(57)【要約】  微生物を用いた粗ナフタレンジカルボン酸の精製方法に関し、前記精製方法によれば、２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換する能力を有する微生物を粗ナフタレンジカルボン酸と反応させた後、反応溶液に一定条件で酸性溶液を加えて撹拌しながら前記粗ナフタレンジカルボン酸を結晶化し、前記結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を洗浄した後、洗浄された生成物を乾燥することで、純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸を得ることにより、粗ナフタレンジカルボン酸が精製される。前記精製方法によると、高純度の結晶形２，６−ナフタレンジカルボン酸を環境親和的に大量生産することができる利点がある。【選択図】図１
2009518054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２−ホルミル−６−ナフトエ酸（２−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）を２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に転換する能力を有する微生物を粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）と反応させて前記粗ナフタレンジカルボン酸中の２−ホルミル−６−ナフトエ酸を除去する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で調製された反応溶液に酸性溶液を加えてｐＨを調整した後、その混合溶液を撹拌しながら反応させることで前記粗ナフタレンジカルボン酸を結晶化する段階；
（ｃ）前記結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を洗浄してその中に含まれている不純物を除去する段階；および
（ｄ）洗浄された生成物を乾燥して純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸を得る段階を含む微生物を用いた粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の精製方法。
【請求項２】
前記（ａ）段階が、
１）前記微生物を液体培地に接種して振盪培養した後、遠心分離により回収した菌体を生理食塩水または蒸留水で懸濁して反応用菌体を準備する段階；
２）基質である粗ナフタレンジカルボン酸を緩衝溶液と混合した後、アルカリ溶液を加えて混合溶液のｐＨを調節して精製反応溶液を製造する段階；および
３）前記１）で調製した活性菌体（ａｃｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）と前記２）で調製した反応溶液とを反応させて粗ナフタレンジカルボン酸中の２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換して２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の純度を高める段階との副段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、バシラスまたはシュードモナス属に属する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、バシラス属Ｆ−１（ＫＣＴＣ−１０３４２ＢＰ）、バシラス属Ｆ−３（ＫＣＴＣ−１０３３５ＢＰ）またはシュードモナス属ＨＮ−７２（ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝溶液が、水、炭酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ２Ｏ３／ＮａＨＣＯ３）、グリシン緩衝溶液（ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ）、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ）、リン酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）、コハク酸緩衝溶液（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ／ＮａＯＨ）、酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸緩衝溶液（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ピロリン酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７／ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ／ＮａＯＨ）およびホウ酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒａｔｅ／ＨＣｌ）からなる群より選択され、その濃度は０．１〜１００ｍＭである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリ溶液が、ＮａＯＨまたはＫＯＨである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記混合溶液が、有機溶媒をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）およびテトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）からなる群より選択され、その添加濃度は０．０１〜１０％である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応が、２５〜５０℃、１分〜２時間で行われる請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸性溶液が、硫酸、塩酸、氷酢酸および硝酸からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＨが、１〜４の範囲に調整される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応が、４〜８０℃、１分〜１２時間で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記撹拌が、０〜１０００ｒｐｍの速度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ｃ）段階が、結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を水に分散させた後、１〜２８ｋｇ／ｃｍ２の圧力および１００〜２５０℃の温度で１０分〜１時間撹拌し、濾過して水を除去する過程を数回繰り返すことで行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記乾燥が、３０〜２００℃で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記（ａ）段階後前記（ｂ）段階前に、前記（ａ）段階で用いた微生物を除去する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物除去が、マイクロフィルターシステム、連続遠心分離機またはデカンター（ｄｅｃａｎｔｅｒ）を用いて行われる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイクロフィルターシステムが、セラミック、ステンレス、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から選択される材質からなる孔径０．１〜０．５□のフィルターを用いる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法により生成された純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【請求項２０】
