(57)【要約】  本発明は、一緒になって RNA二本鎖を形成している、センス RNA鎖および相補的アンチセンス RNA鎖を含む新規な単離されたsiRNA であり、センス RNA鎖がミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列からの14〜30の連続ヌクレオチド断片に関して異なる１以下のヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とするsiRNA に関し、また、少なくとも１種のかかるsiRNA を含む組成物、および少なくとも１種のかかるsiRNA の皮膚脱色 (depigmentation) のための化粧品または治療剤としての使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一緒になって RNA二本鎖を形成している、センス RNA鎖および相補的アンチセンス RNA鎖を含む単離されたsiRNA であり、センス RNA鎖が、ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列の14〜30の連続ヌクレオチドの断片に比べて１以下の異なるヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とする前記siRNA 。
【請求項２】
センス RNA鎖が、ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列の14〜30の連続ヌクレオチドの断片と同じ配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のsiRNA 。
【請求項３】
ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列が、ヒト配列SEQ ID NO:1 であることを特徴とする、請求項１または２記載のsiRNA 。
【請求項４】
ヒトミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列の14〜30の連続ヌクレオチドの断片が、SEQ ID NO:2 、SEQ ID NO:3 およびSEQ ID NO:4 から選ばれたヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項３記載のsiRNA 。
【請求項５】
ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列の14〜30の連続ヌクレオチドの断片が、ヌクレオチド配列  SEQ ID NO:3 からなることを特徴とする、請求項４記載のsiRNA 。
【請求項６】
前記siRNA が、２つの相補的部分がワトソン−クリック結合で対になっており、ヘアピン型構造によって一端で共有結合で連結されている一本鎖 RNAの単分子からなるshRNA であり、ここで該shRNA が配列 SEQ ID NO:17 を含むか、この配列からなることを特徴とする、請求項５記載のsiRNA 。
【請求項７】
センス及び／又はアンチセンス RNA鎖がさらに、２〜４の天然または修飾ＬＮＡ型ヌクレオチドの3'オーバーハング断片を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの項記載のsiRNA 。
【請求項８】
センス RNA鎖及び／又はアンチセンス RNA鎖が、その糖部分、核塩基部分またはヌクレオチド間骨格に少なくとも１つの化学修飾を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかの項記載のsiRNA 。
【請求項９】
化粧品としての使用のための、請求項１〜８のいずれかの項記載のsiRNA 。
【請求項１０】
医薬としての使用のための、請求項１〜８のいずれかの項記載のsiRNA 。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかの項記載の少なくとも１種のsiRNA および許容しうる担体を含む組成物。
【請求項１２】
局所的に投与されることを特徴とする、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
さらに少なくとも１種の他の脱色剤を含むことを特徴とする、請求項１１または１２記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかの項記載の少なくとも１種のsiRNA 、または請求項１１〜１３のいずれかの項記載の組成物の、皮膚を脱色または白くするための化粧品としての使用。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれかの項記載の少なくとも１種のsiRNA 、または請求項１１〜１３のいずれかの項記載の組成物の、皮膚の色素沈着過度の治療または予防用医薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一緒になって RNA二本鎖を形成している、センス RNA鎖および相補的アンチセンス RNA鎖を含む新規な単離されたsiRNA であり、センス RNA鎖がミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列からの14〜30の連続ヌクレオチド断片に比べて多くて１つの異なるヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とするsiRNA に関し、また、少なくとも１種のかかるsiRNA を含む組成物、および少なくとも１種のかかるsiRNA の皮膚脱色 (色素脱失、depigmentation) のための化粧品または治療剤としての使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の色素沈着は多くの過程を含む複雑なプロセスである。メラノサイト (メラニン形成細胞) は表皮の基底層に存在し、内部または外部刺激 (例えば、紫外線 (UV) への暴露) によって活性化され、メラノソームとして知られるリソソーム関連の特殊な細胞小器官中にメラニンを産生する。成熟後、核周囲のメラノソームは微小管およびアクチン細胞骨格に沿ってメラノサイト樹状突起の周縁部に送られる (Lambert J et al. Cell Mol Biol (Noisu-le-grand): 45:905-18, 1999; Hara M et al. J.Invest Dermatol.: 114:438-43, 2000; Vancoillie G et al. J Invest Dermatol.: 114:421-9, 2000)。メラノソームはメラニンを含み、次いで、まだ未知の機構によって樹状突起の遠い末端から隣接するケラチノサイト（角質細胞）に運ばれる。
【０００３】
この複雑なプロセスのある過程における何らかの変化が皮膚の色素沈着の症状をもたらし得る。特に、活性なメラノサイト数の増加、及び／又はメラニン形成の増加、及び／又はメラノソームのメラノサイトからケラチノサイトへの移動の増加が、皮膚の色素沈着過度 (即ち、色素異常症、dyschromatosis）を生じさせ得る。かかる色素沈着は、薬剤、日光、代謝性もしくは栄養的機能不全などの多くの因子、および遺伝的もしくは自己免疫疾患により生じ得る。これは一般的に、患者にとって深刻な美容上および心理上の結果を意味し、患者は多くの場合適切な治療を求めるであろう。
【０００４】
従って、色素沈着過度 (hyperpigmentation)のための有効な治療法を開発するために多くの努力がなされてきた。現在のほとんどの化学的治療は、メラニン合成経路を、特にメラニン合成に必要なチロシナーゼ酵素の活性を阻害することにより標的とする脱色剤 (depigmenting agent) を含む。かかる脱色剤 (色素脱失剤) には特に、ヒドロキノンおよびその誘導体、レチノールもしくはトレチノイン、アスコルビン酸およびその誘導体、胎盤抽出物、コウジ酸、フェルラ酸、アルブチン、ジヒドロキシベンゼン誘導体 (WO 00/47045)、グアイアコール誘導体 (WO 00/47179)、4-(2,3- ジヒドロキシフェニル)-シクロヘキサノール (WO 00/56279)、レソルシノール誘導体 (WO 00/56702)、フェノールアミド (WO 99/32077)がある。これらの物質はある欠点を示す。それらは不安定で、高濃度での使用が必要であり、その作用機序に特異性を欠くか、または細胞毒性を有するかもしくは刺激性である。
【０００５】
中深度の剥離、皮膚剥離またはレーザー治療などの物理的種類の治療も開発されてきた。しかし、これらの治療法は一般的に効果が低く、炎症後色素沈着低下もしくは色素沈着過度、オクロノーシス (組織黒変症) または発癌性の結果を生じ得る瘢痕化 (Briganti S et al. Pigment Cell Res.: 16:101-10, 2003; Halder RM, Nootheti PK. J Am Acad Dermatol.: 48:S143-48, 2003; Halder RM, Richards GM. Skin Therapy Lett.: 9:1-3, 2004) の危険などの二次的な悪影響を生じさせる。
【０００６】
そこで、有効であり信頼性のある色素沈着過度の新規な美容的及び／又は治療的処置を開発する必要がある。
化学的治療の他、遺伝子発現の阻害を得るための別の可能性は、アンチセンス核酸の使用または RNA干渉として知られるプロセスの使用にある (Dykxhoorn DM et al. Nat Rev Mol Cell Biol.:4:457-67, 2003; Soutschek J et al. Nature:432:173-8, 2004) 。
【０００７】
RNA干渉 (以後、RNAiと称する) は、所定のセンス核酸配列を有する二本鎖 RNA (dsRNA)が、この核酸配列を含む全メッセンジャーRNA (mRNA)をこの核酸配列に特異的に破壊するに至るプロセスである。RNAiプロセスはもともとカエノルハブディティス・エレガンス (Caenorhabditis elegans) において証明されたが、RNAiプロセスは非常に一般的な現象であることは現在明らかであり、RNAiによるヒト遺伝子の阻害が行われてきた。
