(57)【要約】本発明は、グリシン及びアラニンを含む抗微生物性調製物を食物に添加することを含む、グラム陰性バクテリアに対して食物を保存する方法に関する。本発明はさらに、ヒト及び動物の腸内細菌叢を調節する為の、該抗微生物性調製物の使用方法に関係する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシンとアラニンとを含む抗微生物性調製物を食物に添加することを含む、グラム陰性バクテリアに対して食物を保存する方法。
【請求項２】
該抗微生物性調製物がＤＬ−アラニンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サルモネラ及びエシェリヒア  コリの少なくとも１に対して該食物が保護される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
サルモネラ  エンテリカ、エシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７の少なくとも１に対して該食物が保護される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくともグリシン及びアラニンから選ばれる２又は３のアミノ酸を含む、ヒト又は動物の腸内細菌叢を調節することにおける使用の為の抗微生物性調製物。
【請求項６】
プロバイオティックバクテリア並びに、少なくともグリシン及びアラニンから選ばれる２又は３のアミノ酸を含む、ヒト又は動物の腸内細菌叢を調節することにおける使用の為の、請求項５に記載の抗微生物性調製物。
【請求項７】
ヒト又は動物の腸内細菌叢を調節することにおける使用の為の、請求項５又は６の抗微生物性調製物。
【請求項８】
少なくともグリシン及びアラニンを含む抗微生物性調製物を投与することによる、ヒト又は動物の腸内細菌叢を調節する方法。
【請求項９】
少なくともグリシン、アラニン及びプロバイオティックバクテリアを含む抗微生物性調製物が投与される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗微生物性調製物及び食物を保存する方法に関係する。特に、本発明は、少なくとも２のアミノ酸の組合せにより食物を保存する方法に関係する。本発明はさらに、ヒト及び動物における腸内細菌叢を制御することにおいてそのような調製物を使用する方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
感染性及び毒素産生性微生物により汚染された食物の消費に関連する罹患率及び死亡率は過小評価されるべきではない。それは、食物の微生物的な品質及び安全性が、食品加工業者、消費者及び政府機関にとって絶えない心配の種の原因であるとの理由の故である。さらに、微生物による食料品の損傷及び腐敗は、その栄養価を落とし、そして実質的な経済的損失をもたらしうる。食物の微生物性の損傷は、微生物の制御されない増殖又は活動から生じる。これを防ぐ為に、食物の品質及び微生物学的安全性を確保する保存技術が開発されてきた。これらの技術は多様であり、そして、（i）食物への微生物の接近を防ぐ手順、（ii）微生物を不活性化する手順、及び（iii）微生物の増殖を妨げ又は遅らせる手順を含む。消費者の要求の変化及び食物の法律の変化は、食品技術者を、既存の食品加工技術を絶えず修正及び改善させ、且つ新たなものを発明及び開発させる。この傾向は、魅力的に、より新鮮に及びより自然にみえるだけでなく、長い保存期間及び調製の容易さのような使用の簡便性とこれを兼ね備える食物を製造することである。さらに、顧客は、風味、テクスチャ、外見及び安全性に関する高い基準も定める。全てを達成する為に、これは、食品技術者にとって主要な挑戦を提示する。食物中の微生物の増殖の遅延又は防止に関して、新しく且つより多くの天然の化学的抗微生物剤についての新たな適用が、着実になされている。これらの新たな化学的保存剤は、しかしながら、多くの要求を満たすべきである；（i）それらは種々の損傷性生物及び食物経由の病原体の広い範囲に対して有効な殺微生物性又は静菌性の活性を有すべきである、（ii）それらは食物の外見、味、風味又はテクスチャに影響すべきでない、及び（iii）それらは消費者にとって毒性であるべきでない。或るアミノ酸が殺微生物性又は静菌性の特性を有することが知られている（例えば、Shive, W. ;C.G.Skinner (1963) Amino acid analogues. In: Metabolic inhibitors. A comprehensive treatise (Hochster,R.M.; J.H.Quastel eds). Academic Press. New York. Volume I, pp 1-73)。