前記２，６−ナフタレンジカルボン酸が、定形または無定形の結晶状態である請求項１９に記載の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【請求項２１】
前記定形の結晶状態が、格子構造である請求項１９に記載の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【請求項２２】
前記２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶の平均粒径が、１００□以上である請求項１９に記載の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた粗ナフタレンジカルボン酸の精製方法および前記方法により得られた結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸に関し、より詳細には、本発明は、２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換する能力を有する微生物を粗ナフタレンジカルボン酸と反応させて前記粗ナフタレンジカルボン酸中に含まれている不純物である２−ホルミル−６−ナフトエ酸を除去した後、一定条件で酸性溶液を反応溶液に加え、その混合溶液を撹拌しながら前記粗ナフタレンジカルボン酸を結晶化し、前記結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を洗浄して前記結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸に含まれているその他の不純物を除去した後、洗浄された生成物を乾燥することで、純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸を得ることを特徴とする粗ナフタレンジカルボン酸の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２，６−ナフタレンジカルボン酸および２，６−ナフタレンジカルボン酸のジエステルは、ポリエステルおよびポリアミドのような様々な高分子物質を調製するのに有用な単量体である。たとえば、２，６−ナフタレンジカルボン酸（以下、ＮＤＡ）および２，６−ナフタレンジカルボン酸のジエステル（以下、ＮＤＣ）をエチレングリコールと縮合して高性能ポリエステル物質であるポリ（エチレン２，６−ナフタレート）（以下、ＰＥＮ）を生成することができる。ＰＥＮから製造された繊維およびフィルムは、ポリ（エチレンテレフタレート）（以下、ＰＥＴ）に比べて強度が高くて熱的性質に優れている。これらの利点に基づき、ＰＥＮは、磁気記録テープおよび電子部品の製造に使用できる薄膜のような商用品を製造するのにとても適している。また、ＰＥＮは、気体拡散、特に二酸化炭素、酸素および水蒸気に対する抵抗性に優れるため、ＰＥＮから製造されたフィルムは、食品容器、特に高温充填する食品容器を製造するのに有用である。さらに、ＰＥＮは、タイヤコード製造に有用な強化繊維を製造するのに用いられることができる。
【０００３】
現在、ＮＤＣは、２，６−ジメチルナフタレン（以下、２，６−ＤＭＮ）を酸化させて粗ナフタレンジカルボン酸（以下、ｃＮＤＡ）を得た後、このｃＮＤＡをエステル化して生産されており、ＰＥＮ合成時、主原料として用いられている。しかし、ＰＥＮ合成時、主原料としてＮＤＣを用いる場合、２，６−ナフタレンジカルボン酸（以下、ＮＤＡ）を用いる場合に比べていくつかの問題がある。まず第一に、ＮＤＡ縮合反応時には副産物として水が生成される反面、ＮＤＣの場合には副産物としてメタノールが生成されて爆発の危険がある。第二に、ＮＤＡをエステル化してエステル化物を精製して純粋なＮＤＣを生産するため、ＮＤＡの使用に比べて一つの段階を追加で必要とする。第三に、既存のＰＥＴ生産設備の利用面においてＮＤＣの使用は適切ではない。このようなＮＤＣの使用により引き起こされる問題点にもかかわらず、ＰＥＮ製造時、ＮＤＣが優先的に用いられる理由は、未だにＰＥＮの合成に必要な純度を有する精製したＮＤＡの製造が難しいためである。
【０００４】
２，６−ＤＭＮの酸化時には、２−ホルミル−６−ナフトエ酸（以下、ＦＮＡ）、２−ナフトエ酸（以下、ＮＡ）、トリメリット酸（以下、ＴＭＬＡ）など各種の不純物を含むｃＮＤＡが生成される。特に、ｃＮＤＡ中のＦＮＡの存在は、ＰＥＮを製造するための重合を停止させて重合度を低下させて重合体（すなわちＰＥＮ）の物理的特性に悪い影響を与えたりポリエステルの着色の原因になるため、ｃＮＤＡ中のＦＮＡを除去しなければならないが、ＦＮＡを除去するのには難しい問題が存在する。
【０００５】
これらの状況下、ｃＮＤＡ中にあるＦＮＡを除去するために、またはＮＤＡを精製するために、たとえば、ｃＮＤＡの再結晶法、ｃＮＤＡをもう一度酸化する方法、ｃＮＤＡをメタノールで処理してＮＤＣを製造した後に水和させてＮＤＡを製造する方法、ｃＮＤＡの水素化により精製したＮＤＡを製造する方法など様々な化学的方法が研究されてきた。これらの化学的方法に加えて、溶媒処理、溶融結晶、高圧結晶、超臨界抽出など多様な方法がＮＤＡを精製するために用いられている。
【０００６】
たとえば、特許文献１には、粗ナフタレンジカルボン酸を脂肪族アミン（ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ａｍｉｎｅ）または脂環式アミン（ａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｍｉｎｅ）を含む水溶液に溶解させ、粗ナフタレンジカルボン酸中に含まれている不純物である重金属成分を１００ｐｐｍ以下になるまで除去した後、前記ナフタレンジカルボン酸アミン塩を含有する水溶液を加熱してアミン成分を蒸留させることで高純度のナフタレンジカルボン酸を提供する、ナフタレンジカルボン酸を製造する方法が開示されている。
【０００７】
特許文献２には、不純物が含まれた芳香族カルボン酸（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）と水との混合物を、水素ガスの存在下、２７７〜３１６℃の温度、７７〜１２１ｋｇ／ｃｍ２の圧力で、水素化金属成分（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含まない炭素触媒と接触させる段階、前記混合物を冷却して前記芳香族カルボン酸を結晶化する段階、冷却した混合物から結晶化した芳香族カルボン酸を回収する段階を含み、純度が向上した芳香族カルボン酸を調製する方法が開示されている。
【０００８】
また、ＮＤＡの結晶化反応に関連して、特許文献３には、ポリ（アルキレンナフタレンジカルボキシレート）［ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌｅｎｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ］を１２５〜４００℃の温度で塩基性溶液（すなわちアルカリ金属ベースの水溶液、ヒドロキシド（ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）水溶液またはアルカリ金属カーボネートの水溶液）に溶解させる段階、１７０〜２４０℃で酸で水溶液を中和する段階、ＮＤＡを回収する段階を含むＮＤＡ結晶を回収する方法が教示されている。たとえば、ＮＤＡ結晶は、ポリエステル物質を１２５〜４００℃の温度でＮａＯＨまたはＫＯＨで溶解させた後、酢酸の水溶液で中和して回収される。
