(57)【要約】  本発明は、味覚シグナル伝達に有用な味覚受容体ならびに関連の細胞性タンパク質および／または分子を天然にまたは組換えにより発現するモデル味覚細胞を提供する。さらに、本発明は、甘味および／またはその他の味覚のシグナル伝達を調節する化合物についてスクリーニングするための、これらのモデル味覚細胞に関する使用方法も提供する。また、モデル味覚細胞を使用して同定した化合物／調節物質を含む組成物も提供する。好ましい実施形態では、モデル味覚細胞は、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞、およびそれに由来する細胞に由来する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞またはそれに由来する細胞に由来するモデル味覚細胞であって、味覚シグナル伝達に有用な１種または複数のシグナル伝達タンパク質を天然にまたは組換えにより発現し、味覚細胞の機能性を示すモデル味覚細胞。
【請求項２】
前記シグナル伝達タンパク質が、甘味物質受容体、そのヘテロ−もしくはホモ−オリゴマー、またはそれらの組合せを含む味覚受容体である、請求項１に記載のモデル味覚細胞。
【請求項３】
前記甘味物質受容体が、ヘテロ−オリゴマー性Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味物質受容体である、請求項２に記載のモデル味覚細胞。
【請求項４】
前記甘味物質受容体が、ホモ−オリゴマー性Ｔ１Ｒ３／Ｔ１Ｒ３またはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ２甘味物質受容体である、請求項２に記載のモデル味覚細胞。
【請求項５】
前記甘味物質受容体が、Ｔ１Ｒ３甘味物質受容体である、請求項２に記載のモデル味覚細胞。
【請求項６】
前記シグナル伝達タンパク質が、味覚受容体タンパク質、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質、またはエフェクターからなる群から選択される全てのタンパク質を含み、前記タンパク質が、味覚シグナル伝達に必要である、請求項１に記載のモデル味覚細胞。
【請求項７】
前記味覚シグナル伝達が、甘味シグナル伝達である、請求項１に記載のモデル味覚細胞。
【請求項８】
前記味覚シグナル伝達が、苦味シグナル伝達である、請求項１に記載のモデル味覚細胞。
【請求項９】
前記味覚シグナル伝達が、うま味シグナル伝達である、請求項１に記載のモデル味覚細胞。
【請求項１０】
前記ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞が、前記ＨｕＴｕ−８０細胞に由来するサブクローン化または改変細胞を含む、請求項１に記載のモデル味覚細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のモデル味覚細胞を使用して、味覚シグナル伝達を調節する化合物についてスクリーニングするための方法であって、
ａ）請求項１に記載のモデル味覚細胞から、味覚シグナル伝達に有用な１種または複数の対象とするタンパク質を単離および精製するステップと、
ｂ）細胞に基づいた多様なアッセイを使用して、対象とする精製したタンパク質に対するか、または味覚シグナル伝達経路中のその他のタンパク質と対象とする精製したタンパク質の相互作用に対する試験化合物の効果を決定するステップと、
ｃ）前記細胞に基づいたアッセイに基づいて、対象とする精製したタンパク質を、または味覚シグナル伝達経路中のその他のタンパク質と対象とする精製したタンパク質の相互作用を調節する試験化合物を同定するステップと、
ｄ）前記モデル味覚細胞中での味覚シグナル伝達の調節において、化合物を検証するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、味覚受容体、Ｇタンパク質、ＲＧＳタンパク質、エフェクターおよび味覚に関する任意の細胞機構からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、Ｔ１Ｒ受容体ファミリー、そのホモ−またはヘテロ−オリゴマーを含む甘味物質受容体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、Ｇαｉタンパク質、α−ガストデューシン、Ｇαｉ２およびその他からなる群から選択されるＧαタンパク質を含むＧタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、ＧＡＩＰ、ＲＧＳｚ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９、ＲＧＳ１１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ１７、ＲＧＳ２１、Ｄ−ＡＫＡＰ１、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦ、ＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦ、ｂＲＥＴ−ＲＧＳ、ＡｘｉｎまたはｍＣＯＮＤＵＣＴＩＮを含むＲＧＳタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記エフェクターが、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、カルシウム（Ｃａ２＋）およびその他のセカンドメッセンジャーからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記効果が、前記モデル味覚細胞中での、カルシウム（Ｃａ２＋）の放出を測定するためのアッセイ、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＰＩＰ２／ＩＰ３またはその他のセカンドメッセンジャーに関するアッセイ、ＧＩペプチドの分泌を測定するためのアッセイおよび神経伝達物質の分泌を測定するためのアッセイからなる群から選択される細胞に基づいたアッセイの観察を通して決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験化合物が、前記モデル味覚細胞中で、味の官能試験を使用してさらに検証される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
甘味を増強するための複数の化合物についてスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１に記載のモデル味覚細胞を提供するステップであって、モデル味覚細胞が、甘味物質受容体および甘味物質シグナル伝達に必要な１種もしくは複数のその他のタンパク質または関連の細胞分子を、天然に発現するステップと、
ｂ）前記モデル味覚細胞を、甘味物質と、単独でまたは試験化合物と組み合わせて接触させるステップと、
ｃ）ｉ）細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、カルシウム、ホスホイノシチド）の変化、
ｉｉ）タンパク質キナーゼ活性（例えば、ＥＲＫ、ＰＫＣ、Ｓｒｃ、ＥＧＦＲ等）の変化、
ｉｉｉ）モデル味覚細胞のＧＩペプチドの分泌の変化、および
ｉｖ）モデル味覚細胞による神経伝達物質の分泌の変化
のうちの１種または複数をモニターするための細胞に基づいたアッセイを使用して、前記モデル味覚細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップと、
ｄ）上記３）に記載した変化をもたらす化合物を同定するステップと、
ｅ）前記モデル味覚細胞中での甘味物質による甘味の増強について、ヒトによる味の官能試験において、同定した化合物の効力を検証するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記甘味物質が、炭水化物の甘味物質、合成の強力な甘味物質、天然の強力な甘味物質、ポリオールおよびアミノ酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
甘味を増強するための複数の化合物についてスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１に記載のモデル味覚細胞を提供するステップであって、前記モデル味覚細胞が、ＲＧＳタンパク質および甘味物質シグナル伝達に必要な１種または複数のその他のタンパク質を天然に発現するステップと、
ｂ）ＲＧＳタンパク質活性を阻害する化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）を同定するステップと、
ｃ）甘味物質単独でおよび化合物（ＲＧＳタンパク質の阻害剤）と組み合わせての、甘味物質受容体によって活性化された甘味シグナル伝達を決定するステップと、
ｄ）前記甘味物質の甘味シグナル伝達を増加させる化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）を同定するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳ２１タンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
味覚を調節するための複数の化合物についてスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１に記載のモデル味覚細胞を提供するステップであって、モデル味覚細胞が、対象とする味覚受容体および味覚シグナル伝達に必要な１種もしくは複数のその他のタンパク質または関連の細胞分子を天然に発現するステップと、
ｂ）前記モデル味覚細胞を、味物質と、単独でまたは試験化合物と組み合わせて接触させるステップと、
ｃ）ｉ）細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、カルシウム、ホスホイノシチド）の変化、
ｉｉ）タンパク質キナーゼ活性（例えば、ＥＲＫ、ＰＫＣ、Ｓｒｃ、ＥＧＦＲ等）の変化、
ｉｉｉ）モデル味覚細胞のＧＩペプチドの分泌の変化、または
ｉｖ）前記モデル味覚細胞による神経伝達物質の分泌の変化
のうちの１種または複数をモニターするための細胞に基づいたアッセイを使用して、前記モデル味覚細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップと、
ｄ）上記３）に記載した変化をもたらす化合物を同定するステップと、
ｅ）前記モデル味覚細胞中での前記味物質による味覚の調節について、ヒトによる味の官能試験において、同定した化合物の効力を検証するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全内容が参照によって本明細書に組み込まれている、２００６年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／８２０４９０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、１種または複数のシグナル伝達タンパク質および味覚シグナル伝達に必要な関連の細胞機構を内因性および／または天然に発現する細胞、ならびに味覚シグナル伝達を調節する化合物／調節物質の同定にこれらの細胞を使用するための方法に関する。具体的には、本発明は、味覚調節化合物を同定するために、味覚受容体および関連の細胞シグナル伝達機構を天然に発現するＨｕＴｕ−８０ヒト腸内分泌細胞およびそれに由来する細胞を使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
