(57)【要約】  本発明は、リポ多糖類結合能を断つことを保証し、抗腫瘍効果及び免疫調節効果を強化するアミノ酸置換が導入された、配列ＨＹＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＫＹＫＧＫＦＷに由来するペプチドの開発に関する。前記ペプチド及びそれらの組み合わせは、癌の治療でも、他の標準的な治療と相乗的にも使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４及び８〜１２のアミノ酸配列を含む、抗腫瘍能及び免疫調節能を有し、ＬＰＳ結合能及びヘパリン結合能を欠く、ＬＡＬＦタンパク質の３２〜５１領域由来のペプチド、並びにこれらのペプチドの相同変異体。
【請求項２】
抗腫瘍効果を保有し、ＬＰＳ結合能又はヘパリン結合能を欠く、請求項１に記載のペプチドを模倣する化合物。
【請求項３】
請求項１及び請求項２に記載のペプチド及び化合物のうち１つ又は複数を含み、賦形剤又は医薬的に許容されるビヒクルも含む医薬組成物。
【請求項４】
免疫原をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫原が、ペプチド性、ガングリオシド性又はタンパク質性の免疫原からなる群より選択され、粒子などのウイルス又は細菌起源のタンパク質性小胞である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
免疫学的障害及び癌を治療及び／又は防止するための医薬組成物を製造するための、請求項１及び請求項２に記載のペプチド及び化合物の使用。
【請求項７】
ヒトにおいて自然免疫応答を刺激するための有効量をも含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
転移を阻害するためにそれを適用することを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌免疫療法の分野に含まれる。より正確には、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）抗ＬＰＳ因子タンパク質の配列３２〜５１由来のペプチド又はそれらの組み合わせは、リポ多糖類に結合できず、癌及び転移を治療するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
主に現在の治療と併用して治療の利点を増強する、癌を治療するための生物学的応答の調節因子の使用が、最近報告されている（ＵＳ２００４／０１０１５１１）。他方、Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）のアゴニストであるＣｐＧ配列の使用は、複数の治療適応症（即ち、非小細胞肺癌、黒色腫及び腎癌）の一部である癌を治療、制御及び防止するための新規薬物として開発された（Ｋｌｉｎｍａｎ  Ｄ．Ｍ．ら、（２００４）ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの免疫療法的使用（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２４９−２５８）。Ｔｏｌｌ様レセプター７（ＴＬＲ７）アゴニストは、免疫系を活性化するために、第Ｉ相臨床試験で現在試験されており、黒色腫及び他の腫瘍を治療するための新規薬物として結果が展望されている（Ｄｕｄｅｋ  Ａ．Ｚ．ら（２００５）ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）。上述のＴＬＲ７及びＴＬＲ９のアゴニストは、宿主において有効な免疫応答を促進するそれらの能力に基づいて、ウイルス感染症においても評価されている。さらに、ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）と名づけられた、ＴＬＲ４に結合するタンパク質が開発されており、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７オンコプロテインとの融合タンパク質として製造されている。この新規免疫療法アプローチは、治療ワクチンとしても知られており、ヒトパピローマウイルス関連疾患を治療するための広い展望を有する（Ｃｈｕ  Ｎ．Ｒ．ら、（２０００）ウシ結核菌カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）ｈｓｐ６５及びＨＰＶ１６  Ｅ７を含む融合タンパク質の投与による、ヒト１６型パピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７発現腫瘍の免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ｔｙｐｅ  １６  Ｅ７−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｂｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ｈｓｐ６５  ａｎｄ  ＨＰＶ１６  Ｅ７．）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２１：２１６−２２５）。Ｔｏｌｌ様レセプターは、免疫系の細胞に存在し、ＬＰＳ、リポテイコ酸、非メチル化ＣｐＧ配列並びにウイルスの二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡなどの病原体関連分子のパターンを認識するレセプター分子である。