(57)【要約】本発明は、IL-17、そのp19サブユニットを介してIL-23、またはIL-17およびIL-23(p19を介する)の両方の活性を遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和することに関する。IL-17およびIL-23は、炎症過程およびヒト疾患に関与するサイトカインである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-17A(SEQ ID NO:2)を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
a)i)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 31；
2) SEQ ID NO: 38；
3) SEQ ID NO: 44；
4) SEQ ID NO: 51；
5) SEQ ID NO: 62；および
6) SEQ ID NO: 68；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 32；
2) SEQ ID NO: 39；
3) SEQ ID NO: 45；
4) SEQ ID NO:52；
5) SEQ ID NO: 63；および
6) SEQ ID NO: 69；ならびに
iii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 33；
2) SEQ ID NO: 40；
3) SEQ ID NO: 46；
4) SEQ ID NO: 53；
5) SEQ ID NO: 64；および
6) SEQ ID NO: 70
を含む軽鎖可変領域；ならびに
b)i)以下からなる群より選択される、重鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 34；
2) SEQ ID NO: 41；
3) SEQ ID NO: 47；
4) SEQ ID NO: 54；
5) SEQ ID NO: 65；および
6) SEQ ID NO: 71；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 35；
2) SEQ ID NO: 42；
3) SEQ ID NO: 48；
4) SEQ ID NO: 55；
5) SEQ ID NO: 66；および
6) SEQ ID NO: 72；ならびに
iii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 36〜37；
2) SEQ ID NO: 43；
3) SEQ ID NO: 49〜50；
4) SEQ ID NO: 56〜61：
5) SEQ ID NO: 67；および
6) SEQ ID NO: 37、57、および73〜77
を含む重鎖可変領域
を含む、抗体。
【請求項２】
抗体断片である、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子である、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
SEQ ID NO:2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
以下からなる群より選択される、抗体：
a) SEQ ID NO: 31の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 32の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 33の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:34の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 36〜37から選択される、抗体
b) SEQ ID NO: 38の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 39の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 40の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 41の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 42の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 43である、抗体
c) SEQ ID NO: 44の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 45の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:46の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 47の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 48の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 49〜50から選択される、抗体
d) SEQ ID NO: 51の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 52の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 53の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 54の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 55の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 56〜61から選択される、抗体
e) SEQ ID NO: 62の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 63の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 64の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 65の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 66の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 67である、抗体および
f) SEQ ID NO: 68の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 69の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 70の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:71の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 72の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 37、57、または73〜77から選択される、抗体。
【請求項５】
抗体断片である、請求項4記載の抗体。
【請求項６】
IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子である、請求項4記載の抗体。
【請求項７】
SEQ ID NO:2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 2の部分が、
a) SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基34〜41；および
b) SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基52〜64
からなる群より選択される、抗体。
【請求項８】
SEQ ID NO:2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 2の部分がSEQ ID NO: 2のアミノ酸残基77〜85である、抗体。
【請求項９】
SEQ ID NO:1022を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1022の部分が、
a) SEQ ID NO: 1022のアミノ酸残基34〜41；および
b) SEQ ID NO: 1022のアミノ酸残基52〜64
からなる群より選択される、抗体。
【請求項１０】
SEQ ID NO:1022を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1022の部分が、
a) SEQ ID NO: 1022のアミノ酸残基77〜85；および
b) SEQ ID NO: 1022のアミノ酸残基123〜128
からなる群より選択される、抗体。
【請求項１１】
SEQ ID NO:1023を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1023の部分が、
a) SEQ ID NO: 1023のアミノ酸残基36〜43；および
b) SEQ ID NO: 1023のアミノ酸残基60〜67
からなる群より選択される、抗体。
【請求項１２】
SEQ ID NO:1023を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1023の部分が、
a) SEQ ID NO: 1023のアミノ酸残基80〜88；および
b) SEQ ID NO: 1023のアミノ酸残基125〜131
からなる群より選択される、抗体。
【請求項１３】
SEQ ID NO:1024を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1024の部分がSEQ ID NO: 1024のアミノ酸残基49〜59である、抗体。
【請求項１４】
SEQ ID NO:1024を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1024の部分が、
a) SEQ ID NO: 1024のアミノ酸残基72〜80；および
b) SEQ ID NO: 1024のアミノ酸残基117〜123
からなる群より選択される、抗体。
【請求項１５】
2009540018.tif 000045
からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、SEQ ID NO :2を含むポリペプチドと結合する、抗体。
【請求項１６】
2009540018.tif 000046
からなる群より選択される重鎖可変領域をさらに含む、請求項15記載の抗体。
【請求項１７】
抗体断片である、請求項16記載の抗体。
【請求項１８】
IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子である、請求項16記載の抗体。
【請求項１９】
2009540018.tif 000047
からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する、抗体。
【請求項２０】
2009540018.tif 000048
からなる群より選択される軽鎖可変領域をさらに含む、請求項19記載の抗体。
【請求項２１】
抗体断片である、請求項20記載の抗体。
【請求項２２】
IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子である、請求項20記載の抗体。
【請求項２３】
SEQ ID NO: 92、80、128、144、136、148、140、96、100、124、132、および108からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、かつSEQ ID NO: 93、81、129、145、137、149、141、97、101、125、133、および109からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する、抗体。
【請求項２４】
抗体断片である、請求項23記載の抗体。
【請求項２５】
IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子である、請求項23記載の抗体。
【請求項２６】
以下からなる群より選択される軽鎖および重鎖を含む、請求項23記載の抗体：
a) SEQ ID NO: 92を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 93を含む重鎖；
b) SEQ ID NO: 80を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 81を含む重鎖；
c) SEQ ID NO: 128を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 129を含む重鎖；
d) SEQ ID NO: 144を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 145を含む重鎖；
e) SEQ ID NO: 136を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 137を含む重鎖；
f) SEQ ID NO: 148を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 149を含む重鎖；
g) SEQ ID NO: 140を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 141を含む重鎖；
h) SEQ ID NO: 96を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 97を含む重鎖；
i) SEQ ID NO: 100を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 101を含む重鎖；
j) SEQ ID NO: 124を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 125を含む重鎖；
k) SEQ ID NO: 132を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 133を含む重鎖；ならびに
l) SEQ ID NO: 108を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 109を含む重鎖。
【請求項２７】
SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
以下からなる群より選択される軽鎖および重鎖を含む抗体と結合に関して競合する、抗体：
a) SEQ ID NO: 92を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 93を含む重鎖；
b) SEQ ID NO: 80を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 81を含む重鎖；
c) SEQ ID NO: 128を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 129を含む重鎖；
d) SEQ ID NO: 144を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 145を含む重鎖；
e) SEQ ID NO: 136を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 137を含む重鎖；
f) SEQ ID NO: 96を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 97を含む重鎖；
g) SEQ ID NO: 100を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 101を含む重鎖；
h) SEQ ID NO: 124を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 125を含む重鎖；
i) SEQ ID NO: 132を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 133を含む重鎖；ならびに
j) SEQ ID NO: 108を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 109を含む重鎖。
【請求項２８】
SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
SEQ ID NO: 148を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 149を含む重鎖を含む抗体と結合に関して競合する、抗体。
【請求項２９】
IL-23(SEQ ID NO:4)を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
i)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 326；
2) SEQ ID NO: 341；
3) SEQ ID NO: 353；
4) SEQ ID NO: 365；
5) SEQ ID NO: 373：
6) SEQ ID NO: 405；
7) SEQ ID NO: 412；
8) SEQ ID NO: 421；
9) SEQ ID NO: 430；
10) SEQ ID NO: 451；
11) SEQ ID NO: 459；
12) SEQ ID NO: 467；および
13) SEQ ID NO: 476；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 327；
2) SEQ ID NO: 342；
3) SEQ ID NO: 354；
4) SEQ ID NO: 366；
5) SEQ ID NO: 374；
6) SEQ ID NO: 406；
7) SEQ ID NO: 413；
8) SEQ ID NO: 422；
9) SEQ ID NO: 431；
10) SEQ ID NO: 452；
11) SEQ ID NO: 460；
12) SEQ ID NO: 468；および
13) SEQ ID NO: 477；ならびに
iii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 328；
2) SEQ ID NO: 343；
3) SEQ ID NO: 355；
4) SEQ ID NO: 367；
5) SEQ ID NO: 375；
6) SEQ ID NO: 407；
7) SEQ ID NO: 414；
8) SEQ ID NO: 423；
9) SEQ ID NO: 432；
10) SEQ ID NO: 453；
11) SEQ ID NO: 461；
12) SEQ ID NO: 469；
13) SEQ ID NO: 478；ならびに
b)i)以下からなる群より選択される、重鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 329；
2) SEQ ID NO: 344；
3) SEQ ID NO: 356；
5) SEQ ID NO: 368；
5) SEQ ID NO: 376；
6) SEQ ID NO: 408；
7) SEQ ID NO: 415；
8) SEQ ID NO: 424；
9) SEQ ID NO: 433；
10) SEQ ID NO: 453；
11) SEQ ID NO: 462；
12) SEQ ID NO: 470；および
13) SEQ ID NO: 479；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 330；
2) SEQ ID NO: 345；
3) SEQ ID NO: 357；
4) SEQ ID NO: 369；
5) SEQ ID NO: 377；
6) SEQ ID NO: 409；
7) SEQ ID NO: 416；
8) SEQ ID NO: 425；
9) SEQ ID NO: 434；
10) SEQ ID NO: 455；
11) SEQ ID NO: 463；
12) SEQ ID NO: 471；および
13) SEQ ID NO: 480；ならびに
iii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 331〜340；
2) SEQ ID NO: 331、346〜352；
3) SEQ ID NO: 358〜364；
4) SEQ ID NO: 370〜372：
5) SEQ ID NO: 378〜404；
6) SEQ ID NO: 410〜411；
7) SEQ ID NO: 417〜420；
8) SEQ ID NO: 426〜429；
9) SEQ ID NO: 435〜450；
10) SEQ ID NO: 456〜458；
11) SEQ ID NO: 464〜466；
12) SEQ ID NO: 472〜475；および
13) SEQ ID NO: 481〜490
を含む重鎖可変領域
を含む、抗体。
【請求項３０】
抗体断片である、請求項29記載の抗体。
【請求項３１】
IL-17A(SEQ ID NO:2)とも結合する二重特異性分子である、請求項29記載の抗体。
【請求項３２】
以下からなる群より選択される、請求項29記載の抗体：
a) SEQ ID NO: 326の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 327の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 328の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:329の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 330の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 331〜340から選択される、抗体
b) SEQ ID NO: 341の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 342の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 343の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 344の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 345の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 331、およびSEQ ID NO:346〜352である、抗体
c) SEQ ID NO: 353の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 354の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:355の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 356の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 357の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 358〜364から選択される、抗体
d) SEQ ID NO: 365の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 366の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 367の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 368の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 369の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 370〜372から選択される、抗体
e) SEQ ID NO: 373の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 374の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 375の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 376の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 377の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 378〜04である、抗体
f) SEQ ID NO: 405の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 406の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 407の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:408の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 409の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 37、57、または410〜411から選択される、抗体
g) SEQ ID NO: 412の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 413の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 414の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 415の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 416の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 417〜420から選択される、抗体
h) SEQ ID NO: 421の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 422の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 423の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:424の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 425の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 426〜429から選択される、抗体
i) SEQ ID NO: 430の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 431の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 432の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 433の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 434の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 435〜450から選択される、抗体
j) SEQ ID NO: 451の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 452の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 453の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:454の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 455の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 456〜458から選択される、抗体
k) SEQ ID NO: 459の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 460の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 461の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:462の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 463の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO:464〜466から選択される、抗体
l) SEQ ID NO: 467の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 468の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 469の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:470の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 471の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 472〜475から選択される、抗体ならびに
m) SEQ ID NO: 476の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 477の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 478の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:479の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 480の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 481〜490から選択される抗体。
【請求項３３】
抗体断片である、請求項32記載の抗体。
【請求項３４】
IL-17A(SEQ ID NO:2)とも結合する二重特異性分子である、請求項32記載の抗体。
【請求項３５】
SEQ ID NO:4を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 4の部分が、
a) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基55〜66；および
b) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基74〜85
からなる群より選択される、抗体。
【請求項３６】
SEQ ID NO:4を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 4の部分が、
a) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基137〜146；および
b) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基155〜164
からなる群より選択される、抗体。
【請求項３７】
SEQ ID NO:1025を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1025の部分が、
a) SEQ ID NO: 1025のアミノ酸残基55〜66；および
b) SEQ ID NO: 1025のアミノ酸残基74〜85
からなる群より選択される、抗体。
【請求項３８】
SEQ ID NO: 1025を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1025の部分が、
a) SEQ ID NO: 1025のアミノ酸残基137〜146；および
b) SEQ ID NO: 1025のアミノ酸残基155〜164
からなる群より選択される、抗体。
【請求項３９】
SEQ ID NO:1026を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1026の部分が、
a) SEQ ID NO: 1026のアミノ酸残基56〜67；および
b) SEQ ID NO: 1026のアミノ酸残基73〜86
からなる群より選択される、抗体。
【請求項４０】
SEQ ID NO: 1026を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1026の部分が、
a) SEQ ID NO: 1026のアミノ酸残基137〜146；および
b) SEQ ID NO: 1026のアミノ酸残基155〜165
からなる群より選択される、抗体。
【請求項４１】
SEQ ID NO:1027を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1027の部分が、
a) SEQ ID NO: 1027のアミノ酸残基55〜68；および
b) SEQ ID NO: 1027のアミノ酸残基73〜86
からなる群より選択される、抗体。
【請求項４２】
SEQ ID NO: 1027を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
抗体が結合するSEQ ID NO: 1027の部分が、
a) SEQ ID NO:1027のアミノ酸残基137〜147；および
b) SEQ ID NO: 1027のアミノ酸残基155〜165
からなる群より選択される、抗体。
【請求項４３】
2009540018.tif 000049
からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 4を含むポリペプチドと結合する、抗体。
【請求項４４】
2009540018.tif 000050
からなる群より選択される重鎖可変領域をさらに含む、請求項43記載の抗体。
【請求項４５】
抗体断片である、請求項44記載の抗体。
【請求項４６】
IL-17A(SEQ ID NO:2)とも結合する二重特異性分子である、請求項44記載の抗体。
【請求項４７】
SEQ ID NO: 768および764からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、かつSEQ ID NO: 769および765からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 4を含むポリペプチドと結合する、抗体。
【請求項４８】
SEQ ID NO: 774および776からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、かつSEQ ID NO: 775および777からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 4を含むポリペプチドと結合する、抗体。
【請求項４９】
インターロイキン-17(IL-17)およびIL-23のアンタゴニストでT細胞を処理する段階を含む、T細胞によるIL-17産生を阻害する方法。
【請求項５０】
IL-23アンタゴニストがIL-23のp19サブユニットと結合する、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
アンタゴニストが抗体である、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
抗体が抗体断片である、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
抗体断片が、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５４】
IL-17およびIL-23のアンタゴニストを哺乳動物対象に投与する段階を含む、哺乳動物対象においてIL-17またはIL-23の発現上昇を特徴とする疾患を治療する方法。
【請求項５５】
以下のうちの少なくとも1つを含み、IL-17A(SEQ ID NO: 2)およびIL-23p19(SEQ ID NO: 4)の両方と結合する、単離された抗体：
a)
2009540018.tif 000051
からなる群より選択される、軽鎖可変領域；
b)
2009540018.tif 000052
からなる群より選択される、重鎖可変領域；
c)
2009540018.tif 000053
からなる群より選択される、軽鎖可変領域；ならびに
d)
2009540018.tif 000054
からなる群より選択される、重鎖可変領域。
【請求項５６】
a)より選択される1つの軽鎖可変領域およびb)より選択される1つの重鎖可変領域を含む、請求項55記載の抗体。
【請求項５７】
c)より選択される1つの軽鎖可変領域およびd)より選択される1つの重鎖可変領域を含む、請求項55記載の抗体。
【請求項５８】
a)より選択される1つの軽鎖可変領域、b)より選択される1つの重鎖可変領域、c)より選択される1つの軽鎖可変領域、およびd)より選択される1つの重鎖可変領域を含む、請求項55記載の抗体。
【請求項５９】
多発性硬化症(MS)、慢性炎症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性眼疾患、関節リウマチ(RA)およびその他の関節炎状態、喘息、全身性エリテマトーデス、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群(IBS)、ならびに炎症性腸疾患(IBD)から選択される疾患を治療する方法。
【請求項６０】
アンタゴニストが以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項59記載の方法：
a)
2009540018.tif 000055
からなる群より選択される、軽鎖可変領域；
b)
2009540018.tif 000056
からなる群より選択される、重鎖可変領域；
c)
2009540018.tif 000057
からなる群より選択される、軽鎖可変領域；ならびに
d)
2009540018.tif 000058
からなる群より選択される、重鎖可変領域。
【請求項６１】
二重特異性抗体である、請求項60記載の抗体。
【請求項６２】
IL-17Aに対するアンタゴニストおよびIL-23p19に対するアンタゴニストの組み合わせを投与する段階を含む、多発性硬化症の再発を予防する、抑制する、または減少させる方法。
【請求項６３】
IL-17Aに対するアンタゴニストとIL-23p19に対するアンタゴニストを同時投与する、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
IL-17Aに対するアンタゴニストがscFV分子であり、IL-23p19に対するアンタゴニストがscFv分子である、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
IL-17Aに対するアンタゴニストおよびIL-23p19に対するアンタゴニストを1つの実体(entity)として投与する、請求項62記載の方法。
【請求項６６】
実体が二重特異性分子である、請求項62記載の方法。
【請求項６７】
IL-17Aに対するアンタゴニストが、
2009540018.tif 000059
からなる群より選択される軽鎖、ならびに
2009540018.tif 000060
からなる群より選択される重鎖を含み、かつ
IL-23p19に対するアンタゴニストが、
2009540018.tif 000061
からなる群より選択される軽鎖を含み、
2009540018.tif 000062
からなる群より選択される重鎖可変領域をさらに含む、
請求項59記載の方法。
【請求項６８】
IL-17Aに対するアンタゴニストおよびIL-23p19に対するアンタゴニストの組み合わせを投与する段階を含む、IBDを予防する、抑制する、または軽減する方法。
【請求項６９】
IL-17Aに対するアンタゴニストとIL-23p19に対するアンタゴニストを同時投与する、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
IL-17Aに対するアンタゴニストがscFV分子であり、IL-23p19に対するアンタゴニストがscFv分子である、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
IL-17Aに対するアンタゴニストおよびIL-23p19に対するアンタゴニストを1つの実体として投与する、請求項68記載の方法。
【請求項７２】
実体が二重特異性分子である、請求項68記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全体として、IL-17およびIL-23(p19を介する)に対するアンタゴニストの同定および単離、ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫系は、感染性病原体(例えば、ウイルス、細菌、および多細胞生物)から、ならびに癌および新生物から個体を保護する。免疫系は、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞(DC)、好酸球、T細胞、およびB細胞などの、多くのリンパ系および骨髄系細胞型を含む。これらの細胞は、サイトカインとして知られるシグナル伝達タンパク質を産生し得る。サイトカインは、免疫細胞の増殖、発達、分化、および/または遊走の誘導、ならびに多くの細胞型の増殖および分化の調節を含む様々な生物学的効果を媒介する可溶性の小さなタンパク質である(例えば、Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990)（非特許文献1）；Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991)（非特許文献2）；Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)（非特許文献3）を参照されたい)。サイトカイン誘導性の免疫機能には、免疫細胞の全身的または局所的な蓄積を特徴とする炎症反応もまた含まれ得る。このような炎症反応は宿主保護効果を有するが、反応が、自己免疫障害(多発性硬化症など)および癌/腫瘍性疾患のような、過剰なおよび/または慢性的な炎症を含む場合には、病的結果を生じ得る(Oppenheim and Feldmann (eds.) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA (2001)（非特許文献4）；von Andrian and Mackay New Engl. J. Med. 343: 1020 (2000)（非特許文献5）；Davidson and Diamond, New Engl. J. Med. 345:340 (2001)（非特許文献6）；Lu et al, Mol. Cancer Res. 4:221(2006)（非特許文献7）；Dalgleish and O'Byrne, Cancer Treat Res. 130:1 (2006)（非特許文献8）)。
【０００３】
サイトカイン群を構成するタンパク質には、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、およびその他の調節分子が含まれる。例えば、ヒトインターロイキン-17A(「IL-17」としても知られる)は、例えば、インターロイキン-6(IL-6)、細胞内接着分子1(ICAM-1)、インターロイキン-8(IL-8)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびプロスタグランジンE2の発現を促進し、CD34+造血前駆細胞の好中球への選択的成熟において役割を果たすサイトカインである(Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995)（非特許文献9）；Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)（非特許文献10）)。別の例として、ヒトインターロイキン-23(「IL-23」としても知られる)は、T細胞、特に記憶T細胞の増殖を促進することが報告されており、Th17細胞の分化および/または維持に寄与し得るサイトカインである。
【０００４】
したがって、サイトカインおよびそれらの受容体の実証されたインビボ活性から、他のサイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカインアゴニスト、およびサイトカインアンタゴニストの臨床上の可能性およびそれらの必要性が明らかにされる。例えば、炎症誘発性サイトカインファミリーの実証されたインビボ活性から、IL-17AおよびIL-23などの炎症誘発性分子のアンタゴニストの非常に大きな臨床上の可能性およびその必要性が明らかにされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990)
【非特許文献２】Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991)
【非特許文献３】Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)
【非特許文献４】Oppenheim and Feldmann (eds.) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA (2001)
【非特許文献５】von Andrian and Mackay New Engl. J. Med. 343: 1020 (2000)
【非特許文献６】Davidson and Diamond, New Engl. J. Med. 345:340 (2001)
【非特許文献７】Lu et al, Mol. Cancer Res. 4:221(2006)
【非特許文献８】Dalgleish and O'Byrne, Cancer Treat Res. 130:1 (2006)
【非特許文献９】Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995)
【非特許文献１０】Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、
IL-17A(SEQ ID NO:2)を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
a)i)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 31；
2) SEQ ID NO: 38；
3) SEQ ID NO: 44；
4) SEQ ID NO: 51；
5) SEQ ID NO: 62；および
6) SEQ ID NO: 68；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 32；
2) SEQ ID NO: 39；
3) SEQ ID NO: 45；
4) SEQ ID NO:52；
5) SEQ ID NO: 63；および
6) SEQ ID NO: 69；ならびに
iii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 33；
2) SEQ ID NO: 40；
3) SEQ ID NO: 46；
4) SEQ ID NO: 53；
5) SEQ ID NO: 64；および
6) SEQ ID NO: 70
を含む軽鎖可変領域；ならびに
b)i)以下からなる群より選択される、重鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 34；
2) SEQ ID NO: 41；
3) SEQ ID NO: 47；
4) SEQ ID NO: 54；
5) SEQ ID NO: 65；および
6) SEQ ID NO: 71；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 35；
2) SEQ ID NO: 42；
3) SEQ ID NO: 48；
4) SEQ ID NO: 55；
5) SEQ ID NO: 66；および
6) SEQ ID NO: 72；ならびに
iii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 36〜37；
2) SEQ ID NO: 43；
3) SEQ ID NO: 49〜50；
4) SEQ ID NO: 56〜61：
5) SEQ ID NO: 67；および
6) SEQ ID NO: 37、57、および73〜77
を含む重鎖可変領域
を含む、抗体
である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、炎症誘発性サイトカインIL-17(本明細書では互換的に「IL-17A」とも称する)(SEQ ID NO:1および2)およびIL-23(SEQ ID NO:5および6)のp19サブユニット(SEQ ID NO:3および4)に対するアンタゴニストを提供することによって、これらの必要性に対処するものである。
【０００８】
IL-17は、数ある中でも、IL-6、ICAM-1、IL-8、GM-CSF、およびプロスタグランジンE2の発現を促進し、CD34+造血前駆細胞の好中球への選択的成熟において役割を果たすサイトカインである(Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995)；Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996))。
【０００９】
IL-23は、特有のサブユニットであるp19(本明細書では互換的に「IL-23」、「p19」、および「IL23/p19」と称する)、およびインターロイキン-12(IL-12)と共有されるp40サブユニットから構成されるヘテロ二量体サイトカインである(Oppmann, Immunity 13:715 (2000))。IL-23は、現在では「新規」Tヘルパー(Th)サブセットとして名づけられている、Th17と命名された活性化CD4+ T細胞からのIL-17AおよびIL-17Fの産生および/または維持を促進することが認められている。IL-23サイトカインおよび受容体の生物学の総説は、Holscher, Curr. Opin. Invest. Drugs 6:489 (2005)、およびLangrish et al. Immunol Rev. 202:96 (2004)に概説されている。Th17細胞は、Th1およびTh2系列と同様に、細胞外細菌などの特定のクラスの病原体に対する適応免疫を提供するように進化してきた可能性が最も高い。しかしながら、不適切なTh17応答は、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、および乾癬を含む、増えつつある多数の自己免疫障害に強く関連づけられている。
【００１０】
実際に、IL-17およびIL-23のいずれもまた、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、および乾癬などの多くの自己免疫疾患において重要な役割を果たすことが報告されている。IL-23およびIL-17はいずれも、多発性硬化症を有するヒトの中枢神経系において、および多発性硬化症の動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)であるマウスにおいて過剰発現している。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG) 35-55ペプチドまたはプロテオリピドペプチド(PLP)のいずれかによってEAEが誘導された場合に、マウスにおいて過剰発現が認められる。さらに、IL-23/p19またはIL-17のいずれか一方を中和すると、マウスにおいてEAE症状が改善される(Park et al, Immunol. 6:1133 (2005)；Chen et al, J Clin Invest. 116:1317 (2006))。
【００１１】
IL-17およびTh17細胞がIL-23非依存性供給源から生成され得ることもまた実証されており、IL-17エフェクター応答のインビボ発生がIL-23非依存的であることが示されている(Mangan et al, Nature 441:231 (2006))。IL-23の中和は、理論的に既存のIL-17産生細胞を排除するが、新規Th17細胞の発達を完全に妨げるわけではない。
【００１２】
IL-23非依存性のTh17生成の重要な調節因子は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-b)である。TGF-b(TGF-b1を含む)が、IL-23に非依存的なTh17発達への傾倒に重要であることが繰り返し実証されている(Mangan et al, Nature. 441:231 (2006))。このことは、TGF-b1欠損マウスにおいてTh17細胞の発達が顕著に損なわれるという事実によってさらに支持される(Mangan et al, Nature. 441:231 (2006))。TGF-b1が抗炎症および炎症誘発の両方の役割を有するようであるという考えは、それが、異なるCD4+ T細胞亜集団による以外は、炎症誘発性サイトカインIL-17およびFoxp3(CD4+CD25+調節性T細胞集団の転写因子)の発現を誘導し得るという事実に一部起因し得る(Mangan et al, Nature. 441:231 (2006))。
【００１３】
サイトカインと結合する受容体は、典型的に、サイトカインと高親和性で結合し、この結合事象を特定の受容体サブユニットの細胞質部分を介して細胞に伝達する1つまたは複数の内在性膜タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、それらの細胞外リガンド結合ドメインの類似性に基づいて、いくつかのクラスに分類されている。IL-17は、その同族受容体、IL-17受容体(IL-17R)およびIL-17RCとの相互作用を介してその効果を媒介する。IL-23受容体とIL-12受容体は、次に受容体応答性に関与する特有の誘導性成分、それぞれIL-23RおよびIL-12Rb-2と対をなすサブユニット、IL-12Rb-1を共有する。この点におけるTGF-bの作用の1つは、IL-23R発現を上方制御することであり、これは次にIL-23に対する応答性を誘導する。
【００１４】
本発明は、これらの炎症誘発性サイトカイン、IL-17およびIL-23/p19の両方の阻害に関する。本発明は、IL-23(p19を介する)およびIL-17を両方拮抗することが、IL-23のみ(p19またはp40を介する)またはIL-17のみを中和するよりも、治療的により効果的であり、したがって炎症性疾患(癌を含む)の効果的な治療に必要であるという驚くべき発見に基づく。より具体的には、本発明は、単一の拮抗分子または中和実体（entity）によるIL-17およびIL-23(p19を介する)の両方の阻害または中和に関する。
【００１５】
拮抗分子または中和実体は、IL-17およびIL-23(p19を介する)の両方の活性を阻害し、ひいては、新規および既存のIL-17およびIL-17産生T細胞(Th17)の生成、維持、および活性を阻害する。TH17細胞はIL-17AおよびIL-17Fを含む。本発明はさらに、IL- 17および/またはIL-23のレベル上昇の存在を特徴とする炎症性疾患の治療における、IL-17およびIL-23/p19アンタゴニストまたは中和実体の使用に関する。本発明はまた、IL- 17および/またはIL-23のレベル上昇の存在を特徴とする癌の治療における、IL-17およびIL-23/p19アンタゴニストの使用に関する。
【００１６】
したがって、本発明は、IL-17およびIL-23/p19の両方を個々にまたは共に拮抗することに関する。IL-17、IL-23/p19、またはIL-23/p40の介入はいくつかの炎症性疾患および種々の癌の効果的な治療として提唱されているため、IL-17、IL-23、IL-23/p19、またはIL-17AおよびIL-23(p19を介する)の両方の活性を遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和することができる本発明のアンタゴニストを使用することは、これら2つのサイトカインの一方のみを標的化する治療に優る利点を有すると考えられる。本発明はさらに、炎症性疾患および癌におけるその使用と共に、関連する組成物および方法を提供する。
【００１７】
A) 概要
免疫関連疾患および炎症性疾患は、正常な生理機能において、傷害または損傷に反応し、傷害または損傷からの修復を開始し、ならびに外来生物に対する生得的および後天的防御を開始するのに非常に重要である、かなり複雑で多くの場合は多重に相互接続した生物学的経路の顕在化または結果である。疾患または病態は、これらの正常な生理的経路が、反応の強さと直接関連して、異常な調節もしくは過度の刺激の結果として、自己に対する反応として、またはこれらの組み合わせとして、さらなる傷害または損傷を引き起こす場合に生じる。
【００１８】
これらの疾患の発生は、多段階経路およびしばしば複数の異なった生物学的系/経路を伴う場合が多く、これらの経路の1つまたは複数における重要な点での介入は寛解または治療効果をもたらし得る。治療的介入は、有害な過程/経路の拮抗作用または有益な過程/経路の促進によって起こり得る。
【００１９】
多くの免疫関連疾患が公知であり、広く研究されている。このような疾患には、免疫介在性炎症性疾患(関節リウマチ、多発性硬化症、脱髄性疾患、自己免疫性眼疾患、ブドウ膜炎；強膜炎、免疫介在性腎疾患、肝胆道疾患、炎症性腸疾患(IBD)、過敏性腸症候群(IBS)、乾癬、および喘息など)、非免疫介在性炎症性疾患、感染症、免疫不全症、新形成等が含まれる。
【００２０】
Tリンパ球(T細胞)は、哺乳動物の免疫応答の重要な成分である。T細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)内の遺伝子によってコードされる自己分子と会合している抗原を認識する。抗原は、抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片等の表面上にMHC分子と共に提示され得る。T細胞系は、宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの変化した細胞を除去する。T細胞には、ヘルパーT細胞および細胞傷害性T細胞が含まれる。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞上の抗原-MHC複合体を認識した後に大規模に増殖する。ヘルパーT細胞はまた、B細胞、細胞傷害性T細胞、および免疫応答に関与する種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を果たす種々のサイトカイン、すなわちリンホカインを分泌する。
【００２１】
体液性および細胞性免疫応答の双方における中心的事象は、ヘルパーT細胞の活性化およびクローン性増殖である。ヘルパーT細胞の活性化は、T細胞受容体(TCR)-CD3複合体と抗原提示細胞の表面上の抗原-MHCとの相互作用によって始まる。この相互作用は、休止ヘルパーT細胞が細胞周期に入る(G0からG1への移行)のを誘導する生化学的事象のカスケードを媒介し、結果としてIL-2および場合によってはIL-4の高親和性受容体の発現をもたらす。活性化T細胞は、増殖して記憶細胞またはエフェクター細胞に分化する周期を通して進行する。
【００２２】
TCRによって媒介されるシグナルに加えて、T細胞の活性化は、抗原提示細胞によって放出されるサイトカインにより、または抗原提示細胞およびT細胞上の膜結合分子との相互作用を介して誘導される付加的な共刺激を伴う。サイトカインIL-1およびIL-6が、共刺激シグナルを提供することが示されている。また、抗原提示細胞の表面上に発現したB7分子とT細胞表面上に発現したCD28およびCTLA-4分子との間の相互作用により、T細胞活性化が生じる。活性化T細胞が発現する細胞接着分子、例えばICAM-1、インテグリン、VLA-4、LFA-1、CD56等の数は増加する。
【００２３】
混合リンパ球培養または混合リンパ球反応(MLR)におけるT細胞増殖は、化合物が免疫系を刺激する能力の確立された指標である。多くの免疫応答において、炎症細胞は損傷または感染部位に浸潤する。この遊走細胞は、罹患組織の組織学的検査によって決定され得るように、好中球、好酸球、単球、またはリンパ球であり得る。Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.
【００２４】
免疫関連疾患は、免疫応答を抑制することによって治療することができる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する本発明のアンタゴニスト(すなわち、抗IL-17抗体および/または抗IL-23/p19抗体)を用いることは、免疫介在性疾患および炎症性疾患の治療に有益であると考えられる。免疫応答を阻害する分子を使用して(タンパク質を直接、または抗体アゴニストの使用を介する)、免疫応答を阻害し、ひいては免疫関連疾患を改善することができる。
【００２５】
IL-17は、Tリンパ球指向性ヘルペスウイルスサイミリ(Saimiri)(HSV)によってコードされるタンパク質の細胞オーソログとして同定された[Rouvier et al., J. Immunol., 150(12): 5445-5456 (1993)；Yao et al., J. Immunol., 122(12):5483-5486 (1995)、およびYao et al., Immunity, 3(6):811-821 (1995)を参照されたい]。後の特徴づけにより、このタンパク質が、多種多様な末梢組織において炎症誘発性反応を誘導するよう作用する強力なサイトカインであることが示された。IL-17は、主にCD4+活性化記憶T細胞によって合成および分泌される、約32 kDaのジスルフィド結合されたホモ二量体サイトカインである(Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16: 541-551 [1998]に概説されている)。具体的には、IL-17は、19〜23残基のN末端シグナル配列を有する155アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、ジスルフィド結合されたホモ二量体糖タンパク質として分泌される。IL-17は、WO9518826 (1995)、WO9715320 (1997)、およびWO9704097 (1997)、ならびに米国特許第6,063,372号に開示されている。
【００２６】
組織分布が限定されているにもかかわらず、IL-17は様々な型の細胞に対して多面的な生物活性を示す。IL-17は、多くのサイトカインの産生を促進することが見出されている。例えば、それは、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮および内皮細胞のような接着細胞によるIL-6、IL-8、IL-12、白血病抑制因子(LIF)、プロスタグランジンE2、MCP-1、およびG-CSFの分泌を誘導する。IL-17はまた、ICAM-1の表面発現、T細胞の増殖、ならびにCD34+ヒト前駆細胞の増殖および好中球への分化を誘導する能力も有する。IL-17はまた、多発性硬化症などの特定の他の自己免疫障害において重要な役割を果たすと考えられている(Matusevicius et al., Mult. Scler. 5:101 (1999)；Park et al, Nat Immunol. 6:1133 (2005))。IL-17は、細胞内シグナル伝達により、ヒトマクロファージにおいてCa2+流入および[cAMP]の減少を促進することがさらに示されている(Jovanovic et al, J. Immunol. 160:3513 (1998))。IL-17で処理した線維芽細胞はNF-κBの活性化を誘導し(Yao et al., Immunity, 3:811 (1995)、Jovanovic et al.、前記)、それで処理したマクロファージはNF-κBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化する(Shalom-Barek et al, J. Biol. Chem. 273:27467 (1998))。