味覚細胞は、舌表面上の味蕾の中に集まっている（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，１９９６，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：７１８−６６）。ＧＰＣＲの２つのファミリー、すなわち、甘味およびうまみ味を媒介するＧＰＣＲのＴ１Ｒファミリー、ならびに苦味を媒介するＧＰＣＲのＴ２Ｒファミリーが、味覚細胞中で同定されている（Ｎｅｌｓｏｎら，２００１，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−９０；Ｎｅｌｓｏｎら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：１９９−２０２；Ｌｉら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：４６９２−９６；Ｚｈａｏら，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２５５−６６；Ａｄｌｅｒら．，２０００，Ｃｅｌｌ  １００：６９３−７０２；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，２０００，Ｃｅｌｌ  １００：７０３−１１；Ｂｕｆｅら，２００２，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２：３９７−４０１）。これらの受容体の全ての下流へのシグナル伝達は、甘味、うま味および苦味の伝達の主要なエフェクター酵素であるホスホリパーゼＣサブタイプβ２（ＰＬＣβ２）、ならびにｔｒｐチャネルサブタイプｍ５（ＴＲＰＭ５）に依存することが示されている（Ｚｈａｎｇら．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１２：２９３−３０１）。
【０００４】
味覚は、苦味、塩味、酸味、甘味およびうま味（すなわち、グルタミン酸の塩に対する応答）の５つの主要な味覚に分けることができる。異なる味覚の様式が、異なる機構によって機能すると思われる。例えば、甘味は、サブユニットであるＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３とのヘテロ二量体であるＧタンパク質共役Ｔ１Ｒ受容体を介して媒介されると思われる。苦味は、１種または複数のＧタンパク質共役Ｔ２Ｒ受容体によって媒介されると思われる。さらに、うま味は、Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ３とのヘテロ二量体（Ｚｈａｏら，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，２５５−２６６）、およびおそらくｍＧｌｕＲ４として知られる代謝調節型のグルタミン酸受容体の改変体（ＣｈａｕｄｈａｒｉおよびＲｏｐｅｒ，１９９，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５５，３９８−４０６）によっても媒介されると思われる。
【０００５】
ガストデューシンは、味選択的Ｇタンパク質である（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３５７，５６３−６９）。ガストデューシンの活性化は、細胞内反応のカスケード、すなわち、ホスホジエステラーゼの活性化；３’，５’−環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および３’，５’−環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の分解；ならびに細胞の脱分極に至る、環状ヌクレオチド依存性カチオンチャネルの閉鎖を引き起こす。ガストデューシンは、トランスデューシンに対して約８０％〜９０％相同である。トランスデューシンもまた、免疫細胞化学的には味蕾に局在化し、味特異的ＰＤＥ活性の活性化による味覚シグナル伝達に関係があるとされている（Ｒｕｉｚ−Ａｖｉｌａら，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，８０−８５）。ガストデューシンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける苦い化合物および甘い化合物に応答した伝達に関係があるとされている（Ｗｏｎｇら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８１，７９６−８００）。
【０００６】
甘い物質および／苦い物質を検出するために味覚系が選択されている（ＨｅｒｎｅｓｓおよびＧｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，１９９９，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６１：８７３−９００；ＨｏｅｆｅｒおよびＤｒｅｎｃｋｈａｈｎ，１９９８，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１０：３０３−３０９）。舌以外では、また、ガストデューシンのαサブユニット（Ｇαｇｕｓｔ）の発現が、胃細胞（Ｈｏｅｆｅｒら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：６６３１−３４；Ｗｕら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：２３９２−９７）および膵臓細胞（ＨｏｅｆｅｒおよびＤｒｅｎｃｋｈａｈｎ，１９９８，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１０：３０３−３０９）にも局在化しており、これは、味を感知する機構が胃腸管中にもまた存在することを示唆する（Ｗｕら，２００５，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２２：１３９−１４９；Ｗｕら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：２３９２−９７）。
【０００７】
種々の味覚受容体が、ＳＴＣ細胞系およびＮＣＩ細胞系等の腸内分泌細胞系中に見い出されている。例えば、ＵＣＬＡの研究者らは、細胞内味覚シグナル伝達に関係があるとされる一連のＴ２Ｒ受容体、ならびにＧタンパク質のアルファサブユニット、すなわちＧαｇｕｓｔおよびＧαｔ−２を均一に発現する誘導体化ＳＴＣ−１系を、単一細胞クローン化を介して単離および同定し、誘導体化ＳＴＣ−１系を使用して、Ｔ２Ｒ受容体を活性化して食欲を調節することができる化合物について、アッセイすることができることを示唆する（ＷＯ０３０３１６０４、また、ＵＣＬＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｆｏｒ  Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ：ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＧＡＳＴＲＯＩＮＴＥＳＴＩＮＡＬ  ＣＨＥＭＳＥＮＳＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＩＮ  ＤＥＲＩＶＡＴＩＺＥＤ  ＭＯＵＳＥ  ＳＴＣ−１  ＣＥＬＬ  ＬＩＮＥＳも参照）。また、ヒト腸内分泌細胞系ＮＣＩ−Ｈ７１６も、１種または複数の味覚シグナル伝達タンパク質を含有することが実証されており、これは、味覚に関する味覚調節物質をスクリーニングおよび同定するために使用されている（米国特許出願公開第２００５／０２４４８１０号、第２００５／０１７７８８６号）。さらに、ＨｕＴｕ−８０細胞もまた、α−ガストデューシン、いくつかの胃ペプチドホルモン、多数のＴ２Ｒ苦味受容体およびＴ１Ｒ３受容体のみを発現することが報告されている（Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔら，２００６，Ａｍ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９１：Ｇ７９２−８０２）。しかし、Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔらは、ＨｕＴｕ−８０細胞が、Ｔ１Ｒ２甘味受容体を発現することを示すこと、およびＨｕＴｕ−８０が任意の甘味物質に応答することを支持する何らかのデータを提供することはできなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
過去１０年にわたり、味覚受容体と相互作用して、天然の味覚刺激物質を模倣または遮断する種々の薬剤の開発に相当な努力が払われている（Ｃａｇａｎ，１９８９，Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｔａｓｔｅ，第４章，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）。しかし、４つの基本的な味を模倣または遮断する新しい薬剤の開発は、味覚の様式の伝達に関与する味覚細胞タンパク質の知識不足によって制限されている。当技術分野においては、味覚の検出および／もしくは伝達に関与するかまたはそれに影響を及ぼす新しい製品および方法が引き続き求められている。味覚の検出および伝達を研究するためのヒトのモデル実験系を見い出すことにより、味覚の分子生物学および生化学の我々の理解に役立つはずである。そのようなモデル系は、新規の甘味物質、望ましい風味の増強物質、または望ましくない風味の遮断物質についてスクリーニングするのに有用となるはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、味覚シグナル伝達に関する化合物および／または調節物質を同定する高スループットスクリーニングアッセイ中で使用するための、味覚受容体ならびに関連シグナル伝達タンパク質および関連の細胞機構を内因性および／または天然に発現する、味を感知する細胞の代替の豊富な供給源（「モデル味覚細胞」）を提供する。１つの好ましい実施形態では、本発明は、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞に由来するモデル味覚細胞、好ましくは、ＨｕＴｕ−８０親細胞系（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−４０（商標））、より好ましくは、ＨｕＴｕ−８０親細胞（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−４０（商標））に由来する強化された甘味感受性のサブクローン化細胞系および／または改変細胞系を提供する。ＨｕＴｕ−８０細胞、ならびに本発明の任意の強化されたサブクローン化細胞および／または改変細胞は、何らかの味覚細胞の機能性を示し、味覚シグナル伝達に必要な、内因性および／または天然に発現した１種または複数のシグナル伝達タンパク質、関連の細胞機構を含む。
