(57)【要約】Ｎａｎｏｇを用いて星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物および方法を開示する。脱分化した神経幹細胞は、星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞への分化能を有する。
2009528048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物。
【請求項２】
Ｎａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、Ｎａｎｏｇタンパク質を発現するベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｎａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、Ｎａｎｏｇタンパク質を発現するウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記脱分化した神経幹細胞が、星状細胞（astrocyte）、ニューロン（neuron）、および希突起膠細胞（oligodendrocyte）への分化能を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｎａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法。
【請求項６】
前記脱分化した神経幹細胞が、星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、（i）星状細胞を培地で培養する段階と、（ii）Ｎａｎｏｇタンパク質、またはコードするヌクレオチド配列を含む核酸を処理する段階と、（iii）星状細胞を神経幹細胞への脱分化に誘導する段階とを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（i）段階で星状培養を培養する培地が、ｂＦＧＦを含む培地である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項５の方法で生産された神経幹細胞。
【請求項１０】
請求項５の方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞に分化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
神経幹細胞（Neural stem cells：ＮＳＣｓ）は、神経系に存在する前駆細胞のサブタイプであって、星状細胞、希突起膠細胞、ニューロンへの分化能を持っている。中枢神経系（Central nervous system：ＣＮＳ）と抹消神経系（peripheral nervous system：ＰＮＳ）から分離してマルチセルラーニューロスフェア（Multicellular neurospheres）を作ることができ、この細胞がそれぞれの条件でグリアリニージ（glial lineage）とニューラルリニージ（neural lineage）に分化する（Sally Temple et al. 2001）。このような神経幹細胞は、難治病の治療に応用されて現在細胞治療の一つの方法として研究されており、倫理的な問題が殆どない成体幹細胞であるから多く研究されている実情である。最近、脱分化に関連した研究が行われている状況で成体幹細胞の重要性がさらに強調されている。このような成体幹細胞は、胚芽幹細胞より得易いが、実際適用するには未だ難しい部分が多い。また、別の人の成体幹細胞を使用するときには免疫拒否反応という問題も提起されるおそれがある。よって、自分の細胞を用いて脱分化を誘導する場合、現在提起されている問題を解決することができる。このような趣旨で、既に分化の進んだ細胞を用いて脱分化を誘導することが重要である。現在、細胞融合や核移植などの方法を用いて脱分化を誘導する研究が進行中にある。別の方法を用いたグループとして、Ａｌｅｘｉｓ Ｊ（Lancet 2004）は、皮膚から分離した細胞を神経幹細胞培養条件で培養したときに神経幹細胞の特性を持っていると報告した。また、Ｔｏｒｕ Ｋ．（Genes & Development 2004）は、希突起膠細胞前駆体（oligodendrocyte precursors）を神経幹細胞に脱分化させたことを報告した。このグループは、これに関連した論文を２０００年から研究して発表し、２００４年の論文では各分化段階で遺伝子の発現がクロマチン再構築(chromatin remodeling)とヒストン修飾（histone modification）に関連していると報告した。
【０００２】
〔発明の背景〕
本研究では、既存の様々な方法の問題点を解決し、より使用に適した方法を確立しようとした。胚芽幹細胞（Embryonic stem cell）の特性である自己再生(self-renewal)を調節している遺伝子として知られている転写因子中の一つを選別し、過発現を誘導して神経幹細胞への分化を研究した。われわれの選別したＮａｎｏｇ遺伝子は、幹細胞の多能性を維持させることに関与している遺伝子である。Ｎａｎｏｇ遺伝子は、ホメオドメインタンパク質であって、転写促進子（transcription activator）として作用している（Kaoru Mitsui, 2003）。Ｎａｎｏｇ遺伝子は、幹細胞の維持と分化を調節するキーとして知られている。Ｎａｎｏｇ遺伝子は、胚芽幹細胞だけでなく、生殖細胞腫（germ cell tumor）でも高い発現量が示されているが、前述したように分化が進むと発現量が減少して最終分化（terminal differentiation）状態では発現量がない（Ian Chambers et al., 2003）。Ｎａｎｏｇ遺伝子は、２００３年Ｃｅｌｌに掲載されて以来、いろんなところで研究が行われ、現在、Ｎａｎｏｇ遺伝子によって調節されている遺伝子に対する研究成果が発表されている（Paromita Deb-Rinker et al., 2005, Guangin Pan et al., 2005）。また、最近、ＢＢＲＣに掲載された論文では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＮａｎｏｇ遺伝子を過発現させた場合、成長速度が速くなることを言及している（Jingyu Ahang et al., 2005）。
【０００３】
