(57)【要約】  本発明は、固体支持体であって、少なくとも１つの認識モチーフに多価形式で結合することを可能にするか、又は少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示する少なくとも１つの分子骨格に結合された固体支持体、このような固体支持体を製造する方法、及び少なくとも１つの固体支持体を含んでなるチップ、特に糖チップに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体であって、少なくとも１つの認識モチーフに多価形式で結合することを可能にするか、又は少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示する少なくとも１つの分子骨格に結合された固体支持体。
【請求項２】
該分子骨格が少なくとも２つの面、特に２つの面を有していることを特徴とする、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
該分子骨格が、特に２つの面を画定するシクロペプチドであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の固体支持体。
【請求項４】
該分子骨格が、特に鎖（Ｌ）Ｐｒｏ−（Ｄ）ＡＡ、又は（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｌ）ＡＡによって形成された、少なくとも１つのベンドを有する、特に２つのベンドを有するシクロペプチドであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項５】
該分子骨格が、アミノ酸残基数１０又は１４のシクロペプチドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項６】
該分子骨格が、下記式（Ｉ）：
【化１】
2009527755.tif 000005
を有するシクロペプチドであり、
上記式中Ｙは、固体支持体との結合を形成する化学的存在物を表し、そしてＸ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はそれぞれ互いに独立して、少なくとも１つの認識モチーフに結合することを可能にする、又はこれに結合している、保護又はマスクされた又はされていない化学的存在物を表す
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項７】
該分子骨格が、その上面上にグラフトされたいくつかの認識モチーフを、特に同じモチーフを数回提示することを特徴とする、請求項２から６までのいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項８】
該分子骨格が、例えばエーテル、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、オキシム、ホスフェート、スルフェート、アルケン、アルキン、ヒドラジド、及びジスルフィド結合、及び特にオキシム結合のタイプの、少なくとも１つの共有結合によって、固体支持体に結合されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項９】
該分子骨格が、特に少なくとも１つのスペーサを介して、固体支持体に間接的に結合されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項１０】
該支持体が、板、特にウェル板、ビード、特にミクロビード、チャネル、特に毛管又はチャンバ、又はナノ構造、特にカーボンナノチューブの形態を成していることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項１１】
該支持体が、ガラス、ケイ素、半導体酸化物、例えば酸化ケイ素、プラスチック、金、金属酸化物、特に例えば酸化インジウム及び酸化錫、ゾル−ゲル、希土類、又は有機集合体、例えばカーボンナノチューブを含んでなることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項１２】
該認識モチーフは、糖、核酸、ペプチド、タンパク質、「混合」分子、特に糖ペプチド、糖タンパク質、リン脂質、及びこれらの混合物を含んでなる群から選択された、関心が持たれる分子、特に生物学的関心が持たれる分子であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項１３】
該認識モチーフが、少なくとも１つの共有結合、特にエーテル、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、オキシム、ホスフェート、アルケン、アルキン、ヒドラジド、及びジスルフィド結合、及び特にオキシム結合によって、該分子骨格に結合されていることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項１４】
該認識モチーフが該分子骨格に間接的に結合されていることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項１５】
