(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病のマーカー、即ちヒトのＣＳＦ中のアミロイド−βオリゴマーの検出方法に関する。この方法は、Ａβペプチドオリゴマーに結合する抗体に関与するエピトープをデマスキングする工程と、エピトープに結合した蛍光標識抗体を、好ましくはＦＲＥＴ技術を用いて検出する工程を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中のアミロイド−βペプチドオリゴマーを検出する方法であって、
ａ）アミロイド−βペプチドオリゴマーの存在に関する被検体液のサンプルを準備する工程と、
ｂ）前記アミロイド−βペプチドオリゴマーに結合する抗体に関与するエピトープをデマスキングする工程と、
ｃ）前記デマスキング工程後の前記サンプルを、前記アミロイド−βペプチドオリゴマーのエピトープと結合する抗体集団を含む1つの抗体に接触させるとともに、前記抗体集団の一部分が第１蛍光マーカーで標識され、前記抗体集団のその他の部分が第２蛍光マーカーで標識される工程、又は
前記デマスキング工程後の前記サンプルを、前記アミロイド−βペプチドオリゴマーの少なくとも２つの異なるエピトープと結合する少なくとも２つの抗体に接触させるとともに、第１抗体が第１蛍光マーカーで標識され、少なくとも第２抗体が第２蛍光マーカーで標識される工程のいずれかを備え、
前記第１蛍光マーカーが、そのエネルギーを前記第２蛍光マーカーに移す供与体として作用し、前記第２蛍光マーカーは受容体として作用し、
前記方法はさらに、
ｄ）前記蛍光標識されたサンプルから放射される蛍光共鳴エネルギー移動信号の強度を測定することにより前記体液サンプルに存在するアミロイド−βペプチドオリゴマーを検出する工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記体液が脊椎動物の体液であって、好ましくは、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ及び齧歯類の体液であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記エピトープが、好ましくは、アミノ末端内のアミノ酸位置ａａ１−２４内に配され、
前記エピトープが、好ましくは、ａａ４−１３のエピトープ、ａａ１７−２４のエピトープ、ａａ１−５のエピトープ、ａａ１−１１のエピトープ、ａａ１−７のエピトープ、ａａ１５−２４のエピトープ、ａａ３−９のエピトープ、ａａ１１−２６のエピトープ、ａａ４−１０のエピトープ、ａａ１３−２８のエピトープ、ａａ１−１０のエピトープ、ａａ３１−４０のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１５−３０のエピトープ、ａａ１７−２４のエピトープ、ａａ１−２８のエピトープ、ａａ１２−２８のエピトープ、ａａ１７−４２のエピトープ、ａａ２０−４０のエピトープ、ａａ３７−４２のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１１−２８のエピトープ、ａａ１−６のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１２−２８のエピトープ、ａａ２５−３５のエピトープ、ａａ１５−３０のエピトープ、ａａ１７−２６のエピトープ、ａａ１−１２のエピトープ、ａａ３２−４０のエピトープ、ａａ３３−４２のエピトープからなる群から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記デマスキングが、１以上の界面活性剤を添加することにより実施され、
前記界面活性剤が、好ましくは、SDS、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、Triton X-100、Tween20、Nonidet P40等の非イオン界面活性剤、CHAPS等の両性イオン界面活性剤、テトラデシルトリメチル臭化アンモニウム（TTAB）等の陽イオン界面活性剤、及び／又はその他の変性デマスキング剤であって、
前記その他の変性デマスキング剤が、好ましくは、ギ酸、塩酸グアニジンもしくは尿素等の塩基性又は酸性試薬、又はアルカリ性水酸化物であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、臨界ミセル濃度よりも低い濃度で使用され、好ましくは約０．０１〜２重量％、より好ましくは０．０２〜１重量％で使用されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記デマスキング工程（ｂ）及び／又は前記接触工程（ｃ）の温度が、約１５〜４０℃、好ましくは１７〜３０℃の範囲であって、
前記デマスキング剤及び／又は前記抗体を用いた培養が、好ましくは約３０〜９０分であることを特徴とする請求項１乃至５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記体液が、脳脊髄液、血液、尿、涙液及び唾液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光共鳴エネルギー移動信号の前記強度が、フローサイトメトリー法又は測光法により測定されることを特徴とする請求項１乃至７いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）及び前記工程（ｃ）が、１つのバッチで同時に処理されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記デマスキング溶液中及び／又は抗体を含む溶液中に、プロテアーゼ阻害剤が添加されることを特徴とする請求項１乃至９いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病のマーカー、即ちヒトのＣＳＦ（脳脊髄液）及びその他の体液中のアミロイド−βペプチドオリゴマーを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も多く見られる神経変性認知症であり、平均死亡予測が７年である（非特許文献１）。現在の臨床研究は、この病気の治療法には有望な将来性があると指摘している（非特許文献２）。しかしながら、理想的な治療の実施及び重要な認知機能の適時保護には、ＡＤを早期発見するための診断手段が必須条件である。
【０００３】
最近の研究によると、Ａβのオリゴマー集合体は、細胞培養及び生体内において神経毒性を有し、これにより長期的に増強作用を抑制することが示されている（非特許文献３、４）。このような低分子量のＡβオリゴマーは、認知機能の一時的欠失を誘発することも示されている（非特許文献５）。神経細胞機能におけるオリゴマーの副作用をさらに実証するには、免疫療法を上手く用いてＡβオリゴマーを中和することにより、生体内のシナプス可塑性が元の状態に戻ることが挙げられる（非特許文献６）。ＡβオリゴマーがＡＤにおける神経毒性種であることを示す証拠として、Ａβオリゴマーの化学構造がヒト脳内でも発見されており、その濃度がＡＤ患者では非認知症の対照群と比較して７０倍高いことが挙げられる（非特許文献７乃至９）。
【０００４】
このようにして、本疾病の重症度は、斑の数よりもオリゴマー濃度に相関することが実証されている（非特許文献１０乃至１２）。そして、脳内に球形Ａβオリゴマーが存在することはＡＤの早期病理学的事象であることが提示されている（非特許文献１３）。したがって、Ａβオリゴマーの検査はヒトのＣＳＦまで拡大されてきた。そして、最近の研究により、本体液中にも安定なＡβオリゴマーが低量存在することが実証された（非特許文献１４乃至１７）。ＡＤ患者のＣＳＦは、非認知症且つ年齢一致の対照群と比較して、オリゴマーの濃度が一貫して高く、これはオリゴマー濃度と病状間の相関性を示すものである（非特許文献１７）。したがって、ＡβオリゴマーをＡＤの早期発見に有望なバイオマーカー及び好適なターゲットとすることができる。
【０００５】
上記の如く、Ａβオリゴマーの検出及び正確な定量化の高感度法が必要とされている。このような方法の１つとして、ＣＳＦ内のアミロイドβ由来拡散性リガンド（ADDLs）を測定するためのバイオバーコードアッセイが最近示されている（非特許文献１７）。この方法はかなり高感度ではあるものの重大な工程を比較的多く含み、これら工程はアッセイの一般的性能に影響を与える可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fitzpatricka, A.L, Kullerb, LH., Lopezc, O. L., Kawasd, CH. & Jaguste W. Survival following dementia onset: Alzheimer's disease and vascular dementia. J. Neurol. Sci. 229-230, 43-49 (2005).
