(57)【要約】膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）を調節する薬剤を検出するための方法を開示する。一態様では、本発明は、リガンド結合するｍＡＲを検出及び随意的に同定する方法を提供する。本発明による一アッセイは、古典的細胞内アンドロゲン受容体（ｉＡＲ又はＡＲ）との結合に関連してｍＡＲを選択的に結合する薬剤を検出する。本発明は、ｍＡＲを優先的に結合する化学物質に関する化学的ライブラリーをスクリーニングする方法を提供することを含む広範囲の有用な適用を有する。【選択図】図１
2009532060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が、
ａ）ｍＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲン化合物を結合して第１の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｍＡＲを当該化合物と接触させること；
ｂ）薬剤及びｍＡＲの間を結合して第２の錯体を形成することを可能にする条件下で、第１の錯体を当該薬剤と接触させること；及び
ｃ）薬剤の存在を指標するものとして、第１の錯体からの検出可能に標識したアンドロゲン化合物の放出を検出すること：
の段階を包含する、膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）の機能を調節する薬剤を検出する方法。
【請求項２】
適切な対照と比較した、検出可能に標識したアンドロゲン化合物の放出の増加が、薬剤の更なる指標をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、
ａ）ｍＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲン化合物を結合して第１の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｍＡＲを当該化合物及び薬剤と接触させること；及び
ｂ）薬剤の存在を指標するものとして、第１の錯体に結合した検出可能に標識したアンドロゲン化合物の濃度の低下を検出すること：
の段階を包含する、膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）の機能を調節する薬剤を検出する方法。
【請求項４】
適切な対照と比較した、結合したアンドロゲン化合物の濃度の低下が、ｍＡＲを調節する薬剤の更なる指標をもたらす、請求項３に記載の方法。  
【請求項５】
方法が、
ｉ）細胞内アンドロゲン受容体（ｉＡＲ）及び（同じ又は異なる）検出可能に標識したアンドロゲン化合物を結合して第３の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｉＡＲを当該化合物と接触させること；及び
ｉｉ）当該化合物及び第３の錯体の間を結合させるようにする条件下で、第３の錯体を薬剤と接触させること：
の段階を更に包含する、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
方法が、細胞内アンドロゲン受容体（ｉＡＲ）及び（同じ又は異なる）検出可能に標識したアンドロゲン化合物を結合して第３の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｉＡＲを当該化合物と接触させる段階を更に包含する、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項７】
方法が、請求項１〜４に記載の方法と本質的に並行して行われる、請求項５〜６に記載の方法。
【請求項８】
方法が、薬剤の存在を指標するものとして、適切な対照と比較した、薬剤の存在下での第３の錯体からの検出可能に標識したアンドロゲン化合物の殆ど無い放出を検出する段階を更に包含する、請求項５〜７に記載の方法。
【請求項９】
１つ又はそれ以上の接触の段階が、ｍＡＲを発現すると知られているか又は考えられている細胞、細胞株、又は組織サンプルを用いて行われる、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項１０】
ｍＡＲを発現する細胞株がＤＵ−１４５又はＬＮＣａＰである、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項１１】
ｍＡＲを発現する組織サンプルが前立腺組織である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項１２】
前立腺の組織が癌性であると分かっている又はその疑いのある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１つ又はそれ以上の接触の段階が、ｉＡＲを発現する細胞、細胞株、又は組織サンプルを用いて行われる、請求項５〜８に記載の方法。
【請求項１４】
ｉＡＲが一時的に細胞、細胞株又は組織サンプルによって発現される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞又は細胞株が、アンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を包含するレポーター遺伝子構築物を更に含有してなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
方法が、薬剤の存在を指標するものとして、適切な対照と比較して、レポーター遺伝子構築物からの殆ど無いシグナルを検出する段階を更に包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｉＡＲが合成リポソーム組成物として存在する、請求項５〜８及び１３〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
方法が、ｍＡＲを発現すると知られているか又は考えられている細胞、細胞株又は組織サンプル由来の細胞亜分画を用いて行われる、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、ｉＡＲを発現する細胞の細胞亜分画を用いて行われる、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項２０】
アンドロゲン化合物が、少なくとも１つの放射性同位元素、蛍光色素分子、蛍光消光剤、酵素、親和性標識、又は化学発光、リン光発光若しくは発色団部分で検出可能に標識されている、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
アンドロゲン化合物がトリチウムで検出可能に標識されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能に標識されているアンドロゲン化合物が、トリチウムジヒドロテストステロン（３Ｈ−ＤＨＴ）又はトリチウムテストステロン（３Ｈ−Ｔ）である、請求項１〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
アンドロゲン化合物が、アンドロゲン及びアンドロゲンと共有結合するリンカーを包含する、請求項１〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
アンドロゲンがテストステロン又はジヒドロテストステロンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
リンカーがＯ−カルボキシメチルオキシリンカーであって、ステロイド環の３'−炭素に結合している、請求項１〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
検出する段階が、少なくとも１つの標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光消光、蛍光偏光、発光、化学発光、蛍光発光、吸収、及びシンチレーション計数を用いて行われる、請求項１〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬剤が、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、抗体又は抗原に結合するその断片、脂質、炭水化物、核酸、小分子、又はその組合せである、請求項１〜２６に記載の方法。
【請求項２８】
薬剤がリンカー及びアミノ酸配列と共有結合するアンドロゲン又はその誘導体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が配列に共有結合している以下の構造体：テストステロン又はその誘導体／リンカー／血清アルブミン又はその誘導体を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
リンカーがカルボキシメチルエーテル基である、請求項１〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
薬剤がテストステロン３−(Ｏ−カルボキシメチル)オキシム−血清アルブミンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
薬剤が検出可能に標識されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
方法が、ｍＡＲの下流のシグナリング分子の迅速な調節を検出する段階を更に包含して、適切な対照と比較した、シグナリング分子の濃度の変化を検出する段階を更に包含する、請求項１〜３２に記載の方法。
【請求項３４】
シグナリング分子の調節を検出する段階が、グアニンヌクレオチド結合又は交換、キナーゼ活性、グアノシントリホスファターゼ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アクチン再構成、レポーター遺伝子発現、及び細胞内カルシウム濃度の少なくとも１つの活性を測定することを包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
キナーゼが、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）又はホスファチジルイノシトール−３（ＰＩ−３）キナーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
方法が、ＦＡＫのホスファチジルイノシトール−３（ＰＩ−３）キナーゼとの関連性を検出することを更に包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
グアノシントリホスファターゼがＣｄｃ４２／Ｒａｃ１である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
グアノシントリホスファターゼがＲＨＯである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
キナーゼがＲＯＣＫである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
キナーゼがＬＩＭＫ２である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
細胞内カルシウム濃度を、カルシウムプローブ、カルシウムプローブに対する抗体、カルシウムイオノフォア、及びカルシウムキレート剤の少なくとも１つを用いて測定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
方法が、ｍＡＲ、ｉＡＲ若しくは両方を発現すると知られているか又は考えられている細胞、細胞株又は組織サンプルによって発現される前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を迅速に検出する段階を更に包含する、請求項１〜４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＳＡを免疫学的に検出する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
方法が、ｍＡＲを発現する細胞、細胞株又は組織サンプル内の細胞死（アポトーシス）を検出する段階を更に包含する、請求項１〜４３に記載の方法。
【請求項４５】
アポトーシスが、アネキシンをアッセイすることにより又は検出可能な小分子を用いることにより検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
方法が、インビボでのｉＡＲの活性化の何れかを検出する段階を更に包含する、請求項１〜４５に記載の方法。
【請求項４７】
方法が、薬剤を精巣摘出を受けた哺乳類に投与する段階を更に包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
方法が、適切な対照と比較して、哺乳類において、以下の特性：
ａ）前立腺の重さをほとんど又は全く増加させない、
ｂ）体重をほとんど又は全く増加させない、
ｃ）体脂肪をほとんど又は全く増加させない、及び
ｄ）骨密度をほとんど又は全く増加させない；
の少なくとも１つを有する薬剤を選択することを更に包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
方法が、薬剤の存在を更に指標することとして、前記特性の少なくとも１つを有する薬剤を選択することを更に包含する、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００６年４月３日に出願された米国特許仮出願第６０７８８，８７８号及び２００６年４月３日に出願されたギリシャ特許出願第ＧＲ２００６／０１００２０７号に係る優先権を主張するものであり、前記特許出願の全内容を参照して本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、一般に膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）を調節するリガンド及び他の薬剤の検出に関する。特に本発明は、そのような薬剤を検出するための方法を提供する。本発明の好ましいアッセイは、細胞内アンドロゲン受容体（ｉＡＲ又はＡＲ）に結合することと比較してｍＡＲを選択的に結合するリガンドを検出する。本発明は、ｍＡＲを特異的に結合するリガンドを検出する。本発明は、特異的にｍＡＲを結合する要素に関する化学的ライブラリーをスクリーニングするための方法を提供することを含む広範囲の有用な適用を有する。
【背景技術】
【０００３】
アンドロゲン活性が細胞内アンドロゲン受容体（本明細書ではｉＡＲ又はＡＲとして示す）に結合することに介在されるという認識がある。ｉＡＲは、リガンドに活性化される転写因子として機能する核内受容体スーパーファミリーの構成要素として知られている。ｉＡＲを発現する細胞に対するアンドロゲン効果は、受容体に結合することを含むと報告されている。更なる効果は、アンドロゲンの内在化、２量化、核転座、核酸結合、及びアンドロゲン感受性遺伝子の活性及び発現を含む。アンドロゲン介在の遺伝子発現（ＡＲを介して作用する）は、一般に数時間掛かる。一般には例えば、Pietras、，RJ. et al.(2001) Endocrine 14:417−427, Kumar, MV (1998) Prog. nucleic Acids Res. Mol. Biol. 59:289-306及びこれらに引用されている文献を参照されたい。
【０００４】
ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）のようなある特定のアンドロゲン誘導体は、天然のＡＲリガンドであると考えられる。これらの影響を最小化又は阻止する薬を開発する試みが報告されている。例えば、多くの小分子ＡＲモジュレータは、酢酸シプロテロン、フルタミド、クロルアミドン（chloramidone)、ビカルタミド、若しくはある特定のキノリン及びキノリノン誘導体を含む。例えば、ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８８５９号(国際公開第２００５／０５２２１１８号公報)、ＰＣＴ／２００４／０２７４８３(国際公開第２００５／０１８５７３号公報)、ＰＣＴ／２００５／０１３７７５号(国際公開第２００５／１０５０９１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２号(国際公開第２００６／０２６１９６号公報)、及びＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、並びにこれらに開示されている文献を参照されたい。
【０００５】
少なくともいくつかのアンドロゲンの生物学的活性が、ＡＲ結合による(数時間）と説明され得るものより更に迅速(数分以内)であるとの認識が高まっている。これらの説によると、「非古典的な」ステロイド結合要素、即ちＡＲを含まない結合要素が報告されている。Papakonstanti, E. et al. (2003) Molecular Endocrinology 17：870; Koukouitaki, S. B. et al. (1999) Mol. Med. 5:731; 及びこれらに引用されている文献を参照されたい。