少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示することを可能にするか、又は提示する少なくとも１つの分子骨格を含んでなる固体支持体を製造する方法であって、認識モチーフを多価形式で提示することを可能にするか、又は提示する少なくとも１つの分子骨格を固体支持体上にグラフトすることから成る工程を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項１６】
該固体支持体が、少なくとも１つのアルデヒド官能基、又はオキシアミン結合を含んでなることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該分子骨格が、固体支持体上に存在する少なくとも１つの官能基と反応することができる少なくとも１つのアルデヒド又はオキシアミン結合を含んでなることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
該固体支持体が、オキシム結合を介して分子骨格に結合されることを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該分子骨格によって担持された少なくとも１つの反応性官能基が、特にセリン残基によって、保護又はマスクされることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該分子骨格によって担持された少なくとも１つの反応性官能基が、保護部除去されるか又は再生され、そして特に少なくとも１つのセリン残基が酸化されることによりグリオキシル酸アルデヒドになることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの認識モチーフが、前記分子骨格の少なくとも１つの反応性官能基との反応によって、該分子骨格上にグラフトされることを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該認識モチーフは、関心が持たれる分子、特に生物学的関心が持たれる分子、特に糖、核酸、ペプチド、タンパク質、別の有機分子、又はこれらの混合物、特に糖ペプチド、糖タンパク質、リン脂質の中から選択されることを特徴とする、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該認識モチーフが、オキシム結合を形成するために、該分子骨格によって担持された少なくとも１つのアルデヒド又はオキシアミン官能基と、特にグリオキシル酸アルデヒド基と反応する少なくとも１つのオキシアミン又はアルデヒド官能基を担持することを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの固体支持体、又は請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法によって得られる少なくとも１つの固体支持体を含んでなるチップ、特に糖チップ。
【請求項２５】
表面を官能化するための、少なくとも１つの認識モチーフに多価形式で結合することを可能にするか、又は少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示する分子骨格の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体上の認識モチーフの固定化に関する。固体支持体上の分子の固定化は特に、生体分子チップ、特に糖チップの製造を可能にすることができる。これらは特に、検出、分析、又はスクリーニング法において有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
固体支持体上に分子を固定する数多くの方法が知られている。これらは２つのグループに分類することができる：
−  特に疎水性の水素結合又はイオン結合タイプの非共有結合相互作用を介して、分子を表面上に吸着することから成る非共有結合固定化法。使用される表面は、ニトロセルロース又はポリスチレン樹脂が塗布されたガラスであってよい。
−  分子と支持体との間に共有結合を形成するために、固体支持体上に存在する官能基と、分子上に存在する官能基とを反応させることから成る共有結合固定化法。
【０００３】
固体支持体上に分子を固定化するこれらの方法は、当該認識モチーフ、特に糖の認識に関与する分子の高速分析を可能にする「認識モチーフ・チップ」を製造するために用いることができる。タンパク質の高速分析を可能にする「糖チップ」を一例として挙げることができる。コンベンショナルな方法によって得られる「認識モチーフ・チップ」は、或る特定の分子、例えば低親和性タンパク質に関する検出レベルが不十分であるおそれがある。例えば、レクチンに関する或る糖チップの事例を挙げることができる。
【０００４】
従って、これらの認識モチーフとこれらを認識する構造との親和力が改善された、認識モチーフを提示する固定支持体が必要である。