【００１０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、内因性および／または天然に発現した甘味物質受容体および／またはそのホモ−もしくはヘテロ−オリゴマー、ならびに甘味シグナル伝達のための１種または複数のその他のタンパク質および関連の細胞機構を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、内因性および／または天然に発現したうま味受容体または苦味受容体を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、天然に発現したＧタンパク質、例として、Ｇαタンパク質を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、天然に発現したＧタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ、ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、天然に発現した、味覚シグナル伝達のためのエフェクターを含む。さらに、本発明は、ヒトＨｕＴｕ−８０内分泌細胞およびそれに由来する細胞からの、モデル味覚細胞を生成する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、味覚シグナル伝達を調節するための化合物および／または調節物質を同定するために、ＨｕＴｕ−８０内分泌細胞およびそれに由来する細胞からの、モデル味覚細胞を使用するための方法も提供する。１つの好ましい実施形態では、本発明は、本発明のモデル味覚細胞を使用して、味覚シグナル伝達を調節する複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法はまた、本発明のモデル味覚細胞から、味覚シグナル伝達に必要な１種または複数の対象とするタンパク質を単離および精製するステップを含んでもよい。この方法はさらに、細胞に基づいた多様なアッセイを使用して、味覚シグナル伝達における、対象とする精製したタンパク質に対するか、またはその他のタンパク質および／または関連の細胞機構と対象とする精製したタンパク質の相互作用に対する試験化合物の効果を決定するステップと；前記細胞に基づいたアッセイに基づいて、味覚シグナル伝達において、対象とする精製したタンパク質を調節するか、またはその他のタンパク質および関連の細胞機構と対象とする精製したタンパク質の相互作用を調節する、試験化合物を同定するステップと；モデル味覚細胞中での味覚シグナル伝達の調節において当該化合物を検証するステップとを含む。
【００１２】
１つの好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞から単離および精製した対象とするタンパク質は、１種または複数の味覚受容体（例えば、Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３）、Ｇタンパク質、ＲＧＳタンパク質、エフェクター、および／または味覚シグナル伝達に有用なさらなる関連の細胞機構を含む。さらに別の好ましい実施形態では、対象とするタンパク質は、甘味受容体およびそのホモ−もしくはヘテロ−オリゴマー；苦味受容体およびそのホモ−もしくはヘテロ−オリゴマー；またはうま味受容体を含む味覚受容体である。さらに別の好ましい実施形態では、対象とするタンパク質は、Ｇαｉタンパク質、α−ガストデューシン、Ｇαｉ２およびその他からなる群から選択されるＧαタンパク質を含むＧタンパク質である。さらに別の好ましい実施形態では、対象とするタンパク質は、ＧＡＩＰ、ＲＧＳｚ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９、ＲＧＳ１１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ１７、ＲＧＳ２１、Ｄ−ＡＫＡＰ１、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦ、ＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦ、ｂＲＥＴ−ＲＧＳ、ＡｘｉｎおよびｍＣＯＮＤＵＣＴＩＮを含むＲＧＳタンパク質である。さらに別の好ましい実施形態では、対象とするタンパク質は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、カルシウム（Ｃａ２＋）およびその他のセカンドメッセンジャーを含むエフェクターである。
【００１３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、甘味の増強について複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、１）本発明のモデル味覚細胞を提供するステップであって、味覚細胞が、味覚受容体、ならびに味覚シグナル伝達に必要な１種もしくは複数のその他のタンパク質および／または関連の細胞機構を内因性および／または天然に発現するステップと；２）モデル味覚細胞を、味物質と、単独でまたは試験化合物と組み合わせて接触させるステップと；３）ａ）細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、カルシウム、ホスホイノシチド）の変化、ｂ）タンパク質キナーゼ活性（例えば、ＥＲＫ、ＰＫＣ、Ｓｒｃ、ＥＧＦＲ等）の変化、ｃ）消化管ペプチド（例えば、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、胃のインスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）等）の分泌の変化、およびｄ）モデル味覚細胞による神経伝達物質の分泌の変化のうちの１種または複数をモニターするための細胞に基づいたアッセイを使用して、モデル味覚細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップと；４）上記３）に記載した変化をもたらす化合物を同定するステップと；５）味物質による味覚の増強について、ヒトによる味の官能試験において、同定した化合物の効力を検証するステップとを含む。本明細書で使用する場合、味物質は、甘味物質、苦味物質およびその他の味覚調節物質を包含する。本明細書で使用する場合、甘味物質として、これらに限定されないが、炭水化物の甘味物質、合成の強力な甘味物質、天然の強力な甘味物質、ポリオールおよびアミノ酸が挙げられる。
【００１４】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒトの味覚を増強するための複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は：本発明のモデル味覚細胞を提供するステップであって、味覚細胞が、ＲＧＳタンパク質、ならびにＧαタンパク質等の味覚シグナル伝達に必要な１種もしくは複数のその他のタンパク質および／または関連の細胞機構を天然に発現するステップと；ＲＧＳタンパク質活性を阻害する化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）を同定するステップと；味物質単独でおよび化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）と組み合わせて、味覚受容体によって活性化された味覚シグナルを決定するステップと；前記味物質の味覚シグナル伝達を増加させる化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）を同定するステップとを含む。１つの好ましい実施形態では、ＲＧＳタンパク質は、ＲＧＳ２１タンパク質である。
【００１５】
さらに、本発明は、ヒトの甘味、ならびにうま味および苦味について、本発明のモデル味覚細胞を使用して同定した化合物および／または調節物質の効果を検証する方法も提供する。１つの好ましい実施形態では、本発明は、試験甘味物質自体を味見して認識された甘さと、試験甘味物質と同定した調節化合物とを組み合わせて味見して認識された甘さとの比較を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、モデル味覚細胞を提供し、甘味シグナル伝達ならびにうま味および苦味のシグナル伝達の調節物質のスクリーニングおよび同定にこれらの細胞を使用するための方法を提供する。本発明のモデル味覚細胞は、ヒトＨｕＴｕ−８０内分泌細胞、ならびにこれらの細胞に由来する任意のサブクローンおよび／または改変細胞を含む。
【００１７】
また、本発明は、モデル味覚細胞、ならびにヒトＨｕＴｕ−８０内分泌細胞（全内容が参照によって本明細書に組み込まれている、Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔら，２００６，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９１：７９２−８０２）および／またはそれに由来する細胞からのモデル味覚細胞を生成する方法も提供する。さらに、本発明は、甘味シグナル伝達、うま味シグナル伝達および苦味シグナル伝達をはじめとする、味覚シグナル伝達を調製するための化合物のスクリーニングおよび同定にこれらのモデル味覚細胞を使用する方法も提供する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「味蕾細胞」または「味覚細胞」は互換的に使用され、舌の味蕾、例えば、葉状、茸状および有郭の細胞を形成する群に組織化される神経上皮細胞を包含する（Ｒｏｐｅｒら，１９８９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３２９−３５３）。また、味覚細胞は、口蓋、ならびに食道、腸および胃等、その他の組織においても見出される。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「モデル味覚細胞」は、１種または複数のシグナル伝達タンパク質および／または味覚シグナル伝達に有用な関連する細胞機構を、内因性および／または天然に発現する味覚細胞を生産することができる細胞系を指す。本明細書で使用する場合、「モデル味覚細胞」は、これらに限定されないが、ヒトＨｕＴｕ−８０内分泌細胞、ならびにＨｕＴｕ−８０内分泌細胞に由来する任意のサブクローンおよび／または改変細胞を含む、それに由来する細胞も含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「発現する」または「発現」は、天然の条件下または外因性シグナルもしくはプロモーターへの応答下のいずれかでの、ゲノムまたは組み換え核酸配列による、対象とするタンパク質の細胞生産を指す。本明細書で使用する場合、「発現する」または「発現」は、ポリヌクレオチドがＲＮＡに転写される過程および／またはポリペプチドに翻訳される過程を包含する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核細胞の宿主を選択する場合には、ＲＮＡのスプライシングを包含してよい。発現のために要求される調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、およびリボゾーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーター等のプロモーター、ならびに転写開始のためのシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧを包含する。同様に、真核細胞の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボゾームの脱離のための終止コドンを包含する。そのようなベクターは、市販品として入手しても、または当技術分野で周知の方法、例えば、一般的なベクターを構築するための以下に記載する方法に記載されている配列によって組み立ててもよい。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、挿入したポリヌクレオチドを、宿主細胞内および／または宿主細胞間に移入する、自己複製の核酸分子を包含する。この用語は、主として核酸分子を細胞内へ挿入するために機能するベクター、主として核酸の複製のために機能する複製ベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを包含することを意図する。複数の上記機能をもたらすベクターも意図される。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、内因性のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの担体、あるいは外因性のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの組み込みのためのベクターのためのレシピエントであるか、またはこれらとなることができる、任意の個々の細胞または細胞培養物を包含することを意図する。