(57)【要約】本発明は、骨形成または骨吸収に影響を与えるために、Ｒｏｒ活性（例えばＲｏｒ２タンパク質活性）および／または１４−３−３βを調節することに関する。本発明は、さらに、骨粗鬆症および骨折等の骨関連障害についてのスクリーニング、診断、および療法の開発のための組成物および方法に関する。Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体および抗体フラグメントは、特に、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を引き起こし、それによってＲｏｒ２の活性化を導くことにおいて有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨関連障害を有する被験体にＲｏｒ２タンパク質を活性化し得る治療有効量の薬剤を投与する工程を含む、骨関連障害を処置または予防する方法。
【請求項２】
前記骨関連障害が、骨量減少と関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨関連障害が、骨粗鬆症、骨の癌、関節炎、くる病、骨折、歯周病、骨部分欠損、溶骨性骨疾患、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、パジェット病、骨軟化症、および骨化過剰症を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２に対するヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、ＩｇＧアイソタイプの抗体である、請求項８、９、または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質に対するＦａｂフラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質に対する少なくとも２つの抗体フラグメントを含み、該抗体フラグメントが共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、非経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、静脈内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒｏｒ２を発現する細胞を、該Ｒｏｒ２を活性化し得る薬剤と接触させる工程を含む、骨芽細胞分化を増加させる方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤が、小分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を引き起こす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、Ｒｏｒ２タンパク質による１４−３−３βのリン酸化を増加させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、幹細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記接触させる工程がエキソビボで実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記接触させる工程が、インビボで実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒｏｒ２タンパク質の発現または活性を増加させる薬剤と細胞とを接触させる工程を含む、脂肪細胞への分化を抑制する方法。
【請求項３１】
Ｒｏ２タンパク質を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程と、
Ｒｏｒ２活性が増加するか否かを決定する工程と
を含む、Ｒｏｒ２活性を増加させる薬剤についてスクリーニングするための方法。
【請求項３２】
Ｒｏｒ２が、Ｒｏｒ２の細胞ドメインである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒｏｒ２が、Ｒｏｒ２のキナーゼドメインである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記決定する工程が、Ｒｏｒ２タンパク質のキナーゼ活性を評価する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒｏｒ２タンパク質のキナーゼ活性を前記評価する工程が、Ｒｏｒ２タンパク質のリン酸化状態を評価する工程を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記決定する工程が、Ｒｏｒ２タンパク質またはＲｏｒ２ポリヌクレオチドの発現レベルを評価する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記決定する工程が、１４−３−３βタンパク質のリン酸化状態を評価する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記決定する工程が、ミネラル化マトリックス形成のレベルを決定する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３１に記載の前記方法によって同定される、薬剤。
【請求項４０】
Ｒｏｒ２に対する抗体であって、それによって該抗体が、Ｒｏｒ２タンパク質の活性化を引き起こす、抗体。
【請求項４１】
前記抗体が、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を引き起こす、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４５】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４６】
前記抗体が、ＩｇＧアイソタイプの抗体である、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４７】
前記抗体が、抗体フラグメントを含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４８】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメントである、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４９】
前記抗体が、Ｒｏｒ２タンパク質に対する少なくとも２つの結合部位を有する、請求項４０に記載の抗体。
【請求項５０】
前記抗体が、Ｒｏｒ２タンパク質に対する正確に２つの結合部位を有する、請求項４０に記載の抗体。
【請求項５１】
骨関連障害を有する被験体に１４−３−３β活性を抑制し得る治療有効量の薬剤を投与する工程を含む、骨関連障害を処置または予防する方法。
【請求項５２】
前記薬剤が、１４−３−３β発現を下方制御する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記薬剤が、１４−３−３β特異的ｓｉＲＮＡまたは１４−３−３β特異的ｓｈＲＮＡである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を促進する薬剤を同定する方法であって、該方法が、
Ｒｏｒ２の細胞外ドメインとＴｒｋＢの細胞内ドメインとを含むキメラレセプターを発現する前記細胞を提供する工程であって、該細胞が、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）プロモーターに作動可能に結合されたレポーター遺伝子構築物を含む、工程と、
該細胞を試験薬剤と接触させる工程と、
該細胞内の該レポーター遺伝子の発現レベルを決定する工程と
を含む、方法。
【請求項５５】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が、前記ＣＲＥプロモーターに作動可能に結合されたルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
アミノ酸配列：
【化１】
2009527485.tif 000005
または配列番号４と少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列の、タンパク質。
【請求項５８】
前記アミノ酸配列が、
【化２】
2009527485.tif 000006
または配列番号４と少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列である、請求項５７に記載のタンパク質。
【請求項５９】
前記アミノ酸配列が、
【化３】
2009527485.tif 000007
である、請求項５７に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、米国仮特許出願第ＵＳＳＮ６０／７７４，５３４号（２００６年２月１７日出願）および同第ＵＳＳＮ６０／８４４，２３９号（２００６年９月１３日出願）（これらは、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
骨関連障害および疾患の話題は、ここ数年にわたり相当の注目を得ている。骨関連障害は、骨吸収と骨形成の間の不均衡に起因する骨量減少によって特徴付けられる。一生の間、骨格の骨のリモデリングは繰り返されている。このリモデリングの過程では、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成の間に繊細な均衡が存在する。軟骨内骨化および膜性骨化の両方に関与する骨芽細胞は、新しい骨の形成をもたらすマトリックスタンパク質を作る骨組織内の特殊化した細胞である。骨形成（すなわち骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ））は、骨格の骨量を維持するために必須である。骨芽細胞とは異なり、破骨細胞は、骨吸収および除去に関連する。正常な骨では、骨芽細胞に媒介される骨形成と破骨細胞に媒介される骨吸収の間の均衡は、調節された複合相互作用を通して維持される。
【０００３】
骨格系と関連する多くの欠乏症、疾患、および障害がある。数例として以下を含むがこれらに限定されない：骨粗鬆症、骨の癌、関節炎、くる病、骨折、歯周病、骨部分欠損（ｂｏｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）、溶骨性骨疾患、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、パジェット病、骨軟化症、骨化過剰症、ならびに大理石骨病。骨形成分化および再生の過程に関与する機構を同定することは、骨生理学および骨粗鬆症等の骨障害を理解するために重要である。これらの障害は、推定される骨芽細胞の前駆体の不完全な成熟化に起因する欠損した骨形成に関係している可能性がある。
【０００４】
骨吸収および骨形成に関連する疾患および障害を処置する方法、骨形成を促進する方法、骨形成を調節する（増加または低下させる）薬剤を同定する方法、骨吸収を調節する（増加または低下させる）薬剤を同定する方法、ならびに骨関連障害に関連する遺伝子またはそれらのタンパク質産物を同定する方法を開発する必要がある。
【０００５】
骨形成および骨吸収に関与する機構を同定することは、骨生理学および骨粗鬆症等の骨障害を理解するために重要である。骨関連障害に関連する遺伝子またはそれらのタンパク質産物は、骨形成、骨吸収の分子機構の解明で、新規薬物のスクリーニングおよび開発で、骨発育障害および骨減少障害の診断、予後、予防、および処置で、ならびに骨粗鬆症等の骨関連障害の治療評価で使用され得る。同定される遺伝子およびタンパク質は、また、骨形成を調節する医薬品の探索で有用であり得る。最近、同定されたそのようなタンパク質の１つは、Ｒｏｒ２タンパク質である。Ｒｏｒ２遺伝子発現の下方制御は、ヒト間葉系幹細胞のデキサメタゾン誘発骨形成分化（図１）を抑制するのに対して、Ｒｏｒ２過剰発現は、これらの細胞の骨形成分化を促進する（参照として本明細書に援用される、米国特許出願第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願））。従って、Ｒｏｒ２およびＲｏｒ２経路は、骨形成を調節するための適切な標的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、骨形成を調節するための系を提供する。この系は、骨芽細胞分化におけるＲｏｒ２の役割の発見に基づいている。特に、Ｒｏｒ２タンパク質の活性化は、ミネラル化骨形成につながる。Ｒｏｒ２発現は、間葉系幹細胞の骨形成分化において重要であることが分った。Ｒｏｒ２過剰発現は、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を抑制することも分った。Ｒｏｒ２タンパク質の活性化が１４−３−３βのリン酸化につながることも分った。１４−３−３βの下方制御は、ヒト間葉系幹細胞でミネラル化マトリックス形成を増加させることが分った。Ｒｏｒ２タンパク質、１４−３−３βタンパク質とのその相互作用、および１４−３−３βの下方制御に関連するこれらの発見は、骨形成を調節する新規薬剤の探索において、Ｒｏｒ２、１４−３−３β、および他の下流シグナル伝達生体分子を主要な標的にする。Ｒｏｒ２タンパク質を活性化させ、１４−３−３βタンパク質を抑制し、または他の下流標的の活性を調節する薬剤は、骨関連障害、特に、骨量減少に関連する障害の処置と予防において有用である。これらの薬剤は、また、骨芽細胞分化を促進する際に、およびミネラル化マトリックス形成を促進する際に有用である。あるいは、これらの薬剤は、また、幹細胞の脂肪細胞への分化の抑制に有用性を見出すことが可能であり、肥満症、代謝障害、または糖尿病の処置で有用になり得る。
【０００７】
本発明は、Ｒｏｒ２タンパク質を活性化する薬剤を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を引き起こし、それによってＲｏｒ２活性化をもたらす。Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化は、キナーゼ活性の増加およびそれに続く、１４−３−３βタンパク質を含むＲｏｒ２の結合パートナーのリン酸化をもたらす。薬剤は、また、骨成長の促進をもたらす。
【０００８】
別の態様では、本発明は、１４−３−３（具体的には１４−３−３βまたは１４−３−３γ）の活性を抑制または下方制御する薬剤を提供する。これらの薬剤は、ＤＮＡまたはタンパク質のレベルで作用し、細胞内の１４−３−３の活性を低減させ得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、骨芽細胞、間葉系幹細胞、胚幹細胞、胎生幹細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、成熟骨芽細胞、または骨芽細胞系列の他の任意の細胞等の骨形成に関与する細胞を標的にする。他の実施形態では、薬剤は、脂肪細胞形成に関与する細胞を標的にする。例えば、薬剤は、骨を標的にするために、ビスホスホネート部分に結合され得る。１４−３−３βの下方制御は、ミネラル化マトリックス形成を増加させることが分った。１４−３−３または１４−３−３の特異的アイソフォームを標的にする薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質を活性化する薬剤（例えば、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を引き起こす薬剤）と併用して使用され得る。そのような組み合わせは、骨形成を促進する際に相乗効果を有し得る。
【０００９】
別の態様では、本発明は、骨形成を調節する際に重要であることが判明したＲｏｒ２／１４−３−３β経路の他の下流エレメントを調節する薬剤を提供する。これらの薬剤は、単独でまたは本明細書に記述する他の薬剤と組み合わせて使用され得る。
【００１０】
本発明の薬剤は、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、および小分子が好ましいが、いかなる種類の化合物であってもよい。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を促進する抗体またはそのフラグメントである。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、しかしヒト被験体の処置のためにヒト化モノクローナル抗体が通常好まれる。抗体またはそのフラグメントは、任意のアイソタイプであり得るが、しかしＩｇＧアイソタイプが概して好まれる。いくつかの実施形態では、薬剤はＲｏｒ２タンパク質へ向けられる二価抗体または多価抗体フラグメントである。他の実施形態では、薬剤は、１４−３−３βに特異的なＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ構築物である。
【００１１】
１つの態様では、Ｒｏｒ２タンパク質を活性化する薬剤、または１４−３−３β活性を抑制する薬剤は、骨形成を促進するために被験体に投与される。いくつかの実施形態では、Ｒｏｒ２タンパク質を活性化する薬剤と１４−３−３β活性を抑制する薬剤とを組み合わせて、被験体に投与される。具体的には、薬剤の投与は、骨芽細胞分化を促進させ、および／またはミネラル化マトリックス形成を増加させる。被験体は、骨粗鬆症、骨の癌、関節炎、くる病、骨折、歯周病、骨部分欠損、溶骨性骨疾患、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、パジェット病、骨軟化症、および骨化過剰症を含むいかなる骨関連障害を患い得るまたは危険性を有し得る。薬剤は、特に、骨量減少に関連する疾患の処置に有用である。１つの態様では、薬剤はＲｏｒ２タンパク質の二量体化を促進させ、それによってＲｏｒ２タンパク質を活性化させる。薬剤は、いかなる種類の化合物でもよいが、しかしながら、小分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、およびペプチドが特に有用である。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質へ向けられる抗体または抗体フラグメントである。例えばクローン病および多発性硬化症等のヒト疾患の処置におけるヒト化モノクローナル抗体の使用の成功を考えると、ヒト化モノクローナルが通常好まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、１４−３−３発現、具体的には１４−３−３βまたは１４−３−３γの発現を下方制御する。いくつかの特定の実施形態では、薬剤は１４−３−３βに特異的なＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡである。本発明の薬剤は、また、脂肪細胞分化の犠牲によって骨芽細胞分化を促進することにより肥満症、代謝障害、または糖尿病を処置するために使用され得る。
【００１２】
別の態様では、骨芽細胞分化または骨形成分化を促進するために、細胞は、Ｒｏｒ２タンパク質を活性化する、または１４−３−３β活性を抑制する薬剤と接触する。接触する細胞は、通常は、Ｒｏｒ２タンパク質または１４−３−３βタンパク質を発現し、かつ骨芽細胞表現型への分化を起こすことが可能である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば間葉系幹細胞等の幹細胞である。細胞は、インビボまたはインビトロで薬剤と接触し得る。細胞は、また、エキソビボで薬剤と接触し、次いでそれを必要とする被験体（例えば、骨関連障害、特に骨量減少と関連する障害を患う被験体）に導入され得る。
【００１３】
Ｒｏｒ２過剰発現および１４−３−３β抑制は、脂肪細胞への分化を抑制することも分った。従って、Ｒｏｒ２タンパク質を活性化し、または１４−３−３β活性を抑制する薬剤は、また脂肪細胞への分化を抑制する際に有用である。本発明の薬剤は、従って、幹細胞（例えば間葉系幹細胞）の脂肪細胞への分化を抑制する際に有用である。この発見に基づいて、Ｒｏｒ２活性因子または１４−３−３β下方制御因子は、肥満症、糖尿病、または他の代謝障害の処置または予防に有用になり得る。
【００１４】
本発明は、また、Ｒｏｒ２活性もしくは発現を調節する、または１４−３−３βタンパク質のリン酸化を調節する薬剤を同定するための系を含む。スクリーニング系は、Ｒｏｒ２タンパク質を薬剤と接触させること、およびＲｏｒ２活性または発現に関する薬剤の効果を検出することを含む。Ｒｏｒ２活性または発現の増加の検出は、骨形成を促進する、骨芽細胞分化を促進する、または脂肪細胞への分化を抑制する際に有用である薬剤を示す。いくつかの実施形態では、Ｒｏｒ２タンパク質の活性は、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化の程度を決定することによってアッセイされる。他の実施形態では、Ｒｏｒ２活性は、Ｒｏｒ２タンパク質それ自体のまたは１４−３−３βのリン酸化状態を決定することによって評価される。他の実施形態では、Ｒｏｒ２キナーゼ活性は、例えば３２ＰγＡＴＰまたは坑ホスホチロシン抗体を用いる免疫沈降法を用いて、測定される。いくつかの実施形態では、アッセイは、Ｒｏｒ２タンパク質を発現する細胞を用いる細胞に基づくアッセイである。他の実施形態では、アッセイは無細胞であり、精製または半精製のＲｏｒ２タンパク質が使用される。本発明のスクリーニング方法を用いて同定される薬剤およびその医薬組成物は、本明細書に記述する本発明の治療法において特に有用である。
【００１５】
本発明は、また、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を促進する薬剤を同定するためのアッセイ法を提供する。このアッセイ法は、特に、見込みのある大量の化合物をスクリーニングするための高スループット技法を受け入れられる。Ｒｏｒ２タンパク質の細胞外ドメインから成るキメラレセプターは、ＴｒｋＢの細胞内ドメインに融合する。細胞外Ｒｏｒ２ドメインを二量体化する薬剤は、ＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化させ、ＣＲＥプロモーター活性の増加をもたらす。ＣＲＥプロモーターに作動可能に結合されたルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子は、次いで、Ｒｏｒ２を二量体化する化合物を同定するために使用され得る。Ｒｏｒ２−ＴｒｋＢキメラアッセイは、Ｒｏｒ２を二量体化することが以前に示された坑Ｒｏｒ２抗体を用いて検証されている。Ｒｏｒ２特異的抗体は、非特異的ＩｇＧ（図１２を参照）で処置された細胞と比較するとき、観察されたルシフェラーゼ活性において用量依存性増加を引き起こす。このアッセイ法は、Ｒｏｒ２を活性化させる薬剤を同定するために、迅速な高スループット、かつ高感度のアッセイを提供する。当業者によって認識されるように、ＴｒｋＢ以外の他の細胞内ドメインは、キメラを調製するために使用され得る。レポーター遺伝子に作動可能に結合された異なるプロモーターは、次いでアッセイで必要になることもある。Ｒｏｒ２の活性化因子または二量体化因子として本発明のアッセイによって同定される薬剤は、また本発明の一部として考えられる。
【００１６】
本明細書は、以下の詳細な説明および本願の一部を形成する添付の図面からより十分に理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（定義）
以下の定義は、本明細書で使用される用語および略語を完全に理解するために提供される。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの」、「その」は、文脈が明確に示さない限り、複数形の参照を含む。従って、例えば「１つの細胞」の参照は、複数のそのような細胞を含み、ならびに「１つの抗体」の参照は、１つまたは複数の抗体および当業者には周知のそれに相当するもの等の参照である。
【００１９】
明細書における略語は、以下のように測定、技法、特性、または化合物に関する単位に対応する：「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「℃」はセ氏温度を意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、［ｌ］はリットルを意味し，「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｐｌ」はピコリットルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「ｍｍｏｌｅ」はミリモルを意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、および「ＲＴ」は室温を意味する。