【０００６】
より具体的には、最小のｉＡＲを発現するか又はｉＡＲを発現しない細胞内のアンドロゲン膜結合部位が報告されている。そのような細胞は、これらに限定はされないが、Ｔリンパ球、単球、骨牙細胞、前立腺組織及びある特定の細胞株を含む。ｍＡＲの調節に含有される報告された一般的な要素は、細胞内カルシウムの増加、検出可能な前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の増加、細胞死（アポトーシス）の増加及び実質的なアクチン再構成を含む。Gorczynska, E. and Handelsman, DJ (1995) Endorcrinology 136:2052; 及びKampa, M. et al (2002) FASEB J. 16:1429を参照されたい。
【０００７】
ｍＡＲの分布及び機能が再検討されている。Kampa, M. E. Castanas (2006) in Mol. And Cell. Endocrinology 246:76; 及び本明細書に開示の文献を参照されたい。端的に、ｍＡＲ活性化は、アクチン再構成、アポトーシス及び細胞内カルシウム濃度の調節における鍵となる働きをする考えられている。ｍＡＲが新規な治療標的を示すことができると提案されている。Kampa, M. E. Castanas (2006) ibid; Hatzoglou, A. et al. (2005) J. of Clinical Endocrinology & Metabolism, 90:893; Kampa, M. et al. (2002), ibid; Stathopouos, E. et al. (2003) BMC Clinical Pathology 3:1; 及びこれらに引用されている文献を参照されたい。
【０００８】
ｍＡＲを調節する薬剤を検出することが望ましいであろう。ＡＲの調節の何れかと比較して、優先的に調節する薬剤を検出する方法を有することがより望ましいであろう。更に好ましい方法は、ＡＲに結合することと比較して、特異的にｍＡＲを結合する受容体結合リガンドを検出することができるものであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は一般に、膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）を調節する(増加させる又は減少させる)薬剤を検出する方法に関する。特に本発明は、細胞内膜受容体（ｉＡＲ又はＡＲ）の調節と比較して、ｍＡＲを優先的に調節する薬剤を検出するために用いることができる方法に関する。より具体的な方法は、ＡＲと比較して特異的にｍＡＲを結合するものからリガンドを検出及び同定するために用いることができる。本発明は、特異的にｍＡＲを結合する分子に関する化学的ライブラリーをスクリーニングするために用いることのできる方法を提供することを含む広範囲の有用な適用を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
例示的な薬剤は、受容体結合リガンド及びその様な分子である。そのような薬剤は、本明細書に記述のように、インビトロ及びインビボ方法の１つ又は組み合わせを用いることにより同定できる。本発明による同定の方法(又は方法の組み合わせ)の選択は、分析する薬剤の数、所望の特異性及び選択性、及び使用者が実施出来る方法の数のような認識するパラメータにより誘導されるであろう。
【００１１】
よって、一態様では、本発明は、ｍＡＲの機能を調節(増加又は減少)できる薬剤を検出する方法を提供する。一態様では、方法は少なくとも１つの、及び好ましくは全ての、下記段階を含有してなる：
ａ）ｍＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲン化合物を結合して第１の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｍＡＲを当該化合物と接触させること；
ｂ）薬剤及びｍＡＲの間を結合して第２の錯体を形成することを可能にする条件下で、第１の錯体を薬剤と接触させること；及び
ｃ）薬剤の存在を指標するものとして、第１の錯体からの検出可能に標識したアンドロゲン化合物の何れかの放出を検出すること。
【００１２】
検出可能に標識したアンドロゲン化合物及び薬剤が本発明に用いられる場合の順番は、意図する結果が達成される限り、重要ではないことを理解されるであろう。よって一態様では、方法は、場合によっては過剰のアンドロゲンで、被検薬剤の添加前に、第１の錯体を形成するように適応されてもよい(飽和形式)。あるいは、薬剤及び検出可能に標識したアンドロゲンは、同時に添加して第１の錯体を形成してもよい（競合形式）。更に別の方法の態様では、検出可能に標識したアンドロゲンは、スクリーニングする薬剤の添加の後に加えられる。
【００１３】
よって一態様では、本発明は、少なくとも１つの及び好ましくは全ての下記段階を含むｍＡＲの機能を調節する薬剤を検出することを包含する：
ａ）ｍＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲン化合物を結合して第１の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｍＡＲを当該化合物及び薬剤と接触させる(例えば、それらを一緒に混合することにより又はそれらを１つずつ組み合わせることにより)こと；及び
ｂ）薬剤の存在を指標するものとして、第１の錯体に結合した検出可能に標識したアンドロゲン化合物の濃度の低下を検出すること。
【００１４】
前記発明の態様では、第１の錯体は、被検薬剤の存在下で形成される。検出可能に標識したアンドロゲンと薬剤は、ｍＡＲに結合するために競合する。ｍＡＲと薬剤の間に形成した何れの錯体も、本明細書で「第２の錯体」として示す。この態様では、検出可能に標識したアンドロゲン化合物の濃度の減少（例えば、第２の錯体は第１の錯体より多く検出される）は、ｍＡＲを調節する薬剤を指標するものとして扱われる。スクリーニング成分の添加の順番は重要ではないが、多くの場合被検薬剤の添加に先行して第１の錯体を形成することが有用であろう。
【００１５】
本発明の最適な実施のために常時必要とされるわけではないが（例えば、特定の薬剤又は公知の薬剤の受容体活性の場合）、多くの場合適切な対照を１つ又は組合せて含むのが有益である。一般に、「適切な対照」は、薬剤又は複数の薬剤の存在しない場合と比較したそのような薬剤又は複数の薬剤の活性についての情報を提供するであろう。或いは又は更に、「適切な対照」は、ＡＲに関しての薬剤又は複数の薬剤の活性についての情報を提供するであろう。そのような対照の賢明な使用は、ｍＡＲを特異的に結合できる薬剤の検出の可能性を高めることを含む、多くの実用的な利益を提供可能である。検討したように、目的とする特定の薬剤は、ｍＡＲ活性を確実に増加させ、そして本明細書で提供されるような対照のアッセイの１つ又は組合せにおいてほとんど若しくは全く活性のないことも好ましく示すであろう。例として、目的とする特定の薬剤は、第１の錯体からの検出可能に標識したアンドロゲン化合物の放出の実質的な増加を、直接的又は間接的のどちらかでもたらすことができる。好ましくは、その薬剤は、ｍＡＲを調節する能力の何れかを検出及び付加的に定量するよう設計された適切な対照アッセイにおいてほとんど又は全く活性を示さない。
【００１６】
従って、ＡＲの調節を検出するよう設計されたような適切な対照アッセイの１つまたはそれ以上を実施することは多くの場合有用であろう。同定の態様では、薬剤がｍＡＲ活性を増加させる能力を評価して、その薬剤がＡＲ機能を増加させる又は減少させる能力と比較する。より特異的な対照アッセイは、薬剤を適切な細胞又はＡＲを発現することが公知の細胞の細胞亜分画（例えば、膜、核、若しくは細胞質分画）と接触させることを含む。そのような対照アッセイは、薬剤の活性を検出することを含む。その活性は、対照アッセイ中に直接的にモニタリングしてもよい（例えば受容体結合をモニタリングすることにより）又は間接的にモニタリングしてもよい（例えば、ＡＲからの「下流」の分子をモニタリングすることにより；遺伝子の転写、翻訳若しくはＡＲの特異タンパク質発現をモニタリングすることにより）。この態様に沿った例示的な対照は、受容体リガンドとしてのＡＲを結合する薬剤の能力を検出及び付加的に定量するよう設計したものである。本発明による好ましい薬剤は、本明細書に開示される対照アッセイの１つ又は組合せによるＡＲ活性の増加をほとんど示さないか又は全く示さないであろう。更に好ましい薬剤は、本発明のｍＡＲアッセイの１つ又はそれ以上における実質的な活性を示し、そしてＡＲ対照アッセイの何れかにおいては活性をほとんど又は全く示さない。
【００１７】
本発明の適切な対照アッセイの一態様では、少なくとも１つの、及び好ましくは全ての下記の段階が実施される：
ｉ）ｉＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲン化合物を結合して第３の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｉＡＲを当該化合物と接触させること；及び
ｉｉ）当該化合物及び第３の錯体の間を結合させるようにする条件下で、第３の錯体を被検薬剤と接触させること。
好ましい薬剤は、第３の錯体からの検出可能に標識したアンドロゲンの放出をほとんど又は全くもたらさないであろう。
【００１８】
別の適切な対照の態様では、ｉＡＲを、検出可能に標識したアンドロゲン化合物及び薬剤と接触させる。ｉＡＲ及び薬剤を結合して第３の錯体を形成することを可能にする条件下での接触が好ましい。本発明のこの例示では、対照は、競合的形式中で第３の錯体の形成をもたらす。ｉＡＲと薬剤の間に形成する第３の錯体の何れかを、本明細書で「第４の錯体」として示す。或いは、被検薬剤を、ｉＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲンの間の接触に先行して、第３（又は第４）の錯体の形成に有利に働く条件下でｉＡＲと接触させてもよい。
【００１９】
本発明は適応性があり、目的とする使用に適合するように必要に応じて改変できる。よって例えば、１つの又は前述の対照に用いる検出可能に標識したアンドロゲン化合物は、選択したｍＡＲアッセイに用いるものと同一又は異なっていてもよい。所定の対照に用いるための検出可能に標識したアンドロゲンの選択は、選択した特異的対照アッセイ、被検薬剤の数、及び所望のアッセイ感受性のような認識されるパラメータにより誘導されるであろう。
【００２０】
本発明の最適な実施のために常時必要であるわけではないが、多くの場合、薬剤のｍＡＲ機能を調節する能力をテストする方法を、薬剤がＡＲを調節する能力の何れかを検出するための対照（又は複数の対照）と、本質的に並行して実施することが有益であろう。よって一態様では、１つ又は組み合わせたｍＡＲスクリーニングアッセイは、薬剤のＡＲを調節する能力を検出するための対照アッセイの１つ又は組合せと本質的に並行して実施する。理解されるであろうように、特定のｍＡＲアッセイ及び対照アッセイを並行して（即ち、同時に）実施することが常時必要であるわけではない。例えば、所定の薬剤（又は複数の薬剤）に関してＡＲの活性が相対的に公知であるような態様では、選択したｍＡＲアッセイを実施する度に対照を実施する必要はないであろう。或いは、及び多数の薬剤をスクリーニングするような（例えば、大きな化学的ライブラリーを試験するような場合）態様では、そこでの１つ又は組合せの対照アッセイは最適な結果を達成するために必要ではないだろう。例えば、最初にｍＡＲを活性化する能力を検出することによる薬剤のスクリーニングを行い、次いで対照アッセイの１つ又は組合せを用いて更なるテストを引き続き実施することが有用であろう。
【００２１】
本発明の多くの態様に関して、特に本発明をハイ−又はウルトラハイ−スループットスクリーニング（ＨＴＳ）形式に従って用いるような態様では、ＡＲ調節をモニタリングするための少なくともいくつかの対照アッセイを含むのが有用であろう。そのような形式は、ｍＡＲ活性化能に関する多数の候補薬剤を分析するために特に有用である。
【００２２】
対照アッセイを第３の錯体（ｉＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲン化合物の間に形成される）を検出するために用いるような態様では、方法は、薬剤の存在下で第３の錯体からの検出可能に標識したアンドロゲン化合物の放出を検出する段階を更に含むであろう。好ましくは、そのような薬剤は第３の錯体からの標識したアンドロゲン化合物の放出をほとんど又は全く示さないであろう。
本発明のこれら及び他の使用並びに利点は、以下の検討及び実施例から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
検討したように、本発明は、ｍＡＲ結合を増大又は低下させる薬剤を検出するために用いることができる。好ましい薬剤は、ＡＲを調節する能力と比較して、優先的に又は排他的にのどちらかでｍＡＲの活性化を増大する受容体リガンドである。好ましい受容体リガンドは、ＡＲを結合して活性化する能力をほとんど又は全く有さずにｍＡＲを特異的に結合する。
【００２４】
本明細書で用いる「薬剤」（複数形を含む）は、非共有又は共有結合のどちらかにより、ｍＡＲ又はＡＲ（又は両方）と結合可能な部分を意味する。好ましい薬剤は、本明細書に開示されている方法の１つ又は組合せにより判定されるようなｍＡＲと、直接的又は間接的のどちらかで優先的に結合する。より好ましい薬剤は、「リガンド」である。「リガンド」は、一般的に非共有結合を介し、ｍＡＲ（又はＡＲ）を結合する特定の薬剤を意味する。好ましいリガンドは、本明細書に開示されているアッセイの１つまたはそれ以上によって、結合の検出を可能にするのに十分な受容体結合定数を有する。そのようなアッセイの具体例は、受容体結合錯体の形成又は分解、二次メッセンジャーの検出、アポトーシスの検出、前立腺特異抗原（ＰＳＡ)の検出、細胞内カルシウムの検出、タンパク質−リガンド結合を測定する結合アッセイ、抗体−抗原の相互作用を測定する免疫アッセイ又は細胞骨格の再構築をを直接的又は間接的にモニタリングすることを含む。本発明による例示的なリガンドは、テストステロン及びその誘導体（例えば、ＤＨＴ）のような特定のアンドロゲンである。他の適切なリガンドは、抗体、抗原、酵素、ペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、核酸、ステロイド、又はｍＡＲを結合する小分子リガンドを含む。好ましいリガンドは、一般に受容体−リガンド錯体を形成するために、ＡＲと相互に作用する能力をほとんど又は全く持たずにｍＡＲを特異的に結合する。
【００２５】
本明細書で用いる「二次メッセンジャー」という用語は、ｍＡＲ又はＡＲの活性化により、産生された又は濃度を変化させられる分子を意味する。「二次メッセンジャーの濃度変化」という用語は、候補モジュレータの非存在下で実施したアッセイにおいて検出した量と比べて、所定の二次メッセンジャーの検出した濃度の少なくとも約１０％の増加又は減少を意味する。例示的な二次メッセンジャー（シグナリング）分子は、本明細書中に提供される。
【００２６】
「特異的に結合する」という用語又は同様の用語は、別の分子（例えば、受容体）を結合して、それにより特異的な結合対を形成する、本明細書に開示されている分子（例えば、薬剤）を意味する。好ましくは、分子は、例えば、ウエスタンブロッティングＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、移動度シフトアッセイ、酵素免疫アッセイ、競合アッセイ、飽和アッセイ、又は当該技術分野で公知の他のタンパク質結合アッセイにより判定されるように、他の分子を認識しないか又は結合しない。一般に、Ausubel, et al. supra; Harlow and Lane in, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) 及び適切な免疫学的方法及び分子間の特異的結合を検出するための方法の実施例に関してそれらで引用されている文献を参照されたい。好ましい態様では、薬剤及びｍＡＲの間の「特異的結合」は、一般に０．０１ｎＭ〜約１００ｎＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲の、1ｍＭ又はそれ以下のＫｄで明示される。Ｋｄを判定するための多種の標準的方法は本明細書に開示されている。
【００２７】
本発明のｍＡＲアッセイが１つ又はそれ以上の二次メッセンジャー、細胞内カルシウム、ＰＳＡ分泌、又は細胞骨格の再構築を検出するような態様では、ｍＡＲが最大の効果を発揮していると見られる時間の間に、即ち約３時間以内に、好ましくは約１〜約２時間以内に、より好ましくは約数分〜約３０分以内に、検出を行うであろう。一方で、アポトーシス効果は、より長い時間、即ち約数時間〜数日間、例えば１、２、３又は４日〜１週間の後に検出してもよい。
【００２８】
薬剤、特にｍＡＲと結合して（例えば、非共有的に結合して）そして天然のｍＡＲリガンド（例えば、テストステロン）の影響を最小化するｍＡＲ受容体リガンドは、本明細書で「ｍＡＲアゴニスト」として示す。一方で、天然のｍＡＲリガンド（例えば、テストステロン）の影響を阻止する薬剤は、「ｍＡＲアンタゴニスト」と称する。
【００２９】
