(57)【要約】本発明は、化合物（１）（式中、−Ｒ１は、４〜２０個の炭素原子の線状アルキル基を示し；−Ｙは、１〜５個の炭素原子の線状アルキル基または式−Ｒ−Ｏ−Ｒ’−、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’−または−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’−の基（ここで、Ｒは、１〜３個の炭素原子の線状アルキル基を示し、Ｒ’は、０〜３個の炭素原子の線状アルキレン基を示す）を示し、Ｙは、６位または７位で二環物と連結し；−Ｚは、３または４個の炭素原子の線状アルキル鎖を示し；−Ａは、酸素原子、硫黄原子、または−ＮＨ基またはアミノアルキル基−ＮＲ”（ここで、Ｒ”は、１〜２０個の炭素原子のアルキル基を示す）を示し；−Ａｒは、６〜１４個の炭素原子からなる芳香族環または多環、または、芳香族ヘテロ環（該芳香族ヘテロ環は、４、５または６個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とを含む）または縮合芳香族ヘテロ二環（該ヘテロ二環は、６〜９個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなる）を示し；−Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、それぞれ、水素原子または１〜４個の炭素原子のアルキル基を示し、Ｒ２およびＲ３は、場合によっては、窒素を含む５〜７員環を形成し；−Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素、線状アルキル基または１〜４個の炭素原子の線状オキシアルキル基を示す）に関する。
2009511566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2009511566.tif 000007
（式中：
−  Ｒ１は、４〜２０個の炭素原子の線状（linear）アルキル基を示し；
−  Ｙは、１〜５個の炭素原子の線状アルキル基または式−Ｒ−Ｏ−Ｒ’−、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’−または−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’―の基を示し、ここで、Ｒは、１〜３個の炭素原子の線状アルキル基を示し、Ｒ’は、０〜３個の炭素原子の線状アルキレン基を示し、Ｙは、６または７位で二環物と連結し；
−  Ｚは、３または４個の炭素原子の線状アルキル鎖を示し；
−  Ａは、酸素原子、硫黄原子または−ＮＨ基、またはアミノアルキル基−ＮＲ”を示し、ここで、Ｒ”は、１〜２０個の炭素原子のアルキル基を示し；
−  Ａｒは、６〜１４個の炭素原子からなる芳香族環または多環、または芳香族ヘテロ環（前記ヘテロ環は、４、５または６個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とを含む）、縮合芳香族ヘテロ二環物（該ヘテロ二環物は、６〜９個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯの群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなる）を示し、；
−  Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、それぞれ、水素原子または１〜４個の炭素原子のアルキル基を示し、Ｒ２およびＲ３は、場合によっては、窒素原子を有する５〜６員環を形成し；
−  Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素、線状アルキル基または１〜４個の炭素原子の線状オキシアルキル基を示す）
の化合物。
【請求項２】
Ａは、酸素原子、硫黄原子または−ＮＨ基を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａｒは、フェニル、ナフチル、フルフリル、ベンゾフルフリル、イソベンゾフルフリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、チエニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリジル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、プリニル、チエノ［３，２−ｂ］チオフェンからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ａｒは、フェニル、ナフチル、フルフリル、ベンゾフルフリル、イソベンゾフルフリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、チエニル、ベンゾチエニル、ピラジニル、ピリミジニルからなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ａｒは、フェニルおよびチエニルからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式（２）：
【化２】
2009511566.tif 000008
の請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
特定式（３）：
【化３】
2009511566.tif 000009
を有する請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
特定式（４）：
【化４】
2009511566.tif 000010
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
請求項６に記載の化合物の調製方法であって、
−  ６−ブロモメチル−４’−（ジエチルアミノ）−３−ヒドロキシフラボンをドデシルメチルアミンと反応させて、対応する第三級アミン（４’−（ジエチルアミノ）−６−（ドデシル（メチル）アミノメチル）−３−ヒドロキシフラボン）を形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（２）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の化合物の調製方法であって、
−  アルコキシド塩基の存在下に、Ｎ１−（４−アセチル−３−ヒドロキシフェニル）アセトアミドを５−ピペリジノ−２−チオチオフェンカルボアルデヒドと反応させ、次いで、過剰の過酸化水素およびアルコキシド塩基を添加して、Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］アセトアミドを形成させる工程と、
−  Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］アセトアミドを酸中で加水分解し、７−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）クロモンを与える工程と、
−  得られた物質をクロロアセチルクロリドと反応させて、Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］−２−クロロアセトアミドを得る工程と、
−  得られた物質をドデシルメチルアミンと反応させて、対応する第三級アミン（Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］−２−ドデシル（メチル）アミノアセトアミドを形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（３）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の化合物の調製方法であって、
−  ３−メチル−２，４−ジヒドロキシアセトフェノンを塩基、好ましくは炭酸カリウムと反応させ、次いで、１−ブロモ−３−クロロプロパンを添加して、４−（３−クロロプロポキシ）−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノンを形成させる工程と、
−  塩基（好ましくは炭酸カリウム）およびヨウ化物（好ましくはヨウ化カリウム）の存在下に、得られた物質をＮ−メチルドデシルアミンと反応させて、４−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノンを形成させる工程と、
−  塩基および過酸化物、好ましくは、それぞれナトリウムメトキシドおよび過酸化水素の存在下に、得られた物質を５−（１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ））−２−チオフェンカルボアルデヒドと反応させて、２−（５−ジエチルアミノチオフェン−２−イル）−７−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−８−メチル−３−ヒドロキシクロモンを形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（４）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法。
【請求項１２】
細胞形質膜の脂質非対称性、その表面電荷および／または形質膜の他の関連構造変化を研究するための蛍光プローブとしての、請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項１３】
細胞膜の脂質組成の変化を検出するための、特に、前記膜のリーフレットの間の脂質分布の変化を検出するための蛍光性２バンドレシオメトリックプローブとしての、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
アポトーシス細胞を検出するための請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
細胞アポトーシスの検出方法であって、
i）請求項１〜７のいずれか１つに記載の化合物を細胞と接触させる工程と、
ii）該細胞をインキュベートする工程と、
iii）細胞を洗浄する工程と、
iv）３５０〜５００ｎｍの励起波長においてプローブの蛍光発光スペクトルを観察することによってアポトーシス細胞を検出する工程と
を包含する方法。
【請求項１６】
細胞アポトーシスの度合いをアッセイする方法であって、ｉ）〜ｉｖ）の工程を包含する方法：
