(57)【要約】本明細書には、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ殺虫性毒素の三次元構造の少なくとも一部を模倣する候補分子を同定する方法であって、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ殺虫性毒素の三次元構造を模倣する候補分子を同定する分子モデルを使用して、本明細書に開示するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ殺虫性毒素の原子座標から作成した分子モデルを提供することと；同定される候補分子を提供することとを含む、方法が開示される。この方法は必要に応じて、Ｕ−ＡＣＴＸのファーマコフォア残基をＱ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４と同定する分子モデルを使用することも含む。
2009540295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素の三次元構造の少なくとも一部を模倣する候補分子を同定する方法であって、
表３の通りのｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ殺虫性毒素の原子座標から作成した分子モデルを提供することと；
該分子モデルを使用して、該ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ分子モデルの構造を模倣する候補分子を同定することと；
同定される候補物質分子を提供することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記分子モデルを使用しながら前記分子モデルにおいてファーマコフォア残基Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４を同定することもさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
提供することが、前記候補分子を合成すること、またはライブラリーから前記候補分子を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
機能アッセイにおいて前記候補分子を試験することもさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記機能アッセイが、昆虫に対する致死性、昆虫カルシウムチャネルの阻害、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害、昆虫カルシウムチャネルへの結合、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合、または前記機能アッセイのうちの１つ以上の組み合わせについての試験を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分子モデルを使用し、改変された候補分子を同定して、前記候補分子と比べて、昆虫に対する致死率が高いか、昆虫カルシウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウムチャネルへの結合が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合が増大しているか、または前記機能のうちの１つ以上が増大している、改変された候補分子を同定および作製することもさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記機能アッセイにより、ワモンゴキブリに由来するＤＵＭニューロンにおけるＣａＶチャネル電流の阻害、ゴキブリｐＳｌｏチャネルの阻害、または前記アッセイのうちの１つ以上を含む組み合わせが測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造の少なくとも一部を模倣する候補分子を選択するための方法であって、
メモリ手段と、データ入力手段と、視覚表示手段とを有するコンピュータを提供することであって、該メモリ手段が、座標データをメモリ手段から読み出すことと、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元像を該視覚表示手段に表示する操作が可能な三次元分子シミュレーションソフトウェアを含む、コンピュータを提供することと；
表３のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１の原子の三次元座標データを該コンピュータに入力して、該メモリ手段にデータを記憶することと；
該候補分子の該三次元像を該視覚表示手段に表示することと；
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと該候補分子との該三次元構造を比較することと；
該候補分子を提供することと、
を含む、方法。
【請求項９】
前記分子モデルを使用しながら該分子モデルにおいて前記ファーマコフォア残基Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４を同定することもさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
提供ことが、前記候補分子を合成すること、またはライブラリーから前記候補分子を得ることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
機能アッセイにおいて前記候補分子を試験することもさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記機能アッセイが、昆虫に対する致死性、昆虫カルシウムチャネルの阻害、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害、昆虫カルシウムチャネルへの結合、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合、または上記機能アッセイのうちの１つ以上の組み合わせについての試験を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分子モデルを使用し、改変された候補分子を同定して、前記候補分子と比べて、昆虫に対する致死率が高いか、昆虫カルシウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウムチャネルへの結合が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合が増大しているか、または前記機能のうちの１つ以上が増大している、改変された候補分子を同定および作製することもさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能アッセイにより、ワモンゴキブリに由来するＤＵＭニューロンにおけるＣａＶチャネル電流の阻害、ゴキブリｐＳｌｏチャネルの阻害、または前記アッセイのうちの１つ以上を含む組み合わせが測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素の三次元構造の少なくとも一部を模倣する分子を同定する方法であって、
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの三次元モデルを作成することと；
該三次元モデルにおいてファーマコフォア残基Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４を同定することと；
コンピュータ解析を行って、該Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの該ファーマコフォア残基を模倣する候補分子を同定することと、
を含む、方法。
【請求項１６】
三次元モデルを作成する前に、
精製されたＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを得ることと、
前記Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの原子座標を得ることと、
をもさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素が、配列番号１と約７０％以上同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素が、配列番号１と約８５％以上同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素が、配列番号１と約９０％以上同一であるアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
昆虫に対する致死性、昆虫カルシウムチャネルの阻害、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害、昆虫カルシウムチャネルへの結合、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合、または前記機能アッセイのうちの１つ以上の組み合わせについて、前記候補分子を機能アッセイにおいて試験することもさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記分子モデルを使用し、改変された候補分子を同定して、前記候補分子と比べて、昆虫に対する致死率が高いか、昆虫カルシウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウムチャネルへの結合が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合が増大しているか、または上記機能のうちの１つ以上が増大している、改変された候補分子を同定および作製することもさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記機能アッセイにより、ワモンゴキブリに由来するＤＵＭニューロンにおけるＣａＶチャネル電流の阻害、ゴキブリｐＳｌｏチャネルの阻害、または上記アッセイのうちの１つ以上を含む組み合わせが測定される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００６年６月６日出願の米国仮出願第６０／８１１，１５３号に対する優先権を主張する。米国仮出願第６０／８１１，１５３号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する言及）
米国政府は、全米科学財団助成金番号ＭＣＢ０２３４６３８に従って本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
害虫に分類される昆虫はごく少数であるにもかかわらず、これらの昆虫は、世界の食物供給の約２０％を破壊しており、ヒトおよび動物の一連の多様な病原体を伝播する。そのため、害虫防除は、世界の農業および医学における重要な課題となっている。昆虫などの節足動物害虫は、１９４０年代にＤＤＴが導入されて以来ずっと主に化学殺虫剤で防除されてきた。しかし、米国および世界の他の国々において害虫防除は、いくつかの理由によりますます複雑になっている。第一に、化学的防除によって昆虫集団はダーウィン淘汰に遭うこととなり、その結果、５００種を超える節足動物が、１種以上の化学殺虫剤に対する耐性を発達させている。第二に、化学殺虫剤が望ましくない環境上の帰結や生態学的な帰結（例えば、対象外の生物に対する毒性）をもたらすという認識が強まってきていることから、政府の規制も、殺虫剤のリスクアセスメントに対してより厳しい要求を課すものへと改正されている。新規の殺虫剤に対する登録要件がより厳しくなることと相まって、耐性発達または登録抹消による殺虫剤の種類全体の減少によって、近い将来に有効な化学殺虫剤のプールは全体として減少するものと考えられる。
【０００４】
これまで多くの研究者が、クモ毒を農業およびその他の用途に関して昆虫に特異的な毒素の供給源となる可能性があると認めている。オメガ−アトラコトキシンとして知られるペプチド毒素の１種は、この毒の「ワタキバガの幼虫に対する抵抗（ａｎｔｉ−ｃｏｔｔｏｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ）」活性についてスクリーニングを行うことによってオーストラリアジョウゴグモから単離されると特許文献１に開示されている。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと呼ばれる、これらの化合物のうちの１つは、哺乳動物ではなく昆虫の電位依存性カルシウムチャネル電流を選択的に阻害することが示されている。第二の無関係の種類の昆虫特異的ペプチドカルシウムチャネル遮断薬は、同じ科のクモから単離されると特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，７６３，５６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５８３，２６４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
サソリおよびクモから単離されるいくつかの殺虫性ペプチド毒素は、殺虫剤の開発につながる有望な手がかりであるようであるが、昆虫に対して迅速かつ強力に作用するものの、昆虫と脊椎動物とで異なった毒性を示す化合物が依然として大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（概要）
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素の三次元構造の少なくとも一部を模倣する候補分子を同定する方法は、ＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｈ１ＺおよびＲＣＳＢ  ＩＤ  ＲＣＳＢ０３７８２８を有するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ殺虫性毒素の原子座標から作成した分子モデルを提供することと；この分子モデルを使用して、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ分子モデルの構造を模倣する候補分子を同定することと；同定される候補分子を提供することとを含む。
【０００８】
別の実施形態において、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造の少なくとも一部を模倣する候補分子を選択するための方法は、メモリ手段と、データ入力手段と、視覚表示手段とを有するコンピュータを提供することであって、このメモリ手段が、座標データをメモリ手段から読み出し、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元像をこの視覚表示手段に表示する操作が可能な三次元分子シミュレーションソフトウェアを含む、コンピュータを提供することと；ＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｈ１ＺおよびＲＣＳＢ  ＩＤ  ＲＣＳＢ０３７８２８を有するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１の原子の三次元座標データをコンピュータに入力して、このメモリ手段にデータを記憶することと；候補分子の三次元像を視覚表示手段に表示することと；ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと候補分子との三次元構造を比較することと；候補分子を提供することとを含む。
【０００９】
さらに別の実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素の三次元構造の少なくとも一部を模倣する分子を同定する方法は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの三次元モデルを作成することと、前記三次元モデルにおいてファーマコフォア残基Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４を同定することと、コンピュータ解析を行って、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドのファーマコフォア残基を模倣する候補分子を同定することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、殺虫性ペプチド毒素（配列番号１〜７）のＵ−ＡＣＴＸファミリーの各種メンバーの一次構造の比較を示す。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）は、２個のＮ末端残基（Ｇｌｎ−Ｔｙｒ）がクローニングの目的でＧｌｙ−Ｓｅｒに置換されている、天然のペプチド毒素（配列番号２）のうちの１つの組換え型である。
【図２】図２は、残基３〜３９の骨格原子（Ｃα、ＣおよびＮ）に最適に重ね合わせるために重ね合わされた一揃いの２５個のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ構造（ＰＤＢファイル２Ｈ１Ｚ）のウォールアイ（ｗａｌｌ−ｅｙｅｄ）ステレオ図を示す。ペプチド毒素のＮ末端およびＣ末端を、それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と標記する。３個のジスルフィド結合を薄灰色の管として示し、各ジスルフィド結合は、ジスルフィド結合を形成する２個のシステイン残基の残基番号で標記する。
【図３】図３は、ＰＲＯＣＨＥＣＫコンピュータプログラムを使用して決定した一揃いの２５個のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ構造のラマチャンドランプロットを示す。ＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムにより算出した統計値を、ラマチャンドランプロットの下に示す。
【図４】図４は、分子エネルギーが最低の一揃いのものによるモデル（ＰＤＢファイル２Ｈ１Ｚのモデル１）の座標に基づく、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造のリチャードソン模式図を示す。模式図をウォールアイステレオ画像として示す。矢印は、Ｃ末端側のヘアピンを形成する２本のβ鎖（β１＝残基２２〜２７；β２＝残基３３〜３８）を表す。ペプチド毒素のＮ末端およびＣ末端を、それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と標記する。この図では、分子を、図２に示す配向から長軸を中心にして約９０°回転させたものである。
【図５】図５は、分子エネルギーが最低の一揃いのものによるモデル（ＰＤＢファイル２Ｈ１Ｚのモデル１）の座標に基づく、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造のリチャードソン模式図を示す。アラニン走査変異誘発実験により決定した重要な官能性残基Ｇｌｎ８、Ｐｒｏ９、Ａｓｎ２８およびＶａｌ３４の側鎖を、黒色の管として示す。分子の配向は、図４に示したものと同様である。ペプチド毒素のＮ末端を「Ｎ」と標記する。
【図６】図６は、分子エネルギーが最低の一揃いのものによるモデル（ＰＤＢファイル２Ｈ１Ｚのモデル１）の座標に基づく、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造の分子表面の代表を示す。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの重要なファーマコフォア要素（Ｇｌｎ８、Ｐｒｏ９、Ａｓｎ２８、およびＶａｌ３４）の表面を、黒色で強調する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上述および他の特徴は、以下の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲から当業者により認識および理解される。
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａとして知られる殺虫性ペプチド毒素の三次元構造の決定に少なくとも部分的に基づく。本発明はまた、本毒素のファーマコフォアの決定にも少なくとも部分的に基づく。本明細書において、本発明者等は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの４つの残基（Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４）がポリペプチドの殺虫活性を提供することを予想外に見出した。
【００１３】
Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、全体が参考として本明細書で援用されるＵＳ２００６／２４２７３４号に記載の殺虫性ペプチド毒素ファミリーのプロトタイプメンバーである。これらの殺虫性毒素は、対になって３個のジスルフィド結合を形成する６個の保存されたシステイン残基を含め、３８〜３９個の残基を含む。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、イエコオロギ（Ａｃｈｅｔａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、および他の昆虫種などの昆虫に注入されると、不可逆的な毒性を生じる。これらの毒素は、昆虫電位依存性カルシウムチャネル（ｉｎｓｅｃｔ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）と昆虫カルシウム依存性カリウムチャネル（ｉｎｓｅｃｔ  ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）の両方を遮断する独特の能力を有する。
