(57)【要約】本発明は、少なくとも1つのC35抗体と化学療法剤とを投与する段階を含む、癌細胞を死滅させる方法に関する。いくつかの好ましい態様では、2つのC35抗体を化学療法剤と共に投与する。本発明はさらに、このような方法に有用なC35抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
C35を発現する癌細胞を死滅させる方法であって、該細胞に、(a)C35に特異的に結合する第1のC35抗体またはその抗原結合断片；(b)C35に特異的に結合する第2のC35抗体またはその抗原結合断片；および(c)治療薬を投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
インビボにおいて実施される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物において実施される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
第1のC35抗体または断片および第2のC35抗体または断片が、異なるC35エピトープにそれぞれ結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基105〜115内に位置するC35エピトープ、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基48〜87内に位置するC35エピトープ、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸残基48〜104内に位置するC35エピトープからなる群より選択されるC35エピトープに結合する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
治療薬が化学療法剤である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、アドリアマイシン、ドセタキセル、タキソテール(taxotere)、ゲムシタビン、およびビノレルビンからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
化学療法剤がパクリタキセルである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
化学療法剤がアドリアマイシンである、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
治療薬が、第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つの投与前に投与される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
治療薬が、第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つの投与後に投与される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
治療薬が、第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つと同時に投与される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
第1のC35抗体および第2のC35抗体が同時に投与される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
第1のC35抗体および第2のC35抗体が連続的に投与される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
C35抗体または断片のそれぞれが、患者の体重1 kgあたり約0.1 mg〜約100 mgの用量で投与される、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、MAb 163またはその変異体もしくは誘導体である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、1B3またはその変異体もしくは誘導体である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、1F2またはその変異体もしくは誘導体である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
第1のC35抗体および第2のC35抗体が、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
第1のC35抗体および第2のC35抗体が、1B3および1F2、またはそれらの変異体もしくは誘導体である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞が、乳癌、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、および黒色腫からなる群より選択される、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
癌細胞が肝臓癌細胞である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
2つを上回るC35抗体またはその断片を投与する段階を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
C35に特異的に結合し、かつ参照モノクローナル抗体MAb 163のC35に対する特異的な結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
MAb 163である、請求項27記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
多重特異的抗体、二重特異的抗体、Fab断片、Fab'断片、F(ab)2断片、Fv断片、および1本鎖抗体からなる群より選択される改変形態である、請求項27または28記載の抗体またはその断片。
【請求項３０】
融合している異種ポリペプチドをさらに含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の抗体またはその断片。
【請求項３１】
治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾物質、医用薬剤、またはPEGからなる群より選択される薬剤に接合している、請求項27〜29のいずれか一項記載の抗体またはその断片。
【請求項３２】
請求項27〜31のいずれか一項記載の抗体またはその断片、および担体を含む、組成物。
【請求項３３】
VH領域およびVL領域を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該VH領域および該VL領域がそれぞれ、20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66からなる参照ポリペプチドと同一であり、かつ該VHおよび該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３４】
免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65の参照重鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり；かつ該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３５】
20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62の参照VHポリペプチド配列と同一のVH領域をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３６】
VHに融合しているシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項34または35記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
VHに融合している重鎖定常領域もしくはその断片をさらに含む、請求項34または35記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69からなる参照軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり；かつ該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:66の参照VLポリペプチド配列と同一のVL領域をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４０】
VLに融合しているシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項38または39記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
VLに融合しているCLドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項38または39記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)またはその変異体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、C35に特異的に結合するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】
Mab 163モノクローナル抗体の少なくとも3つのCDRをコードする核酸配列を含む、請求項42記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】
Mab 163モノクローナル抗体の少なくとも6つのCDRをコードする核酸配列を含む、請求項42記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項34〜44のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４６】
請求項34〜44のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは請求項45記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４７】
請求項46記載の宿主細胞を培養する段階、および抗体または断片を回収する段階を含む、抗C35抗体またはその抗原結合断片を作製する方法。
【請求項４８】
請求項47記載の方法で作製される、抗C35抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４９】
免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)を含む単離されたポリペプチドであって、該VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65からなる参照重鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり、かつ該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【請求項５０】
20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62からなる参照VH配列と同一のVHを含む、単離されたポリペプチドであって、該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【請求項５１】
免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)を含む単離されたポリペプチドであって、該VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69からなる参照軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり、かつ該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【請求項５２】
20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:66からなる参照VL配列と同一のVLを含む、単離されたポリペプチドであって、該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【請求項５３】
融合している異種ポリペプチドをさらに含む、請求項49〜52のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５４】
請求項49〜52のいずれか一項記載のポリペプチドを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５５】
請求項26〜31のいずれか一項記載の単離されたMAb 163抗体またはその断片、請求項34〜44のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項49〜53のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドからなる群より選択される薬剤の有効量を、癌を患っている動物に投与する段階を含む、癌を処置するための方法。
【請求項５６】
動物が哺乳動物である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
哺乳動物がヒトである、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
(a)C35に特異的に結合する第1のC35抗体；(b)C35に特異的に結合する第2のC35抗体；および(c)治療薬を含む、組成物。
【請求項５９】
治療薬が化学療法剤である、請求項58記載の組成物。
【請求項６０】
化学療法剤がパクリタキセルまたはアドリアマイシンである、請求項59記載の組成物。
【請求項６１】
第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つが、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、請求項58記載の組成物。
【請求項６２】
第1のC35抗体がMAb 163である、請求項61記載の組成物。
【請求項６３】
(a)試料または細胞に、請求項26〜31または64〜69のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合断片を接触させる段階；および(b)該抗体またはその抗原結合断片のC35に対する結合を検出する段階を含む、C35の存在を検出する方法。
【請求項６４】
MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含み、かつC35に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６５】
MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つのCDRを含む、請求項64記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６６】
少なくとも1つのCDRが、MAb 163の重鎖のCDR3である、請求項64記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６７】
MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも3つのCDRを含む、請求項64記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６８】
少なくとも3つのCDRが、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65を含む、請求項64記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６９】
少なくとも3つのCDRが、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69を含む、請求項64記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７０】
化学療法剤の投与をさらに含む、癌の処置用の医用薬剤の製造における第1のC35抗体および第2のC35抗体の使用。
【請求項７１】
第1のC35抗体および第2のC35抗体が同時に投与される、請求項70記載の使用。
【請求項７２】
化学療法剤がパクリタキセルまたはアドリアマイシンである、請求項70記載の使用。
【請求項７３】
第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つが、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、請求項70記載の使用。
【請求項７４】
1F2および1B3の変異体または誘導体がヒト化抗体である、請求項73記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、少なくとも1つのC35抗体と化学療法剤とを投与する段階を含む、癌細胞を死滅させる方法に関する。いくつかの好ましい態様では、2つのC35抗体が化学療法剤と共に投与される。本発明はさらに、このような方法に有用なC35抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
細胞の成長は、身体の特定のニーズに反応して細かく調節される過程である。場合によっては、細胞分裂に関する規則を決定する複雑かつ高度に調節されたコントロールが効かなくなる。こうした状況に陥ると、細胞は、そのホメオスタシス調節に無関係に成長および分裂を始め、一般に癌と呼ばれる状態に至る。実際に癌は、25〜44歳の米国人の死因の第2位である。
【０００３】
癌の現在の治療法は、化学療法および放射線療法を含む。化学治療剤は、癌細胞を主にアポトーシスの誘導によって死滅させる(Fisher, D.E., Cell 78:539-542 (1994)(非特許文献1)；Fung, C.Y., and D.E. Fisher, J. Clin. Oncol. 13:801-807 (1995)(非特許文献2)；Lowe, S.W., et al., Cell 74:957-967 (1993)(非特許文献3))。放射線療法は、癌細胞をアポトーシスの誘導によって、および他の機構によって死滅させる。しかしながら、化学療法および放射線療法は、所与の腫瘍中の全ての細胞を死滅させるわけではなく、このような処置を生き延びた細胞は成長を続ける。したがって、これらの処置はしばしば、腫瘍の全体を根絶するのに不十分である。したがって、改善された癌の処置法が求められている。
【０００４】
抗体を使用することで、腫瘍細胞中で差次的に発現される表面膜マーカーを標的とする、癌の免疫治療戦略も開発されている(例えば米国特許第5,770,195号、「Monoclonal Antibodies to the HER2 Receptor」、1995年5月23日出願、1998年6月23日発行(特許文献1))。しかしながら、腫瘍中で差次的に発現されるいくつかの抗原は、腫瘍細胞の表面に露出しない。結果として、このような細胞内抗原は、抗体ベースの治療法の標的として適切ではない。したがって、癌を処置する免疫治療法のさらなる標的が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第5,770,195号、「Monoclonal Antibodies to the HER2 Receptor」、1995年5月23日出願、1998年6月23日発行
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fisher, D.E., Cell 78:539-542 (1994)
【非特許文献２】Fung, C.Y., and D.E. Fisher, J. Clin. Oncol. 13:801-807 (1995)
【非特許文献３】Lowe, S.W., et al., Cell 74:957-967 (1993)
【発明の概要】
【０００７】
発明の簡単な概要
癌細胞を死滅させる方法
本発明は、治療薬の有効量を投与することによって、および癌細胞の細胞内で発現されるが、アポトーシスを起こした癌細胞の細胞表面に露出される、死滅癌細胞の癌関連抗原であるC35に結合する、少なくとも1つ、好ましくは2つ、または2つ以上の抗体の有効量を投与することによって、癌細胞を死滅させる方法を提供する。
【０００８】
いくつかの態様では、治療薬は化学療法剤である。いくつかの態様では、化学療法剤はアポトーシス誘導剤である。アポトーシス誘導療法の実施および抗体または抗体群の投与の時期は、1つまたは複数の抗体が癌細胞に、アポトーシスが進行中の時点または誘導された時点で到達するように計画される。いくつかの態様では、少なくとも1つのC35抗体は、抗体が結合する細胞が死滅するか、および/またはトキシンに曝露された周囲の癌細胞が死滅することを確実なものとするために、トキシンと接合させるか、またはトキシンと複合体を形成させる。1つの態様では、トキシンは放射性同位元素である。別の態様では、トキシンは化学療法剤である。
【０００９】
1つの態様では、方法は、化学療法剤を、1つまたは複数の、および好ましくは2つの抗体またはその断片もしくは変異体の投与の前、投与の後、または投与と同時に投与する段階を含む。いくつかの態様では、抗体の少なくとも1つは、放射性医用薬剤に接合している。
【００１０】
別の態様では、方法は、トキシンと接合していないか、またはトキシンと複合体を形成していない1つまたは複数の、および好ましくは2つの抗体またはその断片もしくは変異体を投与する段階を含み、抗体または断片と結合した細胞は死滅する。好ましい態様では、1つまたは複数の抗体は、抗体に接合していない化学療法剤と共に投与される。
【００１１】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボにおいて実施することが可能であり、ヒトなどの哺乳動物を含む患者を対象とした治療法として使用することができる。
【００１２】
C35に対する抗体およびC35抗体の使用法
本発明は、C35ポリペプチドに結合する抗体も提供する。本発明は、SEQ ID NO:2のポリペプチドなどのC35ポリペプチドまたはC35ポリペプチドのポリペプチド断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体(抗体断片もしくはその変異体を含む分子、または代替的にその抗体断片もしくは変異体からなる分子を含む)を含む。
【００１３】
発明者らは、1つまたは複数のC35ポリペプチド(例えばSEQ ID NO:2)に免疫特異的に結合するマウスおよびヒトの抗体、ならびにこれらの抗体に由来するVH領域およびVL領域をコードするポリヌクレオチドを作製した。したがって本発明は、一部がAmerican Type Culture Collection(「ATCC」)に、表2および表3に記載された日に寄託され、ならびに表2および表3に記載されたATCC寄託番号が与えられた、SEQ ID NO:70および71に記載されたポリペプチド、ならびに以下の表2、表3、および表4に記載されたポリペプチドを含む、これらのポリヌクレオチドを含む。ATCCの所在地は、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USAである。ATCCへの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準じて行われた。
【００１４】
本発明は、1つまたは複数のC35ポリペプチド(例えばSEQ ID NO:2)に免疫特異的に結合するVH領域およびVL領域をコードする寄託済みポリヌクレオチドクローン、寄託済みポリヌクレオチドを含む細胞、寄託済みポリヌクレオチドもしくはその一部(例えばVHまたはVLのCDR)によってコードされたVH領域および/またはVL領域を含む抗体、このような抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む細胞も含む。本発明は、SEQ ID NO:70および71のポリヌクレオチドを含む細胞、SEQ ID NO:70および71のヌクレオチドによってコードされたVH領域および/またはVL領域を含む抗体、またはSEQ ID NO:62および66のポリペプチドによってコードされたVH領域および/またはVL領域、このような抗体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む細胞も含む。このような抗体は、ポリヌクレオチドによってコードされたVH領域およびVL領域を含む当初の抗体と同じエピトープ特異性を有する場合もあれば有さない場合もあり、ならびに当初の抗体の親和性と同じか、またはこれより高い、C35に対する親和性を有する場合もあれば有さない場合もある。1つの態様では、本発明の抗体は、SEQ ID NO:2の残基105〜115内に含まれるC35エピトープに結合する。別の態様では、本発明の抗体は、SEQ ID NO:2の残基48〜104内に含まれるC35エピトープに結合する。別の態様では、本発明の抗体は、SEQ ID NO:2の残基48〜104内に含まれるC35エピトープに結合する。
【００１５】
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたVH、VH CDR、VL、VL CDRの任意の1つのアミノ酸配列を有する、これらの抗体の断片もしくは変異体(例えばscFv、ディアボディ、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabody)、ミニボディ、重鎖、VH領域、VH CDR(相補性決定領域)、軽鎖、VL領域、もしくはVL CDR)を含むか、または代替的にこれらからなる抗体を含む。このような抗体は、寄託済みポリヌクレオチドによってコードされたVH領域およびVL領域を含む当初の抗体と同じエピトープ特異性を有する場合もあれば有さない場合もあり、ならびに当初の抗体の親和性と同じか、またはそれより高い対C35親和性を有する場合もあれば有さない場合もある。
【００１６】
本発明は、1つまたは複数のC35ポリペプチドに結合し、および酵素、蛍光標識、発光標識、または生物発光標識などの検出用標識に結合している抗体、またはその断片もしくは変異体も提供する。本発明は、1つまたは複数のC35ポリペプチドに結合し、および治療薬またはトキシン、例えば放射性物質に結合している抗体、またはその断片もしくは変異体も提供する。1つの態様では、本発明の抗体には放射性同位元素が結合している。
【００１７】
本発明は、一般に単離された、本発明の抗体(抗体の断片もしくはその変異体を含むか、または代替的に抗体の断片もしくはその変異体からなるscFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、VH領域、もしくはVL領域などの分子を含む)をコードする核酸分子も提供する。本発明は、本発明の抗体(抗体断片もしくはその変異体を含むか、または代替的に抗体断片もしくはその変異体からなる、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、VH領域、もしくはVL領域などの分子を含む)をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞、およびこの子孫も提供する。本発明は、本発明の抗体(抗体断片もしくはその変異体を含むか、または代替的に抗体断片もしくはその変異体からなる分子を含む)の作製法も提供する。本発明はさらに、核酸分子から本発明の抗体(抗体断片もしくはその変異体を含むか、または代替的に抗体断片もしくはその変異体からなる分子を含む)を発現させる方法を提供する。
【００１８】
本発明は、C35ポリペプチドまたはその断片もしくはその変異体に免疫特異的に結合する1つまたは複数の、および好ましくは2つの抗体またはそれらの断片もしくは変異体、または関連分子の有効量を、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する段階を含む、癌を処置するための方法および組成物に関する。好ましい態様では、本発明は、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、および黒色腫を処置するための抗体ベースの方法および組成物に関する。
【００１９】
好ましい態様では、本発明は、化学療法剤の有効量、および1つまたは複数の抗体またはその断片もしくは変異体の有効量を、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する段階を含む、癌を処置するための併用療法に関する。いくつかの態様では、抗体、またはその断片もしくは変異体は、トキシン、例えば放射性物質に接合している。いくつかの態様では、抗体またはその断片は、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾物質、医用薬剤、またはPEGからなる群より選択される薬剤に接合している。好ましい態様では、本発明は、C35に特異的に結合する2つの抗体、またはそれらの断片もしくは変異体、および治療薬の有効量を細胞に投与する段階を含む、C35を発現する癌細胞を死滅させる方法に関する。特定の態様では、治療薬は化学療法剤である。より特異的な態様では、化学療法剤はパクリタキセルである。別の特定の態様では、少なくとも1つ、および好ましくは2つのC35抗体または断片は、1B3(Mab 11)、1F2(Mab 76)、MAb 163、MAb 165、Mab 171、MAbc009、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される。より特異的な態様では、2つの抗体は、1B3および1F2、またはそれらの断片もしくは変異体である。
【００２０】
本発明は、C35、またはその断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体またはその断片もしくは変異体、または関連分子の有効量を、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する段階を含む、癌を検出する、診断する、または予後を予測するための方法および組成物も含む。好ましい態様では、本発明は、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、および黒色腫を検出する、診断する、または予後を予測するための抗体ベースの方法および組成物に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、癌におけるC35の発現をモニタリングするための診断ツールとしての本発明の抗体の使用を含む。ある態様では、方法は、アポトーシス誘導レジメンの有効性を確認するための診断法として使用することもできる。
【００２２】
本発明のこれらの、および他の局面を以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
（図１）C35腫瘍抗原を発現する21MT1乳腺腫瘍細胞における放射線誘導によるアポトーシス後の乳腺腫瘍細胞におけるC35の表面染色を示す。図1Aは、アポトーシスを起こしていない(アネキシンV陰性)未処置生細胞(PI陰性)が、抗C35抗体とアイソタイプ対照抗体による染色の差が見られないことから明らかなように、C35を表面膜上に発現しないことを示す。図1Bは同様に、生きた状態であり(PI陰性)、およびアポトーシスを起こすように誘導されていない(アネキシンV陰性)照射腫瘍細胞も、C35を腫瘍細胞表面膜上に発現しないことを示す。図1Cは、これとは対照的に、生きている(PI陰性)がアポトーシスを起こした(アネキシンV陽性)照射腫瘍細胞が、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗C35抗体によって明瞭に差次的に染色されていることを示す。
（図２）マイトマイシンC薬剤によって誘導されたアポトーシス後における乳腺腫瘍細胞のC35の表面染色を示す。図2Aは、アポトーシスを起こしていない(アネキシンV陰性)未処置生細胞(PI陰性)がC35を、抗C35抗体とアイソタイプ対照抗体による染色の差が見られないことから明らかなように、表面膜上に発現していないことを示す。図2Bは同様に、生きた状態であり(PI陰性)、およびアポトーシスを起こすように誘導されなかった(アネキシンV陰性)マイトマイシンC処置腫瘍細胞も、C35を腫瘍細胞表面膜に発現しないことを示す。図2Cは対照的に、生きている(PI陰性)がアポトーシスを起こす(アネキシンV陽性)マイトマイシンC処置腫瘍細胞が、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗C35抗体によって明瞭に差次的に染色されることを示す。
（図３）図3A〜3Cは、抗C35モノクローナル抗体が、C35+腫瘍の壊死領域に局在することを示す。BALB/cマウスの左右の脇腹に、ヒトC35がトランスフェクションされたか、またはされなかった同系の非小細胞肺癌由来のLine 1腫瘍細胞が移植された。C35タンパク質の発現は、抗C35抗体による免疫組織化学的染色によって確認された。インビボにおける成長の14日後に、動物に125I標識抗C35抗体が静脈内注射された。放射標識抗体が注射された120時間後に動物を屠殺し、ならびにC35陽性腫瘍中およびC35陰性腫瘍中の抗C35抗体濃度を、腫瘍切片をフィルムに露光して決定した。図4Aは、放射標識された抗C35抗体がC35陽性腫瘍のみに集中し、C35陰性腫瘍には集中しないことを示す。図4Bおよび図4Cは、腫瘍内における完全細胞の標識およびH&E染色の分布の比較であり、このような条件では、標識された抗C35抗体は、C35陽性腫瘍の壊死領域に特異的に集中することがわかる。
（図４）タキソール(Taxol)(商標)(パクリタキセル)がアポトーシスを誘導し、アポトーシス腫瘍細胞の表面へのC35の露出を生じることを示す。0.5 uMのタキソール(Taxol)(商標)による処置の24時間後に、21MT1腫瘍細胞をアネキシンV-FITC、ヨウ化プロピジウムで、および100 ngの抗C35抗体1F2(濃い線)かアイソタイプ対照抗体(斜線の塗りつぶし)のいずれかで染色した。いずれの抗体も、Alexa-647に直接接合させた。ヒストグラムは、アポトーシスを起こした細胞(アネキシンV陽性/PI陰性)をゲーティングした。抗体は、PAB緩衝液(図3A)、100倍モル過剰の組換えC35タンパク質(図3B)、または100倍モル過剰のβ-ガラクトシダーゼタンパク質(図3C)でプレインキュベーションした。
（図５）Colau.C35腫瘍細胞が移植されたスイスヌードマウスにおいて、131I標識1B3抗C35マウスモノクローナル抗体による放射免疫療法と化学療法(フルオロウラシル、150 mg/kg；ロイコボリン、100 mg/kg)の併用が腫瘍容積に及ぼす効果を示す。化学療法は、腫瘍移植後の11日目に開始され、および300μCiの131I標識1B3抗C35抗体が14日目に投与された。腫瘍の成長は、最長8週間にわたって追跡された。
（図６）化学療法と放射免疫療法の併用様式の処置が腫瘍容積に及ぼす効果を示す。0日目にスイスヌードマウスにColau.C35細胞が移植された。化学療法：15日目および18日目に、2 mg/kgのシスプラチンを静脈内投与。18日目に、180/120 mg/kgの5FU/LVを静脈内投与。放射免疫療法：300μCi(〜50μg)の131I標識マウス1B3抗C35 IgGが21日目に投与。
（図７）C35を天然で発現するヒトの乳腺および結腸の腫瘍、ならびにC35がトランスフェクションされたヒトの乳腺および結腸の腫瘍における発現が同等であることを示す。細胞は、Alexa-647を接合した抗C35 MAb 1F2またはアイソタイプ対照で染色された。MFI Xは、1F2の平均蛍光強度/アイソタイプ対照の平均蛍光強度の比である。正常乳腺上皮に由来するH16N2、および乳腺腫瘍であるMDAMB231、結腸腫瘍であるColauは、低基礎レベルのC35を発現する。乳癌に由来する21MT1は、天然で高レベルのC35を発現する。ColauおよびMDA231には、空のベクター(ヌル)またはヒトC35組換えベクターを形質導入した。全ての腫瘍をインビボで成長させ、腫瘍を摘出し、解離して染色した。
（図８）体重減少によって判定された、スイスヌードマウスにおける化学療法、放射免疫療法、および併用療法の毒性を示す。
（図９）6×His標識組換えヒトC35(rhC35)のLys-Cエンドプロテアーゼによる完全な消化後における推定ペプチド断片を示す。アミノ末端の6×Hisタグの付加を含むrhC35の全配列を示す。アミノ酸の位置に、天然のヒトC35配列のアミノ末端のメチオニン(太字のM)に対する番号を付す。1番目および3番目のリシン(K)残基の星印は、これらの位置における消化の効率が低く、およびいくつかのより長い断片が生じ得ることを意味する。
（図１０）各抗体が結合するC35の断片を示す、1B3(Mab 11)または1F2と抗6×Hisタグによるウェスタンブロットの染色の比較を示す。
（図１１）MAb 165がC35特異的であることを示す。141D10組換えワクシニアウイルスをHeLa細胞にUH8組換えワクシニアウイルスと同時に感染させた。結果として得られた分泌型抗体を、C35または対照タンパク質A27L(ワクシニアウイルスタンパク質)に対する結合に関してELISAで検討した。
（図１２）総用量40 mg/kgのマウスC35抗体1B3(用量20 mg/kg)および1F2(用量20 mg/kg)と用量30 mg/kgのパクリタキセル(TAXOL(登録商標))の組み合わせは、MDA-MB231.hC35腫瘍が移植されたマウスにおける腫瘍成長の低減に有効であることを示す。
（図１３）C35に対するMAb 163の腫瘍特異的な結合を示すウェスタンを示す。レーン1：大腸菌から精製された組換えヒトC35タンパク質(rC35)(100 ng/レーン)；レーン2：21MT1-Dヒト乳腺腫瘍細胞溶解物(100,000細胞相当物/レーン)；およびレーン3：H16N2正常不死化ヒト乳腺細胞系列溶解物(100,000細胞相当物/レーン)。キロダルトンで示す分子量マーカーを図の左側に示す。
（図１４）C35陽性21MT1-D乳癌細胞系列およびC35陰性H16N2正常乳腺細胞系列を使用したフローサイトメトリーによる、抗C35モノクローナル抗体MAb 163およびMab 11のC35特異性の解析を示す。アイソタイプ対照モノクローナル抗体による染色を、黒く塗りつぶした領域で示す。抗C35抗体による染色を、白抜きの線で示す。
（図１５）ヒト乳腺細胞系列を対象としたMAb 163による免疫蛍光染色を示す。MAb 163はC35+細胞で高レベルで蛍光を発することから、MAb 163がC35と結合することがわかる。
（図１６）Biacore解析の1:1の動態モデルを使用して測定されたMAb 163の結合親和性を示す。BIAevaluationソフトウェアを使用し、MAb 163のKaおよびKdが以下のように計算された：(a)ka(1/Ms)＝2.84e5；(b)kd(1/s)＝9.59e-4；(c)KA(1/M)＝2.96e8；および(d)KD(nM)＝3.38。
（図１７）Lys-Cエンドプロテアーゼによる6-His標識組換えヒトC35(rhC35)の部分消化後における推定ペプチド断片を示す。
（図１８）クーマシーブルー染色および抗6-His染色による、組換えヒトC35のLys-Cによる消化後に観察されたペプチド断片。比較用に、推定断片をブロットの左側に示す。
（図１９）クーマシーブルーおよび抗6-Hisブロットに対する、ウェスタンブロットのMAb 163による染色の比較を示す(MAb 163が結合するC35の断片を示す)。比較用に、推定断片をブロットの左側に示す。MAb 163の結合は、推定断片1〜4に対応する断片については認められるが、推定断片5〜11に対応する断片については認められない。
（図２０）MAb 163のエピトープ特異性のグラフ表示。MAb 163は、C35のアミノ酸残基48〜87内のエピトープを認識する(アミノ酸の位置に、天然のヒト配列のアミノ末端のメチオニンに対する番号を付す)(図9参照)。この領域は、以下のアミノ酸配列を有する。
2009544574.tif 000002
（図２１）C35+/Her2+ BT474乳腺腫瘍細胞系列の増殖を阻害するために、H16N2 C35-/Her2-正常乳腺細胞系列と比較時の、抗C35抗体MAb 163、Mab 11(キメラ1B3)、Mab 76(キメラ1F2)、またはハーセプチン(Herceptin)(抗ヒトHer2)を使用した増殖アッセイ法の結果を示す。いずれの乳腺細胞系列ともCD20陰性であるために、リツキシマブ(Rituxan)(抗ヒトCD20)を陰性対照として使用した。ハーセプチンを、Her2陽性細胞系列に対する正の対照として使用した。
（図２２）ウサギポリクローナル抗C35を使用したウェスタンブロッティングによる、C35+ 21MT1乳腺細胞からのnC35の免疫沈降を示す。数字「15」は、15キロダルトンの分子量マーカーを示す。数字「163」は、mAb 163モノクローナル抗体を意味する。「陰性IgG」は、IgG陰性対照抗体を意味する。
（図２３）アドリアマイシン(「ADM」)単独投与後；マウス抗C35抗体1F2および1B3の併用投与後；アドリアマイシン、1F2および1B3の併用投与後；アドリアマイシンおよび1B3の併用投与後；アドリアマイシンおよび1F2の併用投与後；アドリアマイシンおよびIgGアイソタイプ抗体(「iso」)の併用投与後；ならびに抗体なし(「なし」)の場合の、MDA231.rvC35腫瘍細胞が移植されたマウスの平均腫瘍容積(cm2)を示す。黒い矢印は、腫瘍移植後の3日目および10日目におけるアドリアマイシンの投与を示す。白い矢印は、腫瘍移植後の3日目、7日目、10日目、13日目、17日目、20日目、および23日目における抗体投与の実施を意味する。測定は、移植後の6日目に開始した。
（図２４）アドリアマイシン(「ADM」)単独投与後；マウス抗C35抗体1F2および1B3の併用投与後；アドリアマイシン、1F2および1B3の併用投与後；アドリアマイシンおよび1B3の併用投与後；アドリアマイシンおよび1F2の併用投与後；アドリアマイシンおよびIgGアイソタイプ抗体(「iso」)の併用投与後；ならびに抗体なし(「なし」)の場合の、MDA231.rvC35腫瘍細胞が移植されたマウスの腫瘍容積の平均変化(%)を示す。黒い矢印は、腫瘍移植後の3日目および10日目におけるアドリアマイシンの投与を示す。白い矢印は、腫瘍移植後の3日目、7日目、10日目、13日目、17日目、20日目、および23日目における抗体投与の実施を意味する。測定は、移植後の6日目に開始した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
概略
複数の研究で、アポトーシスを起こした細胞の表面膜が変化することが報告されている。このような変化の中でも顕著なものは、表面膜の外層へのホスファチジルセリンの露出を反映した、リン脂質の非対称性の早期喪失である。この表面膜組成の変化は、マクロファージによるアポトーシス細胞を認識および除去を高めることが報告されている(Fadok, V.A., et al., J. Immunol. 148:2207-2216 (1992))。露出したホスファチジルセリン分子に対する抗凝固性のアネキシンVの結合によってアポトーシスを起こした細胞の検出を可能とする一般的な方法が開発されている(Koopman, G., et al., Blood 84:1415-1420 (1994))。
【００２５】
さらにより一般的な関心が寄せられるのは、他の表面膜分子、特にタンパク質の発現および露出が、アポトーシスを起こした細胞では変化し得るという可能性についてである。細胞内で発現すると推定される、アポトーシスに特異的なタンパク質に関する複数の報告がある(Grand, R.J.A., et al., Exp. Cell Res. 218:439-451 (1995)；米国特許第5,972,622号、「Method of Detecting Apoptosis Using an Anti-Human GP46 Monoclonal Antibody」、1997年2月6日出願；1999年10月26日公開)。さらに直接関連するのは、アポトーシスを起こした細胞の表面膜およびミトコンドリア膜に結合するようになるが正常細胞では検出されない38 kDのタンパク質抗原を検出するモノクローナル抗体に関する報告である(米国特許第5,935,801号、「Monoclonal Antibody that Detects Apoptotic Antigen」、1996年3月29日出願；1999年8月10日発行)。アポトーシス角質細胞(Casciola-Rosen, L.A., et al., J. Exp. Med. 179：1317-1330 (1994))、および胚発生期にアポトーシスを起こした細胞(Rotello, R.J., et al., Development 720:1421-1431 (1994))の表面上または表面の近傍で差次的に露出されるようになる他の抗原が報告されている。3つの特定のタンパク質抗原CD3、CD69、およびCD25が、アポトーシスを起こした胸腺細胞の表面膜上で上方制御されることが報告されている(Kishimoto, H., et al., J. Exp. Med. 181:649-655 (1995))。個別の場合において、これらは正常な細胞および組織におけるアポトーシスの表面マーカーである。同じマーカーがアポトーシスを起こした腫瘍細胞に結合している可能性もあるものの、これは、アポトーシスを起こした腫瘍細胞と、正常組織のターンオーバーの一部としてアポトーシスを起こした正常細胞との区別を可能としない。したがって、これは、癌処置時の標的として有用ではないと考えられる。
【００２６】
発明者らは、化学療法または放射線によって誘導されたアポトーシスの条件で腫瘍細胞膜上に露出される、細胞内における腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原のサブセットが存在すること、およびこれが、腫瘍内において放射性同位元素もしくはトキシンと接合させた抗体を濃縮する際の有効な標的と成り得ることを明らかにした。このような抗原に対する抗体を使用する方法は特に有効であると考えられる。なぜなら、癌処置における標準的なアポトーシス誘導性の化学療法および放射線療法の治療的有益性を高める可能性があるためである。本発明では、放射線および/または化学療法によってアポトーシスを起こすように誘導された腫瘍細胞の表面膜上に露出される一群の細胞内腫瘍抗原として、細胞膜の内側に結合する腫瘍特異的抗原−特に、プレニル化モチーフを発現するC35癌特異的抗原などの差次的に発現される分子−が同定される。
【００２７】
本発明は、1つの態様では、腫瘍の根絶を促すための化学療法または放射線療法によるアポトーシス(好ましくは大規模なアポトーシス)の誘導に作用する方法について説明する。これは、腫瘍細胞で差次的に発現される一群の細胞内マーカーが、アポトーシス細胞の表面に露出され、そこで毒性作用物質(payload)に非接合状態または接合状態で投与可能な特異的な抗体の標的となり得るという新たな観察に基づく。この処置法の利点は複数ある。例えばこの方法は、接合型抗体によって、毒性作用物質を腫瘍環境へ送達して、アポトーシス標的の近傍における他の非アポトーシス腫瘍細胞を破壊することが可能である。加えてこの方法は、通常であれば、例えば、表面膜の内容物の変化によって明らかとなるように、アポトーシス誘導性の化学療法剤を用いた処置によって、アポトーシス過程を開始している生細胞が、アポトーシスの進行を逆転させること、および成長を再開することを防ぐ(Hammill, A.K., et al., Exp. Cell Res. 251：16-21 (1999))。
【００２８】
アポトーシス細胞を標的とする本発明は、壊死細胞を標的とする先行発明と区別されるべきである(米国特許第6,071,491号、「Detection of Necrotic Malignant Tissue and Associated Therapy」、1999年8月9日出願；2000年6月6日発行)。壊死は、細胞内内容物の細胞外腫瘍環境への放出につながる。このような細胞内抗原の一部は、そのような環境中に蓄積し、および特異的な抗体の標的となり得る。しかしながら壊死は、活性酸素が存在しないために、放射線療法、またおそらくは放射免疫療法に比較的耐性である、より大きな腫瘍の低酸素領域と関連する。化学療法剤を用いた処置の後に、壊死のある程度の増加は見られるが(Desrues B., et al., Br. J. Cancer 72:1076-82, (1995))、化学療法剤の主要な作用はアポトーシスを増やすことである。したがって壊死は、癌の免疫療法、特に腫瘍の拡散に関与する、より小さな腫瘍および微小転移巣の根絶に対して、アポトーシスより適切な標的ではない。したがって、より小さな腫瘍および微小転移巣の根絶に有効な方法は、侵襲性の癌の処置に特に有用である。
【００２９】
本発明は、C35の一部分(SEQ ID NO:2)と同一の大きな領域を有する抗原(SEQ ID NO:966)を含む842の癌抗原について開示された、米国特許出願US 2002/0052308 A1(2002年5月2日)の開示と区別されるべきである。US 2002/0052308 A1では、「単独、または他のタイプの処置(例えば放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、および抗腫瘍剤)と併用された」842の癌抗原に対する抗体の投与について全般的に開示されている(205ページ、段落［0229］)。しかしながら、公開されている出願には、C35関連標的に対して有効であることは特定されておらず、トキシンを接合したC35特異的抗体は、化学療法剤、放射線療法剤、または他の抗腫瘍剤などのアポトーシス誘導剤の投与によって腫瘍細胞のアポトーシスが誘導された後に投与されるべきである。実際に、C35とは対照的に、腫瘍細胞表面膜上に天然で発現される抗原に対する化学療法と放射免疫療法の併用に関する多数の研究は、最適な結果は、化学療法に先立つ、すなわちアポトーシスが誘導される前における放射免疫治療用抗体の投与によって得られると結論している(DeNardo S.J., et al., Anticancer Res. 18:4011-18, (1998)；Clarke K., et al., Clin. Cancer Res. 6:3621-28, (2000)；Burke P.A., Cancer 94:1320-31 (2002)；Stein, R. et al., Cancer 94:51-61 (2002)；Odonnel R.T., et al., Prostate 50:27-37 (2002))。アポトーシスが、プレニル化されて未処置腫瘍細胞の膜の内側と結合される、表面膜におけるC35を含む一群の細胞内抗原の露出を招くという発見は、全体が参照により本明細書に組み入れられるUS 2005/0158323で説明されている。US 2005/0158323も、このクラスの標的分子に対する放射免疫療法が、抗体が腫瘍部位に、アポトーシス誘導剤の投与によって腫瘍細胞のアポトーシスが誘導されるのとほぼ同じ時間、またはその短時間後に蓄積するように、最も適切に投与されることについて説明している。US 2002/0052308 A1には、C35関連癌抗原の細胞内における局在については記載されておらず、治療効果を得るためにどのように同抗原に対する抗体が投与されるべきかについても記載されていない。US 2002/0052308 A1にも、C35に対する2つまたは2つ以上の抗体が、化学療法剤と共に投与されるべきであるとは記載されていない。
【００３０】
Her2などの、細胞外で発現された抗原を用いて、タンパク質のさまざまなエピトープに対する2つの異なる抗Her2抗体の投与が、インビボおよびインビトロにおいて抗腫瘍活性を生じることを観察した研究者もいる。全体が参照により本明細書に組み入れられる、Spiridon et al., Clin. Cancer Res. 8:1720-30 (2002)。しかしながら、Spiridonらは、上述の細胞外で発現されたタンパク質Her2、C35が、アポトーシスと関連して細胞表面上で発現されるようになる細胞内抗原であることを観察している。
【００３１】
I．定義
「1つの(aまたはan)」実体という表現は、1つまたは複数の実体を意味することに留意されたい；例えば「1つのC35抗体(a C35 antibody)」とは、1つまたは複数のC35抗体を意味すると理解されたい。したがって、「1つの(aまたはan)」、「1つまたは複数の(one or more)」、および「少なくとも1つの(at least one)」といった表現は、本明細書で互換的に使用され得る。
【００３２】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という表現は、単数の「ポリペプチド」、ならびに複数の「ポリペプチド」を含むことが意図され、ならびにアミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線連結している単量体(アミノ酸)を含む分子を意味する。「ポリペプチド」という表現は、2個またはそれ以上のアミノ酸の任意の鎖を意味し、特定の長さの生成物を意味しない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸の鎖」、または2個またはそれ以上のアミノ酸の鎖を意味するように使用される他の任意の表現は「ポリペプチド」の定義に含まれ、および「ポリペプチド」という表現は、これらの任意の表現に代えて、または互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という表現は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基(protecting/blocking group)による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然のアミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を意味することも意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来する場合があるほか、組換え手法によって作られる場合もあるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。これは、化学合成を含む任意の様式で作られる場合がある。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、約3アミノ酸もしくはそれ以上、5アミノ酸もしくはそれ以上、10アミノ酸もしくはそれ以上、20アミノ酸もしくはそれ以上、25アミノ酸もしくはそれ以上、50アミノ酸もしくはそれ以上、75アミノ酸もしくはそれ以上、100アミノ酸もしくはそれ以上、200アミノ酸もしくはそれ以上、500アミノ酸もしくはそれ以上、1,000アミノ酸もしくはそれ以上、または2,000アミノ酸もしくはそれ以上のサイズをとり得る。ポリペプチドは、明確な3次元構造をとり得るが、必ずしもそのような構造をとる必要はない。明確な3次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると表現され、および明確な3次元構造を有さず、むしろ多種多様な立体構造をとり得るポリペプチドは、折りたたまれてないと表現される。本明細書で用いられるように、糖タンパク質という表現は、タンパク質にアミノ酸残基、例えばセリン残基やアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有の側鎖を介して結合される少なくとも1つの糖部分に結合しているタンパク質を意味する。
【００３４】
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体という表現は、その天然の環境には存在しないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要ない。例えば、単離されたポリペプチドは、その本来のまたは天然の環境から取り出され得る。任意の適切な手法で分離されたか、分画されたか、または部分的もしくは実質的に精製された天然のポリペプチドもしくは組換えポリペプチドのように、宿主細胞で発現される、組換え的に作製されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明に鑑みて、単離されていると見なされる。
【００３５】
本発明のポリペプチドには、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびこれらの任意の組み合わせも含まれる。「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という表現は、本発明のC35抗体または抗体ポリペプチドを意味する場合は、対応する天然の抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、本明細書で言及された特定の抗体断片のほかに、タンパク質の分解断片ならびに欠失断片を含む。C35抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上記の断片、ならびにアミノ酸の置換、欠失、または挿入のために変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。変異体は、天然で生じる場合もあれば、非天然で生じる場合もある。非天然の変異体は、当技術分野で既知の変異誘発法で作製可能である。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を含む場合がある。C35抗体の変異体は、ヒト化バージョンの抗体、ならびに親和性成熟または最適化されたC35抗体を含む。親和性の最適化は、当技術分野で周知の常用の方法で実施することができる。あるいは、本発明の抗体を親和性を高める好ましい方法は、US 2002 0123057 A1に開示されている。本発明のC35抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、天然のポリペプチドには見られない付加的な特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例には、融合タンパク質が含まれる。本明細書で用いる、C35抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、機能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化された1個または複数個の残基を有する対象ポリペプチドを意味する。「誘導体」には、20個の標準アミノ酸の1つまたは複数の天然のアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンはプロリンと置換可能であり；5-ヒドロキシリシンはリシンと置換可能であり；3-メチルヒスチジンはヒスチジンと置換可能であり；ホモセリンはセリンと置換可能であり；およびオルニチンはリシンと置換可能である。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」という表現は、単数の核酸ならびに複数の核酸を含むことが意図され、ならびに単離された核酸分子または構築物、例えば伝令RNA(mRNA)やプラスミドDNA(pDNA)を意味する。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合、または通常でない結合(例えばペプチド核酸(PNA)中に見られるようなアミド結合)を含む場合がある。「核酸」という表現は、任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えばポリヌクレオチド中に存在するDNAまたはRNAの断片を意味する。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドという表現は、その天然の環境から取り出された核酸分子であるDNAまたはRNAが意図される。例えば、ベクター中に含まれるC35抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的で単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドの他の例は、異種宿主細胞中に維持されている組換えポリヌクレオチドか、または溶液状の(部分的もしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたRNA分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロのRNA転写物を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸はさらに、合成的に作製されたこのような分子を含む。加えてポリヌクレオチドもしくは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントを含む場合もあれば含まない場合もある。