認識モチーフを認識する構造は、分子又は化合物の部分、分子又は化合物、或いは、これらの分子、化合物、又は分子又は化合物の部分を含んでなる超構造、特にターゲット分子又は化合物であることが可能である。これらの超構造は、例えば細胞又は微生物、例えばバクテリア又はウィルスであることが可能である。
【０００５】
このようにして、本発明者は、認識モチーフが特定の分子骨格を介してその上に固定される固体支持体が、或る特定の構造、例えばターゲット分子又は化合物の検知閾値を改善するのを可能にすることができることを発見した。
【発明の開示】
【０００６】
従って、第１の観点によれば、本発明の対象は、固体支持体であって、少なくとも１つの認識モチーフに多価形式で結合することを可能にするか、又は少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示する少なくとも１つの分子骨格に結合された固体支持体である。
本発明の意味において、「分子骨格」は、一方では固体支持体に結合することができ、そして他方では、特に共有結合の形で、少なくとも１つの認識モチーフに結合することができる分子を意味する。
【０００７】
本発明の意味において、「多価形式で結合」は、それぞれが、少なくとも１つの認識モチーフに結合されたいくつかの結合を意味する。
本発明の意味において、分子骨格が「多価形式で結合」されているとは、分子骨格が、いくつかの認識モチーフに、具体的には同じ認識モチーフに数回にわたって、具体的にはいくつかの結合を介して結合されていることを意味する。
【０００８】
より具体的には、各認識モチーフは、結合によって分子骨格に結合されている。
本発明の意味において、「認識モチーフ」とは、少なくとも１つの他の分子又は化合物、或いは分子又は化合物の一部によって認識することができる、又はこれらと複合体を形成することができる任意のタイプの分子又は化合物を意味する。化合物のうちでは、下記のものをより具体的に挙げることができる：細胞上又は細胞内に存在する受容体、タンパク質、酵素、及び分子。
【０００９】
具体的には、この固体支持体又はチップは、具体的には認識モチーフとの親和性を有する化合物又は存在物に対する優れた検知閾値、より具体的には、前記支持体又はチップによって検出することができる、又は検出されるべき化合物又は物質に関連する優れた検知閾値を有する。
【００１０】
この検知閾値は、１ｍＭ以下、具体的には０．５ｍＭ以下、特に０．２ｍＭ以下、より具体的には０．１ｍＭ以下、おそらく実際には０．０８ｍＭ以下、又はさらに０．０５ｍＭ以下、おそらく実際にさらにより具体的には０．０１ｍＭ以下であることが可能である。
【００１１】
この検知閾値はまた、検出されるべき化合物又は存在物が内在する溶液又は懸濁液としての組成物の容積に対する、検出されるべき化合物又は存在物の重量として、１０００マイクログラム／ｍｌ以下、具体的には５００マイクログラム／ｍｌ以下、特に２００マイクログラム／ｍｌ以下、より具体的には１００マイクログラム／ｍｌ以下、おそらく実際には５０マイクログラム／ｍｌ以下、又はさらに２０マイクログラム／ｍｌ以下、おそらく実際にさらにより具体的には１０マイクログラム／ｍｌ以下であることが可能である。
【００１２】
図１は、例１において得られた板を示す概略図である。
図２は、例２において得られた、ラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンによる直接標識付けを示す写真である。
図３は、Ｎ−アセチルガラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンによる直接標識付けを示す写真である。
図４は、例４において得られた板を示す概略図である。
図５は、Ｎ−アセチルガラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンによる標識付け後、スキャナーを使用して例４で得られた板を示す写真である。
図６は、分子骨格によるガラス板の官能化、酸化、リガンド（それぞれＮ−アセチルガラクトース及びマンノース）の堆積、次いで標識付けによる視角化を示す図である。
【００１３】
分子骨格は、認識モチーフとのいくつかの結合を有することができ；分子骨格は具体的には、いくつかの同一の認識モチーフと、或いは、いくつかの異なる認識モチーフと数回にわたって結合することができる。
【００１４】
少なくとも１つの認識モチーフに多価形式で結合された分子骨格を、下記：
【化１】
2009527755.tif 000002
のように示すことができ、
【００１５】
上記式中、ＣＭは分子骨格を表し、そしてＭＲ1、ＭＲ2、ＭＲ3．．．、ＭＲnはそれぞれ同一又は異なる認識モチーフを表し、ｎは、１よりも大きい、特に２以上、具体的には３以上、おそらく実際には４以上であり、且つ特に３２以下、具体的には２４以下、より具体的には１６以下、おそらく実際には８以下である整数を表す。
【００１６】
多価グラフトは、分子骨格と固体支持体との間のリンク又は結合の数に対する、分子骨格と認識モチーフとの間のリンク又は結合の数の比によって定義することもできる。この場合、この比は１よりも大きく、特に２以上、具体的には３以上、おそらく実際には４以上である。
【００１７】
