレーター化合物をスクリーニングするための方法におけるその使用にさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
別の配列に対して頭-尾の立体配置で配置されている少なくとも3つの核酸部分配列を含む核酸配列によって表される核酸分子であって、これらの核酸部分配列の2つが上皮ナトリウムチャネルのβおよびγサブユニットをコードし、さらなる(複数の)核酸部分配列が、上皮ナトリウムチャネルのαサブユニットをコードする核酸部分配列およびδサブユニットをコードする核酸部分配列からなる群から選択され、上皮ナトリウムチャネルのコードされる各サブユニットが、それぞれ、以下の配列番号：
βサブユニットについて配列番号19、および
γサブユニットについて配列番号21、および
αサブユニットについて配列番号17、および/または
δサブユニットについて配列番号23
を有する、対応する核酸部分配列によってコードされるアミノ酸配列と約85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する核酸分子。
【請求項２】
各核酸部分配列の発現が誘導性である、請求項1に記載の核酸分子。
【請求項３】
各核酸部分配列の発現が、これらの各核酸部分配列に作動可能に連結している誘導性プロモーターの存在により誘導性となる、請求項2に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸配列を含む核酸構築物。
【請求項５】
各核酸部分配列が、適切な発現宿主でサブユニットの産生を誘導するさらなる制御配列の1つまたは複数に作動可能に連結している、請求項4に記載の核酸構築物。
【請求項６】
請求項5に記載の核酸構築物、ならびに転写および翻訳の停止シグナルを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項4もしくは5に記載の核酸構築物、または請求項6に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項7に記載の細胞を用いて上皮ナトリウムチャネルのサブユニットの潜在的モジュレーター化合物をスクリーニングするためのin vitroの方法。
【請求項９】
a)サブユニットを発現し、またはそれらの発現を誘導する、請求項7に記載の細胞を提供するステップと、
b)ステップa)で得た細胞を洗浄し、引き続き蛍光膜電位色素を添加するステップと、
c)ステップb)で得た細胞を、陽イオンの存在下で潜在的モジュレーター化合物と接触させるステップと、
d)ステップc)で得た細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化を、潜在的モジュレーターの非存在下で、c)で得られる細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化と比較するステップと
を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
ステップa)において上皮ナトリウムチャネルの阻害薬を加える、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
膜電位蛍光色素が:
Molecular DevicesのMembrane Potential Assayキット、好ましくはMP-red(カタログ番号R8123、R8126)、またはMP-blue(カタログ番号R8042、R8034)、Di-4-ANEPPS(ピリジウム、4-(2-(6-(ジブチルアミノ)-2-ナフタレニル)エテニル)-1-(3-スルホプロピル))-、水酸化物、分子内塩)、DiSBACC4(2)(bis(1,2-ジバルビツール酸)-トリメチンオキサノール)、DiSBAC4(3)(bis-(1,3-ジバルビツール酸)トリメチンオキサノール)、DiSBAC2(3)(bis-(1,3-ジエチルチオバルビツール酸)トリメチンオキサノール)、およびCC-2-DMPE(Pacific Blue(商標)1,2-ジエトラデカノイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩)
からなるリストから選択される、請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
陽イオンがナトリウムである、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップd)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも2%の増大を示す場合に塩味の潜在的エンハンサーが同定される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ステップd)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも2%の低減を示す場合に塩味の潜在的マスカーが同定される、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
ステップd)で同定される塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーが、
e)サブユニットを発現し、またはそれらの発現を誘導する、請求項7に記載の細胞を提供するステップと、
f)ステップe)で得た細胞を洗浄し、引き続きナトリウム感受性蛍光色素を添加するステップと、
g)ステップf)で得た細胞を、ナトリウムの存在下で、ステップd)で同定した塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーと接触させるステップと、
h)ステップg)で得た細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化を、塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーの非存在下で、g)で得られた細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化と比較するステップと
を含むステップでさらに試験される、請求項13または14に記載の方法。
【請求項１６】
ステップe)および/またはf)において上皮ナトリウムチャネルの阻害薬を加える、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ナトリウム感受性蛍光色素が:SBFI、CoroNa Green、CoroNa-Red、およびSodium Greenからなるリストから選択される、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１８】
ステップh)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも2%の増大を示す場合に塩味のエンハンサーが同定される、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップh)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも2%の低減を示す場合に塩味のマスカーが同定される、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮ナトリウムチャネルのサブユニットに対する発現系に関し、このサブユニットを発現する細胞に関し、上皮ナトリウムチャネルの潜在的モジュレーター化合物をスクリーニングするための方法におけるこの細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮ナトリウムチャネル(ENaC)のα、β、およびγサブユニットに対するコードDNA(cDNA)は、すでに単離されており、これらの遺伝子はクローニングされている(Voilleyら、(1994年)、Proc.Natl.Acad.Sci.、91巻、247〜251頁、およびVoilleyら、(1995年)、Genomics、28巻、560〜565頁)。各cDNAは大型の細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質を1つコードしている。サブユニットは全て、機能的なナトリウムチャネルの形成に必要であると考えられる(Canessaら、(1994年)、Nature、367巻、463〜467頁)。機能的なチャネルを形成するためのα、β、およびγサブユニットの化学量論に対していくつかのモデルが提唱されている(Kosariら、(1998年)、J.Biol.Chem.、273巻、13469〜13474頁、およびStaruschenkoら、(2005年)、Biophys.J.、88巻、3966〜3975頁)。
【０００３】
ENaCは、腎臓、結腸、肺などの多くの器官において、上皮を横切った液体および電解質の輸送を制御することによって、広範囲の細胞機能に関係している(Palmerら、(1986年)、Proc.Natl.Acad.Sci.、83巻、2767〜2770頁、およびVoilleyら、(1994年)、Proc.Natl.Acad.Sci.、91巻、247〜251頁)。さらに、舌の味蕾では、ENaCは脳の大脳に向かって塩味を伝達するための開始点と考えられている(Heckら、(1984年)、Science、223巻、403〜405頁)。齧歯動物の塩味伝達におけるENaCの中心的役割に対する証拠は非常に強力であるが、ヒトにおいて塩を検出する機序については非常に限られた情報しか入手できない。いくつかのENaCのファミリーメンバーが、ヒトで見出されている。ヒトにおける味覚の知覚は、いくつかのENaCファミリーメンバーの組合せによって媒介されていると疑われている。上記で定義したENaCは、ナトリウム、リチウム、およびプロトンに対して高度に選択性である。ENaCのモジュレーターを同定しようと、いくつかのスクリーニング系がすでに開発されている。このようなモジュレーターは、塩の知覚のエンハンサーまたはマスカーのいずれかであり得る。塩の知覚のエンハンサーは、例えば食品で用いることができる。これは、許容できる塩味を保持しながら、食品の塩含有量を低下させることができる。一方、塩の知覚のマスカーは、望ましくない塩の知覚をマスクするのに用いることができる。
