(57)【要約】  本発明はトリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸、その核酸を含むベクター、その核酸またはベクターを含む宿主細胞、原核生物中でのトリアシルグリセロールリパーゼの発現方法、トリアシルグリセロールリパーゼの検出および製造方法、この方法によって取得可能なトリアシルグリセロールリパーゼ、ならびに前記の方法のためのトリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物中での機能性トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の発現方法であって、原核生物宿主細胞中、誘導性プロモーターの制御下でトリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させる方法。
【請求項２】
トリアシルグリセロールリパーゼの発現が低温で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
低温が１℃〜２５℃の範囲から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発現がチオレドキシンレダクターゼ欠失およびグルタチオンレダクターゼ欠失大腸菌株中で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列がカンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）由来のリパーゼＢ（ｃａｌＢ）をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
リパーゼＢが配列番号１（ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）もしくは配列番号２（ｃａｌＢ＿ｗｔ）に示されるヌクレオチド配列またはこれらに相同性を有するヌクレオチド配列にコードされている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列がＴ７のプロモーター（配列番号３）の制御下にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列が低温ショック誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
低温誘導性プロモーターが大腸菌のｃｓｐＡ遺伝子のプロモーター（配列番号４）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１以上のシャペロンを共発現させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
共発現させる１シャペロンまたは共発現させるシャペロン群が大腸菌のＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよびトリガー因子（ＴＦ）から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
トリガー因子を、場合によってＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬとともに共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬを共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
トリアシルグリセロールリパーゼの検出のための方法であって、
ｉ）トリアシルグリセロールリパーゼ活性が推測されるタンパク質を、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって発現させ、
ｉｉ）その発現産物を、トリアシルグリセロールリパーゼによって加水分解可能な基質と接触させ、そして
ｉｉｉ）加水分解活性を測定する、上記方法。
【請求項１７】
タンパク質の発現および／またはその加水分解活性の測定をマイクロタイタープレートで実施する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｉ）におけるタンパク質の発現が、リパーゼによって加水分解可能な基質の存在下で行われる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質の発現が、リパーゼによって加水分解可能な基質を含有する培地において行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｉ）発現させたタンパク質を細胞培養物から分離し、
ｉｉ）トリアシルグリセロールリパーゼによって加水分解可能な基質と接触させ、そして
ｉｉｉ）その加水分解活性を測定する、
請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
加水分解活性を、加水分解可能な基質の減少または加水分解産物の増加から光度測定によって測定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
トリアシルグリセロールリパーゼ活性について突然変異させたタンパク質または突然変異させた核酸にコードされるタンパク質のスクリーニングのための、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２３】
タンパク質が、カンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ（ｃａｌＢ）のコードヌクレオチド配列中に、少なくとも１個の突然変異を有する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
方法が、トリアシルグリセロールリパーゼの検出のために、ハイスループットスクリーニング法として実施される、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載された方法または使用。
【請求項２５】
請求項１６〜２４のいずれか１項に記載された方法を使用して発現させた、トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の活性を有するタンパク質を検出し、このタンパク質を発現する大腸菌株を、リパーゼを発現する条件下で培養し、場合によって発現させたリパーゼを単離する、トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の製造方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法によって取得可能なトリアシルグリセロールリパーゼ。
【請求項２７】
配列番号１に示されるコードヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２と少なくとも１ヌクレオチドが異なっているヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらのそれぞれに相同性を有するヌクレオチド配列を含む、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸。
【請求項２８】
少なくとも１個の調節核酸配列と機能し得るように連結させた請求項２７に記載のコード核酸を含む組換えベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸および／または請求項２８に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法を実施するための、請求項２７に記載のコード核酸配列、請求項２８に記載のベクターまたは請求項２９に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸、その核酸を含むベクター、その核酸またはベクターを含む宿主細胞、原核生物中でのトリアシルグリセロールリパーゼの発現方法、トリアシルグリセロールリパーゼの検出および製造のための方法、それによって取得可能なトリアシルグリセロールリパーゼ、ならびに前記の方法のための、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）は極めて多様な工業的用途、例えば洗剤工業、油化学、食品工業および精密化学物質の製造において、評価が高い、効果的な触媒である（Schmid 1998）。リパーゼはカルボン酸エステルヒドロラーゼ（加水分解酵素）であって、トリグリセリドおよびその他の一般的に疎水性のエステルの加水分解および合成の両方を触媒する。三次元結晶構造が解明されているすべてのトリアシルグリセロールリパーゼがα／β−ヒドロラーゼフォールディングタンパク質ファミリーに属し、これらは全体的に類似した構造をしている（Ollis 1992）。
【０００３】
カンジダ・アンタルクチカのリパーゼＢ（ＣａｌＢ）は多くの反応について効果的な触媒であり、例えば立体選択的変換およびポリエステル合成のために使用されている（Anderson 1998）。ＣａｌＢは溶媒が接近可能な活性中心を持ち（Uppenberg 1994）、また界面活性化を提示しない（Martinelleら、1995）。その活性中心は狭いじょうご状であり、この理由から、ＣａｌＢはトリグリセリドについてよりもカルボン酸エステル、例えばオクタン酸エチルについて高い活性を有する（Martinelle 1995）。有機媒体中のＣａｌＢの活性が水中の活性に匹敵するという事実、および、特に二級アルコールについてのＣａｌＢの高いエナンチオ選択性によって、この酵素がバイオテクノロジーで現在使用されている最も重要なリパーゼになっている。
【０００４】
これまで、大規模な工業上の用途においては、ＣａｌＢは主としてコウジ菌（Aspergillus oryzae）中で発現させていた（Hoegh 1995）。研究目的では、この酵素を酵母ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）（Rotticci-Mulderら、2001）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（Zhangら、2003）で発現させるのに成功した。管理が容易な原核生物発現系、すなわち大腸菌中でのＣａｌＢの発現は成功しなかった（Rotticci-Mulder 2003）。大腸菌の発現は後に初めて達成されたが、機能性ＣａｌＢの低生成率をもたらしただけだった（Rusnak 2004）。これは不幸なことである。なぜならば、大腸菌はその他の発現系よりも多くの顕著な利点を持ち、また大きな遺伝子ライブラリーの迅速で安価なハイスループットスクリーニングが可能だからである。
【０００５】
ランダム突然変異誘発によるＣａｌＢの改変が最近記載された（Chodorgeら、2005）。特定の用途のために、合理的な酵素設計によって、ＣａｌＢを改良するためのいくつかの試みも、文献で報告されている。これらの中には良好な結果をもたらしたものがあったが（Patkarら、1998; Rotticci 2000）、この酵素の触媒特性の理解が不十分なことから、合理的な酵素設計の可能性にはいまだに限界がある。
【０００６】
しかし、なお解決すべき主な問題は、大腸菌中での発現時のＣａｌＢの不十分な機能性であり、それは定方向進化による酵素の改良にとって必須のものである。この理由は、この酵素の複雑な三次構造にあるものと考えられ、それは機能性立体配置を確実にするためには３つのジスルフィド架橋の形成を必要とすることである。大腸菌またはその他の原核生物中でのこうしたタンパク質の製造には困難性がある。なぜならば原核生物の細胞環境、フォールディング機構およびフォールディング特性の制御のチェックポイントが真核生物のものとは異なっているからである（BaneyxおよびMujacic 2004）。これに関連して、大腸菌中でのＣａｌＢの当初の発現実験で、発明者らは、封入体の形成とＣａｌＢの活性の欠損を観察している（結果は不掲載）。
【０００７】
別の問題は翻訳レベルで発生し得る。ｔＲＮＡ種の量は各種生物体中でかなり差異が生じ得る。この問題はコドンの最適化によって克服することができ、事実、いくつかの真核生物タンパク質、例えばヒト１型ニューロフィブロミンタンパク質の１ドメインの発現レベルが顕著に上昇した（Hale 1998）。しかし、機能性酵素の量は発現レベルとは直接相関せず、したがってコドンの利用性とも条件によって相関するのみである。
【０００８】