【００２０】
「高速液体クロマトグラフィー」はＨＰＬＣと省略される。
【００２１】
「読み取り枠」はＯＲＦと省略される。
【００２２】
「質量分析」はＭＳと省略される。
【００２３】
「タンデム質量分析」はＭＳ／ＭＳと省略される。
【００２４】
「ポリアクリルアミドゲル電気泳動」はＰＡＧＥと省略される。
【００２５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと省略される。
【００２６】
「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと省略される。
【００２７】
「ドデシル硫酸ナトリウム」はＳＤＳと省略される。
【００２８】
「ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動」はＳＤＳ−ＰＡＧＥと省略される。
【００２９】
「アデニンヌクレオチドトランスロケーター２」は、ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質と省略される。
【００３０】
「骨塩量」はＢＭＤと省略される。
【００３１】
「リボソームＲＮＡ」はｒＲＮＡと省略される。
【００３２】
「非翻訳領域」はＵＴＲと省略される。
【００３３】
本開示と関連して、多数の用語が利用される必要がある。本明細書で使用されるように、用語「Ｒｏｒ」は、レセプターチロシンキナーゼ様オーファンレセプターのファミリーを言う。「Ｒｏｒ分子」は、Ｒｏｒポリペプチド、Ｒｏｒタンパク質、Ｒｏｒペプチド、そのフラグメント、変種、および変異体、ならびにＲｏｒポリペプチド、Ｒｏｒタンパク質、Ｒｏｒペプチド、そのフラグメント、変種、および変異体をコードする核酸を言う。「Ｒｏｒ分子」は、また、Ｒｏｒポリヌクレオチド、その遺伝子、および変種と変異体を言う。「Ｒｏｒ分子」および「Ｒｏｒ」は、Ｒｏｒ１分子およびＲｏｒ２分子の両方を言う。
【００３４】
「標的Ｒｏｒ分子」は、その活性が本発明の薬剤によって調節されるＲｏｒ分子を言う。標的Ｒｏｒ分子は、Ｒｏｒポリペプチド、その相同体、誘導体、またはフラグメント、または変種または変異体であり得る。目的のＲｏｒ分子は、また、核酸（ＲＮＡもしくはＤＮＡのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）であり得る。例えば、Ｒｏｒ遺伝子のタンパク質が実験で目的である場合、標的Ｒｏｒ分子はタンパク質である。当然のことながら、用語「標的Ｒｏｒ分子」は、タンパク質のエピトープ等の全長分子ならびにそのフラグメント、変種、および変異体を言う。標的Ｒｏｒ分子は、Ｒｏｒ１分子もしくはＲｏｒ２分子のいずれか、または両方であり得る。いくつかの特定の実施形態では、標的Ｒｏｒ分子はＲｏｒ２タンパク質である。
【００３５】
用語「１４−３−３」は、シグナル伝達に関与するタンパク質のファミリーを言う。１４−３−３タンパク質は、多数の結合パートナーを有し、数多くの多様な細胞プロセスの群に関与する。１４−３−３タンパク質は、それらの標的と結合することによってそれらの効果を及ぼし、（１）立体構造変化、（２）配列特異的な特徴または構造タンパク質の特徴の物理的妨害、および／または（３）スカフォールディングを引き起こす。１４−３−３タンパク質の構造および機能に関するいくつかの総説は、以下を含む：Ｂｒｉｄｇｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｈｅａｄ、「１４−３−３  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｕｍｂｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ  ｒｅ１０，２００４；Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈ，「Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｍｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８１：３２９−４２，２００４。これらの総説の各々を参照することによって本明細書に援用する。「１４−３−３」は、１４−３−３ポリペプチド、１４−３−３タンパク質、１４−３−３ペプチド、およびその１４−３−３フラグメント、１４−３−３変種、または１４−３−３変異、ならびに１４−３−３ポリペプチド、１４−３−３タンパク質、１４−３−３ペプチド、およびその１４−３−３フラグメント、１４−３−３変種、１４−３−３変異をコードする核酸を言うこともある。１４−３−３のいくつかのアイソフォームは同定されており、β、ε、η、γ、τ、ζ、およびσを含む。Ｒｏｒ２タンパク質の活性化は、アイソフォーム１４−３−３βのリン酸化を引き起こすことが分っている。１４−３−３βおよび１４−３−３γの両方は、Ｒｏｒ２と相互に作用することが分った。いくつかの例では、１４−３−３βが具体的に言及される。いくつかの他の例では、１４−３−３γが具体的に言及される。
【００３６】
用語「核酸分子」は、一本鎖形態または二本鎖螺旋のリボヌクレオチド（ＲＮＡ分子）もしくはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ分子）のリン酸エステルの形態、またはいかなるリン酸ジエステル類似体を言う。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡ螺旋も可能である。用語核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次構造および二次構造を言い、何か特定の三次形態に限定するものではない。従って、この用語は、発見された二本鎖ＤＮＡ、とりわけ、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）または環状ＤＮＡ分子、プラスミド、および染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論ずる際に、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわちｍＲＮＡと相同的な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向に与える配列だけについて通常の慣例に従って記述され得る。
【００３７】
「組換え核酸分子」は、分子生物学的操作（すなわち、非自然発生的な核酸分子または遺伝子操作されている核酸分子）が行われた核酸分子である。さらに、用語「組換えＤＮＡ分子」は、自然発生的でない、または二つの別々な核酸配列のフラグメントの人為的な組み合わせ（すなわち、本来なら連続していないＤＮＡの切片を連結することで）によって生成され得る核酸配列を言う。「組換えで生成される」とは、化学合成手段によって、または核酸の単離されたフラグメントの人為的な操作、例えば、制限酵素、連結酵素、および類似の組み合わせ技術を用いる遺伝子操作技術（例えば、各々が参照として本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；（１９８９）、またはＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９８９）、およびＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（ｅｄ．Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ）ＩＲＥＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９８５）に記述される。）によって達成されることが多い人為的な組み合わせを意味する。
【００３８】
そのような操作は、通常は、配列を認識部位に導入しながら、または認識部位で取り除きながら、１つのコドンを、そのコドンまたは保存的アミノ酸をコードする重複コドンと置換するために行われ得る。あるいは、一般的な自然形態では見出せない複数の機能を所望の組み合わせで含む単一の遺伝子実体を生成するために、所望の機能の核酸フラグメントを結合することで実行され得る。制限酵素認識部位は、そのような人為的操作の標的になることが多いが、他の部位特異的標的（例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列、読み取り枠、または他の有用な特徴）は、設計によって組み入れることが可能である。組換え核酸分子の例は、５’から３’への（センス）方向または３’から５’への（アンチセンス）方向にあるＲｏｒファミリータンパク質または免疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するクローニングベクターまたは発現ベクター等の組換えベクターを含む。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、および「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ内の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）を言い、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ポリヌクレオチドは、キメラ混合物または誘導体またはその修飾されたバージョン、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータ等を向上させるため、塩基部分、糖質部分、またはリン酸塩バックボーンで修飾され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含む群から選択された修飾塩基部分を１つ含み得るがこれらに限定されない：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリン。ヌクレオチド配列は、一般的に、タンパク質および酵素を産生するための細胞機構によって使用される情報を含む遺伝情報を有する。これらの用語は、二本鎖または一本鎖ゲノムのｃＤＮＡ、ＲＮＡ、いかなる合成および遺伝子操作されたポリヌクレオチド、ならびにセンスとアンチセンスの両ポリヌクレオチドを含む。これは、一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリッド、ならびに複数の塩基を１つのアミノ酸バックボーンに結合させることによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を含む。これは、また、修飾塩基（例えば、チオウラシル、チオグアニン、およびフルオロウラシル）を含有する核酸、または炭水化物もしくは脂質を含有する核酸を含む。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の標準方法、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等から販売されている装置等）を使用することによって合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，３２０９，（１９８８））によって合成されることが可能であり、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドは、制御されたポアガラスポリマー担体の使用（Ｓａｒｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１，（１９８８））等によって調製されることが可能である。いくつかの方法がアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するために開発されてきた。例えば、アンチセンス分子は組織部位に直接注入されることが可能であり、または所望の細胞を標的するように設計された修飾アンチセンス分子（標的細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合されるアンチセンス）は、全身に投与され得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボの転写によって生成され得る。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター等の適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様なベクターに組み込まれ得る。あるいは、使用されるプロモーターに応じてアンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、細胞系に安定に導入され得る。しかしながら、内在性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは困難なことが多い。従って、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーターの制御下に配置される組換えＤＮＡ構築物を利用することである。患者に標的細胞をトランスフェクトするためにそのような構築物を使用することは、内在性標的遺伝子転写物を用いて相補的塩基対を形成し、それによって標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻止する一本鎖ＲＮＡの十分な量の転写をもたらす。例えば、ベクターは、細胞によって取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を方向付けるように、インビボで導入され得る。そのようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するために転写されることが可能な限り、エピソームのまま残存し得る、または染色体に組み込まれ得る。そのようなベクターは、当技術分野で標準の組換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクターは、哺乳類細胞で複製および発現のために使用される当技術分野で周知のプラスミド、ウイルス、または他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳類細胞で、好ましくはヒト細胞で作用するよう当技術分野で周知の任意のプロモーターによってなされ得る。そのようなプロモーターは、誘導的または構成的であり得る。そのようなプロモーターは、以下を含むがこれらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０，３０４−３１０，（１９８１））、ラウス���腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ，２２，７８７−７９７，（１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，１４４１−１４４５，（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ａｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９−４２，（１９８２））等。組織部位に直接導入され得る組換えＤＮＡ構築物を調製するために、任意の種類のプラスミド、コスミド、酵母人工染色体、またはウイルスベクターが使用され得る。あるいは、所望の組織を選択的に感染させるウイルスベクターが使用され得るが、その場合投与は、別の経路（例えば全身的に）で達成され得る。
【００４１】
ポリヌクレオチドは、天然に存在する制御（発現制御）配列によって隣接され得る、またはプロモーター、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、抑制因子、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コーディング領域等を含む異種配列と結合され得る。核酸は、また、当技術分野で周知の多数の手段によって修飾され得る。そのような修飾の非限定的な例は、メチル化、「キャップ」、１つまたは複数の自然発生的ヌクレオチドの類似体との置換、およびインターヌクレオチド修飾（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバミン酸等）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等））を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート剤（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属等）、およびアルキル化剤等の共有結合した１つまたは複数の付加的な部分を含み得る。ポリヌクレオチドは、メチルまたはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデートの結合の形成によって誘導体化され得る。さらに、本明細書のポリヌクレオチドは、また、検出可能なシグナルを直接的または間接的に供給することが可能な標識で修飾され得る。典型的な標識は、放射性同位元素、蛍光分子、ビオチン等を含む。
【００４２】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写の結果生じる産物を言う。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の相補的コピーであるとき、一次転写物と呼ばれるか、または一次転写物の転写後過程由来のＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンがなくて、細胞によってポリペプチドに翻訳され得るＲＮＡを言う。「ｃＲＮＡ」は、組換えｃＤＮＡ鋳型から転写される相補的ＲＮＡを言う。「ｃＤＮＡ」は、相補的でありｍＲＮＡ鋳型に由来するＤＮＡを言う。ｃＤＮＡは、一本鎖であり得、または例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖形状に転換され得る。
【００４３】
ＲＮＡの一部に「相補的な」配列は、ＲＮＡを用いてハイブリダイズすることが可能な十分な相補性を有し、安定な二本鎖を形成する配列を言う。二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの単鎖は、従って、検査されることが可能であり、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度と長さの両方に依存する。通常、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとの不適正塩基対をより多く含む可能性があるが、それでも安定な二本鎖（または場合によって三本鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズされた複合体の融点を決定するために、標準的な方法を用いて不適正の許容できる程度を確認することができる。
【００４４】
用語「核酸」もしくは「核酸配列」、「核酸分子」、「核酸フラグメント」、または「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ」、および「ｃＤＮＡ」と互換的に使用され得る。
【００４５】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、コード配列だけを含み得るポリヌクレオチドならびに付加的なコード配列または非コード配列を含み得るポリヌクレオチドを包含する。
【００４６】
核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度等の適切な条件下で他の核酸分子にアニールできるとき、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ等の別の核酸分子にハイブリダイズ可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．Ｖｏｌｓ．１−３（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６））。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸の予備スクリーニングのために、５５℃のＴｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％乳、およびホルムアミドなし、または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ等と使用され得る。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば５×または６×ＳＳＣで４０％ホルムアミドに対応する。高ストリンジェンシー条件は、最も高いＴｍ、例えば５×または６×ＳＳＣで５０％ホルムアミドに対応する。ハイブリダイゼーションは、そのストリンジェンシーにもよるが、不適正塩基対があり得る、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度（当技術分野では周知の可変エレメント）に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度がより大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼ−ションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。ヌクレオチドの長さが１００を超えるハイブリッドに関して、Ｔｍを算出する式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋらｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．Ｖｏｌｓ．１−３．（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６），９．５０−９．５１）。短い核酸（すなわちオリゴヌクレオチド）を用いるハイブリダイゼーションに関して、不適正塩基対の位置はより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さは、その特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋらｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．Ｖｏｌｓ、１−３．（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６），１１．７−１１．８）。
【００４７】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
【００４８】
当技術分野で周知のように、「同一性」または「類似性」は、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間で、それらの配列を比較することで決定される関係である。当技術分野で、同一性は、また、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度を意味し、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって決定される。同一性と類似性の両方は、以下に記述されるように周知の方法で容易に算出され得る：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１。配列間の同一性または類似性を決定するために一般に用いられる方法は、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されているものを含むが、これらに限定されない。同一性と類似性を決定する方法は、公表されているコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、以下を含むがこれらに限定されない：ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）。
【００４９】