【０００４】
あるいは、マスカーを、血圧を低下させるために、塩、好ましくはナトリウム摂取を低減するのに用いることができる。今までに開発されたスクリーニング系は、通常in vivoをベースとしたアッセイである。ENaCサブユニットは所与の細胞系で発現され、潜在的モジュレーター添加のENaCに対する効果を、陽イオンの存在下でモニターする。哺乳動物の細胞系であるHEK293におけるENaCサブユニットの一過性の発現に対するデータは、US2004/0072254 A1に記載されていた。しかし、本発明者らの実験では、ENaCサブユニットを安定に発現する哺乳動物細胞は、細胞の生命力の強力な低下をもたらした。哺乳動物細胞は、長期間にわたって、大量かつ継続的なナトリウムの流入に対処することができない様子であると思われる。したがって、安定な発現系をベースとするスクリーニングアッセイは、哺乳動物細胞では容易に実現することができない。一過性の発現の代替手段は、同特許出願にやはり記述されている。しかし、これは発現レベルの変動によって、実験上の大きな誤差を導入する。したがって、この代替手段は、ハイスループットのスクリーニングには適さないと思われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US2004/0072254 A1
【特許文献２】UK2396414A
【特許文献３】US5693756
【特許文献４】WO2002/087306 A2
【特許文献５】WO2004/072645 A2
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Voilleyら、(1994年)、Proc.Natl.Acad.Sci.、91巻、247〜251頁
【非特許文献２】Voilleyら、(1995年)、Genomics、28巻、560〜565頁
【非特許文献３】Canessaら、(1994年)、Nature、367巻、463〜467頁
【非特許文献４】Kosariら、(1998年)、J.Biol.Chem.、273巻、13469〜13474頁
【非特許文献５】Staruschenkoら、(2005年)、Biophys.J.、88巻、3966〜3975頁
【非特許文献６】Palmerら、(1986年)、Proc.Natl.Acad.Sci.、83巻、2767〜2770頁
【非特許文献７】Heckら、(1984年)、Science、223巻、403〜405頁
【非特許文献８】Raoら、(2000年)、Analytical Biochemistry、286巻、206〜213頁
【非特許文献９】Yao, F.ら、(1998年) Hum. Gene Therapy、9巻、1939〜1950頁
【非特許文献１０】Yao, F.およびEriksson, E.、(1999年)、Hum. Gene Therapy、10巻、419〜427頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ENaCモジュレーターを同定するための効率的なスクリーニングアッセイで用いることができる、改善されたENaC発現系が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
誘導性の発現系を使用すれば、安定な発現系を用いて記載された毒性の問題を回避することができる。
【０００９】
したがって、頭-尾の立体配置を有する誘導性の発現系の使用は、ENaCのモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法において今まで用いられた古典的な発現系に比べていくつかの利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の発現系で用いられるベクターを示す図である。このベクターはpcDNA5/FRT/TOをベースにしており、頭-尾の配向に配置されたヒト上皮ナトリウムチャネルの3つのサブユニット(α、β、γ)に対する核酸部分配列を含んでいる。この各々にテトラサイクリン誘導性プロモーターが先行した。プラスミドはFRT(Flp組換えターゲット)部位を含んでおり、この部位によって、そのゲノムにFRT部位を有する哺乳動物細胞系のFRT部位でFlpリコンビナーゼ媒介性のDNA組換えにより、プラスミドDNAの部位特異的組込みが可能になっている。
【図２】HEK293 Flp-In T-Rex hENaC細胞の試料でのウエスタンブロット(1レーンあたり等量のタンパク質を用いた)を示す図である。レーンは、pUR8191を、または抗V5抗体に対しては、誘導した(+ドキシサイクリン)もしくは非誘導の(-ドキシサイクリン)条件から得たγ-V5誘導体を含むベクターを、非トランスフェクトした、もしくはトランスフェクトしたいずれかのHEK293 Flp-In T-Rex細胞からのタンパク質試料を含んでいる。免疫ブロットを、抗α、抗β、および抗V5タグ抗体で発色した。
【図３】24時間+/-誘導後の、HEK293-hENaC細胞(pUR8191)におけるMP-Blueシグナルを示す図である。30秒後、140mM NaClまたはNMDGを含有するバッファーを添加することによって細胞を誘発し、最終濃度100または0mMの細胞外Na+をもたらした。蛍光シグナルをt=0で正規化し、平均値を12のウェルに対して決定した。
【図４】hENaCブロッカーであるアミロライド、ベンザミル、およびフェナミルの様々な濃度(Mにおける)に対する用量反応曲線を示す図である。細胞にMP-Blue色素を添加して1時間置き、Flexstationでアッセイした。
【図５】HEK293-hENaC細胞を96ウェルに接種し、24時間増殖させ、誘導し、SBFIを添加して1時間置き、340/510および380/510nmの組合せのフィルターで、Flexstationでアッセイしたことを示す図である。30秒後、140mM NaClの添加によって細胞を誘発し、最終濃度100mMの細胞外Na+をもたらした。12個のウェルに対して平均値を決定した。  ［図６（示さず）］図1と類似し、本発明の発現系で用いられるベクターを示す図である。このベクターはpcDNA5/FRT/TOをベースとしており、頭-尾配向に配置されたヒト上皮ナトリウムチャネルの3つのサブユニット(δ、β、γ)に対する核酸部分配列を含んでいる。この各々に、テトラサイクリン誘導性プロモーターが先行した。プラスミドはFRT(Flp組換えターゲット)部位を含んでおり、この部位によって、そのゲノムにFRT部位を有する哺乳動物細胞系のFRT部位のFlpリコンビナーゼ媒介性のDNA組換えにより、プラスミドDNAの部位特異的組込みが可能になっている。このベクターはpUR8245と命名されている。  ［図７（示さず）］やはり図1と類似し、本発明の発現系で用いられるベクターを示す図である。このベクターはpcDNA5/FRT/TOをベースとしており、頭-尾配向に配置されたヒト上皮ナトリウムチャネルの4つのサブユニット(α、β、γ、δ)に対する核酸部分配列を含んでいる。この各々に、テトラサイクリン誘導性のプロモーターが先行した。プラスミドはFRT(Flp組換えターゲット)部位を含んでおり、これにより、そのゲノムにFRT部位を有する哺乳動物細胞系のFRT部位のFlpリコンビナーゼ媒介性のDNA組換えによって、プラスミドDNAの部位特異的組込みが可能になっている。このベクターはpUR2846と命名されている。  ［図８（示さず）］図3に類似し、24時間+/-誘導後の、HEK293-hENaC細胞(pUR8245)における3MP-Blueシグナルを示す図である。30秒後、140mM NaClまたはNMDGを含有するバッファーを添加することによって細胞を誘発し、最終濃度100または0mMの細胞外Na+をもたらした。蛍光シグナルをt=0で正規化した。  ［図９（示さず）］図3に類似し、24時間+/-誘導後の、HEK293-hENaC細胞(pUR8246)におけるMP-Blueシグナルを示す図である。30秒後、140mM NaClまたはNMDGを含有するバッファーを添加することによって細胞を誘発し、最終濃度100または0mMの細胞外Na+をもたらした。蛍光シグナルをt=0で正規化した。  ［図１０（示さず）］図5に類似し、HEK293-hENaC細胞(pUR8245)を96ウェルに接種し、24時間増殖させ、誘導し、SBFIを添加して1時間置き、320/510および380/510nmの組合せのフィルターで、Flexstationでアッセイしたことを示す図である。30秒後、140mM NaClの添加によって細胞を誘発し、最終濃度100mMの細胞外Na+をもたらした。6個のウェルに対して平均値を決定した。  ［図１１（示さず）］図5に類似し、HEK293-hENaC細胞(pUR8246)を96ウェルに接種し、24時間増殖させ、誘導し、SBFIを添加して1時間置き、320/510および380/510nmの組合せのフィルターで、Flexstationでアッセイしたことを示す図である。30秒後、140mM NaClを加えることによって細胞を誘発し、最終濃度100mMの細胞外Na+をもたらした。6個のウェルに対して平均値を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
核酸分子
