(57)【要約】本発明は、タンパク質の発現特性が改善された宿主細胞に関する。宿主細胞は、１つまたは複数のｒＲＮＡオペロン内に、希少ｔＲＮＡ遺伝子を含む。本発明は特に、ｔＲＮＡをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のｒＲＮＡオペロンを有する宿主細胞に関する。本発明の実施形態において、ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ヒト、酵母に由来してもよく、または宿主細胞のゲノムに由来してもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞であって、前記宿主細胞の１つまたは複数のｒＲＮＡオペロンが、ｔＲＮＡをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項２】
前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、ヒト、酵母、およびその他からなる群から選択される供給体に由来する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜７からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記ｒＲＮＡオペロンが、配列番号１および７を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記ｒＲＮＡオペロンが、配列番号１、５および６を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記ｒＲＮＡオペロンが、配列番号１、５、６および７を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記ｒＲＮＡオペロンが、配列番号１〜７を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、細菌、酵母または昆虫細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記ｒＲＮＡオペロンが、ｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＣ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＥ、ｒｒｎＧおよびｒｒｎＨからなる群から選択される、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、５ＳｒＲＮＡエレメントの３’および転写終結エレメントの５’である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
組換え型異種タンパク質細胞を調製する方法であって、
（ａ）請求項１２に記載の宿主細胞を準備することと、
（ｂ）前記異種タンパク質をコードする遺伝子を発現させることと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／７９３，７５５号の利益を請求する。米国仮特許出願第６０／７９３，７５５号の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ｔＲＮＡの発現の改善による、タンパク質発現用の改変された宿主細胞およびそれに関する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
現代バイオテクノロジーの進歩の１つは、目的タンパク質またはタンパク質を含有する目的遺伝子産物の大量生産である。細菌宿主細胞は、容易に大量発酵することができるため、目的タンパク質の産生に使用されることが多い。数多くの細菌系の１つの重大な欠点は、細菌系が、発現される遺伝子のコドン選択と大きく異なり得る希少コドンを使用することである。細菌の希少コドンは、典型的には、相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡの低レベル発現を伴う。その結果、発現される遺伝子に希少コドンが存在すると、希少ｔＲＮＡの貯留が枯渇するために、細菌宿主細胞内での所望の産物の発現が顕著に減少する可能性がある。
【０００４】
細菌系での発現を増加させるための１つの手法は、発現される遺伝子の希少コドンを、同一アミノ酸をコードする、宿主細胞でより頻繁に出現するしコドンに変化させることである。特許文献１を参照されたい。希少コドンをより望ましいコドンに置換するための目的遺伝子の改変の他の例は、非特許文献１および非特許文献２に見い出すことができる。しかしながら、この手法は、目的遺伝子に対しておそらくは複数ステップの変異誘発を行う必要性によって制限を受ける。加えて、この工程は、１つの遺伝子の発現を増加させるに過ぎない。希少コドンを豊富なコドンに置換する全工程は、目的遺伝子毎に繰り返さねばならない。
【０００５】
