(57)【要約】  本発明は、複数の細胞を含んでいる生物学的サンプルの濃縮に関し、その濃縮は、そのさらなる解析を助ける。本発明は、（ａ）光照射によって誘導されて少なくとも一部の各細胞を不活性化するか死滅させ得る感光性化合物を含む複数の細胞を含んでいるサンプルを提供する工程；（ｂ）サンプルの少なくとも一部の画像を取得する工程；（ｃ）サンプル画像において目的の細胞を同定する工程；（ｄ）工程（ｃ）において同定された細胞以外の細胞を選択する工程；および（ｅ）工程（ｄ）において選択された細胞のみに光線を照射することによって、その細胞内の感光性化合物を誘導して、それらの細胞の少なくとも一部を不活性化するか死滅させ、それによって、さらなる解析のために目的の細胞についてサンプルを濃縮する工程を含む技術を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルを修飾する方法であって：
（ａ）光照射によって誘導されて少なくとも一部の各細胞を不活性化するか死滅させ得る感光性化合物を含む複数の細胞を含んでいるサンプルを提供する工程；
（ｂ）前記サンプルの少なくとも一部の画像を取得する工程；
（ｃ）前記サンプル画像において目的の細胞を同定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において同定された前記細胞以外の細胞を選択する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において選択されたそれらの細胞のみに光線を照射することによって、その細胞内の前記感光性化合物を誘導して、それらの細胞の少なくとも一部を不活性化するか死滅させ、それによって、さらなる解析のために前記目的の細胞についてサンプルを濃縮する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルは、様々な細胞型の細胞を含み、工程（ｃ）において、特定の型の細胞が同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の細胞が、同じ型の細胞からなり、工程（ｃ）において、共通の特性を有する前記複数の細胞のサブグループが同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において取得された前記画像が、ユーザに表示され、前記目的の細胞が、工程（ｃ）においてユーザが入力するシグナルによって同定される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記目的の細胞が、工程（ｃ）において、工程（ｂ）において取得された前記画像を画像処理手段によって解析することによって同定される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）において、細胞が、測定された細胞のパラメータを予め決められた閾値と比較することによって；測定されたパラメータの線形もしくは非線形マッピングによって；最近値に基づいた分類指標を用いて；人工ニューラルネットワークを使用して；サポートベクターマシンを使用して；パターン認識を使用して；または遺伝的アルゴリズムを使用して、目的のものであると同定される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）において、細胞が、他のサンプルから得られたデータ；または前記サンプルに関し、かつ、工程（ｂ）において使用されたものと異なる画像化モダリティを使用して取得した画像もしくはデータを参照することによって目的のものであると同定される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記感光性化合物が、以下：ＣＡＬＩ試薬；アンケージング剤；光増感剤のうちの１つである、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記感光性化合物を前記複数の細胞の各々に導入する工程を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記感光性化合物が、前記複数の細胞の各々において遺伝的にコードされている、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記選択された細胞の少なくとも一部が、工程（ｅ）においてアポトーシスの活性化または有毒物質の放出によって死滅する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、前記サンプルの解析を助ける光照射に応答することができるマーカー化合物を含んでいる細胞を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが：２Ｄまたは３Ｄでの細胞の集合体；組織サンプル；血液などの生物学的流体；生検サンプル；器官；胚；動物もしくは植物の一部；または動物全体もしくは植物全体のうちの１つを含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）の前に、前記サンプルを刺激する工程を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