【０００８】
RNAiプロセスは小さい干渉用RNA(即ち、siRNA)を用いて行いうる。これらのsiRNA は、標的mRNAの断片に高度に相同性、好ましくは同一である配列をそのセンス配列に含む、30ヌクレオチド未満のdsRNA である。siRNA が原形質膜を通ると、細胞の反応は、siRNA および同一もしくは高度に相同性の配列を含む全配列を破壊することである。こうして、siRNA 配列と同一もしくは高度に相同性の断片を有するmRNAは破壊され、この遺伝子の発現は阻害されるであろう。
【０００９】
色素沈着過度の治療のために、チロシナーゼもしくはTRP-1 蛋白質の遺伝子に対する (WO 01/58918)、またはチロシナーゼのリン酸化過程に関与するPKC β1 蛋白質の遺伝子に対する (WO 2005/073243) アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が従来技術において提案されてきた。チロシナーゼ遺伝子を標的とするsiRNA の使用 (WO 2005/060536) もまた提案されてきた。
【００１０】
しかし、これらの遺伝子はすべてメラニンの合成経路に関与するものであり、メラニン合成経路ではなく、メラノサイト内のメラノソームの輸送およびケラチノサイトへのそれらの移動に関与する遺伝子を標的とするsiRNA についての開示または示唆はこれまでになされていない。
【００１１】
ミオシンVa蛋白質がメラノサイト内でメラノソームの輸送に関与することは特に本発明者等によって示された (Lambert J et al. Cell Mol Biol (Noisu-le-grand): 45:905-18, 1999; Lambert J et al. J Invest Dermatol.: 111:835-40, 1998)。より詳しくは、ミオシンVa蛋白質は複数のスプライシングの変異型を有し、エキソンＦを有する変異型はメラノソームの輸送に必要である (Westbroek W et al. J Invest Dermatol.:120:465-75, 2003) 。
【００１２】
しかし、これまで、エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質の変異型の発現をsiRNA を用いて阻害する試み、またはこの手法を色素沈着過度の美容的もしくは治療的処置に適用する試みはなされていない。
【発明の開示】
【００１３】
本発明者等は、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA を合成すること、およびこれらのsiRNA によってミオシンVa蛋白質のエキソンＦに特異的なRNAiプロセスを誘導することが可能であることを見出した。また、本発明者等は、このsiRNA が、細胞の生存能の低下をもたらさないsiRNA の濃度においてエキソンＦを含むミオシンVa蛋白質の変異型の発現を阻害するのに有効であること、およびこの作用が用量依存性であることも示した。さらに、本発明者等は、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の存在により、メラノソームのメラノサイトからケラチノサイトへの移動の阻害が可能となることも見出した。
【００１４】
従って本発明は、一緒になって RNA二本鎖を形成している、センス RNA鎖および相補的アンチセンス RNA鎖を含む新規な単離されたsiRNA であり、センス RNA鎖がミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列の14〜30、有利には15〜29、 16〜28、 17〜27、 18〜25、 18〜23、 または18〜21の連続ヌクレオチドの断片に比べて１以下の異なるヌクレオチドを有する配列を含むことを特徴とするsiRNA に関する。
【００１５】
本願明細書中で使用する「ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列断片を含む」とは、遺伝子配列に対応する RNA配列、即ち、ＴがＵに置換されている、遺伝子配列に対応する RNA配列を意味する。
【００１６】
従って、本発明のsiRNA のセンス鎖は、ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列の14〜30、有利には15〜29、 16〜28、 17〜27、 18〜25、 18〜23、 または18〜21の連続ヌクレオチドの断片であるか、あるいはかかる断片に比べて１つの異なるヌクレオチドを有する配列を含む。これは、RNAiプロセスは配列に特異的であり、有効なRNAiには高度な配列相同性が必要とされるからである。有利には、RNA のセンス鎖は、ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列の14〜30、有利には15〜29、 16〜28、 17〜27、 または18〜25の連続ヌクレオチドの断片と同じ配列を含む。
【００１７】
ミオシンVa蛋白質は様々な種、特にヒト、マウスおよびラットにおいて報告されてきた。有利な態様においては、ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列は、ヒトのミオシンVa蛋白質のエキソンＦのヌクレオチド配列であり、これはSEQ ID NO:１で表される。ヒトミオシンVa蛋白質の配列は図１Ａに示され、エキソンＦ（SEQ ID NO:１）に対応する部分は下線が引かれている。
【００１８】
SEQ ID NO:１の14〜30、有利には15〜29、 16〜28、 17〜27、 18〜25、 18〜23、 または18〜21の連続ヌクレオチドの断片を標的とするsiRNA はすべて本発明の範囲内に含まれる。しかし、標的とされている、即ち、siRNA のセンス鎖に含まれる配列を有するミオシンVa蛋白質のエキソンＦ断片が、ミオシンVa蛋白質のmRNAにおいて特徴的な構造を有するか、または制御蛋白質が結合し得る断片でないのが有利である。本発明で使用される、「特徴的な構造」なる用語は、ミオシンVaのmRNAにおいて生成しうるステムもしくはループもしくはヘアピン型の構造を意味する。いくつかの組織がインターネット上で自由に利用できる種々の手段を提供しており (以下の表１参照) 、ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA を設計するのに使用できる。
【００１９】
siRNA 選択手段を有するインターネットサイト
【００２０】
【表１】
2009518022.tif 000002
注文で作製されたsiRNA を販売する会社のほとんどは合成されたsiRNA の有効性を保証している。さらに、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするすべてのsiRNA の有効性は各種試験、特に実施例１および２に詳細に記載された試験において検証できる。
【００２１】
本発明者等はヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦの各種断片を標的とする特定のsiRNA を複数合成し試験した。本発明のsiRNA の有利な態様においては、ヒトミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列のうちの、14〜30、有利には15〜29、 16〜28、 17〜27、 18〜25、 18〜23、 または18〜21の連続ヌクレオチドの断片は、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３およびSEQ ID NO:４から選ばれるヌクレオチド配列からなる。SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３およびSEQ ID NO:４の３つの配列の位置は図１Ｂに記載されている。特に有利な態様では、ミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子のエキソンＦのヌクレオチド配列のうちの、14〜30、有利には15〜29、 16〜28、 17〜27、 18〜25、 18〜23、 または18〜21の連続ヌクレオチドの断片は、SEQ ID NO:３のヌクレオチド配列からなる。
【００２２】
本発明のsiRNA は、ワトソン−クリック結合で対になったセンス鎖とアンチセンス鎖を有する小さい二本鎖 RNAであり、センス鎖の配列は、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦのヌクレオチド配列のうちの、14〜30、有利には15〜29、 16〜28、 17〜27、 18〜25、 18〜23、 または18〜21の連続ヌクレオチドの断片からなるか、この断片を含む。
【００２３】
30〜50％のグアニンおよびシトシンから構成される配列を有するsiRNA は、グアニンおよびシトシンをより高い割合で含有する配列よりも効果的であることは既知である。従って、本発明のsiRNA は30〜50％のグアニンおよびシトシンからなる配列を有するのが有利である。
【００２４】
本発明のsiRNA は２つの相補的一本鎖 RNA分子を等しく含むか、または２つの相補的部分がワトソン−クリック結合で対になっており、ヘアピン型構造によって一端で共有結合で連結されている一本鎖 RNA分子 (これは「短いヘアピン RNA」のためshRNA としてより具体的に知られている) を含んでもよく、これはsiRNA のサブクラスとして考えることができる。明細書全体にわたって、siRNA なる用語は、特に記載のない限りshRNA を含む広い意味で理解されるべきである。ある有利な態様では、本発明のsiRNA は２つの相補的一本鎖 RNA分子を含む。別の有利な態様では、本発明のsiRNA は、２つの相補的部分がワトソン−クリック結合で対になっており、ヘアピン型構造によって一端で共有結合で連結されている一本鎖 RNAの単分子、即ちshRNA を含むか、これからなる。
