(57)【要約】  本発明は、例えば、対象由来の癌組織又は癌細胞試料において、ベースライン値と比較して、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分、及び／又は相互接続したポリペプチド経路の少なくとも１つの構成成分（例えば、Ａｋｔ経路の構成成分又はＩＲＳ経路の構成成分）のリン酸化状態を測定することを含み、ここでベースライン値と比較して上昇したレベルのリン酸化状態によって、対象が化学療法剤に対して非応答者であること及び／又は予後不良であることが示される、化学療法剤に対する対象の反応及び／又は対象の予後を予測するための方法に関する。対象が上昇したレベルのリン酸化状態を示し、ｍＴＯＲ及び／又は相互接続した経路の１つ又は複数の阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象において癌を治療するための方法もまた記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法剤に対する対象の反応及び／若しくは対象の予後を予測するための方法、並びに／又は化学療法剤を必要とする対象において癌を治療するための方法であって、
対象由来の癌組織又は癌細胞試料において、ベースライン値と比較して、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分及び／又は相互接続したポリペプチド経路の少なくとも１つの構成成分のリン酸化状態を測定すること
を含む方法であって、
ベースライン値と比較して上昇したレベルのリン酸化状態が、対象が化学療法剤に対して非応答者であること及び／又は予後不良であることを示す方法。
【請求項２】
相互接続したポリペプチド経路の構成成分がＡｋｔ経路由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相互接続したポリペプチド経路の構成成分がＩＲＳ経路由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
相互接続したポリペプチド経路の構成成分がＡｋｔ及びＩＲＳ経路以外の経路に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
測定されるリン酸化状態が、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分、Ａｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分、若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分、又はその組合せのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
測定されるリン酸化状態が、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
測定されるリン酸化状態が、Ａｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
測定されるリン酸化状態が、ＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
測定されるリン酸化状態が、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分及びＡｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
測定されるリン酸化状態が、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分及びＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
測定されるリン酸化状態が、Ａｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分及びＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
測定されるリン酸化状態が、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分、Ａｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分、及びＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
測定されたリン酸化状態が、ポリペプチドの特定のリン酸化パターンを反映する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ｍＴＯＲ及び／又は相互接続したポリペプチド経路構成成分が、Ａｋｔ−キナーゼ、ｍＴＯＲ、４Ｅ−ＢＰ１／ＰＨＡＳ−１、ｐ７０ｓ６ｋ、ｅＩＦ−４Ｅ、若しくはｅＩＦ−４Ｇ、ＰＴＥＮ、ＰＤＫ１、ＧＳＫ３β、ＴＳＣ１／２、ＩＬＫ、Ｇａｂ１／２、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＦＫＨＲ、ＦＫＨＲＬ、ｅＮＯＳ、ＡＳＫ１、ＢＡＤ、ｐＲＡＳ４０、１４−３−３、又はＣＨＫ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、経路の構成成分において、ベースライン値と比較してリン酸化状態の有意な増大が観察されない場合に、対象を従来の化学療法で治療する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
さらに、経路の構成成分において、ベースラインと比較して有意に増大したリン酸化の量が観察された場合に、ｍＴＯＲ経路、又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分の阻害剤を対象に投与する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
阻害剤がＦＫＢ１２に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、従来の化学療法剤が、阻害剤と組み合わせて対象に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
従来の化学療法剤が、阻害剤と同時に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
従来の化学療法剤が、阻害剤の投与後の適した時点で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
経路の構成成分のリン酸化状態が、阻害剤の投与後に測定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
投与された阻害剤の量が、経路構成成分のリン酸化の量を減少させるのに有効である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
治療を必要とする対象における化学療法剤で癌を治療する方法において、
治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中のｍＴＯＲ経路又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分において、有意に増大したリン酸化が測定された場合に、ｍＴＯＲ経路、又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分の阻害剤を投与すること
を含む、改良。
【請求項２４】
治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中のｍＴＯＲ経路又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分において、有意に増大したリン酸化が測定された場合に、ｍＴＯＲ経路、又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分の阻害剤を投与すること
を含む、化学療法剤に耐性又は抵抗性のある癌を治療する方法。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法によって、ベースライン値と比較して、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分、及び／又は相互接続したポリペプチド経路の少なくとも１つの構成成分のリン酸化状態を測定すること、並びに、有意な量の増大したリン酸化が測定された場合に、ｍＴＯＲ経路、又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分の阻害剤を投与すること
を含む、治療を必要とする対象において、癌を治療する方法。
【請求項２６】
リン酸化を化学療法の前に測定し、治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中の経路の構成成分において有意に増大したリン酸化が測定された場合に、癌を治療するための治療剤と組み合わせて阻害剤を投与する、請求項１４又は１６〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
経路構成成分のリン酸化が、ＰＩ３−キナーゼ、Ａｋｔ−キナーゼ、ｍＴＯＲ、４Ｅ−ＢＰ１／ＰＨＡＳ−１、ｐ７０ｓ６ｋ、ｅＩＦ−４Ｅ、及びｅＩＦ−４Ｇ．ＰＴＥＮ、ＰＤＫ１、ＧＳＫ３β、ＴＳＣ１／２、ＩＬＫ、Ｇａｂ１／２、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＦＫＨＲ、ＦＫＨＲＬ、ｅＮＯＳ、ＡＳＫ１、ＢＡＤ、ｐＲＡＳ４０、１４−３−３、又はＣＨＫ１から選択される少なくとも１つの構成成分のリン酸化部位に対する抗体を用いて測定される、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
癌が乳癌である、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
癌が横紋筋肉腫である、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
癌が肺癌である、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
肺癌が非小細胞肺癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
試料が転移細胞を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
癌が、ＰＴＥＮの機能喪失、並びに／又は変異及び活性化したＡｋｔと関連しない、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
阻害剤が、ｍＴＯＲ経路、Ａｋｔ経路、若しくはＩＲＳ経路の構成成分、又はその組合せを対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
阻害剤が、ｍＴＯＲ経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
阻害剤が、Ａｋｔ経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
阻害剤が、ＩＲＳ経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
阻害剤が、Ａｋｔ又はＩＲＳ経路以外の相互接続した経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
阻害剤が、ｍＴＯＲ経路の構成成分及びＡｋｔ経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
阻害剤が、ｍＴＯＲ経路の構成成分及びＩＲＳ経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
阻害剤が、Ａｋｔ経路の構成成分及びＩＲＳ経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
阻害剤が、ｍＴＯＲ経路の構成成分、Ａｋｔ経路の構成成分、及びＩＲＳ経路の構成成分を対象とする、請求項１７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
測定されたリン酸化状態が、ポリペプチドの特定のリン酸化パターンを反映する、請求項１７〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中のｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分及び／又は相互接続したポリペプチド経路の少なくとも１つの構成成分のリン酸化状態の変化を測定し、それによって上昇したレベルにより対象が化学療法剤に対して非応答者であること及び／又は予後不良であることが示されること
を含む、化学療法剤に対する対象の反応及び／又は対象の予後を予測する方法。
【請求項４５】
治療を必要とする対象における化学療法剤で横紋筋肉腫を治療する方法において、
対象由来の癌組織又は癌細胞試料において、４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６、ｅＩＦ−４Ｇ  ｓｅｒ１１０８、及び／又はｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９で増大したリン酸化が測定された場合に、ＣＣＩ−７７９を投与すること
を含む、改良。
【請求項４６】
ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分、及び／若しくはＡｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分、及び／若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分、又はその組合せのリン酸化状態を検出するための、１つ又は複数の薬剤を含む、化学療法剤に対する対象の反応及び／又は対象の予後を予測するためのキット。
【請求項４７】
ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＡｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、又はその組合せ、並びに薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の阻害剤と併用して投与することができる化学治療剤をさらに含む、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＡｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、又はその組合せを含む、化学療法剤に耐性又は抵抗性のある癌の患者を治療するためのキット。
【請求項５０】
ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤の阻害剤、及び／若しくはＡｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、又はその組合せと併用して投与することができる化学療法剤をさらに含む、請求項４９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれている、２００５年１０月１８日に出願した米国仮出願第６０／７２７５１０号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腫瘍は、タンパク質リン酸化等の翻訳後修飾によって駆動される、欠損したタンパク質ベースの細胞シグナル伝達プロセスに依存して、増殖、生存及び転移する。これらのシグナル伝達ネットワークはまた、現在の、及び計画されている分子標的阻害剤のほとんどの標的である。一例は、乳癌における機能亢進性上皮成長因子（ＥＧＦ，Epidermal Growth Factor）シグナル伝達系をブロックすることができる薬物である、ハーセプチン（HERCEPTIN）である。このシグナル伝達経路が過剰発現及び活性化された患者のみが、この治療に反応する。患者のケアに対する緊急の重大な必要性は、標準的治療に反応する患者及びより積極的な治療手段を必要とする患者を同定することである。これらの、より積極的な手段は、ほとんど常に、罹患率の増加を伴い、そのため、正当化なしに、先験的に選択されない。例えば、リンパ節転移陰性の乳癌を有し、その腫瘍上にエストロゲン受容体を有する女性は、タモキシフェン治療に適している。しかしながら、タモキシフェン治療に反応せず、例えばアロマターゼ阻害剤（ＡＩ，aromatase inhibitor）でのより積極的な治療を必要とする女性が約３０〜４０％いる。しかしながら、アロマターゼ阻害剤は、中等度〜重度の骨量減少を伴い、そのため、全ての女性にＡＩ治療を施すことは受け入れられないであろう。転帰と治療に対する反応を識別することができる生物マーカーは、この例のコホートにとって、非常に有益であろう。標準治療に反応する集団を予後のより不良なものとの識別するというこの難問は、他のヒト癌のほとんど全てに共通している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
遺伝子発現分析から、転帰についての予後のサインを導くことができるかどうかが示された。しかしながら、これらのエンドポイントは、単純な層別化のみに限定される。サインは、医師に、非応答者群をどのようにして治療するかを教えることはできない。これは単に、誰が反応し、誰が反応しないかを決定するのに用いることができるだけである。一方、タンパク質シグナル伝達プロファイリングは、予後のサインを提供することができ、重要なことに、どの治療によって非応答者コホートを治療するかに関する情報を提供することができる。これは、プロテオミクスの描写が、薬物標的自体に関して構築されるからである。さらに、遺伝子発現分析における多くの遺伝子の分析は複雑であり、一般に、アルゴリズム及び広範なコンピュータ解析の使用を伴い、タンパク質薬物標的の活性化状態又は機能状態を反映しない。遺伝子発現は、シグナル経路タンパク質のリン酸化と相関しない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、例えば、ｍＴＯＲシグナル伝達経路の１つ又は複数の構成成分、並びにこの経路と相互接続した遺伝子及びそれらのコードする生成物の活性化状態を評価することに基づいて癌を治療するための、組合せ及び方法を提供する。本発明の診断アッセイは、少数のタンパク質のリン酸化状態の判定しか必要としないので、アッセイは実施しやすく、複雑なコンピュータベースの分析を必要としない。
【０００５】
本発明は、例えば、化学療法剤に対する対象の反応及び／若しくは対象の予後を予測するため、並びに／又はそれを必要とする対象において癌を治療するための方法であって、
対象由来の癌組織又は癌細胞試料において、ベースライン値と比較して、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分及び／又は相互接続したポリペプチド経路の少なくとも１つの構成成分のリン酸化状態を測定すること
を含み、
ベースライン値と比較して上昇したレベルのリン酸化状態は、対象が化学療法剤に対して非応答者であること及び／又は予後不良であることを示す方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本明細書中で使用される場合、「治療剤に対する反応」は、本明細書中の他所に挙げられているもの等の、従来の化学療法剤に対する反応をいう。この用語は、本明細書中に記載されている新しいクラスの癌阻害剤、すなわちｍＴＯＲ経路の阻害剤、又は本明細書中で考察されている相互接続した経路の１つの阻害剤に対する反応は含まない。
【０００７】
「対象」は、本明細書中で使用される場合、癌を有する任意の動物を含む。適した対象（患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、又はモルモット等）、農業動物、及び家畜又はペット（ネコ又はイヌ等）が挙げられる。非ヒト霊長類、及び好ましくはヒト患者が含まれる。
【０００８】
タンパク質の「リン酸化状態」は、タンパク質のリン酸化の程度（総量）をいう。これは、リン酸化された、タンパク質の部位（例えば、適したＳｅｒ、Ｔｈｒ又はＴｙｒアミノ酸残基）の数、及びアミノ酸鎖上の任意の所与の受容部位でのリン酸化のレベルの両方を含む。
【０００９】
「ベースライン値」は、本明細書中で使用される場合、正常な非癌性の又は無刺激の対象における、同じタンパク質のリン酸化のレベルをいう。タンパク質のリン酸化の量の増大は、リン酸化された、タンパク質の適したアミノ酸残基（例えば、セリン、スレオニン又はチロシン）の数の増大、又は特定のアミノ酸残基でのリン酸化の増大した頻度のいずれかを反映することができる。例えば、ベースライン値は、参照基準を含み、ここで予め定められた閾値（又は値の範囲）によって、測定されたリン酸化タンパク質の量又はタンパク質のリン酸化の状態が「正常な」値より上であるかどうかが判定される。用語、閾値及びベースライン値は、本明細書中で互換的に使用される。リン酸化のレベルを判定する各タンパク質について、細胞中の全てのタンパク質、若しくはアクチン等の構成的に発現されるタンパク質（ハウスキーピング遺伝子由来）の量に対して、値を正規化するか、又は、リン酸化タンパク質の量を、その非リン酸化タンパク質の量と比較することができる。
【００１０】
「相互接続した（interconnected）」ポリペプチド経路は、Ａｋｔ経路、ＩＲＳ経路由来であってもよく、又は、ｐＲｂ等の別の相互接続したポリペプチド、Ａｋｔの基質（ＧＳＫ３等）、若しくはアポトーシスの調節因子（Ｂａｋ等）であってもよい。リン酸化状態は、言及した経路の１つの任意の個々の構成成分、又はその組合せから、測定することができる。例えば、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分を「Ａ」と、Ａｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分を「Ｂ」と、及びＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分を「Ｃ」とコードする場合、測定されるリン酸化状態は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、又はＡ＋Ｂ＋Ｃのものであってもよい。
【００１１】
経路の構成成分は、例えば、Ａｋｔ−キナーゼ、ｍＴＯＲ、４Ｅ−ＢＰ１／ＰＨＡＳ−１、ｐ７０ｓ６ｋ、ｅＩＦ−４Ｅ、若しくはｅＩＦ−４Ｇ、ＰＴＥＮ、ＰＤＫ１、ＧＳＫ３β、ＴＳＣ１／２、ＩＬＫ、Ｇａｂ１／２、ｐ２７Ｋｉｐ１、ＦＫＨＲ、ＦＫＨＲＬ、ｅＮＯＳ、ＡＳＫ１、ＢＡＤ、ｐＲＡＳ４０、１４−３−３、又はＣＨＫ１であってもよい。特定のリン酸化残基は、本明細書中の他所に示されている。別の実施形態において、阻害剤はＦＫＢ１２に結合する。
【００１２】
本発明の別の態様は、上述のように、治療方法である方法であり、さらにここで、経路の構成成分において、ベースライン値と比較してリン酸化状態の有意な増大が観察されない場合に、対象を、従来の化学療法の方法で治療する。
【００１３】
本発明の別の態様は、上述のように、治療方法である方法であり、さらにここで、経路の構成成分において、ベースライン値と比較して有意に増大したリン酸化の量が観察された場合に、ｍＴＯＲ経路又は相互接続したポリペプチド経路の阻害剤を対象に投与する。
【００１４】
「有意な」増大は、本明細書中で使用される場合、一般に確率変数による変化の５％未満の確率の確率値を用いた、適切で当該分野で周知な統計的方法を用いて、統計的に有意な変化を意味する。本明細書中では、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」で示される単数形は、文脈によって明らかに別途指示されない限りは、指示対象語が複数形である場合も包含する。例えば、試験される経路の「ａ」構成成分（”a” member of the tested pathway）は、上記のように、経路の２、３、４、５個又はそれ以上の構成成分を含む。同様に、経路の「ａｎ」阻害剤（”an” inhibitor of the pathway）は、複数の阻害剤を含む。
【００１５】
本発明の実施形態において、従来の化学療法剤を、阻害剤と組み合わせて対象に投与してもよい。従来の化学療法剤は、ｍＴＯＲ若しくは相互接続した経路の構成成分の阻害剤とともに（同時に）投与してもよく、又は、ｍＴＯＲ／相互接続した経路の阻害剤を投与した後の適した時点で投与してもよい（例えば、リン酸化のレベルが「正常な」レベルまで減少した後）。
【００１６】
本発明の態様において、経路構成成分のリン酸化状態は、阻害剤の投与の後測定され、及び／又は投与する阻害剤の量は、経路構成成分のリン酸化の量を減少させるのに有効なものである。
【００１７】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象において、化学療法剤で癌を治療する方法において、改良が、治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中のｍＴＯＲ経路又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分において増大したリン酸化が測定された場合に、ｍＴＯＲ経路又は相互接続したポリペプチド経路の阻害剤を投与することを含む方法である。
【００１８】
本発明の別の態様は、治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中のｍＴＯＲ経路又は相互接続したポリペプチド経路の構成成分において増大したリン酸化が測定された場合に、ｍＴＯＲ経路又は相互接続したポリペプチド経路の阻害剤を投与することを含む、化学療法剤に耐性又は抵抗性のある癌を治療する方法である。
【００１９】
本発明の治療方法において、リン酸化は、化学療法の前に測定してもよく、治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中の経路の構成成分において増大したリン酸化が測定される場合、阻害剤を、癌を治療するための治療剤と組み合わせて投与する。本発明の治療方法において、経路構成成分のリン酸化は、例えばＰＩ３−キナーゼ、Ａｋｔ−キナーゼ、ｍＴＯＲ、４Ｅ−ＢＰ１／ＰＨＡＳ−１、ｐ７０ｓ６ｋ、ｅＩＦ−４Ｅ、及びｅＩＦ−４Ｇから選択される少なくとも１つの構成成分のリン酸化部位に対する抗体を用いて測定してもよい。癌は、例えば、乳癌、横紋筋肉腫、又は肺癌（非小細胞肺癌等）であってもよい。本発明の実施形態において、試料は、転移細胞を含み、並びに／又は、ＰＴＥＮの機能喪失並びに／若しくは変異及び活性化Ａｋｔと関連しない。
【００２０】
本発明の別の態様は、治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中のＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路（又は相互接続した遺伝子及びそれらのコードするポリペプチド）の少なくとも１つの構成成分の量又はリン酸化状態の変化を測定して、それによって、上昇したレベルによって対象が化学療法剤に対する非応答者であること及び／又は予後不良であることが示されること含む、化学療法剤に対する対象の反応及び／又は対象の予後を予測する方法である。
【００２１】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象において、化学療法剤で横紋筋肉腫を治療する方法において、改良が治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中の４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６、ｅＩＦ−４Ｇ  ｓｅｒ１１０８、及び／又はｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９で増大したリン酸化が測定される場合、ＣＣＩ−７７９を投与することを含む方法である。
【００２２】
本発明の別の態様は、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分、Ａｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分、及び／若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分、又はその組合せのリン酸化状態を検出するための１つ又は複数の薬剤を含む、化学療法剤に対する対象の反応及び／又は対象の予後を予測するためのキットである。薬剤は、例えば、タンパク質のリン酸化形態に特異的な抗体であってもよい。キットは、当該分野で既知の、標識又は無標識方法に適した薬剤を含んで、質量分析又は電気泳動移動度を用いてリン酸化部位を測定してもよい。