より広範に、本発明のｍＡＲアゴニストは、ｍＡＲが介在する１つ又はそれ以上の生物学的応答を、天然のリガンド（例えば、テストステロン又はＤＨＴ)の結合のような適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、好ましくは約５倍、より好ましくは約１０倍、及び最も好ましくは約１００倍又はそれ以上（即ち、約１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍〜１０，０００倍）まで、調節する（この場合増大する）であろう。他方で、本発明によるｍＡＲアンタゴニストは、ｍＡＲが介在する１つ又はそれ以上の生物学的応答を、天然のリガンドの存在中の応答と比較して、少なくとも約２倍、好ましくは約５倍、より好ましくは約１０倍、及び最も好ましくは約１００倍又はそれ以上（即ち、約１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍〜１０，０００倍）まで、調節する（この場合低減する）であろう。
【００３０】
「アンドロゲン」（複数形も含む）という用語は、本明細書では、脊椎動物における男性的特徴の発達を刺激する、天然の、合成の、半合成の、又は組換えの物質の何れかを包含するよう用いられる。好ましいアンドロゲンは、一般に、以下に検討するような公知のアッセイの１つ又は組合せにより、ｍＡＲを調節する能力を実証する。より特定のアンドロゲンは、男性付属性器の活性を制御するそれら天然又は合成の化合物を含む。アンドロゲンは、ある場合「アンドロゲンホルモン」として、又はいくつかの場合「精巣」として知られている。
【００３１】
本発明によるより特定のアンドロゲンは、一般に認められるインビトロ又はインビボのアッセイにおいて有意な活性を示す。例えば、ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８８５９号(国際公開第２００５／０５２２１１８号公報)、ＰＣＴ／２００４／０２７４８３(国際公開第２００５／０１８５７３号公報)、ＰＣＴ／２００５／０１３７７５号(国際公開第２００５／１０５０９１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２号(国際公開第２００６／０２６１９６号公報)、及びＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、並びにそれらに開示されている文献におけるＡＲの調節をテストするアッセイを参照されたい。
【００３２】
アンドロゲンを同定するための適切なインビトロアッセイは、「放射性リガンド置換アッセイ」と当該技術分野で称されているものである。端的に、アッセイは、ＡＲ受容体リガンド（例えば、ＤＨＴ）を置換する能力を検出及び好ましくは測定する。この一般的なテストの多様な操作は、所定の薬剤のＩＣ５０、Ｋｄ及びＫｉ値を確認するために実施されてもよい。ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８８５９号(国際公開第２００５／０５２２１１８号公報)、ＰＣＴ／２００４／０２７４８３(国際公開第２００５／０１８５７３号公報)、ＰＣＴ／２００５／０１３７７５号(国際公開第２００５／１０５０９１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２号(国際公開第２００６／０２６１９６号公報)、及びＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、並びにそれらに開示されている文献の１つ又はそれ以上、例えばＰＣＴ／ＵＳ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２６１９６号公報)、具体的には５４〜５６ページを参照されたい。適切なインビボアッセイは、適切な動物モデルにおける睾丸切除に続いて、前立腺（及び必要であれば、副器官）を測定する。他の好ましいアッセイ形式に関して Chang et al. (1984) J. Steroid Biochem. 20:1-17;  及び Chang et al. (1992) PNAS 89:5546も参照されたい。よって本発明による「アンドロゲン」は、これらのアッセイの１つ又はそれ以上において良好な活性を示すであろう。
【００３３】
アンドロゲンの「誘導体」は、テストステロンと構造的及び機能的な関係を持ち、１つ又はそれ以上の新たな化学基もまた有するものである。そのような基は、これらに限定はされないが、飽和基、不飽和基、アルキル基（アルカン、アルケン、アルキン及びヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレーン及びヘテロアリールを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環状化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、β−ラクタム、テトラサイクリン、セファロスポリン、及び炭水化物を含む）、他のステロイド（エストロゲン、他のアンドロゲン、コルチゾン、エコジソン（ecodyson）等を含む）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラーレ、ピロリジジン、及びマイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子ベアリング化合物、アミノ酸、及びヌクレオシドを含む。
【００３４】
より特定のアンドロゲン及びアンドロゲン誘導体は、これに限定されないが、副腎アンドロゲン、即ち副腎皮質により合成された１９−炭素ステロイドの何れかを含む。他のアンドロゲンは、テストステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、特に５−α−ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ、デヒドロイソアンドロステロン又はデヒドロアンドロステロンとも呼ばれる）、アンドロステンジオン、アンドロスタンジオール；  及び天然の、合成の又は半合成の誘導体、並びにその塩を含む。本発明の「アンドロゲン」は、塩、好ましくは薬学的に許容されるものとして提供されてもよい。そのような塩の具体例は、無機酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、若しくはリン酸塩のような、又は有機酸付加塩、例えば酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、若しくはクエン酸塩のような、酸付加塩を含む。薬学的に許容される塩は、金属塩、特にナトリウム塩若しくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩；マグネシウム若しくはカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム若しくはテトラメチルアンモニウム塩のようなのようなアンモニウム塩；又はリジン、グリシン若しくはフェニルアラニン塩のようなアミノ酸付加塩も含んでいてよい。付加的な塩は、ナトリウム、塩化物、臭化物、フマル酸塩、クエン酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、シピオン酸塩、及びカプリン酸塩を含む。
【００３５】
テストステロンの多くの誘導体が公知であり、Ｄ(−)ノルゲステレル、エピテストステロン、１７−安息香酸テストステロン、１７−フェニルプロピオン酸テストステロン、１７β−シピオン酸テストステロン、テストステロン３−(Ｏ-カルボキシメチル）オキシム、テストステロン３−(Ｏ−カルボキシメチル）オキシム：ＢＳＡ、テストステロン３−(Ｏ-カルボキシメチル）オキシム：ＢＳＡ−フルオレセインイソチオシアネート複合体のようなテストステロンのオキシム、酢酸テストステロン、テストステロンβ-Ｄ-グルクロニド、テストステロンβ−Ｄ−グルクロニドナトリウム塩、エナント酸テストステロン、イソカプロン酸テストステロン、プロピオン酸テストステロン、テストステロン−ｄ３、１７−α−２−カルボキシ−エチル−テストステロン−γ−カルボキシ−エチル−ラクトン、酢酸テストステロン、テストステロン−β−Ｄ−グルクロニド、及び１７−α−(２-カルボキシエチル）テストステロン−γ−ラクトン、５α−アンドロスタン−１７β−オル−３−オン、１７−安息香酸アンドロスタノロン、プロピオン酸ジヒドロテストステロン、メチルトリエノロン、アンドロスタノロン、ジヒドロテストステロン、１７−ヒドロキシアンドロスタン−３−オン、ヘルマロン（hermalone）、酢酸アンドロスタノロン、５β−ジヒドロテストステロン、プロピオン酸アンドロスタノロン、エナント酸ジヒドロテストステロン、メスタノロン、１７−ブロモアセトキシジヒドロテストステロン、及びエンジステロン（emdisterone）を含む。
【００３６】
Hauptman,H.(2003) Steroids 68:629（ジヒドロテストステロンの１α−及び１７α−アミノアルキル誘導体を記載している）も参照されたい。テストステロンの更なる誘導体を開示している、国立医学図書館（the National Library of Medicine）（8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894 (USA) ）の公開化学データベース（Pub Chem Databese）も参照されたい。
【００３７】
本発明の範囲内の他の特定のテストステロン誘導体は、例えば、テストステロン又はＤＨＴが、より大きなタンパク質分子に、適切なリンカーを介して直接的又は間接的のどちらかで接続しているような分子を含む。本目的のための例示的なタンパク質は、約３０ｋＤ〜約１００ｋＤ、好ましくは約４０ｋＤ〜約８０ｋＤ、及びより好ましくは約６０ｋＤの分子量を有する。１つの例示的なタンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミンである。例示的なアルブミン（適切なその分画及び誘導体を含む）は、以下に検討する。分子量は、ゲル電気泳動を含む標準的方法により測定する。所望であれば、テストステロンに接続したタンパク質は、例えばＧＦＰのように、それ自身を検出可能であってもよい。
【００３８】
本発明による更なるアンドロゲンは、米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）のインターネットウェブサイトに開示されている。特に、Endocrine Knowledge Disrupter Base（ＥＫＤＢ）は、アンドロゲン性（及び/又はエストロゲン性活性）を持つと報告されている約２０００の天然の又は合成の化合物を掲載している。そのような活性を測定する生物学的アッセイに関するデータが含まれている。アンドロゲンの概説及びその検出のためのインシリコの方法に関する Fang, H. et al. (2003) Chem. Res. Toxicol. 16:1338も参照されたい。
【００３９】
本明細書に開示されている適切な対照アッセイの大部分に関して好ましいアンドロゲンは、テストステロン又はＤＨＴである。しかし、他のアンドロゲン、特にテストステロン誘導体を１つ又はそれ以上のそのようなアッセイに用いることができる(例えば、メチルトリエノロン)ことは理解されるであろう。一般に、ＤＨＴは天然のＡＲリガンドである場合に選択される。
【００４０】
検討したように、本発明の目的は、薬剤、例えばｍＡＲを結合できる、受容体結合リガンド、を検出及び随意的に同定することである。そのような薬剤の代表的なものはｍＡＲアゴニストである。「膜アンドロゲン受容体」(複数形及び「ｍＡＲ」のような短縮形を含む)とは、アンドロゲン介在の効果を「迅速に」、即ち３時間以内に、好ましくは約１〜約２時間未満で、より好ましくは１時間足らずで、更に好ましくは約数分(例えば１又は２分)から約３０分までに、発揮するアンドロゲン感受性受容体を意味する。Kampa, M. E. Castanas (2006),ibid（多種の許容可能なｍＡＲアッセイを概説している)を参照されたい。
【００４１】
例えば、１つのｍＡＲ薬剤の検出形式では、アクチン再構築、細胞内カルシウム放出、又はＰＳＡ放出の１つ又はそれ以上は、約数分〜約３時間でｍＡＲを結合する薬剤を同定するために測定できる。ｍＡＲとの結合は、カルシウム動員、分泌及びアクチン再構成を含む、「迅速」効果に関連すると考えられる。ｍＡＲを検出及び分析するための他の方法は、ある特定の細胞、細胞株及び組織について報告されている。例えば、Porto, C. S. et al. (1995) in Steroid Biochem. Mol. Biol. 53:561を参照されたい。
【００４２】
「組織」とは、器官において特定の機能を果たす細胞の集合体を意味する。本明細書に用いる「組織」という用語は、特定の生理学的領域由来の細胞物質を示す。特定の組織の細胞は、いくつかの異なる細胞型を包含してもよい。この具体例は、これに限定はされないが、例えば全てが所定の組織の切片及びサンプルに含有される、神経細胞、若しくは毛細管内皮細胞及び血球を更に包含する前立腺及び周辺組織であろう。固形組織に加えて、「組織」という用語は、血液及びリンパ液のような非固形組織を含むことも意図している。
【００４３】
ｍＡＲを発現する細胞、細胞株及び組織を同定するための好ましい検討方法は、ここでステロイド環が高分子と連結するようなテストステロンの誘導体とこれを接触することを含む。そのような分子の設計は、アンドロゲンの分子量を大いに増加させることを意図する。そのように実施した場合、ステロイドは、古典的な細胞内アンドロゲン膜受容体（ｉＡＲ）による内在化を防止される。より特定の及び適切な方法では、検出可能に標識したテストステロン−血清アルブミン複合体を、ｍＡＲを同定するためのプローブとして用いる。例えば、Kampa, M. E. and Castanas (2006), ibid; Hatzoglou, A. et al. (2005), ibid; Kampa, M. et al. (2002), ibid; Stathopouos, E. et al. (2003), ibid;（そのようなｍＡＲプローブの作成及び使用に関連する開示に対して）を参照されたい。
【００４４】
Dambaki, C. et al. (2005) BMC Cancer, 5:148; ＰＣＴ/ＩＢ０３/０２７８５号、米国特許出願公開第２００５０２４５４４２号及びギリシャ特許出願第２００２０１００３３５号（E. Castanas (Univercity of Crete Medical School (Heraklion, Greece))も参照されたい。ｍＡＲの検出及び特徴付けのための好ましいテストステロン血清アルブミン複合体は、Ｔｅｓｔ-ＢＳＡである。
【００４５】
適切な方法の１つ又は組合せを用いることにより、 例えば前立腺腫瘍組織、前立腺癌性ＬＮＣａＰ細胞、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞、及びヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄのような、多種の細胞及び組織においてｍＡＲを検出できている。Kampa,et al. (2005), ibid; Kampa, et al. (2002), ibid; Hatzoglou, A. et al. (2005), ibid; を参照されたい。一方、非腫瘍性及び増殖性の細胞のようなある特定の組織サンプルが低いか又はほとんど検出できないレベルのｍＡＲを発現すると考えられる。Stathopolos et al. (2003), ibid。ＬＮＣａＰ細胞がｍＡＲ及びｉＡＲ受容体分子を発現する一方で、ＤＵ-１４５細胞株はｍＡＲだけを発現する（即ち、ｉＡＲは検出できなかった）と報告されている。
【００４６】
ｍＡＲを検出するためのこれらの及び関連する方法を用いて、ｍＡＲの存在に関して所望の細胞、細胞株又は組織サンプルの何れかのほとんどを検査することが可能である。そこでｍＡＲが検出されるようなサンプルは、本明細書に記述する方法に従って用いることができる。具体的には、及び一態様では、ＬＮＣａＰ、Ｔ４７Ｄ又はＤＵ−１４５細胞株を、ｍＡＲの供給源として用いる。ｍＡＲ(ＡＲではなく）を発現する細胞有することが有用であるような態様では、ＤＵ-１４５細胞株の使用が特に好ましいであろう。適切な細胞、細胞株及び組織サンプルは、ドイツ微生物及び細胞培養コレクション（the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）（Brauschweig, Germany）及びAmerican Type Culuture Collection（ＡＴＣＣ）（Manassas, VA）を含む多種の供給源から入手できる。
【００４７】