【非特許文献２】Aisen, P. S. The development of anti-amyloid therapy for Alzheimer's disease: from secretase modulators to polymerisation inhibitors. CNS Drugs. 19, 989-996 (2005).
【非特許文献３】Walsh, D. M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002).
【非特許文献４】Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1 -42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
【非特許文献５】Cleary, J. P. et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 1, 79-84 (2005).
【非特許文献６】Klyubin, I. et al. Amyloid β protein immunotherapy neutralizes Aβ oligomers that disrupt synaptic plasticity in vivo. Nat. Med. 6, 556-561 (2005).
【非特許文献７】Kuo, Y.M. et al. Water-soluble Abeta (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains. J. Biol. Chem. 271, 4077-4081 (1996).
【非特許文献８】Roher, A. E. et al. Morphology and toxicity of Abeta-(1 -42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 271 20631 -20635 (1996).
【非特許文献９】Gong, Y. et al. Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A beta ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100, 10417-10422 (2003).
【非特許文献１０】Lue, L. F. et al. Soluble amyloid beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer's disease. Am. J. Pathol. 155, 853-862 (1999).
【非特許文献１１】McLean, CA. et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
【非特許文献１２】Enya, M. et al. Appearance of sodium dodecyl sulfate-stable amyloid beta-protein (Abeta) dimer in the cortex during aging. Am. J. Pathol. 154, 271 -279 (1999).
【非特許文献１３】Barghorn, S. et al. Globular amyloid beta-peptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease. J. Neurochem. 31, 834-847 (2005).
【非特許文献１４】Vigo-Pelfrey, C, Lee, D., Keim, P., Lieberburg, I. & Schenk, D. B. Characterization of beta-amyloid peptide from human cerebrospinal fluid. J. Neurochem. 611 , 1965- 1968 (1993).
【非特許文献１５】Pitschke, M., Prior, R., Haupt, M. & Riesner, D. Detection of single amyloid beta- protein aggregates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's patients by Fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Med. 4, 832-834 (1998).
【非特許文献１６】Walsh, D.M., Tseng, B.P., Rydel, R.E., Podlisny, M.B. & Selkoe, DJ. The oligomerization of amyloid beta-protein begins intracellularly in cells derived from human brain. Biochemistry 39, 10831 -10839 (2000).
【非特許文献１７】Georganopoulou, D. G. et al. Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 2273-2276 (2005).
【非特許文献１８】Dahlgren, K.N. et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J. Bio.l Chem. 277, 32046-32053 (2002)
【非特許文献１９】Wiltfang, J. et al. Elevation of beta-amyloid peptide 2-42 in sporadic and familial Alzheimer's desease and ist generation in PS1 knockout cells. J. Biol. Chem. 276, 42645-42657 (2001 ).
【非特許文献２０】Schoonenboom N. S. et al. Effects of processing and storage conditions on amyloid beta (1-42) and tau concentrations in cerebrospinal fluid: implications for use in clinical practise. Clin. Chem. 51 , 189-195 (2005).
