(57)【要約】  本発明は、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片を観察して哺乳類細胞のこの過程を観察するための方法及び材料を提供する。本発明の実施態様を用いて、例えば、アポトーシスを観察してアポトーシス誘導薬剤に対する哺乳類の癌細胞の感受性を調べてもよい。2009541741.tif 000012
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞のアポトーシスを検出する方法であって、 
(a) アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体に細胞を接触させる工程、このとき該抗体がＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片に結合するものであり、 
(b) アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体の量を決定する工程、そして、
(c) 工程(b)において結合した抗体の量を、アポトーシスのない哺乳類細胞においてタンパク質断片に結合する抗体の量と比較する工程を含み、このとき工程(B)の量がアポトーシスのない細胞の量よりも大きい場合に、アポトーシスが検出される方法。
【請求項２】
前記細胞のアポトーシスがデスレセプター４(配列番号：５)、デスレセプター５(配列番号：６)又はＦａｓ(配列番号：８)によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞のアポトーシスが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)、ＦａｓＬ(配列番号：９)、Ｆａｓアゴニスト抗体、ＤＲ4アゴニスト抗体又はＤＲ5アゴニスト抗体に細胞を接触させることによって引き起こされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)、ＦａｓＬ(配列番号：９)、Ｆａｓアゴニスト抗体、ＤＲ４アゴニスト抗体又はＤＲ５アゴニスト抗体の投与を含む療法の有効性に関する情報を得るためにアポトーシスの検出を使用する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗体がＡＰ２-α(配列番号：１)のタンパク質断片に結合し、抗体が結合したＡＰ２αのタンパク質断片が６４ｋＤａ又は３３ｋＤａである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
体が結合したタンパク質断片が配列番号：１のＤＶＦＤ又は配列番号：１のＧＰＡＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、ヒトの大腸、結腸直腸、肺、胸部、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣、脳、メラノーマ、白血病又は骨髄腫の癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片が、イムノブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ又は免疫組織化学を用いて観察される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類の細胞における少なくとも一つのｍＲＮＡの発現を調べることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類細胞を一又は複数の試験薬剤にさらした後に、該細胞を抗体と接触させて、哺乳類細胞におけるアポトーシスの検出によって、該一又は複数の試験薬剤を哺乳類細胞におけるアポトーシスのインデューサとして同定されるようにすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項１１】
ヒト癌細胞のアポトーシスを誘導する治療薬に応答する可能性がある、又は応答するヒト癌細胞を同定するための方法であって、 
ヒト癌細胞を治療薬にさらす工程、 
ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片の存在について、治療薬にさらされたヒト癌細胞を調べる工程、
ヒト癌細胞のタンパク質断片の量をリガンドにさらされていないコントロールのヒト癌細胞のタンパク質断片の量と比較する工程を含み、
このとき、
治療薬にさらされたヒト癌細胞に存在するタンパク質断片の量が治療薬にさらされていないコントロールのヒト癌細胞のタンパク質断片の量より大きい場合に、アポトーシスが観察され、ヒト癌細胞のアポトーシスの観察によってヒト癌細胞を該治療薬に応答する可能性があるか、又は応答するものと識別する方法。
【請求項１２】
前記治療薬がデスレセプター４(配列番号：５)、デスレセプター５(配列番号：６)又はＦａｓ(配列番号：８)のシグナル伝達を誘導する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片がイムノブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ又は免疫組織化学を用いて観察される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト癌細胞において少なくとも１つのｍＲＮＡの発現を調べることをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト癌細胞において少なくとも２つの異なるｍＲＮＡの発現を調べることをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒト癌細胞が、大腸、結腸直腸、肺、胸部、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣、脳、メラノーマ、白血病又は骨髄腫の癌細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ヒト癌細胞のアポトーシスがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)、ＦａｓＬ(配列番号：９)、Ｆａｓアゴニスト抗体、ＤＲ４アゴニスト抗体又はＤＲ５アゴニスト抗体に細胞を接触させることによって引き起こされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト癌細胞が、生検から得られ、１か月未満の間インビトロ培養において成長させたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質断片が配列番号：１のＤＶＦＤ又は配列番号：１のＧＰＡＡを含むＡＰ２-αのタンパク質断片である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類細胞におけるアポトーシスを観察するためのキットであって、 
a) ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を結合する一次抗体と、 
b) ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を結合する二次抗体と、このとき、一次及び二次抗体は同じタンパク質を結合しないものであり、
c) (a)及び(b)のための容器と、 
d) キットの抗体を哺乳類細胞のアポトーシスを観察するために用いるための指示書
とを具備するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、出典明記によって本明細書中に全体の内容が援用される、２００６年６月２０日に出願の米国仮特許出願第６０／８１４９５５号の優先権を主張するものである。
本発明は、一般に、アポトーシスを誘導する薬剤にさらされたヒト癌細胞などの哺乳類細胞のアポトーシスを観察するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の細胞数の制御は、細胞増殖及び細胞死の間のバランスによってある程度測定される。時に壊死細胞死と称される細胞死の１タイプは、一般的に、いくつかの外傷又は細胞性損傷から生じる細胞死の病理学的形態に特徴がある。対照的に、通常規則的ないしは制御された様式で進行する細胞死の「生理的」形態がある。細胞死の規則的ないしは制御された形態は、「アポトーシス」と称される[例としてBarr 等, Bio/Technology, 12:487-493 (1994)；Steller 等, Science, 267:1445-1449 (1995)を参照]。アポトーシスの細胞死は、胚発生及び免疫系のクローン選択を含む多くの生理的過程において自然に生じる[Itoh 等, Cell, 66:233-243 (1991)]。
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(ＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、オステオプロテジェリン(ＯＰＧ)、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Pitti等, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wiley等, Immunity, 3：673-682(1995)；Browning等, Cell, 72:847-856(1993)；Armitage等, Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開の国際公報97/01633；1997年7月17日公開の国際公報97/25428；Marsters等, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Simonet等, Cell, 89:309-319 (1997)；Chicheportiche等, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahne等, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開の国際公報98/28426；1998年10月22日公開の国際公報98/46751；1998年5月7日公開の国際公報/98/18921；Moore等, Science, 285:260-263(1999)；Shu等, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneider等, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyay等, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-α及びＴＮＦ-βは感受性のある腫瘍細胞のアポトーシスの死を誘導することが報告されている(Schmid等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtry等, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987))。
【０００３】
ＴＮＦサイトカインのメンバーであると考えられる更なる分子は、アポトーシスに関与することが報告されている。例えば、Pitti等, J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)において、Ａｐｏ-２リガンドと称する分子が記載されている。また１９９７年７月１７日公開の国際公報９７／２５４２８も参照のこと。完全長ヒトＡｐｏ-２のリガンドは、様々な哺乳類細胞のアポトーシスを誘導する２８１のアミノ酸ポリペプチドであることが報告されている。他の研究者はＴＲＡＩＬ(Wiley等, Immunity, 3:673-682 (1995)；１９９７年１月１６日公開の国際公報９７／０１６３３)、及びＡＧＰ-１(１９９７年１２月１１日公開の国際公報９７／４６６８６)と称する関連したポリペプチドを記述している。
ＴＮＦファミリの様々な分子もまた、免疫系の機能又は発達における役割(一又は複数)が明らかにされている(Gruss等, Blood, 85:3378 (1995))。Zheng等は、ＴＮＦ-αがＣＤ８陽性Ｔ細胞の刺激後アポトーシスに関与することを報告している(Zheng等, Nature, 377:348-351 (1995))。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺の自己応答性Ｔ細胞の欠失に関与しうることを報告している(Amakawa等, Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995))。ＣＤ４０リガンドは、増殖、免疫グロブリン分泌及び生存を含むＢ細胞の多くの機能を活性化する(Renshaw等, J. Exp. Med., 180:1889 (1994))。他の最近同定されたＴＮＦファミリサイトカインであるＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ)は、ある条件下において、Ｂ細胞増殖及び免疫グロブリン分泌を誘導することが報告されている。(上掲のMoore等；上掲のSchneider等；Mackay等, J. Exp. Med., 190:1697 (1999))。
マウスＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンドの遺伝子(それぞれｌｐｒ及びｇｌｄと称する)の突然変異はいくつかの自己免疫性疾患と関係していることから、末梢の自己応答性リンパ球のクローン欠失を制御する際にＡｐｏ-１リガンドが役割を果たしうることを示唆する(Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994)；Nagata等, Science, 267:1449-1456 (1995))。Ａｐｏ-１のリガンドもまた、ＣＤ４ポジティブＴリンパ球とＢリンパ球の刺激後アポトーシスを誘導することが報告されており、これらの機能がもはや必要でない場合に活性化されたリンパ球の除去を伴いうる(上掲のKrammer等；上掲のNagata等)。Ａｐｏ-１レセプターに特異的に結合するアゴニストマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵する、又は同類である細胞死活性を表すことが報告されている(Yonehara等, J. Exp. Med., 169:1747-1756 (1989))。
【０００４】
このようなＴＮＦファミリリガンドによって媒介される様々な細胞性応答の誘導は、一般的に特定の細胞レセプターへの結合によって開始される。すべてではなく、いくつかのＴＮＦファミリリガンドは、細胞表面の「デスレセプター」に結合して、それを介して様々な生物学的活性を誘導し、細胞死やアポトーシス経路を行うカスパーゼ又は酵素を活性化する(Salvesen 等, Cell, 91:443-446 (1997)。今日までに同定されたＴＮＦレセプタースーパーファミリのメンバーには、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＡＣＩ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ-４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、Ｆａｓ (Ａｐｏ-１又はＣＤ９５とも称される)、ＤＲ４ (ＴＲＡＩＬ-Ｒ１とも称される)、ＤＲ５ (Ａｐｏ-２又はＴＲＡＩＬ-Ｒ２とも称される)、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、破骨細胞分化抑制因子(ＯＰＧ)、ＲＡＮＫ及びＡｐｏ-３ (ＤＲ３又はＴＲＡＭＰとも称される)が含まれる。(例えば、Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002)；Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308 (1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁；Locksley 等., Cell, 104:487-501 (2001)；Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995)；Hohman 等, J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989)；Brockhaus 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990)；1991年3月20日出願の欧州特許第417,563；Loetscher 等, Cell, 61:351 (1990)；Schall 等, Cell, 61:361 (1990)；Smith 等, Science, 248:1019-1023 (1990)；Lewis 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991)；Goodwin 等, Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)；Stamenkovic 等, EMBO J., 8:1403-1410 (1989)；Mallett 等, EMBO J., 9:1063-1068 (1990)；Anderson 等, Nature, 390:175-179 (1997)；Chicheportiche 等, J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997)；Pan 等, Science, 276:111-113 (1997)；Pan 等, Science, 277:815-818 (1997)；Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997)；Degli-Esposti 等, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)；Marsters 等, Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)；Tsuda 等, BBRC, 234:137-142 (1997)；Nocentini 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997)；vonBulow 等, Science, 278:138-141 (1997))。
【０００５】
これらＴＮＦレセプターファミリメンバーの多くは、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有しており、一方、他のメンバーは膜貫通領域と細胞内ドメインを欠いた可溶性タンパク質として天然にみられる。典型的なＴＮＦＲの細胞外部位には、ＮＨ２-末端から始まる複数のシステインリッチドメイン(ＣＲＤ)の反復性のアミノ酸配列パターンを含有する。
Ａｐｏ-２Ｌ又はＴＲＡＩＬと称されるリガンドはサイトカインのＴＮＦファミリのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWiley等, Immunity, 3:673-682 (1995)；Pitti等, J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)；国際公開公報97/01633；国際公開公報97/25428；1998年6月9日発行の米国特許第5,763,223号；2001年9月4日発行の米国特許第6284236を参照］。完全長天然配列ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ある細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素切断によって、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Mariani等, J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究はＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにする［Hymowitz等, Molec. Cell, 4:563-571 (1999)；Cha 等, Immunity, 11:253-261 (1999)；Mongkolsapaya 等, Nature Structural Biology, 6:1048 (1999)；Hymowitz 等, Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、(ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０の)３つのシステイン残基が併せて亜鉛原子を配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるという独特の構造的特徴を有していることが分かった。［上掲のHymowitz等；Bodmer等, J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)］。
【０００６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは関節リウマチなどの自己免疫性疾患を含む、免疫系の調節において働きうることが文献で報告されている[例として、Thomas 等, J. Immunol., 161:2195-2200 (1998)；Johnsen 等, Cytokine, 11:664-672 (1999)；Griffith 等, J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999)；Song 等, J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)を参照]。
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型は大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含む様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することが報告されている［例えば、上掲のWiley等；上掲のPitti等；2000年2月29日発行の米国特許第6,030,945号；2004年6月8日発行の米国特許第6,746,668号；Rieger 等, FEBS Letters, 427:124-128 (1998)；Ashkenazi 等, J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)；Walczak 等, Nature Med., 5:157-163 (1999)；Keane 等, Cancer Research, 59:734-741 (1999)；Mizutani 等, Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999)；Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999)；Yu 等, Cancer Res., 60:2384-2389 (2000)；Chinnaiyan 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照のこと］。マウス腫瘍モデルでのインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法や放射線療法と組み合わせて、実質的な抗腫瘍効果を生じうることを示唆している［例えば上掲のAshkenazi等；上掲のWalzcak等；Gliniak等, Cancer Res., 59:6153-6158 (1999)；上掲のChinnaiyan等；Roth等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)；PCT出願 US/00/15512；PCT出願 US/01/23691を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenazi等；上掲のWalzcak等］。Ｊｏ等はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が正常な単離された非ヒトではなくヒト肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している［Jo等, Nature Med., 6:564-567 (2000)；またNagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照のこと］。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、罹患細胞対正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrence等, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001)；Qin等, Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)］。
【０００７】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、少なくとも５つの異なるレセプターに結合することが明らかとなった。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに結合するそのレセプターの少なくとも２つは、機能的な細胞質デスドメインを含有している。そのあるレセプターは「ＤＲ４」(あるいはＴＲ４又はＴＲＡＩＬ-Ｒ１)と称されている(Pan 等, Science, 276:111-113 (1997)；また、1998年7月30日公開の国際公開公報98/32856；1999年7月29日公開の国際公開公報99/37684；2000年12月7日公開の国際公開公報00/73349；2003年2月20日発行の米国特許公開2003/0036168；2002年8月13日発行の米国特許第6,433,147号；2002年10月8日発行の米国特許第6,461,823号及び2002年1月29日発行の米国特許第6,342,383号)。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの他のレセプターはＤＲ５と称されている(あるいはＡｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも称されている) (例として、Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997)、Pan 等, Science, 277:815-818 (1997)、1998年11月19日公開の国際公開公報98/51793；1998年9月24日公開の国際公開公報98/41629；Screaton 等, Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczak 等, EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wu 等, Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；1998年8月20日発行の国際公開公報98/35986；1998年10月14日発行の欧州特許第870,827号；1998年10月22日公開の国際公開公報98/46643；1999年1月21日公開の国際公開公報99/02653；1999年2月25日公開の国際公開公報99/09165；1999年3月11日公開の国際公開公報99/11791；2003年5月22日公開の国際公開公報03/042367；2002年12月5日公開の国際公開公報02/097033；2003年5月8日公開の国際公開公報03/038043；2002年8月13日公開の米国特許公開2002/0072091；2001年12月7日公開の米国特許公開2002/0098550；2001年12月6日発行の米国特許第6,313,269号；2001年8月2日公開の米国特許公開2001/0010924；2003年7月3日公開の米国特許公開 2003/01255540；2002年10月31日公開の米国特許公開2002/0160446、2002年4月25日公開の米国特許公開2002/0048785；2004年7月21日発行の米国特許公開2004/0141952；2005年6月16日公開の米国特許公開2005/0129699；2005年6月16日公開の米国特許公開2005/0129616；2002年2月発行の米国特許第6,342,369号；2003年5月27日発行の米国特許第6,569,642号、2000年6月6日発行の米国特許第6,072,047号、2003年11月4日発行の米国特許第6,642,358号；2004年6月1日発行のUS 6,743,625を参照)。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含有し、リガンド結合時(又はリガンドの活性を擬態するアゴニスト抗体などの分子の結合時)にアポトーシスをシグナル伝達することができることが報告された。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＤＲ５とで形成される複合体の結晶構造はHymowitz 等, Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。他の同定されたデスドメイン含有レセプターはＤＲ６と称される(Pan等, FEBS Letters, 431:351-356 (1998))。
