(57)【要約】ＧＬＰ−１化合物に結合された、グルカゴンに結合する抗体を含む組成物、ならびに被験体において、例えば、代謝障害を処置するため、インスリン発現を増強するため、およびインスリン分泌を促進するために該組成物を使用する方法が提供される。このような方法は、例えば、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、種々の脂質障害、肥満症、心血管疾患および骨障害を処置するために用いられ得る。いくつかの組成物では、抗体は、（ｉ）重鎖可変領域、および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、ＧＬＰ−１化合物は該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）グルカゴンに結合する抗体と、
（ｂ）グルカゴンに結合する該抗体に結合したＧＬＰ−１化合物と
を含み、該ＧＬＰ−１化合物がＧＬＰ−１活性を有する、組成物。
【請求項２】
前記抗体が中和抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）前記抗体が、（ｉ）重鎖可変領域および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、
（ｂ）前記ＧＬＰ−１化合物が、該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−１化合物が前記軽鎖可変領域に結合される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、前記軽鎖可変領域のアミノ末端に結合される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＧＬＰ−１化合物と前記軽鎖可変領域とがリンカーによって結合される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１化合物が前記重鎖可変領域に結合される、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、前記重鎖可変領域のアミノ末端に結合される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＧＬＰ−１化合物と前記重鎖可変領域とがリンカーによって結合される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが化学的結合体化により結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが合成リンカーを介して結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とがペプチドリンカーを介して結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが融合タンパク質を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体が複数のＧＬＰ−１化合物に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が多数の異なるＧＬＰ−１化合物に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン３またはエキセンジン４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＧＬＰ−１化合物が、エキセンジン−３またはエキセンジン−４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＧＬＰ−１化合物が、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
（式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略される）
を含むＧＬＰ−１ペプチドを含み、該化合物が、ＧＬＰ−１活性を有する、請求項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体が：
（ａ）配列番号７９と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；あるいは
（ｂ）配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；あるいは
（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨ
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗体が、配列番号７９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬおよび配列番号８３と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗体が、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＶＬおよび配列番号８３のアミノ酸配列を有するＶＨを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体が：
（ａ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｂ）配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖；あるいは
（ｃ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗体が二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖からなる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または（Ｆａｂ’）２である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【請求項３５】
ＧＬＰ−１ペプチドに結合されたグルカゴン結合抗体軽鎖可変領域を含む、ポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号４１〜７４または１２９の任意のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
請求項３６に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。
【請求項３８】
ＧＬＰ−１化合物に結合されたグルカゴン結合抗体重鎖可変領域を含む、ポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。
【請求項４１】
医薬的に許容可能な担体ならびに有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
代謝障害を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の請求項４１に記載の医薬組成物を該被験体に投与する工程を含み、該代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、方法。
【請求項４３】
被験体においてインスリンの発現を増強するための方法であって、有効量の請求項４１に記載の医薬組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項４４】
被験体においてインスリン分泌を促進するための方法であって、有効量の請求項４１に記載の医薬組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項４５】
代謝障害を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を該被験体に投与する工程を含み、該代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、方法。
【請求項４６】
被験体においてインスリンの発現を増強するための方法であって、有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項４７】
被験体においてインスリン分泌を促進するための方法であって、有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願６０／７９３，６９０号（２００６年４月２０日出願）（これは、全ての目的のためにその全体が本明細書に参考として援用される）に基づく利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）および関連ペプチドグルカゴンは、プログルカゴンの分化プロセシングにより産生され、相反する生物活性を有する。プログルカゴン自体は、膵臓のα細胞ならびに主に遠位小腸および結腸に位置する腸内分泌Ｌ細胞において産生される。膵臓ではグルカゴンはプログルカゴンから選択的に切断される。腸では対照的に、プログルカゴンはプロセシングされてＧＬＰ−１およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）を形成し、これらはそれぞれ、プログルカゴンのアミノ酸残基７８〜１０７および１２６〜１５８に対応する（例えば、非特許文献１ならびに非特許文献２を参照）。従来、ＧＬＰ−１のアミノ酸の番号付けは、プログルカゴンの切断から形成されるＧＬＰ−１（１−３７）に基づいている。生物学的活性型はこのペプチドの更なるプロセシングから生成され、これは、１つの番号付け表記ではＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨおよびＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２を生成する。ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨ（または単にＧＬＰ−１（７−３７））およびＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２は同じ活性を有する。便宜上、「ＧＬＰ−１」という用語はこれらの両形態を指すために用いられる。この番号付け表記では、これらのプロセシングされたペプチドの最初のアミノ酸はＨｉｓ７である。しかし、当該分野で認識されている別の番号付け表記では、プロセシングされたペプチドの番号付けが位置７ではなく位置１としてＨｉｓから開始すると想定している。従って、この番号付けスキームでは、ＧＬＰ−１（１−３１）はＧＬＰ−１（７−３７）と同じであり、ＧＬＰ−１（１−３０）はＧＬＰ−１（７−３６）と同じである。
【０００３】
グルカゴンは低血糖に応答して膵臓のα細胞から分泌され、グルカゴンの主要な標的器官は肝臓である。グルカゴンはグリコーゲンの分解を刺激し、グリコーゲンの生合成を抑制する。また、グルカゴンは脂肪酸の合成を抑制するが、グルコース新生を促進する。これらの作用の最終結果は、肝臓へのグルコースの放出を大いに増大させることになる。対照的に、ＧＬＰ−１はグルカゴン分泌を低下させると同時に、腸による栄養素の吸収に応答してインスリン分泌、グルコース取込およびサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成を刺激する。様々な臨床データがこれらの活性のエビデンスを提供している。例えば、管理不良の２型糖尿病患者へのＧＬＰ投与は、空腹時血中グルコース濃度を正常化した（例えば、非特許文献３を参照）。
【０００４】
ＧＬＰ−１は他の多くの重要な活性を有する。例えば、ＧＬＰ−１は胃運動および胃液分泌も抑制する（例えば、非特許文献４を参照）。この作用は、時として、回腸ブレーキ作用と称され、栄養素の可用性の遅滞期をもたらし、従って、迅速なインスリン応答の必要性を大いに低減する。
【０００５】
ＧＬＰ−１が細胞の分化および複製を促進することもでき、これは次に、膵島細胞の保持およびβ細胞量の増加に役立つことが諸研究により示されている（例えば、非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８を参照）。ＧＬＰ−１が満腹感を高め、食物摂取を減少させることができるということもエビデンスが示している（例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１を参照）。
【０００６】
他の研究では、ＧＬＰ−１がＧＬＵＴ−１トランスポーター、インスリン受容体およびヘキソキナーゼ−１を含むβ細胞特異的遺伝子を誘導することを示している（例えば、非特許文献１２を参照）。このような誘導は加齢に関連する耐糖能障害を食い止め得る。
【０００７】
ＧＬＰ−１は代謝恒常性の調節に重要な役割を果たすので、糖尿病、肥満症および代謝症候群を含む様々な代謝障害を処置するための魅力的な標的である。現行の糖尿病の処置はインスリン注射およびスルホニル尿素の投与を含む。しかし、両手法は重要な欠点を有する。例えば、インスリン注射は複雑な投与留意点を要し、スルホニル尿素による処置は経時的に効果を失うことが多い。ＧＬＰ−１療法の潜在的利点は、１）インスリン分泌が高血糖に依存するので、安全性の向上、２）グルカゴン分泌の抑制とそれに続く過剰のグルコース排出の抑制、ならびに３）胃排出の緩徐化とそれに続く栄養素吸収の緩徐化および突発的なグルコース増加の防止を含む。
【０００８】
しかし、ＧＬＰ−１による有効な処置の主要な障害は、ペプチドの非常に短い半減期であり、通常、これはわずか数分である（例えば、非特許文献１３を参照）。分子の半減期を延ばすことを目的に様々な類似体が開発されてきた。しかし、これらの一部は嘔吐および悪心を含む重大な消化管副作用を有する（例えば、非特許文献１４を参照）。
【非特許文献１】ＩｒｗｉｎおよびＷｏｎｇ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：２６７−２７７
【非特許文献２】Ｂｅｌｌら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：３６８−３７１
【非特許文献３】Ｇｕｔｎｉａｋら、１９９２，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１３１６−１３２２
【非特許文献４】Ｔｏｌｅｓｓａ，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：７６４−７７４
【非特許文献５】Ａｎｄｒｅａｓｅｎら、１９９４，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ５５：２２１−２２８
【非特許文献６】Ｗａｎｇら、１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８８３−２８８９
【非特許文献７】Ｍｏｊｓｏｖ，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．４０：３３３−３４３
【非特許文献８】Ｘｕら、１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：２２７０−２２７６
【非特許文献９】Ｔｏｆｔ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２：１１３７−１１４３
【非特許文献１０】Ｆｌｉｎｔら、１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：５１５−５２０
【非特許文献１１】Ｇｕｔｓｗｉｌｌｅｒら、１９９９  Ｇｕｔ  ４４：８１−８６
【非特許文献１２】ＰｅｒｆｅｔｔｉおよびＭｅｒｋｅｌ，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３：７１７−７２５
【非特許文献１３】Ｈｏｌｓｔ，１９９４，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０７：１８４８−１８５５
【非特許文献１４】Ａｇｅｒｓｏら、２００２，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４５：１９５−２０２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、糖尿病、肥満症および代謝症候群のような様々な代謝疾患の処置に用いる、ＧＬＰ−１型活性を有する改良された分子の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
ＧＬＰ−１化合物に結合した抗グルカゴン抗体を含む組成物が提供される。いくつかの組成物では、抗体はヒトグルカゴンに特異的に結合する。有効量の組成物を投与することによって種々の疾患を処置するための方法も提供される。このような方法は、例えば、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、種々の脂質障害、肥満症、心血管疾患および骨障害を処置するために用いられ得る。
【００１１】
例えば、いくつかの組成物は、グルカゴンに結合する抗体およびグルカゴンに結合する抗体に結合したＧＬＰ−１化合物を含み、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。いくつかの組成物では、抗体は、（ｉ）重鎖可変領域、および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、ＧＬＰ−１化合物は該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される。いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端は軽鎖可変領域のアミノ末端に結合し、かつ／あるいはＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端は重鎖可変領域のアミノ末端に結合される。
【００１２】
様々なＧＬＰ−１化合物が抗グルカゴン抗体に結合され得る。一態様では、本明細書で提供される組成物中のＧＬＰ−１化合物は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを含む。
【００１３】
特定の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
を含み、式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａはＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａはＧｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａはＧｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略され、化合物はＧＬＰ−１活性を有する。
【００１４】
従って、いくつかの組成物中のＧＬＰ−１化合物は、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの組成物では、本明細書で提供される組成物の一部である抗体は：
（ａ）（ｉ）配列番号７６と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号７７と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号７８と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ；
（ｂ）（ｉ）配列番号８４と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８５と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号８６と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）（ａ）の１つ以上のＬＣ  ＣＤＲならびに（ｂ）の１つ以上のＨＣ  ＣＤＲ；
を含む。抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含み得る。
【００１６】
特定の組成物では、組成物の一部である抗体は：
（ａ）（ｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上のＬＣ  ＣＤＲ；
（ｂ）（ｉ）配列番号８４に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８５に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上のＨＣ  ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）（ａ）の１つ以上のＬＣ  ＣＤＲならびに（ｂ）の１つ以上のＨＣ  ＣＤＲ
を含む抗体を含む。抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含み得る。
【００１７】
いくつかの例では、組成物の抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ３および／または配列番号８６のアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ３を含む。他の組成物では、抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから少なくとも２または３つのＣＤＲを含み得る。
【００１８】
特定の組成物は、（ａ）配列番号７９と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ｂ）配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；または（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨを含む抗体を含む。このような組成物中の抗体は２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなり得る。
【００１９】
いくつかの組成物では、抗体は、（ａ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖；（ｂ）配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖；または（ｃ）配列番号４１〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ならびに配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２０】
ＧＬＰ−１類似体に結合したグルカゴン結合抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドも本明細書で提供される。特定のこのようなポリペプチドは配列番号４１〜７４の任意のアミノ酸配列を有する。本発明は、更に、配列番号４１〜７４の任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を提供する。
【００２１】
本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドに結合したグルカゴン結合抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドも提供する。特定の態様では、ポリペプチドは配列番号８３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。特定のこのような融合タンパク質では、ＧＬＰ−１化合物は配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７を含む。
【００２２】
医薬的に許容可能な担体および本明細書で提供される有効量の組成物を含む医薬組成物も提供される。例えば、種々の代謝障害を含む種々の疾患を有する被験体を処置するための方法も開示される。通常、このような方法は、本明細書で提供される有効量の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。処置可能な代謝疾患の具体例には、限定的でないが、糖尿病、肥満症および代謝症候群が含まれる。被験体においてインスリンの発現を増強するための方法、インスリンの分泌を促進するための方法も提供され、該方法は、本明細書で提供される有効量の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００２３】
更に、本発明は、グルカゴンに結合する抗体およびこれに結合したＧＬＰ−１化合物を含む有効量の組成物を被験体に投与することにより被験体を処置するための方法を提供し、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。このような組成物により処置可能な疾患には、上記一覧の疾患が含まれる。被験体においてインスリンの発現を増強するための方法、インスリンの分泌を促進するための方法についても本明細書で述べられ、該方法は、グルカゴンに結合する抗体；およびこれに結合したＧＬＰ−１化合物を含む有効量の組成物を被験体に投与する工程を含み、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。
【００２４】
特定の好ましい実施形態の以下の更に詳細な説明および特許請求の範囲から、具体的な実施形態が明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（詳細な説明）
本明細書で用いられる項目の見出しは単に構成を目的とするものであって、述べられる主題を限定すると捉えるべきではない。本願において引用される文献はすべて、任意の目的のために参考として本明細書に明示的に援用される。
Ｉ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別様に指示しない限り、複数形の参照を含む。
【００２６】
別様に明示しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味を有する。以下の文献は本発明において用いられる多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒら、１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ  ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００２７】
本明細書で用いられるように、以下の用語は、別様に特記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００２８】
「インスリン向性活性」は、グルコース依存的にインスリンの合成、放出または分泌を増大させる能力を指す。インスリン向性作用は、インスリン陽性細胞数の増加および／または所定の期間における既存のインスリン陽性細胞から合成もしくは放出されるインスリンの量の増加に起因することを含むがこれに限定されない、多くの異なる機構のいずれかから生じ得る。インスリン向性活性は当該分野で公知の方法、例えば、ＧＬＰ−１受容体の結合活性または受容体活性化を測定するインビボ試験およびインビトロ試験（例えば、欧州特許第６１９，３２２号および米国特許第５，１２０，７１２号において述べられているような膵島細胞またはインスリノーマ細胞を用いたアッセイならびに本明細書で述べられるようなアッセイ）を用いてアッセイすることができる。ヒトでは、インスリン向性活性はインスリン濃度またはＣペプチド濃度を検査することにより測定することができる。
【００２９】
本明細書で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）典型的には天然状態で共に見出される他のタンパク質の少なくとも一部を含まないか、（２）同一供給源、例えば、同一種由来の他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異種由来の細胞により発現されるか、（４）天然状態で会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の少なくとも５０％から分離されるか、（５）天然状態で「単離されたタンパク質」が会合するタンパク質の一部と（共有結合的または非共有結合的相互作用により）会合しないか、（６）天然状態で会合しないポリペプチドと（共有結合的または非共有結合的相互作用により）作動可能に会合するか、あるいは（７）天然で生じないということを意味する。このような単離されたタンパク質は、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡあるいはそれらの任意の組合せにコードされ得る。単離されたタンパク質は、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）を妨げ得るその天然環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。
【００３０】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に用いられ、ペプチド結合により結合したアミノ酸の分子鎖を含む。該用語は生成物の特定の長さには言及しない。従って、ポリペプチドの定義内には「ペプチド」および「オリゴペプチド」が含まれる。該用語はポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、ポリペプチドの意味内にはタンパク質断片、類似体、変異したタンパク質または改変体タンパク質、融合タンパク質などが含まれる。
【００３１】
「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失あるいは天然に存在するポリペプチドまたは組換えで産生されたポリペプチドの置換を有する、モノマーまたはマルチマーとなり得るポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチド断片は少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。特定の実施形態では、断片は少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸長であることが理解されるであろう。特に有用なポリペプチド断片は結合ドメインを含む機能ドメイン含む。本明細書で提供されるような抗体の場合、有用な断片は、限定的でないが、ＣＤＲ領域、特に、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域；重鎖または軽鎖の可変ドメイン；２つのＣＤＲを含む抗体鎖の一部またはちょうどその可変領域などを含む。
【００３２】
本明細書で用いられるような「抗体」または「抗体ペプチド」という用語は、抗原に特異的に結合することができ、抗原の生物学的活性を阻害あるいは調節することができ得る、１つ以上のポリペプチド鎖を含むモノマータンパク質またはマルチマータンパク質を指す。従って、本明細書で用いられる場合、その用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンまたは標的抗原への特異的結合でインタクトな抗体と競合し得るその断片を含み、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および二重特異性抗体を含む。一般に、インタクトな抗体は少なくとも二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含むが、いくつかの例では、重鎖のみを含む場合があり、ラクダにおいて天然に生じる抗体などのより少ない鎖を含み得る。抗体は単一供給源のみに由来しても、「キメラ」（即ち、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来し得る）であってもよい。例えば、ＣＤＲ領域はラットまたはマウスの供給源に由来し得、一方、Ｖ領域のフレームワーク領域はヒトなどの異なる供給源に由来する。本明細書で述べるような抗体または結合断片は、組換えＤＮＡ法またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により、ハイブリドーマにて生成され得る。別様に示さない限り、「抗体」という用語は、二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含む抗体に加え、それらの誘導体、改変体、断片および突然変異タンパク質を含み、それらの例は以下に述べられる。従って、該用語は、抗原（例えば、グルカゴン）に特異的に結合可能な軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のすべてまたは一部を含むポリペプチドを含む。従って、抗体という用語は免疫学的に機能性の断片を含み、例えば、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片を含む。
【００３３】
「軽鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長軽鎖およびその断片を含む。完全長軽鎖は可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽鎖はκ鎖およびλ鎖を含む。
【００３４】
「重鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長重鎖およびその断片を含む。完全長重鎖は可変領域ドメインＶＨならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨドメインはカルボキシル末端に位置し、ＣＨ３が−ＣＯＯＨ端に最も近い。本発明による重鎖は任意のアイソタイプのものでよく、ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプおよびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む。
【００３５】
本明細書で用いられるような免疫グロブリン鎖の「免疫学的に機能性の断片」（または単に「断片」）という用語は、完全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが、抗原に特異的に結合することが可能な抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。このような断片は標的抗原に特異的に結合するという点において生物学的に活性であり、所定のエピトープへの特異的結合でインタクトな抗体と競合し得る。本発明の一態様では、このような断片は、完全長軽鎖または完全長重鎖に存在するＣＤＲを少なくとも１つ保持し、一部の実施形態では、単一の重鎖および／または軽鎖あるいはそれらの一部分を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ法により生成され得、あるいはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断により生成され得る。本発明の免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片は、限定的でないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖドメイン抗体および単鎖抗体を含み、限定的でないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダまたはウサギを含む任意の哺乳動物供給源から得られ得る。二機能性の治療特性を有するか、あるいは血清半減期の延長を有する体内の特定の標的に対する治療剤を作製するために、本発明の抗体の機能性部分、例えば、１つ以上のＣＤＲが第２のタンパク質または小分子に共有結合され得ることが更に検討される。
【００３６】
「Ｆａｂ断片」は、一本の軽鎖ならびに一本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００３７】
「Ｆａｂ断片」は、軽鎖と重鎖との間に鎖間ジスルフィド結合が形成できるように、一本の軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む一本の重鎖の一部分を含む。
【００３８】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、二本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、二本の軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に定常領域の一部分を有する二本の重鎖を含む。従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、二本の重鎖間のジスルフィド結合により共に保持された２つのＦａｂ断片からなる。
【００３９】
「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【００４０】
「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が可撓性リンカーによって結合されて単一ポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子であり、単一ポリペプチド鎖は抗原結合領域を形成する。単鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号において詳細に考察されており、これらの開示内容は参考として援用される。
【００４１】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合し、二価ドメイン抗体を生成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同じかあるいは異なる抗原を標的とし得る。
【００４２】
「二価抗体」は２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例では、２つの結合部位は同一の抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性でもよい（下記参照）。
【００４３】
「多重特異性抗体」は２つ以上の抗原またはエピトープを標的とする抗体である。
【００４４】
「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は多重特異性抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含むがこれらに限定されない種々の方法により生成され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二重特異性抗体の２つの結合部位は、これらは同じかあるいは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【００４５】
「抗原」という用語は、抗体のような選択的結合因子により結合可能であり、さらに、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を生成するために動物において用いることが可能な分子または分子の一部分を指す。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４６】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能な任意の決定基、好ましくは、ポリペプチド決定基を含む。エピトープは抗体により結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基群（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。特定の実施形態では、抗体がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識する際、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。平衡解離定数が１０−７Ｍ以下または１０−８Ｍ以下である場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。一部の実施形態では、平衡解離定数は１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下であり得る。
【００４７】
本明細書で用いられ、対象に適用されるような「天然に存在する」という用語は、対象が天然で見出され得るという事実を指す。例えば、天然供給源から単離され得るとともにヒトによって意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００４８】
本明細書で言及されるような「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長の一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾は、ブロモウリジン（ｂｒｏｍｕｒｉｄｉｎｅ）などの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾を含む。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には一本鎖形状および二本鎖形状のＤＮＡを含む。
【００４９】
本明細書で用いられるような「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源またはそれらの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源により、単離ポリヌクレオチドは、（１）単離ポリヌクレオチドが天然で見出されるポリヌクレオチドの全体または一部と会合せず、（２）天然状態で結合していないポリヌクレオチドに結合し、あるいは（３）より大きい配列の一部として天然で生じない。
【００５０】
本明細書で言及されるような「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然または非天然オリゴヌクレオチド結合により共に結合した天然または修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、通常は一本鎖のメンバーを含むポリヌクレオチドのサブセットであり、２００塩基またはそれ以下の長さを有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、例えば、遺伝子改変体の構築に用いられる。本明細書で提供されるようなオリゴヌクレオチドは、タンパク質コード配列に関してセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００５１】
別記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’→３’付加の方向は転写方向と称され；ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称され；ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称される。
【００５２】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に伝達するのに用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すのに用いられる。
【００５３】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に好適であるとともに、挿入異種核酸配列の発現を誘導および／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現には、限定されないが、転写、翻訳およびイントロンが存在する場合のＲＮＡスプライシングなどのプロセスが含まれる。
【００５４】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列を導入されるか、あるいは導入可能であって、更に、対象選択遺伝子を発現させ、あるいは発現可能な細胞を指すのに用いられる。該用語は親細胞の子孫を含み、選択遺伝子が存在する限り、該子孫が形態または遺伝子構造において元の親と同一であることを問わない。
【００５５】
当該分野で公知のような「同一性」という用語は、それらの配列を比較することにより求められるような、２つもしくはそれ以上のポリペプチド分子または２つもしくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当該分野では、「同一性」は、場合により、２つもしくはそれ以上のヌクレオチドまたは２つもしくはそれ以上のアミノ酸配列のストリング間のマッチにより求められるような、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連度も意味する。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（即ち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアラインメント（存在する場合）により、２つ以上の配列のより小さい配列間の同一マッチのパーセントを測定する。
【００５６】
「類似性」という用語は、関連する概念に関して当該分野で用いられるが、「同一性」と対照的に、「類似性」は同一マッチおよび保存的置換マッチを含む関連性の尺度を指す。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一アミノ酸を有し、他がすべて非保存的置換である場合、同一性パーセントおよび類似性は共に５０％であろう。同じ例において、保存的置換が存在する更に５つの位置がある場合、同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）であろう。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、それら２つのポリペプチド間の同一性パーセントより高くなる。
【００５７】
関連する核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法により容易に計算することができる。このような方法は、限定的でないが、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．  Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，Ｐａｒｔ  １，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３；およびＤｕｒｂｉｎら、１９９８，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに述べられている方法が含まれる。
【００５８】
同一性を定量する好ましい方法は、被験配列間の最大マッチを付与するように設計される。同一性を定量する方法は公共的に利用可能なコンピュータプログラムに示されている。２配列間の同一性を定量する好ましいコンピュータプログラム法には、限定的でないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７を含むＧＣＧプログラムパッケージ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０）が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，上記参照）から公共的に利用可能である。同一性を定量するのに周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも用いられ得る。
【００５９】
２つのアミノ酸またはポリヌクレオチド配列をアラインメントするための特定のアラインメントスキームは、２配列の短い領域のマッチングをもたらすことでき、この小さいアラインメント領域は、その２つの全長配列間に有意な関連がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、特定の実施形態では、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）は標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸にわたるアラインメントをもたらす。一部の実施形態では、アラインメントは標的ポリペプチドの少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のアミノ酸を含み得る。ＧＡＰを用いてポリヌクレオチドがアラインメントされると、アラインメントは少なくとも約１００、１５０または２００個の隣接可能なヌクレオチドにわたり得る。
【００６０】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントが定量される２つのポリペプチドは、それらのそれぞれのアミノ酸の至適マッチングのためにアラインメントされる（アルゴリズムにより求められるような「マッチ範囲」）。特定の実施形態では、ギャップ開始ペナルティ（平均対角の３倍として計算され；「平均対角」は使用される比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」は特定の比較マトリックスによって各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、キャップ開始ペナルティの１／１０である）ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスが、アルゴリズムと共に用いられる。特定の実施形態では、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９を参照）もアルゴリズムにより用いられる。
【００６１】
特定の実施形態では、ポリペプチド配列比較のためのパラメータは以下を含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、上記参照、からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用であり得る。ヌクレオチド配列では、パラメータはギャップペナルティ５０および各ギャップにおける各シンボルに対するペナルティ３であるギャップ長ペナルティ３を含み得る。特定の実施形態では、前記パラメータはＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（エンドギャップに対してはペナルティがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００６２】
本明細書で用いられるように、従来の２０個のアミノ酸ならびにそれらの一文字および三文字略記は従来の使用法を踏襲する。例えば、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−Ａ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９１を参照されたい。同文献は目的に応じて参考として本明細書に援用される。従来の２０個のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）；α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来型アミノ酸も、本明細書で提供されるようなポリペプチドに好適な構成要素であり得る。非従来型アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニンならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で用いられるポリペプチドの表記では、標準的な使用法および慣習に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシル末端方向である。ＧＬＰ−１化合物に関して用いられる際の「下流」という用語は、言及される位置に対してポリペプチドのカルボキシル末端方向、即ち、言及される位置の右側に所在する位置を意味する。ＧＬＰ−１化合物に関して用いられる際の「上流」という用語は、言及される位置に対してポリペプチドのアミノ末端方向、即ち、言及される位置の左側に所在する位置を意味する。推奨ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓが、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４，２１９，３４５−３７３；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，９−３７；１９８５，１５２，１；１９９３，２１３，２；Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，１９８４，２４，ｐ８４以降；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，１４−４２；Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，５６，５９５−６２４；Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９８５，１６，３８７−４１０；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２，ｐａｇｅｓ  ３９−６９において公表されている。
【００６３】
本発明による抗体の結合および中和を評価するにあたり、抗体は特異的に結合し、かつ／あるいはグルカゴンのその受容体への結合を実質的に阻害し、かつ／あるいはグルカゴン受容体の活性化を防止し、その際、過剰の抗体はグルカゴンにより結合され、あるいは活性化される受容体の量を、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上減少させる（それぞれ、インビトロ競合結合アッセイまたはインビトロ機能アッセイにて測定されるように）。特異的結合抗体は、１０−８モル以下のグルカゴンに結合するための平衡解離定数、至適には１０−９または１０−１０モル以下を有することが見込まれ得る。
【００６４】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書で化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子または生体物質で作られる抽出物を示すのに用いられる。
【００６５】
本明細書で用いられるように、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射線標識アミノ酸の組込みによる検出可能なマーカーの組込みまたは蛍光マーカー、化学発光マーカーもしくは検出可能な活性を有する酵素のポリペプチドもしくは核酸への付着または標識アビジン（例えば、好ましくは、蛍光マーカー、化学発光マーカーなどの検出可能なマーカーまたは、特に、光学的方法もしくは比色法により検出可能な酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出可能なビオチン部分のポリペプチドへの付着を指す。特定の実施形態では、標識は治療的であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当該分野で公知であり、本明細書で開示される方法において有利に用いられ得る。ポリペプチド用の標識の例には、限定されないが、以下のものが含まれる：放射性同位元素もしくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、即ち、ＦＩＴＣ、ローダミンまたはランタニド系蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチニル基などのハプテン標識および二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメインまたはエピトープタグ）。特定の実施形態では、標識は立体障害の可能性を低減するため、種々の長さのスペーサーアーム（例えば、（ＣＨ２）ｎ、ｎ＜約２０）によって付着される。
【００６６】
本明細書で用いられるような「生物学的サンプル」という用語は、限定されないが、生物または過去に生きていた生物由来の任意の量の物質を含む。このような生物には、限定されないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギおよび他の動物が含まれる。このような物質には、限定されないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節および皮膚が含まれる。
【００６７】
本明細書で用いられるような「医薬製剤または薬物」という用語は、患者に適切に投与されると、所望の治療効果を誘導することが可能な化学化合物または組成物を指す。
ＩＩ．概要
ＧＬＰ−１化合物に結合した抗グルカゴン抗体（即ち、グルカゴンに結合する抗体）を含む組成物が本明細書で提供される。通常、抗体はグルカゴンがグルカゴン受容体を活性化することができないように、グルカゴンに結合するのみならず、グルカゴンを中和もする。通常、組成物の抗体はヒトグルカゴンに結合し、重鎖可変領域または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含む。特定の組成物を用いた結果は、組成物の抗体が、グルカゴンに結合することができ、一方で、これらの２つの実体を結合しているにもかかわらず、ＧＬＰ−１が依然としてＧＬＰ−１受容体に結合することができるということを示す。従って、このような組成物は二重活性を有する。ＧＬＰ−１化合物に融合したグルカゴン抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドも提供され、これは、任意で１つもしくはそれ以上の他の軽鎖または重鎖またはそれらの断片と組み合わせて抗体を形成することができる。
【００６８】
組成物の抗体は、免疫学的に機能性の断片を含むキメラ抗体、ヒト化抗体またはインタクトなヒト抗体であってよい。抗体抗原結合部位の免疫結合特性を示すことが可能なポリペプチドも本明細書で開示される。抗グルカゴン抗体に結合されるＧＬＰ−１化合物は、天然ＧＬＰ−１、当該分野で公知の任意のＧＬＰ−１類似体または天然ＧＬＰ−１の活性を有する、本明細書で開示されるＧＬＰ−１類似体の１つであってよい。いくつかの組成物では、抗グルカゴン抗体およびＧＬＰ−１化合物は、２つの分子が直接あるいはペプチドリンカーを介して結合した融合タンパク質の一部である。他の組成物では、抗体およびＧＬＰ−１化合物は融合タンパク質の一部ではなく、その代わりに非ペプチドリンカーを介して結合される。抗体およびポリペプチドをコードする核酸ならびにこれらの核酸を用いて抗体を発現させる方法も開示される。
【００６９】
以下に更に詳細に述べられるように、提供されるＧＬＰ−１化合物は種々の疾患を処置するため、治療的または予防的に投与され得る。化合物により処置され得る疾患例には、限定的でないが、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、高血糖、代謝症候群、種々の脂質障害、肥満症、冠動脈疾患、骨障害および過敏性腸症候群が含まれる。
ＩＩＩ．ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物およびポリペプチド
一般に、提供される組成物は、グルカゴンに結合する抗体ならびに該抗体に結合した１つ以上のＧＬＰ−１化合物を含む。抗グルカゴン抗体とＧＬＰ−１化合物との関係を説明するのに用いられる際、「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、各分子が少なくとも１つのその天然活性を依然として保持しながら（例えば、該抗体はグルカゴンに結合する能力を維持し、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を維持する）、２分子が結合することを意味する。抗体はいくつかの組成物では完全ヒト抗体である。通常、抗体はグルカゴンに結合するとともにグルカゴン受容体を活性化するその能力を阻害することができる（例えば、本明細書で述べるようなインビトロまたはインビボアッセイにおいて）中和抗体である。２つ以上のＧＬＰ−１化合物が抗体に結合され得、これらは同一かあるいは異なっていてよい。抗体および化合物はリンカーを介して結合してもしなくてもよい。従って、例えば、ＧＬＰ−１化合物および抗体は、リンカーを用いずに、分子中に天然に存在するか、あるいは導入される反応基を介して化学的に結合され得る。他の例では、化合物および抗体は、直接あるいはペプチドリンカーを介し、融合タンパク質の一部として融合される。他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物と抗体とを結合するのにペプチドまたは合成リンカーが用いられる。抗体とＧＬＰ−１化合物とを結合するための選択肢に関する更なる詳細が以下に挙げられる。化合物は抗体のＮ末端もしくはＣ末端または両末端に結合され得る。
【００７０】
特定の実施形態では、ＧＬＰ−１化合物は、グルカゴンに結合する抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域に結合される。従って、特定の実施形態では、抗体の軽鎖および重鎖の両鎖がＧＬＰ−１に結合される。異なる鎖に結合される化合物は同一かあるいは異なってよい。
【００７１】
提供されるいくつかの組成物の抗体は、少なくとも１０４または１０５／Ｍ×秒のグルカゴンに対する結合親和性（Ｋａ）を有する。他の抗体は少なくとも１０６、１０７、１０８または１０９／Ｍ×秒のｋａを有する。提供される特定の抗体は低い解離速度を有する。一部の抗体は、例えば、１×１０−４ｓ−１、１×１０−５ｓ−１またはそれ以下のＫｏｆｆを有する。
【００７２】
いくつかの組成物における抗体はインビトロまたはインビボにて少なくとも１日の半減期を有する（例えば、ヒトを被験体として投与した場合）。特定の組成物における抗体は少なくとも２または３日の半減期を有する。別の実施形態では、抗体は４日またはそれ以上の半減期を有する。更に別の抗体は７日または８日またはそれ以上の半減期を有する。別の実施形態では、非誘導体化または非修飾抗体と比べて長い半減期を有するように、抗体またはその抗原結合部は誘導体化または修飾される。
【００７３】
任意で１つ以上のＧＬＰ−１化合物に融合したグルカゴン結合部位を含むポリペプチドも提供される。
【００７４】
特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／抗体組成物は、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体、少なくとも１つのリンカーおよび少なくとも１つのＧＬＰ−１化合物を含む。例示的なリンカーには、限定的でないが、ペプチドリンカー、アルキルリンカー、ＰＥＧリンカーおよび２つのポリペプチドを結合するのに用いられる化学的または酵素的プロセスから生じるリンカーが含まれる。いくつかの組成物では、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体は、二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含む。他の組成物では、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体は、少なくとも１つの切断型重鎖および／または少なくとも１つの切断型軽鎖を含む。従って、例えば、特定の組成物では、抗体はグルカゴンに結合する能力を保持する断片である。特定の例示的な抗体断片には、限定的でないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が含まれる。
【００７５】
いくつかの組成物におけるＧＬＰ−１化合物のＣ末端は、抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端に結合され、一方、他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物のＮ末端が軽鎖および／または重鎖のＣ末端に結合される。いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物はそのＮまたはＣ末端を介して別の分子にそのＮまたはＣ末端を介して結合される。
【００７６】