実際の遺伝子配列の外に、プロモーターが発現効力に中心的な役割を持つ。バイオテクノロジーにおいて、使用されることが多いベクター系、例えばｐＥＴベクター系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、はＴ７プロモーターを含有し、これがあるため、大腸菌中での異種タンパク質の顕著な過剰発現の厳密な調節にとって好適なものとなっている。しかし、高発現レベルで異種発現させた酵素は不適正にフォールディングしたタンパク質をもたらすことが非常に多い。
【０００９】
低温感受性プロモーターは低下温度で一定のタンパク質の効果的な遺伝子発現を促進することができることが示されている。特に、以前は主要低温ショック遺伝子ｃｓｐＡのプロモーターが使用されていた（Goldsteinら、1990）。しかし、比較研究から明らかなように、大腸菌中での可溶性タンパク質の発現はなお問題が多く、そのタンパク質およびそのタンパク質の発生源の生物体如何による（Qingら、2004）。
【００１０】
細胞環境もまた機能性タンパク質、すなわち酵素活性があるタンパク質の生成率に影響を与えることがある。グルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）およびチオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）の遺伝子の突然変異が、大腸菌の細胞質中での発現時に、タンパク質のジスルフィド架橋の形成の増加をもたらすことがあることが報告されている（Prinzら、1997）。
【００１１】
大腸菌の細胞質中での可溶性タンパク質の生成率を向上させる１つの方法には、ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質フォールディングに関与する、分子シャペロン類の共発現が含まれる。これについては、シャペロンＤｎａＫ−ＤｎａＪまたはトリガー因子（ＴＦ）の過剰発現が、大腸菌中での発現時に、選択されたタンパク質の溶解度を増大させることが、以前に報告されている（Nishiharaら、2000）。６０ｋＤを超える標的タンパク質について良好な結果が報告された。約６０ｋＤよりも小さい標的タンパク質については、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳに基づく別の機構も有用である（BaneyxおよびMujacic 2004）。
【００１２】
大腸菌中での異種タンパク質の機能性発現に関して過去になされた進歩にもかかわらず、成功する発現はまだ予測することができず、それぞれの場合に使用するタンパク質にかなり依存するにすぎない。
【００１３】
特に、ＣａｌＢなどの組換えトリアシルグリセロールリパーゼの機能性発現の増大については、いまだに報告がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸および原核生物中でのその改善された機能性発現のための方法を提供することであった。別の目的は、トリアシルグリセロールリパーゼを検出する方法、そのトリアシルグリセロールリパーゼをスクリーニングする方法およびそのトリアシルグリセロールリパーゼの製造方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、以下のトリアシルグリセロールリパーゼの発現方法によって達成された。それは、以下にさらに詳細に記載する、特別の条件下で、原核生物、特に大腸菌宿主株中での発現によって、このタンパク質の増大した機能性発現が達成されるというものである。
【００１６】
この目的は、原核生物、特に大腸菌中でのリパーゼＢの発現について最適化されたコードヌクレオチド配列の提供によっても達成された。
【００１７】
この目的は、トリアシルグリセロールリパーゼ、特にＣａｌＢを検出する方法、そのトリアシルグリセロールリパーゼをスクリーニングするためのその検出方法の使用、およびその製造方法によっても、達成された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の第１の対象は、原核生物細胞、好ましくは大腸菌中、誘導性プロモーターの制御下で、トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させることによる、原核生物中での機能性トリアシルグリセロールリパーゼの発現方法に関する。発現は特に組換え原核生物細胞中で実現される。
【００１９】
本発明において、「トリアシルグリセロールリパーゼ」とは、ＩＵＢＭＢ酵素命名法（http://www.iubmb.unibe.ch; http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/）による、クラスＥ．Ｃ．３．１．１．３の酵素を意味する。本発明に係る方法は、特に、その機能性形態のために１ペプチド鎖について１以上のＳ−Ｓ架橋（ジスルフィド架橋）、例えば１、２、３、４、５または６個のＳ−Ｓ架橋であって、この際Ｓ−Ｓ架橋が同一のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸同士（分子内）および／または別のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸間（分子間）で形成されているもの、を必要とするリパーゼの機能性発現のためにさらに好適である。Ｓ−Ｓ架橋を持つリパーゼのその他の例は、コウジ菌（Aspergillus oryzae）由来のリパーゼ（Tsuchiyaら、1996）、シロカビ（Penicillum camenbertii）由来のリパーゼ（Yamaguchiら、1991）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor mihei）由来のリパーゼ（Boelら、1988）およびカンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）由来のリパーゼ（Longhiら、1992）である。
【００２０】
特定の実施形態において、発現は低温で行われる。本発明の目的のため、低温とは室温または室温以下の温度、すなわち約２５℃またはそれ以下の温度、例えば２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、０℃、またはこれらの数値の間の温度と理解すべきである。
【００２１】
別の実施形態において、発現のための温度は１℃〜２０℃の範囲、特に１０℃〜２０℃の範囲、例えば１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃または２０℃、そして特に１３℃〜１６℃の範囲、例えば１３℃、１４℃、１５℃または１６℃から選択される。特定の実施形態において、発現のために使用する温度は約１５℃である。
【００２２】
本発明の対象の１つは、チオレドキシンレダクターゼ欠失および／またはグルタチオンレダクターゼ欠失大腸菌株中での発現に関する。そのような菌株の例はＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）およびＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ（Novagen, Darmstadt, Germany）である。
【００２３】
理論に束縛されるわけではないが、これらの酵素はタンパク質内のＳ−Ｓ架橋の形成を妨害するか、またはすでに形成されているＳ−Ｓ架橋の減少に寄与するものと推定される。したがって、１以上のこれらの酵素の不在またはその酵素活性の抑制が、このＳ−Ｓ架橋を含有するタンパク質の立体配置を安定化する。
【００２４】
本発明に係る方法の特別の実施形態において、機能し得るように発現させるトリアシルグリセロールリパーゼは、カンジダ・アンタルクチカ由来のＣａｌＢの遺伝子産物であるリパーゼＢである。ｃａｌＢ遺伝子は記載されており（Uppenbergら、1994）、そのヌクレオチドまたはタンパク質配列がＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｚ３０６４５およびＣＡＡ８３１２２．１として登録された。より明確に指定する以外は、ここでのＣａｌＢはこのアクセッション番号を持つヌクレオチド配列を意味する。トリアシルグリセロールリパーゼの別の例は、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）由来のリパーゼＢ（Suenら、2004）である。
【００２５】
本発明に係る方法の別の特別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする配列はｃａｌＢ＿ｗｔ（配列番号２）である。ｃａｌＢ＿ｗｔは、ＣａｌＢをピヒア・パストリス（Pichia pastoris）中で機能し得るように発現させた、本発明者らの以前のプロジェクトから発祥したもので、ｐＰＩＣＺαＡ／ｃａｌＢ構築物（Rusnak 2004)中に含まれる。このプロジェクトにおいて、カンジダ・アンタルクチカのゲノムＤＮＡから増幅させたｃａｌＢ遺伝子は、公開されたＣａｌＢ配列（ＣＡＡ８３１２２．１）に比較して、アミノ酸レベルで２つの変化を示した（Ｔ５７Ａ、Ａ８９Ｔ；配列番号１３）。この２つの変化は、ゲノムＤＮＡの２つの別の抽出物からこの遺伝子を増幅させた、２つの独立した増幅アッセイで明らかになった。この理由から、これらはほぼ確実にリパーゼ遺伝子の天然変異である。ピヒア・パストリス中での発現時に、そのリパーゼは、野生型ＣａｌＢの公表された数値に匹敵する活性を示したので、以前のプロジェクトでは、本発明者らはその増幅遺伝子によって研究を続行した（Rotticci-Mulderら、2001; Rusnak 2004）。
【００２６】
本発明に係る方法の別の特別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする配列はｃａｌＢ＿ｓｙｎ（配列番号１）である。ｃａｌＢ＿ｓｙｎは配列最適化した結果のものである。配列最適化戦略は当業者に知られており、ある基準またはいくつかの基準の組み合わせを含む。例えば、選択された宿主中で相対的に最も高頻度に出現する転移ＲＮＡに相当するようなアミノ酸のコドンを選択する。さらに、非常に高い（＞８０％）かもしくは低い（＜３０％）ＧＣ含量を持つ領域、またはそのＤＮＡの発現、したがって転写および／もしくはｍＲＮＡの翻訳に影響を与える特定の配列モチーフを回避するのが有利である。ｃａｌＢ＿ｓｙｎの作製のため、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒＴＭ技法（GeneArt, Regensburg, Germany）を使用して、コドン利用性を最適化し、その上可能な場合は、非常に高いか（＞８０％）または低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を回避した。さらに、ｃｉｓ−作用性配列モチーフ、例えば内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム結合部位、ＡＲＥ、ＩＮＳおよびＣＲＳ配列エレメント、また反復配列およびＲＮＡ二次構造、を回避した。この遺伝子はｃａｌＢ＿ｗｔ配列に比較して２５３ヌクレオチド（２６．５％）が異なっている（図１）。アミノ酸レベルでは、この合成遺伝子は公表されたタンパク質をコードしている（ＣＡＡ８３１２２．１；配列番号１２）。
【００２７】
本発明に係る方法の別の特別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする配列はｃａｌＢ＿ｗｔまたはｃａｌＢ＿ｓｙｎの相同体（ホモログ）である。Ｃ．アンタルクチカ由来のｃａｌＢ、特にｃａｌＢ＿ｗｔおよび／またはｃａｌＢ＿ｓｙｎならびにその相同体、特に機能的等価物をコードする相同体が、本明細書に記載するそれぞれの状況において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする好ましい代表的なヌクレオチド配列である。
【００２８】
相同性ヌクレオチド配列または相同性核酸または相同体は、本発明においては、基準ヌクレオチド配列または基準核酸に比較して、ヌクレオチドの４０％以下、特にヌクレオチドの３５％以下、例えばヌクレオチドの３０％以下、またはヌクレオチドの２６％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％もしくは１％以下が異なっていることを意味する。例えば、配列番号１に相同性を有する配列は、ヌクレオチドの４０％以下、特にヌクレオチドの３５％以下、例えばヌクレオチドの３０％以下、またはヌクレオチドの２６％、２５％、２０％、１５％、もしくは１０％以下について、配列番号１と異なっている。
【００２９】