【００２５】
さらに、特に本発明のsiRNA が２つの相補的一本鎖 RNA分子を含む場合に、センス及び／又はアンチセンス RNA鎖はさらに、２〜４ヌクレオチドの3'オーバーハング (overhang) 断片を含むことができる。ここで用いる「２〜４ヌクレオチドの3'オーバーハング断片」なる表現は、 RNA二本鎖の少なくとも１つの鎖において、鎖の3'末端に相補鎖と対になっていない２〜４ヌクレオチドが存在することを意味する。3'オーバーハング断片に用いられるヌクレオチドは天然のヌクレオチド (リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド) でも、リボースの2'および4'位の間にメチレン架橋を含むLNA (Locked Nucleic Acid) などの修飾ヌクレオチド (Soutschek J. et al. Nature, 2004 Nov 11:432(7014):173-8)でもよい。3'オーバーハング断片はまた、本発明のsiRNA のセンス RNA鎖及び／又はアンチセンス RNA鎖についての以下の項に記載したいずれのタイプの化学的修飾を受けていてもよい。有利には、3'オーバーハング断片は２つのヌクレオチドからなる。この場合、3'オーバーハング断片として好ましい配列は「TT」 (Ｔはデオキシチミジンを意味する) または「UU」（Ｕはウラシルを意味する）である。本発明のsiRNA の両方の相補鎖が3'オーバーハング断片を含むのも同じく有利である。この場合、２つの3'オーバーハング断片の長さおよび配列は同じでも異なっていてもよい。有利には、本発明のsiRNA の両方の相補鎖は、配列「TT」の２ヌクレオチドの同じ3'オーバーハング断片をそれぞれ含む。それぞれの鎖に「TT」配列の3'オーバーハング断片を有する、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:３、またはSEQ ID NO:４に対応する RNA配列を含むかかるsiRNA は、図１Ｃに示され、本発明の有利な態様に相当する。それらは下記に対応する：
−以下の特定の配列を有する、遺伝子配列SEQ ID NO:２の RNA配列を含むsiRNA MyoVa No:1
センス鎖：
【００２６】
【化１】
2009518022.tif 000003
【００２７】
アンチセンス鎖：
【００２８】
【化２】
2009518022.tif 000004
【００２９】
−以下の特定の配列を有する: 遺伝子配列SEQ ID NO:３の RNA配列を含むsiRNA MyoVa No:2
センス鎖：
【００３０】
【化３】
2009518022.tif 000005
【００３１】
アンチセンス鎖：
【００３２】
【化４】
2009518022.tif 000006
【００３３】
−以下の特定の配列を有する、遺伝子配列SEQ ID NO:４の RNA配列を含むsiRNA MyoVa No:3
センス鎖：
【００３４】
【化５】
2009518022.tif 000007
【００３５】
アンチセンス鎖：
【００３６】
【化６】
2009518022.tif 000008
【００３７】
本発明のsiRNA が、２つの相補的部分がワトソン−クリック結合で対になっており、ヘアピン型構造によって一端で共有結合で連結されている一本鎖 RNAの単分子からなるsh  RNA 、即ち本発明のsiRNA がshRNA である場合、このshRNA は好ましくは以下の配列を含むか、これからなる：
【００３８】
【化７】
2009518022.tif 000009
【００３９】
ここで太字の部分は、ワトソン−クリック結合で対になっている２つの相補的部分に対応し、これはsiRNA MyoVa No：２のセンス鎖に含まれる遺伝子配列SEQ ID NO:３およびその相補鎖を有する RNAに対応し、太字でない部分は、２つの相補鎖を連結するヘアピン構造を有する配列に対応する。
【００４０】
さらに、本発明のsiRNA においては、センス RNA鎖及び／又はアンチセンス RNA鎖はそれらの糖部分、核塩基部分またはヌクレオチド間骨格に少なくとも１つの化学的修飾を含んでもよい。かかる修飾は、特に、in vivo でのヌクレアーゼによるsiRNA の破壊の阻害を可能にする。従って、本発明のsiRNA の安定性およびin vivo 生物学的利用能を改善することを可能にするすべての化学的修飾は本発明の範囲に含まれる。糖部分への有利な修飾の中で、特に、リボースの2'位に生じる修飾、例えばリボヌクレオチドの正常な2'-OH 基に代わる、2'- デオキシ、2'- フルオロ、2'- アミノ、2'- チオもしくは2'-O- アルキル、特に2'-O- メチル、またはリボースの2'と4'位の間のメチレン架橋 (LNA)の存在が挙げられる。核塩基については、修飾塩基を使用することが可能であり、例えば、特に5-ブロモウリジン、5-ヨードウリジン、N3- メチル- ウリジン、2,6-ジアミノプリン (DAP)、5-メチル-2'-デオキシシチジン、5-(1- プロピニル)-2'- デオキシ- ウリジン (pdU)、5-(1- プロピニル)-2'- デオキシシチジン (pdC)、またはコレステロールと結合した塩基がある。最後に、ヌクレオチド間骨格の有利な修飾には、ホスホロチオアート、ホスホン酸メチル、ホスホロジアミデート基により骨格中のホスホジエステル基を置換すること、またはペプチド結合で連結されたN-(2- アミノエチル)-グリシン単位 (PNA,Peptide Nucleic Acid) からなる骨格の使用がある。明らかに、各種修飾 (塩基、糖、骨格) を組み合わせてモルホリノ型の修飾核酸 (モルホリン環に固定され、ホスホロジアミデート基により連結された塩基) または PNA [ペプチド結合で連結されたN-(2- アミノエチル)-グリシン単位に固定された塩基] を生成させることができる。
【００４１】
本発明のsiRNA は「単離」されたものであり、これは、天然の状態ではなく、ヒトの介入を含む何らかの手段により得られたことを意味する。特に、本発明のsiRNA は、既に存在するsiRNA の精製により、化学合成により、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)による所望のヌクレオチド配列の増幅により、または組換え体合成により得ることができる。また、多数の会社、特にEurogentec、Ambion、Dharmacon またはQiagenなどの会社が注文により製造するsiRNA 合成を提供している。
【００４２】
本発明はまた、化粧品としての使用のための本発明のsiRNA にも関する。ここで使用する「化粧品」なる用語は、ヒトまたは動物の体の外面部分の美的外観を維持または改善することを可能にする物質を意味する。
【００４３】
本発明はさらに、医薬としての使用のための本発明のsiRNA に関する。事実、本発明のsiRNA は医薬として新規である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の本発明のsiRNA および許容しうる担体を含む組成物である。ここで用いる「許容しうる担体」とは当業者に既知の美容学的または薬理学的に許容しうる担体を意味する。
【００４４】
本発明の組成物は皮膚の化粧的及び／又は治療的処置用であり、従って、有利には局所投与される。
本発明の局所適用のための組成物は、局所適用に慣用的に使用される任意の製剤形態、例えば水溶液、白色もしくは着色クリーム、軟膏、乳剤、ローション、ゲル、膏薬、血清、ペースト、水中油滴型もしくは油中水滴型エマルジョン、または発泡体の形態に処方できる。エアロゾル形態で皮膚に適用することも可能である。また、粉末または非粉末、例えば棒状形態などの固体の形態で提供できる。パッチ、ペンシル、ブラシおよび顔や手のしみに局所適用するための塗布用具の形態で提供してもよい。
【００４５】
本発明組成物はさらに、本発明のsiRNA の送達および生物学的利用能を改善しうる当業者に既知の任意の種類のビヒクルを含んでいてもよい。siRNA と共に使用できる特定のビヒクルには、特に、リポソームおよび、細胞膜を通過できるペプチド (「Cell-Permeable Peptides 」であるためCPP として知られている) がある。ここで使用する「リポソーム」なる用語は、１または複数の脂質二重層からなる膜を有し、蛋白質および核酸を封入して保護し、細胞膜と融合する能力を有し、従って細胞内において内包物質を送達することを可能とする人工的な脂質ビヒクルを意味する。このように、リポソームの使用により、siRNA を保護し、その細胞内への透過を容易にしうる。ここで用いるCPP なる用語は、内部移行でき、生きた細胞の細胞質及び／又は核の区画へ到達することが可能なペプチドを意味する。かかるCPP の例には、ペプチドであるペネトラチン（Penetratine)、トランスポルタン (Transportan)、Tat 、MAP およびSynB1 がある。CPP の特に有用ないくつかの例は、原形質膜を通って拡散しうるナノ粒子を形成するために、送達される核酸と直接相互作用するウイルス由来の両親媒性のペプチドからなる。従って、本発明のsiRNA を任意のCPP に結合させることによりsiRNA を保護し、in vivo での細胞への進入を容易にすることができる。
【００４６】