【００１４】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）は、組換えポリペプチドであり、ここでは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号２）の天然配列の最初の２個の残基（Ｇｌｎ−Ｔｙｒ）が、Ｇｌｙ−Ｓｅｒで置換されて、以下に配列を生じている：
【００１５】
【化１】
2009540295.tif 000003
Ｕ−ＡＣＴＸの他の改変体（配列番号３〜７）を図１に示す。Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの他の相同体（例えば、配列番号１と約７０％、８５％、９０％または９５％以上同一であり、相同ポリペプチドが殺虫活性を有する、相同体）が使用され得る。「相同体」とは、対象配列に対して高度の配列関連性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を示すものとして当該技術分野で使用される一般名である。このような関連性は、比較している配列間の同一性および／または類似性の程度を決定することによって定量され得る。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「相同性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，２２６４−２２６８のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。
【００１６】
大腸菌発現系を使用したミリグラム量のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの産生については、ＵＳ２００６／２４２７３４号に記載された。
【００１７】
本明細書に表３として含まれ、コンパクトディスク１にて提出された、原子座標セットおよび関連の表を参照する。
【００１８】
本明細書に示されるＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造がその配向とは無関係であること、および本明細書で同定される座標は、単に特定の毒素の１つの見込まれる配向を表しているにすぎないことは、当業者に明らかとなる。そのため、原子の相対位置またはそれぞれの構造の特徴を変更することなく、本明細書で同定される原子座標の数学的な回転、変換、拡大縮小、またはこれらの組み合わせが行われ得ることは明らかである。このような数学的操作は、本明細書に包含される。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「結合する」、「結合している」、「結合した」、「結合」または「結合された」という用語は、原子、分子または化学基の会合に関して使用される場合に、２以上の原子、分子または化学基の物理的接触または会合を指す。このような接触および会合には、共有結合型の相互作用および非共有結合型の相互作用が含まれる。
【００２０】
本明細書で使用される「水素結合」という用語は、一方の原子のみに共有結合し、他方とは相互作用する水素を共有する２個の電気陰性原子（ＯまたはＮのいずれか）を指す。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「疎水性相互作用」という用語は、２個の疎水性残基によりなされる相互作用を指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「非共有結合」とは、原子および／または分子の間の共有結合の形成を伴わない、原子および／または分子の間の相互作用を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「分子グラフィックス」という用語は、（好ましくはコンピュータスクリーン上における）原子の三次元像を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「分子モデル」または「分子構造」という用語は、特定の対象内の原子の三次元配置（例えば、毒素を構成する原子の三次元構造）を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「分子モデリング」という用語は、１つ以上のモデルを作成するために、そして必要に応じてリガンドの構造活性相関に関する予測を行うために、コンピュータの使用の有無を問わず実施することができる方法または手順を指す。分子モデリングで使用される方法は、分子グラフィックスから計算機化学までの範囲に及ぶ。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ファーマコフォア」という用語は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの生物活性を担う規定された幾何学的形態を有する一揃いの相互作用性官能基を指す。
【００２７】
一般的に、ファーマコフォアは、標的分子の表面への結合を引き起こす活性残基の表面の精密な電子特性（すなわち、昆虫イオンチャネル）により指定される。通常、これらの特性は、基礎をなす化学構造（例えば、芳香族基、官能基（例えば、−ＣＯＯＨ）など）およびそれらの幾何学的関係によって指定される。非限定的な一態様において、幾何学的関係は、厳密には少なくとも２オングストローム、より具体的には少なくとも１オングストロームである。ファーマコフォアは、２〜４個のこのような基（すなわちファーマコフォアの要素または特徴）の同定を含み得る。しかし、複合タンパク質の認識標的に関しては、ファーマコフォアはより多くの基を含み得る。
【００２８】
図５〜６に示す通り、Ｕ−ＡＣＴＸ毒素のコアファーマコフォア残基には、アミノ酸残基Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４が含まれる。
【００２９】
「基本ファーマコフォアの詳細」とは、ファーマコフォアを構成する化学基と、これらの基の幾何学的関係との両方を指す。いくつかの化学的配置は、類似の電子特性を有する場合がある。例えば、ファーマコフォアの詳細が特定の位置に−ＯＨ基を含む場合、実質的に同等の詳細は、同じ位置に−ＳＨ基を含む。実質的に性質を変更することなくファーマコフォアの詳細において置換され得る同等の化学基は、相同である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物」とは、昆虫電位依存性カルシウムチャネル、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネル、またはこれらの両方のチャネルと相互作用することによりＵ−ＡＣＴＸ毒素として機能する分子を指す。一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物は、昆虫電位依存性カルシウムチャネルおよび昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの両方と相互作用する。模倣物という用語は、Ｕ−ＡＣＴＸファーマコフォアの対応する部分と構造および／または官能基が類似する部分を有する分子を包含する。
【００３１】
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、Ｕ−ＡＣＴＸファミリーの毒素を模倣する新規の分子を設計および／または選択する分子モデリング技術およびコンピュータモデリング技術を含む。
【００３２】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性毒素の三次元構造の少なくとも一部を模倣する候補分子を同定する方法は、ＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｈ１ＺおよびＲＣＳＢ  ＩＤ  ＲＣＳＢ０３７８２８を有するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ殺虫性毒素の原子座標から作成した分子モデル（表３）を提供することと；この分子モデルを使用して、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ分子モデルの構造を模倣する候補分子を同定することと；同定される候補分子を提供することとを含む。必要に応じて、この方法は、この分子モデルを使用しながら前記分子モデルにおいてファーマコフォア残基Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４を同定することもさらに含む。
【００３３】
必要に応じてｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの基本ファーマコフォアの詳細と組み合わせたｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの原子座標は、新規の目的分子（例えば、新規のイオンチャネルモジュレーター）を設計するために、合理的薬物設計（ＲＤＤ）（例えば、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造的模倣物および機能的模倣物としてふるまう殺虫剤の合理的設計）において使用され得る。さらに当業者は、本明細書に開示される原理を使用することによって、例えば、農業用途の場合に、昆虫が植物に対して与える損害が少なくなり、かつ植物の収穫量に著しい悪影響を及ぼさないような方法で、昆虫を殺傷するかもしくは麻痺させるように特に設計したか、または昆虫の発育もしくは増殖を阻害するように特に設計した、新規の殺虫剤を設計、作製、試験、精密化および使用することができる。例えば、当業者は、本明細書で考察する原理を使用することによって、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを機能的に模倣する新規の分子を設計することができる。その結果、分子構造、および必要に応じて本明細書で提供および考察する基本ファーマコフォアの詳細によって、当業者は、低分子毒素ならびにポリペプチド毒素を含めた新規の殺虫性毒素を設計することが可能となる。
【００３４】
Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの原子座標を使用するＲＤＤは、当該技術分野で公知であって使用されるコンピュータハードウェアおよびソフトウェアを使用するコンピュータ支援薬物設計（ＣＡＤＤ）によって、最も容易にされ得る。候補分子は、新たに設計される場合もあれば、あるいは既存の分子（例えば、既存の毒素）を改変したものとして設計される場合もある。一旦設計されると、候補分子は、当該技術分野で公知であって使用される方法論を使用して合成することもできれば、あるいは化合物のライブラリーから得ることもできる。一旦これらが得られれば、候補分子は、生物活性（例えば、昆虫イオンチャネルを阻害する候補分子の能力）について必要に応じてスクリーニングされる。必要に応じて、候補分子の構造は、どの程度構造がｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのファーマコフォアの要素を模倣しているかを決定するために解明される。これらの結果に一部基づいて、候補分子は、所望の生物活性を有するより望ましい分子を作製するために、上記の工程のうちの１つ以上を使用して繰り返し精密化され得る。
【００３５】
本明細書で提供されるツールおよび方法論は、殺虫活性を有する分子の同定および／または設計に使用され得る。基本的に、これらの工程では、候補分子の合成、試験および特性評価が行われる反復プロセスが利用される。最初の分子の試験および特性評価で得られる情報に基づき新規の分子を設計した後、このように新しく同定した分子自体の試験および特性評価を行う。この一連のプロセスは、望ましい結合特性および／または生物活性を有する分子を得るのに必要に応じて何度でも繰り返され得る。候補分子を同定するための方法を、以下にさらに詳述する。
【００３６】
目的の候補分子の設計は、ボール型およびスティック型の物理的モデリング手順によって容易にされ得る。しかし、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ毒素のサイズを鑑みて、候補分子を設計する能力が、コンピュータベースのモデリングおよび設計プロトコルにより大幅に高められ得る。
【００３７】
一実施形態において、候補分子の選択は、操作可能な通信におけるメモリ手段と、データ入力手段と視覚表示手段とを有するコンピュータを提供することも含む。メモリ手段は、座標データをメモリ手段から読み出す操作が可能で、かつ視覚表示手段にその分子またはその一部の三次元像を表示する操作が可能な、三次元分子シミュレーションソフトウェアを含む。本ソフトウェアは、ドメインの化学構造に対するオペレータが選択した変更に応答する改変された三次元類似体像を生成する操作が可能であり、かつ改変した類似体の三次元像を表示する操作も可能である。データ入力手段は、コンピュータ可読データを処理するための中央処理装置を含む。また、本方法は必要に応じて、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの原子の三次元座標データをコンピュータに入力して、メモリ手段にデータを記憶することと；コンピュータのデータ入力手段に、オペレータが選択したｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの化学構造の少なくとも１つの変更を入力することと；分子シミュレーションソフトウェアを実行して、類似体構造の改変された三次元分子像を生成することと；類似体の三次元像を視覚表示手段に表示することとをも含み、それによって化学構造の変化の結果として生じるｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造の変化を視覚的にモニタリングすることができる。また、この方法は必要に応じて、オペレータが選択したｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの化学構造の変更を入力することと；ソフトウェアを実行して、類似体構造の改変された三次元分子像を生成することと；類似体の三次元像を視覚表示手段に表示することとをも含む。また、この方法は、三次元像により表される候補化合物の構造を選択することと、三次元像を、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの機能に関与するファーマコフォア領域の三次元立体配置および空間配置と比較することとをも含む。
【００３８】
候補分子の設計は必要に応じて、例えばＵＮＩＸ（登録商標）ベースまたはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のオペレーティングシステムを実行し、かつ分子モデリングおよび合理的薬物設計に適切なコンピュータプログラムを実行することが可能な、例えばＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｉｎｃ．、およびＳｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されるコンピュータまたはワークステーションを使用して、容易にされる。
【００３９】
一実施形態において、コンピュータベースのシステムは、本明細書に記載のとおりのｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの原子座標および必要に応じて基本ファーマコフォアの詳細が記憶されているデータ記憶手段と、分析手段の支援および実行に必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段とを含む。本明細書で使用される場合、「コンピュータシステム」または「コンピュータベースのシステム」とは、本明細書に記載の通りの配列と、分子構造と、必要に応じて基本ファーマコフォアの詳細とを解析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を指す。本明細書で使用される場合、「データ記憶手段」という用語は、配列データを記憶することが可能なメモリ、または本発明の分子構造が記録された製造物にアクセスすることが可能なメモリアクセス手段を指すものと理解される。
【００４０】
一実施形態において、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの原子座標と、必要に応じてこのポリペプチド毒素の基本ファーマコフォアの詳細は、コンピュータ読み取り可能媒体に記録される。本明細書で使用される「コンピュータ読み取り可能媒体」という用語は、コンピュータによる直接の読み取りおよびアクセスが可能な媒体を意味するものと理解される。このような媒体には、磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ）；光学記憶媒体（例えば、光ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ）；電気記憶媒体（例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ）；これらのカテゴリのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列、分子構造、および／または原子座標を記録したコンピュータ読み取り可能媒体を含む製造物を作製するために、コンピュータ読み取り可能媒体をどのように使用できるのかについて、すぐに理解することができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「記録された」という用語は、コンピュータ読み取り可能媒体に情報を記憶するプロセスを指す。当業者であれば、アミノ酸またはヌクレオチドの配列、原子座標および／またはＮＭＲデータを含む製造物を作製するために、コンピュータ読み取り可能媒体に情報を記録する現在既知の方法を容易に採用することができる。
【００４２】
アミノ酸および／またはヌクレオチドの配列、原子座標および／またはＮＭＲデータを記録したコンピュータ読み取り可能媒体を作製するためには、種々のデータ記憶構造が当業者により利用可能である。データ記憶構造の選択は一般的に、記憶された情報にアクセスするために選択した手段に基づいている。さらに、コンピュータ読み取り可能媒体に配列情報、ＮＭＲデータおよび／または原子座標を記憶するには、種々のデータプロセッサプログラムおよびデータプロセッサフォーマットを使用することができる。上記の情報、データおよび座標は、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄなどの市販のソフトウェアでフォーマットした文書処理テキストファイルで表すこともできれば、あるいはＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなどのデータベースアプリケーションで保存したＡＳＣＩＩファイルの形式で表すこともできる。当業者であれば、情報を記録したコンピュータ読み取り可能媒体を得るために、多くのデータプロセッサ構造化フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に採用することができる。
【００４３】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの配列および原子座標を記憶したコンピュータ読み取り可能媒体を提供することによって、当業者は、配列および／または原子座標に慣用的にアクセスして、異なるＵ−ＡＣＴＸ毒素、その毒素のサブドメイン、またはその毒素の模倣物をモデリングすることができる。当業者がコンピュータ読み取り可能媒体で提供されるこのデータにアクセスし、分子モデリングおよび／またはＲＤＤのためにこれを解析することができるコンピュータアルゴリズムは、公然利用可能であり、市販されている。
【００４４】
コンピュータは必要なわけではないが、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの実物のモデルまたはその一部（例えば、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの基本ファーマコフォアの詳細）の構築にコンピュータを使用することで、分子モデリングをきわめて容易に行うことができる。また、分子モデリングによって、毒素を構造的に模倣するより小さな分子のモデリングが可能となる。分子モデリングで使用される方法は、分子グラフィックス（すなわち、三次元像）から、より小さい分子の構造および活性の予測、ならびに新規分子の設計を行う、計算機化学（すなわち、物理的特性および化学的特性の算出）までの範囲に及ぶ。
【００４５】
分子モデリングの基本的な情報については、例えば、参考として本明細書で援用される、米国特許第６０９３５７３号、第６０８０５７６号、第６０７５０１４号、第６０７５１２３号、第６０７１７００号、第５９９４５０３号、第５８８４２３０号、第５６１２８９４号、第５５８３９７３号、第５０３０１０３号；および第４９０６１２２号を参照されたい。
【００４６】