i）請求項１〜７のいずれか１つに記載の化合物を細胞と接触させる工程；
ii）該細胞をインキュベートする工程；
iii）該細胞を洗浄する工程；および
iv）（ａ）〜（ｃ）により細胞の膜組成の変化を検出する工程；
（ａ）３５０〜５００ｎｍの励起波長で前記化合物を射出させる（exit）ことによりアポトーシス細胞に挿入された化合物の発光スペクトルを集めること；
（ｂ）発光スペクトルにおいてＴ＊バンドおよびＮ＊バンドを選択すること；および
（ｃ）Ｔ＊バンドの強度をＮ＊バンドの強度で除算することによってアポトーシスの間の細胞形質膜の非対称性の喪失を定量すること。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１つに記載の化合物を含み、場合によっては、第二の試薬と接合させられた、アポトーシス細胞またはネクローシス細胞を検出および／または定量化および／または単離するためのキット。
【請求項１８】
第二の試薬は、ヨウ化プロピジウムである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
アポトーシス細胞、ネクローシス細胞および生細胞を単離するためのサイトメトリー分析におけるプローブとしての、請求項１８に記載のキットの使用。
【請求項２０】
アポトーシスを誘導または調節する化合物のスクリーニング方法であって、
i）試験されるべき化合物／薬物を細胞と接触させる工程と、
ii）請求項１５に記載の細胞アポトーシスの検出方法または請求項１６に記載の細胞アポトーシスのアッセイ方法を適用する工程と、
iii）その結果をコントロールにより得られた結果と比較する工程と
を包含する方法。
【請求項２１】
細胞のアポトーシスを伴う患者の疾患の進行を追跡する方法であって、請求項１５または１６に記載の方法を患者のサンプルに適用する、方法。
【請求項２２】
前記疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、心不全および癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のアポトーシスの測定用のプローブの分野に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、３−ヒドロキシフラボン（３−ＨＦ）誘導体および生体膜研究におけるそれらの使用に関する。本発明はまた、細胞のアポトーシスの測定方法およびこれらの化合物をプローブとして使用することを伴う細胞アポトーシスの度合いのアッセイ方法、このような化合物を含むキットおよびアポトーシス細胞、ネクローシス細胞および生細胞をそれぞれ分離するためのサイトメトリー分析におけるプローブとしてのそれらの使用および細胞のアポトーシスを伴う患者の疾患の変化およびこの過程を活性化または調節することができる薬物の作用を追跡する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アポトーシスは細胞死のプログラムされた生理学的形態であり、それは、障害が生じたかまたは不必要な細胞を除去し、組織のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすものである。
【０００４】
アポトーシスは、細胞の増殖と死との間の微妙なバランスが乱された病的状態に関係している。アポトーシスは、内分泌その他の刺激、免疫系の負の選択および多大な比率のＴ細胞傷害によって誘導され得る。それはまた、細胞傷害性化合物への露出、低酸素症またはウイルス感染後の多くの細胞死の主な原因となっている。それは、生育および退行の双方の腫瘍の細胞動態における主要な因子である。
【０００５】
多くの抗癌剤は、アポトーシスの開始を通じてそれらの効果を発揮し、発癌自体の過程でさえも、重大な突然変異ＤＮＡ損傷後の細胞の生存を認容するアポトーシスの選択的な重大な障害に依存し得る。
【０００６】
アポトーシスは、おそらく、アルツハイマー病、パーキンソン病および心不全を含む多くの慢性変性過程に寄与する。細胞死の高効率の多因子性機構のため、アポトーシス自体は、インビボで炎症反応を誘導しない。
【０００７】
アポトーシスとは対照的に、ネクローシスは、細胞膜の化学的または物理的な損傷による偶発的な細胞死である。ネクローシスの形態学的基準は、細胞腫脹（縮小ではない）、細胞溶解、リソソームの漏出および膜完全性の喪失を含む。アポトーシスに特徴的である細胞の変化はまた、ネクローシスに見出され得る。
【０００８】
病理学におけるネクローシスは、細胞が生理学的条件からの極端な変動（例えば、低体温、低酸素症、強いＵＶおよび電離放射線）に露出される場合に発生し、このことは、結果として、形質膜の損傷をもたらす。ネクローシスには、一般的に、リソソーム酵素の細胞外流体への漏出のため、強度の炎症反応および組織損傷が伴う。
【０００９】
正常な細胞は、細胞膜の内側と外側のリーフレットの間の脂質分布の顕著な非対称性を呈するが、これは、アポトーシスおよびネクローシスの早期段階の間に失われることが知られている。この変化における最も特徴的なことは、アミン含有リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamine：ＰＥ）およびホスファチジルセリン（phosphatidylserine：ＰＳ）の細胞表面への露出にある。この露出は、マクロファージによるアポトーシス細胞の認識および除去のためのシグナルを提供するので、機能的に重要である。この細胞膜特性の変化はまた、アポトーシス細胞の同定および特徴付けをすることを可能にする。
【００１０】
細胞アポトーシスを測定するための第１の研究方法の一つは、アミノ基に特異的な化学試薬によって検出され得る細胞表面上のアミノ基の露出の検出に基づいていた。しかしながら、これらの反応の低い特異性および環境に対するそれらの強い依存性によって、アポトーシス研究におけるそれらの適用が制限される。
【００１１】
したがって、表面露出ＰＳおよびＰＥの分子認識に基づくより特異的な方法が開発された。
【００１２】
それらのうちの最もポピュラーなものは、Ｃａ２＋依存性に表面上に露出したＰＳと相互作用するアネキシンＶの特性に基づいている。この方法の種々の変形が開発された。例えば、この変形の一つでは、フローサイトメトリーのためにフルオレセインによりラベリングされたアネキシンＶが用いられた一方で、組織画像化のために近赤外線染料によりラベリングされたアネキシンＶが用いられる。このタンパク質はまた、電子顕微鏡法のためにコロイド金により、組織レベルのオートラジオグラフィーのために放射線トレーサーにより、および、組織化学研究のためにペルオキシダーゼによりラベリングされた。全てのこれらの試験において、Ｃａ２＋イオンの高い（２．５ｍＭまでの）細胞外濃度が、アネキシンＶのＰＳへの完全なバインディングのために提供されなければならない。Ｃａ２＋イオンは、リン脂質分布をランダム化するタンパク質スクランブラーゼを活性化するので、この酵素は、カルシウム依存性にＰＳを細胞表面に移動させ、偽陽性結果に至り得る。
【００１３】
さらに、アネキシンＶは、負電荷を生じさせることによってアミンを改変する酸化による脂質の副生成物を含有する膜表面と会合し得る。
【００１４】
さらに、媒体中の界面活性剤（detergent）も、アネキシンＶ脂質のバインディング特異性を変化させ得る。
【００１５】
また、細胞を付着させるために通常使用される細胞収穫技術、例えば、トリプシン処理も、この方法の適用において誤った結果を生じさせ得る。
【００１６】
最後に、完全なアネキシンＶバインディングのために、１時間までの予備インキュベーション時間が原則として必要とされるが、これは、動力学的測定を問題のあるものにする。
【００１７】
代替方法には、負荷電脂質に対するモノクローナル抗体の適用が含まれる。しかしながら、これらの抗体は、制限された適用を見出した。これはおそらく、不安定性、高いコストおよびそれらのバインディングの視覚化のための複雑な手順のためである。さらに、それらのバインディングは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を阻害することが示された。一方で、抗体の挙動を模倣することは、ＰＳおよびＰＥを特異的に認識し、これらと結合するペプチドを見出すことを可能にした。ビオチン化ペプチドは、アポトーシス細胞の蛍光ラベリングを提供する蛍光ラベリンング化ストレプトアビジンと接合され得る。
【００１８】
リーフレット間の脂質交換の追跡はまた、蛍光ラベリング化脂質を用いてなされ得る。しかしながら、リーフレット間の脂質分布に介入することは、細胞によって十分に許容されず、外因性ＰＳによる細胞処理は、それ自体でアポトーシスを誘導し得る。
【００１９】
細胞表面上へのＰＣの露出のためのプローブは、合成有機化学によって設計され得る。例えば、フルオロフォアおよびＰＳ認識のための人工の亜鉛含有レセプターからなる有機分子が、アポトーシス検出のために提案された。検出手順の大幅な簡略化を提供するが、このプローブは、依然として、アポトーシス細胞を検出するための理想的な解決策からは遠い。主に、媒体中にキレートイオンの存在を必要とするためである。
【００２０】
ＰＳ露出によるアポトーシス細胞の負電荷の増加はまたセンシングのために用いられ得る。組込型蛍光リン脂質類似体を有する陽イオン性リポソームは、アポトーシス細胞に結合し、それらのラベリングを提供する。負荷電表面への選択的バインディングの同じ原理に基づいて、いくつかの正荷電ナノ粒子が、化学的に誘導されたライブラリから選択された。
【００２１】
アポトーシス細胞の膜特異的検出は、全く異なる概念に基づかれ得る。脂質含有量のランダム化は、脂質秩序および膜の剛性の低減を提供するべきである。ＰＥ脂質頭部の小サイズおよび負荷電ＰＳ頭部間の反発力は、外側のリーフレットの水和を増加させるべきであり、これらの変化は、蛍光染料によって検出され得る。
【００２２】
アポトーシス細胞は、陽イオン両親媒性薬物、例えば、クロロプロマジンおよびベラパミルのみならず、負荷電親油性染料であるメロシアニン５４０（Ｍ５４０）にも増加したバインディングを呈するという多くの観測がある。この染料は、構造的に不安定にされた脂質二重層に最も効率的に結合し、したがって、アポトーシス細胞を区別することができることが知られている。しかしながら、Ｍ５４０バインディングに基づく研究方法は、その低い特異性のため、まれにしか用いられない。
【００２３】
