(57)【要約】本発明は、セルロースから誘導されるエタノールの、コストを削減するため、および、収率を上昇させるために改善されたシステムおよび方法に関する。特に、本発明は、バイオマスの増大、リグノセルロース分解性酵素の発現、ならびに収穫および下流の加工の単純化のために、遺伝的に形質転換された植物を提供する。再生可能な燃料および化学薬品を生産するために、きれいな市場性の高い原料を生産する際、および、ファイトレメディエーションをはじめとした他の用途において、これらのトランスジェニック植物を使用するための方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック植物であって、そのゲノムは：
プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素をコードする組換えポリヌクレオチド
が増加されており、ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物における発現に最適化されており、
該少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素は、全可溶性タンパク質の０．５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の２０％を超えるレベルで産生される、トランスジェニック植物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、３０℃未満、５０℃未満または６０℃未満の温度において低活性を示す、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、構成的または組織特異的に発現する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、茎および葉からなる群から選択される植物組織において発現する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、アポプラスト、葉緑体、細胞壁および液胞からなる群から選択される、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
前記植物が、単子葉植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
前記植物が、双子葉植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
前記植物が、作物植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
前記植物が、トウモロコシ、スイッチグラス、ソルガム、ススキ、サトウキビ、ポプラ、マツ、コムギ、イネ、ダイズ、ワタ、オオムギ、芝草、タバコ、タケ、ナタネ、テンサイ、ヒマワリ、ヤナギおよびユーカリからなる群から選択される、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
請求項１に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは：
プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのアミラーゼ酵素をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物における発現に最適化されている、トランスジェニック植物。
【請求項１３】
前記アミラーゼ酵素が、アルファアミラーゼ酵素またはグルコアミラーゼ酵素を含む、請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の２５％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の５０％を超えるレベルで産生される、請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、構成的または組織特異的に発現する、請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、茎および葉からなる群から選択される植物組織において発現する、請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、アポプラスト、葉緑体、細胞壁および液胞からなる群から選択される、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
請求項１に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは：
プロモーター配列に作動可能に連結された、細菌特性を有する少なくとも１つのタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物における発現に最適化されている、トランスジェニック植物。
【請求項２０】
前記細菌特性を有するタンパク質が、抗生物質を含む、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、全可溶性タンパク質の１％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルで産生される、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、構成的または組織特異的に発現する、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２３】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、種子、茎および葉からなる群から選択される植物組織において発現する、請求項２２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、アポプラスト、葉緑体、細胞壁および液胞からなる群から選択される標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項２４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、酵母に対して有毒な物質を産生することによって、または、グルコースを消費し、そしてエタノールへの発酵に利用可能なグルコースを減少させることによって、加工中のエタノール収率を低下させる細菌種に対して有効である、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２７】
請求項１に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、
プロモーター配列に作動可能に連結された、発酵しにくい糖をより容易に発酵可能な糖に変化するための少なくとも１つの酵素をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物における発現に最適化されている、トランスジェニック植物。
【請求項２８】
前記酵素が、キシロースをキシラノースに変換するイソメラーゼである、請求項２７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの酵素が、全可溶性タンパク質の０．５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の２０％を超えるレベルで産生される、請求項２８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３０】
請求項１、１２、１９または２８に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、植物の繁殖による導入遺伝子の分散を最小限にするためにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項３１】
請求項３０に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、該植物に雄性不稔を導入するか、または植物の花成を遅延させるように変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項３２】
請求項１、１２、１９または２８に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、セルロースおよびヘミセルロースと比べて、該トランスジェニック植物におけるリグニンの１つ以上の形態の量を減少させるようにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項３３】
請求項１、１２、１９または２８に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、リグニンおよびヘミセルロースと比べて、該トランスジェニック植物におけるセルロースの１つ以上の形態の量を増加させるようにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項３４】
請求項１、１２、１９または２８に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、リグニンおよびセルロースと比べて、該トランスジェニック植物におけるヘミセルロースの１つ以上の形態の量を増加させるようにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項３５】
トランスジェニック植物であって、そのゲノムは、
該植物における発現に最適化されている、プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素をコードする組換えポリヌクレオチド；および
プロモーターに作動可能に連結された、花成促進遺伝子の発現を低下させるかまたは花成抑制遺伝子を増加させる組換えポリヌクレオチド
が増加されている、トランスジェニック植物。
【請求項３６】
前記トランスジェニック植物の花成が遅延する、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３７】
前記トランスジェニック植物におけるバイオマス生産量が増加する、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、全可溶性タンパク質の０．５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の２０％を超えるレベルで産生される、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、組織特異的に発現する、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、種子、茎および葉からなる群から選択される植物組織において発現する、請求項４０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、アポプラスト、葉緑体、細胞壁および液胞からなる群から選択される、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項４２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４４】
前記植物が、単子葉植物である、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４５】
前記植物が、双子葉植物である、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４６】
前記植物が、作物植物である、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４７】
前記植物が、トウモロコシ、スイッチグラス、ソルガム、ススキ、サトウキビ、ポプラ、マツ、コムギ、イネ、ダイズ、ワタ、オオムギ、芝草、タバコ、タケ、ナタネ、テンサイ、ヒマワリ、ヤナギおよびユーカリからなる群から選択される、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４８】
請求項３５に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは：
プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのアミラーゼ酵素をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物における発現に最適化されている、トランスジェニック植物。
【請求項４９】
前記アミラーゼ酵素が、アルファアミラーゼ酵素またはグルコアミラーゼ酵素を含む、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の２５％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の５０％を超えるレベルで産生される、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、構成的または組織特異的に発現する、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、茎および葉からなる群から選択される植物組織において発現する、請求項５１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項３５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、アポプラスト、葉緑体、細胞壁および液胞からなる群から選択される、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項５３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５５】
請求項３５に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは：
プロモーター配列に作動可能に連結された、細菌特性を有する少なくとも１つのタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物における発現に最適化されている、トランスジェニック植物。
【請求項５６】
細菌特性を有する前記タンパク質が、抗生物質を含む、請求項５５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５７】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、全可溶性タンパク質の０．１％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルで産生される、請求項５５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５８】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、構成的または組織特異的に発現する、請求項５５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５９】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、種子、茎および葉からなる群から選択される植物組織において発現する、請求項５８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６０】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項５４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６１】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、アポプラスト、葉緑体、細胞壁および液胞からなる群から選択される、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現する、請求項６０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６２】
細菌特性を有する前記少なくとも１つのタンパク質が、酵母に対して有毒な物質を産生することによって、または、グルコースを消費し、そしてエタノールへの発酵に利用可能なグルコースを減少させることによって、加工中のエタノール収率を低下させる細菌種に対して有効である、請求項５４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６３】
請求項３５に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、
プロモーター配列に作動可能に連結された、発酵しにくい糖をより容易に発酵可能な糖に変化するための少なくとも１つの酵素をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、該ポリヌクレオチドは、該植物における発現に最適化されている、トランスジェニック植物。
【請求項６４】
前記酵素が、キシロースをキシラノースに変換するイソメラーゼである、請求項６３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの酵素が、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の２０％を超えるレベルで産生される、請求項６４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６６】
請求項３５、４８、５５または６３に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、植物の繁殖による導入遺伝子の分散を最小限にするためにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項６７】
請求項６６に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムが、前記植物に雄性不稔を導入するか、または植物の花成を遅延させるように変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項６８】
請求項３５、４８、５５または６３に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、セルロースおよびヘミセルロースと比べて、該トランスジェニック植物におけるリグニンの１つ以上の形態の量を減少させるようにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項６９】
請求項３５、４８、５５または６３に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、リグニンおよびヘミセルロースと比べて、該トランスジェニック植物におけるセルロースの１つ以上の形態の量を増加させるようにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項７０】
請求項３５、４８、５５または６３に記載のトランスジェニック植物であって、そのゲノムは、リグニンおよびセルロースと比べて、該トランスジェニック植物におけるヘミセルロースの１つ以上の形態の量を増加させるようにさらに変更されている、トランスジェニック植物。
【請求項７１】
コスト効率の良いエタノール調製のための方法であって：
少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を含む植物の一部を、該少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化させる条件下で処理することによって、リグノセルロースを分解して、加水分解産物混合物を形成する工程であって、ここで、該植物の一部は、請求項１〜７０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物から得たものである、工程；および
該加水分解産物混合物の発酵可能な糖のエタノールへの変換を促進する条件下で、該加水分解産物混合物をインキュベートする工程
を含む、方法。
【請求項７２】
前記処理工程の前に、前記植物の一部を前処理しないか、あるいは、非トランスジェニック植物からのバイオマスの前処理に使用される条件よりも弱い熱もしくは弱い酸性の条件下または別途厳しくない条件下もしくは毒性の低い副産物を生成する条件下で前処理する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記植物の一部が、土壌の汚物を実質的に含んでいない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
５０℃超、７５℃超または１００℃超の温度に前記植物の一部を加熱することによって、該植物の一部を前処理する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
水を加えて、前記加水分解産物混合物の粘度を低下させることによって前記植物の一部を前処理する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記植物の一部を、切り刻むこと、粉砕すること、破砕することまたは微粉砕することによって、該植物の一部を前処理する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記処理工程の前に、前記植物の一部に外部のリグノセルロース分解性酵素を加える工程をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記方法が、前記植物の一部を非トランスジェニック植物から得る方法よりもエタノール生産を増加させる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記インキュベート工程の前に、前記加水分解産物混合物から少なくとも１つの発酵不可能な成分を除去する工程をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
前記少なくとも１つの発酵不可能な成分を除去する工程が、発酵可能な糖をエタノールに変換することを加速する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記少なくとも１つの発酵不可能な成分が、リグニン、リグニン分解産物、フェノール、フランおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記少なくとも１つの発酵不可能な成分を前記加水分解産物混合物から除去する工程が、該少なくとも１つの発酵不可能な成分を分離／単離する工程および精製する工程を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つの発酵不可能な成分が、フェノールである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つの発酵不可能な成分またはその誘導体を、燃焼して熱または電気を生産する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記生産された熱が、前記方法において使用される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
蒸留エタノールを得るために、前記加水分解産物混合物の発酵可能な糖の変換により生産されたエタノールを蒸留する工程をさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
少なくとも１つの発酵不可能な成分が、変性剤として蒸留エタノールに加えられる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
少なくとも１つの発酵不可能な成分が、前記蒸留工程の前に、前記加水分解産物混合物の発酵可能な糖の変換により生産されたエタノールに加えられ、該エタノールとともに蒸留され、そして、該蒸留エタノール中に変性剤として残存する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
少なくとも１つの発酵不可能な成分が、変性剤として使用され得る１つ以上の化合物に加工される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
変性剤として使用され得る前記１つ以上の化合物が、アルコールを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
変性剤として使用され得る前記１つ以上の化合物が、メタノールおよびブタノールからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
蒸留エタノールを得るために、前記加水分解産物混合物の発酵可能な糖の変換によって生産されるエタノールを蒸留する工程をさらに含み、ここで、該蒸留エタノールは、変性剤として作用する１つ以上の発酵不可能な成分を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項９３】
トランスジェニック植物のバイオマスからエタノールを生産するプロセスによって、エタノール生産方法において生産される副産物よりも食物としての価値が高い副産物がさらに生産され、ここで、前記植物の一部が、非トランスジェニック植物から得られるものである、請求項８６または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記副産物が、加水分解またはセルロースもしくはヘミセルロースの除去またはリグニンの分解もしくは除去から生じる、高レベルのタンパク質または油を有する乾燥蒸留穀物（ＤＤＧ）を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
同時の糖化および発酵を誘導するために、前記植物の一部に微生物を加える工程をさらに含む、請求項７１または８６に記載の方法。
【請求項９６】
前記微生物が、六炭糖もしくは五炭糖またはその両方を発酵する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記加水分解産物混合物の発酵可能な糖のエタノールへの変換を促進する条件下で該加水分解産物混合物をインキュベートする前記工程が、該加水分解産物混合物に微生物を加えることを含む、請求項７１または８７に記載の方法。
【請求項９８】
前記微生物が、六炭糖もしくは五炭糖またはその両方を発酵する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記植物の一部が、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の２つ以上のトランスジェニック植物から得られる植物の一部を含み、ここで、該トランスジェニック植物が、同じか、または異なる種であり、同じか、または異なるリグノセルロース分解性酵素を産生する、請求項７１に記載の方法。
【請求項１００】
前記植物の一部が、エタノール収率を上昇させるのに望ましい割合で前記リグノセルロース分解性酵素を組み合わせるように同時に加工される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
一層効率的な、多糖類の加水分解ならびにリグニンの分解および除去を達成することによって、エタノール収率を上昇させるのに望ましい割合で前記リグノセルロース分解性酵素を組み合わせるように、前記植物の一部が同時に加工される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０１】
前記植物の一部が、請求項１〜７０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物から得られる植物の一部および非トランスジェニック植物から得られる植物の一部を含み、前記方法が、収穫、サイロに貯蔵すること、切り刻むこと、圧壊、粉砕、液化、糖化、発酵、蒸留、乾燥、貯蔵または輸送のための通常の装置および設備を使用して行われる、請求項７１に記載の方法。
【請求項１０２】
植物の一部が、トウモロコシ子実およびトウモロコシ茎葉を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記トランスジェニック植物のゲノムに、同時の糖化および発酵を促進する１つ以上の酵母遺伝子がさらに増加されている、請求項７１に記載の方法。
【請求項１０４】
デンプンの加水分解を促進する条件下で前記植物の一部を処理する工程をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項１０５】
デンプンの加水分解を促進する条件下で前記植物の一部を処理する前記工程が、少なくとも１つのアミラーゼ酵素を使用する工程を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つのアミラーゼ酵素が、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化する条件下で前記植物の一部を処理する工程と、デンプンの加水分解を促進する条件下で該植物の一部を処理する工程とが、同時に行われる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化する条件下で前記植物の一部を処理する工程と、デンプンの加水分解を促進する条件下で該植物の一部を処理する工程とが、連続的に行われる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記方法が、収穫、サイロに貯蔵すること、切り刻むこと、圧壊、粉砕、液化、糖化、発酵、蒸留、乾燥、貯蔵または輸送のための通常の装置および設備を使用して行われる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
前記植物の一部が、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の２つ以上のトランスジェニック植物から得られる植物の一部を含み、ここで、該トランスジェニック植物が、同じか、または異なる種であり、同じか、または異なるリグノセルロース分解性酵素を産生する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１１】
前記植物の一部が、請求項１〜７０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物から得られる植物の一部および非トランスジェニック植物から得られる植物の一部を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１２】
前記植物の一部が、トウモロコシ子実を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１３】
前記植物の一部が、トウモロコシ子実、トウモロコシ繊維およびトウモロコシ茎葉の１つ以上を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１４】
前記方法が、乾式粉砕プロセスの一部である、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
ファイトレメディエーションにおける汚染物質回収のための方法であって、該方法は：
請求項１〜７０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物由来の種子を、汚染された領域に導入する工程；
該種子からトランスジェニック植物を生長させる工程；
生長したトランスジェニック植物を収穫する工程；
少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を含む植物の一部を、該少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化させる条件下で処理することによって、リグノセルロースを分解してバイオマスを形成し、該植物の一部の中に隔離された汚染物質を遊離する工程であって、ここで、該植物の一部は、該成長し、収穫されたトランスジェニック植物から得られたものである、工程；および
該植物の一部から遊離した該汚染物質を回収する工程
を含む、方法。
【請求項１１６】
前記バイオマスを無害廃棄物として処分する工程をさらに含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記処理工程の前に、前記植物の一部を前処理しないか、または非トランスジェニック植物由来のバイオマスの前処理に使用される条件よりも厳しくない熱および酸性の条件下で前処理する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記植物の一部が：
請求項１〜７０のいずれか１項に記載の第１のトランスジェニック植物から得られる植物の一部であって、前記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素がセルラーゼである、植物の一部；
請求項１〜７０のいずれか１項に記載の第２のトランスジェニック植物から得られる植物の一部であって、該少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、ヘミセルラーゼである、植物の一部；および
請求項１〜７０のいずれか１項に記載の第３のトランスジェニック植物から得られる植物の一部であって、該少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素が、リグニナーゼである、植物の一部
を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記汚染物質が、ヒ素またはセレンなどのメタロイド、鉛、クロム、カドミウム、亜鉛、銅もしくはウランなどの重金属、または、ＤＤＴもしくはＰＣＢなどの残留性有機汚染物質を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２０】
配列番号１の配列を含む、Ｅ１エンドグルカナーゼをコードする、コドンが最適化された単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の植物における発現に最適化されている、ポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
配列番号２の配列を含む、ファミリー４８グリコシド加水分解酵素をコードする、コドンが最適化された単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の植物における発現に最適化されている、ポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
配列番号３の配列を含む、ファミリー１０グリコシド加水分解酵素をコードする、コドンが最適化された単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の植物における発現に最適化されている、ポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
前記ポリヌクレオチドが、トウモロコシ、シロイヌナズナおよびタバコにおける発現に最適化されている、請求項１２０、１２１または１２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
請求項１２０、１２１または１２２に記載のポリヌクレオチドを使用して形質転換された、トランスジェニック植物細胞。
【請求項１２５】
請求項１２０、１２１または１２２に記載のポリヌクレオチドを使用して形質転換された、トランスジェニック植物。
【請求項１２６】
１つのリグノセルロース分解性酵素をコードする微生物ポリヌクレオチド遺伝子配列を提供する工程；
少なくとも１つの第１の植物および１つの第２の植物のコドン使用頻度を平均することによって、複合コドン使用頻度表を得る工程；および
該複合コドン使用頻度表を使用して該ポリヌクレオチド遺伝子配列を改変することによって、該リグノセルロース分解性酵素をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチドを作製する工程であって、ここで、該コドンが最適化されたポリヌクレオチドは、２つ以上の植物における発現に最適化されている、工程
を含む、方法。
【請求項１２７】
前記平均する工程が、３つの異なる植物のコドン使用頻度を平均することを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記平均する工程が、４つの異なる植物のコドン使用頻度を平均することを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記平均する工程が、４つより多い異なる植物のコドン使用頻度を平均することを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記植物のうちの１つが、単子葉植物であり、別のものが、双子葉植物である、請求項１２６〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記植物が、トウモロコシ、シロイヌナズナおよびタバコからなる群から選択される、請求項１２６〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記リグノセルロース分解性酵素が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびリグニナーゼからなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００６年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７７７，１９１号および２００６年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８３２，４１０号からの優先権を主張する。「改善されたバイオ燃料原料のためのエネルギー作物」と題する該仮出願の各々は、本明細書において、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（政府支援）
本明細書中に記載される研究は、米国エネルギー省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）から資金提供を受けた（助成金番号ＤＥ−ＦＧ０２−０４ＥＲ８６１８３）。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