ＴＬＲによる侵入病原体の認識は、免疫系が生物から感染症を効率よく撲滅するためのバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答を誘導することを助ける。癌を治療するための薬物としてのＴＬＲアゴニストの使用は、主な機構としてＩ型インターフェロン（例えば、αＩＦＮ及びβＩＦＮ）及びインターロイキン１２（ＩＬ−１２）によって媒介されるＴｈ１免疫応答を活性化することによって、自然免疫系及び獲得免疫系を活性化することに基づく。したがって、高度に特異的かつ持続性の免疫応答が達成される（Ｓｗｉｔａｊ  Ｔ．、Ｊａｌｉｌｉ  Ａ．ら、（２００４）ＣｐＧ免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド１８２６は、マウスの黒色腫モデルにおいて、インターロイキン１２遺伝子改変腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果を増強する（ＣｐＧ  Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １８２６  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１０：４１６５−４１７５）。この免疫系の二重の活性化は、獲得免疫応答において持続性の効果を生じさせることができず、また引き続く望まれない影響を伴って自然免疫系を非特異的に活性化する、いくつかの他の免疫療法アプローチとは対照的である（Ｓｐｅｉｓｅｒ  Ｄ．Ｅら（２００５）ペプチド、ＩＦＡ及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド７９０９を用いたワクチン接種に対する、迅速かつ強力なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の応答（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＩＦＡ，ａｎｄ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ７９０９．）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１１５（３））。
【０００３】
樹状細胞（ＤＣ）は、細胞−細胞相互作用及びサイトカイン産生を介して自然免疫応答と獲得免疫応答とを連結する、専門的な抗原提示細胞である。ＤＣは、一連の表面分子マーカー及びまたＴＬＲの差次的発現に基づいて、その起源によって骨髄系又はリンパ系に分類される。形質細胞様ＤＣとしても知られるリンパ系ＤＣは、Ｉ型インターフェロンの主な供給源である。これらの特性を考慮して、ＤＣは、癌及び慢性ウイルス感染症に対する治療ワクチンを開発するための有望な細胞性アジュバントとして操作されてきた（Ｓａｎｔｉｎｉ  Ｓ．Ｍ．ら（２００３）高度に活性な樹状細胞への単球の迅速な分化のための、新規Ｉ型ＩＦＮ媒介性経路（Ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｔｏ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２１：３５７−３６２）。しかし、これは非常に高価で難しい技術であり、他のより実際的かつ廉価な治療戦略が開発中である（Ｖａｎ  Ｅｐｐｓ  Ｈ．Ｌ．（２００５）腫瘍ワクチンへの新たな希望（Ｎｅｗ  ｈｏｐｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．２０２：１６１５）。
【０００４】
その抗ウイルス活性によって元々記載されたＩ型インターフェロン（αＩＦＮ、βＩＦＮ）は、ＤＣに対するそれらのアジュバント効果を介して細胞性免疫応答及び体液性免疫応答を促進し、免疫系に対して重要な影響を及ぼすことが最近示されている（Ｂｏｇｄａｎ，Ｃ．（２０００）抗菌免疫におけるＩ型インターフェロンの機能（Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．）Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４１９−４２４）。最近の研究により、高度に免疫原性のあるシンジェニックマウス肉腫の退縮を媒介し、原発性発癌性腫瘍の発生に対して宿主を保護するプロセスにおける、内因性Ｉ型インターフェロンの重要な役割が明らかになっている（Ｇａｖｉｎ  Ｐ．Ｄｕｎｎら（２００５）癌免疫編集におけるＩ型インターフェロンに重要な機能（Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ．）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎｅ  １２）。さらに、ＩＦＮ−αは、インフルエンザなどのウイルス感染症において、ＣＤ４＋Ｔリンパ球又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の直接的活性化を介して抗ウイルス性Ｔリンパ球応答を開始することにおいて、重要な役割を果たす（Ｆｏｎｔｅｎｅａｕ  Ｊ．Ｆら（２００３）インフルエンザウイルス特異的なＣＤ＋４及びＣＤ＋８Ｔ細胞の活性化：獲得免疫における形質細胞様樹状細胞の新規役割（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ＋４  ａｎｄ  ＣＤ＋８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｎｅｗ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、１０１：３５２０−３５２６）。