具体的な実施態様によれば、分子骨格は少なくとも２つの面、特に２つの面を有している。より具体的には、この分子骨格は、特に２つの面、すなわち上面と下面とを画定するシクロペプチドであることが可能である。
分子骨格は、その上面上にグラフトされたいくつかの認識モチーフを提示することができ、特に数回、同じ又は異なる認識モチーフがそれぞれ１回又は２回以上にわたってグラフトされる。
【００１８】
固体支持体は分子骨格に、特にその下面によって、具体的には少なくとも１つの共有結合によって、より具体的にはオキシム結合によって結合されている。
本発明において使用することができる分子骨格のうちでは、国際公開第２００４／０２６８９４号パンフレットに記載されたものを挙げることができる。
【００１９】
分子骨格は、５、１０又は１４個のアミノ酸残基、特にシクロデカペプチドを形成する１０個のアミノ酸から形成されたシクロペプチドであることが可能である。このシクロペプチドは、少なくとも１つのベンド、特に鎖（Ｌ）Ｐｒｏ−（Ｄ）ＡＡ、又は（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｌ）ＡＡを形成するために特に２つのベンドを有することができる。このシクロペプチドは中心対称性を有することもできる。
【００２０】
シクロペプチドは、１０個又は１４個のアミノ酸残基を有し、そして２つのベンドを形成することができ、それぞれのベンドは、（Ｌ）Ｐｒｏ−（Ｄ）ＡＡ、又は（Ｄ）Ｐｒｏ−（Ｌ）ＡＡの組み合わせによって形成され、ＡＡはアミノ酸であり、そして好ましくはグリシンであり、これら２つのベンドは、３つ及び／又は５つのアミノ酸残基によって分離されている。
【００２１】
頭文字ＡＡによって上に表されたベンドのアミノ酸残基は、プロリン以外の、そして対向する立体化学的配置を有するアミノ酸残基であってよく、この残基は具体的にはグリシン残基であってよい。
【００２２】
ベンドは、アミノ酸残基によって、特に奇数のアミノ酸残基によって、そして具体的には、シクロデカペプチドの場合には３つのアミノ酸、及び／又はシクロテトラデカペプチドの場合には５つのアミノ酸によって分離されている。
【００２３】
３つ及び／又は５つのアミノ酸残基はそれぞれ、保護基によって直角方向に保護された化学官能基を有することができる。これらのアミノ酸の側鎖の保護基は、前記骨格の正中面の各側を交互に延びており、そしてこの平面に対していわゆる下面及び上面を画定する。
【００２４】
具体的には、分子骨格は、下記式（Ｉ）：
【化２】
2009527755.tif 000003
を有するシクロデカペプチドであり、
上記式中Ｙは、固体支持体との結合を形成する化学的存在物を表し、そしてＸ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はそれぞれ互いに独立して、少なくとも１つの認識モチーフに結合することを可能にする、又はこれに結合している、保護又はマスクされた又はされていない化学的存在物を表す。
【００２５】
「保護された化学的存在物」は、保護基を担持する化学的存在物を意味する。これらの基は、当業者に従来より知られており、そして参考文献、特に“Protective Groups in Organic Synthesis」（T.W. Green, P.G.M. Wuts著、Wiley Interscience, New York, 1999）に記載されている。
【００２６】
「マスクされた化学的存在物」は、前記化学的存在物を隠すことを可能にする基又は残基を担持する化学的存在物を意味する。このような残基は、アミノ酸残基、例えばセリン残基であってよい。
【００２７】
より具体的には、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、及びＹは、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びヒドラジド官能基を含んでなる基から選択された少なくとも１つの官能基、具体的にはアルデヒド及びオキシアミンを担持する物質を表すことができる。
固体支持体は特に、板、特にウェル板、ビード、特に多孔質体、特にミクロビード、チャネル、特に毛管又はチャンバ、例えば、ミクロ構造表面を有するミクロ成分を構成する閉じた空洞、又はナノ構造、特にカーボンナノチューブの形態を成すことができる。
【００２８】
固体支持体は特に、ガラス、ケイ素、半導体酸化物、例えば酸化ケイ素、プラスチック、金、金属酸化物、特に例えば酸化インジウム及び酸化錫、ゾル−ゲル、希土類、及び有機（炭素系）集合体、例えばカーボンナノチューブを含んでなる群から選択された少なくとも１種の材料を含んでなるか、又はこのような材料から成ることができる。
固体支持体は分子骨格に直接的又は間接的に結合することができる。
【００２９】
「間接的に結合」とは、スペーサが前記物質のそれぞれに結合されていること、さもなければ、結合が少なくとも１つのスペースを介して形成されていることを意味する。