また、単一の細胞の子孫も包含することを意図する。子孫は、天然の、偶然のまたは意図的な変異によって、元々の親細胞とは、（形態において、またはゲノムＤＮＡもしくは全ＤＮＡの相補性において）必ずしも完全に同一でなくてもよい。細胞は、原核生物であっても、または真核生物であってもよく、細胞として、これらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞および、これらに限定されないが、マウス、ラット、サルまたはヒトの細胞をはじめとする、哺乳動物細胞が挙げられる。したがって、本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、遺伝子改変細胞も包含する。「遺伝子改変細胞」という用語は、外来性または外因性の遺伝子またはポリヌクレオチド配列を含有および／または発現する細胞を包含し、それによって、細胞または細胞の子孫の遺伝子型または表現型が改変される。また、「遺伝子改変した」は、細胞内に導入されている遺伝子またはポリヌクレオチド配列を、含有または発現する細胞も包含する。例えば、この実施形態では、遺伝子改変細胞には、細胞にとって内因性でもある遺伝子がすでに導入されている。また、「遺伝子改変した」という用語は、細胞の内因性のヌクレオチドに対する、任意の付加、欠失または破壊も包含する。本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は天然の味蕾細胞および味蕾細胞前駆細胞も包含する。本明細書で使用する場合、「宿主細胞」はモデル味覚細胞も指し、これらに限定されないが、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞およびそれに由来する細胞を含む。
【００２２】
本発明はさらに、上記で定義したモデル味覚細胞を用いた、味覚シグナル伝達を調節する複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は：本発明のモデル味覚細胞から、味覚シグナル伝達に必要な１種もしくは複数の対象とするタンパク質を単離および精製するステップと；多様な細胞フリーおよび細胞に基づいたアッセイを使用して、対象とする精製したタンパク質に対するか、または味覚シグナル伝達におけるその他のタンパク質と対象とする精製したタンパク質の相互作用に対する、試験化合物の効果を決定するステップと；前記細胞に基づいたアッセイに基づいて、対象とする精製したタンパク質を、または味覚シグナル伝達におけるその他のタンパク質と対象とする精製したタンパク質の相互作用を、調節する試験化合物を同定するステップと；前記味覚シグナル伝達の調節において、化合物を検証するステップを含む。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「化合物」または「試験化合物」は、互換的に使用され、好ましくは、小型分子または生理活性作用物質を指す。生理活性作用物質として、これらに限定されないが、哺乳動物中で生理活性を有する天然に存在するかまたは合成の化合物または分子（「生体分子」）、ならびにタンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、多糖、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。好ましくは、生理活性作用物質は、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは生体分子である。当業者であれば、試験化合物の性質が、下記で定義する、対象とするタンパク質および／または分子の性質によって変化する場合があることを理解するであろう。本発明の試験化合物は、天然および／または合成の化合物の系統的なライブラリーをはじめとする、任意の入手可能な供給源から得ることができる。
【００２４】
一般に、タンパク質の阻害剤または活性化剤についてスクリーニングするための方法および組成物、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質対タンパク質およびタンパク質対リガンドの結合研究は、当技術分野で既知であり、本発明の方法と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、本発明は、本発明のモデル味覚細胞中で、対象とするタンパク質と対応するＧαタンパク質との結合を調節することができる試験化合物についてスクリーニングする方法であって、モデル味覚細胞から、対象とするタンパク質とＧαタンパク質を単離および精製すること、試験化合物と、精製した対象とするタンパク質と、精製したＧαタンパク質とを一緒にして組み合わせること、ならびに試験化合物の存在下で、対象とするタンパク質とＧαタンパク質との結合が、生じるかおよび／または変化するかをさらに決定することによって、スクリーニングする方法を提供する。以下に議論するように、試験化合物は、当技術分野で周知の多様なライブラリーから提供することができる。
【００２５】
さらに別の実施形態では、本発明は、モデル味覚細胞を用いて、試験化合物の、味覚受容体に結合する能力および調節する能力を検出するためのスクリーニングアッセイを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、モデル味覚細胞を用いて、試験化合物の、ＲＧＳ２１タンパク質のＧαタンパク質への結合を阻害する能力を検出するためのスクリーニングアッセイを提供する。さらに別の実施形態では、本発明のモデル味覚細胞を用いて、味覚受容体および／またはＲＧＳ２１タンパク質の、発現、活性または結合能を調節する、阻害剤／調節物質も提供される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「調節の／調節／調節物質」、「阻害性の／阻害する／阻害剤」、「活性化する／活性化剤」は、それらの種々の文法上の形態を包含し、タンパク質分子および／または関連する細胞機構の、調節、阻害および／または活性化を指すために互換的に使用され、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならび味覚シグナル伝達に有用なそれらの相同体および模倣物質を指し、対象とする分子および／または細胞機構の、遺伝子もしくはタンパク質または生物学的に活性な部分を含むそれらの断片の発現に影響を及ぼすことを含む。調節物質として、例えば、遺伝子もしくはタンパク質、または生物学的に活性な部分を含むそれらの断片と、それらの対応するＧαタンパク質ならびに味覚シグナル伝達におけるその他のエフェクターおよび／または関連する細胞機構との相互作用を変化させる物質；ならびに対象とする遺伝子もしくはタンパク質、または生物学的に活性な部分を含むそれらの断片の発現レベルを、停止させる、不活性化するおよび脱感作させる物質が挙げられる。調節物質は、変化した活性を有する対象とする遺伝子またはタンパク質の遺伝子改変体、ならびに天然のおよび合成の、リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型化学分子等を包含することができる。「調節効果」は、阻害の上方制御、誘発、刺激、増強、減弱および／または軽減、ならびに阻害および／または下方制御もしくは抑制を指す。阻害剤は、例えば、対象とする遺伝子またはタンパク質と結合して、部分的または全体的に刺激を遮断し、減少させ、阻止し、活性化を遅延し、不活性化し、脱感作し、または下方制御する物質、例えば、アンタゴニストである。活性化剤は、例えば、対象とする遺伝子またはタンパク質と結合して、それを刺激し、増加させ、開放し、活性化し、促進し、その活性化を増強し、感作し、または上方制御する物質、例えば、アゴニストである。
【００２７】
本明細書で使用する場合、対象とするタンパク質の「生物学的に活性な部分」は、そのタンパク質のアミノ酸配列に対して十分に相同な、またはそのタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片を包含し、この部分は、完全長のタンパク質より少ないアミノ酸を包含し、完全長のタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、そのタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。タンパク質の生物学的に活性な部分は、長さが、例えば、１０、２５、５０、１００または２００個以上のアミノ酸であるポリペプチドであることができる。
【００２８】
１つの好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、天然に発現する、甘味物質受容体、うまみ受容体もしくは苦味受容体、および／またはそのヘテロ−もしくはホモ−オリゴマー、ならびに甘味シグナル伝達のための１種または複数の他のタンパク質および／または関連する細胞機構を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、Ｇαタンパク質のような、天然に発現するＧタンパク質を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、天然に発現するＧタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、天然に発現する、味覚シグナル伝達のためのエフェクターを含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞は、天然に発現する、味覚シグナル伝達のために必要な細胞機構を含む。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「味覚受容体」とは味覚細胞膜の表面に存在する受容体タンパク質であって、そのアゴニストおよび／またはリガンドに結合するとＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）シグナル伝達経路を介して味覚シグナル伝達を活性化するタンパク質を指す。「味覚受容体」は、「甘味物質受容体」を指し、甘味シグナル伝達および／またはうまみシグナル伝達を調節する、現在知られているおよび今後記載されるＧＰＣＲのＴ１Ｒファミリーの全てのメンバーを含み、これらに限定されないが、推定上のＴ１Ｒ、たとえばＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３／Ｔ１Ｒ３のようなホモ−オリゴマー；Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３のようなヘテロ−オリゴマー、ならびにそれらのアイソフォームおよび相同体を含む。「味覚受容体」は、「苦味受容体」も指し、苦味シグナル伝達を調節する、現在知られているおよび今後記載されるＧＰＣＲのＴ２Ｒファミリーの全てのメンバーを含み、これらに限定されないが、推定上のＴ２Ｒ、ホモ−オリゴマー、ヘテロ−オリゴマーおよびそれらのアイソフォームまたは相同体を含む。野生型Ｔ１ＲまたはＴ２Ｒタンパク質に対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である味覚受容体が、本発明に包含される。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「Ｇα」または「Ｇαタンパク質」という用語は、現在知られているかまたは今後記載されるＧαｉクラスの全てのメンバーを包含し、メンバーとして、これらに限定されないが、Ｇαｉ１−３、Ｇαｚ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｏｌｆ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１−１４およびＧα１６が挙げられる。