【０００５】
Ｈｏｅｓｓ（ＷＯ９５／０５３９３）は、自身の発明で、グラム陽性又はグラム陰性細菌媒介性の敗血症、細菌感染症一般及び真菌感染症などの感染症を防止又は治療するのに有用な、高い親和性でＬＰＳに結合する物質について述べている。このような物質は、エンドトキシン結合ドメインを保有するＬＰＳ結合ペプチドである（Ｈｏｅｓｓ  Ａ．ら、（１９９３）１．５Ａ０の分解能での、カブトガニ由来のエンドトキシン中和タンパク質リムルス抗ＬＰＳ因子の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ  ｃｒａｂ，Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｎｔｉ−ＬＰＳ  ｆａｃｔｏｒ，ａｔ  １．５Ａ０  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３３５１−３３５６）。元のリムルス抗ＬＰＳ因子（ＬＡＬＦ）タンパク質の結晶構造は、ポリミキシンＢに類似し、正に荷電し、両親媒性の、露出した疎水性及び芳香族残基を含むループを明らかにしている。この原理に基づいて、彼は、ＬＡＬＦタンパク質上のアミノ酸３１〜５２に対応する配列が、ヘパリンに結合し、ヘパリンに関連する効果（抗凝固、血管形成並びに内皮及び腫瘍細胞の増殖の阻害など）を中和できることを報告した。しかし、上記特許中には、この主張を支持する実験データは存在しない。実際、特許されたクレームは、溶液中のＬＰＳを除去するためのデバイスに関し、このデバイスは、固相支持体中に固定化されたペプチドを含むものである（ＵＳ６，３８４，１８８）。
【０００６】
一方、Ｖａｌｌｅｓｐｉ（ＵＳ６，１９１，１１４）は、自身の発明で、αインターフェロン及びγインターフェロンの産生によって媒介される、Ｈｅｐ−２細胞及びＭＤＢＫ細胞に対するＬＡＬＦ３１〜５２ペプチドの抗ウイルス効果について述べ、また、ウイルス感染症及び免疫抑制関連障害を治療するためのこのペプチドの使用についても述べている。さらに、同じ著者は、敗血症の動物モデルにおけるこのペプチドの抗感染症効果を実証している（Ｖａｌｌｅｓｐｉ  Ｍ．Ｇ．ら（２００３）リムルス抗ＬＰＳ因子由来のペプチドは、サイトカイン遺伝子の発現を調節し、マウスにおいて急性細菌感染症の解決を促進する（Ａ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｎｔｉ−ＬＰＳ  ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３：２４７−２５６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
化学療法、放射線照射及び遺伝子治療を含む、癌に対するいくつかの治療が存在する。毒性はこれら全ての治療の１つの主要な不利益であり、高い用量が、いくつかの有利な治療効果を最終的に達成するために、長期間投与される。したがって、より有効な治療を得るための新規薬物の開発がなお必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
腫瘍を検出し腫瘍に対する有効な応答を誘導する免疫系の重要な役割に基づいて、宿主の自然防御機構及び獲得防御機構を活性化するように設計された薬物は、癌治療の強力なツールとなり得る。
【０００９】
そのＬＰＳ結合能を消失させ、免疫調節効果を増強し、またいくつかの腫瘍に対するｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍効果を付与する、ＬＡＬＦタンパク質の配列ＨＹＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＫＹＫＧＫＦＷについてアミノ酸置換は以前に記載されていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ＬＡＬＦタンパク質の配列ＨＹＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＫＹＫＧＫＦＷ（配列番号１３）の３２〜５１領域由来のペプチドを提供して上述の問題点を解決し、この配列では、ＬＰＳ結合能を除去し、抗腫瘍効果及び免疫調節効果を増強するためにアミノ酸が置換されている。
【００１１】
ＬＰＳ結合又はヘパリン結合を禁じ、また元のペプチドと比較して増大した抗腫瘍効果及び免疫調節効果をもたらす置換によってこの配列から誘導される類似ペプチドは、以下の配列からなる：
【化１】
2009527510.tif 000002
【００１２】
Ｈｏｅｓｓ及びＶａｌｌｅｓｐｉによって記載されたＬＰＳ結合ペプチドは、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２プロフィールを、癌患者に有害な優勢Ｔｈ２プロフィールに向かわせるという点で、不利である。これらの患者では共通して、免疫抑制に起因する付随的感染症を示し、血中のＬＰＳ粒子の存在は除外されない。ＬＰＳの存在下での優勢なＴｈ２プロフィールを誘導するペプチドの投与から、患者の免疫学的状態をさらに増悪させ、腫瘍に対する宿主の応答を悪化させる、望まない影響が生じる。さらに、Ｖａｌｌｅｓｐｉにより記載されたペプチドとＬＰＳの結合によって、このペプチドの免疫調節効果が最小となる。
【００１３】