したがって、細胞膜の外側のリーフレットにおける秩序／水和の変化に基づく細胞アポトーシスの検出のための別の研究方法が開発された。この研究方法は、２色レシオメトリック応答を有する環境センシング染料としての３−ヒドロキシフラボン（３ＨＦ）誘導体の独自の特性に焦点を当てている。これらの染料は、リン脂質膜へのバインディングのために機能化された。これは、リン脂質組成の変動に対する蛍光発光の強い２色応答を観測することを可能にした。最も重大な効果は、中性と負荷電のリン脂質二重層の間の比較において観察される表面電荷の変動に起因していた。
【００２４】
しかしながら、これらの３−ヒドロキシフラボン（３ＨＦ）誘導体は、細胞内部での急速な浸透によって特徴付けられ、細胞形質膜に低い選択性を示す。
【００２５】
それ故に、本発明により、これらの３−ヒドロキシフラボン（３ＨＦ）化合物の選択性にとっての鍵となる課題が染料の選択性を形質膜の外側のリーフレットに組み込むことであったことが強調される。本発明者らの研究により、この目的は、長い炭化水素鎖および両性イオン性基を３−ＨＦ部分にカップリングさせて、脂質構造を模倣し、フルオロフォアを膜表面の近くに置くことによって実現され得ることが証明された。それ故に、本発明者らは、二重層を通じたプローブの浸透率を著しく減少させる両性イオン性基と長い炭化水素鎖とを持つ新規な３−ＨＦ化合物を開発した。結果として、この化合物は、細胞内部に再分布させられることはなく、細胞の形質膜内に位置したままである。
【００２６】
本発明者らによる実験により、アポトーシスの検出のための既知の非観血法と比較して、細胞アポトーシスの検出のためのプローブとしての新規３−ＨＦ化合物の使用は、以下の利点を示すことが示された：
・操作および調製がより容易である、
・局所的なプローブ濃度に依存することなく定量的測定を可能にする、
・より短いインキュベーション時間を必要とする、および
・アポトーシスへのその応答は、Ｃａ２＋イオンまたは細胞環境中に存在するあらゆる他の化合物の存在に依存しない。
【００２７】
本発明は、より良好に理解されることになり、本発明の他の態様、利点、目的は、添付の図面と緊密に併用される以下の記載から明らかになるだろう。これらは、例示のみの目的であり、それ故に、本発明を制限することは考慮されない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の開示）
本発明は、一般式（１）：
【００２９】
【化１】
2009511566.tif 000003
【００３０】
（式中：
−  Ｒ１は、４〜２０個の炭素原子の線状（直鎖状）アルキル基を示し；
−  Ｙは、１〜５個の炭素原子の線状アルキレン基または式−Ｒ−Ｏ−Ｒ’−、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’−または−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’−の基を示し、ここで、Ｒは、１〜３個の炭素原子の線状アルキレン基を示し、Ｒ’は、０〜３個の炭素原子の線状アルキレン基を示し、Ｙは、６または７位で二環物に連結され；
−  Ｚは、３または４個の炭素原子の線状アルキレン鎖を示し；
−  Ａは、酸素原子、硫黄原子または−Ｎ（Ｈ）−基またはアミノアルキル基−Ｎ（Ｒ”）−を示し、ここで、Ｒ”は、１〜２０個の炭素原子のアルキル基を示し；
−  Ａｒは、６〜１４個の炭素原子からなる芳香族性の単環または多環、芳香族ヘテロ環（前記ヘテロ環は、４、５または６個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯからなる群において選択される少なくとも１つのヘテロ原子とを含有する）、または、縮合芳香族ヘテロ二環（前記ヘテロ二環は、６〜９個の炭素原子と、Ｎ、ＳおよびＯからなる群において選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなる）を示し；
−  Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、それぞれ、水素原子または１〜８個の炭素原子のアルキル基を示し、Ｒ２およびＲ３は、場合によっては、窒素原子を有する５〜７員環を形成し；
−  Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一または異なって、水素、１〜４個の炭素原子の線状アルキル基または線状オキシアルキル基を示す）
を有する３−ヒドロキシフラボン（３−ＨＦ）化合物に関する。
【００３１】
好ましくは、Ａは、酸素原子、硫黄原子または−Ｎ（Ｈ）−基を示し、Ｒ’は不在である（０個の炭素原子の線状アルキレン基を示す）。
【００３２】
本発明によるアリール基Ａｒの例は、フェニル、ナフチル、フルフリル、ベンゾフルフリル、イソベンゾフルフリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、チエニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾィル、トリアゾリル、ピリジル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、プリニル、チエノ［３，２−ｂ］チオフェンを含む。
【００３３】
これらのアリール基の中で、フェニル、ナフチル、フルフリル、ベンゾフルフリル、イソベンゾフルフリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、チエニル、ベンゾチエニル、ピラジニル、ピリミジニルが挙げられ得る。
【００３４】
好ましくは、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素またはメチル、メトキシ、エチルまたはエトキシ基を示す。
【００３５】
本発明による化合物は、ラセミ混合物として調製される。しかしながら、それらは、さらに、精製されて、各エナンチオマーに分離され得る。
【００３６】
本発明の範囲に含まれる上記一般式（１）の化合物の中で、特に、下記化合物が挙げられ得る：
・式（２）の化合物
【００３７】
【化２】
2009511566.tif 000004
【００３８】
・式（３）の化合物
【００３９】
【化３】
2009511566.tif 000005
【００４０】
・式（４）の化合物
【００４１】
【化４】
2009511566.tif 000006
【００４２】
本発明によると、式（２）の化合物（１−ドデカナミニウム，Ｎ−［［２−［４−ジエチルアミノフェニル］−３−ヒドロキシクロモン−６−イル］−メチル］−Ｎ−メチル−（３−スルホプロピル），分子内塩，「Ｆ２Ｎ１２Ｓ」）は、
ａ）６−ブロモメチル−４’−（ジエチルアミノ）−３−ヒドロキシフラボンをドデシルメチルアミンと反応させて、対応する第三級アミン（４’−（ジエチルアミノ）−６−（ドデシル（メチル）アミノメチル）−３−ヒドロキシフラボン）を形成させる工程と、
ｂ）得られた物質をプロパンスルトンと反応させて、式（２）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法によって得られる。
【００４３】
式（３）の化合物（１−ドデカナミニウム，Ｎ−［２−［［３−ヒドロキシ−［２−［５−（１−ピペリジニル）−２−チエニル］−クロモン−６−イル］アミノ］−２−オキソエチル］−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スルホプロピル），分子内塩）は、
−  アルコキシド塩基、好ましくはメタン酸ナトリウムの存在下に、Ｎ１−（４−アセチル−３−ヒドロキシフェニル）アセトアミドを５−ピペリジノ−２−チオフェンカルボアルデヒドと反応させ、続いて、過剰の過酸化水素およびアルコキシド塩基を添加して、Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］アセトアミドを形成させる工程と、
−  Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］アセトアミドを酸中で加水分解して、７−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）クロモンを提供する工程と、
−  得られたものをクロロアセチルクロリドと反応させて、Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］−２−クロロアセトアミドを得る工程と、
−  得られたものをドデシルメチルアミンと反応させて、対応する第三級アミン（Ｎ１−［３−ヒドロキシ−２−（５−ピペリジノ−２−チエニル）−７−クロモニル］−２−ドデシル（メチル）アミノアセトアミドを形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（３）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法によって得られ得る。
【００４４】
式（４）の化合物（１−ドデカナミニウム，Ｎ−メチル−Ｎ−［３−プロポキシ−［２−［５−ジエチルアミノ−２−チエニル］−３−ヒドロキシ−８−メチルクロモン−７−イル］］−Ｎ−（３−スルホプロピル）−，分子内塩，「ＴＣＮ１２Ｓ」は、
−  ３−メチル−２，４−ジヒドロキシアセトフェノンを塩基、好ましくは炭酸カリウムと反応させ、その後に、１−ブロモ−３−クロロ−プロパンを加えて、４−（３−クロロプロポキシ）−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノンを形成させる工程と、
−  得られたものを、塩基（好ましくは炭酸カリウム）およびヨウ化物（好ましくはヨウ化カリウム）の存在下にＮ−メチルドデシルアミンと反応させて、４−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノンを形成させる工程と、
−  得られたものを、塩基および過酸化物（好ましくは、それぞれ、ナトリウムメトキシドおよび過酸化水素）の存在下に５−（１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ））−２−チオフェンカルボアルデヒドと反応させて、２−（５−ジエチルアミノチオフェン−２−イル）−７−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−８−メチル−３−ヒドロキシクロモンを形成させる工程と、
−  プロパンスルトンと反応させて、式（４）の化合物を形成させる工程と
を包含する方法によって得られ得る。
【００４５】
これらの化合物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製され得る。
【００４６】