一部のＧＬＰ−１／抗体組成物は１つの抗グルカゴン抗体および１つのＧＬＰ−１化合物を含む。他の組成物は１つの抗体および２つの化合物を含む。更に他の組成物は１つの抗体および３つ以上のＧＬＰ−１化合物を含む。特定の組成物は２つ以上の抗体および１つのＧＬＰ−１化合物を含む。他の組成物は２つ以上の抗体および２つ以上の化合物を含む。
【００７７】
特定の組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に結合され、第１の化合物と同じかあるいは異なるアミノ酸配列を有する第２のＧＬＰ−１化合物は、抗体の軽鎖に結合される。この種のいくつかの組成物における抗体および化合物はリンカーを介して結合される。
【００７８】
他の組成物では、少なくとも１つのＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に融合される。更に他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の軽鎖に融合される。いくつかの組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に融合され、第１の化合物と同じかあるいは異なるアミノ酸配列を有する第２のＧＬＰ−１化合物は、抗体の軽鎖に融合される。特定の実施形態では、抗グルカゴン抗体の重鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つのＧＬＰ−１化合物に融合される。特定の実施形態では、抗体の軽鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つのＧＬＰ−１化合物に融合される。特定の実施形態では、抗体の重鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つの第１のＧＬＰ−１化合物に融合され、抗体の軽鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つの第２のＧＬＰ−１化合物に融合される。
【００７９】
特定の組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり２つのＧＬＰ−１化合物の比率を有する。従って、一部の実施形態では、組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物および抗体の第２の重鎖に結合した第２のＧＬＰ−１化合物を含む。特定の実施形態では、このような組成物は、グルカゴン抗体の第１の軽鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物および抗体の第２の軽鎖に結合した第２のＧＬＰ−１化合物を含む。１つのグルカゴン抗体当たり２つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む他の組成物は、当業者には明らかであろう。
【００８０】
いくつかの組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり４つのＧＬＰ−１化合物を含む。従って、一部の実施形態では、組成物は、グルカゴン抗体の第１の重鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第２の重鎖に結合した第２の化合物、抗体の第１の軽鎖に結合した第３の化合物および抗体の第２の軽鎖に結合した第４の化合物を含む。特定の組成物では、このような組成物は、グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第１の重鎖のＣ末端に結合した第２の化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３の化合物および抗体の第２の重鎖のＣ末端に結合した第４の化合物を含む。他の組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物および第２のＧＬＰ−１化合物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合し、第３のＧＬＰ−１化合物および第４のＧＬＰ−１化合物は、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合する。１つの抗グルカゴン抗体当たり４つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む更なる組成物を当業者が設計できるように、他の様々な組成物も本明細書に含まれる。
【００８１】
更に他の組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり８つのＧＬＰ−１化合物を含む。例えば、いくつかの組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第１の重鎖のＣ末端に結合した第２の化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３の化合物、抗体の第２の重鎖のＣ末端に結合した第４の化合物、抗体の第１の軽鎖のＮ末端に結合した第５の化合物、抗体の第１の軽鎖のＣ末端に結合した第６の化合物、抗体の第２の軽鎖のＮ末端に結合した第７の化合物および抗体の第２の軽鎖のＣ末端に結合した第８の化合物を含む。他の組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１および第２のＧＬＰ−１化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３および第４の化合物、抗体の第１の軽鎖のＮ末端に結合した第５および第６の化合物ならびに抗体の第２の軽鎖のＮ末端に結合した第７および第８の化合物を含む。１つの抗グルカゴン抗体当たり８つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む更なるＧＬＰ−１／抗体組成物を当業者が設計できるように、同様の比率を含む他の更なる組合せが含まれる。
Ａ．抗体
組成物の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはインタクトなヒト抗体ならびにこのような抗体の免疫学的に機能性の断片（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、ドメイン抗体または免疫接着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ））であってよい。組成物はグルカゴンに結合する能力を有するポリペプチド（例えば、抗体抗原結合部位を含むポリペプチド）も含み得る。
【００８２】
提供されるいくつかの組成物において有用な、グルカゴンに結合する１つの例示的な抗体は、ＡＧ１５９と称される。この抗体はインタクトなヒト抗体である。完全長軽鎖および重鎖配列、軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列ならびに軽鎖および重鎖ＣＤＲが、以下の表１および２に示される。当業者は本明細書で述べられる方法および手法を用いて、グルカゴンに結合する更なる抗体を作製し、同定することができる。例えば、例示的なグルカゴン抗体およびそれらを作製する方法が米国特許第５，７７０，４４５号に述べられている。
１．例示的な天然抗体
いくつかの組成物は天然抗体と典型的に関連する構造を有する抗体を含む。通常、これらの抗体の構造単位は１つ以上の四量体を含み、その各々が２つの同一対のポリペプチド鎖からなるが、一部の哺乳動物種は単一重鎖のみを有する抗体を生成する。典型的な抗体では、各ペアまたは対は一本の完全長「軽」鎖および一本の完全長「重」鎖を含む。各個々の免疫グロブリン鎖は複数の「免疫グロブリンドメイン」からなり、その各々がほぼ９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを発現する。これらのドメインは抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。通常、各鎖のアミノ末端部分は抗原認識に関与する可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は鎖の他端よりも進化的に保存され、「定常領域」または「Ｃ領域」と称される。一般的に、ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖に分類され、これらの各々が１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含む。通常、重鎖は、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖またはε鎖に分類され、これらは抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義づける。ＩｇＧは複数のサブタイプを有し、限定的でないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。ＩｇＭサブタイプはＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプはＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトでは、ＩｇＡアイソタイプおよびＩｇＤアイソタイプは四本の重鎖および四本の軽鎖を含む；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは二本の重鎖および二本の軽鎖を含む；ＩｇＭアイソタイプは五本の重鎖および五本の軽鎖を含む。通常、重鎖Ｃ領域はエフェクター機能に関与し得る１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数はアイソタイプに依存する。例えば、ＩｇＧ重鎖は各々がＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として周知の３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体はこれらのアイソタイプおよびサブタイプを任意に有することができる。
【００８３】
完全長軽鎖および重鎖では、可変領域および定常領域は約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ（汎用目的にその全体を参照して本明細書に援用される）を参照されたい。通常、各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は抗原結合部位を形成する。
【００８４】
通常、可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。通常、各ペアの２鎖のＣＤＲはフレームワーク領域内に組み込まれ、特定のエピトープへの結合を可能とし得る。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は共に、通常、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。通常、各ドメインへのアミノ酸の割当は、以下に更に詳細に説明されるように、Ｋａｂａｔらの定義に従う。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；更に、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３も参照されたい。ＣＤＲは抗原結合に対する主要表面接触点を構成する。例えば、上記ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋを参照されたい。更に、軽鎖のＣＤＲ３、特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域内にて抗原結合における最も重要な決定基を構成し得る。例えば、上記ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：６０３−１５；ＸｕおよびＤａｖｉｓ（２０００），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３（１）：３７−４５；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２８）：２６２８５−９０；ならびにＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：２７７−３０２を参照されたい。一部の抗体では、重鎖ＣＤＲ３は抗原と抗体との接触の主要領域を構成するように思われる。上記Ｄｅｓｍｙｔｅｒら。抗体の結合特性を変化させるのに、ＣＤＲ３のみが変化させられたインビトロ選択スキームを用いることができる。
【００８５】
ＣＤＲは重鎖可変領域配列において以下のように配置され得る。ＣＤＲ１は成熟抗体のほぼ残基３１にて開始し、通常、約５〜７アミノ酸長であり、ほぼ常に、Ｃｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ（配列番号９３）（「Ｘｘ」は任意のアミノ酸である）が先行する。重鎖ＣＤＲ１に続く残基はほぼ常にトリプトファンであり、Ｔｙｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａであることが多い。ＣＤＲ１における最後の残基とＣＤＲ２における最初の残基との間に、ほぼ常に１４個のアミノ酸があり、通常、ＣＤＲ２は１６〜１９個のアミノ酸を含む。ＣＤＲ２は直前にＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号９４）が先行し、直後にＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが後続し得る。他のアミノ酸がＣＤＲ２に先行あるいは後続し得る。ＣＤＲ２における最後の残基とＣＤＲ３における最初の残基との間に、ほぼ常に３２個のアミノ酸があり、ＣＤＲ３は約３〜２５残基長となり得る。Ｃｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘがほぼ常にＣＤＲ３に直前に先行し、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号９５）がほぼ常にＣＤＲ３に後続する。
【００８６】
軽鎖ＣＤＲは軽鎖配列において以下のように配置され得る。ＣＤＲ１は成熟抗体のほぼ残基２４にて開始し、通常、約１０〜１７残基長である。ＣＤＲ１にはほぼ常にＣｙｓが先行する。ＣＤＲ１の最後の残基とＣＤＲ２の最初の残基との間に、ほぼ常に１５個のアミノ酸があり、ＣＤＲ２はほぼ常に７残基長である。通常、ＣＤＲ２にはＩｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−ＬｙｓまたはＩｌｅ−Ｐｈｅが先行する。軽鎖ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間にほぼ常に３２個の残基があり、通常、ＣＤＲ３は約７〜１０アミノ酸長である。ＣＤＲ３はほぼ常にＣｙｓが先行し、通常、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号９６）が後続する。
【００８７】
ＣＤＲを取り囲むフレームワーク領域の長さが、それらの長さを典型と異なるようにさせる挿入および欠失を含み得ることに当業者は気づくであろう。本明細書で意味するように、重鎖フレームワーク領域の長さは以下：ＦＲ１、０〜４１個のアミノ酸；ＦＲ２、５〜２４個のアミノ酸；ＦＲ３、１３〜４２個のアミノ酸；およびＦＲ４、０〜２１個のアミノ酸；の範囲内である。更に、本発明では、軽鎖フレームワーク領域の長さが以下：の範囲内となることを意図し；ＦＲ１、６〜３５個のアミノ酸；ＦＲ２、４〜２５個のアミノ酸；ＦＲ３、２〜４２個のアミノ酸；およびＦＲ４、０〜２３個のアミノ酸；の範囲内である。
【００８８】
通常、天然抗体は、タンパク質分泌のために抗体を細胞経路に誘導し、かつ成熟抗体には存在しない単一配列を含む。本明細書で提供されるような抗体をコードするポリヌクレオチドは、下述のように、天然シグナル配列または異種シグナル配列をコードし得る。
【００８９】
抗体はインビトロにて成熟させ、改変特性、例えば、抗原に対するより高い親和性またはより低い解離定数を有する抗体を作製することができる。ＣＤＲ内の残基のみ、特に、ＣＤＲ３ｓの変形は、同一の抗原に結合するが、より高い親和性を有する改変抗体をもたらし得る。例えば、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７；Ｙａｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３を参照されたい。本発明は、種々のインビトロでの選択スキーム、例えば、親和性成熟および／または鎖シャッフリング（Ｋａｎｇら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−２３）あるいはＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１）により作製される抗体を包含し、これにより、抗体は有利な特性を有するように選択され得る。多くのスキームでは、公知の抗体がインビトロにて多くはＣＤＲ内の特定の位置においてランダム化され、選択プロセスを受け、これにより、所望の特性、例えば、特定の抗原に対する親和性の増大を有する抗体が単離され得る。例えば、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎら、２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：５９１−６０１；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら、２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：６０３−１５；Ｙａｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７を参照されたい。通常、このような変異抗体は、突然変異誘発および選択工程の設計に依存し、１つ以上のＣＤＲにおける複数の改変残基を含み得る。例えば、上記ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎらを参照されたい。
【００９０】
提供される抗体の一部の完全長軽鎖および重鎖の具体例ならびにそれらの対応するアミノ酸配列は、表１に挙げられるものを含み、表１はＡＧ１５９の軽鎖および重鎖配列を示す。軽鎖および重鎖に関連する更なる配列が表２に挙げられる。一部の重鎖配列のＣ末端は、タンパク質が発現する宿主に依存して、．．．ＳＬＳＰＧＫまたは．．．ＳＬＳＰＧにて終止し得る。Ｃ末端リジンが存在し、あるいは存在しないことは、リジンの記号を括弧に入れることにより、即ち、（Ｋ）により、表１および２に示される。例えば、ＣＨＯ細胞では、Ｃ末端リジンは切断され、．．．ＳＬＳＰＧＫではなく．．．ＳＬＳＰＧのＣ末端配列をもたらす。
【００９１】
表１：軽鎖および重鎖
【００９２】
【表１】
2009534424.tif 000002
表２
【００９３】
【表２】
2009534424.tif 000003
表１に挙げられる軽鎖は表１に示される任意の重鎖と組み合わせられ、抗体を形成することができる。従って、特定の組成物に含まれる抗体は、Ｌ１がＨ１またはＨ２と組み合わせられる抗体を含む。いくつかの例では、抗体は表１に挙げられるものから少なくとも一本の重鎖および一本の軽鎖を含む。他の例では、抗体は二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖を含む。一例として、抗体は二本のＬ１軽鎖および二本のＨ１重鎖あるいは二本のＬ１軽鎖および二本のＨ２重鎖を含み得る。
【００９４】
他の組成物は、表１に示される重鎖および軽鎖の組合せにより形成される抗体の改変体である抗体を含み、これらの鎖のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を各々が有する軽鎖および／または重鎖を含む。いくつかの例では、このような抗体は少なくとも一本の重鎖および一本の軽鎖を含み、一方、他の例では、改変体型は二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖を含む。
２．抗体可変ドメイン
特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、配列番号７９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および／または配列番号８３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ならびにこれらの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の免疫学的に機能性の断片、誘導体、突然変異タンパク質および改変体を含む抗体を含む。可変ドメイン配列は表３に示される。
【００９５】
表３
【００９６】
【表３】
2009534424.tif 000004
いくつかの組成物の抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみにて配列番号７９の配列と異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、このような配列差の各々は独立して、１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。一部の抗体における軽鎖可変領域は、配列番号７９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００９７】
提供される特定の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみにて配列番号８３の配列と異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、このような配列差の各々は独立して、１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。一部の抗体における重鎖可変領域は、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
３．抗体のＣＤＲ
所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，１９９１においてＫａｂａｔらにより述べられているシステムを用いて同定され得る。本明細書で開示される組成物の特定の抗体は、表４にまとめる１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列と同一であるか、あるいは該アミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。
【００９８】
表４：ＣＤＲ
【００９９】
【表４】
2009534424.tif 000005
提供される特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の抗体は、１、２、３、４、５または全６個の上記一覧のＣＤＲを含み得る。一部の抗体は軽鎖ＣＤＲ３および／または重鎖ＣＤＲ３を含む。特定の抗体は表４に挙げたＣＤＲの変異形を有し、１つ以上（例えば、２、３、４、５または６）のＣＤＲの各々が表４に挙げたＣＤＲ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。例えば、抗体または断片は、表４に挙げた軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３のそれぞれと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を各々が有する軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３を含み得る。また、任意のＣＤＲのアミノ酸配列が表４に挙げた配列とわずか１、２、３、４または５個のアミノ酸残基のみ異なるように、提供される一部の抗体のＣＤＲ配列は表４に挙げたＣＤＲ配列と異なり得る。通常、一覧表示された配列との相違は保存的置換である（以下参照）。
【０１００】
好適なベクターを用いることにより、１つもしくはそれ以上の軽鎖または重鎖ＣＤＲを含むポリペプチドが生成され、以下に更に詳細に述べられるようにポリペプチドを好適な宿主細胞に発現させ得る。
【０１０１】
表３および４に開示される重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲは、限定的でないが、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体およびｓｃＦｖｓを含む、当該分野で公知の種々のタイプの免疫学的に機能性の断片のいずれかを調製するのに用いることができる。
４．モノクローナル抗体
提供される特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、グルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）に結合するモノクローナル抗体を含む。当該分野で公知の任意の手法を用いて、例えば、免疫化スケジュールの完了後、トランスジェニック動物から採取した脾細胞を不死化することにより、モノクローナル抗体は作製され得る。当該分野で公知の任意の手法を用いて、例えば、脾細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製することにより、脾細胞は不死化され得る。ハイブリドーマ作製の融合処理に用いる骨髄腫細胞は、非抗体産生性であり、高融合効率および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地で増殖することができないようにさせる酵素欠損を有することが好ましい。マウスにおける融合に用いる好適な細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕ１が含まれ；ラットにおける融合に用いられる細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１０２】
いくつかの例では、グルカゴン免疫原で動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を免疫化し、免疫化動物から脾細胞を採取し、採取した脾細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、これにより、ハイブリドーマ細胞を作製し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、グルカゴンに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することにより、ハイブリドーマ細胞株は作製される。
【０１０３】
ハイブリドーマ細胞株から分泌されるモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の手法を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂｓは、特定の特性、例えば、グルカゴン誘発性活性を阻止する能力を有するｍＡｂを同定するため、更にスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングの例は以下の実施例に示される。
５．キメラ抗体およびヒト化抗体
他のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物はキメラまたはヒト化抗体を含む。治療剤として用いるモノクローナル抗体は使用前に種々の方法で修飾され得る。一例は「キメラ」抗体であり、これは、共有結合して機能性免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖またはそれらの免疫学的に機能性の部分を生成する、異なる抗体由来のタンパク質セグメントからなる抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同であり、一方、鎖の残部は、別の種由来であり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である。キメラ抗体に関する方法については、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照されたい。これらは参考として本明細書に援用される。ＣＤＲグラフト化については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号および同第５，５３０，１０１号に述べられており、これらはすべて、汎用目的で参考として本明細書に援用される。
【０１０４】
一般に、キメラ抗体を作製する目標は、対象患者種由来のアミノ酸の数が最大となるキメラを作製することである。一例は、抗体が、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、一方、抗体鎖の残部が、別の種由来であり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である、「ＣＤＲグラフト化」抗体である。ヒトにおける使用では、齧歯動物抗体由来のＶ領域または選択ＣＤＲがヒト抗体にグラフト化され、ヒト抗体の天然Ｖ領域または選択ＣＤＲを置き換えることが多い。
【０１０５】
１つの有用なタイプのキメラ抗体は「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、当初、非ヒト動物において産出されたモノクローナル抗体から作製される。このモノクローナル抗体における特定のアミノ酸残基、典型的には、抗体の非抗原認識部分由来の残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるように修飾される。ヒト化は種々の方法を用いて、例えば、齧歯動物可変領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域に置換することにより実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６を参照）。
６．完全ヒト抗体
抗体が完全ヒト抗体である組成物も提供される。上述のように、本明細書で開示されるＡＧ１５９  Ａｂは完全ヒト抗グルカゴン抗体の一例である。ヒトを抗原に曝すことなく、グルカゴンに特異的な他の完全ヒト抗体を作製する方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の作製を実施する１つの手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Ｉｇ遺伝子が不活化される、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のマウスへの導入は、任意の所望の抗原で免疫化することができる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製する一手段である。完全ヒト抗体を用いることは、治療剤としてマウスまたはマウス誘導体化Ｍａｂをヒトに投与することによって引き起こされ得る場合がある免疫原性およびアレルギー反応を最小限にすることができる。
【０１０６】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生なしにヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することにより、作製することができる。通常、これを目的とする抗原は６個またはそれ以上の隣接アミノ酸を有し、任意で、ハプテンなどの担体に接合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座を不能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大断片をマウスに挿入することにより、トランスジェニック動物が作製される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体以下のものを有する部分的に改変された動物は、次に、交雑され、所望の免疫系の改変をすべて有する動物が得られる。免疫原を投与されると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に免疫特異的であるがマウスアミノ酸配列よりむしろヒトアミノ酸配列（可変領域を含む）を有する抗体を産生する。このような方法の更なる詳細については、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。これらは参考として本明細書に援用される。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関する更なる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；同第６，７１３，６１０号；同第６，６７３，９８６号；同第６，１６２，９６３号；同第５，５４５，８０７号；同第６，３００，１２９号；同第６，２５５，４５８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号および同第５，５４５，８０６号；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１０７４１，ＷＯ９０／０４０３６ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および欧州特許第５４６０７３Ａ１号に述べられており、これらはすべて、汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０１０７】
本明細書で「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上述のトランスジェニックマウスは、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的変異と共に、再配列されないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンミニ遺伝子座を有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。従って、マウスは免疫化に応答してマウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラス変換および体細胞変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧ  κモノクローナル抗体を生成する（上記Ｌｏｎｂｅｒｇら；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製については、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎら、１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒら、１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；  ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に詳細に説明されており、前記文献は汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。更に、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；ならびに米国特許第５，５４５，８０７号；国際特許公報第ＷＯ９３／１２２７号；同第ＷＯ９２／２２６４６号；および同第ＷＯ９２／０３９１８号を参照されたい。これらすべての開示内容は汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を産生させるために利用される技術は、ＷＯ９８／２４８９３およびＭｅｎｄｅｚら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６にも開示されており、これらは参考として本明細書に援用される。例えば、ヒト抗グルカゴン抗体を作製するのに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジェニックマウス系統を用いることができる。
【０１０８】
ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ＭＡｂが、上述のようなトランスジェニックマウスから産生され、選択され得る。このような抗体は好適なベクターおよび宿主細胞を用いてクローニングされ、発現され得（例えば、以下の実施例を参照）、あるいは抗体は培養ハイブリドーマ細胞から採取され得る。
【０１０９】
完全ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているように）。ファージディスプレイ法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの提示、続いて、選択抗原へのそれらの結合によるファージの選択を通して免疫選択を模倣する。このような手法の１つがＰＣＴ公報第ＷＯ９９／１０４９４号に述べられており（参考として本明細書に援用される）、このような手法を用いたＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体に対する高親和性および機能性アゴニスト抗体の単離について述べている。
７．二重特異性または二重機能性抗体
本明細書で開示される組成物に含まれる抗体は、上述のような１つもしくはそれ以上のＣＤＲまたは１つもしくはそれ以上の可変領域を含む二重特異性および二重機能性抗体であってもよい。いくつかの例における二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、限定的でないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む、種々の方法により作製され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。
８．例示的な変異抗体
本明細書で提供される特定の組成物の抗体は、上記で開示された抗体（例えば、表１および２に挙げられる配列を有する抗体）の改変体形態である。例えば、一部の抗体は、表１および２に挙げられる、１つ以上の重鎖もしくは軽鎖、可変領域またはＣＤＲにおいて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する抗体である。
【０１１０】
天然アミノ酸は側鎖の共通の性質に基づいてクラスに分類され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーの同クラスの他のメンバーとの交換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、通常、生物系での合成よりむしろ化学的ペプチド合成により組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらは、ペプチド擬似体および他の逆形態もしくは転置形態のアミノ酸部分を含む。
【０１１１】
非保存的置換は、上記クラスの１つのメンバーの他のクラスのメンバーとの交換を含み得る。このような置換残基は、ヒト抗体と相同な抗体の領域または分子の非相同領域に導入され得る。
【０１１２】
このような変換を行う際、特定の実施形態に基づき、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質のヒドロパシープロファイルは、各アミノ酸に数値（「ヒドロパシー指数」）を割り当て、次に、ペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均化することにより、計算される。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づき、ヒドロパシー指数を割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１１３】
タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与する際のヒドロパシープロファイルの重要性は、当該分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照）。特定のアミノ酸が同様のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され、なおも同様の生物学的活性を保持し得ることは周知である。ヒドロパシー指数に基づいて変換する際、特定の実施形態では、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。一部の態様では、±１以内のアミノ酸が含まれ、他の態様では、±０．５以内のアミノ酸が含まれる。
【０１１４】
類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得、特に、これにより生成される生理機能タンパク質またはペプチドを、本発明の場合のように、免疫的実施形態に用いることを目的とする場合、効果的になされ得ることも当該分野では理解される。特定の実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性により左右されるような、タンパク質の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原結合もしくは免疫原性、即ち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１１５】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づく変換を行う際、特定の実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内のアミノ酸が含まれ、更に別の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸が含まれる。いくつかの例では、また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定し得る。これらの領域は「エピトープコア領域」と称される。
【０１１６】
例示的な保存的アミノ酸置換が表５に示される。
【０１１７】
表５
【０１１８】
【表５】
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当業者は周知の手法を用いて、本明細書で示されるポリペプチドの好適な改変体を決定することができるであろう。当業者は活性に重要であるとは考えられない領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく、変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。当業者は類似ポリペプチド間に保存された分子の残基および部分を特定することもできるであろう。更なる実施形態では、生物活性または構造に重要でありうる領域でさえも、生物活性を破壊することなく、あるいはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換を受け得る。
【０１１９】
加えて、当業者は構造−機能試験をレビューし、活性または構造に重要な類似ポリペプチドにおける残基を特定することができる。このような比較に照らし、当業者は、類似タンパク質における活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者はこのような予測される重要なアミノ酸残基に対し、化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【０１２０】
当業者は類似ポリペプチドにおける構造に関連して三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報に照らし、当業者はその三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。当業者はタンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に極端な変更をしないように選択し得るが、それは、このような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。更に、当業者は各所望のアミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験される改変体を作製し得る。次に、これらの改変体は、本明細書で述べるようなグルカゴン活性用アッセイを用いてスクリーニングすることができ（以下の実施例を参照）、従って、いずれのアミノ酸が変更でき、また、いずれが変更されてはならないかということに関する情報をもたらす。言い換えると、このような定期試験から収集される情報に基づき、当業者は、単独で、あるいは他の変異と組み合わせて更なる置換を避ける必要があるアミノ酸位置を容易に決定することができる。
【０１２１】
多くの科学文献が二次構造の予測に取り組んできた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８；Ｃｈｏｕら、１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。更に、現在、二次構造の予測を支援するコンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する一方法は相同モデリングに基づく。例えば、３０％超の配列同一性または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。近年のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発展により、二次構造の予測性の向上が得られ、これには、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の折り畳みのポテンシャル数が含まれる。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質には限られた数の折り畳みがあり、また、構造の臨界数が解明されれば、構造予測は劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【０１２２】
二次構造を予測する更なる方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）および「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（上記Ｈｏｌｍ，１９９９；および上記Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９９７を参照）が含まれる。
【０１２３】
本発明の一部の実施形態では、（１）タンパク質分解感受性を低下させ、（２）易酸化性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更し、（４）リガンドまたは抗原結合親和性を変更し、かつ／あるいは（４）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的もしくは機能的性質を付与し、または変更する、アミノ酸置換がなされる。例えば、天然配列において、単一または多重アミノ酸置換（特定の実施形態では保存的アミノ酸置換）がなされ得る。置換は分子間接触を形成するドメインの外側に位置する抗体部分でなされ得る。このような実施形態では、親配列の構造特性を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換を用いることができる（例えば、親または天然抗体を特徴づける二次構造を崩壊しない、１つ以上の置換アミノ酸）。当該分野で認められているポリペプチドの二次および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＢｒａｎｄｅｎおよびＴｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５に述べられており、これらは各々参考として本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
いくつかの組成物において用いられる抗体改変体は、改変Ｆｃ断片または改変重鎖定常領域を含む抗体を含み得る。「結晶化する断片」を表すＦｃ断片または重鎖定常領域は変異によって改変され、抗体に変性特性を付与することができる。例えば、ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ，１９９２，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５１：１−８４；ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−９０；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４；ＴｅｌｌｅｍａｎおよびＪｕｎｇｈａｎｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １００：２４５−２５１；Ｍｅｄｅｓａｎら、１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２−２１００；これらはすべて参考として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このような変異は、置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み得、通常、本明細書で述べられる方法および当該分野で公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．を参照されたい。これらは参考として本明細書に組み込まれる）により、１つ以上の変異原性オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異誘発によって生じる。
【０１２５】
本明細書で開示されるいくつかの組成物における抗体は、本明細書で開示される抗体のグリコシル化改変体を包含し、グリコシル化部位の数および／またはタイプが親ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変更されている。特定の実施形態では、抗体タンパク質改変体は天然抗体よりも多いあるいは少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、Ｘと指定されたアミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸残基であってよい。この配列を生成するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合炭水化物鎖の付加のための新規部位の可能性を与える。あるいは、この配列を排除あるいは変更する置換は、天然ポリペプチドに存在するＮ−結合炭水化物鎖の付加を防止する。例えば、グリコシル化は、Ａｓｎの欠失により、あるいはＡｓｎを異なるアミノ酸に置換することにより、低下し得る。他の実施形態では、１つ以上の新規Ｎ−結合部位が生成される。通常、抗体はＦｃ領域にＮ−結合グリコシル化部位を有する。
【０１２６】
更なる好ましい抗体改変体は、親または天然アミノ酸配列における１つ以上のシステイン残基が欠失され、あるいは別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されたシステイン改変体を含む。システイン改変体は、特に、抗体が生理活性構造に再び折り畳まれる必要がある際に有用である。システイン改変体は天然抗体よりも少ないシステイン残基を有し得、通常、不対システインから生じる相互作用を最小限にするように偶数を有する。
【０１２７】
開示される重鎖および軽鎖の可変領域ドメインおよびＣＤＲは、グルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）に特異的に結合し得る抗原結合領域を含むポリペプチドを調製するのに用いることができる。例えば、表２に挙げられる１つ以上のＣＤＲは、共有結合または非共有結合で分子（例えば、ポリペプチド）に組み込まれ、イムノアドヘジンを生成することができる。イムノアドヘジンはより大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（ｓ）を組み込み、ＣＤＲ（ｓ）を別のポリペプチド鎖に共有結合させ、あるいはＣＤＲ（ｓ）を非共有結合で組み込み得る。ＣＤＲ（ｓ）はイムノアドヘジンが対象とする特定の抗原（例えば、グルカゴンまたはそのエピトープ）に特異的に結合することを可能とする。
【０１２８】
本明細書で述べられる可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく擬似体（例えば、ペプチド擬似体」（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）または「ペプチド擬似体」（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチドあるいはペプチドおよび非ペプチド領域の組合せとなり得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；ならびにＥｖａｎｓら、１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９、これらは目的に応じて参考として本明細書に組み込まれる。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド擬似体は、類似の治療効果または予防効果をもたらすのに用いられ得る。このような化合物はコンピュータ化分子モデリングの支援により開発される場合が多い。一般的に、本発明のペプチド擬似体は、所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当該分野で周知の方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合に任意で置換される、１つ以上のペプチド結合を有するタンパク質である。特定の実施形態では、より安定なタンパク質を生成するのに、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸への体系的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）が用いられ得る。さらに、当該分野で公知の方法により（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、参考として本明細書に援用される）、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することにより、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む制限ペプチドが作製され得る。
【０１２９】
いくつかの組成物では、１つ以上の抗グルカゴン抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが用いられ得る。オリゴマーは共有結合または非共有結合した二量体、三量体または高重合オリゴマーの形態でよい。２つ以上の抗グルカゴン抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが使用のために検討され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが含まれる。
Ｂ．ＧＬＰ−１化合物
組成物の抗グルカゴン抗体には種々のＧＬＰ−１化合物を結合することができ、ＧＬＰ−１それ自体および多種多様のＧＬＰ−１類似体が含まれる。
【０１３０】
本明細書で用いられるように、「ＧＬＰ−１」という用語は、上記背景技術において述べたようなグルカゴン様ペプチド１を指す。ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨのカルボキシル末端は切断され、ＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２を生成することができる。上述のように、ＧＬＰ−１（１−３１）とも称されるＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨおよびＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２は同一活性を有する。便宜上、これら両方の生物活性形態を指すのに、「ＧＬＰ−１」および「天然ＧＬＰ−１」という用語が用いられる。上述のように、当該分野では２つの異なる番号付け表記が用いられている。本明細書で採用される番号付け表記は、ＧＬＰ−１のＮ末端ヒスチジンを残基番号１と考える番号付け表記である。従って、天然ＧＬＰ−１（即ち、ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨ）は以下のアミノ酸配列を有する：
１Ｈｉｓ−２Ａｌａ−３Ｇｌｕ−４Ｇｌｙ−５Ｔｈｒ−６Ｐｈｅ−７Ｔｈｒ−８Ｓｅｒ−９Ａｓｐ−１０Ｖａｌ−１１Ｓｅｒ−１２Ｓｅｒ−１３Ｔｙｒ−１４Ｌｅｕ−１５Ｇｌｕ−１６Ｇｌｙ−１７Ｇｌｎ−１８Ａｌａ−１９Ａｌａ−２０Ｌｙｓ−２１Ｇｌｕ−２２Ｐｈｅ−２３Ｉｌｅ−２４Ａｌａ−２５Ｔｒｐ−２６Ｌｅｕ−２７Ｖａｌ−２８Ｌｙｓ−２９Ｇｌｙ−３０Ａｒｇ−３１Ｇｌｙ（配列番号１）。
【０１３１】
Ｎ末端とＣ末端との間に位置するアミノ酸は、表示されるように連続的に番号付けされる。従って、例えば、位置２におけるアミノ酸はＡｌａであり、位置２０におけるアミノ酸はＬｙｓである。同様に、本明細書で特定位置において置換することに言及する際、同じ番号付けシステムが適用される。従って、例えば、位置１６におけるＡｌａの置換とは、位置１６におけるＧｌｙがＡｌａに置換されたということである。ＧＬＰ−１（１−３１）のアミノ末端においてアミノ酸が付加される場合、位置１のすぐ上流のアミノ酸がアミノ酸−１であり、次の上流アミノ酸が位置−２であるなどのように、位置は減少順に連続的に番号付けされる。アミノ酸がＧＬＰ−１のカルボキシル末端に付加される場合、位置３１のすぐ下流のアミノ酸がアミノ酸３２であり、次の下流アミノ酸が位置３３であるなどのように、位置は増加順に連続的に番号付けされる。天然ＧＬＰ−１配列に対する変更は括弧内に示され、次の形態：ｘ位置番号ｙを有し、ｘは天然ＧＬＰ−１配列での表示位置番号におけるアミノ酸であり、ｙはこの位置で置換されるアミノ酸である。従って、例えば、Ａ２Ｇとは、天然ＧＬＰ−１配列の位置２におけるアラニンがグリシンに置換されたということである。多重置換は順方向スラッシュ（／）により分離される。Ｃ末端に付加されるアミノ酸はプラス記号（＋）、続いて、付加の位置で示される。
【０１３２】
本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１化合物」は、ＧＬＰ−１ペプチドを含む分子を指し、１つ以上の追加の構成要素（例えば、インビボにて化合物の半減期を延長する構成要素）を含み得る。
【０１３３】
本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、天然ＧＬＰ−１または天然ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨもしくはＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２のアミノ酸配列において１つもしくはそれ以上の変更を有するが、少なくとも１つの天然ＧＬＰ−１の活性を保持するペプチドを指す。該用語は、エキセンジン−３およびエキセンジン−４などのエキセンジンファミリーのメンバー（例えば、米国特許第５，４２４，２８６号を参照）あるいはエキセンジンのアミノ酸配列において１つ以上の変更を有するペプチドも含み、但し、ペプチドは少なくとも１つのＧＬＰ−１活性を保持する。例えば、エキセンジン−４は以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１２７）。
【０１３４】
エキセンジン−３は以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ（配列番号１３１）。
【０１３５】
「ＧＬＰ−１活性」という語句またはその文法的等価語は、ＧＬＰ−１およびエキセンジンと関連する任意の活性を広範に指す。被験体に投与される際、このような活性の例には、限定的でないが、インスリン向性活性、胃運動の抑制、胃液分泌の抑制、β細胞の増殖および複製の促進、β細胞量の増加、満腹感の増大ならびに食物摂取の減少が含まれる。
【０１３６】
「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、本明細書で開示されるＧＬＰ−１ペプチドの１つと機能的等価物である、ＧＬＰ−１ペプチドの改変体、断片および誘導体も含み、改変体、断片または誘導体は類似のアミノ酸配列（例えば、保存的置換を含む）を有するとともに、ある程度、少なくとも１つのＧＬＰ−１ペプチド活性を保持するという点で機能的等価物である。
【０１３７】
「ＧＬＰ−１改変体」は、本明細書で述べられるＧＬＰ−１ペプチドと「実質的に同一」（上記定義を参照）であるペプチドを含む。このような改変体は、欠失、挿入および／または置換のようなアミノ酸の変更を有するタンパク質を含む。通常、このような変更は、改変体タンパク質の活性が本明細書で開示されるＧＬＰ−１ペプチドの１つに実質的に類似するように、保存的性質である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照）。置換の場合、別のアミノ酸を置換するアミノ酸は通常、類似の構造および／または化学的性質を有する。ＧＬＰ−１改変体は本明細書で述べるようなＧＬＰ−１ペプチドと少なくとも６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有し得、但し、改変体は依然としてＧＬＰ−１活性を有する。
【０１３８】
本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１誘導体」は、１つ以上のアミノ酸が、１）対応するＤ−アミノ酸に置換され、２）非天然アミノ酸残基に変更され、かつ／あるいは、３）化学的に修飾されたＧＬＰ−１ペプチドの１つを指す。化学修飾の例には、限定されないが、ペプチド骨格および／またはアミノ酸側鎖のアルキル化、アシル化、脱アミド、エステル化、リン酸化およびグリコシル化が含まれる。
【０１３９】
「ＧＬＰ−１断片」は、本明細書で挙げられるＧＬＰ−１ペプチドの切頭形態またはその改変体または誘導体を指す。典型的には、断片は本明細書で示されるＧＬＰ−１ペプチドに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸単位で切頭される。切頭はアミノ末端および／またはカルボキシル末端であってよい。
【０１４０】
