(57)【要約】  本発明は、味覚シグナル伝達において、ＲＧＳ２１遺伝子の発現、ＲＧＳ２１タンパク質の発現および／またはＲＧＳ２１のＧタンパク質との相互作用を、選択的かつ特異的に調節する化合物を同定するための方法を提供する。具体的には、本発明は、甘味またはその他の味の認識を増強させるための、ＲＧＳ２１の活性の調節物質を同定するための方法を提供する。また、味覚シグナル伝達を調節するための、ＲＧＳ２１の活性の調節物質を含む組成物も提供する。
2009544330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子２１（ＲＧＳ２１）タンパク質の活性を特異的に調節する化合物を同定するための方法であって、
ａ）単離したＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片、および単離したＧαタンパク質を提供するステップと、
ｂ）試験化合物の非存在下および存在下で、単離したＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片と単離したＧαタンパク質を組み合わせるステップと、
ｃ）試験化合物の非存在下および存在下で、単離したＧαタンパク質に対する、ＲＧＳ２１のＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ，ＧＴＰａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）活性のレベルを決定するステップと、
ｄ）ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性のレベルを調節する試験化合物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
単離したＧαタンパク質が、α−ガストデューシン、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏ１ｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４およびＧα１６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離したＧαタンパク質が、α−ガストデューシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＧＳ２１タンパク質、Ｇαタンパク質または両方のタンパク質が、味覚細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＧＳ２１タンパク質、Ｇαタンパク質または両方のタンパク質が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、ＧＴＰの加水分解の量を測定することによって決定され、ＧＴＰが、放射標識または蛍光標識を用いて標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、上清中に放出された放射標識無機リン酸（３２Ｐｉ）の量を測定することによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、蛍光分光法によって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性が、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子２１（ＲＧＳ２１）タンパク質の活性を特異的に調節する化合物を同定するための方法であって、
ａ）ＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片、およびＧαタンパク質を発現する宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）宿主細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｃ）宿主細胞中のＲＧＳ２１の活性のレベルを決定するステップと、
ｄ）細胞中のＲＧＳ２１の活性を調節する化合物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
Ｇαタンパク質が、α−ガストデューシン、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏ１ｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４およびＧα１６からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇαタンパク質が、α−ガストデューシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、味覚細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記味覚細胞が、ＳＴＣ−１細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞およびＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞からなる群から選択されるモデル味覚細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記味覚細胞が、ヒト味蕾細胞に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、機能性味覚受容体、Ｇタンパク質、ＲＧＳ２１タンパク質およびエフェクターを天然に発現する真核細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記機能性味覚受容体が、甘味物質受容体、苦味受容体およびうま味受容体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エフェクターが、ホスホリパーゼＣβ２（ＰＬＣβ２）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、細胞中の細胞内セカンドメッセンジャーのレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞内セカンドメッセンジャーが、ｃＡＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｃＡＭＰのレベルが、ｃＡＭＰの量を直接測定することによって検出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｃＡＭＰのレベルが、ｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモーター配列のコントロール下にあるレポーター遺伝子の発現量を測定することによって検出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、放射標識ホスホイノシチドの加水分解のレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
細胞内セカンドメッセンジャーが、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）またはジアシルグリセロール（ＤＡＧ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、細胞中のリン酸化されたキナーゼのレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２８】
リン酸化されたキナーゼが、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ａｋｔ、ＭＥＫおよび上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、細胞中の甘味受容体の内在化のレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３０】
甘味受容体の内在化のレベルが、蛍光顕微鏡法、細胞下分画、甘味受容体の特異的化学的修飾、またはβ−アレスチンの移行のレベルの測定によって測定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、神経伝達物質、神経ペプチドまたは消化管ペプチドのレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３２】
神経伝達物質がＡＴＰである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
消化管ペプチドが、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および胃インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＧＳ２１の活性のレベルが、ＧαサブユニットとＲＧＳ２１との相互作用のレベルを検出することによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項３５】
相互作用のレベルが、蛍光共鳴エネルギー転移または酵母の２ハイブリッドアッセイを使用して測定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
甘味を増強する化合物を同定するための方法であって、
ａ）ＲＧＳ２１の活性を阻害する化合物を同定するステップと、
ｂ）甘味物質単独でおよび化合物と組み合わせて、甘味物質受容体によって活性化された甘味シグナル伝達のレベルを決定するステップと、
ｃ）前記甘味物質によって活性化された甘味シグナル伝達のレベルを、甘味物質単独で検出されたレベルを上回って増加させる化合物を同定するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記甘味物質が、炭水化物の甘味物質、合成の強力な甘味物質、天然の強力な甘味物質、ポリオールおよびアミノ酸からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法によって同定された化合物を含む、味覚の認識を調節するための組成物。
【請求項３９】
請求項１０に記載の方法によって同定された化合物を含む、味覚の認識を調節するための組成物。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法によって同定された化合物を含む、味覚の認識を調節するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全内容が本明細書に組み込まれている、２００６年７月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／８２０４２６号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質の調節物質を同定するための方法に関する。また、本発明は、ＲＧＳの調節化合物を含む組成物、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）シグナル伝達を調節するための、そのような組成物の使用方法にも関する。具体的には、本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片の活性を、特異的に阻害または増強する化合物を同定するための方法；そのような化合物を含む組成物；およびＧＰＣＲ味覚シグナル伝達過程を介して味覚シグナル伝達を調節するための、そのような化合物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、シグナル伝達において主要な役割を担い、多くの治療薬の標的である。ＧＰＣＲシグナル伝達の標準的なモデルは、３成分系、すなわち、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質およびエフェクターに限定されると長い間報告されている（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（３）：１８７−９７）。ＧＰＣＲは、７つの膜貫通ドメインを有する細胞表面受容体タンパク質である。それぞれのＧタンパク質は、膜結合性のへテロ三量体複合体であり、これは、ＧＴＰ加水分解性Ｇαサブユニットと、Ｇβγ二量体サブユニットとを含む。Ｇαサブユニットは、細胞中の広い範囲の生理的過程をコントロールする分子スイッチである。Ｇαサブユニットは、ＧＤＰが結合した不活性な状態またはＧＴＰが結合した活性な状態として存在し、後者の場合、Ｇαサブユニットは、下流のシグナル伝達タンパク質と相互作用して、特異的なシグナル伝達応答を惹起する（図１）。Ｇαタンパク質の活性化および不活性化はそれぞれ、リガンドが結合したＧＰＣＲ、およびＧＴＰアーゼ促進タンパク質（ＧＡＰ，ＧＴＰａｓｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）によって制御されている。ＧＰＣＲは、リガンドが結合すると、へテロ三量体Ｇタンパク質のαサブユニット上で、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）のグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）への交換を触媒することによって、細胞のシグナル伝達を促進する。ＧＡＰは、ＧＴＰが結合した活性型のＧαタンパク質に結合して、Ｇタンパク質の内在性ＧＴＰアーゼ活性を刺激し、それによって、結合しているＧＴＰの末端のリン酸残基が、ＧＤＰに加水分解され、こうして、Ｇαタンパク質は、不活性な状態に戻る（図１）。
【０００４】
アゴニストがＧＰＣＲに結合すると立体構造変化が引き起こされ、これは、ＧＰＣＲのグアニン−ヌクレオチド−交換活性を増強し、ＧαサブユニットによるＧＤＰの放出（およびそれに続くＧＴＰへの結合）に至る。ＧＴＰに結合すると、Ｇαサブユニットの３つの「スイッチ」領域内の立体構造変化により、Ｇβγサブユニットの放出、およびそれに続く、それぞれのＧαサブタイプに特異的なエフェクターの関与が可能になる。遊離したＧβγサブユニットもまた、イオンチャネル、ならびにアデニルシクラーゼおよびホスホリパーゼ（ＰＬＣ）の特異的なアイソフォームをはじめとするエフェクターを調節することができる（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（３）：１８７−９７，図１，及び表１）。
【０００５】
最近になって、ＧＰＣＲシグナル伝達の新しい成分として作用するタンパク質ファミリーが発見されている。このタンパク質ファミリーは、Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質として知られるタンパク質からなる（ＤｅＶｒｉｅｓら，２０００，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：２３５；ＲｏｓｓおよびＷｉｌｋｉｅ，２００１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：７９５）。ＲＧＳタンパク質は、Ｇタンパク質の活性を強力に調節し、ＧＰＣＲシグナル伝達において主要な役割を担う。ＲＧＳタンパク質の最も知られている機能は、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ，ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として作用する機能であり、Ｇタンパク質シグナル伝達を、ＧＴＰの加水分解を促進させることによって阻害し、したがって、Ｇタンパク質のシグナルを遮断する。具体的には、ＲＧＳタンパク質は、活性化されたＧαサブユニットによるシグナル伝達の出力を、ＧＴＰが結合したＧαサブユニットに直接結合することによってコントロールする。この結合は、このサブユニットのＧＴＰ加水分解の速度、したがって、ＧＰＣＲシグナル伝達の不活性化の速度を顕著に促進する（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（３）：１８７−９７；Ｂｅｒｍａｎら，１９９６，Ｃｅｌｌ  ８６：４４５−５２；Ｈｕｎｔら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：１７５−７７；Ｗａｔｓｏｎら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：１７２−７５）。
【０００６】
ヒトゲノム中には、少なくとも３７種のＲＧＳタンパク質が存在し、これらを、それらの機能性ドメインの組成が異なる、別々のタンパク質ファミリーに細区分することができる（図２）。全てのＲＧＳタンパク質が、「ＲＧＳボックス」と呼ばれる、少なくとも１つの保存された、約１２０個のアミノ酸のドメインを含有し、これは、観察されるＲＧＳタンパク質のＧＡＰ活性に関与する（図３）。ＲＧＳボックスは、Ｇαのスイッチ領域に接触して、ＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型との間の遷移状態の立体配置を安定化させる。ＲＧＳタンパク質は、非常に多様であり、独特の組織分布を有し、生存細胞中で多様な機能の役割を担うことから、ＲＧＳタンパク質は、典型的には、ＲＧＳボックス以外の種々のドメインおよびモチーフ（例えば、ＧＧＬ、ＤＥＰ、ＤＨ／ＰＨ、ＰＤＺのドメインおよびシステインストリングモチーフ）もまた含有する。
【０００７】
