(57)【要約】  ヘテロ二量体レセプター、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの可溶型、及びこのようなコンストラクトの生産及び使用方法を記載する。コンストラクトはそれぞれレセプター単量体の可溶性断片を含有しており、いくつかのコンストラクトは、少なくとも一の免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含有している。例示的なコンストラクトは、(１)各可溶性断片が、ついで二量体化可能である免疫グロブリンＦｃドメインに結合しているもの、(２)各可溶性断片が、正確な対応物との二量体化を促進するように変異された免疫グロブリンＦｃドメインに結合しているもの、及び(３)単量体レセプター断片が結合し、Ｃ-末端断片がＦｃドメインに結合している単鎖コンストラクトである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分とＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含む単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項２】
Ｆｃドメインの全て又は一部を含む免疫グロブリンポリペプチド又はその変異体をさらに含む請求項１に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項３】
ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端がＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合し、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している請求項２に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項４】
ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端がＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合し、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している請求項２に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項５】
ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分とＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分が、グリシン及びセリンを含むペプチドリンカーにより結合している請求項３又は４に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項６】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｆレセプターである請求項１から５のいずれか一項に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項７】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａである請求項６に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項８】
配列番号１の残基９９−２３３を含む請求項７に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター。
【請求項９】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃである請求項６に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項１０】
配列番号３の残基９６−２３１を含む請求項９に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプター。
【請求項１１】
配列番号２の残基３５−１７９を含む請求項１から１０のいずれか一項に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
【請求項１２】
配列番号３７−３９のいずれかの配列を含む可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの二量体。
【請求項１４】
可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの発現に適した条件下で、請求項１から１３のいずれか一項に記載の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターをコードする核酸を含む細胞を培養することを含む可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの有効量と製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、治療及び診断用途のための可溶性ヘテロ二量体レセプター、及びこのような可溶性ヘテロ二量体レセプターを設計し作製する方法に関する。本発明の例示的な組成物は、ヘテロ二量体レセプターの可溶性断片並びに免疫グロブリンのＦｃ-部分を含む。
【背景技術】
【０００２】
可溶性レセプター、例えば可溶性ＴＮＦＲ(Enbrel(登録商標))は、治療用途に対する大きな価値が実証されている。また、可溶性レセプターは、診断目的、並びに例えば、癌患者の腫瘍組織のような病変組織でのリガンド発現をスクリーニングするために使用されうる。
レセプターのＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーは、活性化又は阻害可能性を有するヘテロ二量体レセプターメンバーからなる。これらのレセプターは、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットにおいて主として発現され、それらが、感染及び発癌性細胞に対する応答の調節に重要な役割を担っていることが示されている。ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する主要なリガンドはＨＬＡ-Ｅである。Houchinsらの米国特許第６２６２２４４号にはヒトＮＫＧ２Ａ配列(配列番号１)が記載され、Changら(Eur J Immunol. 1995；25：2433-7)はヒトＣＤ９４配列(配列番号２)について報告している。
【０００３】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの可溶型は、研究ツールとしてばかりでなく、治療剤としても関心のあるものである。しかしながら、治療及び診断用途の双方では、適切な生物系で効果的に生産することができる安定な可溶性レセプターが必要とされている。多くのヘテロ二量体レセプター、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２については、今までのところ、これは困難であった。可能性のある理由は、単一サブユニットのホモ二量体化であり、ヘテロ二量体レセプターがより複雑な構造であればある程、十分に安定した可溶性型を設計することはより困難になる。
【０００４】
ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ａタンパク質のタグ化可溶性部分の発現に基づく、ある種の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａコンストラクトは、文献(Brooksら, J Immunol 1999:162:305-13; Dingら Scand. J. Immunol. 1999;49:459-465;及びKaiserら. Journal of Immunology,2005, 174: 2878-2884)において提案されている。そのいくつかが免疫グロブリンＦｃ部分に融合している他の多量体レセプターの可溶型は、例えば多量体ＩＬ-１８レセプター分子に関する国際公開第９９３７７７２号、国際公開第２００２０８２７２号、及び国際公開第２００２３２３７号に記載されており；Wuら(Protein Sci. 1999;8:482-9)は、ＩＬ-２レセプターの可溶性形態を記載しており；国際公開第２００２２２１５３号には、可溶性ＩＬ-２０レセプターが記載されており；可溶性ＺＣＹ-ＴＯＲ１１サイトカインレセプターに関する国際公開第２００２１２３４５号、Ｔ-細胞レセプター等のヘテロ多量体タンパク質に関する国際公開第２００２１０１００６号、国際公開第９５３３０５９号には、ｇｐ１３０のヘテロ二量体レセプター及びオンコスタチンＭレセプターのベータ鎖が記載されており；米国特許第６２３８８９０号には、種々の糖タンパク質の可溶性形態が記載されている。ヘテロ二量体Ｔ-細胞レセプターの可溶型又はそのサブユニットも、例えばClementsら, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002;58:2131-4; Laugelら, J. Biol. Chem. 2005;280:1882-1892; Kimら, J Mol Biol. 2000;302:899-916に記載されている。
【０００５】
さらに、米国特許公開第２００３０１９５３３８号及び同２００４００７２２５６号には、様々なタイプのＦｃ-結合レセプター配列タンパク質が記載されており、米国特許第６０１８０２６号は二量体化融合タンパク質に関し；米国特許第６８３３４４１号はキメラヘテロ多量体の生産方法に関し；国際公開第９２／０６２０４号及び国際公開第０３０１２０６９号は、例えばヘテロ二量体レセプターライブラリーの作製技術に関し；米国特許第２００４０１３８４１７号には、ヘテロ多量体アドヘシンが記載されている。また。ヘテロ多量体形成を促進させる原則は、米国特許公開第２００３００７８３８５号に記載されており、Marvin and Zhu, Acta Pharmacol Sin 2005;26(6):649-658(またKontermann, Acta Pharmacol. Sin. 2005;26:1-9を参照)で概説されている。
しかしながら、診断又は治療用途のためのヘテロ二量体レセプター、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２の可溶型、及び安定な可溶性ヘテロ二量体レセプターの効果的な製造方法は、今だ必要とされている。本発明は、当該分野におけるこれら及び他の必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明はヘテロ二量体レセプターの可溶性コンストラクトを提供する。コンストラクトはヘテロ二量体レセプターの第１及び第２のサブユニットの本質的に可溶性の部分を含む。ある態様では、コンストラクトは、免疫グロブリン分子の１又は２のＦｃ-部分をさらに含む。例示的な一態様では、各可溶性部分は、免疫グロブリンのＦｃ-部分に結合又は共有結合しており、最終的なコンストラクトは、各サブユニット-Ｆｃ融合体又はハイブリッドポリペプチドの一つを含む。他の例示的な態様では、各サブユニット-Ｆｃ融合体のＦｃ-部分又はハイブリッドポリペプチドのＦｃ-部分は、第１のサブユニットの可溶性部分を含む融合又はハイブリッドポリペプチドの、第２のサブユニットの可溶性部分を含む融合又はハイブリッドポリペプチドへのヘテロ二量体化を促進させる一又は複数の変異を含み、よって同一のサブユニット-Ｆｃポリペプチド間のホモ二量体化が低減される。さらなる他の例示的な態様では、可溶性レセプターコンストラクトは、第２のサブユニットの可溶性部分に結合した第１のサブユニットの可溶性部分を含む単鎖可溶性レセプター-Ｆｃ融合体又はハイブリッドタンパク質複合体である。さらなる他の例示的な態様では、可溶性レセプターコンストラクトは、Ｆｃ-部分に結合している第２のサブユニットの可溶性部分に結合した第１のサブユニットの可溶性部分を含む単鎖可溶性レセプター-Ｆｃ融合体又はハイブリッドタンパク質複合体である。一実施態様では、本発明は、単鎖のレセプター-Ｆｃ融合体又はハイブリッドタンパク質の二量体を提供する。
【０００７】
一態様では、ヘテロ二量体レセプターはＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターである。他の態様では、ヘテロ二量体レセプターはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターである。
また本発明は、このような可溶性コンストラクトの種々の作製方法、並びに本発明の可溶性コンストラクトの種々の用途を提供する。例示的な一用途は、生物学的試料中の天然リガンド(例えば、ＨＬＡ-Ｅ)の検出にある。
これら及び他の態様は、以下においてまた図においてさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】例示的な可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ Ｆｃ融合タンパク質。
【図２】強制的なＦｃ１-Ｆｃ２ヘテロ二量体化を含む例示的な可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ Ｆｃ-融合タンパク質。Ｆｃドメインの荷電残基に変異を有するコンストラクトは、ヘテロ二量体が、独立したＣＤ９４-Ｆｃ及びＮＫＧ２Ａ-Ｆｃ鎖から形成されることを可能にする。
【図３】(Ａ)は、ＮＫＧ２ＡのＣ-末端からＣＤ９４のＮ-末端までの、ＧＧＳＧＧＳリンカーを有する例示的な単鎖のＦｃ-ＮＫＧ２Ａ-ＣＤ９４融合タンパク質を示し、(Ｂ)は、ＣＤ９４のＣ-末端からＮＫＧ２ＡのＮ-末端までの、ＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)リンカーを有する例示的な単鎖のＦｃ-ＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａを示す。コンストラクトにより、活性立体配座にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを折り畳むことができ、Ｆｃ部分の二量体化が可能となる。
【図４】図４は、ＨＬＡ-Ｅと複合したＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａのコンピュータ内でのモデルを示す。モデルは、Ｎ及びＣ末端が互いに近接しており、数種のコンストラクトが可能となることを示している。
【図５】図５は、ＧＭ(配列番号８)及びＫＭ(配列番号９)アロタイプ用の重鎖の定常部分のラベリングを示す。
【図６】図６は、カッパ(配列番号１０)及びラムダ(配列番号１１)定常領域のラベリングを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、それぞれのUNIPROTエントリ名により称される、ヒト、マウス及びラットの免疫グロブリン配列のアラインメント(GC1_RAT: 配列番号１２; GC3_MOUSE: 配列番号１３; GCAA_MOUSE: 配列番号１４; GCAB_MOUSE: 配列番号１５; GCA_RAT: 配列番号１６; GCB_MOUSE: 配列番号１７; GCB_RAT: 配列番号１８; GCC_RAT:配列番号１９; IGHG1_HUMAN: 配列番号２０; IGHG1_MOUSE: 配列番号２１; IGHG2_HUMAN: 配列番号２２; IGHG3_HUMAN: 配列番号２３; IGHG4_HUMAN: 配列番号２４)を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、それぞれのUNIPROTエントリ名により称される、ヒト、マウス及びラットの免疫グロブリン配列のアラインメント(GC1_RAT: 配列番号１２; GC3_MOUSE: 配列番号１３; GCAA_MOUSE: 配列番号１４; GCAB_MOUSE: 配列番号１５; GCA_RAT: 配列番号１６; GCB_MOUSE: 配列番号１７; GCB_RAT: 配列番号１８; GCC_RAT:配列番号１９; IGHG1_HUMAN: 配列番号２０; IGHG1_MOUSE: 配列番号２１; IGHG2_HUMAN: 配列番号２２; IGHG3_HUMAN: 配列番号２３; IGHG4_HUMAN: 配列番号２４)を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、それぞれのUNIPROTエントリ名により称される、ヒト、マウス及びラットの免疫グロブリン配列のアラインメント(GC1_RAT: 配列番号１２; GC3_MOUSE: 配列番号１３; GCAA_MOUSE: 配列番号１４; GCAB_MOUSE: 配列番号１５; GCA_RAT: 配列番号１６; GCB_MOUSE: 配列番号１７; GCB_RAT: 配列番号１８; GCC_RAT:配列番号１９; IGHG1_HUMAN: 配列番号２０; IGHG1_MOUSE: 配列番号２１; IGHG2_HUMAN: 配列番号２２; IGHG3_HUMAN: 配列番号２３; IGHG4_HUMAN: 配列番号２４)を示す。
【図８】図８は、マウス野生型及び変異免疫グロブリン配列のアラインメントｍＦｃ：配列番号２５；ｍＦｃ-ＩＧＨＧ１：配列番号２１の残基９８ないし３２４；ｍＦｃ＿ｄｍ＿ＮＫＧ２Ａ：配列番号２６；ｍＦｃ＿ｄｍ＿ＣＤ９４：配列番号２７；ｍＦｃ＿ｓｍ＿ＮＫＧ２Ａ：配列番号２８；及びｍＦｃ＿ｓｍ＿ＣＤ９４：配列番号２９を示す。
【図９】図９は、ｐｃＤＮＡ３．１(＋)-ｍＦｃ-ｈＣＤ９４プラスミドコンストラクト(実施例４)を示す。
【図１０】図１０は、ｐｃＤＮＡ３．１／ヒドロ(＋)-ｍＦｃ-ｈＮＫＧ２Ａプラスミドコンストラクト(実施例４)を示す。
【図１１】図１１は、ｐｃＤＮＡ３．１／ヒドロ(＋)-ｍＦｃ-ｈＮＫＧ２Ａ-ＧＧＳ-ＧＧＳ-ｈＣＤ９４プラスミドコンストラクト(実施例６)を示す。
【図１２】図１２Ａ-Ｃは、(Ａ)非還元条件下でのｈＣＤ９４-ｍＦｃ／ｈＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ、(Ｂ)還元条件下でのｈＣＤ９４-ｍＦｃ／ｈＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ、及び(Ｃ)還元及び非還元条件下で、ＨＥＫ２９３で発現したｍＦｃ-単鎖-ＮＫＧ２Ａ-ＣＤ９４のウエスタンブロットを示す(実施例７)。
【図１３】図１３Ａ及びＢは、(Ａ)抗ＣＤ９４(ＨＰ-３Ｄ９)抗体(Ｃｙ３-ラベリング)、又は(Ｂ)抗ＮＫＧ２Ａ(Ｚ１９９)抗体(Ｃｙ５-ラベリング)を使用する、プロテインＡ精製後のコンストラクトのＳＤＳ-ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析を示す。レーン１：ＭＷマーカー(図示せず)；レーン２：ｐＢＦ５ ＣＤ９４-ｍＦｃ；レーン３：ｐＢＦ１７ ＣＤ９４-２ｘＧＧＳ-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ；レーン４：ｐＢＦ６ ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ；レーン５：ｐＢＦ１９ ＣＤ９４-ｍＦｃ Ｔ２４９Ｙ、及びｐＢＦ２０ ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ Ｙ２９０Ｔ；レーン６：ｐＢＦ５ ＣＤ９４-ｍＦｃ、及びｐＢＦ６ ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ；レーン７：ｐＢＦ２１ ＣＤ９４-ｍＦｃ Ｅ２３９Ｋ、Ｋ２９２Ｄ、及びｐＢＦ２２ ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ Ｄ２８２Ｋ、Ｋ３３２Ｅ(実施例８)。
【図１４】図１４Ａ及びＢは、(Ａ)抗ＣＤ９４(ＨＰ-３Ｄ９)抗体(Ｃｙ３-ラベリンスされたＢ)、及び(Ｂ)抗ＮＫＧ２Ａ(Ｚ１９９)抗体(Ｃｙ５-ラベリング)を使用する、プロテインＡカラムにおけるＣＤ-９４-２ｘＧＧＳ-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ精製からの種々のフラクションのＳＤＳ-ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットを示す。レーン１：ＭＷマーカー；レーン２：適用；レーン３：流水；レーン４：フラクションＡ１０；レーン５：フラクションＡ１１；レーン６：フラクションＡ１２；レーン７：フラクションＢ１；レーン８：フラクションＢ２；レーン９：フラクションＢ３；レーン１０：フラクションＢ４；  レーン１１：フラクションＢ５；レーン１２：フラクションＢ６。
【図１５】図１５は、Ｔｒｘ-ヘキサＨｉｓ ｐＥＴ３２ａ ｈＮＫＧ２Ａプラスミドコンストラクト(ｐＩＳＮＮ４１５)(実施例９)を示す。
【図１６】図１６は、大腸菌における、Ｔｒｘ-ヘキサＨｉｓ-ＮＫＧ２Ａ発現の分析(実施例１０；ｐ＝ペレットフラクション；ｓ＝可溶性フラクション)を示す。
【図１７】図１７は、ＨｅｘａＨｉｓ-ＧＳＴ ＸＰＮＮＢ ｐＥＴ１５ｂ ｈＣＤ９４プラスミドコンストラクト(ｐＩＳＮＮ４２７)(実施例１１)を示す。
【図１８】図１８は、大腸菌における、ヘキサＨｉｓ-ＧＳＴ-ＣＤ９４発現の分析(実施例１２；ｐ＝ペレットフラクション；ｓ＝可溶性フラクション)を示す。
【図１９】図１９Ａ及びＢは、(Ａ)ＮＫＧ２Ａ-２×ＧＧＳコンストラクト；(Ｂ)ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤＦ９４コンストラクト(実施例１３)を示す。
【図２０】図２０は、単鎖二量体ＮＫＧ２Ａ-２×ＧＧＳ-ＣＤ９４ ＧＳＴ ＸＰＮＮＢ ｐＥＴ１５ｂプラスミドコンストラクト(実施例１３)を示す。
【図２１】図２１は、単鎖二量体ＮＫＧ２Ａ-２×ＧＧＳ-ＣＤ９４コンストラクトを示す。
【図２２】図２２は、ＣＤ９４-２ｘＧＧＳ-ＮＫＧ２Ａ ＧＳＴ ＸＰＮＮＢ ｐＥＴ１５ｂプラスミドコンストラクト(実施例１３)を示す。
【図２３】図２３は、大腸菌における、６Ｈｉｓ-ＧＳＴ-ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４及びＴｒｘ-６Ｈｉｓ-ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４発現(実施例１４；ｐ＝ペレットフラクション；ｓ＝可溶性フラクション)を示す。
【図２４】図２４は、抗ＮＫＧ２Ａ(Ｚ１９９、ライトグレイ)及び抗ＣＤ９４(ＨＰ-３Ｄ９、ダークグレイ)抗体への、単鎖のＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４コンストラクト(ｍＦｃ-ＧＳ-ＮＫＧ２Ａ-ＧＧＳ-ＧＧＳ-ＲＳＳ-ＣＤ９４)の結合性を示す(実施例１９)。
【図２５】図２５は、ＮＫＧ２タンパク質の細胞外部分のアラインメントを示す。ＮＫＧ２Ａ完全長(配列番号１)に従い番号付けをする。完全長配列に対して、配列番号１(ＮＫＧ２Ａ)、３(ＮＫＧ２Ｃ)、４(ＮＫＧ２Ｅ)、５５(ＮＫＧ２Ｆ)、及び７０(ＮＫＧ２Ｂ)を参照。
【図２６】図２６は、ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａチップ(黒の実線)、ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃチップ(クレイの線)及びＮＫＧ２Ｄ-Ｆｃチップ(破線)に結合する、ｈｕｍＺ２７０、ｈｕｍＺ１９９、抗ＮＫＧ２Ｃ-ＰＥ、及びｈｕｍＯＮ７２を示す重なりセンサーグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
(定義)
「レセプター」なる用語は、生物活性分子(すなわちリガンド)に結合し、細胞におけるリガンドの効果を調節する細胞-会合性タンパク質を示す。膜結合性レセプターは、典型的にはシグナル形質導入に関与する、細胞内エフェクタードメインと細胞外リガンド-結合ドメインを含有する、マルチ-ドメイン構造体により特徴付けられる。レセプターにリガンドが結合することにより、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子(類)との間の相互作用に起因して、レセプターに構造変化が生じる。この相互作用により、細胞の代謝に次々と変化が生じる。レセプター-リガンドの相互作用に関連した代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化が含まれ、環状ＡＭＰ生成、細胞カルシウムの流通、膜脂質の流通、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解が増加する。ここに記載された例示的レセプターはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターである。
【００１０】
「多量体」又は「ヘテロ多量体」とは、２又はそれ以上の異なるサブユニットを含有することを意味する。「ヘテロ二量体」レセプターは、２つの異なるサブユニットを含有し、ここでは「Ｓ１」(サブユニット１)及び「Ｓ２」(サブユニット２)と示す。
【００１１】
「可溶性」多量体レセプターとは、ここでは多量体レセプターを意味し、各サブユニットはレセプターの細胞外ドメインの全て又は一部を含むが、任意の膜貫通ドメインの一部又は全てを欠き、任意の細胞内ドメインの全てを欠く。一般的に、本発明の可溶性レセプターは、水溶液に溶解する。しかしながら、ある条件下では、レセプターは、標準的な手順により直ちに可溶化される封入体の形態にすることができる。「サブユニット１の可溶性部分」は、ここでは「ｓＳ１」と示され、一方、「サブユニット２の可溶性部分」は「ｓＳ２」と示すことができる。
【００１２】
「ハイブリッド」タンパク質は、ペプチド結合以外の少なくとも一の結合(例えば、ビオチン／アビジンを介した親和相互作用又は化学的カップリング)を介して結合した２つのポリペプチドセグメントを含有するタンパク質である。
「融合」タンパク質は、例えば組換えプロセスにより生成した、ペプチド結合により結合した２つのポリペプチドセグメントを含有するタンパク質である。
【００１３】
「ＮＫＧ２」なる用語は、ＮＫＧ２ファミリーの任意及び全てのメンバーからの、完全長又は部分的ポリペプチドを含み、限定されるものではないが、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、及びＮＫＧ２Ｆ、並びにこれらのメンバーのヒト及び非ヒトオルソログ及びその変異体が含まれる。典型的には、ＮＫＧ２ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列は、対応する野生型ＮＫＧ２ポリペプチドのアミノ酸配列と高度に同一であるか、または類似している(例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一)。
【００１４】
「ＮＫＧ２Ａ」なる用語は、ヒト及び非ヒトオルソログ双方からの完全長又は部分ＮＫＧ２Ａポリペプチド、並びにその変異体を含む。典型的には、ＮＫＧ２Ａポリペプチドの変異体のアミノ酸配列は、野生型ＮＫＧ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列と高度に同一であるか、または類似している(例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一)。
【００１５】
「ＮＫＧ２Ｃ」なる用語は、ヒト及び非ヒトオルソログ双方からの完全長又は部分ＮＫＧ２Ａポリペプチド、並びにその変異体を含む。典型的には、ＮＫＧ２Ａポリペプチドの変異体のアミノ酸配列は、野生型ＮＫＧ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列と高度に同一であるか、または類似している(例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一)。
【００１６】
「ＣＤ９４」なる用語は、ヒト及び非ヒトオルソログ双方からの完全長又は部分ＣＤ９４ポリペプチド、並びにその変異体を含む。典型的には、ＣＤ９４ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列は、野生型ＣＤ９４ポリペプチドのアミノ酸配列と高度に同一であるか、または類似している(例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一)。
【００１７】
「オルソログ」なる用語は、異なる種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的対応物である、一つの種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。オルソログ中の配列差異はスペシエーションの結果によるものである。
【００１８】
ここで「Ｆｃドメイン」とは、一般的に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全体又は一部を含むポリペプチドを称する。限定されるものではないが、これには、全ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド、並びに例えばヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのみを含有するこのようなペプチドの断片が含まれる。Ｆｃドメインは、限定されるものではないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体を含む、任意の種及び／又は任意のサブタイプの免疫グロブリンから誘導されてよい。例示的Ｆｃ配列は、ここでは例えば図５-７に提供されている。
【００１９】
