(57)【要約】  本発明の１実施形態が、高血糖および／または脂肪酸流増加の病理効果を、このような処置もしくは予防治療の必要にある被験体において処置していくかもしくは予防していく方法に関する。この方法が、治療有効量のＲＯＳ阻害剤を含有している組成物を、この必要にある被験体に投与していくことに関与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高血糖の病理効果および／または脂肪酸流の増加を処置していくかまたは予防していく方法であって：
被験体における高血糖の病理効果および／または脂肪酸流の増加を処置するかもしくは予防するに有効な治療有効量のＲＯＳ阻害剤を含有している組成物を、このような処置もしくは予防治療の必要にある被験体に投与していくこと
を含んでいる、方法。
【請求項２】
ＲＯＳ阻害剤が、経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、点眼により、眼内、鼻内、動脈内、病巣内、あるいは、粘膜に対する適用により、投与されている、請求項１の方法。
【請求項３】
ＲＯＳ阻害剤が、医薬として許容可能な、塩、担体、賦形剤、もしくは安定剤と共に、投与されている、請求項１の方法。
【請求項４】
処置されたかもしくは予防された病理効果が、代謝症候群（メタボリックシンドローム）、インシュリン耐性、障害グルコース絶食、障害グルコース寛容、もしくは糖尿病からなっている群から選択されている、請求項１の方法。
【請求項５】
ＲＯＳ阻害剤が、デフェロキサミンである、請求項４の方法。
【請求項６】
高血糖の病理効果および／または脂肪酸流の増加を処置していくかまたは予防していく方法であって：
高血糖の病理効果および／または脂肪酸流の増加を処置するかもしくは予防するに有効な治療有効量の鉄キレート剤を含有している組成物を、このような処置もしくは予防治療の必要にある被験体に投与していくこと
を含んでいる、方法。
【請求項７】
前記鉄キレート剤が、経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、点眼により、眼内、鼻内、動脈内、病巣内、あるいは、粘膜に対する適用により、投与されている、請求項６の方法。
【請求項８】
前記鉄キレート剤が、医薬として許容可能な、塩、担体、賦形剤、もしくは安定剤と共に、投与されている、請求項６の方法。
【請求項９】
高血糖の病理効果および／または脂肪酸流の増加を処置していくかまたは予防していく方法であって：
構造Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｍの治療有効量の鉄キレート剤を含有している組成物を、このような処置もしくは予防治療の必要にある被験体に投与していくこと
を含んでおり、ここにおいて、Ｒが、Ｈ、または、標的細胞における前記鉄キレート剤の浸透を容易化させたり、もしくは、障害させたりできる生体相容部分であり、Ｌが、ＣにＲを接続させているリンカーであり、ここにおいて、Ｌが、急速な細胞取り込みを容易化させ、前記鉄キレート剤の細胞からの退出を遅らせることができ、Ｃが、鉄キレート化部分であり、Ｍが、（ＯＨ．）による開裂に対するマスク官能基である、方法。
【請求項１０】
前記鉄キレート剤が、経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、点眼により、眼内、鼻内、動脈内、病巣内、あるいは、粘膜に対する適用により、投与されている、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記鉄キレート剤が、医薬として許容可能な、塩、担体、賦形剤、もしくは安定剤と共に、投与されている、請求項９の方法。
【請求項１２】
Ｃが、２、３、もしくは６座である、請求項９の方法。
【請求項１３】
高血糖の病理効果および／または脂肪酸流の増加を処置していくかまたは予防していく方法であって：
Ｆｅｎｔｏｎの化学および／またはＦｅｎｔｏｎ様化学によるＲＯＳ種産生が起きていくことから禁じていくことができる治療有効量の組成物を、このような処置もしくは予防治療の必要にある被験体に投与していくこと
を含んでいる、方法。
【請求項１４】
前記組成物が、経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、点眼により、眼内、鼻内、動脈内、病巣内、あるいは、粘膜に対する適用により、投与されている、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、医薬として許容可能な、塩、担体、賦形剤、もしくは安定剤と共に、投与されている、請求項１３の方法。
【請求項１６】
高血糖の病理効果および／または脂肪酸流の増加を処置していくかまたは予防していく方法であって：
置換もしくは非置換３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールまたはこれらの医薬として許容可能な塩を含んでいる、治療有効量の鉄キレート剤を含有している組成物を、このような処置もしくは予防治療の必要にある被験体に投与していくこと
を含んでいる、方法。
【請求項１７】
前記組成物が、経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、点眼により、眼内、鼻内、動脈内、病巣内、あるいは、粘膜に対する適用により、投与されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、医薬として許容可能な、担体、賦形剤、もしくは安定剤と共に、投与されている、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記置換３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールが：
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
エチル［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］酢酸
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸
｛４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−フェニル｝モルホリン−４−イルメタノン
｛４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−フェニル｝−（４−メチルピペラジン−１−イル）−メタノン
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−ベンジル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イルメチル］ベンゾニトリル
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−ジエチルアミノベンジル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−ピロリジン−１−イルベンジル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（ピリジン−４−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１−（ピリジン−３−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（２−ヒドロキシエチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
４−［３，５−ビス（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール］−１−イル］安息香酸
３，５−ビス（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
３，５−ビス（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−１−（４−ジメチルアミノベンジル）−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール
４−［３，５−ビス（５−フルオロ−２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール］−１−イル］安息香酸
４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−［１，２，４］トリアゾール］−１−イル］安息香酸
［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］酢酸
［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−メチルアセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（２−メトキシエチル）アセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（２−モルホリン−４−イルエチル）アセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチルアセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］アセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−１−モルホリン−４−イルエタノン
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−１−（４−メチルピペラジン）−１−イル）−エタノン
Ｎ−ベンジル−２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−メチルアセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アセタミド
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）−Ｎ−メチルアセタミド
２−［３，５−ビス（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］−Ｎ−（２−モルホリン−４−イルエチル）アセタミド
エチル［３，５−ビス（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］酢酸
２−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸
エチル４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸
もしくはこれらの医薬として許容可能な塩からなっている群から選択されている、請求項１６の方法。
【請求項２０】
化合物Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｍもしくはこれの医薬として許容可能な塩を含んでいる、組成物。
【請求項２１】
Ｒが、Ｈ、または、標的細胞における前記組成物の浸透を容易化させたり、もしくは、障害させたりできる生体相容性部分であり、Ｌが、ＣにＲを接続させているリンカーであり、ここにおいて、Ｌが、急速な細胞取り込みを容易化させ、前記組成物の細胞からの退出を遅らせることができ、Ｃが、鉄キレート化部分であり、Ｍが、（ＯＨ．）による開裂に対するマスク官能基である、請求項２０の組成物。
【請求項２２】
（ａ）式Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｍの化合物もしくはこれの医薬として許容可能な塩；および
（ｂ）医薬担体
を含んでいる、治療組成物。
【請求項２３】
Ｒが、Ｈ、または、標的細胞における前記治療組成物の浸透を容易化させたり、もしくは、障害させたりできる生体相容部分であり、Ｌが、ＣにＲを接続させているリンカーであり、ここにおいて、Ｌが、急速な細胞取り込みを容易化させ、前記治療組成物の細胞からの退出を遅らせることができ、Ｃが、鉄キレート化部分であり、Ｍが、（ＯＨ．）による開裂に対するマスク官能基である、請求項２２の治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願が、２００５年５月２４日出願の米国出願第１１／１３６，２５４号の一部継続出願であり、２００４年５月２４日出願の米国仮特許出願第６０／５７３，９４７号に対する利益、および、２００４年５月２４日出願の米国仮特許出願第６０／５７３，９４７号からの優先権を請求する。
【０００２】
本願が、ある１被験体における高血糖における急性の増加および／または脂肪酸流の急性の増加の病理効果を処置していくかもしくは防いでいくある１方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病と関連した心臓血管合併症が、主要な公衆健康問題である
糖尿病が、米国におけるある１流行病である（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、＜＜糖尿病合併症の生化学および分子細胞生物学＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、４１４：８１３〜２０（２００１）；
Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、＜＜ミトコンドリアスーパーオキシド産生の通常化が、高血糖損傷の３経路をブロックする＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：７８７〜９０（２０００）；Ｚｉｍｍｅｔら、＜＜糖尿病の流行のグローバルおよび社会的暗示＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、４１４：７８２〜７（２００１））。現在、米国における１５〜１７，０００，０００人の成人（成人人口の５％）が、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病により影響を受けている（Ｈａｒｒｉｓら、＜＜米国成人における、糖尿病罹患率、グルコース絶食の障害、および、クルコース寛容の障害。第３回国民健康および栄養審査調査、１９８８〜１９９４＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２１：５１８〜２４（１９９８）；ＡＤ協会、＜＜２００２年における米国における糖尿病経済コスト＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２６：９１７〜９３２（２００３））。２０００年までに、糖尿病人口が、もう４４％増加すると予期されている（ＡＤ協会、＜＜２００２年における米国における糖尿病経済コスト＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２６：９１７〜９３２（２００３））。糖尿病を患っている人々に加え、更なる人数の人々が、糖尿病症候群を表示し、グルコースの障害、および、インシュリン寛容、および、脈管反応性の代替を伴っている。
【０００４】
糖尿病の最大のインパクトが、脈管系にある（Ｃａｒｏら、＜＜米国における２型糖尿病から結果来ている合併症の生涯コスト＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２５：４７６〜８１（２００２））。糖尿病患者が、心臓、脳、および末梢血管に影響を及ぼしている脈管疾患に関するリスクの増加を持つ（Ｈｏｗａｒｄら、＜＜予防会議ＶＩ：糖尿病および心臓血管疾患：書記団Ｉ：流行病学＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０５：ｅ１３２〜７（２００２））。糖尿病における心臓血管疾患の相対リスクが、年齢の見合ったコントロールよりも、２〜８倍高い（Ｈｏｗａｒｄら、＜＜予防会議ＶＩ：糖尿病および心臓血管疾患：書記団Ｉ：流行病学＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０５：ｅ１３２〜７（２００２））。糖尿病が、米国における年間健康コストにおける１８０，０００，０００，０００＄を計上し、この額の８５％が、脈管合併症に帰属可能である（Ｃａｒｏら、＜＜米国における２型糖尿病から結果来ている合併症の生涯コスト＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２５：４７６〜８１（２００２））。実際、もし、巨大脈管合併症（発作、卒中、ＭＩ、ＴＩＡ、狭心症）および微小脈管合併症（ネフロパシー、ニューロパシー、レチノパシー、創傷治癒）が一緒に考えられていれば、莫大な糖尿病関連ヘルスケア支出が、ヴァスキュロパシーから結果来る。
【０００５】
糖尿病患者がよくない結末を持つ１理由が、補償脈管成長の障害のためである