本発明の化合物は、細胞を研究するための蛍光プローブとして有用である。特に、本発明による化合物は、細胞の形質膜の脂質非対称性、その表面電荷および／または形質膜の他の関連する構造変化を研究するために用いられ得る。さらに、それらは、それらの特有の特性のために、細胞膜の脂質組成の変化を検出するための、特に、前記膜のリーフレット間の脂質分布の変化を検出するための蛍光性２バンドレシオメトリックプローブ（fluorescent two band ratiometric probe）として有用である。前記膜変化に対するプローブの感度は、脂質小胞においてはそれらの脂質組成の変動によって、並びに、生細胞においてはアクチノマイシンＤによるアポトーシスの誘導によって評価された。
【００４７】
実際に、本発明の化合物は、強いソルバトクロミック性およびエレクトロクロミック性であり、それ故に、膜内の脂質の組成および静電相互作用に対して非常に高感度である。第二に、本発明の化合物は、波長スケールで十分に分離される２つの発光バンドであって、プローブの環境に対して異なって感受性を示すものを呈する。結果として、形質膜における非対称性の喪失は、プローブの局所濃度から独立して来る２つのバンドの強度比から測定され得る。第三に、本発明の化合物は、細胞膜の外側のリーフレットと専ら結合し、測定の間に細胞内部の内側のリーフレットに大幅には移動しない。
【００４８】
プローブＴＣＮ１２Ｓは、Ｆ２Ｎ１２Ｓの類似体であり、蛍光特性を向上させるために合成された。実際に、２−フェニル基の２−チエニルとの置換は、４２０ｎｍから４４５ｎｍに最大吸収をシフトさせ、これは、このプローブをＨｅ／Ｃｄレーザ（４４２ｎｍ）による励起に適したものにした。さらに、２つの発光バンド間の解像度は、９０ｎｍ（Ｆ２Ｎ１２Ｓ）から１２０ｎｍ（ＴＣＮ１２Ｓ）に増加し、これは、２色のレシオメトリックな検出に有利である。
【００４９】
それ故に、本発明の化合物は、それらは二重層の脂質組成に対して、特に、負荷電の脂質ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンの存在に対して強い感受性を示すので、アポトーシス細胞を検出するために用いられる。本発明の化合物は、細胞アポトーシスの間に形質膜の外側のリーフレットにおいて現れる陰イオン性の脂質をセンシングするのに特に適している。
【００５０】
より詳細には、本発明の化合物は、細胞アポトーシスを検出する方法および細胞アポトーシスの度合いをアッセイする方法に必要とされる。
【００５１】
本発明により細胞アポトーシスを検出する方法は、以下の工程を包含する：
i）本発明の化合物を細胞と接触させる工程；
ii）前記細胞をインキュベートする工程；
iii）細胞を洗浄する工程；および
iv）３５０〜５００ｎｍ、好ましくは３８０〜４７０ｎｍで変動する、最も好ましくはその吸収極大値（用いられるプローブに応じて４２０〜４４５ｎｍ）の励起波長におけるプローブの蛍光発光スペクトルを観察することによってアポトーシス細胞を検出する工程であって、プローブは、２バンド応答を証明し、バンドの一方は、初期に励起された正常Ｎ＊型（normal N* form）に属し、他方のバンドは、反応生成物の互変異性Ｔ＊型（tautomer T* form）に属する、工程。
【００５２】
短波長バンドのより高い相対強度は、アポトーシスの間の形質膜の外側のリーフレットにおける負の表面電荷の増加と相関する。
【００５３】
細胞アポトーシスをアッセイする方法は、以下の工程を包含する：
i）本発明の化合物を細胞と接触させる工程；
ii）前記細胞をインキュベートする工程；
iii）該細胞を洗浄する工程；および
iv）以下のａ〜ｃにより細胞の膜組成の変化を検出する工程；
ａ．３５０〜５００ｎｍ、好ましくは３８０〜４７０ｎｍで変動する、最も好ましくは、その吸収極大値（用いられるプローブに応じて４２０〜４４５ｎｍ）における励起波長でアポトーシス細胞に挿入された化合物を励起することによって、該化合物の発光スペクトルを収集すること；
ｂ．発光スペクトルの中からＴ＊バンドおよびＮ＊バンドを選択すること；および
ｃ．Ｔ＊バンドの強度をＮ＊バンドの強度によって除算することによってアポトーシスの間の細胞形質膜の非対称性の喪失を定量すること。
【００５４】
好ましくは、上記方法において、細胞は、５〜１０分の経過時間の間にインキュベートされる。
【００５５】
発光スペクトル中のＴ＊バンドおよびＮ＊バンドの選択は、発光を２つの広帯域（broad-band）フィルタにより２つのスペクトル領域：Ｎ＊バンドの放出をモニタリングするための４７０〜５００ｎｍ（青−緑色領域）およびＴ＊バンドの放出を集めるための５８５ｎｍ超（オレンジ−赤色領域）において集めることによってなされる。上記のように、非対称性の喪失の定量化は、Ｔ＊バンドの強度をＮ＊の強度で除算することによって得られる。前記２つのバンドのより低い比は、アポトーシスの間の細胞形質膜の非対称性の増加した喪失と相関し、それ故に、アポトーシスの形質転換の度合いについての情報が提供される。
【００５６】
アポトーシスを検出するための提案される方法は、蛍光ラベリングされたアネキシンＶに基づく一般に用いられる方法と比較される以下の利点によって特徴付けられる：
１）本発明による化合物の使用による蛍光レシオメトリック測定により、プローブプローブ濃度に依存しない絶対的な値が提供される；したがって、この技術は、より正確であり、アポトーシスのレベルの定量的な推定を可能にする；
２）合成有機分子をプローブとして用いることに基づいているため、この方法は簡単であり安価である。
【００５７】
本発明はまた、アポトーシス細胞またはネクローシス細胞の検出および／または定量化および／または単離に適したキットであって、場合によっては試薬と接合される本発明による化合物を含む、キットに関する。このようなキットは、研究目的のためだけでなく、医学または獣医学分野においても、例えば、人工受精前に精子の量を試験するために有用である。本発明のキットにおいて用いられ得る試薬の例は、細胞のネクローシスについては報告するが、細胞のアポトーシスをセンシングしない化合物を含む。好ましくは、試薬は、ヨウ化プロピジウムであり、その蛍光強度は、死細胞の核への浸透に起因して大きくなる。
【００５８】
ヨウ化プロピジウムに会合する／接合する本発明の化合物を含有するキットは、サイトメトリー分析において、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞および生細胞を分離するためのプローブとして用いられ得る。
【００５９】
本発明はまた、アポトーシスを誘導または調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。このような方法は、以下の工程を包含する：
i）試験されるべき化合物／薬物を細胞と接触させる工程；
ii）本発明による細胞アポトーシスを検出する方法または細胞アポトーシスをアッセイする方法を適用する工程；
iii）その結果を、コントロール（試験されるべき化合物／薬物と接触させられなかった細胞）により得られた結果と比較する工程。
【００６０】
本発明は、さらに、細胞のアポトーシスを検出する方法および／または細胞のアポトーシスの度合いをアッセイする方法を患者サンプルに適用することによって、細胞のアポトーシスを伴う、患者の疾患の進行を追跡する方法に関する。有利には、前記方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病、心不全、癌
等の疾患の進行を追跡するために用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【００６２】
（材料および方法）
・材料
アクチノマイシンＤ、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide：ＰＩ）およびタイプＩ−Ａ  ＲＮアーゼＡ：Sigma Chemical Co.（セントルイス，ＭＯ）から。
【００６３】
ＨＢＳＳ：Gibcoから。
【００６４】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Fluorescein IsoThioCyanate：フルオレセインイソチオシアナート）キット：Immunotechから。
【００６５】
・３−ヒドロキシフラボンプローブの合成
従来技術の３−ＨＦプローブＦおよびＦ２Ｎ８は、Ormson,S.M.et al.（Switching Between Charge-Transfer and Proton-Transfer Emission in the Excited-State of A Substituted 3-Hydroxyflavone.J.Photochem.Photobiol.A:Chem.，1994．81：ｐ．65−72）に記載された調製方法に従って合成された。
【００６６】
式（２）を有する本発明の３−ＨＦプローブＦ２Ｎ１２Ｓは、以下の手順を用いて合成された：最初に、０．１ｇの６−ブロモメチル−４’−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシフラボンが、無水ＴＨＦ３ｍＬ中の０．２ｍＬのドデシルメチルアミンと室温で３時間にわたって反応させられた。回転留去の後、粗生成物（薄層クロマトグラフィーにより十分に高純度である）は、２ｍＬのトルエンおよび５０μＬのジメチルホルムアミドに溶解させられ、次いで、４５μＬのプロパンスルトンが加えられた。反応混合物は、２０時間にわたって還流させられた。冷却後、混合物は、ヘキサンにより希釈され、生成物Ｆ２Ｎ１２Ｓはろ過された。Ｆ２Ｎ１２Ｓの精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフーを用いてなされた（ジクロロメタン／メタノール，４／１，ｖ／ｖ）。収率４０％；アセトトリル中の最大ＵＶ  ４１６ｎｍ，ε＝３４，０００  Ｌ×ｍｏｌ−１×ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  0.86 (3H, t, J 5.80 Hz), 1.16 (6H, t, J 6.8 Hz), 1.2-1.3 (2OH, multiplet), 1.75 (2H, m), 2.13 (2H, m), 2.94 (3H, s), 3.10-3.30 (2H, m), 3.40- 3.60 (6H, multiplet), 4.70 (2H, s), 6.84 (2H, d, J=8.1 Hz), 7.84 (1 H, d, J=8.4 Hz), 7.91 (1 H, d, J=8.4), 8.13 (2H, d, J=8.1 Hz), 8.33 (1 H, s); MS (FAB) m/z 642.4 (M+).