【００２３】
本発明の別の態様は、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＡｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、又はその組合せを含む、それを必要とする対象を治療するための、医薬組成物又はキットである。医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。医薬組成物又はキットは、本発明の阻害剤と併用して投与することができる化学療法剤をさらに含んでもよい。
【００２４】
本発明の別の態様は、ｍＴＯＲ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＡｋｔ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、及び／若しくはＩＲＳ経路の少なくとも１つの構成成分の阻害剤、又はその組合せを含む、化学療法剤に耐性又は抵抗性のある癌の患者を治療するための、医薬組成物又はキットである。医薬組成物又はキットは、阻害剤と併用して、又は連続して投与されてもよい化学療法剤を、さらに含んでもよい。
【００２５】
ｍＴＯＲシグナル伝達経路は、そのシグナル伝達カスケードに関与する任意の構成成分又は成分を含む。これらのものとしては、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ，mammalian target of rapamycin；ＦＲＡＰ、ＲＡＦＴ１、又はＲＡＰＴ１としても知られる）、ｍＴＯＲの調節性結合タンパク質（ＲＡＰＴＯＲ，regulatory associated protein of mTOR）、４Ｅ−ＢＰ１／ＰＨＡＳ−１、ｐ７０ｓ６ｋ、結束性硬化症複合体（ＴＳＣ，tuberous sclerosis complex）、４Ｅ−ＢＰ１／ＰＨＡＳ−１、ｐ７０ｓ６ｋ、ｅＩＦ−４Ｅ、ｅＩＦ−４Ｇ、及び／又はｅＩＦ４Ｅ複合体が挙げられるが、これらに限定されない。ｍＴＯＲ経路と相互接続（相互作用）した遺伝子（又はそれらのコードする生成物）としては、Ａｋｔ経路の構成成分［例えば、Ａｋｔ、ＰＩ３−キナーゼ、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ，phosphatase and tensin homolog）及びＦＫＢＰ１２］、ＩＲＳ経路の構成成分［例えばＩＲＳ−１、並びにＩＧＦ−Ｒ１、ＩＧＦ−Ｒβ、及びＩＧＦ−Ｒαを含むインスリン増殖因子（ＩＧＦ，insulin growth factor）受容体］、及び他の相互に関連のある経路の構成成分［例えば、網膜芽細胞腫タンパク質（腫瘍抑制因子、ｐＲｂ，retinoblastoma protein）、ＧＳＫ３等のＡｋｔの基質、及びＢａｋ等のアポトーシスの調節因子］が挙げられるが、これらに限定されない。ｍＴＯＲ経路の構成成分と相互作用するポリペプチドを含むこれらの経路は、本明細書中で時々、集合的に「ｍＴＯＲ又は相互接続したポリペプチド経路」と呼ばれる。
【００２６】
高リン酸化（例えば、通常より多い）された、リン酸化された位置である好ましい活性化された構成成分としては、例えば、４Ｅ−ＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６、ｅＩＦ−４Ｅ  ｓｅｒ１１０８、ＡＫＴ  ｓｅｒ４７３、ｐ７０ｓ６ｋ  Ｔｈｒ３８９等が挙げられる。本発明に従って、これらのうち１つ又は複数を用いることができる。
【００２７】
上述の遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列は周知であり、常法で決定、並びに種々の知られているデータベースからダウンロードすることができる。例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００２８】
ｍＴＯＲ又は相互接続したシグナル経路の活性化は、任意の適した方法、例えば、リン酸化タンパク質全体又はタンパク質のリン酸化の程度の測定を可能にする方法を用いて、測定することができる。多くの型の適したアッセイに、比色アッセイ、イムノアッセイ（免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ等）、蛍光読み取りに基づくアッセイ、サスペンションビーズアッセイ等がある。例えば、逆相タンパク質マイクロアレイ（ＲＰＭＡ，reverse phase protein microarrays）を用いて、タンパク質測定（例えば、リン酸化タンパク質の測定）を行うことができる。例えば、Nishizuka et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 14229-14239を参照のこと。かかるアッセイにおける使用に適した抗体は市販されており、又は、常法で調製することができ、ポリペプチドのリン酸化及び非リン酸化形態に対する抗体を含む。（キナーゼ基質のリン酸化アイソフォームを特異的に認識するよう開発された抗体が、特に有用である。）また、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫沈降、及び質量分析、並びに他の従来のアッセイを用いて、例えばｍＴＯＲシグナル経路構成成分のリン酸化のレベル及び／又は程度を評価することができる。適した方法としては、非常に小さい試料（例えば約２００個の細胞）中のリン酸化タンパク質を検出することができるものが挙げられる。或いは、大きい試料サイズ（例えば約２００００〜２５０００個の細胞）に適した方法を用いることができる。
【００２９】
増大したリン酸化タンパク質の総量、又はリン酸化の程度が、対象から得られた癌試料中のｍＴＯＲ経路（又は相互接続した経路）の少なくとも１つの構成成分において観察された場合に、ｍＴＯＲ阻害剤（又は相互接続した経路の阻害剤）を投与することができる。
【００３０】
全タンパク質又はリン酸化タンパク質の増大した量は、常法で判定することができる。例えば、予め定められた閾値（又は値の範囲）によって、測定されたタンパク質の量が「正常」値より高いかどうかが判定される、参照基準を用いることができる。かかる閾値は、時々、本明細書中で、ベースライン値と呼ばれる。また、量は、強度によって判定することができ、ここでスコアリング強度を用いて、対象のＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路が活性化されているかどうかが判定される。（例えば、５が最高で、３を超える強度によって経路活性化が示される、１〜５のスコアリングシステムを用いて）。
【００３１】
本発明の態様は、化学療法剤に対する対象の反応及び／又は予後を予測するための予測及び／又は診断として利用することができる。かかる方法は、治療された対象由来の癌組織又は癌細胞試料中のｍＴＯＲ及び／又は相互接続した経路の少なくとも１つの構成成分の量及び／又はリン酸化状態の変化を測定して、それによって、上昇したレベルにより対象が癌を治療するために典型的に使用される化学療法剤に対する非応答者であること及び／又は予後不良であることが示されることを、含むことができる。
【００３２】
Ａｋｔ／ｍＴＯＲ阻害剤としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ，phosphatidylinositol-3-kinase）阻害剤の例としては、例えば、
セレコキシブ、並びにＯＳＵ−０３０１２及びＯＳＵ−０３０１３等のその類似体（例えば、Zhu et al. (2004) Cancer Res. 64(12): 4309-18）、
ＰＸ−３１６等の、３−デオキシ−Ｄ−ミオ−イノシトール類似体（例えば、米国出願第２００４０１９２７７０号、Meuillet et al. (2004) Oncol. Res. 14, 513-27, 2004)、
２’−置換，３’−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール類似体（例えば、Tabellini et al. (2004) Br. J. Haematol. 126(4), 574-82）、
融合ヘテロアリール誘導体（米国特許第６６０８０５６号）、
３−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体（例えば、米国特許第６４０３５８８号及び第６６５３３２０号）、
Ｌｙ２９４００２（例えば、Vlahos et al. (1994) J. Biol., Chem. 269(7), 5241-5248）、
ＩＣ４８６０６８等の、キナゾリン−４−オン誘導体（例えば、米国出願第２００２０１６１０１４号、Geng et al. (2004) Cancer Res. 64, 4893-99）、
３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体（例えば、国際公開第０４  １０８７１５号、また、国際公開第０４  １０８７１３号）、
ＰＸ−８６６（酢酸（１Ｓ，４Ｅ，１０Ｒ，１１Ｒ，１３Ｓ，１４Ｒ）−［４−ジアリルアミノメチレン−６−ヒドロキシ−１−メトキシメチル−１０，１３−ジメチル−３，７，１７−トリオキソ−１，３，４，７，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−２−オキサ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１１−イルエステル）等の半合成ビリジンを含む、ビリジン（例えば、Ihle et al. (2004) Mol Cancer Ther. 3(7), 763-72、米国出願第２００２００３７２７６号、米国特許第５７２６１６７号）、並びに
ワートマンニン及びその誘導体（例えば、米国特許第５５０４１０３号、第５４８０９０６号、第５４６８７７３号、第５４４１９４７号、第５３７８７２５号、第３６６８２２２号）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
Ａｋｔ−キナーゼ（タンパク質キナーゼＢとしても知られる）阻害剤の例としては、例えば、
Ａｋｔ−１−１（Ａｋｔ１を阻害する）（Barnett et al. (2005) Biochem. J., 385 (Pt. 2), 399-408）、
Ａｋｔ−１−１，２（Ａｋ１及び２を阻害する）（Barnett et al. (2005) Biochem. J. 385 (Pt. 2), 399-408）、
ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ（例えば、Jin et al. (2004) Br. J. Cancer 91, 1808-12）、
１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニル化合物（例えば、国際公開第０５０１１７００号）、
インドール−３−カルビノール及びその誘導体（例えば、米国特許第６６５６９６３号、Sarkar and Li (2004) J Nutr. 134(12 Suppl), 3493S-3498S）、
ペリホシン（例えば、Ａｋｔ膜局在化を妨げる；Dasmahapatra et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10(15), 5242-52, 2004）、
ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体（例えば、Gills and Dennis (2004) Expert. Opin. Investig. Drugs 13, 787-97）、
トリシリビン（ＴＣＮ又はＡＰＩ−２又はＮＣＩ識別子：ＮＳＣ  １５４０２０、Yang et al. (2004) Cancer Res. 64, 4394-9）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
ｍＴＯＲ阻害剤の例としては、例えば、
ＦＫＢＰ１２エンハンサー、
ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス）、ＲＡＤ００１（エベロリムス、国際公開第９４０９０１０号）及びＡＰ２３５７３；例えば国際公開第９８／０２４４１号及び国際公開第０１／１４３８７号に開示されているようなラパログ、例えばＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、又はＡＰ２３８４１；４０−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ（ヒドロキシメチル）メチルプロパノエート］−ラパマイシン（ＣＣ１７７９とも呼ばれる）、４０−エピ−（テトラゾリト）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも呼ばれる）、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンチニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシン、及び国際公開第０５００５４３４号に開示されている他の誘導体；米国特許第５２５８３８９号、国際公開第９４／０９０１０１号、国際公開第９２／０５１７９号、米国特許第５１１８６７７号、米国特許第５１１８６７８号、米国特許第５１００８８３号、米国特許第５１５１４１３号、米国特許第５１２０８４２号、国際公開第９３／１１１１３０号、国際公開第９４／０２１３６号、国際公開第９４／０２４８５号、国際公開第９５／１４０２３号、国際公開第９４／０２１３６号、国際公開第９５／１６６９１号、国際公開第９６／４１８０７号、国際公開第９６／４１８０７号及び米国特許第５２５６７９０号に開示されている誘導体を含む、ラパマイシン及びその誘導体、
リン含有ラパマイシン誘導体（例えば、国際公開第０５０１６２５２号）、
４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体（例えば、米国仮出願第６０／５２８３４０号）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
