(57)【要約】細胞傷害性Ｔ細胞免疫反応を引き起こすことができるＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含む、樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏプライミング用の癌ワクチン及び組成物を提供する。特に、ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ、ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ、ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ、ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ及びＳＡＰＤＴＹＰＡＬを含むＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌予防及び／又は治療用ワクチンであって、前記ワクチンは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含み、対象への投与において、ムチン１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発することを特徴とするワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記の少なくとも１種のＨＬＡクラス蛋白質結合ヘルパー分子が、２種もしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質タイプもしくはハプロタイプへ結合していることを特徴とするワクチン。
【請求項３】
請求項１もしくは２に記載のワクチンにおいて、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、マウス及び／又はヒトに生来存在するが、１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が組み込まれる程度に修飾されたアミノ酸配列に相当するものを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項４】
請求項３に記載のワクチンにおいて、前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が、関連する野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープの１つもしくはそれ以上の非アンカー残基位置に位置していることを特徴とするワクチン。
【請求項５】
請求項３に記載のワクチンにおいて、前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が、１もしくはそれ以上の非アンカー残基位置及び、１もしくはそれ以上のアンカー残基位置に位置していることを特徴とするワクチン。
【請求項６】
請求項３から５のいずれかに記載のワクチンにおいて、前記ペプチドが９アミノ酸長であることを特徴とするワクチン。
【請求項７】
請求項３から６のいずれかに記載のワクチンにおいて、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドが、
（ｉ）ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:５）；及び
（ｉｉ）ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８）
から選択されるマウス及び／又はヒト野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープに由来することを特徴とするワクチン。
【請求項８】
請求項３から５のいずれかに記載のワクチンにおいて、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドが、下記の一般式（Ｉ）で表されることを特徴とするワクチン。
（Ｉ）  Ｘａ−Ｘ１−ＴＡＰＰ−Ｘ６−ＨＧ−Ｘ９−Ｘｂ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（式中、Ｘａは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列であり、
Ｘ１はＳｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）から選択され、
Ｘ６は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）から選択され、
Ｘ９は欠失しているか、もしくは、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｌａ（Ａ）及びＮｌｅから選択され、
Ｘｂは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列である。）
【請求項９】
請求項８に記載のワクチンにおいて、Ｘａは欠失し、Ｘ１はＳ及びＴから選択され、Ｘ６はＡ及びＶから選択され、Ｘ９はＶ及びＬから選択され、Ｘｂは欠失していることを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
請求項３から７のいずれかに記載のワクチンにおいて、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドが、次のアミノ酸配列の１つから成ることを特徴とするワクチン。
（ｉ）  ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６）；
（ｉｉ）  ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０）；
（ｉｉｉ）  ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１）；
（ｉｖ）  ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２）；及び、
（ｖ）  ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１３）
【請求項１１】
請求項１もしくは２に記載のワクチンにおいて、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドの類似体であることを特徴とするワクチン。
（Ｉ）  Ｘａ−Ｘ１−ＴＡＰＰ−Ｘ６−ＨＧ−Ｘ９−Ｘｂ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（式中、Ｘａは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列であり、
Ｘ１はＳｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）から選択され、
Ｘ６は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）から選択され、
Ｘ９は欠失しているか、もしくは、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｌａ（Ａ）及びＮｌｅから選択され、
Ｘｂは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列である。）
【請求項１２】
請求項１もしくは２に記載のワクチンにおいて、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、次のアミノ酸配列の１つから成るペプチドの類似体であることを特徴とするワクチン。
（ｉ）  ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６）；
（ｉｉ）  ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０）；
（ｉｉｉ）  ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１）；
（ｉｖ）  ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２）；及び、
（ｖ）  ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１３）
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載のワクチンにおいて、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に共役することを特徴とするワクチン。
【請求項１４】
請求項１３に記載のワクチンにおいて、前記の少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子が、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド、ＰＡＤＲＥペプチド、及びそれらの組合せから成る群から選択されることを特徴とするワクチン。
【請求項１５】
請求項１４に記載のワクチンにおいて、前記の少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子が、ＫＬＨであることを特徴とするワクチン。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載のワクチンにおいて、さらに、医薬として許容される担体を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１７】
請求項１６に記載のワクチンにおいて、前記の医薬として許容される担体が、マンナン、酸化マンナン、部分酸化マンナン、還元マンナン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ＴＡＴ蛋白質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来ＶＰ２２蛋白質、両親媒性ペプチドＰｅｐ−１、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子の６０アミノ酸ＤＮＡ結合ドメイン、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、細胞内移送に関与するアンテナペディアの１６アミノ酸領域、及びその他の受容体介在の担体分子から成る群から選択される担体分子であることを特徴とするワクチン。
【請求項１８】
請求項１７に記載のワクチンにおいて、前記担体分子が酸化マンナンであることを特徴とするワクチン。
【請求項１９】
対象における癌予防及び／又は治療方法であって、前記方法が、請求項１から１８のいずれかに記載のワクチンを前記対象に有効量投与する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
樹状細胞（ＤＣｓ）のｅｘ  ｖｉｖｏプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）用組成物であって、前記組成物が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物において、前記の少なくとも１種のＨＬＡクラス蛋白質結合ヘルパー分子が、２種もしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質タイプもしくはハプロタイプへ結合していることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項２０もしくは２１に記載の組成物において、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、マウス及び／又はヒトに生来存在するが、１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が組み込まれる程度に修飾されたアミノ酸配列に相当するものを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物において、前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が、関連する野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープの１つもしくはそれ以上の非アンカー残基位置に位置していることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の組成物において、前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が、１もしくはそれ以上の非アンカー残基位置及び、１もしくはそれ以上のアンカー残基位置に位置していることを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項２２から２４のいずれかに記載の組成物において、前記ペプチドが９アミノ酸長であることを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求項２２から２５のいずれかに記載の組成物において、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドが、
（ｉ）  ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:５）；及び
（ｉｉ）  ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８）
から選択されるマウス及び／又はヒト野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープに由来することを特徴とする組成物。
【請求項２７】
請求項２２から２４のいずれかに記載の組成物において、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドが、下記の一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする組成物。
（Ｉ）  Ｘａ−Ｘ１−ＴＡＰＰ−Ｘ６−ＨＧ−Ｘ９−Ｘｂ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（式中、Ｘａは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列であり、
Ｘ１はＳｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）から選択され、
Ｘ６は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）から選択され、
Ｘ９は欠失しているか、もしくは、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｌａ（Ａ）及びＮｌｅから選択され、
Ｘｂは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列である。）
【請求項２８】
請求項２７に記載の組成物において、Ｘａは欠失し、Ｘ１はＳ及びＴから選択され、Ｘ６はＡ及びＶから選択され、Ｘ９はＶ及びＬから選択され、Ｘｂは欠失していることを特徴とする組成物。
【請求項２９】