【００３７】
本明細書で用いられる「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)は、アミノ酸に翻訳されないものの、コード領域の一部であると見なされる場合があるが、任意の隣接する配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。本発明の2つもしくはそれ以上のコード領域は、1つのポリヌクレオチド構築物中に、例えば1つのベクター上に、または別のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別の(異なる)ベクター上に存在し得る。また任意のベクターは、1つのコード領域を含む場合があるほか、2個もしくはそれ以上のコード領域を含む場合があり、例えば1つのベクターは、免疫グロブリンの重鎖可変領域および免疫グロブリンの軽鎖可変領域を別にコードする場合がある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、異種コード領域を、C35抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合状態もしくは非融合状態でコードする場合がある。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドや異種の機能性ドメインなどの専門のエレメントまたはモチーフを含むが、これらに限定されないエレメントまたはモチーフを含む。
【００３８】
ある態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合は、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、1つまたは複数のコード領域に機能的に付随しているプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳の制御エレメントを含む場合がある。機能的に付随している場合、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域は、遺伝子産物の発現が調節配列の影響下または制御下に配置されるような方法で、1つまたは複数の調節配列に付随している。例えば、2つのDNA断片(ポリペプチドのコード領域、およびこれに付随したプロモーターなど)は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写を生じる場合に、ならびに2つのDNA断片間の連結の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を誘導する能力に干渉しないか、またはDNAテンプレートが転写され得る能力に干渉しない場合に、「機能的に付随している」。したがってプロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を実施可能な場合に、ポリペプチドをコードする核酸に機能的に付随している。プロモーターは、DNAの実質的な転写を所定の細胞のみで誘導する細胞特異的なプロモーターの場合がある。細胞特異的な転写を誘導するために、プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルをポリヌクレオチドに機能的に付随させることができる。本明細書では、適切なプロモーターおよび他の転写制御領域について開示する。
【００３９】
さまざまな転写制御領域が当業者に既知である。これには、サイトメガロウイルス(最初期プロモーター、イントロン-Aに結合)、シミアンウイルス40(初期プロモーター)、およびレトロウイルス(ラウス肉腫ウイルスなど)に由来するプロモーターおよびエンハンサーのセグメントなどがあるが、これらに限定されない脊椎動物の細胞で機能する転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ-グロビンなどの脊椎動物の遺伝子に由来する転写制御領域、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御可能な他の配列を含む。他の適切な転写制御領域は、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導型のプロモーター(例えばインターフェロンやインターロイキンによって誘導されるプロモーター)を含む。
【００４０】
同様に、さまざまな翻訳制御エレメントが当業者に既知である。これには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび終止コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント(特に、内部リボソームエントリー部位すなわちCITE配列とも呼ばれるIRES)が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば伝令RNA(mRNA)の状態のRNAである。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸のコード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの分泌を誘導する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする他のコード領域と結合している場合がある。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列を有し、これらの配列は、伸長途上のタンパク質の鎖の粗面小胞体を越える輸送が開始される時点で、成熟タンパク質から切り離される。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドが一般に、完全な、すなわち「完全長の」ポリペプチドから切断されて分泌型すなわち「成熟」型のポリペプチドを産生する、ポリペプチドのN末端に融合しているシグナルペプチドを有することを理解している。ある態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のシグナルペプチドが使用されるか、または機能的に付随したポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持する配列の、機能性の誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチド、またはその機能性の誘導体を使用することができる。例えば、野生型のリーダー配列を、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)またはマウスのβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換することができる。
【００４３】
本発明は、特定のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体に関する。天然の抗体などの完全長の抗体であると特に明記した部分を除いて、「C35抗体」(本明細書では「抗C35抗体」という表現と互換的に使用される)という表現は、完全長の抗体、ならびにこのような抗体の抗原結合断片、変異体、類似体、または誘導体、例えば、天然の抗体分子もしくは免疫グロブリン分子、または抗体分子と類似の様式で抗原に結合する改変型の抗体分子または断片を含む。
【００４４】
「抗体」および「免疫グロブリン」という表現は、本明細書で互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、および通常は、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物の系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的詳しくわかっている。これについては例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)を参照されたい。
【００４５】
以下に詳細に説明するように、「免疫グロブリン」という表現は、生化学的に識別可能な、さまざまな広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖が、いくつかのサブクラスを含む(例えばγ1〜γ4)、γ、μ、α、δ、またはεに分類されることを理解すると考えられる。この鎖の性質によって、抗体の「クラス」はそれぞれIgG、IgM、IgA IgG、またはIgEに決定される。免疫グロブリンのサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1などは詳しく特徴が解析されており、機能の特化を付与することが既知である。これらのクラスおよびアイソタイプの個々の修飾されたバージョンは、本発明の開示に鑑みて、当業者によって容易に識別されるので、本発明の範囲に含まれる。免疫グロブリンの全てのクラスが明瞭に本発明の範囲に含まれ、以下の議論は一般に、IgGクラスの免疫グロブリン分子に関する。IgGに関しては、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約23,000ダルトンの2つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が53,000〜70,000ダルトンの2つの同一な重鎖ポリペプチドを含む。4本の鎖は典型的には、「Y」字の形状でジスルフィド結合によって連結し、ここで軽鎖は、「Y」字の開口部から始まって可変領域の全体へと続く重鎖を括る形となる(bracket)。
【００４６】
軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。個々の重鎖のクラスは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかと結合可能である。一般に、軽鎖および重鎖は相互に共有結合的に結合しており、ならびに2つの重鎖の「尾部」部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって作られる場合に、共有結合のジスルフィド結合または非共有結合によって相互に結合している。重鎖の場合、アミノ酸配列は、Y字の二又のN末端から各鎖の基部のC末端へ進む。
【００４７】
軽鎖も重鎖も構造的および機能的な相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」という表現は、機能面に関して使用される。この点に関して、軽鎖(VL)および重鎖(VH)の両部分の可変ドメインが抗原認識および抗原特異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖の定常ドメイン(CL)および重鎖の定常ドメイン(CH1、CH2、またはCH3)は、分泌、経胎盤移動(transplacental mobility)、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣習的に、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位すなわちアミノ酸末端から遠位に向かうにしたがって数が大きくなる。N末端部分は可変領域であり、およびC末端部分は定常領域であり；CH3ドメインおよびCLドメインは実際に、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４８】
上述したように、可変領域によって、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、これに特異的に結合することが可能となる。すなわち、抗体のVLドメインおよびVHドメイン、または相補性決定領域(CDR)のサブセットが結合して、3次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この4元抗体構造は、Y字の個々のアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。具体的には抗原結合部位は、VH鎖およびVL鎖の各鎖上の3つのCDRによって規定される。場合によっては、例えば、ラクダ種に由来する特定の免疫グロブリン分子、またはラクダの免疫グロブリンを元に改変された免疫グロブリン分子の場合は、完全な免疫グロブリン分子は重鎖のみからなり、軽鎖は含まない。これについては例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)を参照されたい。
【００４９】
天然の抗体では、各抗原結合ドメイン中に存在する6つの「相補性決定領域」すなわち「CDR」は、水性環境中で抗体がその3次元構造をとると仮定した場合に、抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置するアミノ酸の短い非隣接配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメイン中の残りのアミノ酸は、分子間のバラツキが小さい。フレームワーク領域はβ-シート構造を大きくとり、かつCDRはβ-シート構造を連結し、場合によってはβ-シート構造の一部を形成するループを形成する。したがってフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用によって、正しい方向にCDRの位置決めを可能とする足場を形成するように作用する。位置決めされたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を決定する。この相補的な表面は、抗体の、その同系エピトープに対する非共有結合を促進する。当業者であれば、CDR領域およびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸を、任意の重鎖または軽鎖の可変領域によって容易に同定可能である。というのは、それらは正確に決定されているからである(全体が参照により本明細書に組み入れられる、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)；およびChothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)を参照)。
【００５０】
当技術分野で使用されるか、および/または受け入れられている表現に、2つもしくはそれ以上の定義がある場合、特に明記しない限りにおいて、本明細書で用いられる表現の定義は、そのような全ての意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖と軽鎖の両ポリペプチドの可変領域中に存在する非隣接抗原結合部位を表現する「相補性決定領域」(「CDR」)という表現の使用である。この特定の領域については、参照により本明細書に組み入れられる、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)、およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載され、その定義は、相互に比較される場合、重複性またはサブセットのアミノ酸残基を含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のCDRを意味するための、いずれかの定義の使用は、本明細書で定義されて使用される表現の範囲に含まれることが意図される。上記の引用された各参考文献で定義される、CDRを含む適切なアミノ酸残基を、比較として表1に示す。特定のCDRを含む正確な残基数は、CDRの配列およびサイズに依存して変動する。当業者であれば常用の手順で、どの残基が、抗体の可変領域のアミノ酸配列を生じる特定のCDRを含むかを決定することができる。
【００５１】
（表１）CDRの定義1
2009544574.tif 000003
1表1中の全てのCDRの定義のナンバリングは、Kabat et al.(後述)に記載されたナンバリングの慣例に準じる。
【００５２】
Kabatらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメインの配列のナンバリングシステムについても定義している。当業者であれば、「Kabatナンバリング」の系を、任意の可変ドメイン配列に、配列そのもの以外に、任意の実験データに依存することなく明確に割り当てることができる。本明細書で用いる、「Kabatナンバリング」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services、「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)に記載されたナンバリングシステムを意味する。特に記載がなければ、本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体中の特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングは、Kabatナンバリングシステムに従う。
【００５３】
ラクダ種では、VHHと呼ばれる重鎖可変領域が、抗原結合ドメインの全体を形成する。ラクダのVHH可変領域と、通常の抗体に由来する可変領域(VH)間の主な差は、(a)VHH中の対応領域と比較してVHの軽鎖接触面中の疎水性アミノ酸が多い、(b)VHH中のCDR3が長い、ならびに(c)VHH中のCDR1とCDR3間におけるジスルフィド結合の存在率が高いことを含む。
【００５４】
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、1本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばFab、Fab'、およびF(ab')2、Fd、Fv、1本鎖Fv(scFv)、1本鎖抗体、ジスルフィド結合したFv(sdFv)、VLもしくはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーによって作製される断片、ならびに抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書に開示されるC35抗体に対する抗Id抗体を含む；これについては例えば、Hudson, P.J. and Couriau, C., Nature Med. 9：129-134 (2003)；米国特許出願公開第20030148409号；米国特許第5,837,242号も参照)を含むが、これらに限定されない。例えばscFv分子は当技術分野で既知であり、例えば米国特許第5,892,019号に記載されている。本発明の免疫グロブリンすなわち抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスの場合がある。
【００５５】
1本鎖抗体を含む抗体断片は可変領域のみを含む場合があるほか、以下の全体もしくは以下の部分を併せて含む場合がある：ヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン。本発明には、ヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを有する可変領域の任意の組み合わせを含む抗原結合断片も含まれる。本明細書に開示される診断法および治療法に使用される抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の起源動物に由来する場合がある。好ましくは抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の態様では、可変領域は、当初からコンドロイチン化(condricthoid)されている可能性がある(例えばサメ由来)。本明細書で用いる「ヒト」抗体は、上記の文献、および例えば、Kucherlapati et al.による米国特許第5,939,598号に記載されているように、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、およびヒト免疫グロブリンのライブラリーから、または1つまたは複数のヒトの免疫グロブリンがトランスジェニックであり、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から、単離される抗体を含む。
【００５６】
本明細書で用いられる「重鎖部分」という表現は、免疫グロブリンの重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば上位、中位、および/または下位のヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはそれらの変異体もしくは断片の少なくとも1つを含む。例えば、本発明に使用される結合ポリペプチドは、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメインおよびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖；またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む場合がある。別の態様では、本発明のポリペプチドは、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明に使用される結合ポリペプチドは、CH2ドメインの少なくとも一部分(例えばCH2ドメインの全体または一部)を欠く場合がある。上述したように、当業者であれば、これらのドメイン(例えば重鎖部分)が、天然の免疫グロブリン分子に由来するアミノ酸配列を変更するように修飾可能なことを理解すると考えられる。
【００５７】
本明細書に開示される特定のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体では、多量体の1つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第2のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同一である。あるいは、本発明の重鎖部分を含む単量体は同一ではない。例えば個々の単量体は、例えば二重特異性抗体を形成する異なる標的結合部位を含む場合がある。
【００５８】
本明細書に開示される診断法および処置法に使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来する場合がある。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、IgG1分子に由来するCH1ドメイン、およびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含む場合がある。別の例では、重鎖部分は、部分的にIgG1分子に由来し、および部分的にIgG3分子に由来するヒンジ領域を含む場合がある。別の例では、重鎖部分は、部分的にIgG1分子に由来し、および部分的にIgG4分子に由来するキメラのヒンジを含む場合がある。
【００５９】
本明細書で用いられる「軽鎖部分」は、免疫グロブリンの軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは軽鎖部分は、VLドメインまたはCLドメインの少なくとも一方を含む。
【００６０】
本明細書に開示されるC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、エピトープすなわち抗原の一部分、例えば、抗体が認識するかまたは特異的に結合する標的ポリペプチド(C35)に関して、記述または特定化され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は、「エピトープ」すなわち「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは1つのエピトープを含む場合があるが、典型的には少なくとも2つのエピトープを含み、かつ抗原のサイズ、構造、およびタイプに依存して任意の数のエピトープを含む場合がある。また標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチドエレメントの場合があるか、または同エレメントを含む場合があり、例えばエピトープは糖側鎖を含む場合があることに留意されたい。
【００６１】
抗体に対するペプチドまたはポリペプチドのエピトープの最小サイズは、約4〜5アミノ酸であると考えられている。ペプチドまたはポリペプチドのエピトープは好ましくは、少なくとも7アミノ酸、より好ましくは少なくとも9アミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約15〜約30アミノ酸を含む。CDRは、その3次構造状態の抗原性のペプチドまたはポリペプチドを認識可能なので、エピトープを含むアミノ酸は隣接している必要はなく、および場合によっては、同じペプチド鎖上に存在していなくともよい。本発明では、本発明のC35抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドのエピトープは、C35の少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、より好ましくは少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、または約15〜約30個の隣接もしくは非隣接のアミノ酸の配列を含む。
【００６２】
「特異的に結合する」という表現は一般に、抗体がエピトープに、その抗原結合ドメインを介して結合することを意味し、および結合は、抗原結合ドメインとエピトープ間における、ある程度の相補性を生じることを意味する。この定義によれば、抗体はエピトープに、その抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合する場合より容易に結合する場合に、エピトープに「特異的に結合する」と表現される。「特異性」という表現は本明細書では、ある抗体があるエピトープに結合する際の相対的な親和性を認定するために使用される。例えば抗体「A」は所与のエピトープに対して、抗体「B」より高い特異性を有すると見なされる場合があるほか、抗体「A」はエピトープ「C」に、関連したエピトープ「D」に対する結合より高い特異性で結合すると表現される場合がある。
【００６３】
「優先的に結合する」という表現は、抗体がエピトープに、関連した、類似の、相同な、または類似性のエピトープに結合する場合より容易に特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、たとえそのような抗体が関連エピトープと交差反応する場合であっても、関連するエピトープより、対象エピトープに結合する可能性が高い場合がある。
【００６４】
非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体の解離定数(KD)よりも小さいKDで第1のエピトープに結合する場合に、第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のKDより少なくとも1桁小さいKDの親和性で第1のエピトープに結合する場合に、第1の抗原に優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のKDより少なくとも2桁小さいKDの親和性で第1のエピトープに結合する場合に、第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。
【００６５】
別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体の解離速度(off rate)(k(off))よりも小さいk(off)で第1のエピトープに結合する場合に、第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のk(off)より少なくとも1桁小さいk(off)の親和性で第1のエピトープに結合する場合に、第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。別の非限定的な例では、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のk(off)より少なくとも2桁小さいk(off)の親和性で第1のエピトープに結合する場合に、第1のエピトープに優先的に結合すると見なされ得る。
【００６６】
本明細書に開示される抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、本明細書に開示される標的ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に、5×10-2 sec-1、10-2 sec-1、5×10-3 sec-1、もしくは10-3 sec-1より小さいか、または等しい解離速度(k(off))で結合すると言われ得る。より好ましくは本発明の抗体は、本明細書に開示される標的ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に、5×10-4 sec-1、10-4 sec-1、5×10-5 sec-1、または10-5 sec-1、5×10-6 sec-1、10-6 sec-1、5×10-7 sec-1、もしくは10-7 sec-1より小さいか、または等しい解離速度(k(off))で結合すると言われ得る。
【００６７】
本明細書に開示される抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、本明細書に開示される標的ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に、103 M-1 sec-1、5×103 M-1 sec-1、104 M-1 sec-1、もしくは5×104 M-1 sec-1を上回るか、または等しい会合速度(on rate)(k(on))で結合すると言われ得る。より好ましくは、本発明の抗体は、本明細書に開示される標的ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に、105 M-1 sec-1、5×105 M-1 sec-1、106 M-1 sec-1、もしくは5×106 M-1 sec-1、または107 M-1 sec-1を上回るか、または等しい会合速度(k(on))で結合すると言われ得る。
【００６８】
抗体はエピトープに、参照抗体のエピトープに対する結合をある程度ブロックする規模で優先的に結合する場合に、所与のエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害するといわれる。競合的な阻害は、当技術分野で既知の任意の方法、例えば競合ELISAアッセイ法で決定することができる。抗体は、所与のエピトープに対する参照抗体の結合を、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、または少なくとも50%、競合的に阻害すると言われ得る。
【００６９】
本明細書で用いられる「親和性」という表現は、個々のエピトープと免疫グロブリン分子のCDRの結合の強度の尺度を意味する。これについては例えば、Harlow et al., Antibodies：A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)の27〜28ページを参照されたい。本明細書で用いる、「結合性(avidity)」という表現は、免疫グロブリンの集団と抗原の複合体の全体的な安定性、すなわち免疫グロブリン混合物と抗原の機能性の組み合わせ強度(functional combining strength)を意味する。これについては例えば、Harlowの29〜34ページを参照されたい。結合性は、特異的なエピトープに対する集団内における個々の免疫グロブリン分子の親和性と、免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連する。例えば、二価のモノクローナル抗体と、ポリマーなどの繰り返しの多いエピトープ構造を有する抗原との相互作用は、高い結合性の1つと言える。
【００７０】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、それらの交差反応性に関して表現または規定される場合もある。本明細書で用いられる「交差反応性」という表現は、1つの抗原に特異的な抗体が第2の抗原と反応する能力；2つの異なる抗原性物質間の関連性の尺度を意味する。したがって抗体は、その形成を誘導する以外のエピトープに結合する場合に、交差反応性を有する。交差反応性を有するエピトープは一般に、誘導性エピトープと同じいくつかの相補的な構造の特徴を含み、場合によっては、当初のエピトープより良好に適合する。
【００７１】
例えば、ある抗体は、関連するが非同一のエピトープ、例えば参照エピトープに対して少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、および少なくとも50%(当技術分野で既知の方法、および本明細書に記載された方法で算出)の同一性を有するエピトープに結合する場合に、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、および50%未満(当技術分野で既知の方法、および本明細書に記載された方法で算出)の同一性を有するエピトープに結合しない場合に、わずかな交差反応性を有するか、または交差反応性を有さないと言われ得る。抗体は、あるエピトープの他の任意のアナログ、オルソログ、またはホモログに結合しない場合に、同エピトープに対して「高度に特異的である」と見なされ得る。
【００７２】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、本発明のポリペプチドに対する、それらの結合親和性に関して表現または規定される場合もある。好ましい結合親和性は、5×10-2 M未満、10-2 M未満、5×10-3 M未満、10-3 M未満、5×10-4 M未満、10-4 M未満、5×10-5 M未満、10-5 M未満、5×10-6 M未満、10-6 M未満、5×10-7 M未満、10-7 M未満、5×10-8 M未満、10-8 M未満、5×10-9 M未満、10-9 M未満、5×10-10 M未満、10-10 M未満、5×10-11 M未満、10-11 M未満、5×10-12 M未満、10-12 M未満、5×10-13 M未満、10-13 M未満、5×10-14 M未満、10-14 M未満、5×10-15 M未満、または10-15 M未満の解離定数すなわちKdの結合親和性を含む。
【００７３】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、「多重特異的(multispecific)」、例えば、二重特異的、三重特異的、またはこれより多数の多重特異性である(つまり1つまたは複数の異なる抗原(例えばタンパク質)上に同時に存在する2個またはそれ以上の異なるエピトープを認識して結合する)場合がある。したがって、C35抗体が「単特異的」または「多重特異的」、例えば「二重特異的」であるか否かは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を意味する。多重特異的な抗体は、本明細書に記載された標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的な場合があるほか、標的ポリペプチドに、ならびに異種ポリペプチドなどの異種エピトープ、または固体支持材料に特異的な場合がある。
【００７４】
本明細書で用いられる「結合価」という表現は、C35抗体、結合ポリペプチド、または抗体中に存在する潜在的な結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を意味する。個々の結合ドメインは、1つのエピトープに特異的に結合する。C35抗体、結合ポリペプチド、または抗体が複数の結合ドメインを含む場合、個々の結合ドメインは、2つの結合ドメインを有する抗体に対する同じエピトープに特異的に結合する(「2価の単特異的である(bivalent monospecific)」と表現)か、または2つの結合ドメインを有する抗体に対する異なるエピトープに特異的に結合する(「2価の二重特異的である(bivalent bispecific)」と表現)場合がある。抗体は、個々の特異性に関して二重特異的および2価の場合もある(「二重特異性の4価の抗体」と表現される)。別の態様では、4価のミニボディまたはドメイン欠損型抗体を作製可能である。
【００７５】
二重特異的な二価の抗体、およびこれを作製する方法は例えば、全ての開示が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,731,168号；第5,807,706号；第5,821,333号；および米国特許出願公開第2003/020734号および第2002/0155537号に記載されている。二重特異的な4価の抗体、およびこれを作製する方法は例えば、いずれの開示とも参照により本明細書に組み入れられる、WO02/096948およびWO00/44788に記載されている。これについては一般に、PCT公報WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)；米国特許第4,474,893号；第4,714,681号；第4,925,648号；第5,573,920号；第5,601,819号；Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照されたい。
【００７６】
既に説明したように、さまざまな免疫グロブリンのクラスのサブユニットの構造、および定常領域の3次元構造は周知である。本明細書で用いられる「VHドメイン」という表現は、免疫グロブリンの重鎖のアミノ末端の可変ドメインを含み、および「CH1ドメイン」という表現は、免疫グロブリン重鎖の先頭の(最もアミノ末端側の)定常領域ドメインを含む。CH1ドメインはVHドメインに隣接しており、およびアミノ末端は免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に隣接している。
【００７７】
本明細書で用いられる「CH2ドメイン」という表現は例えば、従来のナンバリング法で、抗体の残基244位付近から残基360位(Kabatナンバリングでは残基244位〜360位；およびEUナンバリングでは残基231位〜340位；Kabat EA et al., 前掲書を参照)に伸びる重鎖分子の部分を含む。CH2ドメインは、別のドメインと密接に対合しないという意味で固有である。むしろ、2つのN-結合分岐糖鎖が、完全な天然のIgG分子の2つのCH2ドメイン間に挟まれる。CH3ドメインが、IgG分子のCH2ドメインからC末端に伸びており、かつ約108残基を含むことについてもよく調べられている。
【００７８】
本明細書で用いられる「ヒンジ領域」という表現は、CH1ドメインがCH2ドメインと連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約25残基を含み、および柔軟であるため、2つのN末端の抗原結合領域を独立に動かすことができる。ヒンジ領域は、上位、中位、および下位のヒンジドメインの3つの異なるドメインに分けることができる(Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998))。
【００７９】
本明細書で用いられる「ジスルフィド結合」という表現は、2個の硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第2のチオール基との間でジスルフィド結合すなわち架橋を形成可能なチオール基を含む。大半の天然のIgG分子では、CH1領域とCL領域はジスルフィド結合によって連結しており、ならびに2つの重鎖は、Kabatナンバリングで239位および242位(EUナンバリングで226位または229位)に対応する位置における2本のジスルフィド結合によって連結している。
【００８０】
本明細書で用いられる「キメラ抗体」という表現は、免疫反応性の領域もしくは部位が第1の種から得られるか、または第1の種に由来し、ならびに定常領域(完全なもの、部分的なもの、もしくは本発明によって改変されたものの場合がある)が第2の種から得られる任意の抗体を意味する。好ましい態様では、標的結合領域または標的結合部位は、非ヒト供給源(例えばマウスもしくは霊長類)に由来し、および定常領域はヒトに由来する。
【００８１】
本明細書で用いられる「改変型抗体」という表現は、重鎖および軽鎖の一方または両方のいずれかの可変ドメインが、特異性が既知である抗体に由来する1個または複数個のCDRの少なくとも部分的な置換によって、および必要であれば、部分的なフレームワーク領域の置換および配列交換によって改変された抗体を意味する。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスの抗体に、またはさらにはサブクラスも同じ抗体に由来する場合があるが、CDRは、異なるクラスの抗体に由来する場合があること、および好ましくは異なる種に由来する抗体に由来する場合があることが想定される。特異性が既知である非ヒト抗体に由来する1つまたは複数の「ドナー」のCDRが、ヒトの重鎖または軽鎖のフレームワーク領域に移植された改変型抗体は、本明細書で「ヒト化抗体」と呼ばれる。1つの可変ドメインの抗原結合能を別のものに移すために、CDRの全体が、ドナーの可変領域に由来する完全なCDRと置換される必要は必ずしもない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移すことのみが必要な場合がある。上記の説明は例えば、米国特許第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、および第6,180,370号に記載されており、機能性の改変型抗体もしくはヒト化抗体を得ることは、常用の実験法の実施か、または試行錯誤の検討のいずれかによって、当業者の能力の十分な範囲内にある。
【００８２】
本明細書で用いられる、「適切に折りたたまれたポリペプチド」という表現は、ポリペプチドを含む機能性ドメインの全てが明瞭に活性であるポリペプチド(例えばC35抗体)を含む。本明細書で用いられる、「不適切に折りたたまれたポリペプチド」という表現は、ポリペプチドの機能性ドメインの少なくとも1つが活性ではないポリペプチドを含む。1つの態様では、適切に折りたたまれたポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合によって連結しているポリペプチド鎖を含み、また逆に、不適切に折りたたまれたポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合によって連結しているのではないポリペプチド鎖を含む。
【００８３】
本明細書で用いられる「改変型」という表現は、合成手段による(例えば、例えば組換え手法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的なカップリングによる、またはこれらの手段のいくつかの組み合わせによる)核酸分子またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００８４】
本明細書で用いられる、「連結した」、「融合した」、または「融合」という表現は互換的に使用される。これらの表現は、化学的接合もしくは組換え手法を含むあらゆる手段による、2個もしくはそれ以上のエレメントもしくは成分の連結を意味する。「インフレームでの融合」という表現は、連続した、より長いオープンリーディングフレーム(ORF)を、当初のORFの正しい翻訳上の読み枠を維持する様式で形成する、2つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドのORFの連結を意味する。したがって、組換え融合タンパク質は、当初のORFによってコードされたポリペプチドに対応する2個またはそれ以上のセグメントを含む1つのタンパク質である(天然では、セグメントは通常、このように連結していない)。したがって読み枠は、融合セグメントの全体で連続するように作られるが、セグメントは、例えばインフレームのリンカー配列によって物理的または空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリンの可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合させることが可能であるが、「融合した」CDRが連続的なポリペプチドの一部として同時に翻訳される限りにおいて、少なくとも1つの免疫グロブリンのフレームワーク領域または追加のCDR領域をコードするポリヌクレオチドを、間に挟む場合がある。
【００８５】
ポリペプチドに関しては、「直線状配列」または「配列」とは、配列中で相互に隣接する残基がポリペプチドの一次構造中で連続している、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に至る、ポリペプチド中のアミノ酸の並びである。
【００８６】
本明細書で用いられる「発現」という表現は、遺伝子が生化学的生成物、例えばポリペプチドを産生する過程を意味する。この過程は、遺伝子ノックダウン、ならびに一過的発現と安定的発現の両方を含むが、これらに限定されない、細胞内の遺伝子の機能の任意の発現を含む。この過程は、遺伝子の伝令RNA(mRNA)への転写、およびこのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。仮に、最終的な望ましい産物が生化学的生成物である場合、発現は、そのような生化学的生成物および任意の前駆体の産生を含む。遺伝子の発現によって、「遺伝子産物」が作られる。本明細書に記載される遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって作られる伝令RNAか、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかの場合がある。本明細書に記載された遺伝子産物はさらに、翻訳後修飾、例えばポリアデニル化を受けた核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解による切断などを受けたポリペプチドを含む。
【００８７】
本明細書で用いられる、「処置する」または「処置」という表現は、治療目的の処置と、対象において、多発性硬化症の進行などの望ましくない生理学的な変化もしくは疾患が予防されるか、または遅延される(軽減される)、予防的(prophylactic/preventative)な手段の両方を意味する。有益または望ましい臨床的結果は、症状の緩和、疾患の規模の縮小、疾患状態の安定化(すなわち悪化しないこと)、疾患進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の寛解または緩和、および緩解(部分的または全般的)を、検出可能か、または検出不能かに関わらず含むが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合の推定生存期間と比較した場合における生存期間の延長を意味する場合もある。処置を必要とする者は、既に症状もしくは疾患を有する者、ならびに症状もしくは疾患を有する傾向のある者、または症状もしくは疾患が予防される予定である者を含む。
【００８８】
「対象」もしくは「個体」もしくは「動物」もしくは「患者」もしくは「哺乳動物」とは、診断、予後予測、または治療が望ましい任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒトのほか、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、家畜、ウシなどの家畜動物、農場動物、ならびに動物園で飼育されている動物、狩猟対象動物、または愛玩動物を含む。
【００８９】
本明細書で用いられる、「C35抗体の投与による利益を受けるであろうと考えられる対象」、および「処置を必要とする動物」といった表現は、例えば、C35ポリペプチドの検出を目的とした(例えば診断手順の目的のため)、使用されるC35抗体の投与による利益、および/または処置、すなわちC35抗体による疾患の緩和もしくは予防による利益を得るであろうと考えられる哺乳動物対象などの対象を含む。本明細書で詳述されるように、C35抗体は非接合状態で使用可能なほか、例えば薬剤、プロドラッグ、もしくは同位体に接合させることができる。
【００９０】
II．C35の標的ポリペプチド
C35は乳癌、ならびに黒色腫、結腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、および膵臓癌を含む他の腫瘍タイプで差次的に発現される抗原である。C35タンパク質はプレニル化され、および細胞膜の内側に結合するが、生腫瘍細胞の表面膜上には検出されないことがわかっている。発明者らは、C35エピトープを免疫特異的に認識するマウスのモノクローナル抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む、いくつかの抗体を作製した。発明者らは、化学療法剤か、または放射線照射のいずれかの処置による腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導が、完全な腫瘍細胞がC35特異的抗体によって認識されることを可能とする、C35の表面膜への露出につながることも明らかにした。
【００９１】
C35のポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列(SEQ ID NO:1および2)
2009544574.tif 000004
【００９２】
III．C35抗体
本発明は、C35に対する抗体(本明細書では「抗C35抗体」または「C35抗体」と呼ぶ)、このような抗体をコードするポリヌクレオチド、C35関連癌をC35抗体およびC35ポリヌクレオチドで処置する方法、ならびにC35抗体およびC35ポリヌクレオチドを使用する検出法および診断法に関する。C35抗体のポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびにC35抗体の作製法も提供する。本明細書で詳述されるように、本発明は、C35抗体を癌の処置、検出、および診断に使用する方法にも関する。抗体に関する上記の記述は、本明細書に記載されるC35抗体にも適用される。
【００９３】
本発明はさらに、1つまたは複数のC35癌の処置のために、1つのC35抗体を、または他の態様では、少なくとも2つの本発明のC35抗体を対象、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトに投与する段階を含む、抗体ベースの処置法に関する。本発明の治療用化合物は、本発明の抗体(本明細書に記載されたその断片、類似体、および誘導体を含む)、ならびに本発明の抗体(本明細書に記載されたその断片、類似体、および誘導体を含む)をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体は、乳癌、肝臓癌、卵巣癌、結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、および黒色腫を含むC35関連癌の処置、検出、または診断に使用することができる。本発明のC35抗体は、当技術分野で既知か、または本明細書に記載された薬学的に許容される組成物の状態で提供される場合がある。
【００９４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、1本鎖抗体、scFv、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ドメイン欠損型抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発現ライブラリーによって作製される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、および以上の任意のエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない。本明細書で用いられる「抗体」という表現は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスの免疫グロブリン分子の場合がある。
【００９５】
C35ポリペプチドに特異的なハイブリドーマ細胞系列1F2.4.1および1B3.6.1は、ハイブリドーマ法で作製された(Kohler et al., Nature 256:495 (1975)；Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)；Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976)；Hammerling et al., in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp.571-681 (1981))。簡単に説明すると、ハイブリドーマ細胞系列は、C35を過剰に発現するように形質導入された同系のBCA34線維芽細胞腫瘍細胞が接種されたBALB/cマウスの脾細胞と、非分泌型ミエローマ細胞系列NS-I(P3/NS1/1-AG4-1, ATCC #TIB-18)との標準的なPEG融合で作製された。NS-1へのPEG融合後に、ハイブリドーマをメチルセルロース半固体培地で成長させた。約2週間後に、ハイブリドーマのコロニーが96ウェルプレート中に単離され、ならびに個々の上清が、C35反応性に関して、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学的手法によって検討された。陽性のハイブリドーマコロニーがサブクローニングされ、クローン性を確認するために、反応性に関して2回のスクリーニングが行われた。ハイブリドーマの上清から抗体が、標準的な方法によるプロテインGによる親和性精製によって単離された。2つのハイブリドーマ細胞系列(1F2および1B3)に由来する抗体は、ELISAおよびウェスタンブロットアッセイ法で、組換えC35タンパク質に特異的に結合する。ハイブリドーマ細胞系列1F2に由来する抗体は、免疫組織化学的手法で、ホルマリンで固定されてパラフィン包埋されたC35陽性の腫瘍および細胞系列も特異的に染色する。加えて発明者らは、Alexa-647蛍光色素を接合させたハイブリドーマ細胞系列1F2に由来する抗体を使用する定量解析のための細胞内染色フローサイトメトリーアッセイ法を開発した。これらの抗体はそれぞれ異なるが、いずれもC35タンパク質に特異的である。細胞溶解液からC35タンパク質を、このような抗体のいずれかによって免疫沈降させることで、もう一方を検出することが可能である。競合的結合ELISAアッセイ法によって、ハイブリドーマ細胞系列1F2および1B3から作製されたモノクローナル抗体が、C35タンパク質の異なるエピトープに結合することが示唆されている。
【００９６】
本発明のC35抗体は、本発明のSEQ ID NO:2のC35のポリペプチド、ポリペプチド断片、または変異体、および/またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体を含む(特異的な抗体-抗原結合を調べる当技術分野で周知のイムノアッセイ法で決定される)。
【００９７】
本明細書で用いられる「単離された」という表現は、化合物が天然で存在する環境とは異なる環境中に存在する対象化合物(例えばC35抗体)を意味する。「単離された」という表現は、対象化合物が実質的に濃縮されているか、および/または対象化合物が部分的もしくは実質的に精製されている、試料中の化合物を含むことを意味する。
【００９８】
本明細書で用いられる、「実質的に濃縮された」および「実質的に精製された」という表現は、天然の環境から取り出され、ならびに天然では結合する他の成分を少なくとも60%含まず、好ましくは75%含まず、および最も好ましくは90%含まない化合物を意味する。本明細書で使用されるように、参照抗体と「同じ特異性」を有する抗体とは、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合することを意味する。抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか否かの判定は、本明細書に以下に記載されるアッセイ法で実施することができる。
【００９９】
本明細書で論じられるマウスハイブリドーマ細胞系列に由来する抗体は、1F2および1B3である。これらの抗体のVL領域およびVH領域をコードするポリヌクレオチドは、実施例6に記載された手順で、American Type Culture Collection (「ATCC」)に、表2に記載の日に寄託され、表2に記載のATCC寄託番号が与えられたTOPOベクターにクローニングされた。ATCCの所在地は、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USAである。ATCCへの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準じて行われた。
【０１００】
クローン1F2Gは、ATCCに2003年11月11日に寄託され、およびATCC寄託番号PTA-5639が与えられた。クローン1F2Kは、ATCCに2003年11月11日に寄託され、およびATCC寄託番号PTA-5640が与えられた。クローン1B3Gは、ATCCに2003年11月11日に寄託され、およびATCC寄託番号PTA-5637が与えられた。クローン1B3Kは、ATCCに2003年11月11日に寄託され、およびATCC寄託番号PTA-5638が与えられた。
【０１０１】
（表２）マウス抗C35抗体の可変領域をコードする寄託済みポリヌクレオチドクローン
2009544574.tif 000005
【０１０２】
マウスの可変領域の遺伝子、および寄託済みクローンのベクターの一部の配列を以下に記載する。
斜体字＝Topoベクターの配列(寄託済みクローンに含まれる)
点線下線＝TopoベクターのEcoRIクローニング部位
小文字＝generacerプライマーを含む5'非翻訳領域
ATG＝マウスのシグナルペプチドの開始点
太字＝フレームワーク領域(FWR)
二重下線＝CDR1、CDR2、またはCDR3
下線＝マウスのIgG1またはκ鎖の定常領域の5'部分
【０１０３】
1F2マウス抗C35 Vγ1遺伝子のポリヌクレオチド配列(クローン1F2Gに由来する)
2009544574.tif 000006
シグナルペプチド＝18アミノ酸
FR1＝30アミノ酸
CDR1＝6アミノ酸
FR2＝14アミノ酸
CDR2＝16アミノ酸
FR3＝32アミノ酸
CDR3＝7アミノ酸
FR4＝11アミノ酸
【０１０４】
1F2 VHのアミノ酸配列(クローン1F2Gによってコードされる)
2009544574.tif 000007
【０１０５】
1F2マウス抗C35κV遺伝子のポリヌクレオチド配列(クローン1F2Kに由来する)
2009544574.tif 000008
シグナルペプチド＝22アミノ酸
FR1＝23アミノ酸
CDR1＝10アミノ酸
FR2＝15アミノ酸
CDR2＝7アミノ酸
FR3＝32アミノ酸
CDR3＝9アミノ酸
FR4＝10アミノ酸
【０１０６】
1F2-VKのアミノ酸配列(クローン1F2Kによってコードされる)
2009544574.tif 000009
【０１０７】
1B3マウス抗C35 VγV遺伝子(クローン1B3Gによってコードされる)(NC1-A7 V139-D-J1 (VH36-60) M13281)
2009544574.tif 000010
シグナルペプチド＝18アミノ酸
FR1＝30アミノ酸
CDR1＝5アミノ酸
FR2＝14アミノ酸
CDR2＝16アミノ酸
FR3＝32アミノ酸
CDR3＝14アミノ酸
FR4＝11アミノ酸
【０１０８】
1B3 VHのアミノ酸配列(クローン1B3Gによってコードされる)
2009544574.tif 000011
【０１０９】
1B3マウス抗C35κV遺伝子(クローン1B3Kに由来する)
2009544574.tif 000012
シグナルペプチド＝20アミノ酸
FR1＝23アミノ酸
CDR1＝11アミノ酸
FR2＝15アミノ酸
CDR2＝7アミノ酸
FR3＝32アミノ酸
CDR3＝9アミノ酸
FR4＝10アミノ酸
【０１１０】
1B3 VKのアミノ酸配列(クローン1B3Kによってコードされる)
2009544574.tif 000013
【０１１１】