このような背景の下に、本発明者らは、既に分化した星状細胞にＮａｎｏｇ遺伝子を過発現させると、自己再生能と星状細胞、ニューロン、および希突起膠細胞への分化能を持つ神経幹細胞様の細胞（neural stem cell-like cell）に脱分化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００４】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、Ｎａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸からなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物を提供することにある。
【０００５】
本発明の他の目的は、Ｎａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の別の目的は、前記方法で生産された神経幹細胞を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞に分化させる方法を提供することにある。
【０００８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。
【０００９】
図１は免疫細胞化学法（Immunocytochemistry）によってＮａｎｏｇタンパク質の過発現を確認した結果を示す。
【００１０】
図２は脱分化の誘導を示すもので、Ａはｓｐｈｅｒｅ形成を、Ｂはｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅ形成（direct sphere formation）（左：位相コントラスト、右：ＧＦＰ検出）をそれぞれ示す。（ｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されるものを意味し、ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを星状細胞培養条件でアタッチさせてから１２時間後に安定になったときに神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されるものを意味する）。
【００１１】
図３は神経幹細胞マーカーの発現を免疫細胞化学法で考察した結果である。Ａ〜Ｃは神経幹細胞を示し、Ｄ〜Ｋは神経幹細胞様の細胞（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ＃２、＃４、ｐ５３−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ＃４、＃６）を示す。
【００１２】
図４はＮａｎｏｇ遺伝子の発現が細胞成長を促進させることを示す。Ａは成長曲線分析（Growth curve analysis）を行った結果であり、Ｂは低密度シーディングアッセイ（Low density seeding assay）を行った結果である。
【００１３】
図５は神経細胞様細胞の星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞へのインビトロ分化を示す。（Ａ〜Ｃ：神経幹細胞、Ｄ〜Ｋは神経幹細胞様の細胞、Ｄ〜Ｇ：Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ ＧＦＰ ＃２、Ｈ〜Ｊ：＃４、Ｋ：ｐ５３−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ ＧＦＰ＃４、Ｌ〜Ｏ：＃６）を示す。
【００１４】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、Ｎａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸からなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物に関する。
【００１５】
本発明において、用語「神経幹細胞様の細胞」とは、ニューロン、星状細胞、希突起膠細胞などの細胞に分化できる多能性幹細胞（multipotent stem cell）であって、体細胞の脱分化に起源した幹細胞である。本発明において、神経幹細胞様の細胞は神経幹細胞として記述されることもある。
【００１６】
本発明は、星状細胞でＮａｎｏｇを過発現させる場合、既に分化した細胞タイプの星状細胞が、多能性神経幹細胞様の細胞に脱分化することを開示する。
【００１７】
本発明のＮａｎｏｇは、タンパク質、またはこのタンパク質をコードする核酸の形で提供される。
【００１８】
本発明の組成物に使用されるＮａｎｏｇは、ヒト、馬、羊、豚、山羊、駱駝、レイヨウ、犬などの動物に由来した全てのＮａｎｏｇを含む。また、神経細胞への脱分化に使用される本発明のＮａｎｏｇタンパク質は、その野生型のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、Ｎａｎｏｇタンパク質の変異体を含む。
【００１９】
用語「Ｎａｎｏｇタンパク質の変異体」は、Ｎａｎｏｇの天然アミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的もしくは保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を有するタンパク質を意味する。前記変異体は、天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であってもよく、必要に応じてタンパク質の物理化学的性質が変形された変異体であってもよい。好ましくは、物理、化学的環境に対する構造的安定性または生理学的活性が増大した変異体である。
【００２０】
好ましくは、Ｎａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の形で提供される。
【００２１】
Ｎａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、野生型または前述したような変異体型のＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、少なくとも一つの塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異でき、天然から分離されるか或いは合成法を用いて製造できる。
【００２２】
前述したＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子からなる単鎖または二重鎖であってもよい。
【００２３】
一つの好適な様態において、Ｎａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｎａｎｏｇタンパク質を発現するベクターとしての組成物である。
【００２４】
本発明において、用語「ベクター」とは、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能な発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００２５】