糖尿病が、虚血現象後の生存率を障害するとの認識が、前世紀に遡り、独立に、ランドマークの２流行病学研究により確かめられてきている（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ研究ならびにこの糖尿病コントロールおよび合併症試行）（Ｇａｒｃｉａら、＜＜Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ集団における糖尿病における罹患率および死亡率。１６年の追跡研究＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２３：１０５〜１１（１９７４）；ＴＤＣａＣＴＲグループ、＜＜インシュリン依存糖尿病における長期合併症の進展および進行への糖尿病集約処置効果＞＞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３２９：９７７〜８６（１９９３））。これらの予定研究が、心筋梗塞後のよくない血糖コントロールと生存率の減少との間の関係を実質化させた。記すことに、これらの試行が、虚血後の罹患率の増加（Ｋａｎｎｅｌら、＜＜糖尿病および心臓血管危険因子（リスク要因、リスクファクター）：Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ研究＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、５９：８〜１３（１９７９））に加え、糖尿病患者が、より高い割合の心臓疾患および２次虚血現象のような梗塞後合併症を持つことを実証した（Ｈａｆｆｎｅｒら、＜＜２型糖尿病を患っている被験者における、ならびに、前に心筋梗塞を患っていた、および、患っていなかった非糖尿病被験者における、冠心臓疾患からの死亡率＞＞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３３９：２２９〜３４（１９９８）；Ｚｕａｎｅｔｔｉら、＜＜急性心筋梗塞における死亡率への糖尿病の影響：ＧＩＳＳＩ−２研究からのデーター＞＞、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、２２：１７８８〜９４（１９９３））。これらの不一致が、糖尿病集団における梗塞サイズの増加によらなかったが（Ｗｉｌｓｏｎ、＜＜糖尿病および冠心臓疾患＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ、３２：Ｓ８９〜１００（１９９８））、ある１障害が、糖尿病心筋補償応答において存在したことを示唆している。似た障害が、他の糖尿病組織において記載されてきており、四肢および脳を包含している（Ｕｕｓｉｔｕｐａら、＜＜非インシュリン依存糖尿病被験者および非糖尿病被験者における、リポ蛋白組成物における、一般的危険因子（リスク要因、リスクファクター）、インシュリンレベル、および異常に関する粥状硬化脈管疾患の５年罹患率＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８２：２７〜３６（１９９０）；Ｊｕｄｅら、＜＜糖尿病患者および非糖尿病患者における末梢動脈疾患：重篤さおよび結末のある１比較＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２４：１４３３〜７（２００１）；Ｔｕｏｍｉｌｅｈｔｏら、＜＜発作からの死に関するある１危険因子（リスク要因、リスクファクター）としての糖尿病。中年Ｆｉｎｎｉｓｈ集団の予定研究＞＞、Ｓｔｒｏｋｅ、２７：２１０〜５（１９９６））。
【０００６】
これらの障害が、よく適応していない糖尿病脈管構造から結果来るとの概念（コンセプト）が、臨床および実験両方による裏付けを持つ。血管発生および併存する発達が、心臓分水嶺領域に対する血流を復元させるプロセスであるので、微小脈管構造における通常脈管密度の急速な復元が究極的に、虚血後の患者の結末を決める（Ｈｅｌｆａｎｔら、＜＜ヒト冠併存循環の機能面での重要さ＞＞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、２８４：１２７７〜８１（１９７１）；Ｃｈｉｌｉａｎら、＜＜微小脈管閉塞が、冠併存成長を促進させる＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２５８：Ｈ１１０３〜１１（１９９０））。実際、＜＜治療血管発生＞＞に関する理論の基礎が、心臓の虚血領域および分水嶺領域における微小脈管ネットワークを強めていくことが、有益であると思われるとの確信である。臨床研究ならびに実験研究が、糖尿病が、虚血煽動脈管発生を障害するとの結論の証拠を与える（Ａｂａｃｉら、＜＜冠併存血管形成への糖尿病の効果＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９９：２２３９〜４２（１９９９）；Ｔｏｏｋｅ、＜＜糖尿病における微小脈管構造＞＞、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ、３２：７６４〜７１（１９９６）；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、＜＜糖尿病における併存血管の発達の障害：潜在的な細胞機構および治療の暗示＞＞、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ、４９：５５４〜６０（２００１）；Ｙａｒｏｍら、＜＜糖尿病および虚血におけるヒト冠微小血管。自家素材の形態測定研究＞＞、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１６６：２６５〜７０（１９９２））。動物研究において、糖尿病動物が、後肢虚血後の脈管密度の減少を実証する（Ｒｉｖａｒｄら、＜＜アデノＶＥＧＦを用いる筋内遺伝子治療による血管発生の糖尿病関連障害からの救助＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５４：３５５〜６３（１９９９）；Ｔａｎｉｙａｍａら、＜＜ラット糖尿病後肢虚血モデルにおけるヒト肝細胞成長因子遺伝子により誘導された治療血管発生：糖尿病における血管発生の遅れの分子機構＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０４：２３４４〜５０（２００１）；Ｓｃｈａｔｔｅｍａｎら、＜＜血液由来血管芽細胞が、糖尿病マウスにおける血流復元を加速させる＞＞、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０６：５７１〜８（２０００））。ヒト血管造影研究が、糖尿病患者が、非糖尿病コントロールよりも、少ない併存血管を持つことを実証してきている（Ａｂａｃｉら、＜＜冠併存血管形成への糖尿病の効果＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９９：２２３９〜４２（１９９９））。更に、冠血管形成術、冠動脈バイパス外科手術、もしくは下肢再脈管発生経由の再脈管発生が、患者バイパス導管存在下にさえ、糖尿病患者において有意に、より低い成功割合を持ち、微小循環レベルでの欠陥の存在を示唆している（Ｋｉｐら、＜＜糖尿病患者における冠血管形成術。国家心肺血液研究所経皮管腔横断冠血管形成術登録＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９４：１８１８〜２５（１９９６）；Ｐａｌｕｍｂｏら、＜＜糖尿病：１９４５〜１９７０年におけるミネソタ州ロチェスターにおける、罹患率、生存、および死因＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２５：５６６〜７３（１９７６）；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、＜＜バイパス血管形成術再脈管発生調査（ＢＡＲＴ）における糖尿病を患っている患者における冠バイパス移植開通＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０６：２６５２〜８（２００２）；Ｋｉｐら、＜＜初期血管形成術もしくはバイパス外科手術後の心筋の危険の増加への糖尿病の影響の差：バイパス血管形成術再脈管発生調査＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０５：１９１４〜２０（２００２））。
【０００７】
【表１−１】
2009518414.tif 000002
【表１−２】
2009518414.tif 000003
【０００８】
これらの観察の優勢に関わらず、糖尿病における脈管発生の障害に横たわっている機構（機序、メカニズム）が、不明確なままである。ＶＥＧＦ発現の障害が、有意な寄与因子として暗示されてきている（Ｒｉｖａｒｄら、＜＜アデノＶＥＧＦを用いる筋内遺伝子治療による血管発生の糖尿病関連障害からの救助＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５４：３５５〜６３（１９９９）；Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒら、＜＜ＶＥＧＦ遺伝子導入による実験糖尿病ニューロパシー反転＞＞、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０７：１０８３９２（２００１）；Ａｉｅｌｌｏら、＜＜糖尿病脈管合併症における脈管内皮成長因子の役割＞＞、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  Ｓｕｐｐｌ、７７：Ｓ１１３〜９（２０００））。ＶＥＧＦ発現の抑制の機構（機序、メカニズム）の詳細な理解が、虚血現象後の糖尿病の結末を向上させる新しいアプローチに関する有用な枠組みを提供すると思われる。
【０００９】
虚血誘導脈管発生が、２機構（機序、メカニズム）により起きる：血管発生および脈管発生
適切な低酸素シグナルカスケードが開始された後、虚血発作に対して応答して補償の脈管成長が、異なる２機構（機序、メカニズム）により起きる（図１）。＜＜血管発生＞＞において、成熟滞留内皮細胞が、増殖し、血管発生刺激に対して応答して既存の血管から新しい血管を芽吹く。より最近記載された機構（機序、メカニズム）において＜＜脈管発生＞＞とされ、脈管幹細胞（内皮始原細胞、つまり、ＥＰＣｓ）の特徴を有する循環細胞が、虚血現象に対して応答して骨髄から可動化され、次いで、特異的に、虚血脈管床に帰還し、脈管発生に寄与する（Ａｓａｈａｒａら、＜＜血管発生用推定始原内皮細胞の単離＞＞、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５：９６４〜７（１９９７）；Ｓｈｉら、＜＜骨髄由来循環内皮細胞に関する証拠＞＞、Ｂｌｏｏｄ、９２：３６２〜７（１９９８）；Ａｓａｈａｒａら、＜＜生理学的および病理学的脈管発生における生後の脈管発生に応答性の内皮始原細胞の骨髄起源＞＞、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、８５：２２１〜８（１９９９）；Ｉｓｎｅｒら、＜＜生後の脈管発生に向けての治療戦略としての血管発生および脈管発生＞＞、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０３：１２３１〜６（１９９９）；Ｃｒｏｓｂｙら、＜＜造血起源の内皮細胞が、成血管形成に対する有意な寄与をする＞＞、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、８７：７２８〜３０（２０００）；Ｐｅｌｏｓｉら、＜＜生後の生命における血管芽細胞同定＞＞、Ｂｌｏｏｄ、１００：３２０３〜８（２００２））。
【００１０】
低酸素誘導可能因子−１（ＨＩＦ−１）が、引き続いての血管成長を包含して、低酸素応答の中心のメディエーターである
虚血が、血管成長を規制するとの観察が、多くの年の間知られてきていたが、その応答因子が、１９９２年まで同定を逃れたが、その時、Ｓｅｍｅｎｚａおよび同僚が、エリスロポエチン遺伝子アップレギュレーションを媒介するある１低酸素応答転写因子（ＨＩＦ−１）を記述した（Ｓｅｍｅｎｚａら、＜＜ｄｅ  Ｎｏｖｏ蛋白合成経由で低酸素により誘導されたある１核（内）因子が、転写活性化に必要とされたある１部位において、ヒトエリスロポエチン遺伝子エンハンサーに結合する＞＞、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１２：５４４７〜５４（１９９２）；Ｓｅｍｅｎｚａら、＜＜複数の低酸素誘導可能核（内）因子が、ヒトエリスロポエチン遺伝子に対して３’に位置されたある１エンハンサーエレメントに結合する＞＞、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８：５６８０〜４（１９９１））。ＨＩＦ−１が、全後生動物門において保存された新しき転写因子であると証明されたが、普遍的に、このように遠くまで審査された全細胞において存在している（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、＜＜単一ＶＥＧＦ対立遺伝子を欠いている胚における異常な血管の発達および致死率＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：４３５〜９（１９９６））。血管発生におけるその関与に関する証拠が、ＶＥＧＦが強く、低酸素条件によりアップレギュレーションされたとの当初の観察から出てきた（Ｓｈｗｅｉｋｉら、＜＜低酸素により誘導された脈管内皮成長因子が、低酸素開始血管発生を媒介することがある＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、３５９：８４３〜５（１９９２））。このすぐ後、ＨＩＦ−１が、低酸素および低血糖によるＶＥＧＦアップレギュレーションに応答性の転写因子であると示された（Ｆｏｒｓｙｔｈｅら、＜＜低酸素誘導可能因子１による脈管内皮成長因子遺伝子転写活性化＞＞、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１６：４６０４〜１３（１９９６））。今、ＨＩＦ規制ＶＥＧＦ発現が、胚発生、ならびに、生理学的状態および病理学的状態における生後の脈管発生両方の間、脈管の発達に必須であることが、明らかである（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、＜＜単一ＶＥＧＦ対立遺伝子を欠いている胚における異常な血管の発達および致死率＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：４３５〜９（１９９６）；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、＜＜単一ＶＥＧＦ対立遺伝子を欠いている胚における異常な血管の発達および致死率＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：４３５〜９（１９９６）；Ｉｙｅｒら、＜＜低酸素誘導可能因子１αによるＯ2恒常性の細胞および発達コントロール＞＞、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１２：１４９〜６２（１９９８））。ＨＩＦ−１が、酸素規制ＨＩＦ−１αサブユニットおよびＨＩＦ−１βサブユニットからなり、後者が、酸素により規制されていない。ＨＩＦ−１が今、血管発生、脈管発生、造血、および糖代謝を包含して、虚血に対する適応に必須の経路をアップレギュレーションしていくことにより、低酸素に対する生理学的応答に関している真の転写因子であると信じられている（図２）。
【００１１】
ＨＩＦ−１α転写活性化規制
ＨＩＦ−１転写複合体が、ＨＩＦ−１α／β、および、遺伝子転写を調節する他の７より多い因子から構成されている。この複合体の優位な２機能成分が、ＨＩＦ−１αおよびＣＢＰ／ｐ３００であり、直接相互作用し、遺伝子発現を跨って活性化させる。ＨＩＦ−１α機能が優位に、蛋白安定化および翻訳後修飾経由で酸素により規制を受けている。最近の報告が、ＨＩＦ−１αが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて燐酸化により活性化されており、ＨＩＦ媒介遺伝子発現を高めていることを実証する（Ｒｉｃｈａｒｄら、＜＜ｐ４２／ｐ４４マイトジェン活性化蛋白キナーゼが、低酸素誘導可能因子１α（ＨＩＦ−１α）を燐酸化し、ＨＩＦ−１転写活性を高める＞＞、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７４：３２６３１〜７（１９９９））。この修飾が結果的に、ＨＩＦ−１α自体の跨った活性化機能の直接刺激を与え、同時活性化剤の動員を容易化させるかどうか明らかでない（Ｒｉｃｈａｒｄら、＜＜ｐ４２／ｐ４４マイトジェン活性化蛋白キナーゼが、低酸素誘導可能因子１α（ＨＩＦ−１α）を燐酸化し、ＨＩＦ−１転写活性を高める＞＞、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７４：３２６３１〜７（１９９９）；Ｓａｎｇら、＜＜シグナルが、ｐ３００へのその効果により、低酸素誘導可能因子活性をアップレギュレーションさせる＞＞、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８：１４０１３〜９（２００３））。
【００１２】
最近、ＣＢＰ／ｐ３００も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて燐酸化することも、実証されてきており、ＨＩＦ−１αと関連してある１転写活性化剤として機能できるその能力を高めている（Ｓａｎｇら、＜＜シグナルが、ｐ３００へのその効果により、低酸素誘導可能因子活性をアップレギュレーションさせる＞＞、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８：１４０１３〜９（２００３））。これゆえ、これらの２因子の燐酸化を促進させる細胞状態が、低酸素誘導遺伝子発現を増加させるようである一方、脱燐酸化を好む細胞状態が、反対の効果を持つ。ＨＩＦ−１媒介遺伝子発現が、血管発生および脈管発生両方に必須であるが、糖尿病状態におけるその規制の役割が以前に、審査されていない。
【００１３】
血管発生および脈管発生両方が、ＶＥＧＦにより調節されている
