(57)【要約】  本発明は、治療上有効な量の、PAI-1活性を阻害することができる少なくとも１つの酵素を用いて、心血管系疾患に罹っている被験者を治療する方法を提供する。本発明はまた、心血管系疾患に関連する少なくとも１つのリスクファクターを示す被験者において、治療上有効な量の、PAI-1活性を阻害することができる少なくとも１つの酵素を被験者に投与することによって、心血管系疾患の発症リスクを減少させる方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要な被験者においてPAI-1活性を阻害する方法を提供するが、この場合、被験者は、プロテアーゼもしくはペプチダーゼから選択される酵素の投与を受ける。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の、PAI-1阻害活性を示す少なくとも１つの酵素を被験者に投与することを含んでなる、心血管系疾患に罹っている被験者を治療する方法。
【請求項２】
酵素がプロテアーゼもしくはペプチダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素がプロテアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼが、セミアルカリプロテアーゼ、ブロメライン、セラペプターゼ、プロナーゼ、およびパパインからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酵素がセミアルカリプロテアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酵素がブロメラインである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
酵素がナットウキナーゼではない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験者における心血管系疾患の発症リスクを低下させる方法であって、心血管系疾患に関連する少なくとも１つのリスクファクターを示す被験者に、治療上有効な量の、PAI-1阻害活性を示す少なくとも１つの酵素を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項９】
リスクファクターが、肥満、糖尿病、高血圧、ストレス、エストロゲンレベルの低下、慢性炎症、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酵素がプロテアーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
プロテアーゼが、セミアルカリプロテアーゼ、ブロメライン、セラペプターゼ、プロナーゼ、およびパパインからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酵素がセミアルカリプロテアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素がブロメラインである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
酵素がナットウキナーゼではない、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアーゼおよびペプチダーゼから選択される有効量の酵素を被験者に投与することを含んでなる、それを必要とする被験者におけるPAI-1活性を阻害する方法。
【請求項１６】
酵素がプロテアーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼが、セミアルカリプロテアーゼ、ブロメライン、セラペプターゼ、プロナーゼ、およびパパインからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
酵素がセミアルカリプロテアーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酵素がブロメラインである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
酵素がナットウキナーゼではない、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1型（PAI-1）は、線溶系における組織型プラスミノーゲンアクチベーター（tPA-1）およびウロキナーゼ（uPA）の主要な負の制御因子である（非特許文献１）。高レベルのPAI-1は、線維素溶解能を低下させ、その結果血栓症を発症する一因となり得る。血栓性の心血管系疾患は、高齢者人口において特に顕著に認められるが、肥満、インスリン耐性、糖尿病、情緒的ストレス、免疫応答、血管硬化もしくはリモデリング、および心血管系疾患一般といった、一般に加齢に伴うさまざまな病変においても引き起こされる（非特許文献２および非特許文献３）。
【０００２】
多くのPAI-1阻害物質が最近報告されている。これらには、小分子、抗体、およびペプチドがある（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７および非特許文献８）。
【０００３】
PAI-1阻害の明白な治療上の可能性にもかかわらず、in vivoでこの活性を実現しうる酵素は、これまで同定されていない。スブチリシンNAT（ナットウキナーゼ）が、おそらく酵素のタンパク質分解活性によって、in vitroでPAI-1を切断することが最近明らかになったが、in vivoで同様の活性は報告されていない（非特許文献９）。
【非特許文献１】Q. Wuら、Current Drug Targets - Cardiovascular & Haematological Disorders 2 (2002) 27-42
【非特許文献２】K. Yamamotoら、Cardiovascular Research 66 (2005) 276-285
【非特許文献３】B. De Taeyeら、Current Opinion in Pharmacology 5 (2005) 149-154
【非特許文献４】B. Yeら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14 (2004) 761-765