【０００９】
特許文献４には、Ｋ２−ＮＤＡ水溶液を、０〜５０℃の温度、０〜２００ｐｓｉのＣＯ２圧で処理してＫＨ−ＮＤＡを形成した後、前記ＫＨ−ＮＤＡを水に１：８（ＫＨ−ＮＤＡ：水）以上の比率で懸濁し、１００℃以上の温度（１４０〜１６０℃）、１００ｐｓｉ以上のＣＯ２圧（１７５〜２５０ｐｓｉ）でさらに懸濁液を処理する方法を含み、２，６−ＮＤＡの精製収率を４５％まで高める方法が教示されている。
【００１０】
しかしながら、これらの方法は、高純度のＮＤＡ結晶を生成するために、高温および高圧条件、長時間処理、多量の高価材料の使用などを必要とするため、経済的に不利である。また、精製収率および純度が非常に低く、個々のＮＤＡ結晶粒子間に凝集が生じて実際の生産に適用しにくい他の不利な点がある。
【特許文献１】米国特許第５８５９２９４号明細書
【特許文献２】米国特許第６２５５５２５号明細書
【特許文献３】米国特許第６０８７５３１号明細書
【特許文献４】米国特許第６４２６４３１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明は先行文献の問題点に鑑みてなされたもので、本発明の一の目的は、ＦＮＡをＮＤＡに転換する微生物を用いて常温常圧の条件下で粗ナフタレンジカルボン酸を精製および結晶化することで、高収率で高純度のＮＤＡを効率的に生成する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記方法により生成された均一な大きさを有する高純度のＮＤＡ結晶を提供することにある。
【００１３】
本発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、後述の添付図面を含めた詳細な記述からより明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するための本発明の一つの態様では、（ａ）２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換する能力を有する微生物を粗ナフタレンジカルボン酸と反応させて前記粗ナフタレンジカルボン酸中の２−ホルミル−６−ナフトエ酸を除去する段階；（ｂ）前記（ａ）段階で調製された反応溶液に酸性溶液を加えてｐＨを調整した後、その混合溶液を撹拌しながら反応させることで前記粗ナフタレンジカルボン酸を結晶化する段階；（ｃ）前記結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を洗浄して前記結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸の中に含まれている不純物を除去する段階；および（ｄ）洗浄された生成物を乾燥して純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸を得る段階を含む微生物を用いた粗ナフタレンジカルボン酸の精製方法が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の精製方法によれば、ＦＮＡをＮＤＡに転換する能力を有する微生物を用いて、それに適合した条件下で、粗ナフタレンジカルボン酸を精製および結晶化することで、高純度の結晶形２，６−ナフタレンジカルボン酸を有利に環境親和的に大量生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の粗ナフタレンジカルボン酸の精製方法を段階別により詳細に説明する。
【００１７】
（i）第１段階：微生物を用いた精製
この段階では、２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換する能力を有する微生物を粗ナフタレンジカルボン酸と反応させて前記粗ナフタレンジカルボン酸中の２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換する。
【００１８】
本段階では、１）前記微生物を液体培地に接種して振盪培養した後、遠心分離により回収した菌体を生理食塩水または蒸留水で懸濁して菌体を活性化する段階；２）基質である粗ナフタレンジカルボン酸（ｃＮＤＡ）を緩衝溶液と混合した後、アルカリ溶液を加えて混合溶液のｐＨを調節して精製反応溶液を調製する段階；および３）前記１）で調製した活性菌体（ａｃｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）と前記２）で調製した反応溶液とを反応させて粗ナフタレンジカルボン酸中に含まれる２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換して２，６−ナフタレンジカルボン酸の純度を高める段階との副段階を含む。
【００１９】
微生物としては、２−ホルミル−６−ナフトエ酸を分解する能力を有するものであれば、特に制限はないが、バシラス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）またはシュードモナス属（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）に属する微生物が好適に用いられる。
【００２０】
最も好ましくは、バシラス属Ｆ−１（ＫＣＴＣ−１０３４２ＢＰ）、バシラス属Ｆ−３（ＫＣＴＣ−１０３３５ＢＰ）またはシュードモナス属ＨＮ−７２（ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）が挙げられる。バシラス属Ｆ−１およびバシラス属Ｆ−３は、韓国特許出願第２００２−００８７８１９号に記載されている。シュードモナス属ＨＮ−７２菌株は、２００５年６月２１日国際寄託機関である韓国生命工学研究所遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰとして寄託された。
【００２１】
これらの微生物は、２５〜４５℃の広い範囲の温度で、好ましくは２８〜３５℃で液体培地（たとえば、ＬＢまたはＭ９培地）を用いて容易に培養することができる。
【００２２】
前記緩衝溶液の種類としては、特に制限されることはないが、たとえば、水、炭酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ２Ｏ３／ＮａＨＣＯ３）、グリシン緩衝溶液（ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ）、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ）、リン酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）、コハク酸緩衝溶液（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ／ＮａＯＨ）、酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸緩衝溶液（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ピロリン酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７／ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ／ＮａＯＨ）、ホウ酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒａｔｅ／ＨＣｌ）などを用いることができる。好ましくは、ｐＨ６．０〜９．０の緩衝溶液範囲を有するリン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ）またはホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ／ＮａＯＨ）を用いる。このとき、前記緩衝溶液の濃度は、０．０１〜１００ｍＭであるのが好ましい。前記アルカリ溶液としては、ＮａＯＨまたはＫＯＨを用いるのが好ましいが、特に制限されることはない。前記混合液のｐＨは、６〜１０に調節するのが好ましい。