ここで使用される場合、親又は野生型ポリペプチドの「変異」ポリペプチドは、親又は野生型と比較して、一又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含む。典型的には、このような変異体は、親又は野生型配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有し、親又は野生型ポリペプチドと比較して、保存された又は改善された特性を有する。いくつかの変化はタンパク質又はポリペプチドの折り畳み又は活性；当該分野でよく知られているように、類似した物理化学的特性(塩基性アミノ酸：アルギニン、リジン、及びヒスチジン；酸性アミノ酸：グルタミン酸、及びアスパラギン酸；極性アミノ酸：グルタミン及びアスパラギン；疎水性アミノ酸：ロイシン、イソロイシン、バリン；芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；小アミノ酸：グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン)を有する側鎖を持つものに対し、一つのアミノ酸が変化した保存アミノ酸置換、典型的には１〜約３０のアミノ酸の小さな欠失；及び小さなアミノ-又はカルボキシ-末端伸長、例えばアルニノ-末端メチオニン残基、約２０-２５残基までの小リンカーペプチド、又は精製を容易にする小伸長(アフィニティタグ)、例えばポリヒスチジントラクト(tract)、プロテインＡ(Nilssonら, EMBO 1985;14:1075以下参照；Nilssonら, Methods Enzymol. 1991; 198:3以下参照)、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(Smith及びJohnson, Gene 1988;67:31以下参照)、又は他の抗原エピトープ又は結合ドメインにあまり影響を与えない。一般的にはFordら, Protein Expression and Purification 1991;2:95-107を参照。アフィニティタグをコードするＤＮＡは、商業的供給者から入手可能である。
【００２０】
アミノ酸配列における配列の差異又は「同一性」は、任意の適切な技術、例えばNeedleman-Wunschアラインメント分析(Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453を参照)の使用、-１２の初期間隙ペナルティ及び-２の伸長ペナルティを有するBLOSUM50スコアリングマトリックスを使用するALIGN 2.0を用いた分析(Myers及びMiller, CABIOS (1989) 4:11-17を参照、ALIGNプログラムに導入された包括的アラインメント技術の議論のため)を介して提供されるもの等の任意の適切な技術(この発明において適切な一つを選択)により決定することができる。ALIGN 2.0プログラムのコピーは、 例えばSan Diego Supercomputer (SDSC) Biology Workbenchから入手可能である。Needleman-Wunschアラインメント分析では、２つの配列の間の全体的又は包括的同一性測定が提供されるため、より大きなペプチド配列の一部又はサブシーケンスであり得る標的配列が、完全配列に類似した方式で使用可能であるか、又は局所的アラインメント値が、例えばSmith-Watermanアラインメント(J. Mol. Biol. (1981) 147:195-197)により測定される、サブシーケンスの間の関係を評価するのに使用可能であると認知することができ、これは入手可能なプログラムを介して得ることができる(同一性を分析するのに適した他の局所アラインメント法には、 FastA及びBLASTプログラム等の、発見的局所アラインメントアルゴリズムを適用するプログラムが含まれる)。同一性を評価するためのさらなる関連法は、例えば国際特許出願第０３／０４８１８５号に記載されている。また、Needleman-Wunschアルゴリズムを改善するために求められるGotohアルゴリズムも、包括的配列アラインメント用に使用可能である。例えばGotoh, J. Mol. Biol. 162:705-708 (1982)を参照。
【００２１】
(発明の記載)
本発明は、ヘテロ二量体レセプターの２つのサブユニットのそれぞれの可溶性部分と、いくつかの態様では、免疫グロブリン分子の少なくとも一のＦｃ-部分を全て含有する、ヘテロ二量体レセプターからの可溶性レセプター-複合体を提供する。
一態様において、各可溶性部分は免疫グロブリンのＦｃ-部分に会合又は共有結合しており、最終的な可溶性-レセプター複合体は、第２のサブユニットの可溶性部分(ｓＳ２-Ｆｃ)を含むハイブリッド又は融合タンパク質に、第１のサブユニットの可溶性部分(ｓＳ１-Ｆｃ)を含有するハイブリッド又は融合タンパク質を会合又は共有結合させることによって形成される。種々のセグメントの結合は、化学的架橋結合、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などの共有結合、又はアビジン-ビオチン又はロイシンジッパー技術などの親和相互作用を介してなされ得る。
【００２２】
他の態様は、上に記載したものと類似しているが、各融合タンパク質のＦｃ-部分は、異なる融合タンパク質の間が強いてヘテロ二量体化するように設計された特定の変異を含み、結果として融合タンパク質ｓＳ１-Ｆｃ１がｓＳ２-Ｆｃ２と融合した可溶性-レセプター複合体が得られる。
【００２３】
さらなる他の態様は、可溶性レセプター複合体が、第２のサブユニットの可溶性部分(ｓＳ２)に結合した第１のサブユニットの可溶性部分(ｓＳ１)を含有する、単鎖可溶性レセプター-Ｆｃ融合体又はハイブリッドタンパク質-複合体である。特定の実施態様では、ｓＳ１及びｓＳ２の一方のＣ-末端はＦｃ-部分にさらに結合している。種々のセグメントの結合は、化学的架橋結合、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などの共有結合、又はアビジン-ビオチン又はロイシンジッパー技術などの親和相互作用を介してなされ得る。一実施態様では、単鎖のレセプタータンパク質は、融合タンパク質であり、すなわちタンパク質における異なるセグメント間の全ての結合が、ペプチドリンカー又は直接ペプチド-ペプチド結合を介してなされる。
【００２４】
さらなる他の態様において、上に記載された単鎖のＦｃ-融合タンパク質の２つのユニットは連結又は結合しており、よって本質的にヘテロ二量体レセプターのホモ二量体が形成される。例示的な一実施態様では、ヘテロ二量体レセプターはＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターであり、２つの単鎖のＦｃ-融合タンパク質は、ＣＤ９４及びＮＫＧ２サブユニットの可溶性セグメントにおいて自然に生じる、システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合している。
本発明のヘテロ二量体レセプターの可溶性レセプター-複合体はより安定しており、よって、より長時間保存することができる。さらにヘテロ二量体レセプターからの安定した可溶性レセプター-複合体は、例えば免疫化及び治療用途等、長時間の半減期が必要とされる用途に適している。
【００２５】
実施例に記載されているように、ＣＤ９４及びＮＫＧ２ＡのＮ及びＣ末端は、コンピュータ内でのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａモデルにおいて近接していることが発見された。第１のサブユニットのＣ-末端は、短いペプチドリンカーにより、第２のサブユニットのＮ-末端に結合可能であり、ＮＫＧ２Ａタンパク質の可溶性部分においては配列相同性が高いため、このことから、本発明の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロ二量体レセプターの適合性が確認された(図２５を参照)。よって、別の特定の実施態様では、ヘテロ二量体レセプターは、第１のサブユニットのＮ-末端が第２のサブユニットのＣ-末端に近接しているもの、又は第１のサブユニットのＮ-末端が第２のサブユニットのＣ-末端に近接しており、第１のサブユニットのＣ-末端が第２のサブユニットのＮ-末端に近接しているものである。例えば一実施態様では、ここで使用される場合の「近接」とは、それぞれのアルファ炭素間の距離が、互いに約４〜約４０、約４〜約３０、約４〜約２０、又は約４〜約５オングストロームの範囲内であることを意味する。他の実施態様では、「近接」とは、互いに約１３〜約１５オングストローム内であることを意味する。
【００２６】
以下、例示的な可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２コンストラクトである：
１）ＣＤ９４-Ｆｃ／ＮＫＧ２-Ｆｃ：ＣＤ９４とＮＫＧ２タンパク質の細胞外ドメインを含有し、その双方がマウスＦｃにコンジュゲート又は融合している、安定したＦｃ-融合タンパク質又はハイブリッド-タンパク質コンジュゲート。タンパク質は哺乳動物細胞から生産及び分泌可能で、単一工程のアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。例示的な一実施態様では、この可溶性レセプター複合体は、図１に例証されており、例証されているジスルフィド架橋はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターにおいて自然に生じたものである。
【００２７】
２）ＣＤ９４-Ｆｃ１／ＮＫＧ２-Ｆｃ２：ＣＤ９４及びＮＫＧ２タンパク質の細胞外ドメインを含有し、それぞれが別々に変異したマウスＦｃ-ドメインに融合している、安定したＦｃ-融合タンパク質又は-タンパク質コンジュゲート。ＣＤ９４可溶性セグメントに融合又はコンジュゲートしたＦｃ-ドメインにおける変異により、可溶性ＮＫＧ２セグメントに融合又はコンジュゲートした変異Ｆｃ-ドメイン及びその逆を伴う二量体化が促進され、よってＣＤ９４-又はＮＫＧ２-のホモ二量体化が回避される。タンパク質は哺乳動物細胞から生産及び分泌可能で、単一工程のアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。例示的な一実施態様では、この可溶性レセプター複合体は、図２に例証されており、例証されているジスルフィド架橋はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターにおいて自然に生じたものである。
【００２８】
３）単鎖のＣＤ９４／ＮＫＧ２-Ｆｃ：例えばセリン-グリシン-スペーサーにより連結しているか、及び／又はＦｃ-配列に融合又はコンジュゲートしている、ＣＤ９４及びＮＫＧ２タンパク質の細胞外ドメインを含有する、安定した単鎖のＦｃ-融合タンパク質。タンパク質は哺乳動物細胞から生産及び分泌可能で、単一工程のアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。例示的な一実施態様では、可溶性レセプターＦｃ-融合タンパク質は、図３に例証されており、融合タンパク質における種々のセグメント間の結合は、グリシン-セリンリンカーを介して得られる。
【００２９】
実施例１８及び１９に記載されるように、可溶性ＨＬＡ-Ｅに結合した可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター、並びにＣＤ９４(ＨＰ−３Ｄ９)及びＮＫＧ２Ａ(Ｚ１９９)に特異的なＭＡｂ'ｓは、適切に折り畳まれていることが示されている。試験された可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターは、ほとんど例外なく、ＰＢＳにおいて、４℃又は−２０℃での保存後、いくつかの場合には数週間後、可溶性ＨＬＡ-Ｅ四量体、ＨＰ３Ｄ９(抗ＣＤ９４)及び抗ＮＫＧ２Ａ(Ｚ１９９)に結合可能である故に、該ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターは安定していると思われる。さらに、実施例２０及び２１に記載されているように、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターが調製され、抗ＮＫＧ２Ｃ-特異的抗体に結合可能であることが見出された。
【００３０】
本発明のヘテロ二量体レセプターコンストラクトは、各単量体サブユニットの可溶性部分と、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン(すなわち、Ｆｃドメイン)の全て又は一部を含有する少なくとも一のポリペプチドを含む。
本原則が適用可能な、典型的なヘテロ二量体レセプターには、限定されるものではないが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｆレセプターが含まれる。図２５に示すように、ＮＫＧ２ファミリーのレセプターは、高度な配列相同性を有する。本発明のコンストラクトへの使用に適したこれらのレセプターの単量体サブユニットの可溶性部分は、科学文献において公知であるか、又はＴＭＨＭＭ(world-wide web (www) address cbs.dtu.dk/services/TMHMM/から入手可能)等の、公に入手可能なコンピュータベースのアルゴリズムを使用する、アミノ酸配列の標準的なコンピュータ分析を用いて推測することができる。
【００３１】
ＣＤ９４(Uniprot受入番号Ｑ１３２４１号)は、３つのドメインに１７９のアミノ酸を含有しており、細胞質領域は残基１-１０を含有し、膜貫通領域は残基１１-３１を含有し、細胞外領域は残基３２-１７９を含有し、次の配列：
ＭＡＶＦＫＴＴＬＷＲＬＩＳＧＴＬＧＩＩＣＬＳＬＭＡＴＬＧＩＬＬＫＮＳＦＴＫＬＳＩＥＰＡＦＴＰＧＰＮＩＥＬＱＫＤＳＤＣＣＳＣＱＥＫＷＶＧＹＲＣＮＣＹＦＩＳＳＥＱＫＴＷＮＥＳＲＨＬＣＡＳＱＫＳＳＬＬＱＬＱＮＴＤＥＬＤＦＭＳＳＳＱＱＦＹＷＩＧＬＳＹＳＥＥＨＴＡＷＬＷＥＮＧＳＡＬＳＱＹＬＦＰＳＦＥＴＦＮＴＫＮＣＩＡＹＮＰＮＧＮＡＬＤＥＳＣＥＤＫＮＲＹＩＣＫＱＱＬＩ(配列番号２）
を含む。
【００３２】
例示的な一ヘテロ二量体レセプターは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターである。ＮＫＧ２Ａ(Uniprot受入番号Ｐ２６７１５号)は、３つのドメインに２３３のアミノ酸を含有しており、細胞質領域は残基１-７０を含有し、膜貫通領域は残基７１-９３を含有し、細胞外領域は残基９４-２３３を含有し、次の配列：
ＭＤＮＱＧＶＩＹＳＤＬＮＬＰＰＮＰＫＲＱＱＲＫＰＫＧＮＫＳＳＩＬＡＴＥＱＥＩＴＹＡＥＬＮＬＱＫＡＳＱＤＦＱＧＮＤＫＴＹＨＣＫＤＬＰＳＡＰＥＫＬＩＶＧＩＬＧＩＩＣＬＩＬＭＡＳＶＶＴＩＶＶＩＰＳＴＬＩＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＲＴＱＫＡＲＨＣＧＨＣＰＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫＮＳＳＬＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦＬＳＩＩＳＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷＶＴＭＮＧＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮＡＥＬＮＣＡＶＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣＫＨＫＬ(配列番号：１)
を含む。
【００３３】
他の例示的なヘテロ二量体レセプターは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターである。ＮＫＧ２Ｃ配列(配列番号３)は、ＮＫＧ２Ａについて記載したものと類似した配置に、２３１のアミノ酸を含有している。図２５には、ｈＮＫＧ２Ａ及びｈＮＫＧ２Ｃの細胞外部分の間のアラインメントが示されている。
上に記載したように、他のＮＫＧ２レセプターを、本発明のヘテロ二量体レセプターを構成するために適用してもよい。このようなコンストラクトにおいて、一単量体ユニットは、ＣＤ９４配列の可溶性セグメントを含有しており、一つの単量体ユニットは、例えばヒトＮＫＧ２Ｂ(配列番号７０）、ＮＫＧ２Ｅ(配列番号４）、又はＮＫＧ２Ｆ(配列番号５)からのＮＫＧ２配列の可溶性セグメントを含有している。
【００３４】
可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの調製にも使用され得る、ＮＫＧ２Ａ及びＣＤ９４に対するいくつかの非ヒトオルソログが公知である。ヒトＮＫＧ２Ａの非限定的オルソログには、UNIPROT受入番号Ｑ９５ＭＩ５号(UNIPROT-ID：NKG2A_PANTR(チンパンジー））；Ｑ９ＭＺＪ３(UNIPROT-ID:NKG2A_MACMU(アカゲザル)）；Ｑ６８ＶＤ２(UNIPROT-ID:Q68VD2_MACFA(カニクイザル））；Ｏ５４８７２(UNIPROT-ID:O54872_RAT(ラット））；及びＱ９ＷＵ３１(UNIPROT-ID:Q9WU31_MOUSE(マウス))を有するものが含まれる。
ヒトＣＤ９４の非限定的オルソログには、UNIPROT受入番号Ｑ９ＭＺ４１(UNIPROT-ID:KLRD1_PANTR(チンパンジ））；Ｑ８ＭＨＹ９(UNIPROT-ID:KLRD1_PONPY(オランウータン））；Ｑ９ＭＺＫ９(UNIPROT-ID:KLRD1_MACMU(アカゲザル））；Ｑ６８ＶＤ４(UNIPROT-ID:Q68VD4_MACFA(カニクイザル））；Ｏ３５７７８(UNIPROT-ID:O35778_RAT（ラット））；Ｏ５４７０８(UNIPROT-ID:O54708_MOUSE(マウス））；及びＱ３８ＨＳ３(UNIPROT-ID:Q38HS3_CANFA(イヌ））を有するものが含まれる。これらの配列はUniprotウェブサイト(World-wide Web address ebi.uniprot.org/index.shtml)から公に入手可能である。
【００３５】
本発明のコンストラクトの免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ-部分の完全長又は断片、又はその変異体を含有していてもよい。一態様において、免疫グロブリンはＦｃ-ドメインの野生型配列、又はその断片である。他の態様において、変異体は、２つの異なる融合タンパク質のヘテロ二量体化を促進するように設計されており、融合タンパク質ｓＳ１-Ｆｃ１がｓＳ２-Ｆｃ２と融合する、可溶性-レセプター複合体が得られる。他の態様において、変異体は、ここに記載したような２つの異なる単鎖単鎖レセプターのヘテロ二量体化を促進するように設計されている。
【００３６】
特定の態様において、免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、ヒト又は非ヒト哺乳動物抗体から誘導される。一実施態様では、定常ドメインはヒトＩｇＧ１から誘導される。他の実施態様では、定常ドメインはヒトＩｇＧ４から誘導される。他の態様において、定常ドメインは非ヒト(例えば霊長類又は齧歯類)ＩｇＧ分子(又は、組成の観点では、ヒトＩｇＧにかなり類似していると認識されている抗体型)から誘導される。「から誘導される」なる表現は、任意の示した変化(例えば、以下に記載する置換)以外に、野生型又は参照(「親」)免疫グロブリン定常ドメインに対し、アミノ酸配列組成が同一(１００％)又は高度に類似した(例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一)であるポリペプチドを称する。この意味において、「から誘導される」なる表現は、このような抗体又は抗体断片を生成させるための方法、特に組換え発現、化学的タンパク質合成等の任意の適切な方法を示すことを意図していない。
【００３７】
一実施態様では、Ｆｃドメインの一部は、Ｆｃドメインを欠くコンストラクトと比較して、コンストラクトのインビボ半減期を増加させる(循環からのクリアランスがより遅いため)のに十分な大きさと組成のものであり：さらなる特定の態様では、Ｆｃドメインの一部は機能的である(すなわち、コンストラクト抗体に抗体エフェクター機能を付与する))。
【００３８】
本コンストラクトで使用される例示的な野生型免疫グロブリン定常ドメインには、マウスＦｃ(ｍＦｃ)配列(クローン＃６６９：ＩＭＡＧＥ３４９１７６６)を表す配列番号２５；マウスＩｇＧ１配列を表す配列番号２１の残基Ｖａｌ９８ないしＬｙｓ３２４；ヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列を表す、配列番号２０の残基Ｐｒｏ１００ないしＬｙｓ３３０；ヒトＩｇＧ４Ｆｃ配列を表す、配列番号２４の残基Ｇｌｕ９９ないしＬｙｓ３２７が含まれる。他の野生型配列(例えば、配列番号１２-１９及び２１-２３)からの対応する免疫グロブリンポリペプチドは、当該分野で確立された方法を使用して作製することができる。
【００３９】
一態様において、本発明は、このような野生型免疫グロブリン定常ドメインの変異バージョンを提供する。抗体単量体の定常ドメインにおけるアミノ酸対が、このような抗体単量体(及び、ＩｇＧ分子等の抗体分子の場合には、全体として抗体分子)の多量体化及び安定性に、かなり関与していることが見出されており、従って、二重特異性抗体単量体又は分子の形成をさらに促進させるために、種々の方法により修飾させることができる。典型的には、このようなアミノ酸対は、主として抗体分子の重鎖に見出される(例えば、ＩｇＧ分子のＣＨ１及びＣＨ３定常領域に存在するある種のアミノ酸残基の間)。
【００４０】
例えば、ヒト免疫グロブリンＧ抗体については、四量体抗体分子の２つの重鎖(「ＨＣ」)ポリペプチドの架橋結合に寄与しているイオン力は、次の方式において、抗体のＣＨ３領域に存在する６つのアミノ酸：Ｅ２４０-Ｋ２５３、Ｄ２８２-Ｋ２９２、及びＫ３２２-Ｄ２３９(配列位置番号は、(UNIPROT entry IGHG1_HUMAN(配列番号２０)に類似した)ＣＨ１起源から出発するアミノ酸を称する)により、主として寄与していることが見出されている。
【００４１】
本発明のこの発見を適用すると、次の通り-Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄ-ヘテロ二量体レセプター抗原の第１のサブユニットの可溶性セグメントにコンジュゲート、融合又は結合した免疫グロブリンペプチドのＨＣアミノ酸を置換することにより、(元来の野生型四量体抗体分子に自然に生じる)最終的なポリペプチドのホモ二量体化又は「自己ペアリング化」をかなり低減させることができる。置換Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄにより、ヘテロ二量体レセプターの第２のサブユニットの可溶性セグメントにコンジュゲート、結合又は融合した第２の免疫グロブリンポリペプチドのＨＣ配列を同様に修飾することで、このようなポリペプチドのホモ二量体化が低減又は無効化する。
【００４２】
異なるヘテロ二量体レセプターサブユニットからの可溶性セグメントをそれぞれ含有する２つのポリペプチドが共発現すると、イオン相互作用の安定化(例えば、Ｅ２４０-Ｋ２５３、Ｄ２８２-Ｋ２９２、及びＫ３２２-Ｄ２３９)、及びポリペプチドのペアリングが回復し、可溶性ヘテロ二量体レセプターを生じせしめることができる。表１にはこれら種々の置換を(例示的様式で)要約する。他の例示的定常ドメインにおいて対応する変異部位は、ヒトＩｇＧ１(配列番号２０)を有するアラインメント(図７の実施例を参照)により誘導可能である。例えば、表１に示すように、上述した残基１０３の番号では、ＩｇＧ１残基に対応するＩｇＧ４残基を、３を引くことにより得ることができる。
【００４３】
本発明のコンストラクトのＦｃ-ドメインは、表１の変異対の１、２又は全てを含有していてもよい。よって、非限定的な一実施態様では、本発明のヘテロ二量体コンストラクトは、配列番号２０の残基２３９に対応する残基にリジン(Ｋ)、及び配列番号２０の残基２９２に対応する残基にアスパラギン酸(Ｄ)を含有する、第１の変異Ｆｃ-ドメイン、及び配列番号２０の残基２８２に対応する残基にリジン、及び配列番号２０の残基３２２に対応する残基にアスパラギン酸(Ｄ)を含有する、第２の変異Ｆｃ-ドメインを含む。この種のコンストラクトは、ここでは「二重変異」コンストラクトと称される。非限定的な他の実施態様では、本発明のヘテロ二量体コンストラクトは、配列番号２０の残基２３９及び２４０に対応する残基にリジン(Ｋ)、及び配列番号２０の残基２９２に対応する残基にアスパラギン酸(Ｄ)を含有する、第１の変異Ｆｃ-ドメイン、及び配列番号２０の残基２５３に対応する残基にグルタミン酸(Ｅ)、配列番号２０の残基２８２に対応する残基にリジン、及び配列番号２０の残基３２２に対応する残基にアスパラギン酸(Ｄ)を含有する、第２の変異Ｆｃ-ドメインを含む。付加的に又は代替的に、一又は複数の変異対を、他の変異対と組合せてもよい。例示的な一つの代替的又は付加的な変異対は、配列番号２１における残基位置を指すＴ２４３Ｙ、Ｙ２８４Ｔである(IGHG1_MOUSE)。
【００４４】
表１
配列番号２０(UniProt IGHG1_HUMAN)又は配列番号２４(UniProt IGHG4_HUMAN)をそれぞれ指すヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常ドメインにおけるアミノ酸置換例。
2009541274.tif 000002
上に記載したように、種々の野生型又は変異マウスＦｃドメインも、本発明のヘテロ二量体コンストラクトに使用することができる。図８には、実施例において、コンストラクトを調製するのに使用された、マウスの野生型又は変異Ｆｃドメインのいくつかが記載されている。
【００４５】
本発明のヘテロ二量体レセプターにおいて、ポリペプチドの種々のセグメントは、従来からの多様な方法を使用して結合させることができる。例示的な実施態様では、ヘテロ二量体レセプターのサブユニットの可溶性部分は、免疫グロブリンポリペプチド(例えば、ｓＳ１-リンカー-Ｆｃ又はｓＳ２-リンカー-Ｆｃ)に結合しており、又は第１のサブユニットの可溶性部分が第２のサブユニットの可溶性部分(例えば、ｓＳ１-リンカー-ｓＳ２-Ｆｃ、ｓＳ２-リンカー-ｓＳ１-Ｆｃ、ｓＳ１-リンカー１-ｓＳ２-リンカー２-Ｆｃ、ｓＳ２-リンカー１-ｓＳ１-リンカー-２-Ｆｃ)に結合している。例えば(１)化学的架橋結合；(２)可溶性レセプターセグメント及び／又は免疫グロブリンポリペプチドセグメントへ、ペプチド等の部分が付加し、ついで部分又は部分群の付加を介してセグメントが結合し、ハイブリッドタンパク質が形成されることによる親和性会合；及び(３)可溶性レセプターセグメント及び／又は免疫グロブリンポリペプチドセグメントが結合し、ポリペプチドリンカー、すなわち融合タンパク質を介したポリペプチド単鎖の形成により、種々のセグメントを結合させることができる。
【００４６】
第１の結合カテゴリーにおいて、任意の多様な従来からの方法は、２つのポリペプチド鎖を化学的にカップリング(架橋結合)させるのに使用することができる。共有結合は、現存する側鎖の直接縮合(例えば、ある種のＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター中のＣＤ９４及びＮＫＧ２サブユニットの可溶性部分に自然に生じ得る、システイン残基間のジスルフィド結合の形成)により、又は外部架橋分子の導入により達成可能である。多くの二価又は多価薬剤が、ポリペプチドのカップリングに有用である。
【００４７】
一般的に、使用される架橋結合剤は、例えばエプシロン-アミノ基又はチオール基と反応する、二価官能性剤である。これらの架橋リンカーは、２つのカテゴリー：ホモ-及びヘテロ-二官能性試薬に分類することができる。ホモ二官能性試薬は、例えば遊離のチオール(例えば、ジスルフィド結合の還元時に発生)と反応可能であり、例えば遊離のチオールを有する２つのポリペプチド間にチオエーテル結合を形成可能な、５,５'-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)(ＤＮＴＢ)、及びｏ-フェニレンジマレイミド(Ｏ-ＰＤＭ)が含まれる。ヘテロ二官能性試薬は、第２のポリペプチドと反応可能なポリペプチドに、反応基を導入することができる。例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)は、第１級アミノ基と反応して、遊離のチオール基を導入することができる。他の化学的架橋結合剤には、例えばカルボジイミド類、ジイソシアナート類、ジアゾベンゼン類、ヘキサメチレンジアミン類、ジマレイミド、グルタルアルデヒド、４-スクシンイミジル-オキシカルボニル-ａ-メチル-ａ(２-ピリジルチオ)トルエン(ＳＭＰＴ)及びＮ-スクシンイミジル-Ｓ-アセチル-チオアセタート(ＳＡＴＡ)が含まれる。このような薬剤とポリペプチドとを架橋結合させるための手順は、当該分野でよく知られている。例えば、Pierce ImmunoTechnology Catalog & Handbook(1991)E8- E39; Karpovskyら, J. Exp. Med. 1984;160:1686以下参照; Liuら. Proc. Natl. Acad. Sci. 1985;82:8648以下参照; 及び米国特許第4,676,980号を参照。
【００４８】
架橋結合剤の２つの反応基の間のスペーサーアームは、種々の長さ及び化学的組成を有していてよい。スペーサーアームが長ければ長い程、コンジュゲートされたポリペプチドの可動性は良好になり、また架橋中の特定の成分(例えばベンゼン基)により、種々の態様の作用に対する化学的結合の耐性を増加させ、反応基に対する安定性が増す(例えば、ジスルフィド結合は、試薬の還元に対して耐性がある)。ペプチドスペーサー、例えばペプチドリンカー、又は以下に記載されるリンカーペプチドの使用も考えられる。
【００４９】
第２のカテゴリーの結合法において、従来からの方法が、可溶性レセプター部分及び／又は免疫グロブリンポリペプチドに任意の種々の部分(例えばペプチド)を付加するために使用することができ、よって、付加された部分を介して会合可能な、ハイブリッド又は融合タンパク質が生成される。
【００５０】
一実施態様では、ビオチン及びアビジン(ストレプトアビジン)等の部分は、可溶性レセプター部分及び／又は免疫グロブリンポリペプチドに結合しているか、又は複合体化しており、これらの部分は２つのサブユニットと相互作用して会合する。
【００５１】
他の実施態様では、付加された部分は双方ともペプチドであり、ここでは「二量体化-促進ペプチド」と称され得る。使用可能な多種多様なこのようなペプチドリンカーとしては、ＧＳＴ(グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ)融合タンパク質、又はその二量体化モチーフ；ＰＤＺ二量体化ドメイン；ＦＫ-５０６ＢＰ(結合タンパク質)又はその二量体化モチーフ；ｐ５３の天然又は人工のヘリックス-ターン-ヘリックス二量体化ドメイン；及びプロテインＡ又はその二量体化ドメイン、ドメインＢを挙げることができる。一実施態様では、追加されたペプチドはロイシンジッパーの成分である。ロイシンジッパー部分は、多くの場合、ヒト転写因子ｃ-ｊｕｎ及びｃ-ｆｏｓから取られる。
【００５２】