【非特許文献５】A. Liangら、Thrombosis Research 115 (2005) 341-350
【非特許文献６】C. N. Berryら、British Journal of Pharmacology 125 (1998) 20-34
【非特許文献７】J. J. J. van Giezenら、Thrombosis and Haemostasis 77 (1997) 964-969
【非特許文献８】P.R. Guzzoら、Tetrahedron Letters 43 (2002) 41-43
【非特許文献９】T. Uranoら、Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 24690-24696
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、in vivoで使用してPAI-1を阻害することができる酵素が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの実施形態にしたがって、本発明は、PAI-1活性を阻害する必要がある被験者において、PAI-1活性を阻害する方法を提供する。その方法は、プロテアーゼもしくはペプチダーゼから選択される酵素を、被験者に投与することを含んでなる。
【０００６】
別の実施形態にしたがって、本発明は、心血管系疾患に罹っている被験者を治療する方法を提供する。この方法は、PAI-1活性を阻害することができる少なくとも１つの酵素を、治療上有効な量、被験者に投与することを含んでなる。
【０００７】
別の実施形態にしたがって、本発明は、被験者における心血管系疾患の発生リスクを減少させる方法を提供する。その方法は、心血管系疾患に関連する少なくとも１つのリスクファクターを示す被験者に、治療上有効な量の、PAI-1阻害活性を示す少なくとも１つの酵素を投与することを含んでなる。
【０００８】
本発明はまた、心血管系疾患に罹っている被験者を治療するための薬剤の製造において、PAI-1活性を阻害する能力のある少なくとも１つの酵素の使用を提供する。
【０００９】
別の実施形態にしたがって、本発明は、心血管系疾患に関連する少なくとも１つのリスクファクターを示す被験者における心血管系疾患発生のリスクを減少させる目的で、被験者に投与するための薬剤の製造において、PAI-1活性を阻害する能力のある少なくとも１つの酵素を使用することを提供する。
【００１０】
別の実施形態にしたがって、本発明は、被験者のPAI-1活性を阻害するために、被験者に投与する薬剤の製造において、プロテアーゼもしくはペプチダーゼから選択される酵素の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書で使用される場合、単数形は、特に明記しない限り、「１つもしくは複数」を意味する。さらに、本発明の態様が、代替物のリストに関連して記載される場合、本発明は、代替物のリストを構成するあらゆる個々の要素もしくはサブグループ、ならびに１つもしくは複数のそれらの任意の組み合わせを包含する。
【００１２】
本発明者らは、プロテアーゼもしくはペプチダーゼがPAI-1活性を阻害し、しかもin vivoでの使用に適した濃度で阻害することを見出した。本明細書に記載の本発明の方法は、心血管系疾患を治療すること、ならびにその疾患のリスクファクターを示す被験者にそうした疾患が発生するリスクを減少させることに有用である。本明細書に記載の酵素は、人を含めた動物による摂取に関して安全であることが知られており、新たに発見されたPAI-1活性とは関係のない目的で使用されてきている。
【００１３】
本明細書に記載の酵素は、in vivoでPAI-1阻害活性を示す。したがって、本発明の１つの実施形態は、PAI-1活性を阻害するのに有効な量、すなわち治療上有効な量のプロテアーゼもしくはペプチダーゼから選択される酵素を被験者に投与することによって、そうした必要のある被験者において、in vivoでPAI-1活性を阻害する方法を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、酵素はプロテアーゼである。実例としてのプロテアーゼには、セミアルカリプロテアーゼ、ブロメライン、セラペプターゼ、プロナーゼ、およびパパインがあるがそれらに限定されない。これらのプロテアーゼが、抗炎症性および線維素溶解性を示すことは、長い間認められてきた。したがって、こうしたプロテアーゼの既知の適応は、たとえば、スポーツ傷害に起因する炎症、洞の粘膜増加、および肺疾患である。しかしながら、これまで知られている適応症には、PAI-1活性レベルの上昇に関わるいかなる疾患も含まれていない。上記のようなプロテアーゼおよびペプチダーゼは、商業的供給源から便利に入手することができるが、当技術分野でよく知られている手順によって、さまざまな純度で入手および単離することもできる。PAI-1阻害活性を示す他の適当な酵素を、たとえば、実施例に記載の酵素活性アッセイによって同定することができる。
【００１５】
ある実施形態において、単独でも、本明細書に記載の他の任意の実施形態と組み合わせても、酵素はナットウキナーゼではない。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、心血管系疾患に罹っている被験者を治療する方法を提供するが、その方法は、治療上有効な量の、PAI-1阻害活性を示す少なくとも１つの酵素を、被験者に投与することを含んでなる。１つの実施形態において、その酵素はプロテアーゼもしくはペプチダーゼである。別の実施形態において、酵素は上記プロテアーゼのうちの１つである。たとえば、酵素は、セミアルカリプロテアーゼもしくはブロメラインとすることができる。
【００１７】
本発明にしたがって治療もしくは予防することができる心血管系疾患は、特定の疾患に限定されない。これに関する疾患の例には、虚血性心疾患、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高血圧、狭心症、心臓発作、卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症候群、若年発症心筋梗塞、ならびに冠動脈疾患があるがそれらに限定されない。
【００１８】
