(57)【要約】  本発明は、インスリン−オリゴマー複合体ＩＮ−１０５を作製するための方法を特許請求する。式Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｒ−［Ｂ鎖］−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｄ−Ｒ−［Ａ鎖］を有するＩＮ−１０５前駆体をクローニングし、ピシア菌において発現させる。次に生合成前駆体を活性化オリゴマーと複合する。その後、ＩＮ−１０５前駆体−オリゴマー複合体をプロテアーゼで処理し、精製して、式インスリン−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３の活性インスリン−オリゴマー複合体を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン複合体の調製のための方法であって、
ｉ）前駆体ＩＰ−Ｘの発現のためのクローニング
ｉｉ）前駆体ＩＰ−Ｘを生産するためのクローンの発酵
ｉｉｉ）前駆体ＩＰ−Ｘの単離
ｉｖ）オリゴマーと前駆体ＩＰ−Ｘの複合
ｖ）ＩＰ−Ｘ−オリゴマー複合体をプロテアーゼで処理すること、および
ｖｉ）活性インスリン−オリゴマー複合体またはインスリン類似体−オリゴマー複合体を精製すること
を含む方法。
【請求項２】
前駆体ＩＰ−Ｘが、リーダー配列および合成ヒトプロインスリンペプチドまたは類似体から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リーダー配列が負に帯電したアミノ酸を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リーダー配列がＧ−Ａ−Ｖ−Ｒである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
プロインスリンペプチドが［Ｂ鎖］−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｄ−Ｒ−［Ａ鎖］である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前駆体ＩＰ−Ｘが特にＩＰ−Ｆである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前駆体ＩＰ−Ｆが酵母において発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前駆体ＩＰ−Ｆがメチロトロピック酵母において発現される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
メチロトロピック酵母がピシア属（Ｐｉｃｈｉａ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前駆体ＩＰ−Ｆが、イオン交換クロマトグラフィ、ついで結晶化によってブロスから単離される、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１１】
結晶化がフェノール、ＺｎＣｌ２中で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前駆体ＩＰ−Ｘが活性化オリゴマーで処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前駆体ＩＰ−Ｆが活性化オリゴマーで処理される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴマーが一般式ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３（式中、２つのｎは同じかまたは異なり、およびｎは１〜８の整数である）を有する、請求項１２〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴマーがＣ１４Ｈ２３ＮＯ８のスクシンアミド誘導体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
活性化オリゴマーとＩＰ−Ｆの複合が、ホウ酸緩衝液、アセトニトリル、ＤＭＳＯから選択される１またはそれ以上の溶媒中で実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
オリゴマーがＩＰ−Ｆ内のＢ鎖のＬｙｓ−Ｂ２９で複合される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体がＩＰ−Ｆ−［ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３］２である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体がさらに結晶化に供される、請求項１〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体が、活性インスリン−オリゴマー複合体を得るためにプロテアーゼで処理される、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