二量体化-促進ペプチドは、２つのサブユニットが、例えば立体傷害により、それぞれ他方の活性に干渉することを防止するため、適切なタンパク質折り畳みが可能になるように、適切な程度の可動性を提供すべきである。よって、その長さ、アミノ酸組成、及び／又は立体構造を変えることにより、例えばさらなる他の「第２のリンカー部分」又は「ヒンジ部分」を付加することにより、二量体化-促進ペプチドを修飾することが望まれている。多くの種類の第２のリンカー部分は、例えば小さくて、好ましくは中性、さらに極性又は無極性のアミノ酸、例えばグリシン、セリン、スレオニン又はアラニンで、種々の長さ及び組合せのもの；ポリリジン等である。また複数のリンカー及び／又は第２のリンカー部分を使用することができる。また時々は、可動性ヒンジ領域、例えばヒトＩｇＧのヒンジ領域、もしくは所定の間隔を開けてセリン又はスレオニンが挿入されたポリグリシン繰り返しを使用することが望まれている。
【００５３】
二量体化-促進ペプチドの長さ及び組成は、可溶性レセプターの所望する特性、例えばリガンドに対するその結合能力が最適化されるように、当業者により容易に選択可能である。抗体に対する結合性についての従来からのアッセイは、実施例に記載している。
【００５４】
例えば、上述した化学的カップリング(必要であれば、適切なアミノ酸基の二量体化後)；ビオチン／アビジン相互作用を介した付着；当該分野で認定された方法による共有結合(例えば、適切な酵素の使用)；組換え方法；又はそれらの組合せ等、当業者にとって明白であろう様々な方法で、ペプチドを、可溶性レセプター部分及び免疫グロブリンポリペプチドに付加することができる。
【００５５】
第３の結合カテゴリーにおいて、可溶性レセプター部分及び／又は免疫グロブリンポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して共有結合している。このカテゴリーにおいては、フレームにおいて、２つのセグメントのそれぞれの可溶性部分を結合させ、単鎖のポリペプチド分子を形成させるために、組換え技術が使用される。好ましくは、レセプター部分は、任意の長さ又はアミノ酸組成、最も好ましくは可動性ループ構造のリンカーペプチドにより互いに離間しており、２つのレセプター分子は、互いに適切な距離で、最適な相互作用にとって適切なアラインメントに位置することができる。典型的なリンカーペプチドには、小さくて、好ましくは中性、さらに極性又は無極性のアミノ酸、例えばグリシン、セリン、スレオニン又はアラニンで、種々の長さ及び組合せのもの；ポリリジン等が含まれる。ペプチドリンカーは少なくとも一のアミノ酸を有することができ、５００又はそれ以上のアミノ酸を有していてもよい。好ましくは、リンカーは約１００未満のアミノ酸、より好ましくは約２〜３０、最も好ましくは約３〜１０のアミノ酸である。可動性リンカードメイン、例えばヒトＩｇＧのヒンジ領域、又は所定の間隔を開けてセリン又はスレオニンが挿入されたポリグリシン繰り返しが、単独で、又は他の部分との組合せとして使用可能である。例示的なリンカーは、グリシン(Ｇ)、セリン(Ｓ)、及び／又はアルギニン(Ｒ)の組合せをベースにしたものであり、限定されるものではないが、ＧＳ、ＧＳＳ、ＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)、及びＧＧＳＧＧＳＲＳＳ(配列番号７)が含まれる。一実施態様では、単鎖のヘテロ二量体レセプターにおいて第１及び第２のサブユニットを結合させるリンカーはＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)である。他の実施態様では、単鎖のヘテロ二量体レセプターにおいて第１及び第２のサブユニットを結合させるリンカーはＧＧＳＧＧＳＲＳＳ(配列番号７)である。
【００５６】
このような、直鎖状で単鎖のヘテロ二量体レセプターを生成するために使用可能な組換え方法は従来的なものである。さらに、２つの可溶性レセプター部分が、可溶性ヘテロ二量体レセプターの機能を最適化可能な所定の距離及び方向で整列するように、リンカーペプチドを選択し、パラメーターを最適化するための常套的な手順を使用可能である。例えば、米国特許第４９３５２３３号及び同４７５１１８０号を参照。
もちろん、２つのサブユニットは、任意の相対順序又は方向における直列配列等、上述した部分の任意の組合せを介して会合可能である。
【００５７】
よって、一態様において、本発明は、免疫グロブリンをコード化した少なくとも一の核酸、及び少なくとも一の単量体レセプターサブユニットの可溶性部分を含有するポリペプチドをコード化した単離された核酸を有する、可溶性ヘテロ二量体レセプターポリペプチドをコード化した、単離された核酸を提供する。一実施態様では、ある核酸はＮＫＧ２サブユニット(例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、又はＮＫＧ２Ｆサブユニット)と免疫グロブリンポリペプチドをコード化し、ある核酸はＣＤ９４サブユニットと免疫グロブリンポリペプチドをコード化し、コード化されたヘテロ二量体レセプターは、対応するＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する抗体、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの天然リガンドに結合する。例えば、ある核酸は、ＮＫＧ２Ａサブユニットと免疫グロブリンペプチドをコード化可能であり、ある核酸は、ＣＤ９４ポリペプチドと免疫グロブリンペプチドをコード化可能であり、コード化されたヘテロ二量体レセプターは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａリガンド、例えばＨＬＡ-Ｅ、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター、例えばヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに対する抗体に結合可能である。他の実施態様では、単一の単離された核酸は、ＮＫＧ２サブユニット、ＣＤ９４サブユニット、及び免疫グロブリンサブユニットの双方を含有する単鎖のヘテロ二量体レセプターをコード化し、コード化されたヘテロ二量体レセプターは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２リガンド、例えばＨＬＡ-Ｅ、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する抗体に結合する。例えば、単一の単離された核酸は、ＮＫＧ２Ａ(又はＮＫＧ２Ｃ)サブユニット、ＣＤ９４サブユニット、及び免疫グロブリンサブユニットを含有する単鎖のヘテロ二量体レセプターをコード化可能であり、コード化されたヘテロ二量体レセプターは、ＨＬＡ-Ｅ、又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ(又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ)レセプターに対する抗体に結合する。
【００５８】
上に記載した核酸において、ある核酸は、配列番号１に説明されたＮＫＧ２Ａレセプターの可溶性部分、又はその変異体又はオルソログをコード化可能である。一実施態様では、核酸は、配列番号１の残基１１６-２３３を含有するＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号１の残基９９-２３３を含有するＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号１の残基９９-１１６から選択される残基から始まり、残基１１６で終結する、ＮＫＧ２Ａサブユニットの断片をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号１の残基１１６-２３３からなるＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号１の残基９９-２３３からなるＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分をコード化する。
【００５９】
一実施態様では、核酸は、配列番号３の残基１１４-２３１を含有するＮＫＧ２Ｃサブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号３の残基９７-２３１、例えば９６-２３１を含有するＮＫＧ２Ｃサブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号３の残基９６-１１４から選択される残基から始まり、残基１１４で終結する、ＮＫＧ２Ｃサブユニットの断片をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号３の残基１１４-２３１からなるＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号３の残基９６-２３１からなるＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分をコード化する。ある核酸は、配列番号２に説明されたＣＤ９４レセプターの可溶性部分を、付加的に又は代替的にコード化可能である。一実施態様では、核酸は、配列番号２の残基５８-１７９を含有するＣＤ９４サブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号２の残基３５-１７９を含有するＣＤ９４サブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号２の残基３５-５８から選択される残基から始まり、残基１７９で終結する、ＣＤ９４サブユニットの断片をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号２の残基５８-１７９からなるＣＤ９４サブユニットの可溶性部分をコード化する。他の実施態様では、核酸は、配列番号２の残基３５-１７９からなるＣＤ９４サブユニットの可溶性部分をコード化する。
【００６０】
また本発明の核酸は、さらなる特徴のヘテロ二量体レセプターコンストラクト、例えば、ペプチドリンカー、多量体化ドメイン、アフィニティタグ等をコード化してもよい。例えば、核酸は、ヘテロ二量体レセプターのサブユニットの可溶性部分を免疫グロブリンポリペプチド(例えば、ｓＳ１-リンカー-Ｆｃ又はｓＳ２-リンカー-Ｆｃ)、又は第１のサブユニットの可溶性部分を第２のサブユニットの可溶性部分(例えば、ｓＳ１-リンカー-ｓＳ２-Ｆｃ、ｓＳ２-リンカー-ｓＳ１-Ｆｃ、ｓＳ１-リンカー１-ｓＳ２-リンカー２-Ｆｃ、ｓＳ２-リンカー１-ｓＳ１-リンカー２-Ｆｃ)に結合させる、一又は複数のペプチドリンカーをさらにコード化してよい。例示的なリンカーは、グリシン(Ｇ)、セリン(Ｓ）、及び／又はアルギニン(Ｒ)の組合せをベースにしたものであり、限定されるものではないが、ＧＳ、ＧＳＳ、ＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)、及びＧＧＳＧＧＳＲＳＳ(配列番号７)が含まれる。一実施態様では、単鎖のヘテロ二量体レセプターにおいて第１及び第２のサブユニットを結合させるリンカーはＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)である。他の実施態様では、単鎖のヘテロ二量体レセプターにおいて第１及び第２のサブユニットを結合させるリンカーはＧＧＳＧＧＳＲＳＳ(配列番号７)である。
【００６１】
他の実施態様では、発現ベクターの核酸は、一又は複数の分泌シグナル配列をコード化する。一実施態様では、シグナル配列は、
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＭＤ(配列番号３０)
である。
また核酸は、特に、融合タンパク質において異なるセグメント間の一又は複数の切断部位もコード化してよい。例えば、Tuanら, Connective Tissue Research 1996;34:1-9を参照。
【００６２】
一態様において、本発明は、シグナル(Ｓｉｇ)配列、並びに発現ベクター、及びこのような核酸を含有する宿主細胞を有する又は有さない、表２に列挙されたアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。他の態様において、本発明は表２のアミノ酸配列の変異体を提供する。好ましい実施態様では、コード化された変異体は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの天然リガンド、又はヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに対して生じた抗体に結合する。他の好ましい実施態様では、コード化された変異体は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターの天然リガンド、又はヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターに対して生じた抗体に結合する。
【００６３】
表２
例示的な可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターコンストラクトのアミノ酸配列(Ｓｉｇ＝シグナル配列；ｍＦｃ＝マウスＦｃ-タンパク質；ＧＳ、ＧＳＳ等＝グリシン(Ｇ）、セリン(Ｓ)、及びアルギニン(Ｒ)をベースにしたリンカー)。Ｆｃドメインの命名は図８の命名を指す。
2009541274.tif 000003
【００６４】
他の態様において、本発明は、次の作用可能に結合したエレメント：(ａ)転写プロモータ；免疫グロブリンポリペプチドに融合したヘテロ二量体レセプターの可溶性部分の第１のサブユニットをコード化する第１の核酸；及び転写ターミネータを含有する第１の発現ベクター；及び次の作用可能に結合したエレメント：(ｂ)第２の転写プロモータ；免疫グロブリンポリペプチドに融合したヘテロ二量体レセプターの可溶性部分の第２のサブユニットをコード化する第２の核酸；及び転写ターミネータを含有する第２の発現ベクターを提供する。他の態様において、第１及び第２の核酸は、場合によってはインフレームで、単一の発現ベクター内に包含される。他の態様において、発現ベクターは、次の作用可能に結合したエレメント：(ａ)転写プロモータ；単鎖可溶性ヘテロ二量体レセプターをコードする第１の核酸；及び転写ターミネータを含有する。上述した態様の任意の一実施態様では、発現ベクターは、核酸に作用可能に結合した又は含有される分泌シグナル配列、アフィニティタグ、リンカー配列をさらにコード化する。上述した態様の他の実施態様では、ヘテロ二量体レセプターは、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターである。上述した態様の他の実施態様では、ヘテロ二量体レセプターは、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターである。上述した態様の他の実施態様では、ヘテロ二量体レセプターは、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターである。
【００６５】
他の態様において、本発明は、上述した少なくとも一の発現ベクターを含有する培養細胞を提供し、ここで、細胞は発現ベクターによりコード化されたポリペプチドを発現する。単細胞は、免疫グロブリンポリペプチドに融合した可溶性ヘテロ二量体レセプターの単一ユニットをコード化する(例えば、ｓＳ１-Ｆｃ又はｓＳ２-Ｆｃをコード化する)発現ベクター、それそれ免疫グロブリンポリペプチドに融合した可溶性ヘテロ二量体レセプターの第１及び第２のサブユニットの双方をコード化する(例えば、ｓＳ１-Ｆｃ及びｓＳ２-Ｆｃをコードする)発現ベクター、又はヘテロ二量体レセプターの第１及び第２のサブユニット及び免疫グロブリンポリペプチドを含有する単鎖のヘテロ二量体レセプターをコード化(例えば、ｓＳ１-ｓＳ２-Ｆｃ又はｓＳ２-ｓＳ１-Ｆｃ)発現ベクターを含有してよい。
【００６６】
また本発明は、このような発現ベクターで宿主細胞を形質移入し、細胞又は細胞培養物において一又は複数の核酸を発現させることによる、可溶性ヘテロ二量体レセプターの生産方法を提供する。一実施態様では、培養細胞は上述したような発現ベクターを含有し、ここで第１及び第２の核酸は同様の発現ベクター上に位置しており、細胞は発現ベクターによりコード化されたポリペプチドを発現する。他の実施態様では、培養細胞は発現ベクターを含有し、ここで第１及び第２の核酸は、独立して発現ベクター上に位置し、細胞に同時形質移入され、細胞は核酸によりコード化されたポリペプチドを発現する。他の実施態様では、第１の宿主細胞は、上述した毎に第１の核酸をコードする発現ベクターを用いて形質移入され、第２の宿主細胞(同じ又は異なるタイプのもの)は、上述した毎に第２の核酸をコードする核酸を用いて形質移入され、第１及び第２の宿主細胞は核酸によりコード化されたポリペプチドを、別々に発現する。他の実施態様では、培養細胞は上述したような発現ベクターを含有しており、ここで細胞は、核酸によりコード化された単鎖のヘテロ二量体又は多量体可溶性レセプターポリペプチドを発現する。他の実施態様では、培養細胞は、免疫グロブリンペプチド、及びヘテロ二量体レセプターサブユニットの可溶性部分の単量体融合タンパク質を分泌する。他の実施態様では、培養細胞は、可溶性のヘテロ二量体レセプターポリペプチドヘテロ二量体又は多量体複合体を分泌する。他の実施態様では、培養細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する抗体又はＣＤ９４／ＮＫＧ２リガンド又はに結合する、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを分泌する。他の実施態様では、培養細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対する抗体又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａリガンドに結合する、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを分泌する。他の実施態様では、培養細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに対する抗体又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃリガンドに結合する、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターを分泌する。
【００６７】
一実施態様では、本発明は：上述したような細胞を培養し；細胞により生成された可溶性レセプターポリペプチドを単離することをを含む、ヘテロ二量体又は多量体複合体を形成する可溶性ヘテロ二量体レセプターポリペプチドの生産方法を提供する。他の実施態様では、本発明は：第１の免疫グロブリンポリペプチドに結合したヘテロ二量体レセプターの第１のサブユニットの可溶性部分を発現する第１の細胞と、第２の免疫グロブリンポリペプチドに結合したヘテロ二量体レセプターの第２のサブユニットの可溶性部分を発現する第２の細胞を同時培養し、培養培地に形成された可溶性ヘテロ二量体ポリペプチドを単離することを含む、可溶性ヘテロ二量体レセプターの生産方法を提供する。他の実施態様では、本発明は：第１の免疫グロブリンポリペプチドに結合したヘテロ二量体レセプターの第１のサブユニットの可溶性部分を発現する第１の細胞と、第２の免疫グロブリンポリペプチドに結合したヘテロ二量体レセプターの第２のサブユニットの可溶性部分を発現する第２の細胞を別々に培養し、第１及び第２のサブユニット融合タンパク質を別々に精製し、第１及び第２のサブユニット融合タンパク質を混合し、形成された可溶性ヘテロ二量体ポリペプチドを単離することを含む、可溶性ヘテロ二量体レセプターの生産方法を提供する。上述した単離工程は、当該分野で公知の方法に従い、一又は複数の精製工程を含んでいてもよい。
【００６８】
一態様において、本発明は、少なくとも一のハイブリッドタンパク質、すなわち２つのポリペプチド(典型的には、少なくとも一のレセプターと免疫グロブリンセグメント及び／又は他の二量体化-促進ペプチドを含有する融合ポリペプチド)がペプチド結合以外の相互作用(例えば、ジスルフィド結合、アビジン-ビオチン、ロイシンジッパー等)を介して結合したタンパク質を含有する、単離された可溶性ヘテロ二量体レセプターを提供する。この方法において、ポリペプチドは組換え方法により別々に生成され、その後、結合される。
【００６９】
所望するならば、単細胞又は細胞培養体において生成される２つの組換え融合タンパク質の相対量は、例えば異なる強さのプロモータから、それらを発現させることにより調節することができる。例えば、第１のサブユニットＡの付加ペプチドが、高頻度でホモ二量体を形成し、これに対し第２のサブユニットＢの付加ペプチドが、低頻度でホモ二量体を形成するならば、サブユニットＡよりもサブユニットＢをかなり高レベルで発現させることにより、所望のヘテロ二量体の形成を誘導させることができる。最適な相対量は常套的な実験により、実験的に決定することができる。
【００７０】
他の態様において、本発明は、上述した核酸によりコード化され単離された可溶性ヘテロ二量体レセプターを提供する。一実施態様では、単離された可溶性ヘテロ二量体レセプターポリペプチドは、２つのポリペプチドを含有し、第１は免疫グロブリンポリペプチドに結合したヘテロ二量体レセプターの第１のサブユニットの可溶性部分を含有し、第２は免疫グロブリンポリペプチドに結合したヘテロ二量体レセプターの第２のサブユニットを含有する。第１及び第２のポリペプチドは、好ましくは例えばイオン力、共有結合、又はそれらの組合せを介して会合している。少なくとも２のポリペプチドを含有する可溶性ヘテロ二量体レセプターにおいて、ポリペプチドは、レセプターサブユニット部分又は免疫グロブリン部分の間のジスルフィド結合により会合可能であり、及び／又はここで記載したような一免疫グロブリンセグメントにおける変異を介して相互作用させることもできる。一実施態様では、あるポリペプチドはＮＫＧ２サブユニット(例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、又はＮＫＧ２Ｆ)と免疫グロブリンペプチドを含有しており、あるポリペプチドはＣＤ９４ポリペプチドと免疫グロブリンペプチドを含有しており、形成されたヘテロ二量体レセプターは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２リガンド、例えば対応するＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する抗体、又は天然リガンド、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃの場合にはＨＬＡ-Ｅに結合している。他の実施態様では、ヘテロ二量体レセプターは、ヘテロ二量体レセプターの第１及び第２のサブユニットの可溶性部分と免疫グロブリンポリペプチドを含有する、単鎖ポリペプチドである。ヘテロ二量体ＮＫＧ２レセプターのケースにおいて、コード化されたヘテロ二量体レセプターは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター、例えばヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する抗体、又は天然リガンド、例えばＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ等の場合にはＨＬＡ-Ｅに結合可能である。
【００７１】
ヘテロ二量体レセプターは、配列番号１に説明されたＮＫＧ２Ａ配列の可溶性部分、又はその変異体又はオルソログを含有可能である。一実施態様では、ＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分は、配列番号１の残基１１６-２３３を含有する。他の実施態様では、ＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分は、配列番号１の残基９９-２３３を含有する。他の実施態様では、可溶性部分は、配列番号１の残基９９-１１６から選択される残基から始まり、残基１１６で終結する、ＮＫＧ２Ａサブユニットの断片を含有する。他の実施態様では、ＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分は、配列番号１の残基１１６-２３３からなる。他の実施態様では、ＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分は、配列番号１の残基９９-２３３からなる。
【００７２】
またヘテロ二量体レセプターは、配列番号３に説明されたＮＫＧ２Ｃ配列の可溶性部分を、付加的に又は代替的に含有してよい。一実施態様では、ＮＫＧ２Ｃサブユニットは、配列番号３の残基１１４-２３１を含有する。他の実施態様では、ＮＫＧ２Ｃサブユニットの可溶性部分は、配列番号３の残基９７-２３１、例えば９６-２３１を含有する。他の実施態様では、可溶性部分は、配列番号３の残基９６-１１４から選択される残基から始まり、残基１１４で終結する、ＮＫＧ２Ｃサブユニットの断片を含有する。他の実施態様では、ＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分は、配列番号３の残基１１４-２３１からなる。他の実施態様では、ＮＫＧ２Ａサブユニットの可溶性部分は、配列番号３の残基９６-２３１からなる。
【００７３】
またヘテロ二量体レセプターは、例えば、ＮＫＧ２Ａ-残基９９-２３３と共に整列したセグメントを含有する、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｅの可溶性部分を、付加的に又は代替的に含有してよい。
【００７４】
ヘテロ二量体レセプターは、配列番号２に説明されたＣＤ９４レセプターの可溶性部分、又はその変異体又はオルソログを含有可能である。一実施態様では、ＣＤ９４サブユニットの可溶性部分は、配列番号２の残基５８-１７９を含有する。他の実施態様では、ＣＤ９４サブユニットの可溶性部分は、配列番号２の残基３４-１７９又は３５-１７９を含有する。他の実施態様では、可溶性部分は、配列番号２の残基３４-５８から選択される残基から始まり、残基１７９で終結する、ＣＤ９４サブユニットの断片を含有する。他の実施態様では、ＣＤ９４サブユニットの可溶性部分は、配列番号２の残基５８-１７９からなる。他の実施態様では、ＣＤ９４サブユニットの可溶性部分は、配列番号２の残基３５-１７９からなる。
【００７５】
一態様において、本発明は、表１に列挙したアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにこのようなポリペプチドを含有する薬学的組成物を提供する。他の態様において、本発明は、表２のアミノ酸配列の変異体を含有するヘテロ二量体レセプターを提供する。一実施態様では、変異体は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの天然リガンド、例えばＨＬＡ-Ｅ、及び／又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに対して生じた抗体に結合している。変異体は、例えば上述したような保存アミノ酸置換、非保存アミノ酸置換、付加、及び／又は欠失において、親とは異なっていてもよい。例えば、本発明のレセプターポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当該分野で公知の手順、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニン-スキャンニング突然変異誘発(Cunningham及びWells, Science 1989;244:1081-1085; Bassら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991;88:4498-4502)に従い、作製及び同定することができる。後者の技術において、単一のアラニン突然変異は、分子の全ての残基に導入され、得られた突然変異分子は生物活性(例えば、リガンド結合及びシグナル変換)について試験され、分子の活性に対して重要なアミノ酸残基が同定される。また、リガンド-レセプター相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学、又は光親和性標識等の技術により決定される結晶構造を分析することで、決定することができる。例えば、Vosら, Science 1992;255:306-312; Smithら, J. Mol. Biol. 1992;224:899-904; Wlodaverら, FEBS Lett. 1992;309:59-64。また、必須アミノ酸の同定は、関連するレセプターを用いたホモロジーの分析から推論することができる。
【００７６】
多数のアミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えばReidhaar-Olson及びSauer Science 1988;241:53-57、又はBowie及びSauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989;86:2152-2156に記載されているものを使用し、作製及び試験することができる。簡潔には、これらの著者は、ポリペプチドにおける２又はそれ以上の位置を同時にランダム化し、変異誘発したポリペプチドの配列決定をし、各位置における許容可能な置換のスペクトルを測定する方法を開示している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ、例えばLowmanら, Biochem. 1991;30:10832-10837; Ladnerら, 米国特許第5,223,409号; Huse, WIPO Publication WO 92/06204,及び突然変異誘発を指向した分野(Derbyshireら, Gene 46:145,(1986); Nerら, DNA 7:127,(1988))が含まれる。上述したような突然変異生成法は、宿主細胞においてクローンされ、突然変異生成したレセプターの活性を検出するための高スループットスクリーニング方法と組合せることができる。この点に関して好ましいアッセイには、以下に記載するようなバイオセンサーベースのリガンド結合アッセイ、及び細胞増殖アッセイが含まれる。活性化ヘテロ二量体レセプター又はその一部(例えばリガンド結合断片)をコード化した突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、モデム装置を使用し、素早く配列決定することができる。これらの方法により、関心あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を、素早く測定することが可能で、未知の構造のポリペプチドに適用することもできる。
【００７７】
以下、本発明の付加的な例示的態様のいくつかを記載する：