【００２３】
前記２）段階の混合溶液には、ｃＮＤＡを溶解させる目的のため、有機溶媒をさらに添加することができる。好ましい有機溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、“ＤＭＳＯ”）、ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、“ＤＭＦ”）、ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ、“ＤＭＡ”）、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ、“ＴＨＦ”）などが挙げられるが、これらのうち、ジメチルスルホキシドが酵素活性面において最も好ましい。このとき、前記有機溶媒の添加濃度は、０．０１〜１０％添加するのが好ましいが、より好ましくは、有機溶媒を添加しない。前記有機溶媒の濃度が１０％を超過すると、微生物の細胞膜を溶解させて反応を阻害する結果をもたらす。
【００２４】
前記３）段階の反応は、２５〜５０℃、１分〜２時間で行うのが好ましく、３５〜４０℃、２５〜４０分間がより好ましい。反応温度が２５℃未満または５０℃を超過する場合には、菌体の活性が顕著に減少して好ましくない。
【００２５】
一方、ｃＮＤＡ中のＦＮＡ含量、反応溶液中のｃＮＤＡ濃度およびＦＮＡ完全除去のために必要な菌体量の間には密接な関係がある。すなわち、ｃＮＤＡ中のＦＮＡ含量および反応溶液中のｃＮＤＡ濃度が高いほど、ＦＮＡを除去するために多い量の菌体を必要とする。
【００２６】
（ii）第２段階：結晶化
この段階では、前記（ａ）段階で調製された反応溶液に酸性溶液を加えてｐＨを調整した後、撹拌しながら反応させて前記粗ナフタレンジカルボン酸を結晶化する。
【００２７】
より具体的には、ＦＮＡが除去された反応溶液中に存在する非結晶状態のｃＮＤＡを常温常圧の条件下で結晶化するために、撹拌機が装備されている反応器内で、前記（ａ）段階で得られた反応溶液に適当量の酸性溶液を加えてｐＨを所望の範囲に調整した後、撹拌し続けながら適切な温度に維持して反応させる。
【００２８】
この結晶化は、常温常圧の条件で１００□以上の均一な大きさを有するｃＮＤＡ結晶を生成することができるため、本発明の精製方法は製造費用および工程面において経済的であり、個々のｃＮＤＡ結晶粒子間に凝集が生じないため、実用に適し最終生成物の回収率が高い利点がある。
【００２９】
前記酸性溶液としては、硫酸、塩酸、氷酢酸、硝酸などを用いることができ、ｃＮＤＡ結晶の大きさおよび収率を大きくできるため硫酸または硝酸を用いるのが好ましい。すなわち、硫酸または硝酸を加えると、１００□以上の均一な大きさを有するｃＮＤＡ結晶を高収率で生成することができる。
【００３０】
反応溶液の前記ｐＨは、最終生成物の回収率を上げるために１〜４に調整するのが好ましいが、反応溶液の前記ｐＨが低いほど、最終生成物の回収率は約９２％から９９．９％まで高くなる傾向を示す。
【００３１】
結晶化は、約４℃〜約８０℃、好ましくは２５〜６０℃で、約１分〜約１２時間、連続工程面においてより好ましくは２〜３０分間行う。前記結晶化の時間が短すぎると、ｃＮＤＡの結晶化度が低くて重合時に個々の結晶粒子間に凝集が発生し、前記結晶化の時間が長すぎると、不必要なエネルギー損失をもたらす。
【００３２】
ｃＮＤＡの結晶化を行うために必要な撹拌は、通常０〜１０００ｒｐｍの速度であり、好ましくは０〜４００ｒｐｍである。
【００３３】
（iii）第３段階：洗浄
この段階では、上記（ii）段階を通して結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を洗浄してその中に含まれている不純物を除去する。
【００３４】
微生物を用いた精製反応および結晶化反応の後にも、ＦＮＡはＮＤＡに転換されて除去されるが、２−ナフトエ酸（ＮＡ）、メチルナフトエ酸（ＭＮＡ）、トリメリット酸（ＴＬＭＡ）などのその他の不純物は除去されずに残る。したがって、結晶化したｃＮＤＡを水に分散させた後、一定条件下で数回洗浄すると、ｃＮＤＡと不純物との溶解度の差に基づき残っている不純物を完全に除去することができる。このとき、前記不純物だけでなく、ｃＮＤＡを精製するために用いられた微生物も洗浄により除去される。
【００３５】
本段階では、反応副産物が溶媒に溶解されていながら最大限多い量のＮＤＡが析出する状態で分離するのが好ましい。分離のための温度範囲は、１００〜２５０℃の間であり、好ましくは１５０〜２３０℃の間である。溶媒の分離温度が２５０℃を超過すると精製したＮＤＡの損失量が増加して収率が顕著に減少し、１００℃未満ではＮＡ、ＭＮＡ、ＴＬＭＡを含む副産物が溶解しにくい。
【００３６】
より具体的には、結晶化したｃＮＤＡを水に分散させた後、１〜２８ｋｇ／ｃｍ２の圧力および１００〜２５０℃の温度で１０分〜１時間撹拌し、濾過して水を除去する手順を数回繰り返すことで、不純物を除去する。このとき、溶媒の量は、ｃＮＤＡの５〜２０倍の量であるのが好ましい。
【００３７】
(iv）第４段階：乾燥
この段階では、上記洗浄により不純物が除去されたＮＤＡ結晶を一定温度で乾燥することで、純粋な結晶状態のＮＤＡを得る。このとき、乾燥は、３０〜２００℃の温度で行われるのが好ましく、公知の従来技術を制限なく用いることができる。
【００３８】
本発明の方法は、上記（i）段階後（ii）段階前に前記（i）段階で用いた微生物を除去する段階をさらに含むことができる。
【００３９】
ｃＮＤＡ精製後、事前に微生物を除去して結晶化反応を行うと、ｃＮＤＡ結晶の純度および回収率をより向上させることができる。
【００４０】
前記微生物の除去としては、公知の従来技術を制限なく用いることができ、たとえば、マイクロフィルターシステム、連続遠心分離機、デカンター（ｄｅｃａｎｔｅｒ）などを用いて除去することができる。前記マイクロフィルターシステムは、孔径０．１〜０．５□のセラミック、ステンレス、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から選択される材質からなるフィルターを用いる。
【００４１】
本発明の他の態様は、前記精製方法により生成される純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸を提供する。
【００４２】
本発明の精製方法は、２，６−ナフタレンジカルボン酸を、前記精製方法により９９．８％以上の高収率および高純度で、用途および必要に応じて処理条件を変えることで、定形または無定形の結晶状態で生成することができる。特に、定形の２，６−ナフタレンジカルボン酸は格子構造を有する。
【００４３】
また、本発明の２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶は、１００□以上の平均粒径および均一な粒子形態を有するため、ＰＥＮを生成する重合時、エチレングリコールと低粘度スラリーを形成するのにとても適している。２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶の平均粒径が１００□より小さいと、取り扱いが難しく、ＰＥＮ調製でエチレングリコールと混合してスラリーを形成するとき、スラリー形成能力が減少するため、消耗が多くなる。本発明の２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶は、好ましくは、１００〜１５０□の平均粒径を有する。
【００４４】
図９は、本発明の一態様による粗ナフタレンジカルボン酸の精製方法を実施するための精製装置システムを示す。以下、図９を参考にして本発明の態様による精製方法をより詳細に説明する。