請求項２２から２５のいずれかに記載の組成物において、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドが、次のアミノ酸配列の１つから成ることを特徴とする組成物。
（ｉ）  ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６）；
（ｉｉ）  ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０）；
（ｉｉｉ）  ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１）；
（ｉｖ）  ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２）；及び、
（ｖ）  ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１３）
【請求項３０】
請求項２０もしくは２１に記載の組成物において、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドの類似体であることを特徴とする組成物。
（Ｉ）  Ｘａ−Ｘ１−ＴＡＰＰ−Ｘ６−ＨＧ−Ｘ９−Ｘｂ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（式中、Ｘａは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列であり、
Ｘ１はＳｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）から選択され、
Ｘ６は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）から選択され、
Ｘ９は欠失しているか、もしくは、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｌａ（Ａ）及びＮｌｅから選択され、
Ｘｂは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列である。）
【請求項３１】
請求項２０もしくは２１に記載の組成物において、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、次のアミノ酸配列の１つから成るペプチドの類似体であることを特徴とする組成物。
（ｉ）  ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６）；
（ｉｉ）  ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０）；
（ｉｉｉ）  ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１）；
（ｉｖ）  ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２）；及び、
（ｖ）  ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１３）
【請求項３２】
請求項２０から３１のいずれかに記載の組成物において、前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体が、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に共役することを特徴とする組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物において、前記の少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子が、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド、ＰＡＤＲＥペプチド、及びそれらの組合せから成る群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組成物において、前記の少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子が、ＫＬＨであることを特徴とする組成物。
【請求項３５】
請求項２０から３４のいずれかに記載の組成物において、さらに、医薬として許容される担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物において、前記の医薬として許容される担体が、マンナン、酸化マンナン、部分酸化マンナン、還元マンナン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ＴＡＴ蛋白質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来ＶＰ２２蛋白質、両親媒性ペプチドＰｅｐ−１、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子の６０アミノ酸ＤＮＡ結合ドメイン、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、細胞内移送に関与するアンテナペディアの１６アミノ酸領域、及びその他の受容体介在の担体分子から成る群から選択される担体分子であることを特徴とする組成物。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組成物において、前記担体分子が酸化マンナンであることを特徴とする組成物。
【請求項３８】
対象における癌予防及び／又は治療方法であって、前記方法が、請求項２０から３７のいずれかに記載の組成物を用いて、樹状細胞（ＤＣｓ）をｅｘ  ｖｉｖｏ治療する段階を含み、該段階が、前記ＤＣｓをＭＵＣ１で刺激し、その後、刺激されたＤＣｓを前記対象に投与するものであることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法において、前記組成物を用いてＤＣｓをｅｘ  ｖｉｖｏ治療する段階が、該組成物の存在下においてＤＣｓをパルスする（ｐｕｌｓｉｎｇ）ことで達成されることを特徴とする方法。
【請求項４０】
次のアミノ酸配列の１つから成り、実質的に精製された形態であることを特徴とするＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチド。
（ｉ）  ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
（ｉｉ）  ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
（ｉｉｉ）ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；  
（ｉｖ）  ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；及び
（ｖ）  ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【請求項４１】
次のアミノ酸配列の１つから成り、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合するヘルパー分子と融合したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドを含むことを特徴とする融合ポリペプチド。
（ｉ）  ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
（ｉｉ）  ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
（ｉｉｉ）ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
（ｉｖ）  ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；及び
（ｖ）  ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【請求項４２】
請求項４１に記載の融合ポリペプチドにおいて、前記ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子が、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）であることを特徴とする融合ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項４１もしくは４２に記載の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムチン１陽性（ＭＵＣ１＋）腫瘍細胞を特徴とする癌の予防及び／又は治療に関する。特に、本発明は、樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）用の、ＭＵＣ１のＴ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含む癌ワクチン及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療及び／又は予防は、大きな障害である腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）に対する寛容に関係する相互作用の複雑さに妨げられている。
【０００３】
ムチン１（ＭＵＣ１）は、ＴＡＡの一例である。（ＭＵＣ１を含む）ムチンは、正常組織内で発現し、また、乳癌、卵巣癌、結腸癌及び膵臓癌などの癌細胞上では過剰に発現する高分子糖蛋白質である。（ｉ）癌細胞に存在するムチン量は、正常細胞の１００倍にまで増加する、（ｉｉ）ＭＵＣ１は、局所的というよりも、偏在的な細胞分布を有する、（ｉｉｉ）ＭＵＣ１は、グリコシル化異常を有し、正常なムチンでは容易に同定されないペプチドエピトープが露呈される、といった理由から、ＭＵＣ１は腫瘍免疫療法の標的候補として関心を集めている。
【０００４】
マウスにおいては、酸化マンナン（Ｍ−ＦＰ）に共役した２０アミノ酸長のＭＵＣ１縦列反復配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ：ＶＮＴＲ）融合蛋白質が、ＭＵＣ１＋マウス腫瘍の投与からマウスを防御するＨ２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を生じさせることが既に明らかになっている（参考文献８及び１４〜２１）。ヒトにおいては、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、及び結腸癌患者由来ＭＵＣ１の特定エピトープに対するＴ細胞及びＢ細胞免疫応答が確認されており（参考文献１０〜１２）、ＭＵＣ１に対する循環性免疫複合体が、乳癌及び卵巣癌患者の血清中で検出されている。これらの観察結果は、ＭＵＣ１が免疫療法にとって実に適切な標的であることを示している。
【０００５】
ペプチド系ワクチンは容易に合成できる分子の一種であり、いかなる発癌性も有していない。また、この化学物質は、自己免疫反応が起こる可能性を制限するため、容易に修飾することもできる。
【０００６】
ペプチドによる免疫化の有効性は、高結合力のＣＴＬを誘導し活性化させるペプチドの能力に依存する。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合する非自己抗原に由来する高親和性ペプチドは、通常、前記の高結合力をもつＣＴＬを誘導する。ヒト白血球型抗原のＡ２型（ＨＬＡ−Ａ２）は、コーカサス人種集団において最も一般的なヒトＭＨＣクラスＩ蛋白質である。ＨＬＡ−Ａ２は、２及び９位、及びあまり多くはないが６位にある特定のアンカー残基によって、９アミノ酸長のペプチドを選択的に結合する。最新の非自己ＣＴＬエピトープは、このような高親和性結合（もしくは「標準的」）残基を有することから同定されるに至っている。
【０００７】
しかしながら、ペプチドが、過剰発現した自己腫瘍抗原に由来する場合、ワクチン接種は有効でない可能性がある。ほとんどの腫瘍抗原は自己抗原であるため、寛容をもたらすｐ５３癌抗原で実証されているように（参考文献２３〜２５）、その特異的ＣＴＬレパートリーは最も失われやすい。この寛容は、特に、高親和性ＭＨＣ関連エピトープに関与することから、ＭＨＣ親和性のより低いエピトープが、腫瘍免疫療法に好適な候補ペプチドになり得る（参考文献１６〜２２）。
【０００８】
しかしながら、親和性のより低いエピトープの使用には、２つの重大な問題が存在する。
【０００９】
第一に、親和性のより低いペプチドエピトープは、予測されたエピトープのモチーフと一致する可能性が低く、ゆえに、同定が困難である。したがって、そのような低親和性ぺプチドは、溶出試験及び予測アルゴリズムでは検知できないため、それらの同定に効果的な唯一の方法は、系統的な結合試験（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ）及び、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）によるペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）の認識によるものである。
【００１０】
第二に、ＭＨＣに対するペプチド親和性、及びペプチド−ＭＨＣ複合体の安定性は、免疫原性全体における重要因子であるとされてきた（参考文献２９及び３０）。この問題を克服するため、「アンカー」残基をあらかじめ決められた標準アミノ酸と置換することによって、ＭＨＣに対するペプチドの親和性を向上させる多くの試みがなされてきた（参考文献５６）。この方法は、ペプチドとＭＨＣの相互作用を強化し、寛容が生じる可能性を減少させることができる一方、多くの場合で、ＭＨＣアンカー残基への変異により、天然のカンウンターパートを認識しないＣＴＬがもたらされる（参考文献３５、３６、３７）。これらの結果は、効果的なエピトープ増強に必要とされるＭＨＣ親和性と受容体交差反応とのバランスの重要性を浮き彫りにしている。
【００１１】
親和性のより低いペプチドエピトープを用いたこれまでの変異研究では、周知のＭＨＣアンカー残基を、非アンカー残基に変異させることなく、標準アミノ酸に置換することに焦点が置かれてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明につながる研究において、ＭＵＣ１ヒト乳癌抗原に対してＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導する、低親和結合性の９アミノ酸長のＭＵＣ１ペプチドが同定された。次いで、本発明者等は、ＭＨＣクラスＩ蛋白質に対するペプチドの親和性を改善し、さらに、ＴｃＲに対するｐＭＨＣの結合性を向上させる試みにおいて、ＭＵＣ１ペプチドの様々な残基について置換を行った。すると驚くことに、変異したＭＵＣ１ペプチドエピトープの一部は、２位において標準的なＩ１ｅ／Ｌｅｕ／Ｖａｌを有さないにもかかわらず、ＨＬＡ−Ａ２に結合し、ＭＵＣ１＋ヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ７）を特異的に溶解するＣＴＬを誘導できることが分かった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第一の態様において、本発明は、癌の予防及び／又は治療用ワクチン（すなわち癌ワクチン）であって、前記ワクチンは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子（ｈｅｌｐｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含み、対象への投与において、ムチン１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発できることを特徴とするワクチンを提供する。