相同性ヌクレオチド配列は、特に「ストリンジェントな条件」下で前記の基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列などの配列を意味する。この性質は、ポリまたはオリゴヌクレオチドについての、ストリンジェントな条件下でほぼ相補性の配列と結合するが、これらの条件下で相補性が低いもの同士での非特異的結合は存在しない、能力として解釈すべきである。このためには、その配列は７０〜１００％、好ましくは７５％、８０％、８５％または９０％〜１００％相補性であるべきである。互いに特異的に結合することができるという相補性配列の性質は、例えばノーザンブロットもしくはサザンブロット技術またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲでのプライマー結合で利用される。このためには通常、長さが３０塩基対から出発するオリゴヌクレオチドが使用される。「ストリンジェントな条件」とは、例えばノーザンブロット技術では、非特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブまたはオリゴヌクレオチドの溶出のため、５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の熱洗浄溶液、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣバッファー（２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の使用を意味する。そこで上記のように、高度に相補性の核酸のみが互いに結合して残る。ストリンジェントな条件の樹立は当業者に知られており、例えば以下に記載されている：Ausubelら(1989)（第６．３．１−６．３．６節）。相同性核酸は、例えばゲノムまたはｃＤＮＡバンクを調べることによって同定することができ、また場合によって、ＰＣＲで好適なプライマーでそれらから増幅することができ、その後例えば好適なプローブを用いて単離することができる。
【００３０】
本発明に係るトリアシルグリセロールリパーゼ、特にカンジダ・アンタルクチカ由来の本発明に係るリパーゼＢの相同体は、突然変異体、例えば短縮突然変異体のコンビナトリアルバンクのスクリーニングによって、同定することができる。例えば、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素で連結することによって、タンパク質変異体のバンクを作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性がある相同体のバンクを作製するためには、極めて多くの方法を使用することができる。縮重遺伝子配列の化学的合成は自動ＤＮＡ合成機で実施することができ、その後その合成遺伝子を好適な発現ベクター中に連結することができる。遺伝子の縮重セットの使用によって、可能性があるタンパク質配列の所望のセットをコードする全配列を含む混合物の提供が可能となる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に知られている（例えばNarang 1983; Itakuraら、1984; Ikeら、1983）。
【００３１】
別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする、特に本発明に係るＣａｌＢをコードするヌクレオチド配列は、Ｔ７プロモーター、例えば配列番号３に示されるプロモーターまたはこれに相同な配列の制御下にある。Ｔ７プロモーターの制御下での発現を可能にする好適なベクターは当業者に知られており、例えばｐＥＴベクター系（Novagen）、例えばベクターｐＥＴ−３２ａ−ｃ（＋）である。本発明において、ｃａｌＢ＿ｓｙｎまたはｃａｌＢ＿ｗｔをｐＥＴ−３２ｂ（＋）（配列番号７または配列番号８）中で調製する。これらのベクターからの発現は特に上記定義の温度で行われる。本発明において、驚くべきことに、特別の低温誘導性プロモーターを使用することなく、ｐＥＴ−ベクターからのｃａｌＢ＿ｗｔまたはｃａｌＢ＿ｓｙｎの発現時に、低温でのインキュベーションによって増大した割合の機能性タンパク質が形成されることがわかった。
【００３２】
別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする、特に本発明に係るＣａｌＢをコードするヌクレオチド配列は、低温ショックによって誘導可能なプロモーターの制御下にある。本発明の目的のため、低温ショックとはプロモーターを低温に曝露することを意味する。低温ショックによって誘導可能な好適なプロモーターは、大腸菌の主要低温ショック遺伝子ｃｓｐＡのプロモーター（配列番号４）（Goldsteinら、1990）である。このプロモーターを含有させることで、通常の方法によって所望の標的遺伝子をクローン化することが可能になる発現ベクターは当業者に知られており、例えばTakara Bio Inc., Japan（Takara 2003）からの各種の形態のベクターｐＣＯＬＤである。本発明において、ｃａｌＢ＿ｓｙｎまたはｃａｌＢ＿ｗｔはｐＣＯＬＤＩＩＩ中で調製される（配列番号９または配列番号１０）。驚くべきことに、ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）細胞およびＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞中でのこれらのベクターからの発現時に、増大した量の機能性タンパク質が形成されることが発見された。低温ショックプロモーターの誘導は、低温で、また場合によって発現のために必要な別の因子（例えばｌａｃ−オペレーターの制御下にある遺伝子の場合、ＩＰＴＧ）を添加したインキュベーションによって行われる。制御された低温の確立は、場合によって、氷上での予備インキュベーション（例えば３０分のインキュベーション）によって促進することができる。その他の低温誘導性プロモーターは当業者に知られており、例えばQoronflehら、1992、Nakashimaら、1996またはGiladiら、1995、に記載されている。
【００３３】
理論に束縛されるわけではないが、トリアシルグリセロールリパーゼ、特にＣａｌＢおよびその機能的等価物の機能性発現の増大のための戦略の１つは、基本的に低温下のみでタンパク質の発現を可能にすることで成り立っているものと推定される。発現がそれ以上の温度で実施されるならば不適正にフォールディングしたタンパク質が形成されて、それが結晶化の核として作用し、その後通常ならば機能性タンパク質をもたらす条件下（例えば低温）で発現を実施しても、機能性タンパク質の形成を妨げる。本発明におけるこの戦略の実施には低温でのみ認知される発現を可能にするプロモーター（例えばｐＣＯＬＤベクター中に含まれるプロモーター）の制御下での発現を含み、場合によって発現をさらに転写リプレッサー（例えばｌａｃＩの遺伝子産物、これはＩＰＴＧの不在中では転写を抑制し、ＩＰＴＧが存在する場合は転写を可能にする）によって制御させるものである。別の実施では、転写活性を厳密に制御することができるプロモーター、特に強力なプロモーターの使用で構成され、そして低温でのみそれらのプロモーターの転写を可能にするものである。Ｔ７プロモーターを含むｐＥＴベクターと同様に、その他のプロモーターまたはプロモーターと調節エレメント（例えばリプレッサー）の組み合わせが当業者に知られており、例えばＣ１で調節されるプロモーター（Schofieldら、2002）、ＰｌｔｅｔＯ−１プロモーター（Lutz and Bujard、1997）またはｒｈａＴプロモーター（Giacaloneら、2006）がある。
【００３４】
インキュベーション時間は、使用する各ベクター系について、最大量の機能性タンパク質が形成されるように選択され、これは所定の核酸からそれぞれ発現させるタンパク質について、慣用の試験によって当業者が容易に決定することができるものである。通常の時間の長さは１〜４８時間、例えば８、１２、１６および２４時間である。
【００３５】
本発明に係る方法の別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする、特にＣａｌＢをコードするヌクレオチド配列と同時に、１以上のシャペロンを発現させる。シャペロンは例えば大腸菌のＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよびトリガー因子（ＴＦ）から選択される。発現はどんな組み合わせでも可能であるが、特に共発現させる組み合わせは以下である：ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ；またはＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥ；またはＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬ。あるいはトリガー因子を、場合によってＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬとともに共発現させる。シャペロンは１ベクターから、トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列と一緒に発現させることができる。あるいは、別々のベクターから、トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列とシャペロン（群）をコードするヌクレオチド配列（群）を発現させることができる。好適なベクターは市販の「シャペロンプラスミドセット」に含まれており、これはプラスミドｐＧ−ＫＪＥ８、ｐＧｒｏ７、ｐＫＪＥ７、ｐＧ−Ｔｆ２およびｐＴｆ１６を含んでいる（Takara Biomedicals, Japan、Takara 2003b）。
【００３６】
本発明の別の対象は、トリアシルグリセロールリパーゼの検出のための方法に関するものであって、
ｉ）トリアシルグリセロールリパーゼ活性が推測されるタンパク質を、本発明に係る前記の方法の１つによって発現させ、
ｉｉ）その発現産物を、トリアシルグリセロールリパーゼによって加水分解可能な基質と接触させ、そして
ｉｉｉ）加水分解活性を測定する、ものである。
【００３７】
この方法は、新規トリアシルグリセロールリパーゼ、特にカンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢの酵素活性に匹敵する酵素活性を有するもの、の同定、すなわちスクリーニングのために好適である。当業者には、この方法を、その機能性形態のために１ペプチド鎖について１以上のＳ−Ｓ架橋、例えば１、２、３、４、５または６個のＳ−Ｓ架橋であって、同一のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸同士（分子内）および／または別種のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸間（分子間）で形成されていてもよいＳ−Ｓ架橋を必要とするリパーゼについても同様に適用することができることが明らかである。
【００３８】
好適な加水分解可能な基質は当業者に知られており、加水分解活性の証明も通常の方法で実施することかできる。例えば、トリブチリンは、好適な濃度（例えば１％）でアガープレートに添加したとき、その混濁をもたらし、それは酵素による加水分解中に消滅する。その他の好適な基質は、その加水分解切断が呈色の変化をもたらし、それを例えば測光法で検出することができる化合物（例えばパルミチン酸ｐ−ニトロフェニル）である。加水分解活性は、ｐＨスタットアッセイにおいてカルボン酸エステルの酵素での切断によっても判定することができる。放出されたカルボン酸に起因するｐＨ値の低下は、ＮａＯＨでの滴定によって、一定に維持される。したがって、放出されたカルボン酸の量に比例する、ＮａＯＨの消費量が、その酵素の加水分解活性についての情報を提供する。前記の検出方法については、Rusnak, 2004（Chapter 8.4.2）を参照したが、このすべてを参照として考慮に入れている。
【００３９】
トリアシルグリセロールリパーゼによって加水分解可能なその他の基質は、当業者に知られたトリアシルグリセロールリパーゼ（例えば配列ＣＡＡ８３１２２．１を有するＣａｌＢ）で所定の基質を加水分解してみることによって判定することができる。加水分解が発生したならば、トリアシルグリセロールリパーゼの検出のために、本発明に係る方法においてその基質を使用することができる。
【００４０】