ｍＡＲ（又はＡＲ）の存在に関してスクリーニングすることができる細胞の具体例は、全ての型の腫瘍細胞（特にメラノーマ、骨髄性白血病、肺、乳、卵巣、結腸、腎臓、前立腺、膵臓及び睾丸の癌）、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（Ｔ-細胞及びＢ細胞）、肥満細胞、好酸球、血管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を含む白血球、造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓及び筋細胞の幹細胞のような幹細胞（分化及び脱分化の因子に関するスクリーニングに使用するため）、破骨細胞、軟骨細胞及び他の結合組織細胞、ケラチン生成細胞、メラニン細胞、肝細胞、腎細胞、及び含脂肪細胞のような適切な真核細胞型を含む。他の適切な細胞は、ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ等を含む。ＡＴＣＣ細胞株のカタログ一覧を参照されたい。
【００４８】
検討したように、本発明の目的は、ｍＡＲを活性化できる受容体リガンドを検出及び随意的に同定することができる方法を提供することである。好ましい実施は、ｍＡＲ及び検出可能に標識したアンドロゲン化合物（例えば、３Ｈ-ＤＨＴ又はＡＲを結合する他の適切なテストステロン誘導体）を結合して第１の錯体を形成することを可能にする条件下で、ｍＡＲを当該化合物と接触させることを含む。続いて、薬剤及びｍＡＲの間を結合して第２の錯体を形成することを可能にする条件下で、第１の錯体を薬剤と接触させる。好ましくは、第１の錯体からの検出可能に標識したアンドロゲン化合物の放出のいずれかを検出して薬剤の存在の指標とする。
【００４９】
「ｍＡＲ及び薬剤を結合することを可能にする条件」（単数形を含む）という用語は、テストステロン、ＤＨＴ、又はテストステロン３−(Ｏ−カルボキシメチル）オキシム：ＢＳＡのようなテストステロン誘導体のｍＡＲとの結合に通常有利に働くような条件を意味する。そのような条件は、その下で例えばテストステロン３−(Ｏ−カルボキシメチル）オキシム：ＢＳＡがｍＡＲを結合するような、温度、塩濃度、ｐＨ及びタンパク質濃度を包含するであろう。的確な結合の条件は、例えばアッセイが生存細胞を用いるかそれとも細胞の膜分画のみを用いるかのような、アッセイの特性に依存して変化するであろう。しかし、ｍＡＲは細胞表面タンパク質であるので、有利な条件は通常、生理的食塩水（約９０ｍＭ)及びｐＨ（約７．０〜８．０）を含む。結合するための温度は、１５℃〜３７℃に変化させてもよいが、好ましくは、室温〜約３０℃であろう。検出する薬剤の濃度も変化するであろうが、好ましくは、約０．０１ｎＭ〜１００マイクロモルであろう。
【００５０】
本明細書で用いる「膜分画」という用語は、ｍＡＲ又はＡＲを包含する細胞内脂質膜の調製物を示す。この用語を本明細書で用いる場合、「膜分画」は、細胞ホモジネートと異なる、即ち少なくとも非膜関連の細胞構成要素の少なくとも一部（即ち、少なくとも１０％、及び好ましくはそれ以上）が除去されている。「膜関連の」という用語は、脂質膜に組み込まれているか或いは脂質膜に組み込まれている成分と物理的に関連しているかのどちらかである細胞構成要素を示す。
【００５１】
リガンドをｍＡＲ受容体と結合するためのより特定の条件が報告されている。Hatzoglou et al. (2005) J. Clin. Endocrinol Metab. 90:893; 及び Kampa, M. et al. (2002), supra; を参照されたい、ここではＤＨＴ、テストステロン  及びテストステロン３−(Ｏ−カルボキシメチル）オキシム：ＢＳＡ複合体をｍＡＲに結合するための特定の条件がそれぞれの引例に記述されている。
よって「ＡＲ及び薬剤を結合することを可能にする条件」（同類の用語を含む）という用語は、一般にｍＡＲ及びテストステロン、ＤＨＴ又はテストステロン３−(Ｏ−カルボキシメチル）オキシム：ＢＳＡの間を結合することを可能にする条件を意味する。
【００５２】
「検出可能に標識したアンドロゲン」という用語は、少なくとも１つの以下のものを含むアンドロゲンを意味する：放射性同位体、蛍光色素分子、蛍光消光剤、酵素、親和性標識、又は化学発光性、リン光発光性、又は色素体部分。検出可能な標識は、アンドロゲンのステロイド環（例えば、１、３、７、１１及び１５の炭素位の１つ又はそれ以上）に存在していてもよく、或いは別の基に、例えばリンカー、又はアンドロゲン若しくはリンカーと結合するアミノ酸配列に存在していてもよい。そのようなリンカーの具体例は、カルボキシジイミドの使用を介してステロイド環に付加しているカルボキシ−メチルエーテル部分である。より特定のリンカーはオキシム基を含む。一例として、検出可能に標識したアンドロゲンは、テストステロンオキシム及びテストステロン血清アルブミン複合体を含み、ここでは１つ又はそれ以上の検出可能な標識が適切なオキシムリンカーに又はリンカーと結合したアミノ酸配列に付着している。例えば、これらの特定のアンドロゲンの作成及び使用に関連する更なる情報に関して、ＰＣＴ/ＩＢ０３/０２７８５号、米国特許出願公開第２００５０２４５４４２号及びギリシャ特許出願第２００２０１００３３５号を参照されたい。
【００５３】
ｉ．アッセイの検出形式
本発明による使用のための広く多様な検出可能な標識が報告されている。一般に、W. T. Mason in Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity: A Practical Guide to Technology For Quantitative Real-Time Analysis, 2nd Ed. (Academic Press, 1999)を参照されたい。アミノ酸配列を標識するための例示的標識は、フルオロセイン、ローダミンレッド、ＦＩＴＣ及びオレゴングリーンを含む。他の適切な蛍光、発光及び発色のプローブは Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（1600 Faraday Avenue, Carlsbad, CA 92008 (USA)）から入手できる。
【００５４】
付加的な蛍光標識の使用は本発明の範囲内である。
例えば、フルオロセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（Cascade Blue；登録商標）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣレッド ６４０、Ｃｙ５、ＣＹ５．５、及びＬＣレッド ７０５。適切な光学色素は、Richard P. Hauglandによる1996 Molecular Probe Handbookに記述されていて、明確に本明細書に参照して組み込まれる。適切な蛍光標識は、これらに限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Charfie, et al., Science 263(5148):802-805 (Feb. 11, 1994) 及びＥＧＦＰ、Clontech--Genbank Accession Number U55762）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、1. Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal (Quebec) Canada H3H 1J9; 2. Stauber, R. H. Biotechniques 24(3):462-471 (1998); 3. Heim, R. and Tsin, R. Y. Curr. Biol. 6:178-182 (1996)）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、1. Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto Calif. 94303）、ルシフェラーゼ（Ichiki, et al., J. Immunol. 150(12):5408-5417 (1993)）、β-ガラクトシダーゼ（Nolan, et al., Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2603-2607 (April 1988)）及びRenilla（国際公開第９２/１５６７３号公報；同第９５/０７４６３号；同第９８/１４６０５号；同第９８/２６２７７号；同第９９/４９０１９号；米国特許第５，２９２，６５８号；同第５，４１８，１５５号；同第５，６８３，８８８号；同第５，７４１，６６８号；同第５，７７７，０７９号；同第５，８０４，３８７号；同第５，８７４，３０４号；同第５，８７６，９９５号；及び同第５，９２５，５５８号）を含む。
【００５５】
よって本発明の一態様では、テストステロンのようなアンドロゲンは、ＧＦＰタンパク質のような蛍光体又は検出可能なその画分と連結している。この実施例では、ＧＦＰはウミシイタケ（renilla）、プチロサルカス（ptilosarcus）又はオワンクラゲ（aequorea）種由来のＧＦＰを入手した。
さらに本発明のいくつかの態様に関して適切な標識は、Alexa-Fluor色素（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680）、カスケードブルー、カスケードイエロー 及びＲ−フィコエリシン(PE)（分子プローブ)(Eugene, Oreg.)、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Pierce, Rockford, Illinois）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Amersham Life Science, Pitteburgh, Pa.）を含む。Ｃｙ５ＰＥ、Ｃｙ５．５ＰＥ、Ｃｙ７ＰＥ、Ｃｙ５．５ＡＰＣ、Ｃｙ７ＡＰＣに関するタンデム複合体のプロトコルは、drmr.com/abconにて参照できる。蛍光プローブ複合体の定量化を評価して、標識化の程度を判定してもよく、色素スペクトルの特性を含むプロトコルはmetazoa.com/UPL3419にて参照できる。
【００５６】
本発明の一態様では、アンドロゲンは第２の検出可能な標識で、直接的又は間接的（例えばリンカーを介して）の何れかで、検出可能に標識される。第２の標識は、間接的に検出されるものであり；例えば第２の標識は、検出のために第１の標識と結合又は反応することができ、付加的生成物に作用して第１の標識（例えば酵素）等を産生できる。第二の標識は、これらに限定はされないが、結合パートナー対の一方、化学的に修飾可能な部分、ヌクレアーゼ阻害剤、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼルシフェラーゼ等のような酵素を含む。
【００５７】
例として、第二の標識は、結合パートナー対である。例えば標識は、その結合パートナーを結合するであろうハプテン又は抗原でもよい。例えば、適切な結合パートナー対は、これらに限定はされないが、抗原（タンパク質（ペプチドを含む）及び小分子のような）及び抗体（その断片を含む（ＦＡＢｓ等））；ビオチン/ストレプトアビジンを含む、タンパク質及び小分子（、ビオチン/ストレプトアビジンを含む）；酵素及び基質又は阻害剤；他のタンパク質−タンパク質相互作用対；受容体−リガンド；並びに炭水化物及びそれらの結合パートナーを含む。好ましい結合パートナー対は、これらに限定はされないが、ビオチン（又はイミノ−ビオチン）及びストレプトアビジン、並びにジゴキシゲニンを含む。
【００５８】
本発明の別の態様では、第二の標識は化学的に修飾可能な部分である。この態様では、反応性官能基を包含する標識は標識される分子、通常はアンドロゲン、に組み込まれている。官能基は直接的に又は血清アルブミン（その断片を含む）のような適切なリンカー若しくはタンパク質基を介して間接的に、ステロイド環に付加できる。官能基は、続いて第一の標識で標識されてもよい（例えば、アッセイの前または後のどちらか）。適切な官能基は、これらに限定はされないが、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基及びチオール基を含み、アミノ基及びチオール基が特に好ましい。例えば、アミノ基を含有する第一の標識は、例えば当該技術分野で公知のリンカー；例えば公知である（1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200を参照されたい、本明細書に参照して組み込まれている。）ホモ-又はヘテロ−二（元機能）官能性リンカー；を用いてアミノ基を包含する第二の標識に付加できる。
【００５９】
本発明の方法及び組成物は、標識酵素を使用してもよい。標識酵素とは、検出可能な生成物を生成する標識酵素基質の存在下で反応する酵素を示す。本発明で使用するのに適切な標識酵素は、これらに限定はされないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びブドウ糖酸化酵素を含む。そのような基質の使用方法は、当該技術分野で公知である。標識酵素の存在は一般に、識別可能な生成物を生成する標識酵素基質と反応する酵素の触媒作用を通して示される。そのような生成物は、西洋わさびペルオキシダーゼのテトラメチルベンジジンとの反応のように、不透明であってもよく、そして多様な色を有してもよい。ルミノール（Pierce Chemical Co.より入手可能）のような他の標識酵素基質は、蛍光反応生成物を生成するように開発されている。標識酵素基質で標識酵素を同定する方法は、当該技術分野で公知であり、多くの市販キットが入手可能である。多種の標識酵素の使用の具体例及び方法は、Savage et al., Previews 247:6-9 (1998), Young, J. Virol. Methods 24:227-236 (1989)に記述されていて、各々はその全体を参照して本明細書に組み込まれる。
【００６０】
標識酵素及び他の検出可能な標識の検出のため多種の適切な方法は記述されている。Halow and Lane in, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)及びそこで引用されている文献（サンドイッチアッセイ等）を参照されたい。例えば及び一態様では、検出可能な標識はビオチン又はＤＮＰであり、ここでは標準的な抗体検出方法を用いてビオチン部分を検出する。或いは、検出可能な標識は、トリチウム、重水素又は炭素−１４のような、１つ又はそれ以上の放射性同位体である。例示的な放射活性物質で標識したアンドロゲン化合物は、（３Ｈ−ＤＨＴ)又はトリチウム化テストステロン（３Ｈ-Ｔ)である。例えば、特異的にトリチウム化したテストステロン化合物は、テストステロン−［１，２，６，７−３Ｈ］（New England Nuclear, Beverly MA (USA)より入手可能）である。本発明によるアンドロゲンのトリチウム化の方法は、公知であり、例えば通常の同位体交換反応を含む。他の適切な放射性同位体は、１４Ｃ、１２５Ｉ、及び１３１Ｉを含む。
【００６１】
検出可能な標識を、間接的に、例えば抗体により検出してもよい。即ち、抗体はアンドロゲン化合物を直接的に、又は化合物に結合するタグを通して間接的に検出可能であってもてもよい。タグは、一般的に抗体の結合パートナーである。そのような抗体を用いる態様における使用に適切な結合パートナーは、これらに限定はされないが、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ)/抗ＤＮＰ、ダンシル-Ｘ／抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオロセイン、ルシフェールイエロー／抗ルシフェールイエロー、及びローダミン／抗ローダミン、ビオチン／アビジン（又はビオチン／ストレプトアビジン）及びカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンを含む。他の適切な結合対は、ＦＬＡＧ−ペプチド［Hopp et al., Bio Technology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)］；チューブリンエピトープペプチド［Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］のようなポリペプチド並びにそれら各々に対する抗体を含む。
【００６２】
本発明のアンドロゲン化合物を検出可能に標識するために用いることのできる他の適切な「タグ」群は、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ及びニッケル基質；グルタチオン-Ｓトランスフェラーゼタグ及びその抗体基質（Pierce Chemicalより入手可能）；ｆｌｕＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５基質［Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1985)］；ｃ-ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体基質［Evan et al., Molecular and Celluar Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤ（ｇＤ）タグ及びその抗体基質［Parborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。タグもまたポリペプチドである場合の組換え法によるタグ−ポリペプチドの生成を、以下に記述する。タグ−標識したタンパク質の生成は、当該技術分野で公知であり、そのような生成に関するキットは市販されている（例えば、Kodak社及びSigma社より）。タグ標識したタンパク質の具体例は、これに限定はされないが、Flag-ポリペプチド及びHis-ポリペプチドである。タグ標識したタンパク質の生成及び使用の方法は、例えば、Winston et al., Genes and Devel. 13:270-283 (1999)（その全体を参照して本明細書に取り込む）、或いは上記キットにて提供される製品ハンドブックに見出すことができる。