特定の実施形態では、Ｇαタンパク質は、１つまたは複数の変異、欠失または挿入を含有する場合がある。そのような実施形態では、Ｇαタンパク質は、野生型Ｇαタンパク質に対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である。本明細書で使用する場合、「対応するおよび／または適切なＧαタンパク質」は、使用する細胞、スクリーニングアッセイまたは系において、対象とするＲＧＳタンパク質、例えば、ＲＧＳ２１タンパク質に接触することができるＧαタンパク質を意味する。また、対応するＧαタンパク質は、使用する細胞、スクリーニングアッセイまたは系において、ＧＰＣＲに共役し、および／またはＧＴＰに結合し、その結果、Ｇαタンパク質は、ＧＰＣＲおよび／またはＧＴＰに接触することができるか、ＧＰＣＲに結合したアゴニストに応答して、シグナルを伝達することができる。本明細書で使用する場合、「ＧＰＣＲに結合したアゴニスト」という用語は、ＧＰＣＲに結合して応答を惹起する、任意の分子または薬剤を包含する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ＲＧＳ」または「ＲＧＳタンパク質」という用語は、現在知られているかまたは今後記載されるＧタンパク質シグナル伝達の調節因子および／またはタンパク質を包含し、これらは、Ｇαｉクラスのタンパク質またはその他のＧαタンパク質を阻害するかまたはそれに結合することができる。そのようなＲＧＳタンパク質として、これらに限定されないが、ＧＡＩＰ、ＲＧＳｚ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ１７、ＲＧＳ２１、Ｄ−ＡＫＡＰ２、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦ、ＰＤＺ−ＲｈｏＧＥＦ、ｂＲＥＴ−ＲＧＳ、ＡｘｉｎおよびｍＣＯＮＤＵＣＴＩＮ、ならびに任意の現在知られているかまたは今後記載されるアイソフォームまたは相同体が挙げられる。さらに、本明細書で使用する場合、「ＲＧＳタンパク質」という用語は、ＲＧＳボックスドメイン、非ＲＧＳボックスドメイン、または１つもしくは複数の変異、欠失または挿入を有するかまたは有しない、任意のその他の機能性ドメイン／モチーフをはじめとする、ＲＧＳコアドメインを含有する、現在知られているかまたは今後記載されるタンパク質も包含する。１つの好ましい実施形態では、ＲＧＳタンパク質は、ＲＧＳ２１タンパク質、そのアイソフォームまたは相同体を指す。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＧＳ２１タンパク質のコアドメインは、野生型ＲＧＳ２１タンパク質のコアドメインに対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上相同である。本明細書で使用する場合、ＲＧＳ２１タンパク質のコアドメインは、そのタンパク質の生物学的に活性な部分を含む。
【００３２】
本発明はまた、本発明のモデル味覚細胞から対象とする遺伝子および／またはタンパク質を単離および精製する方法を提供する。本明細書で使用する場合、「単離した／単離する」または「精製した／精製する」タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは分子は、それらが天然に存在する環境から取り出したこと、または細胞物質、例として、当該タンパク質のポリヌクレオチドもしくは分子が由来する細胞もしくは組織の供給源からの、その他の混入タンパク質を実質的に有しないこと、または化学合成された場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に有しないことを意味する。「細胞物質を実質的に有しない」という言葉は、それを単離または組換えにより産生または合成した細胞の細胞成分から分離した調製物を包含する。一実施形態では、「細胞物質を実質的に有しない」という言葉は、約３０％（乾燥重量）未満のその他のタンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも呼ばれる）、より好ましくは約２０％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、および最も好ましくは約５％未満のその他のタンパク質を有する、対象とするタンパク質の調製物を包含する。タンパク質またはポリヌクレオチドを組換えによって産生する場合、これはまた、培地を実質的に有しないことが好ましく、すなわち、培地は、対象とするタンパク質の調製物の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、および最も好ましくは約５％未満の容量に相当する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」は、後に転写および翻訳される特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを包含する。また、本明細書に記載する任意のポリヌクレオチド配列を使用して、当該ポリペプチドが関連する遺伝子のより大きな断片または全長コード配列を同定することができる。より大きな断片の配列を単離する方法は、当業者には既知である。本明細書で使用する場合、「天然に存在する」ポリヌクレオチド分子として、例えば、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子が挙げられる。
【００３４】
１つの好ましい実施形態では、本発明のモデル味覚細胞において内因性におよび／または天然に発現する、対象とするタンパク質をコードするｃＤＮＡは、当業者によく知られたＲＴ−ＰＣＲ法を用いてモデル味覚細胞のｍＲＮＡから単離される。本明細書で用いる場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、モデル味覚細胞中に存在するｍＲＮＡ分子と相補的なＤＮＡを含む。ｍＲＮＡは、逆転写酵素のような酵素によりｃＤＮＡに変換することができる。
【００３５】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」、「核酸／ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの高分子の形態を包含する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子の断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、天然に存在するもの、合成、組換え、またはそれらの任意の組合せであってよい。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例として、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドの類似体を含んでよい。ヌクレオチド構造に改変を存在させる場合には、改変を起こすのは、高分子に組み立てる前でも、後でもよい。ヌクレオチド配列を、非ヌクレオチドの成分が中断する場合がある。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分の結合によって等、さらに改変することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖の両方の分子も包含する。別段の記載または要求がない限り、本発明のいずれの実施形態でも、ポリヌクレオチドは、二本鎖の形態も、二本鎖の形態を作り上げることが知られているかまたは予測される、２本の相補的な一本鎖の形態のそれぞれも包含する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合には、チミンに代わるウラシル（Ｕ）の４つのヌクレオチド塩基の特異的な配列から構成される。このアルファベット表示は、コンピュータ中のデータベースに入力して、例えば機能ゲノム解析および相同性検索等のバイオインフォマティクスの適用に向けて使用することができる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「単離したポリヌクレオチド／ｃＤＮＡ分子」という用語は、当該ポリヌクレオチドの天然の供給源中に存在するその他のポリヌクレオチド分子から分離したポリヌクレオチド分子を包含する。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離した」という用語は、ゲノムＤＮＡが天然では結合している染色体から分離したポリヌクレオチド分子を包含する。好ましくは、「単離した」ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で、当該ポリヌクレオチドに天然では隣接する配列（すなわち、対象とするポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に位置する配列）を有しない。例えば、種々の実施形態では、本発明の単離したポリヌクレオチド分子、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、当該ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で、当該ポリヌクレオチド分子に天然では隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子等の「単離した」ポリヌクレオチド分子は、組換え技術によって産生された場合には、その他の細胞物質もしくは培地を実質的に有しないものであることができ、または化学的に合成された場合には、化学的前駆体およびその他の化学物質を実質的に有しないものであることができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物質の化合物を包含する。サブユニットは、ペプチド結合によって連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、その他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって結合することができる。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体をはじめとする、天然および／または非天然あるいは合成のいずれかのアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物質を包含する。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、通例、オリゴペプチドと呼ばれる。４つ以上のアミノ酸のペプチド鎖は、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００３９】
好ましい実施形態では、味覚シグナル伝達に必要な、本発明のモデル味覚細胞において内因性および／または天然に発現する、対象とするタンパク質は、対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質も含む。本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化した複合体を形成する反応を包含する。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対、ホーグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、または任意のその他の配列特異的な様式によって生じることができる。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはポリヌクレオチドのリボザイムによる酵素的な切断等の、より広範な過程におけるステップを構成する場合がある。