血管発生が、ＶＥＧＦにより媒介されていることが、よく知られており、この機構（機序、メカニズム）が、よく研究されてきている（Ｆｅｒｒａｒａら、＜＜ＶＥＧＦおよびこの受容体の生物学＞＞、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９：６６９〜７６（２００３））。最近、ＶＥＧＦが、脈管発生規制においても、暗示されてきている（図２）。虚血が、骨髄からの内皮始原細胞を潜在的に可動化させている。これが、ＶＥＧＦシグナルを通り媒介されているよう見え、同時に、ＥＰＣｓが、この細胞表面上でＶＥＧＦ受容体１および２両方を発現する（Ａｓａｈａｒａら、＜＜ＶＥＧＦが、骨髄由来内皮始原細胞を可動化させていくことにより、生後の脈管発生に寄与する＞＞、Ｅｍｂｏ  Ｊ、１８：３９６４〜７２（１９９９）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、＜＜脈管発生に向けた骨髄由来内皮始原細胞の虚血およびサイトカイン誘導可動化＞＞、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、５：４３４〜８（１９９９）；Ｋａｌｋａら、＜＜脈管内皮成長因子（１６５）遺伝子導入が、ヒト被験者において内皮始原細胞を循環させているのを強める＞＞、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、８６：１１９８〜２０２（２０００）；Ｇｉｌｌら、＜＜脈管外傷が、ＶＥＧＦＲ２（＋）ＡＣ１３３（＋）内皮始原細胞の急速だが一時的な可動化を誘導する＞＞、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、８８：１６７〜７４（２００１）；Ｈａｔｔｏｒｉら、＜＜脈管内皮成長因子およびアンジオポエチン−１が、脈管原性およびヘマトポエチン幹細胞動員による生後の造血を刺激する＞＞、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９３：１００５〜１４（２００１））。ＶＥＧＦ産生が、糖尿病において障害されているとすれば、種々の態様の脈管発生も、ＥＰＣ可動化を包含して、障害されていることが、あるようである。実際、最近の証拠が、血管中へのこれらの脈管始原細胞の取り込みが、糖尿病状態において減っていることを実証してきている。
【００１４】
ＶＥＧＦ発現が、組織特異的な様式で規制されていることがある
糖尿病患者における種々の組織および臓器が、異なる病理を呈することも、明らかである。網膜がしばしば、過剰な血管発生により特徴付けられている一方、糖尿病患者における、皮膚、筋肉、および神経が、少しの新しい血管形成を患う。同様に、糖尿病網膜症が、眼のＶＥＧＦのレベルの増加により特徴付けられてきている（Ａｉｅｌｌｏら、＜＜糖尿病網膜症および他の網膜疾患を患っている患者の眼の流動体における脈管内皮成長因子＞＞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３３１：１４８０〜７（１９９４）；Ａｄａｍｉｓら、＜＜増殖糖尿病網膜症を患っている目の硝子体における脈管内皮成長因子レベルの増加＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、１１８：４４５〜５０（１９９４））一方、創傷治癒の障害が、ＶＥＧＦのレベルの重篤な減少により特徴付けられてきている（Ｆｒａｎｋら、＜＜培養ケラチノサイトにおける脈管内皮成長因子発現規制。通常および障害創傷治癒に関する暗示＞＞、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７０：１２６０７〜１３（１９９５）；Ｐｅｔｅｒｓら、＜＜胚発生および組織修復間の脈管内皮成長因子受容体発現が、内皮の分化および血管の成長における役割を示唆する＞＞、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０：８９１５〜９（１９９３）；Ｓｉｌｈｉ，Ｎ．、＜＜糖尿病および創傷治癒＞＞、Ｊ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ、７：４７〜５１（１９９８）；Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．、＜＜創傷治癒の間の表皮ケラチノサイトによる脈管浸透因子（脈管内皮成長因子）発現＞＞、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１７６：１３７５〜９（１９９２）；Ｎｉｓｓｅｎら、＜＜脈管内皮成長因子が、創傷治癒増殖相間、血管発生活性を媒介する＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５２：１４４５〜５２（１９９８））。このいわゆる＜＜糖尿病パラドックス＞＞が、これにより糖尿病表現型が、過剰なおよび障害された新しい血管形成両方を異なる組織において呈するが、異なるタイプの合併症に至る。この現象が、ＶＥＧＦの転写規制における細胞および組織特異的な違いを提示すると信じられている。
【００１５】
高血糖が結果的に、反応性酸素種過剰産生を通る細胞機能の特定の傷害を与える：ＶＥＧＦに対する潜在的結合
低酸素誘導ＶＥＧＦおよびＳＤＦ−１発現の障害を考慮する細胞機構（機序、メカニズム）がまだ、決定されていない。最近、高血糖誘導細胞損傷（ダメージ）に関する生化学的基準が記載されたが、高グルコースの効果の多くが、特定の４細胞経路を通り、媒介されていることを実証している（図３、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、＜＜糖尿病合併症の生化学および分子細胞生物学＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、４１４：８１３〜２０（２００１）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、＜＜ミトコンドリアスーパーオキシド産生の通常化が、高血糖損傷の３経路をブロックする＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：７８７〜９０（２０００））。グルコースにおける細胞内上昇が、解糖およびクレブス回路を通る代謝物流を増加させ、結果的に、ミトコンドリアによるＲＯＳ過剰産生を与えている。ＲＯＳ過剰産生が、ＧＡＰＤＨ活性を阻害し、結果的に、解糖初期相における早いグルコース代謝物蓄積を与えている。これらの代謝物の潤沢さ、および、解糖を通り進めないそれらが、グルコース利用の代わりの経路中へのこれらの中間体の短絡化を引き起こす（ポリオール経路、ヘキソサミン経路、蛋白キナーゼＣ経路、およびＡＧＥ経路、図３）。これらの経路の各々における末端生成物の蓄積が、細胞機能における特定の変化に至り、遺伝子発現を包含しており（Ｎｉｓｓｅｎら、＜＜脈管内皮成長因子が、創傷治癒増殖相間、血管発生活性を媒介する＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５２：１４４５〜５２（１９９８））、糖尿病合併症病理生理学において暗示されている（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、＜＜糖尿病合併症の生化学および分子細胞生物学＞＞、Ｎａｔｕｒｅ、４１４：８１３〜２０（２００１））。実際、これらの経路のうちの、１、幾つか、もしくは全ての特異的ブロックが、ある１動物モデルにおける糖尿病合併症を防ぐと示されてきており、虚血傷害から結果来るこれらの合併症を包含している（Ｈａｍｍｅｓら、＜＜ベンフォチアミンが、高血糖損傷の主要な３経路をブロックし、実験糖尿病網膜症を防ぐ＞＞、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９：２９４〜９（２００３）；Ｏｂｒｏｓｏｖａら、＜＜アルドース還元酵素阻害剤フィダレスタットが、ストレプトゾトシン糖尿病ラットにおける網膜酸化ストレスおよび脈管内皮成長因子過剰発現を防ぐ＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５２：８６４〜７１（２００３））。
【００１６】
高血糖誘導反応性酸素種が、虚血設定における脈管発生に必要とされているＶＥＧＦおよびケモカインたるＳＤＦ−１の適切なアップレギュレーションを媒介できるＨＩＦ−１αの能力をも、障害する。この障害が、脈管エフェクター細胞の低酸素に特異的な機能にも、影響を及ぼす。これが結果的に、糖尿病状態における、血管発生の障害、脈管発生、および、組織生存率の消失を与える。遊離脂肪酸流の増加が、同一機構（機序、メカニズム）によりＲＯＳを増加させると示されてきている（Ｄｕら、＜＜インシュリン耐性が、脂肪酸酸化誘導スーパーオキシド産生を増加させていくことにより、動脈内皮における原粥腫原性変化を引き起こす＞＞、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．印刷中）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明が、ある１被験体における急性の高血糖および／または脂肪酸流の増加の病理学的後遺症を処置していくかもしくは防いでいくことに関し、こうして、代謝物誘導反応性酸素種媒介傷害を防いでいく。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の１態様が、非糖尿病被験体、代謝症候群（メタボリックシンドローム）／インシュリン耐性被験体、障害グルコース絶食被験体、障害グルコース寛容被験体、および糖尿病被験体における急性の高血糖および／または脂肪酸流の増加の病理学的後遺症を処置していくかもしくは防いでいくある１方法に関する。この方法が、該被験体における急性の高血糖および／または脂肪酸流の増加の病理学的後遺症を処置するかもしくは防ぐに有効な条件下に該被験体にある１ＲＯＳ阻害剤を投与していくことに関与する。
【００１９】
本発明の別のある１態様が、高血糖もしくは脂肪酸流の増加に腹臥の被験体における脈管発生を促進させていくある１方法に関する。この方法が、該被験体における脈管発生を促進させるに有効な条件下に該被験体にある１ＲＯＳ阻害剤を投与していくことに関与する。
【００２０】
本発明の更なるある１態様が、ある１被験体における遊離脂肪酸酸化もしくは過剰放出を阻害していくある１方法に関する。この方法が、該被験体における遊離脂肪酸過剰放出を阻害するに有効な条件下にある特定化合物を該被験体に投与していくことに関与する。これらの化合物が、チアゾリジンジオン、ニコチン酸、エトモキシル、およびラノラジンを包含する。
【００２１】
本発明の更なるある１態様が、ＲＯＳ媒介傷害処置もしくは予防に適した化合物を同定していく方法に関する。この方法が、ある１糖尿病動物モデルを与え、糖尿病を該動物モデルにおいて誘導していくことに関与する。テストされるべきある１化合物が次いで、該動物モデルに投与されている。該動物モデルにおける、局所酸素圧、血流、血管密度増加、および組織生存率の快復を達成する化合物が、ＲＯＳ媒介傷害を処置していくかもしくは防いでいくための治療候補として次いで、回収されている。
【００２２】
本発明が、グルコースおよび脂肪酸代謝疾患を有する患者における虚血に対する応答における血管発生不足を復元させていくある１手段を提供する。これが急激に、下肢切断割合を低減させ、心臓発作および卒中による心臓および脳損傷（ダメージ）の程度を低減させると思われる。加えて、結果的に、現在、利用できる有効な医療処置の全くない主要なある１臨床問題たる難治糖尿病足潰瘍の治癒を与えると思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の１態様が、非糖尿病被験体、代謝症候群（メタボリックシンドローム）／インシュリン耐性被験体、障害グルコース絶食被験体、障害グルコース寛容被験体、および糖尿病被験体における高血糖における急性の増加および／または脂肪酸流の急性の増加の病理効果を処置していくかもしくは防いでいく方法に関する。この方法が、該被験体における高血糖における急性の増加および／または脂肪酸流の急性の増加の病理効果を処置するかもしくは防ぐに有効な条件下に該被験体にある１ＲＯＳ阻害剤を投与していくことに関与する。
【００２４】
上記したとおり、本発明のこの態様において、これら請求された方法が、非糖尿病被験体、代謝症候群（メタボリックシンドローム）／インシュリン耐性被験体、障害グルコース絶食被験体、障害グルコース寛容被験体、および糖尿病被験体に適用され得る。各々の場合（各ケース）において、該被験体が、ベースラインレベルの高血糖および／または脂肪酸流を持つ。本発明が、そのベースラインレベルの高血糖および／または脂肪酸流が、急速で相対的に短期の（つまり、急性）増加をする被験体における病状の予防もしくは処置に関している。
【００２５】
高血糖における急性の増加および／または脂肪酸流の急性の増加が起きる被験体が、以降の病状：
網膜における糖尿病特異的微小脈管病理（つまり、糖尿病網膜症）、腎臓糸球体（つまり、糖尿病ニューロパシー）、末梢神経（つまり、糖尿病ニューロパシー）、心臓、脳、および下肢を賄う動脈に影響を及ぼしている加速粥状（アテローム）巨大脈管疾患（つまり、糖尿病巨大脈管疾患）、あるいは、単なる脂肪症から、脂肪肝炎（＜＜ＮＡＳＨ＞＞）、線維化、および肝硬変までの範囲である広いスペクトルの肝傷害を包含する非アルコール脂肪肝疾患（＜＜ＮＡＦＬＤ＞＞）
のいずれかを患っていることがある。高血糖における急性の増加および／または脂肪酸流の急性の増加の病理効果も、防がれるか、もしくは、処置されていることがあり、該被験体が、決定的なケアの病気、急性心筋梗塞、急性発作を持つ場合であり、もしくは、動脈バイパスもしくは一般的な外科手術を受けてきている被験体である。
【００２６】
高血糖における急性の増加および／または脂肪酸流の急性の増加が、骨髄からの、脈管内皮細胞前駆体の可動化を障害する。これが、骨髄からの、脈管内皮細胞前駆体の可動化を障害している形を採ることがあり、脈管内皮成長因子および／またはＲＯＳ媒介障害の、ＨＩＦ−１αおよびＳＤＦ−１媒介アップレギュレーションを障害しており、脈管発生を阻害する。前記被験体が、ある１虚血病状をも、持ち得、冠状動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、非治癒足潰瘍、もしくは創傷（急性もしくは慢性）を包含する。
【００２７】
高血糖もしくは脂肪酸流の増加によるＲＯＳ発生が、ミトコンドリアにおいて起きる。最もよくあるＲＯＳが、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ．）、脂質過酸化ラジカル（ＬＯＯ．）、および過酸化亜硝酸（ＯＮＯＯ-）である。
【００２８】
Ｈ2Ｏ2が相対的に、安定であり、膜を通り拡散し得る。殆どの細胞において、Ｈ2Ｏ2が、酵素による還元により、Ｈ2ＯおよびＯ2に解毒されている。ミトコンドリアにおいて、酵素たるグルタチオン過酸化酵素（ペルオキシダーゼ）が第１に、この反応に応答性である。細胞質およびペルオキシゾームにおいて、グルタチオン過酸化酵素（ペルオキシダーゼ）および酵素たるカタラーゼ両方が、この反応を媒介する。しかしながら、鉄のような遊離ｄ−ブロック遷移金属存在下に、当該金属の酸化形態が、スーパーオキシドと反応すると考えられており、当該金属の酸化形態および分子酸素を（Ｏ2）を生成させている。この還元された金属が次いで、Ｈ2Ｏ2と反応し、当初の酸化された金属、ヒドロキシルイオン（ＯＨ+）、およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ．）を再生させる。しかしながら、この化学が尚、理解されていることから遠いことを記すことが、重要である。
【００２９】
鉄および他のｄ−ブロックの遷移金属が、フリーラジカル触媒として機能し得ることが、よく知られており、潜在的に、ヒドロキシルラジカルのような毒性種を発生させている。遷移金属が、周期表における大きなブロックの元素であり、ＩＢ、ＩＩＢ、ＩＩＩＢ等のようなＢを伴って終わっている族指定番号を持つ。これらが、該表の心臓において位置された４列の１０元素である。これらが、仕上げの電子が、そのｄ軌道に入る元素でも、ある（いわゆる、ｄ−ブロック金属）。全ての第１列のｄ−ブロック金属が、亜鉛を除き、不対電子を持ち（Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、およびＣｕ）、スピン拘束を除去し、次いで、フリーラジカル触媒において機能するのを可能とし、酵素活性部位において結合した元素として、および、溶液中において遊離して、両方である。
【００３０】
鉄が、多くの化学研究の焦点であってきているのは、この化学が最初に、Ｈ．Ｊ．Ｈ．Ｆｅｎｔｏｎにより１８７６年実証されたからであり、キレート化されなかったＦｅ2+／Ｈ2Ｏ2混合物を水溶液中において使用している。鉄（ＩＩ）と鉄（ＩＩＩ）との組み合わせの間で区別するに当たり、従来は、Ｆｅ3+／Ｈ2Ｏ2混合物に関してＦｅｎｔｏｎ様試薬を使用し、Ｆｅｎｔｏｎ試薬の使用をＦｅ2+／Ｈ2Ｏ2を記すのに制限することである。Ｆｅｎｔｏｎ様試薬が、有機基質を酸化していくことも、可能であるが、やや、Ｆｅｎｔｏｎ試薬よりも、反応性でない。鉄（ＩＩＩ）が、Ｆｅｎｔｏｎ試薬の適用において生成され得るので、Ｆｅｎｔｏｎの化学およびＦｅｎｔｏｎ様の化学がしばしば同時に、起きる。
【００３１】
Ｆｅｎｔｏｎ試薬の化学が尚、充分理解されていることから遠く、Ｆｅｎｔｏｎ様試薬の化学が更に、よりよく理解されていない。数多くの反応機構（機序、メカニズム）が、ＯＨ．およびＯＯＨ．ラジカルならびに高価数イオン種のような異なる活性中間体に基づいたＦｅｎｔｏｎ試薬の化学に関して提案されてきている。ＨａｂｅｒおよびＷｅｉｓｓのＯＨ．ラジカル機構（機序、メカニズム。引用）が恐らく、Ｆｅｎｔｏｎ反応に関する最もポピュラーな候補である：
Ｆｅ2+＋Ｈ2Ｏ2→Ｆｅ3+＋ＯＨ-＋ＯＨ
【００３２】
ポピュラーな代わりの機構（機序、メカニズム）のある１候補が、ＢｒａｙおよびＧｏｒｉｎにより最初に示唆されたものであり（引用）、ここにおいて、第３鉄イオンたる［ＦｅIVＯ］2+が、活性中間体であると考えられている：
Ｆｅ2+＋Ｈ2Ｏ2→［ＦｅIVＯ］2+＋Ｈ2Ｏ
【００３３】
過酸化水素を還元していくのに加え、第１鉄イオンが、アルキルヒドロ過酸化物とも、反応し得、アルコキシルラジカルを生成させる。これらのアルコキシルラジカルが次いで、フリーラジカルチェーンリアクションによる多不飽和脂質の酸化を開始させ得る（引用）。
【００３４】
