(57)【要約】  その必要がある患者の皮膚における脂質生成を局所的に阻害するため、および／またはその必要がある患者の皮脂腺のサイズを縮小するため、および／または重症の座瘡および脂漏症の局所的処置のための医薬を製造するための、４−オキソトレチノイン、４−オキソイソトレチノインおよびそれらの混合物から選択される化合物の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−オキソトレチノイン、４−オキソイソトレチノインおよびそれらの混合物から選ばれる化合物の使用であって、その必要がある患者の皮膚における脂質生成を阻害し、および／またはその必要がある患者の脂質腺の大きさを縮小する、局所的投与のための医薬を製造するための使用。
【請求項２】
４−オキソトレチノイン、４−オキソイソトレチノインおよびそれらの混合物から選ばれる化合物の使用であって、重度の座瘡および脂漏症の局所的処置のための医薬を製造するための使用。
【請求項３】
重度の座瘡を処置するための、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
重度の座瘡が凝塊性座瘡である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
重度の座瘡が結節嚢胞性座瘡である、請求項３記載の使用。
【請求項６】
座瘡が、リーズ改訂座瘡格付け体系による、第７級またはそれ以上の顔面座瘡、あるいは該体系による、第５級またはそれ以上の背部もしくは胸部座瘡である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
座瘡が、リーズ改訂座瘡格付け体系による、第９級またはそれ以上の顔面座瘡、あるいは該体系による、第６級またはそれ以上の背部もしくは胸部座瘡である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の、４−オキソトレチノインの使用。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の、４−オキソイソトレチノイン、または４−オキソイソトレチノインおよび４−オキソトレチノインの混合物の使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の４−オキソイソトレチノインの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重度の皮膚科障害の処置のための、特に、重度の座瘡および脂漏症の処置のための、レチノイドである４−オキソ−全トランスレチノイン酸（４−オキソトレチノイン）および４−オキソ−１３−シスレチノイン酸（４−オキソイソトレチノイン）の使用に関する。
【０００２】
座瘡は、ホルモン、皮膚の油脂および細菌間の、毛胞の炎症を招く相互作用によって生じることが知られている。座瘡は、ほとんど、顔面、上胸部、肩および背部に発生し、吹出物、ならびにときには嚢胞および膿瘍（膿汁に満ちていることもある）を特徴とする。
【０００３】
脂質腺は、油状の物質（皮脂）を分泌して、皮膚の中間層である真皮内に存在する。これらの腺は、毛胞に付着している。皮脂は、皮膚の死細胞とともに、脂質腺および毛胞から上昇し、毛穴をとおして皮膚表面に出てくる。
【０００４】
座瘡は、乾燥した皮脂、皮膚の死細胞および細菌の集塊が毛包を閉塞したために生じて、皮脂が毛穴から脱出するのを遮断する。遮断が不完全ならば、ブラックヘッド（開放面疱）が発生し、遮断が完全ならば、ホワイトヘッド（閉鎖面疱）が発生する。遮断された皮脂が充満した毛包は、毛包内に常在する、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）なる細菌の過剰増殖を促進する。この細菌は、皮膚を刺激する物質へと皮脂を分解する。その結果生じる炎症および感染は、にきびとして一般的に知られる皮疹を生じる。感染が悪化するならば、膿瘍が形成されて、皮膚内に破裂し、遙かに多くの炎症を生起する。
【０００５】
座瘡は、当然、軽症から甚だしい重症まで重篤度に変化がある。軽症の（表在性の）座瘡の人々は、少数の炎症を生じていないブラックヘッド、または程々の数の小さい、軽く刺激された吹出物のみを、大部分は顔面に発症するにすぎない。ブラックヘッドは、正常色の皮膚の小さい腫脹の中心にある、小さく黒点のように見える。吹出物は、僅かに不快であり、赤味を帯びた皮膚の小部域によって囲まれた白色の中心を有する。一方、重症の（深い、または嚢胞性の）座瘡の人々は、無数の大きい、赤色の、膿汁に満ちた、疼痛を伴うしこり（小結節）を有して、それらは、ときには合体さえして、皮膚の下で巨大な、滲出性の膿瘍となる。
【０００６】
軽症の座瘡は、通常、瘢痕を残さない。重症の座瘡の小結節および膿瘍は、破裂することも多く、治癒後も、代表的には瘢痕を残す。瘢痕は、小さく深い穴（アイスピック瘢痕）；様々な深さの比較的幅広い穴；または大きい、不規則なくぼみであり得る。座瘡の瘢痕は、終生存続し、しばしば、美容上重大である。
【０００７】
座瘡のための処置の一選択肢は、レチノイドであって、かつては、座瘡および脂漏症を含む、多数の皮膚科学的障害の処置について広汎に記載された。
【０００８】
クリーム剤およびゲル剤のような、局所的な全トランスレチノイン酸（トレチノイン）は、軽症形態の座瘡を処置するために市販されているが、より重症形態の座瘡および脂漏症には適切でないことが証明されている。
【０００９】
そのような重症形態の脂漏症および、特に、座瘡の適切な処置のため、レチノイドの経口投与が必要であると判明した。経口投与される１３−シスレチノイン酸（イソトレチノイン）は、１９８２年に導入されたとき、重症形態の座瘡の処置を大改革し、現在まで、重症の座瘡を治療できる唯一の治療法であり続けている。経口イソトレチノインは、特に脂質生成の阻害による皮脂産生の実質的な削減を含み、患者の皮脂腺の大きさの縮小をもする、主要なすべての病因因子に影響する唯一の処置であるために、座瘡に対してそのように効果的なのである。こうして、経口イソトレチノインは、過去１０年間に、重症の座瘡の患者の８０％に長期寛解が可能である、座瘡治療法の確たる基準として確立された。