上記の検出方法は通常のペトリ皿または細胞培養容器で実施することができるが、特定の実施形態においては、マイクロタイタープレートの使用を想定している。例えば、推定上のトリアシルグリセロールリパーゼ活性を有するタンパク質の発現は、例えばマイクロタイタープレート中での原核生物の培養およびそのタンパク質の発現の誘導によって、マイクロタイタープレート中でそのまま行うことができる。さらに、加水分解活性の検出もマイクロタイタープレートで実行することができ、そして所定の培養のパラメーター如何によっては、微生物体の事前の除去無しで、検出を実行することができる。例えば、マイクロタイタープレートの各ウェル内で低細胞密度の場合、それぞれ測定した数値が高細胞密度によって誤る（偽性）ことがないので、加水分解活性を培地の混濁度の変化または光学的測定可能な基質の転換から、直接測定することができる。あるいは培養培地中に放出される推定されたトリアシルグリセロールリパーゼ活性を有するタンパク質の発現後、原核生物細胞を培地から分離し（例えば遠心分離による細胞の沈降および上清の除去、あるいはウェルの表面で増殖した接着細胞または支持体に結合した細胞の場合、培地の直接除去による）、推定されるトリアシルグリセロールリパーゼを持つタンパク質を含有する培地を、加水分解活性の測定のために、新たなマイクロタイタープレートに移すことができる。
【００４１】
特別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼ活性を有すると推測されるタンパク質の発現を、加水分解可能な基質、例えば培養培地に溶解させた基質の存在中で行う。別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼ活性を有すると推測されるタンパク質を発現する原核生物を、例えば加水分解可能な基質を含有する培地上で培養することができる。これとの関連で、そのトリブチリン含有によって混濁があるアガー培地が特に好適である。例えば、使用する発現ベクターに応じて、化学物質または温度変化によって、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする遺伝子の誘導後、加水分解活性があるトリアシルグリセロールリパーゼの発現時に、トリブチリンの切断、したがって混濁アガーの清澄化が発生する。したがって、十分なトリアシルグリセロールリパーゼ活性があるアガーの区域では、ハローの形成があり、これを視覚的にまたは好適な画像処理システム（例えばQuantimet 500 Qwin; Leica, Cambridge, Great Britain）によって自動的に検出することができ、またトリアシルグリセロールリパーゼ活性を出現させる細菌コロニーの同定に役立てることができる。当業者にとって、例えばマイクロタイタープレートのトリブチリン−アガーを満たしたウェルに細菌懸濁物を各ウェル中で個々の細菌コロニーが発生することができる希釈度で接種すること、およびその後の視覚的または自動画像分析などの、この方法のその他の改変は明らかであろう。
【００４２】
別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼ活性を有すると推測される、発現させたタンパク質を、これを発現する原核生物細胞、特に大腸菌から分離し、その後、無細胞状態で加水分解可能な基質と接触させる。好適な分離方法は当業者に知られており、例えば遠心分離による細胞の沈降またはろ過による分離がある。この実施形態は、その後の加水分解活性の検出が原核生物細胞の存在に影響を受けないという利点がある。
【００４３】
特別の実施形態において、前記検出は、加水分解可能な基質の減少または加水分解産物の増加の測定によって、光学測定で実施する。好適な基質は当業者に知られており、例えばパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルまたは酢酸ｐ−ニトロフェニルなどのｐ−ニトロフェニルエステルがある。光学測定のパラメーターは、使用する基質および溶液に、当業者が容易に適応させることができる（例えば、パルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を使用する場合、４１０ｎｍでの吸光の増加の測定が推奨される）。
【００４４】
特別の実施形態において、突然変異させたタンパク質または突然変異させた核酸にコードされたタンパク質の、トリアシルグリセロールリパーゼ活性についてのスクリーニングのために、本発明に係る検出方法を使用する。これらとして、突然変異誘発によってトリアシルグリセロールリパーゼ活性を持たせようとするタンパク質（例えばトリアシルグリセロールリパーゼ活性があるとしてもわずかしかないタンパク質に、この酵素活性にとって重要であることが認識されている配列モチーフを組み込むなどによる）、またはすでに既知のトリアシルグリセロールリパーゼ活性を有するが、１以上の突然変異の導入によって改変しようとするタンパク質が可能である。突然変異誘発（突然変異または突然変異したヌクレオチド配列もしくは突然変異したタンパク質をもたらすこと）とは、ヌクレオチド配列については、少なくとも１ヌクレオチドの付加、除去または交換を意味する。タンパク質については、少なくとも１アミノ酸の付加、除去または交換を意味する。本発明に係る突然変異タンパク質は特に、それをコードするヌクレオチド配列がカンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ（ＣａｌＢ）をコードするヌクレオチド配列を含むタンパク質、またはそれをコードするヌクレオチド配列がカンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ（ＣａｌＢ）をコードするヌクレオチド配列に比較して少なくとも１個の突然変異を有するタンパク質、またはそれをコードするヌクレオチド配列がカンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ（ＣａｌＢ）をコードするヌクレオチド配列と相同性を有するタンパク質、またはカンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ（ＣａｌＢ）と機能的等価物であるタンパク質、である。これらのすべてのタンパク質について、それぞれのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の突然変異誘発は必ずしも発現させるタンパク質のアミノ酸配列の変更をもたらす必要はない。すでに上に記載したように、例えば発現のために準備する宿主生物体での好ましいコドン利用性、ｍＲＮＡ二次構造または特定の配列モチーフの回避に関するものなどの、遺伝子のヌクレオチド配列を最適化するための方法は当業者に知られている（例えばＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒＴＭ技法、GeneArt, Regensburg, Germany）。これらの最適化は転写レベルおよび翻訳レベルの両方での発現の改善に役立ち、そして同時に、一定のアミノ酸についていくつかの塩基トリプレットを可能にする縮重コードの利用によって、改変されていないタンパク質の翻訳に役立つ。この場合、本発明に係る検出方法は、機能性タンパク質発現をモニターするのに役立つ。他方において、コードするヌクレオチド配列の突然変異誘発によって、突然変異させていない出発配列によって発現されるタンパク質に比較して、そのアミノ酸配列が異なるタンパク質を産生させることができる。この場合、本発明に係る検出方法によって、突然変異させたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質が、突然変異させていない出発配列によってコードされたタンパク質に比較して、変わらない加水分解活性または改変された加水分解活性、例えば酵素活性の１以上のパラメーターについて、減少（もしくは不在）、増加、または変更があるかどうか��検証することが可能である。前記パラメーターとして、特に本発明に係る検出方法のステップｉｉ）にしたがって、トリアシルグリセロールリパーゼ活性を有することが推測される突然変異タンパク質を加水分解可能な基質と接触させる際の条件の選択によって試験することができるものとしては、例えば以下について考慮することができる：すなわち、基質特異性、そのタンパク質のエナンチオ選択性または転換（turnover）数、ならびに例えば温度、ｐＨ、イオン濃度および／または可能なインヒビターもしくはアクチベーターの存在に対するその依存性。
【００４５】
例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的化した変更、および例えば化学的突然変異誘発による非特異的変更による、ヌクレオチド配列の突然変異誘発は当業者に知られており、また例えばRoufa 1996またはKirchhoff and Desrosiers 1996に記載されている。
【００４６】
本発明に係る検出方法の上記の使用は、特に遺伝子バンクのスクリーニングのために好適である。例えば、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発、例えば酵素による合成オリゴヌクレオチドの混合物の連結によって、タンパク質変異体のバンクを作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性がある相同体のバンクの作製のために使用することができる、多数の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は自動ＤＮＡ合成機で実施することができ、その後合成遺伝子を好適な発現ベクター中に連結することができる。遺伝子の縮重セットの使用によって、ある混合物中の、可能性があるタンパク質配列の所望のセットをコードする全配列を提供することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に知られている（例えばNarang 1983; Itakuraら、1984); Itakuraら、1984; Ikeら、1983）。
【００４７】
本発明に係る使用は、特にサンプルのハイスループットスクリーニング、例えば多数のサンプルの短時間の順次スクリーニングまたはいくつかの同等サンプルの同時スクリーニングあるいはその組み合わせ、に好適である。こうして、特にこれは、上記の遺伝子バンクのスクリーニングにとって好適な方法である。例えば、トリアシルグリセロールリパーゼの特に高い機能性発現を示すクローン、または改変された特性を持つトリアシルグリセロールリパーゼを発現するクローンについて、これらをスクリーニングすることができる。これとの関連において、特にマイクロタイタープレートの使用が、研究中の１以上のタンパク質の発現および／またはその／それらの加水分解活性の測定にとって、有利である。当業者に知られているように、サンプルのハイスループットは自動化、例えばピペッティングロボットによって達成することができる。これは、これらのタンパク質の発現のために使用するマイクロタイタープレートのウェルから、加水分解活性の検出用に意図したウェル中に、推測したヒドロラーゼ活性を有するタンパク質を含有する上清を移す、または前記上清を含有するウェル内に検出試薬をピペットで入れるものである。さらに、マイクロタイタープレートを使用する光学測定評価を、特にプレートリーダーによって、実施することができる。これは個々のウェルに含まれた溶液の吸光を自動的に測定するものである。アガープレートを使用する場合、すでに上に記載したように、加水分解活性によって発生する透明なハローまたはその他の方法によって光学的に検出可能なハローを、例えば好適な画像処理システム（例えばQuantimet 500 Qwin; Leica, Cambridge, Great Britain）を使用して、検出することができる。
【００４８】
本発明の別の対象は、トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の製造方法に関するものであって、発現したトリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の活性を有するタンパク質を上記の検出方法の１つによって検出し、このタンパク質を発現する菌株を、リパーゼを発現する条件下で培養し、そして場合によって発現させたリパーゼを単離するものである。好適な単離方法は、必要ならば、特定のタンパク質について慣用の試験によって適応させることができるものであるが、これは当業者に知られており、また例えば以下に記載するものである。当業者にとっては、この方法を、その機能性形態のために１ペプチド鎖について１以上のＳ−Ｓ架橋、例えば１、２、３、４、５または６個のＳ−Ｓ架橋であって、同一のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸同士（分子内）および／または別種のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸間（分子間）で形成されていてもよいＳ−Ｓ架橋を必要とするリパーゼについても同様に適用することができることが明らかである。