【０００３】
さらに、多くのアミノ酸は、天然に食物中に生じ、そして一般に保存剤として考えられ、そして食品製品中での使用にとって良いと認められる。いくつかのアミノ酸、とりわけグリシンが、防腐剤としての商業的適用が分かったことは、まさにこれらの理由の故である。
【０００４】
セリンにより食料品を保存する方法が、米国特許第２，７１１，９７６号公報及び米国特許第６，６０２，５３２号公報に開示された。米国特許第３，６１５，７０３号公報において、果物若しくは果汁、野菜若しくは野菜汁、又はビールを含む、食料品又は飲料の風味が、該食料品又は飲料を、リジン、オルニチン、ヒスチジン又はそれらの塩と一緒に容器中に密封することにより維持される。独国特許第１，５１０，９４２号公報は、食料品、特には１０〜６０％の糖を含むそれら、例えばゼリー、ジャム及びカスタードの保存の為の方法を開示し、該食料品中にマルトース及びグリシンを組み込むことにより該食料品が腐敗に対して保護される。グリシンは、０．３〜２％の量で適当に存在する。グリシンは商業的な防腐剤として現在広く用いられているが、この化合物は強力な防腐剤ではなくそして、バクテリアの増殖抑制を生じさせる為に、比較的高い濃度が必要とされることも認められている。しかしながら、これらの高い濃度は、新たな一連の問題を生じる。グリシン、アラニン、セリン及びスレオニンは全て、異なる程度で甘味を有し、リジン及びオルニチンは両方とも苦く且つ甘い特徴を有し、一方でアルギニンは極めて苦いことが知られている。味に対するアミノ酸の影響は、食物防腐剤としてのこれらの化合物の適用を制限する。
【０００５】
それ故に、グリシンが食物防腐剤としてより有効に用いられる為に、それ故に、グリシンと一緒に用いられてよく且つその抗微生物性効果を増すことを助ける他の物質についての要求がある。Leeらは、ヘキサメタホスフェート、ＥＤＴＡ、コール酸及びグリセロールモノカプレートとの組合せにおけるグリシンの抗微生物性効果を、多くのグラム陽性及びグラム陰性バクテリアの種に対して試験した（Lee, J.K.; K.Tatsuguchi; M.Tsutsumi; T.Watanabe, J.Food  Hyg.Soc. Japan 26: 279-284 (1985)）。国際公開第０１／５６４０８号パンフレットにおいて、食物保存剤を得る為にアラニン又はグリシンが、１，５−Ｄ−無水フルクトースと一緒に用いられ、これは非常に安全な抗微生物性物質を含有し、そしてこのようにして、食物の味又は風味に対する望ましくない効果を何も発揮することなく、食物の貯蔵に適する品質を改善できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
単独のアミノ酸と１以上の他の非アミノ酸化合物（上記参照）から成る抗微生物性混合物を用いる方法は開示されたが、複数のアミノ酸の混合物の抗微生物的特性についてはほとんど知られていない。
【０００７】
特開２０００−２２４９７６号公報は、食物の６．５超のｐＨ領域の範囲で乳酸菌エンテロコッカス  フェカリスのような微生物の抑制の為の方法であって、さらに乳酸カルシウムとグリシンの混合物並びにいくつかの他の有機酸の塩を用いて、食物の品質をほとんど損なわない上記方法を開示する。同じ出願において、グリシンの一部がアラニンと置換されうることも開示されたが、そのデータは、アラニン並びにアラニンとグリシンとの混合物は、グリシン単独よりも、グラム陽性バクテリア  エンテロコッカス  フェカリスの増殖の有効でない抑制剤であることを示す。