米国におけるエタノール生産は、２００４年には３３億５０００万ガロンに達し、２００３年から１９％上昇した（非特許文献１）。これは、２００６年に販売された１４００億ガロンを超えるガソリンの４％未満であり、米国全体の燃料市場のほんの一部に過ぎないが、近年の原油価格の急激な高騰によって、そのコスト競争力が上昇し、市場占有率を増大することができると示唆される。米国農務省（ＵＳＤＡ）などの連邦政府関係機関は、燃料添加剤としてエタノールなどのバイオ燃料の優先的な買い上げプログラムを実行し始めている。科学技術（輸送燃料）に関する潜在市場は、米国経済の最も大きな市場の１つである。
【０００４】
安価なバイオマスからエタノールを生産する能力は、エタノールをガソリン添加剤として競争力があるものとする「鍵」と呼ばれており（非特許文献２）、ＵＳＤＡ／ＤＯＥの共同研究では、米国内の農地からは、１年で最大５００億ガロン（非特許文献３）および山林と農地の合計からは１年で約１０００億ガロン（非特許文献４）のエタノールを生産することができると予測されている。近年、エネルギーの出力／入力は１．６７と推定されており、リグノセルロースの生産もまた、トウモロコシエタノールの正味エネルギーバランスの増加を助け得る（非特許文献５）。リグノセルロースの原料をエタノールに変換することは、大量の原料の入手が困難でないこと、その材料の焼却または埋立を回避することが望ましいこと、および、セルロースの加水分解によって生産されるグルコースをエタノールに変換することが比較的容易であること、といった利点を有する。結果として、ほとんどの研究では、セルロース原料を使用することによってエネルギーに関する実質的な利点が示されている（例えば、非特許文献６）。
【０００５】
今日、ほとんどの燃料エタノールは、トウモロコシ穀物を粉砕し、熱および酸で前処理することによってリグニンおよびセルロースを分解し、アミラーゼ酵素で処理することによってデンプンを糖に加水分解し、発酵させ、そして、蒸留することによって、生産されている。最近の１０年間にわたり、トウモロコシの茎葉（ｓｔｏｖｅｒ）または他の植物のバイオマスに含まれるセルロースを加水分解することによってエネルギー収率を上昇させる可能性が集中的に研究された。コストの削減についてはかなり進歩したが、２つの実質的な問題が残っている。第１は、リグニンおよびヘミセルロースを除去するためにバイオマスを前処理するコストを削減することである。アンモニア繊維爆砕（ａｍｍｏｎｉａ  ｆｉｂｅｒ  ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ）（ＡＦＥＸ）などの新規技術によって、高収率がもたらされるが、なおも主要な操業コストが高く、また、前処理全般によって硫酸カルシウムなどの大量の副産物を処分する必要が出てくる。第２に、微生物により生成されるセルラーゼ酵素のコストが、現在、エタノール１ガロンあたり＄０．３０から＄１．００超の範囲であることである。現在の研究によって、最終的にはこのコストが１ガロンあたり＄０．１０まで低下し得るが、化石燃料に対抗するエタノールのコスト競合力を改善するために一層安いコストが望ましい。
【０００６】
明らかに、エタノール生産用のバイオ燃料原料のコストを低減するために、技術の改善がなおも必要とされている。
【非特許文献１】Ｓ．Ｈｉｌｌｇｒｅｎ，“Ａｎ  ａｍｂｉｔｉｏｕｓ  ｅｎｅｒｇｙ  ｇｏａｌ”，Ｆａｒｍ  Ｊ．，Ｊａｎ．２００５，ｐ．５８
【非特許文献２】Ｊ．ＤｉＰａｒｄｏ，“Ｏｕｔｌｏｏｋ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍａｎｄ”，ＥＩＡ  Ｆｏｒｅｃａｓｔｓ，２００２
【非特許文献３】Ａ．ＭｃＡｌｏｏｎら、“Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｎ  ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋｓ”，２０００，ＮＲＥＬ／ＴＰ−５８０−２８８９３
【非特許文献４】Ｒ．Ｄ．Ｐｅｒｌａｃｋら、“Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｓ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ  ｆｏｒ  ａ  ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｂｉｌｌｉｏｎ−ｔｏｎ  ａｎｎｕａｌ  ｓｕｐｐｌｙ”，２００５，ＯＲＮＬ／ＴＭ−２００５／６６
【非特許文献５】Ｈ．Ｓｈａｐｏｕｒｉら、“２００１  ｎｅｔ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｒｎ−ｅｔｈａｎｏｌ（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ）”，２００４，ＵＳＤＡ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｅｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｓｔ
【非特許文献６】Ｆａｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１１：５０６−５０８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、現在のバイオエネルギー生産の限界に立ち向かう新規アプローチに関する。特に、本発明は、セルロースから誘導されるエタノールの、コストを削減するため、および、収率を上昇させるために改善されたシステムおよびストラテジーに関する。より詳細には、本発明は、エタノール生産における下流のプロセスの技術革新をもたらすアプローチである、バイオマスとリグノセルロース分解性（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ）酵素の発現の両方を増大させるために遺伝子操作された植物全般に関する。バイオエネルギー用のきれいな、市場性の高い原料を生産することに加えて、本発明のアプローチは、汚染されたバイオマスの処理によって埋立処分に関連するコストおよび責務の低減を可能にし、また、回収された金属のリサイクルを可能にするファイトレメディエーション作物からの汚染物質の回収における現在の最新式を著しく改善し得る。
【０００８】
より詳細には、１つの局面において、本発明は、トランスジェニック植物を提供し、そのゲノムは、プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素をコードする組換えポリヌクレオチドが増加されており、ここで、そのポリヌクレオチドは、その植物における発現に最適化されており、少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素は、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の２０％を超えるレベルで産生される。
【０００９】
上記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼまたはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、このリグノセルロース分解性酵素は、３０℃未満、５０℃未満または６０℃未満の温度において低活性を示す。このリグノセルロース分解性酵素は、構成的または組織特異的に発現し得る。例えば、リグノセルロース分解性酵素は、茎および葉からなる群から選択される植物組織において発現し得る。リグノセルロース分解性酵素は、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官（例えば、アポプラスト、葉緑体、細胞壁または液胞）において発現し得る。
【００１０】
上記植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。ある特定の実施形態において、その植物は、作物植物である。その植物は、トウモロコシ、スイッチグラス、ソルガム、ススキ（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、サトウキビ、ポプラ、マツ、コムギ、イネ、ダイズ、ワタ、オオムギ、芝草（ｔｕｒｆ  ｇｒａｓｓ）、タバコ、タケ、ナタネ、テンサイ、ヒマワリ、ヤナギおよびユーカリからなる群から選択され得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明のトランスジェニック植物のゲノムは、プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのアミラーゼ酵素をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、そのポリヌクレオチドは、その植物における発現に最適化されている。上記アミラーゼ酵素は、アルファ−アミラーゼ酵素またはグルコアミラーゼ酵素であり得る。ある特定の実施形態において、上記少なくとも１つのアミラーゼは、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の２５％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の５０％を超えるレベルで産生される。上記アミラーゼは、構成的または組織特異的に（例えば、茎および／または葉において）発現し得る。上記アミラーゼは、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官（例えば、アポプラスト、葉緑体、細胞壁および／または液胞）において発現し得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明のトランスジェニック植物のゲノムは、プロモーター配列に作動可能に連結された、抗菌特性を有する少なくとも１つのタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、そのポリヌクレオチドは、その植物における発現に最適化されている。上記タンパク質は、抗生物質を含み得る。ある特定の実施形態において、上記の抗菌特性を有する少なくとも１つのタンパク質は、全可溶性タンパク質の０．１％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルで産生される。その細菌タンパク質は、構成的または組織特異的に（例えば、種子、茎および／または葉において）発現し得る。上記抗菌タンパク質は、標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官（例えば、アポプラスト、葉緑体、細胞壁、および／または液胞）において発現し得る。その抗菌タンパク質は、発酵微生物に対して有毒な物質を産生することによって、または、グルコースを消費し、そしてエタノールへの発酵に利用可能なグルコースを減少させることによって、加工中のエタノール収率を低下させる細菌種または真菌種に対して有効であり得る。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明のトランスジェニック植物のゲノムは、プロモーター配列に作動可能に連結された、発酵しにくい糖をより容易に発酵可能な糖に変化するための少なくとも１つの酵素をコードする組換えポリヌクレオチドがさらに増加されており、ここで、そのポリヌクレオチドは、その植物における発現に最適化されている。その酵素は、キシロースをキシラノース（ｘｙｌａｎｏｓｅ）に変換するイソメラーゼであり得る。ある特定の実施形態において、その酵素は、全可溶性タンパク質の０．５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の２０％を超えるレベルで産生される。
【００１４】
本発明のトランスジェニック植物のゲノムはまた、植物の繁殖による導入遺伝子の分散を最小限にするためにさらに変更されていてもよい。例えば、本発明のトランスジェニック植物のゲノムは、植物に雄性不稔もしくは総不稔を導入するか、または植物の花成を遅延させるように変更されていてもよい。
【００１５】
本発明のトランスジェニック植物のゲノムはまた、セルロースおよびヘミセルロースと比べて、トランスジェニック植物におけるリグニンの１つ以上の形態の量を減少させるように、または、リグニンおよびヘミセルロースと比べて、トランスジェニック植物におけるセルロースの１つ以上の形態の量を増加させるように、または、リグニンおよびセルロースと比べて、トランスジェニック植物におけるヘミセルロースの１つ以上の形態の量を増加させるようにさらに変更されていてもよい。
【００１６】
別の局面において、本発明は、トランスジェニック植物を提供し、そのゲノムは、プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素をコードする組換えポリヌクレオチド（そのポリヌクレオチドは、その植物における発現に最適化されている）、および、プロモーターに作動可能に連結された、花成促進（ｆｌｏｗｅｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）遺伝子の発現を低下させるかまたは花成抑制（ｆｌｏｗｅｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）遺伝子を増加させる組換えポリヌクレオチドが増加されている。そのようなトランスジェニック植物では、植物の花成は、遅延し、そして／またはバイオマス生産量が増加する。
【００１７】
ある特定の実施形態において、上記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素は、全可溶性タンパク質の０．５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の５％を超えるレベル、全可溶性タンパク質の１０％を超えるレベルまたは全可溶性タンパク質の２０％を超えるレベルで産生される。その少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リグニナーゼおよびそれらの組み合わせであり得る。上で述べたように、少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素は、構成的または組織特異的に発現し得；そして／または標的化された細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現し得る。
【００１８】
上で述べたように、上記植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。ある特定の実施形態において、上記植物は、作物植物である。上記植物は、トウモロコシ、スイッチグラス、ソルガム、ススキ、サトウキビ、ポプラ、マツ、コムギ、イネ、ダイズ、ワタ、オオムギ、芝草、タバコ、タケ、ナタネ、テンサイ、ヒマワリ、ヤナギおよびユーカリからなる群から選択され得る。
【００１９】
別の局面において、本発明は、コスト効率の良いエタノール調製のための方法を提供する。本発明の方法は：少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を含む植物の一部を、その少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化させる条件下で処理することによって、リグノセルロースを分解して、加水分解産物混合物を形成する工程（その植物の一部は、本発明のトランスジェニック植物から得たものである）；およびその加水分解産物混合物の発酵可能な糖をエタノールに変換することを促進する条件下で、加水分解産物混合物をインキュベートする工程を含む。いくつかの実施形態において、上記植物の一部は、土壌の汚物（ｓｏｉｌ  ｄｉｒｔ）を実質的に含んでいない。
【００２０】
ある特定の実施形態において、上記処理工程の前に、上記植物の一部を前処理しないか、あるいは、非トランスジェニック植物からのバイオマスの前処理に使用される条件よりも弱い熱もしくは弱い酸性の条件下または別途厳しくない条件下もしくは毒性の低い副産物を生成する条件下で前処理する。例えば、上記植物の一部は、５０℃超、７５℃超または１００℃超の温度にその植物の一部を加熱することによって前処理され得る。さらに、または、あるいは、水を加えて、上記加水分解産物混合物の粘度を低下させることによって上記植物の一部を前処理し得る。さらに、または、あるいは、上記植物の一部を、切り刻むこと、粉砕すること、破砕することまたは微粉砕することによって、その植物の一部を前処理する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記方法は、処理工程の前に、植物の一部に外部のリグノセルロース分解性酵素を加える工程をさらに含む。そのような方法は、上記植物の一部を非トランスジェニック植物から得る方法よりもエタノール生産を増加させる。
【００２２】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、インキュベート（発酵）工程の前に、加水分解産物混合物からの少なくとも１つの発酵不可能な（ｕｎｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ）成分を除去する工程をさらに含む。少なくとも１つの発酵不可能な成分を除去する工程は、発酵可能な糖をエタノールに変換することを加速し得る。その少なくとも１つの発酵不可能な成分は、リグニン、リグニン分解産物、フェノール、フランおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。少なくとも１つの発酵不可能な成分を加水分解産物混合物から除去する工程は、その発酵不可能な成分を分離／単離する工程および／または精製する工程を含み得る。ある特定の実施形態において、除去後に、上記少なくとも１つの発酵不可能な成分またはその誘導体を燃焼して熱または電気を生産する。そして、生産された熱を、エタノール生産の本発明の方法において使用することによって、例えば、加水分解産物混合物を加熱し得、そして／またはエタノールを蒸留し得る。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、蒸留エタノールを得るために、加水分解産物混合物の発酵可能な糖の変換によって生産されたエタノールを蒸留する工程をさらに含む。上記加水分解産物混合物から取り出された１つ以上の発酵不可能な成分を、変性剤として蒸留エタノールに加えてもよい。その１つ以上の発酵不可能な成分を、蒸留工程の前にエタノールに加えてもよく、エタノールとともに蒸留してもよく、そして、その蒸留エタノール中に変性剤として残存していてもよい。あるいは、または、さらに、１つ以上の発酵不可能な成分は、変性剤として使用され得る化合物（例えば、メタノール、ブタノールまたは他のアルコール）に加工され得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、蒸留エタノールを得るために、上記加水分解産物混合物の発酵可能な糖の変換によって生産されるエタノールを蒸留する工程をさらに含み、ここで、その蒸留エタノールは、変性剤として作用する１つ以上の発酵不可能な成分を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態において、トランスジェニック植物のバイオマスからエタノールを生産するプロセスによって、例えば、加水分解、および、非トランスジェニック植物からの副産物中に存在するセルロースもしくはヘミセルロースの除去またはリグニンの分解もしくは除去からもたらされる、高レベルのタンパク質および油のような食物としての価値が高い乾燥蒸留穀物（ｄｒｉｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｇｒａｉｎ）固体（ＤＤＧＳ）などの副産物がさらに生産される。
【００２６】
ある特定の実施形態において、本方法は、同時糖化発酵を誘導するために、上記植物の一部に微生物（例えば、六炭糖（例えば、グルコース）もしくは五炭糖（例えば、キシロース）またはその両方を発酵する微生物）を加える工程をさらに含む。あるいは、または、さらに、本発明の方法に使用するトランスジェニック植物のゲノムは、酵母遺伝子または同時糖化発酵を促進する他の発酵生物体の遺伝子が増加されていてもよい。他の実施形態において、発酵の前に、上記微生物を加水分解産物混合物に加える。
【００２７】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、同じか、または異なる酵素を含む、同じか、または異なる種のトランスジェニック植物から得られる植物の一部を使用して行われる。これらの植物は、例えば一層効率的な、多糖類の加水分解ならびにリグニンの分解および除去を達成することによって、エタノール収率を上昇させるのに望ましい割合で上記酵素を組み合わせるように同時に加工される。
【００２８】
他の実施形態において、本発明の方法は、収穫、サイロに貯蔵すること（ｅｎｓｉｌｅｍｅｎｔ）、切り刻むこと、圧壊、粉砕、液化、糖化、発酵、蒸留、乾燥、貯蔵または輸送のための通常の装置および設備を使用してトランスジェニック植物および非トランスジェニック植物から得られる植物の一部を用いて行われる。例えば、上記植物の一部は、トウモロコシ子実およびトウモロコシ茎葉であり得る。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、デンプンの加水分解を促進する条件下で上記植物の一部を処理する工程をさらに含む。デンプンの加水分解を促進する条件下で上記植物の一部を処理する工程は、少なくとも１つのアミラーゼ酵素（例えば、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼまたはそれらの組み合わせ）を使用する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化する条件下で上記植物の一部を処理する工程と、デンプンの加水分解を促進する条件下で上記植物の一部を処理する工程とが、同時に行われる。他の実施形態において、上記少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化する条件下で上記植物の一部を処理する工程と、デンプンの加水分解を促進する条件下で上記植物の一部を処理する工程とが、連続的に行われる。そのような方法において使用される植物の一部を、本発明の２つ以上のトランスジェニック植物から得てもよく、そのトランスジェニック植物は、同じ種であっても、異なる種であってもよく、また、同じリグノセルロース分解性酵素を産生してもよいし、または異なるリグノセルロース分解性酵素を産生してもよい。あるいは、植物の一部は、本発明のトランスジェニック植物および非トランスジェニック植物から得てもよい。ある特定の実施形態において、上記植物の一部は、トウモロコシ子実、トウモロコシ繊維およびトウモロコシ茎葉の１つ以上を含む。本発明の方法は、収穫、サイロに貯蔵すること、切り刻むこと、圧壊、粉砕、液化、糖化、発酵、蒸留、乾燥、貯蔵または輸送のための通常の装置および設備を使用して行われ得る。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、乾式粉砕プロセスの一部である。
【００３０】
別の局面において、本発明は、植物において機能し得る微生物のセルラーゼ酵素を迅速に同定するためのスクリーニング方法を提供する。そのような方法は、微生物のセルラーゼ酵素の酵素活性を評価するために、一過性に形質転換された植物組織（例えば、葉）の使用を含む。
【００３１】
別の局面において、本発明は、植物において微生物のセルラーゼの発現を増加させるために遺伝子配列を改変する方法を提供する。より詳細には、本発明の方法は：１つのリグノセルロース分解性酵素をコードする微生物ポリヌクレオチド遺伝子配列を提供する工程；少なくとも１つの第１の植物および１つの第２の植物の各々のコドン使用頻度を平均することによって、複合コドン使用頻度テンプレートを得る工程；およびそのコドン使用頻度テンプレートを使用して微生物ポリヌクレオチド遺伝子配列を改変することによって、上記リグノセルロース分解性酵素をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチドを作製する工程を含み、ここで、そのポリヌクレオチドは、２つ以上の植物における発現に最適化されている。ある特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、２つの植物、３つの植物、４つの植物または４つを超える植物における発現に最適化されている。ある特定の実施形態において、上記植物の少なくとも１つは、単子葉植物であり、上記植物の少なくとも１つは、双子葉植物である。ある特定の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、トウモロコシ、シロイヌナズナおよびタバコを含む植物の群における発現に最適化されている。
【００３２】
別の局面において、本発明は、いくつかの微生物の遺伝子について、コドンが最適化された配列を提供する。いくつかの実施形態において、そのような配列は、植物における転写を増加させる。いくつかの実施形態において、そのような配列は、２つ以上の植物における発現に最適化されている。より詳細には、本発明は、配列番号１の配列を含む、Ｅ１エンドグルカナーゼをコードする、コドンが最適化された単離ポリヌクレオチド；配列番号２の配列を含む、ファミリー４８グリコシド加水分解酵素をコードする、コドンが最適化された単離ポリヌクレオチド；および配列番号３の配列を含む、ファミリー１０グリコシド加水分解酵素をコードする、コドンが最適化された単離ポリヌクレオチドを提供し、ここで、各ポリヌクレオチドは、２つ以上の植物、すなわち、トウモロコシ、シロイヌナズナおよびタバコにおける発現に最適化されている。本発明は、これらのコドンが最適化されたポリヌクレオチドのうちの１つを使用して形質転換された、植物細胞、植物の一部および植物をさらに提供する。
【００３３】
さらに別の局面において、本発明は、ファイトレメディエーションにおける汚染物質回収のための方法を提供する。本発明の方法は：本発明のトランスジェニック植物由来の種子を、汚染された領域に導入する工程；その種子からトランスジェニック植物を生長させる工程；生長したトランスジェニック植物を収穫する工程；少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を含む植物の一部を、その少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を活性化させる条件下で処理することによって、バイオマスを形成するリグノセルロースを分解して、その植物の一部の中に隔離された汚染物質を遊離する工程（その植物の一部は、成長し、収穫されたトランスジェニック植物から得られたものである）；および上記植物の一部から遊離した汚染物質を回収する工程を含む。上記方法は、上記バイオマスを無害廃棄物として処分する工程をさらに含み得る。
【００３４】
上記汚染物質は、メタロイド（例えば、ヒ素またはセレン）、重金属（例えば、鉛、クロム、カドミウム、亜鉛、銅またはウラン（ｕｒａｍｉｕｍ））または残留性有機汚染物質（例えば、ＤＤＴまたはＰＣＢ）を含み得る。
【００３５】
ある特定の実施形態において、処理工程の前に、上記植物の一部を前処理しないか、あるいは、非トランスジェニック植物からのバイオマスの前処理に使用される条件よりも厳しくない熱および酸性の条件下で前処理する。
【００３６】
本発明のこれらの目的および他の目的、利点ならびに特徴は、以下の詳細な説明を読む当業者に明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
（定義）
以下の段落に定義されるいくつかの用語を、明細書全体を通じて使用する。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、用語「核酸構築物」とは、天然において通常は関連のない核酸配列を含む、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのことをいう。本発明の核酸構築物は、人間の手によって調製、単離または操作される。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で are used herein 交換可能に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態でのデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）ポリマーまたはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）ポリマーのことをいう。本発明において、これらの用語は、そのポリマーの長さに関して限定すると解釈されるべきでなく、天然のヌクレオチドのアナログならびに／または塩基、糖および／もしくはリン酸部分において修飾されているヌクレオチドから作製されたＤＮＡまたはＲＮＡポリマーのアナログを包含するとも理解されるべきである。
【００３９】
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」とは、別々の細胞産物に関与し、そして／または１つ以上の細胞内機能もしくは細胞外機能を行う、別々の核酸配列のことをいう。より詳細には、用語「遺伝子」とは、タンパク質をコードする一部分を含み、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の制御に関与する制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）を必要に応じて包含する核酸のことをいう。遺伝子および制御配列は、同じ天然の供給源から得てもよいし、互いに異種のものであってもよい。この定義は、タンパク質をコードしないが、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの機能的ＲＮＡ分子の転写用の鋳型を提供する核酸も含み得る。あるいは、ある遺伝子は、特定の事象／機能（例えば、タンパク質および／または核酸の結合）に対するゲノムの位置を定義し得る。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含まれる情報を遺伝子産物に変換することをいう。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム構造ＲＮＡまたは他の任意のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化およびエディティングなどのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、翻訳後に修飾されたタンパク質、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
【００４１】
本明細書中で使用されるとき、用語「作動可能に連結された」とは、２つの核酸配列のうちの一方の発現が、もう一方の核酸配列によって支配されているか、制御されているか、または調節されている、それら２つの核酸配列間の関係性のことをいう。好ましくは、第２の核酸配列に作動可能に連結された核酸配列は、そのような第２の配列に直接的または間接的に共有結合しているが、任意の有効な３次元会合も許容可能である。単一の核酸配列が、複数の他の配列に作動可能に連結され得る。例えば、単一のプロモーターは、複数のＲＮＡ種の転写を指示し得る。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」および「プロモーターエレメント」とは、プロモーターに作動可能に連結された、選択されたポリヌクレオチド配列の発現を制御するポリヌクレオチドのことをいい、それは、選択されたポリヌクレオチド配列の細胞中での発現に影響する。用語「植物プロモーター」とは、本明細書中で使用されるとき、植物において機能するプロモーターのことをいう。構成的プロモーターならびに花をはじめとした植物体の一部において選択的に機能する組織特異的プロモーターが好ましい。植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のノパリンシンターゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
用語「導入遺伝子」とは、本明細書中で使用されるとき、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）などのプロセスを使用して人間の手によって宿主細胞に導入されるとき、その宿主細胞によって発現され、そして、細胞のＤＮＡに組み込まれて、導入遺伝子の発現によってもたらされる形質（単数または複数）が、形質転換された細胞の子孫に遺伝する、外来性遺伝子のことをいう。導入遺伝子は、部分的または全体的に異種（すなわち、導入される細胞に対して外来種）であり得る。あるいは、導入遺伝子は、その遺伝子が導入される細胞の内在性遺伝子に対して同種であり得るが、その細胞のゲノムを変更する（例えば、その導入遺伝子が、天然の遺伝子位置とは異なる位置に挿入されるか、またはその挿入によってノックアウトがもたらされる）ような方法で細胞のゲノム内に挿入される（または挿入されている）ように設計される。導入遺伝子はまた、エピソームの形態で細胞内に存在し得る。導入遺伝子は、１つ以上の転写制御配列およびイントロンなどの他の核酸を含み得る。あるいは、または、さらに、導入遺伝子は、本発明において関連するベクター配列と天然には関連がない遺伝子である。
【００４４】
文脈から明らかであるように、用語「植物」とは、本明細書中で使用されるとき、植物体全体、植物の一部（例えば、挿木、塊茎、花粉）、植物の器官（例えば、葉、茎、花、根、果実、枝など）、個別の植物細胞、植物細胞の群（例えば、培養植物細胞）、プロトプラスト、植物抽出物、種子およびそれらの子孫のことをいうことができる。本発明の方法において使用され得る植物のクラスは、形質転換技術に利用しやすい、単子葉植物と双子葉植物の両方をはじめとした高等植物のクラスならびに藻類などのある特定の下等植物と広い。この用語には、倍数体、二倍体および半数体をはじめとした種々の倍数性レベルの植物が含まれる。本発明のある特定の実施形態において、植物は、未開発地域の植物である。他の実施形態において、植物は、「バイオマスエネルギー」のために特別に栽培される。例えば、適当な植物としては、トウモロコシ、スイッチグラス、ソルガム、ススキ、サトウキビ、ポプラ、マツ、コムギ、イネ、ダイズ、ワタ、オオムギ、芝草、タバコ、タケ、ナタネ、テンサイ、ヒマワリ、ヤナギおよびユーカリが挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法を使用して、遺伝的に改変された植物、植物細胞、植物組織、種子などを得ることができる。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、用語「プロトプラスト」とは、細胞培養物または植物体全体に再生する潜在能力を有する、細胞壁を有しない単離植物細胞のことをいう。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、用語「形質転換」とは、外来性核酸分子（例えば、ベクターまたは組換えＤＮＡ分子）を、レシピエント細胞、カルスまたはプロトプラストに導入するプロセスのことをいう。この外来性核酸分子は、宿主細胞、カルスまたはプロトプラストのゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれてもよいし、組み込まれなくてもよい（すなわち、共有結合してもよいし、しなくてもよい）。例えば、この外来性ポリヌクレオチドは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。あるいは、この外来性ポリヌクレオチドは、染色体内に組み込まれて、染色体複製によって娘細胞に遺伝し得る。形質転換のための方法としては、エレクトロポレーション、マグネトポレーション（ｍａｇｎｅｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｃａ２＋処理、注入、粒子銃、レトロウイルス感染およびリポフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、用語「安定的に形質転換された」とは、植物細胞、カルスまたはプロトプラストに適用されるとき、挿入された外来性核酸分子が、自律的に複製するプラスミドとしてかまたは宿主染色体の一部として複製することができる、細胞、カルスまたはプロトプラストのことをいう。安定性は、形質転換された細胞が、外来性核酸分子を含んでいる娘細胞の集団を含む細胞株またはクローンを確立する能力によって証明される。
【００４８】
用語「遺伝的に改変された」および「トランスジェニック」は、本明細書中において交換可能に使用される。トランスジェニック生物または遺伝的に改変された生物は、遺伝子操作を使用することによって、人間の手による操作に少なくとも部分的に起因する遺伝的背景を有する生物である。例えば、用語「トランスジェニック細胞」とは、本明細書中で使用されるとき、本来、非トランスジェニック細胞に存在しない外来性核酸を含むＤＮＡを有する細胞のことをいう。トランスジェニック細胞は、形質転換された細胞に由来し得るか、形質転換された細胞から再生され得るか、または、トランスジェニック細胞に由来し得る。本発明の文脈における代表的なトランスジェニック細胞としては、安定的に形質転換された植物細胞から得られた植物カルスおよびトランスジェニック植物から得られた特定の細胞（例えば、葉、根、茎または生殖細胞）が挙げられる。「トランスジェニック植物」は、その植物の細胞の１つ以上が、人間の介入によって導入された異種核酸配列を含む任意の植物である。トランスジェニック植物は、代表的には、同じ系統のネイティブな非トランスジェニック植物の特徴とは異なる特徴を有する植物をもたらすＤＮＡ配列を発現する。最初に遺伝子操作によって導入された改変の少なくとも一部を保有する、植物、種子、組織培養物ならびに単離組織および単離細胞の形態での、上記のような植物由来の子孫または上記のような植物が関与する交配による子孫が、この定義によって含まれる。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、用語「再生」とは、植物細胞（例えば、植物プロトプラスト、植物カルスまたは植物外植片）から植物が生長するプロセスのことをいう。
【００５０】
（ある特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