本発明において、用語「作動可能に連結された」とは、一般な機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的のタンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組み換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野における公知の遺伝子組み換え技術を用いて実現することができ、部位特異的ＤＮＡ切断および連結は、当該技術分野における公知の酵素などを用いて実現することができる。
【００２６】
本発明のベクターは、プロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどの発現調節要素の他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造できる。ベクターのプロモータは構成的または誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合には複製起源を含む。ベクターは、自己複製し、或いは宿主ＤＮＡに統合できる。
【００２７】
ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクターなどを含む。好ましくは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えばＨＩＶ（Human immunodeficiency virus）、ＭＬＶ（Murine leukemia virus）、ＡＳＬＶ（Avian sarcoma/leukosis）、ＳＮＶ（Spleen necrosis virus）、ＲＳＶ（Rous sarcoma virus）、ＭＭＴＶ（Mouse mammary tumor virus）などのレトロウイルス、アデノウイルス（Adenovirus）、アデノ関連ウイルス（Adeno-associated virus）、およびヘルペスシンプレックスウイルス（Herpes simplex virus）に由来したベクターを含むが、これに限定されない。
【００２８】
Ｎａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、当該分野における公知の方法、例えばベクター形態のネイキッドＤＮＡとして細胞内に伝達し（Wolff et al. Science,  247:1465-8, 1990: Wolff et al. J. Cell Sci. 103:1249-59, 1992）、或いはリポソーム、陽イオン性高分子などを用いて細胞内に伝達することができる。リポソームは、遺伝子伝達のためにＤＯＴＭＡやＤＯＴＡＰなどの陽イオン性リン脂質を混合して製造したリン脂質膜であって、陽イオン性のリポソームと陰イオン性の核酸とを一定の割合で混合すると、核酸−リポソーム複合体が形成される。
【００２９】
別の好適な様態として、Ｎａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｎａｎｏｇタンパク質を発現するウイルスとしての組成物である。
【００３０】
本発明において、用語「ウイルス」とは、Ｎａｎｏｇタンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターをパッケージング細胞に形質転換および感染させて製作した、Ｎａｎｏｇを発現するウイルスを意味する。
【００３１】
本発明のＮａｎｏｇタンパク質を発現するウイルスの製造に使用できるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびヘルペスシンプレックスウイルスを含み、これに限定されない。好ましくは、レトロウイルスである。本発明の具体的な実施では、ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターにＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター（ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ Ｎａｎｏｇ ＩＲＥＳ ＥＧＦＰ）をパッケージング細胞としてのＰＴ６７細胞に形質転換し、Ｎａｎｏｇタンパク質を発現するウイルスを製造した。
【００３２】
別の様態として、本発明は、Ｎａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法に関する。
【００３３】
より具体的に、前記方法は、（i）星状細胞を培地で培養する段階と、（ii）前記培養物をＮａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階と、（iii）星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する段階とを含んでなる。
【００３４】
前記方法の（i）段階で星状細胞を培養する培地は、当該分野で神経幹細胞の培養に通常用いられる培地を全て含む。培養に用いられる培地は、一般に、炭素源、窒素源および微量元素の成分を含む。また、培地は、ペニシリン（penicillin）、ストレプトマイシン（streptomycin）、ゲンタマイシン（gentamicin）などの抗生剤を含むことができる。好ましくは、ｂＦＧＦを含む培地である。
【００３５】
前記方法の（ii）段階で処理されるＮａｎｏｇタンパク質、またはＮａｎｏｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、前述したとおりである。
【００３６】
別の様態として、本発明は、前記方法で製造された神経幹細胞に関する。
【００３７】
本発明の脱分化方法で製造された神経幹細胞は、神経幹細胞特異的なマーカーである、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２が神経幹細胞と同じ水準で発現し、一般な神経幹細胞と同一の分化能を持つことを確認した。また、本発明の脱分化方法で製造された神経幹細胞は自己再生（self-renewal）の特徴を持っている。
【００３８】
別の様態として、本発明は、前記方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞に分化させる方法に関する。
【００３９】
本発明の組成物と方法によって製造された神経幹細胞を、当該分野で知られている通常の星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞の分化条件で分化を誘導する場合、それぞれの細胞への分化が誘導されることを各細胞特異的なマーカーの発現検出によって確認することができた。