アラニンがグリシンの抑制効果に反対に作用することができることは、近縁種であるグラム陽性バクテリア  エンテロコッカス  ヒラエ及びラクトコッカス  ラクティスの場合に示されていないだけでなく、グラム陰性エシェリヒア  コリにおいても示されていない（Snell, E.E.; B.M. Guirard (1943) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 29: 66 - 73, Hishinuma, F.; K. Izaki; H. Takahashi (1969) Effects of glycine and D-amino acids on the growth of various micro organisms Agr.Biol.Chem. 33: 1577 - 1586）。１のアミノ酸が他のアミノ酸により発揮された抑制を相殺できることは良く知られており、そして、多くのグラム陽性及びグラム陰性バクテリア種、例えばグラム陽性バクテリアではバチルス  アンスラシス及びリステリア  モノサイトゲネス並びにグラム陰性バクテリアではエシェリヒア  コリなどにおいて、観察されている（Gladsone,G.P. (1939) Brit.J.Exp.Pathol. 20: 189 - 200; Friedman,M.E.; W.G.Roessler (1961) J.Bacteriol. 82: 528 - 533; de Felice et al. (1979) Microbiol. Rev. 43: 42 - 58）。
【０００８】
米国特許出願公開第２００１／０３３８８４号明細書において、グリシン及びセリンを含む調製物が、グラム陽性及びグラム陰性バクテリアに対して食物を保存する為に用いられる。
【０００９】
特開昭第５３−５０３６１号公報の要約書もまた、食物のｐＨを調節する為のグリシン及びセリンを含む組成物を開示する。
【００１０】
米国特許出願公開第２００１／０３９２６４号明細書及び米国特許出願公開第２００２／１４４９４６号明細書は夫々、重度の運動に伴うアミノ酸の血中濃度を減少し又は疲労を減少するような他の使用方法の為に、及び血液透析における使用方法の為に、少なくとも５以上のアミノ酸を含む他の組成物を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、今、グリシンとアラニンとの組合せが、グラム陰性バクテリアの抑制において相乗効果を発揮することが発見された。
【００１２】
この目的の為に、本発明は、少なくともグリシンとアラニンとを含む、グラム陰性バクテリアに対して向けられた抗微生物性調製物に関する。
【発明の効果】
【００１３】
このように、グリシンとアラニンとの組合せを含むこの抗微生物性調製物は特に、エシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７及びサルモネラ種の増殖を抑制する為に適当である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
これらの２のアミノ酸のこの組合せはさらに、第３のアミノ酸と組み合わせられうることが強調される。これらの組合せは、他のアミノ酸から単離したアミノ酸に基づき予期されうるよりも大きい抗バクテリア性効果を有すること、すなわち相乗効果を示すことが発見された。
【００１５】
アラニンは好ましくはＤ−アラニンである。最も好ましくは、抗微生物性調製物は、ＤＬ−アラニンを含む。もしさらに他のアミノ酸が存在するならば、これらは最も好ましくはＤＬ−アミノ酸である。
【００１６】
他の局面において、本発明は、グリシンとアラニンとを含む上記の抗微生物性調製物を食物に添加することを含む、バクテリアに対して食物を保存する為の方法に関する。
【００１７】
本発明に従う方法は、サルモネラ  エンテリカの少なくとも１に対して、及びエシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７に対して食物を保護する為に特に有用である。
【００１８】
そのような食品製品の例は、肉製品（保存された及び／又は保存されていない、新鮮な及び／又は調理された）、サラダ及び他の野菜製品、飲料及び乳製品、半加工食品、簡便な食品、例えばインスタントの（ready-to-eat）食事及び乾燥した食品製品など、である。いくつかの新鮮な肉製品は、加熱処理を何も伴わず又はバクテリアを殺す為には不十分な加熱処理を伴う、直接の消費（例えば、フィレ  アメリカン（filet  americain）、タルタルステーキ、すし又はカルパッチョ）の為に用いられるので、該方法は特に興味深い。他の肉製品は、例えばミディアム調理されたステーキなどのような意図的に適用された又は食品製品の不適切な調製若しくは不適切な取扱いの故に非意図的に適用された、一部分だけの加熱処理の適用後に消費される。