「相同性の」は、２つのポリマー（すなわちポリペプチド分子または核酸分子）間の配列類似性の程度を言う。本明細書で参照される相同性パーセンテージの数字は、２つのポリマー間の可能な最大相同性（すなわち、２つのポリマーが、一致する（相同性の）位置の最大数を有するように整列したときのパーセント相同性）を示す。
【００５０】
用語「パーセント相同性」は、複数のポリペプチド間のアミノ酸配列の同一性の程度を言う。任意の２つのポリペプチド間の相同性は、どちらかの配列の所定の位置で一致するアミノ酸の総数の直接関数である。例えば、どちらかの配列のアミノ酸の総数の半分が同一の場合、その２つの配列は５０％相同性を示すと言われる。
【００５１】
ポリペプチドを参照するとき、用語「フラグメント」、「類似体」、および「誘導体」は、原型のポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活性を保持することが可能なポリペプチドを言う。従って、活性の成熟ポリペプチドを生成するために、類似体は、前駆体タンパク質の部分を切断することによって活性化され得る前駆体タンパク質を含む。ポリペプチドのフラグメント、類似体、または誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（そのようなアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものであり得る、またはあり得ない）と置換されるもの、または１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、またはポリペプチドの半減期を増加させるためにポリペプチドが化合物（ポリエチレングリコール等）と融合されるもの、または付加的アミノ酸がポリペプチド（シグナルペプチド等）もしくは配列（ポリペプチドもしくは前駆体タンパク質の精製のために用いられるポリヒスチジン標識等）に融合されるものであり得る。そのようなフラグメント、類似体、または誘導体は、本発明の範囲内であると見なされる。
【００５２】
ポリヌクレオチド配列の「保存」残基は、比較される２つ以上の関連する配列の同じ位置に変わらずに生じる残基である。相対的に保存される残基は、配列のほかの位置で現れる残基よりもより関連する配列の間に保存されるものである。
【００５３】
関連するポリヌクレオチドは、同一の残基をかなりの割合で共有するポリヌクレオチドである。
【００５４】
１つのポリヌクレオチドが最終的に別のものから由来する場合、異なるポリヌクレオチドは互いに「対応する」。例えば、メッセンジャーＲＮＡは、それから転写される遺伝子に対応する、ｃＤＮＡは、逆転写反応によって、またはＲＮＡ配列の知識に基づいてＤＮＡの化学合成によって生成されたＲＮＡに対応する。ｃＤＮＡは、また、ＲＮＡをコードする遺伝子に対応する。ポリヌクレオチドが、比較される異なる種、系統、または変種で関連するポリペプチドをコードする等の類似の機能を果たす場合、ポリヌクレオチトも互いに「対応する」。
【００５５】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリヌクレオチドの「類似体」は、形態および／また機能において（例えば、相補的なポリヌクレオチド配列上の塩基対への配列特異的な水素結合に関与する能力において）自然発生的なポリヌクレオチドと類似するが、例えば、異常なもしくは非自然な塩基または変化したバックボーンを保有する点でＤＮＡもしくはＲＮＡと異なる分子を言う。例えば、Ｕｈｌｍａｎｎら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０，５４３−５８４，（１９９０）を参照されたい。
【００５６】
ＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質等の「コード配列」または発現産物を「コードする」配列は、発現すると、そのＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば酵素）の産物をもたらす（つまり、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列をコードする）ヌクレオチド配列である。
【００５７】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手作業での評価によって、またはＢＬＡＳＴ（塩基局所配列検索ツール、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：，４０３−４１０，（１９９３））（ｗｗｗ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴも参照）等のアルゴリズムを用いるコンピュータ自動配列比較および同定によってのいずれかでポリペプチドもしくは遺伝子を推定的に同定するために、そのポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含んでいる部分である。
【００５８】
従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸フラグメントを特異的に同定するおよび／または単離するための配列を十分に含む。本明細書で報告されるように配列の利点を有する同業者は、現在、当業者にとって周知の目的で開示される配列のすべてあるいは実質的な部分を使用し得る。
【００５９】
「合成遺伝子」は、当業者にとって周知の方法を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドの構成エレメントから組み立てられことが可能である。これらの構成エレメントは、次いでその遺伝子全体を構築するために酵素的に組み立てられる遺伝子フラグメントを形成するために結合され、アニールされる。ＤＮＡの配列に関して、「化学的に合成される」とは、成分のヌクレオチドがインビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動による化学合成は、周知の方法を用いて達成されることが可能であり、自動化学合成は、市販されている多数の装置の１つを用いて実行されることが可能である。従って、宿主細胞のコドンバイアスを反映させるために、遺伝子はヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現の目的に合わせて作られ得る。コドン使用が宿主細胞によって好まれるコドンに偏っている場合、当業者は成功する遺伝子発現の可能性を認識する。好ましいコドンを決定することは、配列情報が利用できる宿主細胞から得られる遺伝子の調査に基づくこともある。
【００６０】
「遺伝子」は、調節配列の前のコード配列（５’非コード配列）および後のコード配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質を発現させる核酸フラグメントを言う。「天然の遺伝子」は、天然において見られ、それ自体の調節配列を有する遺伝子を言う。「キメラ遺伝子」または「キメラ構築物」は、天然の遺伝子ではなく、天然においては一緒に見られない調節配列およびコード配列を含む、いかなる遺伝子または構築物を言う。したがって、キメラ遺伝子またはキメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同一の供給源に由来するが、天然において見られるものと異なる形で配置される調節配列およびコード配列を含み得る。「内因性の遺伝子」は、生物のゲノム内のその自然配置の天然の遺伝子を言う。「外来」遺伝子は、通常、宿主生物では見つからないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を言う。外来遺伝子は、非天然生物に挿入される天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００６１】
「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を言う。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含み得る。
【００６２】
「遺伝子制御配列」は、遺伝子転写を開始するために必要なＤＮＡ配列、加えて開始を起こす割合を調節するために必要なＤＮＡ配列を言う。従って、遺伝子制御配列は、一般的な転写因子およびポリメラーゼが組み立てられるプロモーター、それに加えてそのプロモーターでこれらの組み立てプロセスの割合を制御するために、遺伝子調節タンパク質が結合するすべての調節配列から構成され得る。例えば、原核生物に適する制御配列は、プロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含み得る。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、および／またはポリアデニル化シグナルを利用することが可能である。
【００６３】
「プロモーター」は、コード配列の発現または機能性ＲＮＡを制御することが可能なヌクレオチド配列を言う。一般的に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントから成り、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれことが多い。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することが可能であり、かつプロモーターの本質的なエレメントであり得る、またはプロモーターの発現レベルもしくは組織特異性を高めるために挿入される異種エレメントであり得るヌクレオチド配列である。プロモーターは、全体として天然の遺伝子に由来し得る、または天然において見られる様々なプロモーターに由来する様々なエレメントから構成され得る、または合成ヌクレオチドフラグメントを含むこともある。様々なプロモーターが、様々な組織もしくは細胞型で、または発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を方向付けることが可能であることは、当業者によって理解される。
【００６４】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列を言い、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の添加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００６５】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するヌクレオチド配列を言う。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの第一転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性、または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
【００６６】
用語「作動可能に結合される」は、１つのフラグメントの機能が他によって影響されるように単一の核酸フラグメント上で２つ以上の核酸フラグメントを結合することを言う。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができるとき（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）、そのプロモーターは、そのコード配列と作動可能に結合される。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に結合され得る。用語「骨細胞中の作動可能なプロモーター」は、骨細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを言う。
【００６７】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列の転写を触媒するＲＮＡポリメラーゼからもたらされる産物を言う。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるとき、それは第一転写物と呼ばれる。またはそれは、第一転写物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを持たず、ポリペプチドに翻訳され得るＲＮＡを言う。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的であり、かつｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを言う。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含んでいるために細胞によってポリペプチドに翻訳され得るＲＮＡ転写物を言う。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的第一転写物またはｍＲＮＡのすべてもしくは一部に相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を阻止する（参照として本明細書に援用される、米国特許第５，１０７，０６５号を参照。）ＲＮＡ転写物を言う。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定のヌクレオチド配列の任意の部分（すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列）を有し得る。「機能性ＲＮＡ」は、翻訳されることがないが、細胞過程への影響を依然として有するセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または他のＲＮＡを言う。
【００６８】
用語「発現」は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を言う。発現は、また、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を言う。「アンチセンス抑制」は、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を言う。
【００６９】
「過剰発現」は、正常な生物または非形質転換生物内で生成のレベルが限度を超える、生物内の遺伝子産物の生成を言う。「抑制」は、外来もしくは内在性遺伝子またはＲＮＡ転写物の発現を抑制することを言う。
【００７０】
「変化したレベル」は、正常な生物または非形質転換生物のそれとは異なる量もしくは割合での生物における遺伝子産物の生成を言う。本発明のポリペプチドの過剰発現は、コード領域が発生の所望の段階で所望の組織内で遺伝子または構築物の発現を方向付けることができるプロモーターに作動可能に結合されるキメラ遺伝子またはキメラ構築物を最初に構築することで達成され得る。便宜上の理由で、キメラ遺伝子またはキメラ構築物は、同一の遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含み得る。転写末端シグナルをコードする３’非コード配列も、提供され得る。即時型キメラ遺伝子またはキメラ構築物も、遺伝子発現を促進するために１つまたは複数のイントロンを含み得る。即時型キメラ遺伝子またはキメラ構築物を含むプラスミドベクターは、次いで構築され得る。プラスミドベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。当業者は、キメラ遺伝子またはキメラ構築物を含有する宿主細胞の形質転換、選択、および伝播をうまく行うために、プラスミドベクターの上に存在しなければならない遺伝子エレメントについて十分に理解している。当業者は、また、異なる別の形質転換現象が発現の異なるレベルおよびパターンをもたらす（Ｊｏｎｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４，２４１１−２４１８，（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８，７８−８６，（１９８９））ことを認識する。従って、複数の現象は、所望の発現レベルおよびパターンを示す細胞系を得るためにスクリーニングされなければならない。そのようなスクリーニングは、ＤＮＡサザン解析、ｍＲＮＡ発現に関するノーザン解析、タンパク質発現に関するウエスタンまたは免疫細胞化学解析、または表現型解析によって達成され得る。
【００７１】
用語「単数の変種」または「複数の変種」は、Ｒｏｒ分子の核酸配列またはアミノ酸配列の変形を言う。用語「変種」に包含されるのは、Ｒｏｒ分子のヌクレオチドおよびアミノの酸置換、添加、または欠失である。また、用語「変種」に包含されるのは、化学的に修飾された天然および合成のＲｏｒ分子である。例えば、変種は、基準ポリペプチドと異なるポリペプチドを言うことが可能である。通常、基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるポリペプチドと基準ポリペプチドとの間の相違は、基準のアミノ酸配列と変種が全般的に極めて類似し、および一部の領域で同一であるように限定される。変種および基準ポリペプチドは、保存的または非保存的であり得、かつ任意の組み合わせで存在し得る１つまたは複数の置換、欠失、添加、融合、および切り詰めだけがアミノ酸配列で異なり得る。例えば、変種は、例えばいくつか（５０〜３０個、３０〜２０個、２０〜１０個、１０〜５個、５〜３個、３〜２個、２〜１個、または１個）のアミノ酸が任意の組み合わせで挿入、置換、または欠失されるものであり得る。さらに、変種は、末端欠失または内部欠失等によって基準配列よりも短いことで基準ポリペプチド配列と異なる本発明のポリペプチドのフラグメントであり得る。本発明のポリペプチドの変種は、また、例えばポリペプチド（例えば、活性の成熟ポリペプチドを生成するために前駆体部分の切断によって活性化され得る前駆体タンパク質）と同じ生物学的機能または活性を本質的に保持するポリペプチドを含む。これらの変種は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の相違を特徴とする対立遺伝子変異であり得、または差動スプライシングもしくは翻訳後修飾に関与し得る。変種は、また、実質的に同じ生物活性を有するが、異なる種から得られる関連タンパク質を含む。当業者は、単一のもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、添加、または交換を有する変種を生成し得る。これらの変種は、とりわけ以下を含み得る：（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）と置換され、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされる可能性があるもの、またはコードされる可能性がないもの、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸が、ペプチドもしくはタンパク質から除去されるもの、あるいは（ｉｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸が、ポリペプチドもしくはタンパク質に添加されるもの、あるいは（ｉｖ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、置換基を含むもの、あるいは（ｖ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）等の別の化合物と融合するもの、あるいは（ｖｉ）付加的なアミノ酸が、例えばリーダー配列もしくは分泌配列もしくは成熟ポリペプチドの精製のために使用される配列もしくは前駆体タンパク質配列等の成熟ポリペプチドと融合されるもの。ポリペプチドの変種は、また、自然発生的な対立遺伝子変種等の自然発生的変種であり得、または自然発生することが知られていない変種であり得る。上記に定義されるそのような変種のすべては、当技術分野の教示の範囲内であると見なされる。
【００７２】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態で提供され、および均一に精製され得る。場合によっては、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも９０％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９８％の純度、または少なくとも９９％の純度である。
【００７３】
用語「単離された」は、物質がその原型または生来の環境（例えば、それが自然発生的なものであれば、自然環境）から取り出されることを意味する。従って、生きている動物内に存在する自然発生的なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されないが、自然系で共存する物質の一部またはすべてからヒトの介入によって分離される該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離される。例えば、「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖もしくは二本鎖であり、場合により合成の、非天然の、もしくは変化したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態で単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つまたは複数のフラグメントが含まれ可能性があり、かつ炭水化物、脂質、タンパク質、または他の物質と組み合わせることも可能である。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、かつそのようなベクターまたは組成物は、それが天然において見られる環境の一部ではないベクターまたは組成物で依然として単離され得る。同様に、用語「実質的に精製された」は、天然において発生する直接の化学環境からヒトの介入を介して分離または除去された物質を言う。実質的に精製されたポリペプチドまたは核酸は、当技術分野で一般に周知の多くの技術および方法のいずれかによって得られるまたは生成され得る。
【００７４】
用語「精製」は、試料中の特定の１つのポリペプチドまたは複数のポリペプチドの比活性もしくは濃度を上昇させることを言う。１つの実施形態では、比活性は、試料中の標的ポリペプチドの活性と全ポリペプチドの濃度との比率として表される。別の実施形態では、比活性は、標的ポリペプチドの濃度と全ポリペプチドの濃度との比率として表される。精製法は、当業者にとって周知の方法である透析、遠心分離、およびカラムクロマトグラフィー技法を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｙｏｕｎｇら，１９９７，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｄａｉｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ」，ＢｉｏＰｈａｒｍ  １０（６）：３４−３８を参照されたい。
【００７５】
用語「実質的に純粋な」および「単離された」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、天然においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連しない物質との混合物を排除することを目的としていない。
【００７６】
用語「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は、互換的に使用され得る。これらの用語のすべては、また、任意のおよびすべての次世代であるそれらの子孫を含む。意図的なまたは偶発性の変異が原因で、すべての子孫が同一でないこともあり得ると理解される。異種核酸配列を表す文脈では、インビトロで位置付けられようとインビボで位置付けらようと、「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のバクテリア細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥の細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞、および昆虫細胞）を言う。例えば、宿主（および細胞を複製することが可能ないかなる形質転換性生物を含み得る）は、遺伝子導入動物に位置付けられことが可能である。宿主細胞は、ベクターによってコードされる異種核酸を発現する複数のベクターおよび／または単数のベクターのレシピエントとして使用され得る。