【０００８】
リガンドが結合すると、ＤＲ４とＤＲ５はともに、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１と称されるデスドメイン含有アダプター分子を介してアポトーシスインヒビターであるカスパーゼ８を増加又は活性化することによって独立してアポトーシスを引き起こしうる[Kischkel 等, Immunity, 12:611-620 (2000)；Sprick 等, Immunity, 12:599-609 (2000)；Bodmer 等, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]。
また、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合することが報告されている。そのレセプター等はシグナル伝達のトランスデューサーというよりもインヒビターとして機能すると思われている。(例えば、DCR1 (TRID、LIT又はTRAIL-R3とも称される) [Pan 等, Science, 276:111-113 (1997)；Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997)；McFarlane 等, J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997)；Schneider 等, FEBS Letters, 416:329-334 (1997)；Degli-Esposti 等, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)；及びMongkolsapaya 等, J. Immunol., 160:3-6 (1998)；DCR2 (TRUNDD又はTRAIL-R4とも称される) [Marsters 等, Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)；Pan 等, FEBS Letters, 424:41-45 (1998)；Degli-Esposti 等, Immunity, 7:813-820 (1997)]、及びOPG [Simonet 等, supra]。ＤＲ４及びＤＲ５に反して、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
【０００９】
ＤＲ４、ＤＲ５及び／又はＦａｓレセプターに結合する特定の抗体が文献で報告されている。例えば、ＤＲ４レセプターに対するものであり、特定の哺乳動物細胞の拮抗的ないしはアポトーシス的な活性を有する抗ＤＲ４抗体は、例として、1999年7月29日公開の国際公開公報99/37684；2000年7月12日公開の国際公開公報00/73349；2003年8月14日公開の国際公開公報03/066661に記載されている。例として、Griffith 等, J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)；Chuntharapai 等, J. Immunol., 166:4891-4898 (2001)；2002年12月2日公開の国際公開公報02/097033；2003年5月22日公開の国際公開公報03/042367；2003年5月8日公開の国際公開公報03/038043；2003年5月8日公開の国際公開公報03/037913；2003年4月17日公開の米国特許公開2003/0073187；2003年6月12日公開の米国特許公開2003/0108516も参照のこと。特定の抗ＤＲ５抗体も同様に記載されている。例として、1998年11月8日公開の国際公開公報98/51793；Griffith 等, J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)；Ichikawa 等, Nature Med., 7:954-960 (2001)；Hylander 等, “An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”, Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada；2003年5月8日公開の国際公開公報03/038043；2003年5月8日公開の国際公開公報03/037913；2003年9月25日公開の米国特許公開2003/0180296を参照のこと。さらに、ＤＲ４とＤＲ５レセプターの両方と交差反応する特定の抗体が記載されている(例として、2001年6月26日発行の米国特許第6,252,050号を参照)。Ｆａｓを発現している標的細胞のアポトーシスを誘導するアゴニスト抗Ｆａｓ抗体には、限定するものではないが、ＭＡｂ Ｍ２及びＭ３(ＩｇＧ；Alderson等, 1995, J. Exp. Med. 181: 71-77)；抗Ｆａｓ ＭＡｂ(免疫グロブリンＭ；Yonehara等, 1989, J. Exp. Med. 169: 1747-1756)；ＭＡｂ ＣＨ11(免疫グロブリンＭ；Alderson等, 1994, Int. Immunol. 6:1799-806)；及び抗ＡＰＯ-１(ＩｇＧ；Dhein等, 1992, J. Immunol., 149:3166-3173)が含まれる。
【００１０】
アポトーシスは多細胞生物の発達及びホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす(Danial, N.N.等, Cell 116, 205-19 (2004)を参照)。２つの主要なシグナル伝達メカニズムである、細胞内因性及び細胞外因性の経路はアポトーシス誘導を制御する(Strasser, A.,等, Annu Rev Biochem 69, 217-45 (2000)を参照)。これらの経路は、カスパーゼと称する細胞統合性のために必須である様々な細胞性タンパク質を切断するシステインプロテアーゼを活性化する。カスパーゼはアスパラギン酸を含む特定のテトラペプチド配列を認識して、隣接したペプチド結合を切断する(Thornberry, N.A.等, Science 281, 1312-6 (1998)を参照)。細胞外因性経路の活性化は、Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ)及びＡｐｏ２リガンド／ＴＮＦ関連のアポトーシスを誘導するリガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)などのリガンドに応答して、これらのそれぞれの細胞表面「デスレセプター」Ｆａｓ(Ａｐｏ1／ＣＤ９５)及びＤＲ４又はＤＲ５を介して起こる(Nagata, S. Cell 88, 355-65 (1997)及びLeBlanc, H.N.等, Cell Death Differ 10, 66-75 (2003)を参照)。リガンド結合は、レセプターの細胞質側末端内のデスドメインへのアダプターＦＡＤＤ(Ｆａｓ関連の「デス」ドメイン)の動員を誘発する。ＦＡＤＤはイニシエーターであるプロテアーゼカスパーゼ-８を集め、「死を誘導するシグナル伝達複合体」(ＤＩＳＣ)を形成する(Kischkel, F.C.等 Embo J 14, 5579-88 (1995)を参照)。ＤＩＳＣのカスパーゼ-８分子の近くは酵素活性を刺激し、その結果自己プロセシングが生じる(Boatright, K.M.等 Mol Cell 11, 529-41 (2003)を参照)。次いで、切断されたカスパーゼ-８はＤＩＳＣから細胞質に放出し、タンパク分解によってエフェクターであるカスパーゼ、例えばカスパーゼ-３及び-７を活性化する。ある細胞では、ＤＲ刺激は強力なカスパーゼ-８活性を生成し、この活性はエフェクターであるカスパーゼを強く活性化して、細胞にアポトーシスを起こさせる(Scaffidi, C.,等, J Biol Chem 274, 1541-8 (1999)を参照)。他の細胞は内因性経路によるシグナル増幅を必要とする。カスパーゼ-８はＢｃｌ-２相同ドメイン３(ＢＨ3)−オンリータンパク質Ｂｉｄを切断し、マルチ-ＢＨドメインタンパク質であるＢａｘとＢａｋによる内因性経路を起こし、エフェクター-カスパーゼ活性化とアポトーシスを亢進する(Danial, N.N.等, Cell 116, 205-19 (2004)及びStrasser, A.,等, Annu Rev Biochem 69, 217-45 (2000)を参照)。
アポトーシスは一般的に、核クロマチンの凝縮と辺縁趨向、及びいわゆるアポトーシス体への核構造の断片化に特徴がある。このアポトーシスの形態は、従来の染色剤、プロピジウムヨウ素又はヘキスト３３２５８などの選択的に核に蓄積する色素を使用して、又は、電子顕微鏡法によって観察されうる。アポトーシスによる細胞死に関連があることが多いが、そうとは診断できないＤＮＡのヌクレオソーム間断片化もまた、アポトーシスを同定して、定量化するために用いられる。
【発明の概要】
【００１１】
本出願人は、アポトーシス性の細胞死のバイオマーカーとして使われうる、アポトーシスを経る細胞において生成されるタンパク質断片を同定した。本発明の実施態様は、例えば、一又は複数のアポトーシスを誘導する薬剤にさらされた哺乳類細胞のアポトーシス性の細胞死を観察するために、前記タンパク質断片を観察するための方法及び材料を提供する。本発明の例示的な実施態様では、アポトーシスのこれらのバイオマーカーは、アポトーシスを誘導する薬剤、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ又はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬアゴニストの投与を含む療法の有効性を調べるために、ヒト癌細胞において観察される。
【００１２】
本出願の発明は多くの実施態様を有する。本発明の一実施態様は、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体に細胞を接触させること、このとき該抗体がＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片に結合する、 アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体の量を決定すること、そして、この工程において結合した抗体の量を、アポトーシスのない哺乳類細胞においてタンパク質断片に結合する抗体の量と比較すること、このときこの量がアポトーシスのない細胞の量よりも大きい場合に、アポトーシスが検出されることによって、哺乳類細胞のアポトーシスを検出する方法である。場合によって、この方法によって調べられる哺乳類細胞は、ヒトの大腸、結腸直腸、肺、胸部、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣、脳、メラノーマ、白血病又は骨髄腫の癌細胞である。
後述するように、本発明の方法は、アポトーシスが多くの異なる細胞レセプターによって引き起こされるのを観察するために用いてもよい。この方法のいくつかの実施態様では、細胞のアポトーシスは、例えば、ＡＰＯ2Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)又はデスレセプター４(配列番号：５)又はデスレセプター５(配列番号：６)を結合する抗体と細胞を接触させることによって、デスレセプター４(配列番号：５)又はデスレセプター５(配列番号：６)を介して引き起こされる。本発明の他の実施態様では、細胞のアポトーシスは、例えば、ＦａｓＬ(配列番号：９)又はＦａｓを結合する抗体と細胞を接触させることによって、Ｆａｓ(配列番号：８)を介して引き起こされる。 
【００１３】
本発明の方法は、多くの文脈においてさらに応用されてもよい。例えば、アポトーシスを観察するこれらの方法は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)又はデスレセプター４(配列番号：５)又はデスレセプター５(配列番号：６)を結合する抗体に対する細胞の感受性を評価するために用いてもよい。本発明のある例示的な実施態様では、これらの方法は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)又はデスレセプター４(配列番号：５)又はデスレセプター５(配列番号：６)を結合する抗体の投与を含む療法の有効性を評価するために用いてもよい。同様に、本発明の他の実施態様は、例えばＦａｓＬ(配列番号：９)又はＦａｓを結合する抗体の投与を含む療法の有効性を評価するために、ＦａｓＬ(配列番号：９)又はＦａｓを結合する抗体に対する細胞の感受性を調べるために用いてもよい。
以下に詳細に述べられるように、本発明の方法は、一又は複数のアポトーシス断片に対する抗体を用いたイムノアッセイなどの当分野で公知の様々な技術のいずれか一を用いて、細胞内の多くの異なるタンパク質のアポトーシス性の断片化を観察してもよい。例えば、本発明のある実施態様では、抗体はＡＰ２-α(配列番号：１)のタンパク質断片、例えばおよそ６４ｋＤａ又は３３ｋＤａの断片に結合する。本発明のいくつかの実施態様では、抗体が結合したＡＰ２αのタンパク質断片は、配列番号：１のＤＶＦＤ又は配列番号：１のＧＰＡＡを含む。本発明の他の実施態様は、クラスリン重鎖(配列番号：２)のタンパク質断片に結合する抗体を使用してもよい。本発明の他の実施態様は、ＡＰ１／２β(配列番号：３)のタンパク質断片に結合する抗体を使用してもよい。本発明の他の実施態様は、ダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を結合する抗体を使用してもよい。
【００１４】
本発明の特定の実施態様は、特定の生理学的関係において特定のタイプのアポトーシス性の活性及び／又はアポトーシスを調べるために適宜変更される。例えば、本発明の実施態様は、デスレセプター４(配列番号：５)、デスレセプター５(配列番号：６)又はＦａｓ(配列番号：８)によって媒介される哺乳類細胞のアポトーシスを観察するために用いられてもよい。一般的に、このような方法は、細胞をデスレセプター４、デスレセプター５又はＦａｓリガンドにさらすこと、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片の存在についてリガンドにさらした細胞を調べること、細胞のタンパク質断片の量をリガンドにさらされていないコントロール細胞のタンパク質断片の量と比較することを含み、このとき、リガンドにさらされた細胞に存在するタンパク質断片の量がリガンドにさらされていないコントロール細胞のタンパク質断片の量より大きい場合に、アポトーシスが観察される。一般的にこのような方法では、デスレセプター４、デスレセプター５又はＦａｓリガンドは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)、デスレセプター４ないしはデスレセプター５を結合する抗体、ＦａｓＬ(配列番号：９)又はＦａｓを結合する抗体である。
【００１５】
本発明の他の実施態様は、哺乳類細胞をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬにさらすことによる、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)又はＦａｓＬ(配列番号：８)誘導アポトーシスに対する哺乳類細胞の感受性を観察すること、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片の存在についてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬにさらされた細胞を調べること、哺乳類細胞のタンパク質断片の量をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬにさらされていないコントロール哺乳類細胞のタンパク質断片の量と比較することを含み、このとき、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬにさらされた哺乳類細胞に存在するタンパク質断片の量が、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬさらされていないコントロール哺乳類細胞のタンパク質断片の量より多い場合に、該哺乳類細胞がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬが媒介するアポトーシスに対して感受性があることが観察される。
また、本発明の実施態様は、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を結合する抗体を具備する製造品及びキットを提供する。例示的な実施態様は、哺乳類細胞の特徴を表すためのキットであって、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を結合する一次抗体と、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を結合する二次抗体と、このとき、一次及び二次抗体は同じエピトープを結合しない(場合によって同じタンパク質を結合しない)ものであり、(a)及び(b)のための容器と、キットを使用するための指示書を具備するキットである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬがクラスリン依存性のエンドサイトーシス機構の選択的な切断を誘導することを示す。(a) 三量体のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ８)又は抗体架橋、タグ化Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(ＢＪＡＢ、ＨｅＬａ-Ｍ)のいずれかにて３７℃で細胞を処理し、カスパーゼ-８(Ｃ８)、カスパーゼ-３(Ｃ３)、アダプチン(ＡＰ)２α、ＡＰ１／２β(抗体はＡＰ１と２のアイソフォームを区別しない)クラスリン重鎖(ＣＨＣ)又はＴｆレセプター(ＴｆＲ)の切断について、細胞溶解物をイムノブロットによって分析した。(b) Ｃｏｌｏ２０５細胞を(a)に記載のように処理して、様々な種類のクラスリン関連エンドサイトーシス輸送の特定の構成成分のプロセシングについてイムノブロットによって分析した。
【図２】ＡＰ２α及びＣＨＣの切断における異なるカスパーゼの関与を示す。(a) ＢＪＡＢ細胞をパン-カスパーゼインヒビターであるｚＶＡＤ-ｆｍｋ(２０μＭ、３０分)にて処理した後に、架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(１μｇ／ｍＬ)にて処理し、カスパーゼ-８、カスパーゼ-３、ＡＰ２α及びＣＨＣのプロセシングについてイムノブロットによって分析した。矢印は切断生成物を示し、太い矢印は完全長タンパク質を示す。(b−d) Ｂａｘ−／−又はＢａｘ＋／−のＨＣＴ１１６細胞又はカスパーゼ-３欠失ＭＣＦ-７細胞を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて処理して、(a)のように分析した。
【図３】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ前処置がＴｆエンドサイトーシスを阻害することを示す。(a, b) ＢＪＡＢ細胞(a)又はＣｏｌｏ２０５細胞(b)を、架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(a)又は架橋していないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(b)にて、又はこれらを用いないで、示した時間の間３７℃で前処理して、氷上で冷ました。次いで、細胞をＡｌｅｘａ-６４７-コンジュゲートＴｆ(６４７ＴＦ)にて３０分間の氷上で平衡化し、３７℃での取り込みをフローサイトメトリーによって測定した。各々のエンドサイトーシス速度は、４分の吸収動態プロットの開始線形段階の傾斜から得た(a, 挿入図)。速度はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(○)の非存在下で観察された速度に正規化した。その速度は、プレインキュベーション工程からリガンドが除かれるが、アッセイのＴｆインキュベーション段階の間(◆、０分)ではリガンドが存在する場合に観察される速度と同等であった。(c) ＢＪＡＢ細胞をＤＭＳＯビヒクル又はｚＶＡＤ-ｆｍｋに３０分間予めさらし、その後架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて４時間処理し、氷上で冷やし、６４７Ｔｆエンドサイトーシス速度について(a)及び(b)のように分析した。速度はＤＭＳＯ処理試料(±ＳＥＭ)に正規化した。
【図４】ＤＲ５エンドサイトーシスの特徴づけを示す。(a, b) 表面に６４７５Ｃ７ ｍＡｂが結合したＣｏｌｏ２０５細胞を、１０μｇ／ｍｌの三量体のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(■)又は架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(▲)の存在下又は非存在下(◆)にて氷上で３０分インキュベートし、次いで３７℃で示した時間インキュベートし、氷上で急速に冷ました。表面蛍光は酸の除去によって取り除き、ＤＲ５取り込みをフローサイトメトリーによって定量化した。平均値をプロットした(ｂにおいては±ＳＥＭ)。(c) Ｈｅｌａ-ｍ細胞を５μｇ／ｍｌの６４７５Ｃ７及び５μｇ／ｍｌの架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとともに３７℃でインキュベートし、次いで免疫蛍光顕微鏡法のために処理する(バー：２０μＭ)。(d) Ｃｏｌｏ２０５細胞を、非標識ｍＡｂ ５Ｃ７にて３７℃で３０分間予め平衡化して表面及び再循環ＤＲ5プールを結合させた。インキュベーションは１０μｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの有無にかかわらず続け、その後細胞を氷上で急速に冷ました。細胞表面露出したｍＡｂ ５Ｃ７はＣＹ５-抗マウスＩｇＧにて探索し、フローサイトメトリーによって定量化し、平均をプロットした(±ＳＥＭ)。(e) Ｃｏｌｏ２０５細胞を１０μｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて３７℃で前処理し、次いで急速に氷上で冷やし、エンドサイトーシスについてa(６４７５Ｃ７)及び図３ｂ(６４７Ｔｆ)にあるようにアッセイした。エンドサイトーシス速度は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ前処置(±ＳＥＭ)のない値に正規化した。細胞を(c)のように調整し、エンドサイトーシスを表面結合したＣＹ５-抗マウスＦａｂにてアッセイした場合に、類似の結果が観察された。(f−f) 表面にｍＡｂ ５Ｃ７が結合したＣｏｌｏ２０５細胞を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとともに氷上でインキュベートし、３７℃に５分間移し、固定した。超薄凍結切片を、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体及びプロテインＡゴールド(１０ｎｍ)にて標識した。代表的な高電子密度クラスリンコートを矢頭で示す。Ｐ、細胞膜。スケールバー、２００ｎｍ。
【図５】ダイナミンの失活がＤＲ５エンドサイトーシスを阻害することを示す。(a−d) ＤｙｎＧ２７３Ｄを形質導入したＨｅＬａ-Ｍ細胞を、ピューロマイシン選択して、ドキシサイクリンを誘導して、示した温度で２０分間予めインキュベートし、そしてＡｌｅｘａ-４８８コンジュゲートＴｆ(４８８Ｔｆ)の存在下にてさらに２０分間インキュベートした。次いで、ダイナミン-１特異的抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡法のために細胞を処理した。(e, f) 形質導入していないＢＪＡＢ細胞(親)又はクローン化したＤｙｎ１Ｇ２７３Ｄ形質導入ＢＪＡＢ細胞のうちドキシサイクリン誘導あり(＋ｄｏｘ)又はドキシサイクリン誘導なし(ｄｏｘなし)のものを、４８８Ｔｆ又は６４７５Ｃ７取り込みについて、フローサイトメトリーによって３０℃(白色バー)又は３８℃(黒色バー)で２０分間にわたってアッセイし、平均をプロットした(±ＳＤ)。
【図６】ダイナミン失活によりＤＲが媒介するカスパーゼ活性化及びアポトーシスが増えることを示す。(a) ＤｙｎＧ２７３Ｄ形質導入ＢＪＡＢ細胞のうちドキシサイクリン誘導あり又はドキシサイクリン誘導なしのものを、図５のように３８℃で２０分間インキュベートしてダイナミンを不活性化し、その後架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの有無の下で更に４時間インキュベートし、示したタンパク質のプロセシングについてイムノブロットによって分析した。(b) ＤｙｎＧ２７３Ｄ形質導入ＢＪＡＢ細胞のうちドキシサイクリン誘導あり又はドキシサイクリン誘導なしのものを、３０℃又は３８℃で２０分間インキュベートして、その後架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの有無の下で更に２時間インキュベートし、カスパーゼ-３／７活性についてアッセイした。(c) ＤｙｎＧ２７３Ｄ形質導入ＢＪＡＢ細胞のうちドキシサイクリン誘導あり又はドキシサイクリン誘導なしのものを、３８℃で２０分間予めインキュベートして、その後架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ５-選択Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体(Ｄ５-ｓｅｌ)の有無の下で更に４時間インキュベートし、ＤＮＡ断片化をアッセイした(±ＳＥＭ)。
【図７】癌細胞株のクラスリン-経路構成成分のプロセシングを示す。(a) 示した細胞株をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて処理し、ＡＰ２α又はＣＨＣの切断をイムノブロットによって分析した。(b) ＢＪＡＢ細胞を架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬにて処理して、ＡＰ２α又はＣＨＣのプロセシングをイムノブロットによって分析した。(c) ＢＪＡＢ細胞を架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて処理し、ダイナミンのプロセシングをイムノブロットによって測定した。