プロテアーゼが、トリプシンもしくはカルボキシペプチダーゼＢまたはそれらの混合物から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
活性インスリン−オリゴマー複合体がＲＰ−ＨＰＬＣおよび結晶化によって精製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
活性インスリン−オリゴマー複合体が、インスリン−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣＨ３（式中、２つのｎは同じかまたは異なり、およびｎは１〜８の整数である）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
活性インスリン−オリゴマー複合体が、インスリン−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
活性インスリン−オリゴマー複合体が、
（ａ）逆相液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）および結晶化
を含む方法によって精製される、請求項１（ｖｉ）に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＰ−ＨＰＬＣ工程が反復される、請求項２２および２５に記載の方法。
【請求項２７】
充填される試料のｐＨが、ＲＰ−ＨＰＬＣ工程の１つにおいて５〜８の範囲内である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
充填される試料のｐＨが、ＲＰ−ＨＰＬＣ工程の１つにおいて８〜１１の範囲内である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、式インスリン−オリゴマーのインスリン−オリゴマー複合体のための方法に関する。上記方法は、式Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｒ−［Ｂ鎖］−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｄ−Ｒ−［Ａ鎖］の前駆体ＩＰ−Ｆのクローニングおよび発現ならびに発現された生合成前駆体を、活性化オリゴマーとの複合、ついでプロテアーゼ処理および精製に供し、活性インスリン−オリゴマー複合体を得ることを含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
膵島のβ細胞は、タンパク質分解されたとき生物学的に活性なポリペプチドインスリンを生じるプロインスリンとして知られる、インスリンの１本鎖前駆体を分泌する。インスリン分子は種を越えて高度に保存されており、一般にジスルフィド結合によって連結されたアミノ酸の２本の鎖から成る。天然ヒトインスリン分子（分子量５，８０７ダルトン）は、アミノ末端にグリシンを有する２１アミノ酸残基のＡ鎖；およびアミノ末端にフェニルアラニンを有する３０アミノ酸残基のＢ鎖を有する。インスリンは、単量体として存在してもよく、または２量体または３個の２量体から形成される６量体に凝集していてもよい。単量体は受容体に結合する能力を備え、生物学的に活性な形態である。
【０００３】
インスリンポリペプチドは、体内のグルコースの輸送、利用および貯蔵を制御する責任を担う主要ホルモンである。インスリンの不十分な生産またはインスリンに対する受容体の感受性低下の結果としての炭水化物代謝の欠陥は、生物学的障害である糖尿病を導く。糖尿病は、グルコースを利用する正常な能力を損ない、その結果として血糖値を上昇させる（高血糖症）。グルコースが血液中に蓄積したとき、過剰なレベルの糖は尿中に排泄される（糖尿）。糖尿病の他の症状は、尿量および頻度の上昇、口渇、かゆみ、空腹、体重減少および衰弱を含む。糖尿病は、治療せずに放置したとき、ケトーシス、ついで吐き気および嘔吐を伴うアシドーシスに至る。毒性生成物が蓄積し続けたとき、患者は、死に至らせる、糖尿病性昏睡に陥る。２種類の糖尿病が存在する。Ｉ型はインスリン依存性糖尿病、すなわちＩＤＤＭである。ＩＤＤＭは、以前は「若年発症糖尿病」と呼ばれた。ＩＤＤＭでは、インスリンが膵臓によって分泌されず、外部の供給源から供給されねばならない。ＩＩ型、すなわち成人発症糖尿病は、通常は食事によって管理できるが、一部の進んだ症例ではインスリンが必要である。
【０００４】