本発明はさらに、被験者における心血管系疾患の発生リスクを下げる方法を意図する。適当な被験者は、心血管系疾患に関連する少なくとも１つのリスクファクターを示しうるものである。被験者に、治療上有効な量の、PAI-1阻害活性を示す少なくとも１つの酵素が投与される。上記酵素はいずれも、この方法に用いるのに適している。たとえば、酵素は、セミアルカリプロテアーゼもしくはブロメラインといったプロテアーゼとすることができる。
【００１９】
心血管系疾患に関わるリスクファクターはよく知られており、したがって、リスクファクターは、心血管系疾患の予防が当然必要とされる患者集団を特定する手段を臨床医に提供する。こうしたリスクファクターには、肥満、糖尿病、高血圧、ストレス、エストロゲンレベルの低下、慢性炎症、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。２つ以上のリスクファクターを示す被験者は、非常に心血管系疾患を発症しやすく、本発明によって提供される予防処置にふさわしい被験者である。
【００２０】
本発明に従って、酵素を単独で、もしくは相互に併用して、または他の活性物質もしくは不活性物質と併用して、投与することができる。酵素を組み合わせて使用する場合、本発明は、少なくとも２つの異なる酵素を同時に、もしくは順次、投与することを意図する。
【００２１】
酵素は、基本的に純粋な形で投与することができるが、たとえば、酵素の食味を高めること、患者の治療計画に対するコンプライアンスを高めること、および／または一般的な投与のしやすさを高めることを目的として、投与前に酵素を調剤して組成物とすることが望ましい。したがって、本発明は、PAI-1阻害活性を有する１つもしくは複数の酵素に加えて、他の成分、たとえば、1つもしくは複数の製薬上許容される結合剤、潤滑剤、懸濁剤、甘味料、香味料、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、および他の賦形剤を含んでなる、酵素組成物の使用を包含する。こうした賦形剤は、当技術分野でよく知られており、当業者は容易にこれを選択することができる。
【００２２】
１つの実施形態において、酵素組成物は、少なくとも１つの製薬上許容される賦形剤と混合され、賦形剤で希釈され、またはカプセル、小袋、錠剤、バッカル錠、トローチ剤、紙、もしくは他の容器の形をとることができる担体中に封入される。賦形剤が希釈剤の役割をなす場合、賦形剤は、固体、半固体、もしくは液体物質とすることができるが、これらは組成物のバランスを取るためのビヒクル、担体、もしくは媒体として機能するものである。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、カプセル（たとえば、ソフトおよびハードゼラチンカプセル）、坐剤、トローチ剤、バッカル剤、滅菌注射用溶液、および無菌包装粉末剤に製剤化することができる。
【００２３】
結合剤の例としては、さまざまなセルロース、ならびに架橋ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、たとえばAvicel PH101およびAvicel PH102、微結晶セルロース、ケイ化微結晶セルロース（SMCC）、およびマンニトールがある。
【００２４】
適当な潤滑剤は、圧縮される粉末製剤の流動性に作用する物質を含むが、これにはコロイド状二酸化ケイ素、たとえばAerosil 200など；タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびシリカゲルが含まれる。
【００２５】
甘味料の例には、天然もしくは人工の甘味料、たとえば、ショ糖、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム、ならびにアセサルフェームおよびその塩がある。香味料の例は、Magnasweet（MAFCOの商標）、バブルガムフレーバー、フルーツフレーバーなどである。
【００２６】
防腐剤の例には、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸およびその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル（たとえば、ブチルパラベン）、エチルアルコールもしくはベンジルアルコールなどのアルコール類、フェノールなどのフェノール性化合物、または塩化ベンザルコニウムなどの4級化合物が含まれる。
【００２７】
適当な希釈剤には、製薬上許容される不活性増量剤、たとえば、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、糖類、および／または前記の任意の混合物がある。希釈剤の例としては、微結晶セルロース、たとえばAvicel PH101およびAvicel PH102；リン酸水素カルシウム、たとえばEmcompress；マンニトール；デンプン；ソルビトール；ショ糖；およびグルコースがある。
【００２８】
適当な崩壊剤としては、架橋度の低いポリビニルピロリドン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、および加工デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００２９】
発泡剤の例には、有機酸と炭酸塩もしくは重炭酸塩とのような発泡性カップルが含まれる。適当な有機酸には、たとえばクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸およびアルギン酸、ならびにそれらの酸無水物および塩がある。適当な炭酸塩および重炭酸塩には、たとえば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、グリシン炭酸ナトリウム、L-リジン炭酸塩、およびアルギニン炭酸塩がある。あるいは、発泡性カップルの酸成分だけが存在してもよい。
【００３０】
