(57)【要約】【解決課題】テトラヒドロキシクルクミン、デメチルクルクミン、デメチルモノデメトキシクルクミン、およびビスデメトキシクルクミンを含有するテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクション、ならびにそれらの無色テトラヒドロ誘導体の製造プロセス。【解決手段】プロセスは、クルクマ種由来のウコンの有機溶媒抽出物から得られる天然のクルクミンの脱メチル化からなる。このテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションを水素化して無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションを得る。テトラヒドロキシクルクミンおよび無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの濃縮フラクションは、強力な抗酸化性を示し、炎症を抑える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０−８０％の範囲のテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン、４−２０％の範囲のテトラヒドロデメチルクルクミン、５−２５％の範囲のテトラヒドロデメチルモノデメトキシクルクミン、および０．１−１０％の範囲のテトラヒドロビスデメトキシクルクミンを含む、テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン混合物の濃縮フラクションの組成物。
【請求項２】
３０−８０％の範囲のテトラヒドロキシクルクミン、４−２０％の範囲のデメチルクルクミン、５−２５％の範囲のデメチルモノデメトキシクルクミン、および０．１−１０％の範囲のビスデメトキシクルクミンを含む、テトラヒドロキシクルクミンおよび他の脱メチル化クルクミン混合物の濃縮フラクションの組成物。
【請求項３】
以下の工程、
（ｉ）クルクマ・ロンガの根から得られる、クルクミン、モノデメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、およびテトラヒドロキシクルクミンを含む天然のクルクミン混合物を、有機溶媒中、ルイス酸、ピリジン、およびヨウ化アルカリ金属の存在下、脱メチル化して、テトラヒドロキシクルクミン、デメチルモノデメトキシクルクミン、デメチルクルクミン、およびビスデメトキシクルクミンを含む粗脱メチル化クルクミン組成物を得ること、
（ｉｉ）該粗テトラヒドロキシクルクミン混合物を、有機溶媒中、水素ガスまたは水素供与体の存在下、金属触媒で水素化して、テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン、テトラヒドロデメチルクルクミン、テトラヒドロデメチルモノデメトキシクルクミン、およびテトラヒドロビスデメトキシクルクミンを含むテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン組成物を得ること、を含む、
請求項１および２に記載のテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン混合物およびテトラヒドロキシクルクミン混合物が濃縮されたフラクションを製造するプロセス。
【請求項４】
工程（ｉ）で用いられる前記ルイス酸は、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、および塩化ベリリウムからなる群より選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記粗テトラヒドロキシクルクミン混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて、約８０−１００％の範囲で濃縮されたテトラヒドロキシクルクミンを含有するフラクションを得る、請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
前記テトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、続いて結晶化により、純粋なテトラヒドロキシクルクミン、デメチルクルクミン、デメチルモノデメトキシクルクミン、およびビスデメトキシクルクミンを得る、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
工程（ｉｉ）で用いられる前記金属触媒は、パラジウム、ラネーニッケル、マンガン、または亜鉛から選択され、そして前記水素供与体は、ギ酸、酢酸、プロパン酸、およびギ酸アンモニウムからなる群より選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項８】
工程（ｉｉ）で用いられる前記有機溶媒は、アセトン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項９】