本発明の組成物は、所望の効果を向上させることを目的とする１またはいくつかの活性成分をも含みうる。ある特定の態様では、本発明の組成物は特に、少なくとも１種の他の脱色剤をさらに含むことができる。ここで用いる「脱色剤」なる用語は、その活性、またはメラニン合成経路の１段階、その他、メラノソームの樹状突起への輸送およびケラチノサイトへのその移行を阻害することによりメラノサイトに直接作用する任意の物質を意味する。本発明の組成物に添加するのに適した既知の脱色剤の中で、特に、ヒドロキノンおよびその誘導体、レンチノールもしくはトレチノイン、アスコルビン酸およびその誘導体、胎盤抽出物、コウジ酸、フェルラ酸、アルブチン、ジヒドロキシベンゼン誘導体 (WO 00/47045)、グアイアコール誘導体 (WO 00/47179)、4-(2,3- ジヒドロキシフェニル)-シクロヘキサノール (WO 00/56279)、レソルシノール誘導体 (WO 00/56702)、フェノールアミド (WO 99/32077)が挙げられる。本発明の組成物に添加するのに適したその他の脱色剤には、メラニン合成経路の１段階、またはメラノソームの樹状突起への輸送およびケラチノサイトへのその移行に関与するミオシンVa蛋白質をコードする遺伝子以外の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNA 、例えば特に、チロシナーゼ (WO 01/58918 およびWO 2005/060536参照) 、蛋白質TRP-1 (WO 01/58918参照) または蛋白質PKC β1 (WO 2005/073243 参照) を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNA がある。
【００４７】
本発明の組成物はまた、スキンケアに関する局所用組成物で慣用的に使用される活性物質または賦形剤を含んでもよく、例えば、化学的および物理的日焼け止め (例、メトキシ桂皮酸オクチル、ブチル−メトキシジベンゾイル−メタン、酸化チタンおよび酸化亜鉛) 、抗グリケーション剤及び／又は単独もしくは組み合わせて用いる抗酸化剤 (例、トコフェロールおよびその誘導体、エルゴチオネイン、チオタウリン、ヒポタウリン、アミノグアニジン、ピロリン酸チアミン、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシン三リン酸) 、抗炎症剤 (例、ステアリルグリシルヘチネイト) 、鎮静剤およびそれらの混合物、保存剤 (抗菌もしくは抗真菌) 、保湿剤、pH調整剤、表皮剥離及び／又は角質溶解剤 (例、サリチル酸およびその誘導体) 、ビタミン類、増粘剤、皮膚軟化剤、温泉水、張力活性物質、ポリマー類、シリコーン油、植物油、精油、香料、着色剤もしくは顔料などがある。
【００４８】
本発明はまた、本発明の少なくとも１種のsiRNA または組成物の、皮膚を脱色または白くするための化粧品としての使用に関する。本発明のsiRNA および組成物は、皮膚全部の色素沈着を減少させるために全体的に、あるいは色素沈着の原因が何であっても色素沈着過度の部分において、皮膚の脱色または白くするための化粧品として使用できる。これは、かかる使用により皮膚の色素沈着がより均一になり、それによって外見を改善できるからである。さらに、色素沈着過度の部分がない場合でも、全体の色素沈着をより少なくしたい人々がいるかもしれず、それは本発明の化粧用途により可能となる。
【００４９】
本発明はさらに、皮膚の色素沈着過度、特に表皮性色素沈着過度、黒皮症および炎症後色素沈着過度の治療または予防用の薬剤を製造するための、本発明の少なくとも１種のsiRNA または組成物の使用に関する。色素沈着過度は多くの種々の疾患を原因としうる。特に、顔および首の黒色症、例えば肝班、リール黒皮症、顔と首の網状色素性多形皮膚萎縮症 (Reticulated Pigmentary Poikilodermia of the Face and Neck)、または遺伝性硬化性多形皮膚萎縮症；そばかす；ミルクコーヒー班；サットン母班；例えば血色素症、アジソン病、クッシング症候群もしくは甲状腺亢進症などの代謝性原因からの色素沈着過度；および外因性の原因からの色素沈着過度、例えば、薬剤 (クロルプロマジン、フェノチアジン、ヒダントイン、無機のヒ素、抗マラリア薬などの物質) または重金属 (銀、金、水銀) による色素沈着過度；外傷、湿疹性発疹、慢性単純苔癬、エリテマトーデスおよび皮膚病 (バラ色粃糠疹、乾癬、疱疹状皮膚炎、固定色素性紅班および光による皮膚病を含む) 後に誘導される炎症後色素沈着過度；ロートムンド−トムソン症候群；良性黒色表皮腫もしくは悪性黒色表皮腫が挙げられる。薬剤を製造するための本発明のsiRNA または組成物の使用により、これらの種々の症状を治療し、これらの症状からくる色素沈着過度の部分を消失させることができる。また、これらの種々の症状を原因とする色素沈着過度の部分の出現を予防することも可能となる。
【００５０】
本発明はまた、本発明の組成物を局所投与することを含む、皮膚の脱色および白くするための美容的処置方法にも関する。
さらに本発明は、本発明の組成物の局所投与することを含む、皮膚の色素沈着過度の治療的処置の方法にも関する。
【００５１】
以下の実施例は本発明を例を挙げて説明するものであるが、何ら本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５２】
ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の設計、合成および検討
1.1 ３種のsiRNA の設計および合成
エキソンＦを含むヒトミオシンVa蛋白質のスプライシング変異型の配列 (実際にはエキソンＡＢＣＤＥＦを含む）を図１Ａに示す。
【００５３】
EurogentecのsiRNA 設計および合成サービスを用いて、エキソンＦ内で、ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とする３種のsiRNA を設計し合成した。これらのsiRNA が特異的なエキソンＦの部分を図１Ｂに示す。
【００５４】
図１Ｃに示すように、３種のsiRNA を配列「TT」を有する3'オーバーハング断片を用いて合成した。これらの３種のsiRNA を以後、MyoVa No.1 (センス鎖はSEQ ID NO:2 を含む) 、MyoVa No.2( センス鎖はSEQ ID NO:3 を含む) 、またはMyoVa No.3 (センス鎖はSEQ ID NO:4 を含む) と称し、括弧内に示す配列番号は、siRNA のセンス RNA鎖に含まれるヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦ断片の配列に対応する。
【００５５】
1.2 初代ヒト表皮性メラノサイト (PHEM) へのエレクトロポレーション (電気穿孔) 後のsiRNA の効果の試験
1.2.1 電気穿孔プログラムの選択
初代ヒト表皮性メラノサイト (PHEM) を、2.5 ％ウシ胎仔血清 (FCS)、１％Ultroser、５ng/ml 塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) 、10ng/ml エンドセリン-1 (ET-1) 、0.33nMコレラ毒素(CT)、0.033mM イソブチル−メチル−キサンチン (IBMX) 、および5.3nM の12-O- テトラデカノイルホルボール-13-酢酸 (TPA)を添加したハムF10 培地 (Gibco, Invitrongen Ltd. 英国、ペーズリー) 中で増殖させた。細胞は40〜70％のコンフルエンスまで増殖させ、継代２〜５で用いた。
【００５６】
まず、プラスミドpMAX-GFP (３μｇ) をメラノサイトの電気穿孔のための３種の異なるプログラム、即ち、U16 、U20 およびU24 プログラムを試験するのに用いた。電気穿孔には500,000 個の細胞を使用した。正常ヒト新生児表皮性メラノサイト用のNHEM-Neo Nucleofector キット (Amaxa, #VDP-1 003)をすべての電気穿孔において使用した。
【００５７】
T25 フラスコ中の電気穿孔された細胞を、pMAX-GFPプラスミドにより発する緑色蛍光シグナルを検出しうる蛍光フィルターを備えたArcturus顕微鏡 (LCM)の下で24〜48時間生きた状態で評価した。
【００５８】
電気穿孔された細胞をスライドグラス上でも増殖させた。電気穿孔の24時間後、細胞を氷冷したメタノールに固定し、裁置用液体 (DAKO) を用いてスライドグラス上に載せた。緑色蛍光シグナルの発光に関係する細胞をZeiss 蛍光顕微鏡で分析した。
【００５９】
生きた細胞で得られた結果から、電気穿孔プログラムが何であろうと等量の死んだ細胞が見られたが、最も有効な電気穿孔はU24 プログラムで得られることが示された。固定細胞で得られた結果により、U24 プログラムが最も有効な電気穿孔を提供することが確認された。従って、以降はU24 プログラムをすべてのその他の実験において使用した。
【００６０】
1.2.2 siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)の効果の予備的分析
500,000 個の細胞をpMAX-GFPプラスミド (３μｇ) および以下のsiRNA 二本鎖を用いて電気穿孔した：FAM 標識したGAPDH(３μｇまたは２μM 、Ambion) を標的とする陽性対照、陰性対照のBLOCK-iTTM Fluorescent Oligo (Invitrogen) 、およびヒトミオシンVa蛋白質の遺伝子のエキソンＦに特異的なsiRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)の２本鎖。U24 プログラムを電気穿孔に使用し、細胞を電気穿孔の24時間後に回収した。
【００６１】
次いで、リアルタイム定量的RT-PCR (QPCR) によって RNAについて分析を行った。簡単に述べると、 RNAの抽出後に、試料をDNase で処理し、iScript 逆転写酵素 (Biorad) を用いてcDNAを合成した。ミオシンVa蛋白質のエキソンＦ用のQPCRプライマー (センスプライマー：
【００６２】
【化８】
2009518022.tif 000010
【００６３】
アンチセンスプライマー：
【００６４】
【化９】
2009518022.tif 000011
【００６５】
) およびGAPDH を、アンプリコン (amplicon)(75bp) のために最小サイズ限度のみを修飾し、デフォルトとしてTaqmanパラメーターを有するPrimerExpress 2.0 ソフトウェア (Applied Biosystems) を用いて設計した。遺伝子発現の相対量を、２つの最適化した段階においてSYBR green /RT-PCR試験を用いて測定した。定量化のためにCt比較法を用いた。ＰＣＲ反応はABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystem)において行った。抽出された RNAの量およびcDNA合成の効率における違いを補正するために、遺伝子発現の相対的量を既にメラノサイト分析に用いられてきた３つのハウスキーピンク遺伝子 (RPL13a、SDHAおよびUBC)の幾何学的平均に対して標準化した (Vandesompele J et al., Gemone Biol.:3:researchoo34.001−research0034.001, 2002) 。