数多くの生化学テキストブックにおけるその出現にかかわらず、Ｆｅｎｔｏｎの化学の生物学的意義が、多くのフリーラジカル化学者により問われてきているのは一部、還元された複数の金属およびこれらの錯体の、Ｈ2Ｏ2との反応に関する速度定数が、急速でなく、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける金属リガンドが、未知であるからである（引用）。しかしながら、最近、ＨＣＯ3-およびＣＯ2が大きく、Ｍｎ2+および他の遷移金属によるＨ2Ｏ2還元速度を加速させることが、示されてきている（引用）。恐らく、多くの提案された機構（機序、メカニズム）が互いと、複雑な予言不可能なやり方で競合し、これら金属リガンド、これらの価数、溶媒、ｐＨ、および、酸化されるべき有機基質のような反応条件に依っている（引用）。
【００３５】
ＲＯＳ阻害剤が、αリポ酸、スーパーオキシド不均化酵素（ジスムターゼ）模倣体、もしくはカタラーゼ模倣体たり得る。該スーパーオキシド不均化酵素（ジスムターゼ）模倣体もしくは該カタラーゼ模倣体が、ＭｎＴＢＡＰ（Ｍｎ（ＩＩＩ）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロリド）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍにより生産された）、ＺｎＴＢＡＰ（Ｚｎ（ＩＩＩ）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロリド）、ＳＣ−５５８５８［マンガン（ＩＩ）ジクロロ（２Ｒ，３Ｒ，８Ｒ，９Ｒ−ビス−シクロヘキサノ−１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロペンタデカン）］、Ｅｕｋ−１３４（３，３’−メトキシサレンＭｎ（ＩＩＩ））（Ｅｕｋａｒｉｏｎにより生産された）たり得る。
【００３６】
あるいは、ＲＯＳ阻害剤が、ある１鉄キレート剤、または、複数の鉄キレート剤の混合物を含んでいる組成物たり得る。キレート剤が、小分子であり、非常にタイトに、金属イオンに結合する。全てのキレート剤により分かち合われた鍵となる特性が、当該キレート剤に結合した金属イオンの反応性が大きく、抑えられているが、ある幾つかの場合において、および、ある特定条件下に、キレート剤−金属錯体自体が、反応性酸素フリーラジカルを発生し得ることである。臨床的に有用なキレート剤が、鉄のようなｄ−ブロックの１遷移金属に高度に特異的でなくてはならない。非特異的であるキレート剤が高度に、毒性である。
【００３７】
ある１キレート剤の基礎特性が、その閉環要員としてある１金属鉄を有する複素（ヘテロ）環状環構造を形成させる能力を持っていることにある。該キレート剤が、該金属鉄との結合形成用の１対の電子を供与し得る原子を有する２以上の官能基（リガンド）を保有しなければならない。供与原子が通常、Ｎ、Ｏ、およびＳであり：−ＣＯＯＨ、ＯＨ（フェノール性、エノール性）のようなある１酸性基、−ＳＨ、−ＮＨ＝Ｏ、−ＮＯＨの要員としても、機能し得、この場合において、そのプロトンが、その金属イオンにより取り替えられているか、または、−Ｃ＝Ｏ、−ＮＨ2、−Ｏ−Ｒ、−ＯＨ（アルコール性）、−Ｓ−−チオエーテルのような電子供与体（ルイス塩基）の不対電子（ローンペア）としてであり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、１１、２１６１〜２１８３において記載されたとおりであり、この全体において、本明細書において、援用されている。
【００３８】
理想的に、ある１キレート剤に対する鉄のタイトな結合が完全に、ある１フリーラジカル触媒として機能できるその能力を阻害するはずである。鉄キレート剤が、分類されており、鉄との結合の化学量論に従っている。鉄イオンが、６電気化学的配位部位を持つ。これゆえ、ある１キレート剤分子が、全６部位に１：１の比で結合し、＜＜６座＞＞と呼ばれている。ある１キレート剤分子が、これら６部位のうちの２部位だけに結合し、＜＜２座＞＞と呼ばれており、キレート剤分子が、これら６部位のうちの３部位に結合し、＜＜３座＞＞と呼ばれている。理論では、３分子の２座キレート剤が、１分子の６座キレート剤と同じく完全に、遊離鉄の反応性を抑えるはずである。しかしながら、２座鉄キレート剤を用いると、フリーラジカル触媒一部還元生成物の形成がしばしば、起きる。実際には、これが、化学的大過剰のこのようなキレート剤が、これらの反応性のキレート剤−鉄錯体の形成を避けるために必要とされていることを意味する。
【００３９】
鉄キレート剤が、分類され得、その起源（合成  対  生物学的に産生された分子）、水のような溶媒とのその相互作用（疎水性  対  親水性）、あるいはその化学量論相互作用（２座  対  ６座）のような数多くの基準（クライテリア）を使用している。
【００４０】
有効なある１鉄キレート剤の一般的な構造が、通則的な構造たるＲ−Ｌ−Ｃ−Ｍおよびこれらの全ての組み合わせを含む。
【００４１】
例えば、Ｃが、選択的鉄結合親和性（アフィニティー）および結合力により特徴付けられた、２、３、もしくは６座の鉄キレート化部分を表し得、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、１１、２１６１〜２１８３において記載されたとおりである。組み合わせたるＣ−Ｍが、２官能基薬剤構造を表し得、ある１マスク基Ｍに結合したある１鉄キレート化部分Ｃを含有しており、電子供与原子たり得ると思われる。細胞内ヒドロキシルラジカルＯＨ．が、Ｍの電子により抑えられ得、ＭをＣから開裂させ、一旦マスクを外されたら、遊離鉄イオンと結合し得る。
【００４２】
組み合わせたるＲ−Ｃが、骨格のある１側鎖Ｒに結合した鉄キレート化部分たるＣを表し得、式中、Ｒが、Ｈ、線状脂肪族鎖構造、あるいは、芳香族、脂肪族、および／または複素芳香環を包含している脂肪族鎖たり得る。キレート剤の相対潜在力が、当該分子の親水性に関連されているよう見えるので、Ｒの化学構造が、標的細胞および／または標的細胞区画（コンパートメント）におけるこれらキレート剤の浸透を容易化させたり、または、障害させたりし得る。仕上げに、組み合わせたるＲ−Ｌ−Ｃが、ある１リンカーＬを通してある１側鎖Ｒに結合した鉄キレート化部分たるＣを表し得る。リンカーたるＬが、急速な細胞取り込みを容易化させ、Ｃの細胞からの退出を遅らせ得、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２、１２４、１２６６６〜１２６６７において記載されたとおりであり、この全体において、本明細書において、援用されている。例えば、Ｒ−Ｌ−Ｃが、ある１原親水性薬剤（プロドラッグ）を表し得る。Ｌが、ある１エステル結合たり得、Ｒが、ある１エステル部分、Ｃが、ある１鉄キレート化部分たり得る。当該細胞における進入時、Ｒ−Ｌ−Ｃが、エステラーゼにより媒介された親油性部分たるＲの加水分解時、高度に、親水性に転じ得る。こうして、Ｌが、加水分解されており、Ｒが、化学的に、当該分子から取り外されており、このより親水性のＣが、当該細胞内側で保持されており、ここで、そのキレート化機能を果たし得る。
【００４３】
他の一般的な構造の有効な鉄キレート剤が、米国特許第６，４６５，５０４号明細書において記載された式１の３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールのファミリーを含み、この全体において、本明細書において、援用されている。
【００４４】
これら鉄キレート剤のうち、デフェロキサミン、つまり、ＤＦＯが、最も重要であることがあるのは、サラセミアにおける鉄過剰の処置用に、ＦＤＡにより認可されているからである。
【００４５】
デフェロキサミンが、用いられている場合、患者（例えば、急性心筋梗塞を患っている患者）が、１，０００〜１０，０００ｍｇのデフェロキサミンの筋内注射、または、１００〜１０，０００ｍｇのデフェロキサミンの静脈内注射を用いて処置され得る。このような患者が、１００〜１０，０００ｍｇ／リットル（Ｌ）の濃度のデフェロキサミンでの液体形態におけるデフェロキサミン静脈内注射により、発症２４時間内で処置され得る。デフェロキサミンが、ＤＦＰ、ＩＣＬ−６７０、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ阻害剤、ならびに、高血糖誘導ＲＯＳ産生を防ぐグルカゴン様ペプチド−１断片、例えば、ＧＬＰ−１（９〜３６アミド）およびＧＬＰ−１（９〜３７）と一緒でも、投与され得る。あるいは、デフェロキサミンが、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ阻害剤と一緒に、投与され得、ニコチンアミド、３−アミノベンズアミド、ＰＪ３４、（Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロ−フェナントリジン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド）、およびこれらの混合物を包含しているが、これらに限られなかった。
【００４６】
デフェロキサミンが、鉄過剰負荷状況における患者のための救命処置を提供し得る一方、数多くのデフェロキサミン誘導体も、用いられ得る。ＤＦＯの、脂肪族、芳香族、琥珀酸、およびメチルスルホン酸類似体が、合成されてきているが、ＤＦＯの親油性を高める（Ｉｈｎａｔら、＜＜デフェロキサミンアミドの溶液平衡＞＞、Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９１：１７３３〜１７４１（２００２）、この全体において、本明細書において、援用されている）。特に、これらの誘導体が、ホルムアミドデフェロキサミン、アセタミドデフェロキサミン、プロピルアミドデフェロキサミン、ブチルアミドデフェロキサミン、ベンゾイルアミドデフェロキサミン、スクシンアミドデフェロキサミン、およびメチルスルホンアミドデフェロキサミンを包含する。ヒドロキシルエチル澱粉（スターチ、ＨＥＳ）デフェロキサミンが、合成されてきており、デフェロキサミンよりも、長い血漿半減寿命を持つと示された（Ｐｅｄｃｈｅｎｋｏら、＜＜デスフェリオキサミンが、ＳＪＬマウスにおけるＭＢＰにより誘導された実験アレルギー脳脊髄炎を抑える＞＞、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８４：１８８〜１９７（１９９８）、この全体において、本明細書において、援用されている）。ある１アミノオキシアセチルフェリオキサミンも、調製されてきており、抗体に対する部位特異的共役を求めている（Ｐｏｃｈｏｎら、＜＜抗体に対する部位特異的共役を求めるＣｈｅｌｏｎたるデスフェリオキサミンの新しきある１誘導体＞＞、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４３：１１８８〜１１９４（１９８９）、この全体において、本明細書において、援用されている）。蛍光デフェロキサミン誘導体も、合成されてきており、ある範囲の生物学実験条件における遊離鉄測定用である（Ａｌ−Ｍｅｈｄｉら、＜＜Ｉｎ  ｓｉｔｕにおける肺内皮剪断ストレスにおける剥離抑制を伴う脱分極関連鉄放出＞＞、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．２：３３５〜３４５（２０００）、この全体において、本明細書において、援用されている）。
【００４７】
他の適切な鉄キレート剤が、表２において説明されたものも、包含する：
【００４８】
【表２−１】
2009518414.tif 000004
【表２−２】
2009518414.tif 000005
【００４９】
ＨＥＢＥＤが、ある１種の合成キレート剤であり、ＤＦＯよりも、高い効率を持ち、より少ない悪影響を持つよう見える。しかしながら、霊長類研究において尚、皮下点滴により投与されていなくてはならなかった（Ｃｈａｓｔｏｎら、＜＜鉄過剰負荷疾患処置用鉄キレート剤：構造、酸化還元（レドックス、Ｒｅｄｏｘ）活性、および毒性間の関係＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．７３：２００〜２１０（２００３）、この全体において、本明細書において、援用されている）。
【００５０】
ＰＩＨが、ある１種の経口で活性な３座キレート剤であり、ＤＦＯよりも、遙かによく膜を横断する。ＰＣＩＨ（つまり、２−ピリジルカルボキシアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン類似体）化合物（表２において、示されていない）が実質的に、ＰＩＨに似ている。この分類（クラス）のキレート剤も、ミトコンドリア鉄プールに近づき得、稀な遺伝子疾患たるＦｒｉｅｄｒｉｃｈ失調（ミトコンドリア鉄−硫黄複合体シャペロンたるフラタキシンにおける突然変異により引き起こされた）用の潜在的な薬剤としている。
【００５１】
ＨＢＥＤのように、ＤＦＴおよびＧＴ５６−２５２両方が、第２世代のヒドロキシピリドンであり、前臨床もしくはフェーズＩ試行にある。
【００５２】
ＤＦＰ、つまり、デフェリポンが、商品名Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘの下に、欧州において、臨床使用に関して、承認されている。これが、ある１種の２座キレート剤であり、経口投与されている。しかしながら、この薬剤の効率および毒性が尚、反対に遭っている。ＤＦＯおよびＤＦＰの使用の組み合わせが、提案されてきている。
【００５３】
Ｓ−ＤＦＯが、ある１種のスターチ結合ＤＦＯ誘導体であり、静脈内投与後、より長い半減寿命を持つ。
【００５４】
ＩＣＬ−６７０が現在、フェーズＩＩＩ試行にあるトリアゾールファミリーのある１種の３座キレート剤である。経口利用可能であり、１日１回投与されている（Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ｃ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９７：１１１５〜１１２２（２００１）、この全体において、本明細書において、援用されている）。
【００５５】
別のある１分類（クラス）の鉄キレート剤が、生体模倣の分類である（Ｍｅｉｊｌｅｒ，ＭＭら、＜＜マスクされた親水性部分を有する鉄キレート剤の合成および評価＞＞、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１２６６〜１２６７（２００２）、この全体において、本明細書において、援用されている）。これらの分子が、ＤＦＯおよびフェリクロームとしてのこのように天然に産出されたキレート剤の修飾類似体（アナログ）である。これら類似体（アナログ）が、親油性部分の取り付けを可能とし（例えば、アセトキシメチルエステル）、大きく、膜通過を高める。これら親油性部分が次いで細胞内で、内因性エステラーゼにより開裂されており、当該細胞から漏れ出得ない親水性分子へとこれらキレート剤を戻して変換していく。これらの化合物が、高度に有効であるよう見え、ＤＦＯよりも、遙かに効率的に、遊離鉄媒介酸化損傷（ダメージ）を抑える。
【００５６】
最後に、数多くの化合物が、進んだ糖化末端製品（ＡＧＥ）形成および／または分解阻害剤として開発され、動物糖尿病合併症モデルにおいてテストされたが、キレート化経由で作用するよう見える（Ｐｒｉｃｅ，ＤＬら、ＪＢＣ、２７６：４８９６７〜７２（２００１）、この全体において、本明細書において、援用されている）。これらが（最弱から最強銅キレート化に向かう順で）：アミノグアニジンおよびピリドキサミン；カルノシン、フェナジンジアミン、ＯＰＢ−９１９５、およびテニルセタムを包含する。いわゆるＡＧＥブレーカーたる、フェナシルチアゾルムおよび臭化フェナシルジメチルチアゾリウム、ならびにこれらの加水分解産物が、アスコルビン酸の銅触媒自動酸化の最も潜在的な阻害剤の間にあった。アミノグアニジンが、フェーズＩＩ／ＩＩＩ試行を通ってきており、ピリドキサミンが、フェーズＩＩ試行を通ってきており、これらＡＧＥブレーカーが現在、フェーズＩＩ試行にある。
【００５７】
これら阻害剤が、経口、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、点眼により、眼内、鼻内、動脈内、病巣内、あるいは、鼻、喉、および気管のもののような粘膜に対する適用により、投与され得る。これら阻害剤が、単独、あるいは、医薬として許容可能な塩、担体、賦形剤、もしくは安定剤と共に、投与され得、固体もしくは液体の形であり得、例えば、錠剤（タブレット）、カプセル、粉体、溶液、懸濁、もしくはエマルションを包含している。
【００５８】
これら固体単位（ユニット）用量形態が、従来型（タイプ）のものであり得る。該固体形態が、カプセルたり得、本発明の阻害剤、および、担体、例えば、潤滑剤、および、ラクトース、スクロース、もしくはコーンスターチのような不活性充填剤（フィラー）を含有している普通のゼラチンタイプのようなものである。別のある１実施形態において、これら阻害剤が、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンのようなバインダー、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、もしくはアルギン酸のような崩壊剤、および、ステアリン酸もしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と組み合わせて、ラクトース、スクロース、もしくはコーンスターチのような従来の錠剤（タブレット）ベースを用いて錠剤（タブレット）化されている。
【００５９】
別のある１態様において、本発明の阻害剤が、例えば、ある１不活性稀釈剤と共に、もしくは、ある１食物同化担体と共に、経口投与されていてよく、または、硬いかもしくは柔らかい殻のカプセル中において閉じ込められていてよく、または、錠剤（タブレット）中に圧縮されていてよく、または、ダイエット食品と共に、直接、取り込まれていてよい。経口治療投与用に、本発明の阻害剤が、賦形剤と共に、取り込まれていてよく、錠剤（タブレット）、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、および同様のものの形で使用されていてよい。１態様において、このような製剤が、本発明の阻害剤の少なくとも０．１％を含有するべきである。本発明の製剤における阻害剤の％が勿論、変動されていてよく、便利に、約２％〜約６０％の重量単位（ユニット）であってよい。本発明の製剤における阻害剤の量が、適切な用量が、得られてくるようなものである。１例として、本発明に従っている製剤が、経口用量単位（ユニット）が、約１〜２５０ｍｇのこれら阻害剤を含有するよう調製されている。