【００４０】
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェントな条件下で行うことができる。本発明は、低いストリンジェントな条件、より好ましくはストリンジェントな条件、および最も好ましくは高いストリンジェントな条件の下で、本明細書に記載する対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを包含する。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、１０×デンハルト溶液、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、６０℃での一晩のハイブリダイゼーションを指す。ブロットを、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、次に１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、および最後に０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６２℃で各回３０分間順次洗浄する。また本明細書で使用する場合、好ましい実施形態では、「ストリンジェントな条件」という語句は、６×ＳＳＣ溶液中、６５℃でのハイブリダイゼーションも指す。別の実施形態では、「高いストリンジェントな条件」は、１０×デンハルト溶液、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、６５℃での一晩のハイブリダイゼーションを指す。ブロットを、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、次に１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、および最後に０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、６５℃で各回３０分間順次洗浄する。核酸のハイブリダイゼーションのための方法は、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５；ならびにＴｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，パートＩ，第２章，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３に記載されている。好ましい実施形態では、本明細書で使用する、核酸によってコードされる対象とするタンパク質は、対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％相同であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である核酸を包含する。別の好ましい実施形態では、本発明は、対象とするタンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％相同であり、好ましくは７５％相同であり、より好ましくは８５％相同であり、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同であるタンパク質を、内因性におよび／または天然に発現するモデル味覚細胞も提供する。
【００４１】
さらに、本明細書で使用する対象とするタンパク質はまた、キメラタンパク質または融合タンパク質であることができる。本明細書で使用する場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、第１のポリペプチドを含み、これは、第２のポリペプチドに動作可能に連結している。キメラタンパク質は、第１または２のポリペプチドに動作可能に連結している第３、４もしくは５、またはその他のポリペプチドを場合によっては含むことができる。キメラタンパク質は、２つ以上の異なるポリペプチドを含むことができる。キメラタンパク質は、同一のポリペプチドの複数のコピーを含むことができる。また、キメラタンパク質は、ポリペプチドのうちの１つまたは複数において、１つまたは複数の変異を含んでもよい。キメラタンパク質を作製するための方法は、当技術分野では周知である。本発明の一実施形態では、キメラタンパク質は、ある味覚受容体タンパク質のその他の味覚受容体タンパク質とのキメラである。本発明のさらに別の実施形態では、キメラタンパク質は、あるＧタンパク質とその他のＧタンパク質とのキメラ、またはＧタンパク質のあるサブユニットとＧタンパク質のその他のサブユニットとのキメラである。
【００４２】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、甘味を増強するためおよび／または苦味を阻害するための、複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、１）本発明のモデル味覚細胞を提供するステップであって、モデル味覚細胞が、甘味物質受容体ならびに味覚シグナル伝達に必要な１種もしくは複数のその他のタンパク質および／または関連の細胞機構を、内因性におよび／または天然に発現するステップと；２）前記モデル味覚細胞を、甘味物質と、単独でまたは試験化合物と組み合わせて接触させるステップと；３）ａ）細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、カルシウム、ホスホイノシチド）の変化；ｂ）タンパク質キナーゼ活性（例えば、ＥＲＫ、ＰＫＣ、Ｓｒｃ、ＥＧＦＲ等）の変化；ｃ）消化管ペプチドの分泌の変化；ｄ）モデル味覚細胞による神経伝達物質の分泌の変化、のうちの１種または複数をモニターするための細胞に基づいたアッセイを使用して、前記モデル味覚細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップと；４）上記３）に記載した変化をもたらす化合物を同定するステップと；５）味物質による呈味の調節について、ヒトによる味の官能試験において、同定した化合物の効力を検証するステップを含む。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「甘味物質」として、ａ）これらに限定されないが、スクロース、グルコース、フルクトース、ＨＦＣＳ、ＨＦＳＳ、Ｄ−タガトース、トレハロース、Ｄ−ガラクトース、ラムノースをはじめとする、炭水化物甘味物質；ｂ）これらに限定されないが、アスパルテーム、ネオテーム、アセスルファムＫ、スクラロース、チクロ、サッカリン、ネオヘスペリジン・ジヒドロカルコンをはじめとする、合成の強力な甘味物質；ｃ）これらに限定されないが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、ダルコシドＡ、ダルコシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モナチン、クルクリン、グリシリジン、タウマチン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、モナチン、ヘルナンズルチン（Ｈｅｒｎａｎｄｕｌｃｉｎ）、フィロズルチ（Ｐｈｙｌｌｏｄｕｌｃｉ）をはじめとする、天然の強力な甘味物質；ｄ）これらに限定されないが、エリスリトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、イソマルトをはじめとする、ポリオール、およびｅ）これらに限定されないが、グリシン、Ｄ−またはＬ−アラニン、Ｄ−トリプトファン、アルギニン、セリン、スレオニンをはじめとする、アミノ酸が挙げられる。
【００４４】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、細胞内セカンドメッセンジャーをモニターするための細胞に基づいたアッセイを提供する。１つの好ましい実施形態では、本発明は、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰをはじめとする、環状ヌクレオチドを測定するためのアッセイを提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、細胞内カルシウム放出を測定するためのアッセイを提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ホスホイノシチドを測定するための従来の方法を使用したアッセイを提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、セリン／スレオニン・キナーゼであるＥＲＫ１および２等のタンパク質キナーゼの活性をモニターするための細胞に基づいたアッセイを提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のモデル味覚細胞からの神経伝達物質の分泌をモニターするための細胞に基づいたアッセイを提供する。さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のモデル味覚細胞からの消化管ペプチドの分泌をモニターするための細胞に基づいたアッセイを提供する。
【００４５】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、甘味を増強するための複数の化合物についてスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、本発明のモデル味覚細胞を提供するステップであって、モデル味覚細胞が、ＲＧＳタンパク質、ならびにＧαタンパク質等の甘味物質シグナル伝達に必要な１種もしくは複数のその他のタンパク質および／または関連の細胞機構を天然に発現するステップと；ＲＧＳタンパク質活性を阻害する化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）を同定するステップと；甘味物質単独の場合および化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）と組み合わせた場合の、甘味物質受容体によって活性化された甘味シグナル伝達を決定するステップと；前記甘味物質の甘味シグナル伝達を増加させる化合物（ＲＧＳタンパク質阻害剤）を同定するステップとを含む。１つの好ましい実施形態では、ＲＧＳタンパク質は、ＲＧＳ２１タンパク質である。
【００４６】
具体的には、これらのシグナル伝達の「計測値」のうちの１種に対する上記で定義した甘味物質の効果を、同定した調節化合物と組み合わせた甘味物質の効果と、モデル味覚細胞中で比較する。１つの好ましい実施形態では、本発明によれば、甘味物質受容体の活性化剤および／またはＲＧＳ２１タンパク質の阻害剤によって、甘味物質の観察される効果が増加する。例えば、甘味物質単独で、細胞内カルシウムの放出が増加する場合には、その甘味物質と甘味物質受容体の活性化剤および／またはＲＧＳ２１の阻害剤との組合せによって、カルシウムの放出が、甘味物質単独の場合を上回って増加するはずである。さらに別の好ましい実施形態では、本発明はまた、任意の味覚を調節するための複数の化合物について、本発明のモデル味覚細胞を使用してスクリーニングする方法も提供する。
【００４７】
さらに、本発明は、ヒトの甘味、ならびにうま味および苦味について、本発明のモデル味覚細胞中で同定した化合物および／または調節物質の効果を検証する方法も提供する。１つの好ましい実施形態では、本発明は、試験味物質自体を味見して認識された味覚と、試験味物質と同定した調節化合物とを組み合わせて味見して認識された味覚との比較を提供する。
【００４８】