上で述べたように、本発明は、リグノセルロースバイオマスからのエタノール生産のコストを削減するためおよび収率を上昇させるために改善されたシステムおよびストラテジーに関する。
【００５１】
Ｉ．リグノセルロース分解性酵素
１つの局面において、本発明は、１つ以上のリグノセルロース分解性酵素を産生するように操作された（すなわち、遺伝的に形質転換された）植物を提供する。適当なリグノセルロース分解性酵素としては、リグノセルロースの破壊および／または分解に関与する酵素が挙げられる。リグノセルロースバイオマスは、結晶性セルロースがヘミセルロースおよびリグニンのマトリックス内に包埋されている複合体基質である。リグノセルロースは、ほとんどの植物材料の乾燥重量の約９０％を占め、セルロースは、リグノセルロースの乾燥重量の３０％〜５０％を構成し、ヘミセルロースは、リグノセルロースの乾燥重量の２０％〜５０％を構成する。
【００５２】
リグノセルロース分解性酵素によるリグノセルロースの破壊および分解（例えば、加水分解）によって、単糖類、二糖類、多糖類およびフェノールをはじめとした物質が形成される。リグノセルロース分解性酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびリグニナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
Ａ−セルラーゼ
セルラーゼは、セルロース分解に関与する酵素である。セルラーゼ酵素は、その作用様式に基づいて分類される。基本的な２種類のセルラーゼ：ポリマー鎖を内部で切断するエンドセルラーゼ；およびエンドセルラーゼの作用によって生成された分子の還元末端および非還元末端から切断するエキソセルラーゼが存在する。セルラーゼとしては、セロビオヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、エンドグルカナーゼおよびβ−Ｄ−グルコシダーゼが挙げられる。エンドグルカナーゼは、セルロース基質の無定形領域をランダムに攻撃し、主に高級（ｈｉｇｈｅｒ）オリゴマーをもたらす。セロビオヒドロラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は、結晶性セルロースを加水分解し、セロビオース（グルコース二量体）を放出するエキソセルラーゼである。両方のタイプの酵素が、β−１，４−グリコシド結合を加水分解する。β−Ｄ−グルコシダーゼまたはセロビアーゼ（ｃｅｌｌｕｌｏｂｉａｓｅ）は、オリゴ糖およびセロビオース（ｃｅｌｌｕｂｉｏｓｅ）をグルコースに変換する。
【００５４】
本発明によれば、植物は、セルラーゼ酵素をコードする遺伝子を含むように操作され得る。あるいは、植物は、セルラーゼ酵素をコードする２つ以上の遺伝子を含むように操作され得る。例えば、植物は、セロビオヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｕｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）クラスのセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子、エンドグルカナーゼクラスのセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子および／またはβ−Ｄ−グルコシダーゼクラスのセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子を含むように操作され得る。
【００５５】
本発明において使用され得るエンドグルカナーゼ遺伝子の例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（米国特許第６，６２３，９４９号；ＷＯ９４／１４９５３）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ（米国特許第６，６２３，９４９号）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（Ｋｉｔａｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，４６：５３８−５４４；米国特許第６，６３５，４６５号）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎら、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，２００２，３７：１９０−１９６）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ，１９８６，４４：３１５−３２４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＭａｃＫａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８６，１４：９１５９−９１７０）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｐａｃｈｎｏｄａｅ（Ｃａｚｅｍｉｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９９，５２：２３２−２３９）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２００２，４１：８９−９８）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（Ｈａｇｅｎら、Ｇｅｎｅ，１９９４，１５０：１６３−１６７；Ｓｈｅｐｐａｒｄら、Ｇｅｎｅ，１９９４，１５０：１６３−１６７）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ（米国特許第５，９１２，１５７号；Ｄａｖｉｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，２０００，３４８：２０１−２０７）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｐｅｎｔｔｉｌａら、Ｇｅｎｅ，１９８６，４５：２５３−２６３）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ，２００２，４１：８９−９８）、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，１３：３４４−３５０）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（米国特許第５，９１２，１５７号）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（Ｍｏｒｉｙａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３，１８５：１７４９−１７５６）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，１３：２１９−２２８）およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ（Ｋｗｏｎら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，６３：１７１４−１７２０；Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ，２００２，４１：８９−９８）から得ることができる。
【００５６】
ある特定の実施形態において、植物は、エンド−１，４−β−グルカナーゼＥ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３３２１２）を含むように操作される。この遺伝子は、好熱性細菌のＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓから単離されたものである。Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓは、植物セルロースを加水分解する能力および分解する能力を有すると特徴付けられている。Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓによって生成されるセルラーゼ複合体は、７５℃〜８３℃において最大活性を有するいくつかの異なる熱安定性セルラーゼ酵素を含むと知られている。これらのセルラーゼは、エンド−セルラーゼおよびエキソ−セルラーゼによって触媒される反応の最終産物であるセロビオースからの阻害に抵抗性である。
【００５７】
Ｅ１エンド−１，４−β−グルカナーゼについては、米国特許第５，２７５，９４４号に詳細に記載されている。このエンドグルカナーゼは、最適温度が８３℃であり、タンパク質の１ｍｇあたりのカルボキシメチルセルロースから１分あたり４０μｍｏｌのグルコースを放出する特異的活性を有すると証明されている。このＥ１エンドグルカナーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、等電点ｐＨが６．７であり、分子量が８１，０００ダルトンであることがさらに同定された。このエンドグルカナーゼは、細菌における搬出経路に対して方向付けるシグナルペプチドを有する前駆体として合成される。この成熟酵素は、５２１アミノ酸（ａａ）長である。約４０ｋＤ（３５８ａａ）の触媒ドメインの結晶構造が報告されている（Ｊ．Ｓａｋｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，３５：１０６４８−１０６６０）。そのｐｒｏ／ｔｈｒ／ｓｅｒリッチリンカーは、６０ａａであり、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）は、１０４ａａである。その機能をもたらすセルロース結合ドメインの特性は、十分に特徴付けられていない。Ｅ１遺伝子の植物での発現が報告されている（例えば、Ｍ．Ｔ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６：３７−４６；Ｚ．Ｄａｉら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６：２７７−２８５；Ｚ．Ｄａｉら、Ｔｒａｎｓｇ．Ｒｅｓ．，２０００，９：４３−５４；およびＴ．Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００１，８：１４７−１５８を参照のこと）。
【００５８】
本発明において使用され得るセロビオヒドロラーゼ遺伝子の例は、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（米国特許第６，１２７，１６０号）、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ（Ｃｈｏｗら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，６０：２７７９−２７８５）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（Ｔａｋａｄａら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９８，８５：１−９）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ｇｉｅｌｋｅｎｓら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５：１９９９，４３４０−４３４５）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（Ｋｉｔａｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，４６：５３８−５４４）、Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ（ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＢ１０３４６１）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＸ６５７５７１およびＣＱ８３８１５０）、Ｃｕｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ（Ｍｅｉｎｋｅら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，１２：４１３−４２２）、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎら、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，２００２，３７：１９０−１９６）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ（Ｈａｇｅｎら、Ｇｅｎｅ，１９９４，１５０：１６３−１６７）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．１２８（ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＢ０８９３４３）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ（ｄｅ  Ｏｌｉｖｉｅｒａ  ａｎｄ  Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：６６８；Ｔａｋａｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，１２４：７１７−７２５）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ（ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＸ６５７５７１）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ（Ｔｅｅｒｉら、Ｇｅｎｅ，１９８７，５１：４３−５２）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｅｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＸ６５７５９９）、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ（Ｄｅｎｍａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６，６２：１８８９−１８９６）、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｔｅｍｐｅｌａａｒｓら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，６０：４３８７−４３９３）、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ（Ｚｈａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４：３３８６−３３９５）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｔｅｒｒｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８３，１：６９６−６９９；Ｃｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８７，５：２７４−２７８）およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ（ＥＭＢＬアクセッション番号Ａ４３６８６８６およびＡ４３６８６８８）から得ることができる。
【００５９】
本発明において使用され得るβ−Ｄ−グルコシダーゼ遺伝子の例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ，１９９６，１７３：２８７−２８８）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ（Ｉｗａｓｈｉｔａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，６５：５５４６−５５５３）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（ＷＯ２００２／０９５０１４）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｂｉａｚｏｔｅａ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ，１９９８，２０７：７９−８６）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ（ＷＯ２００４７８９１９）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ（Ｍａｃｈｉｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８８，５４：３１４７−３１５５）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１５：８７１−８８０）およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｂａｒｎｅｔｔら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９：５６２−５６７）から得ることができる。
【００６０】
セルロースをグルコースに変換するためのセルラーゼの導入遺伝子の植物における発現が報告されている（例えば、Ｙ．Ｊｉｎ  Ｃａｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，６５：５５３−５５９；Ｃ．Ｒ．Ｓａｎｃｈｅｚら、Ｒｅｖｉｓｔａ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，１９９９，３０：３１０−３１４；Ｒ．Ｃｏｈｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．，２９９５，７１：２４１２−２４１７；Ｚ．Ｄａｉら、Ｔｒａｎｓｇ．Ｒｅｓ．，２００５，１４：６２７−５４３を参照のこと）。
【００６１】
Ｂ−ヘミセルラーゼ
ヘミセルラーゼは、ヘミセルロース分解に関与する酵素である。ヘミセルラーゼとしては、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ（ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）、アセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ（ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ）およびアラビナーゼ（ａｒａｂｉｎａｓｅ）が挙げられる。セルラーゼ酵素と同様に、ヘミセルラーゼは、その作用様式に基づいて分類される：エンド作用ヘミセルラーゼは、多糖鎖内の内部結合を攻撃し；エキソ作用ヘミセルラーゼは、多糖鎖の還元末端または非還元末端から進行的に作用する。
【００６２】
本発明によれば、植物は、ヘミセルラーゼ酵素をコードする遺伝子を含むように操作され得る。あるいは、植物は、ヘミセルラーゼ酵素をコードする２つ以上の遺伝子を含むように操作され得る。例えば、植物は、キシラナーゼクラスのヘミセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子、アラビノフラノシダーゼクラスのヘミセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子、アセチルキシランエステラーゼクラスのヘミセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子、グルクロニダーゼクラスのヘミセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子、マンナナーゼクラスのヘミセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子、ガラクタナーゼクラスのヘミセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子および／またはアラビナーゼクラスのヘミセルラーゼをコードする１つ以上の遺伝子を含むように操作され得る。
【００６３】
エンド作用ヘミセルラーゼの例としては、エンドアラビナナーゼ（ｅｎｄｏａｒａｂｉｎａｎａｓｅ）、エンドアラビノガラクタナーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドマンナナーゼ、エンドキシラナーゼおよびフェラキサン（ｆｅｒａｘａｎ）エンドキシラナーゼが挙げられる。エキソ作用ヘミセルラーゼの例としては、α−Ｌ−アラビノシダーゼ（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄａｓｅ）、β−Ｌ−アラビノシダーゼ、α−１，２−Ｌ−フコシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−キシロシダーゼ、エキソグルコシダーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エキソマンノビオヒドロラーゼ（ｍａｎｎｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、エキソマンナナーゼ、エキソキシラナーゼ、キシランα−グルクロニダーゼおよびコニフェリンβ−グルコシダーゼが挙げられる。
【００６４】
ヘミセルラーゼ遺伝子は、真菌および細菌の生物（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、ＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ）をはじめとした任意の適当な起源から得ることができる。本発明において使用され得るヘミセルラーゼの例は、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ（Ｉｎａｇａｋｉら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，６２：１０６１−１０６７）、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ（Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，２７７：２７３−２８４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（米国特許第６，１９７，５６４号；米国特許第５，６９３，５１８号）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｉｔｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，５６：９０６−９１２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＦ１０８９４４）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ（Ｗｕら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１９９５，８：５０６−５１４）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（Ｈａａｓら、Ｇｅｎｅ，１９９３，１２６：２３７−２４２）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＷＯ０２／２４９２６）およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｘ６９５７３、Ｘ６９５７４およびＡＹ２８１３６９）から得ることができる。
【００６５】
ある特定の実施形態において、植物は、Ｃｏｃｈｌｉｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍのエンドキシラナーゼ（ＸＹＬ１）（Ｐ．Ｃ．Ａｐｅｌら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１９９３，６：４６７−４７３）を含むように操作される（実施例の項を参照のこと）。
【００６６】
Ｃ−リグニナーゼ
リグニナーゼは、リグニンの分解に関与する酵素である。リグニン分解酵素としては、リグニンペルオキシダーゼ、マンガン依存性ペルオキシダーゼ、複合型ペルオキシダーゼ（リグニンペルオキシダーゼとマンガン依存性ペルオキシダーゼとの複合特性を示す）およびラッカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ペルオキシダーゼによる補基質として必要な過酸化水素は、グルコースオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼおよび／またはリグニンペルオキシダーゼ活性化グリオキサールオキシダーゼによって生成され得る。
【００６７】
本発明によれば、植物は、リグニナーゼ酵素をコードする遺伝子を含むように操作され得る。あるいは、植物は、リグニナーゼ酵素をコードする２つ以上の遺伝子を含むように操作され得る。例えば、植物は、リグニンペルオキシダーゼクラスのリグニナーゼをコードする１つ以上の遺伝子、マンガン依存性ペルオキシダーゼクラスのリグニナーゼをコードする１つ以上の遺伝子、複合型ペルオキシダーゼクラスのリグニナーゼをコードする１つ以上の遺伝子および／またはラッカーゼクラスのリグニナーゼをコードする１つ以上の遺伝子を含むように操作され得る。
【００６８】
リグニン分解遺伝子は、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ（ＷＯ０２／０７９４００を参照のこと）、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅから得てもよい。
【００６９】
本発明において使用され得るリグニナーゼをコードする遺伝子の例は、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ（ＷＯ２００１／０９８４６９）、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ（Ｃｏｎｅｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，９３：１４３−１５８）、Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ  ｃｉｂａｒｉｕｓｉ（Ｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００４，３１３：３７−４１）、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ（ＷＯ９７／００８３２５；Ｃｏｎｅｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，９３：１４３−１５８）、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ（Ｎａｇａｉら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，６０：３２７−３３５，２００２）、Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ（Ｋｉｉｓｋｉｎｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４，５７６：２５１−２５５，２００４）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（ＷＯ９５／００６８１５）、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｃｏｎｅｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，９３：１４３−１５８；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｅｎｚ，Ｍｉｃｒｏｂ，Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，３０：４２５−４４４）、Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ（Ｃｏｎｅｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，９３：１４３−１５８）、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ（Ｃｏｎｅｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，９３：１４３−１５８）、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｐｉｎｓｉｔｕｓ（ＷＯ９６／０００２９０）、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｕｓ（Ｇａｒａｖａｇｌｉａら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４，３４２：１５１９−１５３１）、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ（ＷＯ９６／００７９８８）、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（ＷＯ９５／０３３８３７）、Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００４，３１５：４５０−４５４）およびＴｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｃｏｎｅｓａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，９３：１４３−１５８）から得ることができる。
【００７０】
例えば、植物は、１つ以上のリグニンペルオキシダーゼを含むように操作され得る。リグニンペルオキシダーゼをコードする遺伝子は、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍまたはＰｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａから得てもよい。リグニンペルオキシダーゼは、活性が過酸化水素依存性であり、また、リグニンポリマーの酸化的切断を触媒する、グリコシル化されたヘムタンパク質（ＭＷ３８〜４６ｋＤａ）である。リグニンペルオキシダーゼ活性を有する少なくとも６つのヘムタンパク質（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８およびＨ１０）が、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのＢＫＭＦ−１７６７株において同定されている。ある特定の実施形態において、植物は、白色腐朽繊維状Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍリグニナーゼ（ＣＧＬ５）（Ｈ．Ａ．ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｇｅｎｅ，１９８８，６９（２）：３６９）を含むように操作される（実施例の項を参照のこと）。
【００７１】
Ｄ−他のリグノセルロース分解性酵素
セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびリグニナーゼに加えて、本発明の実施において使用され得るリグノセルロース分解性酵素には、ペクチン質を分解する酵素も含まれる。ペクチン質は、ホモガラクツロナン（またはペクチン）、ラムノガラクツロナンおよびキシロガラクツロナン（ｘｙｌｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ）から構成される。ホモガラクツロナンを分解する酵素としては、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼおよびペクチンメチルエステラーゼが挙げられる。ラムノガラクツロナンを分解する酵素としては、アルファ−アラビノフラノシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、アルファ−アラビノフラノシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンリアーゼおよびラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼが挙げられる。キシロガラクツロナンを分解する酵素としては、キシロガラクツロノシダーゼ（ｘｙｌｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎｏｓｉｄａｓｅ）、キシロガラクツロナーゼ（ｘｙｌｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ）およびラムノガラクツロナンリアーゼが挙げられる。リグノセルロースの破壊および／または分解を増大または促進し得る他の酵素としては、アミラーゼ（例えば、アルファアミラーゼおよびグルコアミラーゼ）、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、プロテアーゼおよびペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
Ｅ−リグノセルロース分解性酵素の組み合わせ
本発明によれば、植物は、リグノセルロース分解性酵素、例えば、セルラーゼ酵素、ヘミセルラーゼ酵素またはリグニナーゼ酵素をコードする遺伝子を含むように操作され得る。あるいは、植物は、リグノセルロース分解性酵素、例えば、セルラーゼの様々なクラスの酵素、ヘミセルラーゼの様々なクラスの酵素、リグニナーゼの様々なクラスの酵素をコードする２つ以上の遺伝子またはそれらの任意の組み合わせを含むように操作され得る。例えば、遺伝子の組み合わせは、リグノセルロースのうちの１成分（例えば、セルロース、ヘミセルロースまたはリグニン）の効率的な分解をもたらすように選択され得る。あるいは、遺伝子の組み合わせは、リグノセルロース材料の効率的な分解をもたらすように選択され得る。
【００７３】
ある特定の実施形態において、遺伝子は、特定の植物（例えば、トウモロコシ、タバコ、スイッチグラス）における基質（例えば、セルロース、ヘミセルラーゼ、リグニンまたはリグノセルロース材料全体）に対して最適化されたものである。１つの植物種由来の組織は、別の植物種由来の組織と物理的および／または化学的に異なる可能性がある。所与の植物組織の効率的な分解を達成する遺伝子の選択または遺伝子の組み合わせは、当業者の技術範囲内である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、遺伝子の組み合わせは、相乗的な酵素活性をもたらすように選択される（すなわち、遺伝子は、区別可能な酵素または酵素活性との相互作用によって、一緒に使用される酵素の活性全体が、個別の活性の影響の合計よりも高くなるように選択される）。
【００７５】
有効なリグノセルロース分解性活性は、単一のトランスジェニック植物において２つ以上の酵素の産生によって達成され得る。上で述べたように、植物は、２つ以上の酵素を発現するように、例えば、選択された酵素の各々をコードする複数の遺伝子構築物、または、選択された酵素の各々をコードする複数のヌクレオチド配列を含む単一の構築物を使用することによって形質転換され得る。あるいは、所与の酵素を発現するように各々が安定的に形質転換された個別のトランスジェニック植物を、当該分野で公知の方法（例えば、受粉、手作業で房を取り除くこと（ｈａｎｄ  ｄｅｔａｓｓｌｉｎｇ）、細胞質雄性不稔など）によって交配することにより、個別の出発植物のすべての酵素を産生することができる植物を得てもよい。
【００７６】
あるいは、有効なリグノセルラーゼ分解活性は、別々の植物において２つ以上のリグノセルロース分解性酵素を産生することによって達成され得る。例えば、３つの別個の植物系統（例えば、トウモロコシ）（１つは、セルラーゼクラスの１つ以上の酵素を発現し、もう１つは、ヘミセルラーゼクラスの１つ以上の酵素を発現し、第３のものは、リグニナーゼクラスの１つ以上の酵素を発現する）を、開発して、同時に生長させてもよい。産生される酵素の所望の「混合物」は、農場の気候および土壌タイプを考慮に入れて、単純に種子の比を変化させること（植物における酵素収率に影響すると予想される）によって達成され得る。
【００７７】
このアプローチの他の利点としては、植物の健康状態の向上（導入される遺伝子の数が増えるにつれて悪影響を受けると知られている）、より簡便な形質転換の手順、および、大規模生産用の市販の植物品種において所望の特性を導入する際の高い順応性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
Ｆ−植物において機能し得る微生物のセルロース酵素の同定方法
現在のところ、微生物の酵素が、組換えＤＮＡ技術によって植物において機能的に発現することができるか否かを判定することは、非常に長く、大きな労働力を要するプロセスである。安定的なトランスジェニック植物が作製、特徴付けられなければないし、また、その酵素が、バイオマスから抽出されなければならないし、インビトロにおいて試験されなければならない。本発明は、植物において機能し得る微生物のセルラーゼ酵素を迅速に同定するためのスクリーニング方法を提供する。ある特定の実施形態において、本発明のスクリーニング方法によって、数週間ではなく、ほんの数日または数時間のうちに植物組織における酵素活性を評価することができる。
【００７９】