スペーサは、これが付着されるべき物質と結合することができるいかなるタイプの分子であってもよい。具体的には、スペーサは、１〜２０個の原子、特に２〜１５個の原子、具体的には４〜１０個の原子によって２つの物質を分離する分子であることが可能である。より具体的には、スペーサは、場合によっては少なくとも１つのヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、窒素、又はリンを含む炭素質主鎖を有している。
【００３０】
分子骨格は、少なくとも１つの結合、特に共有結合によって固体支持体に結合されており、この分子骨格は、例えばエーテル、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、オキシム、ホスフェート、アルケン、アルキン、ヒドラジド、及びジスルフィド結合を含んでなる群から選択することができる。
【００３１】
具体的に実施態様によれば、固体支持体は、オキシム結合を介して分子骨格に結合されている。
認識モチーフは種々異なるタイプであってよく、本発明に基づいて使用可能な認識モチーフのうち、関心が持たれる分子、特に生物学的関心が持たれる分子を挙げることができる。
【００３２】
認識モチーフのうち、下記のものを挙げることができる：糖、具体的には単糖又はオリゴ糖、核酸、ペプチド、タンパク質、並びに「混合」分子、例えば糖ペプチド、糖タンパク質、又はリン脂質、又は有機分子、具体的には治療又は診断上、関心が持たれる有機分子、及びこれらの混合物を含んでなる群から選択された分子。
【００３３】
単糖、及び具体的にはオリゴ糖を含んでなる単糖又はオリゴ糖内に含まれる単糖のうち、下記のものを挙げることができる：グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、フコース、グルコサミン、ガラクトースアミン、マンノースアミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｎ−アセチルマンノースアミン、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、及び３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸。
【００３４】
認識モチーフは、分子骨格に直接的又は間接的に結合することができる。
認識モチーフは、少なくとも１つの共有結合によって、分子骨格に結合することができ、これは、エーテル、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、オキシム、ホスフェート、アルケン、アルキン、ヒドラジド、及びジスルフィド結合の中から選択することができる。
【００３５】
具体的な実施態様によれば、認識モチーフは、オキシム結合を介して分子骨格に結合されている。
本発明の別の観点によれば、本発明の別の対象は、少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示することを可能にするか、又は提示する少なくとも１つの分子骨格を含んでなる固体支持体を製造する方法であって、少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示することを可能にするか、又は提示する少なくとも１つの分子骨格を固体支持体上にグラフトすることから成る工程を少なくとも含んでなる、方法である。
本発明の意味において、「グラフトされる」とは、特に共有結合タイプの結合が、２つの化学的存在物の間に形成されることを意味する。
【００３６】
第１の実施態様によれば、分子骨格／認識モチーフを含んでなる複合体が、固体支持体上にグラフトされる。
この方策は、分子骨格／認識モチーフ、具体的には分子骨格／糖を含んでなる複合体を個々に合成・精製し、次いで、これらを固体支持体上にグラフトすることから成る。
分子骨格によって担持された官能基と、認識モチーフによって担持された官能基とを縮合することから生じる化学結合により、分子骨格上に認識モチーフをグラフトすることができる。認識モチーフを分子骨格上にグラフトするのを可能にする結合のうち、下記のものを挙げることができる：アミド、エステル、エーテル、アミン、オキシム、ホスフェート、アルケン、アルキン、ヒドラジド、及びジスルフィド結合。
【００３７】
変更形によれば、分子骨格は、固体支持体上に存在する少なくとも１つの官能基と反応することができる少なくとも１つのアルデヒド又はオキシアミン結合を含んでなる。
分子骨格がアミノ酸残基を含んでなる場合、具体的には認識モチーフが糖である事例では、オキシアミンの化学特性を用いて、分子骨格上に認識モチーフをグラフトすることができる。この場合、分子骨格はカルボニル含有誘導基（アルデヒド又はケトン）を担持することができ、そして糖は、アノマー位置に関してオキシアミン（−ＯＮＨ2）官能基によって改質することができ、或いはその逆に、糖は、特にその還元末端上にカルボニル含有官能基を担持することができ、そして分子骨格はオキシアミン（−ＯＮＨ2）官能基を担持することができる。
【００３８】
より具体的には、分子骨格によって担持された少なくとも１つの反応性官能基が、特にセリン残基によって、保護又はマスクされている。
反応性官能基、すなわち認識モチーフと反応するように意図された官能基が保護又はマスクされる場合、反応性官能基を解放するために保護部除去又は再生の工程を行うことが必要である。