三次元モデリングには、構造の三次元像の作成、構造の描画、構造の物理モデルの構築、既知の座標を使用した関連毒素および毒素／リガンド複合体の構造の決定が含まれてもよいが、これらに限定されない。適切な座標は、分子モデリングのための１つ以上のコンピュータプログラムに入力される。例として、三次元構造の閲覧または操作に有用なコンピュータプログラムの一覧には、Ｍｉｄａｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、サンフランシスコ）、ＭｉｄａｓＰｌｕｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、サンフランシスコ）、ＭＯＩＬ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、Ｙｕｍｍｉｅ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｓｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、Ｉｎｓｉｇｈｔ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｑｕａｎｔａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｃｅｒｉｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ａｌｃｈｅｍｙ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒａｓｍｏｌ（Ｇｌａｘｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｒｉｂｂｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ）、ＮＡＯＭＩ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｅｙｅｃｈｅｍ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、Ｕｎｉｖｉｓｉｏｎ（Ｃｒａｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｍｏｌｓｃｒｉｐｔ（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｃｈｅｍ−３Ｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｃｈａｉｎ（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、０（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＧＲＡＳＰ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｘ−Ｐｌｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｓｐａｒｔａｎ（Ｗａｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｍｏｌｃａｄｄ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）、ＶＭＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、Ｓｃｕｌｐｔ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｐｒｏｃｈｅｃｋ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ）、ＤＧＥＯＭ（ＱＣＰＥ）、ＲＥ＿ＶＩＥＷ（Ｂｒｕｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（Ｂｉｒｂｅｃｋ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｘｍｏｌ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨｙｐｅｒＣｈｅｍ（Ｈｙｐｅｒｃｕｂｅ）、ＭＤ  Ｄｉｓｐｌａｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、ＰＫＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＩＨ）、ＣｈｅｍＸ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ．）、Ｃａｍｅ���ｅｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、Ｉｄｉｔｉｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、およびＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ）が含まれる。
【００４７】
ＲＤＤの１つのアプローチは、目的の部位を模倣する既知の分子構造を検索することである。分子モデリングを使用して、ＲＤＤプログラムは、目的部位を模倣する分子の一連の種々の分子構造を検索することが可能であり、コンピュータスクリーン上でそれらを移動させることによるか、若しくは計算によって、どの化合物が目的部位の最良の構造的模倣物であるのかを決定することができる。例えば、分子モデリングプログラムを使用することで、特定の組の化合物の内のどの化合物がｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのファーマコフォア領域の最良の構造的模倣物であるのかを決定できると考えられる。
【００４８】
分子モデリングおよび／またはＲＤＤを容易に行うために、当業者は、登録番号ＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｈ１ＺおよびＲＣＳＢ  ＩＤ  ＲＣＳＢ０３７８２８でＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託した原子座標、および／または表３の原子座標の内の一部またはすべてを使用し得る。上記の原子座標を使用することで、当業者は、Ｕ−ＡＣＴＸ毒素の構造的模倣物を設計することができる。
【００４９】
本明細書で提供される原子座標はまた、既知の殺虫性毒素の改良された類似体を設計するのにも有用である。
【００５０】
また、本明細書に示す原子座標により、Ｕ−ＡＣＴＸ毒素またはその一部の三次元構造を種々の異なる化学的特徴を含む分子と比較して、Ｕ−ＡＣＴＸ毒素構造を模倣するのに最適な部位を決定することが可能となる。
【００５１】
Ｕ−ＡＣＴＸ毒素の原子座標によって、当業者は、合理的薬物設計の出発点の役割を果たし得る毒素の標的位置を同定することが可能となる。特に、Ｕ−ＡＣＴＸ毒素の基本ファーマコフォアの詳細の同定によって、毒素機能に重要な残基および官能基を同定することが可能となる。
【００５２】
候補分子は、脂質、核酸、ペプチド、有機低分子、無機低分子、化合物、元素、糖、同位体、炭水化物、イメージング剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、それらの抗体または断片、上記のうちのいずれかの任意の組み合わせ、上記のうちのいずれかの任意の化学修飾または改変体のうちの少なくとも１つを含むが、これらに限定されない。さらに、候補分子は、検出可能な標識を必要に応じて含み得る。さらに、候補分子は、検出可能な標識を必要に応じて含むことができる。このような標識としては、酵素標識、放射性同位体もしくは放射性の化合物もしくは元素、蛍光性の化合物もしくは金属、化学発光化合物、および生物発光化合物が挙げられるが、これらに限定されない。このような検出可能な標識の候補分子への結合には、周知の方法が使用され得る。
【００５３】
脂質、核酸、ペプチド、有機低分子、無機低分子、化学化合物、糖、同位体、炭水化物、イメージング剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、抗体、および抗体断片などの候補分子を合成するのに有用な方法は、当該技術分野で周知である。このような方法には、１回に１個ずつ１つの規定されたペプチドなどのこのような１つの候補分子を合成する手法のほか、１つ以上の容器中の複数の候補分子の合成の組み合わせが含まれる。このような複数の候補分子には、既に同定されている候補分子の１つ以上の改変体が含まれ得る。複数の候補分子の合成を組み合わせる方法は、当該技術分野で公知のスクリーニング技法で使用され得るコンビナトリアルライブラリーを調製するのに特に有用である。
【００５４】
例えば、複数のペプチドおよびオリゴヌクレオチドが同時に合成され得る。小さいペプチド（長さが最高で約５０アミノ酸のもの）である候補分子は、標準的な固相ペプチド合成手順を使用して合成され得る。例えば、合成中に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸は、Ｃ末端で不溶性ポリマー支持体（例えば、ポリスチレンビーズ）に連結される成長中のポリペプチド鎖に段階的に追加される。前記ペプチドは、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬との反応によって活性化したＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシ基に、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を連結することによって合成される。活性化したカルボキシルに遊離アミノ基が結合することによって、ペプチド結合の形成がもたらされる。最も一般的に使用されるＮ−α−保護基には、酸に不安定なＢｏｃ基および塩基に不安定なＦｍｏｃ基が含まれる。
【００５５】
簡単に説明すると、まず、Ｃ末端のＮ−α−保護アミノ酸をポリスチレンビーズに結合する。次いで、Ｎ−α−保護基を除去する。次のＮ−α−保護アミノ酸の活性化したα−カルボキシレート基に、脱保護したα−アミノ基を結合する。所望のペプチドが合成されるまで、このプロセスを繰り返す。得られたペプチドを不溶性ポリマー支持体から切断し、アミノ酸側鎖を脱保護する。これよりも長いペプチド（例えば、長さが約５０アミノ酸を超えるもの）は、保護されたペプチド断片の縮合によって誘導される。適切な化学、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬の詳細は、当該技術分野で周知である。
【００５６】
得られたペプチドの精製は、逆相クロマトグラフィ、ゲル浸透クロマトグラフィおよび／またはイオン交換クロマトグラフィなどの手順を使用して行われる。適切なマトリクスおよび緩衝液の選択は、当該技術分野で周知である。
【００５７】
合成ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、および／または、例えば、正荷電した、負荷電した、疎水性の、親水性の、または芳香族のアミノ酸といった、特異的な特徴を有するアミノ酸を含む。ペプチド合成で使用されるアミノ酸には、Ｌ型立体異性体またはＤ型立体異性体が含まれる。
【００５８】
化合物を合成するのに有用な既知の方法の多くは、自動化されてもよく、さもなければ商業規模で実施されてもよい。したがって、一旦候補分子が商業的可能性を有すると確認されれば、その分子が容易に大量生産され得る。候補分子は、完全に新規に設計することもできれば、あるいは既存の殺虫性毒素に基づいてもよい。これらの手法のいずれも、殺虫性毒素を模倣できる、化学実体、薬剤、リガンドまたは化合物について、低分子のデータベースおよびライブラリーをコンピュータでスクリーニングすることにより、容易に行うことができる。
【００５９】
化合物が有する可能性がある、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの基本ファーマコフォアの詳細との構造的類似性は、コンピュータモデリング技法を使用することで、実際の合成およびアッセイ前に予測することができる。候補分子の理論的な構造によって構造的類似性が不十分であることが示唆される場合には、その候補分子の合成と試験が不要となる。しかし、コンピュータモデリングによって強い構造的類似性が示される場合は、分子を合成し、殺虫性毒素としての役割を果たす能力の試験が行われる。このようにして、効力のない分子の合成が回避され得る。場合によっては、不活性分子が合成され、モデリングによって予測された後、試験が行われて、特定の構造的特徴を有する分子のＳＡＲ（構造活性相関）が作成される。本明細書で使用される場合、「ＳＡＲ」という用語は、化合物の活性／特性とその化学構造との間の関係に関連する、構造と活性／構造と特性の関係を指す。
【００６０】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの模倣物を選択／設計する際には、いくつかの因子を考慮に入れることができる。第一に、模倣物は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのファーマコフォアの詳細の少なくとも一部を模倣しなければならない。模倣物上の官能基は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および静電的相互作用に関与する能力について評価すべきである。第二に、模倣物は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造の少なくとも一部を模倣することを可能にする立体配座をとることが可能であるべきである。このような立体構造因子には、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造の全体または一部に関する模倣物の全体的な三次元構造および配向、あるいはＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａおよび類似の毒素の分子標的と直接相互作用するいくつかの化学実体を含む模倣物の官能基間の間隔が含まれる。
【００６１】
当業者は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造またはその一部（例えば、本明細書で同定される基本ファーマコフォアの詳細）を模倣する能力について、化学的部分、化学実体、化合物または他の薬剤を同定するのに、いくつかの方法のうちの１つ以上を使用し得る。このプロセスは、登録番号ＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｈ１ＺおよびＲＣＳＢ  ＩＤ  ＲＣＳＢ０３７８２８でＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に寄託した原子座標を使用して、例えばｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのファーマコフォアの目視検査またはコンピュータ支援モデリングで始まり得る。一実施形態において、化合物の設計には、特定の分子がｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造をどの程度よく模倣するかについて計算するコンピュータモデリングプログラムが使用される。選択した化学的部分、化学実体、化合物、または薬剤は、種々の配向で配置される。化学構造のデータベースは、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｅｒ（英国ケンブリッジ）およびＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（オハイオ州コロンバス）から利用することができる。
【００６２】
専門のコンピュータプログラムもまた、化学実体を選択するプロセスの助けとなる。一旦適切な化学的部分、化学実体、化合物または薬剤が選択されると、これらは、単一の分子にアセンブリさせることができる。アセンブリは、三次元空間における化学部分、化学実体、化合物または薬剤の相互の間の空間的関係の目視検査および／またはコンピュータモデリングおよびコンピュータ解析によって行われ得る。その後、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌなどのソフトウェアを使用してモデルの構築およびエネルギーの最小化を行うことができ、その後、必要に応じてＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲなどの標準的な分子力学力場によりエネルギーの最小化と分子動力学法を行うことができる。
【００６３】
個々の化学実体、化合物または薬剤の選択および結合の助けとなる有用なプログラムには、ＧＲＩＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄ）、ＣＡＴＡＬＹＳＴ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カリフォルニア州サンフランシスコ）、ＡＬＡＤＤＩＮ、ＣＬＩＸ、ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ、ＧＲＯＷ、およびＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
一実施形態において、試験分子は、水素結合能力などの、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａファーマコフォアの詳細の１つ以上の主要な化学的特徴を模倣する。特定の一例示的実施形態において、試験化合物は、Ｇｌｎ８の側鎖アミド部分の水素結合能力を模倣する。
【００６５】
上記の通りの１回に１個の化学実体の目的分子の段階的な構築を行う代わりに、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの完全な基本ファーマコフォアの詳細またはその一部のいずれかを使用して、目的分子を完全な実体として設計する。モデリング中、殺虫剤として投与する分子に有用な化学的部分を目的分子に導入することができる。例えば、標的イオンチャネルへの分子の結合に直接の影響を及ぼさないかもしれないが、例えば農業で許容される担体への分子の全体的な溶解度、分子の生物学的利用能、および／または分子の毒性に寄与する化学的部分を、目的分子に導入することもできれば、あるいは目的分子から除外することもできる。
【００６６】
完全に新規に目的分子を設計する代わりに、既存の分子またはその一部が、新規の候補の設計の出発点として使用され得る。また、新規の分子の設計に有用な手法の多くも、既存の分子の改変に有用である。
【００６７】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造と比較した殺虫性毒素の構造に関する知識によって、元の分子よりも良好な殺虫活性を有する新規の毒素の設計が可能となり得る。本明細書で提供される原子座標を使用して種々の改変分子が設計される。例えば、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造と比べた１つ以上の殺虫性ペプチド毒素の空間的関係を知ることで、殺虫特性が改良された新規のポリペプチド毒素を産生することができる。
【００６８】
上述の方法によって一旦候補分子が設計または選択されれば、化合物の合成後に、コンピュータによる評価、および／または生物活性試験によって、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ毒素に対するその類似性が決定される。さらにその後、候補分子の特性の改善または改変を行うために、候補分子の原子または側鎖基の一部で置換を行い得る。一般的に、最初の置換は保存的であり、すなわち、置換基は、元の基と大きさ、形状、疎水性、および電荷がほとんど同じとなる。当然ながら、立体配座を変更することが知られている成分は回避すべきであることを理解すべきである。一実施形態において、このように置換された化学化合物は、上に詳述したのと同じコンピュータ法によって、Ｕ−ＡＣＴＸとの構造的類似性について解析される。
【００６９】
一実施形態において、前記方法は、分子モデルまたはその一部を使用して、改変された候補分子を同定し、そして前記候補分子と比べて、昆虫に対する致死率がより高いか、昆虫カルシウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害が増大しているか、昆虫カルシウムチャネルへの結合が増大しているか、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合が増大しているか、または上記機能のうちの１つ以上が増大している、改変された候補分子を作製することもさらに含む。
【００７０】
一実施形態において、上述の方法により設計、選択および／または最適化した分子は、一旦作製されれば、化合物が生物活性を有するかどうかを決定する種々のアッセイを使用して特性評価される。例えば、前記分子は、前記分子が予測された活性、結合活性および／または結合特異性を有するかどうかを決定する（以下に記載のアッセイを含むがこれらに限定されない）アッセイによって特性評価される。適切なアッセイにより、例えば、選択した分子が昆虫を殺傷するかまたは麻痺させる能力、昆虫カルシウムチャネルを阻害する能力、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルを阻害する能力、昆虫カルシウムチャネルを結合する能力、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルを結合する能力、および上記機能のうちの１つ以上を含む組み合わせが測定される。
【００７１】
（１）昆虫に対する致死率：候補分子の活性は、Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）などの昆虫に候補分子を直接注入することによって定量的に決定することができる。１つのプロトコルの例においては、昆虫生理食塩水に溶解された１〜２μＬの候補分子がイエバエ（体重１０〜２５ｍｇ）に注入され、対照のハエには、２μＬの昆虫生理食塩水が注入される。前記注入物の投与には、例えば、２９ゲージ針を備えたＡｒｎｏｌｄマイクロアプリケータ（Ｂｕｒｋａｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｕｐｐｌｙ、英国リクマンズワース）が使用される。標本は、注入のために一時的に４℃にて固定し、その後すぐに室温（２４℃）に戻すことが可能である。
【００７２】
ＬＤ５０値（すなわち、注入後２４時間に５０％のハエを殺傷する候補分子の投与量）は、得られた対数用量応答曲線に以下の式をフィッティングすることによって計算され得る：
【００７３】
【数１】
2009540295.tif 000004
（式中、ｙは注射後２４時間の試料群の死亡百分率であり、ｘは毒素用量（ｐｍｏｌ  ｇ−１）であり、ｎは可変勾配係数であり、ａは最大応答であり、ｂは最小応答である）。
【００７４】
（２）電気生理学的アッセイ：昆虫イオンチャネルの阻害は、特異的なチャネルまたは上記のうちの１つ以上を含む組み合わせを発現する組換え細胞または組換え卵母細胞において、単離された昆虫ニューロンを使用して試験され得る。一実施形態において、試験するイオンチャネルは、昆虫ニューロン系で天然に認められる電位依存性カルシウムチャネルおよび／またはカルシウム依存性カリウムチャネルである。
【００７５】