前記テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンフラクションを、有機溶媒を用いてシリカゲルに通すカラムクロマトグラフィーにかけ、約８０−１００％の範囲の純度のテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンを得る、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記濃縮フラクションをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、続いて結晶化により純粋なテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン、テトラヒドロデメチルクルクミン、テトラヒドロデメチルモノデメトキシクルクミン、およびテトラヒドロビスデメトキシクルクミンを得る、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
１種または複数の適した薬学的に許容可能な賦形剤と配合された、請求項１および２に記載のテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションまたはテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションを含むクルクミノイド混合物濃縮フラクションを少なくとも１種治療上有効量で含む、抗酸化および抗炎症活性の向上した薬学的／栄養補助食品。
【請求項１２】
前記テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン混合物濃縮フラクションは、適した薬学的キャリア／賦形剤とともに、３０−８０％の範囲のテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン、４−２０％の範囲のテトラヒドロデメチルクルクミン、５−２５％の範囲のテトラヒドロデメチルモノデメトキシクルクミン、および０．１−１０％の範囲のテトラヒドロビスデメトキシクルクミンを含む、請求項１１に記載の薬学的／栄養補助食品。
【請求項１３】
前記テトラヒドロキシクルクミン混合物濃縮フラクションは、適した薬学的キャリア／賦形剤とともに、３０−８０％の範囲のテトラヒドロキシクルクミン、４−２０％の範囲のデメチルクルクミン、５−２５％の範囲のデメチルモノデメトキシクルクミン、および０．１−１０％の範囲のビスデメトキシクルクミンを含む、請求項１１に記載の薬学的／栄養補助食品。
【請求項１４】
１種または複数種の薬学的に許容可能な賦形剤と混合して、請求項１および２に記載のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションおよび／またはテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションを１種以上治療上有効量で含む、炎症性疾患、癌、およびフリーラジカルが媒介する疾患を治療するのに用いるための薬学的組成物または栄養補助食品。
【請求項１５】
そのような治療を必要とする哺乳類に治療上有効量の請求項１および２に記載のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションおよび／またはテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションを投与することを含む、炎症性疾患、癌、ならびにパーキンソンおよびアルツハイマーをはじめとするフリーラジカルが媒介する疾患の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラヒドロキシクルクミンおよびそのテトラヒドロ誘導体である、テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの濃縮フラクションを製造するプロセスに関する。これらの濃縮フラクションは、強力な抗酸化作用を示し、炎症を減少させる。本発明の生成物は、食品添加物、栄養補助食品用途、または薬用化粧品用途に適している。
【背景技術】
【０００２】
フリーラジカルは、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、および循環器疾患のような広範囲の病理疾患の開始および進行で大きな役割を果たす。食品産業では、フリーラジカルは、加工および貯蔵の間の食品劣化の原因であることがわかっている。このことを考慮して、食品への抗酸化剤添加および生体系への抗酸化剤補充によりフリーラジカルを捕捉することに大きな注目が集められてきた。抗酸化化合物は、２種類に分類することができる。フェノール類とβ-ジケトン類である。フェノール化合物は、まず水素原子供与体として作用し、それによりラジカル連鎖反応の伝播を阻害することにより、その抗酸化活性を発揮する。フェノール類の抗酸化能は、フェノール性ヒドロキシル基の数と配置、ならびに芳香環のその他の置換基の性質に依存する。天然の産物には、クルクミノイドなど同一分子にフェノール基およびβ-ジケトン基の両方を有し、したがって強力な抗酸化剤になるものがほとんどない。フェノール性ジアリールヘプタノイドであるクルクミンは、ウコン（クルクマロンガ）の特徴的な黄色構成成分であり、栄養補助食品、食品、および化粧品に広く使われている。図１は、クルクミン類、すなわちクルクミン、モノデメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、テトラヒドロキシクルクミン（本明細書中、Ｃ、ＭＤＣ、ＢＤＣ、ＴＣと示す）の化学構造を示す。これらの化合物は、抗酸化、抗炎症、抗癌、アルツハイマー、および抗ウイルス性の性質を保持すると報告された。４種のクルクミン全ての中で、ＴＣは、最も高い抗癌、抗酸化、および抗炎症活性を示す。しかし、天然のクルクミン混合物は、原材料に依存して、非常に低濃度（０−５％）でしかＴＣを含有しない。