第一の態様において、本発明は、別のものに関して頭-尾の立体配置で配置されている少なくとも3つの核酸部分配列を含む核酸配列によって表される核酸分子を提供する。これらの核酸部分配列の2つは、上皮ナトリウムチャネルのそれぞれβおよびγサブユニット、またはこれらのサブユニットの各々の変異体、フラグメント、もしくは機能的同等物をコードする。さらなる(複数の)核酸部分配列は、上皮ナトリウムチャネルのαサブユニットをコードする核酸部分配列およびδサブユニットをコードする核酸部分配列、またはこれらのサブユニットの各々の変異体、フラグメント、もしくは機能的同等物からなる群から選択される。
【００１２】
核酸部分配列は、本明細書において、所与のポリペプチドをコードする核酸配列と定義される。核酸部分配列は、コード配列(cDNA)、またはゲノムDNA配列であってよい。本発明の核酸配列に存在する各核酸部分配列は、本明細書において、mRNA中に転写された場合に、上記で定義した上皮ナトリウムチャネルまたはENaCのサブユニットの1つ中に引き続き翻訳される核酸配列と定義される。
【００１３】
したがって、以下のENaCのサブユニットの組合せが、本発明の核酸分子に存在することが好ましい:
上皮ナトリウムチャネルのα、β、およびγサブユニットのそれぞれ、またはこれらの各サブユニットの変異体、フラグメント、もしくは機能的同等物、
上皮ナトリウムチャネルのδ、β、およびγサブユニットのそれぞれ、またはこれらの各サブユニットの変異体、フラグメント、もしくは機能的同等物、
上皮ナトリウムチャネルのα、δ、β、およびγサブユニットのそれぞれ、またはこれらの各サブユニットの変異体、フラグメント、もしくは機能的同等物。
【００１４】
ENaCのサブユニットのこれら3つの組合せは、発明を実施するための形態において後に例示するように、適切な宿主細胞で発現されるときに機能的であることが予想される。上記で定義したサブユニットの組合せは各々、機能的な上皮ナトリウムチャネルまたはENaCを代表することが予想される。
【００１５】
ENaCのサブユニットの組合せの機能性は、細胞のシグナルにおける、陽イオン媒介性、好ましくはナトリウム媒介性の変化を測定することによって、適切な宿主細胞で発現された場合に評価することが好ましい。この評価は、サブユニットの潜在的モジュレーターを加えないこと以外は、本明細書で後に記載する本発明の方法のステップa)からd)に記載する通りに行うことが好ましい。細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化は、サブユニット(またはチャネル)の機能性の指標である。
【００１６】
使用されるENaCサブユニットをコードする核酸部分配列は、天然に存在する形態、SNP(一塩基変異多型)を含む変異体、選択的にスプライスされた形態、形態の組合せ、または当技術分野では知られている任意の機能的な変異体であってよい。
【００１７】
上記で定義したサブユニットをコードするいくつかの核酸部分配列は、すでに開示されている。ヒト上皮ナトリウムチャネル(ENaC)のα、β、およびγサブユニットに対するコードDNA(cDNA)は、Voilleyの2つの出版物(Voilleyら、(1994年)、Proc.Natl.Acad.Sci.、91巻、247〜251頁、およびVoilleyら、(1995年)、Genomics、28巻、560〜565頁)で最初に発表された。他の出版物が、これらのサブユニットに対する類似のヒトコードDNAを後に開示した:UK2396414A(αについては図1a、ベータについては図1b、γについては図1cを参照せよ)、または(δについてNCBIデータベース中にある)受託番号NM 002978。US 2004/0072254 A1も、α、β、γ、およびδサブユニットに対するヒトcDNA配列を、配列番号1、2、3、および7として開示している。あるいは、ラットα鎖のスプライスされた形態がUS5693756にすでに開示されている。
【００１８】
好ましい実施形態によると、上記で定義したENaCのサブユニットをコードする各核酸部分配列は、
1)ENaCのコードされる各サブユニットであって、以下の配列番号、
βサブユニットについて配列番号2および/もしくは配列番号19、ならびに
γサブユニットについて配列番号3および/もしくは配列番号21、ならびに
αサブユニットについて配列番号1および/もしくは配列番号17、ならびに/または
δサブユニットについて配列番号7および/もしくは配列番号23
を有する、対応する核酸部分配列によってコードされるアミノ酸配列に、約80%を超えるアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するENaCのコードされる各サブユニット、かつ/あるいは、
2)ENaCのαサブユニットであって、配列番号15のアミノ酸配列と約80%を超えるアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ/または配列番号12もしくは配列番号13もしくは配列番号14に示されるアミノ酸フラグメントを含むENaCのαサブユニット、かつ/あるいは、
3)ENaCのコードされた各サブユニットであって、特異的に抗体、例えば、1)もしくは2)で定義した対応する核酸部分配列の1つによってコードされるアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生されたポリクローナル抗体、またはその免疫原性のフラグメント、およびその保存的変異体に結合するENaCのコードされた各サブユニット、かつ/あるいは、
4)サブユニットをコードする各核酸部分配列であって、ストリンジェントな条件下、1)もしくは2)で定義した対応する核酸部分配列、またはそれらの補体、およびそれらの保存的に修飾されている変異体に特異的にハイブリダイズする配列
からなる群から選択される。
【００１９】
配列番号1または配列番号17を有する核酸部分配列は、それぞれ配列番号4および配列番号16に対応するアミノ酸配列を有するα鎖サブユニットをコードする。
【００２０】
配列番号2または配列番号19を有する核酸部分配列は、それぞれ配列番号5および配列番号18に対応するアミノ酸配列を有するβ鎖サブユニットをコードする。
【００２１】
配列番号3または配列番号21を有する核酸部分配列は、それぞれ配列番号6および配列番号20に対応するアミノ酸配列を有するγ鎖サブユニットをコードする。
【００２２】
配列番号7または配列番号23を有する核酸部分配列は、それぞれ配列番号8および配列番号22に対応するアミノ酸配列を有するδ鎖サブユニットをコードする。
【００２３】
配列番号12、または配列番号13、または配列番号14の各アミノ酸フラグメントは、配列番号9、配列番号10、配列番号11のそれぞれの核酸配列によってコードされる。これらのアミノ酸フラグメントは各々、対応するアミノ酸部分配列全体のGlu470の位置で始まる(US5693756の図5Bに示す通り)。配列番号12のアミノ酸フラグメントは、配列番号15のアミノ酸部分配列の部分である。配列番号15のアミノ酸部分配列は、ENaCのラットαサブユニットである。配列番号13または配列番号14のアミノ酸フラグメントを含む、2)で定義される2つのαサブユニットは、US5693756に開示されているラットα鎖のスプライスされた形態を表す。
【００２４】
より好ましい一実施形態では、本発明の核酸分子は、別の配列に対して頭-尾の立体配置で配置されている少なくとも3つの核酸部分配列を含む核酸配列によって表され、これらの核酸部分配列の2つは上皮ナトリウムチャネルのβおよびγサブユニットをコードし、さらなる(複数の)核酸部分配列は、上皮ナトリウムチャネルのαサブユニットをコードする核酸部分配列およびδサブユニットをコードする核酸部分配列からなる群から選択され、上記で特定した上皮ナトリウムチャネルのコードされる各サブユニットは、
それぞれ、βサブユニットについて配列番号19、および
γサブユニットについて配列番号21、および
αサブユニットについて配列番号17、および/または
δサブユニットについて配列番号23
を有する、対応する核酸部分配列によってコードされるアミノ酸配列と約85%以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するとして同定される。
【００２５】
このサブユニットの好ましい組合せは、ラット由来ではないサブユニットに関するものである。より好ましくは、これらはヒト由来である。さらにより好ましくは、この好ましい実施形態で定義される核酸分子は、哺乳動物、さらにより好ましくはヒト細胞における機能上の発現のためである。ヒト配列と高度に相同である(約85%以上の同一性)配列の使用は魅力的である、というのは、これらの核酸分子が、哺乳動物、好ましくはヒト細胞で発現され機能的であることを、本発明者らは期待できるからである。さらに、これらの配列は、ヒト配列と非常に高度に相同性であるので、それゆえ調製される細胞型は、ヒトの味覚を擬し、例えばラットの配列で調製される細胞型よりも効率的であると本発明者らは期待している。しかし、ヒト配列に高度に相同性である配列の、安定な、かつ機能的な高レベルの発現は、今まで得るのが非常に困難であった。これが、今まで他者によって好ましくない発現系:一過性の発現系(WO2002/087306 A2)またはヒトチャネルサブユニットの動物の相同体を内因性に発現する細胞系の使用(WO2004/072645 A2)のいずれかが用いられた理由である。
【００２６】
さらにより好ましくは、本明細書で先に定義した同一性は約85%以上であり、さらにより好ましくは約90%以上であり、さらにより好ましくは約91%以上であり、さらにより好ましくは約92%以上であり、さらにより好ましくは約93%以上であり、さらにより好ましくは約94%以上であり、さらにより好ましくは約95%以上であり、さらにより好ましくは約96%以上であり、さらにより好ましくは約97%以上であり、さらにより好ましくは約98%以上であり、さらにより好ましくは約99%以上であり、さらにより好ましくは約100%である。
【００２７】