細菌系で発現を増加させる別の手法は、希少コドンの同種ｔＲＮＡをコードする遺伝子を含有するプラスミドを、宿主細胞に導入することである。例えば、幾つかのプラスミドは、希少ｔＲＮＡの発現を増加させるために構築されてきた。特許文献２には、アルギニンに対応するＡＧＧおよびＡＧＡコドン用の希少ｔＲＮＡ分子の遺伝子を含有するプラスミドが記載されている。非特許文献３には、アルギニン、イソロイシン、およびグリシンに対応するｔＲＮＡ：ａｒｇＵ（ＡＧ（Ａ／Ｇ））、ｉｌｅＸ（ＡＵＡ）、およびｇｌｙＴ（ＧＧ（Ａ／Ｇ））をコードするｐＡＣＹＣ１８４に由来するプラスミドが記載されている。希少ｔＲＮＡの追加コピーを提供するプラスミドを含有する細胞も、商業的に入手可能である。希少ｔＲＮＡ発現用のプラスミドの使用は、産生の費用を増加させる選択可能なマーカーの必要性によって制限を受ける。さらに、典型的に使用される高コピー数のプラスミドは、宿主細胞内で遺伝的不安定性を招き得る。
【特許文献１】米国特許第６，８２１，７５５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２７０，９８８号明細書
【非特許文献１】Ｐｒａｐｕｎｗａｔｔａｎａら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．第８３巻：９３〜１０６頁（１９９６年）
【非特許文献２】Ｐａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２７巻：１０９４〜１１０３頁（１９９９年）
【非特許文献３】Ｂａｃａら、Ｉｎｔ’ｌ．  Ｊ．  Ｐａｒａｓｉｔ．第３０巻：１１３、１１８頁（２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当技術分野は、希少コドンを有するタンパク質を産生するための効率的な系を必要とし続けている。本発明は、この必要性およびその他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ｔＲＮＡをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のｒＲＮＡオペロンを有する宿主細胞に関する。ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ヒト、酵母に由来してもよく、または宿主細胞のゲノムに由来してもよい。
【０００８】
ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜７のいずれかの配列を含んでよい。ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１および７を含んでよい。ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、５および６を含んでよい。ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、５、６および７を含んでよい。ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜７を含んでよい。
【０００９】
宿主細胞は、細菌、酵母または昆虫細胞でよい。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞のｒＲＮＡオペロンは、１つまたは複数のｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＣ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＥ、ｒｒｎＧおよびｒｒｎＨでよい。ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、５ＳｒＲＮＡエレメントの３’および転写終結エレメントの５’でよい。宿主細胞は、異種タンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。異種遺伝子は、宿主細胞の前駆体での希少ｔＲＮＡに伴う１つまたは複数のコドンを含んでよい。
【００１０】
本発明は、組換え型異種タンパク質細胞を産生する方法にも関する。異種タンパク質をコードする遺伝子は、本明細書中に記載した宿主細胞内で発現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（詳細な説明）
本発明は、宿主細胞のｒＲＮＡオペロン内にｔＲＮＡ遺伝子を含む宿主細胞により特徴付けられる、宿主細胞でのタンパク質発現を増加させるための方法および組成物を提供する。ｒＲＮＡオペロンは強力プロモーターを有するため、ｒＲＮＡオペロンは、ｔＲＮＡ遺伝子を導入するための望ましい目的地である。これは、ｒＲＮＡが細胞ＲＮＡの主要な構成要素であることにより証明される。さらに、ポリヌクレオチドは、ｒＲＮＡの発現およびプロセシングに干渉することなく、ｒＲＮＡオペロンに付加できる。
【００１２】
本発明による方法および組成物を使用すると、従来技術から公知である工程と比較して、向上した効率性でタンパク質発現の増加を達成することが可能である。本発明のこれらの方法および組成物は、Ｘ線結晶解析およびＮＭＲなど、生物物理学的研究用のタンパク質だけでなく、医薬品の大量生産にも有用であり得る。他の考えうる使用は、当業者であれば自明であろう。
【００１３】