一実施形態において、試験化合物の活性は、単離された昆虫ニューロンの活性を阻害する能力により評価される。一実施形態においては、ゴキブリ（ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））の最終腹部神経節（ＴＡＧ）から単離される背側不対正中（ＤＵＭ）ニューロンが使用される。ＤＵＭニューロンは、全細胞パッチクランプ記録技法を使用してＣａｖチャネル電流（ＩＣａ）を記録することができる電位依存性カルシウムチャネル（Ｃａｖチャネル）を含む。ＤＵＭニューロン細胞体は、ワモンゴキブリの神経索のＴＡＧの正中線から単離される。一実施形態においては、−２０℃にて約５分間冷却することによってゴキブリを麻酔する。次いで、背面側を上にしてゴキブリを解剖皿にピンで留め、背部真皮と腸内容物と縦走筋とを切除する。神経節神経索を同定して、ＴＡＧを慎重に取り出し、規定昆虫生理食塩水（ＮＩＳ）に入れる。この規定昆虫生理食塩水は、２００ｍＭのＮａＣｌと、３．１ｍＭのＫＣｌと、５ｍＭのＣａＣｌ２と、４ｍＭのＭｇＣｌ２と、１０ｍＭのＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）と、５０ｍＭのスクロースと、５％（体積／体積）仔ウシ血清と、５０ＩＵ  ｍＬ−１のペニシリンと、５０μｇ  ｍＬ−１のストレプトマイシンとを含有し、ＮａＯＨを使用してｐＨが７．４に調整されている。ＴＡＧを慎重に切開し、２００ｍＭのＮａＣｌと、３．１ｍＭのＫＣｌと、１０ｍＭのＨＥＰＥＳと、６０ｍＭのスクロースと、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリンと、５０ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシンとを含有するがＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まず、ＮａＯＨを使用してｐＨが７．４に調整されている、無菌昆虫生理食塩水に入れる。次いで、前記神経節を脱鞘し、１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含有するがＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない昆虫生理食塩水中で２０分間インキュベーションする。前記神経節を規定昆虫生理食塩水中で３回すすぐ。得られた懸濁液を、２４ウェルクラスタープレートの８つのウェルに分注する。各ウェルは、コンカナバリンＡ（２ｍｇ／ｍＬ）を予めコーティングした直径１２ｍｍのカバーガラスを含む。単離細胞が、インキュベーター（相対湿度１００％、３７℃）中で一晩かけてカバーガラスに付着する。
【００７６】
一実施形態において、電気生理学実験では、ゴキブリのＤＵＭニューロンの電位依存性ナトリウム電流と電位依存性カリウム電流と電位依存性カルシウム電流とを測定するために、全細胞の構成でパッチクランプ記録技法が使用される。単離細胞を有するカバーガラスを、位相差顕微鏡のステージ上に載置した１ｍＬガラス底灌流チェンバーに移す。ナトリウム電流とカリウム電流とカルシウム電流の全細胞記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ積分増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して行う。単回使用記録用マイクロピペットの引き抜きには、ホウ珪酸ガラス毛細管が使用される。
【００７７】
外溶液および内溶液の内容物は、行う記録手順の種類、さらには試験される特定のイオン電流によって変化する。保持電位は、例えば−８０ｍＶであってもよい。電極チップ抵抗は、０．８〜４．０ＭΩの範囲であってもよい。外溶液および内溶液の両方の容量オスモル濃度は、浸透圧ストレスを低下させるために、スクロースで３１０ミリオスモル濃度／リットルに調整され得る。内溶液と外溶液の間の液間電位差（ｌｉｑｕｉｄ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は、ＪＰＣａｌｃプログラムを使用して決定され得る。
【００７８】
一実施形態においては、直径が４５μｍを超える大きな涙形のＤＵＭニューロンが、実験のために選択される。逆電圧クランプ指令パルスを、Ａｇ／ＡｇＣｌペレット／３Ｍ  ＫＣｌ寒天架橋をとおして浴に適用する。ギガオームシールを形成した後、吸引を適用して膜を破る。望ましくない電流の完全に遮断するため、５〜１０分間は実験を開始すべきではない。
【００７９】
刺激と記録はいずれも、Ａｐｐｌｅ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータで作動するＡｘｏＤａｔａデータ獲得システム（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により制御され得る。データのフィルタリングは５ｋＨｚで行い（ローパスベッセルフィルタ）、デジタルサンプリングレートは、電圧プロトコルの長さに応じて１５〜２５ｋＨｚの間である。漏洩電流および容量性電流は、Ｐ−Ｐ／４手順でデジタル減算する。実験の完了後、オフラインでデータ解析を行う。以下の式の非線形回帰を行うことにより、このデータにＩ／Ｖデータをフィッティングさせる：
【００８０】
【数２】
2009540295.tif 000005
（式中、Ｉは所与の電位Ｖにおけるピーク電流の振幅であり、ｇｍａｘは最大導電率であり、Ｖ１／２は最大活性化の半分における電圧であり、ｓは勾配係数であり、Ｖｒｅｖは逆転電位である）。
【００８１】
別の実施形態において、昆虫イオンチャネルは、異種発現された昆虫カルシウム依存性カリウムチャネル（別名、ＢＫＣａ、ＫＣａ１．１、Ｍａｘｉ−Ｋ、またはＳｌｏ１）（例えば、ゴキブリ（ワモンゴキブリ）に由来するｐＳｌｏチャネルの孔形成αサブユニット）を含む。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国メリーランド州ベセスダ）は、１０％仔ウシ血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ／Ｈｉｇｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カンザス州レネクサ）中で維持される。ｐＳｌｏチャネル（ワモンゴキブリの高導電率カルシウム依存性カリウムチャネル）の発現は、Ｇ４１８耐性遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）をも担持する発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングされたｐＳｌｏコード領域を含む構築体でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトすることにより行われる。３５ｍｍ２の皿のＨＥＫ２９３単層を、９μＬのリポフェクトアミン試薬（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）と５μｇのＤＮＡとを使用してトランスフェクトする。次いで、安定してトランスフェクトした細胞を、１０００μｇ  ｍＬ−１のＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）によって選択する。これらの細胞を、上述の規定増殖培地中で維持し、パッチクランプ実験に使用する無菌カバーガラス上で培養する。
【００８２】
全細胞ｐＳｌｏチャネル電流を、２〜４ＭΩの抵抗でホウ珪酸ピペット（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｌｔｄ、英国ケント）を使用して室温にて測定する。電流測定は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ積分増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して行う。すべての実験の保持電位は−９０ｍＶである。ｐＳｌｏ全細胞電流を記録するため、４ｍＭのＮａＣｌと、１４０ｍＭのＫＣｌと、２ｍＭのＡＴＰ−Ｍｇ２と、０．６ｍＭのＣａＣｌ２と、１０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）とを含有し、２ＭのＫＯＨでｐＨが７．２５に調整されている溶液をピペットに充填する。外溶液は、１３５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．３３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのグルコース、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有し、２ＭのＮａＯＨでｐＨが７．４に調整されている。容量オスモル濃度は、約２９０ミリオスモル濃度／Ｌである。膜を破った後、２ＭΩ超のシールを形成できるように、１０〜１５分間は実験を開始しない。
【００８３】
試験化合物の効力は、昆虫カルシウムチャネルまたは昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルのＩＣ５０（活性の５０％を阻害する用量）で表すことができる。ＩＣ５０が１ナノモル濃度未満、特に２５マイクロモル濃度未満、さらに特に１マイクロモル濃度未満の化合物である。このような化合物の有効殺虫量は、好ましくはＩＣ５０を含む濃度範囲内にある。
【００８４】
（３）他のイオンチャネルアッセイ。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの推定上の模倣物が特定の昆虫イオンチャネルの活性を調節するかどうかを決定するには、多くの代替アッセイも適切であることは、当業者に理解される。例としては、（１）放射性フラックスアッセイ（例えば、カリウムチャネルの活性の測定のための８６Ｒｂ＋の使用）（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２８，１７７−１９１，２００２）、および（２）膜電位感受性蛍光色素を使用して、膜電位の変化の監視により間接的にチャネル活性を監視する、電圧センサアッセイ（Ｇｏｎｚａ’ｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｍａｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ８，２８３−２９５，２００２）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８５】
放射性フラックスアッセイの例では、心臓Ｉｋｒカリウム（Ｋ＋）チャネルの孔形成サブユニットをコードするヒトｅｔｈｅｒ−ａ  ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ＨＥＲＧ）を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトする。培地１μＬ当たり約２００個の細胞の密度で、細胞を９６ウェルプレートに播種する。播種後、使用前に細胞を５％のＣＯ２で３７℃にて一晩インキュベートする。Ｒｂ流出アッセイの場合は、細胞培養培地をルビジウム（８６Ｒｂ）に変更する。８６Ｒｂで４時間細胞をインキュベートし、培地を除去して、細胞を洗浄する。これらの細胞を、１０５ｍＭのＮａＣｌと、２ｍＭのＣａＣｌ２と、４０ｍＭのＫＣｌと、２ｍＭのＭｇＣｌ２と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳと、１０ｍＭのグルコースとを含有する４０ｍＭのＫ＋試験緩衝液で洗浄する。ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整する。試験化合物は、高Ｋ＋試験緩衝液に含まれる。電気生理学検査記録を使用して、チャネルに対する試験化合物の効果を測定する。内溶液を充填した時の電極は、２〜３ＭΩの抵抗を有する。内溶液は、１００ｍＭのＫＦと、４０ｍＭのＫＣｌと、５ｍＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのＥＧＴＡと、１０ｍＭのＨＥＰＥＳとを含有し、ＫＯＨでｐＨが７．４に調整されている。１４０ｍＭのＮａＣｌと、２ｍＭのＣａＣｌ２と、５ｍＭのＫＣｌと、２ｍＭのＭｇＣｌ２と、１０ｍＭのグルコースと、１０ｍＭのＨＥＰＥＳとを含有し、ＮａＯＨでｐＨが７．４に調整されている外溶液でこの細胞を潅流する。接合部電位は、ｐＣｌａｍｐ  ８ソフトウェアを使用して算出され得る。電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ−１Ｄ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にて５ｋＨｚでフィルタリングされ、ｐＣｌａｍｐ８（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して１ｋＨｚのサンプルレートでＰＣに記録され得る。データは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）とＯｒｉｇｉｎソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を使用して分析され得る。
【００８６】
別の例示的実施形態においては、膜電位感受性蛍光色素を使用して、膜電位の変化の監視により間接的にチャネル活性を監視する。ＦＲＥＴに基づく膜電位センサは、イオンチャネルの高スループットスクリーニングに有用である。一実施形態において、前記センサは、原形質膜に結合し、膜電位を検出する高蛍光性疎水性イオンである第１の成分と、原形質膜の一方の面に結合し、可動性電圧検出イオンとのＦＲＥＴパートナーとして機能する蛍光分子である第２の成分とからなる、二成分センサである。一実施形態において、第１の成分は、クマリン標識リン脂質（ＣＣ２−ＤＭＰＥ）であり、第２の成分は、ビス−（１，３−ジアルキルチオバルビツール酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＳＢＡＣｎ（３）（式中、ｎは、ｎアルキル基中の炭素原子数に相当する））である。例えば、Ｖｅｒｔｅｘは、このようなＦＲＥＴに基づく電圧センサと適合するキネティックプレートリーダを開発した。ＶＩＰＲ（登録商標）は、９６ウェルまたは３８４ウェルの一体型液体処理装置および蛍光リーダである。このリーダは、走査型光ファイバ照射検出システムを使用する。その他の同様のシステムとプローブも使用され得る。
【００８７】
（４）表面結合研究：結合活性に関する新規の分子のスクリーニングでは、種々の結合アッセイが有用である。１つの手法としては、例えば、目的分子が昆虫電位依存性カルシウムチャネルまたは昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルに結合するかどうかを評価するのに使用され得る、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）がある。
【００８８】
ＳＰＲ法は、量子力学的表面プラズモンの生成により２以上の高分子間の相互作用をリアルタイムで測定する方法である。ある装置ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＲＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）は、金膜（使い捨てのバイオセンサ「チップ」として提供される）と、ユーザによる調節が可能な緩衝液コンパートメントとの間の界面に多色光の集束ビームを提供する。金膜には、目的分析物の共有結合による固定のためのマトリクスを提供するカルボキシル化されたデキストランから構成される１００ｎｍ厚の「ヒドロゲル」が付着する。集束光が金膜の遊離電子雲と相互作用すると、プラズモン共鳴が高くなる。得られた反射光は、最適に共鳴が発生した波長のスペクトルが減衰させられる。反射多色光を構成波長に分離し（プリズムによる）、減衰した振動数を決定することによって、ＢＩＡｃｏｒｅは、生成した表面プラズモン共鳴の作用を正確に報告する光インターフェースを確立する。上述の通りに設計した場合のプラズモン共鳴（したがって減衰スペクトル）は、エバネセント場の質量（ヒドロゲルの厚さにほぼ相当）に対して感受性を有する。相互作用する対の内の一方の成分をヒドロゲルに固定し、相互作用するパートナーを緩衝液コンパートメントを介して提供する場合、２つの成分間の相互作用は、エバネセント場の質量の蓄積と、減衰スペクトルで測定されるプラズモン共鳴の対応する効果とに基づいて、リアルタイムで測定される。このシステムにより、いずれの成分も標識する必要なく、分子相互作用の測定を高速かつ高感度でリアルタイムに行うことが可能となる。例えば、ＳＰＲは、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの推定上の模倣物が、昆虫イオンチャネルからこのペプチド毒素を競合的に置換できるかどうかを評価するのに有用である。
【００８９】
（５）蛍光偏光法：蛍光偏光法（ＦＰ）は、２個の分子間の会合反応に関するＩＣ５０値およびＫｄ値を導き出すために、タンパク質−タンパク質間およびタンパク質−リガンド間の相互作用に容易に適用される測定技法である。この技法では、目的分子の１つがフルオロフォアと結合される。これは一般的に、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの低分子模倣物などの小さい方の分子である。結合した低分子と、昆虫電位依存性カルシウムチャネルまたは昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルのいずれかとの両方を含有するサンプル混合物を、垂直偏光で励起する。光はプローブのフルオロフォアによって吸収され、しばらくした後に再放射される。この放射光の偏光度を測定する。放射光の偏光は、溶液の粘度といったいくつかの因子およびフルオロフォアの見かけ上の分子量によって決まる。適切な制御下では、放射光の偏光度の変化が、フルオロフォアの見かけ上の分子量の変化によってのみ決まり、ひいては、プローブ−リガンド結合体が溶液中で遊離しているのか、あるいは受容体に結合しているのかによって決まる。ＦＰに基づく結合アッセイには、真の均一な平衡条件下におけるＩＣ５０値およびＫｄ値の測定、分析の速度、自動化に対する快適性、ならびに混濁懸濁液および着色溶液中でのスクリーニング能力を含めた、多くの重要な利点がある。
【００９０】
（６）ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａとの競合：一実施形態において、分子が特定の昆虫イオンチャネルへのｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの結合を模倣する能力は、当該チャネルに由来するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを競合的に置換する能力から測定される。例えば、蛍光標識または放射活性標識ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを、対象イオンチャネルを含むニューロン膜または細胞株にまず結合させる。その後、目的化合物がｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを競合的に置換して、媒体へと標識毒素を放出させる能力を測定する。種々の濃度の目的分子を使用してこの置換アッセイを繰り返すことで、ＩＣ５０値を計算し、他の推定上の模倣物のＩＣ５０値と比較することが可能となり、それによって分子を結合親和性の順にランク付けすることが可能となる。
【００９１】
さらに、このようなアッセイを使用した解析を高速化させるために、高スループットスクリーニングが使用され得る。その結果、新規分子が昆虫イオンチャネルと相互作用する能力のスクリーニングを、本明細書に開示される器具および方法を使用して、高速に行うことが可能となり得る。例えば、高スループットスクリーニングを実施する一般的な方法論については、参考として本明細書で援用される、米国特許第５，７６３，２６３号に記載されている。高スループットアッセイでは、上述の技法を含むがこれらに限定されない、１種類以上の異なるアッセイ技法を使用することができる。
【００９２】
一旦同定されると、この活性分子は、使用前に適切な担体に必要に応じて組み込まれる。より具体的には、活性分子の用量、投与様式、および適切な担体の使用は、目的の標的生物および非標的生物に依存する。
【００９３】
昆虫を防除する方法は、昆虫または昆虫の幼虫を殺虫有効量のＵ−ＡＣＴＸ模倣物と接触させることを含む。Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物は、例えば、有機低分子、化学化合物、精製ポリペプチド、必要に応じて発現ベクター内のＵ−ＡＣＴＸ模倣物をコードするポリヌクレオチド、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を発現する昆虫ウイルス、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を発現する植物細胞もしくは細菌細胞などの細胞、またはＵ−ＡＣＴＸ模倣物を発現するトランスジェニック植物の形態であり得る。Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物は、スノードロップレクチンまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδエンドトキシンのうちの１種など、昆虫が摂取した際に化合物の活性を高める薬剤に必要に応じて融合されるか、またはこの薬剤とともに送達される。例えば、接触には、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物の注入、外部接触、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物の摂取、あるいはＵ−ＡＣＴＸ模倣物を発現するポリヌクレオチド、ウイルスまたは細菌の摂取が含まれる。
【００９４】