【００６６】
得られた結果から、使用したsiRNA はPHEM細胞での電気穿孔の後、標的遺伝子による RNAの発現の減少をもたらすことが判明した。事実、陰性対照に比べ、GAPDH では75％の減少 (図２Ａ) がエキソンＦを含むミオシンVa蛋白質の転写物では62％の減少 (図２Ｂ) が見られた。
【００６７】
1.2.3 siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2)、MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)またはMyoVa No.3 (SEQ ID NO:4)での電気穿孔後の、PHEM細胞におけるミオシンVa蛋白質の遺伝子の転写物の発現
500,000 のPHEM細胞をNucleofector試薬 (MOCK) 単独、GAPDH を標的とするsiRNA(１μｇ) 、陰性対照siRNA 、またはミオシンVa蛋白質の遺伝子のエキソンＦに特異的な MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2 )、MyoVa No.2(SEQ ID NO:3) 、またはMyoVa No.3 (SEQ ID NO:4)の３種類のsiRNA の１つを用いて電気穿孔した。U24 プログラムを電気穿孔に使用し、細胞を電気穿孔の48時間後に回収した。
【００６８】
次いで、エキソンＦを含む転写物について (エキソンＦ検出) またはミオシンVa蛋白質の球状部分(GP)の検出による全転写物について、前に記載のようにしてQPCRにより RNAについて解析を行った。ミオシンVa蛋白質の球状部分(GP)用のQPCRプライマー (センスプライマー：
【００６９】
【化１０】
2009518022.tif 000012
【００７０】
アンチセンスプライマー：
【００７１】
【化１１】
2009518022.tif 000013
【００７２】
) をPrimerExpress 2.0 (Applied Biosystem) ソフトウェアを用いて前に記載のようにして設計した。
【００７３】
ミオシンVa蛋白質のエキソンＦを含む転写物については、siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2 ) 、MyoVa No.2(SEQ ID NO:3) 、およびMyoVa No.3 (SEQ ID NO:4)に対してそれぞれ85％、94％および60％の阻害が観察された (図３Ａ) 。最大の阻害はMyoVa No.2(SEQ ID NO:3) について見られた。
【００７４】
球状部分(GP)を用いて検出したミオシンVa蛋白質の全転写物については、siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2 ) 、MyoVa No.2(SEQ ID NO:3) 、およびMyoVa No.3 (SEQ ID NO:4)に対してそれぞれ39％、56％および０％の阻害が観察された (図３Ｂ) 。このように阻害が減少するのは、特に、使用したsiRNA がエキソンＦを特異的に標的とし、従ってエキソンＦを含まない転写物の破壊には至らないという事実により説明できる。
【００７５】
1.2.4 結論
これらの最初の結果は、３種の合成siRNA を用いることにより、エキソンＦを含まない転写物に影響を及ぼすことなく、エキソンＦを含むヒトミオシンVa蛋白質の転写物の量を特異的にかつ顕著に減少させることができることを明らかに示す。
【００７６】
最も顕著な結果はsiRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)で見られた。
1.3 siRNA 濃度の最適化
1.3.1   最大の効果を有する最小濃度の決定
最大の効果のための最小のsiRNA 濃度を決定する目的で、0.05〜２μM の範囲の種々の濃度を、前に記載したと同じプロトコルを用いて試験した。陰性対照siRNA およびGAPDH を標的とするsiRNA を１μM の濃度で用いた。
【００７７】
U24 プログラムを用い、細胞を電気穿孔後48時間で分析した。
次いで分析を、前述のようにQPCRによりエキソンＦを含む転写物に対して行った (特異的エキソンＦ検出) 。
【００７８】
siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2)については、陰性対照に比べ、エキソンＦを含む転写物における47.5％、31％、73％、73％および79％の減少が、それぞれ0.05、0.1 、0.25、0.5 および１μM の濃度で観察された (図４Ａ) 。このように、最も大きい効果は１μM 濃度で得られたが、0.25および0.5 μM の濃度でほとんど同じ有効な阻害が得られた。
【００７９】
siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)に関しては、試験した全濃度で大きい減少が見られた (図４Ｂ) 。最大の効果は１μM の濃度で見られたが、0.5 μM 濃度で得られた阻害もほとんど同じであった。
【００８０】
従って、siRNA の最適濃度は約0.5 〜１μM である。
1.3.2 細胞生存能に対するsiRNA 濃度の影響
次いで、細胞生存能に対するsiRNA 濃度の影響を、siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)を用いて分析した。このために、同じ範囲の濃度 (0.05〜２μM ) を、生存能のある細胞の数を測定するMTS 試験 (Promega Benelux)と並行して試験した。U24 プログラムを用いた電気穿孔の48時間後、細胞を分析した。
【００８１】
結果を図５に示し、これより細胞の生存能は１または２μM のsiRNA 濃度において著しく減少する(20 ％) だけであることが判明した。１μM 未満では、細胞の生存能は90％より大きい。
【００８２】
1.3.3 結論
これらの結果より、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の効果は用量依存性であり、最大の効果は0.5 と１μM の間の濃度で知られることが分かった。
【００８３】
さらに、１μM 未満では、siRNA の存在はPHEM細胞の生存能に影響しない。
従って、高い効果と高い細胞生存能を合わせもつため、0.5 μM の濃度が最良であるようである。この濃度を以下に記載の全実施例において用いた。
【００８４】
1.4   経時的分析
本発明のsiRNA の経時的効果を分析するために、0.5 μM のsiRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2 ) またはMyoVa No.2(SEQ ID NO:3) で電気穿孔したPHEM細胞を、電気穿孔後24、48、72および96時間に上記のようにしてQPCRによって分析した。陽性または陰性対照  (0.5μM ) で処理した細胞を電気穿孔48時間後に分析した。
【００８５】
siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2 ) については、エキソンＦを含む転写物の減少は24時間で最大 (90％より大) であり、次いで48時間 (65％) および72時間 (60％) で減少し、発現量は96時間で正常に戻った (図６Ａ参照) 。
【００８６】
siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3 ) については、24時間および48時間で85％より大きい転写物の減少が見られ、次いで、72時間および96時間で減少し、陰性対照と比べると有意なままであった (図６Ｂ参照) 。
【００８７】
従って、これらの結果は最大の効果が電気穿孔の24〜48時間後に得られ、MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3 ) の効果は経時的に、siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2 ) よりも大きいことを示す。
【００８８】
1.5 結論
このように、上に示した結果は明らかに、エキソンＦを標的とするsiRNA を用いることにより、エキソンＦを含有するミオシンVa蛋白質の転写物の量を著しく減少させることが可能であることを示す。３つの異なるsiRNA を試験し、これらのsiRNA のそれぞれがエキソンＦを含有するミオシンVa蛋白質の転写物の量を著しく減少させる。siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:2 ) および、殊に、MyoVa No.2(SEQ ID NO:3) が特に効果的である。
【００８９】
さらにミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の効果は用量依存性であり、最大の効果を細胞生存能に影響しない濃度で得ることができる。
効果はまた、経時的に変化し、電気穿孔後24〜48時間で最大に達する。
【実施例２】
【００９０】
in vitroでのメラノソームのメラノサイトからのケラチノサイトへの移動に対する、ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の存在の影響
2.1 試験の原理
メラニンのメラノサイトからのケラチノサイトへの移動に対する、ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とする本発明のsiRNA の影響を試験するために、in vitro試験を開発した。