【００１９】
グリシン／アラニンを含む調製物を含む、本発明の抗微生物性調製物はさらに、サルモネラ及びエシェリヒアのようなグラム陰性バクテリアを抑制して、選択の有利をラクトバチルスのようなグラム陽性バクテリアに与えることにより、例えばプロバイオティックバクテリア（probiotic  bacteria）と一緒の投与により、腸内細菌叢を調節するような他の適用においても、適用されうる。
【００２０】
以下の培養物が研究において用いられた：エシェリヒア  コリ血清型Ｏ１５７：Ｈ７  （ＡＴＣＣ  ７００７２８）、サルモネラ  エンテリカ（ＡＴＣＣ  １３３１１）。全ての培養物が、１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロス（Ｏｘｏｉｄ、ベイジングストーク、英国）を有するスクリューキャップチューブ（１００×１６ｍｍ)中に、毎日移し替えられた。培養物は、攪拌無しで、３０℃でインキュベートされた。ブレインハートインフュージョンブロスは、該２のアミノ酸の増加する量を有して調製された。該アミノ酸の濃度範囲は、１０の５０ｍＭ段階での、０〜４５０ｍＭである。これは、１００の異なる培地を結果した。該培地のｐＨは、６．１〜６．２に調節された。培地は、１０ｍｌの量で調製され、そして、ろ過により滅菌された（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  セルロースナイトレート膜  ０．４５μｍ孔径）。夫々の培地の３００μｌが、滅菌Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  ｈｏｎｅｙｃｏｍｂ１００ウェルプレートのパネルに移された。ウェルプレートは、ブレインハートインフュージョンブロス中で一晩増殖させられた培養物の５μｌにより、滅菌Ｈａｍｉｌｔｏｎ５μｌリピーティングディスペンサー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｂｏｎａｄｕｚ、スイス）を用いて植菌された。増殖速度は、垂直分光器により濁度の進展を速度論的に測定するＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ヘルシンキ、フィンランド）により決定された。プレートは、３７℃で１６〜２４時間インキュベートされ、培養物の光学密度が、広帯域フィルタを用いて４２０〜５８０ｎｍで３０分毎に測定された。Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎは、設定時間の間隔で、培養物の光学密度を測定する。これらのデータから、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎは、最大の比増殖速度を計算する。
【００２１】
さらなるデータ加工の目的は、２のアミノ酸の夫々が互いに独立して作用するかどうか又は２つのアミノ酸がそれらの抑制性作用において互いに刺激するか（相乗効果）若しくは互いに抑制効果を相殺するか（拮抗作用）を解明することである。或る化合物が生物に対して効果を有さないとき、この生物の比増殖速度（μ）は、増殖制限基質濃度（ｓ）の関数として、例えばモノーの方程式により表されることができ、これは：μ  ＝  μｍａｘ・ｓ／（Ｋｓ  ＋  ｓ）であり、ここでμｍａｘは、最大の比増殖速度を表し、ｓは培地中の増殖制限基質の変わらない濃度を表し、及びＫｓはμ＝０．５μｍａｘであるところの基質濃度を表す。しかしながら、抑制剤Ｐの存在が細胞の増殖に影響するときは、μについての関数ｆは修正されなければならず、すなわちμ＝ｆ（ｓ、ｐ）であり、ここでｐは抑制剤Ｐの濃度を表す。バクテリアの増殖抑制速度論の多くの研究は、多くの抑制剤が非競合的な抑制剤として振舞うことを示した。これは、最大の比増殖速度（μｍａｘ）の値だけが影響され及び親和性（Ｋｓ）は影響されないことを暗示する。それ故に、抑制剤の存在下における該比増殖速度は、μ  ＝  μi・ｓ／（Ｋｓ＋ｓ）として書かれ、ここでμiは抑制剤Ｐの存在下における最大の比増殖速度である。