【００３９】
例えば、分子骨格の上面が１つ又は２つ以上のセリンを担持する場合、これらは、グリオキシル酸アルデヒド（−ＣＯ−ＣＨＯ）官能基を得るように、特に過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化することができる。
保護部除去工程の終了時に、次いで分子骨格上に認識モチーフをグラフトすることが可能である。
【００４０】
認識モチーフは具体的には、オキシム結合を形成するために、分子骨格のアルデヒド官能基と反応することができるオキシアミンを担持する糖であることが可能である。
１変更形によれば、認識モチーフは、スペーサを介して分子骨格上にグラフトすることができる。
【００４１】
可能なグラフトのタイプのうち、固体支持体上に存在するアルデヒド官能基と、分子骨格の下面上に存在するオキシアミン官能基との反応を挙げることができる。一般に、この反応は効率的且つ選択的であり、そしてオキシム結合を形成させる。
こうして、より具体的には、固体支持体はオキシム結合を介して、分子骨格に結合される。
【００４２】
認識モチーフを担持する分子骨格を固体支持体上にグラフトする工程は、ほぼ１ｍＭのスポット直径を提供するように手作業で、或いはスポットのサイズを例えば１８０μｍに低減するのを可能にするプログラミング可能な制御装置を使用して、分子骨格／認識モチーフ分子を含んでなる溶液の液滴を堆積させることによって実施することができる。
【００４３】
別の実施態様によれば、分子骨格が固体支持体上にグラフトされ、そして認識モチーフは次に分子骨格上にグラフトされる。
認識モチーフの多価提示を可能にする固体支持体を製造するこの方法は、少なくとも下記工程、すなわち：
−  固体支持体上に分子骨格をグラフトし；
−  分子骨格に認識モチーフをグラフトする
ことから成る工程を含んでなることができる。
この方法は、下記工程、すなわち：
分子骨格と反応しておらず、そして後続の工程を妨害する可能性のある、固体支持体の反応性官能基をマスク及び／又は保護し；そして
認識モチーフと反応するように意図された、分子骨格の反応性官能基から保護部を除去する
ことから成る工程のうちの少なくとも少なくとも１つを含んでなることもできる。
【００４４】
この実施態様は、単一の分子骨格を使用して極めて多様な認識モチーフを提示する支持体の製造を可能にすることができるので、特に有利である。
この場合、認識モチーフ、例えば分子骨格の上面上に存在する認識モチーフと反応するように意図された官能基は、これらの性質により、又はこれらが保護又はマスクされているため、固体支持体上に存在する官能基と反応しない。
【００４５】
固体支持体上の分子骨格の固定化は、固体支持体によって担持された官能基と、分子骨格によって担持された、具体的には分子骨格の下面上に配置された少なくとも１つの官能基とを反応させることによって、行うことができる。より具体的には、固体支持体によって担持された官能基は、アルデヒド官能基であり、そして分子骨格によって担持された官能基は、オキシム結合を形成させるオキシアミンである。
【００４６】
グラフト工程は、分子骨格を含んでなる溶液を固体支持体上に堆積させることによって行うことができる。堆積は、この支持体の表面全体にわたって、又は或る特定の場所だけで行うことができる。
【００４７】
この分子骨格グラフト工程に続いて、分子骨格と反応していない、固体支持体の反応性官能基をマスクするのを可能にする工程を、例えば反応していないアルデヒド官能基をマスクするために固体支持体をヒドロキシルアミン溶液と接触させることによって、行うことができる。
【００４８】
１変更形によれば、前記分子骨格の少なくとも１つの反応性官能基との反応によって、分子骨格上に少なくとも１つの認識モチーフがグラフトされる。
本発明による方法は、認識モチーフを特異的には認識しないタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を吸収することから成ることができる飽和工程を含んでなっていてもよい。この工程は特に、例えば被検出タンパク質による認識モチーフの認識ステップ中に表面上にタンパク質又はターゲットが非特異的に吸収されるのを回避することを可能にすることができる。この飽和工程は、バックグラウンド・ノイズを低減するのを可能にすることができる。
【００４９】
本発明の別の観点によれば、本発明のさらに別の対象は、上記少なくとも１つの固体支持体、又は上記方法によって得られる少なくとも１つの固体支持体を含んでなるチップである。
【００５０】
チップは具体的には、特に糖の認識に関与するタンパク質の高速分析において主な重要性を有する糖チップであることが可能である。認識モチーフとして作用することができる残基のうち、下記のものを挙げることができる：多くの病理、例えば癌（糖に基づく腫瘍マーカーの存在）、ＡＩＤＳ、又は、場合によっては認識モチーフ、例えば受容体をサッカリド・モチーフとともに表面に提示する病原体又はバクテリア性因子による攻撃から生じるその他の病理に関与する配糖体残基を挙げることができる。
【００５１】