より詳細には、目的の遺伝子の導入遺伝子を発現させるため、およびセルラーゼ酵素活性を評価するために、一過性に形質転換された植物組織を使用するスクリーニング方法が、お本明細書中で提供される。植物組織における導入遺伝子の一過性の発現は、酵素を産生するのに必要な時間が数ヶ月から数日に短縮する。本発明のスクリーニング方法の実施形態は、実施例９に記載する。このスクリーニング方法では、タバコの葉を使用する。土壌細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して、細菌を葉に浸透させることによって、標準的な植物形質転換ベクター内に含まれる目的の遺伝子がタバコ細胞に導入され得る（Ｃａｚｚａｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｖｅｌｔｅｎ，Ｐｌａｎｔａ，２００６，２２４：５８２−５９７）。３〜５日後に、その浸透された組織は、酵素活性を解析するのに十分なレベルで導入遺伝子を発現する。
【００８０】
セルラーゼの酵素活性は、任意の適当な方法を使用して解析することができる。実施例９に記載されるように、酵素活性は、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）を使用して評価され得る。セルラーゼ酵素は、セルロースにおいてグルカン分子同士を連結している１，４−グルカン結合を迅速に加水分解することができる。ＣＭＣは、コンゴーレッド色素で染色され得るが、しかしながら、ＣＭＣは、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＥ１エンドグルカナーゼなどのセルラーゼ酵素によって加水分解されると、コンゴーレッドに対して反応性でなくなる。ＣＭＣは、ペトリ皿に注ぎ込まれてＣＭＣプレートを形成し得る固体培地を形成する寒天とともに使用してもよい（Ｍ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００，６：３７−４６；Ｔ．Ｔｅａｔｈｅｒら、Ａｐｐ．＆  Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８２，４３：７７７−７８０）。目的の遺伝子を発現するトランスジェニック植物を、このＣＭＣプレートの表面上に直接置き、そして、インキュベートし得る。インキュベートして、植物バイオマスを除去した後、そのＣＭＣプレートを、その培地中のセルロースを染色するためにコンゴーレッドで浸漬する。プレートがコンゴーレッドによって染色されていないこと（すなわち、ＣＭＣの加水分解）は、導入遺伝子の細胞内での酵素活性を示唆する。
【００８１】
Ｇ−植物における微生物のセルラーゼ酵素の発現を増加させるために遺伝子配列のコドンを最適化する方法
植物における微生物酵素の最適な発現のために、コドン配列を選択的に変化させることが重要である。本発明は、植物において微生物のセルラーゼの発現を増加させるために遺伝子配列を改変する方法を提供する。本発明の方法は、少なくとも２つの異なる植物の既知の配列決定されたゲノムのコドン使用頻度を平均することによって、複合コドン使用頻度表を構築することを含む。次いで、その複合コドン使用頻度表をテンプレートとして使用して、リグノセルロース分解性酵素をコードする微生物ポリヌクレオチド遺伝子配列のポリヌクレオチド配列を改変する。この方法により、植物において微生物酵素の発現により適したポリヌクレオチド配列を作製することが可能になる。
【００８２】
本発明の方法では、平均する工程は、２つ、３つ、４つまたは５つ以上の異なる植物のコドン使用頻度を使用して行われ得る。当業者が認識するように、本発明の方法は、任意の数の植物および任意の組み合わせの植物からのコドン使用頻度情報を使用して行われ得る。ある特定の実施形態において、植物は、少なくとも１つが単子葉植物であり、少なくとも１つが双子葉植物であるように選択される。ある特定の実施形態において、植物は、ポリヌクレオチドの意図される目的に基づいて選択される（例えば、トウモロコシおよびタバコにおける発現に使用されるべき微生物の遺伝子配列は、好ましくは、Ｚｅａ  ｍａｙｓおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのコドン使用頻度を平均することによって構築される複合コドン使用頻度表を使用して最適化されたコドンである）。
【００８３】
本発明の方法に従ってコドンが最適化された単離ポリヌクレオチド配列、ならびに、これらのコドンが最適化されたポリヌクレオチドを使用して形質転換された植物細胞、植物の一部および植物もまた本明細書中で提供される。
【００８４】
本発明の方法の１つの実施形態は、実施例８に記載され、そこでは、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのコドン使用頻度を平均することによって複合コドン使用頻度表を構築した。この方法を使用して、コドンが最適化された３つのポリヌクレオチドを作製した（実施例８を参照のこと）：配列番号１を含むＥ１エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド配列；配列番号２を含むファミリー４８グリコシド加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列；および、配列番号３を含むファミリー１０グリコシド加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列。
【００８５】
Ｈ−他の特性
ある特定の実施形態において、全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の０．５％を超えるレベルでリグノセルロース分解性酵素（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはリグニナーゼ）を発現するように植物を操作する。他の実施形態において、ＴＳＰの５％を超えるレベルでリグノセルロース分解性酵素を発現するように植物を操作する。さらに他の実施形態において、ＴＳＰの１０％を超えるレベルでリグノセルロース分解性酵素を発現するように植物を操作する。なおも他の実施形態において、ＴＳＰの２０％を超えるレベルでリグノセルロース分解性酵素を発現するように植物を操作する。高レベルの酵素産生によって、特に、上に記載したようなトランスジェニック植物品種の「混合物」において使用されるとき、各品種が、他方の品種ならびにそれ自体のバイオマス由来の標的リグノセルロースを加水分解する酵素を産生する場合に、より完全なリグノセルロース材料の分解がもたらされる。
【００８６】
例えば、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニン（これらは併せてトウモロコシ茎葉バイオマスの約７５％を占める）を標的化することによって、セルラーゼのみのアプローチと比べて、２倍を超えるリグノセルロースバイオマスが加水分解されると予想される。
【００８７】
植物において発現される酵素は、推定基質を加水分解することに加えて、他の多糖類に対する分解／加水分解効果も同様に有し得る。例えば、図１８は、植物において発現するＥ１能力が、キシロースレベルならびにグルコースレベルが上がるにつれて、セルロースだけでなくヘミセルロースの重合の程度（ＤＰ）を低下させることができることについて図示している。
【００８８】
本発明に従って、植物内に組み込まれた酵素遺伝子は、好ましくは２つの特性：それらの遺伝子が熱安定性であることと、所望のエタノール生産温度において最適な活性を示すこと、の両方を示す。利点としては、（１）通常の植物生長条件下では酵素活性が低いので、植物生長に対する有害作用（「収率の低下」）が回避または最小化されることおよび（２）植物において要求される酵素発現が低いために、同じ植物にさらなる酵素の特徴を付加する能力が高いことが挙げられる。
【００８９】
従って、本発明はまた、１つ以上のリグノセルロース分解性酵素が発現するように、そして少なくとも１つの望ましい特徴を示すように操作された植物も提供する（以下を参照のこと）。
【００９０】
ＩＩ．バイオマスを増加させ、花成を遅延させるための遺伝子
本発明は、バイオマスおよび／またはセルラーゼの植物生産が最大となるように、そして／または植物の花成を遅延させるように操作された（すなわち、遺伝的に形質転換された）植物を提供する。
【００９１】
栄養植物生長（すなわち、葉の生産）から繁殖状態（すなわち、花の生産）に移った後は、バイオマスとセルラーゼの生産の両方が低下する。それゆえ、花成の開始を遅延させることができるならば、その植物により長い生産的期間を付与することができるだろう。花成の遅延のさらなる利点は、遺伝的に改変された植物と天然の植物との花成時期が一致する可能性が低くなるので（すなわち、生物学的隔離（ｂｉｏｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ））、それらの他家受精の可能性が低下することである。
【００９２】
植物における花成時期の制御は、極めて複雑で、慎重に制御される植物生長プロセスであり、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて約８０個の遺伝子座が花成時期に影響することが知られている（Ｙ．Ｙ．Ｌｅｖｙ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８，１０：１９７３−１９９０）。この多因子性の管理モデルは、植物ホルモンおよび環境による合図をはじめとした種々の花成応答、ならびに、どのようにしてそれらが正しい環境下および内因性の条件下で生長から花成への移行を管理するために相互作用するのか、を考慮に入れるように試みられている。条件的長日植物であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでは、花成時期を制御する少なくとも４つの経路が同定されている。２つの経路は、環境からのシグナル（日長および春化、低温）を媒介するものであり、もう２つは、外部の環境シグナルとは無関係（自律的でジベレリン酸依存性）であり、植物の内因性の生長状態をモニターするとみられる（Ｙ．Ｙ．Ｌｅｖｙ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９８，１０：１９７３−１９９０）。
【００９３】
現在、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の重要な花成時期遺伝子の相互作用は、かなり良く理解されている。この生長プロセスを遅延させるためには、促進的な遺伝子を破壊することまたは抑制的な遺伝子の活性を増大することのいずれかによって、通常の情報の流れのバランスを崩す必要がある。これを行うための良好な候補は、インヒビターである花成遺伝子座Ｃ（Ｆｌｏｗｅｉｎｇ  Ｌｏｃｕｓ  Ｃ）遺伝子すなわちＦＬＣである。これは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける花成の用量依存的リプレッサーであり（Ｓ．Ｄ．Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ａｍａｓｉｎｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９９，１１：９４９−９５６）、ＳＯＣｌおよびＦＴなどの花成を促進する遺伝子の発現を負に制御することによって作用する。
【００９４】
ＦＬＣは、花成誘導における重要な調節性遺伝子の１つであり、自律的な花成経路（Ｄ．Ｔ．Ｒｏｕｓｅら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００２，２９：１８３−１９１；Ｈ．Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｓ．ｖａｎ  Ｎｏｃｋｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００２，３１：６６３−６７３）と春化経路（Ｈ．Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｓ．ｖａｎ  Ｎｏｃｋｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００２，３１：６６３−６７３；Ｊ．Ｍｏｏｎら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００３，３５：６１３−６２３）の両方からの応答を統合するものである。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＦＬＣ（ＡｔＦＬＣ）の発現は、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（Ｍ．Ｔａｄｅｇｅら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，２８：５４５−５５３）とイネ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（Ｍ．Ｔａｄｅｇｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．，２００３，１：３６１−３６９）の両方において花成を遅延させることが示されており、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＦＬＣのＢ．ｎａｐｕｓオルソログ（ＢｎＦＬＣ１−５）を発現させるという相反性実験によってもまた、有意に花成が遅延した（Ｍ．Ｔａｄｅｇｅら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，２８：５４５−５５３）。Ｂｒａｓｓｉｃａ（双子葉）やイネ（単子葉）くらい多様な種において花成を遅延させるＡｔＦＬＣの有効性は、花成誘導においてこの遺伝子産物の遍在性を強調するものである。重要なことには、ＦＬＣがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに導入されるとき、ＦＬＣは、長期間にわたる花成の遅延とともに、大量の葉をもたらした（Ｓ．Ｄ．Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ａｍａｓｉｎｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９９，１１：９４９−９５６）。このバイオマスの増加は、バイオ燃料およびファイトレメディエーションの用途に対して非常に望ましいことである。
【００９５】
以下の実施例の項に示されるように、本出願人は、タバコにおけるＡｔＦＬＣの発現が、花成を遅延させ、植物バイオマスを有意に増加させることを確認した。ゆえに、ＦＬＣが花成誘導抑制の際に中心的役割を果たすおかげで、ＦＬＣが、生物学的隔離の方法としてトウモロコシの花成を遅延させ、また、トウモロコシの植物バイオマスを増加させる理想的な選択候補となる。
【００９６】
従って、本発明は、ＦＬＣを発現するように、および、少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはリグニナーゼ）を産生するように操作された植物を提供し、その植物は、エタノール生産において有益に使用され得る。
【００９７】
少なくとも１つのリグノセルロース分解性酵素を産生するように操作され、そして総不稔（すなわち、生物学的隔離）のために改変（例えば、操作）された植物もまた本発明によって提供される。植物の総不稔を誘導するための遺伝子および技術は、当該分野で公知である。
【００９８】
ＩＩＩ．発酵遺伝子
１つの局面において、本発明は、植物の糖のアルコールへの発酵に関与する物質（例えば、酵素）および／または発酵プロセスを補助し得る物質を発現するように操作された（すなわち、遺伝的に形質転換された）植物を提供する。
【００９９】
例えば、酵母遺伝子は、植物のゲノムに組み込まれ得る。そのような遺伝子は、様々な酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸欠損株、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｊａｄｉｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｆａｂｉａｎｉｉおよびＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）から得ることができる。
【０１００】
五炭糖（例えば、ヘミセルロースの加水分解から生じるキシロースまたはアラビノース）をより容易に発酵される糖に変換する酵素を発現する遺伝子を組み込むことは、特に有益であり得る。エタノール生産に関与する発酵プロセスにおいて一般に使用されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、六炭糖のグルコース、ガラクトースおよびマンノースを発酵するが、１つ以上の酵素工程を欠いているので、五炭糖のキシロースおよびアラビノースを発酵することはできない。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、キシロースの異性化産物であるキシルロースをエタノールに発酵させることができる（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８０，９４：２４８−２５４；Ｃｈｉａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８１，４２：８４−２８９；Ｓｅｎａｃ  ａｎｄ  Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：１２０−１２６，１９９０）。ゆえに、キシロースをキシルロースに変換するイソメラーゼについての遺伝子を組み込むことによって、エタノール生産のために、ヘミセルロースをより効率的に使用することが可能になり、また、乾燥蒸留穀物（ＤＤＧ）中に残存する、発酵されない糖に関する問題を低減することが可能になる。
【０１０１】
真核細胞において、キシロースの最初の代謝は、キシロースをキシリトールに還元するキシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトールをキシルロースに酸化するキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）によって触媒される。次いで、キシルロースは、キシルロースキナーゼ（ＸＫ）によってキシルロース５−リン酸にリン酸化されて、五炭糖リン酸経路およびエタノールへの解糖を介してさらに代謝される。ＸＲおよびＸＨＤの供給源としては、キシロース発酵酵母であるＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｏｉｖｏｌａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８４，４７：１２２１−１２２３）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｅｈａｔａｅ（Ｊ．Ｃ．Ｄｕｐｒｅｅｚ  ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９８３，５：３５７−３６２）およびＰｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｇｒｏｏｔｊｅｎら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９０，１２：２０−２３）が挙げられ、これらは、広く特徴付けられている。キシロース発酵酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来のＸＲおよびＸＤＨに対する遺伝子は、クローニングされている（ＷＯ９１／１５５８８；Ｋｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｉｒｉａｃｙ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：７７６−７８３，１９９３およびこれらの文献に引用されている参考文献）。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック植物は、キシロースをキシルロースに変換する１つ以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子（例えば、ＸＲまたはＸＤＨをコードする遺伝子）を含むように操作されている。
【０１０３】
あるいは、または、さらに、本発明のトランスジェニック植物は、バイオマス原料からのエタノール生産に関与する発酵プロセスを補助し得る物質をコードする１つ以上の遺伝子を含むように操作され得る。そのような遺伝子の例としては、発酵プロセスにおいて使用される微生物が必要とする栄養分を植物が取り込むのを増大させる遺伝子（例えば、ＰＨＴ１またはＮＲＴ１）が挙げられる。発酵微生物の増殖を可能にする栄養分としては、例えば、マグネシウム、窒素、カリウム、リン酸、金属およびビタミンが挙げられる。適当な遺伝子の他の例としては、マッシュへの細菌の混入を防止する、耐熱性の抗生物質または細菌化合物を生成する遺伝子が挙げられる。ある特定の細菌は、酵母に対して有毒な酢酸および乳酸を蓄積し、これは、エタノール生産者にとって重要な問題を引き起こす。適当な遺伝子の他の例としては、加工（例えば、リグノセルロース分解性酵素による多糖類およびリグニンの加水分解）中にバイオマスマッシュの粘度を変化させる物質を生成する遺伝子が挙げられる。そのマッシュの標的粘度を維持することは、エタノール生産者の重要な目的である。
【０１０４】
ＩＶ．核酸構築物
本発明の実施において使用されるべき核酸構築物は、一般に、目的の植物における発現用の発現カセットを包含する。このカセットは、一般に、リグノセルロース分解性酵素（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはリグニナーゼ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された５’および３’制御配列を含む。
【０１０５】
発現カセット
酵素（例えば、リグノセルロース分解性酵素）をコードする遺伝子を単離またはクローニングするために使用される技術は、当該分野で公知であり、その技術としては、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製またはそれらの組み合わせが挙げられる。そのようなゲノムＤＮＡからの遺伝子のクローニングは、例えば、共有の構造的特徴を有するクローニングされたＤＮＡフラグメントを検出するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングまたは発現ライブラリーを使用することによって実施され得る（Ｉｎｎｉｓら、“ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。他の核酸増幅手順（例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ｌｉｇａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＬＡＴ）およびヌクレオチド配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ））を使用してもよい。
【０１０６】
発現カセットは、一般に、５’−３’方向の転写で、植物において機能する、転写開始領域および翻訳開始領域、リグノセルロース分解性酵素のためのコード配列ならびに転写終結領域および翻訳終結領域を含む。転写開始領域、すなわち、プロモーターは、ネイティブもしくは類似（すなわち、天然の植物に見られるもの）であり得るか、または、植物宿主にとって外来性もしくは異種（すなわち、天然の植物に見られないもの）であり得る。さらに、プロモーターは、天然配列あるいは合成配列であり得る。
【０１０７】
ある特定の実施形態において、プロモーターは、構成的植物プロモーターである。植物プロモーターの例としては、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター、ノパリンシンターゼのプロモーターおよびオクトピンシンターゼのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。植物において使用される他の構成的プロモーターの例は、１９Ｓプロモーターならびにアクチンおよびユビキチンをコードする遺伝子由来のプロモーターである。プロモーターは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによってゲノムＤＮＡから得、次いで、構築物にクローニングされ得る。
【０１０８】
核酸構築物内に存在し得る他の配列は、遺伝子発現を増大する配列（例えば、イントロン配列およびリーダー配列）である。発現を増大すると報告されているイントロンの例としては、トウモロコシのＡｄｈ１遺伝子のイントロンおよびトウモロコシのｂｒｏｎｚｅｌ遺伝子のイントロン（Ｊ．Ｃａｌｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１９８７，１：１１８３−１２００）が挙げられるが、これらに限定されない。発現を増大することが知られている非翻訳リーダー配列の例としては、タバコモザイクウイルス由来のリーダー配列（ＴＭＶ，「オメガ配列」）、トウモロコシ黄化斑ウイルス（Ｍａｉｚｅ  Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＣＭＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）（例えば、Ｄ．Ｒ．Ｇａｌｌｉｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７，１５：８６９３−８７１１；Ｊ．Ｍ．Ｓｋｕｚｅｓｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，１５：６５−７９を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
転写終結領域および翻訳終結領域は、転写開始領域とネイティブであり得るか、作動可能に連結された目的のポリヌクレオチド配列とネイティブであり得るか、または、別の起源に由来し得る。便利な終結領域は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ１−プラスミド（例えば、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼの終結領域（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９８９，１：１１５−１２２；Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９１，２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃｅｌｌ，１９９１，６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９９１，５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９０，２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら、Ｇｅｎｅ，１９９０，９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９８７，１５：９６２７−９６３９））から入手可能である。
【０１１０】
必要に応じて、目的の酵素をコードする遺伝子またはポリヌクレオチド配列は、形質転換された植物における発現に最適化されたコドンを含むように改変され得る（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９０，９２：１−１１；Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７：４７７−４９８；Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：２３６７ならびに米国特許第５，０９６，８２５号；同第５，３８０，８３１号；同第５，４３６，３９１号；同第５，６２５，１３６号、同第５，６７０，３５６号および同第５，８７４，３０４号）。コドンが最適化された配列は、合成配列であり、好ましくは、リグノセルロース分解性酵素をコードする、コドンが最適化されていない親ポリヌクレオチドによってコードされるものと同一のポリペプチド（または、完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する、完全長ポリペプチドの酵素的に活性なフラグメント）をコードする。
【０１１１】
他のポリヌクレオチド配列
核酸構築物の任意の構成要素としては、１つ以上のマーカー遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子は、マーカー遺伝子を発現する細胞に、明瞭な表現型を付与する遺伝子であり、ゆえに、形質転換された細胞と、マーカーを有しない細胞とを識別することが可能になる。そのような遺伝子は、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードし得る。その特徴的な表現型によって、その構築物を含んでいる、細胞、細胞群、組織、器官、植物の一部または植物体全体を同定することができる。適当なマーカー遺伝子の多くの例は、当該分野で公知である。そのマーカーはまた、トランスジェニック植物に対してさらなる利点（例えば、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、耐病性および環境ストレス（例えば、乾燥）に対する高い寛容性）も付与し得る。
【０１１２】
あるいは、マーカー遺伝子は、いくつかの他の可視的な反応性の応答をもたらし得る（例えば、マーカー遺伝子は、いくつかの物質の存在下、すなわち、それらが、植物もしくは植物細胞に直接適用されるとき、または、植物もしくは植物細胞の培養基中に存在するときに、選択可能なマーカー遺伝子を発現していない植物または植物細胞と比べて、色または生長パターンなどの特有の外観を引き起こし得る）。構築物内で適当なプロモーターに作動可能に連結されたアントシアニン生合成の転写活性化因子が、植物細胞の形質転換において、非植物毒性マーカーとして広範な有用性を有することは、現在、当該分野で周知である。
【０１１３】
除草剤に対する抵抗性をもたらすマーカーの例としては、除草剤グルホシネートに対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｗ由来のｂａｒ遺伝子；イミダゾリノン（ｉｍｉｄａｚａｌｉｎｏｎｅ）またはスルホニル尿素に対する抵抗性をコードする変異遺伝子（例えば、ＡＬＳ酵素およびＡＨＡＳ酵素の変異体をコードする遺伝子）（Ｌｅｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８８，７：１２４１；Ｍｉｋｉら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９０，８０：４４９；および米国特許第５，７７３，７０２号）；グリコホスフェート（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に対する抵抗性を付与する遺伝子（例えば、ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡの変異型）；Ｌ−ホスフィノスリシンに対する抵抗性を付与する遺伝子（例えば、グルタミン合成酵素遺伝子）；グルホシネートに対する抵抗性を付与する遺伝子（例えば、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴおよびｂａｒ）遺伝子）；およびフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｏｎｅ）に対する抵抗性を付与する遺伝子（例えば、ＡＣＣＡｓｅインヒビターをコードする遺伝子）（Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，８３：４３５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
害虫または病害に対する抵抗性を付与する遺伝子の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓタンパク質（例えば、デルタ−エンドトキシン）をコードする遺伝子（米国特許第６，１００，４５６号）；レクチンをコードする遺伝子（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，２４：８２５）；ビタミン結合タンパク質（例えば、害虫に対する殺幼虫剤として使用され得るアビジンおよびアビジンのホモログ）をコードする遺伝子；プロテアーゼまたはアミラーゼのインヒビターをコードする遺伝子（例えば、イネシステインプロテイナーゼインヒビター（Ａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２：１６７９３）およびタバコプロテイナーゼインヒビターＩ（Ｈｕｂｂら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２１：９８５））；昆虫特異的なホルモンまたはフェロモン（例えば、エクジステロイドおよび若年性ホルモンならびにそれらのバリアント、それらに基づく模倣剤またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニスト）をコードする遺伝子；発現すると害虫の生理機能を破壊する、昆虫特異的なペプチドまたは神経ペプチドをコードする遺伝子；昆虫特異的な毒液（例えば、スズメバチ、ヘビなどによって産生される）をコードする遺伝子；モノテルペン、セスキテルペン、アステロイド（ａｓｔｅｒｏｉｄ）、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する他の非タンパク質分子の蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子；生物学的に活性な分子の修飾に関与する酵素をコードする遺伝子（米国特許第５，５３９，０９５号）；シグナル伝達を刺激するペプチドをコードする遺伝子；疎水性モーメント（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｍｅｎｔ）ペプチド（例えば、真菌病原体を阻害するＴａｃｈｙｐｌｅｓｉｎの誘導体）をコードする遺伝子；膜パーミアーゼ、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤をコードする遺伝子（Ｊａｙｎｅｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，１９９３，８９：４３）；ウイルス侵襲性タンパク質またはそれらから誘導される複合毒素をコードする遺伝子（Ｂｅａｃｈｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，１９９０，２８：４５１）；昆虫特異的な抗体もしくは抗毒素またはウイルス特異的抗体をコードする遺伝子（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６６：４６９）；ならびに、病害を防止する、植物、病原体または寄生生物によって産生される、生長を引きつける（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ−ａｒｒｅｓｔｉｖｅ）タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
環境ストレスに対する抵抗性を付与する遺伝子の例としては、環境ストレス因子に対する抵抗性を付与する遺伝子であるｍｔｌｄおよびＨＶＡ１；乾燥、低温、塩ストレスまたはアブシジン酸への曝露に応答して誘導され、そして、植物がそのストレスを許容できるようにする親水性タンパク質をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの遺伝子であるｒｄ２９Ａおよびｒｄ１９Ｂ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９４，６：２５１−２６４）が挙げられるが、これらに限定されない。他の企図される遺伝子は、米国特許第５，２９６，４６２号および同第５，３５６，８１６号に見ることができる。
【０１１６】
組織特異的発現
ある特定の実施形態において、リグノセルロース分解性酵素発現を、トランスジェニック植物の特定の組織に標的化する。例えば、組織特異的発現は、子実または種子ではなく葉および茎において酵素を優先的に発現させるために行われ得る（これは、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）の人間の消費についての懸念を低下することができる）。組織特異的発現は、適切な基質に対する酵素の標的化発現をはじめとした他の利点も有する。
【０１１７】
組織特異的発現は、その遺伝子産物（例えば、リグノセルロース分解性酵素）が望ましくない組織においてのみ発現するアンチセンス遺伝子と組み合わせて、構成的に発現する遺伝子を導入することによって、機能的に達成され得る。例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターを使用して、すべての組織において発現するように、リグノセルロース分解性酵素をコードする遺伝子を導入してもよい。例えば、ゼインプロモーターを使用したトウモロコシ穀粒における遺伝子のアンチセンス転写物の発現は、リグノセルロース分解性酵素の種子中の蓄積を回避し得る。ゆえに、導入された遺伝子によってコードされる酵素は、穀粒を除くすべての組織に存在し得る。
【０１１８】