本発明のある実施形態において、酵素組成物は、経口投与に適した投与単位に形成する。たとえば、PAI-1活性を阻害する１つもしくは複数の酵素を、固体の微粉担体、たとえば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロール誘導体もしくはゼラチンと、ならびに潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびポリエチレングリコールワックスと混合することができる。次に混合物を錠剤にプレスすることができる。コーティング錠が望ましい場合には、上記で調製した錠剤を、たとえば糖の濃厚溶液（アラビアゴム、ゼラチン、タルク、二酸化チタンを含有してもよい）、または揮発性有機溶媒もしくは溶媒混合物に溶解したラッカーで、コーティングすることができる。異なる酵素もしくは異なる量で含まれる酵素を含有する錠剤を区別するために、このコーティングにさまざまな色素を加えることができる。
【００３１】
本発明は、１つもしくは複数の酵素を、経口投与に適したソフトカプセルとして提供することも意図し、このソフトカプセルは、１つもしくは複数の酵素と、植物油、もしくはたとえば、ポリエチレングリコールなどの非水性で水混和性の物質との混合物を含有するカプセルなどである。あるいは、１つもしくは複数の酵素を、ハードカプセルとして提供することもでき、このカプセルは顆粒状の酵素組成物をソルビトール、マンニトール、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロール誘導体もしくはゼラチンなどの固体の微粉担体とともに含有することができる。
【００３２】
直腸投与用の投与単位も意図される。これは、１つもしくは複数の酵素および中性脂肪基剤を含有する坐剤の形態で調製することができる。あるいは、１つもしくは複数の酵素を植物油もしくはパラフィン油との混合物として含有する、ゼラチン直腸カプセルの形で調製することができる。
【００３３】
他の実施形態としては、本明細書に記載の酵素組成物の粒状の形態がある。粒状の形態は、経口用の錠剤の調製に有用であり、典型的には、以下の方法で調製されるが、当業者によく知られている他の方法を用いることもできる。（１つもしくは複数の酵素を包含する）固体を、緩やかに粉砕、もしくはふるいにかけて望ましい粒径となるようにし、得られたものを軽くプレスして、望ましいサイズのステンレス製の篩を通過させる。その後、混合物の層を一定時間、制御された乾燥ユニット内で乾燥し、望ましい粒子サイズおよび堅さを得る。乾燥混合物の顆粒を軽くふるいにかけて、粉末を除去する。この混合物に、崩壊剤、潤滑剤、および／または付着防止剤を適宜加えることができる。最後に、望ましい錠剤サイズを得るのに適した臼杵を備えた機械によって、混合物を錠剤にプレスする。この機械の操作パラメーターは、当業者が選択することができる。
【００３４】
PAI-1阻害活性を有する１つもしくは複数の酵素を含んでなる、トローチ剤およびバッカル剤の投与形態も、本発明において有用である。これらは、当業者に知られている方法によって調製することができる。
【００３５】
本発明の１つもしくは複数の酵素はまた、たとえば、約2時間から約16時間などの長時間にわたって酵素を放出する組成物に製剤化することができる。ある実施形態において、酵素は約3時間から約12時間にわたって放出される。さらに他の実施形態において、酵素は約4時間から約8時間にわたって放出される。当業者は、当技術分野で知られている方法によって、そうした持続放出を調製することができる。
【００３６】
他の実施形態において、１つもしくは複数の酵素は、１つもしくは複数の層によって囲まれたコアに含まれることがあり、こうした層は、たとえば、医薬品製剤に関連して当業者に知られている保護サブコーティングを有する、もしくは有しない腸溶性コーティング層である。サブコーティングを使用しない場合には、腸溶性コーティングは、コアに含まれる活性成分を分解しないように選択される。
【００３７】
腸溶層は、一般的に、腸溶性のポリマーを含んでなる。腸溶性ポリマーの例には、メタクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネートがあるがそれらに限定されない。さまざまなタイプのメタクリル酸コポリマー、たとえば、メタクリル酸コポリマータイプA (Eudragit（登録商標）L-100)、メタクリル酸コポリマータイプB (Eudragit（登録商標）S-100)、メタクリル酸コポリマータイプC (Eudragit（登録商標）L 30D55、Eudragit（登録商標）L-100-55)、メタクリル酸、メタクリル酸メチルおよびメタクリル酸メチルのコポリマー (Eudragit（登録商標）FS) ならびにそれらの混合物、たとえば、Eudragit（登録商標）L-100-55およびEudragit（登録商標）S-100の重量比約3:1から約2:1までの混合物、またはEudragit（登録商標）L 30D55およびEudragit（登録商標）FSの重量比約3:1から約5:1までの混合物を使用することができる。
【００３８】
腸溶層は、他の物質、たとえば、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、酢酸トリメリト酸セルロース、セラックおよび／またはゼインをさらに包含することができる。
【００３９】
場合により、腸溶層はさらに、粘着防止剤、たとえば、タルクもしくはモノステアリン酸グリセリル；可塑剤、たとえば、クエン酸トリエチルもしくはポリエチレングリコール；および／または色素、たとえば二酸化チタンもしくは酸化鉄を含んでなる。
【００４０】
腸溶層はさらに、１つもしくは複数の可塑剤を含んでよく、これには、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸アセチルトリブチル、アセチル化モノグリセリド、グリセリン、トリアセチン、プロピレングリコール、フタル酸エステル (たとえば、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル)、ヒマシ油、ソルビトール、およびdibutyl seccateがあるが、それらに限定されない。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、腸溶層がヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、トリアセチン、シリカおよびステアリン酸を含んでなる、腸溶性コーティング製剤を提供する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」という語句は、被験者におけるPAI-1活性を阻害するのに有効な量を意味する。この量は、被験者によって異なる可能性があり、一般に、1日当たり約20から約40 mgまでの範囲とすることができる。別の実施形態において、投与量は、1日当たり約25から約35 mgまでの範囲である。典型的な投与量は１日当たり約30 mgである。本発明の酵素組成物の治療上有効な量は、1日1回で投与することができる。あるいは、1日に複数回、分割した量で、治療上有効な量を投与することができる。実例となる投与計画では、約15 mgの酵素組成物が1日2回与えられる。それに代わる適当な投与量を、当業者は決定することができる。