【００４９】
本発明の別の対象は、上記の製造方法によって取得することができるトリアシルグリセロールリパーゼ、例えば原核生物宿主の細胞環境中に存在するトリアシルグリセロールリパーゼ、または部分的に、大部分がもしくは完全に精製されたトリアシルグリセロールリパーゼに関する。特に好適なトリアシルグリセロールリパーゼは、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＣＡＡ８３１２２．１で登録されている配列とは少なくとも１アミノ酸が異なっている、カンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ８３１２２．１で登録されている配列に相同なタンパク質であり、これは機能的等価物に相当する。
【００５０】
「機能的等価物」とは特に、本発明においては、基準として取り上げるトリアシルグリセロールリパーゼ、特にいずれかのリパーゼＢのアミノ酸配列とは少なくとも１配列部位で異なっているが、それでも前記の生物学的活性、例えば以下の１つの生物学的活性を保持する突然変異体を意味する：すなわち、一定の、減少したもしくは増加した加水分解活性、または改変された基質特異性、エナンチオ選択性もしくは転換数、ならびに例えば温度、ｐＨ、イオン濃度、または可能なインヒビターもしくはアクチベーターの存在に対するその依存性。
【００５１】
したがって、「機能的等価物」には１以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって取得可能な突然変異体が含まれ、これらの変更は、本発明に係る特性プロフィルを有する突然変異体をもたらす限り、どの配列部位で生じてもよい。機能的等価性は特に、突然変異体と未変化ポリペプチド間の反応パターンの性質が一致する、すなわち例えば同一の基質が異なる速度で変換される場合にも存在する。
【００５２】
記載したポリペプチドの「前駆体」ならびにこのポリペプチドの「機能性誘導体」および「塩」も、上記の意味においては「機能的等価物」である。
【００５３】
「前駆体」は所望の生物学的活性を有するか有しない、ポリペプチドの天然または合成の前段階のものである。
【００５４】
発現「塩」は、本明細書の意味としては、本発明に係るタンパク質分子のカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両方である。カルボキシル基の塩は周知の方法によって製造することができ、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩などの無機塩、ならびに有機塩基、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどのアミン、との塩を含む。酸付加物の塩、例えば鉱物酸、塩酸または硫酸など、との塩ならびに有機酸、酢酸およびシュウ酸など、との塩も、本発明の対象である。
【００５５】
本発明に係る酵素の「機能性誘導体」は、既知の技術によって、機能性アミノ酸側鎖基またはそのＮ−もしくはＣ−末端でも製造することができる。前記誘導体として例えば以下が含まれる：カルボン酸基の脂肪族エステル；アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によって取得可能な、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって製造される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；あるいはアシル基との反応によって製造される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体。
【００５６】
「機能的等価物」には、別の生物体から取得することができるポリペプチド、および天然に存在する変異体も、当然含まれる。例えば、配列比較によって相同性配列領域を確定することができ、本発明の具体的な説明を基礎として、等価な酵素を判定することができる。
【００５７】
「機能的等価物」として、本発明に係るポリペプチドの断片、特に個々のドメインまたは配列モチーフであって、例えば所望の生物学的活性を有する断片も含まれる。
【００５８】
「機能的等価物」はその外に、天然ラセマーゼ配列またはこれから誘導された機能的等価物の１つと、機能性を持って（すなわち互いに融合タンパク質部分の機能を実質的に損なうことなく）Ｎ−またはＣ−末端に連結している少なくとも１つの別の機能的に異なる異種配列を含む融合タンパク質である。こうした異種配列の非限定的な例は、例えばシグナルペプチドまたは酵素である。
【００５９】
本発明の対象となる「機能的等価物」は、天然タンパク質に相同性のタンパク質である。これらはPearsonおよびLipmanのアルゴリズム（Pearson and Lipman 1988）によって算出して、天然アミノ酸配列の１つと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、９５％または９９％の相同性を有している。本発明に係る相同性ポリペプチドの相同性パーセンテージは、特に本発明に係る酵素または酵素サブユニットのアミノ酸配列の１つの全長を基礎としたアミノ酸残基の同一性パーセンテージを意味する。本発明には特に、上に示した定義にしたがう機能的等価物であって、その上、出発配列に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、９５％または９９％の相同性を有するものが含まれる。
【００６０】
グリコシル化が可能なタンパク質の場合、本発明に係る「機能的等価物」には、脱グリコシル化またはグリコシル化した形態、およびグリコシル化パターンを変更することによって得られる改変形態の、上記指定の種類のタンパク質が含まれる。
【００６１】
機能的等価物は本発明に係る方法を使用して判定することができる。例えば、トリアシルグリセロールリパーゼおよび特にＣａｌＢに対する機能的等価性を判定しようとするタンパク質を、本発明に係る発現方法によって発現させて、本発明に係る検出方法によって調べることができる。発現させた、加水分解活性、特にトリアシルグリセロールリパーゼもしくはＣａｌＢに比較して変更された加水分解活性を有するタンパク質が機能的等価物である。
【００６２】
これとの関連で、本発明に係るトリアシルグリセロールリパーゼを発現する原核生物を既知の方法によって培養および発酵させることができる。その後、ポリペプチドが培養培地中に分泌されない場合は、細胞を崩壊させて、溶解物から既知のタンパク質単離方法によって産物を取得する。細胞は場合によって、高周波数の超音波、高圧、例えばフレンチプレスセル中、浸透圧、界面活性剤、溶菌酵素もしくは有機溶媒の作用、ホモジナイザーの使用、または列挙した方法のいくつかの組み合わせによって、崩壊させることができる。
【００６３】
ポリペプチドは既知のクロマトグラフィー方法、例えば分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、例えばＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィー、ならびにその他の通常の方法、例えば限外ろ過、結晶化、塩析、透析およびネイティブゲル電気泳動など、によって精製することができる。好適な方法は例えばCooper(1980)またはScopes(1981)に記載されている。
【００６４】
本発明の別の対象は、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸、特にカンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢをコードする核酸であって、配列番号１のコードヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２と少なくとも１ヌクレオチドが異なっているヌクレオチド配列を含むか、またはこれらに相同性を有するヌクレオチド配列を含むもの、に関する。前記のヌクレオチド配列は例えばＣａｌＢの機能的等価物をコードする。特別の実施形態において、その核酸は配列番号１に示されるコードヌクレオチド配列またはこれに相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
本発明の別の対象は、少なくとも１つの調節核酸配列に機能的に連結された、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸を含む、組換えベクターに関する。別の特別の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸配列は配列番号１または配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む。「機能的連結」とは、調節エレメントのそれぞれが定義されたようにコード配列の発現においてその機能を果たすように、プロモーター、コード配列、ターミネーターおよび場合によってその他の調節エレメントの配列の配置を意味する。機能的に連結し得る配列の例は、標的配列とエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。その他の調節エレメントには、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。好適な調節配列は例えばGoeddel 1990に記載されている。本発明において、例えば特に、ｐＧＲＯ７との共発現時に、ｃａｌＢ＿ｓｙｎ（配列番号１）およびｃａｌＢ＿ｗｔ（配列番号２）の機能性発現が増加することがわかった。
【００６６】
プラスミドおよびファージと同様に、「ベクター」も当業者に知られたその他のすべてのベクターを意味し、したがって例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、ならびに線状もしくは環状ＤＮＡがある。これらのベクターは宿主生物体中で自己複製するか、または染色体として複製することができる。これらのベクターは本発明の別の実施形態となる。好適なプラスミドは例えば以下である：ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、ｌｇｔ１１またはｐＢｄＣＩ（大腸菌中）、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１（ストレプトミセス中）、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４（バチルス中）、ｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７（コリネバクテリウム中）。前記のプラスミドは可能なプラスミドの中の少数の例である。その他のプラスミドは確実に当業者に知られており、例えば以下の文献から知ることができる：Cloning Vector（発行：Pouwels P. H.ら、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018）。好適なベクターはトリアシルグリセロールリパーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の機能性発現を可能にするものであって、これはその後上記の検出方法によって判定することができる。
【００６７】
特別の実施形態は、以下のベクターを含む：ｐＥＴ３２ｂ（＋）およびｐＥＴベクターファミリー（Novagen 1999）のその他の代表例、特にｐＥＴ−３２ａ−ｃ、ｐＥＴ−４１ａ−ｃおよびｐＥＴ−４２ａ−ｃ、ならびにｐＣＯＬＤＩＩＩおよびｐＣＯＬＤベクターファミリーのその他の代表例（例えばｐＣＯＬＤ Ｉ、ｐＣＯＬＤ ＩＩ、ｐＣＯＬＤ ＩＶ、ｐＣＯＬＤ ＴＦ、例えばTakara Bio Europe S.A.S, Gennevilliers, Franceから取得可能）。かなり特定の実施形態において、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸を含む組換えベクターとして、以下を、本発明にしたがって調製する：
ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ（配列番号７、ｃａｌＢ＿ｓｙｎ、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）中）、
ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ｃａｌＢ＿ｗｔ（配列番号８、ｃａｌＢ＿ｗｔ、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）中）、
ｐＣＯＬＤＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ（配列番号９、ｃａｌＢ＿ｓｙｎ、ｐＣＯＬＤＩＩＩ中）および
ｐＣＯＬＤＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｗｔ（配列番号１０、ｃａｌＢ＿ｗｔ、ｐＣＯＬＤＩＩＩ中）。
【００６８】
本発明の別の対象は、トリアシルグリセロールリパーゼをコードするベクターまたは核酸であって、配列番号１に示されるコードヌクレオチド配列またはこれに相同性を有するヌクレオチド配列を含むベクターまたは核酸を含む組換え宿主細胞に関する。この組換え細胞は特に原核生物細胞、特に大腸菌細胞である。原核生物細胞のその他の例は以下である：グラム陰性細菌中、エンテロバクテリアシー科（Enterobacteriaceae）の代表例、例えばサルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、セラチア（Serratia）、プロテウス（Proteus）、クレブシエラ（Klebsiella）またはエンテロバクター（Enterobacter）、シュードモナス（Pseudomonas）など；グラム陽性細菌中、例えばバチルス属の代表例、例えば枯草菌（B.subtilis）およびＢ．リケニホルミス（B.licheniformis）。
【００６９】
本発明の別の対象は、機能性トリアシルグリセロールリパーゼの発現のための本発明に係る方法、機能性トリアシルグリセロールリパーゼの検出のための本発明に係る方法、または機能性トリアシルグリセロールリパーゼの製造のための本発明に係る方法を実施するための、本発明に係るコード核酸配列、本発明に係るベクターまたは本発明に係る宿主細胞の使用に関する。本発明に係るベクターを本発明に係る発現方法、特に低インキュベーション温度で使用したとき、驚くべきことに、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）（配列番号８もしくは配列番号７）またはｐＣＯＬＤＩＩＩ（配列番号１０もしくは配列番号９）中でｃａｌＢ＿ｗｔ及びｃａｌＢ＿ｓｙｎの機能性発現量が増加することがわかった。さらに、本発明によれば、ｐＧ−ＫＪＥ８との共発現、そして特にｐＧＲＯ７、ｐＧ−Ｔｆ２、またはｐＴｆ１６との共発現時に、ｃａｌＢ＿ｓｙｎ（配列番号１）およびｃａｌＢ＿ｗｔ（配列番号２）が特に高度に機能性発現することがわかった。
【００７０】
当業者には、機能性トリアシルグリセロールリパーゼの発現のための本発明に係る方法、その検出のための方法およびその製造のための方法を、トリアシルグリセロールリパーゼ以外の酵素にも同様に適用できることが明らかであろう。例えば、これらの方法をＥＣクラス３．１の酵素（エステルヒドロラーゼ）または一般的にＥＣクラス３の酵素（ヒドロラーゼ）（http://www.iubmb.unibe.ch; ）に適応させることができる。したがって、本発明に係る方法を、これらの方法で開示した一般的原則を使用して発現させ、検出しまたは製造することができるすべての酵素、特にその機能性のために１ペプチド鎖について１以上のＳ−Ｓ架橋（ジスルフィド架橋）、例えば１、２、３、４、５または６個のＳ−Ｓ架橋であって、同一のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸同士（分子内）および／または別種のペプチド鎖の硫黄含有アミノ酸間（分子間）で形成されているＳ−Ｓ架橋の形成を必要とする酵素に拡張することができる。
【実施例】
【００７１】
Ｉ．全般的情報
化学物質
他に明記しない限り、全化学物質をFluka（Buchs, Switzerland）、Sigma-Aldrich（Taufkirchen, Germany）およびRoth GmbH（Karlsruhe, Germany）から取得した。
【００７２】
菌株およびプラスミド
大腸菌ＤＨ５αをClontech（Heidelberg, Germany）から取得した。大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢおよびプラスミドｐＥＴ−３２ｂ（＋）はNovagen（Darmstadt, Germany）から取得した。プラスミドｐＵＣ１８はMBI Fermentas（St. Leon-Rot, Germany）から取得し、ｐＣｏｌｄＩＩＩならびにプラスミドｐＧ−ＫＪＥ８、ｐＧｒｏ７、ｐＫＪｅ７、ｐＧ−Ｔｆ２およびｐＴｆ１６を含有するシャペロン−プラスミドセットはTakara（Otsu, Japan）から取得した。コドンを最適化したｃａｌＢ遺伝子を含有する構築物ｐＰＣＲ／ＣａｌＢは、GENEART（Regensburg, Germany）によって合成された。構築物ｐＰＩＣＺαＡ／ｃａｌＢはすでに記載されている（Rusnak 2004）。
【００７３】
ｃａｌＢ変異体のクローニング
鋳型構築物ｐＰＩＣＺαＡ／ｃａｌＢから、プライマーｗｔ＿ｐＵＣ１８＿ｆｗおよびｗｔ＿ｐＵＣ１８＿ｒｅｖ（表１）を使用して、ｃａｌＢ＿ｗｔを増幅させ、次にベクターｐＵＣ１８中にクローン化して、構築物ｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｗｔを取得した。ｐＥＴ−３２ｂ（＋）中でのサブクローニングのためには、プライマーｗｔ＿ｐＥＴ−３２ｂ（＋）＿ｆｗおよびｗｔ＿ｐＥＴ３２ｂ（＋）＿ｒｅｖ（表１、下記参照）を使用して、リパーゼ遺伝子を増幅させ、その後ＥｃｏＲ１およびＮｏｔＩ制限部位を利用してこのベクター中にクローン化した（ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ｃａｌＢ＿ｗｔ）。ｐＣｏｌｄＩＩＩ中でのサブクローニングのためには、プライマーｗｔ＿ｐＣｏｌｄＩＩＩ＿ｆｗおよびｗｔ＿ｐＣｏｌｄＩＩＩ＿ｒｅｖ（表１）を使用して、ＣａｌＢを増幅させ、その後標準的方法を使用してこのベクター中にクローン化した（ｐＣｏｌｄＩＩＩ／ＣａｌＢ＿ｗｔ）。
【００７４】
ｐＰＣＲ／ｃａｌＢから、プライマーｓｙｎ＿ｐＵＣ１８／ｐＥＴ−３２ｂ（＋）＿ｆｗとｓｙｎ＿ｐＵＣ１８＿ｒｅｖ、ｓｙｎ＿ｐＵＣ１８／ｐＥＴ−３２ｂ（＋）＿ｆｗとｓｙｎ＿ｐＥＴ−３２ｂ（＋）＿ｒｅｖまたはｓｙｎ＿ｐＣｏｌｄＩＩＩ＿ｆｗとｓｙｎ−ｐＣｏｌｄＩＩＩ＿ｒｅｖ（表１）を使用して、ＣａｌＢ＿ｓｙｎを増幅させ、その後標準的方法を使用して、プラスミドｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ｃａｌＢ＿ｓｙｎおよびｐＣｏｌｄＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ中にクローン化して、構築物ｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ｃａｌＢ＿ｓｙｎおよびｐＣｏｌｄＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｓｙｎを取得した。
【００７５】
以下の表１に、ｃａｌＢ変異体のサブクローニングのために使用したプライマーを示す。その制限部位に下線を付けている。
【表１】
2009532050.tif 000002
【００７６】
リパーゼ発現およびシャペロンの共発現
発現実験を４〜６回繰り返して、活性を平均値として示している。
【００７７】
ｐＵＣ１８発現：
ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢおよびＤＨ５α細胞をｐＵＣ１８構築物で形質転換させた。細胞を、１００μｇ／ｍｌアムピシリンを含有させたＬＢ培地（Luria 1960）（ＬＢａｍｐ）１００ｍｌ中、３７℃および１８０回転／分で、６００ｎｍでの光学密度が０．６になるまで増殖させた。次に、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）の添加によって、リパーゼ発現を誘発した。細胞を３０℃および１８０回転／分でさらに４時間増殖させ、４℃、４０００ｇで３０分の遠心分離によって回収した。
【００７８】
ｐＥＴ−３２ｂ（＋）発現：
ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）細胞をｐＥＴ３２ｂ（＋）構築物で形質転換させた。細胞をＬＢａｍｐ１００ｍｌ中、３７℃および１８０回転／分で、６００ｎｍでの光学密度が０．６になるまで増殖させ、前記のように処理した。あるいは細胞を氷上で冷却した後、１５℃で２４時間かけて誘導および発現を実施した。
【００７９】
ｐＣｏｌｄＩＩＩ発現：
ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞をｐＣｏｌｄＩＩＩ構築物で形質転換させた。細胞を、ＬＢａｍｐ１００ｍｌ中、３７℃および１８０回転／分で、６００ｎｍでの光学密度が０．４〜０．６になるまで増殖させた。次に、培養物を氷上で３０分冷却し、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）の添加によって、リパーゼ発現を誘発した。細胞を１５℃および１８０回転／分でさらに２４時間増殖させ、４℃、４０００ｇで３０分の遠心分離によって回収した。
【００８０】
シャペロンプラスミドとｐＣｏｌｄＩＩＩ構築物の共発現：
ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞をシャペロンプラスミドで形質転換させた。細胞を、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ１００ｍｌ中、３７℃で増殖させ、通常の方法によってコンピテント細胞を産生させた。この組換え細胞をｐＣｏｌｄＩＩＩ構築物で形質転換させ、ＬＢｃｍ＋ａｍｐ上で選択した。発現のため、細胞を、（ｐＧｒｏ７、ｐＫＪＥ７およびｐＴｆ１６の場合）１ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−アラビノースおよび（ｐＧ−Ｔｆ２の場合）５ｎｇ／ｍｌテトラサイクリンまたは（ｐＧ−ＫＪＥ８の場合）前記濃度のＬ−アラビノースおよびテトラサイクリンを含有するＬＢｃｍ＋ａｍｐ中、３７℃および１８０回転／分で、６００ｎｍでの光学密度が０．４〜０．６になるまで増殖させた。培養物を氷上で３０分冷却した。その後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）の添加によって、リパーゼ発現を誘発した。細胞を１５℃および１８０回転／分でさらに２４時間増殖させ、４℃、４０００ｇで３０分の遠心分離によって回収した。
【００８１】
トリブチリン−アガープレートアッセイ
１％乳化トリブチリンおよび対応する抗生物質、ならびにｐＧｒｏ７、ｐＫＪＥ７もしくはｐＴｆ１６の共発現では１ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−アラビノース、ｐＧ−Ｔｆ２の共発現では５ｎｇ／ｍｌテトラサイクリン、またはｐＧ−ＫＪＥ８の共発現ではＬ−アラビノースおよびテトラサイクリンを含有するＬＢ−アガープレート上で、細胞を培養した。細胞を３７℃で２４時間増殖させた後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する軟質アガー（水中０．６％アガー）の層でプレートを覆い、発現のために、３０℃、１５℃または室温でインキュベートした。機能性リパーゼの発現は、コロニーの周囲の透明なハローの形成によって示された。
【００８２】
リパーゼ活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリー分析