これらのチップを使用して生体液中の抗原、バクテリア、及びウィルスを探索することを考えることもできる。
本発明は、水又は空気中の病原体の検出という脈絡の中で用いることもできる。
本発明は、高速スクリーニングという脈絡の中で、糖の認識に基づいて細胞受容体のアンタゴニスト又はアゴニストを認識することを通して医薬を発見する上で利用することもできる。
【００５２】
天然の糖、また合成の糖に関しても、その特異性及び親和性を研究するために、本発明を利用することもできる。生物内部の認識に関与する細胞及び／又はタンパク質のタイプの特定、及び糖の構造との相関も考えられる。
【００５３】
本発明はまた、具体的には糖を用いて表面を官能化するために、少なくとも１つの認識モチーフに多価形式で結合することを可能にするか、又は少なくとも１つの認識モチーフを多価形式で提示する分子骨格を使用することに関する。
以下の例は、説明のために提供するものであり、いかなる状況においても、本発明の限定をもたらすことはできない。
【実施例】
【００５４】
例
例１：レクチンの検出を可能にするチップの調製
下記のものを調製した：
−  下記式（ＩＩ）：
【化３】
2009527755.tif 000004
（上記式中Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はそれぞれ、−ＮＨＣＯＣＨ＝ＮＯＲを表し、Ｒはラクトースを表し、そしてＺは−ＮＨＣＯＣＨ2ＯＮＨ2を表す）
を有する３０μＭの化合物（Ａ）を含んでなる水溶液（Ａ）；
−  ３０μＭのＲ−ＯＮＨ2（Ｒはラクトースを表す）を含んでなる水溶液（Ｂ）；
−  上記式（ＩＩ）（Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はそれぞれ、−ＮＨＣＯＣＨ＝ＮＯＲを表し、Ｒは−Ｎ−アセチルガラクトースを表し、そしてＺは−ＮＨＣＯＣＨ2ＯＮＨ2を表す）を有する３０μＭの化合物（Ｃ）を含んでなる水溶液（Ｃ）；及び
３０μＭのＲ−ＯＮＨ2（Ｒは−Ｎ−アセチルガラクトースを表す）を含んでなる水溶液（Ｄ）。
【００５５】
これらの組成物それぞれの液滴を手作業で、又はロボット（例えば、圧電ピペット、例えばPackard Instrument BioChip Arrayer 1を備えている）によって、例えば書類ＥＮ  ００１６９４０に記載された方法に従って製造された、アルデヒドによって官能化されたガラス板の一部の上に堆積させる。
得られた板を図１に概略的に示す：
−  ラインＡは、溶液（Ａ）で得られたスポットを表し；
−  ラインＢは、溶液（Ｂ）で得られたスポットを表し；
−  ラインＣは、溶液（Ｃ）で得られたスポットを表し；
−  ラインＤは、溶液（Ｄ）で得られたスポットを表す。
【００５６】
例２：例１から得られたチップによる、ラクトース特異的なＦＩＴＣ−レクチンの検出
次に、例１から得られたチップの直接標識付けを、ラクトース特異的なＦＩＴＣ−レクチンで実施する。多価形式、この場合には四価形式でラクトース認識モチーフを提示するチップの部分による前記レクチンの特異的検出を次いで観察する。結果を図２に示す。
図２から判るように、４つのラクトース・モチーフを担持する分子骨格によって得られたスポットだけが、３０μＭのラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンを検出する。
【００５７】
例３：例１から得られたチップによる、Ｎ−アセチルガラクトース特異的なＦＩＴＣ−レクチンの検出
例１から得られたチップの直接標識付けを、Ｎ−アセチルガラクトース特異的なＦＩＴＣ−レクチンで実施する。多価形式、この場合には四価形式でＮ−アセチルガラクトース認識モチーフを提示する板の部分による前記レクチンの特異的検出を次いで観察する。結果を図３に示す。
【００５８】
図３から判るように、４つのＮ−アセチルガラクトース・モチーフを担持する分子骨格によって得られたスポットだけが、３０μＭのＮ−アセチルガラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンを検出する。
【００５９】
例４：分子骨格、次いで認識モチーフがグラフトされた固体支持体の調製
式（ＩＩ）（Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はそれぞれ、セリン残基を表し、そしてＺは−ＮＨＣＯＣＨ2ＯＮＨ2を表す）と一致する５０μＭの分子骨格（Ｅ）を含んでなる水溶液（Ｅ）を調製する。
アルデヒド基を担持するガラス板を、分子骨格溶液（Ｅ）中にこれを浸すことにより官能化する。
次いで、ヒドロキシルアミンと反応していない、ガラス板のアルデヒド官能基を、前記板を１０ｍＭヒドロキシルアミン溶液中に浸すことにより反応させることから成る、いわゆる飽和工程を実施する。
【００６０】
次いで、板を１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム溶液中に６０分間にわたって浸すことにより、セリンを酸化することによってアルデヒドにする。
次いで、−Ｏ−ＮＨ2官能基を担持するＮ−アセチルガラクトース溶液の液滴をアノマー炭素上に堆積させる。