μiとμｍａｘの関係及び抑制剤Ｐの濃度はロジスティック用量応答方程式を用いて記載され、これはμi／μｍａｘ＝１／（１＋（ｐ／ｐ０．５）ｂ）を読む（Jungbauer, A. (2001). The logistic dose response function: a robust fitting function for transition phenomena in life sciences. J. Clinical Ligand Assay 24: 270 - 274）。この方程式において、ｐは抑制剤Ｐの濃度を表し及びｐ０．５はμi＝０．５μｍａｘであるところのＰの濃度を表す；μｍａｘは、抑制剤Ｐの不在下での比増殖速度である最大の比増殖速度であり、ｂは次元の無い量であり、これはμiとｐの間の関係を決定する。モノーの方程式及びロジスティック用量応答方程式を組み合わせることにより、それはμ＝μｍａｘ（ｓ／Ｋｓ＋ｓ）／（１＋（ｐ／ｐ０．５）ｂ）として書かれることができる。ｓが通常はＫｓよりも何倍も高いバッチ培養において、この方程式は、μ＝μｍａｘ／（１＋（ｐ／ｐ０．５）ｂ）へと変形する。
【００２２】
同じ条件下で増殖された異なる生物を比較するとき又は異なる条件化で増殖された同じ生物を比較するとき、比較の基準として絶対的増殖速度よりもむしろ、相対的増殖速度を用いることがより重要である。相対的増殖速度（Ｏ）は、最大の増殖速度（μｍａｘ）に対する増殖速度（μ）の比であり、すなわちＯ＝μ／μｍａｘである。μ及びμｍａｘが（時間）−１の次元を有する一方で、それらの比Ｏは次元が無く、すなわち純粋な数字であることがわかる。同様に、我々は相対的な抑制剤濃度εをｐ／ｐ０．５として定義することができる。変形されたモノー及びロジスティック用量応答方程式は、Ｏ＝１／（１＋εｂ）として今、書かれることができる。２の抑制剤Ｘ及びＹについて、例えばＯについての以下の２の式が定義されうる：
Ｏｘ＝１／（１＋εｂ１）及びＯｙ＝１／（１＋εｂ２）。
Ｏｘ及びＯｙは、標的生物の増殖速度に対するＸ又はＹの抑制効果を試験することにより実験的に評価されうる。Ｏｘ及びＯｙについて評価された作用を知ることで、理論上の独立の効果がＯｘ・Ｏｙとして定義される。相対的増殖速度に対するＸ及びＹの組合せの実験的に観察された効果は、Ｏｘｙとして定義される。Ｘ及びＹが、或る生物に対して互いに独立して作用するとの仮説は、数学的にＯｘｙ／Ｏｘ・Ｏｙ＝１へと言い換えられる。この仮説の拒絶は、Ｘ及びＹの組み合わせられた効果が、相加的効果ではなく、相乗的又は拮抗的であることを暗示する。抑制剤Ｘ及びＹが標的生物に対して相乗的に作用する場合、Ｏｘｙ／Ｏｘ・Ｏｙ＜１（しかし＞０）である。抑制剤Ｘ及びＹの組み合わせられた効果が、拮抗的である場合、Ｏｘｙ／Ｏｘ・Ｏｙ＞１である。相乗効果、独立的効果、及び拮抗作用は、Ｏｘｙ対Ｏｘ・Ｏｙのプロットにおいて視覚化されうる。
【００２３】
これは、図１において例証され、ここでエシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ  ７００７２８）についてのＯＧｌｙ・Ａｌａ（実験的に観察された相対的増殖速度）対ＯＧｌｙ・ＯＡｌａ（予測される相対的増殖速度）のプロットが与えられ、グリシンとＤＬ−アラニンの間の抑制における相乗効果を示す。このグラフ中の実線は、実験的に観察された相対的増殖速度（ＯＧｌｙ・Ａｌａ）が予測される相対的増殖速度（ＯＧｌｙ・ＯＡｌａ）と等しくそしてＧｌｙ及びＡｌａが独立の抑制剤として作用するところの線を表す。
【００２４】
ＤＬ−アラニンとグリシンとの組合せは、サルモネラ  エンテリカ及びエシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７に対して特に有効である（相乗効果）。
【００２５】
エシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ  ７００７２８）とラクトバチルス  プランタラム（ＤＳＭ  ２０１７４）の間の競合（混合した培養物Ａ）、並びにサルモネラ  エンテリカ（ＡＴＣＣ  １３３１１）とラクトバチルス  プランタラム（ＤＳＭ  ２０１７４）との間の競合（混合した培養物Ｂ）が、ブロス培養物において研究された。エシェリヒア  コリ、サルモネラ  エンテリカ、及びラクトバチルス  プランタラムは、１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロス（Ｏｘｏｉｄ、ベイジングストーク、英国）を有するスクリューキャップチューブ（１００×１６ｍｍ）中に、毎日移し替えられた。培養物は、攪拌無しで３０℃でインキュベートされた。エシェリヒア  コリの一晩培養物５００μｌ及びラクトバチルス  プランタラムの培養物５μｌが、新たに調製された１０ｍｌのプレインハートインフュージョンブロスを有するスクリューキャップチューブ又は、２００ｍＭのＤＬ−アラニン及び２００ｍＭのグリシンを有する１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロス若しくは４００ｍＭのＤＬ−アラニン及び４００ｍＭのグリシンを有する１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロスを有するスクリューキャップチューブに移し替えられた（混合した培養物Ａ、第１の移し替え）。サルモネラ  エンテリカの一晩培養物５００μｌ及びラクトバチルス  プランタラムの培養物５μｌが、新たに調製された１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロスを有するスクリューキャップチューブ又は、２００ｍＭのＤＬ−アラニン及び２００ｍＭのグリシンを有する１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロス若しくは４００ｍＭのＤＬ−アラニン及び４００ｍＭのグリシンを有する１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロスを有するスクリューキャップチューブへと移し替えられた（混合した培養物Ｂ、第１の移し替え）。両方の混合した培養物は３０℃でインキュベートされた。２４時間後、培養物は、新鮮な培地へと移し替えられ（第２の移し替え）、そしてＶｉｏｌｅｔ  Ｒｅｄ  Ｂｉｌｅアガー（Ｏｘｏｉｄ、ベイジングストーク、ＣＭ０４８５）上及びＭＲＳアガー（Ｏｘｏｉｄ、ベイジングストーク、ＣＭ０３６１）上にもまかれた。第２の移し替えは、３０℃で２４時間インキュベートされ、そして次にＶｉｏｌｅｔ  Ｒｅｄ  Ｂｉｌｅアガー上及びＭＲＳアガー上にまかれた。表１に要約されるこの分析の結果は、ＤＬ−アラニン及びグリシンを有する培地中での、エシェリヒア  コリ又はサルモネラ  エンテリカと混合した培養物中でのラクトバチルス  プランタラムの競合上の有利を示す。
【００２６】
2009532049.tif 000002
表１．第１及び第２の移し替えにおける、ｍｌブロス当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）。
【００２７】
本発明が、食物を保存する為に用いられた。以下の実施例は、本発明の実例となる。液体の培養物を植菌する為に用いられたサルモネラ  テフィムリウム  ＡＴＣＣ  １３３１１及びエシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７  ＡＴＣＣ  ７００７２８のストック培養物は、１．５％アガーを補強されたブレインハートインフュージョン（Ｏｘｏｉｄ  ＣＭ２２５、ベイジングストーク、英国）を有するアガープレート上に規定どおりに維持された。エシェリヒア  コリ及びサルモネラ  ティフィムリウムの培養物が、１０ｍｌのブレインハートインフュージョンブロスを有するスクリューキャップチューブ（１００×１６ｍｍ）中で増殖され、そして３０℃で一晩インキュベートされた。食物への植菌の直前に、該培養物は、０．１％ペプトン及び０．８５％ＮａＣｌを有する溶液により希釈された。
【００２８】
乳
滅菌無脂肪乳が、地元のスーパーマーケットから入手された。アミノ酸の適当な量が添加された。
【００２９】
パスタ（ラザニア）
インスタントのラザニア・ボロネーゼが地元のスーパーマーケットから入手され、そして卓上ミキサーを用いて完全に均質化された。アミノ酸の適当な量が、均質化された５００ｇのラザニアに添加された。この混合物が、真空包装され、そして次に照射された（１０ｋＧｒａｙ）。照射されたラザニアは、さらなる使用まで、−３０℃で保存された。