一態様において、本発明は、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分とＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを提供する。一態様において、単鎖コンストラクトは、Ｆｃドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチドをさらに含有してよい。よって、本発明は、Ｆｃドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチド、及びＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを提供する。一実施態様では、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターでは、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合可能であり、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。他の実施態様では、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターでは、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合し、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターにおいて、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分、免疫グロブリンポリペプチドを含有する実施態様ではは免疫グロブリンポリペプチドは、例えば共有結合により会合可能である。例えば、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分及びＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分は、グリシン及びセリンを含有するペプチドリンカーにより結合可能である。
【００７８】
他の態様において、本発明は、ＮＫＧ２Ａアミノ酸配列の可溶性部分と、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを提供する。一態様において、単鎖コンストラクトは、Ｆｃドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチドをさらに含有してよい。よって、本発明は、Ｆｃドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチド、及びＮＫＧ２Ａアミノ酸配列の可溶性部分、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターを提供する。一実施態様では、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターでは、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、ＮＫＧ２Ａアミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合可能であり、ＮＫＧ２Ａアミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。他の実施態様では、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターでは、ＮＫＧ２Ａアミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合し、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターにおいて、ＮＫＧ２Ａアミノ酸配列の可溶性部分、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分、免疫グロブリンポリペプチドを含有する実施態様ではは免疫グロブリンポリペプチドは、例えば共有結合により会合可能である。例えば、ＮＫＧ２Ａアミノ酸配列の可溶性部分及びＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分は、グリシン及びセリンを含有するペプチドリンカーにより結合可能である。
【００７９】
他の態様において、本発明は、ＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列の可溶性部分と、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターを提供する。一態様において、単鎖コンストラクトは、Ｆｃドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチドをさらに含有してよい。よって、本発明は、Ｆｃドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチド、及びＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列の可溶性部分、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含有する、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターを提供する。一実施態様では、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターでは、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、ＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合可能であり、ＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。他の実施態様では、単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターでは、ＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合し、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端は、免疫グロブリンポリペプチドに結合する。単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターにおいて、ＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列の可溶性部分、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分、免疫グロブリンポリペプチドを含有する実施態様ではは免疫グロブリンポリペプチドは、例えば共有結合により会合可能である。例えば、ＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列の可溶性部分及びＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分は、グリシン及びセリンを含有するペプチドリンカーにより結合可能である。
【００８０】
他の態様において、本発明は、上述したような、任意で単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターの二量体を提供する。
【００８１】
他の態様において、本発明は、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分を含有するＮＫＧ２サブユニット、及びＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含有するＣＤ９４サブユニットを含む、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを提供し、ここでＮＫＧ２サブユニット及びＣＤ９４サブユニットの少なくとも一方は、Ｆｃドメインの全て又は一部又はその変異体を含有する免疫グロブリンポリペプチドを含み、ＮＫＧ２サブユニットの非限定的例はＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃである。例えば、免疫グロブリンポリペプチドは、コンストラクトのインビボ半減期を増加させる、ＩｇＧ Ｆｃドメインの一部を含有してよい。一実施態様では、免疫グロブリンポリペプチドは機能的Ｆｃドメインである。他の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４抗体からのものである。さらなる他の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１抗体からのものである。
【００８２】
他の態様において、ＮＫＧ２及びＣＤ９４サブユニットの一方のみが、免疫グロブリンポリペプチドに結合している。例えば、免疫グロブリンポリペプチドは、サブユニットのＣ-末端部分に結合可能である。一実施態様では、ＮＫＧ２及びＣＤ９４サブユニットは、ペプチドリンカーを介して結合している。例えば、ペプチドリンカーは、配列ＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)又はＧＧＳＧＧＳＲＳＳ(配列番号７)を含有していてよい。特定の実施態様では、ＮＫＧ２Ａサブユニットは免疫グロブリンポリペプチドに共有結合的に結合している。他の実施態様では、ＣＤ９４サブユニットは免疫グロブリンポリペプチドに共有結合的に結合している。
【００８３】
他の態様において、ＮＫＧ２及びＣＤ９４サブユニットのそれぞれは、免疫グロブリンポリペプチドに共有結合的に結合している。例えば、ＮＫＧ２サブユニットのＮ-末端は、第１のポリペプチドが形成されるように、第１の免疫グロブリンポリペプチドのＣ-末端に結合可能であり、ＣＤ９４サブユニットのＮ-末端は、第２のポリペプチドが形成されるように、第２の免疫グロブリンポリペプチドのＣ-末端に結合可能である。一実施態様では、第１及び第２の免疫グロブリンポリペプチドの双方は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの変異体であり、第１の免疫グロブリンポリペプチドは、Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄに対応する置換を含み、第２の免疫グロブリンポリペプチドは、Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄに対応する置換を含み、又は逆もしかりである。他の実施態様では、第１及び第２の免疫グロブリンポリペプチドの双方は、ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインの変異体であり、第１の免疫グロブリンポリペプチドは、Ｋ２５０Ｅ、Ｄ２７９Ｋ、及びＫ３１９Ｄに対応する置換を含み、第２の免疫グロブリンポリペプチドは、Ｅ２３６Ｋ、Ｅ２３７Ｋ、Ｒ２８９Ｄに対応する置換を含み、又は逆もしかりである。
【００８４】
任意の上述した態様において、ＮＫＧ２サブユニットはＮＫＧ２Ａとすることができ、ここでＮＫＧ２Ａアミノ酸配列は、例えばヒトＮＫＧ２Ａ(配列番号１)のものとすることができる。例えば、ＮＫＧ２Ａサブユニットは、配列番号１の残基９９-２３３を含有していてよい。
任意の上述した態様において、ＮＫＧ２サブユニットはＮＫＧ２Ｃとすることができ、ここでＮＫＧ２Ｃアミノ酸配列は、例えばヒトＮＫＧ２Ｃ(配列番号３)のものとすることができる。例えば、ＮＫＧ２Ｃサブユニットは、配列番号３の残基９６-２３１を含有していてよい。
任意の上述した態様において、ＣＤ９４アミノ酸配列は配列番号２とすることができる。例えば、ＣＤ９４サブユニットは、配列番号２の残基３５-１７９を含有していてよい。
【００８５】
任意の上述した態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、配列番号１２-２９から選択される配列の完全長又は断片を含有していてもよい。配列番号１２-２９それぞれの完全長又は断片を含有するヘテロ二量体コンストラクトは、特異的な別の本発明の実施態様である。
任意の上述した態様において、免疫グロブリンポリペプチドは、シグナル配列に共有結合的に結合可能である。例えば、シグナル配列は配列番号３０の配列を含有していてもよい。
付加的な又は代替的な態様において、本発明は、配列番号３１及び３２；配列番号３３及び３４；配列番号３５及び３６；配列番号３７；配列番号３８、及び配列番号３９の配列を含有する可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター、又は配列番号５９を含有する可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターを提供する。
【００８６】
他の態様において、本発明は、任意の上述した態様の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターをコードする核酸を提供する。このような核酸を含有する発現ベクターで形質転換された細胞が提供され、ここで該細胞は、例えば原核細胞又は真核細胞であってよい。また、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの発現に適した条件下でこのような細胞を培養することを含む、ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの生産方法も提供される。
他の態様において、本発明は、任意の上述した態様の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを有効量と、製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物を提供する。
他の態様において、本発明は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに対する抗体を生成させる方法を提供し、該方法は、任意の上述した態様の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターで動物に予防接種し、ここでポリペプチドは、動物において免疫反応を誘発させ、抗体を生成させるものであり、動物から抗体を単離することを含む。
【００８７】
可溶性ヘテロ二量体レセプターの調製
本発明のヘテロ二量体レセプターポリペプチドは、従来からの技術に従い、遺伝子操作された宿主細胞において生成することができる。
適切な宿主細胞は、外来性ＤＮＡで形質転換又は形質移入可能で、培養にて成長可能なタイプの細胞であり、細菌、真菌細胞、培養された高等真核細胞が含まれる。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローンされたＤＮＡ分子を操作し、種々の宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入するための技術は、出典明示によりここに援用される：Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,(1989)に開示されている。
【００８８】
一般的に、可溶性ヘテロ二量体レセプターポリペプチドをコード化したＤＮＡ配列は、その発現に必要な他の遺伝要素に作用可能に結合しており、一般的には、発現ベクター内の転写プロモータ及びターミネータが含まれる。また、一般的にベクターは、一又は複数の選択可能なマーカー、及び一又は複数の複製起源を含有しているであろうが、当業者であれば、あるシステムにおいて選択可能なマーカーが別々のベクター上に提供されてよく、外来性ＤＮＡの複製は宿主細胞ゲノムに統合されることにより生成されてよいことを認識しているであろう。プロモータ、ターミネータ、選択可能なマーカー、ベクター及び他のエレメントの選択は、当該分野の技術レベルにおける常套的な設計事項である。多くのこのようなエレメントは文献に記載されており、商業的供給者を介して入手可能である。可溶性レセプター複合体の多くの成分は、個々のベクターにおいて、同時形質移入が可能であり、又は単一の発現ベクターを包含可能である。タンパク質複合体の多くの成分を発現するこのような技術は、当該分野でよく知られている。
【００８９】
宿主細胞の分泌経路にヘテロ二量体レセプターポリペプチドを向かわせるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プロプレ配列又はプレ配列としても公知)が、発現ベクター中に提供されてもよい。分泌シグナル配列はレセプターのものであってよいし、又は他の分泌タンパク質(例えば、ｔ-ＰＡ)から誘導されるか、新たに合成されたものであってもよい。分泌シグナル配列は、正確なリーディングフレームにおいて、ヘテロ二量体レセプターポリペプチドＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、関心あるポリペプチドをコード化したＤＮＡ配列に対し、５'に位置しているが、あるシグナル配列は、関心あるＤＮＡ配列にいずれかに位置していてもよい(例えば、Welchら, 米国特許第5,037,743号; Hollandら, 米国特許第5,143,830号を参照)。
培養された哺乳動物細胞は、好ましくは本発明の宿主である。
【００９０】
哺乳動物宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入するための方法には、リン酸カルシウム媒介性形質移(Wiglerら, Cell 11978;4:725、以下参照; Corsaro及びPearson, Somatic Cell Genetics 1981;7:603、以下参照: Graham及びVan der Eb, Virology 1973;52:456、以下参照、電気穿孔(Neumannら, EMBO J. 1982;1:841-845)、ＤＥＡＥデキストラン媒介性形質移入(Ausubelら編, Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)、及びリポソーム媒介性形質移入(Hawley-Nelsonら, Focus 1993;15:73、以下参照; Ciccaroneら, Focus 1993;15:80、以下参照)が含まれ、文献は出典明示によりここに援用される。培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばLevinsonら, 米国特許第4,713,339号; Hagenら, 米国特許第4,784,950号; Pahniterら, 米国特許第4,579,821号; 及びRingold, 米国特許第4,656,134号に開示されている。適切な培養された哺乳動物細胞には、ＣＯＳ-１(ATCC No. CRL 1650)、ＣＯＳ-７(ATCC No. CRL1651)、ＢＨＫ(ATCC No. CRL 1632)、ＢＨＫ５７０(ATCC No. CRL 10314)、２９３(ATCC No. CRL 1573; Grahamら, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)、及びチャイニーズハムスターの卵巣(例えば、ＣＨＯ−Ｋ１; ATCC No. CCL 61)細胞系が含まれる。一実施態様では、細胞は、その増殖について、外来的に供給された造血成長因子に依存する。この種の好ましい細胞系は、ＩＬ-３依存性マウスプレ-Ｂ細胞系である、 ＢａＦ３(Palacios及びSteinmetz, Cell 41: 727-734,(1995))、及びＧＭ-ＣＳＦ-依存性ヒト白血球細胞系である、ＡＭＬ-１９３細胞系(ATCC番号CRL-9589)、及びヒトＴＦ-１細胞系(ATCC番号CRL-2003)である。付加的な適切な細胞系は、当該分野でよく知られており、American Type Culture Collection, Rockville, Maryland等の公的な保存者から入手可能である。一般的に、強い転写プロモータ、例えばＳＶ-４０又はサイトメガロウイルスからのプロモータが好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照。他の適切なプロモータには、メタロチオネイン遺伝子(米国特許第4,579,821号及び同4,601,978号)及びアデノウイルスメジャーレイトプロモータ(adenovirus major late promoter)からのものが含まれる。
【００９１】
薬剤選択を一般的に使用し、外来性ＤＮＡが挿入された哺乳動物細胞を培養するために選択される。このような細胞は、通常、「形質移入体」と称される。選択された薬剤の存在下で培養され、それらの子孫に対して関心のある遺伝子を通過可能な細胞は、「安定した形質移入体」と称される。好ましい選択可能マーカーは、抗菌性ネオマイシンに対する遺伝子コード化耐性である。選択はネオマイシン型の薬剤、例えばＧ-４１８等の存在下で実施される。選択系は、関心ある遺伝子の発現レベル、「増幅」と称されるプロセスを増加させるように使用することができる。
【００９２】
増幅は低レベルの選択剤の存在下、形質移入体を培養し、導入した遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するように、選択剤の量を増加させることによって実施される。好ましい増幅性選択可能マーカーは、メトトレキサートに対する耐性に寄与する、ジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することもできる。
【００９３】
宿主として、他の高等真核細胞を使用することもでき、昆虫細胞、植物細胞及びトリ細胞が含まれる。昆虫細胞の形質転換及びそこでの外来性ポリペプチドの生成については、出典明示によりここに援用される、Guarinoら, 米国特許第5,162,222号; Bangら, 米国特許第4,775,624号;及びWIPO publication WO 94/06463に開示されている。植物細胞において、遺伝子を発現させるためのベクターとしてアグロバクテリウム根粒菌を使用することは、Sinkarら, J. Biosci.(Bangalore)11:47-58,(1987)により概説されている。
【００９４】
また、酵母細胞、特にサッカロミセス属の細胞を含む真菌細胞を、融合ポリペプチドの生成のために、本発明において使用することもできる。外来性ＤＮＡを用いて酵母細胞を形質転換し、そこから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawasaki, 米国特許第4,599,311号; Kawasakiら, 米国特許第4,931,373号; Brake, 米国特許第4,870,008号; Welchら, 米国特許第5,037,743号;及びMurrayら, 米国特許第4,845,075号に開示されている。形質転換した細胞は、選択可能マーカーにより決定された表現型、一般的に薬剤耐性、又は特定の栄養素(例えばロイシン)の不在下で成長する能力により選択される。酵母に使用される好ましいベクター系は、グルコース含有培地で増殖させることにより、形質転換細胞を選択可能な、Kawasakiら(米国特許第4,931,373号)により開示されているＰＯＴ１ベクター系である。酵母への使用に適した適切なプロモータ及びターミネータには、解糖酵素遺伝子(例えば、Kawasaki, 米国特許第4,599,311号; Kingsmanら, 米国特許第4,615,974号;及びBitter, 米国特許第4,977,092号を参照)、及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものが含まれる。米国特許第4,990,446号; 同5,063,154号; 同5,139,936号及び同4,661,454号を参照。Hansenula polymorpha、Schizosaccharomyces ponibe、Kluyveroinyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Ustilago maydis、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia guillennondii及びCandida maltosaを含む他の酵母用の形質転換系も公知である。例えば、Gleesonら, J. Gen. Microbiol. 1986;132:3459-3465 and Cregg, 米国特許第4,882,279号を参照。アルペルギルス細胞は、McKnightら, 米国特許第4,935,349号の方法に従い利用されてよい。Acreinonium chrysogenumを形質転換するための方法は、Suminoら, 米国特許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラを形質転換するための方法は、Lainbowitz, 米国特許第4,486,533号に開示されている。
【００９５】
形質転換又は形質移入された宿主細胞は、栄養素、及び選択された宿主細胞の成長に必要な他の成分を含有する培養培地において、従来からの手順に従い培養される。定められた培地及び複合培地を含む種々の適切な培地が当該分野でよく知られており、一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン類及びミネラル類を含有する。また培地は、必要であれば、成長因子又は血清等の成分を含有していてもよい。成長培地は、一般的には外来的に付加されたＤＮＡを含有する細胞用に、発現ベクターに担持された又は宿主細胞において同時形質移入された選択可能マーカーで補完される、必須栄養素における欠失、又は薬剤選択により選択されるであろう。
【００９６】
好ましくは、本発明の適切なヘテロ二量体レセプターは「単離」されており、例えばバッファー、キットの一部又は薬学的組成物等として再構成待ちをしている乾燥形態等、自然に生じるもの以外の形態である。「単離されたポリペプチド」なる用語は、(１)少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の物質(すなわち汚染物)で、自然に会合するものから分離した、本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターを称する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、治療、診断、予防又は研究用途に干渉しない、その自然環境に見出される任意の他の汚染ポリペプチド又は他の汚染物質を、実質的に含有しない。
【００９７】
本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターを単離及び／又は精製する、又はそれらに結合する前の種々のポリペプチド成分を単離及び／又は精製するために、多くの従来からの方法が使用可能である。本発明の可溶性レセプター及び／又はそれらのサブユニットは、可溶性タンパク質(好ましくは培養液に分泌された後)、又は封入体として細胞から回収され、それらは８Ｍの塩酸グアニジン及び透析等、定量的に抽出されてよい。使用可能な従来からの精製方法には、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及び／又はゲル濾過が含まれる。好ましい実施態様ではは、ある種の可溶性レセプターに存在するＦｃ部分に結合可能な、プロテインＡ又はプロテインＧを含有するカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィーが使用される。他の実施態様では、それぞれのポリペプチドは、適切なアフィニティーカラムに結合可能な部分、好ましくは切断可能なもので「タグ化」されている。例えば、一方又は双方のサブユニットは、金属-キレートクロマトグラフィーにより急速に精製可能なポリＨｉｓ(例えば、Ｈ'Ｓ６)；ストレプトアビジンに結合し、イミノビオチンで溶出(clute)可能なストレプ(Strep)-タグ；アイニロース(ainylose)に結合し、マルトースで溶出可能なマルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)；又はアフィニティークロマトグラフィーにより分離可能な任意の他のこのような部分でタグ化可能である。また、抗体が入手可能なエピトープを用いて、サブユニットの一方又は双方をタグ化可能であり、例えばＦＬＡＧＯペプチド、Ａｓｐ-Ｔｙｒ-ＬｙＳ-Ａｓｐ-Ａｓｐ-Ａｓｐ-Ａｓｐ-Ｌｙｓ(Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CTから入手可能)である。アフィニティタグを使用する典型的な方法は、例えばRecombinant Protein Protocols: Detection and Isolation, Edited by Rocky S. Tuan, Methods in Molecular Biology, Vol.. 63, Humana Press, 1997、及び実施例５及び６を参照。
【００９８】
任意の上述した種類の精製方法の組合せを使用することもできる。
レセプターの純度は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、及びアミノ末端アミノ酸配列分析を含む、標準的な方法を使用して測定することができる。
【００９９】
ヘテロ二量体レセプターの天然リガンド、又は天然ヘテロ二量体レセプターに対する抗体への、可溶性ヘテロ二量体レセプターの結合性は、従来からの方法で評価することができる。リガンド-結合レセプターコンストラクトを使用する好ましいアッセイシステムは、商業的に入手可能なバイオセンサー機器(BlAcoreTm, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を使用し、ここでリガンド、抗体、又はその断片は、レセプターチップの表面に固定される。この機器の使用については、Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-240,(1991)、及びCunningham及びWells, J. Mol. Biol. 234:554-563,(1993)に開示されている。リガンド、抗体、又は断片は、アミン又はスルフヒドリル化学を使用し、フローセル内の金膜に結合するデキストラン繊維に共有結合的に結合する。試験用試料をセルに通過させる。試料中の可溶性ヘテロ二量体レセプターコンストラクトがリガンド又は抗体に結合するならば、それは固定化されたリガンド又は抗体に結合し、これは媒体の屈折率における変化の原因であり、金膜の表面プラズモン共鳴における変化として検出される。このシステムにより、オン-及びオフ-レイトの決定が可能となり、結合親和力から、結合化学量論の算出及び評価をすることが可能となる。