【０００３】
現在、非ステロイド房の植物ベースの抗炎症剤へと需要が大きく動いている。５-リポキシゲナーゼは、アラキドン酸からロイコトリエンおよび５（Ｓ）-ＨＥＴＥ（炎症、アレルギー、および閉塞プロセスの重要なメディエータ）を生合成するための重要な酵素である。５-リポキシゲナーゼは、喘息、関節炎、潰瘍性大腸炎などの腸疾患、ならびに発作および虚血などの循環障害をはじめとする様々な炎症および過敏性によるヒトの疾患に対処する可能性を有する阻害剤を同定するための標的酵素である。
【０００４】
クルクミノイドに毒性がなく安全性が証明されており、また上記の問題を解決するテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションがないことから、炎症性疾患、フリーラジカル媒介疾患を処置する安全な健康補助食品、ならびに栄養補助食品用途および化粧品用途として濃縮テトラヒドロキシクルクミンを提供することが本発明の目的である。
【０００５】
【化１】
2009511573.tif 000002
図１：クルクマロンガのクルクミン類の化学構造。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、少量化合物のデメチルクルクミン（ＤＣ）、デメチルデメトキシクルクミン（ＤＭＤＣ）およびビスデメトキシクルクミン（ＢＤＣ）とともに、テトラヒドロキシクルクミン（ＴＣ）を含有するウコン（クルクマ種）抽出物から、テトラヒドロキシクルクミンの濃縮フラクションを製造するプロセスに関する。本発明はまた、動物に投与するためのこのフラクション、および様々な炎症症状を治療する方法も包含し、また本発明のフラクションを投与することにより様々な酸化疾患を予防する方法も包含する。
【０００７】
本発明の他の目的は、上記のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションから濃縮された無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン（ＴＨＴＣ）を製造するプロセス、ならびに本発明の無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンフラクションを投与することにより様々な炎症症状を治療し、および様々な酸化疾患を予防もする方法である。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、カラムクロマトグラフィーとそれに続く結晶化により、ＴＣ、ＤＣ、ＤＭＤＣ、およびＢＤＣを純粋な形で単離する方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
クルクマ種、特にクルクマロンガの有機溶媒抽出物は、全部で４種類のクルクミンを含んでいることがわかっている。これらを図１に示し、Ｃ、ＭＤＣ、ＢＤＣ、およびＴＣで示す。図１でＴＣと示されるテトラヒドロキシクルクミンの濃度は、天然のクルクミンフラクション中、０．１−５％にしかならない（Ｍｉｍｕｒａ  Ａｋｉｏら、ＵＳ５２６６３４４，１９９３年）。４種のクルクミンの中で、ＴＣが最も強力な抗癌、抗酸化、および抗炎症活性を示す。しかしながら、クルクミン混合物中のＴＣを濃縮するプロセスは報告されていない。
【００１０】
本発明は、クルクミンフラクション中のＴＣ濃度を上限１００％まで所望の濃度に濃縮することを目的とする。本発明の別の目的は、抽出物中に存在する強力でないクルクミンを脱メチル化により非常に抗酸化力の強いデメチルクルクミンに転換することである。この脱メチル化は、フラクションをＴＣ濃度のより高いものにする。純粋なＴＣは、簡単な精製プロセスによりＴＣ濃縮フラクションから得ることもできる。
【００１１】
簡単な化学反応とクロマトグラフ法による精製の組合せがこれらの目的を達成させる。
【００１２】
【化２】
2009511573.tif 000003
図２：テトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションの構成要素の化学構造
【００１３】
天然のクルクマ抽出物から得られる本発明のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションは、全部で４種類の化合物を含有する。それらを図２に示し、ＴＣ、ＤＣ、ＢＭＤＣ、およびＢＤＣで示す。ＴＣの濃度は、１０−１００％の範囲である。
【００１４】
プロセスは、適した溶媒中、クルクマロンガ抽出物をルイス酸触媒で脱メチル化して、テトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションにすることを含む。アルミニウムハライドの他に有機塩基および触媒を脱メチル化に用いる。簡単な後処理後得られる乾燥物は、ＨＰＬＣ分析で、５０−８０％のＴＣを示した。
【００１５】
塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、三臭化ホウ素または三塩化ホウ素-メチルスルフィド錯体またはＮ-メチルアニリンのナトリウム塩またはナトリウムエタンチオレートまたは塩化リチウムのジメチルホルムアミド溶液または塩化ベリリウムなどのルイス酸触媒が用いられる。クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、および酢酸エチルなどの溶媒、またはそれらの混合物が用いられる。ピリジン、トリエチルアミン、ピペリジンなどの有機塩基が用いられ、触媒はヨウ化ナトリウムもしくはヨウ化カリウムから選択されるか、テトラブチルアンモニウムブロミドなどのＰＴＣ触媒が用いられる。
【００１６】
純粋なＴＣは、テトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションからクロマトグラフ法により得られる。シリカゲル、逆相シリカ、アルミナ、およびセファデックスなどの固体支持体をこのプロセスに用いることができる。クロマトグラフ技法は、重力落下カラム、フラッシュクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分取高圧液体クロマトグラフィー、およびそれらの組合せから選択される。アセトン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、ヘキサンおよび水などの溶媒が、単独また組合せで、重力落下カラム、フラッシュカラム、または中圧カラムを走らせるのに用いられる。
【００１７】
本発明は、クルクマ種、特にクルクマロンガの抽出物から５０％−１００％のＴＣを製造するプロセスに関し、このプロセスはこの抽出物の脱メチル化工程、続いてクロマトグラフ分離により５０％−１００％の範囲でＴＣが濃縮されたフラクションを得る工程を含む。
【００１８】
本発明はまた、極性溶媒および非極性溶媒を溶出液として用いるカラムクロマトグラフィー、続いて結晶化により、本発明のテトラヒドロキシクルクミンフラクション中の４種の化合物を全て純粋な形で単離するプロセスにも関する。単離された純粋なＴＣ、ＤＣ、ＤＭＤＣ、およびＢＤＣの構造（図２）は、それらの物理データおよびスペクトルデータ（ＩＲ、ＮＭＲ、および質量）から確認されている。
【００１９】
上記のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションはクルクミンよりも強力な抗酸化活性を示すものの、その黄色が強いため用途が限定されるかもしれない。無色の食品および化粧品に応用するため、本発明者らは、水素化プロセスによる無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンフラクションを発明した。クルクミンの水素化プロセスは、胃腸管でも自然に起こり得る。テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンフラクションもテトラヒドロキシクルクミンと同様な強い抗酸化剤であり、黄色ではないことと相まって、現在は従来の合成抗酸化剤が用いられている無彩色の食品および化粧品用途に有用なものとなる。
【００２０】
そこで、本発明は無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン（ＴＨＴＣ）濃縮フラクションを得ることも目的とする。
【００２１】
【化３】
2009511573.tif 000004
図３：テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンフラクションの化学構造
【００２２】
このテトラヒドロキシクルクミンフラクションからの本発明の無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションは、全部で４種のテトラヒドロ化合物を含有することがわかっている。それらを図３に示し、テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン（ＴＨＴＣ）、テトラヒドロデメチルクルクミン（ＴＨＤＣ）、テトラヒドロデメチルモノデメトキシクルクミン（ＴＨＢＭＤＣ）、およびテトラヒドロビスデメトキシクルクミン（ＴＨＢＤＣ）と示す。ＴＨＴＣ濃度は、１０−１００％の範囲である。
【００２３】
このプロセスは、適した溶媒中、金属触媒と、水素ガスまたは水素供与体を用いて二重結合を還元することによりＴＣ濃縮フラクションを水素化してテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン（ＴＨＴＣ）の濃縮フラクションにすることを含む。所望であれば、有機塩基も用いる。
【００２４】
パラジウムー炭素、ラネーニッケル、白金、亜鉛、またはマンガンなどの金属触媒が用いられる。酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、またはそれらの混合物などの溶媒が用いられる。ギ酸、酢酸、プロパン酸、またはギ酸アンモニウムなどの水素供与体が用いられる。トリエチルアミン、トリメチルアミン、またはピペリジンなどの有機塩基が用いられる。
【００２５】