【００９１】
この試験の原理を図７に示す。
正常ヒトメラノサイト (MC) を、0.1 μM 、0.25μM および0.5 μM の濃度でヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA で電気穿孔するか、またはしない。次いで、電気穿孔された (siRNA MC) またはされない (MC) メラノサイトを、2[2-14C]チオウラシル−これはMCによって産生されたメラニン中に導入され、14Ｃで標識されたメラニンを含むメラノサイト (MC* またはsiRNA MC* ) を得ることを可能にする−の存在下で強化TFA 培地中で増殖させる。
【００９２】
MC* またはsiRNA MC* を、ケラチノサイト (KC) を有する低カルシウム濃度の無血清ケラチノサイト培地 8K-SFM, Gibco) での培養物に入れるが、これは同じ培地中で１または２回の継代培養を行ったものである。MC* またはsiRNA MC* とKCは１：３の比で培養物に入れる。
【００９３】
次いで、共培養物を場合によりUVで照射し、メラノソームのMC* またはsiRNA MC* からKCへの移動を刺激する。これは、UV照射は、メラノソームのメラノサイトからのケラチノサイトへの移動を刺激することが知られているため、行う。共培養および任意のUV照射の後、ケラチノサイトはMC* またはsiRNA MC* から移動したメラニンの量に比例して14Ｃ放射性（KC *) である。
【００９４】
次いで、KC *を、メラノサイトおよび抗PEビーズに結合する抗CD117PE 抗体を用いたMACS手法 (Miltenyi Biotech) によって陰性選択により精製する。
最後に、精製したKC *の14Ｃ放射能を測定する。
【００９５】
2.2 結果
得られた結果より、ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA での電気穿孔を行わない場合、UV照射によってメラニンのメラノサイトからケラチノサイトへの移動を効果的に刺激することが可能であることが分かる。
【００９６】
これに対し、電気穿孔をミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA を用いて行った場合、電気穿孔を行わない対照に比べてUV照射後のケラトノサイトへ移動した14Ｃ放射性メラニンの量が減少する。
【００９７】
2.3 結論
これらの結果は明らかに、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の使用により、メラニンのメラノサイトからケラチノサイトへの移動を減少させることができ、従って、本発明者等によって使用される手法が皮膚の色素沈着を減少させるのに有効であることを示す。
【実施例３】
【００９８】
初代ヒト表皮性メラノサイト (PHEM) へのトランスフェクション後のミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の効果
3.1 ミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA を用いたPHEMのトランスフェクション
3.1.1 HiPerFect トランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションの最適化
200,000 個のPHEM (0.5ml 培地/ ６ウェルプレート中) をsiRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)および陰性対照のBLOCK-iTTM Fluorescent Oligoオリゴヌクレオチド (Invitrogen) でトランスフェクトした。それぞれのトランスフェクションには、各siRNA を25nMまたは10nMを、HiPerFect 試薬 (Qiagen) の12または18μL と組み合わせて使用した。
【００９９】
エキソンＦを含む転写物 (MyoVa exF 転写物) だけか、あるいはGP部分で検出されるミオシンVa蛋白質の全転写物 (MyoVa GP転写物) について、 RNA量での阻害評価を、実施例1.2.2 の項に記載した定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。
【０１００】
MyoVa exF またはMyoVa GP転写物についてHiPerFect 試薬12μL または18μL で得られた結果を図８に示し、この結果から以下のことが判明する：
−HiPerFect 試薬12μL でのMyoVa exF 転写物については、MyoVa siRNA No.2 (SEQ ID NO:3)25nMおよび10nMで、それぞれ80％および85％の阻害が観察された (図８Ａ) 。
−HiPerFect 試薬12μL でのMyoVa GP転写物については、MyoVa siRNA No.2 (SEQ ID NO:3)25nMおよび10nMで、それぞれ50％および60％の阻害が観察された (図８Ｂ) 。
−HiPerFect 試薬18μL でのMyoVa exF 転写物については、MyoVa siRNA No.2 (SEQ ID NO:3)25nMおよび10nMで、それぞれ90％および85％の阻害が観察された (図８Ｃ) 。
−HiPerFect 試薬18μL でのMyoVa GP転写物については、MyoVa siRNA No.2 (SEQ ID NO:3)25nMおよび10nMで、それぞれ63％および58％の阻害が観察された (図８Ｄ) 。
【０１０１】
3.1.2 結論
これらの結果は、MyoVa siRNA No.2 (SEQ ID NO:3)およびHiPerFect 試薬でのPHEMのトランスフェクションによりエキソンＦを含むミオシンVa蛋白質の転写物 (MyoVa exF 転写物) の数の顕著で特異的な阻害を示す。最も効果的な阻害は、siRNA No.2 (SEQ ID NO:3)25nMおよびHiPerFect 試薬18μL で得られる。
【０１０２】
これらの最適の条件を以下に記載の実施例３の全実験において使用する。
3.2 siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)でのPHEMトランスフェクション後に得られる阻害の評価
3.2.1 長期間の実験における RNA量および蛋白質量での阻害の評価
800,000 個のPHEM (培地2.5ml/60ウェルプレート中) を、HiPerFect 試薬18μL およびsiRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)25nMで、またはBLOCK-iTTM Fluorescent Oligoオリゴヌクレオチド (陰性対照)25nM でトランスフェクトした。８日間にわたり阻害の効果を評価した。1/3 の細胞を RNAの抽出に使用し、2/3 の細胞を細胞溶解物の精製に使用した。
【０１０３】
エキソンＦを含む転写物 (MyoVa exF 転写物) について、 RNA量での阻害評価を、実施例1.2.2 の項に記載した定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。
RNA量で見られる阻害と、蛋白質量での発現との関係を示すために、エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームに対して特異的なポリクローナル抗体がEurogentecにより開発された。精製抗体の反応性および特異性をウェスタンブロット解析法および免疫組織化学により試験した。
【０１０４】
実験の間に得られた細胞溶解物をウェスタンブロット解析法により分析した。
RNA 量
結果は図９Ａに示され、この結果は、MyoVa exF 転写物について、陰性対照に対して72％、81％、78％および82％の減少が種々の時点 (それぞれD2、D4、D6およびD8) において見られたことを示す。
【０１０５】
蛋白質量
ウェスタンブロットによる細胞溶解物の解析の結果は図９ＢおよびＣに示され、この結果はそれぞれ、ウェスタンブロットからの生の結果、およびQuantity Oneソフトウェア(Biodad)で得られ、チューブリンで標準化された定量を示す。
【０１０６】
結果は、MyoVa exF 転写物について、陰性対照に対して35％、40％、70％および75％の減少が種々の時点 (それぞれD2、D4、D6およびD8) において見られたことを示す。
3.2.2 PHEMにおけるメラノソームの位置／分布に対するsiRNA MyoVa exF No.2 (SEQ IDNO:3) により生じる阻害の影響
MyoVa exF 転写物が皮質下のアクチンネットワークにおけるメラノソームの捕捉に関与することは上記に示された。従って、MyoVa exF 転写物の阻害が、メラノサイト樹状突起の遠方末端でのメラノソームの捕捉の減少、およびおそらくメラノソームの核周囲の蓄積をもたらし得るであろう。
【０１０７】
この仮説を試験するために、25nMのsiRNA MyoVa exF No.2 (SEQ ID NO:3)および25nMの陰性対照siRNA でのトランスフェクションを、丸型スライドグラス上に置いた300,000 個のPHEMにおいて行った。トランスフェクション後 (３日目、６日目および８日目) 種々の時点でPHEMを３％パラホルムアルデヒド中に固定した。
【０１０８】
次いで、免疫組織化学的実験のために、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦに特異的な抗体 (1/500 希釈)(上記参照) を、 (プレ) メラノソーム蛋白質silverに対するモノクローナル抗体NKI-beteb (1/40 希釈) (Sanbio B.V., Uden, The Netherlands)と組み合わせて使用した。次いで、分析を共焦点顕微鏡検査によって行った。
【０１０９】
結果
トランスフェクション後３日目