一方、本発明中に記載されたペプチドのヘパリンへの結合の欠如により、そのペプチドは、Ｈｏｅｓｓ及びＶａｌｌｅｓｐｉによって以前に記載されたものよりも優れたものとなる。虚血性心疾患、脳血管疾患、静脈血栓塞栓疾患（深部静脈血栓症及び肺塞栓症）及び後脚虚血に罹患した患者などの重篤な患者において、ヘパリンが治療として示される（Ｄ．Ｃａｂｅｓｔｒｅｒｏ  Ａｌｏｎｓｏら（２００１）重篤な患者における低分子量ヘパリン：使用、適応症及び型（Ｈｅｐａｒｉｎａｓ  ｄｅ  ｂａｊｏ  ｐｅｓｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎ  ｐａｃｉｅｎｔｅｓ  ｃｒｉｔｉｃｏｓ：ｕｓｏｓ，ｉｎｄｉｃａｃｉｏｎｅｓ  ｙ  ｔｉｐｏｓ．）Ｍｅｄｉｃｉｎａ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖａ、Ｖｏｌ．９５：１８−２６）。引き続いてヘパリン結合ペプチドを投与することは、この薬物の効果を妨害するため、この場面では禁忌であり得る。癌及び血栓塞栓疾患（深部静脈血栓症及び肺塞栓症など）の関連は、癌患者における罹患率及び死亡率に有意に寄与し得る充分に記載された現象である。前記で言及したこれらの理由に基づき、ヘパリンに結合できず、かつ癌患者（これらの患者の有意な割合が共通して手術を受け、凝固亢進などの他の障害を示す）の治療において抗腫瘍効果及び免疫調節効果を示すペプチドが利用可能であることは有利となる（Ｃａｓｔｅｌｌｉ  Ｒ．ら（２００４）ヘパリンと癌：臨床試験及び生物学的特性の総説（Ｔｈｅ  ｈｅｐａｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．）Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．９：１−９）。
【００１４】
本発明はまた、アラニンによって２つ又はそれ以上のアミノ酸が置換されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
【化２】
2009527510.tif 000003
を含むペプチド、及びこれら上記ペプチドの任意の他の相同又は模倣変異体を含み、それらは合成手順又は組換え手順により任意の融合ペプチドの一部として得られる。相同変異体とは、ＬＰＳ結合能又はヘパリン結合能を欠き、抗腫瘍効果及び免疫調節効果を保有する任意のペプチドをいう。同様に、前記模倣変異体とは、その構造がＬＰＳ結合能又はヘパリン結合能を欠き、抗腫瘍効果及び免疫調節効果を保持する、化学物質起源の（非タンパク質性の）任意の分子をいう。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、医薬組成物は、１種又は複数のペプチド及び化合物又はそのそれぞれの医薬的に許容される塩、並びに医薬的に許容される賦形剤又はビヒクルを含む。
【００１６】
本発明の他の好ましい実施形態において、医薬組成物はさらに、細菌抗原、ウイルス抗原又は癌抗原を含む群から選択される抗原を含む。
【００１７】
同様に、本発明のペプチドは、化学療法、手術、放射線照射などの、癌に対する従来の治療と併用して使用され得る。
【００１８】
本発明はまた、有効なＴｈ１免疫応答を要求する免疫学的障害を治療及び／又は防止するため、癌の治療又は防止のため、並びに細菌若しくはウイルス起源の感染症に対する有効な免疫応答を発生させるための医薬組成物の調製のための、これらのペプチド及び化合物の使用を含む。
【００１９】
記載されたペプチドは、ＬＰＳ結合のためのコンセンサス最適ドメインとして以前に記載された元のＨＹＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷ配列の代わりに、ＬＰＳ結合能を欠くことによって規定された（Ｈｏｅｓｓら、（１９９３）１．５Ａ０の分解能での、カブトガニ由来のエンドトキシン中和タンパク質リムルス抗ＬＰＳ因子の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ  ｃｒａｂ，Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｎｔｉ−ＬＰＳ  ｆａｃｔｏｒ，ａｔ  １．５Ａ０  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３３５１−３３５６）。同様に、本発明中に記載したペプチドは、Ｖａｌｌｅｓｐｉが自身の特許（ＵＳ６，１９１，１１４）で抗ウイルス及び免疫調節ペプチドとして言及したアミノ酸３１〜５１を含むＬＡＬＦタンパク質由来のペプチドと比較して、ＩＦＮ−αの分泌によって媒介される免疫調節効果を増強する。
【００２０】
同様に、本発明中に記載したペプチドは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患した患者及び複雑な手術を受けた患者などの、免疫抑制患者及び免疫状態の活性化を必要とする患者に投与され得る。
【００２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏの実験データにより、マウスに移植された腫瘍において、類似ペプチドの有効性が実証された。これらの腫瘍は、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来の悪性肺上皮細胞及びマウス肺癌から得られた３ＬＬ−Ｄ１２２細胞由来である。
【００２２】
別の実施形態では、ペプチドを投与して、転移事象を最小化することができる。
【００２３】