さらに、いくつかの組織特異的に制御される遺伝子および／またはプロモーターが、植物において報告されている。いくつかの報告されている組織特異的遺伝子としては、種子貯蔵タンパク質（例えば、ナピン（ｎａｐｉｎ）、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）、β−コングリシニンおよびファゼオリン）ゼインもしくは油体タンパク質（例えば、オレオシン）をコードする遺伝子または脂肪酸生合成に関与する遺伝子（アシルキャリアタンパク質、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ（ｆａｄ２−１）を含む）および胚の発生中に発現する他の遺伝子（例えば、Ｂｃｅ４）（Ｋｒｉｄｌら、Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，１：２０９）が挙げられる。報告されている組織特異的プロモーターの例としては、レクチン（Ｖｏｄｋｉｎ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１９８３，１３８：８７；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、Ｄｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９０，１１：１６０）、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（Ｄｅｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８４，１２：９８３）、トウモロコシ集光性複合体（Ｂａｎｓａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：３６５４）、トウモロコシ熱ショックタンパク質、エンドウマメ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ、Ｔｉプラスミドマンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼ、Ｔｉプラスミドノパリンシンターゼ、ペチュニアカルコンイソメラーゼ（ｖａｎ  Ｔｕｎｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８８，７：１２５）、マメグリシンリッチタンパク質１（Ｋｅｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９８９，３：１６３９）、切断型ＣａＭＶ３５ｓ（Ｏｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１３：８１０）、ジャガイモパタチン（Ｗｅｎｚｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８９，１３：３４７）、根細胞（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：７４４９）、トウモロコシゼイン（Ｒｅｉｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：６４２５；Ｋｒｉｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８７，２０７：９０；Ｗａｎｄｅｌｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７  ２３５４）、ＰＥＰＣアーゼ、Ｒ遺伝子複合体関連プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９８９，１：１１７５）およびカルコンシンターゼプロモーター（Ｆｒａｎｋｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：２６０５）が挙げられる。種子特異的発現に特に有用なのは、エンドウマメビシリンプロモーターである（Ｃｚａｋｏら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，２３５：３３）。
【０１１９】
細胞内特異的発現
いくつかの実施形態において、リグノセルロース分解性酵素発現を、特定の細胞内コンパートメントまたは細胞小器官（例えば、サイトゾル、液胞、核、小胞体、ミトコンドリア、アポプラスト、ペルオキシソームまたはプラスチド）に標的化する。リグノセルロース分解性酵素を特定の細胞コンパートメントまたは細胞小器官に方向づけることによって、その酵素が、植物生長中に基質と接触しないように局在させることができる。
この酵素がその基質に接触する（例えば、粉砕によって細胞の完全性を物理的に破壊した後に）まで、この酵素の酵素作用は生じない。
【０１２０】
特に、本発明は、１つ以上のリグノセルロース分解性酵素をアポプラスト、葉緑体および／または液胞において発現するように操作された植物を提供する。リグノセルロース分解性酵素の発現を細胞壁に（アポプラスト中として）標的化することによって、外部の酵素による効率的な加水分解を達成しにくくさせる、疎水性セルロースと親水性酵素との混合の困難さの克服を助けることができる。
【０１２１】
本発明は、１つのリグノセルロース分解性酵素（またはいくつかのリグノセルロース分解性酵素）を２つ以上の細胞内コンパートメントまたは細胞小器官において発現するように操作された植物を提供する。植物細胞内の様々な位置において、標的化されたプロモーターを使用することによって、植物において産生される酵素全体を増加させることができる。従って、例えば、植物において、Ｅ１遺伝子を伴うアポプラストプロモーターおよびＥ１遺伝子を伴う葉緑体プロモーターを使用することにより、その植物における単一のプロモーター／Ｅ１構築物に比べて、Ｅ１全体の産生が増加し得る。さらに、複数のリグノセルロース分解性酵素が発現する場合に、植物における様々な位置において、標的化されたプロモーターを使用することによって、複数の相乗的な酵素が細胞内に存在するときに生じるインビボでの（前加工時の）細胞壁の破壊を最小限にすることができる。例えば、エンドグルカナーゼとアポプラストプロモーターとを組み合わせること、ヘミセルラーゼと液胞プロモーターとを組み合わせることおよびエキソグルカナーゼと葉緑体プロモーターとを組み合わせることによって、各酵素が細胞の異なる部分に隔離され、上で列挙した利点が達成される。この方法は、単一の細胞小器官または細胞の位置において発現し得る酵素質量に対する限界を回避する。
【０１２２】
核でコードされるタンパク質（例えば、酵素）の細胞内での局在性は、そのタンパク質のアミノ酸配列によって決定されることが知られている。タンパク質のアミノ酸配列を変化させるような様式でそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を改変することによって、そのタンパク質の局在性を変化させることができる。任意の適当な方法によって、リグノセルロース分解性酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、コードされる酵素の細胞内の局在性を再指示するように変更することができる（Ｄａｉら、Ｔｒａｎｓ．Ｒｅｓ．，２００５，１４：６２７）。
【０１２３】
発現ベクター
本発明の核酸構築物は、ベクター内、例えば、プラスミド内にクローニングされ得る。植物細胞の形質転換に適したベクターとしては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴｉプラスミド（Ｊ．Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｈ．Ｆ．Ｌｏｄｉｓｈ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、β−グルクロニダーゼ遺伝子およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター＋アルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列を含むプラスミド（Ｊ．Ｃ．Ｓａｎｆｏｒｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２２：７５１−７６５）またはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターおよびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）リーダーの下流にクローニングされたｂａｒ遺伝子を含むプラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。他のプラスミドは、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）または他のＤＮＡ配列から得られたものなどのイントロンをさらに含み得る。ベクターのサイズは、制限因子ではない。
【０１２４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換における使用を意図した構築物については、そのプラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて複製することができる複製起点およびＥ．ｃｏｌｉにおいて機能的な高コピー数の複製起点を含み得る。このことにより、後で植物に導入するために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入する前にＥ．ｃｏｌｉにおいて導入遺伝子を容易に生成することおよび試験することが可能になる。耐性遺伝子（１つは、細菌におけるセレクション用の遺伝子（例えば、ストレプトマイシン）であり、もう１つは、植物において機能し得る遺伝子（例えば、カナマイシン耐性または除草剤抵抗性をコードする遺伝子）である）がベクター上に保持され得る。１つ以上の導入遺伝子を付加するための制限エンドヌクレアーゼ部位およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの導入機能によって認識されるときに、植物に導入されるＤＮＡ領域を区切る指向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）Ｔ−ＤＮＡボーダー配列もベクター上に存在する。
【０１２５】
核酸構築物および発現ベクターの調製方法は、当該分野で周知であり、いくつかの教科書（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒおよびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ，ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ’”，１９８４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９８９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されているのを見ることができる。
【０１２６】
トランスジェニック植物のさらに望ましい特性としては、様々な気候条件および土壌条件における生長に適応する能力；よく研究された遺伝モデルシステム；雄性（または総）不稔の花などの生物学的隔離の特徴の組み込み；ファイトレメディエーション特徴（例えば、汚染物質の過剰な蓄積、より多いバイオマスまたは汚染物質分解性菌根の促進）の組み込みが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２７】
Ｖ．トランスジェニック植物の作出
上に記載したものなどの核酸構築物を使用して、単子葉および双子葉をはじめとした任意の植物を形質転換することができる。いくつかの実施形態において、植物は、未開発地域の植物である。他の実施形態において、植物は、「バイオマスエネルギー」および／またはファイトレメディエーションのために特別に栽培される。本発明の方法において使用するのに適した植物の例としては、トウモロコシ、スイッチグラス、ソルガム、ススキ、サトウキビ、ポプラ、マツ、コムギ、イネ、ダイズ、ワタ、オオムギ、芝草、タバコ、タケ、ナタネ、テンサイ、ヒマワリ、ヤナギおよびユーカリが挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法を使用して、遺伝的に改変された植物、植物細胞、植物組織、種子などを得ることができる。
【０１２８】
本発明の形質転換は、任意の適当な方法によって行われ得る。ある特定の実施形態において、形質転換は、上に記載したような核酸構築物を植物細胞またはプロトプラストに導入することにより、安定的に形質転換された植物細胞またはプロトプラストを得る工程；および安定的に形質転換された植物細胞またはプロトプラストから植物体全体を再生する工程を含む。
【０１２９】
細胞の形質転換
核酸構築物を真核細胞に送達または導入することは、種々の方法のいずれかを使用して達成され得る。形質転換に使用される方法は、本発明にとって決定的なものではない。適当な手法としては、非生物学的方法（例えば、マイクロインジェクション、微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション、誘導性取り込み（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）およびエアロゾル・ビーム・インジェクション（ａｅｒｏｓｏｌ  ｂｅａｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））ならびに生物学的方法（例えば、直接的なＤＮＡの取り込み、リポソームおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換）が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞またはプロトプラストの効率的な形質転換をもたらす上記方法の任意の組み合わせもまた、本発明の実施において使用され得る。
【０１３０】
核酸構築物を植物細胞またはプロトプラストに導入する方法が、報告されている。例えば、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（Ｅｄｓ．），１９８９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ；“Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”，１９９５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；および米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，２４０，８５５号；同第５，３０２，５２３号；同第５，３２２，７８３号；同第５，３２４，６４６号；同第５，３８４，２５３号；同第５，４６４，７６５号；同第５，５３８，８７７号；同第５，５３８，８８０号；同第５，５５０，３１８号；同第５，５６３，０５５号；および同第５，５９１，６１６号）を参照のこと。
【０１３１】
特に、エレクトロポレーションは、植物細胞を形質転換するために使用されることが多い（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照のこと）。この方法は、一般に、ペクチン分解酵素に曝露することまたは制御された様式で機械的に傷つけることによるエレクトロポレーションによって、より形質転換しやすくなった、未熟な胚または他の組織化された組織由来の、もろい組織（例えば、細胞の懸濁培養物または胚形成カルス）または標的レシピエント細胞を使用して行われる。トウモロコシ（例えば、Ｋ．Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ，１９９２，４：１４９５−１５０５；Ｃ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，５５：１２１−１３１；および米国特許第５，３８４，２５３号を参照のこと）、コムギ、トマト、ダイズおよびタバコのインタクトな細胞が、エレクトロポレーションによって形質転換されている。例えば、Ｇ．Ｗ．Ｂａｔｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，１１１：３５９−３６６）によって概説されているように、エレクトロポレーションは、プロトプラストを形質転換するためにも使用され得る。
【０１３２】
形質転換の別の方法は、微粒子銃である（例えば、米国特許第５，５３８，８８０号；同第５，５５０，３１８号；および同第５，６１０，０４２号；ならびにＷＯ９４／０９６９９を参照のこと）。この方法では、核酸を粒子上または微粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）（例えば、タングステン、白金または金）上にコーティングまたは沈殿し、そしてそのコーティングされた微粒子を生細胞に発射することによって、その核酸を生細胞に送達する。微粒子銃技術は、広く適用可能であり、実質的に任意の単子葉植物種または双子葉植物種を形質転換するために使用され得る（例えば、米国特許第５，０３６，００６号；同第５，３０２，５２３号；同第５，３２２，７８３号および同第５，５６３，０５５号；ＷＯ９５／０６１２８；Ａ．Ｒｉｔａｌａら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４，２４：３１７−３２５；Ｌ．Ａ．Ｈｅｎｇｅｎｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２３：６４３−６６９；Ｌ．Ａ．Ｈｅｎｇｅｎｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２２：１１０１−１１２７；Ｃ．Ｍ．Ｂｕｉｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｂｅｎｂｏｗ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９４，２４３：７１−８１；Ｃ．Ｓｉｎｇｓｉｔら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１９９７，６：１６９−１７６を参照のこと）。
【０１３３】
植物細胞におけるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換の使用は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号を参照のこと）。この方法は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコをはじめとした双子葉植物の形質転換において長く使用されており、最近では、単子葉植物（例えば、イネ、コムギ、オオムギおよびトウモロコシ）に対しても適用可能になっている（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号を参照のこと）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換が有効である植物系統では、容易であり、また、遺伝子導入の性質が規定されているので、この方法が好まれることが多い。植物細胞のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換は、２相において行われる。第１には、クローニングおよびＤＮＡ改変の工程が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて行われ、次いで、目的の遺伝子構築物を含むプラスミドを熱ショック処理によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入し、得られたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を使用して、植物細胞を形質転換する。
【０１３４】
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションおよびこれらの処理の組み合わせに基づく方法を使用して達成され得る（例えば、Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８５，１９９：１６９−１７７；Ｍ．Ｅ．Ｆｒｏｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３１：７９１−７９３；Ｊ．Ｃａｌｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９８７，１：１１８３−１２００；Ｓ．Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２１：４１５−４２８を参照のこと）。
【０１３５】
例えば、Ｍ．Ｒａｋｏｃｚｙ−Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００２，７：８４９−８５８）によって概説されている植物細胞の形質転換の代替方法もまた、本発明の実施において使用され得る。
【０１３６】
宿主植物細胞またはプロトプラストへの核酸構築物の送達の成功は、予備的に視覚的に評価され得る。安定的に形質転換された植物細胞のセレクションは、例えば、通常では抑制性のいくつかの薬剤（例えば、抗生物質または除草剤）に対する抵抗性を付与するマーカー遺伝子を含む核酸構築物を細胞に導入することによって行われ得る。使用され得る抗生物質の例としては、アミノグリコシド抗生物質であるネオマイシン、カナマイシンおよびパロモマイシンまたは抗生物質であるハイグロマイシンが挙げられる。使用され得る除草剤の例としては、ホスフィノスリシンおよびグリホサートが挙げられる。次いで、潜在的に形質転換された細胞を選択的な薬剤に曝露する。抵抗性付与遺伝子が組み込まれ、細胞生存を可能にするのに十分なレベルで発現する細胞は、概して、生存細胞集団内に存在する。
【０１３７】
あるいは、本発明の核酸配列を含み、その遺伝子産物を発現する宿主細胞は、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ手法（例えば、核酸もしくはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液もしくはチップをベースとした技術）をはじめとした、種々の手順によって同定され、セレクションされ得る。
【０１３８】
植物細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＤ）をはじめとした多岐にわたる供給機関、または、例えば、Ａ．Ａｔｌｅｅ  Ｂｕｒｐｅｅ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏ．（Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）、Ｐａｒｋ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏ．（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ＳＣ）、Ｊｏｈｎｎｙ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏ．（Ａｌｂｉｏｎ，ＭＥ）またはＮｏｒｔｈｒｕｐ  Ｋｉｎｇ  Ｓｅｅｄｓ（Ｈａｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＳＣ）をはじめとした多くの種苗会社のいずれかから入手可能である。有用な宿主細胞に関する説明および供給機関は、Ｉ．Ｋ．Ｖａｓｉｌ，“Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ”，Ｖｏｌ．Ｉ、ＩＩおよびＩＩ；１９８４，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒ．Ａ．Ｄｉｘｏｎら、“Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，１９８５，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ならびにＧｒｅｅｎら、“Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにも見られる。
【０１３９】
本発明に従って安定的に形質転換された植物細胞またはプロトプラストは、本明細書中で提供される。
【０１４０】
植物再生
植物では、すべての細胞が、成熟植物に再生することができ、さらに、その植物の次の世代が目的の導入遺伝子を含むように生殖細胞系に導くことができる。安定的に形質転換された細胞を、従来の方法に従って植物に生長させ得る（例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９８６，５：８１−８４を参照のこと）。培養プロトプラストからの植物再生は、例えば、Ｅｖａｎｓら、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ”，Ｖｏｌ．１，１９８３，ＭａｃＭｉｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＩ．Ｒ．Ｖａｓｉｌ（Ｅｄ．），“Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ”，Ｖｏｌ．Ｉ（１９８４）およびＶｏｌ．ＩＩ（１９８６），Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ：Ｏｒｌａｎｄｏに記載されている。
【０１４１】
再生のための手段は、植物の種ごとに異なるが、一般に、形質転換されたプロトプラストの懸濁液または形質転換された外植片を含むペトリ皿をまず準備する。カルス組織が形成され、カルスからシュート、続いて根が誘導され得る。あるいは、体細胞胚の形成がカルス組織において誘導され得る。これらの体細胞胚は、植物を形成する天然の胚として発芽する。一般に、培養液は、様々なアミノ酸および植物ホルモン（例えば、オーキシンおよびサイトカイニン）を含む。グルタミン酸およびプロリンもまた、その培養液に添加され得る。効率的な再生は、一般に、培養液、遺伝子型および培養の経歴に依存する。
【０１４２】
トランスジェニック植物の植物体全体を得るための、形質転換された個別の細胞からの再生は、数多くの植物において可能であることが示されている。例えば、双子葉植物（例えば、リンゴ；Ｍａｌｕｓ  ｐｕｍｉｌａ；ブラックベリー，Ｒｕｂｕｓ；ブラックベリー／ラズベリー雑種，Ｒｕｂｕｓ；レッドラズベリー，Ｒｕｂｕｓ；ニンジン；Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ；カリフラワー；Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ；セロリ；Ａｐｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ；キュウリ；Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ；ナス；ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ；レタス；Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ；ジャガイモ；Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ；ナタネ；Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ；ダイズ（野生種）；Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｃａｎｅｓｃｅｎｓ；イチゴ；Ｆｒａｇａｒｉａ  ｘ  ａｎａｎａｓｓａ；トマト；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ；クルミ；Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ；メロン；Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ；ブドウ；Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ；マンゴー；およびＭａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）ならびに単子葉植物（例えば、イネ；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ；ライムギ，Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ；およびトウモロコシ）において再生が実証されている。
【０１４３】
次いで、最初のトランスジェニック植物を従来の方法を使用して生育させ得る。植物栽培のための様々な手法は、当該分野で周知である。植物は、土壌において生長し得るし、あるいは、水耕法でも生長し得る（例えば、米国特許第５，３６４，４５１号；同第５，３９３，４２６号；および同第５，７８５，７３５号を参照のこと）。最初のトランスジェニック植物は、同じ形質転換系統または異なる系統と受粉し得、所望の表現型特徴を有する雑種が同定され、選抜される。２世代以上を生長させることにより、対象の表現型特徴が、確実に安定的に維持され、遺伝し、そして確実に所望の表現型または他の特性が達成された種子を収穫する。
【０１４４】
当該分野で周知のとおり、植物は、様々な培地（例えば、土壌、生長溶液または水）において生長し得る。
【０１４５】
上記構築物を用いて形質転換された植物の選抜は、任意の適当な方法、例えば、ノーザンブロット、サザンブロット、除草剤抵抗性スクリーニング、抗生物質耐性スクリーニングまたはこれらのもしくはその他の方法の任意の組み合わせによって行われ得る。サザンブロットおよびノーザンブロットの手法は、それぞれ、目的の核酸配列およびそれに対応するＲＮＡの存在（植物組織中の）について試験するものであり、標準的な方法である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒを参照のこと）。
【０１４６】
ＶＩ．本発明のトランスジェニック植物の用途
本明細書中に開示されるトランスジェニック植物およびトランスジェニック植物の一部は、種々の応用法において有利に使用され得る。より詳細には、本発明は、バイオマスの増加とリグノセルロース分解性酵素の発現の増大の両方のために遺伝的に操作された植物に関する本発明によって、エタノール生産、ファイトレメディエーションおよび水素生産をはじめとした種々の応用法における下流のプロセスの技術革新および／または改良がもたらされる。
【０１４７】
Ａ−エタノール生産
本発明に従って形質転換された植物は、エタノール収率を上昇させる手段、バイオマスの糖化のために酸／熱による前処理の必要性を低下させることによって前処理コストを削減する手段；ならびに／または、例えば、商業的に価値ある副産物の複数の応用法および単離を可能にすることによって他の植物の生産コストおよび加工コストを削減する手段を提供する。
【０１４８】
植物の栽培。上ですでに述べたように、農業家は、本発明の様々なトランスジェニック植物（例えば、異なる品種のトランスジェニックトウモロコシ、各々が、リグノセルロース分解性酵素または酵素の組み合わせを発現する）を生育することができるのと同時に、種子の比を変化させることによって産生される所望の酵素の「混合」が達成される。
【０１４９】
植物の収穫。本発明のトランスジェニック植物は、当該分野で公知のとおりに収穫され得る。例えば、現在の手法では、子実の収穫と同時にトウモロコシ茎葉を切断し得るが、茎葉は、後で回収するために圃場に放置する。しかしながら、茎葉によって集められる汚れは、リグノセルロース材料からのエタノール生産を妨害し得る。本発明は、トランスジェニック植物を、土壌との接触を最小限にするように、切断、回収、貯蔵および輸送する方法を提供する。汚れによるエタノール生産の妨害を最小限にすることに加えて、この方法は、収穫コストおよび輸送コストの削減をもたらし得る。
【０１５０】
前処理。従来の方法は、物理的、化学的および／または生物学的な前処理を含む。例えば、物理的前処理手法としては、様々なタイプの粉砕、圧壊、照射、蒸熱／蒸気爆発および水熱分解（ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｓ）の１つ以上が挙げられ得る。化学的前処理手法としては、酸、アルカリ、有機溶媒、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素およびｐＨ制御性水熱分解が挙げられ得る。生物学的前処理手法は、リグニン可溶化微生物の適用を含み得る（Ｔ．−Ａ．Ｈｓｕ，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ”，ＣＥ．Ｗｙｍａｎ（Ｅｄ．），１９９６，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１７９−２１２；Ｐ．Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｎｇｈ，Ａ．，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，３９：２９５−３３３；Ｊ．Ｄ．ＭｃＭｉｌｌａｎ，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｅｌｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｍ．Ｈｉｍｍｅｌら、（Ｅｄｓ．），１９９４，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５６６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｂ．Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，１９９６，１８：３１２−３３１；およびＬ．Ｖａｌｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｅ．Ｌ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９０，４２：６３−９５）。前処理工程の目的は、リグニンおよび炭水化物の構造を破壊して、セルロース画分をセルロース分解性酵素に接近させることである。
【０１５１】
本発明の１つ以上のセルラーゼ、１つ以上のヘミセルラーゼおよび／または１つ以上のリグニナーゼを発現するトランスジェニック植物を同時に使用することによって、バイオマスの高額な粉砕が減少または削除され、セルロースを加水分解する前にセルロースからリグニンおよびヘミセルロースを取り出すために必要な熱および強酸の必要が減少または削除される。それゆえ、本発明は、既存の前処理方法の改善を提供する。そのような改善としては、バイオマス粉砕の減少、バイオマス粉砕の削除、前処理温度の低下、前処理における加熱の削除、前処理工程における酸の強度の低下、前処理工程における酸の削除およびそれらの任意の組み合わせの１つ以上が挙げられ得る。
【０１５２】
ある特定の実施形態において、前処理された材料は、さらなる操作なしに糖化に使用される。他の実施形態において、リグノセルロース分解性酵素を含む抽出物を生産するように、植物組織を加工することが望ましい場合がある。この場合、抽出は、植物組織からの活性な酵素の抽出に好ましく、そして／またはリグノセルロースバイオマス中の細胞壁多糖類の分解を増強する当該分野で公知の成分の存在下で行われる。そのような成分としては、塩、キレート剤、界面活性剤、酸化防止剤、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、残存する植物組織を前処理プロセスに供し得る。
【０１５３】
糖化。糖化（または酵素的加水分解）では、前処理された材料中に存在するリグノセルロース分解性酵素によって、リグノセルロースを発酵可能な糖に変換する。所望であれば、外部のセルロース分解性酵素（すなわち、加工されたトランスジェニック植物によって産生されたものではない酵素）をこの混合物に加えてもよい。上で記載されたように得られたリグノセルロース分解性酵素を含む抽出物を、糖化の前に、リグノセルロースバイオマスに加えることができる。ここで、再度、外部のセルロース分解性酵素を糖化反応混合物に加え得る。
【０１５４】
糖化は、一般に、制御されたｐＨ、温度および混合条件の下で撹拌槽型反応器または発酵槽において行われる。糖化工程は、最長で２００時間続くことがある。糖化は、約３０℃〜約６５℃、特におよそ５０℃、および約４〜約５の範囲のｐＨ、特におよそｐＨ４．５で行われ得る。糖化は、前処理した材料全体において行われ得る。
【０１５５】
本出願人は、Ｅ１を形質転換した植物にセルラーゼを加えることが、非トランスジェニック植物にセルラーゼを加えるときよりもグルコース生産全体を増加させることを示しており、これは、単純に、現在の外部のセルラーゼ手法とともにトランスジェニックＥ１植物を使用することによって、エタノール収率を実質的に上昇させることができることを示唆する。この実験はまた、セルラーゼをＥ１植物に加えることによって、セルラーゼを非トランスジェニック植物に加えるときよりもグルコース生産全体が増加することも示唆する。これは、単純に、現在の外部のセルラーゼ手法とともにトランスジェニックＥ１植物を使用することによって、前処理プロセスの存在下または非存在下でエタノール収率を実質的に上昇させることができることを示唆するので、これは重要な結果である。
【０１５６】
発酵。発酵工程では、前処理および酵素的加水分解工程の結果としてリグノセルロースから放出された糖を、発酵微生物（例えば、酵母および／または細菌）によって１つ以上の有機物質、例えば、エタノールに発酵する。この発酵はまた、制御されたｐＨ、温度および混合条件の下で、同じ容器内で酵素的加水分解と同時に行われ得る。糖化および発酵が、同じ容器内で同時に行われるとき、このプロセスは、一般に、同時糖化発酵またはＳＳＦと呼ぶ。
【０１５７】
発酵微生物およびエタノール生産においてそれらを使用するための方法は、当該分野で公知である（Ｓｈｅｅｈａｎ，“Ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｇｒａｍ”：“Ｇｌｕｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ”，．ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ７６９，２００１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。バイオマスとしてトウモロコシ子実を利用する既存のエタノール生産方法は、代表的には、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株の使用を含む。本発明の方法では、そのような株を利用し得る。そのような株は、セルロースおよび／またはデンプンの分解から得られるグルコースからのエタノールの生産に好ましいことがあるが、本発明の方法は、特定の微生物もしくはそれらの株または前記微生物および前記株の任意の特定の組み合わせの使用に依存しない。
【０１５８】
酵母または他の微生物は、代表的には、加水分解産物に加えられ、発酵は、２４〜９６時間（例えば、３５〜６０時間）進められる。発酵の温度は、代表的には、２６〜４０℃（例えば、３２℃）かつｐＨ３〜６（例えば、約ｐＨ４〜５）である。
【０１５９】