【００１０】
しかしながら、イソトレチノインは、他の多くのレチノイドと同様に、特に、全身的に投与されたとき、出生時欠損；自殺の危険性を包含する精神衛生の問題；たとえば、視覚の永久的喪失へと導き兼ねない、脳圧の無統制の上昇；肝、膵、腸および食道の損傷；あり得る骨および筋の問題；血中における高レベルのコレステロールその他の脂肪の発生；およびその他のような、いくつかのひどい副作用を生じる可能性があることが知られている。それが、全身イソトレチノインが、通常は、たとえば、重症の結節性座瘡（イソトレチノインのあり得る利益がその危険性に優ると考えられる）の処置のための、たとえば、全身的抗体のような、その他の座瘡処置によって治癒することができない重症形態の座瘡の処置にのみ、適用されるにすぎない理由である。
【００１１】
局所投与のためのレチノイド配合物は、投与部位から局所投与に関係する作用部位までの薬物の経路が実質的により短い（より少ない全身的さらしを招く）ために、確かに、あり得る副作用のリスクに関しての改善を提供する。しかし、局所レチノイドは、面疱消散(comedolytic)効果のみを有するにすぎない。それらは、小嚢上の上皮層の落屑を正常化するのに実質的に有効であり、既存の面疱の流出を改善し、新たな微細面疱の形成を防止し、小嚢上の微細環境を回復する。局所トレチノインも局所イソトレチノインも、真皮の脂質生成および皮脂産生に対する影響を有することは見出されていない［Ch. Zouboulis, "Modern acne treatment", Akt. Dermatol. 2003, 29, 49-57］。
【００１２】
しかし、軽症の座瘡に比して、より重症形態の座瘡は、罹患した皮膚の真皮および表皮における増大した脂質生合成によって強く特徴付けられることが知られている［S. Shuster; M.F. Cooper; D. McGibbon; P.D. Wilson; "Epidermal Lipid Biosynthesis in Acne", Br. J. Dermatol., 1980; 103:127-130］。
【００１３】
前記の事実によれば、当技術においては更に、局所イソトレチノインは、経口イソトレチノインとは対照的に、重症の座瘡および脂漏症の処置に役立たないことが知られている。これは、局所投与後、イソトレチノインの経口投与後に得られる効果に比して、皮脂腺の大きさを縮小し、皮脂産生を抑制する、イソトレチノイン効果の９０％減少が知られていることによる。トレチノインの低い局所的な薬効は、経口投与後の前記の薬理学的効果を創造するのに有効なイソトレチノインの代謝産物が、皮膚の生理学的環境では形成されないことを示していることがあり得る。
【００１４】
イソトレチノインの代謝産物に関しては、４−オキソイソトレチノインおよび生理学的条件下でのその平衡化合物である４−オキソトレチノインは、該化合物を全身的に適用したときのイソトレチノインの主要な代謝産物であることが更に知られている。
【００１５】
更に、４−オキソイソトレチノインおよび４−オキソトレチノインは、医薬品としての使用について既に示唆されている。米国特許第４，１６９，１０３号明細書は、哺乳動物における腫瘍成長を低減するための４−オキソトレチノインおよび４−ヒドロキシトレチノインの使用を記載している。この参考文献の該主な主題と実際には関連せずに、４−オキソトレチノインおよび４−ヒドロキシトレチノインは、座瘡、乾癬および増大するまたは病理学的に変化する角質化の増大を特徴とする皮膚科学障害はもとより、炎症性およびアレルギー性の皮膚科学的状態の、全身および局所療法にも役立つはずであると、更に述べている。しかし、この無関係の開示は別としても、この参考文献は、皮膚科学的状態の処置に関しては完全に沈黙し、特に、重症の座瘡に関連する、皮脂腺の大きさおよび病理学的な真皮の脂質生成についての４−オキソトレチノインまたは４−ヒドロキシトレチノインのあり得る効果については何も触れていない。
【００１６】
更に、英国特許出願公開第２，１５６，６７６号公報は、４−オキソイソトレチノインおよび４−ヒドロキシイソトレチノインを、座瘡および脂漏症の処置に適切な、薬学的および化粧配合物の活性成分として用いることができることを開示している。好適な投与経路は経口であるが、液剤、ローション剤または洗髪剤の形態での局所投与も記述されている。該参考文献には、該化合物による処置について実際に想定される、座瘡および／または脂漏症の重篤度に関して、指摘は一切存在せず、また重症形態の座瘡に関連する、皮脂腺の大きさおよび病理学的な真皮の脂質生成についての４−オキソトレチノインまたは４−ヒドロキシトレチノインのあり得る効果については、やはり何も触れていない。
【００１７】
非常に最近、４−オキソイソトレチノインは、経口的に適用されたとき、皮脂の分泌率を減少させることが更に示された［Canadian Dermatology Accociation Meeting 2003］。しかし、４−オキソイソトレチノインは、その親薬物であるイソトレチノインの半分しか薬理学的に活性がないことが見出された［Ulf-W Wiegand "Roaccutane（登録商標）- Important New Data for Efficacy and Safety Business Briefing" European Pharmacotherapy 2003］。
【００１８】
ここに、局所投与された、４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインは、両者とも、重症の座瘡を処置するための現在の確たる基準である、経口投与されたイソトレチノインに少なくとも匹敵する程度にまで、皮膚における脂質生成を阻害し、および／または皮脂腺の大きさを縮小するのに効果的であることが見出された。
【００１９】
更に、４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインは、皮膚に局所投与されたとき、局所的に適用されたときにほとんどすべてのレチノイド（イソトレチノイン自体も包含する）に伴う問題である、皮膚への、驚異的に弱い刺激を生じるにすぎないことも見出された。