【００２７】
IL-17の幅広い効果と一致して、IL-17の細胞表面受容体が多くの組織および細胞型において広く発現していることが見出された(Yao et al., Cytokine, 9:794 (1997))。ヒトIL-17受容体(IL-17R)(866アミノ酸)のアミノ酸配列から、1回膜貫通ドメインおよび長い525アミノ酸の細胞内ドメインを有するタンパク質が予測されるが、この受容体配列は特有であり、サイトカイン/増殖因子受容体ファミリー由来の受容体のいずれの配列とも類似していない。このことは、IL-17自体が他の公知のタンパク質との類似性を欠くことと併せて、IL-17およびその受容体が、シグナル伝達タンパク質および受容体の新規なファミリーの一部であり得ることを示している。IL-17の活性は、その特有の細胞表面受容体への結合によって媒介されることが実証されており、これまでの研究から、T細胞を可溶型のIL-17受容体ポリペプチドと接触させると、PHA、コンカナバリンA、および抗TCRモノクローナル抗体によって誘導されるT細胞増殖およびIL-2産生が阻害されることが示されている(Yao et al, J. Immunol, 155:5483 (1995))。
【００２８】
IL-17およびIL-23は、免疫応答および炎症反応の操作に革新的なアプローチを提供する、サイトカインネットワーク内の特有のシグナル伝達系を表すと考えられる。
【００２９】
したがって、本発明のアンタゴニスト(すなわち、抗IL-17抗体および/または抗IL-23/p19抗体)のようなIL-17およびIL-23活性に対するアンタゴニストは、炎症性疾患の治療的処置において、特に炎症性疾患の治療においてIL-17およびIL-23/p19の両方の一つずつまたは双方に対するアンタゴニストとして、特に多発性硬化症、炎症性腸疾患(IBD)、関節リウマチ、乾癬、および癌の治療においてIL-17およびIL-23/p19の両方に対するアンタゴニストとして有用である。さらに、本発明のアンタゴニスト(すなわち、抗IL-17抗体および/または抗IL-23/p19抗体)のようなIL-17およびIL-23/p19活性に対するアンタゴニストは、他の炎症性疾患の治療的処置において有用である。これらのアンタゴニストは、アトピー性および接触性皮膚炎、大腸炎、内毒素血症、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、自己免疫性眼疾患(ブドウ膜炎、強膜炎)、成人呼吸器疾患(ARD)、脱髄性疾患、敗血症ショック、多臓器不全、喘息などの炎症性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気道過敏症、慢性気管支炎、アレルギー性喘息、乾癬、湿疹、潰瘍性大腸炎およびクローン病などのIBSおよび炎症性腸疾患(IBD)、糖尿病、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)感染症、腹膜炎症の結果としての(すなわち、感染症、損傷等による)腹腔内癒着および/または膿瘍、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、全身性硬化症、ネフローゼ症候群、臓器同種移植片拒絶、移植片対宿主病(GVHD)、腎臓、肺、心臓等の移植片拒絶、連鎖球菌細胞壁(SCW)誘発関節炎、変形性関節症、歯肉炎/歯周炎、疱疹間質性角膜炎、再狭窄、川崎病、ならびに、これらに限定されないが前立腺癌、腎癌、結腸癌、卵巣癌、および子宮頸癌、ならびに白血病を含む、IL-17および/またはIL-23発現を特徴とする癌/腫瘍性疾患の治療において、IL-17およびIL-23(p19を介する)を(個別にまたは共に)結合するか、遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和することができる(Tartour et al, Cancer Res. 59:3698 (1999)；Kato et al, Biochem. Biophys. Re.s Commun. 282:735 (2001)；Steiner et al, Prostate. 56:171 (2003)；Langowksi et al, Nature 442: 461, 2006)。
【００３０】
他の発明の中でも、本発明は、IL-17およびIL-23/p19の新規アンタゴニスト、ならびに炎症性疾患および自己免疫疾患の治療におけるそれらの使用を提供する。本発明の中和抗IL-17抗体および抗IL-23/p19抗体を含む本発明のIL-17アンタゴニストおよびIL-23/p19アンタゴニストは、多発性硬化症、癌(IL-17および/またはIL-23の発現を特徴とする)、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、自己免疫性眼疾患、内毒素血症、IBS、および炎症性腸疾患(IBD)、大腸炎、喘息、同種移植片拒絶、免疫介在性腎疾患、肝胆道疾患、アテローム性動脈硬化症、腫瘍増殖の促進、または変性関節疾患、ならびに本明細書に開示する他の炎症状態などの炎症および炎症性疾患の治療において、IL-17もしくはIL-23(p19を介する)のいずれか一方、またはIL-17およびIL-23(p19を介する)の両方の活性を遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和するために用いることができる。
【００３１】
本発明は、IL-17(例えば、SEQ ID NO:2に示されるヒトIL-17ポリペプチド配列)と結合する単離されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、IL-23(例えば、SEQ ID NO:6に示されるヒトIL-23ポリペプチド配列)と結合する、上記に開示される単離されたポリペプチドを提供する。より具体的には、本発明は、IL-23のp19サブユニット(例えば、SEQ ID NO:4に示されるヒトp19ポリペプチド配列)に結合するポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明はまた、SEQ ID NO:2または4のアミノ酸配列の少なくとも15個連続したアミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドおよびエピトープを提供する。例示的なポリペプチドには、SEQ ID NO:2または4を含むかまたはそれからなるポリペプチド、その抗原エピトープが含まれる。さらに、本発明はまた、IL-17またはIL-23に結合するか、その活性を遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和する、上記に開示される単離されたポリペプチドを提供する。
【００３３】
本発明の好ましい態様は、IL-17またはIL-23/p19に結合する結合ペプチド、抗体、およびそれらの任意の断片または置換物(本明細書では互換的に「IL-17/IL-23アンタゴニスト」、「IL-17アンタゴニスト」、「IL-23アンタゴニスト」、「p19アンタゴニスト」、「IL-17/IL-23抗体」、「IL-17/p19抗体」、「IL-17抗体」、「IL-23抗体」、「p19抗体」、「IL-17/IL-23/p19抗体」、IL-17A中和実体、IL-23p19中和実体等と称する)を含む。具体的には、そのような結合ペプチドまたは抗体は、ヒトIL-17およびIL-23(p19を介する)の両方に特異的に結合することができ、ならびに/またはIL-17およびIL-23のいずれか一方もしくは両方と関連した生物活性を調節することができ、したがって炎症および免疫関連疾患などの種々の疾患および病的状態の治療において有用である。
【００３４】
したがって、本発明は、IL-17および/またはIL-23(p19を介する)と特異的に結合する抗体および抗体断片を提供する。例示的な抗体には、中和抗体、ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、およびヒトモノクローナル抗体が含まれる。例示的な抗体断片には、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位が含まれる。中和抗体は、好ましくは、IL-17およびIL-23とそれらそれぞれの受容体(すなわち、IL-17についてはIL-17RAまたはIL-17RC；IL-23についてはIL-12b1およびIL-23R)との相互作用が遮断される、阻害される、減少される、拮抗される、または中和されるように、IL-17またはIL-23/p19と優先的に結合する。すなわち、本発明の中和IL-17抗体およびIL-23/p19抗体は、IL-17もしくはIL-23のそれぞれを個々に結合する、遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、もしくは中和することができるか、またはIL-17およびIL-23を共に結合する、遮断する、阻害する、減少させる、拮抗する、もしくは中和することができる。本発明は、担体、および本明細書に記載のペプチド、ポリペプチド、または抗体を含む組成物をさらに含む。
【００３５】
本発明は、薬学的に許容される担体、および本明細書に記載のポリペプチドまたは抗体を含む薬学的組成物をさらに含む。
【００３６】
本発明はまた、SEQ ID NO:2、4のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその任意の断片と特異的に結合する抗体または抗体断片と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体断片も意図する。例示的な抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:2または4からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と結合する。
【００３７】
本発明はまた、本発明のアンタゴニストおよび免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質も提供する。そのような融合タンパク質において、免疫グロブリン部分は、ヒトFc断片などの免疫グロブリン重鎖定常領域であってよい。本発明は、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子をさらに含む。
【００３８】
特定の態様において、本発明は、IL-17およびIL-23の両方と結合する二重特異性抗体または結合タンパク質を提供する。二重特異性抗体(BsAb)とは、抗体が2つの異なる抗原に特異的に結合するように、2つの異なる抗原結合部位を有する抗体である。より高い結合価(すなわち、3つ以上の抗原に結合する能力)を有する抗体を調製することもでき、これらは多重特異性抗体と称される。
【００３９】
二重特異性抗体は、各標的に関してモノクローナル抗体(MAb)であってよい。特定の態様において、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってよい。完全ヒト抗体は、以下に考察するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されているトランスジェニックマウスを免疫する段階を含む手順によって作製することができる。IL-17およびIL-23(p19を介する)と結合する本発明の二重特異性抗体は、本明細書において、二重特異性IL-17/IL-23抗体または二重特異性IL-17/p19 MAbと称する。
【００４０】
さらなる他の特定の態様では、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。別の態様において、IL-17/IL-23抗体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンからなる群より選択される1つもしくは複数の非タンパク質性ポリマー、または細胞毒性剤もしくは酵素、または放射性同位体、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物に連結される。
【００４１】
本発明の典型的な方法は、IL-17および/またはIL-23の発現および/または活性の増加または増強を伴うかまたはそれによって起こる、哺乳動物における病的状態または疾患を治療するための方法を含む。本治療方法では、それぞれの受容体結合またはそれらの受容体に対する活性化を優先的に遮断するかまたは減少させる本発明の抗体を投与することができる。任意に、本方法において使用される抗体は、IL-17およびIL-23(p19)の両方の活性を遮断または中和することができ、例えば、IL-17AまたはIL-23の活性を遮断または中和する二重アンタゴニストである。本方法は、単一の二重特異性結合ペプチドもしくは抗体、または2つもしくはそれ以上の抗体(それぞれがIL-17に、またはp19を介してIL-23に特異的に結合する)の組み合わせの使用を意図する。
【００４２】
本発明はまた、IL-17/IL-23抗体を含む組成物も提供する。任意に、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。好ましくは、本組成物は、病的状態または疾患を治療するのに治療的に有効な量で、1つまたは複数のIL-17/IL-23抗体を含む。
【００４３】
したがって、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における炎症または免疫関連疾患の診断および治療に有用な組成物および方法に関する。本発明は、1つのみの中和と比較した、IL-17およびIL-23の両方を中和する相乗効果の同定に基づく。免疫関連疾患は、免疫応答を抑制するかまたは増強することによって治療することができる。免疫応答を増強する抗体は、抗原に対する免疫応答を促進または増強する。免疫応答を促進する抗体は、免疫応答の増強が有益である場合に治療的に用いることができる。または、免疫応答を抑制する抗体は、抗原に対する免疫応答を弱めるかまたは低下させ(例えば、中和抗体)、免疫応答の減弱が有益である場合に(例えば、炎症)、治療的に用いることができる。
【００４４】
したがって、本発明のアンタゴニスト(すなわち、IL-17およびIL-23と個々にまたは共に結合する抗体または結合ペプチド)はまた、例えば、全身性エリテマトーデス、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、中枢神経系および末梢神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチー、またはギラン・バレー症候群など、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン過敏性腸症、自己免疫性眼疾患、癌、腫瘍性疾患、および血管新生を含む免疫関連疾患および炎症性疾患の治療のための薬剤および医薬品の調製にも有用である。
【００４５】
特定の局面において、そのような薬剤および医薬品は、薬学的に許容される担体と共に治療有効量のIL- 17/IL-23抗体を含む。好ましくは、混合物は無菌である。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、IL-17およびp19の両方を候補分子と接触させる段階、ならびにIL-17および/またはIL-23によって媒介される生物活性をモニターする段階を含む、IL-17およびIL-23/p19のアンタゴニスト抗体を同定する方法に関する。別の態様において、本発明は、担体または賦形剤との混合物中に、IL-17およびIL-23の両方と結合するIL-17/IL-23アンタゴニスト抗体を含む組成物に関する。1つの局面において、本組成物は、治療有効量のIL-17/IL-23抗体を含む。本組成物は、(a) それを必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を減少させる、(b) それを必要とする哺乳動物において免疫応答を阻害するもしくは減少させる、(c) それを必要とする哺乳動物において、抗原に応答したTリンパ球の増殖を減少させる、(d) Tリンパ球の活性を阻害する、(e) 血管透過性を減少させる、または(f) IL-17および/もしくIL-23の全身および/もしくは局所濃度を減少させるのに有用である。
【００４７】
別の態様において、本発明は、治療有効量のIL-17/IL-23アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含む、それを必要とする哺乳動物において免疫関連障害を治療する方法に関する。
【００４８】
任意に、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または一本鎖抗体である。別の態様において、本発明は、IL-17およびIL-23の両方に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は標識することができ、固体支持体上に固定化することができる。さらなる局面において、抗体は、抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、または抗イディオタイプ抗体である。
【００４９】
さらに別の態様において、本発明は、IL-17およびIL-23の両方に結合し得る本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００５０】
さらに別の態様において、本発明は、IL-17およびIL-23の両方に結合し得る本発明の単離されたポリペプチドに関する。
【００５１】
さらに別の態様において、本発明は、IL-23/p19(IL-23)のアンタゴニストでT細胞を処理することにより、IL-17の産生および/または維持を阻害する方法に関する。
【００５２】
別の局面において、本発明は、IL-17およびIL-23のアンタゴニストの有効量を哺乳動物対象に投与する段階を含む、哺乳動物対象において、IL-17およびIL-23の発現上昇を特徴とする炎症性疾患を治療する方法に関する。
【００５３】
さらに別の局面において、本発明は、(a) 候補分子の存在下および非存在下において、T細胞の培養物をIL-23と共にインキュベートする段階；(b) 該培養物中のIL-17のレベルをモニターする段階、ならびに(c) IL-17のレベルがそのような候補分子の非存在下よりも存在下において低い場合に、該候補分子が抗炎症薬として同定される段階を含む、抗炎症薬を同定する方法に関する。
【００５４】
抗体の発現に適した条件下で、適切なコード核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階、および細胞培養物から該抗体を回収する段階を含む、これを生産する工程もまた本明細書に記載する。
【００５５】
さらに別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体との混合物中にIL-17/IL-23抗体を含む組成物を提供する。1つの局面において、本組成物は治療有効量の抗体を含む。好ましくは、本組成物は無菌である。本組成物は、長期貯蔵安定性を達成するように保存できる液体薬学的製剤の形態で投与することができる。または、抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、または一本鎖抗体である。
【００５６】
さらなる態様において、本方法は、(a) IL-17/IL-23抗体、またはIL-17およびIL-23(p19を介する)の両方に特異的に結合する抗体を含む組成物；(b) 該組成物を含む容器、ならびに(c) 免疫関連疾患の治療における該IL-17/IL-23抗体の使用に言及する、該容器に貼られたラベルまたは該容器に含まれる添付文書を含む製造品に関する。該組成物は、治療有効量のIL-17/IL-23抗体を含み得る。
【００５７】
さらに別の態様において、本発明は、(a) 哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料中、および(b) 同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料中のIL-17および/またはIL-23のいずれか一方または両方をコードする遺伝子の発現レベルを検出する段階を含み、対照試料と比較して試験試料中の発現レベルが高いことまたは低いことによって、試験組織細胞が得られた哺乳動物において免疫関連疾患が存在することが示される、哺乳動物において免疫関連疾患を診断する方法に関する。
【００５８】
別の態様において、本発明は、(a) IL-17/IL-23抗体を哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料と接触させる段階、ならびに(b) 該抗体と、該試験試料中のIL-17およびIL-23のいずれか一方または両方との間の複合体の形成を検出する段階を含み、該複合体の形成によって免疫疾患の有無が示される、哺乳動物において免疫疾患を診断する方法に関する。検出は定性的または定量的であってよく、同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料において複合体形成をモニターすることと比較して行うことができる。試験試料においてより大量の複合体が形成されることによって、試験組織細胞が得られた哺乳動物における免疫疾患の有無が示される。抗体は検出可能な標識を保有することが好ましい。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光測定法、または当技術分野で公知の他の技術を用いてモニターすることができる。試験試料は、通常、免疫系の欠損または異常を有すると疑われる個体から得られる。
【００５９】
別の態様において、本発明は、哺乳動物から得られた組織細胞の試験試料中のIL-17およびIL-23の両方の有無を検出する段階を含み、該試験試料中のIL-17およびIL-23の両方の有無によって該哺乳動物における免疫関連疾患の存在が示される、哺乳動物において免疫関連疾患を診断する方法を提供する。
【００６０】
なおさらなる態様において、本発明は、IL-17/IL-23p19抗体などのIL-17/IL-23アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含み、それによって該哺乳動物におけるTリンパ球の活性が減少する、哺乳動物においてTリンパ球の活性を減少させる方法を提供する。
【００６１】
なおさらなる態様において、本発明は、(a) IL-17/IL-23p19抗体などのIL-17/IL-23アンタゴニストを哺乳動物に投与する段階を含み、それによって該哺乳動物におけるTリンパ球の増殖が減少する、哺乳動物においてTリンパ球の増殖を減少させる方法を提供する。
【００６２】
本発明はまた、1つまたは複数のIL-17抗体、IL-23抗体、またはIL-17/IL-23抗体を含む製造品およびキットも提供する。
【００６３】
本発明のこれらおよびその他の局面は、以下の詳細な説明を参照することにより明らかになると考えられる。加えて、種々の参考文献が以下で確認されるが、これらは全体として参照により組み入れられる。
【００６４】
B) 定義
以下の説明においては、いくつかの用語が頻繁に用いられる。本発明の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
【００６５】
「抗体」(Ab)および「免疫グロブリン」(Ig)は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンは、抗体、および抗原特異性を欠くその他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、および骨髄腫によって高レベルで産生される。したがって、本明細書で使用する「抗体」または「抗体ペプチド」という用語は、無傷の抗体、または特定の結合に関して無傷の抗体と競合するその結合断片を指し、これにはキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体が含まれる。特定の態様において、結合断片は、組換えDNA技術によって作製される。さらなる態様において、結合断片は、無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって作製される。結合断片には、これらに限定されないが、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv、および一本鎖抗体が含まれる。「天然の抗体および免疫グロブリン」は、通常、同一軽(L)鎖2本および同一重(H)鎖2本からなる、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン(VH)を有し、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン(VL)を有し、もう一方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第1定常ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている(Clothia et al., J. Mol. Biol. 186:651 (1985)；Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 (1985))。
【００６６】
本明細書で使用する「単離された抗体」という用語は、その天然環境の成分から同定され、分離および/または回収された抗体を指す。その天然環境の混入成分は、抗体の診断または治療上の使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい態様において、抗体は、(1) ローリー法により決定して、抗体の95重量%を上回るまで、より好ましくは99重量%を上回るまで、(2) スピニングカップ配列決定装置の使用により、少なくとも15残基のN末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで、または(3) クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を使用して、還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも1つの成分は存在しないであろうという理由から、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチューの抗体も含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製段階によって調製される。
【００６７】
「変種」抗IL-17抗体および抗IL-23抗体、ならびに/またはIL-17/IL-23抗体とは、本明細書において、親抗体配列内の1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、および/または置換によって、「親」抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる分子を指す。好ましい態様において、変種は、親抗体の1つまたは複数の超可変領域において1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、変種は、親抗体の1つまたは複数の超可変領域において、少なくとも1つ、例えば約1〜約10個、好ましくは約2〜約5個の置換を含み得る。通常、変種は、親抗体重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも75%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、最大パーセントの配列同一性を得るために、必要に応じて配列を整列化しギャップを導入した後の、候補配列中の親抗体残基と同一であるアミノ酸残基の割合として定義される。抗体配列へのいかなるN末端、C末端、または内部の伸長、欠失、または挿入も、配列同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されない。変種はヒトIL-17および/またはIL-23(p19を介する)と結合する能力を保持し、好ましくは親抗体の特性よりも優れた特性を有する。例えば、変種は、より強力な結合親和性、IL-17Aおよび/またはIL-23誘導性炎症を阻害する強化された能力を有し得る。そのような特性を解析するには、例えば、変種のFab型を親抗体のFab型と比較するか、または変種の全長型を親抗体の全長型と比較すべきであるが、それは、抗IL-17/IL-23抗体の形態が、本明細書に開示する生物活性アッセイ法においてその活性に影響を及ぼすことが見出されているからである。本明細書において特に対象となる変種抗体は、親抗体と比較した場合に、少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約20倍、最も好ましくは少なくとも約50倍の生物活性の増強を示す変種抗体である。
【００６８】
本明細書で使用する「親抗体」という用語は、変種の調製に用いたアミノ酸配列によってコードされる抗体を指す。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有し、存在するのであればヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体はヒト化抗体またはヒト抗体であってよい。
【００６９】
「アゴニスト」という用語は、別の分子の活性、活性化、または機能を増大させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子(10 kD未満)を含む任意の化合物を指す。
【００７０】
「アンタゴニスト」という用語は、別の分子の活性、活性化、または機能を減少させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子(10 kD未満)を含む任意の化合物を指す。
【００７１】
「リガンドに対する本発明のポリペプチドの結合」という用語は、これらに限定されないが、受容体に対する本発明のリガンドポリペプチドの結合；リガンドに対する本発明の受容体ポリペプチドの結合；抗原またはエピトープに対する本発明の抗体の結合；抗体に対する本発明の抗原またはエピトープの結合；抗イディオタイプ抗体に対する本発明の抗体の結合；リガンドに対する本発明の抗イディオタイプ抗体の結合；受容体に対する本発明の抗イディオタイプ抗体の結合；リガンド、受容体、または抗体に対する本発明の抗抗イディオタイプ抗体の結合等を含む。
【００７２】
特定の態様における「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の「二価抗体」は、同じ抗原特異性を有する結合部位を含むと理解される。
【００７３】
「二重特異性」または「二機能性」抗体とは、2つの異なる重鎖/軽鎖対および2つの異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、これらに限定されないが、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含む種々の方法によって作製することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315-321；Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。
【００７４】
「キメラ抗体」という用語は、典型的に遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域遺伝子および定常領域遺伝子からその軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が構築されている抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントを、γ1およびγ3のようなヒト定常セグメントに連結することができる。したがって、典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体由来の可変ドメインまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体由来の定常ドメインから構成されるが、他の哺乳動物種も用いることができる。具体的には、キメラ抗体は、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、またはその両方のヒンジ領域および定常領域のすべてまたは一部が、別の動物の免疫グロブリン軽鎖または重鎖に由来する対応する領域に対して置換される、組換えDNA技術によって作製される。このようにして、親モノクローナル抗体の抗原結合部分が、別の種の抗体の骨格に移植される。Winter et al.に対するEP 0239400に記載されている1つのアプローチは、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域ドメイン由来の相補性決定領域(CDR)を、マウス可変領域ドメイン由来のCDRで置換するといった、1つの種のCDRの別の種のCDRに対する置換について記載している。これらの改変抗体は、その後ヒト免疫グロブリン定常領域と組み合わせて、抗原に特異的なマウスCDRが置換されている以外はヒトである抗体を形成することができる。抗体のCDR領域を移植する方法は、例えば、Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327、およびVerhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536に見出すことができる。
【００７５】
本明細書で使用する「有効中和力価」という用語は、動物(ヒトまたはコットンラット)の血清中に存在する、臨床上有効であること(ヒトにおいて)、または例えばコットンラットにおいてウイルスを99%減少させることが示されている量に対応する抗体の量を指す。99%の減少は、RSVの、例えば103 pfu、104 pfu、105 pfu、106 pfu、107 pfu、108 pfu、または109 pfu)といった特定の投与によって規定される。
【００７６】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、モノクローナル抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。したがって、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的活性表面基からなり、通常は、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。より具体的には、本明細書で使用する「IL-17エピトープ」、「IL-23エピトープ」、および/または「IL-23/p19エピトープ」という用語は、動物において、好ましくは哺乳動物において、最も好ましくはマウスまたはヒトにおいて、抗原活性または免疫原活性を有する対応するポリペプチドの部分を指す。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するIL-17および/またはIL-23/p19ポリペプチドの部分である。抗原活性を有するエピトープは、例えば免疫測定法によるなど、当技術分野において周知の任意の方法によって決定した場合に、抗体が免疫特異的に結合するIL-17および/またはIL-23/p19ポリペプチドの部分である。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。このようなエピトープは天然において直線状であってよく、または非連続的なエピトープであってよい。したがって、本明細書で使用する「立体構造エピトープ」という用語は、一連の切れ目のないアミノ酸以外の、抗原のアミノ酸間の空間的関係によって形成される非連続的なエピトープを指す。
【００７７】
本明細書で使用する場合の「エピトープでタグ化された」という用語は、「エピトープタグ」に融合された抗IL-17抗体および/または抗IL-23/p19抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、それに対して抗体が生じ得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、本発明の抗体の活性を妨げないほど十分に短い。エピトープタグは、好ましくは、それに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分に特有である。適切なタグポリペプチドは、一般的に少なくとも6個のアミノ酸残基、通常は約8〜50個のアミノ酸残基(好ましくは約9〜30残基)を有する。例としては、flu HAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5(Field et al. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988))；c-mycタグ、ならびにそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7、および9E10抗体(Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616(1985))；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグおよびその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553(1990))が含まれる。特定の態様において、エピトープタグは「サルベージ受容体結合エピトープ」である。本明細書で使用する「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、IgG分子のインビボ血清半減期の延長に関与するIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4)のFc領域のエピトープを指す。
【００７８】
本明細書で使用する「断片」という用語は、IL-17もしくはIL-23/p19ポリペプチド、またはIL-17もしくはIL-23ポリペプチド(p19を介する)のいずれか一方またはIL-17およびIL-23/p19ポリペプチドの両方に免疫特異的に結合する抗体の少なくとも5個の連続したアミノ酸残基、少なくとも10個の連続したアミノ酸残基、少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、少なくとも20個の連続したアミノ酸残基、少なくとも25個の連続したアミノ酸残基、少なくとも40個の連続したアミノ酸残基、少なくとも50個の連続したアミノ酸残基、少なくとも60個の連続したアミノ酸残基、少なくとも70個の連続したアミノ酸残基、少なくとも80個の連続したアミノ酸残基、少なくとも90個の連続したアミノ酸残基、少なくとも100個の連続したアミノ酸残基、少なくとも125個の連続したアミノ酸残基、少なくとも150個の連続したアミノ酸残基、少なくとも175個の連続したアミノ酸残基、少なくとも200個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも250個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００７９】
本明細書で使用する「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。免疫グロブリンの1つの形態は、抗体の基礎構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の2つの同じ対からなり、各対は軽鎖1本および重鎖1本を有する。各対において、軽鎖および重鎖可変領域は共に抗原に対する結合に関与し、定常領域は抗体エフェクター機能に関与する。
【００８０】
全長免疫グロブリン「軽鎖」(約25 Kdまたは約214アミノ酸)は、NH2末端(約110アミノ酸)が可変領域遺伝子によって、COOH末端がκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」(約50 Kdまたは446アミノ酸)も同様に、可変領域遺伝子(約116アミノ酸)およびその他の上記の定常領域遺伝子の1つ(約330アミノ酸)によってコードされる。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、抗体アイソタイプをそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEと規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域と定常領域は約12またはそれ以上のアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖はまた約10アミノ酸より大きいアミノ酸の「D」領域も含む。(一般的に、Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7(すべての目的のために全体として参照により組み入れられる)を参照されたい)。
【００８１】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、3つの超可変領域によって分断された「フレームワーク」領域からなる。したがって、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」(すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、および89〜97(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基31〜35(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))由来のアミノ酸残基、および/または「超可変ループ」(すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、および91〜96(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)；Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917)(いずれも参照により本明細書に組み入れられる)由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基とは、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。したがって、「ヒトフレームワーク領域」とは、天然ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一である(約85%またはそれ以上、通常90〜95%またはそれ以上)フレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち成分軽鎖および重鎖の組み合わされたフレーム領域は、CDRを位置づけ、整列させるのに役立つ。CDRは主に、抗原のエピトープに対する結合に関与する。
【００８２】
したがって、「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト(通常マウスまたはラット)免疫グロブリン由来の1つまたは複数のCDRを含む免疫グロブリンを指す。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約85〜90%、好ましくは約95%またはそれ以上同一でなければならない。したがって、おそらくはCDRを除いたヒト化免疫グロブリンの部分はすべて、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、キメラ抗体の可変領域は全体が非ヒトであるため、ヒト化抗体は上記で定義した典型的なキメラ抗体を包含しない。
【００８３】
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または例えば米国特許第5,939,598号においてKucherlapati et al.によって記載されるように、1つもしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００８４】
「遺伝子改変された抗体」という用語は、アミノ酸配列が天然抗体のものと異なる抗体を意味する。抗体の作製における組換えDNA技術の関連性のため、当業者は天然抗体に見出されるアミノ酸の配列に限定される必要はなく、抗体は所望の特性を得るために再設計することができる。考えられる変化は多数あり、わずかに1個または数個のアミノ酸の変化から、例えば可変領域または定常領域の完全な再設計に及ぶ。一般に、定常領域における変化は、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能といった特徴を改善しまたは変化させるために行われる。可変領域における変化は、抗原結合特徴を改善するために行われる。
【００８５】
抗体に加えて、免疫グロブリンも、例えば、一本鎖またはFv、Fab、および(Fab')2、ならびにダイアボディ、直鎖状抗体、多価または多重特異性ハイブリッド抗体(上記、およびLanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)に詳述される)を含む様々な他の形態で、ならびに一本鎖で(例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)、およびBird et al., Science, 242, 423-426 (1988)、これらは参照により本明細書に組み入れられる)で存在し得る。(一般的には、参照により本明細書に組み入れられる、Hood et al., 「Immunology」, Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984)、およびHunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)を参照されたい)。
【００８６】
本明細書で使用する「一本鎖Fv」、「一本鎖抗体」、「Fv」、または「scFv」とは、単一ポリペプチド鎖内で、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く抗体断片を指す。一般的に、一本鎖抗体は、VHドメインとVLドメインの間に、抗原結合を可能にする所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)によって詳細に考察されている。米国特許第4,694,778号および同第5,260,203号；WO 88/01649；Bird (1988) Science 242:423-442；Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Ward et al. (1989) Nature 334:54454；Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041に記載されている方法を含む、一本鎖抗体を作製する様々な方法が公知であり、これらの開示はすべての目的のために参照により組み入れられる。特定の態様において、一本鎖抗体はまた、二重特異性および/またはヒト化抗体であってもよい。
【００８７】
「Fab断片」は、1つの軽鎖、ならびに1つの重鎖のCH1および可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００８８】
「Fab'断片」は、1つの軽鎖、およびCH1ドメインとCH2ドメインの間のより多くの定常領域を含む1つの重鎖を含み、2つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されて、F(ab')2分子が形成され得る。
【００８９】
「F(ab')2断片」は、2つの軽鎖、およびCH1ドメインとCH2ドメインの間の定常領域の一部を含む2つの重鎖を含み、2つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されている。
【００９０】
「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)内に軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同一鎖上の2つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成するようになり、2つの抗原結合部位が作成される。ダイアボディは、例えば、EP 404,097；WO 93/11161；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)において詳述されている。
【００９１】
「直鎖状抗体」という用語は、Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載されている抗体を指す。簡潔に説明すると、これらの抗体は、1対の抗原結合領域を形成する、1対の直列Fdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であってよい。
【００９２】
本明細書で使用する「免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片」という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の少なくとも可変ドメインを含むポリペプチド断片を指す。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片は、リガンドに結合すること、リガンドのその受容体への結合を妨げること、受容体に対するリガンド結合によって起こる生物学的応答を妨げること、またはそれらの任意の組み合わせを行うことができる。好ましくは、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片は、IL-17もしくはIL-23/p19のいずれか一方、またはIL-17およびIL-23/p19の両方に特異的に結合する。
【００９３】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により作製された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指すものであり、それを作製する方法を指すものではない。
【００９４】
本明細書において使用する「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により作製された断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより作製された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド(DNAおよびRNAなど)、もしくは天然ヌクレオチドの類似体(例えば、天然ヌクレオチドのα-鏡像異性体)、または両者の組み合わせである単量体から構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分に、および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による1つもしくは複数のヒドロキシル基の置換が含まれ、または糖はエーテルもしくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的および電子的に類似の構造体と置換され得る。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、またはそのような結合の類似結合によって連結され得る。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)、ホスホロジセレノエート(phosphorodiselenoate)、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホラニリデート(phosphoranilidate)、ホスホロアミダート等が含まれる。「核酸分子」という用語には、ポリアミド骨格に結合した天然または修飾核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」もまた含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい。
【００９５】
「核酸分子の相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比較して逆方向の相補的ヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。例えば、配列5' ATGCACGGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'と相補的である
【００９６】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して1つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【００９７】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、その後そのmRNAが特定のポリペプチドに特有であるアミノ酸配列に翻訳される核酸分子を指す。
【００９８】
「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNA中に組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された増殖因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれていない化学合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【００９９】
「核酸分子構築物」とは、天然には存在しない配置で組み合わせかつ並置された核酸のセグメントを含むように人の介入により修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【０１００】
「線状DNA」は、遊離の5'および3'末端を有する非環状DNA分子を意味する。線状DNAは、酵素消化または物理的破壊により、プラスミドなどの閉環状DNA分子から調製され得る。
【０１０１】
「相補的DNA(cDNA)」とは、逆転写酵素によってmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的に、mRNAの一部と相補的なプライマーが、逆転写の開始に用いられる。当業者はまた、このような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を指して、「cDNA」という用語を使用する。「cDNA」という用語はまた、RNA鋳型から合成されたcDNA分子のクローンも意味する。
【０１０２】
「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、共通ヌクレオチド配列によって特徴づけられる場合が多い。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993))、サイクリックAMP応答エレメント(CRE)、血清応答エレメント(SRE；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990))、グルココルチコイド応答エレメント(GRE)、ならびにCRE/ATF(O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992))、AP2(Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994))、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB；Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993))、およびオクタマー因子などの他の転写因子の結合部位が含まれる(一般的には、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)を参照されたい)。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質に応じて増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質による調節を受けない。抑制性プロモーターもまた公知である。
【０１０３】
「コアプロモーター」は、TATAボックスおよび転写開始点を含む、プロモーターの機能に不可欠なヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し得るかまたは組織特異的活性を付与し得る特定の配列の非存在下で、検出可能な活性を有する場合もあれば有さない場合もある。
【０１０４】
「調節エレメント」とは、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織、または細胞小器官において独占的にまたは優先的に転写を可能にする細胞因子と結合する核酸配列を含み得る。このような種類の調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」様式で発現する遺伝子に付随している。
【０１０５】
「エンハンサー」とは、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写効率を増大し得る調節エレメントの一種である。
【０１０６】
「異種DNA」とは、所与の宿主細胞内に天然では存在しないDNA分子またはDNA分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA(すなわち、外因性DNA)と結合している限り、宿主細胞種に由来するDNA(すなわち、内因性DNA)を含み得る。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNAセグメントに機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であると見なされる。逆に、異種DNA分子は、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性遺伝子を含み得る。別の例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠く変異細胞に導入される場合、異種DNAと見なされる。
【０１０７】
「ポリペプチド」とは、天然で産生されようと合成で産生されようと、ペプチド結合で連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と称される。
【０１０８】
「タンパク質」とは、1本または複数本のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、糖質基などの非ペプチド成分を含み得る。糖質およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加され得、これは細胞の種類によって異なる。タンパク質は、本明細書ではそのアミノ酸骨格構造の観点から定義され、糖質基などの置換基は一般に規定しないが、それにもかかわらず存在する場合がある。
【０１０９】
非宿主DNA分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【０１１０】
「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは、典型的に、ベクターの必須の生物学的機能を失うことのない確定した様式で核酸分子の挿入を可能とする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択での使用に適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子には、典型的に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が含まれる。
【０１１１】
「発現ベクター」とは、宿主細胞において発現させる遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常プロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子はプロモーターに「機能的に連結された」と称される。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、機能的に連結されている。
【０１１２】
「組換え宿主」とは、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。本発明の状況において、組換え宿主の一例は、発現ベクターから本発明のアンタゴニストを産生する細胞である。対照的に、そのようなアンタゴニストは、該アンタゴニストの「天然供給源」であり、発現ベクターを欠く細胞によって産生され得る。
【０１１３】
「組込み形質転換体」とは、異種DNAが細胞のゲノムDNA中に組み込まれた組換え宿主細胞である。
【０１１４】
「融合タンパク質」とは、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば融合タンパク質は、親和性基質と結合するポリペプチドと融合されたIL-17RAポリペプチドの少なくとも一部を含み得る。このような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより大量のIL-17RAを単離するための手段を提供する。
【０１１５】
「受容体」という用語は、「リガンド」と称する生物活性分子に結合する細胞会合型タンパク質を意味する。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を媒介する。受容体は、膜結合型受容体、細胞質受容体、または核内受容体であってよく；単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、βアドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体、およびIL-6受容体)であってよい。膜結合型受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、および典型的にシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含む多ドメイン構造を特徴とする。特定の膜結合型受容体では、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を構成する別個のポリペプチド内に位置する。
【０１１６】
一般に、リガンドが受容体に結合することで受容体の高次構造が変化し、これによって細胞内でエフェクタードメインと他の分子との間で相互作用が起こり、次いで細胞の代謝変化が生じる。受容体-リガンド相互作用と結びつけられることの多い代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。
【０１１７】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を介してより大きな該ポリペプチドを方向づけるペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を意味する。より大きなポリペプチドは、通常、分泌経路を介した移行過程において切断されて、分泌ペプチドが除去される。
【０１１８】
「単離されたポリペプチド」とは、天然状態でポリペプチドと会合している糖質、脂質、またはその他のタンパク質性不純物などの混入細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的に、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態の、すなわち少なくとも約80%純粋、少なくとも約90%純粋、少なくとも約95%純粋、95%を超えて純粋、例えば96%、97%、または98%もしくはそれ以上純粋、または99%を超えて純粋なポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクマシーブリリアントブルー染色後の、単一バンドの出現による。しかしながら「単離された」という用語は、二量体または他の様式でグリコシル化もしくは誘導体化された形態など、別の物理的形態での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【０１１９】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、本明細書において、ポリペプチド内の位置を示すために用いられる。その状況が可能である場合、これらの用語は、近接性または相対位置を示すためにポリペプチドの特定の配列または部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するとは限らない。