【非特許文献２１】Stenh, C. et al. Amyloid-beta oligomers are inefficiently measured by enzymelinked immunosorbent assay. Ann. Neurol. 58, 147-150 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の課題は、Ａβオリゴマーの検出及び正確な定量化のための高感度法を提供することである。この方法は、実験者側で容易に管理可能な工程を備え、その工程数が少なく限られている一方、信頼性及び再現性が高いため、合理的なコストで商業ベースとして使用可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、体液中のアミロイド−β（Ａβ）ペプチドオリゴマーを検出する方法を提供する。この方法は、
ａ）アミロイド−βペプチドオリゴマーの存在に関する被検体液のサンプルを準備する工程と、
ｂ）前記アミロイド−βペプチドオリゴマーに結合する抗体に関与するエピトープをデマスキングする工程と、
ｃ）前記デマスキング工程後の前記サンプルを、前記アミロイド−βペプチドオリゴマーのエピトープと結合する抗体集団を含む1つの抗体に接触させるとともに、前記抗体集団の一部分が第１蛍光マーカーで標識され、前記抗体集団のその他の部分が第２蛍光マーカーで標識される工程、又は
前記デマスキング工程後の前記サンプルを、前記アミロイド−βペプチドオリゴマーの少なくとも２つの異なるエピトープと結合する少なくとも２つの抗体に接触させるとともに、第１抗体が第１蛍光マーカーで標識され、少なくとも第２抗体が第２蛍光マーカーで標識される工程のいずれかを備え、
前記第１蛍光マーカーが、そのエネルギーを前記第２蛍光マーカーに移す供与体として作用し、前記第２蛍光マーカーは受容体として作用し、
前記方法はさらに、
ｄ）前記蛍光標識されたサンプルから放射される蛍光共鳴エネルギー移動信号の強度を測定することにより前記体液サンプルに存在するアミロイド−βペプチドオリゴマーを検出する工程を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本アッセイの原理を示す。（ａ）アミロイド−βオリゴマーが、２つの特異的な抗アミロイド−βｍＡｂと、ＦＲＥＴを用いて検出されている。供与体抗体はAlexa Fluor 488標識されたクローン４Ｇ８であり、受容体抗体はAlexa Fluor 594標識されたクローン６Ｅ１０である。（ｂ）本アッセイは、ＣＳＦサンプルを、標識抗体を含む検出バッファで希釈するという１つの工程からなる。暗所で培養後、アミロイド−βオリゴマーがフローサイトメトリーを用いて検出される。
【図２】本アッセイの感度を示す。本アッセイの感度は、インビトロで集合したＡβ原線維（１ｎＭ以下から０．０ｎＭの濃度範囲）の滴定によって測定された。原線維の濃度は原線維を集合させるために用いた開始モノマーから推定したものであり、１つの原線維が１００−１０００モノマーに相当するため、測定された原線維の実濃度は、検出限界をフェムトモル範囲まで下げるものとなる。
【図３】Ａβモノマーは、フローサイトメトリーによって検出されない。Ａβのモノマーがフローサイトメトリーによって検出可能であるか否かを調査するために、Dahlgrenらの記述に基づき処理したＡβモノマー１−４２（Bachem社）１ｎＭを、供与体／受容体対とともに培養し、フローサイトメトリーを用いて分析した。どの事例においても信号は検出されなかった（ＦＳＣ対ＳＣ；ＦＬ１対ＦＬ３ ドットプロット；ａ、ｂ）。Ａβモノマーとは対照的に、インビトロで集合したＡβ原線維 [シードレスアミロイド−（１−４２）をＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich社）に溶解させて１００μＭとし、ＰＢＳで希釈して０．５μＭとし、３７℃で７２時間培養した。この原線維の使用濃度は開始モノマー濃度に基づく。] １ｎＭにおいて、ＦＲＥＴ事象が検出された（ＦＳＣ対ＳＣＣ；ＦＬ１対ＦＬ３；ｃ、ｄ）。これらは、本アッセイがモノマーＡβ（検出不可能）とＡβオリゴマーとを判別可能であることを示している。
【図４】ＣＳＦ内のアミロイドβオリゴマーのデマスキングを示す。溶液１及び溶液２を使用すると、アミロイドオリゴマーを効率的にデマスキングし、フローサイトメトリーによる効率的な検出を可能とする。
【図５】検出バッファの最適化を示す。０．５倍濃度の溶液１は、オリゴマーの検出に最適である。
【図６】本アッセイの検証を示す。（ａ）ＣＳＦサンプルが供与体抗体（4G8 Alexa Fluor 488）とともに培養される場合には、ＦＬ１チャネルの事象のみが検出される。（ｂ）ＣＳＦサンプルが抗体の供与体／受容体対とともに培養されると、ＦＲＥＴ事象（ＦＬ１及びＦＬ３）が検出される。（ｃ）ヒストグラム分析は、検出された事象（ＦＬ３無しの事象；緑色曲線）からＦＬ３チャネル（ＦＬ３有りの事象；赤色曲線）の推移を示す。（ｄ）ソートされたＣＳＦプールがウェスタンブロット法を用いて非還元条件下で分析された場合、Ａβオリゴマーが検出された（レーン２）。ソートされていないＣＳＦ２０μｌにはオリゴマーが検出されなかった（レーン３）。バンドの分子量の対照として、検出された５０ｐｇのアミロイドβモノマーがロードされた（Bachem社, Switzerland；レーン１）。（ｅ）抗オリゴマー特異性抗体Ａ１１を用いてソートされたＣＳＦのドットブロットは、ＣＳＦ内のオリゴマーの存在をさらに裏付けた（レーン３）。ドットブロットの対照として、健康な個体又はＡＤ患者から得られた脳ホモジネート５μｌが、それぞれレーン１とレーン２にロードされた。
【図７】本アッセイの臨床成績を示す。非認知症の被験者から得られた１７４つのＣＳＦサンプルを分析すると、年齢とＡβオリゴマー量との間の正の相関性が現れた。Ａβオリゴマー（ＦＲＥＴ事象）対年齢の散布図である。非認知症の対照被験者から得られた１７４つのＣＳＦサンプルを分析した結果、年齢とＡβオリゴマー量との間の正の相関性（ｒｈｏ＝０．２２；Ｐ＝０．００３６）が明らかになった。全ての値は２つの独立した測定結果の平均値である。線形回帰と９５％の信頼区間は実線で示されている。
【図８】本アッセイの天然Ａβオリゴマーの安定性、再現性及び臨床成績を示す。（ａ）ＣＳＦ内の天然Ａβオリゴマー検出における冷凍／解凍のサイクルの影響。ＣＳＦプール内に検出されたＡβオリゴマー濃度は冷凍／解凍サイクルを３回適用しても変動しなかった。（ｂ）フローサイトメトリーを用いた７つの異なるＣＳＦサンプルの分析。全てのサンプルは２重に分析され、値は平均値及び標準偏差を示している。（ｃ）ｂで分析されたＣＳＦサンプルのウェスタンブロット。ウェスタンブロット法によって検出されたＡβ量とオリゴマー量との間に相関性はなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