・細胞培養およびアポトーシスの誘導
ヒトリンパ系ＣＥＭ  Ｔ細胞は、X-vivo 15培地（Cambrex，フランス）中３７℃で湿気のある５％のＣＯ２雰囲気中で培養された。細胞の生存度は、トリパンブルー排除によってチェックされた。細胞は、５×１０５細胞／ｍＬで、アクチノマイシンＤ（０．５μｇ／ｍＬ）の存在下または不存在下に１８時間にわたって播かれた。細胞は、５分間にわたる１５００ｒｐｍの遠心分離によってペレット状にされ、実験のために１×１０６細胞／ｍＬで、X-vivo 15培地中に再懸濁させられた。
【００６７】
・低二倍体（hypodiploid）ＤＮＡの測定
アポトーシス細胞の比率を実証するために、フローサイトメトリーによるＰＩを用いた低二倍体ＤＮＡの測定が行われた。アポトーシス処理の後、細胞は採取され、ナンバリングされた。７０％エタノール水溶液中の濃度は、５×１０５細胞／ｍＬに調節され、固着が、４℃で少なくとも１時間にわたって継続することを可能にされた。細胞は、ハンクスの平衡塩類液（Hank’s balanced salt solution：ＨＢＳＳ）において１回洗浄され、その後に、ＲＮアーゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ＰＩ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有するＨＢＳＳに再懸濁させられ、１５分間にわたって室温で暗所においてインキュベートされた。サンプルが、CELLQuestソフトウェア（Becton Dickinson，San Jose，ＣＡ）を用いるフロサイトメトリーによって分析された。これらの条件下に、ＣＥＭ  Ｔ細胞中の低二倍体ＤＮＡの含有量は、３０±２％（平均±ＳＥＭ）であった。
【００６８】
・細胞の調製
細胞は、各実験の前に、ウシ胎仔血清を除去するためにＨＢＳＳによって２回洗浄された。選別実験において、細胞は、結合バッファー中に再懸濁させられ、アネキシンＶ−ＦＩＴＣキットによりラベリングされた。本発明のプローブＦ２Ｎ１２Ｓによる蛍光測定（蛍光光度法、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法）のために、細胞は、ＨＢＳＳ中に０．１μＭのＦ２Ｎ１２Ｓと共に再懸濁させられた。次いで、細胞懸濁液は、１０分間にわたりインキュベータ中の振とう浴（shaker bath）に置かれた。細胞の染色パターンは、共焦点イメージングシステムＭＲＣ−１０２４（BioRad）によりチェックされ、蛍光が形質膜から生じていることが確かめられた。
【００６９】
・フローサイトメトリー
上記のようにアクチノマイシンＤによりアポトーシスの誘導のために処理された細胞は、ＦＩＴＣラベリングアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて、アルゴンレーザ（４８８ｎｍ）およびそれぞれ５３０ｎｍおよび６３０ｎｍを中心とする蛍光フィルタ（emission filter）ＤＦ３０およびＤＦ２２を備えたFACStar+細胞選別機（BD Biosciences，ＣＡ，米国）により、生細胞、アポトーシス細胞および死細胞に選別された。選別された細胞の集団は、続く新染料による蛍光分析のために用いられた。
【００７０】
細胞のサイトメトリーにおけるＦ２Ｎ１２Ｓの確認のために、本発明者らは、アルゴンレーザ（４８８ｎｍ）およびダイオードレーザ（４０７ｎｍ）およびそれぞれ５３０ｎｍ、５８５ｎｍおよび６１０ｎｍを中心とする蛍光フィルタＤＦ３０、ＤＦ４２およびＤＦ２０を備えたFACSAria細胞選別機（BD Biosciences，ＣＡ，米国）を用いた。アルゴンレーザおよびダイオードレーザに対応する光学経路は独立している。データは、FACSDiva Software（BD Biosciences）を用いて分析された。顆粒形成、サイズおよび蛍光強度は、１秒当たり約１０００細胞の速度で記録された。
【００７１】
・毒性試験
Ｆ２Ｎ１２Ｓ分子の毒性は、ＰＩ（１９μＭ）を用いるフローサイトメトリーによって試験された。細胞は、上記のように２回洗浄され、９個のバッチに分離された：３バッチはコントロール測定用、３バッチは１０−７ＭのＦ２Ｎ１２Ｓを有し、３バッチは１０−６ＭのＦ２Ｎ１２Ｓを有する。バッチは、それぞれ０．５時間、１時間および４時間にわたってインキュベートされた。励起光源として４８８ｎｍの線状アルゴンレーザが用いられた。発光は６３０ＦＤ２２フィルタを用いて集められた。
【００７２】
・分光計測
蛍光スペクトルは、FluoroMax-3（JobinYvon Horiba）蛍光分光計を用いて記録された。Ｆ２Ｎ１２Ｓプローブの蛍光発光スペクトルのための励起波長は４００ｎｍであった。全スペクトルは、ランプ強度変化（lamp intensity variation）およびブランクからのシグナルについて修正された。
【００７３】
・蛍光画像化
細胞画像を集めるために、レーザ走査共焦点画像化システムＭＲＣ−１０２４（Bio-Rad）が用いられた。チャンバー型カバーガラス中の細胞は、上記の調製手順に従うことによって調製された。励起光源として４４２ｎｍの線状ＨｅＣｄレーザが用いられた。発光は２つのフィルタ：Ｎ＊バンドのための４８５／３０およびＴ＊バンドのための５８５ＬＰを用いることによって集められた。集められた画像は、Amira3.0ソフトウェアによって分析された。
【００７４】
（実施例）
（実施例１）
細胞の形質膜に対して高選択性および表面ポテンシャルに対して強烈な感度を有する新しいプローブの開発
共焦点レーザ顕微鏡法が、これらの第一世代の分子により染色された付着性のＬ９２９細胞について行われた（図１（ｂ）、（ｃ））。得られた蛍光画像は、これらの染料の細胞内部への迅速な透過を示す。
【００７５】
プローブＦ２Ｎ１２Ｓにより染色された付着性Ｌ９２９細胞の画像（図１（ｄ））は、形質膜のみからの発光を示す。プローブは、観察時間全体の間、顕微鏡下に膜中にとどまるが、これは、ＨＢＳＳバッファ中の細胞の生存期間によって制限される（約１時間）。さらに、Ｆ２Ｎ１２Ｓプローブは、個々の細胞の蛍光顕微鏡法のために十分に明るいことが見出された。形質膜における蛍光強度の分布に若干の不均質性が観察された。これは、おそらく、プローブの分布に影響を及ぼす二重層における不均一な脂質分布と関係する。
【００７６】
次に、新しく合成されたプローブＦ２Ｎ１２Ｓの細胞毒性が、ヒトリンパ細胞系ＣＥＭ  Ｔについて評価された。Ｆ２Ｎ１２Ｓは、０．１μＭ（作用濃度（working concentration））および１μＭで加えられ、種々の時間（０．５時間、１時間および４時間）にわたってインキュベートされた。０．１μＭのＦ２Ｎ１２Ｓでは、４時間のインキュベーション時間にわたってさえも毒性は観察されなかった。１μＭの濃度によってさえも、Ｆ２Ｎ１２Ｓの細胞毒性は、死細胞の百分率が４％を超えなかったので、大きく制限された。
【００７７】
（実施例２）
Ｆ２Ｎ１２Ｓ蛍光についての表面ポテンシャルの効果
アポトーシスの間の形質膜の外側リーフレットにおける表面陰電荷の増加をモデリングするために、中性（ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine：ＰＣ）およびホスファチヂルエタノールアミン（phosphatidylethanolamine：ＰＥ））および陰荷電（ホスファチヂルグリセロール（phosphatidylglycerol：ＰＧ）およびホスファチジルセリン（phosphatidylserine：ＰＳ）リン脂質からなる大単膜小胞（large unilamellar vesicle：ＬＵＶ）が用いられた。本発明のプローブＦ２Ｎ１２Ｓは、大単膜小胞（ＬＵＶ）における表面電荷に対して強い２バンド応答を示す。実際に、陰イオン性の小胞（ＰＧおよびＰＳ）では、このプローブは、中性のＰＣ小胞と比較して短波長バンドのより高い相対強度を示す（図２）。短波長バンドの相対強度における著しくより小さい増加も、中性のＰＥ小胞について観察される。