【０１００】
また、リガンド-結合レセプターポリペプチドは、当該分野で公知の他のアッセイシステムにより評価することもできる。このようなシステムには、結合親和性の決定用のスキャッチャード分析が含まれる。例えば、Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 1949;51: 660-672、及びカロリーアッセイ(Cunninghamら, Science 1991;253:545-548; Cunninghamら, Science 1991;254:821-825)を参照。
【０１０１】
レセプターの安定性は、種々の時間長で、異なる条件(例えば、温度、ｐＨ、種々のバッファー)下で、それを保存することにより試験することができる。ついで、機能的安定性が、結合能力を分析することにより試験される。例えば、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃは、種々の期間及び異なる保存条件下で保存した後のＢｉｏＣｏｒｅ又は同様のアッセイにおいて、そのリガンド(ＨＬＡ-Ｅ)又は特定の抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ抗体(例えば、Ｚ１９９、Ｚ２７０、ＨＰ-３Ｄ９、ＦＡＢ１２８Ｐ)へ結合する能力について試験可能である。参照となる可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２(例えば、標準的な条件下で保存されてもよいもの)と比較した、保存されたＣＤ９４／ＮＫＧ２の結合パーセンテージで、その安定性を測定することができる。
【０１０２】
可溶性ヘテロ二量体レセプターの使用
本発明の特定の態様は、免疫剤、研究及び選択用ツール、診断用試薬、及び治療剤としての、可溶性ヘテロ二量体レセプターコンストラクトの使用に関する。
一態様において、本発明は、ヘテロ二量体レセプターに対する抗体反応を誘発させるために、本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターで動物を免疫化するための方法を提供する。可溶性断片単独の代わりに、本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターコンストラクトを使用することの例示的利点には、半減期が長くなること、レセプターの３次元折り畳みが正確であること、Ｆｃタグにより容易になるＡＰＣ'ｓへの取込が効率的であることが含まれる(よって、より強固な抗体反応が促進される)。ついで、ヘテロ二量体レセプターに対する抗体は、血液から収集されるか(ポリクローナル抗体の調製)、又はハイブリドーマ技術又はモノクローナル抗体の生成で確立された他の技術を使用し、抗体生成Ｂ細胞から調製することもできる。一実施態様では、本発明は：ここに記載した可溶性ヘテロ二量体レセプターで動物を免疫化させ、ポリペプチドが、動物において免疫反応を誘発させ、抗体を生成させるものであり；動物から抗体を単離することを含む、可溶性ヘテロ二量体レセプターに抗体を生成させる方法を提供する。
【０１０３】
他の態様において、本発明は、ここに記載した可溶性ヘテロ二量体レセプターを含有する可溶性ヘテロ二量体又は多量体レセプター複合体に特異的に結合し、上述にて開示した方法により生成された抗体を提供する。一実施態様では、上述にて開示された抗体はモノクローナル抗体である。
【０１０４】
抗原を用いて非ヒト哺乳動物を免疫化する工程は、マウスにおける抗体生成を刺激するための、当該分野でよく知られている任意の方式で実施されてよい(例えば、E. Harlow及びD. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1988)を参照)。可溶性ヘテロ二量体レセプター、又はその断片は、場合によっては、完全フロイントアジュバント等のアジュバントを用い、バッファーに懸濁又は溶解される。免疫原の量を測定するための方法、バッファーの種類、及びアジュバントの量は、当業者によく知られている。これらのパラメータは異なる免疫原については異なっていてもよいが、容易に明らかである。
【０１０５】
同様に、抗体の生成を刺激するのに十分な免疫化の位置及び頻度も、当該分野でよく知られている。典型的な免疫化プロトコルにおいて、非ヒト動物は、１日目、約１週間後に再度、腹腔内に抗原を注射される。続いて、約２０日、場合によっては完全フロイントアジュバント等のアジュバントを用い、抗原のリコール注射を行う。リコール注射は静脈内に実施され、連続した数日間、繰り返されてよい。ついで、典型的にはアジュバントなしに、静脈内又は腹腔内のいずれかに、４０日目に、ブースター注射がなされる。このプロトコルにより、約４０日後に、抗原-特異性抗体-生成Ｂ細胞の生成に帰する。また、免疫化に使用される抗原を指向する抗体を発現するＢ細胞を生成する限りは、他のプロトコルも利用可能である。
【０１０６】
ポリクローナル抗体を調製するために、血清は、免疫化された非ヒト動物から得られ、そこに存在する抗体はよく知られている技術により単離される。血清は、天然ヘテロ二量体レセプターを発現する細胞、又は可溶性ヘテロ二量体レセプターと反応する抗体を得るために、固形支持体に結合した、上述にて説明した任意の免疫原を使用し、親和精製されてよい。
【０１０７】
モノクローナル抗体を調製するために、非ヒト哺乳動物は、任意の完全長配列、任意の細胞外配列、又は任意のその断片を含む、ここで記載された任意の可溶性ヘテロ二量体レセプターで免疫化される。ついで、脾細胞を単離し、不死化細胞と融合させ、抗体-生成ハイブリドーマが形成される。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は当該分野でよく知られており、典型的には、麻酔された非ヒト哺乳動物から脾臓を取り除き、小片に切断し、脾膜から、細胞ストレーナーのナイロンメッシュを通して脾細胞を適切なバッファー内に圧搾し、単細胞懸濁液を生成させることを含む。細胞を洗浄し、遠心分離にかけ、任意の赤血球が溶解したバッファーに再懸濁させる。再度、溶液を遠心分離にかけ、最後に、ペレットに残存したリンパ球を新鮮なバッファーに再懸濁させる。
【０１０８】
単離し、単細胞懸濁液に存在してすぐに、リンパ球を不死化細胞株に融合させる。これは、典型的には、マウスの骨髄腫細胞系であるが、ハイブリドーマの作製に有用な他の多くの不死化細胞株も、当該分野で公知である。好ましいマウス骨髄腫細胞系には、限定されるものではないが、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A.から入手可能なＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、又はAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A.から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３及びＳＰ-２細胞から誘導されるものが含まれる。ポリエチレングリコールなどを使用して、融合がなされる。ついで、得られたハイブリドーマを、未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含有する選択培地において増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠くならば、典型的には、ハイブリドーマ用の培養培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろうし(ＨＡＴ培地)、物質はＨＧＰＲＴ-不完全細胞の増殖を防止するものである。
【０１０９】
ハイブリドーマは、典型的には、マクロファージの支持細胞層において増殖する。マクロファージは、好ましくは脾細胞の単離に使用された非ヒト哺乳動物の同腹子からのもので、典型的には、ハイブリドーマを蒔く前の数日間、不完全フロイントアジュバントで予備刺激されている。融合方法は、例えば(Goding、「Monoclonal Antibodies：Principles and Practice」、pp.59-103(Academic Press、1986))に記載されている。
【０１１０】
細胞は、コロニー形成及び抗体生成に十分な時間；通常は７と１４日の間、選択培地で増殖させることができる。ついで、ハイブリドーマコロニーを、天然ヘテロ二量体レセプターを発現する細胞、又は可溶性ヘテロ二量体レセプターに結合する抗体の生成についてアッセイする。アッセイは、典型的には、比色分析ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、ＢｉａＣｏｒｅアッセイ(上述)、又はシンチレーション近接アッセイ(ＳＰＡ)、並びに当該分野でよく知られているものを含む、いくつかの他の種類のアッセイも使用されてよい。一又は複数の明確なコロニーが存在するならば、測定のために、所望の抗体生成のためのウェルポジティブが調査される。一以上のコロニーが存在するならば、細胞は再クローンされ、単細胞のみが、所望の抗体を生成するコロニーを生じるように、確実に増殖させてもよい。単一の明らかなコロニーを有するポジティブウェルは、典型的には再クローンされ、再アッセイされて、確実にモノクローナル抗体のみが検出及び生成される。
【０１１１】
ついで、この発明のモノクローナル抗体を生成することが確認されているハイブリドーマを、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０等の適切な培地において、多量に増殖させる。また、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させることもできる。
【０１１２】
所望のモノクローナル抗体を生成させるために、十分に増殖させた後、モノクローナル抗体を含有する増殖培地(又は腹水)を細胞から分離させ、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、プロテインＡ又はプロテインＧ-セファロース、又はアガロース又はセファロースビーズ等の固体支持体に結合した抗マウスＩｇを使用するクロマトグラフィー(全ては、例えばAntibody Purification Handbook、Amersham Biosciences、publication No.18-1037-46、Edition AC,に記載されており、その開示は、出典明示によりここに援用される)により達成可能である。結合した抗体を、典型的には、抗体-含有フラクションの即時中和を伴い、低ｐＨのバッファー(ｐＨ３．０又はそれ未満のグリシン又はアセタートバッファー)を使用することにより、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出させる。これらのフラクションをプールしておき、必要に応じて、透析、及び濃縮する。
【０１１３】
また、本発明の抗体をコード化したＤＮＡはハイブリドーマから単離され、適切な宿主に形質移入された適切な発現ベクターに配される。ついで、宿主は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の抗原認識部位を有する抗体又はキメラ抗体の活性断片の組換え生成に使用される。
【０１１４】
本発明の付加的な又は代替的な態様において、本発明の可溶性レセプター、例えば可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターは、治療又は診断用途のための、ＮＫＧ２結合及び／又はＣＤ９４結合剤を選択する方法に使用可能である。例えば、一又は複数の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターは、このような方法、例えば単鎖ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、単鎖ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、単鎖ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ、単鎖ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、及び／又は単鎖ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｆに使用されてよい。例示的な薬剤には、限定されるものではないが、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、及び／又はＮＫＧ２Ｆに対する抗体、並びにこのような抗体の抗原結合断片又は誘導体が含まれる。例示的な抗体断片については、例えば、Holliger及びHudson(Nat Biotechnol  2005;23:1126-1136)を参照。
【０１１５】
一実施態様では、本発明は：(ａ)ＮＫＧ２ポリペプチドに特異的に結合する抗原-結合化合物を提供し；(ｂ)ここに記載された可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合する抗原-結合化合物を試験し；(ｃ)抗原-結合化合物が可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合することが決定されるならば、抗原-結合化合物を選択し；及び(ｄ)場合によっては、所定量の選択された抗原-結合化合物を生成させることを含む、抗ＮＫＧ２抗原-結合化合物の生産方法を提供する。
【０１１６】
他の実施態様では、本発明は、抗ＮＫＧ２抗原-結合化合物の生産方法を提供し、該方法は：(ａ)ＮＫＧ２ポリペプチドに特異的に結合する、所定量の抗原-結合化合物を生成させ；(ｂ)ここに記載された可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターへの結合性について、該量の抗原-結合化合物からの試料を試験し；(ｃ)抗原-結合化合物が可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに結合することが決定されるならば、医薬として及び／又は医薬の製造への使用に所定量を選択し；及び(ｄ)場合によっては、ヒトへ投与するための所定量を調製し、場合によっては製薬的に許容可能な担体と共に、所定量の選択された抗原-結合化合物を処方することを含む。
【０１１７】
他の実施態様では、本発明は、抗ＮＫＧ２抗原-結合化合物の生産方法を提供し、該方法は：(ａ)ＮＫＧ２ポリペプチドに特異的に結合する多量の抗原-結合化合物を提供し、(ｂ)ここに記載した可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターへの結合性について、それぞれの抗原-結合化合物を試験し；(ｃ)抗原-結合化合物が該可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに結合することが決定されるならば、抗原-結合化合物を選択し；及び(ｄ)場合によっては、ヒトへの投与に適切な抗原-結合化合物を作製し；及び／又は(ｅ)場合によっては、所定量の選択された抗原-結合化合物を生成させることを含む。
【０１１８】
また上述した方法は、例えば抗原-結合化合物のキメラ又はヒト化体を作製するために、ヒトに適した抗原-結合化合物を作製することを含んでいてもよい。さらに上述した方法は、適切な培地において抗原-結合化合物を発現する細胞を培養し、抗原-結合化合物を回収することを含む、所定量の抗原-結合化合物を生成させることを含んでよい。特定の実施態様では、上述した方法の抗原-結合化合物は、抗体又はその抗原-結合断片を含有していてよい。ＮＫＧ２ポリペプチドは、例えばＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、及び／又はＮＫＧ２Ｆから選択されてよい。例えば、抗原-結合化合物は、一又は複数のＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、及びＮＫＧ２Ｆに結合してよい。特定の実施態様では、抗原-結合化合物は少なくとも一のＮＫＧ２Ａに結合する。他の特定の実施態様では、抗原-結合化合物は少なくともＮＫＧ２Ｃに結合する。
【０１１９】
また本発明は、本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターと、ＨＬＡ-Ｅ分子を含有してよい試料を接触させることを含む、ＨＬＡ-Ｅ分子の検出方法(例えば、実験又は診断アッセイ)に関する。一実施態様では、可溶性ヘテロ二量体レセプターは、ここに記載された、単鎖ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターコンストラクトである。可溶性ヘテロ二量体レセプターは、放射活性又は蛍光実体等、このような目的に使用される、従来からの検出可能な部分でラベリングされてよい。代替的に、可溶性ヘテロ二量体レセプターのＦｃ-部分に対する第２の抗体、又は検出されない基質を検出可能な生成物に転換可能な酵素に可溶性ヘテロ二量体レセプターをコンジュゲートさせる等の間接的な方法を使用してもよい。もちろん、このようなアッセイは定量的とすることができる。一実施態様では、このようなアッセイは、親から取り出された生物学的試料が、細胞表面でＨＬＡ-Ｅを発現する細胞を含有しているかどうかを決定するために使用される。他の実施態様では、このようなアッセイは、関心ある薬剤が、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃに結合するために有用なＨＬＡ-Ｅの量を、細胞内で増加又は減少させるかどうか(例えば、ヒト又はマウス細胞；試験用チューブ内、組織試料、培養中又は動物内)、及び／又はＨＬＡ-Ｅの生物活性(例えば、可溶性レセプターへの結合性)を調節(阻害又は向上)させるかどうかを決定するために使用される。例示的な生物学的試料には、限定されるものではないが、例えばバイオプシー又は外科手術により得られる腫瘍試料；及び血液試料が含まれる。
【０１２０】
他の態様において、本発明は、本発明の可溶性ヘテロ二量体レセプターを投与することによる、被験者における、ＨＬＡ-Ｅ発現又はＨＬＡ-Ｅ過剰発現している細胞を特異的に標的にする方法を提供する。ついで、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣのＦｃ-部分はエフェクタードメインとして機能可能であり、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ反応を介したＨＬＡ-Ｅ発現細胞の細胞崩壊を誘発する。
【０１２１】
他の態様において、可溶性ヘテロ二量体レセプターは、天然レセプターに対する抗体又はレセプターリガンドの精製に使用される。可溶性ヘテロ二量体レセプターは固体状支持体、例えばアガロースビーズ、架橋結合したアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカベースの樹脂、ポリスチレン、架橋結合したポリアクリルアミド、又は使用条件下で安定した物質に固定されている。また可溶性ヘテロ二量体レセプターは、そのＦｃ-部分を介して、例えばプロテインＡ又はプロテインＧアフィニティーカラムに結合していてもよい。固体状支持体にポリペプチドを結合させる方法は当該分野でよく知られており、アミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、及びヒドラジド活性化が含まれる。一般的には、得られた培地をカラムの形態で遠心分離させ、リガンドを含有する液体を、一又は複数回、カラムに通過させ、レセプターにリガンドを結合させる。ついで、塩濃度又はｐＨを変えることでリガンドを溶出させ、リガンド-レセプター結合を分裂させる。
【０１２２】
細胞毒性アッセイ
特定の実施態様では、本発明は、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターコンストラクト、及びこのような可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターコンストラクトに対して生じた抗体等の薬剤を提供する。このようなコンストラクト又は抗体が、ＨＬＡ-ＥとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの相互作用を低減又はブロック可能かどうか、よってＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-制限リンパ球の細胞毒性が増加するかどうかを決定するために、次の試験を実施することができる。
【０１２３】
標的細胞、例えばＰ８１５、Ｋ５６２細胞、又はそれぞれの開示の全体が出典明示によりここに援用される、Sivoriら, J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitaleら, J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessinoら. J. Exp. Med. 1998;188:953-960;Neriら. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135;Pendeら. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516に開示されている適切な腫瘍細胞を死滅させ、ＮＫ細胞を刺激する抗体の能力を評価するための他のパラメータ、又はクロム放出性を測定する、細胞ベースの細胞毒性アッセイを使用し、ＮＫ細胞活性を評価することができる。例示的な一アッセイにおいて、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-媒介性シグナル伝達を低減させる薬剤の能力は、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫＬ細胞、及びＨＬＡ-Ｅを発現する標的細胞を使用する、標準的な４時間インビトロ細胞毒性アッセイにおいて試験することができる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａが、リンパ球媒介性細胞崩壊を防止する、阻害シグナル伝達の開始及び伝播に至る、ＨＬＡ-Ｅを認識するために、このようなＮＫＬ細胞は、ＨＬＡ-Ｅを発現する標的を効果的に死滅させない。例えば、Coliganら編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y.,(1992, 1993)に記載されているように、このようなインビトロにおける細胞毒性アッセイは、当該分野でよく知られている標準的な方法で実施可能である。標的細胞は、ＮＫＬ細胞の添加前に５１Ｃｒでラベリングされ、ついで、死滅の結果として、死滅度は、細胞から培地への５１Ｃｒの放出度合いに対する比率として推定される。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ-Ｅへの結合を防止する薬剤を添加すると、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介して阻害シグナル伝達の開始及び伝搬が防止される。よって、このような薬剤が添加されると、標的細胞のリンパ球-媒介性死滅度が増加する。この工程により、例えばリガンド結合をブロックすることで、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-誘発性ネガティブシグナル伝達を防止する薬剤が同定される。特定の５１Ｃｒ-放出細胞毒性アッセイにおいて、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-発現ＮＫＬエフェクター-細胞は、ＨＬＡ-Ｅ-ネガティブＬＣＬ７２１.２２１標的細胞を死滅させることが可能であるが、ＨＬＡ-Ｅ-発現ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３細胞に対してはあまり効果的ではない。これに対し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを欠くＹＴＳエフェクター-細胞は、双方の細胞系を効果的に死滅させる。よって、ＮＫＬエフェクター細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介したＨＬＡ-Ｅ-誘発性阻害シグナル伝達のため、ＨＬＡ-Ｅ＋ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３細胞を死滅させることはできない。このような５１Ｃｒ-放出細胞毒性アッセイにおいて、ＮＫＬ細胞が、本発明の抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体のブロッキングを伴い、プレインキュベートされている場合、ＨＬＡ-Ｅ-発現ＬＣＬ７２１.２２１-Ｃｗ３細胞は、抗体-濃度依存性様式で死滅される。
【０１２４】
この発明のレセプター又は抗体組成物の阻害又は増強活性は、例えばその開示が出典明示によりここに援用される、Sivoriら, J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136に記載されたような、細胞内の遊離のカルシウムへの影響等による、任意の多くの他の方法で評価することができる。
【０１２５】
またＮＫ細胞活性は、サイトカイン-放出アッセイを使用して取り組むことが可能であり、ここでＮＫ細胞はレセプターコンストラクト又は抗体と共にインキュベートされて、ＮＫ細胞のサイトカイン生産(例えばＩＦＮ-ｙ及びＴＮＦ-α生成)が刺激される。例示的なプロトコルでは、ＰＢＭＣからのＩＦＮ-ｙ生産は、細胞表面及び細胞質内染色、及び培養４日後のフローサイトメトリーによる分析で評価される。簡単に述べると、培養の最後４時間に、５μｇ／ｍｌの最終濃度でブレフェルジン(Sigma Aldrich)を添加する。ついで、細胞を、透過処理前に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６ｍＡｂ(IntraPrepTM; Beckman Coulter)と共にインキュベートし、ＰＥ-抗ＩＦＮ-ｙ又はＰＥ-ＩｇＧ１(Pharmingen)で染色する。ポリクローナル活性化ＮＫ細胞からのＧＭ-ＣＳＦ及びＩＦＮ-ｙ生産を、ＥＬＩＳＡ(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-: OptElA set, Pharmingen)を使用し、上清において測定する。
【０１２６】
レセプターコンストラクト及び抗体を含むこの発明の化合物は、ＮＫ細胞の細胞毒性のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ媒介性阻害を部分的に低減させる等、部分的阻害活性を示し得る。一実施態様では、抗体調製は、ＮＫ細胞毒性の少なくとも１０％増加、好ましくはＮＫ細胞毒性の少なくとも４０％又は５０％増加、又はＮＫ細胞毒性の少なくとも７０％増加の原因である。最も好ましい化合物は、化合物が存在しない細胞と比較して、例えば細胞毒性アッセイで測定して、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％又は５０％、もしくはそれ以上のＮＫ細胞活性を阻害(又は、活性化レセプターの場合では刺激)可能である。また好ましくは、化合物は、化合物が存在しない枯渇レベルに対して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又はそれ以上まで、標的細胞の枯渇度合いを増加させることができる。また、本発明の化合物は、マッチした又はＨＬＡ適合性又は自己標的細胞集団、すなわち前記抗体の不在下でＮＫ細胞によっては効果的には溶解されない細胞集団の溶解を誘発させることができる。従って、この発明の化合物は、インビボにおけるＮＫ細胞活性を促進させるものと定義できる。
【０１２７】
薬学的組成物
また本発明は、リンパ球、場合によってはＨＬＡ-Ｅ-発現標的細胞を含有する生物学的試料又は患者において、リンパ球の細胞毒性を検出可能に高めるのに効果的な量で、可溶性ヘテロ二量体レセプター又は抗体(その断片及び誘導体を含む)を任意の適切なビヒクルに含有せしめてなる組成物を提供する。組成物は、製薬的に許容可能な担体又は賦形剤をさらに含有する。このような担体及び賦形剤は当該分野でよく知られており、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995に記載されている。
ここで使用される「生物学的試料」には、限定されるものではないが、体液(例えば、血清、リンパ、又は血液)、細胞試料、又は組織試料(例えば骨髄)が含まれる。
この発明のさらなる態様及び利点は、例示と見なされなければならず、この出願の範囲を限定するものではない以下の実験セクションに開示されるであろう。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：ＨＬＡ-ＥとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの相互作用のモデル化
この実施例は、ＨＬＡ-Ｅとの相互作用をカバーするＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａセグメントを同定するインシリコ・モデル化について記載する。ここで言及したタンパク質データベース(PDB; Protein Data Bank)は、H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne: The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp.235-242(2000)に記載されている。ＰＤＢ識別子は、例えば、しばしば１ＮＫＲｐｄｂ＆１ＯＭ３．ｐｄｂと称される１ＮＫＲ＆１ＯＭ３等の、常に４つの英数字である。
【０１２９】
そのリガンドＨＬＡ-Ｅと複合体を形成したＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａのモデルを、インシリコで組み立てた。このため、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体モデルを、ホモロジーモデル(ＰＤＢ−ＩＤ：１Ｂ６Ｅ)として、ＣＤ９４ホモ二量体のＸ線構造を使用して組み立てた。加えて、ＨＬＡ-Ｅの分解結晶構造を使用した(ＰＤＢ-ＩＤ：１ＭＨＥ)。ついで、関連するＮＫＧ２Ｄ-ＭＩＣＡ複合体(ＰＤＢ-ＩＤ：１ＨＹＲ)のＸ線構造を使用し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ及びＨＬＡ-Ｅの複合体をインシリコで組み立てた。完全なモデルを図４に示す。