【０１２０】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAから1つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。
【０１２１】
本明細書で使用する「免疫調節物質」という用語には、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、共刺激分子、造血因子等、およびこれらの分子の合成類似体が含まれる。
【０１２２】
「相補体/抗相補体対」という用語は、適切な条件下において非共有結合された安定した対を形成する非同一な部分を意味する。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補体/抗相補体対の典型的なメンバーである。その他の例示的な相補体/抗相補体対には、受容体/リガンド対、抗体/抗原(またはハプテンもしくはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対等が含まれる。相補体/抗相補体対が後に解離されることを所望する場合には、相補体/抗相補体対は109 M-1未満の結合親和性を有することが好ましい。
【０１２３】
本明細書で使用する「治療薬」とは、抗体部分と結合されて治療に有用な複合体を生じる分子または原子である。治療薬の例には、薬物、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体が含まれる
【０１２４】
「検出可能な標識」とは、抗体部分と結合されて診断に有用な分子を生じ得る分子または原子である。検出可能な標識の例には、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、またはその他のマーカー部分が含まれる。
【０１２５】
「親和性タグ」という用語は、本明細書において、第2ポリペプチドの精製もしくは検出を提供するか、または基材に対して第2ポリペプチドを付着させるための部位を提供する目的で、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために用いられる。原理上は、抗体またはその他の特異的な結合剤が用いることができる任意のペプチドまたはタンパク質を、親和性タグとして用いることができる。親和性タグには、ポリヒスチジン区域、プロテインA(Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985)；Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991))、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988))、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985))、サブスタンスP、FLAGペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。一般的には、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)を参照されたい。親和性タグをコードするDNA分子は、市販業者(例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から入手することができる。
【０１２６】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」とは、少なくとも1つのエピトープを含み、かつ腫瘍細胞または感染性病原体抗原を保有する細胞などの標的細胞上に発現するアミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対する主要組織適合遺伝子複合体分子によって提示されるペプチドエピトープを認識し、典型的に標的細胞を溶解するかまたは標的細胞の部位に他の免疫細胞を動員し、それにより標的細胞を死滅させる。
【０１２７】
真核生物では、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生させる。RNA転写産物が特定のmRNAの配列と相補的な配列を有するRNAポリメラーゼII鋳型を含むように、核酸分子を設計することができる。このようなRNA転写産物は「アンチセンスRNA」と称され、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と称される。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子に結合し、その結果mRNAの翻訳を阻害することができる。
【０１２８】
「IL-17AまたはIL-23に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、(a) IL-17AまたはIL-23遺伝子の一部と安定した三重鎖を形成し得る、または(b) IL-17AまたはIL-23遺伝子のmRNA転写産物の一部と安定した二重鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１２９】
「リボザイム」とは、触媒中心を含む核酸分子である。この用語には、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己切断RNA、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子が含まれる。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と称される。
【０１３０】
「外部ガイド配列」とは、内因性リボザイムであるRNアーゼPを特定の細胞内mRNA種に導くことで、RNアーゼPによるmRNAの切断をもたらす核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は、「外部ガイド配列遺伝子」と称される。
【０１３１】
「対立遺伝子変種」という用語は、本明細書において、同じ染色体座を占める遺伝子の2つまたはそれ以上の別の形態のいずれかを示すために用いられる。対立遺伝子の変化は変異によって自然に生じ、集団内で表現型多型を生じ得る。遺伝子変異はサイレントである(コードされるポリペプチドに変化がない)場合もあれば、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。対立遺伝子変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変種によってコードされるタンパク質を示すために用いられる。
【０１３２】
「オーソログ」という用語は、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オーソログ間の配列の差は、種分化の結果である。
【０１３３】
「パラログ」とは、生物によって作製される、異なるが構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子重複によって生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、およびミオグロビンは互いにパラログである。
【０１３４】
標準的な解析法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは概数値であると理解される。このような値が「約」Xまたは「およそ」Xと表記される場合、Xの記載値は±10%で正確であると理解される。
【０１３５】
C) IL-17およびIL-23(p19を介する)と結合する抗体
本発明の抗体は、IL-17およびIL-23(p19を介する)に特異的に結合する。いくつかの態様において、本発明の抗体は、単量体型のIL-17およびIL-23の両方と特異的に結合する。いくつかの態様において、本発明の抗体は、ホモ二量体型のIL-17またはIL-23のいずれか一方と結合する。さらに他の態様において、本発明の抗体は、多量体型のIL-17またはIL-23(例えば、ヘテロ二量体型)と特異的に結合する。例えば、IL-17は、IL-17B、IL-17C、またはIL-17FなどのIL-17ファミリーのリガンドの任意の他のメンバーとヘテロ二量体を形成し得る。本発明の好ましい抗体は、IL-17およびIL-23の生物活性を個々にまたは共に遮断する。
【０１３６】
好ましい抗体および本発明の方法における使用に適した抗体には、例えば、完全ヒト抗体、ヒト抗体相同体、ヒト化抗体相同体、キメラ抗体相同体、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、およびF(v)抗体断片、一本鎖抗体、ならびに抗体重鎖もしくは軽鎖の単量体もしくは二量体、またはこれらの混合物が含まれる。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１３７】
本発明の抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(およびそれらのサブタイプ)を含む任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリンを含む。抗体は、好ましくは無傷のIgGを含み、より好ましくはIgG1を含む。免疫グロブリンの軽鎖は、κまたはλであってよい。軽鎖は好ましくはκである。
【０１３８】
本発明の抗体は、例えば、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、F(v)断片、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、重鎖1本および軽鎖1本からなる二量体等、抗原結合特異性を保持する無傷の抗体の一部を含むか、または一部からなる。したがって、上記の抗体に由来する抗原結合断片、および全長二量体または三量体ポリペプチドは、それ自体有用である。
【０１３９】
ヒト治療薬としてのげっ歯類モノクローナル抗体(MAb)の直接的な使用が、げっ歯類由来抗体で処置した患者のかなりの数で生じたヒト抗げっ歯類抗体(「HARA」)(例えば、ヒト抗マウス抗体(「HAMA」))応答を引き起こした(Khazaeli, et al., (1994) Immunother. 15:42-52)。より少ないマウスアミノ酸配列を含むキメラ抗体は、ヒトにおいて免疫応答を誘発するという問題を回避すると考えられている。
【０１４０】
HARA応答の問題を回避するための抗体の改良によって、「ヒト化抗体」の開発に至った。ヒト化抗体は組換えDNA技術によって作製され、抗原結合に必要でないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸の少なくとも1つが、非ヒト哺乳動物免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸に対して置換されている。例えば、免疫グロブリンがマウスモノクローナル抗体である場合、抗原結合に必要でない少なくとも1つのアミノ酸を、対応するヒト抗体のその位置に存在するアミノ酸を使用して置換する。いかなる特定の操作理論により束縛されることも望まないが、モノクローナル抗体の「ヒト化」は外来免疫グロブリン分子に対するヒトの免疫学的反応性を阻害すると考えられる。
【０１４１】
非限定的な例として、相補性決定領域(CDR)移植を実施する方法は、標的抗原(例えば、IL-17および/またはIL-23/p19)に結合する関心対象の抗体のマウス重鎖および軽鎖の配列を決定する段階、CDRのDNA配列を遺伝子操作する段階、および部位特異的突然変異誘発により対応するヒトV領域にこれらのアミノ酸配列を付与する段階によって行うことができる。所望のアイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメントが付加され、「ヒト化」重鎖および軽鎖遺伝子が哺乳動物細胞において共発現されて、可溶性ヒト化抗体を産生する。典型的な発現細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。キメラ抗体を作製する適切な方法は、例えば、Jones et al. (1986) Nature 321:522-525；Riechmann (1988) Nature 332:323-327; Queen et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029；およびOrlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833に見出すことができる。
【０１４２】
Queen et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029-10033およびWO 90/07861は、ヒト化抗体の調製について記載している。ヒトおよびマウスの可変フレームワーク領域が、最適なタンパク質配列相同性のために選択された。マウス可変領域の三次構造をコンピュータでモデル化し、相同なヒトフレームワーク上に重ねて、アミノ酸残基とマウスCDRとの最適な相互作用を示した。これは、抗原に対する結合親和性(CDR移植されたキメラ抗体を作製する上で典型的に減少する)が改善された抗体の開発につながった。ヒト化抗体を作製するための別のアプローチが当技術分野で公知であり、例えば、Tempest (1991) Biotechnology 9:266-271に記載されている。
【０１４３】
本発明の抗体は、単独で、または細胞毒性剤との免疫複合体として用いることができる。いくつかの態様において、細胞毒性剤は化学療法薬である。いくつかの態様において、細胞毒性剤は、これらに限定されないが、鉛-212、ビスマス-212、アスタチン-211、ヨウ素-131、スカンジウム-47、レニウム-186、レニウム-188、イットリウム-90、ヨウ素-123、ヨウ素-125、臭素-77、インジウム-111、およびホウ素-10またはアクチニドなどの核分裂性核種を含む放射性同位体である。他の態様において、細胞毒性剤は、これらに限定されないが、リシン、改変シュードモナスエンテロトキシンA、カリケアマイシン、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル等を含む毒素または細胞毒性薬である。このような細胞毒性剤に抗体および抗体断片を結合させる方法は、文献において公知である。
【０１４４】
本発明の抗体は、例えば、共有結合が抗体のそのエピトープに対する結合の妨げにならないような、抗体への任意の種類の分子の共有結合によって改変された誘導体を含む。適切な誘導体の例には、これらに限定されないが、フコシル化抗体および断片、グリコシル化抗体および断片、アセチル化抗体および断片、ペグ化抗体および断片、リン酸化抗体および断片、ならびにアミド化抗体および断片が含まれる。本発明の抗体およびそれらの誘導体は、公知の保護/封鎖基、タンパク質分解切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質への結合等によってそれら自体が誘導体化され得る。本発明のいくつかの態様において、抗体の少なくとも1つの重鎖はフコシル化されている。いくつかの態様において、フコシル化はN結合型である。いくつかの好ましい態様において、抗体の少なくとも1つの重鎖は、フコシル化N結合型オリゴ糖を含む。
【０１４５】
本発明の抗体は、本発明の抗体の生物学的特性(例えば、IL-17および/またはIL-23のそれらそれぞれの受容体に対する結合を遮断する、IL-17およびIL-23の生物活性を遮断する、結合親和性)を保持する、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変種を含む。当業者は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変種を作製することができる。これらの変種には、とりわけ、(a) 1つまたは複数のアミノ酸残基が、保存的または非保存的アミノ酸と置換された変種、(b) 1つまたは複数のアミノ酸がポリペプチドに付加されるか、またはポリペプチドから欠失された変種、(c) 1つまたは複数のアミノ酸が置換基を含む変種、および(d) ポリペプチドが、例えば、抗体のエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分等といった、ポリペプチドに有用な特性を付与し得る、融合パートナー、タンパク質タグ、またはその他の化学的部分などの別のペプチドまたはポリペプチドと融合された変種が含まれ得る。本発明の抗体は、1つの種に由来するアミノ酸残基が、保存的位置または非保存位置のいずれかにおいて、別の種の対応する残基に対して置換された変種を含み得る。別の態様において、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的または非保存的残基と置換される。遺伝的(抑制、欠失、突然変異等)、化学的、および酵素的技術を含む、これらの変種を得るための技術は、当業者に公知である。本発明の抗体は抗体断片も含む。「断片」とは、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、および少なくとも約100アミノ酸長であり、かつ、例えば、IL-17および/またはIL-23のそれらそれぞれの受容体に対する結合を遮断する能力、IL-17およびIL-23の生物活性を遮断する能力、ならびに結合親和性に影響を及ぼす能力など、全長配列の一部の生物活性または免疫学的活性を保持するポリペプチド配列を指す。
【０１４６】
本発明はまた、卵巣癌、乳癌、腎癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮内膜癌、または脳腫瘍患者の末梢血単核細胞に由来するような完全ヒト抗体も包含する。そのような細胞は骨髄腫細胞と融合して、例えば、IL-17およびIL-23/p19の両方に対する完全ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成することができる。
【０１４７】
本発明はまた、IL-17およびIL-23(p19を介する)の両方に結合する二重特異性抗体も包含する。
【０１４８】
IL-17AおよびIL-23p19に結合する抗体は、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。ファージディスプレイによるスクリーニング方法は、Babas, Phage Display: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab Press, 2001、およびLo, Benny K.C., A., Antibody Engineering, 2004などの標準的な参考教科書に詳述されている。そのようなファージディスプレイライブラリーを用いて、相補的な結合実体を機能的に単離できるように、細胞または他の物質の表面上に発現タンパク質を提示させることができる。1つのそのようなファージディスプレイライブラリーでは、抗体軽鎖可変領域および重鎖可変領域の一部をヒト抗体配列をコードする合成DNAと組み合わせ、次にこれをFab抗体断片としてファージおよびファージミドライブラリー上に提示させる(Dyax(登録商標)ヒト抗体ライブラリー、Dyax Corp.、マサチューセッツ州、ケンブリッジ)。したがって、抗体の可変軽鎖断片および重鎖断片をFab形態で単離することができる。次に、これらの可変領域を操作して、IL-17AまたはIL-23p19に対するscFv、二重特異性scFv、および多重特異性多機能性アンタゴニストのような、抗原結合断片を含む抗体を作製することができる。
【０１４９】
この技術を用いて、本明細書の実施例15〜18に記載されるプレートベースのアッセイ法において、Fabの可変領域が、IL-17AまたはIL-23p19のいずれか一方を結合する、およびまたは中和するそれらの特徴について同定された。これらの可変領域を操作して、IL-17AまたはIL-23p19を結合するおよび/または中和するscFvを含む種々の結合実体を作製した。
【０１５０】
以下の表1は、IL-17Aと結合するFabまたはscFvの一覧を示す。
【０１５１】
（表１）
2009540018.tif 000002
2009540018.tif 000003
2009540018.tif 000004
2009540018.tif 000005
2009540018.tif 000006
2009540018.tif 000007
【０１５２】
以下の表2は、IL-23p19と結合するFabまたはscFvの一覧を示す。
【０１５３】
（表２）
2009540018.tif 000008
2009540018.tif 000009
2009540018.tif 000010
2009540018.tif 000011
2009540018.tif 000012
2009540018.tif 000013
2009540018.tif 000014
2009540018.tif 000015
2009540018.tif 000016
2009540018.tif 000017
2009540018.tif 000018
2009540018.tif 000019
2009540018.tif 000020
【０１５４】
（表３）細胞ベースのアッセイ法におけるクラスター番号とクローンの関係
2009540018.tif 000021
【０１５５】
IL-17AまたはIL-23p19と結合するscFv実体は、軽鎖可変領域を重鎖可変領域のアミノ末端側またはそのカルボキシル末端側にして配置することができる。加えて、各標的、すなわちIL-17AおよびIL-23p19にそのそれぞれの可変領域が結合できるように、直列scFvをいくつかの配置で調製することもできる。したがって、可変領域が標的と結合できる限り、1つの抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域が他の抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と分散し得るように、直列scFV分子の構築物を調製することができる。両標的と結合する直列scFv分子は、一連のグリシンおよびセリン残基を含むGly- Serリンカーを含む、scFv実体間のリンカーを用いて調製することができ、またさらなるアミノ酸も含み得る。クラスター番号c103およびc87の可変領域を有する直列二重特異性scFv分子は、本明細書の実施例5に記載されるアッセイ法においてIC50(nM) 4.3を示した。
【０１５６】
本発明の抗体およびそれらの誘導体は、1×10-2未満の解離定数(Kd)を含む結合親和性を有する。いくつかの態様において、Kdは1×10-3未満である。他の態様において、Kdは1×10-4未満である。いくつかの態様において、Kdは1×10-5未満である。さらなる他の態様において、Kdは1×10-6未満である。他の態様において、Kdは1×10-7未満である。他の態様において、Kdは1×10-8未満である。他の態様において、Kdは1×10-9未満である。他の態様において、Kdは1×10-10未満である。さらなる他の態様において、Kdは1×10-11未満である。いくつかの態様において、Kdは1×10-12未満である。他の態様において、Kdは1×10-13未満である。他の態様において、Kdは1×10-14未満である。さらなる他の態様において、Kdは1×10-15未満である。
【０１５７】
本明細書において単離され記載される抗IL-17A抗体および抗IL23p19抗体は、抗IL-17AについてはSEQ ID NO: 31〜77および抗IL-23p19についてはSEQ ID NO: 326〜491に示される共通CDRのファミリーに分類された。以下の表4は、SEQ ID NOと抗IL-17A共通CDRの関係を示す。
【０１５８】
（表４）
2009540018.tif 000022
【０１５９】
以下の表5は、SEQ ID NOと抗IL-23p19共通CDRの関係を示す。
【０１６０】
（表５）
2009540018.tif 000023
【０１６１】
したがって、本発明は、IL-17A(SEQ ID NO:2)を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
i) 以下からなる群より選択される、軽鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 31；
2) SEQ ID NO: 38；
3) SEQ ID NO: 44；
4) SEQ ID NO: 51；
5) SEQ ID NO: 62；および
6) SEQ ID NO: 68；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 32；
2) SEQ ID NO: 39；
3) SEQ ID NO: 45；
4) SEQ ID NO:52；
5) SEQ ID NO: 63；および
6) SEQ ID NO: 69；ならびに
iii) 以下からなる群より選択される、軽鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 33；
2) SEQ ID NO: 40；
3) SEQ ID NO: 46；
4) SEQ ID NO: 53；
5) SEQ ID NO: 64；および
6) SEQ ID NO: 70；
を含む軽鎖可変領域、ならびに
b)i) 以下からなる群より選択される、重鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 34；
2) SEQ ID NO: 41；
3) SEQ ID NO: 47；
4) SEQ ID NO: 54；
5) SEQ ID NO: 65；および
6) SEQ ID NO: 71；ならびに
ii) 以下からなる群より選択される、重鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 35；
2) SEQ ID NO: 42；
3) SEQ ID NO: 48；
4) SEQ ID NO: 55；
5) SEQ ID NO: 66；および
6) SEQ ID NO: 72；ならびに
iii) 以下からなる群より選択される、重鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 36〜37；
2) SEQ ID NO: 43；
3) SEQ ID NO: 49〜50；
4) SEQ ID NO: 56〜61：
5) SEQ ID NO: 67；および
6) SEQ ID NO: 37、57、および73〜77；
を含む重鎖可変領域
を含む抗体を提供する。1つの態様において、抗体は抗体断片である。別の態様において、抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択される。別の態様において、抗体は二重特異性分子である。別の態様において、抗体はまたIL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する。
【０１６２】
本発明は、SEQ ID NO:2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、以下からなる群より選択される抗体を提供する：
a) SEQ ID NO: 31の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 32の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 33の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:34の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 35の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 36〜37から選択される、抗体；
b) SEQ ID NO: 38の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 39の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 40の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 41の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 42の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 43である、抗体
c) SEQ ID NO: 44の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 45の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:46の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 47の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 48の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 49〜50から選択される、抗体
d) SEQ ID NO: 51の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 52の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 53の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 54の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 55の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 56〜61から選択される、抗体
e) SEQ ID NO: 62の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 63の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 64の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 65の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 66の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 67である、抗体および
f) SEQ ID NO: 68の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 69の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 70の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:71の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 72の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 37、57、または73〜77から選択される抗体。
【０１６３】
本発明は、IL-23(SEQ ID NO:4)を含むポリペプチドと結合する抗体であって、
i) 以下からなる群より選択される、軽鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 326；
2) SEQ ID NO: 341；
3) SEQ ID NO: 353；
4) SEQ ID NO: 365；
5) SEQ ID NO: 373：
6) SEQ ID NO: 405；
7) SEQ ID NO: 412；
8) SEQ ID NO: 421；
9) SEQ ID NO: 430；
10) SEQ ID NO: 451；
11) SEQ ID NO: 459；
12) SEQ ID NO: 467；および
13) SEQ ID NO: 476；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、軽鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 327；
2) SEQ ID NO: 342；
3) SEQ ID NO: 354；
4) SEQ ID NO: 366；
5) SEQ ID NO: 374；
6) SEQ ID NO: 406；
7) SEQ ID NO: 413；
8) SEQ ID NO: 422；
9) SEQ ID NO: 431；
10) SEQ ID NO: 452；
11) SEQ ID NO: 460；
12) SEQ ID NO: 468；および
13) SEQ ID NO: 477；ならびに
iii) 以下からなる群より選択される、軽鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 328；
2) SEQ ID NO: 343；
3) SEQ ID NO: 355；
4) SEQ ID NO: 367；
5) SEQ ID NO: 375；
6) SEQ ID NO: 407；
7) SEQ ID NO: 414；
8) SEQ ID NO: 423；
9) SEQ ID NO: 432；
10) SEQ ID NO: 453；
11) SEQ ID NO: 461；
12) SEQ ID NO: 469；
13) SEQ ID NO: 478；ならびに
b)i)以下からなる群より選択される、重鎖CDR1：
1) SEQ ID NO: 329；
2) SEQ ID NO: 344；
3) SEQ ID NO: 356；
5) SEQ ID NO: 368；
5) SEQ ID NO: 376； 
6) SEQ ID NO: 408；
7) SEQ ID NO: 415；
8) SEQ ID NO: 424；
9) SEQ ID NO: 433；
10) SEQ ID NO: 453；
11) SEQ ID NO: 462；
12) SEQ ID NO: 470；および
13) SEQ ID NO: 479；ならびに
ii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR2：
1) SEQ ID NO: 330；
2) SEQ ID NO: 345；
3) SEQ ID NO: 357；
4) SEQ ID NO: 369；
5) SEQ ID NO: 377；
6) SEQ ID NO: 409；
7) SEQ ID NO: 416；
8) SEQ ID NO: 425；
9) SEQ ID NO: 434；
10) SEQ ID NO: 455；
11) SEQ ID NO: 463；
12) SEQ ID NO: 471；および
13) SEQ ID NO: 480；ならびに
iii)以下からなる群より選択される、重鎖CDR3：
1) SEQ ID NO: 331〜340；
2) SEQ ID NO: 331、346〜352；
3) SEQ ID NO: 358〜364；
4) SEQ ID NO: 370〜372：
5) SEQ ID NO: 378〜404；
6) SEQ ID NO: 410〜411；
7) SEQ ID NO: 417〜420；
8) SEQ ID NO: 426〜429；
9) SEQ ID NO: 435〜450；
10) SEQ ID NO: 456〜458；
11) SEQ ID NO: 464〜466；
12) SEQ ID NO: 472〜475；および
13) SEQ ID NO: 481〜490；
を含む重鎖可変領域
を含む抗体を提供する。態様において、抗体は、抗体断片、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディ、ならびにIL-17A(SEQ ID NO: 2)と結合する二重特異性分子である。
【０１６４】
本発明は、以下からなる群より選択される抗体を提供する：
a) SEQ ID NO: 326の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 327の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 328の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:329の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 330の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 331〜340から選択される、抗体
b) SEQ ID NO: 341の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 342の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 343の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 344の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 345の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 331、およびSEQ ID NO:346〜352である、抗体
c) SEQ ID NO: 353の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 354の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:355の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 356の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 357の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 358〜364から選択される、抗体
d) SEQ ID NO: 365の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 366の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 367の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 368の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 369の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 370〜372から選択される、抗体
e) SEQ ID NO: 373の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 374の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 375の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 376の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 377の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 378〜04である、抗体
f) SEQ ID NO: 405の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 406の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 407の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:408の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 409の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 37、57、または410〜411から選択される、抗体
g) SEQ ID NO: 412の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 413の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 414の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 415の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 416の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 417〜420から選択される、抗体
h) SEQ ID NO: 421の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 422の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 423の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:424の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 425の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 426〜429から選択される、抗体
i) SEQ ID NO: 430の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 431の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 432の軽鎖CDR3、SEQ ID NO: 433の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 434の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 435〜450から選択される、抗体
j) SEQ ID NO: 451の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 452の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 453の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:454の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 455の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 456〜458から選択される、抗体
k) SEQ ID NO: 459の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 460の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 461の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:462の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 463の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO:464〜466から選択される、抗体
l) SEQ ID NO: 467の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 468の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 469の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:470の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 471の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 472〜475から選択される、抗体ならびに
a) SEQ ID NO: 476の軽鎖CDR1、SEQ ID NO: 477の軽鎖CDR2、SEQ ID NO: 478の軽鎖CDR3、SEQ ID NO:479の重鎖CDR1、SEQ ID NO: 480の重鎖CDR2を含み、重鎖CDR3がSEQ ID NO: 481〜490から選択される抗体。
態様において、抗体は、抗体断片、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディ、ならびにIL-17A(SEQ ID NO: 2)と結合する二重特異性分子である。
【０１６５】
本発明は、SEQ ID NO:2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、抗体が結合するSEQ ID NO: 2の部分がSEQ ID NO: 2のアミノ酸残基77〜85である抗体を提供する。他の哺乳動物種のIL-17に由来するエピトープに対する抗体もまた有用であり得る。したがって、本発明は、
1)抗体が結合するSEQ ID NO: 1022(カニクイザル)の部分が、
a) SEQ ID NO: 1022のアミノ酸残基77〜85；および
b) SEQ ID NO: 1022のアミノ酸残基123〜128
からなる群より選択される、SEQ ID NO:1022；
2)抗体が結合するSEQ ID NO: 1023(マウス)の部分が、
a) SEQ ID NO: 1023のアミノ酸残基80〜88；および
b) SEQ ID NO: 1023のアミノ酸残基125〜131；および
c) 抗体が結合するSEQ ID NO: 1024(ラット)の部分が、以下からなる群より選択される、SEQ ID NO:1024：
a) SEQ ID NO: 1024のアミノ酸残基72〜80；および
b) SEQ ID NO: 1024のアミノ酸残基117〜123：
からなる群より選択される、SEQ ID NO:1023
を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。
【０１６６】
本発明は、SEQ ID NO:2を含むポリペプチドを中和する抗体であって、抗体が結合するSEQ ID NO: 2の部分が、a) SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基34〜41；およびb) SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基52〜64からなる群より選択される抗体を提供する。他の哺乳動物種のIL-17に由来するエピトープに対する抗体もまた有用であり得る。したがって、本発明は、
1)抗体が結合する部位が、
a) SEQ ID NO: 1022(カニクイザル)のアミノ酸残基34〜41；および
b) SEQ ID NO: 1022のアミノ酸残基52〜64
からなる群より選択される、SEQ ID NO: 1022；
2)抗体が結合する部位が、
a) SEQ ID NO: 1023(マウス)のアミノ酸残基36〜43；および
b) SEQ ID NO: 1023のアミノ酸残基60〜67
からなる群より選択される、 SEQ ID NO: 1023；
3)抗体が結合する部位が、SEQ ID NO: 1024(ラット)のアミノ酸残基49〜59である、SEQ ID NO: 1024
を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。
【０１６７】
本発明は、SEQ ID NO:4を含むポリペプチドと結合する抗体であって、抗体が結合するSEQ ID NO: 4の部分が、a) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基55〜66；およびb) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基74〜85からなる群より選択される抗体を提供する。他の哺乳動物種のIL-17に由来するエピトープに対する抗体もまた有用であり得る。したがって、本発明は、
1) 抗体が結合する部位が、
a) SEQ ID NO: 1025(カニクイザル)のアミノ酸残基55〜66；および
b) SEQ ID NO: 1025のアミノ酸残基74〜85
からなる群より選択される、SEQ ID NO: 1025；
2) 抗体が結合する部位が、
a) SEQ ID NO: 1026(マウス)のアミノ酸残基56〜67；および
b) SEQ ID NO: 1026のアミノ酸残基73〜86
からなる群より選択される、SEQ ID NO: 1026；
3)抗体が結合する部位が、
a) SEQ ID NO: 1027(ラット)のアミノ酸残基55〜68；および
b) SEQ ID NO: 1027のアミノ酸残基73〜86
からなる群より選択される、SEQ ID NO: 1027
を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。
【０１６８】
本発明は、SEQ ID NO:2を含むポリペプチドを中和する抗体であって、抗体が結合するSEQ ID NO: 4の部分が、a) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基137〜146；およびb) SEQ ID NO: 4のアミノ酸残基155〜164からなる群より選択される抗体を提供する。他の哺乳動物種のIL-17に由来するエピトープに対する抗体もまた有用であり得る。したがって、本発明は、
1)抗体が結合する部位が、
a) SEQ ID NO: 1025(カニクイザル)のアミノ酸残基137〜146；および
b) SEQ ID NO: 1025のアミノ酸残基155〜164
からなる群より選択される、SEQ ID NO: 1025；
2)抗体が結合する部位が、
a) SEQ ID NO: 1026(マウス)のアミノ酸残基137〜146；および
b) SEQ ID NO: 1026のアミノ酸残基155〜165
からなる群より選択される、SEQ ID NO: 1026；ならびに
3)a) SEQ ID NO: 1027のアミノ酸残基137〜147；および
b) SEQ ID NO: 1027のアミノ酸残基155〜165
からなる群より選択される、抗体が結合する部位
を含む抗体を提供する。
【０１６９】
本発明は、SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、272、276、280、284、288、292、296、300、304、308、312、316、320、および325からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、IL-17A(SEQ ID NO :2)を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。1つの態様において、本抗体は、SEQ ID NO: 81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169、173、177、181、185、189、193、197、201、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、249、253、257、261、265、269、273、277、281、285、289、293、297、301、305、309、313、317、321、および323からなる群より選択される重鎖可変領域をさらに含む。1つの態様において、軽鎖可変領域は重鎖可変領域のアミノ末端側にあるか、または重鎖可変領域は軽鎖可変領域のアミノ末端側にある。1つの態様において、抗体は抗体断片である。1つの態様において、抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択される。1つの態様において、抗体は二重特異性分子である。1つの態様において、二重特異性分子はまたIL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する。
【０１７０】
本発明は、SEQ ID NO: 81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169、173、177、181、185、189、193、197、201、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、249、253、257、261、265、269、273、277、281、285、289、293、297、301、305、309、313、317、321、および323からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。1つの態様において、本抗体は、SEQ ID NO: 80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、272、276、280、284、288、292、296、300、304、308、312、316、320、および325からなる群より選択される軽鎖可変領域をさらに含む。1つの態様において、軽鎖可変領域は重鎖可変領域のアミノ末端側にあるか、または重鎖可変領域は軽鎖可変領域のアミノ末端側にある。1つの態様において、抗体は抗体断片である。1つの態様において、抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択される。1つの態様において、抗体は二重特異性分子である。1つの態様において、二重特異性分子はまたIL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する。
【０１７１】
本発明は、SEQ ID NO: 92、80、128、144、136、148、140、96、100、124、132、および108からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、かつSEQ ID NO: 93、81、129、145、137、149、141、97、101、125、133、および109からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。1つの態様において、抗体は抗体断片である。1つの態様において、抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択される。1つの態様において、二重特異性分子である。1つの態様において、二重特異性分子はまたIL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する。
【０１７２】
本発明は、SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、以下からなる群より選択される軽鎖および重鎖を含む抗体を提供する：
a) SEQ ID NO: 92を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 93を含む重鎖；
b) SEQ ID NO: 80を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 81を含む重鎖；
c) SEQ ID NO: 128を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 129を含む重鎖；
d) SEQ ID NO: 144を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 145を含む重鎖；
e) SEQ ID NO: 136を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 137を含む重鎖；
f) SEQ ID NO: 148を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 149を含む重鎖；
g) SEQ ID NO: 140を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 141を含む重鎖；
h) SEQ ID NO: 96を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 97を含む重鎖；
i) SEQ ID NO: 100を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 101を含む重鎖；
j) SEQ ID NO: 124を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 125を含む重鎖；
k) SEQ ID NO: 132を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 133を含む重鎖；ならびに
) SEQ ID NO: 108を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 109を含む重鎖。
1つの態様において、抗体は抗体断片である。1つの態様において、抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択される。1つの態様において、抗体は、IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子ある。1つの態様において、軽鎖可変領域は、重鎖可変領域のアミノ末端側またはカルボキシル末端側にある。
【０１７３】
本発明は、SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、以下からなる群より選択される軽鎖および重鎖を含む抗体と結合に関して競合する抗体を提供する：
a) SEQ ID NO: 92を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 93を含む重鎖；
b) SEQ ID NO: 80を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 81を含む重鎖；
c) SEQ ID NO: 128を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 129を含む重鎖；
d) SEQ ID NO: 144を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 145を含む重鎖；
e) SEQ ID NO: 136を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 137を含む重鎖；
f) SEQ ID NO: 96を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 97を含む重鎖；
g) SEQ ID NO: 100を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 101を含む重鎖；
h) SEQ ID NO: 124を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 125を含む重鎖；
i) SEQ ID NO: 132を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 133を含む重鎖；
j) SEQ ID NO: 108を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 109を含む重鎖。
複数の態様において、抗体は、抗体断片、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディ、IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子ある。
【０１７４】
本発明は、SEQ ID NO: 2を含むポリペプチドと結合する抗体であって、SEQ ID NO: 148を含む軽鎖およびSEQ ID NO: 149を含む重鎖を含む抗体と結合に関して競合する抗体を提供する。複数の態様において、抗体は、抗体断片、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディ、IL-23p19(SEQ ID NO: 4)とも結合する二重特異性分子ある。
【０１７５】
本発明は、
2009540018.tif 000024
からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 4を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。1つの態様において、本抗体は、
2009540018.tif 000025
からなる群より選択される重鎖可変領域をさらに含む。態様において、抗体は、抗体断片であり、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択され、IL-17A(SEQ ID NO: 2)と結合する二重特異性分子である。
【０１７６】
本発明は、SEQ ID NO: 768および764からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、かつSEQ ID NO: 769および765からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 4を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。態様において、抗体は、抗体断片であり、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択され、IL-17A(SEQ ID NO: 2)と結合する二重特異性分子である。
【０１７７】
本発明は、SEQ ID NO: 774および776からなる群より選択される軽鎖可変領域を含み、かつSEQ ID NO: 775および777からなる群より選択される重鎖可変領域を含み、SEQ ID NO: 4を含むポリペプチドと結合する抗体を提供する。態様において、抗体は、抗体断片であり、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択され、IL-17A(SEQ ID NO: 2)と結合する二重特異性分子である。
【０１７８】
本発明は、多発性硬化症、IBD、および脱髄性疾患を含む自己免疫疾患を治療する方法を提供する。本発明は、インターロイキン-17(IL-17)のアンタゴニスト、およびIL-23のp19サブユニットと結合するIL-23のアンタゴニストでT細胞を処理する段階を含む、T細胞によるIL-17産生を阻害する方法を提供する。T細胞は活性化され得、記憶細胞であってよい。
【０１７９】
本発明は、IL-17およびIL-23のアンタゴニストの有効量を哺乳動物対象に投与する段階を含む、哺乳動物対象において、多発性硬化症(MS)、慢性炎症、自己免疫性糖尿病、関節リウマチ(RA)およびその他の関節炎状態、喘息、全身性エリテマトーデス、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群(IBS)、ならびに炎症性腸疾患(IBD)などの疾患を含むIL-17またはIL-23の発現上昇を特徴とする炎症性疾患を治療する方法を提供する。態様において、抗体は、抗体断片であり、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab') 2、scFv、およびダイアボディからなる群より選択され、IL-17A(SEQ ID NO: 2)およびIL-23p19(SEQ ID NO: 4)と結合する二重特異性分子である。
【０１８０】
本発明は、IL-17Aに対するアンタゴニストおよびIL-23p19に対するアンタゴニストの組み合わせを投与する段階を含む、多発性硬化症の再発を予防する、抑制する、または減少させる方法を提供する。1つの態様では、IL-17Aに対するアンタゴニストとIL-23p19に対するアンタゴニストを同時投与する。別の態様において、IL-17Aに対するアンタゴニストはscFv分子であり、IL-23p19に対するアンタゴニストがscFv分子である。別の態様では、IL-17Aに対するアンタゴニストおよびIL-23p19に対するアンタゴニストを1つの実体として投与する。1つの態様において、本実体は二重特異性分子である。1つの態様において、IL-17Aに対するアンタゴニストは、
2009540018.tif 000026
からなる群より選択される軽鎖を含み、ならびに/または
2009540018.tif 000027