純粋なＴＨＴＣは、上記のようにクロマトグラフ方法によりテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの濃縮フラクションから得られる。純粋なＴＨＴＣは、純粋なＴＣの水素化によっても得ることができる。
【００２６】
本発明は、上記の濃縮テトラヒドロキシクルクミンまたは精製ＴＣまたは無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの使用による炎症の治療法も記載し、活性は５-リポキシゲナーゼ活性の測定により支持された。本発明のテトラヒドロキシクルクミンフラクションまたは純粋なＴＣまたはテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの５-リポキシゲナーゼ阻害値の割合（表１）から強力な５-リポキシゲナーゼ活性が示され、この活性は既存の市販のクルクミン混合物のものより優れており、ボスウェリア・セラータ由来の強力な５-リポキシゲナーゼ阻害剤であるＡＫＢＡの活性に匹敵する。
【００２７】
本発明はまた、上記のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションまたは精製ＴＣまたは無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの使用による、ラジカルが媒介するヒトの合併症または食品の問題の治療または予防法も記載し、活性はスーパーオキシドおよびＤＰＰＨラジカル捕捉活性の測定により支持された。本発明のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションまたは純粋なＴＣまたは無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの阻害値の割合（表２）から強力な抗酸化活性が示され、この活性は既存の市販のクルクミン混合物、ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）、ビタミンＣ、およびビタミンＥのものより優れている。
【００２８】
本発明はまた、抗炎症症状を治療するための、ＴＣを７０−１００％含有するテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションの使用も記載する。抗炎症活性は、カラギーナン誘導肢浮腫法により実証された。上記のＴＣ濃縮フラクションは、５０ｍｇ濃度で２０．５６％の阻害を示したが、標準薬のジクロフェナクナトリウムは２５ｍｇ濃度で６３．１０％の阻害を示した。これらの結果から、本発明のテトラヒドロキシクルクミンフラクションは有意義な抗炎症活性を示したことが明らかである。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、上記のテトラヒドロキシクルクミンフラクションまたはＴＣまたは無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンの濃縮フラクションを薬学的に許容可能なキャリア（例えば、水性キャリアまたは非水性キャリア）中に含む薬学的配合物である。
【００３０】
本発明のなおさらなる態様は、治療上有効量（例えば、治療、進行の鈍化などに有効な量）の上記のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクションまたは純粋なＴＣまたは無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンを、それを必要とするヒトまたは動物被検体に投与することを含む、炎症性疾患の治療法である。
【００３１】
本発明のなおさらなる態様は、治療上有効量（例えば、治療、進行の鈍化などに有効な量）の上記の濃縮テトラヒドロキシクルクミンまたは純粋なＴＣまたは無色テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンを、それを必要とするヒトまたは動物被検体に投与することを含む、ラジカルにより媒介される疾患の予防法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は以下に与えられる実施例で記載されるが、それらは例示としてのみ提供され、本発明の範囲を制限するとして解釈されはしない。
【実施例１】
【００３３】
テトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクション。クルクミン混合物（９５％、５５ｇ）のＥｔＯＡｃ（２．５Ｌ）溶液を氷冷し、これに塩化アルミニウム（１５０ｇ）を加え、続いてピリジン（３５０ｍＬ）を１５分かけて滴下し、そして反応混合物を７時間加熱還流させた。１０℃まで反応混合物を冷却した後、冷希ＨＣｌ（２０％）を加えて塩化アルミニウム錯体を分解し、酢酸エチル（５×１．０Ｌ）で抽出した。混合酢酸エチル層を水、ブラインで洗い、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を濾過し、蒸発させた。残渣をクロロホルム（１００ｍＬ）で希釈して１０時間保ち、固体を濾過し乾燥させて生成物を得た（２１ｇ、３８％）。
【００３４】
ＨＰＬＣ分析：
ＴＣ      ＝７８．４０
ＤＣ      ＝４．１１