【００２０】
したがって、本発明は、４−オキソイソトレチノイン、４−オキソトレチノインおよびそれらの混合物の群から選ばれる化合物の使用であって、その必要がある患者の皮膚における脂質生成を阻害し、および／またはその必要がある患者の皮脂腺の大きさを縮小する、局所投与のための医薬を製造するための使用に関する。
【００２１】
もう一つの態様では、本発明は、４−オキソイソトレチノイン、４−オキソトレチノインおよびそれらの混合物の群から選ばれる化合物の使用であって、重症の座瘡および脂漏症の局所的処置のための医薬を製造するための使用に関するものである。
【００２２】
座瘡、特に、尋常性座瘡は、一般的には、３種類の形態、すなわち、軽症の、程々の、または重症の座瘡に区分される。
【００２３】
座瘡は、しばしば、病因論(ethiology)では多因子性である皮脂毛包(follicle)の慢性疾患であり、特に、顔面に発生するが、顔面でない皮膚、たとえば、背部、肩または胸部にも発生する。
【００２４】
軽症および程々の座瘡が、皮膚表面の薄い層の下に皮脂が蓄積したときに生じる、いわゆる、ホワイトヘッド、すなわち、閉鎖面疱、および酸化により暗く見える、ケラチノサイトの中核によって拡げられた毛包から結果として生じ、実質的に炎症ではない、ブラックヘッドまたは開放面疱の唯一の存在により主として特徴づけられるのに対し、重症形態の座瘡は、炎症および病変、特に、丘疹、膿疱、小結節または嚢胞の存在により主として特徴づけられる。
【００２５】
丘疹は、直径が１．０cmまたはそれ以下の隆起した病変であり、一方、膿疱は、膿汁を含む、類似の病変である。小結節は、１．０cmまたはそれ以上の病変であって、しばしば、より深く、またはより高く延伸し、触ると固いことが多い。嚢胞は、液体、しばしば膿汁で満ち小結節である。
【００２６】
重症の座瘡は、明確に視認できる瘢痕化を生じ、深い炎症性小結節を生じることになる。この状態のもう一つの名称は、膿疱性座瘡であって、背部、胸部および肩まで拡がる、無数の面疱、丘疹および膿疱、ならびに顔面、頚部および胴体上部の、無数の大きい嚢胞または小結節、ならびに重篤な瘢痕化により主として特徴づけられる。重症の座瘡の下位群のうちには、下記のものがある。
【００２７】
凝塊性座瘡は、重症の座瘡の慢性形態であって、深い膿瘍；強い炎症；皮膚に対する重篤な損傷；大規模な瘢痕化；多数の面疱の周囲に形成され、崩壊して、膿汁を放出するまで成長する炎症性小結節；小結節の下に形成されて、ケロイド型瘢痕を生成する深い潰瘍；および深く潰瘍化した小結節を覆って形成される痂皮（かさぶた）を示す。膿瘍は、深い、不規則な瘢痕を形成することがある。凝塊性座瘡は、治癒せずに、むしろ急速に悪化する、座瘡嚢胞、丘疹または膿疱により、先行されえ、ときには、何年も休止していた座瘡で再発する。
【００２８】
結節嚢胞性座瘡は、嚢胞を有する重症の座瘡である。それらは、孤立して生じるか、または顔面、頚部、頭皮、背部、胸部および肩を覆って拡散することがある。それらは、非常に疼痛性であることもある。座瘡嚢胞は、炎症を有する小結節である。膿疱は、濃密で黄色の膿汁様液体で満たされ、炎症を生じ、感染している。膿疱を排液するならば、無菌条件下で実施しなければならない。
【００２９】
「尋常性座瘡：合衆国厚生省食品医薬局の治療薬の開発（ＣＤＥＲ）２００５年９月及び座瘡分類に関する合意会議の報告」Washington, DC、１９９０年３月２４及び２５日［J. Am. Acad. Dermatol. 1991; 24: 495-500］なる産業界向け指針は、重症の座瘡の軽症ないし程々の形態からの区別に関する更なる詳細を含む。
【００３０】
更に、重症の座瘡と対比して、座瘡を軽症および程々の形態に分類するために、いくつかの格付け体系が存在し、その比較的新しい一つが、S.C. O'Brian, J.B. LewisおよびW.J. CunliffeによってJournal of Dermatological Treatment (1998), 9, 215-220に記載された、リーズ改訂座瘡格付け体系であり、顔面の座瘡を１２等級に（第１２級が最も重症）、および背部および胸部の座瘡を８等級に（第８級が最も重症）に区分する。
【００３１】
本願の目的のため、用語「重症の座瘡」は、好ましくは、たとえば、全身的な、特に、アキュテイン（accutane）またはロアキュテイン（roaccutane）のような、経口的なイソトレチノインでこれまで慣用的に処置されてきたような形態の座瘡を意味すると解される。これらの形態の座瘡は、膿疱結節性座瘡、凝塊性座瘡、電撃性座瘡、アクネ・インヴェルサ、および下記の特徴のいずれかが存在する尋常性座瘡の形態を含む、該特徴は、持続的または再発性の炎症性小結節、大規模な丘疹膿疱性疾患、進行性の瘢痕化、病巣または洞管からの、持続的な膿状および／もしくは漿液血液状の排液である。
【００３２】
上記のリーズ改訂座瘡格付け体系には、重症の座瘡は、該格付け体系によれば、第７〜１２の等級を有する、顔面座瘡の形態、ならびに第５〜８の等級を有する、背部および胸部の形態をカバーすると解される。
【００３３】
脂漏症は、過活動性の皮脂腺による、過度に油性の皮膚であり、通常、座瘡に関係する。本願の目的のため、用語「重症の脂漏症」は、特に、上記に定義されたような、座瘡の重症形態関係する脂漏症に向けられる。
【００３４】
本発明の好適実施態様では、４−オキソイソトレチノインおよび４−オキソトレチノインは、重症の座瘡、特に、リーズ改訂座瘡格付け体系による、第７級、より具体的には、第９級またはそれ以上の顔面座瘡または該体系による、第５級、より具体的には、第６級またはそれ以上の背部もしくは胸部座瘡の処置のための医薬を製造するのに用いられる。
【００３５】
好適な更なる実施態様は、凝塊性座瘡の処置のための医薬を製造するための４−オキソイソトレチノインおよび４−オキソトレチノインの使用、または結節嚢胞性座瘡の処置のための医薬を製造するための該化合物の使用である。
【００３６】
本発明の特定の実施態様は、更に、重症の座瘡および脂漏症の局所的処置のための医薬を製造するための４−オキソトレチノインの使用である。
