(57)【要約】  本発明は、酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、目的とする酒類の醸造に好適な凝集性を有する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子であるCIS3、特にビール酵母に特徴的なnon-ScCIS3遺伝子の発現量を制御することによって、目的とする酒類の醸造に好適な凝集性を付与した醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号:２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項１１】
凝集性が増大した請求項１０に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項７に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、凝集性が増大した請求項１１に記載の酵母。
【請求項１３】
(A)請求項８もしくは９に記載のベクターを導入することによって、(B)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、あるいは(C) プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって、請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母。
【請求項１４】
凝集性が低下した請求項１０または１３に記載の酵母。
【請求項１５】
請求項１０から１４のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
醸造する酒類がワインである請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１９】
配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の凝集性について評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の凝集性を評価する方法。
【請求項２１】
被検酵母を培養して、請求項７に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする凝集性に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択する、請求項２１に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における請求項７に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、請求項２１に記載の酵母の選択方法。
【請求項２４】
請求項１０〜１４に記載の酵母および請求項２１〜２３に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行うことを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、適度な凝集性を有する酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードするCIS3、特にビール酵母に特徴的なnon-ScCIS3遺伝子の発現量を制御することを利用した、好適な凝集性を示す酵母、その選択方法、育種方法、および当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類の製造において、その醸造に供される酵母の凝集性は非常に重要である。ここで酵母の凝集性とは、個々の酵母細胞が相互作用して凝集塊を形成し、液体培地中で液底に沈降する性質をいう。
【０００３】
例えば、現在広く愛飲されているラガータイプのビール醸造に用いられる酵母は、発酵が終了に近づくと酵母が凝集して発酵液の底に沈降する特徴を有することから下面ビール酵母ともよばれている。ビール醸造では、発酵が終了した酵母を回収して次回の発酵に使用することから、酵母の凝集性は醸造工程の作業効率からみて非常に重要な特性である。つまり、凝集性の低い酵母は発酵終期になっても沈降せず、これを回収するためには遠心分離などの余分な工程が必要になってしまうという問題がある。一方で、凝集性が高過ぎる酵母は発酵途中から沈降し、充分に発酵が進まなくなってしまう可能性もあり、この場合製品の香味にも重大な影響を及ぼし得ることから、目的とする酒類の製造に適した凝集性を示す酵母を使用することは非常に重要である。
【０００４】
また、酒類に限らず工業用アルコール生産（新規凝集性アルコール発酵酵母；特公平6-36734号公報参照）や排水処理（高凝集活性変異株；特許第3044284号公報）の分野ではより効率性が求められることから、酵母凝集の研究は盛んに行われている。
【０００５】
このように産業上重要な性質である酵母の凝集性に関する膨大な研究から、酵母の凝集性に関与する遺伝子として、これまでにFLO遺伝子群（FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO10、FLO11）やSFL1等が確認されてきた。
【０００６】
これらの研究としては、例えばFLO1遺伝子でその分子レベルでの解析がなされており（Bidard et al., YEAST, 11(9), 809 (1995)）、Flo1pを用いたビール酵母の凝集性の制御方法についても検討されている（特許第3643404号公報）。また、FLO8遺伝子の発現調節による酵母凝集性の制御方法（特開平08-270号公報）や、FLO5遺伝子の塩基配列を用いた凝集性判定方法（国際公開第01/040514号パンフレット）などが報告されている。
【０００７】
一方で、凝集性酵母に特異的な酵母細胞表層タンパク質は他にもいくつか知られているが、いずれも充分な知見には乏しく、ビール酵母の凝集性を制御するための試みにはつながっていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記状況において、醸造酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子ならびに該タンパク質を利用して、目的とする酒類の製造に好適な凝集性を示す酵母を育種し、酒類の高効率製造を可能にすることが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子の発現を制御した形質転換酵母を作製し、実際に酵母の凝集性を制御し得ることを確認して、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、醸造酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酵母凝集性の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターあるいはDNA断片、該ベクターあるいはDNA断片が導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【００１１】
（１）以下の(a)〜(ｆ)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）以下の(g)〜(i)からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８ａ）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（８）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８ｂ）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（８）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８ｃ）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（８）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（９）上記（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（１０）上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターが導入された酵母。
（１１）凝集性が増大した上記(１０)に記載の酵母。
（１２）上記（７）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって凝集性が増大した上記（１１）に記載の酵母。
（１３）(A)上記（８）〜（９）のいずれかに記載のベクターを導入することによって、(B)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、あるいは(C) プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母。
（１４）凝集性が低下した上記（１０）または（１３）に記載の酵母。
（１５）上記（１０）〜（１４）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１７）醸造する酒類がワインである上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１８）上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１９）配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の凝集性について評価する方法。
（１９ａ）上記（１９）に記載の方法によって、凝集性が高い、あるいは低い酵母を選別する方法。
（１９ｂ）上記（１９ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（２０）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の凝集性を評価する方法。
（２０ａ）上記（２０）に記載の方法で、被検酵母を評価し、酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が高い、あるいは低い酵母を選別する、酵母の選択方法。
（２０ｂ）上記（２０ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（２１）被検酵母を培養して、上記（７）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする凝集性に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２２）基準酵母及び被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与する遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。
（２３）基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。
（２４）上記（１０）〜（１４）に記載の酵母および上記（２１）〜（２３）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行うことを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、目的とする酒類の製造に好適な凝集性を示す酵母を使用することにより、酒類を高効率に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者らは、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、醸造酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードするnon-ScCIS3遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：1に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１４】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来の凝集性に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：2のアミノ酸配列と約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、酵母凝集性の判定は、例えば特開平8-205890号公報に記載の方法によって測定することができる。
【００１５】
また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えばDNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えばDNA）を検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記DNAの発現を抑制する場合に好適に利用することができる。