好適な実施形態とその利点は、下記の実施例、図面及び請求の範囲を含む詳細な説明により明らかなものとなる。
【００１１】
本発明は、体液中のアミロイド−βペプチドオリゴマーを検出する方法を提供することを目的とする。用語「体液」は、脊椎動物の体内に生じる全ての種類の液体を網羅する。典型例としては、血液、尿、涙液、唾液及び脳脊髄液が挙げられ、脳脊髄液が特に好ましい。他の全ての種類の体液を、オリゴマーアミロイド−βペプチドの存在に関する検査に用いてもよい。
【００１２】
体液は、好ましくはヒトから採取される。しかしながら、本方法に基づき、脊椎動物全種を検査可能である。脊椎動物としては、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ並びにマウス、ネズミ及びウサギ等の齧歯類が挙げられる。特に、ＡＤ又はその他神経変性病の初期罹患を示す全てのヒトを検査可能である。
【００１３】
第２の工程では、アミロイド−βペプチドオリゴマーに結合したタンパク質を、ペプチドから全て除去することが重要であり、この除去は、該タンパク質を抗体に接触させる前に行う必要がある。Ａβに結合したタンパク質の除去は、「デマスキング」と称される。信頼性のある検査結果を得るためには、Ａβのエピトープに結合した全てのタンパク質を少なくとも除去する必要がある。好ましくは、全ての異種タンパク質を除去する。
【００１４】
デマスキング工程は、好ましくは、体液を界面活性剤に接触させることによって実施される。界面活性剤は、好ましくは、陰イオン界面活性剤、又は界面活性剤の併用物である。陰イオン界面活性剤の典型例としては、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Triton Ｘ-100（t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH: ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）等のTriton、NP-40（Nonidet P-40、エチルフェニルポリエチレングリコール）、デオキシコール酸塩、特に好ましくはそのナトリウム塩が挙げられる。その他の界面活性剤、例えば、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤及び両性界面活性剤を用いることも可能である。追加的な実施形態においては、タンパク質を変性可能な他のデマスキング剤が用いられ、例えば、塩基性又は酸性試薬が挙げられる。しかしながら、例えば塩基性試薬の不利な点は、モノクローナル抗体を添加する前に、これら試薬を除去する必要があることである。界面活性剤は、一般的には、Ａβ（例えば、アルブミン、アポリポタンパク質Ｅ）から、全てのタンパク質、好ましくはエピトープに結合したタンパク質を除去可能な界面活性剤であれば全て使用可能である。追加的な実施形態では、複数の界面活性剤の混合物が用いられる。
【００１５】
一般的には、体液は、例えばHepes、塩化ナトリウム及び／又はTrisHClを含むバッファで希釈される。バッファ成分の濃度は研究者が調節してもよい。一般的には、界面活性剤の濃度は０．１〜１．０重量％の範囲であり、好ましくは０．２〜０．７重量％である。好ましくは、プロテアーゼ阻害剤がデマスキング溶液に添加される。さらに追加的な実施形態では、抗体を含む溶液がプロテアーゼ阻害剤も含む。特に最も好適な実施形態においては、デマスキング工程と抗体培養工程は１つの工程（バッチ）として実施されてもよい。プロテアーゼ阻害剤の例としては、アプロチニン、ベスタチン、EDTA、PMSF、ロイペプチンが挙げられる。バッファ溶液中の成分の好ましい濃度を以下に示す。しかしながら、当業者であればバッファ成分の種類を応用し、特定の検査方法に基づいて各成分の濃度を応用可能であることは強調されるべき点である。
【００１６】
（好ましいデマスキング溶液）
＜溶液１＞
４〜０．６、好ましくは０．５重量％  NP-40
２〜０．３、好ましくは０．２５重量％  デオキシコール酸ナトリウム
０１〜０．５、好ましくは０．０５重量％  SDS
１００〜２００、好ましくは１５０ｍＭ  塩化ナトリウム
２０〜１００、好ましくは５０ｍＭ  Hepes
＜溶液２＞
１０〜５０、好ましくは２５ｍＭ  Tris-HCl  ｐＨ８
４〜０．６、好ましくは０．５重量％  Triton X-100
４〜０．６、好ましくは０．５重量％  NP-40
【００１７】
プロテアーゼ阻害剤は、実験上の必要性に応じて添加される。
【００１８】
界面活性剤及びその他のデマスキング剤の例としては、ＳＤＳ、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、Triton X-100、Tween20、Nonidet P40等の非イオン界面活性剤、CHAPS等の両性イオン界面活性剤、テトラデシルトリメチル臭化アンモニウム（TTAB）等の陽イオン界面活性剤、及び／又はその他の変性デマスキング剤（好ましくは、ギ酸、塩酸グアニジンもしくは尿素等の塩基性又は酸性試薬、又はアルカリ性水酸化物）が挙げられる。
【００１９】
界面活性剤と体液を含むバッファ溶液は、約１５分〜３時間、好ましくは３０〜９０分間培養される。この培養時の温度は約１０〜４０℃、好ましくは１５〜３７℃、さらに好ましくは１７〜３０℃である。培養時間と培養温度は、実施する特定の検査、例えば被検体液や使用する界面活性剤の種類に基づき、当業者が調整可能である。
【００２０】
界面活性剤の好ましい濃度は、約０．０１〜２重量％、より好ましくは０．０２〜１重量％である。この濃度は、臨界ミセル濃度（０．５〜５％）よりも低い濃度である。
【００２１】
上述のデマスキング工程の後、サンプルを、Ａβペプチドに特異的なエピトープに結合する1つ以上の抗体に接触させる。より好適な実施形態では、デマスキング工程（ｂ）と接触工程（ｃ）は１つの工程（１つのバッチ）で行われる。
【００２２】