【００７８】
（実施例３）
細胞懸濁液におけるアポトーシスに対するＦ２Ｎ１２Ｓの応答およびこの応答のＣａ２＋依存性
ＣＥＭ  Ｔ細胞のアポトーシスは、ＤＮＡ初回刺激型ＲＮＡポリメラーゼ（DNA-primed RNA polymerase）の阻害剤であるアクチノマイシンＤによって誘導された。その後、アポトーシス細胞は、ＦＩＴＣ−アネキシンマーカーを用いるサイトメトリーによって生細胞から分離された。次に、生細胞およびアポトーシス細胞は、Ｆ２Ｎ１２Ｓによりラベリングされ、それらの発光スペクトルが４００ｎｍの励起波長において記録された。この波長で、ＦＩＴＣの励起は最小であり、その残留発光は、Ｆ２Ｎ１２Ｓの発光スペクトルから減算された。結果は、図３に提示される。アポトーシスによって、プローブＦ２Ｎ１２Ｓの蛍光スペクトルの劇的な変化がもたらされる。短波長バンドの相対強度が、生細胞の相対強度よりほぼ２倍高いからである。この結果は、実施例２の脂質小胞における表面電荷効果についてのモデル実験（図２）と一致している。生細胞において、Ｆ２Ｎ１２Ｓの２つのバンドの分離は、脂質小胞における分離より相当大きい。培地中のＣａ２＋濃度に対するＦ２Ｎ１２Ｓ応答の依存性が試験された（図４）。結果は、アポトーシス細胞におけるＦ２Ｎ１２Ｓの応答が、０〜２ｍＭの濃度範囲においてＣａ２＋に無反応であることを示す。Ｃａ２＋濃度についてのこの非依存性は、アネキシンＶに基づく一般的に用いられる方法論を超える重大な利点である。
【００７９】
（実施例４）
正常細胞およびアポトーシス細胞のレシオメトリック画像化
Ｆ２Ｎ１２Ｓにより染色されたＣＥＭ  Ｔ細胞の二色共焦点蛍光顕微鏡法が実施された。発光は、２つのスペクトル領域に集められた：Ｎ＊バンドの発光をモニタリングするための４７０〜５００ｎｍおよびＴ＊バンドの発光を集めるための５８５ｎｍ超。レシオメトリック画像は、Ｔ＊バンドの強度をＮ＊バンドの強度で除算することによって得られ、アクチノマイシンＤの付与によって誘導される細胞の形質膜変化をモニタリングするために用いられた（図５（ａ）〜（ｃ））。Ｎ＊バンドの強度に対するＴ＊バンドの強度の比率は、カラーコードを用いることによって擬似カラーで左のスケールで表示される。
【００８０】
Ｆ２Ｎ１２Ｓプローブは、単一細胞レベルで膜非対称性の変化に対して強くて良好に検出し得るレシオメトリック応答を提供する。
【００８１】
未処理細胞において（図５（ａ））、形質膜における蛍光強度比は、細胞懸濁液における蛍光測定（図３）から予想されるように、約１である。（細胞選別によって得られる）アポトーシスＣＥＭ  Ｔ細胞では、形質膜からの染料の発光比は、大きく異なり、平均して０．２５前後である（図５ｂ）。この４倍の比の変化は、細胞懸濁液において観察される変化より一層高い。
【００８２】
アクチノマイシンＤにより処理されているがサイトメトリーによって選別されていない細胞の蛍光レシオメトリック画像化が実施された（図５ｃ）。細胞膜上の蛍光比の強い異質性が観察され得る。図５（ｃ）において、緑色の擬似カラー（比率約１）の生細胞は、赤色の擬似カラー（比率約０．２５）のアポトーシス細胞から容易に区別され得る。０．２５と１との間の強度比を有する細胞も観察される。これらの細胞において、アポトーシス過程は、中間状態にあるかもしれない。これらの細胞は、比（カラー）の分布の強い異質性によって特徴付けられ、このことは、アポトーシスの間の形質膜の種々の部分における膜非対称性の種々のレベルと結び付けられ得る。それ故に、アポトーシスの度合いをアッセイする方法は、アポトーシスの検出を可能にするだけではなく、細胞膜のアポトーシス形質転換の度合い並びにこの形質転換の空間的および動力学的な変化についての情報を提供する。
【００８３】
（実施例５）
フローサイトメトリー分析におけるＦ２Ｎ１２Ｓの確認
Ｔリンパ芽球様細胞がアクチノマイシンＤにより処理され、同時にＦＩＴＣラベルされたアネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＦ２Ｎ１２Ｓによってラベリングされた。ＦＩＴＣおよびＰＩの選択的な励起は、Ｆ２Ｎ１２Ｓが吸収しない波長である４８８ｎｍにおいて得られた。ＦＩＴＣおよびＰＩの発光は、それぞれ、５１５〜５４５ｎｍおよび６００〜６２０ｎｍのスペクトル領域において集められた。蛍光強度の双助変数（bi-parametric）表示（ＰＩ対ＦＩＴＣ）により、３つの相異なる集団が示される：i）低ＦＩＴＣおよびＰＩシグナルを有する生存細胞、ii）高ＦＩＴＣおよび低ＰＩシグナルを有するアポトーシス細胞およびiii）細胞膜の完全性の破壊に起因して高ＦＩＴＣおよびＰＩシグナルを呈する死細胞（図６（ａ））。生細胞、アポトーシス細胞および死細胞の百分率は、それぞれ、３３、１８および４９％であることが分かった。同一細胞についてのＦ２Ｎ１２Ｓの選択的励起は、４０７ｎｍでの第２のレーザ源により達成された。この場合の発光は、２つのスペクトル領域において集められた：Ｎ＊バンドの発光をモニタリングするための５１５〜５４５ｎｍおよびＴ＊バンドの発光を集めるための５６４〜６０６ｎｍ（図６（ｂ））。Ｆ２Ｎ１２Ｓデータの双助変数表示（５３０および５８５ｎｍにおけるＮ＊バンド対Ｔ＊バンド強度）（図６（ｂ））により、２つの集団が明らかに示された。第１のものは、低いＮ＊／Ｔ＊強度比を呈し、本発明者らのスペクトルデータに従って生細胞に割り当てられ得る。第２のものは、高いＮ＊／Ｔ＊強度比（赤色で示される）によって特徴付けられ、アポトーシス細胞および死細胞に割り当てられ得る。顕著には、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩなしでプローブＦ２Ｎ１２Ｓが用いられた場合に、Ｔ＊／Ｎ＊比は、３重の染色手順において観察されるものに非常に近く、これにより、本発明者らのサイトメトリー実験において、Ｆ２Ｎ１２Ｓ染料の蛍光シグナルが、他の２種の染料の蛍光により汚染されないことが示された。
【００８４】
本発明のプローブＦ２Ｎ１２Ｓは、ＰＩと結合し、ＰＩの蛍光強度は、Ｆ２Ｎ１２ＳのＴ＊／Ｎ＊比の関数として表された（図６（ｃ））。この場合、アポトーシス細胞および死細胞の集団は、ＰＩ強度の差異を用いることによって明確に区別される。興味深いことに、生細胞、アポトーシス細胞および死細胞の百分率は、それぞれ、３２．５％、１９．５％および４８％であり、それ故に、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩにより得られたものと密接に符合することが分かった。この結論は、Ｆ２Ｎ１２Ｓ／ＰＩ対によって区別された集団がアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ対とのそれらの応答に従って着色された場合にさらに強化された（図６（ｄ））。図６（ｄ）の図６（ｃ）との比較により、２つの染料の対によって同定された集団間の非常に良好な重複が示され、これは、細胞選別におけるＦ２Ｎ１２Ｓ／ＰＩの使用を確証する。さらに、Ｔリンパ芽球様細胞が３Ｔ３繊維芽細胞またはヒーラ細胞によって置換された場合に、非常に類似したＦ２Ｎ１２Ｓ強度比の値が得られ（データは不図示）、これにより、Ｆ２Ｎ１２Ｓ応答は、一般的であり、所与の細胞系に特異的でないことが示された。