ＩＲＳ経路阻害剤の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。中和抗体、アンタゴニストペプチド、又は選択的キナーゼ阻害剤ＮＶＰ−ＡＤＷ７４２での特異的ＩＧＦ−１Ｒ阻害は、多様な腫瘍細胞型に対する活性を有することが実証されている。プロテアソーム阻害剤、ＭＧ１３２及びラクタシスチンは、ＩＲＳ−１リン酸化を阻害する。プロテアソーム阻害剤は、グルコース輸送につながる、ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化及び下流のインスリンシグナル経路を制御することができる。誘導性一酸化窒素合成酵素、ｉＮＯＳ及びＮＯドナーは、ＩＲＳ分解を誘導する。ＩＲＳ−１のセリンリン酸化は、κＢキナーゼ複合体の阻害剤によって制御される。タプシガルジンはＩＲＳ−１を下方制御する。ＰＫＣ経路及びＡｋｔ阻害剤としては、カルフォスチンＣ、スタウロスポリン、及びＬＹ２９４００２が挙げられる。ＳＴＩ５７１は、本発明の経路に関連するｃＫｉｔ経路のさらなる阻害剤である。
【００３７】
前臨床又は臨床使用における化合物の例としては、例えば、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３８４１、ＣＣＩ−７７９、及びＲＡＤ００１が挙げられる。
【００３８】
その原因である機序に無関係に、本発明に従って、任意の腫瘍又は癌を治療することができる。これは、例えば、結腸、膵臓、乳房、前立腺、骨、肝臓、腎臓、肺、精巣、皮膚、膵臓、胃、前立腺、卵巣、子宮、頭頸部、血液細胞、リンパ等を含むがこれらに限定されない、任意の臓器の腫瘍又は癌を含む。
【００３９】
本発明に従って治療することができる癌としては、脳腫瘍、乳癌、骨肉腫（ｂｏｎｅ  ｓａｒｃｏｍａ）（例えば、骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）及びユーイング肉腫）、気管支の前悪性状態、子宮内膜癌、神経膠芽腫、造血器腫瘍、肝細胞癌、ホジキン病、腎臓腫瘍、白血病、レイミオサルコーマ、脂肪肉腫、リンパ腫、レルミット−ダクロス病、悪性神経膠腫、メラノーマ、悪性黒色腫、転移、多発性骨髄腫、骨髄異形成、骨髄芽細胞症候群、非小細胞肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌（例えば、進行性、進行性難治性）、横紋筋肉腫、軟部肉腫、皮膚の扁平上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない、
【００４０】
乳癌の例としては、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管癌、及び非浸潤性小葉癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
気道の癌の例としては、小細胞癌、非小細胞肺癌、気管支腺腫、及び胸膜肺芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
脳癌の例としては、脳幹及びハイポフタルミックグリオーマ、小脳及び大脳星細胞腫、髄芽腫、上衣腫、並びに神経外胚葉性及び松果体腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
男性生殖器の腫瘍としては、前立腺及び精巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。女性生殖器の腫瘍としては、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣、及び外陰部癌、並びに子宮の肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
消化管の腫瘍としては、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸、及び唾液腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
尿路の腫瘍としては、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、及び尿路癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
眼癌の例としては、眼球内黒色腫及び網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
肝臓癌の例としては、肝細胞癌（線維層板状変異体を有する、又は有さない肝臓細胞癌）、胆管癌（肝内胆管癌）、及び混合型肝細胞胆管癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
皮膚癌としては、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌、及び非メラノーマ性皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
頭頸部癌としては、咽頭、下咽頭、鼻咽頭、及び／又は中咽頭癌、並びに口唇及び口腔癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
リンパ腫としては、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、及び中枢神経系のリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
肉腫としては、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫、及び横紋筋肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、及び毛様細胞性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
例えば、ＰＴＥＮの機能喪失;変異及び活性化Ａｋｔ（例えば、ＰＴＥＮ欠損腫瘍及びｒａｓ変異を有する腫瘍）；又は癌の原因である主要な原因遺伝子又はポリペプチドとして同定された、ｍＴＯＲ若しくは相互接続した阻害剤経路における他の変異と関連する癌などは、また、本発明から除外することができる。
【００５４】
治療方法は、
Ａ：腫瘍試料中のｍＴＯＲシグナル経路の活性化状態及び／又は他のシグナル経路との相互接続の測定。活性化は、上流及び下流のシグナルの正及び負の調節を制御する経路構成成分のリン酸化（及び／又は総量）によって評価することができる。Ｂ：シグナル経路活性化パターンに基づいて、独立型の治療として、又はネオアジュバント療法或いは併用療法プロトコルにおいて使用される治療としての経路の活性化をブロックするための治療の投与を含むことができる。
【００５５】
本発明の一態様は、ｍＴＯＲ経路のリン酸化タンパク質構成成分を採用する、癌についての診断又は予測試験である。分析物例は、本明細書中の他所で考察されている。実施例に示されるように、ｍＴＯＲ経路又は相互接続した経路の活性化によって、現在の標準治療で治療された肺、乳房及び横紋筋肉腫患者における結果を予測することができることが発見された。例えば、タンパク質、ｍＴＯＲ、４ＥＢＰ１、Ｅ１Ｆ４Ｇ、Ｅ１Ｆ４Ｅ、及びｐ７０Ｓ６は、それらのリン酸化状態において、結果と相関することがある。他の経路の活性化はそれほど相関することが観察されていない。簡潔に言えば、活性化されたｍＴＯＲ経路を有する患者は、ｍＴＯＲの下流の基質のリン酸化レベルによって証明されるように、より短い生存、無病生存期間、又はｍＴＯＲ活性化を有さない患者と比較した治療の成功の他の尺度を有する。この標準治療としては、手術、化学療法及びエストロゲン受容体療法（乳房）が挙げられよう。これらの腫瘍型は、種々の微小環境から生じる、分散した病理学的系譜を表すので、この発見が、癌として：結腸直腸、前立腺、卵巣（ｏｖａｒｉａｎ）、乳房、肺、卵巣（ｏｖａｒｙ）、脳、甲状腺、腎臓並びに肉腫：線維肉腫、血管肉腫、及びメラノーマ等を含む、他の腫瘍型又はそれに由来する腫瘍幹細胞に有用であると予測することができる。
【００５６】
本発明の態様はまた、化学療法治療に耐性又は抵抗性になった、癌を有する対象を治療することを含む。後者によって、以前は少なくとも１つの化学療法剤での治療に反応していた患者が、薬剤に曝露された後、それに続くかかる薬剤での治療の後に抗癌を示さないか、又はわずかしか示さない（例えば、腫瘍増殖の阻害がないか、又はわずかしかない等の、抗増殖性反応）ことが意味される。したがって、患者が化学療法剤でうまく治療されたが、それに続く治療によって情動が示されないか、又はわずかしか示されない後に、癌は、薬剤に耐性又は抵抗性があると述べることができる。方法は、かかる患者を同定すること、及び、次いでそれらが上昇したｍＴＯＲ経路活性化を有するかどうかを判定することを含む。この集団は、治療されたｍＴＯＲ阻害剤（又は下流、上流、若しくは下流及び上流の両方の、相互接続した経路の阻害剤）であってもよい。
【００５７】
本発明の一実施形態において、対象は、ｍＴＯＲ又は相互接続した経路における特定の結節点を標的とした１つ又は複数の阻害剤（例えば、ｍＴＯＲ又はＡＫＴ特異的阻害剤）で治療される。別の実施形態において、阻害剤の組合せを用いて、経路における複数の結節点を阻害する。これによって、時に、より低い毒性で、より低用量の阻害剤を投与することが可能になり、経路に沿った複数の点が破棄される。かかる手法は、例えば、いくつかのタンパク質が増大したリン酸化を示す場合に、有用である場合がある。
【００５８】
患者が抵抗性になる又は耐性を獲得することがある化学療法剤の例としては、例えば、例えばアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、アジリジン、エポキシド、スルホン酸アルキル）、シスプラチン及びその類似体（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン）、トポイソメラーゼ相互作用剤（例えば、カンプトテシン、イリノラカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビノレルビン等のビンカアルカロイド、パクリタキセル及びドセタキセル等のタキサン）、インターフェロン、インターロイキン−２、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、モノクローナル抗体、エストロゲン調節因子（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン）、メゲストロール、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、オクトレオチド）、オクトレオチド、抗アンドロゲン薬（例えば、フルタミド、カソデックス）、キナーゼ及びチロシン阻害剤（例えば、イマチニブ（ＳＴＩ５７１又はGleevac）、ゲフィチニブ（Iressa）、及びエルロチニブ（Tarceva）等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Cancer: Principles and Practice of Oncology, 7th Edition, Devita et al, Lippincott Williams & Wilkins, 2005, Chapters 15, 16, 17, and 63を参照のこと。
【００５９】
本発明者らは、異なる作用機序を有する種々の化学療法剤に耐性（抵抗性）のある対象は全て、ｍＴＯＲ又は相互接続した経路の活性化を示すことを見出した。したがって、これらの経路の１つ又は複数の活性化を、本明細書中で例示されるもの以外の種々の化学療法剤に耐性のある癌に適用することを期待することができよう。
【００６０】
実施例から、動物異種移植モデルにおいて、ｍＴＯＲ阻害剤の投与によって、対照と比較して、ｍＴＯＲ経路内のタンパク質の下流のリン酸化が抑制され、２つの異なるＲＭＳ系の増殖速度が大いに減少したことが示される。このことは、ｍＴＯＲ阻害剤、及び相互接続した遺伝子／タンパク質の阻害剤の、治療上の有用性を支持する。
【００６１】
したがって、本発明は、予後のサイン並びに新しい薬物標的の両方である。これは、ここで、「テラノスティック」と呼ばれ、ここで測定された分析物は、診断並びに治療標的の両方として機能する。これの現在の例はｅ−ｅｒｂＢ２である。このタンパク質は、ＥＧＦ受容体ファミリーの構成成分であり、予後不良である患者についての診断エンドポイントとして、乳癌患者において測定されるが、それ自体、HERCEPTINの薬物標的である。したがって、治療を階層化し、標的化する働きをする。
【００６２】
ｍＴＯＲ（又は相互接続した）経路の活性化に特異的に関連した以下のエンドポイントについて、生検又は他の組織若しくは細胞試料（血液試料、及び転移部位由来の試料を含む）を分析することができる：
全ｍＴＯＲ
全４ＥＢＰ１
全ＥＩＦ４Ｇ
全Ｅ１Ｆ４Ｅ
全ｐ７０Ｓ６
リン酸化ｐＡＫＴ
リン酸化ｍＴＯＲ
リン酸化４ＥＢＰ１
リン酸化ＥＩＦ４Ｇ
リン酸化Ｅ１Ｆ４Ｅ
リン酸化ｐ７０Ｓ６
【００６３】
これらの特定のエンドポイント、又は他の経路構成成分の強度値の組合せを用いて、施された標準治療に対する患者、又は、限定されないがＣＣＩ−７７９、ラパマイシン阻害剤等のｍＴＯＲ阻害剤（及び／又は相互接続した経路の阻害剤）の投与計画を受ける患者を、階層化することができる。
【００６４】
言及されたタンパク質は、それらの非リン酸化及びリン酸化状態において、作用機序に無関係に、本発明に従って使用することができる。したがって、機序はｍＴＯＲ経路によると考えられているが、本発明は、テラノスティック、治療、及び／又は予測方法が成功を獲得するいかなる機序にも拘束されない。
【００６５】
本明細書中で考察される阻害剤は、種々の組成物、例えば治療処置方法における使用のための医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物を、キットとして集合させることができる。一般に、本発明の医薬組成物は、抗癌有効量の阻害剤を含む。「抗癌有効量」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも、相応な時間枠にわたって個体において治療反応を生じさせるのに十分な量である。例えば、これは、少なくとも検出可能な程度まで、癌の症状を寛解させるか、又は腫瘍の増殖を阻害すること等ができる。
【００６６】