使用する代表的な抗体は、Ａβペプチドのアミノ末端内、好ましくはアミノ酸（ａａ）位置１−２４内のエピトープを認識するモノクローナル抗体である。特に好ましいエピトープは、アミノ酸（ａａ）４−１３又は１７−２４を含む。しかしながら、Ａβペプチドに特異的なその他のエピトープを用いることにより、アミノ末端以外のＡβペプチドまで範囲を広げることも可能である。例としては、ａａ１−５のエピトープ、ａａ１−１１のエピトープ、ａａ１−７のエピトープ、ａａ１５−２４のエピトープ、ａａ３−９のエピトープ、ａａ１１−２６のエピトープ、ａａ４−１０のエピトープ、ａａ１３−２８のエピトープ、ａａ１−１０のエピトープ、ａａ３１−４０のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１５−３０のエピトープ、ａａ１７−２４のエピトープ、ａａ１−２８のエピトープ、ａａ１２−２８のエピトープ、ａａ１７−４２のエピトープ、ａａ２０−４０のエピトープ、ａａ３７−４２のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１１−２８のエピトープ、ａａ１−６のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１２−２８のエピトープ、ａａ２５−３５のエピトープ、ａａ１５−３０のエピトープ、ａａ１７−２６のエピトープ、ａａ１−１２のエピトープ、ａａ３２−４０のエピトープ、ａａ３３−４２のエピトープが挙げられる。
【００２３】
特に好ましくは２つの抗体が使用され、アミノ酸位置４−１３及び１７−２４を網羅する抗体が好ましい。一方で、本発明の追加的な実施形態では、２つ以上（例えば３もしくは４つ）の抗体、または１つのみの抗体を使用してもよい。
【００２４】
１つの抗体を使用する場合には、抗体集団の一部分が第１蛍光マーカーで標識される一方、抗体集団のその他の部分が第２蛍光マーカーで標識される。これらマーカーは、供与体及び受容体として作用することにより、ＦＲＥＴ技術の基準を満たす。１つのＡβオリゴマーは、同一のエピトープを複数回備えるため、ＦＲＥＴ技術が使用可能となる。用語「１つの抗体」は、同種物（即ち、モノクローナル抗体の同一集団）を包含すると理解されるべきである。さらに追加的な実施形態では、２つ以上の抗体を使用し、各抗体は、夫々異なる蛍光マーカーで標識されるか、２つの蛍光マーカーのみを用いて標識される。
【００２５】
使用する抗体は、蛍光マーカーを用いて特異的に標識される。蛍光標識された抗体は、従来からよく知られており、市販物を購入してもよい。タンパク質の蛍光染色は従来からよく知られており、また蛍光標識された抗体を検出する方法も公知である。一般的に、蛍光色素は、非共有結合性又は共有結合性の相互作用によって、タンパク質と結合する。本発明では、本発明のモノクローナル抗体に結合可能であるとともにサイトメトリーや測光法によって検出可能な蛍光色素であれば全て使用できる。サイトメトリーや測光法としては、例えば、フローサイトメトリーが挙げられる。特に好ましくは、ＦＲＥＴに使用可能な蛍光色素が用いられる。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を併用したフローサイトメトリーを使用する。ＦＲＥＴは、生体分子間の距離及び生体分子の超分子構造を決定するのに優れた手段である（図１ａ）。ＦＲＥＴは、好ましいスペクトル条件と空間条件下で、励起した供与体分子から受容体分子にエネルギーが移動する間における蛍光分光特有の現象である（非特許文献１９）。Ａβを検出するには、１つのエピトープが供与体で標識され、その他のエピトープが受容体で標識される。実用的用途として最も一般的なＦＲＥＴの対は、ＣＦＰとＹＦＰである。これら両方とも緑色蛍光タンパク質ＧＦＰの色変異型である。供与体と受容体が互いにかなり離れている場合には、供与体の放射が供与体の励起時に検出される。一方で、供与体と受容体が接近している（供与体と受容体間の相互作用による）場合には、供与体から受容体への分子間ＦＲＥＴによって、受容体の放射が優勢的に観察された。併用したＦＲＥＴの効果を得るためには、供与体の放射ピークは受容体の励起ピークと重なり合う必要がある。ＦＲＥＴでは、光エネルギーを供与体蛍光物質の励起周波数で加えることによりエネルギーの一部を受容体へと移動させ、そして、受容体が自身の放射波長で光を再放射する。最終的には、供与体は通常もたらすエネルギーよりも少ないエネルギーを放射し（エネルギーの一部が代わりに受容体へと移動するため）、その一方、受容体はその励起周波数でより多くの光エネルギーを放射する（供与体蛍光物質から追加のエネルギー量を得ているため）。
【００２７】
ＦＲＥＴ技術は、分解能に優れるという利点を有する。ＦＲＥＴは２つの蛍光物質が互いに２〜１０ｎｍの範囲内である場合のみ生じる。このことは、蛍光物質をかなり近接した空間距離内に集める必要があることを示している。蛍光物質が２０ｎｍ以上離れている場合には、信号は何も観察されない。したがって、フローサイトメトリーと併用してＦＲＥＴ効果を利用するには、Ａβのエピトープを選択することが重要となる。
【００２８】
本発明の典型的な実施形態では、Ａβペプチド配列の異なるエピトープを認識する２つのモノクローナル抗Ａβ抗体が、蛍光色素Alexa Fluor 488（mAb 4G8、Aβ17-24に対する）及びAlexa Fluor 594（mAb 6E10、Aβ4-13に対する）で標識される。その他の蛍光色素として、例えばATTO又はCy等も好適に用いられる。一般的には、供与体／受容体分子にＦＲＥＴ効果を与えることが可能な蛍光色素であれば、公知の全てのものが使用できる。例えば、mAb 4G8-Alexa Fluor 488は供与体分子に相当し、mAb 6E10-Alexa Fluor 594は受容体分子としての機能を有する（図１ａ）。この供与体／受容体の組み合わせにおいて、Ａβモノマーは現状では検出不可能である。この理由は、Ａβモノマーに結合可能な蛍光体物質が少量であり（モノマーあたり抗体が最大２つ）、結果として、放射される蛍光及びＦＲＥＴ信号の強度が極めて低いからである（図３）。対照的に、Ａβのオリゴマー構造は、十分量の抗体分子と結合可能であり、フローサイトメトリーで検出するのに十分な強い蛍光信号を発生させる（図３）。蛍光信号の情報量がＦＲＥＴによって増加することとなり、mAb 4GBとその他分子との非特異的結合の差異化が可能となる。したがって、6E10-Alexa Fluor 594抗体からの信号は、両方の抗体間の距離が１０ｎｍよりも近い場合にのみ観察される。この１０ｎｍはフェルスター距離であり、供与体と受容体の蛍光物質間でエネルギーを移動可能とする。
【００２９】
最終工程では、蛍光標識されたサンプルから放射される蛍光共鳴エネルギー移動信号を、その後公知の手段を用いて検出する。この手段として、例えばフローサイトメトリー又は測光法が挙げられる。蛍光信号を検出する全ての方法や手段が適応可能である。
【００３０】
以下、実施例に関して、本発明の好ましい実施形態を記述する。本発明は下記の実施例に限定されないことに留意されたい。
【００３１】
（方法）
＜脳脊髄液（ＣＳＦ）の採取＞