【００６３】
本発明のある特定の検出可能アンドロゲン化合物をビオチン化してもよい。標的の分子及び基質のビオチン化は公知であり、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、カルボン酸のビオチン化のための、アミン反応性及びチオール反応性の薬剤；chapter 4, Molecular Probes Catalog, Haugland, 6th Ed. 1996（参照して本明細書に取り込む）を参照のこと；を含む、多数のビオチン化薬剤が知られる。ビオチン化した基質は、アビジン又はストレプトアビジンを介してビオチン化した成分に付加できる。同様に、多数のハプテン化試薬も知られている（Ｉｄ）。
【００６４】
タンパク質を放射性同位体で標識するための方法は当該技術分野で公知である。例えば、そのような方法は Ohta et al., Molec. Cell 3:535-541(1999)に見出され、その全体を参照して本明細書に取り込む。
組み換え法によるタグを有するタンパク質の生成は公知であり、そのようなタンパク質を生成するためのキットは市販されている。例えば、そのようなキット及びその使用は、Joanne Crowe et al. によるQiagen社のQIAexpress Handbook に記述されていて、これは明確に参照して本明細書に取り込まれる。よって一態様では、血清アルブミンは１つ又はそれ以上のタグで組換え的に発現する。そのような修飾したアルブミンは、直接的に又は適切なリンカーを介して、標準的な方法論を用いてアンドロゲンと連結できる。
【００６５】
「検出可能に標識したアンドロゲン化合物の放出」という用語は、適切な対照（例えば薬剤の非存在下での放出）と比較して、特定のアッセイにおける薬剤の存在によるアンドロゲン化合物の放出の検出可能な増加をを示す。好ましくは、放出が、薬剤を添加しない対照と比較して少なくとも約２０％多く、好ましくは少なくとも約５０％多く、より好ましく少なくとも約８０％、約９０％、又は約９５％若しくはそれ以上である。この態様では、薬剤は、単離でき、同定でき、そして本発明による更なる試験を行うことができる、潜在的なｍＡＲアゴニストである。
【００６６】
以下のＡ〜Ｅの欄は、薬剤又は複数の薬剤（例えば薬剤のライブラリー）のｍＡＲ機能を調節する（増加又は減少させる）能力を検出及び定量化するための好ましい方法を記述する。
「ｍＡＲ機能」とは、本明細書で定義したようなシグナリング分子の調節、ＰＳＡ分泌、カルシウム流出の調節、及び細胞骨格再構成の１つ又はそれ以上を調節する（増加又は減少）受容体の能力である。好ましくは、この機能は、適切な化合物薬剤（例えばＤＨＴ）と接触後３時間以内に、好ましくは約数分〜約１時間の間に、より好ましくは約数分〜３０分の間に観測する。
【００６７】
Ａ.膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）結合
検出可能に標識したアンドロゲンの放出は、例えば薬剤のアゴニスト活性を確認するために及び／又はその活性の強度を測定するために、定量化してもよい。よって一態様では、以下の特定のｍＡＲ結合アッセイは薬剤のＫｄを判定するために用いてもよい。
初めに、適切なｍＡＲ発現細胞（例えばＤＵ−１４５細胞）は、１〜２日間無血清培地に保持される。以下のアッセイの一方又は両方を前記細胞で実施する：（１）トリチウム化ＤＨＴに対するＫｄを判定するｍＡＲ飽和分析又は（２）ｍＡＲに対する薬剤のＤＨＴとの競合能力を評価する競合結合アッセイ。そのようなアッセイは以下の検討に例示されている。
【００６８】
ＤＵ−１４５細胞は、無血清培地に保持した後、１００倍超の非標識ＤＨＴの存在下又は非存在下（全(total)結合）で、検出可能に標識したＤＨＴ（例えば３Ｈ−ＤＨＴ）の飽和量、一般に０．０５ｎＭ〜約２０ｎＭの範囲の量を含む培地と接触させてもよい。競合的アッセイに関して、約０．１ｎＭ〜約１ｎＭの３Ｈ−ＤＨＴ及び１つ又はそれ以上の被検薬剤(１０−１０Ｍ〜１０−５Ｍの濃度範囲）を含む細胞培地を細胞に添加する。各サンプルに対して３つの複製物を用いるのが好ましい。３７℃にて約５時間、好ましくは３〜４時間培養した後、３Ｈ−ＤＨＴのそれぞれの濃度での全結合培地のアリコートを取り出し、結合していない３Ｈ−ＤＨＴの量を測定する。残りの培地を取り出し、細胞を洗浄して未結合の薬剤を取り除き、そして細胞をTriton-Ｘ-１００に溶解する。溶解物は、標準的シンチレーションカウンターを用いて、結合した３Ｈ−ＤＨＴの量に関してアッセイする。任意の非特異的結合を従来法で測定できる。
所望であれば、アッセイは、ＬＮＣａＰのような他の適切な細胞、又はｍＡＲを発現する他の適切な細胞で実施してもよい。
【００６９】
ｉ．ｍＡＲ飽和分析 
飽和分析に関して、全結合と非特異的結合との間の差異は正規化される。特異的なｍＡＲ受容体結合は、標準的 Scatchard 分析を用いて評価して３Ｈ−ＤＨＴに対するＫｄを判定することができる。Scatchard 分析は、飽和結合実験からのデータを線形化して結合定数（Ｋｄ）を判定するための方法であることは理解されるであろう。特異的結合（Ｘ軸）に対する（vs.）特異的結合／非結合の放射性リガンド濃度（Ｙ軸）の「第二の」プロットを作成する。例えば、Robard, D. in Ligand Assay, J. Langon and JJ. Clapp (eds.) (Masson Publishing U.S.A.), pp.45-49 (1981)を参照されたい。
目的とする特定の薬剤は、約１マイクロモルより小さい、好ましくは約０．０１ｎＭ〜約０．１マイクロモル、より好ましくは約０．１ｎＭ〜５０ｎＭのＫｄを示すであろう。
【００７０】
ｉｉ．ｍＡＲ競合分析
受容体競合の検討に関して、データは、所定の薬剤に対する容量-応答曲線の範囲を超えて残る３Ｈ−ＤＨＴの量（薬剤の非存在下での対照に対する％）としてプロットできる。５０％の量の３Ｈ−ＤＨＴが競合する受容体リガンドの非存在下で結合することを阻止する何れの薬剤の濃度も、標準的方法を用いて定量化できる（ＩＣ５０と称す）。例えば、Robard, D. (1981), supra; 及びＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７４８３を参照されたい。何れかの非特異的結合の補正後、ＩＣ５０値を判定してもよい。ＩＣ５０値は、本明細書では結合を約５０％減少させるのに必要とする競合する薬剤の濃度として定義する。
目的とする特定の薬剤は、約１マイクロモルより小さい、好ましくは約０．０１ｎＭ〜約０．１マイクロモル、より好ましくは約０．１ｎＭ〜約２０ｎＭのＩＣ５０を示すであろう。
【００７１】
Ｂ．膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）シグナリング分子の検出
検討したように、本発明の目的は、ｍＡＲ受容体活性を調節する薬剤を検出することである。そのような活性は、受容体結合のレベルで又はそのような結合の後で（ｍＡＲの「下流」活性として示す）検出してもよい。少なくとも１つの及び好ましくは全ての、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）、ホスファチジルイノシトール−３（ＰＩ−３）キナーゼ、細胞分裂周期４２（ｃｄｃ４２）及びｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（Ｒａｃ１）分子を含む、いくつかの下流ｍＡＲシグナリング分子が報告されている。この特定の経路の活性は、迅速なアクチンの細胞骨格再構成（例えば、細胞の増殖、分泌及び移動性を制御すること）をもたらす。Papakonstanti, E. et al. (2003) Mol. Endocrinology 17:870を参照されたい。
【００７２】
最近になって、アクチンの細胞骨格再構成が、ｍＡＲ活性化の１つの重要な成果として明示されている。Papadopoulon, N.D. et al. (2004), 56th Meeting of HSBMB (Hellenic Society of Biochemistry and Molecular Biology) 25-27 November 2004, Larissa Greece を参照されたい。 
非ゲノムのアンドロゲン効果は、膜レベルで開始する。これは、例えば特異的な分泌機序及びシグナリング機構（ｉＡＲの下流のそれらとは異なる）を提示する。アンドロゲン膜結合部位（即ちｍＡＲ）は、ＬＮＣａＰヒト前立腺細胞に存在する。
【００７３】
本開示から理解されるであろうように、細胞をテストステロン-ＢＳＡと接触させることにより、ＤＵ-１４５のｍＡＲの活性化が可能である。この接触は、有意なアクチンの再構築、これに続く細胞移動、接着及び侵襲の低減を誘発した。さらに示されるように、これらの効果は、Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＡＢ（ＲｈｏＡ／Ｂ）、Ｒｈｏ関連コイルド−コイルキナーゼ（ＲＯＣＫ）及びＬＩＭ−モチーフ含有キナーゼ（ＬＩＭＫ２）の少なくとも１つ及び好ましくは全てを含む、下流のシグナリング経路の活性化を通してもたらされた。この経路の活性化はシグナリング及びアクチンの再構成を誘発した。この経路は、ＬＮＣａＰ細胞では活性化しない。テストステロン−ＢＳＡは、ＬＮＣａＰ及びＤＵ１４５細胞の両方でアポトーシス、アクチンの細胞骨格再構成により調節された１効果をもたらした。加えて、ＬＮＣａＰ接種ヌードマウスのインビボ実験では、テストステロン-ＢＳＡ（８ｍｇ／ｋｇ／体重）での１ヶ月の処理が、対照動物と比較して６０％の腫瘍サイズの減少をもたらすことを示した。この効果は抗−アンドロゲンフルタミドでは観察されなかった。対照動物での明確な毒性作用は見られなかった。この実施例は、ｍＡＲの活性化が前立腺癌細胞のアポトーシス退行を誘発できることを示す。
【００７４】
従って、及び本発明の一態様では、前記薬剤検出方法の１つ又は組み合わせは、ｍＡＲの下流のシグナリング分子の調節を検出する段階をさらに含んでもよい。「下流」とは、特定の分子が、ｍＡＲ活性化に応答性のある生物化学的経路の中にあることを意味する。好ましくは、このような方法は、適切な対照（例えば、薬剤を付加しないような場合）と比較した、シグナリング分子のレベルの変化を検出する段階をさらに含む。シグナリング分子の調節を検出する段階は、例えば、グアニンヌクレオチド結合又は交換、キナーゼ活性、グアノシントリホスファターゼ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アクチン再構成、レポーター遺伝子発現、及び細胞内カルシウム濃度の少なくとも１つの活性（即ち、増加又は減少）を測定することを含んでいてもよい。好ましくは、キナーゼは焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）又はホスファチジルイノシトール−３（ＰＩ−３）キナーゼの一方である。そのような方法は、ＦＡＫのホスファチジルイノシトール−３（ＰＩ−３）キナーゼとの関連を検出する段階をさらに含んでもよい。特定のグアノシントリホスファターゼはＣｄｃ４２／Ｒａｃ１である。
ある特定のこれら及び他のシグナリング分子の検出のための免疫学的方法が報告されている。Papakonstanti, E. et al. (2003), supra; 及びPapadopoulon, N.D. et al. (2004), supra;を参照されたい。一般に、方法は、定着した免疫沈降、キナーゼ、及び免疫ブロッティング型検出形式を含む。
【００７５】
Ｃ．ｍＡＲによる細胞内カルシウムの調節 
ｍＡＲに結合するテストステロンの共通効果は迅速に、数秒以内に、細胞内カルシウムを増加させることであると報告されている。Kampa, et al. (2004), supra;及び Kampa and Castanas (2006), supra を参照されたい。この増加は、Ｇタンパク質受容体アンタゴニスト、Ｇタンパク質共役受容体を示す百日咳毒素に感受性があると報告されている。これはＡＲを欠く細胞でも観察され、酢酸シプロテロン又はフルタミドのような抗アンドロゲンにより効果的でない。これは、とりわけ非古典的受容体媒介作用を示す。Gong et al. (1995) Endrocrinology 136:2172も参照されたい。
【００７６】
従って、及び一態様では、ｍＡＲの調節を検出するための前記方法の１つ又は組み合わせは、細胞内カルシウムの増加を検出及び随意的に定量化するための従来のテストと組み合わせてもよい。適切なテストの具体例は、例えば、Kampa et al. (2004), supraに記述されている。さらに、適切なテストは一般に、カルシウムプローブ、カルシウムプローブに対する抗体、カルシウムイオノフォア及び細胞内カルシウムの変化を検出するためのカルシウムキレート剤の少なくとも１つを用いるであろう。Cell Signaling & Neuroscience (2002-2003)なる表題のthe Sigma-Aldrich Catalogue Book、特にカルシウム濃度を検出及び測定するためのそのような物質の使用に係る開示に関する、pages 482-498を参照されたい。例示的な形式は、ＡｒｓｅｎａｚｏIII、Ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ−３ａｍ、Ｆｕｒａ２及び細胞内カルシウムの増加（又は減少）の検出可能な指標としての使用を含む。
【００７７】
よって一態様では、適切な細胞、細胞株又は組織サンプル（例えば、ＤＵ−１４５又はＬＮＣａＰ細胞）の細胞内カルシウム濃度は、ｍＡＲの１つ又はそれ以上の薬剤との接触に続いて検出される。薬剤なしでの培養のような適切な対照と比較した、何れの細胞内カルシウム濃度の増加も、ｍＡＲを調節する薬剤を指標するものとできる。好ましい薬剤は、１つ又は組み合わせの前記の標準的アッセイにより測定し、薬剤のない対照と比較して、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％、及びより好ましくは少なくとも約９０％、９５％、１００％〜約３００％、５００％、〜約１０００％、細胞内カルシウム濃度を増加させるであろう。
【００７８】
Ｄ．前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の調節
ｍＡＲの刺激がＰＳＡの分泌に付随して起こることが報告されている。Kampa, M et al. (2002), supra を参照されたい。特に、分泌はサイトカラシンＢでの前処理の後に阻害された。よって、１つ又は組み合わせのｍＡＲを調節する薬剤の検出のための前記の方法は、アッセイに用いる細胞、細胞株又は組織が分泌するＰＳＡの濃度の変化を検出するためのテストをさらに含んでいてもよい。一態様では、そのようなテストは、適切な対照（例えば薬剤の添加なし）と比較して、細胞、細胞株、組織サンプルが発現するＰＳＡの何れかを検出する段階をさらに含む。適切な細胞、細胞株及び組織サンプルは、公知であり、ｍＡＲ，ｉＡＲ又は両方を発現すると考えられているものでもよい。
【００７９】
ＰＳＡを検出する特定の方法は、従来の免疫学的手段に依存する。一態様では、分泌したＰＳＡを、特異的にＰＳＡに結合する抗ＰＳＡモノクローナル抗体と接触させることにより、ＰＳＡを測定する。そのようなアッセイは、直接検出又はサンドイッチアッセイ形式を用いることによるような、許容できる形式の何れかで実施できる。ＰＳＡに対して反応性があると報告される多種の適切な抗体はＡＴＣＣより入手できる。
【００８０】
上記のＰＳＡアッセイによる目的とする特定の薬剤は、ＰＳＡ分泌の濃度を、薬剤なしの適切な対照と比較して、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約９０％、９５％、１００％〜約２００％又は３００％増加させるであろう。好ましくは、ＰＳＡは、ＰＳＡを結合すると知られるモノ−又はポリクローナル抗体のような適切な免疫学的試薬の１つ又は組み合わせを用いて検出される。
【００８１】
Ｅ．膜アンドロゲン受容体（ｍＡＲ）によるアポトーシスの調節
ｍＡＲの活性化がインビトロ及びインビボの両方で前立腺癌細胞のアポトーシス退行をもたらすことが報告されている。Hatzoglou, A. et al. (2005); supra を参照されたい。よって、ｍＡＲの調節を検出する前記方法の１つ又は組み合わせは、アッセイに用いる細胞、細胞株又は組織のアポトーシスのレベルの変化を検出する方法をさらに含んでもよい。従って、及び一態様では、薬剤を検出方法は、ｍＡＲを発現する細胞、細胞株又は組織サンプルの細胞死（アポトーシス）を検出する段階をさらに含む。好ましくは、本発明の薬剤は、アッセイに用いる細胞、細胞株又は組織のアポトーシスのレベルを、適切な対照（例えば、薬剤の非存在下でアッセイを実施する）と比較して、増加させる。