【００８５】
２つの染料対をさらに比較するために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣについての単波長強度値の分布（図７（ａ））が、プローブＦ２Ｎ１２Ｓの２バンド強度比の値の分布（図７（ｂ））と比較された。生細胞、アポトーシス細胞および死細胞の相対標準偏差は、それぞれ、（ａ）において０．８４、１．０６および１．１７であり、（ｂ）において０．１４、０．２１および０．１６である。そして、全３種の細胞集団について、Ｆ２Ｎ１２Ｓについての分布の分散は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣについての分布の分散よりはるかに狭いことが分かり、このことは、集団のより正確な分離、特に、生細胞と非生細胞との間の分離を可能にした。
【００８６】
次の工程において、Ｆ２Ｎ１２Ｓの応答（図８（ｂ））は、非処理Ｔリンパ芽球様細胞についてアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ対の応答（図８（ａ））と比較された（図８）。生細胞（緑色）および死細胞（赤色）の２つの相異なる集団は、死細胞の同一の百分率（５％）により両方の場合において容易に区別され得た。これにより、Ｆ２Ｎ１２Ｓのみが非処理細胞集団において死細胞の百分率を制御するために用いられることが示された。
【００８７】
総合すれば、データにより、細胞は、Ｆ２Ｎ１２Ｓ／ＰＩによって選別され、改善された分離、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ対より簡単な調製手順およびより少ない予防措置でネクローシス細胞、アポトーシス細胞および生細胞の部分母集団を提供し得ることが示される。
【００８８】
（実施例６）
共焦点顕微鏡法におけるＦ２Ｎ１２Ｓの適用
Ｆ２Ｎ１２ＳおよびアネキシンＶ誘導型プローブをさらに比較するために、アポトーシスを受けているＦ２Ｎ１２Ａラベル細胞の二色レシオメトリック画像が、レーザ走査共焦点顕微鏡法によって記録され、アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて得られた強度に基づく画像と比較された。アネキシンＶ−ＦＩＴＣは、アポトーシス細胞およびネクローシス細胞のみをラベルリングするので、それは、蛍光画像において正常な細胞を視覚化しない（図９（ａ））。さらに、アポトーシス細胞の蛍光強度は、細胞毎に相当変化する。これらの相違は、解釈するのが困難である。強度が、プローブの濃度並びに細胞のサイズおよび集合（confluence）に依存するからである。アネキシンＶ−ＦＩＴＣとは対照的に、Ｆ２Ｎ１２Ｓは、正常細胞（図９（ｂ））およびアポトーシス細胞（図９（ｃ））の両方を染色するが、それは異なる色においてである。Ｆ２Ｎ１２Ｓにより染色された正常細胞は、４〜６の強度比を呈する。アクチノマイシンＤにより処理された細胞は、より不均一な強度比を呈する（図９（ｃ））。正常細胞に対応する約５の比を有する細胞が、はるかにより低いＴ＊／Ｎ＊強度比（１〜２）を呈する細胞と一緒に観察されるからである。本発明者らの分光法およびフローサイトメトリーデータによると、後者の細胞は、アポトーシスである。興味深いことに、２〜４の中間的な比を有する細胞も観察され、アポトーシスの初期段階にある細胞に対応する。これにより、本発明によるプローブは、アポトーシス細胞を同定するだけでなく、それらのアポトーシス形質転換のレベルを定量化することができることが示される。それ故に、アネキシンＶ−ＦＩＴＣとは異なり、これらのプローブにより、プローブ／細胞濃度および励起光強度とは無関係に、調整され得、かつ、アポトーシスのレベルを特徴付けることができる完全なパラメータ（強度比）が提供される。さらに、本発明者らにより、正常細胞およびアポトーシスの初期段階の細胞では、Ｔ＊／Ｎ＊強度比は、所与の細胞の形質膜内で均一には分配されないことが観察された。これは、脂質ドメインの存在と関連する可能性があるそれらの形質膜の不均質な脂質組成を示し得る。
【００８９】
本発明者らはまた、時間の関数としての形質膜のアポトーシス形質転換を追跡する。正常細胞およびアクチノマイシンＤ処理された細胞が、対応するプローブにより染色され、蛍光画像が、続いて、２０分の間に記録された。アネキシンＶ−ＦＩＴＣが用いられた場合、正常細胞およびアポトーシス細胞の両方において何らの時間依存性変化を検出することは可能ではなかった。Ｆ２Ｎ１２Ｓを用いると、アクチノマイシンＤ処理された細胞が、それらの膜の発光色において相対的に速い変化を呈する（図１０）が、その一方で、正常細胞は、同一時間の期間内で有意な色変化を示さないことが観察された。細胞の色は、青−緑からオレンジ−赤に変化する。これは、２０分内に発生するアポトーシス過程の展開を示している。
【００９０】
結論として、本発明によるプローブの最も重要な利点は、アポトーシスに対するその蛍光レシオメトリック応答次第である。このレシオメトリック応答は、アポトーシス形質転換の自己校正完全パラメータ（self-calibrating absolute parameter）を提供し、これは、プローブ濃度または機器要因、例えば、光源強度の変動、検出器の感度等に依存しない。この点で、これらのプローブは、単一の励起光源を用いる二色レシオメトリック共焦点画像化のために特に興味深いものである。これらのプローブを用いると、細胞形質膜上のアポトーシス変化の度合い、空間分布および動力学が、敏感にモニタリングされ得る。
【００９１】
（実施例７）
プローブＴＣＮ１２Ｓの合成
４−（３−クロロプロポキシ）−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノン
３−メチル−２，４−ジヒドロキシアセトフェノン（０．３ｇ）および炭酸カリウム（０．５ｇ）が、３０分間にわたってアセトン中で還流せられた。次いで、フラスコは冷却され、１−ブロモ−３−クロロ−プロパン（０．３ｍＬ）が加えられた。次いで、混合物は、２４時間にわたって還流させられた。生成物は、カラムクロマトグラフィーにより、溶出液として酢酸エチル／ヘプタン（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝２０／８０）を用いて精製された。収率８２％。
【００９２】
４−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノン
４−（３−クロロプロポキシ）−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノン（０．１ｇ）、Ｎ−メチルドデシルアミン（０．５ｍＬ）、炭酸カリウム（０．５ｇ）およびヨウ化カリウム（０．１ｇ）の混合物が、ブタノン中４８時間にわたって還流させられた。生成物は、カラムクロマトグラフィーにより、溶出液として酢酸エチル／ヘプタン（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝６０／４０）を用いることによって精製された。収率７２％。
【００９３】
２−（５−ジエチルアミノチオフェン−２−イル）−７−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−８−メチル−３−ヒドロキシクロモン