【００１４】
本発明において「ムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体」という用語は、ＣＴＬ応答（すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘発できる、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来のペプチドもしくはペプチド類似体を意味するが、マウス及び／又はヒトに生来存在するムチン１アミノ酸配列から構成されるペプチドを包含するものではない。例えば、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドにおいて、前記ペプチドは、マウス及び／又はヒトに生来存在するが（すなわちマウス及び／又はヒト野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ）、１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が組み込まれる程度に修飾されたアミノ酸配列に相当するものを含むことが好ましい。前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換は、関連する野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープの１つもしくはそれ以上の非アンカー残基に位置していることが好ましい。このような１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＨＬＡクラスＩ蛋白質（特にＨＬＡ−Ａ２）に対する結合親和性を増加させる、及び／又は野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープに関連するＴｃＲへの、ｐＭＨＣの結合性を向上させるように選択されることが好ましい。
【００１５】
前記の少なくとも１種のＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体は、ヒトＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープに由来することが好ましい。
【００１６】
前記ワクチンは、ムチン１陽性（ＭＵＣ１＋）腫瘍細胞を溶解させるのに効果的な、ムチン１に対するＣＴＬ応答を引き起こせることが好ましい。
【００１７】
第二の様態において、本発明は、対象における癌予防及び／又は治療方法であって、前記方法が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含むワクチンを前記対象に有効量投与する段階を含み、前記ワクチンが、対象への投与において、ムチン１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を引き起こすことを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
第三の態様において、本発明は、樹状細胞（ＤＣｓ）のｅｘ  ｖｉｖｏプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）用組成物であって、前記組成物は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含むことを特徴とする組成物を提供する。
【００１９】
第四の態様において、本発明は、対象における癌予防及び／又は治療方法であって、前記方法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含む組成物を用いて、樹状細胞（ＤＣｓ）をｅｘ  ｖｉｖｏ治療する段階を含み、該段階が、前記ＤＣｓをＭＵＣ１で刺激し、その後、前記の刺激されたＤＣｓを前記対象に投与するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
前記の刺激されたＤＣｓは、前記対象への投与において、ムチン１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を引き起こす。ＭＵＣ１に対する前記のＣＴＬ応答は、ムチン１陽性（ＭＵＣ１＋）腫瘍細胞の溶解を引き起こすのに効果的であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、抗Ｈ−２Ｋｂ特異抗体を用いたインキュベーションの前に、ＭＵＣ１−８（ＳＡＰＤＴＲＰＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（グラフＡ）、ＭＵＣ１−８−５Ｆ（ＳＡＰＤＦＲＰＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（グラフＢ）、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ（ＳＡＰＤＦＲＰＬ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（グラフＣ）、及びＭＵＣ１−８−８Ｌ（ＳＡＰＤＴＲＰＬ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（グラフＤ）でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞のフローサイトメトリー分析結果を表したものである。様々な濃度のペプチドを添加し、それぞれ１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、及び「ペプチド無し」と示した。
【００２２】
【図２】図２は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる、Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ−γの測定値を示したものである。ＭＵＣ１−８（ｉ）、ＭＵＣ１−８−５Ｆ（ｉｉ）、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ（ｉｉｉ）、もしくはＭＵＣ１−８−８Ｌ（ｉｖ）ペプチドでパルスしたＤＣで、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（グラフＡ）、及びＭＵＣ１ｘＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス（グラフＢ）を免疫化した。全ての免疫化マウス群において、ＭＵＣ１−８（■）、ＭＵＣ１−８−５Ｆ（□）、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ（▲）もしくはＭＵＣ１−８−８Ｌ（△）ペプチドを認識する、特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８Ｔ細胞が産生されている。オボアルブミン（ＯＶＡ８）を陰性対照として、ＣｏｎＡ（Ｔ細胞の非特異的刺激）を内部陽性対照として使用した。本データは、５×１０５細胞あたりのスポット形成単位（ｓｐｏｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ：ＳＦＵ）で表す。実験は、１グループ当り３匹のマウスを用い、少なくとも２回行った。
【００２３】
【図３】図３の（Ａ）は、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌの最終的な電子密度図を示したものである。（Ｂ）はＭＵＣ１−８−５Ｆ８ＬとＭＵＣ１−８、（Ｃ）はＭＵＣ１−８−５Ｆ８ＬとＯＶＡ８のＣα主鎖を重ね合わせた図（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）である。ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌは黄色、ＭＵＣ１−８はピンク、ＯＶＡ８は青緑で表示している。（Ｄ）はＯＶＡ８（青緑）とＭＵＣ１−８（結晶構造）、（Ｅ）はＯＶＡ８（青緑）とＭＵＣ１−８−５Ｆ（モデル）、及び（Ｆ）はＯＶＡ８（青緑）とＭＵＣ１−８−８Ｌ（モデル）のＣα主鎖を重ね合わせた図である。
【００２４】
【図４】図４は、（Ａ）ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ、（Ｂ）ＭＵＣ１−８、及び（Ｃ）ＯＶＡ８をもつ結晶複合体における、Ｈ−２Ｋｂ結合グルーブ内の水素結合ネットワークを図示したものである。ペプチドの残基をＰ１〜Ｐ８、Ｈ−２Ｋｂ分子の残基を、アミノ酸の３文字の記号及び上付き数字で示し、水素結合は点線で示した。結合グルーブ及びペプチドのみを図示する。
【００２５】
【図５】図５は、（Ａ）ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ、（Ｂ）ＭＵＣ１−８、及び（Ｃ）ＯＶＡ８における、Ｈ−２Ｋｂ水の結合グルーブ内の水分子（青緑部分）位置を示した図である。ペプチドの残基をＰ１〜Ｐ８で示した。また、結合グルーブポケットを示す。標準アンカー残基が、Ｃ及びＦポケットをほとんど完全に埋めている一方で、小さな非標準アンカーは、前記ポケットをほとんど埋めていないことに留意する。
【００２６】
【図６】図６は、変異させたペプチドで免疫化した後のＣＴＬ応答をグラフ化したものである。ＫＬＨに共役し、その後、酸化マンナンに共役させた、ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）（◆）、ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（○）、ＤＬＨＷＡＳＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（■）で、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂマウスをそれぞれ免疫化した。酸化マンナン−ＭＵＣ１融合蛋白質（ＭＦＰ）（＋）を、内部陽性対照として使用した。ＭＣＦ７ＭＵＣ１陽性腫瘍細胞を５１Ｃｒで標識し、標準的ＣＴＬアッセイにおける標的として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
第一の態様において、本発明は、癌の予防及び／又は治療用ワクチン（すなわち癌ワクチン）であって、前記ワクチンは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含み、対象への投与において、ムチン１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発できることを特徴とするワクチンを提供する。上述の通り、本発明において「ムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体」という用語は、ＣＴＬ応答を誘発できる、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来のペプチドもしくはペプチド類似体を意味するが、マウス及び／又はヒトに生来存在するムチン１アミノ酸配列から構成されるペプチドを包含するものではない。
【００２８】
本発明に適するＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドにおいて、前記ペプチドは、マウス及び／又はヒトに生来存在するが（すなわちマウス及び／又はヒト野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ）、１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換が組み込まれる程度に修飾されたアミノ酸配列に相当するものを含むことが好ましい。
【００２９】
前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換は、関連する野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープの１つもしくはそれ以上の非アンカー残基に位置していることが好ましい。前記非アンカー残基は、ＭＨＣ／ＨＬＡ蛋白質に対するエピトープペプチドの高親和性結合に必要であるとして当業者にこれまで認識されていなかった残基から構成される。したがって、例えば、ＨＬＡ−Ａ２に対する９アミノ酸長のペプチドの高親和性結合において、アンカー残基の位置は、２及び９位、及びあまり多くはないが６位であり（位置の番号付けは、通常、Ｎ末端アミノ酸残基から始まる）、非アンカー残基位置は、１、３、４、５、７、及び８位である。
【００３０】
前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質（特にＨＬＡ−Ａ２）に対する結合親和性を増加させる、及び／又は野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープに関連するＴｃＲへの、ｐＭＨＣ結合性を向上させるように選択されることが好ましい。これは、１種もしくはそれ以上のアミノ酸を、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質に対するエピトープペプチドの結合に有利なアミノ酸に置換することで達成できる。上記は、前記アンカー残基位置にある１種もしくはそれ以上のアミノ酸の、標準残基への置換を含む。したがって、例えば、ＨＬＡ−Ａ２に対して低もしくは中程度の結合親和性を有する９アミノ酸長のペプチドの結合親和性を増加させるために、６位のアンカー残基のアミノ酸を、標準アミノ酸Ｖａｌ（Ｖ）に置換し、及び／又は９位のアンカー残基のアミノ酸を、標準アミノ酸Ｌｅｕ（Ｌ）もしくはＶａｌ（Ｖ）に置換してもよい。しかしながら、２位のアンカー残基のアミノ酸は変えずにおく（すなわち、アミノ酸が非標準である場合）か、または、Ｔｈｒ（Ｔ）などの非標準アミノ酸に置換することが好ましい。
【００３１】
前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドは９アミノ酸長であることが好ましい。
【００３２】
前述の通り、適したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドは、マウス及び／又はヒト野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープに由来することが好ましい（すなわち、適したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドは、マウス及び／又はヒト野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列に相当するが、１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことによって修飾された配列を含むことが好ましい）。より好適には、適したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドは、
（ｉ）  ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；及び、