【００８２】
免疫学的な、色素媒介の及びサイトメトリーのアッセイを含む、アポトーシスを検出及び定量化するための多種の適切なアッセイが報告されている。Hatzoglou, A. et al. (2005); supraを参照されたい。他の適切なアッセイは、例えば Cell Signaling & Neuroscience (2002-2003)なる表題の the Sigma-Aldrich Catalogue Book、特に pages 17-98に開示されている。よって本発明の一態様では、アネキシン、検出可能な小分子、及びアポトーシス又はプロアポトーシスタンパク質の少なくとも１つをアッセイすることによりアポトーシスを検出する。実施例は、とりわけＢＣＬ−２、ＢＣＬ-Ｘ、Ｃａｓｐａｓｅ９、Ａｐａｆ−１を含む。
【００８３】
好ましい本発明の実施は、ｍＡＲを発現することが知られているか又は考えられている所望の細胞、細胞株又は組織サンプルと接触させる段階の１つ又はそれ以上を実施することを含む。よって一態様では、本発明は、ＤＵ−１４５細胞を例えばｍＡＲの供給源として用いるような、適切なｍＡＲ受容体リガンドを検出する方法を包含する。或いは、ＬＮＣａＰ又は前立腺組織をｍＡＲの供給源として用いる。ｍＡＲは、全細胞若しくは組織として、又は細胞亜分画（通常、膜分画）として、選択するアッセイ形式に依存して、提供されてもよい。
【００８４】
上記のアポトーシスのアッセイによる目的とする特定の薬剤は、薬剤を用いない場合のような適切な対照と比較して、細胞死のレベルを、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約９０％、９５％、１００％〜約２００％又は３００％増加させるであろう。
以下のＦ〜Ｇの欄は、薬剤又は複数の薬剤（例えば薬剤のライブラリー）のＡＲを調節する（増加させる又は減少させる）能力を検出及び定量化するための方法を記述する。
【００８５】
Ｆ．ＡＲ調節を検出するための対照アッセイ（インビトロ）
検討したように、多くの本発明の態様では、薬剤のＡＲ機能を増大する又は低下させる能力を検出及び随意に定量化するための、対照アッセイの１つ又は組合せを実施することは有用であろう。一態様では、適切なＡＲを発現する細胞、細胞株又は組織サンプルを、薬剤と接触させて、活性があればそれを同定する。ＡＲは、男性生殖組織（前立腺及び付属組織を含む）、女性生殖組織、ある特定のＣＮＳ組織、更にはある特定の骨及び筋肉細胞のような、多数の生体組織で発現されると報告されている。ＡＲは、一般に内因性アンドロゲンリガンドテストステロン及び５−α−ジヒドロテストステロンに対して感受性があると考えられている。ＡＲが３つの機能的ドメイン：リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ-結合ドメイン、及びアミノ−末端ドメイン：から成っているとの認識がある。例えば、Caplan. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:5251; Fliss et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:34045;及びFang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:28697;並びにそこで引用されている文献を参照されたい。
【００８６】
ＡＲ、例えばＡＲ受容体リガンド、と結び付く及び天然のＡＲリガンドの影響を最小化する薬剤を、本明細書では「ＡＲアゴニスト」として示し、一方、天然リガンドの影響を阻害する化合物を「ＡＲアンタゴニスト」と称する。本発明の好ましい薬剤は、本明細書に開示する対照アッセイの何れか１つ又は組み合わせにより判定されるように、ＡＲアゴニスト又はアタゴニストとしての活性をほとんど若しくは全く有していない。
【００８７】
ＡＲ、例えばＲＢＡ、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２、ＤＤＴ１ＭＦ-２、ＲＷＰＥ−２等を発現すると報告されている、多種の細胞株は、ＡＴＣＣ（Manassas, VA(USA)）より入手できる。ＭＤＡ（MDA-MB-453）細胞は、内因性ＡＲを発現するとも報告されている。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２及びそこで開示されている文献を参照されたい。ＭＤＡ細胞は、対照アッセイが、ＭＤＡ  ＡＲに対する薬剤の親和性における放射性リガンド置換アッセイであるような態様において特に好ましい。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２の５４〜５６ページを参照されたい。ＡＲを発現する別の細胞株はＬＮＣａＰである。  
【００８８】
組換えヒトアンドロゲン受容体（ｈＡＲ）をある特定の対照アッセイに用いてもよい。一態様では、競合的結合分析はｈＡＲを発現する細胞で実施される。そのような細胞は、公知であり、例えば、バキュロウイルス／Ｓｆ９産生ｈＡＲ細胞及びその抽出物を含む。或いは、ＡＲを発現すると知られる他の細胞、細胞株及び組織、例えばＭＤＡ細胞、を用いてもよい。Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. 1989);及び標準的組換え技術に関する検討についての Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Ney York を参照されたい。
【００８９】
ＡＲ（又はｈＡＲ）を発現する適切な細胞、細胞株又は組織を入手して、異なる濃度の薬剤及び一定の濃度の３Ｈ−ＤＨＴトレーサーの存在下又は非存在下で結合を実施する。アッセイに係る一般的開示に関する Chang, et al. (1984) J. Steroid Biochem. 20:11を参照されたい。端的には、段階的に減少した濃度の薬剤は、ＡＲ又はｈＡＲの抽出物の存在下並びに非存在下で、例えばハイドロキシアパタイト及び約１ｎＭの３Ｈ−ＤＨＴとともに、４℃にて約１時間培養する。 続いて、結合反応物を洗浄して、過剰の標識を除去する。ＡＲ又はｈＡＲに結合する３Ｈ−ＤＨＴのレベルを化合物（競合的結合）の存在下で判定して、薬剤なしの結合（最大の結合）と比較する。Chang et. al. (1992) PNAS 89:5546を参照されたい。ｈＡＲに対する薬剤結合親和性は、最大結合の半分を阻害する薬剤の濃度（ＩＣ５０）として表される。  
【００９０】
ヒトアンドロゲン受容体をコードするｃＤＮＡのような多種の核酸が報告されている。Chang, CS. (1988) Science 240:324を参照されたい。他の適切な配列に関して国立医学図書館（ＧＥＮＢＡＮＫ）、特にaccession no. ＮＭ_００１０１１６４５にて閲覧できるもの、も参照されたい。
本発明による特定の薬剤は、これらのアッセイにおいて活性をほとんど又は全く示さない。好ましくは、そのような薬剤は、約１０〜約１０００マイクロモルを超える又はそれ以上のＩＣ５０を示す。
【００９１】
ｉ．アンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）活性化の検出
いくつかの対照の態様では、通常は受容体を発現しない細胞（例えば、ＣＯＳ又はＣＶ−１細胞）において異種ＡＲ（例えば、ｈＡＲ）を発現させるのが有用であろう。好ましくは、ｈＡＲを発現させるように組換え核酸技術を用いて、ＡＲを一時的に発現させる。一手段では、異種ＡＲを発現させるような条件下で細胞を培養して、ＡＲを調節する可能性がある化合物と接触させる。ＡＲの調節は、検出可能なアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）を含む、導入されたプラスミド構築物の活性の変化を検出できる、手段で観察される。例示的なＡＲＥは、アンドロゲン応答遺伝子プロモーター、アンドロゲン応答遺伝子エンハンサー等を含む。ＡＲを結合する薬剤は、「下流」のＡＲＥ活性を観測することによる方法で検出できる。
【００９２】
ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７４８３（国際公開第２００５／０１８５７３号公報）に概説されている一手段では、適切な細胞（ＣＯＳ又はＣＶ−１）は、Berger et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. (1992) 41:733に開示されている物質及び方法に従って、トランスフェクトされる。
用いる構築物は、ｐＳｈＡＲ（ＡＲを発現する）、ＭＴＶ−ＬＵＣ、ｐＲＳ−β−ＧＡＬ及びｐＧＥＭ（フィラー(filler)ＤＮＡ）を含む。受容体プラスミド、ｐＲＳｈＡＲは、ＳＶ-４０の構成的制御下でヒトＡＲを含む。Simental et al. J. Biol. Chem. (1992) 266:510を参照されたい。レポーター遺伝子構築物、ＭＴＶ−ＬＵＣは、マウス乳癌ウィルス(ＭＴＶ)の長い末端反復の制御下で蛍ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードするｃＤＮＡ、アンドロゲン応答要素を含む条件付プロモーターを含む。Berger, et al., supraを参照されたい。或いは、大腸菌β-ガラクトシダーゼの構成的発現をコードするｐＲＳβ−ＧＡＬが、内部制御として含まれていてもよい。
【００９３】
トランスフェクションに続いて、培地をトランスフェクトした細胞から除去して、細胞を洗浄する。続いて、本発明による薬剤を含んでいる培地を細胞に添加する。許容できる薬剤の濃度は、１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍの範囲のようなものを用いてもよい。約２〜３日、好ましくは約２日間、培地で細胞を培養後、細胞を洗浄して、TritonX-100又はその他の適切な洗浄剤に溶解して、標準的手順を用いてＬＵＣ及びβ−ＧＡＬ活性に関するアッセイを行う。ＡＲアンタゴニスト(２−ＯＨ−フルタミド)及びＡＲアゴニスト（ＤＨＴ）に対する陽性対照の使用を含む、この特定のアッセイに関する更なる開示は、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７４８３の特許出願に見られる。
【００９４】
本明細書で言及している「ＭＴＶ−ＡＲＥアッセイ」は、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７４８３の出願に開示されているアッセイを示す。本発明による好ましい薬剤は、１つ又はそれ以上の適切な対照と比較（例えばアッセイにおけるＤＨＴの活性と比較）した場合、ＭＴＶ−ＡＲＥアッセイにおいてほとんど又は全く活性を示さないであろう。
ＡＲＥ活性を検出及び随意に定量化するために用いてもよいレポーター遺伝子構築物（ベクター）の一覧（例えば、ｐＡＲ−ＬＵＣはそのようなベクターの１つである）に関する、Panomic, Inc. (6519 Dumbarton Circle, Fremont CA (USA)）も参照されたい。そのようなベクターの使用説明書は、上記の企業より入手できる。
【００９５】
Ｇ．ＡＲの調節を検出するための対照アッセイ（インビボ）
いくつかの本発明の適用に関して、ＡＲをインビトロで調節する薬剤の能力を検討するのが有用であろう。有意に、単一の薬剤（若しくは薬剤のライブラリーでも）での複数の検出アッセイ（例えば、インビトロ及び/又はインビボでのアッセイの組合せ）の使用は、検出の選択性及び感受性を拡張することができる。
【００９６】
そのような広範囲のテストは更なる利点を提供する。よって、例えば本発明のインビトロアッセイは、複数の分析を効果的に実施して、それにより治療的潜在能力を有する薬剤を同定することにおける効率及び確率を増進させることができる。多数の薬剤をテストする必要がある場合、これは特に有用である。例えば、潜在的ｍＡＲ結合リガンド及び他の薬剤のライブラリーを、コンビナトリアルタイプの化学操作を含む標準的合成方法により作成して、次いで本発明によりテストすることができる。
【００９７】
よって一態様では、１つ又は組合せの前記方法は、インビボでのｉＡＲのいかなる活性も検出する段階を更に含む。ＡＲの調節を検出する適切な方法はすでに記述されている。例えば、ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８８５９号(国際公開第２００５／０５２２１１８号公報)、ＰＣＴ／２００４／０２７４８３(国際公開第２００５／０１８５７３号公報)、ＰＣＴ／２００５／０１３７７５号(国際公開第２００５／１０５０９１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２号(国際公開第２００６／０２６１９６号公報)、及びＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、並びにこれらに開示されている文献を参照されたい。
【００９８】
特定の態様では、本発明の薬剤はＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２に開示されているインビボ前立腺アッセイでテストされる。若年の性的に成熟したラットに睾丸摘出（ＯＲＸ）を施す。薬剤の用量を、例えば約１〜２回／日、約１〜２週間、約０．１マイクログラム／ｋｇ〜約１００マイクログラム／ｋｇの範囲で、ラットに皮下又は経口投与する。この期間後、前立腺及び精嚢の腹側部をそれぞれ秤量する。薬剤がこれらの組織のＯＲＸに誘発される欠損をどの程度阻害できるかを標準的方法により評価する。
【００９９】
よって一態様では、前記のインビボでの方法は、適切な対照と比較して、被検哺乳類において、以下の特性：（1）前立腺の重さをほとんど又は全く増加させない、（２）体重をほとんど又は全く増加させない、（３）体脂肪をほとんど又は全く増加させない、及び（４）骨密度をほとんど又は全く増加させない：の少なくとも１つを有する薬剤を選択することを更に含む。本発明の実施例では、方法は、少なくとも１つの前記特性を有する薬剤を選択することを、薬剤の存在を更に指標することとして含んでもよい。
【０１００】
本明細書で言及している「ほとんど又は全く」シグナル又は活性を検出しないとは、適切な対照における結果の１つ又は組合せを説明する場合、そのアッセイにおけるＤＨＴの活性が約２０％より低いこと、好ましくはその活性が約１０％より低いこと、より好ましくはそのアッセイにおけるＤＨＴの活性が約５％より低い、約３％より低い又は約１％より低いことを意味する。本発明の好ましい薬剤は、前記の対照アッセイの１つ又は組合せによるＡＲを調節する能力をほとんど又は全く示さないであろう。
【０１０１】
本発明による非常に好ましい薬剤は、例えば、Ｆ〜Ｇの欄に記述する対照アッセイの１つ又はそれ以上において検出可能な活性を示さないｍＡＲ受容体リガンドである。他方、そのような好ましい薬剤は、上記Ａ〜Ｅの欄に提供するアッセイの１つ又はそれ以上において実質的な活性を示す。
【０１０２】
特定の対照アッセイの最適な実施は、場合により少なくとも１つのｍＡＲ及びｉＡＲが、分画、合成又は半合成形態で提供されることを必要とするであろう。例えば、一態様では、ｉＡＲは合成リポソーム組成物として存在する。そのような組成物を生成する方法は報告されている。他の受容体の態様は、ｉＡＲを含むウィルス誘発の出芽膜上への提示を含む。国際公開第０１０２５５１号公報及びMirzabekov et al,. 2000 を参照されたい。
【０１０３】
本発明は適応性があり、多様なアッセイ形式に用いることができる。従ってｍＡＲを調節する能力に関して薬剤をテストする一態様では、ｍＡＲ及び／又はｉＡＲを発現すると知られているか又は考えられている、細胞由来の細胞亜分画、細胞株、又は組織サンプルを用いる。よって一態様では、本明細書に記述のように対照アッセイは、ｉＡＲを発現する細胞の細胞亜分画、好ましくは膜、細胞質又は核の分画を用いて実施することができる。
【０１０４】
ｍＡＲ及びｉＡＲの調節を検出するためのアッセイの１つ又は組合せは、１つ又はそれ以上の以下の検出段階を用いて実施してもよい：標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光消光、蛍光偏光、発光、化学発光、蛍光発光、吸収、及びシンチレーション計数。特定の検出形式の選択は、例えば、選択した検出可能に標識したアンドロゲン及び必要とするアッセイの感受性の程度のような従来の変数に依存するであろう。
【０１０５】
Ｈ．薬剤供給源
本発明は、多種多様な薬剤を検出して随意に同定するために用いることができる。好ましい薬剤は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、抗体又は抗原に結合するその断片、脂質、炭水化物、核酸、小分子、、又はそれらの組合せを含む。本明細書で用いる「小分子」という用語は、３０００ダルトンより小さい、好ましくは２０００又は１５００より小さい、より好ましくは１０００より小さい、最も好ましくは６００ダルトンよりも小さい分子量を有する化合物を示す。「有機小分子」は、炭素を包含する小分子である。
【０１０６】