以下の画像化技術：１つ以上の励起周波帯における蛍光；ルミネセンス；広視野；共焦点；位相差；ＤＩＣ；構成照射；蛍光寿命；偏光；または多光子プロセスのうちの１つを使用して、画像を工程（ｂ）において取得する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
一連の画像を工程（ｂ）において取得し、同定工程（ｃ）をその一連の画像を参照して行う、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記取得した一連の画像が：明視野像；蛍光像；特定の焦平面における共焦点像；ある範囲における蛍光寿命画像；赤外から紫外までの特定の周波帯における画像；時間系列；画像スタック；またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記さらなる解析は：検査；回収；選別；培養；または試薬の投薬による前記サンプルの処理のうちの１つを含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前述の請求項のいずれかに記載の方法に従って生物学的サンプルを修飾するための装置であって：
前記サンプルの少なくとも一部の画像を取得するための検出器：
前記サンプルの選択された領域を照射する光線を発生させるための光源；および
複数の選択された細胞の各々の少なくとも一部のみを照射するように前記光源を操作するために設置されたコントローラ
を備えた、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、複数の細胞を含む生物学的サンプルの修飾に関する。より詳細には、本発明は、そのさらなる解析を助けるために、目的の細胞についてサンプルを濃縮することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
生物学的サンプルの研究において、共通するのは、細胞の混合物中に特定の目的の細胞を含んでいるサンプルを有することである。さらなる処理および解析のためにその集団内の目的の細胞についてサンプルを濃縮することが有用であり得る。
【０００３】
この将来性は、細胞のプロセスのメカニズムについての理解をもたらす研究分野において興味深く、その技術は、例えば細胞分化、細胞系譜および運命の研究、系の発生の研究、調節の分野、任意の外部刺激に対する応答において応用されることにより、新しい知見および理解がもたらされる。この将来性はまた、その結果と正常なものとを比較することによって疾患または障害を診断すること（ある状態の存在を検出すること、ある状態の程度を評価すること）；および経時的に変化を観察することによって処置の有効性を評価することにおいても興味深い。
【０００４】
典型的には、特定の細胞型は、複数の細胞型の不均一な集団内に存在する。例としては、組織サンプルおよび幹細胞内の分化した細胞［Ｓｏ  ２００４］；組織サンプル内の癌細胞および血管；支持細胞の基質において成長するニューロン；母親の血液中の胎児細胞；血液サンプル中の様々なタイプの白血球（ナチュラルキラー細胞など）；組織サンプル中の転移性癌細胞などが挙げられる。さらに、特定の細胞型は、いくつかの特別な特徴に関して、それ自体が不均一な集団からなる場合がある。例えば、細胞は、細胞周期において異なる局面の細胞（静止状態（非分裂）であるものを含む）のサブグループからなる場合がある。さらに、細胞は、様々な方法で環境に応答し得るか、または様々な方法で活性化され得るので、目的の様々なタンパク質もしくは分子またはプロセス全体もしくは経路全体を発現し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞を選別する現在の１つのアプローチは、フローサイトメータまたはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ）装置を使用することである。その実施は、１つ以上の蛍光標識で細胞を標識すること、適切なキャリア媒体中に細胞を分散すること、および、その細胞を含んでいるキャリア培地をＦＡＣＳ装置に通すことであり、そのキャリアは、ノズルを通過することによって液滴に形成される。生じた液滴を励起光の光線に曝露することによって、個々の細胞内で蛍光標識が蛍光を発し、シグナルの形態で検出される光を発し、そのシグナルを、細胞を認容するか拒絶するかの分類の判定基準を形成するために使用し、その細胞をさらなる処理用の容器に迂回させる。複数の標識を使用して、細胞の様々な状態を判定することができ、ゆえに、より複雑な分類の判定が可能になる。このようなアプローチは、蛍光標識が必要な感度および選択性を有しているとき、適度な速度かつ良好な識別能力で細胞を選別することができる。