【００４３】
下記の実施例は本発明を説明するために与えられる。しかし当然のことながら、本発明はこれらの実施例に記載の特定の条件もしくは細目に限定されることはない。
【実施例】
【００４４】
実施例１
さまざまな酵素によるPAI-1の阻害
この実施例の目的は、さまざまな酵素がPAI-1を阻害する程度を評価すること、および心血管系疾患の治療における各酵素の有効性をそれによって判断することである。
【００４５】
セミアルカリプロテアーゼ（「セアプローゼ」）、ナットウキナーゼ、ブロメラインおよびパパインはAmano Enzyme USA Co., Ltdより購入した。セラペプチダーゼは、Dasen 10 mg錠（Takeda）から水で抽出した。フィブリノーゲン、トロンビン、α1-アンチトリプシン（「AAT」）、α1-アンチキモトリプシン（「ACT」）、α2-マクログロブリン（「MG」）、およびアゾカゼインはSigma Chemical Co.より購入した。
【００４６】
水100μl中のプロテアーゼ1μgを用いて、37℃にて1時間、AAT、ACT およびMG (0-100μg)による阻害実験を行った。次に、10 mg/mLアゾカゼイン100μlを添加して37℃にて1時間インキュベートすることによって、各酵素のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ反応を止めるために、10%トリクロロ酢酸（「TCA」）200μlを添加した。その後、反応混合物をボルテックスして、微量遠心機で10分間10,000 RPMで遠心した。上清のO.D.440を、プロテアーゼ活性の指標として測定した。下記の表1において、記号「-」は、使用した阻害剤のいかなる濃度でも、阻害が観察されなかったことを示すが、「+」は、100%阻害が観察されたことを示す。
【００４７】
それぞれのプロテアーゼ酵素に関するPAI-1阻害実験は、0-100μgのプロテアーゼを、100μlのヒト血漿（Innovative Research, Inc.）とともに37℃にて1時間インキュベートすることにより行った。次に、血漿中のPAI-1活性をELISAアッセイ（Innovative Research, Inc.）によって測定した。IC50値は、速度論ソフトウェアパッケージによって決定された（GraFit Version 5, Erithacus Software Ltd., Horley, U.K.）。IC50は、0.1 mLのヒト血漿中のPAI-1活性の50%を阻害するために必要な酵素の量を表す。下記の表1は、各酵素のこれらの値をまとめる。
【００４８】
酵素活性アッセイを行うための速度論実験は、Fibrinolytic Unitアッセイ（FU）を使用した。1.4 mLの50 mMホウ酸ナトリウム（pH 8.5）および0.4 mLの0.72%フィブリノーゲンを入れた試験管を37℃にて5分間プレインキュベートした。その後、トロンビン溶液（50 mMホウ酸ナトリウムバッファー中200 U/mL）0.1 mLを加え、試験管の内容物を混合した。10分後に、プロテアーゼ0.1 mLを加え、得られた溶液を37℃でさらにインキュベートした。プロテアーゼとともに60分間インキュベートした後、2 mLの0.2M TCAを加え、試験管の内容物を混合してから、さらに37℃にて20分間インキュベートした。1 mLの反応混合物を遠心チューブに移して、微量遠心機で5分間15,000 RPMにて遠心した。上清溶液のO.D.275を測定した。
【００４９】
活性の1ユニットは、その反応条件下でO.D.275を0.01/分だけ増加させるプロテアーゼの量である。FUアッセイを用いて、ただしフィブリノーゲン濃度を0-10 mMまで変化させることによって、Km実験を行った。Km値はGraFit速度論ソフトウェアパッケージによって求めた。本明細書で使用される場合、Kmという用語はMichaelis定数を表し、これは、基質濃度の関数として活性を測定したときに、最大酵素活性の半値に対応する基質濃度を指すものである。こうしたことから、Kmは、基質に対する酵素の親和性の指標となる。したがって、低いKmは、基質に対する高い親和性を有する酵素の特徴であって、基質に対する高い親和性は、通常、より効率的な酵素であることを意味するので、それは好ましい。下記の表１で用いられるように、比活性は、酵素グラムあたりの、線維素溶解ユニット（FU）アッセイにおける酵素活性のユニットを表す。さらに、触媒効率は、式Vmax= Kcat[E]（式中、[E]は酵素濃度（mM）であり、Km（mM）はFUフィブリンアッセイにおけるKmである）を用いて算出された。活性は、反応条件下1分当たりのTCA可溶性生成物の量（放出されたチロシン相当量のmMとして表される）として定義される。
【表１】
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【００５０】
実施例２Ａ
セアプローゼによるPAI-1の阻害
セミアルカリプロテアーゼ（「セアプローゼ」）は、Aspergillus melleus (Amano Enzyme USA)の培養物から単離した。酵素はさまざまな濃度で、PAI-1を含有するヒト血清100μlとともに、37℃にて1時間インキュベートした。PAI-1活性は、PAI-1に対する抗体およびウロキナーゼでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、Innovative Research (Human PAI-1 Activity Assay Kit)に記載されたように測定した。
【００５１】
各濃度でのセミアルカリプロテアーゼ活性はSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド(0.5 mg/mL水溶液 100μL)を添加し、得られた溶液を37℃にて1時間インキュベートし、405 nmでO.D.を測定することによって測定される。