本化合物、産物および組成物ならびに方法を開示し説明する前に、本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけの目的であり、限定することを意図しないことが、理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明確にそうではないと指示しない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、複数の参照対象を含むことに留意しなければならない。
【００１４】
１．ｔＲＮＡ遺伝子
本発明は、１つまたは複数のｔＲＮＡ遺伝子を宿主細胞の染色体に導入することに関する。各ｔＲＮＡ遺伝子は、宿主細胞の１つまたは複数のｒＲＮＡオペロンの１つまたは複数の位置に導入できる。
【００１５】
宿主細胞のｒＲＮＡオペロンに導入するｔＲＮＡ遺伝子は、宿主細胞で発現されるコドン頻度または同種ｔＲＮＡの頻度と比較した、目的タンパク質をコードする遺伝子に存在するコドン頻度に基づいて選択できる。希少ｔＲＮＡをコードする、または希少コドンの同種ｔＲＮＡをコードする希少ｔＲＮＡ遺伝子は、宿主細胞のｒＲＮＡオペロンに導入できる。目的タンパク質の遺伝子が複数の希少コドンを含む場合、１つまたは複数のそのような同種ｔＲＮＡの遺伝子は、宿主細胞のｒＲＮＡオペロンに挿入することができる。全てのｔＲＮＡまたはその任意の部分を、それらの出現率にかかわらず、ｒＲＮＡオペロンに導入することもでき、それにより、全てのｔＲＮＡのｔＲＮＡレベルを増加させることができる。
【００１６】
希少コドンは、１０００当たり、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１より少ない頻度で宿主細胞内に存在する、宿主細胞内の任意のコドンでよい。希少ｔＲＮＡは、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡに対して、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１より少ない細胞含量の、任意のｔＲＮＡでよい。図１には、大腸菌のｔＲＮＡ頻度と共に、大腸菌および結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のコドン頻度を列挙している。
【００１７】
希少ｔＲＮＡ遺伝子は、宿主細胞のｔＲＮＡ遺伝子に由来し得る。天然性の希少ｔＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、クローニングまたは合成し、宿主細胞のｒＲＮＡオペロンに挿入できる。希少ｔＲＮＡ遺伝子は、目的タンパク質をコードする遺伝子の供給体など、別の生物にも由来し得る。希少ｔＲＮＡはまた、合成ｔＲＮＡ、変異性ｔＲＮＡ、改変されたｔＲＮＡ、サプレッサーｔＲＮＡ、ウイルスｔＲＮＡまたはバクテリオファージｔＲＮＡでよい。
【００１８】
希少ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡの非定常部分で改変することができる。ｔＲＮＡをコードする遺伝子の「定常」位置は以下の通りであり得る：Ｙ＝ＣまたはＴ、およびＲ＝ＧまたはＡとして、８（Ｔ）、１１（Ｙ）、１４（Ａ）、１５（Ｒ）、１８（Ｇ）、１９（Ｇ）、２１（Ａ）、２４（Ｒ）、２６（Ｒ）、３２（Ｙ）、３３（Ｔ）、３７（Ｒ）、４８（Ｙ）、５２（Ｒ）、５３（Ｇ）、５４（Ｔ）、５５（Ｔ）、５６（Ｃ）、５７（Ｒ）、５８（Ａ）、６０（Ｙ）、６１（Ｃ）、６２（Ｙ）、７４（Ｃ）、７５（Ｃ）および７６（Ａ）。非定常部分は、置換または欠失により改変することができる。図１は、欠失可能なそれらの位置（Ｄループ内の１７、１７Ａ、２０Ａおよび２０Ｂならびに可変領域内の４５と４６との間の塩基）を楕円で示した、ｔＲＮＡの二次構造を図示する。希少ｔＲＮＡはまた、米国特許出願第２００４０２６５９５２号に記載のように、非天然アミノ酸を導入するためのｔＲＮＡでよい。
【００１９】
使用できるｔＲＮＡ遺伝子の代表的な例は、表１に列挙した大腸菌遺伝子を含む。
【００２０】
【表１】
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２．ｒＲＮＡオペロン
各ｒＲＮＡオペロンは、一連のポリシストロン性遺伝子である。ｒＲＮＡオペロンは、リボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、および５ＳｒＲＮＡ）、スペーサーｔＲＮＡ、遠位ｔＲＮＡ、および制御エレメントをコードするＤＮＡの組合せを含んでよい。大腸菌の７つのポリシストロン性ｒＲＮＡオペロンの概略を表２に示す。
【００２１】
【表２】
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１つまたは複数の希少ｔＲＮＡ遺伝子は、それらの発現をもたらすオペロン内の任意の位置に、個々にまたは一緒に導入できる。希少ｔＲＮＡ遺伝子は、ｒＲＮＡオペロンのＰ１またはＰ２の３’に導入できる。希少ｔＲＮＡ遺伝子は、ｒＲＮＡオペロンの構成要素間（遺伝子間）に、またはｒＲＮＡオペロンの構成要素内（遺伝子内）に導入できる。
【００２２】