発酵刺激物質を使用して、発酵プロセス、特に、発酵微生物の能力（例えば、速度上昇およびエタノール収率）をさらに改善してもよい。増殖のための発酵刺激物質としては、ビタミンおよびミネラルが挙げられる。ビタミンの例としては、マルチビタミン、ビオチン、パントテネート、ニコチン酸、メソイノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラアミノ安息香酸、葉酸、リボフラビンならびにビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが挙げられる（Ａｌｆｅｎｏｒｅら、“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ａ  ｖｉｔａｍｉｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｐｒｏｃｅｓｓ”，２００２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。ミネラルの例としては、リン酸、カリウム、マンガン、硫黄、カルシウム、鉄、亜鉛、マグネシウムおよび銅を含む栄養分を供給し得るミネラルおよびミネラルの塩が挙げられる。
【０１６０】
回収。発酵（またはＳＳＦ）の後、マッシュを蒸留してエタノールを抽出する。純度が９６体積％よりも高いエタノールを得ることができる。
【０１６１】
副産物。リグノセルロースの原材料の加水分解プロセスもまた、発酵プロセスに対して抑制性である副産物（例えば、弱酸、フランおよびフェノール化合物）を放出する。そのような副産物を除去することにより、発酵が向上し得る。特に、糖化されたセルロースバイオマス由来のリグニンおよびリグニン分解産物（酵素活性および他の加工活性によって生成されたもので、例えば、フェノール）は、発酵の速度を上げることおよび最適な粘度を維持することにとって重要であり得る。
【０１６２】
従って、別の局面において、本発明は、発酵の速度を上げる方法を提供し、その方法は、発酵され得ない酵素プロセスの生成物を加水分解産物から除去する工程を含む。そのような生成物としては、リグニン、リグニン分解産物、フェノールおよびフランが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、発酵され得ない酵素プロセスの生成物を分離し得、その後使用し得る。例えば、その生成物を燃焼することにより、エタノール生産のいくつかの工程（例えば、糖化、発酵およびエタノール蒸留）において必要とされる熱を提供することができ、それによって、現在の外部のエネルギー供給源（天然ガスなど）の必要性を低下させることによってコストが削減され得る。あるいは、そのような副産物は、商業的な価値を有し得る。例えば、フェノールは、プラスチックから医薬品および農薬といった多岐にわたる応用法における化学中間体としての応用法があり得る。アルデヒド類（例えば、メタナール）と縮合したフェノールは、電気的な装置において、そして木製品（例えば、合板および中質繊維板（ＭＤＦ））を製造する際の結合剤として使用されるプラスチックの基礎である樹脂化合物を生成する。
【０１６３】
加水分解産物からの副産物の分離は、副産物（例えば、リグニンおよびフェノール）の様々な化学的および物理的特性に依存する種々の化学的および物理的手法を使用して行われ得る。そのような手法としては、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手順（例えば、調製用等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば、硫安塩析）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、蒸留または抽出が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
フェノールなどの一部の加水分解副産物またはメタノールなどの発酵／加工産物を、エタノール変性剤として使用することができる。現在未許可の非燃料使用を回避するために、アルコール・タバコ・火器局（Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌ，Ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅａｒｍｓ）の規制の下、約５％ガソリンを変性剤として蒸留エタノールに直ちに加える。これには、ガソリンをエタノール生産プラントに輸送し、次いで、エタノールを含むガソリンを精製所に送り返す必要がある。また、ガソリンは、性能を向上させるためにより高いエタノールの圧縮比およびより多いオクタンを使用するエタノール向けに最適化されたエンジンの使用を妨害する。トランスジェニック植物から得られたフェノールおよび／またはメタノールを、ガソリンの代わりに変性剤として使用することによって、コストを削減することができ、また、自動車エンジン設計の選択肢を増やすことができる。
【０１６５】
リグニン含有量の低下。加水分解産物中の発酵不可能なリグニンおよびリグニン分解産物を減少させる別の方法は、本発明のトランスジェニック植物におけるリグニン含有量を低下させることである。そのような方法は、すでに開発されており、その方法を使用して、本発明の植物を改変することができる（例えば、米国特許第６，４４１，２７２号および同第６，９６９，７８４号、米国特許出願番号２００３−０１７２３９５、ＵＳおよびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／７１６７０を参照のこと）。
【０１６６】
デンプンの加水分解とセルロース分解性材料の加水分解との併用。本明細書中に開示されるトランスジェニック植物およびトランスジェニック植物の一部は、エタノール収率を上昇させるために、デンプンの加水分解とセルロース材料の加水分解とを併用することを含む方法において使用され得る。これらの方法は、エタノールの高収率を提供することに加えて、既存のデンプンベースのエタノール加工設備において行うことができる。
【０１６７】
デンプンは、発酵のための個別のグルコース分子に容易に加水分解されるグルコースポリマーである。デンプンの加水分解は、デンプン分解性の微生物または酵素（例えば、アミラーゼ酵素）の存在下で行われ得る。本発明のある特定の実施形態において、デンプンの加水分解は、少なくとも１つのアミラーゼ酵素の存在下で行われる。適当なアミラーゼ酵素の例としては、α−アミラーゼ（アミロースのα（１−４）グリコシド結合をランダムに切断して、デキストリン、マルトースまたはグルコース分子を生成する）およびグルコアミラーゼ（アミロースおよびアミロペクチンのα（１−４）およびα（１−６）グリコシド結合を切断して、グルコースを生成する）が挙げられる。
【０１６８】
本発明の方法において、デンプンの加水分解およびセルロース材料の加水分解は、同一条件下で（例えば、デンプンの加水分解に通常使用される条件下で）、同時に（すなわち、同じ時に）行われ得る。あるいは、加水分解反応は、連続的に行われ得る（例えば、リグノセルロースの加水分解は、デンプンの加水分解の前に行われ得る）。デンプンとセルロースの材料とが同時に加水分解されるとき、その条件は、好ましくは、デンプン分解を促進し、そしてリグノセルロースの分解に対するリグノセルロース分解性酵素を活性化するように選択される。そのような条件を最適化するために変更され得る因子としては、植物または植物の一部の物理的加工および反応条件（例えば、ｐＨ、温度、粘度、加工時間およびデンプン加水分解のためのアミラーゼ酵素の添加）が挙げられる。
【０１６９】
本発明の方法は、トランスジェニック植物（または植物の一部）単独、または、非トランスジェニック植物（または植物の一部）と本発明に従って形質転換された植物（または植物の一部）との混合物を使用し得る。適当な植物としては、デンプンベースのエタノール生産に使用され得る任意の植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、キャッサバなど）が挙げられる。例えば、本発明の方法は、トウモロコシ子実からのエタノール収率を上昇させるために使用され得る。
【０１７０】
Ｂ−ファイトレメディエーション
上ですでに述べたように、リグノセルロース分解性酵素の発現とバイオマスの増加の両方のために遺伝的に形質転換された本発明のトランスジェニック植物は、バイオエネルギー生産とファイトレメディエーションのために同時に使用され得る。
【０１７１】
汚染物質除去速度は、バイオマスならびに生物濃縮の関数（植物中の汚染物質と土壌中の汚染物質との比）であるので、バイオエネルギーのために求められる高いバイオマス収量は、金属、メタロイドおよび放射性核種のファイトレメディエーションにおいても望ましい。さらに、埋立の負担を最小限にする、汚染バイオマスの処分の新規方法が、探されている。現在の処理方法は、植物バイオマスから回収された金属の６０〜９０％を除去することができ（Ｅｄｅｎｓｐａｃｅ，非公開データ）、いくつかの汚染物質については、処理されたバイオマスを無害廃棄物として処分するには不十分である。金属は、代表的には、細胞壁内に隔離されており、現在の手法の使用では、コスト効率よく分解することが困難である。１次細胞壁および２次細胞壁中のセルロースは、代表的には、植物乾燥重量の３５〜５０％を占める（Ｂ．Ｂ．Ｂｕｃｈａｎａｎら、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ”，２０００，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）。
【０１７２】
安価なセルラーゼを用いて細胞壁を分解する能力は、バイオエネルギー用のきれいな市場性の高い原料を生産しながら、回収された金属のリサイクルを可能にするファイトレメディエーション作物からの汚染物質回収における当該分野の現在の状況を著しく改善することができ、汚染バイオマスの処理によって、埋立処分に関連するコストおよび責務が低下し得る。重要なことには、バイオマスの生産コストおよび処理コストのほとんどが、ファイトレメディエーションプロジェクトによってまかなわれ得るので、セルラーゼおよび本発明の加水分解されたバイオエネルギー原料を生産する限界費用をかなり低くできる。バイオ燃料作物専用することに対する重大なコストの問題（Ｂ．Ｓ．Ｈｏｏｋｅｒら、“Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ”，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，２００１，７６９：５５−９０）があるとはいえ、作物の栽培コストをまかない、１エーカーあたり＄１５０〜＄２００の利益を農業家にもたらすために必要な金額は、代表的には１エーカーあたり＄１０，０００以上の環境改善予算のほんの一部である（Ｄ．Ｊ．Ｇｌａｓｓ，Ｕ．Ｓ．ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｋｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，１９９９−２０００，１９９９，ｐｐ．１１２−１１４）。
【０１７３】
以下の実施例の項に報告されるように、本出願人は、植物バイオマスからの収穫後の金属の回収の増大および重金属を含む材料の正常なセルラーゼ活性の増大を含む、Ｅ１タバコの許容可能なファイトレメディエーションの能力を実証した。
【０１７４】
Ｃ−水素生産
バイオマスからの水素生産に関する米国国立再生可能エネルギー研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）による２００２年２月の報告では、短期から中期において、バイオマスからの水素の生産は、他の再生可能なプロセス（例えば、太陽光もしくは風力による電気分解または光生物学的な水分解）からの生産よりも実行可能であることが示唆されている（Ｔ．Ａ．Ｍｉｌｎｅら、Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｍａｓｓ：ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＩＥＡ／Ｈ２−ＴＲ−０２／００１，Ｆｅｂ．１，２００２）。この報告では、バイオマスからの水素生産は、現在、独立型水素のために改質している天然ガス蒸気と経済的に対抗していないとも講評されており、その理由の一部は、バイオマスのエネルギー含有量が比較的低く、バイオマスの酸素含有量が高いからである。また、この報告は、複数の生成物が、コストを分担しながら、財源のさらなる供給源を提供することによって生産経済を改善するので、将来の研究の焦点は、共同生産の機会の検証および発展であるべきだと示唆している。米国学術研究会議（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）による２００４年の報告でも、植物バイオマスからの水素生産のコストを削減するために、潜在的な共同生産の機会が重要であること、ならびに、原料として穀物の残余部分（例えば、トウモロコシの茎葉）を使用する方法を探索することが望ましいと述べられている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ．Ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｅｃｏｎｏｍｙ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，ｃｏｓｔｓ，ｂａｒｒｉｅｒｓ，ａｎｄ  Ｒ＆Ｄ  ｎｅｅｄｓ，２００４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ５  １０１−１０３）。２００４年に、諮問委員会は、その推奨研究計画を更新し、米国エネルギー省および米国農務省がセルロースのＲ＆Ｄプログラムに対する財政的支援を著しく増加させることを特に推奨している（Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＢＲＤＴＡＣ），Ｓｕｍｍａｒｙ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ，Ｊｕｌｙ  ２００４）。
【０１７５】
従って、別の局面において、本発明は、バイオマスベースの水素の生産において、リグノセルロース分解性酵素の発現とバイオマスの増加の両方のために形質転換されたトランスジェニック植物を使用することを提供する。例えば、大規模なファイトレメディエーションプロジェクトによって生産されるバイオマスならびに肥料の流出を減少させるために広く使用されるスイッチグラスおよび他の「バリアーストリップ」作物から生産されるバイオマスは、バイオマスベースの水素の生産者にとって、安価なセルラーゼおよびバイオエネルギー原料の重大な供給源であり得る。バイオマス生産のコストおよび収穫後の処理コストをファイトレメディエーションと分担することによって、バイオ燃料用に加水分解された原材料を生産するコストは、劇的に低下し得、水素燃料のコスト競争力を上昇させていく重要な工程である。
【実施例】
【０１７６】
（実施例）
以下の実施例では、本発明を作製し、そして実施する好ましい様式のいくつかを説明する。しかしながら、これらの実施例は、例示の目的のみであって、本発明の範囲を限定すると意味しないことが理解されるべきである。さらに、実施例中の記載が、過去形で示されていない限り、本明細書の他の部分と同様にその文言は、実験を実際に行ったか、またはデータを実際に得たことを示唆すると意図しない。
【０１７７】
本項で記載される結果のいくつかは、最近公開が承諾された原稿に示されている（Ｈ．Ｓａｌｅｈｉら、“Ｄｅｌａｙ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｌｏｒａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ＦＬＣ“ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｃ”，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００５，１６２：７１１−７１７；およびＨ．Ｓａｌｅｈｉら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｌｏｃｕｓ  Ｃ  ｉｎ  ａｎ  Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｅｎｄｏ−１，４−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（Ｅ１）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ  Ｌ．）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｄｅｌａｙ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｓｓ”，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−ＰＬＡＮＴ，２００５）。これらの各原稿は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１７８】
（実施例１：トランスジェニックタバコの作出）
トランスジェニックタバコを作出するために、以下に記載するように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用し、Ｅ１遺伝子およびＡｔＦＬＣ遺伝子を用いて野生型タバコを形質転換させた。
【０１７９】
ドナーの説明。エンド−１，４−β−グルカナーゼＥ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３３２１２）を好熱性細菌Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓから単離した。この細菌は、Ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｒｋの酸性温泉における腐敗中の木から初めて単離され、コレクション番号４３０６８としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託された（Ａ．Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂａｃｅｒｉｌ．，１９８６，３６：４３５−４４３；Ｔｕｃｋｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８９，７：８１７−８２０）。本明細書中ですでに述べたように、この細菌は、植物セルロースを加水分解し、分解する能力を有すると特徴付けられている。
【０１８０】
タバコへの形質転換に向けて、アクセッション番号Ｕ３３２１２に収載されている９５０〜２０２０ｂｐを含むＥ１触媒ドメインをゲノム配列から単離した。Ｅ１触媒構築物を作製するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｅ１のＶａｌ−３５８を特定するコドンのうしろに終止コドンを導入し、そして、そのタンパク質をアポプラストに対して標的化するために、その遺伝子の５’末端をダイズ栄養貯蔵タンパク質ＶＳＰβ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６９８０）のアミノ末端の２１アミノ酸に融合した（Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ，２００１，８：１４７−１５８）。クローニングの目的で、ＳａｃＩ部位を、終止コドンの後のＥ１遺伝子の３’末端に付加し、ＶＳＰβ配列の５’末端にＸｂａＩ部位を付加した。
【０１８１】
インヒビターである花成遺伝子座Ｃ遺伝子すなわちＦＬＣ（アクセッション＃  ＢＫ０００５４６）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける花成の用量依存性リプレッサーであり（Ｓ．Ｄ．Ｍｉｃｈａｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ａｍａｓｉｎｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９９，１１：９４９−９５６）、花成を促進する遺伝子（例えば、ＳＯＣｌおよびＦＴ）の発現を負に制御することによって作用する。５９１ｂｐのｃＤＮＡをＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離し、タバコに形質転換するために改変することなく使用した。
【０１８２】
レシピエントの説明。レシピエント生物は、実験室での研究に通常使用される品種であるＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｗ３８であった。タバコは、何世紀にもわたって栽培されている、非常によく特徴付けられた作物である。
【０１８３】
ベクターおよび形質転換プロセスの説明。アグロバクテリア媒介性形質転換に使用される既存のｐＢＩ１２１バイナリーＴｉベクターからＥ１形質転換ベクターを構築した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８７，６：３９０１）。標準的なアグロバクテリア形質転換によって、右境界と左境界との間のＤＮＡ配列を植物ゲノムに安定的に導入させた。ｐＢＩ１２１の完全な配列は、１４，７５８ｂｐであり（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０２１２８）、右境界配列と左境界配列との間に抗生物質のカナマイシン耐性およびＧＵＳ遺伝子を含む（図１に示されるように）。ｐＢＩ１２１−Ｅ１を開発するために、β−グルクロニダーゼ遺伝子を、ＸｂａＩおよびＳａｃＩを用いる消化によって切除し、ＶＳＰβ／Ｅ１構築物で置換した（図２に示されるように）。
【０１８４】
標準的な手順（Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１２２９）に従い、ｐＢＩ１２１−Ｅ１を用いてタバコ葉外植片を形質転換した。葉外植片は、ＭＳ培地上で維持されたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｗ３８のインビトロでの３週齢のシュート培養物の完全に展開した第２葉および第３葉から採取したものであった。前培養の後、その外植片を、一晩培養したものから得られた、改変ｐＢＩ１２１ベクターを含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞の懸濁液に入れた。葉片を１００ｍｇ／Ｌカナマイシンによってセレクションし、１０〜１４日後に、切断された葉縁に沿って形成されたカルスから未発達植物（代表的には、２つまたは３つ）が発生した。未発達植物を切り取り、Ｍａｇｅｎｔａ  ＧＡ７容器において１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＭＳ培地に根付かせた（Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ，２００１，８：１４７−１５８）。
【０１８５】
セルロースの加水分解の測定と並行して、形質転換植物を、葉抽出物を使用してＥ１遺伝子のゲノムＰＣＲ増幅によって確認した（Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ，２００１，８：１４７−１５８）。Ｅ１遺伝子の存在とＥ１活性の両方が陽性であった植物を成熟するまで生長させ、さらなる研究のために種子を回収した。形質転換後に、複数の世代のタバコにおいてＥ１遺伝子の安定な発現およびＥ１活性が観察された。
【０１８６】
ＡｔＦＬＣ  ｃＤＮＡを単離し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの支配下のｐＧｒｅｅｎベクター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｐｇｒｅｅｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｌａｓｍｉｄ．ｈｔｍ）（図３を参照のこと）にサブクローニングすることにより、Ｅ１タバコを形質転換した。このｐＧｒｅｅｎベクターは、左境界配列と右境界配列との間に形質転換植物における除草剤Ｂａｓｔａのセレクション用のｂａｒ遺伝子（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード領域）も含む。タバコのバイオマスを増加させるため、および他の農作物へのトランスジェニック花粉の導入を防止する方法として花成時期を遅延させるために、ＡｔＦＬＣを同じ方法によって上で開発されたＥ１タバコのＴ４世代に形質転換した。形質転換植物を、５ｍｇ／Ｌグルホシネートアンモニウムを用いてセレクションし、次いで、ゲノムＰＣＲおよびＡｔＦＬＣの発現レベルを測定するＲＮＡブロット解析を用いて確認した。最も強い表現型を有する系統から種子を回収し、使用するために混合した。
【０１８７】
Ｅ１遺伝子の存在。Ｅ１遺伝子の存在を確認するために、茎頂から第３葉または第４葉をタンパク質抽出に使用し得る。葉サンプルを、明期に入って２〜３時間後に採取し得る。葉組織を約１ｃｍ２片に切断し得、そして均質化のために貯蔵し得る。以前に報告されているように（Ｚ．Ｄａｉら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，２０００，９：４３−５４）、酵素アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを行い得る。
【０１８８】
Ｅ１活性。Ｅ１活性を評価するために、トランスジェニック植物の茎頂から第３葉または第４葉を採取し得る。葉組織の半分を１ｃｍ×２ｃｍ片に切り取り、もう半分を上に記載したように直接抽出に使用した。約０．１５ｇの葉片を、２０水銀インチで２回（各々１０分間）、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）に真空浸漬し得る。浸漬葉片を１．５ｍＬ微量遠心管に移し、３５０ｇで１０分間遠心することにより、細胞間隙から液体を得ることができる。約１５〜２５μＬの組織間液をＥ１活性測定に使用し得、そして、３０〜５０μＬの組織間液をタンパク質定量に使用し得る。
【０１８９】
（実施例２：Ｅ１タバコの酵素の能力および安定性）
Ｅ１−ＦＬＣトランスジェニックタバコにおける葉タンパク質濃縮物および関連するＥ１セルラーゼの安定性特性を特徴付けた。
【０１９０】
ブレンダーにおいて、８：１（ｗ／ｌ）の比で氷とともにタバコ葉を浸軟することによって、葉タンパク質濃縮物を調製した。カルボキシメチルセルロースを使用して、これらの抽出物のサンプルをセルラーゼ活性について解析した。図１６に示されるように、Ｅ１植物由来の抽出物はセルラーゼを加水分解し得るが、野生型タバコは加水分解しない。また、これらの濃縮物のサンプルを様々な条件に供することによって、外部のセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ製のＳｐｅｚｙｍｅ  ＣＰ）に加える前の、２℃での冷蔵の影響、そのサンプルの９０℃での予熱の影響、乳酸を用いたｐＨ４．０への酸性化の影響、および植物材料の乾燥の影響を判定した。これらの変更点の９通りの組み合わせをセルラーゼの添加（２５μＬセルラーゼ／ｍＬ）の有りおよび無しにおいて研究した。
【０１９１】
セルロース生産およびグルコース生産の加水分解の機能として、これらの濃縮物内のセルラーゼ酵素の安定性／活性（添加／外部酵素と内因性酵素の両方）を測定した。各サンプルの１ｍＬのアリコートを０．２５ｇの微結晶性セルロースに加えた。この溶液を、ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液で１０ｍＬにした。その溶液を５日間加水分解させ、そしてグルコース濃度を測定することにより、サンプルのセルラーゼ活性を評価した。最長６ヶ月間のうちの様々な時点についてセルラーゼ活性の測定値を測定するために、長期間にわたる研究が進行中である。サンプルにおけるグルコース濃度の関数としてのセルロースの加水分解を表１に表す。
【０１９２】
表１から明らかなように、酸を添加することによって、約ｐＨ４．９において最大であるセルラーゼの活性が厳しく制限される。重大なことに、酸を添加した場合を除くすべての場合におけるトランスジェニック植物＋セルラーゼの実験では、コントロール＋セルラーゼよりもより多くのグルコースが生成された。これは、トランスジェニックタバコにおけるセルラーゼ活性の発現についての強力な証拠である。いくつかのトランスジェニックサンプルは、セルラーゼを加えなくても、測定可能なグルコース生成を示したのに対し、コントロールは、そのようなセルラーゼ活性を示さなかった。たった２週間後にすべての室温での酸性化サンプルにおいて細菌の増殖が見られ、１つの冷蔵サンプルにおいては、１ヵ月後にいくらかの増殖が見られた。同様に、室温での酸性化貯蔵は、長期間の貯蔵条件に明らかに適していない。
【０１９３】
この実験から、Ｅ１植物の濃縮物中のＥ１セルラーゼ活性がかなり安定であることが示唆され、これは、この植物抽出液が、非トランスジェニック植物のバイオマスを加水分解するセルラーゼの供給源として使用され得るか、または、別途その酵素を不活性化し得る前加工工程（例えば、高温または酸による処理）が完了した後に、トランスジェニック植物自体に戻され得ることを示唆する。この実験はまた、セルラーゼをＥ１植物に加えることによって、セルラーゼを非トランスジェニック植物に加えるときよりもグルコース生成全体が増加することも示唆する。これは、単純に、現在の外部のセルラーゼ手法とともにトランスジェニックＥ１植物を使用することによって、エタノール収率を実質的に上昇させることができることを示唆するので、重要な結果である。
【０１９４】
上で述べたように、「セルラーゼ」酵素系は、複雑であり、様々な活性を含むが、このトランスジェニックＥ１タバコ植物は、これらの活性のうちの１つだけ、すなわちエンドグルカナーゼを発現する。上記の実験では、３つのサンプルが、複雑なセルロース複合体の非存在下でグルコースイベントを示したが、これは、有望な結果である。
【０１９５】
セルラーゼ複合体のさらなるメンバーを加えることは、Ｅ１タバコバイオマスの加水分解を増大させると予想され得る。この仮説を検証するために、エンドグルカナーゼ、グルコアミラーゼおよびヘミセルラーゼ（ＢＩＯ−ＣＡＴ，Ｔｒｏｙ，ＶＡから入手したもの）を非トランスジェニックタバコおよびＥ１−ＦＬＣタバコに加えた。図４に示されるように、これらの結果は、様々な酵素タイプを加えることにより、トランスジェニックタバコにおいて、化学的な前処理をすることなくグルコース生成をほぼ倍増することを示唆する。Ｅ１−ＦＬＣタバコはまた、以前の実験において使用されたＥ１のみのタバコよりも高いレベルのグルコースを生成することが見出された。
【０１９６】
この結果は、セルラーゼ複合体（例えば、リグニナーゼおよびヘミセルラーゼ）の異なるメンバーを発現するさらなる植物遺伝子型を作出することが、Ｅ１植物の加水分解収率を増加し得ることを示唆する。この結果はまた、Ｅ１活性が、エンドグルカナーゼの活性に制限されないことも示唆する。外部のセルラーゼの非存在下でのグルコースの高い生成は、多糖類および二糖類のさらなる酵素的加水分解が、エキソグルカナーゼで観察された様式と同様の様式で生じることを示唆し、これは、Ｅ１が、「前進的な」エンドグルカナーゼと呼ばれているものであり得ることを示唆する。
【０１９７】
（実施例３：Ｅ１タバコのファイトレメディエーション能力）
本出願人は、以前に、金属（例えば、鉛およびウラン）のファイトレメディエーションにおけるタバコの使用を実証した（Ｅｄｅｎｓｐａｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２００２，ＵＳＥＰＡ  ＳＢＩＲ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ，助成金Ｎｏ．６８−Ｄ−０２−０１８）。非トランスジェニックタバコ系統  対  Ｅ１タバコのファイトレメディエーション能力のベースライン比較を行った。３つの能力指標：（１）よくある土壌汚染物質である鉛（Ｐｂ）の植物の取り込み；（２）収穫後のバイオマスからのＰｂの抽出率；および（３）植物組織における収穫後のセルラーゼ活性に対するＰｂの影響を評価した。
【０１９８】
植物の重金属の取り込み。Ｐｂ汚染土壌において、形質転換タバコによるＰｂおよび亜鉛（Ｚｎ）の取り込みを野生型および他のタバコ品種と比較した。Ｅ１−ＦＬＣ形質転換タバコおよびＸａｎｔｈｉ（非形質転換）タバコを８００ｍｇ／ｋｇのＰｂ濃度を有する、米国北東部から回収した３００ｇの土壌を含むポットに播種した。この植物を、Ｅｄｅｎｓｐａｃｅのグロースチャンバー内で１６時間明期／８時間暗期を用いて、６週間栽培した。６週間後に、鉛の取り込みを促進する化学的な誘導薬剤を土壌施用した後、その植物を収穫および解析することにより、トランスジェニックタバコ植物の取り込みとコントロールタバコ植物の取り込みとの差を判定した。土壌表面から約０．５インチ上の各植物の茎を切断することによって、すべての植物を収穫した。その植物を７０℃で乾燥させ、粉砕して、２０メッシュスクリーンに通過させ、そしてＥＰＡ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２０５０（ＵＳＥＰＡ，１９８６）に従って消化した後、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光分析（ＥＰＡ  Ｍｅｔｈｏｄ  ６０１０；ＵＳＥＰＡ，１９８６）を用いて解析した。
【０１９９】
図５に示されるように、ＰｂおよびＺｎの取り込みは、形質転換タバコおよび非形質転換タバコにおいて類似しており、これは、Ｅ１植物が、ファイトレメディエーションに首尾良く使用され得ることを示唆する。この結果は、共同生産によるコストの節約の機会を作り出す、ファイトレメディエーション用ならびにバイオ燃料用としてトランスジェニック植物を栽培することの将来性を支持するので、この結果は、重大である。
【０２００】
植物に抽出された金属の回収。金属のファイトエキストラクション（Ｐｈｙｔｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）によって、土壌（アルミノケイ酸塩マトリックス）から金属が除去され、そして、植物組織（リグノセルロースマトリックス）内に金属が濃縮される。セルロースが、効率的に分解されて、その組織から金属を容易に抽出および分離することができる場合、リサイクルまたは効率的な処分に向けてバイオマスからの金属の回収を改善するべきである。
【０２０１】
この実験から、乾燥バイオマスへの外来性セルラーゼの適用が、実際に植物組織からの金属抽出率の改善をもたらしたことが実証される。ヒ素および鉛を含む土壌からの乾燥植物バイオマスを、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびグルコアミラーゼが加えられたクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に平衡化した。鉛およびヒ素（Ａｓ）については、セルラーゼを加えることなく、元素濃度の９５％超が乾燥バイオマスから抽出可能であり、これは、ファイトレメディエーション産業におけるバイオマスの処理および処分に対して潜在的に非常に重要な結果である。細かく粉砕すること（２０メッシュ）と加熱とを組み合わせることが、本出願人が別の抽出方法を使用して達成した率よりも優れたこの高い抽出率に関与していると考えられる。セルラーゼの添加は、このすでに高い抽出率に対して有意な影響を及ぼさなかった。
【０２０２】
興味深いことに、図６に示されるように、セルラーゼの適用によって、植物の栄養分である金属（例えば、鉄（Ｆｅ）およびカルシウム（Ｃａ））の抽出率が改善されたことから、これらの金属は、リグノセルロースマトリックスにおいて、汚染物質（例えば、ＰｂおよびＡｓ）よりも強く結合していることが示唆される。セルラーゼ複合体のメンバーによって能力にばらつきが観察された；例えば、ヘミセルラーゼは、カルシウムよりも鉄を放出する際により有効であったことから、これらの金属が、マトリックス中に様々な形態で結合していることが示唆される。
【０２０３】
実際に行われ得る生産プロセスをより示す、より粗い粉砕は、植物の粒径が大きくなるにつれて、金属抽出に対するセルラーゼの影響が、より顕著になるという予想とともに試験されるだろう。
【０２０４】
セルラーゼ活性に対する抽出された金属の影響。植物バイオマス中のＰｂ濃度が、セルラーゼ形成を阻害し得るか否かを判定するために、非汚染土壌とＰｂ汚染土壌の両方においてＥ１タバコ植物を栽培し、次いで、収穫し、上に記載したようにＰｂ取り込みについて解析した。
【０２０５】
図７に示されるように、グルコース生成は、Ｐｂ汚染土壌において栽培されたＥ１植物において有意に低下した。しかしながら、外来性セルラーゼを適用することにより、Ｐｂの存在下と非存在下の両方において収穫された乾燥バイオマスから、同様のグルコース生成がもたらされた。この結果について、いくつかの説明が成り立ち得、それらとしては、Ｐｂが、Ｅ１活性を阻害するが、他のセルラーゼの活性を阻害しないという可能性、および、金属の取り込みを化学的に誘導することによって引き起こされた植物ストレスが、収穫後のグルコース安定性および／またはＥ１活性を阻害するという可能性が挙げられる。これらの３つの可能性を検証する実験が行われるだろう。
【０２０６】
（実施例４：ＦＬＣによるタバコの形質転換）
本発明に開示されるように、ＦＬＣを植物に付加する目的としては、バイオエネルギーおよびファイトレメディエーション能力を改善するためにバイオマスを増加させること、および、トランスジェニック花粉が他の農作物に導入することを防止する方法として花成時期を遅延させることが挙げられる。以前は、タバコにおいてＡｔＦＬＣが発現しなかったので、第１の課題は、野生型コントロールタバコとＥ１タバコの両方において形質転換を行うことであり、次いで、Ｅ１タバコにおけるＡｔＦＬＣの組み込みおよび発現の成功ならびにＥ１の継続した発現について試験することであった。
【０２０７】
非トランスジェニックタバコおよびＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのＥ１エンド−１，４−β−グルカナーゼ産生トランスジェニックタバコ（Ｔ１種子は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＳ．Ａｕｓｔｉｎ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ博士から頂いた）のＴ４世代の形質転換に向けて、ＦＬＣ構築物（実施例１に記載したとおり）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターに導入した。
【０２０８】