からなる群より選択される重鎖を含む。1つの態様において、IL-23p19に対するアンタゴニストは、
2009540018.tif 000028
からなる群より選択される軽鎖を含み、ならびに/または
2009540018.tif 000029
からなる群より選択される重鎖可変領域を含む。同様に、本発明は、IL-17Aに対するアンタゴニストおよびIL-23p19に対するアンタゴニストの組み合わせを投与する段階を含む、IBDを予防する、抑制する、または軽減する方法を提供する。
【０１８１】
本発明は、以下の少なくとも1つを含み、IL-17A(SEQ ID NO: 2)およびIL-23p19(SEQ ID NO: 4)の両方と結合する、単離された抗体を提供する：
a)
2009540018.tif 000030
からなる群より選択される、軽鎖可変領域；
b)
2009540018.tif 000031
からなる群より選択される、重鎖可変領域；
c)
2009540018.tif 000032
からなる群より選択される、軽鎖可変領域；ならびに
d)
2009540018.tif 000033
からなる群より選択される、重鎖可変領域。
【０１８２】
D) 核酸
本発明はまた、本発明の抗体の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸も含む。本発明の核酸は、本発明の核酸と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%、最も好ましくは少なくとも約98%の相同性を有する核酸を含む。特定の配列に言及する場合の「パーセント類似性」、「パーセント同一性」、および「パーセント相同性」という用語は、ウィスコンシン大学GCGソフトウェアプログラムに記載の通り用いられる。本発明の核酸はまた、相補的核酸も含む。いくつかの例において、配列は整列させた場合に(ミスマッチなく)十分に相補的である。他の例では、配列中に最大約20%のミスマッチが存在し得る。本発明のいくつかの態様において、本発明の抗体の重鎖および軽鎖を両方コードする核酸を提供する。当業者は、本明細書において提供する核酸配列を、特定の宿主での発現を最適化するために、コドン最適化、縮重配列、サイレント変異、およびその他のDNA技術を用いて使用できることを理解すると考えられる。本発明は、このような配列修飾物も包含する。本発明は、本明細書に開示する抗IL-17A抗体および抗IL-23p19抗体をコードする、DNAおよびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は、遺伝暗号の縮重の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間で相当数の配列変化が可能であることを容易に認識すると考えられる。
【０１８３】
本発明の核酸は、別の遺伝子配列またはエレメント(DNAまたはRNA)を挿入して、その結合した配列またはエレメントの複製をもたらすことができる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体(BAC、YAC)、またはウイルスなどのベクターにクローニングすることができる。いくつかの態様において、発現ベクターは、構成的に活性のあるプロモーターセグメント(これらに限定されないが、CMV、SV40、伸長因子、またはLTR配列など)、または核酸の発現を調節することができる、ステロイド誘導性pINDベクター(Invitrogen)のような誘導性プロモーター配列を含む。本発明の発現ベクターは、例えばリボソーム内部進入部位といった調節配列をさらに含み得る。発現ベクターは、例えばトランスフェクションによって、細胞内に導入することができる。
【０１８４】
E) IL-17およびIL-23に対する抗体の作製方法
本発明はまた、IL-17およびIL-23に対して個々にまたは共に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法を提供する。本発明の抗体は、インビボまたはインビトロで作製することができる。IL-17およびIL-23の両方に対する抗体を作製するための1つの戦略は、IL-17およびIL-23の両方で動物を免疫する段階を含む。いくつかの態様では、単量体型または多量体型のIL-17およびIL-23の両方で動物を免疫する。このように免疫された動物は、IL-17およびIL-23の両方に対する抗体を産生する。これらに限定されないが、ハイブリドーマ技術(Kohler & Milstein, (1975) Nature 256:495-497を参照されたい)；トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72を参照されたい)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 77-96を参照されたい)を含む、モノクローナル抗体を作製する標準的な方法が公知である。
【０１８５】
IL-17およびIL-23はいずれも、タンパク質を単離および精製するための様々な周知の技術を用いて、細胞からまたは組換え系から精製することができる。例えば、限定するわけではないが、IL-17およびIL-23はいずれも、SDS-PAGEゲルでこのタンパク質を泳動し、該タンパク質を膜にブロッティングすることにより、該タンパク質の見かけの分子量に基づいて単離することができる。その後、いずれかのタンパク質に対応する適切な大きさのバンドを膜から切り出し、動物において免疫原として直接使用するか、または最初に該タンパク質を膜から抽出もしくは溶出することによって使用することができる。別の例として、タンパク質は、単独でまたは他の単離および精製手段と併用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって単離することができる。
【０１８６】
本発明はまた、ホモ二量体型、ヘテロ二量体型、および/または多量体型のIL-17およびIL-23/p19の両方に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法を提供する。これらの異なる形態は、タンパク質を単離および精製するための様々な周知の技術を用いて、細胞からまたは組換え系から精製することができる。例えば、限定するわけではないが、IL-17およびIL-23/p19はいずれも、SDS-PAGEゲルでこのタンパク質を泳動し、該タンパク質を膜にブロッティングすることにより、該タンパク質の見かけの分子量に基づいて単離することができる。その後、それぞれに対応する適切な大きさのバンドを膜から切り出し、動物において免疫原として直接使用するか、または最初に該タンパク質を膜から抽出もしくは溶出することによって使用することができる。別の例として、タンパク質は、単独でまたは他の単離および精製手段と併用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって単離することができる。
【０１８７】
他の精製手段は、Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation And Use Of Monoclonal Antibodies And Engineered ntibody Derivatives (Basics: From Background To Bench) Springer-Verlag Ltd., New York, 2000；Basic Methods In Antibody Production And Characterization, Chapter 11, 「Antibody Purification Methods,」 Howard and Bethell, Eds., CRC Press, 2000；Antibody Engineering (Springer Lab Manual.), Kontermann and Dubel, Eds., Springer-Verlag, 2001のような標準的な参考教科書で入手できる。
【０１８８】
インビボでの抗体産生には、一般的に、IL-17もしくはIL-23のいずれか、またはいずれかの免疫原性部分で動物を免疫する。抗原は、一般に、免疫原性を促進するためにアジュバントと混合する。アジュバントは、免疫に使用する種によって異なる。アジュバントの例には、これらに限定されないが、フロイント完全アジュバント(「CFA」)、フロイント不完全アジュバント(「IFA」)、ミネラルゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、界面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン)、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン(「KLH」)、ジニトロフェノール(「DNP」)、ならびにカルメット・ゲラン桿菌(「BCG」)およびコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。このようなアジュバントは、当技術分野においても周知である。免疫化は、周知の手順を用いて達成することができる。用量および免疫化計画は、免疫する哺乳動物の種、その免疫状態、体重、および/または算出表面積等に依存する。典型的に、免疫した哺乳動物から血清を試料採取し、例えば以下に記載する適切なスクリーニングアッセイ法を用いて、抗IL-17抗体および抗IL-23/p19抗体についてアッセイする。
【０１８９】
ヒト化抗体を作製するための一般的な方法は、ヒトIg骨格にMAb(げっ歯類宿主を免疫することによって作製)由来のCDR配列を移植し、このキメラ遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞にトランスフェクションするものであり、このCHO細胞はこの細胞によって分泌される機能的Abを産生する(Shields, R. L., et al. (1995) Int Arch. Allergy Immunol. 107:412-413)。本出願に記載する方法は、げっ歯類細胞株、植物、酵母、および原核生物などの宿主細胞にトランスフェクションされたIg遺伝子またはキメラIg内に遺伝子変化をもたらすのにも有用である(Frigerio L, et al. (2000) Plant Physiol. 123:1483-1494)。
【０１９０】
免疫動物由来の脾細胞は、この脾細胞(抗体産生B細胞を含む)を骨髄腫株などの不死細胞株と融合させることによって、不死化することができる。典型的に、骨髄腫細胞株は脾細胞ドナーと同じ種に由来する。1つの態様において、不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培養液(「HAT培地」)に対して感受性がある。いくつかの態様において、骨髄腫細胞はエプスタイン・バーウイルス(EBV)感染に関して陰性である。好ましい態様において、骨髄腫細胞は、HAT感受性、EBV陰性、かつIg発現陰性である。任意の適切な骨髄腫を用いることができる。マウスハイブリドーマは、マウス骨髄腫細胞株(例えば、P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653、またはSp2/O-Ag14骨髄腫株)を用いて作製することができる。これらのマウス骨髄腫株は、ATCCから入手可能である。これらの骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール(「PEG」)、好ましくは分子量1500のポリエチレングリコール(「PEG 1500」)で、ドナー脾細胞と融合させる。融合によって生じたハイブリドーマ細胞を、融合されなかった骨髄腫細胞および非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるHAT培地において選択する。非融合脾細胞は、短期間の培養で死滅する。いくつかの態様において、骨髄腫細胞は免疫グロブリン遺伝子を発現しない。
【０１９１】
以下に記載するようなスクリーニングアッセイ法によって検出される所望の抗体を産生するハイブリドーマは、培養または動物において抗体を生成するために用いることができる。例えば、ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を培養液中に分泌できるようにする条件下において、かつそうするのに十分な時間をかけて、ハイブリドーマ細胞を栄養培地で培養することができる。これらの技術および培養液は当業者に周知である。または、ハイブリドーマ細胞を非免疫動物の腹腔に注射することもできる。細胞は腹腔内で増殖し、抗体を分泌し、これは腹水液として蓄積する。腹水液を、モノクローナル抗体の豊富な供給源として、腹腔からシリンジで回収することができる。
【０１９２】
ヒト抗体を作製するための別の非限定的な方法は、米国特許第5,789,650号に記載されており、これは、自身の内因性免疫グロブリン遺伝子が不活化されている、別の種(例えば、ヒト)の抗体を産生するトランスジェニック哺乳動物について記載している。異種抗体の遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。再編成されていない免疫グロブリンコード領域を含む導入遺伝子を、非ヒト動物に導入する。得られたトランスジェニック動物は、トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再編成し、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる種々のアイソタイプの抗体のレパートリーを産生することができる。その後、トランスジェニック動物由来のB細胞を、不死化細胞株(例えば、骨髄腫細胞)との融合を含む種々の方法のいずれかによって不死化する。
【０１９３】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて、インビトロで調製することもできる。例えば、限定するわけではないが、IL-17およびIL-23/p19に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、インビトロ刺激したヒト脾細胞を使用することによって調製することができる(Boerner et al. (1991) J. Immunol. 147:86-95)。
【０１９４】
または、例えば、「レパートリークローニング」によって本発明の抗体を調製することもできる(Persson et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2432-2436；およびHuang and Stollar (1991) J. Immunol. Methods 141:227-236)。さらに、米国特許第5,798,230号は、エプスタイン・バーウイルス核抗原2(EBNA2)を発現するエプスタイン・バーウイルスによる感染よって不死化されたヒトB抗体産生B細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製について記載している。不死化に必要なEBNA2はその後不活化され、抗体価の増加をもたらす。
【０１９５】
別の態様において、本発明の抗体は、末梢血単核細胞(「PBMC」)のインビトロ免疫化によって形成される。これは、例えば、文献(Zafiropoulos et al. (1997) J. Immunological Methods 200:181-190)に記載されている方法を使用するなど、当技術分野で公知の任意の手段によって達成することができる。
【０１９６】
特定の態様においては、IL-17およびIL-23の両方と結合する二重特異性抗体および一本鎖抗体を作製する。本発明の1つの方法は、二重特異性IL-17/IL-23抗体を作製する方法である。本方法は、IL-17と結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、IL-23/p19と結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞と融合させ、それによって二重特異性IL-17/IL-23モノクローナル抗体を分泌するハイブリッドハイブリドーマを調製する段階を含む。1つの態様において、本方法は、拮抗性(または作動性)IL-17 MAbを分泌するハイブリドーマ細胞を、拮抗性(または作動性)IL-23/p19 MAbを分泌するハイブリドーマ細胞と融合させる段階を含む。そのような融合を行う、および所望のハイブリッドハイブリドーマを単離する従来技術は、本明細書の他所に記載する技術、および以下の実施例において例証する技術を含む。
【０１９７】
米国特許第6,060,285号は、少なくとも、第1特異性を有する抗体の軽鎖および重鎖の可変部分の遺伝子を、第2特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞にトランスフェクションする、二重特異性抗体を作製する工程を開示している。トランスフェクションされたハイブリドーマ細胞を培養すると、二重特異性抗体が産生され、当技術分野で公知の種々の手段によってこれを単離することができる。
【０１９８】
他の研究者らは、抗体断片の化学的結合を用いて、2つの異なる抗原に対して特異性を有する抗原結合分子を調製している(Brennan et al., Science 229:81 1985；Glennie et al., J. Immunol. 139:2367, 1987)。米国特許第6,010,902号もまた、例えば、GMBS(マレイミドブチリルオキシスクシンイミド)またはSPDP(N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸)などのヘテロ二官能性架橋試薬を用いることによって二重特異性抗体を調製し得る、当技術分野で公知の技術について考察している。(例えば、Hardy, 「Purification And Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry」, Handbook Of Experimental Immunology, 4th Ed., Volume 1, Immunochemistry, Weir et al. (eds.), pp. 31.4-31.12, 1986を参照されたい)。
【０１９９】
組換えDNA技術によって抗体を作製する能力により、二重特異性抗体の作製が容易になった。Kostelny et al.は、fosおよびjunタンパク質(優先的にヘテロ二量体を形成する)由来のロイシンジッパー部分を使用して、細胞表面分子CD3およびIL-2の受容体の両方と結合できる二重特異性抗体を作製した(J. Immunol. 148:1547; 1992)。
【０２００】
アミノ酸架橋(短いペプチドリンカー)を介して重鎖および軽鎖可変領域(Fv領域)断片を連結して、単一ポリペプチド鎖にすることによって、1本鎖抗体を形成することができる。このような1本鎖Fv(scFv)は、2つの可変領域ポリペプチド(VLおよびVH)をコードするDNAの間にペプチドリンカーをコードするDNAを融合することによって調製されている。得られた抗体断片は、2つの可変ドメイン間の可動性リンカーの長さなどの要因に依存して、二量体またはより高次のオリゴマーを形成することができる(Kortt et al., Protein Engineering 10:423, 1997)。特定の態様では、化学架橋剤を用いることにより、2つまたはそれ以上のscFvを連結する。
【０２０１】
一本鎖抗体の作製について開発された技術を、IL-17およびIL-23の両方と結合する本発明の一本鎖抗体を作製するために適合化することができる。そのような技術には、米国特許第4,946,778号；Bird (Science 242:423, 1988)；Huston et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988)；およびWard et al. (Nature 334:544, 1989)に記載されている技術が含まれる。所望の一本鎖抗体が同定された場合には(例えば、ファージディスプレイライブラリーから)、当業者は、一本鎖抗体をコードするDNAをさらに操作して、Fc領域を有する二重特異性抗体を含む二重特異性抗体をもたらすことができる。
【０２０２】
IL-17およびIL-23に対する一本鎖抗体は、いずれかの順序でコンカテマー化することができる(すなわち、抗IL-17-抗IL-23または抗IL-23-抗IL-17)。特定の態様において、二重特異性IL-17/IL-23抗体を調製するための出発材料は、IL-17に対する拮抗性(または作動性)一本鎖抗体およびIL-23/p19に対する拮抗性(または作動性)一本鎖抗体を含む。
【０２０３】
米国特許第5,582,996号は、二重特異性抗体の作製においてヘテロ二量体形成を促進するための相補的相互作用ドメイン(ロイシンジッパー部分または他の鍵と鍵穴相互作用ドメイン構造など)の使用を開示している。Fab断片と重鎖の別の部分(すなわち、重鎖のCH1領域またはCH2領域)との間に、相補的相互作用ドメインを挿入することができる。2つの異なるFab断片および優先的にヘテロ二量体化する相補的相互作用ドメインを用いることによって、二重特異性抗体分子が得られる。システイン残基を相補的相互作用ドメインに挿入して、相補的相互作用ドメイン間のジスルフィド結合を可能にし、得られた二重特異性抗体を安定化することができる。
【０２０４】
米国特許第5,959,083号に記載されるように、抗体のF(ab')2断片の重鎖をコードするDNAと、第2のF(ab')2分子の重鎖をコードするDNA(CH1ドメインがCH3ドメインと交換されている)、または抗体の一本鎖Fv断片をコードするDNAいずれかとの融合によって、四価二重特異性分子を調製することができる。哺乳動物細胞において、得られた融合遺伝子を対応する軽鎖の遺伝子と共に発現させると、選択された抗原に対して特異性を有する四価二重特異性分子が生じる。
【０２０５】
二重特異性抗体はまた、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,807,706号に記載されるように作製することもできる。一般的に、この方法は、ポリペプチド界面において、第1ポリペプチドに隆起を、第2ポリペプチドに対応する空洞を導入する段階を含む。隆起と空洞は、ヘテロ多量体形成を促進し、ホモ多量体形成を妨げるように配置する。隆起は、小さい側鎖を有するアミノ酸をより大きな側鎖を有するアミノ酸と置換することによって作成される。空洞は、逆のアプローチによって、すなわち比較的大きな側鎖を有するアミノ酸をより小さな側鎖を有するアミノ酸と置換することによって作成される。
【０２０６】
隆起および空洞は、ポリペプチドにおいてアミノ酸置換を引き起こす従来法によって作製することができる。例えば、ポリペプチドをコードする核酸を、従来のインビトロ突然変異誘発技術によって変化させることができる。または、ペプチド合成によって、所望のアミノ酸置換を組み入れたポリペプチドを調製することもできる。置換のために選択されるアミノ酸は、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドの間の界面に位置する。
【０２０７】
F) 抗体特異性のスクリーニング
IL-17および/またはIL-23/p19に特異的に結合する抗体のスクリーニングは、当技術分野で公知の手順およびアッセイ法ならびに本明細書に記載の手順およびアッセイ法を用いて達成することができる。例えば、マイクロタイタープレートをIL-17およびIL-23(またはp19のみ)のいずれか一方または両方でコーティングする酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を用いることができる。いくつかの態様においては、陽性反応を示すクローンに由来する、IL-17およびIL-23/p19の両方と結合する抗体を、他の形態のIL-17およびIL-23/p19または他のIL-17ファミリーメンバーでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、ELISAベースのアッセイ法で反応性についてさらにスクリーニングすることができる。別の形態またはファミリーメンバーと反応する抗体を産生するクローンを排除し、IL-17およびIL-23/p19の両方と反応する抗体を産生するクローンを、さらなる拡大および開発のために選択することができる。IL-17およびIL-23/p19の両方に対する抗体の反応性の確認は、例えば、卵巣癌、乳癌、腎癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮内膜癌、または脳腫瘍細胞由来のタンパク質、ならびに精製FR-αおよび他の葉酸受容体アイソフォームをSDS-PAGEゲルで泳動し、次いで膜にブロッティングするウェスタンブロットアッセイ法を用いて達成することができる。次に、膜を推定抗FR-α抗体でプロービングし得る。IL-17およびIL-23/p19の両方と反応し、別のファミリーメンバーとは反応しないことによって、IL-17およびIL-23/p19の両方に対する反応性の特異性が確認される。
【０２０８】
いくつかの態様では、本発明の抗体の結合親和性を決定する。本発明の抗体は、好ましくは少なくとも約1×10-7 M、より好ましくは少なくとも約1×10-8 M、より好ましくは少なくとも約1×10-9 M、最も好ましくは少なくとも約1×10-10 Mの、IL-17およびIL-23/p19(個々、または二重特異性抗体もしくはscFVのように双方)に対する結合親和性を有する。本発明の好ましい抗体産生細胞は、実質的に、少なくとも約1×10-7 M、より好ましくは少なくとも約1×10-8 M、より好ましくは少なくとも約1×10-9 M、最も好ましくは少なくとも約1×10-10 Mの、IL-17およびIL-23/p19(個々、または二重特異性抗体もしくはscFVのように双方)に対する結合親和性を有する抗体のみを産生する。本発明の好ましい組成物は、実質的に、少なくとも約1×10-7 M、より好ましくは少なくとも約1×10-8 M、より好ましくは少なくとも約1×10-9 M、最も好ましくは少なくとも約1×10-10 Mの、IL-17およびIL-23/p19(個々、または二重特異性抗体もしくはscFVのように双方)に対する結合親和性を有する抗体のみを含む。
【０２０９】
G) 抗IL-17抗体および抗IL-23/p19抗体産生細胞
本発明の抗体産生細胞は、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞などの公知の任意の昆虫発現細胞株を含む。発現細胞株はまた、例えばサッカロミスス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞およびシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)細胞などの酵母細胞株であってもよい。発現細胞株はまた、例えば、ハイブリドーマ細胞(例えば、NS0細胞)、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ヒト胚腎臓株293、正常イヌ腎細胞株、正常ネコ腎細胞株、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、COS細胞、および非腫瘍形成マウス筋芽G8細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスNIH/3T3細胞、LMTK31細胞、マウスセルトリ細胞、ヒト子宮頸癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、TRI細胞、MRC 5細胞、ならびにFS4細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。
【０２１０】
いくつかの好ましい態様において、本発明の抗体産生細胞は、IL-17およびIL-23/p19に(個々に、または二重特異性抗体もしくはscFVのように共に)特異的に結合する抗体を産生する。細胞は、好ましくは、IL-17およびIL-23結合競合物をいずれも実質的に含まない。好ましい態様において、抗体産生細胞は、IL-17およびIL-23結合競合物をいずれも、約10重量%未満、好ましくは約5重量%未満、より好ましくは約1重量%未満、より好ましくは約0.5重量%未満、より好ましくは約0.1重量%未満、最も好ましくは約0重量%含む。いくつかの好ましい態様において、抗体産生細胞によって産生された抗体は、IL-17およびIL-23結合競合物をいずれも実質的に含まない。好ましい態様において、抗体産生細胞によって産生された抗体は、IL-17およびIL-23結合競合物をいずれも、約10重量%未満、好ましくは約5重量%未満、より好ましくは約1重量%未満、より好ましくは約0.5重量%未満、より好ましくは約0.1重量%未満、最も好ましくは約0重量%含む。本発明の好ましい抗体産生細胞は、実質的に、少なくとも約1×10-7 M、より好ましくは少なくとも約1×10-8 M、より好ましくは少なくとも約1×10-9 M、最も好ましくは少なくとも約1×10-10 Mの、IL-17およびIL-23/p19(個々、または二重特異性抗体もしくはscFVのように双方)に対する結合親和性を有する抗体のみを産生する。
【０２１１】
H) 抗体精製
抗体精製の方法は、当技術分野において公知である。本発明のいくつかの態様において、抗体精製の方法は、濾過、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および濃縮を含む。濾過段階は、好ましくは限外濾過、より好ましくは限外濾過およびダイアフィルトレーションを含む。濾過は、好ましくは少なくとも約5〜50回、より好ましくは10〜30回、最も好ましくは14〜27回行う。アフィニティーカラムクロマトグラフィーは、例えばPROSEPアフィニティークロマトグラフィー(Millipore、マサチューセッツ州、ビルリカ)を用いて行うことができる。好ましい態様において、アフィニティークロマトグラフィー段階はPROSEP-VAカラムクロマトグラフィーを含む。溶出液は、溶媒界面活性剤で洗浄し得る。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えばSP-Sepharose陽イオン交換クロマトグラフィーを含み得る。陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、これに限定されないが、Q-Sepharose Fast Flow陰イオン交換を含み得る。陰イオン交換段階は好ましくは非結合であり、それによってDNAおよびBSAを含む混入物の除去が可能になる。抗体産物は、好ましくは、例えばPall DV 20ナノフィルターを用いてナノ濾過する。抗体産物は、例えば限外濾過およびダイアフィルトレーションを用いて濃縮することができる。本方法は、凝集体を除去するために、サイズ排除クロマトグラフィーの段階をさらに含んでもよい。
【０２１２】
I) IL-17抗体およびIL-23/p19抗体の治療的使用
IL-17およびIL-23の両方に結合する抗体を用いて、IL-17およびIL-23/p19と(個々に、または二重特異性抗体もしくはscFVのように共に)結合させ、ひいてはIL-17とIL-17RAおよび/またはIL-17RCとの結合、ならびにIL-23とその受容体(IL-12RB1/IL-23R)またはそれらが結合し得る任意の他の受容体、特にIL-17受容体ファミリーメンバーとの結合を妨げることにより、免疫系を調節することができる。本発明の抗体を用いて、IL-17と内因性IL-17RAおよび/またはIL-17RC受容体との結合ならびにIL-23とその内因性受容体(IL-12RB1/IL-23R)との結合を両方阻害することにより、免疫系を調節することもできる。本発明の抗体を用いて、過剰なIL-17および/またはIL-23を産生する対象を治療することもできる。適切な対象には、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。例えば、本発明の抗体は、多発性硬化症、脱髄性疾患、自己免疫性眼疾患、ブドウ膜炎、強膜炎、癌(IL-17およびIL-23発現を特徴とする)、乾癬、IBS、炎症性腸疾患(IBD)、大腸炎、腫瘍増殖の促進、関節炎、または変性関節疾患、および本明細書に開示する他の炎症状態などの炎症および炎症性疾患の治療において、IL-17およびIL-23の両方を(個々に、または二重特異性抗体もしくはscFVのように共に)結合するか、遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和するのに有用である。
【０２１３】
好ましい態様において、本発明の抗体は、インビボでIL-23(p19を介する)およびIL-17に個々にまたは共に(二重特異性抗体もしくはscFVのように)結合するか、それらを個々にまたは共に(二重特異性抗体もしくはscFVのように)遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和する。
【０２１４】
さらに、本発明の抗体は以下に対して有用である。
(1) 癌、急性炎症、および炎症性腸疾患(IBD)、IBS、慢性大腸炎、脾腫、関節リウマチなどの慢性炎症性疾患、ならびに急性期反応の誘導に関連する他の疾患の治療において、IL-17およびIL-23を介したシグナル伝達を遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和するため。
(2) インスリン依存性糖尿病(IDDM)、多発性硬化症(MS)、脱髄性疾患、自己免疫性眼疾患、ブドウ膜炎、強膜炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、関節リウマチ、IBS、およびIBDなどの自己免疫疾患の治療において、それらの受容体(例えば、IL-17RAおよびIL-17RC)を介した免疫細胞(例えば、リンパ球、単球、白血球)のシグナル伝達を妨げるまたは阻害するために、IL-17またはIL-23を介したシグナル伝達を遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和するため。
本発明の抗体を用いて、IL-17RAおよびIL-17RCを介したシグナル伝達を遮断する、阻害する、減少させる、または拮抗することはまた、膵臓、腎臓、下垂体、および神経細胞の疾患に恩恵をもたらす場合もある。IDDM、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)、膵炎、および膵癌が恩恵を受ける可能性がある。
【０２１５】
本明細書に記載の抗体は、上記のように、多発性硬化症、癌、自己免疫疾患、アトピー性疾患、NIDDM、膵炎、および腎不全の治療において、IL-23およびIL-17と個々に、または二重特異性抗体もしくはscFVのように共に結合させる、それらの活性を個々に、または二重特異性抗体もしくはscFVのように共に遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和するために用いることができる。本発明の抗体は、IL-17またはIL-23のアンタゴニストとして有用である。このような拮抗効果は、IL-17およびIL-23(p19を介する)の直接的中和または結合によって達成することができる。
【０２１６】
本明細書における抗体はまた、薬物、毒素、放射性核種等に直接または間接的に結合させることができ、これらの複合体をインビボ診断または治療用途に用いることができる。例えば、IL-17またはIL-23を認識する抗体または結合ポリペプチドを用いて、対応する抗相補的分子を発現する組織または器官を同定または治療することができる。より具体的には、IL-17もしくはIL-23に対する抗体またはその生物活性断片もしくは部分を、検出可能な分子または細胞毒性分子に結合させ、これらのサイトカインを発現する細胞、組織、または器官、IL-17またはIL-23発現癌を有する哺乳動物に送達することができる。
【０２１７】
適切な検出可能分子を、「結合ポリペプチド」(先に開示した結合ペプチドを含む)、抗体、またはその生物活性断片もしくは部分のような本発明のアンタゴニストに直接または間接的に結合させることができる。適切な検出可能分子には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等が含まれる。適切な細胞毒性分子をポリペプチドまたは抗体に直接または間接的に結合させることもでき、これには、細菌または植物毒素(例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン等)、およびヨウ素-131、レニウム-188、またはイットリウム-90のような治療的放射性核種(ポリペプチドもしくは抗体に直接結合させる、または例えばキレート部分によって間接的に結合させる)が含まれる。結合ポリペプチドまたは抗体を、アドリアマイシンなどの細胞毒性薬に結合させることもできる。検出可能な分子または細胞毒性分子の間接的結合に関しては、検出可能な分子または細胞毒性分子を相補体/抗相補体対のメンバーと結合させることができ、この場合、もう一方のメンバーは結合ポリペプチドまたは抗体部分に結合されている。これらの目的に関して、ビオチン/ストレプトアビジンは例示的な相補体/抗相補体対である。
【０２１８】
別の態様においては、結合ポリペプチド-毒素融合タンパク質または抗体-毒素融合タンパク質を、細胞または組織の阻害または除去の標的化(例えば、癌細胞または組織を治療するため)に用いることができる。または、結合ポリペプチドが複数の機能ドメイン(すなわち、活性化ドメインまたはリガンド結合ドメイン＋標的化ドメイン)を有する場合、標的化ドメインのみを含む融合タンパク質は、関心対象の細胞または組織型に検出可能な分子、細胞毒性分子、または相補的分子を指向するのに適している可能性がある。単一のドメインのみを含む融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗相補的分子を検出可能な分子または細胞毒性分子に結合させることができる。したがって、このようなドメイン-相補的分子融合タンパク質は、一般的な抗相補体-検出可能分子/細胞毒性分子複合体の細胞/組織特異的送達のための一般的な標的化ビヒクルとなる。
【０２１９】
炎症は、侵入物質を回避するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞性および液性メディエータを含むカスケード事象である。一方では、炎症反応を抑制すると、宿主は免疫無防備状態になり得る。しかしそのままにしておくと、炎症は、慢性炎症性疾患(例えば、喘息、乾癬、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患等)、敗血症ショック、および多臓器不全を含む重篤な合併症を引き起こし得る。重要なことに、これらの多様な疾患状態は、共通の炎症性メディエータを共有する。炎症を特徴とする総体的疾患は、ヒトの罹患率および死亡率に大きな影響を及ぼす。したがって、IL-17抗体およびIL-23/p19抗体のようなIL-17およびIL-23/p19に対するアンタゴニストなどの抗炎症タンパク質が、喘息およびアレルギーから自己免疫、癌、および敗血症ショックに至る膨大な数のヒトおよび動物疾患にとって非常に重要な治療可能性を有し得ることは明白である。
【０２２０】
1. 関節炎
変形性関節炎、関節リウマチ、損傷の結果としての関節炎関節等を含む関節炎は、本発明のアンタゴニストなどの抗炎症タンパク質の治療的使用から恩恵を受けると考えられる一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチ(RA)は全身を侵す全身性疾患であり、関節炎の最も多く見られる形態の1つである。これは関節を裏打ちする膜の炎症を特徴とし、これによって疼痛、硬直、発熱、発赤、および腫脹が生じる。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節内層、滑膜が骨および軟骨に侵入して損傷を与え、他の生理的影響の中でも特に関節悪化および激痛をもたらし得る。罹患関節はその形状および配置構造を失って、疼痛および運動障害を生じ得る。
【０２２１】
関節リウマチ(RA)は、重度の障害および死亡率の上昇を引き起こす炎症およびそれに続く組織損傷を特に特徴とする免疫介在性疾患である。リウマチ様関節では、種々のサイトカインが局所的に産生される。2つの原型炎症誘発性サイトカインであるIL-1およびTNF-αが、滑膜炎症および進行性関節破壊に関与する機構において重要な役割を果たすことが、多くの研究から実証されている。実際に、RA患者にTNF-αおよびIL-1阻害剤を投与すると、炎症の臨床学的および生物学的徴候が飛躍的に改善し、骨浸食および軟骨破壊の放射線学的徴候が低減した。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、かなりの割合の患者がこれらの薬剤に応答せず、このことから、他のメディエータもまた関節炎の病態生理に関与していることが示唆される(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149 (2002))。そのようなメディエータの1つは、いくつかの報告において関節リウマチにおいて役割を果たすことが実証されているIL-17またはIL-23であると考えられる。例えば、IL-17およびIL-23/p19は、関節リウマチのない個体と比較して、関節リウマチ患者の滑膜および滑膜線維芽細胞で過剰発現している。さらに、IL-17およびIL-23/p19は、滑膜/滑膜細胞培養物に添加した場合に、基質分解を促進し、炎症性基質破壊サイトカインの発現を増強することが実証されている。(Murphy et al, J. Exp. Med 198:1951 (2003)；Lubberts et al, Arthritis Res Ther. 7:29 (2005)、およびKim et al, Rheumatology, 46:57 (2007)において概説されている)。したがって、本発明のアンタゴニストのような、IL-17またはIL-23と結合するまたはその活性を阻害する分子は、関節リウマチおよびその他の関節炎疾患において炎症を軽減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２２２】
当技術分野において公知である関節リウマチの動物モデルがいくつか存在する。例えば、コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルでは、マウスはヒトの関節リウマチに非常によく似た慢性炎症性関節炎を発症する。CIAはRAと類似の免疫学的および病理学的特徴を共有するため、これは潜在的なヒト抗炎症化合物をスクリーニングするための理想的なモデルとなる。CIAモデルは、発症するために免疫応答および炎症反応の両方に依存する、マウスの周知のモデルである。免疫応答は、抗原として投与されたコラーゲンに応答したB細胞およびCD4+ T細胞の相互作用を含み、抗コラーゲン抗体の産生をもたらす。炎症期は、これらの抗体のいくつかがマウスの天然コラーゲンと交差反応し、補体カスケードを活性化する結果としての、炎症のメディエータによる組織応答の結果である。CIAモデルを用いることの利点は、発症の基本的機構が公知である点である。II型コラーゲン上の関連するT細胞およびB細胞エピトープが同定されており、また免疫介在性関節炎に関連する種々の免疫学的パラメータ(例えば、遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体)および炎症パラメータ(例えば、サイトカイン、ケモカイン、および基質分解酵素)が決定されており、したがってこれらを用いてCIAモデルにおける被験化合物の有効性を評価することができる(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20 (1999)；Williams et al., Immunol. 89:9784-788 (1992)；Myers et al., Life Sci. 61:1861-78 (1997)；およびWang et al., Immunol. 92:8955-959 (1995))。
【０２２３】
あるグループは、抗マウスIL-17抗体によって、対照マウスと比較してマウスCIAモデルにおいて症状が軽減されることを示しており、別のグループは、IL-23/p19の欠損がCIAにおいて保護的であることを示しており(Murphy et al, J. Exp. Med 198:1951 (2003))、したがって本発明のアンタゴニストがヒト疾患の治療に有益であり得ることが概念的に示される。単一のマウスIL-17特異的ラット抗血清を投与すると、予防的に導入した場合に、またはモデルにおいて関節炎の症状が既に存在した後でも、動物における関節炎の症状は軽減された(Lubberts et al, Arthritis Rheum. 50:650-9 (2004))。
【０２２４】
以下の実施例に記載するように、IL-17およびIL-23/p19はいずれもCIAにおいて過剰発現している。したがって、本発明のアンタゴニストは、関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、IBS、大腸炎、および本明細書に開示する他の炎症状態などの特定のヒト疾患の治療において、IL-17および/またはIL-23(p19を介する)を中和するために用いることができる。
【０２２５】
本発明のアンタゴニストをこれらのCIAモデルマウスに投与することにより、疾患の症状を改善し疾患の経過を変更するためのこれらアンタゴニストの使用が評価される。さらに、これらのアンタゴニストによるIL-17および/またはIL-23シグナル伝達の阻害を示す結果から、本明細書に開示するようなIL-17およびIL-23/p19アンタゴニストもまた、疾患の症状を改善し疾患の経過を変更するために用いることができるという概念の証拠が提供される。一例として、非限定的に、マウス当たり10〜200 ugの抗IL-17および抗IL-23/p19の注射(皮下、腹腔内、または筋肉内投与経路により週に1〜7回であり、これに限定されるわけではないが最長で4週間)により、疾患スコア(足スコア、炎症または疾患の発生率)が有意に減少し得る。投与の開始に応じて(例えば、コラーゲン免疫化の前もしくはその時点で、または疾患が既に進行した時点を含む2回目のコラーゲン免疫化後の任意の時点で)、本発明のアンタゴニストは、関節リウマチを予防する上でおよびその進行を妨げる上で有効であり得る。
【０２２６】
2. 炎症性腸疾患 IBD
米国では、約135万人(G7国では190万人超)の人々が、結腸および直腸(潰瘍性大腸炎)、または小腸および大腸の両方(クローン病)に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患(IBD)に罹患している。クローン病および潰瘍性大腸炎のいずれにおいても、腸微生物叢の抗原に対する不適切なまたは過剰な免疫応答によって、組織損傷が生じる。共通した基盤が管腔抗原に対する過剰反応性にあるにもかかわらず、クローン病と潰瘍性大腸炎は免疫学的に異なる実体である。クローン病は、インターフェロン-γおよび腫瘍壊死因子-αの産生増強を特徴とする、Th1 T細胞媒介性応答により関連している。インターロイキン(IL)-12および場合によりIL-23はTh1細胞分化を支配するが、極性化Th1細胞の最適な誘導および安定化には、IL-15、IL-18、およびIL-21などのさらなるサイトカインが必要である。潰瘍性大腸炎では、局所的免疫応答の極性化は低く、CD1反応性ナチュラルキラーT細胞のIL-13産生を特徴とする。これらの違いを超えて、クローン病と潰瘍性大腸炎は、免疫粘膜細胞と非免疫粘膜細胞との間の活発なクロストークによって媒介される、腸損傷の重要な最終段階エフェクター経路を共有する。以下の実施例および参考文献において示されるように、IL-17およびIL-23はいずれも、IBDを有するヒトおよびIBDのマウスモデルの腸および/または血清において過剰発現している。(Nielson et al, Scand J Gastroenterol. 38:180 (2003)；Schmidt et al, Inflamm. Bowel Dis. 11:16 (2005)；Fuss et al, Inflamm Bowel Dis. 12:9 (2006))。さらに、IL-17および/またはIL-23/p19の中和によって、IBDの動物モデルにおいて疾患症状および病態が軽減される(Yen et al, J. Clin. Invest. 116:1310 (2006)；Zhang et al, Inflamm Bowel Dis. 12:382 (2006))。
【０２２７】
以下の実施例に示すように、IL-17およびIL-23/p19の発現はいずれも、DSS大腸炎モデルおよびT細胞移植大腸炎モデルで増加しており、抗IL-17A抗体と抗IL23p19抗体の併用による治療は、オキサゾロンIBDモデルにおいていずれか一方の抗体のみによる治療よりも効果的である。したがって、本発明のアンタゴニストは、IBDおよび関連疾患において炎症および病理学的影響を軽減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２２８】
クローン病は、腸管の慢性再発寛解型炎症性疾患である。クローン病は若年齢で発症する場合が多く、したがって患者は何十年もの間治療を必要とする。潰瘍性大腸炎ではより限定した組織層が罹患するのに対して(すなわち、結腸の粘膜および粘膜下層)、クローン病は、大腸および小腸の両方の腸壁全層にまで広がり得る。クローン病の症状には、下痢、体重減少、血液、および腹痛が含まれる。合併症は非常に重篤であり、これには腸瘻、膿瘍、および閉塞が含まれる。
【０２２９】
健康な人では、これらの抗原に対する免疫応答は持続して臨床的に検出されない。クローン病では、この応答は持続的であり、増幅される。正確な原因も特定の抗原誘因物も同定されていないが、遺伝的素因、＋内因性または外因性腸抗原への曝露などの環境的要因の組み合わせであると仮定されている。したがって、この特徴的な異常な免疫応答を抑制する試みでは、CD患者を治療するために免疫抑制剤が用いられる。しかしながら、これらの薬物の副作用および応答/非応答率から、より選択的でありかつ有効な治療法が必要であることが明白である。
【０２３０】
健康な腸の粘膜層には、好中球、マクロファージ、Bリンパ球およびTリンパ球、ならびに肥満細胞を含む多くの免疫細胞が存在する。粘膜を裏打ちする無傷の上皮は、GI管が日常的に曝露される大きな抗原負荷によってこれらの細胞が過剰刺激されるのを防いでいる。クローン病患者では、免疫細胞を多くの抗原に曝露する腸透過性が増大している(おそらくは、上記の遺伝的素因による)と考えられている。IL-23およびIL-17は、過剰反応および後の疾患進行において役割を果たすと考えられる。
【０２３１】
潰瘍性大腸炎(UC)は、結腸の粘膜または最内層の炎症および潰瘍形成を特徴とする、一般に結腸と称される大腸の炎症性疾患である。この炎症は高い頻度で結腸を空にし、下痢を引き起こす。症状には、軟便および関連する腹部痙攣、発熱、ならびに体重減少が含まれる。
【０２３２】
UCの正確な原因は不明であるが、最近の研究から、身体が異物と見なす体内のタンパク質に対して身体の天然の防御が作用すること(「自己免疫反応」)が示唆されている。おそらくはそれらが腸内の細菌タンパク質に似ているため、これらのタンパク質が、結腸の内層を破壊し始める炎症過程を誘導または促進する可能性がある。結腸の内層が破壊されると、潰瘍が形成されて、粘液、膿、および血液が放出される。この疾患は通常は直腸領域で始まり、最終的に大腸全体に広がり得る。炎症を繰り返して発症することで、腸壁および直腸壁は瘢痕組織を伴い肥厚する。結腸組織の死滅または敗血症は、重篤な疾患を併発し得る。潰瘍性大腸炎の症状は重症度が多様であり、その発症は段階的である場合もあれば、突発性である場合もある。呼吸器感染症またはストレスを含む多くの要因により、発作が誘発され得る。
【０２３３】
現在のところUCについての治療法は存在しないが、治療は結腸内層の異常な炎症過程の抑制に重点が置かれている。この疾患を治療するためには、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキセ−ト)、およびアミノサリチル酸を含む治療が用いることができる。しかし、副腎皮質ステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤の長期使用は、骨の菲薄化、白内障、感染症、ならびに腎臓および骨髄への影響を含む重度の副作用をもたらし得る。現在の治療法で良好な結果が得られない患者では、手術も1つの選択肢である。手術は結腸全体および直腸の摘出を含む。
【０２３４】
慢性潰瘍性大腸炎を部分的に模倣し得る動物モデルがいくつか存在する。最も広く用いられているモデルのいくつかは2,4,6-トリニトロベンスルホン酸/エタノール(TNBS)誘発大腸炎モデルまたはオキサゾロンモデルであり、これは結腸において慢性炎症および潰瘍形成を誘発する。直腸内点滴によりTNBSまたはオキサゾロンを感受性マウスの結腸に導入すると、これにより結腸粘膜においてT細胞媒介性免疫応答が誘導され、この場合、大腸壁全体にわたるT細胞およびマクロファージの高密度浸潤を特徴とする重度の粘膜炎症が起こる。さらに、この組織病理像は、進行性体重減少(消耗)、出血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚の臨床像を伴う(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000)。
【０２３５】
別の大腸炎モデルではデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を使用し、これにより出血性下痢、体重減少、結腸短縮、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍形成を呈する急性大腸炎が誘発される。DSS誘発大腸炎は、リンパ過形成、局所的陰窩損傷、および上皮潰瘍形成を伴う、固有層への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴づけられる。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性作用に起因して、固有層細胞の食作用ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生によって生じると考えられている。一般的に使用されているにもかかわらず、ヒト疾患との関連性についてのDSSの機構に関するいくつかの問題点は末解決のままである。DSSは、SCIDマウスなどのT細胞欠損動物においても認められるため、T細胞非依存性モデルと見なされる。
【０２３６】
本発明のアンタゴニストをこれらのTNBS、DSS、オキサゾロン、またはT細胞移植モデルに投与することにより、胃腸疾患の症状を改善しその疾患の経過を変更するためのそれらアンタゴニストの使用を評価することができる。さらに、IL-17およびIL-23シグナル伝達の阻害を示す結果から、他のIL-17/IL-23アンタゴニストもまた、大腸炎/IBDモデルにおいて症状を改善し疾患経過を変更するために用いることができるという概念の証拠が提供される。実施例28を参照されたい。
【０２３７】
3. 乾癬
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人が罹患している慢性皮膚疾患である。乾癬は新しい皮膚細胞が異常に増殖する場合に起こり、古い皮膚が十分に素早く脱落しない部位に、炎症性の肥大したかつ鱗状の皮膚斑を生じる。最もよく見られる形態である斑状乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた炎症性皮膚斑(「病変」)を特徴とする。乾癬は少数の斑に限定される場合もあれば、皮膚の中程度から広範囲の領域を侵す場合もあり、頭皮、膝、肘、および体幹に最もよく現れる。乾癬は目立つものの、感染性の疾患ではない。この疾患の病因は、罹患組織の慢性炎症を含む。IL-17およびIL-23はいずれも、非乾癬皮膚と比較して乾癬皮膚において過剰発現している(Li et al, J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 24:294 (2004)；Piskin et al, J Immunol. 176:1908 (2006))。したがって、本発明のアンタゴニストは、乾癬、その他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜のアレルギー、ならびに関連疾患において炎症および病理学的影響を軽減するための有益な治療薬として役立ち得る。
【０２３８】
乾癬は、相当な不快感を招き得る、皮膚のT細胞媒介性炎症性疾患である。乾癬は、治療法がなく、あらゆる年齢の人々が罹患する疾患である。ヨーロッパおよび北アメリカの人口の約2%が乾癬に罹患している。軽度の乾癬を有する個体は局所薬により疾患を制御できる場合が多いが、世界中の100万人を超える患者は、紫外線または全身免疫抑制療法を必要とする。不運なことには、紫外線照射の不便性および危険性、ならびに多くの治療法の毒性のために、長期使用が制限される。さらに、患者は通常、乾癬を再発し、場合によっては免疫抑制療法の停止直後にリバウンドが起こる。
【０２３９】
本明細書に記載する他の疾患モデルに加えて、ヒト乾癬病変に由来する炎症組織に及ぼす本発明のアンタゴニストの活性は、重症複合免疫不全(SCID)マウスモデルを用いてインビボで測定することができる。ヒト細胞を免疫不全マウスに移植したいくつかのマウスモデルが開発されている(まとめて異種移植モデルと称される)；例えば、Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22 (1994)、およびFlavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82 (1996)を参照されたい。乾癬のインビボ異種移植モデルとして、ヒト乾癬皮膚組織をSCIDマウスモデルに移植し、適切なアンタゴニストを投与する。さらに、ヒト乾癬皮膚移植片をAGR129マウスモデルに移植し、適切なアンタゴニストを投与するなど、当技術分野におけるその他の乾癬動物モデルを用いて、本発明のアンタゴニストを評価することも可能である(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Boyman, O. et al., J. Exp. Med. 199:731 (2004)を参照されたい)。IL-17、IL-23、またはIL-17およびIL-23の両方と結合するか、その活性を遮断するか、阻害するか、減少させるか、拮抗するか、または中和するIL-17/IL-23抗体または結合ペプチドは好ましいアンタゴニストである。同様に、ヒト大腸炎、IBD、関節炎、またはその他の炎症病変に由来する組織または細胞をSCIDモデルにおいて用いて、本明細書に記載のIL-17およびIL-23アンタゴニストの抗炎症特性を評価することもできる。
【０２４０】
治療の有効性は、当技術分野で周知の方法を用いて、治療集団における抗炎症効果の経時的な増加として測定され、統計学的に評価される。いくつかの例示的な方法には、これらに限定されないが、例えば乾癬モデルでの表皮肥厚、真皮上層における炎症細胞数、および不全角化の等級の測定が含まれる。そのような方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。例えば、Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253 (2001)；Zollner, T. M. et al. J. Clin. Invest. 109:671 (2002)；Yamanaka, N. et al. Microbio.l Immunol. 45:507 (2001)；Raychaudhuri, S. P. et al. Br. J. Dermatol. 144:931 (2001)；Boehncke, W. H et al.  Arch. Dermatol. Res. 291:104, (1999)；Boehncke, W. H et al.. J. Invest. Dermatol. 116:596 (2001)；Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146:580 (1995)；Boehncke, W. H et al. J. Cutan. Pathol. 24:1, (1997)；Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17:85 (1998)；およびVilladsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 112:1571 (2003)を参照されたい。炎症はまた、試料中に存在する炎症または損傷細胞数、IBDのスコア(体重減少、下痢、直腸出血、結腸の長さ)を定量するために、フローサイトメトリー(またはPCR)などの周知の方法を用いて経時的にモニターしてもよい。例えば、そのようなモデルにおいて試験するのに適した治療戦略には、IL-17およびIL-23とそれらの受容体との相互作用の破壊に基づく、IL-17およびIL-23アンタゴニスト(個々にまたは共に)または関連する複合体もしくはアンタゴニストを用いる直接治療が含まれる。
【０２４１】
4. アトピー性皮膚炎
ADは、ヘルパーT細胞サブセット2(Th2)の過活性化サイトカインを特徴とする一般的な慢性炎症性疾患である。ADの正確な病因は不明であるが、過活性Th2免疫応答、自己免疫、感染症、アレルゲン、および遺伝的素因を含む多くの要因が関連づけられている。疾患の重要な特徴には、乾皮症(皮膚の乾燥)、そう痒症(皮膚の痒み)、結膜炎、炎症性皮膚病変、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染症、血中好酸球増加、血清IgEおよびIgG1の上昇、ならびにT細胞、肥満細胞、マクロファージ、および好酸球浸潤を伴う慢性皮膚炎が含まれる。黄色ブドウ球菌による定着または感染症はADを悪化させ、この皮膚疾患の慢性性を持続させることが認識されている。
【０２４２】
ADは喘息およびアレルギー性鼻炎患者において認められる場合が多く、アレルギー疾患の最初の症状であることが多い。西欧諸国における人口の約20%がこれらのアレルギー疾患に罹患しており、先進諸国におけるADの発症率は理由がわからないものの上昇している。ADは典型的に小児期に始まり、青年期を通して成人期まで持続し得る場合が多い。ADの現在の治療には、外用副腎皮質ステロイド、経口シクロスポリンA、タクロリムス(FK506軟膏)などの非副腎皮質ステロイド免疫抑制剤、およびインターフェロン-γが含まれる。ADに関する多様な治療にもかかわらず、多くの患者の症状は改善せず、または患者は投薬に対する副作用を有して、他のより効果的な治療薬を探す必要がある。本発明のアンタゴニストは、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、および本明細書に開示する他の炎症状態などの特定のヒト疾患の治療において、IL-17およびIL-23(p19を介する)を中和するために用いることができる。
【０２４３】
5. 喘息
IL-17は、気道におけるアレルゲン誘発性T細胞活性化および好中球流入において重要な役割を果たす。IL-17の受容体は気道で発現しており(Yao, et al. Immunity 3:811 (1995))、アレルギー性喘息におけるIL-17媒介性好中球動員は、主として、IL-17刺激を受けたヒト気管支上皮細胞(HBEC)およびヒト気管支線維芽細胞によって産生される化学誘引物質IL-8、GRO-α、およびマクロファージ炎症性タンパク質-2(MIP-2)により誘導される(Yao, et al. J Immunol 155:5483 (1995))；Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001))。IL-17はまたHBECを刺激して好中球活性化因子であるIL-6を放出させ(Fossiez, et al, J Exp Med 183:2593 (1996)、およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001))、TNF-αと相乗作用してインビトロでヒト好中球の生存を延長することが示されている(Laan, et al. Eur Respir J 21:387 (2003))。さらに、IL-17は、気道再構築に関連したサイトカイン、例えば、線維化促進性(profibrotic)サイトカインであるIL-6およびIL-11、ならびに炎症性メディエータ顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の分泌を増強するその能力により、喘息における炎症反応を増幅し得る(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001))。
【０２４４】