【図８】ＡＰ２α及びＣＨＣの切断のためのカスパーゼの必要性を示す。(a) ＢＪＡＢ細胞を、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ(２０μＭ、３０分)の有無の下で予めインキュベートし、架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(１μｇ／ｍＬ)にて示したように２４時間処理した。カスパーゼ-８、カスパーゼ-９、カスパーゼ-３及びＡＰ２αのプロセシングについて細胞をイムノブロットによって分析した。(b) 以下のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株：Ａ３(ｗｔ)、Ｉ９.２(カスパーゼ-８欠失)及びＥ１(ＦＡＤＤ欠失)を、示した時間間、架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬにて処理し、図１のようにクラスリンが媒介するエンドサイトーシス経路の構成成分のプロセシングについて分析した。(c) ＨＴ１０８０線維肉腫細胞に、カスパーゼ-３特異的なｓｉＲＮＡ(Ｃ３)又はコントロールｓｉＲＮＡを形質移入して、示した時間の間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて処理して、ＡＰ２α又はＣＨＣの切断について、又はカスパーゼ-３のｓｉＲＮＡ枯渇についてイムノブロットによって分析した。
【図９】ＡＰ２α切断部位の決定。(a) 切断したＡＰ２αのＣ末端断片を、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬで刺激したＢＪＡＢ細胞から免疫沈降して、トリプシンにて消化して質量分析によって分析してその同一性を検査するか、又はゲル電気泳動及びウェスタン転移によって単離してＮ末端配列決定を行った。タンデム型質量分析によって同定されたトリプシンペプチドを、ＡＰ２αのＣ末端配列と整列配置する。Ｎ末端配列決定により、切断部位がＤＸＸＤカスパーゼ認識モチーフ(下線部)であることが同定された。(b) 切断部位をＡＰ２αの「ヒンジ」領域にマッピングした。これは機能的に異なる「ｅａｒ」と「ｔｒｕｎｋ」ドメインを連結する。
【図１０】温度感受性が高いＤｙｎ１Ｇ２７３ＤとドミナントネガティブなＤｙｎ１Ｋ４４Ａ変異体は、ＨｅＬａ-Ｍ細胞におけるＴｆ及びＤＲ５のエンドサイトーシスを阻害する。(a, b) 図６のレトロウイルスで形質導入したＨｅＬａ-Ｍ細胞集団由来の２つのクローン化細胞株であるｔｓ３とｔｓ１のうちドキシサイクリン誘導あり(＋ｄｏｘ)又はドキシサイクリン誘導なし(ｄｏｘなし)のものを、４８８Ｔｆ(A)又は６４７５Ｃ７(B)取り込みについて、実験の手順の項目に記載のように、フローサイトメトリーによって３０℃(白色バー)又は３８℃(黒色バー)で２０分間にわたってアッセイし、平均をプロットした(±ＳＤ)。(c) ＤｙｎＫ４４Ａを形質導入したＨｅＬａ-Ｍ細胞及び形質導入していないＨｅＬａ-Ｍ細胞(親)のうちドキシサイクリン誘導あり又はドキシサイクリン誘導なしのものを、正規化していない図５ｄの記載のように、４８８Ｔｆ又は６４７５Ｃ７エンドサイトーシス速度(±ＳＤ)についてアッセイした。
【図１１】エンドサイトーシスの非存在下でのＤＩＳＣ集合化を示す。(a) ＢＪＡＢ細胞を６４７Ｔｆにて氷上で平衡化し、示した取り込み間隔の間、３７℃又は氷上でインキュベートし、そして、蛍光をフローサイトメトリーによって定量化した。(b) ＢＪＡＢ細胞を架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(１μｇ／ｍＬ)にて、示した時間の間、３７℃又は氷上で処理し、ＤＩＳＣを材料と方法の項目に記載のように、リガンドで免疫沈降した。ＤＩＳＣ関連のＦＡＤＤとカスパーゼ-８をイムノブロットによって視覚化した。(c, d) ＤｙｎＧ２７３Ｄを形質導入したＢＪＡＢ細胞を、バッファ(Ｄｏｘなし)又はドキシサイクリン(Ｄｏｘ)にて処理し、３８℃に２０分間移し、ダイナミンを不活性化した。細胞を架橋したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて示した時間の間処理し、ＤＩＳＣを免疫沈降させた。ＤＩＳＣ関連のＦＡＤＤとカスパーゼ-８をイムノブロット(c)によって視覚化するか、又は既に記載されているように(Sharp等 J Biol Chem 280, 19401-409, 2005)、ＤＩＳＣ関連のカスパーゼ-８活性を測定した。
【図１２】ＤＮＡ傷害剤がクラスリン-経路構成成分の切断を誘導することを示す。ＢＪＡＢ細胞又はＣｏｌｏ２０５細胞をビンブラスチン又はアドリアマイシンにて、示した時間の間処理し、図１にあるようにイムノブロットによって分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本明細書において記述されるか又は参照される技術及び手順は一般的に十分に理解されており、当業者によって従来の方法論を用いて共通して実施される。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は通常、特に明記しない限り製造業者が定めたプロトコール及び／又はパラメーターに従って実行される。特に定めない限り、本明細書において使用するすべての技術用語、表記法及び他の科学的な用語は、本発明が関係する当業者によって共通に理解される意味を有することを意図する。場合によって、共通して理解されている意味を有する用語は、明確にするため及び／又はすぐに参照できるように本明細書において定め、そして、本明細書にこのような定義を含めることは、通常、当分野において一般的に理解されていることと実質的な相違を表すためであると必ずしも解釈されるものではない。さらに、特定の略記号が本明細書中で用いられる。４８８-:コンジュゲートしたＡｌｅｘａ-４８８、６４７-:コンジュゲートしたＡｌｅｘａ-６４７、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ：Ａｐｏ２Ｌリガンド／ＴＮＦ関連のアポトーシス誘導リガンド、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＤＲ：デスレセプター、ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水、Ｔｆ：トランスフェリン、そして、ｚＶＡＤ-ｆｍｋ：Ｎ-ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン。
【００１８】
Ｉ．定義
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称す。この活性は、当該技術で公知の多くの技術、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法、そしてより詳細にはアネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、及び／又は膜ベジクル(アポトーシス体と呼ばれる)の生成により、決定し測定することができる。
「Ａｐｏ-２リガンド」、「Ａｐｏ-２Ｌ」又は「ＴＲＡＩＬ」という用語は、Pitti等, J. Biol. Chem., 271：12687-12690 (1996)の図１Ａに示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、残基９１−２８１、残基９２−２８１、残基４１−２８１、残基１５−２８１、又は残基１−２８１、並びに上記配列の生物活性な断片、欠失、挿入又は置換変異体を含むポリペプチドを称する。一実施態様において、ポリペプチド配列は、残基１１４−２８１を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は、少なくとも残基９１−２８１又は残基９２−２８１を有する。他の好適な実施態様では、生物活性な断片又は変異体は、上記配列の何れかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、そして更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本定義は、（上掲のPitti等に示す配列の番号を用いて）位置２０３、２１８又は２６９で少なくとも１のアミノ酸がアラニン残基によって置換される、Pitti等, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)の図１Ａのアミノ酸９１−２８１を含んでなるＡｐｏ-２リガンドの置換変異体を包含する。本定義は、例えばヒト組織型又は他の供給源のようなＡｐｏ-２リガンド供給源から単離されるか、組み換え又は合成法により調製されたＡｐｏ-２リガンドを包含する。Ａｐｏ-２リガンドという用語はまた上掲の国際公開第97/25428号及び上掲の国際公開第97/01633号に記載されたポリペプチドを称する。
【００１９】
「Ａｐｏ-２リガンドレセプター」は、当該分野において「ＤＲ４」及び「ＤＲ５」と称されるレセプターを含む。Pan等は、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリのメンバーを開示している［Pan等, Science, 276：111-113(1997)；また1998年7月30日公開の国際公開第98/32856号を参照］。ＤＲ４レセプターは、細胞自殺機構に関わることが可能な細胞質死ドメインを含むことが報告されている。Pan等は、ＤＲ４がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとして知られるリガンドのレセプターであると考えられると開示している。Sheridan等, Science, 277：818-821 (1997)及びPan等, Science, 277：815-818 (1997)においては、Ａｐｏ-２L／ＴＲＡＩＬの他のレセプターが記載されている。［1998年11月19日発行の国際公開第98/51793号；1998年9月24日発行の国際公開第98/41629号を参照のこと］。このレセプターはＤＲ５とも呼ばれる。(該レセプターはまた、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれる；Screaton等，Curr.Biol., 7：693-696(1997)；Walczak等，EMBO J., 16：5386-5387(1997)；Wu等，Nature Genetics, 17：141-143(1997)；1998年8月20日に公開の国際公開第98/35986号；1998年10月14日に公開の欧州特許第870,827号；1998年10月22日に公開の国際公開第98/46643号；1999年1月21日に公開の国際公開第99/02653号；1999年2月25日に公開の国際公開第99/09165号；1999年3月11日に公開の国際公開第99/11791号]。ＤＲ４のように、ＤＲ５は細胞質死ドメインを含み、アポトーシスのシグナル伝達が可能であると報告されている。前記されるように、Ａｐｏ-２Ｌに対する他のレセプターはＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及びＯＰＧを含む[Sheridan等、上掲；Marsters等、上掲；及びSimonet等、上掲を参照のこと]。ここで使用される場合の「Ａｐｏ-２Ｌレセプター」という用語は天然配列レセプター及びレセプター変異体を含む。これらの用語は、ヒトを含む様々な動物で発現されるＡｐｏ-２Lレセプターを含む。Ａｐｏ-２Lレセプターは、様々なヒト組織系統で自然に発生して内因的に発現されても、あるいは組換え又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列Ａｐｏ-２Ｌレセプター」は、自然から誘導したＡｐｏ-２Ｌレセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。よって、天然配列Ａｐｏ-２Ｌレセプターは、任意の動物から自然に発生したＡｐｏ-２Ｌレセプターのアミノ酸配列を有することができる。このような天然配列Ａｐｏ-２Ｌレセプターは、自然から単離することができ、あるいは組換え又は合成法によって作成することもできる。「天然配列Ａｐｏ-２Ｌレセプター」なる用語は、特にレセプターの自然に発生する切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶化形態など）、自然に発生する変異形態（例えば選択的にスプライシングされた形態）及び自然に発生する対立遺伝子変異体を含む。レセプター変異体は天然配列Ａｐｏ-２Ｌレセプターの断片又は欠失突然変異を含みうる。
【００２０】
「Ｆａｓ」なる用語は、ＮＣＢＩ寄託番号ＡＡＡ６３１７４に示され、Itoh等, Cell 66 (2), 233-243 (1991)において記述されるアミノ酸残基１−３１９を含むポリペプチド、並びに、上記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入又は置換の変異体を指すために本明細書中で用いられる。このポリペプチドは、ある文献では「Ａｐｏ-１」及び「ＣＤ９５」と称される。「Ｆａｓリガンド」又は「ＦａｓＬ」なる用語は、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿０００６３０に示され、Suda等, Cell 75 (6), 1169-1178 (1993)において記述されるアミノ酸残基１−２８１を含むポリペプチド、並びに、上記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入又は置換の変異体を指すために本明細書中で用いられる。ＦａｓＬのＦａｓへの結合、又はアゴニスト抗体とのＦａｓの架橋は細胞死となるアポトーシスを誘導する(例としてNagata, S. Ann. Rev. Genet. 33:29, 1999；及びLabroille等, Cytometry 39(3): 195-202 (2000)を参照)。ＦａｓＬのＦａｓへの結合はＦＡＤＤアダプター(デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質)を介してカスパーゼのカスケードを活性化する。これによって、様々な細胞性基質の切断とＤＮＡ断片化が起こる。
【００２１】
ここで同定されるポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。場合によっては、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25：3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝10、最小低複合長＝15/5、マルチパスｅ-値＝0.01、マルチパスの定数＝25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝25、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
【００２２】
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成した多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び抗体断片の範囲にわたる。ここで用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養物によって合成され、他の免疫グロブリンと混合しない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得た抗体の特性を表し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって、作ることができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。目的の抗原に「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性及び／又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
【００２３】
「デスレセプター抗体」は、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーであり、アポトーシスをシグナル伝達することができるデスドメインを含有するレセプターに対する抗体(一ないし複数)を一般的に意味するものであり、このような抗体にはＤＲ５抗体、ＤＲ４抗体及びＦａｓ抗体が含まれる。
「ＤＲ５レセプター抗体」、「ＤＲ５抗体」又は「抗ＤＲ５抗体」とは、広義で、ＤＲ５レセプターの少なくとも一形態に結合する抗体を意味する。場合によっては、ＤＲ５抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は抗体がより高次の複合体又はオリゴマー複合体を形成させる又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ５抗体はＤＲ５レセプターに結合するが、任意の付加的なＡｐｏ-２Ｌレセプター(例えばＤＲ４、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２)と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである(例として米国特許公開20040005314及び20060188498を参照)。
【００２４】
「ＤＲ４レセプター抗体」、「ＤＲ４抗体」又は「抗ＤＲ４抗体」とは、広義で、ＤＲ４レセプター又はその細胞外ドメインの少なくとも一形態に結合する抗体を意味する。場合によっては、ＤＲ４抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は抗体がより高次の複合体又はオリゴマー複合体を形成させる又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ４抗体はＤＲ４レセプターに結合するが、任意の付加的なＡｐｏ-２Ｌレセプター(例えばＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２)と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ４シグナル伝達活性のアゴニストである(例として米国特許公開20040005314及び20060188498を参照)。
「Ｆａｓ抗体」又は「抗Ｆａｓ抗体」は、広義に用いられ、少なくとも一つのＦａｓの形態又はその細胞外ドメインに結合する抗体を指す。場合によって、Ｆａｓ抗体は異種性の配列又は分子に融合するか又は結合する。好ましくは、異種性の配列により、抗体が高次構造又はオリゴマー複合体を形成するが可能になるか又は促される。場合によって、Ｆａｓ抗体はＦａｓレセプターを結合するが、任意の更なるＦａｓＬレセプターと結合しないか又は交差反応しない。場合によって、抗体はＦａｓシグナル伝達活性のアゴニストである(例としてNagata, S. Ann. Rev. Genet. 33:29, 1999；及びLabroille等, Cytometry 39(3): 195-202 (2000)を参照)。
【００２５】
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：6851-6855 (1984)）。
【００２６】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jones等, Nature, 321：522-525(1986)；Reichmann等, Nature, 332：323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2：593-596(1992)参照。ヒト化抗体はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤTMを含み、抗体の抗原結合領域が、関心ある抗原でマカク属サルに免疫性を与えることで生成される抗体から得られる。
【００２７】
抗体は、典型的には、特定の抗原に結合特異性を示すタンパク質又はポリペプチドである。天然抗体は、通常はヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一な軽（Ｌ）鎖と２つの同一な重（Ｈ）鎖とからなる。典型的には、各軽鎖は共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。また各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に多数の定常ドメインに続く可変ドメイン（ＶＨ）を持つ。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている［Chothia等, J. Mol. Biol., 186：651-663 (1985)；Novotny及びHaber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82：4592-4596 (1985)］。任意の脊髄動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型に割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられる。免疫グロブリンには５つの大きなクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、そのうちの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、及びＩｇＧ-４；ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。
【００２８】
「抗体断片」は無傷の抗体の一部、一般的には無傷の抗体の抗原結合性又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片、ダイアボディ(diabodies)、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
ここで「可変」という用語は、抗体間で配列が異なり各特定の抗体のその抗原に対する結合性及び特異性の使用される可変ドメインの或る一部を記述するのに用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインを通して常に均一に分布しているわけではない。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインにおいて相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存される部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、これは大きくβ-シート配置をとり、３つのＣＤＲに結合してループ状結合を形成するが、β-シート構造の一部を形成する場合もある。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域の直近に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する［Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)参照］。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接含まれないが、抗体依存的細胞毒性における抗体の寄与といった様々なエフェクター機能を示す。
ここで、モノクローナル抗体は、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラスの命名にかかわらず、キメラ、定常ドメインを有する抗-Ａｐｏ-２Ｌレセプター抗体の可変(高頻度可変を含む)ドメインをスプライシングすることによって生産されるハイブリッド及び組換え抗体（例えば「ヒト化」抗体）、又は重鎖を有する軽鎖、又は他の種からの鎖を有するある種からの鎖、又は異種タンパク質との融合体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限り抗体断片(例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ)を特に含む。例えば、米国特許第4,816,567号、及びMage等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97(Marcel Dekker, Inc.:ニューヨーク, 1987)を参照。
【００２９】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を製造するいずれかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体この定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、この分野で知られている種々の技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Vaughan等, Nature Biotechnology 14：309-314 (1996)：Sheetsら. PNAS, (USA)95：6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227：381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222：581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。この試みでは、遺伝子再構成、構築及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10：779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368：856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368：812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14：845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14：826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13：65-93 (1995)。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を生産するヒトＢリンパ球の固定化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個々から回収されてもよいし、インビトロで免疫化してもよい）。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第5,750,373号を参照のこと。
【００３０】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化で生じ得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域である。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、又は約位置Ｐｒｏ２３０からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸展すると定義される(ここにおいては、Kabatら，上掲の番号方式を使用）。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、二つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。
ここで「Ｆｃ領域鎖」とは、Ｆｃ領域の二つのポリペプチド鎖のうちの一つを意味する。
【００３１】
ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる)は通常アミノ酸残基で約位置２３１からアミノ酸残基で約位置３４０まで伸展する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、２つのＮ-結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在されている。炭水化物はドメイン-ドメイン対形成に対する代替物を提供し、ＣＨ２ドメインを安定化させるのに役立つと推測されてきた。Burton, Molec. Immunol. 22：161-206 (1985)。ここにおけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであってもよい。
「ＣＨ３ドメイン」は、残基Ｃ末端からＦｃ領域のＣＨ２ドメインへの伸長を含む(すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基で約位置３４１からアミノ酸残基で約位置４４７）。ここにおけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインでもよい(例えば、その一つの鎖の導入された「突出部(protroberance)」を伴うＣＨ３ドメイン、及びその他の鎖の相当する導入された「空洞(キャビティ)」；米国特許第5,821,333号を参照のこと）。
【００３２】
「ヒンジ領域」は、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６、又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22：161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と整列させられうる。ここにおけるヒンジ領域は、天然配列ヒンジ領域又は変異体ヒンジ領域であってもよい。変異体ヒンジ領域の二つのポリペプチド鎖は、一般的に、ポリペプチド鎖当たり少なくとも一つのシステイン残基を保持し、変異体ヒンジ領域の二つのポリペプチド鎖は、二つの鎖の間でジスフィルド結合を形成できる。ここにおける好ましいヒンジ領域は、天然配列ヒトヒンジ領域で、例えば天然配列ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも一つの「エフェクター機能」を有する。模範的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合を含む；補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介障害活性(ＡＤＣＣ)；ファゴサイトーシス；細胞表層レセプターの下方制御(例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）等。このようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメインと結合するＦｃ領域を必要とし(例えば、抗体可変ドメイン）、そのような抗体エフェクター機能を評価するための分野で知られた種々のアッセイを使用して評価できる。
【００３３】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一つのアミノ酸修飾によって天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較し、少なくとも一つの一アミノ酸置換を有する、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１から約１０アミノ酸置換、及び好ましくは約１から約５アミノ酸置換である。ここにおける変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＩＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15：203-234(1997)に概説されている）。ＦｃＲｓはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9：457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4：25-34 (1994)；及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126：330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲｓが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧｓの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyer等, J. Immumol. 117：587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24：249 (1994))。
【００３４】
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。Marksら. Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメイン混合による親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier 等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol., 155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226：889-896(1992)に記載されている。
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、抗体などの試薬に直接的又は間接的にカップリングないしは融合され、カップリングないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識、蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００３５】
「アンタゴニスト」なる用語は、最も広い意味で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボでのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５、ＦａｓＬ又はＦａｓの一又は複数の生物学的活性を一部ないしは完全に遮断する、阻害する又は中和する任意の分子を包含する。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４又はＤＲ５のこのような生物学的な活性の例には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＤＲ４又はＤＲ５への結合、アポトーシスの誘導、並びに文献に報告される更なるものが含まれる。ＦａｓＬ及びＦａｓのこのような生物学的な活性の例には、ＦａｓＬのＦａｓへの結合、アポトーシスの誘導、並びに文献に報告される更なるものが含まれる。アンタゴニストは直接的又は間接的な方法で機能しうる。例えば、アンタゴニストは、ＤＲ４又はＤＲ５に直接結合して、インビトロ、インサイツ又はインビボでのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの一又は複数の生物学的活性を一部ないしは完全に遮断する、阻害する又は中和しうる。また、アンタゴニストは、例えば他のエフェクター分子を遮断するか又は阻害して、インビトロ、インサイツ又はインビボでのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４又はＤＲ５の一又は複数の生物学的活性を一部ないしは完全に遮断する、阻害する又は中和するように間接的に機能しうる。アンタゴニスト分子は、該分子がＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５、Ｆａｓ又はＦａｓＬの生物学的活性を一部ないしは完全に遮断する、阻害する又は中和することが可能である「二重」アンタゴニスト活性を含みうる。
【００３６】
「アゴニスト」なる用語は広義で用いられ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４ないしＤＲ５、ＦａｓＬ又はＦａｓのインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。このような生物学的活性の例には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの、ＤＲ４又はＤＲ５への結合、アポトーシス並びに更に文献に報告されているものが含まれる。このような生物学的活性の例には、ＦａｓＬのＦａｓへの結合、アポトーシスの誘導、並びに更に文献に報告されるものが含まれる。アゴニストは直接的ないし間接的形式で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を起こすＤＲ４ないしＤＲ５への直接的結合の結果としてのインビトロ、インサイツないしインビボでのＤＲ４ないしＤＲ５の一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために機能するかもしれない。また、アゴニストは、例えば、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化ないしシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としてのＤＲ４ないしＤＲ５のインビトロ、インサイツないしインビボでの一以上の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するために間接的に機能するかもしれない。アゴニストは、ＤＲ４ないしＤＲ５の活性化ないし活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として働きうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物の内因性のＡｐｏ−２Ｌの活性を亢進しうる。例えば、これはＤＲ４ないしＤＲ５をプレ複合体化することによって、ないし、ＤＲ４ないしＤＲ５レセプターとのそれぞれのリガンドの複合体を安定化することによって達成することができる(Ａｐｏ-２ＬとＤＲ４ないしＤＲ５との天然複合体型を安定化するなど)。
【００３７】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なほど精製される。タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
ここでの目的における「生物学的に活性な」又は「生物学的活性」とは、(ａ)インビボ及び／又はエキソビボで、少なくとも一種類の哺乳類癌細胞又はウイルス感染した細胞においてアポトーシスを誘発又は刺激する能力を有する；(ｂ)抗体を産生する能力がある、すなわち免疫原である；又は(ｃ)天然又は天然に生じるＡｐｏ-２リガンドポリペプチドの活性を保持していることを意味する。
【００３８】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ及び／又はインビボにおいて細胞の成長を阻害する化合物又は組成物のことを称する。従って、成長阻害剤には、Ｓ期の細胞の割合を著しく減少させるようなものでありうる。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ期以外の時点において)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。典型的なＭ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール(登録商標)、トポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。また、Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、癌の分子的基礎、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００３９】
この出願で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物に比べて、癌細胞に対する細胞毒性が低く、より活性な親形態に、酵素的に活性化又は転換され得る製薬的に活性な物質の先駆体又は誘導体形態を称する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)及びStella等,「Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」, Directed Drug Delivery, Borchardt等,(編), pp.247-267, Humana Press(1985)を参照。 限定するものではないが、本発明のプロドラッグには、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、下記の化学療法剤が含まれる。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は放射活性アイソトープ（例えばＡｔ211，Ｉ131，Ｉ125，Ｙ90，Ｒｅ186，Ｒｅ１８８，Ｓｍ１５３，Ｂｉ212，Ｐ32，及びＬｕの放射性アイソトープ）、化学療法剤、及び断片及び／又はその変異体を含む細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又は小分子毒素等の毒素を含むことが意図されている。
【００４０】
「化学療法剤」は、癌のような症状の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXANTM)のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin ）；デュカロマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）；エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin ）；サルコデイチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin ）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５-ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００４１】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、副甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；マレリアン(mullerian)阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ-αのような神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、γコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-βのような腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００４２】
「処理」又は「治療」とは、双方とも、治癒的処理、及び予防的又は防護的処置を称する。
「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量に相当する。癌の場合は、治療的有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、腫瘍の負荷又は体積の評価、例えば病状の進行時間(ＴＴＰ)の評価、及び／又は応答速度(ＲＲ)の測定により測定される。
【００４３】
処置又は治療を目的とした「哺乳動物」とは、ヒト、家畜及び農場飼育動物、及び動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「被検体」又は「患者」は、ヒトを含む、治療が望まれる任意の単一の被検体を意味する。また、臨床試験に用いられる疾患の臨床的な特徴を全く示さない任意の被検体、又は疫学的な研究に用いられる被検体、又はコントロールとして用いられる被検体も被検体に含まれる。
【００４４】
「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、精巣癌、食道癌、胃腸癌、腎癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、膠腫、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、子宮内膜カルチノーマ、唾液腺カルチノーマ、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な形態の頭頸部癌が含まれる。
本出願中で用いられる「バイオマーカー」なる用語は一般的に、遺伝子、タンパク質ないしタンパク質断片、糖質構造又は糖脂質を含む分子を指し、哺乳動物組織又は細胞中ないしは組織又は細胞上での該分子の発現は標準的な方法(本明細書中で開示される方法)によって検出されうるものであり、哺乳動物細胞又は組織のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬないしはデスレセプター抗体などのアポトーシスを誘導する薬剤への感受性を予測するものである。本発明で考慮されるこのようなバイオマーカーには、限定するものではないが、本明細書中に開示される(例として図１及び２を参照)ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片が含まれる。
【００４５】
「組織又は細胞試料」は、被検体又は患者の組織から採取された同種の細胞の集まりを意味する。組織又は細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織試料又は生検又は吸引による固形組織；血液又は血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってもよい。また、組織試料は原発性又は培養した細胞又は細胞株であってもよい。場合によっては、組織又は細胞試料は原発性腫瘍又は転移性腫瘍から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。
本明細書中の組織試料の「切片」とは、組織試料の一部又は一片、例えば組織試料から切り出した組織又は細胞の一薄片を意味する。組織試料の複数の切片は採取され、本発明の分析に供されうることが理解される。
「相関」又は「相関する」は、任意の方法で、第一の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果を、第二の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコルを行う際に第一の分析又はプロトコルの結果を用いてもよいし、第一の分析又はプロトコルの結果を用いて、第二の分析又はプロトコルを行うかどうかを決定してもよい。本明細書に開示される様々な実施態様に関し、アポトーシスの間に生成されるＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)の断片を同定するもの等の分析アッセイの結果を用いて、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、デスレセプター抗体などのアポトーシスを誘導する薬剤を使用する特定の治療計画を実行するかどうかを決定してもよい。
【００４６】
II．方法と材料
Ａ．方法
通常、本発明の方法と材料は、例えば、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体に哺乳類細胞を接触させること、このとき該抗体がＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片に結合する、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体の量を決定すること、そして、該哺乳類細胞において結合した抗体の量を、アポトーシスのない哺乳類細胞においてタンパク質断片に結合する抗体の量と比較すること、このときこの試験した細胞の量がアポトーシスのない細胞の量よりも大きい場合に、アポトーシスが検出されることによって、哺乳類細胞のアポトーシスを検出及び／又はモニターするために用いられる。本明細書において提供される実施例にて図示するように、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体に細胞を接触させることには、細胞の細胞構成成分と接触させる方法が含まれる。一般的に、細胞は、細胞の構成成分の抗体の接触を促すために、例えば抽出(例えば、本明細書中で言及されるウエスタンブロット手順など)によって前処理される。
本明細書において開示される方法及びアッセイが、多くの場面で使われてもよい。例えば、中には、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体の細胞死誘導作用に耐性がある、罹患したヒトの細胞型の集団(例えば癌細胞のある集団)がある。したがって、開示された方法及びアッセイは、患者を治療するために適切又は有効な療法を評価する際に有用なデータ及び情報を得るための、簡便でかつ効率的な、費用対効果が良いと思われる手段を提供しうると思われる。例えば、癌又は免疫関連の症状を診断された患者は、組織又は細胞試料を得るために生検が実施され、その試料を本発明の様々なインビトロアッセイによって調べられ、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体などの治療薬に対して患者の細胞が感受性があるか否かを決定してもよい。
【００４７】
試料調整のために、哺乳動物(一般的にヒト患者)からの組織又は細胞試料が使われてもよい。試料の例には、限定するものではないが、癌細胞、例として大腸、胸部、前立腺、卵巣、肺、胃、膵臓、リンパ腫、及び白血病の癌細胞が含まれる。場合によって、試料には、非小細胞肺癌細胞、膵臓癌細胞又は非ホジキンリンパ腫癌細胞が含まれる。試料は、外科的切除、吸引又は生検を含むがこれらに限らない当分野で公知の様々な手順によって得られてよい。
本明細書中に開示される発明は多くの実施態様を有する。例えば、本発明のある実施態様は、細胞アポトーシス及び、哺乳動物などの被検体、特にヒト患者の関連する症状を観察するために用いてもよい。ある例示的な実施態様では、本発明の方法は、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬなどの一又は複数のアポトーシスを誘導する薬剤に対する哺乳類細胞の感受性を調べるために、例えば該薬剤の投与を含む療法の有効性を評価するために、哺乳類細胞のアポトーシスの存在(又は不在)を観察するために用いられる。また、本発明の方法は、哺乳類細胞のアポトーシス活性を低減する又は亢進する際の候補化合物の活性の程度を決定するために用いられてもよい。この化合物は、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)、ＦａｓＬ(配列番号：９)、Ｆａｓアゴニスト抗体、ＤＲ４アゴニスト抗体又はＤＲ５アゴニスト抗体などのアポトーシスを誘導する薬剤の活性を調整するものがある。また、本発明の実施態様は、化合物がアポトーシス生成タンパク質断片の形成を阻害するか又は刺激することを決定することによって、アポトーシス性の細胞死を阻害するか又は刺激する化合物を同定するために有用である。
【００４８】
本発明の代表的な実施態様は、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体に哺乳類細胞を接触させること、このとき該抗体がＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片に結合する、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合する抗体の量を決定すること、そして、該哺乳類細胞において結合した抗体の量を、アポトーシスのない哺乳類細胞においてタンパク質断片に結合する抗体の量と比較すること、このときこの哺乳類細胞における量がアポトーシスのない細胞の量よりも大きい場合に、アポトーシスが検出されることによって、哺乳類細胞のアポトーシスを検出する方法である。多種多様な哺乳類細胞がこのような方法で用いられてもよい。本発明のある実施態様では、細胞はヒトの大腸、結腸直腸、肺、胸部、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣、脳、メラノーマ、白血病又は骨髄腫の癌細胞である。
本発明の他の実施態様は、ヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導する治療薬に応答するか又は応答する可能性があるヒト癌細胞を同定するための方法である。本発明の実施態様には、ヒト癌細胞を治療薬にさらす工程、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片の存在について治療薬にさらされたヒト癌細胞を調べる工程、ヒト癌細胞におけるタンパク質断片の量を、リガンドにさらされていないコントロールのヒト癌細胞におけるタンパク質断片の量と比較する工程が含まれる。この実施態様では、治療薬にさらされたヒト癌細胞に存在するタンパク質断片の量が治療薬にさらされていないコントロールのヒト癌細胞のタンパク質断片の量より大きい場合に、アポトーシスが観察され、ヒト癌細胞のアポトーシスの観察によってヒト癌細胞を該治療薬に応答する可能性があるか、又は応答するものと識別される。本発明のある実施態様では、ヒト癌細胞は、癌と診断された個体から得られ、１か月未満の間、典型的には２週間未満、又は１週間未満の間、インビトロ培養において成長させたものである。代替的な実施態様では、ヒト癌細胞は、インビトロ培養物由来の不死化細胞株である。
【００４９】
本発明の代表的な実施態様では、アポトーシスの存在について観察される哺乳類細胞、例えばアポトーシスを誘導する薬剤にさらされた哺乳類細胞において結合した抗体の量は、アポトーシスのない哺乳類細胞、例えばアポトーシスを誘導する薬剤にさらされていないコントロール細胞におけるタンパク質断片に結合する抗体の量と比較される。当業者は、このようなコントロール細胞は、試験している変動要因(例えばアポトーシスを誘導する薬剤への曝露)を除いてはアポトーシスの存在について観察されている実験的哺乳類細胞と類似しているとして選択されたものであることを理解する。本発明の一実施態様では、コントロール細胞は、同じ供与源からの細胞(例えば原発性又は転移性の腫瘍の部位からの生検試料)であり、及び／又は、コントロールの哺乳類細胞がデスレセプター４(配列番号：５)、デスレセプター５(配列番号：６)又はＦａｓ(配列番号：８)のシグナル伝達を引き起こす薬剤にさらされていないことを除いてはアポトーシスの存在について観察される実験的哺乳類細胞と同じ系統のものである。本発明のある実施態様では、前記のコントロール細胞におけるＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)の断片化のパターンはすでに特徴付けられており、アポトーシスの存在について観察される哺乳類細胞におけるＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)の断片化のパターンと比較されるコントロール細胞の断片化の既に特徴付けがされたパターンである。このような実施態様は、例えば細胞のコントロール、例えば細胞にアポトーシスが起こらないと特徴付けたコントロールの不要かつ重複した特徴付けを除くために用いられる。
【００５０】