【００３７】
更なる実施態様は、重症の座瘡および脂漏症の局所的処置のための医薬を製造するための、４−オキソトレチノイン、または４−オキソトレチノインおよび４−オキソトレチノインの混合物、好ましくは、４−オキソトレチノインの使用である。
【００３８】
好ましくは、４−オキソイソトレチノインおよび４−オキソトレチノインは、該レチノイドの副作用を可能な限り低く保つために、これらの化合物の内在性血漿レベルを有意に上昇させない投与量、すなわち、ヒトでは、４−オキソイソトレチノインについては、約４．８５±３．８９ng/ml（ｎ＝５０）、４−オキソトレチノインについては、約９．８８±７．５７ng/ml（ｎ＝４８）で適用される。本発明の特定の実施態様では、投与量は、大きく越えたときでさえ、動物において、奇形遺伝性を誘発しないように選ばれる。適切な投与量は、以下に記載され、たとえば、体重、年齢および疾患の最新状態のような、通常のパラメーターに基づいて医師により決定されうる。
【００３９】
４−オキソイソトレチノインおよび／または４−オキソトレチノインは、本発明によれば、たとえば、液剤、クリーム剤、軟膏またはゲル剤の形態でありうる、局所組成物の形態で使用されうる。これらの組成物は、該組成物中の活性成分のための、希釈剤、分散剤または担体として作用する、化粧上許容され得るビークルを更に含んでもよく、それにより、該組成物を皮膚に塗布したとき、その分配が促進される。該ビークルは、たとえば、液体もしくは固体の皮膚軟化剤、溶剤、保湿剤、増粘剤、乳化剤または充填剤のような、局所的適用形態に常用される更なる賦形剤も含むことができる。本発明の組成物中の活性成分の濃度は、好ましくは、約０．００１〜約１％、より好ましくは、約０．０２５〜約０．２％、最も好ましくは、約０．０５〜約０．１５％の範囲である。代表的な例は、約０．１％の４−オキソトレチノイン、および薬学的に許容され得る担体、ならびに場合により１以上の賦形剤を含む、局所組成物である。
【００４０】
局所的に適用できる医薬中の、４−オキソイソトレチノインおよび／または４−オキソトレチノインのそのような濃度は、適切な投与量レジメ、たとえば、体重５０〜１２０kgの成人の皮膚に、１日につき１ないし数回、たとえば、１〜４回、かつ適切な期間、たとえば、４週間ないし数ヶ月間で投与されるとき、大きな皮膚刺激を生じないことが見出されている。好適な投与量は、エリア（１０ｘ１０cm）あたり、０．５％以下の４−オキソトレチノインまたは１％以下の４−オキソイソトレチノインの有効量を含有するクリーム剤約０．５〜１gの、１日１〜２回の投与からなるであろう。
【００４１】
油／水クリーム剤の具体的な例は、たとえば、下記のとおりである：
活性物質                                  ０．１g
乳化性セトステアリルアルコール            ９．０g
液体パラフィン                          １０．５g
ワセリン                                １０．５g
水                                      ６９．９g
【００４２】
軟膏の具体的な例は、たとえば下記のとおりである：
活性物質                                  ０．１g
ウール（ラノリン）アルコール              ３．０g
セトステアリルアルコール                  ０．２５g
ワセリン                                ４６．７５g
水                                      ４９．９g
【００４３】
水性ゲル剤の具体的な例は、たとえば下記のとおりである：
活性物質                                  ０．１g
ブチル化ヒドロキシトルエン                ０．０２g
ヒドロキシプロピルセルロース              ２．０g
９９．５％エタノール                    ９７．０７g
【００４４】
４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインのin vitroでの潜在的遺伝毒性は、微量エームズ試験およびＭＮＴ試験で陰性である。
【００４５】
本発明に従って用いられる、化合物４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインの臨床的薬効は、たとえば、下記のプロトコールの概要に従って実施される、通常の臨床試験によって当業者に示されうる：
【００４６】
【表１】
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【００４７】
皮膚における脂質生成、およびファジーラットモデルにおける皮脂腺のサイズについての、４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインの効果の評価
ファジーラットは、出生時に、そのカールする鼻毛によって、表現型上の正常なきょうだいから、および１０〜１５日以後、波状の毛皮になる、短く、破断された体毛を有する当初はまばらなその毛並み（次いで、急速に体毛を失う）にもづき、識別することができる。約２月齢で、突然変異種のような表現型の外見は、まばらな縮れた毛皮からほとんど完全な無毛までにわたる。組織学的検査では、皮膚は、貧弱に発達して、ケラチン性の物質の集中的な薄層状の蓄積を含有する、様々な大きさの嚢胞性の毛包（肥大した皮脂腺に関係することが多い）を有する。同形式の貧毛を示す二つの変種が記載されている［Ferguson et al., Lab. Anim. Sci., 29: 459-465, 1979］。
【００４８】