臨床的証拠から、喘息の急性重症悪化が気道における好中球の動員および活性化と関連していることが示され、したがってIL-17が喘息において重要な役割を果たしている可能性は高い。さらに、IL-23はIL-17産生細胞(例えば、Th17細胞)の維持および分化に重要であるため、IL-23も同様に喘息において役割を果たしている可能性が高い。軽症喘息患者は、遊離可溶性IL-17タンパク質の局所濃度の検出可能な増加を示し(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001))、豚舎に曝露されたために重度の気道炎症を誘発された健康なヒトボランティアは、気管支肺胞腔中の遊離可溶性IL-17タンパク質濃度の顕著な増加を示す(Fossiez et al, J Exp Med 183:2593 (1996)、およびLinden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001))。さらに、喀痰中のIL-17レベルは、気道過敏性が増加した個体と相関していた Barczyk, et al. Respir Med 97:726 (2003)。
【０２４５】
気道過敏症の動物モデルにおいて、感作マウスにオボアルブミンを長期吸入させると、気管支好中球増加と共に、気管支好酸球性炎症および炎症肺組織におけるIL-17 mRNA発現の早期誘導が起こった Hellings, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003)。抗IL-17モノクローナル抗体により気管支好中球流入は大きく減少したが、気管支肺胞洗浄液および血清中のIL-5レベルが有意に増強され、またアレルゲン誘発性気管支好酸球流入が悪化し、IL-17が抗原攻撃後の好中球蓄積と好酸球蓄積と間の平衡の決定に関与している可能性が示唆される 同文献。
【０２４６】
喘息のほかに、いくつかの慢性炎症性気道疾患も気道中の好中球動員を特徴とし、IL-17およびIL-23はいずれも、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、細菌性肺炎、および嚢胞性線維症などの呼吸器疾患の発症において重要な役割を果たすことが報告されている(Linden, et al. Eur Respir J 15:973 (2000)、Ye, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 25:335 (2001)、Rahman, et al. Clin Immunol 115:268 (2005)；Dubin and Kolls, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 292: L519-28 (2007)；McAllister et al. J. Immunol. 175:404-412 (2005))。抗IL-17および/または抗IL-23治療分子は、炎症のインビトロモデルにおいて慢性炎症性気道疾患に有効であることが実証され得た。IL-17および/またはIL-23活性に対するアンタゴニストが、培養HBECまたは気管支線維芽細胞からのサイトカインおよびケモカイン産生を誘導するためのIL-17またはおよび/またはIL-23シグナル伝達を阻害する能力は、IL-17および/またはIL-23刺激に直接起因する炎症性メディエータの産生の防止におけるこのようなアンタゴニストの有効性の尺度として用いることができる。IL-17および/またはIL-23活性に対するアンタゴニストを添加することで、炎症性メディエータの産生および発現が顕著に減少する場合には、そのアンタゴニストは慢性気道炎症と関連する炎症局面において有効であることが予測される。
【０２４７】
6. 多発性硬化症
多発性硬化症は、中枢神経系(CNS)の脱髄および慢性炎症を特徴とする、比較的よくみられる自己免疫疾患である。疾患発症の基礎をなす機構は明確に理解されていないが、多発性硬化症の臨床的進行に寄与する疾患過程は、炎症、脱髄、および軸索喪失、または神経変性である。マクロファージおよびミクログリアはCNSの主要な免疫細胞である。これらの細胞、ならびにT細胞、好中球、アストロサイト、およびミクログリアは、例えば多発性硬化症の免疫関連病態に寄与し得る。さらに、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、およびミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質(MOG)、ならびにおそらくは他のミエリンタンパク質を含むいくつかのミエリンタンパク質に対するT細胞反応性/自己免疫が、多発性硬化症の疾患状態および病態の誘導および持続に関連づけられている。自己反応性T細胞とミエリンタンパク質のこの相互作用は、とりわけTNF-a、IFN-g、およびIL-17を含む炎症誘発性サイトカインの放出をもたらし得る。付加的に、T細胞の増殖、B細胞およびマクロファージの活性化、ケモカインおよび接着分子の上方制御、ならびに血液脳関門の破壊を来たす。その後、オリゴデンドロサイトおよび軸索の喪失、ならびに脱髄「プラーク」の形成という病態が起こる。プラークは、ミエリン鞘が存在せず、脱髄軸索がグリア性瘢痕組織内に埋め込まれた病変からなる。脱髄はまた、自己抗体によるミエリン抗原の特異的認識およびオプソニン化、その後の補体および/または活性化マクロファージ媒介性破壊の結果としても起こり得る。進行性多発性硬化症で認められる不可逆的神経障害に主に関与すると考えられているのは、この軸索喪失および神経変性である。
【０２４８】
ヒト多発性硬化症の経過中には、大量の臨床的および病理学的不均一性が存在する。症状はほとんどの場合18〜50歳で現れるが、あらゆる年齢層で現れ得る。多発性硬化症の臨床症状は、軽度の視覚障害および頭痛から、失明、重度の運動失調、および麻痺まで様々であり得る。患者の大部分(約70〜75%)は、疾患症状が数時間から数日のうちに再発し、その後非常にゆっくりと回復する再発寛解型多発性硬化症を有し、寛解期に症状が見られないことは珍しくない。再発および寛解の発生および頻度は大きく異なり得るが、時間が経つにつれて、回復期が不完全となり、回復期が起こるのが遅くなる場合がある。このような場合の疾患のこの悪化は二次性進行型多発性硬化症として分類され、多発性硬化症患者の約10〜15%で起こる。別の10〜15%の患者は一次性進行型多発性硬化症と診断され、疾患症状および身体障害は疾患過程を通して一定の速度で進行する。
【０２４９】
IL-23およびIL-17はいずれも、多発性硬化症を有するヒトの中枢神経系において、および多発性硬化症の動物モデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)であるマウスにおいて過剰発現している。(実施例11を参照されたい)。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG) 35-55ペプチドまたはプロテオリピドペプチド(PLP)のいずれかによってEAEが誘導された場合に、マウスにおいて過剰発現が認められる。さらに、IL-23/p19またはIL-17のいずれか一方を中和すると、マウスにおいてEAE症状が改善される(Park et al, Nat Immunol. 6:1133 (2005);)；Chen et al, J Clin Invest. 116:1317 (2006))。
【０２５０】
IL-17および/またはIL-23活性に対するアンタゴニストが、IL-17またはおよび/またはIL-23シグナル伝達誘導性サイトカインおよびケモカイン産生を阻害する能力は、多発性硬化症の治療におけるこのようなアンタゴニストの有効性の尺度として用いることができる。IL-17および/またはIL-23活性に対するアンタゴニストを添加することで、炎症性メディエータの産生および発現(すなわち、CNS浸潤免疫細胞；炎症性サイトカイン/ケモカインのCNS発現等)および多発性硬化症の症状(例えば、麻痺；運動失調；体重減少等)が顕著に減少する。実施例8を参照されたい。これらの結果から、IL-17および/またはIL-23活性に対するアンタゴニストがヒトの治療において有効であることが示される。
【０２５１】
7. 癌
慢性炎症は長い間悪性腫瘍の発生増加と関連づけられており、調節機構における類似性が1世紀以上にわたり示唆されてきた。自然免疫細胞の浸潤、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性上昇、ならびに血管新生および血管密度の増加は、慢性炎症と腫瘍関連炎症との間の類似性のいくつかの例である。逆に、免疫監視による早期の悪性病変の排除は、腫瘍浸潤T細胞または上皮内リンパ球の細胞傷害活性に依存するが、癌を発症するリスクの律速段階であると考えられている。
【０２５２】
腫瘍生物学および/または血管新生におけるIL-23およびIL-17の重要な役割を記載している出版物が多数存在する。IL-23およびIL-17はいずれも、これらに限定されないが、結腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、および胃癌、ならびに黒色腫およびT細胞リンパ腫を含むいくつかのヒト腫瘍および癌において上方制御されることが発表されている(Tartour et al, Cancer Res. 59:3698 (1999)；Kato et al, Biochem. Biophys. Re.s Commun. 282:735 (2001)；Steiner et al, Prostate. 56:171 (2003)；Langowksi et al, Nature, 442:461-5, (2006))。したがって、IL-17およびIL-17の重要な上流調節因子であるIL-23(p19を介する)を両方中和することは、癌および他の腫瘍性疾患を治療する強力かつ効果的な手段である。したがって、本発明のアンタゴニスト(すなわち、二重特異性抗体または二重特異性scFvのような、IL-17およびIL-23に対する単一の中和実体もしくは抗体、または両方を共に中和する拮抗分子)でIL-17およびIL-23を両方中和することは、IL-17またはIL-23のいずれか一方のみに対するアンタゴニストよりもこれらの疾患においてより有効であると考えられる。
【０２５３】
血管新生とは、既存の血管からの新たな毛細血管の形成を指す。血管新生が血液悪性腫瘍および固形腫瘍において重要な役割を果たすという報告がいくつか存在する。血管新生の開始および血管新生表現型への転換は、血管新生促進因子と血管新生阻害因子との間の変化を必要とする(Folkman, Nat. Med.1:27 (1995))。IL-17は、成熟好中球の増殖を開始することにより、および骨髄系前駆細胞を拡大することにより、刺激性造血サイトカインとして働く。IL-17が血管新生促進活性を有し、腫瘍促進と関連した血管内皮細胞の遊走を促進することが十分に実証されている(Numasaki et al, Blood, 101:2620 (2003)；Yang et al, J. Biol. Chem., 278:33232 (2003)；Fujino et al, Gut, 52:65 (2003))。インビトロ血管新生活性は、中和抗IL-17モノクローナル抗体によるIL-17の中和によって抑制することができ、この作用におけるIL-17の役割がさらに支持される。IL-17はまた、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、および血管内皮増殖因子(VEGF)の分裂促進活性を選択的に増強することもでき、血管内皮細胞のbFGF、HGF、およびVEGF誘導性増殖を介してbFGF、HGF、およびVEGF媒介性血管新生を促進することもできる(Takahashi et al, Immunol Lett. 98:189 (2005))。IL-17は、非小細胞肺癌(NSCLC)株において、いくつかの血管新生CXCケモカイン(例えば、CXCL1、CXCL5、CXCL6、およびCXCL8)の分泌を増加させることが報告されている。内皮細胞走化性活性(正味の血管新生能の基準)は、組換えIL-17で刺激したNSCLC由来の馴化培地に応答して増加する。IL-17をトランスフェクションしたNSCLC株は、SCIDマウスに移植した場合に、対照と比較してより迅速に増殖した(Numasaki et al, J Immunol. 175:6177 (2005))。さらに、IL-17は腫瘍部位においてIL-6増加と関連していることが報告されており、MMP-9発現を増加させることが十分に報告されている。MMP-9は、炎症疾患、自己免疫、および癌における重要な調節因子である。したがって、これらの報告は、IL-17の血管新生促進作用および腫瘍促進作用を明らかに意味する。したがって、本発明のアンタゴニスト(すなわち、二重特異性抗体または二重特異性scFvのような、IL-17およびIL-23に対する単一の中和実体もしくは抗体、または両方を共に中和する拮抗分子)でIL-17およびIL-23を両方中和することは、IL-17またはIL-23のいずれか一方のみに対するアンタゴニストよりもより有効であると考えられる。
【０２５４】
IL-17と同様に、IL-23もMMP-9の上方制御を含む炎症応答を促進し、また血管新生を増加させることおよびCD8+ T細胞浸潤を減少させることが報告されている。総合すると、これらの作用は、腫瘍、癌、および他の形質転換増殖の開始、進行、および/または維持の増強をもたらし得る。IL-23が癌性疾患において重要な役割を果たすことは、モノクローナル抗体またはマウスにおける遺伝子欠失よるIL-23の中和が、いくつかのマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を減少させるという知見によって支持される(Langowksi et al. Nature, 442: 461-5 (2006))。有効性は、IL-17発現の減少、ならびに顆粒球浸潤、G-CSF、およびMMP-9などのIL-17関連腫瘍形成バイオマーカーの減少と関連している。したがって、本発明のアンタゴニスト(すなわち、二重特異性抗体または二重特異性scFvのような、IL-17およびIL-23に対する単一の中和実体もしくは抗体、または両方を共に中和する拮抗分子)でIL-17およびIL-23を両方中和することは、IL-17またはIL-23のいずれか一方のみに対するアンタゴニストよりもこれらの疾患においてより有効であると考えられる。
【０２５５】
8. 過敏性腸症候群(IBS)
過敏性腸症候群(IBS)は、腹痛もしくは腹部不快感および排便習慣異常を特徴とする疾患である。IBS患者は、排便習慣に基づいて3つの主要な群に特徴づけられ得る：主に軟便または頻回便である群、主に硬便または低頻度便である群、および交互便または通常便である群(Talley et al., Expert Opin. Emerg. Drugs 7:91-8 (2002))。腸運動の変化、上皮機能の異常、便およびガスの通過異常、ならびにストレスが症状に寄与し得るが、内臓過敏が大部分の患者における重要な特徴である。疼痛シグナル伝達に影響する遺伝要因および求心性シグナルの中央処理障害が、特定の環境曝露後に個体をIBSにかかりやすくすると仮定される。研究から、結腸における炎症反応が平滑筋および腸神経の感受性増加に寄与し、ひいては腸における感覚-運動機能を撹乱し得ることもまた実証されている(Collins et al., Can. J. Gastroenterol. 15 Suppl. B:14B-16B (2001))。IBSとIBDとの間には臨床的重複が認められ、IBDと診断される前の患者ではIBS様症状が頻繁に報告され、確定されたIBDからの寛解期にある患者には予想を上回るIBS症状が存在する。このように、これらの病態は予想よりも高い頻度で共存し得るか、または連続体上に存在して、IBSとIBDが両極端に位置し得る。しかし、大部分のIBS患者では、結腸生検試料は正常に見えることに留意されたい。それにもかかわらず、IBSは非常に多くの個体に重大な影響を及ぼし(米国における2000年の罹患率は、約1千600万人である)、総費用負担は17億ドルに上る(2000年)。このように、最も蔓延しかつ費用のかかる胃腸の疾患および障害の中でも、IBSは胃食道逆流症(GERD)に次いで第2位である。しかしGERDとは異なり、IBSの治療は不十分なままであり((Talley et al., Expert Opin. Emerg. Drugs 7:91-8 (2002))；Farhadi et al., Expert Opin. Investig. Drugs 10:1211-22 (2001)；Collins et al., Can. J. Gastroenterol. 15 Suppl. B:14B-16B (2001))、IBSでは医学的な必要性が明らかに満たされていないことが実証される。
【０２５６】
正常な恒常性の中枢性(心理社会的)または末梢性(組織刺激、炎症、感染)撹乱に至る、中枢神経系(CNS)におけるまたは腸における神経、免疫、または神経免疫回路の反応増強を仮定した、収束疾患モデルが提唱されている(Talley et al., Expert Opin. Emerg. Drugs 7:91-8 (2002))。この反応増強が腸運動、上皮機能(免疫、透過性)、および内臓過敏の調節不全を引き起こし、次にこれがIBS症状を引き起こす。
【０２５７】
IBSの病因には、ニューロンを刺激する分子、ならびにIL-17AおよびIL-23p19を含む炎症過程の開始に関与する分子の役割を含む、いくつかの異なる分子の役割が存在すると考えられる。
【０２５８】
これら分子の阻害剤の有効性は、動物疾患モデルにおいてインビボで試験することができる。IBSの重要な特徴を模倣し、中枢標的化刺激(ストレス)または末梢標的化刺激(感染、炎症)に伴って生じるいくつかの動物モデルが提唱されている。IBSの治療における阻害剤の有効性を判定するために用いることのできるインビボ動物モデルの2つの例には、(i) IBSの一次CNS標的化病因に焦点をおいたモデル(ストレスモデル)、および(ii) 腸標的化ストレス誘導因子(すなわち、腸炎症、感染、または身体的ストレス)に焦点をおいたモデルがある。しかしながら、CNSにおけるまたは胃腸(GI)管における事象は分離して起こらないこと、およびIBSの症状は、CNSからGIに対するシグナルとその逆のシグナルとの間の複雑な相互作用によって生じる可能性が最も高いことに留意されたい。
【０２５９】
したがって、要約すると、自己免疫疾患および癌性疾患の両方の発症、進行、および維持において重要な役割を果たす分子、ならびにIL-17およびIL-23によって共有される発症経路がいくつか存在する。これらには、IL-17およびIL-23の血管新生促進の役割；IL-17およびIL-23によるMMP-9レベルおよび活性の増強；IL-23、TGF-b、およびIL-6によって媒介されるTh17細胞の生成および/または維持；Foxp3+調節性T細胞の生成におけるTGF-bおよびIL-6の役割；ならびにさらなる経路および分子が含まれる。したがって、IL-17/IL-23軸は、自己免疫疾患に関連した不適切でかつ病原性のT細胞応答、腫瘍促進炎症誘発過程、および適応的免疫監視が腫瘍に浸潤できないことへの重要な関連を示す。したがって、本発明のアンタゴニスト(すなわち、二重特異性抗体または二重特異性scFvのような、IL-17およびIL-23に対する単一の中和実体もしくは抗体、または両方を共に中和する拮抗分子)でIL-17およびIL-23を両方中和することは、IL-17またはIL-23のいずれか一方のみに対するアンタゴニストよりもこれらの疾患においてより有効であると考えられる。
【０２６０】
J) 薬学的製剤
薬学的使用のために、本発明の抗体は、従来法に従って非経口送達、特に静脈内または皮下送達用に製剤化する。静脈内投与は、ボーラス注射、例えばミニポンプもしくはその他の適切な技術を用いる制御放出、または典型的に1〜数時間にわたる注入による。一般的に、薬学的製剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、5%デキストロース水溶液等の薬学的に許容される溶媒と共に造血タンパク質を含む。製剤は、1つまたは複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミン等をさらに含み得る。そのような併用療法を用いる場合、サイトカインは単一製剤中に併用してもよく、または別の製剤として投与してもよい。製剤化方法は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990に開示されている。治療用量は、一般的に0.1〜100 mg/kg患者体重/日の範囲であり、好ましくは0.5〜20 mg/kg/日の範囲であり、正確な用量は、治療しようとする病態の性質および重症度、患者の体質等を考慮して、容認される基準に従って臨床医により決定される。用量の決定は当業者のレベルの範囲内である。タンパク質は、一般的に、化学療法もしくは骨髄移植後最長28日までの期間にわたり、または血小板数＞20,000個/mm3、好ましくは＞50,000個/mm3が得られるまで投与する。より一般的には、タンパク質は1週間またはそれ未満にわたり、多くの場合1〜3日間にわたり投与する。概して、本発明の抗体の治療有効量は、リンパ系または骨髄系前駆細胞の増殖および/または分化の臨床的に有意な増加を生じるのに十分な量であり、これは成熟細胞(例えば、血小板または好中球)の循環レベルの増加として現れる。したがって、血小板障害の治療は、血小板数が少なくとも20,000個/mm3、好ましくは50,000個/mm3に達するまで継続する。本発明の抗体はまた、IL-3、IL-6、およびIL-11；幹細胞因子；エリスロポエチン；G-CSFおよびGM-CSFなどの他のサイトカインと併用して投与することもできる。併用療法の投与計画において、他のサイトカインの1日量は当業者に一般に公知であり、または過度の実験を行うことなく決定され得る。例えばEPOとの併用療法は、EPOレベルが低い貧血患者において適応とされる。
【０２６１】
一般的に、投与する抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、および既往歴などの要因に応じて変動する。典型的には、約1 pg/kg〜10 mg/kg(薬剤量/患者体重)という用量範囲の抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、状況に応じてこれよりも低用量または高用量を投与してもよい。
【０２６２】
対象に対する本発明の抗体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、局所カテーテルによる潅流、または直接的病巣内注射であってよい。注射により治療タンパク質を投与する場合、投与は持続注入または単回もしくは複数回のボーラス投与によるものであってよい。
【０２６３】
さらなる投与経路には、経口、経粘膜、経肺、および経皮が含まれる。経口送達は、ポリエステル微粒子、ゼイン微粒子、プロテイノイド微粒子、ポリシアノアクリレート微粒子、および脂質ベースの系に適している(例えば、DiBase and Morrel,「Oral Delivery of Microencapsulated Proteins」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)を参照されたい)。鼻腔内送達の実行可能性は、インスリン投与のような様式で例証される(例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)を参照されたい)。本発明の抗体を含む乾燥または液体粒子を調製し、乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を用いて吸入させることができる(例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998)；Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999))。このアプローチは、エアロゾル化されたインスリンを肺に送達する携帯式の電動吸入装置である、AERX糖尿病管理システムによって例証される。研究の結果、48,000 kDaもの大きさのタンパク質が、低周波数超音波を用いることで皮膚を介して治療濃度で送達されることが示されており、これは経皮投与の実行可能性を示すものである(Mitragotri et al., Science 269:850 (1995))。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、IL-17およびIL-23/p19結合活性を有する分子を投与するための別の手段を提供する(Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997))。
【０２６４】
本発明の1つまたは複数の抗体を含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それにより治療タンパク質は薬学的に許容される担体との混合物中に組み込まれる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得る場合に、「薬学的に許容される担体」と表現される。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。その他の適切な担体は当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)を参照されたい。
【０２６５】
治療目的のために、本発明の抗体および薬学的に許容される担体を、治療有効量で患者に投与する。本発明の治療分子と薬学的に許容される担体との混合物は、投与量が生理学的に有意である場合に、「治療有効量」で投与されると表現される。薬剤は、その存在によりレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化が生じる場合に、生理学的に有意である。例えば、炎症の治療に用いられる薬剤は、その存在により炎症反応が軽減する場合に、生理学的に有意である。効果的な治療は、様々な方法で評価することができる。1つの態様において、効果的な治療は炎症の軽減によって決定される。他の態様では、効果的な治療は炎症の抑制によって明らかにされる。さらなる他の態様では、効果的な治療は、体重増加、体力回復、疼痛軽減、成長、および健康回復に関する患者からの主観的指標などの徴候を含む患者の満足感向上により測定される。
【０２６６】
本発明の抗体を含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射用溶液および経口懸濁剤によって例証される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態は、小型浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997)；Ranade, 「Implants in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., 「Protein Delivery with Infusion Pumps」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., 「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。
【０２６７】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象の静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与で送達するための1つの手段を提供する。リポソームとは、水性区画を囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微視的小胞である(一般的には、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993)、Kim, Drugs 46:618 (1993)、およびRanade, 「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは組成が細胞膜と類似しており、その結果リポソームは安全に投与することができ、また生分解性である。調製法に応じて、リポソームは単層または多層の場合があり、またリポソームの大きさは0.02μm〜10μm超の直径で様々であり得る。種々の薬剤をリポソーム内に封入することができ：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987）、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)を参照されたい)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより、封入薬剤の治療利用能を制御することが可能である。
【０２６８】
リポソームは実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、次いで封入された薬剤を緩やかに放出し得る。または、吸収されたリポソームは、食作用性の細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、封入薬剤が放出される(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985))。静脈内投与後、小さなリポソーム(0.1〜1.0μm)は、典型的に、主に肝臓および脾臓に位置する網内系の細胞によって取り込まれ、3.0μmより大きなリポソームは肺に蓄積する。網内系の細胞による小さなリポソームのこのような選択的取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０２６９】
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的なマクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避され得る(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984))。加えて、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質をリポソーム膜に取り込むと、網内系による取り込みが有意に減少することが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０２７０】
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、またはリポソームに受容体もしくはリガンドを挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するように調製することができる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含めて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられている(Hayakawa et al.、日本特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993))。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油(HCO-60)を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで水によりこの混合物を再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)とダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的化することが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997))。
【０２７１】
または、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの種々の標的化リガンドをリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面上に発現するアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的化することができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソームの取り込みが大きく促進されることを示している。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェチュインを事前に注入することにより阻害され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997))。ポリアコニチル化(polyaconitylated)ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に標的化するための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997))。さらに、Geho, et al. 米国特許第4,603,044号は、肝臓の特殊化した代謝細胞に会合している肝胆道受容体に対して特異性を有する肝細胞指向性リポソーム小胞送達系について記載している。
【０２７２】
組織標的化のためのより一般的なアプローチでは、標的細胞を、標的細胞によって発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体であらかじめ標識する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体をリポソームに直接結合する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。
【０２７３】
ポリペプチドおよび抗体は、タンパク質微小カプセル化の標準的な技術を用いてリポソーム内に封入することができる(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991)、Alving et al. 「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」, Liposome Technology, 2nd Edithion, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)を参照されたい)。上述したように、治療上有用なリポソームは様々な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０２７４】
分解性ポリマー微粒子は、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するように設計されている。微粒子は、ポリ(ラクチド・グリコリド共重合体)(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、このポリマー内にタンパク質が封入される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995)；Ranade, 「Role of Polymers in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, 「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール(PEG)でコーティングされたナノ粒子もまた、治療タンパク質を静脈内投与するための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)を参照されたい)。
【０２７５】
scFv、Fab、ダイアボディ等を含む本明細書に記載の抗体断片は、その半減期を延長するための実体に融合させることができる。例えば、Kubetzko S. et al. J Biol Chem 281:35186 (2006) [修飾p185Her2(Her2)特異的scFv 4D5、ならびに結合親和性、機能的親和性、腫瘍分布、およびPKの測定。腫瘍を有するマウスにおいて、scFv単量体および二量体の20 kDペグ化により、血清半減期が延長し、腫瘍分布が拡大した。]；Yang K et al. Protein Engineering 16:761 (2003) [2O kDまたは40 kDペグ化抗TNF-a scFv(D2E7/Humira)は、標的に対する親和性および薬理学的活性を保持した。マウスでの静脈内投与後、40 kDペグ化scFvは、非修飾scFvと比較して循環半減期が200倍延長し、AUCが800倍増加した。]；Chapman AP et al. Nature Biotech 17:780 (1999). [ランダム 対 標的化PEG結合および異なる大きさのPEG分子の親和性および半減期を探索する実験においてFabを使用。ヒンジ領域システイン残基に対するPEG部分の部位特異的結合により、PEGのランダム結合と比較して、標的に対する結合親和性が高まることを実証している。Biacore解析によって測定される結合親和性は、親Igと、5 kD、25 kD、および分枝40 kD PEGの結合によって修飾されたFab分子とで等しかった。25 kDおよび40 kDペグ化Fabは、マウスおよびサルにおいて、親Ig分子と匹敵するかまたはそれよりも長い半減期を有し、親Ig分子の50〜70%のAUCを有した]；Muller D et al. J Biol Chem 282:12650 (2007). [癌胎児抗原(CEA)およびCD3に対するいくつかの二重特異性抗体へのヒト血清アルブミン(HSA)の融合、ならびに活性および薬物動態の比較。HSAに融合されたscFv2、scDb、およびtaFv(論文中に示される構築物)は、完全な結合能および活性を保持した。HSA構築物の血清中での半減期は、それらそれぞれの非修飾親分子と比較して5〜11倍延長し、AUCは6〜7倍増加した]；およびKipriyanov SM et al. J Mol Biol 293:41 (1999). [抗CD3/CD-19直列ダイアボディ分子は、一本鎖Fv断片およびダイアボディと比較して、より高い親和性、より緩慢な解離、血清中でのより高い安定性、より高いインビボ安定性、およびより長いインビボ半減期を有することが実証された]を参照されたい。
【０２７６】
本発明はまた、抗IL-17A抗体および抗IL-23/p19抗体などの、IL-17およびIL-23結合活性を有するポリペプチドであって、上記のポリマーに連結された化学修飾ポリペプチドも意図する。
【０２７７】
当業者は、例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されるように、他の剤形を考案することができる。
【０２７８】
例として、薬学的組成物は、本発明の抗体を含む容器を含むキットとして提供され得る。本発明の抗体は、単回もしくは複数回用量の注射用溶液の形態で、または注射前に再構成される滅菌粉末として提供され得る。または、このようなキットは、治療ポリペプチドを投与するための乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を含み得る。このようなキットは、薬学的組成物の適応および用法に関する書面情報をさらに含み得る。さらに、このような情報は、抗体組成物が、IL-17およびIL-23に対する公知の過敏症を有する患者には禁忌であるという記述を含み得る。
【０２７９】
本発明の抗体を含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射用溶液、エアロゾル、滴剤、トポロジー溶液(topological solution)、および経口懸濁剤によって例証される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態は、小型浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997)；Ranade, 「Implants in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., 「Protein Delivery with Infusion Pumps」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., 「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。その他の固体形態には、クリーム剤、ペースト剤、その他のトポロジー適用(topological application)等が含まれる。
【０２８０】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象の静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与で送達するための1つの手段を提供する。リポソームとは、水性区画を囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微視的小胞である(一般的には、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993)、Kim, Drugs 46:618 (1993)、およびRanade, 「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは組成が細胞膜と類似しており、その結果リポソームは、安全に投与されることができ、かつ生分解性である。調製法に応じて、リポソームは単層または多層の場合があり、またリポソームの大きさは0.02μm〜10μm超の直径で様々であり得る。種々の薬剤をリポソーム内に封入することができ：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987）、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)を参照されたい)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより、封入薬剤の治療利用能を制御することが可能である。
【０２８１】
リポソームは実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、次いで封入された薬剤を緩やかに放出し得る。または、吸収されたリポソームは、食作用性の細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、封入薬剤が放出される(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985))。静脈内投与後、小さなリポソーム(0.1〜1.0μm)は、典型的に、主に肝臓および脾臓に位置する網内系の細胞によって取り込まれ、3.0μmより大きなリポソームは肺に蓄積する。網内系の細胞による小さなリポソームのこのような選択的取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０２８２】
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的なマクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避され得る(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984))。加えて、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質をリポソーム膜に取り込むと、網内系による取り込みが有意に減少することが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０２８３】
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、またはリポソームに受容体もしくはリガンドを挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するように調製することができる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含めて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられている(Hayakawa et al.、日本特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993))。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油(HCO-60)を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで水によりこの混合物を再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)とダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的化することが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997))。
【０２８４】
または、本発明の抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの種々の標的化リガンドをリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面上に発現するアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的化することができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソームの取り込みが大きく促進されることを示している。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェチュインを事前に注入することにより阻害され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997))。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に標的化するための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997))。さらに、Geho, et al. 米国特許第4,603,044号は、肝臓の特殊化した代謝細胞に会合している肝胆道受容体に対して特異性を有する肝細胞指向性リポソーム小胞送達系について記載している。
【０２８５】
組織標的化のためのより一般的なアプローチでは、標的細胞を、標的細胞によって発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体であらかじめ標識する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体をリポソームに直接結合する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。
【０２８６】
本発明の抗体は、タンパク質微小カプセル化の標準的な技術を用いてリポソーム内に封入することができる(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991)、Alving et al. 「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」, Liposome Technology, 2nd Edithion, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)を参照されたい)。上述したように、治療上有用なリポソームは様々な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０２８７】
分解性ポリマー微粒子は、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するように設計されている。微粒子は、ポリ(ラクチド・グリコリド共重合体)(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、このポリマー内にタンパク質が封入される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995)；Ranade, 「Role of Polymers in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, 「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール(PEG)でコーティングされたナノ粒子もまた、治療タンパク質を静脈内投与するための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)を参照されたい)。
【０２８８】
当業者は、例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されるように、他の剤形を考案することができる。
【０２８９】
本発明は、IL-17およびIL-23のアンタゴニスト、ならびに本明細書に記載のこのようなアンタゴニストを含む方法および治療的使用を意図する。そのような組成物は担体をさらに含み得る。担体は、従来の有機または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が含まれる。
【０２９０】
本発明を以下の非制限的な実施例によりさらに説明する。
【０２９１】
実施例
実施例1
ヒトIL-17のヒトIL-17Rへの結合
A) 同族IL-17受容体(IL-17R)をトランスフェクションした細胞に対するビオチン化IL-17の結合
ヒトIL-17R(SEQ ID NO:7に示されるポリヌクレオチド；SEQ ID NO:8に示されるポリペプチド)をコードする発現ベクターをトランスフェクションしたベビーハムスター腎(BHK)細胞を、ビオチン化ヒトIL-17と結合する能力に関して評価した。細胞をベルセンを用いて回収し、計数し、HBSS＋1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、10 mM Hepes、および0.1%アジ化ナトリウム(w/v)である染色媒体(SM)で107個細胞/mlとなるよう希釈した。ビオチン化ヒトIL-17(SEQ ID NO:2)を、種々の濃度で細胞と共に氷上で30分間インキュベートした。30分後、過剰なサイトカインをSMで洗浄除去し、細胞をフィコエリトリン結合ストレプトアビジン(SA-PE)の1:100希釈液と共に氷上で30分間インキュベートした。過剰なSA-PEを洗浄除去し、細胞をフローサイトメトリーにより解析した。サイトカイン結合の量を、サイトカイン染色の平均蛍光強度から定量した。結果から、ヒトIL-17がヒトIL-17Rトランスフェクション細胞に高い親和性で結合することが実証される。
【０２９２】
B) 非標識サイトカインによるビオチン化ヒトIL-17の特異的結合の阻害
上記の通りに結合試験を行ったが、過剰な非標識ヒトIL-17を、過剰な非標識IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、およびIL-23と同様に結合反応物中に含めた。BHK細胞を用いた試験において、非標識サイトカインの量を一定範囲の濃度にわたって変更し、本発明者らは、非標識ヒトIL-17の添加が、ヒトIL-17Rトランスフェクション細胞に対するヒトIL-17の結合において競合したことを見出した。このことから、ヒトIL-17がヒトIL-17Rに特異的に結合すること；試験した他のIL-17ファミリーサイトカイン(B、C、D、E、およびF)が結合に関して競合できなかったことが示され、IL-17Rに対するIL-17の特異性、および抗体によるIL-17の拮抗的結合を試験するためのこのアッセイ法の使用がさらに支持される。
【０２９３】
C) 抗ヒトIL-17アンタゴニストによるビオチン化ヒトIL-17の特異的結合の阻害
ヒトIL-17に対する一定範囲の濃度の本発明のアンタゴニスト(すなわち、抗体)を結合反応物中に含めることを除いては、上記の通りに結合試験を行った。本発明者らは、抗ヒトIL-17抗体がヒトIL-17RトランスフェクションBHK細胞に対するヒトIL-17の結合を阻害することを見出し、このことから、抗ヒトIL-17抗体が、IL-17のその受容体への結合を遮断する上で効果的であることが示される。アイソタイプ一致陰性対照抗体、およびIL-17以外のIL-17サイトカインファミリーメンバーに対する抗体は、ヒトIL-17のIL-17RAトランスフェクション細胞への結合を遮断することができず、このことから、抗ヒトIL-17抗体の作用がヒトIL-17に特異的であることが示される。
【０２９４】
実施例2
ヒトIL-17に応答するマウスNih3t3細胞
A) 細胞のプレーティングおよびkz142アデノウイルスレポーター感染
マウス線維芽細胞に由来するNih3t3細胞を、グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/10% FBSを用いて固体白色細胞培養コーティング96ウェルプレート(Cat. #3917. Costar)に5000個細胞/ウェルでプレーティングし、37℃および5% CO2で一晩培養した。この2日目に、プレーティング培地を除去し、感染効率5000粒子/細胞のKz142アデノウイルス粒子を、グルタミンを含みピルビン酸で改良したDMEM/1% FBSで調製し、37℃および5% CO2で一晩培養した。
【０２９５】
B) kz142アデノウイルスレポーター感染nih3t3細胞のIL-17活性化を測定するルシフェラーゼアッセイ法
アデノウイルス粒子レポーターと共に一晩インキュベートした後、ヒトIL-17リガンド処理物を、0.28% BSAに改良した「無血清培地」で調製した。アデノウイルス粒子および培地を除去し、適切なリガンド用量を3通りで付与した。37℃および5% CO2でのインキュベーションを4時間継続し、その後培地を除去し、細胞を15分かけて溶解し、ルシフェラーゼアッセイ系および試薬(Cat.#e1531 Promega. ウィスコンシン州、マディソン)ならびにマイクロプレートルミノメーターを用いて平均蛍光強度(MFI)を測定した。0.1〜1000 ng/mLヒトIL-17の範囲の濃度で活性を検出し、約50 ng/LというEC50値を得た。これらのデータから、nih3t3細胞がヒトIL-17に対する受容体を保有すること、ならびにIL-17がNfKb/Ap-1転写因子を活性化することが示唆され、よって、IL-17媒介性活性およびこの活性を増大させるための抗体の使用を試験するための適切な細胞株が提供される。
【０２９６】
実施例3
ヒトIL-17受容体(IL-17R)を発現するマウスNih3t3細胞
nih3t3 RNAのRTPCR解析から、この細胞がヒトIL-17Rに関して陽性であることが実証され、これは、ヒトIL-17に対するそのnfkb/ap1応答がこの受容体を介して媒介されることと一致する。
【０２９７】
A) マウスIL-17R PCR
標準的な方法を用いて、nih3t3細胞から単離した全RNAから第1鎖cDNAを調製した。hot startポリメラーゼおよび製造業者の推奨(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)により、センスプライマー、zc38520(SEQ ID NO:9)およびアンチセンスプライマー、zc 38521(SEQ ID NO:10)、ならびに35サイクルの増幅を用いてPCRを適用した。アガロースゲル電気泳動から、予測される498 bpの大きさの単一の強い単位複製配列が明らかになった。
【０２９８】
実施例4
ap1/nfkb転写因子を発現する安定したNih3t3アッセイクローンの作製
上記のマウスnih3t3細胞株に、ネオマイシン選択マーカーを含むkz142 ap1/nfkbレポーター構築物を安定にトランスフェクションした。Neo耐性トランスフェクションプールを、クローン密度でプレーティングした。クローニングリングを用いてクローンを単離し、誘導物質としてヒトIL-17リガンドを用いてルシフェラーゼアッセイ法によりスクリーニングした。最も高い平均蛍光強度(MFI)(ap1/NfkBルシフェラーゼによる)および最も低いバックグラウンドを有するクローンを選択した。安定したトランスフェクタント細胞株を選択し、nih3t3/kz142.8と命名した。
【０２９９】
実施例5
ヒトIL-17に対するアンタゴニストを用いた、マウスNih3t3細胞におけるヒトIL-17による活性化の阻害
ルシフェラーゼアッセイ法において、ヒトIL-17に対する抗体または他のIL-17A中和実体を、ap1/nfkbエレメントのヒトIL-17活性化のアンタゴニストとして使用した。このアッセイ法において、抗ヒトIL-17抗体または中和実体は、マウスnih3t3/kz142.8アッセイ細胞株においてヒトIL-17媒介性ap1/nfkb活性化のEC50レベルを阻害した。非常に効果的な抗体の場合、約10μg/mL濃度で使用した際に、抗体はヒトIL-17によって誘導される活性を完全に中和し、活性の阻害は低濃度において用量依存的様式で減少した。上記の濃度で試験したアイソタイプ一致陰性対照mAbは、活性の阻害をもたらさなかった。これらの結果から、IL-17に対する抗体および他の中和実体が、炎症誘発性サイトカイン、IL-17の活性を拮抗し得ることが実証される。このアッセイ法における阻害は、抗ヒトIL-17抗体または中和実体の代わりに、IL-17以外のIL-17ファミリーの他のリガンドメンバーに対する抗ヒト抗体を添加した場合には認められなかった。以下の表6は、中和IL-17Aアンタゴニスト陽性対照および本明細書に記載の抗IL-17A中和実体の能力に関する代表的な例のデータを示す。データから、これらの中和実体が、ヒトIL-17Aによって誘導される活性を減少させ得ることが実証される。
【０３００】
（表６）
2009540018.tif 000034
【０３０１】
実施例6
抗ヒトIL-17抗体によるIL-17活性の中和
細胞ベースの中和アッセイ法を用いて、精製抗ヒトIL-17抗体を、例えば10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、625 ng/ml、313 ng/ml、156 ng/ml、および78 ng/mlの段階希釈物として添加した。アッセイプレートを37℃、5% CO2で4日間インキュベートし、その時点でアラマーブルー(Accumed、イリノイ州、シカゴ)を20μl/ウェルで添加した。プレートを再度、37℃、5% CO2で16時間インキュベートした。このアッセイ法は、精製抗ヒトモノクローナル抗体が、ヒトIL-17のシグナル伝達を中和し得ることを実証することができる。非常に効果的な抗体の場合、約10μg/mL濃度で使用した際に、抗体はヒトIL-17によって誘導される増殖を完全に中和し、増殖の阻害は低濃度において用量依存的様式で減少する。上記の濃度で試験するアイソタイプ一致陰性対照マウスmAbは、いずれのサイトカインの増殖阻害も提供しないと予測された。これらの結果から、IL-17に対する抗体が、炎症誘発性リガンド、IL-17の活性を実際に拮抗し得ることがさらに実証される。このアッセイ法における阻害は、抗ヒトIL-17抗体の代わりに、IL-17以外のIL-17ファミリーの他のリガンドメンバーに対する抗ヒト抗体を添加した場合には認められず、よってIL-17A特異性が実証される。
【０３０２】
実施例7
エクスビボ多発性硬化症モデルにおいて炎症および炎症性メディエータを減少させるIL-17およびIL-23に対する単一の中和実体
多発性硬化症は、リンパ球および単核細胞炎症性浸潤の存在ならびにCNS全体にわたる脱髄を含むいくつかの要因によって媒介されると考えられる複合疾患である。ミクログリアは中枢神経系(CNS)に存在するマクロファージ様細胞であり、損傷または感染時に活性化される。ミクログリアは、多発性硬化症を含む種々のCNS疾患において重大な役割を果たすと関連づけられており、疾患の開始、進行、および治療の機構を研究するために用いることができる(Nagai et al. Neurobiol. Dis. 8:1057 (2001)；Olson et al. J Neurosci Methods 128:33 (2003))。したがって、不死化ヒトミクログリア細胞株および/または確立されたヒトアストログリア細胞株を用いて、これらの細胞型に及ぼす炎症性メディエータの効果のうちのいくつか、およびそれらの中和の可能性を試験することができる。炎症性メディエータ(これらに限定されないが、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、RANTES、IP-10、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSF等を含む)は、炎症経路および下流エフェクター細胞の活性化に及ぼすそれらの効果により、MSに関連した症状および病態に寄与し得る。
【０３０３】
IL-17およびIL-23の炎症誘発作用、ならびにこれらの活性に対するアンタゴニスト、例えばIL-17およびIL-23と個々にもしくは共に結合する分子、または本発明のIL-17/IL-23抗体を含むそれらに対する抗体がこれらの効果を中和するまたは減少させる能力を評価するために、培養グリア細胞を以下のうちの1つで処理することができる：ビヒクル；rhIL-17；rhIL-23；またはミクログリア細胞および/もしくはアストログリア細胞による炎症反応を誘導することが知られている化合物のいずれか(例えば、LPS、他のTLRアゴニスト、炎症サイトカイン等)。さらに、これらを、IL-17またはIL-23いずれか一方のアンタゴニストを単独でまたは組み合わせて用いて、または用いずに処理する。様々な時間(1時間〜数日)培養した後、上清および細胞を回収し、上記のものを含む炎症性メディエータのレベルおよび/または発現について解析する。炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルは、ビヒクル単独で処理した培養物と比較して、rhIL-17および/もしくはIL-23ならびに/または他の炎症刺激物質の存在下で上昇する。本発明の抗体などのIL-17および/またはIL-23活性に対するアンタゴニストを添加すると、炎症性メディエータの産生および発現が顕著に減少し、したがってヒト多発性硬化症に関連した炎症局面に有効であると予測される。
【０３０４】
実施例8
多発性硬化症のモデルとしてのマウス実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)において疾患の発症率および進行を減少させるIL-17およびIL-23に対する中和実体
A) マウスアレルギー性脳脊髄炎(EAE)モデル
多発性硬化症の潜在的治療の機構を研究し、その効果を評価するには、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の動物モデルが一般的に用いられる。再発寛解型EAEモデルのために、9〜10週齢雌SJLマウス(JacksonまたはCharles River Labs)に、フロイント完全アジュバントで乳化したプロテオリピドペプチド(PLP)を皮下より、および百日咳毒素を静脈内より免疫した。約6〜23日以内に、動物は、このモデルに特徴的な体重減少および麻痺の症状を呈し始める。体重を測定し、以下に詳述する通りに各マウスに臨床スコア(0〜8)を割り当てることにより、マウスの疾患の程度を毎日評価する。免疫したがそれ以外では処置していないマウスにおける疾患症状の典型的なパターンは、体重減少および麻痺のいずれか、それに続く一定期間の疾患症状の寛解、およびその後の疾患症状の再発である。疾患症状の再発および寛解のパターンが後に続いて起こり、これはまた、再発寛解型疾患として知られるこの型の多発性硬化症を有するヒトにおいても認められる。慢性進行性多発性硬化症および二次性進行型多発性硬化症もまた、IL-17およびIL-23/p19中和抗体のこの治療組み合わせ、または本明細書に記載の二重特異性抗体もしくはscFVなどの単一の中和実体の標的適応症である。これらの後者の型の多発性硬化症は、SJLマウスにおいてPLPを用いる代わりに、C57BL/6マウスにおいてMOG35-55ペプチドを用いて同様の様式で試験される。
【０３０５】
EAE疾患症状の最初のピークからの寛解中に、マウスIL-17およびIL-23p19に対する中和モノクローナル抗体を、別々にまたは治療組み合わせとして投与した。抗体は、1日おきに腹腔内注射として、または同様の投与計画として送達した。群には、動物当たり用量当たり各抗体25μg、50μg、または100μgを単独でまたは治療組み合わせとして投与し、対照群にはビヒクル対照、PBS(Life Technologies、メリーランド州、ロックビル)または抗体アイソタイプ対照を投与する。
【０３０６】
B) 疾患のモニタリング
動物は、PLPまたはMOG35-55免疫化後約6〜23日の間に、麻痺および体重減少の徴候を示し始め得る。大部分の動物は免疫化の11〜17日以内に症状を発症するが、動物によってはこれよりも早くまたは遅く症状を示す場合もある。
【０３０７】
疾患状態を評価するために、すべての動物を毎日観察し、体重測定を行い、臨床スコアを割り当てる。
【０３０８】
C) 臨床スコア
0＝正常；健康。
1＝軽微な尾部脱力(尾部の先端がカールしないおよび)
2＝尾部の麻痺(尾を直立して保持することができない)
3＝尾部の麻痺および軽度の動揺性歩行
4＝尾部の麻痺および重度の動揺性歩行
5＝尾部の麻痺および肢1本の麻痺
6＝尾部の麻痺およびいずれか2本の肢の麻痺