特定の組成物での使用に好適なＧＬＰ−１ペプチドの多数の例が、例えば、米国特許第６，３２９，３３６号；同第６，７０３，３６５号；同第５，７０５，４８３号；同第５，９７７，０７１号；同第６，１３３，２３５号；同第６，４１０，５１３号；同第６，３８８，０５３号；同第６，３５８，９２４号；同第５，５１２，５４９号；同第６，００６，７５３号；同第５，５４５，６１８号；同第５，１１８，６６６号；同第５，１２０，７１２号；同第５，６１４，４９２号；同第５，９５８，９０９号；同第６，１６２，９０７号；同第６，８４９，７０８号；同第６，８２８，３０３号；同第６，２８４，７２７号；同第６，３４４，１８０号；同第６，５０６，７２４号；同第６，８５８，５７６号；同第６，８８４，５７９号；同第６，５２８，４８６号；同第５，８４６，９３７号；同第５，９９０，０７７号；同第６，７７０，６２０号；同第６，６２０，９１０号；同第５，５４５，６１８号；同第６，５６９，８３２号；および第６，２６８，３４３号に述べられており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。特定の組成物において抗グルカゴン抗体に結合可能な他のＧＬＰ−１ペプチドが、例えば、以下の米国特許出願公開：第２００４／００５３３７０号；同第２００４／０１２７３９９号；同第２００３／０２２１２０１号；同第２００３／０２２６１５５号；同第２００４／００２３３３４号；同第２００４／０１４３１０４号；同第２００５／０１０７３１８号；同第２００４／０１０６５４７号；同第２００４／０１７６３０７号；同第２００４／００５２８６２号；同第２００４／００８２５０７号；同第２００４／０１４６９８５号；同第２００４／００５３３７０号；同第２００３／０１９９６７２号；および第２００１／００１１０７１号に開示されており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。特定の組成物において使用可能な更に別のＧＬＰ−１ペプチドが、例えば、以下のＰＣＴ出願公開：ＷＯ００／３４３３１；ＷＯ００３４３３２；ＷＯ０２／４６２２７；ＷＯ０３／０６００７１；ＷＯ２００５／００３２９６；ＷＯ０３／０１８５１６；ＷＯ０１／９８３３１；ＷＯ０３／０５９９３４；ＷＯ２００４／０７８７７７；ＷＯ９９／３０７３１；ＷＯ９８／４３６５８；ＷＯ００／１６７９７；ＷＯ００／１５２２４；ＷＯ０３／１０３５７２；ＷＯ０３／０８７１３９；ＷＯ２００４／１１０４７２；ＷＯ０３／０１８５１６；ＷＯ２００５／０００８９２；ＷＯ０３／０２８６２６；ＷＯ２００４／０２０４０４；ＷＯ２００４／０２０４０５；ＷＯ２００４／０１９８７２；ＷＯ０３／０２０７４６；ＷＯ２００４／０９４４６１；ＷＯ９１／１１４５７；ＷＯ８７／０６９４１；ＷＯ９０／１１２９６；ＷＯ００／３４３３２；ＷＯ２００４／０９３８２３；ＷＯ０３／０４０３０９；ＷＯ２００４／０２２００４；ＷＯ９９／６４０６１；ＷＯ０３／０１１８９２；ＷＯ２００４／０２９０８１；ＷＯ２００４／００５３４２；ＷＯ９０／０１５４０；ＷＯ０２／２２１５１；ＷＯ９９／４３３４１；ＷＯ９６／２９３４２；ＷＯ９８／０８８７１；ＷＯ９９／４３７０５；ＷＯ９９／４３７０６；ＷＯ９９／４３７０７；ＷＯ９９／４３７０８；ＷＯ２００４／１０５７８１；ＷＯ２００４／１０５７９０；ＷＯ２００５／０２７９７８；ＷＯ０４／０７４３１５；ＷＯ２００５／０２８５１６；およびＷＯ２００５／０４６７１６に述べられている。いくつかの組成物において使用可能な更なるＧＬＰ−１ペプチドが、欧州特許第０７３３６４４号；同第１３６４９６７号；同第０６９９，６８６号；同第０６１９３２２号；同第１０８３９２４号；同第０５１２０４２号；および第１０６１９４６号に述べられており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。
【０１４１】
いくつかの組成物に存在する特定のＧＬＰ−１ペプチドは、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
を含み、式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略され、化合物はＧＬＰ−１活性を有する。従って、例えば、位置３２におけるアミノ酸が省略される場合、位置３３〜３７にもアミノ酸はない。同様に、位置３３におけるアミノ酸が省略される場合、位置３４〜３７にもアミノ酸はない。また、位置３４におけるアミノ酸が省略される場合、位置３５〜３７にアミノ酸はない、などという具合である。
【０１４２】
特定の組成物では、ＧＬＰ−１ペプチドは、下記表６に示されるような配列番号１〜３５もしくは配列番号１２６の任意のアミノ酸配列またはエキセンジン−３もしくはエキセンジン−４（配列番号１２７）を含む。一部の他の組成物におけるＧＬＰ−１ペプチドは、１、２、３、４もしくは５以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７を含み、但し、改変体はＧＬＰ−１活性（例えば、インスリン向性活性）を有する。更に別の組成物では、ＧＬＰ−１ペプチドは、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。
【０１４３】
表６
【０１４４】
【表６】
2009534424.tif 000007
Ｃ．抗体とＧＬＰ−１化合物との結合
上記のように、抗グルカゴン抗体とＧＬＰ−１化合物に関連して「結合される（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語が用いられる際、これら２つの分子はリンカーによって接合される（ｊｏｉｎｅｄ）場合もあれば、そうでない場合もある。特定の実施形態では、リンカーが抗体と化合物との間のスペーサーとして機能するように用いられる場合、種々の異なる化学構造を用いることができる。例えば、特定の実施形態では、リンカーはペプチド結合によって結合したアミノ酸残基を含み、即ち、リンカーはペプチドを含む。従って、特定の実施形態では、リンカーはこれらの終点間のすべての数を含む１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドである。リンカーにおいて用いられるアミノ酸残基は従来型または非従来型アミノ酸残基でよい。特定の実施形態では、リンカーにおけるアミノ酸残基は別の態様でグリコシル化および／または誘導体化され得る。特定の実施形態では、リンカーにおけるアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。特定の実施形態では、リンカーはグリシンおよび／またはアラニンなどの立体的に障害されないアミノ酸残基の過半数を含む。従って、特定の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン（例えば、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）およびポリアラニンから選択される。特定の典型的なリンカーには、限定されないが、
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号９７）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号９８）；
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号９９）；
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１００）；および
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＡｌａＰｒｏ（配列番号１３０）
が含まれる。
【０１４５】
上記の表記について説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。特定の実施形態では、リンカーはＧｌｙ残基とＡｌａ残基との組合せを含む。特定の実施形態では、リンカーは１０またはそれ以下のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、リンカーはこれらの終点間のすべての数を含む１１〜３０個のアミノ酸残基を含む。
【０１４６】
本明細書で提供されるような組成物において用いることができる特定のリンカーの更なる例には、ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＧＧＧＧＧＧ（配列番号３６）；ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３７）；およびＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３８）が含まれる。
【０１４７】
特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、２つのポリペプチドを単一コード配列にクローニングするのに用いられる制限酵素部位から生じ得る。特定の実施形態では、制限酵素部位は１つまたは両方のポリペプチドのコード配列に付加される。特定の実施形態では、このようなリンカーのアミノ酸配列は、少なくとも部分的に、クローニング処理に対して選択される制限酵素部位により決定する。
【０１４８】
特定の実施形態では、非ペプチドリンカーが提供される。特定の典型的な非ペプチドリンカーには、限定的ではないが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーが含まれる。このようなアルキルリンカーは、特定の実施形態では、更に、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの非立体障害基を含むが、これに限定されない置換を含む。非限定的な典型的非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカー
【０１４９】
【化１】
2009534424.tif 000008
であり、式中、ｎはリンカーが１００〜５０００ｋＤの分子量を有するような数である。特定の実施形態では、ｎは、リンカーがこれらの終点間の全ポイントを含む１００〜５００ｋＤの分子量を有するような数である。
【０１５０】
特定の実施形態では、リンカーは２つのポリペプチドを互いに結合するのに用いられる化学的および／または酵素的プロセスから生じ得る。ポリペプチドを結合するための特定の例示的な化学的および／または酵素的プロセスが、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ（２００３／２００４）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に述べられている。
Ｄ．ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の具体例
提供される組成物の一部の具体例は、抗体がＡＧ１５９の１つもしくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ（配列番号７６〜７８）および１つもしくはそれ以上の重鎖ＣＤＲ（配列番号８４〜８６）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに結合（例えば、融合）した例である。他の組成物では、抗体はＡＧ１５９の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域（それぞれ、配列番号７９、８３）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに融合される。更に別の組成物では、抗体はＡＧ１５９の成熟重鎖（配列番号８２または８９）および／または成熟軽鎖（配列番号４０）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに融合される。
【０１５１】
これまで詳細に上述したように、これらのＧＬＰ−１ペプチドはＡＧ１５９抗体または断片に種々の異なる方法で結合することができ、例えば、多数のＧＬＰ−１ペプチド（同一または互いに異なる）が異なる数および位置にて抗体に結合されるような方法が含まれる。
【０１５２】
提供される特定の例示的な組成物が表６に挙げられている。これらの特定の組成物が、単に、本明細書で述べられる一般的組成物の具体例を示すために提供され、また、組成物がこれらの特定の形態に限定されないということが理解されるべきである。表６の最初の縦列は組成物の一般構造を示す。一般的ではあっても必ずしもそうではないが、本明細書で採用されている省略形はＬＣ：ＨＣであり、軽鎖形態がコロンの前に挙げられ、重鎖形態がコロンの後に挙げられている。上記に示したように、天然ＧＬＰ−１配列に対する変更は、括弧で示され、形態：ｘ位置番号ｙを有し、ｘは天然ＧＬＰ−１配列での表示位置番号におけるアミノ酸であり、ｙはこの位置で置換されるアミノ酸である。多重置換は順方向スラッシュ（／）により分離される。Ｃ末端に付加されるアミノ酸はプラス記号（＋）、続いて、付加の位置で示される。ＧＬＰ−１ペプチドがＬＣに結合される場合、これはＧＬＰ−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５と表示され、ＧＬＰ−１ペプチドはコロンの左側に挙げられている。ＧＬＰ−１ペプチドがＨＣに結合される場合、これはＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ−ＡＧ１５９と表示され、即ち、ＧＬＰ−１ペプチドはコロンの右側に挙げられている。ＧＬＰ−１ペプチドおよびＡＧ１５９抗体の軽鎖または重鎖はリンカー（配列番号３６〜３８）を介して融合される。
【０１５３】
これらの特定の組成物では、ＡＧ１５９抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプであることが示されるが、他の任意の免疫グロブリンアイソタイプであってもよい。これらの融合では、ＧＬＰ−１ペプチドのカルボキシ末端がリンカー（例えば、配列番号３６〜３８）を介してＡＧ１５９抗体のアミノ末端に融合される。しかし、上述のように、ＧＬＰ−１ペプチドは他の位置および他の配向にて結合され得る。
【０１５４】
特定の組成物は、配列番号４１〜７４または配列番号１２９のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチド融合を含む。特定の組成物では、軽鎖ポリペプチド融合はＡＧ１５９の重鎖（配列番号８２または８９）と対をなす。いくつかの組成物は配列番号４１〜７４の同一の二対の軽鎖融合およびＡＧ１５９の同一の二対の重鎖を含み、四量体構造を有する抗体を形成する。
【０１５５】
ＧＬＰ−１ペプチド（例えば、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７）が軽鎖ではなく、ＡＧ１５９の重鎖ポリペプチド（配列番号８２または８９）に融合されることを除き、他の組成物は同様である。このような重鎖ポリペプチド融合はＡＧ１５９の軽鎖（配列番号４０または７５）と対をなすことができ、いくつかの組成物は同一の二対の重鎖融合およびＡＧ１５９の同一の二対の軽鎖を含み、四量体構造を有する抗体を形成する。
【０１５６】
詳細に上述したように、本明細書で提供されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、抗体および／またはＧＬＰ−１ペプチドが本明細書の表に挙げられるものの改変体であるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む。変更は抗体および／またはＧＬＰ−１ペプチドにおいて可能である。従って、例えば、特定の組成物は、表１〜４または７に挙げられる鎖のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有するポリペプチド鎖を含む。他の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下のアミノ酸置換を含む、表７のポリペプチドを含み、典型的には、その置換は上述のような保存的置換である。
【０１５７】
別の実施形態では、配列番号４１〜７４または配列番号１２８または１２９の任意の１つに示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【０１５８】
表７
【０１５９】
【表７−１】
2009534424.tif 000009
【０１６０】
【表７−２】
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【０１６１】
【表７−３】
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【０１６２】
【表７−４】
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Ｅ．任意の構成要素
いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物および／または抗グルカゴン抗体は追加の構成要素を含むように改変される。例えば、ＧＬＰ−１化合物または抗体は１つ以上の水溶性ポリマーに結合され得る。好適な水溶性ポリマーまたはその混合物には、限定されないが、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物、糖類（例えば、キトサン、キサンタンゴム、セルロースおよびその誘導体、アカシアゴム、カラヤゴム、グアーゴム、カラギーナンおよびアガロースなどの多糖類）、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（タンパク質を誘導体化するのに用いられているＰＥＧ形態を含み、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチリングリコールが含まれる）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ポリビニルアルコールならびに前述のコポリマーが含まれる。
【０１６３】
特定の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は好適な二価金属カチオンと複合体を形成する。ＧＬＰ−１化合物の二価金属複合体は懸濁液として皮下投与することができ、一般に、このようなＧＬＰ−１化合物の複合体が生理的ｐＨほどの水溶液に不溶性であるため、インビボにて放出速度が低下する。ＧＬＰ−１化合物と複合体を形成するのに好適な二価金属カチオンの非限定例には、Ｚｎ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｃｄ＋＋、Ｎｉ＋＋などが含まれる。ＧＬＰ−１化合物の二価金属複合体は、例えば、参考として本明細書に援用されるＷＯ０１／９８３３１に述べられているような手法を用いて得ることができる。
ＩＶ．核酸
本明細書で述べられるような抗体の１鎖もしくは両鎖またはＧＬＰ−１ペプチドと抗グルカゴン抗体の１鎖との融合をコードする核酸、ならびにこのような抗体または融合体の断片、誘導体、突然変異タンパク質もしくは改変体をコードする核酸も提供される。ポリペプチドまたは抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、あるいは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたはシークエンシングプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチドも提供される。核酸は任意の長さでよい。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれ以上のヌクレオチド長でよく、かつ／あるいは１つ以上のさらなる配列、例えば、調節配列を含むことができ、かつ／あるいはより大きな核酸の一部、例えば、ベクターでよい。核酸は一本鎖または二本鎖でよく、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチドならびにそれらの人工的改変体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
【０１６４】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖もしくは軽鎖、可変ドメインのみまたは完全長）をコードするＤＮＡは、グルカゴンまたはその免疫原性断片で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離され得る。ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手法により単離され得る。ファージ提示は公知の手法の別例であり、これにより、抗体の誘導体が調製され得る。一手法では、対象抗体の構成要素であるポリペプチドは、任意の好適な組換え発現系において発現され、発現ポリペプチドは組み合わされて抗体分子を形成する。
【０１６５】
別の態様では、本発明のポリペプチドまたはその一部（例えば、１つもしくはそれ以上のＣＤＲまたは１つもしくはそれ以上の可変領域ドメイン）をコードする核酸を含むベクターが提供される。ベクターの例には、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム性哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが含まれる。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態での本発明の核酸を含み得る。組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これは発現する核酸に機能的に結合される。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する調節配列（ＳＶ４初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示する調節配列（例えば、組織特異的調節配列、Ｖｏｓｓら、１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７を参照；それらの全体が参考として本明細書に援用される）ならびに特定の処置または病状に応答してヌクレオチド配列の誘導発現を指示する調節配列（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）プロモーターならびに原核細胞系および真核細胞系におけるｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター）（同文献参照）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され、これにより、本明細書で述べるような核酸にコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを生成することができる。
【０１６６】
別の態様では、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であってよい。ベクターＤＮＡは従来の形質転換またはトランスフェクション手法により、原核細胞または真核細胞に導入することができる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのため、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション法に依って、極少数の細胞が外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが既知である。一般的に、これらの不可欠構成要素（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を同定し、選択するため、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性のための）をコードする遺伝子が対象遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する選択可能マーカーを含む。導入核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でも特に、薬物選択により同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、一方で、他の細胞は死滅する）。
Ｖ．抗体の調製
提供される非ヒト抗体は、例えば、任意の抗体産生動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバまたは非ヒト霊長動物（例えば、サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー））に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、インビトロでの細胞培養および細胞培養ベースの用途または抗体に対する免疫応答が生じないか、もしくは顕著でないか、防止可能であるか、懸案事項でないか、もしくは所望される他の任意の用途において用いることができる。本発明の特定の実施形態では、抗体はヒトグルカゴンで免疫化することにより作製され得る。抗体はポリクローナル、モノクローナルであってよく、あるいは組換えＤＮＡを発現させることにより宿主細胞において合成され得る。
【０１６７】
完全ヒト抗体は、上述のように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を免疫化することにより、あるいはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージディスプレイライブラリーを選択することにより、調製され得る。
【０１６８】
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は種々の手法により作製することができ、従来のモノクローナル抗体法、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法が含まれる。あるいは、モノクローナル抗体を作製する他の手法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを調製するのに好適な動物系の１つはマウス動物系であり、これは十二分に確立した手法である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび技法は、当該分野で公知である。このような手法では、免疫化マウス由来のＢ細胞は、好適な不死化された融合パートナー、例えば、マウス動物骨髄腫細胞株と融合される。所望により、マウスの代わりに更にラットまたは他の哺乳動物を免疫化することができ、このような動物由来のＢ細胞をマウス動物骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを形成することができる。あるいは、マウス以外の供給源由来の骨髄腫細胞株が用いられ得る。ハイブリドーマを作製するための融合手法も周知である。
【０１６９】
提供される単鎖抗体は、アミノ酸橋（短いペプチドリンカー）を介して重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片（例えば、配列番号７９および８３）を結合することにより形成され得、単一ポリペプチド鎖が生じる。このような単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）は、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡｓ間に融合することにより調製され得る。生じたポリペプチドは折り畳んで抗原結合モノマーを形成することができ、あるいは２つの可変ドメイン間の可撓性リンカーの長さに依存し、マルチマー（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔら、１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔら、２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを結合することにより、異なるエピトープに結合するマルチマーｓｃＦｖｓを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら、２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。単鎖抗体の作製のために開発された技法は、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９；Ｗａｒｄら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４，ｄｅ  Ｇｒａａｆら、２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に述べられている技法を含む。
【０１７０】
１つのサブクラスである本明細書で提供される抗体は、サブクラス転換法を用いて異なるサブクラス由来の抗体に変換することができる。従って、例えば、ＩｇＧ抗体はＩｇＭ抗体に由来し得、その逆も同様である。このような技法は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体と異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物特性も示す新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ法が用いられ得る。このような手法では、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローンＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡが用いられ得る。例えば、Ｌａｎｔｔｏら、２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６を参照されたい。更に、ＩｇＧ４が所望される場合、ＩｇＧ４抗体における不均一性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するため、Ｂｌｏｏｍら、１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７；参照して本明細書に援用される）に報告されているように、ヒンジ領域に点突然変異（ＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ）を導入することも望まれ得る。
【０１７１】
異なる性質（即ち、抗体が結合する抗原に対する異なる親和性）を有する抗体を得る技法も公知である。鎖シャッフリングと称されるこのような技法の１つは、免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーを糸状バクテリオファージの表面上に提示することを含み、ファージディスプレイと称されることが多い。Ｍａｒｋｓら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９に報告されているように、鎖シャッフリングはハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体を調製するのに用いられている。
【０１７２】
本明細書で述べられる抗体および断片の機能的および／または生化学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えば、シート構造またはヘリカル構造としての置換の領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性あるいは（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することへの影響が有意に異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換をなすことによって果たされ得る。「保存的アミノ酸置換」は、当該位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷への影響をほとんどまたは全く有さない、天然アミノ酸残基の非天然残基との置換を含み得る。更に、また、アラニン走査突然変異誘発について過去に述べられているように、ポリペプチドにおける任意の天然残基がアラニンに置換され得る。
【０１７３】
対象抗体のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、日常技術を適用することによって当業者により実施され得る。アミノ酸置換は、本明細書で提供される抗体の重要な残基を同定し、あるいはヒトグルカゴンに対するこれらの抗体の親和性を増減させるのに用いることができる。
ＶＩ．抗グルカゴン抗体の発現
抗グルカゴン抗体は多くの従来技法の任意の技法により調製することができる。例えば、抗グルカゴン抗体は、当該分野で公知の任意の手法を用いて組換え発現系により作製され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）：およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい。
【０１７４】
本発明の抗体はハイブリドーマ細胞株またはハイブリドーマ以外の細胞株において発現され得る。哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換するのに、抗体をコードする発現構築物を用いることができる。形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法を用いて実施することができ、例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は任意の目的で参考として本明細書に援用される）に例示されるように、当該分野で公知のトランスフェクション手法により、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージにパッケージングし、宿主細胞に構築物を形質導入することを含む。用いられる至適形質転換手法はどのタイプの宿主細胞が形質転換されるかに依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は当該分野で公知であり、限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、核酸の正荷電脂質との混合およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションを含む。
【０１７５】
典型的には、本発明の組換え発現構築物は、１つ以上の以下のもの：抗グルカゴン抗体の重鎖定常領域；重鎖可変領域；軽鎖定常領域；軽鎖可変領域；軽鎖または重鎖の１つもしくはそれ以上のＣＤＲを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。通常、ベクターは用いられる宿主細胞において機能的であるように選択される（即ち、ベクターは宿主細胞機構と適合性があり、遺伝子の増幅および／または発現が生じることを可能にする）。一部の実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを用いて、タンパク質断片相補性アッセイを用いるベクターが用いられる（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照；これは参考として本明細書に援用される）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社またはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（以前は「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社」）から購入することができる。本発明の抗体および断片をクローニングし、発現させるための他の有用なベクターには、ＢｉａｎｃｈｉおよびＭｃＧｒｅｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８４（４）：４３９−４４（２００３）（これは参考として本明細書に援用される）に報告されているベクターが含まれる。更なる好適な発現ベクターが、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（これは参考として本明細書に援用される）において考察されている。
【０１７６】
通常、任意の宿主細胞において用いられる発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルス維持のための配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。これらの配列は、集合的に「フランキング配列」と称され、通常、１つ以上の次の機能的に結合したヌクレオチド配列：プロモーター、１つもしくはそれ以上のエンハンサー配列、複製開始点、転写終止配列、ドナーおよびアクセプター・スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域ならびに選択可能マーカー因子を含む。
【０１７７】
任意で、ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、コード配列の５’または３’端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得、オリゴヌクレオチド配列はポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉｓ）またはこれに対して市販の抗体が存在する別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ））もしくはｍｙｃをコードする。通常、タグは発現と同時に抗体タンパク質に融合され、宿主細胞由来の抗体の親和性精製のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、抗体を親和性マトリックスとしてのタグに対して用いて、カラムクロマトグラフィにより果たすことができる。任意で、タグは続いて種々の手段、例えば、切断のための特定のペプチダーゼを用いて、精製抗体ポリペプチドから除去することができる。
【０１７８】
発現ベクターにおけるフランキング配列は、同種（即ち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（即ち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（即ち、２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組合せ）、合成または天然でよい。そのようなものとして、フランキング配列の供給源は任意の原核または真核生物、任意の脊椎または無脊椎生物あるいは任意の植物であってよく、但し、フランキング配列は宿主細胞機構において機能的であり、宿主細胞機構により活性化され得る。
【０１７９】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該分野で周知の複数の方法の任意の方法により得られ得る。典型的には、本発明において有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。場合により、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が公知であり得る。本発明では、フランキング配列は、本明細書で述べられる、核酸合成またはクローニングのための方法を用いて合成され得る。
【０１８０】
すべてまたは一部分のみのフランキング配列が公知である場合、それは、ＰＣＲを用いて、かつ／あるいは同種または別種由来の好適なオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列断片を含むゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、得られ得る。フランキング配列が公知でない場合、フランキング配列を含むＤＮＡ断片が、例えば、コード配列または更には別の遺伝子もしくは遺伝子群を含み得る、より大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成され得、適切なＤＮＡ断片を生成し、次に、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ社、カリフォルニア州）または当業者には公知の他の方法を用いて単離する。この目的を果たすための好適な酵素の選択は、当業者には簡単に明らかとなるであろう。
【０１８１】
通常、複製開始点は、特に、市販購入される原核細胞発現ベクターの一部であり、該開始点は宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択ベクターが複製開始点部位を含まない場合、複製開始点部位は公知の配列に基づいて化学的に合成され、ベクターにライゲーションされ得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）由来の複製開始点は大部分のグラム陰性菌に好適であり、種々の開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）が哺乳動物細胞においてベクターをクローニングするのに有用である。一般的に、哺乳動物の複製開始点は哺乳動物細胞発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０開始点は単に初期プロモーターを含むという理由から使用されることが多い）。
【０１８２】
通常、本発明の発現およびクローニングベクターは、宿主生物により認識されるとともに、抗グルカゴン抗体をコードする核酸に機能的に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（即ち、５’）に位置する非転写配列である。従来、プロモーターは２クラス：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの一方に分類されている。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の有無または温度変化に応答してその制御下でＤＮＡからの転写のレベルの上昇を開始する。一方、構成的プロモーターは連続的遺伝子産物の産生を開始する；即ち、遺伝子発現に対する試験的制御はほとんどまたは全くない。種々の潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、あるいはポリメラーゼ連鎖反応によりプロモーターを増幅し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、抗グルカゴン抗体をコードするＤＮＡに機能的に結合される。
【０１８３】
酵母宿主で用いるのに好適なプロモーターも当該分野で周知である。酵母プロモーターには酵母エンハンサーが有利に用いられる。哺乳動物細胞で用いる好適なプロモーターは周知であり、限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を含む。他の好適な哺乳動物プロモーターは、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターを含む。
【０１８４】
本発明の組換え発現ベクターの実施に有用な特定のプロモーターは、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）を含む。更に使用可能なものは、組織特異性を示すとともにトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性を示すエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性を示すインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性を示すマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性を示すアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性を示すαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性を示すα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄細胞において活性を示すβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳内オリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）；ならびに、特に、リンパ球細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）である。
【０１８５】
エンハンサー配列はベクターに挿入され、高等真核細胞において抗グルカゴン抗体をコードする核酸の転写を増大させ得る。エンハンサーは、通常、約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性因子であり、プロモーターに作用して転写を増大させる。エンハンサーは比較的に配向および位置独立性である。エンハンサーは転写単位の５’および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から得られる複数のエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。ウイルス由来のエンハンサー配列も用いることができる。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが、真核細胞プロモーターの活性のための典型的なエンハンサー因子である。エンハンサーは核酸分子の５’または３’位置にてベクター中にスプライシングされ得るが、通常、プロモーターの５’部位に配置される。
【０１８６】
発現ベクターにおいて、通常、転写終止配列はポリペプチドコード領域端の３’に配置され、転写を終止する機能を果たす。通常、原核細胞における発現のために用いられる転写終止配列はＧ−Ｃに富む断片、続いてのポリＴ配列である。配列はライブラリーから容易にクローニングされ、あるいは更にはベクターの一部として市販購入されるが、本明細書で述べるような核酸合成法を用いて容易に合成することもできる。
【０１８７】
選択可能マーカー遺伝子因子は、選択培養媒体中で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。発現ベクターにおいて用いられる典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に対して抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンに対する耐性を付与し、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補い、あるいは（ｃ）複合媒体から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択可能マーカーの例には、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる。原核宿主細胞および真核宿主細胞における選択に細菌のネオマイシン耐性遺伝子を用いることもできる。
【０１８８】
他の選択遺伝子は発現される遺伝子を増幅するのに用いることができる。増幅は、特定の選択条件下で細胞の生存および増殖を可能にするのに十分に高いレベルにて単一コピーで発現することができない遺伝子が、歴代の組換え細胞の染色体内にタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な増幅可能な選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターを含まないチミジンキナーゼが含まれる。これらのマーカーの使用では、哺乳動物細胞形質転換体は選択圧下に置かれ、ベクターに存在する選択遺伝子により、形質転換体のみが特異的に生存に適応する。媒体中の選択因子の濃度が連続的に高められる条件下で形質転換細胞を培養することにより、選択圧が課され、これにより、選択遺伝子が増幅された細胞のみの生存が可能となる。これらの状況下、選択遺伝子に隣接するＤＮＡ、例えば、本発明の抗体をコードするＤＮＡは、選択遺伝子と共増幅される。その結果、増量した抗グルカゴンポリペプチドが増幅ＤＮＡから合成される。
【０１８９】
通常、リボソーム結合部位は、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガルノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）を特徴とする。通常、因子はプロモーターの３’および発現されるポリペプチドのコード配列の５’に位置する。
【０１９０】
場合により、例えば、真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合、グリコシル化または収率を向上させるため、種々のプレ配列を操作することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更することができ、あるいはプロ配列を付加することができ、これもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）１位に、発現に伴う１つ以上の完全には除去されていない場合がある付加アミノ酸を有し得る。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される、１または２個のアミノ酸残基を有し得る。あるいは、一部の酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域にて切断する場合、わずかに切頭されているが活性形態の所望のポリペプチドを生じさせ得る。
【０１９１】
市販の発現ベクターが上述のような所望のフランキング配列の一部を欠く場合、これらの配列をベクターに個々にライゲーションすることにより、ベクターを改変することができる。ベクターが選択され、所望のように改変された後、抗グルカゴン抗体をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入される。
【０１９２】
本発明の抗体またはその免疫学的に機能性の断片をコードする配列を含む完成ベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入される。抗グルカゴン−１抗体に対する発現ベクターの選択宿主細胞への形質転換は、周知の方法、例えば、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法または他の公知の技法を含む方法により達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞型の関数である。これらの方法および他の好適な方法は当業者には周知である。
【０１９３】
形質転換宿主細胞は適切な条件下で培養されると、抗グルカゴン抗体を合成し、これは、続いて、培養媒体から（宿主細胞が抗体を媒体に分泌する場合）、あるいは抗体を産生する宿主細胞から直接（抗体が分泌されない場合）回収することができる。適切な宿主細胞の選択は様々な因子、例えば、所望の発現レベル、活性に望ましく、もしくは必要なポリペプチドの改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物活性分子への折り畳みの容易性に依存する。
【０１９４】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得られる多くの不死化細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および他の多くの細胞株を含む。特定の実施形態では、特定のＤＮＡ構築物を発現させるのに最適な細胞株は、種々の細胞株を試験し、いずれが最大レベルの発現を有するとともにグルカゴン結合特性を有する抗体を産生するのかを決定することにより、選択され得る。
ＶＩＩ．例示的な治療有用性
ＧＬＰ−１に関連する種々の活性に照らし（背景技術を参照）、本明細書で述べられるＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、一般的に、１）インスリン放出を刺激し、２）血中グルコース濃度を低下させ、３）血漿中インスリン濃度を上昇させ、４）β細胞特異的遺伝子（例えば、ＧＬＵＴ−１トランスポーター、インスリン受容体およびヘキソキナーゼ−１）の転写を刺激し、５）β細胞のアポトーシスを阻害し、β細胞の増殖および複製を増大させることによってβ細胞量を増加させ、６）満腹感を誘発し、これにより、食物摂取を低減し、減量を促進し、７）胃液分泌を低下させ、８）胃排出を遅延させ、かつ、９）胃運動を低下させるのに用いることができる。
【０１９５】
従って、ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、限定されないが、Ｉ型もしくはＩＩ型糖尿病、耐糖能障害、インスリン抵抗性、潜在性自己免疫性成人型糖尿病（ＬＡＤＡ）、妊娠性糖尿病、代謝症候群および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）を含む、多くの異なる形態の糖尿病あるいはこれに密接に関連する疾患を処置するのに用いることができる。従って、ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、感染、ストレス、脳卒中に起因するインスリン感受性の低下または妊娠中に誘発される感受性の低下を有する患者を処置するのに用いることができる。処置可能な他のタイプの糖尿病は、糖尿病が別の内分泌性疾患、例えば、グルカゴノーマ、原発性アルドステロン症、クッシング症候群およびソマトスタチノーマに関連している糖尿病あるいは特定の薬物またはホルモン（例えば、エストロゲン含有医薬品、向精神薬、抗高血圧薬およびサイアザイド系利尿薬）の投与に起因して生じる糖尿病である。
【０１９６】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、例えば、高血圧、冠動脈疾患、脂質異常症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症および心筋梗塞を含む、種々の冠疾患ならびに脂質障害に関連する疾患を処置するのにも用いることができる。
【０１９７】
骨障害、骨粗鬆症および他の関連疾患もＧＬＰ−１化合物を含む組成物で処置することができる。
【０１９８】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物で処置することができる更なる疾患には、肥満症、過敏性腸症候群、脳卒中、術後代謝変化、心筋梗塞）および高血糖症が含まれる。ＧＬＰ−１化合物は鎮静剤としても用いることができる。
【０１９９】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は予防的に用いることもでき、上記一覧のような疾患を発症するリスクを有する個体の処置を含む。具体例として、化合物は、非インスリン依存性糖尿病のリスクまたは肥満症になるリスクを有する個体に予防的に投与することができる。このような個体には、例えば、耐糖能障害を有する個体、過体重個体および前述の疾患に対する遺伝的素因を有する個体（例えば、糖尿病の既往を有する家族の個体）が含まれる。
【０２００】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物で様々な異なる被験体を処置することができる。本明細書で用いられるような「被験体」または「患者」という用語は、通常、哺乳動物を指し、必ずしもその必要はないが、多くの場合、前述の疾患の一疾患のリスクにあり、あるいはリスクを有するヒトである。しかし、被験体は非ヒト霊長動物（例えば、類人猿、サル、ゴリラ、チンパンジー）であってもよい。被験体は霊長動物以外の哺乳動物、例えば、獣医動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタ）または実験動物（例えば、マウスまたはラット）であってもよい。
ＶＩＩ．医薬組成物
Ａ．組成物
本明細書で提供されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、治療有用性に関するセクションで挙げられた疾患の処置用に処方された医薬組成物中の活性成分として用いることができる。従って、開示されるＧＬＰ−１／抗体組成物は、上記一覧の用途を含む、様々な治療用途に用いる薬物の調製に用いることができる。
【０２０１】
ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物に加え、医薬組成物は、ＧＬＰ−１化合物が有用性を有する１つ以上の種々の疾患を処置するのに有用な１つ以上の他の治療剤も含むことができる。特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物と組み合わせることができる他の治療剤の一般的なクラスは、限定されないが、インスリン放出剤、グルカゴン分泌阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グルカゴン拮抗薬、抗肥満剤、カロリー摂取量を減少させる化合物、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、ステロイドもしくは非ステロイドホルモン、増殖因子および食物栄養素を含む。
【０２０２】
このようなさらなる治療剤は、例えば、高血糖症、糖尿病、高血圧、肥満症および骨障害を処置するための治療剤を含み得る。組成物中に含まれ得る、糖尿病を処置するための他の治療剤の例には、脂質障害を処置するのに用いられる治療剤が含まれる。このような治療剤の具体例には、限定されないが、胆汁酸金属イオン封鎖剤（例えば、コレスチラミン、リポスタビル、テトラヒドロリプスタチン）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、米国特許第４，３４６，２２７号；同第５，３５４，７７２号；同第５，１７７，０８０号；同第５，３８５，９２９号；および同第５，７５３，６７５号を参照）、ニコチン酸、ＭＴＰ阻害剤（例えば、米国特許第５，５９５，８７２号；同第５，７６０，２４６号；同第５，８８５，９８３号；および同第５，９６２，４４０号を参照）、リポキシゲナーゼ阻害剤、フィブリン酸誘導体、コレステロール吸収阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤（例えば、米国特許第４，８７１，７２１号；同第５，７１２，３９６号；および同第４，９２４，０２４号を参照）および回腸ナトリウム／胆汁酸共輸送体阻害剤が含まれる。組成物中に組み込むことができる他の抗糖尿病剤には、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ビグナイド、インスリン分泌促進剤、インスリン増感剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ−α作動薬、ＰＰＡＲ−γ作動薬が含まれる。
【０２０３】
ＧＬＰ−１類似体のＮ末端での切断を阻害するため、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤も含まれ得る。
【０２０４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共に、１つまたは複数の有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む。許容可能な処方材料は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。好ましい実施形態では、治療有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物が提供される。
【０２０５】
特定の実施形態では、許容可能な処方材料は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。
【０２０６】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘性、清澄性、色調、等張性、臭気性、無菌性、安定性、溶出または放出速度、吸着または侵入を改変し、維持し、あるいは保つための処方材料を含み得る。このような実施形態では、好適な処方材料は、限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌薬；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、芳香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール  ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈液；賦形剤ならびに／あるいは医薬補助剤を含む。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【０２０７】
特定の実施形態では、至適医薬組成物は、例えば、対象投与経路、送達様式および所望の用量に依って、当業者により決定される。例えば、上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。特定の実施形態では、このような組成物は、抗体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度およびインビボでのクリアランス率に影響を及ぼし得る。
【０２０８】
特定の実施形態では、医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は本来水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、おそらく、非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を補充された注射用の水、生理食塩水または人工脳脊髄液でよい。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水は、更なる例示的なビヒクルである。好ましい実施形態では、医薬組成物はｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、更に、ソルビトールまたはその好適な代替物を含み得る。特定の実施形態では、抗グルカゴン抗体組成物は、所望の純度を有する選択組成物を任意の処方材料（上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態での保存用に調製され得る。更に、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／抗体組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０９】
医薬組成物は非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は吸入または消化管を通じた送達、例えば、経口用に選択され得る。このような医薬的に許容可能な組成物の調製は当該分野の範囲内にある。
【０２１０】
処方成分は投与部位に対して許容可能な濃度にて存在することが好ましい。特定の実施形態では、生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、通常、約５〜約８の範囲のｐＨに組成物を維持するのに緩衝剤が用いられる。
【０２１１】
非経口投与が検討される場合、本発明において用いる治療用組成物は、医薬的に許容可能なビヒクル中のＧＬＰ−１化合物を含む所望の組成物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容可能な水溶液の形態にて提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、ＧＬＰ−１／抗体組成物が適切に保存された無菌等張液として処方される無菌蒸留水である。特定の実施形態では、調製は、デポー注射により送達可能な生成物の制御または持続放出を与えうる、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの薬物を含む所望の分子の処方を含み得る。特定の実施形態では、循環における持続時間を促進する作用を有するヒアルロン酸も用いられ得る。特定の実施形態では、所望のＧＬＰ−１／抗体組成物を導入するのに、埋め込み型薬物送達デバイスが用いられ得る。
【０２１２】
医薬組成物は吸入用に処方することができる。これらの実施形態では、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物は、吸入可能な乾燥粉末として有利に処方される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いても処方され得る。特定の実施形態では、溶液は噴霧状にされ得る。肺投与、従って、処方法が更に国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に述べられており、これは、参考として援用され、化学修飾されたタンパク質の肺送達について述べている。
【０２１３】
処方物を経口投与することができることも検討される。この様式で投与されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の調合に習慣的に用いられる担体の有無にかかわらず処方することができる。特定の実施形態では、バイオアベイラビリティが最大化され、全身移行前の分解が最小化される際に、消化管におけるポイントに処方物の活性部分を放出するようにカプセルが設計され得る。組成物の吸収を促進するため、追加の作用物質が含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤も用いられ得る。