ＲＧＳタンパク質は、ＧＰＣＲのシグナル伝達を負に制御し、したがって、ＲＧＳボックスのＧＡＰ活性の阻害により、アゴニストが結合したＧＰＣＲからの延長かつ増強されたシグナル伝達が得られるはずであることから、ＲＧＳタンパク質は創薬の有望な標的であるとみなされている（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（３）：１８７−９７）。ＲＧＳタンパク質の阻害剤は、Ｇαタンパク質の不活性化を損なうことによって、Ｇタンパク質のシグナル伝達を増強することができる。ＲＧＳ阻害剤の治療上の有望な役割として、これらに限定されないが、内因性神経伝達物質の機能の増強；外因性ＧＰＣＲアゴニスト薬物の機能の増強；アゴニスト薬物に対する脱感作の低減；外因性アゴニストの特異性の改変；およびＲＧＳタンパク質媒介エフェクター活性制御の遮断が挙げられる（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（３）：１８７−９７，Ｂｏｘ  １；ＺｈｏｎｇおよびＮｅｕｂｉｇ，２００１，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７：８３７−４５）。
【０００８】
いくつかのＲＧＳ遺伝子が、中枢神経系（ＣＮＳ）において見い出され、アルツハイマー病、うつ病、てんかん、パーキンソン病、疼痛およびけい縮等のＣＮＳ疾患に対して、ＲＧＳの阻害剤を臨床使用するための有望な薬物標的を提供する（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（３）：１８７−９７，表３及び表４）。しかし、ＲＧＳタンパク質の高度な多様性および複雑性のために、それぞれのＲＧＳタンパク質の効果は、ＲＧＳボックス、ＲＧＳボックス以外のモチーフおよび／またはその他の機能性モジュールをはじめとする、特定のドメインの機能によって異なる可能性がある（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１（３）：１８７−９７）。
【０００９】
味覚細胞は、舌表面上の味蕾の中に集まっている（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，１９９６，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：７１８−６６）。ＧＰＣＲの２つのファミリー、すなわち、甘味およびうまみ味を媒介するＧＰＣＲのＴ１Ｒファミリー、ならびに苦味を媒介するＧＰＣＲのＴ２Ｒファミリーが、味覚細胞中で同定されている（Ｎｅｌｓｏｎら，２００１，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−９０；Ｎｅｌｓｏｎら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：１９９−２０２；Ｌｉら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：４６９２−９６；Ｚｈａｏら，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２５５−６６；Ａｄｌｅｒら．，２０００，Ｃｅｌｌ  １００：６９３−７０２；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，２０００，Ｃｅｌｌ  １００：７０３−１１；Ｂｕｆｅら，２００２，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２：３９７−４０１）。これらの受容体の全ての下流へのシグナル伝達は、甘味、うま味および苦味の伝達の主要なエフェクター酵素であるホスホリパーゼＣサブタイプβ２（ＰＬＣβ２）、ならびにｔｒｐチャネルサブタイプｍ５（ＴＲＰＭ５）に依存することが示されている（Ｚｈａｎｇら．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１２：２９３−３０１）。
【００１０】
Ｂｕｃｃｈｏｌｔｚらは、別のＲＧＳタンパク質であるＲＧＳ２１を同定し、ＲＧＳ２１が、葉状、茸状および有郭の味蕾細胞中で特異的に発現し、そこでは、ＲＧＳ２１は、苦味受容体（Ｔ２Ｒ）、うま味受容体（Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３）、甘味物質受容体（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３）、α−ガストデューシンおよびホスホリパーゼＣβ２（ＰＬＣβ２）と共に局在化することを実証した。Ｂｕｃｈｈｏｌｔｚらはまた、ＲＧＳ２１タンパク質が、Ｇαｉ／ｏ／ｔ／ｚ、Ｇｑ／１１／１４およびα−ガストデューシンと結合できることも示した。ヒトＲＧＳ２１の配列解析は、ＲＧＳ２１が、単一のＲＧＳボックスドメインを含有するが、その他の機能性ドメインは含有しないことを示す。さらに、Ｇｉ／ｏタンパク質およびＧｑタンパク質に関するＧＡＰであるＲＧＳ２のＲＧＳボックスドメインに対するＲＧＳ２１のＲＧＳボックスドメインの配列相同性は、ＲＧＳ２１がこれらのＧタンパク質を同様に制御する可能性をさらに支持する（図３）。その他のＲＧＳタンパク質から類推して、まだ実証されていないが、ＲＧＳ２１タンパク質が、α−ガストデューシンおよび／または味覚細胞のシグナル伝達に関与するその他の関連Ｇαタンパク質を減弱する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
当技術分野で求められているのは、味覚シグナル伝達を調節するのに有用である化合物を同定するための方法である。また、味覚シグナル伝達を調節する化合物、およびそのような化合物を、味覚シグナル伝達の調節のために使用する方法も求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＲＧＳ２１タンパク質は、味覚組織中で選択的に発現し、甘味シグナル伝達成分と同時発現し、かつＲＧＳ２１タンパク質は、甘味伝達過程を制御する可能性を有することから、本発明は、ＲＧＳ２１の活性を制御する化合物の同定を提供する。また、本発明は、甘味を増強するため、または炭水化物および／もしくはカロリーのない甘味物質と組み合わせた場合の甘味物質の時間的プロフィールを調節するための、そのようなＲＧＳ２１の制御化合物の使用も提供する。
【００１３】
本発明は、甘味感受性味蕾細胞のシグナル伝達の増強物質および調節物質の発見を可能にする、複数の化合物をスクリーニングするための方法および／または生化学的アッセイを提供する。具体的には、本発明は、甘味の増強物質および調節物質の発見のための、甘味物質受容体に依存しない、味蕾細胞中における代替タンパク質標的を提供する。好ましい実施形態の１つでは、本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質と選択的かつ特異的に相互作用し、その活性を阻害する、複数の化合物をスクリーニングするための方法および／または生化学的アッセイを提供する。ＲＧＳ２１タンパク質は、甘味シグナル伝達の負の調節因子である。ＲＧＳ２１タンパク質の機能を、規定された一過性の様式で阻害すると、甘味シグナル伝達が、活性化された甘味物質受容体１個あたりのシグナル伝達の出力を増加させることによって増強される。さらに、甘味感受性の味蕾細胞のシグナル伝達の、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤による増強は、甘味物質受容体活性の正のアロステリックな調節を介する増強とは、比較的無関係である。
【００１４】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、宿主細胞中でＲＧＳ２１遺伝子の発現を阻害または増強する、複数の化合物をスクリーニングするための方法を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、宿主細胞中でＲＧＳ２１タンパク質の発現を阻害または増強する、複数の化合物をスクリーニングするための方法を提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質の適切なＧタンパク質との相互作用を妨げるかまたは促進する、複数の化合物をスクリーニングするための方法を提供する。本発明の方法によって同定された全ての化合物は、ＲＧＳ２１タンパク質に結合して、ＲＧＳ２１タンパク質の対応するＧタンパク質との相互作用を妨げるかまたは増強する場合には、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤および／または調節物質であるとみなされる。したがって、同定された調節化合物は、ＲＧＳ２１タンパク質の活性（例えば、ＧＰＣＲ媒介シグナル伝達では、それぞれＧＴＰアーゼ促進（ＧＡＡ）活性またはＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ，ＧＴＰａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）活性）の阻害または増強をもたらす。
【００１５】
本発明は、Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子２１（ＲＧＳ２１）タンパク質の活性を特異的に調節する化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、単離したＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片、および単離したＧαタンパク質を提供するステップと；試験化合物の非存在下および存在下で、単離したＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片と単離したＧαタンパク質を組み合わせるステップと；試験化合物の非存在下および存在下で、単離したＧαタンパク質に対するＲＧＳ２１のＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ，ＧＴＰａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）活性のレベルを決定するステップと；ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性のレベルを調節する試験化合物を同定するステップとを含む。１つの好ましい実施形態では、本発明は、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞中におけるＲＧＳ２１タンパク質およびＧαタンパク質の組換え発現および精製のための方法を提供する。そのような方法は、ＲＧＳ２１タンパク質および適切なＧαタンパク質のそれぞれをコードするｃＤＮＡをクローン化するステップと、ＲＧＳ２１タンパク質およびＧαタンパク質の両方をコードする組換えｃＤＮＡを産出するステップとを含む。１つの好ましい実施形態では、適切なＧαタンパク質として、これらに限定されないが、α−ガストデューシン、Ｇαｉ１−３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏｌｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１−１４およびＧα１６からなる群から選択されるＧαｉタンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、ＲＧＳ２１タンパク質、Ｇαタンパク質または両方を、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞中で発現させて、そこから精製する。本発明によれば、そうしたタンパク質を、味覚細胞中で発現させて、そこから精製することもできる。好ましい実施形態では、そうしたタンパク質を、ヒトＨｕＴｕ−８０細胞中で発現させて、そこから精製する。さらに、本発明は、上記のタンパク質をコードする特異的な組換えコンストラクト、およびこの組換えコンストラクトを発現することができる細胞性宿主も提供する。
【００１６】
ＲＧＳ２１の活性を調節する化合物を同定するための本発明の方法は、その化合物の存在下および非存在下におけるＲＧＳ２１のＧＡＰ活性のレベルを決定することを含む。ＧＴＰに結合しているＧαｉタンパク質に、精製したＲＧＳ２１を添加すると、ＧＴＰの加水分解の速度が増加する。したがって、本発明は、ＧＴＰの加水分解を測定するための方法を提供する。好ましい実施形態の１つでは、本発明は、膜結合性のＧαタンパク質からの放射活性の喪失から、ＧＴＰの加水分解の尺度が得られるという条件で、放射活性のある結合性ＧＴＰの加水分解を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＧＳ２１添加時にＧαタンパク質からＢＯＤＩＰＹ蛍光放出が喪失することで、ＧＴＰの加水分解の尺度が得られるという条件で、ＢＯＤＩＰＹＦＬ−ＧＴＰの蛍光分光法を提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＧαとＲＧＳ２１との相互作用を阻害する調節化合物が、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを減少させるという条件で、ＧαとＲＧＳ２１との相互作用に関する時間分解ＦＲＥＴアッセイを提供する。
【００１７】
本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質の適切なＧαタンパク質との相互作用を妨げる、複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、ＲＧＳ２１タンパク質またはその生物学的に活性な断片、およびＧαタンパク質を発現する宿主細胞を提供するステップと；宿主細胞を試験化合物と接触させるステップと；宿主細胞中のＲＧＳ２１の活性のレベルを決定するステップと；細胞中のＲＧＳ２１の活性を調節する化合物を同定するステップとを含む。好ましい実施形態では、適切なＧαタンパク質として、これらに限定されないが、α−ガストデューシン、Ｇαｉ１−３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏｌｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１−１４およびＧα１６からなる群から選択されるＧαｉタンパク質が挙げられる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、味覚細胞である。より好ましい実施形態では、味覚細胞が、ヒト味蕾細胞に由来するか、ＳＴＣ−１細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞またはＨｕＴｕ−８０細胞からなる群から選択されるモデル味覚細胞である。別の実施形態では、宿主細胞が、細菌、昆虫、酵母または哺乳動物の細胞である。
【００１８】
本発明の方法は、味覚細胞中におけるＲＧＳ２１のＧＡＰ活性に対して上記で同定した調節化合物の効果を決定することを含む。好ましい実施形態では、甘味物質受容体の活性をモニターする、標準的なシグナル伝達アッセイを使用する。そのようなアッセイとして、これらに限定されないが、ａ）セカンドメッセンジャー（例えば、カルシウム（Ｃａ２＋）、ＩＰ３、ＤＡＧ、ＰＩＰ２、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等）の変化、ｂ）タンパク質キナーゼ活性（例えば、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＧＲＫ、ＥＲＫ、Ａｋｔ、Ｓｒｃ、ＲＴＫ等）の変化、ｃ）消化管ペプチドの分泌の変化、および／またはｄ）神経伝達物質の分泌の変化を決定することが挙げられる。具体的には、これらのシグナル伝達の「計測値」のうちの１つに対する甘味物質単独の効果を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物と組み合わせた甘味物質の効果と比較する。本発明によれば、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤によって、観察される甘味物質の効果が増加する。例えば、甘味物質単独で、細胞内カルシウムの放出が増加する場合には、その甘味物質とＲＧＳ２１の阻害剤との組合せによって、カルシウムの放出が、甘味物質単独の場合を上回って増加するはずである。別の好ましい実施形態では、本発明はまた、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤、ならびにうま味および苦味を調節する調節物質についてスクリーニングするための方法も提供する。
【００１９】
本発明は、甘味を増強する化合物を同定するための方法を提供し、これは、ＲＧＳ２１の活性を阻害する化合物を同定するステップと；甘味物質単独の場合およびこの化合物と組み合わせた場合の、甘味物質受容体によって活性化された甘味シグナル伝達のレベルを決定するステップと；前記甘味物質によって活性化された甘味シグナル伝達のレベルを、前記甘味物質単独の場合に検出されたレベルを上回って増加させる化合物を同定するステップとを含む。好ましい実施形態では、甘味物質は、炭水化物の甘味物質、合成の強力な甘味物質、天然の強力な甘味物質、ポリオールおよびアミノ酸からなる群から選択される。
【００２０】
さらに、本発明は、ＲＧＳ２１調節物質のヒトの甘味ならびにうま味および苦味に対する効果を検証するための方法を提供する。１つの好ましい実施形態によれば、本発明は、試験甘味物質自体で試験した場合に認識された甘さと、試験甘味物質とＲＧＳ２１の調節化合物とを組み合わせた場合に認識された甘さとの比較を提供する。本発明によれば、ＲＧＳ２１の阻害剤は、試験甘味物質の認識される甘さを増強し、一方、ＲＧＳ２１の増強物質は、試験甘味物質の認識される甘さを低下させる。
【００２１】