また、本発明は、上記で定義したモデル味覚細胞中で、対象とする遺伝子および／またはタンパク質の活性または発現を、阻害および／または調節することができる試験化合物について高スループットスクリーニングを実施する方法も提供する。当技術分野で周知の、多様な高スループット機能アッセイを組み合わせて使用して、異なる種類の活性化試験化合物の反応性をスクリーニングおよび／または研究することができるが、共役系はしばしば、予測することが困難であることから、広い範囲の共役機構を検出するためには、いくつかのアッセイを構成する必要がある場合がある。多様な蛍光に基づいた技術が、当技術分野では周知であり、活性を高スループットおよび超高スループットでスクリーニングすることができる。大きな容量のかつ多様な試験化合物を、良好な感度でスクリーニングすることができるので、味覚シグナル伝達に関する有望な阻害剤および／または調節物質の解析が可能となる。
【００４９】
本発明は、当技術分野で既知の高スループットアッセイまたは蛍光に基づいたアッセイ中で、試験化合物と、対象とする遺伝子および／またはタンパク質とを組み合わせることにより、モデル味覚細胞を使用して、対象とする遺伝子および／またはタンパク質の活性を、ならびに／あるいは味覚シグナル伝達におけるその他のタンパク質と対象とする遺伝子および／またはタンパク質の相互作用を調節する能力について試験化合物を高スループットでスクリーニングするための方法を提供する。一実施形態では、高スループットスクリーニングアッセイは、味覚受容体の遺伝子および／またはタンパク質に結合する、複数の試験化合物の能力を検出する。別の実施形態では、高スループットスクリーニングアッセイは、ＲＧＳタンパク質の結合パートナー（Ｇαタンパク質等）がＲＧＳタンパク質に結合するのを阻害する、複数の試験化合物の能力を検出する。さらに別の実施形態では、高スループットスクリーニングアッセイは、味覚受容体シグナル伝達を通して味覚シグナル伝達を調節する、複数の試験化合物の能力を検出する。
【００５０】
さらに、本発明は、甘味シグナル伝達を増強するための、モデル味覚細胞中で対象とする遺伝子および／またはタンパク質の阻害剤および／または調節化合物を含む組成物も提供する。また、本発明は、甘味だけでなく、うま味および苦味も調節するための、モデル味覚細胞中で対象とする遺伝子および／またはタンパク質の阻害剤および／または調節化合物を含む組成物も提供する。
【００５１】
本発明のこれらおよび多くの他の変形形態および実施形態が、付随する説明および実施例を精査することによって、当業者には明らかとなるであろう。
【実施例１】
【００５２】
モデル味覚細胞の製造方法
Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔらにより記載された方法（２００６，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９１：７９２−８０２）に基づいて、ヒトＨｕＴｕ−８０腸内分泌細胞を製造する。プラスチックまたはコラーゲンＩ被覆プレート中、５％ＣＯ２／９５％空気中、３７℃で、１０％  ＦＢＳおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ）を含有する最小必須イーグル培地中で、親ＨｕＴｕ−８０（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−４０（登録商標））内分泌細胞を増殖する。
【実施例２】
【００５３】
モデル味覚細胞を用いた、味覚シグナル伝達の調節物質のスクリーニングおよび同定
味覚シグナル伝達に必要な、１種または複数の対象とするタンパク質を、上記のモデル味覚細胞から単離し精製する。対象とする精製したタンパク質に対するか、または味覚シグナル伝達中のその他のタンパク質と対象とする精製したタンパク質の相互作用に対する、試験化合物の効果を、以下に記載する様々な細胞に基づいたアッセイを用いて決定する。実施した細胞に基づいたアッセイにおいて、対象とする精製したタンパク質を、または味覚シグナル伝達中のその他のタンパク質と対象とする精製したタンパク質の相互作用を調節する試験化合物を同定し、次いで味覚シグナル伝達の調節においてさらに検証する。
【００５４】
本実施例中で用いる細胞に基づいたアッセイは、以下のものを含む：
【００５５】
Ａ．細胞内セカンドメッセンジャーの、細胞に基づいたアッセイ：
【００５６】
環状ヌクレオチドの測定：ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ等の環状ヌクレオチドの変化を、細胞抽出物中のそれらの量を、市販の非放射性のＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ  ｃＡＭＰアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を使用することにより定量化することによって測定することができる。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ｃＡＭＰアッセイは、アデニル酸シクラーゼ活性の調節時にＧＰＣＲにより産生したｃＡＭＰのレベルを直接測定するように設計されている。アッセイは、内因性のｃＡＭＰと外因性の添加したビオチン化ｃＡＭＰとの間の競合に基づく。ｃＡＭＰの捕捉は、アクセプター（Ａｃｃｅｐｔｏｒ）ビーズに結合させた特異的な抗体を使用することによって達成する。アッセイは、ＧαｉおよびＧαｓに共役したＧＰＣＲに対するアゴニストおよびアンタゴニストの両方の活性を測定するのに効率的である。ＧＰＣＲのＴ１ＲおよびＴ２Ｒのファミリーは、ＧαｉファミリーのＧタンパク質であるガストデューシンを活性化する。
【００５７】
ＨｕＴｕ−８０細胞を、マルチウエルプレート中に、刺激用緩衝液、ｐＨ７．４（０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ）および抗ｃＡＭＰ抗体結合受容体ビーズ中に蒔く。次いで、３０分かけてその最大能力の５０％でｃＡＭＰを産生する、経験的に決定したフォルスコリンの濃度で、細胞を処理する。各種の濃度の味物質（例えば、スクロース、アスパルテーム等）を、フォルスコリンおよび推定上の味覚調節化合物と一緒に添加する。細胞を、暗所で３０分間インキュベートし、次いで、細胞可溶化用緩衝液中のビオチン化ｃＡＭＰに結合したストレプトアビジンでコートしたビーズ（０．２５Ｕ／μｌ）の混合物と共に、暗所で４時間インキュベートする。蛍光シグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー中で測定する。この実験系では、味物質の濃度が増加すると、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎのシグナルが、ビオチン化ｃＡＭＰおよび抗ｃＡＭＰ抗体ビーズとの競合に利用可能な細胞性のｃＡＭＰを減少させるアデニリルシクラーゼの阻害によって増加することが予想される。
【００５８】
別法として、モデル味覚細胞に、ｃＡＭＰの量と比例するよう、転写性レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等）を発現するプラスミドＤＮＡを、安定にトランスフェクトし得る。このアッセイは、ｃＡＭＰ感受性転写因子である、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）の活性化をモニターする。
【００５９】
ＨｕＴｕ−８０細胞を、２４ウエル・プレート中に蒔き、これに、ＣＲＥ−ルシフェラーゼ（ホタル）レポータープラスミド（０．４μｇ）およびｐＲＬ−Ｔｋ（０．１μｇ）を同時トランスフェクトする。ｐＲＬ−Ｔｋは、（Ｎｇｕｙｅｎら，２００４，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １６：１１４１−５１；Ｌｅｅら，２００４，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１８：１７４０−５５）に記載されているように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用して、ウミシイタケルシフェラーゼを、トランスフェクションの効率に関する対照として、構成的に発現する。次いで、その最大能力の５０％でｃＡＭＰを産生する、経験的に決定した、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中のフォルスコリンの濃度で、５〜１２時間細胞を処理する。各種の濃度の味物質の（例えば、スクロース、アスパルテーム等）を、フォルスコリンおよび推定上の味覚調節化合物と一緒に、５〜１２時間添加する。細胞を可溶化し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、市販のＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用して、製造者の指示に従って決定する。ホタルルシフェラーゼの活性を、ウミシイタケルシフェラーゼの活性で割って、トランスフェクションの効率の変動について規準化し、味物質の濃度のｌｏｇ１０の関数としてプロットする。
【００６０】
細胞内カルシウムの測定：細胞内カルシウムの変化を、モデル味覚全細胞中で、カルシウム感受性色素（例えば、ＦＵＲＡ−２、Ｆｌｕｏ−３等）の蛍光の強度および放出の変化をモニターすることによって測定することができる。これらの色素は市販されている。手短にいうと、ＨｕＴｕ−８０細胞を、９６ウエル・プレート中で、２４時間増殖させ、次いで、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．１％ＢＳＡを補ったＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）（Ｃａ＋＋緩衝液と呼ばれる）で２回すすぎ、１．０μＭ  ｆｕｒａ２−ＡＭを有する、１ｍｌの同一の緩衝液中、３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、培養物を、Ｃａ＋＋緩衝液で３回洗浄し、推定上の味覚調節化合物の存在下または非存在下で、各種の濃度の味物質の（例えば、スクロース、デナトニウム等）と共に、２０から３０秒間インキュベートしてから、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製蛍光プレートリーダー中で、蛍光応答（４８０ｎｍの励起および５３５ｎｍの放出）を平均化した。データを、化合物の添加前に測定したバックグランドの蛍光について補正し、次いで、カルシウム・イオノフォアであるイオノマイシン（１μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）に対する応答に対して規準化する。
【００６１】
別法として、細胞内カルシウムの放出の変化を、ＨｕＴｕ−８０細胞に、カルシウム感受性蛍光タンパク質であるエクオリンをコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって測定することができる。エクオリンの蛍光放出は、基質であるセレンテラジンの存在下で、カルシウム結合時に増加する。エクオリンのカルシウムに対する親和性は、低いマイクロモルの範囲にあり、この酵素の活性は、生理的範囲のカルシウム濃度（５０ｎＭから５０μＭ）に比例する（Ｂｒｉｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９８９６−９９０３，１９９５；Ｒｉｚｚｕｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２６：１２５９−１２６８，１９９５）。
【００６２】
ホスホイノシチドの従来のアプローチによる測定：甘味物質は、モデル味覚細胞中で、酵素ＰＬＣ−β２の活性化をもたらす。この酵素は、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）を、セカンドメッセンジャーであるイノシトール三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とに切断する。放射性標識ホスホイノシチドの加水分解を、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して定量化することによって、ＰＩＰ２の変化をモニターすることができる（Ｐａｉｎｇら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１２９２−１３００）。