【０１３０】
モデルは、相互作用残基としてＨＬＡ-Ｅ残基Ｒ６５、Ｄ６９、Ｑ７２、Ｒ７５、Ｒ７９、Ｈ１５５、Ｄ１６２、Ｅ１６６を同定する変異研究と一致した(H. Wadaら, Eur. J. Immunol. 2004. 34, 81-90)。ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｄのアラインメントで、該モデルは、ＣＤ９４：Ｆ１０７(ＣＤ９４)、Ｆ１６５(ＮＫＧ２Ａ)との対形成のための重要な残基を同定する。対応する残基はＮＫＧ２Ｄには保存されていない。
【０１３１】
モデルはまたＮ-末端及びＣ-末端が互いに近接していることも同定した。図４に示したモデルでは、距離は、ＮＫＧ２ＡのＮ-末端とＣＤ９４のＣ-末端のアルファ-炭素間で１３．２Å、ＮＫＧ２ＡのＣ-末端とＣＤ９４のＮ-末端のアルファ-炭素間で１４．７Åであった。比較すると、一つのアミノ酸残基の長さは約３．７５Å、例えばＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)リンカーの長さは約２２．５Åである。
【０１３２】
実施例２−免疫グロブリンにおけるイオン相互作用の原因であるアミノ酸残基の同定
重鎖定常領域の位置番号に対する参照は、ここでは特に、ＣＨ１(Uniprot-id:IGHG1_HUMAN(配列番号２０)に類似)の最初(Ｎ-末端)から出発した野生型定常領域配列の位置を示す。定常軽鎖の位置については、番号付けはUniprot-id:KAC_HUMAN(配列番号１０)による。ヒトＩｇＧ１におけるイオン相互作用の原因となるアミノ酸は、ＧＭ及びＫＭアロタイプ双方のＣＨ３-ＣＨ３ドメイン-ドメイン相互作用に利用可能なＸ線構造、及びＣＨ１-Ｃカッパ及びＣＨ１-Ｃラムダ相互作用に利用可能なＸ線構造の分析を使用し、同定した。
【０１３３】
特に、次のＫＭＸ線構造：１ＨＺＨ、１ＺＡ６、１ＯＱＸ、１ＯＱＯ、１Ｌ６Ｘを分析し；次のＧＭＸ線構造：１Ｔ８９、１Ｔ８３、１ＩＩＸ、１Ｈ３Ｘを分析し；次のＣＨ１-ＣカッパＸ線構造：１ＴＺＧ、１ＨＺＨを分析し；次のＣＨ１-ＣラムダＸ線構造：２ＲＣＳを分析した。
ＧＭ(配列番号８)及びＫＭ(配列番号９)アロタイプの定常ドメインのアラインメントを図５に示す。カッパ(配列番号１０)及びラムダ(配列番号１１)の定常ドメインのアラインメントを図６に示す。
【０１３４】
例えばChemical Computing Group(www.chemcomp.com)から入手可能なＭＯＥ(Molecular Operating Environment)ソフトウエア等、入手可能な分子モデリングパッケージにおける標準的な方法を使用して、分子内イオン相互作用を同定した。この分析により、以下に全てを列挙する、特に６ ＣＨ３-ＣＨ３ ＧＭイオン相互作用、６ ＣＨ３-ＣＨ３  ＫＭイオン相互作用、２ ＣＨ１-Ｃカッパ及び２ ＣＨ１-Ｃラムダ相互作用の同定に至った。
ＣＨ３-ＣＨ３ ＫＭ：Ｄ２３９-Ｋ３２２、Ｅ２４０-Ｋ２５３、Ｄ２８２-Ｋ２９２
ＣＨ３-ＣＨ３ ＧＭ：Ｅ２３９-Ｋ３２２、Ｅ２４０-Ｋ２５３、Ｄ２８２-Ｋ２９２
Ｃカッパ-ＣＨ１：Ｅ１５-Ｋ９６、Ｄ１４-Ｋ１０１
Ｃラムダ-ＣＨ１：Ｅ１６−Ｋ９６、Ｅ１７-Ｋ３０
【０１３５】
実施例３：ヘテロ二量体形成を促進させる第１及び第２軽鎖重鎖対のアミノ酸修飾
上述した相互作用に関連したアミノ酸残基は、ヘテロ二量体相互作用と、よって好ましいヘテロ二量体相互作用(に必要な)エネルギーを増加させるため、異なる特異性を有する異なる抗体から、２つの軽鎖重鎖対の置換を受けた。同じ原則を、重-軽鎖相互作用と、可溶性ヘテロ二量体レセプターに適用することができる。
ＣＨ３−未修飾      ＜−＞    ＣＨ３−未修飾
Ｄ２３９      ＜−＞    Ｋ３２２
Ｅ２４０      ＜−＞    Ｋ２５３
Ｋ２９２      ＜−＞    Ｄ２８２
Ｋ３２２      ＜−＞    Ｄ２３９
Ｋ２５３      ＜−＞    Ｅ２４０
Ｄ２８２      ＜−＞    Ｋ２９２
【０１３６】
Ａ鎖におけるＫ３２２Ｄ、Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＢ鎖におけるＤ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、Ｋ２９２Ｄの修飾の示唆は、以下のような適合対のみとのＣＨ３-修飾-Ａ＜−＞ＣＨ３-修飾-Ｂに至る。
Ｄ２３９＜−＞ Ｋ３２２
Ｅ２４０ ＜−＞ Ｋ２５３
Ｋ２９２ ＜−＞ Ｄ２８２
Ｄ３２２ ＜−＞ Ｋ２３９
Ｅ２５３ ＜−＞ Ｋ２４０
Ｋ２８２ ＜−＞ Ｄ２９２
【０１３７】
ＣＨ３-修飾-Ａ＜−＞ＣＨ３-修飾-Ａ相互作用は：
Ｄ２３９ ＜−＞ Ｄ３２２
Ｅ２４０ ＜−＞ Ｅ２５３
Ｋ２９２ ＜−＞ Ｋ２８２
Ｄ３２２ ＜−＞ Ｄ２３９
Ｅ２５３ ＜−＞ Ｅ２４０
Ｋ２８２ ＜−＞ Ｋ２９２
であり、電荷斥力対のみを有する。
類似のアプローチを、ＧＭ、及び重軽鎖相互作用に適用することができる。
【０１３８】
免疫グロブリンの高ホモロジーに基づくと、構造ホモロジーを予測することができ、上述した相互作用は、他のヒトアイソタイプ(ＩｇＧ２-４)及びマウス及びラットＩｇＧｓに対する対応物を有する。対応する残基を同定するために、アラインメントが実施され、図７に示される。
重鎖の保存に関し、以下の結論を出すことができる：
・Ｄ２３９又はＥ２３９は、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・Ｋ３２２は、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・Ｅ２４０は、ヒト、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ａに保存されている。
・Ｋ２５３は、ヒト、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａに保存されている。
・Ｄ２８２は、マウスＩｇＧ１を除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・Ｋ３２２は、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・Ｋ９６は、ヒトＩｇＧ３を除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・Ｋ１０１又はＲ１０１は、マウスＩｇＧ２ｂを除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
・Ｋ３０は、ヒトＩｇＧ３を除く、全てのサブタイプ及び種に保存されている。
軽鎖の保存に関し、以下の結論を出すことができる：
・Ｅ１５は、ヒト及びマウスに保存されている(ラットは調査せず)。
・Ｄ１４Ｈ保存されない。
・Ｅ１６は、ヒト及びマウスに保存されている(ラットは調査せず)。
・Ｅ１７は、ヒト及びマウスに保存されている(ラットは調査せず)。
【０１３９】
実施例３：可溶性ヒトＣＤ９４(ｈＣＤ９４)及びヒトＮＫＧ２Ａ(ｈＮＫＧ２Ａ)のクローニング
ヒトＣＤ９４(ｈＣＤ９４)及びヒトＮＫＧ２Ａ(ｈＮＫＧ２Ａ)を、Spring Bioscience(#PHD-138)から購入したヒトＮＫ ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。受託番号Ｕ３０６１０(ｈＣＤ９４)及びＡＦ４６１８１２(ｈＮＫＧ２Ａ)を用いてＮＣＢＩデータベースからの配列を使用し、プライマーを設計した。ｈＣＤ９４用に使用されたプライマーは：
５’ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＣＴＧＡＧＴＡＴＴＧＡＧＣＣＡＧＣ(順方向；配列番号４０)
５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＡＴＡＴＡＡＣＧ(逆方向、配列番号４１)
であった。
ｈＮＫＧ２Ａ用に使用されたプライマーは：
５’ＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧ(順方向、配列番号４２)
５’ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧ(逆方向、配列番号４３)
であった。
順方向プライマーはＢａｍＨＩ制限部位を含み、逆方向プライマーはＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位を含んでいた。産物はタッチ-ダウンＰＣＲ法を使用して増幅した。
可溶性ｈＣＤ９４により、ｐＣＲ４ブラント-Ｔｏｐｏにクローニングされた４３８ｂｐ断片が得られ、配列が確認された。可溶性ｈＮＫＧ２Ａ(４０５ｂｐ)はｐＣＲ２．１-ＴＯＰＯにクローニングされ、正確なクローンが配列決定により同定された。
【０１４０】
実施例４：哺乳動物細胞に対するｍＦｃ-ｈＮＫＧ２Ａ又はｍＦｃ-ｈＣＤ９４発現コンストラクト
マウスＦｃ(ｍＦｃ)をＩＭＡＧＥクローン＃２６５１２１７からクローンした。使用したプライマーは、
５’ＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＧ(順方向、配列番号４４)
５’ＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣ(逆方向、配列番号４５)
であった。
【０１４１】
順方向プライマーはＮｈｅＩ制限部位と、続くＣＤ３３シグナルペプチド及びｍｅｔ及びａｓｐ残基を含む。逆方向プライマーはＢａｍＨＩ制限部位を含む。ＰＣＲは、３００ｎｇの鋳型、２００μＭのｄＮＴＰミックス、Ｅａｓｙ-Ａ 高品位ＰＣＲクローニング酵素、Stratagene #600400からのバッファーを使用し、５０μｌの反応で実施した。９４Ｃ／２分での単一の変性工程に、９４℃／３０秒；６８℃／３０秒；７２℃／９０秒、最後に７２℃／１０分の１５サイクルが続いた。ＰＣＲ産物を、ＥｔＢｒを含む１％アガロースで分離させ、Amersham Biosciences #27-9602-01からのＧＦＸキットを用いて精製し、ｐＣＲ４-ＴＯＰＯ(Invitrogen)にクローニングし、配列決定した。
制限部位ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩを使用して、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐｃＤＮＡ３．１／ヒドロ(Invitrogen)中にｍＦｃを挿入した。ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ(ｐＢＦ５)を使用し、ｈＣＤ９４をｍＦｃを有するｐｃＤＮＡ３．１中に挿入し、同じ方法(ｐＢＦ６)で、ｈＮＫＧ２ＡをｐｃＤＮＡ３．１／ヒドロに挿入した。図９及び１０を参照。
【０１４２】
ｐＢＦ６は、次のものをコードする(配列番号３１)：
１       ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＭＤＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴ
５１     ＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳ
１０１   ＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰ
１５１   ＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧ
２０１   ＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫＧＳＱＲＨ
２５１   ＮＮＳＳＬＮＴＲＴＱＫＡＲＨＣＧＨＣＰＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫＮ
３０１   ＳＳＬＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦＬＳＩＩＳＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷＶＴＭＮＧＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳ
３５１   ＤＮＡＥＬＮＣＡＶＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣＫＨＫＬ
【０１４３】
ｐＢＦ５は、次のものをコード化する(配列番号３２)：
１       ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＭＤＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴ
５１     ＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳ
１０１   ＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰ
１５１   ＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧ
２０１   ＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫＧＳＳＦＴ
２５１   ＫＬＳＩＥＰＡＦＴＰＧＰＮＩＥＬＱＫＤＳＤＣＣＳＣＱＥＫＷＶＧＹＲＣＮＣＹＦＩＳＳＥＱＫＴＷＮＥＳＲ
３０１   ＨＬＣＡＳＱＫＳＳＬＬＱＬＱＮＴＤＥＬＤＦＭＳＳＳＱＱＦＹＷＩＧＬＳＹＳＥＥＨＴＡＷＬＷＥＮＧＳＡＬ
３５１   ＳＱＹＬＦＰＳＦＥＴＦＮＴＫＮＣＩＡＹＮＰＮＧＮＡＬＤＥＳＣＥＤＫＮＲＹＩＣＫＱＱＬＩ
【０１４４】
実施例５：哺乳動物細胞発現のための変異Ｆｃ-部分コンストラクト
ｍＰｃ部における突然変異を、実施例３のコンストラクトに対するクイックチェンジ突然変異誘発を使用して達成した。配列番号１４中のＴ２４９Ｙ、Ｙ２９０Ｔ[GCAA_MOUSE;ＩｇＧ２Ａ］）に対応する単一変異(配列番号２１中のＴ２４３Ｙ、Ｙ２８４Ｔ[IGHG1_MOUSE；ＩｇＧ１]を、Stratagene #200523からのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット及びマニュアルと次の２つのプライマーセットを使用して実施した：
５’ＧＧＣＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＣ(配列番号４６)
５’ＧＡＡＧＴＣＴＧＴＴＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＴＴＧＧＣＣ(配列番号４７)、及び
５’ＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧ(配列番号４８)
５’ＣＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＡＧＴＡＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧ(配列番号４９)。
９５℃／３０秒での単一の変性工程に、９５℃／３０秒；５５℃／１分；６８℃／７分、最後に７２℃／１０分の１５サイクルが続いた。
【０１４５】
二重変異(一方のＦｃ-ペプチドにおいてはＥ２３９Ｋ及びＫ２９２Ｄ、他方のＦｃ-ペプチドにおいてはＤ２８２Ｋ及びＫ３３２Ｅ)を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅマルチ部位特異的突然変異誘発キット及びマニュアル(stratagene)#200513及び次のプライマーセットを使用して実施した：
Ｅ２３９Ｋ：ＣＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧ(配列番号５０)
Ｋ２９２Ｄ：ＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣ(配列番号５１)、及び
Ｄ２８２Ｋ：ＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＧ(配列番号５２)
Ｋ３２２Ｅ：ＣＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧ(配列番号５３)
９５℃／１分での単一の変性工程に、９５℃／１分；５５℃／１分；６５℃／１３．５分の３０サイクルが続いた。
【０１４６】
実施例６：哺乳動物細胞中での発現のための単鎖ＮＫＧ２Ａ-ＣＤ９４
ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４を、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位(ｐＢＦ１７)においてｍＦｃを有するｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏにクローニングした。図１１を参照。
ｐＢＦ１７は次のものをコードする(配列番号３９)：
１       ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＭＤＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴ
５１     ＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳ
１０１   ＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰ
１５１   ＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧ
２０１   ＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫＧＳＱＲＨ
２５１   ＮＮＳＳＬＮＴＲＴＱＫＡＲＨＣＧＨＣＰＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫＮ
３０１   ＳＳＬＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦＬＳＩＩＳＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷＶＴＭＮＧＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳ
３５１   ＤＮＡＥＬＮＣＡＶＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣＫＨＫＬＧＧＳＧＧＳＲＳＳＦＴＫＬＳＩＥＰＡ
４０１   ＦＴＰＧＰＮＩＥＬＱＫＤＳＤＣＣＳＣＱＥＫＷＶＧＹＲＣＮＣＹＦＩＳＳＥＱＫＴＷＮＥＳＲＨＬＣＡＳＱＫ
４５１   ＳＳＬＬＱＬＱＮＴＤＥＬＤＦＭＳＳＳＱＱＦＹＷＩＧＬＳＹＳＥＥＨＴＡＷＬＷＥＮＧＳＡＬＳＱＹＬＦＰＳ
５０１   ＦＥＴＦＮＴＫＮＣＩＡＹＮＰＮＧＮＡＬＤＥＳＣＥＤＫＮＲＹＩＣＫＱＱＬＩ
【０１４７】
実施例７：哺乳動物細胞中での発現
実施例２−５の全てのコンストラクトを、形質移入のためにInvitrogenからの２９３フェクチン＃１２３４７-０１９を使用し、ＨＥＫ２９３細胞中で一過性に発現させた。１２５ｍｌの三角フラスコに５×１０５細胞／ｍｌを播種した。次の日、細胞を次のようにして形質移入した：３０μｇのＤＮＡを１ｍｌのＯｐｔｉ-Ｍｅｍで希釈し、４０μｌの２９３フェクチンを９６０μｌのＯｐｔｉ-Ｍｅｍで希釈した。室温(ＲＴ)で５分後、細胞培養物に添加する前に、２つの混合物を混合し、室温で２５分インキュベートした。４−６日後、１５００×ｇで１５分遠心分離することにより、培地を収集した。ウエスタンブロット分析により結果を視覚化し、ここで、全てのブロットはヤギ抗マウスＩｇＧを用いて探索した。
ウエスタンブロット分析の例示的な結果を図１２Ａ−１２Ｃに示す。全てのブロットはヤギ抗マウスＩｇＧを用いて探索した。ｍＦｃ-ＣＤ９４及びｍＦｃ-ＮＫＧ２Ａは、ＨＥＫ２９３中で個々に発現させた。ｍＦｃ-ＮＫＧ２ＡはｍＦｃ-ＣＤ９４の不在下では発現しなかった。ｍＦｃ-単鎖-ＮＫＧ２Ａ-ＣＤ９４はＨＥＫ２９３中で発現させた。
【０１４８】
実施例８：哺乳動物細胞株中で生産されたＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃヘテロ二量体の精製
ＣＤ９４-ｍＦｃ及びＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ融合タンパク質の７つの異なる変異体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。融合タンパク質は、ＣＤ９４-ｍＦｃホモ二量体、ＣＤ９４-２ｘＧＧＳ-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ、ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ、ＣＤ９４-ｍＦｃ(Ｔ２４９Ｙ)ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ(Ｙ２９０Ｔ)、ＣＤ９４-ｍＦｃ ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ、ＣＤ９４-ｍＦｃ(Ｅ２３９Ｋ、Ｋ２９２Ｄ)ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ(Ｄ２８２Ｋ、Ｋ３３２Ｅ)であった。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-マウスＦｃ融合タンパク質は、無血清培地を使用して生産した。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-マウスＦｃ融合タンパク質は、ＣＨＯ-ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞から発現させた。
【０１４９】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ-マウスＦｃ融合タンパク質の精製を以下のようにして実施した。細胞培養上清を滅菌濾過し、AKTA explorer FPLCシステム(GE-Healthcare, Hillerod, Denmark)を使用し、ＸＫ１６カラム(GE-Healthcare, Hillerod, Denmark)に充填された１０ｍｌのプロテインＡセファロースカラム(Sigma, St. Louis, Mo)に適用した。プロテインＡカラムを、６ｍｌ／分、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で平衡にした。試料適用後、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度が低下するまで、カラムを洗浄した。結合したタンパク質を０〜１００％の５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．７の段階的勾配を使用して溶出させ、２ｍｌのフラクションを収集した。関心あるタンパク質を含むフラクションをプールし、中性のｐＨまで滴定した。いくつかの場合には、プールしたタンパク質をVivaspin 20, 30.000 MWCO(Sartorius, Roskilde, Denmark)を使用して濃縮し、バッファーをＰＢＳバッファーに交換した。タンパク質濃度を(１．５ｇ／ｌ)-１×ｃｍ−１の伸長係数でＯＤ２８０により測定した。
【０１５０】
精製タンパク質を、ＭＯＰＳバッファーで操作される４−１２％のＮｕＰａｇｅゲル(InVitrogen, Carlsbad, CA)での１-Ｄ ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。１-ＤゲルをＧｅｌｃｏｄｅクーマシー染色(Pierce, Rockford, IL)を使用して染色するか、又はＰＶＤＦ膜(InVitrogen, Carlsbad, CA)上にブロットした。
抗体Ｚ１９９(抗ＮＫＧ２Ａ、Beckman Coulter, Fullerton, CA)及びＨＰ-３Ｄ９(抗ＣＤ５９、Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)を、Ｃｙ-染料タンパク質ラベリングキット(GE-Healthcare, Hillerod, Denmark)を使用し、Ｃｙ３及びＣｙ５でラベリングすることにより、ウエスタンブロット用に調製した。ブロット後、膜を５％ｂｌｏｔｔｏ(Pierce, Rockford, IL)でブロックし、洗浄バッファー中で１：２００に希釈した双方の抗体と共にインキュベートした。洗浄後、２つの異なるフルオロフォア用のセッティングを使用し、Ettan Dige Imager又はTyphoon Trio＋スキャナー(GE-Healthcare, Hillerod, Denmark)のいずれかで、ブロットをスキャンした。
【０１５１】
結果
ＨＥＫ２９３細胞からの３３０−３５０ｍｌの無血清培養上清から精製したタンパク質は、０．０８〜１．１７ｍｇのタンパク質を生じた。表３を参照。最も多量のタンパク質は、マウス免疫グロブリン定常領域中に単一の変異を有する２つのプラスミドを発現する細胞から精製した。１-Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥにより精製されたタンパク質を分析すると、精製により、明らかな汚染物が存在しない非常に純粋なタンパク質が生じていることが示された。主要なバンドはタンパク質の二量体形成に対応するが、より高分子量の種は四量体形成に対応する。
2009541274.tif 000004
【０１５２】
精製されたタンパク質がＣＤ９４及びＮＫＧ２Ａの双方の組合せであることを確認するために、ウエスタンブロットを作製し、ここで２つの抗体Ｚ１９９及びＨＰ−３Ｄ９(それぞれＮＫＧ２Ａ及びＣＤ９４に対するもの)を使用した。抗体を蛍光染料で標識し、単一ブロットにおいて双方の抗体を使用できるようにした(図１３Ａ及びＢ)。ブロットの２つの異なる検出から、ＣＤ９４-ｍＦｃだけを発現する細胞株がこのタンパク質だけを生産したことが明らかになった。ＮＫＧ２Ａホモ二量体が存在すべき箇所でタンパク質を観察することはできず、このタンパク質はホモ二量体を生成しないことが示された。全ての他のレーンでは、ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ａ双方の存在に対応するバンドを観察することができ、真のヘテロ二量体が生成されたことが示された。
【０１５３】
単鎖ＣＤ９４-２ｘＧＧＳ-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃコンストラクトを発現する安定なＣＨＯ細胞株(ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１１)を使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ分析用のタンパク質を生産した。２１５ｍｌの細胞培養上清をプロテインＡカラムで精製し、バッファーをＰＢＳに交換した。得られたタンパク質を、蛍光染料で標識した２つの抗体Ｚ１９９及びＨＰ-３Ｄ９を使用してウエスタンブロット及び１-Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した(図１４Ａ及びＢ)。１-Ｄゲル並びにウエスタンブロットの双方は、単鎖タンパク質が二量体として現れ、抗ＣＤ９４及び抗ＮＫＧ２Ａ抗体の双方に対して応答を与えることを示した。
【０１５４】
実施例９：大腸菌中での発現のためのＮＫＧ２Ａプラスミドコンストラクト
ＮＫＧ２を、Ｔｒｘ-ｈｅｘａＨｉｓ ｐＥＴ３２ａ中のＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩＩ ｉ ＢａｍＨＩ＋脱リン酸化(仔ウシ腸ホスファターゼを使用)にサブクローニングして、次の配列(配列番号５４)(図１５)をコードするｐＩＳＮＮ４１５を生産した。
ＭＳＤＫＩＩＨＬＴＤＤＳＦＤＴＤＶＬＫＡＤＧＡＩＬＶＤＦＷＡＥＷＣＧＰＣＫＭＩＡＰＩＬＤＥＩＡＤＥＹＱＧＫＬＴＶＡＫＬＮ          ６０
ＩＤＱＮＰＧＴＡＰＫＹＧＩＲＧＩＰＴＬＬＬＦＫＮＧＥＶＡＡＴＫＶＧＡＬＳＫＧＱＬＫＥＦＬＤＡＮＬＡＧＳＧＳＧＨＭＨＨＨＨ          １２０
ＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤＤＤＫＡＭＡＤＩＧＳＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＲＴＱＫＡ          １８０
ＲＨＣＧＨＣＰＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫＮＳＳＬＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦＬＳＩＩＳＰＳＳ          ２４０
ＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷＶＴＭＮＧＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮＡＥＬＮＣＡＶＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣＫＨＫＬ          ３００
＊＊                                              ３０２
【０１５５】
実施例１０：大腸菌中でのＮＫＧ２Ａ細胞外ドメインの発現
ヒトＮＫＧ２Ａ(配列番号１の残基９９−２３３)細胞外ドメインを大腸菌中で発現させた。ＮＫＧ２Ａをチオレドキシン(Ｔｒｘ)及びｈｅｘａＨｉｓタグにＮ-末端で融合させた。予想された分子量は３３ｋＤａであった。Ｔｒｘ及びｈｅｘａＨｉｓは、エンテロキナーゼを使用しタンパク分解的に除去することができる。Ｔｒｘ-ＮＫＧ２Ａが、５００ｍＬの研究室規模の培養にて、約１０ｍｇ／Ｌで発現された(図１６)。
【０１５６】
実施例１１：大腸菌中での発現のためのＣＤ９４プラスミドコンストラクト
ＣＤ９４を、ＢａｍＨＩ中のＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩＩ＋脱リン酸化(子ウシの腸のホスファターゼを使用)ヘキサＨｉｓ-ＧＳＴ ＸＰＮＮＢ ｐＥＴ１５ｂにサブクローニングし、次の配列(配列番号５５)(図１７)をコード化したｐＩＳＮＮ４２７を生成させた。
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＬＥＳＰＩＬＧＹＷＫＩＫＧＬＶＱＰＴＲＬＬＬＥＹＬＥＥＫＹＥＥＨＬＹＥＲＤＥＧ          ６０