細胞を、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）中、それぞれ３０秒で３回の超音波処理によって崩壊させ、遠心分離によって細胞破砕物を除去した。ｐＨスタット装置（Metrohm, Filderstadt, Germany）を使用して、細胞溶解物を活性について試験した。１０ｍＭ  ＮａＯＨでの滴定によって、基質（２％アラビアゴムを含む水中で乳化した５％トリブチリン）の加水分解をモニターした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Bradford 1976）によって、細胞溶解物のタンパク質含量を測定した。１リパーゼ活性単位を、１分間に脂肪酸１μｍｏｌの放出として定義した。清澄化した細胞溶解物５０μｇ（０．２〜０．４ｍｌ細胞培養物に相当）または細胞培養物０．５ｍｌからの不溶性細胞破砕物を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、標準的方法（Laemmli 1970）にしたがって、不溶性および可溶性画分を調査した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。「Scion Image」プログラム（Frederick, Maryland, USA）を使用するデンシトメトリーによって、細胞タンパク質に対する可溶性ＣａｌＢのパーセンテージを測定した。
【００８３】
ハイスループット発現および活性アッセイ
シャペロンプラスミドを持つｐＣｏｌｄＩＩＩ構築物およびＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞を、ＬＢｃｍ＋ａｍｐ１５０μｌ＋シャペロン誘導因子（上記参照）を含有する９６ウェルマイクロタイタープレート（Greiner, Nurtingen, Germany）中、３７℃および４００回転／分で光学密度が０．４〜０．６になるまで増殖させた。細胞を氷上で３０分冷却し、ＩＰＴＧの最終濃度１ｍＭまでの添加によって、リパーゼ発現を誘発した。１５℃、２００回転／分で振蕩する２４時間の発現後、遠心分離によって細胞を回収し、溶解バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１μｌ／ＤＮＡｓｅ）５０μｌの添加によって溶解させた。溶解物を３７℃で振蕩（３００回転／分）しながらインキュベートし、氷上で３０分冷却した。−８０℃で１時間のインキュベーション後、細胞を室温（ＲＴ）で融解させ、４℃、４０００回転／分で３０分の遠心分離によって、細胞破砕物を除去した。
【００８４】
リパーゼ活性を検出するため、清澄化した細胞溶解物２０μｌをアッセイ溶液１８０μｌ（溶液Ｂ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２００ｍｌ中、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  １ｇ＋アラビアゴム０．２ｇ）１６２μｌ＋溶液Ａ（ｎ−プロパノール２０ｍｌ中ｐＮＰＰ６０ｍｇ）１８μｌ）に添加した。５分後、４１０ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３４０ＰＣ、Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA）での吸光を測定することによって、ｐ−ニトロフェノラートの形成を測定した。あるいは、ｐＨスタットアッセイ（上記の通り）によって、リパーゼ活性を定量した。
【００８５】
ＩＩ．適用例
１．カンジダ・アンタルクチカからのｃａｌＢのクローニング
Ｎ−末端プレプロペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含まないｃａｌＢ＿ｗｔ遺伝子を大腸菌発現ベクターｐＵＣ１８、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）またはｐＣｏｌｄＩＩＩ（表２）中にクローン化した。カンジダ・アンタルクチカ由来のｃａｌＢ遺伝子を含有するｐＰＩＣＺαＡ／ｃａｌＢ構築物（Rusnak 2004）を、リパーゼ遺伝子の増幅のための鋳型として利用した。
【００８６】
ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒＴＭ技法を使用して、ｃａｌＢ遺伝子を最適化した。コドン優先選択の最適化に加えて、可能ならば非常に高い（＞８０％）かまたは低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を回避した。さらに、ｃｉｓ−作用性配列モチーフ、例えば内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム結合部位、ＡＲＥ、ＩＮＳおよびＣＲＳ配列エレメントなど、同様に反復配列およびＲＮＡ二次構造を回避した。最適化した遺伝子（ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）はｃａｌＢ＿ｗｔ配列とは２５３ヌクレオチド（２６．５％）が異なっている。影響を受けた変化を図１に示す。アミノ酸レベルでは、この合成遺伝子は公表されたタンパク質（ＣＡＡ８３１２２．１）をコードする。その後、この合成遺伝子を表２に記載した発現ベクター中にサブクローン化した。
【表２】
2009532050.tif 000003
【００８７】
２．３種のベクター系中でのリパーゼ発現
ｃａｌＢをコードするベクターの発現のため、大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ株およびＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）株を使用した。これらは、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ欠失という特性を持っている。ｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｗｔで形質転換したＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞はトリブチリン−アガープレート上でハロー形成を示したが、比較株ＤＨ５αではそうではなかった（データ不掲載）。しかし、ｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｗｔまたはｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｓｙｎで形質転換したＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞中では、ＣａｌＢ活性は非常に低く、これは、両構築物について、総可溶性タンパク質１ミリグラムについてわずかに約２Ｕトリブチリンの加水分解に相当した（図４）。１Ｕ（単位）は１分間に基質１μｍｏｌの転換として定義する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、可溶性画分ではＣａｌＢの質量（３３ｋＤ）に相当するタンパク質バンドが検出されなかったが（データ不掲載）、不溶性画分のＣａｌＢ含量は１０〜１２％であった（表３）。
【表３】
2009532050.tif 000004
【００８８】
活性な酵素の生成率を増大させるため、遺伝子ｃａｌＢ＿ｗｔおよびｃａｌＢ＿ｓｙｎを、ベクターｐＥＴ−３２ｂ（＋）を使用してチオレドキシン−タグ（Ｔｒｘ・ＴＡＧＴＭ）と融合させ、大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）中で発現させた。室温でのインキュベーション時に、形質転換した細胞は透明なハロー形成を示したが、３７℃での培養では検出可能な酵素活性を何らもたらさなかった。３０℃での振蕩フラスコ培養でのＴｒｘ−ＣａｌＢの発現は、不溶性画分中の酵素の量の顕著な増加をもたらした（１８〜１９％、表３）ものの、溶解度、したがってＣａｌＢの活性の増加にはならなかった。１５℃での発現では、ｗｔ−遺伝子（ｃａｌＢ＿ｗｔ）では１７Ｕ／ｍｇまでの可溶性タンパク質、そして合成遺伝子（ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）では８Ｕ／ｍｇが産生された（図４）。さらに、この系では、トリブチリン−アガープレート上でのハロー形成は低培養温度でのみ観察された。それにもかかわらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用すると、１５℃での発現でも、大量の不溶性タンパク質が、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）（２４％および２６％）ならびにｐＣｏｌｄＩＩＩ（４２％および３８％）からの発現で検出された（図２、表３）。
【００８９】
３．分子シャペロンの共発現でのリパーゼ発現
適用例２のｐＣｏｌｄＩＩＩ構築物を、TaKaRaシャペロンプラスミドセットで提供されるシャペロンのいくつかの組み合わせとともに共発現させた(下記表４参照)。
【表４】
2009532050.tif 000005
【００９０】
ＣａｌＢおよびシャペロン発現プラスミドの両方を持つすべての組換えＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞が１５℃のインキュベーション温度で、トリブチリン−アガープレート上の透明なハロー形成と振蕩フラスコスケールでのＣａｌＢの発現を示した（図３）が、可溶性リパーゼの量は著しく異なった（図４）。ＣａｌＢ＿ｗｔはｐＧｒｏ７との発現時に最も効率的に発現された（６１Ｕ／ｍｇ）（図４）。機能性酵素の発現はまた、ｐＧ−Ｔｆ２（３３Ｕ／ｍｇ）、ｐＴｆ１６（２４Ｕ／ｍｇ）との発現、そしてより低割合ではあるがｐＧ−ＫＪＥ８（１８Ｕ／ｍｇ）との発現時に、増加した。ｐＫＪＥ７との共発現は、ＣａｌＢの発現に有意な影響を与えなかった。活性アッセイの結果をデンシトメトリーによって確認したところ、ｐＧｒｏ７との共発現に最大量の可溶性ＣａｌＢが見られ、ｐＧ−Ｔｆ２およびｐＴｆ１６との共発現がこれに続いた（表３）。
【００９１】
合成ｃａｌＢ遺伝子についても同様の結果が得られた。すなわちｐＧｒｏ７、ｐＧ−Ｔｆ２、ｐＴｆ１６およびｐＧ−ＫＪＥ８の共発現の陽性効果が示された。ｐＥＴ−３２ｂ（＋）およびｐＣｏｌｄＩＩＩ発現と同様に、リパーゼ活性および可溶性酵素の含量について得られた数値は、野生型遺伝子ｃａｌＢ＿ｗｔよりも合成遺伝子ｃａｌＢ＿ｓｙｎの方が低かった（図４、表３）。
【００９２】
４．トリブチリン−アガープレート上のリパーゼ発現
（ｐＧｒｏ７にコードされた）ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬとｃａｌＢ＿ｗｔまたはｃａｌＢ＿ｓｙｎを発現するＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞は、１５℃でのインキュベーション時に、トリブチリンを添加したアガープレート上に透明なハローの形成を示した。ハローの形成は、同一の構築物を含有させたＤＨ５α細胞でも、リパーゼ遺伝子を含まないｐＧｒｏ７ベクターおよびｐＣｏｌｄＩＩＩベクターを含有するＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ対照細胞についても観察されなかった（データ不掲載）。
【００９３】
５．マイクロタイタープレートスケールでのリパーゼ発現
ＣａｌＢから誘導した酵素変異体についてのハイスループットスクリーニング系のためのモデルとして、９６ウェルマイクロタイタープレートのスケールで、ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞中でｃａｌＢ＿ｗｔまたはｃａｌＢ＿ｓｙｎとｐＧｒｏ７の共発現を実施した。清澄化した細胞溶解物の活性を、基質としてｐＮＰＰを使用する比色アッセイによって定量した。黄色ｐ−ニトロフェノラートの形成で示されるように（図６）、両構築物は相当量を機能的に発現した。リパーゼ遺伝子を含まない対照細胞は顕著に低下した４１０ｎｍでの吸光値を示した。
【００９４】
マイクロタイタープレート中での発現時の活性を、振蕩フラスコ内での構築物ｐＣｏｌｄＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｗｔとｐＧｒｏ７の共発現で得られた数値と比較するため、基質トリブチリンを含む代表的な５ウェルの活性を、ｐＨスタットアッセイによって調査した。増殖条件はそれぞれのウェルについて同一とした。判明した結果は、清澄化した細胞溶解物中で５７〜８１Ｕ／ｍｇ可溶性タンパク質の比活性、または１０〜１５Ｕ／ｍｌ細胞培養物の総活性であった。ウェル内の総リパーゼの発現レベルをデンシトメトリー分析によって測定したところ、０．０４±０．０１μｇ  ＣａｌＢ／ｍｌ細胞培養物であった。
【００９５】
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Zhang N., Suen W.C., Windsor W., Xiao L., Madison V., Zaks A., Protein Eng. 16(8): 599-605 (2003)
上記の説明で記載した、以下の配列またはプラスミドは、表示した配列番号で配列表中に含まれる：