発明者らは、2002年9月5日に公開されたUS 2002 0123057 A1に記載された方法で、2つのC35抗体(MAb 165およびMAb 171)も作製した。MAb 165およびMAb 171の重鎖可変領域は、上記の1B3抗体の重鎖可変領域と同じCDR3領域を含む。MAb 165および171の残りの部分はヒト由来である。本発明は、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、もしくはSEQ ID NO:60のVH領域またはVL領域のいずれか1つか、またはSEQ ID NO:56もしくはSEQ ID NO:60によってコードされたいずれかのVH領域と、SEQ ID NO:58によってコードされたVL領域との組み合わせを含む、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、および好ましくはC35特異的な抗体であるMAb 165またはMAb 171に関する。MAb 165もMAb 171も、同じκ軽鎖であるUH8 VK L120を含む。
【０１１２】
MAb 165およびMAb 171の重鎖および軽鎖の可変領域の配列を以下に示す。
下線＝CDR1、CDR2、またはCDR3
【０１１３】
MAb 165 VH(141D10 VH H732)のヌクレオチド配列
2009544574.tif 000014
【０１１４】
MAb 165 VH(141D10 VH H732)のアミノ酸配列
2009544574.tif 000015
【０１１５】
MAb 171 VH(MSH3 VH H835)のヌクレオチド配列
2009544574.tif 000016
【０１１６】
MAb 171 VH(141D10 VH H732)のアミノ酸配列
2009544574.tif 000017
【０１１７】
UH8 VK L 120のヌクレオチド配列
2009544574.tif 000018
【０１１８】
UH8 VK L 120のアミノ酸配列
2009544574.tif 000019
【０１１９】
発明者らは、US 2002 0123057 A1に開示された方法で、ヒトC35抗体MAbc009も作製した。本発明は、表3に記載されたポリヌクレオチドクローンによってコードされたVH領域およびVL領域を含む、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、好ましくは、完全なヒトC35特異的抗体MAbc009に関する。この抗体のVL領域およびVH領域をコードするポリヌクレオチドは、実施例6に記載された手順で、American Type Culture Collection (「ATCC」)に表3に記載された日に寄託され、表3に記載されたATCC寄託番号が与えられたTOPOベクターにクローニングされた。ATCCの所在地は、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USAである。ATCCへの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に準じて行われた。
【０１２０】
クローンH0009は、ATCCに2003年11月11日に寄託され、ATCC寄託番号PTA-5641が与えられた。クローンL0010は、ATCCに2003年11月11日に寄託され、ATCC寄託番号PTA-5542が与えられた。
【０１２１】
（表３）ヒト抗C35の可変領域をコードする寄託済みポリヌクレオチドクローン
2009544574.tif 000020
【０１２２】
ヒトの可変領域の遺伝子、および寄託済みクローンのベクターの一部の配列を以下に示す。
点線下線＝TopoベクターのEcoRIクローニング部位
ATG＝ヒトシグナルペプチドの開始点
太字＝フレームワーク領域
二重下線＝CDR1、CDR2、またはCDR3
下線＝ヒトIgG1GSまたはκ定常領域
【０１２３】
MAbc0009のVHのヌクレオチド配列(クローンH0009に由来する)
2009544574.tif 000021
【０１２４】
MAbc0009のVHのアミノ酸配列(クローンH0009によってコードされる)
2009544574.tif 000022
【０１２５】
MAbc0009のVKのヌクレオチド配列(クローンL0010に由来する)
2009544574.tif 000023
【０１２６】
MAbc0009のVKのアミノ酸配列(クローンL0010によってコードされる)
2009544574.tif 000024
【０１２７】
マウスのC35抗体は、SEQ ID No:3〜10で表される重鎖および軽鎖の可変領域を有する。マウス抗体1F2および1B3は、γ1アイソタイプおよびκ軽鎖を有する。1B3マウス抗体と同じ重鎖可変領域のCDR3を有する抗体MAb 165およびMAb 171は、SEQ ID NO:56〜60で表される重鎖および軽鎖の可変領域を有する。抗体MAb 165およびMAb 171は、κ軽鎖を有する。ヒト抗体MAbc009は、SEQ ID No:11〜14で表される重鎖および軽鎖の可変領域を有する。ヒト抗体MAbc009は、γ1アイソタイプおよびκ軽鎖を有する。
【０１２８】
発明者らは、US 2002 0123057 A1に記載された方法で、別のヒトC35抗体MAb 163も作製した。本発明は、表4に記載されたポリヌクレオチドクローンによってコードされたVH領域およびVL領域を含む、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、好ましくは、完全ヒトC35特異的抗体MAb 163に関する。
【０１２９】
（表４）ヒトの抗C35抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドクローン
2009544574.tif 000025
【０１３０】
ヒトの可変領域の遺伝子およびクローンのベクターの一部の配列を以下に示す(CDRに下線)。
【０１３１】
MAb 163のVHのアミノ酸配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000026
MAb 163のVH CDR1のアミノ酸配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000027
MAb 163のVH CDR2のアミノ酸配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000028
MAb 163のVH CDR3のアミノ酸配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000029
【０１３２】
MAb 163のVLのアミノ酸配列(クローンL74に由来する)
2009544574.tif 000030
MAb 163のVL CDR1のアミノ酸配列(クローンL74に由来する)
2009544574.tif 000031
MAb 163のVL CDR2のアミノ酸配列(クローンL74に由来する)
KASTLQS(SEQ ID NO:68)
MAb 163のVL CDR3のアミノ酸配列(クローンL74に由来する)
QQYYSYLRT(SEQ ID NO:69)
【０１３３】
MAb 163のVHのヌクレオチド配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000032
MAb 163のVH CDR1のヌクレオチド配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000033
MAb 163のVH CDR2のヌクレオチド配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000034
MAb 163のVH CDR3のヌクレオチド配列(クローンH730に由来する)
2009544574.tif 000035
【０１３４】
MAb 163のVLのヌクレオチド配列(クローンL74に由来する)
2009544574.tif 000036
MAb 163のVL CDR1のヌクレオチド配列(クローンL74に由来する)
2009544574.tif 000037
MAb 163のVL CDR2のヌクレオチド配列(クローンL74に由来する)
2009544574.tif 000038
MAb 163のVL CDR3のヌクレオチド配列(クローンL74に由来する)
2009544574.tif 000039
【０１３５】
本発明は、C35ポリペプチド、またはその断片、もしくは融合タンパク質に免疫特異的に結合する抗体を含む(その抗体断片もしくは変異体を含むか、またはその抗体断片もしくは変異体からなる分子を含む)。C35ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のC35ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。C35ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のポリペプチドをコードする核酸の組換え発現によって作製できる(C35のエピトープ含有断片については、WO01/74859および米国特許出願公開第2004/0063907号を参照)。
【０１３６】
好ましくは、例示的な抗体の類似体は、例示的な抗体と保存的アミノ酸置換が異なる。アミノ酸置換を保存的または非保存的に分類する目的で、アミノ酸を以下のように分類することができる：グループI(疎水性側鎖)：met、ala、val、leu、ile；グループII(中性の親水性側鎖)：cys、ser、thr；グループIII(酸性側鎖)：asp、glu；グループIV(塩基性側鎖)：asn、gln、his、lys、arg；グループV(鎖の方向に影響を及ぼす残基)：gly、pro；およびグループVI(芳香族側鎖)：trp、tyr、phe。保存的な置換は、同じクラスのアミノ酸間の置換を含む。非保存的な置換は、これらのクラスの1つのいくつかのメンバーと別のメンバーの交換を含む。
【０１３７】
本発明の1つの態様では、C35ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO:62〜69のいずれかのアミノ酸配列を有するか、あるいは表4に記載のおよび/またはSEQ ID NO:70に記載のポリヌクレオチドによってコードされたVH領域のアミノ酸配列、または表4に記載のおよび/またはSEQ ID NO:71に記載のポリヌクレオチドによってコードされたVL領域のアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを含む。好ましい態様では、本発明の抗体は、表4に記載されたクローンH730によってコードされたVH領域のアミノ酸配列、およびクローンL74によってコードされたVL領域のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
いくつかの好ましい態様では、本発明の抗体は、クローンH730によってコードされたVH領域、およびクローンL74によってコードされたVL領域のアミノ酸配列を含む。C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する、表2、表3、または表4に記載されたポリヌクレオチドの少なくとも1つによってコードされたVH領域および/またはVL領域の抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子も、これらのVH領域およびVL領域、分子、断片、および/または変異体をコードする核酸分子と同様に、本発明に含まれる。
【０１３９】
本発明は、前記抗体が、SEQ ID NO:62〜64またはSEQ ID NO:70によってコードされるかまたは表4に記載されたVH領域に含まれる任意の1つ、2つ、または3つのVH CDRのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる、C35ポリペプチドのポリペプチドまたはポリペプチド断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体も提供する。特に本発明は、SEQ ID NO:70によってコードされるかまたは表4に記載されたVH領域に含まれるVH CDR1のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を提供する。別の態様では、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO:70によってコードされるかまたは表4に記載されたVH領域に含まれるVH CDR2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。好ましい態様では、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO:70によってコードされるかまたは表4に記載されたVH領域に含まれるVH CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。C35ポリペプチドまたはC35ポリペプチドの断片もしくはその変異体に免疫特異的に結合するこれらの抗体またはその抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片、および/または変異体をコードする核酸分子と同様に本発明に含まれる。
【０１４０】
本発明は、前記抗体が、SEQ ID NO:71によってコードされるかまたは表4に記載されたVL領域に含まれるVL CDRの任意の1つ、2つ、または3つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる、C35ポリペプチドのポリペプチドまたはポリペプチド断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体も提供する。特に本発明は、SEQ ID NO:71によってコードされるかまたは表4に記載されたVL領域に含まれるVL CDR1のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を提供する。別の態様では、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO:71によってコードされるかまたは表4に記載されたVL領域に含まれるVL CDR2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。好ましい態様では、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体は、SEQ ID NO:71によってコードされるかまたは表4に記載されたVL領域に含まれるVL CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。C35ポリペプチドまたはC35ポリペプチド断片もしくはその変異体に免疫特異的に結合するこれらの抗体またはその抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片、および/または変異体をコードする核酸分子と同様に本発明に含まれる。
【０１４１】
本発明は、前記抗体が、SEQ ID NO:62〜69の1つまたは複数のポリペプチドによってコードされた1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVH CDR、および1つ、2つ、または3つのVL CDRを含むか、またはこれらからなる、C35ポリペプチドまたはC35ポリペプチドのポリペプチド断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体(抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子を含む)も提供する。特に本発明は、前記抗体が、SEQ ID NO:62〜69のVH CDRおよびVLのCDRのうち、VH CDR1とVL CDR1、VH CDR1とVL CDR2、VH CDR1とVL CDR3、VH CDR2とVL CDR1、VH CDR2とVL CDR2、VH CDR2とVL CDR3、VH CDR3とVH CDR1、VH CDR3とVL CDR2、VH CDR3とVL CDR3、またはこれらの任意の組み合わせを含むか、またはこれらからなるか、またはSEQ ID NO:56、58、もしくは60の1つもしくは複数のポリヌクレオチドによってコードされるか、または表2、表3、もしくは表4に記載されたVH領域もしくはVL領域に含まれる、C35ポリペプチドのポリペプチドもしくはポリペプチド断片または変異体に免疫特異的に結合する抗体を提供する。1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVH CDR、および1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVL CDRは、クローンH0009およびL0010、クローンH0009および1F2K、クローンH0009および1B3K、クローンH009およびSEQ ID NO:58、クローン1F2Gおよび1F2K、クローン1F2Gおよび1B3K、クローン1F2GおよびL0010、クローン1F2GおよびSEQ ID NO:58、クローン1B3Gおよび1B3K、クローン1B3Gおよび1F2K、クローン1B3GおよびL0010、クローン1B3GおよびSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:56、およびSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:56、ならびにクローンL0010、SEQ ID NO:56およびクローン1F2K、SEQ ID NO:56およびクローン1B3K、SEQ ID NO:60およびSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60およびクローンL0010、SEQ ID NO:60およびクローン1F2K、SEQ ID NO:60およびクローン1B3K、クローンH730およびクローンL74、SEQ ID NO:70およびクローンL74、またはクローンH730およびSEQ ID NO:71に由来する場合がある。C35ポリペプチドに免疫特異的に結合するこれらの抗体の断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子も、これらの抗体、分子、断片、または変異体をコードする核酸分子と同様に本発明に含まれる。
【０１４２】
最も好ましくは、抗体は、本発明のヒト抗体、キメラ(例えばヒトとマウスのキメラ)抗体、もしくはヒト化抗体、またはFab、Fab'、およびF(ab')2、Fd、1本鎖Fv(scFv)、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、1本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(scFv)、およびイントラボディ、ならびにVL領域もしくはVH領域のいずれかを含む断片を含むが、これらに限定されない抗原結合抗体断片である。1本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変領域を単独で、または以下の全体もしくは一部と組み合わせて含む場合がある：ヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン。本発明には、可変領域とヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインも任意の組み合わせで含む抗原結合断片も含まれる。本発明の治療法における好ましいC35抗体は、CH2ドメインの欠失を含む抗体である。
【０１４３】
本発明の抗体は、認識または特異的に結合する本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して記載または特定される場合がある。エピトープすなわちポリペプチドの一部分は、本明細書に記載されているように、例えばN末端およびC末端の位置によって、または隣接するアミノ酸残基のサイズによって規定される場合がある。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体を除外してもよい。したがって本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、および同ポリペプチドの除外を可能とする抗体を含む。
【０１４４】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性に関して記載または規定することもできる。好ましい結合親和性は、5×10(-7) M未満、10(-7) M未満、5×10(-8) M未満、10(-8) M未満、5×10(-9) M未満、10(-9) M未満、5×10(-10) M未満、10(-10) M未満、5×10(-11) M未満、10(-11) M未満、5×10(-12) M未満、10(-12) M未満、5×10(-13) M未満、10(-13) M未満、5×10(-14) M未満、10(-14) M未満、5×10(-15) M未満、または10(-15) M未満の解離定数すなわちKdの親和性を含む。
【０１４５】
本発明の抗体は、抗体1F2、1B3、MAb 163、MAb 165、MAb 171、またはMAbc009の親和性と同じか、または同等の対C35親和性を有する。好ましくは本発明の抗体は、抗体1F2、1B3、MAb 163、MAb 165、MAb 171、またはMAbc009の親和性より高い対C35親和性を有する。好ましい態様では、本発明の抗体は、MAb 163の親和性と同じか、同等か、または高い対C35親和性を有する。
【０１４６】
本発明は、競合結合を決定するための当技術分野で既知の任意の方法、例えば、本明細書に記載されたイムノアッセイ法および抗体結合アッセイ法で決定される、C35エピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体も提供する。好ましい態様では、抗体は、エピトープに対する結合を少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、または少なくとも50%、競合的に阻害する。
【０１４７】
本発明の抗体は、その交差反応性に関して記載または規定することもできる。本発明のポリペプチドの他の任意のアナログ、オルソログ、またはホモログに結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、および少なくとも50%の同一性(当技術分野で既知の方法および本明細書に記載された方法で算出)を有するポリペプチドに結合する抗体も本発明に含まれる。特定の態様では、本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウス、ラット、および/またはウサギのホモログ、ならびにこれらの対応するエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、および50%未満の同一性(当技術分野で既知の方法および本明細書に記載された方法で算出)を有するポリペプチドに結合しない抗体も本発明に含まれる。特定の態様では、上記の交差反応性は、任意の1つの特異的な抗原性もしくは免疫原性のポリペプチド、または本明細書に開示される2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはそれ以上の特異的な抗原性および/または免疫原性のポリペプチドの組み合わせに関する。さらに本発明には、本発明のポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書に記載)でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに結合する抗体が含まれる。
【０１４８】
本発明の抗体は、認識または特異的に結合する本発明のポリペプチドのエピトープまたは一部分に関して記載または規定することができる。エピトープまたはポリペプチドの一部分は、本明細書に記載されたように、例えばN末端およびC末端の位置によって、隣接するアミノ酸残基、または表および図に記載されたアミノ酸残基のサイズによって規定され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体を除外することもできる。したがって本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、および同ポリペプチドの除外を可能とする抗体を含む。
【０１４９】
特定の態様では、本発明の抗体は、天然のC35配列の残基105〜115で表される断片内に含まれるエピトープに結合する。別の態様では、本発明の抗体は、天然のC35配列の残基53〜104で表される断片内に含まれるエピトープに結合する。いくつかの態様では、本発明の抗体は、MAb 163と同じエピトープに結合する。
【０１５０】
本発明の抗体は、その交差反応性、またはその非存在に関して記載または規定される場合がある。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ、またはホモログに結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、および少なくとも50%の同一性(当技術分野で既知の方法および本明細書に記載された方法で算出)を有するポリペプチドに結合する抗体も本発明に含まれる。特定の態様では、本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウス、サル、ラット、および/またはウサギのホモログ、ならびにそれらの対応するエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、55%未満、および50%未満の同一性(当技術分野で既知の方法、および本明細書に記載された方法で算出)を有するポリペプチドに結合しない抗体も本発明に含まれる。特定の態様では、上記の交差反応性は、任意の1つの特定の抗原性もしくは免疫原性を有するポリペプチド、または本明細書に開示される特定の抗原性および/または免疫原性のポリペプチドの2つ、3つ、4つ、5つ、もしくはそれ以上の組み合わせに関する。さらに、本発明のポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書に記載)でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに結合する抗体が本発明に含まれる。
【０１５１】
本発明は、本明細書に記載された抗体分子(例えばVH領域および/またはVL領域)の変異体(誘導体を含む)を含むか、またはこれらからなる抗体も提供する(抗体はC35ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する)。例えば、アミノ酸の置換を生じる部位特異的変異導入やPCRによる変異誘発を含む、当業者に既知の標準的な手法で、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、変異体(誘導体を含む)は、参照のVH領域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL領域、VL CDR1、VL CDR2、もしくはVL CDR3に対して50個未満のアミノ酸置換、40個未満のアミノ酸置換、30個未満のアミノ酸置換、25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。このようなファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖を有するアミノ酸(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。あるいは変異を、コード配列の全体または一部に飽和変異誘発法などによってランダムに導入することが可能であり、および結果として生じた突然変異体を、生物学的活性に関してスクリーニングして、活性(例えばC35ポリペプチドに結合する能力)を保持する突然変異体を同定することができる。
【０１５２】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみに、またはCDR領域のみに変異を導入することができる。導入された変異は、サイレント変異または中性のミスセンス変異、すなわち抗体の抗原結合能力に作用がないか、またはほとんどない場合がある。このようなタイプの変異は、コドン使用を最適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用な場合がある。あるいは、非中性のミスセンス変異は、抗体の抗原結合能力を変化させる場合がある。大半のサイレント変異および中性のミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域中に存在する可能性が高い一方で、大半の非中性のミスセンス変異の位置は、CDR中に存在する可能性が高いが、これは絶対条件ではない。当業者であれば、抗原結合活性に変化がないこと、または結合活性の変化(例えば親和性成熟もしくは最適化、または抗原結合活性もしくは抗体特異性の変化における他の改善)などの望ましい特性を有する変異分子を設計および検討することができると考えられる。変異誘発後に、コードされたタンパク質は常用の手段で発現させることが可能であり、ならびにコードされたタンパク質の機能的活性および/または生物学的活性(例えば、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する能力)を本明細書に記載された手法で、または当技術分野で既知の手法を常用の修飾手段で決定することができる。
【０１５３】
特定の態様では、C35ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する、本発明の抗体(その抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子を含む)は、SEQ ID NO:56、58、60、70、もしくは71の1つもしくは複数の核酸によってコードされる配列か、または表2、表3、もしくは表4に記載されたVH領域またはVL領域の1つをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列に対して、ストリンジェントな条件（例えば6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)によるフィルター結合DNAに対する約45℃におけるハイブリダイゼーションと、これに続く高度にストリンジェントな条件における0.2×SSC/0.1% SDSによる約50〜65℃における1回もしくは複数回の洗浄、例えば6×SSCによるフィルター結合核酸に対する約45℃におけるハイブリダイゼーションと、これに続く0.1xSSC/0.2% SDSによる約68℃における、または当業者に既知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(例えば、Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL.I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New Yorkの6.3.1〜6.3.6および2.10.3ページを参照)における1回もしくは複数回の洗浄）でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に含まれる。
【０１５４】
類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその断片もしくは変異体が、類似の構造およびいくつかの同じ生物学的活性を有する場合があることは当技術分野で周知である。したがって1つの態様では、C35ポリペプチドまたはC35ポリペプチドの断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体(その抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子を含む)は、SEQ ID NO:56、60、もしくは70の核酸、または表2、表3、もしくは表4に記載された核酸によってコードされたVH領域のアミノ酸配列に対して少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有するVH領域を含むか、またはこれらからなる。
【０１５５】
別の態様では、C35ポリペプチドまたはC35ポリペプチドの断片もしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体(その抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子を含む)は、SEQ ID NO:58もしくは71の核酸、または表2、表3、もしくは表4に記載された核酸によってコードされたVL領域のアミノ酸配列に対して少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有するVL領域を含むか、またはこれらからなる。
【０１５６】
本発明は、本明細書に記載された1つまたは複数の抗体と1つまたは複数の同じ生物学的特徴を有する抗体(これらの抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子を含む)も含む。「生物学的特徴」という表現は、インビトロもしくはインビボにおける活性、または例えば、C35ポリペプチド(例えば、アポトーシス中に細胞表面上に発現されるC35ポリペプチド)に結合する能力；C35ポリペプチドを介した生物学的活性を実質的に阻害もしくは無効にする能力；C35関連癌細胞を死滅させる(例えばC35関連癌を処置もしくは診断する)か、またはC35を検出する能力などの抗体の特性を意味する。任意で本発明の抗体は、本明細書で具体的に言及された抗体の少なくとも1つと同じエピトープに結合する。このようなエピトープ結合は、当技術分野で既知のアッセイ法、および以下に本明細書に記載されたアッセイ法で、常用の手順で決定することができる。
【０１５７】
表2に記載された核酸によってコードされたマウスのVH領域およびVL領域に由来するヒト化抗体の作製に関して以下に記載された規則を使用して、SEQ ID NO:56、58、もしくは60に、または表3に記載された核酸によってコードされたヒトのVH領域および/またはVL領域を含む抗体の変異体を作製することもできる。
【０１５８】
本発明のヒト化された免疫グロブリンおよびヒト抗体の変異体は、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する可変フレームワーク領域(アクセプター免疫グロブリンと呼ばれる)と、表2のクローンによってコードされたマウスのC35のVH領域およびVL領域に実質的に由来するかまたは表3および表4のクローンならびにSEQ ID NO:70および71によってコードされたヒトC35のVH領域およびVL領域に実質的に由来するCDR(ドナー免疫グロブリンと呼ばれる)とを有する。定常領域も、仮に存在するのであれば、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する。ヒト化抗体およびヒト抗体の変異体は、少なくとも10(2)、10(3)、10(4)、10(5)、10(6)、10(7)、10(8)、10(9)、または10(10) M(-1)のC35に対する特異的な結合親和性を示す。通常、ヒトC35に対するヒト化抗体およびヒト抗体の変異体の結合親和性の上限は、マウス抗体1F2もしくは1B3、またはヒト抗体MAbc009の、または抗体MAb 163、MAb 165、もしくはMAb 171の3倍、4倍、5倍、または10倍以内にある。しばしば、結合親和性の下限も、マウス抗体1F2もしくは1B3、またはヒト抗体MAbc009の、または抗体MAb 163、MAb 165、もしくはMAb 171の3倍、4倍、5倍、もしくは10倍以内である。好ましいヒト化免疫グロブリンおよびヒト抗体の変異体は、マウス抗体1F2もしくは1B3、またはヒト抗体MAbc009、または抗体MAb 163、MAb 165、もしくはMAb 171と、C35に対する結合をめぐって競合し、およびC35が個々のマウスもしくはヒトの抗体に結合することを防ぐ。
【０１５９】
可能なヒトアクセプター抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)に記載されている。ヒトのアクセプター抗体は、その可変領域が、マウスC35抗体と高い配列同一性を示すように選択される。重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、同じか、または異なるヒト抗体配列に由来する場合がある。ヒト抗体の配列は、天然のヒト抗体の配列の場合があるほか、複数のヒト抗体の共通配列の場合がある。
【０１６０】
ヒト化免疫グロブリンの設計は、以下の手順で実施することができる。アミノ酸が以下のカテゴリーに含まれる場合は、使用されるヒト免疫グロブリン(アクセプター免疫グロブリン)のフレームワークのアミノ酸は、CDRを供与する非ヒト免疫グロブリン(ドナー免疫グロブリン)に由来するフレームワークのアミノ酸と置換される。
(a)アクセプター免疫グロブリンのヒトのフレームワーク領域中のアミノ酸は、対象となる位置においてヒト免疫グロブリンとは異なる一方で、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸は、対象位置においてヒト免疫グロブリンと同じである；
(b)アミノ酸の位置は1つのCDRのすぐ隣である；または
(c)アミノ酸はCDRと相互作用可能である(それぞれがいずれも参照により本明細書に組み入れられる、Queen et al., WO92/11018., およびCo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)を参照)。
ヒト化免疫グロブリンの作製の詳細に関しては、Queen et al.およびCo et al.を参照されたい。
【０１６１】
通常、ヒト化抗体およびヒト抗体の変異体中のCDR領域は実質的に同一であり、およびより一般的には、それらが由来するマウスまたはヒトの抗体中の対応するCDR領域と同一である。CDR残基の1つまたは複数のアミノ酸置換を、結果として得られるヒト化免疫グロブリンまたはヒト抗体の変異体の結合親和性に過度に影響を及ぼすことなく作製することが可能であり、ならびに場合によっては、CDR領域の置換またはCDR領域中における置換は、結合親和性を高める場合がある。これについては例えば、Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36：1079-1091 (1999)；Glaser et al., J. Immunol. 149(8)：2607-2614 (1992)；およびTamura et al., J. Immunol. 164：1432-1441 (2000)を参照されたい。
【０１６２】
上述した特定のアミノ酸置換以外に、ヒト化免疫グロブリンおよびヒト抗体の変異体のフレームワーク領域は通常、実質的に同一であり、より一般的には、それが由来するヒト抗体(アクセプター免疫グロブリン)のフレームワーク領域と同一である。フレームワーク領域中のアミノ酸の多くが、抗体の特異性もしくは親和性にほとんど寄与しないか、または全く寄与しないことは言うまでもない。したがって、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、結果として得られるヒト化免疫グロブリンもしくはヒト抗体の変異体の特異性または親和性にそれほどの変化はなく、許容され得る。
【０１６３】
ファージディスプレイ法は、親配列に対して実質的な配列同一性を有する類似体を、結合の親和性および特異性を維持しながら選択する強力な手法である(例えば、それぞれの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる、Dower et al., WO91/17271；McCafferty et al., WO92/01047；およびHuse, WO92/06204を参照)。
【０１６４】
表2、表3、もしくは表4、またはSEQ ID NO:56、58、60、70、もしくは71の核酸クローン中のVHおよびVLの遺伝子を使用して、C35に特異的な完全ヒト抗体を、2002年9月5日に公開されたUS 2002 0123057 A1、「In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells」に記載された方法で選択することができる。簡単に説明すると、ヒトのCHに連結しているマウス(またはヒト)のVHを使用して、このような軽鎖のライブラリーから、マウス(またはヒト)のVHとの対形成時にC35に対する特異性を付与する完全ヒト免疫グロブリンの軽鎖を選択する。次に、選択された完全ヒト免疫グロブリンの軽鎖を使用して、このような重鎖のライブラリーから、完全なヒト軽鎖との対形成時にC35に対する特異性を付与する完全なヒト免疫グロブリンの重鎖を選択する。同様に、ヒトのCLに連結しているマウス(またはヒト)のVLを使用して、このような重鎖のライブラリーから、マウス(またはヒト)のVLとの対形成時にC35に対する特異性を付与する完全なヒト免疫グロブリンの重鎖を選択してもよい。次に、選択された完全なヒト免疫グロブリンの重鎖を使用して、このような軽鎖のライブラリーから、完全なヒト重鎖との対形成時にC35に対する特異性を付与する完全なヒト免疫グロブリンの軽鎖を選択する。高頻度で、このように選択された完全なヒト抗体は、当初のマウス(もしくはヒト)のC35特異的抗体と同一か、または密接に関連するエピトープ特異性を有する。
【０１６５】
US 2002 0123057 A1に記載の方法を、全てのメンバーが1つまたは複数の非ヒト(例えばマウス)のCDRを有する重鎖または軽鎖のライブラリーと共に使用することもできる。一例では、ライブラリーの個々のメンバーは、C35に特異的な単離されたマウスモノクローナル抗体、例えば1F2または1B3に由来するCDR3領域を含む。
【０１６６】
SEQ ID NO:56、58、60、70、もしくは71の核酸、または表2、表3、もしくは表4に記載された核酸によってコードされた免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変領域によって開始される、US 2002 0123057 A1に記載の方法で選択される、全ての完全ヒト抗体、または1つまたは複数の非ヒト(例えばマウス)のCDRを有する抗体(その抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子を含む)は本発明に含まれる。
【０１６７】
上記の手順で作製されたヒト化抗体またはヒト抗体の変異体の可変セグメントは典型的には、免疫グロブリンの定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部に連結される。ヒトの定常領域のDNA配列は、不死化されたB細胞などの、さまざまなヒト細胞から周知の手順で単離することができる(前掲のKabat et al.およびWO87/02671を参照)。抗体は、軽鎖と重鎖の両方の定常領域を含む場合がある。重鎖定常領域は、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、CH3領域、および場合によってはCH4領域を含む場合がある。治療目的で、CH2ドメインを欠失または省略してもよい。
【０１６８】
ヒト化抗体またはヒト抗体の変異体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む全てのタイプの定常領域、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む任意のアイソタイプを有する抗体を含む。ヒト化抗体またはヒト抗体の変異体が細胞毒性活性を示すことが望ましい場合は、定常ドメインは通常、補体結合性の定常ドメインであり、およびクラスは典型的にはIgG1である。このような細胞毒性活性が望ましくない場合は、定常ドメインをIgG2クラスとすることができる。ヒト化抗体またはヒト抗体の変異体は、複数のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含む場合がある。
【０１６９】
キメラ抗体も本発明に含まれる。このような抗体は、ヒトやマウスやウマなどの別の種のCH領域および/またはCL領域と融合している、SEQ ID NO:56、58、60、70、もしくは71の核酸、または表2、表3、もしくは表4に記載された核酸によってコードされたVH領域および/またはVL領域を含む場合がある。好ましい態様では、キメラ抗体は、ヒトのC領域に融合しているマウスの抗C35抗体によってコードされたVH領域および/またはVL領域を含む。抗体が治療目的で使用される場合は、ヒトのCH2ドメインを欠失させてもよい。キメラ抗体は、上記の抗体断片を含む。
【０１７０】
上記の手順で作製されたキメラ抗体の可変セグメントは典型的には、免疫グロブリンの定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部に連結される。ヒトの定常領域のDNA配列は、不死化B細胞などの、さまざまなヒト細胞から周知の手順で単離することができる(前掲のKabat et al.およびWO87/02671を参照)。抗体は、軽鎖と重鎖の両方の定常領域を含む場合がある。重鎖定常領域は、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、CH3領域、および場合によってはCH4領域を含む場合がある。治療目的で、CH2ドメインを欠失または省略してもよい。
【０１７１】
キメラ抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む全てのタイプの定常領域、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む任意のアイソタイプを有する抗体を含む。キメラ抗体が細胞毒性活性を示すことが望ましい場合は、定常ドメインは通常、補体固定性の定常ドメインであり、およびクラスは典型的にはIgG1である。このような細胞毒性活性が望ましくない場合は、定常ドメインはIgG2クラスのドメインとすることができる。キメラ抗体は、複数のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含む場合がある。
【０１７２】
このような免疫グロブリンを作製するには、さまざまな方法が用いられる。遺伝コードには縮重性があるため、さまざまな核酸配列が、個々の免疫グロブリンのアミノ酸配列をコードする。望ましい核酸配列は、望ましいポリヌクレオチドの事前に作製された変異体を対象としたデノボ固相DNA合成によって、またはPCR変異誘発によって作製することができる。本出願に記載された抗体をコードする全ての核酸は、本発明に明示的に含まれる。
【０１７３】
ひとたび発現すれば、本発明の抗体の全体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の形状の免疫グロブリンを、硫酸アンモニウム沈殿法、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野の標準的な手順で精製することができる(一般に、参照により本明細書に組み入れられる、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)を参照)。少なくとも約90〜95%の均一性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、および薬学的な使用には、98〜99%またはそれ以上の均一性が最も好ましい。部分的に、または望ましくは均一に精製されたら、次にポリペプチドを治療(体外を含む)に、アッセイ法の手順、免疫蛍光染色などの開発および実施に使用することができる(一般に、Immunological Methods, Vols. I and II, Lefkovits and Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 and 1981)を参照)ほか、C35を検出するか、またはC35関連癌を診断するために使用することができる。
【０１７４】
本発明は、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体(その抗体断片もしくは変異体を含むか、またはこれらからなる分子を含む)、および異種ポリペプチドを含むか、またはこれらからなる融合タンパク質も提供する。好ましくは、抗体に融合している異種ポリペプチドは機能に有用であるか、または乳癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌、および膵臓癌の細胞、および黒色腫細胞を含むが、これらに限定されないC35ポリペプチド発現細胞を標的とするのに有用である。別の好ましい態様では、抗体に融合している異種ポリペプチドは、T細胞、マクロファージ、および/または単球の機能に有用であるか、または抗体をT細胞、マクロファージ、もしくは単球に対して標的化するのに有用である。1つの態様では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の任意の1つもしくは複数のVH領域のアミノ酸配列、または本発明の抗体の任意の1つもしくは複数のVL領域のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは変異体、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。別の態様では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の任意の1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上のVH CDRのアミノ酸配列、または本発明の抗体の任意の1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上のVL CDRのアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは変異体、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。好ましい態様では、融合タンパク質は、本発明の抗体のVH CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その断片もしくは変異体、および異種ポリペプチド配列を含むか、またはこれらからなる(融合タンパク質は、C35ポリペプチドに免疫特異的に結合する)。別の態様では、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも1つのVH領域のアミノ酸配列、および本発明の抗体の少なくとも1つのVL領域のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは変異体、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。好ましくは、融合タンパク質のVH領域およびVL領域は、本発明の1つの抗体(またはscFv断片もしくはFab断片)に対応する。さらに別の態様では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の任意の1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上のVH CDRのアミノ酸配列、および本発明の抗体の任意の1つ、2つ、3つ、もしくはそれ以上のVL CDRのアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくは変異体、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、またはこれらからなる。好ましくは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、もしくはそれ以上のVH CDRまたはVL CDRは、本発明の1つの抗体(またはscFv断片もしくはFab断片)に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含まれる。
【０１７５】
以下に詳述するように、本発明の抗体は単独で使用可能なほか、相互に組み合わせて使用したり、または他の組成物と組み合わせて使用したりすることもできる。抗体はさらに異種ポリペプチドに、N末端もしくはC末端において組換え的に融合させることができるほか、ポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に接合させることができる(共有結合的な接合および非共有結合的な接合を含む)。例えば本発明の抗体を、検出アッセイ法における標識として有用な分子に、および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、もしくはトキシンなどのエフェクター分子に組換え的に融合または接合させることができる。これについては例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられる、PCT公報WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；米国特許第5,314,995号；およびEP 396,387を参照されたい。
【０１７６】
別の非限定的な例として、本発明の抗体を受動免疫の状態で個体に投与することができる。あるいは本発明の抗体を、抗体と結合するエピトープを同定するためのエピトープマッピングに使用することができる。このような方法で同定されるエピトープは例えば、ワクチン候補として、すなわち個体を免疫化して、治療法に用いられる天然の形状のC35に対する抗体を誘発するために使用することができる。
【０１７７】
本発明の抗体は、C35ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する場合がある。
【０１７８】
本発明の抗体を、例えば、インビトロとインビボの両方における診断法および治療法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出、および標的とすることを含むがこれらに限定されない目的で、使用することができる。例えば抗体は、生物学的試料中の本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するイムノアッセイ法に有用である。これについては例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられる、Harlow et al., Antibodies：A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)を参照されたい。
【０１７９】
本発明の抗体は、共有結合の付加が、抗体の抗イディオタイプ反応の発生またはC35に対する結合を妨げないように、任意のタイプの分子の抗体への共有結合による付加によって修飾される誘導体を含む。例えば、限定する意図はないものの、抗体の誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィレーション(phosphylation)、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞内リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって修飾された抗体を含む。任意の数多くの化学的修飾は、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知の手法で実施することができる。加えて誘導体は、1つまたは複数の非従来型のアミノ酸を含む場合がある。
【０１８０】
本発明の抗体は、ペプチド結合または修飾型ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターで相互に連結されたアミノ酸を含む場合があり、かつ遺伝子をコードする20個のアミノ酸以外のアミノ酸を含む場合がある。C35抗体は、翻訳後プロセシングなどの天然の過程によって、または当技術分野で周知の化学的修飾法によって修飾可能である。このような修飾は、基礎的な教科書に、および詳細なモノグラフに、ならびに数多くの研究論文に詳しく記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸の側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、C35抗体中の任意の位置に対して行うことができる。同じタイプの修飾は、任意のC35抗体中の複数の部位に同じ程度か、または多様な程度で存在する場合があることが理解される。任意のC35抗体は、多様なタイプの修飾を含む場合もある。C35抗体は、例えばユビキチン化の結果として分岐される場合があり、および分岐によって、または分岐なしに環状となる場合がある。環状、分岐状、および分岐状で環状のC35抗体は、翻訳後の天然の過程で生じる場合があるほか、合成法で作られる場合がある。修飾は、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、共有結合によるフラビンの付加、共有結合によるヘム部分の付加、共有結合によるヌクレオチドもしくはヌクレオチドの誘導体の付加、共有結合による脂質もしくは脂質誘導体の付加、共有結合によるホスファチジルイノシトールの付加、架橋、環状化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニル化などの転移RNAを介したタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化を含む(例えば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs.1-12 (1983)；Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990)；Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)を参照)。
【０１８１】
本発明のさらなる態様は、少なくとも1個のアミノ酸置換、多くて50個のアミノ酸置換、さらにより好ましくは多くて40個のアミノ酸置換、さらにより好ましくは多くて30個のアミノ酸置換、およびさらにより好ましくは多くて20個のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するC35抗体の配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。選択をさらに高めるために、ポリペプチドが、少なくとも1個、多くて10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、または1個のアミノ酸置換を含むC35抗体配列を含むアミノ酸配列を有することが極めて好ましいことは言うまでもない。特定の態様では、C35抗体配列中における付加、置換、および/または欠失の数は、1〜5個、5〜10個、5〜25個、5〜50個、10〜50個、もしくは50〜150個である。置換に関しては、保存的なアミノ酸置換が好ましい。置換は、フレームワーク領域もしくはCDR、またはこの両方の範囲内に位置してよい。
【０１８２】
このセクションの記述は、C35抗体に、および本発明の方法に有用な他の抗体に適用される。このような抗体は、本明細書に記載された手順でトキシンに接合させるか、またはトキシンと複合体を形成させることができるほか、非接合状態もしくは非複合体状態の場合がある。
【０１８３】
IV．C35抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸分子も提供する。
【０１８４】
1つの態様では、本発明は、重鎖可変領域のCDRの少なくとも1つ、または重鎖可変領域のCDRの少なくとも2つが、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の重鎖CDR1、CDR2、もしくはCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、もしくは100%同一である、免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)をコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。あるいは、VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域は、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一である。したがって、例えばこの態様では、本発明の重鎖可変領域は、SEQ ID NO:62〜65のポリペプチド配列と関連するCDR1、CDR2、またはCDR3のポリペプチド配列を有する。