ＤＫＷＲＮＫＫＦＥＬＧＬＥＦＰＮＬＰＹＹＩＤＧＤＶＫＬＴＱＳＭＡＩＩＲＹＩＡＤＫＨＮＭＬＧＧＣＰＫＥＲＡＥＩＳＭＬＥＧＡ          １２０
ＶＬＤＩＲＹＧＶＳＲＩＡＹＳＫＤＦＥＴＬＫＶＤＦＬＳＫＬＰＥＭＬＫＭＦＥＤＲＬＣＨＫＴＹＬＮＧＤＨＶＴＨＰＤＦＭＬＹＤＡ          １８０
ＬＤＶＶＬＹＭＤＰＭＣＬＤＡＦＰＫＬＶＣＦＫＫＲＩＥＡＩＰＱＩＤＫＹＬＫＳＳＫＹＩＡＷＰＬＱＧＷＱＡＴＦＧＧＧＤＨＰＰＫ          ２４０
ＳＤＬＶＰＲＧＳＳＦＴＫＬＳＩＥＰＡＦＴＰＧＰＮＩＥＬＱＫＤＳＤＣＣＳＣＱＥＫＷＶＧＹＲＣＮＣＹＦＩＳＳＥＱＫＴＷＮＥＳ          ３００
ＲＨＬＣＡＳＱＫＳＳＬＬＱＬＱＮＴＤＥＬＤＦＭＳＳＳＱＱＦＹＷＩＧＬＳＹＳＥＥＨＴＡＷＬＷＥＮＧＳＡＬＳＱＹＬＦＰＳＦＥ          ３６０
ＴＦＮＴＫＮＣＩＡＹＮＰＮＧＮＡＬＤＥＳＣＥＤＫＮＲＹＩＣＫＱＱＬＩ＊＊  ３９６
【０１５７】
実施例１２：大腸菌におけるＣＤ９４細胞外ドメインの発現
ヒトＣＤ９４(配列番号２の残基３４-１７９)細胞外ドメインを、大腸菌で発現させた。ＣＤ９４をヘキサＨｉｓ及びグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)に、Ｎ-末端で融合させた。予期される分子量は４６ｋＤａであった。ヘキサＨｉｓ-ＧＳＴは、トロンビンでの切断により除去することができる。ＧＳＴ-ＣＤ９４の発現レベルは、５００ｍＬの研究室規模の培養にて、約５０ｍｇ／Ｌであった。発現を３０℃で得た。融合タンパク質を不溶性形態で発現させた。この特定の実験では、種々の溶菌方法がスクリーニングされた(ＴＥＮ(ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ)を使用する凍結-解糖(ｆｚ)サイクル、又はBugBuster(Novagen)もしくはPopCulture(Novagen)を使用する洗浄ベースの溶菌)(図１８)。
【０１５８】
実施例１３：単鎖ＮＫＧ２Ａ-ＣＤ９４又はＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａ発現コンストラクトのクローニング：２つの方法
使用したプライマーは以下の通りである：
２ｘＧＧＳ−アップ：ＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡ(配列番号５６)
２ｘＧＧＳ−ダウン：ＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡ(配列番号５７)
２ｘＧＧＳ−挿入ダウン：ＧＴＴＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＣ(配列番号５８)
ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４。第１に、ＮＫＧ２Ａの３'末端をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ-ＳＫ(−)に整列させた。親水性リンカーの添加、及び最初のクローンの停止コドンの除去と同時に、アニール化されたオリゴ('２ｘＧＧＳ−アップ'及び'２ｘＧＧＳ−ダウン')を、ＮＫＧ２Ａ-ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ-ＳＫ(−)(ｐＩＳＮＮ４２５)において、ＨｉｎｄＩＩＩ-ＢｇｌＩＩにサブクローニングさせた(図１９Ａ)。第２に、ＣＤ９４を、ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳリンカーｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ-ＳＫ(−)制限ＢｇｌＩＩ-ＮｏｔＩ中のＢａｍＨＩ-ＮｏｔＩに挿入した(図１９Ｂ)。正確なクローンを制限消化により同定し、Ｔ７ ｏｇ Ｔ３プライマーを使用して配列決定した。
ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４(ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４-ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ-ＳＫ(−)))を、ＢａｍＨＩ制限及び脱リン酸化(子ウシの腸のホスファターゼを使用)-へキサＨｉｓ-ＧＳＴ ＸＰＮＮＢ ｐＥＴ１５ｂ中のＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩＩ、又はＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩＩ ｉ ＢａｍＨＩ＋脱リン酸化Ｔｒｘ-ヘキサＨｉｓ ｐＥＴ３２ａにサブクローニングさせた(図２０)。
【０１５９】
ＣＤ９４-２ｘＧＧＳ-ＮＫＧ２Ａ。他のアプローチにおいて、ＣＤ９４を、ＢａｍＨＩ制限及び脱リン酸化されたＮＫＧ２Ａ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ-ＳＫ(−)(ｐＩＳＮＮ４２５)中のＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩＩに挿入した。停止コドンの除去と親水性リンカーの添加と同時に、リンカー(２ｘＧＧＳ挿入ダウン)を、部位特異的突然変異誘発により挿入した。プライマーは５-リン酸化されており、「Ｑｕｉｃｋ-ｃｈａｎｇｅマルチ部位特異的突然変異誘発キット」(Stratageneから購入)を使用する。配列検証のために、Ｔ７及びＴ３プライマーを使用する。ＣＤ９４-２ｘＧＧＳ-ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体を、ＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩＩ ｉ ＢａｍＨＩ＋脱リン酸化ヘキサＨｉｓＧＳＴ ＸＰＮＮＢ ｐＥＴ１５ｂ又はＢａｍＨＩ-ＢｇｌＩＩ ｉ ＢａｍＨＩ＋脱リン酸化Ｔｒｘ-ヘキサＨｉｓ ｐＥＴ３２ａにサブクローニングする。図２１及び２２を参照。
コンストラクトはＢＬ２１(ＤＥ３)で発現する。
【０１６０】
ヘキサＨｉｓ-ＧＳＴ ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４についてのアミノ酸配列は(配列番号３７)である：
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＬＥＳＰＩＬＧＹＷＫＩＫＧＬＶＱＰＴＲＬＬＬＥＹＬＥＥＫＹＥＥＨＬＹＥＲＤＥＧ          ６０
ＤＫＷＲＮＫＫＦＥＬＧＬＥＦＰＮＬＰＹＹＩＤＧＤＶＫＬＴＱＳＭＡＩＩＲＹＩＡＤＫＨＮＭＬＧＧＣＰＫＥＲＡＥＩＳＭＬＥＧＡ          １２０
ＶＬＤＩＲＹＧＶＳＲＩＡＹＳＫＤＦＥＴＬＫＶＤＦＬＳＫＬＰＥＭＬＫＭＦＥＤＲＬＣＨＫＴＹＬＮＧＤＨＶＴＨＰＤＦＭＬＹＤＡ          １８０
ＬＤＶＶＬＹＭＤＰＭＣＬＤＡＦＰＫＬＶＣＦＫＫＲＩＥＡＩＰＱＩＤＫＹＬＫＳＳＫＹＩＡＷＰＬＱＧＷＱＡＴＦＧＧＧＤＨＰＰＫ          ２４０
ＳＤＬＶＰＲＧＳＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＲＴＱＫＡＲＨＣＧＨＣＰＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫ          ３００
ＮＳＳＬＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦＬＳＩＩＳＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷＶＴＭＮＧＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮＡＥＬＮＣＡＶ          ３６０
ＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣＫＨＫＬＧＧＳＧＧＳＲＳＳＦＴＫＬＳＩＥＰＡＦＴＰＧＰＮＩＥＬＱＫＤＳＤＣＣＳＣＱ          ４２０
ＥＫＷＶＧＹＲＣＮＣＹＦＩＳＳＥＱＫＴＷＮＥＳＲＨＬＣＡＳＱＫＳＳＬＬＱＬＱＮＴＤＥＬＤＦＭＳＳＳＱＱＦＹＷＩＧＬＳＹＳ          ４８０
ＥＥＨＴＡＷＬＷＥＮＧＳＡＬＳＱＹＬＦＰＳＦＥＴＦＮＴＫＮＣＩＡＹＮＰＮＧＮＡＬＤＥＳＣＥＤＫＮＲＹＩＣＫＱＱＬＩ＊＊              ５３９
【０１６１】
Ｔｒｘ-ヘキサＨｉｓ-ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４についてのアミノ酸配列は(配列番号３８)である：
ＭＳＤＫＩＩＨＬＴＤＤＳＦＤＴＤＶＬＫＡＤＧＡＩＬＶＤＦＷＡＥＷＣＧＰＣＫＭＩＡＰＩＬＤＥＩＡＤＥＹＱＧＫＬＴＶＡＫＬＮ          ６０
ＩＤＱＮＰＧＴＡＰＫＹＧＩＲＧＩＰＴＬＬＬＦＫＮＧＥＶＡＡＴＫＶＧＡＬＳＫＧＱＬＫＥＦＬＤＡＮＬＡＧＳＧＳＧＨＭＨＨＨＨ          １２０
ＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳＰＤＬＧＴＤＤＤＤＫＡＭＡＤＩＧＳＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＲＴＱＫＡ          １８０
ＲＨＣＧＨＣＰＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫＮＳＳＬＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦＬＳＩＩＳＰＳＳ          ２４０
ＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷＶＴＭＮＧＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮＡＥＬＮＣＡＶＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣＫＨＫＬ          ３００
ＧＧＳＧＧＳＲＳＳＦＴＫＬＳＩＥＰＡＦＴＰＧＰＮＩＥＬＱＫＤＳＤＣＣＳＣＱＥＫＷＶＧＹＲＣＮＣＹＦＩＳＳＥＱＫＴＷＮＥＳ          ３６０
ＲＨＬＣＡＳＱＫＳＳＬＬＱＬＱＮＴＤＥＬＤＦＭＳＳＳＱＱＦＹＷＩＧＬＳＹＳＥＥＨＴＡＷＬＷＥＮＧＳＡＬＳＱＹＬＦＰＳＦＥ          ４２０
ＴＦＮＴＫＮＣＩＡＹＮＰＮＧＮＡＬＤＥＳＣＥＤＫＮＲＹＩＣＫＱＱＬＩ＊＊    ４５６
【０１６２】
実施例１４：大腸菌におけるＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４の発現
ｇｌｙ-ｇｌｙ-ｓｅｒ-ｇｌｙ-ｇｌｙ-ｓｅｒリンカーにより離間したヒトＮＫＧ２Ａ(配列番号１の残基９９-２３３)及びヒトＣＤ９４(配列番号２の残基３４-１７９)細胞外パートが、大腸菌株ＢＬ２１(ＤＥ３)における単鎖融合体として発現された。それらのＮ-末端で、それぞれチオレドキシン(Ｔｒｘ)及びヘキサＨｉｓタグ、又はヘキサＨｉｓ及びグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)を担持する、２つの異なるＮＫＧ２Ａ-ＣＤ９４融合コンストラクトが発現された。Ｔｒｘ-ヘキサＨｉｓ-ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４が、５００ｍＬの研究室規模の培養にて、約１００ｍｇ／Ｌ発現した。ヘキサＨｉｓ-ＧＳＴ-ＮＫＧ２Ａ-２ｘＧＧＳ-ＣＤ９４の発現レベルは、５００ｍＬの研究室規模の培養にて、約７０ｍｇ／Ｌであった。Ｔｒｘ-ヘキサＨｉｓはエンテロキナーゼを使用し、タンパク質分解的に除去されてよい。ヘキサＨｉｓ-ＧＳＴは、トロンビンで切断することにより除去することができる。発現は３７℃で得られた。融合タンパク質は不溶性のペレットフラクション(ｐ)において高度に発現した(図２３)。
【０１６３】
実施例１５：大腸菌におけるＴＲＸ-Ｈｉｓ-タグ-ＮＫＧ２Ａ-ＧＧＳＧＧＳ-ＣＤ９４単鎖コンストラクトの発現
２５０ｍｌの発酵体から単離された細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡで１度洗浄した。得られたペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｗ／ｖ％のスクロース、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのベンズアミジンに再懸濁させ、フレンチプレスで溶解させた。不溶性の封入体を遠心分離により収集し、洗浄し、６Ｍのグアジニウムヒドロクロリド、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、４０ｍＭのＤＴＴに溶解させた。
溶解したタンパク質を、２０ｍｌのリフォールディングバッファー、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２、７５０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｇ／ＬのＰＥＧ３３５０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、４ｍＭのシステイン、１．５ｍＭのＤＴＴで希釈した。リフォールディング混合物を一晩５℃で放置した。
リフォールディングタンパク質を１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８で５回希釈し、５ｍｌのＱセファロース高速流カラムに適用することにより精製した。２Ｃｖ  １０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した後、タンパク質を１０ＣＶ以上、１０ｍＭまでのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２ＭのＮａＣｌによる直線状勾配により溶出させた。
【０１６４】
実施例１６：ＴＲＸ-Ｈｉｓ-タグ-ＮＫＧ２Ａ-ＧＧＳＧＧＳ-ＣＤ９４
１Ｌの発酵体から単離された細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡで１度洗浄した。得られたペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｗ／ｖ％のスクロース、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのベンズアミジンに再懸濁させ、フレンチプレスで溶解させた。不溶性の封入体を遠心分離により収集し、洗浄し、６Ｍのグアジニウムヒドロクロリド、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、４０ｍＭのＤＴＴに溶解させた。
溶解したタンパク質を、１００ｍｌのリフォールディングバッファー、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２、７５０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのＮａＣｌ、０，５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｇ／ＬのＰＥＧ３３５０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、４ｍＭのシステイン、１．５ｍＭのＤＴＴで希釈した。リフォールディング混合物を一晩５℃で放置した。
リフォールディングタンパク質を１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８で５回希釈し、５ｍｌのＱセファロース高速流カラムに適用することにより精製した。２Ｃｖ  １０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した後、タンパク質を１０ＣＶ以上、１０ｍＭまでのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２ＭのＮａＣｌによる直線状勾配により溶出させた。
【０１６５】
実施例１７：ＨｉＳ-タグ-ＧＳＴ-ＮＫＧ２Ａ-ＧＧＳＧＧＳ-ＣＤ９４
１Ｌの発酵体から単離された細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡで１度洗浄した。得られたペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｗ／ｖ％のスクロース、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのベンズアミジンに再懸濁させ、フレンチプレスで溶解させた。不溶性の封入体を遠心分離により収集し、洗浄し、６Ｍのグアジニウムヒドロクロリド、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、４０ｍＭのＤＴＴに溶解させた。
溶解したタンパク質を、２０ｍｌのリフォールディングバッファー、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２、７５０ｍＭのアルギニン、１０ｍＭのＮａＣｌ、０，５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｇ／ＬのＰＥＧ３３５０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、４ｍＭのシステイン、１．５ｍＭのＤＴＴで希釈した。リフォールディング混合物を一晩５℃で放置した。
リフォールディングタンパク質を１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８で５回希釈し、５ｍｌのＱセファロース高速流カラムに適用することにより精製した。２Ｃｖ  １０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した後、タンパク質を１０ＣＶ以上、１０ｍＭまでのＴｒｉｓ、ｐＨ８、２ＭのＮａＣｌによる直線状勾配により溶出させた。
【０１６６】
実施例１８：表面プラズモン共鳴分析による組換えＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａコンストラクトの特徴付け
次のコンストラクトを固定化抗体、ＨＰ-３Ｄ９、Ｚ１９９、及びウサギ-抗マウス(ＲａＭ)に対する結合性、続いてＨＬＡ-Ｅ四量体の結合性について分析した。
ＣＤ９４-ｍＦｃ  ホモ二量体
ＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ  単鎖
ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ  ホモ二量体
ＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａ  単一変異を有するヘテロ二量体
ＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａ  ヘテロ二量体
ＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａ  二重変異を有するヘテロ二量体
【０１６７】
物質
表面プラズモン共鳴研究を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)において実施した。リガンドの固定化を、製造者により記載された標準的なアミンカップリングキット(Biacore AB)を使用し、センサーチップ(Biacore AB)において実施した。
ランニングバッファーとして、全ての希釈用に、ＨＢＳ-ＥＰバッファー(１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のポリドルバート２０(ｖ／ｖ))を使用した。センサーチップの再生は、１０ｍＭのグリシン-ＨＣｌ、ｐＨ１．８の短パルス(１５μｌ、流速３０μｌ／分)により実施した。
全ての実験を流速１０μｌ／分、２５℃で実施した。Biaevaluation 4.1ソフトウェアを使用し、データを分析した。
抗ＣＤ９４モノクローナル抗体ＨＰ-３Ｄ９(BD Pharmingen, cat# 555887)、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体Ｚ１９９(Immunotech, France)、及びウサギ-抗マウス(ＲａＭ)ポリクローナル抗体(Biacore AB)を、ＣＭ５センサーチップにおける個々のフローセルに〜５０００ＲＵのレベルまで、アミンカップリングすることにより固定した。
【０１６８】
抗ＣＤ９４及び抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体へのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａコンストラクトの結合、及びＨＬＡ-Ｅ四量体結合における競合
全てのコンストラクトを、ＨＢＳ-ＥＰにおいて１μｇ／ｍｌに希釈した。ＨＬＡ-Ｅ四量体を５μｇ／ｍｌ濃度で試験した。各サイクルは、付与されたコンストラクトの最初の注入と、続いてのＨＬＡ-Ｅ四量体の注入からなる。コンストラクト及びＨＬＡ-Ｅ四量体を３分と、センサーチップ表面の再生前にそれぞれ２．５分の解離相を続けた。
全てのコンストラクトを、４℃及び−２０℃で保存して試験した。
ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃホモ二量体を除く全てのコンストラクトが、固定化されたＨＰ-３Ｄ９に結合することが示された。ＨＰ-３Ｄ９に個々のコンストラクトが結合することは、単一変異コンストラクトを有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体を除き、保存条件に影響されない思われ、オンレイト(on-rate)における見かけの減少が、−２０℃で保存されたコンストラクトについて検出することができた。しかしながら、コンストラクトは固定化されたＨＰ-３Ｄ９に結合しなかった。
二重変異コンストラクトを有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体の見かけオフ-レイト(off-rate)は、見かけ同一の解離パターンを示す他のコンストラクトと比較して高かった。二重変異を有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体を除く全てのコンストラクトが、２．５分の解離相中、安定した結合性を示した。
【０１６９】
ＨＰ-３Ｄ９と複合した任意の個々のコンストラクトに結合したＨＬＡ-Ｅ四量体は検出されなかった。
固定化されたＺ１９９への結合は、保存条件に関係なく、ＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ単鎖、ＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体、及び二重変異コンストラクトを有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体について観察された。また、４℃で保存された、単一変異コンストラクトを有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体の結合は検出されたが、−２０℃で保存された同様のコンストラクトでは、結合は示されなかった。ＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体及び単鎖変異コンストラクトを有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体の結合は検出されたが、ＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ単鎖、及び二重変異コンストラクトを有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体のものと比較して、固定化されたＺ１９９へのそれらの会合性は、低下していると思われる。
【０１７０】
ＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ単鎖、ＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体、及び単一変異を有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体(４℃で保存)の結合性は、２．５分の解離相中、安定していると思われ、二重変異を有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体の解離はかなり速かった。
Ｚ１９９と複合したコンストラクトへのＨＬＡ-Ｅ四量体の結合は、ＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ単鎖コンストラクトについて検出された。ＨＬＡ-Ｅ四量体の結合性は、２．５分の解離期間中、安定していると思われた。
【０１７１】
ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃホモ二量体を除く全てのコンストラクトは、固定化ＲａＭに結合した。再度、−２０℃で保存された単一変異コンストラクトを有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体の会合性は、４℃で保存された同様のコンストラクトと比較して、低下していると思われる。
ＲａＭと個々のコンストラクトとの複合体へのＨＬＡ-Ｅ四量体の結合は、ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃホモ二量体を除く全てのコンストラクトについて観察された。結合した相対的に多量のＨＬＡ-Ｅ四量体は、ＣＤ９４-ＮＫＧ２Ａ-ｍＦｃ単鎖及び二重変異複合体を有するＣＤ９４-ｍＦｃ／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体について観察された。
【０１７２】
実施例１９：抗ＣＤ９４及び抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体へのＴＲＸ-Ｈｉｓ-タグ-ＮＫＧ２ａ-ＧＳＳ-ＧＳＳ-ＣＤ９４-Ｈｉｓ-タグ／ｐＥＴ３２ａの結合
大腸菌発現したＴＨＸ-Ｈｉｓ-タグ-ＮＫＧ２ａ-ＧＳＳ-ＧＳＳ-ＣＤ９４-Ｈｉｓ-タグ／ｐＥＴ３２ａを、固定化されたＨＰ-３Ｄ９及びＺ１９９モノクローナル抗体への結合性について分析した(実施例１８を参照)。それぞれｐＨ６．０、７．０及び８．０で調製された２つの異なる調製物を試験した；一方は２５０ｍｌの発酵体(Ｂ３)から得られたもの、一方は１Ｌの発酵体からのものである(Ｂ１２)(実施例１５及び１６を参照)。
２５０ｍｌの発酵体からの調製物を、ＨＢＳ-ＥＰにおいて１：１０に希釈して試験し、３分注入し、続いて２．５分解離した。調製物は固定化されたＨＰ-３Ｄ９及び固定化されたＺ１９９の双方に結合し、固定化されたＨＰ-３Ｄ９には多量結合した(図２４)。
１Ｌの発酵体からの調製物を、１０μｇ／ｍｌまで希釈し、３分注入し、続いて２．５分解離した。この調製物は、固定化されたＨＰ-３Ｄ９及びＺ１９９の双方に結合することが示された(図２４)。
【０１７３】
実施例２０：ｍＦｃ-ｈＮＫＧ２Ｃ-ｈＣＤ９４発現コンストラクトの設計及び生成
可溶性ヒトＮＫＧ２ＣをGeneart, Regensburg, Deutschlandから得た。ｐＢＦ７４(ＮＫＧ２Ｃ／ＣＤ９４-Ｆｃ)で得られたｐＢＦ１７からｈＮＫＧ２Ａ(配列番号５９)を容易に置き換えるために、配列は、５'ＢａｍＨＩ制限部位及び３'ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する順番であった。
１ ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬ  ＷＡＧＡＬＡＭＤＶＰ  ＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣ  ＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩ  ＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴ
５１ ＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶ  ＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥ  ＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶ  ＥＶＨＴＡＱＴＫＰＲ  ＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳ
１０１ ＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤ  ＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲ  ＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩ  ＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲ  ＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰ
１５１ ＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫ  ＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦ  ＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱ  ＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫ  ＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧ
２０１ ＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶ  ＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴ  ＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬ  ＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳ  ＨＳＰＧＫＧＳＦＬＥ