（ｉｉ）ＳＡＰＤＴＲＰＡＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
から選択されるマウス及び／又はヒト野生型ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープに由来する。
【００３３】
このように、好適なＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドとしては、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ：５もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に相当するが、１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことによって（その結果、「非自己」エピトープを生じる）修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。アミノ酸置換数は、好適には１〜４、より好適には２〜４である。前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換は、アンカー残基位置、非アンカー残基位置、及び／又はアンカー及び非アンカー残基を組み合わせた位置に施すことができる。また、前記の１種もしくはそれ以上のアミノ酸置換は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｏｒ  ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）から選択することもできる。
【００３４】
典型的な保存的アミノ酸置換を下記表１に挙げる。想定される特定の保存的アミノ酸置換としては、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ；及びＰ、Ｎα―アルキルアミノ酸が挙げられる。
【００３５】
【表１】
2009544291.tif 000002
【００３６】
さらに、特に好適なＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドとして、下記一般式（Ｉ）で表されるペプチドが挙げられる。
（Ｉ）Ｘａ−Ｘ１−ＴＡＰＰ−Ｘ６−ＨＧ−Ｘ９−Ｘｂ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（式中、Ｘａは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列である：
Ｘ１はＳｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）から選択される：
Ｘ６は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）から選択される：
Ｘ９は欠失しているか、もしくは、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｌａ（Ａ）及びＮｌｅから選択される：
Ｘｂは欠失しているか、もしくは、任意のアミノ酸、又は、２〜５個の任意のアミノ酸の配列である。ただし、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換が組み込まれる。）
【００３７】
好適には、Ｘａは欠失しており、Ｘ１はＳ及びＴから選択され、Ｘ６はＡ及びＶから選択され、Ｘ９はＶ及びＬから選択され、Ｘｂは欠失している。
【００３８】
さらに、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドは、次のアミノ酸配列の１つから成ることが最も好ましい。
（ｉ）ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
（ｉｉ）ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
（ｉｉｉ）ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
（ｉｖ）ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；及び
（ｖ）ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【００３９】
適したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチド類似体としては、一般式（Ｉ）で表されるペプチドの類似体、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として上記に示したアミノ酸配列の１種から成るペプチドの類似体が挙げられる。二次及び三次構造の情報がない場合は、ペプチド配列に基づくペプチドの類似体を設計する公知の方法を任意に用い、前記のような類似体を設計してもよい（参考文献６０）。例えば、ペプチド類似体は、ペプチドの特定領域の疎水性を増加させるためにアミノ酸側鎖を修飾する段階（例えば、ペプチドの芳香族残基において水素基をメチル基に置換する）、アミノ酸側鎖を非アミノ酸側鎖に置換する段階（例えば、ペプチドの芳香族残基を他のアリル基に置換する）、及び、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端を様々な置換基に置換する段階（例えば、脂肪族基を置換して疎水性を増加する）ことにより製造することができる。または、適したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチド類似体は、ペプチド主鎖の修飾（すなわち、例えば、ペプチド主鎖中の窒素原子を炭素原子に置換することによるアミド結合の代替の導入）を含むか、もしくは、Ｎ置換グリシン残基、（Ｌ−アミノ酸に代わる）１種もしくはそれ以上のＤ−アミノ酸、及び／又は（β−アミノ酸もしくはγ−アミノ酸に代わる）１種もしくはそれ以上のα−アミノ酸を含む、いわゆるペプトイド（すなわち非ペプチド）であってもよい。さらに、適したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチド類似体には、ペプチド結合が逆になっており、Ｄ−アミノ酸がベースとなるペプチド配列のＬ−アミノ酸に対して逆順に組み立てられている「ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチド」、及び、ステロイド、サッカリド、ベンザゼピン１，３，４三置換ピロリジノン（ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ  １,３,４−ｔｒｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、ピリドン及びピリドピラジンなどの非ペプチド骨格が挙げられる。
【００４０】
前記ワクチンは、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質に結合したヘルパー分子であって、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体へ（共有もしくは非共有のどちらかで）共役できるヘルパー分子を少なくとも１つ含むことが好ましい。少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子の存在は、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞の刺激に効果的である。
【００４１】
少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子は、例えば、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド、もしくはＰＡＤＲＥペプチドなどのより小さなＴ細胞ヘルパーエピトープ（参考文献５８）、及びそれらの組合せなど、当業者に周知のものであればよい。少なくとも１種のヘルパー分子は、２種もしくはそれ以上のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質タイプもしくはハプロタイプへ結合していることが好ましい。また、少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子が、ＫＬＨであることが最も好ましい。
【００４２】
少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子は、短いリンカーを介し、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体に共有共役していることが好ましい。短いリンカーとは、たとえば、単一アミノ酸、もしくは、アミノ酸数が２〜１５、より好適には３〜１０の短いアミノ酸配列である。適したリンカーの例としては、（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）５が挙げられる。
【００４３】
前記ワクチンは、さらに、医薬として許容される担体を含んでもよい。本願では、「医薬として許容される担体」という用語は、生物学的またはその他の面において不適切ではない（すなわち、実質的な副作用を引き起こすことなく、担体が、活性物質とともに対象へ投与される）任意の溶液、物質もしくはそれらの組合せを意味するものと理解される。したがって、前記担体は、賦形剤及び、希釈剤（例えば水、生理食塩水、グリセロール、エタノールもしくはその類など）、界面活性剤、着色剤、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤及びその類、及びそれらの組合せなどのようなその他の添加剤から選択してもよい。前記担体は、任意の蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、多糖類、もしくは、抗原もしくはエピトープが細胞内に輸送され、その後処理されて、ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ分子とともに細胞表面上に現れる能力を増強するその他の分子を追加的または代替的に含むことができる。このような担体分子の例としては、マンナン、酸化マンナン、部分酸化マンナン、還元マンナン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ＴＡＴ蛋白質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来ＶＰ２２蛋白質、両親媒性ペプチドＰｅｐ−１、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子の６０アミノ酸ＤＮＡ結合ドメイン（「ホメオドメイン」）、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、細胞内移送に関与するアンテナペディアの１６アミノ酸領域（すなわち、「透過性（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）」もしくは「内部（ｉｎｔ）」ペプチド）、及びその他の受容体介在の担体分子が挙げられる。これらの担体分子は、例えば、上述のような短いリンカーを介して、直接的もしくは間接的（例えば、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子を介して）に、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体に共有共役してもよい。特に好適な担体分子は、酸化マンナン（参考文献６１）である。酸化マンナンは、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子を介して、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体に共有共役することが好ましい。前記ワクチンは、対象への投与において、ＭＵＣ１に対するＣＴＬ応答を引き起こす。ＭＵＣ１に対する前記のＣＴＬ応答は、ムチン１陽性（ＭＵＣ１＋）腫瘍細胞を溶解するのに効果的であることが好ましい。
【００４４】
前記ワクチンは、ＭＵＣ１＋腫瘍細胞を特徴とする癌の予防もしくは治療に用いることができる。このような癌としては、卵巣癌、乳癌、膵癌、結腸癌が挙げられる。
【００４５】
第二の態様において、本発明は、対象における癌予防及び／又は治療方法であって、前記方法が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含むワクチンを前記対象に有効量投与する段階を含み、前記ワクチンが、対象への投与において、ムチン１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を引き起こすことを特徴とする方法を提供する。
【００４６】
本願では、「対象」という用語は、任意の動物を意図するものと理解される。しかしながら、前記対象は、好適には哺乳類であり、より好適には、ヒト、純血種のウマなどの家畜、及びイヌやネコなどのペット動物から成る群から選択される。もちろん、前記対象はヒトであることが最も好ましい。
【００４７】
本発明のワクチンは、主として、溶液状もしくは懸濁液状の注射製剤（例えば、静脈注射、筋肉注射、腔腹内注射、皮下注射もしくは皮内注射など）として対象へ投与するために処方されるが、経口、経鼻、口腔、膣内、及び直腸投与などのその他の投与経路に適した剤形も意図している。また、本発明のワクチンは、通常、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの変性剤を組み込んだ免疫賦活剤（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）の使用を避けるように処方されるが、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（アラム（ａｌｕｍ））、及び成長因子及びサイトカインを含む、その他の医薬的に許容し得る免疫賦活剤は適し得る。
【００４８】
本発明のワクチンは、対象における癌予防及び／又は治療のために、有効量で対象へ投与される。前記有効量とは、「治療有効量」（すなわち、ＭＵＣ１及び、特にＭＵＣ１＋腫瘍細胞に対するＣＴＬ応答を引き起こすのに有効な量）と考えられる。したがって、本願において、「有効量」及び「治療有効量」という用語は、所望する治療的もしくは生理学的な効果又は転帰をもたらすのに十分なワクチン量を意味すると理解される。当業者には明らかなように、前記のような効果もしくは転帰は、好ましくない作用（例えば副作用）をともなう可能性があるため、実施者は、適切な「有効量」を決める際に、潜在的リスクと潜在的利益のバランスをとる必要があり得る。さらに、正確な必要量は、対象の種、年齢及び一般的な条件、投与方法などによって、対象ごとに異なる。しかしながら、一例として、１投与当たり１〜１０，０００μｇ、より好適には５〜５００μｇの範囲のＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープペプチドもしくはペプチド類似体が供給されるように、有効量のワクチンを対象へ投与することが可能である。
【００４９】