7＝四肢不全麻痺(4本の肢すべての麻痺)
8＝瀕死または死亡
【０３０９】
実験期間を通して血液を採取して、サイトカインの血清レベルおよび疾患の他のメディエータのレベルをモニターする。安楽死の時点で、血清用に血液を採取し、組織学的検査のために脳および脊髄を10% NBF中に採取した。別の動物において、TaqMan定量リアルタイムPCRによるmRNAの定量用に、組織(リンパ節、脳、脊髄、脾臓、およびその他を含む)を摘出した。
【０３１０】
D) 結果
IL-17およびIL-23/p19に対する中和モノクローナル抗体の治療組み合わせを投与したマウス群(それぞれn＝13〜15匹)は、PBS、組み合わせで使用した場合と同様の用量のいずれか一方の抗体のみ、またはアイソタイプ対照抗体で処置したマウスと比較した、臨床スコアおよび体重減少の有意な(p＜0.05)減少によって証明される、疾患重症度の有意な(p＜0.05)減少によって特徴づけられた。さらに、治療抗体組み合わせで処置したマウスでは疾患再発は完全に認められず、一方、他のすべての処置群では有意な疾患再発を経験するマウスが35〜85%存在した。したがって、治療組み合わせを送達することは、活動性疾患を軽減する上で、および重要なことには疾患再発を予防する上で、同様の用量のいずれか一方のモノクローナル抗体のみを送達するよりも有意により有効であった。疾患再発はこの疾患モデルおよびヒトの再発寛解型MSの特徴であるため、これは非常に重要な知見である。PBSまたはアイソタイプ対照抗体のみで処置したマウスでは、CNS実質への炎症細胞の広範な浸潤が認められた。マウスのCNSにおける炎症細胞浸潤が全体的に最も減少したのは、IL-17およびIL-23/p19に対する中和モノクローナル抗体の治療組み合わせで処置したマウスであった。これらの治療抗体で処置すると、PBS処置マウスと比較して血清IL-6、IL-13、IL-17A、IL-23、G-CSF、およびTNF-a濃度もまた有意に減少した。最初の疾患発症のピーク後の同じ時点(27日目)であり、かつ同じ回数の抗体投与(11回)後に、試料を採取した。これと同じ時点でマウスから流入領域リンパ節を摘出し、PLP139-151と共に24時間培養した。治療抗体組み合わせで処置したマウスは、TNF-a含有流入領域リンパ節細胞の割合が他のマウス群と比較して少なかった。したがって、抗体組み合わせで処置したマウスにおける疾患重症度および疾患再発の有意な減少は、CNS炎症性浸潤および炎症性サイトカイン産生の減少と関連しており、観察された有効性の作用機序が示唆される。
【０３１１】
まとめると、これらの結果から、IL-17およびIL-23/p19中和抗体の治療組み合わせが、ヒト多発性硬化症のモデルとしてのEAEの治療においてより有効であることが示される。治療組み合わせは、臨床疾患症状を軽減することができ、分子レベルで働いて、炎症、炎症性浸潤、炎症性サイトカイン/ケモカイン、およびこのように影響を受けることが判明している他の機構を減少させる。
【０３１２】
実施例9
マウスIL-23に対する抗マウスIL-23/p19の活性を評価するための細胞ベースのバイオアッセイ法
IL-23中和抗体を試験する上で使用するためのバイオアッセイ法を開発する試みにおいて、内因的に発現されたマウスIL-12RB1と共にヒトDCRS2受容体がマウスIL-23と結合して、細胞のシグナル伝達および増殖をもたらすことができるかどうかを決定するために、ヒトDCRS2(IL-23R、SEQ ID NO: 22)を発現するIL-3依存性マウス細胞株を、増殖アッセイ法において組換えマウスIL-23を用いて試験した。マウスIL-23がヒトDCRS2と結合する能力が確立された時点で、マウスIL-23/p19を特異的に中和するその能力を決定するために、マウスIL-23およびマウスIL-23/p19に対するモノクローナル抗体を用いて第2の増殖アッセイ法を行った。
【０３１３】
A) 全長DCRS2を発現するBaF3細胞の構築
BaF3アッセイ細胞株は以前に用いた細胞株であり、この細胞株がヒトDCRS2を発現することから、これらのアッセイ法において使用するために選択した。ヒトDCRS2を発現しない、以前に用いたBaF3細胞株を、陰性対照として使用するために選択した。ヒトWSX1を含む発現ベクター(pZP7Z)およびヒトDCRS2を含む発現ベクター(pZP7NX)をBaF3細胞に順次導入することによって、アッセイ細胞株を構築した。これらの発現ベクターおよびそれに続く細胞株は、以下の段階を用いて構築した。
【０３１４】
B) 全長DCRS2のクローニング
米国特許出願番号WO 00/73451、Dowling LM et alは、その同族リガンドが結合してもシグナル伝達する能力がないと考えられる非常に短い細胞質ドメインを有する、DCRS2(SEQ ID NO:22)と命名されたオーファンクラスIサイトカイン受容体について記載している。古典的なシグナル伝達エレメントを有する細胞質ドメインを有するさらなるアイソフォームを発見する試みにおいて、PCRである、cDNA末端の3'迅速増幅(RACE)クローニング戦略を開始した。
【０３１５】
DCRS2転写産物を含むcDNA鋳型供給源を同定するため、cDNAライブラリーの収集物をzc38188(SEQ ID NO:11)およびzc38247(SEQ ID NO:12)を用いてPCRによってスクリーニングした。Advantage II熱安定性DNAポリメラーゼおよび緩衝液(Clontech、カリフォルニア州、パロアルト)、0.125 mM dNTPs、ならびに40 ng/uL cDNAライブラリープラスミド鋳型と共に、これらのオリゴを0.2 pmol/uLの濃度でPCR反応において使用した。「ホットスタート」として知られる94℃での3分間のプレインキュベーション後に、反応物を94℃、30秒および68℃、90秒の30回の熱サイクルに供した。反応産物をTAE、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって解析し、以下のcDNAライブラリーから反応産物が認められた。ヒト副腎、ヒト骨髄、ヒト活性化CD3+ T細胞、およびヒト精巣。これらの産物を単離し、配列決定し、DCRS2であることを確認した。これらのDCRS2含有cDNA鋳型は定方向にクローニングされたプラスミドライブラリーであったため、3'cDNAクローニング部位の下流のプラスミド配列に相補的な「ネステッド」オリゴプライマーを用いて、3'RACEを行うことができた。zc 38188(SEQ ID NO:11)およびzc 26405(SEQ ID NO:13)ならびに鋳型としての4つのDCRS2陽性cDNAライブラリーを用いること以外は上記と同じ反応成分を用いて、一次3'RACE PCR反応を行った。これらの反応の産物を、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて製造業者の推奨するプロトコールに従って精製した。この精製PCR産物を、zc 38188(SEQ ID NO:11)およびzc 38247(SEQ ID NO:12)を用いて得られた予測されるDCRS2-プラスミドPCR産物内にその相補的配列が位置し、そのため「ネステッドプライマー」と称されるPCRプライマー、zc 38248(SEQ ID NO:14)およびzc 5020(SEQ ID NO:15)を用いる二次増幅に供した。これらの反応の熱サイクル条件は、ホットスタートプレインキュベーションから開始し、94℃、30秒；64℃、20秒；71℃、70秒の30サイクルで継続した。産物をゲル精製し、同じ増幅プライマーを用いて直接配列決定した。配列解析から、推定ボックス1、2、および3 STAT結合モチーフを含む伸長した細胞質ドメインが明らかになった。これらの配列が、60サイクルの増幅の間にAdvantageIIによるPCRによってランダムに導入される変異を含むリスクを考えて、忠実度が高く、したがって変異率が低いことが知られている熱安定性ポリメラーゼを用いてPCRを反復することが促された。
【０３１６】
この2ラウンド目の3' RACEにおいて、5'プライマーはcDNAクローニング部位の上流のベクター配列に相補的であり、3'プライマーは上記の3'RACE産物から得られた配列に基づいて設計した。8つの同一の反応物を設定し、熱サイクルのアニーリング段階を一定範囲の温度、66〜57℃で行った。Turbo Pfu1ポリメラーゼ(Stratagene、カリフォルニア州、ラホーヤ)およびその緩衝液を、0.125 mM dNTPs、40 ng/uLヒト副腎cDNA鋳型、zc 14063(SEQ ID NO:16)およびzc 38777(SEQ ID NO:17)と共に、ホットスタート後、94℃、30秒；アニーリング35秒；72℃、130秒の30回の熱サイクルに供した。Qiaquick PCR精製キット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて、これらの反応の産物を、取り込まれなかったプライマーから精製した。
【０３１７】
次に、これらの産物を「ネステッド」PCR反応の鋳型として使用した。zc 38776(SEQ ID NO:18)およびzc38188(SEQ ID NO:11)を用いて、各鋳型について上記のように5つの同じ平衡した反応物を構築し、各反応ではアニーリング温度を59℃、62℃、63.5℃、65℃、66℃とわずかに変更した。TAEアガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色により、57℃の一次反応から生じた鋳型を使用したすべての反応において、約1800 bpのDNA産物が可視化された。
【０３１８】
配列決定の前にこのPCR産物の哺乳動物発現ベクターへのクローニングを容易にするために、オリゴヌクレオチドおよびTurbo Pfuによる3ラウンド目のPCRを用いて、制限部位を付加した。Xho1部位を含むZc 38776(SEQ ID NO:18)を、dNTPs、ポリメラーゼ、緩衝液、および上記で得られた1800 bp PCR産物に加えてzc 38246(SEQ ID NO:19)と混合し、ホットスタート後、95℃、30秒；55℃、40秒；72℃、150秒の30サイクルでインキュベートした。zc38776の配列はzc38188の5'末端と一致し、BamH1部位およびコザック共通配列もまた含む。得られたPCR産物をQiaquick mini-eluteキット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて精製し、BamH1およびXho1制限酵素を用いて37℃で90分間消化することにより、哺乳動物発現ベクターへのクローニング用に調製した。哺乳動物発現ベクターpZP7NXも同様にBamH1およびXho1で消化して、全長DCRS2 cDNAを受容できるように調製した。両消化物をTAEゲル電気泳動に供し、適切な断片を回収し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて製造業者の推奨に従って精製した。BamH1/Xho1消化したpZP7NX約40 ngおよびBamH1/Xho1消化したDCRS2約10 ngを、0.25 U T4 DNAリガーゼ(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)を用いて連結し、22℃で4時間インキュベートした。次に、連結反応物1 uLを、2.3 Kv、100オーム、および25 uFに設定したGenepulserエレクトロポレーション装置(Biorad、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)を用いて、Electromax DH10b細胞(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド) 25 uLにエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの段階希釈物をLB-アンピシリンアガープレートにプレーティングした後、クローンを単離し、配列解析によってこれがサイレント変異を1つ有する全長であることを確認した(SEQ ID NO:22)。大量プラスミド調製を行い、このプラスミドを種々の哺乳動物細胞トランスフェクションに使用した。
【０３１９】
マウス骨髄に由来するIL-3依存性プレリンパ球細胞株であるBaF3は(Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727 (1985)；Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133 (1986))、10%熱非働化ウシ胎仔血清、2 ng/mLマウスIL-3(R&D、ミネソタ州、ミネアポリス)、2 mM L-グルタミン(Gibco-BRL)、および1 mMピルビン酸ナトリウム(Gibco-BRL)を添加した完全培地(RPMI培地；JRH Bioscience Inc.、カンザス州、レネックサ)で維持した。
【０３２０】
RPMI培地(JRH Bioscience Inc.、カンザス州、レネックサ)で2回洗浄し、次いで107個細胞/mlの細胞密度でRPMIに再懸濁することにより、BaF3細胞をエレクトロポレーション用に調製した。再懸濁したBaF3細胞1 mLをpZP7Z/h.WSX1プラスミドDNA 30μgと混合し、個々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー(Gibco-BRL)に移した。次に、細胞に、エレクトロポレーション装置(CELL-PORATOR(商標)；Gibco-BRL、メリーランド州、ベテスダ)によって供給される2回の連続したショック(800 lFad/300 V；1180 lFad/300 V)を与えた。続いてエレクトロポレーションした細胞を完全培地20 mlに移し、インキュベーター中に24時間置いた(37℃、5% CO2)。次に細胞を遠心沈降させ、T-75フラスコ中の240μg/mLゼオシン(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)選択を含む完全培地20 mLに再懸濁して、ゼオシン耐性プールを単離した。得られた安定な細胞株を、BaF3/WSX1と命名した。
【０３２１】
RPMI培地(JRH Bioscience Inc.、カンザス州、レネックサ)で2回洗浄し、次いで107個細胞/mLの細胞密度でRPMIに再懸濁することにより、BaF3/WSX1細胞をエレクトロポレーション用に調製した。再懸濁したBaF3細胞1 mLをpZP7NX_DCRS2プラスミドDNA 30μgと混合し、個々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー(Gibco-BRL)に移した。次に、細胞に、エレクトロポレーション装置(CELL-PORATOR(商標)；Gibco-BRL、メリーランド州、ベテスダ)によって供給される2回の連続したショック(800 lFad/300 V；1180 lFad/300 V)を与えた。続いてエレクトロポレーションした細胞を240μg/mLゼオシン(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)を含む完全培地20 mlに移し、インキュベーター中に24時間置いた(37℃、5% CO2)。次に細胞を遠心沈降させ、T-75フラスコ中の1×G418(Gibco-BRL、メリーランド州、ベテスダ)および240μg/mLゼオシン(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)選択を含む完全培地20 mLに再懸濁して、G418耐性プールを単離した。得られた安定な細胞株を、BaF3 WSX1/DCRS2と命名した。
【０３２２】
C) Baf3/KZ134細胞株の構築
陰性対照細胞株、BaF3/KZ134は以下の段階を用いて構築した。KZ134プラスミドは、4つの遺伝子に由来するSTAT転写因子結合エレメントを含む相補的オリゴヌクレオチドZC12749(SEQ ID NO:20)およびZC12748(SEQ ID NO:21)を用いて構築し、これらのエレメントは、改変c-fos Sis誘導性エレメント(m67SIEまたはhSIE)(Sadowski, et al., Science 261: 1739 (1993))、p21 WAF1遺伝子由来のp21 SIE1(Chin et al., Science 272: 719 (1996))、γ-カゼイン遺伝子の乳腺応答エレメント(Schmitt-Ney et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745 (1991))、およびFcγ RI遺伝子のSTAT誘導性エレメント(Seidel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041 (1995))を含む。これらのオリゴヌクレオチドはAsp718-XhoI適合性末端を含み、標準的な方法を用いて、同じ酵素で消化しかつネオマイシン選択マーカーを含む、c-fosプロモーターを有するレシピエントホタルルシフェラーゼレポーターベクター(Poulsen et al., J. Biol. Chem. 273:6229 (1998))に連結した。KZ134プラスミドを用いて、標準的なトランスフェクション法および選択法により、BaF3細胞を安定にトランスフェクションして、BaF3/KZ134細胞株を作製した。
【０３２３】
D) ヒトDCRS2を発現するBaF3細胞に対するIL-23の種特異性を決定するためのアラマーブルー増殖アッセイ法
ヒトDCRS2、およびマウスBaF3細胞で内因的に発現されるマウスIL-12RB1が、マウスIL-23、およびおそらくはヒトIL-23と結合できるかどうかを決定するために、アラマーブルー増殖アッセイ法を行った。組換えヒトIL-23(R&D Systems、Cat.#1290-IL)およびマウスIL-23(R&D Systems、Cat.#1887-ML)は、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.3 ng/mL、および3.1 ng/mLの濃度で実行した。マウスIL-3の陽性対照は、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2.5 pg/mL、1.25 pg/mL、0.6 pg/mL、0.3 pg/mL、および0.15 pg/mLの濃度で実行した。陰性対照は、マウスIL-3不含培地のみを用いて並行して実行した。試料を96ウェル平底プレート(Bectin-Dickinson、ニュージャージー州、フランクリンレイクス)に100μL容量でプレーティングした。細胞をIL-3不含培地で3回洗浄し、血球計数器を用いて計数した。細胞をIL-3不含培地に再懸濁し、試料を含むプレートに、100μL中5000個細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、全ウェル容量を200μLとした。アッセイプレートを37℃、5% CO2で3日間インキュベートし、その時点でアラマーブルー(Accumed、イリノイ州、シカゴ)を20μL/ウェルで添加する。アラマーブルーは生細胞数に基づいて蛍光読み取り値をもたらし、したがってこれは陰性対照と比較した細胞増殖の直接的測定値である。プレートを再度37℃、5% CO2で24時間インキュベートする。Wallac 1420マイクロプレートリーダー(PerkinElmer Life Sciences、マサチューセッツ州、ボストン)で、プレートを波長544(励起)および590(発光)において読み取る。
【０３２４】
結果から、ヒトIL-23およびマウスIL-23がいずれも、BaF3 WSX1/DCRS2細胞株に同様の増殖応答をもたらすことが示される。ヒトIL-23およびマウスIL-23は、BaF3/KZ134細胞株に対しては陰性であり、このことから、この応答がDCRS2発現の存在に限定されることが示される。ヒトDCRS2を発現する第2のBaF3細胞株もまた試験し、BaF3 WSX1/DCRS2細胞株と同様にヒトIL-23およびマウスIL-23に応答して増殖することが認められた。
【０３２５】
E) ヒトDCRS2を発現するBaF3細胞に及ぼすマウスIL-23/p19に対する中和抗体の効果を決定するためのアラマーブルー増殖アッセイ法
抗体がマウスIL-23を中和する能力を試験するため、別の増殖アッセイ法を行った。試験した抗体は、ラット抗マウスIL-23/p19クローンG23-8(Cat.#16-723285、eBioscience、カリフォルニア州、サンディエゴ)であった。10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.6 ng/mL、0.3 ng/mL、0.15 ng/mL、および0.08 ng/mLのマウスIL-23濃度で実行した。抗IL-23/p19抗体がp19サブユニットに特異的であり、IL-12/23p40サブユニットと交差反応しないかどうかを決定するために、一定範囲の組換えマウスIL-23p40濃度(最大200 ng/mL)もまた試験した。抗マウスIL-23/p19抗体の濃度は10 ug/mL、5 ug/mL、2.5 ug/mL、1.25 ug/mL、0.6 ug/mL、0.3 ug/mL、0.15 ug/mL、および0.08 ug/mLで実行し、陰性対照抗体、ラットIgG1抗マウスCD115(Cat. #MCA1848、Serotec、ノースカロライナ州、ラーリー)もまた抗マウスIL-23/p19抗体と同じ希釈で実行した。マウスIL-23を最終濃度1.5 ng/mLマウスIL-23で、抗マウスIL-23/p19抗体またはマウスCD115抗体を含む各ウェルに添加した。抗体を含まないウェルもまた1.5 ng/mLのマウスIL-23を用いて設定し、これは最大IL-23応答の約80%である。マウスIL-3の陽性対照は、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2.5 pg/mL、1.25 pg/mL、0.6 pg/mL、0.3 pg/mL、および0.15 pg/mLの濃度で実行した。陰性対照は、マウスIL-3不含培地のみを用いて並行して実行した。試料を96ウェル平底プレート(Bectin-Dickinson、ニュージャージー州、フランクリンレイクス)に100μL容量でプレーティングした。
【０３２６】
細胞をIL-3不含培地で3回洗浄し、血球計数器を用いて計数した。細胞をIL-3不含培地に再懸濁し、試料を含むプレートに、100μL中5000個細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、全ウェル容量を200μLとした。アッセイプレートを37℃、5% CO2で3日間インキュベートし、その時点でアラマーブルー(Accumed、イリノイ州、シカゴ)を20μL/ウェルで添加した。アラマーブルーは生細胞数に基づいて蛍光読み取り値をもたらし、したがってこれは陰性対照と比較した細胞増殖の直接的測定値である。プレートを再度37℃、5% CO2で24時間インキュベートした。Wallac 1420マイクロプレートリーダー(PerkinElmer Life Sciences、マサチューセッツ州、ボストン)で、プレートを波長544(励起)および590(発光)において読み取った。
【０３２７】
結果から、抗マウスIL-23/p19抗体が、用量依存的様式で、マウスIL-23増殖応答を中和することが示される。組換えマウスIL-12/IL-23p40の中和は認められず、したがって抗マウスIL-23/p19抗体がIL-23のp19サブユニットに特異的であることが示される。CD115抗体は最大濃度でのみ増殖応答をわずかに阻害する。これらのアッセイ法から、ヒトDCRS2受容体はBaF3増殖アッセイ系においてマウスIL-23によってシグナル伝達を引き起こすことができ、マウスIL-23に対する中和抗体をスクリーニングするために使用できることが示される。さらに、これらの結果から、抗マウスIL-23/p19抗体がマウスIL-23のp19サブユニットに特異的であることも実証される。
【０３２８】
実施例10
ヒトIL-23に対する抗ヒトIL-23/p19の中和活性を評価するための細胞ベースのバイオアッセイ法
ヒトIL-23/p19中和抗体を試験する上で使用するためのバイオアッセイ法を開発する試みにおいて、内因的に発現されたマウスIL-12RB1と共にヒトDCRS2受容体がヒトIL-23と結合して、細胞のシグナル伝達および増殖をもたらすことができるかどうかを決定するために、ヒトDCRS2(IL-23R、SEQ ID NO: 22)を発現するIL-3依存性マウス細胞株を、増殖アッセイ法において組換えヒトIL-23を用いて試験した。上記の実施例9に示したように、細胞株および得られたバイオアッセイ法は、マウスおよびヒトIL-23活性の両方ならびにIL-23中和活性を試験するのに適していることが見出された。したがって、その実施例に示されるように、ヒトIL-23がヒトDCRS2と結合する能力が確立された時点で、ヒトIL-23/p19を中和するその能力および特異性を決定するために、ヒトIL-23およびヒトIL-23/p19に対するモノクローナル抗体を用いて第2の増殖アッセイ法を行った。
【０３２９】
A) 全長DCRS2を発現するBaF3細胞の構築およびBaf3/KZ134細胞株の構築
BaF3アッセイ細胞株は以前に用いた細胞株であり、この細胞株がヒトDCRS2を発現することから、これらのアッセイ法において使用するために選択した。ヒトDCRS2を発現しない以前に用いたBaF3細胞株を、陰性対照として使用するために選択した。ヒトWSX1を含む発現ベクター(pZP7Z)およびヒトDCRS2を含む発現ベクター(pZP7NX)をBaF3細胞に順次導入することによって、アッセイ細胞株を構築した。これらの発現ベクターおよびそれに続く細胞株は、実施例9に概説した段階を用いて構築した。陰性対照細胞株、BaF3/KZ134も、実施例9に概説した段階を用いて構築した。
【０３３０】
B) ヒトDCRS2を発現するBaF3細胞に及ぼすヒトIL-23/p19に対する中和抗体の効果を決定するためのアラマーブルー増殖アッセイ法
抗体がIL-23/p19を介してヒトIL-23を中和する能力を試験するため、別の増殖アッセイ法を行った。10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.6 ng/mL、0.3 ng/mL、0.15 ng/mL、および0.08 ng/mLの組換えヒトIL-23濃度で実行した。抗IL-23/p19抗体がp19サブユニットに特異的であり、IL-12/IL-23p40サブユニットと交差反応しないかどうかを決定するために、一定範囲の組換えヒトIL-12濃度(最大200 ng/mL)もまた試験した。抗ヒトIL-23/p19抗体の濃度は10 ug/mL、5 ug/mL、2.5 ug/mL、1.25 ug/mL、0.6 ug/mL、0.3 ug/mL、0.15 ug/mL、および0.08 ug/mLで実行し、陰性対照抗体もまた抗ヒトIL-23/p19抗体と同じ希釈で実行した。ヒトIL-23を最終濃度1.5 ng/mLヒトIL-23で、抗ヒトIL-23/p19抗体または陰性対照抗体を含む各ウェルに添加した。抗体を含まないウェルもまた1.5 ng/mLのヒトIL-23を用いて設定し、これは最大IL-23応答の約80%である。ヒトIL-3の陽性対照は、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2.5 pg/mL、1.25 pg/mL、0.6 pg/mL、0.3 pg/mL、および0.15 pg/mLの濃度で実行した。陰性対照は、ヒトIL-3不含培地のみを用いて並行して実行した。試料を96ウェル平底プレート(Bectin-Dickinson、ニュージャージー州、フランクリンレイクス)に100μL容量でプレーティングした。
【０３３１】
細胞をIL-3不含培地で3回洗浄し、血球計数器を用いて計数した。細胞をIL-3不含培地に再懸濁し、試料を含むプレートに、100μL中5000個細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、全ウェル容量を200μLとした。アッセイプレートを37℃、5% CO2で3日間インキュベートし、その時点でアラマーブルー(Accumed、イリノイ州、シカゴ)を20μL/ウェルで添加した。アラマーブルーは生細胞数に基づいて蛍光読み取り値をもたらし、したがってこれは陰性対照と比較した細胞増殖の直接的測定値である。プレートを再度37℃、5% CO2で24時間インキュベートした。Wallac 1420マイクロプレートリーダー(PerkinElmer Life Sciences、マサチューセッツ州、ボストン)で、プレートを波長544(励起)および590(発光)において読み取った。
【０３３２】
結果から、抗ヒトIL-23/p19抗体が、用量依存的様式で、ヒトIL-23増殖応答を中和することが示される。外因的に添加した組換えヒトIL-12の中和は認められず、したがって抗ヒトIL-23/p19抗体がIL-23のp19サブユニットに特異的であることが示される。したがって、これらの結果から、ヒトDCRS2受容体はBaF3増殖アッセイ系においてヒトIL-23によってシグナル伝達を引き起こすことができ、マウスIL-23に対する中和抗体をスクリーニングするために使用できることが示される。さらに、これらの結果から、抗ヒトIL-23/p19抗体がIL-23のp19サブユニットに特異的であることも実証される。
【０３３３】
実施例11
非罹患対照と比較して、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)のマウスモデルの選択された組織において調節されるマウスIL23/p19およびIL-17 mRNA
PLP EAEモデルの疾患発症のピーク時に、マウスから組織を採取した。このモデルは、上記の実施例8に記載の通り、百日咳毒素の存在下または非存在下において、雌SJLマウスにPLP139-151を免疫する標準的な手順に従って施行し、これには適切な非免疫非罹患対照も含めた。採取した組織には、脳、脊髄、および頸部リンパ節が含まれた。標準的な手順を用いて、全組織からRNAを単離した。簡潔に説明すると、組織を採取し、液体N2中で直ちに凍結し、次いで処理時まで-80℃に移しておいた。処理に際しては、組織をQiazol試薬(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)中に入れ、Qiagen Rneasyキットを用いて製造業者の推奨に従ってRNAを単離した。マウスIL-23/p19およびIL-17 mRNAの発現を、多重リアルタイム定量RT-PCR法(TaqMan)およびABI PRISM 7900配列検出システム(PE Applied Biosystems)により測定した。IL-23/p19およびIL-17 mRNAレベルは、マウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼmRNAの発現に対して標準化し、比較閾値サイクル法(User Bulletin 2；PE Applied Biosystems)により決定した。マウスIL-23/p19のプライマーおよびプローブには、フォワードプライマー5' gcctgagttctagtcagcagtg、リバースプライマー5' tggaggcttcgaaggatct、およびプローブcagcgcccccttctccgttccが含まれた。マウスIL-17のプライマーおよびプローブには、フォワードプライマー5' gctccagaaggccctcaga、リバースプライマー5' agctttccctccgcattga、およびプローブctctccaccgcaatgaagaccctgaが含まれた。結果は以下の通りであった。
1) マウスIL23/p19 mRNA発現は、脳、脊髄、および頸部リンパ節を含む試験したすべての組織で検出された；
2) マウスIL23/p19 mRNAレベルは、非免疫対照と比較して、PLPを免疫したマウスの脊髄において約2.2倍増加していた；
3) マウスIL-17 mRNA発現は、非免疫対照マウスのリンパ節で非常に低いレベルで検出され、脳および脊髄では検出レベル未満であった；
4) マウスIL-17 mRNAレベルは、非免疫対照と比較して、PLPを免疫したマウスの脳組織において約104倍増加していた；
5) マウスIL-17 mRNAレベルは、非免疫対照と比較して、PLPを免疫したマウスの脊髄において約695倍増加していた；および
6) マウスIL-17 mRNAレベルは、非免疫対照と比較して、PLPを免疫したマウスの頸部リンパ節において約1.9倍増加していた。
【０３３４】
PLP誘発再発寛解型EAEを有するマウスのCNSでは、IL-17およびIL-23/p19のいずれのレベルも有意に高いため(すなわち、同じマウスで測定して)、このことから、多発性硬化症においてこれらのサイトカインを両方拮抗する必要性がさらに支持される。したがって、本発明のアンタゴニストは、単独のIL-17またはIL-23治療を上回る治療上の利点を有する。
【０３３５】
実施例12
非罹患マウスの組織と比較して、コラーゲン誘発関節炎(CIA)を有するマウスの組織において過剰発現するIL-17およびIL-23/p19
A) 実験プロトコール
様々な疾患程度を有する、コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルのマウスから、組織を採取した。このモデルは、雄DBA/1Jマウスの尾部にフロイント完全アジュバント(CFA)中のコラーゲンを免疫し、3週間後にフロイント不完全アジュバント(IFA)中のコラーゲンで同様の免疫化を行う標準的な手順に従って施行した。比較のために、非罹患の年齢および性別一致DBA/1Jマウスもまた含めた。単離した組織には罹患足が含まれた。標準的な手順を用いて、組織からRNAを単離した。簡潔に説明すると、組織を採取し、液体N2中で直ちに凍結し、次いで処理時まで-80℃に移しておいた。処理に際しては、組織をQiazol試薬(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)中に入れ、Qiagen Rneasyキットを用いて製造業者の推奨に従ってRNAを単離した。マウスIL-17およびIL-23/p19 mRNAの発現を、多重リアルタイム定量RT-PCR法(TaqMan)およびABI PRISM 7900配列検出システム(PE Applied Biosystems)により測定した。マウスIL-17およびIL-23/p19 mRNAレベルは、マウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼmRNAの発現に対して標準化し、比較閾値サイクル法(User Bulletin 2；PE Applied Biosystems)により決定した。マウスIL-17およびIL-23/p19のプライマーおよびプローブは、実施例11に記載したものと同じであった。
【０３３６】
B) 結果
試験した組織において、マウスIL-17およびIL-23/p19 mRNA発現が検出された。IL-17およびIL-23/p19 mRNAはいずれも、非罹患対照から得られた組織と比較して、CIA関節炎モデルのマウスの足で増加していた。マウスIL-17 mRNAは、非罹患対照と比較して、より軽度の疾患を有するマウスの足では約8倍、およびより重度の疾患を有するマウスの足では約9.3倍増加していた。マウスIL-23/p19 mRNAは、非罹患対照と比較して、より軽度の疾患を有するマウスの足では約2.4倍、およびより重度の疾患を有するマウスの足では約2.1倍増加していた。
【０３３７】
CIAを有するマウスの罹患足では、IL-17およびIL-23/p19のいずれのレベルも有意に高いため(すなわち、同じマウスで測定して)、このことから、関節リウマチにおいてこれらのサイトカインを両方拮抗する必要性がさらに支持される。
【０３３８】
実施例13
非罹患マウスの組織と比較して、DSS誘発大腸炎を有するマウスの組織において過剰発現するIL-17およびIL-23/p19
A) 実験プロトコール
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)大腸炎モデルのマウスから、組織を採取した。このモデルは、雌C57BL/6マウスの飲用水中に1.5〜2.5% DSSを5〜7日間投与し(急性的プロトコール)、その後標準水およびDSS水の周期を施す(慢性プロトコール)標準的な手順に従って施行した。比較のために、非罹患の年齢および性別一致C57BL/6マウスもまた含めた。単離した組織には、下行結腸および近位結腸が含まれた。標準的な手順を用いて、組織からRNAを単離した。簡潔に説明すると、組織を採取し、液体N2中で直ちに凍結し、次いで処理時まで-80℃に移しておいた。処理に際しては、組織をQiazol試薬(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)中に入れ、Qiagen Rneasyキットを用いて製造業者の推奨に従ってRNAを単離した。マウスIL-17およびIL-23/p19 mRNAの発現を、多重リアルタイム定量RT-PCR法(TaqMan)およびABI PRISM 7900配列検出システム(PE Applied Biosystems)により測定した。マウスIL-17およびIL-23/p19 mRNAレベルは、マウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼmRNAの発現に対して標準化し、比較閾値サイクル法(User Bulletin 2；PE Applied Biosystems)により決定した。マウスIL-17およびIL-23/p19のプライマーおよびプローブは、実施例11に記載したものと同じであった。
【０３３９】
B) 結果
試験した組織において、マウスIL-17およびIL-23/p19 mRNA発現が検出された。IL-17およびIL-23/p19 mRNAはいずれも、非罹患対照から得られた組織と比較して、急性および慢性DSS大腸炎モデルのマウスの下行結腸および近位結腸で増加していた。マウスIL-17 mRNAは、非罹患対照と比較して、DSSで急性的に処置したマウスの下行結腸では約50倍、および近位結腸では約180倍増加していた。慢性DSS処置の場合、IL-17 mRNAレベルは、非罹患対照と比較して、下行結腸および近位結腸においてそれぞれ約21倍および22倍高かった。マウスIL-23/p19 mRNAは、非罹患対照と比較して、DSSで急性的に処置したマウスの下行結腸では約2倍、および近位結腸では約4.4倍増加していた。慢性DSS処置の場合、IL-23/p19 mRNAレベルは、非罹患対照と比較して、下行結腸および近位結腸においてそれぞれ約1.5倍および2倍高かった。DSS大腸炎を有するマウスの結腸では、IL-17およびIL-23/p19のいずれのレベルも有意に高いため(すなわち、同じマウスで測定して)、このことから、炎症性腸疾患においてこれらのサイトカインを両方拮抗する必要性がさらに支持される。
【０３４０】
実施例14
マウス脾細胞におけるヒトIL-23媒介性IL-17AおよびIL-17F産生の中和に関するバイオアッセイ法
組換えヒトIL-23(rhIL-23)は、マウス脾細胞においてIL-17AおよびIL-17Fの産生を誘導した。IL-23に対するアンタゴニストを評価するため、rhIL-23で処理したマウス脾細胞におけるIL-17AおよびIL-17F産生を調べた。rhIL-23に対するアンタゴニストを、市販の中和抗体抗IL-12p40(Pharmingen、ニュージャージー州、フランクリンレイクス)と比較する。
【０３４１】
実験プロトコール：
C57BL/6マウスまたはBALB/cマウスから摘出した脾臓全体から、脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。ACK緩衝液(0.010 M KHCO3、0.0001 M EDTA、0.150 M NH4Cl)による赤血球溶解後、脾細胞をRPMI緩衝液(1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸ナトリウム、2.5 mM HEPES、1% L-グルタミン、0.00035% 2-メルカプトエタノール、1% Pen/Strep、10% FCS、および50 ng/mlヒトIL-2(R&D Systems、ミネソタ州、ミネアポリス)を含む)で洗浄し、これに再懸濁した。細胞を、96ウェル丸底プレートに500,000個細胞/ウェルで播種した。別のプレートで、10 pM濃度のrhIL-23を、表7に記載のアンタゴニストの3倍段階希釈物と共に37℃で30〜90分間プレインキュベートした。アンタゴニストの濃度は0〜343 nMであった。次に、IL-23リガンド＋アンタゴニストを脾細胞に添加し、37℃、5% CO2で24〜72時間インキュベートした。上清を回収し、処理直前まで-80℃で凍結しておいた。上清中のIL-17AおよびIL-17Fタンパク質のレベルを、ビーズベースのサンドイッチELISAを用いて測定した。市販のキット(Upstate、バージニア州、シャーロッツビル)を用いて、IL-17Aタンパク質を測定した。ビーズに結合させたIL-17F(R&D)に対する抗体を用いて社内で開発したビーズベースのELISAを用いて、IL-17Fを測定した。各アンタゴニストのIC50値を、rhIL-23の活性の50%を中和するのに必要なアンタゴニストの量として算出した。
【０３４２】
結果：
rhIL-23の存在下において、表7に記載のアンタゴニストは、IL-17AおよびIL-17F産生を減少させる上で有効であり、IC50値は0.27〜100.0 nMであった。
【０３４３】
（表７）マウス脾細胞アッセイ法において測定されたIC50値。
2009540018.tif 000035
【０３４４】
実施例15
IL-17Aのプレートベースの結合アッセイ法
材料および方法：
Costar(#9018) 96ウェルプレートを、0.1 M NaHCO3、pH 9.6中の2 ug/mlのIL-17A(社内で作製)またはIL-17F(社内で作製) 50 ulで、4℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを0.1% Tween-20/PBS(PBST)で3回洗浄した。ブロッキングのため、各ウェルを2%ミルク(#170-6404、Bio-Rad)/PBST 350 ulで満たし、室温で1時間置いた。次いで、アッセイプレートをPBSTで3回洗浄した。各ウェルを2%ミルク/PBST 50 ulで満たし、その後FabまたはscFv上清25 ulを添加した。次にウェルを混合した後、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。Fabを検出する場合には、2%ミルク/PBST中の(1:4000)抗ヒトFab特異的pAb-HRP(#31482、Pierce) 50 ulを各ウェルに添加し、室温で1時間置いた。scFvを検出する場合には、2%ミルク/PBST中の(1:4000)抗HisタグmAb-HRP(Sigma、#A7058) 50 ulを各ウェルに添加し、室温で1時間置いた。次に、プレートをPBSTで3回洗浄した。TMB(TMBW-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを各ウェルに添加して20〜30分間発色させた後、停止緩衝液(STPR-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを添加して反応を停止させた。次いで、プレートをプレートリーダーにおいて450 nmで読み取った。IL-17FでコーティングしたプレートよりもIL-17Aでコーティングしたプレートにおいてより良好な結合を示したウェルを、さらなる解析および操作のために選択した。
【０３４５】
実施例16
IL-23のプレートベースの結合アッセイ法
材料および方法：
Costar(#9018) 96ウェルプレートを、0.1 M NaHCO3、pH 9.6中の4 ug/mlのIL-23(社内で作製)またはIL-12(#219-IL/CF、R&D Systems) 50 ulで、4℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを0.1% Tween-20/PBS(PBST)で3回洗浄した。ブロッキングのため、各ウェルを2%ミルク(#170-6404、Bio-Rad)/PBST 350 ulで満たし、室温で1時間置いた。次いで、アッセイプレートをPBSTで3回洗浄した。各ウェルを2%ミルク/PBST 50 ulで満たし、その後FabまたはscFv上清25 ulを添加した。ウェルを混合した後、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。Fabを検出する場合には、2%ミルク/PBST中の(1:4000)抗ヒトFab特異的pAb-HRP(#31482、Pierce) 50 ulを各ウェルに添加し、室温で1時間置いた。scFvを検出する場合には、2%ミルク/PBST中の(1:4000)抗HisタグmAb-HRP(Sigma、#A7058) 50 ulを各ウェルに添加し、室温で1時間置いた。プレートをPBSTで3回洗浄した。TMB(TMBW-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを各ウェルに添加して20〜30分間発色させた後、停止緩衝液(STPR-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを添加して反応を停止させた。次いで、プレートをプレートリーダーにおいて450 nmで読み取った。
【０３４６】
IL-12ヘテロ二量体でコーティングしたプレートよりもIL-23ヘテロ二量体でコーティングしたプレートにおいてより良好な結合を示したウェルを、さらなる解析および操作のために選択した。
【０３４７】
実施例17
IL-17Aのプレートベースの中和アッセイ法
材料および方法：
Costar(#9018) 96ウェルプレートを、0.1 M NaHCO3、pH 9.6中の1 ug/ml抗ヒトIgG Fcγ特異的抗体(#109-005-098、Jackson Immunology) 50 ulで、4℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを0.1% Tween-20/PBS(PBST)で3回洗浄した。PBS中の0.25 ug/ml IL-17RA(社内で作製) 50 ulを各ウェルに添加した後、室温(RT)で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSTで3回洗浄した。ブロッキングのため、各ウェルを2%ミルク(#170-6404、Bio-Rad)/PBST 350 ulで満たし、室温で1時間置いた。プレートのブロッキング中、隣接プレートを、ビオチン化IL-17AとFabまたはscFv上清のプレインキュベーション用に設定した。プレインキュベーションプレートをFab上清75 ulで満たし、その後4%ミルク/PBST中の0.10 ug/ml IL-17A(社内で作製) 25 ulを添加した。各ウェルを混合した後、室温で30分間インキュベートした。次にアッセイプレートをPBSTで3回洗浄し、上清/IL-17A複合体の容量をプレインキュベーションプレートからアッセイプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSTで3回洗浄した。PBST中の(1:3000)ストレプトアビジン-HRP(#21124、Pierce) 50 ulを各ウェルに添加して、1時間インキュベートした。次に、プレートをPBSTで3回洗浄した。TMB(TMBW-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを各ウェルに添加して20〜30分間発色させた後、停止緩衝液(STPR-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを添加して反応を停止させた。次いで、プレートをプレートリーダーにおいて450 nmで読み取った。
【０３４８】
実施例18
IL-23のプレートベースの中和アッセイ法
材料および方法：
Costar(#9018) 96ウェルプレートを、0.1 M NaHCO3、pH 9.6中の1 ug/ml抗ヒトIgG Fcγ特異的抗体(#109-005-098、Jackson Immunology) 50 ulで、4℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを0.1% Tween-20/PBS(PBST)で3回洗浄した。PBS中の0.25 ug/ml IL-23R(#1400-IR-050、R&D Systems) 50 ulを各ウェルに添加した後、室温(RT)で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSTで3回洗浄した。ブロッキングのため、各ウェルを2%ミルク(#170-6404、Bio-Rad)/PBST 350 ulで満たし、室温で1時間置いた。プレートのブロッキング中、隣接プレートを、ビオチン化IL-23とFabまたはscFv上清のプレインキュベーション用に設定した。プレインキュベーションプレートをFabまたはscFv上清75 ulで満たし、その後4%ミルク/PBST中の0.10 ug/mlのIL-23ヘテロ二量体またはp19(社内で作製) 25 ulを添加した。各ウェルを混合した後、室温で30分間インキュベートした。次にアッセイプレートをPBSTで3回洗浄し、上清/IL-23複合体の容量をプレインキュベーションプレートからアッセイプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSTで3回洗浄した。PBST中の(1:3000)ストレプトアビジン-HRP(#21124、Pierce) 50 ulを各ウェルに添加して、1時間インキュベートした。次に、プレートをPBSTで3回洗浄した。TMB(TMBW-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを各ウェルに添加して20〜30分間発色させた後、停止緩衝液(STPR-1000-01、BioFX Laboratories) 50 ulを添加して反応を停止させた。次いで、プレートをプレートリーダーにおいて450 nmで読み取った。
【０３４９】
実施例19
非罹患マウスの組織と比較して、T細胞養子移植大腸炎のマウスモデルの組織において過剰発現するIL-17およびIL-23/p19
T細胞養子移植大腸炎モデル
マイナー組織適合性が合致しないマウスまたは同系免疫不全マウスにナイーブT細胞を養子移植すると、大腸炎(Leach MW et al 1996、Powrie F et al, 1997)および乾癬に似た皮膚病変(Schon MP et al 1997、Davenport CM et al 2002)が発症する。Balb/Cマウス由来の20万個程度のCD4+CD25- T細胞を免疫不全C.B-17 SCIDマウスに移植すると、体重減少、ヘモカルト陽性便、および皮膚病変の発症が起こる(これらのマウスにおける症状は群によって異なる)。これらの症状は、通常、移植の7〜10週間後にマウスで生じる。
【０３５０】
この大腸炎モデルはヒトクローン病にある程度にており、ヒトにおけるこの疾患の治療有効性を試験するために広く用いられている。この実験を行うため、マウス(Balb/C雌10匹、CB17 SCID雌20匹)をCRLから入手した。マウスには、-6日目から水道水を与えた。Balb/Cマウス10匹から脾臓を採取する。プールした脾臓から、CD4+ CD25- T細胞を回収する(方法に関しては以下を参照されたい)。CB17 SCIDマウスに、静脈内注射により、脾臓由来のCD4+ CD25- T細胞 5×10^5個または7.5×10^5個を投与する。すべてのマウスを週に3回体重測定し、体重減少に関して注意深く観察する。体重減少が観察された場合、疾患活動指数(DAI)スコア[便の硬さ、体重、および血便]を測定する。DAIスコア4または20%超の体重減少を認めた動物は、すべて安楽死させる。脾細胞全体の対照は存在しない。
【０３５１】
LPS/IL-12促進乾癬については、CB17 SCIDマウスに、静脈内注射により、脾臓由来のCD4+ CD25- T細胞 5×105個を投与する。0、7、および14日目に、マウスを、腹腔内注射液100 ul中のLPS(サルモネラ由来) 20 ugおよびrm IL-12 10 ngで処理する。すべてのマウスを週に3回体重測定し、体重減少に関して注意深く観察する。耳の肥厚が観察された場合、耳の厚みを週に3回測定する。マウスを、乾癬の徴候(抜け毛、ひっかき行動、脱毛等)について注意深くモニターする。
【０３５２】
処置群は以下の通りであった。大腸炎：(群I) CD4+ CD25細胞50万個を投与、Nは6、および(群II) CD4+ CD25細胞75万個を投与、Nは6。乾癬(群III) CD4+ CD25細胞50万個を投与、Nは4。
【０３５３】
組織学的検査用に、小腸の遠位部位および結腸全体を10% NBF中に採取し、24時間後に70% ETOHに移す。肉芽腫の存在を含む大腸炎の組織学的証拠について、試料を供する。GEMS用に、MLN、小腸の遠位部位、近位結腸、および遠位結腸を採取し、液体窒素中で瞬時凍結する。
【０３５４】
CD4+ CD25- T細胞の単離：
Balb/CマウスをCO2窒息によって屠殺し、脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液を調製する。無菌磁気濃縮プロトコールを用いることにより、CD4 T細胞を濃縮する。無菌磁気濃縮プロトコールを用いて、またはセルソーターを用いて選別することにより、CD4+CD25-T細胞をさらに濃縮する。T細胞の純度をフローによって評価する。
【０３５５】
CD4+CD25-T細胞のSCIDマウスへの養子移植：
0日目に、免疫不全C.B-17 SCIDマウスに、濃縮CD4+CD25- T細胞 50万個または75万個を静脈内注射した。大腸炎動物を屠殺した。マウスは、約15日目に、BW減少の徴候を示し始めた。21日目に、マウスに軟便および下痢が認められ、マウスを屠殺した。血清用に、眼窩後採血によりマウスから採血した後、頸椎脱臼により安楽死させた。腸全体を摘出し、測長のため結腸全体を切除した。結腸を半分に切断し(近位および遠位)、瞬時凍結した。盲腸近位の回腸を摘出し、瞬時凍結した。採取した腸組織すべてから、糞便を注意深く除去した。腸間膜LNを採取し、瞬時凍結した。組織学的検査用に(各群の動物6匹中2匹)、腸全体を摘出し、PBSおよびその後10% NBFで洗い流した。無傷の腸全体を10% NBF中で一晩固定し、70% ETOHに移し、組織学的検査に供した。
【０３５６】
T細胞養子移植大腸炎のマウスモデルにおいて疾患が発症した後、マウスから組織を採取した。このモデルは、マイナー組織適合性が合致しないマウスまたは同系免疫不全マウスにナイーブT細胞を養子移植する標準的な手順に従って施行し、これには適切な免疫不全非罹患対照も含めた。採取した組織には、小腸の遠位部位、近位結腸、遠位結腸、および腸間膜リンパ節が含まれた。標準的な手順を用いて、全組織からRNAを単離した。簡潔に説明すると、組織を採取し、液体N2中で直ちに凍結し、次いで処理時まで-800Cに移しておいた。処理に際しては、組織をQiazol試薬(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)中に入れ、Qiagen Rneasyキットを用いて製造業者の推奨に従ってRNAを単離した。発現を、多重リアルタイム定量RT-PCR法(TaqMan)およびABI PRISM 7900配列検出システム(PE Applied Biosystems)により測定した。IL-17mRNAレベルは、マウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼmRNAの発現に対して標準化し、比較閾値サイクル法(User Bulletin 2；PE Applied Biosystems)により決定した。マウスIL-17AおよびIL-23p19のプライマーおよびプローブは、実施例11に記載したものと同じであった。
【０３５７】
結果：
IL-17A mRNA：
- 遠位結腸では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約9000倍高いIL-17A mRNAレベルを有した。
- 近位結腸では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約18,900倍高いIL-17A mRNAレベルを有した。
- 小腸では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約990倍高いIL-17A mRNAレベルを有した。
- 腸間膜リンパ節では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約175倍高いIL-17A mRNAレベルを有した。
- これらすべての試料において、IL-17A mRNAは対照マウスにおいて基本的に検出不能であった。
【０３５８】
IL-17F mRNA
- 遠位結腸では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約3.8倍高いIL-17F mRNAレベルを有した。
- 近位結腸では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約7.4倍高いIL-17F mRNAレベルを有した。
- 小腸では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約4.8倍高いIL-17F mRNAレベルを有した。
- 腸間膜リンパ節では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約213倍高いIL-17F mRNAレベルを有した。
【０３５９】
IL-23p19 mRNA
- 小腸では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約2倍高いIL-23p19 mRNAレベルを有した。
- 腸間膜リンパ節では、大腸炎マウスは、対照マウス(大腸炎なし)のレベルよりも約1.5倍高いIL-17A mRNAレベルを有した。
【０３６０】
実施例20
正常試料およびヒトIBD試料由来の固有層T細胞および単球/マクロファージに及ぼすIL-17AおよびIL-23の影響
免疫の調節不全または持続による炎症は、組織損傷または不適切なもしくは長期的な免疫応答への永続的歪みにより、IBDに関連した症状および病態に寄与し得る。このモデルでは、腸組織の周辺環境のサイトカイン環境中に存在し得るIL-17AおよびIL-23に対する疾患関連T細胞および単球の曝露の潜在的下流事象を決定することができる。
【０３６１】
インビボでヒトIBDに有効であると考えられる治療薬は、炎症性メディエータ(これらに限定されないが、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17AおよびIL-17F、IL-18、IL-23、TNF-a、IFN-g、MIPファミリーメンバー、MCP-1、G-CSFおよびGM-CSF等)の産生および/または存在を阻害するおよび/または中和することにより、エクスビボモデルで作用すると考えられる。
【０３６２】
このモデルでは、HBSS中で生検試料をハサミで慎重に細分し、コラゲナーゼおよびディスパーゼIIで処理し、振盪機中で37℃にて1時間インキュベートすることにより、T細胞および単球/マクロファージを腸生検試料から単離する。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液を濾過して、残屑および細胞凝集塊を除去し、HBSSで複数回洗浄する。直接的細胞選別またはビーズ枯渇/濃縮プロトコールを用いて、T細胞およびマクロファージ/単球を単離し得る。単離した細胞を、IL-17AおよびIL-23の存在下でインキュベートする。これによって、T細胞および単球/マクロファージによる炎症性メディエータの産生が誘導されるか、またはその後のT細胞応答が高度に炎症誘発性の応答へと偏る。IBD患者由来の細胞によって産生される炎症性メディエータの種類と正常個体の細胞によるものとを比較することができ、この比較から、IBD患者由来のT細胞および単球/マクロファージが、IL-17AおよびIL-23の存在下においてより炎症誘発性の高いプロファイルを生じることが示唆され得る。下流炎症性メディエータの産生を中和するために、IL-17AおよびIL-23p19に対する抗体を添加することは、IBD患者の治療的処置に有効であると考えられる。
【０３６３】
実施例21
過敏性腸症候群(「IBS」)における、IL-17AおよびIL-23の両方に対する抗体の有効性：CNS標的化病因
IBSに特有の症状を誘発するためにストレス刺激を使用する、IBSの一次CNS標的化病因に焦点をおいたモデル。新生仔心理社会的ストレスモデルは、内臓痛覚過敏、下痢、およびストレス感受性を含む、IBS患者に付随するいくつかの臨床的特徴を模倣する。出生後4〜18日の間、同腹仔を母親から毎日180分間分離すると、母性行動の変化が起こり、身体をなめる/毛づくろいをする行動回数が有意に減少する。新生仔へのストレスは、CNSの永続的変化を生じて、ストレス誘発性の内臓および体性痛覚感受性の変化が起こる。これらの動物ではストレスに応答して結腸運動機能が高まり、予備データから、腸透過性の増加の証拠が示される(Mayer et al., Eur. J. surg. Suppl. (587): 3-9 (2002))。本発明の抗体で処置し、結腸運動機能、上皮透過性、およびストレス刺激に対する応答をその後解析することで、IBSのこの動物モデルにおける有効性を決定することができる。これらの阻害剤による処置後に症状の発生率が減少すれば、IBSの治療における潜在的有効性が示唆される。
【０３６４】
実施例22
過敏性腸症候群(「IBS」)における、IL-17AおよびIL-23p19を拮抗する抗体の有効性：一次腸標的化ストレス誘導因子
これは、一次腸標的化ストレス誘導因子(すなわち、腸炎症、感染、または身体的ストレス)に焦点をおいたモデルである。動物試験から、軽度の炎症または免疫活性化が、腸の運動性ならびに/または求心性および上皮機能の変化の根拠となり得ることが示されている(Mayer et al., Eur. J. surg. Suppl. (587): 3-9 (2002))。このモデルでは、カラシ油を結腸内に毎日注射する方式で、新生仔動物(8〜21日)において常時的結腸過敏を生じさせる。カラシ油は神経刺激物質であり、結腸内投与後に内臓痛覚過敏を誘発することが示されている。このモデルは、内臓痛覚過敏および排便習慣の変化を含むIBSの重要な特徴を模倣する。動物はまた、IBS患者の重要な特徴である下痢または便秘を呈する(Mayer et al., Eur. J. surg. Suppl. (587): 3-9 (2002));(Kimball et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Pathol. 288: G1266 (2005))。本発明の抗体を送達して、このモデルに関連した症状の発症の変化を判定することができる。本発明者らの阻害剤による治療的処置後に、内臓痛覚過敏および腸運動性の変化の発生率または程度が減少すれば、これらの分子がIBSの治療に有効である可能性が示唆される。
【０３６５】
実施例23
IL-17 NIH-3T3/huIL-17RCx4 Iκβ-αバイオアッセイ法
NIH-3T3/KZ142.8/huIL-17RCx4トランスフェクション細胞株を、2005年6月10日に出願されたWO 2005/123778に記載される通りに作製した。1日目に、NIH-3T3/KZ142.8/huIL-17RCx4細胞を、96ウェル平底組織培養プレートに、増殖培地(L-グルタミン＋5%ウシ胎仔血清、1%ピルビン酸ナトリウム、1μM MTXを含むDMEM)中7,500個細胞/ウェルでプレーティングした。2日目に、細胞をアッセイ培地(L-グルタミン＋0.1% BSAおよび10 mM HEPESを含むDMEM)に切り替えた。3日目に、ヒトIL-17A(ZGI大腸菌(E. coli)物質およびZGI 293F B物質)の段階希釈物をアッセイ培地で調製し、細胞を含むプレートに添加し、37℃で10分間共にインキュベートした。さらに、このアッセイ法を用いて、IL-17A活性の中和も測定した。準最大濃度(EC50またはEC90、それぞれ50%および90%有効濃度)のIL-17Aを、ヒトIL-17RA-Fc可溶性受容体(ZGI)、抗ヒトIL-17Aモノクローナル抗体(R&D、MAB317)、および抗ヒトIL-17Aポリクローナル抗体(R&D、AF317NA)の段階希釈物と混合し、アッセイ培地中で37℃で30分間共にインキュベートしてから、細胞に添加した。プレインキュベーション後、細胞を含むプレートに処理物を添加し、37℃で10分間共にインキュベートした。
【０３６６】
インキュベーション後、製造業者の説明書に従って(BIO-PLEX細胞溶解キット、BIO-RAD Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)、細胞を氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、氷上に置いて反応を停止させた。50μL/ウェルの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。溶解物を氷上でピペッティングして5回上下させ、その後マイクロプレートプラットホーム振盪機上で300 rpm、4℃で20分間撹拌した。プレートを4500 rpm、4℃で20分間遠心分離した。上清を回収し、新しいマイクロタイタープレートに移して-20℃で保存した。