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ところが、これらの実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００４１】
（実施例１：研究方法）
１．Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞、ｐ５３−／−星状細胞とマウス神経幹細胞の培養
Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞、ｐ５３−／−星状細胞は、ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）１０％、ペニシリン／ストレプトマイシン１％、Ｌ−グルタミン１％（ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium（高グルコース、ＨｙＣｌｏｎｅ））で培養した。対照群として使用された神経幹細胞は、Ｅ１３．５日齢のマウスから分離してインスリン（Ｓｉｇｍａ）、ａｐｏ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、セレニウム（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｎ２）に血清代替物（serum-replacement）としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、ヒト組み換えベイシック（human recombinant basic）ＦＧＦおよびヒト組み換え（human recombinant）ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を添加して培養した。
【００４２】
２．レトロウイルス媒介感染（Retroviral-mediated infection）
ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ Ｎａｎｏｇ ＩＲＥＳ ＥＧＦＰ（ｈｕｍａｎ Ｎａｎｏｇ（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿０２４８６５）ｃＤＮＡとｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターに由来したＩＲＥＳ ＥＧＦＰ部分をｐＢａｂｅ ｐｕｒｏにライゲーションして製造した）とｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ ＥＧＦＰをＰＴ６７パッケージングセルライン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて形質転換した後、ピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下に選別した。こうして作られた細胞株は、９０％以上になったとき、上澄み液を取って０．４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でフィルターリングして細胞残屑（cell debris）を除去した後、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加して１０時間間隔で分離したマウス星状細胞に２回感染させた。その後、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）の存在下に選別した。
【００４３】
３．成長曲線分析および低密度シーディング分析
１２ウェルプレートに１×１０４の細胞をシーディングし、１２時間後から６日間毎日０．０１％クリスタルバイオレット染色（crystal violet stain）を行った。１０％酢酸で抽出した後、分光光度計６００ｎｍで密度を測定して細胞生長速度を確認した。低密度シーディング分析（Low density seeding assay）は、６ウェルプレートに３００個の細胞をシーディングさせた後、２週間後、再び０．０１％クリスタルバイオレット染色を行って成長速度を確認した。
【００４４】
４．脱分化の誘導（Induction of de-differentiation）
脱分化は、神経幹細胞培養条件と同様に培養しながら誘導した。この際、２つの相違な方法を用いて培養した。その一つの方法は、６ウェルプレートに１×１０５の細胞をプレイティングし、１２時間後、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、ａｐｏ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、セレニウム（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｎ２）に血清代替物（serum-replacement）としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）とヒト組み換えベイシックＦＧＦ、ヒト組み換えＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を添加した培地で取り替えながら培養する方法である。細胞は、毎日ｂＦＧＦで処理し、培地を二日おきに取り替えながら培養した。もう一つの方法は、適正の培養条件で培養した細胞を、トリプシン化した後、３×１０５ずつ６０ｍｍのバクテリア培養プレート（bacterial culture plate）にシーディングし、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、ａｐｏ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、セレニウム（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｎ２）に血清代替物(serum-replacement)としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、ヒト組み換えベイジックＦＧＦおよびヒト組み換えＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）が添加された培地で培養する方法である。
【００４５】
５．免疫細胞化学法（Immunocytochemistry）による過発現の確認および各マーカーの確認
Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは、４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ）で１時間４℃で固定した後、２０％のスクロースを添加して４℃で一晩シェーキングを行った。その後、ＯＣＴ化合物を用いて８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に低温保存（cryopreservation）した。８〜１０μｍでセクションした後、染色を行った。１０％正常山羊血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）＋０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）が含まれているＰＢＳでブロッキングを行った後、ａｎｔｉ−ｎｅｓｔｉｎ（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ａｎｔｉ−ＣＤ１３３（ＭＡＣＳ）、ａｎｔｉ−Ｓｏｘ２（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ−Ｎａｎｏｇ（Ｒ＆Ｄ）を用いて４℃で一晩反応させた後、ＲＴでａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ｃｙ３（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）、ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−ｃｙ３（Ｚｙｍｅｄ）で反応させた後、最後にＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて核染色を行った。染色の後、Ｚｅｉｓｓ ｃｏｎｆｏｃａｌ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で確認した。分化した細胞の場合、前述した方法で染色を行った。この際、使用した抗体は、ａｎｔｉ−ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ）、ａｎｔｉ−Ｓ１００β（Ｚｙｍｅｄ）、ａｎｔｉ−β−ｔｕｂｕｌｉｎIII（ｃｏｖａｎｃｅ）、ａｎｔｉ−Ｍａｐ２ａ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ−ＴＨ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ−Ｏ４（Ｒ＆Ｄ）、ａｎｔｉ−ＣＮＰａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）であった。
【００４６】
６．インビトロ分化（In vitro differentiation）
ＰＬＯ）Poly-L-ornithinte）（Ｓｉｇｍａ）とラミニン（laminin）或いはフィブロネクチン（fibronectin）（Ｓｉｇｍａ）でコートした後、下記の分化条件で培養した。
【００４７】
星状細胞への分化は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）が含まれているＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、高グルコース）にヒト組み換えｂＦＧＦとＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を添加し、或いはＣＮＴＦ（recombinant rat ciliary neurotrophic factor（upstate））で５〜７日間培養することにより誘導した。
【００４８】
ニューロン（neuron）への分化は、血清代替物としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）が含まれているＮ２培養液にヒト組み換えＦＧＦを４日間処理した後、８日間ＦＧＦのない培地で培養することにより誘導した。他の方法では、濃度１〜１０μＭのＲＡ（retinoic acid）（Ｓｉｇｍａ）を添加して７〜１４日間培養することにより、分化を誘導した。別の方法では、濃度１〜１０ＭｍのＶＰＡ（Valproic acid）（Ｓｉｇｍａ）を濃度１〜１０μＭのＲＡ（Ｓｉｇｍａ）と共に添加して７〜１４日間培養することにより、分化を誘導した。
【００４９】
希突起膠細胞への分化は、血清代替物としてのＢ２７が添加されているＮ２培養液にＰＤＧＦ−ＡＡ（platelet derived growth factor-AA）（Ｒ＆Ｄ）、Ｔ３（3,3,5-triiodo-L-thyronine）（Ｓｉｇｍａ）、およびヒト組み換えベイシックＦＧＦとＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を共に添加して２０日間培養することにより誘導した。
【００５０】
前述した条件で培養を行い、それぞれの分化した細胞の形態を観察しながら、それぞれの分化マーカーとして使用される抗体を用いて免疫細胞化学法（immunocytochemistry）によって確認した。
【００５１】
（実施例２：研究結果）
既に分化の進んだＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞、ｐ５３−／−星状細胞にレトロウイルス導入システム（retroviral transduction system）を用いてＮａｎｏｇ（ヒト）遺伝子を過発現させた。免疫細胞化学法によって過発現有無をＮａｎｏｇ抗体を用いて確認し、遺伝子の真後ろにあるＧＦＰの発現検出によって再び確認した（図１）。
【００５２】
その後、神経幹細胞の培養条件を用いて脱分化を誘導した。まず、一定の数（１×１０５）の細胞を６ウェルプレートにシーディングした後、１２時間後から神経幹細胞培養条件で培養を行い、培養３〜４日目に神経幹細胞と同じ形態を示すことを観察することができた。また、一定の数（３×１０５）の細胞を６０ｍｍのバクテリアプレート（bacterial plate）に神経幹細胞と同一の培養条件で培養した結果、依然として神経幹細胞と同じ形態を示していることを観察することができた。一方、対照区ベクターであるｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ ＥＧＦＰに感染した細胞では、前者の方法で行った場合はｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅが形成されていないが、後者の方法で行った場合はｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅが形成されていることを確認することができた。ところが、Ｎａｎｏｇ遺伝子が感染して発現されている細胞より大きさと数が少なかった（図２）。一週間経過後からｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを他のプレートに移して培養し続けた場合も、神経幹細胞と同じ形態を示した。Ｎａｎｏｇ遺伝子を用いて作られた細胞が自己再生特性を持っているかを調べるためにｓｕｂｓｐｈｅｒｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを行った結果、単細胞でｓｐｈｅｒｅが形成されることを１週間経過後から観察することができた（データを示さず）。