ＤＭＤＣ  ＝１１．５２
ＢＤＣ    ＝０．８６
合計      ＝９４．８９％
【実施例２】
【００３５】
テトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクション。クルクミン混合物（９５％、１１０ｇ）のＥＤＣ（４Ｌ）溶液を氷冷し、これに乾燥塩化アルミニウム（１６０ｇ）を加え、続いてピリジン（蒸留したもの、２００ｍＬ）を１５分かけて滴下し、続いてヨウ化ナトリウム（５ｇ）を加え、そして反応混合物を２７時間加熱還流させた。１０℃まで反応混合物を冷却した後、水（２Ｌ）で希釈し、ＨＣｌ（５０％）で酸性にし、そして１５分間撹拌した。有機層を分離して、水層が体積１０Ｌになるまで水を加えた。水層を室温で２時間撹拌して１６時間放置した。形成した固体を濾過し、水（２．５Ｌ）で洗い、そして乾燥させてデメチルクルクミンの粗混合物、９４ｇを得た。これを酢酸エチル（２．５Ｌ）中、７０-８０℃で１時間撹拌し、スーパーセルで濾過し、溶媒を蒸発させて生成物、８４ｇを得た。この固体をジエチルエーテル（５００ｍＬ）とともに室温で３０分間撹拌し、濾過し、乾燥させて生成物、５８ｇを得た。
【００３６】
ＨＰＬＣ分析：
ＴＣ      ＝７５．６８
ＤＣ      ＝６．３２
ＤＭＤＣ  ＝１１．２４
ＢＤＣ    ＝１．１
合計      ＝９５．３１％
【実施例３】
【００３７】
純粋なＴＣ［１，７-ビス（３，４-ジヒドロキシフェニル）-１，６-ヘプタジエン-３，５-ジオン］の単離。実施例２のデメチルクルクミン混合物（１Ｋｇ、７５％ＴＣ）をシリカゲル（１００-２００メッシュ、２Ｋｇ）に吸着させて、溶出液としてクロロホルム-メタノール（９５：５）を用いてシリカゲルカラムでクロマトグラフにかけ、純粋なＴＣを得た。これをクロロホルム-メタノールから再結晶させて黄色粉末とした（０．５Ｋｇ）、ｍｐ３０２-３０４℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４８８、３３８６、１６２９、１６１７、１６００、１２７１、１２８９、１１４２、１１２０、９５５ｃｍ-１；１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６）δ６．０６（１Ｈ、ｓ、Ｈ-４）、６．５６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ、Ｈ-２、６）、６．７７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、Ｈ-５’、５”）、７．００（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、Ｈ-２’、２”）、７．０６（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．３、１．８Ｈｚ，Ｈ-６’、６”）、７．４４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ、Ｈ-１、７）、１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６）δ１８３．１、１４７．８、１４５．１、１４０．８、１２７．７、１２６．５、１２１．９、１１５．９、１１４．５、１００．９；ＬＣ-ＭＳｍ／ｚ（％）：（ＥＳＩ-陰イオン化モード）３３９［（Ｍ-Ｈ）-、１００］。
【実施例４】
【００３８】
テトラヒドロキシクルクミンフラクション中の他の成分の単離および特性決定。実施例２のデメチルクルクミン混合物（１Ｋｇ）をシリカゲル（１００-２００メッシュ、２Ｋｇ）に吸着させて、溶出液としてクロロホルム-メタノール（９５：５）を用いてシリカゲルカラムでクロマトグラフにかけ、純粋なＤＣ、ＤＭＤＣ、およびＢＤＣを得た。以下は、単離された化合物のスペクトルデータである。
ＤＣ［１-（３，４-ジヒドロキシフェニル）-７-（３-メトキシ-４-ヒドロキシフェニル）-１，６-ヘプタジエン-３，５-ジオン］。黄色粉末、ｍｐ１６４-１６６℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３４８４、１６２１、１２６７、１１３２、１１４０、９６４ｃｍ-１、１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６）δ３．８２（３Ｈ、ｓ、Ａｒ-ＯＣＨ３）、６．０４（１Ｈ，ｓ、Ｈ-４）、６．５３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ-２またはＨ-６）、６．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ-２またはＨ-６）、６．７６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、Ｈ-５’）、６．８０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、Ｈ-５”）、７．０７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．５、１．８Ｈｚ、Ｈ-６１）、７．００（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、Ｈ-２’）、７．