【０２１４】
医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中の１つまたは複数の有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含むように提供されることが好ましい。錠剤を無菌水または別の適切なビヒクルに溶解することにより、単位剤形にて溶液が調製され得る。好適な賦形剤には、限定されないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸塩、ラクトースまたはリン酸カルシウム；あるいは結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；あるいは潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが含まれる。
【０２１５】
持続または制御送達処方物中のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む処方物を含む、更なる医薬組成物が当業者には明らかであろう。他の種々の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射を処方する技法も当業者には公知である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい；これは、参考として援用され、医薬組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出について述べている。持続放出型調製物は、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル形状の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出型マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第０５８４８１号に開示されているように；これらの各々は参考として援用される）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（上記Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号）を含み得る。持続放出型組成物は、当該分野で公知の複数の方法の任意の方法により調製可能なリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号；同第０８８，０４６号および第１４３，９４９号（参考として援用される）を参照されたい。
【０２１６】
通常、インビボ投与に用いられる医薬組成物は無菌調製物として提供される。滅菌は無菌濾過膜を通した濾過により成すことができる。組成物が凍結乾燥される際、この方法を用いた滅菌は凍結乾燥および復元の前後に行われ得る。非経口投与用の医薬組成物は凍結乾燥形態にて、あるいは溶液中に保存することができる。一般的に、非経口用組成物は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって突き通すことが可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【０２１７】
該医薬組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存され得る。このような処方物は即座に使用可能な形態または投与前に再構成される形態にて保存され得る。
【０２１８】
単回投与単位を作製するためのキットも提供される。キットは各々、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性処方物を有する第２の容器を含む。本発明の特定の実施形態では、事前に充填されたシングルおよびマルチチャンバーシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
Ｂ．用量
上述のように、医薬組成物は予防的および／または治療的処置のために投与することができる。一般的に、「有効量」は、症状の重症度および／または頻度の低下または排除ならびに／あるいは損傷の改善または修復である、所望の効果を果たすのに十分であるが非毒性の活性成分（例えば、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物）の量である量を指す。「治療有効量」は、病態または症状を改善し、あるいは疾患または他の任意の望ましくない症状の進行を予防し、阻止し、遅延させ、または逆行させるのに十分である量を指す。「予防有効量」は、病態または症状の開始を予防し、阻止し、または遅延させるのに有効である量を指す。
【０２１９】
一般に、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の毒性および治療有効性は、細胞培養および／または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができ、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な投与量）を求めることを含む。毒性作用と治療効果との投与量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が望ましい。
【０２２０】
細胞培養および／または動物試験から得られるデータは、ヒトに対する一連の用量を調剤するのに用いることができる。通常、活性成分の用量は、ほとんどあるいは全く毒性がないＥＤ５０を含む一連の循環濃度範囲内に並ぶ。使用剤形および使用投与経路に依存し、用量はこの範囲内で変動し得る。
【０２２１】
活性成分の投与量は、担当臨床医によって評価することができる様々な因子、例えば、疾患の重症度、処置被験体の年齢およびサイズならびに個々の疾患自体に依存する。しかし、一般的には、投与されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物自体の総量は、通常、１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。他の処置レジメンでは、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は５０μｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日または１００μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日にて投与される。
【０２２２】
投与頻度は使用処方物中の個々の組成物の薬物動態パラメータに依存する。通常、臨床医は投与量が所望の効果に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回投与として、あるいは経時的に２または３回投与として（同量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）、あるいは埋め込みデバイスまたはカテーテルによる継続注入として投与され得る。適切な投与量の更なる改善は、当業者により日常的になされ、当業者により日常的に実行される職務の範囲内にある。適切な用量は適切な用量応答データを用いることにより確認され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は長期間にわたって患者に投与することができる。組成物中の抗体の長期投与は、非ヒト動物におけるヒト抗原に対する抗体、例えば、非ヒト動物種において作製される非完全ヒト抗体または非ヒト抗体と一般的に関連する有害な免疫またはアレルギー応答を最小化する。
Ｃ．投与
本明細書で述べられる医薬組成物は種々の異なる方法で投与することができる。例として、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内および頭蓋内投与法により、医薬的に許容可能な担体を含む組成物を投与することが含まれる。
【０２２３】
経口投与では、活性成分は、固体剤形、例えば、カプセル、錠剤および粉末にて、あるいは液体剤形、例えば、エリキシル、シロップおよび懸濁液にて投与することができる。活性成分は、不活性成分および粉末状担体、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムと共にゼラチンカプセルに封入することができる。所望の色調、風味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の所望の特徴を付与するために添加され得る付加不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタンおよび可食白色インクである。圧縮錠剤を作製するのに同様の希釈剤を用いることができる。錠剤およびカプセルは共に、長時間にわたる薬物の継続的放出を付与するため、持続放出型製品として製造することができる。圧縮錠剤は不快な風味を隠すため、および、大気から錠剤を保護するために、糖衣し、またはフィルムコーティングし、あるいは消化管における選択的崩壊のために腸溶コーティングすることができる。経口投与用の液体剤形は患者の受容を高めるため、着色および芳香を含むことができる。
【０２２４】
活性成分は単独であるいは他の好適な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル処方物にすることができる（即ち、「噴霧状」にすることができる）。エアロゾル処方物は許容可能な加圧噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素中に入れることができる。
【０２２５】
直腸投与に好適な処方物は、例えば、坐薬基剤を含むパッケージングされた活性成分からなる坐薬を含む。好適な坐薬基剤は天然もしくは合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素を含む。さらに、例えば、液状トリグリセリド、ポリエチレングリコールまたはパラフィン炭化水素を含む基剤とパッケージングされた活性成分との組合せからなるゼラチン直腸カプセルを用いることも可能である。
【０２２６】
非経口投与、例えば、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路に好適な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および処方物を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張性無菌注射液ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。
【０２２７】
医薬組成物を処方するのに用いられる成分は、高純度であって、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくとも国内食品（ＮＦ）グレード、一般的には分析グレード、より典型的には少なくとも医薬品グレード）ことが好ましい。更に、インビボでの使用を目的とする組成物は、通常、無菌である。所定の化合物が使用前に合成される必要がある限り、典型的に、生じる生成物は、合成または精製プロセスの間に存在し得る潜在的毒物、特に、エンドトキシンを実質的に含まない。非経口投与用の組成物も無菌で実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。
【０２２８】
実施試験および得られた結果を含む以下の実施例は、単に例示的な目的として示されるものであり、本発明を限定するものと捉えるべきではない。
【実施例】
【０２２９】
実施例１：グルカゴンに対するヒトモノクローナル抗体の作製
グルカゴンに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、各々がヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウス系を用いてＭｅｄａｒｅｘ社によって調製された。このようなモノクローナル抗体を調製する方法は、Ｃｈｅｎら（１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）および国際特許出願公報第ＷＯ０１／０９１８７号（参考として援用される）の実施例１に述べられている。Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号および同第５，５４５，８０７号ならびに国際特許出願公報第ＷＯ０１／０９１８７号（参考として援用される）の実施例２も参照されたい。
【０２３０】
グルカゴンに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するため、ＨｕＭａｂマウスを精製組換えヒトグルカゴンで免疫化した。免疫化の方法は、国際特許出願公報第ＷＯ０４／０３５７４７；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；上記Ｆｉｓｈｗｉｌｄらおよび国際特許出願公報第ＷＯ９８／２４８８４に述べられており、これらの各々の教示は参考として援用される）。
【０２３１】
抗グルカゴンヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを用いて、ハイブリドーマ細胞においてモノクローナル抗体を産生させた。このようなハイブリドーマを生成する方法は、国際特許出願公報第ＷＯ０４／０３５７４７号において考察されている。ハイブリドーマのスクリーニングから選択した抗体をＡＧ１５９と指定した。その抗体を選択した理由の１つは、インビトロおよびインビボにてグルカゴンを中和し得るためであった。
【０２３２】
実施例２：抗グルカゴン抗体の軽鎖および重鎖のクローニング
グルカゴン結合モノクローナル抗体ＡＧ１５９を発現するハイブリドーマを供給源として用い、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡを単離した。伸長アダプターを有するランダムプライマー（５’−ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＮ  ＮＮＮ  ＮＮＴ−３’；配列番号１０１）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を行った。
【０２３３】
軽鎖をコードする完全なｃＤＮＡを調製するため、順方向プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ネスト化プライマー（５’ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’；配列番号１０２）であり、逆方向プライマーは、ヒトκ鎖の３’非翻訳領域に見出されるｃＤＮＡ配列の保存領域を認識するように設計した（５’−ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＧＧ−３’；配列番号１０３）。
【０２３４】
可変領域重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するため、順方向プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ネスト化プライマー（５’ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’；配列番号１０４）であり、逆方向プライマーは、ヒトＩｇＧ鎖のＦｃ領域におけるコード配列における保存領域を認識するように設計した（５’−ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  Ｇ−３’；配列番号１０５）。
【０２３５】
ＲＡＣＥ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。コンセンサスＤＮＡ配列を決定し、完全長κ鎖および可変領域重鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計するのに用いた。
【０２３６】
ＶＫ−１シグナルペプチド配列（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ  ＲＣ；配列番号１０６）を含むように、成熟軽鎖をコードするＤＮＡ配列を伸長させるのに一連のプライマーを用いた。最初の５’プライマーはシグナルペプチドの最後の７個のアミノ酸および成熟軽鎖の１４個のアミノ酸をコードし（５’−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＣ−３’；配列番号１０７）、３’逆方向プライマーはカルボキシル末端および終止コドンならびにＳａｌＩ制限部位をコードした（５’−ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  Ｃ−３’；配列番号１０８）。シグナルペプチドの１５個のアミノ酸をコードする５’プライマー（５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ−３’；配列番号１０９）および前に使用したものと同じ逆方向プライマーを用いて、生じた生成物を更に増幅した。シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および至適Ｋｏｚａｋ配列をコードする５’プライマー（５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ−３’；配列番号１１０）および同一の逆方向プライマーを用いて、最終反応を行った。生じたＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、ゲルで単離し、哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲａ１９にライゲーションした（国際出願公報第ＷＯ９０／４１３６３号を参照；任意の目的で参考として本明細書に援用される）。
【０２３７】
ＶＫ−１シグナルペプチド配列（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ  ＲＣ；配列番号１０６）を含むように、成熟重鎖をコードするＤＮＡ配列を伸長させるのに一連のプライマーを用いた。最初の５’プライマーはシグナルペプチドの最後の７個のアミノ酸および成熟重鎖の６個のアミノ酸をコードし（５’−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  Ｇ−３’；配列番号１１１）、３’逆方向プライマーは天然センス鎖ＢｓｍＢＩ部位を含む可変領域のカルボキシル末端をコードした（５’−ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＣＣ−３’；配列番号１１２）。シグナルペプチドの１５個のアミノ酸をコードする５’プライマー（５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ−３’；配列番号１１３）および前に使用したものと同じ逆方向プライマーを用いて、生じた生成物を更に増幅した。シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および至適Ｋｏｚａｋ配列をコードする５’プライマー（５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ−３’；配列番号１１４）および前述の逆方向プライマーを用いて、最終反応を行った。生じたＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ゲルで単離し、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲａ１９にライゲーションした。
ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ＡＧ１５９抗体鎖融合遺伝子の構築
上流ＸｂａＩ部位をコードするＤＮＡ配列、至適Ｋｏｚａｋ配列、ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ペプチドおよびリンカー配列および独特の制限部位を含むＡＧ１５９  ＬＣもしくはＨＣ  ｃＤＮＡの一部を、Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社（テキサス州ヒューストン）により合成した（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＧＧＧＧＧＧ；配列番号１１５）。κ鎖に対する天然の独特なＫｐｎＩ部位を用い、合成遺伝子由来のＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片を用いてＡＧ１５９κ鎖ｐＤＳＲａ１９構築物における同義断片を置換し、ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ融合遺伝子を得た。同様に、ＡＧ１５９重鎖ＤＮＡ配列における天然の独特なＰｖｕＩＩ部位を用い、合成ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ＤＮＡ配列をＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、ＡＧ１５９重鎖構築物における同義断片を置換するのに用いてＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ１重鎖融合遺伝子を作製した。
【０２３８】
ＩｇＧ１定常領域を含むＢｓｍＢＩ−ＳａｌＩ断片を、ＰＣＲによって増幅されたＩｇＧ２定常領域に置換することにより、ＡＧ１５９の重鎖定常領域のアイソタイプをＩｇＧ１からＩｇＧ２に転換し、遺伝子の５’および３’末端に同様の制限部位を生成した。
ＡＧ１５９κ軽鎖およびＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ軽鎖発現プラスミドの構築
完全長ＡＧ１５９  ＬＣを、プライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、クローニングを目的として遺伝子の一端に新規制限部位を導入した。５’プライマーは、ＳａｌＩ制限部位、至適Ｋｏｚａｋ配列およびＶＫ−１シグナル配列のアミノ末端を含み（５’−ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ−３’；配列番号１１６）、一方、３’プライマーはカルボキシル末端および終止コドンならびにＮｏｔＩ制限部位をコードした（５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡ−３’；配列番号１１７）。生じた断片を精製し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、発現ベクターｐＤＣ３２３およびｐＤＳＲα２４にクローニングした。ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ構築物をテンプレートとして用いて同じプロセスを実施した。
ＡＧ１５９  ＩｇＧ１，ＡＧ１５９  ＩｇＧ２，ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ１およびＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２の重鎖発現プラスミドの構築
ＳａｌＩ部位、至適Ｋｏｚａｋ配列およびシグナル配列（上述の配列番号１０６）のアミノ末端をコードする５’プライマーならびにカルボキシル末端、終止コドンおよびＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマーを用いたＰＣＲにより、上述のＡＧ１５９  ＩｇＧ１重鎖可変領域を増幅した（５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡ−３’；配列番号１１８）。生じたＰＣＲ断片を精製し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲルで単離し、発現ベクターｐＤＣ３２４およびｐＤＳＲα２４にクローニングした。上述のＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ１、ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２構築物をテンプレートとして用いて同じプロセスを実施した。
異種ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ鎖突然変異体の構築
融合タンパク質からのタンパク質分解的切断に対してＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）ペプチドを保護するため、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異（ｍｕｔａｇｅｎｅｉｓ）により、変更を行った。ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ鎖ＤＮＡ配列をテンプレートとして用いて、ＰＣＲを行い、リンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列に新規ＢａｍＨＩ制限部位を導入した。ＢａｍＨＩ部位を含む順方向プライマー（５’−ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＧＣＴ−３’；配列番号１１９）および前述のＫｐｎＩ部位を含む配列領域に対してアニーリングした逆方向プライマー（５’−ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ−３’；配列番号１２０）を用いて、リンカーおよびＡＧ１５９  ＬＣの最初の３５個のアミノ酸をコードする領域を増幅した。ＸｂａＩ制限部位の上流のベクタープロモーター領域においてアニーリングした５’プライマー（５’−ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ−３’’；配列番号１２１）を、所望の変更およびＢａｍＨＩ制限部位を含む特異的３’プライマー（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ−３’；配列番号１２２）、（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＡ−３’；配列番号１２３）、（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＡＧＣ−３’；配列番号１２４）、（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ−３’；配列番号１２５）と組み合わせた。別個のＰＣＲ生成物を精製し、適切な制限酵素（ＸｂａＩとＢａｍＨＩまたはＢａｍＨＩとＫｐｎＩ）で消化し、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化されたＡＧ１５９  ＬＣ  ＤＮＡを含む発現ベクターｐＤＳＲα２０にライゲーションした。
【０２３９】
実施例３：インビトロアッセイ
グルカゴン受容体機能性レポーターのアッセイ
中和活性を有する化合物／抗体組成物を同定するため、ヒトまたはラットグルカゴン受容体を発現するレポーター細胞株を作製した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現増強により、ｃＡＭＰ濃度の上昇を測定した。簡潔に述べると、サイクリックＡＭＰ濃度によって調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を保持することに加え、ラットまたはヒトグルカゴン受容体を発現するＣＨＯＫ１細胞を、アッセイの２日前にプレーティングし、次に、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。アッセイ前の夜間に細胞を洗浄し、媒体を、０．５％プロテアーゼ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清非含有媒体に取り換え、次いで、一晩培養した。ヒトまたはラットグルカゴン受容体を発現する細胞それぞれについて、０．５％プロテアーゼ非含有ＢＳＡおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含む媒体にて３７℃で６時間、細胞を１ｎＭまたは０．１ｎＭグルカゴンを含む一連の濃度の試験される組成物に曝した。ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解物をアッセイした。ルシフェラーゼ活性はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州Ｍａｒｉｅｔｔａ）を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた化合物濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」はグルカゴン刺激性活性が５０％低下する時点での化合物／抗体組成物の濃度を表す。
ＧＬＰ−１受容体機能性レポーターのアッセイ
ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の効力を比較するため、ヒトまたはマウスＧＬＰ−１受容体を発現するレポーター細胞株を作製した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現増強により、ｃＡＭＰ濃度の上昇を測定した。簡潔に述べると、サイクリックＡＭＰ濃度によって調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を保持することに加え、マウスまたはヒトＧＬＰ−１受容体を発現するＣＨＯＫ１細胞を、アッセイの２日前にプレーティングし、次に、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。アッセイ前の夜間に細胞を洗浄し、媒体を、０．５％プロテアーゼ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清非含有媒体に取り換え、次に、一晩培養した。０．５％プロテアーゼ非含有ＢＳＡおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含む媒体にて３７℃で６時間、細胞を一連の濃度の試験される組成物またはＧＬＰ−１に曝した。ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解物をアッセイした。ルシフェラーゼ活性はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州Ｍａｒｉｅｔｔａ）を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた化合物濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」は最大活性の５０％が得られる時点でのＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の濃度を表す。
膜調製
ヒトまたはマウスＧＬＰ−１受容体（あるいはラットまたはヒトグルカゴン受容体）を発現するＣＨＯＫ１細胞を、ＰＢＳを用いた１５０ｍｍ培養皿から採取した。１５００ｒｐｍで１０分、細胞を沈降させた。電動式ガラス装着Ｔｅｆｌｏｎホモジナイザを用いて、１５ｍｌの氷冷スクロース緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３２Ｍスクロース、アジ化ナトリウム０．２５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）中で生じたペレットを均質化した。そのホモジネートを４８，０００×ｇ、４℃で１０分、遠心分離し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて２５ｍｌアッセイ緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ非含有ＢＳＡ１０ｍｇ／ｍｌ、ＳＴＩ  ０．１ｍｇ／ｍｌおよびＰｅｆａｂｌｏｃ  ０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、次に、４８，０００×ｇで１０分、再度遠心分離した。ペレットをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒを用いて１５ｍｌアッセイ緩衝剤中で３回目にて均質化し、再度、４８，０００×ｇで１０分、遠心分離した。生じたペレットを湿重量濃度４ｍｇ／ｍｌにてアッセイ緩衝剤中で再懸濁させた。
リガンド結合アッセイ
９６ウェルＵ底プレートにて結合アッセイを行った。総容量１００μｌにて一連の濃度の試験される組成物またはＧＬＰ−１（またはグルカゴン）で、０．２ｎＭ  １２５Ｉ−ＧＬＰ−１（または０．２ｎＭ  １２５Ｉ−グルカゴン）を含むアッセイ緩衝剤（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マサチューセッツ州ボストン）中で膜（組織２００μｇ）を室温で２時間インキュベートした。さらに、１μＭ非標識ＧＬＰ−１存在下で非特異的結合を評価した。０．５％ポリエチレンイミンに予め浸漬したＵｎｆｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタープレート（ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ  １９６  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、コネティカット州Ｓｈｅｌｔｏｎ）を通した迅速な濾過により、反応を終了し、次に、３００μｌの低温５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションおよび蛍光計数器（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、コネティカット州Ｓｈｅｌｔｏｎ）を用いて結合放射能を定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」は最大の特異的１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（または１２５Ｉ−グルカゴン）結合を５０％低下させる化合物の濃度を表す。
【０２４０】
実施例４：ＡＧ１５９抗体のグルカゴン中和活性
抗体可変領域をｃＤＮＡからクローニングし、ハイブリドーマから精製した抗体の質量分光学的分析によって確認した。クローニングしたＡＧ１５９が受容体結合および受容体活性化アッセイにおいてグルカゴン中和活性を有し、かつ糖尿病マウスモデルにおいて血中グルコースを低下させることを実証した（図１１〜１３）。図１１では、グルカゴン刺激性レポーター活性のＡＧ１５９による中和を示す。組換えグルカゴン受容体を発現する細胞を、一連の濃度のＡＧ１５９または対照ＩｇＧに加え、０．１ｎＭグルカゴンでインキュベートした。このアッセイにおけるＡＧ１５９のＩＣ５０は４ｎＭである（図１１）。図１２では、グルカゴン受容体を組換え的に発現する細胞の粗膜画分を、一連の用量のＡＧ１５９または対照抗体と共に２００ｐＭ  １２５Ｉ−グルカゴンでインキュベートした。この１２５Ｉ−グルカゴン結合アッセイにおけるＡＧ１５９のＩＣ５０は０．２ｎＭである（図１２）。図１３はＡＧ１５９に応答したｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定したグルコース濃度を示す。
【０２４１】
実施例５：インビボアッセイ
供給血中グルコースに関して組成物を更に検討するため、このスクリーニングではｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルを用い、血中グルコース濃度がベースライン濃度に戻るまで１、２、４、６および２４時間時に、あるいは２４時間毎にこの測定をモニタリングした。ｄｂ／ｄｂマウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社からＪＡＸ（登録商標）ＧＥＭＭ（登録商標）系−偶発突然変異コンジェニックマウスとして市販されており、糖尿病偶発突然変異（Ｌｅｐｒｄｂ）と同型である。これらのマウスは３〜４週齢頃に識別可能に肥満になる。この試験に加わるための本発明者らの各マウスに対する選択基準は、少なくとも３００ｍｇ／ｄＬの血中グルコースである。８．５週齢（長期１〜２週試験用）から約１０〜１１週齢（急性１〜３日試験用）のｄｂ／ｄｂマウスに、各被験分子を１回（急性試験）あるいは複数回（長期試験）注射した。試験当日、午前９時（ベースライン値）にマウスの採血を行い、次に、即座に注射担当者に手渡し、次に、注射担当者は適切なＧＬＰ−１構築物または陽性／陰性対照を注射する。次に、摂食行為に関連する血中グルコース濃度の変動性を制限するため、餌を与えずに新鮮ケージ内にマウスを入れる。通常、１時間、４時間、６時間および２４時間時の血中グルコース濃度を測定する。２４時間時において血中グルコース値が開始時未満であると、血中グルコースがベースライン濃度に戻るまで２４時間ごとに血中グルコース濃度を測定する。６時間時後、マウスに通常の餌を与えた。
【０２４２】
１０〜１２週齢のＣ５７Ｂ１６（正常な細身）マウスを用いた。これらのマウスは任意の供給メーカー、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社またはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社を通じて市販されており、正常であるとみなされる。「細身」という用語は、これらのマウスを肥満型ｄｂ／ｄｂマウスと対比するのに用いられる。Ｃ５７Ｂ１６マウスを体重に関して無作為化した。ベースライン血中グルコースを測定するため、午前９時の採血を行い、化合物またはＰＢＳを投与し、その後、餌を与えずにケージ内にマウスを入れた。４〜５時間後、２ｇ／ｋｇのグルコース投与量を用いて腹腔内グルコース負荷試験（グルコース負荷試験ではグルコースを代謝する体能を測定する）を行った。血中グルコース濃度はグルコース負荷の投与後３０分および９０分時ならびに２４時間時あるいは血中グルコース濃度が初期値に回復するまで測定した。これらの試験から、グルコースを用いる際の陰性対照ＰＢＳと対照的なＧＬＰ−１作用の増強効果が認められる。
【０２４３】
実施例６：ＡＧ１５９抗体の結合活性
抗体可変領域をｃＤＮＡからクローニングし、ハイブリドーマから精製した抗体の質量分光学的分析によって確認した。クローニングしたＡＧ１５９が受容体結合および受容体活性化アッセイにおいてグルカゴン中和活性を有することを実証した。ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）をＡＧ１５９の軽鎖または重鎖のＮ末端と融合した（上記実施例２を参照）。プラスミドをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションし、完全長融合タンパク質を生成した。生じた抗体構造は、ＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２であった。インビトロでの分析により（実施例３を参照）、この２つの融合タンパク質は同等の結合（ヒト受容体に対してＩＣ５０５〜１０ｎＭ）および活性化（ヒト受容体の活性化ではＥＣ５０＝０．１ｎＭ、マウス動物受容体では５ｎＭ）を有することが示された。更に、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）を軽鎖と融合した抗体構築物は、グルカゴン存在下でヒト受容体を活性化することも示された。さらに、融合抗体がＧＬＰ−１受容体存在下で依然としてグルカゴンを中和する活性を示すことを立証した。これらのインビトロデータは、融合ＧＬＰ−１類似体が二機能性であることを示した。
【０２４４】
更に詳細には、ＧＬＰ（Ａ２６）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）をアッセイし、構築物がグルカゴン存在下でＧＬＰ−１受容体結合特性を維持するかを決定した。０、１、１０または１００ｎＭグルカゴンを加え、上述のようにリガンド結合アッセイを行った。図１に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９はグルカゴン存在下でヒトＧＬＰ−１受容体への１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合に匹敵する。
【０２４５】
別の試験では、グルカゴン存在下でのＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性について、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を評価した。一連のグルカゴン濃度を加え、上述の実施例３のようにＧＬＰ−１Ｒレポーターアッセイを行った。図２に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９はグルカゴン存在下でヒトＧＬＰ−１受容体を活性化する。このグラフではグルカゴン単独による（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を含まない）ＧＬＰ−１受容体の活性化の用量応答曲線も示している（−−−−−）。
【０２４６】
図２に提示するデータは図３と異なる形態で示されている。図３では、残余活性がグルカゴンに起因するように、特定のＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９濃度（グルカゴンを含まない）に起因する活性を、それぞれのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９濃度に関し、グルカゴンの全投与量に対する総活性から差し引いた。図３に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９の存在は、用量依存的にグルカゴンに誘発される活性を低下させる。
【０２４７】
実施例７：異種ＧＬＰ−１類似体を含む抗体融合体による結果
上記実施例において説明したように、ＧＬＰ−１化合物とＡＧ１５９との様々な融合体を調製し、それらの結合能の試験を行った。下記表８は天然ＧＬＰ−１のＣ末端が修飾された複数の融合タンパク質の結果を示す（融合のための配列は表１および７に一覧表示されている）。
【０２４８】
表８
【０２４９】
【表８】
2009534424.tif 000013
タンパク質分解を低減するため、グリコシル化コンセンサス部位（ＮＴＸ）の導入が切断部位を保護するかを検討する目的で、上述のように一連の置換改変体ＧＬＰ−１類似体を設計した。さらに、グルタミンのヘリカル構造性向が切断特性からの精製および保護を伴ったより安定したペプチドを促進し得るという理論により、選択位置においてグルタミン残基に置換した。これらのＧＬＰ−１類似体をＡＧ１５９の軽鎖と融合し、試験を行った（これらの融合のための配列は表１および７に一覧表示されている）。表９に結果を示す。
【０２５０】
表９：グルタミンおよびグリコシル化ＧＬＰ−１化合物／抗体融合体
【０２５１】
【表９−１】
2009534424.tif 000014
【０２５２】
【表９−２】
2009534424.tif 000015
実施例８：インビボでの結果
ＡＧ１５９および異種ＧＬＰ−１類似体を含む多くの異種融合分子を用いて試験を行い、時間の関数として血中グルコース濃度を低下させるそれらの能力を判定した。これらの試験は実施例３に記載するように行い、Ｄｂ／ｄｂマウスに異なる組成物を１回注射した（異なる類似体の配列は表１および７に示されている）。
【０２５３】
図４は種々のＧＬＰ−１化合物／ＡＧ１５９融合の結果を示す。抗体融合体は、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）または以下のＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合したＧＬＰ−１ペプチドの１つを含んだ：Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ（配列番号２８）、Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ（配列番号２３）、Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号９）およびＡ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号１２）。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と組み合わせ、以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。投与量は１２ｕｇ／マウスであった。これらの融合のための配列は上記表１および７に一覧表示されている。
【０２５４】
図４において認められるように、血中グルコースは大部分の類似体に関して１時間時に低下し、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２が最大の血中グルコース低下作用を示した。血中グルコース濃度は単回注射の２４後にベースラインに戻った。最大効果は単回注射の４〜６時間後に認められた。
【０２５５】
ＡＧ１５９ＬＣと融合した別の一連のＧＬＰ−１ペプチドを用いて、別の一連の試験を行った。試験された抗体融合体は以下のＧＬＰ−１ペプチドを含んだ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）（配列番号３１）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）（配列番号２９）およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）（配列番号２８）。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と組み合わせ、以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。この例における投与量は１ｍｇ／ｋｇであった。
【０２５６】
図５において認められるように、各被験類似体では、血中グルコースは単回注射後の最初の６時間低下し、単回注射の２４時間後にベースラインに戻った。最大効果は単回注射の４〜６時間後に認められた。
【０２５７】
実施例９：応答曲線
実施例３に記載したようなｄｂ／ｄｂマウスを用いてインビボでの用量応答測定を行った。一試験で用いた組成物はＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）がＡＧ１５９のＬＣと融合した組成物であり、抗体ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２を得た（配列については表８を参照）。投与量は７ｕｇ、１２ｕｇまたは２５ｕｇであった。
【０２５８】
図６において認められるように、血中グルコース濃度は用量依存的に低下することが見出された。これらの結果は組成物が作用機序に基づいて作用するということも示している。
【０２５９】
ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）類似体（配列番号４）をＡＧ１５９  ＬＣと融合し、抗体ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＨＣ  ＩｇＧ２が得られた組成物を用いて、正常マウスにおいて別の用量応答試験を行った。この組成物の用量応答は、グルコース負荷試験（図７）時のグルコース注射後３０分時点ならびに抗体組成物の注射後２４および４８時間後でより明らかであった。この用量応答は正常血糖マウスにおいて実施したため、多少、最小限の効果である。高血糖動物モデル（ｄｂ／ｄｂマウス）においてよりも、血中グルコースが正常な動物モデルにおいて血中グルコースを低下させることはより手腕が問われる。
【０２６０】
実施例１０：ＬＣ対ＨＣと融合したＧＬＰ−１のインビボでの比較
この試験は、ＧＬＰ−１化合物のＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣへの結合が活性差をもたらすかを判定するように設計した。被験構築物は、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）をＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣのいずれかに結合し、以下の２つの抗体構築物ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）  ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ）およびＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ−１−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＨＣ）として得られたものであった。図８において認められるように、両構築物は血中グルコース濃度を低下させるのに本質的に同等に有効であった。
【０２６１】
実施例１０：細身マウスＧＴＴ試験
ＧＬＰ−１類似体Ａ２Ｇ／Ｒ３０ＧをＡＧ１５９と融合して抗体構築物ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＨＣ  ＩｇＧ２または単にＲ３０Ｇとして得られた融合タンパク質に関して別の試験を行った（配列については表１および７を参照）。この試験は、Ｒ３０Ｇが正常マウスにおいて長期間、血中グルコースを低下し得るかを判定するために行った。有効性枠に関する読み取りを増加できるように、試験設計にグルコース負荷試験を加えた。
【０２６２】
Ｃ５７Ｂ１６マウスを体重に関して無作為化した。午前９時の採血を行ってベースライン血中グルコース濃度を定量し、それからＲ３０ＧまたはＰＢＳを投与した。４〜５時間の絶食後、投与量２ｇ／ｋｇを用いて腹腔内グルコース負荷試験を行った。血中グルコース濃度は、グルコース負荷後３０分および９０分時ならびに血中グルコース濃度が初期値に回復するまで２４時間毎に測定した。図９に示すように、Ｒ３０Ｇ組成物を用いた処置により、耐糖能が向上した。
【０２６３】
実施例１２：多回投与試験
あるＧＬＰ−１化合物に関する問題点は、多回注射後に有効性を失いうるということである（タキフィラキシーの判定）。ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＨＣ  ＩｇＧ２抗体または単にＲ３０Ｇを用いて別の試験を行い、それがこの分子にも当てはまるかを判定した。実施例５に記載のように、１日目に細身マウスにおいてＲ３０Ｇを注射した。１回目の注射の４時間後、最大有効性を示すためにグルコース負荷試験を行った。２日および３日目のビヒクルまたは化合物を注射した。４日目にビヒクルまたは化合物の注射の４時間後、２回目のグルコース負荷試験を行った。
【０２６４】
図１０に示すように、顕著なタキフィラキシーが認められないことは明らかであった。従って、Ｒ３０Ｇは１回目のグルコース負荷試験時と同様に、２回目のグルコース負荷試験時に血中グルコースを低下させるのに有効であった。
【０２６５】
本明細書で述べた実施例および実施形態は単に例示を目的とするものであり、また、それらに照らした種々の改変または変更は当業者に示唆されるものであって、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用した文献、特許および特許出願はすべて、個々の文献、特許または特許出願が参考としてそのように援用されることを具体的かつ個別的に示唆されるかのようにと同じ程度に、あらゆることを目的としてそれらの全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】グルカゴン存在下でＧＬＰ−１受容体結合特性を維持し得るかを判定するためのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）構築物のアッセイを示すグラフである。０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのグルカゴンを加え、実施例に記載のようにリガンド結合アッセイを行った。
【図２】グルカゴン存在下でのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を判定するためのアッセイを示すグラフである。このグラフではグルカゴン単独による（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を含まない）ＧＬＰ−１受容体の活性化の用量応答曲線も示している（−−−−−）。
【図３】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）の存在が、グルカゴンに誘発される活性を用量依存的に低下させることを示すグラフである。
【図４】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）がＡＧ１５９の軽鎖と融合した構築物）および他の種々の抗体融合体の結果を示すグラフである。抗体融合体は、ＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合した以下のＧＬＰ−１ペプチド：Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ（配列番号２８）、Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ（配列番号２３）、Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号９）およびＡ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号１２）；を含んだ。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と対にして以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。投与量は１２ｕｇ／マウスであった。
【図５】、血中グルコースが、試験された組成物の各々について、単回注射後の最初の６時間低下し、単回注射の２４時間後にベースライン濃度に戻ったことを示すグラフである。試験された抗体融合体はＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合した以下のＧＬＰ−１ペプチド：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）（配列番号３１）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）（配列番号２９）およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）（配列番号２８）；を含んだ。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と対にして以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。
【図６】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２が用量依存的に血中グルコース濃度を低下させたことを示すグラフである。
【図７】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）がＡＧ１５９の軽鎖と融合し、そしてＡＧ１５９の重鎖と対になって抗体融合ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２を与える組成物を用いてグルコース負荷試験によってチャレンジされた正常マウスにおいて行われた、用量応答試験を示すグラフである。
【図８】生じる抗体がそれぞれ、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（図８ではＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣと称される）およびＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（図８ではＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＨＣと称される）であるように、ＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣのいずれかに対するＧＬＰ（Ａ２Ｇ）の結合における活性差を示すグラフである。両構築物は血中グルコース濃度を低下させるのに同等に有効であった。
【図９】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２で処置されたマウスにおける血中グルコース濃度を示すグラフである。血中グルコースは、血中グルコース濃度が初期値に戻るまで、グルコース負荷試験の間において２４時間毎に測定した。
【図１０】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２で処置されたマウスにおけるタキフィラキシー試験の結果を示すグラフである。
【図１１】グルカゴン刺激性レポーター活性のＡＧ１５９による中和を示すグラフである。
【図１２】ＡＧ１５９がヒトグルカゴン受容体に対する１２５Ｉ−グルカゴンの結合を破壊することを示すグラフである。
【図１３】ＡＧ１５９がｏｂ／ｏｂマウスにおいて血中グルコース低下させることを示すグラフである。
【図１】
2009534424.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月16日(2008.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）グルカゴンに結合する抗体と、
（ｂ）グルカゴンに結合する該抗体に結合したＧＬＰ−１化合物と
を含み、該ＧＬＰ−１化合物がＧＬＰ−１活性を有する、組成物。
【請求項２】
前記抗体が中和抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）前記抗体が、（ｉ）重鎖可変領域および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、
（ｂ）前記ＧＬＰ−１化合物が、該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−１化合物が前記軽鎖可変領域に結合される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、前記軽鎖可変領域のアミノ末端に結合される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＧＬＰ−１化合物と前記軽鎖可変領域とがリンカーによって結合される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１化合物が前記重鎖可変領域に結合される、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、前記重鎖可変領域のアミノ末端に結合される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＧＬＰ−１化合物と前記重鎖可変領域とがリンカーによって結合される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが化学的結合体化により結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが合成リンカーを介して結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とがペプチドリンカーを介して結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体と前記ＧＬＰ−１化合物とが融合タンパク質を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体が複数のＧＬＰ−１化合物に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が多数の異なるＧＬＰ−１化合物に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン３またはエキセンジン４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＧＬＰ−１化合物が、エキセンジン−３またはエキセンジン−４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＧＬＰ−１化合物が、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
（式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略される）
を含むＧＬＰ−１ペプチドを含み、該化合物が、ＧＬＰ−１活性を有する、請求項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体が：
（ａ）配列番号７９と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；あるいは
（ｂ）配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；あるいは
（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨ
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗体が、配列番号７９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬおよび配列番号８３と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗体が、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＶＬおよび配列番号８３のアミノ酸配列を有するＶＨを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体が：
（ａ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｂ）配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖；あるいは
（ｃ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗体が二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖からなる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または（Ｆａｂ’）２である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【請求項３５】
ＧＬＰ−１ペプチドに結合されたグルカゴン結合抗体軽鎖可変領域を含む、ポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号４１〜７４または１２９の任意のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
請求項３６に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。
【請求項３８】
ＧＬＰ−１化合物に結合されたグルカゴン結合抗体重鎖可変領域を含む、ポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。
【請求項４１】
医薬的に許容可能な担体ならびに有効量の請求項１、２４または３０に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
代謝障害を有する被験体を処置するための、請求項４１に記載の組成物であって、該代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、組成物。
【請求項４３】
被験体においてインスリンの発現を増強するための、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