植物を処理する方法は、この植物を殺虫有効量のＵ−ＡＣＴＸ模倣物と接触させることを含む。Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物は、例えば、有機低分子、化学化合物、精製ポリペプチド、必要に応じて発現ベクター内のＵ−ＡＣＴＸ模倣物をコードするポリヌクレオチド、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を発現するウイルス、またはＵ−ＡＣＴＸ模倣物を発現する植物細胞もしくは細菌細胞などの細胞の形態である。
【００９５】
一実施形態においては、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物と、農業で許容される担体、希釈剤および／または賦形剤とを含む殺虫性組成物が提供される。別の実施形態において、殺虫性組成物は、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を発現するウイルスを含む。昆虫ウイルスは、このウイルスが一旦宿主昆虫に感染すれば、宿主昆虫内で複製および発現させることができる。昆虫ウイルスへの昆虫の感染は、例えば、摂取、吸入、昆虫または昆虫の幼虫と昆虫ウイルスとの直接の接触などを含めた方法により達成され得る。
【００９６】
殺虫性組成物は、例えば、水性の溶液または懸濁液などの流動性の溶液または懸濁液の形態である。このような水性の溶液または懸濁液は、適用前に希釈される濃縮原液としてか、あるいはすぐに適用できる希釈溶液として提供される。別の実施形態において、殺虫剤組成物は、水分散性顆粒を含む。さらに別の実施形態において、殺虫剤組成物は、水和剤、微粉、ペレットまたはコロイド状濃縮物を含む。このような乾燥形態の殺虫性組成物は、濡れるとすぐに溶解するように、あるいは制御放出様式、持続放出様式または他の時間依存的な様式で溶解するように製剤化される。
【００９７】
Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物が昆虫ウイルスによって発現される場合は、保護すべき作物に、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を発現するウイルスを適用することができる。このウイルスは、単独で、あるいは１つまたはいくつかの他のＵ−ＡＣＴＸポリペプチドまたは模倣物と組み合わせて、あるいは向上したまたは相乗的な殺虫活性をもたらし得る他の殺虫性ポリペプチド毒素などの他の殺虫剤と組み合わせて、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を発現するように設計され得る。適切なウイルスとしては、バキュロウイルスが挙げられるが、これに限定されない。
【００９８】
殺虫性組成物がＵ−ＡＣＴＸ模倣物を発現する無傷細胞（例えば細菌細胞）を含む場合、このような細胞は種々の方法で製剤化される。これらの細胞は、無機ミネラル（フィロシリケート、カルボネート、スルフェート、ホスフェートなど）または植物性材料（粉末状のトウモロコシの穂軸、籾殻、クルミの殻など）などの種々の不活性材料、および上記材料の１つ以上を含む組み合わせと混合することによって、水和剤、顆粒または微粉として使用され得る。この製剤には、展着剤−固着剤アジュバント、安定化剤、他の殺虫性添加剤、界面活性剤、および上記添加剤の１つ以上を含む組み合わせが含まれ得る。液体製剤は、水性ベースである場合もあれば、非水性である場合もあり、泡剤、懸濁液、乳化可能濃縮物などとして使用され得る。この成分には、レオロジー剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、ポリマー、リポソーム、および上記成分のうちの１つ以上を含む組み合わせが含まれ得る。
【００９９】
あるいは、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され、その後に圃場に適用するために単離される。このような模倣物は、例えば、粗細胞溶解液、懸濁液、コロイドなどの形態であるか、あるいは活性殺虫性製剤に製剤化する前に精製、精密化、緩衝化および／またはさらなる処理が行われる場合もある。
【０１００】
適用方法にかかわらず、活性成分の量は殺虫有効量で適用されるが、この殺虫有効量は、例えば、防除すべき特定の昆虫、処理すべき特定の植物または作物、環境条件、ならびに殺虫活性組成物を適用する方法、速度および量などの因子により変動する。
【０１０１】
Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を含む殺虫性組成物は、例えば、農業で許容される担体とともに製剤化される。この組成物は、凍結乾燥、冷凍乾燥、乾燥保存などの適切な手段での投与、あるいは水性担体、媒体または適切な希釈剤（例えば生理食塩水または他の緩衝液）での投与の前に製剤化され得る。製剤化した組成物は、微粉または顆粒状物質の形態である場合もあれば、あるいは油中懸濁液（植物または鉱物）の形態である場合もあり、あるいは水エマルジョンまたは油／水エマルジョンの形態である場合もあり、あるいは水和剤として使用される場合もあり、あるいは農業用途に適切な別の担体材料と併用される場合もある。適切な農業用担体は、固体または液体であってよく、当該技術分野で周知である。「農業で許容される担体」という用語は、殺虫剤製剤化技術で通常使用されるすべてのアジュバント（例えば、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤など）を包含し、これらは、殺虫剤製剤化分野の当業者に周知である。この製剤は、１つ以上の固体アジュバントまたは液体アジュバントと混合され、種々の手段（例えば、従来の製剤化法を使用した適切なアジュバントと殺虫性組成物の均一な混合、調合および／または粉砕）によって調製され得る。
【０１０２】
例えば、殺虫性組成物は、好ましくは噴霧のような方法によって、標的昆虫の環境、例えば、保護すべき植物または作物の葉の上に適用される。殺虫剤を適用する強度および期間は、特定の害虫に特異的な条件、処理すべき作物、および特定の環境条件に関して設定され得る。当然ながら、担体に対する活性成分の比率は、殺虫性組成物の化学的性質、溶解度および安定度、ならびに意図される特定の製剤によって決まる。
【０１０３】
また、他の適用技法（例えば、散粉、散布（ｓｐｒｉｎｋｌｉｎｇ）、浸漬、土壌注入、種子コーティング、芽生えのコーティング、噴霧、曝気（ａｅｒａｔｉｎｇ）、ミスティング、アトマイジングなど）も可能であり、例えば根または茎への外寄生を引き起こす昆虫の防除などの特定の状況下で必要となる場合もあれば、あるいは繊細な植生または観賞植物に適用するために必要となる場合もある。これらの適用手順はまた、当業者に周知でもある。
【０１０４】
殺虫性組成物は、単独で、または他の殺虫剤を含むがこれに限定されない他の化合物と組み合わせて使用される。殺虫性組成物は、界面活性剤、洗剤、ポリマー、または時限放出製剤などの他の処理剤とともに使用され得る。殺虫性組成物は、必要に応じて昆虫誘引剤を含む。殺虫性組成物は、全身使用または局所使用のいずれかのために製剤化される。このような薬剤は、必要に応じて昆虫に直接適用され得る。
【０１０５】
環境、全身または葉への適用に使用される殺虫性組成物の濃度は、特定の製剤の性質、適用手段、環境条件、および殺菌活性の程度により変動する。
【０１０６】
あるいは、作物は、単独で、あるいは向上したまたは相乗的な殺虫活性をもたらし得る殺虫性ポリペプチド毒素と組み合わせて、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を発現するように操作される。この手法が有用である作物には、ワタ、トマト、スイートコーン、ムラサキウマゴヤシ、ダイズ、ソルガム、ソラマメ（ｆｉｅｌｄ  ｐｅａ）、アマ、ベニバナ、ナタネ、ヒマワリ、およびシロバナルーピン（ｆｉｅｌｄ  ｌｕｐｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
殺虫性ポリペプチドによる処理に適切で、農業、家庭および／または医学／獣医学において重要性を持つ節足動物には、例えば、以下の綱および目のメンバーが含まれる：鞘翅目（例えば、インゲンマメゾウムシ（Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、ハムシ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ  ａｌｎｉ）、コメツキムシ（Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｌｉｎｅａｔｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、グレインビートル（Ａｈａｓｖｅｒｕｓ  ａｄｖｅｎａ）、サマーシェーファー（Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ  ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ）、家具食い虫（Ａｎｏｂｉｕｍ  ｐｕｎｃｔａｔｕｍ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｓｐｐ．（ゾウムシ））、ピグミーマンゴールドビートル（Ａｔｏｍａｒｉａ  ｌｉｎｅａｒｉｓ）、カーペットビートル（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ヨツモンマメゾウムシ（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕ）、クリヤケシキスイ（Ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｓ  ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ）、キャベツサヤゾウムシ（Ｃｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｓｓｉｍｉｌｉｓ）、ナタネ冬茎（ｒａｐｅ  ｗｉｎｔｅｒ  ｓｔｅｍ）ゾウムシ（Ｃｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｐｉｃｉｔａｒｓｉｓ）、ハリガネムシ（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ  ｖｅｓｐｅｒｔｉｎｕｓおよびＣｏｎｏｄｅｒｕｓ  ｆａｌｌｉ）、バショウオサゾウムシ（Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ  ｓｏｒｄｉｄｕｓ）、ニュージーランド草地虫（Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ  ｚｅａｌａｎｄｉｃａ）、コフキコガネ（Ｃｏｔｉｎｉｓ  ｎｉｔｉｄａ）、ヒマワリ茎（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｓｔｅｍ）ゾウムシ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ  ａｄｓｐｅｒｓｕｓ）、オビカツオブシムシ（Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ  ｌａｒｄａｒｉｕｓ）、ネクイハムシ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、およびＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉ）、インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、イエカミキリ（Ｈｙｌｏｔｒｏｐｅｓ  ｂａｊｕｌｕｓ）、アルファルファタコゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ  ｐｏｓｔｉｃａ）、セマルヒョウホンムシ（Ｇｉｂｂｉｕｍ  ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ）、タバコシバンムシ（Ｌａｓｉｏｄｅｒｍａ  ｓｅｒｒｉｃｏｒｎｅ）、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、ヒラタキクイムシ（Ｌｙｃｔｕｓ  ｓｐｐ．）、花粉ビートル（Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ  ａｅｎｅｕｓ）、ヨーロッパコフキコガネ（Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ  ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ）、アメリカヒョウホンムシ（Ｍｅｚｉｕｍ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、キンイロヒョウホンムシ（ｇｏｌｄｅｎ  ｓｐｉｄｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（Ｎｉｐｔｕｓ  ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ）、グレインビートル（Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ  ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓおよびＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｒｃａｔｏｒ）、キンケクチブトゾウムシ（Ｏｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｕｌｃａｔｕｓ）、マスタードビートル（Ｐｈａｅｄｏｎ  ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ）、アブラナ（ｃｒｕｃｉｆｅｒ）ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、キスジノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｓｔｒｉｏｌａｔａ）、キャベツグキ（ｃａｂｂａｇｅ  ｓｔｅａｍ）ノミハムシ（Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ、Ｐｔｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）（ヒョウホンムシ）、コナナガシンクイムシ（Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ  ｄｏｍｉｎｉｃａ）、アカアシチビコフキゾウムシ（Ｓｉｔｏｎａ  ｌｉｎｅａｔｕｓ）、ココクゾウ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅおよびＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｇｒａｎａｒｉｕｓ）、赤ヒマワリ種子（ｒｅｄ  ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｓｅｅｄ）ゾウムシ（Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ  ｆｕｌｖｕｓ）、ジンサンシバンムシ（Ｓｔｅｇｏｂｉｕｍ  ｐａｎｉｃｅｕｍ）、チャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）、フラワービートル（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍおよびＴｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃｏｎｆｕｓｕｍ）、ウェアハウスビートルおよびキャビネットビートル（ｗａｒｅｈｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｃａｂｉｎｅｔ  ｂｅｅｔｌｅｓ）（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、サンフラワービートル（Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ  ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ））；ハサミムシ目（ハサミムシ類）（例えば、ヨーロッパクギヌキハサミムシ（Ｆｏｒｆｉｃｕｌａ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）およびオオハサミムシ（Ｌａｂｉｄｕｒａ  ｒｉｐａｒｉａ））；網翅目（例えば、コバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、マデイラゴキブリ（Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ  ｍａｄｅｒａｅ）、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、およびクロゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ｆｕｌｉｇｉｎｏｓａ））；倍脚綱（例えば、スポッティッドスネークミリピード（ｓｐｏｔｔｅｄ  ｓｎａｋｅ  ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ）（Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ  ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）、フラットバックミリピード（ｆｌａｔ−ｂａｃｋ  ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ）（Ｂｒａｃｈｙｄｅｓｍｕｓ  ｓｕｐｅｒｕｓ）、およびヤケヤスデ（Ｏｘｉｄｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ））；双翅目（例えば、アフリカツンブバエ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ  ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、ヌカカ（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ハチジラミバエ（Ｂｒａｕｌａ  ｓｐｐ．）、アカザモグリハナバエ（Ｐｅｇｏｍｙｉａ  ｂｅｔａｅ）、黒バエ（Ｃｎｅｐｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ウマバエ（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ  ｓｐｐ．、Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ガガンボ（Ｔｉｐｕｌａ  ｓｐｐ．）、メマトイ（Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ  ｓｐｐ．）、雑草育種（ｆｉｌｔｈ−ｂｒｅｅｄｉｎｇ）バエ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｆａｎｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｈｅｒｍｅｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃａ  ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃｉｎａ  ｓｐｐ．、Ｐｈａｅｎｉｃｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｈｏｒｍｉａ  ｓｐｐ．）、ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｓｐｐ．、Ｗｏｈｌｆａｈｒｔｉａ  ｓｐｐ．））；フリットフライ（Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ  ｆｒｉｔ）、ショウジョウバエ（Ｄａｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、ヘッドフライおよびカ���オンフライ（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｃａｒｉｏｎ  ｆｌｙ）（Ｈｙｄｒｏｔｅａ  ｓｐｐ．）、コムギタマバエ（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ツノバエおよびバッファローバエ（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ  ｓｐｐ．）、ウマバエおよびシカバエ（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ  ｓｐｐ．、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ  ｓｐｐ．、Ｔａｂａｎｕｓ  ｓｐｐ．）、シラミバエ（Ｌｉｐｏｐｔｅｎａ  ｓｐｐ．、Ｌｙｎｃｈｉａ  ｓｐｐ．、およびＰｓｅｕｄｏｌｙｎｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、チチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｕｓ  ｓｐｐ．）、カ（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｕｌｅｘ  ｓｐｐ．、Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．）