【００６０】
これら錠剤（タブレット）、カプセル、および同様のものが、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンのようなバインダー；燐酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ならびに、スクロース、ラクトース、もしくはサッカリンのような甘味料をも、含有してよい。前記用量単位（ユニット）形態がある１カプセルである場合、上のタイプの素材に加え、脂肪油のような液体担体を含有してよい。
【００６１】
種々の他の素材が、コーティングとして、もしくは、前記用量単位（ユニット）の物理的形態を修飾するよう、存在していてよい。例えば、錠剤（タブレット）が、シェラック、糖、もしくは両方を用いてコーティングされていてよい。シロップが、活性成分に加え、甘味料としてスクロース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、染料、ならびに、桜ん坊（サクランボ）もしくは橙（オレンジ）香料のような香料を含有してよい。
【００６２】
上記したとおり、本発明の１態様において、これら阻害剤を含有している製剤が、非経口投与されていてよい。これら阻害剤の溶液もしくは懸濁が、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散体も、油中において、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中において、調製され得る。例示の油が、石油、動物油、植物油、もしくは合成油起源のものであり、例えば、ピーナッツ油、大豆油、もしくは鉱油である。一般的に、水、食塩水、デキストロースおよび関連した糖の水溶液、ならびに、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコールが好ましい液体担体であり、特に、注入可能な溶液に関してである。保管および使用の普通の条件下に、これらの調製物が、保存料を含有し、微生物の成長を防ぐ。
【００６３】
前記阻害剤がデフェロキサミンである場合、非経口使用用デフェロキサミン組成物が、ある１溶液もしくは懸濁の形であり得る。このような溶液もしくは懸濁が、注射用水、食塩水溶液、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤をも、包含してよい。非経口製剤が、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、または、重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤をも、包含してよい。アセテート、シトレート、もしくはホスフェートのような緩衝剤（バッファー）、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられていてよい。該非経口調製物が、アンプル、使い捨てシリンジ、または、ガラスもしくはプラスチックでできた多数回用量ヴァイアル中において閉じ込められ得る。
【００６４】
注入可能な使用に適した医薬形態が、無菌水溶液もしくは分散体、および、注入可能な無菌水溶液もしくは分散体即時調製用無菌粉体を包含する。全ての場合において、該形態が、無菌でなくてはならず、容易なシリンジの可能性が存在する程度にまで、流動体でなくてはならない。製造および保管条件下に安定でなくてはならず、バクテリアおよび真菌のような微生物の混入動作に対して保存されていなくてはならない。前記担体が、溶媒もしくは分散媒体たり得、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、および植物油を含有している。
【００６５】
筋内投与用徐放デフェロキサミン組成物が、標準方法により製剤されていてよく、微結晶組成物のようなものである。より長い半減寿命を有するデフェロキサミン調製物が、例えば、デキストランもしくはポリエチレングリコールとのデフェロキサミンの共役により製剤されていてよい。加えて、細胞膜に浸透する偉大な能力を有するデフェロキサミン誘導体が、アセトキシメチルエステルのような親油性エステル部分にデフェロキサミンを結合させていくことにより調製され得、次いで、一旦、当該化合物がその細胞内側に入ると、細胞内エステラーゼにより除去されている（Ｍｅｉｊｌｅｒら、＜＜マスクされた親水性部分を有する鉄キレート剤合成および評価＞＞、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１２６６６〜１２６６７（２００２））。
【００６６】
本発明の阻害剤を含有している製剤が、エアロゾルの形で気道に直接投与されていても、よい。エアロゾルとしての使用用に、溶液もしくは懸濁中の本発明の阻害剤が、従来のアジュバントを有する適切な噴射剤、例えば、プロパン、ブタン、もしくはイソブタンのような炭化水素噴射剤と一緒に、加圧エアロゾル容器中においてパッケージされていてよい。本発明の阻害剤が、ネブライザーもしくはアトマイザーにおけるような非加圧形態において投与されていても、よい。
【００６７】
この方法を完遂していくことにおいて、ある１ＲＯＳ媒介傷害が処置もしくは予防され得る。こうして処置もしくは予防され得る高血糖病状が、慢性高血糖を包含する。これが、高血糖糖尿病もしくは急性高血糖（ストレス高血糖のような）を包含する。インシュリンに対する耐性（インシュリン耐性）が、本発明のこの態様に従っているある１代謝物誘導過剰ＲＯＳ産生の別のある１形態である。これが、インシュリンに対する耐性がある場合、あり得、結果的に、血管細胞による遊離脂肪酸流の増加および遊離脂肪酸酸化の増加を与える。
【００６８】
本発明の別のある１態様が、高血糖もしくは脂肪酸流の増加に対して腹臥しているある１被験体における脈管発生を促進させていくある１方法に関する。この方法が、該被験体における脈管発生を促進させるに有効な条件下に該被験体にある１ＲＯＳ阻害剤を投与していくことに関与する。
【００６９】
ここで、脈管発生が、低酸素シグナルに対して応答性であり得、血管発生（例えば、心臓もしくは下肢）または脈管発生両方に関与する。前記被験体が、冠状動脈疾患、末梢血管疾患、脳血管疾患、または、慢性もしくは急性である創傷のような虚血病状を持ち得る。
【００７０】
本発明のこの実施形態用の、ＲＯＳ阻害剤、この製剤、およびこの投与様式（モード）が、上記したものと同一である。
【００７１】
ここで、前記被験体が好ましくはヒトであり、高血糖もしくは脂肪酸流に対して腹臥している。
【００７２】
本発明の更なるある１態様が、ある１被験体における遊離脂肪酸酸化もしくは過剰放出を阻害していくある１方法に関する。この方法が、該被験体における遊離脂肪酸酸化もしくは過剰放出を阻害するに有効な条件下にある特定化合物を該被験体に投与していくことに関与する。これらの化合物が、チアゾリジンジオン、ニコチン酸、エトモキシル、およびラノラジンを包含する。
【００７３】
本発明のこの実施形態において、上で同定された化合物が、上で記されたと実質的に同一のやり方で製剤されており、投与されている。
【００７４】
本発明のこの態様において、前記被験体が哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【００７５】
本発明の更なるある１態様が、ＲＯＳ媒介傷害処置もしくは予防に適した化合物を同定していく方法に関している。この方法が、糖尿病動物モデルを与えていくこと、および、糖尿病を該動物モデルにおいて誘導していくことに関与する。テストされるべき１化合物が次いで、該動物モデルに投与されている。ＲＯＳ媒介傷害を処置していくかもしくは防いでいくための治療候補としての、局所酸素圧回復、血管密度における血流の増加、および、該動物モデルにおける組織生存率を達成させる化合物が次いで、回収されている。
【実施例】
【００７６】
実施例１−３種の異なるマウス糖尿病モデルが、虚血に対する応答において、組織壊死の増加を呈する
糖尿病組織が、虚血に対する寛容の抑制を持つことが、よく理解されている（Ｈａｆｆｎｅｒら、＜＜２型糖尿病を患っている被験者における、ならびに、より前の心筋梗塞を患っている非糖尿病被験者および患っていない非糖尿病被験者における、冠心臓疾患からの死＞＞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３３９：２２９〜３４（１９９８）；Ｊｕｄｅら、＜＜糖尿病および非糖尿病患者における末梢動脈疾患：重篤さおよび結果のある１比較＞＞、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ、２４：１４３３〜７（２００１）；Ｔｕｏｍｉｌｅｈｔｏら、＜＜発作からの死に関する危険因子（リスクファクター）としての糖尿病：中年で終える集団の予定研究＞＞、Ｓｔｒｏｋｅ、２７：２１０〜５（１９９６）；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、＜＜糖尿病における側副血管の進展の障害：潜在的細胞機構および治療方針＞＞、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ、４９：５５４〜６０（２００１）；Ｒｉｖａｒｄら、＜＜アデノ−ＶＥＧＦを用いる筋内遺伝子治療による血管新生糖尿病関連障害救助＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５４：３５５〜６３（１９９９）；Ｋｉｐら、＜＜当初の血管移植もしくはバイパス外科手術後の心筋の危難の増加への糖尿病の影響の差：バイパス血管移植再脈管新生調査＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０５：１９１４〜２０（２００２）；Ｐａｒｔａｍｉａｎら、＜＜糖尿病２５８症例における急性心筋梗塞：即死率および５年生存率＞＞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、２７３：４５５〜６１（１９６５）；Ｓｉｍｏｖｉｃら、＜＜決定的な肢虚血を患っている患者における筋内ｐｈＶＥＧＦ１６５遺伝子導入後の慢性虚血ニューロパシーにおける向上＞＞、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ、５８：７６１〜８（２００１）；Ｍａｒｇｏｌｉｓら、＜＜ニューロパシー糖尿病足潰瘍治癒の遅れに関する危険因子（リスクファクター）：解析のある１プール＞＞、Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１３６：１５３１〜５（２０００）、これらの全体において、本明細書において、援用されている）。臨床的に、これが結果的に、心疾患率の増加、死の増加、および、創傷治癒の引き延ばしを与える。この関係が、動物心臓および後肢虚血モデルにおいて研究されてきている一方（Ｒｉｖａｒｄら、＜＜アデノ−ＶＥＧＦを用いる筋内遺伝子治療による血管新生糖尿病関連障害救助＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５４：３５５〜６３（１９９９）；Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒら、＜＜ＶＥＧＦ遺伝子導入による実験糖尿病ニューロパシーの反転＞＞、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０７：１０８３〜９２（２００１）、これらの全体において、本明細書において、援用されている）、これらのモデルに対する限界がある。大血管解剖における変法（バリエーション）により、この結果得られてくる壊死パターンが予言不可能であり、これら実験結果における差異に至っていく。加えて、犠牲を除いて、組織生存率を求めるのが可能でない。更に、レーザードップラーのような潅流間接測定がしばしば、虚血を推定するのに利用されていなければならないが、これらの手法が組織酸素化を監視している直接の情報を与えない。
【００７７】
これらの問題を解決させるに当たり、マウス背軟組織における勾配を付けられた虚血の新しきモデルが創出されてきている（図５、Ｔｅｐｐｅｒら、＜＜ＩＩ型糖尿病からのヒト内皮始原細胞が、増殖の障害、接着、そして脈管構造中への取り込みを呈する＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０６：２７８１〜６（２００２）、この全体において、本明細書において、援用されている）。マウスの背中の脈管解剖が精密に知られており、主要な縦の血管が容易に視覚化され得るので、該組織における再現性ある酸素勾配を有する虚血の信頼できる領域（帯、ゾーン）を創出し得る。これが、直接組織酸素圧測定を用いて確かめられてきており、最少虚血領域から、最多虚血領域に向かって進んでいく０．５ｃｍ離された５参照点（ｐ１〜ｐ５）を利用している。これが、虚血の離散微小環境（領域Ａ、Ｂ、Ｃ）の研究にも、向かっており、領域Ａが、最少虚血であり、領域Ｃが、該軟組織の最多虚血部分である。このモデルの設計（デザイン）が、酸素圧直接動的測定、組織生存定量を、遺伝子発現における変化との特定酸素圧の相関を可能とするある程度の再現性を伴って容易化させる。
【００７８】
このモデルを使用しながら、虚血に対する応答が劇的に、全て有意な高血糖により特徴付けられた３種の異なるマウス糖尿病モデルにおいて障害されていることが観察されてきている。ＩＩ型糖尿病のある１種のレプチン受容体（レセプター）欠損モデルたるｄｂ／ｄｂマウスにおいて、虚血が、殆ど全ての組織の有意な壊死を生み出す一方、＜＜全組織＞＞が、非糖尿病動物において＜＜生存した＞＞ことが実証されてきている。似た結果が、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスモデル（Ｓｔｚ）において記されたが、同様に、ＡｋｉｔａマウスＩ型糖尿病モデルも、非糖尿病マウスにおいて観察されたもののおよそ３０％の組織生存を有した（図６）。重要なことに、酸素圧および脈管密度（ＣＤ３１染色およびＦＩＴＣレクチン潅流）が、外科手術前に、全４群（グループ）において同一であったが、組織生存における違いが、脈管密度におけるベースラインの違いよりも、むしろ虚血に対する応答の障害によったことを示唆している。
【００７９】
実施例２−糖尿病マウスが、虚血に対する脈管新生応答の消失を持つ
このモデルにおいて観察された組織生存の減少が、当該生存組織における脈管新生の消失とも、関連されていた。外科手術７日後、非糖尿病マウス虚血軟組織における酸素圧が、通常の皮膚のものに近づく（図７、灰色プロット）一方、これら糖尿病マウスが、複数の同一参照点での酸素圧の有意な低減を実証する（黒色プロット）。これらの知見が、糖尿病マウスにおける当該生存組織において観察された血管数の低減と相関した（図８、黒色プロット）が、ＣＤ３１染色により求められたとおりであった。これが、虚血誘導脈管新生が、糖尿病マウスにおいて障害されていることを示唆する。
【００８０】
実施例３−高血糖誘導反応性酸素種予防が、糖尿病動物モデルにおける組織生存を復元させる
酸化損傷（ダメージ）の増加が、糖尿病動物における虚血に対する組織応答の障害の上流でのある１調節者であったかどうかが、審査されてきている。この問いを解決させるに当たり、ミトコンドリアマンガンスーパーオキシド不均化酵素（ジスムターゼ、ＭｎＳＯＤ）を過剰発現する遺伝子導入マウスが使用された。ＭｎＳＯＤが、スーパーオキシドからの分子酸素形成を触媒し、ＲＯＳ生成を防いでおり、有効に、高血糖損傷（ダメージ）の全４経路をブロックする。糖尿病が、野生型マウスおよびＭｎＳＯＤ遺伝子導入マウスにおいて、ストレプトゾトシン注入を介して誘導されたが、高血糖（＞４００ｍｇ／ｄＬ）が１ヶ月間、維持された。虚血外科手術後、組織が、直接酸素圧測定により、１、３、および７日目に、モニターされた。野生型糖尿病マウスに比べたら、ＭｎＳＯＤ糖尿病マウスが、局所組織酸素圧の急速な回復、脈管新生、および、非糖尿病マウスにおいて観察されたものに似ていた組織生存の増加を実証した（図９）。非糖尿病ＭｎＳＯＤコントロールマウスが、野生型マウスに似ていた。これが、高血糖誘導ＲＯＳ予防が、虚血現象後の糖尿病動物における組織生存を向上させることを示唆する。
【００８１】
実施例４−慢性高グルコース水準（レベル）が、ミトコンドリア膜電位（ポテンシャル）の増加とも、相関する
高グルコース培養の、ミトコンドリア膜電位（ポテンシャル）への効果も、電位（ポテンシャル）依存カチオン染料ＪＣ−１を使用しながら、急性もしくは慢性高グルコースに晒されたＣ２Ｃ１２細胞において、審査された。これが、酸化ストレス指示剤として、使用されてきている。最近の報告（Ｄｕら、＜＜高血糖が、Ａｋｔ部位での翻訳後修飾により、内皮一酸化窒素合成酵素（シンターゼ）活性を阻害する＞＞、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０８：１３４１〜８（２００１）、この全体において、本明細書において、援用されている）と調和して、慢性高グルコースが深遠に、通常グルコース培養、もしくは、高グルコースに対する急性被曝に比べたら、ミトコンドリアプロトン電気化学勾配を増加させる（橙（オレンジ）−赤蛍光に向かってのシフトにより、証拠付けられた、図１０、Ｄｕら、＜＜高血糖が、Ａｋｔ部位での翻訳後修飾により、内皮一酸化窒素合成酵素（シンターゼ）活性を阻害する＞＞、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０８：１３４１〜８（２００１）、この全体において、本明細書において、援用されている）。これゆえ、ある１相関が、高血糖、酸化ストレス、および、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＶＥＧＦ障害の間で存在する。