ｃａｌＢ＿ｓｙｎ：配列番号１
ｃａｌＢ＿ｗｔ：配列番号２
Ｔ７のプロモーター：配列番号３
ｃｓｐＡプロモーター（大腸菌）：配列番号４
ｐＵＣ１９（ｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）中のｃａｌＢ＿ｓｙｎ：配列番号５
ｐＵＣ１９（ｐＵＣ１８／ｃａｌＢ＿ｓｗｔ）中のｃａｌＢ＿ｗｔ：配列番号６
ｐＥＴ−３２ｂ（＋）（ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）中のｃａｌＢ＿ｓｙｎ：配列番号７
ｐＥＴ−３２ｂ（＋）（ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ｃａｌＢ＿ｗｔ）中のｃａｌＢ＿ｗｔ：配列番号８
ｐＣＯＬＤＩＩＩ（ｐＣＯＬＤＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）中のｃａｌＢ＿ｓｙｎ：配列番号９
ｐＣＯＬＤＩＩＩ（ｐＣＯＬＤＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｗｔ）中のｃａｌＢ＿ｗｔ：配列番号１０
ｐＰＣＲ／ＣａｌＢ：配列番号１１
ＣａｌＢ（ＣＡＡ８３１２２．１）：配列番号１２
Ｔ５７ＡとＡ８９Ｔが交換されたＣａｌＢ：配列番号１３
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１−１】Ｃ．アンタルクチカから増幅したｃａｌＢ＿ｗｔと、ｐＰＣＲ／ｃａｌＢベクターを起源とする配列最適化した合成遺伝子ｃａｌＢ＿ｓｙｎ間の配列比較。差異を太字で強調している。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】ＣａｌＢの発現実験中、発現ベクターｐＥＴ３２−ｂ（＋）（ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）細胞中）またはｐＣｏｌｄＩＩＩ（ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞中）を使用し、１５℃で取得した、可溶性（Ｓ）および不溶性（Ｉ）画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離。ＣａｌＢバンド（３３ｋＤａ）およびＴｒｘ−ＣａｌＢ融合タンパク質バンド（４５ｋＤａ）に矢印を付けている。Ｍ：分子量標準。Ｃ：空ベクターを持つ対照の画分。
【図３】ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞中の各種シャペロンプラスミド（ａ：ｐＧｒｏ７、ｂ：ｐＧ−Ｔｆ２、ｃ：ｐＴｆ１６、ｄ：ｐＫＪＥ７、ｅ：ｐＧ−ＫＪＥ８）を持つｐＣｏｌｄＩＩＩ構築物を使用するＣａｌＢの共発現実験によって取得した、可溶性（Ｓ）および不溶性（Ｉ）画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離。ＣａｌＢ（３３ｋＤａ）およびシャペロン（ＧｒｏＥＬ：６０ｋＤａ、Ｔｆ：５６ｋＤａ、ＤｎａＫ：７０ｋＤａ、ＤｎａＪ：４０ｋＤａ）に矢印を付けている。Ｍ：分子量標準（２９、４３および６６ｋＤａ）。Ｃ：空ベクターを持つ対照の画分。
【図４】記載した構築物を持つ大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＴＭ２（ＤＥ３）細胞（ｐＥＴ３２ｂ（＋）発現の場合）およびＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞（その他の全構築物）からの清澄化した細胞溶解物のトリブチリンについての加水分解活性。４〜６回の独立した発現実験からの平均値および標準偏差を示す。
【図５】ｐＣｏｌｄＩＩＩ／ｃａｌＢ＿ｗｔまたは＿ｓｙｎ）およびＧｒｏＥＳ／ＧｒｏＥＬ（ｐＧｒｏ７）を含有する、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ細胞からの清澄化した細胞溶解物による、９６ウェルマイクロタイタープレート中でのｐＮＰＰの加水分解。ＣａｌＢを発現する細胞の場合、１７ウェル（ｃａｌＢ＿ｗｔ）および１８ウェル（ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）を調査した。空ｐＣｏｌｄＩＩＩベクターおよびｐＧｒｏ７を含有するＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ細胞を含む６ウェルを対照として使用した。その数値をバックグラウンド吸光値（細胞溶解物を含まない基質）について正規化した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2009532050000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月12日(2008.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物中での機能性トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の発現方法であって、１℃〜２５℃の範囲から選択される温度にて、原核生物宿主細胞中、誘導性プロモーターの制御下でトリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させる方法。
【請求項２】
温度が１℃〜２０℃の範囲から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
温度が１℃〜１７℃の範囲から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発現がチオレドキシンレダクターゼ欠失およびグルタチオンレダクターゼ欠失大腸菌株中で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列がカンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）由来のリパーゼＢ（ｃａｌＢ）をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
リパーゼＢが配列番号１（ｃａｌＢ＿ｓｙｎ）もしくは配列番号２（ｃａｌＢ＿ｗｔ）に示されるヌクレオチド配列またはこれらに相同性を有するヌクレオチド配列にコードされている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列がＴ７のプロモーター（配列番号３）の制御下にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
トリアシルグリセロールリパーゼをコードするヌクレオチド配列が低温ショック誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
低温誘導性プロモーターが大腸菌のｃｓｐＡ遺伝子のプロモーター（配列番号４）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１以上のシャペロンを共発現させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
共発現させる１シャペロンまたは共発現させるシャペロン群が大腸菌のＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよびトリガー因子（ＴＦ）から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥを共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
トリガー因子を、場合によってＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬとともに共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬを共発現させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
トリアシルグリセロールリパーゼの検出のための方法であって、
ｉ）トリアシルグリセロールリパーゼ活性が推測されるタンパク質を、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって発現させ、
ｉｉ）その発現産物を、トリアシルグリセロールリパーゼによって加水分解可能な基質と接触させ、そして
ｉｉｉ）加水分解活性を測定する、上記方法。
【請求項１７】
タンパク質の発現および／またはその加水分解活性の測定をマイクロタイタープレートで実施する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｉ）におけるタンパク質の発現が、リパーゼによって加水分解可能な基質の存在下で行われる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質の発現が、リパーゼによって加水分解可能な基質を含有する培地において行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｉ）発現させたタンパク質を細胞培養物から分離し、
ｉｉ）トリアシルグリセロールリパーゼによって加水分解可能な基質と接触させ、そして
ｉｉｉ）その加水分解活性を測定する、
請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
加水分解活性を、加水分解可能な基質の減少または加水分解産物の増加から光度測定によって測定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
トリアシルグリセロールリパーゼ活性について突然変異させたタンパク質または突然変異させた核酸にコードされるタンパク質のスクリーニングのための、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２３】
タンパク質が、カンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼＢ（ｃａｌＢ）のコードヌクレオチド配列中に、少なくとも１個の突然変異を有する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
方法が、トリアシルグリセロールリパーゼの検出のために、ハイスループットスクリーニング法として実施される、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載された方法または使用。
【請求項２５】
請求項１６〜２４のいずれか１項に記載された方法を使用して発現させた、トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の活性を有するタンパク質を検出し、このタンパク質を発現する大腸菌株を、リパーゼを発現する条件下で培養し、場合によって発現させたリパーゼを単離する、トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の製造方法。
【請求項２６】
配列番号１に示されるコードヌクレオチド配列を含むか、または２５％以下のヌクレオチドが異なる、これと相同性を有するヌクレオチド配列を含む、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする核酸。
【請求項２７】
少なくとも１個の調節核酸配列と機能し得るように連結させた請求項２６に記載のコード核酸を含む組換えベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸および／または請求項２７に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法を実施するための、請求項２６に記載のコード核酸配列、請求項２７に記載のベクターまたは請求項２８に記載の宿主細胞の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月15日(2008.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009532050000001.app
【国際調査報告】
2009532050.tif 000012
2009532050.tif 000013
2009532050.tif 000014
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