本発明の他の結果は、記載されたペプチドが、組織学的起源が様々な腫瘍細胞系に対して抗増殖効果を示すことを示しており、癌細胞に対する直接的細胞傷害効果を実証している。
【００２４】
原則的に、記載されたペプチドは、単独で使用することができ、又は手術、放射線照射若しくは化学療法などの、癌を治療するための現在の治療と併用することができる。
【００２５】
同様に、本発明中に記載したペプチドは、予防的に投与した場合、腫瘍に対する迅速な自然免疫応答を生じ、引き続いて抗原特異的な獲得免疫応答を発生させ、癌に対する予防的又は治療的なワクチンにおけるそれらの使用を強調する。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）
ペプチド合成
本発明のペプチドは、固相手順に従って合成する。粗ペプチドを、３０％酢酸溶液で抽出し、凍結乾燥し、さらにＲＰ−ＨＰＬＣで精製する。精製ペプチドの分子量は、ＦＡＢ銃を備えた質量分析器ＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＨＸ１１０ＨＦを使用してチェックする。得られた調製物は非抗原性で非発熱性であり、動物及びヒトにおける投与について医薬的に許容される。置換は、ペプチドＨＹＲＩＫＰＴＦＲＲＬＫＷＫＹＫＧＫＦＷの元の配列の各々の位置にアラニンアミノ酸を導入することによって実施した。
【００２７】
（実施例２）
リポ多糖（ＬＰＳ）結合能を欠く類似ペプチドの選択
このアッセイは、競合ＥＬＩＳＡシステムからなる（Ｈａｒｄｙ  Ｅ．ら（１９９４）固相への生物学的に活性なＬＰＳ又はリピドＡの有効なコーティングのためにＴＣＡを使用して増強されたＥＬＩＳＡの感受性（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＥＬＩＳＡ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ＴＣＡ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ＬＰＳ  ｏｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．Ｖｏｌ．１７６：１１１−１１６）。ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）を、０．２％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４由来のＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、さらに１×リン酸緩衝化生理食塩水（１×ＰＢＳ）＋０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄溶液）で１０回洗浄した。固相表面に固定されたＬＰＳに対する類似ペプチドの結合を、最大のＬＰＳ結合の９０％を得る０．２μＭのビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドを用いた競合ＥＬＩＳＡにより評価した。阻害曲線を推定するために、１０μＭ〜０．０１μＭの種々の濃度の類似ペプチドを使用し、ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドの曲線を実験対照とした。ビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１を、３７℃で２時間類似ペプチドの存在下でインキュベートし、その後プレートを洗浄溶液で５回洗浄した。ＬＰＳに結合したビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１を、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートと共に１：２，０００希釈で３７℃で４５分間インキュベートすることによって検出した。プレートを洗浄溶液で５回洗浄し、基質溶液（０．０５Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１錠の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン及び０．０２５％過酸化水素）を添加した。１５分間のインキュベーション後、２Ｍ硫酸を添加することによって反応を停止させた。吸光度を、プレートリーダー（Ｓｅｎｓｉｄｅｎｔ  Ｓｃａｎ）で４５０ｎｍで定量した。光学密度値と類似ペプチドのＬＰＳ結合能との間には相関がある。より高いＬＰＳ結合能を有する類似ペプチドは、ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドの阻害曲線と比較して、より低いＯ．Ｄ．の阻害曲線を示す。
【００２８】
より低いＬＰＳ結合能を有する類似ペプチドは、ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドの阻害曲線と比較して、Ｏ．Ｄ．値を有する阻害曲線を示す。結果を図１Ａに示す。これは、Ｌ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０と命名されたペプチドがＬＰＳに結合する能力を失っており、ペプチドＬ−９及びＬ−１９がＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドに類似した能力を保持していることを示す。一方、Ｌ−３ペプチドはより高いＬＰＳ結合能を示している。
【００２９】