【０１８５】
ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVHを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１８６】
別の態様では、本発明は、CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:62〜65に示されたCDR1群、CDR2群、およびCDR3群と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)をコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVHを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１８７】
さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:62の参照VHポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、もしくは100%同一のVHをコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVHを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１８８】
追加の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるVH核酸配列を含む、重鎖可変領域(VH)をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVHを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１８９】
さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:70と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、もしくは100%同一の、VHをコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドは、C35に特異的または優先的に結合するVHのポリペプチドをコードする。
【０１９０】
別の態様では、本発明は、軽鎖可変領域のCDRの少なくとも1つ、または軽鎖可変領域のCDRの少なくとも2つが、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の軽鎖CDR1、CDR2、もしくはCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%同一である、免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。あるいは、VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域は、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%同一である。したがって、例えばこの態様では、本発明の軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:66〜69のポリペプチド配列と関連するCDR1、CDR2、またはCDR3のポリペプチド配列を有する。
【０１９１】
ある態様では、本発明は、前記ポリヌクレオチドが、C35に特異的に結合するポリペプチドをコードする、MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)またはその変異体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。他の態様では、本発明は、前記ポリヌクレオチドが、C35に特異的に結合するポリペプチドをコードする、MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの相補性決定領域(CDR)またはその変異体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましい態様では、ポリヌクレオチドは、前記CDRが重鎖のCDR3であるMAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つのCDRを含む。
【０１９２】
ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVLを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１９３】
別の態様では、本発明は、CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:66〜69に示すCDR1、CDR2、およびCDR3と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVLを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１９４】
さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:71からなる群より選択される参照VLポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%同一のVLをコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVLを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１９５】
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:66からなるポリペプチド配列を有するVLをコードする核酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVLを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１９６】
さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:66からなる参照VLポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%同一のVLをコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVLを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１９７】
別の局面では、本発明は、本発明のVLをコードする核酸配列、例えばSEQ ID NO:71を含むか、本質的にこれらからなる、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVLを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１９８】
追加の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:71からなるVLの核酸配列を含む、軽鎖可変領域(VL)をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVLを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０１９９】
さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:71からなるVLのポリヌクレオチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、または100%同一のVLをコードする核酸を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。ある態様では、ポリヌクレオチドは、C35に特異的または優先的に結合するVLのポリペプチドを含む。
【０２００】
ある態様では、上記のポリヌクレオチドの1つもしくは複数によってコードされたVHもしくはVLを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる抗体またはその抗原結合断片は、1F2、1B3、MAbc009、MAb 163、MAb 165、もしくはMAb 171からなる群より選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的または優先的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体の対C35結合を競合的に阻害する。
【０２０１】
ある態様では、上記のポリヌクレオチドの1つもしくは複数によってコードされたVHもしくはVLを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる抗体またはその抗原結合断片は、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的または優先的に結合する。
【０２０２】
上記の任意のポリヌクレオチドはさらに、例えば、コードされたポリペプチド、本明細書に記載された抗体定常領域、または本明細書に記載された他の異種ポリペプチドの分泌を誘導するためのシグナルペプチドをコードする追加の核酸を含む場合がある。
【０２０３】
また本発明でより詳細に説明されているように、本発明は、上記のポリヌクレオチドの1つまたは複数を含むポリヌクレオチドを含む組成物を含む。1つの態様では、本発明は、前記第1のポリヌクレオチドが本明細書に記載されたVHのポリペプチドをコードし、かつ前記第2のポリヌクレオチドが本明細書に記載されたVLのポリペプチドをコードする、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを含む組成物を含む。具体的には、前記VHのポリヌクレオチドおよび前記VLのポリヌクレオチドがそれぞれSEQ ID NO:70およびSEQ ID NO:71であるVHのポリヌクレオチドおよびVLのポリヌクレオチドを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物を含む。
【０２０４】
本発明は、本明細書に記載された本発明のポリヌクレオチドの断片も含む。加えて、本明細書に記載された融合ポリヌクレオチド、Fab断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。
【０２０５】
ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の任意の方法で作製または製造することができる。例えば、仮に抗体のヌクレオチド配列が既知であれば、抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから集合させることができる(例えば、Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)に記載)。簡単に説明すると、この方法は、抗体をコードする配列の一部を含む重複するオリゴヌクレオチドの合成、このようなオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびにこれに続く、連結済みオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅を含む。
【０２０６】
あるいは、C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを、適切な供給源に由来する核酸から作製することができる。仮に、特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが利用できないものの、抗体分子の配列が既知であれば、抗体をコードする核酸を化学的に合成するか、または適切な供給源から入手することができる(例えば、抗体のcDNAライブラリー、または抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体または他のC35抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくはポリA+RNAから作製されたcDNAライブラリー)を、配列の3'末端および5'末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するPCR増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって、例えばcDNAクローンを、抗体または他のC35抗体をコードするcDNAライブラリーから同定する。PCRによって作製された増幅済みの核酸は次に、複製可能なクローニングベクターに、当技術分野で周知の任意の方法でクローニングすることができる。
【０２０７】
C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体のヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列が決定されたら、そのヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を操作する当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的変異導入、PCRなどで操作して(例えば、いずれも全体が参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)、およびAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)に記載された手法を参照)、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製する、例えばアミノ酸の置換、欠失、および/または挿入を作製することができる。
【０２０８】
C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、非修飾型のRNAもしくはDNA、または修飾型のRNAもしくはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含む場合がある。例えば、C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、1本鎖および2本鎖のDNA、1本鎖領域と2本鎖領域の混合物であるDNA、1本鎖RNAおよび2本鎖RNA、ならびに1本鎖領域と2本鎖領域の混合物であるRNA、1本鎖、もしくはより典型的には2本鎖であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子、または1本鎖領域と2本鎖領域の混合物を含む場合がある。加えて、C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNA、またはRNAとDNAの両方を含む3本鎖領域を含む場合がある。C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、安定性のために、または他の理由のために修飾された、1つもしくは複数の修飾塩基、またはDNAもしくはRNAの主鎖を含む場合もある。「修飾」塩基は例えば、トリチル化された塩基、およびイノシンなどの非定型塩基を含む。さまざまな修飾をDNAおよびRNAに加えることが可能なことから；「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形状を含む。
【０２０９】
免疫グロブリン(例えば、免疫グロブリンの重鎖部分もしくは軽鎖部分)に由来するポリペプチドの非天然の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、コードされるタンパク質に1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失が導入されるように、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することで作製することができる。変異は、部位特異的変異導入およびPCRによる変異誘発などの標準的な手法で導入することができる。好ましくは、保存的なアミノ酸置換が1個または複数個の非必須アミノ酸残基に作られる。
【０２１０】
V．C35抗体のポリペプチド
本発明はさらに、C35抗体を構成する単離されたポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のC35抗体は、ポリペプチド、例えば免疫グロブリン分子に由来するC35特異的な抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。記載のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、ポリペプチドの起源を意味する。場合によっては、特定の開始ポリペプチドまたはアミノ酸の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、開始配列、またはこの部分のアミノ酸配列と本質的に同一のアミノ酸配列を有する(この部分は、少なくとも10〜20アミノ酸、少なくとも20〜30アミノ酸、少なくとも30〜50アミノ酸からなるか、またはその起源を開始配列に有することが当業者によって同定され得る)。
【０２１１】
1つの態様では、本発明は、重鎖可変領域の少なくとも1つのCDR、または重鎖可変領域の少なくとも2つのCDRが、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の重鎖CDR1、CDR2、もしくはCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90% 95%、99%、もしくは100%同一である、免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを提供する。あるいは、VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域は、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一である。したがって、この態様では、本発明の重鎖可変領域は、SEQ ID NO:62〜65のポリペプチド配列と関連するCDR1、CDR2、およびCDR3のポリペプチド配列を有する。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVHを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２１２】
別の態様では、本発明は、CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:62〜65で表されるCDR1、CDR2、およびCDR3と同一のポリペプチド配列を有する免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを提供する。ある態様では、ポリヌクレオチドによってコードされたVHを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２１３】
さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:62からなる参照VHポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一のVHのポリペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを含む。ある態様では、VHのポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２１４】
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:62からなるVHのポリペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを含む。ある態様では、VHのポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２１５】
ある態様では、上記のVHのポリペプチドの1つもしくは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる抗体またはその抗原結合断片は、1F2、1B3、MAbc009、MAb 163、MAb 165、もしくはMAb 171からなる群より選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的または優先的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体のC35への結合を競合的に阻害する。
【０２１６】
ある態様では、本発明は、MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体または前記断片はC35に特異的に結合する。好ましい態様では、抗体またはその抗原結合断片は、MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも3つのCDRを含む。別の態様では、抗体または断片は、MAb 163の1つのCDRを含む。特定の態様では、1つのCDRは重鎖のCDR3である。
【０２１７】
ある態様では、上記のVHのポリペプチドの1つもしくは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる抗体またはその抗原結合断片は、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的または優先的に結合する。
【０２１８】
別の態様では、本発明は、軽鎖可変領域のCDRの少なくとも1つ、または軽鎖可変領域のCDRの少なくとも2つが、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の重鎖CDR1、CDR2、もしくはCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、もしくは100%同一の免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを提供する。あるいは、VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域は、本明細書に開示されるモノクローナルC35抗体に由来する参照の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、または100%同一である。したがって、この態様では、本発明の軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:66〜69で示されるポリペプチドと関連したCDR1、CDR2、およびCDR3のポリペプチド配列を有する。ある態様では、VLのポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２１９】
別の態様では、本発明は、CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:66で示されるCDR1、CDR2、およびCDR3と同一のポリペプチド配列を有する免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを提供する。ある態様では、VLのポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２２０】
さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:66からなる参照VLポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、99%、もしくは100%同一のVLのポリペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを含む。ある態様では、VLのポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２２１】
別の局面では、本発明は、SEQ ID NO:66からなるVLのポリペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる、単離されたポリペプチドを含む。ある態様では、VLのポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、C35に特異的または優先的に結合する。
【０２２２】
ある態様では、上記のVLのポリペプチドの1つもしくは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる抗体またはその抗原結合断片は、1F2、1B3、MAbc009、MAb 163、MAb 165、もしくはMAb 171からなる群より選択されるモノクローナル抗体と同じエピトープに特異的または優先的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体のC35に対する結合を競合的に阻害する。
【０２２３】
ある態様では、上記のVLのポリペプチドの1つもしくは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる抗体もしくはその抗原結合断片は、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的または優先的に結合する。
【０２２４】
他の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66からなる群より選択されるVHのポリペプチドおよびVLのポリペプチド、またはこの2つの組み合わせを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。
【０２２５】
上記の任意のポリペプチドは、追加のポリペプチド、例えば、コードされたポリペプチド、本明細書に記載された抗体の定常領域、または本明細書に記載された他の異種ポリペプチドの分泌を誘導するためのシグナルペプチドをさらに含む場合がある。加えて、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されたポリペプチド断片を含む。加えて本発明のポリペプチドは、本明細書に記載された融合ポリペプチド、Fab断片、および他の誘導体を含む。
【０２２６】
また、本明細書に詳述されているように、本発明は、上記のポリペプチドを含む組成物を含む。
【０２２７】
当業者であれば、本明細書に記載されたC35抗体のポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、同ポリペプチドが由来する天然の結合ポリペプチドからは変化するように修飾され得ることも理解すると考えられる。例えば、記載のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、開始配列と類似している場合があり、例えば、ある程度のパーセント同一性を有する場合があり、例えば、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%が開始配列と同一である。
【０２２８】
さらに、「非必須」アミノ酸領域における保存的な置換もしくは変化に至るヌクレオチドもしくはアミノ酸の置換、欠失、または挿入が作製可能である。例えば、記載のタンパク質に由来するポリペプチドもしくはアミノ酸の配列は開始配列と、1個もしくは複数個の個々のアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、またはそれ以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失を除いて同一な場合がある。ある態様では、記載のタンパク質に由来するポリペプチドもしくはアミノ酸の配列は、開始配列に対して1〜5個、1〜10個、1〜15個、または1〜20個の個々のアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失を有する。
【０２２９】
本発明のあるC35抗体のポリペプチドは、ヒトのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。しかしながら、あるC35抗体のポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来する1個または複数個の隣接アミノ酸を含む。例えば、本発明のC35抗体は、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分、または抗原結合領域を含む場合がある。別の例では、1個または複数個のマウス由来のアミノ酸が、非マウスの抗体のポリペプチド中に、例えばC35抗体の抗原結合部位中に存在する場合がある。ある治療的応用では、C35特異的抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは類似体は、抗体が投与される動物において免疫原性を有しないように設計される。
【０２３０】
ある態様では、C35抗体ポリペプチドは、抗体と通常結合しないアミノ酸配列、または1つもしくは複数の部分を含む。例示的な修飾について以下に詳述する。例えば、本発明の1本鎖fv抗体断片は、柔軟なリンカーの配列を含む場合があるほか、機能性部分(例えばPEG、薬剤、トキシン、または標識)が付加されるように修飾され得る。
【０２３１】
本発明のC35抗体のポリペプチドは、融合タンパク質を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる場合がある。融合タンパク質は、例えば少なくとも1か所の標的結合部位を有する免疫グロブリンの抗原結合ドメイン、および少なくとも1つの異種部分、すなわち天然では連結していない部分を含むキメラ分子である。アミノ酸配列は通常、融合ポリペプチド中に集合する別のタンパク質中に存在する場合があるほか、通常は、同じタンパク質中に存在するが、融合ポリペプチド中では新たな配置で位置する場合がある。融合タンパク質は例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が望ましい関連性でコードされるポリヌクレオチドを作製および翻訳させることで作製することができる。
【０２３２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される「異種」という表現は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較対象となる残りの実体とは異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書で用いられるC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは類似体と融合している「異種ポリペプチド」は、同じ種の非免疫グロブリンのポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンのポリペプチドに由来する。
【０２３３】
「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換である。塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。したがって、免疫グロブリンのポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と交換される。別の態様では、一連のアミノ酸は、側鎖ファミリーのメンバーの順序および/または組成が異なる構造的に似た一連のアミノ酸と置換され得る。
【０２３４】
あるいは別の態様では、変異は、免疫グロブリンのコード配列の全体または一部に、飽和変異誘発などによってランダムに導入することが可能であり、ならびに結果として得られる突然変異体を、本明細書に開示される診断法および処置法に使用されるC35抗体中に組み入れることが可能であり、ならびに望ましい抗原、例えばC35に対する結合能力に関してスクリーニングを行うことができる。
【０２３５】
VI．融合タンパク質および抗体接合体
本明細書で詳述されるように、本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はさらに、異種ポリペプチドと、N末端もしくはC末端において組換え的に融合させることができるほか、ポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に接合させることができる(共有結合的および非共有結合的な接合を含む)。例えば、C35特異的抗体を、検出アッセイ法における標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、またはトキシンなどのエフェクター分子に、組換え的に融合または接合させることができる。これについては例えば、PCT公報WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；米国特許第5,314,995号；およびEP 396,387を参照されたい。
【０２３６】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、例えば共有結合による付加が、C35に対する抗体の結合を妨げないように、抗体への任意のタイプの分子の共有結合による付加によって修飾された誘導体を含む。例えば、限定する意図はないものの、抗体の誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィレーション(phosphylation)、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞内リガンドもしくは他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体を含む。任意の数多くの化学的修飾は、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知の手法で実施することができる。加えて誘導体は、1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含む場合がある。
【０２３７】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ペプチド結合もしくは修飾型ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターによって相互に結合されたアミノ酸を含む場合があり、および遺伝子によってコードされる20個のアミノ酸以外のアミノ酸を含む場合がある。C35特異的抗体は、翻訳後プロセシングなどの天然の過程によって、または当技術分野で周知の化学的修飾法によって修飾され得る。このような修飾は、基本的な教科書に、およびより詳細なモノグラフに、ならびに多数の研究論文に詳しく記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含む、C35特異的抗体中のどの位置においても、または糖などの部分上に生じ得る。同じタイプの修飾が、任意のC35特異的抗体中の複数の部位に、同じか、または異なる程度で存在し得ることが理解される。また、任意のC35特異的抗体は、いくつかのタイプの修飾を含む場合がある。C35特異的抗体は、例えばユビキチン化の結果として分岐状とすることが可能であり、および分岐を伴うか、または伴わない環状とすることができる。環状で分岐状の、および分岐状で環状のC35特異的抗体は、翻訳後の天然の過程で生じる場合があるほか、合成法によって作製することができる。修飾は、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、共有結合によるフラビンの付加、共有結合によるヘム部分の付加、ヘム部分の共有結合によるヘム部分の付加、共有結合による脂質もしくは脂質誘導体の付加、共有結合によるホスファチジルイノシトールの付加、架橋、環状化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質への転移RNAを介したアミノ酸の付加、およびユビキチン化を含む(例えば、Proteins-Structure And Molecular Properties, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs.1-12 (1983)；Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990)；Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)を参照)。
【０２３８】
本発明は、C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体、および異種ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供する。抗体に融合している異種ポリペプチドは、機能に役立つ場合があるほか、C35ポリペプチド発現細胞を標的とするのに有用である。1つの態様では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の任意の1つもしくは複数のVH領域のアミノ酸配列、または本発明の抗体の任意の1つもしくは複数のVL領域のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。別の態様では、本明細書に開示される診断法および処置法に使用される融合タンパク質は、C35特異的抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体の任意の1つ、2つ、3つのVH CDRのアミノ酸配列、またはC35特異的抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体の任意の1つ、2つ、3つのVL CDRのアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。1つの態様では、融合タンパク質は、本発明のC35特異的抗体、またはその断片、誘導体、もしくは変異体のVH CDR3のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および融合タンパク質がC35の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する異種ポリペプチド配列を含む。別の態様では、融合タンパク質は、本発明のC35特異的抗体の少なくとも1つのVH領域のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および本発明のC35特異的抗体、またはその断片、誘導体、もしくは変異体の少なくとも1つのVL領域のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を含む。好ましくは、融合タンパク質のVH領域およびVL領域は、C35の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する1つの供給源の抗体(またはscFv断片もしくはFab断片)に対応する。さらに別の態様では、本明細書に開示される診断法および処置法に使用される融合タンパク質は、C35特異的抗体の任意の1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVH CDR、およびC35特異的抗体、またはその断片もしくは変異体の任意の1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVL CDRのアミノ酸配列、ならびに異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、もしくはそれ以上のVH CDRまたはVL CDRは、本発明の1つの供給源の抗体(またはscFv断片もしくはFab断片)に対応する。このような融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含まれる。
【０２３９】
文献に報告されている例示的な融合タンパク質は、T細胞受容体の融合体(Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987))；CD4の融合体(Capon et al., Nature 337:525-531 (1989)；Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989)；Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990)；およびByrn et al., Nature 344:667-670 (1990))；L-セレクチン(ホーミング受容体)の融合体(Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990)；およびWatson et al., Nature 349: 164-167 (1991))；CD44の融合体(Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990))；CD28およびB7の融合体(Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991))；CTLA-4の融合体(Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991))；CD22の融合体(Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991))；TNF受容体の融合体(Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991)；Lesslauer et al., Eur. J. Immunol 27:2883-2886 (1991)；およびPeppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991))；ならびにIgE受容体aの融合体(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991))を含む。
【０２４０】
本明細書に記載されているように、本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を異種ポリペプチドに融合させることで、ポリペプチドのインビボにおける半減期を延長させることができるほか、当技術分野で既知の方法によるイムノアッセイ法に使用することができる。例えば1つの態様では、PEGを本発明のC35抗体に接合させて、インビボにおけるその半減期を延長させることができる。Leong, S.R., et al., Cytokine 16:106 (2001)；Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002)；またはWeir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)。
【０２４１】
さらに、本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、ペプチドなどのマーカー配列と融合させることで、その精製または検出を容易にすることができる。好ましい態様では、マーカーとなるアミノ酸配列は、特に、多くが市販されているpQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)中に提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。例えば、Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を可能とする。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「HA」タグ(Wilson et al., Cell 37:767 (1984))、および「flag」タグを含むが、これらに限定されない。
【０２４２】
融合タンパク質は、当技術分野で周知の方法で作製することができる(例えば米国特許第5,116,964号および第5,225,538号を参照)。融合が生じる正確な部位は、融合タンパク質の分泌特性または結合特性が最適化されるように、実験によって選択することができる。次に、融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞にトランスフェクションして発現させる。
【０２４３】
本発明のC35抗体は、非接合状態で使用することができるほか、例えば分子の治療特性を改善するために、標的の検出を容易にするために、または患者のイメージングもしくは治療用に、多様な分子の少なくとも1つに接合させることができる。本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、精製が行われる場合には、精製前または精製後のいずれかの時点で標識もしくは接合が可能である。
【０２４４】
特に、本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾物質、医用薬剤、またはPEGに接合させることができる。
【０２４５】
当業者であれば、接合体を、接合用に選択される薬剤に依存して、さまざまな手法で集合させることが可能なことも理解すると考えられる。例えば、ビオチンとの接合体は、例えば結合ポリペプチドを、ビオチンN-ヒドロキシスクシニミドエステルなどのビオチンの活性化エステルと反応させることで作製される。同様に、蛍光マーカーとの接合体は、例えば本明細書に記載されたカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン-イソチオシアネートと反応させることで作製することができる。本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の接合体は類似の様式で作製される。
【０２４６】
本発明はさらに、診断薬または治療薬に接合している本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。C35抗体は、例えば、所与の処置および/または予防のレジメンの有効性を判定する臨床検討の一部として、疾患の発生または進行をモニタリングする診断に使用することができる。検出は、C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を検出用物質にカップリングさせることで容易にすることができる。検出用物質の例は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性物質、さまざまな陽電子放出トモグラフィーを使用する陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含む。本発明による診断に用いられる抗体に接合可能な金属イオンに関しては例えば、米国特許第4,741,900号を参照されたい。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンを含み；適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンを含み；発光材料の例はルミノールを含み；生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み；ならびに適切な放射性物質の例は、125I、131I、111In、または99Tcを含む。
【０２４７】
C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、これを化学発光化合物にカップリングさせることで検出用に標識することもできる。化学発光標識C35抗体の存在は後に、化学反応の過程で生じる発光を検出することで判定される。特に有用な化学発光標識用化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０２４８】
C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を検出可能に標識可能な方法の1つは、これらを酵素に連結させること、および連結化合物を酵素イムノアッセイ法(EIA)に使用することである(Voller, A.,「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)」 Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978))；Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978)；Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981)；Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980)；Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981))。C35抗体に結合する酵素は、適切な基質、好ましくは色素生産性基質と、例えば分光光度的、蛍光定量的な手段によって、または視覚的な手段によって検出され得る化学的部分を産生するように反応する。抗体を検出可能に標識する際に使用可能な酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない。加えて検出は、酵素に対する色素生産性基質を使用する比色法で達成することができる。検出は、同様に作製された標準との比較における、基質の酵素反応の程度の視覚的比較によって達成することもできる。
【０２４９】
検出は、任意のさまざまな他のイムノアッセイ法で達成することもできる。例えば、C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を放射活性的に標識することによって、ラジオイムノアッセイ法(RIA)によって抗体を検出することができる(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986))を参照)。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを含むが、これらに限定されない手段で検出することができる。
【０２５０】
C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、152Euもしくはランタニド系列の他の金属などの蛍光放出金属を使用して検出可能に標識することもできる。このような金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)やエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート基を使用して抗体に結合させることができる。
【０２５１】
さまざまな部分をC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体に接合させる手法は周知であり、例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985))のArnon et al.,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」；Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp.623-53 (1987)のHellstrom et al.,「Antibodies For Drug Delivery」；Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985)のThorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp.303-16 (1985)の「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、およびThorpe et al.,「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)を参照されたい。個々の参考文献は、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５２】
VII．抗体ポリペプチドの発現
周知のように、RNAを当初のハイブリドーマ細胞から、または他の形質転換細胞から、グアニジニウムイソチオシアネートによる抽出および沈降、これに続く遠心もしくはクロマトグラフィーなどの標準的な手法によって単離することができる。望ましいならば、mRNAを全RNAから、オリゴdTセルロース上のクロマトグラフィーなどの標準的な手法で単離することができる。適切な手法は、当技術分野でよく知られている。
【０２５３】
1つの態様では、抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAを、同時か、または個別かのいずれかの時点で、周知の方法に逆転写酵素およびDNAポリメラーゼを使用して作製することができる。PCRは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開された重鎖および軽鎖のDNAならびにアミノ酸の配列に基づく、より特異的なプライマーによって開始することができる。上述したように、PCRで抗体の軽鎖および重鎖をコードするDNAクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリーを、コンセンサスプライマー、またはマウスの定常領域プローブなどのより長い相同プローブによってスクリーニングすることができる。
【０２５４】
DNA、典型的にはプラスミドDNAは、当技術分野で周知の手法で単離することが可能であり、例えば、組換えDNA技術に関する前述の参考文献に詳細に記載された標準的な周知の手法で制限酵素によるマッピングが行われ、配列が決定される。DNAを本発明によって、単離過程または後の解析中の任意の時点で合成することができることは言うまでもない。
【０２５５】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を提供するために、単離された遺伝材料を操作した後、望ましい量のC35抗体の産生に使用され得る宿主細胞への導入用に、C35抗体をコードするポリヌクレオチドは典型的には発現ベクター中に挿入される。
【０２５６】
抗体、またはその断片、誘導体、もしくは類似体、例えば本明細書に記載された標的分子に結合する抗体(例えばC35)の重鎖または軽鎖の組換え的発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはこの部分(好ましくは重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインを含む)をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体分子の産生用のベクターを、当技術分野で周知の手法による組換えDNA技術で作製することができる。したがって本明細書では、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることでタンパク質を作製する方法について開示する。当業者に周知の方法で、抗体コード配列、ならびに適切な転写および翻訳の制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。このような方法は例えば、インビトロにおける組換えDNA技術、合成法、およびインビボにおける遺伝子組換えを含む。したがって本発明は、プロモーターに機能的に連結している、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターには、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列(例えば、PCT公報WO86/05807；PCT公報WO89/01036；および米国特許第5,122,464号を参照)を含めることが可能であり、ならびに抗体の可変ドメインを、そのようなベクターにクローニングすることで、重鎖もしくは軽鎖の全体を発現させることができる。
【０２５７】
「ベクター」または「発現ベクター」という表現は本明細書において、所望の遺伝子を宿主細胞に導入し、かつ宿主細胞内で発現させるための媒介物として本発明で使用されるベクターを意味するように使用される。当業者であれば承知しているように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群より容易に選択することができる。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、適切な制限酵素切断部位を含み、所望の遺伝子のクローニングを容易にし、かつ真核細胞または原核細胞中への侵入能力、および/またはこれらの細胞における複製能力を含む。
【０２５８】
本発明の目的に対して、数多くの発現ベクター系を使用することができる。例えば、1つのクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTV、もしくはMOMLV)、またはSV40ウイルスなどの動物ウイルスに由来するDNAエレメントを利用する。他の発現ベクター系は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を含む。加えて、DNAが染色体中に組み込まれた細胞を、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能とする1つまたは複数のマーカーを導入することで選択することができる。マーカーは栄養要求性の宿主に、原栄養性(prototrophy)、殺生物剤(例えば抗生物質)耐性、または銅などの重金属に対する耐性を付与することができる。選択マーカーの遺伝子は、発現対象のDNA配列に直接連結可能なほか、同時形質転換によって同じ細胞に導入することができる。追加的なエレメントが、mRNAの最適な合成に必要とされる場合もある。このようなエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写のプロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含む場合がある。
【０２５９】
特に好ましい態様では、クローニングされた可変領域の遺伝子が発現ベクター中に、上記の手順で合成された重鎖および軽鎖の定常領域の遺伝子(好ましくはヒト)と共に挿入される。真核細胞における発現を誘導可能な任意の発現ベクターが本発明で使用可能なことは言うまでもない。適切なベクターの例は、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、およびpZeoSV2(Invitrogen, San Diego, CAから入手可能)、ならびにプラスミドpCI(Promega, Madison, WIから入手可能)を含むが、これらに限定されない。一般に、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を適切に高レベルで発現する多数の形質転換細胞をスクリーニングすることは、例えばロボットシステムにより実施可能な常用の実験法である。
【０２６０】
より一般的には、C35抗体のモノマーのサブユニットをコードするベクターまたはDNA配列が作製されたら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知のさまざまな手法で達成することができる。このような手法は、トランスフェクション(電気泳動およびエレクトロポレーションを含む)、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿法、封入化DNAによる細胞融合、マイクロインジェクション、ならびに完全ウイルスの感染を含むが、これらに限定されない。これについては、Ridgway, A.A.G.,「Mammalian Expression Vectors」Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Chapter 24.2, pp.470-472 (1988)を参照されたい。典型的には、宿主へのプラスミドの導入はエレクトロポレーションによる。発現構築物を保有する宿主細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適した条件で成長させ、ならびに重鎖および/または軽鎖のタンパク質合成に関するアッセイ法を行う。例示的なアッセイ法は、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ法(RIA)、または蛍光活性化細胞選別解析(FACS)、免疫組織化学的手法などを含む。