【００５２】
PAI-1活性は、約50μg/mLより高いセアプローゼ濃度で完全に阻害され、0.56μg/mLのセアプローゼ濃度で50%（IC50）近く阻害された。
【００５３】
実施例２Ｂ
セラペプターゼによるPAI-1の阻害
セラペプターゼは、市販のセラペプターゼ錠剤（DASEN（登録商標）、Takeda）の水性抽出物から単離した。酵素はさまざまな濃度で、PAI-1を含有するヒト血清100μlとともに、37℃にて1時間インキュベートした。PAI-1活性は、PAI-1に対する抗体およびウロキナーゼでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、Innovative Research (Human PAI-1 Activity Assay Kit)に記載されたように測定した。
【００５４】
セラペプターゼ活性は、それぞれの濃度で、アゾカゼイン（10 mg/mL水溶液 100μL）を添加し、得られた溶液を37℃にて1時間インキュベートすることによって測定した。その後、等量（200μL）の10%トリクロロ酢酸（TCA）を加え、得られた溶液を混合し、氷中に10分間おいた。最後に、溶液を8,500 RPMで5分間遠心して、440 nmでO.D.を測定した。
【００５５】
PAI-1活性は約20μg/mLより高いセラペプターゼ濃度で完全に阻害され、1.8μg/mLのセラペプターゼ濃度で50%（IC50）近く阻害された（図６）。
【００５６】
実施例２Ｃ
ブロメラインによるPAI-1の阻害
ブロメラインはAmano Enzyme USAより購入した。酵素はさまざまな濃度で、PAI-1を含有するヒト血清100μlとともに、37℃にて1時間インキュベートした。PAI-1活性は、PAI-1に対する抗体およびウロキナーゼでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、Innovative Research (Human PAI-1 Activity Assay Kit)に記載されたように測定した。
【００５７】
PAI-1活性は約25μg/mLより高いブロメライン濃度で完全に阻害され、1.8μg/mLのブロメライン濃度で50%（IC50）近く阻害された（図７）。
【００５８】
実施例２Ｄ
プロナーゼによるPAI-1の阻害
プロナーゼはAmano Enzymeより購入した。酵素はさまざまな濃度で、PAI-1を含有するヒト血清100μlとともに、37℃にて1時間インキュベートした。PAI-1活性は、PAI-1に対する抗体およびウロキナーゼでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、Innovative Research (Human PAI-1 Activity Assay Kit)に記載されたように測定した。
【００５９】
PAI-1活性は約10μg/mLより高いプロナーゼ濃度で完全に阻害され、0.9μg/mLのプロナーゼ濃度で50%（IC50）近く阻害された（図８）。
【００６０】
実施例２Ｅ
パパインによるPAI-1の阻害
パパインはAmano Enzymeより購入したが、これは、当技術分野でよく知られている手順によって、パパイヤ樹液から単離することができる。酵素はさまざまな濃度で、PAI-1を含有するヒト血清100μlとともに、37℃にて1時間インキュベートした。PAI-1活性は、PAI-1に対する抗体およびウロキナーゼでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、Innovative Research (Human PAI-1 Activity Assay Kit)に記載されたように測定した。
【００６１】
PAI-1活性は約10μg/mLより高いパパイン濃度で完全に阻害され、6.3μg/mLのパパイン濃度で50%（IC50）近く阻害された（図９）。
【００６２】
比較実施例１
ナットウキナーゼによるPAI-1の阻害
この比較例の目的は、本明細書に記載の他の酵素と比較して、ナットウキナーゼのPAI-1活性を阻害する効力が著しく低いことを示すことである。ナットウキナーゼは、納豆菌（Bacillus natto）発酵大豆タンパク質から酵素を抽出することにより、単離することができ、あるいはAmano Enzyme USAから市販されている。酵素はさまざまな濃度で、PAI-1を含有するヒト血清100μlとともに、37℃にて1時間インキュベートした。PAI-1活性は、PAI-1に対する抗体およびウロキナーゼでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いて、Innovative Research (Human PAI-1 Activity Assay Kit)に記載されたように測定した。
【００６３】
PAI-1活性は約1000μg/Lより高いナットウキナーゼ濃度で完全に阻害され、22.8μg/mLのナットウキナーゼ濃度で50%（IC50）近く阻害された（図１０）が、これは、本明細書に記載の他の酵素と比較して約20-100倍効力が低いことを意味する。
【００６４】
実施例３
PAI-1阻害のin vivoおよび臨床での実証
この実施例の目的は、心血管系疾患の治療および予防において重要なセアプローゼのin vivoでの効果を実証することである。
【００６５】
I. 作用のメカニズム
PAI-1阻害物質は、ヒトの血液中に通常認められるセルピンプロテアーゼインヒビター：α1-アンチトリプシンおよびα1-アンチキモトリプシンによって不活性化されない（表１）。PAI-1阻害物質は、ヒト血液中でもっとも多いプロテアーゼインヒビターであるα2-マクログロブリンと結合し、タンパク質基質とのプロテアーゼ活性が阻害されるが、合成ペプチド基質とのペプチダーゼ活性は阻害されない（図１および表１）。
【００６６】
A. マクログロブリンによるプロテアーゼ活性の阻害
別個のセアプローゼ（1μg）をそれぞれα2-マクログロブリン（0-250μg）とともに、37℃にて１時間インキュベートした。得られた反応混合物を、次に、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性についてアッセイした。プロテアーゼ活性を評価するために、10 mg/mLアゾカゼイン100μlを試験管に加えて37℃で１時間インキュベートした。その後、10%TCA 100μLを加え、試験管を混合して、15,000 RPMで5分間遠心した。上清のO.D.440を測定し、プロテアーゼ活性の指標とした（図１）。