被験体においてインスリン分泌を促進するための、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
代謝障害を有する被験体を処置するための、請求項１、２４または３０に記載の組成物であって、該代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、組成物。
【請求項４６】
被験体においてインスリンの発現を増強するための、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【請求項４７】
被験体においてインスリン分泌を促進するための、請求項１、２４または３０に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願６０／７９３，６９０号（２００６年４月２０日出願）（これは、全ての目的のためにその全体が本明細書に参考として援用される）に基づく利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）および関連ペプチドグルカゴンは、プログルカゴンの分化プロセシングにより産生され、相反する生物活性を有する。プログルカゴン自体は、膵臓のα細胞ならびに主に遠位小腸および結腸に位置する腸内分泌Ｌ細胞において産生される。膵臓ではグルカゴンはプログルカゴンから選択的に切断される。腸では対照的に、プログルカゴンはプロセシングされてＧＬＰ−１およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）を形成し、これらはそれぞれ、プログルカゴンのアミノ酸残基７８〜１０７および１２６〜１５８に対応する（例えば、非特許文献１ならびに非特許文献２を参照）。従来、ＧＬＰ−１のアミノ酸の番号付けは、プログルカゴンの切断から形成されるＧＬＰ−１（１−３７）に基づいている。生物学的活性型はこのペプチドの更なるプロセシングから生成され、これは、１つの番号付け表記ではＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨおよびＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２を生成する。ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨ（または単にＧＬＰ−１（７−３７））およびＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ２は同じ活性を有する。便宜上、「ＧＬＰ−１」という用語はこれらの両形態を指すために用いられる。この番号付け表記では、これらのプロセシングされたペプチドの最初のアミノ酸はＨｉｓ７である。しかし、当該分野で認識されている別の番号付け表記では、プロセシングされたペプチドの番号付けが位置７ではなく位置１としてＨｉｓから開始すると想定している。従って、この番号付けスキームでは、ＧＬＰ−１（１−３１）はＧＬＰ−１（７−３７）と同じであり、ＧＬＰ−１（１−３０）はＧＬＰ−１（７−３６）と同じである。
【０００３】
グルカゴンは低血糖に応答して膵臓のα細胞から分泌され、グルカゴンの主要な標的器官は肝臓である。グルカゴンはグリコーゲンの分解を刺激し、グリコーゲンの生合成を抑制する。また、グルカゴンは脂肪酸の合成を抑制するが、グルコース新生を促進する。これらの作用の最終結果は、肝臓へのグルコースの放出を大いに増大させることになる。対照的に、ＧＬＰ−１はグルカゴン分泌を低下させると同時に、腸による栄養素の吸収に応答してインスリン分泌、グルコース取込およびサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成を刺激する。様々な臨床データがこれらの活性のエビデンスを提供している。例えば、管理不良の２型糖尿病患者へのＧＬＰ投与は、空腹時血中グルコース濃度を正常化した（例えば、非特許文献３を参照）。
【０００４】
ＧＬＰ−１は他の多くの重要な活性を有する。例えば、ＧＬＰ−１は胃運動および胃液分泌も抑制する（例えば、非特許文献４を参照）。この作用は、時として、回腸ブレーキ作用と称され、栄養素の可用性の遅滞期をもたらし、従って、迅速なインスリン応答の必要性を大いに低減する。
【０００５】
ＧＬＰ−１が細胞の分化および複製を促進することもでき、これは次に、膵島細胞の保持およびβ細胞量の増加に役立つことが諸研究により示されている（例えば、非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８を参照）。ＧＬＰ−１が満腹感を高め、食物摂取を減少させることができるということもエビデンスが示している（例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１を参照）。
【０００６】
他の研究では、ＧＬＰ−１がＧＬＵＴ−１トランスポーター、インスリン受容体およびヘキソキナーゼ−１を含むβ細胞特異的遺伝子を誘導することを示している（例えば、非特許文献１２を参照）。このような誘導は加齢に関連する耐糖能障害を食い止め得る。
【０００７】
ＧＬＰ−１は代謝恒常性の調節に重要な役割を果たすので、糖尿病、肥満症および代謝症候群を含む様々な代謝障害を処置するための魅力的な標的である。現行の糖尿病の処置はインスリン注射およびスルホニル尿素の投与を含む。しかし、両手法は重要な欠点を有する。例えば、インスリン注射は複雑な投与留意点を要し、スルホニル尿素による処置は経時的に効果を失うことが多い。ＧＬＰ−１療法の潜在的利点は、１）インスリン分泌が高血糖に依存するので、安全性の向上、２）グルカゴン分泌の抑制とそれに続く過剰のグルコース排出の抑制、ならびに３）胃排出の緩徐化とそれに続く栄養素吸収の緩徐化および突発的なグルコース増加の防止を含む。
【０００８】
しかし、ＧＬＰ−１による有効な処置の主要な障害は、ペプチドの非常に短い半減期であり、通常、これはわずか数分である（例えば、非特許文献１３を参照）。分子の半減期を延ばすことを目的に様々な類似体が開発されてきた。しかし、これらの一部は嘔吐および悪心を含む重大な消化管副作用を有する（例えば、非特許文献１４を参照）。
【非特許文献１】ＩｒｗｉｎおよびＷｏｎｇ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：２６７−２７７
【非特許文献２】Ｂｅｌｌら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：３６８−３７１
【非特許文献３】Ｇｕｔｎｉａｋら、１９９２，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１３１６−１３２２
【非特許文献４】Ｔｏｌｅｓｓａ，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：７６４−７７４
【非特許文献５】Ａｎｄｒｅａｓｅｎら、１９９４，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ５５：２２１−２２８
【非特許文献６】Ｗａｎｇら、１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８８３−２８８９
【非特許文献７】Ｍｏｊｓｏｖ，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．４０：３３３−３４３
【非特許文献８】Ｘｕら、１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：２２７０−２２７６
【非特許文献９】Ｔｏｆｔ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９９，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２：１１３７−１１４３
【非特許文献１０】Ｆｌｉｎｔら、１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：５１５−５２０
【非特許文献１１】Ｇｕｔｓｗｉｌｌｅｒら、１９９９  Ｇｕｔ  ４４：８１−８６
【非特許文献１２】ＰｅｒｆｅｔｔｉおよびＭｅｒｋｅｌ，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３：７１７−７２５
【非特許文献１３】Ｈｏｌｓｔ，１９９４，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０７：１８４８−１８５５
【非特許文献１４】Ａｇｅｒｓｏら、２００２，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４５：１９５−２０２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、糖尿病、肥満症および代謝症候群のような様々な代謝疾患の処置に用いる、ＧＬＰ−１型活性を有する改良された分子の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
ＧＬＰ−１化合物に結合した抗グルカゴン抗体を含む組成物が提供される。いくつかの組成物では、抗体はヒトグルカゴンに特異的に結合する。有効量の組成物を投与することによって種々の疾患を処置するための方法も提供される。このような方法は、例えば、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、種々の脂質障害、肥満症、心血管疾患および骨障害を処置するために用いられ得る。
【００１１】
例えば、いくつかの組成物は、グルカゴンに結合する抗体およびグルカゴンに結合する抗体に結合したＧＬＰ−１化合物を含み、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。いくつかの組成物では、抗体は、（ｉ）重鎖可変領域、および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、ＧＬＰ−１化合物は該重鎖可変領域または該軽鎖可変領域に結合される。いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端は軽鎖可変領域のアミノ末端に結合し、かつ／あるいはＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端は重鎖可変領域のアミノ末端に結合される。
【００１２】
様々なＧＬＰ−１化合物が抗グルカゴン抗体に結合され得る。一態様では、本明細書で提供される組成物中のＧＬＰ−１化合物は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを含む。
【００１３】
特定の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
を含み、式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａはＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａはＧｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａはＧｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略され、化合物はＧＬＰ−１活性を有する。
【００１４】
従って、いくつかの組成物中のＧＬＰ−１化合物は、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの組成物では、本明細書で提供される組成物の一部である抗体は：
（ａ）（ｉ）配列番号７６と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号７７と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号７８と少なくとも６０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ；
（ｂ）（ｉ）配列番号８４と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８５と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号８６と少なくとも６０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）（ａ）の１つ以上のＬＣ  ＣＤＲならびに（ｂ）の１つ以上のＨＣ  ＣＤＲ；
を含む。抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含み得る。
【００１６】
特定の組成物では、組成物の一部である抗体は：
（ａ）（ｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上のＬＣ  ＣＤＲ；
（ｂ）（ｉ）配列番号８４に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号８５に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ３からなる群より選択される１つ以上のＨＣ  ＣＤＲ；あるいは
（ｃ）（ａ）の１つ以上のＬＣ  ＣＤＲならびに（ｂ）の１つ以上のＨＣ  ＣＤＲ
を含む抗体を含む。抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含み得る。
【００１７】
いくつかの例では、組成物の抗体は、配列番号７８のアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ３および／または配列番号８６のアミノ酸配列を有するＨＣ  ＣＤＲ３を含む。他の組成物では、抗体は、（ａ）および（ｂ）における上記一覧のＣＤＲから少なくとも２または３つのＣＤＲを含み得る。
【００１８】
特定の組成物は、（ａ）配列番号７９と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または（ｂ）配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；または（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨを含む抗体を含む。このような組成物中の抗体は２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなり得る。
【００１９】
いくつかの組成物では、抗体は、（ａ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖；（ｂ）配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖；または（ｃ）配列番号４１〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ならびに配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００２０】
ＧＬＰ−１類似体に結合したグルカゴン結合抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドも本明細書で提供される。特定のこのようなポリペプチドは配列番号４１〜７４の任意のアミノ酸配列を有する。本発明は、更に、配列番号４１〜７４の任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を提供する。
【００２１】
本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドに結合したグルカゴン結合抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドも提供する。特定の態様では、ポリペプチドは配列番号８３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質である。特定のこのような融合タンパク質では、ＧＬＰ−１化合物は配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７を含む。
【００２２】
医薬的に許容可能な担体および本明細書で提供される有効量の組成物を含む医薬組成物も提供される。例えば、種々の代謝障害を含む種々の疾患を有する被験体を処置するための方法も開示される。通常、このような方法は、本明細書で提供される有効量の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。処置可能な代謝疾患の具体例には、限定的でないが、糖尿病、肥満症および代謝症候群が含まれる。被験体においてインスリンの発現を増強するための方法、インスリンの分泌を促進するための方法も提供され、該方法は、本明細書で提供される有効量の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００２３】
更に、本発明は、グルカゴンに結合する抗体およびこれに結合したＧＬＰ−１化合物を含む有効量の組成物を被験体に投与することにより被験体を処置するための方法を提供し、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。このような組成物により処置可能な疾患には、上記一覧の疾患が含まれる。被験体においてインスリンの発現を増強するための方法、インスリンの分泌を促進するための方法についても本明細書で述べられ、該方法は、グルカゴンに結合する抗体；およびこれに結合したＧＬＰ−１化合物を含む有効量の組成物を被験体に投与する工程を含み、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を有する。
【００２４】
特定の好ましい実施形態の以下の更に詳細な説明および特許請求の範囲から、具体的な実施形態が明らかになるであろう。
【００２５】
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）  （ａ）グルカゴンに結合する抗体と、
（ｂ）グルカゴンに結合するこの抗体に結合したＧＬＰ−１化合物と
を含み、このＧＬＰ−１化合物がＧＬＰ−１活性を有する、組成物。
（項目２）  上記抗体が中和抗体である、項目１に記載の組成物。
（項目３）  （ａ）上記抗体が、（ｉ）重鎖可変領域および（ｉｉ）軽鎖可変領域を含み、
（ｂ）上記ＧＬＰ−１化合物が、この重鎖可変領域またはこの軽鎖可変領域に結合される、項目１に記載の組成物。
（項目４）  上記ＧＬＰ−１化合物が上記軽鎖可変領域に結合される、項目３に記載の組成物。
（項目５）  上記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、上記軽鎖可変領域のアミノ末端に結合される、項目４に記載の組成物。
（項目６）  上記ＧＬＰ−１化合物と上記軽鎖可変領域とがリンカーによって結合される、項目３に記載の組成物。
（項目７）  上記ＧＬＰ−１化合物が上記重鎖可変領域に結合される、項目３に記載の組成物。
（項目８）  上記ＧＬＰ−１化合物のカルボキシ末端が、上記重鎖可変領域のアミノ末端に結合される、項目７に記載の組成物。
（項目９）  上記ＧＬＰ−１化合物と上記重鎖可変領域とがリンカーによって結合される、項目８に記載の組成物。
（項目１０）  上記抗体と上記ＧＬＰ−１化合物とが化学的結合体化により結合される、項目１に記載の組成物。
（項目１１）  上記抗体と上記ＧＬＰ−１化合物とが合成リンカーを介して結合される、項目１に記載の組成物。
（項目１２）  上記抗体と上記ＧＬＰ−１化合物とがペプチドリンカーを介して結合される、項目１に記載の組成物。
（項目１３）  上記抗体と上記ＧＬＰ−１化合物とが融合タンパク質を形成する、項目１に記載の組成物。
（項目１４）  上記抗体が複数のＧＬＰ−１化合物に結合される、項目１に記載の組成物。
（項目１５）  上記抗体が多数の異なるＧＬＰ−１化合物に結合される、項目１に記載の組成物。
（項目１６）  上記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１７）  上記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号１のアミノ酸配列を有する、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）  上記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン分子を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１９）  上記ＧＬＰ−１化合物がエキセンジン３またはエキセンジン４を含む、項目１に記載の組成物。
（項目２０）  上記ＧＬＰ−１化合物が、エキセンジン−３またはエキセンジン−４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１に記載の組成物。
（項目２１）  上記ＧＬＰ−１化合物が、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
（式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、このアミノ酸の各アミノ酸下流も省略される）
を含むＧＬＰ−１ペプチドを含み、この化合物が、ＧＬＰ−１活性を有する、項目に記載の組成物。
（項目２２）  上記ＧＬＰ−１化合物が、５以下の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）  上記ＧＬＰ−１化合物が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７の任意のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２４）  上記抗体が：
（ａ）配列番号７９と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；あるいは
（ｂ）配列番号８３と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；あるいは
（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨ
を含む、項目１に記載の組成物。
（項目２５）  上記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）  上記抗体が、配列番号７９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬおよび配列番号８３と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２７）  上記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）  上記抗体が、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＶＬおよび配列番号８３のアミノ酸配列を有するＶＨを含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２９）  上記抗体が２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬからなる、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）  上記抗体が：
（ａ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｂ）配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖；あるいは
（ｃ）配列番号４０〜８１の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３９もしくは８２〜９１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３１）  上記抗体が二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖からなる、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）  上記抗体がモノクローナル抗体である、項目１、２４または３０に記載の組成物。
（項目３３）  上記抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または（Ｆａｂ’）２である、項目１、２４または３０に記載の組成物。
（項目３４）  上記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、項目１、２４または３０に記載の組成物。
（項目３５）  ＧＬＰ−１ペプチドに結合されたグルカゴン結合抗体軽鎖可変領域を含む、ポリペプチド。
（項目３６）  配列番号４１〜７４または１２９の任意のアミノ酸配列を含む、項目３５に記載のポリペプチド。
（項目３７）  項目３６に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。
（項目３８）  ＧＬＰ−１化合物に結合されたグルカゴン結合抗体重鎖可変領域を含む、ポリペプチド。
（項目３９）  配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、項目３８に記載のポリペプチド。
（項目４０）  項目３９に記載のポリペプチドを含む、グルカゴンに結合する抗体。
（項目４１）  医薬的に許容可能な担体ならびに有効量の項目１、２４または３０に記載の組成物を含む、医薬組成物。
（項目４２）  代謝障害を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の項目４１に記載の医薬組成物をこの被験体に投与する工程を含み、この代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、方法。
（項目４３）  被験体においてインスリンの発現を増強するための方法であって、有効量の項目４１に記載の医薬組成物をこの被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目４４）  被験体においてインスリン分泌を促進するための方法であって、有効量の項目４１に記載の医薬組成物をこの被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目４５）  代謝障害を有する被験体を処置するための方法であって、有効量の項目１、２４または３０に記載の組成物をこの被験体に投与する工程を含み、この代謝障害が、糖尿病、肥満症および代謝症候群の群から選択される、方法。
（項目４６）  被験体においてインスリンの発現を増強するための方法であって、有効量の項目１、２４または３０に記載の組成物をこの被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目４７）  被験体においてインスリン分泌を促進するための方法であって、有効量の項目１、２４または３０に記載の組成物をこの被験体に投与する工程を含む、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（詳細な説明）
本明細書で用いられる項目の見出しは単に構成を目的とするものであって、述べられる主題を限定すると捉えるべきではない。本願において引用される文献はすべて、任意の目的のために参考として本明細書に明示的に援用される。
Ｉ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別様に指示しない限り、複数形の参照を含む。
【００２７】
別様に明示しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味を有する。以下の文献は本発明において用いられる多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒら、１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ  ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００２８】
本明細書で用いられるように、以下の用語は、別様に特記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００２９】
「インスリン向性活性」は、グルコース依存的にインスリンの合成、放出または分泌を増大させる能力を指す。インスリン向性作用は、インスリン陽性細胞数の増加および／または所定の期間における既存のインスリン陽性細胞から合成もしくは放出されるインスリンの量の増加に起因することを含むがこれに限定されない、多くの異なる機構のいずれかから生じ得る。インスリン向性活性は当該分野で公知の方法、例えば、ＧＬＰ−１受容体の結合活性または受容体活性化を測定するインビボ試験およびインビトロ試験（例えば、欧州特許第６１９，３２２号および米国特許第５，１２０，７１２号において述べられているような膵島細胞またはインスリノーマ細胞を用いたアッセイならびに本明細書で述べられるようなアッセイ）を用いてアッセイすることができる。ヒトでは、インスリン向性活性はインスリン濃度またはＣペプチド濃度を検査することにより測定することができる。
【００３０】
本明細書で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）典型的には天然状態で共に見出される他のタンパク質の少なくとも一部を含まないか、（２）同一供給源、例えば、同一種由来の他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異種由来の細胞により発現されるか、（４）天然状態で会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の少なくとも５０％から分離されるか、（５）天然状態で「単離されたタンパク質」が会合するタンパク質の一部と（共有結合的または非共有結合的相互作用により）会合しないか、（６）天然状態で会合しないポリペプチドと（共有結合的または非共有結合的相互作用により）作動可能に会合するか、あるいは（７）天然で生じないということを意味する。このような単離されたタンパク質は、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡあるいはそれらの任意の組合せにコードされ得る。単離されたタンパク質は、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）を妨げ得るその天然環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。
【００３１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に用いられ、ペプチド結合により結合したアミノ酸の分子鎖を含む。該用語は生成物の特定の長さには言及しない。従って、ポリペプチドの定義内には「ペプチド」および「オリゴペプチド」が含まれる。該用語はポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、ポリペプチドの意味内にはタンパク質断片、類似体、変異したタンパク質または改変体タンパク質、融合タンパク質などが含まれる。
【００３２】
「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失あるいは天然に存在するポリペプチドまたは組換えで産生されたポリペプチドの置換を有する、モノマーまたはマルチマーとなり得るポリペプチドを指す。特定の実施形態では、ポリペプチド断片は少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。特定の実施形態では、断片は少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸長であることが理解されるであろう。特に有用なポリペプチド断片は結合ドメインを含む機能ドメイン含む。本明細書で提供されるような抗体の場合、有用な断片は、限定的でないが、ＣＤＲ領域、特に、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域；重鎖または軽鎖の可変ドメイン；２つのＣＤＲを含む抗体鎖の一部またはちょうどその可変領域などを含む。
【００３３】
本明細書で用いられるような「抗体」または「抗体ペプチド」という用語は、抗原に特異的に結合することができ、抗原の生物学的活性を阻害あるいは調節することができ得る、１つ以上のポリペプチド鎖を含むモノマータンパク質またはマルチマータンパク質を指す。従って、本明細書で用いられる場合、その用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンまたは標的抗原への特異的結合でインタクトな抗体と競合し得るその断片を含み、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および二重特異性抗体を含む。一般に、インタクトな抗体は少なくとも二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含むが、いくつかの例では、重鎖のみを含む場合があり、ラクダにおいて天然に生じる抗体などのより少ない鎖を含み得る。抗体は単一供給源のみに由来しても、「キメラ」（即ち、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来し得る）であってもよい。例えば、ＣＤＲ領域はラットまたはマウスの供給源に由来し得、一方、Ｖ領域のフレームワーク領域はヒトなどの異なる供給源に由来する。本明細書で述べるような抗体または結合断片は、組換えＤＮＡ法またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により、ハイブリドーマにて生成され得る。別様に示さない限り、「抗体」という用語は、二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含む抗体に加え、それらの誘導体、改変体、断片および突然変異タンパク質を含み、それらの例は以下に述べられる。従って、該用語は、抗原（例えば、グルカゴン）に特異的に結合可能な軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のすべてまたは一部を含むポリペプチドを含む。従って、抗体という用語は免疫学的に機能性の断片を含み、例えば、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片を含む。
【００３４】
「軽鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長軽鎖およびその断片を含む。完全長軽鎖は可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽鎖はκ鎖およびλ鎖を含む。
【００３５】
「重鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長重鎖およびその断片を含む。完全長重鎖は可変領域ドメインＶＨならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨドメインはカルボキシル末端に位置し、ＣＨ３が−ＣＯＯＨ端に最も近い。本発明による重鎖は任意のアイソタイプのものでよく、ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプおよびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む。
【００３６】
本明細書で用いられるような免疫グロブリン鎖の「免疫学的に機能性の断片」（または単に「断片」）という用語は、完全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが、抗原に特異的に結合することが可能な抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。このような断片は標的抗原に特異的に結合するという点において生物学的に活性であり、所定のエピトープへの特異的結合でインタクトな抗体と競合し得る。本発明の一態様では、このような断片は、完全長軽鎖または完全長重鎖に存在するＣＤＲを少なくとも１つ保持し、一部の実施形態では、単一の重鎖および／または軽鎖あるいはそれらの一部分を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ法により生成され得、あるいはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断により生成され得る。本発明の免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片は、限定的でないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖドメイン抗体および単鎖抗体を含み、限定的でないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダまたはウサギを含む任意の哺乳動物供給源から得られ得る。二機能性の治療特性を有するか、あるいは血清半減期の延長を有する体内の特定の標的に対する治療剤を作製するために、本発明の抗体の機能性部分、例えば、１つ以上のＣＤＲが第２のタンパク質または小分子に共有結合され得ることが更に検討される。
【００３７】
「Ｆａｂ断片」は、一本の軽鎖ならびに一本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００３８】
「Ｆａｂ断片」は、軽鎖と重鎖との間に鎖間ジスルフィド結合が形成できるように、一本の軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む一本の重鎖の一部分を含む。
【００３９】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、二本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、二本の軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に定常領域の一部分を有する二本の重鎖を含む。従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、二本の重鎖間のジスルフィド結合により共に保持された２つのＦａｂ断片からなる。
【００４０】
「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く。
【００４１】
「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が可撓性リンカーによって結合されて単一ポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子であり、単一ポリペプチド鎖は抗原結合領域を形成する。単鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号において詳細に考察されており、これらの開示内容は参考として援用される。
【００４２】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合し、二価ドメイン抗体を生成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は同じかあるいは異なる抗原を標的とし得る。
【００４３】
「二価抗体」は２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例では、２つの結合部位は同一の抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性でもよい（下記参照）。
【００４４】
「多重特異性抗体」は２つ以上の抗原またはエピトープを標的とする抗体である。
【００４５】
「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は多重特異性抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含むがこれらに限定されない種々の方法により生成され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二重特異性抗体の２つの結合部位は、これらは同じかあるいは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【００４６】
「抗原」という用語は、抗体のような選択的結合因子により結合可能であり、さらに、その抗原のエピトープに結合可能な抗体を生成するために動物において用いることが可能な分子または分子の一部分を指す。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４７】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能な任意の決定基、好ましくは、ポリペプチド決定基を含む。エピトープは抗体により結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基群（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。特定の実施形態では、抗体がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識する際、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。平衡解離定数が１０−７Ｍ以下または１０−８Ｍ以下である場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。一部の実施形態では、平衡解離定数は１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下であり得る。
【００４８】
本明細書で用いられ、対象に適用されるような「天然に存在する」という用語は、対象が天然で見出され得るという事実を指す。例えば、天然供給源から単離され得るとともにヒトによって意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００４９】
本明細書で言及されるような「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長の一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。前記修飾は、ブロモウリジン（ｂｒｏｍｕｒｉｄｉｎｅ）などの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾を含む。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には一本鎖形状および二本鎖形状のＤＮＡを含む。
【００５０】
本明細書で用いられるような「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成起源またはそれらの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源により、単離ポリヌクレオチドは、（１）単離ポリヌクレオチドが天然で見出されるポリヌクレオチドの全体または一部と会合せず、（２）天然状態で結合していないポリヌクレオチドに結合し、あるいは（３）より大きい配列の一部として天然で生じない。
【００５１】
本明細書で言及されるような「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然または非天然オリゴヌクレオチド結合により共に結合した天然または修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、通常は一本鎖のメンバーを含むポリヌクレオチドのサブセットであり、２００塩基またはそれ以下の長さを有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、例えば、遺伝子改変体の構築に用いられる。本明細書で提供されるようなオリゴヌクレオチドは、タンパク質コード配列に関してセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００５２】
別記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’→３’付加の方向は転写方向と称され；ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称され；ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称される。
【００５３】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に伝達するのに用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すのに用いられる。
【００５４】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に好適であるとともに、挿入異種核酸配列の発現を誘導および／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現には、限定されないが、転写、翻訳およびイントロンが存在する場合のＲＮＡスプライシングなどのプロセスが含まれる。
【００５５】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列を導入されるか、あるいは導入可能であって、更に、対象選択遺伝子を発現させ、あるいは発現可能な細胞を指すのに用いられる。該用語は親細胞の子孫を含み、選択遺伝子が存在する限り、該子孫が形態または遺伝子構造において元の親と同一であることを問わない。
【００５６】
当該分野で公知のような「同一性」という用語は、それらの配列を比較することにより求められるような、２つもしくはそれ以上のポリペプチド分子または２つもしくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当該分野では、「同一性」は、場合により、２つもしくはそれ以上のヌクレオチドまたは２つもしくはそれ以上のアミノ酸配列のストリング間のマッチにより求められるような、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連度も意味する。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（即ち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアラインメント（存在する場合）により、２つ以上の配列のより小さい配列間の同一マッチのパーセントを測定する。
【００５７】
「類似性」という用語は、関連する概念に関して当該分野で用いられるが、「同一性」と対照的に、「類似性」は同一マッチおよび保存的置換マッチを含む関連性の尺度を指す。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一アミノ酸を有し、他がすべて非保存的置換である場合、同一性パーセントおよび類似性は共に５０％であろう。同じ例において、保存的置換が存在する更に５つの位置がある場合、同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）であろう。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、それら２つのポリペプチド間の同一性パーセントより高くなる。
【００５８】
関連する核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法により容易に計算することができる。このような方法は、限定的でないが、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．  Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，Ｐａｒｔ  １，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３；およびＤｕｒｂｉｎら、１９９８，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに述べられている方法が含まれる。
【００５９】
同一性を定量する好ましい方法は、被験配列間の最大マッチを付与するように設計される。同一性を定量する方法は公共的に利用可能なコンピュータプログラムに示されている。２配列間の同一性を定量する好ましいコンピュータプログラム法には、限定的でないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７を含むＧＣＧプログラムパッケージ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０）が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，上記参照）から公共的に利用可能である。同一性を定量するのに周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも用いられ得る。
【００６０】
２つのアミノ酸またはポリヌクレオチド配列をアラインメントするための特定のアラインメントスキームは、２配列の短い領域のマッチングをもたらすことでき、この小さいアラインメント領域は、その２つの全長配列間に有意な関連がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、特定の実施形態では、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）は標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸にわたるアラインメントをもたらす。一部の実施形態では、アラインメントは標的ポリペプチドの少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のアミノ酸を含み得る。ＧＡＰを用いてポリヌクレオチドがアラインメントされると、アラインメントは少なくとも約１００、１５０または２００個の隣接可能なヌクレオチドにわたり得る。
【００６１】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントが定量される２つのポリペプチドは、それらのそれぞれのアミノ酸の至適マッチングのためにアラインメントされる（アルゴリズムにより求められるような「マッチ範囲」）。特定の実施形態では、ギャップ開始ペナルティ（平均対角の３倍として計算され；「平均対角」は使用される比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」は特定の比較マトリックスによって各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、キャップ開始ペナルティの１／１０である）ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスが、アルゴリズムと共に用いられる。特定の実施形態では、標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９を参照）もアルゴリズムにより用いられる。
【００６２】
特定の実施形態では、ポリペプチド配列比較のためのパラメータは以下を含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、上記参照、からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用であり得る。ヌクレオチド配列では、パラメータはギャップペナルティ５０および各ギャップにおける各シンボルに対するペナルティ３であるギャップ長ペナルティ３を含み得る。特定の実施形態では、前記パラメータはＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（エンドギャップに対してはペナルティがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００６３】
本明細書で用いられるように、従来の２０個のアミノ酸ならびにそれらの一文字および三文字略記は従来の使用法を踏襲する。例えば、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−Ａ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９１を参照されたい。同文献は目的に応じて参考として本明細書に援用される。従来の２０個のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）；α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来型アミノ酸も、本明細書で提供されるようなポリペプチドに好適な構成要素であり得る。非従来型アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニンならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で用いられるポリペプチドの表記では、標準的な使用法および慣習に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシル末端方向である。ＧＬＰ−１化合物に関して用いられる際の「下流」という用語は、言及される位置に対してポリペプチドのカルボキシル末端方向、即ち、言及される位置の右側に所在する位置を意味する。ＧＬＰ−１化合物に関して用いられる際の「上流」という用語は、言及される位置に対してポリペプチドのアミノ末端方向、即ち、言及される位置の左側に所在する位置を意味する。推奨ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓが、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４，２１９，３４５−３７３；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，９−３７；１９８５，１５２，１；１９９３，２１３，２；Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，１９８４，２４，ｐ８４以降；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，１４−４２；Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，５６，５９５−６２４；Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９８５，１６，３８７−４１０；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２，ｐａｇｅｓ  ３９−６９において公表されている。
【００６４】
本発明による抗体の結合および中和を評価するにあたり、抗体は特異的に結合し、かつ／あるいはグルカゴンのその受容体への結合を実質的に阻害し、かつ／あるいはグルカゴン受容体の活性化を防止し、その際、過剰の抗体はグルカゴンにより結合され、あるいは活性化される受容体の量を、少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上減少させる（それぞれ、インビトロ競合結合アッセイまたはインビトロ機能アッセイにて測定されるように）。特異的結合抗体は、１０−８モル以下のグルカゴンに結合するための平衡解離定数、至適には１０−９または１０−１０モル以下を有することが見込まれ得る。
【００６５】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書で化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子または生体物質で作られる抽出物を示すのに用いられる。
【００６６】
本明細書で用いられるように、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射線標識アミノ酸の組込みによる検出可能なマーカーの組込みまたは蛍光マーカー、化学発光マーカーもしくは検出可能な活性を有する酵素のポリペプチドもしくは核酸への付着または標識アビジン（例えば、好ましくは、蛍光マーカー、化学発光マーカーなどの検出可能なマーカーまたは、特に、光学的方法もしくは比色法により検出可能な酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出可能なビオチン部分のポリペプチドへの付着を指す。特定の実施形態では、標識は治療的であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当該分野で公知であり、本明細書で開示される方法において有利に用いられ得る。ポリペプチド用の標識の例には、限定されないが、以下のものが含まれる：放射性同位元素もしくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、即ち、ＦＩＴＣ、ローダミンまたはランタニド系蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチニル基などのハプテン標識および二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメインまたはエピトープタグ）。特定の実施形態では、標識は立体障害の可能性を低減するため、種々の長さのスペーサーアーム（例えば、（ＣＨ２）ｎ、ｎ＜約２０）によって付着される。
【００６７】
本明細書で用いられるような「生物学的サンプル」という用語は、限定されないが、生物または過去に生きていた生物由来の任意の量の物質を含む。このような生物には、限定されないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギおよび他の動物が含まれる。このような物質には、限定されないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節および皮膚が含まれる。
【００６８】
本明細書で用いられるような「医薬製剤または薬物」という用語は、患者に適切に投与されると、所望の治療効果を誘導することが可能な化学化合物または組成物を指す。
ＩＩ．概要
ＧＬＰ−１化合物に結合した抗グルカゴン抗体（即ち、グルカゴンに結合する抗体）を含む組成物が本明細書で提供される。通常、抗体はグルカゴンがグルカゴン受容体を活性化することができないように、グルカゴンに結合するのみならず、グルカゴンを中和もする。通常、組成物の抗体はヒトグルカゴンに結合し、重鎖可変領域または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含む。特定の組成物を用いた結果は、組成物の抗体が、グルカゴンに結合することができ、一方で、これらの２つの実体を結合しているにもかかわらず、ＧＬＰ−１が依然としてＧＬＰ−１受容体に結合することができるということを示す。従って、このような組成物は二重活性を有する。ＧＬＰ−１化合物に融合したグルカゴン抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含むポリペプチドも提供され、これは、任意で１つもしくはそれ以上の他の軽鎖または重鎖またはそれらの断片と組み合わせて抗体を形成することができる。
【００６９】
組成物の抗体は、免疫学的に機能性の断片を含むキメラ抗体、ヒト化抗体またはインタクトなヒト抗体であってよい。抗体抗原結合部位の免疫結合特性を示すことが可能なポリペプチドも本明細書で開示される。抗グルカゴン抗体に結合されるＧＬＰ−１化合物は、天然ＧＬＰ−１、当該分野で公知の任意のＧＬＰ−１類似体または天然ＧＬＰ−１の活性を有する、本明細書で開示されるＧＬＰ−１類似体の１つであってよい。いくつかの組成物では、抗グルカゴン抗体およびＧＬＰ−１化合物は、２つの分子が直接あるいはペプチドリンカーを介して結合した融合タンパク質の一部である。他の組成物では、抗体およびＧＬＰ−１化合物は融合タンパク質の一部ではなく、その代わりに非ペプチドリンカーを介して結合される。抗体およびポリペプチドをコードする核酸ならびにこれらの核酸を用いて抗体を発現させる方法も開示される。
【００７０】
以下に更に詳細に述べられるように、提供されるＧＬＰ−１化合物は種々の疾患を処置するため、治療的または予防的に投与され得る。化合物により処置され得る疾患例には、限定的でないが、糖尿病、耐糖能異常、インスリン抵抗性、高血糖、代謝症候群、種々の脂質障害、肥満症、冠動脈疾患、骨障害および過敏性腸症候群が含まれる。
ＩＩＩ．ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物およびポリペプチド
一般に、提供される組成物は、グルカゴンに結合する抗体ならびに該抗体に結合した１つ以上のＧＬＰ−１化合物を含む。抗グルカゴン抗体とＧＬＰ−１化合物との関係を説明するのに用いられる際、「結合した（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、各分子が少なくとも１つのその天然活性を依然として保持しながら（例えば、該抗体はグルカゴンに結合する能力を維持し、ＧＬＰ−１化合物はＧＬＰ−１活性を維持する）、２分子が結合することを意味する。抗体はいくつかの組成物では完全ヒト抗体である。通常、抗体はグルカゴンに結合するとともにグルカゴン受容体を活性化するその能力を阻害することができる（例えば、本明細書で述べるようなインビトロまたはインビボアッセイにおいて）中和抗体である。２つ以上のＧＬＰ−１化合物が抗体に結合され得、これらは同一かあるいは異なっていてよい。抗体および化合物はリンカーを介して結合してもしなくてもよい。従って、例えば、ＧＬＰ−１化合物および抗体は、リンカーを用いずに、分子中に天然に存在するか、あるいは導入される反応基を介して化学的に結合され得る。他の例では、化合物および抗体は、直接あるいはペプチドリンカーを介し、融合タンパク質の一部として融合される。他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物と抗体とを結合するのにペプチドまたは合成リンカーが用いられる。抗体とＧＬＰ−１化合物とを結合するための選択肢に関する更なる詳細が以下に挙げられる。化合物は抗体のＮ末端もしくはＣ末端または両末端に結合され得る。
【００７１】
特定の実施形態では、ＧＬＰ−１化合物は、グルカゴンに結合する抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域に結合される。従って、特定の実施形態では、抗体の軽鎖および重鎖の両鎖がＧＬＰ−１に結合される。異なる鎖に結合される化合物は同一かあるいは異なってよい。
【００７２】
提供されるいくつかの組成物の抗体は、少なくとも１０４または１０５／Ｍ×秒のグルカゴンに対する結合親和性（Ｋａ）を有する。他の抗体は少なくとも１０６、１０７、１０８または１０９／Ｍ×秒のｋａを有する。提供される特定の抗体は低い解離速度を有する。一部の抗体は、例えば、１×１０−４ｓ−１、１×１０−５ｓ−１またはそれ以下のＫｏｆｆを有する。
【００７３】
いくつかの組成物における抗体はインビトロまたはインビボにて少なくとも１日の半減期を有する（例えば、ヒトを被験体として投与した場合）。特定の組成物における抗体は少なくとも２または３日の半減期を有する。別の実施形態では、抗体は４日またはそれ以上の半減期を有する。更に別の抗体は７日または８日またはそれ以上の半減期を有する。別の実施形態では、非誘導体化または非修飾抗体と比べて長い半減期を有するように、抗体またはその抗原結合部は誘導体化または修飾される。
【００７４】
任意で１つ以上のＧＬＰ−１化合物に融合したグルカゴン結合部位を含むポリペプチドも提供される。
【００７５】
特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／抗体組成物は、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体、少なくとも１つのリンカーおよび少なくとも１つのＧＬＰ−１化合物を含む。例示的なリンカーには、限定的でないが、ペプチドリンカー、アルキルリンカー、ＰＥＧリンカーおよび２つのポリペプチドを結合するのに用いられる化学的または酵素的プロセスから生じるリンカーが含まれる。いくつかの組成物では、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体は、二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖を含む。他の組成物では、少なくとも１つの抗グルカゴン抗体は、少なくとも１つの切断型重鎖および／または少なくとも１つの切断型軽鎖を含む。従って、例えば、特定の組成物では、抗体はグルカゴンに結合する能力を保持する断片である。特定の例示的な抗体断片には、限定的でないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が含まれる。