同一性パーセント値は、配列における同一のヌクレオチドの数を、全ヌクレオチドの長さから任意のギャップの長さを差し引いたもので除した比率を計算することによって決定した。DNAマルチプルシークエンスアラインメントを、DNAmanバージョン4.0などのDNAアラインメントプログラムを用いて、Optimal Alignment(Full Alignment)プログラムまたはClone Manager SuiteのAlign Plusソフトウェアを用いて行った。
【００２８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、5×SSPE、0.3%SDS、せん断し変性させたサケ精子DNA200pg/ml、および50%ホルムアミド中、42℃のプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。引き続き、ハイブリダイゼーション反応を、65℃で、2×SSC、0.2%SDSを用いて30分間、3回洗浄する。
【００２９】
好ましくは、用いる核酸部分配列は、ヒト由来である。さらにより好ましくは、上記に定義するサブユニットをコードする核酸部分配列は以下のものである:
- 用いるα鎖サブユニットは配列番号4または配列番号16の以下のアミノ酸配列を有し、これはそれぞれ配列番号1または配列番号17の以下の核酸部分配列によってコードされ、かつ/あるいは、
- α鎖サブユニットは配列番号15の以下のアミノ酸配列を有し、および/または配列番号12、もしくは配列番号13、もしくは配列番号14を有するいずれかのアミノ酸フラグメントを含み、かつ/あるいは、
- 用いるβ鎖サブユニットは配列番号5または配列番号18の以下のアミノ酸配列を有し、これはそれぞれ配列番号2または配列番号19の以下の核酸部分配列によってコードされ、かつ/あるいは、
- 用いるγ鎖サブユニットは配列番号6または配列番号20の以下のアミノ酸配列を有し、これはそれぞれ配列番号3または配列番号21の以下の核酸部分配列によってコードされ、かつ/あるいは、
- 用いるδ鎖サブユニットは配列番号8または配列番号22の以下のアミノ酸配列を有し、これはそれぞれ配列番号7または配列番号23の以下の核酸部分配列によってコードされる。
【００３０】
あるいは、かつ別の好ましい一実施形態によると、用いる核酸部分配列は、本明細書で先に定義した核酸部分配列の変異体である。本明細書で定義した核酸部分配列の変異体は、本明細書で定義する対応する導入された核酸分子の発現が、本明細書で先に定義されたアッセイにおいて機能的である場合、機能的であることが好ましい(本発明の方法のステップa)からd)のサブユニットの潜在的モジュレーターのないもの)。核酸配列の変異体は、これら核酸部分配列のフラグメントであってよい。好ましい変異体はサイレント突然変異を含んでいる。あるいは、またはそれと組み合わせて、核酸配列の変異体は、別のアミノ酸配列を生じないが、核酸部分配列が発現される宿主細胞のコドン使用頻度（codon usage）に対応するヌクレオチド置換の導入によって得ることもできる。好ましくは、核酸部分配列の変異体は、本明細書で先に定義した核酸部分配列のいずれか1つから開始して5’および/または3’終端の1つまたは複数のヌクレオチドが欠失しているようなものである。あるいは、またはそれと組み合わせて、核酸部分配列の変異体は、他の生物体から単離した核酸配列、および/または本明細書で先に定義した核酸部分配列の別のファミリーメンバーであることが好ましい。これらの変異体は全て、選択された種からのcDNAまたはゲノムライブラリーを用いて、典型的な取組みにおいて得ることができる。ライブラリーは、上記に定義したストリンジェントな条件下、ハイブリダイゼーションによって、本明細書で先に定義した核酸部分配列の1つ、またはその部分で引き続きスクリーニングすることができる。ヒトが好ましい種である。
【００３１】
別の好ましい一実施形態によると、核酸部分配列の変異体は、対立遺伝子の変異体である。対立遺伝子の変異体は、同じ染色体の遺伝子座を占める遺伝子の、任意の2つ以上の代替の形態を意味する。対立遺伝子の変異体は、突然変異によって天然に生じ、集団内で表現型の遺伝子多型をもたらし得る。
【００３２】
別の好ましい一実施形態によると、核酸部分配列の変異体は、遺伝暗号の縮重のおかげで、本明細書で先に定義した任意の核酸部分配列と異なる。
【００３３】
頭-尾の立体配置は、本明細書において、各核酸部分配列の転写の方向が、単一の核酸分子を形成するのに互いに類似している立体配置と定義される。これは、Raoらが例証している(Raoら、(2000年)、Analytical Biochemistry、286巻、206〜213頁)。この単一の核酸分子は、引き続き細胞中に導入され得る。頭-尾の立体配置の使用は本発明にとって有利である、というのは、得られる発現系は以前の系よりも再現性があり、より安定であると期待されるからである。さらに、頭-尾の配列における少なくとも3つのサブユニットを含む単一の核酸分子の使用は、ENaCの生理学的な/機能上の化学量論が尊重され得るような方法で、少なくとも3つのサブユニットの共発現のレベルを制御すると期待されている。
【００３４】
さらにより好ましくは、上記で定義した本発明の核酸配列に存在する各核酸部分配列の発現は、誘導性である。各核酸部分配列の発現の誘導性は、当業者には知られている任意の方法によって実現することができる。例えば、Invitrogen T-Rex system(テトラサイクリン制御性の発現、tetオペロンをベースとし、培地に誘導物質が加えられるまで挿入された遺伝子の発現が抑制される)、Invitrogen Gene-Switch System(GaI4-Elbプロモーターの活性化に基づく)、Stratagene Complete Control Inducible mammalian Expression system (キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)エクジソン受容体に対する遺伝子、およびエクジソン受容体に対する結合部位を含むプロモーターの両方を内部に持つ哺乳動物細胞における、昆虫ホルモンであるエクジソンまたはその類似体であるポナステロンA(ponA)による転写の活性化に基づく)、New England Biolabs RheoSwitch(登録商標)Mammalian Inducible Expression System(合成の誘導物質であるRheoSwitch Ligand RSL Iと、キメラの2部分の核受容体との高度に特異的な相互作用に基づく)、Qbiogene Q-mate(商標) Inducible Expression System、またはQ-mate(商標)CymR system(誘導物質分子であるキューメート(cumate)の非存在下、オペレーター部位に結合しているキューメートリプレッサータンパク質CymRによる遺伝子の発現の阻止に基づく。キューメートの存在下、CymRはキューメートに結合し、立体配置の変化を経験し、オペレーター部位からのその放出をもたらす)、StratageneのLacSwitch(登録商標)II誘導性哺乳動物発現系(lacオペロンをベースにし、誘導物質が培地に加えられるまで挿入された遺伝子の発現が抑制される)がある。
【００３５】
さらにより好ましくは、各核酸部分配列の発現は、本発明の核酸配列に存在する各核酸部分配列に作動可能に連結している誘導性プロモーターの存在により誘導性となる。本発明の状況下では、「作動可能に連結している」は、制御配列、ここではプロモーター配列が、制御配列が核酸部分配列の発現を誘導するように、核酸部分配列に対する位置に好適に配置される立体配置と定義される。
【００３６】
誘導性のプロモーターは、上記に定義した所与の核酸部分配列に対して、および所与の細胞において機能的である任意のプロモーターまたはその部分であってよく、プロモーターの転写開始活性は、細胞を培養する間に所与の誘導剤を添加したときに細胞において誘導され得る。
【００３７】
より好ましくは、誘導性プロモーターはテトラサイクリン制御性プロモーターである。さらにより好ましくは、誘導性プロモーターは、Yaoらに記載されているテトラサイクリン制御性のハイブリッドヒトサイトメガロウイルスプロモーターである(Yao, F.ら、(1998年) Hum. Gene Therapy、9巻、1939〜1950頁、ならびにYao, F.およびEriksson, E.、(1999年)、Hum. Gene Therapy、10巻、419〜427頁)。このシステムは、InvitrogenからT-Rex発現系として購入することができる。
【００３８】
誘導性の発現系を使用すれば、安定な発現系を用いて記載された毒性の問題を回避することができる。
【００３９】
したがって、頭-尾の立体配置を有する誘導性の発現系の使用は、ENaCのモジュレーターを同定するためのスクリーニング方法において今まで用いられた古典的な発現系に比べていくつかの利点がある。
【００４０】
核酸構築物および発現ベクター
第2の態様において、本発明は、上記で定義した本発明の核酸配列によって代表される本発明の核酸分子を含む核酸構築物を提供する。
【００４１】
本明細書における核酸構築物は、天然に存在する遺伝子から単離され、または組み合わされ、他の方法では天然に存在しない様式で並置された核酸のセグメントを含むように修飾されている、1本鎖または2本鎖いずれかの核酸分子と定義される。核酸構築物の語は、核酸構築物がコード配列の発現に必要とされる制御配列を全て含む場合には、発現カセットの語と同義である。コード配列の境界線は一般的に、mRNAの5’終端のATG開始コドン、およびmRNAの3’終端のオープンリーディングフレームを終結させる翻訳停止コドン配列によって決定される。あるいは、コード配列は、それだけには限定されないが、核酸配列(DNA)、cDNA、および組換えの核酸配列を含むことができる。
【００４２】
好ましくは、本発明の核酸配列に存在する各核酸部分配列は、各核酸部分配列、換言すると適切な発現宿主における各サブユニットの産生を誘導する、1つまたは複数のさらなる制御配列に作動可能に連結している。