【００６７】
ペプチダーゼ活性を評価するために、5 mg/mL D-Val-Leu-Lys p-ニトロアニリド(Sigma Chemical Co.) 1μlを別の反応混合物に加え、37℃にて１時間インキュベートした。O.D.405を測定し、ペプチダーゼ活性の指標とした（図１）。
【００６８】
B. セアプローゼ-α2-マクログロブリン複合体からのセアプローゼの遊離に対する過酸化水素およびクロラミンTの効果
おそらく、小ペプチド基質は、α2-マクログロブリンの「ケージ」構造内に入り込むことができるので、PAI-1阻害物質によって加水分解されるが、それよりはるかに大きなタンパク質基質は「ケージ」構造内に入り込むことができず、PAI-1阻害物質と接触しない。いかなる特定の理論にも縛られたくはないが、本発明者は、PAI-1阻害物質はα2-マクログロブリンの「ケージ」構造の内部に隔離されてはいるが、依然として活性であることを示唆する。PAI-1阻害物質は、過酸化水素もしくはクロラミンTによりin vivoで発生するような活性酸素種の作用によって、α2-マクログロブリンの「ケージ」構造から遊離される（図２）。
【００６９】
したがって、1μgのセアプローゼを、100μgのα2-マクログロブリンとともに37℃で１時間インキュベートした。過酸化物（0-100 mM）もしくはクロラミンT（0-2 mM）のいずれか一方を加え、反応混合物をさらに37℃で１時間インキュベートした。遊離したセアプローゼを、上記のようにアゾカゼインを用いてアッセイした。遊離セアプローゼは、α2-マクログロブリン無添加で測定されたプロテアーゼ活性のパーセンテージとして表された（図２）。
【００７０】
炎症および血栓部位に存在する活性化顆粒球は、α2-マクログロブリンとの複合体からPAI-1阻害物質を遊離させるのに十分なレベルで、活性酸素種を微小環境中に放出することができる（Stief, Thomas W. and Heimburger, Norbert Biol. Chem. 369 (1988) 1337-1342）。このことは、α2-マクログロブリンがPAI-1阻害物質の担体タンパク質として機能し、炎症もしくは血栓の部位にそれらを運搬し、そこで、PAI-1阻害物質が活性化顆粒球の作用によって遊離されるという、作用メカニズムを示唆する。次に、遊離されたPAI-1阻害物質は、自由に、炎症もしくは血栓の部位に存在するPAI-1を不活性化し、それによって、架橋したフィブリンの分解をもたらすプラスミンの局所濃度を増加させる。それに加えて、PAI-1阻害物質は、in vitroで、架橋したフィブリン基質に対する直接的なプロテアーゼ活性も示すので（表１）、PAI-1阻害物質は炎症もしくは血栓の部位で、架橋されたフィブリンを直接分解することもできる。
【００７１】
上記酵素とは対照的に、もう一つの既知のPAI-1阻害物質であるナットウキナーゼは、プロテアーゼインヒビターであるα1-アンチトリプシンおよびα1-アンチキモトリプシンによって不活性化される。また、ナットウキナーゼはPAI-1阻害物質としても、架橋したフィブリンを分解することができるプロテアーゼとしても有効性が比較的低い（表１）。
【００７２】
この実施例において、更なる研究はPAI-1阻害物質であるセアプローゼに焦点をおいたが、その理由は、この酵素が高レベルのPAI-1阻害活性、ならびに架橋フィブリン活性を示すためである。
【００７３】
C. 線維素溶解活性についてのin vivoでの証明
本研究は、Nanotherapeutics, Inc., Gainesville, FLにて、IACUC（Institutional Animal Care and Use Committee）の承認を受けたプロトコルの下で実施された。
【００７４】
６匹のラットそれぞれの、右側の頸静脈を外科的に露出して、初期の血流測定値を記録した。血流はプローブ2SBを取り付けたT206 超音波血流計によって測定した。次に右側頸静脈に化学的に血栓を導入し（左側静脈が対照となる）、切開を閉じた。２時間後、右側の静脈を再び外科的に露出して、右側の静脈を流れる血流を測定し、血流が実質的に遮断されているのを確認した。
【００７５】
その後、ラットの半分に、2週間、セアプローゼ(50 mg/kg/日)を餌に入れて与えた後、右側静脈を外科的に露出し、血流が血栓導入前のレベルに回復していることが明らかになった（図３）。残り半分のラット（対照ラット）にはセアプローゼを与えず、これらのラットでは2週間後に血流の回復は見られなかった（図４）。セアプローゼを与えたラットでは2週間後に、静脈の外観検査から血栓の徴候は見られなかったが、対照ラットは血栓の存在を示した。
【００７６】
D. PAI-1阻害についての臨床での証明
下記の臨床試験は、IRB (施設内倫理委員会)の承認を受けてAMK Clinical Laboratory, Gainesville, FLで実施された。この試験のためにPAI-1レベルの高い3人の被験者を選択した。これらの被験者は薬物治療を受けていなかった。試験開始１週間前に、最初の血液サンプルを採取した（Pre-SAP）。４週間にわたって、被験者は、朝食後および夕食後に、セアプローゼの15 mgカプセルを１つずつ摂取した。週に一度血液サンプルを採取した（SAP）。セアプローゼ治療が終了した２週間後にもう１回、血液サンプルを採取した（Post SAP）。PAI-1レベルは、ELISA (Innovative Research, Inc.)によって測定し、PAPレベルは、ELISA (ALPCO Diagnostics) によって測定し、D-ダイマーレベルは、ELISA (American Diagnostica, Inc.) によって測定し、そしてLDLレベルは標準法(Quest Diagnostics)によって測定した。各検査の正常レベルは、アッセイの製造供給元によって決定された。ELISAデータは３連で測定して平均値が報告され、変動は5%未満であった。SAP結果の値は、4つの血液サンプルの平均であり、変動は10%未満であった。臨床試験の結果は表２に示す。
【表２】