【０２６１】
発現ベクターが従来の手法で宿主細胞に導入された後に、トランスフェクションされた細胞が従来の手法で培養されることで、本明細書に記載された方法に使用される抗体が産生される。したがって本発明は、異種プロモーターに機能的に連結している、本発明の抗体もしくはその断片、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。2本鎖抗体を発現させるための好ましい態様では、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子の全体の発現を目的として、宿主細胞中で同時に発現させることができる。
【０２６２】
本明細書で用いられる「宿主細胞」とは、組換えDNA技術で構築されたベクター、および少なくとも1つの異種遺伝子コードするベクターを保有する細胞を意味する。組換え宿主からの抗体の単離の過程に関する記述では、「細胞」および「細胞培養物」という表現は、特に明記されない限り、抗体の供給源を意味するように互換的に使用される。言い換えるならば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、沈降させた細胞全体からか、または培地と懸濁細胞の両方を含む細胞培養物からのいずれかを意味する場合がある。
【０２６３】
本明細書に記載された方法に使用される抗体分子を発現させるために、さまざまな宿主-発現ベクター系を使用することができる。このような宿主-発現系は、対象となるコード配列が産生後に精製され得る媒体を意味するが、適切なヌクレオチドのコード配列によって形質転換またはトランスフェクションされた場合に、本発明の抗体分子をインサイチューで発現可能な細胞も意味する。これらは、抗体コード配列を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAの発現ベクターで形質転換された細菌(例えば大腸菌、枯草菌)などの微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えばサッカロミセス(Saccharomyces)、ピキア(Pichia))；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換え発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させたか、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)、もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルスの後期プロモーター；ワクシニアウイルスの7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系(例えばCOS細胞、CHO細胞、BLK細胞、293細胞、3T3細胞)を含むが、これらに限定されない。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、およびより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現用の真核細胞が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子のプロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞が、抗体の有効な発現系である(Foecking et al., Gene 45：101 (1986)；Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990))。
【０２６４】
タンパク質の発現に使用される宿主細胞系列は哺乳動物起源であることが多く；当業者であれば、所望の遺伝子産物を発現させるのに最も適した特定の宿主細胞系列を優先的に決定できると考えられる。例示的な宿主細胞系列は、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)、DG44およびDUXB11(チャイニーズハムスター卵巣系列、DHFR-)、HELA(ヒト子宮頚癌)、CVI(サル腎臓系列)、COS(SV40のT抗原によるCVIの誘導体)、VERY、BHK(ベビーハムスター腎臓)、MDCK、293、WI38、R1610(チャイニーズハムスター線維芽細胞)、BALBC/3T3(マウス線維芽細胞)、HAK(ハムスター腎臓系列)、SP2/O(マウス骨髄腫)、P3x63-Ag3.653(マウス骨髄腫)、BFA-1c1BPT(ウシ内皮細胞)、RAJI(ヒトリンパ球)、および293(ヒト腎臓)を含むが、これらに限定されない。宿主細胞系列は典型的には業者から、American Tissue Culture Collectionから、または公開された文献から入手できる。
【０２６５】
また、挿入された配列の発現を調節するか、または望ましい特異的な様式で、遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾(例えばグリコシル化)およびプロセシング(例えば切断)は、タンパク質の機能に重要な場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾のための特徴的および特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実なものとするために、適切な細胞系列または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞装置を保有する真核宿主細胞を使用することができる。
【０２６６】
組換えタンパク質の長期の高収量の産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系列を作製することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント(例えばプロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)、および選択マーカーによって制御されるDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入後に、改変細胞を1〜2日間にわたって濃縮培地で成長させ、その後に選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、ならびにプラスミドを細胞の染色体に安定に組み込ませること、および最終的にクローニングされて細胞系列中で増殖する増殖巣を形成するように細胞を成長させることを可能とする。この方法は、抗体分子を安定に発現する細胞系列の作製に有利に使用することができる。
【０２６７】
単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子(Wigler et al., Cell 11:223 (1977))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992))、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子(Lowy et al., Cell 22:817 1980)を含むが、これらに限定されない、いくつかの選択系を、それぞれtk-、hgprt-、またはaprt-の細胞に使用することができる。また、以下の遺伝子の選択の基礎として代謝拮抗剤耐性を使用することができる：メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)；O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981))；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981))；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993)；ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984))。使用可能な、組換えDNA技術の技術分野で既知の方法は、全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；ならびに、Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)の第12章および第13章；Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)に記載されている。
【０２６８】
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅によって高めることができる(総説として、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol.3. (1987)を参照)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅され得る場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの上昇は、マーカー遺伝子のコピー数を増やすと考えられる。増幅される領域は抗体遺伝子に結合しているので、抗体の産生も高まる(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983))。
【０２６９】
インビトロにおける産生によって、望ましいポリペプチドを大量に得るためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養する手法は当技術分野で既知であり、例えば、エアリフト反応槽中におけるか、または連続撹拌(continuous stirrer)反応槽中における均一な懸濁培養か、または例えば中空繊維やマイクロカプセル中におけるか、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上における固定化もしくは捕捉された細胞培養物を含む。必要であれば、および/または望ましいならば、ポリペプチドの溶液は、例えば合成ヒンジ領域のポリペプチドの選択的な生合成の後に、または本明細書に記載されたHICクロマトグラフィー段階の前もしくは後における、常用のクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE-セルロースによるクロマトグラフィー、または(イムノ)アフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【０２７０】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコードする遺伝子を、細菌または酵母もしくは植物の細胞などの非哺乳動物細胞で発現させることもできる。核酸を容易に取り込む細菌は、大腸菌やサルモネラの株などの腸内細菌科；枯草菌(Bacillus subtilis)などのバシラス科；肺炎球菌(Pneumococcus)；連鎖球菌(Streptococcus)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)を含む。さらに、細菌で発現させた場合に、異種ポリペプチドが典型的には、封入体の一部となることが理解されると考えられる。異種ポリペプチドは、単離され、精製された後に、機能性分子に集合されなければならない。4価の形状の抗体が望ましいならば、次にサブユニットを4価の抗体に自己集合させる(WO02/096948A2)。
【０２７１】
細菌の系では、いくつかの発現ベクターを有利には、発現される抗体分子の意図される使用に依存して選択することができる。例えば、抗体分子の薬学的組成物の作製用に、このようなタンパク質が大量に産生される場合は、精製が容易な高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターは、大腸菌の発現ベクターpUR278(Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983))(コード配列は、融合タンパク質が産生されるように、lacZのコード領域とインフレームで抗体ベクターに個別に連結可能である)；pINベクター(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985)；Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989))ほかのベクターを含むが、これらに限定されない。pGEXベクターを使用して、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、および溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズへの吸着および結合と、これに続く遊離のグルタチオンの存在下における溶出によって容易に精製することが可能である。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から切り離し可能なように、トロンビンまたは第Xa因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０２７２】
原核生物に加えて、真核微生物を使用することもできる。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、すなわち一般的なパン酵母は最も広く使用されている真核微生物であるが、例えばピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの他のいくつかの株が一般に入手できる。
【０２７３】
サッカロミセスにおける発現では、例えばプラスミドYRp7(Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979)；Kingsman et al., Gene 7:141 (1979)；Tschemper et al., Gene 10：157 (1980))が広く使用されている。このプラスミドは当初から、トリプトファンの存在下で成長能力を欠く酵母、ATCC番号44076またはPEP4-1の変異株の選択マーカーとなるTRP1遺伝子を含んでいる(Jones, Genetics 85:12 (1977))。酵母宿主細胞のゲノムの特徴としてのtrp1の欠損の存在は後に、トリプトファンの非存在下における成長によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０２７４】
昆虫の系では、キンウワバの一種(Autographa californica)の核多角体病ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして主に使用されている。このウイルスは、ヨウトガ(Spodoptera frugiperda)の細胞内で成長する。抗体のコード配列をウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)中に個別にクローニングし、およびAcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置することができる。
【０２７５】
本発明の抗体分子が組換え的に発現されたら、それを、免疫グロブリン分子の精製に関する当技術分野で既知の任意の方法で、例えば、クロマトグラフィー(例えばイオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインA後の特異的抗原に対する親和性を利用するアフィニティクロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度の差、またはタンパク質を精製する任意の他の標準的な手法によって精製することができる。あるいは、本発明の抗体の親和性を高める好ましい方法は、US 2002/0123057 A1に開示されている。
【０２７６】
VIII．治療用C35抗体を用いた処置法
本発明は、過剰増殖性疾患を処置する、例えば癌を処置するためのC35の使用に関する。いくつかの態様では、1つのC35抗体が投与される場合がある。他の態様では、2つまたはそれ以上、および好ましくは2つのC35抗体が投与される。さらに、抗体または抗体群は治療薬と共に投与することができる。特定の態様では、治療薬は化学療法剤である。より特定の態様では、化学療法剤はパクリタキセルである。別の特定の態様では、化学療法剤はアドリアマイシンである。
【０２７７】
少なくとも2つのC35抗体が投与される態様では、抗体はC35中のさまざまなエピトープに結合可能である。例えば、1つの抗体は、C35(SEQ ID NO:2)の残基105〜115内に位置するエピトープに結合可能であるが、別の抗体は、C35(SEQ ID NO:2)の残基48〜104内に位置するエピトープに結合可能である。特定の態様では、C35のこれらの領域内のエピトープに結合するC35抗体は1B3および1F2である。別の態様では、少なくとも2つのC35抗体のうちの少なくとも1つは、C35(SEQ ID NO:2)の残基48〜87内のエピトープに結合する。特定の態様では、C35(SEQ ID NO:2)の残基48〜87内のエピトープに結合する少なくとも1つの抗体はMAb 163である。
【０２７８】
本発明は、同じエピトープに結合する2つのC35抗体を投与する段階も含む。例えば、C35(SEQ ID NO:2)の残基105〜115内に位置するエピトープに結合する2つの異なるC35抗体を投与することができる。同様に、C35(SEQ ID NO:2)の残基48〜104内に位置するエピトープに結合する2つの異なるC35抗体を投与することができる。
【０２７９】
いくつかの態様では、C35抗体または本発明の方法に使用される抗体は、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、参照モノクローナル抗体の解離定数(KD)よりも小さいKDを特徴とする親和性で結合する、その能力に基づいて選択され得る。本発明は、これらの態様の目的で参照モノクローナル抗体として本明細書に開示される全てのC35抗体を含む。特定の態様では、本明細書に開示されるモノクローナル抗体1B3および1F2は参照抗体である。
【０２８０】
別の態様では、参照モノクローナル抗体はMAb 163である。したがって、いくつかの態様では、C35抗体または抗体群は、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに結合する抗体は、MAb 163の解離定数(KD)よりも小さいKDによって特徴付けられる親和性で結合する(後述の実施例16を参照)。
【０２８１】
いくつかの態様では、本発明の方法に使用される少なくとも1つのC35抗体または断片は、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する。
【０２８２】
いくつかの態様では、本発明は、1つのC35抗体を化学療法剤と共に投与する段階を含む。本明細書に開示される任意のC35抗体を、この方法に使用することができる。いくつかの態様では、C35抗体は、化学療法剤の投与前、投与後、または投与と同時に投与される。好ましい態様では、MAb 163は化学療法剤と共に投与される。1つの態様では、化学療法剤はパクリタキセルである。
【０２８３】
いくつかの好ましい態様では、本発明は、少なくとも2つのC35抗体を化学療法剤と共に投与する段階を含む。C35抗体の任意の組み合わせが投与可能であり、および全ての組み合わせが本発明に含まれる。例えば、任意の以下の組み合わせを使用することができる：1F2と1B3、1F2とMAbc009、1F2とMAb 163、1F2とMAb 165、1F2とMAb 171、1B3とMAbc009、1B3とMAb 163、1B3とMAb 165、1B3とMAb 171、MAbc009とMAb 163、MAbc009とMAb 165、MAbc009とMAb 171、MAb 163とMAb 165、MAb 163とMAb 171、またはMAb 165とMAb 171。本発明には、変異体(例えばヒト化バージョン、親和性が最適化されたバージョン)の投与、または相互に組み合わされる、および治療薬(例えば化学療法剤)と組み合わされる、これらの任意の抗体の誘導体の投与も含まれる。抗体と治療薬の組み合わせ、または抗体と治療薬なしの組み合わせを含む組成物も本発明に含まれる。
【０２８４】
いくつかの好ましい態様では、MAb 163は、MAb 165および化学療法剤と組み合わせて投与可能である。同様に、図12から、パクリタキセルと組み合わせた場合のマウスのC35抗体1F2および1B3が、マウスの腫瘍容積の縮小に有効なことがわかる。
【０２８５】
癌を有する対象がヒトである態様では、投与される抗体は好ましくは、完全ヒト抗体またはヒト化抗体である。ヒト化抗体は、MAb 165、または本明細書に開示される任意のマウスのC35抗体のヒト化抗体、例えば1F2および/または1B3のヒト化バージョンを含むが、これらに限定されない場合がある。MAb 163、MAb 165、1B3、および1F2を含むが、これらに限定されない、親和性が最適化されたバージョンの抗体も本発明に含まれる。
【０２８６】
本発明の方法および組成物は、新生物を含む過剰増殖性の疾患、障害、および/または症状の処置に使用することができる。本発明の記載の方法によって処置可能な過剰増殖性の疾患、障害、および/または症状の例は、以下の部位に位置する新生物を含むが、これらに限定されない：前立腺、結腸、腹部、骨、乳腺、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、目、頭頸部、神経(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器。
【０２８７】
このような過剰増殖性障害の他の例は、以下を含むが、これらに限定されない：急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人(原発性)肝細胞癌、成人(原発性)肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部肉芽、AIDS関連リンパ腫、AIDS関連悪性腫瘍、肛門癌、星細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂および輸尿管の癌、中枢神経系(原発性)リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頚癌、小児(原発性)肝細胞癌、小児(原発性)肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児性頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児の視床下部および視覚経路の神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児の松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉芽種、小児の視覚経路および視床下部の神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨肉腫性白血病(Chronic Myelogenous Leukemia)、結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、目の癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高γグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内悪性黒色腫、膵島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌、口唇および口腔の癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖症候群、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頚癌、転移性原発性扁平上皮頚癌、転移性扁平上皮頚癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨肉腫性白血病(Myelogenous Leukemia)、骨髄性白血病(Myeloid Leukemia)、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫型皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌(Occult Primary Metastatic Squamous Neck Cancer)、口咽頭癌、骨/悪性線維性肉腫、骨肉腫/悪性線維性肉腫組織球腫、骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在性腫瘍、膵臓癌、異常蛋白血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物/多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂および尿管の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉種、扁平上皮頚癌、胃癌、テント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、T細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、移行性の腎盂および尿管の癌、栄養膜腫瘍、尿管および腎盂細胞の癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、��覚経路および視床下部の神経膠腫、外陰部の癌、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに任意の他の過剰増殖性疾患、ならびに異常増殖であって上記に列挙された器官系に位置づけられるもの。
【０２８８】
いくつかの特定の態様では、過剰増殖性障害は、乳腺、膀胱、肝臓、結腸、卵巣、および皮膚からなる群より選択される組織または器官の癌である。
【０２８９】
本発明の方法および組成物は、前癌状態を処置するために、および上記の障害を含むが、これらに限定されない新生物すなわち悪性状態への進行を予防するために使用することができる。このような使用は、特に、過形成、化生、または最も特異的には形成異常からなる非新生物細胞の成長が生じる場合における、新生物もしくは癌への前述の進行が既知であるか、または疑われる状態で指示される(このような異常成長状態の総説として、Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.68-79を参照)。
【０２９０】
過形成は、構造もしくは機能において有意な変化を伴わない、組織または器官における細胞数の増大を含む、制御された細胞増殖形態である。本発明の方法で処置可能な過形成障害は、脈管濾胞性縦隔リンパ節過形成、好酸球増加症を伴う血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節過形成、セメント質過形成、先天性副腎皮質過形成、先天性皮脂腺過形成、嚢胞過形成、乳房嚢胞性過形成、義歯性線維症、乳管過形成、子宮内膜過形成、線維筋性過形成、局所性上皮過形成、歯肉過形成、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭状過形成、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性過形成、老人性脂腺増殖症、および疣贅性肥厚を含むが、これらに限定されない。
【０２９１】
化生は、成体の細胞または完全に分化した細胞の1つの型が、別の型の成体の細胞に置き換わる、制御された細胞増殖形態である。本発明に記載の方法で処置可能な化生障害は、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄化生、二次性骨髄様化生、扁平化生、羊膜の扁平化生、および症候性骨髄化生を含むが、これらに限定されない。
【０２９２】
形成異常は、癌の前兆であることが多く、および主に上皮に見出される；形成異常は、非腫瘍性細胞増殖の最も乱れた形態であり、これは、個々の細胞の一様性の喪失および細胞の構築的配向の喪失を含む。形成異常細胞は、しばしば異常に大きく、濃く染色される核を有し、および多態性を呈する。形成異常は、特徴的に慢性的な過敏または炎症の存在する部位に生じる。本発明の記載の方法で処置可能な形成異常障害は、無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指(atriodigital)形成異常、気管支肺異形成症、終脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉異形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋骨手根足根骨形成不全、頭蓋骨幹端形成異常、象牙質異形成症、骨幹形成異常、外胚葉形成異常、エナメル質形成異常、脳-眼球異形成(encephalo-opthalmic dysplasia)、足根骨肥大、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性顎骨の線維性形成異常、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨異形成症、遺伝性腎性-網膜性形成異常(hereditary renal-retinal dysplasia)、発汗性外胚葉形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳腺形成異常、顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型形成異常(Mondini dysplasia)、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成異常、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質異形成症、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔-視覚異形成症、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常を含むが、これらに限定されない。
【０２９３】
本発明の方法および組成物で処置可能な他の前新生物(pre-neoplastic)障害は、良性の増殖異常(dysproliferative)障害(例えば良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道異形成)、白斑症、角化症、ボーエン病、ファーマーズスキン(Farmer's skin)、日光口唇炎、および日光性角化症を含むが、これらに限定されない。
【０２９４】
好ましい態様では、本発明の方法および組成物は、癌、特に上記の癌の成長、進行、および/または転移を阻害するために使用される。
【０２９５】
好ましい態様では、本発明の方法および組成物を、癌、特に乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、および黒色腫からなる群より選択される癌の処置、成長、進行、および/または転移の阻害に使用することができる。
【０２９６】
過剰増殖性疾患を処置するために投与される抗体または抗体群は、任意でアポトーシスを誘導可能な薬剤と共に投与することができる。アポトーシス誘導療法は、化学療法剤(抗悪性腫瘍剤としても知られる)、放射線照射療法、および放射線療法と化学療法の併用を含む。
【０２９７】
いくつかの好ましい態様では、過剰増殖性疾患、例えば癌を処置するために投与されるC35抗体または抗体群は、化学療法剤と共に投与される。例えば本発明は、少なくとも2つのC35抗体を治療薬と共に投与する段階を含む、癌を処置する方法を含む。
【０２９８】
例示的な治療薬は、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、アントラサイクリン系抗生物質、アクチノマイシンD、プリカマイシン、ピューロマイシン、グラミシジンD、パクリタキセル (タキソール(Taxol)(商標), Bristol Myers Squibb)、コルヒチン、サイトカラシンB、エメチン、メイタンシン(maytansine)、およびアムサクリン(または「mAMSA」)である。ビンカアルカロイドのクラスについては、Goodman and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics (7th ed.), (1985)のpp.1277〜1280に記載されている。例示的なビンカアルカロイドは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビンデシンである。エピポドフィロトキシンのクラスについては、Goodman and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics (7th ed.), (1985)のpp.1280〜1281に記載されている。例示的なエピポドフィロトキシンは、エトポシド、エトポシド・オルトキノン、およびテニポシドである。アントラサイクリン系抗生物質のクラスについては、Goodman and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics (7th ed.), (1985)のpp.1283〜1285に記載されている。例示的なアントラサイクリン系抗生物質は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン(mitoxantraone)、およびビサントレンである。ダクチノマイシンとも呼ばれるアクチノマイシンDについては、Goodmand and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics (7th ed.), (1985)のpp.1281〜1283に記載されている。ミスラマイシンとも呼ばれるプリカマイシンについては、Goodmand and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics (7th ed.), (1985)のpp.1287〜1288に記載されている。他の化学療法剤は、シスプラチン (Platinol(商標), Bristol Myers Squibb)、カルボプラチン (Paraplatin(商標), Bristol Myers Squibb)、マイトマイシン (Mutamycin(商標), Bristol Myers Squibb)、アルトレタミン (Hexalen(商標), U.S. Bioscience, Inc.)、シクロホスファミド (Cytoxan(商標), Bristol Myers Squibb)、ロムスチン (CCNU)(CeeNU(商標), Bristol Myers Squibb)、カルムスチン (BCNU)(BiCNU(商標), Bristol Myers Squibb)を含む。
【０２９９】
例示的な化学療法剤は、アクラシノマイシンA、アクラルビシン、アクロニン、アクロナイシン(acronycine)、アドリアマイシン、アルデスロイキン (インターロイキン-2)、アルトレタミン (ヘキサメチルメラミン)、アミノグルテチミド、アミノグルテチミド (シタドレン(cytadren))、アミノイミダゾールカルボキサミド、アムサクリン (m-AMSA；アムシジン(amsidine))、アナストラゾール (アリミデックス(arimidex))、アンシタビン、アントラサイクリン(anthracyline)、アントラマイシン、アスパラギナーゼ (エルスパー(elspar))、アザシチジン(azacitdine)、アザシチジン (ラダカマイシン(ladakamycin))、アザグアニン、アザセリン、アザウリジン、1,1',1''-ホスフィノチオイリジネトリス(phosphinothioylidynetris)アジリジン、アジリノ(2',3':3,4)ピロロ(1,2-a)インドール-4,7-ジオン、BCG (セラシス(theracys))、BCNU、BCNUクロロエチルニトロソ尿素、ベンズアミド、4-(ビス(2-クロロエチル)アミノ)ベンゼンブタン酸、ビカルタミド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブレオマイシン、ブレオマイシン (ブレノザン(blenozane))、ブレオマイシン、ブロモデオキシウリジン、ブロクスウリジン、ブスルファン (ミレラン(myleran))、カルバミン酸エチルエステル、カルボプラチン、カルボプラチン (パラプラチン(paraplatin))、カルムスチン、カルムスチン (BCNU；BiCNU)、クロランブシル (リューケラン(leukeran))、クロロエチルニトロソ尿素、クロロゾトシン(chorozotocin) (DCNU)、クロモマイシンA3、シス-レチノイン酸、シスプラチン (シス-ddpl；プラチノール(platinol))、クラドリビン (2-クロロデオキシアデノシン；2cda；ロイスタチン(leustatin))、コホルマイシン、シクロロイシン、シクロホスファミド、シクロホスファミド無水物、クロランブシル、シタラビン、シタラビン、塩酸シタラビン (サイトサール-u(cytosar-u))、2-デオキシ-2-(((メチルニトロソアミノ)カルボニル)アミノ)-D-グルコース、ダカルバジン、ダクチノマイシン (コスメゲン(cosmegen))、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン (セルビジン(cerubidine))、デカルバジン、デカルバジン (DTIC-dome)、デメコルチン、デキサメタゾン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアゾオキソノルロイシン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル (タキソテール(taxotere))、塩酸ドキソルビシン (アドリアマイシン)、塩酸ドキソルビシン、エフロルニチン(eflomithine)、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム (emcyt)、エチオダイズド油、エトグルシド、カルバミン酸エチル、メタンスルホン酸エチル、エトポシド (VP 16-213)、フェンレチニド、フロキシウリジン、フロキシウリジン (fudr)、フルダラビン (フルダラ(fludara))、フルオロウラシル (5-FU)、フルオキシメステロン (ハロテスチン(halotestin))、フルタミド、フルタミド (ユーレキシン(eulexin))、フロクスウリジン(fluxuridine)、硝酸ガリウム (グラニット(granite))、ゲムシタビン (ジェムザール(gemzar))、ゲニステイン、2-デオキシ-2-(3-メチル-3-ニトロソウレイド)-D-グルコピラノース、ゴセレリン (ゾラデックス(zoladex))、ヘキセストロール、ヒドロキシ尿素 (ハイドラ(hydra))、イダルビシン (イダマイシン(idamycin))、イホスファゲムシタビン(ifosfagemcitabine)、イホスファミド (iflex)、イホスファミド＋メスナ (MAID)、インターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンα-2a、α-2b、α-n3、インターロイキン-2、ヨーベングアン(iobenguane)、ヨーベングアン ヨーベングアン、イリノテカン (カンプトサール(camptosar))、イソトレチノイン (アキュテイン(accutane))、ケトコナゾール、4-(ビス(2-クロロエチル)アミノ)-L-フェニルアラニン、ジアゾ酢酸L-セリン、レンチナン、ロイコボリン、酢酸ロイプロリド (LHRH-アナログ)、レバミゾール (エルガミソール(ergamisol))、ロムスチン (CCNU；cee-NU)、マンノムスチン、メイタンシン、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン (ナイトロジェンマスタード)、酢酸メドロキシプロゲステロン (プロベラ(provera)、デポプロベラ(depo provera))、酢酸メゲストロール (メナス(menace))、酢酸メレンゲストロール、メルファラン (アルケラン(alkeran))、メノガリル、メルカプトプリン、メルカプトプリン (プリネトール(purinethol))、メルカプトプリン無水物、MESNA、メスナ (メスネ(mesne))、メタンスルホン酸のエチルエステル、メトトレキセート (mtx；メトトレキセート)、メチル-ccnu、ミモシン、ミソニダゾール、ミスラマイシン、ミトアントロン(mitoantrone)、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン (ムタマイシン(mutamycin))、マイトマイシンC、ミトタン (o,p'-DDD；リソドレン(lysodren))、ミトキサントロン、塩酸ミトキサントロン (ノバントロン(novantrone))、モピダモール、N,N-ビス(2-クロロエチル)テトラヒドロ-2H-1,3,2-オキサザホスホリン-2-アミン-2-オキシド、N-(1-メチルエチル)-4-((2-メチルヒドラジノ)メチル)ベンズアミド、N-メチル-ビス(2-クロロエチル)アミン、ニカルジピン、ニルタミド (ニランドロン(nilandron))、ニムスチン、ニトラクリン、ナイトロジェンマスタード、ノコダゾール、ノガラマイシン、オクトレオチド (サンドスタチン(sandostatin))、パクリタキセル(pacilataxel) (タキソール(Taxol))、パクリタキセル、パクタマイシン、ペガスパルガーゼ (PEGx-1)、ペントスタチン (2'-デオキシコホルマイシン)、ペプロマイシン、ペプチケミオ、フォトフォレシス(photophoresis)、プリカマイシン(picamycin) (ミトラシン(mithracin))、ピシバニル、ピポブロマン、プリカマイシン、ポドフィロックス(podofilox)、ポドフィロトキシン、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、塩酸プロカルバジン (マチュレーン(matulane))、プロスピジウム、ピューロマイシン、ピューロマイシンアミノヌクレオシド、PUVA (ソラレン+紫外線a)、ピラン共重合体、ラパマイシン、s-アザシチジン、2,4,6-トリス(1-アジリジニル)-s-トリアジン、セムスチン、ショードマイシン、シロリムス、ストレプトゾシン (ザノサール(zanosar))、スラミン、クエン酸タモキシフェン (ノルバデックス(nolvadex))、タクソン(taxon)、テガフール、テニポシド (VM-26；ブモン(vumon))、テヌアゾン酸、TEPA、テストラクトン、チオテパ、チオグアニン、チオテパ (チオプレックス(thioplex))、チロロン、トポテカン、トレチノイン (ベサノイド(vesanoid))、トリアジコン、トリコデルミン、トリエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミダイト、トリメトレキサート (ニュートレキシン(neutrexin))、トリス(1-アジリニジル)ホスフィンオキシド、トリス(1-アジリジニル)ホスフィン硫化物、トリス(アジリジニル)-p-ベンゾキノン、トリス(アジリジニル)ホスフィン硫化物、ウラシル・マスタード、ビダラビン、リン酸ビ��ラビン、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン (ベルバン(velban))、硫酸ビンクリスチン (オンコビン(oncovin))、ビンデシン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン (ナベルビン(navelbine))、(1)-ミモシン、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)1-ニトロソ尿素、(8S-シス)-10-((3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-α-L-リキソ-ヘキソピラノシル)オキシ)-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-8-(ヒドロキシアセチル)-1-メトキシ-5,12-ナフタセンジオン、131-メタ-ヨードベンジルグアニジン (I-131 MIBG)、5-(3,3-ジメチル-1-トリアゼニル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミド、5-(ビス(2-クロロエチル)アミノ)-2,4(1H,3H)-ピリミジンジオン、2,4,6-トリス(1-アジリニジル)-s-チアジン、2,3,5-トリス(1-アジリニジル)-2,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジオン、2-クロロ-N-(2-クロロエチル)-N-メチルエタナミン、N,N-ビス(2-クロロエチル)テトラヒドロ-2H-1,3,2-オキサザホスホリン-2-アミン-2-オキシド、3-デアザウリジン、3-ヨードベンジルグアニジン、5,12-ナフタセンジオン、5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、(1aS,8S,8aR,8bS)-6-アミノ-8-(((アミノカルボニル)オキシ)メチル)-1,1a,2,8,8a,8b-ヘキサヒドロ-8a-メトキシ-5-メチルアジリノ(2',3':3,4)ピロロ(1,2-a)インドール-4,7-ジオン、6-アザウリジン、6-メルカプトプリン、8-アザグアニン、およびこれらの組み合わせも含む。
【０３００】
特定の態様では、本発明の方法で使用される化学療法剤はパクリタキセルである。別の特定の態様では、本発明の方法で使用される化学療法剤はアドリアマイシンである。
【０３０１】
アポトーシス誘導療法として投与可能な好ましい治療薬とその組み合わせは、ドキソルビシンとドキセタキセル(Doxetaxel)、トポテカン、パクリタキセル (タキソール)、カルボプラチンとタキソール、シスプラチンと放射線、5-フルオロウラシル (5-FU)、5-FUと放射線、トクソテール(Toxotere)、フルダラビン、Ara C、エトポシド、ビンクリスチン、およびビンブラスチンを含む。
【０３０２】
本発明に記載の方法で投与可能な化学治療薬は、抗生物質誘導体(例えばドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン)；抗エストロゲン剤(例えばタモキシフェン)；代謝拮抗剤(例えばフルオロウラシル、5-FU、メトトレキセート、フロキシウリジン、インターフェロンα-2b、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および6-チオグアニン)；細胞毒性薬(例えばカルムスチン、BCNU、ロムスチン、CCNU、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、および硫酸ビンクリスチン)；ホルモン(例えばメドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン、およびテストラクトン)；ナイトロジェンマスタード誘導体(例えばメファレン、クロランブシル、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)およびチオテパ)；ステロイドおよび組み合わせ(例えばリン酸ベタメタゾンナトリウム)；ならびに他の薬剤(例えばジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド)を含むが、これらに限定されない。
【０３０３】
特定の態様では、本発明の抗体は、CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)と組み合わせて、またはCHOPの成分との任意の組み合わせで投与される。
【０３０４】
（表５）主要な癌の適応に一般に使用されている化学療法剤
2009544574.tif 000040
【０３０５】
本発明は、癌の処置用の医用薬剤の調製における少なくとも2つのC35抗体の使用にも関する。1つの態様では、使用はさらに、化学療法剤を投与する段階を含む。特定の態様では、抗体は同時に投与される。他の態様では、抗体は連続的に投与される。他の態様では、抗体は、さまざまな間隔を設けて投与される。いくつかの態様では、化学療法剤は、1つまたは複数の抗体と同時に投与される。他の態様では、化学療法剤は、本明細書に記載された抗体とは異なるタイムコースで投与される。
【０３０６】
いくつかの態様では、本発明の方法は、C35抗体を治療用放射線照射と共に投与する段階に関する。任意で、このような方法は、化学療法剤の投与と共に実施される場合もある。例えば、いくつかの態様では、本発明は、少なくとも1つのC35抗体を化学療法剤および治療用放射線照射と共に投与する段階を含む場合がある。
【０３０７】
治療用放射線は例えば、分割放射線療法、非分割放射線療法、および多分割放射線療法、ならびに放射線療法と化学療法の併用を含む。放射線のタイプは、電離(γ)放射線、粒子放射線、低エネルギー伝達(LET)、高エネルギー伝達(HET)、紫外光、赤外光、可視光、および光感受性の放射線も含む。本明細書で用いるように、化学療法は、1つの化学療法剤による処置、または薬剤の組み合わせによる処置を含む。処置を必要とする患者の場合は、化学療法を、外科的処置もしくは放射線療法と、または他の抗悪性腫瘍処置様式と併用することができる。
【０３０８】
さらなる態様では、本発明の抗体またはその組み合わせは、抗ウイルス薬と組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能な抗ウイルス薬は、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン(remantidine)を含むが、これらに限定されない。
【０３０９】
本発明の抗体またはその組み合わせは、2-(エチルチオ)-10-(3-(4-メチル-1-ピペラジニル)プロピル)-10H-フェノチアジン(エチルチオペラジン)、1-(p-クロロ-α-フェニルベンジル)-4-(m-メチルベンジル)-ピペラジン(メクロジン(meclozine)、メクリジン)などの制吐薬、およびこれらの組み合わせと共に投与することもできる。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書に開示されているか、または当技術分野で既知の、他の治療薬およびそれらの組み合わせと共に投与することもできる。
【０３１０】
本発明の抗体またはその組み合わせと併用して投与可能な従来の非特異的な免疫抑制剤は、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似体、シクロホスファミド、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、FK-506、15-デオキシスペルグアリン、および反応性T細胞の機能を抑制することで作用する他の免疫抑制剤を含むが、これらに限定されない。
【０３１１】
特定の態様では、本発明の抗体またはその組み合わせは、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能な免疫抑制剤の調製物は、ORTHOCLONE(商標)(OKT3)、SANDIMMUNE(商標)/NEORAL(商標)/SANGDYA(商標)(シクロスポリン)、PROGRAF(商標)(タクロリムス)、CELLCEPT(商標)(ミコフェノレート(mycophenolate))、アザチオプリン、グルココルチコステロイド(glucorticosteroid)、およびRAPAMUNE(商標)(シロリムス)を含むが、これらに限定されない。特定の態様では、臓器移植または骨髄移植の拒絶の予防に免疫抑制剤を使用することができる。
【０３１２】
追加の態様では、本発明の抗体は単独で、または1つもしくは複数の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能な静脈内免疫グロブリン調製物は、GAMMAR(商標)、IVEEGAM(商標)、SANDOGLOBULIN(商標)、GAMMAGARD S/D(商標)、およびGAMIMUNE(商標)を含むが、これらに限定されない。特定の態様では、本発明の抗体は、移植療法(例えば骨髄移植)において、静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０３１３】
追加の態様では、本発明の抗体は単独で、または抗炎症薬と組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能な抗炎症薬は、グルココルチコイドおよび非ステロイド性抗炎症薬、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、e-アセトアミドカプロン酸、S-アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン、ペリソキサール、ピフォキシム(pifoxime)、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダップを含むが、これらに限定されない。
【０３１４】
追加の態様では、本発明の抗体は、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能なサイトカインは、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、DL13、IL15、抗CD40、CD40L、IFN-γ、およびTNF-αを含むが、これらに限定されない。別の態様では、本発明の抗体は、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、およびIL-21を含むが、これらに限定されない任意のインターロイキンと共に投与される場合がある。
【０３１５】
追加の態様では、本発明の抗体は、血管新生作用をもつタンパク質と組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能な血管新生作用をもつタンパク質は、欧州特許番号EP-399816に開示されている神経膠腫由来の成長因子(GDGF)；欧州特許番号EP-6821 10に開示されている血小板由来成長因子-A(PDGF-A)；欧州特許番号EP-282317に開示されている血小板由来成長因子-B(PDGF-B)；国際公開公報番号WO92/06194に開示されている胎盤成長因子(PIGF)；Hauser et al., Growth Factors, 4:259-268 (1993)に開示されている胎盤成長因子-2(PIGF-2)；国際公開公報番号WO90/13649に開示されている血管内皮成長因子(VEGF)；欧州特許番号EP-506477に開示されている血管内皮成長因子-A(VEGF-A)；国際公開公報番号WO96/39515に開示されている血管内皮成長因子-2(VEGF-2)；血管内皮成長因子B(VEGF-3)；国際公開公報番号WO96/26736に開示されている血管内皮成長因子B-186(VEGF-B186)；国際公開公報番号WO98/02543に開示されている血管内皮成長因子-D(VEGF-D)；国際公開公報番号WO98/07832に開示されている血管内皮成長因子-D(VEGF-D)；およびドイツ特許番号DE19639601に開示されている血管内皮成長因子-E(VEGF-E)を含むが、これらに限定されない。言及された上記の参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３１６】
追加の態様では、本発明の抗体は、造血成長因子と組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能な造血成長因子は、LEUKINE(商標)(SARGRAMOSTIM(商標))およびNEUPOGEN(商標)(FILGRASTIM(商標))を含むが、これらに限定されない。
【０３１７】
追加の態様では、本発明の抗体は、線維芽細胞成長因子と組み合わせて投与される。本発明の抗体と共に投与可能な線維芽細胞成長因子は、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、およびFGF-15を含むが、これらに限定されない。
【０３１８】
投与の時期
本明細書に記載された任意のアポトーシス誘導療法は、本発明の1つまたは複数のC35抗体と同時に実施することができる。いくつかの態様では、2つまたはそれ以上のC35抗体が同時に投与される。他の態様では、C35抗体は個別に投与される。例えば、第1のC35抗体をまず投与した後に、第2のC35抗体を、第1のC35抗体が投与された同じ日に、または1日後、もしくはそれ以上の日数後に投与することができる。複数のC35抗体の投与を、化学療法剤、例えば、パクリタキセル(タキソール(Taxol)(商標))、アドリアマイシン、または本明細書に記載された他の任意の薬剤などの投与前、投与後、または投与と同時に実施することができる。例えば、1つもしくは2つまたはそれ以上のC35抗体を、パクリタキセル、アドリアマイシン、もしくは他の薬剤と同じ時間に、または同じ日に投与することができる。あるいは、パクリタキセル、アドリアマイシン、または他の薬剤を、C35抗体が投与されない日に、例えば少なくとも1つのC35抗体の投与に先立つ日に、または少なくとも1つのC35抗体の投与の次の日に投与することができる。
【０３１９】
いくつかの態様では、アポトーシス誘導剤を、少なくとも1つのC35抗体の投与後に投与することができる。例えば、アポトーシス誘導剤は、処置を必要とする対象への少なくとも1つのC35抗体の投与の約1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、7時間後、8時間後、9時間後、10時間後、11時間後、12時間後、13時間後、14時間後、15時間後、16時間後、17時間後、18時間後、19時間後、20時間後、21時間後、22時間後、23時間後、または24時間後に投与することができる。いくつかの態様では、アポトーシス誘導剤は、処置を必要とする対象への少なくとも1つのC35抗体の投与の約1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後、9日後、10日後、11日後、12日後、13日後、14日後、15日後、16日後、17日後、18日後、19日後、20日後、21日後、22日後、23日後、24日後、25日後、26日後、27日後、28日後、29日後、30日後、または31日後に投与することができる。好ましい態様では、アポトーシス誘導療法は、化学療法剤、例えばパクリタキセルである。
【０３２０】
いくつかの態様では、アポトーシス誘導剤は、少なくとも1つのC35抗体の投与前に投与することができる。例えば、アポトーシス誘導剤は、処置を必要とする対象への少なくとも1つのC35抗体の投与の約1時間前、2時間前、3時間前、4時間前、5時間前、6時間前、7時間前、8時間前、9時間前、10時間前、11時間前、12時間前、13時間前、14時間前、15時間前、16時間前、17時間前、18時間前、19時間前、20時間前、21時間前、22時間前、23時間前、または24時間前に投与することができる。いくつかの態様では、アポトーシス誘導剤は、処置を必要とする対象への少なくとも1つのC35抗体の投与の約1日前、2日前、3日前、4日前、5日前、6日前、7日前、8日前、9日前、10日前、11日前、12日前、13日前、14日前、15日前、16日前、17日前、18日前、19日前、20日前、21日前、22日前、23日前、24日前、25日前、26日前、27日前、28日前、29日前、30日前、31日前に投与することができる。好ましい態様では、アポトーシス誘導剤は、化学療法剤、例えばパクリタキセルまたはアドリアマイシンである。
【０３２１】
1つの態様では、化学療法剤は、処置期間中、週間隔で投与される。特定の態様では、化学療法剤は、処置期間中は、週に1回、2週間にわたって投与される。より特異的な態様では、化学療法剤は、処置期間の最初の2週間中は、週に1回投与される。いくつかの態様では、少なくとも2つのC35抗体が、処置期間中、週に1回、2回、または3回投与される。特定の態様では、C35抗体は、処置期間中、週に2回投与される。