図１Ｂは、固相表面に吸着したＬＰＳに対するビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１（０．２μＭ）の結合を置き換えるそれらの能力による、０．５Ｍの固定濃度での類似ペプチドの阻害割合を示す。
阻害％＝｛１−（（［Ｏ．Ｄ．］試料−［Ｏ．Ｄ．］最小）／（［Ｏ．Ｄ．］最大−［Ｏ．Ｄ．］最小））｝×１００
［Ｏ．Ｄ．］試料：固定濃度の類似ペプチドの存在下での光学密度値；
［Ｏ．Ｄ．］最小：ＥＬＩＳＡバックグラウンド；
［Ｏ．Ｄ．］最大：類似ペプチドなしでの光学密度値。
【００３０】
表１．実施例において使用したペプチドの配列
【表１】
2009527510.tif 000004
【００３１】
これらの分析の結果として、ＬＰＳ結合能を欠くペプチドから開始して、二重、三重及び四重の変異を実施した：
【化３】
2009527510.tif 000005
【００３２】
（実施例３）
類似ペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０のヘパリン結合能の評価
このアッセイは、上記したものと類似の競合ＥＬＩＳＡシステムからなる。ビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドを、１×ＰＢＳ中でポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）に吸着させ、４℃で一晩インキュベートした。類似ペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０を、２μＭで、２５０単位のヘパリン（Ｓｏｄｉｃ  Ｈｅｐａｒｉｎ、５，０００Ｕ／ｍｌ、Ｌｉｏｒａｄ）と、１×ＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で混合した。その後、混合物を、固相表面に吸着した０．０２μＭのビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドを含むＥＬＩＳＡプレートに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄溶液で５回洗浄し、固相表面に固定化されたビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドを、１：２，０００でストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートと共に３７℃で４５分間インキュベートすることによって検出した。その後、プレートを洗浄溶液で５回洗浄し、基質溶液を添加した。１５分間さらにインキュベートした後、２Ｍ硫酸溶液を添加することによって反応を停止させた。類似ペプチドへのヘパリンの結合の欠如は、光学密度の低下と相関する。なぜなら、これらの類似ペプチドは、固相表面に吸着したビオチン化ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドに結合したヘパリンを置き換えることができないからである。１００×モル過剰の未標識のＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドをこのアッセイの対照として使用した。未標識ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドのヘパリンへの結合は、光学密度値の増加により実証される。なぜなら、過剰の未標識ペプチドがヘパリンへの結合について競合するからである。図２に示されるように、結果は、本発明に記載したペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０がヘパリンに結合できないことを示している。
【００３３】
（実施例４）
ヒト単核細胞におけるＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の発現に対する類似ペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０の影響
このアッセイのために、ヒト単核細胞を、ドナーの白血球濃縮物即ち「バフィーコート」からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配によって単離した。最大５×１０６を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２４穴プレートに播種した。各ペプチドを、０．１ｍｌ体積のＲＰＭＩ培地中４０μｇ／ｍｌでさらに添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で１８時間培養した。総ＲＮＡを、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ法を用いて抽出した。その後、ＩＦＮ−α遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子の発現を、逆転写反応及びＰＣＲ増幅によって決定した（ＲＴ−ＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。結果を、β−アクチンハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して標準化したメッセンジャーＲＮＡの相対的な量として示す。このアッセイで得られた結果は、図３Ａに示すように、本発明に記載したペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０が、ＩＦＮ−α遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子の発現を誘導することが可能であることを実証した。図３Ｂに示すように、類似ペプチドＬ−２、Ｌ８及びＬ−１２は、ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドよりもＩＦＮ−α遺伝子の発現の誘導において特により効果的である。この実施例は、元のＬＡＬＦ３２〜５１配列におけるアミノ酸置換が、ＬＰＳに結合する能力を消失させ、引き続いて得られたペプチドの免疫調節効果を増強することを実証している。