陰性対照siRNA でトランスフェクトしたPHEM、およびsiRNA MyoVa exF No.2 (SEQ ID NO:3)でトランスフェクトしたPHEMについてメラノソームの分布には何ら異常は見られなかった (核周囲および樹状突起の遠方末端に存在) 。
トランスフェクション後６日目
抗NKI-beteb 抗体および抗ミオシンVaエキソンＦ抗体での共標識により、siRNA MyoVa exF No.2 (SEQ ID NO:3)でトランスフェクトしたPHEMにおけるメラノソームの分布に変化が示された：メラノソームは主に核周囲の領域に位置する。さらに、エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームの標識は、樹状突起の遠方末端には存在しないか弱かった。
トランスフェクション後８日目
６日目と同じ結果が観察された。
【０１１０】
結論
siRNA MyoVa exF No.2 (SEQ ID NO:3)または対照siRNA でトランスフェクトされたPHEMの、抗NKI-beteb 抗体および抗ミオシンVaエキソンＦ抗体を用いた免疫組織化学的解析により、メラノソームの細胞内輸送を視覚化し (NKI-beteb により) 、またエキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームの発現を検出することが可能となる。
【０１１１】
得られた結果より、エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームの阻害は、トランスフェクションの６〜８日後に、PHEM中のメラノソームの異常な分布、即ち周縁部よりも核周囲の分布を生じる結果となり、陰性対照では樹状突起の遠方末端に存在する。
【０１１２】
3.3 siRNA MyoVa No.1(SEQ ID NO:2) でのPHEMトランスフェクション後のMyoVa exF 転写物の阻害効果の確認
これらの実験では、阻害が本当にミオシンVa蛋白質のエキソンＦに特異的であることを確認し、そして非特異的な人工産物の効果を排除するするために、異なるsiRNA 、即ちsiRNA MyoVa No.1(SEQ ID NO:2) をPHEMのトランスフェクションに用いた。
【０１１３】
3.3.1 長期間の実験における RNA量および蛋白質量での阻害の評価
siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)に代えてsiRNA MyoVa No.1(SEQ ID NO:2) を用い、3.2.1 の項と同様の実験を繰り返した。
【０１１４】
RNA 量での結果を図10に示し、これは、種々の時点 (D2、D4、D6およびD8) においてそれぞれ58％、59％、41％および51％の減少を示す。
さらに、蛋白質量で得られた結果は RNAで得られた結果と関係した (データ示さず) 。
【０１１５】
3.3.2 PHEMにおけるメラノソームの位置／分布に対するsiRNA MyoVa exF No.1 (SEQ ID NO:2)により生じる阻害の影響
siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)に代えてsiRNA MyoVa No.1(SEQ ID NO:2) を用い、3.2.2 の項と同様の実験を繰り返した。
【０１１６】
siRNA MyoVa No.1(SEQ ID NO:2) でトランスフェクション後８日目に得られた結果は、siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:3)についてと同様、陰性対照に比較して、PHEM中においてメラノソームの核周囲の分布を示す (データ示さず) 。
【０１１７】
3.3.3 結論
エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォーム (MyoVa exF 転写物) の阻害はsiRNA MyoVa exF No.1 (SEQ ID NO:2)では、siRNA MyoVa exF No.2 (SEQ ID NO:3)を用いた場合よりも効果が低いにもかかわらず、MyoVa exF 転写物の発現は、siRNA MyoVa exF No.1 (SEQ ID NO:2)を用いると RNA量および蛋白質量の両方で著しく低下したままである。
【０１１８】
さらに、トランスフェクトされたPHEMを固定して免疫組織化学的に解析しても、PHEM中のメラノソームの位置および輸送の破壊が明らかになる。従って、エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームの阻害、およびsiRNA MyoVa exF No.1および2 (SEQ ID NO:2および3)の使用により生じる観察された表現型の効果は特異的であり、人工産物ではない。
【実施例４】
【０１１９】
エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質の転写物 (MyoVa exF 転写物) の長期阻害による表現型効果の誘導
エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームのPHEMでの長期間の安定な阻害を得るために、ミオシンVa蛋白質のエキソンＦに対する短いヘアピン RNA (即ちshRNA)を発現するレンチウイルスベクターを合成した。
【０１２０】
4.1 材料および方法
siRNA MyoVa No.2 (遺伝子配列SEQ ID NO:3 を有する RNA配列を含む) であるMyoVa exF を阻害するために最も有効なsiRNA のsiRNA 配列からshRNA 配列を作成した。より詳しくは、以下の配列からなる二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した：
−センス鎖：
【０１２１】
【化１２】
2009518022.tif 000014
【０１２２】
−アンチセンス鎖：
【０１２３】
【化１３】
2009518022.tif 000015
【０１２４】
上記において、
−太字の部分は、ワトソン−クリック結合により対となるshRNA の２つの相補的部分に対応し、siRNA MyoVa No.2のセンス鎖の遺伝子配列SEQ ID NO:3 を有する RNAおよびその相補配列に対応し、
−通常タイプの配列部分は、２つの相補鎖を連結するヘアピン構造を有する配列に対応し、
−下線部分は、発現ベクターにおいて二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることを可能にする5'オーバーハング断片に対応し、そして
−イタリック体の部分は RNApolIII型H1プロモーターにより開始される転写終止配列に対応する。
【０１２５】
次いで、この二本鎖オリゴヌクレオチドを RNApolIII型H1プロモーターの制御下にレンチウイルスベクター中でクローニングした。
これはトランスフェクトされた細胞中で以下の配列を有するshRNA の産生を可能にした：
【化１４】
2009518022.tif 000016
【０１２６】
ここで、太字の部分は、ワトソン−クリック結合により対となる２つの相補的部分に対応し、siRNA MyoVa No.2のセンス鎖の遺伝子配列SEQ ID NO:3 を有する RNA配列およびその相補配列に対応し、通常タイプの配列部分は、２つの相補鎖を連結するヘアピン構造を有する配列に対応する。
【０１２７】
スクランブルshRNA を発現するレンチウイルスベクターも陰性対照として使用されるために製造された。この場合、 RNApolIII型H1プロモーターにより制御されたレンチウイルスベクター中でクローン化されたオリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖配列は以下の通りである：
−センス鎖：
【０１２８】
【化１５】
2009518022.tif 000017
【０１２９】
−アンチセンス鎖：
【０１３０】
【化１６】
2009518022.tif 000018
【０１３１】
上記において、
−太字の部分は、ワトソン−クリック結合により対となるshRNA の２つの相補的部分に対応し、siRNA MyoVa No.2のセンス鎖の遺伝子配列SEQ ID NO:3 を有する RNA配列の無秩序な塩基およびその相補配列に対応し、
−通常タイプの配列部分は、２つの相補鎖を連結するヘアピン構造を有する配列に対応し、
−下線部分は、発現ベクターにおいて二重鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることを可能にする5'オーバーハング断片に対応し、そして
−イタリック体の部分は RNApolIII型H1プロモーターにより開始される転写終止配列に対応する。
【０１３２】
これはトランスフェクトされた細胞中で以下の配列を有するshRNA の産生を可能にした：
【０１３３】
【化１７】
2009518022.tif 000019
【０１３４】
ここで、太字の部分は、ワトソン−クリック結合により対となるshRNA の２つの相補的部分に対応し、(siRNA MyoVa No.2 のセンス鎖の遺伝子配列SEQ ID NO:3 を有する RNA配列の無秩序な塩基およびその相補配列に対応し) 、通常タイプの配列部分は、２つの相補鎖を連結するヘアピン構造を有する配列に対応する。
【０１３５】
4.2 形質導入の効率
PHEMでの形質導入の効率を、上述のレンチウイルスベクター中のGFP マーカーの存在に基づくFACS解析により測定した。
【０１３６】
感染多重度 (MOI)10で100,000 個のPHEMをレンチウイルスで形質導入すると、２サイクルの感染後に90％の形質導入効率を得た。
4.3 RNA 量および蛋白質量での阻害の評価
RNA 量および蛋白質量での阻害の効果を評価するために、600,000 個のPHEMを、それぞれsiRNA MyoVa exF No.2またはスクランブルshRNA(陰性対照) を含むレンチウイルスベクターを用いMOI 10で形質導入した。
【０１３７】