対象における癌治療のための本発明のワクチンの使用は、放射線治療、化学療法（例えば、アントラサイクリン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、トポイソメラーゼ阻害剤、シスプラチン、及びカルボプラチンを用いるもの）、もしくはホルモン治療又はホルモン調整剤（例えばクエン酸タモキシフェン（ｃａｔａｍｏｘｉｆｅｎ））を用いた療法などといった従来の癌治療の１種もしくはそれ以上と組み合わせて行ってもよい。当然のことながら、前記のような併用療法も本発明に包含される。
【００５０】
さらに、当然のことながら、本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏ使用のための組成物（例えば、癌樹状細胞療法用など）を包含する。
【００５１】
第三の態様において、本発明は、樹状細胞（ＤＣｓ）のｅｘ  ｖｉｖｏプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）用組成物であって、前記組成物は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１つのムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含むことを特徴とする組成物を提供する。
【００５２】
前記の少なくとも１種のＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体は、本発明のワクチンとの関連で既に述べた通りである。したがって、本組成物は、下記のアミノ酸配列のうち１種からなるＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドを少なくとも１つ含むことが最も好ましい。
（ｉ）ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
（ｉｉ）ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
（ｉｉｉ）ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
（ｉｖ）ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；及び
（ｖ）ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【００５３】
前記ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体は、ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質（例えばＫＬＨ）及び／又は、上述の医薬として許容される担体に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に、（共有もしくは非共有のどちらかで）共役してもよい。特に好適な、医薬として許容される担体は、酸化マンナンである。
【００５４】
第四の態様において、本発明は、対象における癌予防及び／又は治療方法であって、前記方法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合する少なくとも１種のヘルパー分子に随意に共役する、少なくとも１種のムチン１（ＭＵＣ１）Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含む組成物を用いて、樹状細胞（ＤＣｓ）をｅｘ  ｖｉｖｏ治療する段階を含み、該段階が、前記ＤＣｓをＭＵＣ１で刺激し、その後、前記の刺激されたＤＣｓを前記対象に投与するものであることを特徴とする方法を提供する。
【００５５】
前記の刺激されたＤＣｓは、前記対象への投与において、ムチン１に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を引き起こす。ＭＵＣ１に対する前記のＣＴＬ応答は、ムチン１陽性（ＭＵＣ１＋）腫瘍細胞の溶解を引き起こすのに効果的であることが好ましい。
【００５６】
前記の刺激されたＤＣｓは、ＭＵＣ１＋腫瘍細胞を特徴とする癌の予防もしくは治療に用いることができる。このような癌としては、卵巣癌、乳癌、膵癌、及び結腸癌が挙げられる。      
【００５７】
本組成物によるＤＣｓのｅｘ  ｖｉｖｏ治療段階は、適切な条件の下、前記組成物の存在下においてＤＣｓを培養及び／又はインキュベートするなどの、当業者に周知の任意の方法によって達成することができる。好適には、前記治療段階には、前記組成物存在下においてＤＣｓを「パルスする（ｐｕｌｓｉｎｇ）」従来技術が含まれる。
【００５８】
前記方法で処理されたＤＣｓは、自家性（すなわち、刺激されたＤＣｓを投与する対象から得られたもの）であることが好ましい。前記ＤＣｓは、対象の血液についてアフェレーシスを行い（例えば、アフェレーシス装置を用いて）、その後、ＤＣｓ産生に適切な条件下（参考文献６３）で、分離した白血球（すなわち、リンパ球、顆粒球、及び単球）を培養することによって治療用に調製することができる。一度ＤＣｓが産生されれば、例えば、ＤＣ培養物に前記組成物を添加することによって、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドもしくはペプチド類似体を含む組成物でＤＣｓを処理することができる。その後、刺激されたＤＣｓは、成熟度及び／又は純度の試験を行い、例えば液体窒素中で随意に保存し、その後、好ましくは注射によって対象へ投与するため、必要に応じ、医薬として許容される担体（例えば、生理食塩水）中で懸濁することができる。
【００５９】
第五の態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列の１つから成る、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドを実質的に精製された形態で提供する。
（ｉ）ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
（ｉｉ）ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
（ｉｉｉ）ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；  
（ｉｖ）ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；及び
（ｖ）ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【００６０】
第六の態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列の１つから成り、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ蛋白質に結合するヘルパー分子と融合したＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。
（ｉ）ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
（ｉｉ）ＳＴＡＰＰＶＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；
（ｉｉｉ）ＳＴＡＰＰＡＨＧＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
（ｉｖ）ＴＴＡＰＰＡＨＧＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；及び
（ｖ）ＳＡＰＤＴＹＰＡＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【００６１】
ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子は、単一アミノ酸、もしくは、アミノ酸数が２〜１５、より好適には３〜１０の短いアミノ酸配列などの短いリンカーを介し、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドと融合することができる。前記ＨＬＡクラスＩＩ蛋白質結合ヘルパー分子は、標準的な組み換え発現技法による融合ポリペプチドの発現が可能な方法で、ＭＵＣ１Ｔ細胞エピトープ由来ペプチドと融合することが好ましい。
【００６２】
また、第七の態様において、本発明は、第六の態様にかかる融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００６３】
前記ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはそれらの混合であり、また、実質的に精製された形態であってよい。前記ポリヌクレオチド分子は、当業者に周知の発現カセット及び／又は複製ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡベクター（例えば、発現ベクターなど（参考文献６２））に含まれ得る。前記のような発現カセットもしくはベクターは、当業者に周知の任意の方法によって、コードされた融合ポリペプチドの発現に適した宿主細胞中に導入することができる。
【００６４】
本願において、（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」といった）単数形は、明確な指示がない限り、複数の態様も包含する。したがって、例えば、「ａ  ｖａｃｃｉｎｅ」という表現は、１種のワクチンと同様に２種以上のワクチンも包含し、「ａｎ  ａｇｅｎｔ」もしくは「ａ  ｒｅａｇｅｎｔ」という表現は、１種の製剤もしくは試薬と同様に２種以上の製剤もしくは試薬も包含しており、その他についても同様とする。
【００６５】
以下、非限定の実施例及び添付図面に関して、本発明を説明する。
【００６６】
実施例
実施例では下記の略称を使用する。
ＢＳＡ                            ウシ血清アルブミン
ＣＴＬ                           細胞傷害性Ｔリンパ球
ＣＴＬｐ                     細胞傷害性Ｔリンパ球前駆細胞
ＤＣｓ                                 樹状細胞
ＥＬＩＳＡ                      酵素結合免疫吸着定量法
ＥＬＩＳＰＯＴ                  酵素結合免疫スポット法
Ｅ：Ｔ                    標的細胞に対するエフェクターの割合
ＦＡＣＳ                        蛍光活性化細胞選別装置
ＦＩＴＣ                   フルオレセインイソチオシアネート
ＨＬＡ                              ヒト白血球抗原
ｋＤａ                               キロダルトン
ＫＬＨ                      スカシ貝リンペットヘモシアニン
ＭＨＣ                         主要組織適合遺伝子複合体
ｍＰＢＳ                      マウスリン酸緩衝生理食塩水
ＭＵＣ１                               ムチン１
ＮａＣｌ                            塩化ナトリウム
Ｏ／Ｎ                                   一晩
ＯＶＡ                              オボアルブミン
ＯｘＭａｎ                           酸化マンナン
ＰＢＳ                           リン酸緩衝生理食塩水
ＰＩ                              ヨウ化プロピジウム
ＲｅｄＭａｎ                         還元マンナン
ＲＭＳＤ                               標準偏差
ＲＴ                                     室温
ＳＥ                                   標準誤差
ＴＡＡ                               腫瘍関連抗原
ＴｃＲ                              Ｔ細胞受容体
【実施例１】
【００６７】
＜マウスによるＭＨＣクラスＩ結合性の調査：Ｈ−２Ｋｂ結合性増進に対する腫瘍関連ＭＵＣ１−８ペプチドのアンカー修飾＞
本実施例では、ＭＵＣ１由来非標準腫瘍関連ペプチド、すなわちＭＵＣ１−８（ＳＡＰＤＴＲＰＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を、そのＭＨＣアンカー残基において、ＳＡＰＤＦＲＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ）で修飾した。これによって、Ｈ−２Ｋｂに対する結合性が向上し、免疫反応が改善された。さらに、Ｈ−２Ｋｂと複合化したＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌの結晶構造が決定され、ＭＨＣに対するペプチド結合性が、標準ペプチドＯＶＡ８（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の結合性と類似していることが明らかになった。
【００６８】
材料と方法
ペプチド
ペプチドとして、ＳＡＰＤＴＲＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ＭＵＣ１−８）、及び、アンカー修飾された類似体であるＳＡＰＤＦＲＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（ＭＵＣ１−８−５Ｆ）、ＳＡＰＤＦＲＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ）及びＳＡＰＤＴＲＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（ＭＵＣ１−８−８Ｌ）を合成した。高親和結合性ペプチドである、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）−ニワトリオボアルブミン２５７−２６４（ＯＶＡ８）、ＦＡＰＧＮＹＰＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）−センダイウイルスＮＰ３２４−３３２（ＳＥＶ９）、及び、ＲＧＹＶＹＱＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）−水疱性口内炎ウイルスＮＰ５２−５９（ＶＳＶ８）を、ＭＵＣ１−８アンカー修飾ペプチドとの比較に用いた。ペプチドは全て、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ社（オーストラリア国所在、ＶＩＣ社）によって合成され、その純度は９５％より高く、分子量はエレクトロスプレー質量分析法で測定された。
【００６９】
可溶性Ｈ−２Ｋｂの製造