さらに、本発明は、甘味シグナル伝達を増強するための組成物も提供し、これは、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤および／または調節物質を含む。また、本発明は、その他の味覚、例えば、うま味および苦味の認識を調節するための、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤および／または調節物質を含む化合物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＧＰＣＲおよびＲＧＳ２１タンパク質によるヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達の制御を示す図である。ＧＰＣＲが、Ｇαタンパク質を、ＧＤＰのＧＴＰへの交換を促進することによって活性化する。これは、Ｇαサブユニットによる下流のシグナル伝達、およびβγサブユニットの放出を刺激する。ＲＧＳ２１タンパク質は、Ｇαタンパク質の内在性ＧＴＰ加水分解活性を刺激することによって、Ｇαタンパク質を不活性化する。これによって、活性なＧα−ＧＴＰが、不活性なＧα−ＧＤＰの形態に戻り、これは、βγサブユニットと再結合し、これにより、両方の実体によるシグナル伝達が終了する。
【図２】ＲＧＳタンパク質のドメイン構造を示す図である。ＲＧＳタンパク質は、８つのサブクラスに細区分される。全てのＲＧＳタンパク質は、少なくとも１つの保存された、１２０個のアミノ酸のドメインを含有し、これは、ＲＧＳボックスと呼ばれる。このドメインは、観察されるＲＧＳタンパク質のＧＡＰ活性に関与する（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：１８７−９７）。
【図３】ＲＧＳタンパク質のＲＧＳボックスの系統樹を示す図である。ＲＧＳタンパク質のＲＧＳボックスドメインを、ＳＭＡＲＴソフトウエアを使用して予測し、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウエアを使用して整列させ、アラインメントを使用して、配列の根のある系統樹を生成した。この図は、ＲＧＳ２１のＲＧＳボックスの配列は、Ｇαｉタンパク質、Ｇαｏタンパク質およびＧαｑタンパク質に関するＧＡＰであるＲＧＳ２のそれに最も類似することを示している（Ｈａｉｎｓら，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．３８９：７１−８８に概説されている）。ＲＧＳ２とＲＧＳ２１との間の配列類似性は、ガストデューシンおよびトランスデューシンをはじめとするＧαｉファミリーメンバーに共役する、Ｔ１Ｒ受容体およびＴ２Ｒ受容体からのＧタンパク質シグナル伝達を制御するＲＧＳ２１の役割を支持する。
【図４】ｈＲＧＳ２１の調節化合物を同定するための、単一ヌクレオチド結合および代謝回転スクリーニングアッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、甘味、うま味および苦味を、Ｇタンパク質共役味覚受容体を通して調節する目的で、味覚細胞中のＲＧＳ２１タンパク質の活性を調節する化合物を同定するための方法を提供する。具体的には、本発明は、ＲＧＳ２１遺伝子発現、ＲＧＳ２１タンパク質発現および／またはＲＧＳ２１のＧαタンパク質との相互作用を特異的に調節し、味覚細胞中において、ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性等のＲＧＳ２１の活性に対する調節効果をもたらし、それによって、甘味感受性の味覚細胞のシグナル伝達を増強する化合物のライブラリーをスクリーニングするための方法および／または生化学的アッセイを提供する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、化合物のライブラリーは、生理活性作用物質であり、例として、天然に存在する化合物、生体分子、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、多糖、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。代わりとしては、化合物は、小型分子である。本明細書で使用する場合、「味蕾細胞」または「味覚細胞」は互換的に使用され、舌の味蕾、例えば、葉状、茸状および有郭の細胞を形成する群に組織化される神経上皮細胞を包含する（Ｒｏｐｅｒら，１９８９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３２９−３５３）。また、味覚細胞は、口蓋、ならびに食道、腸および胃等、その他の組織においても見い出される。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「調節の」、「調節」、「調節物質」、「阻害性の」、「阻害する」、「阻害剤」、「活性化する」および「活性化剤」は、それらの種々の文法上の形態を包含し、ＲＧＳ２１タンパク質を調節、阻害および／または活性化する分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならびにＲＧＳ２１遺伝子もしくはＲＧＳ２１タンパク質に影響を及ぼすそれらの相同体および模倣物質、あるいは生物学的に活性な部分を含むそれらの断片を指すために互換的に使用される。調節物質として、例えば、ＲＧＳ２１遺伝子もしくはＲＧＳ２１タンパク質、または生物学的に活性な部分を含むそれらの断片と、Ｇαタンパク質およびＧＰＣＲシグナル伝達におけるその他のエフェクターとの相互作用を変化させる物質；ならびにＲＧＳ２１遺伝子またはＲＧＳ２１タンパク質を、停止させる、不活性化するおよび脱感作させる物質が挙げられる。調節物質は、変化した活性を有するＲＧＳ２１遺伝子またはＲＧＳ２１タンパク質の遺伝子改変体、ならびに天然に存在するおよび合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型化学分子等を包含することができる。「調節効果」は、阻害の上方制御、誘発、刺激、増強、減弱および／または軽減、ならびに阻害および／または下方制御もしくは抑制を指す。阻害剤は、例えば、ＲＧＳ２１遺伝子またはタンパク質と結合して、部分的または全体的に刺激を遮断し、減少させ、阻止し、活性化を遅延し、不活性化し、脱感作し、または下方制御する物質、例えば、アンタゴニストである。活性化剤は、例えば、ＲＧＳ２１遺伝子またはＲＧＳ２１タンパク質と結合して、それを刺激し、増加させ、開放し、活性化し、促進し、その活性化を増強し、感作し、または上方制御する物質、例えば、アゴニストである。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「ＲＧＳ」または「ＲＧＳタンパク質」という用語は、現在知られているかまたは今後記載されるＧタンパク質シグナル伝達調節因子タンパク質を包含し、これらは、Ｇαｉクラスのタンパク質またはその他のＧαタンパク質を阻害するかまたはそれに結合することができる。そのようなＲＧＳタンパク質として、これらに限定されないが、ＧＡＩＰ、ＲＧＳｚ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ１７、ＲＧＳ２１、Ｄ−ＡＫＡＰ２、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦ、ＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦ、ｂＲＥＴ−ＲＧＳ、ＡｘｉｎおよびｍＣＯＮＤＵＣＴＩＮ、ならびに任意の現在知られているかまたは今後記載されるアイソフォームまたは相同体が挙げられる。さらに、本明細書で使用する場合、「ＲＧＳタンパク質」という用語は、ＲＧＳボックスドメイン、非ＲＧＳボックスドメイン、または１つもしくは複数の変異、欠失または挿入を有するかまたは有しない、任意のその他の機能性ドメイン／モチーフをはじめとする、ＲＧＳコアドメインを含有する、現在知られているかまたは今後記載されるタンパク質も包含する。１つの好ましい実施形態では、ＲＧＳタンパク質は、ＲＧＳ２１タンパク質、そのアイソフォームまたは相同体を指す。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＧＳ２１タンパク質のコアドメインは、野生型ＲＧＳ２１タンパク質のコアドメインに対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である。本明細書で使用する場合、ＲＧＳ２１タンパク質のコアドメインは、そのタンパク質の生物学的に活性な部分を含む。
【００２７】
本明細書で使用する場合、ＲＧＳタンパク質、好ましくは、ＲＧＳ２１タンパク質の「生物学的に活性な部分」は、そのタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同な、またはそのタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を包含し、この部分は、完全長のタンパク質より少ないアミノ酸を包含し、完全長のタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、そのタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。タンパク質の生物学的に活性な部分は、長さが、例えば、１０、２５、５０、１００または２００個以上のアミノ酸であるポリペプチドであることができる。一実施形態では、ＲＧＳ２１タンパク質の生物学的に活性な部分を、ＲＧＳ２１のＧαタンパク質との相互作用を調節する薬剤を開発するための標的として使用することができる。
【００２８】
本発明は、これらに限定されないが、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞をはじめとする、宿主細胞中で、ＲＧＳ２１タンパク質ならびに対応するおよび／または適切なＧαタンパク質を組換え発現させて、精製するための方法を提供する。１つの好ましい実施形態では、この方法は、ＲＧＳ２１タンパク質および適切なＧαｉタンパク質のそれぞれをコードするｃＤＮＡをクローン化および単離することから開始する。次いで、ＲＧＳ２１タンパク質および適切なＧαｉタンパク質をコードする、単離したｃＤＮＡのそれぞれを、発現ベクター内にクローン化し、さらに、組換えのＲＧＳ２１タンパク質およびＧαｉタンパク質を産生させるために、宿主細胞中に形質転換して発現させる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「組換えの」は、合成された、またはそうでなければｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくはその他の生物学的な系中で遺伝子産物を産生するために組換えのポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えのポリヌクレオチドがコードするポリペプチド（「組換えタンパク質」）に適用される。また、「組換えの」は、異なる供給源からの、種々のコード領域もしくはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸を、発現用（例えば、本発明の転座ドメインおよび本発明のプライマーを使用して増幅した核酸配列を含む融合タンパク質の誘導性または構成的発現用）の、発現カセットまたはベクター内に連結することも含む。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「Ｇα」または「Ｇαタンパク質」という用語は、現在知られているかまたは今後記載されるＧαｉクラスの全てのメンバーを包含し、メンバーとして、これらに限定されないが、Ｇαｉ１−３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏｌｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１−１４およびＧα１６が挙げられる。本明細書で使用する場合、「対応するおよび／または適切なＧαタンパク質」は、使用する細胞、スクリーニングアッセイまたは系において、対象とするＲＧＳタンパク質、例えば、ＲＧＳ２１タンパク質に接触することができるＧαタンパク質を意味する。特定の実施形態では、Ｇαタンパク質は、１つまたは複数の変異、欠失または挿入を含有する場合がある。そのような実施形態では、Ｇαタンパク質は、野生型Ｇαタンパク質に対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である。本明細書で使用する場合、「対応するおよび／または適切なＧαタンパク質」という用語は、使用する細胞、スクリーニングアッセイまたは系において、ＲＧＳタンパク質、例えば、ＲＧＳ２１タンパク質に接触することができるＧαタンパク質を意味する。より好ましくは、適切なＧαタンパク質は、ＲＧＳ２１に接触することができる。また、対応するＧαタンパク質は、使用する細胞、スクリーニングアッセイまたは系において、ＧＰＣＲに共役し、および／またはＧＴＰに結合し、その結果、Ｇαタンパク質は、ＧＰＣＲおよび／またはＧＴＰに接触することができるか、ＧＰＣＲに結合したアゴニストに応答して、シグナルを伝達することができる。本明細書で使用する場合、「ＧＰＣＲに結合したアゴニスト」という用語は、ＧＰＣＲに結合して応答を惹起する、任意の分子または薬剤を包含する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、細胞中に存在するｍＲＮＡ分子に相補的であるＤＮＡ、または逆転写酵素等の酵素を用いてｃＤＮＡに変換することができる、生物体のｍＲＮＡに相補的であるＤＮＡを包含する。１つの好ましい実施形態では、ＲＧＳ２１をコードするｃＤＮＡを、ヒト味蕾細胞のｍＲＮＡから、当技術分野で周知のＲＴ−ＰＣＲ法を使用して単離する。
【００３２】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」、「核酸／ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの高分子の形態を包含する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子の断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、天然に存在するもの、合成、組換え、またはそれらの任意の組合せであってよい。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例として、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドの類似体を含んでよい。ヌクレオチド構造に改変を存在させる場合には、改変を起こすのは、高分子に組み立てる前でも、後でもよい。ヌクレオチド配列を、非ヌクレオチドの成分が中断する場合がある。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分の結合によって等、さらに改変することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖の両方の分子も包含する。別段の記載または要求がない限り、本発明のいずれの実施形態でも、ポリヌクレオチドは、二本鎖の形態も、二本鎖の形態を作り上げることが知られているかまたは予測される、２本の相補的な一本鎖の形態のそれぞれも包含する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合には、チミンに代わるウラシル（Ｕ）の４つのヌクレオチド塩基の特異的な配列から構成される。このアルファベット表示は、コンピュータ中のデータベースに入力して、例えば機能ゲノム解析および相同性検索等のバイオインフォマティクスの適用に向けて使用することができる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「単離したポリヌクレオチド／ｃＤＮＡ分子」という用語は、当該ポリヌクレオチドの天然の供給源中に存在するその他のポリヌクレオチド分子から分離したポリヌクレオチド分子を包含する。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離した」という用語は、ゲノムＤＮＡが天然では結合している染色体から分離したポリヌクレオチド分子を包含する。好ましくは、「単離した」ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で、当該ポリヌクレオチドに天然では隣接する配列（すなわち、対象とするポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に位置する配列）を有しない。例えば、種々の実施形態では、本発明の単離したポリヌクレオチド分子、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、当該ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で、当該ポリヌクレオチド分子に天然では隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子等の「単離した」ポリヌクレオチド分子は、組換え技術によって産生された場合には、その他の細胞物質もしくは培地を実質的に有しないものであることができ、または化学的に合成された場合には、化学的前駆体およびその他の化学物質を実質的に有しないものであることができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」は、後に転写および翻訳される特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを包含する。また、本明細書に記載する任意のポリヌクレオチド配列を使用して、当該ポリペプチドが関連する遺伝子のより大きな断片または全長コード配列を同定することができる。より大きな断片の配列を単離する方法は、当業者には既知である。本明細書で使用する場合、「天然に存在する」ポリヌクレオチド分子として、例えば、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物質の化合物を包含する。サブユニットは、ペプチド結合によって連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、その他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって結合することができる。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体をはじめとする、天然および／または非天然あるいは合成のいずれかのアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物質を包含する。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、通例、オリゴペプチドと呼ばれる。４つ以上のアミノ酸のペプチド鎖は、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００３７】