そのため、このラットモデルは、皮膚における脂質生成および皮脂腺サイズについて、試験化合物の影響、したがって、該試験化合物の皮脂抑制効果を研究するのに、大いに適している。例として、Puhvelら［Arc. Dermatol. Res., 277: 395-399, 1985］は、ファジーラットモデルに、皮膚への局所投与後、１３−シスレチノイン酸（）の薬効をファジーラットモデルで研究し、無害の投与量で、局所１３−ＲＡ（シスレチノイン酸）は、検出可能な皮脂抑制活性を実質的に示さないことを見出している。
【００４９】
材料および方法
試験物質、参照物質およびビークル
試験物質は、感光性を有し、そのため、低強度の光（＜１００Lux）によって照明された室内で操作された。
【００５０】
４−オキソトレチノインは、アセトン／エタノール１／１中、０．２％の４−オキソトレチノイン溶液を含有する２５本のバイアル、およびアセトン／エタノール１／１中、０．１％の４−オキソトレチノイン溶液を含有する２５本のバイアル内にアリコートされ、収容された。各バイアルを−２０℃で保管した。
【００５１】
試験物質の４−オキソイソトレチノインは、アセトン／エタノール１／１中、０．５％の４−オキソイソトレチノイン溶液を含有する２５本のバイアル、およびアセトン／エタノール１／１中、０．１％の４−オキソイソトレチノイン溶液を含有する２５本のバイアル内にアリコートされ、収容された。各バイアルを−２０℃で保管した。
【００５２】
正の参照、すなわち、１３−シスレチノイン酸は、０．０１％のα−トコフェロールとともにオリーブ油中に、２mg/mlとして懸濁させた１３−シスレチノイン酸（ＲＡ）１１mlをそれぞれ充填した、２４本のアンバーガラス製注射用バイアル内にアリコートされ、収容された。各バイアルを−２０℃で保管した。ビークルのアセトン／エタノール１／１は、２本の透明ガラス製２５ml入り実験用ボトル内に収容され、室温で保管された。
【００５３】
放射性元素
［４−14Ｃ］コレステロール（参照番号  ＣＦＡ１２８−５０ＵＣＩ、バッチ番号  １５１、５０μCi、１．８５MBq、３．７ＭＢq/ml、１００μCi/ml、Amersham Biosciences、フランス国）の放射性標識化リガンドを、購入し、トルエン溶液に溶解した。比放射能は、５８mCi/mmolであった。化合物は、供給者の指示に従って、受け入られ、保管され、操作された。
【００５４】
Ｄ−［Ｕ−14Ｃ］デキストロース（参照番号  ＣＦＢ９６−１ＭＣＩ、バッチ番号  ２２３、１mCi、３７MBq、７．４ＭＢq/ml、２００μCi/ml、Amersham Biosciences、フランス国）の放射性標識化リガンドを、購入し、３％エタノールを含有する水溶液に溶解した。比放射能は、２８１mCi/mmolであった。化合物は、供給者の指示に従って、受け入られ、保管され、操作された。
【００５５】
用量および投与経路
４−オキソトレチノインは、二つの濃度、すなわち、０．１および０．２％（１アリコート／用量／処置日）での即席アリコートとして用いられた。これを、２５μlのMicroman Gilsonピペットを用い、２５μl/2cm2の局所塗布によって投与した。
【００５６】
４−オキソイソトレチノインは、二つの濃度、すなわち、０．１および０．５％（１アリコート／用量／処置日）での即席アリコートとして用いられた。これを、Microman Gilsonピペットを用い、２５μl/2cm2の局所塗布によって投与した。
【００５７】
正の参照、すなわち、１３−シスレチノイン酸は、ダイズ外皮油中、２mg/mlとして用いられ、５mg/kgで経口経路（ＰＯ）によって投与され、投与量は１０mg/kgであった。
【００５８】
ビークル［エタノール：アセトン（１：１体積比）］は、Microman Gilsonピペットを用い、２５μl/2cm2の局所塗布によって投与した。
【００５９】
１１週齢の健康な雌のファジーラット１８匹を、Harlan（Gannat、フランス国）から入手した。動物は、慣用の、公認された動物飼育ユニット内に７日間維持されてから、研究は開始された。動物実験は、動物実験の倫理ガイダンス［Principle d'ethique de l'experimentation animale, Directive n°86/609 CEE du 24 Nov. 1986, Decret n°87/848 du 19 Oct. 1987, Arrete d'Application du 19 Avril 1988］に従って実施された。
【００６０】
動物は、温度（２１±１℃）、湿度（６０±５％）、光周期（明１２時間／暗１２時間）および換気の制御された条件下、室内で維持された。動物は慣用の状態に保もたれ；室温および湿度を絶えず監視した。空気取扱いシステムを、再循環なしに、毎時１４回の換気にプログラムした。一連のフィルターをとおして、新鮮な外気を通過させてから、各室内に均等に拡散させた。慣用の条件下で作業するすべての担当者は、動物飼養エリアに立ち入るときの衛生および着衣に関する特有の指針を遵守した。研究の開始（Ｄ０）から終了まで、試験物質が感光性を有するため、室は低強度の光（＜１００Lux）によって照明された。
【００６１】
動物は、飼料および水を提供するよう装備されたポリカーボネート製ケージ（ＵＡＲ, Epinay sur Orge、フランス国）内で飼育された。用いた標準的サイズのケージは、８００cm2であって、所内の標準的操作手順に従って、１ケージあたり最多３匹のラットを有した。動物の寝床は、無菌の鉋（かんな）屑、ＤＩＥＴＥＸ（Saint-Gratien、フランス国）であり、週２回交換された。
【００６２】
飼料は、ケージ頂部の金属の蓋に入れて、随意に動物に与えられた。水も、ゴム栓および吸飲管を備えた水ボトルから随意に与えられた。水ボトルは、週１回、浄化され、滅菌され。交換された。
【００６３】
１３−シスレチノイン酸（ＲＡ）、４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインでの動物の処置
Ｄ０に、雌のファジーラット１８匹を、体重の基準に従って、４群に無作為に群別した（試験物質および正の対照に５匹／群、ビークル群に３匹／群）：
ビークルの１群は、処置スケジュール（１日１回、週５日間、４週間、すなわち［Ｑ１Ｄｘ５］ｘ４週））に従って、すべての処置の間、同一の、２cm2という所定のパッチ（１ラットにつき１枚）で、賦形剤の局所貼付によって処置された（第１群、平均体重：２１２．３±１２．１g）。