【００４５】
まず、微生物により粗ナフタレンジカルボン酸が精製される反応器（Ａ）に所定量の緩衝溶液を注入し、反応器（Ａ）にｃＮＤＡを添加して撹拌しながらアルカリ溶液を添加して反応溶液のｐＨを調節した後、所定量の水を添加して精製反応溶液を調製する。前記反応溶液を一定温度に維持しながら事前に準備した活性菌体を加えて反応させる。この手順により反応器（Ａ）でｃＮＤＡ中のＦＮＡをＮＤＡに転換して除去することができる。
【００４６】
反応完了後、前記反応溶液を装置（Ｂ）に通過させてＦＮＡを除去するために用いた微生物を除去する。この装置（Ｂ）を用いた微生物除去工程は必要に応じて省略することができる。微生物除去は下流の濾過および洗浄装置（Ｆ）で達成することができる。
【００４７】
微生物が除去された反応溶液を結晶化反応器（Ｃ）へ移送し、この結晶化反応器（Ｃ）に酸性溶液を添加するとともに撹拌しながら結晶化反応を行う。
【００４８】
結晶化反応後、結晶化したｃＮＤＡを含むスラリーが得られる。このスラリーを予備加熱器（Ｄ）を用いて約１００〜約２５０℃に加熱して前記スラリーの温度を１００〜２５０℃に維持させるための加熱手段が具備されている濾過および洗浄装置（Ｆ）に供給する。前記濾過および洗浄装置（Ｆ）の圧力は、１〜２５ｋｇ／ｃｍ２で維持される。また、前記濾過および洗浄装置（Ｆ）には、濾過器が具備されている（孔径１０〜１００□）。
【００４９】
前記濾過および洗浄装置（Ｆ）は、高圧濾過液回収装置（Ｇ）に連結されていて前記濾過および洗浄装置（Ｆ）から前記高圧濾過液回収装置（Ｇ）へ濾過液を放出し、固相分を前記濾過および洗浄装置（Ｆ）に含まれる濾過器で濾す。
【００５０】
また、溶媒加熱供給装置（Ｅ）で予熱した水（１００〜２５０℃）を濾過および洗浄装置（Ｆ）に供給して一定時間撹拌した後、高圧濾過液回収装置（Ｇ）へ二次濾過液を放出する。必要であれば、上記の洗浄段階を１回または２回繰り返す。洗浄後に残った純粋なＮＤＡは、予熱した水（１００〜２５０℃）と混合してスラリーを形成し、前記スラリーは、スラリー放出ラインを通して高圧スラリー回収装置（Ｈ）に送られる。純粋なＮＤＡを含むスラリーを、前記高圧スラリー回収装置（Ｈ）の圧力を常圧まで降下させてパウダー分離装置（Ｉ）を通じて溶媒を除去した後、乾燥装置（Ｊ）で乾燥すると、純粋なＮＤＡを回収することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げながら詳しく本発明の構成および効果を説明するが、これら実施例は説明を目的としたに過ぎず、発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【００５２】
［実施例１］
第１段階：微生物の選抜
（１）菌株分離
微生物の分離のために、韓国京畿道所在の排水処理場、油類貯蔵所およびガソリンスタンドから土壌を採取して使用した。それぞれの土壌サンプル５ｇを０．８５％生理食塩水５０ｍｌに入れて振盪した後、濾過した濾過液を得た。この濾過液を適度に希釈してｃＮＤＡを含むＬＢ固体培地に塗抹して３０℃の培養器で培養した。培養した結果、２００余種の微生物が分離された。
【００５３】
そのうち、ＦＮＡと同じ位置にホルミル基（ｆｏｒｍｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する２−ナフトアルデヒド（２−ｎａｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）を分解する微生物を一次選別するために、まず、前記２００余種の微生物をそれぞれＬＢ液体培地１ｍｌに接種して３０℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪しながら培養した後、その培養液を遠心分離して回収した菌体を０．８５％生理食塩水１ｍｌに懸濁した。次いで、全てのガラスキュベットにβ―ＮＡＤ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ；１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）に溶解）３ｍｌが含まれるサンプルキュベットには２−ナフトアルデヒド溶液（５０□／ｍｌ；ＤＭＳＯに溶解）０．２ｍｌを、β―ＮＡＤ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ；１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）に溶解）３ｍｌが含まれるブランクキュベットにはＤＭＳＯ０．２ｍｌをそれぞれ添加した。その後、上記キュベットを分光器に入れて３分間安定化した後、上記微生物懸濁液０．０５ｍｌをサンプルキュベットにそれぞれ添加し、５分後、３４０ｎｍで吸光度を測定してブランクキュベットとの吸光度の差と比べることで、２−ナフトアルデヒドのホルミル基のカルボキシル基への酸化可否を確認した。その結果、吸光度の差が最小０．１以上である４種の微生物を分離した。
【００５４】
一次選別した４種の微生物をそれぞれＬＢ液体培地に接種して３０℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪しながら培養した。その培養液を遠心分離して菌体を回収し、０．８５％生理食塩水で洗浄した後、下記表１に示す組成の反応溶液と３０℃の反応槽で３時間反応させた。反応生成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析してＦＮＡ除去能力の優れた菌株を最終選別した。ＨＰＬＣ分析は下記表２に示した条件下で行った。ＨＰＬＣ分析では、ＨＮ―７２と命名した菌株が高いＦＮＡ分解能力を持っていることを確認することがわかる。
【００５５】
【表１】
2009518054.tif 000003
【００５６】
【表２】
2009518054.tif 000004
【００５７】
（２）微生物の同定
上記（１）で得られた菌株を同定するために、分離した菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分シークエンシング（ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。その結果を図１（配列表）に示す。
【００５８】
この結果によると、前記菌株は、シュードモナス属に属すると確認された。したがって、前記菌株をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＨＮ−７２と命名し、２００５年６月２１日国際寄託機関である韓国生命工学研究所遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰとして寄託した。前記菌株（シュードモナス属ＨＮ−７２）の形態学的および生化学的性質を実験した結果は、下記表３および４のようである。
【００５９】
【表３】
2009518054.tif 000005
【００６０】
【表４】
2009518054.tif 000006
【００６１】
第２段階：微生物を用いたｃＮＤＡの精製
上記第１段階で選抜したシュードモナス属ＨＮ−７２菌株をＬＢ液体培地３００ｍｌに接種して３０℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪培養器で振盪しながら培養した後、その培養液を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を０．８５％生理食塩水で洗浄した後、また０．８５％生理食塩水５ｍｌに懸濁して菌体を活性化した。
【００６２】
次に、反応器（Ａ）に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液５０Ｌを注入し、この反応器（Ａ）にｃＮＤＡ１〜１０ｋｇを添加して撹拌しながらＫＯＨまたはＮａＯＨを添加して反応溶液のｐＨを８．０になるように調節した後、また水を混合溶液に添加して１００Ｌの精製反応液（ｃＮＤＡ濃度：１〜１０％、ｃＮＤＡ中のＦＮＡ含量：０．０１〜４％）を調製した。