【００３４】
（実施例５）
ＴＣ−１腫瘍モデルにおける類似ペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０の抗腫瘍効果
８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６雌マウスをこのアッセイに使用した（１実験群当たりｎ＝１０の動物）。腫瘍移植のために、Ｃ５７Ｂｌ／６悪性肺上皮細胞由来のＴＣ−１腫瘍細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁して使用した。２００μｌの体積中細胞５０，０００個の量を、右後脚中に皮下経路によってマウスに接種した。最初のペプチド投与を、腫瘍が１００ｍｍ３の体積に達したところで、右わき腹に皮下経路で実施し、２回目のペプチド投与を１０日後に実施した。このアッセイにおいて、体重１ｋｇ当たり４ｍｇの用量を評価した（８０μｇ／マウス）。図４Ａ及び４Ｂに示すように、動物の生存及び腫瘍塊を、目的のペプチドの抗腫瘍効果を測定するのに評価したパラメーターとした。類似ペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０はそれぞれ、腫瘍進行を阻害し、マウスを延命させるのに有効であった。これらの結果は、マウスの固形腫瘍モデルにおける類似ペプチドの抗腫瘍効力を証明している。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ法を、群間の有意な差異を検出するための統計的分析として使用した。結果は、類似ペプチドＬ−２、Ｌ−８、Ｌ−１２及びＬ−２０が、ＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドと比較して、動物の生存を有意に増大させることを証明した（＊ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＬＡＬＦタンパク質の元の３２〜５１配列中のアミノ酸の置換が、ペプチドの抗腫瘍能を有意に増大させ得ることを実証している。
【００３５】
（実施例６）
黒色腫モデルにおける類似ペプチドＬ−２の抗腫瘍効果
８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６雌マウスをこのアッセイに使用した（１実験群当たりｎ＝１０の動物）。腫瘍移植のために、ＭＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁して使用した。２００μｌの体積中細胞１５，０００個の量を、右後脚中に皮下経路によって接種した。４日後、Ｌ−２ペプチドを投与し、２回目の注射を最初の注射の７日後に投与し、３回目の免疫を１４日後に投与した。このアッセイにおいて、動物の体重１ｋｇ当たり４ｍｇのペプチドの用量を評価した。このアッセイの間に与えられたペプチドの抗腫瘍効果を測定するために評価したパラメーターは、腫瘍移植の時間及び動物の生存であった。図５Ａ中に示すように、Ｌ−２類似ペプチドは、腫瘍移植を有意に遅延させた（＊ｐ＜０．０５、Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ法）。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ法による生存の分析は、Ｌ−２ペプチドが動物の生存を有意に増大させたことを実証し（＊ｐ＜０．０５）、図５Ｂに示すように、これはＬＡＬＦ３２〜５１ペプチドよりも有効であった。これらの結果は、肺上皮性癌細胞に対してだけでなく身体の他の組織学的及び解剖学的部分由来の癌細胞（黒色腫など）に対しても、Ｌ−２ペプチドに抗腫瘍効力があることを証明している。
【００３６】
（実施例７）
ＴＣ−１腫瘍モデルにおける、治療の予防的スケジュールにおけるＬ−２類似ペプチドの抗腫瘍効果
８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６雌マウスをこのアッセイに使用した（１実験群当たりｎ＝１０の動物）。腫瘍移植のために、ＴＣ−１腫瘍細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。マウスに、最初にＬ−２ペプチド（体重１ｋｇ当たり４ｍｇのペプチド）を注射した。７日後、マウスに同じ用量の２回目の注射を受けさせ、最初のペプチド注射の１４日後、動物に２００μｌの体積中細胞５０，０００個を、右後脚中に皮下経路によって接種した。ペプチドの抗腫瘍効果を測定するために評価したパラメーターは、腫瘍移植の時間（図６Ａ）及び動物の生存（図６Ｂ）を含んだ。このアッセイで得られた結果は、本発明のＬ−２ペプチドが腫瘍の発生を防止するのに有効であり、また動物の生存を増大させたことを実証した。これらの結果は、本発明のペプチドが、腫瘍の樹立を防止する予防効果を示すことを証明している。