１群は、処置スケジュール［（Ｑ１Ｄｘ５）ｘ４週］に従って、１０mg/kgの１３−シスレチノイン酸（ＲＡ）で経口的に（ＰＯ）処置された（第２群、平均体重：２１４．６±１０．５g）。
１群は、１ラットあたり、２種類の濃度（０．１および０．２％）の４−オキソトレチノインで処置された。各ラットは、処置スケジュール［（Ｑ１Ｄｘ５）ｘ４週］に従って、２種類の２cm2という所定のパッチで、試験物質の局所貼付によって処置された（第３群、平均体重：２１２．２±８．０g）。
１群は、１ラットあたり、２種類の濃度（０．１および０．５％）の４−オキソイソトレチノインで処置された。各ラットは、処置スケジュール［（Ｑ１Ｄｘ５）ｘ４週］に従って、２種類の２cm2という所定のパッチで、試験物質の局所貼付によって処置された（第４群、平均体重：２１３．８±１１／５g）。
【００６４】
実験設定を、下表に要約する。
【００６５】
【表２】
2009518318.tif 000003
【００６６】
処置後２時間、ラットを観察した。重大な体重減少は全く観察されなかったため、ラットの生育能力、挙動および体重を、実験の終了まで週２回記録した。体重減少を、各ラットの開始体重に対比して査定した。
【００６７】
実験の途上で、下記のいずれも生じなかったため、動物を殺さなかった：
罹患のサイン（悪疫質、衰弱、運動または摂食の困難）、
化合物の毒性（背中を丸める、けいれん）、
いづれかの日における２５％の体重減少、
【００６８】
４週間の処置期間の終点で、ペントバルビタール（参照番号  Ｐ３７６１、バッチ番号５９Ｈ０６１２、Sigma；腹腔内経路（ＩＰ）による７０mg/kg）を用いて、ＣＯ2の吸入による犠牲前に、動物を麻酔した。
【００６９】
脂質生成の研究
生検の採集
処置の終点で、ＩＰ経路による７０mg/kgのペントバルビタールで、動物を麻酔した。各ラットについて、試験物質で処置された領域ごとに、背部皮膚３mmの、二つの生検を採集した。各生検を秤量した。ＣＯ2の吸入によって、ラットを犠牲にした。
【００７０】
生検の半数は、脂質生成の更なる分析のために、直ちに、クレブス−リンゲル緩衝液（ＫＲＢ：ＮａＣｌ  １０８mM、参照番号  Ｈ５２７１、バッチ番号  １０４１７６、Promega；ＫＣｌ  ４．７４mM、参照番号  Ｐ３９１１、バッチ番号  １１２Ｋ３７２０、Sigma；ＭｇＳＯ4  １．１９mM、参照番号  Ｍ５９２１、バッチ番号  ０３４Ｋ００６６、Sigma；ＣａＣｌ2  ２．５４mM、参照番号  Ｃ７９０２、バッチ番号  ０４４Ｋ０１６０、Sigma；ＫＨ2ＰＯ4  １．１９、参照番号  Ｐ５３７９、バッチ番号  ０２４Ｋ００５０、Sigma；ＮａＨＣＯ3  １８mM、参照番号  Ｓ６２９７、バッチ番号  ０８２Ｋ０１２５、Sigma；ウシ血清アルブミン  ０．２％、参照番号  Ａ９４１８、バッチ番号  ０８４Ｋ０５７８、Sigma；Ｄ−グルコース  ８．３mM、参照番号  Ｇ７５２８、バッチ番号  ０３３Ｋ０１２１、Sigma）中に移転された。
【００７１】
他方の生検は、更なるパラフィン包埋および皮脂腺の大きさの分析のために、４％パラホルムアルデヒド固定剤（ＰＡＦ；参照番号  1.04003.5000、Merck、フランス国）溶液の固定液中に移転した。
【００７２】
ビークルで処置したラットから、表皮からの脂質抽出率を評価するために、三つの皮膚生検を採集した。
【００７３】
放射性元素とのインキュベーション
生検（１７５〜４６６mg）を、１mlのＫＲＢ中、５μCiのＤ−［Ｕ−14Ｃ］デキストロース／ｍｌの存在下、３７℃、５％ＣＯ2で、３時間インキュベーションした。更に三つの皮膚生検を、ビークルで処置したラットから採集し、ＫＲＢ中、３７℃、５％ＣＯ2で、３時間インキュベーションした。インキュベーションの終点で、５μCiの［４−14Ｃ］コレステロール／ｍｌを加えた。このサンプルは、非特異的な放射能を算出させた。
【００７４】
真皮および表皮の分離
インキュベーションの後、生検を、ＫＲＢ３mlで３回洗浄した。Levang, A.K.ら［４］が記載した方法に従って、真皮および表皮を分離した。それには、皮膚生検を、６０℃の水中に４５秒間浸漬した。次いで、皮膚を取り出し、吸取紙にて乾燥し、皮膚の真皮側を下にしてピン止めした。表皮および真皮を解体によって分離し、表皮を秤量した。
【００７５】
表皮からの脂質の抽出
各画分（１００mg）の表皮を、外科用メスを用いることによって、小断片に裁断した。断片を、クロロホルム：メタノール［（体積比２：１）、参照番号  Ｃ２４３２、バッチ番号  ０５５Ｋ００７０、Sigma、フランス国：参照番号  Ｍ３６４１−１Ｌ、バッチ番号  １０４Ｋ３６４１、Sigma、フランス国］とともに、クロロホルム：メタノール（体積比２：１）１mlあたり組織５０mgの比率に従って、Potter-Elvehjem型ホモジナイザー［５］（参照番号  ４８７８０、Dutscher、フランス国）を用いてホモジナイズした。抽出の対照のため、インキュベーションの終点直前に、５μCiの［４−14Ｃ］コレステロール／ｍｌを表皮に加えた。
【００７６】
次いで、混合物を、水０．２容で洗浄した。２相を、８００  x  gで、２０分間の遠心分離によって分離した。各相の体積は、上方の相（水相）が４０％であり、下方の相（有機相）が６０％であった。上相を、非常に注意深く、かつ下相を乱すことなく除去した。
【００７７】
下相を、液体シンチレーション計数管（Beckman、フランス国）により、シンチレーション液（参照番号  ＮＯＣＳ１０４、バッチ番号  Ａ４３４０、Amersham、フランス国）１５ml中で、放射能を計数するために、シンチレーション管（参照番号  ７２０−０４９４、Amersham、フランス国）内に移した。
【００７８】
放射性標識化されたデキストロースの比放射能を、Ｄ−Ｕ−14Ｃ−デキストロース１μlをクロロホルム：メタノール（体積比２：１）１mlおよびシンチレーション液１５ml中に加えることによって評価した。放射能のカウント（cpm）は、比放射能をcpm/nmoleとして決定させた。