好ましい実施形態では、本明細書で使用するＲＧＳタンパク質は、味覚細胞および／または宿主細胞中で、天然におよび／または組換えによって発現するＲＧＳタンパク質を指す。より好ましくは、ＲＧＳ２１タンパク質またはＲＧＳ２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、味覚細胞および／または宿主細胞中で、天然におよび／または組換えによって発現する。本明細書で使用する場合、「発現する」または「発現」は、ポリヌクレオチドがＲＮＡに転写される過程および／またはポリペプチドに翻訳される過程を包含する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核細胞の宿主を選択する場合には、ＲＮＡのスプライシングを包含してよい。発現のために要求される調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、およびリボゾーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーター等のプロモーター、ならびに転写開始のためのシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧを包含する。同様に、真核細胞の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボゾームの脱離のための終止コドンを包含する。そのようなベクターは、市販品として入手しても、または当技術分野で周知の方法、例えば、一般的なベクターを構築するための以下に記載する方法に記載されている配列によって組み立ててもよい。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、挿入したポリヌクレオチドを、宿主細胞内および／または宿主細胞間に移入する、自己複製の核酸分子を包含する。この用語は、主として核酸分子を細胞内へ挿入するために機能するベクター、主として核酸の複製のために機能する複製ベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを包含することを意図する。複数の上記機能をもたらすベクターも意図される。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、ベクターのための、あるいは外因性のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの組み込みのための、レシピエントとなることができるかまたはレシピエントである、任意の個々の細胞または細胞培養物を包含することを意図する。また、単一の細胞の子孫も包含することを意図する。子孫は、天然の、偶然のまたは意図的な変異によって、元々の親細胞とは、（形態において、またはゲノムＤＮＡもしくは全ＤＮＡの相補性において）必ずしも完全に同一でなくてもよい。細胞は、原核生物であっても、または真核生物であってもよく、細胞として、これらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞および、これらに限定されないが、マウス、ラット、サルまたはヒトの細胞をはじめとする、哺乳動物細胞が挙げられる。また、本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、遺伝子改変細胞も包含する。「遺伝子改変細胞」という用語は、外来性または外因性の遺伝子またはポリヌクレオチド配列を含有および／または発現する細胞を包含し、それによって、細胞または細胞の子孫の遺伝子型または表現型が改変される。また、「遺伝子改変した」は、細胞内に導入されている遺伝子またはポリヌクレオチド配列を、含有または発現する細胞も包含する。例えば、この実施形態では、遺伝子改変細胞には、細胞にとって内因性でもある遺伝子がすでに導入されている。また、「遺伝子改変した」という用語は、細胞の内因性のヌクレオチドに対する、任意の付加、欠失または破壊も包含する。本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は味覚細胞も包含する。１つの好ましい実施形態では、味覚細胞は、ヒトの味覚細胞である。好ましい実施形態では、味覚細胞は、ヒトの味蕾細胞に由来する。別の好ましい実施形態では、味覚細胞は、ＳＴＣ−１細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞、またはＨｕＴｕ−８０細胞等の味覚細胞モデルである。
【００３９】
より好ましくは、本明細書で使用するＲＧＳ２１タンパク質は、ＲＧＳ２１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるＲＧＳタンパク質を包含する。本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化した複合体を形成する反応を包含する。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対、ホーグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、または任意のその他の配列特異的な様式によって生じることができる。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはポリヌクレオチドのリボザイムによる酵素的な切断等の、より広範な過程におけるステップを構成する場合がある。
【００４０】
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェントな条件下で行うことができる。本発明は、低いストリンジェントな条件、より好ましくはストリンジェントな条件、および最も好ましくは高いストリンジェントな条件の下で、本明細書に記載するＲＧＳ２１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを包含する。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、１０×デンハルト溶液、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、６０℃での一晩のハイブリダイゼーションを指す。ブロットを、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、次に１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、および最後に０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６２℃で各回３０分間順次洗浄する。また本明細書で使用する場合、好ましい実施形態では、「ストリンジェントな条件」という語句は、６×ＳＳＣ溶液中、６５℃でのハイブリダイゼーションも指す。別の実施形態では、「高いストリンジェントな条件」は、１０×デンハルト溶液、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、６５℃での一晩のハイブリダイゼーションを指す。ブロットを、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、次に１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、および最後に０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６５℃で各回３０分間順次洗浄する。核酸のハイブリダイゼーションのための方法は、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５；ならびにＴｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，パートＩ，第２章，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３に記載されている。したがって、本明細書で使用する核酸によってコードされるＲＧＳ２１タンパク質は、配列番号２に記載するアミノ酸配列を有するＲＧＳ２１タンパク質をコードする配列番号１に記載するポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％相同であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である核酸を包含する。
【００４１】
さらに、本明細書で使用するＲＧＳ２１タンパク質はまた、キメラタンパク質または融合タンパク質であることができる。本明細書で使用する場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、第１のポリペプチドを含み、これは、第２のポリペプチドに動作可能に連結している。キメラタンパク質は、第１または２のポリペプチドに動作可能に連結している第３、４もしくは５、またはその他のポリペプチドを場合によっては含むことができる。キメラタンパク質は、２つ以上の異なるポリペプチドを含むことができる。キメラタンパク質は、同一のポリペプチドの複数のコピーを含むことができる。また、キメラタンパク質は、ポリペプチドのうちの１つまたは複数において、１つまたは複数の変異を含んでもよい。キメラタンパク質を作製するための方法は、当技術分野では周知である。本発明の一実施形態では、キメラタンパク質は、ＲＧＳ２１タンパク質のその他のＲＧＳタンパク質とのキメラである。本発明のさらに別の実施形態では、キメラタンパク質は、Ｇαｉタンパク質とその他のＧαタンパク質とのキメラである。
【００４２】
本発明は、味覚シグナル伝達を調節するための、ＲＧＳ２１タンパク質と選択的かつ特異的に相互作用する複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、ＲＧＳ２１タンパク質を宿主細胞から単離および精製するステップと；精製したＲＧＳ２１タンパク質の試験化合物との結合をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップと；精製したＲＧＳ２１タンパク質と結合する試験化合物の存在下で、精製したＲＧＳ２１タンパク質の精製したＧαタンパク質との結合を決定するステップと；さらに、精製したＲＧＳ２１タンパク質と結合して、精製したＲＧＳ２１タンパク質の精製したＧαタンパク質との結合を調節する試験化合物の存在下で、精製したＧαタンパク質に対するＲＧＳ２１タンパク質の活性を決定するステップと；精製したＲＧＳ２１タンパク質と結合して、精製したＲＧＳ２１タンパク質の精製したＧαタンパク質との結合を変化させ、ＲＧＳ２１タンパク質の活性をさらに調節する試験化合物を同定するステップとを含む。一実施形態では、ＲＧＳ２１タンパク質の活性は、ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性である。
【００４３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、宿主細胞中でＲＧＳ２１遺伝子の発現を阻害する複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、ＲＧＳ２１遺伝子を選択的に発現する宿主細胞を提供するステップと；当該宿主細胞中で、試験化合物の非存在下および存在下、ＲＧＳ２１遺伝子の発現を測定するステップと；当該宿主細胞中でＲＧＳ２１遺伝子の発現を阻害する化合物を同定するステップとを含む。ＲＧＳ２１遺伝子の発現は、（ｖｏｎ  Ｂｕｃｈｈｏｌｔｚら．，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９，１５３５−１５４４）に記載されている逆転写酵素ＰＣＲを使用して測定することができる。
【００４４】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、宿主細胞中でＲＧＳ２１タンパク質の発現を阻害する複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、ＲＧＳ２１タンパク質を選択的に発現する宿主細胞を提供するステップと；当該宿主細胞中で、試験化合物の非存在下および存在下、ＲＧＳ２１タンパク質の発現を測定するステップと；当該宿主細胞中でＲＧＳ２１タンパク質の発現を阻害する化合物を同定するステップとを含む。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「単離した」または「精製した」タンパク質、ポリヌクレオチドまたは分子は、それらが天然に存在する環境から取り出したこと、または細胞物質、例として、当該タンパク質のポリヌクレオチドもしくは分子が由来する細胞もしくは組織の供給源からの、その他の混入タンパク質を実質的に有しないこと、または化学合成された場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に有しないことを意味する。「細胞物質を実質的に有しない」という言葉は、それを単離または組換えにより産生または合成した細胞の細胞成分から分離した調製物を包含する。一実施形態では、「細胞物質を実質的に有しない」という言葉は、約３０％（乾燥重量）未満のその他のタンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも呼ばれる）、より好ましくは約２０％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、および最も好ましくは約５％未満のその他のタンパク質を有する、対象とするタンパク質の調製物を包含する。タンパク質またはポリヌクレオチドを組換えによって産生する場合、これはまた、培地を実質的に有しないことが好ましく、すなわち、培地は、対象とするタンパク質の調製物の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、および最も好ましくは約５％未満の容量に相当する。
【００４６】
さらに、本発明は、ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性を測定する方法を提供する。本明細書で使用する場合、「ＧＡＰ」という用語は、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質を指す。ＲＧＳ２１タンパク質をはじめとする、全てのＲＧＳタンパク質は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧｉおよび／またはＧｑのクラスのアルファサブユニットに関するＧＡＰである。ＲＧＳのＧＡＰ活性を測定するための方法は、当技術分野では周知であり、ＲＧＳのＧＡＰ活性が、ホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）によって阻害されるが、その他のリン脂質、ホスホイノシチドおよびジアシルグリセロールによっては阻害されないことが報告されている。
【００４７】