【００６３】
ＨｕＴｕ−８０細胞を、［３Ｈ］標識ミオ−Ｄ−イノシトールを用いて２４時間標識し、細胞の培地を、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および２０ｍＭ塩化リチウムで交換する。次いで、細胞を、味物質を用いて、３７℃で、最長３０分間刺激し、５０ｍＭギ酸を用いて、室温で４５分間抽出し、次いで、１５０ｍＭ  ＮＨ４ＯＨで中和する。次いで、細胞抽出物を、アニオン交換ＡＧ  Ｉ−Ｘ８樹脂（１００〜２００メッシュのサイズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）カラム上に直接載せ、Ｈ２Ｏ、次いで５０ｍＭギ酸アンモニウムで洗浄し、１．２ｍＭギ酸アンモニウム、０．１ｍＭギ酸を用いて溶出した。このアッセイ中で溶出したイノシトール一、二および三リン酸を、シンチレーション測定によって定量化する。
【００６４】
別法として、上記のｃＡＭＰのＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイに類似する、ＩＰ３のａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して、ＩＰ３の産生を測定することができる。ＩＰ３のａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイは、細胞性のＩＰ３の能力を測定する。細胞性のＩＰ３は、甘味物質受容体のＰＬＣ−β２を介する活性化に応答して生成して、ＩＰ３結合タンパク質を含有する受容体ビーズに結合するビオチン化ＩＰ３ビーズと競合する。したがって、甘味物質の濃度が増加すると、ＩＰ３の細胞濃度が増加すると予想され、次いで、この濃度の増加から、ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎシグナルの用量依存性の減少を生じる。
【００６５】
９６ウエル・プレート中で増殖させたＨｕＴｕ−８０細胞を、推定上の味覚調節化合物の存在下または非存在下で、増加させた各濃度の味物質（例えば、スクロース、デナトニウム等）とともに３０秒間インキュベートする（ＰＢＳ／Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中）。次いで、細胞を、洗浄剤に溶解し、ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ試薬と共に、製造者の指示に従ってインキュベートして、蛍光シグナルを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製蛍光プレートリーダーで測定する。
【００６６】
Ｂ．タンパク質キナーゼ活性の、細胞に基づいたアッセイ
【００６７】
甘味物質受容体の活性化が、セリン／スレオニン・キナーゼであるＥＲＫ１および２を、Ｇｉシグナル伝達経路を介して活性化することが示されている（Ｏｚｅｃｋら，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４８９：１３９−４９）。ＥＲＫに加えて、Ａｋｔ等のセリン／スレオニン・キナーゼ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）チロシン・キナーゼ等の受容体型チロシン・キナーゼをはじめとする、多くのその他のキナーゼもまた、Ｇｉシグナル伝達経路を介して活性化される。多くのキナーゼの活性化における主要なステップは、キナーゼ自体のリン酸化であり、これを、実験的に決定することができる。例えば、ＥＲＫ１および２の活性化の程度を決定する最も一般的な方法は、免疫測定法または免疫ブロット法のいずれかによる、ＥＲＫのリン酸化された、したがって、活性化された形態に特異的な抗体の使用である。
【００６８】
甘味物質受容体の活性化の、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ａｋｔ、ＭＥＫおよびＥＧＦ−Ｒの活性に対する効果を測定するために、６ウェル・ディッシュ中で増殖させたＨｕＴｕ−８０細胞を、推定上の味覚調節化合物の存在下または非存在下、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中で、３７℃で５〜１０分間、味物質で処理し、次いで洗浄剤緩衝液中に溶解する。処理した細胞からの細胞抽出物を、抗ホスホキナーゼ抗体を使用して、プレート免疫測定法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）中でまたは免疫ブロット法によってのいずれかで解析する。さらに、リン酸化特異的抗体による解析のために、細胞抽出物のパラレルな試料も、全キナーゼ（リン酸化および非リン酸化の両方）を認識する抗体を使用して、プレート免疫測定法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）中でまたは免疫ブロット法によって解析する。リン酸化されたキナーゼ対全キナーゼの比は、甘味物質の濃度に直接比例する。
【００６９】
Ｃ．神経伝達物質分泌の測定
【００７０】
味覚細胞シグナル伝達の最終的かつ最も重要なステップは、神経伝達物質の放出であり、これは、求心性神経線維をさらに刺激する。Ｆｉｎｇｅｒらは、ＡＴＰが、決定的な「神経伝達物質」であり、これは、味覚細胞から分泌され、神経線維上の特異的なプリン作動性のＡＴＰに結合する受容体と相互作用することを示している（Ｆｉｎｇｅｒら，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１４９５−９９）。
【００７１】
９６ウエル・プレート中で増殖させたＨｕＴｕ−８０細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中ですすぎ、同一の緩衝液中で、味物質で、３７℃で０〜３０分間刺激する。刺激したＨｕＴｕ−８０細胞の培地の試料を収集し、ＡＴＰの濃度を、市販のＡＴＰのための発光アッセイ（例えば、ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を使用して決定する。
【００７２】
Ｄ．消化管ペプチドの分泌の測定
【００７３】
ＨｕＴｕ−８０細胞等の腸内分泌細胞は、味覚受容体の刺激に応答して、消化管ペプチド（例えば、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、胃インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）等）を分泌することが知られている（Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ、２００６、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９１：Ｇ１７１−Ｇ１７７）。ＧＩペプチドのＨｕＴｕ−８０細胞からの分泌を測定するために、競合的なＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを使用することができる。例として、ＧＬＰ−１の分泌を、市販の競合的酵素免疫測定法（例えば、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）を使用して測定することができる。
【００７４】
手短にいうと、ＨｕＴｕ−８０細胞を、マルチウエル・ディッシュ（例えば、６ウエル、１２ウエル等）中で増殖させ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中ですすぎ、同一の緩衝液中で、味覚調節試験化合物の存在下および非存在下で、味物質で、３７℃で０〜３０分間刺激する。刺激したＨｕＴｕ−８０細胞の培地の試料を、収集して、ヤギ抗ＧＬＰ−１抗体でコートした９６ウエル・プレートに、ビオチン化ＧＬＰ−１標準物質およびウサギ抗ＧＬＰ−１抗体と一緒に添加する。プレートを、暗所、４℃で、一晩、１６〜１８時間インキュベートする。ウエルを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４ですすぎ、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共に、暗所、室温で、１時間インキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰを除去した後、ＰＢＳ、ｐＨ７．４ですすぎ、ｏ−フェニレンジアミン塩酸塩の基質溶液を添加して、反応を、暗所、室温で、３０分間展開する。反応を停止させ、ウエルの光学的吸収を４９２ｎｍで測定する。分泌されたＧＬＰ−１の量は、組換えＧＬＰ−１の既知の量を用いて平行して求めた標準曲線との比較によって決定する。
【実施例３】
【００７５】
ヒトの味覚テストにおける味覚調節化合物の効果の検証
試験味物質（例えば、甘味物質、風味物質、塩味物質または苦味物質）自体で認識された強度を、試験味物質と味覚調節化合物とを組み合わせて認識された強度と比較する。味覚増強物質の候補は試験味物質の認識される強度を増強させ、一方味覚阻害剤は試験味物質の認識される強度を減少させる。
【００７６】
ある特定の実施形態では、一連の査定者を使用して、試験味物質溶液の強度を測定する。手短にいうと、一連の査定者（一般に、８〜１２人）を訓練して、味覚強度の認識を評価させ、強度を、試料を最初に口に入れた時から、試料を吐き出す３分後までのいくつかの時点で測定する。統計的解析を使用して、結果を、添加物を含有する試料と、添加物を含有しない試料との間で比較する。試料が口から除去された後に測定した時点のスコアの減少は、味物質の認識の低下が存在していることを示す。
【００７７】
一連の査定者を、当技術分野で周知の手順を使用して訓練することができる。ある特定の実施形態では、一連の査定者を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（商標）  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄ（Ｍｅｉｌｇａａｒｄら，Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，第１１章）を使用して訓練することができる。望ましくは、訓練の焦点は、基本の味；具体的には、甘味、塩味、酸味、うま味および苦味の認識および測定でなければならない。結果の正確さおよび再現性を確保するために、各査定者は、味物質の強度の測定を、１つの試料あたり、約３回から約５回まで繰り返す必要があり、少なくとも５分間の休憩を、繰り返す度および／または試料の度にとり、水で十分にすすいで口をきれいにする。
【００７８】
一般に、味物質の強度を測定する方法は、１０ｍＬの試料を口に入れるステップと、試料を口の中に５秒間保ち、試料を口の中で穏やかに回すステップとを含む。認識された味物質の強度を、５秒後にランク付けし、試料を吐き出し（試料を吐き出した後には飲み込まない）、口を一口分の水ですすぎ（例えば、うがい液のときのように水を口の中で激しく動かす）、すすぎ水は吐き出す。認識された味物質の強度を、すすぎ水を吐き出した直後に、４５秒後待って、およびこの４５秒の間にランク付けし、認識された味覚の最大強度の時を同定し、その時点でのこの強度をランク付けする（口を普通に動かし、必要であれば、飲み込む）。試料間では、５分間の休憩をとり、水で十分にすすいで口をきれいにする。
【国際調査報告】
2009544332.tif 000002
2009544332.tif 000003
2009544332.tif 000004