【００７６】
いくつかの組成物におけるＧＬＰ−１化合物のＣ末端は、抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端に結合され、一方、他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物のＮ末端が軽鎖および／または重鎖のＣ末端に結合される。いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物はそのＮまたはＣ末端を介して別の分子にそのＮまたはＣ末端を介して結合される。
【００７７】
一部のＧＬＰ−１／抗体組成物は１つの抗グルカゴン抗体および１つのＧＬＰ−１化合物を含む。他の組成物は１つの抗体および２つの化合物を含む。更に他の組成物は１つの抗体および３つ以上のＧＬＰ−１化合物を含む。特定の組成物は２つ以上の抗体および１つのＧＬＰ−１化合物を含む。他の組成物は２つ以上の抗体および２つ以上の化合物を含む。
【００７８】
特定の組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に結合され、第１の化合物と同じかあるいは異なるアミノ酸配列を有する第２のＧＬＰ−１化合物は、抗体の軽鎖に結合される。この種のいくつかの組成物における抗体および化合物はリンカーを介して結合される。
【００７９】
他の組成物では、少なくとも１つのＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に融合される。更に他の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の軽鎖に融合される。いくつかの組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物は抗グルカゴン抗体の重鎖に融合され、第１の化合物と同じかあるいは異なるアミノ酸配列を有する第２のＧＬＰ−１化合物は、抗体の軽鎖に融合される。特定の実施形態では、抗グルカゴン抗体の重鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つのＧＬＰ−１化合物に融合される。特定の実施形態では、抗体の軽鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つのＧＬＰ−１化合物に融合される。特定の実施形態では、抗体の重鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つの第１のＧＬＰ−１化合物に融合され、抗体の軽鎖は同じかあるいは異なる配列を有する、少なくとも２つの第２のＧＬＰ−１化合物に融合される。
【００８０】
特定の組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり２つのＧＬＰ−１化合物の比率を有する。従って、一部の実施形態では、組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物および抗体の第２の重鎖に結合した第２のＧＬＰ−１化合物を含む。特定の実施形態では、このような組成物は、グルカゴン抗体の第１の軽鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物および抗体の第２の軽鎖に結合した第２のＧＬＰ−１化合物を含む。１つのグルカゴン抗体当たり２つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む他の組成物は、当業者には明らかであろう。
【００８１】
いくつかの組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり４つのＧＬＰ−１化合物を含む。従って、一部の実施形態では、組成物は、グルカゴン抗体の第１の重鎖に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第２の重鎖に結合した第２の化合物、抗体の第１の軽鎖に結合した第３の化合物および抗体の第２の軽鎖に結合した第４の化合物を含む。特定の組成物では、このような組成物は、グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第１の重鎖のＣ末端に結合した第２の化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３の化合物および抗体の第２の重鎖のＣ末端に結合した第４の化合物を含む。他の組成物では、第１のＧＬＰ−１化合物および第２のＧＬＰ−１化合物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合し、第３のＧＬＰ−１化合物および第４のＧＬＰ−１化合物は、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合する。１つの抗グルカゴン抗体当たり４つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む更なる組成物を当業者が設計できるように、他の様々な組成物も本明細書に含まれる。
【００８２】
更に他の組成物は１つの抗グルカゴン抗体当たり８つのＧＬＰ−１化合物を含む。例えば、いくつかの組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１のＧＬＰ−１化合物、抗体の第１の重鎖のＣ末端に結合した第２の化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３の化合物、抗体の第２の重鎖のＣ末端に結合した第４の化合物、抗体の第１の軽鎖のＮ末端に結合した第５の化合物、抗体の第１の軽鎖のＣ末端に結合した第６の化合物、抗体の第２の軽鎖のＮ末端に結合した第７の化合物および抗体の第２の軽鎖のＣ末端に結合した第８の化合物を含む。他の組成物は、抗グルカゴン抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合した第１および第２のＧＬＰ−１化合物、抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合した第３および第４の化合物、抗体の第１の軽鎖のＮ末端に結合した第５および第６の化合物ならびに抗体の第２の軽鎖のＮ末端に結合した第７および第８の化合物を含む。１つの抗グルカゴン抗体当たり８つのＧＬＰ−１化合物の比率を含む更なるＧＬＰ−１／抗体組成物を当業者が設計できるように、同様の比率を含む他の更なる組合せが含まれる。
Ａ．抗体
組成物の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはインタクトなヒト抗体ならびにこのような抗体の免疫学的に機能性の断片（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、ドメイン抗体または免疫接着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ））であってよい。組成物はグルカゴンに結合する能力を有するポリペプチド（例えば、抗体抗原結合部位を含むポリペプチド）も含み得る。
【００８３】
提供されるいくつかの組成物において有用な、グルカゴンに結合する１つの例示的な抗体は、ＡＧ１５９と称される。この抗体はインタクトなヒト抗体である。完全長軽鎖および重鎖配列、軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列ならびに軽鎖および重鎖ＣＤＲが、以下の表１および２に示される。当業者は本明細書で述べられる方法および手法を用いて、グルカゴンに結合する更なる抗体を作製し、同定することができる。例えば、例示的なグルカゴン抗体およびそれらを作製する方法が米国特許第５，７７０，４４５号に述べられている。
１．例示的な天然抗体
いくつかの組成物は天然抗体と典型的に関連する構造を有する抗体を含む。通常、これらの抗体の構造単位は１つ以上の四量体を含み、その各々が２つの同一対のポリペプチド鎖からなるが、一部の哺乳動物種は単一重鎖のみを有する抗体を生成する。典型的な抗体では、各ペアまたは対は一本の完全長「軽」鎖および一本の完全長「重」鎖を含む。各個々の免疫グロブリン鎖は複数の「免疫グロブリンドメイン」からなり、その各々がほぼ９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを発現する。これらのドメインは抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。通常、各鎖のアミノ末端部分は抗原認識に関与する可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は鎖の他端よりも進化的に保存され、「定常領域」または「Ｃ領域」と称される。一般的に、ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖に分類され、これらの各々が１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含む。通常、重鎖は、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖またはε鎖に分類され、これらは抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義づける。ＩｇＧは複数のサブタイプを有し、限定的でないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。ＩｇＭサブタイプはＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプはＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトでは、ＩｇＡアイソタイプおよびＩｇＤアイソタイプは四本の重鎖および四本の軽鎖を含む；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは二本の重鎖および二本の軽鎖を含む；ＩｇＭアイソタイプは五本の重鎖および五本の軽鎖を含む。通常、重鎖Ｃ領域はエフェクター機能に関与し得る１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数はアイソタイプに依存する。例えば、ＩｇＧ重鎖は各々がＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として周知の３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体はこれらのアイソタイプおよびサブタイプを任意に有することができる。
【００８４】
完全長軽鎖および重鎖では、可変領域および定常領域は約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ（汎用目的にその全体を参照して本明細書に援用される）を参照されたい。通常、各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は抗原結合部位を形成する。
【００８５】
通常、可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。通常、各ペアの２鎖のＣＤＲはフレームワーク領域内に組み込まれ、特定のエピトープへの結合を可能とし得る。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は共に、通常、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。通常、各ドメインへのアミノ酸の割当は、以下に更に詳細に説明されるように、Ｋａｂａｔらの定義に従う。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）；更に、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３も参照されたい。ＣＤＲは抗原結合に対する主要表面接触点を構成する。例えば、上記ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋを参照されたい。更に、軽鎖のＣＤＲ３、特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域内にて抗原結合における最も重要な決定基を構成し得る。例えば、上記ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：６０３−１５；ＸｕおよびＤａｖｉｓ（２０００），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３（１）：３７−４５；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２８）：２６２８５−９０；ならびにＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：２７７−３０２を参照されたい。一部の抗体では、重鎖ＣＤＲ３は抗原と抗体との接触の主要領域を構成するように思われる。上記Ｄｅｓｍｙｔｅｒら。抗体の結合特性を変化させるのに、ＣＤＲ３のみが変化させられたインビトロ選択スキームを用いることができる。
【００８６】
ＣＤＲは重鎖可変領域配列において以下のように配置され得る。ＣＤＲ１は成熟抗体のほぼ残基３１にて開始し、通常、約５〜７アミノ酸長であり、ほぼ常に、Ｃｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘ（配列番号９３）（「Ｘｘ」は任意のアミノ酸である）が先行する。重鎖ＣＤＲ１に続く残基はほぼ常にトリプトファンであり、Ｔｙｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａであることが多い。ＣＤＲ１における最後の残基とＣＤＲ２における最初の残基との間に、ほぼ常に１４個のアミノ酸があり、通常、ＣＤＲ２は１６〜１９個のアミノ酸を含む。ＣＤＲ２は直前にＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号９４）が先行し、直後にＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが後続し得る。他のアミノ酸がＣＤＲ２に先行あるいは後続し得る。ＣＤＲ２における最後の残基とＣＤＲ３における最初の残基との間に、ほぼ常に３２個のアミノ酸があり、ＣＤＲ３は約３〜２５残基長となり得る。Ｃｙｓ−Ｘｘｘ−Ｘｘｘがほぼ常にＣＤＲ３に直前に先行し、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号９５）がほぼ常にＣＤＲ３に後続する。
【００８７】
軽鎖ＣＤＲは軽鎖配列において以下のように配置され得る。ＣＤＲ１は成熟抗体のほぼ残基２４にて開始し、通常、約１０〜１７残基長である。ＣＤＲ１にはほぼ常にＣｙｓが先行する。ＣＤＲ１の最後の残基とＣＤＲ２の最初の残基との間に、ほぼ常に１５個のアミノ酸があり、ＣＤＲ２はほぼ常に７残基長である。通常、ＣＤＲ２にはＩｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−ＬｙｓまたはＩｌｅ−Ｐｈｅが先行する。軽鎖ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間にほぼ常に３２個の残基があり、通常、ＣＤＲ３は約７〜１０アミノ酸長である。ＣＤＲ３はほぼ常にＣｙｓが先行し、通常、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙ（配列番号９６）が後続する。
【００８８】
ＣＤＲを取り囲むフレームワーク領域の長さが、それらの長さを典型と異なるようにさせる挿入および欠失を含み得ることに当業者は気づくであろう。本明細書で意味するように、重鎖フレームワーク領域の長さは以下：ＦＲ１、０〜４１個のアミノ酸；ＦＲ２、５〜２４個のアミノ酸；ＦＲ３、１３〜４２個のアミノ酸；およびＦＲ４、０〜２１個のアミノ酸；の範囲内である。更に、本発明では、軽鎖フレームワーク領域の長さが以下：の範囲内となることを意図し；ＦＲ１、６〜３５個のアミノ酸；ＦＲ２、４〜２５個のアミノ酸；ＦＲ３、２〜４２個のアミノ酸；およびＦＲ４、０〜２３個のアミノ酸；の範囲内である。
【００８９】
通常、天然抗体は、タンパク質分泌のために抗体を細胞経路に誘導し、かつ成熟抗体には存在しない単一配列を含む。本明細書で提供されるような抗体をコードするポリヌクレオチドは、下述のように、天然シグナル配列または異種シグナル配列をコードし得る。
【００９０】
抗体はインビトロにて成熟させ、改変特性、例えば、抗原に対するより高い親和性またはより低い解離定数を有する抗体を作製することができる。ＣＤＲ内の残基のみ、特に、ＣＤＲ３ｓの変形は、同一の抗原に結合するが、より高い親和性を有する改変抗体をもたらし得る。例えば、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７；Ｙａｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３を参照されたい。本発明は、種々のインビトロでの選択スキーム、例えば、親和性成熟および／または鎖シャッフリング（Ｋａｎｇら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−２３）あるいはＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１）により作製される抗体を包含し、これにより、抗体は有利な特性を有するように選択され得る。多くのスキームでは、公知の抗体がインビトロにて多くはＣＤＲ内の特定の位置においてランダム化され、選択プロセスを受け、これにより、所望の特性、例えば、特定の抗原に対する親和性の増大を有する抗体が単離され得る。例えば、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎら、２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：５９１−６０１；Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏら、２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：６０３−１５；Ｙａｎｇら、１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−６７を参照されたい。通常、このような変異抗体は、突然変異誘発および選択工程の設計に依存し、１つ以上のＣＤＲにおける複数の改変残基を含み得る。例えば、上記ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎらを参照されたい。
【００９１】
提供される抗体の一部の完全長軽鎖および重鎖の具体例ならびにそれらの対応するアミノ酸配列は、表１に挙げられるものを含み、表１はＡＧ１５９の軽鎖および重鎖配列を示す。軽鎖および重鎖に関連する更なる配列が表２に挙げられる。一部の重鎖配列のＣ末端は、タンパク質が発現する宿主に依存して、．．．ＳＬＳＰＧＫまたは．．．ＳＬＳＰＧにて終止し得る。Ｃ末端リジンが存在し、あるいは存在しないことは、リジンの記号を括弧に入れることにより、即ち、（Ｋ）により、表１および２に示される。例えば、ＣＨＯ細胞では、Ｃ末端リジンは切断され、．．．ＳＬＳＰＧＫではなく．．．ＳＬＳＰＧのＣ末端配列をもたらす。
【００９２】
表１：軽鎖および重鎖
【００９３】
【表１】
2009534424.tif 000029
表２
【００９４】
【表２】
2009534424.tif 000030
表１に挙げられる軽鎖は表１に示される任意の重鎖と組み合わせられ、抗体を形成することができる。従って、特定の組成物に含まれる抗体は、Ｌ１がＨ１またはＨ２と組み合わせられる抗体を含む。いくつかの例では、抗体は表１に挙げられるものから少なくとも一本の重鎖および一本の軽鎖を含む。他の例では、抗体は二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖を含む。一例として、抗体は二本のＬ１軽鎖および二本のＨ１重鎖あるいは二本のＬ１軽鎖および二本のＨ２重鎖を含み得る。
【００９５】
他の組成物は、表１に示される重鎖および軽鎖の組合せにより形成される抗体の改変体である抗体を含み、これらの鎖のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を各々が有する軽鎖および／または重鎖を含む。いくつかの例では、このような抗体は少なくとも一本の重鎖および一本の軽鎖を含み、一方、他の例では、改変体型は二本の同一軽鎖および二本の同一重鎖を含む。
２．抗体可変ドメイン
特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、配列番号７９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および／または配列番号８３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ならびにこれらの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の免疫学的に機能性の断片、誘導体、突然変異タンパク質および改変体を含む抗体を含む。可変ドメイン配列は表３に示される。
【００９６】
表３
【００９７】
【表３】
2009534424.tif 000031
いくつかの組成物の抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみにて配列番号７９の配列と異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、このような配列差の各々は独立して、１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。一部の抗体における軽鎖可変領域は、配列番号７９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【００９８】
提供される特定の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみにて配列番号８３の配列と異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、このような配列差の各々は独立して、１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。一部の抗体における重鎖可変領域は、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
３．抗体のＣＤＲ
所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，１９９１においてＫａｂａｔらにより述べられているシステムを用いて同定され得る。本明細書で開示される組成物の特定の抗体は、表４にまとめる１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列と同一であるか、あるいは該アミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。
【００９９】
表４：ＣＤＲ
【０１００】
【表４】
2009534424.tif 000032
提供される特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の抗体は、１、２、３、４、５または全６個の上記一覧のＣＤＲを含み得る。一部の抗体は軽鎖ＣＤＲ３および／または重鎖ＣＤＲ３を含む。特定の抗体は表４に挙げたＣＤＲの変異形を有し、１つ以上（例えば、２、３、４、５または６）のＣＤＲの各々が表４に挙げたＣＤＲ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。例えば、抗体または断片は、表４に挙げた軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３のそれぞれと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を各々が有する軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３を含み得る。また、任意のＣＤＲのアミノ酸配列が表４に挙げた配列とわずか１、２、３、４または５個のアミノ酸残基のみ異なるように、提供される一部の抗体のＣＤＲ配列は表４に挙げたＣＤＲ配列と異なり得る。通常、一覧表示された配列との相違は保存的置換である（以下参照）。
【０１０１】
好適なベクターを用いることにより、１つもしくはそれ以上の軽鎖または重鎖ＣＤＲを含むポリペプチドが生成され、以下に更に詳細に述べられるようにポリペプチドを好適な宿主細胞に発現させ得る。
【０１０２】
表３および４に開示される重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲは、限定的でないが、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体およびｓｃＦｖｓを含む、当該分野で公知の種々のタイプの免疫学的に機能性の断片のいずれかを調製するのに用いることができる。
４．モノクローナル抗体
提供される特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、グルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）に結合するモノクローナル抗体を含む。当該分野で公知の任意の手法を用いて、例えば、免疫化スケジュールの完了後、トランスジェニック動物から採取した脾細胞を不死化することにより、モノクローナル抗体は作製され得る。当該分野で公知の任意の手法を用いて、例えば、脾細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製することにより、脾細胞は不死化され得る。ハイブリドーマ作製の融合処理に用いる骨髄腫細胞は、非抗体産生性であり、高融合効率および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地で増殖することができないようにさせる酵素欠損を有することが好ましい。マウスにおける融合に用いる好適な細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕ１が含まれ；ラットにおける融合に用いられる細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１０３】
いくつかの例では、グルカゴン免疫原で動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を免疫化し、免疫化動物から脾細胞を採取し、採取した脾細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、これにより、ハイブリドーマ細胞を作製し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、グルカゴンに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することにより、ハイブリドーマ細胞株は作製される。
【０１０４】
ハイブリドーマ細胞株から分泌されるモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の手法を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂｓは、特定の特性、例えば、グルカゴン誘発性活性を阻止する能力を有するｍＡｂを同定するため、更にスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングの例は以下の実施例に示される。
５．キメラ抗体およびヒト化抗体
他のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物はキメラまたはヒト化抗体を含む。治療剤として用いるモノクローナル抗体は使用前に種々の方法で修飾され得る。一例は「キメラ」抗体であり、これは、共有結合して機能性免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖またはそれらの免疫学的に機能性の部分を生成する、異なる抗体由来のタンパク質セグメントからなる抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同であり、一方、鎖の残部は、別の種由来であり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である。キメラ抗体に関する方法については、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照されたい。これらは参考として本明細書に援用される。ＣＤＲグラフト化については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号および同第５，５３０，１０１号に述べられており、これらはすべて、汎用目的で参考として本明細書に援用される。
【０１０５】
一般に、キメラ抗体を作製する目標は、対象患者種由来のアミノ酸の数が最大となるキメラを作製することである。一例は、抗体が、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、一方、抗体鎖の残部が、別の種由来であり、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一かあるいは相同である、「ＣＤＲグラフト化」抗体である。ヒトにおける使用では、齧歯動物抗体由来のＶ領域または選択ＣＤＲがヒト抗体にグラフト化され、ヒト抗体の天然Ｖ領域または選択ＣＤＲを置き換えることが多い。
【０１０６】
１つの有用なタイプのキメラ抗体は「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、当初、非ヒト動物において産出されたモノクローナル抗体から作製される。このモノクローナル抗体における特定のアミノ酸残基、典型的には、抗体の非抗原認識部分由来の残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるように修飾される。ヒト化は種々の方法を用いて、例えば、齧歯動物可変領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域に置換することにより実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６を参照）。
６．完全ヒト抗体
抗体が完全ヒト抗体である組成物も提供される。上述のように、本明細書で開示されるＡＧ１５９  Ａｂは完全ヒト抗グルカゴン抗体の一例である。ヒトを抗原に曝すことなく、グルカゴンに特異的な他の完全ヒト抗体を作製する方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の作製を実施する１つの手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Ｉｇ遺伝子が不活化される、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のマウスへの導入は、任意の所望の抗原で免疫化することができる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製する一手段である。完全ヒト抗体を用いることは、治療剤としてマウスまたはマウス誘導体化Ｍａｂをヒトに投与することによって引き起こされ得る場合がある免疫原性およびアレルギー反応を最小限にすることができる。
【０１０７】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生なしにヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することにより、作製することができる。通常、これを目的とする抗原は６個またはそれ以上の隣接アミノ酸を有し、任意で、ハプテンなどの担体に接合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座を不能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大断片をマウスに挿入することにより、トランスジェニック動物が作製される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体以下のものを有する部分的に改変された動物は、次に、交雑され、所望の免疫系の改変をすべて有する動物が得られる。免疫原を投与されると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に免疫特異的であるがマウスアミノ酸配列よりむしろヒトアミノ酸配列（可変領域を含む）を有する抗体を産生する。このような方法の更なる詳細については、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。これらは参考として本明細書に援用される。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関する更なる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；同第６，７１３，６１０号；同第６，６７３，９８６号；同第６，１６２，９６３号；同第５，５４５，８０７号；同第６，３００，１２９号；同第６，２５５，４５８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号および同第５，５４５，８０６号；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１０７４１，ＷＯ９０／０４０３６ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および欧州特許第５４６０７３Ａ１号に述べられており、これらはすべて、汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０１０８】
本明細書で「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上述のトランスジェニックマウスは、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的変異と共に、再配列されないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンミニ遺伝子座を有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。従って、マウスは免疫化に応答してマウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラス変換および体細胞変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧ  κモノクローナル抗体を生成する（上記Ｌｏｎｂｅｒｇら；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製については、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎら、１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒら、１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；  ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に詳細に説明されており、前記文献は汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。更に、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；ならびに米国特許第５，５４５，８０７号；国際特許公報第ＷＯ９３／１２２７号；同第ＷＯ９２／２２６４６号；および同第ＷＯ９２／０３９１８号を参照されたい。これらすべての開示内容は汎用目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を産生させるために利用される技術は、ＷＯ９８／２４８９３およびＭｅｎｄｅｚら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６にも開示されており、これらは参考として本明細書に援用される。例えば、ヒト抗グルカゴン抗体を作製するのに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジェニックマウス系統を用いることができる。
【０１０９】
ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ＭＡｂが、上述のようなトランスジェニックマウスから産生され、選択され得る。このような抗体は好適なベクターおよび宿主細胞を用いてクローニングされ、発現され得（例えば、以下の実施例を参照）、あるいは抗体は培養ハイブリドーマ細胞から採取され得る。
【０１１０】
完全ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているように）。ファージディスプレイ法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの提示、続いて、選択抗原へのそれらの結合によるファージの選択を通して免疫選択を模倣する。このような手法の１つがＰＣＴ公報第ＷＯ９９／１０４９４号に述べられており（参考として本明細書に援用される）、このような手法を用いたＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体に対する高親和性および機能性アゴニスト抗体の単離について述べている。
７．二重特異性または二重機能性抗体
本明細書で開示される組成物に含まれる抗体は、上述のような１つもしくはそれ以上のＣＤＲまたは１つもしくはそれ以上の可変領域を含む二重特異性および二重機能性抗体であってもよい。いくつかの例における二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、限定的でないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む、種々の方法により作製され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。
８．例示的な変異抗体
本明細書で提供される特定の組成物の抗体は、上記で開示された抗体（例えば、表１および２に挙げられる配列を有する抗体）の改変体形態である。例えば、一部の抗体は、表１および２に挙げられる、１つ以上の重鎖もしくは軽鎖、可変領域またはＣＤＲにおいて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する抗体である。
【０１１１】
天然アミノ酸は側鎖の共通の性質に基づいてクラスに分類され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーの同クラスの他のメンバーとの交換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、通常、生物系での合成よりむしろ化学的ペプチド合成により組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらは、ペプチド擬似体および他の逆形態もしくは転置形態のアミノ酸部分を含む。
【０１１２】
非保存的置換は、上記クラスの１つのメンバーの他のクラスのメンバーとの交換を含み得る。このような置換残基は、ヒト抗体と相同な抗体の領域または分子の非相同領域に導入され得る。
【０１１３】
このような変換を行う際、特定の実施形態に基づき、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質のヒドロパシープロファイルは、各アミノ酸に数値（「ヒドロパシー指数」）を割り当て、次に、ペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均化することにより、計算される。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づき、ヒドロパシー指数を割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１１４】
タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与する際のヒドロパシープロファイルの重要性は、当該分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照）。特定のアミノ酸が同様のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され、なおも同様の生物学的活性を保持し得ることは周知である。ヒドロパシー指数に基づいて変換する際、特定の実施形態では、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。一部の態様では、±１以内のアミノ酸が含まれ、他の態様では、±０．５以内のアミノ酸が含まれる。
【０１１５】
類似アミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得、特に、これにより生成される生理機能タンパク質またはペプチドを、本発明の場合のように、免疫的実施形態に用いることを目的とする場合、効果的になされ得ることも当該分野では理解される。特定の実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性により左右されるような、タンパク質の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原結合もしくは免疫原性、即ち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１１６】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づく変換を行う際、特定の実施形態では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内のアミノ酸が含まれ、更に別の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸が含まれる。いくつかの例では、また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定し得る。これらの領域は「エピトープコア領域」と称される。
【０１１７】
例示的な保存的アミノ酸置換が表５に示される。
【０１１８】
表５
【０１１９】
【表５】
2009534424.tif 000033
当業者は周知の手法を用いて、本明細書で示されるポリペプチドの好適な改変体を決定することができるであろう。当業者は活性に重要であるとは考えられない領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく、変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。当業者は類似ポリペプチド間に保存された分子の残基および部分を特定することもできるであろう。更なる実施形態では、生物活性または構造に重要でありうる領域でさえも、生物活性を破壊することなく、あるいはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換を受け得る。
【０１２０】
加えて、当業者は構造−機能試験をレビューし、活性または構造に重要な類似ポリペプチドにおける残基を特定することができる。このような比較に照らし、当業者は、類似タンパク質における活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者はこのような予測される重要なアミノ酸残基に対し、化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【０１２１】
当業者は類似ポリペプチドにおける構造に関連して三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報に照らし、当業者はその三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。当業者はタンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に極端な変更をしないように選択し得るが、それは、このような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。更に、当業者は各所望のアミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験される改変体を作製し得る。次に、これらの改変体は、本明細書で述べるようなグルカゴン活性用アッセイを用いてスクリーニングすることができ（以下の実施例を参照）、従って、いずれのアミノ酸が変更でき、また、いずれが変更されてはならないかということに関する情報をもたらす。言い換えると、このような定期試験から収集される情報に基づき、当業者は、単独で、あるいは他の変異と組み合わせて更なる置換を避ける必要があるアミノ酸位置を容易に決定することができる。
【０１２２】
多くの科学文献が二次構造の予測に取り組んできた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８；Ｃｈｏｕら、１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。更に、現在、二次構造の予測を支援するコンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する一方法は相同モデリングに基づく。例えば、３０％超の配列同一性または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。近年のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発展により、二次構造の予測性の向上が得られ、これには、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の折り畳みのポテンシャル数が含まれる。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質には限られた数の折り畳みがあり、また、構造の臨界数が解明されれば、構造予測は劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【０１２３】
二次構造を予測する更なる方法には、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）および「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（上記Ｈｏｌｍ，１９９９；および上記Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９９７を参照）が含まれる。
【０１２４】
本発明の一部の実施形態では、（１）タンパク質分解感受性を低下させ、（２）易酸化性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更し、（４）リガンドまたは抗原結合親和性を変更し、かつ／あるいは（４）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的もしくは機能的性質を付与し、または変更する、アミノ酸置換がなされる。例えば、天然配列において、単一または多重アミノ酸置換（特定の実施形態では保存的アミノ酸置換）がなされ得る。置換は分子間接触を形成するドメインの外側に位置する抗体部分でなされ得る。このような実施形態では、親配列の構造特性を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換を用いることができる（例えば、親または天然抗体を特徴づける二次構造を崩壊しない、１つ以上の置換アミノ酸）。当該分野で認められているポリペプチドの二次および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ＢｒａｎｄｅｎおよびＴｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５に述べられており、これらは各々参考として本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
いくつかの組成物において用いられる抗体改変体は、改変Ｆｃ断片または改変重鎖定常領域を含む抗体を含み得る。「結晶化する断片」を表すＦｃ断片または重鎖定常領域は変異によって改変され、抗体に変性特性を付与することができる。例えば、ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ，１９９２，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５１：１−８４；ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−９０；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４；ＴｅｌｌｅｍａｎおよびＪｕｎｇｈａｎｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １００：２４５−２５１；Ｍｅｄｅｓａｎら、１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２−２１００；これらはすべて参考として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このような変異は、置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み得、通常、本明細書で述べられる方法および当該分野で公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．を参照されたい。これらは参考として本明細書に組み込まれる）により、１つ以上の変異原性オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異誘発によって生じる。
【０１２６】
本明細書で開示されるいくつかの組成物における抗体は、本明細書で開示される抗体のグリコシル化改変体を包含し、グリコシル化部位の数および／またはタイプが親ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変更されている。特定の実施形態では、抗体タンパク質改変体は天然抗体よりも多いあるいは少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、Ｘと指定されたアミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸残基であってよい。この配列を生成するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合炭水化物鎖の付加のための新規部位の可能性を与える。あるいは、この配列を排除あるいは変更する置換は、天然ポリペプチドに存在するＮ−結合炭水化物鎖の付加を防止する。例えば、グリコシル化は、Ａｓｎの欠失により、あるいはＡｓｎを異なるアミノ酸に置換することにより、低下し得る。他の実施形態では、１つ以上の新規Ｎ−結合部位が生成される。通常、抗体はＦｃ領域にＮ−結合グリコシル化部位を有する。
【０１２７】
更なる好ましい抗体改変体は、親または天然アミノ酸配列における１つ以上のシステイン残基が欠失され、あるいは別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されたシステイン改変体を含む。システイン改変体は、特に、抗体が生理活性構造に再び折り畳まれる必要がある際に有用である。システイン改変体は天然抗体よりも少ないシステイン残基を有し得、通常、不対システインから生じる相互作用を最小限にするように偶数を有する。
【０１２８】
開示される重鎖および軽鎖の可変領域ドメインおよびＣＤＲは、グルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）に特異的に結合し得る抗原結合領域を含むポリペプチドを調製するのに用いることができる。例えば、表２に挙げられる１つ以上のＣＤＲは、共有結合または非共有結合で分子（例えば、ポリペプチド）に組み込まれ、イムノアドヘジンを生成することができる。イムノアドヘジンはより大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（ｓ）を組み込み、ＣＤＲ（ｓ）を別のポリペプチド鎖に共有結合させ、あるいはＣＤＲ（ｓ）を非共有結合で組み込み得る。ＣＤＲ（ｓ）はイムノアドヘジンが対象とする特定の抗原（例えば、グルカゴンまたはそのエピトープ）に特異的に結合することを可能とする。
【０１２９】
本明細書で述べられる可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく擬似体（例えば、ペプチド擬似体」（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）または「ペプチド擬似体」（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチドあるいはペプチドおよび非ペプチド領域の組合せとなり得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；ならびにＥｖａｎｓら、１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９、これらは目的に応じて参考として本明細書に組み込まれる。治療上有用なペプチドに構造的に類似するペプチド擬似体は、類似の治療効果または予防効果をもたらすのに用いられ得る。このような化合物はコンピュータ化分子モデリングの支援により開発される場合が多い。一般的に、本発明のペプチド擬似体は、所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当該分野で周知の方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合に任意で置換される、１つ以上のペプチド結合を有するタンパク質である。特定の実施形態では、より安定なタンパク質を生成するのに、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸への体系的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）が用いられ得る。さらに、当該分野で公知の方法により（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、参考として本明細書に援用される）、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することにより、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む制限ペプチドが作製され得る。
【０１３０】
いくつかの組成物では、１つ以上の抗グルカゴン抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが用いられ得る。オリゴマーは共有結合または非共有結合した二量体、三量体または高重合オリゴマーの形態でよい。２つ以上の抗グルカゴン抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが使用のために検討され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが含まれる。
Ｂ．ＧＬＰ−１化合物
組成物の抗グルカゴン抗体には種々のＧＬＰ−１化合物を結合することができ、ＧＬＰ−１それ自体および多種多様のＧＬＰ−１類似体が含まれる。
【０１３１】
本明細書で用いられるように、「ＧＬＰ−１」という用語は、上記背景技術において述べたようなグルカゴン様ペプチド１を指す。ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨのカルボキシル末端は切断され、ＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２を生成することができる。上述のように、ＧＬＰ−１（１−３１）とも称されるＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨおよびＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２は同一活性を有する。便宜上、これら両方の生物活性形態を指すのに、「ＧＬＰ−１」および「天然ＧＬＰ−１」という用語が用いられる。上述のように、当該分野では２つの異なる番号付け表記が用いられている。本明細書で採用される番号付け表記は、ＧＬＰ−１のＮ末端ヒスチジンを残基番号１と考える番号付け表記である。従って、天然ＧＬＰ−１（即ち、ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨ）は以下のアミノ酸配列を有する：
１Ｈｉｓ−２Ａｌａ−３Ｇｌｕ−４Ｇｌｙ−５Ｔｈｒ−６Ｐｈｅ−７Ｔｈｒ−８Ｓｅｒ−９Ａｓｐ−１０Ｖａｌ−１１Ｓｅｒ−１２Ｓｅｒ−１３Ｔｙｒ−１４Ｌｅｕ−１５Ｇｌｕ−１６Ｇｌｙ−１７Ｇｌｎ−１８Ａｌａ−１９Ａｌａ−２０Ｌｙｓ−２１Ｇｌｕ−２２Ｐｈｅ−２３Ｉｌｅ−２４Ａｌａ−２５Ｔｒｐ−２６Ｌｅｕ−２７Ｖａｌ−２８Ｌｙｓ−２９Ｇｌｙ−３０Ａｒｇ−３１Ｇｌｙ（配列番号１）。
【０１３２】
Ｎ末端とＣ末端との間に位置するアミノ酸は、表示されるように連続的に番号付けされる。従って、例えば、位置２におけるアミノ酸はＡｌａであり、位置２０におけるアミノ酸はＬｙｓである。同様に、本明細書で特定位置において置換することに言及する際、同じ番号付けシステムが適用される。従って、例えば、位置１６におけるＡｌａの置換とは、位置１６におけるＧｌｙがＡｌａに置換されたということである。ＧＬＰ−１（１−３１）のアミノ末端においてアミノ酸が付加される場合、位置１のすぐ上流のアミノ酸がアミノ酸−１であり、次の上流アミノ酸が位置−２であるなどのように、位置は減少順に連続的に番号付けされる。アミノ酸がＧＬＰ−１のカルボキシル末端に付加される場合、位置３１のすぐ下流のアミノ酸がアミノ酸３２であり、次の下流アミノ酸が位置３３であるなどのように、位置は増加順に連続的に番号付けされる。天然ＧＬＰ−１配列に対する変更は括弧内に示され、次の形態：ｘ位置番号ｙを有し、ｘは天然ＧＬＰ−１配列での表示位置番号におけるアミノ酸であり、ｙはこの位置で置換されるアミノ酸である。従って、例えば、Ａ２Ｇとは、天然ＧＬＰ−１配列の位置２におけるアラニンがグリシンに置換されたということである。多重置換は順方向スラッシュ（／）により分離される。Ｃ末端に付加されるアミノ酸はプラス記号（＋）、続いて、付加の位置で示される。
【０１３３】
本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１化合物」は、ＧＬＰ−１ペプチドを含む分子を指し、１つ以上の追加の構成要素（例えば、インビボにて化合物の半減期を延長する構成要素）を含み得る。
【０１３４】
本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、天然ＧＬＰ−１または天然ＧＬＰ−１（１−３１）−ＯＨもしくはＧＬＰ−１（１−３０）−ＮＨ２のアミノ酸配列において１つもしくはそれ以上の変更を有するが、少なくとも１つの天然ＧＬＰ−１の活性を保持するペプチドを指す。該用語は、エキセンジン−３およびエキセンジン−４などのエキセンジンファミリーのメンバー（例えば、米国特許第５，４２４，２８６号を参照）あるいはエキセンジンのアミノ酸配列において１つ以上の変更を有するペプチドも含み、但し、ペプチドは少なくとも１つのＧＬＰ−１活性を保持する。例えば、エキセンジン−４は以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１２７）。
【０１３５】
エキセンジン−３は以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ（配列番号１３１）。
【０１３６】
「ＧＬＰ−１活性」という語句またはその文法的等価語は、ＧＬＰ−１およびエキセンジンと関連する任意の活性を広範に指す。被験体に投与される際、このような活性の例には、限定的でないが、インスリン向性活性、胃運動の抑制、胃液分泌の抑制、β細胞の増殖および複製の促進、β細胞量の増加、満腹感の増大ならびに食物摂取の減少が含まれる。
【０１３７】
「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、本明細書で開示されるＧＬＰ−１ペプチドの１つと機能的等価物である、ＧＬＰ−１ペプチドの改変体、断片および誘導体も含み、改変体、断片または誘導体は類似のアミノ酸配列（例えば、保存的置換を含む）を有するとともに、ある程度、少なくとも１つのＧＬＰ−１ペプチド活性を保持するという点で機能的等価物である。
【０１３８】
「ＧＬＰ−１改変体」は、本明細書で述べられるＧＬＰ−１ペプチドと「実質的に同一」（上記定義を参照）であるペプチドを含む。このような改変体は、欠失、挿入および／または置換のようなアミノ酸の変更を有するタンパク質を含む。通常、このような変更は、改変体タンパク質の活性が本明細書で開示されるＧＬＰ−１ペプチドの１つに実質的に類似するように、保存的性質である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照）。置換の場合、別のアミノ酸を置換するアミノ酸は通常、類似の構造および／または化学的性質を有する。ＧＬＰ−１改変体は本明細書で述べるようなＧＬＰ−１ペプチドと少なくとも６０％、７０％または７５％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有し得、但し、改変体は依然としてＧＬＰ−１活性を有する。
【０１３９】
本明細書で用いられるような「ＧＬＰ−１誘導体」は、１つ以上のアミノ酸が、１）対応するＤ−アミノ酸に置換され、２）非天然アミノ酸残基に変更され、かつ／あるいは、３）化学的に修飾されたＧＬＰ−１ペプチドの１つを指す。化学修飾の例には、限定されないが、ペプチド骨格および／またはアミノ酸側鎖のアルキル化、アシル化、脱アミド、エステル化、リン酸化およびグリコシル化が含まれる。
【０１４０】
「ＧＬＰ−１断片」は、本明細書で挙げられるＧＬＰ−１ペプチドの切頭形態またはその改変体または誘導体を指す。典型的には、断片は本明細書で示されるＧＬＰ−１ペプチドに対して１、２、３、４または５個のアミノ酸単位で切頭される。切頭はアミノ末端および／またはカルボキシル末端であってよい。
【０１４１】