１つの好ましい実施形態では、ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性を、ＧＴＰの加水分解を測定することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する。本発明によれば、ＧＴＰに結合しているＧαｉタンパク質に精製したＲＧＳ２１を添加すると、ＧＴＰの加水分解の速度が増加する。したがって、本発明は、ＧＴＰの加水分解をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するための方法を提供する。ＧＴＰの加水分解をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するための方法は、当技術分野では周知である。好ましい実施形態の１つでは、本発明は、膜結合性のＧαタンパク質からの放射活性の喪失から、ＧＴＰの加水分解の尺度が得られるという条件で、放射活性のある結合ＧＴＰの加水分解を提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＧＳドメインのＧＴＰアーゼ促進活性についての蛍光に基づいた直接的なアッセイを提供する（Ｗｉｌｌａｒｄら，２００５，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５；３４０（２）：３４１−５１）。この方法は、リボゾーム結合型蛍光グアニン・ヌクレオチド類似体であるＢＯＤＩＰＹＦＬ−ＧＴＰを、分光学的なプローブとして使用して、内因性の、ＲＧＳタンパク質が触媒するＧαによるヌクレオチドの加水分解を測定する（Ｗｉｌｌａｒｄら，２００５，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５；３４０（２）：３４１−５１）。本発明によれば、ＲＧＳ２１添加時のＧαタンパク質からのＢＯＤＩＰＹ蛍光放出の喪失から、ＧＴＰの加水分解の尺度が得られる。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＧαとＲＧＳ２１との相互作用に関する時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ，ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）アッセイを提供する（Ｌｅｉｆｅｒｔら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．印刷中）。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、キナーゼ活性の定量化のための、高感度かつ強力な高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）の代表的な方法である（Ｍｏｓｈｉｎｓｋｙら，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅ．８（４）：４４７−４５２）。本発明によれば、ＧαとＲＧＳ２１との相互作用を阻害する調節化合物が、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを減少させる。さらに、本発明によれば、ＧＴＰの加水分解を測定することによるＲＧＳ２１のＧＡＰ活性を測定するための方法は、本明細書に提示する方法に限定されるわけではなく、ＧＴＰの加水分解を測定するための、その他の周知の方法もまた、ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性によるＧＴＰの加水分解を検出するために適用することができる。
【００４８】
さらに、本発明は、ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性を調節する化合物のライブラリーについてスクリーニングする方法も提供する、すなわち、本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質に関する調節物質を同定するための方法またはスクリーニングアッセイを提供する。ＲＧＳ２１タンパク質に関する調節物質は、（ａ）上記で定義したＲＧＳ２１遺伝子もしくはＲＧＳ２１タンパク質に結合する、または（ｂ）ＲＧＳ２１タンパク質の、天然の基質のうちの１種もしくは複数（例えば、Ｇαｉ）との相互作用に対して調節効果を有する、または（ｃ）上記で定義したＲＧＳ２１遺伝子またはＲＧＳ２１タンパク質の発現に対して阻害効果を有する部分（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物質、ペプトイド、ポリヌクレオチド、小型分子またはその他の薬物）を含む、化合物または薬剤を包含する。そのようなアッセイは、典型的には、ＲＧＳ２１遺伝子またはＲＧＳ２１タンパク質と１種または複数のアッセイ成分との間の反応を含む。その他の成分は、試験化合物自体であっても、または試験化合物とＲＧＳ２１遺伝子またはＲＧＳ２１タンパク質の結合パートナーとの組合せであってもよい。
【００４９】
本発明の試験化合物は、一般に、小型分子または生理活性作用物質のいずれかである。１つの好ましい実施形態では、試験化合物は、小型分子である。別の好ましい実施形態では、試験化合物は、生理活性作用物質である。生理活性作用物質として、これらに限定されないが、哺乳動物中で生理活性を有する天然に存在するかまたは合成の化合物または分子（「生体分子」）、ならびにタンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、多糖、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。好ましくは、生理活性作用物質は、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは生体分子である。当業者であれば、試験化合物の性質が、ＲＧＳ２１遺伝子によってコードされるタンパク質または上記で定義したタンパク質の性質によって変化する場合があることを理解するであろう。本発明の試験化合物は、天然および／または合成の化合物の系統的なライブラリーをはじめとする、任意の入手可能な供給源から得ることができる。
【００５０】
一般に、タンパク質の阻害剤または活性化剤についてスクリーニングするための方法および組成物、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質対タンパク質およびタンパク質対リガンドの結合研究は、当技術分野で既知であり、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質とＧαタンパク質との結合を阻害することができる試験化合物について、試験化合物と、単離および／または精製したＲＧＳ２１タンパク質と、単離および／または精製したＧαタンパク質とを一緒にして組み合わせて、試験化合物の存在下で、ＲＧＳ２１タンパク質とＧαタンパク質との結合が、生じるかおよび／または変化するかを決定することによってスクリーニングする方法を提供する。試験化合物は、小型分子または生理活性作用物質のいずれかであってよい。以下に議論するように、試験化合物は、当技術分野で周知の多様なライブラリーから提供することができる。さらに別の実施形態では、本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質のＧαタンパク質への結合を阻害する、試験化合物の能力を検出することを伴うスクリーニングアッセイを提供する。さらに別の実施形態では、ＲＧＳ２１の発現、活性または結合能の阻害剤／調節物質もまた、ＲＧＳ２１が制御する味覚シグナル伝達を調節するために、本発明において提供される。
【００５１】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＲＧＳ２１タンパク質とＧαタンパク質との結合を妨げることができる試験化合物についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、単離および／または精製したＲＧＳ２１タンパク質と、試験化合物と、単離および／または精製したＧαタンパク質とを組み合わせるステップと；ＲＧＳ２１タンパク質とＧαタンパク質との結合を決定するステップと；試験化合物の結合を妨げる能力を相関させるステップとを包含し、試験化合物の非存在下と比較して、試験化合物の存在下でのＲＧＳ２１タンパク質とＧαとの結合が低下することは、試験化合物が、結合を阻害することができることを示す。好ましい実施形態の１つでは、単離および／または精製したＧαｉタンパク質ならびにＲＧＳ２１タンパク質あるいは上記で定義したＲＧＳ２１タンパク質の生物学的に活性な部分を含むＲＧＳ２１タンパク質の機能性断片との培養物に、試験化合物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、同時、またはＴＲ−ＦＲＥＴが平衡に達した後のいずれかに添加する。次いで、ＴＲ−ＦＲＥＴのシグナルを測定する。本発明によれば、ＧαとＲＧＳ２１との相互作用を阻害する調節化合物は、ＴＲ−ＦＲＥＴのシグナルを減少させる。
【００５２】
また、本発明は、上記で定義したＲＧＳ２１遺伝子および／またはＲＧＳ２１タンパク質の活性または発現を阻害することができる試験化合物について高スループットスクリーニングを実施する方法も提供する。一実施形態では、高スループットスクリーニングの方法では、適切なＧαタンパク質の存在下で、試験化合物と、ＲＧＳ２１遺伝子および／またはＲＧＳ２１タンパク質とを組み合わせて、試験化合物のＲＧＳ２１遺伝子および／またはＲＧＳ２１タンパク質に対する効果を、上記で議論した機能アッセイを使用して検出することを伴う。当技術分野で周知の、多様な高スループット機能アッセイを組み合わせて使用して、異なる種類の活性化試験化合物の反応性をスクリーニングおよび／または研究することができるが、共役系はしばしば、予測することが困難であることから、広い範囲の共役機構を検出するためには、いくつかのアッセイを構成する必要がある場合がある。多様な蛍光に基づいた技術が、当技術分野では周知であり、活性を高スループットおよび超高スループットでスクリーニングすることができる。大きな容量のかつ多様な試験化合物を、良好な感度でスクリーニングすることができるので、有望なＲＧＳ２１阻害剤の解析が可能となる。本発明は、ＲＧＳ２１遺伝子および／またはＲＧＳ２１タンパク質の活性を阻害する能力について、高スループット・アッセイ、または当技術分野で既知の蛍光に基づいたアッセイにおいて、試験化合物と、遺伝子および／またはタンパク質とを組み合わせることによって、試験化合物を高スループットでスクリーニングするための方法を提供する。一実施形態では、高スループットスクリーニングアッセイは、ＲＧＳ２１遺伝子および／またはＲＧＳ２１タンパク質に結合する、複数の試験化合物の能力を検出する。別の実施形態では、高スループットスクリーニングアッセイは、ＲＧＳ２１タンパク質の結合パートナー（Ｇαタンパク質等）がＲＧＳ２１タンパク質に結合するのを阻害する、複数の試験化合物の能力を検出する。さらに別の実施形態では、高スループットスクリーニングアッセイは、味覚受容体シグナル伝達を通して味覚シグナル伝達を調節する、複数の試験化合物の能力を検出する。
【００５３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、甘味の増強について複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、ＲＧＳ２１タンパク質の活性を阻害する化合物（ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤）を同定するステップと、甘味物質単独の場合および化合物（ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤）と組み合わせた場合の、甘味物質受容体によって活性化された甘味シグナル伝達を決定するステップと、当該甘味物質の甘味シグナル伝達を増加させる化合物（ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤）を同定するステップとを含む。
【００５４】
さらに、本発明は、味覚細胞中での、ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性に対する、上記で同定した調節化合物の効果を決定するための方法を提供する。好ましい実施形態では、甘味物質受容体の活性化をモニターする標準的なシグナル伝達アッセイを使用する。そのような測定として、これらに限定されないが、ａ）セカンドメッセンジャー（例えば、カルシウム、ＩＰ３、ＤＡＧ、ＰＩＰ２、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等）の変化、ｂ）タンパク質キナーゼ活性（例えば、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＧＲＫ、ＥＲＫ、Ａｋｔ、Ｓｒｃ、ＲＴＫ等）の変化、ｃ）甘味物質受容体の局在化の変化、およびｄ）味覚細胞膜電位の変化の決定が挙げられる。本明細書で使用する場合、「甘味物質受容体」は、味覚シグナル伝達経路に関与する、現在知られているおよび今後発見される受容体タンパク質を指し、こうした受容体タンパク質として、これらに限定されないが、ＧＰＣＲのＴ１ＲファミリーおよびＧＰＣＲのＴ２Ｒファミリー、それらのアイソフォームおよび相同体が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「甘味物質」として、ａ）これらに限定されないが、スクロース、グルコース、フルクトース、ＨＦＣＳ、ＨＦＳＳ、Ｄ−タガトース、トレハロース、Ｄ−ガラクトース、ラムノースをはじめとする、炭水化物甘味物質；ｂ）これらに限定されないが、アスパルテーム、ネオテーム、アセスルファムＫ、スクラロース、チクロ、サッカリン、ネオヘスペリジン・ジヒドロカルコンをはじめとする、合成の強力な甘味物質；ｃ）これらに限定されないが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、ダルコシドＡ、ダルコシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モナチン、クルクリン、グリシリジン、タウマチン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、モナチン、ヘルナンズルチン（Ｈｅｒｎａｎｄｕｌｃｉｎ）、フィロズルチ（Ｐｈｙｌｌｏｄｕｌｃｉ）をはじめとする、天然の強力な甘味物質；ｄ）これらに限定されないが、エリスリトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、イソマルトをはじめとする、ポリオール、およびｅ）これらに限定されないが、グリシン、Ｄ−またはＬ−アラニン、Ｄ−トリプトファン、アルギニン、セリン、スレオニンをはじめとする、アミノ酸が挙げられる。
【００５６】
具体的には、上記で定義した甘味物質の、これらのシグナル伝達の「計測値」に対する効果を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物と組み合わせた甘味物質の効果と比較する。本発明によれば、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤は、甘味物質の観察される効果を増加させる。例えば、甘味物質単独で、細胞内カルシウムの放出が増加する場合には、その甘味物質とＲＧＳ２１阻害剤との組合せによって、カルシウムの放出が、甘味物質単独の場合を上回って増加するはずである。別の好ましい実施形態では、本発明はまた、うま味および苦味を調節する、ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤および調節物質についてスクリーニングするための方法を提供する。
【００５７】
さらに、本発明は、ヒトにおいて、ヒトの甘味感覚、ならびにうま味および苦味の感覚に対するＲＧＳ２１の調節物質の効果を検証するための方法も提供する。１つの好ましい実施形態では、本発明は、試験甘味物質自体で試験した場合に認識された甘さと、試験甘味物質とＲＧＳ２１の調節化合物とを組み合わせた場合に認識された甘さとの比較を提供する。本発明によれば、ＲＧＳ２１の阻害剤は、試験甘味物質の認識される甘さを増強し、一方、ＲＧＳ２１の増強物質は、試験甘味物質の認識される甘さを低下させる。
【００５８】
さらに、本発明は、味覚細胞中で、ＲＧＳ２１タンパク質と特異的に相互作用して、それを阻害する、複数の化合物をスクリーニングするための方法を提供する。そのような方法は：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３等の甘味物質受容体を含む、味覚シグナル伝達のための１種または複数のタンパク質を天然に発現する味覚細胞、アルファサブユニットであるα−ガストデューシンを含有する対応するＧタンパク質、ＰＬＣβ２等のエフェクター、およびＲＧＳ２１タンパク質を提供するステップと；ＲＧＳ２１タンパク質を当該味覚細胞から単離および精製するステップと；精製したＲＧＳ２１タンパク質の試験化合物との結合をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定するステップと；精製したＲＧＳ２１タンパク質と結合する試験化合物の存在下で、精製したＲＧＳ２１タンパク質の精製したＧαタンパク質との結合を決定するステップと；さらに、精製したＲＧＳ２１タンパク質と結合して、精製したＲＧＳ２１タンパク質の精製したＧαタンパク質との結合を調節する試験化合物の存在下で、精製したＧαタンパク質に対するＲＧＳ２１タンパク質の活性を決定するステップと、精製したＲＧＳ２１タンパク質と結合して、精製したＲＧＳ２１タンパク質の精製したＧαタンパク質との結合を調節し、ＲＧＳ２１タンパク質の活性をさらに調節する試験化合物を同定するステップとを含む。１つの好ましい実施形態では、ＲＧＳ２１タンパク質の活性は、ＧＡＰ活性である。別の好ましい実施形態では、味覚細胞は、ヒトの味蕾細胞に由来する。別の好ましい実施形態では、味覚細胞は、ＳＴＣ−１細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞またはＨｕＴｕ−８０細胞等の味覚細胞モデルである。
【００５９】
さらに、本発明は、甘味シグナル伝達を増強するための、ＲＧＳ２１遺伝子および／またはＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤および／または調節化合物を含む組成物も提供する。また、本発明は、甘味だけでなく、うま味および苦味も調節するための、ＲＧＳ２１遺伝子および／またはＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤および／または調節化合物を含む組成物も提供する。
【００６０】
本発明のこれらおよび多くの他の変形形態および実施形態が、付随する説明および実施例を精査することによって、当業者には明らかとなるであろう。
【実施例１】
【００６１】
ＲＧＳ２１タンパク質およびＧαタンパク質の組換え発現