【００７７】
哺乳類細胞系によって産生される外来タンパク質を発現させ、回復させる一般法は、例えば、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら，（ｅｄｓ．）ｐａｇｅｓ  １６３（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって提供される。細菌系によって産生されるタンパク質を回復させる標準技法は、例えば、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒら，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ５９−９２（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）によって提供される。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの生成は、米国特許第５，１６２，２２２号および世界知的所有権機関公報、国際公開第９４／０６４６３号（Ｇｕａｒｉｎｏらら）によって開示される。バキュロウイルス系から組換えタンパク質を単離する方法は、また、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（ｅｄ．），「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）によって記述される。１つの実施形態では、本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現系を用いて発現させることが可能である（全体を参照として本明細書に援用される、Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６，４７，「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙら，（Ｅｄｓ．），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、米国特許第４，８７９，２３６号を参照。）。さらに、ＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全なバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）は、例えば、昆虫細胞で生成するために使用され得る。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、また、特定の性質を利用することによって単離され得る。例えば、固定化金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーは、ポリヒスチジン標識を構成するそれらを含む、ヒスチジンが豊富なタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言うと、キレートを形成するために最初にゲルを二価金属イオンで荷電する（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：１（１９８５））。ヒスチジンが豊富なタンパク質は、使用される金属イオンによって、異なる親和性でこのマトリックスに吸着され、競合的溶出、ｐＨの低下、または強力なキレート化剤の使用によって溶出される。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を含む（Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：５２９（１９９０））。本発明の付加的な実施形態では、目的のポリペプチドと親和性標識の融合（例えばマルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）は、精製を促進するために構築され得る。
【００７９】
本発明の宿主細胞は、Ｒｏｒポリペプチドの大規模な生成のための方法で使用され得る。その方法では、細胞が適切な培地で増殖され、所望のポリペプチド産物が細胞から単離されるか、または細胞が当技術分野で周知の精製法（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、レセプター親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチン親和性クロマトグラフィー、サイズ排除濾過、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ等を含む従来のクロマトグラフィー方法）によって細胞が増殖される培地から単離される。他の精製法は、所望のタンパク質が、特異的結合パートナーまたは薬剤によって認識される特異的な標識、ラベル、またはキレート化部分を有する融合タンパク質として発現され、精製される。精製タンパク質は、切断されて所望のタンパク質をもたらし得る、またはインタクトな融合タンパク質として残され得る。融合成分の切断は、切断プロセスの結果として付加的なアミノ酸残基を有する所望のタンパク質の形を生成し得る。
【００８０】
用語「インビトロ」は、人工的な環境を言い、人工的な環境内で起こる反応またはプロセスを言う。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物を含むがこれらに限定されない。用語「インビボ」は、自然環境（例えば、動物または細胞）を言い、自然環境内で起こる反応またはプロセスを言う。
【００８１】
本発明の方法は、核抽出物を含む細胞（培養細胞）および細胞可溶化物を用いてインビトロで実行され得る。骨形成を調節する薬剤を同定するために考えられる細胞の例は、頭蓋冠細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、および多能性前駆細胞（多能性骨髄間質細胞等）を含むがこれらに限定されない。骨芽細胞および骨芽細胞の前駆細胞系の具体例は、ＡＴＣＣカタログ（国際公開第０１／１９８５５号）に提供されているＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、Ｃ２Ｃ１２、ＭＧ−６３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＵＭＲ１０６細胞、ＲＯＳ１７／２．８細胞、ＳａＯＳ−２細胞等、ならびに以下に記述されるＨＯＢ細胞系を含む（Ｂｏｄｉｎｅ  ＰＶ，Ｖｅｒｎｏｎ  ＳＫ，Ｋｏｍｍ  ＢＳ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，４５９２−４６０４，（１９９６），Ｂｏｄｉｎｅ  ＰＶＮ，ＴｒａｉｌＳｍｉｔｈ  Ｍ，Ｋｏｍｍ  ＢＳ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ  Ｒｅｓ，１１，８０６−８１９，（１９９６），Ｂｏｄｉｎｅ  ＰＶ，Ｇｒｅｅｎ  Ｊ，Ｈａｒｒｉｓ  ＨＡ，Ｂｈａｔ  ＲＡ，Ｓｔｅｉｎ  ＧＳ，Ｌｉａｎ  ＪＢ，Ｋｏｍｍ  ＢＳ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６５，３６８−３８７，（１９９７），Ｂｏｄｉｎｅ  ＰＶ，Ｋｏｍｍ  ＢＳ．，Ｂｏｎｅ，２５，５３５−４３（１９９９），Ｂｏｄｉｎｅ  ＰＶＮ，Ｈａｒｒｉｓ  ＨＡ，Ｋｏｍｍ  ＢＳ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２４３９−２４５１，（１９９９），Ｐｒｉｎｃｅ  Ｍ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ  Ｃ，Ｊａｖｅｄ  Ａ，Ｇｒｅｅｎ  Ｊ，Ｌｉａｎ  ＪＢ，Ｓｔｅｉｎ  ＧＳ，Ｂｏｄｉｎｅ  ＰＶ，Ｋｏｍｍ  ＢＳ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，８０，４２４−４０，（２００１））。本発明の方法は、また、無細胞系を用いて実行され得る。
【００８２】
用語「発現系」は、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のために適切な条件下での宿主細胞および適合するベクターを言う。一般の発現系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、および哺乳類宿主細胞とベクターを含む。
【００８３】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへの転移を言う。形質転換した核酸フラグメントを含む宿主生物は、「遺伝子組換え」生物と呼ばれる。
【００８４】
用語「分化する」は、組織または細胞の最初の型と異なる特徴または機能を有することを言う。従って、「分化」は、分化するプロセスまたは行為である。
【００８５】
用語「骨芽細胞分化」は、細胞が骨芽細胞への成熟期に特殊化した機能を発達させるプロセスを言う。骨芽細胞分化は、前骨芽細胞、初期骨芽細胞と成熟骨芽細胞、前骨細胞と成熟骨細胞の各段階を含み得る（Ｂｏｄｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ６５，１０１−１５１（２００２），ＳｔｅｉｎらＥｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １４，４２４−４４２（１９９３）、およびＬｉａｎらＶｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ５５，４４３−５０９（１９９９））。
【００８６】
用語「増殖」は、類似細胞の成長および生成を言う。
【００８７】
用語「表現型」は、細胞または生物の観察可能な特徴を言う。そのような観察可能な特徴は、外見ならびに細胞または生物に存在する特定の生理学的組成物のレベルを含み得る。骨芽細胞表現型は、骨に特異的な転写因子Ｃｂｆａｌ；Ｉ型コラーゲン；アルカリホスファターゼ、オステオカルシン；および骨シアロタンパク質等のいくつかのマーカータンパク質の発現を含む。
【００８８】
本明細書で使用されるように、用語「結合パートナー」または「相互作用タンパク質」は、特異性を有する別の分子を結合し得る分子（例えば抗原と抗原特異的抗体または酵素とその抑制物質として）を言う。結合パートナーは、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビシン、ＩｇＧとタンパク質Ａ、レセプター−リガンド結合、タンパク質−タンパク質相互作用、および相補的ポリヌクレオチド鎖を含み得る。用語「結合パートナー」は、また、細胞内でキナーゼに結合するポリペプチド、脂質、小分子、または核酸を言う。キナーゼと結合パートナーとの間の相互作用の変化は、相互作用を形成する確率の増加もしくは低下として、またはキナーゼ−結合パートナー複合体の濃度の増加もしくは低下として現れる。例えば、Ｒｏｒ１もしくはＲｏｒ２タンパク質は、別のタンパク質もしくはポリペプチドに結合し、Ｒｏｒ１もしくはＲｏｒ２活性を調節する結果になり得る複合体を形成し得る。
【００８９】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞内シグナルになるために細胞膜を通して細胞外シグナルを伝播する分子を言う。このシグナルは、次いで細胞応答を刺激することができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は、レセプターおよび非レセプタータンパク質チロシンキナーゼであり得る。
【００９０】
「レセプター」は、通常、特異的物質を選択的に結合することを特徴とする細胞内または細胞の表面上の分子構造を言う。典型的なレセプターは、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体フラグメント、および免疫グロブリンのための細胞表面レセプターならびにステロイドホルモンのための細胞質レセプターを含む。
【００９１】
用語「調節する」は、機能の抑制、増強、または誘導を言う。例えば、遺伝子発現の「調節」または「制御」は、遺伝子活性の変化を言う。発現の調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑圧を含み得るがこれらに限定されない。「調節する」または「制御する」は、また、タンパク質、酵素、抑制物質、シグナル伝達物質、レセプター、転写活性化因子、補助因子等の生物活性を増加させる、または減少させる方法、条件、または薬剤を言う。活性のこの変化は、ｍＲＮＡ翻訳、ＤＮＡ転写、および／またはｍＲＮＡ分解もしくはタンパク質分解の増加または減少になり得、次に生物活性の増加または減少に対応し得る。そのような増強または抑制は、シグナル伝達経路の活性化等の特定の現象の発生に付随する可能性があり、および／または特定の細胞型でのみ明白である可能性がある。
【００９２】
「調節活性」は、タンパク質の生物学的活性型によって調節されるいかなる活性、状態、疾患、または表現型を言う。調節は、生物学的に活性のタンパク質の濃度に影響を及ぼすことによって（例えば、発現もしくは分解を調節することによって、または例えば基質の抑制、活性化、結合、もしくは放出。化学的もしくは構造的な修飾を通して直接的なアゴニスト作用もしくは拮抗作用によって、または付加的な因子を含み得る直接的もしくは間接的な相互作用によって）影響を与え得る。
【００９３】
「修飾物質」は、骨形成またはＲｏｒ分子発現等の比活性の発現を変化させる任意の薬剤を言う。例えば、骨形成を調節する薬剤は、骨形成を変化させる、または変える（増加させるまたは減少させる）。修飾物質は、例えば、抗体、小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質等の任意の化合物を含むことを目的とする。
【００９４】
「プラズマ細胞」は、抗体（免疫グロブリン）の産生のために特殊化される成熟Ｂリンパ球を言う。プラズマ細胞は、まれに末梢血で見られる。プラズマ細胞は、骨髄白血球数の０．２％〜２．８％を含む。成熟プラズマ細胞は、卵型または扇型であることが多く、測定される大きさは８〜１５μｍである。核心は、偏心型および卵型である。
【００９５】
用語「小分子」は、合成化合物もしくは自然発生的化合物（例えば、場合により誘導体化され得るペプチドもしくはオリゴヌクレオチド、天然物もしくは他のいかなる低分子量（つ上、約５ｋダルトン未満）の有機化合物、天然由来もしくは合成由来のいずれかの生物無機化合物もしくは無機化合物）を言う。そのような小分子は、送達可能な治療物質であり得、またはさらに送達を促進するために誘導体化され得る。
【００９６】
本明細書で使用されるように、用語「誘導物質」は、骨形成またはＲｏｒ分子発現の比活性を誘導する、増強する、促進する、または増加させるいかなる薬剤を言う。
【００９７】
本明細書で使用されるように、用語「インヒビター」もしくは「レプレッサー」は、骨形成またはＲｏｒ分子発現の比活性を阻害する、抑制する、抑圧する、または減少させるいかなる薬剤を言う。
【００９８】
本明細書で使用されるように、用語「薬剤」または「試験薬剤」は、検査される任意の化合物または分子を言う。本発明の薬剤の例は、ペプチド、小分子、および抗体を含むが、これらに限定されない。薬剤は無作為に選択され得る、または合理的に選択または設計され得る。明細書で使用されるように、薬剤が、その薬剤と標的化合物または部位との間の特異的相互作用を考慮せずに無作為に選択されるとき、薬剤は、「無作為に選択される」と言われる。本明細書で使用されるように、薬剤と標的化合物または部位および／または薬剤の作用に関連する立体構造との間の特異的相互作用を考慮する非無作為な基準に基づいて薬剤が選択されるとき、薬剤は「合理的に選択または設計される」と言われる。
【００９９】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分（例えば抗原結合部分）を言う。抗体は、自然に産生される、または全体的にもしくは部分的に合成で生成される。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、抗体をペプシン等の酵素で切断することによって生成され得るＦ（ａｂ）、Ｆｖ、およびＦ（ａｂ’）フラグメントを含む。特異的結合能力を維持するそのすべての誘導体も、この用語に含まれる。この用語は、また、免疫グロブリン結合ドメインと相同性である、または大部分は相同性である結合ドメインを有するいかなるタンパク質を包含する。これらのタンパク質は、天然源に由来し得る、または部分的にもしくは全体的に合成的に生成され得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラス抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）のいずれかを含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。しかしながらＩｇＧクラスの誘導体は、通常、本発明で好まれる。
【０１００】
用語「抗体フラグメント」は、全長に満たない抗体のいかなる誘導体を言う。好ましくは、抗体フラグメントは、全長抗体の特異的結合能力の少なくとも重要な部分を保持する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ二重特異性抗体、およびＦｄフラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体フラグメントは、任意の手段で生成され得る。例えば、抗体フラグメントは、インタクトな抗体の断片化によって酵素的にもしくは化学的に生成され得る、または抗体の部分配列をコードする遺伝子から組換えで生成され得る。あるいは、抗体フラグメントは、全体的にまたは部分的に合成で生成され得る。抗体フラグメントは、場合により単鎖抗体フラグメントであり得る。あるいは、抗体フラグメントは、例えば、ジスルフィド結合または他のより安定な結合によって結合される複数の鎖を含み得る。抗体フラグメントは、また、場合により多分子複合体であり得る。機能的抗体のフラグメントは、一般的に、少なくとも約５０のアミノ酸を含み、より一般的に少なくとも約２００のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、少なくとも２つの抗原結合部位を有する。いくつかの好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、正確に、２つ、３つ、４つ、または５つの抗原結合部位を有する。２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントは、本発明で特に有用である。そのような薬剤は、多量体を形成することなくＲｏｒ２を二量体化する。
【０１０１】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ポリペプチドリンカーによって互いに共有結合した可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）だけから成る組換え抗体フラグメントである。ＶＬまたはＶＨのいずれかはＮＨ２末端ドメインであり得る。ポリペプチドリンカーは、２つの可変ドメインが、重大な立体的干渉なして架橋される限り、可変長および可変組成であり得る。一般的に、リンカーは、溶解性のために散在されるいくつかのグルタミン酸またはリシンの残基を有するグリシンおよびセリンの残基の伸展を主に含む。
【０１０２】
二重特異性抗体は、二量体ｓｃＦｖである。一般的に、二重特異性抗体の成分は、大部分のｓｃＦｖよりも短いペプチドリンカーを有し、それらは、二量体として結合することに対する選択性を示す。
【０１０３】
Ｆｖフラグメントは、非共有結合性相互作用によって結合される１つのＶＨドメインと１つのＶＬドメインから成る抗体フラグメントである。用語ｄｓＦｖは、ＶＨ−ＶＬ対を安定させるために設計された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを言うために、本明細書で使用される。
【０１０４】
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ｐＨ４．０〜４．５で酵素ペプシンを用いる消化によって免疫グロブリン（典型的にＩｇＧ）から得られるフラグメントと本質的に同等の抗体フラグメントである。フラグメントは、組換えで生成され得る。
【０１０５】
Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの２つの重鎖をつなぐ架橋の低減によって得られるフラグメントと本質的に同等の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、組換えで生成され得る。
【０１０６】
Ｆａｂフラグメントは、酵素パパインを用いる消化によって免疫グロブリン（典型的にＩｇＧ）から得られるフラグメントと本質的に同等の抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、組換えで生成され得る。Ｆａｂフラグメントの重鎖セグメントは、Ｆｄ小片である。
【０１０７】
本明細書で使用されるように、用語「レポーター遺伝子」は、その表現型発現が容易にモニターできる任意の遺伝子を言う。レポーター遺伝子の使用は、どの試験薬剤がシグナル伝達経路を活性化するかを決定するスクリーニングにおいて特に有用である。レポーター遺伝子は、シグナル伝達経路によって制御されるプロモーターまたは他の調節エレメントに作動可能に結合される。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物が作られ、そこでレポーター遺伝子が特定の目的のプロモーター領域または他の調節領域に機能的に結合し、次いでその構築物は細胞もしくは生物に形質移入される。一般的に用いられるレポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、およびクロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）を含む。
【０１０８】
本明細書で使用されるように、用語「処置」、「処置すること」、および「療法」は、治療的処置および予防的処置、または予防的操作、または種々の処置（骨細胞分化もしくは骨形成を刺激する、骨障害症状の発症を延ばす、および／または骨障害の重症度および／もしくは骨障害から発症するもしくは発症すると予測されるそのような症状を低減する）を言う。これらの用語は、さらに、既存の骨障害症状を寛解させること、さらなる症状を予防すること、症状の根底にある代謝的原因を改善するもしくは予防すること、症状の根底にある代謝的原因を予防もしくは逆転させること、または骨成長を予防もしくは促進することを含む。従って、これらの用語は、骨障害、またはそのような障害を発症する可能性を有する被験体に有益な結果が与えられたことを意味する。さらに、用語「処置」は、疾患、疾患の症状、もしくは疾患に罹りやすい傾向を有す可能性のある被験体に、または被験体から単離した組織もしくは細胞系に、該疾患、該疾患の症状、もしくは該疾患になりやすい傾向を治す、治癒する、軽減する、和らげる、変化させる、改善する、寛解させる、向上させる、または影響を及ぼす目的で、薬剤（例えば、治療薬または治療的組成物）の適用または投与として定義される。本明細書で使用されるように、「治療薬」は、疾患の処置（例えば、骨形成活性を調節する、または新骨形成を誘導する）で役に立ついかなる物質または物質の組み合わせを言う。従って、治療薬は、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
治療薬または治療的組成物は、また、特定の疾患の症状を予防するおよび／または低減する医薬的に許容される形状の化合物を含み得る。例えば、治療的組成物は、骨関連障害の症状を予防するおよび／または低減する医薬組成物であり得る。本発明の治療的組成物は、任意の適切な形状で提供されると考えられる。治療的組成物の形状は、投与モードを含むいくつかの要素に依存する。治療的組成物は、他の成分からの希釈剤、アジュバント、および賦形剤を含み得る。
【０１１０】
骨強度は、骨密度（ミネラルｇ／体積ｃｍ３）および骨質（ミネラル化、骨構造、骨代謝回転、微細損傷）によって決定され得る。骨強度の測定として、骨塩量（ＢＭＤ）が通常使用される。例えば、骨は、そのＢＭＤが、若い白人の成人女性の平均値以下で２．５標準偏差を超える場合、骨粗鬆症と断言され得る（世界保健機関、１９９４年、閉経後骨粗鬆症のスクリーニングへの骨折リスクおよびその適用の評価。テクニカルリポートシリーズ８４３、ジュネーブ、世界保健機関）。