【００７９】
放射性標識化されたコレステロールの比放射能を、［４−14Ｃ］コレステロール５μlをクロロホルム：メタノール（体積比２：１）１mlおよびシンチレーション液１５ml中に加えることによって評価した。放射能のカウント（cpm）は、比放射能をcpm/nmoleとして決定させた。
【００８０】
皮脂腺の大きさ（サイズ）の研究
皮脂腺のサイズは、生検の組織学的研究によって評価した。４％ＰＡＦ中で固定された生検を、ＡＳＰ３００（Leica）自動装置によって、下記の手順に従って、パラフィン包埋した：
【００８１】
【表３】
2009518318.tif 000004
【００８２】
生検の組織学的切片を実現した（５枚／生検）。各１枚を、ヘマルン／エオシン／サフランＯＴＴＩＸ着色法によって、下記のプロトコールに従って着色した：
【００８３】
【表４】
2009518318.tif 000005
【００８４】
ＣＫＸ４１光学顕微鏡（Olympus、フランス国）を用いることによって、顕微鏡的観察を実施した。１切片／生検内の各皮脂腺を、ディジタルカメラ（Pwershot A80、Canon）で数値化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア１．３２ｊを用いることによって測定した。
【００８５】
脂質生成の分析
放射性標識化されたデキストロースの比放射能を、Ｄ−［Ｕ−14Ｃ］−デキストロース１μlをクロロホルム：メタノール（体積比２：１）１mlおよびシンチレーション液１５ml中に加えることによって評価した。放射能のカウント（dpm）は、比放射能をcpm/nmoleとして決定させた。
【００８６】
放射性標識化されたコレステロールの比放射能を、［４−14Ｃ］コレステロール１μlをクロロホルム：メタノール（体積比２：１）１mlおよびシンチレーション液１５ml中に加えることによって評価した。
【００８７】
脂質抽出率を、下記のとおりに算出した：
Ｒ＝（抽出後のｄｐｍ［４−14Ｃ］コレステロール）／（抽出前のｄｐｍ［４−14Ｃ］コレステロール）  ｘ１００
これは、脂質抽出率を百分率で評価させる。脂質生成を、ｄｐｍの数／組織１００
mgとして評価した。
脂質生成＝ｃｐｍ  ｘ  Ｒ  ｘ  ＡＳ（Ｄ−［Ｕ−14Ｃ］−デキストロース）
【００８８】
皮脂腺のサイズの分析
１切片／生検  内の各皮脂腺を、ディジタルカメラ（Pwershot A80、Canon）で数値化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア１．３２ｊを用いることによって測定した。各群について、腺のサイズの平均を算出した。
【００８９】
統計的解析
VisualStat（登録商標）Professionalなるソフトウェア（Visualstat Computing、米国）に従って、スチューデント−ｔ検定を実施した。この研究は、両試験物質、すなわち、正の対照群とビークルの対照群との間の比較をさせた。
【００９０】
結果
ラット体重および全体的観察についての処置の効果
ファジーラット１８匹を、［（Ｑ１Ｄｘ５）ｘ４週］のスケジュールに従って、ビークル（第１群；ｎ＝３；局所投与）、正の対照の１３−シスレチノイン酸（ＲＡ）（第２群；ｎ＝５；１０mg/kg；経口(os)）、試験物質の４−オキソトレチノイン（第３群；ｎ＝５；用量  ０．１、０．２％；局所投与）および４−オキソイソトレチノイン（第４群；ｎ＝５；用量  ０．１、０．５％；局所投与）で処置した。局所的適用（２５μl）は、ラット皮膚上の２cm2のパッチで実施した。
【００９１】
ラットを、秤量し、表Ｉに示したとおり、Ｄ０で無作為群別し、実験の経過の間、週２回秤量した。
【００９２】
表Ｉ：無作為化日（Ｄ０）および処置期間終点（Ｄ２５）でのラットの体重。Ｄ０からＤ２５までの平均体重変化を算出した。各群について、平均体重変化（g）を平均±ＳＤとして表す。
【００９３】
【表５】
2009518318.tif 000006
【００９４】
各群について、ラットの平均体重は、処置の間徐々に増加し（第１群について、Ｄ０における２１２．２〜２１４．６gから、Ｄ２５における２３４．０〜２４４．３gまで）、これは、ビークルが無害であることを示唆した。しかし、第４群における平均体重変化は、第１群で観察されたそれとは統計的に差があった（それぞれ、２０．２±５．８gおよび３２．０±２．０g、ｐ＜０．０５）。この有意差は、Ｄ２１とＤ２５との間に出現した。これは、第１群における平均体重の増加によるものであった。
【００９５】
脂質生成の研究
処置の終点（Ｄ２５）で、ラットを麻酔し、皮膚生検を採集し、脂質生成を査定した。略述すると、生検を、クレブス−リンゲル緩衝液中、14Ｃ−デキストロースとともに、３７℃、５％ＣＯ2で、３時間インキュベーションした。真皮および表皮の分離後、表皮から全脂質を抽出した。β−計数管を用いて、放射能を計数した。
【００９６】
結果を、表IIに、各群および試験物質の用量について、組織１００mg中に集積した14Ｃ−デキストロースの、平均ＤＰＭおよび平均pmoleとして表す。
【００９７】
表II：表皮分離後の、皮膚生検における脂質生成の研究。結果は、各群について、組織１００mg中に集積した14Ｃ−デキストロースの、平均のＤＰＭおよびpmoleとして表す。（）：対照群の百分率（％）。
【００９８】
【表６】
2009518318.tif 000007
【００９９】
表皮では、ビークル群（第１群）について得られた脂質生成の値は、１００mgあたり、９．８２±１．９４pmoleの14Ｃ−デキストロースであった。１３−シスレチノイン酸（ＲＡ）で処置された群では（１００mgあたり、６．５５±２．３８pmoleの14Ｃ−デキストロース）、それが、スチューデント−ｔ検定（ｐ＜０．０５）によって決定された限り、有意に低下（３３％）した。
【０１００】
試験物質の４−オキソトレチノインで処置された群では、脂質生成は、０．２％の用量で低下した（ビークル群の６４％；１００mgあたり、６．３０±２．８０pmoleの14Ｃ−デキストロース）。０．１％の用量でも、弱い低下が観察された（ビークル群の９１％；１００mgあたり、９．１０±５．２３pmoleの14Ｃ−デキストロース）。