【００５３】
この細胞が神経幹細胞と同一の特性を持つ細胞であるかを確認するために、それぞれのマーカーを用いて免疫細胞化学法を行った。神経幹細胞で最も多く発現されているマーカーＮｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２を用いて染色した結果、神経幹細胞で発現されているのと同様に、神経幹細胞様の細胞でも発現されていることが観察された。この際、作られたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅをｃｒｙｏ−ｓｅｃｔｉｏｎして確認した結果、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２の発現を確認することができた（図３）。
【００５４】
こうして作られたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを、一つずつＰＬＯとラミニンでコートした４ウェルプレートにシーディングし、星状細胞の培養条件で培養した。このような方法でそれぞれ６つのクローンを得た。成長速度を比較し、最も成長速度が速い２つのクローンを選別した。成長曲線分析の結果、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞にＮａｎｏｇ遺伝子が過発現された場合は＃２、＃４が、ｐ５３−／−星状細胞にＮａｎｏｇ遺伝子が過発現された場合は＃４、＃６が６つのクローンの中でも成長速度が最も速かった（図４）。
【００５５】
神経幹細胞様の細胞が神経幹細胞のように分化能力を持つかを確認するために、星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞への分化を前述の方法で誘導し、分化有無をそれぞれの分化マーカーに特異的な抗体を用いて確認した結果、神経幹細胞のように３つのタイプに分化がなされることを確認することができた。まず、星状細胞への分化はＧＦＡＰとＳ１００の発現によって確認し、ニューロンへの分化はβ−ｔｕｂｕｌｉｎ III（Ｔｕｊ１）とＭａｐ２ａの発現によって確認した。また、希突起膠細胞のマーカーであるＯ４とＣＮＰａｓｅも希突起膠細胞への分化条件を与えたときに発現されていることを確認することができた（図５）。
【００５６】
この研究によって、Ｎａｎｏｇ遺伝子はＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞、ｐ５３−／−星状細胞を神経幹細胞様の細胞に脱分化させることに関与する重要な遺伝子であり、このように脱分化した神経幹細胞様の細胞は星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞にさらに分化することを確認することができた。
【００５７】
〔産業上の利用可能性〕
前述したように、Ｎａｎｏｇを用いて星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導することができ、脱分化した神経幹細胞は多様な疾病治療に使用できる。
【００５８】
〔従来の技術の文献情報〕
1. Toru Kondo, Martin Raff. Chromatin remodeling and histone modification in the conversion of oligodendrocyte precursors to neural stem cells. Genes & Development 2004;18: 2963-2972.
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】免疫細胞化学法（Immunocytochemistry）によってＮａｎｏｇタンパク質の過発現を確認した結果を示す。
【図２】脱分化の誘導を示すもので、Ａはｓｐｈｅｒｅ形成を、Ｂはｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅ形成（direct sphere formation）（左：位相コントラスト、右：ＧＦＰ検出）をそれぞれ示す。（ｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されるものを意味し、ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを星状細胞培養条件でアタッチさせてから１２時間後に安定になったときに神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されるものを意味する。）
【図３】神経幹細胞マーカーの発現を免疫細胞化学法で考察した結果である。Ａ〜Ｃは神経幹細胞を示し、Ｄ〜Ｋは神経幹細胞様の細胞（Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ＃２、＃４、ｐ５３−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ＃４、＃６）を示す。
【図４】Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現が細胞成長を促進させることを示す。Ａは成長曲線分析（Growth curve analysis）を行った結果であり、Ｂは低密度シーディングアッセイ（Low density seeding assay）を行った結果である。
【図５】神経細胞様細胞の星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞へのインビトロ分化を示す。（Ａ〜Ｃ：神経幹細胞、Ｄ〜Ｋは神経幹細胞様の細胞、Ｄ〜Ｇ：Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ ＧＦＰ ＃２、Ｈ〜Ｊ：＃４、Ｋ：ｐ５３−／−星状細胞Ｎａｎｏｇ ＧＦＰ＃４、Ｌ〜Ｏ：＃６）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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