組成物は、薬学的に許容される担体等の担体を含んでもよい。「薬学的に許容される」によって、生物学的でなく、又はそうでなければ望ましくない物質が意味され、すなわち、物質は、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすこと、又はそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく、対象に投与されることができる。担体は、当然、当業者に周知なように、対象において、活性成分の任意の分解を最小限にするよう、及び任意の有害な副作用を最小限にするよう、選択されよう。薬学的に許容される担体、及び医薬組成物中の他の成分の考察については、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990を参照のこと。
【００６７】
本発明の医薬組成物又はキットは、ｍＴＯＲ又は相互接続した経路の構成成分の阻害剤（複数可）に加えて、他の医薬品（化学療法剤等）を含んでもよい。患者の治療の間、同時に、又は連続してのいずれかで、任意の適した時に他の化学療法剤（複数可）を投与してもよい。例えば、一実施形態において、他の化学療法剤（複数可）は、本発明の阻害剤での治療によって対象におけるｍＴＯＲ経路の活性化が有意に減少した後に投与される。別の実施形態において、他の化学療法剤は、ｍＴＯＲ等の阻害剤と同じ時に（同時に）投与される。一実施形態において、他の化学療法剤は、対象が抵抗性になるか耐性を獲得する場合がある、上記の薬剤の１つである。別の実施形態において、その代表的な例が表２中に挙げられている、他の化学療法剤を使用することができる。
【００６８】
当業者は、特定の製剤が、部分的に、本発明の特定の阻害剤、又は採用される他の化学療法剤、及び選択される投与の経路に依存することを、認識するであろう。したがって、本発明の組成物の、多種多様な適した製剤がある。
【００６９】
【表１】
2009511935.tif 000002
【００７０】
経口投与に適した製剤は、水、食塩水、又は果汁等の希釈剤中に溶解した有効量の薬剤等の溶液；それぞれが固体、顆粒又は凍結乾燥セルとして、予め定められた量の活性成分を含むカプセル剤、小袋又は錠剤；水性液体中の溶液又は懸濁液；及び水中油型乳濁液又は油中水型乳濁液からなってもよい。錠剤形状は、１つ又は複数のラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味料、並びに薬学的に許容される担体を含んでもよい。経口送達に適した製剤はまた、合成及び天然の重合体ミクロスフェア、又は他の手段に組み込まれて、胃腸管内の分解から本発明の薬剤を保護してもよい。
【００７１】
非経口投与（例えば、静脈内）に適した製剤としては、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、及び製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含んでもよい、水性及び非水性の、等張な無菌注射溶液、並びに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含んでもよい水性及び非水性の無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプル又はバイアル等の、単位用量又は複数用量の密封された容器中で提供されてもよく、使用の直前に、注射のための無菌の液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。これまでに記載されている種類の無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から、即席の注射溶液及び懸濁液を調製することができる。
【００７２】
本発明の阻害剤は、単独で、又は他の化学療法剤と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の、加圧された許容される噴霧剤中に配置することができる。
【００７３】
本発明の阻害剤は、単独で、又は他の化学療法剤と組み合わせて、経皮的な適用及び吸収のための適した製剤にすることができる（Wallace et al., 1993, supra）。経皮エレクトロポレーション又はイオン導入を用いて、皮膚を通して本発明の薬剤及び／又は医薬組成物の全身送達を促進及び／又は制御することもできる（例えば、Theiss et al. (1991), Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 13, 353-359参照）。
【００７４】
局所投与に適している製剤としては、香味料、通常はショ糖及びアカシア若しくはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ、ゼラチン若しくはグリセリン等の不活性な基剤、若しくはショ糖及びアカシア中に活性成分を含む香錠、適した液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄薬、又はクリーム、乳濁液、懸濁液、溶液、ゲル、クリーム、ペースト、気泡、潤滑剤、噴霧剤、坐剤等が挙げられる。
【００７５】
当業者は、すくにでも特定の用途に基づいて、適した、又は適切な製剤を選択、適応又は開発することができることを理解するであろう。
【００７６】
本発明の阻害剤の投薬量は、錠剤又はカプセル剤等の単位投薬形態であってもよい。用語「単位投薬形態」は、本明細書中で使用される場合、ヒト及び動物対象の単位投薬量として適した物理的に別々の単位をいい各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は媒体と関連して所望の効果を生じるのに十分な量で計算して、単独で、又は他の化学療法剤と組み合わせて、予め定められた量の本発明の阻害剤を含む。
【００７７】
当業者は、個々の患者において、所望の抗癌有効量又は薬剤の有効濃度を達成するために、使用される組成物の正確な製剤についての、適切な用量、スケジュール、及び投与の方法を、容易に判定することができる。当業者はまた、適切な患者試料（例えば、血液及び／又は組織）の直接又は間接分析によって、本発明の化合物の「有効濃度」の適切な指標を容易に判定及び使用することができる。
【００７８】
動物、特にヒトに投与される、本発明の阻害剤、又はその組成物の用量は、本発明の文脈において、相応な時間枠にわたって、個体において少なくとも治療反応を生じるのに十分であるべきである（抗癌有効量）。用量の正確な量は、対象の種、年齢、体重及び全身状態、治療される任意の障害の重症度又は機序、使用される特定の薬剤又は媒体、その投与の様式等に応じて、患者によって変化する。インビボの所望の抗癌濃度を達成するのに使用される用量は、採用される特定の阻害剤の作用強度、宿主において薬剤と関連する薬力学、感染した個体の疾患状態の重症度、並びに、全身投与の場合、個体の体重及び年齢によって、判定される。用量のサイズはまた、採用される特定の阻害剤、又はその組成物が伴うことがある任意の有害な副作用の存在によって判定される。一般に、可能ならいつでも、有害な副作用を最小限に維持することが望ましい。
【００７９】
併用療法において投与される場合、他の化学療法剤は、例えば、阻害剤と同じ時に投与してもよく、又は、投薬は、所望によりずらしてもよい。２つの薬物はまた、組成物中で組み合わされてもよい。それぞれの用量は、組合せで使用される場合、それぞれが単独で使用される場合よりも少なくてもよい。
【００８０】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で開示されている方法のいずれかに有用なキットである。かかるキットは、本明細書中で（例えば、診断又は治療方法について）考察されている１つ又は複数の阻害剤を含む。例えば、対象における癌の治療処置に適したキットは、薬学的に許容される担体、及び容器又は包装材料をさらに含んでもよい。その他の使用としては、本発明のキットは、実験用途にあってもよい。当業者は、本発明の方法のいずれかを行うのに適したキットの成分を認識するであろう。
【００８１】
キットは、方法を行うための使用説明書を含んでもよい。本発明のキットの任意の要素としては、適したバッファー、薬学的に許容される担体等、容器、又は包装材料が挙げられる。キットの試薬は、その中で試薬が安定である容器中に、例えば凍結乾燥形態又は安定化された液体で、あってもよい。試薬はまた、１回使用形態、例えば単一剤形であってもよい。
【００８２】
上記、及び以下の実施例において、全ての温度は、訂正されていない摂氏温度で示され、別途指示しない限り、全ての部分及びパーセンテージは重量による。
［実施例］
【実施例１】
【００８３】
リン酸化経路マッピング：Ａｋｔ／ｍＴＯＲ活性化は、小児横紋筋肉腫生存と関連性がない。
Ａ．導入
横紋筋肉腫（ＲＭＳ、rhabdomyosarcoma）は、骨格筋特性を有する未分化な間葉系細胞から生じる。ＲＭＳは、小児において最も一般的な軟部肉腫であり、３つの組織学的サブタイプ、胞巣、胎児、及びボチロイドからなる。併用化学療法、並びに胞巣ＲＭＳにおける転位置ｔ（２；１３）（ｑ３５；ｑ１４）及びｔ（１；１３）（ｐ３６；ｑ１４）の分子の知識における最近の進歩にもかかわらず、小児横紋筋肉腫を有する全ての患者の全体的生存は、６０〜７０％の範囲にとどまっている。
【００８４】
ＲＭＳのための治療計画に関するいくつかの公開されている研究において、全体的な無病生存率は、わずか６７％であった。不幸にも、病期又は組織学的サブタイプにかかわらず、初期の治療が失敗する運命にある３３％の小児を同定する方法はない。一方、標準的治療に反応する６０〜７０％の小児は、非常によく反応し、これらの患者の大部分は、現在無病で生存している。結果として、急を要する臨床の目標は、３０〜４０％の非応答者ＲＭＳ対象と関連する機能的に重要な分子ネットワークを、このグループのための新しい治療計画を開発するために、同定することである。
【００８５】
Ｂ．材料及び方法
１．標本及び患者データ。全ての標本（ｎ＝５９）及び関連性のある臨床データを、適切なＩＲＢ承認を有するChildren's Oncology Groupからの群間横紋筋肉腫試験（ＩＲＳ、Intergroup Rhabdomyosarcoma Study）IV、Ｄ９５０２及びＤ９８０３試験から得た。
【００８６】
全ての標本を液体窒素中で瞬間凍結し、治療の前に獲得した。試料セットを、２つのグループ、１Ａ及び１Ｂで分析した（図１Ａ）。図１Ｂは、２つの試験セットについての生存特性を示す。最終的なデータ解析の前に、臨床生存転帰について、試料を匿名化及び盲検化した。試験セット１Ａを代表する試料（図１Ａ）は、横紋筋肉腫の病理学的診断を有する３３人の異なる患者についての、９つの瞬間凍結外科標本及び２９０個の凍結切片スライドからなった。ここで使用した全ての患者は、試験参加の前に、３期（腫瘍＜５ｃｍ又は領域リンパ節転移）疾患及びIII群腫瘍（治療後に残る肉眼的遺残病変）を有した。４６個の凍結切片試料及び臨床データのさらなるセットを、同じプロトコル由来の患者についてのＣＯＧによって提供した（図１Ａ、表１Ｂ）。治療の前に、病理学的診断を言い渡した。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションの前に、独立した有資格の病理学者によって、診断が検証された。組織学的サブタイプは、胞巣、胎児、ぶどう状肉腫及び混合形態型を表した。PixCell II（Molecular Devices社製、カリフォルニア州サニーベール）で、組織切片から純粋な腫瘍細胞集団を顕微解剖した。
【００８７】
２．逆相タンパク質マイクロアレイ。以前に公開された方法（例えば、Petricoin et al. (2005), J. Clin Oncol 23, 3614-3621、Liotta et al. (2003) Cancer Cell 3, 317-325、Sheehan et al. (2005) Mol Cell Proteomics 4, 346-365）によって生じた顕微解剖した細胞を溶解に供し、Sheehan et al. (2005), supraによって記載されているように、全細胞タンパク質溶解物で、逆相タンパク質マイクロアレイを２回印刷した。簡潔に言えば、５００μｍピンを備えたGMS 417アレイヤー（Affymetrix社製、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、溶解物を、ガラス支持ニトロセルロースアレイスライド（FAST Slides Whatman社製、ニュージャージー州フローハムパーク）上に印刷した。各溶解物を、滑らかな１：２、１：４、１：８、１：１６及び陰性対照希釈を表す希釈曲線中に印刷した。免疫染色の前に、乾燥剤（Drierite、W.A. Hammond社製、オハイオ州ジーニア）とともに−２０℃でスライドを保存した。
【００８８】
３．タンパク質マイクロアレイ免疫染色。製造業者の使用説明書によって、自動化スライド染色装置上で、免疫染色を行った（Autostainer CSAキット、Dako社製、カリフォルニア州カーピンテリア）。各スライドを、単一の一次抗体とともに、室温で３０分間インキュベートした。ポリクローナル一次抗体は、ＧＳＫ３α／β  Ｔｙｒ２７９／２１６（Invitrogen-Biosource社製、カリフォルニア州カールスバッド）、ＢＣＬ−２、ＨＩＦ−１α（BD社製、ニュージャージー州フランクリンレークス）、４ＥＢＰ１、ＦＫＨＲ  ｓｅｒ２５６、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅ  ｓｅｒ２０９、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｇ  ｓｅｒ１１０８、ＩＧＦＲ−β、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−１  ｓｅｒ６１２、ＳＧＫ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＡＤ、ＢＡＤ  ｓｅｒ１１２、ＢＡＤ  ｓｅｒ１３６、ＢＡＤ  ｓｅｒ１５５、Ｂ−Ｒａｆ、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ  ｓｅｒ２４４８、ｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、ｐ７０Ｓ６  ｓｅｒ３７１、Ｓ６キナーゼｓｅｒ２４０／２４４、Ａｋｔ、Ａｋｔ  ｓｅｒ４７３、Ａｋｔ  Ｔｈｒ３０８、４ＥＢＰ１  ｓｅｒ６５、４ＥＢＰ１  ｓｅｒ７０、及び４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６（Cell Signaling Technology社製、マサチューセッツ州ダンバーズ）であった。陰性対照スライドを、抗体希釈液とともにインキュベートした。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ抗体（１：５０００）（Vector Labs社製、カリフォルニア州バーリンゲーム）であった。