ＦＬＣによる非Ｅ１タバコの形質転換。Ｅ１と無関係のＦＬＣの作用を観察するために、まず、非Ｅ１タバコをＦＬＣ遺伝子で形質転換した。ｐＧｒｅｅｎ構築物を含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＧＶ３１０１株を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ‘Ｓａｍｓｕｎ’）におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＦＬＣ遺伝子の導入に使用した。５つの推定トランスジェニック系統が選抜され、ＦＬＣの存在について調べた。ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡを葉から単離し、それぞれポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＲＮＡブロット解析に使用した。ＤＮＡとＲＮＡの両方の試験により、５系統すべておよびそれらのＴ１子孫におけるＦＬＣの組み込みおよび転写が確かめられた。トランスジェニック植物の１系統では、コントロール植物よりも、平均して３６日の花成時期の遅延を示し（図８を参照のこと）、全系統の全体平均は、１４日の遅延であった。トランスジェニック植物はまた、葉の大きさおよびバイオマス収量の増大ならびに花成時期における植物体の高さの低下を示した。これらの結果を表している原稿（Ｈ．Ｓａｌｅｈｉら、“Ｄｅｌａｙ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｌｏｒａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｃ）”，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００５）。
【０２０９】
ＦＬＣによる第４世代のＥ１タバコの形質転換。Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのＥ１エンド−１，４−β−グルカナーゼ産生トランスジェニックタバコのＴ４世代をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＦＬＣ遺伝子のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換および発現に使用した。ここでも、ＦＬＣおよびｂａｒ選択可能マーカーカセット（ｐＧｒｅｅｎ）を含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＶ３１０１株を形質転換に使用した。Ｅ１とＦＬＣの両方の組み込みを示す植物を、ｂａｒ選択可能マーカーおよびＰＣＲを使用して選抜した。５ｍｇ／Ｌグルホシネートアンモニウムに耐性である６つのＥ１およびＦＬＣ陽性推定トランスジェニック系統をさらなる分子解析に向けて選抜した。６週齢の温室植物の葉から全ＲＮＡを単離し、ＦＬＣ  ＲＮＡブロット解析に使用した。ＲＮＡ試験により、６つのＥ１ｃｄ−ＦＬＣ系統のすべてにおいてＦＬＣの転写が確認された。
【０２１０】
表２ａに示されるように、トランスジェニックＥ１ｃｄ−ＦＬＣ植物は、Ｅ１ｃｄ発現コントロール植物と比べて、花成時期が平均９〜２１日遅延し、全系統における花成の遅延についての全体平均は、１４日であった。ＦＬＣのみのタバコ植物と同様に、Ｅ１ｃｄ−ＦＬＣ植物もまた、葉の大きさおよびバイオマス収量が統計学的に有意な増加を示した（表２ｂを参照のこと）。すべてのトランスジェニックＥ１ｃｄ−ＦＬＣ植物は、花成時期においてコントロールタバコよりも有意に植物体の高さが低かった。これらの結果を示している原稿（Ｈ．Ｓａｌｅｈｉら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｌｏｃｕｓ  Ｃ  ｉｎ  ａｎ  Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｅｎｄｏ−１，４−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（Ｅ１）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ  Ｌ．）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｄｅｌａｙ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｓｓ”，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−ＰＬＡＮＴ，２００５）。
【０２１１】
これらの実験、特に、自然受粉した作物（例えば、トウモロコシ）において実証された花成の遅延は、圃場においてトランスジェニック花粉と交雑可能な植物との相互汚染の機会を減少させる有用な生物学的隔離システムであり得る。第１世代のタバコの３系統において見られたバイオマスの実質的な増加は、バイオエネルギー含有量およびファイトレメディエーション能力を増大させる有用な特徴であり得る。
【０２１２】
（実施例５：Ｅ１−ＦＬＣによるトウモロコシの形質転換）
トウモロコシを形質転換するための系を発展させるために、Ｅ１遺伝子およびｂａｒ遺伝子の導入に穀類のモデル植物系としてイネを使用した。そのために、ｐＺＭ７６６Ｅ１−ｃａｔを、ｂａｒ選択可能マーカー遺伝子およびｇｕｓ変色指示遺伝子を含んでいるｐＣＡＭＢＩＡ（ｐＣＡＭＢＩＡ  Ｃｏ（Ｃａｍｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入）に挿入した（図９を参照のこと）。そのプラスミドは、材料移転協定（Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）（ＭＴＡ）締結のもと、Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＫ．Ｄａｎｎａ博士から得た。Ｅ１トランスジェニックイネ植物は、ＰＣＲによって３つすべての導入遺伝子（Ｅ１、ｂａｒおよびｇｕｓ）の組み込みを示した。さらに、それらは、全可溶性タンパク質の２４％の高さでＥ１産生を示し、Ｅ１導入遺伝子の酵素活性も示した。
【０２１３】
次いで、遺伝子銃照射を使用して、いくつかの独立したトウモロコシトランスジェニック系統を作出した。組み込み、発現、酵素活性およびアポプラスト内での導入遺伝子産物の蓄積が確認された系統を、以下に記載するようなさらなる試験および発展に向けて維持した。
【０２１４】
トウモロコシの外植片の調製および遺伝子銃照射。本出願人は、Ｅ１構築物とｂａｒ構築物との混合物の遺伝子銃照射のための複数の分裂組織頂端のシュート原基を作出した。トウモロコシを温室内で栽培した。未成熟胚を作出し、培養し、そしてカルス系統を作出し、その未成熟胚由来のカルス系統に、Ｅ１遺伝子を含むプラスミドと上記３つのプラスミドのうちの１つ（各々ｂａｒ選択可能マーカー遺伝子を含む）とを１：１比で照射した。
【０２１５】
Ｅ１プラスミドの場合、ｐＭＺ７６６Ｅ１−ｃａｔ（図９を参照のこと）が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて全可溶性タンパク質の最高２６％のＥ１酵素を産生した（Ｍ．Ｔ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６：３７−４６）ので、この構築物を選択した。この構築物は、強力なプロモーターおよびエンハンサーならびにアポプラスト標的化エレメントを含む。各々が、それ自体の潜在的な利点を有するので、トウモロコシの複数の分裂組織および未成熟胚由来カルス系統を、ｐＺＭ７６６Ｅ１−ｃａｔおよびＧｒｅｅｎ（図ＸＸ０、ｐＤＭ３０２（図１０）またはｐＢＹ５２０（図１１）を用いて同時形質転換した。
【０２１６】
Ｅ１トランスジェニックトウモロコシの確認解析。ＰＰＴ選抜されたいくつかの未発達植物においてＰＣＲを使用し、Ｅ１遺伝子およびｂａｒ遺伝子の存在を確認した。陽性のシグナルを示した未発達植物をさらなる研究に向けて選抜した。遺伝子特異部位を使用してトウモロコシ植物におけるＥ１のコピー数を決定していないが、サザンブロット解析によって、いくつかのＰＣＲ陽性トウモロコシ系統におけるＥ１導入遺伝子の安定な組み込みが確認された（図１２を参照のこと）。トウモロコシにおけるＥ１導入遺伝子の翻訳を、ウエスタンブロットを使用して確認し、そしてタバコおよびイネにおけるＥ１の翻訳と比較した（図１３を参照のこと）。
【０２１７】
トランスジェニックトウモロコシにおけるＥ１のアポプラスト局在性に関する予備実験。共焦点顕微鏡を用いたトウモロコシにおける他の遺伝子産物（ポリヒドロキシブチレート）の局在性研究での以前の経験に基づいて、Ｅ１の１次抗体および適切な２次抗体を使用して、トランスジェニックトウモロコシ組織におけるＥ１の局在性を調べた。ほとんどのサンプルが、蛍光結合体の植物組織への強力な非特異的結合を示したが、いくつかのサンプルは、アポプラストにＥ１が局在する可能性を示した（図１４）。本明細書中に記載されるように作出された植物系統は、Ｅ１がそれらの組織に非特異的結合していることから生長に悪影響を示さないとみられる。可能性のある任意の非特異的結合を低下させるいくつかの異なるブロッキング剤を使用して、アポプラストにおけるＥ１の局在性の増大が探求されるだろう。
【０２１８】
トランスジェニック植物におけるＥ１の産生およびＥ１の生物学的活性のレベル。Ｔ０トウモロコシのいくつかの系統を栽培した。産生されたＥ１酵素の量およびその生物学的活性を測定し、Ｔ４Ｅ１タバコおよびＴ０Ｅ１イネにおける成績と比較した。トウモロコシゲノムにおけるＥ１の挿入点の位置が異なるので、Ｔ０系統間の成績は多様である。トウモロコシの系統１−２では、良好なＥ１の産生および活性が示され、Ｅ１は、全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の９．０７％またはトウモロコシ総乾燥重量の約１％を占めていた。比較として、イネの１系統は、Ｅ１をＴＳＰの２４．１３％産生し、タバコの１系統は、Ｅ１をＴＳＰの３．８％産生した（表３を参照のこと）。本研究において観察されたイネ系統の産生力は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて以前に達成された結果に匹敵し、これは、トウモロコシにおいて、本研究で得られた収率よりも高い収率が達成され得ることを示唆する。従って、新規Ｅ１トウモロコシ系統が作出され、ＴＳＰの２０％を超える酵素収率が探索されるだろう。
【０２１９】
得られた結果の要旨
本明細書中で報告される実施例において得られた結果から、作物植物の特徴を調整することによって、バイオ燃料の収率が著しく改善され得、バイオ燃料生産のコストを低下させ得るという主張に対する強力な支持がもたらされる。重要なセルラーゼ酵素であるＥ１エンドグルカナーゼによる強い活性が、形質転換されたタバコおよびトウモロコシにおいて実証された。Ｅ１トウモロコシの１系統は、全可溶性タンパク質の９％超のＥ１産生を示し、そのレベルは、今日の加水分解用のセルロースバイオマスに添加される外来性酵素のレベルにほぼ等しい。重大なことには、外来性酵素の添加によって、非形質転換タバコよりも高いグルコース収率がＥ１タバコからもたらされ、これは、より高いエタノール収率が、Ｅ１作物植物において今日の加水分解手法を使用することによって簡単に達成され得ることを示唆する。得られた結果は、ＦＬＣ遺伝子が、以前にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて花成を遅延すると示されたのと同様に、タバコにおいても花成を遅延することも示し、この花成の遅延は、バイオエネルギー作物における導入遺伝子の生物学的隔離において有用であり得る特徴である。ＦＬＣはまた、より多いバイオマスをもたらし得る。バイオエネルギーおよびファイトレメディエーション用の作物の共同生産の観点から、本結果は、Ｅ１−ＦＬＣ植物が、ファイトレメディエーションにおいて通常使用される植物と同じ量の汚染物質を抽出し得ること、ならびに、ほとんどの汚染物質のうちの２つ、ヒ素および鉛が、９５％を超えるレベルで、収穫されたバイオマスから抽出され得ることにより、金属のリサイクルおよび加水分解された糖の下流でのバイオエネルギーの使用を促進することを示した。
【０２２０】
今後の研究
今後の研究は、これらの結果に基づいて進めていくことになる。野外試験用の信頼性のある高収率の系統を作出するように、そして、米国国立再生可能エネルギー研究所と共同してエタノール生産を導くように、トウモロコシの既存のＥ１系統を栽培、育種する。新規Ｅ１系統は、さらにＥ１収率を上昇させるという目標をもって作出される。さらに、２つの新規トウモロコシ遺伝子型が作出されることになるが、この両方ともが、ＦＬＣ遺伝子を有しており、一方は、リグニンに特異的なリグニナーゼをさらに含み、他方は、キシランに特異的なヘミセルラーゼを含むことにより、様々なタイプのセルラーゼ酵素の組み合わせにより、単一の酵素よりも高い総合的な加水分解が達成されるという証明を引き続き行う。さらなる研究はまた、どのように形質転換トウモロコシが現在の加工技術を単純化できるのかについて、例えば、前処理の必要性を低下させることによって、行われる。ファイトレメディエーション実験の継続により、共同生産の制約および機会について、さらなる情報がもたらされるだろう。計画のとおり、今後の研究は、実質的、短期的な燃料エタノールおよびファイトレメディエーションの市場潜在能力を備えた多特性の作物植物を導入するための基盤を提供するべきであり、水素経済のための再生可能な原料の創出に不可欠な、バイオマスの生産、輸送および加工するためのインフラを整えるべきである。今後の研究としては、より詳細には以下に記載される研究が挙げられ得る。
【０２２１】
Ｅ１エンドグルカナーゼ、ヘミセルラーゼおよびリグニナーゼを全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の１５％を超えるレベルで産生する３つの別個のトウモロコシ系統の開発
セルラーゼ、ヘミセルロースおよびリグニン（これらは、併せてトウモロコシ茎葉バイオマスの約７５％を含む）を標的化することによって、セルラーゼのみのアプローチと比べて、リグノセルロースバイオマスの２倍超が加水分解されると予想される。ＴＳＰの４％を超えるＥ１が、トウモロコシバイオマスにおいてセルロースを加水分解するのに十分であり、１０％というレベルが、外来性セルラーゼの現在の添加率にほぼ等しいが、約２５％というレベルが、イネおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて実証されていることから、トウモロコシにおいては、現実的な達成目標を１０％〜２０％にする。特に、トウモロコシ品種の「混合物」中の各品種が、他の品種ならびにそれ自体のバイオマスから標的のリグノセルロースを加水分解しなければならない「混合物」において、より高レベルの酵素の産生が使用されるとき、より完全な加水分解がもたらされる。各々が異なる酵素を産生するこの３つ別々のトウモロコシ遺伝子型は、播種する際に種子の混合を調整することによって、単純に任意の所望の割合の酵素をもたらすという順応性を提供する。
【０２２２】
キシラナーゼおよびリグニナーゼ遺伝子を用いたトウモロコシの形質転換。バイオマスからの糖の生産を最大にするために、高バイオマストウモロコシを、キシラナーゼを産生するように形質転換する（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪｏｎａｔｈａｎ  Ｗａｌｔｏｎ博士から提供された遺伝子を使用して）か、または、リグニナーゼを産生するように形質転換する（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣ．Ａ．Ｒｅｄｄｙ博士から提供された遺伝子を使用して）。トランスジェニック植物を、導入遺伝子の組み込み、コピー数および転写、酵素の翻訳レベル、酵素活性およびアポプラスト局在性、植物体全体の健康状態ならびにバイオマス生産について試験する。
【０２２３】
キシラナーゼおよびリグニナーゼ遺伝子構築物の作製。２つの新規遺伝子構築物を開発し、一方は、Ｃｏｃｈｌｉｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍのエンドキシラナーゼ（ＸＹＬ１）（Ｐ．Ｃ．Ａｐｅｌら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１９９３，６：４６７−４７３）を含んでおり、他方は、白色腐朽繊維状Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのリグニナーゼ（ＣＧＬ５）（Ｈ．Ａ．ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｇｅｎｅ，１９８８，６９（２）：３６９）を含んでいる。各々は、タバコモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターおよびエンハンサーによって制御されているｃＤＮＡ配列、および、トウモロコシアポプラスト内に酵素を標的化するタバコ病因関連タンパク質１ａ（Ｐｒ１ａ）シグナルペプチドを含み、ここで、これらの３つの酵素の安定性にとっては、約５．５のｐＨが理想的である（４．８〜５．５のｐＨが必要）。これらの構築物（図１５を参照のこと）は、上で報告した実施例に示した実験において使用された、ＮＲＥＬのＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓのエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ（Ｅ１）遺伝子（図９を参照のこと）を含む構築物に類似している。このＥ１含有プラスミドを使用することにより、トランスジェニック植物におけるＥ１酵素の産生は、ＴＳＰの０．１％から２５％の範囲であった（ばらつきは、位置効果が原因である）（Ｍ．Ｔ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６：３７−４６）。上で報告したように、それぞれ最高でＴＳＰの３．８％および２４％を産生した、トランスジェニックトウモロコシおよびトランスジェニックイネを作出した。
【０２２４】
上記遺伝子構築物を用いたトウモロコシの形質転換。ＨＩＩＩトウモロコシ系統を温室内で成熟するまで栽培する。上で報告したトウモロコシの形質転換において記載したように、インビトロにおける未成熟胚由来の細胞株を作出するために未成熟胚を回収する。次いで、このＨＩＩＩトウモロコシ未成熟胚由来細胞株を、Ｅ１トランスジェニックトウモロコシを作出するために行ったように（上記を参照のこと）、上記の３つの構築物の各々およびｂａｒ除草剤抵抗性選択可能マーカーおよびＡｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ  Ｆｌｏｗｅｉｎｇ  Ｌｏｃｕｓ  Ｃ（ＦＬＣ）遺伝子を含んでいる別の構築物（ｐＧｒｅｅｎ）を用いて同時形質転換する。各トランスジェニック植物が、エンドキシラナーゼおよびＦＬＣまたはリグニナーゼおよびＦＬＣを発現するように、ＸＹＬ１とＦＬＣまたはＣＧＬ５とＦＬＣとの比１：１で別々に植物を形質転換する。
【０２２５】
上に記載したように、細胞壁分解性プラスミドとｂａｒ−ＦＬＣ遺伝子を含んでいるプラスミドとの各々の比が１：１でコーティングされたタングステン粒子を用いて胚性細胞株を照射する。照射された外植片を、６〜１０ｍｇ／Ｌグルホシネートアンモニウム（ＰＰＴ）を含んでいる選択培地にさらに６〜８週間移す。化学的に選択された細胞を、同じＰＰＴ濃度を含む適切な培地中で、体細胞胚に再生し、未発達植物に発芽させる。１０センチメートルの未発達植物をポットに移し、順化し、そしてＥｄｅｎｓｐａｃｅのトウモロコシ温室に移し、その温室において成熟するまで栽培する。
【０２２６】
形質転換トウモロコシにおけるセルラーゼ産生の試験
形質転換トウモロコシを、様々な作用条件および前処理において、セルラーゼの産生および安定性について試験する。
【０２２７】
トウモロコシの遺伝子組換えの確認。Ｅ１トランスジェニックトウモロコシの遺伝子の組み込み（図１２）および発現（図１３）ならびにＦＬＣトランスジェニックタバコ（Ｈ．Ｓａｌｅｈｉら、“Ｄｅｌａｙ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｌｏｒａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ＦＬＣ（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｃ）”，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００５での公開が許可およびＨ．Ｓａｌｅｈｉら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｌｏｃｕｓ  Ｃ  ｉｎ  ａｎ  Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｅｎｄｏ−１，４−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（Ｅ１）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ  Ｌ．）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｄｅｌａｙ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｓｓ”，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−ＰＬＡＮＴ，２００５での公開が許可）について行われたように、上記導入遺伝子の組み込み、コピー数および転写を確認するために、温室において栽培されたトウモロコシ植物を評価する。形質転換の成功についての最初の選択基準として、除草剤抵抗性を使用する。除草剤抵抗性を示す未発達植物を、ＰＣＲ、サザンブロット解析、ウエスタンブロット解析およびノーザンブロット解析を使用するさらなる特徴付けに供する。
【０２２８】
ＰＣＲを使用して、植物中の外来遺伝子の存在を確認する。陽性シグナルを示すシュート／未発達植物は、形質転換されていると推定的に考えられる。植物中の導入遺伝子のコピー数を決定するために、温室で栽培された推定的トランスジェニック植物およびコントロール（非形質転換）植物からゲノムＤＮＡを単離し、次いで、サザンブロット解析を行う。そのプラスミドに特有な部位を用いたサザンブロット解析によって、トランスジェニック植物における各導入遺伝子のコピー数が決定される。トランスジェニック植物における導入遺伝子の翻訳を認めるために、ウエスタンブロットを行う。トウモロコシにおけるＥ１導入遺伝子の翻訳は、すでに確認されており（図１３を参照のこと）、トランスジェニックタバコおよびトランスジェニックイネにおける同じＥ１導入遺伝子の翻訳と比較した。転写レベルでの遺伝子の発現を確認するために、植物組織から全細胞ＲＮＡを単離する。上記と同様に標識された、サザンブロットハイブリダイゼーションで使用したプローブと同じプローブを使用するＲＮＡブロット解析によって、外来遺伝子をコードするｍＲＮＡを検出する。このｍＲＮＡを変性ホルムアルデヒドアガロースゲルにおいて電気泳動し、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルターに転写し、適切なプローブとハイブリダイズさせ、次いで、Ｘ線フィルムに露光する。プローブとハイブリダイズしたＲＮＡを含むフィルターをＸ線フィルムに露光した後、デンシトメーターを用いて、ハイブリダイゼーションバンドをスキャンすることにより、特定のｍＲＮＡの存在レベルを測定する。
【０２２９】
酵素発現の特徴付けおよび高発現系統の同定。各トランスジェニック系統における上記の３酵素の各々の酵素活性とともに、植物全可溶性タンパク質の画分としてのＥ１、ＸＹＬ１およびＣＧＬ５異種タンパク質の各々の産生レベルを、上に記載したＥ１トランスジェニックトウモロコシ植物について行った様式と同様の様式で測定する。将来の種子の大型化および試験に向けて高産生系統を保存する。上に報告した実施例において、トランスジェニックトウモロコシ、トランスジェニックイネおよびトランスジェニックタバコ植物におけるＥ１酵素の産生および生物学的活性を測定した。ＸＹＬ１およびＣＧＬ５形質転換トウモロコシについての酵素産生活性のさらなる評価を、Ｗａｌｔｏｎ博士およびＲｅｄｄｙ博士（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって提供された手順を使用して行う。
【０２３０】
植物アポプラスト中の酵素貯蔵の確認。細胞壁と細胞膜との間の領域である植物アポプラスト中の上記の３つの異種酵素の各々の局在性（葉緑体または液胞に対する局在性、他のトランスジェニックセルラーゼ植物において達成されたような局在性）を、それらの１次抗体および２次抗体の各々を使用した後、上に記載したように（図１４を参照のこと）共焦点顕微鏡観察することによって確認する。植物の生長に対しての、Ｅ１発現による有害作用は、これまでに作出されたＥ１形質転換植物において観察されなかったが、植物代謝からＥ１の貯蔵を分離するアポプラスト発現が望ましい。
【０２３１】
ＸＹＬ１およびＣＧＬ５に対する抗体を調製し、トランスジェニックトウモロコシアポプラストにおけるＸＹＬ１およびＣＧＬ５の局在性を測定するために免疫蛍光抗体染色を行う。上記２酵素の各々の１次抗体を含む溶液中で、トランスジェニック葉切片サンプルをインキュベートする。未結合抗体を除去するために洗浄した後、その組織を、２次抗体−フルオロフォア結合体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ結合体）中でインキュベートする。未結合の抗体−結合体を除去するために洗浄した後、その組織を顕微鏡用スライドの上に載せ、レーザー走査共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察することにより、これらの異種酵素のトランスジェニック植物における局在性を測定する。
【０２３２】
バイオマス生産および花成時期の測定。得られた結果は、ＦＬＣで形質転換されたタバコにおける花成の著しい遅延および植物バイオマス生産の改善を示した。ＦＬＣ異種タンパク質の産生レベルならびに花成の遅延およびバイオマス生産の増加に対する効果を形質転換トウモロコシにおいて測定する。成績の良いＥ１トウモロコシ系統を使用して、小さな野外試験においてプロジェクトの目標を検証する。
【０２３３】
野外試験用および生産試験用のＴ１（Ｒ２）Ｅ１トウモロコシ種子の生産。成熟するまで栽培し、種子を大型化するために交配および／または自殖させたＴ１植物を使用して、Ｅ１形質転換トウモロコシ（および他の有望なトランスジェニック系統を使用する小規模の野外試験用の種子を得る。除草剤抵抗性についてスコアリングすることによってトランスジェニック植物を確かめ、そして導入遺伝子の挿入事象が損なわれていないことおよびその事象の回数を、ＤＮＡブロットを使用して測定する。
原料生産および多目的応用のための形質転換植物由来のバイオマスの用途の評価
トランスジェニックトウモロコシおよびトランスジェニックタバコを、バイオエネルギー用途ならびに潜在的な用途（例えば、ファイトレメディエーション応用（例えば、バリアーストリップ、流出の管理、汚染土壌のレメディエーション））について評価する。主要な目標の１つは、高収量バイオ燃料原料に必要な特徴を有する作物を開発することである；しかしながら、いくつかの場合において、作物開発コストは、さらなる利益をもたらすファイトレメディエーションなどの応用によって資金調達され得る。上の実施例に示したように、鉛に対するファイトレメディエーション作物として機能する能力ならびにかなりのレベルのＥ１活性を発現する能力を有するＥ１−ＦＬＣタバコを開発した。さらに、バイオマス中に鉛の蓄積が観察され、この蓄積により、外部のセルラーゼを添加しないときにＥ１形質転換植物においてグルコース生産が中程度に抑制された。しかしながら、外部のセルラーゼを加えるとき、グルコース生産は、非形質転換植物のグルコース生産と同等であることが観察された。形質転換タバコおよび形質転換トウモロコシを使用する可能性が、さらに評価される。
【０２３４】
形質転換タバコおよび形質転換トウモロコシ（本明細書中に記載されるように得たもの）および種々の従来のトウモロコシの種子を、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄにおけるある場所からの鉛汚染土壌およびポット用混合物に播種し、Ｅｄｅｎｓｐａｃｅ内のグロースチャンバーおよび温室において栽培する。その植物を収穫するまで１０週間栽培する。収穫の１週間前に、各土壌において生長した植物の半分に対して、土壌中のＰｂおよび他の金属の取り込みを増大させるために土壌へのクエン酸の施与を行う。次いで、そのバイオマスを収穫し、各処理組について２つのサブサンプルに分割する。各処理からの一方のバイオマスサブサンプルを７０℃で乾燥させ、そしてＷｉｌｅｙミルを使用して２０メッシュスクリーンに通すことにより粉砕する。残りのバイオマスサブサンプルを、１：２植物（生体重）：水の比の水とともにブレンダーにおいて個別にホモジナイズする。次いで、その懸濁液を濾過することにより粗雑な固体を除去し、そして得られた抽出物をＥ１活性（グルコース生産）の解析に使用する。
【０２３５】
原料生産の評価。向上した植物によって生産された糖の量および質（発酵適合性）を、市販のセルラーゼとヘミセルラーゼとの混合物を使用して、従来の植物によって生産された糖と比較する。セルラーゼとヘミセルラーゼとの混合物を加えて、および加えずに、５０℃で２４時間および４８時間、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）とともに、抽出物および乾燥植物バイオマスをインキュベートする。次いで、得られた抽出物の糖含有量を、ＨＰＬＣを使用して測定することにより、セルラーゼ活性を評価する。
【０２３６】
セルラーゼ活性に対する金属取り込みの作用の測定。セルラーゼを加えてインキュベートする前に、植物抽出物および乾燥植物バイオマスをＰｂおよび他の金属について解析する。インキュベートした後、抽出物を０．４５μｍに濾過し、そして、植物バイオマスからの金属の放出に対するセルラーゼ活性の作用を測定するために、ならびに、植物による金属取り込みの結果としてのセルラーゼ活性のいくらかの低下を定量するために、金属全体について解析する。
【０２３７】
バイオ燃料作物の圃場規模での生産
Ｅｄｅｎｓｐａｃｅによって行われる実証実験を行う場所が選択されている。圃場での実証実験は、ＵＳＤＡ  ＡＰＨＩＳの許可のもとで行われる。Ｅｄｅｎｓｐａｃｅは、トランスジェニック植物を用いた他の圃場作業についてそのような許可を得ている。その場所は、任意の近縁野生種または他のトウモロコシ作物から実験トウモロコシを空間的に隔離する様式で選択され、実験植物の周りに３ｍ幅の非トランスジェニック花粉捕獲作物を植え、そして収穫後、１年間にわたって定期的にその場所を訪問し、植物がこの実証実験から生き残っていないことを確実にする。
【０２３８】
ＡＰＨＩＳ許可の規定に基づいて、１０，０００平方フィートの実証実験場所を準備し（適切な緩衝地帯を含む）、施肥し、そしてＥ１−ＦＬＣ（または他の有望な系統）を形質転換したトウモロコシ、コントロール（野生型）および既存の高デンプントウモロコシの品種の播種を行う。選択した遺伝子型をプロット地帯に播種し、そして成熟するまですべての季節にわたって栽培する。生長パラメータ（例えば、発芽率、植物群、花成まで日数、子実収量および総バイオマス収量）を各遺伝子型についてモニターする。
【０２３９】
成熟しているが、老化する前の時点において、子実およびその残りのバイオマス（茎葉）を収穫し、各遺伝子型について分離する。バイオマスおよび子実の代表的なサンプルを全デンプン含有量、糖含有量およびセルロース含有量について解析する。
【０２４０】
ＮＲＥＬ実験的生産設備における形質転換トウモロコシのエタノール収率の試験
米国国立再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）内の国立バイオエネルギーセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）は、Ｇｏｌｄｅｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏにおけるバイオエタノールパイロットプラント設備において、向上したトウモロコシを使用してエタノール生産の評価を行うプロジェクトの一部を援助することに同意している。３系統のトウモロコシ（形質転換トウモロコシ（例えば、Ｅ１−ＦＬＣトウモロコシ）；野生型コントロールトウモロコシおよび非形質転換コントロールトウモロコシ）を、試験プロットにおいてそれぞれ栽培し、３つのバイオマスサンプルタイプがもたらされる。これらのトウモロコシサンプルの各々を以下に記載するように使用する。
【０２４１】
トランスジェニックバイオマスからのエタノール収率と、コントロールバイオマスに添加された外来性セルラーゼから得られたエタノール収率との比較。非汚染土壌において栽培された形質転換トウモロコシ（例えば、Ｅ１−ＦＬＣトウモロコシ）の約２．５ｋｇの生体重のバイオマス（子実を除く）（サンプルタイプ１）を１０メッシュに粉砕する。水を加えることにより、スラリーの総体積を５Ｌにする。そのスラリーをパイロット生産容器内で、５０℃の温度において４８時間加熱する。次いで、発酵微生物を加え、４８時間、加熱を４０℃に下げる。合計９６時間にわたって、六炭糖と五炭糖との組成解析およびエタノール解析のために１０ｍＬのサンプルを６時間間隔で採取する。
【０２４２】
この手順をサンプル２および３について繰り返すが、野生型コントロールトウモロコシおよび非形質転換コントロールトウモロコシでは、ｔ＝０において外部のセルラーゼ（ＣｅｌｌｕｃｌａｓｔＴＭ）を加える。
【０２４３】
スラリー残渣を乾燥し、計量することにより、加工後に残存しているバイオマスの割合を測定する。エタノール生産についてトランスジェニックトウモロコシの成績と非トランスジェニックトウモロコシの成績とを比較することによって、結果を解析する。
【０２４４】
外来性セルラーゼを加えたトランスジェニックバイオマスからのエタノール収率の評価。上記の手順の後、試験場所からのトランスジェニックトウモロコシ（例えば、Ｅ１−ＦＬＣトウモロコシ）（サンプル１）をＣｅｌｌｕｃｌａｓｔとともに加工する。トランスジェニックトウモロコシのみおよびＣｅｌｌｕｃｌａｓｔのみのプロセスからの収率と、エタノール収率を比較する。
【０２４５】
コントロールバイオマスと組み合わされたトランスジェニックバイオマスからのエタノール収率の評価。上記の手順の後、上記場所からの１．２５ｋｇの生体重のトランスジェニックトウモロコシ（例えば、Ｅ１−ＦＬＣトウモロコシ）（サンプル１）を１．２５ｋｇの生体重のコントロールトウモロコシ（サンプル２）と組み合わせて、外来性セルラーゼを添加して加工する。得られた結果から、トランスジェニック（例えば、Ｅ１−ＦＬＣ）バイオマスにおける酵素（例えば、Ｅ１）の標的産生レベル（ＴＳＰの２０％）が、その酵素（例えば、Ｅ１）を含んでいない添加バイオマスにおいてセルロースを加水分解するのに十分な程度か判定することができる。
【０２４６】
同時に行う加水分解および発酵からのエタノール収率の評価。上記の手順の後、上記場所からのトランスジェニックトウモロコシ（例えば、Ｅ１−ＦＬＣトウモロコシ）（サンプル１）（乾式粉砕トウモロコシ種子を含む）を２つのアミラーゼ酵素（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ）とともに加工する。これを、非汚染場所からのコントロールトウモロコシ（サンプル２）について繰り返す。結果を比較することにより、リグノセルロースバイオマスとデンプンとを同時に加工する能力が証明される。
【０２４７】
セルラーゼの性能に対する前加工の影響の評価。ＮＲＥＬは、Ｅｄｅｎｓｐａｃｅが供給するセルロースバイオマス原料の最初のスクリーニング実験を行う。この実験は、変換収率（すなわち、重合体の材料を単量体の糖に変換すること）を最大にする条件を同定する目的で種々の前加工条件を検討する。ＮＲＥＬは、外界温度条件および高温条件ならびに加圧条件においてサンプルを加工し、そしてフラスコ振盪実験において変換収率を評価し、また、前加工の前後において酵素活性を評価する。
【０２４８】
化学的前処理／熱前処理の代わりとなるリグニナーゼおよびヘミセルラーゼの適用能力の評価。上に記載した評価の結果に基づいて、ＮＲＥＬは、５Ｌの小規模発酵槽において性能試験を行い、正確な材料バランスデータによって裏づけされる性能結果がもたらされる。先のフラスコ振盪実験において変換収率を最大にする条件において、この研究に十分な材料を生産する。次いで、前処理による変換の結果を、前処理の代わりとしてリグニナーゼおよびヘミセルラーゼを含むトウモロコシを使用した結果と比較する。
【０２４９】
経済的成果の評価
向上したトウモロコシからのエタノール生産コストの予備的な見積もりを行う。評価されるべき因子としては、エタノール収率の差とともに、外来性セルラーゼ、前処理方法、発酵および他の生産方法ならびに植物の栽培のコストの差が挙げられる。水素燃料の生産において、上記手法を将来的に使用することに対する長所とともに、既存のエタノール生産設備にトランスジェニック植物を調和することに対する長所がもたらされるだろう。
【０２５０】
（実施例６：エタノール生産を増加するためのセルロース材料とデンプンとの同時加工）
背景。米国では、トウモロコシ子実中のデンプンからグルコースを発酵することによって、燃料エタノールが生産されているが、穀物供給量の限界ならびに食用および動物飼料用との競争によって、この供給源からのエタノール生産の将来成長は抑えられるだろう。本発明は、セルラーゼ酵素を発現するようにトウモロコシを操作することによって、トウモロコシ子実からのエタノール収率を上昇させる方法を提供し、それにより、子実中のセルロース材料を発酵可能な糖に加水分解することが促進される。子実中に酵素が産生されることによって、現在の生産技術よりも著しく進歩する可能性がもたらされ、その進歩としては、酵素に対する変動コストの低下および酵素とセルロース基質との良好な混合が挙げられる。このプロジェクトが無事に終了すると、２０１２年までに、毎年さらに１１億ガロンのエタノールをトウモロコシ子実から生産することができるようになる。また、このプロジェクトは、トウモロコシ茎葉、スイッチグラスおよび他の再生可能なエネルギー作物をはじめとしたセルロースバイオマスの一層多量な供給源に対して、この「植物内酵素」アプローチのより広い応用の基礎を築くことになる。
【０２５１】