ＲＧＳ２１をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１０３９１５２）を、ヒト味蕾ｍＲＮＡから、ｖｏｎ  Ｂｕｃｈｏｌｔｚら（２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：１５３５−４４）に記載されているＲＴ−ＰＣＲを使用して単離する。完全長ＲＧＳ２１タンパク質（配列番号２をコードする配列番号１）をコードするｃＤＮＡまたはＲＧＳ２１のＲＧＳボックスをコードする（配列番号２のアミノ酸２１位から１３７位をコードする）ｃＤＮＡ配列のいずれかを、Ｗｉｌｌａｒｄら（２００５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４０：３４１−５１）によって記載されている、適切なｐＧＥＸベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）等の組換えタンパク質の発現および精製に適したベクター内にクローン化する。この実施例では、大腸菌中で、タンパク質の精製を促進するためにＮ末端グルタチオンＳトランスフェラーゼタグを付けて、組換えＲＧＳ２１を発現させる。
【００６２】
適切なＧαｉタンパク質（例えば、α−ガストデューシン、Ｇαｉ２等）をコードするｃＤＮＡを、Ｗｉｌｌａｒｄら（２００５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４０：３４１−５１）によって記載されているｐＰＲＯＥＸＨＴｂ真核細胞発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．製）内にクローン化する。切断可能なヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を、Ｇαタンパク質のＮ末端上に付けて、タンパク質の精製を促進する。
【００６３】
ＢＬ２１細菌を、上記の発現プラスミドを用いて形質転換して、ＲＧＳ２１タンパク質およびＧαタンパク質を産生するために使用する。形質転換した細菌を、３０〜３７℃で増殖させ、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドと共にインキュベートして、タンパク質の発現を誘導する。Ｈｉｓ６−Ｇαタンパク質を、Ｎｉ２＋−ニトリロ三酢酸クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ製）、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ、Ａｍｅｒｓｈａｍ製）および分子ふるいクロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００、Ａｍｅｒｓｈａｍ製）によって、順次精製する。ＧＳＴ−ＲＧＳ２１を、グルタチオンアガロースクロマトグラフィーおよび分子ふるいクロマトグラフィーを使用して精製する（Ｗｉｌｌａｒｄら，２００５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４０：３４１−５１）。
【００６４】
ＲＧＳ２１タンパク質およびＧαタンパク質を、別法として、バキュロウイルス発現ベクターを用いて感染させたＳｆ９昆虫細胞（ｖｏｎ  Ｂｕｃｈｈｏｌｔｚら，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：１５３５−４４）、または適切な発現プラスミドを用いて形質転換した酵母細胞（Ｌｅｉｆｅｒｔら．，２００６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５５，２０１−２１２）中で発現させる。全ての場合において、組換えタンパク質を、誘導した細胞の可溶化液から、上記のクロマトグラフィーのスキームを使用して単離する。
【実施例２】
【００６５】
ＲＧＳ２１のＧＡＰ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける測定、およびＲＧＳ２１の調節化合物のスクリーニング
精製したＲＧＳ２１の、ＧＴＰに結合したＧαｉタンパク質との相互作用は、ＧＴＰの加水分解を増加させる。ＧＴＰの加水分解を、以下の方法を使用して測定する。
【００６６】
方法１．放射活性のある結合型ＧＴＰの加水分解：
【００６７】
ＧαのＧＴＰアーゼ活性を、Ｓｎｏｗら（１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１７７４９−５５）に記載されているように溶液中で決定する。手短にいうと、ＧＴＰを取り込んだＧαｉ１−３およびＧαガストデューシンは、［γ−３２Ｐ］−ＧＴＰ（５００ｃｐｍ／ピコモル）の存在下で、以下の緩衝液中、２０℃で３時間Ｇαタンパク質をインキュベートすることによって生成する：（最終容量：１５０μｌ）：１０ｍＭ  ＧＴＰ、５．５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳナトリウム、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、３０ｍＭ  （ＮＨ２）２ＳＯ４および４％グリセロール。取込みの後、反応混合液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５クロマトグラフィーによって、１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１８ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンに交換する。次いで、タンパク質の溶離液を、氷冷したＯＧ緩衝液（０．１％オクチルグルコピラノシド、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳナトリウム、ｐＨ７．５、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび１ｍＭ  ＧＴＰ）中で４倍に希釈する。
【００６８】
ＧＡＰ活性を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下または非存在下のＲＧＳ２１タンパク質試料および（９ｍＭ  ＭｇＳＯ４を補った）ＯＧ緩衝液に、Ｇα−ＧＴＰを添加することによって開始する。時間を決めて、１００μｌの一定分量を取り出して、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の５％（ｗ／ｖ）Ｎｏｒｉｔ  Ａ活性炭スラリー、９００ｍｌを用いて反応を停止する。活性炭をペレット化して、３２Ｐｉを含有する上清を計数する。上清中の増加した３２Ｐｉは、増加したＧＴＰアーゼの活性を示す。
【００６９】
方法２．ＢＯＤＩＰＹＦＬ−ＧＴＰの蛍光分光法：
【００７０】
ＢＯＤＩＰＹＦＬ−ＧＴＰは、Ｇαタンパク質との結合時には、ベースラインから２００％の蛍光放出の増加を示すが、一方、加水分解によって生成したＢＯＤＩＰＹＦＬ−ＧＤＰは、Ｇαタンパク質と結合した場合、ベースラインからわずか２７％の蛍光放出の増加を示すに過ぎない（Ｗｉｌｌａｒｄら，２００５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４０：３４１−５１）。ＲＧＳ２１添加時のＧαタンパク質からのＢＯＤＩＰＹの蛍光放出の喪失から、ＧＴＰの加水分解の尺度が得られる。Ｗｉｌｌａｒｄら（２００５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４０：３４１−５１）によって記載されている、単一ヌクレオチド結合および代謝回転アッセイの形成を使用して、ＲＧＳ２１の調節化合物をスクリーニングする（図４）。
【００７１】
方法３．ＧαとＲＧＳ２１との相互作用についての時間分解ＦＲＥＴアッセイ：
【００７２】
ＲＧＳ２１タンパク質は、ＧＴＰアーゼの活性を刺激するためには、Ｇαｉと物理的に結合する必要がある（ＮｅｕｂｉｇおよびＳｉｄｅｒｏｖｓｋｉ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：１８７−９７）。このアッセイは、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を使用して、ＲＧＳ２１タンパク質とＧαタンパク質との物理的な結合をモニターする。Ｈｉｓ６タグ付きＲＧＳ２１タンパク質およびＨｉｓ６タグ付きＧαｉタンパク質を、Ａｌｅｘａ５４６蛍光およびテルビウムクリプテート（Ｔｂ）キレートをそれぞれ使用して、タンパク質に対して５倍モル過剰の蛍光を使用して蛍光標識する（Ｌｅｉｆｅｒｔら，２００６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５５：２０１−１２）。Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に固定化した、組換えのＲＧＳ２１タンパク質およびＧαタンパク質を、Ａｌｅｘａ５４６マレイミドまたはテルビウムクリプテートマレイミドのいずれかと共に、室温で２〜３時間インキュベートする。インキュベートした後、Ｇαタンパク質を含有するカラムを、５ｍＭイミダゾールおよび３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．５％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレン−１０−ラウリルエーテルおよび１０μＭ  ＧＤＰ、ｐＨ８．０）で洗浄して、未結合のＡｌｅｘａ５４６またはテルビウムを除去する。標識Ｇαタンパク質を、カラムから、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  βメルカプトエタノール、１０μＭ  ＧＤＰ、１％（ｗ／ｖ）コール酸、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  ＮａＦおよび３０μＭ  ＡｌＣｌ３）を使用して溶出する。Ｈｉｓ６−Ｇαタンパク質を含有する溶出画分を、プールして、溶出用緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１μＭ  ＧＤＰおよび０．１％（ｗ／ｖ）コール酸）に対して透析する。標識Ｈｉｓ６−ＲＧＳ２１タンパク質を、カラムから、（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ６．０）を用いて溶出する。Ｈｉｓ６−ＲＧＳ２１を含有する溶出画分を、プールして、溶出用緩衝液に対して透析する。
【００７３】
Ａｌｅｘａ５４６−ＲＧＳ２１を、マルチウエルプレート（例えば、９６ウエル等）中で、推定上の調節化合物と共に、室温で少なくとも１０分間あらかじめインキュベートする。平行して、Ｔｂ−Ｇαｉタンパク質を、ＦＲＥＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴ）中の３０μＭ  ＡｌＣｌ３および１０ｍＭ  ＮａＦと共に、少なくとも１０分間インキュベートして、Ｔｂ−Ｇαｉ・ＧＤＰ・ＡｌＦ４−の遷移状態の「活性化された」複合体を形成させる。ＴＲ−ＦＲＥＴ反応を、ＴＲ−ＦＲＥＴ測定システムを備えた蛍光プレートリーダー内において、活性化されたＴｂ−Ｇαｉ・ＧＤＰ・ＡｌＦ４−を、（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０μＭ  ＡｌＣｌ３、１０ｍＭ  ＮａＦおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）中のＡｌｅｘａ５４６−ＲＧＳ２１タンパク質と、１００μｌの反応容量で混合することによって開始し、０〜３０分間インキュベートする。以下の装置の設定で、時間分解蛍光測定を実施する：励起：３４０ｎｍ、放出：５７２ｎｍ、遅延：５０μ秒、および計数期間：９００μ秒。読取りは、蛍光放出が安定するまで行う。その時点で、未標識のＧαタンパク質またはＲＧＳ２１等のその他の成分を添加し、次いで、蛍光の読取りを、蛍光が再び安定するまで続ける。バックグランドの蛍光は、適切な濃度のテルビウム標識タンパク質を、インキュベーション用緩衝液に添加して、同一のＴＲ−ＦＲＥＴ条件に暴露することによって決定する。バックグランドの蛍光を、全てのデータから差し引くと、動態学的パラメータが測定可能になる。いずれの調節化合物も存在しない状態では、結合の平衡は、この時間枠内に達成され、時間の関数としてのＦＲＥＴシグナルのプラトーとして観察される（Ｌｅｉｆｅｒｔら，２００６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５５：２０１−１２）。ＧαとＲＧＳ２１との相互作用を阻害する調節化合物は、ＴＲ−ＦＦＲＴシグナルを減少させ、一方、ＧαとＲＧＳ２１との相互作用を増強する調節化合物は、ＴＲ−ＦＦＲＴシグナルを増加させるであろう。
【実施例３】
【００７４】
ＲＧＳ２１の活性を、味覚受容体の活性化／脱感作を変化させることによって調節する化合物を同定するための、細胞に基づいたアッセイ
完全な細胞中で推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の効果を決定するために、標準的なシグナル伝達アッセイを使用して、甘味、うま味および苦味の受容体をはじめとする、Ｇタンパク質共役受容体のシグナル伝達をモニターする。本明細書で使用する、好ましい標準的なシグナル伝達アッセイは、ａ）セカンドメッセンジャー（例えば、カルシウム（Ｃａ２＋）、環状ヌクレオチド、脂質の種／代謝産物等）の変化、ｂ）タンパク質キナーゼ活性（例えば、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＧＲＫ、ＭＡＰキナーゼ、Ａｋｔ、Ｓｒｃ、受容体型チロシン・キナーゼ等）の変化、ｃ）味覚受容体の局在化の変化、およびｄ）神経伝達物質（例えば、ＡＴＰ、ＧＬＰ−１、ＣＣＫ、セロトニン、ＰＹＹ等）の放出の測定からなる群から選択することができる。これらの標準的な手順は、当技術分野では周知であり、以下に詳細に記載する。以下に記載する細胞に基づいた技術は、組換えのＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の味覚受容体を異種発現する細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞等）に適用することができ、また、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を天然に発現する細胞（例えば、培養した味蕾細胞、マウスＳＴＣ−１腸内分泌細胞、ヒトＮＣＩ−Ｈ７１６腸内分泌細胞およびヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞等）にも適用することができる。
【００７５】
基本的な実験計画では、これらのシグナル伝達の「計測値」に対する甘味物質の効果を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物と組み合わせた甘味物質の効果と比較する。ＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤は、甘味物質の観察される効果の増加を示す。例えば、甘味物質単独で、細胞内カルシウムの放出が増加する場合には、その甘味物質とＲＧＳ２１の阻害剤との組合せによって、カルシウムの放出が、甘味物質単独の場合に見られるレベルを上回って増加する。
【００７６】
Ａ．細胞内セカンドメッセンジャーの、細胞に基づいたアッセイ：
【００７７】
環状ヌクレオチドの測定：ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ等の環状ヌクレオチドの変化を、細胞抽出物中のそれらの量を、市販の非放射性のＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ  ｃＡＭＰアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を使用することにより定量化することによって測定することができる。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ｃＡＭＰアッセイは、アデニル酸シクラーゼ活性の調節時にＧＰＣＲにより産生したｃＡＭＰのレベルを直接測定するように設計されている。アッセイは、内因性のｃＡＭＰと外因性の添加したビオチン化ｃＡＭＰとの間の競合に基づく。ｃＡＭＰの捕捉は、アクセプター（Ａｃｃｅｐｔｏｒ）ビーズに結合させた特異的な抗体を使用することによって達成する。アッセイは、ＧαｉおよびＧαｓに共役したＧＰＣＲに対するアゴニストおよびアンタゴニストの両方の活性を測定するのに効率的である。ＧＰＣＲのＴ１ＲおよびＴ２Ｒのファミリーは、ＧαｉファミリーのＧタンパク質であるガストデューシンを活性化する。
【００７８】
味覚受容体およびＲＧＳ２１を発現する細胞（例えば、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、味蕾細胞、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞等）を、マルチウエルプレート中に、刺激用緩衝液、ｐＨ７．４（０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で、抗ｃＡＭＰ抗体結合受容体ビーズと共に蒔く。次いで、３０分かけてその最大能力の５０％でｃＡＭＰを産生する、経験的に決定したフォルスコリンの濃度で、細胞を処理する。各種の濃度の味物質（例えば、スクロース、アスパルテーム等）を、フォルスコリンおよび推定上のＲＧＳ２１の調節化合物と一緒に添加する。細胞を、暗所で３０分間インキュベートし、次いで、細胞可溶化用緩衝液中のビオチン化ｃＡＭＰに結合したストレプトアビジンでコートしたビーズ（０．２５Ｕ／μｌ）の混合物と共に、暗所で４時間インキュベートする。蛍光シグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー中で測定する。この実験系では、味物質の濃度が増加すると、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎのシグナルが、ビオチン化ｃＡＭＰおよび抗ｃＡＭＰ抗体ビーズとの競合に利用可能な細胞性のｃＡＭＰを減少させるアデニリルシクラーゼの阻害によって増加することが予想される。