【０３２２】
1つの態様では、少なくとも2つのC35抗体が週に2回投与され、およびアポトーシス誘導剤が週に1回投与される。1つの態様では、アポトーシス誘導剤は処置の1日目に投与され、およびアポトーシス誘導剤の第2の投与が1週間後に実施される一方で、C35抗体は週に2回投与される。
【０３２３】
特定の態様では、処置期間は、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、1か月間、2か月間、3か月間、4か月間、5か月間、6か月間、7か月間、8か月間、9か月間、10か月間、11か月間、または1年間、続けられる場合がある。処置期間は、癌のタイプ、使用される抗体、化学療法剤、患者の年齢などに依存する。当業者であれば、これらのパラメータを決定することができる。
【０３２４】
治療活性の証明
本発明の方法および抗体は、ヒトにおける使用に先立って、好ましくはインビトロで、および後にインビボで、望ましい治療活性または予防活性に関して検討される。例えば、化合物もしくは薬学的組成物の治療または予防上の有用性を証明するインビトロアッセイ法は、細胞系列または患者の組織試料に対する化合物の作用を含む。細胞系列および/または組織試料に対する化合物または組成物の作用は、ロゼット形成アッセイ法および細胞溶解物アッセイ法を含むが、これらに限定されない、当業者に既知の手法で見極めることができる。本発明では、特定の化合物の投与が適応となるか否かの判定に使用可能なインビトロアッセイ法は、患者の組織試料を培養物中で成長させ、および化合物に曝露するか、または化合物を投与し、ならびにこのような化合物の組織試料に対する作用を観察する、インビトロ細胞培養アッセイ法を含む。
【０３２５】
キット
本発明は、上記の方法に使用可能なキットを提供する。1つの態様では、キットは、本発明の1つまたは複数の抗体、好ましくは1つまたは複数の精製された抗体を1個または複数個の容器内に含む。特定の態様では、本発明のキットは、キットに含まれる抗体に特異的に免疫反応性を有するエピトープを含む実質的に単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、対象ポリペプチドとは反応しない対照抗体をさらに含む。別の特定の態様では、本発明のキットは、抗体と対象ポリペプチドの結合を検出するための手段を含む(例えば抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物、もしくは発光化合物などの検出用基質に接合させることが可能なほか、第1の抗体を認識する第2の抗体を検出用基質に接合させることが可能である)。
【０３２６】
本発明の別の特定の態様では、キットは、増殖性および/または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに特異的な抗体を含む血清のスクリーニングに使用される診断用キットである。このようなキットは、対象ポリペプチドとは反応しない対照抗体を含む場合がある。このようなキットは、少なくとも1つの抗ポリペプチド抗原抗体に特異的に免疫反応性を有するエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含む場合がある。さらに、このようなキットは、前記抗体と抗原の結合を検出するための手段を含む(例えば、抗体は、フローサイトメトリーによって検出可能なフルオレセインやローダミンなどの蛍光化合物に接合可能である)。特定の態様では、キットは、組換え的に作製されたか、または化学的に合成されたポリペプチド抗原を含む場合がある。キットのポリペプチド抗原は、固体支持体に結合させることもできる。
【０３２７】
より特定の態様では、上記のキットの検出手段は、前記ポリペプチド抗原が結合される固体支持体を含む。このようなキットは、非結合性のレポーター標識抗ヒト抗体を含む場合もある。この態様では、ポリペプチド抗原に対する抗体の結合は、前記レポーター標識抗体の結合によって検出することができる。
【０３２８】
追加の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む試料のスクリーニングに使用される診断用キットを含む。診断用キットは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原に特異的に免疫反応性を有する、実質的に単離された抗体、およびポリヌクレオチド抗原またはポリペプチド抗原と抗体の結合を検出するための手段を含む。1つの態様では、抗体は固体支持体に結合される。特定の態様では、抗体はモノクローナル抗体の場合がある。キットの検出手段は、第2の標識されたモノクローナル抗体を含む場合がある。代替的または追加的に、検出手段は、標識された競合性抗原を含む場合がある。
【０３２９】
1つの診断様式では、試験試料は、本発明の方法で得られた表面結合抗原を有する固相試薬と反応させる。試薬に対する特異的な抗原抗体の結合、および洗浄による非結合の試料成分の除去後に、レポーターを、固体支持体上の結合した抗抗原抗体の量に比例的に試薬に結合させるように、試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。試薬は再洗浄によって非結合の抗体が除去され、および試薬と会合したレポーターの量が決定される。典型的には、レポーターは、固相を適切な蛍光定量用(fluorometric)基質、発光基質、または熱量測定用基質(Sigma, St. Louis, Mo.)の存在下でインキュベーションすることで検出される酵素である。
【０３３０】
上記のアッセイ法における固体表面試薬は、タンパク質材料を、ポリマービーズ、ディップスティック、96ウェルプレート、またはフィルター材料などの固体支持材料に結合させる既知の手法で調製される。このような結合法は一般に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着、またはタンパク質の、典型的には遊離アミン基を介した、活性化されたカルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基などの固体支持体上の化学反応基への共有結合による付加を含む。あるいは、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートをビオチン化抗原と共に使用することができる。
【０３３１】
したがって本発明は、この診断法を実施するためのアッセイ法の系またはキットを提供する。キットは一般に、組換え抗原が表面に結合された支持体、および表面に結合される抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体を含む。
【０３３２】
遺伝子治療
特定の態様では、C35抗体などの抗体、またはその機能性誘導体をコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療により、C35の異常な発現および/または活性と関連する疾患もしくは障害を処置するために、阻害するために、もしくは予防するために投与される。遺伝子治療は、発現された核酸または発現され得る核酸の対象への投与によって実施される治療法を意味する。本発明のこの態様では、核酸は、治療効果を担う、そのコードタンパク質を生じる。
【０３３３】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療の任意の方法を本発明で用いることができる。例示的な方法を以下に示す。
【０３３４】
遺伝子治療の方法に関する全般的な総説については、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)；Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)を参照されたい。使用可能な、組換えDNA技術の技術分野で一般に使用されている方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０３３５】
好ましい局面では、化合物は、抗体をコードする核酸配列を含む(該核酸配列は、適切な宿主中で抗体もしくはその断片、またはキメラタンパク質、または重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である)。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に機能的に連結しているプロモーターを有する(該プロモーターは、誘導的または構成的であり、および任意で組織特異的である)。別の特定の態様では、核酸分子が使用され、そこでは、抗体コード配列および任意の他の望ましい配列が、ゲノム中の望ましい部位における相同組換えを促進する領域に連結しており、抗体をコードする核酸の染色体内発現を可能とする(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989)；Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)。特定の態様では、発現される抗体分子は1本鎖抗体であり；あるいは核酸配列は、抗体の重鎖と軽鎖の両方、またはその断片をコードする配列を含む。
【０３３６】
患者への核酸の送達は、患者が核酸もしくは核酸を保持するベクターに直接曝露されることによる直接的か、細胞が最初にインビトロで核酸によって形質転換された後に患者に移植されることによる間接的かのいずれかの場合がある。この2つの方法はそれぞれ、インビボ遺伝子治療またはエクスビボ遺伝子治療として知られている。
【０３３７】
特定の態様では、核酸配列はインビボで直接投与され、インビボで発現されて、コード産物が産生される。これは、当技術分野で既知の任意の数多くの方法によって達成することができる：例えばこれらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、およびこれを、細胞内に存在するように投与することによって、例えば欠損型もしくは減弱型のレトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを用いた感染によって(米国特許第4,980,286号を参照)、または裸のDNAを直接注射することによって、または微粒子銃(例えば遺伝子銃)を使用することによって、または脂質もしくは細胞表面受容体またはトランスフェクション用試薬でコーティングするか、またはリポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセルに封入するか、またはこれらを、核に入ることが既知であるペプチドと共に投与することによって、これを受容体を介したエンドサイトーシスを受けるリガンド(例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照)(受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするように使用可能)と共に投与することによって、達成することができる。別の態様では、核酸-リガンド複合体を形成させることができ、そこでは、リガンドが、エンドソームを破壊して核酸がリソゾームによる分解を免れることを可能とするための融合活性を有するウイルスペプチドを含む。さらに別の態様では、特異的な受容体を標的とすることによって、核酸は、細胞特異的な取り込みおよび発現のインビボでの標的とされうる(例えば、PCT公報WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188、WO93/20221を参照)。あるいは、核酸を細胞内に導入して、相同組換えによって発現されるように宿主細胞のDNA内に組み入れることができる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989)；Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
【０３３８】
特定の態様では、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる(Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照)。このようなレトロウイルスベクターは、正確なウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞のDNAへの組み込みに必要な成分を含む。遺伝子治療に使用される抗体をコードする核酸配列は、患者への遺伝子の送達を促す1つまたは複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターの詳細に関しては、化学療法に対する耐性の強い幹細胞を作製することを目的としたmdr1遺伝子の造血性幹細胞への送達におけるレトロウイルスベクターの使用に関して述べている、Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用について説明している他の参考文献には、Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)；Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994)；Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)；およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3：110-114 (1993)などがある。
【０３３９】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用可能な他のウイルスベクターである。アデノウイルスは特に、遺伝子を呼吸上皮に送達する際に魅力的な媒体である。アデノウイルスは天然で呼吸上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞に感染が可能であるという利点がある。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)は、アデノウイルスベースの遺伝子治療に関する総説である。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)には、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を送達するためのアデノウイルスベクターの使用について報告されている。遺伝子治療におけるアデノウイルスの他の使用については、Rosenfeld et al., Science 252:431434 (1991)；Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)；Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)；PCT公報WO94/12649；およびWang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)に記載されている。好ましい態様では、アデノウイルスベクターが使用される。
【０３４０】
アデノ随伴ウイルス(AAV)も遺伝子治療に使用可能なことが提案されている(Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)；米国特許第5,436,146号)。
【０３４１】
遺伝子治療の別の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法などによる、組織培養物中の細胞への遺伝子の移入を含む。通常、移入法は、細胞への選択マーカーの移入を含む。後に細胞は、遺伝子を取り込んでいて、移入された遺伝子を発現する細胞を単離するために、選択条件に置かれる。このような細胞が後に、患者に送達される。
【０３４２】
この態様では、核酸が細胞中に導入された後に、結果として得られた組換え細胞がインビボで投与される。このような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体を介する遺伝子移入、マイクロセルを介する遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含むが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意の方法で実施することができる。細胞への外来遺伝子の導入に関しては、数多くの手法が当技術分野で既知であり(例えば、Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993)；Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993)；Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92m (1985)を参照)、かつレシピエント細胞の、必要とされる発生および生理学的な機能が損なわれないという条件で、本発明で使用することができる。このような手法は、核酸が細胞で発現可能なように、および好ましくは遺伝されてその子孫細胞で発現可能となるように、細胞への核酸の安定な移入を可能とすべきである。
【０３４３】
結果として得られた組換え細胞を患者に、当技術分野で既知のさまざまな方法で送達することができる。組換え血液細胞(例えば造血性幹細胞や前駆細胞)は好ましくは静脈内に投与される。使用が想定される細胞の量は、所望の効果や患者の状態などに依存し、および当業者であれば決定することができる。
【０３４４】
遺伝子治療の目的で核酸を導入可能な細胞は、任意の望ましい入手可能な細胞型を含み、かつ上皮細胞、内皮細胞、角質細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；さまざまな幹細胞もしくは前駆細胞、特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られる造血幹細胞もしくは前駆細胞を含むが、これらに限定されない。
【０３４５】
好ましい態様では、遺伝子治療に使用される細胞は、患者にとって自家である。
【０３４６】
組換え細胞が遺伝子治療に使用される態様では、抗体をコードする核酸配列は細胞中に、それらが細胞またはその子孫によって発現され得るように導入され、および後に治療効果を目的に、組換え細胞がインビボで投与される。特定の態様では、幹細胞または前駆細胞が使用される。インビトロで単離および維持が可能な任意の幹細胞および/または前駆細胞を、本発明のこの態様で潜在的に使用することができる(例えば、PCT公報WO94/08598；Stemple and Anderson, Cell 71:973-985 (1992)；Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980)；およびPittelkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)を参照)。
【０３４７】
特定の態様では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、核酸の発現が、適切な転写誘導剤の有無を制御することで制御可能なように、コード領域に機能的に連結している誘導型のプロモーターを含む。
【０３４８】
IX．薬学的組成物および投与法
本発明の1つまたは複数のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を作製し、およびこれを必要とする対象に投与する方法は周知であるか、または当業者であれば容易に決定することができる。1つまたは複数のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口的、非経口的、吸入または局所などの場合がある。本明細書で用いられる非経口的という表現は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、または膣内への投与を含む。これら全ての形態の投与は、本発明の範囲内にあることが明らかに想定されるが、投与の形態は、注射用の溶液、特に静脈内もしくは動脈内への注射、または点滴の場合がある。注射に適した薬学的組成物は通常、緩衝液(例えば酢酸、リン酸、またはクエン酸の緩衝液)、界面活性剤(例えばポリソルベート)、任意で安定剤(例えばヒトアルブミン)などを含む場合がある。しかしながら、本明細書の手法に適合する他の方法では、本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、有害細胞集団の部位に直接送達することで、疾患組織の治療薬に対する曝露を高めることができる。
【０３４９】
既に説明したように、本発明の少なくとも1つのC35抗体、またはより好ましくは、少なくとも2つもしくはそれ以上のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、癌のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与することができる。好ましい態様では、本発明の2つのC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、癌のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与することができる。
【０３５０】
この点に関しては、開示される抗体は、活性薬剤の投与を容易にし、および安定性を高めるように製剤化されることが理解されると考えられる。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存剤などの、薬学的に許容される非毒性の無菌の担体を含む。本出願の目的に鑑みて、接合型または非接合型の、C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の薬学的有効量は、標的に対する有効な結合を達成するのに、および利点を達成する、例えば疾患もしくは障害の症状を改善するのに、または物質もしくは細胞を検出するのに十分な量を意味すると見なされる。
【０３５１】
1つの態様では、抗体全体の用量が、単回ボーラスで提供される。あるいは用量は、持続的注入法などの複数回の投与によって、または数時間もしくは数日間、例えば約2〜約4日間にわたって実施される反復的な注入によって提供することができる。実施例5、9、10、および14、ならびに表7〜10も参照されたい。
【０３５２】
いくつかの態様では、2つもしくはそれ以上のC35抗体は、同じ薬学的調製物として投与される。他の態様では、抗体は個別の薬学的調製物として、同時か、または連続的かのいずれかで投与される。
【０３５３】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用可能な製剤および投与法については上述しており；他の適切な剤形および投与経路は、本明細書に以下に記載されたものから選択することができる。
【０３５４】
さまざまな送達系が既知であり、および本発明の化合物の投与に使用することができる(例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、化合物を発現可能な組換え細胞、受容体を介したエンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu、J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照)、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など)。導入法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路を含むが、これらに限定されない。化合物もしくは組成物は、任意の簡便な経路で、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮もしくは皮膚粘膜(例えば口腔粘膜、直腸、および腸粘膜など)の内層を介した吸収によって投与することが可能であり、ならびに他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は全身または局所とすることができる。加えて、本発明の薬学的な化合物または組成物を中枢神経系に、脳室内および髄腔内への注射を含む任意の適切な経路で導入することが望ましい場合があり；脳室内への注射は、例えばオマヤレザバーなどのレザバーに接続された脳室内カテーテルによって可能となる場合がある。肺内投与も、例えば吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル形成剤による製剤化を使用することで用いられる。
【０３５５】
特定の態様では、本発明の薬学的な化合物または組成物を、処置が必要とされる部位に局所的に投与することが望ましい場合があり；これは例えば、限定する意図はないものの、外科手術中における局所注入、例えば外科手術後の創傷被覆と組み合わせた局所塗布によって、注射によって、カテーテルを使用する手段によって、坐薬を使用する手段によって、またはインプラント(該インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜などの膜、または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料の場合がある)を使用する手段によって達成される場合がある。好ましくは、本発明の抗体を含むタンパク質の投与時は、タンパク質が吸収されてしまわない材料を使用するように注意しなければならない。
【０３５６】
別の態様では、化合物または組成物は、小胞、特にリポソーム状で送達することができる(Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989)；Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327を参照；一般に同文献を参照)。
【０３５７】
さらに別の態様では、化合物または組成物は、制御放出系で送達することができる。1つの態様では、ポンプを使用することができる(Langer、前掲；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)；Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)；Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照)。別の態様では、ポリマー材料を使用することができる(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)を参照；Levy et al., Science 228:190 (1985)；During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989)；Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)も参照)。さらに別の態様では、制御放出系を、治療標的、すなわち脳の近傍に留置することが可能であり、必要量は全身投与量の一部だけで済む(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138 (1984)を参照)。
【０３５８】
他の制御放出系については、Langerの総説(Science 249:1527-1533 (1990))に記載されている。
【０３５９】
本発明の発明がタンパク質をコードする核酸である特定の態様では、核酸をインビボで投与することで、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、およびそれを細胞内に至るように投与することによって、例えばレトロウイルスベクター(米国特許第4,980,286号参照)を使用することによって、または直接注射することによって、または微粒子銃(例えば遺伝子銃；Biolistic, Dupont)を使用することによって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション用薬剤でコーティングすることによって、またはこれを核内に入ることが既知であるホメオボックス様ペプチドに連結させた状態で投与することによって(例えば、Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)を参照)、または他の手法によって、そのコードされたタンパク質の発現を促進することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、および相同組換えによって発現用の宿主細胞のDNA中に組み込むことができる。
【０３６０】
本発明は、薬学的組成物も提供する。このような組成物は、化合物の治療的有効量、および薬学的に許容される担体を含む。特定の態様では、「薬学的に許容される」という表現は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方、または動物における、特にヒトにおける使用に関する一般に認識された薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という表現は、治療薬が共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または溶媒を意味する。このような薬学的担体は、水、および石油、動物性油、植物性油、または合成起源の油を含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、無菌の液体の場合がある。薬学的組成物が静脈内に投与される場合には、水が好ましい担体である。生理食塩液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射用の溶液用の液体状担体として使用することもできる。適切な薬学的添加剤は、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物には、望ましいならば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含めることができる。このような組成物は、溶液、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤などの形状をとり得る。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体によって坐剤として製剤化することができる。経口製剤には、製薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の薬剤などの標準的な担体を含めることができる。適切な薬学的担体の例は、E.W. Martinの「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、化合物の治療的有効量を、好ましくは純粋な状態で、患者への適切な投与用の形状を提供するような適量の担体と共に含む場合がある。製剤は、投与様式に適したものとすべきである。
【０３６１】
好ましい態様では、組成物は、常用の手順で、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液の溶液である。必要であれば、組成物に可溶化剤、および注射部位における疼痛を和らげるリグノカインなどの局所麻酔剤を含めることができる。一般に内容物は、個別に、または単位投与剤形中に混合した状態のいずれかで、例えば、活性薬剤の量が明記されたアンプルやサシェット(sachette)などの密封容器内の凍結乾燥粉末すなわち水を含まない濃縮物として提供される。組成物が注入によって投与される場合は、無菌の製薬等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルによって調剤することができる。組成物が注射によって投与される場合は、注射用の無菌の水または生理食塩水のアンプルが、投与時に内容物を混合可能なように提供されてもよい。
【０３６２】
本発明の化合物は、中性または塩の状態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩などの陰イオンによって形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などの陽イオンによって形成される塩を含む。
【０３６３】
本発明のポリペプチドの異常な発現および/または活性と関連する疾患もしくは障害の処置、阻害、および予防に有効となる本発明の化合物の量は、標準的な臨床的手法で決定することができる。さらに、最適な用量範囲の同定を容易にするために、インビトロアッセイ法を任意に使用することができる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、および疾患もしくは障害の重症度にも依存し、ならびに実施者の判断および個々の患者の環境にしたがって決定すべきである。有効用量は、インビトロモデルまたは動物モデルの試験系で得られた用量反応曲線から推定することができる。
【０３６４】
抗体に関しては、患者に投与される投与量は典型的には、患者の体重1 kgあたり約0.1 mg〜約100 mgである。好ましくは、患者に投与される投与量は、患者の体重1 kgあたり約0.1 mg〜約20 mgであり、より好ましくは、患者の体重1 kgあたり約1 mg〜約10 mgである。いくつかの態様では、2つまたはそれ以上のC35抗体は、患者の体重1 kgあたり約10 mg〜約50 mgの総用量で投与される。別の態様では、抗体は、約20 mg/kg〜約40 mg/kgの総用量で投与される。一般に、ヒト抗体は人体内では、外来ポリペプチドに対する免疫応答のために、他の種に由来する抗体より長い半減期を有する。したがって、より少ない投与量のヒト抗体、およびより低頻度の投与がしばしば可能となる。さらに、本発明の抗体の投与量および投与回数は、例えば脂質付加などの修飾によって抗体の取り込みおよび組織への浸透を高めることで減じることができる。実施例5も参照されたい。
【０３６５】
上述したように、本発明は、本発明の薬学的組成物の1つまたは複数の内容物が充填された1個または複数個の容器を含む薬剤パックまたはキットも提供する。例えば、薬学パックまたはキットには、2つまたはそれ以上のC35抗体、およびパクリタキセルやアドリアマイシンなどの化学療法剤を含む抗体調製物を含めることができる。いくつかの態様では、抗体は同じ容器内に収められている。他の態様では、抗体は別の容器内に収められている。いくつかの態様では、化学療法剤は、抗体調製物と同じ容器内に収められている。他の態様では、化学療法剤は、別の容器内に収められている。このような容器には、任意で、医用薬剤または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する行政機関によって指示される形態の通知書が付随していてもよく、この通知書には、ヒトへの投与に関する製造、使用、または販売を規制する当局による承認が反映される。
【０３６６】
抗体は、当業者に既知の従来の免疫組織学的な方法による、生物学的試料中の本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのレベルを調べるために使用することができる(例えば、Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985)；Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)を参照)。タンパク質をコードする遺伝子の発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)やラジオイムノアッセイ法(RIA)などのイムノアッセイ法を含む。適切な抗体アッセイ法用の標識は当技術分野で既知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115mIn、113In、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc、99mTc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、88Re、142Pr、105Rh、97Ruなどの放射性同位元素；ルミノールなどの発光標識；ならびにフルオレセインやローダミンおよびビオチンなどの蛍光標識を含む。
【０３６７】
生物学的試料中における本発明のポリペプチドのレベルを調べることに加えて、タンパク質をイメージングによってインビボで検出することもできる。タンパク質のインビボイメージング用の抗体標識もしくはマーカーは、X線撮影、NMR、またはESRによって検出可能なものを含む。X線撮影の場合、適切な標識は、検出可能な放射線を放出するが、対象に明瞭な害を及ぼさない、バリウムやセシウムなどの放射性同位元素を含む。NMRおよびESRに適切なマーカーは、関連するハイブリドーマに対する栄養素の標識によって抗体中に取り込ませることが可能な、重水素などの、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカーを含む。
【０３６８】
放射性同位元素(例えば、131I、112In、99mTc、(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115mIn、113mIn、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc、99mTc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、59Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru)、放射線不透性物質、または核磁気共鳴によって検出可能な材料などの、適切な検出可能なイメージング部分によって標識されたタンパク質特異的な抗体または抗体断片が、免疫系疾患の検討対象の哺乳動物に(例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に)導入される。当技術分野では、対象の大きさ、および使用されるイメージングシステムが、診断用画像を得るのに必要なイメージング部分の量を決定することが理解されると考えられる。ヒト対象用の放射性同位体部分の場合は、注入される放射能の量は通常、約5〜20ミリキュリーの99mTcの範囲である。次に、標識された抗体または抗体断片は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを発現する細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボにおける腫瘍イメージングについては、S.W. Burchiel et al.,「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments」(Chapter 13 in Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982))に記載されている。
【０３６９】
1つの態様では、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸に結合している本発明のポリペプチド(例えば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドおよび/または抗体)の投与による、本発明の組成物を細胞に特異的に送達する方法を提供する。1つの例では、本発明は、治療用タンパク質を標的細胞中に送達する方法を提供する。別の例では、本発明は、1本鎖核酸(例えばアンチセンスもしくはリボザイム)、または2本鎖核酸(例えば、細胞のゲノム中に組み込まれるか、もしくはエピソームとして複製し、および転写され得るDNA)を標的細胞中に送達する方法を提供する。
【０３７０】
本発明のポリペプチド(抗体を含む)の標識には、当技術分野で既知の手法を応用することができる。このような手法は、二機能性の接合用薬剤の使用を含むが、これらに限定されない(例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,756,065号；第5,714,631号；第5,696,239号；第5,652,361号；第5,505,931号；第5,489,425号；第5,435,990号；第5,428,139号；第5,342,604号；第5,274,119号；第4,994,560号；および第5,808,003を参照)。
【０３７１】
X．診断法
本発明はさらに、個体に由来する組織または他の細胞もしくは体液中におけるC35タンパク質もしくは転写物の発現レベルを測定する段階、および測定された発現レベルを、正常な組織または体液における標準的なC35の発現レベルと比較する段階を含み、標準と比較時した場合の発現レベルの上昇は、疾患を意味する、癌の診断の際に有用な診断法を提供する。
【０３７２】
C35特異的抗体は、当業者に既知の従来の免疫組織学的方法による、生物学的試料中のタンパク質レベルを調べるために使用することができる(例えば、Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985)；Jalkanen, et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)を参照)。タンパク質の発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)などのイムノアッセイ法、免疫沈降法、またはウェスタンブロッティングを含む。適切なアッセイ法は、本明細書で詳述されている。
【０３７３】
「C35ポリペプチドの発現レベルを調べる」という表現は、直接的(例えば、絶対タンパク質レベルの決定もしくは推定による)か、または相対的(例えば、第2の生物学的試料中の疾患関連ポリペプチドのレベルとの比較による)のいずれかによる、第1の生物学的試料中のC35ポリペプチドのレベルを定性的もしくは定量的に測定または推定することが意図される。好ましくは、第1の生物学的試料中のC35ポリペプチドの発現レベルが測定または推定され、および標準的なC35ポリペプチドのレベルと比較される(標準は、疾患を有さない個体から得られた第2の生物学的試料から採取されるか、または疾患を有さない個体の集団に由来するレベルを平均化することで決定される)。当技術分野で明らかなように、「標準的な」C35ポリペプチドのレベルが既知であれば、比較用の標準として繰り返し使用することができる。
【０３７４】
「生物学的試料」は、潜在的にC35を発現する個体、細胞系列、組織培養物、または細胞の他の供給源から得られる任意の生物学的試料を意図する。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当技術分野で周知である。
【０３７５】
上述の診断法に使用されるC35抗体は、本明細書に記載されているように、C35遺伝子産物に特異的に結合する任意のC35抗体を含む。
【０３７６】
XI．イムノアッセイ法
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を、当技術分野で既知の任意の方法によって、免疫特異的な結合に関して検討することができる。使用可能なイムノアッセイ法は例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ法、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、免疫放射線アッセイ法、蛍光イムノアッセイ法、プロテインAイムノアッセイ法ほかの手法を使用する、競合的および非競合的なアッセイ法の系を含むが、これらに限定されない。このようなアッセイ法は常用されており、および当技術分野で周知である(例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol.1 (1994)を参照)。例示的なイムノアッセイ法について、以下に簡単に説明する(しかし、限定する意図はない)。
【０３７７】
免疫沈降のプロトコルは一般に、細胞集団を、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤(例えばEDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム)が添加されたRIPA緩衝液(1% NP-40もしくはTriton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15 M NaCl、0.01 Mリン酸ナトリウム(pH 7.2)、1%トラシロール(Trasylol))などの溶解用緩衝液に溶解する段階、対象抗体を細胞溶解物に添加する段階、4℃で一定時間(例えば1〜4時間)インキュベーションする段階、プロテインAおよび/またはプロテインGセファロースビーズを細胞溶解物に添加する段階、4℃で約1時間もしくはそれ以上インキュベーションする段階、ビーズを溶解用緩衝液で洗浄する段階、ならびにビーズをSDS/試料緩衝液に再懸濁する段階を含む。対象抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウェスタンブロット解析で評価することができる。当業者であれば、抗原に対する抗体の結合を高めるために、およびバックグラウンドを低めるために修飾され得るパラメータについて理解していると考えられる(例えば、細胞溶解物をセファロースビーズで事前に清澄化する)。免疫沈降のプロトコルに関する、さらなる議論については例えば、Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol.1 (1994)の10.16.1を参照されたい。
【０３７８】
ウェスタンブロット解析は一般に、タンパク質試料を調製する段階、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原の分子量に依存して8%〜20% SDS-PAGE)によりタンパク質試料を電気泳動する段階、ポリアクリルアミドゲルからタンパク質試料をニトロセルロース、PVDF、もしくはナイロンなどの膜に転写する段階、膜をブロッキング溶液(例えば、3% BSAもしくは脱脂除去乳が添加されたPBS)でブロックする段階、膜を洗浄用緩衝液(例えばPBS-Tween 20)で洗浄する段階、膜を、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体(対象抗体)でブロックする段階、膜を洗浄用緩衝液で洗浄する段階、膜を、ブロッキング緩衝液で希釈した、酵素基質(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(例えば32Pもしくは125I)に接合した二次抗体(一次抗体を認識する抗体、例えば抗ヒト抗体)でブロックする段階、膜を洗浄用緩衝液で洗浄する段階、ならびに抗原の存在を検出する段階を含む。当業者であれば、検出されるシグナルを高め、および背景ノイズを低めるようにパラメータを修飾し得ることを理解していると考えられる。ウェスタンブロットのプロトコルに関する、さらなる議論については例えば、Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Vol.1 (1994)の10.8.1を参照されたい。
【０３７９】
ELISAは、抗原を調製する段階、96ウェルのマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする段階、酵素基質(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ)などの検出用化合物に接合した対象抗体をウェルに添加する段階、ならびに一定期間インキュベーションして抗原の存在を検出する段階を含む。ELISAでは、対象抗体は、検出用化合物に接合させる必要はなく；代わりに、検出用化合物に接合した二次抗体(対象抗体を認識する)をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体でウェルをコーティングすることができる。この場合、検出用化合物に接合した二次抗体を、コーティング済みのウェルへの対象抗原の添加後に添加することができる。当業者であれば、検出されるシグナルを高めるように修飾され得るパラメータ、および当技術分野で既知のELISAの他の変数に関して理解していると考えられる。ELISAに関する、さらなる議論については例えば、Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol.1 (1994)の11.2.1を参照されたい。
【０３８０】
抗原に対する抗体の結合親和性、および抗体-抗原相互作用の解離速度(off-rate)は、競合結合アッセイ法で決定することができる。競合結合アッセイ法の一例は、非標識抗原の量を増大させる条件下、標識抗原(例えば3Hまたは125I)を対象抗体と共にインキュベーションすること、および標識抗原に結合した抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイ法である。特定の抗原に対する対象抗体の親和性、および結合解離速度は、スキャッチャードプロット解析によるデータから決定することができる。二次抗体との競合も、ラジオイムノアッセイ法で決定することができる。この場合、抗原は、非標識二次抗体の量を増大させる条件下、標識化合物(例えば3Hまたは125I)に接合した対象抗体と共にインキュベーションされる。
【０３８１】
本発明のC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はさらに、癌抗原の遺伝子産物、またはその保存された変異体もしくはペプチド断片のインサイチューにおける検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡、または非免疫学的アッセイ法に組織学的に使用することができる。インサイチューにおける検出は、患者から組織学的標本を分離し、およびこれを標識C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体に添加することで、好ましくは、標識抗体(または断片)を生物学的試料に重ねることにより添加することで達成することができる。このような手順の使用によって、C35タンパク質またはその保存された変異体もしくはペプチド断片の存在だけでなく、検討組織中におけるその分布の判定も可能となる。本発明を用いることで、当業者であれば、任意のさまざまな組織学的方法(染色手順など)が、このようなインサイチューにおける検出を達成するために改変可能であることを容易に理解すると考えられる。
【０３８２】
C35の遺伝子産物またはその保存された変異体もしくはペプチド断片を対象としたイムノアッセイ法および非イムノアッセイ法は典型的には、体液、組織抽出物、回収直後の細胞、または細胞培養物中にインキュベーションされた細胞の溶解物などの試料を、C35またはその保存された変異体もしくはペプチド断片に結合可能な検出可能に標識された抗体の存在下でインキュベーションする段階、ならびに結合状態の抗体を当技術分野で周知の任意のいくつかの手法で検出する段階を含む。
【０３８３】
生物学的試料は、固相支持体またはニトロセルロースなどの担体、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定し得る他の固体支持体と接触させること、ならびにこれらに固定することが可能である。支持体を後に適切な緩衝液で洗浄後に、検出可能に標識されたC35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体で処置することができる。次に固相支持体を緩衝液で2回洗浄して非結合抗体を除去することができる。後に任意で抗体は標識される。次に、固体支持体上の結合標識の量を、従来の手段で検出することができる。
【０３８４】
「固相支持体または担体」という表現は、抗原もしくは抗体に結合可能な任意の支持体を意図する。周知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾型のセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩、および磁鉄鉱を含む。担体の性質は、本発明の目的において、ある程度の可溶性、または不溶性のいずれかである。支持体の材料は実質的に、結合している分子が抗原または抗体に結合可能な限りにおいて、任意の可能な構造形態を有し得る。したがって、支持体の形状は、ビーズのような球状、または試験管の内面もしくは棒の外面のような円柱状をとり得る。あるいは表面は、シート、試験ストリップなどの平面の場合がある。好ましい支持体はポリスチレンビーズを含む。当業者であれば、抗体または抗原の結合に適した他のいくつかの担体を承知しているか、これらを常用の実験法で確認できる。
【０３８５】
C35抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の所与のロットの結合活性は、周知の方法で決定することができる。当業者であれば、個々の決定のための、アッセイ法の操作的および最適な条件を、常用の実験法で決定することができる。
【０３８６】
抗体-抗原相互作用の親和性の測定に利用可能なさまざまな方法が存在するが、速度定数を決定する方法は比較的少ない。方法の大半は、常用の測定法を不可避的に複雑なものとし、および測定量に不確実性を持ち込む、標識用の抗体または抗原のいずれかに依存する。
【０３８７】
BIAcoreで実施される表面プラズモン共鳴(SPR)は、抗体-抗原間の相互作用の親和性を測定する従来法をしのぐ、以下のいくつかの利点を提供する：(i)抗体または抗原のいずれかを標識する必要がない；(ii)抗体は事前に精製する必要がなく、細胞培養物の上清を直接使用可能である；(iii)さまざまなモノクローナル抗体の相互作用の迅速な半定量比較を可能とするリアルタイム測定が可能で、多くの評価目的に十分である；(iv)生体特異的表面を、一連の多様なモノクローナル抗体が同一条件で容易に比較可能なように再生することが可能である；(v)解析手順が完全に自動化されており、かつ大規模な一連の測定をユーザーの介入なく実施可能である。BIA applications Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE code No. BR-1001-86；BIA technology Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE code No. BR-1001-84。
【０３８８】
SPRベースの結合試験には、結合対のうちの1つのメンバーがセンサー表面に固定化されることが必要である。固定化された結合パートナーはリガンドと呼ばれる。溶液中の結合パートナーは解析対象物と呼ばれる。場合によっては、リガンドは表面に、捕捉分子と呼ばれる別の固定化された分子への結合を介して間接的に結合される。SPR反応は、解析対象物が結合または解離する、検出器の表面における質量濃度の変化を反映する。
【０３８９】
SPRに基づいて、リアルタイムBIAcore測定で、相互作用が生じたときに相互作用が直接モニタリングされる。この手法は、動的パラメータの決定によく適している。比較親和性の順位づけは極めて簡単に行われ、および動的な定数と親和性の定数の両方をセンサーグラムのデータから導き出すことができる。
【０３９０】
リガンド表面にわたって離散型パルスで解析対象物が注入されると、結果として得られるセンサーグラムは、以下の3つの本質的な相に分割され得る：(i)試料注入中における解析対象物とリガンドの結合；(ii)解析対象物の結合速度が、複合体からの解離によって釣り合わされる、試料注入中における平衡状態または定常状態；(iii)緩衝液流中における表面からの解析対象物の解離。
【０３９１】
結合相および解離相は、解析対象物-リガンドの相互作用の動態に関する情報を提供する(kaおよびkd、複合体の形成および解離の速度、kd/ka＝KD)。平衡相は、解析対象物-リガンドの相互作用の親和性(KD)に関する情報を提供する。
【０３９２】
BIAevaluationソフトウェアは、数値積分とグローバルフィッティングアルゴリズムの両方を使用したカーブフィッティング用の総合的な能力(comprehensive facilities)を提供する。データの適切な解析によって、相互作用の分離速度および親和性定数を、単純なBIAcore実験から得ることができる。この手法で測定可能な親和性の範囲は、mM〜pMと極めて広い。
【０３９３】
エピトープの特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。BIAcoreによるエピトープマッピングは、ラジオイムノアッセイ法、ELISA、または他の表面吸着法を使用する従来の手法とは対照的に、標識抗体または精製抗体を必要とせず、および複数のモノクローナル抗体の配列を使用する複数の部位を対象とした特異性試験を可能とする。加えて、多数の解析対象物を自動的に処理することができる。
【０３９４】
ペアワイズ結合実験では、2つのMAbが同じ抗原に同時に結合する能力が検討される。個別のエピトープに対するMAbは独立に結合する一方で、同一のエピトープまたは密接に関連したエピトープに対するMAbは相互の結合に干渉する。BIAcoreによる、このような結合実験は容易に実施することができる。
【０３９５】
例えば、捕捉分子を使用して第1のMAbに結合させた後に、抗原および第2のMAbを連続的に付加することができる。センサーグラムから、以下の事実が明らかになる：1．第1のMAbに結合する抗原の数、2．第2のMAbが表面結合抗原に結合する程度、3．第2のMAbが結合しない場合には、ペアワイズ試験の順序の逆転が結果を変えるか否か。
【０３９６】
ペプチドの阻害は、エピトープマッピングに用いられる別の手法である。この方法は、ペアワイズ抗体結合試験を補完可能であり、および抗原の一次配列が既知である場合に、機能性エピトープを構造的特性に関連づけることが可能である。ペプチドまたは抗原の断片を、固定化された抗原に対する多様なMAbの結合の阻害に関して検討することができる。任意のMAbの結合に干渉するペプチドは、対象MAbによって決定されたエピトープと構造的に関連すると推定される。
【０３９７】
本発明の実施は、特に明記した部分を除いて、当技術分野の範囲に含まれる細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の手法を用いる。このような手法は文献に詳しく説明されている。例えば、
2009544574.tif 000041
およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。
【０３９８】
抗体工学の一般原理は、Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995)に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995)に記載されている。抗体結合および抗体-ハプテン結合の一般原理は、Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2nd ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984)；およびSteward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984)に記載されている。加えて、当技術分野で既知であり、特異的に記載されていない、免疫学における標準的な方法は一般に、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York；Stites et al. (eds) , Basic and Clinical-Immunology (8th ed.)、Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、およびMishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980)に従う。
【０３９９】
免疫学の一般原理について記載した標準的な参考文献は、
2009544574.tif 000042
を含む。
【０４００】
上記の引用された全ての参考文献、ならびに本明細書に引用され、および以下に引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０４０１】
本発明の任意の特異的で非限定的な態様を以下に示す。
【０４０２】
項目1：C35を発現する癌細胞を死滅させる方法であって、該細胞に、(a)C35に特異的に結合する第1のC35抗体またはその抗原結合断片；(b)C35に特異的に結合する第2のC35抗体またはその抗原結合断片；および(c)治療薬を投与する段階を含む、方法。
【０４０３】
項目2：インビボにおいて実施される、項目1に記載の方法。
【０４０４】
項目3：哺乳動物において実施される、項目2に記載の方法。
【０４０５】
項目4：哺乳動物がヒトである、項目3に記載の方法。
【０４０６】