【０１１１】
「骨組織」は、石灰化した組織（例えば頭蓋冠、脛骨、大腿骨、椎骨、歯）、骨梁、骨梁以外の空洞である骨髄腔、骨梁および骨髄腔等の外側周辺を覆う皮質骨等を言う。骨組織は、また、通常ミネラル化コラーゲンのマトリックス内に位置する骨細胞、骨細胞に栄養を供給する血管、骨髄液、滑液、骨組織に由来する骨細胞を言い、かつ脂肪骨髄も含み得る。骨組織は、全体の骨、全体の骨の部分、骨片、骨粉、骨組織バイオプシー、コラーゲン画分、またはその混合物等の骨生成物を含む。本発明の目的で、用語「骨組織」は、特に明記しない限り、ヒトまたは動物を問わず、前述の骨組織および骨生成物のすべてを包含するために使用される。
【０１１２】
本明細書で使用されるように、「骨関連活性」は、骨形成活性および骨再吸収活性を含む。骨形成活性は、骨芽細胞活性、骨前駆細胞からの骨芽細胞への分化、および骨芽細胞増殖を増加させることによって、骨芽細胞アポトーシスを減少させることによって、およびその任意の組み合わせによって誘導され得る。さらに、骨再吸収活性は、破骨細胞活性、破骨細胞分化と増殖を減少させることによって、破骨細胞アポトーシスを増加させることによって、およびその任意の組み合わせによって抑制され得る。骨形成活性は、種々の骨組織または細胞で誘導され得る。
【０１１３】
本明細書で使用されるように、語句「骨形成を調節すること」は、骨形成を増加させるまたは減少させることを言う。「骨形成の増加」は、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体の骨部位への補充を意味し、それによって成熟してない骨芽細胞内の細胞分化および骨物質でミネラル化し、その部位で骨量を増加させるそれらのコラーゲンマトリックスの分泌をもたらす。この用語は、また、成熟骨芽細胞によるコラーゲンマトリックスの増加生成および分泌を包含する。骨形成の増加は、骨折率の減少、面骨密度の増加、ミネラル骨密度の体積増加、骨梁の結合性の増加、骨梁密度の増加、皮質密度もしくは厚さの増加、骨径の増加、および骨無機物含有量の増加から１つまたは複数によって決定され得る。骨形成の増加は、骨細胞（例えば骨芽細胞）の結合、増殖、生存、および／または分化の増加、およびそれに続く骨ミネラル化に起因し得る。
【０１１４】
「骨関連障害」は、骨形成および骨吸収の障害を含む。これらの疾患および状態は、以下を含むがこれらに限定されない：くる病、骨軟化症、骨減少症、骨硬化症、腎性骨異栄養症、骨粗鬆症（老人性および閉経後骨粗鬆症を含む）、パジェット病、骨腫瘍転移、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、大理石骨病、歯周炎、ならびにリウマチ関節炎および骨関節炎を併発し得る骨代謝の異常変化。これらの疾患の一部は、不十分な骨形成または骨量減少を特徴とするが、その他は、骨組織の異常な肥厚または硬化に関与する。骨の異常な肥厚を抑制することから恩恵を受ける疾患の例は、大理石骨病と骨硬化症を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
「骨関連薬剤」は、骨形成または骨吸収に影響を与える薬剤を言う。「骨関連薬剤」は、同化効果または異化効果を誘導することが可能であり、骨吸収を抑制し、骨塩量の増加をもたらすことが可能であり、骨形成を増加させ、または骨形成と骨吸収の間のバランスを維持することが可能である。
【０１１６】
用語「化合物」または「薬剤」は、被験体（ヒトまたは動物）に投与されたとき、局所作用および／または全身作用によって所望の薬理効果および／または生理的効果を誘導する１つの化合物または複数の化合物または物質の組成物を言うために本明細書では互換的に使用される。
【０１１７】
用語「被験体」は、ヒトまたは非ヒト非験者を含む任意の哺乳類を言う。非ヒト被験体は、実験動物、試験動物、畜産動物、エンターテインメント動物、またはペットを含み得る。被験体は、ヒトであり得る。被験体は、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜であり得る。被験体は、マウス、ラット、ウサギ、サル等の実験動物であり得る。
【０１１８】
用語「生体試料」は、広範に定義され、いかなる細胞、組織、生体液、器官、多細胞生物等を含む。生体試料は、例えば、インビトロの細胞培養物または組織培養物に由来し得る。あるいは、生体試料は、生物または単細胞生物の集団に由来し得る。生体試料は、生骨等の生きている組織であり得る。用語「生体試料」は、また被験体から単離した細胞、組織、または生体液等の試料、ならびに被験体内に存在する試料を含むことを目的としている。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボ生体試料中のＲｏｒ  ｍＲＮＡ、タンパク質、ゲノムＤＮＡ、または活性を検出するために使用され得る。例えば、Ｒｏｒ  ｍＲＮＡの検出のインビトロ技法は、ＴａｑＭａｎ解析、ノーザンハイブリダイゼーション、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。Ｒｏｒタンパク質の検出のインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降法、および免疫蛍光法を含む。ＲｏｒゲノムＤＮＡの検出のインビトロ技法は、サザンハイブリダイゼーションを含む。
【０１１９】
（発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、骨代謝、特に骨芽細胞分化におけるＲｏｒファミリーおよびその下流シグナル伝達生体分子の役割の発見に由来する。米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号、第６０／４６３，３６４号、および第６０／５０１，３４０号を参照されたい。これらの各々は、参照することによって本明細書に援用される。出願者は、下方制御するＲｏｒ２発現が、ヒト間葉系幹細胞のデキサメタゾン誘導骨形成分化を抑制することを発見した（図１）。対照的に、Ｒｏｒ２過剰発現は、ヒト間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制する（図２）。出願者は、また、下方制御する１４−３−３β発現が、ヒト間葉系幹細胞においてミネラル化マトリックス形成を増強することを示した（図１０）。さらに、Ｒｏｒ２過剰発現および１４−３−３β抑制は、いずれかの単独よりもより大きなマトリックスミネラル化を誘導する（図１０）。これらの発見に基づいて、タンパク質レベルでＲｏｒ２活性を調節する、または１４−３−３β活性を調節する薬剤もしくはその医薬組成物は、骨疾患および／または代謝障害（肥満症もしくは糖尿病等）の処置に有用である。実際に、Ｒｏｒ２タンパク質の活性を増加させる薬剤は、骨芽細胞分化を促進させ、それによってミネラル化骨形成を増加させる（図８および９）。また、１４−３−３β活性を抑制する薬剤は、骨芽細胞分化を促進し、それによってミネラル化骨形成を増加させる（図１０）。
【０１２０】
１つの態様では、本発明は、Ｒｏｒ２タンパク質の活性を調節する（増加または減少させる）薬剤を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質の活性を増加させる。他の実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質の活性を減少させる。一般的に、これらの薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質の活性レベルを増加または減少させるタンパク質レベルで作用する。本明細書で述べるように、Ｒｏｒ２活性を増加させる薬剤は、ミネラル化骨形成および骨形成分化を促進する際に有用である。これらの薬剤は、また、脂肪細胞への分化を抑制することによって肥満症の処置に有用になり得る（図２）。特定の理論に制約されることを願わずに、Ｒｏｒ２活性の増加は、脂肪細胞への分化を抑制しながら、骨形成分化を促進すると思われる。
【０１２１】
Ｒｏｒ２活性を調節するこれらの薬剤は、小分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド等を含むいかなる種類のキメラ化合物であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤はタンパク質である。他の実施形態では、薬剤はペプチドである。さらに他の実施形態では、薬剤はポリヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、薬剤は、小分子（例えば、１５００ｇ／モル未満の分子量を有する）である。好ましくは、薬剤はＲｏｒ２タンパク質に特異的であり、他の生体分子に結合しない。特に、いくつかの実施形態では、薬剤は、他のＲｏｒファミリーメンバーに結合しない。他の実施形態では、他の生体分子もしくはＲｏｒファミリーメンバーと交差反応性があり得るが、しかしこれらの他の分子に対する該薬剤の親和性はＲｏｒ２タンパク質に対するよりも低い。
【０１２２】
いくつかの特定の実施形態では、薬剤は２つのＲｏｒ２タンパク質の二量体化を引き起こすことで作用する。Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化は、Ｒｏｒ２レセプターの活性化を引き起こすと考えられる。Ｒｏｒ２キナーゼ活性の活性化は、１４−３−３βタンパク質を含むその結合パートナーのリン酸化につながる。他のＲｏｒ２結合パートナーは、以下を含むがこれらに限定されない：ＡＤＰ／ＡＴＰ担体タンパク質、ＵＤＰ−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼ様１、１４−３−３タンパク質γ、リボフォリンＩ、アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、細胞アポトーシス感受性タンパク質、ＮＯＴＣＨ２タンパク質、およびヒト骨格筋ＬＩＭタンパク質３（参照として本明細書に援用される、米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願））。薬剤は、一般的に、Ｒｏｒ２タンパク質を指向する少なくとも２つの結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質を指向する正確に２つの結合ドメインを有する（すなわち薬剤は二価である）。多価である他の薬剤も、本発明では有用である。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化を促進する小分子またはポリヌクレオチドである。他の実施形態では、薬剤はタンパク質またはペプチドである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体または抗体フラグメント（例えば二重特異性抗体）である。抗体または抗体フラグメントは、Ｒｏｒ２タンパク質の任意の領域に向けられ得るが、しかし抗原結合部位は、Ｒｏｒ２の生物活性に（例えばキナーゼ活性）または２つのタンパク質の二量体化に干渉し得る領域に、好ましくは向けられない。抗体または抗体フラグメントによる２つのＲｏｒ２タンパク質の結合は、Ｒｏｒ２タンパク質の二量体化およびそれによってその活性化を促進する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体は、いかなるアイソタイプであり得るが、しかしＩｇＧアイソタイプが、通常好まれる。抗体は、任意の種に由来し得るが、しかしヒトで用いるためには、抗体は一般的にヒト由来またはヒト化されたものである。抗体を他の種で使用する場合、抗体はその種に適合され得る。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体は完全にヒト抗体である。いくつかの特定の実施形態では、抗体は完全にヒトモノクローナル抗体である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ウサギまたは他のげっ歯類等の哺乳類を、Ｒｏｒ２タンパク質に由来する精製されたヒトＲｏｒ２タンパク質またはペプチドで免疫することによってＲｏｒ２タンパク質に対する抗体が、調製される。免疫化の後、Ｂ細胞またはプラスミド細胞等の抗体を産生する細胞は、採取されて、次いでＲｏｒ２タンパク質に対する抗体の生成を選別されるハイブリドーマを調製するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｒｏｒ２タンパク質を二量体化するおよび／または活性化するそれらの性能を選別される。一旦所望の抗体を産生するＢ細胞が同定されると、そのＢ細胞は不死化され得る。結果として生じるハイブリドーマは、次いで、所望のモノクローナル抗体を生成するために使用され得る。ハイブリドーマによって生成される抗体は、さらに特徴付けられ、修飾され得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト被験体への抗体の投与が有害反応（治療抗体のクリアランスの増加から致命的なアナフィラキシーまでに及び得る）を引き起こさぬようヒト化され得る。いくつかの実施形態では、Ｒｏｒ２タンパク質（すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ））を認識する抗体の領域は、異なる特異性のヒト抗体のＣＤＲを置換するために使用される。抗体を操作し調製する技法は、当技術分野では周知であり、米国特許第４，８１６，５６７号（１９８９年３月２８日発行）、米国特許第５，０７８，９９８号（１９９２年１月７日発行）、米国特許第５，０９１，５１３号（１９９２年２月２５日発行）、米国特許第５，２２５，５３９号（１９９３年７月６日発行）、米国特許第５、５８５、０８９号（１９９６年１２月１７日発行）、米国特許第５，６９３，７６１号（１９９７年１２月２日発行）、米国特許第５，６９３，７６２号（１９９７年１２月２日発行）、米国特許第５，８６９，６１９号（１９９１年発行）、米国特許第６，１８０，３７０号（２００１年１月３０日発行）、米国特許第６，５４８，６４０号（２００３年４月１５日発行）、米国特許第６，８８１，５５７号（２００５年４月１９日発行）、米国特許第６，９８２，３２１号（２００６年１月３日発行）に記述されており、これらは参照することによって本明細書に援用される。他の実施形態では、抗体は、Ｒｏｒ２タンパク質に対してより高い特異性および／または親和性を有する抗体を得るために、進化されおよび／または修飾される。
【０１２５】
他の実施形態では、薬剤はＲｏｒ２タンパク質に対する抗体のフラグメントを含む。Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体の１つまたは複数のフラグメントが、使用され得る。フラグメントは、一般的に、Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体親和性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。Ｒｏｒ２タンパク質を二量体化するために、Ｒｏｒ２タンパク質に対して少なくとも２つの結合部位が必要である。従って薬剤は、互いに結合した２つの抗体フラグメントであり得る。フラグメントは、共有結合または非共有結合され得る。例えば、薬剤は、共有結合している２つのＦａｂフラグメントであり得る。薬剤は、また、二重特異性抗体であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、２つを超える抗体フラグメントを含み得る。例えば、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質に対する３つ、４つ、５つ、または６つの抗原結合部位を含み得る。
【０１２６】
いくつかの他の実施形態では、薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質等のＲｏｒタンパク質に対する抗体の抗原結合部位を模倣するタンパク質、ペプチド、または小分子であり得る。これらの薬剤は、Ｒｏｒ２タンパク質に対する抗体の抗原結合部位の構造に基づいてコンピュータで設計または同定され得る。薬剤は、次いで、Ｒｏｒ２タンパク質を二量体化しおよび／または活性化するための薬剤の性能を評価するために種々のインビトロアッセイで検査され得る。薬剤は、また、小分子、ペプチド、またはポリヌクレオチドのライブラリーを使用する高スループットスクリーニング方法を用いて同定され得る。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、Ｒｏｒ活性を調節する際に本発明の薬剤の使用方法を提供する。Ｒｏｒタンパク質、特にＲｏｒ２タンパク質の活性を調節する薬剤は、骨関連活性を調節するために有用である。これらの薬剤は、また、肥満症、糖尿病、または他の代謝障害の処置で脂肪細胞分化を調節する際に有用であり得る。骨関連活性を調節する（例えば骨形成を増強する）必要性を特徴とする多数の疾患および状態がある。最も明らかなものは骨折の症例であり、この場合、骨成長を刺激するおよび骨修復を急いで完了させることが望ましい。例えば、骨形成を増強する薬剤は、顔面再構築法または整形方法で潜在的に有用であり得る。他の骨欠損状態は、以下を含むがこれらに限定されない：骨部分欠損、歯周病、転移性骨疾患、溶骨性骨疾患、および軟骨の欠損もしくは損傷の治癒または再生等の結合組織の修復が有益である状態。また、非常に重要なものは、加齢性骨粗鬆症および閉経後のホルモン状態に関連する骨粗鬆症を含む骨粗鬆症の状態である。骨成長の必要性を特徴とする他の状態は、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、糖尿病関連骨粗鬆症、廃用性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド関連骨粗鬆症を含む。
【０１２８】
Ｒｏｒ２活性を増加させる薬剤は、ミネラル化骨形成を促進するために使用され得る。これらの薬剤は、また、骨芽細胞分化を促進させるために使用され得る。骨芽細胞分化の促進は、脂肪細胞への分化の犠牲によってなされ得る。薬剤は、また、ミネラル化マトリックス形成を促進するために使用され得る。
【０１２９】
別の態様では、本発明は、１４−３−３（例えば、１４−３−３β、１４−３−３γ等）の活性を調節する（増加させるまたは減少させる）薬剤を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は１４−３−３の活性を抑制する。他の実施形態では、薬剤は１４−３−３の活性を増加させる。薬剤は、核酸またはタンパク質のレベルで作用し得る。いくつかの実施形態では、薬剤は１４−３−３βの発現を減少させる。本明細書で述べるように、１４−３−３β活性を抑制する薬剤は、ミネラル化骨形成および骨形成分化を促進する際に有用である。いくつかの実施形態では、薬剤は１４−３−３γの発現を減少させる。これらの薬剤は、また、脂肪細胞への分化を抑制することによって肥満症、糖尿病、または他の代謝障害を処置する際に有用であり得る。特定の理論に制約されることを願わずに、下方制御する１４−３−３、特に１４−３−３βの発現は、脂肪細胞への分化を抑制しながら、骨形成分化を促進すると思われる。
【０１３０】
１４−３−３活性を調節するこれらの薬剤は、小分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド等を含む任意の種類のキメラ化合物であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤はタンパク質である。他の実施形態では、薬剤はペプチドである。さらに他の実施形態では、薬剤はポリヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、薬剤は小分子である。いくつかの実施形態では、薬剤はポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、薬剤はＤＮＡである。他の実施形態では、薬剤はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、薬剤は１４−３−３特異的ＲＮＡｉである。いくつかの特定の実施形態では、薬剤は１４−３−３β特異的ＲＮＡｉである。いくつかの特定の実施形態では、薬剤は１４−３−３特異的ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、薬剤は１４−３−３β特異的ｓｉＲＮＡである。いくつかの特定の実施形態では、薬剤は１４−３−３特異的ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態では、薬剤は１４−３−３β特異的ｓｈＲＮＡである。他の実施形態では、薬剤は１４−３−３γに特異的である。特に、いくつかの実施形態では、薬剤は、具体的には間葉系幹細胞または骨芽細胞等の骨細胞に見られる１４−３−３を標的にする。例えば、いくつかの実施形態では、薬剤は標的部分を含む。いくつかの実施形態では、標的薬剤は、ビスホスホネートまたは他の骨組織標的薬剤である。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、１４−３−３活性を調節する際に本発明の薬剤を使用する方法を提供する。１４−３−３の活性を調節する薬剤、特に１４−３−３βは、骨関連活性を調節するために有用である。これらの薬剤は、また、肥満症、糖尿病、または他の代謝障害の処置で脂肪細胞分化を調節する際に有用であり得る。骨関連活性を調節する（例えば骨形成を補強する）必要性を特徴とする多くの疾患および状態がある。最も明らかなものは骨折の症例であり、この場合、骨成長を刺激するおよび骨修復を急いで完了させることが望ましい。例えば、骨形成を増強する薬剤は、顔面再構築法または整形方法で潜在的に有用であり得る。他の骨欠損状態は、以下を含むがこれらに限定されない：骨部分欠損、歯周病、転移性骨疾患、溶骨性骨疾患、および軟骨の欠損もしくは損傷の治癒または再生等の結合組織の修復が有益である状態。また、非常に重要なものは、加齢性骨粗鬆症および閉経後のホルモン状態に関連する骨粗鬆症を含む骨粗鬆症の状態である。骨成長の必要性を特徴とする他の状態は、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、糖尿病関連骨粗鬆症、廃用性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド関連骨粗鬆症を含む。
【０１３２】
１４−３−３活性を減少させる薬剤は、ミネラル化骨形成を促進するために使用され得る。これらの薬剤は、また、骨芽細胞分化を促進するために使用され得る。骨芽細胞分化の促進は、脂肪細胞への分化の犠牲でなされ得る。薬剤は、また、ミネラル化マトリックス形成を促進するために使用され得る。
【０１３３】
本発明の方法における使用のための薬剤は、被験体への投与に適する医薬組成物に組み込まれ得る。本明細書で使用されるように、薬剤は、Ｒｏｒ分子（例えばＲｏｒ２タンパク質）活性または１４−３−３活性（例えば１４−３−３β、１４−３−３γ）を調節することを同定された任意の化合物（例えば、小分子、経口で有効な分子、有機分子、タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、ペプチド）であり得る。そのような組成物は、一般的に、化合物および医薬的に許容される担体を含む。本発明の組成物は、骨関連活性を調節することが知られている１つまたは複数の薬剤の組み合わせで、１つまたは複数の薬剤を含有し得る。例えば、Ｒｏｒ活性を促進するまたは１４−３−３活性を抑制する薬剤は、エストロゲン、ビスホスホネート、または組織選択的エストロゲン（すなわち、選択的エストロゲンレセプター修飾物質（ＳＥＲＭ））等の骨吸収を抑制する薬剤と組み合わせられ得る。本発明の薬剤は、骨形成を促進する他の薬剤と組み合わせられ得る。
【０１３４】