ＣＳＦは、多発性硬化症等の診断を受けた神経疾患の患者１７４人（平均年齢４９．３歳、範囲８−８９歳）から得た。全てのサンプルは腰椎穿刺によって得て、分析前に２時間以内で冷凍し、−８５℃で保存したものである。冷凍／解凍のサイクルを反復することは避けた。
【００３２】
＜抗体の蛍光標識＞
抗Ａβ抗体４ＧＢ及び６Ｅ１０（Chemicon International社）は、蛍光色素Alexa Fluor 488又はAlexa Fluor594を用いて、製品の取扱説明書に基づき標識された（各モノクローナル抗体標識キット（Monoclonal Antibody Labelling Kits；Invitrogen社）を利用した）。
【００３３】
＜サンプルの調製＞
２００μｌのＣＳＦを、２００μｌの１倍溶液１（５倍溶液１は、２５０ｍＭのHEPES、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．２５％SDS、１．２５％デオキシコール酸ナトリウム、２．５％NP-40Alternative（Calbiochem社）及び１錠剤のプロテアーゼ阻害剤カクテルComplete（商標）Mini（Roche Applied Science社）を２ｍｌの５倍溶液１中に含むものである）で希釈した。そして、蛍光標識抗体を、供与体抗体（4G8 Alexa Fluor 488で標識）及び受容体抗体（6E10 Alexa Fluor 594で標識）それぞれに２ｎＭ及び８ｎＭ濃度添加した。培養後（室温で９０分、遮光下）、サンプルは、後述する如く、FACS Calibur （BD Biosciences社）で分析された。
【００３４】
＜フローサイトメトリー＞
Ａβオリゴマーを検出するために、１５ｍＷの４８８ｎｍの空冷アルゴンイオンレーザーを備えるFACS Caliburフローサイトメーター（BD Biosciences社）が使用された。オリゴマー粒子は、対数表示の前方／側方散乱のドットプロットにゲート設定された（ＦＳＣ対ＳＳＣ）。色素Alexa Fluor488及びAlexa Fluor594の緑色又は赤色蛍光は、対応するＦＬ１及びＦＬ３（対数目盛）光電子増倍管によって夫々検出された。このＦＬ１及びＦＬ３光電子増倍管は、５３０／３０又は６７０ＬＰの帯域通過フィルターを通過したものである。ＣＳＦサンプルの差異による測定誤差を回避するために、全てのサンプルはTruCountTube（BD Biosciences社）を用いて測定され、28,000個ビーズを数えた後分析を終了した。
【００３５】
＜ソーティング＞
オリゴマー特異的領域のソーティングは、FACS Vantageセルソーター（BD Biosciences社）によって行い、閾値をＦＬ１チャネルに設定した。対象となる集団は、ＦＬ１対ＦＬ３のドットプロットにゲート設定された。そして、ＦＲＥＴ信号に関連する事象のみがソートされた。
【００３６】
＜ウェスタンブロット法＞
２０μｌのＣＳＦサンプル又は２５μｌのソートされたＣＳＦを、１６％のトリシンゲル（Invitrogen社）に添加し、２時間経った後、ｔＰＶＤＦ膜上に移動させた。膜をＰＢＳ内で５分間煮沸し、TBS-T（１０ｍＭ Tris-HCl、ｐＨ７．６（１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％のTween20を含む））の５％脱脂粉乳中で２時間遮断した。そして、モノクローナル抗Ａβ抗体６Ｅ１０を添加し、一晩培養した。この膜をTBS-Tで洗浄した後、結合した抗体を、HRP接合した第２抗マウス抗体及びECL検出（SuperSignal West Femto Subsrate、Pierce社）を用いて視覚化した。
【００３７】
＜ドットブロット法＞
ドットブロットアッセイにおいて、サンプルをニトロセルロース膜に直接的に添加し、空気乾燥させた。その後、この膜を処理し、抗オリゴマー特異的抗体Ａ−１１（Biosource社）を製品の取扱説明書に基づいて用い、Ａβオリゴマーの存在を判定した。
【００３８】
＜ＡＤ脳ホモジネートからのアミロイド−βオリゴマーの単離＞
対照群人物及びＡＤ患者の前頭側頭脳組織は、ドイツの脳バンクにより誠意を持って提供されたものを使用した。対照群とＡＤの脳から、Wiltfangらの方法（非特許文献１９）に基づき、オリゴマーが単離された。
【００３９】
＜統計分析＞
統計分析は、MedCalcソフトウェア及びスピアマンの順位相関係数を用いて実施した。
【００４０】
＜シードレス（seedless）Ａβ（１−４２）（シード（種）を有さないAβ）の調製＞
Ａβ（１−４２）はBachem社から購入したものであり、Dahlgrenら（Dahlgren, K.N. et al, Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J. Biol.Chem. 277, 32046-32035 (2002)）の記述に基づき、シードレス処理をした。その後、RP-HPLC（コラム：Source 5RPC 4.6/150 ST Amersham； 溶媒Ａ：H2O中０．１％NH4OH（２５％） ｐＨ９．０； 溶媒Ｂ：６０％アセトニトリル ４０％溶媒Ａ； 勾配：２５−５６％溶媒Ｂを３１分間；流量：１．０ｍｌ／分）によって精製し、凍結乾燥した。
【００４１】
＜インビトロの原線維生成＞
シードレスＡβ（１−４２）をDMSO（Sigma-Aldrich社）に溶解させて１ｍＭとし、１０ｍＭの塩酸で希釈して１００μｍとし、２４時間３７℃で培養した（Dahlgrenら2002）。保管するために、原線維調製物は、１００ｍＭのHepes、２．５ｍＭのDTT、５ｍＭのEDTA、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２％グリセリン（ｐＨ７．６）で希釈して５μＭとし、−８０℃で冷凍した。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
アッセイの感度は、インビトロで集合したＡβ原線維（１ｎＭ以下から０．００２５ｎＭの範囲）の滴定によって測定された。この範囲において、アッセイは線形である。原線維の濃度は、原線維を集合させるために用いた開始モノマー濃度から推定したものであり、１つの原線維が１００−１０００モノマーに相当する。したがって、測定された原線維の実濃度は、検出限界をフェムトモル範囲まで下げるものとなる（図２）。
【００４３】
（実施例２）