本発明の実施態様は、プログラムされた細胞死を引き起こすことが知られている多種多様な因子のいずれかによって誘導されるアポトーシスを経る細胞を調べるために用いられてもよい。これらの実施態様は、一般的に、細胞表面上のレセプター、例えばデスレセプター４(配列番号：５)、デスレセプター５(配列番号：６)又はＦａｓ(配列番号：８)によって引き起こされる細胞のアポトーシスを観察する。本発明のある実施態様では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)、ＦａｓＬ(配列番号：９)、Ｆａｓアゴニスト抗体、ＤＲ4アゴニスト抗体又はＤＲ5アゴニスト抗体などのポリペプチドに細胞を接触させ、アポトーシスの検出のための記述される方法(アポトーシスがないことの検出を含む)は、例えばこのような薬剤の投与を含む療法の有効性に関する情報を得るために用いられる。
また、本発明の方法は、新規のアポトーシスを誘導する薬剤及び／又はアポトーシスを誘導する薬剤のモジュレータを同定するために用いてもよい。例示的な実施態様には、哺乳類細胞を一又は複数の試験薬剤にさらす工程と、アポトーシスを観察するために本発明の方法を使用する工程を含み得、哺乳類細胞のアポトーシスの検出によって該一又は複数の試験薬剤が哺乳類細胞のアポトーシスのインデューサーとして同定される。また、本発明の方法は、細胞性分析、例えば遺伝子のプロファイリングの補完的な方法と組み合わされてもよい。本発明のそのような実施態様には、アポトーシスが観察される哺乳類細胞において少なくとも一つのｍＲＮＡの発現を調べる工程が含まれる。
【００５１】
本発明の方法には、アポトーシスを経ている細胞中の断片として本明細書中で示される細胞のタンパク質の観察が含まれる。これらのタンパク質断片、例えばＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)の断片は、当分野で公知の多種多様なアッセイのいずれかによって観察されうる。一般的に、このような断片は、イムノブロッティング、酵素連結された免疫吸着剤アッセイ又は免疫組織化学を使用しているのを見られる。さらに、本発明の方法は、本明細書において同定される多数のタンパク質断片、例えばおよそ６４ｋＤａ又は３３ｋＤａの分子量を有するＡＰ２αのタンパク質断片を調べるために用いてもよい。本発明のある実施態様では、抗体が結合したタンパク質断片は、その断片、例えばＡＰ２-αアミノ酸配列である配列番号：１のＤＶＦＤ又は配列番号：１のＧＰＡＡに特異的なアミノ酸配列によって同定される。
【００５２】
上記したように、本発明の実施態様には、癌と診断されたヒト患者が一又は複数のアポトーシスを誘導する薬剤、例えばＡＰＯ-２／ＴＲＡＩＬに応答する可能性があるか否かを決定する方法を包含する。これらの方法は、癌と診断された患者がアポトーシスを誘導する薬剤などの薬剤(一又は複数)を有する治療に応答する可能性があるか否かの決定を促す当分野で公知の多様な他の方法、例えば癌(例えば原発性腫瘍又は転移)と診断されたヒト患者において少なくとも一つの遺伝子(例えばｍＲＮＡ又はこのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の存在又はレベル)の発現を調べる方法とともに用いられるように応用してもよい。このような遺伝子のプロファイリング方法は、当分野で公知であり、米国特許第２００６００１５９５２号の実施例に記載されている。
本発明の方法のそのような実施態様には、患者から入手した癌細胞における、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を含む、アポトーシス中に生成される断片を観察する工程を、複数の遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得る工程と組み合わせて、それを、同系統の非癌性細胞及び／又は一又は複数のアポトーシスを誘導する薬剤による治療に応答する(ないしは選択的に応答しない)ことがわかっている動物モデルから入手した癌細胞の遺伝子発現プロファイルと比較することが含まれる。一般的に、前記のような方法には、例えば患者から入手した癌細胞が、一又は複数のアポトーシスを誘導する薬剤による治療の利益を得ることがわかっている患者(又は癌の動物モデル)から入手した癌細胞の遺伝子発現プロファイルに類似する遺伝子発現プロファイルを有する場合に、該患者を、一又は複数のアポトーシスを誘導する薬剤による治療の利益を得る可能性があると同定する工程がさらに含まれる。
【００５３】
本明細書中では、「同様の」とは、遺伝子発現特性を測定するために用いるアッセイ又は技術による量又は他の測定可能な発現パラメータにおいて約８０％から１００％の同一性、更に以下に詳細に記載するようにより好ましくは約９０％から１００％、より好ましくは約９５％から１００％の同一性の範囲内である発現特性を示すことによって、当該発現特性がある程度又はかなりにているないしは互いに重なることを意味する。患者及び動物モデルからの癌細胞の遺伝子発現特性は、通常、比較を容易にするために、同じ技術又はアッセイによって得る。
遺伝子発現プロファイリングの方法は公知技術であり、一般的にポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析又はポリヌクレオチドの配列決定に基づく。試料中のｍＲＮＡ発現の定量化のために公知技術の最も一般的に用いられる方法には、ノーザンブロット法及びインサイツハイブリッド形成(Parker及びBarnes, Methods in Molecular Biology, 106:247-283 (1999))；ＲＮアーゼ保護アッセイ(Hod, Biotechniques, 13:852-854 (1992))；及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）(Weis等, Trends in Genetics, 8:263-264 (1992))が含まれる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二体鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はタンパク質二本鎖を含む特異的な複合化を認識するために抗体を用いてもよい。配列決定ベースの遺伝子発現分析法の典型的な方法には、遺伝子発現の段階的分析法（ＳＡＧＥ）、及び大規模並列シグネチャ配列決定による遺伝子発現分析（ＭＰＳＳ）が含まれる。これらの方法又は公知技術の他の方法の何れかを用いて、患者（例えばヒト患者及びＴＧＦ-βアンタゴニストに応答する癌のモデルとして役立つマウスモデルなどの動物）から得られた腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイリングを決定することができる。ヒト患者の場合、腫瘍細胞の供与源は、新鮮な、凍結された又は、固定してパラフィン包埋された組織サンプルでもよく、その試料はｍＲＮＡが抽出され、遺伝子発現分析を受けることができるものである。
【００５４】
あるいはまた、プロテオミクス技術は、また、癌細胞中のヒトと参照（例えばマウス）のタンパク質の発現プロフィルを比較するために用いることができる。プロテオミクスプロフィルは、生物学的試料（例えば癌組織）中の複数のタンパク質の発現パターンの表れである。例えば、発現プロフィルは、質量範囲として表されるが、タンパク質の任意の物理化学的又は生化学特性に基づく他の表現でもよい。したがって、発現プロフィルは、２-Ｄ ＰＡＧＥなどの二次元のゲル電気泳動法によって測定されるタンパク質の電気泳動的性質の違いに基づいてもよく、例えば二次元電気泳動ゲルの複数の点として表されるものでもよい。プロテオミクス技術は公知技術であり、例として以下のテキストに詳述されている： Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (Principles and Practice), M.R. Wilkins等, 編集, Springer Verlag, 1007; 2-D Proteome Analysis Protocols, Andrew L Link, editor, Humana Press, 1999；Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice), T.  Rabilloud editor, Springer Verlag, 2000；Proteome Research: Mass Spectrometry (Principles and Practice), P. James editor, Springer Verlag, 2001；Introduction to Proteomics, D. C. Liebler editor, Humana Press, 2002; Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis, R. Westermeier等, 編集, John Wiley & Sons, 2002。
【００５５】
試料中の、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を含む、アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片は当分野で周知の多くの手段によって分析されてもよい。例としてAusubel等 eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unit 15 (Immunoblotting)には、前記のようなタンパク質断片を評価するための代表的なプロトコールが示されている。本発明のある実施態様において使われうるイムノアッセイには、限定するものではないが、ウエスタンブロット、免疫沈降、スロットないしドットブロットアッセイ、免疫染色、ＲＩＡ、シンチレーション近接アッセイ、フルオレセイン又はローダミンなどの蛍光物質の抗体コンジュゲート又は抗原コンジュゲートを用いた蛍光イムノアッセイ、オークタロニー倍拡散分析、ＥＬＩＳＡ、細胞ベースのＥＬＩＳＡ、フィルター-結合ＥＬＩＳＡ、阻害ＥＬＩＳＡ、及びアビジン-ビオチン又はストレプトアビジン-ビオチン検出システムを用いたイムノアッセイが含まれる。
本発明のいくつかの実施態様では、イムノアッセイに使用する抗体はインタクトなタンパク質とタンパク質断片とに結合し、タンパク質断片は例えばウエスタンブロット手順においてはその特徴的に小さいサイズによって認識される。例えば、本発明の実施態様において使用する抗体は、本明細書中で開示される例示的な抗体のいずれか一つ、又は本明細書中で開示される例示的な抗体のいずれか一つが結合したエピトープに結合する抗体であってもよい。本発明の他の実施態様では、インタクトなタンパク質でなく、アポトーシス性の生成されたタンパク質断片を特異的に認識する抗体を用いてもよい。このような抗体は、前記断片を免疫原として用いて、インタクトなタンパク質でなくアポトーシス性の生成されたタンパク質断片を結合する生成された抗体を同定する、標準的な免疫化方法によって調製されてもよい。
【００５６】
本発明の代表的な実施態様では、分析は、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動(「ＰＡＧＥ」)によって分離された溶解細胞から得られるタンパク質について実行される。タンパク質を抗体と接触させ、好ましくはイムノアッセイによって分析を行い、抗体に結合するタンパク質断片の存在を決定する。アポトーシスがないことがわかっている同様な溶解細胞(例えば同じ供与源及び／又は系統からの細胞)のタンパク質からなるコントロールと比較を行ってもよい。上記のいずれかのイムノアッセイを用いて生きている被検体からの組織試料を分析してもよい。この分析のために可能な生体試料には、標準的な方法によって入手することができる血液細胞ないしは生検細胞又は組織試料が含まれる。上記の生体試料におけるアポトーシス性の生成されたペプチド断片のレベルは、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片に特異的に結合する抗体を用いる上記いずれかのイムノアッセイにおいて決定されうる。分析される被検体の生体試料において決定されるアポトーシス性の生成されたペプチド断片のレベルは、罹患していない患者細胞、又は公知の基準において見られるレベルと比較される。例示的な基準は、例えば、アポトーシスを経ていない細胞において(例えば、アポトーシスを誘導する薬剤にさらされていないコントロール細胞において)典型的に観察される一又は複数のタンパク質断片の存在及び／又は濃度であってもよい。このような実施態様は、例えば、異常なアポトーシスに特徴を示す症状を診断するために用いられてもよい。本発明のある実施態様では、アポトーシスのレベルは細胞内で観察され、例えばコントロール試料と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０又は５０パーセント、１００又は１５０パーセントのアポトーシス性の生成されたペプチド断片の増加となっている場合に、病的状態であることが示される。本発明の他の実施態様では、アポトーシスのレベルは細胞内で観察され、例えばコントロール試料と比較して、アポトーシス性の生成されたペプチド断片の増加が少なくとも１０倍、１００倍又は１０００倍となっている場合に、病的状態であることが示される。
本発明の実施態様は、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片の検出及び定量化に有用な免疫学的アッセイに使用するために応用してもよい。このようなアッセイには、必要に応じて、タンパク質断片を認識して結合することが可能な一又は複数の抗体が含まれうる。これらのアッセイは、様々な様式のウエスタンブロットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、酵素結合免疫蛍光アッセイ(ＥＬＩＦＡ)などを含むがこれらに限らず、当分野で周知の様々な免疫学的アッセイ様式の範囲内で実施される。
【００５７】
例示的な方法では、試料を、抗体-バイオマーカー複合体が形成するために十分な条件下で、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片などのバイオマーカーに特異的な抗体と接触させ、次いで該複合体を検出してもよい。タンパク質断片バイオマーカーの存在を検出することは多くの方法、例えば血漿又は血清を含む多種多様な組織及び試料を検定するためのウェスタンブロッティング(免疫沈降工程を含む場合と含まない場合)及びＥＬＩＳＡ手順によって行ってもよい。このようなアッセイ様式を用いた広範囲にわたるイムノアッセイ技術は利用可能である。米国特許第４０１６０４３号、同第４４２４２７９号及び同第４０１８６５３号参照。これらには、単一の部位及び２-部位の両方、あるいは非競合型の「サンドイッチ」アッセイ、並びに従来の競合的結合アッセイが含まれる。また、これらのアッセイには、標的バイオマーカーに対する標識抗体の直接結合が含まれる。
サンドイッチアッセイは最も有用なものの一つで、一般的に用いられるアッセイである。サンドイッチアッセイ技術には多くのバリエーションあり、そのすべては本発明により包含されることを目的とする。簡潔には、代表的な最近のアッセイでは、非標識抗体を固体基板上に固定して、試験する試料を結合した分子に接触させる。抗体-抗原複合体が形成されるくらいの適当な期間インキュベートした後、検出可能なシグナルを産生できるレポーター分子で標識した、抗原特異的な第二抗体を添加して、更なる抗体-抗原-標識抗体の複合体が形成されるために十分な時間インキュベートする。反応しなかった材料を洗い流し、レポーター分子により産生されるシグナルを観察することによって抗原の存在を決定する。結果は、可視的なシグナルを単純に観察したものであれば質的なものであり、バイオマーカーを既知量含有するコントロール試料と比較したものであれば量的なものである。
【００５８】
前記のアッセイへのバリエーションには、試料及び標識抗体の両方を結合した抗体に同時に添加する同時アッセイなどがある。これらの技術は当分野の技術者には公知であり、多少のバリエーションが加えられることは容易に明らかであろう。代表的な近年のサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーに対して特異性を有する第一抗体は固形表面に共有結合するか受動的に結合する。固形表面は一般的にガラス又はポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固形支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートの皿、又はイムノアッセイを行うために適切な他の任意の表面の形態でもあってもよい。結合方法は従来技術において周知であり、一般に、架橋性共有結合物理的吸着から成り、ポリマー-抗体複合体は試験試料の調整において洗浄される。次いで、試験される試料の分割量を固相複合体に添加し、抗体中に存在する任意のサブユニットが結合するために十分な時間(例えば、より便利であるならば２〜４０分又は前夜)と適切な条件(例えば室温から４０℃、例えば２５℃から３２℃の間)下でインキュベートする。インキュベーションの後、抗体サブユニット固相を洗浄して、乾燥させ、一部のバイオマーカーに特異的な二次抗体とともにインキュベートする。二次抗体は、分子マーカーへの二次抗体の結合を表すために用いられるレポーター分子に結合させる。
【００５９】
別法では、試料中の標的バイオマーカーを固定して、その後レポーター分子にて標識しているか又は標識していない特異的抗体に固定された標的を曝すことを伴う。標的の量及びレポーター分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体で直接標識することによって、検出可能でありうる。あるいは、一次抗体に特異的な二次標識抗体を標的-一次抗体複合体に曝して、標的-一次抗体-二次抗体の三位複合体を形成させる。複合体は、レポーター分子により発されるシグナルにより検出される。本明細書中で用いられる「レポーター分子」は、その化学的性質によって、抗原と結合した抗体を検出するための分析して同定可能となるシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイにおいて、最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光体又は分子を含有する放射性核種(すなわち放射性同位体)及び化学発光分子である。
酵素イムノアッセイの場合、一般にグルタールアルデヒド又は過ヨウ素酸塩によって、酵素を二次抗体にコンジュゲートさせる。しかしながら、容易に認識されるように、技術者に容易に利用可能である多種多様な異なるコンジュゲート技術が存在する。一般的に用いられる酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ−中でもガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼなどがある。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解の際に生じる検出可能な色の変化で選択する。適切な酵素の例として、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどがある。また、上記の色素生産性基質よりも蛍光性産物を産生する蛍光性基質を用いることができる。多くの場合、酵素標識抗体を一次抗体-分子マーカー複合体に加えて、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。次いで、適当な基質を含有する溶液を抗体-抗原-抗体の複合体に加える。基質は二次抗体と結合した酵素と反応して、通常は分光測定法による量的なものでもある定性的な可視化シグナルを生じ、試料中に存在するバイオマーカーの量を表す。あるいは、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光性化合物を、抗体の結合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を照射することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを吸収し、それによリその分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を用いて目視で検出可能な特徴的な色で光が放射される。ＥＩＡでは、蛍光標識抗体は、一次抗体-分子マーカー複合体に結合できる。結合していない試薬を洗い落とした後に、残りの三位複合体を適当な波長の光に曝すと、対象の分子マーカーの存在を示す蛍光発光が観察される。免疫蛍光法及びＥＩＡ技術は何れも、当分野で非常に確立されたものである。しかしながら、放射性同位体、化学発光性分子又は生物発光性分子などの他のレポーター分子も用いられてもよい。
【００６０】
上記のように、本発明の実施態様は、完全なタンパク質(例えば完全長タンパク質の切断によって生成されるエピトープに結合する抗体)でなく、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片に結合する抗体を用いてもよい。このような実施態様を用いて、免疫組織化学染色技術によって細胞のタンパク質断片を調べることができる。このような技術では、組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい(例として、“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,” 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.を参照)。当分野の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する組織の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。実施例では、中性緩衝ホルマリン、ブアン固定液又はパラホルムアルデヒドを用いて組織試料を固定してもよい。組織調製の後に、組織切片に対して当分野で公知の多様な免疫組織化学技術のいずれか一つを行ってもよい。
【００６１】
Ｂ．材料
多種多様なアポトーシスを誘導する薬剤のいずれか一、並びにアポトーシス性の細胞死の間に生成される本明細書中で開示されるタンパク質断片を結合する抗体を含む本発明の実施において、様々な材料が用いられてもよい。例示的なアポトーシスを誘導する薬剤には、Ａｐｏ２Ｌ、抗ＤＲ４ないしはＤＲ５アゴニスト抗体、ＦａｓＬ及び抗Ｆａｓアゴニスト抗体が含まれる。本方法において使用することができるＡｐｏ-２Ｌには、上掲のPitti等、上掲の国際公開第97/25428号、及び上掲の国際公開第97/0163号に記載されたＡｐｏ-２Ｌポリペプチド(ＴＲＡＩＬと称されるポリペプチド)を含む。全長ポリペプチド並びに細胞外ドメイン(ＥＣＤ)配列を含んでなるＡｐｏ-２Ｌの可溶型のような、Ａｐｏ-２Ｌの様々な形態を使用することができると考えられる。そのような可溶型ＥＣＤ配列の例には、Pitti等, J. Biol. Chem., 271：12687-12690 (1996)の図１Ａに示されたＡｐｏ-２Ｌ配列のアミノ酸１１４−２８１、９５−２８１、９１−２８１又は９２−２８１を含んでなるポリペプチドが含まれる。アミノ酸９２−２８１を含んでなるポリペプチはＡｐｏ-２Ｌの天然に切断した型であると現在は信じられている。本出願人は、ＣＨＯ細胞においてヒトＡｐｏ-２Ｌを発現させ、９２−２８１ポリペプチドがＡｐｏ-２Ｌの発現型であることを見出した。国際公開第97/25428号に記載された共有結合的に修飾された型のようなＡｐｏ-２Ｌの修飾型が含まれる。特に、ポリエチレングリコールのような非タンパク性ポリマーに結合したＡｐｏ-２Ｌが本方法に使用されるものに含まれる。Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは国際公開第97/25428号に記載された方法の何れかにより調製することができる。
【００６２】
該方法で使用されうるアポトーシス活性を有するＡｐｏ-２リガンドの変異体は、例えばアラニンスキャン技術により同定されたものを含む。特に置換変異体は、位置２０３、２１８又は２６９でアミノ酸の少なくとも１種がアラニン残基で置換された、Pitti等, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)の図１Ａのアミノ酸９１-２８１を含んでなる。場合によっては、Ａｐｏ-２リガンド変異体は１又は複数のこれら３つの異なった部位の置換を含みうる。
Ａｐｏ-２Ｌ及び／又はＦａｓＬのアポトーシス活性を模倣する分子がまた現在開示した方法において使用しうると考えられる。そのような分子の例には、Ａｐｏ-２Ｌに少なくとも匹敵するか、もしくは同様な方法でアポトーシスを誘発しうるアゴニスト抗体が含まれる。特に、これらのアゴニスト抗体はＡｐｏ-２Ｌのレセプターの一又は複数に対する抗体を含む。好ましくは、アゴニスト抗体は、ＤＲ４又はＤＲ５のような細胞質死ドメインを含むＡｐｏ-２Ｌレセプターに対する。さらに好ましくは、アゴニスト抗体は、そのようなレセプターに結合し、その結合は例えばＦＡＣＳ分析又はＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。ＤＲ５(又はＡｐｏ-２)と呼ばれるレセプターに対するアゴニスト抗体は、以下に記載するような融合技術を使用して調製されている。ＤＲ５又はＡｐｏ-２レセプターアゴニスト抗体の一つは３Ｆ１１.３９.７と呼ばれ、1998年1月13日に寄託番号ＨＢ-１２４５６としてＡＴＣＣに寄託されている。Ａｐｏ-２Ｌレセプター抗体のアゴニスト活性は、アポトーシス活性の様々な検査方法を使用して測定することができ、さらに場合によっては、このような抗体のアポトーシス活性は、Ｆｃ免疫グロブリン又は補体を用いて、抗体、単独又は架橋結合した形態でアッセイすることにより決定される。
【００６３】
さらに、ＤＲ４と呼ばれる他のＡｐｏ-２Ｌレセプターに対するアゴニスト抗体もまた、調製される。例としてＤＲ４アゴニスト抗体は、４Ｈ６.１７.８と称され、1998年1月13日に寄託番号ＨＢ-１２４５５としてＡＴＣＣに寄託されている。Ａｐｏ-２Ｌレセプター抗体のアゴニスト活性は、アポトーシス活性の様々な検査方法を使用して測定することができ、さらに場合によっては、このような抗体のアポトーシス活性は、アポトーシス活性を検査するための様々なアッセイを用いて測定してもよいし、場合によっては、Ｆｃ免疫グロブリン又は補体を用いて、抗体、単独又は架橋結合した形態をアッセイすることにより測定することもできる。
本発明において考察されているアゴニスト抗体には、１つのＡｐｏ-２Ｌレセプター又は１以上のＡｐｏ-２Ｌレセプターと結合する抗体が含まれる。１以上のＡｐｏ-２Ｌレセプターを結合する抗体は、例えば以下の実施例にあるようにＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより決定される、２又はそれ以上のそれぞれ異なる抗原と「交差反応し」、それぞれの異なる抗原と結合することができる抗体として特徴づけられうる。場合によっては、２又はそれ以上の異なる抗原と「特異的に交差反応する」抗体は、第１の抗原と結合するもので、さらに第２の異なる抗原と結合し、約１０μｇ／ｍＬの抗体濃度で第２の抗原に対する抗体の結合能力は、捕獲ＥＬＩＳＡ(以下の実施例にあるような)で決定されるように第１の抗原の結合能力の約５０％〜約１００％(好ましくは約７５％〜約１００％)である。例えば抗体は、ＤＲ５(「第１抗原」)と特異的に結合しても、更にＤＲ４のような他のＡｐｏ-２レセプター(「第２抗原」)と特異的に交差反応してもよく、ここで、約１０μｇ／ｍＬの抗体のＤＲ４との結合の範囲は、ここでの捕獲ＥＬＩＳＡにおいてＤＲ５に対する抗体の結合能力の約５０％〜約１００％である。様々なＡｐｏ-２Ｌレセプターとの抗体の交差反応は、国際特許出願番号PCT/US99/13197の更なる詳細に記載される。
以下に記載されるように、本発明の実施態様の実施において有用な抗体の例示的な形態としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
【００６４】
１．ポリクローナル抗体