【０００６】
しかしながら、このアプローチは、多くの弱点を有している。サンプルの調製および粗い取り扱いは、サンプルを乱して、そのサンプルを１回の継代に限定することがある。非
接着性細胞だけを使用するときに、細胞が支持マトリックス中に存在している場合、および／または、細胞間の相互作用が維持されるべきである場合に、このことは問題となる。さらに、ＦＡＣＳプロセスでは、いくらか遅れが生じるので、これにより、いくつかの細かい時間的および動力学的情報が失われ、一部の研究（例えば、細胞周期の同調）が非常に困難になる。また、各細胞から収集されたデータは、かなり大雑把な性質であり、例えば移動プロセスが原因で、その標識の異なる空間的構成を区別することが困難になる。
【０００７】
代替のアプローチでは、サンプルは、顕微解剖用ステージを用いて顕微鏡下において手作業で解析され得る。マーカー（染色剤）を加えることによって様々な細胞型、成分および構造を可視化し、識別し、操作することが可能になり得る。これは、時間がかかり、面倒で間違いが発生しやすく、また、サンプル成分間の相互汚染を回避することまたは生きている物体を使用することが困難である。細胞型が希少である場合、これは適しない。
【０００８】
さらなる技術では、顕微解剖のためにレーザーを使用して目的の細胞の周囲を切断し得る［Ｗｉｔｔｋｅ  ２００５；Ｓｃｈｕｅｔｚｅ  １９９７］。これにより、汚染の問題の回避が容易になる。あるいは、光ピンセットを使用することによって、小さい生物学的物体が取り出され得るが、望ましくない付着材料を切断または除去するなどの特定のタイプの操作を効率的に行うことができない。不必要な材料を除去するためにレーザー切除を使用することもできる。
【０００９】
別のアプローチでは、サンプルを溶解し、マイクロアレイを用いて、特定の分子または分子の組み合わせ（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）について探索し得る。このアプローチは、非常に感度が高く、選択的であり得る。しかしながら、これはかなり時間がかかり、細かい時間的情報を得るのが妨害され得、また、通常、研究中に細胞が破壊されるために、特定の型の細胞の回収およびさらなる使用が妨害される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨および詳細な説明
本発明は、生物学的サンプルを修飾する方法であって：
（ａ）光照射によって誘導されて少なくとも一部の各細胞を不活性化するか死滅させ得る感光性化合物を含む複数の細胞を含んでいるサンプルを提供する工程；
（ｂ）サンプルの少なくとも一部の画像を取得する工程；
（ｃ）サンプル画像において目的の細胞を同定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において同定された細胞以外の細胞を選択する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において選択された細胞のみに光線を照射することによって、その細胞内の感光性化合物を誘導して、それらの細胞の少なくとも一部を不活性化するか死滅させ、それによって、さらなる解析のために目的の細胞についてサンプルを濃縮する工程
を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書中で提案する技術は、好ましくは、特定の細胞または一部の不必要な細胞に照射光線を標的化することができる適切な画像取得装置とともに１つ以上の適切なマーカーを用いて、目的の細胞の位置を見出し、生細胞の集団から同定することに関する。１つ以上の適切な感光性化合物を導入するとき、照射光線は、感光性化合物を修飾するように作用する。細胞の外観に基づいて、照射光線を向けて、活性化させる決定がなされ得、その結果、その細胞を死滅させるような方法で種を放出する。
【００１２】
従来技術に対する本発明のアプローチの利点は、本発明によって、手作業で行うアプローチを使用するときの可能な数よりも多くのサンプルの検査が可能となり、珍しい事象（例えば、癌転移）：高速の事象または細かい時間的情報を伴う事象（例えば、相同期（ｐ
ｈａｓｅ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ））：複数の事象、同時発生的な事象または時間もしくは空間で分断された事象：事象または微細な空間的詳細を見ることの困難さ：長時間にわたって発生する事象、および、より質の高い濃縮（真の陽性が多く、偽陽性が少なく、汚染が少ない）に基づいた濃縮が容易になる点であり、研究中のサンプルへの干渉が少ない。