米国では、エタノールは、トウモロコシ子実から生産されており、トウモロコシ子実は、発酵のための個別のグルコース分子に容易に加水分解されるグルコースポリマーであるデンプンから主に構成されている（次いで、酵母を使用することにより、アルコール発酵を介して、グルコースをエタノールに変換することができる）。トウモロコシ穀粒をエタノールに変換するための大規模な方法が２つあり、それは、湿式粉砕プロセスおよび乾式粉砕プロセスである。湿式粉砕では、湿式粉砕することおよびそれらをデンプン、油、繊維およびタンパク質成分に分画することによって、穀粒を加工する（Ｍ．Ｒ．Ｌａｄｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｓｗａｒｃｚｋｏｐｆ，Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９１，３６：８３−９５；およびＭ．Ｇｕｌａｔｉら、Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，５８：２５３−２６４）。デンプン画分のみをエタノールに使用する場合、その他の成分は、動物飼料およびトウモロコシ油などの価値ある製品を生産するために使用される。乾式粉砕では、穀粒全体を穀粉になるまで粉砕し、そして共に加工されることにより、一連の工程を介してエタノールが生産される。トウモロコシ穀粒が完全に粉砕され、液化されることにより、子実中のデンプンが放出し、次いで、それを加水分解し、発酵することにより、エタノールおよび動物飼料として使用される乾燥蒸留穀物が生産される（Ｍ．Ｒ．Ｌａｄｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｓｗａｒｃｚｋｏｐｆ，Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９１，３６：８３−９５；およびＭ．Ｇｕｌａｔｉら、Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，５８：２５３−２６４）。２０００年には、米国におけるエタノール生産の約５４％が、湿式粉砕からである（Ｍ．Ｇｒａｂｏｓｋｉ，“Ｆｏｓｓｉｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｏｒｎ  Ｅｔｈａｎｏｌ”，Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｎ  Ｇｒｏｗｅｒｓ’  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００２）が、乾式粉砕プロセスは、エタノールを生産するための技術的により簡易なプロセスであり、乾式粉砕プラントの建設はそれほど高額ではない（Ｖ．Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｅｃｋｈｏｆｆ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．，１９９６，７３：７１６−７２０）。その結果、現在建築中の大部分のエタノールプラントは、乾式粉砕プラントであり、２０１２年までには、米国で生産されるエタノールの８０％が、乾式粉砕プラントからとなるだろう（Ｍ．Ｇｒａｂｏｓｋｉ，“Ｆｏｓｓｉｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｏｒｎ  Ｅｔｈａｎｏｌ”，Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｎ  Ｇｒｏｗｅｒｓ’  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００２）。
【０２５２】
本明細書中に報告されるように、本出願人は、Ｅ１を発現するタバコ植物が、Ｅ１を活性化する温度でインキュベートされるときに、より高いレベルのグルコースを生産することを証明した。セルラーゼ酵素を植物に導入する目的は、トランスジェニックバイオマスをグルコースに直接変換することであるが、そのトランスジェニック植物はまた、セルロース加水分解用に他の植物バイオマスに添加され得るセルラーゼの供給源としても使用され得る。トウモロコシ穀粒の大部分は、デンプンから構成されているが、穀粒の穀皮は、主にセルロースである。全体的に、トウモロコシ穀粒中の約９％のバイオマスは、セルロース材料（４％セルロース、５％ヘミセルロース）であり（Ｍ．Ｇｕｌａｔｉら、Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，５８：２５３−２６４）、そして、希酸処理（Ｂ．Ｄｉｅｎら、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９９，２２：５７５−５８１）またはセルラーゼ酵素によって効率的に加水分解されることにより、発酵用のさらなるグルコースおよび五炭糖がもたらされ得（Ｄ．Ｉｒｗｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００３，６１：３５２−３５８）、エタノール収率が上昇し得る（Ｖ．Ｓｉｎｇｈら、ＡＳＡＥ／ＣＳＡＥ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐａｐｅｒ  Ｎｏ．０４６０５６，２００４，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＩ）。さらに、トウモロコシ穀粒には、セルロースを酵素的加水分解から保護するリグニンがほとんど存在しないので、トウモロコシ穀粒中のセルロースは、魅力的なセルロース原料である。
【０２５３】
予備的な結果および技術的目標。予備試験において、本出願人は、Ｅ１酵素を産生する植物が、トウモロコシ穀粒中のセルロースをグルコースに変換するのに有用であるか否かを、Ｅ１タバコからの抽出物を使用して調べた。乾燥し、２０メッシュに粉砕した野生型トウモロコシ穀粒を、Ｅ１タバコ抽出物とともに６５℃でインキュベートすることにより、Ｅ１酵素を活性化させた。炭水化物解析と組み合わせたイオンクロマトグラフィによる解析から、インキュベート後のトウモロコシ穀粒溶液中に高い糖濃度が存在する（Ｅ１を含まない野生型タバコ抽出物とともにインキュベートしたサンプル中には存在しなかった）ことが同定される（図１７を参照のこと（ａ））。Ｅ１抽出物とともにインキュベートしたトウモロコシサンプルにおけるグルコースピークは、野生型タバコ抽出物とともにインキュベートしたトウモロコシサンプルにおいて見出されたピークよりも著しく大きいが、野生型サンプルは、少量の未同定の糖を含む。２４時間、野生型タバコ抽出物とともにインキュベートされたトウモロコシ穀粒から生産される少量のグルコースは、クエン酸緩衝液中でインキュベートされた穀粒において、感知できるほどに多くない（図１７（ｂ））。グルコース二量体のセロビオースは、セルロースにおいてグルコース分子を連結しているβ−１，４−グリコシド結合をランダムに切断することによるＥ１エンドグルカナーゼの機能として観察されると予想された。しかしながら、Ｅ１は、２つのグルコース分子同士を連結するグリコシド結合を効率的に切断せず、かなりのレベルのインタクトなセロビオースが残存する。この実験においてグルコース収量を最大にするために、微生物のセロビオアーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏａｓｅ）（Ｎｏｖｏ１８８，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）をＥ１タバコ抽出物および野生型タバコ抽出物に加えることにより、セロビオースをグルコースに加水分解した。
【０２５４】
トウモロコシ穀粒中のセルロースを加水分解するために外部のセルラーゼを加えるという余分な加工工程を回避するために、トウモロコシ穀粒中において直接その酵素を産生させることは、より効率的である。本出願人は、構成的に活性なプロモーターの制御下でＥ１酵素を発現するトランスジェニックトウモロコシ系統を開発した。ウエスタンブロット解析から、複数の系統由来のトウモロコシ組織中にＥ１タンパク質が存在することが明らかに示され（図１３、レーン１、２、５および６、上のパネル）、また、プロモーターの性質に起因して、導入遺伝子Ｅ１の発現の指示が、穀粒中で発現させ、蓄積させるとも予想される。
【０２５５】
トウモロコシ子実中にリグニンが存在せず、また、収穫コストおよび加工コストをトウモロコシ子実中のデンプンからの既存のエタノール生産と分担できるので、トウモロコシ子実中のセルロースは、ほとんどのリグノセルロースバイオマスよりも魅力的な原料である。トウモロコシ子実からのエタノール収率の上昇の可能性は、セルロースをデンプンとともに加工するとき、トウモロコシ１ブッシェルあたり２．８４ガロンというエタノール収率が実証され、デンプンからの２．５８ガロン／ブッシェルの収率（Ｖ．Ｓｉｎｇｈら、ＡＳＡＥ／ＣＳＡＥ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐａｐｅｒ  Ｎｏ．０４６０５６，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＩ，２００４，ＡＳＡＥ）と比べて、収率が１０％上昇する。中型のエタノールプラントは、１年におよそ１億ガロンのエタノールを生産することができる。トウモロコシ穀粒中のセルロース画分を、グルコースに変換することができ、次いで、エタノールに発酵することができる場合、さらに毎年９００万ガロンのエタノールを生産することができ、これは、変換効率が８０％と推定される（Ｍ．Ｇｕｌａｔｉら、Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，５８：２５３−２６４）。さらに、エタノールを生産するためにセルロースを利用することによって、可溶物を含む乾燥蒸留穀物（ＤＤＧＳ）が、より少ない繊維ならびにより多いタンパク質および脂肪含有量を有することになり、ＤＤＧＳがより価値あるものになる。エタノール価格が、２００６年６月４日に報告された１ガロンあたり＄２．９０という現在の価格付近で維持され続ける場合、エタノール生産が増加すると、生産者にとってわずかに追加コストが必要となるだけの状況で、大きな収入がもたらされるので、これらの利点によって、エタノールが協同組合およびトウモロコシ生産者にとってかなり興味深いものとなるはずである。さらに、トウモロコシ子実中のセルロースを利用することによってもエタノール収率を増加させるセルラーゼを含むトウモロコシ作物を使用することによって、セルロースからのエタノール生産に向けて操作された、向上した作物に対する最も重要な市場がもたらされる。
【０２５６】
このプロジェクトを支持する技術的な目標の１つは、Ｅ１エンドグルカナーゼを発現するように操作されたトウモロコシ子実におけるセルロースの加水分解を実証することである。タバコからのＥ１抽出物を使用した予備的なデータは、Ｅ１酵素が、トウモロコシ穀粒中のセルロース画分を加水分解する能力を有すると示唆している。構成的プロモーターの支配下でＥ１を発現するトランスジェニックトウモロコシ系統が作出され、この酵素が、穀粒中ならびに植物体の残りの部分に蓄積される。これらのＥ１トウモロコシ系統は、トウモロコシ穀粒中のセルロースをグルコースに変換することについて試験される。
【０２５７】
別の技術的な目標は、Ｅ１トウモロコシにおける、セルロース加水分解とデンプン加水分解とを組み合わせることによって、グルコース収率の４％増加を達成することである。Ｅ１トウモロコシ子実を、乾式粉砕プロセスにおいて、デンプン加水分解に対して標準的な条件下で加工する。処理において変更される点としては、穀粒の物理的加工（例えば、粒子メッシュサイズ）および反応条件（例えば、ｐＨ、温度、粘度、加工時間およびデンプン加水分解用のアミラーゼ酵素の添加）が挙げられる。成功結果は、湿式粉砕プロセスにおいて最初に分画され、次いで別々に加水分解されるのとは対照的に、トウモロコシ穀粒中のセルロースが、デンプン画分とともに直接加工され得、野生型穀粒と比較して、標的とする４％のグルコース収率の増加をもたらすことを証明する。この証明は、トウモロコシ穀粒由来のセルロースからのグルコース生産が、乾式粉砕プロセスに比較的容易に組み込まれ得ることの証明にとって重要である。
【０２５８】
別の技術的な目標は、Ｅ１トウモロコシ穀粒中のセルロース成分とデンプン成分の両方からエタノールを生産することである。トウモロコシ穀粒中のセルロースおよびデンプンの消化から生産されるグルコースは、エタノールを合成するために実験室規模の発酵反応において使用される。エタノール収率に対する、セルロース加水分解の副産物（例えば、五炭糖）の正と負の作用の両方が測定される。
【０２５９】
より詳細には、今後の研究は、以下が挙げられる：
１．セルロース処理による、Ｅ１トウモロコシ穀粒中のセルロースからのグルコース生産のレベルの特徴づけ
インビトロにおけるトウモロコシ穀粒抽出物由来のＥ１活性の確認。トランスジェニックＥ１タバコ葉およびトランスジェニックＥ１トウモロコシ葉からの抽出物中のＥ１セルラーゼ活性が、インビトロにおいて証明されている。現在、トランスジェニックトウモロコシ系統の種子を大型化する必要性があるため、Ｅ１トウモロコシ穀粒は、まだ解析されていないが、トランスジェニックトウモロコシ植物は、現在栽培中であり、これらの解析用に十分な子実がもたらされるだろう。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）は、市販されていて、セルロースと結合する色素であるコンゴーレッドと組み合わせてセルラーゼ活性を解析するために通常使用される（Ｐ．Ｂｅｄｕｉｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８３，１３１：３３３−３３６）合成セルロース分子である。ＣＭＣが、ペトリ皿中の寒天プレート内に取り込まれているとき、セルラーゼがプレートに適用されるとＣＭＣを分解することができる。コンゴーレッドとともにインキュベートされるとき、これらの分解領域は、赤く染色されないことにより、明らかに目で見ることができる。各系統を別々に解析することができるように、Ｅ１トウモロコシ穀粒が個別の穂軸から収穫される。その穂軸を４０℃にて乾燥し、次いで、穀粒を取り出し、２０メッシュに粉砕する。各穂軸からのＥ１トウモロコシ穀粒の３つの１００ｍｇサンプルからの抽出物を、７０℃におけるセルラーゼ活性についてＣＭＣプレート上でアッセイし、セルラーゼ活性を示すすべての系統をさらなる特徴付けに使用する。個別のトウモロコシ系統において、Ｅ１タンパク質発現のレベルについての解析がすでになされており、そして、酵素レベルとセルラーゼ活性との間に直接的な相関が存在するか否かを調べるために、セルラーゼ活性のレベルをタンパク質発現と比較する。
【０２６０】
Ｅ１トウモロコシからのグルコース収率の解析。Ｅ１タバコからの抽出物が、トウモロコシ穀粒からのグルコース収率を上昇させることを示している予備的な結果によって示唆されているように（図１７（ｂ））、トウモロコシ穀粒へのＥ１エンドグルカナーゼの組み込みにより、グルコース回収率が上昇すると予想される。粉砕したトウモロコシ穀粒を、８０℃にて２４時間、クエン酸緩衝液，ｐＨ５．０中でインキュベートした後に、グルコースレベルを測定することによって、この仮説を検証する。市販の検査キット（Ｒａｉｃｈｅｍ）を使用して、４００ｎｍの波長においてグルコースを分光光度的に測定し、また、セルロース分解産物も測定することができるイオンクロマトグラフィ（Ｍｅｔｒｏｈｍ）によってグルコースを測定する。ネガティブコントロールとして野生型穀粒および推奨温度５５℃においてインキュベートされる市販のセルラーゼ混合物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）であるセルラーゼＡＮと、トランスジェニックトウモロコシ穀粒とを比較する。条件（例えば、温度およびインキュベート時間）を検討して、グルコースの最適な収率をもたらす条件を特定する。
【０２６１】
２．Ｅ１トウモロコシ穀粒中のセルロースおよびデンプンからの組み合わされたグルコース生産の測定
デンプン加水分解についての代表的な反応条件下におけるＥ１活性の測定。Ｅ１を発現するトランスジェニックトウモロコシからの予測される利点は、既存のデンプン加水分解反応条件に対して重大な改変なしにセルロースバイオマスが加工され得るという仮説からくるものである。本出願人は、最適な小規模の反応条件およびデンプン糖化に必要な原料の必要量を決定する。次いで、本出願人は、デンプン加工にセルラーゼインキュベート工程を組み込む最適な方法を決定するが、それには、セルラーゼ反応条件の改変を含み得る。原料としてＥ１トウモロコシ穀粒を使用して、これらの条件を検討することにより、トウモロコシ穀粒中のセルロースから生産され得るグルコースの量を測定する。グルコース生産は、分光光度的におよびＩＣによって測定される。デンプンおよびセルロースが、同時に加水分解され得るか否かを検討するために、デンプンアミラーゼ活性について最適化された条件（代表的には、Ｅ１の最適な条件よりも高い温度およびｐＨにおけるものである）下で、Ｅ１トウモロコシ穀粒をインキュベートし、グルコースレベルを測定する。
【０２６２】
セルロースとデンプンの両方を加水分解するように処理されたＥ１トウモロコシ穀粒からのグルコースのレベルの測定。トウモロコシ子実中のデンプンは、エタノールプラントにおいて、グルコアミラーゼとα−アミラーゼ酵素との組み合わせを使用して、加水分解される。得られた結果が、デンプン加水分解に最適な反応条件下においてＥ１が機能しないと示唆する場合、トウモロコシ穀粒中のセルロースをアミラーゼ処理の前に加水分解することによって、高温でのＥ１の変性の可能性を回避する。先に記載したように決定された条件下において粉砕トウモロコシ穀粒をインキュベートした後、α−アミラーゼをその反応物に加え、そしてα−アミラーゼが完了した後に、グルコアミラーゼを加えることによって、デンプン消化が完結する。得られた結果が、デンプン加水分解に必要な反応条件下においてＥ１酵素が効率的に機能し得ると示唆する場合、トウモロコシ穀粒を単独で、アミラーゼ活性に必要なインキュベート工程に供する。Ｅ１トウモロコシ穀粒を原料として使用し、グルコースの供給源としてデンプンとセルロースの両方を利用することから得られるグルコースの収率を評価する。内在性のＥ１酵素を使用した場合を、外部のセルラーゼＡＮ酵素の添加の場合およびセルラーゼが存在しない野生型トウモロコシ穀粒からのグルコース生産の基礎レベルと比較する。
【０２６３】
３．小規模でのＥ１トウモロコシ穀粒からのエタノールの生産
Ｅ１トウモロコシ穀粒中のセルロースが、エタノールを合成する下流のプロセスを干渉せずにグルコースに変換され得ることを確かめるために、Ｅ１トウモロコシ穀粒からのバイオマスを使用して、実験室規模の量のエタノールを生産する。Ｅ１トウモロコシ穀粒からのグルコースの定量の後、残存溶液をオートクレーブし、次いで、グルコースをエタノールに変換するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅという接種材料とともに、嫌気的発酵系においてインキュベートする。発酵反応物からサンプルを４８時間後に取り出し、アルコールデヒドロゲナーゼを使用してエタノール濃度を分光光度的に測定する（Ｌ．Ｋｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘ．，２００５，２９：６６−７９）。アルコールデヒドロゲナーゼ酵素は、エタノールの存在下で、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を、３４０ｎｍにて分光光度的に測定することができるＮＡＤＨに還元する。
【０２６４】
今後の研究としては：（１）複数のトウモロコシ系統をセルラーゼおよびヘミセルラーゼの高発現についてスクリーニングすること；（２）トウモロコシ子実中のセルラーゼとヘミセルラーゼの特徴を組み合わせることによって、現在の乾式粉砕生産よりも全体で９％増のエタノール収率を示すこと；（３）セルロース材料の供給源としてトウモロコシ穂軸の使用の可能性を検討すること；（４）野外条件下で良好な子実収量を示し、その後の加工に向けて子実が大型化された、操作されたトウモロコシを用いて野外試験を行うこと；および（５）実際の乾式粉砕加工条件下でのエタノール収率について、操作されたトウモロコシ種子を試験すること、も挙げられる。
【０２６５】
（実施例７：トランスジェニックバイオマスからのグルコース変換の増加）
Ｅ１サンプルおよび野生型サンプルを風乾することにより水分含有量を１６％にし、次いで、そのバイオマスのサブセットを、標準的な手法に従ってＡＦＥＸ（すなわち、アンモニア繊維爆砕）前処理した。外部のセルラーゼ酵素であるＳｐｅｚｙｍｅおよびＮｏｖｏ１８８を加えることによって、未処理サンプルおよびＡＦＥＸ処理サンプルを同時に加水分解反応に供した。この反応物を５０℃で２４時間インキュベートした後、存在するグルコースレベルを測定した。
【０２６６】
結果を図１９に示す。野生型バイオマスと比べて、Ｅ１エンドグルカナーゼを発現するトランスジェニックタバコバイオマスの加水分解からグルコースレベルの上昇が観察された。未処理Ｅ１タバコは、野生型バイオマスよりも高いグルコースレベルをもたらした（６．０ｇ／Ｌ  対  ２．９ｇ／Ｌ）。未処理Ｅ１タバコから生産されたグルコースのレベルは、ＡＦＥＸ前処理バイオマスのレベルと類似しており、これは、セルラーゼ酵素の組み込みによって、化学的な前処理（アンモニア繊維爆砕）の必要性が減り得るか、または排除され得ることを示唆する。
【０２６７】
（実施例８：植物における微生物セルラーゼの発現用にコドンが最適化された遺伝子配列）
上ですでに述べたように、植物における発現を増加させるために微生物の遺伝子を改変する方法が開発された。Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍの配列決定されたゲノムを解析することによって、複合植物コドン使用頻度表を構築した。これらのゲノムの各々のコドン使用頻度を平均することにより、単子葉植物および双子葉植物から複合コドン使用頻度を得て、そしてこの複合表をテンプレートとして使用することにより、微生物配列が、植物における発現により適したコドン使用頻度を有するように微生物のＤＮＡ配列を改変した。
【０２６８】
植物におけるＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（アクセッション番号Ｕ３３２１２）からのＥ１エンドグルカナーゼの転写発現を増加させるために、複合植物コドン使用頻度表を使用して、その遺伝子の微生物配列を最適化した。Ｚｅａ  ｍａｙｓおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおける平均コドン使用頻度は、Ｋａｚｕｓａ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から得られ、また、平均することにより、複合植物コドン使用頻度表を作成した。最適化し、植物への形質転換に使用したＥ１配列は、以下のような配列番号１を有していた：
【０２６９】
【化１】
2009528033.tif 000002
Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓゲノムの配列決定から同定された、推定ファミリー４８グリコシド加水分解酵素（アクセッション番号ＹＰ８７２３７６）およびファミリー１０グリコシド加水分解酵素（アクセッション番号ＹＰ８７１９４１）をコードする遺伝子もまた、トウモロコシにおいて転写発現を増加させるためにコドンを最適化した。Ｚｅａ  ｍａｙｓについての平均コドン使用頻度表を使用した最適化の後、ファミリー４８酵素に対する以下の配列（配列番号２）を植物における発現に対して使用した：
【０２７０】
【化２】
2009528033.tif 000003
【０２７１】
【化３】
2009528033.tif 000004
コドン最適化の後、ファミリー１０酵素に対する以下の配列（配列番号３）を植物における発現に対して使用した：
【０２７２】
【化４】
2009528033.tif 000005
（実施例９：植物において機能し得る微生物セルラーゼ酵素を迅速に同定するためのスクリーニング方法）
精製されたセルロース基質であるカルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）を寒天とともに使用することによって、ペトリ皿に注ぎ込まれた固形培地を形成した。上ですでに述べたように、ＣＭＣは、セルラーゼ酵素（例えば、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＥ１エンドグルカナーゼ）によって加水分解されると、コンゴーレッド色素に反応しなくなる。Ｅ１遺伝子を発現するトランスジェニックタバコバイオマスをＣＭＣプレートの表面上に直接置き、６５℃で３０分間インキュベートした。この温度は、Ｅ１活性の最適温度付近であり（Ｚ．Ｄａｉら、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０００，６：２７７−２８５；Ｚ．Ｄａｉら、Ｔｒａｎｓｇ．Ｒｅｓ．，２０００，９：４３−５４）、かつ、ＣＭＣプレートを融解させない温度である。インキュベートした後、タバコバイオマスを除去し、そのＣＭＣプレートを、その培地中のセルロースを染色するためにコンゴーレッドで浸漬した。野生型非形質転換タバコ葉と対照的に（図２０Ａを参照のこと）、Ｅ１タバコ葉は、隣接したＣＭＣを明らかに加水分解し、コンゴーレッドによって培地が染色されず、明確な葉の形の領域がもたらされたことが観察された（図２０Ｂを参照のこと）。
【０２７３】
この方法を使用することにより、葉（または他の植物組織）のサンプルによって一過性に発現された酵素（例えば、微生物酵素）のセルラーゼ活性を迅速に評価することができる。
【０２７４】
その他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書中に開示される本発明の実施から当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は、単なる例示と考えられ、本発明の真の範囲は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】図１は、実施例１に報告されるタバコの形質転換において使用されるｐＢＩ１２１ベクターのマップである。以下の配列は、省略して記載される；ＮＯＳプロモーター（Ｎ−ｐ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）、ＮＯＳターミネーター（Ｎ−ｔ）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、アグロバクテリア右境界配列（ＲＢ）、左境界配列（ＬＢ）。
【図２】図２は、実施例１に報告されるタバコの形質転換において使用されるｐＢＩ１２１−Ｅ１ベクターの右境界配列と左境界配列との間のマップである。Ｅ１構築物は、Ｅ１触媒ドメインのＮ末端に融合したＶＳＰβシグナルペプチドを含む。以下の配列は、省略して記載される；ＮＯＳプロモーター（Ｎ−ｐ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）、ＮＯＳターミネーター（Ｎ−ｔ）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、アグロバクテリア右境界配列（ＲＢ）、左境界配列（ＬＢ）。
【図３−１】図３は、ｐＧｒｅｅｎのマップを示している。この構築物は、２つのカセット：（１）ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）およびノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターのポリアデニル化シグナルによって制御されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ花成Ｃ（ＦＬＣ）コード配列および（２）３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターによって制御されるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード領域（ｂａｒ）除草剤抵抗性選択可能マーカー遺伝子を含む。
【図３−２】表１は、加水分解の５日後のトランスジェニックタバコおよび非トランスジェニックタバコ由来のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を表している。これらの結果は、Ｅ１タバコが、自己加水分解することができることおよびＥ１タバコとともに使用される外来性セルロースがより有効であることを示している。
【図４】図４は、セルラーゼＡＮ、グルコアミラーゼおよびヘミセルラーゼの添加の有りまたは無しにおいて、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中、５０℃で２４時間平衡化した、乾燥Ｅ１−ＦＬＣおよびＷ３８（野生型）タバコのバイオマスからのグルコース生産を示すグラフである。エラーバーは、±１標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図５】図５は、Ｐｂ汚染土壌において栽培された、非形質転換タバコおよびＥ１−ＦＬＣ形質転換タバコにおけるＰｂ（鉛）およびＺｎ（亜鉛）のシュート濃度を示すグラフである。この結果から、非形質転換タバコと形質転換タバコのファイトレメディエーション能力が類似していることが示唆される。
【図６】図６は、乾燥させ粉砕したバイオマスを、様々なセルラーゼが添加されたｐＨ４．５クエン酸緩衝液とともに５０℃においてインキュベートしたものから抽出可能なＣａ（カルシウム）およびＦｅ（鉄）の濃度を示すグラフである。
【図７】図７は、非汚染土壌およびＰｂ汚染土壌において栽培されたＥ１タバコからの、外来性セルラーゼの存在下または非存在下におけるグルコース生成の結果を示すグラフである。これらの結果は、約３００ｍｇ／ｋｇのＰｂを含むＥ１タバコにおけるグルコースの生成は低いが、この影響は、外来性セルラーゼが加えられるときに無くなることを示している。
【図８−１】図８は、ＦＬＣ形質転換タバコにおいて花成の遅延およびバイオマスの増加を示している２枚の写真である。図８（Ａ）は、コントロール非形質転換植物と比べて、花成が遅延し、葉の大きさが大きくなり、植物体の高さが低くなり、頑丈な習性を示すＦＬＣトランスジェニック植物を示している。図８（Ｂ）は、コントロール非形質転換植物の完全に成熟し、花粉が脱落した葯およびＦＬＣ植物のまだ成熟していない葯を示している。
【図８−２】表２ａは、花成遅延および花成前の栄養生長に関するコントロール（非形質転換）とＴ０Ｅ１−ＦＬＣトランスジェニックタバコ植物との比較を示している。各系統が、別個のヘテロ接合性の遺伝子型であり、タバコゲノムにおけるＦＬＣ遺伝子の潜在的な影響が能力のばらつきを生むことに注意されたい。表２ｂは、１植物あたりの生体重および乾燥重量のバイオマス、１０００個の種子重ならびに種子の収量における、コントロール（非形質転換）とＴ０Ｅ１−ＦＬＣトランスジェニックタバコ植物との比較を示している。
【図８−３】表２ａは、花成遅延および花成前の栄養生長に関するコントロール（非形質転換）とＴ０Ｅ１−ＦＬＣトランスジェニックタバコ植物との比較を示している。各系統が、別個のヘテロ接合性の遺伝子型であり、タバコゲノムにおけるＦＬＣ遺伝子の潜在的な影響が能力のばらつきを生むことに注意されたい。表２ｂは、１植物あたりの生体重および乾燥重量のバイオマス、１０００個の種子重ならびに種子の収量における、コントロール（非形質転換）とＴ０Ｅ１−ＦＬＣトランスジェニックタバコ植物との比較を示している。
【図９】図９は、３５Ｓプロモーターによって動かされるＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  Ｅ１触媒ドメインおよびＥ１酵素のアポプラスト標的化用のタバコ病因関連タンパク質１ａ（Ｐｒ１ａ）シグナルペプチドをコードする配列を含む構築物であるｐＭＺ７６６Ｅ１−ｃａｔを示している。このスキームにおいて使用される省略形は、以下のとおりである：ＣａＭＶ  ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；Ω：タバコモザイクウイルスΩ翻訳エンハンサー；Ｐｒ１ａ  ＳＰ：タバコ病因関連タンパク質１ａ（Ｐｒ１ａ）シグナルペプチドをコードする配列；Ｅ１−ｃａｔ：Ａ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  Ｅ１の触媒ドメイン；およびｎｏｓ：ノパリンシンターゼのポリアデニル化シグナル。
【図１０】図１０は、イネアクチン１プロモーターおよびｎｏｓターミネーターによって制御されるｂａｒ除草剤選択可能マーカー遺伝子を含む構築物であるｐＤＭ３０２を示している。このスキームにおいて使用される省略形は、以下のとおりである：ｂａｒ：フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（選択可能マーカー／除草剤抵抗性）コード配列；ｎｏｓ：ノパリンシンターゼターミネーター。
【図１１】図１１は、イネアクチン１（Ａｃｔ１）プロモーターおよびジャガイモプロテイナーゼインヒビターＩＩターミネーターによって制御されるオオムギＨｖａ１コード配列の構築物であるｐＢＹ５２０を示している。これもまた、３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターによって制御されるｂａｒ除草剤抵抗性選択可能マーカーを含む。このスキームにおいて使用される省略形は、以下のとおりである：Ａｃｔ１−５’：イネ作用１プロモーター；Ｈｖａ１：オオムギＬｅａｈタンパク質コード配列；ＰｉｎＩＩ−３’：ジャガイモプロテイナーゼインヒビターターミネーター；３５Ｓ−５’：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；ｂａｒ：フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（選択可能マーカー／除草剤抵抗性）コード配列；およびｎｏｓ：ノパリンシンターゼターミネーター。
【図１２】図１２は、Ｅ１−ｃａｔをプローブとして使用した、トウモロコシ植物由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット解析の結果を示している。レーン１：ｐＭＺ７６６からの１０ｐｇのＳａｃＩ  Ｅ１フラグメント；レーン２〜３：非形質転換トウモロコシコントロール（レーン２：未消化ＤＮＡおよびレーン３：消化ＤＮＡ）；レーン４〜１３：５つの独立したｐＭＺ７６６形質転換体；（レーン４、６、８、１０および１２：未消化ＤＮＡ；レーン５、７、９、１１および１３：ＳａｃＩで消化したＤＮＡ）。バンドのサイズは、１ｋｂである。
【図１３】図１３は、トランスジェニックイネおよびトランスジェニックタバコと比較したときのトランスジェニックトウモロコシのウエスタンブロットを示している。
【図１４−１】図１４（Ａ）は、Ｅ１の１次抗体およびＦＩＴＣ抗マウス２次抗体を使用して、免疫蛍光共焦点レーザー顕微鏡像観察によって得られたＥ１トランスジェニックトウモロコシ葉組織の写真である。この写真は、Ｅ１トランスジェニック葉組織が、植物アポプラスト内にＥ１の明らかな貯蔵を示すことを表している。図１４（Ｂ）は、Ｅ１酵素の発現を示していない非形質転換コントロールトウモロコシ葉由来の葉組織の共焦点顕微鏡像である。
【図１４−２】表３は、Ｔ０トウモロコシ、Ｔ４タバコおよびＴ０イネにおける、Ｅ１の酵素活性および全可溶性タンパク質中のＥ１のパーセンテージを示している。結果がこの表に記載されているトウモロコシの系統は、図１３においてウエスタンブロットによって研究された系統と同じである。
【図１５】図１５は、３５Ｓプロモーターおよびエンハンサーによって制御されているＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍのエンドキシラナーゼ／ヘミセルラーゼｃＤＮＡを含んでいる構築物を示している。この構築物は、ＸＹＬ１を植物アポプラストに標的化するためのタバコ病因関連タンパク質１ａ（Ｐｒ１ａ）シグナルペプチドをコードする配列を含む。このスキームにおいて使用される省略形は、以下のとおりである：ＣａＭＶ  ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；Ω：タバコモザイクウイルス翻訳エンハンサー；およびＰｒ１ａ  ＳＰ：タバコをコードする配列。
【図１６】図１６は、Ｅ１を発現するトランスジェニックタバコ由来の粗抽出物のセルラーゼ活性を示している。このペトリ皿内の赤いカルボキシメチルセルロースは、Ｅ１抽出物または市販のセルラーゼ酵素（セルラーゼＡＮ，ＢＩＯ−ＣＡＴ）を適用することによって加水分解されて、透き通った領域を形成した。野生型タバコ抽出物からはセルラーゼ活性は観察されなかった。
【図１７】図１７（ａ）は、Ｅ１またはＷＴタバコ抽出物とともにインキュベートされたトウモロコシ穀粒からのＩＣクロマトグラムを示しており、溶液中に様々な糖分子が存在することを示唆している（実施例６を参照のこと）。ピークは、以下のとおり標識される：Ｇｌｕ：グルコース；ＣＢ：セロビオース。ＷＴ抽出物インキュベーションには、セロビオースの小さいピークが観察されるが、グルコースは存在しない。その代わり、ＷＴ抽出物とのインキュベーションには、不明な炭水化物ピークが見られる。図１７（ｂ）は、クエン酸緩衝液コントロール、Ｅ１タバコ抽出物または野生型タバコ抽出物のいずれかの中でインキュベートされたトウモロコシ子実サンプルからのグルコースの濃度を示すグラフである。抽出物添加の０時間後および２４時間後にグルコースの検出を行った。
【図１８】図１８は、Ｅ１遺伝子で形質転換されたタバコ植物においてキシロースが高産生されていることを図示するＩＣクロマトグラムを示している。Ｅ１形質転換タバコ植物組織または野生型タバコ植物組織を、８０℃において２時間、クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中でインキュベートした。その懸濁液を濾過し、可溶性糖について解析した。Ｅ１植物の抽出物中のキシロース（ヘミセルロースの１成分）の濃度は、野生型抽出物中のキシロース濃度（３ｇ／ｋｇ）よりもかなり高かった（１４．８ｇ／ｋｇ）。
【図１９】図１９は、Ｅ１エンドグルカナーゼを発現するトランスジェニックタバコバイオマスの加水分解からのグルコースの生産が野生型バイオマスと比べて高いことを示しているグラフである。ＡＦＥＸ（アンモニア繊維爆砕）処理の前後において、Ｅ１サンプルおよび野生型サンプルからのグルコースレベルを測定した（実施例７を参照のこと）。
【図２０】図２０は、コンゴーレッド染色を用いてＣＭＣ（カルボキシルメチルセルロース）のＥ１加水分解を可視化している２枚の写真である。６５℃で３０分間インキュベートする前（Ａ）およびした後（Ｂ）に、コンゴーレッドで染色した、非形質転換タバコ（左）およびトランスジェニックＥ１タバコ（右）の葉の先端。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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