本発明の実施において用いられる抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射することにより哺乳動物に注射する。免疫化剤は、例えば完全又は部分的なＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)ポリペプチドを含みうる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物で免疫原性が知られたタンパク質に抱合させるのが有用である。そのような免疫原性タンパク質の例は、限定するものではないが、キーホール・リンペット(keyhole limpet)ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。哺乳動物から採血し、血清を検定して抗体価を求める。望まれるならば、抗体価が増加又は平坦化するまで哺乳動物に追加免疫を施す。
【００６５】
２．モノクローナル抗体
本発明の実施において用いられる抗体は、あるいは、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256：495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するかあるいは産生可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親の細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００６６】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これはカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。そのようなマウス骨髄腫細胞株の例は、Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１である。ヒトモノクローナル抗体産生ためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Kozbor, J. Immunol., 133：3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
ハイブリドーマ細胞が培養される培地は、次いで所望の免疫原に対するモノクローナル抗体の存在について検定することができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107：220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００６７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
【００６８】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明の実施において用いられるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順によって(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。場合によって、本明細書中で開示される抗体のいずれか一などの抗体の少なくとも一の可変ドメイン又は高頻度可変ドメインを含むキメラ抗体が構築されてもよい。
場合によって、本発明の抗体は、本明細書中で開示されるいずれかの抗体と同じエピトープ(一又は複数)に結合するであろう。これは本明細書において記載されるような様々なアッセイを実施することによって決定されてもよい。例えば、モノクローナル抗体が本明細書において特別に言及される抗体と同じ特異性を有するか否かを決定するために、アポトーシスアッセイにおいてその活性を比較してもよい。
【００６９】
本発明の実施において用いられる抗体は、「架橋」抗体を含む。ここにおいて使用されている「架橋」という用語は、一（又は単）分子を形成するための、少なくとも二つのＩｇＧ分子が互いに結合することを称する。抗体は種々のリンカー分子を使用して架橋されてもよい。場合によっては、抗体は、抗ＩｇＧ分子、補体、化学修飾又は分子工学を使用して架橋される。一度抗体が細胞表層膜へ結合すると、補体が抗体分子に対して比較的に高い親和性を有することは、当業者とっては高く評価されることである。従って、細胞表層膜へ結合している二又はそれ以上の抗体を連結するための架橋分子として、補体を使用してもよいと考えられる。種々のマウスＩｇアイソタイプの中で、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは、補体を固定することが知られている。
本発明の実施において用いられる抗体は、抗体の多価型と同様に、二量体抗体を任意に含むことができる。当業者は、当該分野で知られている技術及びここにおける抗Ａｐｏ-２Ｌレセプター抗体を使用して、そのような二量体又は多価型を組み立てることができる。
本発明の実施において用いられる抗体は一価抗体を含み得る。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連したシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【００７０】
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。例えば、消化はパパインの使用により行うことができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日に公開された国際公開第94/29348号、及び米国特許第4,342,566号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Ｆａｂ断片と呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原の架橋が尚も可能なＦ(ａｂ')２断片が得られる。
また、抗体の消化により生産されたＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体のヒンジ領域から一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されているということで、Ｆａｂ断片とは異なっている。Ｆａｂ'-ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、本来は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
また、Iliades等, FEBS Letters, 409：437-441 (1997)に記載されているように、一本鎖Ｆｖ断片も産生されうる。このような一本鎖断片の種々のリンカーを用いた結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10：423-433 (1997)に記載されている。
【００７１】
上記に記載の抗体に加えて、キメラ又はハイブリッド抗体が、架橋剤を含む合成タンパク質化学における周知の方法を用いてインビトロで調製されうると考えられる。例えば、免疫毒素はジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合の形成により作成することができる。この目的に好適な薬剤の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミデートが含まれる。
本発明の実施において用いられる抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合性サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321：522-525 (1986)；Riechmann 等, Nature, 332：323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2：593-596 (1992)］。
【００７２】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野で良く知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者の方法［Jones等, Nature, 321：522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332：323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239：1534-1536 (1988)］に従って、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性の軽減のためには、ヒト化抗体を作成するために使用するヒトの可変ドメイン、軽鎖及び重鎖両方の選択が非常に重要である。「ベストフィット法」に従うと、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる［Sims等, J. Immunol., 151：2296-2308 (1993)；Chothia及びLesk, J. Mol. Biol., 196：901-917 (1987)］。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる［Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285-4289 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151：2623-2632 (1993)］。
【００７３】
さらに、抗体は、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、ＦＲ残基を共通及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている［1994年、3月3日に公開された国際公開第94/04679号を参照］。
【００７４】
ヒトモノクローナル抗体は、ヒトＢリンパ球を融合パートナーとして使用する、Kohler及びMilsteinによって最初に記載されたハイブリドーマ法を適応することによって作製することができる。関心ある抗体を生産するヒトＢリンパ球は、例えば、インフォームド・コンセントを得た後に、ヒト個人から単離される。例えば、個人は、全身性紅斑性狼瘡(Shoenfeldら，J.Clin. Invest., 70：205(1982)）、免疫媒介血小板新生紫斑病(ＩＴＰ）(Nugentら，Blood, 70(1)：16-22(1987)）、又は癌のようなある疾患とともに生じる自己抗原に対する抗体を生産している。或いは、又は付加的に、リンパ球はインビトロで免疫化される。例えば、単離されたヒト末梢血リンパ球をlysomotrophic agent(例えばＬ-ロイシン-Ｏ-メチルエステル、Ｌ-グルタミン酸ジメチルエステル又はＬ-ロイシル-Ｌ-ロイシン-Ｏ-メチル エステル）（米国特許第5,567,610号、Borrebaeck等,）へ暴露させる；及び／又はインビトロでＴ細胞欠損ヒト末梢血リンパ球を８-メルカプトグアノシン及びサイトカインのようなアジュバントで処理（米国特許第5,229,275号、Goroff等）してもよい。
被検者より回収されたかインビトロで免疫化されたＢリンパ球は、次には通常、ヒトモノクローナル抗体を生成するために不死化される。限定されるものではないが、Ｂリンパ球を不死化する技術は、（ａ）ヒトＢリンパ球とヒト、マウスミエローマ又はマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞との融合；（ｂ）ウイルスによる形質転換（例えば、エプスタイン・バーウイルス；例えば、Nugentら，上掲を参照のこと）；（ｃ）リンパ芽球腫細胞株との融合；又は（ｄ）リンパ腫細胞との融合、を含む。
【００７５】
リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.590-103(Academic Press, 1986))。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、成長させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。適切なヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133：3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により成長させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【００７６】
また、ヒト抗体は、ヒト抗体を生産することのできるマウスのような非ヒト宿主を使用して生成してもよい。上記のように、免疫化することで、内在性免疫グロブリンが生成されない状態でもヒト抗体の完全リパートリを生成することができるトランスジェニックマウスを利用することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおいて抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子をホモ接合的に欠失させると内在性抗体生産の完全な阻害が生じることが記述されている。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列を移すと、抗原投与時にヒト抗体の生成が生じる。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：2551(1993)；Jakobovits等, Nature, 362：255-258 (1993)；Bruggermann等, Year in Immuno., 7：33 (1993)；米国特許第5,591,669号；米国特許第5,589,369号；及び米国特許第5,545,807号を参照のこと。また、ヒト抗体は、ＳＣＩＤ-ｈｕマウス（Duchosalら，Nature 355：258-262(1992)）を使用して作製してもよい。
【００７７】
その他の実施態様では、ヒト抗体は、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリより選択してもよい。抗体又はその断片のライブラリの調製は当該分野で良く知られており、宿主細胞へ導入可能な形質転換ベクターのファミリの構築のためには、いずれの既知の方法を使用してもよい。ファージ中の抗体軽鎖及び重鎖(Huseら，Science, 246：1275(1989)）、又はファージ或いはファージミド中の融合タンパク質のライブラリは、既知の方法によって調製が可能である。例えば、Vaughan等, Nature Biotechnology 14：309 -314(1996)；Barbasら，Proc. Nalt. Acad. Sci., USA, 88：7978-7982(1991)；Marks等, J.Mol.Biol., 222：581-597(1991)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227：381-388 (1992)；Barbasら，Proc. Nalt. Acad. Sci., USA, 89：4457-4461(1992)；Griffiths等, EMBO Journal, 13：3245-3260(1994)；de Kruifら，J. Mol. Biol., 248：97-105(1995)；国際公開第98/05344号；国際公開第98/15833号；国際公開第97/47314；国際公開第97/44491号；国際公開第97/35196号；国際公開第95/34648号；米国特許第5,712,089号；米国特許第5,702,892号；米国特許第5,427,908号；米国特許第5,403,484号；米国特許第5,432,018号；米国特許第5,270,170号；国際公開第92/06176号；国際公開第99/06587号；米国特許第5,514,548号；国際公開第97/08320号；及び米国特許第5,702,892号を参照のこと。関心ある抗原は、標的抗原と結合するファージ抗体を選択するための分野において既知の方法を使用し、ファージライブラリに対して選別される。
【００７８】
ここに記載の抗体は、場合によっては一又は複数の所望する生物活性又は特性を有する。そのような抗体は、限定されないが、キメラ、ヒト化、ヒト、及び親和性成熟抗体を包含してもよい。記載されているように、抗体は、これらの所望する活性又は特性を達成するための種々の技術を使用して構築又は設計される。一実施態様では、抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは１０６Ｍ−１から１０７Ｍ−１の範囲、さらに好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１から１０１２Ｍ−１の範囲、及びよりさらに好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１から１０１２Ｍ−１の範囲の結合親和性を有する。抗体の結合親和性は、スキャッチャード分析法(Munsonら、上掲を参照のこと）を包含する当該分野において既知の技術に従った抗体の試験による過度の実験なしに測定することができる。
他の実施態様では、本発明の抗体は、本明細書中で開示した抗体が結合する同じエピトープと結合するか、又は本明細書中で開示した抗体が結合するエピトープと一致又は重複するエピトープと結合する。本発明の抗体のエピトープ結合特性は、当該分野において既知の技術を用いて決定されてもよい。例えば、抗体は、公知の結合相互作用をブロック又は阻害する抗体の能力を測定するための、競争阻害アッセイのようなインビトロアッセイにおいて試験されてもよい。
【００７９】
３．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305：537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えたため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を作成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開第93/08829号、及びTraunecker等, EMBO J.,10：3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を生成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121：210(1986)を参照されたい。
【００８０】
４．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対して標的化させるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第91/00360号；国際公開号92/200373号；欧州特許第03089号］提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を使用してインビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な薬剤の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
【００８１】
５．トリアボディ(triabodies)
トリアボディも本発明の範囲内である。このような抗体は、例えば上掲のIliades等及び上掲のKortt等に記載されている。
【００８２】
６．他の修飾
抗体の他の修飾はここにおいて考慮されている。本発明の実施において用いられる特定の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第81/01145号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素、又は細胞障害剤(毒素分子等)に抗体をコンジュゲートさせることにより修飾することができる。例えば国際公開第88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。また、この技術は、「抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法」(ＡＤＥＰＴ）と呼ばれている。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；カスパーゼ、例えばカスパーゼ-３；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβ-ラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、当該技術において「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328：457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００８３】
この酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えばヘテロ二官能性架橋剤を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312：604-608[1984])。
当分野で公知であるように、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を検出するためにイムノアッセイにおいて用いられるものなどの抗体を様々な造影剤(imaging agent)にコンジュゲートさせてもよい。抗体と造影剤とを直接又は連結してコンジュゲートしてもよいし、又は中間体分子基が抗体と活性剤との間に提供されてもよい。しばしば用いられる架橋剤(crosslinker)は、付着部位を各々の成分に提供することによってコンジュゲートを促す。架橋剤には、スペーサーとして働いて互いに成分を分離して他の活性を阻害することを防ぐ更なる分子基が含まれる。
【００８４】
造影()は、当業者に周知の多くの手順によって実施されてよく、このような手順で有用な適切な造影剤は周知の方法によって抗体にコンジュゲートされてもよい。例えば、ウェスタン手順の結果を、放射性シンチグラフィ、核磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)又はコンピューター断層装置(ＣＴスキャン)によって可視化することによって造影してもよい。共通して使用される放射性核種造影剤には放射性ヨウ素やインジウムが含まれる。ＣＴスキャンによる造影は、鉄キレートなどの重金属を使用してもよい。ＭＲＩスキャニングは、ガドリニウム又はマンガンのキレートを使用してもよい。更に、ポジトロン放出断層撮影(ＰＥＴ)は、酸素、窒素、鉄、炭素又はガリウムのポジトロン発光体を使用して可能である。造影手順で有用な放射性核種の例には、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ及び２０６Ｂｉなどがある。  
出典明記によって本明細書中に援用される、Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Fla., and Barchel, S. W.及びRhodes, B. H., (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y.は、抗体のアミノ酸への様々な治療用及び診断用の放射性核種のコンジュゲートを教示している。このような反応は、適切なリンカーによって抗体に放射性核種をコンジュゲートするために応用されてもよい。適切な標識には、例えば、放射性核種、酵素(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ)、基質、補助因子、インヒビター、蛍光剤、化学発光剤(chemiluminescer)及び／又は磁性粒子などがある。このような標識の使用を教示している特許の例として、米国特許第３８１７８３７号；同第３８５０７５２号；同第３９３９３５０号；同第３９９６３４５号；同第４２７７４３７号；同第４２７５１４９号；及び同第４３６６２４１号を参照のこと。これらすべては出典明記によって援用される。
【００８５】
さらなる抗体の修飾も考察されている。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。また抗体は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）にコロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Oslo編(1980)に開示されている。抗体の血清半減期を増大させるために、米国特許第5,739,277号に記載されているように抗体(特に抗体断片）へサルベージレセプター結合エピトープを組み込んでもよい。ここで使用される「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を増加させる原因となるＩｇＧ分子(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを称する。
【００８６】
７．組み換え体方法
本発明はまた、対象のポリペプチドをコードする単離された核酸、例えば、タンパク質断片(例として、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片)及び／又は本明細書中で開示される抗体、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び対象のポリペプチドの生産のための組換え技術を提供する。
対象のポリペプチドの組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。対象のポリペプチドをコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法(例えば、対象のポリペプチドをコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用するもの)を用いて配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
ここにおける方法は、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)を結合し、抗体軽鎖又は重鎖（又は軽鎖及び重鎖の両方）をコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターを提供する工程、宿主細胞をベクターでトランスフェクト又は形質転換する工程、及び組み換え産物を産生するのに十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、キメラ又は組み換え体抗体の生産のための方法を包含する。
【００８７】
（i）シグナル配列成分
対象のポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても産生される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然のシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第90/13646号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡにリーディングフレームが結合される。
【００８８】
（ii）複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
【００８９】
（iii）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシラス菌に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換したこれらの細胞は、抗薬物性を付与し、選択療法を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンが使用される。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【００９０】
あるいは、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85：12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ATCC20,622あるいは 38,626)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