【００４３】
「制御配列」の語は、本明細書において、サブユニットの発現に必要または有利であるすべての構成成分を含むと定義される。各制御配列は、サブユニットをコードする核酸部分配列に対して、天然であってもよく、または外来性であってもよい。このような制御配列には、それだけには限定されないが、リーダー、最適な翻訳開始配列、ポリアデニレーション配列、プロモーター、および転写ターミネーターが含まれる。最低限、制御配列には、プロモーター、ならびに転写および翻訳の停止シグナルが含まれる。制御配列は、サブユニットをコードする遺伝子のコード領域とともに、制御配列の連結を促進する特異的な制限酵素認識部位を導入する目的で、リンカーとともに提供され得る。
【００４４】
さらなる一態様では、上記に定義した核酸構築物、ならびに転写および翻訳の停止シグナルを含む発現ベクターが提供される。好ましいプロモーターは、特に、宿主細胞がヒトである場合、および/または核酸部分配列がヒト由来である場合は、ヒトサイトメガロウイルス前初期(CMV)プロモーターである。
【００４５】
宿主細胞
さらなる一態様では、両方とも先に定義した、核酸構築物、または発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。当業者であれば、細胞の選択は、選択されたサブユニットをコードする核酸部分配列の由来に大いに依存することを知っている。発現されるサブユニットが機能的である限り、任意の細胞を選択することができる。好ましくは、サブユニットの発現は安定であり、場合により誘導性である。さらに、機能的なチャネルが、先に定義したように形成される。細胞が原核細胞または真核細胞であることが好ましい。細胞が昆虫または哺乳動物の細胞であるのが、より好ましい。哺乳動物の細胞がヒト細胞であるのが、さらにより好ましい。哺乳動物の細胞の例には、HEK293、HEK293T、MDCK、CHO、COS、NIH3T3、Swiss3T3、BHK、およびA549がある。細胞が、HEK293などの哺乳動物の細胞であるのが、さらにより好ましい。本発明の細胞は、組換えの細胞としてみることができる。本発明の細胞は、以下に示すように本発明の方法において有利に用いられる。3つのタイプの宿主細胞を調製することができる:
α、β、およびγサブユニットを発現する宿主細胞、または
β、γ、およびδサブユニットを発現する宿主細胞、または
本明細書で先に定義したα、β、γ、およびδサブユニット全てを発現する宿主細胞。
【００４６】
方法
さらなる一態様では、本発明は、先に定義した本発明の細胞を用いて、上皮ナトリウム(すなわちENaC)チャネルのサブユニットの潜在的モジュレーター化合物をスクリーニングするためのin vitroの方法に関する。この方法は、ヒトの身体上では行わない。
【００４７】
ENaCチャネルの潜在的モジュレーターは、本明細書では、ナトリウムイオンを細胞内に入れるENaCの能力を、阻止し、阻害し、変調し、または増強することにより、塩味の知覚を阻止、阻害、変調、または増強することができる化合物と定義される。天然に存在する、または合成のいずれかの任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖、脂質(例えばスフィンゴ脂質)、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどを、本発明の方法で味わうことができる。潜在的モジュレーター化合物は、十分な範囲の多様性をもたらすコンビナトリアルの、またはランダム化したライブラリーなどの、化合物のライブラリーの形態であることができる。
【００４８】
好ましい一実施形態では、その方法は、
a)ENaCのサブユニットを発現し、またはそれらの発現を誘導する、本発明の細胞を提供するステップと、
b)ステップa)で得た細胞を洗浄し、引き続き蛍光膜電位色素を添加するステップと、
c)ステップb)で得た細胞を、陽イオンの存在下で潜在的モジュレーター化合物と接触させるステップと、
d)ステップc)で得た細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化を、潜在的モジュレーターの非存在下でc)で得られた細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化と比較するステップと
を含む。
【００４９】
ステップa)
選択された発現系のタイプに応じて、当業者であれば、培養条件をENaCサブユニットの最も好ましい発現レベルを得るのに適応させることができるであろう。誘導性の発現系の場合は、当業者であれば、おそらく、細胞に加える誘導剤の量を最適化することもできる。発現の誘導の時間、および発現の誘導の間の温度もまた、おそらく最適化することができる。好ましい一実施形態によると、ENaCサブユニットの発現の誘導の開始時に、サブコンフルエントの細胞を、適切な培地を用いて96ウェルのプレートに入れる。サブコンフルエントは、好ましくは約70%のコンフルエント、より好ましくは約80%のコンフルエントを意味する。
【００５０】
好ましい一実施形態では、上記に記載する好ましい誘導性の発現系を用いる場合は、加える誘導剤は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンである(テトラサイクリン制御性プロモーター)。
【００５１】
好ましい一実施形態では、上皮ナトリウムチャネルのサブユニットの阻害薬をさらに加える。阻害薬がヒト上皮ナトリウムチャネルの既知の阻害薬であるのが、より好ましい。この阻害薬が、フェナミル、ベンザミル、およびアミロライド、ならびにこれらの任意の他の誘導体からなるリストから選択されるのがさらにより好ましい。阻害薬がフェナミルであるのが最も好ましい。阻害薬を加えることによってENaCチャネルの基底の活性を阻害することは、このチャネルのバックグラウンドの活性を低減し、したがってアッセイの感度を改善する一方法である。
【００５２】
ステップb)
ステップa)の終わりに、細胞を洗浄し、引き続き蛍光膜電位色素を添加する。洗浄媒体が等浸透圧性であることが好ましい。洗浄媒体がNMDG(N-メチル-D-グルカミン)(Sigma)であるのがより好ましい。膜電位蛍光色素は、本明細書において、その分布が膜の脱分極時に変化する分子または分子の組合せと定義される。これらの色素は、細胞で発現される場合にはENaCなどのイオンチャネルの活性における変化を検出するのに用いられ得る。既知の任意の膜電位蛍光色素を、製造元の指示にしたがって用いることができる。費用の問題により、濃度を、その有効性に影響を及ぼさずにおそらく低下させることができる。膜電位蛍光色素の例には、Molecular DevicesのMembrane Potential Assayキット、好ましくはMP-red(カタログ番号R8123、R8126)、またはMP-blue(カタログ番号R8042、R8034,)、Di-4-ANEPPS (ピリジウム、4-(2-(6-(ジブチルアミノ)-2-ナフタレニル)エテニル)-1-(3-スルホプロピル))-、水酸化物、分子内塩)、DiSBACC4(2)(bis-(1,2-ジバルビツール酸)-トリメチンオキサノール)、DiSBAC4(3)(bis-(1,3-ジバルビツール酸)-トリメチンオキサノール)、DiSBAC2(3)(bis-(1,3-ジエチルチオバルビツール酸)トリメチンオキサノール)、CC-2-DMPE (Pacific Blue(商標)1,2-ジエトラデカノイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩)がある。膜電位蛍光色素が、上記で定義する、Molecular DevicesからのMembrane Potential AssayキットMP-redまたはMP-blueであることが好ましい。
【００５３】
ステップc)
引き続き、ステップb)で得た細胞を、陽イオンの存在下、潜在的モジュレーター化合物と接触させる。陽イオンは、ENaCチャネルを通過することができることが知られている任意の陽イオンであってよい。準最適濃度の陽イオンを細胞に加えることが好ましい。陽イオンがナトリウムまたはリチウムであることが好ましい。陽イオンがナトリウムであるのがより好ましい。準最適濃度のナトリウムまたはリチウムを細胞に加えるのが、さらにより好ましい。準最適濃度のナトリウムまたはリチウムは、好ましくは10と100mMとの間、より好ましくは20と80mMとの間、さらにより好ましくは30と60mMとの間を含む。準最適のナトリウムまたはリチウムの濃度が約50mMであるのが最も好ましい。蛍光は、典型的には蛍光プレートリーダー上で測定する。先に定義したMolecular Devicesの好ましいMembrane Potentialキットを用いる場合は、細胞混合物を530nmで励起することが好ましい。蛍光の発光を565nmで測定する。
【００５４】
ステップd)
ステップc)で得た細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化を、潜在的モジュレーターの非存在下、c)で得られた細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化と比較する。換言すると、準最適濃度の陽イオンを(潜在的モジュレーターなしで)コントロールの細胞に加えた場合、典型的にはチャネルの準最大シグナルが観察される。準最適濃度の陽イオンで得られたチャネルの準最適シグナルを増大する化合物は、塩味の潜在的エンハンサーである。それとは対照的に、準最適濃度の陽イオンで得られたチャネルの準最適シグナルを低減する化合物は、塩味の潜在的マスカーである。ナトリウムまたはリチウムの準最適濃度は、ステップc)に捧げた段落で定義されている。チャネルの準最適シグナルを、準最適濃度のナトリウムを用いて得ることが好ましい。チャネルのシグナルは、本明細書において、ナトリウムイオンの添加後に測定された細胞の相対的な蛍光の単位における変化と定義される。