【００６３】
次いで、前記反応溶液を４０℃に維持しながら活性菌体を０．２〜１０ｋｇ／Ｌ投入した後、４０℃で１０分〜２時間反応させて前記ｃＮＤＡに含まれるＦＮＡをＮＤＡに転換した。
【００６４】
第３段階：精製したｃＮＤＡの結晶化
上記第２段階で調製したｃＮＤＡ精製溶液１００Ｌを撹拌装置が装備されている結晶化反応器（Ｃ）へ移送し、この結晶化反応器に硫酸溶液を添加してｐＨを３．０になるように調整した後、撹拌速度を５０ｒｐｍにし、温度を４０℃に維持しながら３０分間結晶化反応を行った。
【００６５】
結晶化が終わった後、顕微鏡および粒度分析器を用いて結晶の分析を行った結果、ｃＮＤＡは個々の結晶間に凝集が発生せずに順調に結晶化したことを確認することができた。結晶化したｃＮＤＡの平均粒径は約１６０．７□と測定された。前記結晶化したｃＮＤＡの顕微鏡写真を図２に示す。
【００６６】
第４段階：結晶化したｃＮＤＡの洗浄および乾燥
上記第３段階で調製した結晶化したｃＮＤＡスラリー溶液を予備加熱器（Ｄ）により２２０℃以上に加熱した後、濾過および洗浄装置（Ｆ）に投入して圧力２４．７ｋｇ／ｃｍ２、温度２２５℃で３０分間撹拌した後、濾過して高圧濾過液回収装置（Ｇ）により濾過液（すなわち水）を排出した。ここに、また溶媒加熱供給装置（Ｅ）から２２５℃の水１００Ｌを添加して同一条件下で３０分間撹拌した後、濾過して高圧濾過液回収装置（Ｇ）により水を排出する手順を２回繰り返した。ここに、再び前記溶媒加熱供給装置（Ｅ）から２２５℃の水１００Ｌを添加した後、３０分間撹拌して純粋なＮＤＡを均一に分散させた後、純粋なＮＤＡを含むスラリーを高圧スラリー回収装置（Ｈ）へ移送し、圧力を常圧まで降下させてパウダー分離装置（Ｉ）であるデカンター（ｄｅｃａｎｔｅｒ）へ移送し、水を除去した後、乾燥装置（Ｊ）により１２０度で乾燥して純粋な結晶状態のＮＤＡを得た。
【００６７】
［実施例２］
上記実施例１の第２段階後第３段階前に、前記第２段階で得られたｎＣＤＡ精製溶液をポリプロピレンフィルター（孔径０．２□）を用いて微生物を除去した後、結晶化反応に使用したことを除いて、上記実施例１と同様の方法で純粋な結晶状態のＮＤＡを得た。
【００６８】
［実施例３および４］
シュードモナス属ＨＮ−７２（ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）の代わりに、それぞれバシラス属Ｆ−１（ＫＣＴＣ−１０３４２ＢＰ）およびバシラス属Ｆ−３（ＫＣＴＣ−１０３３５ＢＰ）を使用したことを除いて、上記実施例１と同様の方法で純粋な結晶状態のＮＤＡを得た。
【００６９】
［実施例５および６］
シュードモナス属ＨＮ−７２（ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）の代わりに、それぞれバシラス属Ｆ−１（ＫＣＴＣ−１０３４２ＢＰ）およびバシラス属Ｆ−３（ＫＣＴＣ−１０３３５ＢＰ）を使用したことを除いて、上記実施例２と同様の方法で純粋な結晶状態のＮＤＡを得た。
【００７０】
上記実施例１における未精製のｃＮＤＡ、第２段階（精製段階）後に得られたｃＮＤＡ精製溶液および第４段階（洗浄および乾燥段階）後に得られた純粋な結晶状態のＮＤＡに対してそれぞれ成分を分析した。その結果を下記表５に示す。
【００７１】
【表５】
2009518054.tif 000007
【００７２】
上記表５の結果から、本発明の微生物を用いたｃＮＤＡ精製方法を用いる場合、ｃＮＤＡ中の不純物をほとんど完全に除去することができ、特に、ＦＮＡはＮＤＡに１００％転換されて９９．９％以上の高純度の２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶を生成することができることを確認することができた。
【００７３】
一方、本発明の微生物を用いたｃＮＤＡの精製段階中、特にｃＮＤＡ精製溶液の結晶化段階の最適反応条件を決めるために、下記表６〜８に示すように反応条件を変化させて実験し、反応条件の違いによるそれぞれの結晶化反応後に得られたｃＮＤＡの平均粒径および回収率を比較分析した。
【００７４】
実験例１：酸種類および撹拌速度の変化による結晶化反応
上記実施例１の第２段階で調製したｃＮＤＡ精製溶液１００ｍｌを撹拌装置が装備されている反応器に入れ、この反応器にそれぞれ硫酸、塩酸、氷酢酸および硝酸を添加してｐＨを３．０になるように調整した後、混合溶液を撹拌速度０、５０、１００、２００、４００、８００および１０００ｒｐｍに維持した。このとき、混合溶液の温度は２５℃に維持し、上記の条件下で３０分間結晶化反応を行った。
【００７５】
結晶化が終わった後、顕微鏡および粒度分析器を用いてｃＮＤＡ結晶を分析した結果、個々の結晶粒子間に凝集が発生せずに順調に結晶化したことを確認することができた。そのうち、硫酸溶液を添加した後、反応速度をそれぞれ５０ｒｐｍ、２００ｒｐｍ、８００ｒｐｍに維持して得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真を図３、４および５に示す。また、上記のそれぞれの条件下で得られたｃＮＤＡ結晶の平均粒径を下記表６に示す。下記表６の結果から確認されるように、硫酸または塩酸の添加後に０〜４００ｒｐｍの速度で撹拌して得られたｃＮＤＡ結晶がより良い結果を示した。
【００７６】
【表６】
2009518054.tif 000008
【００７７】
実験例２：酸種類および温度条件の変化による結晶化反応
撹拌速度を５０ｒｐｍにし、反応温度を４、１５、２５、４０、６０および８０℃にしたことを除いて、上記実験例１の手順を繰り返した。
【００７８】
結晶化が終わった後、顕微鏡および粒度分析器を用いてｃＮＤＡ結晶を分析した結果、個々のｃＮＤＡ結晶間に凝集が発生せずに順調に結晶化したことを確認することができた。そのうち、硫酸溶液を添加した後、反応温度をそれぞれ１５℃，４０℃，８０℃にして得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真を図６、７および８に示す。また、上記のそれぞれの条件下で得られたｃＮＤＡ結晶の平均粒径を下記表７に示す。下記表７の結果から確認されるように、硫酸または塩酸の添加後に４０℃の反応速度で撹拌して得られたｃＮＤＡ結晶がより良い結果を示した。
【００７９】
【表７】
2009518054.tif 000009
【００８０】
実験例３：種々のｐＨ値による回収率
反応温度４０℃、撹拌速度５０ｒｐｍにし、ｐＨ範囲を１、２、３、４、５および６に異ならせたことを除いて上記実験例の手順を繰り返した。すなわち、３０分間結晶化反応を行った後、反応溶液の一定量をそれぞれの反応器から取ってｃＮＤＡの回収率を測定し、その結果を下記表８に示す。下記表８の結果は、ｐＨ３以下でｃＮＤＡ回収率が９９％を超えることを示し、ｐＨが低いほどｃＮＤＡの回収率が高くなる傾向を示した。
【００８１】
【表８】
2009518054.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、ＦＮＡをＮＤＡに転換する微生物を用いて、それに適合した条件下で、粗ナフタレンジカルボン酸を精製および結晶化することで、高純度の結晶形２，６−ナフタレンジカルボン酸を環境親和的に大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、本発明の方法に用いられるシュードモナス属ＨＮ-７２菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分シークエンスを示す。