、サシチョウバエ（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、ラセンウジバエ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｂｅｚｚｉａｎａおよびＣｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、ヒツジシラミバエ（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｐ．）；サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｓｐｐ．）、ツェツェバエ（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｓｐｐ．）、およびウシバエ（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．））；等翅目（シロアリ）（シュウカクシロアリ科、レイビシロアリ科、ムカシシロアリ科、ミゾガシラシロアリ科、セリテルメス科、シロアリ科、オオシロアリ科の種を含む）；異翅目（例えば、ナンキンムシ（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）、アカホシカメムシ（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ムギチャイロカメムシ（Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｃｅｐｓ）、ミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、アオクサカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ａｎｔｅｎｎａｔａ）、ミナミアオカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ）、およびサシガメ（Ｐａｎｓｔｒｏｇｙｌｕｓ  ｍｅｇｉｓｔｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｐａｌｌｅｓｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｐｒｏｌｉｘｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｄｉｍｉｄｉａｔａ、Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、およびＴｒｉａｔｏｍａ  ｓｏｒｄｉｄａ））；同翅目（例えば、アカマルカイガラムシ（Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉｉ）、マメクロアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｆａｂａｅ）、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、リンゴアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｐｏｍｉ）、ミカントゲコナジラミ（Ａｌｅｕｒｏｃａｎｔｈｕｓ  ｓｐｉｎｉｆｅｒｕｓ）、シロマルカイガラムシ（Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ  ｈｅｄｅｒａｅ）、タバココナジラミ（Ｂｅｍｅｓｉａ  ｔａｂａｃｉ）、ダイコンアブラムシ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ヨーロッパナシキジラミ（Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ  ｐｙｒｉｃｏｌａ）、カランツ（ｃｕｒｒａｎｔ）アブラムシ（Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ  ｒｉｂｉｓ）、ブドウネアブラムシ（Ｄａｋｔｕｌｏｓｐｈａｉｒａ  ｖｉｔｉｆｏｌｉａｅ）、ミカンキジラミ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ  ｃｉｔｒｉ）、ジャガイモヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）、マメヨコバイ（ｂｅａｎ  ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｏｌａｎａ）、ブドウ葉ヨコバイ（ｖｉｎｅ  ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）（Ｅ��ｐｏａｓｃａ  ｖｉｔｉｓ）、リンゴワタムシ（Ｅｒｉｏｓｏｍａ  ｌａｎｉｇｅｒｕｍ）、セイヨウカジツカイガラムシ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｆｒｕｉｔ  ｓｃａｌｅ）（Ｅｕｌｅｃａｎｉｕｍ  ｃｏｒｎｉ）、モモコフキアブラムシ（Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ  ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）、
ヒメトビウンカ（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ  ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）、チューリップヒゲナガアブラムシ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）、ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ）、トビイロウンカ（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ）、エゾマツカサアブラムシ（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｓｐｐ．）、ホップイボアブラムシ（Ｐｈｏｒｏｄｏｎ  ｈｕｍｕｌｉ）、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｐａｄｉ）、オリーブカタカイガラムシ（Ｓａｉｓｓｅｔｉａ  ｏｌｅａｅ）、ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ムギヒゲナガアブラムシ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ）、およびオンシツコナジラミ（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ））；等脚目（例えば、オカダンゴムシ（Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびホンワラジムシ（Ｏｎｉｓｃｕｓ  ａｓｅｌｌｕｓ））；鱗翅目（例えば、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ  ｏｒａｎａ（リンゴコカクモンハマキ）、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｏｌｏｎ（タマナヤガ）、Ａｒｃｈｉｐｓ  ｐｏｄａｎａ（果樹ハマキガ）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ  ｐｙｒｉｖｏｒｅｌｌａ（ナシチビガ）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ  ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ（コットンリーフパーフォレーター（ｃｏｔｔｏｎ  ｌｅａｆ  ｐｅｒｆｏｒａｔｏｒ））、Ｂｕｐａｌｕｓ  ｐｉｎｉａｒｉｕｓ（マツシャクトリムシ）、Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（コドリンガ）、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ）、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（東部トウヒノムシ）、Ｃｏｃｈｙｌｉｓ  ｈｏｓｐｅｓ（バンデッドサンフラワーモス（ｂａｎｄｅｄ  ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｔｈ））、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（サウスウェスタンコーンボーラー）、Ｅａｒｉｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ（エジプトタバコガ（Ｅｇｙｐｔｉａｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ））、Ｅｕｐｈｅｓｔｉａ  ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ（スジコナマダラメイガ）、Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ（ブドウホソハマキ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ（シロバネドクガ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｓｕｂｆｌａｖａ（ドクガ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ（オオハチミツガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ（アメリカタバコガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（アメリカタバコガ）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（オオタバコガ）、Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｔｅｌｌａ（ブラウンハウスガ）、Ｈｏｍｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ（サンフラワーモス）、Ｈｏｍｏｎａ  ｍａｇｎａｎｉｍａ（チャハマキガ）、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ  ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ（リンゴカバホソガ）、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ（マイマイガ）、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｎｅｕｓｔｒｉａ（テンマクケムシ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（ヨトウガ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ（バーサアーミーワーム）、イモムシ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａおよびＭａｎｕｄｕｃａ  ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ）、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ  ｂｒｕｍａｔａ（ナミスジフユナミシャク）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（アワノメイガ）、Ｐａｎｏｌｉｓ  ｆｌａｍｍｅａ（マツキリガ）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ワタアカミムシガ）、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ（ミカンハモグリガ）、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（モンシロチョウ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ソイビーンルーパー）、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ  ｖｉｒｇｉｎｉｃａ（イエローベアーモス（ｙｅｌｌｏｗ  ｂｅａｒ  ｍｏｔｈ））、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ（シロイチモンジヨトウガ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ（コットンリーフワーム）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ（ハスモンヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｐｒａｅｆｉｃａ（イエローストリップドアーミーワーム）、Ｓｙｌｅｐｔａ  ｄｅｒｏｇａｔａ（ワタノメイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ  ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（コイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ  ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ（イガ）、Ｔｏｒｔｒｉｘ  ｖｉｒｉｄａｎａ（ヨーロピアンオークリーフローラー）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサキンウワバ）、Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｐａｄｅｌｌａ（スモールアーミンモス））；直翅目（例えば、イエコオロギ（Ａｃｈｅｔａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、ツリーローカス（ｔｒｅｅ  ｌｏｃｕｓｔ）（Ａｎａｃｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ワタリバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）、ツーストライプグラスホッパー（ｔｗｏｓｔｒｉｐｅｄ  ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ）、ディファレンシャルグラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、アカアシバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、トビバッタ（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）、キタモグラコオロギ（Ｎｅｏｃｕｒｔｉｌｌａ  ｈｅｘａｄｅｃｔｙｌａ）、アカトビバッタ（Ｎｏｍａｄａｃｒｉｓ  ｓｅｐｔｅｍｆａｓｃｉａｔａ）、ショートウィングドモールクリケット（ｓｈｏｒｔｗｉｎｇｅｄ  ｍｏｌｅ  ｃｒｉｃｋｅｔ）（Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ  ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ）、ミナミモグラコオロギ（Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ  ｂｏｒｅｌｌｉｉ）、トーニーモールクリケット（ｔａｗｎｙ  ｍｏｌｅ  ｃｒｉｃｋｅｔ）（Ｓｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ  ｖｉｃｉｎｕｓ）、およびエジプトツチイナゴ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ））；シラミ目（例えば、ウシハジラミ（Ｂｏｖｉｃｏｌａ  ｂｏｖｉｓ）、ハジラミ（Ｄａｍａｌｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、ネコハジラミ（Ｆｅｌｉｃｏｌａ  ｓｕｂｒｏｓｔｒａｔａ）、ウシジラミ（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｅｕｒｙｓｔｅｒｎｕｓ）、テールスイッチシラミ（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｑｕａｄｒｉｐｅｒｔｕｓｓｕｓ）、ブタジラミ（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｓｕｉｓ）、カオジラミ（Ｌｉ���ｏｇｎａｔｈｕｓ  ｏｖｉｌｌｕｓ）、アシジラミ（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｐｅｄａｌｉｓ）、イヌジラミ（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｓｅｔｏｓｕｓ）、ウシホソジラミ（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｖｉｔｕｌｉ）、ニワトリオオハジラミ（Ｍｅｎａｃａｎｔｈｕｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ）、ニワトリハジラミ（Ｍｅｎｏｐｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、ヒトジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ）、ケジラミ（Ｐｈｔｈｉｒｕｓ  ｐｕｂｉｓ）、ケブカウシジラミ（Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ  ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ）、およびイヌハジラミ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ  ｃａｎｉｓ））；チャタテムシ目（例えば、コチャタテ類（Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ  ｂｏｓｔｒｙｃｈｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ  ｄｅｃｏｌｏｒ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、およびＴｒｏｇｉｕｍ  ｐｕｌｓａｔｏｒｉｕｍ））；ノミ目（例えば、トリノミ（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、イヌノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｃａｎｉｓ）、ネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）、ヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）、およびケオプスネズミノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ  ｃｈｅｏｐｉｓ）；結合綱（例えば、ガーデンシンフィラン（ｇａｒｄｅｎ  ｓｙｍｐｈｙｌａｎ）（Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ  ｉｍｍａｃｕｌａｔａ））；総尾目（例えば、オナガシミ（Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ  ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔａ）、フォーラインドシルバーフィッシュ（ｆｏｕｒ−ｌｉｎｅｄ  ｓｉｌｖｅｒｆｉｓｈ）（Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ  ｑｕａｄｒｉｓｅｒｉａｔａ）、セイヨウシミ（Ｌｅｐｉｓｍａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、およびマダラシミ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））；総翅目（例えば、タバコアザミウマ（ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｈｒｉｐｓ）（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ）、ヒラズハナアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｉｎｔｏｎｓａ）、ミカンキイロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、コットンバッドスリップス（ｃｏｔｔｏｎ  ｂｕｄ  ｔｈｒｉｐｓ）（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｓｃｈｕｌｔｚｅｉ）、バンデッドグリーンハウススリップス（ｂａｎｄｅｄ  ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ  ｔｈｒｉｐｓ）（Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ  ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）、ダイズアザミウマ（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｈｒｉｐｓ）（Ｎｅｏｈｙｄａｔｏｔｈｒｉｐｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ケリーズシトラススリップス（Ｋｅｌｌｙ’ｓ  ｃｉｔｒｕｓ  ｔｈｒｉｐｓ）（Ｐｅｚｏｔｈｒｉｐｓ  ｋｅｌｌｙａｎｕｓ）、アボカドアザミウマ（ａｖｏｃａｄｏ  ｔｈｒｉｐｓ）（Ｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ  ｐｅｒｓｅａｅ）、ミナミキイロアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｐａｌｍｉ）、およびネギアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ））；など、ならびに上記昆虫のうちの１つ以上を含む組み合わせ。