【００５５】
好ましい実施形態によると、塩味の潜在的エンハンサーは、ステップd)で行われる比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも約2%の増大を示す場合に同定される。より好ましくは塩味の潜在的エンハンサーが、ステップd)で行われた比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも約4%、少なくとも約6%、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約12%、少なくとも約14%、少なくとも約16%、少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約26%、少なくとも約28%、少なくとも約30%、少なくとも約32%、少なくとも約34%、少なくとも約36%、少なくとも約38%、少なくとも約40%、少なくとも約42%またはそれを超える増大を示す場合に同定される。これらの増大が全て、10と100mMとの間、より好ましくは20と80mMとの間、さらにより好ましくは30と60mMとの間からなる準最適濃度のナトリウムを用いて測定されることが好ましい。準最適ナトリウム濃度が約50mMであるのが最も好ましい。
【００５６】
別の好ましい一実施形態によると、塩味の潜在的マスカーは、ステップd)で行われる比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも約2%の低減を示す場合に同定される。より好ましくは、塩味の潜在的マスカーが、ステップd)で行われた比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも約4%、少なくとも約6%、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約12%、少なくとも約14%、少なくとも約16%、少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約26%、少なくとも約28%、少なくとも約30%、少なくとも約32%、少なくとも約34%、少なくとも約36%、少なくとも約38%、少なくとも約40%、少なくとも約42%またはそれを超える低減を示す場合に同定される。これらの低減が全て、10と100mMとの間、より好ましくは20と80mMとの間、さらにより好ましくは30と60mMとの間からなる準最適濃度のナトリウムを用いて測定されることが好ましい。準最適ナトリウム濃度が約50mMであるのが最も好ましい。
【００５７】
より好ましい一実施形態によると、ステップd)で同定される塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーは、
e)サブユニットを発現し、またはそれらの発現を誘導する、本発明の細胞を提供するステップと、
f)ステップe)で得た細胞を洗浄し、引き続きナトリウム感受性蛍光色素を添加するステップと、
g)ステップf)で得た細胞を、ナトリウムの存在下で、ステップd)で同定した塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーと接触させるステップと、
h)ステップg)で得た細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化を、塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーの非存在下で、g)で得られた細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化と比較するステップと
を含むステップでさらに試験される。
【００５８】
ステップe)はステップa)に類似する。ステップf)はステップb)に類似するが、加える蛍光色素がナトリウムに特異的である点が異なる。任意の市販のナトリウム蛍光色素を用いることができる。ナトリウム蛍光色素が、SBFI(ナトリウム結合性ベンゾフランイソフタレート)、CoroNa Green、CoroNa-Red、またはSodium Greenからなるリストから選択されることが好ましい。これらの色素は全て、Molecular Probesから入手することができる。ナトリウム蛍光色素がSBFIであるのがより好ましい。
【００５９】
ENaCチャネルの阻害薬は、ステップa)で定義したように、ステップe)および/またはf)で用いることが好ましい。好ましい阻害薬は、ステップa)に関する段落ですでに定義した。
【００６０】
ステップg)は、ステップc)に類似しており、陽イオンとしてナトリウムを用いる。ステップd)で同定した潜在的エンハンサーまたはマスカーを、潜在的モジュレーター化合物の代わりに試験する。
【００６１】
ステップh)は、やはりステップd)に類似しており、陽イオンとしてナトリウムを用いる。ステップg)で得た細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化を、ステップd)で同定した潜在的エンハンサーまたはマスカーの非存在下でg)で得られた細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化と比較する。換言すると、準最適濃度のナトリウムを(潜在的エンハンサーまたはマスカーなしで)コントロールの細胞に加えた場合、典型的には準最大のチャネルのシグナルが観察される。このステップにおいて、準最適のナトリウムの濃度は、好ましくは2と50mMとの間、より好ましくは5と40mMとの間、さらにより好ましくは7と30mMとの間、さらにより好ましくは10と25mMとの間を含む。
【００６２】
準最適の濃度のナトリウムで得られたチャネルの準最適シグナルを増大する化合物は、塩味の潜在的エンハンサーである。それとは対照的に、準最適濃度のナトリウムで得られたチャネルの準最適シグナルを低減する化合物は、塩味の潜在的マスカーである。チャネルのシグナルは、ステップd)に捧げられた段落ですでに先に定義されている。
【００６３】
好ましい実施形態によると、塩味の潜在的エンハンサーは、ステップh)で行われる比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも約2%の増大を示す場合に同定される。より好ましくは塩味の潜在的エンハンサーは、ステップh)で行われた比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも約4%、少なくとも約6%、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約12%、少なくとも約14%、少なくとも約16%、少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約26%、少なくとも約28%、少なくとも約30%、少なくとも約32%、少なくとも約34%、少なくとも約36%、少なくとも約38%、少なくとも約40%、少なくとも約42%またはそれを超える増大を示す場合に同定される。これらの増大が全て、2と50mMとの間、より好ましくは5と40mMとの間、さらにより好ましくは7と30mMとの間、さらにより好ましくは10と25mMとの間からなる準最適濃度のナトリウムを用いて測定されたステップであることが好ましい。
【００６４】
別の好ましい一実施形態によると、塩味の潜在的マスカーは、ステップh)で行われる比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも約2%の低減を示す場合に同定される。より好ましくは、塩味の潜在的マスカーが、ステップh)で行われた比較が、シグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも約4%、少なくとも約6%、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約12%、少なくとも約14%、少なくとも約16%、少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約26%、少なくとも約28%、少なくとも約30%、少なくとも約32%、少なくとも約34%、少なくとも約36%、少なくとも約38%、少なくとも約40%、少なくとも約42%またはそれを超える低減を示す場合に同定される。これらの低減が全て、好ましくは2と50mMとの間、より好ましくは5と40mMとの間、さらにより好ましくは7と30mMとの間、さらにより好ましくは10と25mMとの間からなる準最適濃度のナトリウムを用いて測定することが好ましい。
【００６５】
これら2つのアッセイを組み合わせたスクリーニング方法は、唯一の単一のアッセイを用いたスクリーニング方法よりも効率的であると期待される。
【００６６】
本明細書で先に言及したように、3タイプの宿主細胞を調製することができる:
α、β、およびγサブユニットを発現する宿主細胞、または
β、γ、およびδサブユニットを発現する宿主細胞、または
本明細書で先に定義した、α、β、γ、およびδサブユニットの全てを発現する宿主細胞。これら3タイプの細胞は、本発明の方法において機能的であることが、実施例において広範に実証されている。したがって、別の好ましい実施形態では、ステップa)からd)、またはa)からh)を含む本発明の方法は、本発明の任意の3つの宿主細胞を用いて実行される。本発明の3つの細胞型の1つを用いてこの方法で試験される潜在的モジュラー化合物を、本発明の別の細胞型を用いてこの方法でさらに試験するのがより好ましい。本発明の各細胞型において潜在的モジュラー化合物を引き続き試験することも包含される。本発明の方法において、本発明の1つから3つの異なる細胞型を使用することにより、潜在的モジュレーター化合物の特質に関するさらなる情報がもたらされ得る。