【００１３】
マーカープローブおよび感光性化合物を用いて画像を取得および解析するための好ましい技術が、本発明者らによって開発されており、それによって、選択的に個々の細胞を照射し、不活性化または死滅させることができる。
【００１４】
ある割合の目的の細胞のみを排除することによってサンプルを濃縮することにより、いくつかの長期間にわたる研究（経時的な変化を追跡する研究）および／または細胞型間の相互作用の調節もしくは操作が容易になり得る。
【００１５】
感光性化合物を使用することにより、光のみを使用して細胞を破壊するのに必要とされるよりも低出力の光源（例えば、低出力レーザー）を使用して、十分に制御された様式で濃縮することが可能になる。
【００１６】
以下の工程が、１回の実施と考えられる：
１）細胞の混合集団からなるサンプルをもたらす工程；
２）マーカー分子を用いて探索する工程；
３）感光性化合物を導入する工程（任意）；
４）サンプルを刺激する工程（任意）；
５）観察用光学機器（ｖｉｅｗｉｎｇ  ｏｐｔｉｃｓ）でサンプルを見る工程（様々な画像化様式）；
６）焦点をはじめとした観察パラメータをさらに正確にする工程（任意）；
７）デジタル画像セットを取得する工程；
８）その画像を処理して、画像基準を得る工程；
９）１つ以上の画像基準の一致に基づいて目的の細胞を分類する工程；
１０）サンプル上で作用を実行するために特定の瞬間にサンプル中の特定の位置に照射光線を向ける工程；
１１）工程３（導入）、工程４（刺激）または工程５（観察）から繰り返す工程；または１２）終了し、サンプルをさらに処理する工程。
【００１７】
サンプルは、典型的には、複数の細胞型の不均一な集団内の特定の細胞型である。例としては、幹細胞、先祖細胞、前駆体を含む分化中の組織および組織サンプル内の分化した細胞が挙げられる。
【００１８】
さらに、特定の細胞型は、それ自体がいくつかの特別な特徴に関して不均一な集団からなる場合がある。例えば、細胞は、細胞周期において異なる局面の細胞（静止状態（非分裂）であるものを含む）のサブグループからなる場合がある。
【００１９】
あるいは、細胞の集団は、様々な細胞型の細胞の不均一な集団、またはいくつかの遺伝的なバリエーション、変異もしくは表現型を含む細胞の不均一な集団、または様々な程度で物質がトランスフェクトされた細胞の不均一な集団であり得る。
【００２０】
その細胞は、様々な方法でその環境に応答し得るか、または様々な方法で活性化され得るので、目的の様々なタンパク質もしくは分子またはプロセス全体を発現する。
【００２１】
そのサンプルは、細胞の一部、細胞小器官および／または細胞内の細胞領域であり得る。あるいは、細胞の集団は、２Ｄまたは３Ｄでの細胞の集合体：組織サンプル：血液など
の生物学的流体：生検サンプル：器官：胚：動物もしくは植物の一部；または動物全体もしくは植物全体であり得る。
【００２２】
マーカー分子および感光性化合物は、以下：蛍光分子：発光分子：光切断可能な結合によって発色団もしくはフルオロフォアに結合した活性部分を有するアンケージング剤［Ｇｕｒｎｅｙ  １９９９］：色素と結合体化したリガンド：ＣＡＬＩ試薬（色素と結合体化した非遮断抗体［Ｉｌａｇ  ２０００］）：ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ（Ｅｖｒｏｇｅｎから販売）などの光増感剤：ＧＦＰなどの遺伝的にコードされた分子：光で活性化可能な分子（例えば、遺伝的にコードされたＰＡ−ＧＦＰまたはケージド分子）［Ｓａｗｉｎ  １９９９］：ＫＦＰなどの光スイッチング分子：タイマータンパク質［Ｔｅｒｓｋｉｋｈ  ２０００］［Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ  ２００４］：細胞周期マーカー：電圧または電位感受性マーカー：バイオセンサー：多機能マーカープローブ（多機能マーカープローブは、金属イオン［Ｋｏｍａｔｓｕ  ２００５］またはキナーゼ／ホスホリパーゼ［Ｓｃｈｕｌｔｚ  ２００５］）の存在を伴って励起発光プロファイルの変化によって複数の種の存在を示唆する）：遺伝的にコードされたタグに結合する外来性分子：結合体化された量子ドット：結合体化された金属ナノ粒子：結合体化された被包性蛍光ナノ粒子の１つ以上を含み得るか；または内因性分子の蛍光に依存し得る。外来性（遺伝的にコードされていない）マーカーは、細胞透過性であり得る。遺伝的にコードされたマーカーおよび遺伝的にコードされていないマーカーは、多くの公知技術によって、細胞に導入されてもよいし、予め細胞に導入されていてもよい。
【００２３】
サンプルの刺激としては、任意の外部刺激（生化学的、化学的、物理的、熱的、光学的、電気的、磁気的、電磁気的など）が挙げられ得る。
【００２４】