【０３６７】
製造業者の説明書に従って(BIO-PLEXリン酸化タンパク質検出キット、BIO-RAD Laboratories)、捕捉ビーズ(BIO-PLEXホスホ-Iκβ-αアッセイ法、BIO-RAD Laboratories)を1:1希釈溶解物50μLと混合し、96ウェルフィルタープレートに添加した。アルミ箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で一晩インキュベートした。プレートをマイクロタイター真空装置に移し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。25μL/ウェルの検出抗体を添加した後、箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で30分間インキュベートした。プレートを濾過し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。ストレプトアビジン-PE(50μL/ウェル)を添加し、箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で15分間インキュベートした。プレートを濾過し、ビーズ再懸濁緩衝液で2回洗浄した。最終洗浄後、ビーズを125μL/ウェルのビーズ懸濁緩衝液に再懸濁し、30秒間振盪し、製造業者の説明書に従ってアレイリーダー(BIO-PLEX、BIO-RAD Laboratories)で読み取った。解析用ソフトウェア(BIO-PLEX MANAGER 3.0、BIO-RAD Laboratories)を用いて、データを解析した。溶解物中に存在するリン酸化Iκβ-α転写因子のレベルの増加は、IL-17A受容体-リガンド相互作用を示した。中和アッセイ法の場合、溶解物中に存在するリン酸化Iκβ-α転写因子のレベルの減少は、IL-17A受容体-リガンド相互作用の中和を示した。GraphPad Prism(登録商標) 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc.、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いてIC50(50%阻害濃度)値を算出し、中和アッセイ法における各試薬のモル比として表した。
【０３６８】
IL-17Aは用量依存的様式でIκβ-αリン酸化を誘導し、EC90濃度は、いずれの形態のリガンドについても0.25 nMであると決定された。IL-17Aは、1:1モル比の抗ヒトIL-17Aポリクローナル抗体によって、7:1モル比のヒトIL-17RA-Fc可溶性受容体によって、および50:1モル比の抗ヒトIL-17Aモノクローナル抗体によって中和された。以下の表8は、IL-17RA-FcおよびIL-17Aポリクローナル抗体対照と比較した、本明細書に記載する代表的なIL-17A中和実体のIC50値を示す。結果から、IL-17Aクローンが、ヒトIL-17Aによって誘導されるシグナルを減少させる上で有効であることが示される。
【０３６９】
（表８）
2009540018.tif 000036
【０３７０】
実施例24
IL-23 Baf3/huIL-23R/huIL-12Rβ1 STAT3バイオアッセイ法
Baf3/KZ134/huIL-23R/huIL-12Rβ1クローン6トランスフェクション細胞株を、本明細書に記載した通りに作製した。Baf3/KZ134/huIL-23R/huIL-12RB1クローン6細胞をアッセイ培地(L-グルタミン＋10%ウシ胎仔血清、1%ピルビン酸ナトリウム、および2 uM βメルカプトエタノールを含むRPMI 1640)で2回洗浄してから、96ウェル丸底組織培養プレートに30,000個細胞/ウェルでプレーティングした。組換えヒトIL-23(ZGI CHO物質またはeBioscienceの昆虫ヘテロ二量体物質)の段階希釈物をアッセイ培地で調製し、細胞を含むプレートに添加し、37℃で15分間共にインキュベートした。さらに、このアッセイ法を用いて、IL-23活性の中和も測定した。半最大濃度(EC50、50%有効濃度)のIL-23を、抗ヒトIL-12 p40モノクローナル抗体(Pharmingen)、抗ヒトIL-23 p19ポリクローナル抗体(R&D、AF1716)、およびヒトIL-23R-Fc可溶性受容体(ZGI)の段階希釈物と混合し、アッセイ培地中で37℃で30分間共にインキュベートしてから、細胞に添加した。プレインキュベーション後、細胞を含むプレートに処理物を添加し、37℃で15分間共にインキュベートした。
【０３７１】
インキュベーション後、製造業者の説明書に従って(BIO-PLEX細胞溶解キット、BIO-RAD Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)、細胞を氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、氷上に置いて反応を停止させた。次に細胞を2000 rpm、4℃で5分間遠心沈降させて、培地を除去した。50μL/ウェルの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。溶解物を氷上でピペッティングして5回上下させ、その後マイクロプレートプラットホーム振盪機上で300 rpm、4℃で20分間撹拌した。プレートを4500 rpm、4℃で20分間遠心分離した。上清を回収し、新しいマイクロタイタープレートに移して-20℃で保存した。
【０３７２】
製造業者の説明書に従って(BIO-PLEXリン酸化タンパク質検出キット、BIO-RAD Laboratories)、捕捉ビーズ(BIO-PLEXホスホ-STAT3アッセイ法、BIO-RAD Laboratories)を1:1希釈溶解物50μLと混合し、96ウェルフィルタープレートに添加した。アルミ箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で一晩インキュベートした。プレートをマイクロタイター真空装置に移し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。25μL/ウェルの検出抗体を添加した後、箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で30分間インキュベートした。プレートを濾過し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。ストレプトアビジン-PE(50μL/ウェル)を添加し、箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で15分間インキュベートした。プレートを濾過し、ビーズ再懸濁緩衝液で2回洗浄した。最終洗浄後、ビーズを125μL/ウェルのビーズ懸濁緩衝液に再懸濁し、30秒間振盪し、製造業者の説明書に従ってアレイリーダー(BIO-PLEX、BIO-RAD Laboratories)で読み取った。解析用ソフトウェア(BIO-PLEX MANAGER 3.0、BIO-RAD Laboratories)を用いて、データを解析した。溶解物中に存在するリン酸化STAT3転写因子のレベルの増加は、IL-23受容体-リガンド相互作用を示した。中和アッセイ法の場合、溶解物中に存在するリン酸化STAT3転写因子のレベルの減少は、IL-23受容体-リガンド相互作用の中和を示した。GraphPad Prism(登録商標) 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc.、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いてIC50(50%阻害濃度)値を算出し、中和アッセイ法における各試薬のモル比として表した。
【０３７３】
IL-23は用量依存的様式でSTAT3リン酸化を誘導し、EC50濃度はZGI A1806Fについては20 pMであり、eBioscienceヘテロ二量体については30 pMであると決定された。表9は、IL-23陽性対照(IL-23 p19ポリAbおよびIL-23R-Fc)および本明細書に記載のIL-23中和実体の例示的なIC50データを示す。これらのデータから、IL-23中和実体が、IL-23の効果を減少させる上で有効であり、対照と同等であるかまたはそれよりも優れていることが示される。
【０３７４】
（表９）
2009540018.tif 000037
【０３７５】
実施例25
カニクイザルIL-17AおよびIL-23p19ポリヌクレオチド配列
高忠実度熱安定性ポリメラーゼ(Expand、Roche Applied Science、インディアナ州、インディアナポリス)を用いて、PCRによってCnIL-17Aをクローニングした。チンパンジーおよびヒトIL-17AのUCSC Genome Browserから入手可能な配列情報に基づいて、オリゴヌクレオチド56837(SEQ ID NO: 27)および56838(SEQ ID NO: 28)を設計して、カニクイザル遺伝子オープンリーディングフレームを増幅した。PMAおよびイオノマイシン刺激カニクイザルPBMCから精製した全RNAから、製造業者の推奨に従って(Invitrogen corp. カリフォルニア州、カールズバッド)SuperscriptII逆転写酵素を使用して、オリゴdTプライマーを用いてcDNA合成を開始した。13歳雄カニクイザル(M. fascularis)動物から得られた全血からPBMCを単離し、10 ng/ml PMAおよび0.5 ug/mlイオノマイシンで4時間刺激した。製造業者の推奨に従ってRNeasyミニキット(Qiagen, Inc. カリフォルニア州、バレンシア)を用いて、全RNAを単離した。カニクイザルの配列情報が欠如していることから、配列比較のためにいくつかのPCR産物をPCR4 TO(Invitrogen corp. カリフォルニア州、カールズバッド)にクローニングした。12クローンからヌクレオチド共通配列が得られ、これをSEQ ID NO: 29に示す。
【０３７６】
高忠実度熱安定性ポリメラーゼ(Expand、Roche Applied Science、インディアナ州、インディアナポリス)を用いて、PCRによってCnIL-23p19をクローニングした。チンパンジーおよびヒトIL-23p19のUCSC Genome Browserから入手可能な配列情報に基づいて、オリゴヌクレオチド56846(SEQ ID NO: 1016)および56855(SEQ ID NO: 1017)を設計して、カニクイザル遺伝子を増幅した。LPS、ポリIC、TNF、およびCD40リガンド刺激した単球由来樹状細胞から精製した全RNAから、製造業者の推奨に従って(Invitrogen corp. カリフォルニア州、カールズバッド)SuperscriptII逆転写酵素を使用して、オリゴdTプライマーを用いてcDNA合成を開始した。X歳雄カニクイザル(M. fascularis)動物から得られた全血からPBMCを単離し、これを用いて、CD14非ヒト霊長類マイクロビーズ(Miltneyi Biotec、ドイツ、ベルギッシュ)を使用してCD14+細胞を精製した。CD14+細胞をそれぞれ10 ng/mlのhGMCSFおよびhIL-4を用いて4日間かけて分化させ、その後1 ug/ml LPS、25 ug/mlポリIC、20 ng/ml TNF、および10 ug/ml CD40リガンドで4時間刺激した。製造業者の推奨に従ってRNeasyミニキット(Qiagen, Inc. カリフォルニア州、バレンシア)を用いて、全RNAを単離した。カニクイザルの配列情報が欠如していることから、配列比較のためにいくつかのPCR産物をPCR4 TO(Invitrogen corp. カリフォルニア州、カールズバッド)にクローニングした。16クローンからヌクレオチド共通配列が得られ、これをSEQ ID NO: 30に示す。
【０３７７】
実施例26
IL-12バイオアッセイ法
白血球搬出PBMC：
PBMCの一貫したプールを得るために、正常ヒトドナーを自主的にアフェレーシスに供した。白血球搬出PBMCを滅菌500 mlプラスチック瓶に注ぎ入れ、室温PBS＋1 mM EDTAで400 mlに希釈し、250 mlコニカルチューブに移した。250 mlチューブを1500 rpmで10分間遠心分離して、細胞をペレット化させた。次に細胞上清を除去し、廃棄した。次いで細胞ペレットを混合し、PBS＋1 mM EDTA 400 mlに懸濁した。細胞懸濁液(25 ml/チューブ)を、50 mlコニカルチューブ中のフィコール(20 ml/チューブ)上に重層した(全部でチューブ16本)。チューブを2000rpm、室温で20分間遠心分離した。白血球および残存血小板を含む界面層(「軟膜」)を回収し、プールし、血小板の大部分が除去されるまでPBS＋1 mM EDTAで繰り返し洗浄した。次に白血球を氷冷凍結保存培地(70% RPMI＋20% FCS＋10% DMSO) 100 mlに懸濁し、滅菌クライオバイアルに分注した(細胞1 ml/バイアル)。クライオバイアルを-80℃冷凍庫に24時間置いてから、液体窒素冷凍庫に移した。典型的なアフェレーシスによる白血球収量は、0.5〜1.0×1010個細胞である。この方法で処理したアフェレーシス細胞は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、および樹状細胞を含む。
【０３７８】
PHAブラストの調製：
T細胞は、IL-12受容体を発現し、IL-12およびIL-23に応答し得るためには、活性化されなければならない。凍結保存した白血球搬出PBMCを融解し、滅菌50 mlコニカルチューブに移し、加温RPMI＋10%熱非働化FBS＋1 ug/ml DNAse I(Calbiochem) 50 mlで一度洗浄し、新鮮なRPMI/FBS/DNAse培地50 mlに再懸濁し、細胞が融解から回復できるように37°F水浴中で少なくとも1時間インキュベートした。次に細胞を遠心分離し、細胞上清を廃棄した。細胞ペレットをRPMI＋10% FBSに再懸濁し、滅菌75 cm2組織培養フラスコに分注した(40 ml/フラスコで1×107個細胞/フラスコ)。PHA-L(PBS中の5 mg/ml保存液)を最終濃度5 ug/mlで細胞に添加した。次に、細胞を加湿インキュベーター中、37℃で全部で5日間培養した。4日目の午後に細胞を回収し、培養液をPHA-Lを含まない新鮮なRPMI＋10% FBS(40 ml/フラスコ)と交換し、細胞をそれらのフラスコに戻し、細胞を加湿インキュベーター中、37℃で5日間の培養期間の残りの期間インキュベートすることにより、細胞をいくつかの実験のために「静止」させた。
【０３７９】
IL-12およびIl-23バイオアッセイ法：
正常ヒトT細胞に対するヒトIL-12およびIl-23生物活性を検出するための3つのインビトロアッセイ法が確立されている：1) IFN-γおよびMIP-1α産生、2) 増殖([3H]取り込み)、および3) STAT3活性化。培養5日目にヒトPHAブラスト(活性化T細胞)を回収し、新鮮なRPMI＋10% FBSに懸濁し、96ウェルプレートに所望の細胞数/ウェルでプレーティングした。
【０３８０】
IL-12アッセイ法も含めることにより、本明細書に記載の中和実体のIL-12ではなくIL-23p19に対する特異性を決定した。
【０３８１】
IFN-γ産生アッセイ用に、細胞を平底96ウェルプレートに1×106個/ウェルでプレーティングした。細胞を、培地のみ、ヒトIL-2のみ(10 ng/ml；R & D Systems)、ヒトIL-12のみ(段階的用量；Invitrogen)、ヒトIL-23のみ(段階的用量；ZGIロット#A1806；CHO由来)、抗ヒトCD28 mAbのみ(段階的用量；クローン28.2、e-Biosciences)、または抗ヒトCD28 mAbと組み合わせた各サイトカインと共に、最終容量200 ul/ウェルで37℃で培養した。各培養条件について、3通りのウェルを設定した。IFN-γ産生アッセイ法のため、細胞を加湿インキュベーター中で37℃で24〜48時間培養した後に、細胞上清(120 ul/ウェル)を回収した。これらの上清(各3通りについてプール)中のヒトIFN-γおよびMIP-1α濃度を、製造業者の説明書に従って市販のLuminexビーズベースのELISAキット(Invitrogen)を用いて測定した。
【０３８２】
プレート固定化抗ヒトCD3 mAb(5 ug/ml)および可溶性抗ヒトCD28mAb(1 ug/ml)と共に細胞を培養し、細胞を加湿インキュベーター中で37℃で48時間培養した後に上清(120 ul/ウェル)を回収することによって、IFN-γおよびMIP-1α産生に及ぼすIL-23の効果を強化した。これらの上清(各3通りについてプール)中のヒトIFN-γ濃度を、製造業者の説明書に従って市販のLuminexビーズベースのELISAキット(Invitrogen)を用いて測定した。
【０３８３】
[3H]取り込みアッセイ用に、細胞をU底96ウェルプレートに2×105個細胞/ウェルでプレーティングした。細胞を37℃で72時間培養した。この培養期間の最後の8時間にわたり、細胞を1 uCi/ウェルの[3H]-チミジン(Amersham)でパルスした。次に細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、取り込まれた[3H]のCPMをβカウンター(Topcount NXT、Packard)を用いて定量した。
【０３８４】
これら上記の終点パラメータのそれぞれについて、IL-23によって媒介される活性の効果的な中和が、本明細書に記載の抗IL-23p19中和実体の存在下において、0.1〜100 nMの範囲のIC50値で認められた。IL-12によって媒介される効果の中和に及ぼす抗IL-23p19アンタゴニストの効果は認められず、IL-23p19に対するアンタゴニストの特異性が示される。
【０３８５】
STAT3バイオアッセイ法：
STAT3バイオアッセイ用に、細胞をU底96ウェルプレートに2×105個細胞/ウェルでプレーティングした。ヒトIL-12(R&D)または組換えヒトIL-23(ZGI CHO由来物質またはeBioscienceの昆虫ヘテロ二量体物質)の段階希釈物をアッセイ培地(L-グルタミン＋10%ウシ胎仔血清を含むRPMI 1640)で調製し、細胞を含むプレートに添加し、37℃で15分間共にインキュベートした。さらに、このアッセイ法を用いて、市販の中和試薬(「対照」として)または本明細書に記載の抗IL-23p19含有中和実体を使用してIL-12およびIL-23活性の中和も測定した。半最大濃度(EC50、50%有効濃度)のIL-12またはIL-23を、抗ヒトIL-12 p40モノクローナル抗体(Pharmingen)、抗ヒトIL-23 p19ポリクローナル抗体(R&D、AF1716)、ヒトIL-23R-Fc可溶性受容体(ZGI)、または本明細書に記載の中和実体のいずれかの段階希釈物と混合し、アッセイ培地中で37℃で30分間共にインキュベートしてから、細胞に添加した。プレインキュベーション後、細胞を含むプレートに処理物を添加し、37℃で15分間共にインキュベートした。
【０３８６】
インキュベーション後、製造業者の説明書に従って(BIO-PLEX細胞溶解キット、BIO-RAD Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)、細胞を氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、氷上に置いて反応を停止させた。次に細胞を2000 rpm、4℃で5分間遠心沈降させて、培地を除去した。50 ul/ウェルの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。溶解物を氷上でピペッティングして5回上下させ、その後マイクロプレートプラットホーム振盪機上で300 rpm、4℃で20分間撹拌した。プレートを4500 rpm、4℃で20分間遠心分離した。上清を回収し、新しいマイクロタイタープレートに移して-20℃で保存した。
【０３８７】
製造業者の説明書に従って(BIO-PLEXリン酸化タンパク質検出キット、BIO-RAD Laboratories)、捕捉ビーズ(BIO-PLEXホスホ-STAT3アッセイ法、BIO-RAD Laboratories)を1:1希釈溶解物50 ulと混合し、96ウェルフィルタープレートに添加した。アルミ箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で一晩インキュベートした。プレートをマイクロタイター真空装置に移し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。25μL/ウェルの検出抗体を添加した後、箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で30分間インキュベートした。プレートを濾過し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。ストレプトアビジン-PE(50 ul/ウェル)を添加し、箔で覆ったプレートを、300 rpmで振盪させながら室温で15分間インキュベートした。プレートを濾過し、ビーズ再懸濁緩衝液で2回洗浄した。最終洗浄後、ビーズを125 ul/ウェルのビーズ懸濁緩衝液に再懸濁し、30秒間振盪し、製造業者の説明書に従ってアレイリーダー(BIO-PLEX、BIO-RAD Laboratories)で読み取った。解析用ソフトウェア(BIO-PLEX MANAGER 3.0、BIO-RAD Laboratories)を用いて、データを解析した。
【０３８８】
溶解物中に存在するリン酸化STAT3転写因子のレベルの増加は、IL-12またはIL-23受容体-リガンド相互作用を示した。中和アッセイ法の場合、溶解物中に存在するリン酸化STAT3転写因子のレベルの減少は、IL-12またはIL-23受容体-リガンド相互作用の中和を示した。GraphPad Prism(登録商標) 4ソフトウェア(GraphPad Software, Inc.、カリフォルニア州、サンディエゴ)を用いてIC50(50%阻害濃度)値を算出し、中和アッセイ法における各試薬および/または中和実体のモル比として表した。
【０３８９】
IL-12およびIL-23はいずれも、PHA活性化ヒトT細胞のドナーごとに異なるが、用量依存的様式でSTAT3リン酸化を誘導した。IL-23のEC50値は12〜53 pMの範囲であった。IL-12およびIL-23はいずれも抗ヒトIL-12 p40モノクローナル抗体によって中和されたが、抗ヒトIL-23 p19ポリクローナル抗体およびヒトIL-23R-Fc対照、ならびに本明細書に記載の抗IL23p19中和実体ではIL-23のみが中和された。
【０３９０】
一例ではあるが、一人のドナーについて、EC50濃度がIL-12に関して200 pM、およびIL-23に関して20 pM(ZGI CHO由来タンパク質ロットA1806Fを用いて)、およびIL-23に関して30 pM(eBioscienceヘテロ二量体を用いて)であると決定された。IL-12およびIL-23はいずれも、市販の抗ヒトIL-12 p40モノクローナル抗体によって中和された。市販の抗ヒトIL-23 p19ポリクローナル抗体およびヒトIL-23R-Fc可溶性受容体(「対照」として)ではIL-23のみが中和され、このアッセイ法がその目的とするサイトカイン活性/中和用途に特異的であることが示される。結果から、本明細書に記載の有効な中和実体が、rhIL-23の効果を中和する上で、市販の試薬と同等であるかまたはそれよりも優れていることが示された。(代表的な例示的中和値については表10を参照されたい)。さらに、結果から、中和実体はrhIL-23を特異的に阻害し、IL-12は阻害しないことが示される(データは示さず；すべてのデータグラフから、IL-12誘導性活性に対する抗IL-23p19クローンの中和能は全く示されなかった)。
【０３９１】
（表１０）ヒトPHAブラストにおけるIL-23媒介性pSTAT3活性の中和に関するIC50値
2009540018.tif 000038
【０３９２】
実施例27
ヒト小気道上皮細胞におけるhuIL-17誘導性サイトカイン産生の中和に関するバイオアッセイ法(SAEC IL-12 PHAバイオアッセイ法)
ヒト小気道上皮細胞(SAEC)をrhIL-17で処理すると、サイトカインG-CSF、IL-6、およびIL-8の産生が誘導され、次にこれらは、IL17/IL23p19中和実体が有効であると考えられる疾患に関連した病態において役割を果たす。本明細書に記載する中和実体のいずれかがこれらサイトカインのrhIL-17媒介性産生を中和する能力をこのバイオアッセイ法で測定し、それによってこれらサイトカインに対するインビボ有効性もまた予測される。
【０３９３】
方法：
SAEC(細胞および増殖培地はCambrex, Inc.から購入)を96ウェル平底組織培養マルチウェルプレートに8,000個細胞/ウェルでプレーティングし、37℃、5% CO2インキュベーターに入れた。翌日、10〜20 ng/mL rhIL-17と組み合わせた一定の用量範囲の中和実体で細胞を処理した。リガンドおよび中和実体を37℃で30分間共にインキュベートしてから、細胞に添加した。各用量について、2通りまたは3通りのウェルを設定した。24〜48時間後に上清を回収し、直接使用しない場合には-80℃で保存した。上清を採取する前に、倒立顕微鏡によってウェルをスキャンして、どのウェルが考慮すべき細胞死を有するかを書き留めた。そのようなウェルは、最終的な計算に含めなかった。次に、上清を多重ビーズベースのアッセイ系(Bio-Rad Laboratories)でサイトカインhuG-CSF、huIL-6、およびhuIL-8についてアッセイし、IC50を決定した。
【０３９４】
結果：
rhIL-17の存在下において、本明細書に記載の中和実体はサイトカイン産生を減少させる上で有効であり、IC50値は0.1〜100 nMであった。SAECのドナーが異なるために、実験間でいくらか変動があったものの、他よりも優れた中和能を有するいくつかの抗IL17Aクローンが明らかに存在した。例えば、あるドナーのSAECを用いた場合、クローンM7.19.E7(SQ7_c87)は31.1 nMのIC50でヒトIL-17A誘導性G-CSF産生を阻害し、別のドナーのSAEC培養物を用いた場合、同じクローンは13.4 nMのIC50でIL-17A媒介性G-CSF産生を阻害することができた。これらのデータから、ドナー間/実験間で変動があるものの、IL-17A中和実体は、ヒト初代細胞に及ぼすIL-17Aの生物学的効果を中和する上で有効であることが実証される。
【０３９５】
実施例28
いずれか一方のmAbのみよりも有効である、マウス大腸炎における抗IL-17 mAbと抗IL-23p19 mAbの併用
IL-23およびIL-17は、Th17細胞の作用を介して、マウス大腸炎およびヒトIBDにおいて重要な役割を担う。IL-23およびIL-17は大腸炎およびIBDにおいて上方制御され、いずれか一方のサイトカインのみを中和することは、いくつかの大腸炎動物モデルにおいて有効である(Fujino et al, Gut, 2003, 52:65-70；Schmidt et al, Inflamm Bowel Dis. 2005, 11 :16-23；Yen et al, J Clin Invest. 2006, 116:1310-1316；Zhang et al, Inflamm Bowel Dis. 2006, 12:382-388；Kullberg et al, J Exp Med. 2006, 203:2485-94.)。IL-23はTh17細胞の維持、分化、および/または誘導に重要であるため、両サイトカインを中和することは、疾患を軽減する上でいずれか一方のサイトカインのみよりも有効であると考えられる。本実施例は、ヒト潰瘍性大腸炎(UC)に似ているオキサゾロン誘発大腸炎モデルにおいて、これを支持するデータを提供する。
【０３９６】
方法：
この実験には、C57BL/10雌マウス40匹(Harlanから入手)を使用した。-5日目に、マウスの腹部を、100%エタノール中の3.0%(w/v)オキサゾロン200 ulで局所的に処置した(「感作」)。0日目に、全マウスに、軽度のイソフルランガス麻酔下で、50%エタノール中の2.0%(w/v)オキサゾロンを直腸内注射する(それぞれ120 uL)(「惹起」)。便の硬さ、体重、および血便を含む疾患活動指数(DAI)スコアを用いて、マウスを疾患についてモニターした。mAb処置のため、マウスに以下のうちの1つを腹腔内注射により-5、-3、および-1日目に投与した：PBS、50 ug中和抗マウスIL-17、50 ug中和抗マウスIL-23p19 mAb、または抗IL17 mAb＋抗IL-23p19 mAbの組み合わせ。
【０３９７】
2日目にマウスを安楽死させた。血清を採取し、後に解析するために保存した。結腸を摘出し、大腸炎の任意の肉眼的徴候(病変、結腸短縮、および結腸壁肥厚)について観察した。次いで結腸を縦方向に切断し、組織学的検査用および24時間の結腸培養用に処理した。
【０３９８】
結果：
抗IL-17抗体＋抗IL-23p19抗体の組み合わせで処置したマウスでは、PBSおよびいずれか一方のmAbのみと比較して、DAIスコアの有意な減少(p＝0.0216；PBS群と比較して54%減少)および組織学的形態の有意な(p＜0.05)改善(例えば、結腸損傷の軽減および炎症の軽減)が認められた。これらの利点と一致して、抗体の組み合わせで処置したマウスでは、PBS処置マウスおよびいずれか一方の抗体のみで処置したマウスと比較して、結腸短縮も有意に改善された(p＜0.0112)。結腸培養物からの炎症性サイトカインの産生に関して、抗IL-17＋抗IL-23p19組み合わせ抗体で処置したオキサゾロンマウスでは、PBS処置オキサゾロンマウスと比較して、IL-1b、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、およびTNF-aの増加が低かった。抗IL-17抗体＋抗IL-23p19抗体の組み合わせによる処置はまた、PBS処置マウスと比較して、血清IL-12、IL-17、IL-23、およびTNF-a濃度の有意な減少をもたらした。
【０３９９】
したがって、抗IL-17抗体および抗IL-23p19抗体の治療組み合わせの送達は、いくつかの局面：疾患症状、病態、および炎症性サイトカイン産生から、大腸炎を軽減する上で有意により有効であった。まとめると、これらの結果から、IL-17およびIL-23/p19中和抗体の治療組み合わせが、ヒトIBDのモデルとしてのオキサゾロン大腸炎の治療においてより有効であることが示される。治療組み合わせは、臨床疾患症状を軽減することができ、分子レベルで働いて、炎症、組織損傷、炎症性サイトカイン、およびこのように影響を受けることが判明している他の機構を減少させる。
【０４００】
実施例29
表面プラズモン共鳴法(Biacore)による抗IL-17A分子のIL-17Aに対する結合親和性の測定
表面プラズモン共鳴法およびBiacore T-100装置(GE Healthcare)を用いて、本明細書に記載の抗IL-17A実体をIL-17Aに対する結合親和性について評価した。組換えヒトIL-17Aをセンサーチップに固定化し、その後アンタゴニストを固定化リガンド上を通過させて親和性測定を行った。これらの方法により、IL-17A中和実体のそれらそれぞれのリガンド(IL-17A)に関する結合親和性測定が可能となり、IL-17ファミリーの他のメンバーのような、似ているが異なるリガンドに対して結合を示さないことによって、IL-17Aに対する特異性もまた実証される。
【０４０１】
固定化の最良の条件を決定するため、一連のpH探索実験を行った。これらの実験のため、組換えヒトIL-17A(ZGIロットA1781F)を、5つの異なる固定化緩衝液；酢酸-4.0、酢酸-4.5、酢酸-5.0、酢酸-5.5、およびホウ酸-8.5で100 nMになるよう希釈した。Immobilization Scouting Wizardを用いてこれらの条件を試験したが、最終的に酢酸-4.0が固定化の最良条件であった。
【０４０２】
固定化手順に関しては、IL-17Aタンパク質を酢酸-4.5で10 ug/mlになるよう希釈し、次にアミンカップリングキットおよびBiacore Immobilization Wizardを用いて、Series S Sensor Chip(CM5、GE Healthcare / Biacore #BR-1006-68)上に固定化した。簡潔に説明すると、固定化のレベルを300 Biacore共鳴単位(RU)になるように設定し、IL-17Aのみを活性フローセル上に注入した。固定化手順後、フローセル上の活性部位をエタノールアミンでブロッキングした。50 mM NaOHで洗浄することによって、非特異的に結合したタンパク質を除去した。最終的な固定化レベルは466 RUであった。参照セルを活性化し、次にエタノールアミンでブロッキングした。
【０４０３】
動態学的実行のため、対照タンパク質であるIL-17RA-Fc(ZGIロットA1763F)もしくはIL-17Aモノクローナル抗体(R&D MAB317)、または本明細書に記載の抗IL-17A中和実体の段階希釈物を1×HBS-EP+緩衝液で調製した。各濃度の注入を2通りで行った。分析物の注入は30 ul/分で行い、解離時間600秒を伴った。装置のノイズおよびドリフトの減算ができるように、緩衝液の注入も行った。
【０４０４】
Regeneration Scouting Kit(GE Healthcare / Biacore # BR-1005-56)中に供給される再生緩衝液を用いて、再生条件を決定した。標準的なBiacore法を実施して、100 nM IL-17RA-Fcを用いて、IL-17A表面について最良の再生条件を規定した。最も穏やかな条件を最初に試験し、強度を上げていった。選択された最終的な再生条件は、50 ul/分での10 mM H3PO4の1〜60秒パルスおよびその後の1×HSB-EP緩衝液の1〜60秒パルスであった。
【０４０５】
IL-17A特異的相互作用の確認として、固定化組換えヒトIL-17F(ZGIロットA1275F)を用いて同様の手順を行った。
【０４０６】
Biacore Evaluation software(v.1.1.1)を用いてデータを解析して、IL-17Aと対照タンパク質(IL-17Aモノクローナル抗体およびIL-17RA-Fc)および本明細書に記載のIL-17A中和実体との相互作用の動態値を規定した。基準安定性を評価して、再生段階が一連の注入を通して一貫した結合表面を提供したことを保証した。二重参照により結合曲線を標準化し、2通りの注入曲線を再現性について確認した。得られた結合曲線は、包括的に二価相互作用モデルに適合した。
【０４０７】
データから、対照アンタゴニストタンパク質(IL-17RA-Fcおよび抗IL-17Aモノクローナル抗体)および本明細書に記載のIL-17A中和実体に対するヒトIL-17Aの高親和性結合が実証される。IL-17Fに対する対照IL-17Aアンタゴニストタンパク質および抗IL-17A中和実体の結合が認められないことから、IL-17A標的化の特異性の証拠が提供される。
【０４０８】
具体的には、ヒトIL-17Aは、IL-17R-Fcについて約5 nMおよびIL-17Aモノクローナル抗体について約2 nMの解離平衡定数(KD)を示す。本明細書に記載の中和実体は広範囲の親和性を示したが、十分にこの範囲(0.4〜＜15 nM)内であり、したがって匹敵する結合親和性が実証される。
【０４０９】
実施例30
表面プラズモン共鳴法(Biacore)による抗IL-17A分子のIL-17Aに対する解離速度(off-rate)解析
表面プラズモン共鳴法およびBiacore T-100装置(GE Healthcare)を用いて、本明細書に記載の抗IL-17A実体をIL-17Aに対する結合解離速度について評価した。解離速度が遅いことによって、長時間にわたって相互作用の程度が高いことが予測されるため、解離速度解析はインビボで起こる相互作用を推定するのに役立つと考えられる。これらの実験のため、組換えヒトIL-17Aをセンサーチップに固定化し、その後アンタゴニストを固定化リガンド上を通過させて解離速度解析を行った。Biacore親和性の実施例(実施例29を参照されたい)と同様に、IL-17A特異性を実証するために、IL-17Fを陰性対照として使用した。
【０４１０】
固定化の最良の条件を決定するため、一連のpH探索実験を行った。これらの実験のため、組換えヒトIL-17A(ZGIロットA1781F)またはヒトIL-17F(ZGIロットA1275F)を、5つの異なる固定化緩衝液；酢酸-4.0、酢酸-4.5、酢酸-5.0、酢酸-5.5、およびホウ酸-8.5で100 nMになるよう希釈した。Immobilization Scouting Wizardを用いてこれらの条件を試験したが、最終的に酢酸-4.0が固定化の最良条件であった。
【０４１１】
固定化手順のため、ヒトIL-17A(天然およびビオチン化)およびIL-17Fを酢酸-4.0で10 ug/mlになるよう希釈した。アミンカップリングキットおよびBiacore Immobilization Wizardを用いて、全3種のタンパク質をSeries S Sensor Chip(CM5、GE Healthcare / Biacore #BR-1006-68)上に固定化した。簡潔に説明すると、固定化のレベルを500 Biacore共鳴単位(RU)になるように設定した。フローセル1を参照として使用し、したがって活性化しか行わず、その後エタノールアミンでブロッキングした。天然型IL-17Aをフローセル2に固定化し、ビオチン化IL-17Aをフローセル3に固定化し、IL-17Fをフローセル4に固定化した。分析物のみを活性フローセル(フローセル2、3、および4)上に注入した。固定化後、フローセル上の活性部位をエタノールアミンでブロッキングした。50 mM NaOHで洗浄することによって、非特異的に結合したタンパク質を除去した。最終的な固定化レベルは、フローセル1(参照)では175.0 RUであり、活性フローセル(フローセル2〜4)では669.5〜695.6 RUであった。
【０４１２】
抗IL-17A中和実体の試料を、1×HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare / Biacore、#BR-1006-69)で100 nMになるよう希釈した。陽性対照として、IL-17RA-FcおよびIL-17Aモノクローナル抗体も1×HBS-EP+緩衝液で100 nMに調製した。各試料の注入を2通りで行った。分析物の注入は30 ul/分で行い、解離時間600秒を伴った。装置のノイズおよびドリフトの減算ができるように、緩衝液の注入も行った。
【０４１３】
regeneration scouting kit中に供給される再生緩衝液を用いて、再生条件を決定した。この手順によって、最適な再生条件は、流速50 ul/分での10 mM H3PO4の注入、60秒およびその後の1×HBS-EP+緩衝液の注入、60秒であることが見出された。
【０４１４】
Biacore Evaluation softwareを用いてデータを評価して、抗IL-17A中和実体の固定化IL-17Aに対する相互作用の解離速度を規定した。基準安定性を評価して、再生段階が一連の注入を通して一貫した結合表面を提供したことを保証した。二重参照により結合曲線を標準化した。2通りの注入曲線を再現性について確認し、その結果得られた結合曲線は、包括的に二価相互作用モデルに適合した。
【０４１５】
Biacore動態学実験のすべてのデータを回収し、Biacore Evaluation Software v1.1.1を用いて解析した。解離相直前のIL-17A中和実体の最終センサーグラムを、すべてy軸で標準化した。これらの解離曲線を用いて、試料をそれらの解離速度に従って最も遅いものから最も速い方ものへと順位付けした。解離速度を、陽性対照であるIL-17RA-Fc(解離速度2.53×10-5秒-1)と比較した。
【０４１６】
（表１１ａ）抗IL-17A Fabの解離速度の順位付け：パネル#1
2009540018.tif 000039
【０４１７】
（表１１ｂ）抗IL-17A Fabの解離速度の順位付け：パネル#2
2009540018.tif 000040
【０４１８】
（表１１ｃ）抗IL-17A scFvの解離速度の順位付け
2009540018.tif 000041
【０４１９】
実施例31
表面プラズモン共鳴法(Biacore)による抗IL-23p19分子のIL-23に対する結合親和性の測定
表面プラズモン共鳴法およびBiacore T-100装置(GE Healthcare)を用いて、本明細書に記載の抗IL-23p19実体をIL-23に対する結合親和性について評価した。組換えヒトIL-23をセンサーチップに固定化し、その後アンタゴニストを固定化リガンド上を通過させて親和性測定を行った。これらの方法により、IL-23p19中和実体のそれらそれぞれのリガンド(IL-23)に関する結合親和性測定が可能となり、IL-12のような、似ているが異なるリガンドに対して結合を示さないことによって、IL-23に対する特異性もまた実証される。
【０４２０】
固定化の最良の条件を決定するため、一連のpH探索実験を行った。これらの実験のため、組換えヒトIL-23(ZGIロットA1806F)を、5つの異なる固定化緩衝液；酢酸-4.0、酢酸-4.5、酢酸-5.0、酢酸-5.5、およびホウ酸-8.5で100 nMになるよう希釈した。Immobilization Scouting Wizardを用いてこれらの条件を試験したが、最終的に酢酸-4.5が固定化の最良条件であった。
【０４２１】
固定化手順に関しては、IL-23タンパク質を酢酸-4.5で10 ug/mlになるよう希釈し、次にアミンカップリングキットおよびBiacore Immobilization Wizardを用いて、Series S Sensor Chip(CM5、GE Healthcare / Biacore #BR-1006-68)上に固定化した。簡潔に説明すると、固定化のレベルを300 Biacore共鳴単位(RU)になるように設定し、IL-23のみを活性フローセル上に注入した。固定化手順後、フローセル上の活性部位をエタノールアミンでブロッキングした。50 mM NaOHで洗浄することによって、非特異的に結合したタンパク質を除去した。最終的な固定化レベルは466 RUであった。参照セルを活性化し、次にエタノールアミンでブロッキングした。
【０４２２】
最適な接触時間を決定するため、RL(リガンドの共鳴シグナル)試験を行った。対照タンパク質である可溶性IL-23R-Fc(ZGIロットA1913F)および抗IL-23p19ポリクローナル抗体(R&D Systems)を1×HSB-EP+流動緩衝液(GE Healthcare / Biacore、#BR-1006-69)で100 nMになるよう希釈した。IL-23R-FcまたはIL-23p19ポリクローナル抗体を、3つの異なる接触時間で活性セルおよび参照セル上に注入した。このRL試験から、IL-23p19ポリクローナル抗体の接触時間は60秒であると決定され、IL-23R-Fcでは接触時間は300秒であった。
【０４２３】
動態学的実行のため、対照タンパク質であるIL-23R-FcもしくはIL-23p19ポリクローナル抗体、または本明細書に記載の抗IL-23p19中和実体の段階希釈物を1×HBS-EP+緩衝液で調製した。各濃度の注入を2通りで行った。分析物の注入は30 ul/分で行い、解離時間600秒を伴った。装置のノイズおよびドリフトの減算ができるように、緩衝液の注入も行った。
【０４２４】
Regeneration Scouting Kit(GE Healthcare / Biacore # BR-1005-56)中に供給される再生緩衝液を用いて、再生条件を決定した。この実行は、最も弱い穏やかな条件から開始して手動で実施した。この手順が終わって、最適な再生条件は、流速50 ul/分での2 M塩化マグネシウムの注入、60秒およびその後の1×HBS-EP+緩衝液の注入、60秒であった。
【０４２５】
IL-23特異的相互作用の確認として、固定化組換えヒトIL-12(R&D Systems)を用いて同様の手順を行った。
【０４２６】
Biacore Evaluation software(v.1.1.1)を用いてデータを解析して、IL-23と対照タンパク質(IL-23p19ポリクローナル抗体およびIL-23R-Fc)および本明細書に記載のIL-23p19中和実体との相互作用の動態値を規定した。基準安定性を評価して、再生段階が一連の注入を通して一貫した結合表面を提供したことを保証した。二重参照により結合曲線を標準化し、2通りの注入曲線を再現性について確認した。得られた結合曲線は、包括的に二価相互作用モデルに適合した。
【０４２７】
データから、対照アンタゴニストタンパク質であるIL-23R-Fcおよび抗IL-23p19ポリクローナル抗体に対するヒトIL-23の、親和定数(KD)それぞれ0.8 nMおよび5.1 nMでの高親和性結合が実証された。本明細書に記載のIL-23p19中和実体はこの範囲内であった。例えば、scFvとしてのクローンM7.36_B06(SQ22_c305)は3.4×10-8というKD (M)を有した。IL-12に対する対照IL-23アンタゴニストタンパク質および抗IL-23p19中和実体の結合が認められないことから、IL-23標的化の特異性の証拠が提供される。
【０４２８】
実施例32
表面プラズモン共鳴法(Biacore)による抗IL-23p19分子のIL-23に対する解離速度解析
表面プラズモン共鳴法およびBiacore T-100装置(GE Healthcare)を用いて、本明細書に記載の抗IL-23p19実体をIL-23に対する結合解離速度について評価した。解離速度が遅いことによって、長時間にわたって相互作用の程度が高いことが予測されるため、解離速度解析はインビボで起こる相互作用を推定するのに役立つと考えられる。これらの実験のため、組換えヒトIL-23をセンサーチップに固定化し、その後アンタゴニストを固定化リガンド上を通過させて解離速度解析を行った。Biacore親和性の実施例(実施例31を参照されたい)と同様に、IL-23特異性を実証するために、IL-12を陰性対照として使用した。
【０４２９】
固定化の最良の条件を決定するため、一連のpH探索実験を行った。これらの実験のため、組換えヒトIL-23(ZGIロットA1806F)を、5つの異なる固定化緩衝液；酢酸-4.0、酢酸-4.5、酢酸-5.0、酢酸-5.5、およびホウ酸-8.5で100 nMになるよう希釈した。immobilization scouting wizardを用いてこれらの条件を試験したが、最終的に酢酸-4.5が固定化の最良条件であった。
【０４３０】
固定化手順のため、ヒトIL-23(天然およびビオチン化)およびIL-12を酢酸-4.5で10 ug/mlになるよう希釈した。アミンカップリングキットおよびBiacore Immobilization Wizardを用いて、全3種のタンパク質をSeries S Sensor Chip(CM5、GE Healthcare / Biacore #BR-1006-68)上に固定化した。簡潔に説明すると、固定化のレベルを300 Biacore共鳴単位(RU)になるように設定した。フローセル1を参照として使用し、したがって活性化しか行わず、その後エタノールアミンでブロッキングした。天然型IL-23をフローセル2に固定化し、ビオチン化IL-23をフローセル3に固定化し、IL-12をフローセル4に固定化した。分析物のみを活性フローセル(フローセル2、3、および4)上に注入した。固定化後、フローセル上の活性部位をエタノールアミンでブロッキングした。50 mM NaOHで洗浄することによって、非特異的に結合したタンパク質を除去した。最終的な固定化レベルは379〜415 RUであった。
【０４３１】
抗IL-23p19中和実体の試料を、1×HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare / Biacore、#BR-1006-69)で100 nMになるよう希釈した。陽性対照として、IL-23R-Fcも1×HBS-EP+緩衝液で100 nMに調製した。各試料の注入を2通りで行った。分析物の注入は30 uL/分で行い、解離時間600秒を伴った。装置のノイズおよびドリフトの減算ができるように、緩衝液の注入も行った。
【０４３２】
regeneration scouting kit中に供給される再生緩衝液を用いて、再生条件を決定した(RR-2007001)。この手順を用いて、最適な再生条件は、流速50 ul/分での2 M塩化マグネシウムの注入、60秒およびその後の1×HBS-EP+緩衝液の注入、60秒であることが見出された。
【０４３３】
Biacore Evaluation softwareを用いてデータを評価して、抗IL-23p19中和実体の固定化IL-23に対する相互作用の解離速度を規定した。基準安定性を評価して、再生段階が一連の注入を通して一貫した結合表面を提供したことを保証した。二重参照により結合曲線を標準化した。2通りの注入曲線を再現性について確認し、その結果得られた結合曲線は、包括的に二価相互作用モデルに適合した。
【０４３４】
（表１２ａ）抗IL-23p19 Fabの解離速度の順位付け
2009540018.tif 000042
【０４３５】
（表１２ｂ）抗IL-23p19の解離速度の順位付け：パネル#1
2009540018.tif 000043
【０４３６】
（表１２ｃ）抗IL-23p19 scFvの解離速度の順位付け
2009540018.tif 000044
【０４３７】
実施例33
抗IL-17A Fabの特徴づけ
16の異なる大腸菌クローンに由来する抗IL-17A Fabが、細胞ベースの中和アッセイ法において、IL-17Aの活性を中和する能力を示した。競合的結合(エピトープビニング(binning))実験を用いて、これらの抗IL-17A中和Fabの機能的結合特性をさらに特徴づけた。
【０４３８】
競合的エピトープ結合(エピトープビニング)
エピトープビニング実験を行って、どの抗IL-17A FabがヒトIL-17Aに同時に結合できるのかを決定した。抗原上の同じまたは重複した結合部位(エピトープ)に関して競合する抗IL-17A Fabは同時に結合することができず、単一のファミリーまたは「エピトープビン（epitope bin）」」に機能的に分類される。抗原上の同じ結合部位に関して競合しない抗IL-17A Fabは同時に結合することができ、別のファミリーまたは「エピトープビン」に分類される。Biacore 3000(商標)装置を用いて実験を行った。Biacoreは、一連の抗体断片およびモノクローナル抗体をエピトープビンに割り当てるために日常的に用いられている種々のアッセイ形式の一つにすぎない。多くの参考文献(例えば、The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 6,6 Glenn E. Morris ed.)が、抗体断片を「分類する(bin)」ために(当業者によって)用いられ得、抗IL-17A FabのヒトIL-17Aに対する結合特性に関して匹敵するデータを提供すると予測される別法を記載している。可溶性の天然抗原を用いて、エピトープビニング実験を行った。
【０４３９】
材料および方法
エピトープビニング研究は、Biacore3000(商標)システム(Biacore、スウェーデン、ウプサラ)で行った。Biacore Control Software、v 3.2を用いて、方法をプログラミングした。ヒトIL-17A(ZymoGenetics)を、Biacore CM5センサーチップに共有結合で固定化した。続いて、試験対の第1抗IL-17A Fab(一次)を注入し、センサーチップ上に固定化された抗原に特異的に結合させた。Biacore装置はセンサーチップ表面に結合したタンパク質の質量を測定し、したがって抗原の固定化および試験対の一次Fabの特異的結合が各試験サイクルで確認された。試験対の二次抗IL-17A Fabへの曝露前に、一次Fabに対する結合部位がすべて飽和されていることを確認するように注意を払った。試験対の一次Fabの結合後、二次抗IL-17A Fabを注入し、固定化抗原に結合させた。二次抗IL-17A Fabが一次Fabと同時に抗原と結合できる場合には、チップの表面上の質量または結合の増加が検出された。しかし、二次抗IL-17A Fabが一次Fabと同時に抗原と結合できない場合には、付加的な質量も結合も検出されなかった。自身に対して試験した各抗IL-17A Fabを陰性対照として用いて、バックグラウンド(非結合)シグナルのレベルを確立した。
【０４４０】
ヒトIL-17Aに対して作製された15クローン(M7.19 E7；M7.24 E5；M7.20 G6；M7.24 E8；M7.19 F4；M7.24 G6；M7.19 D10；M7.20 E5；M7.24 A5；M7.20 C10；M7.20 F11；M7.20 A9；M7.24 C2；M7.20 F4；M7.24 D8)に由来する精製抗IL-17A Fabの結合特性を試験するために、一連の実験を完了した。EDC:NHSを用いて、約2000 RUの密度までIL-17Aを共有結合で固定化した。以前の実験から、この種類の固定化が抗IL-17A Fabの結合を妨げないことが実証されている。各抗IL-17A Fabを、二次抗IL-17A Fabのサブセットと組み合わせて、一次抗IL-17A Fabとして試験した。一次抗IL-17A Fabは濃度200 nMおよび流速10μL/分で試験し、二次抗IL-17A Fabは濃度100 nMおよび流速50μL/分で試験した。実験は25℃で行った。サイクル間に、チップ上の抗原を10 mMリン酸で再生した。BioEvaluation 4.1 RCIソフトウェアを用いてデータを蓄積し、その後さらなるデータ処理のためにExcel(商標)にロードした。
【０４４１】
結果：
ヒトIL-17Aと結合する精製抗IL-17A Fabのサブセットを特徴づけし、エピトープビンに割り当てた。Biacoreによって報告されるシグナル(RU、応答単位)は、センサーチップ表面上の質量と直接相関する。陰性対照に関するバックグラウンドシグナル(RU)のレベルが確立されると(一次Fabおよび二次Fabの両方として使用した単一の抗IL-17A Fab)、ビニング結果は陽性結合または陰性結合のいずれかとして報告された。陽性結合は、2つの異なる抗IL-17A Fabが同時に抗原と結合できることを示す。陰性結合は、2つの異なる抗IL-17A Fabが同時に抗原と結合できないことを示す。この実験における陽性応答値と陰性応答値との差は顕著であり、13種の抗IL-17A Fabが2つの異なるファミリーまたはエピトープビンに明確に割り当てられ得た。中和抗IL-17A Fabのこのセット内で2つの結合エピトープが同定され、複数の大腸菌クローンがエピトープの1つに結合することが見出された。第1エピトープビンは、クローンM7.19 E7；M7.20 G6；M7.24 E8；M7.19 F4；M7.19 D10；M7.20 E5；M7.24 A5；M7.20 C10；M7.20 F11；M7.20 A9；M7.24 C2；M7.20 F4に由来する抗IL-17A Fabからなった。第2ビンは、クローンM7.24 G6に由来する抗IL-17A Fabからなった。
【０４４２】
実施例34
抗IL-23p19 Fabの特徴づけ
9つの異なる大腸菌クローンに由来する抗IL-23p19 Fabが、細胞ベースの中和アッセイ法において、IL-23の活性を中和する能力を示した。競合的結合(エピトープビニング)実験を用いて、これらの抗IL-23p19中和Fabの機能的結合特性をさらに特徴づけた。
【０４４３】
競合的エピトープ結合(エピトープビニング)
エピトープビニング実験を行って、どの抗IL-23p19 FabがヒトIL-23に同時に結合できるのかを決定した。抗原上の同じまたは重複した結合部位(エピトープ)に関して競合する抗IL-23p19 Fabは同時に結合することができず、単一のファミリーまたは「エピトープビン」に機能的に分類される。抗原上の同じ結合部位に関して競合しない抗IL-23p19 Fabは同時に結合することができ、別のファミリーまたは「エピトープビン」に分類される。Biacore 3000(商標)装置を用いて実験を行った。Biacoreは、一連の抗体断片およびモノクローナル抗体をエピトープビンに割り当てるために日常的に用いられている種々のアッセイ形式の一つにすぎない。多くの参考文献(例えば、The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 6,6 Glenn E. Morris ed.)が、抗体断片を「分類する」ために(当業者によって)用いられ得、抗IL-23p19 FabのヒトIL-23に対する結合特性に関して匹敵するデータを提供すると予測される別法を記載している。可溶性の天然抗原を用いて、エピトープビニング実験を行った。
【０４４４】
材料および方法
エピトープビニング研究は、Biacore3000(商標)システム(Biacore、スウェーデン、ウプサラ)で行った。Biacore Control Software、v 3.2を用いて、方法をプログラミングした。ヒトIL-23(ZymoGenetics)を、Biacore CM5センサーチップに共有結合で固定化した。続いて、試験対の第1抗IL-23p19 Fab(一次)を注入し、センサーチップ上に固定化された抗原に特異的に結合させた。Biacore装置はセンサーチップ表面に結合したタンパク質の質量を測定し、したがって抗原の固定化および試験対の一次Fabの特異的結合が各試験サイクルで確認された。試験対の二次抗IL-23p19 Fabへの曝露前に、一次Fabに対する結合部位がすべて飽和されていることを確認するように注意を払った。試験対の一次Fabの結合後、二次抗IL-23p19 Fabを注入し、固定化抗原に結合させた。二次抗IL-23p19 Fabが一次Fabと同時に抗原に結合できる場合には、チップの表面上の質量または結合の増加が検出された。しかし、二次抗IL-23p19 Fabが一次Fabと同時に抗原と結合できない場合には、付加的な質量も結合も検出されなかった。自身に対して試験した各抗IL-23p19 Fabを陰性対照として用いて、バックグラウンド(非結合)シグナルのレベルを確立した。
【０４４５】
ヒトIL-23に対して作製された9クローン(M7.3 D4；M7.7 F5；M7.9 A7；M7.9 G9；M7.12 A7；M7.12 B9；M7.12 F9；M7.13 A6；M7.13 D7)に由来する精製抗IL-23p19 Fabの結合特性を試験するために、単一の実験を完了した。EDC:NHSを用いて、約2000 RUの密度までIL-23を共有結合で固定化した。以前の実験から、この種類の固定化が抗IL-23p19 Fabの結合を妨げないことが実証されている。各抗IL-23p19 Fabを、一連の二次抗IL-23p19 Fab全体と組み合わせて、一次Fabとして試験した。一次抗IL-23p19 Fabは濃度210 nMおよび流速10μL/分で試験し、二次抗IL-23p19 Fabは濃度60 nMおよび流速50μL/分で試験した。実験は25℃で行った。サイクル間に、チップ上の抗原を2 M MgCl2で再生した。BioEvaluation 4.1 RCIソフトウェアを用いてデータを蓄積し、その後さらなるデータ処理のためにExcel(商標)にロードした。
【０４４６】
結果：
ヒトIL-23と結合する精製抗IL-23p19 Fabのサブセットを特徴づけし、エピトープビンに割り当てた。Biacoreによって報告されるシグナル(RU、応答単位)は、センサーチップ表面上の質量と直接相関する。陰性対照に関するバックグラウンドシグナル(RU)のレベルが確立されると(一次Fabおよび二次Fabの両方として使用した単一の抗IL-23p19 Fab)、ビニング結果は陽性結合または陰性結合のいずれかとして報告された。陽性結合は、2つの異なる抗IL-23p19 Fabが同時に抗原と結合できることを示す。陰性結合は、2つの異なる抗IL-23p19 Fabが同時に抗原と結合でいないことを示す。この実験における陽性応答値と陰性応答値との差は顕著であり、6種の抗IL-23p19 Fabが2つの異なるファミリーまたはエピトープビンに明確に割り当てられ得た。中和抗IL-23p19 Fabのこのセット内で2つの結合エピトープが同定され、複数の大腸菌クローンが各エピトープに結合することが見出された。第1エピトープビンは、クローンM7.12 B9；M7.9 G9；およびM7.13 D7に由来する抗IL-23p19 Fabからなった。第2ビンは、クローンM7.7 F5；M7.12 A7；およびM7.13 A6に由来する抗IL-23p19 Fabからなった。
【０４４７】
実施例35
IL-17Aバイオアッセイ法における、抗ヒトIL-17A中和実体がカニクイザルIL-17Aと交差反応し、カニクイザルIL-17A誘導性活性を中和する能力の決定
種交差反応性研究(特に非ヒト霊長類交差反応性に関する)は、治療用アンタゴニストの開発戦略を説明するのに重要な活性である。本明細書に記載の抗ヒトIL-17A中和実体がカニクイザルIL-17Aと交差反応し、カニクイザルIL-17Aによって誘導される活性を中和できるかどうかを決定するため(ひいては、生存試験種としてのカニクイザルを正当化するため)、中和を試験するために本明細書で使用するバイオアッセイ法において、組換えヒトIL-17Aおよび組換えカニクイザルIL-17Aによって匹敵する活性が誘導されることを実証することがまず必要であった。実施例5、23、および27に記載したIL-17A活性アッセイの方法を、一連(0〜112 nM)の組換えヒトIL-17A(ZGIロットA1781F)または組換えカニクイザルIL-17A(ZGIロットA1906F)と共に使用した。結果から、本明細書で使用したヒトおよびカニクイザルIL-17Aタンパク質によって誘導される活性は、3つのアッセイ法すべてにおいてほぼ等しく、識別不能な曲線およびEC50値(各実験について種間で等しく、別の日に行った独立した反復実験において0.22〜0.41 nMであった)をもたらすことが示される。
【０４４８】
実施例5に概説した方法において、ヒトIL-17RA-Fcを含めることでヒトIL-17AまたはカニクイザルIL-17Aの効果を中和することができ、IC50値は両種でほぼ等しかった(すなわち、ヒトIL-17Aに対する中和については2.9 nMであり、カニクイザルIL-17Aに対する中和については2.8 nMであった)。本明細書に記載のIL-17A中和実体も中和能の種交差反応性について試験したところ、一連の中和能が認められたが、ヒトIL-17Aを中和するのに最も良く働いたアンタゴニストは、カニクイザルIL-17Aによって誘導される活性もまた効率的に中和することができた。例えば、ヒトSAECバイオアッセイ法(実施例27に記載)において、クローンM7.19.E7(SQ7_c87)はヒトIL-17A誘導性G-CSF産生を阻害するのにIC50 31.1 nMを有し、これと同じクローンは、カニクイザルIL-17A誘導性G-CSF産生を阻害するのにIC50 約90 nMを有した。したがって、IC50値はヒトIL-17Aと比較してカニクイザルIL-17A活性に対してより高かったものの、IL-17A媒介性生物活性を阻害する抗IL-17A中和実体の能力には種交差反応性が明らかに存在した。
【０４４９】
実施例36
IL-23バイオアッセイ法における、抗ヒトIL-23中和実体がカニクイザルIL-23と交差反応し、カニクイザルIL-23誘導性活性を中和する能力の決定
実施例XX(カニクイザルIL-17A実験)に上記したのと同様の実験を、実施例24および26に記載したIL-23活性アッセイ法を用いて、一連(0〜4050 pM)の組換えヒトIL-23(ZGIロットA1806F)または組換えカニクイザルIL-23(ZGIロットA1922F)を用いて、ヒトIL-23対カニクイザルIL-23で行った。結果から、これら2つの種のIL-23によって誘導される活性はルシフェラーゼベースのアッセイ法で等しく(例えば1つの実験では、両種のIL-23についてEC50 85 pM)、pSTAT3ベースのアッセイ法でほぼ等しい(ヒトIL-23およびカニクイザルIL-23 EC50値は、それぞれ46 pMおよび39 pM)ことが示された。
【０４５０】
本明細書に記載のIL-23中和実体がヒトIL-23およびカニクイザルIL-23を中和する能力を評価するように設計された実験において、結果はカニクイザルIL-17Aについて上記した結果と同様であった。すなわち、一連の中和能が認められたが、ヒトIL-23を最も良好に中和したものは、カニクイザルIL-23誘導性活性に対しても最大の中和を示した。例えば、IL23R/IL12Rb1トランスフェクタントバイオアッセイ法(実施例24)において、scFvとしてのクローンM7.36_B06(SQ22_c305)は、ヒトIL-23媒介性pSTAT3活性をIC50 0.13 nMで中和することができ、カニクイザルIL-23媒介性pSTAT3活性をIC50 0.077 nMで中和した。これらの結果から、IL-23媒介性生物活性を阻害する能力に関するカニクイザル交差反応性が実証された。
【０４５１】
実施例37
IL-23発現構築物
1つはpIL12Bの配列を含み、1つはpIL23Aの配列を含む2つのDNA断片、および発現ベクターpZMP42を用いて、相同組換えにより発現プラスミドを構築した。pIL12B断片は、プライマーzc56242およびzc56243を用いてPCR増幅により作製した。pIL23A断片は、プライマーzc56244およびzc56245を用いてPCR増幅により作製した。
【０４５２】