【００６７】
本文書、およびその特許請求の範囲において、動詞「含む」、およびその活用形は、その非限定的な意味において、語の後の項目が含まれることを意味するように用いられるが、特に言及されなかった項目が除外されるわけではない。さらに、不定冠詞である「一つの(a)」または「一つの(an)」による要素に対する指示内容は、前後関係によって1つまたはたった1つの要素が存在することが明らかに必要とされる以外は、1つを超える要素が存在する可能性を除外するものではない。したがって、不定冠詞である「一つの(a)」または「一つの(an)」は、通常「少なくとも1つ」を意味する。
【００６８】
本発明を以下の実施例によってさらに記載するが、実施例が本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００６９】
(実施例1)
ヒト上皮ナトリウムチャネルのα、β、およびγ鎖を発現する機能的な哺乳動物細胞
1.使用した発現構築物の説明
哺乳動物の細胞系をトランスフェクションするための組換えプラスミドを、標準の分子生物学の技術を用いて構築した。図1は、哺乳動物の細胞系のトランスフェクションに用いるためのヌクレオチドベクターの典型的な例を示す。ベクターは、pcDNA5/FRT/TO(Invitrogen)をベースにしており、頭-尾の配向に配列されたヒト上皮ナトリウムチャネルの3つのサブユニットに対するコードDNA配列を含んでいる(配列番号17はαをコードし、配列番号19はβをコードし、配列番号21はγをコードする)。これらの各々に、テトラサイクリン誘導性プロモーターが先行した。プラスミドはFRT(Flp組換えターゲット)部位を含んでおり、これによって、そのゲノムにFRT部位を有する哺乳動物細胞系のFRT部位でFlpリコンビナーゼ媒介性のDNA組換えによってプラスミドDNAの部位特異的組込みが可能になっている。
【００７０】
γサブユニットに対する効果的な市販の抗体は存在しない。したがって、γサブユニットが細胞で産生されたか否かを調べるために、標準の組換えDNA技術を用いて、γサブユニットがV5でタグ付けされたバージョンによって置き換えられたpUR8191の誘導体(γ-V5-タグ)を創出した。V5-タグに対する抗体は、Invitrogenから購入した。
【００７１】
2.細胞のトランスフォーメーション
ヒト細胞Flp-In T-Rex293(Invitrogen、カタログ番号R780-07)を、リポフェクタミン2000 (Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションは、本質的に製造元のマニュアルにしたがって行った。12ウェルのプレートに、抗体を含まない1ml DMEM(Life Technologies 31966-021)/10% FCS中、1ウェルあたり細胞0.5×106個を接種した。翌日、1)で調製した発現ベクターDNA2μgおよびpOG44 DNA(Flp-リコンビナーゼを発現する)8μgをOpti-MEM100μl中に加えた。引き続き、4μlのリポフェクタミン2000をこれらのOpti-MEM100μl中に加えた。この混合液を30分間インキュベートし、細胞に加えた。1から2日後、ブラストサイジン5μg/mlおよびハイグロマイシン100μg/mlを含むテトラサイクリンを含まない10%FCS(BD Biosciences 631101または631106)を補ったDMEM培地を加えることにより、培地を新しくした。約2〜3日ごとに、生存細胞系が肉眼によって明らかに見えるまで培地を新しくした。明らかに見えるようになったら、クローンを好適な体積に移し(96ウェル〜6ウェルプレート)、引き続きサブユニットのタンパク質の産生に対してスクリーニングした。
【００７２】
3.チャネルサブユニットの発現の証拠
α、β、およびγサブユニットのタンパク質を分析するために、6ウェルプレートに、1ウェルあたり培地2ml中、安定なHEK293 T-Rex Flp-In hENaC細胞1.5×106個を接種し、約20時間増殖させた。
【００７３】
1ウェルあたり0.6mlのドキソルビシン(最終濃度0.25μg/ml)を含むDMEM増殖培地を加えることによって、hENaCチャネルの発現を誘導した。20〜48時間後、細胞を掻き取り、2分間2000rpmで遠心分離し、PBS 1mlで洗浄し、CompleteEDTA(Roche、1873580、10mlあたり1錠)を有するPBS 90μlに再懸濁してプロテアーゼ活性を阻害した。細胞を、30秒間振幅6ミクロンのSoniprep150(MSE)で超音波処理することによって破壊し、氷上に配置し、使用用に凍結した。試料中のタンパク質濃度を、BioRadタンパク質測定キット(試料5μl、BioRad試薬40μl、および水160μl)を用いて、製造元のプロトコールにしたがって測定した。ゲルローディングの前に、4×試料バッファー(8%SDS、40%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、0.2MTris-HCl pH6.8、βメルカプトエタノール75μl/ml)30μlを加えた。
【００７４】
1試料あたり約10μgを、8%Novex Tris-グリシンゲル(Invitrogen、カタログ番号EC6015)上SDS-PAGEによって、125Vで分離した。ウェスタン分析用に、Ancosセミドライブロッティング法(150mA、2ブロットに対して1.5時間)によってタンパク質をImmobillon二フッ化ポリビニリデン膜(Milliporeカタログ番号IPVH00010)上に移した。ブロット上の非特異的な染色を4%(w/v)乾燥粉ミルク(Marvel)を含むPBSで15分間ブロックした。PBS/Marvelを除去し、ブロットを、PBS/0.1%Marvel中、抗α(1:2500希釈、ABR PA1-920)、抗β(1:2500希釈、ABR PA1-921)、または抗V5(1:2000希釈、Invitrogen)のいずれかである、第1の抗体とともに一夜インキュベートした。
【００７５】
引き続き、ブロットを、PBS-T(0.05%v/vTween20を含む)50mlで3回洗浄し、αおよびβに対しては1:5000希釈の抗ウサギAPコンジュゲート(Promega、S3731)とともに、またはV5-タグに対しては1:5000希釈の抗マウスAPコンジュゲート(Promega、S3721)とともに、2時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄後、タンパク質を、Biorad(NBT/BCIP)のアルカリホスファターゼコンジュゲート基質キットで可視化した。
【００７６】
3つのサブユニットは全て、誘導細胞では高含量で産生されたが、非誘導細胞では、誘導細胞におけるαサブユニットに観察されたバンドよりもサイズがわずかに小さい微かなバンドを示した抗α抗体以外、バンドは観察されなかった(図2を参照されたい)。このバンドは、おそらく、野生型の細胞にも存在するような、抗体と交差反応するタンパク質を表している。抗βおよび抗V5抗体だけが誘導細胞系においてタンパク質を認識し、分子量はβおよびγサブユニットに期待されたものであった。抗V5抗体は複数のバンドを認識したが、これは、サブユニット全てがヒト細胞における細胞外ドメインではやはりグリコシル化されているので、おそらく様々な形態のグリコシル化を表している。
【００７７】
4.1次スクリーニング:MPアッセイ
HEK293 Flp-In T-Rex hENaC細胞を、約80%のコンフルエントに増殖させ、37℃で1〜5分間、トリプシン/EDTAで培養皿から解離させた。解離した細胞を、DMEM/Tetを含まないFCS/ブラストサイジン/ハイグロマイシン培地中1×105と1×106細胞/mlとの間の濃度で取り上げた。1ウェルあたり100μlの細胞を、ポリ-L-リジンコーティングした透明底黒色ウェル96ウェルプレートに加えた。細胞を一夜増殖させ、次いで、ドキシサイクリンを含み(最終濃度0.25μg/ml)DMEM/Tetを含まないFCS/ブラストサイジン/ハイグロマイシン培地100μlを加えることによって誘導した。あるいは、いくつかのウェルでは、誘導中にhENaCチャネルの活性を阻害するためにアミロライドを加えた。
【００７８】
20から48時間後に培地を除去し、細胞をバッファーで洗浄し、引き続き製造元の指示にしたがって37℃で1時間、(Molecular Devicesの)MP-Blue(カタログ番号R8042)またはMP-Red(カタログ番号R8123)色素を添加した。蛍光測定用に、プレートを引き続き、FlexstationII中に添加した。30秒のベースライン測定後、化合物を様々な濃度でウェルに加えた。37℃、4秒の間隔で300秒間、励起/発光波長530/565nmで測定を行った。蛍光の値を、最初の5つの時間点の平均値に対して正規化した。
【００７９】
HEK293-Flp-In T-Rex hENaC細胞の膜電位色素とのナトリウム依存性の反応の一例として、誘導細胞および非誘導細胞に上記に記載したようにMP-Blueを添加し、NaCl 0および100mMで刺激した。図3に示すように、hENaC発現細胞(誘導細胞)だけが、Na+バッファーの添加後に蛍光シグナルの増大を示し、Na+流入の増大により膜の脱分極がより強力になったことを示していた。SigmaからのNMDG(N-メチル-D-グルカミン)の添加により、hENaC発現細胞において過分極がもたらされ、蛍光シグナルにおける低減として明らかであった。この過分極はNa+イオンの流出によって引き起こされる、というのは細胞内Na+濃度は細胞外濃度よりも高いからである。100mM NaClまたはNaClを含まないバッファーのいずれかで非誘導細胞を刺激しても、過分極を誘起する。しかし、Na+チャネルの非存在により、これらの細胞ではK+チャネルが膜電位に対する主な決定要因であり、細胞の内側のK+濃度が外側よりも高いので、この過分極は、ほぼ確実にK+イオンの流出によって引き起こされる。