４−［３−（ドデシルメチルアミノ）−プロポキシ］−３−メチル−２−ヒドロキシアセトフェノン（０．４ｇ）および５−（１−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ））−２−チオフェンカルボアルデヒド（０．２ｇ）が、最小限の容積のＤＭＦに溶解させられ、次いで、ＮａＯＭｅ（０．２ｇ）が添加された。混合物は、終夜攪拌された後、エタノールにより希釈され、その後に、続いて、１．５ｇのナトリウムメトキシドおよび１．５ｍＬの３０％過酸化水素が加えられた。混合物は、３分間にわたって還流させられ、室温に冷却され、水中に注がれた。希ＨＣｌによる中和の後、得られた沈殿物はろ過され、生成物は、カラムクロマトグラフィーにより、溶出液として酢酸エチル／ヘプタン（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン＝２０／８０）を用いることによって精製された。収率３０％。
【００９４】
プローブＴＣＮ１２Ｓ
ヒドロキシクロモン（４）（６０ｍｇ）が、アセトニトリルに溶解させられ、次いで、プロパンスルトン（３０μＬ）が添加された。混合物は、２４時間にわたって還流させられた。次いで、溶媒が留去され、生成物の精製は、シリカゲルクロマトグラフィーにより、溶出液としてジクロロメタン／メタノール混合物（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９０／１０）を用いることによってなされた。収率７０％。
【００９５】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) 0.89 (3H, t, J 5.80 Hz), 1.2-1.3 (26H, m), 1.75 (2H, m) 2.05 (2H, m), 2.3 (3H, s), 2.44 (2H, m), 2.9 (2H, m), 3.12 (3H, s), 3.20-3.30 (6H, m), 3.48 (2H, m), 3.76 (2H, m), 3.9-4.1 (2H, m), 6.03 (1H, bs), 6.81 (1 H, bs), 7.72 (2H, bs). 
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】（ａ）従来技術の３−ＨＦプローブＦおよびＦ２Ｎ８および本発明のプローブＦ２Ｎ１２Ｓの式およびリン脂質二重層中の位置；プローブＦ（ｂ）、Ｆ２Ｎ８（ｃ）およびＦ２Ｎ１２Ｓ（ｄ）により染色されたＬ  ９２９細胞の共焦点蛍光画像。画像は全て、プローブ添加１０分後に波長範囲５８５〜７００ｎｍの蛍光を集めることによって得られた。尺度棒，１０μｍ（ｂ）。
【図２】リポソーム組成の変動に対するＦ２Ｎ１２Ｓの発光スペクトルの蛍光応答：ＥＹＰＣ（実線）、ＥＹＰＥ（点線）、ＥＹＰＧ（鎖線）およびＢＢＰＳ（破線）。スペクトルは、４００ｎｍで励起された。最終のプローブ濃度は０．１μＭであった。
【図３】生ＣＥＭ細胞（実線）およびアポトーシスＣＥＭ細胞（破線）におけるプローブＦ２Ｎ１２Ｓの発光スペクトル。励起波長は４００ｎｍであった。最終のプローブ濃度は０．１μＭであった。
【図４】アポトーシスＣＥＭ細胞におけるＦ２Ｎ１２Ｓ発光スペクトルのＣａ２＋依存性。励起波長は４００ｎｍであった。スペクトルは、０．２、０．４、０．８、１．２および２ｍＭのＣａ２＋濃度で記録され規格化された。最終のプローブ濃度は０．１μＭであった。
【図５】Ｆ２Ｎ１２Ｓにより染色されたＣＥＭ細胞の共焦点蛍光レシオメトリック画像：正常細胞（ａ）；アクチノマイシンにより処理された細胞のＦＩＴＣ−アネキシンベースの選別によって得られたアポトーシス細胞（ｂ）；およびアクチノマイシン処理されたが細胞選別のないもの（ｃ）。画像は、プローブを細胞と共に１０分間インキュベートした後に記録された。尺度棒，１０μｍ。
【図６】アクチノマイシンＤによって処理されたＴリンパ芽球様細胞のフローサイトメトリー分析。細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ、ＰＩおよびＦ２Ｎ１２Ｓによって染色された。（ａ）では、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩが、４８８ｎｍで選択的に励起された。細胞は、生細胞、死細胞およびアポトーシス細胞の集団に選別された。（ｂ）では、Ｆ２Ｎ１２Ｓが、４０７ｎｍで選択的に励起された。生細胞は、アポトーシス細胞およびネクローシス細胞から同定された。（ｃ）では、ＰＩ蛍光強度が、Ｆ２Ｎ１２ＳのＴ＊／Ｎ＊比に対してプロッティングされている。生細胞は緑色であり、アポトーシス細胞はシアン色であり、死細胞はオレンジ色である。（ｄ）では、Ｆ２Ｎ１２Ｓ／ＰＩ対を用いて選別された集団が、アネキシンＶ／ＰＩ対によるそれらの応答に従って色付けされた。用いられたフィルタの最大透過率（transmission)の波長および帯域幅が囲み内に示される。
【図７】アネキシンＶ−ＦＩＴＣの強度計測応答（ａ）のＦ２Ｎ１２Ｓのレシオメトリック蛍光応答（ｂ）との比較。生細胞、死細胞およびアポトーシス細胞は、図６において記載されたように、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（ａ）またはＦ２Ｎ１２Ｓ／ＰＩ（ｂ）のいずれかの染料対を用いることによって同定された。
【図８】アネキシンＶ−ＦＩＴＣ、ＰＩおよびＦ２Ｎ１２Ｓによって染色された非処理Ｔリンパ芽球様細胞についてのアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＦ２Ｎ１２Ｓの応答の比較。（ａ）では、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩは、４８８ｎｍで選択的に励起された。（ｂ）では、Ｆ２Ｎ１２Ｓは、４０７ｎｍで選択的に励起された。細胞は、生細胞および死細胞の集団に選別される。
【図９】アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ａ）およびＦ２Ｎ１２Ｓ（ｂおよびｃ）により染色されたＴリンパ球の共焦点レーザ走査画像化。１８時間にわたりアクチノマイシンＤにより処理された細胞の透過像および蛍光画像の組合せ。ＦＩＴＣ強度は、正しいスケールでカラーコードを用いることによって擬似カラーで表示される。それらのアネキシンＶに対する低いバインディングに起因して、正常細胞は、蛍光画像において視覚化されていない（ｂおよびｃ）。０．２μＭのＦ２Ｎ１２Ｓにより染色された正常細胞（ｂ）およびアクチノマイシンＤ処理された細胞（ｃ）のレシオメトリック画像。２つのバンドの強度の比Ｔ＊／Ｎ＊は、正しいスケールでカラーコードを用いることによって擬似カラーで表示される。画像サイズは、６０×７３．１μｍである。
【図１０】Ｆ２Ｎ１２Ｓにより染色されたアクチノマイシンＤ処理Ｔリンパ球の共焦点蛍光レシオメトリック画像の時系列。細胞は、１８時間にわたりアクチノマイシンＤにより処理され、次いで、プローブ（０．２μＭ）と共に５分間にわたりインキュベートされた。画像は、インキュベーション後１分（ａ）、１０分（ｂ）および２０分（ｃ）に記録された。強度の比は、図９のように表示される。画像のサイズは、６０×７３．１μｍである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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