【００３０】
新鮮な肉
約２０％の脂肪を有する新たに切り取られらた牛肉（胸肉）が、１／８”グラインダープレートを備えられたＰｒｉｍｕｓ  ＭＥＷ  ６１３  Ｍｅａｔグラインダー（Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ  Ｄｏｒｎｈａｎ，Ｄｏｒｎｈａｎ，ドイツ）を用いてすりつぶされた。温度は、全部の手順の間、１０℃で維持された。アミノ酸の適当な量が、５００ｇのひき肉に添加された。該肉アミノ酸混合物は次に照射された（１０ｋＧｒａｙ）。照射された肉は、さらなる使用まで−３０℃で保存された。
【００３１】
ラザニア及び新鮮な肉の植菌
冷凍の七面鳥ハム、ラザニア、又は新鮮な肉が、−４（±１）℃で一晩解凍された。５００ｇのなお凍結した製品が素早く２〜４ｃｍ片へと切られ、そしてキッチンフードプロセッサ（Ｔｅｆａｌ  Ｋａｌｅｏ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｔｙｐｅ  ６７６０４）のバケットへ移された。１．５ｍｌの適当に希釈されたバクテリアの培養物が添加され、そして、全ての混合物が約３０〜６０秒間混合された。この段階で、該混合物の温度は、なお０℃より低かった。混合の後、その約２５ｇが正副２つ、バッグフィルター（Interscience,  St  Nom,  フランス）へと素早く移された。エシェリヒア  コリ又はサルモネラ  ティフィムリウムにより植菌された製品が、１２℃で最大で２週間インキュベートされた。
【００３２】
乳の植菌
乳は１０℃に冷却され、そして次にサルモネラ  ティフィムリウムの適当に希釈された培養物により植菌された。植菌された乳の試料が１２℃でインキュベートされた。
【００３３】
微生物の分析
食物試料の微生物の分析は以下のとおりに行われた：密封バッグが開けられ、そしてここに滅菌希釈流体（８．５％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌ及び０．１％（ｗ／ｖ）細菌学的ペプトン）の正味重量が２回添加された。試料は、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  ４００  ｌａｂ  ブレンダー（Ｓｅｗａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ロンドン、イングランド）中で１分間均質化され、そしてホモジネートの５０μｌが、Ｅｄｄｙｊｅｔ  ｔｙｐｅ  １．２３スパイラルプレーター（ＩＵＬ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，バルセロナ、スペイン）を用いて適当なアガー培地上にまかれた。エシェリヒア  コリ  Ｏ１５７：Ｈ７及びサルモネラ  ティフィムリウムが、ＶＲＢＧアガー（Ｏｘｏｉｄ、ＣＭ０４８５、ベイジングストーク、英国）上にまかれた。プレートは、３０℃で２４時間インキュベートされ、そして次に計数された。
【００３４】
結果
１２℃での乳中のサルモネラ  ティフィムリウムの増殖に対する、グリシン、ＤＬ−アラニン、及び、グリシン（０．６７％）とＤＬ−アラニン（０．８％）との混合物の、１回の添加の効果が表Ｉ：
2009532049.tif 000003
に与えられる
【００３５】
該表は、ブロス培養物において、１００ｍＭの濃度までのグリシン及び１００ｍＭの濃度までのＤＬ−アラニンは、サルモネラ  ティフィムリウムの増殖速度に対して影響をほとんど有さないか又は影響を有さない。他方の組合せは、乳中のこの生物の増殖を抑制することにおいて非常に有効であると示された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】グリシンとＤＬ−アラニンの間の抑制における相乗効果を示すグラフである。
【図１】
2009532049.tif 000004
【国際調査報告】
2009532049.tif 000005
2009532049.tif 000006
2009532049.tif 000007
2009532049.tif 000008
2009532049.tif 000009
2009532049.tif 000010