【００３７】
（実施例８）
二重誘発スケジュールにおけるＬ−２類似ペプチドの抗腫瘍効果
上記実施例のスケジュールにおいて腫瘍が樹立されていない動物（ｎ＝６）に、ＰＢＳ中２００μｌの体積中５０，０００個のＴＣ−１細胞で、左後脚中に皮下経路によって２回目のさらなる誘発を行った（最初の誘発の４９日後）。同量の腫瘍細胞を、齢数の均一性を保証するために実験の対照群と同じ同腹仔由来の「ナイーブ」マウスに接種し、ペプチドを受けない同じ条件下で維持した（ｎ＝１０の動物）。Ｌ−２ペプチドの抗腫瘍効果を測定するために評価したパラメーターには、腫瘍移植の時間及び動物の生存が含まれた。このアッセイで得られた結果は、Ｌ−２ペプチドが、腫瘍細胞による２回目の誘発からマウスを保護し、腫瘍の樹立を遅延させ（図７Ａ）、動物の生存を増大させる（図７Ｂ）ことができることを実証している。この結果は、本発明のペプチドが持続性の抗腫瘍応答を誘導でき、腫瘍細胞での２回目の誘発に対してなお機能的であることを証明しており、抗原特異的な獲得免疫応答の発生を証明している。
【００３８】
（実施例９）
ルイス癌の転移モデルにおけるＬ−２類似ペプチドの抗腫瘍効果
８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６雌マウスをこのアッセイに使用した（１実験群当たりｎ＝８の動物）。これらの動物に、２５０，０００個のマウス肺癌３ＬＬＤ１２２細胞を右後足蹠に接種した。７日後、体重１ｋｇ当たり４ｍｇの用量のＬ−２類似ペプチドを皮下注射した。腫瘍が直径８ｍｍに達した段階で、原発性腫瘍を担体の脚から外科的に除去した。この外科的手順の２１日後にマウスを屠殺した。肺を計量して、肺上の転移の量を示した。図８に示す結果は、本発明のＬ−２類似ペプチドが、転移性腫瘍事象を減少させることが可能であることを示している。
【００３９】
（実施例１０）
腫瘍細胞の増殖に対するＬ−２類似ペプチドの効果
このアッセイのために、ＴＣ−１、Ｈ−１２５（ヒト非小細胞肺癌）及びＬ９２９（マウス線維芽細胞）細胞を、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ中細胞２×１０４個で、９６穴培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に播種した。２４時間後、ペプチドを９μＭ〜３００μＭの範囲で培養物に添加した。５％のＣＯ２で７２時間プレートをインキュベートし、その時間の後、アッセイをクリスタルバイオレットで明らかにした。プレートを水道水で完全に洗浄し、プレートを５６２ｎｍで読み取った。結果を図９に示す。顕著なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖効果を有するアポトーシス促進性ペプチドを陽性対照として使用した（Ｐｅｒｅａ，Ｓ．ら（２００４）プロテインキナーゼ２によるリン酸化を損なう新規アポトーシス促進性ペプチドの抗腫瘍効果（Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  Ｉｍｐａｉｒｓ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ２．）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：７１２７−７１２９）。得られた結果は、Ｌ−２ペプチドがＴＣ−１細胞及びＨ−１２５細胞に対して用量依存的な抗増殖効果を生じることを実証した。しかし、マウス線維芽細胞Ｌ９２９細胞系では本発明のペプチドによる影響は検出されなかった。この結果は、本発明のペプチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞に対する選択的細胞傷害効果を示すことを実証している。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】細菌リポ多糖（ＬＰＳ）結合能に対するペプチドの影響を示す図である。図１Ａ、これらの実験は、３連で実施した。１つの実験の阻害曲線を示す。図１Ｂに示す阻害の割合は、３つの独立した実験の平均を示す。
【図２】アニオン性化合物ヘパリンに結合する能力に対するペプチドの影響を示す図である。３つの独立した実験の平均を示す。
【図３】ヒト単核細胞におけるα及びγインターフェロン並びにＩＬ−１２の産生に対するペプチドの影響を示す図である。３つの実験を異なるドナーで実施し、それらのうち１つの結果を示す。
【図４】ＴＣ−１腫瘍モデルにおけるペプチドの抗腫瘍効果を示す図である。
【図５】黒色腫モデルにおけるＬ−２ペプチドの抗腫瘍効果を示す図である。
【図６】ＴＣ−１腫瘍モデルの予防的投与スケジュールにおける類似Ｌ−２ペプチドの抗腫瘍効果を示す図である。
【図７】ＴＣ−１腫瘍細胞での二重誘発スケジュールにおける類似Ｌ−２ペプチドの抗腫瘍効果を示す図である。
【図８】類似ペプチドＬ−２の抗転移能を示す図である。
【図９】ＴＣ−１細胞、Ｈ−１２５細胞及びＬ９２９細胞の増殖に対する類似ペプチドＬ−２の効果を示す図である。
【図１】
2009527510.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009527510.tif 000013
【図９】
2009527510.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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