参考文献４６、４７及び４８に記載の通り、メタロチオネインプロモーターの支配下において、Ｈ−２Ｋｂの可溶性細胞外ドメイン（Ｃ末端ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有する重鎖残基１−２７４、及びβ２−ミクログロブリン残基１−９９）が、キイロショウジョウバエ（Ｄ.  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞で発現した。端的に言うと、キイロショウジョウバエ細胞は、無血清のＩｎｓｅｃｔ  Ｘｐｒｅｓｓ（登録商標）培地（アメリカ合衆国ニュージャージー州イーストラザフォード所在、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）中で、大規模（最大６Ｌまで）に増殖させ、Ｈ−２Ｋｂの発現を誘導するため、採取の３〜５日前にＣｕＳＯ４（最終濃度６２５μＭ）を添加した。上清を、ＣＥＮＴＲＡＭＡＴＥ接線流入式濃縮器（アメリカ合衆国ニューヨーク州イーストヒルズ所在、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）で１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜（ＰＡＬＬ社製）を用いて濃縮し、その後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに注入し、１０−２５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）のグラジェントによって溶出した。さらに、Ｍｏｎｏ−Ｑカラム（アメリカ合衆国所在、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製；トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）における２５−５００ｍＭのＮａＣｌグラジェントによる溶出。）を用いて精製を行い、最終サンプルを再蒸留水で一晩透析した。これを、さらに、Ｎａｎｏｓｅｐ濃縮器（１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜）（ＰＡＬＬ社製）を用いて濃縮し、最終濃度を１０〜１５ｍｇ／ｍｌとした。前記最終濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（アメリカ合衆国デラウェア州ウィルミントン所在、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ社製）を用いて計測した。
【００７０】
親和性測定
可溶性Ｈ−２Ｋｂ分子に対するペプチド結合の親和性測定を、参考文献４８及び４９の通りに行った。全ての親和性測定は、少なくとも２〜３回くり返された。
【００７１】
ＲＭＡ−Ｓ細胞を用いたペプチド安定化試験
マウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ（Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＡＰ２−欠損細胞）のＭＨＣクラスＩ分子は、クラスＩ分子に対するペプチドの直接結合の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での測定に用いることができる。ＲＭＡ−Ｓ細胞（５×１０５細胞）を、ペプチド（１０−４〜１０−１３Ｍ）とともに２６℃で３時間、その後、３７℃に移して３０分間インキュベートした。０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳ（２ｍｌ）で洗浄した後、上清である抗Ｈ−２Ｋｂ（ＨＢ−１５８）ＩｇＧ２ａ（１／５０希釈、１００μｌ）を、ＲＭＡ−Ｓペプチド保持細胞に添加し、４℃で４５分間インキュベートした。前記細胞を再度洗浄し、１００μｌ（１：５００希釈）のＦＩＴＣ共役ヒツジ（Ｆａｂ’）２抗マウス免疫グロブリンを添加し、４℃で４５分間インキュベートした。そして、さらに洗浄した後、細胞をＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【００７２】
マウス、樹状細胞（ＤＣ）発生と免疫化
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）もしくはＭＵＣ１×ＨＬＡ−Ａ２（Ｈ−２ｂ／Ｈ−２ｄ／ＨＬＡ−Ａ２）遺伝子導入の６〜８週齢のマウスを用いた。Ｃ５７ＢＬ／６もしくはＭＵＣ１×ＨＬＡ−Ａ２雌マウスの骨髄細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４が補充された組織培養培地にて１ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度で培養した。６日目に、細胞を洗浄し、同じ培地中で再懸濁して、２０μｇ／ｍｌのペプチドをＤＣｓに３時間負荷した。パルスしたＤＣを洗浄し、１００μｌ（１−２×１０６細胞）を雌マウスのしっぽの付け根に皮内注射した。１４日後にマウスを追加免疫し、１６日後の脾細胞をＥＬＩＳｐｏｔで評価した。
【００７３】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
各ペプチドについて、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるペプチド特異的ＩＦＮ−γの産生を評価するため、免疫化マウス由来の脾細胞をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。脾臓細胞は、１０−５〜１０−１０Ｍの各ＭＵＣ１ペプチド、無関係ペプチド（ＯＶＡ８、ＳＩＩＮＦＥＫＬ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）もしくは、内部陽性対照であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）とともに、（抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体で予め被覆された）ニトロセルロース平板上で、８％のＣＯ２下にて３７℃で１８時間インキュベートした。平板は、参考文献５０の通りに作成した。
【００７４】
Ｈ−２Ｋｂ／ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ複合体の調製及び結晶化
参考文献４６、４７及び４８記載の通り、Ｈ−２Ｋｂの可溶性細胞外ドメイン（重鎖残基１−２７４及びβ２−ミクログロブリン残基１−９９）は、キイロショウジョウバエ細胞で発現した。５倍モル過剰量のＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌペプチドにより、Ｈ−２Ｋｂ−ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ複合体の大型結晶（＞１０ｍｇ／ｍｌ）が、１〜２％（ｖ／ｖ）の２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）を含む１．８〜２．０ＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．６〜７．４）中に、１８℃の条件下で生成した。Ｈ−２Ｋｂ及びペプチドの両方を再蒸留水中に入れ（結晶の生成前に予め３時間インキュベートしておく）、０．５μｌのＭＨＣペプチド混合物をプラットフォームに加え、その直後に０．５μｌの母液を添加したものを用いるシッティングドロップ蒸気拡散法により結晶を生成させた。１モルの母液を、２４ウェルＣｒｙｓｃｈｅｍ  ｐｌａｔｅ（アメリカ合衆国カリフォルニア州アリソビエホ所在、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）の各ウェルへ添加した。５日以内に結晶が生成され、２週以内に０．２×０．２×０．１ｍｍの大きさへ成長した。
【００７５】
データ収集及び構造決定
データ収集に先立ち、結晶が生成された溶液よりも０．２Ｍ低く、１〜２％のＭＰＤ、及び抗凍結剤として２５％（ｖ／ｖ）のグリセリンを含むＮａＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ６．６〜７．４）中で、結晶を採取した。結晶を、窒素気流中で、−１７０℃に低温冷却した。４０ｋＶ及び２０ｍＡで操作されたＭｉｃｒｏＭａｘ００７  ＲｉｇａｋｕＸ線発生装置を用いて、Ｘ線回折データを収集した。Ｏｓｍｉｃ  Ｂｌｕｅ共焦点光学装置（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｏｐｔｉｃｓ）を用い、Ｘ線を直径０．３ｍｍに合わせ、さらに、Ｒ−Ａｘｉｓ  ＩＶ＋＋検出器を用い、結晶−検出器間距離２００ｍｍにて、回折像（Δφ＝０．５°）を撮影した。回折データを、ＨＫＬプログラムスイート（バージョン１．９６．６）を用いて処理した。関連データ処理の統計データを表２に示す。
【００７６】
【表２】
2009544291.tif 000003
【００７７】
ＣＮＳプログラムによる、高分解能（１．６オングストローム）のＨ−２Ｋｂ−ＭＵＣ１−８構造の座標を用いてデータを段階的に実行することによって、Ｈ−２Ｋｂ−ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ結晶構造を決定した。まずは、ＭＵＣ１−８ペプチドを除外し、プログラムＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯ  ＶＥＲＳＩＯＮ５．５（フランス国マルセイユ所在、ＢｉｏＧｒａｐｈｉｃｓ社）を用い、｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜電子密度中にＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌぺプチドを構築した。ＣＮＳプログラムスイート（バージョン０．９）を用い、最尤ターゲットと相互に検証をした結晶構造精密化を実行した。結晶構造の精密化サイクルの合間に、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション上において、プログラムＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯを用いて、２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜及び｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜分布図に構造モデルを適合させた。結晶学的Ｒ−因子（Ｒｗｏｒｋ）が０．２５を下回った時点で、炭水化物成分（ＮＡＧ及びＦＵＣ）、ＰＯ４３−イオン、溶媒（ＭＰＤ及び水）を前記モデルに加えた。構造精密化の最終サイクル中に、バルク溶媒補正及び全体として異方性のあるＢ因子の精密化を行った。表３は、精密化の最終段階と、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ社）によって評価されたモデル特性とをまとめたものである。ＰＲＯＣＨＥＣＫによる最終モデルの分析によると、残基の８９．３％はラマチャンドランプロットの最適領域に存在し、非許容領域にはないことが示された。ＭＨＣポリペプチドの回転側鎖領域以外の、全残基に対する電子密度が明確となった。ＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯ  ５．５及びＤＳ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  １．１（アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ所在、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ社製）を用いて図を作成した。
【００７８】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋの受入番号
Ｈ−２Ｋｂ−ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ複合体の原子座標及び構造因子を、受入番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｄｅ）２Ｆ０４として、ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに登録した。
【００７９】
分子モデリング
ＭＵＣ１−８ペプチド類似体（ＭＵＣ１−８−５Ｆ及びＭＵＣ１−８−８Ｌ）のモデルは、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌに複合体化した、マウスＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｋｂのα−鎖のＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ結晶構造（本願記載）を基にした。分子構造を最適化するために、ＣＨＡＲＭＭ力場を利用するＤＳ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  １．１ソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）により分子モデリングを行った。分子動力学シミュレーションに先立ち、ＲＭＳＤが０．１ｋｃａｌｍｏｌ−１未満になるまで最急降下勾配アルゴリズムを用い、その後、ＲＭＳＤが０．０１ｋｃａｌｍｏｌ−１未満になるまで、基底系導入ニュートラン−ラプソンアルゴリズムを用いて構造を緩和させた。距離依存性の誘電体を用い、水性溶媒条件をシミュレートした。続いて、前記ペプチドの半径２０オングストローム内のペプチド分子及び全ての原子を、１０００段階でＲＴ（３００Ｋ）まで加熱し、２００ｐｓの分子動力学シュミレーションを開始する前に、同じ温度において、さらに１０００段階で平衡化し、１００段階毎に構造を保存した。最終的な立体構造は、全ての追加的な解析に採用した。ペプチドの立体構造における変化の基準として、ＭＵＣ１−８、ＯＶＡ８、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ及びアンカー修飾類似体（ＭＵＣ１−８−５Ｆ及びＭＵＣ１−８−８Ｌ）の間にある全残基について、主鎖のＣα原子間のＲＭＳＤを計算した。ペプチドとＨ−２Ｋｂ分子の間にある全ての満足なＨ結合及び塩橋が同定された。
【００８０】
結果
ＭＵＣ１−８ペプチド変異体の可溶性Ｈ−２Ｋｂとの親和性測定
ＭＵＣ１−８ペプチドは、Ｐ２、Ｐ５及びＰ８位に好適なアンカー残基を含まなかったため、低親和性で結合することが見出されたが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＣＴＬを誘導した（参考文献４８）。ＭＵＣ１−８の親和性は、４℃で４．３×１０−７Ｍ、２３℃で８．７×１０−７Ｍ（表３：ＯＶＡ８もしくは他の高親和性ペプチドＶＳＶ８及びＳＥＶ９よりも１００〜３００倍低い）とする阻害試験により測定した。Ｔｈｒ−Ｐ５からＰｈｅ−Ｐ５への変異（ＭＵＣ１−８−５Ｆ）では、２３℃及び３７℃において、ペプチド親和性が少なくとも７倍に増加し、Ａｌａ−Ｐ８からＬｅｕ−Ｐ８への変異（ＭＵＣ１−８−８Ｌ）では、２３℃及び３７℃において、ペプチド親和性が少なくとも３倍に増加した。一方、Ｔｈｒ−Ｐ５／Ａｌａ−Ｐ８からＰｈｅ−Ｐ５／Ｌｅｕ−Ｐ８への二重置換変異（ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ）では、単独変異の場合よりもペプチド親和性が著しく増加し（すなわち、２３℃で１４倍）、３７℃において高い熱安定化がもたらされた（表３）。
【００８１】
【表３】
2009544291.tif 000004
【００８２】
ＭＵＣ１−８、ＭＵＣ１−８−５Ｆ、ＭＵＣ１−８−８Ｌ及びＭＵＣ１−８−５Ｆ８ＬペプチドによるＲＭＡ−Ｓ細胞上ＭＨＣクラスＩの安定化