本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。
本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
【００１６】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質である。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ酵母に凝集性を付与するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；  C群：アスパラギン、グルタミン；  D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；  E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；  F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；  G群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００１７】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）又は上記(j)〜（m）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記DNAの発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。
また、本発明においてはプロモーターに変異を加えることによって、あるいはプロモーターを相同組み換えによって組み換えることによってターゲット遺伝子の発現量を制御することもできる。このような変異の導入方法はNucleic Acids Res. 29、 4238-4250（2001）に、また、プロモーターの変換による遺伝子の発現制御方法は、例えば、Appl Environ Microbiol.,72,5266-5273 (2006)に記載されている。
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzymol., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20%〜50%となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００１８】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターあるいはDNA断片を目的とする酒類の醸造に適した酵母に導入し、該遺伝子の発現量を制御することによって、目的とする酒類に好適な凝集性を示す酵母を得ることができ、酒類の製造を高効率に行うことが可能となる。すなわち、上述した本発明のベクターあるいはDNA断片を導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が制御（促進又は抑制）された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、凝集性を調節（増大又は低減）することによって、所望の酒類を高効率に製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒等のほか、燃料用などの実用アルコールなども挙げることができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく、酒類の製造を高効率に行うことができる。
【００１９】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の凝集性について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷO01／040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、酵母に凝集性を付与するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子又は特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の凝集性について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性質についてより正確に予測・評価することが可能である。
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の凝集性を評価することもできる。この場合は、被検酵母を培養し、酵母に凝集性を付与するタンパク質をコードする遺伝子産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有する酵母に凝集性を付与するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする凝集性に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母（例えば、ゲノム解読株サッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株）及び被検酵母を培養して配列番号：1の塩基配列を有する遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現（すなわち、発現が促進されている）、あるいは低発現である（すなわち、発現が抑制されている）被検酵母を選択することによって、目的とする酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
あるいは、被検酵母を培養して、凝集性の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクター又はＤＮＡフラグメントを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が制御された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。酵母の凝集性は、例えば特開平8-205890号公報に記載の方法によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39  酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス  パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエ及びサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲン シス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１：酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子（non-ScCIS3）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、醸造酵母の凝集性に関与するタンパク質をコードする遺伝子、non-ScCIS3を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnon-ScCIS3_F（配列番号：３）／non-ScCIS3_R（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス  パストリアヌス  W34/70株（「W34/70株」と略記することがある。）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnon-ScCIS3の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたnon-ScCIS3遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。non-ScCIS3遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００２２】
実施例２：ビール試醸中のnon-ScCIS3遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行った。
麦汁エキス濃度    12.69％
麦汁容量          70L
麦汁溶存酸素濃度  8.6ppm
発酵温度          15℃
酵母投入量        12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。non-ScCIS3遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnon-ScCIS3遺伝子が発現していることを確認した。
【００２３】
実施例３：non-ScCIS3高発現株の作製
実施例１に記載のnon-ScCIS3/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、non-ScCIS3高発現ベクターnon-ScCIS3/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株を形質転換し、ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００２４】
実施例４：non-ScCIS3高発現株の凝集性評価
実施例３で得られた高発現株および親株（W34/70株）の凝集性を以下の方法で評価した。
酵母を50mLのglucoseCM培地（3%glucose, 1%bacto peptone、0.5%yeast extract, 0.5%KH2PO4, 0.2%MgSO4・7H2O）に接種し、30℃で2日間静置培養した。この全量を450mLのglucoseCM培地に移し、15℃で4日間静置培養した。遠心分離によって集菌後、5℃の冷水で2回洗浄し、得られた湿潤菌体を正確に1.5g秤量して20mLの2mM Ca含有0.1M酢酸バッファー（pH4.5）に懸濁して15℃恒温室で温度平衡化させた。
以下測定手順は15℃恒温室で行った。酵母懸濁液をボルテックスミキサーで30秒間撹拌したものをビュレットに注ぎ入れ、直ちに2mLを採取して0minサンプルとした。そのまま静置し、10分後に2mLを採取して10minサンプルとした。
それぞれ採取した酵母懸濁液のOD600を測定し、以下の計算式を用いて酵母凝集性（Sedimentation Index; SI）とした。結果を図４に示す。値はn=2の測定の平均値である。
SI=(OD10min-OD0min)/OD0min*100
図４に示すように、親株のSI=208に比べて高発現株ではSI=252となり、non-ScCIS3高発現によって酵母の凝集性が増大することが明らかとなった。
【００２５】
実施例５：non-ScCIS3遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1), pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製した。PCR用のプライマーとして、non-ScCIS3_delta_for（配列番号：５）、non-ScCIS3_delta_rv（配列番号：６）を用いた。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスW34/70株より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換した。形質転換は特開平07-303475号公報に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００２６】
実施例６：non-ScCIS3破壊株の凝集性評価
実施例５で得られた破壊株および親株（W34/70-2株）の凝集性を実施例４と同様の方法で評価した。図５に示すように、親株のSI=244に比べて破壊株ではSI=94となり、non-ScCIS3破壊によって酵母の凝集性が低下することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の酒類製造法によれば、発酵中における酵母の凝集性を制御することができるため、目的とする酒類の製造に好適な凝集性を示す酵母を使用することにより、酒類を高効率に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるnon-ScCIS3遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】図４は、non-ScCIS3高発現株の凝集性試験結果を示す図である。縦軸は凝集性の指標であるSedimentation Indexを示している。
【図５】図５は、non-ScCIS3破壊株の凝集性試験結果を示す図である。縦軸は凝集性の指標であるSedimentation Indexを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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