１２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、Ｈ-２”）、７．２９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．３、１．８Ｈｚ、Ｈ-６”）、７．４４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ-１またはＨ-７）、７．５１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ-１またはＨ-７）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６）：１８３．０、１８３．２、１４８．６、１４７．９、１４７．７、１４５．１、１４０．８、１４０．７、１２６．５、１２２．８、１２１．９、１２１．０、１２０．７、１１５．９、１１５．６、１１４．６、１１１．０、１０１．０、５５．４；ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（％）：３５４（Ｍ＋、１６）、３３６（２０）、３２８（５４）、２７１（７１）、１９２（５３）、１９１（３０）、１７７（１００）、１６７（４７）、１６３（４９）、１５０（４０）、１４９（２４）、１４５（８４）、１３５（４８）、１１７（４２）、８９（５７）、７７（４３）。
ＤＭＤＣ［１-（４-ヒドロキシフェニル）-７-（３，４-ジヒドロキシフェニル）-１，６-ヘプタジエン-３，５-ジオン］。黄色粉末、ｍｐ２１８-２２０℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３３３８、１６２７、９６２ｃｍ’１；１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６）δ６．０６（１Ｈ、ｓ、Ｈ-４）、６．５９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．８Ｈｚ、Ｈ-２またはＨ-６）、６．６９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．８Ｈｚ、Ｈ-２またはＨ-６）、６．８３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、Ｈ-５”）、６．７９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ-３’、５’）、７．０３（１Ｈ、ｓ、Ｈ-２”）、７．０９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、Ｈ-６”）、７．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．９Ｈｚ、Ｈ-１またはＨ-７）、７．４７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．９Ｈｚ、Ｈ-１またはＨ-７）、７．５７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ-２’、６’）、９．１７（１Ｈ、ｂｒｓ、Ａｒ-ＯＨ）、９．６３（１Ｈ、ｂｒｓ、Ａｒ-ＯＨ）、１０．０４（１Ｈ、ｂｒｓ、Ａｒ-ＯＨ）；ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（％）：３２４（Ｍ＋、１８）、３０６（８）、２９９（３４）、２９８（９０）、２４２（３０）、２４１（１００）、１６３（４９）、１６１（２６）、１６２（３８）、１４７（８７）、１１０（４３）、１１９（３９）、９１（２１）、４４（３４）。
ＢＤＣ［１，７-ビス（４-ヒドロキシフェニル）-１，６-ヘプタジエン-３，５-ジオン］。黄色粉末、ｍｐ２２２-２２４℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３２１１、１６２０、１６００、１２６９、１１６８、１１４０、９５５、８３１ｃｍ−１；１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６）δ６．０３（１Ｈ、ｓ、Ｈ-４）、６．６８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ-２、６）、６．８０（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ-３’、５’、３”．５”），７．５０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、Ｈ-１、７）、７．５５（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ-２’、６’、２”、６”）；ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（％）：３０８（Ｍ＋、２０）、２９０（１４）、１５９（３６）、１４６（１００）、１４７（８７）、１１９（３８）、１０６（４２）、９０（４２）、６５（３２）。
【実施例５】
【００３９】
テトラヒドロテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクション。実施例２のテトラヒドロキシクルクミン濃縮フラクション（９５％、２５ｇ）の酢酸エチル（１００ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（５０ｍＬ）およびパラジウム-炭酸カルシウム（５％、３．７５ｇ）を加え、続いて還流温度でギ酸（８ｍＬ）を１時間かけて滴下した。反応混合物を８時間還流させた。２時間の間隔で周期的にギ酸（４．５ｍＬ）を加えた。反応完了後、溶媒を留去した（約５０ｍＬ）。冷やした反応混合物を、ＨＣｌ（５０％）で酸性にし、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した。溶液をスーパーセルで濾過し、酢酸エチル層を分離した。水層をさらに酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出し、酢酸エチル層を合わせて水、ブラインで洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液を濾過し、容積１０ｍＬまで蒸発させて、ヘキサン（２０ｍＬ）で希釈した。溶出液としてクロロホルム-メタノール（１０％、１００ｍＬ）を用いて、溶液をシリカゲルカラムに通し、低融点の固体として生成物（１３ｇ）を得た。
【００４０】
ＨＰＬＣ分析：
ＴＨＴＣ      ＝７２．８６％
ＴＨＤＣ      ＝１５．９８％
ＴＨＤＭＤＣ  ＝７．５６％
ＴＨＢＤＣ    ＝０．１２％
合計          ＝９６．３９％
【００４１】
抗酸化剤活性
（ａ）スーパーオキシドフリーラジカル捕捉活性。ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）法によりスーパーオキシドフリーラジカル捕捉活性を求めた。反応混合物は、ＥＤＴＡ（６．６ｍＭ）、ＮａＣＮ（３μｇ）、リボフラビン（２μＭ）、ＮＢＴ（５０μＭ）、様々な濃度の試験薬のエタノール溶液、およびリン酸緩衝液（５８ｍＭ、ｐＨ７．８）を最終体積３ｍｌで含んだ。５６０ｎｍで光学密度を測定した。試験管を白熱灯で１５分間均一に照らし、その後光学密度を５６０ｎｍで再び測定した。対照の吸光度値と試験化合物の吸光度値を比較することで、阻害割合とスーパーオキシドラジカル生成を測定した。μｇでの濃度対阻害割合のプロットからＩＣ５Ｏ値を得た。
（ｂ）ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性。有色ＤＰＰＨのメタノール溶液の還元に基づいてＤＰＰＨ（１，１-ジフェニル-２-ピクリル-ヒドラジル）フリーラジカル捕捉活性を測定した。試験薬のエタノール溶液をＤＰＰＨのメタノール溶液に加えた場合のフリーラジカル捕捉活性は、ＤＰＰＨ溶液の５１６ｎｍでの初期吸収および最終吸収の差に逆比例する。反応混合物は、ＤＰＰＨおよび様々な濃度の試験薬の１×１０-４ｍＭメタノール溶液を含んだ。試験管と対照管の吸光度値を比較することで、阻害割合を求めた。
【００４２】
５-リポキシゲナーゼ活性：比色法を用いて、テトラヒドロキシクルクミン混合物の濃縮フラクション、純粋なＴＣ、およびテトラヒドロテトラヒドロキシクルクミンフラクションを、それらの５-リポキシゲナーゼ阻害能についてスクリーニングした。アッセイ混合物は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）、５-リポキシゲナーゼ、様々な濃度の試験物質のジメチルスルホキシド溶液、およびリノール酸を最終体積０．５ｍＬで含んだ。上記反応混合物を５分間インキュベーション後、第二鉄-キシレノールオレンジ試薬０．５ｍＬを加え、２分後に分光光度計を用いて５８５ｎｍでＯＤを測定した。試験物質の代わりにビヒクルを用いた以外は同様な様式で、試験とともに対照試験を行った。試験溶液の吸光度を対照の吸光度値と比較することで、阻害割合を計算した。
抗炎症活性（カラギーナン誘導肢浮腫法）：
実験前に、動物（１８０−３００ｇの体重のいずれかの性別のアルビノウィスターラット）を水は絶やさずに全て断食させそして体重を測り、番号を付けて、無作為に３匹からなる群に分けた。最初の足の体積をプレチスモメーターで測定し記録した。全ての群に、対応する試験物質を胃管を用いて経口で与えた。対照群には、１０ｍＬ／Ｋｇのビヒクル（０．５％、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩）を与えた。３０分後、全ての動物の左後肢の足裏部分に、１％カラギーナン０．１ｍＬを皮下針を用いて皮下注射した。全ての動物に水２０ｍＬ／Ｋｇ体重を投与して、３時間水のない状態を維持した（均一な水分補給を維持した）。３時間後、全ての動物の足の体積を２回測定し、２回の測定の平均値を記録した。試験物質を与えられた群の足浮腫と対照群の足浮腫を比較することで、足浮腫の阻害％を計算した。
【００４３】
【表１】
2009511573.tif 000005
ＢＨＡ：ブチル化ヒドロキシアニソール；ＢＨＴ：ブチル化ヒドロキシトルエン
ＩＣ５０値が下がるほど、抗酸化活性は高くなる。
【００４４】
【表２】
2009511573.tif 000006
ＡＫＢＡ：アセチル-ケト-ボスウェリア酸；ＮＤＧＡ：ノルジヒドログアヤレチック酸
【国際調査報告】
2009511573.tif 000007