項目5：第1のC35抗体または断片および第2のC35抗体または断片が、異なるC35エピトープにそれぞれ結合する、項目1〜4のいずれか一項目に記載の方法。
【０４０７】
項目6：第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基105〜115内に位置するC35エピトープ、SEQ ID NO:2のアミノ酸残基48〜87内に位置するC35エピトープ、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸残基48〜104内に位置するC35エピトープからなる群より選択されるC35エピトープに結合する、項目1〜5のいずれか一項目に記載の方法。
【０４０８】
項目7：治療薬が化学療法剤である、項目1〜6のいずれか一項目に記載の方法。
【０４０９】
項目8：化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、アドリアマイシン、ドセタキセル、タキソテール(taxotere)、ゲムシタビン、およびビノレルビンからなる群より選択される、項目7に記載の方法。
【０４１０】
項目9：化学療法剤がパクリタキセルである、項目8に記載の方法。
【０４１１】
項目10：化学療法剤がアドリアマイシンである、項目8に記載の方法。
【０４１２】
項目11：治療薬が、第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つの投与前に投与される、項目1〜10のいずれか一項目に記載の方法。
【０４１３】
項目12：治療薬が、第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つの投与後に投与される、項目1〜10のいずれか一項目に記載の方法。
【０４１４】
項目13：治療薬が、第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つと同時に投与される、項目1〜10のいずれか一項目に記載の方法。
【０４１５】
項目14：第1のC35抗体および第2のC35抗体が同時に投与される、項目1〜10のいずれか一項目に記載の方法。
【０４１６】
項目15：第1のC35抗体および第2のC35抗体が連続的に投与される、項目1〜10のいずれか一項目に記載の方法。
【０４１７】
項目16：C35抗体または断片のそれぞれが、患者の体重1 kgあたり約0.1 mg〜約100 mgの用量で投与される、項目1〜15のいずれか一項目に記載の方法。
【０４１８】
項目17：第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、項目1〜16のいずれか一項目に記載の方法。
【０４１９】
項目18：第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、MAb 163またはその変異体もしくは誘導体である、項目17に記載の方法。
【０４２０】
項目19：第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、1B3またはその変異体もしくは誘導体である、項目17に記載の方法。
【０４２１】
項目20：第1のC35抗体もしくは断片または第2のC35抗体もしくは断片のうちの少なくとも1つが、1F2またはその変異体もしくは誘導体である、項目17に記載の方法。
【０４２２】
項目21：第1のC35抗体および第2のC35抗体が、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、項目17に記載の方法。
【０４２３】
項目22：第1のC35抗体および第2のC35抗体が、1B3および1F2またはそれらの変異体もしくは誘導体である、項目21に記載の方法。
【０４２４】
項目23：癌細胞が、乳癌、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、および黒色腫からなる群より選択される、項目1〜22のいずれか一項目に記載の方法。
【０４２５】
項目24：癌細胞が乳癌細胞である、項目23に記載の方法。
【０４２６】
項目25：癌細胞が肝臓癌細胞である、項目23に記載の方法。
【０４２７】
項目26：2つ以上のC35抗体またはその断片を投与する段階を含む、項目1〜25のいずれか一項目に記載の方法。
【０４２８】
項目27：参照抗体MAb 163と同じC35エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０４２９】
項目28：C35に特異的に結合し、かつ参照モノクローナル抗体MAb 163のC35に対する特異的な結合を競合的に阻害する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０４３０】
項目29：C35に特異的に特異的に結合し、かつMAb 163である、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０４３１】
項目30：直線状エピトープに結合する、項目27〜29のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３２】
項目31：非直線状の立体構造のエピトープに結合する、項目27〜29のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３３】
項目32：多価(multivalent)であり、かつ少なくとも2つの重鎖および少なくとも2つの軽鎖を含む、項目27〜31のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３４】
項目33：多重特異的である、項目27〜32のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３５】
項目34：二重特異的である、項目27〜32のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３６】
項目35：ヒト化されている、項目27〜28または30〜34のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３７】
項目36：キメラである、項目27〜34のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３８】
項目37：霊長類化されている、項目27〜34のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４３９】
項目38：完全にヒトである、項目27〜34のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４０】
項目39：Fab断片である、項目27〜38のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４１】
項目40：Fab'断片である、項目27〜38のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４２】
項目41：F(ab)2断片である、項目27〜38のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４３】
項目42：Fv断片である、項目27〜38のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４４】
項目43：1本鎖抗体である、項目27〜38のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４５】
項目44：MAb 163の解離定数(KD)より小さいKDによって特徴付けられる親和性で、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに特異的に結合する、項目27〜28または28〜43のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４６】
項目45：5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに特異的に結合する、項目27〜43のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４７】
項目46：約3.4×10-9 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに特異的に結合する、項目45に記載の抗体またはその断片。
【０４４８】
項目47：融合している異種ポリペプチドをさらに含む、項目27〜46のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４４９】
項目48：治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾物質、医用薬剤、またはPEGからなる群より選択される薬剤に接合している、項目27〜47のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片。
【０４５０】
項目49：項目27〜48または214〜220のいずれか一項目に記載の抗体またはその断片、および担体を含む、組成物。
【０４５１】
項目50：VH領域およびVL領域を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該VH領域および該VL領域がそれぞれ、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66からなる参照ポリペプチドと少なくとも90%同一のポリペプチド配列を含み、かつ該VHおよび該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０４５２】
項目51：VH領域およびVL領域がそれぞれ、参照ポリペプチドと少なくとも95%同一のポリペプチド配列を含む、項目50に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【０４５３】
項目52：VH領域およびVL領域を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該VH領域および該VL領域がそれぞれ、20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66からなる参照ポリペプチドと同一であり、かつ該VHおよび該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０４５４】
項目53：VH領域およびVL領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外は参照ポリペプチドと同一である、項目51に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
【０４５５】
項目54：VH領域およびVL領域を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該VH領域および該VL領域がそれぞれ、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66のポリペプチドを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０４５６】
項目55：免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65の参照の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり；かつ該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【０４５７】
項目56：VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、5個未満のアミノ酸置換以外は同一である、項目55に記載のポリヌクレオチド。
【０４５８】
項目57：VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65のポリペプチド配列を含む、項目55〜56のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４５９】
項目58：免疫グロブリン重鎖(VH)をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、およびSEQ ID NO:74の参照核酸配列によってコードされる、単離されたポリヌクレオチド。
【０４６０】
項目59：SEQ ID NO:62の参照VHポリペプチド配列と少なくとも90%同一のVH領域をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【０４６１】
項目60：VH領域が、SEQ ID NO:62の参照VHポリペプチド配列と少なくとも95%同一である、項目59に記載のポリヌクレオチド。
【０４６２】
項目61：20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62の参照VHポリペプチド配列と同一のVH領域をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【０４６３】
項目62：核酸が、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62の参照VHポリペプチド配列と同一のVH領域をコードする、項目61に記載のポリヌクレオチド。
【０４６４】
項目63：VHが参照VHと同一である、項目55〜62のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４６５】
項目64：VHがSEQ ID NO:70の核酸配列によってコードされる、項目55〜62のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４６６】
項目65：SEQ ID NO:70と90%、95%、99%、または100%同一の核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【０４６７】
項目66：VHに融合しているシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目55〜65のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４６８】
項目67：VHに融合している重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、項目55〜66のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４６９】
項目68：定常領域またはその断片がCH1ドメインである、項目67に記載のポリヌクレオチド。
【０４７０】
項目69：定常領域またはその断片がCH2ドメインである、項目67に記載のポリヌクレオチド。
【０４７１】
項目70：定常領域またはその断片がCH3ドメインである、項目67に記載のポリヌクレオチド。
【０４７２】
項目71：定常領域またはその断片がヒンジ領域である、項目67に記載のポリヌクレオチド。
【０４７３】
項目72：定常領域またはその断片がヒトである、項目67〜71のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４７４】
項目73：定常領域またはその断片がIgGに由来する、項目72に記載のポリヌクレオチド。
【０４７５】
項目74：VHを含む抗体またはその抗原結合断片が、MAb 163と同じエピトープに特異的に結合する、項目55〜73のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４７６】
項目75：VHを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35に対するMAb 163の結合を競合的に阻害する、項目55〜73のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４７７】
項目76：免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69からなる参照の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり；かつ該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【０４７８】
項目77：VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、5個未満のアミノ酸置換以外は参照の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一である、項目76に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０４７９】
項目78：VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、項目76〜77のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４８０】
項目79：免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、およびSEQ ID NO:77の参照核酸配列によってコードされる、単離されたポリヌクレオチド。
【０４８１】
項目80：SEQ ID NO:66の参照VLポリペプチド配列と少なくとも90%同一のVL領域をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【０４８２】
項目81：VL領域が参照VLポリペプチド配列と少なくとも95%同一である、項目80に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０４８３】
項目82：20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:66の参照VLポリペプチド配列と同一のVL領域をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリヌクレオチド。
【０４８４】
項目83：核酸が、10個未満のアミノ酸置換以外は参照VLポリペプチド配列と同一のVL領域をコードする、項目81に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０４８５】
項目84：VLが参照VLと同一である、項目76〜83のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４８６】
項目85：VLが、SEQ ID NO:71からなる核酸配列によってコードされる、項目84に記載のポリヌクレオチド。
【０４８７】
項目86：SEQ ID NO:71と90%、95%、99%、または100%同一の核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【０４８８】
項目87：VLに融合しているシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目76〜86のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４８９】
項目88：VLに融合しているCLドメインをコードする核酸をさらに含む、項目76〜87のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４９０】
項目89：VLに融合しているCLドメインをコードするポリヌクレオチドであって、CLドメインがκ鎖である、項目88に記載のポリヌクレオチド。
【０４９１】
項目90：VLに融合しているCLドメインをコードするポリヌクレオチドであって、CLドメインがλ鎖である、項目88に記載のポリヌクレオチド。
【０４９２】
項目91：VLに融合しているCLドメインをコードするポリヌクレオチドであって、CLドメインがヒトである、項目88〜90のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４９３】
項目92：VLを含む抗体またはその抗原結合断片が、MAb 163と同じエピトープに特異的に結合する、項目76〜91のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４９４】
項目93：VLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35に対するMAb 163の結合を競合的に阻害する、項目76〜92のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４９５】
項目94：異種ポリヌクレオチドをさらに含む、項目55〜93のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４９６】
項目95：異種ポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコードする、項目94に記載のポリヌクレオチド。
【０４９７】
項目96：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、直線状エピトープに特異的に結合する、項目55〜95のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４９８】
項目97：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、非直線状の立体構造のエピトープに特異的に結合する、項目55〜95のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０４９９】
項目98：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも2つの重鎖および少なくとも2つの軽鎖を含む多価(multivalent)抗体分子である、項目55〜97のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５００】
項目99：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、多重特異的である、項目55〜98のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０１】
項目100：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、二重特異的である、項目55〜98のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０２】
項目101：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、一価、二価、多価(polyvalent)、もしくは二機能性である、項目55〜100のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０３】
項目102：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化されている、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０４】
項目103：VH、VL、またはVHとVLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、キメラである、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０５】
項目104：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、完全にヒトである、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０６】
項目105：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、Fab断片である、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０７】
項目106：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、Fab'断片である、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０８】
項目107：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、F(ab)2断片である、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５０９】
項目108：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、Fv断片である、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５１０】
項目109：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、1本鎖抗体である、項目55〜101のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５１１】
項目110：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目55〜109のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチド。
【０５１２】
項目111：抗体または断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、約3.4×10-9 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目110に記載のポリヌクレオチド。
【０５１３】
項目112：MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)またはその変異体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、C35に特異的に結合するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【０５１４】
項目113：Mab 163モノクローナル抗体の少なくとも2つのCDRをコードする核酸配列を含む、項目112に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０５１５】
項目114：Mab 163モノクローナル抗体の少なくとも3つのCDRをコードする核酸配列を含む、項目112に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０５１６】
項目115：Mab 163モノクローナル抗体の少なくとも4つのCDRをコードする核酸配列を含む、項目112に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０５１７】
項目116：Mab 163モノクローナル抗体の少なくとも5つのCDRをコードする核酸配列を含む、項目112に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０５１８】
項目117：Mab 163モノクローナル抗体の少なくとも6つのCDRをコードする核酸配列を含む、項目112に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０５１９】
項目118：項目55〜117または213のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【０５２０】
項目119：ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能的に付随している、項目118に記載のベクター。
【０５２１】
項目120：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドが、インフレームで融合しており、これらに機能的に付随している1つのプロモーターから同時に転写され、かつ1本鎖抗体またはその抗原結合断片へと同時に翻訳される、項目119に記載のベクター。
【０５２２】
項目121：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドが、これらに機能的に付随している1つのプロモーターから同時に転写されるが、個別に翻訳される、項目119に記載のベクター。
【０５２３】
項目122：VHをコードするポリヌクレオチドとVLをコードするポリヌクレオチドの間に配置されたIRES配列をさらに含む、項目121に記載のベクター。
【０５２４】
項目123：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドが個別に転写され、それぞれが個別のプロモーターに機能的に付随している、項目121に記載のベクター。
【０５２５】
項目124：個別のプロモーターが、同じプロモーターのコピーである、項目123に記載のベクター。
【０５２６】
項目125：個別のプロモーターが同一ではない、項目123に記載のベクター。
【０５２７】
項目126：項目55〜125のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、組成物。
【０５２８】
項目127：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、該VHをコードするポリヌクレオチドおよび該VLをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66からなる参照ポリペプチドと少なくとも90%同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ該VHをコードするポリヌクレオチドおよび該VLをコードするポリヌクレオチドが共に、C35に特異的に結合する抗体またはその結合断片をコードする、組成物。
【０５２９】
項目128：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドが、参照ポリペプチドと少なくとも95%同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目127に記載の組成物。
【０５３０】
項目129：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、該VHをコードするポリヌクレオチドおよび該VLをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ、20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66からなる参照ポリペプチドと同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ該VHをコードするポリヌクレオチドおよび該VLをコードするポリヌクレオチドが共に、C35に特異的に結合する抗体またはその結合断片をコードする、組成物。
【０５３１】
項目130：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドが、10個未満のアミノ酸置換以外は参照ポリペプチドと同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、項目129に記載の組成物。
【０５３２】
項目131：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、該VHをコードするポリヌクレオチドおよび該VLをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ、SEQ ID NO:62およびSEQ ID NO:66からなる参照ポリペプチドと同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、組成物。
【０５３３】
項目132：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ、SEQ ID NO:70およびSEQ ID NO:71を含む、項目126〜131のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５３４】
項目133：VHをコードするポリヌクレオチドおよびVLをコードするポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドによってコードされるVHポリペプチドおよびVLポリペプチドが1本鎖抗体またはその断片中に含まれるように、同じオープンリーディングフレーム中に含まれる、項目126〜132のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５３５】
項目134：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、直線状エピトープに特異的に結合する、項目126〜133のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５３６】
項目135：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、非直線状の立体構造のエピトープに特異的に結合する、項目126〜133のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５３７】
項目136：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも2つの重鎖および少なくとも2つの軽鎖を含む多価(multivalent)抗体分子である、項目126〜135のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５３８】
項目137：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、多重特異的である、項目126〜136のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５３９】
項目138：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、二重特異的である、項目126〜136のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４０】
項目139：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、一価、二価、多価(polyvalent)、もしくは二機能性である、項目126〜136のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４１】
項目140：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化されている、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４２】
項目141：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、キメラである、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４３】
項目142：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、完全にヒトである、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４４】
項目143：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、Fab断片である、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４５】
項目144：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、Fab'断片である、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４６】
項目145：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、F(ab)2断片である、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４７】
項目146：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、Fv断片である、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４８】
項目147：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、1本鎖抗体である、項目126〜139のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５４９】
項目148：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目126〜147のいずれか一項目に記載の組成物。
【０５５０】
項目149：項目55〜75のいずれか一項目に記載のVHコードポリヌクレオチドを含む第1のベクターおよび項目76〜93のいずれか一項目に記載のVLコードポリヌクレオチドを含む第2のベクターを含む、組成物。
【０５５１】
項目150：項目55〜117のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチドまたは項目112〜119のいずれか一項目に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【０５５２】
項目151：少なくとも第1および第2のベクターを含む宿主細胞であって、該第1のベクターと該第2のベクターが同一ではなく、該第1のベクターが、免疫グロブリンの重鎖可変領域をコードする項目55〜75のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチドを含み、かつ該第2のベクターが、免疫グロブリンの軽鎖可変領域をコードする項目76〜93のいずれか一項目に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【０５５３】
項目152：項目150〜151のいずれか一項目に記載の宿主細胞を培養する段階、および抗体または断片を回収する段階を含む、抗C35抗体またはその抗原結合断片を作製する方法。
【０５５４】
項目153：項目152に記載の方法で作製される、抗C35抗体またはその抗原結合断片。
【０５５５】
項目154：免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)を含む単離されたポリペプチドであって、該VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65からなる参照の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり、かつ該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【０５５６】
項目155：VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、5個未満のアミノ酸置換以外は参照の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一である、項目154に記載のポリペプチド。
【０５５７】
項目156：免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)を含む単離されたポリペプチドであって、該VHのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65を含む、単離されたポリペプチド。
【０５５８】
項目157：SEQ ID NO:62からなる参照VH配列と少なくとも90%同一のVHを含む、単離されたポリペプチドであって、該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【０５５９】
項目158：参照VH配列と少なくとも95%同一のVHを含む、項目157に記載のポリペプチド。
【０５６０】
項目159：20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:62からなる参照VH配列と同一のVHを含む、単離されたポリペプチドであって、該VHを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【０５６１】
項目160：10個未満のアミノ酸置換以外は参照VH配列と同一のVHを含む、項目159に記載のポリペプチド。
【０５６２】
項目161：VHを含む抗体またはその抗原結合断片が、参照抗体MAb 163と同じエピトープに特異的に結合する、項目154〜160のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５６３】
項目162：VHを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35に対するMAb 163の結合を競合的に阻害する、項目154〜161のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５６４】
項目163：VHを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目154〜162のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５６５】
項目164：VHを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、約3.40×109 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目163に記載のポリペプチド。
【０５６６】
項目165：免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)を含む単離されたポリペプチドであって、該VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、10個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69からなる参照の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一であり、かつ該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【０５６７】
項目166：VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域が、5個未満のアミノ酸置換以外は参照の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の配列と同一である、項目165に記載のポリペプチド。
【０５６８】
項目167：免疫グロブリンの軽鎖可変領域(VL)を含む単離されたポリペプチドであって、該VLのCDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域がそれぞれ、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69を含む、単離されたポリペプチド。
【０５６９】
項目168：SEQ ID NO:66からなる参照VL配列と少なくとも90%同一のVLを含む、単離されたポリペプチドであって、該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【０５７０】
項目169：VLが参照VL配列と少なくとも95%同一である、項目168に記載のポリペプチド。
【０５７１】
項目170：20個未満のアミノ酸置換以外はSEQ ID NO:66からなる参照VL配列と同一のVLを含む、単離されたポリペプチドあって、該VLを含む抗体またはその抗原結合断片がC35に特異的に結合する、単離されたポリペプチド。
【０５７２】
項目171：VLが、10個未満のアミノ酸置換以外は参照VL配列と同一である、項目170に記載の単離されたポリペプチド。
【０５７３】
項目172：VLがSEQ ID NO:66である、項目165〜171のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５７４】
項目173：VLを含む抗体またはその抗原結合断片が、参照抗体MAb 163と同じエピトープに特異的に結合する、項目165〜171のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５７５】
項目174：VLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35に対するMAb 163の結合を競合的に阻害する、項目165〜173のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５７６】
項目175：VLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目165〜174のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５７７】
項目176：VLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、約3.40×10-9 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目175に記載のポリペプチド。
【０５７８】
項目177：融合している異種ポリペプチドをさらに含む、項目154〜176のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５７９】
項目178：治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾物質、医用薬剤、またはPEGからなる群より選択される薬剤に接合している、項目154〜177のいずれか一項目に記載のポリペプチド。
【０５８０】
項目179：治療薬が化学療法剤である、項目178に記載のポリペプチド。
【０５８１】
項目180：治療薬が放射性医用薬剤である、項目178に記載のポリペプチド。
【０５８２】
項目181：VHおよびVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35に特異的に結合する、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドを含む組成物。
【０５８３】
項目182：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、直線状エピトープに特異的に結合する、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５８４】
項目183：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、非直線状の立体構造のエピトープに特異的に結合する、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５８５】
項目184：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも2つの重鎖および少なくとも2つの軽鎖を含む多価(multivalent)抗体分子である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５８６】
項目185：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、多重特異的である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５８７】
項目186：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、二重特異的である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５８８】
項目187：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、一価、二価、多価(polyvalent)、もしくは二機能性である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５８９】
項目188：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化されている、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９０】
項目189：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、キメラである、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９１】
項目190：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、完全にヒトである、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９２】
項目191：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Fab断片である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９３】
項目192：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Fab'断片である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９４】
項目193：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、F(ab)2断片である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９５】
項目194：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Fv断片である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９６】
項目195：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、1本鎖抗体である、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９７】
項目196：VH、VL、または該VHと該VLの両方を含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、5×10-2 M、10-2 M、5×10-3 M、10-3 M、5×10-4 M、10-4 M、5×10-5 M、10-5 M、5×10-6 M、10-6 M、5×10-7 M、10-7 M、5×10-8 M、10-8 M、5×10-9 M、10-9 M、5×10-10 M、10-10 M、5×10-11 M、10-11 M、5×10-12 M、10-12 M、5×10-13 M、10-13 M、5×10-14 M、10-14 M、5×10-15 M、または10-15 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目154〜180のいずれか一項目に記載のポリペプチドまたは項目181に記載の組成物。
【０５９８】
項目197：VHまたはVLを含む抗体またはその抗原結合断片が、C35ポリペプチドもしくはその断片またはC35変異体ポリペプチドに、約3.40×10-9 M以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる親和性で特異的に結合する、項目196に記載のポリペプチド。
【０５９９】
項目198：項目154〜197のいずれか一項目に記載のポリペプチド、および担体を含む、組成物。
【０６００】
項目199：項目154〜198のいずれか一項目に記載のポリペプチドを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６０１】
項目200：項目24〜51のいずれか一項目に記載の単離されたMAb 163抗体またはその断片、項目55〜117のいずれか一項目に記載の単離されたポリヌクレオチド、項目154〜197のいずれか一項目に記載の単離されたポリペプチド、または項目126〜149のいずれか一項目に記載の組成物からなる群より選択される薬剤の有効量を、癌を患っている動物に投与する段階を含む、癌を処置するための方法。
【０６０２】
項目201：動物が哺乳動物である、項目200に記載の方法。
【０６０３】
項目202：哺乳動物がヒトである、項目201に記載の方法。
【０６０４】
項目203：(a)C35に特異的に結合する第1のC35抗体；(b)C35に特異的に結合する第2のC35抗体；および(c)治療薬を含む、組成物。
【０６０５】
項目204：治療薬が化学療法剤である、項目203に記載の組成物。
【０６０６】
項目205：化学療法剤がパクリタキセルである、項目204に記載の組成物。
【０６０７】
項目206：化学療法剤がアドリアマイシンである、項目205に記載の組成物。
【０６０８】
項目207：第1のC35抗体または第2のC35抗体のうちの少なくとも1つが、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171、およびそれらの変異体または誘導体からなる群より選択される、項目206に記載の組成物。
【０６０９】
項目208：第1のC35抗体がMAb 163である、項目207に記載の組成物。
【０６１０】
項目209：第1のC35抗体および第2のC35抗体の両方が、1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、およびMAb 171からなる群より選択される、項目203に記載の組成物。
【０６１１】
項目210：(a)試料もしくは細胞に、項目27〜54または217〜220のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を接触させる段階；および(b)抗体またはその抗原結合断片のC35に対する結合を検出する段階を含む、C35の存在を検出する方法。
【０６１２】
項目211：検出段階がインビボにおいて実施される、項目210に記載の方法。
【０６１３】
項目212：検出段階がインビトロにおいて実施される、項目210に記載の方法。
【０６１４】
項目213：CDRがSEQ ID NO:72〜77からなる群より選択される、項目55〜58、76〜79、112〜117のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０６１５】
項目214：MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含み、かつC35に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６１６】
項目215：MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも1つのCDRを含む、項目214に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６１７】
項目216：少なくとも1つのCDRが、MAb 163の重鎖のCDR3である、項目214に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６１８】
項目217：少なくとも1つのCDRがSEQ ID NO:65である、項目214に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６１９】
項目218：MAb 163モノクローナル抗体の少なくとも3つのCDRを含む、項目214に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６２０】
項目219：少なくとも3つのCDRが、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:65を含む、項目214に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６２１】
項目220：少なくとも3つのCDRが、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:69を含む、項目214に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【０６２２】
実施例
実施例1
放射線照射によるアポトーシス後に乳腺腫瘍細胞の表面膜上に露出するC35
C35腫瘍抗原を発現する、持続的に成長する乳腺腫瘍細胞の系列に300 Gyを照射したか、または処置を行わなかった。数日間にわたってインビトロ培養を継続することでアポトーシスを起こさせた後に、細胞を回収し、洗浄し、およびそれぞれ蛍光色素Alexa 647に接合させた50 ngの1F2モノクローナル抗C35抗体またはマウスIgG抗体対照で染色した。25℃で50分間のインキュベーション後に、標準的な市販のキット(Pharmingen)を使用して、細胞をアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。細胞をアネキシンV、ヨウ化プロピジウム、およびAlexa 647による染色に関して、標準的なプロトコルによるフローサイトメトリーで解析した。
【０６２３】
図1に示す結果から、アポトーシスを起こしていない(アネキシンV陰性)未処置生細胞(PI陰性)が、抗C35抗体とアイソタイプ対照抗体による染色に差が見られないことから明らかなように、C35を表面膜上に発現していないことがわかる(図1A)。同様に、生存しており(PI陰性)、およびアポトーシスを起こすように誘導されなかった(アネキシンV陰性)照射腫瘍細胞も、C35を腫瘍細胞の表面膜上で発現していない(図1B)。これと著しい対照をなして、生存している(PI陰性)がアポトーシスを起こした(アネキシンV陽性)照射腫瘍細胞は、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗C35抗体によって明瞭に差次的に染色されている(図1C)。
【０６２４】
実施例2
薬剤によって誘導されたアポトーシス後に乳腺腫瘍細胞の表面膜上に露出したC35
C35腫瘍抗原を発現する、持続的に成長する乳腺腫瘍細胞の系列を、6 ug/mlのマイトマイシンCで処置したか、または処置を行わなかった。アポトーシスの発生を可能とする48時間の持続的なインビトロ培養後に、細胞を回収し、洗浄し、およびそれぞれ蛍光色素Alexa 647に接合させた50 ngの1F2モノクローナル抗C35抗体またはマウスIgG抗体対照で染色した。25℃で50分間のインキュベーション後に、標準的な市販のキット(Pharmingen)を使用して、細胞をアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。細胞を、アネキシンV、ヨウ化プロピジウム、およびAlexa 647による染色に関して、標準的なプロトコルによるフローサイトメトリーで解析した。
【０６２５】
図2に示す結果から、アポトーシスを起こしていない(アネキシンV陰性)未処置生細胞(PI陰性)が、抗C35抗体およびアイソタイプ対照抗体による染色に差が見られないことから明らかなように、C35を表面膜上に発現していないことがわかる(図2A)。同様に、生存しており(PI陰性)、かつアポトーシスを起こすように誘導されなかった(アネキシンV陰性)マイトマイシンC処置腫瘍細胞も、C35を腫瘍細胞の表面膜上で発現していない(図2B)。これと著しい対照をなして、生存している(PI陰性)がアポトーシスを起こした(アネキシンV陽性)マイトマイシンC処置腫瘍細胞は、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗C35抗体によって明瞭に差次的に染色されている(図2C)。