【００８０】
ENaC阻害薬の役割
hENaCチャネルを、利尿性の分子であるアミロライドまたはその誘導体であるベンザミルおよびフェナミルによって阻止することができることを検証するために、上記に記載した方法にしたがって、阻害に対する用量反応曲線を作成した。図4に示すように、阻害に対する最良の化合物はフェナミルであり、ベンザミル、およびアミロライドが続く。
【００８１】
5.2次スクリーニング:SBFIアッセイ
HEK293 Flp-In T-Rex hENaC細胞を約80%のコンフルエントに増殖させ、37℃で1〜5分間、トリプシン/EDTAで培養皿から解離させた。解離した細胞を、DMEM/Tetを含まないFCS/ブラストサイジン/ハイグロマイシン培地中1×105と1×106細胞/mlとの間の濃度で取り上げた。1ウェルあたり細胞100μlを、ポリ-L-リジンコーティングした黒色ウェル透明底96ウェルプレートに加えた。細胞を一夜増殖させ、次いで、ドキシサイクリン(最終濃度0.25μg/ml)を含みDMEM/Tetを含まないFCS/ブラストサイジン/ハイグロマイシン培地100μlを加えることによって誘導した。あるいは、いくつかのウェルでは、アミロライドを加えて、誘導の間にhENaCチャネルの活性を阻害した。
【００８２】
20から48時間後に培地を除去し、細胞を一回洗浄し、製造元の指示にしたがって色素ローディングバッファー中SBFI(Molecular Probes)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、色素を除去し、細胞を一回洗浄し、バッファー70μlで取り上げた。
【００８３】
次いで、340/510nmおよび380/510nmの励起-発光波長ペアでの蛍光レベルを決定するために、プレートを蛍光プレートリーダー(FlexstationII、Molecular Devices)中に入れた。ベースラインを測定後、化合物、典型的にはNaCl 100mMもしくはバッファー(NaClを含まない)を加え、またはNaClの濃度範囲および正規化した340/380nmの比率を決定した。
【００８４】
図5は、誘導細胞または非誘導細胞のいずれかにNaCl 100mMを加えた実験の例を示している。この実験は、本発明の細胞におけるSBFIベースのスクリーニングの機能性を確かめるものである。
【００８５】
(実施例2)
ヒト上皮ナトリウムチャネルのβ、γ、およびδ鎖またはα、β、γ、およびδ鎖のいずれかを発現する機能的な哺乳動物細胞
実施例1におけるのと同じ戦略を用いた。用いたベクターは実施例1のものと類似していたが、存在する核酸配列の同一性が異なった。ベクターを図6、7に示す。ヒト上皮ナトリウムチャネルのβ、γ、およびδ鎖をコードする核酸配列として、それぞれ配列番号19、配列番号21、および配列番号23の核酸配列を用いた。
【００８６】
ヒト上皮ナトリウムチャネルのα、β、γ、およびδ鎖をコードする核酸配列として、それぞれ配列番号17、配列番号19、配列番号21、および配列番号23の核酸配列を用いた。用いた細胞は実施例1におけるのと同じであった。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法における、ヒト上皮ナトリウムチャネルのβ、γ、およびδ鎖、またはα、β、γ、およびδ鎖のいずれかを発現する両方の細胞系の機能性を実証するために、実施例1におけるように1次スクリーニング(MPアッセイ)を行った(図8、9)。得られた結果は、図3で得られたものと類似していた。引き続き2次スクリーニング(SBFIアッセイ)を、実施例1における通りに行った(図10、11)。得られた結果は、図5で得られたものと類似していた。両方のスクリーニングアッセイとも、両方の細胞系において機能的であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月24日(2009.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
別の配列に対して頭-尾の立体配置で配置されている少なくとも3つの核酸部分配列を含む核酸配列によって特徴付けられる核酸分子であって、これらの核酸部分配列の2つが上皮ナトリウムチャネルのβおよびγサブユニットをコードし、さらなる(複数の)核酸部分配列が、上皮ナトリウムチャネルのαサブユニットをコードする核酸部分配列およびδサブユニットをコードする核酸部分配列からなる群から選択され、上皮ナトリウムチャネルのコードされる各サブユニットが、それぞれ、以下の配列番号：
βサブユニットについて配列番号19、および
γサブユニットについて配列番号21、および
αサブユニットについて配列番号17、および/または
δサブユニットについて配列番号23
を有する、対応する核酸部分配列によってコードされるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、各核酸部分配列の発現が誘導性である、核酸分子。
【請求項２】
各核酸部分配列の発現が、これらの各核酸部分配列に作動可能に連結している誘導性プロモーターの存在により誘導性となる、請求項1に記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項1または2に記載の核酸配列を含む核酸構築物。
【請求項４】
各核酸部分配列が、適切な発現宿主でサブユニットの産生を誘導するさらなる制御配列の1つまたは複数に作動可能に連結している、請求項3に記載の核酸構築物。
【請求項５】
請求項4に記載の核酸構築物、ならびに転写および翻訳の停止シグナルを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項3もしくは4に記載の核酸構築物、または請求項5に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項6に記載の細胞を用いて上皮ナトリウムチャネルのサブユニットの潜在的モジュレーター化合物をスクリーニングするためのin vitroの方法。
【請求項８】
a)サブユニットを発現し、またはそれらの発現を誘導する、請求項6に記載の細胞を提供するステップと、
b)ステップa)で得た細胞を洗浄し、引き続き蛍光膜電位色素を添加するステップと、
c)ステップb)で得た細胞を、陽イオンの存在下で潜在的モジュレーター化合物と接触させるステップと、
d)ステップc)で得た細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化を、潜在的モジュレーターの非存在下で、c)で得られる細胞のシグナルにおける陽イオン媒介性の変化と比較するステップと
を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ステップa)において上皮ナトリウムチャネルの阻害薬を加える、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
陽イオンがナトリウムである、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
ステップd)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも2%の増大を示す場合に塩味の潜在的エンハンサーが同定され、あるいはステップd)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも2%の低減を示す場合に塩味の潜在的マスカーが同定される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ステップd)で同定される塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーが、
e)サブユニットを発現し、またはそれらの発現を誘導する、請求項6に記載の細胞を提供するステップと、
f)ステップe)で得た細胞を洗浄し、引き続きナトリウム感受性蛍光色素を添加するステップと、
g)ステップf)で得た細胞を、ナトリウムの存在下で、ステップd)で同定した塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーと接触させるステップと、
h)ステップg)で得た細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化を、塩味の潜在的エンハンサーまたはマスカーの非存在下で、g)で得られる細胞のシグナルにおけるナトリウム媒介性の変化と比較するステップと
を含むステップでさらに試験される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
ステップe)および/またはf)において上皮ナトリウムチャネルの阻害薬を加える、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ナトリウム感受性蛍光色素が:SBFI、CoroNa Green、CoroNa-Red、およびSodium Greenからなるリストから選択される、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
ステップh)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の増大の少なくとも2%の増大を示す場合に塩味のエンハンサーが同定され、あるいはステップh)で行われる比較がシグナルにおけるナトリウム媒介性の低減の少なくとも2%の低減を示す場合に塩味のマスカーが同定される、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2009544282.tif 000007
2009544282.tif 000008
2009544282.tif 000009