１つまたは複数の薬剤は、治療有効量で使用される。治療有効量は、改善（例えば、処置される障害、疾患、または状態に関連する徴候および／または症状の減少）を示すのに十分である薬剤のその量を言う。単独で投与される個々の成分に適用されるとき、この用語は、単独でのその成分を言う。組み合わせに適用されるとき、この用語は、連続的にまたは同時に組み合わせて投与されるか否かに関わらず、改善をもたらす複数の成分を組み合わせた量を言う。例えば、処置での使用の有効量は、骨折修復の治癒速度で臨床的に有意な上昇；骨粗鬆症被験体における骨量減少の回復および骨折の予防；軟骨欠損または障害の回復；骨粗鬆症の発症の予防または遅延；骨粗鬆症と関連するさらなる骨量減少の防止；骨折偽関節および仮骨延長における骨形成の刺激および／または抑制；人工舗装具内への骨成長の増加および／または減少；歯欠損の修復等をもたらす薬剤を含む組成物の量である。そのような有効量は、日常的な最適化技法を用いて決定され、処置される特定の状態、患者の状態、投与経路、製剤形態、医者の判断、および当業者にとって明らかな他の要因に依存する。本発明の化合物に必要とされる用量（例えば骨形成の増加が望ましい骨粗鬆症では）は、処置群と対照群の間で統計学的に有意な相違を確実にする用量である。骨量のこの相違は、例えば、処置群では骨量で５〜２０％以上の増加として見なされ得る。治癒における臨床的に有意な増加の他の測定は、種々の検査、例えば破壊強度と張力、破壊強度とねじれ、４点屈曲、骨生検における結合性の増加、および当業者にとって周知の他の生体力学検査を含み得る。処置レジメンのための一般的なガイダンスは、目的の疾患の動物モデルで実行される実験から得られ得る。
【０１３５】
薬剤の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に治療効果のある用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物で標準的な医薬方法によって測定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）として表すことが可能である。大きな治療指数を示す薬剤または化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトでの使用の投与量の範囲を策定する際に使用され得る。そのような薬剤または化合物の投与量は、ほとんど毒性がないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内であり得る。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路によってこの範囲内で変わり得る。
【０１３６】
本発明の方法で使用される任意の薬剤に対する治療有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。例えば、用量は、細胞培養または動物試験で決定されるようにＥＤ５０を含む循環血漿濃度（すなわち、Ｒｏｒ２タンパク質の最大半量の二量体化を達成する検査化合物の濃度）の範囲を達成するための動物モデルで策定され得る。そのような情報は、ヒトでの有用量をより正確に決定するため使用され得る。血漿レベルは、例えばＨＰＬＣで測定され得る。投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。担当医は、投与の終了、中断、または調整を行う方法と時期を承知しているだろう。逆に、臨床反応が十分でない（毒性を除外して）場合、担当医は、処置をより高いレベルに調節することも承知しているだろう。目的の障害の管理において投与される用量の大きさは、処置される状態の重症度によって変化する。状態の重症度は、例えば、標準的な予後評価法によって部分的に評価され得る。さらに、用量およびおそらく投薬回数は、また個々の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。上述したものに比較できる処置プログラムは、獣医学で使用され得る。
【０１３７】
特定の状況のための適切な投与量の決定は、当技術分野の範囲内である。通常、処置は、化合物の適量より少ない投与量で開始される。その後、この条件下で最適な効果に達するまで、投与量を少しずつ増やす。例えば、必要に応じて１日の総投与量は、その日の割り当てに分けられて投与され得る。１日の投与量は、２つ、３つ、または４つの部分に分けられることが可能であり、各部分は、２４時間の間に投与される。
【０１３８】
投与される薬剤としての抗体または抗体フラグメントの場合、薬剤は、一般的に、静脈内注入で投与される。投与量は、１〜６週間ごとに１〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、投与量は、１〜６週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、１〜１０ｍｇ／ｋｇの薬剤は、３〜５週間ごとに静脈内注入によって送達される。他の実施形態では、３〜６ｍｇ／ｋｇの薬剤は、４週間ごとに静脈内注入によって送達される。
【０１３９】
処置される特定の状態によって、薬剤は調剤されることが可能であり、全身的にまたは局所的に投与され得る。本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように調剤される。剤形および投与の技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）に見出し得る。適切な投与経路は、２〜３例を挙げると、経口、経直腸、経膣、経皮、経粘膜または経腸の投与；筋肉内、皮下、および髄内の注射を含む非経口送達；ならびにくも膜下腔内、脳室内に直接、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼球内の注射を含み得る。使用し得る一部の送達方法は、以下を含むがこれらに限定されない：リポソームのカプセル化、人工舗装具への組み込み、レトロウイルスベクターによる形質導入、およびエキソビボでの細胞のトランスフェクションとその後の再移植またはトランスフェクトした細胞の投与。
【０１４０】
組成物が医薬的に使用されるとき、それらの組成物は、診断および処置上の使用のために「医薬的に許容される担体」と組み合わせられる。そのような組成物の剤形は、この分野の当業者には周知である。本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の付加的な薬剤を含むことが可能であり、好ましくは、医薬的に許容される担体を含み得る。
【０１４１】
適切な医薬的に許容される担体および／または希釈剤は、任意のおよびすべての従来の溶媒、分散媒、賦形剤、固定担体、水溶液、コーティング剤、抗菌剤および坑真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。用語「医薬的に許容される担体」は、それが投与される患者にアレルギー反応または他の有害作用を引き起こさない担体を言う。適切な医薬的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール等、ならびにその組み合わせから１つまたは複数を含む。医薬的に許容される担体は、さらに、組成物の１つまたは複数の薬剤の有効期間または有効性を増強する湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤等を少量含み得る。医薬的に許容される物質に対するそのような媒介および薬剤の使用は、当技術分野では周知である。
【０１４２】
非経口の、皮内の、または皮下の適用で使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の坑菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の坑酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸等の緩衝剤および塩化ナトリウムまたはブドウ糖等の浸透圧を調節する薬剤を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節され得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または反復投与バイアルに封入され得る。注射に適する医薬組成物は、無菌注射剤の即時調製のための無菌水溶液（水溶性の）または分散および無菌粉末を含む。静脈内投与のための適切な担体は、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）、またはリン酸緩衝食塩水を含む。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用によって、分散の場合には必要とされる粒子径の維持によって、おおび表面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および坑真菌剤，例えばパラビン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、によって達成され得る。多くの場合、例えば糖もしくはポリアルコール（マニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム等）の等張剤を組成物に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等）を組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１４３】
さらに、本発明によって同定される疾患および状態を処置するための薬剤は、また、処置される状態に対してそれらの特定の有効性のために選択される他の治療薬と同時投与され得る。例えば、薬剤は、エストロゲンもしくはエストロゲン関連化合物または他の骨吸収インヒビターと併用され得る。エストロゲン化合物は、抱合エストロゲン、エストラジオール、およびその類似体を含むが、これらに限定されない。他の骨関連治療化合物は、以下を含むがこれらに限定されない：ビスホスホネートと関連化合物（例えば米国特許第５，３１２，８１４号に記述されているもの）、カルシウム補給剤（Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５，１１８９，（１９９１））、ビタミンＤ補給剤（Ｃｈａｐｕｙ  Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７，１６３７（１９９２））、フッ化ナトリウム（Ｒｉｇｇｓ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２７，６２０，（１９９２））、アンドロゲン（Ｎａｇｅｎｔ  ｄｅ  Ｄｅｕｘｃｈａｉｓｎｅｓ，Ｃ，ｉｎ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，ａ  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｐｒｏｂｌｅｍ，Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．５５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．２９１，（１９８３））、およびカルシトニン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｃ．，Ｂｏｎｅ  １３（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３５，（１９９２））。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、Ｒｏｒタンパク質を活性化する薬剤を同定するための系を提供する。薬剤がＲｏｒ２タンパク質の活性を変化させるか否かを決定するための方法は、当業者には周知の解析およびアッセイを行うことを含む。例は、以下を含むがこれらに限定されない：組織化学解析、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、酵素アッセイ（例えばキナーゼアッセイ）、および例えば、Ｒｏｒもしくは１４−３−３βリン酸化（より高い活性を反映するより高いリン酸化状態）の程度の測定を含む機能解析。いくつかの実施形態では、Ｒｏｒ（具体的にはＲｏｒ２タンパク質）の活性は、Ｒｏｒ２タンパク質に結合し、Ｒｏｒ２タンパク質によってリン酸化されることが示されている１４−３−３βのリン酸化状態を決定することによって評価される。１４−３−３βタンパク質のリン酸化は、当技術分野で周知の任意の技法を用いてアッセイされ得る。特に、坑ホスホチロシン抗体を使用する免疫沈降は、１４−３−３βタンパク質のリン酸化を追跡するために用いられ得る。あるいは、リンの放射性同位元素（例えば３２Ｐ−γ−ＡＴＰ）も使用可能である。
【０１４５】
本発明は、また、Ｒｏｒ分子（例えばＲｏｒ２タンパク質）の活性の増加または減少は、薬剤が骨関連活性を調節することを示す、骨関連活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、キメラレセプター（例えばＲｏｒ２／ＴｒｋＢ）およびＲｏｒ２の二量体化によって調節されるレポーター遺伝子（例えばシフェラーゼ等）を用いるＲｏｒ２の二量体化を促進する薬剤を同定するためのアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢの細胞内ドメインに融合したＲｏｒ２の細胞外ドメインを含むキメラレセプターを発現する細胞は、本発明のアッセイで用いられる。いくつかの特定の実施形態では、Ｒｏｒ２タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸１〜４０７は、ＴｒｋＢ（アミノ酸４３２〜８２２）の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合する。他の実施形態では、異なる細胞内ドメインが、キメラを構築する際に使用される。例えば、二量体化時に活性化される任意の細胞内ドメインは、ＴｒｋＢドメインの代わりに使用さることが可能である。好ましくは、細胞内ドメインは、単一スパンの膜貫通レセプターからであり、シグナル伝達経路は知られている。キメラレセプターを調製する際に使用され得る他の細胞内ドメインの非限定的な例は、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、およびＦＧＦＲの細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、細胞外ドメインの二量体化時に活性化され、最終的にレポート遺伝子の上方制御をもたらすシグナル伝達カスケードを活性化する。例えば、キメラレセプターの細胞外Ｒｏｒ２ドメインを二量体化する薬剤は、Ｒｏｒ２／ＴｒｋＢキメラの場合、ＴｒｋＢシグナル伝達経路の活性化を引き起こす。ＴｒｋＢシグナル伝達経路の活性化は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）プロモーター−レポーター遺伝子系の使用によって評価される。例えばＥＧＦＲ等の別のシグナル伝達経路の活性化は、ＥＧＦＲ経路によって活性化されるＳＴＡＴ結合エレメントに基づくもの等の別のレポーター遺伝子系を必要とする。ＴｒｋＢ経路の活性化は、その制御下で任意のレポーター遺伝子の発現を次々に増加させるＣＲＥプロモーターの刺激を引き起こす。ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）等の容易にアッセイされるレポーターは、ＣＲＥプロモーターの制御下に置かれることが可能であり、本発明のアッセイで使用され得る。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、レポーター遺伝子として使用される。他の実施形態では、緑色蛍光タンパク質がレポーター遺伝子として使用される。いくつかの実施形態では、プラスミドの上のＣＲＥプロモーター−レポーター構築物は、キメラレセプターを発現する細胞にトランスフェクトされる。他の実施形態では、構築物は、細胞のゲノムの一部である。いくつかの実施形態では、構築物は、細胞に安定にトランスフェクトされる。Ｒｏｒ２／ＴｒｋＢキメラに基づく本発明のアッセイ系は、本明細書に示されるＲｏｒ２特異的抗体を用いてＲｏｒ２を二量体化することが検証された。Ｒｏｒ２特異的抗体は、観察されるレポーター（すなわちルシフェラーゼ）活性で用量依存性増加を引き起こす。図１２を参照されたい。
【０１４７】
本発明のキメラレセプターアッセイ系は、対応するプロモーター系と対の異なる細胞内ドメインを用いて修飾され得る。他の細胞内ドメインの例は、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、およびＦＧＦＲの細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインによって調節される対応するプロモーターは、次いでレポーター系で使用される。例えば、ＳＴＡＴ結合エレメントは、ＥＧＦＲ細胞内ドメインを有するキメラレセプターを使用する系で使用され得る。
【０１４８】
本発明は、本発明のキメラレセプターアッセイを行うための複数のキットを含む。これらのキットは、本発明のアッセイを使用する試験薬剤をスクリーニングするために必要な成分の一部またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、キットの成分は、研究者が使用するために便利にパッケージされている。キットは、以下のいずれかまたはすべてを含み得る：ＤＮＡ構築物、細胞系、緩衝剤、酵素、マルチウェルプレート、陽性および陰性の対照、培地、坑菌薬、ヌクレオチド、説明書等。いくつかの実施形態では、キットは、Ｒｏｒ２／ＴｒｋＢキメラレセプターを発現する細胞系を含む。他の実施形態では、キットは、Ｒｏｒ２／ＴｒｋＢキメラレセプターをコードするＤＮＡ構築物を含む。他の実施形態では、キットは、ＣＲＥプロモーターに作動可能に結合されたレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＣＲＥプロモーターに作動可能に結合されたルシフェラーゼ遺伝子を含む。レポーター遺伝子／ＣＲＥプロモーターの構築物は、プラスミドであり得る。
【０１４９】
本発明は、上述の本発明のアッセイで使用される細胞外Ｒｏｒ２ドメインを有するキメラレセプターを含む。キメラＲｏｒ２／ＴｒｋＢレセプターの典型的なアミノ酸配列は、以下の通りである。Ｒｏｒ２タンパク質に由来するアミノ酸配列は、大文字で示され、ＴｒｋＢタンパク質に由来するアミノ酸配列は、小文字で示される。
【０１５０】
【化４】
2009527485.tif 000003
当業者によって認識されるように、種々の変異、欠失、置換等が、本発明から逸脱することなく本発明のキメラタンパク質になされる可能性がある。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、上述のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、または７０％の相同的である。いくつかの実施形態では、キメラレセプターは、該キメラレセプターの細胞外Ｒｏｒ２ドメインによって引き起こされる二量体化時にＴｒｋＢ経路等のシグナル伝達経路を活性化する。当業者によって認識されるように、上述のタンパク質配列への種々の変化は、キメラレセプターの活性を変化させることなくなされ得る。キメラレセプターのこれらの変種は、本発明の範囲内であるとみなされる。本発明は、また、キメラレセプターまたはその変種をコードするポリヌクレオチド配列を含む。そのコード配列は、キメラタンパク質の発現および／または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサー、調節エレメント等に場合により作動可能に結合される。本発明は、また、キメラレセプターをコードする本発明のポリヌクレオチド配列を含む細胞を含む。
【０１５１】
本発明の方法は、高スループットアッセイを含む利用可能な任意の形式で修飾または実行され得る。高スループットアッセイは、所定の期間内に数多くの試験薬剤をスクリーニングするために有用である。別の実施形態では、細胞に基づいたスクリーニングを用いるアッセイが行われる。参照することによって本明細書に援用した米国特許第６，１０３，４７９号（２０００年８月１５日発行）は、細胞に基づいたスクリーニング用の小規模な細胞アレイ方法および装置を開示している。方法は、均一な細胞のミクロパターンアレイの作製について、他の応用について（例えば、坑光化学フォトリソグラフィー（Ｍｒｋｓｉｃｈ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２５，５５−７８，（１９９６））記述されている。参照することによって本明細書に援用した米国特許第６，０９６，５０９号（２０００年８月１日発行）は、流動する懸濁液の細胞上で試験薬剤への細胞応答の実時間測定のための装置および方法を提供する。そこでは、一連の細胞型の各メンバーの均一な懸濁液は、特定の濃度で検査化合物と組み合わせられ、検出ゾーンを通って方向づけられ、次いで検査混合物中の細胞が検出ゾーンを通って流動するにつれて、生細胞の細胞応答が実時間で測定される。この特許は、試験薬剤（例えば小分子）のライブラリーの自動スクリーニングでの装置の使用を開示している。これらの米国特許で開示される方法は、試験薬剤がＲｏｒ分子の発現または活性を調節するか否かを決定するために、例えば骨芽細胞（一次骨芽細胞、ヒト骨芽細胞（例えばＴＥ−８５、Ｕ２ＯＳ、ＳａＯＳ−２、もしくはＨＯＢ）、ラット骨芽細胞（例えばＵＭＲ１０６もしくはＲＯＳ１７／２．８）、マウス骨芽細胞（例えばＭＣ３Ｔ３もしくは他）、非骨芽細胞（ＣＯＳ−７および他）等）、幹細胞（間葉系幹細胞、胚幹細胞）、前駆体細胞、またはＲｏｒヌクレオチド配列を含む操作された細胞等の細胞を用いて修飾され得る。さらに他の実施形態では、酵素アッセイ（例えばキナーゼアッセイ）に基づくアッセイが行われる。
【０１５２】
Ｒｏｒタンパク質の活性を調節する際に有用であると同定された試験薬剤は、次いでさらに検査され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は他の細胞に基づくアッセイまたは非細胞に基づくアッセイで検査される。化合物は、種々の骨疾患および障害の動物モデルを含む種々の疾患の動物モデルで検査され得る。例えば、薬剤は、骨折、骨粗鬆症、骨の癌、骨量減少等の動物モデルで検査され得る。
【０１５３】
本発明は、分子および細胞生物学の分野で周知の方法および技法を参照することによって援用する。これらの技法は、以下の刊行物に記述される技法を含むがこれらに限定されない：Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．＆Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（３ｄ  Ｅｄ．１９８５）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｖ．２：４０９ｐｐ．（ＩＳＢＮ０−６３２−０１３１８−４），Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，，ＮＹ，Ｖｏｌｓ．１−３（ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．１６９ｐｐ．（ＩＳＢＮ０−８７９６９−１９８−０）。
【実施例】
【０１５４】
本発明は、さらに、特に明記しない限り、すべての部分およびパーセンテージは重量で、温度はセ氏である以下の実施例で定義される。当然のことながら、本発明の好ましい実施形態を表しながら、これらの実施例は、説明のみの目的で与えられている。上述の考察、実施形態、およびこれらの実施例から、本発明の新規の教示から実質的に逸脱することなく、ならびにその趣旨および範囲から逸脱することなく、数多くの修飾が典型的な実施形態で可能であることを、当業者は容易に認識する。さらに、当業者は、それを種々の用途および条件に適応させるために、本発明への種々の変更および修飾をなし得る。従って、そのようなすべの修飾は、添付の特許請求の範囲に定義されるように、本発明の範囲内に含まれることを目的としている。
【０１５５】
本明細書で述べる特許、特許出願、検査方法、および刊行物は、それらの全体を参照することによって、本明細書で援用される。
【０１５６】
（一般の方法）
（物質および組織培養）