【０１０８】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物を含む殺虫性組成物は、外部寄生虫の処理に使用される。外部寄生虫には、例えば、ノミ、マダニ、ダニ症、ダニ、カ、不快害虫およびサシバエ、シラミ、ならびに上記外部寄生虫のうちの１つ以上を含む組み合わせが含まれる。ノミという用語は、ノミ目の寄生ノミの通常または偶発的な種、特にイヌノミ属種、特にＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｃａｎｉｓ、ネズミノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ  ｃｈｅｏｐｉｓ）、およびヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）を包含する。家畜（例えば、ウシ）、伴侶動物（例えば、ネコおよびイヌ）およびヒトにおける外部寄生虫が処理され得る。家畜および家庭内動物の場合、処理には、首輪内への含浸、または局所領域への局所適用とその後に行われる動物の真皮を通した拡散および／または皮脂腺における蓄積が含まれ得る。ヒトの場合、処理剤は、ヒトのシラミの治療に適切な組成物を含み得る。このような組成物は、シャンプーまたはコンディショナーなど、ヒトの頭皮への適用に適切なものであり得る。
【０１０９】
以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに例示する。
【実施例】
【０１１０】
（実施例１：構造機能研究のためのｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの産生）
構造機能解析のために、プロトタイプＵ−ＡＣＴＸファミリーメンバーの誘導体（ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）（図１））を選択した。コドンが大腸菌の発現に最適化されたｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの合成遺伝子を、ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドにクローニングし、得られた誘導体プラスミド（ｐＢＬＳ１）を使用して、大腸菌ＢＬ２１細胞を形質転換した。このプラスミドから、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と毒素コード領域との間にトロンビン切断部位を有するＧＳＴのＣ末端への融合体として、毒素を産生する。これらの細胞を、３００μＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による融合タンパク質の誘導前に、Ａ６００が０．６〜０．８になるまで、３７℃にてＬＢ培地中で増殖させた。Ａ６００が１．９〜２．１になったら、遠心分離により細胞を収集し、さらに使用するまで凍結した。細胞ペレットを解凍した後、溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。次いで音波処理によって細胞を溶解した。ＧＳＨ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でアフィニティクロマトグラフィを使用して、可溶性細胞分画から組換え融合タンパク質を精製した。カラムで精製した後、カラムビーズをトロンビン緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）中で平衡化し、再懸濁した後、５０Ｕのウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を添加した。カラムを３７℃のインキュベーターに一晩配置して、融合タンパク質をタンパク質分解により切断した。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いてカラムから、遊離した毒素を溶出した。その毒素を、逆相（ｒｐ）ＨＰＬＣを使用して直ちに精製し、その後凍結乾燥させた。次いで、凍結乾燥させた毒素を、適切な緩衝液中に再懸濁した。
【０１１１】
Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８分析カラム（４．６×２５０ｍｍ、細孔径５μｍ）を使用したｒｐＨＰＬＣによって、非天然ジスルフィド結合異性体および他の汚染物から、正確に折り畳まれた組換え毒素を分離した。その毒素を、１０〜１８％のアセトニトリルの線形勾配を使用して、２０分間かけて１ｍＬ／分の流速でカラムから溶出した。正確に折り畳まれた毒素は、滞留時間が９〜１０分において主要なピークとして溶出した。毒素分子量を、エレクトロスプレー質量分析を使用して確認した。正確に折り畳まれた組換え毒素の収率を、関連するＨＰＬＣピークの積分により見積もり、約７０〜８０％であることが明らかになった。
【０１１２】
（実施例２：ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造の決定）
ＮＭＲ実験を、パルスフィールド勾配を備えた４チャンネルのＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ６００  ＮＭＲスペクトロメータを使用して行った。すべての実験を２５℃にて行った。すべてのデータを、ＮＭＲＰｉｐｅを使用して処理した。処理したスペクトルを解析し、ＸＥＡＳＹプログラムを使用してピークを積分した。
【０１１３】
３Ｄ  ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡＣＯ、ＨＮＨＡ、およびＨＮＨＢ実験からのデータを使用して、骨格１Ｈ、１５Ｎ、１３Ｃの化学シフトの割り当てを行った。側鎖原子の化学シフトの割り当てを、３Ｄ  Ｃ（ＣＯ）ＮＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣ（ＣＯ）ＮＨ−ＴＯＣＳＹ、およびＨＣＣＨ−ＣＯＳＹのスペクトルを使用して行った。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの１Ｈ、１５Ｎおよび１３Ｃの化学シフト割り当ての完全なセットを、ＢｉｏＭａｇＲｅｓＢａｎｋに登録番号７１１７で寄託した。
【０１１４】
プロトン間距離の拘束条件を、３Ｄ  １５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹおよび１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルのピーク強度の積分によって得た。まず、ＣＹＡＮＡのＣＡＮＤＩＤマクロを使用してＮＯＥの割り当てを行った後、手動にて細密化した。ＣＹＡＮＡプログラムのＣＡＬＩＢＲＡマクロを使用して、ＮＯＥＳＹスペクトルからのクロスピーク強度を距離拘束条件に変換した。
【０１１５】
Ｈα、Ｃα、ＣβおよびＨＮの化学シフトのＴＡＬＯＳ解析から二面角拘束条件を得て、構造計算のために、各拘束条件の範囲をＴＡＬＯＳ予測の標準偏差の２倍に設定した。１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄおよび１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ実験により測定したＨα−ＨβおよびＨＮ−Ｈβ  ＮＯＥ強度とカップリングした、３Ｄ  ＨＮＨＢ実験により導き出されたＨＮ−Ｈβカップリングの解析を使用して、χ１拘束条件を求め、β−メチレンプロトンの立体特異的な割り当てを行った。その他の立体特異的割り当ては、ＣＹＡＮＡコンピュータプログラムを使用して計算した予備構造の解析により行った。
【０１１６】
同じ毒素のスーパーファミリーの一部であるω−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａおよびＪ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｃ毒素において実験的に決定したジスルフィド結合パターンから、ジスルフィド結合を割り当てた。したがって、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのジスルフィド結合は、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ１８、Ｃｙｓ１０−Ｃｙｓ２３、およびＣｙｓ１７−Ｃｙｓ３７であった。
【０１１７】
水素結合を、以下の２つの方法から決定した：（ｉ）２Ｄ  ＨＮＣＯ実験における水素結合のスカラー結合の直接観察、ならびに（ｉｉ）凍結乾燥させたｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの試料を１００％のＤ２Ｏに溶解し、ＨＮプロトンと溶媒重陽子との交換を２Ｄ  ＨＳＱＣスペクトルの時間経過におけるピーク強度の変化から監視した、水素−重水素交換実験の解析。表１にまとめた通り、これらの解析から１４個の水素結合の割り当てが行われた。構造計算のため、各水素結合のＯ−ＮおよびＯ−ＨＮ間の距離を、それぞれ２．７〜３．１Åおよび１．７〜２．１Åの範囲に拘束した。
【０１１８】
【表１】
2009540295.tif 000006
実験で導き出したすべての拘束条件を使用して、１０００個のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造を、ＣＹＡＮＡコンピュータプログラムを使用してランダムな最初の構造から計算した。次いで、最終ペナルティ関数値が最も低いものと定義された最良の６０個の構造を、Ｘ−ＰＬＯＲコンピュータプログラムを使用して、ダイナミックシミュレーションアニーリングによって精密化した。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ構造の代表的なものとして、Ｘ−ＰＬＯＲで分子エネルギーが最も低かった２５個の構造を選択した（図２）。この２５個のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ構造の一揃いの原子座標を、構造算出に使用される拘束条件の一覧とともに、登録番号２Ｈ１ＺでＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託した。
【０１１９】
この一揃いのｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの構造は非常に正確であり、明確に規定された領域（残基３〜３９）の骨格Ｎ、Ｃ’およびＣα原子の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）は、算出された平均座標構造に対して０．１４±０．０５Åであった。残基３〜３９の全重元素のｒｍｓｄは、平均座標構造に対して０．５９±０．０７Åであった。
【０１２０】
ＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムを使用した一揃いのｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ構造の解析により、非Ｇｌｙ／非Ｐｒｏ残基の８５％がラマチャンドランプロットの「最も好ましい（ｍｏｓｔ  ｆａｖｏｒｅｄ）」領域にある一方で、残りの１５％が「さらに許容される（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｌｌｏｗｅｄ）」領域にあることが示された（図３）。「許容されない（ｄｉｓａｌｌｏｗｅｄ）」領域にある残基はなかった（図３）。
【０１２１】
図４は、ＭＯＬＭＯＬコンピュータプログラムを使用して作成したｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの三次元構造のリチャードソン模式図を示している。主要な二次構造要素は、β鎖１（β１、残基２２〜２７）とβ鎖２（β２、残基３３〜３８）とを含有するＣ末端β−ヘアピンである。
【０１２２】
（実施例３：ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの機能的ファーマコフォアの詳細の決定）
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの機能に不可欠な残基を、アラニン走査型変異誘発を使用して決定した。この手法では、個々の残基をアラニンに変異させた後、変異毒素の活性を、野生型ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）の活性と比較した。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの阻害性システインｋｎｏｔモチーフを含む６個のシステイン残基（すなわち、Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ１０、Ｃｙｓ１７、Ｃｙｓ１８、Ｃｙｓ２３、およびＣｙｓ３７）は、毒素の三次元構造の規定に重要であると推定されることから、アラニン走査から除外したため、これらの埋もれたシステイン残基は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａが標的とする昆虫イオンチャネルと相互作用するとは予想されない。Ａｌａ２１およびＡｌａ３９も変異させなかった。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの一次構造に存在する残りの２８個の非アラニン残基を、個別にアラニンに変異させた。
【０１２３】
大部分の変異毒素は、野生型ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａについて上に記載したように、可溶性ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で成功裏に過剰産生された。しかし、Ｌ１０Ａ融合タンパク質は不溶性であることが判明したため、この残基のさらなる変異は行わなかった。
【０１２４】
アラニン側鎖は、ほとんどの種類のポリペプチド二次構造（すなわち、α−ヘリックス、β−シート、およびβ−ターン）に含めることが可能であるため、大きな構造摂動を導入する可能性を最小限にするために、走査型変異誘発で利用されることが多い。しかし、たいていの場合アラニン置換が構造的に十分に許容されるにもかかわらず、各ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ変異体を、野生型毒素と比較して構造摂動について解析した。唯一の窒素源として１５Ｎを有する最小培地中で増殖させた大腸菌ＢＬ２１細胞で過剰産生によって、２Ｄ  １Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを得るために、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）およびその変異体の試料を調製した。１５Ｎで均一に標識した各変異毒素の２Ｄ  ＨＳＱＣスペクトルを、同一の実験条件を用いて得られた野生型ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＨＳＱＣスペクトルと比較した。変異毒素のＨＳＱＣスペクトルがｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＨＳＱＣスペクトルと厳密に重なった場合には、アラニン置換を導入しても、いかなる有意な構造摂動も変異毒素において引き起こされないと結論付けた。
【０１２５】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＨＳＱＣスペクトルの各ピークの化学シフトと、変異毒素のスペクトルの対応するピークの化学シフトとの間の差を測定することにより、ＨＳＱＣスペクトルを定量的に比較した。化学シフトの差（Δδ）を、以下の式を使用して算出した：
【０１２６】
【数３】
2009540295.tif 000007
（式中、ΔδＮおよびΔδＨは、それぞれ窒素（１５Ｎ）およびプロトン（１Ｈ）の特性におけるＨＳＱＣピークの化学シフトの差である）。
【０１２７】
ＨＳＱＣスペクトルのピークの１０％以上が０．２５ｐｐｍを超えるΔδ値を有する場合に、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに比べて構造的に摂動したと変異体を判断した。この基準に基づくと、４つの変異毒素だけが、構造摂動を表す化学シフトの差を示した。Ｅ２６Ａ変異体のＨＳＱＣスペクトルは、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＨＳＱＣスペクトルと劇的に異なっており、大きな構造摂動が示された。そのため、これを機能アッセイから除外した。その他３つの変異体、すなわちＴ１４Ａ、Ｙ３５Ａ、およびＲ３８ＡのＨＳＱＣスペクトルによって、４〜６残基のピークが０．２５ｐｐｍを超えるΔδを有することが明らかにされ、軽微な構造摂動が示された。
【０１２８】
残り２７個のアラニン走査変異体のそれぞれのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を、イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）に注入した際のＬＤ５０値をｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのＬＤ５０値に比べて評価することにより決定した。これらの変異体の内の２０個は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに比べると、殺虫活性を５分の１より大きい活性にさせた（表２を参照）。したがって、これらの２０個の残基は毒素活性に不可欠なものではないと結論付けた。アラニンへの変異によって殺虫活性が５分の１より小さくなった残基は７個あり、これらの残基はＧｌｎ８、Ｐｒｏ９、Ａｓｎ２８、Ｔｈｒ３３、Ｖａｌ３４、Ｔｙｒ３５、およびＴｙｒ３６であった。しかし、上に概説したＨＳＱＣ構造解析では、Ｙ３５Ａ変異体が野生型ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ構造に対して構造的に摂動したことが示された。したがって、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの殺虫活性に重要であると思われる残基は、６個（Ｇｌｎ８、Ｐｒｏ９、Ａｓｎ２８、Ｔｈｒ３３、Ｖａｌ３４、およびＴｙｒ３６）存在する。
【０１２９】
殺虫作用またはｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに最も不可欠な残基は、Ｇｌｎ８、Ｐｒｏ９、Ａｓｎ２８およびＶａｌ３４である。なぜなら、これらの残基のアラニンへの変異は、殺虫能力を１９分の１から１６４分の１にしたためである。それに対して、Ｔｈｒ３３およびＴｙｒ３６のアラニンへの変異は、毒素活性を５．３分の１から７．２分の１というわずかしか低下させなかった。これら４つの不可欠な残基は、毒素の単一面のきわめて近い位置にあり（図５）、毒素と標的昆虫イオンチャネルとの相互作用の一次エピトープを表す可能性が最も高い。これらの残基はｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの一次ファーマコフォア要素である。
【０１３０】
これら４つの一次ファーマコフォア要素は、機能的ファーマコフォアの詳細である、ほとんど連続した特徴を、毒素の表面に形成する（図５）。これらの残基に囲まれた表面積は、代表的な有機殺虫剤または医薬品の表面積とほとんど同じである。
【０１３１】
【表２】
2009540295.tif 000008
本明細書では、殺虫剤として有用なＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの構造的および／または機能的な模倣物を同定する方法が開示される。特に、ＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｈ１ＺおよびＲＣＳＢ  ＩＤ  ＲＣＳＢ０３７８２８を有するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ殺虫性毒素の原子座標から作成した分子モデルを使用して、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ分子モデルの構造を模倣する候補分子を同定する。分子モデルを使用しながら分子モデルにおいてファーマコフォア残基Ｑ８、Ｐ９、Ｎ２８およびＶ３４を同定する方法は、機能性Ｕ−ＡＣＴＸ模倣物の同定の助けとなる。特に、昆虫に対する致死性、昆虫カルシウムチャネルの阻害、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルの阻害、昆虫カルシウムチャネルへの結合、昆虫カルシウム依存性カリウムチャネルへの結合、または上記のうちの１つ以上の組み合わせを示す模倣物が特に望ましい。
【０１３２】
本明細書において「第１」、「第２」などの用語は、何らかの順序、量、または重要性を示すのではなく、むしろそれぞれの要素を区別するために使用される。また、本明細書において「ａ」および「ａｎ」という用語は、量の制限を示すのではなく、むしろ言及した項目が少なくとも１つ存在することを示す。本明細書で開示される範囲はすべて包括的なものであり、組み合わせが可能である。