２６℃下におけるＴＡＰ２欠損細胞（ＲＭＡ−Ｓ）中のＭＨＣ重鎖のペプチドに依存した安定性に基づいて、ＭＵＣ１−８、ＭＵＣ１−８−５Ｆ、ＭＵＣ１−８−８Ｌ及びＭＵＣ１−８−５Ｆ８ＬペプチドのＭＨＣクラスＩであるＨ−２Ｋｂへの結合を、アセンブリ試験において測定した。ＭＵＣ１−８は１０−４Ｍを超えてＭＨＣクラスＩであるＨ−２Ｋｂを安定化、ＭＵＣ１−８−５Ｆは１０−７Ｍを超えてＨ−２Ｋｂを安定化、ＭＵＣ１−８−８Ｌは１０−６Ｍを超えてＨ−２Ｋｂを安定化、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌは１０−９Ｍを超えて安定化した（図１）。
【００８３】
生体内におけるＴ細胞発生
生体外での１８時間のＥＬＩＳｐｏｔアッセイでは、特異的に活性化した記憶（エフェクター）細胞（ＣＤ４及びＣＤ８両方のサイトカインを産生する末端エフェクター）を検知するため、細胞増殖を必要としない。前記アッセイの検出感度は、限界希釈法、ＦＡＣｓｃａｎ分析もしくはＥＬＩＳＡ法よりも高く、５００，０００個の細胞につき１個の抗原特異的エフェクターの前駆体頻度を確実に検知できる（参考文献２０及び２１）。このように、前記方法は、低い前駆体頻度で抗原特異的細胞を検知するのに適切な方法であるため、ＣＴＬアッセイは行わなかった。
【００８４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＭＵＣ１−８、ＭＵＣ１−８−５Ｆ、ＭＵＣ１−８−８Ｌ及びＭＵＣ１−８−５Ｆ８ＬペプチドがＴ細胞反応を誘発する能力の測定は、様々な濃度（１０−５〜１０−１２Ｍ）でのＭＵＣ１−８、ＭＵＣ１−８−５Ｆ、ＭＵＣ１−８−８Ｌ及びＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌペプチドを認識させた後、ＥＬＩＳｐｏｔ分析によってＩＦＮ−γを測定することにより行った。ＤＣ−ＭＵＣ１−８で免疫されたマウスでは、１０−７〜１０−５Ｍの濃度において全てのペプチドを認識するＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞が産生された（図２Ａ、ｉ）。ＤＣ−ＭＵＣ１−８−５ＦもしくはＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌで免疫されたマウスのＴ細胞では、１０−１０〜１０−５Ｍの範囲で全てのペプチドを認識するＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞が産生されたが、細胞５００，０００個あたりのｓｆｕ値は、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌで免疫されたマウスのほうが高かった（図２Ａ、ｉｉ及びｉｉｉ）。ＭＵＣ１−８−８Ｌで免疫されたマウスでは、１０−９〜１０−５Ｍで他のペプチド全てを認識するＴ細胞が産生された（図２Ａ、ｉｖ）。したがって、ペプチドの親和性と相関するＴ細胞誘導は、すなわち、強度の増加において、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ＞ＭＵＣ１−８−５Ｆ＞ＭＵＣ１−８−８Ｌ＞ＭＵＣ１−８という順序であった。
【００８５】
ＭＵＣ１−８が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて免疫原性であることは明らかであるので、該ペプチドは、ＭＵＣ１ｘＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスにおいては免疫原性でない（図２Ｂ、ｉ）。しかし、ＭＵＣ１−８−５Ｆ、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ及びＭＵＣ１−８−８ＬをもたらすＭＵＣ１−８ペプチドに対する変異によって、ＭＵＣ１ｘＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス（ＭＵＣ１−８は自己である）におけるＴ細胞応答の大きさは増加する（図２Ｂ）。すなわち、ＭＵＣ１−８−５Ｆ及びＭＵＣ１−８−８Ｌは、ＭＵＣ１−８よりも１０倍高く全ペプチドを認識し（図２Ｂ、Ｉ、ｉｉ及びｉｖ）、二重置換変異ペプチド類似体ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌで免疫されたマウスでは、全てのペプチドを認識する、親和性のより一層高いＴ細胞が産生した（図２Ｂ、ｉｉｉ）。さらに、ＭＵＣ１−８ペプチドの免疫化は、２００ｓｆｕ／５００，０００細胞＝１／２，５００の前駆体頻度をもたらし、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌの免疫化では、４００ｓｆｕ／５００，０００細胞＝１／１，２５０の前駆体頻度をもたらす。前駆体頻度が２倍に増加することが、生体内におけるペプチドの予防効果及びＣＴＬによる腫瘍細胞の認識に、劇的な影響を及ぼす。このことは、前駆体頻度が腫瘍予防及びＣＴＬ誘導に関連している、様々なＭＵＣ１抗原製剤において実証されており、２倍の増加でも劇的な効果を生じる（参考文献５３）。さらに、肝臓段階のマラリアを使った研究では、前駆体頻度が２倍（１／８，０００〜１／４，０００）増加することにより、ＣＤ８Ｔ細胞の予防効果が４倍増加することが示されている（参考文献５１）。重要なことに、これらの頻度値における差異は、統計的に有意であり、一層高い親和性を伴ったＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ結合を示唆し、図１及び表３に示した結合アッセイのデータを裏付ける定量的に有効なデータをもたらす。野生型ＭＵＣ１−８ペプチドへの変異が、寛容を克服し、より親和性の高いＴ細胞をもたらすことは明らかである。
【００８６】
ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ変異ペプチドのＨ−２Ｋｂとの結合：Ｘ線結晶構造
２．７オングストローム分解能におけるＨ−２Ｋｂ−ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌの結晶構造を分子置換によって決定し、精密化によって最終的なＲｗｏｒｋは１９．３％、Ｒｆｒｅｅは２４．７％となった（表２）。最終的な原子座標は、Ｈ−２Ｋｂ重鎖（残基１−２７４）、β２−ミクログロブリン（残基１−９９）、４つの糖鎖（重鎖Ａｓｎ８６におけるＮＡＧ及び、重鎖Ａｓｎ１７６におけるＮＡＧ及びＦＵＣ）及び、全てのペプチド残基Ｐ１−Ｐ８（ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ）から構成されていた。さらに、２個のリン酸（ＰＯ４３−）分子及び４個のＭＰＤ分子が存在していた。結合ペプチドの電子密度は、連続的で、よく分離されていた（図３Ａ）。
【００８７】
ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ、ＭＵＣ１−８及びＯＶＡ８の重ね合わせ図では、横から見た際に、よく似たオーバーレイが確認された（図３、Ｂ及びＣ）。ＭＵＣ１−８とＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌとの間のＲＭＳＤは非常に低かった（０．１９オングストローム、表４）が、ＯＶＡ８とＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌとの間のＲＭＳＤは大幅に高く（０．５７オングストローム、表４）、ＭＵＣ１−８とＯＶＡ８との間（ＲＭＳＤ  ０．５１オングストローム；図３Ｄ）と同程度であった。
【００８８】
【表４】
2009544291.tif 000005
【００８９】
ＭＵＣ１−８−５Ｆ８ＬペプチドのＨ−２Ｋｂとの相互作用：Ｘ線結晶構造
高親和性の相互作用は、主にＮ及びＣ末端周辺にあるＭＨＣ側鎖とペプチド主鎖間の高度に保存された水素結合ネットワークの構造、及び、ＭＨＣポケット（ｐｏｃｋｅｔ）中のペプチド側鎖の最適適合と一致する。ペプチド残基とＭＨＣとの間にある分子間Ｈ結合を、表５及び図４にまとめた。
【００９０】
【表５】
2009544291.tif 000006
【００９１】
ＭＨＣグルーブ内のペプチド付近に位置する水分子の数は、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ、ＭＵＣ１−８及びＯＶＡ８の結晶構造間で異なっていた。ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ結晶構造では、ＭＵＣ１−８結晶構造（１０個の水分子；図５Ｂ）、もしくはＯＶＡ８（７個の水分子；図５Ｃ）よりも少ない水分子（６個の水分子；図５Ａ）が確認された。ＭＵＣ１−８では、ＡｓｐＰ４とＬｙｓ６６との間に塩橋の損失が観察されたが、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ結晶構造には、ＡｓｐＰ４とＡｒｇ１５５との間、及び、ＡｒｇＰ６とＧｌｕ１５２との間に分子間塩橋が保存されていた。ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌペプチドでは、親である非標準ペプチドＭＵＣ１−８で確認されたように、ＡｓｐＰ４とＡｒｇＰ６との間に認められる分子間塩橋が保存されていた。ＯＶＡ８において、ＧｌｕＰ６とＬｙｓＰ７との間に存在する分子間塩橋によって、ＧｌｕＰ６を伴うＡｒｇ１５５とＬｙｓＰ７を伴うＡｓｐ７７との間に分子間塩橋が確認された。
【００９２】
Ｈ−２Ｋｂグルーブ内のペプチド結合は、主に、Ｈ結合と塩橋形成の相対的な寄与に起因している。さらに、Ｈ−２Ｋｂポケット内、すなわち、Ｃ及びＦ内の関連残基に対するペプチド残基の結合を補助する水分子の介入もまた大きな要因である。Ｈ−２Ｋｂ−ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ結晶のＣ及びＦの両ポケットは、ＯＶＡ８において確認されたのと同様に、Ｐ５及びＰ８の側鎖によって占められている。ＭＵＣ１−８の短いＰ５及びＰ８のアンカー残基をそれぞれＰｈｅ及びＬｅｕに修飾することが、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８ＬペプチドのＨ−２Ｋｂに対する強固な結合に貢献していたのである。対して、ＭＵＣ１−８のＨ−２Ｋｂに対する弱い結合は、これらのポケットを埋める位置に、適切なアンカーが欠如していることによると考えられる。結果的に、ペプチドのＭＨＣに対する結合は、ポケットＣ及びＦの近傍における水分子との間接的なＨ結合を通じて行われる。
【００９３】
ＭＵＣ１−８ぺプチド類似体のＨ−２Ｋｂとの相互作用：分子モデリング
ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌの結晶構造を、ＭＵＣ１−８−５Ｆ及びＭＵＣ１−８−８Ｌペプチド類似体のモデル化に使用した。これらの得られたモデルを、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌの結晶構造（本願記載）と同様、親である非標準ペプチドＭＵＣ１−８（１Ｇ７Ｑ）及び標準ペプチドＯＶＡ８（１ＶＡＣ）の結晶構造と比較した。Ｈ−２Ｋｂへの結合におけるアンカー修飾の効果を評価するために、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ、ＭＵＣ１−８及びＯＶＡ８間における比較も行った。Ｃα主鎖原子におけるＲＭＳＤｓを計算し、表４に記載した。ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌと、分子モデルのＭＵＣ１−８−５Ｆ及びＭＵＣ１−８−８Ｌとを重ね合わせたところ、それぞれ、１．１８オングストローム及び０．５８オングストロームというＲＭＳＤ値が得られた。比較のために、すべてのペプチドを標準ＯＶＡ８ペプチドと重ね合わせたところ、０．５１オングストローム（ＭＵＣ１−８）、０．５７オングストローム（ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ）、０．６０オングストローム（ＭＵＣ１−８−８Ｌ）及び１．２７オングストローム（ＭＵＣ１−８−５Ｆ）というＲＭＳＤ値が得られた（図３Ｄ−Ｆ）。最大偏差は、５Ｆアンカー修飾ペプチド（ＭＵＣ１−８−５Ｆ）において確認され、ＲＭＳＤ値は、１．２７オングストローム（ＯＶＡ８）、１．１８オングストローム（ＭＵＣ１−８）及び１．１４オングストローム（ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ）であった。このデータは、４℃で行った親和性測定と非常に相関していた（表２）。分子間Ｈ結合を、表５にまとめる。
【００９４】
考察
癌患者において効果的な免疫反応を導き出すために適切な抗原を選択することは、効果的なワクチン設計の第一歩である。しかし、そのような抗原に対する寛容が、依然として克服における障害となっている。さらに、抗原部分の同定及び、もっとも重要な免疫原性断片の同定においても課題が残されている。今日まで、癌免疫療法のために選択された中〜高程度の親和性ペプチドは、臨床試験において限られた成果しかもたらしてこなかった。例えば、部分的もしくは全体的な腫瘍退縮は、メラノーマペプチドを投与された患者の１０〜３０％にしか確認されなかった（参考文献５４）。免疫系の構築中に除去されているＴ細胞が欠乏してしまうため、効果的なＣＴＬ応答を引き起こし、腫瘍細胞の予防もしくは根絶をもたらす親和性の高い「自己」エピトープの有効性については成果が得られていなかった（参考文献２３〜２６）。つい最近では、より有望な結果が得られる低〜中程度の親和性ペプチドが選択されている。例えば、自然発現したマウステロメラーゼ逆転写酵素（ｍＴＥＲＴ）由来の低親和性エピトープのヘテロクリット性（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）変異体は、ワクチン接種による高い有効性が確認され、低親和性ｐ５７２及びｐ９８８エピトープで免疫されたマウスにおいて、腫瘍負荷に対する保護作用がもたらされた（参考文献５５）。
【００９５】
Ｈ−２Ｋｂと複合化した低親和性の非標準ＭＵＣ１−８ペプチドの結晶構造は、すでに報告されている（参考文献２０）。さらに、ＭＵＣ１−８は、Ｈ−２Ｋｂに対して低親和性であるにもかかわらず、マウスにおいて免疫反応を引き起こす能力があることが示されている。本願では、Ｈ−２Ｋｂと複合化したＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌペプチドの結晶構造を報告しており、これは、非標準アンカー残基を標準アンカー残基に修飾して（ＴｈｒＰ５をＰｈｅ、ＡｌａＰ８をＬｅｕ）、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌとした後に、親であるＭＵＣ１−８ペプチドのＨ−２Ｋｂに対する結合性が向上することを理解する上での手掛かりとなる。本発明では、Ｔ細胞応答の向上が確認され、この応答は、修飾するアンカーによって異なっていた。生物学的データによって、Ｐ８のＬｅｕへの修飾（ＭＵＣ１−８−８Ｌ）は、ＭＵＣ１−８と比べると３倍しかペプチド親和性を増加させなかったが、主要アンカーＰ５のＰｈｅへの修飾（ＭＵＣ１−８−５Ｆ）においては、Ｐ８残基のＬｅｕへの修飾（ＭＵＣ１−８−８Ｌ）に比べて７倍もペプチド親和性を増加させたことが判明した（競合研究における測定より）。比較において、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌは、結合親和性において１４倍もの増加を示した。ＦＡＣＳによって測定を行った、ＴＡＰ２欠損ＲＭＡ−Ｓ細胞を用いた安定化研究においても同様の結果が得られた。