それから本発明による薬剤を選択する、多種多様なコレクションを入手することができる。特定の被検薬剤は、合成又は天然の化合物の多くのライブラリーに含まれていてよい。現在、多数の方法が、サッカリド、ペプチド及び核酸よりなる化合物のランダムな及び有向的な合成のために用いられている。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex (Princeton N.J.)、Brandon Associates (Merrimack, N.H.)及びMicrosource (New Milford, Conn.)を含む、数多くの企業から市販されている。レアケミカルライブラリーは、Aldrich (Milwaukee, Wis.)から市販されている。コンビナトリアルライブラリーは入手可能であり調製してもよい。或いは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物形態の天然化合物のライブラリーは、例えば Pan Laboratories (Bothell, Wash.) 若しくは MycoSearch (NC) から入手でき、又は当該技術分野で公知の方法で容易に作成できる。更に、天然の及び合成的に生成したライブラリー並びに化合物は、通常の化学的、物理的、及び生物化学的方法を通じて容易に修飾される。
【０１０７】
候補薬剤の他の供給源は、多種の単量体及びオリゴマーフラバノール、特にカテキン、エピカテキン及びその誘導体を含む。Nifli, A-P et al. (2005) Exp. Cell Res. 309:329を参照されたい。候補薬剤の更なる供給源は、オピオイドである。Kampa, M. et al. (2004) Exp. Cell Res. 294:234を参照されたい。
或いは、ＡＲを結合すると言われている小分子の１つ又は組合せは、優先的なｍＡＲ結合のためにテストしてもよい。例えば、ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８８５９号(国際公開第２００５／０５２２１１８号公報)、ＰＣＴ／２００４／０２７４８３(国際公開第２００５／０１８５７３号公報)、ＰＣＴ／２００５／０１３７７５号(国際公開第２００５／１０５０９１号公報)、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９５９２号(国際公開第２００６／０２６１９６号公報)、及びＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２５９２号(国際公開第２００６／０２４９３１号公報)を参照されたい。
【０１０８】
本発明による有用な薬剤は、多数の化学的分類に見出すことができる。有用な化合物は、有機化合物、又は有機小化合物でもよい。有機小化合物は、５０より大きくさらに約２５００ドルトンより小さい、好ましくは約７５０より小さい、より好ましくは約３５０ドルトンより小さい分子量を有する。具体的な分類は、ヘテロ環、ペプチド、サッカリド、ステロイド等を含む。化合物は、効能、安定性、薬学的適合性等を増強するように修飾されてもよい。薬剤の構造同定は、更なる薬剤を同定、産生、又はスクリーニングするために用いてもよい。例えば、ペプチド薬剤が同定される場合、それらは、例えばアミノ基のアシル化又はアルキル化及びカルボキシル基のエステル化又はアミジフィケーション（amidification）等のための、アミノ又はカルボキシル末端の機能化による、Ｄ-アミノ酸、特にＤ-アラニンのような非天然アミノ酸を用いるような、それらの安定性を増強するために多様な方法で修飾されてもよい。
【０１０９】
本発明による更なる試験可能な薬剤は、１つ又はそれ以上のテストステロン環の炭素分子、例えば、テストステロンの３'炭素（例えば、Ｔ-３-ＢＳＡ)、又はテストステロンの１７'炭素（例えば、Ｔ-１７-ＢＳＡ)を結合する血清アルブミン分子を含む。一態様では、血清アルブミンは、テストステロンに３'炭素で結合するオキシムリンカーのような適切なリンカーによりステロイド環から離れている。Goeji, AF et al. (1986) J. Steroid Biochem. 24:1017を参照されたい。他の化合物が、血清アルブミン（ＢＳＡ又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ))の断片と結合するテストステロンのような有用な薬剤であってもよいことは理解されるであろう。好ましいフラグメントは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、約９５％〜約９９％の血清アルブミンのアミノ酸配列を有するそれらの配列を含む。適切なフラグメントは連続的又は非連続的な欠失を有してもよい。
【０１１０】
「ウシ血清アルブミン」又はＢＳＡとは、その好ましいフラグメント及び対立遺伝子多型を含む、Ｓｗｉｓｓ-ＰｒｏｔエントリーＰ０２７６９により表される、アミノ酸配列を意味する。「ヒト血清アルブミン」又はＨＳＡとは、その好ましいフラグメント及び対立遺伝子多型を含む、Ｓｗｉｓｓ-ＰｒｏｔエントリーＰ０２７６８により表される、アミノ酸配列を意味する。よって前記血清アルブミン配列の対立遺伝子多型は、本発明の薬剤を生成するために用いてもよい（そのような多型の好ましいフラグメントも同様に包含する）。
【０１１１】
第一のスクリーニングに関して、被検薬剤の有用な濃度は、約１０マイクロモル〜約１００マイクロモルより高い（即ち１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ又は１Ｍでも）が、１ｎＭ及びそれより高くても、１ｐＭ及びそれより高くても、又は１ｆＭ及びそれより高くてもよい。第一のスクリーニングの濃度は、９つの付加的な濃度とともに、（ここでは９つの付加的な濃度は第２の検査のために又は濃度曲線を作成するために第一のスクリーニング濃度を半対数区間（例えば９より多い濃度に関して）で低下することにより判定される）上限として用いられるであろう。
【０１１２】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」は互換可能に用いられてもよく、少なくとも二つの共有結合しているアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は、天然のアミノ酸及びペプチド結合、又は合成のペプチド様構造で構成されてもよい。よって本明細書で用いる「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は、天然及び合成の両方のアミノ酸を示す。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは本発明の目的のためのアミノ酸と考えられる。「アミノ酸」は、プロリン及びヒドロキシプロリンのようなイミノ酸残基も含む。側鎖は（Ｒ）又は（Ｓ）のどちらかの立体配置でよい。好ましい態様では、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ-立体配置である。非天然型側鎖を用いる場合、非アミノ酸置換基を、例えばインビボの分解を予防又は遅延するために、用いてもよい。非天然型アミノ酸を含むタンパク質は、合成しても又はいくつかの場合組換え的に生成してもよい。van Hest et al., FEBS Lett 428:(1-2)68-70 May 22, 1988 及び Tang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S218:U138 Part2 Aug. 22, 1999を参照されたく、この両方は明確に参照して本明細書に取り込まれる。
【０１１３】
本明細書で用いる「検出可能な段階」「検出可能な」等の用語は、直接的に、例えば２次メッセンジャーの測定若しくは修飾（例えばリン酸化）タンパク質の検出による、又は間接的に、例えばその段階の下流の効果を観測することによる、のどちらかで測定できる段階を示す。例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化は、ｃＡＭＰの産生をもたらす。アデニル酸シクラーゼは、直接的に、例えばアッセイにおけるｃＡＭＰの生成物を観測するアッセイにより、又は間接的に、例えば実際のｃＡＭＰレベルの測定により、測定できる。他の検出可能な段階は、カルシウム流出、アポトーシス、ＰＳＡ分泌及び骨格細胞の再構成の測定を含む。
本明細書で用いる、例えば結合若しくはシグナリング活性又はＰＳＡ分泌、アポトーシス及び/若しくはカルシウム流出に適用するような、「変化」、「差異」、「減少」又は「増加」という用語は、それらのそれぞれの活性の少なくとも１０％の増加又は減少を示す。
【０１１４】
Ｇ．ハイスループットスクリーニングアッセイ
検討したように、１つ又はそれ以上の検出可能に標識したアンドロゲンを、（１）ｍＡＲを発現する細胞を検出するために；及び（２）ｍＡＲ結合受容体リガンド及び他の薬剤についてスクリーニングするために：用いることは本発明の範囲内である。そのようなスクリーニングは、ハイ又はウルトラハイスループット形式で実施できるように容易に適合できる。本発明の態様の実施は、蛍光、発光、リン光発光又は化学発光化合物（複数も）を用いることにより、前述のように、アンドロゲンを直接的又は間接的のどちらかで標識して達成できる。
【０１１５】
蛍光標識したアンドロゲンを用いる場合、異なる蛍光モニタリングシステムの１つ又は組合せを用いてもよい。これは、例えばＦＡＣＳシステムを含む。好ましくは、ＦＡＣＳシステム、又はハイスループットスクリーニング、例えば９６ウェル又はそれ以上のマイクロタイタープレート専用のシステムを用いる。蛍光物質においてアッセイを実施する方法は公知であり、例えば Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. Taylor, D. L. & Wang, Y. -L., San Diego: Academic Press (1989), pp. 219-243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin / Cummings Publishing Col, Inc. (1978), pp. 296-361に記載されている。多種のＦＡＣＳシステムが当該技術分野で知られていて、本発明の方法に用いることができる（例えば、１９９９年４月１６日に出願の国際公開第９９/５４４９４号公報、２００１年７月５日出願の米国特許出願公開第２０，０１０，００６，７８７号を参照されたい、各々は明確に参照して本明細書に取り込まれる）。
【０１１６】
例えば、薬剤の存在下でのｍＡＲ陽性細胞からの蛍光標識したアンドロゲンの実質的な消失は、ｍＡＲを結合する能力を有する薬剤の指標である。そのような方法の結果は、標準的なハイ及びウルトラハイスループットスクリーニングの方法を用いて達成できる。所望であれば、そのような方法は、対照もハイ又はウルトラハイスループットのプラットホームにて実施されるような、本明細書に開示の１つ又はそれ以上の適切な対照アッセイと組合せる（例えば、本質的に同時に行う）ことができる。
【０１１７】
本発明の一態様によると、サンプルの蛍光性は蛍光光度計を用いて測定できる。一般に、第一波長を有する励起源からの、励起放射は励起光学部品を通過する。励起光学部品は、励起放射がサンプルを励起するように働く。それに応じて、サンプル中の蛍光タンパク質は、励起波長とは異なる波長を有する放射を放つ。次いで、収集光学部品は、サンプルからの放出を収集する。装置は、走査の間サンプルを特異的な温度に維持する温度制御部を含んでいてもよい。一態様によると、多軸平行移動ステージは、異なるウェルが露光するように配置されるように、複数のサンプルを保持しているマイクロタイタープレートを移動させる。多軸平行移動ステージ、温度制御部、自動焦点特性、並びに画像化及びデータ収集に関連する電子機器は、適正にプログラム化されたデジタルコンピュータに管理されてもよい。コンピューターは、アッセイ中に収集したデータを提示のために別の形式に変換することもできる。
【０１１８】
別の態様では、フローサイトメトリーは蛍光性を検出するために用いる。蛍光性を検出するための他の方法、例えば量子ドット法（例えば Goldman et al., J. Am. Chem. Soc. (2002) 124: 6378-82; Pathak et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123:4103-4; 及び Remade et al., Proc. Natl. Sci. USA (2000) 18:553-8を参照されたい、各々は明確に参照して本明細書に取り込まれる）も用いられてもよい。
ハイスループット及び関連するスクリーニングアッセイの実施についての一般的開示に関して、Olah, NM et al. (2004) Current Drug Discov. Technology, 3:211; deLong et al. (2005) in J. Chromatogr. B. Analyt. Biomed. Life Science, 829:1; 及び Liu B. et al. (2005) Am. J. Pharmacogenomics 4:263も参照されたい。  
【０１１９】
特に定められていない限り、本明細書でテストステロン-ＢＳＡ複合体（多種の短縮形を含む）とは、以下の特定の化合物：テストステロン３−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム：ＢＳＡを示す。
本明細書に記載する全ての文献は、その全体を参照して本明細書に取り込まれる。以下の非限定的な実施例は本発明を例示するものである。
【０１２０】
（実施例）
本参考実施例は、Kampa, M et al. (2002) FASEB J. 16:1429を再現している。とりわけ、トリチウム化テストステロンのｍＡＲ（ＬＮａＣＰ）細胞を発現する細胞の膜上への飽和及び置換の結合を示す。
【０１２１】
図１Ａ−Ｂに関して、３Ｈ-テストステロンのＬＮＣａＰ細胞の膜への飽和結合（１Ａ）及び置換結合（１Ｂ）を示す。（Ａ）飽和結合。細胞膜は、Kampa, M et al. (2002), ibid に従い、２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に調製した。これらを、１００倍を超える非標識のアンドロゲン（ＤＨＴ）の存在下又は非存在下で２〜５０ｎＭに変化させた６つの濃度の３Ｈ−テストステロンとともに４℃で一晩培養した。図は Scatchard 座標におけるデータの解析を示す。図は３通りに行った典型的な実験の結果を表す。（１Ｂ）置換結合。細胞膜（２００マイクログラム）を、約５ｎｍの３Ｈ−テストステロン単独（Ｂｏ）と又は１０−１２〜１０−６Ｍの範囲の指定の濃度の非標識のステロイド（ＤＨＴ、エストラジオール、プロゲステロン）の存在下で培養した。非特異的な結合を、５マイクロモルＤＨＴを導入してアッセイした。図（２通りに実施した３つの異なる実験の平均）は、指定の濃度のＤＨＴの存在下の特異的な結合（Ｂｓ）のＤＨＴの非存在下の特異的な結合（Ｂｏ）に対する比率、Ｂｓ/Ｂｏを示す。
【０１２２】
前立腺癌細胞株（Kampa et al 2002）において、更にはヒト前立腺腫瘍において高度にがん細胞に発現する（Stathopoulos et al 2003）、アンドロゲンに対する機能的ｍＡＲの同定が報告されている。１つの非透過性のテストステロンの類縁体である、テストステロン−ＢＳＡによるこれらの結合部位の活性化は、迅速なアクチン細胞骨格の再構成を誘発して、数分内に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の分泌を増加させることが示された。アクチン再構成の分子機構を調節する特異的な非ゲノムシグナル伝達カスケードが、同定されている（Papakonstanti et al 2003）。更に、より最近の検討では、ＢＳＡに結合したテストステロンが、ａ）ｉＡＲ陰性のＤＵ１４５又はｉＡＲ陽性のＬＮＣａＰのどちらかのヒト前立腺癌細胞のアポトーシス、及びｂ）インビトロ及びインビボの両方での前立腺癌の退行を誘発することが示された（Hatzoglou et al 2005）。これらの発見は、ｍＡＲの活性化因子が前立腺癌のアポトーシス退行のための重要な手段であることを暗示する。しかし、観察されたアクチンの再分布及びアポトーシスの誘発を制御する分子機構は、完全には理解されていない。
【０１２３】
下記のように、アクチン細胞骨格再構成及びアポトーシスの間のクロストークを詳細に検討するために、ｉＡＲ陰性のＤＵ１４５前立腺癌細胞株を用いて、活性ｍＡＲを発現することが示された（Hatzoglou et al 2005）。テストステロン−ＢＳＡ処理によるＤＵ１４５細胞のアクチン再構成及びアポトーシス応答の誘発を調節する分子機構を検討して、前立腺癌細胞のアポトーシス退行におけるアクチン骨格細胞再構成の中心的な調節の役割を示唆する。
【実施例１】
【０１２４】
テストステロン−ＢＳＡはＤＵ１４５細胞の強力なアクチン重合を迅速に誘発する。