希少ｔＲＮＡ遺伝子を挿入するオペロンおよびオペロン上の位置を決定する際に、当業者であれば、相同組換え事象の可能性を考慮できる。ｒＲＮＡオペロン間の高度な類似性のため、ｔＲＮＡの導入部位は、ｒＲＮＡオペロン間の相同組換えをもたらし得る。幾つかの実験では、ｒｒｎオペロン配列の均質化に関与する遺伝子変換事象が、スペーサー領域でなされた付加の喪失に繋がり得ることが示されている（ＨａｒｖｅｙおよびＨｉｌｌ  １９９０年；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００３年）。
【００２３】
大腸菌での相同組換えを最小限に抑えることが望ましい場合は、例えば、希少ｔＲＮＡをｒＲＮＡオペロンの５Ｓ遠位領域に挿入できる。大腸菌のｒｒｎオペロンは、各オペロンの３’末端に位置する５Ｓ遠位領域にかなりの差異を示す。ｒｒｎＨオペロン上の発現に悪影響を及ぼさずに、遺伝子マーカーをｒｒｆＨの代替として導入することに成功している（Ａｍｍｏｎｓら、１９９８年）。ｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＥ、およびｒｒｎＧオペロンも、遠位ｔＲＮＡを既に含んではいないので、希少ｔＲＮＡ遺伝子の付加の候補である。
【００２４】
３．宿主細胞
本発明は、宿主細胞の１つまたは複数のｒＲＮＡオペロンに１つまたは複数の希少ｔＲＮＡ遺伝子を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞に存在する希少ｔＲＮＡの量は、親細胞内の希少ｔＲＮＡのレベルに比べて増加している。宿主細胞内の希少ｔＲＮＡの量は、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍または５．０倍を超えて増加し得る。
【００２５】
宿主細胞は、目的タンパク質の発現に好適な任意の親細胞に由来し得る。親細胞は、真核性または原核性のいずれかであってよく、グラム陽性またはグラム陰性でよい。親細胞の代表的な例は、酵母、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、例えば、Ｓ．カルノサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）などのブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、および公開コレクションから入手可能な他の細胞を含むが、それらに限定されない。親細胞は、細菌であってもよく、米国特許出願第１０／０５７５８２号およびＢｌａｔｔｎｅｒ（２００４年）に記載されている縮小ゲノム細菌であってもよく、両文献は両方とも参考として本明細書中に援用される。
【００２６】
４．宿主細胞の作製方法
本発明は、宿主細胞の作製方法にも関する。宿主細胞は、１つまたは複数の希少ｔＲＮＡ遺伝子を、親細胞の１つまたは複数のｒＲＮＡオペロンに導入することにより作製できる。ｔＲＮＡ遺伝子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１年）に見い出すことができるような当技術分野で周知の方法により、ｒＲＮＡオペロンに導入できる。
【００２７】
５．発現可能な宿主細胞
本発明は、目的タンパク質をコードする異種遺伝子を含む本発明の宿主細胞を含む発現可能な宿主細胞にも関する。異種遺伝子は、プロモーターエレメントに作用可能に連結できる。
【００２８】
異種遺伝子は、発現可能な宿主細胞の染色体内に配置できる。異種遺伝子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（２００１年）に記載のそれらの方法など、当技術分野で周知の方法を使用して、発現可能な宿主細胞の染色体内に挿入できる。異種遺伝子は、発現可能な宿主細胞がそのベクターを含む、ベクター上に配置することもできる。ベクターは、自律複製が可能であってもよく、または微生物のＤＮＡに組み込んでもよい。ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターなどを含むがそれらに限定されない、異種遺伝子を輸送可能な任意のポリヌクレオチドでよい。ベクターは、発現可能な宿主細胞内の異種遺伝子の発現のために好適な形態でよい。発現ベクターは、宿主細胞内の目的タンパク質の発現用に設計できる。
【００２９】
目的タンパク質は、例えば、インスリン、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのインターロイキン（ＩＬ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン（ＩＦＮ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）アルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮオメガまたはＩＦＮタウなど、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＮＦアルファおよびＴＮＦベータ、ＴＲＡＩＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦならびに抗体など、当技術分野で公知の任意のタンパク質でよい。
【００３０】
６．タンパク質発現