さらに、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8：135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9：968-975 (1991)。
【００９１】
（iv)プロモーター成分
通常、発現及びクローニングベクターは、宿主生体により認識され、抗体核酸に作用可能に結合するプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた対象のポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００９２】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的利点を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第73657号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００９３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによって、提供されるこのようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIIIＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の変更例は米国特許第4,601,978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００９４】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による対象のポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297：17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００９５】
（vi）転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、多価抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示した発現ベクターを参照されたい。
【００９６】
（vii）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びＢ．リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開された DD 266,710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ATCC31446)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ATCC31537)及び大腸菌Ｗ３１１０(ATCC27325)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ATCC12424)、Ｋ．ブルガリカス(ATCC16045)、Ｋ．ウィッケラミイ(ATCC24178)、Ｋ．ワルチイ(ATCC56500)、Ｋ．ドロソフィラルム(ATCC36906)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(欧州特許第402,226号)；ピチア・パストリス(欧州特許第183,070号)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(欧州特許第244,234号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属(Aspergillus)宿主、例えば偽巣性コウジ菌(A. nidulans）及びクロカビ(A. niger）が使用できる。
【００９７】
対象のポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、このようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００９８】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓株［293又は懸濁培養での成長のためにサブクローン化された293細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36：59 (1977)］；ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77：4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞［TM4, Mather, Biol. Reprod., 23：243-251 (1980)］；サルの腎細胞 (CVI ATCC CCL 70)；アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34)；バッファローラット肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；マウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATTC CCL51)；ＴＲＩ細胞［Motherほか, Annals N.Y. Acad. Sci., 383：44-68 (1982)］；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝癌株(HepG2)；及びミエローマ又はリンパ腫細胞(例えば、Y0, J558L, P3及びNS0細胞）(米国特許第5,807,715号を参照のこと）である。
宿主細胞は、対象のポリペプチドの生成のための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
【００９９】
（viii）宿主細胞の培養
対象のポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地、例えばハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58：44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102：255 (1980), 米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,927,762号；同4,560,655号；又は同5,122,469号；国際公開第90/03430；国際公開第87/00195；又は米国特許再発行第30,985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１００】
（ix）精製
組換え技術を使用する場合、対象のポリペプチドは細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。対象のポリペプチドが細胞内に生成される場合、第１段階として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は限外濾過にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10：163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌されるタンパク質を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。対象のポリペプチドが培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には第１に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１０１】
細胞から調製した組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62：1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5：15671575 (1986)）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他の技術も、回収される対象のポリペプチドに応じて利用可能である。
【０１０２】
III．製造品
本発明の他の実施態様では、前述した方法の実施態様の実施に有用な物質を具備する製造品が提供される。製造品は容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器はアポトーシスの観察に有効な組成物を収容しており、滅菌したアクセスポートを有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。組成物中の典型的な薬剤には、ＡＰ２-α(配列番号：１)、クラスリン重鎖(配列番号：２)、ＡＰ１／２β(配列番号：３)又はダイナミン(配列番号：４)のタンパク質断片を結合する一又は複数の抗体が含まれる。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、アポトーシスの観察及び／又は選択された病状の評価に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０１０３】
このような一実施態様では、本発明は、細胞アポトーシスの検出において、そして、それに関連する疾患の診断において用いられうるキットを提供する。このような一キットは、(1) アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合することが可能な一次抗体と、(2) シグナルを産生する標識にコンジュゲートされた二次抗体と(該二次抗体は一次抗体に結合するものである)、(3) タグ化二次抗体を認識することが可能なシグナルを産生する三次試薬とを具備する。本発明係るアポトーシス性の生成されるタンパク質断片の検出に有用である他のキットは、(1) アポトーシスの間に生成されるタンパク質断片に結合することが可能な一次抗体と、(2) シグナルを産生する標識にコンジュゲートされた二次抗体とを具備し、該二次抗体はアポトーシス性の生成されるタンパク質断片とも反応するが、一次抗体が結合する部位とは異なる部位に結合するものである。 
本発明のキットの実施態様では、二次抗体に結合したシグナル産生性の標識は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素であってもよい。酵素及び基質はキットに具備されるのが好ましい。また、キットは、アッセイされる試料又は一次抗体が固定されうるコーティングしていない支持体を具備していてもよい。
【０１０４】
IV．アポトーシスと関係している細胞過程を調べるための本発明の方法と材料の使用
本発明の方法及び材料は、エンドサイトーシスなどの多種多様な細胞過程を調べるために用いてもよい。本発明のある実施態様は、例えば、アポトーシスの指標として細胞性エンドサイトーシスの速度の変化を観察し、アポトーシスの証拠となるエンドサイトーシスを阻害するものである。エンドサイトーシスは細胞ホメオスタシスの様々な態様に重要である。エンドサイトーシスは膜結合型小胞を通して細胞膜(ＰＭ)結合型タンパク質を内部移行させ、養分摂取、増殖因子シグナル伝達及び膜ホメオスタシスなどの多くの細胞性機能を支持する(Conner, S.D.等, Nature 422, 37-44 (2003)を参照)。最も特徴的なエンドサイトーシス経路のうちの一つはタンパク質クラスリンに依存する(Bonifacino, J.S.等, Annu Rev Biochem 72, 395-447 (2003)を参照)。アダプタータンパク質２(ＡＰ２)などのクラスリンアダプターは、クラスリン-被覆小孔として知られるＰＭ陥入の形成の間、クラスリンをエンドサイトーシスカーゴの細胞質の決定基に連結させる。アダプターはまた、補助的又は調節タンパク質を補充することによってエンドサイトーシスの足場機能を果たす(Owen, D.J., et. al, P.R. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 153-91 (2004)を参照)。ダイナミンによるＧＴＰ加水分解は、ＰＭからエンドサイトーシス運搬小胞を放出するために深く陥入した被覆小孔の切断を促す。アンコーテイングの後に、小胞は早期のエンドソームとドッキングして融合し、カーゴは、例えばＰＭに再利用するための管-小胞のエンドソーム膜、又はリソソーム分解のための多小胞の後期エンドソームの内膜など、異なる運命をたどる。
【０１０５】
本発明の方法及び材料を使用して、プロ-アポトーシス性のデスレセプター(ＤＲ)がクラスリンに依存するエンドサイトーシス機構を選択的に破壊する引き金となることが示される。ＤＲ刺激は、重要なクラスリン-経路構成成分の迅速な、カスパーゼが媒介する切断を誘導し、典型的なカーゴタンパク質トランスフェリンの細胞性取り込みを停止させる。ＤＲ近位のイニシエーターであるカスパーゼは機能的に異なるドメイン間のクラスリンアダプターサブユニットＡＰ２αを切断したのに対して、エフェクターカスパーゼはクラスリンの重鎖をプロセシングした。ＤＲ５はリガンド誘導性のクラスリンが媒介するエンドサイトーシスを経ることが示されており、これによってＤＲシグナル伝達複合体の内部移行がカスパーゼによってクラスリン-経路ターゲッティングを容易にするということがいえる。エンドサイトーシス-遮断性、温度感受性のダイナミン-１変異体は、ＤＲ内部移行を低減し、ＤＲの下流のカスパーゼ刺激を亢進し、アポトーシスを増加させた。ゆえに、ＤＲが誘発するカスパーゼ活性は、クラスリン依存性のエンドサイトーシスを中断させ、プログラムされた細胞死を増幅させる。
以下、本発明の方法と材料の更なる例示的な適用について説明する。
【０１０６】
ＤＲ活性化は、クラスリン依存性のエンドサイトーシス機構のカスパーゼが媒介する切断を誘導する
ＤＲ５エンドサイトーシスの研究において、ＤＲ５リガンドＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬがＡＰ２のαサブユニット(ＡＰ２α)のタンパク質分解性の切断を引き起こすことが観察された。いくつかの癌細胞株の分析から、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬがカスパーゼ-８及び-３の予想されるプロセシングだけでなく、ＡＰ２α、ＡＰ１／２β及びクラスリン重鎖(ＣＨＣ)の切断も促進することが示された(図１ａ)。これらの現象は２時間以内に生じ、ＨＣＴ８などの耐性細胞株よりも、Ｃｏｌｏ２０５、ＢＪＡＢ及びＨｅＬａ-ＭなどのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが誘導するアポトーシスに影響されやすい細胞株に限定されていた(図１ａ)。更なる細胞株によりこの所見を確認した(図７ａ)。ＦａｓＬは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと同様に、ＢＪＡＢ細胞におけるＡＰ２αとＣＨＣの切断を刺激した(図７ｂ)。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬもダイナミンの切断を誘導し、刺激から１時間以内に完全長タンパク質の枯渇が生じた(図７ｃ)。同じ時間枠において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、他のタイプのクラスリン依存性の小胞運搬現象を媒介する構造的に類似したアダプターのタンパク質分解を誘導しなかった(図１ｂ)。これには、トランスゴルジネットワークとエンドソーム間の輸送を支持するＡＰ１α、ＡＰ３βないしδ、及びＡＰ４ε、そして、小胞体とゴルジ間の運搬を媒介するＣＯＰ-Ｉサブユニットβ-ＣＯＰ又はＣＯＰ-ＩＩサブユニットＳｅｃ２３などがある(例としてBonifacino, J.S.等, Annu Rev Biochem 72, 395-447 (2003)及びMcMahon, H.T.等, Curr Opin Cell Biol 16, 379-91 (2004)を参照)。したがって、ＤＲ活性化により、クラスリン依存性のエンドサイトーシスに伴うタンパク質の迅速かつ特異的な切断が促進される。
【０１０７】
カスパーゼ-８及び-３のリガンド誘導性のプロセシングを阻害した用量のパン-カスパーゼインヒビターであるＮ-ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン(ｚＶＡＤ-ｆｍｋ)による前処置により、ＡＰ２α及びＣＨＣ(図２ａ)、並びにＢＪＡＢ細胞におけるＡＰ２α(図８ａ)の切断が阻害されることから、カスパーゼ活性の必要性が示唆された。さらに、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬは、ｗｔジャーカットＴ細胞においてＡＰ２αとＣＨＣの切断を誘導したのに対し、いずれのリガンドもカスパーゼ-８欠損変異体ジャーカット細胞株又はＦＡＤＤ欠損変異体ジャーカット細胞株においてこれらターゲットのプロセシングを刺激しなかった(図８ｂ)。ＡＰ２α切断は速く、カスパーゼ-８プロセシングの時間と相関しており、カスパーゼ-３プロセシングに先行していた(図１ａ)。それに対して、ＣＨＣ切断は相対的に遅く、カスパーゼ-３プロセシングの時間とより相関していた。ＨＣＴ１１６細胞では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによるカスパーゼ-３活性化とアポトーシス誘導はＢａｘが必要であるのに対し、カスパーゼ-８刺激は必要としない(例としてLeBlanc, H.N.等, Cell Death Differ 10, 66-75 (2003)を参照)。予想されるように、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＢａｘ＋／−ＨＣＴ１１６細胞においてはカスパーゼ-８と-３両方のプロセシングを刺激するが、Ｂａｘ−／−ＨＣＴ１１６細胞においてはカスパーゼ-８のみを刺激する(図２ｂ、ｃ)。ＡＰ２α切断はＢａｘとは無関係であるのに対して、ＣＨＣ切断はＢａｘを必要とする(図２ｂ、ｃ)。カスパーゼ-３を欠損しているＭＣＦ７細胞においては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはカスパーゼ-８及びＡＰ２αのプロセシングを相対的に弱く、ゆっくりと誘導するが、ＣＨＣ切断は刺激しなかった(図２ｄ)(例としてKischkel, F.C.等, Immunity 12, 611-20 (2000)を参照)。さらに、ＨＴ１０８０細胞におけるカスパーゼ-３のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＣＨＣのリガンド誘導性のプロセシングをブロックするが、ＡＰ２αのリガンド誘導性のプロセシングはブロックしなかった(図８ｃ)。これらの所見から、ＤＲ経路のイニシエーターであるカスパーゼがＡＰ２αを切断するのに対して、エフェクターであるカスパーゼはＣＨＣをプロセシングすると言える。
【０１０８】
ＡＰ２αは２つの主要な機能部分であるＣ末端の「ｅａｒ」ドメインとＮ末端の「ｔｒｕｎｋ」ドメインを含有しており、「ヒンジ」領域によって連結されている(例としてOwen, D.J., et. al, P.R. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 153-91 (2004)を参照)。ＡＰ２α切断の一次部位を定めるために、Ｃ末端の３３ｋＤａの切断産物をＢＪＡＢ細胞から免疫精製し、質量分析によるそのトリプシンペプチドの同一性を確認した(図９ａ)。Ｎ末端配列決定により、ＤＶＦＤのすぐ上流の配列であるGPAAQPSLGPTPEEAFLS(図９ａ)が、非常に特徴的なカスパーゼ認識部位に似ているテトラペプチド配列であることが明らかになった(例としてStennicke, H.R., et. al, Biochem J 350 Pt 2, 563-8 (2000)を参照)。切断部位は、裂けやすい結合に隣接しているＰ１位及びＰ１'位のそれぞれにＡｓｐ及びＧｌｙを、Ｐ４位にＡｓｐを有しており、これらはカスパーゼ-８に十分に許容される(例としてBlanchard, H.等 J Mol Biol 302, 9-16 (2000)を参照)。このテトラペプチド切断部位配列はＡＰ２αのアイソフォームＡに存在するが、アイソフォームＣには存在しない。この相違と一致して、ＢＪＡＢ、Ｃｏｌｏ２０５、ＬＳ１０３４及びＳＷ９４８細胞において、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、アイソフォームＡほど多くないアイソフォームＣの切断を誘導しなかった。このＡＰ２α切断部位はヒンジ内に存在することから(図９ｂ)、その加水分解によりＡＰ２機能が破壊しうることが言える。特定の細胞株のより長いリガンド刺激により、二次部位でＡＰ２αの更なるプロセシングが生じた。この二次部位は最初の３３ｋＤａの断片内にあるようである(図７ａ及びｂ)。
これらカスパーゼが媒介する切断現象の機能的結果を評価するために、トランスフェリン(Ｔｆ)の取り込みを調べた。レセプター結合したＴｆの内部移行はクラスリン-被覆小孔を経て生じ、ＡＰ２を完全に必要とする(例としてBonifacino, J.S.等, Annu Rev Biochem 72, 395-447 (2003)を参照)。蛍光標識Ｔｆのエンドサイトーシス速度を決定するために、測定値を、開始時、取り込みの線形段階、内部移行したタンパク質がＰＭに細胞内再利用される前に限定した(図３ａ、挿入図)。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ＢＪＡＢ及びＣｏｌｏ２０５細胞のＴｆエンドサイトーシスの速度を７５〜８５％阻害したが(図３ａ、ｂ)、ｚＶＡＤ-ｆｍｋによる前処置により実質的にこの阻害が起こらなかった(図３ｃ)。したがって、ＤＲ活性化により、クラスリンが媒介するエンドサイトーシスはカスパーゼに依存して破壊される。
【０１０９】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはクラスリンが媒介するＤＲ５エンドサイトーシスを誘導する
クラスリン経路構成成分が迅速かつ選択的に切断されると、クラスリンコートタンパク質にＤＲが物理的に近いことによりタンパク質分解現象が促されうると言える。したがって、ＤＲ５がリガンド刺激時にクラスリンが媒介するエンドサイトーシスを経るかどうかを調べた。リガンド結合について競合しないレセプターの細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体(ｍＡｂ ５Ｃ７)を用いた(例としてKischkel, F.C.等, Immunity 12, 611-20 (2000)を参照)。３７℃での飽和量の５Ｃ７とのインキュベートは、他のオーバーラップしていないｍＡｂによって検出されるように表面ＤＲ５レベルに影響しないことから、５Ｃ７自体がＤＲ５エンドサイトーシスを変更しないことが確認された。ｍＡｂ ５Ｃ７(６４７５Ｃ７)の蛍光コンジュゲートを調製して、０℃でＣｏｌｏ２０５細胞に結合させ、その後、３７℃でＤＲ５エンドサイトーシスの動態を測定した(図４ａ)。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの三量体又は多量体の(抗体が架橋した)形態にさらすと、いずれもＤＲ５エンドサイトーシスの速度を２倍以下に促進した(図４ａ)。これによって２時間にわたるレセプター内部移行が３分の１以下、主に開始３０分以内になった(図４ｂ)。同様に、細胞-表面ＤＲ５は刺激から３０分の間に減少し、その後、このＤＲ５プールは安定した(図４ｃ)。同種の結果はＢＪＡＢ細胞においても観察された。３７℃でリガンドに短時間さらした際に得られたデータに反して(図４ａ)、曝露を２時間に延長すると、Ｔｆのエンドサイトーシスと同時にＤＲ５エンドサイトーシスが阻害され、それぞれ５分の１又は２．５分の１に速度が減少した(図４  ｄ)。これらの結果から、クラスリン経路がＤＲ５のエンドサイトーシスを支持していると言える。実際、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて短時間処理したＣｏｌｏ２０５細胞では、電子顕微鏡(ＥＭ)によりわずかな細胞表面５Ｃ７がクラスリン被覆小孔に局在しており、被覆されていない表面陥入部又は小窩部には局在が検出されなかった(図４ｆ−ｈ)。
【０１１０】
次に、レトロウイルス-感染細胞のＧＴＰアーゼダイナミン-１(ｄｙｎＧ２７３Ｄ)の温度感受性突然変異体のドキシサイクリン-調節発現に基づいた確立されたインターベンション方策を用いた。この変異体は、許容温度(３０℃)から非許容温度(３８℃)に変えると、急速かつ可逆的にクラスリン依存性のエンドサイトーシスを阻害する(例としてDamke, H.,等, J Cell Biol 131, 69-80 (1995)を参照)。ＨｅＬａ-Ｍ細胞の最初の実験により、ドキシサイクリン誘導がｄｙｎＧ２７３Ｄ発現を有する細胞の３８℃でのＴｆ取り込みをブロックするが、隣接する発現していない細胞でも３０℃でもブロックしなかったことが確認された(図５ａ−ｄ及び図１０ａ)。ＨｅＬａ-Ｍ又はＣｏｌｏ２０５細胞におけるｄｙｎＧ２７３Ｄの誘導発現は十分に安定していなかったのに対して、形質導入したＢＪＡＢ細胞株では安定しており、３８℃でのＴｆ取り込みを強くブロックした(図５ｅ)。ｄｙｎＧ２７３Ｄのドキシサイクリン刺激性の発現もまた、リガンド誘導性のＤＲ５取り込みを３０℃で２５％以下から３８℃で１０％以下に減少させ、エンドサイトーシスはドキシサイクリン非存在下において両温度で同程度であった(図５ｆ)。ＨｅＬａ-Ｍ細胞では、ｄｙｎＧ２７３Ｄ誘導の後に３８℃に移しても、リガンド誘導性のＤＲ５取り込みを低減した。おそらくｄｙｎＧ２７３Ｄ発現が減少したためにこの効果がＢＪＡＢ細胞において弱くなったのであろう(図１０ｂ)。これら２０分の取り込み実験でのＤＲ５取り込みの減少が、４分の取り込み間隔にわたってエンドサイトーシス速度が最も減少したことよりはむしろ、エンドサイトーシスの再利用の増加に起因するというありそうにない可能性を除外するために、無条件でクラスリン依存性のエンドサイトーシスをブロックするドミナントネガティブなダイナミン変異体(ダイナミン-１Ｋ４４Ａ)を用いた(例としてDamke, H.,等, J Cell Biol 127, 915-34 (1994)を参照)。ダイナミン-１Ｋ４４Ａは、ＨｅＬａ-Ｍ細胞においてＴｆ及びリガンド誘導性のＤＲ５エンドサイトーシスを阻害した(図１０ｃ)。
【０１１１】
ＥＭデータと合わせると、これらの結果から、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性のＤＲ５取り込みがクラスリン依存性のエンドサイトーシスにより主に起こることが示唆される。ゆえに、クラスリンコート構成成分に対して被覆小孔内のＤＩＳＣが物理的に近い場合にそれらの切断を促しうる。本当であれば、ＤＩＳＣ集合及びイニシエーター-カスパーゼ活性化には被覆小孔の実際の内部移行が必要でないであろう。これを調べるために、ＢＪＡＢ細胞を氷上で冷やし、Ｔｆエンドサイトーシスをブロックした(図１１ａ)。ブロックしたにもかかわらず、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬは、それぞれのレセプターに依然としてＦＡＤＤ及びカスパーゼ-８を補充し、カスパーゼ-８をプロセシングした(図１１ｂ)。さらに、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ｄｙｎＧ２７３Ｄによってエンドサイトーシスが阻害されたにもかかわらず、３８℃のＤＩＳＣにおいて、類似のＤＩＳＣ形成、カスパーゼ-８プロセシング及びカスパーゼ-８活性を誘導した(図１１ｃ及びｄ)。
【０１１２】
クラスリンが媒介するエンドサイトーシスの阻害は、ＤＲ誘導性のカスパーゼ活性化とアポトーシスを増やす