【００８２】
実施例５−ＶＥＧＦ産生の障害が、ＲＮＡ転写レベルにおいて、横たわる
高血糖状態における血管新生の障害に寄与する者として、ＶＥＧＦ産生の減少を暗示している証拠と共に、高グルコースがＶＥＧＦ発現を代える機構（機序、メカニズム）が審査された。低酸素条件下に通常および高グルコース培養において存在するＶＥＧＦｍＲＮＡ転写体の解析が、高グルコースにおいて培養された細胞におけるＶＥＧＦｍＲＮＡ産生の実質的な低減を解き明かした（図１１）。この知見に関する可能な説明が、異常なｍＲＮＡ安定化を包含したか、または、高グルコースにおけるプロモーター活性を減少させた。ｍＲＮＡ安定化問題を解決させるに当たり、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＲＮＡ半減（１／２）寿命が、アクチノマイシンＤを用いて転写を阻害していくことにより審査された。これらの実験の結果が、ＶＥＧＦ蛋白レベルにおける有意な違いに関わらず、通常細胞と高血糖細胞との間でのＶＥＧＦｍＲＮＡ安定性における違いを全く、示さなかった（図１２）。ＶＥＧＦプロモーター活性が次いで、ある１ルシフェラーゼ遺伝子に融合された全長ＶＥＧＦプロモーターを含有しているレポーター構築体を使用しながら、審査された。この構築体が一過性に、通常および高グルコースにおいて培養されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞中に同時トランスフェクションされたが、トランスフェクション効率に関してコントロールするに当たり、構造的に発現されたＲｅｎｉｌｌａプラスミドを用いた。低酸素誘導ルシフェラーゼ産生が有意に、通常グルコースコントロールに比べたら、高グルコース条件において障害されていた（図１３）。これが、低酸素におけるＶＥＧＦ蛋白産生の障害が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶＥＧＦ転写の減少から、結果来たことを実証する。
【００８３】
実施例６−ｐ３００およびＨＩＦ−１αが、Ｏ−結合グリコシル化用基質であり、潜在的に、低酸素誘導ＶＥＧＦ発現における障害に対する高血糖酸化損傷（ダメージ）のヘキソサミン経路に結合（リンク）している
低酸素誘導ＶＥＧＦ発現の障害に関する機構（機序、メカニズム）として、高グルコースにおいて、ＨＩＦ−１αトランス活性化の障害を暗示している知見に基づいたら、ＨＩＦ−１αの潜在的な転写後修飾が、これらの条件下に審査された。当初、ＨＩＦ−１αが、Ｏ−結合グリコシル化用基質であるかどうかが、審査された。ＨＩＦ−１αが、通常もしくは高グルコース条件において成長させられた細胞から、免疫沈降されたが、ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットが、該Ｏ−結合グリコシル化修飾を含有している残基を特異的に認識する抗体を用いて探索（プローブ）された。グリコシル化ＨＩＦ−１αが全く、通常グルコース条件下に存在していなかった一方、有意なグリコシル化が高グルコースにおいて、あった（図１４）。これが、ＨＩＦ−１αが、Ｏ−結合グリコシル化用基質であるとの最初の実証であり、好ましくは、高グルコース条件下にグリコシル化されている。
【００８４】
ＨＩＦ−１転写複合体が、幾つかの同時活性化剤から構成されているので、ＨＩＦ−１の主要な同時活性化剤たるｐ３００も、グリコシル化されたかどうかも、審査された。多くの転写因子が、構造的にｐ３００と会合すると見出されてきている一方、この相互作用が、転写後修飾により調節されているある幾つかの場合が、同定されてきている（Ｚａｎｇｅｒら、＜＜ＣＲＥＢ結合蛋白の、転写複合体に対する動員が、このＧＦボックスの、成長因子依存燐酸化を必要とする＞＞、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、７：５５１〜８（２００１）；Ｓｏｕｔｏｇｌｏｕら、＜＜アセチル化が、多重のレベルにおいて、転写因子活性を規制する＞＞、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、５：７４５〜５１（２０００）、これらの全体において、本明細書において、援用されている）。これらＨＩＦ−１実験を繰り返していくと、ｐ３００が、高グルコース条件において、転写後Ｏ−結合グリコシル化用基質としても、働くことも、見出された。これが生理学的に有意であったのは、ｐ３００の、転写因子たるペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体（レセプター）γ（ＰＰＡＲγ）との会合が、同時免疫沈降アッセイにより、通常グルコースに比べた高グルコース条件において、抑えられたからである（図１５）。興味あることに、ヘキソサミン生合成律速酵素たるグルタミン：フルクトース−６−燐酸アミド転移酵素（ＧＦＡＴ）の、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたブロックが３倍近く、高グルコースにおけるｐ３００のＯ−結合グリコシル化の量を抑え、通常グルコースにおいて成長させられた細胞に比べられるレベルにまで、ｐ３００／ＰＰＡＲγ相互作用を復元させた（図１５ＡおよびＢ）。これが、ｐ３００の、転写複合体に対する動員が、高グルコース条件において障害されていることを示唆し、これが、グルコース誘導Ｏ−結合グリコシル化を防いでいくことにより、覆され得る。ＨＩＦ−１αのＯ−結合グリコシル化の生理学的関連が、明らかでない。しかしながら、グリコシル化が、ｐ３００の機能を修飾するとの実証が、可能な機構（機序、メカニズム）を示唆し、これにより、ＨＩＦ−１転写因子複合体が、ＶＥＧＦ発現をアップレギュレーションするのに失敗し、これが、この、転写活性化に必要とされた同時活性化剤（つまり、ｐ３００）を動員できずおよび／または会合できない無能力による。
【００８５】
実施例７−高血糖誘導反応性酸素種が、細胞損傷（ダメージ）経路を活性化させ、内皮細胞機能を障害している
こうして提示されたデーターが遠く、低酸素条件下にＶＥＧＦをアップレギュレーションできる能力における深遠な欠乏をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方において、高グルコースレベルが生み出すとの当初の観察に応答性の機構（機序、メカニズム）を審査している。
【００８６】
非虚血設定における高血糖誘導脈管損傷（ダメージ）を審査している有意な文献があるが、非常に少ない研究しか、虚血設定における脈管機能への高血糖誘導細胞損傷（ダメージ）の効果を審査していない。これが臨床的に重要であり、殆どの状況が新しい脈管成長を必要としており、有意な組織低酸素により特徴付けられたシナリオにおいて起きる。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高グルコースにおいて成長された内皮細胞が、ＲＯＳのミトコンドリア産生の増加を示すことが、実証されてきている。これが結果的に、ヘキソサミン経路活性の増加を与え、ある特定の転写因子（ＳＰＩ）およびシグナル分子（ｅＮＯＳ）のグリコシル化の増加を伴い、ＰＫＣ活性の増加が結果的に一部、ＮＦκＢ活性の増加、ＡＧＥｓのより多くの蓄積、および、ソルビトール経路を通る流れの増加を与えている（図１６）。これらの細胞内の出来事（現象）の下流での結末が同様に結果的に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察された脈管新生の障害を与えるが、中間ステップが明らかでないままである。
【００８７】
実施例８−糖尿病細胞が、血管新生に決定的な機能において障害されている
ＶＥＧＦ発現が糖尿病状態において代えられていることが明らかである一方、糖尿病細胞が他のやり方で障害されていることも、実証されてきている。糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）から単離された線維芽細胞が、金塩食速度論転位アッセイを使用しながら、コラーゲンおよびフィブロネクチン上で、通常線維芽細胞よりも、転位の劇的な減少（４分の１）を示す。これらの細胞の走触性応答が、修飾Ｂｏｙｄｅｎチャンバー転位アッセイを使用しながら、審査された場合、血清およびＰＤＧＦに対する応答における転位の７７％の似た減少が、観察された（Ｌｅｒｍａｎら、＜＜糖尿病線維芽細胞における細胞不全：転位における障害、脈管内皮成長因子産生、および、低酸素に対する応答＞＞、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１６２：３０３〜１２（２００３）、この全体において、本明細書において、援用されている）。
【００８８】
もう１回、この違いが、低酸素により強勢化された（図１７）。通常細胞における転位が、低酸素によりアップレギュレーションされた（２倍）一方、糖尿病細胞が、低酸素における転位速度における違いを全く示さなかった。これらのアッセイが再び、糖尿病が１種の細胞機能を持つとの深遠なインパクト、および、このインパクトが低酸素条件下に大きくされていることを強調させる。
【００８９】
これらの転位の違いが、糖尿病線維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー構成員相違発現によることがある。糖尿病線維芽細胞が、通常線維芽細胞よりも、高いレベルのｐｒｏ−ＭＷ−９を持つが、活性ＭＭＰ−９若しくは活性／ｐｒｏ−ＭＭＰ−２において、全く、違いがないことが、実証されてきている（図１８）。これが、高グルコースにおいて培養された内皮細胞における似た知見を確かめる（Ｕｅｍｕｒａら、＜＜糖尿病が、脈管マトリックスメタロプロテアーゼ活性を高める：酸化ストレスの役割＞＞、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、８８：１２９１〜８（２００１）、この全体において、本明細書において、援用されている）。更に、これらの知見が、糖尿病細胞不全が、全細胞蛋白もしくは機能の単なるダウンレギュレーションにより特徴付けられていないが、特定遺伝子および蛋白の選択的調節に関与することを示唆する。
【００９０】
実施例９−ＩＩ型糖尿病患者からの複数の内皮始原細胞が、これらの、増殖でき、接着でき、そして脈管構造中に取り込める能力において、障害されている
脈管新生エフェクター細胞、内皮始原細胞、もしくは前駆体細胞における高血糖の代替が、まだよく定義されていない。最近、ＩＩ型糖尿病患者から回収された複数の内皮始原細胞（ＥＰＣｓ）が、通常酸素条件下に齢の見合ったコントロールに比べたとおり、増殖の抑制、接着、そして脈管構造中への取り込みを呈することが、実証された（Ｔｅｐｐｅｒら、＜＜ＩＩ型糖尿病からのヒト内皮始原細胞が、増殖の障害、接着、および、脈管構造中への取り込みを呈する＞＞、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０６：２７８１〜６（２００２）、この全体において、本明細書において、援用されている）。糖尿病培養が拡大７日後、有意に、より少ないＥＰＣｓを含有したが（図１９）、これがＨｂＡicと、逆相関されていた。加えて、有意により少ないＥＰＣ保有クラスターが糖尿病患者の培養において、記された。これが糖尿病臨床年数と、逆相関されていた（Ｒ＝−０．４７１、Ｐ＜０．０１）。機能的に、これらの細胞がより少なくＴＮＦ−α活性化内皮単層に接着すると見出されたが、静穏な内皮単層に対する通常の接着を呈したが、これらの、環境の手がかりに応答できる能力が欠けていることを示唆する。これがｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイを用いて確かめられたが、より少ない糖尿病ＥＰＣｓが、齢の見合ったコントロールに比べた場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で、細管中に取り込まれたことを実証する。
【００９１】
実施例１０−糖尿病患者からの内皮始原細胞が、低酸素に応答できる能力の障害を持つ
低酸素に対する応答の障害を糖尿病細胞が持つと示唆している暫定データーが与えられ、ＥＰＣｓにおける研究が特に、これらの細胞の、虚血環境に対する応答を審査するものであった。ＩＩ型糖尿病患者からのＥＰＣｓが、低酸素内皮単層に対して接着し、低酸素内皮細胞から条件の整った培地に向かって転位し、そして低酸素環境を増殖させる能力において、障害されていたことが、実証された（それぞれ、図１０Ａ、Ｂ、Ｃ）。これが、これらの細胞の、適切に低酸素環境の手がかりを感受し応対できる能力の障害の反映であることがあり、結果的に、乏しい脈管形成を与えている。
【００９２】
実施例１１−デフェロキサミンが、血管内皮細胞において、高血糖誘導反応性酸素産生を防ぐ
培養血管内皮細胞がデフェロキサミンを用いて処理され、デフェロキサミンの、これらの細胞による高血糖誘導反応性酸素産生への効果を求めた。
【００９３】
細胞培養条件：ＲＯＳ測定用に、複数の牛大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣｓ、４〜１０継代）が、９６ウェルプレートにおいて、１００，０００細胞／ウェルにおいて、１０％ＦＢＳ、必須および非必須アミノ酸、ならびに抗生物質を含有しているＥａｇｌｅのＭＥＭにおいて播かれた。細胞が、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミン、３０ｍＭグルコース＋２５０μＭデフェロキサミンと共に、インキュベートされた。デフェロキサミンが調製されたてであり、これら細胞に連続３日で加えられた。これらＲＯＳ測定が当初の処置の７２時間後、実施された。
【００９４】
細胞内反応性酸素種測定値：反応性酸素種細胞内形成が、蛍光プローブたるＣＭＨ２ＤＣＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用しながら、検出された。細胞（１×１０５ｍＬ−１）が１０ｉＭのＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＤＡと共に、ロードされ、４５分間、３７℃において、インキュベートされ、ＨＴＳ７０００Ｂｉｏ  Ａｓｓａｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオアッセイ蛍光プレート読み取り機、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において、解析されたが、そのＨＴソフトプログラムを使用している。ＲＯＳ産生がＨ２０２標準曲線（１０−２００ナノモル（ｎｍｏｌ）ｍＬ−１）から、求められた。
【００９５】
図２１において示されたとおり、デフェロキサミンが培養において、血管内皮細胞におけるＲＯＳ産生を阻害した。糖尿病レベルの高血糖がこれらの細胞において、ＲＯＳ（スーパーオキシド）産生の増加を引き起こす（図２１、棒（バー）２）。２５０μＭデフェロキサミンを加えていくと、完全に、この損傷（ダメージ）を与えている効果を防ぐ（図２１、棒（バー）４）。
【００９６】
こうして、鉄キレート剤たるデフェロキサミンが、血管内皮細胞への、深遠な効果を持ち、つまり、完全に、ヒドロキシルラジカルの高血糖誘導過剰産生を防ぐ（図２１）。
【００９７】
実施例１２−過剰のミトコンドリアスーパーオキシド産生を通常化させると、大動脈内皮細胞において、細胞内遊離鉄の高血糖誘導増加を阻害する
細胞内遊離鉄測定用に、複数の牛大動脈内皮細胞（＜＜ＢＡＥＣｓ＞＞、４〜１０継代）が、２４ウェルプレートにおいて、５００，０００細胞／ウェルにおいて、１０％ＦＢＳ、必須および非必須アミノ酸、ならびに抗生物質を含有しているＥａｇｌｅのＭＥＭにおいて播かれた。細胞がそれぞれ、ＵＣＰ−１、Ｍｎ−ＳＯＤ、もしくは空のアデノウィルスベクターを用いて、４８時間、感染させられた。３０ｍＭグルコースが、当該アデノウィルスを用いて感染させられた各ウェルに加えられた。非感染細胞が５ｍＭおよび３０ｍＭグルコースと共に、コントロールとして、インキュベートされた。細胞内遊離鉄が２４時間後、検出された。
【００９８】
細胞内遊離鉄を検出するために、細胞がｆｕｒａ−２ＡＭと共に、暗所において、３７℃において、１５分間、５μＭのｆｕｒａ−２ＡＭを含有しているＴＢＳＳ１ｍＬ中において、ロードされた。ロード後、細胞が５分間、２０μＭのＥＤＴＡ１ｍＬを有するＴＢＳＳと共に、インキュベートされた（Ｋｒｅｓｓら、＜＜培養神経、星状細胞（アストロサイト）、およびオリゴ樹状細胞（デンドロサイト）における、細胞内遊離鉄と細胞傷害との間の関係＞＞、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．、２２（１４）：５８４８〜５８５５（２００２）、この全体において、本明細書において、援用されている）。蛍光が、１０×対物レンズを有するＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０を使用しながら、検出され、Ｉ．Ｐ．Ｌａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍにより、Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ  コンピューター上で実行された。解析がＩ．Ｐ．Ｌａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いて、実施された。
【００９９】
図２２において示されたとおり、棒（バー）２、高血糖が、遊離鉄量を３倍近く増加させた。プローブたるｆｕｒａ−２ＡＭが特異的に、Ｆｅ3+鉄を検出するので、これが、増加されているのが遊離Ｆｅ3+鉄であることを示す。この効果の、電子輸送鎖によるスーパーオキシド形成を防ぐミトコンドリア蛋白たる非共役（カップリング）蛋白−１の過剰発現による阻害が（棒（バー）３）、ミトコンドリアが、この高血糖誘導スーパーオキシドの起源であることを実証する。この効果の、酵素たるスーパーオキシド不均化酵素（ジスムターゼ）ミトコンドリアアイソフォームたるＭｎＳＯＤ過剰発現による阻害が（棒（バー）４）、ミトコンドリアスーパーオキシドが、正にその反応性酸素種であり、細胞内遊離鉄の増加を誘導することを実証する。