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【００７７】
このように、血液サンプルは、PAI-1活性、PAPレベル（血液中のプラスミンはプラスミン-アンチプラスミン複合体として存在する）、D-ダイマーレベル（D-ダイマーは架橋したフィブリンの最終分解産物であり、高いD-ダイマーレベルは炎症もしくは血栓の持続を示す）、および低密度脂質（LDL）について検査した。
【００７８】
被験者１は、PAI-1が非常に高レベルであったが（79 U/mL）、セアプローゼ治療中は正常の範囲内のレベルにまで低下した（8.8 U/mL）。セアプローゼ治療を２週間止めると、PAI-1活性レベルは、正常値を超えるレベルにもどった（16.2 U/mL）。セアプローゼ治療の間に、最初は血中に低レベルで存在したプラスミンが（130μg/mL）、正常レベル近くまで増加し（220μg/mL）、セアプローゼ治療後にはわずかに低下した（214μg/mL）。D-ダイマーレベルは、最初は高かったが（502 ng/mL）、セアプローゼ治療中は正常レベルに下がった（平均377、最低は治療の第４週で263 ng/mL）。LDLレベルは初めは非常に高かったが（192 mg/dL）、セアプローゼ治療中は正常レベル近くまで低下した（148 mg/dL）。セアプローゼ治療後、LDLは再び上昇した（155 mg/dL）。これらの結果が示すのは、セアプローゼがPAI-1阻害に有効であること、ならびに、PAI-1阻害の結果としてプラスミンレベルが増加したこと、こうしたことの結果として、D-ダイマー濃度の劇的な低下によって判断されるように、心血管系の健康状態が改善されたことである。LDLレベルの目覚ましい低下も認められ、これはセアプローゼがα2-マクログロブリンを活性化したことを示す（Degryse, Bernardら、The Journal of Biological Chemistry 279(21) (2004) 22595-22604, Wu, Sean M.ら、The Journal of Biological Chemistry 272(33) (1997) 20627-20635を参照されたい）。HDLは試験の間、変化しなかった。
【００７９】
被験者２は、やや高いPAI-1活性を示したが（16.2 U/mL）、セアプローゼ治療で正常レベルに低下し（7.7 U/mL）、セアプローゼ治療を終えた後わずかに増加した（9.4 U/mL）。プラスミンレベルは常に正常範囲内であった。D-ダイマーレベルは、初めは高く（567 ng/mL）、セアプローゼ治療中は減少し、最低点は第３週であって（433 ng/mL）、正常レベルに達した。D-ダイマー濃度は、セアプローゼ治療を止めた後、高レベルに上昇した（539 ng/mL）。LDLレベルは、セアプローゼ治療を受けている間に、正常を超えるレベルから（168 mg/dL）、正常レベルへ減少したが（133 mg/mL）、その後セアプローゼ治療を止めた後、かなり増加した（161 mg/dL）。HDLは試験の間、変化しなかった。被験者２に関するこれらの結果は、セアプローゼが治療中にPAI-1活性を低下させ、その結果Dダイマーレベルの低下をもたらしたことを示す。セアプローゼ治療中にLDLの劇的な減少が認められた。
【００８０】
被験者３はPAI-1活性が高かったが（29.1 U/mL）、セアプローゼ治療中に正常レベルまで低下し（5.6 U/mL）、セアプローゼ治療後に再び増加した（11.7 U/mL）。プラスミンレベルも、正常を下回るレベルから（223μg/mL）、セアプローゼ治療中に正常を超えるレベルに増加し（319μg/mL）、セアプローゼ治療後は（412μg/mL）であった。D-ダイマーレベルは、最初は正常値を超えていたが（585 ng/mL）、セアプローゼ治療中に正常レベルに低下し（第３週に476 ng/mL）、セアプローゼ治療後に増加した（567 ng/mL）。LDLレベルは、初めは正常の範囲内であったが（114 mg/dL）、セアプローゼ治療中にわずかに減少した（100 mg/dL）。被験者３から得られた結果もやはり、セアプローゼがPAI-1活性を阻害し、それが、プラスミンレベルを上昇させることによって、次にD-ダイマーレベル（心血管系リスク）を低下させることを示している。
【００８１】
米国特許を含む、本明細書で引用されているすべての公衆に利用可能な文献は、その全体を参照により、本明細書で完全に説明されているように、組み入れるものとする。
【００８２】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に記載の発明に対して、さまざまな置換および変更を行うことができる。上記の記載および実施例は、説明するためだけのものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、それは特許請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、マクログロブリンによるセアプローゼのプロテアーゼ活性（ペプチダーゼ活性ではない）の阻害を図示する。
【図２】図２Aおよび２Bは、過酸化水素（2A）またはクロラミンT（2B）の作用によるセアプローゼ-α2-マクログロブリン複合体（SAP-MG）からのセアプローゼ(SAP)の遊離を示す。
【図３】図３は、ラットにおいて、血栓によって遮断された静脈の血流に対するセアプローゼの回復効果を示す。
【図４】図４は、対照ラットにおいて、血栓によって遮断された静脈の血流に対するセアプローゼなしの影響を示す。
【図５】図５は、ヒト血清中のセミアルカリプロテアーゼ濃度の関数として、PAI-1阻害の程度を示す。
【図６】図６は、ヒト血清中のセラペプターゼ濃度の関数として、PAI-1阻害の程度を示す。
【図７】図７は、ヒト血清中のブロメライン濃度の関数として、PAI-1阻害の程度を示す。
【図８】図８は、ヒト血清中のプロナーゼ濃度の関数として、PAI-1阻害の程度を示す。
【図９】図９は、ヒト血清中のパパイン濃度の関数として、PAI-1阻害の程度を示す。
【図１０】図１０は、ヒト血清中のナットウキナーゼ濃度の関数として、PAI-1阻害の程度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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