次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液による飽和工程を行う。
得られた板を図４に概略的に示す。
最後に、Ｎ−アセチルガラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンで標識付けすることにより、視角化を行い、そしてスキャナーを通過させた。その結果を図５に示す。
図５から判るように、上記のように得られた４つのＮ−アセチルガラクトース・モチーフを担持する分子骨格によって得られたスポットが、３０μＭのＮ−アセチルガラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンの検出を可能にする。
【００６１】
例５：分子骨格、次いで認識モチーフがグラフトされた固体支持体の調製
式（ＩＩ）（Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はそれぞれ、セリン残基を表し、そしてＺは−ＮＨＣＯＣＨ2ＯＮＨ2を表す）と一致する５０μＭの分子骨格（Ｅ）を含んでなる水溶液（Ｅ）を調製する。
アルデヒド基を担持するガラス板を、分子骨格溶液（Ｅ）中にこれを浸すことにより官能化する。
次いで、ヒドロキシルアミンと反応していない、ガラス板のアルデヒド官能基を、前記板を１０ｍＭヒドロキシルアミン溶液中に浸すことにより反応させることから成る、いわゆる飽和工程を実施する。
【００６２】
次いで、板を１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム溶液中に６０分間にわたって浸すことにより、セリンを酸化することによってアルデヒドにする。
次いで、−Ｏ−ＮＨ2官能基を担持するＮ−アセチルガラクトース又はマンノースの５０μＭの溶液の液滴をアノマー炭素上に堆積させる。これを３０分間にわたって水とともにインキュベートさせておき、次いで、０．２％  ＳＤＳ、次いで再び水で洗浄する。
次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液による飽和工程を行う。
最後に、間接標識付けによって視角化を行う。すなわち、Ｎ−アセチルガラクトース又はマンノース（濃度１０μｇ／ｍＬ）に対して特異的なレクチンの溶液中に板を浸すと共に、ストレプトアビジンＣｙ３を使用して視角化を行い、そしてスキャナーを通過させた。その結果を図６に示す。
【００６３】
図６から判るように、上記のように得られた４つのＮ−アセチルガラクトース・モチーフを担持する分子骨格によって得られたスポットが、Ｎ−アセチルガラクトースに対して特異的な対応レクチンの検出を可能にし、そして上記のように得られた４つのマンノース・モチーフを担持する分子骨格が、５０μＭのマンノースに対して特異的な対応レクチンの検出を可能にする。さらに、良好な認識選択性が観察される。その理由は、上記のように得られる４つのＮ−アセチルガラクトース・モチーフを担持する分子骨格を用いた場合、マンノースに対して特異的な対応レクチンによる信号はなく、また、上記のように得られる４つのマンノース・モチーフを担持する分子骨格を用いた場合、Ｎ−アセチルガラクトースに対して特異的な対応レクチンによる信号はないからである。
【００６４】
より正確には、図６は以下のものを示す：
−ステップ１：分子骨格（Ｅ）によるガラス板の官能化、次いでＮＨ2ＯＨによる飽和；
−ステップ２：セリン残基の、アルデヒドへの酸化；
−ステップ３：−Ｏ−ＮＨ2官能基を担持するＮ−アセチルガラクトース（ライン１）又はマンノース（ライン２）の５０μＭ溶液の液滴の堆積；
−ステップ４：間接標識付けによる視角化、ライン１はＮ−アセチルガラクトースに対して特異的なビオチン化レクチン、次いでストレプトアビジンＣｙ３、そしてライン２はマンノースに対して特異的なビオチン化レクチン、次いでストレプトアビジンＣｙ３（濃度１０μｇ／ｍｌ）。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、例１において得られた板を示す概略図である。
【図２】図２は、例２において得られた、ラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンによる直接標識付けを示す写真である。
【図３】図３は、Ｎ−アセチルガラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンによる直接標識付けを示す写真である。
【図４】図４は、例４において得られた板を示す概略図である。
【図５】図５は、Ｎ−アセチルガラクトースに対して特異的なＦＩＴＣ−レクチンによる標識付け後、スキャナーを使用して例４で得られた板を示す写真である。
【図６】図６は、分子骨格によるガラス板の官能化、酸化、リガンド（それぞれＮ−アセチルガラクトース及びマンノース）の堆積、次いで標識付けによる視角化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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