【図２】図２は、本発明の実施例１の第３段階で得られた結晶化したｃＮＤＡの顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明の実験例１で精製されたｃＮＤＡの反応溶液に硫酸溶液を加えた後、その混合溶液を５０ｒｐｍの速度で攪拌して得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、本発明の実験例１で精製されたｃＮＤＡの反応溶液に硫酸溶液を加えた後、その混合溶液を２００ｒｐｍの速度で攪拌して得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、本発明の実験例１で精製されたｃＮＤＡの反応溶液に硫酸溶液を加えた後、その混合溶液を８００ｒｐｍの速度で攪拌して得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真である。
【図６】図６は、本発明の実験例２で精製されたｃＮＤＡの反応溶液に硫酸溶液を加えた後、その混合溶液を１５℃の反応温度で攪拌して得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、本発明の実験例２で精製されたｃＮＤＡの反応溶液に硫酸溶液を加えた後、その混合溶液を４０℃の反応温度で攪拌して得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真である。
【図８】図８は、本発明の実験例２で精製されたｃＮＤＡの反応溶液に硫酸溶液を加えた後、その混合溶液を８０℃の反応温度で攪拌して得られたｃＮＤＡ結晶の顕微鏡写真である。
【図９】図９は、本発明の一態様による粗ナフタレンジカルボン酸の精製方法を実施するための精製装置システムを示す。
【図１】
2009518054.tif 000011
【図２】
2009518054.tif 000012
【図３】
2009518054.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2009518054.tif 000019
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月12日(2008.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２−ホルミル−６−ナフトエ酸（２−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）を２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）に転換する能力を有する微生物を粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）と反応させて前記粗ナフタレンジカルボン酸中の２−ホルミル−６−ナフトエ酸を除去する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で調製された反応溶液に酸性溶液を加えてｐＨを調整した後、その混合溶液を撹拌しながら反応させることで前記粗ナフタレンジカルボン酸を結晶化する段階；
（ｃ）前記結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を洗浄してその中に含まれている不純物を除去する段階；および
（ｄ）洗浄された生成物を乾燥して純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸を得る段階を含む微生物を用いた粗ナフタレンジカルボン酸（ｃｒｕｄｅ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の精製方法。
【請求項２】
前記（ａ）段階が、
１）前記微生物を液体培地に接種して振盪培養した後、遠心分離により回収した菌体を生理食塩水または蒸留水で懸濁して反応用菌体を準備する段階；
２）基質である粗ナフタレンジカルボン酸を緩衝溶液と混合した後、アルカリ溶液を加えて混合溶液のｐＨを調節して精製反応溶液を製造する段階；および
３）前記１）で調製した活性菌体（ａｃｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）と前記２）で調製した反応溶液とを反応させて粗ナフタレンジカルボン酸中の２−ホルミル−６−ナフトエ酸を２，６−ナフタレンジカルボン酸に転換して２，６−ナフタレンジカルボン酸（２，６−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の純度を高める段階との副段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、バシラスまたはシュードモナス属に属する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、バシラス属Ｆ−１（ＫＣＴＣ−１０３４２ＢＰ）、バシラス属Ｆ−３（ＫＣＴＣ−１０３３５ＢＰ）またはシュードモナス属ＨＮ−７２（ＫＣＴＣ−１０８１９ＢＰ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝溶液が、水、炭酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ２Ｏ３／ＮａＨＣＯ３）、グリシン緩衝溶液（ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ）、リン酸カリウム緩衝溶液（ＫＨ２ＰＯ４／ＫＯＨ）、リン酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）、コハク酸緩衝溶液（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ／ＮａＯＨ）、酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、クエン酸緩衝溶液（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ピロリン酸ナトリウム緩衝溶液（Ｎａ４Ｐ２Ｏ７／ＨＣｌ）、ホウ酸緩衝溶液（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ／ＮａＯＨ）およびホウ酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒａｔｅ／ＨＣｌ）からなる群より選択され、その濃度は０．１〜１００ｍＭである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリ溶液が、ＮａＯＨまたはＫＯＨである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記混合溶液が、有機溶媒をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ジメチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）およびテトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）からなる群より選択され、その添加濃度は０．