Ａβのモノマーがフローサイトメトリーによって検出可能か否かを検査するために、Dahlgrenら（非特許文献１５）に記載された方法に基づいて処理されたＡβモノマー１−４２（Bachem社）１ｍＭを、供与体／受容体抗体対とともに培養した後、フローサイトメトリーを用いて分析した。どの事例においても信号は検出されなかった（ＦＳＣ対ＳＣ；ＦＬ１対ＦＬ３ドットプロット；図３ａ、ｂ）。Ａβモノマーとは対照的に、１ｎＭのインビトロで集合したＡβ原線維 [シードレスアミロイド−（１−４２）をDMSO（Sigma-Aldrich社）に溶解させて１００μＭとし、ＰＢＳで希釈して０．５μＭとし、３７℃で７２時間培養した。この原線維の使用濃度は開始モノマー濃度に基づく。] において、ＦＲＥＴ事象が検出された（ＦＳＣ対ＳＣＣ；ＦＬ１対ＦＬ３）。これらは、本アッセイがモノマーＡβ（検出不可能）とＡβオリゴマーとを判別可能であることを示している（図３ｃ、ｄ）。
【００４４】
（実施例３）
フローサイトメトリー法に用いるために、ＣＳＦを異なるバッファ溶液に溶解させた。幾つかの特定量の界面活性剤を含むバッファにＣＳＦを希釈した場合のみ、アミロイドβオリゴマーを最適に検出することが可能であった（溶液１及び２）。したがって、前処理工程は、アミロイドβオリゴマーを測定するために必須であり、非常に重大な工程である。図４に示す如く、ＣＳＦを希釈するために水又は一般的なバッファ（PBS、HEPES）を使用すると、サンプル内に存在するオリゴマーの微小部分しか検出することができない。このようにオリゴマーが非効率的に検出される理由は、抗体結合と競合する、いわゆるエピトープ−マスキングとなるからである。
【００４５】
（実施例４）
実施例３から明らかである如く、溶液１はＣＳＦ内のアミロイドβオリゴマーの検出に優れている。したがって、このバッファ溶液は、さらなる測定用として選択され、その濃度を最適化した。図５（上）に示す如く、溶液１は、１倍濃縮溶液として用いた時、測定ノイズを増加させた（矢印）。バッファ濃度を０．２５倍まで下げた場合にも同様の結果が得られ、殆どの検出信号は非特異的ノイズであった（図５下）。しかしながら、０．５倍濃縮溶液１は、非特異的なノイズ信号を増加させずにオリゴマーを十分にデマスキングした（図５真中）。このようにして、本実施例は、ＣＳＦ内のオリゴマー検出はサンプルの前処理（即ち、適切な界面活性剤混合物の選択）に原則的に依存し、それ故にバッファ条件に依存することを実証している。
【００４６】
（実施例５）
現行の設備において、２００μｌのＣＳＦが２００μｌの溶液１で希釈され、その後、ＦＲＥＴ抗体混合物とともに培養された。各ＣＳＦサンプルを２００μｌ使用したが、この量に限定されず、高感度が必要な場合には量を増やしてもよい。ＦＲＥＴ効果をより視覚化するために、まずヒトＣＳＦを、抗体4G8−Alexa Fluor 488だけを用いて培養した。その後のフローサイトメトリー分析においては、オリゴマー特異的な集団が検出され、蛍光１チャネルのみにおいて事象が示された（図６ａ；FL1−H）。その後、FRET受容体抗体6E10−Alexa Fluor 594を添加すると、蛍光３チャネルにおいて追加的な蛍光信号が誘導された（図６ｂ−ｃ；FL3−H）。Alexa Fluor 594特異的な放射が得られるということは、両方の抗体が、互いに近接して（＜１０ｎｍ）結合していることを実証しており、Alexa Fluor488供与体からAlexa Fluor594受容体蛍光物質へのエネルギー移動が可能となっている。検出された信号の感度は、受容体抗体を追加することにより増えるが、特異的な事象の全体数は同時に減少する。これは、各エピトープに対する両方の抗体が立体的に競合すること、及び受容体蛍光物質のＦＲＥＴ誘導による蛍光性クエンチングが原因であると考えられる。両方の抗体が１０ｎｍより近い距離で非特異的に結合する確率は、非常に低いことから、これらのデータは、検出された事象が実際にはＡβオリゴマーであることを意味している。本仮定をさらに立証するために、ＣＳＦのプール（６ｍｌ）を準備し、上述の如く分析した。一方、対象となる領域内に検出された事象を、FACS Vantageセルソーターによってソートし、続いてウェスタンブロット法及びドットブロット法により分析した。図６ｄに示す如く、モノマーからペンタマーまでの範囲のＡβ集合体は、ウェスタンブロット法により検出可能であり、ソートされた粒子がＡβペプチドの構成物であることが確認された（図６ｄ、２レーン）。ソーティング由来のサンプルと、ゲル上に直接的にロードされたＣＳＦサンプルを比較すると、高分子量型では、ソーティングによって濃縮されたサンプル（図６ｄの２−３レーン）のみが検出可能であることが示されている。本アッセイはＡβモノマーを検出しない（図３）ため、このことは、ソーティングされた成分のモノマーバンドがオリゴマー構造から生じたものであることを示している。このように、ＣＳＦで発見されたオリゴマーの殆どが、共有結合架橋されていないか、ＳＤＳ耐性ではないことが示されている。検出されたＡβオリゴマーの更なる立証は、ソートされた集団をドットブロットアッセイすることによって得られ、その結果、オリゴマー特異的抗体Ａ−１１でプローブした場合に正の信号を示した（図６ｅ）。
【００４７】
（実施例６）
臨床分析性能を検査するために、私達はついに、ＣＳＦアッセイを、様々な神経疾患を有する非認知症の個体１７４人から得られたサンプルにまで拡大した（図７）。データの評価は、検出されたオリゴマー濃度において大きなばらつきを示した。しかしながら、個体の年齢とＡβオリゴマー量との間の相関性が発見された（ｒｈｏ＝０．２２；Ｐ＝０．００３６）。この相関性は、Ａβオリゴマー濃度が加齢に伴い増加することを初めて示したものである。この結果は、可溶性−非可溶性Ａβの平衡が加齢に伴い阻害されるという仮定を支持するものであり、また、観察されるＣＳＦ中のモノマーＡβが年齢に依存して減少すること、即ちオリゴマーが形成されることに対する説明を提供するものである。
【００４８】
（実施例７）
ＣＳＦの冷凍／解凍のサイクルを反復することにより、Ａβモノマーの濃度が減少することはよく知られている（非特許文献２０）。しかしながら、確実な検出方法が欠如すると、このようなオリゴマーの研究が不可能なものとなる。したがって、私達は、冷凍／解凍サイクルの影響を、−８０℃に冷凍させたＣＳＦのプールを用いて連続的に３回解凍することにより検査した。第１の値は冷凍前に測定し、１００％として設定した。Ａβモノマーの観察状況（非特許文献２０）とは対照的に、全ての実際に適用された冷凍／解凍サイクルのオリゴマーの総量において、有意な影響は観察されなかった（図８）。
【００４９】