結果は、RNA 量および蛋白質量の両方において、陰性対照に比較して、shRNA MyoVa exF No.2を含むレンチウイルスベクターで形質導入した細胞中で、エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームが大きく減少することを示す。
【０１３８】
4.4 メラノソームの輸送に対する阻害の影響
続いて、shRNA MyoVa exF No.2またはスクランブルshRNA(陰性対照) を含むレンチウイルスベクターで形質導入したPHEMの免疫組織化学的解析を行った。結果は、陰性対照に比べ、shRNA MyoVa exF No.2を含むレンチウイルスベクターで形質導入したPHEM中のメラノソームが核周囲に分布していることを示す。
【０１３９】
これらの結果から、先の合成siRNA の使用によるMyoVa exF 転写物の阻害の場合に見られた効果が確認される。
4.5 再構成した表皮の3Dモデルにおけるメラニンのメラノサイトからケラチノサイトへの移動に対するMyoVa exF 転写物の阻害の影響
50,000個のPHEMを、shRNA MyoVa exF No.2を発現するレンチウイルスベクターを用い形質導入した。これらの安定的に形質導入されたPHEMを、500,000 個のケラチノサイトを用いて再構成皮膚モデルに導入した。スクランブルshRNA を発現するレンチウイルスベクターを用い安定的に形質導入されたPHEMを陰性対照として使用した。次いで、再構成した皮膚を日光を模したUVで照射または照射しなかった。
【０１４０】
再構成皮膚の目による観察により、スクランブルshRNA を発現するレンチウイルスベクターを用い形質導入されたPHEMを含む皮膚とは反対に、shRNA MyoVa exF No.2を発現するレンチウイルスベクターを用い形質導入したPHEMを含む皮膚については照射後に色素沈着は増加しなかったことが示された。次いで、フォンタナ−マッソン染色法およびデジタル着色画像解析による色素沈着の定量的評価により、これらの観察を確認することが可能となった。
【０１４１】
次いで、メラノサイトおよびケラチノサイト中のメラノソームの分布を電子顕微鏡で調べた。これらの分析は、非照射皮膚に比べ、UVで照射され、スクランブルshRNA を発現するレンチウイルスベクターを用い形質導入されたPHEMを含む再構成皮膚において、メラノサイトからケラチノサイトへ色素の移動が刺激されることを示した。これに対し、UVで照射され、shRNA MyoVa exF No.2を発現するレンチウイルスベクターで形質導入したPHEMを含む再構成皮膚では、非照射の対照皮膚に比べて低いメラニンの移動しか見られなかった。
【０１４２】
4.6 結論
従って、結果は、ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを特異的に標的とするshRNA を発現するレンチウイルスベクターでのPHEMの安定な形質導入は、MyoVa exF 転写物と、エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォームの量への、およびメラノソームの輸送と、メラノサイトからケラチノサイトへのその移動への顕著な干渉を可能とすることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とする３種のsiRNA の設計を示す。ＡはエキソンＦを含むヒトミオシンVa蛋白質の転写物のヌクレオチドコード配列 (エキソンＡＤＣＤＥＦを含む）。エキソンＦに対応する部分に下線が引いてある。ＢはエキソンＦの配列の詳細。選択された３種のsiRNA に対応する位置に、下線 [siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:３)]、あるいは、上に線を引いてある [siRNA MyoVa No. １ (SEQ ID NO:２) および MyoVa No.３ (SEQ ID NO:４) 。ＣはヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とする３種のsiRNA の構造を示す。
【図２】siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:３) ２μM を用いて電気穿孔したPHEM細胞中のエキソンＦを含むミオシンVa蛋白質の転写物の量の減少を示す。PHEM細胞を２μM の陰性対照siRNA 、GAPDH 遺伝子を標的とするsiRNA 、またはsiRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:３) を用いて電気穿孔した。各種のsiRNA の効果はQPCRにより RNAの量を測定した。Ａは電気穿孔されたsiRNA に関するGAPDH 遺伝子の相対的発現量。Ｂは電気穿孔されたsiRNA に関するエキソンＦを含有するミオシンVa蛋白質の転写物の発現量。
【図３】エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質の転写物の量における特異的減少を示すが、エキソンＦを含まない転写物はそうではない。Ａは電気穿孔されたsiRNA に関するエキソンＦを含有するミオシンVa蛋白質の転写物の相対的発現量。Ｂは電気穿孔されたsiRNA に関する粒状部分 (GP) の検出によるミオシンVa蛋白質の全転写物の相対的発現量。
【図４】siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:２) 、および MyoVa No.2 (SEQ ID NO: ３) の最大の効果を有する最小濃度の決定を示す。ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の種々の濃度を、Ａ.siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO: ２) 、およびＢ. MyoVa No.2 (SEQ ID NO:３) について試験した。 MyoVa No.2 については標準偏差を有する平均値の形で結果を示す。
【図５】細胞の生存能に対するsiRNA 濃度の影響を示す。エキソンＦを含む転写物の相対的発現量と、細胞の生存能を、siRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:３) の種々の濃度について並行して決定した。siRNA 濃度をＸ軸に、エキソンＦを含む転写物の相対的発現量、および細胞生存能をＹ軸に、それぞれヒストグラム（灰色のブロック）および平均値と標準偏差を示す線で表す。
【図６】ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA の経時的効果を示す。ＰＨＥＭ細胞を0.5 μM のsiRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:２) またはMyoVa No.2 (SEQ ID NO:３) の電気穿孔後の各種時間において分析した。Ａ.MyoVa No.1 (SEQ ID NO: ２) についての相対的発現量、Ｂ.MyoVa No.2 (SEQ ID NO: ３) についての相対的発現量。
【図７】ヒトミオシンVa蛋白質のエキソンＦを標的とするsiRNA による、メラノソームのメラノサイトからケラチノサイトへの移動の阻害のin vitro試験の原理を示す。
【図８】25nMもしくは10nMのsiRNA MyoVa No.2 (SEQ ID NO:３；exF)、またはBLOCK-iTTM Fluorescentオリゴヌクレオチド (siNEG)および12もしくは18μL のHiPerFect 試薬でトランスフェクトしたPHEMにおける、エキソンＦを含む転写物 (MyoVa exF 転写物) およびGP部分で検出したミオシンVa蛋白質の全転写物 (MyoVa GP転写物) の阻害の評価を示す。Ａ.MyoVa exF転写物、12μL のHiPerFect 試薬、Ｂ.MyoVa GP 転写物、12μL のHiPerFect 試薬、Ｃ.MyoVa exF転写物、18μL のHiPerFect 試薬、Ｄ.MyoVa GP 転写物、18μL のHiPerFect 試薬。
【図９】長期間の実験 (トランスフェクション後D2、D4、D6、D8) の間の RNA量および蛋白質量における阻害の評価を示す。Ａ. 定量的リアルタイムＰＣＲによる RNA量の分析、Ｂ. エキソンＦを含むミオシンVa蛋白質のアイソフォーム (isoform)に対して特異的な抗体を用いたウェスタンブロット法による蛋白質量の分析、Ｃ. すべて生データに基づきチューブリンと比較して標準化した、Quantity Oneソフトウェエを用いて行った数量化。
【図１０】siRNA MyoVa No.1 (SEQ ID NO:２；exF)、またはBLOCK-iTTM Fluorescentオリゴヌクレオチド (siNEG)および18μL のHiPerFect 試薬でトランスフェクトしたPHEMにおける、エキソンＦを含む転写物 (MyoVa exF 転写物) の阻害の評価を示す。
【図１】
2009518022.tif 000020
【図２】
2009518022.tif 000021
【図３】
2009518022.tif 000022
【図４】
2009518022.tif 000023
【図５】
2009518022.tif 000024
【図６】
2009518022.tif 000025
【図７】
2009518022.tif 000026
【図８Ａ】
2009518022.tif 000027
【図８Ｂ】
2009518022.tif 000028
【図８Ｃ】
2009518022.tif 000029
【図８Ｄ】
2009518022.tif 000030
【図９】
2009518022.tif 000031
【図１０】
2009518022.tif 000032
【配列表】
2009518022000001.app
【国際調査報告】
2009518022.tif 000033
2009518022.tif 000034
2009518022.tif 000035
2009518022.tif 000036
2009518022.tif 000037
2009518022.tif 000038