特定の組成物での使用に好適なＧＬＰ−１ペプチドの多数の例が、例えば、米国特許第６，３２９，３３６号；同第６，７０３，３６５号；同第５，７０５，４８３号；同第５，９７７，０７１号；同第６，１３３，２３５号；同第６，４１０，５１３号；同第６，３８８，０５３号；同第６，３５８，９２４号；同第５，５１２，５４９号；同第６，００６，７５３号；同第５，５４５，６１８号；同第５，１１８，６６６号；同第５，１２０，７１２号；同第５，６１４，４９２号；同第５，９５８，９０９号；同第６，１６２，９０７号；同第６，８４９，７０８号；同第６，８２８，３０３号；同第６，２８４，７２７号；同第６，３４４，１８０号；同第６，５０６，７２４号；同第６，８５８，５７６号；同第６，８８４，５７９号；同第６，５２８，４８６号；同第５，８４６，９３７号；同第５，９９０，０７７号；同第６，７７０，６２０号；同第６，６２０，９１０号；同第５，５４５，６１８号；同第６，５６９，８３２号；および第６，２６８，３４３号に述べられており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。特定の組成物において抗グルカゴン抗体に結合可能な他のＧＬＰ−１ペプチドが、例えば、以下の米国特許出願公開：第２００４／００５３３７０号；同第２００４／０１２７３９９号；同第２００３／０２２１２０１号；同第２００３／０２２６１５５号；同第２００４／００２３３３４号；同第２００４／０１４３１０４号；同第２００５／０１０７３１８号；同第２００４／０１０６５４７号；同第２００４／０１７６３０７号；同第２００４／００５２８６２号；同第２００４／００８２５０７号；同第２００４／０１４６９８５号；同第２００４／００５３３７０号；同第２００３／０１９９６７２号；および第２００１／００１１０７１号に開示されており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。特定の組成物において使用可能な更に別のＧＬＰ−１ペプチドが、例えば、以下のＰＣＴ出願公開：ＷＯ００／３４３３１；ＷＯ００３４３３２；ＷＯ０２／４６２２７；ＷＯ０３／０６００７１；ＷＯ２００５／００３２９６；ＷＯ０３／０１８５１６；ＷＯ０１／９８３３１；ＷＯ０３／０５９９３４；ＷＯ２００４／０７８７７７；ＷＯ９９／３０７３１；ＷＯ９８／４３６５８；ＷＯ００／１６７９７；ＷＯ００／１５２２４；ＷＯ０３／１０３５７２；ＷＯ０３／０８７１３９；ＷＯ２００４／１１０４７２；ＷＯ０３／０１８５１６；ＷＯ２００５／０００８９２；ＷＯ０３／０２８６２６；ＷＯ２００４／０２０４０４；ＷＯ２００４／０２０４０５；ＷＯ２００４／０１９８７２；ＷＯ０３／０２０７４６；ＷＯ２００４／０９４４６１；ＷＯ９１／１１４５７；ＷＯ８７／０６９４１；ＷＯ９０／１１２９６；ＷＯ００／３４３３２；ＷＯ２００４／０９３８２３；ＷＯ０３／０４０３０９；ＷＯ２００４／０２２００４；ＷＯ９９／６４０６１；ＷＯ０３／０１１８９２；ＷＯ２００４／０２９０８１；ＷＯ２００４／００５３４２；ＷＯ９０／０１５４０；ＷＯ０２／２２１５１；ＷＯ９９／４３３４１；ＷＯ９６／２９３４２；ＷＯ９８／０８８７１；ＷＯ９９／４３７０５；ＷＯ９９／４３７０６；ＷＯ９９／４３７０７；ＷＯ９９／４３７０８；ＷＯ２００４／１０５７８１；ＷＯ２００４／１０５７９０；ＷＯ２００５／０２７９７８；ＷＯ０４／０７４３１５；ＷＯ２００５／０２８５１６；およびＷＯ２００５／０４６７１６に述べられている。いくつかの組成物において使用可能な更なるＧＬＰ−１ペプチドが、欧州特許第０７３３６４４号；同第１３６４９６７号；同第０６９９，６８６号；同第０６１９３２２号；同第１０８３９２４号；同第０５１２０４２号；および第１０６１９４６号に述べられており、これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される。
【０１４２】
いくつかの組成物に存在する特定のＧＬＰ−１ペプチドは、式Ｉのアミノ酸配列（配列番号９２）：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｘａａ２８−Ｘａａ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１（式Ｉ、配列番号９２）
を含み、式中、
Ｒ１はＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ２およびＲ３は独立して水素または（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
位置１におけるＸａａは、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンまたはα−メチル−ヒスチジンであり；
位置２におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ｂＡｌａ（２−アミノプロピオン酸）、Ａｓｐ、Ａｌａ、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、２−アミノイソ酪酸またはα−α−二置換アミノ酸であり；
位置３におけるＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＨｉｓであり；
位置５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置６におけるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり；
位置７におけるＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり；
位置８におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置９におけるＸａａは、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり；
位置１０におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
位置１１におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置１２におけるＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１３におけるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１４におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１５におけるＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１６におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１７におけるＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１８におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置１９におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２０におけるＸａａは、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２１におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２２におけるＸａａは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２３におけるＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２４におけるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ホモリジン、オルニチン、４−カルボキシ−フェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−ホモグルタミン酸またはホモグルタミン酸であり；
位置２５におけるＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２６におけるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置２７におけるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｙｓであり；
位置２８におけるＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
位置２９におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３０におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＨｉｓであり；
位置３１におけるＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
位置３２におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓであるか、あるいは省略され；
位置３３におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏであるか、あるいは省略され；
位置３４におけるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｔｈｒであるか、あるいは省略され；
位置３５におけるＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３６におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
位置３７におけるＸａａは、Ｇｌｙであるか、あるいは省略され；
但し、位置３２、３３、３４、３５、３６または３７におけるアミノ酸が省略される場合、該アミノ酸の各アミノ酸下流も省略され、化合物はＧＬＰ−１活性を有する。従って、例えば、位置３２におけるアミノ酸が省略される場合、位置３３〜３７にもアミノ酸はない。同様に、位置３３におけるアミノ酸が省略される場合、位置３４〜３７にもアミノ酸はない。また、位置３４におけるアミノ酸が省略される場合、位置３５〜３７にアミノ酸はない、などという具合である。
【０１４３】
特定の組成物では、ＧＬＰ−１ペプチドは、下記表６に示されるような配列番号１〜３５もしくは配列番号１２６の任意のアミノ酸配列またはエキセンジン−３もしくはエキセンジン−４（配列番号１２７）を含む。一部の他の組成物におけるＧＬＰ−１ペプチドは、１、２、３、４もしくは５以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７を含み、但し、改変体はＧＬＰ−１活性（例えば、インスリン向性活性）を有する。更に別の組成物では、ＧＬＰ−１ペプチドは、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。
【０１４４】
表６
【０１４５】
【表６】
2009534424.tif 000034
Ｃ．抗体とＧＬＰ−１化合物との結合
上記のように、抗グルカゴン抗体とＧＬＰ−１化合物に関連して「結合される（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語が用いられる際、これら２つの分子はリンカーによって接合される（ｊｏｉｎｅｄ）場合もあれば、そうでない場合もある。特定の実施形態では、リンカーが抗体と化合物との間のスペーサーとして機能するように用いられる場合、種々の異なる化学構造を用いることができる。例えば、特定の実施形態では、リンカーはペプチド結合によって結合したアミノ酸残基を含み、即ち、リンカーはペプチドを含む。従って、特定の実施形態では、リンカーはこれらの終点間のすべての数を含む１〜２０個のアミノ酸残基を有するペプチドである。リンカーにおいて用いられるアミノ酸残基は従来型または非従来型アミノ酸残基でよい。特定の実施形態では、リンカーにおけるアミノ酸残基は別の態様でグリコシル化および／または誘導体化され得る。特定の実施形態では、リンカーにおけるアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。特定の実施形態では、リンカーはグリシンおよび／またはアラニンなどの立体的に障害されないアミノ酸残基の過半数を含む。従って、特定の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン（例えば、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）およびポリアラニンから選択される。特定の典型的なリンカーには、限定されないが、
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号９７）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号９８）；
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号９９）；
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１００）；および
ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＡｌａＰｒｏ（配列番号１３０）
が含まれる。
【０１４６】
上記の表記について説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。特定の実施形態では、リンカーはＧｌｙ残基とＡｌａ残基との組合せを含む。特定の実施形態では、リンカーは１０またはそれ以下のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、リンカーはこれらの終点間のすべての数を含む１１〜３０個のアミノ酸残基を含む。
【０１４７】
本明細書で提供されるような組成物において用いることができる特定のリンカーの更なる例には、ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＧＧＧＧＧＧ（配列番号３６）；ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３７）；およびＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３８）が含まれる。
【０１４８】
特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、２つのポリペプチドを単一コード配列にクローニングするのに用いられる制限酵素部位から生じ得る。特定の実施形態では、制限酵素部位は１つまたは両方のポリペプチドのコード配列に付加される。特定の実施形態では、このようなリンカーのアミノ酸配列は、少なくとも部分的に、クローニング処理に対して選択される制限酵素部位により決定する。
【０１４９】
特定の実施形態では、非ペプチドリンカーが提供される。特定の典型的な非ペプチドリンカーには、限定的ではないが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーが含まれる。このようなアルキルリンカーは、特定の実施形態では、更に、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの非立体障害基を含むが、これに限定されない置換を含む。非限定的な典型的非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカー
【０１５０】
【化１】
2009534424.tif 000035
であり、式中、ｎはリンカーが１００〜５０００ｋＤの分子量を有するような数である。特定の実施形態では、ｎは、リンカーがこれらの終点間の全ポイントを含む１００〜５００ｋＤの分子量を有するような数である。
【０１５１】
特定の実施形態では、リンカーは２つのポリペプチドを互いに結合するのに用いられる化学的および／または酵素的プロセスから生じ得る。ポリペプチドを結合するための特定の例示的な化学的および／または酵素的プロセスが、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ（２００３／２００４）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に述べられている。
Ｄ．ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の具体例
提供される組成物の一部の具体例は、抗体がＡＧ１５９の１つもしくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ（配列番号７６〜７８）および１つもしくはそれ以上の重鎖ＣＤＲ（配列番号８４〜８６）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに結合（例えば、融合）した例である。他の組成物では、抗体はＡＧ１５９の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域（それぞれ、配列番号７９、８３）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに融合される。更に別の組成物では、抗体はＡＧ１５９の成熟重鎖（配列番号８２または８９）および／または成熟軽鎖（配列番号４０）を含み、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドあるいは本明細書で開示される他の任意のＧＬＰ−１ペプチドに融合される。
【０１５２】
これまで詳細に上述したように、これらのＧＬＰ−１ペプチドはＡＧ１５９抗体または断片に種々の異なる方法で結合することができ、例えば、多数のＧＬＰ−１ペプチド（同一または互いに異なる）が異なる数および位置にて抗体に結合されるような方法が含まれる。
【０１５３】
提供される特定の例示的な組成物が表６に挙げられている。これらの特定の組成物が、単に、本明細書で述べられる一般的組成物の具体例を示すために提供され、また、組成物がこれらの特定の形態に限定されないということが理解されるべきである。表６の最初の縦列は組成物の一般構造を示す。一般的ではあっても必ずしもそうではないが、本明細書で採用されている省略形はＬＣ：ＨＣであり、軽鎖形態がコロンの前に挙げられ、重鎖形態がコロンの後に挙げられている。上記に示したように、天然ＧＬＰ−１配列に対する変更は、括弧で示され、形態：ｘ位置番号ｙを有し、ｘは天然ＧＬＰ−１配列での表示位置番号におけるアミノ酸であり、ｙはこの位置で置換されるアミノ酸である。多重置換は順方向スラッシュ（／）により分離される。Ｃ末端に付加されるアミノ酸はプラス記号（＋）、続いて、付加の位置で示される。ＧＬＰ−１ペプチドがＬＣに結合される場合、これはＧＬＰ−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５と表示され、ＧＬＰ−１ペプチドはコロンの左側に挙げられている。ＧＬＰ−１ペプチドがＨＣに結合される場合、これはＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ−ＡＧ１５９と表示され、即ち、ＧＬＰ−１ペプチドはコロンの右側に挙げられている。ＧＬＰ−１ペプチドおよびＡＧ１５９抗体の軽鎖または重鎖はリンカー（配列番号３６〜３８）を介して融合される。
【０１５４】
これらの特定の組成物では、ＡＧ１５９抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプであることが示されるが、他の任意の免疫グロブリンアイソタイプであってもよい。これらの融合では、ＧＬＰ−１ペプチドのカルボキシ末端がリンカー（例えば、配列番号３６〜３８）を介してＡＧ１５９抗体のアミノ末端に融合される。しかし、上述のように、ＧＬＰ−１ペプチドは他の位置および他の配向にて結合され得る。
【０１５５】
特定の組成物は、配列番号４１〜７４または配列番号１２９のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチド融合を含む。特定の組成物では、軽鎖ポリペプチド融合はＡＧ１５９の重鎖（配列番号８２または８９）と対をなす。いくつかの組成物は配列番号４１〜７４の同一の二対の軽鎖融合およびＡＧ１５９の同一の二対の重鎖を含み、四量体構造を有する抗体を形成する。
【０１５６】
ＧＬＰ−１ペプチド（例えば、配列番号１〜３５、配列番号１２６または配列番号１２７）が軽鎖ではなく、ＡＧ１５９の重鎖ポリペプチド（配列番号８２または８９）に融合されることを除き、他の組成物は同様である。このような重鎖ポリペプチド融合はＡＧ１５９の軽鎖（配列番号４０または７５）と対をなすことができ、いくつかの組成物は同一の二対の重鎖融合およびＡＧ１５９の同一の二対の軽鎖を含み、四量体構造を有する抗体を形成する。
【０１５７】
詳細に上述したように、本明細書で提供されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、抗体および／またはＧＬＰ−１ペプチドが本明細書の表に挙げられるものの改変体であるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む。変更は抗体および／またはＧＬＰ−１ペプチドにおいて可能である。従って、例えば、特定の組成物は、表１〜４または７に挙げられる鎖のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有するポリペプチド鎖を含む。他の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下のアミノ酸置換を含む、表７のポリペプチドを含み、典型的には、その置換は上述のような保存的置換である。
【０１５８】
別の実施形態では、配列番号４１〜７４または配列番号１２８または１２９の任意の１つに示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【０１５９】
表７
【０１６０】
【表７−１】
2009534424.tif 000036
【０１６１】
【表７−２】
2009534424.tif 000037
【０１６２】
【表７−３】
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【０１６３】
【表７−４】
2009534424.tif 000039
Ｅ．任意の構成要素
いくつかの組成物では、ＧＬＰ−１化合物および／または抗グルカゴン抗体は追加の構成要素を含むように改変される。例えば、ＧＬＰ−１化合物または抗体は１つ以上の水溶性ポリマーに結合され得る。好適な水溶性ポリマーまたはその混合物には、限定されないが、Ｎ結合またはＯ結合炭水化物、糖類（例えば、キトサン、キサンタンゴム、セルロースおよびその誘導体、アカシアゴム、カラヤゴム、グアーゴム、カラギーナンおよびアガロースなどの多糖類）、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（タンパク質を誘導体化するのに用いられているＰＥＧ形態を含み、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチリングリコールが含まれる）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ポリビニルアルコールならびに前述のコポリマーが含まれる。
【０１６４】
特定の組成物では、ＧＬＰ−１化合物は好適な二価金属カチオンと複合体を形成する。ＧＬＰ−１化合物の二価金属複合体は懸濁液として皮下投与することができ、一般に、このようなＧＬＰ−１化合物の複合体が生理的ｐＨほどの水溶液に不溶性であるため、インビボにて放出速度が低下する。ＧＬＰ−１化合物と複合体を形成するのに好適な二価金属カチオンの非限定例には、Ｚｎ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｃｄ＋＋、Ｎｉ＋＋などが含まれる。ＧＬＰ−１化合物の二価金属複合体は、例えば、参考として本明細書に援用されるＷＯ０１／９８３３１に述べられているような手法を用いて得ることができる。
ＩＶ．核酸
本明細書で述べられるような抗体の１鎖もしくは両鎖またはＧＬＰ−１ペプチドと抗グルカゴン抗体の１鎖との融合をコードする核酸、ならびにこのような抗体または融合体の断片、誘導体、突然変異タンパク質もしくは改変体をコードする核酸も提供される。ポリペプチドまたは抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、あるいは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたはシークエンシングプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチドも提供される。核酸は任意の長さでよい。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれ以上のヌクレオチド長でよく、かつ／あるいは１つ以上のさらなる配列、例えば、調節配列を含むことができ、かつ／あるいはより大きな核酸の一部、例えば、ベクターでよい。核酸は一本鎖または二本鎖でよく、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチドならびにそれらの人工的改変体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
【０１６５】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖もしくは軽鎖、可変ドメインのみまたは完全長）をコードするＤＮＡは、グルカゴンまたはその免疫原性断片で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離され得る。ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手法により単離され得る。ファージ提示は公知の手法の別例であり、これにより、抗体の誘導体が調製され得る。一手法では、対象抗体の構成要素であるポリペプチドは、任意の好適な組換え発現系において発現され、発現ポリペプチドは組み合わされて抗体分子を形成する。
【０１６６】
別の態様では、本発明のポリペプチドまたはその一部（例えば、１つもしくはそれ以上のＣＤＲまたは１つもしくはそれ以上の可変領域ドメイン）をコードする核酸を含むベクターが提供される。ベクターの例には、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム性哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが含まれる。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態での本発明の核酸を含み得る。組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これは発現する核酸に機能的に結合される。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する調節配列（ＳＶ４初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示する調節配列（例えば、組織特異的調節配列、Ｖｏｓｓら、１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７を参照；それらの全体が参考として本明細書に援用される）ならびに特定の処置または病状に応答してヌクレオチド配列の誘導発現を指示する調節配列（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）プロモーターならびに原核細胞系および真核細胞系におけるｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター）（同文献参照）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され、これにより、本明細書で述べるような核酸にコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを生成することができる。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であってよい。ベクターＤＮＡは従来の形質転換またはトランスフェクション手法により、原核細胞または真核細胞に導入することができる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのため、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション法に依って、極少数の細胞が外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが既知である。一般的に、これらの不可欠構成要素（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を同定し、選択するため、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性のための）をコードする遺伝子が対象遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する選択可能マーカーを含む。導入核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でも特に、薬物選択により同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、一方で、他の細胞は死滅する）。
Ｖ．抗体の調製
提供される非ヒト抗体は、例えば、任意の抗体産生動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバまたは非ヒト霊長動物（例えば、サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー））に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、インビトロでの細胞培養および細胞培養ベースの用途または抗体に対する免疫応答が生じないか、もしくは顕著でないか、防止可能であるか、懸案事項でないか、もしくは所望される他の任意の用途において用いることができる。本発明の特定の実施形態では、抗体はヒトグルカゴンで免疫化することにより作製され得る。抗体はポリクローナル、モノクローナルであってよく、あるいは組換えＤＮＡを発現させることにより宿主細胞において合成され得る。
【０１６８】
完全ヒト抗体は、上述のように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を免疫化することにより、あるいはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージディスプレイライブラリーを選択することにより、調製され得る。
【０１６９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は種々の手法により作製することができ、従来のモノクローナル抗体法、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法が含まれる。あるいは、モノクローナル抗体を作製する他の手法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを調製するのに好適な動物系の１つはマウス動物系であり、これは十二分に確立した手法である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび技法は、当該分野で公知である。このような手法では、免疫化マウス由来のＢ細胞は、好適な不死化された融合パートナー、例えば、マウス動物骨髄腫細胞株と融合される。所望により、マウスの代わりに更にラットまたは他の哺乳動物を免疫化することができ、このような動物由来のＢ細胞をマウス動物骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを形成することができる。あるいは、マウス以外の供給源由来の骨髄腫細胞株が用いられ得る。ハイブリドーマを作製するための融合手法も周知である。
【０１７０】
提供される単鎖抗体は、アミノ酸橋（短いペプチドリンカー）を介して重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片（例えば、配列番号７９および８３）を結合することにより形成され得、単一ポリペプチド鎖が生じる。このような単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）は、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡｓ間に融合することにより調製され得る。生じたポリペプチドは折り畳んで抗原結合モノマーを形成することができ、あるいは２つの可変ドメイン間の可撓性リンカーの長さに依存し、マルチマー（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔら、１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔら、２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを結合することにより、異なるエピトープに結合するマルチマーｓｃＦｖｓを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら、２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。単鎖抗体の作製のために開発された技法は、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９；Ｗａｒｄら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４，ｄｅ  Ｇｒａａｆら、２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に述べられている技法を含む。
【０１７１】
１つのサブクラスである本明細書で提供される抗体は、サブクラス転換法を用いて異なるサブクラス由来の抗体に変換することができる。従って、例えば、ＩｇＧ抗体はＩｇＭ抗体に由来し得、その逆も同様である。このような技法は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体と異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物特性も示す新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ法が用いられ得る。このような手法では、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローンＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡが用いられ得る。例えば、Ｌａｎｔｔｏら、２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６を参照されたい。更に、ＩｇＧ４が所望される場合、ＩｇＧ４抗体における不均一性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するため、Ｂｌｏｏｍら、１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７；参照して本明細書に援用される）に報告されているように、ヒンジ領域に点突然変異（ＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ）を導入することも望まれ得る。
【０１７２】
異なる性質（即ち、抗体が結合する抗原に対する異なる親和性）を有する抗体を得る技法も公知である。鎖シャッフリングと称されるこのような技法の１つは、免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーを糸状バクテリオファージの表面上に提示することを含み、ファージディスプレイと称されることが多い。Ｍａｒｋｓら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９に報告されているように、鎖シャッフリングはハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体を調製するのに用いられている。
【０１７３】
本明細書で述べられる抗体および断片の機能的および／または生化学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えば、シート構造またはヘリカル構造としての置換の領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性あるいは（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することへの影響が有意に異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換をなすことによって果たされ得る。「保存的アミノ酸置換」は、当該位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷への影響をほとんどまたは全く有さない、天然アミノ酸残基の非天然残基との置換を含み得る。更に、また、アラニン走査突然変異誘発について過去に述べられているように、ポリペプチドにおける任意の天然残基がアラニンに置換され得る。
【０１７４】
対象抗体のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、日常技術を適用することによって当業者により実施され得る。アミノ酸置換は、本明細書で提供される抗体の重要な残基を同定し、あるいはヒトグルカゴンに対するこれらの抗体の親和性を増減させるのに用いることができる。
ＶＩ．抗グルカゴン抗体の発現
抗グルカゴン抗体は多くの従来技法の任意の技法により調製することができる。例えば、抗グルカゴン抗体は、当該分野で公知の任意の手法を用いて組換え発現系により作製され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）：およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい。
【０１７５】
本発明の抗体はハイブリドーマ細胞株またはハイブリドーマ以外の細胞株において発現され得る。哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換するのに、抗体をコードする発現構築物を用いることができる。形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法を用いて実施することができ、例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は任意の目的で参考として本明細書に援用される）に例示されるように、当該分野で公知のトランスフェクション手法により、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージにパッケージングし、宿主細胞に構築物を形質導入することを含む。用いられる至適形質転換手法はどのタイプの宿主細胞が形質転換されるかに依存する。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は当該分野で公知であり、限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、核酸の正荷電脂質との混合およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションを含む。
【０１７６】
典型的には、本発明の組換え発現構築物は、１つ以上の以下のもの：抗グルカゴン抗体の重鎖定常領域；重鎖可変領域；軽鎖定常領域；軽鎖可変領域；軽鎖または重鎖の１つもしくはそれ以上のＣＤＲを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。通常、ベクターは用いられる宿主細胞において機能的であるように選択される（即ち、ベクターは宿主細胞機構と適合性があり、遺伝子の増幅および／または発現が生じることを可能にする）。一部の実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを用いて、タンパク質断片相補性アッセイを用いるベクターが用いられる（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照；これは参考として本明細書に援用される）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社またはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（以前は「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社」）から購入することができる。本発明の抗体および断片をクローニングし、発現させるための他の有用なベクターには、ＢｉａｎｃｈｉおよびＭｃＧｒｅｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８４（４）：４３９−４４（２００３）（これは参考として本明細書に援用される）に報告されているベクターが含まれる。更なる好適な発現ベクターが、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（これは参考として本明細書に援用される）において考察されている。
【０１７７】
通常、任意の宿主細胞において用いられる発現ベクターは、プラスミドもしくはウイルス維持のための配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。これらの配列は、集合的に「フランキング配列」と称され、通常、１つ以上の次の機能的に結合したヌクレオチド配列：プロモーター、１つもしくはそれ以上のエンハンサー配列、複製開始点、転写終止配列、ドナーおよびアクセプター・スプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域ならびに選択可能マーカー因子を含む。
【０１７８】
任意で、ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、コード配列の５’または３’端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得、オリゴヌクレオチド配列はポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉｓ）またはこれに対して市販の抗体が存在する別の「タグ」、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ））もしくはｍｙｃをコードする。通常、タグは発現と同時に抗体タンパク質に融合され、宿主細胞由来の抗体の親和性精製のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、抗体を親和性マトリックスとしてのタグに対して用いて、カラムクロマトグラフィにより果たすことができる。任意で、タグは続いて種々の手段、例えば、切断のための特定のペプチダーゼを用いて、精製抗体ポリペプチドから除去することができる。
【０１７９】
発現ベクターにおけるフランキング配列は、同種（即ち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（即ち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（即ち、２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組合せ）、合成または天然でよい。そのようなものとして、フランキング配列の供給源は任意の原核または真核生物、任意の脊椎または無脊椎生物あるいは任意の植物であってよく、但し、フランキング配列は宿主細胞機構において機能的であり、宿主細胞機構により活性化され得る。
【０１８０】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該分野で周知の複数の方法の任意の方法により得られ得る。典型的には、本発明において有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。場合により、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が公知であり得る。本発明では、フランキング配列は、本明細書で述べられる、核酸合成またはクローニングのための方法を用いて合成され得る。
【０１８１】
すべてまたは一部分のみのフランキング配列が公知である場合、それは、ＰＣＲを用いて、かつ／あるいは同種または別種由来の好適なオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列断片を含むゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、得られ得る。フランキング配列が公知でない場合、フランキング配列を含むＤＮＡ断片が、例えば、コード配列または更には別の遺伝子もしくは遺伝子群を含み得る、より大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成され得、適切なＤＮＡ断片を生成し、次に、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ社、カリフォルニア州）または当業者には公知の他の方法を用いて単離する。この目的を果たすための好適な酵素の選択は、当業者には簡単に明らかとなるであろう。
【０１８２】
通常、複製開始点は、特に、市販購入される原核細胞発現ベクターの一部であり、該開始点は宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択ベクターが複製開始点部位を含まない場合、複製開始点部位は公知の配列に基づいて化学的に合成され、ベクターにライゲーションされ得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）由来の複製開始点は大部分のグラム陰性菌に好適であり、種々の開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）が哺乳動物細胞においてベクターをクローニングするのに有用である。一般的に、哺乳動物の複製開始点は哺乳動物細胞発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０開始点は単に初期プロモーターを含むという理由から使用されることが多い）。
【０１８３】
通常、本発明の発現およびクローニングベクターは、宿主生物により認識されるとともに、抗グルカゴン抗体をコードする核酸に機能的に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（即ち、５’）に位置する非転写配列である。従来、プロモーターは２クラス：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの一方に分類されている。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の有無または温度変化に応答してその制御下でＤＮＡからの転写のレベルの上昇を開始する。一方、構成的プロモーターは連続的遺伝子産物の産生を開始する；即ち、遺伝子発現に対する試験的制御はほとんどまたは全くない。種々の潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、あるいはポリメラーゼ連鎖反応によりプロモーターを増幅し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、抗グルカゴン抗体をコードするＤＮＡに機能的に結合される。
【０１８４】
酵母宿主で用いるのに好適なプロモーターも当該分野で周知である。酵母プロモーターには酵母エンハンサーが有利に用いられる。哺乳動物細胞で用いる好適なプロモーターは周知であり、限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を含む。他の好適な哺乳動物プロモーターは、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターを含む。
【０１８５】
本発明の組換え発現ベクターの実施に有用な特定のプロモーターは、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）を含む。更に使用可能なものは、組織特異性を示すとともにトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性を示すエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性を示すインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性を示すマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性を示すアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性を示すαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性を示すα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄細胞において活性を示すβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳内オリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）；ならびに、特に、リンパ球細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）である。
【０１８６】
エンハンサー配列はベクターに挿入され、高等真核細胞において抗グルカゴン抗体をコードする核酸の転写を増大させ得る。エンハンサーは、通常、約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性因子であり、プロモーターに作用して転写を増大させる。エンハンサーは比較的に配向および位置独立性である。エンハンサーは転写単位の５’および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から得られる複数のエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。ウイルス由来のエンハンサー配列も用いることができる。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが、真核細胞プロモーターの活性のための典型的なエンハンサー因子である。エンハンサーは核酸分子の５’または３’位置にてベクター中にスプライシングされ得るが、通常、プロモーターの５’部位に配置される。
【０１８７】
発現ベクターにおいて、通常、転写終止配列はポリペプチドコード領域端の３’に配置され、転写を終止する機能を果たす。通常、原核細胞における発現のために用いられる転写終止配列はＧ−Ｃに富む断片、続いてのポリＴ配列である。配列はライブラリーから容易にクローニングされ、あるいは更にはベクターの一部として市販購入されるが、本明細書で述べるような核酸合成法を用いて容易に合成することもできる。
【０１８８】
選択可能マーカー遺伝子因子は、選択培養媒体中で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。発現ベクターにおいて用いられる典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に対して抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンに対する耐性を付与し、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補い、あるいは（ｃ）複合媒体から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択可能マーカーの例には、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる。原核宿主細胞および真核宿主細胞における選択に細菌のネオマイシン耐性遺伝子を用いることもできる。
【０１８９】
他の選択遺伝子は発現される遺伝子を増幅するのに用いることができる。増幅は、特定の選択条件下で細胞の生存および増殖を可能にするのに十分に高いレベルにて単一コピーで発現することができない遺伝子が、歴代の組換え細胞の染色体内にタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な増幅可能な選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターを含まないチミジンキナーゼが含まれる。これらのマーカーの使用では、哺乳動物細胞形質転換体は選択圧下に置かれ、ベクターに存在する選択遺伝子により、形質転換体のみが特異的に生存に適応する。媒体中の選択因子の濃度が連続的に高められる条件下で形質転換細胞を培養することにより、選択圧が課され、これにより、選択遺伝子が増幅された細胞のみの生存が可能となる。これらの状況下、選択遺伝子に隣接するＤＮＡ、例えば、本発明の抗体をコードするＤＮＡは、選択遺伝子と共増幅される。その結果、増量した抗グルカゴンポリペプチドが増幅ＤＮＡから合成される。
【０１９０】
通常、リボソーム結合部位は、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガルノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）を特徴とする。通常、因子はプロモーターの３’および発現されるポリペプチドのコード配列の５’に位置する。
【０１９１】
場合により、例えば、真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合、グリコシル化または収率を向上させるため、種々のプレ配列を操作することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更することができ、あるいはプロ配列を付加することができ、これもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）１位に、発現に伴う１つ以上の完全には除去されていない場合がある付加アミノ酸を有し得る。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される、１または２個のアミノ酸残基を有し得る。あるいは、一部の酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域にて切断する場合、わずかに切頭されているが活性形態の所望のポリペプチドを生じさせ得る。
【０１９２】
市販の発現ベクターが上述のような所望のフランキング配列の一部を欠く場合、これらの配列をベクターに個々にライゲーションすることにより、ベクターを改変することができる。ベクターが選択され、所望のように改変された後、抗グルカゴン抗体をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入される。
【０１９３】
本発明の抗体またはその免疫学的に機能性の断片をコードする配列を含む完成ベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入される。抗グルカゴン−１抗体に対する発現ベクターの選択宿主細胞への形質転換は、周知の方法、例えば、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法または他の公知の技法を含む方法により達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞型の関数である。これらの方法および他の好適な方法は当業者には周知である。
【０１９４】
形質転換宿主細胞は適切な条件下で培養されると、抗グルカゴン抗体を合成し、これは、続いて、培養媒体から（宿主細胞が抗体を媒体に分泌する場合）、あるいは抗体を産生する宿主細胞から直接（抗体が分泌されない場合）回収することができる。適切な宿主細胞の選択は様々な因子、例えば、所望の発現レベル、活性に望ましく、もしくは必要なポリペプチドの改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物活性分子への折り畳みの容易性に依存する。
【０１９５】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得られる多くの不死化細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および他の多くの細胞株を含む。特定の実施形態では、特定のＤＮＡ構築物を発現させるのに最適な細胞株は、種々の細胞株を試験し、いずれが最大レベルの発現を有するとともにグルカゴン結合特性を有する抗体を産生するのかを決定することにより、選択され得る。
ＶＩＩ．例示的な治療有用性
ＧＬＰ−１に関連する種々の活性に照らし（背景技術を参照）、本明細書で述べられるＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、一般的に、１）インスリン放出を刺激し、２）血中グルコース濃度を低下させ、３）血漿中インスリン濃度を上昇させ、４）β細胞特異的遺伝子（例えば、ＧＬＵＴ−１トランスポーター、インスリン受容体およびヘキソキナーゼ−１）の転写を刺激し、５）β細胞のアポトーシスを阻害し、β細胞の増殖および複製を増大させることによってβ細胞量を増加させ、６）満腹感を誘発し、これにより、食物摂取を低減し、減量を促進し、７）胃液分泌を低下させ、８）胃排出を遅延させ、かつ、９）胃運動を低下させるのに用いることができる。
【０１９６】
従って、ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、限定されないが、Ｉ型もしくはＩＩ型糖尿病、耐糖能障害、インスリン抵抗性、潜在性自己免疫性成人型糖尿病（ＬＡＤＡ）、妊娠性糖尿病、代謝症候群および若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）を含む、多くの異なる形態の糖尿病あるいはこれに密接に関連する疾患を処置するのに用いることができる。従って、ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、感染、ストレス、脳卒中に起因するインスリン感受性の低下または妊娠中に誘発される感受性の低下を有する患者を処置するのに用いることができる。処置可能な他のタイプの糖尿病は、糖尿病が別の内分泌性疾患、例えば、グルカゴノーマ、原発性アルドステロン症、クッシング症候群およびソマトスタチノーマに関連している糖尿病あるいは特定の薬物またはホルモン（例えば、エストロゲン含有医薬品、向精神薬、抗高血圧薬およびサイアザイド系利尿薬）の投与に起因して生じる糖尿病である。
【０１９７】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は、例えば、高血圧、冠動脈疾患、脂質異常症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症および高コレステロール血症および心筋梗塞を含む、種々の冠疾患ならびに脂質障害に関連する疾患を処置するのにも用いることができる。
【０１９８】
骨障害、骨粗鬆症および他の関連疾患もＧＬＰ−１化合物を含む組成物で処置することができる。
【０１９９】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物で処置することができる更なる疾患には、肥満症、過敏性腸症候群、脳卒中、術後代謝変化、心筋梗塞）および高血糖症が含まれる。ＧＬＰ−１化合物は鎮静剤としても用いることができる。
【０２００】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物は予防的に用いることもでき、上記一覧のような疾患を発症するリスクを有する個体の処置を含む。具体例として、化合物は、非インスリン依存性糖尿病のリスクまたは肥満症になるリスクを有する個体に予防的に投与することができる。このような個体には、例えば、耐糖能障害を有する個体、過体重個体および前述の疾患に対する遺伝的素因を有する個体（例えば、糖尿病の既往を有する家族の個体）が含まれる。
【０２０１】
ＧＬＰ−１化合物を含む組成物で様々な異なる被験体を処置することができる。本明細書で用いられるような「被験体」または「患者」という用語は、通常、哺乳動物を指し、必ずしもその必要はないが、多くの場合、前述の疾患の一疾患のリスクにあり、あるいはリスクを有するヒトである。しかし、被験体は非ヒト霊長動物（例えば、類人猿、サル、ゴリラ、チンパンジー）であってもよい。被験体は霊長動物以外の哺乳動物、例えば、獣医動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタ）または実験動物（例えば、マウスまたはラット）であってもよい。
ＶＩＩ．医薬組成物
Ａ．組成物
本明細書で提供されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は、治療有用性に関するセクションで挙げられた疾患の処置用に処方された医薬組成物中の活性成分として用いることができる。従って、開示されるＧＬＰ−１／抗体組成物は、上記一覧の用途を含む、様々な治療用途に用いる薬物の調製に用いることができる。
【０２０２】
ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物に加え、医薬組成物は、ＧＬＰ−１化合物が有用性を有する１つ以上の種々の疾患を処置するのに有用な１つ以上の他の治療剤も含むことができる。特定のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物と組み合わせることができる他の治療剤の一般的なクラスは、限定されないが、インスリン放出剤、グルカゴン分泌阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グルカゴン拮抗薬、抗肥満剤、カロリー摂取量を減少させる化合物、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、ステロイドもしくは非ステロイドホルモン、増殖因子および食物栄養素を含む。
【０２０３】
このようなさらなる治療剤は、例えば、高血糖症、糖尿病、高血圧、肥満症および骨障害を処置するための治療剤を含み得る。組成物中に含まれ得る、糖尿病を処置するための他の治療剤の例には、脂質障害を処置するのに用いられる治療剤が含まれる。このような治療剤の具体例には、限定されないが、胆汁酸金属イオン封鎖剤（例えば、コレスチラミン、リポスタビル、テトラヒドロリプスタチン）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、米国特許第４，３４６，２２７号；同第５，３５４，７７２号；同第５，１７７，０８０号；同第５，３８５，９２９号；および同第５，７５３，６７５号を参照）、ニコチン酸、ＭＴＰ阻害剤（例えば、米国特許第５，５９５，８７２号；同第５，７６０，２４６号；同第５，８８５，９８３号；および同第５，９６２，４４０号を参照）、リポキシゲナーゼ阻害剤、フィブリン酸誘導体、コレステロール吸収阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤（例えば、米国特許第４，８７１，７２１号；同第５，７１２，３９６号；および同第４，９２４，０２４号を参照）および回腸ナトリウム／胆汁酸共輸送体阻害剤が含まれる。組成物中に組み込むことができる他の抗糖尿病剤には、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ビグナイド、インスリン分泌促進剤、インスリン増感剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ＰＰＡＲ−α作動薬、ＰＰＡＲ−γ作動薬が含まれる。
【０２０４】
ＧＬＰ−１類似体のＮ末端での切断を阻害するため、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤も含まれ得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、医薬組成物は、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共に、１つまたは複数の有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む。許容可能な処方材料は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。好ましい実施形態では、治療有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物が提供される。
【０２０６】
特定の実施形態では、許容可能な処方材料は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。