【００８９】
４．マイクロアレイ分析のためのバイオインフォマティクス法。各アレイをスキャンし、スポット強度を分析し、データを正規化及び標準化し、アレイ上の各試料について単一のデータ値を生じた（Image Quant v5.2、GE Healthcare社製、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。固定された領域にわたって、スポット強度を統合した。印刷されていない隣接するスライドバックグラウンドで、各スポットについて、局部バックグラウンド強度を計算した。これによって、アレイ上の他の全てのスポットとの比較のために、各試料について、単一のデータポイントが生じた。JMP v5.0（SaS Institute社製、ノースカロライナ州カリー）を用いて、二元配置階層的クラスター分析のためのウォード法を行った。ウィルコクソン２標本順位和検定を用いて、２つのグループの間で値を比較した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。可変因子の正規分布を仮定できなかった場合、ノンパラメトリック法を用いた。単変量生存分析のために、カプラン−メイヤー（ログランク）生存推定値を用いた。
【００９０】
５．インビボ異種移植腫瘍モデル。国立衛生研究所実験動物委員会のガイドラインに従って、動物試験を行った。雌の４〜６週齢のベージュＳＣＩＤマウスを、Charles River Laboratories社（マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入した。０．２ｍｌ希釈液（５％Tween-80、５％ポリエチレングリコール−４００（Sigma社製、ミズーリ州セントルイス））中のＲｈ３０胞巣又はＲＤ胎児細胞のいずれかの中コンフルエント培養物から収集した２００万個の生存細胞を、左後肢の腓腹筋に正所性に注射し、１週間後、マウスを対照（ｎ＝８）又はＣＣＩ−７７９処置群（ｎ＝８）にランダムに割り当てた。３日ごとに、連続した３０日間、２０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰのＣＣＩ−７７９（Developmental Therapeutics Program、National Cancer Institute and Wyeth、ニュージャージー州マディソン）又は媒体単独で、マウスをＩＰ処置した。３日ごとにノギスで腫瘍増殖を測定し、式Ｖ（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２によって腫瘍体積を計算し、式中、ａは最長の腫瘍軸であり、ｂは最短の腫瘍軸である。ＣＯ２での窒息によって、全てのマウスを屠殺し、腫瘍増殖の確認のために剖検を経た。腫瘍を切除し、分析まで−８０℃で瞬間凍結した。
【００９１】
Ｃ．有用なｍＴＯＲ経路の構成成分の同定
３４人の患者由来の腫瘍の試験セットを用いて、ｍＴＯＲ経路の構成成分を、３４個の標本のセットをほぼ完璧な精度で識別することができるとして、同定した。これらの所見を検証するために、転帰及び治療に対する反応によって異なった別々の盲検化した２６人の患者由来の腫瘍のセットを、複数のシグナル伝達事象を一度に分析する逆相タンパク質マイクロアレイ技術によって分析した。第一のセットにおいて、結果に基づいて患者を分離することができた特定のタンパク質はまた、第二の独立したセットを分離することもでき、下記の表３に示す。
【００９２】
【表２】
2009511935.tif 000003
2009511935.tif 000004
【００９３】
上位の実行できる予測の判断材料は、全てｍＴＯＲ経路に属する。
【００９４】
Ｄ．ＲＭＳ腫瘍セット１Ａの探索的データ分析
分析の前にレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ、Laser Capture Microdissection）による腫瘍細胞の濃縮を行って、非癌性細胞による混入なしに、分析のための細胞が癌細胞集団内に由来するのを確実にした（Petricoin et al. (2005), supra、Emmert-Buck et al. (1996) Science 274, 998-1001）。試験セット１Ａ（ｎ＝３３）については、１５個の特定のシグナル伝達タンパク質（図２Ａ）を、逆相タンパク質マイクロアレイ分析のために最初に選択した。１５のタンパク質エンドポイントの教師なし階層的クラスター分析から、２つの主要なクラスの腫瘍が明らかになった。１方のクラスターはＡｋｔ／ｍＴＯＲ活性化／リン酸化を有し、他方は比較的低いレベルのシグナル伝達を有する（図２Ａ）。ＣＯＧから臨床転帰データを得た後、年齢、性別、原発部位、組織学、浸潤及びリンパ節転移の患者特性に基づいたフィッシャーの直接確率検定によって、これらの２つのクラスターを比較した（図２Ｂ）。ｐ＜０．０５の統計的有意性に達した特性はなかったが、傍髄膜（ＰＭ、parameningeal）頭頸部原発部位腫瘍を有する患者は、６２％のクラスター１を含んだが、クラスター２は、ＰＭ原発部位腫瘍を有する２７％の患者を有した（フィッシャーの直接確率検定ｐ＝０．０６）。また、クラスター２は、７３％の胞巣腫瘍を含んだが、クラスター１は６２％の胎児腫瘍を有した（フィッシャーの直接確率検定ｐ＝０．０６）。典型的には、眼窩又は非傍髄膜部位由来の胎児ＲＭＳ腫瘍を有する患者は、最良の予後を有する。これらの２つのクラスターは、一般に許容される、ＲＭＳと関連した予後／臨床因子について、統計的に異ならなかった。
【００９５】
続けて、タンパク質被分析物値を、試験セット１ＡについてのＣＯＧによって提供された無病生存及び全生存臨床転帰データと関連付けた。臨床転帰データの後に現れた腫瘍の明確な分割が、ＣＯＧから得られた。全てＡｋｔ／ｍＴＯＲ経路の成分である３つのタンパク質−４ＥＢＰ１、リン酸化４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６及びｅＩＦ４Ｅの決定木解析によって、持続的完全寛解にある患者を、標準的治療で治療した後に再発及び死亡した患者と分割した。これらのエンドポイントのうち、４ＥＢＰ１及び４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６は、個々に、ウィルコクソン一元配置分析、４ＥＢＰ１（ｐ＜０．００６４）及び４ＥＢＰ１（ｐ＜０．０１３５）によって、生存と有意に相関があることが見出された（図３Ａ）。ログランク単変量生存分析（カプラン−メイヤー）は、４ＥＢＰ１の、試験セット１Ａにおける全生存及び無再発生存における転帰との関連を支持した（図３Ｂ）（ＯＡＳ  ｐ＝０．０１８、ＲＦＳ  ｐ＝０．０３７０）。
【００９６】
試験セット１Ａにおける無再発生存については、４ＥＢＰ１レベル（Ｐ２＝０．００７４、ＨＲ＝７．４４、ＣＩ：１．７１〜３２．３６）が、有意な予後因子として現れた。したがって、試験セット１Ａ（図１〜３）については、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路内の個々の成分が、生存と相関があることがわかった。
【００９７】
Ｅ．横紋筋肉腫患者における無病生存及び全生存は、Ａｋｔ及びｍＴＯＲ経路のリン酸化成分と関連する。
試験セット１Ａの所見に基づいて、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路と関連するタンパク質の広範なセットの分析のための独立した試料のセット（セット１Ｂ、図１Ａ）をＣＯＧ（ｎ＝２６）から得た。２つの不均一な試料セット（セット１Ａ及び１Ｂ）の単変量ログランク分析から、試料セット（ＯＡＳ  ｐ＝０．２１１１、ＲＦＳ  ｐ＝０．５８２４）又は組織学（ＯＡＳ  ｐ＝０．４１０３、ＲＦＳ  ｐ＝０．４３１２）による全生存又は無再発生存の有意な差は明らかにならなかった（図１Ｂ及びＣ）。セット１Ａのように、ＬＣＭ及び逆相タンパク質マイクロアレイによってセット１Ｂを分析した。エンドポイントの数を２７に拡大して、経路活性化の独立した評価のために、Ａｋｔ及びｍＴＯＲの上流及び下流のさらなるシグナル伝達タンパク質を含めた。
【００９８】
データの非盲検化に続いて、試験セット１Ｂの結果（図４）から、無病生存及び全生存の、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ経路のリン酸化成分との有意な関連性が実証された。高レベルのＡｋｔ  Ｓｅｒ４７３、４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６、ｅＩＦ４Ｇ  Ｓｅｒ１１０８及びｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９は、全て、低い全生存及び低い無病生存と有意に関連していた（Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３（ＯＡＳ  ｐ＜０．００１、ＲＦＳ  ｐ＜０．０００９）、４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６（ＯＡＳ  ｐ＜０．０１１０、ＲＦＳ  ｐ＜０．０１０６）、ｅＩＦ４Ｇ  Ｓｅｒ１１０８（ＯＡＳ  ｐ＜０．００１７、ＲＦＳ  ｐ＜０．００７２）、及びｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９（ＯＡＳ  ｐ＜０．００８５、ＲＦＳ  ｐ＜０．０２９６）（図４Ａ〜Ｄ）。２７の成分のそれぞれはまた、生存者対非生存者状態との統計的相関について、個々に評価した。６つのエンドポイント−ここでも、Ａｋｔ／ｍＴＯＲネットワークの全ての成分（４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７、Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３、ｅＩＦ４Ｇ  Ｓｅｒ１１０８、ｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９、Ｂａｋ及びＧＳＫ３α／β  Ｔｈｒ２７９／２１６）−は、個々に生存と相関があった（ウィルコクソン一元配置分析４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６（ｐ＜０．０３４８）、ＧＳＫ３α／β  Ｔｙｒ２７９／２１６（ｐ＜０．０３４８）、ｅＩＦ４Ｇ  Ｓｅｒ１１０８（ｐ＜０．０１９６）、Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３（ｐ＜０．０２２７）、Ｂａｋ（ｐ＜０．０３２１）、及びｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９（ｐ＜０．０３７３））（図４Ｅ）。
【００９９】
Ｆ．ＩＲＳ−１／Ａｋｔ／ｍＴＯＲフィードバックループは、非生存者コホートにおいて調節不全である
チロシンリン酸化インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１、Insulin Receptor Substrate-1）は、ｍＴＯＲによって、セリン６１２で、ＰＩ３K、ＩＲＳ−１のセリンリン酸化によるＡｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達を活性化するが、ｐ７０Ｓ６はＩＲＳ−１チロシン活性化を下方制御する。したがって、ＩＲＳ−１は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ活性化に対する反応における負のフィードバック制御の対象である（図５Ａ）。試験セット１Ｂ（ｎ＝２６）における腫瘍についての逆相タンパク質マイクロアレイによって、リン酸化されたＩＲＳ−１／Ａｋｔ／ｍＴＯＲフィードバックループの構成成分のレベルを調べた。ＩＲＳ−１  Ｓｅｒ６１２のレベルは生存者と非生存者との間で異ならなかったが、ＩＲＳ−１  Ｓｅｒ６１２のリン酸化は、生存者コホートにおけるＳｅｒ２４４８でｍＴＯＲのリン酸化と強く相関があり（スピアマンのρノンパラメトリックｐ＜０．００２７）、これらの２つのシグナル伝達事象の間の関連が示唆された（図５Ｂ）。対照的に、これらの同じ２つのシグナル伝達タンパク質のリン酸化は、非生存者コホートにおいて相関がなかった（スピアマンのρノンパラメトリックｐ＝０．７３５８）（図５Ｂ〜Ｃ）。この、ＩＲＳ−１  Ｓｅｒ６１２リン酸化との相関の欠如はまた、ｍＴＯＲ下流成分ｅＩＦ４Ｅ  Ｓｅｒ２０９（生存者ｐ＝０．０００６、非生存者ｐ＝０．１０１７）及びｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９（生存者ｐ＝０．００００４、非生存者ｐ＝０．１８２７）についても有効であった（図５Ｂ及びＤ）。したがって、ｍＴＯＲ経路タンパク質によるＩＲＳ−１活性の負のフィードバック制御は、低い生存を有する患者の腫瘍において、接続を切られる場合がある。対照的に、ＩＲＳ−１シグナル伝達は、長期生存を有する患者の腫瘍において、インタクトな負のフィードバック制御を示すことがわかる（図５Ａ〜Ｄ）。
【０１００】
Ｇ．タンパク質のリン酸化対非リン酸化状態の取調べ