【０１００】
実施例１３−デフェロキサミンが、大動脈内皮細胞において、細胞内鉄イオンの高血糖誘導増加を阻害する
複数の牛大動脈内皮細胞（＜＜ＢＡＥＣｓ＞＞、４〜１０継代）が、２４ウェルプレートにおいて、５００，０００細胞／ウェルにおいて、１０％ＦＢＳ、必須および非必須アミノ酸、ならびに抗生物質を含有しているＥａｇｌｅのＭＥＭにおいて播かれた。細胞が、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、もしくは３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミンと共に、インキュベートされた。細胞内遊離鉄測定が２４時間後で、実施された。細胞内遊離鉄を検出するに当たり、細胞がｆｕｒａ−２ＡＭと共に、ロードされたが、上で実施例１２において記載されたとおりである。
【０１０１】
図２３Ｂにおいて示されたとおり、高血糖（３０ｍＭグルコースインキュベートにより、成就された）が劇的に、図２３Ａにおいて示されたとおり、通常の血糖症（５ｍＭグルコース処置により、成就された）に比べたら、Ｆｅ3+の形の細胞内遊離鉄を増加させ、実施例１２において増加させたとおりである。図２３Ｃにおいて示されたとおり、Ｆｅ3+−特異的鉄キレート剤たるデフェロキサミン（１００μＭ）が完全に、高血糖のこの効果を防ぐ。
【０１０２】
実施例１４−デフェロキサミンおよびヒドロキシルラジカルスキャベンジャーたるＤＭＳＯ両方が、大動脈内皮細胞において、ＤＮＡ鎖破壊の高血糖誘導増加を阻害する
複数の牛大動脈内皮細胞（＜＜ＢＡＥＣｓ＞＞、４〜１０継代）が、集密となるまで、１０ｍｍ細胞培養プレートにおいて播かれた。細胞が、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミン（ＤＦＯ）、もしくは３０ｍＭグルコース＋１００μＭのヒドロキシルラジカルスキャベンジャーたるＤＭＳＯと共に、７日間、インキュベートされた。試薬を有する培地が毎日、変えられた。ＤＮＡ鎖破壊が、Ｃｏｍｅｔ  アッセイ方法を使用しながら、検出された。
【０１０３】
ＤＮＡ破壊検出が、Ｃｏｍｅｔ  Ａｓｓａｙ  キット（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ  ＭＤ）を使用しながら、実施された。端的に（簡潔に）、単一細胞電気泳動が、Ｃｏｍｅｔ  スライド上で、１０分間、１ボルト（Ｖ）／センチメートル（ｃｍ）（１電極〜別の１電極で測定された）において、実施された。風乾後、Ｃｏｍｅｔ  スライドが、ＳＹＢＲグリーン（緑）を用いて、染色された。蛍光が、Ｏｌｙｍｐｕｓ（オリンパス）ＩＸ７０蛍光顕微鏡を使用しながら、検出され、ＤＮＡ破壊蛍光密度解析（尾の長さ）が、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ソフトウェアを使用しながら、実施された。
【０１０４】
以前、ミトコンドリア電子輸送鎖による高血糖誘導スーパーオキシド産生が、ＤＮＡ鎖破壊を大動脈内皮細胞において引き起こすことが示されており、図２４Ｂにおいて実証されたとおりである。図２４Ｃにおいて示されたデーターが、この効果が、遊離Ｆｅ3+のスーパーオキシド誘導増加を必要とすることを証明する。同様に、図２４Ｄにおいて示されたデーターが、この効果が、スーパーオキシド誘導ヒドロキシルラジカル産生を必要とすることを示す。一緒に、これらのデーターが、デフェロキサミン処置が、ミトコンドリア電子輸送鎖による継続したスーパーオキシド過剰産生に関わらず、ヒドロキシルラジカル生成そして引き続いてのＤＮＡ鎖破壊を防ぐことを示す。
【０１０５】
実施例１５−デフェロキサミンおよびヒドロキシルラジカルスキャベンジャーたるＤＭＳＯ両方が、大動脈内皮細胞において、ＰＡＲＰ活性の高血糖誘導増加を阻害する
複数の牛大動脈内皮細胞（＜＜ＢＡＥＣｓ＞＞、４〜１０継代）が、集密となるまで、１０ｍｍ細胞培養プレートにおいて播かれた。細胞が、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミン、もしくは３０ｍＭグルコース＋１００μＭ  ＤＭＳＯと共に、６日間、インキュベートされ、培地が毎日変えられた。
【０１０６】
3Ｈ−ＮＡＤ取り込み方法が使用され、ＰＡＲＰ活性を査定した。ＢＡＥＣｓが、５６ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２８ｍＭのＫＣｌ、２８ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０１％のジギトニン、２５ｍＭのＮＡＤ+、および１μＣｉ／ｍＬの3ＨＮＡＤ+から構成された緩衝液（バッファー）と共に、１０分間、３７℃においてインキュベートされた。ＴＣＡが加えられ、リボシル化蛋白を沈澱させ、細胞が２％のＮａＯＨ中において溶解された。取り込まれた3Ｈ−ＮＡＤ検出が、液体シンチレーションカウンターを使用しながら、実施され、ＰＡＲＰ活性が3Ｈ−ＮＡＤｄｐｍ数に従いながら、求められた。
【０１０７】
以前、ミトコンドリア電子輸送鎖による高血糖誘導スーパーオキシド産生が、ＤＮＡ鎖破壊を引き起こし、次いで、酵素たるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）を大動脈内皮細胞において活性化させることが示されており、図２５において示されたとおりである。棒（バー）３において示されたデーターが、この効果が、遊離Ｆｅ3+のスーパーオキシド誘導増加を必要とすることを証明する。同様に、棒（バー）４において示されたデーターが、この効果が、スーパーオキシド誘導ヒドロキシルラジカル産生を必要とすることを示す。一緒に、これらのデーターが、デフェロキサミン処置が、ミトコンドリア電子輸送鎖による継続したスーパーオキシド過剰産生に関わらず、ヒドロキシルラジカル生成、引き続いてのＤＮＡ鎖破壊、そしてこの結果得られてくるＰＡＲＰ活性化を防ぐことを示す。
【０１０８】
実施例１６−デフェロキサミンが、大動脈内皮細胞において、プロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ、ＰＧＦ−１ａ）の高血糖誘導阻害を防ぐ
複数の牛大動脈内皮細胞（＜＜ＢＡＥＣｓ＞＞、４〜１０継代）が、２４ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）において播かれた。細胞が、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース、もしくは３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミンと共に、インキュベートされた。プロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）産物たるＰＧＦ−１αが２４時間後で、測定された。
【０１０９】
プロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）活性が、プロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ、ＰＧＦ−１ａ）安定産物濃度として測定された。競合免疫アッセイ方法（相関−ＥＩＡ）が、６−ケト−ＰＧＦ1αの定量的決定に使用された。ＢＡＥＣｓ培養培地から集められたサンプル（１００μＬ）がアッセイプレートに加えられたが、これが予め抗体を用いてコーティングされていた（６−ケト−ＰＧＦ1α、ＥＩＡ共役溶液）。ＰＧＦ１α濃度が、標準曲線に従いながら、算出され、データー解析が、ＡｓｓａｙＺａｐソフトウェアを使用しながら、実施された。
【０１１０】
以前、ミトコンドリア電子輸送鎖による高血糖誘導スーパーオキシド産生が完全に、粥腫（アテローム）進展に対する主要な天然防御である、内皮酵素たるプロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）を不活化させることが示されている。図２６の棒（バー）２において、高血糖が示されており、この酵素の活性を９０％以上減らす。対照的に、棒（バー）３が、高血糖が全く、この重要な抗粥腫（アテローム）発生酵素の活性を阻害しないことを示し、遊離Ｆｅ3+のスーパーオキシド誘導増加がデフェロキサミンにより防がれている場合である。
【０１１１】
実施例１７−デフェロキサミンが、糖尿病マウス大動脈において、プロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ、ＰＧＦ−１ａ）の高血糖誘導阻害を防ぐ
雄Ｃ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）が、連続５日間、８時間の絶食後、０．０５Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ４．５において、５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンの毎日の注射により、糖尿病とされた。当初の注射の２週後、血糖が求められたが、これら糖尿病マウスがランダムに、等しい平均血糖レベルを有する２群（グループ）にされた。デフェロキサミン（１０ｍｇ／ｋｇ）が、糖尿病動物の１群において７日間、１日当たり１回皮下で、注射された。大動脈がプロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）活性測定用に、集められた。
【０１１２】
プロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）活性測定Ａ競合免疫アッセイ方法（相関−ＥＩＡ）が、６−ケト−ＰＧＦ1αの定量的決定に使用された。マウス大動脈がＰＢＳを用いて洗浄され、２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（バッファー、ｐＨ７．５）および１５μＭアラキドン酸を含有している４００μＬインキュベート緩衝液（バッファー）中において、３時間、３７℃においてインキュベートされた。１００μＬのサンプルが使用され、ＰＧＦ1αを測定した。
【０１１３】
以前、ミトコンドリア電子輸送鎖による糖尿病誘導スーパーオキシド産生が完全に、糖尿病マウス大動脈における内皮酵素たるプロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）を不活化させることが示されている。図２７の棒（バー）２において、高血糖が示されており、この酵素の活性をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて９０％以上減らす。対照的に、図２７の棒（バー）３が、高血糖が全く、この重要な抗粥腫（アテローム）発生酵素の活性を阻害しないことを示し、遊離Ｆｅ3+のスーパーオキシド誘導増加がデフェロキサミンにより防がれている場合である。
【０１１４】
実施例１８−デフェロキサミンが、大動脈内皮細胞において、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の高血糖誘導阻害を防ぐ
複数の牛大動脈内皮細胞（＜＜ＢＡＥＣｓ＞＞、４〜１０継代）が、２４ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）において播かれた。細胞が２４時間、５ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース単独、もしくは３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミンと共に、インキュベートされた。ｅＮＯＳ活性決定６時間前、アルギニンなし培地がこれら細胞に加えられ、内因性アルギニンを減損させた。
【０１１５】
ｅＮＯＳ活性測定が、以降のとおり、成就された。複数のＢＡＥＣが、４００μＬのＰＢＳ−3Ｈ−アルギニン（１．５μｃｉ／ｍＬ）緩衝液と共に、３０分間、３７℃において、インキュベートされた。この反応が、１ＮのＴＣＡ（５００μＬ／ウェル、氷冷）を加えていくことにより停止され、これら細胞が２分間、液体窒素中において凍結破砕され、３７℃において５分間、解凍され、その細胞の溶解物を得た。エーテルを用いた抽出後、その細胞の溶解物が、２ｍＭのＥＤＴＡおよび２ｍＭのＥＧＴＡを含有しているＨｅｐｅｓ緩衝液（バッファー）を使用しながら、ｐＨ５．５に調整され、次いで、Ｔｒｉｓ−形成ＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８  イオン交換カラム上にロードされ、3Ｈ−シトルリンが集められた。3Ｈ−シトルリン検出が、液体シンチレーションカウンターを使用しながら、実施され、ｅＮＯＳ活性が、3Ｈ−シトルリン発生量から、算出された。
【０１１６】
以前、高血糖誘導スーパーオキシド形成が有意に、ある１種の別の決定的な内皮酵素たる内皮一酸化窒素合成酵素（シンターゼ、ｅＮＯＳ）を不活化させることが示されている。この酵素が、低酸素に対する応答における血管急性膨張における決定的な役割、ならびに、粥腫（アテローム）発生の展開および進行に対するある１種の別の主要な防御としての慢性の役割を演じる。図２８の棒（バー）２において、高血糖が示されており、ｅＮＯＳ活性を６５％減らす。対照的に、棒（バー）３が、高血糖が全く、この重要な抗粥腫（アテローム）発生酵素の活性を阻害しないことを示し、遊離Ｆｅ3+のスーパーオキシド誘導増加がデフェロキサミンにより防がれている場合である。
【０１１７】
実施例１９−デフェロキサミンが、糖尿病マウス大動脈において、内皮一酸化窒素合成酵素（シンターゼ、ｅＮＯＳ）の、糖尿病誘導阻害を防ぐ
雄Ｃ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）が、連続５日間、８時間の絶食後、０．０５Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ４．５において、５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンの毎日の注射により、糖尿病とされた。当初の注射の２週後、血糖が求められたが、これら糖尿病マウスがランダムに、等しい平均血糖レベルを有する２群（グループ）にされた。デフェロキサミン（１０ｍｇ／ｋｇ）が、糖尿病動物の１群において７日間、１日当たり１回皮下で、注射された。大動脈が内皮一酸化窒素合成酵素（シンターゼ、ｅＮＯＳ）活性測定用に、集められた。
【０１１８】
ｅＮＯＳ活性測定が、以降のとおり、成就された。大動脈が液体窒素中において集められ、組織蛋白が単離された。免疫（免役）沈降方法が使用され、組織溶解物から、ｅＮＯＳを精製した。精製されたｅＮＯＳ免疫複合体が、１００μＬの反応緩衝液（バッファー。３μＭテトラヒドロビオプテリン、１ｍＭのＮＡＰＤＨ、２．５ｍＭのＣａＣｌ2、２００Ｕのカルモジュリン、3Ｈ−Ｌ−アルギニン０．２μＣｉ）と共に、４５分間、３７℃において、くゆらせながら（ローリング）、インキュベートされた。該インキュベート後、サンプルがＴｒｉｓ−形成ＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８  イオン交換カラム上にロードされ、3Ｈ−シトルリンが集められた。3Ｈ−シトルリンが、液体シンチレーションカウンターを使用しながら、定量化され、ｅＮＯＳ活性が、3Ｈ−シトルリン発生量から、算出された。
【０１１９】
以前、ミトコンドリア電子輸送鎖による糖尿病誘導スーパーオキシド産生が糖尿病マウス大動脈において、内皮酵素ｅＮＯＳを不活性化させることが示されている。図２９の棒（バー）２において、糖尿病高血糖が示されており、この酵素の活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、６５％減らす。対照的に、棒（バー）３が、高血糖が全く、この重要な抗粥腫（アテローム）発生酵素の活性を阻害しないことを示し、遊離Ｆｅ3+のスーパーオキシド誘導増加がデフェロキサミンにより防がれている場合である。
【０１２０】
実施例２０−デフェロキサミンが、糖尿病創傷治癒および糖尿病誘導不全を、虚血に対する血管新生応答において、通常化させる
図３０ＡおよびＢが、糖尿病動物が、非糖尿病動物がそうするように、新しい血管を形成していくことにより、酸素化を増加させないことを示す。図３０ＣおよびＤが、糖尿病動物が、虚血に対する応答において、０．２２対１．８３％の骨髄由来内皮前駆細胞しか可動化させないことを示す。図３０ＥおよびＦが、糖尿病が、虚血組織における毛管形成を増加させないことを示す（黒色の棒（バー））。
【０１２１】
研究者らが、マウス背軟組織における勾配を付けられた虚血の新しきモデルを創出している。マウスの背の脈管解剖が精密に知られているので、主要な縦の血管が容易に視覚化され得、このモデルが、該組織における再現性ある酸素勾配を有する虚血の信頼できる領域（帯、ゾーン）を創出する。これが、最少から最多虚血領域に進みながら、０．５ｃｍ離された４参照点（ｐ１〜ｐ４）を利用しながら、直接組織酸素圧測定値を用いて確かめられている。
【０１２２】
この糖尿病誘導欠陥に横たわっている機構（機序、メカニズム）が複雑であり、完全に理解されていないが、ミトコンドリアスーパーオキシド過剰産生に関与すると見られるのは、該欠陥が有意に、ミトコンドリアアイソフォームのＳＯＤを過剰発現する糖尿病遺伝子導入マウスにおいて、防がれているからである。
【０１２３】
実施例２１−デフェロキサミンが、糖尿病創傷治癒および糖尿病誘導不全を、虚血に対する血管新生応答において、通常化させる
ストレプトゾトシン誘導糖尿病（ＳＴＺ）および野生型Ｃ５７（ＷＴ）マウスにおける虚血脈管新生への、デフェロキサミン、鉄キレート剤の効果が、審査された。雄Ｃ５７Ｂ１６マウス（６〜８週齢）が、連続５日間、８時間の絶食後、０．０５Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ４．５において、５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンの毎日の注射により、糖尿病とされた。当初の注射の２週後、血糖が求められたが、これら糖尿病マウスがランダムに、等しい平均血糖レベルを有する２群（グループ）にされた。