本発明は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現可能な宿主細胞に由来する目的タンパク質を単離することを含む、目的タンパク質の産生方法にも関する。タンパク質発現を至適化する方法は、Ｈａｎｎｉｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１６巻（第２号）：５４〜６０頁（１９９８年）で考察され、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００３１】
発現可能な宿主細胞は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを恒常的に発現してもよい。ポリヌクレオチドの発現は、それらに限定はされないが、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む、１つまたは複数の作用可能に連結された制御配列により制御することもできる。誘導可能な制御配列は、発現可能な宿主細胞の局所的環境に基づき、活性化または抑制ができる。
【００３２】
７．キット
本発明は、本発明の宿主細胞を含む容器を含むキットにも関する。宿主細胞は、コンピテント細胞でよい。キットは、１つもしくは複数のプラスミド、形質転換に使用するための１つもしくは複数の試薬、または発現可能な宿主細胞もしくは目的タンパク質を産生する際の宿主細胞の使用説明書を必要に応じて含んでよい。
【００３３】
本発明は、本発明の発現可能な宿主細胞を含む容器を含むキットにも関する。発現可能な宿主細胞は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでよい。キットは、細胞を増殖させるための、または目的タンパク質産生用の細胞を使用するための説明書を必要に応じて含んでよい。
【００３４】
本発明は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例により例証される。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
ｔＲＮＡ増量化大腸菌内での、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ジヒドロプテロイン酸シンテターゼ（ＤＨＰＳ、ｄｉｈｙｄｒｏｐｔｅｒｏａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）の発現
ａｒｇＵおよびｉｌｅＸ遺伝子を、ｒｒｎＧオペロンの３’末端で染色体に挿入することにより、大腸菌宿主細胞ＭＤＳ４２株を形質転換する。この結果生じたｔＲＮＡ増量化宿主細胞もまた、アンピシリンに対する抗生物質耐性マーカーと共にプロモーターの下流に配置された熱帯熱マラリア原虫ジヒドロプテロイン酸シンテターゼ（ＤＨＰＳ）を含む発現ベクターで形質転換する。非改変ＭＤＳ４２大腸菌細胞の第２の試料を、対照として同一の発現ベクターで形質転換する。
【００３６】
形質転換したｔＲＮＡ増量化宿主細胞の単一コロニーを採取し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した３ｍｌのルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地に播くことにより、終夜培養物を調製する。翌朝、１００μｌの終夜培養物を使用して、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した２ｍｌのＬＢを含有するフラスコに播く。細胞密度ＯＤ６００が０．５〜０．７に達するまで、これらの培養物を３７℃で３〜４時間インキュベートする。０．５ｍＭの終濃度でＩＰＴＧを添加することにより、培養物を誘導し、次いで、誘導３時間後に回収する。タンパク質の発現は、ｔＲＮＡ増量化がなされた細胞およびなされなかった細胞の誘導前および回収した全細胞溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察する。熱帯熱マラリア原虫ＤＨＰＳに対してウエスタン解析を実施し、タンパク質の同一性を確認する。
【００３７】
非増量化対照細胞と比較した、ｔＲＮＡ増量化細胞に対する酵素アッセイから、熱帯熱マラリア原虫ＤＨＰＳの発現が、ｔＲＮＡ増量化細胞内で著しく亢進されることが示される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１−１】大腸菌のｔＲＮＡ頻度と、大腸菌および結核菌のコドン頻度を示す図である。
【図１−２】大腸菌のｔＲＮＡ頻度と、大腸菌および結核菌のコドン頻度を示す図である。
【図２】塩基位置を標準的な付番体系で表記したｔＲＮＡのクローバーリーフ型二次構造を描いた図である。楕円により表された塩基は、存在してもしなくてもよいという点で可変性がある。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009534043.tif 000009
2009534043.tif 000010
2009534043.tif 000011
2009534043.tif 000012
2009534043.tif 000013