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞におけるｍＡＲ部位の活性化は、数分内に、強力なアクチン重合及びマイクロフィラメント再構成による指標として、アクチン細胞骨格の顕著な再構成をもたらすことが認識されている（Kampa et al 2002）。発明者らは、非透過性のテストステロン類縁体及び細胞内アンドロゲン受容体（ｉＡＲ）の特異的な阻害剤又はアンタゴニストの両方を用いて、ＬＮＣａＰ細胞のこの事象がｍＡＲの活性化を通して誘発されたという強力な証拠を提供した。発明者らは、ヒト前立腺癌細胞におけるｍＡＲ活性化及びアクチン細胞骨格の間のクロストークに関する究極の実験的証拠を提供する目的で、テストステロン−ＢＳＡが、ｉＡＲ陰性であるがｍＡＲ陽性のＤＵ１４５細胞のアクチン細胞骨格の動態に影響を与え得るかどうかを検討した。図２Ａ−Ｂから算出されるように、細胞の１０−７Ｍのテストステロン−ＢＳＡ複合体との培養は、Ｔｒｉｔｏｎ−不溶性（繊維状）に対するＴｒｉｔｏｎ-可溶性（単量体）のアクチンの比を４５％にまで有意に減少させた。これらの定量的結果は、テスト−ＢＳＡ処理のＤＵ１４５細胞におけるアクチン細胞骨格の共焦点レーザー走査顕微鏡分析によって全面的に支持された。実際、図３Ａ−Ｃに示されるように、マイクロフィラメント構造の完全な亜膜性再分布が１０分以内に明白に表れ、少なくとも２時間持続した。これらの結果から、アンドロゲンによるｍＡＲの活性化が、発現又は細胞内アンドロゲン受容体とは無関係に、前立腺癌細胞における迅速で強力なアクチン細胞骨格再分布を誘発すると断定できる。
【実施例２】
【０１２５】
アクチン再構成は、テストステロン−ＢＳＡ誘発のＤＵ１４５細胞のアポトーシス応答のために必要である。
テスト−ＢＳＡによるｍＡＲの活性化がＬＮＣａＰ及びＤＵ１４５前立腺癌細胞株の両方におけるアポトーシスの有意な誘発をもたらすという報告がある。発明者らは、ｍＡＢＳ活性化による、アクチン細胞骨格再構成及びアポトーシスの間の可能性のあるクロストークを分析する目的で、アクチン再構成を阻止する特異的な薬剤の存在下で、ＤＵ１４５細胞のアポトーシス応答を検討した。アクチン再分布を阻止するサイトカラシンＢ（１０−６Ｍ）又はファラシジン（１０−６Ｍ）との細胞の培養は、テスト−ＢＳＡで処理したＤＵ１４５細胞のアポトーシス応答を明白に阻止することを示した（図４）。ＦＡＣＳ分析は、これらの観察を全面的に支持した。これらの結果から、アクチン再分布が、テストステロン膜結合部位の活性化により、ＤＵ１４５前立腺癌細胞のアポトーシス応答へと導くシグナル伝達事象を調節することができる、必要な段階であることが断定される。この説は、アクチン再構成が、ＴＮＦα誘発の抗アポトーシス応答におけるＮＦｋＢの転位及び転写調節を調節する、重要なシグナル伝達段階であることを示す、先に公開されたデータ（Papakonstanti and Stournaras, Mol Biol cell, 2004）と一致するものである。
【実施例３】
【０１２６】
ＤＵ１４５細胞におけるｍＡＲの活性化は、ＦＡＫ／ＰＩ−３Ｋ／Ｒａｃ１経路を誘発しない。
ＬＮＣａＰ細胞におけるｍＡＲの活性化が、ＦＡＫ／ＰＩ−３Ｋ／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１を含む非ゲノムシグナル伝達経路を迅速に誘発して、アクチン再構成へと導くことは示されている（Papakonstanti et al. Mol Endocrinol 2003）。意外にも、ｉＡＲ陰性のＤＵ１４５細胞では、この経路は、迅速な非ゲノムアクチンシグナル伝達の媒介に関わらないと考えられる。実際、図５Ａ−Ｂに示されるように、ＦＡＫはＤＵ１４５細胞に構造的にリン酸化されていた。細胞をテスト−ＢＳＡと培養した場合、明白な更なるＦＡＫリン酸化も、下流のシグナル伝達分子ＰＩ−３Ｋ、及びＲａｃ1の活性化もどちらも記録できなかった。これらの結果と一致して、ＤＵ１４５細胞の特異的ＰＩ−３Ｋ阻害剤である、ワートマニン（wortmannin）との培養は、テストステロン処理により誘発されたアクチン重合に影響を与えず、ＰＩ−３Ｋシグナル伝達がこれらの細胞におけるテストステロン誘発の迅速なアクチン再構成に関わらないことを示唆した。これらの発見は、図２Ａ−Ｂに示す迅速なアクチン再構成を調節する、代替的な非ゲノムシグナル伝達カスケードの存在を暗示している。
【実施例４】
【０１２７】
ＤＵ１４５細胞のｍＡＲの活性化は、迅速なＲｈｏＡ及びＲＯＣＫ活性化を誘発する。
ＤＵ１４５細胞における非ゲノムのテストステロン信号伝達を媒介する代替的機構を探して、発明者らは、Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼの可能性のある迅速な活性化を分析した。実際、そのようなアクチン再構成の過程を調節するシグナル伝達エフェクターの中で、Ｒｈｏファミリーの小さいＧＴＰアーゼが最も理解された。古典的に、原形質膜受容体は、頻繁にリン酸化を介して特異的なグアニン交換因子（ＧＥＦ）を活性化して、これはＲｈｏ−ＧＴＰアーゼのＧＴＰとの順次的な結合をもたらす。活性なＲｈｏＧＴＰアーゼは、Ｒｈｏコイルド-コイルドキナーゼ（ＲＯＣＫ1）及び/又はｐ２１−活性化キナーゼ（Ｐａｋ１）へのシグナル伝送を続ける。活性化したＰａｋ１及びＲＯＣＫ１は、各々Ｌｉｍ−キナーゼ１及び２（Ｌｉｍｋ１及びＬｉｍｋ２）をリン酸化及び活性化する。Ｌｉｍｋ１及びＬｉｍｋ２は、２つのＮ-末端Ｌｉｍドメイン及びＣ-末端キナーゼドメインから構成される密接に関連するタンパク質である。Ｌｉｍドメインは、アクチン細胞骨格と相互作用する細胞質タンパク質に頻繁に見い出されるタンパク質−結合モチーフである。最終的に、Ｌｉｍｋ１及びＬｉｍｋ２は、不活性化されてアクチン重合を生じさせる、コフィリン及びアクチン脱重合因子（ＡＤＦ）のような、アクチン脱重合タンパク質をリン酸化する。図６Ａ−Ｂに示すように、ＤＵ１４５細胞の１０−７Ｍテストステロン-ＢＳＡでの処理は、ＲｈｏＡの極めて速い（３分以内）活性化を誘発して、これは３０分後の最大活性を２時間まで持続させた。ＲｈａＡ活性化の下流のエフェクターを更に分析するために、テストステロン-ＢＳＡで活性化したＤＵ１４５細胞を、特異的ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２で処理して、アクチン再分布をＧ/総アクチン比を用いて定量的に記録した。図６Ｂに示すように、テストステロン誘発の迅速なアクチン重合は、Ｙ２７６３２の存在下で全面的に阻止されて、ＲＯＣＫが、ＤＵ１４５細胞におけるｍＡＲ活性化の非ゲノムシグナル伝達のＲｈｏＡエフェクターであることを示した。
【実施例５】
【０１２８】
Ｒｈｏ／ＲＯＣＫシグナル伝達カスケードの阻止は、アクチン再構成及びアポトーシス誘発の両方を防止する。
図４に示すように、アクチン再分布は、ｍＡＲの活性化によるＤＵ１４５前立腺癌細胞のアポトーシス応答へと導くシグナル伝達事象を調節する、必要な段階であると考えられる。発明者らはこ、の現象を更に検討するために、新規に同定されるシグナル伝達カスケードを阻止して、アクチン再構成を導く阻害剤の存在下で、ＤＵ１４５細胞のアポトーシス応答を分析した。興味深いことに、図６Ａ−Ｂに示すように、ＤＵ１４５細胞のＹ２７６３２との培養は、テスト−ＢＳＡ処理によるプロ−アポトーシス細胞の応答の無効化をもたらした。図の結果を考慮して、Ｒｈｏ/ＲＯＣＫシグナル伝達カスケードの阻止が、アクチン再構成及びアポトーシス誘発の両方を防止することが示された。これらの結果は、アクチン再分布が、ｍＡＢＳに活性化されたＤＵ１４５細胞のアポトーシス応答の制御における重要な調節役として機能するという説を支持する。他方で、ワートマニン（wortmannin）との細胞の培養は、テスト−ＢＳＡ誘発のアポトーシス応答になんら影響が見られず、ＰＩ-３Ｋシグナル伝達がｉＡＲ陰性のＤＵ１４５細胞のアポトーシス細胞応答に関与しないという証拠を支持した。
【０１２９】
下記の原料、方法及び科学的文献は本発明を理解することの助けとなるであろう。
原料
ＲＰＭＩ１６４０及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はGibco-BRL（MD，USA）から入手した。ローダミン−ファロイジン及びＳＬＯＷ  ＦＡＤＥ  Ａｎｔｉｆａｄｅキットは、Molecular Probe Inc.（Eugene, OR）から入手した。
【０１３０】
ＥＣＬ  ウエスタンブロットキットは、Amersharm（Arlington Heights, IL, USA）から入手した。テストステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ（テストステロン−ＢＳＡと称す）はSigma（St. Louis, MO）から入手した。テストステロン−ＢＳＡは、１０回の各実験の所定の濃度で培養培地に溶解した。次いでこの保存溶液を炭（３０ｍｇ／ｍｌ）及びデキストラン（０．０３ｍｇ／ｍｌ）の溶液で３０分間室温にて処理して、１５分間３０００ｘで遠心分離に付し、０．２２μｍのフィルターに通して、ステロイド無しの何れの汚染の可能性も取り除いた。処理したテストステロン−ＢＳＡは全検討を通して順次用いた。全ての他の化学物質は、通常の市販の供給源から得られる最も精製された等級で入手した。
【０１３１】
細胞及び培養条件
転移性脳腫瘍（ＤＭＳＺ, Braunschweig, Germany）から単離したＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞は、２〜９代継代の間で検討した。細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ培地で３７℃にて空気中５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で培養した。それらは、何れかの実験の前に、１週間継代培養して、無血清培地で２４時間培養した。
【０１３２】
可溶性及び不溶性アクチンの免疫ブロットアッセイ
１０−７Ｍテストステロン−ＢＳＡでの処理の後、細胞を、０．５ｍＬのトリトン抽出緩衝液（０．３％のトリトンX-100、５ｍＭのトリス−ＨＣＬ、２ｍＭのＥＧＴＡ、３００ｍＭのショ糖、４００μＭのＰＭＳＦ、１０μＭのロイペプチン、２μＭのファロイジン、ｐＨ７．４）中で氷上５分間培養した。トリトン可溶性タンパク質を、等量の６％過塩素酸（ＰＣＡ）で沈殿化した。トリトン不溶性画分は、1ｍＬの３％ＰＣＡで沈殿化した。各画分の等量をＳＤＳ電気泳動に付して、ＬＫＢ電気泳動装置（LKB,Bromma, Sweden）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜へ転移した。次いで、膜を抗アクチンモノクローナル抗体と培養して、続いて適切な標識した第２の抗体と培養した。ブロットは、拡張した化学蛍光システムを用いて展開して、バンド強度は、ＰＣ−ベースのイメージ分析（Image Analysis, Inc., Ontario, Canada)）により定量化した。
【０１３３】
共焦点レーザー走査顕微鏡法
線維状（Ｆ）アクチンの直接蛍光顕微鏡検査法を、各々１時間及び２時間の１０−７Ｍテストステロン−ＢＳＡで処理したＤＵ１７５細胞のローダミン−ファロイジン染色により実施した。サンプルは、共焦点レーザー走査モジュール（Leica Lasertechnik, Heidelberg, Germany）で分析した。
【０１３４】
アポートーシスの定量的測定
ＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ（Biocolor Ltd., Belfast, N. Ireland）を製造者取扱説明書に従い、アポトーシスを定量化するために用いた。このキットは、ホスファチジルセリンが外葉に転移した場合に膜「フリップフロップ」事象を受けるアポトーシス細胞を赤く染色する色素を用いている。アポトーシスの検出は、倒立顕微鏡下で容易に観察できる。アポトーシスの定量化に関して、標識した細胞内の色素の量を順次的に溶液中に放出して、濃度を色フィルターマイクロプレート測色計（Dynatech MicroElisa reader Chantilly, VA）を用いて、５５０ｎｍの波長で（基準フィルター；６２０ｎｍ）測定することができる。
【０１３５】
Etienne-Manneville, S., and Hall, A. (2002) Nature 420(6916), 629-35; Schmidt, A., and Hall, A. (2002) Genes Dev 16(13), 1587-609; Amano, M., Fukata, Y., and Kaibuchi, K. (2000) Exp Cell Res 261(1), 44-51; Jaffer, Z. M., and Chernoff, J. (2002) Int J Biochem Cell Biol 34(7), 713-7; Amano, T., Tanabe, K., Eto, T., Narumiya, S., and Mizuno, K. (2001) Biochem J 354(Pt 1), 149-59; Edwards, D. C., Sanders, L. C., Bokoch, G. M., and Gill, G. N. (1999) Nat Cell Biol 1(5), 253-9; Maekawa, M., Ishizaki, T., Boku. S., Watanabe, N., Fujita, A., Iwamatsu, A., Obinata, T., Ohashi, K., Mizuno, K., and Narumiya, S. (1999) Science 285(5429), 895-8; Ohashi, K., Nagata, K., Maekawa, M., Ishizaki, T., Narumiya, S., and Mizuno, K. (2000) J Biol Chem 275(5), 3577-82; Sumi, T., Matsumoto, K., and Nakamura, T. (2001) J Biol Chem 276(1), 670-6; Bach, I. (2000) Mech Dev 91(1-2), 5-17; 及び Arber, S., Barbayannis, F. A., Hanser, H., Schneider, C., Stanyon, C. A., Bernard, O., and Caroni, P. (1998) Nature 393(6687), 805-9も参照されたい。
【０１３６】
本明細書に引用する全ての参照文献の開示は参照して組み込まれる。本発明はその好ましい態様に関して詳細に記述するものである。しかし、当業者であれば、この開示を考慮して本発明の精神及び範囲を逸脱することなく修正及び改良を行うことができることを理解されるであろう。
【０１３７】
参照による組み込み
本出願全体を通して引用されているすべての参考文献（参照文献、登録済み特許、公開特許出願、及び審査中の特許出願を含む）の内容は、それらの全体を参照して明白に本明細書に組み込まれる。
【０１３８】
均等物
当業者は、本明細書に記述の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識、又は通常の実験だけを使用して確認することができる。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１Ａ−Ｂは、ｍＡＲ（ＬＮａＣＰ）細胞を発現する細胞の膜上のトリチル化テストステロンの飽和及び置換の結合を示すグラフである。
【図２】図２Ａ−Ｂは、テストステロン処理後のＣＵ１４５細胞における修飾及び重合化したアクチンを示すグラフである。  （テストステロン処理後のＤＵ１４５細胞における単量体の修飾及び重合化アクチン。３５ｍｍ皿無血清培地で培養したＤＵ１４５細胞は１０-７Ｍテストステロン-ＢＳＡと異なる期間培養した。細胞下分画後、単量体及び全アクチンは定量的な免疫ブロットアッセイにより測定した。図Ａは２時間以内のＧ／全アクチン比の減少を表す。重合化の効果は、図Ｂの繊維状アクチン値の増加に反映される。）
【図３】図３Ａ−Ｃは、アクチン細胞骨格構築へのアンドロゲン効果の形態学的分析を示す顕微鏡写真である。  （アクチン細胞骨格構築へのアンドロゲン効果の形態学的分析。アクチンフィラメントの再分布はローダミンーファロイジン染色により測定した。（Ａ）ＤＵ１４５未処理細胞（７セクションの平均）、（Ｂ）テストステロン−ＢＳＡで１時間処理したＤＵ１４５細胞（５セクションの平均）、（Ｃ）テストステロン−ＢＳＡで２時間処理したＤＵ１４５細胞（７セクションの平均）の共焦点レーザー走査顕微鏡分析（倍率ｘ６３）。）
【図４】図４は、多種の化合物へ暴露された細胞における細胞死（アポトーシス）を示すグラフである。
【図５】図５Ａ−Ｂは、テストステロン-ＢＳＡ複合体への暴露後の多種のシグナル伝達分子の活性を示すグラフである。
【図６】図６Ａはゲルの発現、図６Ｂはグラフである。共に、ＤＵ１４５細胞をテストステロン−ＢＳＡ複合体で処理した場合、ＲｈｏＡ及びＲＯＣＫのシグナル伝達分子が活性化されることを示す。
【図１】
2009532060.tif 000003
【図２】
2009532060.tif 000004
【図３】
2009532060.tif 000005
【図４】
2009532060.tif 000006
【図５】
2009532060.tif 000007
【図６】
2009532060.tif 000008
【国際調査報告】
2009532060.tif 000009
2009532060.tif 000010
2009532060.tif 000011