【０１３３】
本発明を好ましい実施形態を参照して説明してきたが、種々の変更が行われることができ、本発明の範囲から逸脱することなく、その要素が均等物で代用され得ることを、当業者は理解する。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるように多くの改変を行い得る。したがって、本発明は、本発明を実施することが意図される最良の形態として開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲に含まれるすべての実施形態を包含することが意図される。
【０１３４】
引用されるすべての特許、特許出願およびその他の参考文献は、全体が参考として本明細書で援用される。
【０１３５】
Ｕ−ＡＣＴＸの座標を含む表３がコンパクトディスク１にて提出されている。コンパクトディスク１に関する情報は、本明細書で参考として組み込まれる。
【０１３６】
【表３−１】
2009540295.tif 000009
【０１３７】
【表３−２】
2009540295.tif 000010
【０１３８】
【表３−３】
2009540295.tif 000011
【０１３９】
【表３−４】
2009540295.tif 000012
【０１４０】
【表３−５】
2009540295.tif 000013
【０１４１】
【表３−６】
2009540295.tif 000014
【０１４２】
【表３−７】
2009540295.tif 000015
【０１４３】
【表３−８】
2009540295.tif 000016
【０１４４】
【表３−９】
2009540295.tif 000017
【０１４５】
【表３−１０】
2009540295.tif 000018
【０１４６】
【表３−１１】
2009540295.tif 000019
【０１４７】
【表３−１２】
2009540295.tif 000020
【０１４８】
【表３−１３】
2009540295.tif 000021
【０１４９】
【表３−１４】
2009540295.tif 000022
【０１５０】
【表３−１５】
2009540295.tif 000023
【０１５１】
【表３−１６】
2009540295.tif 000024
【０１５２】
【表３−１７】
2009540295.tif 000025
【０１５３】
【表３−１８】
2009540295.tif 000026
【０１５４】
【表３−１９】
2009540295.tif 000027
【０１５５】
【表３−２０】
2009540295.tif 000028
【０１５６】
【表３−２１】
2009540295.tif 000029
【０１５７】
【表３−２２】
2009540295.tif 000030
【０１５８】
【表３−２３】
2009540295.tif 000031
【０１５９】
【表３−２４】
2009540295.tif 000032
【０１６０】
【表３−２５】
2009540295.tif 000033
【０１６１】
【表３−２６】
2009540295.tif 000034
【０１６２】
【表３−２７】
2009540295.tif 000035
【０１６３】
【表３−２８】
2009540295.tif 000036
【０１６４】
【表３−２９】
2009540295.tif 000037
【０１６５】
【表３−３０】
2009540295.tif 000038
【０１６６】
【表３−３１】
2009540295.tif 000039
【０１６７】
【表３−３２】
2009540295.tif 000040
【０１６８】
【表３−３３】
2009540295.tif 000041
【０１６９】
【表３−３４】
2009540295.tif 000042
【０１７０】
【表３−３５】
2009540295.tif 000043
【０１７１】
【表３−３６】
2009540295.tif 000044
【０１７２】
【表３−３７】
2009540295.tif 000045
【０１７３】
【表３−３８】
2009540295.tif 000046
【０１７４】
【表３−３９】
2009540295.tif 000047
【０１７５】
【表３−４０】
2009540295.tif 000048
【０１７６】
【表３−４１】
2009540295.tif 000049
【０１７７】
【表３−４２】
2009540295.tif 000050
【０１７８】
【表３−４３】
2009540295.tif 000051
【０１７９】
【表３−４４】
2009540295.tif 000052
【０１８０】
【表３−４５】
2009540295.tif 000053
【０１８１】
【表３−４６】
2009540295.tif 000054
【０１８２】
【表３−４７】
2009540295.tif 000055
【０１８３】
【表３−４８】
2009540295.tif 000056
【０１８４】
【表３−４９】
2009540295.tif 000057
【０１８５】
【表３−５０】
2009540295.tif 000058
【０１８６】
【表３−５１】
2009540295.tif 000059
【０１８７】
【表３−５２】
2009540295.tif 000060
【０１８８】
【表３−５３】
2009540295.tif 000061
【０１８９】
【表３−５４】
2009540295.tif 000062
【０１９０】
【表３−５５】
2009540295.tif 000063
【０１９１】
【表３−５６】
2009540295.tif 000064
【０１９２】
【表３−５７】
2009540295.tif 000065
【０１９３】
【表３−５８】
2009540295.tif 000066
【０１９４】
【表３−５９】
2009540295.tif 000067
【０１９５】
【表３−６０】
2009540295.tif 000068
【０１９６】
【表３−６１】
2009540295.tif 000069
【０１９７】
【表３−６２】
2009540295.tif 000070
【０１９８】
【表３−６３】
2009540295.tif 000071
【０１９９】
【表３−６４】
2009540295.tif 000072
【０２００】
【表３−６５】
2009540295.tif 000073
【０２０１】
【表３−６６】
2009540295.tif 000074
【０２０２】
【表３−６７】
2009540295.tif 000075
【０２０３】
【表３−６８】
2009540295.tif 000076
【０２０４】
【表３−６９】
2009540295.tif 000077
【０２０５】
【表３−７０】
2009540295.tif 000078
【０２０６】
【表３−７１】
2009540295.tif 000079
【０２０７】
【表３−７２】
2009540295.tif 000080
【０２０８】
【表３−７３】
2009540295.tif 000081
【０２０９】
【表３−７４】
2009540295.tif 000082
【０２１０】
【表３−７５】
2009540295.tif 000083
【０２１１】
【表３−７６】
2009540295.tif 000084
【０２１２】
【表３−７７】
2009540295.tif 000085
【０２１３】
【表３−７８】
2009540295.tif 000086
【０２１４】
【表３−７９】
2009540295.tif 000087
【０２１５】
【表３−８０】
2009540295.tif 000088
【０２１６】
【表３−８１】
2009540295.tif 000089
【０２１７】
【表３−８２】
2009540295.tif 000090
【０２１８】
【表３−８３】
2009540295.tif 000091
【０２１９】
【表３−８４】
2009540295.tif 000092
【０２２０】
【表３−８５】
2009540295.tif 000093
【０２２１】
【表３−８６】
2009540295.tif 000094
【０２２２】
【表３−８７】
2009540295.tif 000095
【０２２３】
【表３−８８】
2009540295.tif 000096
【０２２４】
【表３−８９】
2009540295.tif 000097
【０２２５】
【表３−９０】
2009540295.tif 000098
【０２２６】
【表３−９１】
2009540295.tif 000099
【０２２７】
【表３−９２】
2009540295.tif 000100
【０２２８】
【表３−９３】
2009540295.tif 000101
【０２２９】
【表３−９４】
2009540295.tif 000102
【０２３０】
【表３−９５】
2009540295.tif 000103
【０２３１】
【表３−９６】
2009540295.tif 000104
【０２３２】
【表３−９７】
2009540295.tif 000105
【０２３３】
【表３−９８】
2009540295.tif 000106
【０２３４】
【表３−９９】
2009540295.tif 000107
【０２３５】
【表３−１００】
2009540295.tif 000108
【０２３６】
【表３−１０１】
2009540295.tif 000109
【０２３７】
【表３−１０２】
2009540295.tif 000110
【０２３８】
【表３−１０３】
2009540295.tif 000111
【０２３９】
【表３−１０４】
2009540295.tif 000112
【０２４０】
【表３−１０５】
2009540295.tif 000113
【０２４１】
【表３−１０６】
2009540295.tif 000114
【０２４２】
【表３−１０７】
2009540295.tif 000115
【０２４３】
【表３−１０８】
2009540295.tif 000116
【０２４４】
【表３−１０９】
2009540295.tif 000117
【０２４５】
【表３−１１０】
2009540295.tif 000118
【０２４６】
【表３−１１１】
2009540295.tif 000119
【０２４７】
【表３−１１２】
2009540295.tif 000120
【０２４８】
【表３−１１３】
2009540295.tif 000121
【０２４９】
【表３−１１４】
2009540295.tif 000122
【０２５０】
【表３−１１５】
2009540295.tif 000123
【０２５１】
【表３−１１６】
2009540295.tif 000124
【０２５２】
【表３−１１７】
2009540295.tif 000125
【０２５３】
【表３−１１８】
2009540295.tif 000126
【０２５４】
【表３−１１９】
2009540295.tif 000127
【０２５５】
【表３−１２０】
2009540295.tif 000128
【０２５６】
【表３−１２１】
2009540295.tif 000129
【０２５７】
【表３−１２２】
2009540295.tif 000130
【０２５８】
【表３−１２３】
2009540295.tif 000131
【０２５９】
【表３−１２４】
2009540295.tif 000132
【０２６０】
【表３−１２５】
2009540295.tif 000133
【０２６１】
【表３−１２６】
2009540295.tif 000134
【０２６２】
【表３−１２７】
2009540295.tif 000135
【０２６３】
【表３−１２８】
2009540295.tif 000136
【０２６４】
【表３−１２９】
2009540295.tif 000137
【０２６５】
【表３−１３０】
2009540295.tif 000138
【０２６６】
【表３−１３１】
2009540295.tif 000139
【０２６７】
【表３−１３２】
2009540295.tif 000140
【０２６８】
【表３−１３３】
2009540295.tif 000141
【０２６９】
【表３−１３４】
2009540295.tif 000142
【０２７０】
【表３−１３５】
2009540295.tif 000143
【０２７１】
【表３−１３６】
2009540295.tif 000144
【０２７２】
【表３−１３７】
2009540295.tif 000145
【０２７３】
【表３−１３８】
2009540295.tif 000146
【０２７４】
【表３−１３９】
2009540295.tif 000147
【０２７５】
【表３−１４０】
2009540295.tif 000148
【０２７６】
【表３−１４１】
2009540295.tif 000149
【０２７７】
【表３−１４２】
2009540295.tif 000150
【０２７８】
【表３−１４３】
2009540295.tif 000151
【０２７９】
【表３−１４４】
2009540295.tif 000152
【０２８０】
【表３−１４５】
2009540295.tif 000153
【０２８１】
【表３−１４６】
2009540295.tif 000154
【０２８２】
【表３−１４７】
2009540295.tif 000155
【０２８３】
【表３−１４８】
2009540295.tif 000156
【０２８４】
【表３−１４９】
2009540295.tif 000157
【０２８５】
【表３−１５０】
2009540295.tif 000158
【０２８６】
【表３−１５１】
2009540295.tif 000159
【０２８７】
【表３−１５２】
2009540295.tif 000160
【０２８８】
【表３−１５３】
2009540295.tif 000161
【０２８９】
【表３−１５４】
2009540295.tif 000162
【０２９０】
【表３−１５５】
2009540295.tif 000163
【０２９１】
【表３−１５６】
2009540295.tif 000164
【０２９２】
【表３−１５７】
2009540295.tif 000165
【０２９３】
【表３−１５８】
2009540295.tif 000166
【０２９４】
【表３−１５９】
2009540295.tif 000167
【０２９５】
【表３−１６０】
2009540295.tif 000168
【０２９６】
【表３−１６１】
2009540295.tif 000169
【０２９７】
【表３−１６２】
2009540295.tif 000170
【０２９８】
【表３−１６３】
2009540295.tif 000171
【０２９９】
【表３−１６４】
2009540295.tif 000172
【０３００】
【表３−１６５】
2009540295.tif 000173
【０３０１】
【表３−１６６】
2009540295.tif 000174
【０３０２】
【表３−１６７】
2009540295.tif 000175
【０３０３】
【表３−１６８】
2009540295.tif 000176
【０３０４】
【表３−１６９】
2009540295.tif 000177
【０３０５】
【表３−１７０】
2009540295.tif 000178
【０３０６】
【表３−１７１】
2009540295.tif 000179
【０３０７】
【表３−１７２】
2009540295.tif 000180
【０３０８】
【表３−１７３】
2009540295.tif 000181
【０３０９】
【表３−１７４】
2009540295.tif 000182
【０３１０】
【表３−１７５】
2009540295.tif 000183
【０３１１】
【表３−１７６】
2009540295.tif 000184
【０３１２】
【表３−１７７】
2009540295.tif 000185
【０３１３】
【表３−１７８】
2009540295.tif 000186
【０３１４】
【表３−１７９】
2009540295.tif 000187
【０３１５】
【表３−１８０】
2009540295.tif 000188
【０３１６】
【表３−１８１】
2009540295.tif 000189
【０３１７】
【表３−１８２】
2009540295.tif 000190
【０３１８】
【表３−１８３】
2009540295.tif 000191
【０３１９】
【表３−１８４】
2009540295.tif 000192
【０３２０】
【表３−１８５】
2009540295.tif 000193
【０３２１】
【表３−１８６】
2009540295.tif 000194
【０３２２】
【表３−１８７】
2009540295.tif 000195
【０３２３】
【表３−１８８】
2009540295.tif 000196
【０３２４】
【表３−１８９】
2009540295.tif 000197
【０３２５】
【表３−１９０】
2009540295.tif 000198
【０３２６】
【表３−１９１】
2009540295.tif 000199
【０３２７】
【表３−１９２】
2009540295.tif 000200
【０３２８】
【表３−１９３】
2009540295.tif 000201
【０３２９】
【表３−１９４】
2009540295.tif 000202
【０３３０】
【表３−１９５】
2009540295.tif 000203
【０３３１】
【表３−１９６】
2009540295.tif 000204
【０３３２】
【表３−１９７】
2009540295.tif 000205
【０３３３】
【表３−１９８】
2009540295.tif 000206
【０３３４】
【表３−１９９】
2009540295.tif 000207
【０３３５】
【表３−２００】
2009540295.tif 000208
【０３３６】
【表３−２０１】
2009540295.tif 000209
【０３３７】
【表３−２０２】
2009540295.tif 000210
【０３３８】
【表３−２０３】
2009540295.tif 000211
【０３３９】
【表３−２０４】
2009540295.tif 000212
【０３４０】
【表３−２０５】
2009540295.tif 000213
【０３４１】
【表３−２０６】
2009540295.tif 000214
【０３４２】
【表３−２０７】
2009540295.tif 000215
【０３４３】
【表３−２０８】
2009540295.tif 000216
【０３４４】
【表３−２０９】
2009540295.tif 000217
【０３４５】
【表３−２１０】
2009540295.tif 000218
【０３４６】
【表３−２１１】
2009540295.tif 000219
【０３４７】
【表３−２１２】
2009540295.tif 000220
【０３４８】
【表３−２１３】
2009540295.tif 000221
【０３４９】
【表３−２１４】
2009540295.tif 000222
【０３５０】
【表３−２１５】
2009540295.tif 000223
【０３５１】
【表３−２１６】
2009540295.tif 000224
【０３５２】
【表３−２１７】
2009540295.tif 000225
【０３５３】
【表３−２１８】
2009540295.tif 000226
【０３５４】
【表３−２１９】
2009540295.tif 000227
【０３５５】
【表３−２２０】
2009540295.tif 000228
【０３５６】
【表３−２２１】
2009540295.tif 000229
【０３５７】
【表３−２２２】
2009540295.tif 000230
【０３５８】
【表３−２２３】
2009540295.tif 000231
【０３５９】
【表３−２２４】
2009540295.tif 000232
【０３６０】
【表３−２２５】
2009540295.tif 000233
【０３６１】
【表３−２２６】
2009540295.tif 000234
【０３６２】
【表３−２２７】
2009540295.tif 000235
【０３６３】
【表３−２２８】
2009540295.tif 000236
【０３６４】
【表３−２２９】
2009540295.tif 000237
【０３６５】
【表３−２３０】
2009540295.tif 000238
【０３６６】
【表３−２３１】
2009540295.tif 000239
【０３６７】
【表３−２３２】
2009540295.tif 000240
【０３６８】
【表３−２３３】
2009540295.tif 000241
【０３６９】
【表３−２３４】
2009540295.tif 000242
【０３７０】
【表３−２３５】
2009540295.tif 000243
【０３７１】
【表３−２３６】
2009540295.tif 000244
【０３７２】
【表３−２３７】
2009540295.tif 000245
【０３７３】
【表３−２３８】
2009540295.tif 000246
【０３７４】
【表３−２３９】
2009540295.tif 000247
【０３７５】
【表３−２４０】
2009540295.tif 000248
【０３７６】
【表３−２４１】
2009540295.tif 000249
【０３７７】
【表３−２４２】
2009540295.tif 000250
【０３７８】
【表３−２４３】
2009540295.tif 000251
【０３７９】
【表３−２４４】
2009540295.tif 000252
【０３８０】
【表３−２４５】
2009540295.tif 000253
【０３８１】
【表３−２４６】
2009540295.tif 000254
【０３８２】
【表３−２４７】
2009540295.tif 000255
【図１】
2009540295.tif 000256
【図２】
2009540295.tif 000257
【図３】
2009540295.tif 000258
【図４】
2009540295.tif 000259
【図５】
2009540295.tif 000260
【図６】
2009540295.tif 000261
【配列表】
2009540295000001.xml
【国際調査報告】
2009540295.tif 000512
2009540295.tif 000513
2009540295.tif 000514