pIL12B断片は、以前に作製されたpIL12Bのクローンを鋳型として用いて作製した。この断片は、pZMP42ベクター配列との5'重複、pIL12Bセグメント、およびpIL12BをpIL23Aに連結するように設計されたリンカー配列を含む。pIL23A断片は、以前に作製されたpIL23Aのクローンを鋳型として用いて作製した。この断片は、pIL23AをpIL12Bに連結するように設計されたリンカー配列、pIL23Aセグメント、およびpZMP42ベクター配列との3'重複を含む。使用したPCR条件は以下の通りであった： 94℃で5分の1サイクル； 94℃で1分、58℃で2分、72℃で3分の35サイクル；72℃で10分の1サイクル。
【０４５３】
PCR反応混合物を1%アガロースゲルで泳動し、挿入断片の大きさに相当するバンドを、QIAquick(商標)ゲル抽出キット(Qiagen、Cat. No. 28704)を用いてゲル抽出した。
【０４５４】
プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列を挿入するための複数制限部位、およびotPAシグナルペプチド配列；C型肝炎ウイルス由来のリボソーム内部進入部位(IRES)エレメント、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン；ポリオウイルス由来のリボソーム内部進入部位(IRES)エレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター；大腸菌複製開始点；ならびにS. セレビシエにおける選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。これはpZMP21(特許公開番号US 2003/0232414 A1)(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託、ATCC# PTA-5266と命名)から構築された。
【０４５５】
PCR断片との酵母内での組換えの前に、プラスミドpZMP42をBglIIで切断した。コンピテント酵母(S. セレビシエ)細胞100μlを個々に、挿入DNA 10μlおよび切断したpZMP42ベクター100 ngと混合し、混合物を0.2-cmエレクトロポレーションキュベットに移した。0.75 kV(5 kV/cm)、∞オーム、および25μFというパワーサプライ(BioRad Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ)の設定を用いて、酵母/DNA混合物に電気パルスをかけた。1.2 Mソルビトール600μlをキュベットに添加し、酵母を2枚のURA-Dプレートに100μlおよび300μl分割量でプレーティングし、30℃でインキュベートした。約72時間後、単一プレートからのUra+酵母形質転換体をH2O 1 mlに再懸濁し、短時間遠心して酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを、溶解緩衝液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA) 0.1 ml、およびZymolyase(Zymo Research、cat# E1002) 10単位を添加したP1(QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen、cat# 27106による) 0.1 mLに、ボルテックスによって再懸濁した。酵母懸濁液を37℃水浴中で10分間インキュベートした。標準的なQIAprep Spin Miniprep Kitプロトコール(Qiagen、cat# 27106)を用いて、試薬P2を添加する段階から開始して、酵母からDNAを単離した。
【０４５６】
酵母DNA調製物5μlおよび細胞50μlを用いて、エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞(DH12S)の形質転換を行った。2.0 kV、25μF、および400オームで細胞に電気パルスをかけた。エレクトロポレーション後、SOC(2% Bacto(商標) Tryptone(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 1 mlを添加し、次に2枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標) Agar(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)に50μlおよび200μl分割量でプレーティングした。
【０４５７】
構築物のクローン5個の挿入断片を配列解析に供し、正しい配列を含むクローン1個を選択した。製造業者の説明書に従って市販のキット(QIAGEN Plasmid Mega Kit、Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて、大量のプラスミドDNAを単離した。
【０４５８】
zCyto38f2構築物200μgの3組をそれぞれPvuI 200単位で37℃で3時間消化し、次にIPAで沈殿させ、1.5 mLマイクロチューブ中で遠心沈降させた。上清をペレットからデカント除去し、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを微量遠心機で14,000 RPMで10分間遠心し、上清をペレットからデカント除去した。次にペレットを滅菌環境においてZF1培地750μlに再懸濁し、60℃で10分間インキュベートし、室温まで冷却した。5E6 5xSA細胞を3本のチューブそれぞれにおいて遠心沈降させ、DNA-培地溶液を用いて再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップキュベットに入れ、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションした。950μF、高容量、および300 V。次にキュベットの内容物を取り出してプールし、ZF1培地で25 mLに希釈し、125 mL振盪フラスコに入れた。フラスコを37℃、6% CO2の振盪器上のインキュベーターに入れ、120 RPMで振盪させた。
【０４５９】
細胞株を栄養選択に供した後、200 nMメトトレキセート(MTX)の段階増幅に供した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞株を拡大し、続いてタンパク質精製を行った。
【０４６０】
実施例38
Wave ReactorでのCHO DXB11細胞におけるIL23 C末端Hisタグ化タンパク質の発現
20 L Wavebag Reactor(Wave Biotech)中、ZG構築物1564をトランスフェクションしたCHO DXB11細胞においてIL23 v.1 CH6タンパク質(IL23A/IL12B)を発現させた。5 mM L-グルタミン(200 mM L-グルタミン、Gibcoカタログ#25030-081による)、1 mMピルビン酸ナトリウム(100 mMピルビン酸ナトリウム、Gibcoカタログ#11360-070による)、および500 nMメトトレキセートを添加したZF1培地(JRH imMEDIAte Advantage Cat# 65633)を用いて、振盪フラスコ中で細胞を拡大した。L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含むがメトトレキセートを含まないZF1培地8.3 Lに対数期の振盪フラスコ培養物1.7 Lを播種することによって、リアクターの運転を開始した。これにより、3.1×10E5個c/mLの密度を有する10 Lの最終的な作業容量が得られた。
【０４６１】
CO2レベルは6%に維持し、リアクターのヘッドスペースに0.1 LPMで連続して送り込んだ。プラットフォーム上で、25振動/分の速度、角度設定9.5で培養物を振動させることによって、細胞の溶存酸素必要量を満たした。pHは調節しなかったが、6.6〜6.9に留まった。密度が7.5×10E5個細胞/mLに到達するまでは温度を37℃に維持し、その後残りの運転中は温度を34℃に下げた。グルコースレベルは2 g/L超、およびL-グルタミンは2 mM超に維持した。
【０４６２】
播種の9日後に、4.7×10E6個細胞/mLの密度および97%生存度を有する培養物を回収した。上清を3500×gで15分間遠心分離し、清澄化した馴化培地を0.22μmフィルター(Millipore Opticap Cat# KW1904HB3)に通し、タンパク質精製に供した。
【０４６３】
実施例39
293細胞におけるカニクイザルIL23タンパク質のトランスフェクションおよび発現
293F細胞(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# R790-07)において、カニクイザルIL23を一過的に産生させた。製造業者の説明書に従ってPureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# K210009)を用いて、大量のプラスミドDNAを単離した。293F懸濁細胞を、95 RPMの4つの3 Lスピナーフラスコで、293 Freestyle培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 12338-018)中37℃、6% CO2で培養した。トランスフェクションの直前に新鮮な培地を各スピナーに添加して、最終密度1×10E6個細胞/mLの1.5リットル作業容量を得た。各スピナーについて、Lipofectamine 2000(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 11668-019) 2.0 mLをOpti-MEM培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 31985-070) 20 mLに添加し、DNA(ZG構築物1630) 1.5 mgをOpti-MEM 20 mLの別のチューブに希釈した。各スピナーについて、DNAおよび脂質を室温で5分間別々にインキュベートし、その後混合し、時々穏やかに混合しながら室温でさらに30分間共にインキュベートした。脂質-DNA混合物のチューブ1本を293F細胞の各スピナーに添加し、スピナーを37℃、6% CO2、75 RPMに戻した。約96時間後、馴化培地を回収し、0.2μMで濾過し、タンパク質精製に供した。
【０４６４】
実施例40
LL-23タンパク質精製
A) ヒトIL-23の精製
IMAC捕捉用のヒトIL23 v.1の調製−
1×培地約10 Lを、1000×保存液によって0.02%アジ化ナトリウムになるよう補強し、UF/DF工程に供して、まず最初に、培地をペリスタポンプシステムで3×0.1 m2 10 kD Pellicon膜(Millipore)に対して10倍濃縮した。次に濃縮物を、5回のシステム容量交換によりリン酸緩衝生理食塩水に透析濾過した。回収されたUF/DF培地を0.5 M NaCl(0.4 M固体の添加による)、25 mMイミダゾール(固体の添加)に調整し、pHを7.5に調整した(HClを使用)。調整した濃縮物を0.22 umで滅菌濾過し(Nalgene)、RP-HPLCおよびウェスタンブロットにより回収率について解析し、1×培地および透過物に対して比較した。解析から、この段階で標的がほぼ完全に回収されていることが示される。
【０４６５】
IMAC(固定化金属アフィニティークロマトグラフィー)捕捉−
2 cmガラスカラム(Millipore)に充填した137 mL Ni NTA His Bind Resin(Novagen)に、UF/DF培地を0.2 mL/分、4Cで負荷した。500 mM NaCl、50 mM NaPO4、25 mMイミダゾール pH 7.5緩衝液でカラムを平衡化した。供した培地の完全な洗い流しに際しては、流速を20 mL/分に上げ、254 nmおよび280 nmでのUVが基線で安定するまでカラムを平衡化緩衝液で洗浄した。それぞれ平衡化緩衝液中の40 mMおよび500 mMイミダゾールを用いて、結合したタンパク質を段階的に溶出した。溶出流速は20 mL/分であり、25 mL画分を回収した。A280 nmの屈折に基づいてプールを作製し、RP-HPLCならびに還元および非還元SDS-PAGEクマシーゲルにより解析した。500 mMプールのみが、これらの方法によって解析される標的を有した。ウェスタンブロットおよびRP-HPLCにより評価して、タンパク質はIMAC樹脂によって完全に捕捉された。
【０４６６】
Superdex 200粗SEC(サイズ排除クロマトグラフィー)
500 mM IMACプールは、最終的な製剤化および仕上げのためのSECを保証するのに十分純粋であると見なされた。このプールを最初に、Labscale TFFシステムで1×50 cm2 100 kD MWCO膜(Millipore)に対して50 mLにまで濃縮した。50 mLの時点で、この濃縮物を30 kD Ultracel膜(Millipore)に移した。最終容量が15 mLに達するまで、遠心分離により濃縮を続けた。最終濃縮物を、35 mM NaPO4、120 mM NaCl pH 7.2で運転する26/60(318 mL) Superdex 200サイズ排除カラム(GE Healthcare)に3.0 mL/分で注入した。均一濃度溶出を通して、2.5 mL画分を回収した。運転当たり6 mLを注入して、全部で3回の運転を行った。溶出画分をSDS-PAGE非還元ゲルによって解析し、得られたプールをRP-HPLCによって分析した。単量体タンパク質を選択的にプールした。
【０４６７】
Superdex 200微細SEC(サイズ排除クロマトグラフィー)
1回目のサイズ排除運転によるタンパク質のプールには、より高い分子量種がわずかに混入していた。それらを共にプールし、63.5 mm YM30撹拌セル膜(Millipore)に対して＜10 mLにまで再濃縮した。濃縮物を、以前と同じ条件下でSuperdex 200サイズ排除カラムに再注入した。280 nmでのUV吸光度屈折に基づいて保存プールを作製し、推定標的濃度に関してRP-HPLCによりアッセイした。この最終プールを0.22 umで濾過し(Millipore)、分注し、-80Cで保存した。
【０４６８】
B) 293F一過性宿主からのカニクイザルIL23 v.4の精製−
IMAC捕捉−
送達された培地約5.8 Lを、ペリスタポンプシステムを用いて1×0.1 m2 MWCO pellicon膜(Millipore)に対して＜1 Lにまで濃縮した。濃縮培地の伝導率を、0.4 M固体試薬の添加により0.5 M NaCl、固体の添加により25 mMイミダゾール、HClを使用してpH 7.5の伝導率と同等になるよう調整し、直径1 cmのガラスカラム(Millipore)に充填した5 mL Ni Sepharose 6 FF樹脂(GE Healthcare)に0.9 mL/分、4Cで一晩かけて負荷した。培地の枯渇に際しては、流速を4 mL/分に上げ、A254 nmおよびA280 nmでのUVが基線で安定するまで50 mM NaPO4、500 mM NaCl、25 mMイミダゾール pH 7.5でカラムを洗浄した。上記の平衡化緩衝液中の40 mMおよび500 mMイミダゾールの段階を用いて、結合した標的を溶出した。溶出は2 mL/分で行い、終始3 mL画分を回収した。タンパク質のプールは500 mM段階のA280 nmの屈折に基づいて行い、プール標的の濃度をRP-HPLCにより分析した。
【０４６９】
Superdex 200 SEC
500 mMイミダゾールプールは、最終的な製剤化および仕上げのためのサイズ排除クロマトグラフィーを保証するのに十分純粋であると見なされた。Ni Sepharoseタンパク質プールを、30 kD MWCO Ultracel膜(Millipore)に対して＜3.0 mLにまで濃縮した。濃縮物を、35 mM NaPO4、120 mM NaCl pH 7.2で平衡化した16/60(120 mL) Superdex 200サイズ排除カラム(GE Healthcare)に流速1.02 mL/分で注入した。均一濃度溶出を通して、画分(1.0 mL)を回収した。保存的プールは、A280 nmシグナルの屈折に基づいて行った。サイズ排除プールを別の30 kD MWCO Ultracel膜を用いて2 mLにまで濃縮し、0.22 umで濾過し(Millipore)、分注し、-80Cで保存した。
【０４７０】
実施例41
Wave ReactorでのCHO DXB11細胞におけるIL23R Fcタグ化タンパク質の発現
20 L Wavebag Reactor(Wave Biotech)中、ZG構築物1602をトランスフェクションしたCHO DXB11細胞においてIL23R Fc5タンパク質を発現させた。5 mM L-グルタミン(200 mM L-グルタミン、Gibcoカタログ#25030-081による)、1 mMピルビン酸ナトリウム(100 mMピルビン酸ナトリウム、Gibcoカタログ#11360-070による)、および500 nMメトトレキセートを添加したZF1培地(JRH imMEDIAte Advantage Cat# 65633)を用いて、振盪フラスコ中で細胞を拡大した。L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含むがメトトレキセートを含まないZF1培地9.1 Lに対数期の振盪フラスコ培養物900 mLを播種することによって、リアクターの運転を開始した。これにより、2.0×10E5個c/mLの密度を有する10 Lの最終的な作業容量が得られた。
【０４７１】
CO2レベルは6%に維持し、リアクターのヘッドスペースに0.1 LPMで連続して送り込んだ。プラットフォーム上で、25振動/分の速度、角度設定9.5で培養物を振動させることによって、細胞の溶存酸素必要量を満たした。pHは調節しなかった。密度が約8×10E5個細胞/mLに到達するまでは温度を37℃に維持し、その後残りの運転中は温度を34℃に下げた。グルコースレベルは2 g/L超、およびL-グルタミンは2 mM超に維持した。
【０４７２】
播種の9日後に、8.0×10E6個細胞/mLの密度および98%生存度を有する培養物を回収した。上清を3500×gで15分間遠心分離し、清澄化した馴化培地を0.22μmフィルター(Millipore Opticap Cat# KW1904HB3)に通し、タンパク質精製に供した。
【０４７３】
実施例42
CHO細胞からのヒトIL23R-Fc5の精製
組換えカルボキシル末端Fc5タグ化ヒトIL23Rは、標的を発現するトランスフェクションCHO細胞から12 mg/Lで産生された。CHOのトランスフェクションは、当技術分野で公知の方法を用いて行った。馴化培地10 Lを回収し、0.2μmフィルターを用いて滅菌濾過し、pH 7.4に調整した。POROS(登録商標) A50プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(Applied Biosciences、カリフォルニア州、フォスターシティー)およびSuperdex 200サイズ排除クロマトグラフィー(GE Healthcare、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)を併用して、濾過培地からタンパク質を精製した。27 ml POROS(登録商標) A50カラム(20 mm×85 mm)を3カラム容量(CV)の25 mMクエン酸-リン酸(1.61 mMクエン酸ナトリウム-23.4 mMリン酸ナトリウム)、250 mM硫酸アンモニウム pH 3緩衝液であらかじめ溶出し、20 CVのPBSで平衡化した。カラムへの8 ml/分での一晩、4℃での直接負荷によって、馴化培地中のIL23R-Fc5を捕捉した。負荷が完了した後、10 CVの平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。次にカラムを10 CVの25 mMクエン酸-リン酸、250 mM硫酸アンモニウム pH 7.4緩衝液で洗浄し、その後クエン酸-リン酸-硫酸アンモニウム緩衝液を用いて形成した5 CVのpH 7.4〜pH 3勾配を用いて、結合したタンパク質を10 ml/分で溶出した。500μlの2.0 M Tris、pH 8.0を含むチューブ中に各5.0 mlの画分を回収し、溶出されたタンパク質を中和するために直ちに混合した。A280および非還元SDS-PAGEに基づいて、画分をプールした。
【０４７４】
IL23R-Fc5含有プールを、Amicon Ultra-15 30 K NWML遠心装置(Millipore)を用いて限外濾過によって10 mlにまで濃縮し、35 mMリン酸ナトリウム、120 mM NaCl pH 7.3で予め平衡化した318 ml(26 mm×600 mm) Superdex 200カラムに28 cm/時間で注入した。A280およびSDS PAGEに基づいて、精製IL23R-Fc5を含む画分をプールし、0.2μmフィルターを通して濾過し、分割量として-80℃で凍結した。最終的な精製タンパク質の濃度は、BCAアッセイ法(Pierce、イリノイ州、ロックフォード)により決定した。全工程での回収率は約66%であった。
【０４７５】
精製IL23R-Fc5の解析
組換えIL23R-Fc5を、SDS-PAGE(4〜12% BisTris、Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)のタンパク質に関する0.1%クマシーR250染色により、および抗IgG-HRPによる免疫ブロッティングにより解析した。精製タンパク質を電気泳動し、25 mM Trisベース、200 mMグリシン、および20%メタノールを含む緩衝液中、常温、600 mAで45分かけてニトロセルロース(0.2μm；Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)に転写した。次にフィルターを、50 mM Tris、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.05% Igepal(TBS)中の10%脱脂粉乳で室温にて15分間ブロッキングした。ニトロセルロースを速やかにリンスし、IgG-HRP抗体(1:10,000)を添加した。ブロットを、穏やかに振盪させながら4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ブロットをTBSで10分間ずつ3回洗浄し、次いでH2O中で速やかにリンスした。市販の化学発光基質試薬(Roche LumiLight)を用いてブロットを顕色させ、Lumi-ImagerのLumi Analyst 3.0ソフトウェア(Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ)を用いてシグナルを捕捉した。精製IL23R-Fc5は、非還元クマシー染色ゲルおよび免疫ブロットのいずれにおいても約200 kDAのバンドとして出現し、予測通りグリコシル化二量体型が示唆された。タンパク質は正確なNH2末端および正確なアミノ酸組成を有した。
【０４７６】
実施例43
293FにおけるカニクイザルIL17A CH6発現
IL17A CH6配列を含むDNA断片との酵母内での相同組換えにより、カニクイザルIL17A CH6をコードする発現プラスミドを構築した。
【０４７７】
cDNA断片はPCRを用いて作製し、残基1〜465を含む。上流プライマーは、ベクター骨格と重複する41塩基、および挿入遺伝子のアミノ末端の5'末端オープンリーディングフレームの24塩基からなる。下流プライマーは、骨格ベクターと重複する37塩基、GSGGリンカーを伴うHisタグ、および該遺伝子の23塩基を含む。
【０４７８】
潜在的切断部位を排除するために、アミノ酸127をRからPに変異させた。この変異は、この位置においてカニクイザル配列をヒト配列に変換する。変異は、PCRにより2つの断片を重ね合わせることによって作製した。上記のzc57312を、その5'末端がアミノ酸127であり、その3'末端がアミノ酸134である24塩基の下流プライマーと共に使用した。これにより、変異を含む遺伝子の5'断片が作製された。3'断片は、アミノ酸126〜155の配列全体を含むフォワードプライマーを用いて構築した。これは、先に記載したプライマーzc57313と重複した。これら2つの断片をPCRにより融合した。
【０４７９】
PromegaのGoTaq(Promega、ウィスコンシン州、マディソン、カタログ#M712B)を用いるPCR増幅条件は以下の通りであった：94℃で5分の1サイクル；94℃で1分、55℃で30秒、68℃で30秒の29サイクル；4℃で保持する1サイクル。解析のため、各PCRの全産物を、1×TAE緩衝液を用いて1% LMPアガロースゲル(Seaplaque GTG)で泳動した。適切なバンドを切り出した後、Qiagenのゲル精製キット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア、カタログ#28704)を用いてこれを精製した。
【０４８０】
コンピテント酵母細胞(S. セレビシエ)100μLを、上記の精製DNA 10μlと混合し、BglII切断プラスミド100 ngと混合し、0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。0.75 kV(5 kV/cm)、∞オーム、25μFで、酵母-DNA混合物に電気パルスをかけた。1.2 Mソルビトール600μlを各キュベットに添加し、酵母をURA-DSプレートにプレーティングし、30℃でインキュベートした。約72時間後、単一プレートのUra+酵母形質転換体から採取された固く詰まった酵母細胞約50μLを、溶解緩衝液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA) 100μL、Qiagenミニプレップキット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア、カタログ#27104)によるQiagen P1緩衝液100μL、およびZymolyase(Zymo Research、カリフォルニア州、オレンジ、カタログ#1001) 20 Uに再懸濁した。この混合物を37℃で30分間インキュベートし、溶出に緩衝液EB 30 uLを用いてQiagenミニプレッププロトコールの残りを実施した。
【０４８１】
0.2 cmエレクトロポレーションキュベット中で、エレクトロコンピテント大腸菌細胞(DH12S、Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド) 40μLに酵母DNA 3μLを形質転換した。1.75 kV、25μF、および400オームで細胞に電気パルスをかけた。エレクトロポレーション後、SOC(2% Bacto Tryptone(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 600μLをキュベットに添加した。この溶液10μLをLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto Agar(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)にプレーティングした。
【０４８２】
挿入断片の存在を確認するための20 U FspIおよび20 U PvuIIによる制限消化によって、カニクイザルIL17A CH6の正確な発現構築物を有する独立クローンを同定した。陽性クローンの挿入断片を配列解析に供した。製造業者の説明書に従ってInvitrogen mega prepキット(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド、カタログ#457009)を用いて、大量のプラスミドDNAを単離した。
【０４８３】
293F細胞へのトランスフェクション：
カニクイザルIL17A CH6タンパク質の発現を試験するため、Lipofectamine2000(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド、カタログ#11668-019)およびOptiMEM(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド、カタログ#31985-070)を用いて293F細胞を一過的にトランスフェクションし、12ウェルプレートで培養した。プラスミドDNA 1μgおよび100万個の細胞をトランスフェクションに使用した。96時間後、培地を回収し、ウェスタンブロットアッセイ用に調製した。
【０４８４】
検出抗体として抗6Xヒスチジン(R&D Systems、ミネソタ州、ミネアポリス、カタログ#MAB050H)を用いるウェスタンブロットに、Invitrogenの材料およびプロトコールを使用した。顕著な発現が認められたため、タンパク質獲得のために大規模なトランスフェクションを行った。
【０４８５】
6つの1000 mLフラスコに、100万個細胞/mLの293F細胞250 mLを播種した。OptiMEM 20 mLを50 mLコニカルチューブ2本にそれぞれ入れた。Lipofectamine2000 2mLを一方の50 mLコニカルチューブ添加し、カニクイザルIL17A CH6発現プラスミド1.5 mgをもう一方のチューブに入れた。チューブを数回反転させ、室温で5分間インキュベートした。その後2本のチューブを混合し、数回反転させ、室温で30分間インキュベートした。細胞を回旋させながら、DNA-Lipofectamine2000混合物を6つのフラスコそれぞれに均等に分配した。次にフラスコを振盪機上で37℃、6% CO2でインキュベートし、120 rpmで振盪させた。96時間後に細胞を回収した。
【０４８６】
DNA配列をSEQ ID NO:1018に示す。ポリペプチド配列をSEQ ID NO: 1019に示す。
【０４８７】
実施例44
293細胞におけるカニクイザルIL17A C末端Hisタグ化タンパク質のトランスフェクションおよび発現
293F細胞(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# R790-07)において、カニクイザルIL17A R127P CH6を一過的に産生させた。簡潔に説明すると、293F懸濁細胞を、95 RPMの3 Lスピナーフラスコで、293 Freestyle培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 12338-018)中37℃、6% CO2で培養した。トランスフェクションの直前に新鮮な培地を添加して、最終密度1×10E6個細胞/mlの1リットル作業容量を得た。各スピナーについて、Lipofectamine 2000(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 11668-019) 1.3 mLをOpti-MEM培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 31985-070) 15 mLに添加し、DNA(ZG構築物1623) 1.0 mgをOpti-MEM 15 mLの別のチューブに希釈した。各チューブを室温で5分間別々にインキュベートし、その後混合し、時々穏やかに混合しながら室温でさらに30分間共にインキュベートした。次に脂質-DNA混合物を293F細胞のスピナーに添加し、スピナーを37℃、6% CO2、75 RPMに戻した。約96時間後、馴化培地を回収し、0.2μMで濾過し、タンパク質精製に供した。
【０４８８】
実施例45
293FにおけるカニクイザルIL17F CH6発現
IL17F CH6配列を含むDNA断片との酵母内での相同組換えにより、カニクイザルIL17F CH6をコードする発現プラスミドを構築した。
【０４８９】
cDNA断片はPCRを用いて作製し、残基1〜522を含む。上流プライマーは、ベクター骨格と重複する42塩基、および挿入遺伝子のアミノ末端の5'末端オープンリーディングフレームの24塩基からなる。下流プライマーは、骨格ベクターと重複する37塩基、GSGGリンカーを伴うHisタグ、および該遺伝子の23塩基を含む。
【０４９０】
PromegaのGoTaq(Promega、ウィスコンシン州、マディソン、カタログ#M712B)を用いるPCR増幅条件は以下の通りであった：94℃で5分の1サイクル；94℃で1分、55℃で30秒、68℃で30秒の29サイクル；4℃で保持する1サイクル。解析のため、各PCRの全産物を、1×TAE緩衝液を用いて1% LMPアガロースゲル(Seaplaque GTG)で泳動した。適切なバンドを切り出した後、Qiagenのゲル精製キット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア、カタログ#28704)を用いてこれを精製した。
【０４９１】
コンピテント酵母細胞(S. セレビシエ)100μLを、上記の精製DNA 10μlと混合し、BglII切断プラスミド100 ngと混合し、0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。0.75 kV(5 kV/cm)、∞オーム、25μFで、酵母-DNA混合物に電気パルスをかけた。1.2 Mソルビトール600μlを各キュベットに添加し、酵母をURA-DSプレートにプレーティングし、30℃でインキュベートした。約72時間後、単一プレートのUra+酵母形質転換体から採取された固く詰まった酵母細胞約50μLを、溶解緩衝液(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 8.0、1 mM EDTA) 100μL、Qiagenミニプレップキット(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア、カタログ#27104)によるQiagen P1緩衝液100μL、およびZymolyase(Zymo Research、カリフォルニア州、オレンジ、カタログ#1001) 20 Uに再懸濁した。この混合物を37℃で30分間インキュベートし、溶出に緩衝液EB 30 uLを用いてQiagenミニプレッププロトコールの残りを実施した。
【０４９２】
0.2 cmエレクトロポレーションキュベット中で、エレクトロコンピテント大腸菌細胞(DH12S、Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド) 40μLに酵母DNA 3μLを形質転換した。1.75 kV、25μF、および400オームで細胞に電気パルスをかけた。エレクトロポレーション後、SOC(2% Bacto Tryptone(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース) 600μLをキュベットに添加した。この溶液10μLをLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto Agar(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)にプレーティングした。
【０４９３】
挿入断片の存在を確認するための20 U FspIおよび20 U BsrGIによる制限消化によって、カニクイザルIL17F CH6の正確な発現構築物を有する独立クローンを同定した。陽性クローンの挿入断片を配列解析に供した。製造業者の説明書に従ってInvitrogen mega prepキット(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド、カタログ#457009)を用いて、大量のプラスミドDNAを単離した。
【０４９４】
293F細胞へのトランスフェクション：
カニクイザルIL17F CH6タンパク質の発現を試験するため、Lipofectamine2000(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド、カタログ#11668-019)およびOptiMEM(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド、カタログ#31985-070)を用いて293F細胞を一過的にトランスフェクションし、12ウェルプレートで培養した。プラスミドDNA 1μgおよび100万個の細胞をトランスフェクションに使用した。96時間後、培地を回収し、ウェスタンブロットアッセイ用に調製した。
【０４９５】
検出抗体として抗6Xヒスチジン(R&D Systems、ミネソタ州、ミネアポリス、カタログ#MAB050H)を用いるウェスタンブロットに、Invitrogenの材料およびプロトコールを使用した。顕著な発現が認められたため、タンパク質獲得のために大規模なトランスフェクションを行った。
【０４９６】
6つの1000 mLフラスコに、100万個細胞/mLの293F細胞250 mLを播種した。OptiMEM 20 mLを50 mLコニカルチューブ2本にそれぞれ入れた。Lipofectamine2000 2mLを一方の50 mLコニカルチューブ添加し、カニクイザルIL17F CH6発現プラスミド1.5 mgをもう一方のチューブに入れた。チューブを数回反転させ、室温で5分間インキュベートした。その後2本のチューブを混合し、数回反転させ、室温で30分間インキュベートした。細胞を回旋させながら、DNA-Lipofectamine2000混合物を6つのフラスコそれぞれに均等に分配した。次にフラスコを振盪機上で37℃、6% CO2でインキュベートし、120 rpmで振盪させた。96時間後に細胞を回収した。
【０４９７】
DNA配列をSEQ ID NO:1020に示す。ポリペプチド配列をSEQ ID NO: 1021に示す。
【０４９８】
実施例46
293細胞におけるカニクイザルIL17F C末端Hisタグ化タンパク質のトランスフェクションおよび発現
293F細胞(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# R790-07)において、カニクイザルIL17F CH6を一過的に産生させた。簡潔に説明すると、293F懸濁細胞を、95 RPMの3 Lスピナーフラスコで、293 Freestyle培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 12338-018)中37℃、6% CO2で培養した。トランスフェクションの直前に新鮮な培地を添加して、最終密度1×10E6個細胞/mLの1リットル作業容量を得た。各スピナーについて、Lipofectamine 2000(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 11668-019) 1.3 mLをOpti-MEM培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド Cat# 31985-070) 15 mLに添加し、DNA(ZG構築物1628) 1.0 mgをOpti-MEM 15 mLの別のチューブに希釈した。各チューブを室温で5分間別々にインキュベートし、その後混合し、時々穏やかに混合しながら室温でさらに30分間共にインキュベートした。次に脂質-DNA混合物を293F細胞のスピナーに添加し、スピナーを37℃、6% CO2、75 RPMに戻した。約96時間後、馴化培地を回収し、0.2μMで濾過し、タンパク質精製に供した。
【０４９９】
実施例47
カニクイザルIL17A R127P CH6およびカニクイザルIL17F CH6の精製
Ni IMAC捕捉−
送達された培地を、固体の添加により0.5 M NaClおよび25 mMイミダゾールに、撹拌しながら10 N NaOHをゆっくりと添加することによりpH 7.5に調整した。調整した培地を、直径1.0 cmのカラム(Millipore)に充填した5 mL Ni Sepharose 6 FF樹脂(GE Healthcare)に0.9 mL/分、4Cで一晩かけて負荷した。培地の枯渇に際しては、流速を4 mL/分に上げ、A254 nmおよびA280 nmでのUVが基線で安定するまで50 mM NaPO4、500 mM NaCl、25 mMイミダゾール pH 7.5でカラムを洗浄した。上記の平衡化緩衝液中の40 mMおよび500 mMイミダゾールの段階を用いて、結合した標的を溶出した。溶出は2 mL/分で行い、終始3 mL画分を回収した。500 mMイミダゾール段階からの画分のみが標的を含み、280 nm吸光度屈折に基づいてプールを作製し、RP HPLCにより分析した。分析用RP-HPLCによると、発現された全CH6標的がIMAC樹脂上に捕捉された。
【０５００】
Superdex 75サイズ排除クロマトグラフィー：
500 mMイミダゾールプールは、最終的な製剤化のためのサイズ排除クロマトグラフィーを保証するのに十分純粋であると見なされた。500 mMイミダゾールIMACプールを、10 kD MWCO Ultracel膜(Millipore)に対して＜5.0 mLにまで濃縮した。濃縮物を、35 mM NaPO4、120 mM NaCl pH 7.2で平衡化した26/60(318 mL) Superdex 75 SECカラム(GE Healthcare)に流速3.0 mL/分で注入し、均一濃度溶出を通して2.5 mL画分を回収した。保存的プールは、A280 nmシグナルの屈折および回収画分のSDS-PAGE解析に基づいて行った。サイズ排除プールを別の10 kD MWCO Ultracel膜を用いて1 mg/mLにまで濃縮し、0.22 umで濾過し(Millipore)、分注し、-80Cで保存した。
【０５０１】
実施例48
Wave ReactorでのCHO DXB11細胞におけるヒトIL17RA Fcタグ化タンパク質の発現
20 L Wavebag Reactor(Wave Biotech)中、ZG構築物1466をトランスフェクションしたCHO DXB11細胞においてIL17RA Fc5(別称IL17R[FL]x1 C Fc5)タンパク質を発現させた。5 mM L-グルタミン(200 mM L-グルタミン、Gibcoカタログ#25030-081による)、1 mMピルビン酸ナトリウム(100 mMピルビン酸ナトリウム、Gibcoカタログ#11360-070による)、および500 nMメトトレキセートを添加したZF1培地(JRH imMEDIAte Advantage Cat# 65633)を用いて、振盪フラスコ中で細胞を拡大した。L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含むがメトトレキセートを含まないZF1培地9 Lに対数期の振盪フラスコ培養物1 Lを播種することによって、リアクターの運転を開始した。これにより、1.7×10E5個c/mLの密度を有する10 Lの最終的な作業容量が得られた。
【０５０２】
CO2レベルは6%に維持し、リアクターのヘッドスペースに0.1 LPMで連続して送り込んだ。プラットフォーム上で、25振動/分の速度、角度設定9.5で培養物を振動させることによって、細胞の溶存酸素必要量を満たした。pHは調節しなかったが、6.6〜7.0に留まった。密度が約1×10E6個細胞/mLに到達するまでは温度を37℃に維持し、その後残りの運転中は温度を34℃に下げた。グルコースレベルは2 g/L超、およびL-グルタミンは2 mM超に維持した。
【０５０３】
播種の12日後に、6.3×10E6個細胞/mLの密度および98%生存度を有する培養物を回収した。上清を3500×gで15分間遠心分離し、清澄化した馴化培地を0.22μmフィルター(Millipore Opticap Cat# KW1904HB3)に通し、タンパク質精製に供した。
【０５０４】
実施例49
CHO DXB11 5xSA培地からのヒトIL17R [FL][x1] C(Fc5)の精製
PorosプロテインA 50アフィニティーカラム捕捉−
送達された培地中のFc5タグ化標的の発現を、分析用プロテインA-HPLCアッセイ法により評価した。発現レベルの決定に際しては、結合能が標的約9 mg/mL充填ベッドであると仮定して、適当量のPoros A50樹脂を用いて、発現された標的を捕捉した。送達された培地10 Lを、それぞれベッド体積が50 mLである2本の2 cmガラスカラム(Millipore)で捕捉した。カラムにはそれぞれPoros A50樹脂(AB Biosystems) 50 mLを充填し、下記の洗浄緩衝液で平衡化した。樹脂に培地の全容量を負荷した後、A280 nmでのUVが基線で安定するまで、1.6 mMクエン酸一水和物、10.9 mMリン酸水素ナトリウム、0.25 M硫酸アンモニウム、pH 6.0で、カラムを洗浄した。上記の洗浄緩衝液から20 mMクエン酸一水和物、5 mMリン酸水素ナトリウム、0.25 M硫酸アンモニウム、pH 3.0の60 CVの勾配により、20 mL/分で、結合したタンパク質を樹脂から溶出した。画分を回収し、十分な2 M Tris pH 8.0を用いて中和して、最終pHを7.0にした。溶出プールを、上記の分析用プロテインA-HPLCアッセイ法により分析した。
【０５０５】
プロテインAアフィニティーカラムプールの濃縮−
Labscale TFFシステム(Millipore)に据え付けた1×50 cm2 10 kD MWCO Biomax膜(Millipore)を用いて、プロテインAアフィニティープールの最初の濃縮を行った。容量が120 mLに到達した時点で、濃縮物を、10 kD PES膜(Millipore)を備えた撹拌セルシステム(Millipore)に移した。最終容量が20 mLになるまで濃縮を続けた。撹拌セル透過物を、上記の分析用プロテインA-HPLCアッセイ法によりFcタグ化標的について分析した。
【０５０６】
Superdex 200サイズ排除クロマトグラフィー−
2×10 mL容量の濃縮プロテインAアフィニアティープールを、340 mL XK26ガラスSuperdex 200 SECカラム(GE Healthcare)に流速3.5 mL/分で注入した。カラムは以下の移動層で平衡化した。35 mM NaPO4、120 mM NaCl、pH 7.2。Fcタグ化標的を含む画分をプールし、0.22 umで濾過し(Millipore)、分注し、-80℃で保存した。
【０５０７】
実施例50
大腸菌からの不溶性IL17Aの調製および抽出：
ヒトIL17Aを含む、2 Lバイオリアクター発酵からの大腸菌W3110細胞を、200 mM NaClおよび5 mM EDTAを含む50 mM Tris pH 8で洗浄して、ブロス混入物を除去した。細胞ペレット323 gに氷冷溶解緩衝液(50 mM Tris pH 8、200 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mMベンズアミジン、および5 mM DTT) 1.2 Lを添加し、Polytron組織破砕機を用いて凝集塊がすべて破壊されるまでホモジナイズした。次いで、細胞懸濁液を4℃に冷却しながら、細菌細胞をMicroFluidizerを3回通して溶解した。細胞溶解物の最終容量は1.73 Lであった。8本の250ml遠心ボトル中、20,000×g(Beckman J2-21M遠心機のJA-14ローターで12,000 rpm)、4℃で30分間遠心分離することにより、この溶解物中の封入体をペレット化した。封入体を溶解緩衝液で3回洗浄して、ペレット化した封入体タンパク質から、大腸菌の非破壊細胞および大きな細胞残屑を除去した。ペレットから上清を慎重に流し捨て、ペレットを溶解緩衝液に懸濁し、完全にホモジナイズすることにより封入体を洗浄して、可溶性タンパク質および細胞成分を洗い落とした。15,000×g(JA-14で12,000 rpm)、4℃で30分間遠心分離することにより、洗浄した封入体を回収した。250 mlボトル中の洗浄ペレット4本(各38 g)のうち3本を-80℃で保存し、4本目のボトルをさらに処理した。100 mM亜硫酸ナトリウムおよび20 mMテトラチオン酸ナトリウムを含む50 mM Tris pH 8中の7 Mグアニジン-HClを用いて、洗浄ペレットから組換えタンパク質を抽出した。変性剤による抽出はタンパク質関相互作用を解離し、タンパク質の折りたたみをほどく。結果として、抽出されたタンパク質は、還元状態にありかつスルホン化されたスルフヒドリル基を有する、ほどけた単量体からなる。組織ホモジナイザーを使用して、ペレット38 gを抽出緩衝液150 mlでホモジナイズし、懸濁液を35,000×g、4℃で2時間遠心分離することにより清澄化した。清澄化抽出物178 mlを、RP HPLC(23.3 mg/ml)およびSDS PAGE(20.4 mg/ml)によって評価し、4分割した。必要時まで、3分割分を-80℃で保存した。折りたたまれたIL17Aを調製するための抽出物には1/4を使用した。
【０５０８】
再折りたたみ：
以下の組成の氷冷再折りたたみ緩衝液(4リットル)を調製した；0.75 Mアルギニン、55 mM MES(N-モルホリノエタンスルホン酸)、10.56 mM NaCl、0.44 mM KCl、0.055% Peg 3.4 K(w/v)、1.1 mM EDTA、440 mMスクロース、550 mM GuHCl、1 mM GSH(還元型グルタチオン)、1 mM GSSG(酸化型グルタチオン)、pH 6.5。
【０５０９】
GuHCl可溶化、S-スルホン化封入体保存液を希釈する直前に、酸化-還元対(GSH:GSSG)を添加した。亜硫酸分解された(Sulfytolized)封入体の濃度は、適切なIL17F標準物質を用いてRP HPLCにより決定して20.4 mg/mLであった。濃縮保存液20 mLを、十分に撹拌した氷冷再折りたたみ緩衝液4リットルに1滴ずつ添加した。希釈工程が完了した時点で、大気を窒素で満たし、容器の蓋をしっかり閉め、低温室に置き穏やかに撹拌を続けた。様々な時間間隔で、RP HPLC分析用に試料を採取した。試料を採取するたびに、容器を窒素ガスで満たし、蓋をしっかり閉め、低温室に戻して穏やかに撹拌を続けた。
【０５１０】
早い時点で観察されたHPLC動態は、出発材料の溶出時間よりも早い溶出時間を有する複数の密集したピークを示す。出発材料の溶出時間の下流には、最小限のピークが認められた。時間と共に、上流のピーク群が減少して場の強さが弱まる方向の(downfield)ピークが増加し始めた。このピーク群は多くの部分的グルタチオン化部分を表す。上流ピーク群が減少して、二量体産物のピークが時間と共にゆっくりと上昇した。
【０５１１】
陽イオン交換(CIEX)での捕捉および回収：
SP Fast Flow(GE Healthcare)の陽イオン交換カラム(ベッド体積63 ml、直径2 cm)を緩衝液A：25 mM酢酸、100 mM NaCl、pH 5.0で平衡化した。2つの他の緩衝液を使用してCIEX工程を行った：緩衝液B：25 mM酢酸；2モルNaCl、pH 5.0、および希釈緩衝液：100 mM酢酸、pH 4.7。
【０５１２】
捕捉戦略では、20%再折りたたみRxnと80%希釈緩衝液のインライン希釈比率を使用して、負荷物を供した。クロマトグラフィーの試料供試段階の流速は10 ml/分であった。カラム流出液の伝導率は、負荷条件下で20ミリジーメンスである。逆相HPLC分析；カラム通過物の500 ul注入により、この負荷パラメータ下で物質がすべて結合していることが示された。
【０５１３】
再折りたたみ反応物をすべて供した後、280 nm波長での安定したUV吸光度基線が得られるまで、カラムを20カラム容量の緩衝液Aで洗浄した。安定した基線が得られた時点で、ポンプ比率を10%緩衝液Bに設定し、カラムを1 CV分洗浄してから、結合したタンパク質を10%緩衝液B(開始条件)から100% Bの15 CVの勾配で溶出した。勾配の開始後ほぼすぐ、対称的なピークが溶出した。UV追跡により示されるタンパク質を含む画分を、逆相HPLCによって標的含有量について分析した。陽イオン交換タンパク質プールの分析から、この段階で二量体産物ピークが非常に高い比率で存在し、集団ピークの一部がなお観察され得ることが示された。タンパク質含有画分の非還元SDS-PAGE解析を使用して、それらの複雑性を調べた。ゲルから、この段階で、1:1比の相当量の単量体種と二量体種が存在することが示される。
【０５１４】
Phenyl HP HIC段階：
陽イオン交換プールを、10 kDカットオフ膜(Amicon Ultra-15)に対して40 mlにまで濃縮し、十分に撹拌した濃縮物に十分な固体をゆっくりと添加することにより0.7 M [NH4]2SO4に調整した。疎水性相互作用カラムに均一濃度で通過させるための準備として、最終的に2 N NaOHによりpHを7.5に調整した。高速Phenyl HP(Pharmacia)カラム(17 mL、直径2 cm)を、0.7 M硫酸アンモニウム；20 mM NaPO4、20 mM MES、pH 7.5緩衝液で室温で平衡化した。調整済みのタンパク質プールを、スーパーループ注入ポートを使用して流速2.5 ml/分でカラムに供した。2.5 mL/分での試料供試中に、タンパク質はほとんど通過しなかった。全試料を注入した時点で、平衡化緩衝液の流速を上げて非結合タンパク質を洗い流した。しかし、洗浄段階のために流速を10 mL/分に上げた際に、タンパク質はカラムから溶出し始めた。前部側面および後部側面上に小さなプラトーを有するほぼ対称的なピークが溶出した。前部および後部プラトー画分を除いたプールを作製し、RP HPLCにより分析した。SDS-PAGE解析(非還元)から、この段階により高分子量の多量体がすべて除去されたこと、ならびにIL17Aの単量体種および二量体種のみが残存し、二量体が主な種であることが示された。
【０５１５】
脱塩段階：
疎水性クロマトグラフィー段階からプールしたタンパク質を、10 kDカットオフ膜(Amicon Ultra-15)に対して10 mLにまで濃縮し、35 mM NaPO4 109 mM NaCl、pH 7.0緩衝液で平衡化したHi Trap 26/10脱塩カラム(Pharmacia)に注入した。タンパク質含有溶出液画分をRP HPLCにより分析し、滅菌濾過し、タンパク質含有量について解析し、エンドトキシンについて試験し、その後分注して-80℃で凍結した。
【０５１６】
実施例51
293F B細胞からのヒトIL17A CH6の精製
組換えカルボキシル末端6-ヒスチジンタグ化ヒトIL17Aタンパク質は、該標的を発現するトランスフェクションCHO細胞から約0.3 mg/Lで産生された。CHOのトランスフェクションは、当技術分野で公知の方法を用いて行った。馴化培地約7 Lを回収し、0.2μmフィルターを用いて滅菌濾過し、2枚のPellicon 2 Mini 10 Kフィルターを備えたMillipore ProFlux M12接線流濾過システムで1.0 Lリットルにまで濃縮し、次に10倍量を用いてPBS(0.137 M NaCl、0.0027 M KCl，0.0072 Na2HPO4、0.0015 M KH2PO4、pH 7.4)に緩衝液交換した。HisTrap HP固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC、GE Healthcare、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)およびSuperdex 200(GE Healthcare)サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の併用により、この緩衝液交換した培地からタンパク質を精製した。
【０５１７】
緩衝液交換した培地1.4 Lを25 mMイミダゾールに調整し、3 CVの500 mMイミダゾールであらかじめ溶出し、20 CVの25 mMイミダゾール、50 mMリン酸ナトリウム、500 mM NaCl、0.02%アジ化物 pH 7.4で平衡化した5 ml(1.6×2.5 cm) HisTrap HPカラムに、1.2 ml/分(36 cm/時間)で4℃で一晩かけて負荷した。負荷後、カラムを20 CVの平衡化緩衝液で洗浄し、次に10 CVの、いずれも50 mMリン酸ナトリウム、500 mM NaCl、0.02%アジ化物 pH 7.4中の50 mMイミダゾールおよび500 mMイミダゾールの2段階で5 ml/分(149 cm/時間)で溶出した。溶出画分をSDS-PAGEにより解析し、標的を含む画分をプールした。通過物の抗Hisウェスタン解析から、すべての標的が結合したことが示された。
【０５１８】
次に、IMACプール 9mlを0.9 mlにまで濃縮し、35 mMリン酸、120 mM NaCl、pH 7.3で平衡化した23 ml Superdex 200(10 mm×300 mm)カラムに注入し、0.4 ml/分(30 cm/時間)で溶出した。画分を回収し、SDS-PAGEおよびA280に基づいてプールし、0.2μmフィルターで滅菌し、分割量として-80℃で凍結した。最終的な精製タンパク質の濃度は、BCAアッセイ法(Pierce、イリノイ州、ロックフォード)により決定した。全工程での回収率は約80%であった。
【０５１９】
精製ヒトIL17A CH6の解析
組換えヒトIL17A CH6を、SDS-PAGE(10% BisTris、Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)のタンパク質に関する0.1%クマシーR250染色により、およびニトロセルロースに転写後の抗His-HRPによる免疫ブロッティングにより解析した。NovexのXcell IIミニセルを用いて精製タンパク質を電気泳動し、25 mM Trisベース、200 mMグリシン、および20%メタノールを含む緩衝液中、常温、600 mAで45分かけてニトロセルロース(0.2 mm；Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)に転写した。次にフィルターを、50 mM Tris、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.05% Igepal(TBS)中の10%脱脂粉乳で室温にて15分間ブロッキングした。ニトロセルロースを速やかにリンスし、抗His-HRP抗体(1:2500)を添加した。ブロットを、穏やかに振盪させながら4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ブロットをTBSで15分間ずつ3回洗浄し、次いでH2O中で速やかにリンスした。市販の化学発光基質試薬(Roche LumiLight)を用いてブロットを顕色させ、Lumi-ImagerのLumi Analyst 3.0ソフトウェア(Boehringer Mannheim GmbH、ドイツ)を用いてシグナルを捕捉した。
【０５２０】
精製ヒトIL17A CH6は、還元および非還元条件下でのウェスタンブロットおよびクマシー染色ゲルのいずれにおいても2〜3本のバンドとして出現し、非還元条件下で約39 kDaの主要バンドを有するグリコシル化型が示唆された。タンパク質は正確なアミノ酸組成を有し、N末端配列決定から、正確なNH2末端を有する強力な単一配列が得られた。
【０５２１】
実施例52
大腸菌によるヒトIL-17Fタンパク質産生：A1275F工程；
大腸菌からの不溶性IL17Fの調製および抽出：
ヒトIL17Fを含む、2 Lバイオリアクター発酵からの大腸菌W3110細胞を、200 mM NaClおよび5 mM EDTAを含む50 mM Tris pH 8で洗浄して、ブロス混入物を除去した。細胞ペレット350 gに氷冷溶解緩衝液(50 mM Tris pH 8、200 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mMベンズアミジン、および5 mM DTT) 1.2 Lを添加し、Polytron組織破砕機を用いて凝集塊がすべて破壊されるまでホモジナイズした。次いで、細胞懸濁液を4℃に冷却しながら、細菌細胞をMicroFluidizerを3回通して溶解した。細胞溶解物の最終容量は1.73 Lであった。8本の250ml遠心ボトル中、20,000×g(Beckman J2-21M遠心機のJA-14ローターで12,000 rpm)、4℃で30分間遠心分離することにより、この溶解物中の封入体をペレット化した。封入体を溶解緩衝液で3回洗浄して、ペレット化した封入体タンパク質から、大腸菌の非破壊細胞および大きな細胞残屑を除去した。ペレットから上清を慎重に流し捨て、ペレットを溶解緩衝液に懸濁し、完全にホモジナイズすることにより封入体を洗浄して、可溶性タンパク質および細胞成分を洗い落とした。15,000×g(JA-14ローターで12,000 rpm)、4℃で30分間遠心分離することにより、洗浄した封入体を回収した。洗浄封入体の半分(約64グラム湿重量)を250 mlボトル中で-80℃で保存し、残りの半分をさらに処理した。100 mM亜硫酸ナトリウムおよび20 mMテトラチオン酸ナトリウムを含む50 mM Tris pH 8中の7 Mグアニジン-HClを用いて、洗浄ペレットから組換えタンパク質を抽出した。変性剤による抽出はタンパク質関相互作用を解離し、タンパク質の折りたたみをほどく。結果として、抽出されたタンパク質は、還元状態にありかつスルホン化されたスルフヒドリル基を有する、ほどけた単量体からなる。組織ホモジナイザーを使用して、ペレット64 gを抽出緩衝液100 mlでホモジナイズし、懸濁液を35,000×g、4℃で2時間遠心分離することにより清澄化した。清澄化抽出物60 mlをRP HPLCによって評価し(28.4 mg/ml)、4分割した。必要時まで、3分割分を-80℃で保存した。折りたたまれたIL17Fの調製に1/4を使用した。
【０５２２】
再折りたたみ：
以下の組成の氷冷再折りたたみ緩衝液(4リットル)を調製した；0.75 Mアルギニン、55 mM MES(N-モルホリノエタンスルホン酸)、10.56 mM NaCl、0.44 mM KCl、0.055% Peg 3.4 K(w/v)、1.1 mM EDTA、440 mMスクロース、550 mM GuHCl、1 mM GSH(還元型グルタチオン)、1 mM GSSG(酸化型グルタチオン)、pH 6.5。
【０５２３】
GuHCL可溶化、S-スルホン化封入体保存液を希釈する直前に、酸化-還元対(GSH:GSSG)を添加した。亜硫酸分解された封入体の濃度は、RP HPLCにより決定して28.4 mg/mLであった。濃縮保存液15 mLを、十分に撹拌した氷冷再折りたたみ緩衝液4リットルに1滴ずつ添加した。希釈工程が完了した時点で、容器の蓋をしっかり閉め、低温室に置き穏やかに撹拌を続けた。様々な時間間隔で、RP HPLC分析用に試料を採取した。HPLC分析に基づき、容器を低温室で72時間穏やかに撹拌してから、回収を開始した。
【０５２４】
UF/DF工程：
再折りたたみ後、再折りたたみ混合物をUF/DF工程段階に供した。混合物をまず最初に、5 Kカットオフ膜に対して4リットルから約475 mLにまで濃縮した。この段階で、この濃縮物を低温室で一晩穏やかに撹拌し続けた。翌朝、透析濾過段階を開始し、900 mL処理量の20 mM Tris；120 mM NaCl(pH 8.0)緩衝液を用いて残留緩衝液組成を変換した。透析濾過が進行するにつれて、475 mLの固定容器容積では、濁りおよび流動速度の低下が明白となった。この時点で容器の内容物を回収し、遠心分離して、形成された沈殿物を除去した。清澄化溶液のRP HPLC分析から、標的が沈殿しなかったことが示された。清澄化混合物を25 mM酢酸、pH 5.4で1:1(v/v)希釈した。伝導率は9.8ミリジーメンスと測定され、陽イオン交換カラム段階に結びつけるのに必要な伝導率と一致していた。pHを5.4に保持するために同時に滴定しながら(2N NaOHを添加)、さらに0.68 mlの酢酸を1滴ずつ添加した。このようにして調整した溶液を1.2マイクロメートルフィルターを通して濾過し、陽イオン交換カラム捕捉段階に供した。
【０５２５】
陽イオン交換(CIEX)での捕捉および回収：
UF/DF工程からの調整済み溶液を、緩衝液A：25 mM酢酸；100 mM NaCl、pH 5.4で平衡化した59 mlベッド(直径2 cm)のSP Fast Flow陽イオン交換媒体(Pharmacia)に20 mL/分で負荷した。試料負荷の完了後、280 nmでの安定した基線吸光度が得られるまで、20 CVの緩衝液Aでカラムを洗浄した。その時点で、緩衝液Aと緩衝液B：20 mM 酢酸；2 M NaCl、pH 5.4との間で形成された20 CVの勾配により産物を溶出した。勾配は100%緩衝液Aで開始し、20 CVの時点で25%緩衝液A:75%緩衝液Bで完了する。CIEX工程は室温で行った。産物は、30〜60ミリジーメンス伝導率において対照的なピークとして溶出した。タンパク質を含む画分を非還元SDS-PAGEクマシー染色により解析し、二量体IL17Fを有する画分をプールし、サイズ排除仕上げおよび緩衝液交換の準備として濃縮した。
【０５２６】
サイズ排除クロマトグラフィー：
濃縮した陽イオン交換プール(7 mL、タンパク質200 mgを含有)を、50 mM NaPO4、109 mM NaCl、pH 7.2で平衡化したSuperdex 75(26/60)サイズ排除カラム(Pharmacia)のベッドに3.5 ml/分で注入した。主に二量体の純粋なIL17Fタンパク質を含む溶出画分をプールし、滅菌濾過し、タンパク質濃度およびエンドトキシンレベルについてアッセイし、その後分注して-80℃で保存した。
【０５２７】
以上のことから、説明を目的として本発明の特定の態様を本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることが理解されると考えられる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に制限される以外に、制限されることはない。
【配列表】
2009540018000001.app
【国際調査報告】
2009540018.tif 000063
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