【０１２４】
糖尿病動物の１群において７日間、１日当たり１回皮下で、デフェロキサミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の毎日の注射を伴う実験を完遂して、背に創出された虚血弁を持つに至る７日前に、処置群が予め処置された。
【０１２５】
７日目に、血流が通常にまで、ＳＴＺ−デフェロキサミン群（グループ、ＤＭ＋ＤＥＦ）において、非糖尿病非処置群（グループ、ＷＴ）、および、重篤に障害されたＳＴＺ−非処置群（グループ、ＤＭ）と比べた場合、Ｄｏｐｐｌｅｒにより査定されたとおり、図３１Ａにおいて示されたとおり、復元されたことが見出された。図３１Ｂが、組織生存が通常にまで、ＳＴＺ−デフェロキサミン群（グループ、ＤＭ＋ＤＥＦ）において、非糖尿病非処置群（グループ、ＷＴ）、および、重篤に障害されたＳＴＺ−非処置群（グループ、ＤＭ）と比べた場合、復元されたことが見出された。ＣＤ３１陽性血管計数（カウント）が、虚血後脈管新生が、ＳＴＺ−デフェロキサミン群（グループ、ＳＴＺ−Ｄｅｆ  Ｃ）において、復元されたことを実証し、図３２において示されたとおりであった。興味あることに、デフェロキサミンがこれら野生型マウス（ＷＴ  Ｄｅｆ  Ｃ）においても、脈管新生を向上させた。ＥＰＣ可動化も、ＳＴＺ−デフェロキサミン群（グループ）において、非処置ＳＴＺマウスと比べた場合、改善された。ＳＴＺマウスがデフェロキサミンを用いて処置された場合、糖尿病骨髄由来劣化株細胞集団の、ＳＤＦに向かっての転移が通常にまで、復元された。図３５参照。
【０１２６】
これらの結果が、デフェロキサミンを用いた糖尿病動物の処置が完全に、虚血に対する通常血管新生応答における糖尿病誘導欠陥を防ぐことを示す。
【０１２７】
実施例２２−デフェロキサミンが、糖尿病創傷治癒および糖尿病誘導不全を、虚血に対する血管新生応答において、通常化させる
複数の糖尿病マウス（マイス、ｄｂ／ｄｂ）において、これらをデフェロキサミンを用いて処置していくことにより、創傷治癒を抑えてしまう効果も、実施例２０のマウスの背軟組織における勾配を付けられた虚血の新しきモデルにおいて、研究された。これら動物が、実施例２１において記載されたとおり、糖尿病とされた。デフェロキサミン処置糖尿病マウスが、１６日目において、完結した創傷閉鎖を実証した一方、複数の非処置ｄｂマウス（マイス）が、これらの創傷を、２６日目まで、閉じなかった（図３３ＡおよびＢ）。デフェロキサミン処置糖尿病マウスがそうするように、糖尿病動物が新しい血管を形成していくことにより、酸素化を増加させないことを、図３４ＡおよびＢが示す。０．２２％の糖尿病デフェロキサミン非処置マウスに比べたら、虚血に対する応答において、デフェロキサミン処置糖尿病動物が１．１２％の骨髄由来内皮前駆細胞を可動化させることを、図３４ＣおよびＤが示す。糖尿病デフェロキサミン非処置マウスに比べたら、デフェロキサミン処置糖尿病マウスが実質的に、虚血組織における毛管形成を増加させることを、図３４ＥおよびＦが示す（黒色の棒（バー））。
【０１２８】
好ましい実施形態が本明細書において詳細に、描かれ記載されてきたが、当業者に、本発明の精神から逸脱してしまうことなく、種々の修飾、追加、置換、および同様のことがなされ得、これらがこれゆえ、本発明の範囲内にあると考慮され、以降の請求項において定義されたとおりであることが明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】血管新生および脈管新生スキームを示す。
【図２】虚血応答におけるＨＩＦおよびＶＥＧＦの中心的な役割を示す。
【図３】高血糖損傷（ダメージ）経路を示す。
【図４】全体の実験計画（プラン）を示す。
【図５】勾配を付けられた皮膚虚血マウスモデルを示す。領域Ａ、Ｂ、およびＣが益々、虚血組織領域を反映し、参照点ｐ１（２７ｍｍＨｇ）〜ｐ５（６ｍｍＨｇ）での直接組織酸素圧により測定されたとおりである。
【図６】糖尿病マウスにおける組織生存を示す。
【図７】通常皮膚酸素圧（ＮＬ  Ｓｋｉｎ）に比べた、最少虚血（ｐ１）〜最多虚血（ｐ５）の虚血組織における酸素圧測定値を示す。
【図８】ＣＤ３１により同定された血管数を示し、虚血弁領域Ａ、Ｂ、およびＣにおいて染色している。
【図９】ストレプトゾトシン誘導糖尿病を有する野生型およびＭｎＳＯＤ遺伝子導入マウスにおいて術後、酸素圧測定値を示す。
【図１０】通常グルコース（５ｍＭ）、ならびに、急性および慢性高グルコース（２５ｍＭ）において培養されたＣ２Ｃ１２筋芽細胞のＪＣ−１染色を示す。
【図１１】低酸素に対する応答における高および低グルコースにおけるＶＥＧＦｍＲＮＡを示す。
【図１２】通常グルコース（・）もしくは高グルコース（ｏ）条件において培養された細胞におけるＶＥＧＦｍＲＮＡ半減寿命を示す。
【図１３】低酸素刺激後の、通常（５ｍＭ、灰色）および高グルコース（２５ｍＭ、黒色）におけるＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるＶＥＧＦプロモーター活性を示す。
【図１４】ＨＩＦ−Ｉαが好ましくは、通常のグルコース（ＮＧ、５ｍＭ）に比べたら、高グルコース条件（ＨＧ、２５ｍＭ）においてグリコシル化されていることを示す。
【図１５】図１５ＡおよびＢが、高グルコース（３０ｍＭ）が、ｐ３００とＰＰＡＲγとの間の会合を障害することを示す。この効果が、ＧＦＡＴを阻害していくことにより、廃された。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃが、反応性酸素種から結果得られてくる細胞損傷（ダメージ）経路が選択的に、標的化され得、防がれ得ることを示す。
【図１７】図１７ＡおよびＢが、糖尿病マウスからの線維芽細胞が、非糖尿病細胞において見られた転位の、通常の低酸素誘導増加を実証しないことを示す（ｐ＜．０５）。
【図１８】図１８ＡおよびＢが、糖尿病マウスからの線維芽細胞が、より多くの原ＭＭＰ−９を産生するが、活性ＭＭＰ−９でないことを示す（ｐ＜．００１）。
【図１９−１】図１９Ａ〜Ｄが、ＩＩ型糖尿病からの複数のＥＰＣが、拡大（Ａ）の間、より少なく増殖し、ＨｂＡｌｃレベル（Ｂ）と逆相関したことを示す。より少ないＥＰＣクラスターが、培地（Ｃ）において形成したが、これも、糖尿病を患っての合計年数に逆相関された。
【図１９−２】図１９Ａ〜Ｄが、ＩＩ型糖尿病からの複数のＥＰＣが、拡大（Ａ）の間、より少なく増殖し、ＨｂＡｌｃレベル（Ｂ）と逆相関したことを示す。より少ないＥＰＣクラスターが、培地（Ｃ）において形成したが、これも、糖尿病を患っての合計年数に逆相関された。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃが、ＩＩ型糖尿病患者からの複数のＥＰＣが、低酸素刺激に対する応答におけるそれらの、接着、転位、および増殖できる能力において、障害されていることを示す（＆＝ｐ＜．００１、＆＆＝ｐ＜．０５）。
【図２１】高血糖誘導ＲＯＳへの、デフェロキサミンの効果を示す。
【図２２】ＵＣＰ−１、Ｍｎ−ＳＯＤ、もしくは空のアデノウィルスベクターを用いた感染、ならびに、５ｍＭもしくは３０ｍＭグルコースを用いた引き続いての処置後の、牛大動脈内皮細胞における細胞内遊離鉄測定を示す。ｘ軸が、これら異なる処置を示す。ｙ軸が、遊離鉄量を指し示している蛍光単位を示す。
【図２３】図２３Ａ〜Ｃが、２４時間の、５ｍＭもしくは３０ｍＭグルコース（それぞれ、図２３Ａおよび２３Ｂ）または３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミン（図２３Ｃ）を用いたインキュベート後の、牛大動脈内皮細胞における細胞内遊離鉄測定を示す。遊離鉄検出が、蛍光マーカーたるｆｕｒａ−２  ＡＭを可視化させることにより達成された。
【図２４】図２４Ａ〜Ｄがそれぞれ、７日間の、５ｍＭもしくは３０ｍＭグルコースまたは３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミンを用いたインキュベート後の、大動脈内皮細胞におけるＤＮＡ鎖破壊を示す。図２４Ａ〜Ｄがそれぞれ、７日間の、５ｍＭもしくは３０ｍＭグルコースまたは３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミンを用いたインキュベート後の、大動脈内皮細胞におけるＤＮＡ鎖破壊を示す。
【図２５】６日間の、５ｍＭもしくは３０ｍＭグルコース、３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミン、または３０ｍＭグルコース＋１００μＭ  ＤＭＳＯを用いたインキュベート後の、大動脈内皮細胞におけるＰＡＲＰ活性を示す。3Ｈ  ＮＡＤ取り込みが使用され、ＰＡＲＰ活性を査定した。ｘ軸が、これら異なる処置を示す。ｙ軸が、ピコモル（ｐｍｏｌ）／ミリグラム（ｍｇ）蛋白で測定されたとおりのＰＡＲＰ活性を示す。
【図２６】５ｍＭもしくは３０ｍＭグルコースまたは３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミンを用いたインキュベート２４時間後の、大動脈内皮細胞におけるプロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）活性を示す。ｘ軸が、これら異なる処置を示す。ｙ軸が、プロスタサイクリン合成酵素産物たるＰＧＦ−１αの濃度として表現されたプロスタサイクリン合成酵素活性を示す。
【図２７】７日間の、毎日のデフェロキサミンの注入後の、糖尿病マウスおよびコントロールマウスの大動脈におけるプロスタサイクリン合成酵素（シンターゼ）活性を示す。ｘ軸が、これら異なる処置を示す。ｙ軸が、プロスタサイクリン合成酵素産物たるＰＧＦ−１αの濃度により測定されたとおりのプロスタサイクリン合成酵素活性を示す。
【図２８】２４時間の、５ｍＭもしくは３０ｍＭグルコースまたは３０ｍＭグルコース＋１００μＭデフェロキサミンを用いたインキュベート後の、大動脈内皮細胞におけるｅＮＯＳ活性を示す。ｘ軸が、これら異なる処置を示す。ｙ軸が、１０5細胞当たり、１分当たり生成された3Ｈ−シトルリンの関数として、該ｅＮＯＳ活性を示す。
【図２９】７日間の、毎日のデフェロキサミンの注入後の、糖尿病マウスおよびコントロールマウスの大動脈におけるｅＮＯＳ活性を示す。ｘ軸が、これら異なる処置を示す。ｙ軸が、蛋白１ｍｇ当たり、１分当たり生成された3Ｈ−シトルリンの関数として、該ｅＮＯＳ活性を示す。
【図３０−１】図３０Ａ〜Ｆが、虚血に対するマウス血管新生応答における糖尿病誘導欠陥を示す。図３０Ａ〜Ｂがそれぞれ、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスにおける酸素化レベルを示す。Ｐ１〜Ｐ４がｙ軸上で、該虚血の皮弁の隣接している四分円を指定し、当該動物に対する取り付け部位に最も近く始まっており（つまり、Ｐ１）、遠くＰ４に進んでいく。図３０Ｃ〜Ｄが、虚血に対する応答における、骨髄由来内皮細胞可動化を示す。Ｆｌｋ−１がｙ軸上で、虚血骨髄由来内皮前駆細胞に関するマーカーである。ＣＤ１１ｂがｘ軸上で、骨髄由来内皮前駆細胞に関する一般的なマーカーである。図３０Ｅ〜Ｆがそれぞれ、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスにおける、毛管形成量を示す。ＮＩがｙ軸上で、非虚血コントロールの毛管密度を表す。領域Ｃがｙ軸上で、７日後の、虚血皮弁での毛管密度を表す。
【図３０−２】図３０Ａ〜Ｆが、虚血に対するマウス血管新生応答における糖尿病誘導欠陥を示す。図３０Ａ〜Ｂがそれぞれ、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスにおける酸素化レベルを示す。Ｐ１〜Ｐ４がｙ軸上で、該虚血の皮弁の隣接している四分円を指定し、当該動物に対する取り付け部位に最も近く始まっており（つまり、Ｐ１）、遠くＰ４に進んでいく。図３０Ｃ〜Ｄが、虚血に対する応答における、骨髄由来内皮細胞可動化を示す。Ｆｌｋ−１がｙ軸上で、虚血骨髄由来内皮前駆細胞に関するマーカーである。ＣＤ１１ｂがｘ軸上で、骨髄由来内皮前駆細胞に関する一般的なマーカーである。図３０Ｅ〜Ｆがそれぞれ、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスにおける、毛管形成量を示す。ＮＩがｙ軸上で、非虚血コントロールの毛管密度を表す。領域Ｃがｙ軸上で、７日後の、虚血皮弁での毛管密度を表す。
【図３０−３】図３０Ａ〜Ｆが、虚血に対するマウス血管新生応答における糖尿病誘導欠陥を示す。図３０Ａ〜Ｂがそれぞれ、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスにおける酸素化レベルを示す。Ｐ１〜Ｐ４がｙ軸上で、該虚血の皮弁の隣接している四分円を指定し、当該動物に対する取り付け部位に最も近く始まっており（つまり、Ｐ１）、遠くＰ４に進んでいく。図３０Ｃ〜Ｄが、虚血に対する応答における、骨髄由来内皮細胞可動化を示す。Ｆｌｋ−１がｙ軸上で、虚血骨髄由来内皮前駆細胞に関するマーカーである。ＣＤ１１ｂがｘ軸上で、骨髄由来内皮前駆細胞に関する一般的なマーカーである。図３０Ｅ〜Ｆがそれぞれ、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスにおける、毛管形成量を示す。ＮＩがｙ軸上で、非虚血コントロールの毛管密度を表す。領域Ｃがｙ軸上で、７日後の、虚血皮弁での毛管密度を表す。
【図３１−１】図３１Ａ〜Ｃが、デフェロキサミン処置が、虚血に対するマウス血管新生応答における糖尿病誘導欠陥を正すことを示す。これら処置群が、野生型マウス（ＷＴ）、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウス（図３１Ｃにおいて、ＳＴＺとして、図３１Ａ〜Ｂにおいて、ＤＭとして示された）、および、デフェロキサミン処置ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウス（図３１Ｃにおいて、ＳＴＺ＋デフェロキサミンとして、図３１Ａ〜Ｂにおいて、ＤＭ＋ＤＥＦとして示された）であった。
【図３１−２】図３１Ａ〜Ｃが、デフェロキサミン処置が、虚血に対するマウス血管新生応答における糖尿病誘導欠陥を正すことを示す。これら処置群が、野生型マウス（ＷＴ）、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウス（図３１Ｃにおいて、ＳＴＺとして、図３１Ａ〜Ｂにおいて、ＤＭとして示された）、および、デフェロキサミン処置ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウス（図３１Ｃにおいて、ＳＴＺ＋デフェロキサミンとして、図３１Ａ〜Ｂにおいて、ＤＭ＋ＤＥＦとして示された）であった。
【図３２】野生型マウス（ＷＴ  Ｃ）、デフェロキサミンを用いて処置された野生型マウス（ＷＴ  Ｄｅｆ  Ｃ）、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウス（ＳＴＺ  Ｃ）、および、デフェロキサミンを用いて処置されたストレプトゾトシン誘導糖尿病マウス（ＳＴＺ  Ｄｅｆ  Ｃ）における、ＣＤ３１陽性血管計測値を示す。ｙ軸が、ｈｐｆ当たりのＣＤ３１陽性血管計測値を示す。
【図３３】図３３Ａ〜Ｂが、デフェロキサミン処置が、虚血に対するマウス血管新生応答における糖尿病誘導欠陥を正すことを示す。糖尿病が、これらマウス（マイス、ｍｉｃｅ）において、ストレプトゾトシン（図３３Ａ〜Ｂにおいて、ＳＴＺと略された）により誘導された。図３３Ａにおいて示されたマウスが、ビヒクル単独を用いて処置された一方、図３３Ｂにおいて示された糖尿病マウスが、デフェロキサミンを用いて処置された（図３３Ｂにおいて、ＳＴＺ．デフェロキサミンとして標識された）。
【図３４】図３４Ａ、Ｃ、およびＥが、糖尿病が、虚血に対するマウス血管新生応答における欠陥を誘導することを示す。図３４Ｂ、Ｄ、およびＦが、これらの欠陥が、デフェロキサミンを用いる処置により正されていることを示す。図３４Ａ〜Ｂがそれぞれ、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスにおける酸素化レベル（図３３Ａ）およびデフェロキサミン処置ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスにおける酸素化レベル（図３３Ｂ）を示す。Ｐ１〜Ｐ４がｙ軸上で、該虚血の弁の隣接している四分円を指定し、当該動物に対する取り付け部位に最も近く始まっており（つまり、Ｐ１）、遠くＰ４に進んでいく。図３４Ｃ〜Ｄが、虚血に対する応答における、骨髄由来内皮細胞可動化を示す。Ｆｌｋ−１がｙ軸上で、骨髄由来内皮前駆細胞に関するマーカーである。ＣＤ１１ｂがｘ軸上で、骨髄（ミエロイド）、マクロファージ、および顆粒球株の、骨髄由来細胞に関する一般的なマーカーである。図３４Ｅ〜Ｆがそれぞれ、ビヒクル処置ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスおよびデフェロキサミン処置ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスにおける、毛管形成量を示す。ＮＩがｙ軸上で、非虚血コントロールの毛管密度を表す。領域Ｃがｙ軸上で、７日後の、最も遠い３番目の虚血皮弁での毛管密度を表す。
【図３５】棒（バー）チャートであり、コントロール、ＳＴＺ、およびＳＴＺ−デフェロキサミンマウスに関するＥＰＣ可動化を示している。ＥＰＣ可動化が、７日目の虚血後発作において求められた。糖尿病が結果的に、ＥＰＣ可動化の３倍の減少となった（１／３）。デフェロキサミンが、非処置ＳＴＺマウスに比べたら、虚血特異的ＥＰＣ可動化を復元させた（ｐ＜．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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