リン酸化は、経路及びキナーゼ阻害剤標的の活性化状態の読出しとしての潜在的な重要性を有する、重要な翻訳後修飾である。ＩＲＳ−１／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路内の潜在的な重要な細胞シグナル伝達タンパク質をさらに調べるために、分析を拡大して、以下のさらなるエンドポイントを含めた：ＢＡＤ、ｅＩＦ４Ｇ、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＩＧＦＲ−β、及びＳ６  ｓｅｒ２４０／２４４。リン酸化タンパク質、全タンパク質形態、及び重要なタンパク質エンドポイントのリン酸化対全形態の比について、ウィルコクソン一元配置分析及びカプラン−メイヤー生存分析を行った（図５Ｂ）。結果から、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ及び関連した経路内のタンパク質エンドポイントの特定のリン酸化形態が、被分析物タンパク質（４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６  ｐ＜０．０３、ｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９  ｐ＜０．０３７３、ＧＳＫ３αβ  Ｙ２７９／２１６  ｐ＜０．３４８、Ａｋｔ  ｓｅｒ４７３  ｐ＜０．０２２７、ｅＩＦ４Ｇ  ｓｅｒ１１０８  ｐ＜０．０１９６）の非リン酸化全形態と比較して、生存と関連している（ｐ＜０．０５）ことが、明らかに実証される。これは、単一の経路節中の全タンパク質の集団がリン酸化形態と比較して過剰であるようなので、重要な区別である。リン酸化形態は、シグナル伝達に活発に携わっている全タンパク質の亜集団を構成する。
【０１０１】
Ｈ．マウス異種移植モデルにおけるｍＴＯＲ経路の抑制によって腫瘍増殖が減少する。
本発明者らのＩＲＳ−１／Ａｋｔ／ｍＴＯＲネットワーク分析の機能的重要性を検証するために、マウス異種移植処置モデルを用いて、十分特徴付けられているｍＴＯＲタンパク質キナーゼ経路の阻害剤であるラパマイシン類似体を採用した。ＲＤ胎児細胞又はＲｈ３０胞巣細胞のいずれかを、ベージュＳＣＩＤマウスの後肢に正所性に注射した。これらの２つの異なる細胞系を使用して、異なる組織学的腫瘍カテゴリーにおけるｍＴＯＲ阻害の効果を判定した。ラパマイシン類似体ＣＣＩ−７７９（Wyeth社製、ニュージャージー州マディソン）投薬量は２０ｍｇ／ｋｇであったが、これは現在第Ｉ相及び第II相臨床試験においてヒトに投与されている投薬量に対応する（Raymond et al. (2004), J Clin Oncol 22, 2336-2347、Smolewski et al. (2006) Anticancer Drugs 17, 487-494）。ｍＴＯＲ下流標的のリン酸化を抑制すると検証されている用量でのＣＣＩ−７７９の投与によって、ＳＣＩＤベージュマウスモデルにおいて測定すると、横紋筋肉腫異種移植片の増殖が大いに減少した（Ｒｈ３０異種移植グループｐ＝０．０００２、ＲＤ異種移植グループｐ＝０．００００８、両方のグループについてｎ＝８）（図６Ａ〜Ｃ）。ｍＴＯＲの確立した下流標的である４ＥＢＰ１及びＳ６リボソームタンパク質のリン酸化を測定することによって、ｍＴＯＲ経路の抑制をモニタリングした。ＣＣＩ−７７９は、Ｒｈ３０胞巣及びＲＤ胎児異種移植由来腫瘍の両方におけるｍＴＯＲシグナル伝達の遮断に相応な、これらの下流標的のリン酸化を阻害した。
【０１０２】
Ｉ．考察
この実施例において、１２年の追跡データが利用可能である２つの独立したＲＭＳ腫瘍試験セットを利用した処置又は生存に対して盲検化して、タンパク質シグナル伝達経路の分析を行った。続いて、患者を、最近完了したＩＲＳ  IV試験であるＣＯＧ  Ｄ９５０２、又は進行中のＣＯＧ  Ｄ９８０３試験で処置した。２つの独立した試験セット（図１Ａ、表１Ａ及び１Ｂ）を、凍結標本の貯蔵所からランダムに得た。各試験セットは、種々の治療法、組織学的サブタイプ、及び腫瘍部位を示した。２つのセットは、胞巣対胎児組織学を有する試料の割合が異なった（図１）（３、４）。試料セットは不均一であったが、２つの試験セットの間で、全生存又は無再発生存のいずれにも、統計的に有意な差はなかった（全生存ｐ＝０．２１１１、無再発生存ｐ＝０．５８２４）（図１Ｂ）。
【０１０３】
横紋筋肉腫と診断された患者の、現在の予後指標は、年齢、病期、グループ、組織学、及び原発部位であり、眼窩又は非傍髄膜頭頸部由来の胎児ＲＭＳを有する１〜８歳のグループにおける患者が最良の予後を有する（１５）。教師なしクラスター分析を用いて、任意のタンパク質シグナル伝達サインが組織学的サブタイプと相関があるかどうかを判定しようと努力した。第一の試験セットについては、１５の特異的シグナル伝達タンパク質（図２Ａ及び３Ａ）を、複数の生存促進性の関連事象の広範な調査を構成したので、最初に選択した。選択したリン酸化状態の多重測定によって、細胞増殖又は生存を稼働させる選択されたネットワーク内の、進行しているキナーゼ活性事象の平均化された描写が提供された。
【０１０４】
最初の教師なしクラスター分析は組織学と有意に関連しなかったが、一方のクラスターがＡｋｔ／ｍＴＯＲタンパク質の活性化を示す、２つのクラスターへの試料の明確な分割があった（図２Ａ）。したがって、タンパク質エンドポイントと臨床データとの間のさらなる探索的関連付けのために、ＣＯＧから臨床転帰データを得た。セット１Ａの結果から、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）シグナル伝達経路に連結したタンパク質の生存と活性化／抑制との間の統計的に有意な関連性が明らかになった（図３Ａ）。
【０１０５】
セット１Ａの結果に基づいて、この探索的分析を、第二の独立した試料のセットに適用される２７のエンドポイントまで拡大した（図１Ａ、表１Ｂ）。第２の試験セットにおいて、生存又は失敗と相関があるようであるタンパク質を、Ａｋｔ／ｍＴＯＲキナーゼ経路中で連結させた（１３、２７、２８）。ＩＲＳ−１（インスリン受容体基質）、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、伸長結合因子（４ＥＢＰ１、elongation binding factor）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３α／β、glycogen synthase kinase-3）、及びｐ７０Ｓ６のリン酸化成分は、転帰と関連があることがわかった（図４）。ＩＲＳ−１、Ａｋｔ及びＧＳＫ３βは、細胞増殖、生存、インスリン応答及びグルコース代謝と関連がある。ｍＴＯＲ、４ＥＢＰ１及びｐ７０Ｓ６は、タンパク質翻訳の必須の成分であり、ここで４ＥＢＰ１のリン酸化によって、ｅＩＦ４Ｅから４ＥＢＰ１が放出され、ｃａｐ依存性翻訳が活性化される。これらの経路は、細胞周期及びアポトーシスに重要なタンパク質のグループの生存促進及び翻訳の制御に関与することが既知であり、サイクリンＤ、ｃ−ｍｙｃ、及びＨｉｆ−１α等のいくつかの既知の癌遺伝子が含まれる。
【０１０６】
Ａｋｔ／タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ、protein kinase B）は、グリコーゲン合成、細胞周期制御並びに細胞生存及びアポトーシスの維持を含む複数の細胞機能において、中心的な役割を果たす。試験セット１Ｂについて、Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３は生存と相関がある（ｐ＜０．０２）が、セット１Ａにおいて生存と相関がない（ｐ＝０．２４６０）。これは、２つのグループの間の腫瘍組織学及び原発の部位の相対組成の差のためであった可能性がある（図１Ａ）。
【０１０７】
ホルモン、増殖因子、マイトジェン、サイトカイン及びＧタンパク質結合型受容体アゴニストを含む種々のオートクライン及びパラクリン刺激は、ｍＴＯＲ経路において、４ＥＢＰ１高リン酸化、及び同時のｅＩＦ４Ｅ結合活性の喪失を誘発する。ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ、phosphoinositide 3 kinase）又は下流のエフェクターキナーゼＡｋｔの活性化は、４ＥＢＰ１高リン酸化につながり、ｅＩＦ４Ｅからのその放出に影響を及ぼす。複数の部位上の４ＥＢＰ１のリン酸化は、インスリン受容体経路及びＰＩ３Ｋ経路への連関と関連がある。４ＥＢＰ１上で６つのリン酸化部位が同定されている。Ｔｈｒ３７、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ６５、及びＴｈｒ７０は、インスリン刺激の後リン酸化状態になり、かかるリン酸化は、ラパマイシン（ｍＴＯＲの阻害剤）及びワートマンニン（ＰＩ３Ｋの阻害剤）によってブロックすることができる。ｍＴＯＲ自体、並びにｍＴＯＲ関連キナーゼが、４ＥＢＰ１上の部位を直接リン酸化することが示されている。Gingras et alは、リン酸基を最初にＴｈｒ３７及びＴｈｒ４６に付加することを確立した。この開始するリン酸化は、結合に必要な他の部位のリン酸化に必要である。したがって、Ｔｈｒ３７／４６によって開始される、複数のキナーゼから引き起こされる複数のリン酸化事象は、ｅＩＦ４Ｅからの４Ｅ−ＢＰ１の放出に関与している。
【０１０８】
チロシンリン酸化インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）は、ＰＩ３ＫによるＡｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達、ｍＴＯＲによるＩＲＳ−１（セリン６１２）のセリンリン酸化を活性化し、ｐ７０Ｓ６はＩＲＳ−１チロシン活性化を下方制御する。したがって、ＩＲＳ−１が、ｐ７０Ｓ６によるＡｋｔ／ｍＴＯＲ活性化に反応した負のフィードバック制御の対象であることが示唆されている（図５Ａ）。ノンパラメトリック相関によって、Ａｋｔ及びｍＴＯＲ経路の成分とのＩＲＳ−１フィードバックループ相互関係を調べた（図５Ｂ〜Ｄ）。ＩＲＳ−１セリン６１２及び種々の潜在的相互作用タンパク質の取調べによって、ＩＲＳ−１の負のフィードバック制御に関与する実際のリン酸化部位とのタンパク質相互作用を評価する手段が提供された。ＩＲＳ−１ｓｅｒ６１２の平均レベルは、不良転帰を有するものと比較して、良好な転帰を有する患者由来の腫瘍の間で統計的に異ならなく（図４Ｅ）、ＩＲＳ−１上流活性のレベルが同様であることが示唆された。ＩＲＳ−１リン酸化の平均レベルは、良好な転帰対不良転帰の症例で同様であったが、Ａｋｔ及びｍＴＯＲ経路タンパク質のリン酸化レベルとの、各腫瘍における個々のＩＲＳ−１リン酸化レベルの相関は、これら２つの表現型において、高度に異なっていた。一方、Ｂａｘ、ＦＫＨＲ  ｓｅｒ２５６、及び４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ７０は、両方のグループについて、有意に相関があった（図５Ｂ）。図５に示されるように、良好な転帰を有する腫瘍において、ＩＲＳ−１  ｓｅｒ６１２とｍＴＯＲ  ｓｅｒ２４４８及びｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ２８９（ｐ＝０．００００４）の強力な正の相関（ｐ＝０．００２６９）があった（図５Ｂ〜Ｄ）。このことから、ｍＴＯＲとＩＲＳ−１との間のフィードバックループと一致する関連、及び良好な転帰を有してこれらの腫瘍中にインビボ状態で存在することができる可能性が示唆される。これらのデータは、不良転帰を有する腫瘍におけるフィードバックループの選択的分離を支持する。
【０１０９】
生存者及び非生存者のＩＲＳ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ相互接続のこれらの差の暗示は２倍であった。まず、ＩＲＳ−１とｍＴＯＲとの間の相互接続の見かけの欠如は、正常な負のフィードバック制御を破壊することがあった。これは、不良転帰を有する患者由来の腫瘍において気づき、図５Ａに示したように、Ａｋｔの増大したリン酸化を生じることがある。第二に、攻撃的腫瘍のためのｍＴＯＲ阻害剤療法は、負のフィードバックループが機能しておらず、Ａｋｔの増大したリン酸化を引き起こすことができない。リン酸化Ａｋｔ及びｍＴＯＲのベースライン値は、攻撃的腫瘍において増大していることがあり、ここでＩＲＳ−１によるｍＴＯＲの負のフィードバック制御が破壊され、腫瘍の持続した増殖及び生存につながる。
【０１１０】
同定された４Ｅ−ＢＰ１リン酸化部位は、ラパマイシン処置によって特異的に阻害されることが既知である。良好な治療転帰を有した患者に見られるｍＴＯＲ経路抑制が明らかになった本発明者らのネットワーク分析の機能的重要性を検証するために、ｍＴＯＲタンパク質キナーゼ経路の十分特徴付けられた阻害剤であるラパマイシン類似体の存在を利用した。これらの類似体のいくつかは、現在、癌を有する成人の第Ｉ相及び第II相臨床試験にある（Raymond et al. (2004), supra、Smolewski et al. (2006) supra）。ｍＴＯＲの確立した下流基質である４ＥＢＰ１及びＳ６キナーゼのリン酸化の状態を測定することによって、ｍＴＯＲ経路の抑制をモニタリングした（１３、２７、２８、３０、３１）。ＣＣＩ−７７９は、Ｒｈ３０胞巣又はＲＤ胎児細胞由来の異種移植腫瘍におけるｍＴＯＲシグナル伝達の遮断に相応な下流標的の予測されたリン酸化を阻害した（図６）。
【０１１１】
要約すると、処置の前に得られた、顕微解剖されたヒトＲＭＳ臨床標本のタンパク質経路分析から、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の活性化と、この最初の探索的分析における不良転帰との間の、強力な関連性が明らかになった。この観察は、２つの、独立して分析された臨床試験セットの間で、一致することがわかった。さらに、特定の標的化阻害剤ＣＣＩ−７７９を用いてＳＣＩＤベージュＲＭＳ異種移植モデルにおける腫瘍増殖を抑制して、ＲＭＳにおけるＩＲＳ−１／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路活性化の機能的重要性を検証した。これらのデータは、予後不良患者をより耐久性のある転帰に変える潜在的な方法として、この腫瘍型においてラパマイシン類似体を使用するための、論理的根拠を支持する。併用療法戦略は、標準的な細胞障害性ＲＭＳ療法を増強する手段として、上流のシグナル伝達因子活性化並びに下流のｍＴＯＲシグナル伝達の両方をブロックすることを目的とすることができる。
【実施例２】
【０１１２】
逆相タンパク質マイクロアレイを用いた肺癌リン酸化プロテオミクス分析；最も一般的な肺癌の形態である非小細胞肺癌における転帰の判定におけるｍＴＯＲ経路の重要性
Ａ．材料及び方法
１．試料。２０個の初期肺腺癌外科標本。手術のときに、肺外科標本を患者から収集し、凍結した。（国民死亡記録によって患者生存を確認した）
【０１１３】
２．凍結切片。８μｍの凍結組織切片を、シラン処理されたスライド上で調製した。
【０１１４】
３．レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）。Molecular Devices社製のPixCell又はVeritas装置を用いて、純粋な腫瘍細胞集団を得た。
【０１１５】