注記したところを除いて、組織細胞試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（カリフォルニア州カールスバッド）から購入し、他の試薬および化学薬品は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｋｃａｌ  Ｃｏ．社（ミズーリ州セントルイス）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のいずれかから購入した。組換えヒトＲｏｒ２のＧＳＴ標識細胞質ゾルドメインは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手した。ＧＳＴ標識組換えヒト１４−３−３βは、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＰ社（ペンシルバニア州プリマスミーティング）製であった。坑フラッグＭ２マウスモノクローナル抗体、および坑フラッグ−Ｍ２親和性アガロース、および坑βアクチンマウスモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｍａ社から入手した。坑ヒトＲｏｒ２ヤギポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。坑１４−３−３β抗体および坑ヒスウサギポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．社（カリフォルニア州サンタクルーズ）製であった。非抱合型およびアガロース結合坑ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０）は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（バージニア州シャーロッツビル）から入手した。固定化ホスホチロシン抗体Ｐ−Ｔｙｒ−１００は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（マサチューセッツ州ベヴァリー）製であった。たんぱく質Ａセファロースおよび、グルタチオンセファロースはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製であった。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合二次抗体は、サンタクルスバイオテクノジー製であった。
【０１５７】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｉｎｃ．社（メリーランド州バルチモア）から購入し、ｈＭＳＣ成長培地（ＭＳＣＧＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用して、３７℃で、５％ＣＯ２−９５％加湿空気インキュベーターで維持した。Ｕ２ＯＳヒト骨肉腫細胞を、１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および２ｍＭグルタマトリックス−Ｉを含有するマッコイ５Ａ改変培地で、３７℃で保持した。
【０１５８】
（プラスミドおよびアデノウイルス）
ヒトＲｏｒ２フラッグ発現プラスミドの生成は、前述した（米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｏｄｉｎｅ、２００４年４月１４日出願）；ＢｉｌｌｉａｒｄらＭｏｌ  Ｅｎｄｏ  １９，９０−１０１，２００５）。Ｒｏｒ２−フラッグのＣＯＯＨ末端でフラッグエピトープタグを６個のヒスチジンをコードする配列と置換することによってＲｏｒ２−ヒス  構築物を生成した。Ｒｏｒ２（ＧＳＴ−Ｒｏｒ２ｃ）の細胞質ゾルドメインのＧＳＴ融合を、ＧＳＴタグの後のフレーム内のヒトＲｏｒ２（アミノ酸４２８〜９４４をコードする）の細胞内ドメインをｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に挿入することによって得た。
【０１５９】
全長ヒト１４−３−３βｃＤＮＡをＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アラバマ州ハンツビル）から購入し、ｐＥＴ２８ａバクテリア発現ベクター内にサブクローニングした。
【０１６０】
ヒトコクサッキーアデノウイルスレセプター（ｈＣＡＲ）、Ｒｏｒ２特異的ｓｈＲＮＡ、およびＥＧＦＰ特異的ｓｈＲＮＡを含むアデノウイルスを、Ｇａｌａｐａｇｏｓ  Ｉｎｃ．社（ベルギー、メッヘレン）から入手した。Ｒｏｒ２、Ｒｏｒ２ＫＤ、およびβ−ガラクトシダーセ（β−ｇａｌ）アデノウイルスの生成は記述されている（参照として本明細書に援用される，米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｏｄｉｎｅ、２００４年４月１４日出願））。
【０１６１】
（頭蓋冠の器官培養および感染）
４日齢の同腹仔のマウスから切除した頭蓋冠を矢状縫合に沿って切断し、０．１％ＢＳＡを含有する無血清ＢＧＪ培地で２４時間インキュベートした。次いで、１２ウェルプレートのウェル内のステンレス鋼製グリッド（Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ  Ｉｎｃ．社、フロリダ州マイアミ）の上に各半頭蓋冠を、凹面を下に向けて置いた。各ウェルには、β−ｇａｌもしくはＲｏｒ２アデノウイルス（３．７５百万ウイルス粒子／ウェル）を添加または無添加で、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した１ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＧＪ）培地が含まれていた。５％ＣＯ２−９５％加湿空気式のインキュベーターで頭蓋冠をインキュベートし、４日後に培地およびアデノウイルスを交換した。
【０１６２】
アデノウイルス存在下での７日間のインキュベーションの後、１０％中性リン酸緩衝ホルムアルデヒド溶液中で頭蓋冠を室温で７２時間固定し、次いで、ＰＢＳ中の１０％ＥＤＴＡ溶液で６時間脱灰した。各群の頭蓋冠を同じパラフィンブロックに平行に埋め込んだ。４μｍの切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した。着実な骨面積（前頭縫合から２００μｍ離れた）を、組織形態計測解析用に選択した。手短に言うと、２００μｍの正方格子を各頭蓋冠の上に置き、骨芽細胞の数と全骨面積を骨測定装置（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社、ジョージア州アトランタ）で決定した。骨表面上のすべての細胞を骨芽細胞としてカウントした。カルシウム診断キット（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、製造者のプロトコールに従って培地のカルシウムを測定した。
【０１６３】
（ウイルス感染）
ヒトＭＳＣを１２ウェルまたは６ウェルプレートに６，０００／ｃｍ２で播種して付着させ、一晩、増殖させた。感染効率を向上させるために、ｈＣＡＲ（感染多重度（ＭＯＩ）＝７５０）の存在下でＭＯＩ＝７５０でＲｏｒ２、Ｒｏｒ２ＫＤ、またはβ−ｇａｌアデノウイルスを用いて、細胞を０．４ｍｌ／ｃｍ２のＭＳＣＧＭ（間葉系幹細胞用培地）で２４時間感染させた。２４時間後、細胞をＰＢＳおよびＭＳＣＧＭ中で１回洗浄し、０．０５ｍＭのアスコルビン酸および１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を補充したＭＳＣＧＭ、または脂肪生成補給剤（ＰＴ−３００４、ケンブレックス）を含有するＭＳＣＧＭを加えた。必要とする場合、１００ｎＭデキサメタゾン（ｄｅｘ）および／または表示した抗体を培地に加えた。ｓｈＲＮＡ感染のため、１２ウェルまたは６ウェルプレートに６，０００／ｃｍ２で細胞を播種して付着させ、３日間増殖させた。ｈＣＡＲ（ＭＯＩ＝７５０）の存在下で、Ｒｏｒ２特異的ｓｈＲＮＡ、またはＥＧＦＰ特異的ｓｈＲＮＡをコードするアデノウイルスを細胞あたり（最初に播種密度に基づく）４，０００ウイルス粒子を用いて０．４ｍｌ／ｃｍ２のＭＳＣＧＭ中で細胞を７２時間感染させた。７２時間後、細胞をＰＢＳおよびＭＳＣＧＭ中で１回洗浄し、０．０５ｍＭのアスコルビン酸および１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を補充したＭＳＣＧＭを加えた。必要とする場合、１００ｎＭのｄｅｘおよび／または特定の抗体を培地に加えた。５日毎に、全培地またはその半分を新しい培地と交換した。
【０１６４】
Ｕ２ＯＳ細胞を６ウェルプレートに７５，０００／ｃｍ２で播種し、２４時間後にＲｏｒ２、Ｒｏｒ２ＫＤ、またはβ−ｇａｌのアデノウイルスをＭＯＩ＝１００で感染させた。感染を２４時間続行させてから、２４時間後に細胞抽出物を収集した。
【０１６５】
（アリザリンレッドＳ組織化学染色法）
ｈＭＳＣによるミネラル化根粒の形成を、アリザリンレッドＳ組織化学染色法によって１２ウェルプレート上で決定した。細胞およびマトリックスを７０％（容積比）エタノールを用いて室温で１時間固定し、脱イオン化水で洗浄してから、４０ｍＭのアリザリンレッドＳ（ｐＨ４．２）を用いて室温で１時間染色した。染色したマトリックスを脱イオン化水で洗浄して、撮影した。アリザリンレッドＳ染色のレベルを定量化するために、染料を１ｍｌ／ウェルの１０％（重量比）塩化セチルピリジニウムを用いて溶出した。溶出試料中のアリザリンレッドＳを、ミクロプレートリーダーを用いて５６２ｎｍで定量化（０〜８００μＭ染料の対標準曲線）した。
【０１６６】
（オイルレッドＯ組織化学染色法）
オイルレッドＯ組織化学染色法によって１２ウェルプレート上のｈＭＳＣ中の脂肪生成をモニターした。１０％中性緩衝ホルマリンを用いて細胞を室温で２時間固定してから、ＰＢＳで洗浄し、６０％イソプロパノール（ｐＨ７）液中の１８ｍｇ／ｍｌのオイルレッドＯを用いて室温で１０分間染色した。染色した細胞をＰＢＳで洗浄してから撮影した。
【０１６７】
（ＲＮＡ単離とリアルタイムＰＣＲ解析）
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、製造者の説明書に従って全細胞ＲＮＡを単離し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析にかけた。すべてのｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子（シクロフィリンＢ）のレベルに標準化した。ヒトＣ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγ用のプライマーおよびプローブをアプライドバイオシステムズから購入した。ヒトシクロフィリンＢのプライマーおよびプローブは以下の通りである：
【０１６８】
【化５】
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（一過性のトランスフェクション）
Ｒｏｒ２プラスミドトランスフェクションのために、Ｕ２ＯＳ細胞を約８０％のコンフルエント密度で播種し、２４時間後に１１μｇの全プラスミドＤＮＡ／１９．６ｃｍ２を、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナ州インディアナポリス）を使用して、製造者の説明書に従ってトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクションのため、Ｕ２ＯＳ細胞を５２，０００細胞／ｃｍ２で６ウェルプレート上に蒔き、２４時間後に１０μｌのリポフェクタミン２０００試薬を用いて製造者の説明書に従って、２５ｎＭのＲｏｒ２  ｓｉＲＮＡまたは非特異的ｓｉＲＮＡ（両方ともにＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．社製、コロラド州ラファイエット）とトランスフェクトした。
【０１６９】
（免疫沈降およびウエスタン免疫ブロット）
プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ社）を補充した溶解緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、１％トリトンＸ１００）で細胞を可溶化し、抽出物を１０，０００ｘｇ、４℃で１０分間、遠心分離によって明らかにした。フラッグ免疫沈降のため、１ｍｇの全細胞可溶化液を３０μｌのＭ２フラッグ親和性アガロース（Ｓｉｇｍａ社）を用いて４℃で１時間回転させながらインキュベートした。ビーズを遠心分離によって収集し、３５０ｍＭＮａＣｌを含む溶解緩衝液中で３回洗浄して、溶解緩衝液中で３回洗浄した。１４−３−３β沈降のために、１５μｌの１４−３−３β抗体を、１ｍｌの溶解緩衝液中で３０μｌのタンパク質Ａセファロースを用いて、４℃で一晩インキュベートした。ビーズを遠心分離によって収集し、溶解緩衝液中で洗浄してから１ｍｇの全細胞可溶化液を加えた。４℃で２時間穏やかに回転させながら結合反応を行った。フラッグ沈降に関してビーズを収集して洗浄した。ホスホチロシン沈殿のために、１ｍｇ（過剰発現タンパク質を検出するために）または１５ｍｇ（内在性タンパク質を検出するために）の細胞抽出物を１００μｌのＧ４１０ビーズに加え、４℃で３時間付着させた。この時点では、Ｐ−Ｔｙｒ−１００固定化抗体（１００μｌ）をこの混合に加えて、さらに３時間続行した。すべてのビーズを遠心分離によって収集し、フラッグ沈降に関して洗浄した。すべての免疫沈降反応の終了後に、ビーズを３０〜５０μｌの還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した２×ＬＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で沸騰させた。可溶化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。ゲルを０．４５μｍニトロセルロース膜の上に移し、各特異的抗体を用いて検出した。
【０１７０】
沈降を行わない免疫ブロットのために、全細胞可溶化液の示された量を、変性および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ゲルを０．４５μｍニトロセルロース膜の上に移し、各特異的抗体を用いて検出した。
【０１７１】
（ＧＳＴプールダウンおよびインビトロキナーゼアッセイ）
１４−３−３βを、Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（登録商標）インビトロタンパク質合成装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて製造者の説明書に従って５０μｌ反応で、１４−３−３β−ｐＥＴ２８ａからインビトロ翻訳した。ｐＧＥＸ−４Ｔ−２またはｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＳＴだけをコードする）中のＧＳＴ−Ｒｏｒ２ｃを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。培養物を０．７のＡ６００に増殖し、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ社；１ｍＭの最終濃度）を加えて、４時間のインキュベーションによって組換えタンパク質を発現するよう誘導した。細菌ペレットを遠心分離によって収集し、ＰＢＳで洗浄して、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ社）を補充した３０ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。細胞を、１６，０００ｐｓｉでフレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ）（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ニューヨーク州ロチェスター）に２回通過させて溶解させ、細菌デブリを遠心分離によって除去した。生成されたＧＳＴ−Ｒｏｒ２ｃまたはＧＳＴタンパク質を、グルタチオンセファローセを用いて４℃で４時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、１ｍｌＰＢＳで再懸濁させ、１４−３−３βインビトロ翻訳反応の全５０μｌを４℃で４時間加えた。このインキュベーションの終了後、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した２×ＬＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で沸騰させ、可溶化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを０．４５μｍニトロセルロース膜の上に移し、各特異的抗体を用いて検出した。
【０１７２】
インビトロキナーゼアッセイのために、６．５μｇの精製組換えヒトＧＳＴ−１４−３−３β（バイオモル）を、０．９μｇの精製組換えヒトＧＳＴ−Ｒ２ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した、または添加しない２５μｌのキナーゼ反応緩衝液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ  ＡＴＰ）中で再懸濁させた。キナーゼ反応を、３７℃で３０分間続行させ、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した１×ＬＤＳ緩衝液中で沸騰させることによって停止させた。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、０．４５μｍニトロセルロース膜の上に移し、ホスホチロシン抗体を用いて検出した。引き続いて、その膜を取り除き、同等の添加を確認するために１４−３−３β抗体で再検出した。
【０１７３】
（統計解析）
データを平均値±ＳＥとして表す。統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡまたはスチューデントのｔ検定を用いて決定した。Ｐ＜０．０５であるとき、結果を統計的に異なると見なした。
【０１７４】
（実施例１）
（内在性Ｒｏｒ２は、ｈＭＳＣ分化に関与する）
出願者は、Ｒｏｒ２発現がｈＭＳＣの骨形成分化の間に増加することを前述した（各々が参照として本明細に援用される、米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願）；ＢｉｌｌｉａｒｄらＭｏｌ  Ｅｎｄｏ  １９：９０−１０１，２００５）。ｈＭＳＣ分化の間のＲｏｒ２発現の増加が骨芽細胞発生のために決定的に重要であるかを評価するために、出願者は、Ｒｏｒ２発現が抑制されたときにｄｅｘ誘導分化を実行した。この目的を達成するために、Ｒｏｒ２特異的ｓｈＲＮＡを含むアデノウイルスにｈＭＳＣを感染させた。これは、ＥＧＦＰ特異的対照ｓｈＲＮＡと比較すると、実際に、Ｒｏｒ２タンパク質発現においてｄｅｘ誘導による増加を強力に抑制した（図１Ａ）。Ｒｏｒ２  ｓｈＲＮＡへの感染は、マトリックスミネラル化を誘導するｄｅｘの性能をほぼ完全に抑止し（図１Ｂおよび１Ｃ）、Ｒｏｒ２の増加が少なくとも一部ｈＭＳＣのｄｅｘ誘導骨芽細胞分化を媒介することを示唆する。
【０１７５】
（実施例２）
（Ｒｏｒ２過剰発現は、ｈＭＳＣの脂肪細胞への分化を抑制する）
出願者は、また、Ｒｏｒ２過剰発現が骨芽細胞系統へのＭＳＣの関係づけを開始し、並びに骨芽細胞発生の初期および後期の段階で分化を促進することを前述した（参照として本明細に援用される、米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願））。出願者は、ここで、インドメタシンおよびＩＢＭＸを含有する脂肪生成カクテルでのインキュベーションによって誘導されるｈＭＳＣの細胞運命の交代（脂肪生成）に関するＲｏｒ２の効果を評価した。ヒトＭＳＣを、野生型Ｒｏｒ２またはキナーゼドメイン変異体（Ｒｏｒ２ＫＤ）（それぞれＣＯＯＨ末端にフラッグエピトープタグを含む）をコードするアデノウイルスに感染させた。Ｒｏｒ２ＫＤでは、５０４（推定ＡＴＰ結合ドメイン内）、５０７、および５０９の位置で３つのリシンをイソロイシンと置換させることで、著しく減少したチロシンキナーゼ活性をもたらせた（ＨｉｋａｓａらＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，５２２７−５２３９，２００２；米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願）；ＢｉｌｌｉａｒｄらＭｏｌ  Ｅｎｄｏ  １９，９０−１０１，２００５）。対照のために、ｈＭＳＣを同じアデノウイルスのバックグラウンドでβガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）発現カセットに感染させた。Ｒｏｒ２およびＲｏｒ２ＫＤ変異体は、双方とも主要な脂肪生成転写因子、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー−結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）、およびペルオキシソーム増加因子活性レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の発現を抑制し（図２Ａ）、オイルレッドＯ陽性の脂質生成脂肪細胞を形成するｈＭＳＣの性能を著しく低下させた（図２Ｂ）。出願者の以前の結果（参照として本明細に援用される、米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号、（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願））をまとめると、３つのデータは、Ｒｏｒ２が骨芽細胞発生を支持する転写因子の均衡を切り替えることによってＭＳＣの細胞運命を変化させることを示している。
【０１７６】
（実施例３）
（Ｒｏｒ２は、マウス頭蓋冠の全骨面積を増加させる）
出願者は、次に、ｈＭＳＣ分化に関するＲｏｒ２のインビトロ効果がエキソビボ器官培養物内で骨形成の増加に転換されるかを検査した。４日齢の同腹仔マウスの頭蓋冠骨を、β−ｇａｌまたはＲｏｒ２アデノウイルスに非感染のままにしておくかまたは感染させた。アデノウイルスの存在下での培養の７日間後、該骨をヘマトキシリン−エオシンで染色し、２００μｍ２の着実な切片（前頭縫合から２００μｍ離れた）を、骨測定装置を使用して組織形態計測解析にかけた。非感染の対照条件下で、頭蓋冠の２００μｍ２の切片には、骨面積５１７１±２３５μｍ２の骨面積および８４±６．５の骨芽細胞が含まれていた。Ｒｏｒ２ウイルスの感染は、骨芽細胞の数に影響を与えることなく全骨面積で５０％の増加をもたらし、Ｒｏｒ２が骨芽細胞を活性化して骨マトリックスをより多く生成したことを示す（図３）。
【０１７７】
（実施例４）
（１４−３−３βは、Ｒｏｒ２キナーゼの最初に同定された基質である）
出願者は、質量分析法によってＵ２ＯＳ骨肉腫細胞内の９つの潜在的なＲｏｒ２結合因子の同定について以前に報告している（参照として本明細に援用される、米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願））。これらのうち、１４−３−３タンパク質は、細胞周期の進行および分化に関与する（Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８１，３２９−３４２，２００４）ことを示しており、出願者は、追跡調査のために１４−３−３βを選択した。最初に、免疫沈降法を用いる質量分析によって観察された相互作用を確認した。
【０１７８】
Ｕ２ＯＳ細胞をβ−ｇａｌ、Ｒｏｒ２、またはＲｏｒ２ＫＤアデノウイルスに感染させ、全細胞タンパク質を単離し、坑フラッグ親和性アガロースの上で免疫沈降にかけ、続いて坑１４−３−３β抗体を用いる免疫ブロットを行った（図４Ａ、上段のパネル）。極めて少量の１４−３−３βを対照条件下（β−ｇａｌ感染細胞）で沈降させたが、Ｒｏｒ２の過剰発現時に相当量を共沈降させた。Ｒｏｒ２ＫＤ変異体では、複合体形成がさらに強く、キナーゼ活性が複合体解離の原因となることを示した。同じレベルの沈降を、坑フラッグ抗体を用いる免疫ブロットによって検証した（図４Ａ、下段のパネル）。１４−３−３βとＲｏｒ２との間の相互作用を、１４−３−３βまたは１４−３−３β特異的抗体を沈降させることによって、および坑フラッグ免疫ブロットによって複合体内のＲｏｒ２の存在を検証することによって、さらに検証した（図４Ｂ）。
【０１７９】
Ｒｏｒ２が１４−３−３βのリン酸化を引き起こすかを評価するために、坑ホスホチロシン抗体を用いて図４Ａのブロットを再検出した。この抗体は、１４−３−３βと同じ分子量で移動し、野性型Ｒｏｒ２を発現するがβ−ｇａｌまたはキナーゼ不活性変異体を発現しない細胞内だけに存在するリン酸化タンパク質を同定した（図４中段のパネル）。これは、Ｒｏｒ２がチロシン残基上で直接的に、または間接的に１４−３−３βをリン酸化することを示唆する。坑ホスホチロシン抗体上でＵ２ＯＳ抽出物内のすべてのチロシンリン酸化タンパク質を免疫沈降させ、Ｒｏｒ２の過剰発現時にホスホ−１４−３−３βの量の有意な増加を観察することによって、この仮説を確認した（図４Ｃ）。