【０６２６】
実施例3
哺乳動物細胞における抗体の発現
本発明のポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現させることが可能である。典型的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAの転写の開始に関与するプロモーターエレメント、タンパク質をコードする配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。他のエレメントには、エンハンサー、Kozak配列、およびRNAスプライシング用のドナー部位とアクセプター部位に挟まれた介在配列などがある。効率の高い転写は、SV40に由来する初期および後期のプロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLV1、HIV1に由来する長い末端反復配列(LTR)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターによって達成される。しかしながら、細胞由来のエレメントを使用することもできる(例えばヒトのアクチンプロモーター)。
【０６２７】
本発明の実施に使用される適切な発現ベクターは例えば、pSVLやpMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport 2.0、およびpCMVSport 3.0などのベクターを含む。使用可能な哺乳動物の宿主細胞は、ヒトのHela細胞、293細胞、H9細胞、およびジャーカット細胞、マウスのNIH3T3細胞およびC127細胞、Cos 1細胞、Cos 7細胞、およびCV1細胞、ウズラのQC1-3細胞、マウスのL細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含む場合がある。
【０６２８】
あるいはポリペプチドは、染色体中に組み入れられたポリヌクレオチドを含む安定な細胞系列中で発現させることができる。DHFR、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの選択マーカーとの同時トランスフェクションによって、トランスフェクションされた細胞の同定および単離が可能となる。
【０６２９】
トランスフェクションされた遺伝子を増幅して、コードされたタンパク質を大量に発現させることもできる。DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)マーカーは、数百コピーまたはさらには数千コピーの対象遺伝子を保有する細胞系列の開発に有用である(例えば、Alt, F.W., et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978)；Hamlin, J.L. and Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990)；Page, M.J. and Sydenham, M.A., Biotechnology 9:64-68 (1991)を参照)。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミン合成酵素(GS)である(Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991)；Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)。これらのマーカーを使用することで、哺乳動物細胞は選択培地で成長し、および極めて高い耐性を有する細胞が選択される。これらの細胞系列は、染色体中に組み込まれた状態で増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびNSO細胞が、タンパク質の産生にしばしば使用される。
【０６３０】
プラスミドpSV2-dhfr(ATCCアクセッション番号37146)、発現ベクターpC4(ATCCアクセッション番号209646)、およびpC6(ATCCアクセッション番号209647)の誘導体は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター(LTR)(Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (March, 1985))に加えて、CMVエンハンサーの断片(Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985))を含む。例えばBamHI、XbaI、およびAsp718の制限酵素切断部位を有するマルチクローニングサイトの存在によって、対象遺伝子のクローニングが容易になる。ベクターは、3'イントロン、ラットのプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終結シグナル、およびマウスのDHFR遺伝子も、SV40の初期プロモーターの制御下に含む。
【０６３１】
具体的には、例えばプラスミドpC6は、適切な制限酵素によって消化された後に、仔牛小腸由来ホスファターゼ(phosphate)によって、当技術分野で既知の手順で脱リン酸化される。次にベクターは、1%アガロースゲルから単離される。
【０６３２】
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で既知のプロトコルに従って増幅される。仮に天然のシグナル配列が本発明のポリペプチドの作製に使用される場合は、ベクターは第2のシグナルペプチドを必要としない。または、仮に天然のシグナル配列が使用されない場合は、異種シグナル配列を含むようにベクターを修飾することができる(例えばWO96/34891を参照)。
【０６３３】
増幅された断片は、1%アガロースゲルから、市販のキット(「Geneclean」、BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.)を使用して単離される。次に断片は適切な制限酵素で消化され、および再び1%アガロースゲルで精製される。
【０６３４】
次に、増幅された断片を同じ制限酵素で消化し、1%アガロースゲルで精製する。単離された断片、および脱リン酸化されたベクターを次に、T4 DNAリガーゼで連結する。次に、大腸菌のHB101細胞またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、およびプラスミドpC6中に挿入された断片を含む細菌を、例えば制限酵素解析によって同定する。
【０６３５】
活性DHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞がトランスフェクションに使用される。5μgの発現プラスミドpC6またはpC4を、0.5μgのプラスミドpSVneoと共に、リポフェクチンを使用して同時にトランスフェクションする(Felgner et al., 前掲)。プラスミドpSV2-neoは、優性選択マーカーである、G418を含む一群の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードするTn5に由来するneo遺伝子を含む。細胞を、1 mg/mlのG418が添加されたα-MEM(alpha minus MEM)に添加する。2日後に細胞をトリプシン処理し、およびハイブリドーマクローニングプレート(Greiner, Germany)中の、10 ng/ml、25 ng/ml、または50 ng/mlのメトトレキセート＋1 mg/mlのG418が添加されたα-MEMに添加する。約10〜14日後に、単一のコロニーをトリプシン処理後に、6ウェルのペトリ皿または10 mlのフラスコに、異なる濃度のメトトレキセート(50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、800 nM)と共に添加する。次に、最高濃度のメトトレキセートで成長するクローンを、さらに高濃度(1μM、2μM、5μM、10 mM、20 mM)のメトトレキセートを含む新しい6ウェルプレートに移す。同じ手順を、100〜200μMの濃度で成長するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現は例えば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットで、または逆相HPLC解析で解析する。
【０６３６】
実施例4
C35を発現する生腫瘍の壊死領域中における放射標識されたC35特異的抗体濃縮物
BALB/cマウスの左右の脇腹に、ヒトC35がトランスフェクションされているか、またはされていないかいずれかの同系の非小細胞肺癌に由来するLine 1腫瘍細胞を移植した。C35タンパク質の発現は、抗C35抗体による免疫組織化学的染色で確認した。14日間のインビボ成長後に、動物に125I標識抗C35抗体を静脈注射した。放射標識抗体の注射から120時間後に動物を屠殺し、C35陽性腫瘍およびC35陰性腫瘍中における抗C35抗体の濃度を、腫瘍切片をフィルムに露光することで決定した。図3に示すように、放射標識された抗C35抗体は、C35陰性腫瘍ではなく、C35陽性腫瘍のみに高濃度で存在した。腫瘍中における標識の分布と、完全な細胞に関するH&E染色の比較から、このような条件では、標識された抗C35抗体が特異的に、C35陽性腫瘍の壊死領域に高濃度で存在することが確認された。
【０６３７】
実施例5
線量測定用および治療用放射標識抗体の投与のプロトコル
線量測定用の放射標識抗体と治療用の放射標識抗体の両方を含む、放射標識抗体(もしくは抗体断片)の組成物が、静脈内または動脈内に注射で投与される。注射可能な放射標識抗体組成物は、静脈中または動脈中に、5分〜約60分間かけて、好ましくは15分〜30分間かけて注入される。腫瘍が既知の動脈によって供給される場合、治療用放射標識抗体組成物については動脈内投与が好ましい。線量測定用の放射標識抗体と治療用の放射標識抗体のいずれも、無菌の水溶液、典型的にはリン酸緩衝生理食塩水、または非経口的注射に適した他の溶媒として投与される。初期の線量測定用の放射標識抗体の用量は、約5〜50 mCiの放射線が照射される約5〜100 mgの抗体となる。線量測定目的の投与の約5〜10日後に、治療用放射標識抗体が、約10〜500 mgの用量で投与される(各治療用量ごとに300 mCi程度の放射線が送達される)。この線量測定/治療用レジメンは繰り返すことができる。米国特許第5,057,313号および米国特許第5,120,525号も参照されたい。
【０６３８】
実施例6
抗C35マウス抗体およびヒト抗体の可変領域の遺伝子の、寄託済みTOPOクローンへのクローニング
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域をTOPOベクター(Invitrogen)に、V領域のPCR増幅と、TOPOベクターへのTAクローニングによってクローニングした。この連結系は、制限酵素による消化を必要としない(ただしTOPOベクターは、挿入物の後の切り出しを可能とするEcoRI部位を保有する)。TAクローニングには、後にTOPOクローニングキット(Invitrogen)中に提供される直線化されたベクター中の5'Tオーバーハングと対を形成可能な、TaqポリメラーゼのPCR増幅産物中に天然で付加された3'Aオーバーハングを有するという利点がある。
【０６３９】
TOPOへの挿入用に可変領域の遺伝子をPCR増幅するために、発明者らは、定常領域配列の5'末端に相補的な下流プライマー(重鎖と軽鎖およびマウスとヒトで異なる)、ならびに可変領域の5'末端に、Invitrogen GeneRacerキットを使用する5'RACEによって付加される既知の固定(fixed)プライマー配列を使用した。これらの方法は当業者に周知である。
【０６４０】
実施例7
寄託済みTopoクローンからPCMV発現構築物への可変遺伝子のクローニング
Pcmv発現構築物の作製
ワクシニア移入プラスミド(pVHE、pVKE、およびpVLE)の構築は、過去の特許出願(US 2002 0123057 A1、「In vitro Methods of Producing and Identifying Immunoglobulin Molecules in Eukaryotic Cells」、2002-09-05公開)に記載されている。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を発現させるための哺乳動物の発現ベクターを作製するために、NotI〜SalIの発現カセットを、このワクシニア移入プラスミドから切り出して、pCMV-Scriptベクター(ベクターのマルチクローニングサイト中のXhoI部位は穴埋め(fill-in)および平滑末端連結によって破壊されている)にクローニングし、pCMV-VH、pCMV-VK、およびpCMV-VLの各ベクターを得た。このような発現カセットは、シグナルペプチド、V遺伝子用のクローニング部位、ならびに膜に結合するμ重鎖およびκ軽鎖の遺伝子に由来する定常領域を含む。
【０６４１】
pCMV-VHでは、カセットは、開始コドンに対してアミノ酸位置-19［アミノ酸(-19)］〜アミノ酸(-3)に由来するシグナルペプチドと、これに続くVH遺伝子のアミノ酸(109〜113)、および重鎖定常領域の全体を含む。アミノ酸(-4)〜アミノ酸(110)の選択されたVH遺伝子は、pCMV-VH中のBssHII［アミノ酸(-4〜-3)］およびBstEII［アミノ酸(109〜110)］部位でクローニングすることができる。
【０６４２】
pCMV-VK(κ)では、カセットは、アミノ酸(-19)〜アミノ酸(-2)のシグナルペプチドと、これに続くVK遺伝子のアミノ酸(104〜107)、およびκ鎖定常領域の全体を含む。アミノ酸(-3)〜アミノ酸(105)の選択されたVK遺伝子は、pCMV-VK中のApaLI［アミノ酸(-3〜-2)］およびXhoI［アミノ酸(104〜105)］部位でクローニングすることができる。
【０６４３】
pCMV-VL(λ)では、カセットは、アミノ酸(-19)〜アミノ酸(-2)のシグナルペプチドと、これに続くVL遺伝子のアミノ酸(103〜107)、およびκ鎖定常領域の全体を含む。アミノ酸(-3)〜アミノ酸(104)の選択されたVL遺伝子は、pCMV-VL中のApaLI［アミノ酸(-3〜-2)］およびHindIII［アミノ酸(103〜104)］部位でクローニングすることができる。結果として得られたλ軽鎖は、VλCκのキメラ構造を示す。
【０６４４】
選択された抗体を分泌型のヒトIgG1として発現させるために、IgG1の定常領域をB細胞または骨髄細胞からRT-PCRによってクローニングした。以下のプライマーセットを使用した。
5'フォワードプライマー：
2009544574.tif 000043
3'リバースプライマー：
2009544574.tif 000044
【０６４５】
結果として得られるPCR産物は、以下の構造を示す：BamHI-BstEII(アミノ酸109〜110)-(アミノ酸111〜113)-Cγ1-TGA-SalI。CH1領域に位置する内部のBstEIIをサイレント変異を介して除去する標準的なプロトコルによる部位特異的変異導入を実施するために、PCR産物をpBluescriptII/KSのBamHIおよびSalI部位でサブクローニングした。次に、VH遺伝子が同ベクターのBssHII/BstEIIにサブクローニングされると分泌型のIgG1の重鎖の発現が誘導されるように、結果として得られたCγ1をpCMV-VHのBstEIIおよびSalIでサブクローニングしてPCMV-Cγ1を得た。
【０６４６】
V遺伝子挿入用のIgG1分泌型のヒトγ1重鎖リーダーおよび定常領域のカセットの配列を以下に示す。
下線＝制限酵素部位
太字＝定常領域
太字/斜体字＝シグナルペプチド
2009544574.tif 000045
【０６４７】
Vκ遺伝子挿入用のヒト軽鎖リーダーおよびκ定常領域のカセットの配列を以下に示す。
2009544574.tif 000046
【０６４８】
Vλ遺伝子挿入用のヒト軽鎖リーダーおよびκ定常領域のカセットの配列を以下に示す。
2009544574.tif 000047
【０６４９】
分泌型のIgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、およびIgMを含む、他のアイソタイプの分泌型ヒト抗体を発現させるベクターを構築するために、個々の定常領域をクローニングし、任意の内部のBstEII部位に変異を導入し、およびpCMV-Cγ1ベクターのBstEII〜SalI部位間でCγ1を他のアイソタイプの定常領域と置換する場合と同じ方法を用いることができる。
【０６５０】
他のアイソタイプの定常領域をクローニングするために、以下のプライマー対を使用した。
2009544574.tif 000048
【０６５１】
高度の配列保存のために、使用されたプライマーが、IgG1とIgG2との間、IgG3とIgG4との間、およびIgA1とIgA2との間で同じであることに留意されたい。
【０６５２】
Topoクローンに由来する可変遺伝子の、pCMV発現構築物へのクローニング
段階1：V-遺伝子断片の作製
A．ヒトのv-遺伝子
MMH1
1．MMH1プラスミドDNA(クローンH0009)を、BssHII(GCGCGC(SEQ ID NO:36))およびBsteII(GGTCACC(SEQ ID NO:37))によって、標準的なプロトコルで消化する。
2．DNAをアガロースゲル上で、標準的なプロトコルで分離する。
3．357 bpの断片をゲルから切り出し、DNAを標準的なプロトコルで単離する。
【０６５３】
MMK1
1．MMK1プラスミドDNA(クローンL0010)を、ApaLI(GTGCAC(SEQ ID NO:38))およびXhoI(CTCGAG(SEQ ID NO:39))によって、標準的なプロトコルで消化する。
2．DNAをアガロースゲル上で、標準的なプロトコルで分離する。
3．343 bpの断片をゲルから切り出し、DNAを標準的なプロトコルで単離する。
【０６５４】
B．マウスのハイブリドーマのv-遺伝子
1F2 VK
1．マウスハイブリドーマのv-遺伝子は、ATCC寄託済みクローン1F2Kから、以下のプライマーを使用したPCRで増幅しなければならない。これは、ヒトのκ軽鎖定常領域の発現カセット中でマウスv-遺伝子とヒト定常領域のキメラ抗体を作製するために必要である。
1F2VKフォワードプライマー：
2009544574.tif 000049
1F2VKリバースプライマー：
2009544574.tif 000050
(小文字＝マウス1F2 VK配列に非相同、制限酵素部位を含む。大文字＝マウス1F2 VK配列に相同。)
2．331 bpのPCR産物をApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO:42))およびXhoI(CTCGAG(SEQ ID NO:43))によって、標準的なプロトコルで消化する。
3．DNAをアガロースゲル上で、標準的なプロトコルで分離する。
4．315 bpの消化断片をゲルから切り出し、DNAを標準的なプロトコルで単離する。
【０６５５】
1F2 VH
1．マウスハイブリドーマのv-遺伝子は、ATCC寄託済みクローン1F2Gから、以下のプライマーを使用してPCRで増幅しなければならない。これは、ヒトの重鎖定常領域発現カセット中のマウスのv-遺伝子とヒトの定常領域のキメラ抗体を作製するために必要である。
1F2VHフォワードプライマー：
2009544574.tif 000051
1F2VHリバースプライマー：
2009544574.tif 000052
(小文字＝非相同で、制限酵素部位を含む。大文字＝相同。)
2．360 bpのPCR産物をBssHII(GCGCGC(SEQ ID NO:36))およびBsteII(GGTCACC(SEQ ID NO:37))によって、標準的なプロトコルで消化する。
3．DNAをアガロースゲル上で、標準的なプロトコルで分離する。
4．343 bpの消化DNA断片を含むゲル切片を切り出し、DNAを標準的なプロトコルで単離する。
【０６５６】
1B3VK
1．マウスハイブリドーマのv-遺伝子は、寄託済みクローン1B3Kから、以下のプライマーを使用してPCRで増幅しなければならない。これは、ヒトのκ軽鎖定常領域の発現カセット中のマウスのv-遺伝子とヒトの定常領域のキメラ抗体を作製するために必要である。
1B3VKフォワードプライマー：
2009544574.tif 000053
1B3VKリバースプライマー：
2009544574.tif 000054
(小文字＝非相同で、制限酵素部位を含む。大文字＝相同。)
2．334 bpのPCR産物をApaL1(GTGCAC(SEQ ID NO:42))およびXhoI(CTCGAG(SEQ ID NO:43))によって、標準的なプロトコルで消化する。
3．DNAをアガロースゲル上で、標準的なプロトコルで分離する。
4．322 bpの消化DNA断片を含むゲル切片を切り出し、DNAを標準的なプロトコルで単離する。
【０６５７】
1B3VH
1．マウスハイブリドーマのv-遺伝子は、寄託済みクローン1B3Gから、以下のプライマーを使用してPCRで増幅しなければならない。これは、ヒトの重鎖定常領域発現カセット中のマウスのv-遺伝子とヒトの定常領域のキメラ抗体を作製するために必要である。
1B3VHフォワードプライマー：
2009544574.tif 000055
1B3VHリバースプライマー：
2009544574.tif 000056
(小文字＝非相同で、制限酵素部位を含む。大文字＝相同。)
2．378 bpのPCR産物をBssHII(GCGCGC(SEQ ID NO:36))およびBsteII(GGTCACC(SEQ ID NO:37))によって、標準的なプロトコルで消化する。
3．DNAをアガロースゲル上で、標準的なプロトコルで分離する。
4．366 bpの消化DNA断片を含むゲル切片を切り出し、DNAを標準的なプロトコルで単離する。
【０６５８】
段階2：発現構築物の集合
1．pCMV-VHおよびpCMV-VKの発現ベクターを適切な酵素によって、標準的なプロトコルで消化する。
a．pCMV-VH−BsteIIおよびBssHII
b．pCMV-VK−ApaL1およびXhoI
2．DNAをアガロースゲル上で分離し、直線化されたベクターを標準的なプロトコルで切り出す。
3．DNAをゲル切片から、標準的なプロトコルで単離する。
4．軽鎖のv-遺伝子をpCMV-VKに、および重鎖のv-遺伝子をpCMV-VHに、標準的なプロトコルで連結する。
5．連結したDNAでコンピテント細胞を形質転換し、プラスミドDNAを標準的なプロトコルで単離する。
【０６５９】
実施例8
免疫グロブリンの定常領域の配列
以下の遺伝子、およびコードされたアミノ酸配列を使用して、ヒト化抗体、ヒト変異体抗体、キメラ抗体、およびそれらの断片を作製することができる。
【０６６０】
ホモ・サピエンスの免疫グロブリンの定常領域のG2遺伝子(IgG2(n-)アロタイプ)(GenBank番号Z49802)(SEQ ID NO:50)
2009544574.tif 000057
【０６６１】
ホモ・サピエンスの免疫グロブリンの定常領域のG2遺伝子(IgG2(n+)アロタイプ)(GenBank番号Z49801)(SEQ ID NO:51)
2009544574.tif 000058
【０６６２】
免疫グロブリンの定常領域、重鎖、α-2サブユニットをコードするホモ・サピエンスのCH遺伝子(GenBank番号AJ012264)(SEQ ID NO:52)
2009544574.tif 000059
【０６６３】
ホモ・サピエンスの定常領域、重鎖、α-2サブユニット(GenBank番号CAA09968.1)(SEQ ID NO:53)
2009544574.tif 000060
【０６６４】
ホモ・サピエンスの免疫グロブリンの重鎖定常領域α1(IGHA1遺伝子)の部分的mRNA(GenBank番号AJ294729)(SEQ ID NO:54)
2009544574.tif 000061
【０６６５】
免疫グロブリン重鎖定常領域α1(GenBank番号CAC20453.1)(SEQ ID NO:55)
2009544574.tif 000062
【０６６６】
追加の定常領域の配列(ヒトのIgM1、IgM2、IgD1、IgA1、IgG1、IgG3、IgE1、IgE2、κ、およびλ；マウスのIgM1、κ、およびλ；ウサギのIgM1、κ、およびλ；ならびにイヌのIgM1)は、FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (3d ed.), William E. Paul (ed.), Raven Press, New York, NY (1993)の296〜300ページに記載されている。他の多くの定常領域の配列(ポリヌクレオチドおよびアミノ酸)は当技術分野で既知であり、本発明で使用することができる。
【０６６７】
実施例9
放射免疫療法と化学療法の併用
化学療法と抗C35放射免疫療法の併用は、腫瘍容積の縮小に関して、いずれかの療法の単独の場合より有効なことがわかっている。第1の実験では、131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体による放射免疫療法と、150 mg/kgの5-フルオロウラシル(FU)と100 mg/kgのロイコボリン(LV)による化学療法の併用の効果を、Colau.C35腫瘍細胞が移植されたスイスヌードマウスを対象に検討した。Colau.C35は、ヒト結腸癌から適合され、およびC35レトロウイルス組換え体を形質導入されて組織培養されたColau細胞のC35抗原陽性のクローンである。
【０６６８】
化学療法を腫瘍移植から11日目に開始し、および300μCiの131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体を14日目に投与した。腫瘍の成長を最長8週間にわたって追跡した。
【０６６９】
図5に示す結果から、放射免疫療法と化学療法が併用された群では、化学療法単独か、または化学療法および非放射標識(「非放射性」)の1B3抗C35抗体が投与された群と比較して、腫瘍の成長が阻害されることがわかる。成長阻害の標準的なパラメータを、放射免疫療法と化学療法が併用された群に対して、未処置対照群と比較して計算した。
【０６７０】
図5に示すように、腫瘍倍加遅延(Tumor Doubling Delay; TDD)は、3.8(腫瘍容積が400 mm3時)に等しく、TDDは、(処置時-対照{指定容積に至るまでの日数})/TVDTに等しく、およびTVDT＝対照の腫瘍容積倍加時間{指数増殖期中}である。死滅細胞数の対数値(Log Cell Kill; LCK)は、TDD/3.3＝1.15と決定される。これは、有効な腫瘍療法に関して受け入れられた標準に見合う(例えば、Skipper HE et al., Cancer Chemotherapy Rep. 35:1-111 (1964)；Coldman AJ and Goldie JH, Mathematical Biosciences 65:291-307 (1983)；およびNorton L and Simon R, Cancer Treat. Rep. 61:1307-1317 (1977)を参照)。
【０６７１】
第2の実験では、131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体による放射免疫療法と、15日目および18日目における2 mg/kgのシスプラチンによる化学療法の併用の効果を、Colau.C35腫瘍細胞が移植されたスイスヌードマウスを対象に検討した。シスプラチンは、腫瘍移植から15日目および18日目に投与した。300μCiの131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体を21日目に投与した。腫瘍の成長を最長10週間にわたって追跡した。
【０６７２】
同実験で、Colau.C35腫瘍細胞が移植された別の群のスイスヌードマウスには、180 mg/kgの5-フルオロウラシル(5FU)と120 mg/kgのロイコボリン(LV)か、または18日目に実施されたこの同じ化学療法レジメンの実施後に、300μCiの131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体を21日目に投与した。
【０６７３】
図6に示す結果から、化学療法のみ(シスプラチンまたは5FU/LVのいずれか)を受けた群では、Colau.C35腫瘍の成長はある程度阻害され、131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体が投与された群では阻害は大きく、また化学療法と131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体が併用された群における腫瘍の成長の阻害が最も大きかったことがわかる。以下の表6を参照されたい。
【０６７４】
（表６）図6における、腫瘍容積に対する治療様式の効果の比較
2009544574.tif 000063
RIT＝放射免疫療法
T-C＝処置腫瘍(T)および対照(C)腫瘍が任意の容積(1200 mm3)に至るまでの時間の差
TDD＝腫瘍倍加遅延＝T-C/未処置の腫瘍容積倍加時間
LCK＝死滅細胞数の対数値＝TDD/3.32
【０６７５】
これらの実験モデルの使用を簡便にするため、比較的速やかに成長し、および組換えC35を形質導入しなければならない腫瘍の異種移植片を選択した。しかしながら、併用療法の成功は、形質導入腫瘍における異常に高レベルのC35発現に起因するものではなかった。図7は、C35の発現が、天然でC35を発現する21MT1などの腫瘍で、およびColau.C35やMDA231.C35などのC35形質導入腫瘍で極めて類似していることを示す。細胞をAlexa-647接合抗C35 MAb 1F2またはアイソタイプ対照で染色した。「MFI X」は、1F2の平均蛍光強度/アイソタイプ対照の平均蛍光強度の比である。正常な乳腺上皮に由来するH16N2、および乳腺腫瘍MDAMB231、ならびに結腸腫瘍Colauは、低基礎レベルのC35を発現する。乳癌に由来する21MT1は、天然で高レベルのC35発現する。ColauおよびMDA231には、空のベクター(ヌル)またはヒトC35組換えベクターを形質導入した。全ての腫瘍はインビボで成長させ、腫瘍は摘出し、解離して染色した。
【０６７６】
実施例10
化学療法剤の最大耐用量(MTD)の決定
化学療法と放射免疫療法の併用時には、累積用量制限による骨髄毒性が懸念されるので、併用療法の最大耐用量(MTD)を決定することが必要であり、また2つの治療薬の毒性が相加的であれば、両毒性薬剤の投与を許容する戦略を採用する。MTDは、末梢循環中における血小板および白血球の回復に必要な時間に関連する調節基準によって決定される。このような標準は、当業者であれば承知している。マウスモデルの場合、しばしば使用されるMTDの代理定義(surrogate definition)は、平均して20%未満の体重減少または10%未満の死亡率につながる最大用量である。標準的な臨床プロトコルで、または動物モデルで使用されている最も一般的な化学療法剤に関して現在確立されているMTDを、以下の表7〜10に示す。
【０６７７】
（表７）異種移植モデル(ヌードマウス)における代表的な化学療法プロトコル
2009544574.tif 000064
注：
TBD：未決定
1．発明者らによって確認されたMTD。最大耐用量は、20%以上の平均体重減少および/または10%を上回る死亡率と定義される。
2．所定のスケジュールにおける非毒性用量。
3．Fichtner I et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. Eur J Can 2004. 40：298-307。
4．Villena-Heinsen C et al. Human ovarian cancer xenografts in nude mice：chemotherapy trials with paclitaxel, cisplatin, vinorelbine, and titanocene dichloride. Anticancer Drugs 1998. 9：557-563。
5．Higgins B. et al. Antitumor activity of erlotinib (OSI-774, Tarceva) alone or in combination in human non-small cell lung cancer tumor xenograft models. Anti-Cancer Drugs 2004. 15：503-512。
6．Kraeber-Bodere F. et al. Enhanced Antitumor Activity of Combined pretargeted radioimmunotherapy and Paclitaxel in Medullary Thyroid Cancer Xenograft. Mol Can Ther 2002. 1：267-274。
7．Kraus-Berthier, L et al. Histology and sensitivity to anticancer Drugs of two human non-small cell lung carcinomas implanted in the pleural cavity of nude mice. 2000. Clin Can Res 6:297-304。
【０６７８】
（表８）乳癌の代表的な化学療法のプロトコル
2009544574.tif 000065
出典：DataMonitor Pipeline Insight: Breast Cancer June 2004; http://www.bccancer.bc.ca
【０６７９】
（表９）結腸癌療法の代表的なプロトコル
2009544574.tif 000066
出典：http://www.bccancer.bc.ca
【０６８０】
（表１０）肺癌の化学療法の代表的なプロトコル
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出典：http://www.bccancer.bc.ca
【０６８１】
化学療法および放射免疫療法による処置のMTDを低下させる有効な戦略は、以下を含む：投与される化学療法剤の用量を、MTDで放射免疫療法と共に投与した場合に、相加的な毒性を生じないレベルに低減すること(以下の実施例10Aを参照)；放射免疫療法と併用した場合に、相加的な毒性に寄与しない化学療法剤を選択すること(以下の実施例10Bを参照)；ならびに放射免疫治療薬による骨髄毒性を低下させること(以下の実施例10Cを参照)。
【０６８２】
A．毒性を低減させるための化学療法剤の用量の低減
15日目および18日目に2 mg/kgのシスプラチン(MTDの約50%)をスイスヌードマウスに投与し、72時間後に131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体をMTD(300μCi)で投与した。図8に示すように、体重減少によって決定されるシスプラチンと放射免疫治療薬の総毒性は、MTDで投与された放射免疫治療薬単独による毒性と有意には異ならなかった。
【０６８３】
B．相加的な毒性に寄与しない化学療法剤
120 mg/kgのロイコボリンと180 mg/kgのMTDにおける5-フルオロウラシルを18日目に投与後、131I標識1B3抗C35モノクローナル抗体をMTD(300μCi)で21日目に投与した。図8に示すように、毒性を有する2つの薬剤は各々、その個々のMTDで投与されたが、その2つの薬剤を併用した場合のMTDを超えなかった。
【０６８４】
C．放射免疫治療薬による骨髄毒性の低下
別の戦略は、末梢循環からの放射標識抗体のクリアランスを加速させる生化学的修飾によって、放射免疫治療薬による骨髄毒性を低減させることである。適切な修飾は、表10に記載されているIgG3、IgA、IgD、またはIgEなどのさまざまな抗体アイソタイプの使用、またはその長期血清半減期に関与するIgGのCH2ドメインの欠失を含む(Mueller BM, RA Reisfeld, and SD Gillies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5702-5705 (1990)；Slavin-Chiorini DC, et al., Int. J. Cancer 53:97-103 (1993)を参照)。
【０６８５】
（表１１）ヒト免疫グロブリンアイソタイプの血清半減期
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【０６８６】
血清半減期が短縮されるように、抗体および/または抗体断片を改変するか、または抗体構造を改変する他の戦略も応用可能である。このような改変型の抗体および/または抗体断片の例は、ドメイン欠失型の抗体、Fab、F(ab')2、scFv、ミニボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディなどを含むが、これらに限定されない。
【０６８７】
実施例11
1B3抗体および1F2抗体のC35ペプチドのエピトープ
1B3抗体および1F2抗体のエピトープ特異性を局在化させるために、大腸菌で6×Hisタグを用いて合成された組換えヒトC35(rhC35)をLys-Cエンドプロテイナーゼで消化した。この酵素は、タンパク質配列中のリシン(K)残基の後を切断する。図9に、Lys-CによるrhC35の完全消化後の推定ペプチド断片を示す。アミノ末端の6×Hisタグの付加を含むrhC35の全配列を示す。アミノ酸の位置には、天然のヒト配列のアミノ末端のメチオニン(M)に対する番号を付してある。1番目および3番目のリシンと、これに続く負に帯電した残基における消化は効率が悪く、ある程度長い組み合わせの断片が生じる場合があることに留意されたい。Lys-Cエンドプロテイナーゼを、精製済みのrhC35に重量比50:1で添加し、25 mM Tris、pH 8.0中で37℃で18時間インキュベーションした。消化物をエタノールで沈殿させ、還元(reducing)トリシン試料緩衝液に再溶解した。100℃で5分間の加熱後に、試料を16%のトリシンゲル(Invitrogen)による電気泳動で分離した。ペプチドをPVDF膜に転写し、全てのペプチドを検出するために、図10に示すブロットをクーマシーブルー(左および右のパネルのレーン1〜3)によって染色するか、または以下のうちの1つの処置を行った：1μg/mlのマウス1F2抗C35抗体と、これに続くアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗マウス抗体(左のパネルのレーン4)；1μg/mlの1B3抗C35免疫グロブリン可変領域(ヒトの定常領域(MAb 11)に結合)と、これに続くアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒト抗体(左のパネルのレーン5)；または抗6×Hisタグマウス抗体(Amersham)と、これに続くアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗マウス抗体(右のパネルのレーン4および5)。BCIP/NBT基質を添加して発色させ、二次試薬を検出した。分子量マーカーを両パネルの隣接レーンに示す。
【０６８８】
図10では、記載のバンドAが、未消化rhC35の位置に移動している。バンドBが、MAb 11(1B3)抗C35抗体ではなく1F2抗体により染色され、バンドCが1F2抗体とMAb 11(1B3)抗体のいずれによっても染色されないことに留意されたい。バンドBとCはいずれも、rhC35のアミノ末端において6×Hisタグに対する抗6×Hisタグ抗体で染色されることから、いずれの断片ともC末端のペプチド断片を欠くと結論することができる。約15 kDaのバンドBの場合、MAb 11(1B3)による染色に必要な、失われたエピトープは、天然のC35配列の残基105〜115に相当する11アミノ酸のC末端のC35ペプチドITNSRPPCVILである。このエピトープは、1F2による染色には必要ではない。これとは対照的に、1F2抗体は、天然のC35配列の残基48〜104をさらに欠く約8 kDaのバンドCと反応しない。この結果から、1B3抗体が、C35の残基105〜115(ITNSRPPCVIL)内のエピトープに特異的であり、1F2抗体は、C35の残基48〜104内のエピトープに特異的であることがわかる。
【０６８９】
実施例12
1B3抗C35モノクローナル抗体に関連するヒト抗体
マウスの1B3抗C35モノクローナル抗体と同じ免疫グロブリン重鎖のCDR3領域を有する点を除いてヒト由来である2つの抗体を、2002年9月5日に公開されたUS 2002 0123057 A1に開示された方法で作製した。
【０６９０】
MAb 165は、141D10 VH H732の重鎖可変領域(SEQ ID NO:56および57)、ならびにUH8 VK L120のκ軽鎖可変領域(SEQ ID NO:58および59)を含む。図11に示すように、MAb 165はC35に特異的である。141D10組換えワクシニアウイルスをHeLa細胞に、UH8組換えワクシニアウイルスと共感染させた。結果として得られた分泌型抗体を、C35または対照タンパク質A27L(ワクシニアウイルスのタンパク質)に対する結合に関してELISAで検討した。
【０６９１】
MAb 171は、MSH3 VH H835の重鎖可変領域(SEQ ID NO:60および61)、ならびにUH8 VK L120のκ軽鎖可変領域(SEQ ID NO:58および59)を含む。
【０６９２】
実施例13
抗C35抗体によって認識されるC35ペプチドのエピトープの同定
組換えC35に対するウサギポリクローナル抗体を、当技術分野で周知の標準的な免疫化法で作製した。各アミノ酸残基1〜101で始まる115アミノ酸長のC35タンパク質の配列に対応する、長さが15アミノ酸の重複性ペプチドを合成した。ペプチドは、個々の15アミノ酸のペプチド中のC35上のアミノ酸末端の残基の位置を元に命名された。天然のC35配列の30位、33位、および112位におけるシステイン残基が重複する各ペプチドで、ジスルフィド架橋されたペプチドの形成を避けるために、アラニンをシステインと置換した。
【０６９３】
96ウェルのMaxisorpマイクロタイタープレートのウェルを、2μgのC35タンパク質、またはC35タンパク質配列に由来する14μgもしくは40μgの記載の15アミノ酸のペプチドのいずれかでコーティングし、およびウサギC35免疫血清中の抗体の結合を、以下に詳述する手順で判定した。以下の表12のデータは、陽性および陰性の対照、ならびに陽性結合の検出用のC35由来のペプチドを示す。ペプチド結合レベルのバラツキは、特異的な抗体種の濃度の差、抗体の親和性の差、またはこれらの組み合わせのいずれかに起因する可能性がある。
【０６９４】
A．ペプチド試料の調製
100% DMSO中のC35ペプチドの15-mer(10 mg/ml)のアリコートを、40μg/チューブとなるように1.5 mlチューブ中に無菌条件で採取後、高速真空処理を行ってDMSOを除去する。ペプチドをPBS、pH 7.2に、1 ml/チューブとなるように再懸濁し、十分に混合して遠心分離した。個々のペプチド濃度(「ペプチド溶液」)は40μg/mlとした。ペプチド溶液は、使用するまで-20℃で保存すべきである。解凍後は、2週間まで4℃で維持すべきである。
【０６９５】
B．Maxisorpプレート上における試料のコーティング
14μg/mlのペプチドでコーティングするプレートについては、1ウェルあたり65μlのPBS、pH 7.2を添加した後に、1ウェルあたり35μlのペプチド溶液(総容積100μl/ウェル)を添加して十分に混合した。40μg/mlのペプチドでコーティングするプレートについては、100μlのペプチド溶液を、100μl/ウェルとなるように直接プレート上に添加した。対照C35タンパク質をPBS、pH 7.2で、2μg/mlとなるように希釈し、プレートに100μl/ウェルとなるように添加した。コーティングされたプレートを室温で2時間インキュベーションした後に、4℃で一晩インキュベーションした。
【０６９６】
C．ELISA条件
各プレートをプレート洗浄機で3回洗浄した。プレートを「ブロッキング緩衝液」(PBS、pH 7.2および10% FBS)で室温で2時間かけてブロックした後に、各プレートをプレート洗浄機で3回洗浄した。一次抗体であるウサギ抗ヒトC35ポリクローナル抗体(Bethyl製、バッチ62902)を、「アッセイ法希釈物」(PBS、pH 7.2プラス0.05% Tween 20および10% FBS)で希釈し、プレートに100μl/ウェルとなるように添加した。プレートを室温で2時間インキュベーションした。14μg/mlのペプチドでコーティングされたプレートについては、100 ng/mlの一次抗体を添加した。40μg/mlのペプチドでコーティングされたプレートについては、1μg/mlの一次抗体を添加した。プレートをプレート洗浄機で5回洗浄した。Zymedの二次抗体であるHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)接合ヤギ抗ウサギFcポリクローナル抗体を、1:20,000の希釈率でアッセイ法緩衝液に希釈し、プレートに100μl/ウェルとなるように添加した。プレートを室温で2時間インキュベーションした。プレートをプレート洗浄機で7回洗浄した。基質を、同キットの製造業者の指示書に従って添加し、暗条件で室温で15分間インキュベーションした。反応は、2 N H2SO4を100μl/ウェルとなるように添加することで停止させた。450〜570 nmにおける吸光度を直ちに読みとった。
【０６９７】
（表１２）C35エピトープに対する抗体の結合
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【０６９８】
実施例14
2つのC35抗体と化学療法の併用
図12に示すように、およびこの実施例で説明するように、化学療法剤と併用した2つのC35抗体の投与による癌の処置法について検討した。500万個のC35陽性MDA231腫瘍細胞を、スイスヌードマウスの乳腺脂肪体の皮下に移植した。少なくとも5匹のマウス群のそれぞれを対象に、移植後17日目から以下の処置を開始した。
1．処置なし(対照群)。
2．17日目および24日目における30 mg/kgのパクリタキセルの腹腔内注射。
3．17日目および24日目における30 mg/kgのパクリタキセルの腹腔内注射と共に、400μgの1F2マウスモノクローナル抗体の静脈内注射(20 mg/kg)を17日目に開始し、週2回、3週間にわたって継続。
4．17日目および24日目における30 mg/kgのパクリタキセルの腹腔内注射と共に、400μgの1B2マウスモノクローナル抗体の静脈内注射(20 mg/kg)を17日目に開始し、週2回、3週間にわたって継続。
5．17日目および24日目における30 mg/kgのパクリタキセルの腹腔内注射と共に、400μgの1F2の静脈内注射(20 mg/kg)、および400μgの1B3マウスモノクローナル抗体の静脈内注射(20 mg/kg)(計40 mg/kg)を17日目に開始し、週2回、3週間にわたって継続。
6．17日目および24日目における30 mg/kgのパクリタキセルの腹腔内注射と共に、400μgのモノクローナルアイソタイプ対照抗体の静脈内注射を17日目に開始し、週2回、3週間にわたって継続。
【０６９９】
マウス腫瘍容積の平均値を、移植後のさまざまな時点で測定した。個々の腫瘍を対象に、2つの寸法をノギスで測定し；腫瘍容積を、(長さ×幅2)/2の式で計算した。結果を図12に示すが、2つのマウス抗C35抗体(1F2と1B3)と化学療法(パクリタキセル)の併用が、インビボにおけるC35陽性腫瘍の成長を阻害したことがわかる。図12に示すように、化学療法剤のパクリタキセルと共に個別に投与された1F2も1B3も、マウスの腫瘍の成長の阻害に有効ではなかった。1F2および1B3とパクリタキセルの併用によって処置されたマウスの腫瘍の成長は、最終抗体投与から約1週間後に再開し、インビボにおける抗体の推定半減期と相関する。
【０７００】
実施例15
C35に対する腫瘍特異的な結合を示すMAB 163
図13に示すように、MAb 163は、ウェスタンブロットによる検出により、腫瘍特異的な結合を示すことが明らかとなった。試料をLaemli緩衝液に再懸濁し、β-MEおよび加熱により還元し、4〜20% SDS-PAGEに流し、ならびにPVDF膜に転写した。膜をMAb 163(4.4 ug/ml)とインキュベーションした後に、ヤギ抗ヒトIgG-HRPによる検出を行って化学発光によって発色させた。
【０７０１】
以下のレーンを図13に示す：レーン1：大腸菌から精製された組換えヒトC35タンパク質(rC35)(100 ng/レーン)；レーン2：21MT1-Dヒト乳腺腫瘍細胞溶解物(100,000細胞相当物/レーン)；およびレーン3：H16N2正常不死化ヒト乳腺細胞系列溶解物(100,000細胞相当物/レーン)。キロダルトンで示す分子量マーカーを図の左側に示す。
【０７０２】
この実験から、MAb 163が、腫瘍細胞溶解物中の天然のC35単量体には結合するが；正常細胞系列では結合は見られないことが明らかとなった。MAb 163は、rC35単量体(16 kD)、二量体(〜32 kD)、およびこれより大きい凝集物にも結合する。組換えC35(レーン1)は、rC35中の6×Hisタグの存在のために、天然のC35(レーン2)よりわずかに大きい。
【０７０３】
図14は、フローサイトメトリーによるMAb 163の特異性の解析を示す。細胞内FACSを以下の手順で実施した：H16N2(C35陰性の正常不死化乳腺細胞系列)細胞および21MT1(C35陽性乳腺腫瘍細胞系列)細胞を固定化して透過処理を行った後に、50万個の細胞を、1μgのAlexa-647に接合した抗C35抗体(MAb 163もしくはMab 11のいずれか)またはアイソタイプがマッチした対照抗体と共に、Xenonラベリングキット(Molecular Probes)を使用して、45分間インキュベーションした。次に、洗浄後の細胞をFACS Calibur(BD Biosciences)で解析した。アイソタイプ対照Mabによる染色を図14の塗りつぶされた領域で示し；抗C35 Mabによる染色を塗りつぶされていない線で示す。塗りつぶされていない線の変化は、C35抗体の21MT特異性におけるMAb 163またはMab 11を示す。
【０７０４】
ヒト乳腺細胞系列を対象としたMAb 163による免疫蛍光的手法による検討でも、MAb 163がC35に特異的に結合することが確認された。図15のイメージは、以下のプロトコルで得た。パラホルムアルデヒドで固定された細胞(C35+またはC35-のいずれか)を、さまざまな濃度のMAb 163(3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、または0.1μg/ml)と共にインキュベーションした後に、二次抗体であるAPCに接合させた抗ヒトIgGによる検出を行い、FMATで可視化した。この検討の結果を図15に示す。C35陰性のH16N2細胞は免疫蛍光染色を全く示さず、およびC35陽性の21MT1-D細胞は用量依存性の免疫蛍光を示すことがわかる。
【０７０５】
図22に示すように、Mab 163を使用して、21MT1-D C35を発現する細胞系列の細胞溶解物からC35を免疫沈殿させた。簡単に説明すると、10 mlのCHO細胞上清中のMAb 163を、PBSに緩衝液を交換して1 mlに濃縮した。濃縮後のMAb 163をプロテインAビーズに1時間以上かけて添加した。洗浄後に、プロテインA/MAb 163を、C35陽性の21MT1-D細胞溶解液に2時間かけて添加した。ビーズを洗浄後に、タンパク質を還元試料緩衝液で100℃で溶出した。
【０７０６】
免疫沈降した試料を、ウサギ抗C35ポリクローナル血清を使用するウェスタンブロットで解析した。図22の左側のレーンに示すように、100,000個の21MT1-D細胞に由来する溶解物を対照としてウェスタンブロットに含めた。図22の「15」という数字は、15キロダルトンの分子量マーカーを意味する。図22から、MAb 163(中央に「163」と示すもの)は、C35タンパク質を免疫沈降させるが、IgG陰性対照抗体(右側に「陰性IgG」と示す)は免疫沈降を生じないことがわかる。
【０７０７】
実施例16
Mab 163の親和性の検討
図16に示すように、1:1の動態モデルを使用して、MAb 163のKAおよびKDを決定する実験を実施した。Biacoreを使用して親和性を測定するために、CM5チップ表面を、ヤギ抗ヒトIgG Fcをアミンカップリングで固定化して調製した。次に、モノクローナルヒト抗体MAb 163を、ヤギ抗ヒトIgGを含むチップ上に流すことによって捕捉した。次にrC35は、広範囲の濃度点および結合効率をカバーするために2つの別のシリーズに段階希釈した後に、結合状態のMAb 163を含むチップ上にC35を流した。結合は、一連のセンサーグラムに記録した。結合は、BIAevaluationソフトウェアを使用して評価した。KaおよびKdは、カーブフィッティング、およびMass Transferを補正して計算した。これらの実験から、MAb 163に関して以下の結果が得られた：(a)ka(1/Ms)＝2.84e5；(b)kd(1/s)＝9.59e-4；(c)KA(1/M)＝2.96e8；および(d)KD(nM)＝3.38。
【０７０８】
実施例17
Mab 163エピトープのマッピング
MAb 163のエピトープ特異性の局在を明らかにするために、大腸菌で6×Hisタグを用いて合成された組換えヒトC35(rhC35)を、Lys-Cエンドプロテイナーゼで消化した。この酵素は、タンパク質配列中のリシン(K)残基の後を切断する。試料を電気泳動で10ウェルの16%トリシンゲル(Invitrogen)で分離した。ヒト抗体と、これに続く西洋ワサビペルオキシダーゼに接合させたヤギ抗ヒト二次抗体のインキュベーションを使用するウェスタンブロッティングで、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)を色素源として検出を行った。全てのペプチドの検出には、クーマシーブルー染色を用いた。プロトコルの詳細については、前記の実施例11を参照されたい。
【０７０９】
図17から、Lys-Cエンドプロテアーゼによる6-His標識組換えヒトC35(rhC35)の部分消化後の推定ペプチド断片がわかる。11個の推定消化断片のそれぞれは、異なる形式の線で表し、これは図18および図19におけるウェスタンブロットの左側との比較からわかるように、同じ推定断片に対応する。
【０７１０】
図18は、クーマシーブルー染色および抗6-His染色による、Lys-CによるrhC35の消化後に観察されたペプチド断片を示す。比較のために、推定部分消化断片をブロットの左側に示す。これからわかるように、より短い推定断片(すなわち6〜11)は、ブロットにあまり転写されなかった。
【０７１１】
図19は、MAb 163が結合するC435エピトープを含む断片を同定する、クーマシーブルーおよび抗6-Hisブロットに対する、MAb 163染色のウェスタンブロットの比較を示す。比較のために、推定断片をブロットの左側に示す。推定断片1〜4に対応する、C35断片に対するMAb 163の結合は図19では認められるが、推定断片5〜11に対する結合は認められない。
【０７１２】
図20に示す結果から、MAb 163が、C35のアミノ酸残基48〜87内のエピトープに特異的なことがわかる(アミノ酸の位置のナンバリングは、天然のヒト配列のアミノ末端のメチオニンに対する)(図9参照)。この領域は、
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のアミノ酸配列を有する。
【０７１３】
実施例18
C35+/Her2+腫瘍細胞系列のインビトロにおける増殖を阻害するヒト抗C35 Mabまたはハーセプチン
図21に、C35陽性/Her2陰性の乳腺腫瘍細胞系列であるBT474細胞、およびC35陰性/Her2陰性の正常乳腺細胞系列であるH16N2細胞を使用して実施した細胞増殖アッセイ法の結果を示す。細胞は3連で播種し、一晩かけて吸着させた。細胞を90μMのキニジンによって24時間かけてG0に同期させた。洗浄して細胞をG0から解放させた後に、抗体を150μg/ml、または約1 Mの濃度で添加した。検討された全ての乳腺系列はCD20陰性であるため、リツキシマブ(ヒト抗CD20)を陰性抗体対照とした。ハーセプチン(抗Her2/neu)を、Her2陽性腫瘍細胞系列の陽性抗体対照として使用した。実験には、MAb 163、MAb 11(キメラ1B3)、およびMAb 76(キメラ1F2)の抗C35抗体を使用した。
【０７１４】
増殖を解析するために、アラマーブルー(Alamar blue)をさまざまな時点で添加した。アラマーブルーは、複数の代謝酵素の存在下で減じて色を変化させる。アラマーブルーは、MTTに類似のNADPH、FADH、FMNH、NADHによって減じさせることができるが、MTTとは異なり、シトクロムによっても減じさせることができる。アラマーブルーとの90分間のインキュベーション後に、530 nmにおける蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダー上で検出した。図21に示すデータは、抗体が添加されたか、または添加されなかった6日目のインビトロ培養物に由来するものである。
【０７１５】
増殖アッセイ法の結果から、ヒトの抗C35抗体またはハーセプチンが、C35陽性/Her2陽性の乳腺腫瘍細胞系列であるBT474の増殖を阻害するが、C35陰性/Her2陰性の正常乳腺細胞系列であるH16N2は阻害しないことがわかる。抗C35抗体の標的を生じるインビトロにおけるアポトーシスの自然発生的な誘導は低レベルであり、抗C35抗体の存在下における細胞増殖の低下に寄与するようである。インビトロにおける、この阻害作用に対する感受性は、インビボより大きいようである。というのは、個々の抗体が介在し、および特異性の組み合わせ、または化学療法(インビトロにおける広範囲の細胞死を誘導する)を必要としないからである。
【０７１６】
実施例19
2つのC35抗体とアドリアマイシンの併用による腫瘍成長の予防
図23および図24に示すように、ならびにこの実施例で説明するように、インビボにおける腫瘍の成長に対する作用に関して、2つのC35抗体と化学療法剤の併用を検討した。上記の実施例14と同様に、500万個のC35陽性MDA231腫瘍細胞を、スイスヌードマウスの乳腺脂肪体の皮下に移植した。6匹からなるマウス群にそれぞれ以下の処置を行った(移植から3日目に開始)。
1．処置なし(対照群)。
2．移植後の3日目および10日目における8 mg/kgのアドリアマイシンの静脈内投与。
3．移植後の3日目、7日目、10日目、13日目、17日目、20日目、および23日目における、20 mg/kgの1B3マウスモノクローナル抗体の静脈内投与、および1F2の20 mg/kgの静脈内投与。
4．移植後の3日目および10日目における8 mg/kgのアドリアマイシンの静脈内投与と、3日目、7日目、10日目、13日目、17日目、20日目、および23日目における40 mg/kgの1F2マウスモノクローナル抗体の静脈内投与。
5．移植後の3日目および10日目における8 mg/kgのアドリアマイシンの静脈内投与と、3日目、7日目、10日目、13日目、17日目、20日目、および23日目における40 mg/kgの1B2マウスモノクローナル抗体の静脈内投与。
6．移植後の3日目および10日目における8 mg/kgのアドリアマイシンの静脈内投与と、3日目、7日目、10日目、13日目、17日目、20日目、および23日目における20 mg/kgの1F2の静脈内投与および20 mg/kgの1B3の静脈内投与の併用(全抗体について40 mg/kg)。
7．移植後の3日目および10日目における8 mg/kgのアドリアマイシンの静脈内投与と、3日目、7日目、10日目、13日目、17日目、20日目、および23日目における40 mg/kgのモノクローナルアイソタイプ対照抗体の静脈内投与。
【０７１７】
上記の実施例14と同様に、移植後のさまざまな時点で、マウスの腫瘍容積の平均を測定した。図23および図24に示す結果から、用量8 mg/kgのアドリアマイシン(ドキソルビシン)と併用した、総用量が40 mg/kgのマウスのC35抗体1B3(用量20 mg/kg)および1F2(用量20 mg/kg)は、MDA231.C35腫瘍が移植されたマウスにおける腫瘍成長の予防に関して、総用量40 mg/kgの1B3および1F2、総用量40 mg/kgの1B3とアドリアマイシン、総用量40 mg/kgの1F2とアドリアマイシン、アドリアマイシン単独、IgGアイソタイプ抗体対照、または処置なしの場合より有効であることがわかった。移植後の18日目までに、1B3および1F2とアドリアマイシンの組み合わせのみが、腫瘍成長の予防に有効であった(図23および図24)。1F2および1B3とアドリアマイシンの組み合わせが投与されたマウスにおける腫瘍成長は、移植後の23日目における最終抗体投与後の1週間以内に再開した(図23および図24)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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