０１〜１０％である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応が、２５〜５０℃、１分〜２時間で行われる請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸性溶液が、硫酸、塩酸、氷酢酸および硝酸からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＨが、１〜４の範囲に調整される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応が、４〜８０℃、１分〜１２時間で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記撹拌が、０〜１０００ｒｐｍの速度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ｃ）段階が、結晶化した粗ナフタレンジカルボン酸を水に分散させた後、１〜２８ｋｇ／ｃｍ２の圧力および１００〜２５０℃の温度で１０分〜１時間撹拌し、濾過して水を除去する過程を数回繰り返すことで行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記乾燥が、３０〜２００℃で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記（ａ）段階後前記（ｂ）段階前に、前記（ａ）段階で用いた微生物を除去する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物除去が、マイクロフィルターシステム、連続遠心分離機またはデカンター（ｄｅｃａｎｔｅｒ）を用いて行われる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイクロフィルターシステムが、セラミック、ステンレス、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から選択される材質からなる孔径０．１〜０．５μｍのフィルターを用いる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法により生成された純粋な結晶状態の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【請求項２０】
前記２，６−ナフタレンジカルボン酸が、定形または無定形の結晶状態である請求項１９に記載の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【請求項２１】
前記定形の結晶状態が、格子構造である請求項１９に記載の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【請求項２２】
前記２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶の平均粒径が、１００μｍ以上である請求項１９に記載の２，６−ナフタレンジカルボン酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
この結晶化は、常温常圧の条件で１００μｍ以上の均一な大きさを有するｃＮＤＡ結晶を生成することができるため、本発明の精製方法は製造費用および工程面において経済的であり、個々のｃＮＤＡ結晶粒子間に凝集が生じないため、実用に適し最終生成物の回収率が高い利点がある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
前記酸性溶液としては、硫酸、塩酸、氷酢酸、硝酸などを用いることができ、ｃＮＤＡ結晶の大きさおよび収率を大きくできるため硫酸または硝酸を用いるのが好ましい。すなわち、硫酸または硝酸を加えると、１００μｍ以上の均一な大きさを有するｃＮＤＡ結晶を高収率で生成することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
前記微生物の除去としては、公知の従来技術を制限なく用いることができ、たとえば、マイクロフィルターシステム、連続遠心分離機、デカンター（ｄｅｃａｎｔｅｒ）などを用いて除去することができる。前記マイクロフィルターシステムは、孔径０．１〜０．５μｍのセラミック、ステンレス、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から選択される材質からなるフィルターを用いる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
また、本発明の２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶は、１００μｍ以上の平均粒径および均一な粒子形態を有するため、ＰＥＮを生成する重合時、エチレングリコールと低粘度スラリーを形成するのにとても適している。２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶の平均粒径が１００μｍより小さいと、取り扱いが難しく、ＰＥＮ調製でエチレングリコールと混合してスラリーを形成するとき、スラリー形成能力が減少するため、消耗が多くなる。本発明の２，６−ナフタレンジカルボン酸結晶は、好ましくは、１００〜１５０μｍの平均粒径を有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
結晶化反応後、結晶化したｃＮＤＡを含むスラリーが得られる。このスラリーを予備加熱器（Ｄ）を用いて約１００〜約２５０℃に加熱して前記スラリーの温度を１００〜２５０℃に維持させるための加熱手段が具備されている濾過および洗浄装置（Ｆ）に供給する。前記濾過および洗浄装置（Ｆ）の圧力は、１〜２５ｋｇ／ｃｍ２で維持される。また、前記濾過および洗浄装置（Ｆ）には、濾過器が具備されている（孔径１０〜１００μｍ）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
そのうち、ＦＮＡと同じ位置にホルミル基（ｆｏｒｍｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する２−ナフトアルデヒド（２−ｎａｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）を分解する微生物を一次選別するために、まず、前記２００余種の微生物をそれぞれＬＢ液体培地１ｍｌに接種して３０℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪しながら培養した後、その培養液を遠心分離して回収した菌体を０．８５％生理食塩水１ｍｌに懸濁した。次いで、全てのガラスキュベットにβ―ＮＡＤ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ；１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）に溶解）３ｍｌが含まれるサンプルキュベットには２−ナフトアルデヒド溶液（５０μｇ／ｍｌ；ＤＭＳＯに溶解）０．２ｍｌを、β―ＮＡＤ溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌ；１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）に溶解）３ｍｌが含まれるブランクキュベットにはＤＭＳＯ０．２ｍｌをそれぞれ添加した。その後、上記キュベットを分光器に入れて３分間安定化した後、上記微生物懸濁液０．０５ｍｌをサンプルキュベットにそれぞれ添加し、５分後、３４０ｎｍで吸光度を測定してブランクキュベットとの吸光度の差と比べることで、２−ナフトアルデヒドのホルミル基のカルボキシル基への酸化可否を確認した。その結果、吸光度の差が最小０．１以上である４種の微生物を分離した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
結晶化が終わった後、顕微鏡および粒度分析器を用いて結晶の分析を行った結果、ｃＮＤＡは個々の結晶間に凝集が発生せずに順調に結晶化したことを確認することができた。結晶化したｃＮＤＡの平均粒径は約１６０．７μｍと測定された。前記結晶化したｃＮＤＡの顕微鏡写真を図２に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
［実施例２］
上記実施例１の第２段階後第３段階前に、前記第２段階で得られたｎＣＤＡ精製溶液をポリプロピレンフィルター（孔径０．２μｍ）を用いて微生物を除去した後、結晶化反応に使用したことを除いて、上記実施例１と同様の方法で純粋な結晶状態のＮＤＡを得た。
【国際調査報告】
2009518054.tif 000020
2009518054.tif 000021
2009518054.tif 000022