クラスリン-経路タンパク質が迅速に切断されることから、エンドサイトーシスの破壊がリガンド誘導性のカスパーゼ活性化及びアポトーシスを促進しうると言える。実際、エンドサイトーシスがｄｙｎＧ２７３Ｄによりブロックされると、全細胞溶解物からの合計の細胞のカスパーゼ-８プール、Ｂｉｄ、ＡＰ２α及びエフェクターカスパーゼ-３ないし-７のリガンド誘導性のプロセシングが顕著に増加し(図６ａ)、ＤＩＳＣ自体の形成と活性化を有意に変化させた(図１１ｃ及びｄ)。定量分析により、ｄｙｎＧ２７３Ｄの誘導と３０℃より３８℃への温度移行の後にリガンド刺激性のカスパーゼ-３／７酵素活性が実質的に増加したことが示された(図６ｂ)。さらに、この条件によっても結果としてアポトーシスが増大し(図６ｃ)、この効果はｗｔリガンド又はＤＲ５選択変異体による刺激の後に観察された(例としてKelley, R.F.等, J Biol Chem 280, 2205-12 (2005)を参照)。感作(sensitization)は、用量-応答曲線の左シフトだけでなく、断片化したＤＮＡを有する細胞の割合の最大が大きくなっていることからも明らかであった(図６ｃ)。これらの結果から、クラスリン依存性のエンドサイトーシスがカスパーゼによって破壊されるとＤＩＳＣの下流のカスパーゼ活性化が増幅され、より強力なアポトーシス刺激が生じることが示される。
【０１１３】
上記のように、本発明の方法及び材料を用いて、細胞外因性アポトーシス経路とクラスリン依存性のエンドサイトーシス機構との間の予想外の相互作用が明らかとなった。プロ-アポトーシスのＤＲ嵌入(engagement)の数分以内に、活性化されたカスパーゼは、クラスリン依存性のエンドサイトーシスを媒介するタンパク質を切断し始める。ＡＰ２α切断の相対的に迅速な動態、ＦＡＤＤ及びカスパーゼ-８のためのこの現象の必要性、及びＢａｘ及びカスパーゼ-３に依存していないことから、ＤＲ近位のカスパーゼ、最も可能性が高いものにはカスパーゼ-８及び／又はカスパーゼ-１０がＡＰ２αを始めにプロセシングすると言える。実際、ＡＰ２αヒンジのカスパーゼ切断部位は、カスパーゼ-８が認識することが可能である配列と合う(例としてNicholson, D.W., Cell Death Differ 6, 1028-42 (1999)を参照)。
【０１１４】
ＤＲ活性化によるクラスリン依存性のエンドサイトーシスの阻害はカスパーゼ刺激と同じ時間枠で起こり、ｚＶＡＤ-ｆｍｋによってその刺激が後退したことから、カスパーゼ活性に依存することを示す。一次ＡＰ２αプロセシング部位はヒンジ領域にマップされた。ヒンジは、補助的なタンパク質動員を支持するｅａｒドメインを、他のＡＰ２サブユニットと連動してＰＭ会合(association)とカーゴ結合を媒介するｔｒｕｎｋドメインに連結させる(例としてOwen, D.J., et. al, P.R. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 153-91 (2004)を参照)。ＣＯＳ７細胞のＡＰ２αｅａｒドメインの過剰発現によりクラスリン依存性のエンドサイトーシスが阻害され、補助的-タンパク質の結合を阻害する突然変異によって効果が無効になる(例としてOwen, D.J.等, Cell 97, 805-15 (1999)を参照)。逆に、いくつかの細胞がｅａｒのないＡＰ２αだけを発現するショウジョウバエの研究から、ｅａｒドメインが一般的なエンドサイトーシスに必要でないと言える(例としてBerdnik, D.,等, Dev Cell 3, 221-31 (2002)を参照)。ゆえに、ＡＰ２αのカスパーゼ切断単独ではエンドサイトーシスを乱すために十分であるか否か、又は、他のクラスリン-経路構成成分のプロセシングも貢献するか否かは、不明である。とにかく、ＤＲが媒介するカスパーゼ活性化により、急速にクラスリン依存性のエンドサイトーシスが破壊される。
【０１１５】
活性化したカスパーゼがクラスリンコート基質にどのように近づいているのかを考慮する場合、データから、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ刺激の後、表面ＤＲ５の実質部分がクラスリン依存性のエンドサイトーシスを通って細胞へ移動すると言える。予備的なＥＭ研究によって、ＤＲ５がクラスリン-被覆小孔と会合することを確認する。近年の研究により、クラスリン及びＡＰ２のＲＮＡｉが媒介するノックダウンがＦａｓによるアポトーシスのシグナル伝達を阻害することが示され、この結果はレセプターシグナル伝達のためのエンドサイトーシスの必要性を表すと解釈される(例としてLee, K.H.等, Embo J 25, 1009-23 (2006)を参照)。エンドサイトーシスが氷上のインキュベーションによって、又は、ダイナミン不活性化によって阻害される場合に、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ  ＤＩＳＣ集合、活性化及びアポトーシスが依然として起こりうるという所見を考慮すると、依然として細胞表面において、おそらくクラスリン-被覆小孔内でＤＲ５がＦＡＤＤ及びカスパーゼ-８を結合しうると推測される。実際、氷上でのインキュベート又は温度感受性ダイナミンによってエンドサイトーシスをブロックしても被覆小孔形成やカーゴ動員を干渉しない(例としてDamke, H.,等, J Cell Biol 131, 69-80 (1995)を参照)。ＤＲ活性化によりＡＰ２αがほぼ完全に破壊された。それに対して、ＣＨＣ及びＡＰ１／２βプロセシングは、全細胞タンパク質の一部、おそらくＤＲエンドサイトーシスにに直接関与するする部分のみを必要とする。ゆえに、内部移行するＤＲ会合ＤＩＳＣの近くのカスパーゼが活性化されることにより、特定のクラスリン-経路構成成分の局所の破壊が生じうる。
【０１１６】
カスパーゼがクラスリンが媒介するエンドサイトーシスを破壊する所見のある直接的な影響は、このメカニズムを除去するとアポトーシスのプログラムの以前には認識されていない部分が明らかになりうることであり、アポトーシスを受ける細胞は、もはや栄養分の取り込みも、増殖因子への応答も、又は膜ホメオスタシスの維持も必要なくなる。しかしながら、クラスリン及びＡＰ２が、多くの異なる研究グループによってｓｉＲＮＡを使用して効率よくノックダウンされているので、これら自体の切断がアポトーシスを誘発することはありそうになく、結果としてアポトーシスの増加が報告されていない。特に、細胞障害能、ＤＮＡ損傷薬剤ビンブラスチン及びアドリアマイシンもクラスリン機構の構成成分の切断を誘導したが、ＤＲリガンドより非常に遅い動態であった(図１２)。一方では、クラスリンアダプターのカスパーゼ媒介性のプロセシングも非アポトーシス性の細胞調節において機能しうる。未成熟の樹状細胞において、基礎のカスパーゼ活性により、アダプチンサブユニットの切断がいくらか起こるのに対して、この効果をｚＶＡＤ-阻害すると樹状細胞成熟が促進される(例としてSantambrogio, L.等, Nat Immunol 6, 1020-8 (2005)を参照)。 
第二のおそらくより驚くべきことは、ＤＲとクラスリンエンドサイトーシス機構との間の相互作用は、この相互作用が外因性経路によるカスパーゼ活性化を補強するポジティブフィードバックループを提供することを意味することである。このモデルによると、例えば標準以下の閾値リガンドレベルに応答してクラスリン機構が完全なままである場合、活性化されたＤＲのエンドサイトーシスは細胞生存を保存するためにアポトーシスのシグナル伝達を妨害する。しかしながら、ＤＲ刺激によりエンドサイトーシスを崩壊させるのに十分なカスパーゼ活性が生じる場合、シグナルは持続し、さらにカスパーゼ活性化を増幅して、アポトーシスを促進する。おそらく、ＤＲエンドサイトーシスは、リソソーム分解によるＤＲシグナル伝達、シグナル終了のいくつかの他の形状、又は競合する抗アポトーシスのシグナルの誘導を妨害しうる。エンドサイトーシスは、最初のＤＩＳＣ会合のレベルでカスパーゼ活性化を制御しなかった。それにもかかわらず、ダイナミンが不活性化すると全細胞性カスパーゼ-８、順に、カスパーゼ-３及び-７のプロセシングが亢進され、より強力なアポトーシス活性化に至った。このことから、エンドサイトーシスが最初のＤＩＳＣの下流の更なるカスパーゼ活性化を制御するということが言える。
【０１１７】
まとめると、ＤＲ誘導性のアポトーシス及びクラスリン依存性のエンドサイトーシスの双方向性の関係が本明細書において開示された。それは、ＤＲ活性化によりクラスリンエンドサイトーシスの機構の重要な構成成分がカスパーゼによって媒介されて破壊され、これによって、この過程が停止されるということである。クラスリン依存性のエンドサイトーシスの破壊によりＤＲの下流のカスパーゼ活性化が増し、アポトーシスが増える。このことから、カスパーゼ活性化及びアポトーシスの実行を増幅するポジティブフィードバックループがあると言える。
以下の実施例は例示としてであって、制限するために示すものではない。本明細書中のすべての引用の開示内容は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：例示的な材料と方法
ＡＰ２αカスパーゼ切断部位の同定
ＢＪＡＢ細胞(５×１０８)をＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて３０分かけて刺激し、その後溶解し、Ｃ末端特異的抗ＡＰ２α(ＡＰ６、ABRの＃ＭＡ１-０６４)を用いて免疫沈降し、そしてプロテインＡ／Ｇアガロース(Pierce)にて回収した。Ｃ末端断片をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、トリプシン切断のために溶出して液体クロマトグラフィ-エレクトロスプレーイオン化-イオントラップタンデム型質量分析にて分析するか、又は異なるＩＰで、Ｎ末端配列決定のためにＰＶＤメンブランに移した。
【０１１９】
エンドサイトーシス、取り込み及び表面ダウンレギュレーションアッセイ
常法のＴｆ測定のために、１０６の懸濁された細胞を、１〜１０μｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて３７℃で示された時間の間前処理した。いくつかの研究では、細胞は０．２５％ＤＭＳＯ＋／−５０ｍＭ ｚＶＡＤｆｍｋにて３７℃で３０分かけて前処理し、その後Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを加えた。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ刺激の後、細胞を、５μｇ／ｍｌの蛍光Ｔｆを含む結合培地(無血清ＤＭＥ、３％ＢＳＡ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２)にて氷上で３０分かけて平衡化し、示されるように、０〜５分間３７℃に移し、その後急速に氷上で冷やしてエンドサイトーシスを停止させた。沈殿した細胞を、氷温の２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳに再懸濁し、１００００個の細胞の平均蛍光強度をクールターＥｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅ-ＥＳＰフローサイトメーター(Hialeah, FL)にて定量化した。エンドサイトーシス速度は定常状態内部／表面プロット線の線形傾斜から決定した(例としてWiley, H.S. et. al, J Biol Chem 257, 4222-9 (1982)を参照)。温度を変える実験のために、氷温結合(ice binding)インキュベートを省略した。その代わりに、細胞を２０分かけて調製し、３０℃又は３８℃の結合培地中で維持し、６４７Ｔｆとともに更に０分(コントロール)又は２０分インキュベートし、氷上で冷却し、フローサイトメトリーのために処理して内部／表面６４７Ｔｆ比率を決定した。
【０１２０】
常法のＤＲ５測定のために、細胞を、５μｇ／ｍｌの６４７５Ｃ７を含む結合培地にて氷上で飽和させ、氷温の結合培地にて３回洗浄し、１０μｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある場合又はない場合で、氷上にて３０分インキュベートした。次いで細胞を、示した時間の間３７℃に移し、急速に冷却して、氷温の２Ｍ 尿素、５０ｍＭ グリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．４にて３回未満処理することによる酸ストリップを行うか、又は酸ストリップを行わなかった。細胞をフローサイトメトリーのために処理し、内部移行を以下の方程式を用いた既に記載されている方法と同じように算出した。％取り込み＝１００×[(Ｓｔ−Ｓ０)／(Ｎ−Ｓ０)]、このときＳｔ及びＳ０はそれぞれ、時間＝ｔ及び時間＝０の間インキュベートして酸ストリップした試料の値であり、Ｎはストリップしていない蛍光であり、このＮは３７℃のインキュベーションの間、本質的に変わらなかった(例としてAustin, C.D.等, Mol Biol Cell 15, 5268-82 (2004)を参照)。
温度変化のために、細胞を２０分間調製して、３０℃又は３８℃で維持し、５μｇ／ｍｌの６４７５Ｃ７にて３分間平衡化し、０分(コントロール)又は２０分の間、１０μｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて処理し、その後氷上で３０分間冷却した。細胞は酸ストリップするか又は酸ストリップしないで、フローサイトメトリーにて定量化した。
表面ＤＲ５ダウン調節アッセイのために、懸濁した細胞を非標識５Ｃ７にて３７℃で３０分間予め平衡化し、表面及びリサイクルＤＲ５プールを結合させ、１０μｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある場合又はない場合で示された時間の間処理して、氷上で冷却した。表面５Ｃ７をＣＹ５-抗マウスＩｇＧにて探索し、フローサイトメトリーにて定量化した。この技術は、６４７５Ｃ７にて直接プロービングした際に見られるように、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性のレセプタークラスター形成に起因する表面プロービング効率の低下を避けるために行った。
【０１２１】
カスパーゼ活性アッセイ
カスパーゼ-３／７アッセイをＡｐｏ-Ｏｎｅ同種カスパーゼ-３／７アッセイ(Promega)を用いて行った。細胞を回収して、計数し、各々の処理について等しい数に等分し、３０℃又は３８℃で４時間、異なる用量のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて処理し、次いで、同種カスパーゼ-３／７試薬(カスパーゼ-３／７基質Ｚ-ＤＥＶＤ-Ｒ１１０を含有)にて溶解した。溶解物を室温で１時間インキュベートして、蛍光光度計にて４８５／５３０ｎＭを読み取った。
【０１２２】
アポトーシスアッセイ
細胞をエタノール固定とＲＮアーゼ処理の後に、プロピジウムヨウ素で染色し、標準以下のジプロイドＤＮＡの量を、Ｅｐｉｃｓ ＸＬ.ＭＣＬ血球計算器(Coulter Beckman)とＥｘｐｏ３２ソフトウェアを用いて、既に記載されるようにフローサイトメトリーにて分析した(例としてNicholson, D.W., Cell Death Differ 6, 1028-42 (1999)参照)。
【０１２３】
ＤＩＳＣ免疫沈降
ＢＪＡＢ細胞(時間点につき１×１０７)を抗ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｂを交差結合させたＦｌａｇ-Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにて処理し、回収して、溶解し、免疫沈降して、記述されるように、ＤＩＳＣを分析した(例としてKischkel, F.C.等, Immunity 12, 611-20 (2000)を参照)。
【０１２４】
細胞株と試薬
ヒト結腸直腸腺癌Ｃｏｌｏ２０５細胞、ヒトＢ細胞リンパ腫ＢＪＡＢ細胞、及びヒトＴ細胞カルチノーマＪｕｒｋａｔ野生型細胞(Ａ３クローン)、ＦＡＤＤ欠損(Ｅ１)、及びカスパーゼ-８-欠損(Ｉ９.３)を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)＋２ｍＭ グルタミン＋１０００Ｕ／ｍｌ ペニシリン-ストレプトマイシン(Life Technologies)にて培養した。ヒト子宮頚癌ＨｅＬａ-Ｍ細胞、ヒト胸部腺癌ＭＣＦ７、及びヒト結腸直腸腺癌ＨＣＴ１５、ＨＣＴ８、ＳＷ９４８、Ｃｏｌｏ３２０、ヒト線維肉腫ＨＴ１８０(ＡＴＣＣ)、ＨＣＴ１１６Ｂａｘ(−／−)、ＨＣＴ１１６Ｂａｘ(＋／−)を、５０：５０ダルベッコの変更イーグル培地及びＦＫ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋１０００Ｕ／ｍｌ ペニシリン-ストレプトマイシン中で生育させた。温度感受性ダイナミンをコードするｃＤＮＡクローンはＧ２７３Ｄ変異ダイナミン-１とドミナントネガティブなＫ４４Ａ変異ダイナミン-１(それぞれＤｙｎＧ２７３ＤとＤｙｎＫ４４Ａ)であった。ＤｙｎＧ２７３Ｄは、Genentechで構築された単一のレトロウイルスのプラスミドテトラサイクリン誘導発現系であるｐＨＵＳＨ-ＰｒｏＥｘから発現された。まずｃＤＮＡを、ＣＭＶエンハンサー-プロモーター配列と２コピーのテトラサイクリンオペレーターＴｅｔＯ２を含有するシャトルプラスミドにクローニングし、次いで、インビトロファージλベースの組み換え、又はＧａｔｅｗａｙ(登録商標)技術(Invitrogen, Carlsbad)によって、野生型Ｔｅｔレプレッサーが異なるβアクチンプロモーターによって制御され、その後に内在性リボソームエントリー配列とピューロマイシン選別カセットが続いているマローニーマウス白血病ウイルス主鎖ベクターに転移させた。ＤｙｎＫ４４Ａは、連続して感染させて、２-ベクターテトラサイクリン誘導レトロウイルスの発現系であるｐＲｅｖＴｅｔ-Ｏｎ／ｐＲｅｖ-Ｔｒｅ(Clontech)から発現させた。レトロウイルスベクターを、リポフェクタミン２０００(Stratagene)を用いてナツメヤシ両種指向性マローニーマウス白血病ウイルスパッキング細胞にトランスフェクションした。既に記載されているように(Simpson等 J Cell Biol 137, 835-45, 1997)、レトロウイルス粒子を回収し、ＨｅＬａ-Ｍ及びＢＪＡＢ細胞感染に用いた。ＤｙｎＧ２７３感染細胞を、１〜２週間かけてピューロマイシン選択し(２〜３μｇ／ｍｌ)、手動で個々のＨｅＬａ-Ｍコロニーをピックアップするか又は耐性ＢＪＡＢ細胞のＦＡＣＳ分類(プロピジウムヨウ素の排除についてゲートする)によってクローニングし、Ａｕｔｏｃｌｏｎｅ装置(Coulter, Hialeah, FL)を備えたＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ-ＥＳＰを用いて９６ウェル細胞培養プレートに単一細胞を播いた。細胞クローンを、免疫蛍光顕微鏡法によってドキシサイクリン誘導ダイナミン-１の発現の均一性についてスクリーニングした。ＤｙｎＫ４４Ａ-感染細胞は、１〜２週間かけてヒグロマイシンＢ(４００μｇ／ｍｌ)及びＧ４１８(１ｍｇ／ｍｌ)選択した。既に記載されているように(Damke等 J Cell Biol 131, 69-80 1995)、ドキシサイクリン(１μｇ／ｍｌ)により３２℃で７２時間かけて誘導を行った。硫酸ビンクリスチン(＃Ｔ-１１７)、アドリアマイシン.ＨＣＬ(ＧＲ-３１９)はBiomolから、テトラサイクリンのないＦＢＳはHycloneから、ピューロマイシンはClontechから、ドキ���サイクリンはSigmaから購入した。ｚＶＡＤ-ｆｍｋ(Ｎ-ベンジルオキシカルボニル-Ｖａｌ-Ａｌａ-Ａｓｐ-フルオロメチルケトンとして)をMD Biosciences(＃ＦＫ-００９)から入手した。
【０１２５】
組換えタンパク質、抗体及び蛍光マーカー
タグ化していない又はＦｌａｇタグ化した形態のヒト組み換え可溶性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＦｌａｇタグ化ＦａｓＬを、記載されるように(Sharp等 J Biol Chem 280, 19401-409, 2005)調製した。イムノブロット分析のために、以下の抗体を用いた。Cell Signalingの抗カスパーゼ-８(１Ｃ１２、＃９７４６)及び抗カスパーゼ-７(Ｃ７、＃９４９４)、Immunotechの抗カスパーゼ-８(５Ｆ７、＃ＩＭ３１４８)、BD Transductionの抗ＦＡＤＤ(＃６１０３９９)、抗ＡＰ２α(＃６１０５０１)、抗ＡＰ１／２α(＃６１０３８１)、抗ＡＰ１γ(＃６１０３８５)、抗ＡＰ３δ(＃６１１３２８)、抗ＣＨＣ(＃６１０４９９)、抗ＡＰ４ε(＃６１２０１８)、抗Ｂｉｄ(＃５５０３６５)、及び抗ダイナミン１／２(＃６１０２４５)、Biomolの抗カスパーゼ３(ＳＡ-３２０)、Oncogeneの抗カスパーゼ９(Ａｂ２, #ＡＭ４７)、Zymedの抗Ｔｆレセプター(#１３-６８００)、Sigmaの抗βＣｏｐ(Ｍ３Ａ５, #Ｇ２２７９)、Gentexの抗Ｓｅｃ２３(＃ＧＴＸ２２９１３)、Genentech, Inc.で生成された抗ＤＲ５(３Ｈ３及び５Ｃ７)モノクローナル抗体、及び既に記載されている(例としてSimpson等, J Cell Biol. Volume 137, No. 4 pp 835-845 (1997)を参照)抗ＡＰ３β。二次試薬として以下の西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)-コンジュゲートＡｂを用いた。BD Bioscienceの抗マウス-ＩｇＧ１(＃５５９６２６)；及び、Southern Biotechnology Associatesの抗マウス-ＩｇＧ２β(＃１９０-０５)、Jackson ImmunoResearchの抗ウサギＩｇＧ(＃７１１-０３５-１５２)。免疫沈降実験のために、以下の抗体を用いた。ABRの抗Ｆｌａｇ(Ｍ２, Sigma)及び抗ＡＰ２α(ＡＣ１-Ｍ１１, #ＭＡ３-０６１)又は(ＡＰ６, #ＭＡ１-０６４)。フローサイトメトリーと免疫蛍光顕微鏡法のために、Molecular Probesの４８８Ｔｆ(Ｔ-１３３４２)、６４７Ｔｆ(Ｔ-２３３６６)、５９４抗ウサギＩｇＧ(#Ａ-１１０３７)、及び５９４抗ヤギＩｇＧ(#Ａ-１１０５８)。Jackson ImmunoResearchの断片抗マウスＩｇＧ(#１１５-１７７-００３)、Santa Cruz Biotechnologyの抗ダイナミン-１(#ｓｃ-６４０２)、及びＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲートウシ血清アルブミン(Molecular Probes, Inc.)を抗原として用いてGenentech, Inc.で生成され、Ａｌｅｘａ蛍光６４７カダベリン(Molecular Probes, Inc.)と(ＣＮＢｒ)-活性化セファロースを反応させることによって作製したＡｌｅｘａ-６４７セファロースカラムにて親和性精製した抗Ａｌｅｘａ ６４７ウサギポリクローナル抗体。製造業者の指示に従って、Ａｌｅｘａ-６４７サクシニミジルエステル(Molecular Probes, Inc.)と反応させることによってＡｌｅｘａ-６４７をｍＡｂ ５Ｃ７ (６４７５Ｃ７)にコンジュゲートさせた。
【０１２６】
免疫蛍光顕微鏡法
６４７５Ｃ７取り込みイメージングのために細胞を６４７５Ｃ７とともに３７℃でインキュベートし、示した時間の間、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを交差結合させた。温度感受性実験のために細胞を結合培地にて、３０℃と３８℃で２０分間前処理し、次いで、４８８Ｔｆを加え、示した時間の間、それぞれの温度でインキュベートを続けた。その後、細胞を３％パラホルムアルデヒドにて２０分間固定し、０．４％サポニンにて透過処理し、ウサギ抗Ａｌｅｘａ ６４７ ＩｇＧ、その後５９４抗ウサギＩｇＧ(６４７５Ｃ７取り込み)、又は抗ダイナミン-１抗体、その後５９４抗ヤギＩｇＧ(温度感受性実験)にて染色した。イメージングには、Plan-Apochromat 1.4 NA 63x対物レンズ、ＣＣＤカメラ(AxioCam; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.)、及びQuad透過フィルターセット(Chroma Technology Corp.)を備えた顕微鏡(Axiovert 200; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.)を用い、AxioVison 3.1ソフトウェア(Carl Zeiss MicroImaging, Inc.)にてすべて制御した。
【０１２７】
免疫電子顕微鏡法
懸濁したＣｏｌｏ２０５細胞を１０μｇ／ｍｌの５Ｃ７を含む結合培地とともに氷上で３０分間インキュベートし、洗浄して、１０ｍｇ／ｍｌのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを含む結合培地とともに氷上で３０分間インキュベートして、その後３７℃に５分間移し、２％パラホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒドにて固定し、ウサギ抗マウスＩｇＧ(Dako, Glostrup, Denmark)による超薄凍結切片のイムノゴールド標識のために既に記載されるように(Austin等 Mol Biol Cell 15, 5268-82, 2004)処理した。
【０１２８】
前述の記載は当業者が本発明を実施するために十分であるとみなされる。本発明は本明細書に提示した実施例によって権利範囲が制限されるものではない。事実、本明細書に示したもの及び記載内容に本発明の様々な変更が加わることは、前述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内のものである。
【０１２９】
表１  本発明の実施に有用な例示的なポリペプチド
ＡＰ２-α(配列番号：１)  ＮＣＢＩ寄託番号：ＣＡＢ６６８５９
2009541741.tif 000003
クラスリン重鎖(配列番号：２)  ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ００４８５０
2009541741.tif 000004
ＡＰ１／２β(配列番号：３)  ＮＣＢＩ寄託番号：Ｐ６３０１０
2009541741.tif 000005
ダイナミン(配列番号：４)  ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ００１００５３３６
2009541741.tif 000006
デスレセプター４(配列番号：５)  ＮＣＢＩ寄託番号：Ｏ００２２０
2009541741.tif 000007
デスレセプター５(配列番号：６)  ＮＣＢＩ寄託番号：ＡＡＢ６７１０３
2009541741.tif 000008
ＡＰＯ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ(配列番号：７)  ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ００３８０１
2009541741.tif 000009
ＦＡＳ(配列番号：８)  ＮＣＢＩ寄託番号：ＡＡＡ６３１７４
2009541741.tif 000010
ＦＡＳリガンド(配列番号：９)  ＮＣＢＩ寄託番号：ＮＰ０００６３０
2009541741.tif 000011
【図１Ａ】
2009541741.tif 000013
【図１Ｂ】
2009541741.tif 000014
【図２】
2009541741.tif 000015
【図３】
2009541741.tif 000016
【図４】
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【図５】
2009541741.tif 000018
【図６】
2009541741.tif 000019
【図７】
2009541741.tif 000020
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2009541741.tif 000025
【配列表】
2009541741000001.app
【国際調査報告】
2009541741.tif 000026
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