【００９６】
生体内におけるＴ細胞応答では、二重置換ＭＵＣ１−８ペプチド、すなわちＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌで免疫されたＣ５７ＢＬ/６マウスにおいて、その他の全てのペプチド（ＭＵＣ１−８、ＭＵＣ１−８−５Ｆ及びＭＵＣ１−８−８Ｌ）がより強く認識されることも明らかにした。ＭＵＣ１×ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスでは、もっと弱いＴ細胞応答が確認されたが、全体的傾向においては、非標準低親和性ＭＵＣ１−８ペプチドに対するアンカー置換によって、より一層免疫原性が高くなる（すなわち、寛容を克服する）ことが判明した。Ｐ１位におけるチロシン置換によって、免疫原性、及びＨＬＡ−Ａ２．１に対する非免疫原性の低親和性ペプチドの結合性が向上した。親ペプチドに比べ、結合親和性を５５倍に増加する及び／又は２時間を超えて安定化することが可能となる。もっとも重要なことに、前記変異によって、親ペプチドをも認識するＣＴＬが誘導された（参考文献４２）。低親和性ＭＵＴ１ペプチド（３ＬＬルイス肺癌から分離されたＴＡＡ）を、アンカー位置Ｐ３、Ｐ５及びＰ８で修飾したところ、同様に、免疫応答及びＨ−２Ｋｂに対する結合性において向上がみられた（参考文献４３）。さらに、もっと親和性の高いペプチド（ＳＡＰＤＴＲＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）から、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌと同程度の親和性であるＳＡＰＤＴ−ＧａｌＮＡｃ−ＲＰＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）までを用いてマウスを免疫化した。発生したＴ細胞は、非変異のより低親和性ペプチドに比べ、変異した親和性のより高いペプチドを一層効率的に認識した（参考文献２１）。
【００９７】
Ｈ−２Ｋｂと複合化したＭＵＣ１−８及びＯＶＡ８の両結晶構造を比較したところ、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌの結晶構造においては、Ｎ末端、すなわち、Ｔｙｒ７、Ｇｌｕ６３、Ｔｙｒ１５９及びＴｙｒ１７１を伴うＳｅｒＰ１において多くのＨ結合が失われていることが判明した。また、様々なＣ末端Ｈ結合も、ＯＶＡ８に関してＳｅｒ７３ではなくＴｙｒ１４７を伴うＰｒｏＰ７、及び、Ｌｙｓ１４６を伴うＬｅｕＰ８（Ｐ８位のＡｌａ残基をもつＭＵＣ１−８に見られる）に認められた。ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌペプチドの結合配座は、ＭＵＣ１−８の主鎖と非常に類似しており、ＯＶＡ８のものと同等であった。興味深いことに、ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌペプチドを取り巻く水分子の数は、ＭＵＣ１−８（１０個）よりも低く（６個）、ＯＶＡ８（７個）とほぼ同程度であった。Ｃ及びＦポケットは、大型の疎水性残基であるＰｈｅ及びＬｅｕで完全に埋まっており、ＯＶＡ８と同様のペプチドのＨ−２Ｋｂに対する強い結合親和性に起因すると考えられる方法で、このペプチドが結合グルーブ内で安定化するのを助けている。ＭＵＣ１−８構造中のＣ及びＦの両ポケットに存在する大きな空洞は、低親和性ＭＵＣ１−８ペプチドの安定化を助ける水分子で占められている。つまり、これらの水分子は、高親和性結合ペプチドであるＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ及びＯＶＡ８には存在しない。ＯＶＡ８及びＭＵＣ１−８と比較すると、Ｈ−２Ｋｂ−ＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌ結晶構造では、Ｈ−２ＫｂのＥポケットに水分子が存在しないことに注目すべきである。
【００９８】
分子モデリング研究では、ＭＵＣ１−８−５Ｆが最大値を過ぎて、親であるＭＵＣ１−８ペプチド構造ＯＶＡ８及びＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌから逸脱していることを示した（表４）。ＭＵＣ１−８−８ＬとＭＵＣ１−８との間、ＯＶＡ８とＭＵＣ１−８−５Ｆ８Ｌとの間のＲＭＳＤｓはさらに低く（表４）、ペプチドのＣ末端における修飾が、ペプチド−Ｈ−２Ｋｂ複合構造に影響しないことを同程度に示している。つまり、そのデータには、４℃で得られた親和性のデータとの相関性が認められた。
【００９９】
全体的に、本実施例の成果によって、ＭＵＣ１−８などの非標準腫瘍エピトープになされたアンカー修飾により、ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｋｂへの結合性が著しく向上し、その際には、Ｔ細胞応答もまた改善され得ることが実証された。
【実施例２】
【０１００】
＜人体研究−ＨＬＡ−Ａ２に対する親和性を高めるペプチド修飾の原理＞
ＭＵＣ１エピトープペプチドを参考文献２２記載の通りに同定し、低い親和性でＨＬＡ−Ａ＊０２０１クラスＩ分子に結合することができ、さらに、ＭＵＣ１＋ヒト乳癌細胞を直接溶解可能なＣＴＬを誘発することのできるペプチドを選択した。生体内におけるＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答によって測定されたペプチドの免疫原性は、ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩに対するペプチド結合親和性と相関を示すと考えられたため（参考文献２９及び３０）、本実施例では、「アンカー」残基をあらかじめ決められた標準アミノ酸に置換（参考文献３１）することによって、ペプチドＭＨＣ相互作用の向上と、それに続く免疫原性の改善がもたらされるかを調べた。
【０１０１】
参考文献５９の研究では、下記の観察結果が得られている。
【０１０２】
模倣ペプチドＤＡＨＷＥＳＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１８）への変異
マウス模倣ペプチド（ＤＡＨＷＥＳＷＬ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）は、周知のＨＬＡ−Ａ２アンカーアミノ酸を含まない。マウス模倣ペプチドに対していくつかの変異を施した。つまり、ＭＵＣ１に対する免疫反応が向上したものもあったが、特異免疫反応を減少させたもの、もしくは特異免疫反応を全く示さなかったものもあった。まとめると、
ＤＡＨＷＥＳＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）は、１／１８，０００のＣＴＬｐを生じた；
ＤＡＨＷＲＳＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）は、１／１，０００，０００より少ないＣＴＬｐを生じた；
ＤＡＨＷＹＳＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）は、１／８００，０００のＣＴＬｐを生じた；及び、
ＤＡＨＷＦＳＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）は、１／１３０，０００のＣＴＬｐを生じた。
【０１０３】
つまり、前記ペプチドに対する変異は、必ずしも免疫反応の向上をもたらすものではなかった。
【０１０４】
また、ＤＡＨＷＥＳＷＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を、ＤＬＨＷＡＳＷＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）へ変異させた。ここでは、ある特定のアンカー残基を置換し、ＨＬＡ−Ａ２とより相性のよいペプチドを生成した。ペプチドＤＬＨＷＡＳＷＶ−ＫＬＨ酸化マンナンによるＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスの免疫化によって、ＭＣＦ７細胞（ヒトＭＵＣ１＋乳癌細胞株）を特異的に溶解することができるＣＴＬの産生がもたらされた。この変異されたペプチドを、現在の試験において対照として用いた。
【０１０５】
ＨＬＡ−Ａ２に結合する低親和性ＭＵＣ１ペプチド（ＳＡＰＤＴＲＰＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及び低〜中程度の親和性ペプチド（ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、高親和性結合を可能にする標準アンカーアミノ酸を含んでいない。Ｐ２、Ｐ６、Ｐ９位の残基は、ＨＬＡ−Ａ２のペプチド結合グルーブ中に向かって「下向く（ｐｏｉｎｔ  “ｄｏｗｎ”）」（参考文献２０）。結合に好適な残基は、Ｐ２におけるＬｅｕ／Ｍｅｔ及び、Ｐ９におけるＬｅｕ／Ｖａｌである。さらに、Ｐ６のＶａｌは、補助的なアンカー残基として働く（参考文献３１）。残りのアミノ酸残基は、主に、ＴｃＲへの提示に関与している。
【０１０６】
ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を、Ｐ６位及びＰ９位における変異によって変化させた（高親和性への変化と想定される）。２種類のアミノ酸を置換し、ペプチドＳＴＡＰＰＶＨＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を生成させた。さらに、Ｐ１位のＳｅｒ残基をＴｈｒへ変異させた（ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。ペプチドＴＴＡＰＰＶＨＧＬ−ＫＬＨ−酸化マンナンによるＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスの免疫化は、ＭＣＦ７細胞（ヒトＭＵＣ１＋乳癌細胞株）を特異的に溶解できるＣＴＬの産生をもたらした。ＴＴＡＰＰＶＨＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は、ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で免疫されたマウスと同様に、ＭＣＦ７細胞を溶解した。つまり、前記の溶解は、マンナン−ＭＵＣ１融合蛋白質と、模倣変異ペプチド（ＤＬＨＷＡＳＷＶ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の場合とも似ていた（図１）。
【実施例３】
【０１０７】
＜人体研究−共役体の調製とマウスの免疫化＞
材料及び方法
ペプチド−ＫＬＨ共役
グルタルアルデヒドを介して、ペプチドをＫＬＨに結合させた。端的に言うと、２ｍｇのＫＬＨを含む１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、２ｍｇのペプチドを含む１ｍｌのＰＢＳとを混合し、０．７５％のグルタルアルデヒドを１ｍｌ滴下添加し、室温で一晩反応させた。グルタルアルデヒドは、アミノ基を介して２つの化合物を連結させる二官能性カップリング試薬である。
【０１０８】
ペプチド−ＫＬＨへの酸化マンナン共役
１４ｍｇのマンナンを、１ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中に溶解し、続いて、０．１Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム（ｐＨ６のリン酸緩衝液で溶解）を１００μl添加し、暗所にて氷上で１時間インキュベートした。その後、１０μＬのエタンジオールを前記混合物に添加し、氷上でさらに３０分間インキュベートした。得られた混合物（酸化マンナン）を、予めｐＨ９．０のリン酸緩衝液中で平衡化したＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラム）に通過させ、過ヨウ素酸ナトリウム及びエタンジオールを除いた。酸化マンナン（７ｍｇ／ｍｌ）を、２ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ９）で溶出し、そこに、１ｍｇのペプチド−ＫＬＨを添加し、暗所にて、室温で一晩反応させた。共役は、ＫＬＨ及び酸化マンナンの遊離アミノ基間におけるシッフ塩基形成を介して起こる。試料は、さらに精製することなく用いた。酸化マンナンは、参考資料８、１５、１６、１８、１９、２２及び２８にすでに記載の通り、ＭＵＣ１融合蛋白質（Ｍ−ＦＰ）に共役された。
【０１０９】
マウスの免疫化
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスを、０日目、１０日目、１７日目に、５μｇのペプチドを腹腔内投与して免疫化し、７〜１０日後に、参考資料１８、１９、２２及び２８記載の通り、標準的なＣＴＬアッセイを用いてＣＴＬ応答を測定した。
【０１１０】
結果及び考察
本結果によって、ペプチドＴＴＡＰＰＶＨＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）−ＫＬＨ−酸化マンナンで免疫されたＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスが、ＭＣＦ７細胞（ヒトＭＵＣ１＋乳癌細胞株）を特異的に溶解できるＣＴＬの産生をもたらすことが実証された。変異したエピトープは、２位に標準Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｖａｌを有していなかったため、本結果は驚くべきものである。
【０１１１】
本明細書全体にわたり、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載される要素や、整数、または要素群や整数群を包含するが、任意の他の要素、整数または、要素群もしくは整数群を排除するものではない。
【０１１２】
以下で参照される全ての科学的引用、特許、特許出願及び製造者の技術仕様書は、余すところ無く本願に組み込まれる。
【０１１３】
本明細書における任意の先行技術の参照は、その先行技術が、任意の国において、共通の一般的知識の一部を形成することを認めるもの、もしくはいかなる形でも示唆するものではなく、且つ、そのように解釈してはならない。
【０１１４】
特に記載がない限り、本発明は特定の製剤成分、製造方法、生物学的物質もしくは試薬、用法・用量などに限定されることはなく、したがってこれらが変動しうることも理解されるべきである。本願で使用される専門用語は、特定の実施態様を記載する目的だけであって、限定されることを意図するものでないことも理解されるべきである。
【０１１５】
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【図１】
2009544291.tif 000007
【図２】
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【図３】
2009544291.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2009544291.tif 000015
2009544291.tif 000016
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