【００７９】
別法として、モデル味覚細胞に、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含有するプロモーター配列のコントロール下にある転写性レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等）をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを安定にトランスフェクトする。このアッセイは、ｃＡＭＰ感受性転写因子である、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のよる転写の活性化をモニターする。したがって、トランスフェクトした細胞は、転写性レポータータンパク質を、細胞中の利用可能なｃＡＭＰの量に比例して発現する。味覚受容体およびＲＧＳ２１を発現する細胞（例えば、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、味蕾細胞、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞等）を、２４ウエル・プレート中に蒔き、これに、ＣＲＥ−ルシフェラーゼ（ホタル）レポータープラスミド（０．４μｇ）およびｐＲＬ−Ｔｋ（０．１μｇ）を同時トランスフェクトする。ｐＲＬ−Ｔｋは、（Ｎｇｕｙｅｎら，２００４，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １６：１１４１−５１；Ｌｅｅら，２００４，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１８：１７４０−５５）に記載されているように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用して、ウミシイタケルシフェラーゼを、トランスフェクションの効率に関する対照として、構成的に発現する。次いで、その最大能力の５０％でｃＡＭＰを産生する、経験的に決定した、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中のフォルスコリンの濃度で、５〜１２時間細胞を処理する。各種の濃度の味物質の（例えば、スクロース、アスパルテーム等）を、フォルスコリンおよび推定上のＲＧＳ２１の調節化合物と一緒に、５〜１２時間添加する。細胞を可溶化し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、市販のＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用して、製造者の指示に従って決定する。ホタルルシフェラーゼの活性を、ウミシイタケルシフェラーゼの活性で割って、トランスフェクションの効率の変動について規準化し、味物質の濃度のｌｏｇ１０の関数としてプロットする。
【００８０】
細胞内カルシウムの測定：細胞内カルシウムの変化を、モデル味覚全細胞中で、カルシウム感受性色素（例えば、ＦＵＲＡ−２、Ｆｌｕｏ−３等）の蛍光の強度および放出の変化をモニターすることによって測定することができる。これらの色素は市販されている。手短にいうと、味覚受容体およびＲＧＳ２１を発現する細胞（例えば、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、味蕾細胞、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞等）を、９６ウエル・プレート中で、２４時間増殖させ、次いで、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．１％ＢＳＡを補ったＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）（Ｃａ＋＋緩衝液と呼ばれる）で２回すすぎ、１．０μＭ  ｆｕｒａ２−ＡＭを有する、１ｍｌの同一の緩衝液中、３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、培養物を、Ｃａ＋＋緩衝液で３回洗浄し、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下または非存在下で、各種の濃度の味物質の（例えば、スクロース、デナトニウム等）と共に、２０から３０秒間インキュベートしてから、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製蛍光プレートリーダー中で、蛍光応答（４８０ｎｍの励起および５３５ｎｍの放出）を平均化する。データを、化合物の添加前に測定したバックグランドの蛍光について補正し、次いで、カルシウム・イオノフォアであるイオノマイシン（１μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）に対する応答に対して規準化する。
【００８１】
別法として、細胞内カルシウムの放出の変化を、味覚受容体およびＲＧＳ２１を発現する細胞（例えば、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、味蕾細胞、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞等）に、カルシウム感受性蛍光タンパク質であるエクオリンをコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって測定することができる。エクオリンの蛍光放出は、基質であるセレンテラジンの存在下で、カルシウム結合時に増加する。エクオリンのカルシウムに対する親和性は、低いマイクロモルの範囲にあり、この酵素の活性は、生理的範囲のカルシウム濃度（５０ｎＭから５０μＭ）に比例する（Ｂｒｉｎｉら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９８９６−９９０３；Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２６：１２５９−１２６８）。
【００８２】
ホスホイノシチドの従来のアプローチによる測定：甘味物質は、モデル味覚細胞中で、酵素ＰＬＣ−β２の活性化をもたらす。この酵素は、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）を、セカンドメッセンジャーであるイノシトール三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とに切断する。放射性標識ホスホイノシチドの加水分解を、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して定量化することによって、ＰＩＰ２の変化をモニターすることができる（Ｐａｉｎｇら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１２９２−１３００）。味覚受容体およびＲＧＳ２１を発現する細胞（例えば、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、味蕾細胞、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞等）を、［３Ｈ］標識ミオ−Ｄ−イノシトールを用いて２４時間標識し、細胞の培地を、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および２０ｍＭ塩化リチウムで交換する。次いで、細胞を、種々の濃度の味物質（２〜３ｌｏｇ単位超）を用いて、３７℃で、最長３０分間刺激し、５０ｍＭギ酸を用いて、室温で４５分間抽出し、次いで、１５０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨで中和する。次いで、細胞抽出物を、アニオン交換ＡＧ  Ｉ−Ｘ８樹脂（１００〜２００メッシュのサイズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）カラム上に直接載せ、Ｈ２Ｏ、次いで５０ｍＭギ酸アンモニウムで洗浄し、１．２ｍＭギ酸アンモニウム、０．１ｍＭギ酸を用いて溶出する。このアッセイ中で溶出したイノシトール一、二および三リン酸を、シンチレーション測定によって定量化する。
【００８３】
別法として、上記のｃＡＭＰのＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイに類似する、ＩＰ３のａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して、ＩＰ３の産生を測定することができる。ＩＰ３のａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイは、細胞性のＩＰ３の能力を測定する。細胞性のＩＰ３は、甘味物質受容体のＰＬＣ−β２を介する活性化に応答して生成して、ＩＰ３結合タンパク質を含有する受容体ビーズに結合するビオチン化ＩＰ３ビーズと競合する。したがって、甘味物質の濃度が増加すると、ＩＰ３の細胞濃度が増加すると予想され、次いで、この濃度の増加から、ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎシグナルの用量依存性の減少を生じる。９６ウエル・プレート中で増殖させた味覚受容体およびＲＧＳ２１を発現する細胞（例えば、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、味蕾細胞、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞等）を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下または非存在下で、増加させた各濃度の味物質（例えば、スクロース、デナトニウム等）とともに３０秒間インキュベートする（ＰＢＳ／Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中）。次いで、細胞を、可溶化し、ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ試薬と共に、製造者の指示に従ってインキュベートして、蛍光シグナルを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製蛍光プレートリーダーで測定する。
【００８４】
Ｂ．タンパク質キナーゼ活性の、細胞に基づいたアッセイ
【００８５】
甘味物質受容体の活性化が、セリン／スレオニン・キナーゼであるＥＲＫ１および２を、Ｇｉシグナル伝達経路を介して活性化することが示されている（Ｏｚｅｃｋら，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４８９：１３９−４９）。ＥＲＫに加えて、Ａｋｔ等のセリン／スレオニン・キナーゼ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）チロシン・キナーゼ等の受容体型チロシン・キナーゼをはじめとする、多くのその他のキナーゼもまた、Ｇｉシグナル伝達経路を介して活性化される。多くのキナーゼの活性化における主要なステップは、キナーゼ自体のリン酸化であり、これを、実験的に決定することができる。例えば、ＥＲＫ１および２の活性化の程度を決定する最も一般的な方法は、免疫測定法または免疫ブロット法のいずれかによる、ＥＲＫのリン酸化された、したがって、活性化された形態に特異的な抗体の使用である。
【００８６】
したがって、甘味物質受容体の活性化の、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ａｋｔ、ＭＥＫおよびＥＧＦ−Ｒの活性に対する効果を測定するために、処理したモデル味覚細胞からの細胞抽出物を、リン酸化されたキナーゼに対する抗体を使用して、プレート免疫測定法中でまたは免疫ブロット法によってのいずれかで解析する。甘味物質を用いて処理されているモデル味覚細胞から調製した細胞抽出物中で検出されるリン酸化されたキナーゼの量は、甘味物質の濃度に直接比例する。したがって、この系はまた、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の甘味物質受容体の活性化に対する効果を、甘味物質および推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の両方を用いてモデル味覚細胞を処理し、次いで、得られた細胞抽出物中のリン酸化されたキナーゼの量を、リン酸化されたキナーゼに特異的な抗体を使用して検出することによって決定するのに有用でもある。
【００８７】
Ｃ．味覚受容体の局在化の変化の測定
【００８８】
β２−アドレナリン受容体、グルカゴン様ペプチド受容体およびＧＡＢＡ（Ｂ）受容体等、大部分のＧＰＣＲのアゴニストによる刺激は、エンドサイトーシスを介する、細胞内へのそれらの内在化を引き起こし（Ｍｏｏｒｅら，２００７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６９：４５１−４８２）、受容体の内在化は、受容体の活性化の尺度として広く使用されている。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の内在化を、多様な技術、例として、蛍光顕微鏡法に基づいた画像法、エンドソームの細胞下分画および細胞表面の受容体の特異的生化学的修飾(differential biochemical modification)（例えば、細胞表面のビオチン化、放射性ヨウ素を用いたヨウ素化等）を使用して測定することができる。
【００８９】
味覚受容体の局在化の蛍光顕微鏡法による測定：蛍光顕微鏡法に基づいた画像法アプローチの例として、Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３を、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、またはそのような蛍光タンパク質のうちのいくつかのスペクトル変異体（例えば、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質等））に融合させる。次いで、遺伝子改変したＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の受容体の対を、適切な哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨｅｐＧ２等）中で異種発現させる。これらの細胞を、顕微鏡用のスライドまたはカバーガラス上で増殖させ、次いで、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下または非存在下で、甘味物質を用いて、３７℃で０〜３時間刺激する。蛍光標識したＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の局在化を、生存細胞または固定細胞のいずれかの蛍光顕微鏡法を使用して決定する。未刺激の細胞中では、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は、細胞膜に主に局在化し、これは、多様な蛍光色素（例えば、ＦＭＩ−４３等）で標識することができる。甘味物質による刺激後は、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は、エンドソームに再分布し、これは、蛍光標識トランスフェリンで、生存細胞を１０〜３０分間インキュベートして標識することができる。
【００９０】
別法として、細胞表面のＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３のいずれかを、蛍光標識プローブ（例えば、抗体、リガンド等）で標識する。このアプローチは、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を異種発現する細胞またはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を天然に発現する細胞に適用することができる。この場合、細胞を、顕微鏡用のスライドまたはカバーガラス上で培養し、蛍光標識プローブと共に、４℃で０〜６０分間インキュベートする。次いで、細胞を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下または非存在下で、甘味物質と共に、３７℃まで、０〜３時間加温する。蛍光標識されたＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の局在化を、生存細胞または固定細胞のいずれかの蛍光顕微鏡法（例えば、落射蛍光、共焦点等）を使用して決定する。未刺激の細胞中では、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は、細胞膜に主に局在化し、これは、多様な蛍光色素（例えば、ＦＭＩ−４３等）で標識することができる。甘味物質による刺激後は、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は、エンドソームに再分布し、これは、蛍光標識トランスフェリンで、生存細胞を１０〜３０分間インキュベートして標識することができる。
【００９１】
味覚受容体の局在化の、細胞下分画による測定：一実施形態では、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のエンドソームへの局在化を、細胞下分画を使用して測定する。この場合、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を発現する細胞（例えば、異種発現または自然な発現）を、機械的なせん断によって破壊し、可能であれば、密度マトリックス（例えば、スクロース、フィコール等）の使用も併用して、高速および低速を組み合わせた遠心分離によって分離する。画分を、遠心チューブから収集し、Ｔ１Ｒ２タンパク質および／またはＴ１Ｒ３タンパク質の存在について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法によって解析する。