２５１ ＱＮＮＳＳＰＮＴＲＴ  ＱＫＡＲＨＣＧＨＣＰ  ＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣ  ＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷ  ＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫ
３０１ ＮＳＳＬＬＳＩＤＮＥ  ＥＥＭＫＦＬＡＳＩＬ  ＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮ  ＳＳＨＨＰＷＶＴＩＮ  ＧＬＡＦＫＨＫＩＫＤ
３５１ ＳＤＮＡＥＬＮＣＡＶ  ＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱ  ＣＧＳＳＭＩＹＨＣＫ  ＨＫＬＧＧＳＧＧＳＲ  ＳＳＦＴＫＬＳＩＥＰ
４０１ ＡＦＴＰＧＰＮＩＥＬ  ＱＫＤＳＤＣＣＳＣＱ  ＥＫＷＶＧＹＲＣＮＣ  ＹＦＩＳＳＥＱＫＴＷ  ＮＥＳＲＨＬＣＡＳＱ
４５１ ＫＳＳＬＬＱＬＱＮＴ  ＤＥＬＤＦＭＳＳＳＱ  ＱＦＹＷＩＧＬＳＹＳ  ＥＥＨＴＡＷＬＷＥＮ  ＧＳＡＬＳＱＹＬＦＰ
５０１ ＳＦＥＴＦＮＴＫＮＣ  ＩＡＹＮＰＮＧＮＡＬ  ＤＥＳＣＥＤＫＮＲＹ  ＩＣＫＱＱＬＩ
コンストラクトは、単一ペプチドＣＤ３３(配列番号３０)、２２７Ｆｃ-部分(ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３)(配列番号２１)、リンカー(ＧＳ)、ｈＮＫＧ２Ｃ(配列番号３)の残基９６-２３１、ＧＧＳＧＧＳＲＳＳスペーサー、及びｈＣＤ９４(配列番号２)の残基３４ないし１８０を含有する。
【０１７４】
哺乳動物細胞発現に対する変異したＮＫＧ２Ａ-部分コンストラクト
単鎖コンストラクトに使用されたＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃの可溶性部分のアミノ酸配列は、図２５のアラインメントの番号付けを使用すると、残基９９、１００、１０１、１０６、１６７、１６８、１７０、１８９及び１９７のみが異なっている。単鎖コンストラクトに使用された配列が、上述した番号付けスキームに従い、ＮＫＧ２Ｃ(ＦＬＥＱ……)については位置９８、及びＮＫＧ２Ａ(ＱＲＨ……)については９９で開始することが記されている。
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ-単鎖コンストラクトのシリーズは、単鎖コンストラクト(Ｓｉｇ)-(ｍＦｃ)-ＧＳ-(ＮＫＧ２Ａ)-ＧＧＳ-ＧＧＳ-ＲＳＳ-(ＣＤ９４)(配列番号３９)に基づき開発された。このコンストラクトは、ｈＣＤ９４(配列番号２)の残基３４ないし１８０、ｈＮＫＧ２Ａ(配列番号１)の残基９９-２３３、ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ａ部分の間のＧＧＳＧＧＳＲＳＳスペーサー、及び２２７Ｆｃ-部分を含有する。シリーズは以下の表４に列挙された反復変異を用いて調製された。
2009541274.tif 000005
【０１７５】
ｈＮＫＧ２Ａ部分における変異を、コンストラクトｐＢＦ１７(配列番号３９)において、素早い突然変異誘発を使用して達成した。素早い突然変異誘発において使用されるプライマーは以下の通りである：
変異１ＬＥＱ−Ｐ；順方向(配列番号６０)、逆方向(配列番号６１)
変異２ＡＳ-Ｌ；順方向(配列番号６２)、逆方向(配列番号６３)
変異３Ｉ；順方向(配列番号６４)、逆方向(配列番号６５)
変異４Ｋ；順方向(配列番号６６)、逆方向(配列番号６７)
変異Ｍ；順方向(配列番号６８)、逆方向(配列番号６９)
これらの変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的突然変異誘発キット、及びStratagene #200523のマニュアルを称して実施した：９５℃／３０秒での単一変性工程に、９５℃／３０秒；５５℃／１分；６８℃／７分、最後に７２℃／１０分の１５サイクルが続いた。
【０１７６】
実施例２１：ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ又はｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ組換えタンパク質に結合する抗ＮＫＧ２Ａ又は-ＮＫＧ２Ｃ抗体のＳＰＲ研究
材料及び方法
表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)測定を、２５℃でBiacore T100装置(Biacore GE Healthcare)において実施した。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ランニングバッファー及びセンサーグラムとして供給されるＨＢＳ-ＥＰ＋バッファー(Biacore GE Healthcare)を、Biaevaluation 4.1及びBiacore T100 Evaluationソフトウェアを用いて分析した。使用した抗体は抗ＮＫＧ２Ａ(ｈｕｍＺ２７０及びＺ１９９)、抗ＮＫＧ２Ｃ(Immunotech-Beckman Coulter)、及び抗ＮＫＧ２Ｄ(ＯＮ７２)であった。
【０１７７】
タンパク質固定化
組換えタンパク質を、センサーチップＣＭ５(チップ)上のデキストラン層中のカルボキシル基に、共有結合的に固定化させた。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ(Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化させた。タンパク質をカップリングバッファー(１０ｍＭのアセタート、ｐＨ５．６)において１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベルに達するまで注入した(すなわち、それぞれ２Ａ、２Ｃ及び２Ｄについて７００、６３０及び４００ＲＵ)。
残存した活性化基の不活性化を、１００ｍＭのエタノールアミン、ｐＨ８(Biacore GE Healthcare)を使用して実施した。
【０１７８】
結合研究
単一の結合実験において、ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｄ-Ｆｃ組換えタンパク質チップに、１０μｌ／分の流速で１分間、１０μｇ／ｍｌの一定濃度の抗体を注入した。各サイクル後、流速４０μｌ／分で、５００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＮａＯＨバッファーを８秒注入することにより、チップを再生させた。各抗体について、種々のタンパク質チップについて得られたセンサーグラムを重ね合わせ、Ｙ軸について１００ＲＵの任意値に対して正規化させた。
【０１７９】
親和性測定
動的実験において、０．１７８〜５ナノＭと、一連の希釈された可溶性抗体を、固定化されたｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ組換えタンパク質を含有するデキストラン層に、一定流速４０μｌ／分で２分注入し、５００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＮａＯＨバッファーを８秒注入することによる再生前に、３分解離させることができた。
得られたセンサーグラムを適切なラングミュアモデルを使用し、包括的フィッティングにより分析した。
【０１８０】
ＨＬＡ-Ｅ四量体結合阻害
阻害実験において、固定化されたｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ組換え標的タンパク質を含有するデキストラン層に、１０μｇ／ｍｌの一定濃度で抗体を注入した。各競合サイクルは、１０μｌ／分の一定流速での２分間の注入工程３回からなる。第１に、抗体を２回注入する。第２に、結合した抗体を除去することなく、８μｇ／ｍｌでＨＬＡ-Ｅ四量体を注入し、センサーグラム及びＲＵ値をモニターする。抗体の存在下におけるＨＬＡ-Ｅ四量体の結合シグナルを、ＨＬＡ-Ｅ四量体が、裸の組換えｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａタンパク質に直接注入された場合に得られたものと比較する。次の式：Ｉ％＝(１-(ＲＵ＋Ａｂ／ＲＵ無し))＊１００を使用し、注入終了１０秒後に得られたＲＵ値から、阻害パーセンテージ(Ｉ％)を決定した。ＲＵ＋Ａｂ及びＲＵ無しは、抗体の存在及び不在下において、それぞれモニターされたＨＬＡ-Ｅ結合ＲＵ値である。ＨＬＡ-Ｅ注入(第３工程)に対応するセンサーグラムを、Ｘ及びＹ軸双方についで、注入出発時をゼロに位置あわせして、重ねた。
各サイクル後、流速４０μｌ／分で、５００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＮａＯＨバッファーを８秒注入することにより、チップを再生させた。
【０１８１】
結果
組換えＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｄタンパク質に対するｈｕｍＺ２７０及びｈｕｍＺ１９９抗体の結合性を、ＳＰＲにより分析した(図２６)。双方の抗体はｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａチップには結合したが、ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃチップには結合しなかった。負の対照体として、ＮＫＧ２Ｄ-Ｆｃタンパク質を使用した。
ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃチップを、ＮＫＧ２Ｃチップに１分間、２．５μｇ／ｍｌで注入された抗ＮＫＧ２Ｃ-ＰＥ(FAB138P, R&D Systems)を使用してチェックした。この抗体は、細胞表面で発現した天然ＮＫＧ２Ｃによく結合する。ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃチップに結合した抗体は、細胞表面状態を模倣した適切な状態に固定化タンパク質が存在することを示す。ＮＫＧ２Ｄ-ＦｃチップをｈｕｍＯＮ７２抗体を使用してチェックした。
ＨＬＡ-Ｅ結合特性を分析するために、ｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡチップへのＨＬＡ-Ｅ四量体の結合性を、ｈｕｍＺ２７０の不在下及び存在下においてモニターした。ｈｕｍＺ２７０抗体を使用するｓｃＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａチップの状態で、ＨＬＡ-Ｅ四量体の結合を競合的に阻害した(ＩＺ２７０＝８１．８％)。
【０１８２】
例示的実施態様
１．ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分とＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含む単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２．Ｆｃドメインの全て又は一部を含む免疫グロブリンポリペプチド又はその変異体をさらに含む実施態様１の単鎖コンストラクト。
３．ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端がＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合し、ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している実施態様２の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
４．ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端がＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＮ-末端に結合し、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分のＣ-末端が免疫グロブリンポリペプチドに結合している実施態様２の単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
５．ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分とＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分が、グリシン及びセリンを含むペプチドリンカーにより結合している実施態様３及び４のいずれかの単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
６．上述した実施態様のいずれかの単鎖可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの二量体。
７．ＮＫＧ２アミノ酸配列の可溶性部分を含むＮＫＧ２サブユニットと、ＣＤ９４アミノ酸配列の可溶性部分を含むＣＤ９４サブユニットを含み、ＮＫＧ２サブユニット及びＣＤ９４サブユニットの少なくとも一方が、Ｆｃドメインの全て又は一部を含む免疫グロブリンポリペプチド又はその変異体を含む可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
８．免疫グロブリンポリペプチドが、コンストラクトのインビボ半減期を増加させるＩｇＧ Ｆｃドメインの一部を含む実施態様７の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
９．免疫グロブリンポリペプチドが機能的Ｆｃドメインである実施態様７−８のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１０．ＦｃドメインがＩｇＧ４抗体由来である実施態様７−９のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１１．ＦｃドメインがＩｇＧ１抗体由来である実施態様７−１０のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１２．ＮＫＧ２Ａ及びＣＤ９４サブユニットの一方のみが免疫グロブリンポリペプチドを含む実施態様７−１１のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１３．免疫グロブリンポリペプチドがサブユニットのＣ-末端部分に結合している実施態様１２の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１４．ＮＫＧ２Ａ及びＣＤ９４サブユニットがペプチドリンカーを介して結合している実施態様１２−１３のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１５．ペプチドリンカーが配列ＧＧＳＧＧＳ(配列番号６)を含む実施態様１３の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１６．ＮＫＧ２サブユニットが免疫グロブリンポリペプチドに共有結合している実施態様１２−１５のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１７．ＣＤ９４サブユニットが免疫グロブリンポリペプチドに共有結合している実施態様１２−１５のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１８．ＮＫＧ２及びＣＤ９４サブユニットのそれぞれが免疫グロブリンポリペプチドに共有結合している実施態様７の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
１９．ＮＫＧ２サブユニットのＮ-末端が第１の免疫グロブリンポリペプチドのＣ-末端に結合して第１のポリペプチドが形成され、ＣＤ９４サブユニットのＮ-末端が第２の免疫グロブリンポリペプチドのＣ-末端に結合して第２のポリペプチドが形成される実施態様１８の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２０．第１の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおいて、残基２３９に対応する残基にリジンを、残基２９２に対応する残基にアスパラギン酸を含み、第２の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおいて、残基２８２に対応する残基にリジンを、残基３２２に対応する残基にアスパラギン酸を含む実施態様１９の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２１．第１の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおいて、残基２３９及び２４０に対応する残基にリジンを、残基２９２に対応する残基にアスパラギン酸を含み、第２の免疫グロブリンポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおいて、残基２５３に対応する残基にグルタミン酸を、残基２８２に対応する残基にリジンを、残基３２２に対応する残基にアスパラギン酸を含む実施態様１９及び２０のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２２．第１の第２の免疫グロブリンポリペプチドの双方がヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの変異体であり、第１の免疫グロブリンポリペプチドが、Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄに対応する置換を含み、第２の免疫グロブリンポリペプチドが、Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄに対応する置換を含み、又はその逆である実施態様２０及び２１のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２３．第１の第２の免疫グロブリンポリペプチドの双方がヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインの変異体であり、第１の免疫グロブリンポリペプチドが、Ｋ２５０Ｅ、Ｄ２７９Ｋ、及びＫ３１９Ｄに対応する置換を含み、第２の免疫グロブリンポリペプチドが、Ｅ２３６Ｋ、Ｅ２３７Ｋ、Ｒ２８９Ｄに対応する置換を含み、又はその逆である実施態様２０及び２１のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２４．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａである上記実施態様のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２５．ＮＫＧ２Ａサブユニットが配列番号１の残基９９−２３３を含む実施態様２５の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター。
２６．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃである実施態様１−２３のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２７．ＮＫＧ２Ｃサブユニットが配列番号３の残基９６−２３１を含む実施態様２６の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプター。
２８．ＣＤ９４アミノ酸配列が配列番号２である上記実施態様のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
２９．ＣＤ９４サブユニットが配列番号２の残基３５−１７９を含む実施態様２８の可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター。
３０．免疫グロブリンポリペプチドがシグナル配列に共有結合している上記実施態様のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター。
３１．配列番号３７−３９のいずれかの配列を含む可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプター。
３２．配列番号５９の配列を含む可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプター。
３３．上記実施態様のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターをコードする核酸。
３４．実施態様３３の核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞。
３５．原核細胞又は真核細胞である実施態様３４の細胞。
３６．可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの製造方法において、可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの発現に適した条件下で実施態様３５の細胞を培養することを含む方法。
３７．実施態様１から３２のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの有効量と製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物。
３８．ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する抗体の製造方法であって、
ａ．実施態様１から３２のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターを動物に接種し、ここで該ポリペプチドは動物に免疫反応を誘発させて抗体を生成させるものであり；及び
ｂ．動物から抗体を単離する
ことを含む方法。
３９．ＨＬＡ-Ｅ分子の検出方法であって、
ａ．ＨＬＡ-Ｅ発現細胞を含有する生物学的試料を実施態様１から３２のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターと接触させ；
ｂ．細胞に対する可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの結合を検出する
ことを含む方法。
４０．抗ＮＫＧ２抗原結合化合物の製造方法であって、
ａ．ＮＫＧ２ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を提供し；
ｂ．実施態様１から３２のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに対する結合について抗原結合化合物を試験し；
ｃ．抗原結合化合物が可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに結合することが決定されるならば抗原結合化合物を選択し；
ｄ．場合によっては、所定量の選択された抗原結合化合物を製造する
ことを含む方法。
４１．抗ＮＫＧ２抗原結合化合物の製造方法であって、
ａ．ＮＫＧ２ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合化合物を所定量提供し；
ｂ．実施態様１から３２のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターに対する結合について該所定量の抗原結合化合物からの試料を試験し；
ｃ．抗原結合化合物が可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに結合することが決定されるならば医薬として及び／又は医薬の製造への使用に所定量を選択し；
ｄ．場合によっては、ヒトへ投与するための所定量を調製し、場合によっては製薬的に許容可能な担体と共に所定量の選択された抗原結合化合物を製剤化する
ことを含む方法。
４２．抗ＮＫＧ２抗原結合化合物の製造方法であって、
ａ．ＮＫＧ２ポリペプチドに特異的に結合する複数の抗原結合化合物を提供し；
ｂ．実施態様１から３２のいずれかの可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに対する結合性についてそれぞれの抗原結合化合物を試験し；
ｃ．抗原結合化合物が該可溶性ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターに結合することが決定されるならば抗原結合化合物を選択し；
ｄ．場合によっては、抗原結合化合物をヒトへの投与に適したものにし；及び／又は
ｅ．場合によっては、所定量の選択された抗原結合化合物を製造する
ことを含む方法。
４３．抗原結合化合物をヒトへの投与に適したものにすることが、抗原結合化合物をキメラ又はヒト化することを含む実施態様４０から４２のいずれかに記載の方法。
４４．所定量の抗原結合化合物を製造することが、適切な培地中で抗原結合化合物を発現する細胞を培養し、抗原結合化合物を回収することを含む実施態様４０−４３のいずれか一の方法。
４５．抗原結合化合物が抗体又はその抗原結合断片を含む実施態様４０−４４のいずれかの方法。
４６．抗原結合化合物が抗体である実施態様４０−４５のいずれかの方法。
４７．ＮＫＧ２ポリペプチドがＮＫＧ２Ａである実施態様４０−４６のいずれかの方法。
４８．ＮＫＧ２ポリペプチドがＮＫＧ２Ｃである実施態様４０−４６のいずれかの方法。
【０１８３】
ここに引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているのと同じ程度に、出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解してはならない。
その全ての可能な変形例における上述の要素の任意の組合せも、他の記載が示されていないか文脈上はっきりと矛盾していない限りは、本発明に包含される。
【０１８４】
発明を記述する際に使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語及び同様の指示対象は、ここで別の記載がなされていないか、文脈上はっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーしていると解されるものである。
ここでの値の範囲の記載は、他の記載が示されていない限りは、その範囲に入るそれぞれ別個の値に個々に言及することを省略する方法となるものであることを単に意図しており、それぞれ別個の値は、ここで個々に列挙されているように、明細書に援用される。他の記載がなされない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は「約」により修飾される、対応する近似測定値をまた提供すると考えることができる)。
ここで記載される全ての方法は、ここで示され、前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、任意の適切な順序で実施することができる。
【０１８５】
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に別段の記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も、明示的に記載していない限り、如何なる要素も本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
【０１８６】
他に言及しない又は前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、要素又は要素群に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含んでいる」等の用語を使用する本発明の任意の態様又は実施態様のここでの記載は、その特定の要素又は要素群「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含む」本発明の類似した態様又は実施態様をサポートすることを意図したものである(例えば、特定の要素を含むものとしてここに記載されている組成物は、他に言及しない限り又は前後関係ではっきりと矛盾していないならば、その要素からなる組成物をまた記載しているものと理解すべきである)。
本発明は、適用される法律によって許容される最大の範囲で、ここに提示された態様又は特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変形例及び均等物を含む。
【図１】
2009541274.tif 000006
【図２】
2009541274.tif 000007
【図３】
2009541274.tif 000008
【図４】
2009541274.tif 000009
【図５】
2009541274.tif 000010
【図６】
2009541274.tif 000011
【図７Ａ】
2009541274.tif 000012
【図７Ｂ】
2009541274.tif 000013
【図７Ｃ】
2009541274.tif 000014
【図８】
2009541274.tif 000015
【図９】
2009541274.tif 000016
【図１０】
2009541274.tif 000017
【図１１】
2009541274.tif 000018
【図１２】
2009541274.tif 000019
【図１３】
2009541274.tif 000020
【図１４】
2009541274.tif 000021
【図１５】
2009541274.tif 000022
【図１６】
2009541274.tif 000023
【図１７】
2009541274.tif 000024
【図１８】
2009541274.tif 000025
【図１９】
2009541274.tif 000026
【図２０】
2009541274.tif 000027
【図２１】
2009541274.tif 000028
【図２２】
2009541274.tif 000029
【図２３】
2009541274.tif 000030
【図２４】
2009541274.tif 000031
【図２５】
2009541274.tif 000032
【図２６】
2009541274.tif 000033
【配列表】
2009541274000001.app
【国際調査報告】
2009541274.tif 000034
2009541274.tif 000035
2009541274.tif 000036