私達はさらに、本アッセイの再現性について調査し、図８ｂに示す７つの異なるＣＳＦサンプルを用いて実証した。これらサンプルの標準偏差は３．５±２．１％であり（図８ｂ）、全てのアッセイにおいて５％以下であった。この図から明らかな如く、ウェスタンブロット法で検出すると全てのサンプルが略等量のモノマーを含んでいたにもかかわらず、ＣＳＦサンプルのうち２つはＡβオリゴマーに対して陰性であった（図８ｃ）。これは、ウェスタンブロット法又はＥＬＩＳＡ法によって検出されたオリゴマー量とＡβ濃度の間には相関性が無いことを再度実証するものであり、また、他の方法によるアッセイの利点（即ち、オリゴマー特異性、測定可能なサンプル量そして増強感度）を強調するものである。
【００５０】
フローサイトメトリーは日常診断によく用いられる慣用法であるため、本アッセイは、他の方法と比較して安価な代替手段として使用でき、特に、高いサンプル処理能力と自動化を可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
2009544954.tif 000012
【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月1日(2009.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中のアミロイド−βペプチドオリゴマーを検出する方法であって、
ａ）アミロイド−βペプチドオリゴマーの存在に関する被検体液のサンプルを準備する工程と、
ｂ）前記アミロイド−βペプチドオリゴマーに結合する抗体に関与するエピトープをデマスキングする工程と、
ｃ）前記デマスキング工程後の前記サンプルを、前記アミロイド−βペプチドオリゴマーのエピトープと結合する抗体集団を含む1つの抗体に接触させるとともに、前記抗体集団の一部分が第１蛍光マーカーで標識され、前記抗体集団のその他の部分が第２蛍光マーカーで標識される工程、又は
前記デマスキング工程後の前記サンプルを、前記アミロイド−βペプチドオリゴマーの少なくとも２つの異なるエピトープと結合する少なくとも２つの抗体に接触させるとともに、第１抗体が第１蛍光マーカーで標識され、少なくとも第２抗体が第２蛍光マーカーで標識される工程のいずれかを備え、
前記第１蛍光マーカーが、そのエネルギーを前記第２蛍光マーカーに移す供与体として作用し、前記第２蛍光マーカーは受容体として作用し、
前記方法はさらに、
ｄ）前記蛍光標識されたサンプルから放射される蛍光共鳴エネルギー移動信号の強度を測定することにより前記体液サンプルに存在するアミロイド−βペプチドオリゴマーを検出する工程を備えることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記体液が脊椎動物の体液であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記脊椎動物の体液が、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ及び齧歯類からなる群から選択される体液であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記エピトープが、アミノ末端内のアミノ酸位置ａａ１−２４内に配されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記エピトープが、ａａ４−１３のエピトープ、ａａ１７−２４のエピトープ、ａａ１−５のエピトープ、ａａ１−１１のエピトープ、ａａ１−７のエピトープ、ａａ１５−２４のエピトープ、ａａ３−９のエピトープ、ａａ１１−２６のエピトープ、ａａ４−１０のエピトープ、ａａ１３−２８のエピトープ、ａａ１−１０のエピトープ、ａａ３１−４０のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１５−３０のエピトープ、ａａ１７−２４のエピトープ、ａａ１−２８のエピトープ、ａａ１２−２８のエピトープ、ａａ１７−４２のエピトープ、ａａ２０−４０のエピトープ、ａａ３７−４２のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１１−２８のエピトープ、ａａ１−６のエピトープ、ａａ８−１７のエピトープ、ａａ１２−２８のエピトープ、ａａ２５−３５のエピトープ、ａａ１５−３０のエピトープ、ａａ１７−２６のエピトープ、ａａ１−１２のエピトープ、ａａ３２−４０のエピトープ、ａａ３３−４２のエピトープからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記デマスキングが、１以上の界面活性剤を添加することにより実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、及び変性デマスキング剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、臨界ミセル濃度よりも低い濃度で使用され、好ましくは約０．０１〜２重量％で使用されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記界面活性剤が、約０．０１〜２重量％又は０．０２〜１重量％で使用されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記デマスキング工程（ｂ）と前記接触工程（ｃ）の温度のいずれか、又は、前記デマスキング工程（ｂ）と前記接触工程（ｃ）の温度の両方が、約１５〜４０℃の範囲であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記デマスキング剤を用いた培養と前記抗体を用いた培養のいずれか、又は、前記デマスキング剤を用いた培養と前記抗体を用いた培養の両方が、約３０〜９０分であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記体液が、脳脊髄液、血液、尿、涙液及び唾液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光共鳴エネルギー移動信号の前記強度が、フローサイトメトリー法又は測光法により測定されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｂ）及び前記工程（ｃ）が、１つのバッチで同時に処理されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記デマスキング溶液中と抗体を含む溶液中のいずれか、又は前記デマスキング溶液中と前記抗体を含む溶液中の両方に、プロテアーゼ阻害剤が添加されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【国際調査報告】
2009544954.tif 000018
2009544954.tif 000019
2009544954.tif 000020