【００９２】
細胞表面の受容体の特異的化学的修飾による、味覚受容体の局在化の測定：一実施形態では、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の添加または未添加で、甘味物質と共にインキュベートする前（０時）および後（０〜３時間）の両方で、細胞表面のＴ１Ｒ２受容体／Ｔ１Ｒ３受容体を、細胞を透過しない化学薬剤（例えば、官能性をもたせたビオチン架橋剤、放射性ヨウ素化、標識された甘味物質等）を用いて直接標識する。Ｔ１Ｒ２受容体／Ｔ１Ｒ３受容体を、免疫沈降法等の技術により単離し、標識された味覚受容体の存在量について解析する。休止細胞中では、味覚受容体は、細胞表面に主に存在し、したがって、これらの細胞は、最大存在量の標識された表面の味覚受容体を含有することが予想される。甘味物質による刺激時の味覚受容体の内在化により、細胞表面の味覚受容体の量が減少し、休止細胞（０時）から得たシグナルと、甘味物質を用いて処理した細胞から得たシグナルとの間の差が、受容体の内在化の尺度を提供する。
【００９３】
蛍光標識β−アレスチンの細胞膜への移行のモニター：大部分のＧＰＣＲは、脱感作し、細胞内シグナル伝達をさらに刺激することができない（Ｍｏｏｒｅら，２００７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６９：４５１−４８２）。２つの主なステップ、すなわち、受容体のリン酸化、および多機能性足場タンパク質であるβ−アレスチンとの結合が、ＧＰＣＲの脱感作を促進する。休止細胞においては、β−アレスチンは、細胞の細胞質に主に存在するが、アゴニストによる刺激の数分以内に、細胞膜に移行して、リン酸化されたＧＰＣＲと結合する。β−アレスチンの細胞膜へのこの移行を、蛍光標識β−アレスチン（例えば、β−アレスチン−ＧＦＰのキメラタンパク質）を発現する細胞中で、可視化することができる。一実施形態では、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３を発現する細胞（例えば、これらの味覚受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞、培養した味蕾細胞、培養したヒトＴｕＨｕ−８０腸内分泌細胞等）に、β−アレスチン−ＧＦＰをコードするプラスミドを安定にトランスフェクトする。そのような細胞を、顕微鏡用のスライドまたはカバーガラス上で増殖させ、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下または非存在下で、甘味物質を用いて、０〜３時間刺激する。β−アレスチンの局在化を、生存細胞または固定細胞中で、蛍光顕微鏡法を使用して決定する。β−アレスチン−ＧＦＰの細胞質から細胞膜への移行が、甘味物質受容体の活性化の尺度として使用される。
【００９４】
Ｄ．神経伝達物質および神経ペプチドの放出の測定
【００９５】
味覚細胞および、腸内分泌細胞等のその他の細胞型が、味物質に応答して、ＡＴＰに加えて、ＧＬＰ−１、ＣＣＫ、ＰＹＹおよびセロトニンをはじめとする、神経ペプチドを放出することが実証されている。ＡＴＰの分泌は、ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光アッセイ系を使用して定量化する。神経ペプチドの分泌は、ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡの競合アプローチを使用して定量化し、以下に、例として、ＧＬＰ−１について記載する。
【００９６】
ＡＴＰの分泌の測定：味覚細胞シグナル伝達の最終的かつ最も重要なステップは、神経伝達物質の放出であり、これは、求心性神経線維をさらに刺激する。Ｋｉｎｎａｍｏｎらは、ＡＴＰが、決定的な「神経伝達物質」であり、これは、味覚細胞から分泌され、神経線維上の特異的なプリン作動性のＡＴＰに結合する受容体と相互作用することを示している（Ｆｉｎｇｅｒら，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１４９５−９９）。味覚受容体およびＲＧＳ２１を発現する細胞（例えば、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、味蕾細胞、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞等）を、９６ウエル・プレート中で増殖させ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中ですすぎ、同一の緩衝液中で、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下および非存在下で、種々の濃度の味物質（２〜３ｌｏｇ単位超）を用いて、３７℃で０〜３０分間刺激する。刺激した細胞の培地の試料を収集し、ＡＴＰの濃度を、市販のＡＴＰのための発光アッセイ（例えば、ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を使用して決定する。
【００９７】
消化管ペプチドの分泌の測定：ＨｕＴｕ−８０細胞等の腸内分泌細胞は、味覚受容体の刺激に応答して、消化管ペプチド（例えば、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、胃インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）等）を分泌することが知られている（Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ、２００６、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９１：Ｇ１７１−Ｇ１７７）。ＧＩペプチドのＨｕＴｕ−８０細胞からの分泌を測定するために、競合的なＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを使用することができる。例として、ＧＬＰ−１の分泌を、市販の競合的酵素免疫測定法（例えば、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）を使用して測定することができる。手短にいうと、ＨｕＴｕ−８０細胞を、マルチウエル・ディッシュ（例えば、６ウエル、１２ウエル等）中で増殖させ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中ですすぎ、同一の緩衝液中で、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下および非存在下で、種々の濃度の味物質（２〜３ｌｏｇ単位超）を用いて、３７℃で０〜３０分間刺激する。刺激したＨｕＴｕ−８０細胞の培地の試料を、収集して、ヤギ抗ＧＬＰ−１抗体でコートした９６ウエル・プレートに、ビオチン化ＧＬＰ−１標準物質およびウサギ抗ＧＬＰ−１抗体と一緒に添加する。プレートを、暗所、４℃で、一晩、１６〜１８時間インキュベートする。ウエルを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４ですすぎ、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共に、暗所、室温で、１時間インキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰを除去した後、ＰＢＳ、ｐＨ７．４ですすぎ、ｏ−フェニレンジアミン塩酸塩の基質溶液を添加して、反応を、暗所、室温で、３０分間展開する。反応を停止させ、ウエルの光学的吸収を４９２ｎｍで測定する。分泌されたＧＬＰ−１の量は、組換えＧＬＰ−１の既知の量を用いて平行して求めた標準曲線との比較によって決定する。
【実施例４】
【００９８】
ＲＧＳ２１の活性を、ＲＧＳ２１のタンパク質対タンパク質の相互作用を破壊することによって調節する化合物を同定するための、細胞に基づいたアッセイの使用
味覚受容体、Ｇαタンパク質およびβγタンパク質の相互作用の、ＦＲＥＴを使用した測定：タンパク質対タンパク質の相互作用を、生存細胞中で、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のアプローチを使用してモニターすることができる。ＦＲＥＴの基礎は、適切なＦＲＥＴの供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォア（例えば、ＹＦＰおよびＣＦＰ）を含有する、２つのタンパク質が、相互に結合するか、または相互に１０〜１００Å以内に存在する場合、フルオロフォア間に照射性のエネルギー転移が存在し、それによって、供与体フルオロフォア（例えば、ＣＦＰ）からの放出エネルギーが、受容体フルオロフォア（例えば、ＹＦＰ）を励起させる。その結果として、供与体フルオロフォア（例えば、ＣＦＰ）による励起に応答した受容体フルオロフォア（例えば、ＹＦＰ）からの蛍光放出が観察される。したがって、正のＦＲＥＴシグナルは、２つのタンパク質間の密接な相互作用を示す。ＲＧＳ２１は、活性化されたＧαタンパク質と相互作用して、ＧＴＰの加水分解を促進するはずであることから、ＦＲＥＴを使用して、ＲＧＳ２１とＧαの活性型との間の相互作用をモニターすることができる。
【００９９】
一実施形態では、それぞれがＦＲＥＴ解析のための適切なフルオロフォアを有する、タンパク質の相互作用パートナーの対（例えば、Ｇα−ＹＦＰ＋ＲＧＳ２１−ＧＦＰ等）を、適切な細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、Ｓｆ９昆虫細胞、酵母等）中で同時発現させる。当技術分野で既知の標準的な分子生物学の方法を使用して、キメラタンパク質を生み出し、それによって、ＹＦＰをＧαガストデューシンに融合させ、ＣＦＰをＲＧＳ２１に融合させて、これらのキメラタンパク質を、適切なタンパク質発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１等）内にクローン化する。タンパク質の対を、宿主細胞内に安定にトランスフェクトする。Ｇαガストデューシン−ＹＦＰ＋ＲＧＳ２１−ＣＦＰの場合、休止細胞は、低いＦＲＥＴシグナルを示すことが予想される。これは、Ｇα−ガストデューシンは、ＧＤＰ結合状態にあり、したがって、ＲＧＳ２１との結合ではなく、Ｇβ３Ｇγ１３との結合を形成するはずであるからである。味物質またはＡｌＦ４−のいずれかを用いて刺激した細胞は、ＦＲＥＴシグナルの増加を示すことが予想される。
【０１００】
Ｇαガストデューシン−ＹＦＰ＋Ｇβ３−ＣＦＰ＋Ｇγ１３を、顕微鏡用スライドまたはマルチウエル・ディシュ上で増殖させ、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物と共に、３７℃で、少なくとも１０分間あらかじめインキュベートする。次いで、細胞を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物の存在下および非存在下で、３０μＭ  ＡｌＣｌ３および１０ｍＭ  ＮａＦ（ＡｌＦ４−）、または種々の濃度の味物質（２〜３ｌｏｇ単位超）を用いて刺激する。単一細胞の解析のために、生存細胞を、ＦＲＥＴを測定するのに適切な光学フィルターを備える蛍光顕微鏡中で試験し、ＦＲＥＴが生成した蛍光シグナルを、適切な画像解析ソフトウエアによってコントロールされている冷却ＣＣＤカメラを用いて測定することによって、ＦＲＥＴシグナルを定量化する。中から高のスループットの化合物スクリーニングのためには、マルチウエル・ディッシュ（例えば、９６ウエル等）中で増殖させた細胞を、蛍光プレートリーダー中で解析する。
【０１０１】
味覚受容体、Ｇαタンパク質およびβγタンパク質の相互作用の、酵母の２ハイブリッドアッセイ中での測定：別の実施形態では、ＧαガストデューシンとＧβ１３γ１３との相互作用を、酵母細胞中で、酵母の２ハイブリッドアッセイを使用して測定することができる（Ｙｏｕｎｇら，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３８９：２７７−３０１）。一実施例では、通常であれば、酵母のＧαサブユニットであるＧｐａ１を不活性化する、内因性の酵母のＲＧＳタンパク質であるＳｓｔ２を欠く、酵母の菌株（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内に、ＲＧＳ２１のｃＤＮＡを挿入する。この菌株の酵母はまた、当技術分野では周知の分子生物学の技術を使用することにより、ＦＵＳ１プロモーターのコントロール下にあるウミシイタケルシフェラーゼのレポーター遺伝子を発現するように工学的に作製されている。この系では、酵母フェロモンシグナル伝達経路の、酵母α因子受容体であるＧＰＣＲを介しての活性化が、シグナル伝達経路の刺激をもたらし、これは、ＦＵＳ１が促進するルシフェラーゼタンパク質の発現を促進する。Ｓｓｔ２を欠失する親株との比較により、フェロモンによる刺激時に親株中では観察されたルシフェラーゼ活性化抑制の解除を鈍らせる、ＲＧＳ２１が与えた抑制のレベルを示す。したがって、ＲＧＳ２１およびＦＵＳ１−ルシフェラーゼのＤＮＡコンストラクトを発現する細胞を、推定上のＲＧＳ２１の調節化合物（例えば、化学物質ライブラリー、天然産物ライブラリー等）と共にインキュベートし、次いで、アルファ因子フェロモンを用いて刺激する。ＲＧＳ２１の阻害剤は、フェロモンによるルシフェラーゼの誘発の阻害を軽減することが予想される。
【０１０２】
別の実施形態では、ＲＧＳ２１を、Ｇａ１４転写活性化ドメインに融合させ、Ｇαガストデューシンの恒常的に活性な変異体（Ｑ２０４Ｌ）を、Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。これらのＤＮＡコンストラクトを、発現が基本プロモーターおよびいくつかの上流のＧａ１４結合部位によってコントロールされるレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ等）を発現する酵母の菌株内に安定に組み込む。ＧαガストデューシンＱ２０４Ｌは、ＲＧＳ２１と恒常的な結合を形成し、したがって、高レベルのレポーター遺伝子の活性を得ることが予想される。したがって、レポーター遺伝子の活性を低下させる任意の化合物は、ＲＧＳ２１の阻害剤であることが予想される。
【実施例５】
【０１０３】
ヒトの味覚テストにおけるＲＧＳ２１の調節化合物の効果の検証
試験味物質（例えば、甘味物質、風味物質または苦味物質）自体で認識された強度を、試験味物質とＲＧＳ２１の調節化合物とを組み合わせて認識された強度と比較する。ＲＧＳ２１の増強物質の候補は、試験味物質の認識される強度を減少させ、一方、ＲＧＳ２１阻害剤は、試験味物質の認識される強度を増強させることが予想される。ある特定の実施形態では、一連の査定者を使用して、試験味物質溶液の強度を測定する。手短にいうと、一連の査定者（一般に、８〜１２人）を訓練して、味覚強度の認識を評価させ、強度を、試料を最初に口に入れた時から、試料を吐き出す３分後までのいくつかの時点で測定する。統計的解析を使用して、結果を、添加物を含有する試料と、添加物を含有しない試料との間で比較する。試料が口から除去された後に測定した時点のスコアの減少は、味物質の認識の低下が存在していることを示す。
【０１０４】
一連の査定者を、当技術分野で周知の手順を使用して訓練することができる。ある特定の実施形態では、一連の査定者を、ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄ（Ｍｅｉｌｇａａｒｄら，Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第３版，第１１章）を使用して訓練することができる。望ましくは、訓練の焦点は、基本の味；具体的には、甘味、塩味、酸味、うま味および苦味の認識および測定でなければならない。結果の正確さおよび再現性を確保するために、各査定者は、味物質の強度の測定を、１つの試料あたり、約３回から約５回まで繰り返す必要があり、少なくとも５分間の休憩を、繰り返す度および／または試料の度にとり、水で十分にすすいで口をきれいにする。
【０１０５】
一般に、味物質の強度を測定する方法は、１０ｍＬの試料を口に入れるステップと、試料を口の中に５秒間保ち、試料を口の中で穏やかに回すステップとを含む。認識された味物質の強度を、５秒後にランク付けし、試料を吐き出し（試料を吐き出した後には飲み込まない）、口を一口分の水ですすぎ（例えば、うがい液のときのように水を口の中で激しく動かす）、すすぎ水は吐き出す。認識された味物質の強度を、すすぎ水を吐き出した直後に、４５秒後待って、およびこの４５秒の間にランク付けし、認識された味覚の最大強度の時を同定し、その時点でのこの強度をランク付けする（口を普通に動かし、必要であれば、飲み込む）。試料間では、５分間の休憩をとり、水で十分にすすいで口をきれいにする。
【０１０６】
付録
ＲＧＳ２１のヌクレオチド配列（配列番号１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１０３９１５２）
【化１】
2009544330.tif 000003
ＲＧＳ２１のアミノ酸配列（配列番号２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１０３４２４１）
【化２】
2009544330.tif 000004
【図１】
2009544330.tif 000005
【図３】
2009544330.tif 000006
【図４】
2009544330.tif 000007
【図２】
2009544330.tif 000008
【国際調査報告】
2009544330.tif 000009