４．逆相タンパク質マイクロアレイを、Affymetrix GMS 417ピン及びリング式アレイヤーを用いて、Whatman Schleicher及びSchuell FASTスライド上で印刷した（試料を、ドットあたり１０ヒットで２回印刷した）。
【０１１６】
５．免疫染色。発色検出（ＤＡＢ）を用いるDako社製の触媒性シグナル増幅化学を用いて、Dako Autostainer上で特定のタンパク質について、マイクロアレイをプローブした（ビオチンタイラマイドのホースラディッシュペルオキシダーゼ媒介性析出）。
【０１１７】
Ｂ．分割解析
Image Quant ver5.2で、マイクロアレイスポット強度を行った。
二元配置階層的クラスター分析（ウォード法）及び分割解析のために、JMPソフトウエアを用いた。結果を下記の表４及び図７に示す。
【０１１８】
【表３】
2009511935.tif 000005
【０１１９】
Ｃ．カプラン−メイヤー生存プロットによる、ＲＰＭＡによる分析
このセットにおいて、長期生存の１０人の患者及び短期生存の１０人の患者を、逆相アレイ分析によって、及び主成分分析に基づいて、分析した。カプラン−メイヤー生存プロット（図８及び９）として示されるように、結果から、ここでも、ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の成分が、転帰を推進する主要なものであることがわかったことが示される。また、上昇したｐ４ＥＢＰ１及びｐＡＫＴを有する患者は、有意により短い全生存時間を有した。
【実施例３】
【０１２０】
逆相タンパク質マイクロアレイを用いた乳癌リン酸化プロテオミクス分析
この実施例において、少なくとも１０年の追跡を有し、全てタモキシフェン単剤療法によって処置されたＥＲ＋リンパ節陰性及びリンパ節陽性乳癌患者から採取された腫瘍の試験セットを、逆相タンパク質マイクロアレイを用いた分子ネットワーク分析によって分析した。分析した５５のホスホエンドポイントのうち、転帰分離の主な主成分はｍＴＯＲ経路に属した。重要なことに、ｍＴＯＲ経路成分、主にｐＥＢＰ１、及びｐ７０Ｓ６は、リンパ節状態にかかわらず、転帰を分離することができた。
【０１２１】
図１０は、ｐ４ＥＢ−Ｐ１によって分類された、積関連生存率適合法、ＬＮのみのサブセット由来の生存を示す。図１１は、分割の主成分としてｐ７０Ｓ６を示すＬＮ＋集団の分割解析を示す。図１２は、ＬＮ−及びＬＮ＋両方の、全ての症例由来の生存プロットを示す。
【０１２２】
結論：データは、リンパ節状態にかかわらず、タモキシフェン単剤療法で処置されたＥＲ＋乳癌の女性についての再発までの時間が、ｍＴＯＲ経路の特定の成分のリン酸化状態と強力な関連があったという結論を明らかに支持する。この情報は、ａ）誰がタモキシフェン療法を受けるべきかを決定する、及び／又はｂ）予後不良であると予測されるその患者のサブセットに二次療法を施す決定のための基礎となることができる。適した、かかる二次療法剤は、本明細書中の他所で考察されている。
【０１２３】
前述の記載から、当業者は、本発明の必須な特徴を容易に解明することができ、その精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の変更及び改変を行って、種々の用途及び条件に適応させ、本発明をその最大限の程度まで利用することができる。前述の好ましい特定の実施形態は、単に例示として解釈され、本発明の範囲を決して限定しない。上記及び図中で引用された全ての出願、特許、及び刊行物（２００５年１０月１８日に提出した米国仮出願第６０／７２７５１０号を含む）の開示全体は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
図１は、横紋筋肉腫試料セットの特徴を示す図である。
【図１Ａ】２つの独立した試験セット、セット１Ａ及び１Ｂを、逆相タンパク質マイクロアレイによって評価して、細胞内シグナル伝達タンパク質の状態をプロファイリングした。
【図１Ｂ】横紋筋肉腫試料セット１Ａ及び１Ｂの生存分析。両方の不均一な試験セットについての全生存（overall survival、ＯＡＳ）及び無再発生存（recurrence free survival、ＲＦＳ）は、カプラン−メイヤー生存推定値によると、有意に異ならなかった（ＯＡＳログランクｐ＝０．２１１１及びＲＦＳ  ｐ＝０．５８２４）。
【図１Ｃ】組織学的サブタイプは、試験セットの間で、有意な差を示さなかった（カプラン−メイヤーＯＡＳログランクｐ＝０．４１０３及びＲＦＳ  ｐ＝０．４３１２）。
【０１２５】
図２は、横紋筋肉腫試験セット１Ａの探索的データ分析を示す図である。
【図２Ａ】正規化されたタンパク質エンドポイント（縦列）の教師なしベイジアンクラスタリングから、２つの主要な腫瘍のクラスター（横列）が示された。これらのクラスターは、（図２Ｂ）中の臨床パラメータと関連がないようである。２つのクラスターを、フィッシャーの直接確率検定によって比較した。ｐ＞０．０５。
【図２Ｂ】正規化されたタンパク質エンドポイント（縦列）の教師なしベイジアンクラスタリングから、２つの主要な腫瘍のクラスター（横列）が示された。これらのクラスターは、（図２Ｂ）中の臨床パラメータと関連がないようである。２つのクラスターを、フィッシャーの直接確率検定によって比較した。ｐ＞０．０５。
【０１２６】
図３は、横紋筋肉腫試料セット１Ａについての逆相タンパク質マイクロアレイキナーゼ経路プロファイリング結果を示す図である。
【図３Ａ】４ＥＢＰ１及び４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６から、試験セット１Ａにおける非生存者及び生存者状態の分離についての統計的に有意な相関が実証された。（（４ＥＢＰ１ウィルコクソン一元配置カイ二乗０．００６４、ｄｆ＝１、ｎ＝３２）、非生存者平均値は４ＥＢＰ１＝８２．４、平均値の標準誤差＝１１．４８、生存者平均値は４ＥＢＰ１＝１４５．６１、平均値の標準誤差＝１４．８９（４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６カイ二乗０．０１３５、ｄｆ＝１、ｎ＝３３））。
【図３Ｂ】決定木解析から、４ＥＢＰ１は試験セット１Ａにおける生存について識別するものであることが示され、したがって、４ＥＢＰ１についてのカプラン−メイヤー生存推定値を計算した。カプラン−メイヤープロットから、比較的高いレベルの４ＥＢＰ１（灰色の線）が、比較的低い４ＥＢＰ１レベルを有する試料（黒色の線）と比較して、全生存（ログランクｐ＜０．０１７７、ｎ＝３２［１つの試料についてはデータを使用できない］）及び無再発生存（ｐ＝０．０３７０）と有意な統計学的相関を有することが示された。
【０１２７】
図４は、横紋筋肉腫試料セット１Ｂについての逆相タンパク質マイクロアレイキナーゼ経路プロファイリング結果を示す図である。
【図４Ａ−Ｄ】（図４Ａ）カプラン−メイヤー生存分析から、Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３（ＯＡＳ  ｐ＜０．００１、ＲＦＳ  ｐ＜０．０００９）、（図４Ｂ）ｅＩＦ４Ｇ  Ｓｅｒ１１０８（ＯＡＳ  ｐ＜０．００１７、ＲＦＳ  ｐ＜０．００７２）、（図４Ｃ）４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６（ＯＡＳ  ｐ＜０．０１１０、ＲＦＳ  ｐ＜０．０１０６）、及び（図４Ｄ）ｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９（ＯＡＳ  ｐ＜０．００８５、ＲＦＳ  ｐ＜０．０２９６）についてのセット１Ｂにおけるログランク分析によって、全生存及び無再発生存の両方において、統計的に有意な相関が示された。灰色の線は、比較的高レベルの、示されたタンパク質エンドポイントを示し、黒色の線は、比較的低いレベルを表す。
【図４Ｅ】横紋筋肉腫試料セット１Ｂについての逆相タンパク質マイクロアレイによって評価したタンパク質エンドポイント（□生存者状態、■非生存者状態）。４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６（ｐ＜０．０３４８）、ＧＳＫ３α／β  Ｔｈｒ２７９／２１６（ｐ＜０．０３４８）、ｅＩＦ４Ｇ  Ｓｅｒ１１０８（ｐ＜０．０１９６）、Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３（ｐ＜０．０２２７）、Ｂａｋ（ｐ＜０．０３２１）、及びｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９（ｐ＜０．０３７３）は、ウィルコクソン一元配置解析によって、全生存と統計的に有意に関連していることがわかった（平均値±ＳＥＭ）。
【０１２８】
図５は、横紋筋肉腫試験セット１ＢにおけるＩＲＳ−１細胞シグナル伝達経路を示す図である。
【図５Ａ】ＩＲＳ−１フィードバックループ図。ＩＲＳ−１は、Ａｋｔによる正のフィードバックループ並びにＩＲＳ−１  ｓｅｒ６１２を介したｍＴＯＲ及びｐ７０Ｓ６による負のフィードバックループの両方によって制御される。
【図５Ｂ】試料セット１ＢにおけるＩＲＳ−１／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路タンパク質のノンパラメトリック分析（表１Ｂ）。試料セット１Ｂについて評価した、選択された生存促進性及びアポトーシスシグナル伝達タンパク質の、スピアマンのρテーブル。
【図５Ｃ】スピアマンのρノンパラメトリック分析から、非生存者状態（ｐ＝０．７３５８）を有する患者由来の腫瘍と比較して、生存者状態（ｐ＝０．００２７）を有する患者由来の腫瘍について、ＩＲＳ−１  Ｓｅｒ６１２とｍＴＯＲ  Ｓｅｒ２４４８との間の相関が示された。
【図５Ｄ】同様の相関が、生存者状態（ｐ＝０．００００４）を有する患者由来の腫瘍試料対非生存者状態（ｐ＝０．１８２７）を有する患者由来の腫瘍試料について、ＩＲＳ−１  Ｓｅｒ６１２とｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９との間で注目された。
【０１２９】
図６は、マウス異種移植モデルにおける、ヒト横紋筋肉腫腫瘍増殖のＣＣＩ−７７９抑制を示す図である。
【図６Ａ】異種移植処置モデルにおける腫瘍組織内のｍＴＯＲ経路下流基質のリン酸化の時間依存的なＣＣＩ−７７９阻害。ＣＣＩ−７７９は、アクチンと比較して、関連していない筋肉及び腫瘍組織の両方におけるｍＴＯＲ経路基質、ｐＳ６  Ｓｅｒ２３５／２３６及び４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ７０のリン酸化を阻害した。
【図６Ｂ】ＣＣＩ−７７９は、Ｒｈ３０及びＲＤマウス異種移植モデルにおいて、腫瘍増殖を阻害した。Ｒｈ３０胞巣又はＲＤ胎児細胞系のいずれか由来の、マウス１匹あたり０．２ｍＬの総体積中２×１０６個の細胞を、ＳＣＩＤベージュマウスモデルの左後肢腓腹筋に正所性に注射した。１週間後、マウスを対照（ｎ＝８）又はＣＣＩ−７７９処置群（ｎ＝８）に割り当てた。ノギスで測定した腫瘍体積は、Ｒｈ３０及びＲＤ異種移植の両方について、媒体のみと比較して、ＣＣＩ−７７９処置群において、より少なかった。−−▲−−ＲＤ対照、−■−Ｒｈ３０＋ＣＣＩ−７７９、−−◆−−Ｒｈ３０対照、−−Ｘ−−ＲＤ＋ＣＣＩ−７７９、（ＲＤ  ｐ＝０．００００８、Ｒｈ３０  ｐ＝０．０００２、スチューデントｔ検定）。
【図６Ｃ】ＣＣＩ−７７９を、３日ごとに３０日間、２０ｍｇ／ｋｇ／ＩＰで投与した。Ｒｈ３０及びＲＤマウス異種移植腫瘍又は浸潤のない筋肉由来のタンパク質抽出物を、ＣＣＩ−７７９又は媒体で３０日間処置し、Ｓ６及び４ＥＢＰ１リン酸化について、ウエスタンブロッティングによって分析した。ＣＣＩ−７７９は、Ｒｈ３０及びＲＤ筋肉及び腫瘍細胞の両方において、４ＥＢＰ１のリン酸化を抑制する。
【図７Ａ】肺腺癌腫瘍試料の分割解析を示す図である。
【図７Ｂ】肺腺癌腫瘍試料の分割解析を示す図である。
【図８】肺癌についての、ｐ４ＥＢＰ１カットポイントによって分類された、被分析物関連生存率適合法を示す図である。
【図９】肺癌についての、ｐ４ＥＢＰ１  ｐＡＫＴｓｅｒ４７３カットポイントによって分類された、被分析物関連生存率適合法を示す図である。
【図１０】乳癌についての、ｐ４ＥＢ−Ｐ１カットポイントによって分類された、被分析物関連生存率適合法、ＬＮのみのサブセット由来の生存を示す図である。
【図１１Ａ】乳癌についての、分離の主成分としてｐ７０Ｓ６を示すＬＮ＋集団の分割解析を示す図である。
【図１１Ｂ】乳癌についての、分離の主成分としてｐ７０Ｓ６を示すＬＮ＋集団の分割解析を示す図である。
【図１２】乳癌についての、全ての症例、ＬＮ−及びＬＮ＋の両方由来の、生存プロットを示す図である。
【図１Ａ】
2009511935.tif 000006
【図１Ｂ】
2009511935.tif 000007
【図１Ｃ】
2009511935.tif 000008
【図２Ａ】
2009511935.tif 000009
【図２Ｂ】
2009511935.tif 000010
【図３Ａ】
2009511935.tif 000011
【図３Ｂ】
2009511935.tif 000012
【図４Ａ−Ｄ】
2009511935.tif 000013
【図４Ｅ】
2009511935.tif 000014
【図５Ａ】
2009511935.tif 000015
【図５Ｂ】
2009511935.tif 000016
【図５Ｃ】
2009511935.tif 000017
【図５Ｄ】
2009511935.tif 000018
【図６Ａ】
2009511935.tif 000019
【図６Ｂ】
2009511935.tif 000020
【図６Ｃ】
2009511935.tif 000021
【図７Ａ】
2009511935.tif 000022
【図７Ｂ】
2009511935.tif 000023
【図８】
2009511935.tif 000024
【図９】
2009511935.tif 000025
【図１０】
2009511935.tif 000026
【図１１Ａ】
2009511935.tif 000027
【図１１Ｂ】
2009511935.tif 000028
【図１２】
2009511935.tif 000029
【国際調査報告】
2009511935.tif 000030
2009511935.tif 000031
2009511935.tif 000032
2009511935.tif 000033
2009511935.tif 000034
2009511935.tif 000035
2009511935.tif 000036