画像化様式としては、以下：１つ以上の励起周波帯における蛍光：ルミネセンス：広視野：共焦点：位相差：ＤＩＣ：構成照射：蛍光寿命：偏光；または多光子プロセスの１つ以上が挙げられ得る。
【００２５】
改変され得る観察パラメータとしては、焦点、焦点面、視野、励起出力レベル、波長および周波帯、偏光、パルス型ならびに検出パラメータ（例えば、波長感度、露光のタイミングおよび持続時間）、マルチサンプルホルダー内の位置などが挙げられ得る。
【００２６】
デジタル画像セットは、以下：明視野像：蛍光像：特定の焦平面における共焦点像：ある範囲における蛍光寿命画像：赤外から紫外までの特定の周波帯における画像：時間系列：画像スタックまたは上記の任意の組み合わせの１つ以上を含み得る。
【００２７】
適切な画像基準としては、細胞の位置、境界、範囲：細胞の形態：細胞分裂または細胞周期における局面：細胞の生存能：画像の特徴（例えば、輝度、相対輝度、輝度の変化、テクスチャ基準（ｔｅｘｔｕｒｅ  ｍｅａｓｕｒｅ））：寿命、相対寿命、寿命の変化：スペクトルシフト：運動、遊走または自動運動性：成長：細胞性または亜細胞性の事象（例えば、細胞質から核、膜から核、細胞小器官から核、膜から細胞質、細胞小器官から細胞質、核から細胞質、細胞質から膜、核から膜、細胞小器官から膜、細胞質から細胞小器官、膜から細胞小器官、核から細胞小器官への移動、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、粒子またはウイルスによる侵入）：ベシクルの動き：膜ラフリング：細胞のブレブ形成：成長円錐伸張：特定のｐＨ値またはｐＨ値の範囲、特定のイオン濃度またはイオン濃度の範囲：ＤＮＡ含有量：ＤＮＡ断片化：膜電位：ＤＮＡ座の数およびサイズ：結合事象：シグナル伝達：接着；または他の測定値（例えば、電流、電圧、インピーダンスまたは相互コンダクタンス）が挙げられ得る。
【００２８】
分類の決定は、範囲より上もしくは下もしくは範囲内の１つ以上の基準、モデルとの比
較もしくは１組の例からの統計的距離；または基準のいくつかの線形もしくは非線形マッピング；または最近値に基づいた分類指標：人工ニューラルネットワーク：サポートベクターマシン：パターン認識；または遺伝的アルゴリズムに基づいてなされ得る。
【００２９】
行われる措置によって、細胞の少なくとも一部が不活性化され得るか、死滅し得る。これは、閃光光分解、アンケージングまたは放出（例えば、ルシフェリン［Ｙａｎｇ  １９９３］またはセレンテラジンなどのルミネセンス基質：フリーラジカル）有毒物質、細胞壁の穿孔、トランスフェクション、アブレーションまたは他の特定の構造（例えば、微小管）の改変；またはアポトーシスなどの経路の活性化によって達成され得る。
【００３０】
さらなる処理または解析としては、検査、回収、選別、培養または試薬の投薬によるサンプルの処理が挙げられ得る。
【００３１】
本発明は、本明細書中に記載される技術を行うための装置をさらに提供し、その装置は：サンプルの少なくとも一部の画像を取得するための検出器：サンプルの選択された領域を照射する光線を発生させるための光源；および複数の選択された細胞の各々の少なくとも一部のみを照射するように光源を操作するために設置されたコントローラを備える。
【００３２】
工程５（観察）から１０（実行）をもたらすために構成され得る装置は、先の特許出願［Ｃｏｕｒｔｎｅｙ  ２００５］に記載されている。
【００３３】
分類工程は、他の画像化モダリティ（Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ）：データベースまたは他の外部の供給源から得た事前の取得から得られたデータに基づき得る。
【００３４】
照射する位置、領域および時点は、サンプルおよび所望の実験プロトコルについての情報に基づき得る。
【００３５】
その装置は、単一のサンプルまたは観察する位置の間でその位置を動かす必要のある、より大きなサンプルを研究するために構成され得る。さらに、複数のサンプルが、より大きなキャリア上に提示され得ることによって、サンプルは、いくつかの点で異なる（異なる細胞、異なる試薬、異なる環境）。
【００３６】
本明細書中に開示される技術のさらなる応用法としては：
−変化を観察することによる薬物候補の活性についてのスクリーニング：
−薬物候補または治療薬の安全性についてのスクリーニング：
−疾患または障害の存在の検出（診断）；
−疾患または障害の程度の評価（層別化）；
−処置の有効性の評価；および
−上記のいずれかを示す生物学的マーカーの発見
が挙げられ得る。
【００３７】
[参考資料]
2009528043.tif 000002
【００３８】
2009528043.tif 000003
【国際調査報告】
2009528043.tif 000004
2009528043.tif 000005
2009528043.tif 000006