【０１０１】
試験物質の４−オキソイソトレチノインで処置された群では、脂質生成は、用量が０．１％で（ビークル群の７１％；１００mgあたり、６．９５±３．３１pmoleの14Ｃ−デキストロース）および０．５％で（ビークル群の８４％；１００mgあたり、８．２５±２．２８pmoleの14Ｃ−デキストロース）、低下した。
【０１０２】
皮脂腺のサイズの研究
処置の終点で（Ｄ２５；１０／１３／２００６）、ラットを麻酔し、皮膚生検を採集し、パラフィンに包埋してから、ヘマトキシリン／エオシン溶液によって染色した。次いで、生検を、顕微鏡の使用によって、観察し、数値化した。生検内のすべての皮脂腺を測定した。結果を、表IIIに、各群および試験物質の用量について、皮脂腺の平均のサイズ（画素2）として表す。
【０１０３】
表III：皮膚生検における皮脂腺のサイズの研究。結果は、各群について、画素2での平均のサイズ（大きさ）として表す。（）：対照群の百分率（％）。
【０１０４】
【表７】
2009518318.tif 000008
【０１０５】
１３−シスレチノイン酸（ＲＡ）での処置は、ビークル群と比較したとき、皮脂腺の大きさを縮小させた（３０，４１７±１７，４９４画素2から２５，４９３±１７，０６５画素2まで）。この減少した値は、スチューデント−ｔ検定によれば、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。比較のため、０．１％の４−オキソイソトレチノイン（処置の最低用量）で処置された第４群Ｂで、皮脂腺の平均の大きさを測定した。皮脂腺の平均の大きさは、２４，９８８±１５，９３１画素2であって、ビークル群（第１群；３０，４１７±１７，４９４画素2）と比較したとき、統計的に有意な減少であると判明した。
【０１０６】
結論
ラットの体重は、４週間の処置の完全終了後、いずれの処置でも増加し、これは、試験された濃度で、試験物質が無害であることを示唆した。
【０１０７】
文献によれば［Puhvel et al., Arc. Dermatol. Res., 277: 395-399, 1985］、皮脂抑制剤として、局所１３−シスレチノイン酸（１３−シスＲＡ）の効果が、無毛（「ファジー」）ラットおよび無毛マウスで評価された。無害な投与量（すなわち、体重減少を誘導しない濃度）では、局所１３−シスレチノイン酸は、これらの種のいずれにおいて、検出可能な皮脂抑制効果を有さなかった。
【０１０８】
本研究では、無毛（「ファジー」）ラットにおいて、１３−シスレチノイン酸の経口処置が、皮膚生検（表皮）において、脂質生成の減少および皮脂腺のサイズの縮小をさせたことが示された。このことは、重症の座瘡のため、経口１３−シスレチノイン酸（たとえば、市販の１３−シスレチノイン酸医薬、Roaccutane（登録商標））で、好成績に処置される、ヒトでなされた知見と非常に良く相関する。
【０１０９】
４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインは、表皮における脂質生成を実質的に阻害した。
更に、例として、４−オキソイソトレチノインは、０．１％の用量で、皮脂腺のサイズを縮小させることが示された。
【０１１０】
両者について、すなわち、脂質生成の阻害および皮脂腺のサイズの縮小について、局所的適用後、４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインの予想外の活性は、重症の座瘡ならびに脂漏症の局所的処置のため、４−オキソトレチノインおよび／または４−オキソイソトレチノインの有用性を証明するものである。
【０１１１】
４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインの潜在的刺激性の評価
以下のデータは、レチノイドについて、４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインの驚異的に低い潜在的刺激性を示すものである。
【０１１２】
４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインの累積的な瀬在的皮膚刺激性を、雄のウィスター系ラット（ｎ＝５）で検討した。試験化合物を、アセトン／エタノール（１：１）に溶解し、０、０．１、０．５、１または２％の濃度（限定された溶解度により、４−オキソトレチノインについての最高濃度、１．５％）で、背部の所定の皮膚エリア（部域：約２cm2）に、１日、１回宛４週間（週５日）、投与した。観察および検査は、皮膚反応の臨床的追跡および研究の終点で切除された皮膚標本の組織病理学的検査を包含した。４−オキソイソトレチノインでは、いかなる濃度でも、皮膚刺激の徴候は認められなかった。４−オキソトレチノインでは、用量依存性の、僅かないし程々までの皮膚刺激が０．５％以上の濃度で認められ、臨床的に、発赤（紅斑）および時折の落屑として現れた。処置された皮膚エリア(部域)の組織病理学的検査は、皮脂腺の、濃度依存的角質増殖、表皮肥厚、および肥大／過形成を示し、１％以上の濃度で、時折の壊死がみられた。ヒトでは、クリーム剤として局所的に適用された、イソトレチノインおよびトレチノインは、０．１％および０．０５％の強さで局所的刺激を示した。
【０１１３】
皮膚における２種類の４−オキソ異性体の相互転換
ラット（１化合物につきｎ＝５）への、１．５％または２％の、それぞれの４−オキソトレチノインおよび４−オキソイソトレチノインの局所投与の後、４−オキソイソトレチノインおよび４−オキソトレチノインの皮膚およびストリップレベルを、一連のサンプルにおいて、で決定した。適用された化合物を考慮することもなく、４−オキソイソトレチノインおよび４−オキソトレチノインの双方への皮膚の接触は、２異性体間の相互転換が生じたことを示すことを証することができた。４−オキソ異性体のin vivoでのこの相互転換は、皮膚表面でも配合物中でもなくて、皮膚内部で生じることを証明した。
【国際調査報告】
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