【０２０７】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘性、清澄性、色調、等張性、臭気性、無菌性、安定性、溶出または放出速度、吸着または侵入を改変し、維持し、あるいは保つための処方材料を含み得る。このような実施形態では、好適な処方材料は、限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌薬；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、芳香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール  ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈液；賦形剤ならびに／あるいは医薬補助剤を含む。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【０２０８】
特定の実施形態では、至適医薬組成物は、例えば、対象投与経路、送達様式および所望の用量に依って、当業者により決定される。例えば、上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。特定の実施形態では、このような組成物は、抗体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度およびインビボでのクリアランス率に影響を及ぼし得る。
【０２０９】
特定の実施形態では、医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は本来水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、おそらく、非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を補充された注射用の水、生理食塩水または人工脳脊髄液でよい。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水は、更なる例示的なビヒクルである。好ましい実施形態では、医薬組成物はｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、更に、ソルビトールまたはその好適な代替物を含み得る。特定の実施形態では、抗グルカゴン抗体組成物は、所望の純度を有する選択組成物を任意の処方材料（上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態での保存用に調製され得る。更に、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／抗体組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方され得る。
【０２１０】
医薬組成物は非経口送達用に選択することができる。あるいは、組成物は吸入または消化管を通じた送達、例えば、経口用に選択され得る。このような医薬的に許容可能な組成物の調製は当該分野の範囲内にある。
【０２１１】
処方成分は投与部位に対して許容可能な濃度にて存在することが好ましい。特定の実施形態では、生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、通常、約５〜約８の範囲のｐＨに組成物を維持するのに緩衝剤が用いられる。
【０２１２】
非経口投与が検討される場合、本発明において用いる治療用組成物は、医薬的に許容可能なビヒクル中のＧＬＰ−１化合物を含む所望の組成物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容可能な水溶液の形態にて提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、ＧＬＰ−１／抗体組成物が適切に保存された無菌等張液として処方される無菌蒸留水である。特定の実施形態では、調製は、デポー注射により送達可能な生成物の制御または持続放出を与えうる、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの薬物を含む所望の分子の処方を含み得る。特定の実施形態では、循環における持続時間を促進する作用を有するヒアルロン酸も用いられ得る。特定の実施形態では、所望のＧＬＰ−１／抗体組成物を導入するのに、埋め込み型薬物送達デバイスが用いられ得る。
【０２１３】
医薬組成物は吸入用に処方することができる。これらの実施形態では、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物は、吸入可能な乾燥粉末として有利に処方される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いても処方され得る。特定の実施形態では、溶液は噴霧状にされ得る。肺投与、従って、処方法が更に国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に述べられており、これは、参考として援用され、化学修飾されたタンパク質の肺送達について述べている。
【０２１４】
処方物を経口投与することができることも検討される。この様式で投与されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む医薬組成物は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の調合に習慣的に用いられる担体の有無にかかわらず処方することができる。特定の実施形態では、バイオアベイラビリティが最大化され、全身移行前の分解が最小化される際に、消化管におけるポイントに処方物の活性部分を放出するようにカプセルが設計され得る。組成物の吸収を促進するため、追加の作用物質が含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤も用いられ得る。
【０２１５】
医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中の１つまたは複数の有効量のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含むように提供されることが好ましい。錠剤を無菌水または別の適切なビヒクルに溶解することにより、単位剤形にて溶液が調製され得る。好適な賦形剤には、限定されないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸塩、ラクトースまたはリン酸カルシウム；あるいは結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；あるいは潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが含まれる。
【０２１６】
持続または制御送達処方物中のＧＬＰ−１化合物／抗体組成物を含む処方物を含む、更なる医薬組成物が当業者には明らかであろう。他の種々の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射を処方する技法も当業者には公知である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい；これは、参考として援用され、医薬組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出について述べている。持続放出型調製物は、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル形状の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出型マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第０５８４８１号に開示されているように；これらの各々は参考として援用される）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（上記Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号）を含み得る。持続放出型組成物は、当該分野で公知の複数の方法の任意の方法により調製可能なリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号；同第０８８，０４６号および第１４３，９４９号（参考として援用される）を参照されたい。
【０２１７】
通常、インビボ投与に用いられる医薬組成物は無菌調製物として提供される。滅菌は無菌濾過膜を通した濾過により成すことができる。組成物が凍結乾燥される際、この方法を用いた滅菌は凍結乾燥および復元の前後に行われ得る。非経口投与用の医薬組成物は凍結乾燥形態にて、あるいは溶液中に保存することができる。一般的に、非経口用組成物は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって突き通すことが可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【０２１８】
該医薬組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存され得る。このような処方物は即座に使用可能な形態または投与前に再構成される形態にて保存され得る。
【０２１９】
単回投与単位を作製するためのキットも提供される。キットは各々、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性処方物を有する第２の容器を含む。本発明の特定の実施形態では、事前に充填されたシングルおよびマルチチャンバーシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
Ｂ．用量
上述のように、医薬組成物は予防的および／または治療的処置のために投与することができる。一般的に、「有効量」は、症状の重症度および／または頻度の低下または排除ならびに／あるいは損傷の改善または修復である、所望の効果を果たすのに十分であるが非毒性の活性成分（例えば、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物）の量である量を指す。「治療有効量」は、病態または症状を改善し、あるいは疾患または他の任意の望ましくない症状の進行を予防し、阻止し、遅延させ、または逆行させるのに十分である量を指す。「予防有効量」は、病態または症状の開始を予防し、阻止し、または遅延させるのに有効である量を指す。
【０２２０】
一般に、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の毒性および治療有効性は、細胞培養および／または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができ、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な投与量）を求めることを含む。毒性作用と治療効果との投与量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が望ましい。
【０２２１】
細胞培養および／または動物試験から得られるデータは、ヒトに対する一連の用量を調剤するのに用いることができる。通常、活性成分の用量は、ほとんどあるいは全く毒性がないＥＤ５０を含む一連の循環濃度範囲内に並ぶ。使用剤形および使用投与経路に依存し、用量はこの範囲内で変動し得る。
【０２２２】
活性成分の投与量は、担当臨床医によって評価することができる様々な因子、例えば、疾患の重症度、処置被験体の年齢およびサイズならびに個々の疾患自体に依存する。しかし、一般的には、投与されるＧＬＰ−１化合物／抗体組成物自体の総量は、通常、１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。他の処置レジメンでは、ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物は５０μｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日または１００μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日にて投与される。
【０２２３】
投与頻度は使用処方物中の個々の組成物の薬物動態パラメータに依存する。通常、臨床医は投与量が所望の効果に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回投与として、あるいは経時的に２または３回投与として（同量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）、あるいは埋め込みデバイスまたはカテーテルによる継続注入として投与され得る。適切な投与量の更なる改善は、当業者により日常的になされ、当業者により日常的に実行される職務の範囲内にある。適切な用量は適切な用量応答データを用いることにより確認され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は長期間にわたって患者に投与することができる。組成物中の抗体の長期投与は、非ヒト動物におけるヒト抗原に対する抗体、例えば、非ヒト動物種において作製される非完全ヒト抗体または非ヒト抗体と一般的に関連する有害な免疫またはアレルギー応答を最小化する。
Ｃ．投与
本明細書で述べられる医薬組成物は種々の異なる方法で投与することができる。例として、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内および頭蓋内投与法により、医薬的に許容可能な担体を含む組成物を投与することが含まれる。
【０２２４】
経口投与では、活性成分は、固体剤形、例えば、カプセル、錠剤および粉末にて、あるいは液体剤形、例えば、エリキシル、シロップおよび懸濁液にて投与することができる。活性成分は、不活性成分および粉末状担体、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムと共にゼラチンカプセルに封入することができる。所望の色調、風味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の所望の特徴を付与するために添加され得る付加不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタンおよび可食白色インクである。圧縮錠剤を作製するのに同様の希釈剤を用いることができる。錠剤およびカプセルは共に、長時間にわたる薬物の継続的放出を付与するため、持続放出型製品として製造することができる。圧縮錠剤は不快な風味を隠すため、および、大気から錠剤を保護するために、糖衣し、またはフィルムコーティングし、あるいは消化管における選択的崩壊のために腸溶コーティングすることができる。経口投与用の液体剤形は患者の受容を高めるため、着色および芳香を含むことができる。
【０２２５】
活性成分は単独であるいは他の好適な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル処方物にすることができる（即ち、「噴霧状」にすることができる）。エアロゾル処方物は許容可能な加圧噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素中に入れることができる。
【０２２６】
直腸投与に好適な処方物は、例えば、坐薬基剤を含むパッケージングされた活性成分からなる坐薬を含む。好適な坐薬基剤は天然もしくは合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素を含む。さらに、例えば、液状トリグリセリド、ポリエチレングリコールまたはパラフィン炭化水素を含む基剤とパッケージングされた活性成分との組合せからなるゼラチン直腸カプセルを用いることも可能である。
【０２２７】
非経口投与、例えば、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路に好適な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および処方物を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張性無菌注射液ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。
【０２２８】
医薬組成物を処方するのに用いられる成分は、高純度であって、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくとも国内食品（ＮＦ）グレード、一般的には分析グレード、より典型的には少なくとも医薬品グレード）ことが好ましい。更に、インビボでの使用を目的とする組成物は、通常、無菌である。所定の化合物が使用前に合成される必要がある限り、典型的に、生じる生成物は、合成または精製プロセスの間に存在し得る潜在的毒物、特に、エンドトキシンを実質的に含まない。非経口投与用の組成物も無菌で実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。
【０２２９】
実施試験および得られた結果を含む以下の実施例は、単に例示的な目的として示されるものであり、本発明を限定するものと捉えるべきではない。
【実施例】
【０２３０】
実施例１：グルカゴンに対するヒトモノクローナル抗体の作製
グルカゴンに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、各々がヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウス系を用いてＭｅｄａｒｅｘ社によって調製された。このようなモノクローナル抗体を調製する方法は、Ｃｈｅｎら（１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）および国際特許出願公報第ＷＯ０１／０９１８７号（参考として援用される）の実施例１に述べられている。Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号および同第５，５４５，８０７号ならびに国際特許出願公報第ＷＯ０１／０９１８７号（参考として援用される）の実施例２も参照されたい。
【０２３１】
グルカゴンに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するため、ＨｕＭａｂマウスを精製組換えヒトグルカゴンで免疫化した。免疫化の方法は、国際特許出願公報第ＷＯ０４／０３５７４７；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；上記Ｆｉｓｈｗｉｌｄらおよび国際特許出願公報第ＷＯ９８／２４８８４に述べられており、これらの各々の教示は参考として援用される）。
【０２３２】
抗グルカゴンヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを用いて、ハイブリドーマ細胞においてモノクローナル抗体を産生させた。このようなハイブリドーマを生成する方法は、国際特許出願公報第ＷＯ０４／０３５７４７号において考察されている。ハイブリドーマのスクリーニングから選択した抗体をＡＧ１５９と指定した。その抗体を選択した理由の１つは、インビトロおよびインビボにてグルカゴンを中和し得るためであった。
【０２３３】
実施例２：抗グルカゴン抗体の軽鎖および重鎖のクローニング
グルカゴン結合モノクローナル抗体ＡＧ１５９を発現するハイブリドーマを供給源として用い、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡを単離した。伸長アダプターを有するランダムプライマー（５’−ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＮ  ＮＮＮ  ＮＮＴ−３’；配列番号１０１）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を行った。
【０２３４】
軽鎖をコードする完全なｃＤＮＡを調製するため、順方向プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ネスト化プライマー（５’ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’；配列番号１０２）であり、逆方向プライマーは、ヒトκ鎖の３’非翻訳領域に見出されるｃＤＮＡ配列の保存領域を認識するように設計した（５’−ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＧＧ−３’；配列番号１０３）。
【０２３５】
可変領域重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するため、順方向プライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）ネスト化プライマー（５’ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’；配列番号１０４）であり、逆方向プライマーは、ヒトＩｇＧ鎖のＦｃ領域におけるコード配列における保存領域を認識するように設計した（５’−ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  Ｇ−３’；配列番号１０５）。
【０２３６】
ＲＡＣＥ生成物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。コンセンサスＤＮＡ配列を決定し、完全長κ鎖および可変領域重鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計するのに用いた。
【０２３７】
ＶＫ−１シグナルペプチド配列（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ  ＲＣ；配列番号１０６）を含むように、成熟軽鎖をコードするＤＮＡ配列を伸長させるのに一連のプライマーを用いた。最初の５’プライマーはシグナルペプチドの最後の７個のアミノ酸および成熟軽鎖の１４個のアミノ酸をコードし（５’−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＣ−３’；配列番号１０７）、３’逆方向プライマーはカルボキシル末端および終止コドンならびにＳａｌＩ制限部位をコードした（５’−ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  Ｃ−３’；配列番号１０８）。シグナルペプチドの１５個のアミノ酸をコードする５’プライマー（５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ−３’；配列番号１０９）および前に使用したものと同じ逆方向プライマーを用いて、生じた生成物を更に増幅した。シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および至適Ｋｏｚａｋ配列をコードする５’プライマー（５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ−３’；配列番号１１０）および同一の逆方向プライマーを用いて、最終反応を行った。生じたＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、ゲルで単離し、哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲａ１９にライゲーションした（国際出願公報第ＷＯ９０／４１３６３号を参照；任意の目的で参考として本明細書に援用される）。
【０２３８】
ＶＫ−１シグナルペプチド配列（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ  ＲＣ；配列番号１０６）を含むように、成熟重鎖をコードするＤＮＡ配列を伸長させるのに一連のプライマーを用いた。最初の５’プライマーはシグナルペプチドの最後の７個のアミノ酸および成熟重鎖の６個のアミノ酸をコードし（５’−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  Ｇ−３’；配列番号１１１）、３’逆方向プライマーは天然センス鎖ＢｓｍＢＩ部位を含む可変領域のカルボキシル末端をコードした（５’−ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＣＣ−３’；配列番号１１２）。シグナルペプチドの１５個のアミノ酸をコードする５’プライマー（５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ−３’；配列番号１１３）および前に使用したものと同じ逆方向プライマーを用いて、生じた生成物を更に増幅した。シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および至適Ｋｏｚａｋ配列をコードする５’プライマー（５’−ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＧ−３’；配列番号１１４）および前述の逆方向プライマーを用いて、最終反応を行った。生じたＰＣＲ生成物を精製し、ＸｂａＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ゲルで単離し、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲａ１９にライゲーションした。
ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ＡＧ１５９抗体鎖融合遺伝子の構築
上流ＸｂａＩ部位をコードするＤＮＡ配列、至適Ｋｏｚａｋ配列、ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ペプチドおよびリンカー配列および独特の制限部位を含むＡＧ１５９  ＬＣもしくはＨＣ  ｃＤＮＡの一部を、Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社（テキサス州ヒューストン）により合成した（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＧＧＧＧＧＧ；配列番号１１５）。κ鎖に対する天然の独特なＫｐｎＩ部位を用い、合成遺伝子由来のＸｂａＩ−ＫｐｎＩ断片を用いてＡＧ１５９κ鎖ｐＤＳＲａ１９構築物における同義断片を置換し、ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ融合遺伝子を得た。同様に、ＡＧ１５９重鎖ＤＮＡ配列における天然の独特なＰｖｕＩＩ部位を用い、合成ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）ＤＮＡ配列をＸｂａＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、ＡＧ１５９重鎖構築物における同義断片を置換するのに用いてＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ１重鎖融合遺伝子を作製した。
【０２３９】
ＩｇＧ１定常領域を含むＢｓｍＢＩ−ＳａｌＩ断片を、ＰＣＲによって増幅されたＩｇＧ２定常領域に置換することにより、ＡＧ１５９の重鎖定常領域のアイソタイプをＩｇＧ１からＩｇＧ２に転換し、遺伝子の５’および３’末端に同様の制限部位を生成した。
ＡＧ１５９κ軽鎖およびＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ軽鎖発現プラスミドの構築
完全長ＡＧ１５９  ＬＣを、プライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、クローニングを目的として遺伝子の一端に新規制限部位を導入した。５’プライマーは、ＳａｌＩ制限部位、至適Ｋｏｚａｋ配列およびＶＫ−１シグナル配列のアミノ末端を含み（５’−ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ−３’；配列番号１１６）、一方、３’プライマーはカルボキシル末端および終止コドンならびにＮｏｔＩ制限部位をコードした（５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡ−３’；配列番号１１７）。生じた断片を精製し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、発現ベクターｐＤＣ３２３およびｐＤＳＲα２４にクローニングした。ＧＬＰ−Ｉ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ構築物をテンプレートとして用いて同じプロセスを実施した。
ＡＧ１５９  ＩｇＧ１，ＡＧ１５９  ＩｇＧ２，ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ１およびＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２の重鎖発現プラスミドの構築
ＳａｌＩ部位、至適Ｋｏｚａｋ配列およびシグナル配列（上述の配列番号１０６）のアミノ末端をコードする５’プライマーならびにカルボキシル末端、終止コドンおよびＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマーを用いたＰＣＲにより、上述のＡＧ１５９  ＩｇＧ１重鎖可変領域を増幅した（５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡ−３’；配列番号１１８）。生じたＰＣＲ断片を精製し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲルで単離し、発現ベクターｐＤＣ３２４およびｐＤＳＲα２４にクローニングした。上述のＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ１、ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２構築物をテンプレートとして用いて同じプロセスを実施した。
異種ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ鎖突然変異体の構築
融合タンパク質からのタンパク質分解的切断に対してＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）ペプチドを保護するため、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異（ｍｕｔａｇｅｎｅｉｓ）により、変更を行った。ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９κ鎖ＤＮＡ配列をテンプレートとして用いて、ＰＣＲを行い、リンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列に新規ＢａｍＨＩ制限部位を導入した。ＢａｍＨＩ部位を含む順方向プライマー（５’−ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＧＣＴ−３’；配列番号１１９）および前述のＫｐｎＩ部位を含む配列領域に対してアニーリングした逆方向プライマー（５’−ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ−３’；配列番号１２０）を用いて、リンカーおよびＡＧ１５９  ＬＣの最初の３５個のアミノ酸をコードする領域を増幅した。ＸｂａＩ制限部位の上流のベクタープロモーター領域においてアニーリングした５’プライマー（５’−ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＧ−３’’；配列番号１２１）を、所望の変更およびＢａｍＨＩ制限部位を含む特異的３’プライマー（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ−３’；配列番号１２２）、（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＡ−３’；配列番号１２３）、（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＡＧＣ−３’；配列番号１２４）、（５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ−３’；配列番号１２５）と組み合わせた。別個のＰＣＲ生成物を精製し、適切な制限酵素（ＸｂａＩとＢａｍＨＩまたはＢａｍＨＩとＫｐｎＩ）で消化し、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化されたＡＧ１５９  ＬＣ  ＤＮＡを含む発現ベクターｐＤＳＲα２０にライゲーションした。
【０２４０】
実施例３：インビトロアッセイ
グルカゴン受容体機能性レポーターのアッセイ
中和活性を有する化合物／抗体組成物を同定するため、ヒトまたはラットグルカゴン受容体を発現するレポーター細胞株を作製した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現増強により、ｃＡＭＰ濃度の上昇を測定した。簡潔に述べると、サイクリックＡＭＰ濃度によって調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を保持することに加え、ラットまたはヒトグルカゴン受容体を発現するＣＨＯＫ１細胞を、アッセイの２日前にプレーティングし、次に、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。アッセイ前の夜間に細胞を洗浄し、媒体を、０．５％プロテアーゼ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清非含有媒体に取り換え、次いで、一晩培養した。ヒトまたはラットグルカゴン受容体を発現する細胞それぞれについて、０．５％プロテアーゼ非含有ＢＳＡおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含む媒体にて３７℃で６時間、細胞を１ｎＭまたは０．１ｎＭグルカゴンを含む一連の濃度の試験される組成物に曝した。ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解物をアッセイした。ルシフェラーゼ活性はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州Ｍａｒｉｅｔｔａ）を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた化合物濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」はグルカゴン刺激性活性が５０％低下する時点での化合物／抗体組成物の濃度を表す。
ＧＬＰ−１受容体機能性レポーターのアッセイ
ＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の効力を比較するため、ヒトまたはマウスＧＬＰ−１受容体を発現するレポーター細胞株を作製した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現増強により、ｃＡＭＰ濃度の上昇を測定した。簡潔に述べると、サイクリックＡＭＰ濃度によって調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を保持することに加え、マウスまたはヒトＧＬＰ−１受容体を発現するＣＨＯＫ１細胞を、アッセイの２日前にプレーティングし、次に、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。アッセイ前の夜間に細胞を洗浄し、媒体を、０．５％プロテアーゼ非含有ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清非含有媒体に取り換え、次に、一晩培養した。０．５％プロテアーゼ非含有ＢＳＡおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含む媒体にて３７℃で６時間、細胞を一連の濃度の試験される組成物またはＧＬＰ−１に曝した。ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、ルシフェラーゼ活性について細胞溶解物をアッセイした。ルシフェラーゼ活性はＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オハイオ州Ｍａｒｉｅｔｔａ）を用いて測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた化合物濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」は最大活性の５０％が得られる時点でのＧＬＰ−１化合物／抗体組成物の濃度を表す。
膜調製
ヒトまたはマウスＧＬＰ−１受容体（あるいはラットまたはヒトグルカゴン受容体）を発現するＣＨＯＫ１細胞を、ＰＢＳを用いた１５０ｍｍ培養皿から採取した。１５００ｒｐｍで１０分、細胞を沈降させた。電動式ガラス装着Ｔｅｆｌｏｎホモジナイザを用いて、１５ｍｌの氷冷スクロース緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３２Ｍスクロース、アジ化ナトリウム０．２５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）中で生じたペレットを均質化した。そのホモジネートを４８，０００×ｇ、４℃で１０分、遠心分離し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて２５ｍｌアッセイ緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ非含有ＢＳＡ１０ｍｇ／ｍｌ、ＳＴＩ  ０．１ｍｇ／ｍｌおよびＰｅｆａｂｌｏｃ  ０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、次に、４８，０００×ｇで１０分、再度遠心分離した。ペレットをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒを用いて１５ｍｌアッセイ緩衝剤中で３回目にて均質化し、再度、４８，０００×ｇで１０分、遠心分離した。生じたペレットを湿重量濃度４ｍｇ／ｍｌにてアッセイ緩衝剤中で再懸濁させた。
リガンド結合アッセイ
９６ウェルＵ底プレートにて結合アッセイを行った。総容量１００μｌにて一連の濃度の試験される組成物またはＧＬＰ−１（またはグルカゴン）で、０．２ｎＭ  １２５Ｉ−ＧＬＰ−１（または０．２ｎＭ  １２５Ｉ−グルカゴン）を含むアッセイ緩衝剤（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マサチューセッツ州ボストン）中で膜（組織２００μｇ）を室温で２時間インキュベートした。さらに、１μＭ非標識ＧＬＰ−１存在下で非特異的結合を評価した。０．５％ポリエチレンイミンに予め浸漬したＵｎｆｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタープレート（ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ  １９６  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、コネティカット州Ｓｈｅｌｔｏｎ）を通した迅速な濾過により、反応を終了し、次に、３００μｌの低温５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションおよび蛍光計数器（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、コネティカット州Ｓｈｅｌｔｏｎ）を用いて結合放射能を定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、得られた濃度曲線の非線形回帰分析を行った。「ＩＣ５０」は最大の特異的１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（または１２５Ｉ−グルカゴン）結合を５０％低下させる化合物の濃度を表す。
【０２４１】
実施例４：ＡＧ１５９抗体のグルカゴン中和活性
抗体可変領域をｃＤＮＡからクローニングし、ハイブリドーマから精製した抗体の質量分光学的分析によって確認した。クローニングしたＡＧ１５９が受容体結合および受容体活性化アッセイにおいてグルカゴン中和活性を有し、かつ糖尿病マウスモデルにおいて血中グルコースを低下させることを実証した（図１１〜１３）。図１１では、グルカゴン刺激性レポーター活性のＡＧ１５９による中和を示す。組換えグルカゴン受容体を発現する細胞を、一連の濃度のＡＧ１５９または対照ＩｇＧに加え、０．１ｎＭグルカゴンでインキュベートした。このアッセイにおけるＡＧ１５９のＩＣ５０は４ｎＭである（図１１）。図１２では、グルカゴン受容体を組換え的に発現する細胞の粗膜画分を、一連の用量のＡＧ１５９または対照抗体と共に２００ｐＭ  １２５Ｉ−グルカゴンでインキュベートした。この１２５Ｉ−グルカゴン結合アッセイにおけるＡＧ１５９のＩＣ５０は０．２ｎＭである（図１２）。図１３はＡＧ１５９に応答したｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定したグルコース濃度を示す。
【０２４２】
実施例５：インビボアッセイ
供給血中グルコースに関して組成物を更に検討するため、このスクリーニングではｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルを用い、血中グルコース濃度がベースライン濃度に戻るまで１、２、４、６および２４時間時に、あるいは２４時間毎にこの測定をモニタリングした。ｄｂ／ｄｂマウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社からＪＡＸ（登録商標）ＧＥＭＭ（登録商標）系−偶発突然変異コンジェニックマウスとして市販されており、糖尿病偶発突然変異（Ｌｅｐｒｄｂ）と同型である。これらのマウスは３〜４週齢頃に識別可能に肥満になる。この試験に加わるための本発明者らの各マウスに対する選択基準は、少なくとも３００ｍｇ／ｄＬの血中グルコースである。８．５週齢（長期１〜２週試験用）から約１０〜１１週齢（急性１〜３日試験用）のｄｂ／ｄｂマウスに、各被験分子を１回（急性試験）あるいは複数回（長期試験）注射した。試験当日、午前９時（ベースライン値）にマウスの採血を行い、次に、即座に注射担当者に手渡し、次に、注射担当者は適切なＧＬＰ−１構築物または陽性／陰性対照を注射する。次に、摂食行為に関連する血中グルコース濃度の変動性を制限するため、餌を与えずに新鮮ケージ内にマウスを入れる。通常、１時間、４時間、６時間および２４時間時の血中グルコース濃度を測定する。２４時間時において血中グルコース値が開始時未満であると、血中グルコースがベースライン濃度に戻るまで２４時間ごとに血中グルコース濃度を測定する。６時間時後、マウスに通常の餌を与えた。
【０２４３】
１０〜１２週齢のＣ５７Ｂ１６（正常な細身）マウスを用いた。これらのマウスは任意の供給メーカー、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社またはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社を通じて市販されており、正常であるとみなされる。「細身」という用語は、これらのマウスを肥満型ｄｂ／ｄｂマウスと対比するのに用いられる。Ｃ５７Ｂ１６マウスを体重に関して無作為化した。ベースライン血中グルコースを測定するため、午前９時の採血を行い、化合物またはＰＢＳを投与し、その後、餌を与えずにケージ内にマウスを入れた。４〜５時間後、２ｇ／ｋｇのグルコース投与量を用いて腹腔内グルコース負荷試験（グルコース負荷試験ではグルコースを代謝する体能を測定する）を行った。血中グルコース濃度はグルコース負荷の投与後３０分および９０分時ならびに２４時間時あるいは血中グルコース濃度が初期値に回復するまで測定した。これらの試験から、グルコースを用いる際の陰性対照ＰＢＳと対照的なＧＬＰ−１作用の増強効果が認められる。
【０２４４】
実施例６：ＡＧ１５９抗体の結合活性
抗体可変領域をｃＤＮＡからクローニングし、ハイブリドーマから精製した抗体の質量分光学的分析によって確認した。クローニングしたＡＧ１５９が受容体結合および受容体活性化アッセイにおいてグルカゴン中和活性を有することを実証した。ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）をＡＧ１５９の軽鎖または重鎖のＮ末端と融合した（上記実施例２を参照）。プラスミドをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションし、完全長融合タンパク質を生成した。生じた抗体構造は、ＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２であった。インビトロでの分析により（実施例３を参照）、この２つの融合タンパク質は同等の結合（ヒト受容体に対してＩＣ５０５〜１０ｎＭ）および活性化（ヒト受容体の活性化ではＥＣ５０＝０．１ｎＭ、マウス動物受容体では５ｎＭ）を有することが示された。更に、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）を軽鎖と融合した抗体構築物は、グルカゴン存在下でヒト受容体を活性化することも示された。さらに、融合抗体がＧＬＰ−１受容体存在下で依然としてグルカゴンを中和する活性を示すことを立証した。これらのインビトロデータは、融合ＧＬＰ−１類似体が二機能性であることを示した。
【０２４５】
更に詳細には、ＧＬＰ（Ａ２６）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）をアッセイし、構築物がグルカゴン存在下でＧＬＰ−１受容体結合特性を維持するかを決定した。０、１、１０または１００ｎＭグルカゴンを加え、上述のようにリガンド結合アッセイを行った。図１に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９はグルカゴン存在下でヒトＧＬＰ−１受容体への１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合に匹敵する。
【０２４６】
別の試験では、グルカゴン存在下でのＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性について、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を評価した。一連のグルカゴン濃度を加え、上述の実施例３のようにＧＬＰ−１Ｒレポーターアッセイを行った。図２に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９はグルカゴン存在下でヒトＧＬＰ−１受容体を活性化する。このグラフではグルカゴン単独による（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を含まない）ＧＬＰ−１受容体の活性化の用量応答曲線も示している（−−−−−）。
【０２４７】
図２に提示するデータは図３と異なる形態で示されている。図３では、残余活性がグルカゴンに起因するように、特定のＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９濃度（グルカゴンを含まない）に起因する活性を、それぞれのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９濃度に関し、グルカゴンの全投与量に対する総活性から差し引いた。図３に示すように、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９の存在は、用量依存的にグルカゴンに誘発される活性を低下させる。
【０２４８】
実施例７：異種ＧＬＰ−１類似体を含む抗体融合体による結果
上記実施例において説明したように、ＧＬＰ−１化合物とＡＧ１５９との様々な融合体を調製し、それらの結合能の試験を行った。下記表８は天然ＧＬＰ−１のＣ末端が修飾された複数の融合タンパク質の結果を示す（融合のための配列は表１および７に一覧表示されている）。
【０２４９】
表８
【０２５０】
【表８】
2009534424.tif 000040
タンパク質分解を低減するため、グリコシル化コンセンサス部位（ＮＴＸ）の導入が切断部位を保護するかを検討する目的で、上述のように一連の置換改変体ＧＬＰ−１類似体を設計した。さらに、グルタミンのヘリカル構造性向が切断特性からの精製および保護を伴ったより安定したペプチドを促進し得るという理論により、選択位置においてグルタミン残基に置換した。これらのＧＬＰ−１類似体をＡＧ１５９の軽鎖と融合し、試験を行った（これらの融合のための配列は表１および７に一覧表示されている）。表９に結果を示す。
【０２５１】
表９：グルタミンおよびグリコシル化ＧＬＰ−１化合物／抗体融合体
【０２５２】
【表９−１】
2009534424.tif 000041
【０２５３】
【表９−２】
2009534424.tif 000042
実施例８：インビボでの結果
ＡＧ１５９および異種ＧＬＰ−１類似体を含む多くの異種融合分子を用いて試験を行い、時間の関数として血中グルコース濃度を低下させるそれらの能力を判定した。これらの試験は実施例３に記載するように行い、Ｄｂ／ｄｂマウスに異なる組成物を１回注射した（異なる類似体の配列は表１および７に示されている）。
【０２５４】
図４は種々のＧＬＰ−１化合物／ＡＧ１５９融合の結果を示す。抗体融合体は、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）または以下のＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合したＧＬＰ−１ペプチドの１つを含んだ：Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ（配列番号２８）、Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ（配列番号２３）、Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号９）およびＡ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号１２）。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と組み合わせ、以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。投与量は１２ｕｇ／マウスであった。これらの融合のための配列は上記表１および７に一覧表示されている。
【０２５５】
図４において認められるように、血中グルコースは大部分の類似体に関して１時間時に低下し、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２が最大の血中グルコース低下作用を示した。血中グルコース濃度は単回注射の２４後にベースラインに戻った。最大効果は単回注射の４〜６時間後に認められた。
【０２５６】
ＡＧ１５９ＬＣと融合した別の一連のＧＬＰ−１ペプチドを用いて、別の一連の試験を行った。試験された抗体融合体は以下のＧＬＰ−１ペプチドを含んだ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）（配列番号３１）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）（配列番号２９）およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）（配列番号２８）。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と組み合わせ、以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。この例における投与量は１ｍｇ／ｋｇであった。
【０２５７】
図５において認められるように、各被験類似体では、血中グルコースは単回注射後の最初の６時間低下し、単回注射の２４時間後にベースラインに戻った。最大効果は単回注射の４〜６時間後に認められた。
【０２５８】
実施例９：応答曲線
実施例３に記載したようなｄｂ／ｄｂマウスを用いてインビボでの用量応答測定を行った。一試験で用いた組成物はＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）がＡＧ１５９のＬＣと融合した組成物であり、抗体ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２を得た（配列については表８を参照）。投与量は７ｕｇ、１２ｕｇまたは２５ｕｇであった。
【０２５９】
図６において認められるように、血中グルコース濃度は用量依存的に低下することが見出された。これらの結果は組成物が作用機序に基づいて作用するということも示している。
【０２６０】
ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）類似体（配列番号４）をＡＧ１５９  ＬＣと融合し、抗体ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＨＣ  ＩｇＧ２が得られた組成物を用いて、正常マウスにおいて別の用量応答試験を行った。この組成物の用量応答は、グルコース負荷試験（図７）時のグルコース注射後３０分時点ならびに抗体組成物の注射後２４および４８時間後でより明らかであった。この用量応答は正常血糖マウスにおいて実施したため、多少、最小限の効果である。高血糖動物モデル（ｄｂ／ｄｂマウス）においてよりも、血中グルコースが正常な動物モデルにおいて血中グルコースを低下させることはより手腕が問われる。
【０２６１】
実施例１０：ＬＣ対ＨＣと融合したＧＬＰ−１のインビボでの比較
この試験は、ＧＬＰ−１化合物のＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣへの結合が活性差をもたらすかを判定するように設計した。被験構築物は、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）をＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣのいずれかに結合し、以下の２つの抗体構築物ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）  ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣ）およびＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ−１−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＨＣ）として得られたものであった。図８において認められるように、両構築物は血中グルコース濃度を低下させるのに本質的に同等に有効であった。
【０２６２】
実施例１０：細身マウスＧＴＴ試験
ＧＬＰ−１類似体Ａ２Ｇ／Ｒ３０ＧをＡＧ１５９と融合して抗体構築物ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＨＣ  ＩｇＧ２または単にＲ３０Ｇとして得られた融合タンパク質に関して別の試験を行った（配列については表１および７を参照）。この試験は、Ｒ３０Ｇが正常マウスにおいて長期間、血中グルコースを低下し得るかを判定するために行った。有効性枠に関する読み取りを増加できるように、試験設計にグルコース負荷試験を加えた。
【０２６３】
Ｃ５７Ｂ１６マウスを体重に関して無作為化した。午前９時の採血を行ってベースライン血中グルコース濃度を定量し、それからＲ３０ＧまたはＰＢＳを投与した。４〜５時間の絶食後、投与量２ｇ／ｋｇを用いて腹腔内グルコース負荷試験を行った。血中グルコース濃度は、グルコース負荷後３０分および９０分時ならびに血中グルコース濃度が初期値に回復するまで２４時間毎に測定した。図９に示すように、Ｒ３０Ｇ組成物を用いた処置により、耐糖能が向上した。
【０２６４】
実施例１２：多回投与試験
あるＧＬＰ−１化合物に関する問題点は、多回注射後に有効性を失いうるということである（タキフィラキシーの判定）。ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＨＣ  ＩｇＧ２抗体または単にＲ３０Ｇを用いて別の試験を行い、それがこの分子にも当てはまるかを判定した。実施例５に記載のように、１日目に細身マウスにおいてＲ３０Ｇを注射した。１回目の注射の４時間後、最大有効性を示すためにグルコース負荷試験を行った。２日および３日目のビヒクルまたは化合物を注射した。４日目にビヒクルまたは化合物の注射の４時間後、２回目のグルコース負荷試験を行った。
【０２６５】
図１０に示すように、顕著なタキフィラキシーが認められないことは明らかであった。従って、Ｒ３０Ｇは１回目のグルコース負荷試験時と同様に、２回目のグルコース負荷試験時に血中グルコースを低下させるのに有効であった。
【０２６６】
本明細書で述べた実施例および実施形態は単に例示を目的とするものであり、また、それらに照らした種々の改変または変更は当業者に示唆されるものであって、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用した文献、特許および特許出願はすべて、個々の文献、特許または特許出願が参考としてそのように援用されることを具体的かつ個別的に示唆されるかのようにと同じ程度に、あらゆることを目的としてそれらの全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】グルカゴン存在下でＧＬＰ−１受容体結合特性を維持し得るかを判定するためのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）構築物のアッセイを示すグラフである。０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのグルカゴンを加え、実施例に記載のようにリガンド結合アッセイを行った。
【図２】グルカゴン存在下でのＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を判定するためのアッセイを示すグラフである。このグラフではグルカゴン単独による（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９を含まない）ＧＬＰ−１受容体の活性化の用量応答曲線も示している（−−−−−）。
【図３】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９）の存在が、グルカゴンに誘発される活性を用量依存的に低下させることを示すグラフである。
【図４】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）がＡＧ１５９の軽鎖と融合した構築物）および他の種々の抗体融合体の結果を示すグラフである。抗体融合体は、ＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合した以下のＧＬＰ−１ペプチド：Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ（配列番号２８）、Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ（配列番号２３）、Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号９）およびＡ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ（配列番号１２）；を含んだ。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と対にして以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｑ１７Ｎ／Ａ１９Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｖ１０Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｗ２５Ｑ／Ｖ２７Ｑ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。投与量は１２ｕｇ／マウスであった。
【図５】、血中グルコースが、試験された組成物の各々について、単回注射後の最初の６時間低下し、単回注射の２４時間後にベースライン濃度に戻ったことを示すグラフである。試験された抗体融合体はＡＧ１５９の軽鎖（ＬＣ）と融合した以下のＧＬＰ−１ペプチド：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）（配列番号１２６）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）（配列番号３１）、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）（配列番号２９）およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）（配列番号２８）；を含んだ。これらのＬＣ融合をＡＧ１５９  ＩｇＧ２重鎖と対にして以下の抗体を得た（これらの試験を行った）：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ３１Ｎ／＋Ｇ３２／＋Ｔ３３）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｇ２９Ｎ／Ｇ３１／Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２およびＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｋ２８Ｎ／Ｒ３０Ｔ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２。
【図６】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２が用量依存的に血中グルコース濃度を低下させたことを示すグラフである。
【図７】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）がＡＧ１５９の軽鎖と融合し、そしてＡＧ１５９の重鎖と対になって抗体融合ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２を与える組成物を用いてグルコース負荷試験によってチャレンジされた正常マウスにおいて行われた、用量応答試験を示すグラフである。
【図８】生じる抗体がそれぞれ、ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（図８ではＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＬＣと称される）およびＡＧ１５９ＬＣ：ＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＩｇＧ２（図８ではＧＬＰ（Ａ２Ｇ）−ＡＧ１５９  ＨＣと称される）であるように、ＡＧ１５９のＬＣまたはＨＣのいずれかに対するＧＬＰ（Ａ２Ｇ）の結合における活性差を示すグラフである。両構築物は血中グルコース濃度を低下させるのに同等に有効であった。
【図９】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２で処置されたマウスにおける血中グルコース濃度を示すグラフである。血中グルコースは、血中グルコース濃度が初期値に戻るまで、グルコース負荷試験の間において２４時間毎に測定した。
【図１０】ＧＬＰ（Ａ２Ｇ／Ｒ３０Ｇ）ＡＧ１５９ＬＣ：ＡＧ１５９  ＩｇＧ２で処置されたマウスにおけるタキフィラキシー試験の結果を示すグラフである。
【図１１】グルカゴン刺激性レポーター活性のＡＧ１５９による中和を示すグラフである。
【図１２】ＡＧ１５９がヒトグルカゴン受容体に対する１２５Ｉ−グルカゴンの結合を破壊することを示すグラフである。
【図１３】ＡＧ１５９がｏｂ／ｏｂマウスにおいて血中グルコース低下させることを示すグラフである。
【国際調査報告】
2009534424.tif 000043
2009534424.tif 000044
2009534424.tif 000045
2009534424.tif 000046
2009534424.tif 000047