【０１８０】
内在性Ｒｏｒ２が、図４Ｃで観察された１４−３−３βのバックグラウンドのリン酸化を媒介するかを検査するために、Ｕ２ＯＳ細胞内のＲｏｒ２発現をＲｏｒ２特異的ｓｉＲＮＡによって抑制した。図５Ａに示すように、スクランブル対照ｓｉＲＮＡと比較すると、Ｒｏｒ２特異的ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションは、結果としてＲｏｒ２タンパク質発現のほぼ完全な抑制となった。Ｒｏｒ２発現の減少は、Ｕ２ＳＯ細胞内の１４−３−３βタンパク質の量に影響を及ぼさなかったが、そのチロシンリン酸化の著しい下方制御を引き起こした（図５Ｂ）。図４Ｃと比較すると、１４−３−３βのバックグラウンドのリン酸化の程度における明らかな増加は、ここで用いられた曝露時間が長かったことに起因する。
【０１８１】
Ｒｏｒ２の１４−３−３βへの結合および１４−３−３βのリン酸化が直接であるかを評価するために、組換え精製タンパク質によってインビトロ実験を行った。結合の実験のために、ヒトＲｏｒ２の細胞質ゾルドメインのＧＳＴ融合（ＧＳＴ−Ｒｏｒ２ｃ）を細菌細胞で発現させ、グルタチオンセファロース上で沈降させ、インビトロ翻訳した１４−３−３βを用いてインキュベートした。図６Ａに示すように、ＧＳＴ単独には結合せずに、ＧＳＴ−Ｒｏｒ２ｃに結合した１４−３−３βは、それがＲｏｒ２の細胞質ゾルドメインに直接的に結合することを示す。インビトロで翻訳された１４−３−３βは、キナーゼアッセイに不適合のＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（登録商標）タンパク質合成緩衝液を含んでいたので、精製組換えＧＳＴ標識１４−３−３βを購入し、精製組換えＧＳＴ−Ｒｏｒ２ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてインビトロキナーゼアッセイを実行した。図６Ｂに示すように、Ｒｏｒ２ｃは、１４−３−３βおよびそれ自体の両方をリン酸化し、１４−３−３βがＲｏｒ２チロシンキナーゼのための直接的な基質であることを確認した。
【０１８２】
（実施例５）
（Ｒｏｒ２特異的抗体は、Ｒｏｒ２レセプターを二量体化して活性化する）
いくつかのレセプターチロシンキナーゼは、抗体によって二量体化されて、活性化されることが示されている（参照として本明細書に援用される、ＳｐａａｒｇａｒｅｎらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１７３３−１７３９，１９９１；ＦｕｈらＳｃｉｅｎｃｅ  ２５６，１６７７−１６８０，１９９２）。従って、ヒトＲｏｒ２の細胞外ドメイン全体に対して産生されるＲｏｒ２特異的抗体を、Ｒｏｒ２レセプターチロシンキナーゼを二量体化し、活性化するするその性能について検査した。二量体化を評価するために、フラッグ標識およびヒス標識されたＲｏｒ２レセプター構築物をＵ２ＯＳ細胞で発現させ、その細胞を、Ｒｏｒ２特異的ヤギポリクローナルＩｇＧ（ヒトＲｏｒ２の細胞外ドメインに対して産生されたＡＦ２０６４、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）または非特異的ヤギＩｇＧ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて３７℃で１時間、処置した。インキュベーション後、全細胞タンパク質を抽出し、坑フラッグ親和性アガロースの上で沈降させ、坑ヒス抗体による免疫ブロットにかけた。図７Ａの上段のパネルに示すように、非特異的ＩｇＧ処置の対照条件下で、ヒス標識Ｒｏｒ２レセプターとフラッグ標識Ｒｏｒ２レセプターとの間にある関連があり、Ｕ２ＯＳ細胞での過剰発現時にＲｏｒ２がホモ二量体を形成することを示した。このホモ二量体形成は、Ｒｏｒ２抗体を用いる処置時に強力に増強され、抗体がＲｏｒ２レセプターを二量体化できることを確認する。Ｒｏｒ２−フラッグの非在化では坑フラッグ抗体は、Ｒｏｒ２−ヒスの免疫沈降ができず、坑ヒス抗体はＲｏｒ２−フラッグタンパク質を認識しなかった（図７Ａ、上段のパネル）という事実によってこの実験計画が検証された。同じレベルのＲｏｒ２−フラッグ沈降を、坑フラッグ抗体を用いる免疫ブロットによって検証した（図７Ａ、下段のパネル）。
【０１８３】
抗体がＲｏｒ２チロシンキナーゼを活性化したか否かに取り組むために、Ｒｏｒ２特異的抗体またはＩｇＧ対照を用いてＵ２ＯＳ細胞を３７℃で１時間処置し、全細胞タンパク質抽出物を単離して、ホスホチロシン抗体上でチロシンリン酸化たんぱく質をすべて沈降させた。図７Ｂは、坑Ｒｏｒ２抗体がＲｏｒ２キナーゼの著しい自己リン酸化をもたらし、ならびにそれ自体の基質（１４−３−３βタンパク質）のリン酸化をもたらしたことを示す。これらのデータは、坑Ｒｏｒ２抗体がＲｏｒ２チロシンキナーゼレセプターを二量体化し、活性化することの強力な証拠を提供する。
【０１８４】
（実施例６）
（Ｒｏｒ２特異的活性化抗体は、ｈＭＳＣミネラル化を促進する）
次に、Ｒｏｒ２の抗体誘導二量体化および活性化が、ｈＭＳＣの骨形成分化に関して機能的意義を有するか否かに取り組んだ。ｈＭＳＣは、骨形成表現型に向かって分化しない限りＲｏｒ２を発現しない（参照として本明細書に援用される、米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄ  ａｎｄ  Ｂｏｄｉｎｅ、２００４年４月１４日出願）；ＢｉｌｌｉａｒｄらＭｏｌ  Ｅｎｄｏ  １９，９０−１０１，２００５）ので、Ｒｏｒ２発現を、骨形成カクテル（０．０５ｍＭアスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸、および１００ｎＭ  ｄｅｘを補充したＭＳＣＧＭ）を用いる処置によって誘導し、Ｒｏｒ２特異的ヤギＩｇＧまたは非特異的ヤギＩｇＧを次第に加えた。９日間のインキュベーション後、ミネラル化マトリックス形成の程度をアリザリンレッドＳ組織化学染色によって評価した。図８に示すように、坑Ｒｏｒ２抗体は、ｈＭＳＣ内の石灰化マトリックス形成の程度を用量依存的に増加させた。非特異的ヤギＩｇＧは、１００μｇ／ｍｌの最も高い用量で観察された軽微な抑制を除いて、検査したすべての濃度でマトリックスミネラル化に関して効果をおよぼさなかった。明確にするために、非特異的ＩｇＧの用量をただ１つ（５０μｇ／ｍｌ）図８に示す。ヒトＲｏｒ１の細胞外ドメイン全体に対して産生されたヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＦ２０００）も効果がなかった（図８）。ｈＭＳＣ内のＲｏｒ２発現は、Ｒｏｒ２特異的ｓｈＲＮＡによって抑制されたとき、坑Ｒｏｒ２抗体の効果が消失したので、坑Ｒｏｒ２抗体の効果は、Ｒｏｒ２レセプターを介して媒介された（図９Ａ）。さらにまた、アデノウイルス感染を介してＲｏｒ２を発現するよう細胞を誘導した場合、坑Ｒｏｒ２抗体は、ｄｅｘの非存在下でさえも石灰化マトリックス形成を誘導した（図９Ｂ）。従って、Ｒｏｒ２特異的抗体は、Ｒｏｒ２レセプターの二量体化、活性化が可能であり、間葉系幹細胞でＲｏｒ２媒介による石灰化マトリックス形成を促進することが可能であり、活性化Ｒｏｒ２抗体が骨粗鬆症および他の骨疾患に効果的な処置を提供し得ることを示唆する。
【０１８５】
（実施例７）
（１４−３−３βの抑制は、ｈＭＳＣミネラル化を増強する）
１４−３−３βが骨形成分化に関与しているかを検査するために、Ｒｏｒ２過剰発現の非存在下および存在下で１４−３−３β発現を抑制した。この目的を達成するために、スクランブル対照ｓｈＲＮＡと比較すると、実際に内在性タンパク質を強力に下方抑制する１４−３−３β特異的ｓｈＲＮＡにｈＭＳＣを感染させた（図１０Ａ）。ｈＭＳＣを、スクランブルｓｈＲＮＡおよびβ−ガラクトシダーゼを含む２つの対照ウイルスに感染させたとき、低い程度のマトリックスミネラル化を観察した（図１０Ｂ）。これは、それ自体による二重感染がｈＭＳＣ培養物中で軽度の骨形成を媒介することを示唆する。以前に観察されたように（米国特許出願連番第１０／８２３，９９８号（Ｂｉｌｌｉａｒｄら、２００４年４月１４日出願））、Ｒｏｒ２アデノウイルスによる感染は、ミネラル化マトリックスの形成を強力に促進する。驚いたことに、１４−３−３βの下方制御も、ミネラル化の程度を大きく増加させる（図１０Ｂ）。Ｒｏｒ２過剰発現および１４−３−３β抑制は、どちらか単独よりも、共により強いマトリックスミネラル化を誘導する（図１０Ｂ）。これは、１４−３−３βスカフォールドタンパク質がｈＭＳＣの骨形成分化に対して抑制効果を与えることを示唆する第一の証拠である。
【０１８６】
（実施例８）
（抗体誘導Ｒｏｒ２活性化および１４−３−３β抑制は、エキソビボ頭蓋冠培養物で新規骨形成を促進する）
次に、Ｒｏｒ２活性化および１４−３−３β抑制のインビトロ効果がエキソビボ器官培養物での骨形成の増加に変わるかを検査した。４日齢の同腹仔マウスの頭蓋冠骨をスクランブルｓｈＲＮＡまたは１４−３−３β特異的ｓｈＲＮＡを５×１０７ウイルス粒子／ｍｌで含有するアデノウイルスに感染させ、次いで４８時間後に１５μｇ／ｍｌのカルセインの存在下で１２μｇ／ｍｌの坑Ｒｏｒ２抗体または非特異的ＩｇＧで処置した。アデノウイルスおよび抗体を用いる培養の７日間後に、骨をヘマトキシリン−エオシンで染色し、着実な３００μｍの伸展（前頭縫合から４５０μｍ離れた）をＢｉｏｑｕａｎｔ−ＮＯＶＡ  ＭＲ５．５０．８（テネシー州ナッシュビル）を使用して組織形態計測解析にかけた。スクランブルｓｈＲＮＡ感染およびＩｇＧ処置の対照条件下で、６００μｍ長の頭蓋冠は、９３９４±１３３３μｍ２の骨面積および３９．５±７．４の骨芽細胞を含有していた。特異的ｓｈＲＮＡによる１４−３−３βの抑制は、全骨面積で６０％の増加、骨芽細胞数で５０％の増加をもたらし、１４−３−３βタンパク質が骨芽細胞数および／または活性を抑制することを示した（図１１）。坑Ｒｏｒ２抗体を用いる頭蓋冠骨の処置は、骨芽細胞数で８５％の増加および全骨面積で５０％の増加をもたらし、ここでも活性化Ｒｏｒ２抗体が骨粗鬆症および他の骨疾患に有効な処置を提供し得ることを示唆した。しかしながら、１４−３−３βｓｈＲＮＡ感染をＲｏｒ２抗体処置と組み合わせることは、相加効果を生成せず、いずれか単独の処置と比較して、若干反応が少ない結果とさえなった（図１１）。経験上、観察された５０〜８０％の増加は、このアッセイ系の飽和には達していないので、Ｒｏｒ２および１４−３−３βの双方が骨芽細胞分化および／または機能を制御する同じ経路にあると推測したくなる。
【０１８７】
（実施例９）
（Ｒｏｒ２活性のための高スループット、高感度アッセイの開発）
図１２Ａに示すように、このアッセイは、特徴がはっきりしたＴｒｋＢレセプターシグナル伝達経路を利用する。ＴｒｋＢレセプターは、標的遺伝子のプロモーター内にＥｒｋのリン酸化およびｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の刺激を引き起こすリガンド誘導性ホモ二量体化によって活性化される。出願者は、ＴｒｋＢ（アミノ酸４３２〜８２２）の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合したＲｏｒ２（アミノ酸１〜４０７）の細胞外ドメインからなるキメラレセプターを生成した。このキメラを使用すると、Ｒｏｒ２二量体化をもたらす薬剤は、ＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化し、ＣＲＥプロモーター活性の増加をもたらすと仮定される。この仮説を検証するために、キメラレセプターを、Ｄｒ．Ｓｅｏｎｇｅｕｎ  Ｃｈｏ（Ｗｙｅｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ニュージャージー州プリンストン）から入手したＣＲＥ−ルシフェラーゼプラスミド（ＨＥＫ−ＣＲＥ）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に安定的にトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｙｇｒｏ中のＲｏｒ２−ＴｒｋＢキメラを、ＥＣＭ６００電気穿孔装置（ＢＴＸ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてＨＥＫ−ＣＲＥ細胞に電気穿孔処理し、ハイグロマイシン耐性細胞の単離コロニーが形成されるまでこの細胞を３５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンで増殖させた。コロニーをトリプシン処理して、９６ウェルプレートの１ウェルごとに１コロニーを移した。コロニーを３５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを用いて３７℃で増殖させ、Ｒｏｒ２−ＴｒｋＢ発現のレベルをウエスタン免疫ブロットおよび免疫細胞化学によって評価した。Ｒｏｒ２−ＴｒｋＢキメラを発現させたＨＥＸ−ＣＲＥ細胞を、Ｒｏｒ２を二量体化することが以前に示された坑Ｒｏｒ２抗体を用いて処理した（実施例５を参照）。図１２に示すように、非特異的ＩｇＧで処置した細胞と比較して、Ｒｏｒ２特異的抗体は、観察されたルシフェラーゼ活性において強い用量依存性増加を引き起こした。このように、出願者は、Ｒｏｒ２の二量体化および活性化を誘導する薬剤（小分子、ペプチド、タンパク質、または抗体を含むがこれらに限定されない）の性能を測定する迅速で高スループット、かつ高感度のアッセイを開発した。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、下方制御するＲｏｒ２発現が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のｄｅｘ誘導骨形成分化を抑制することを示す。ヒトＭＳＣを、Ｒｏｒ２特異的ｓｈＲＮＡまたはＥＧＦＰ特異的ｓｈＲＮＡ（対照）を含むアデノウイルス発現ベクターに感染させ、０．０５ｍＭのアスコルビン酸、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸（β−ＧＰ）、および１００ｎｍのデキサメタゾン（ｄｅｘ）を補充したＭＳＣ増殖培地（ＭＳＣＧＭ）でインキュベートした。９日間のインキュベーションの後、全細胞タンパク質抽出物（５０μｇ／レーン）を、ローディングコントロールとして内在性Ｒｏｒ２タンパク質またはβアクチンを調べるためにウエスタン免疫ブロットにかけた（Ａ）。１１日間のインキュベーションの後、ミネラル化マトリックス形成の程度を評価するために、アリザリンレッドＳ染色を行い（Ｂ）、定量化した（Ｃ）。Ｃでは、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡの存在下でアリザリンレッドＳが取り込まれた量を１００％に設定した。ＢおよびＣの結果は、３つの独立した実験の特徴を表す（図１を実施例１で参照する）。
【図２】図２は、Ｒｏｒ２の過剰発現がｈＭＳＣの脂肪細胞への分化を抑制することを示す。Ａ．ヒトＭＳＣを、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、Ｒｏｒ２、またはＲｏｒ２ＫＤに感染させ、脂肪生成カクテルを補充したＭＳＣＧＭで８日間インキュベートした。細胞ＲＮＡ全体を単離し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手したプライマーおよびプローブを用いて、脂肪生成転写因子Ｃ／ＥＢＰαおよびＰＰＡＲγを調べるためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。ｍＲＮＡのレベルを、各試料中のシクロフィリンＢの発現に標準化し、β−ｇａｌ感染細胞中のｍＲＮＡの相対的発現を１００％に設定した。Ｂ．ヒトＭＳＣを、β−ｇａｌ、Ｒｏｒ２、またはＲｏｒ２ＫＤに感染させ、脂肪生成カクテルを補充したＭＳＣＧＭで２１日間インキュベートし、次いでオイルレッドＯ染色を行った（図２を実施例２で参照する）。
【図３】図３は、Ｒｏｒ２タンパク質の過剰発現が全骨面積を増加させるが、新生仔マウスの頭蓋冠の骨芽細胞数を増加させないことを示す。４日齢の同腹仔マウスの頭蓋冠骨を、非感染で残す（対照）か、またはβ−ガラクトシダーゼ（β）またはヒトＲｏｒ２（Ｒ２）をコードするアデノウイルスに感染させた。アデノウイルスの存在下での７日間のインキュベーションの後、全骨面積および骨芽細胞数を評価する前に、頭蓋冠をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。非感染培養物で得た値を１００％に設定した。結果は、状態あたり４〜５頭蓋冠の平均値∀  ＳＥ（標準誤差）（β−ガラクトシダーゼ感染と比較して、＊−Ｐ＜０．０１）である。このグラフは、３つの独立した実験を表す（図３を実施例３で参照する）。
【図４】図４は、Ｒｏｒ２タンパク質がチロシン上で１４−３−３βに結合し、それをリン酸化することを示す。Ｕ２ＯＳ細胞をβ−ｇａｌ（β）、Ｒｏｒ２（Ｒ２）、またはＲｏｒ２ＫＤ（ＫＤ）アデノウイルスに感染させ、２４〜４８時間後に、全細胞可溶化液を調製し、坑フラッグ抗体（Ａ）、坑１４−３−３β抗体（Ｂ）、または坑ホスホチロシン抗体（Ｃ）で免疫沈降させた。表示した抗体を用いる免疫ブロットによって免疫沈降を解析した（図４を実施例４で参照する）。
【図５】図５は、内在性Ｒｏｒ２タンパク質がインビボで１４−３−３βリン酸化を媒介することを示す。Ｕ２ＯＳ細胞にＲｏｒ２  ｓｉＲＮＡまたは非特異的ｓｉＲＮＡを一過性でトランスフェクトし、４８時間後に、全細胞タンパク質抽出物を、５０μｇ抽出物／レーンを用いて内在性Ｒｏｒ２タンパク質またはβアクチン（ローディングコントロール）を調べるためにウエスタン免疫ブロットにかけた（Ａ）。また、該可溶化液も１４−３−３β抗体（２０μｇ／レーン）で直接的に、または坑ホスホチロシン抗体を用いる免疫沈降後に解析した（Ｂ）（図５を実施例４で参照する）。
【図６】図６は、Ｒｏｒ２タンパク質の細胞質ゾルドメインが１４−３−３βに結合して、インビトロで直接リン酸化することを示す。Ａ．Ｒｏｒ２のＧＳＴ標識された細胞質ゾルドメイン（ＧＳＴ−Ｒ２ｃ）またはＧＳＴ単独をグルタチオンセファロースビーズに付着させ、インビトロ翻訳した１４−３−３βを用いて４℃で４時間インキュベートした。結合した物質を坑１４−３−３β抗体で解析した。Ｂ．インビトロキナーゼアッセイを、Ｒｏｒ２タンパク質の精製した組換え細胞質ゾルドメイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＧＳＴ−Ｒ２ｃ）および精製した組換えＧＳＴ−１４−３−３β（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｉｎｃ．社）を用いて「一般法」に記述されるように実行した（図６を実施例４で参照する）。
【図７】図７は、Ｒｏｒ２特異的抗体がＲｏｒ２レセプターの二量体化および活性化を引き起こすことを示す。Ａ．二量体化を示すために、ＣＯＯＨ終端でフラッグ（Ｒ２−Ｆ）またはヒス（Ｒ２−Ｈ）のいずれかのエピトープタグを標識したＲｏｒ２発現プラスミドを用いて、Ｕ２ＯＳ細胞をトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＲｏｒ２特異的ヤギポリクローナルＩｇＧまたは非特異的ヤギＩｇＧを用いて３７℃で１時間処置し、次いで全細胞タンパク質抽出物を調製し、坑フラッグ親和性アガロースの上で免疫沈降させた。沈澱物を、坑ヒス抗体（上段のパネル）を用いて免疫ブロットによって解析した。下段のパネルは、坑フラッグ抗体を用いて沈降レベルの対照を再探索した同じ膜を示す。Ｂ．活性化を示すために、非トランスフェクトＵ２ＯＳ細胞を、Ａ．のようにＲｏｒ２特異的抗体または対照ＩｇＧを用いて処置した。全細胞抽出物を坑ホスホチロシン抗体の上で沈降させ、Ｒｏｒ２または１４−３−３β抗体を用いて解析した（図７を実施例５で参照する）。
【図８】図８は、Ｒｏｒ２抗体がｈＭＳＣでミネラル化マトリックス形成を引き起こすことを示す。ヒトＭＳＣを、０．０５ｍＭのアスコルビン酸、１０ｍＭのβ−ＧＰおよび１００ｎＭのｄｅｘを含有し、非特異的ヤギＩｇＧもしくはＲｏｒ１特異的ヤギＩｇＧ（各５０μｇ／ｍｌ）のいずれかを補充した、またはＲｏｒ２特異的ヤギＩｇＧの濃度を上げたＭＳＣＧＭでインキュベートした。９日間のインキュベーションの後、アリザリンレッドＳ染色でマトリックスミネラル化の程度を評価した（図８を実施例６で参照する）。
【図９】図９は、Ｒｏｒ２抗体によって誘導されたｈＭＳＣミネラル化がＲｏｒ２によって媒介されることを示す。Ａ．ｈＭＳＣを、Ｒｏｒ２またはＥＧＦＰ（対照）に特異的なｓｈＲＮＡを含有するアデノウイルス発現ベクターに感染させ、０．０５ｍＭのアスコルビン酸、１０ｍＭのβ−ＧＰおよび１００ｎＭのｄｅｘを補充したＭＳＣＧＭでインキュベートした。９日間のインキュベーションの後、アリザリンレッドＳ染色でマトリックスミネラル化の程度を評価した。Ｂ．ヒトＭＳＣをＲｏｒ２アデノウイルスに２４時間感染させ、次いで０．０５ｍＭのアスコルビン酸、１０ｍＭのβ−ＧＰ、およびＲｏｒ２特異的ヤギＩｇＧまたは非特異的ヤギＩｇＧのいずれかを含有するＭＳＣＧＭで１９日間インキュベートさせて、アリザリンレッドＳ染色を行った（図９を実施例６で参照する）。
【図１０】図１０は、下方制御する１４−３−３βがｈＭＳＣ内でミネラル化マトリックス形成を増強することを示す。ヒトＭＳＣを、スクランブルｓｈＲＮＡ、１４−３−３β特異的ｓｈＲＮＡ、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）過剰発現カセット、またはＲｏｒ２過剰発現カセットを含有するデノウイルス発現ベクターに感染させ、次いで０．０５ｍＭのアスコルビン酸、１０ｍＭのβ−ＧＰおよび１００ｎＭのｄｅｘを補充したＭＳＣＧＭでインキュベートした。９日間のインキュベーションの後、５０μｇの全細胞タンパク質抽出物を、内在性１４−３−３βタンパク質を調べるためにウエスタン免疫ブロットにかけた（Ａ）。１２日間のインキュベーションの後、アリザリンレッドＳ染色を実行し（Ｂ）、ミネラル化マトリックス形成の程度を評価した（図１０を実施例７で参照する）。
【図１１】図１１は、Ｒｏｒ２抗体処置および１４−３−３β下方制御がエキソビボで新骨形成を促進することを示す。マウス頭蓋冠骨をスクランブルｓｈＲＮＡ（ｓｃｒ）または１４−３−３β特異的ｓｈＲＮＡを含有するアデノウイルスベクターに感染させ、４８時間後に、カルセインの存在下で１２μｇ／ｍｌの坑Ｒｏｒ２抗体または非特異的ＩｇＧを用いて処置した。アデノウイルスおよび抗体による７日間のインキュベーションの後、頭蓋冠をヘマトキシリン−エオシンで染色し、全骨面積（グラフ中白の棒で示す）と骨芽細胞数（グラフ中黒の棒で示す）を決定した。感染したスクランブルｓｈＲＮＡ培養物およびＩｇＧ処置培養物で得た値を１００％に設定した。結果は、状態ごとに４頭蓋冠の平均値∀  ＳＥ（＊−ｐ＜０．０５）である（図１１を実施例８で参照する）。
【図１２】図１２は、Ｒｏｒ２活性を調べるための高スループット、高感度アッセイの生成を示す。Ａ．ＴｒｋＢレセプターのシグナル伝達経路を利用するアッセイの模式表示。ＴｒｋＢレセプターを、標的遺伝子のプロモーター内でＥｒｋのリン酸化およびｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の刺激作用を引き起こすリガンド誘導性ホモニ量体化によって活性化させる。出願者は、ＴｒｋＢ（アミノ酸４３２〜８２２）の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合したＲｏｒ２（アミノ酸１〜４０７）の細胞外ドメインから成るキメラレセプターを生成した。このキメラを使用するとき、Ｒｏｒ２二量体化を引き起こす薬剤は、ＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化させ、次いでこの活性化は、ＣＲＥプロモーター−ルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価され得る。Ｂ．ＨＥＫ２９３細胞をＲｏｒ２−ＴｒｋＢキメラおよびＣＲＥ−ルシフェラーゼプラスミドを用いて安定にトランスフェクトして、表示した量の坑Ｒｏｒ２抗体または非特異的ＩｇＧを用いて２４時間処置し、ルシフェラーゼ活性を評価した。非特異的ＩｇＧを用いた処置後に観察されたルシフェラーゼ活性を１に設定した。結果は、３つの独立した実験を表す（平均値∀  ＳＥ；ｎ＝４；＊−ｐ＜０．０５）（図１２を実施例９で参照する）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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