伝統的に、ウシおよびブタインスリンがヒトにおける糖尿病を治療するためにほとんど独占的に使用された。組換え技術の開発と共に、ヒトインスリンの商業規模での製造が発酵によって可能となった。さらに、天然ヒトインスリンに匹敵する生物活性を有する遺伝子操作されたインスリン類似体が、疾患に対抗するために開発された。しかし、糖尿病の治療は、典型的にはインスリンの定期的な注射を必要とする。インスリン注射の不便さゆえに、非注射経路による投与のためのインスリンを製剤するべく様々なアプローチが試みられてきた。そのような公表文献のリストは以下を含む：米国特許第４，３３８，３０６号（Ｋｉｔａｏら）では、インスリンの直腸投与のためのインスリンおよび炭素数８〜１４の脂肪酸、ならびにそれらの非毒性塩の医薬組成物を報告する；米国特許第４，５７９，７３０号（Ｋｉｄｒｏｎら）では、インスリンの経口投与のための胆汁酸またはそのアルカリ金属塩を含む腸溶被覆したインスリン組成物を報告する；米国特許第５，２８３，２３６号（Ｃｈｉｏｕら）では、より高い分子量のポリペプチドの全身吸収を助けるための透過促進剤を含むインスリン組成物、ならびに薬剤が鼻涙管に入り込み、循環中へと吸収される、目を通してのインスリンの全身送達のためのペプチダーゼ阻害剤を報告する；
米国特許第５，６５８，８７８号（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら）では、インスリンと、下気道におけるインスリンの吸収を高める炭素鎖長１０（すなわちカプリン酸ナトリウム）、１２（ラウリン酸ナトリウム）または１４（ミリスチン酸ナトリウム）の飽和脂肪酸のナトリウム塩とを報告する；米国特許第５，８５３，７４８号（Ｎｅｗら）では、インスリンの経口投与のために、腸のｐＨを７．５〜９のｐＨに調整するために使用される、インスリン、胆汁酸塩または胆汁酸、および炭酸または重炭酸イオンの腸溶被覆組成物を報告する。米国特許第６，２００，６０２号（Ｗａｔｔｓら）は、錠剤、カプセルまたはペレットが近位結腸に達するまでインスリンと吸収促進剤の放出を防ぐため、剤皮中に、分散剤と共に炭素数６〜１６の脂肪酸およびその塩の混合物または中鎖脂肪酸のモノ／ジグリセリドの混合物を含む吸収促進剤を有する、インスリンの結腸送達のためのインスリンの薬剤送達組成物を報告する。
【０００５】
経口投与によってインスリンを送達するためのいくつかの試みが文献中に認められる。糖尿病患者において正常血糖を達成するためのインスリンの経口投与に関連する問題は、薬学および医学文献において広く記述されている。胃腸管内の消化酵素はインスリンを速やかに分解し、生物学的分解産物を生じる。胃では、たとえば、経口投与されたインスリンは酵素的タンパク質分解と酸性分解を受ける。腸における生存は過度のタンパク質分解によって妨げられる。管腔において、インスリンは、胃および膵酵素、エキソおよびエンドペプチダーゼ、ならびに刷子縁ペプチダーゼを含む様々な酵素に浴びせられる。インスリンがこの酵素攻撃を生き延びた場合でも、インスリンがインビボでその受容体に到達できる前に横切られねばならない生物学的障壁がインスリンの経口投与を制限し得る。たとえばインスリンは、管腔から血流に入るその能力を制限する、低い膜透過性を有し得る。
【０００６】
インスリンなどの医薬的に活性なポリペプチドは、薬剤−オリゴマー複合体の多分散混合物を提供するために、ポリエチレングリコールの多分散混合物またはポリエチレングリコール含有ポリマーの多分散混合物と複合されてきた；米国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓら）では、インスリンなどのポリペプチドを、Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅによって供給されるＭＰＥＧ−１９００およびＭＰＥＧ−５０００などの様々なポリエチレングリコールと複合することを報告する。米国特許第５，５６７，４２２号（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ）では、５，０００ダルトンの数平均分子量を有する、ｍ−ＰＥＧ−ＯＨ（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ）などのポリエチレングリコールと生物学的に活性な求核試薬の複合を報告する。
【０００７】
ポリエチレングリコール修飾糖脂質ポリマーおよびポリエチレングリコール修飾脂肪酸ポリマーとインスリンなどのポリペプチドの複合は、米国特許第５，３５９，０３０号（Ｅｋｗｕｒｉｂｅら）の中で報告されている。
【０００８】
米国特許第６，０１１，００８号（Ｄｏｍｂら）では、過ヨウ素酸酸化によって多糖をジアルデヒドに活性化すること；（ｂ）ジアルデヒドを干渉アニオンおよび副産物から精製すること；および（ｃ）複合体を形成するためにシッフ塩基形成によって酸化感受性物質を精製ジアルデヒドに結合することを含む、酸化感受性物質の水溶性多糖複合体を生産するための方法を報告する。場合により、工程（ｃ）の複合体を、還元物質によってアミン複合体に還元する。ｐＨ８．９のホウ酸緩衝液中の純粋な酸化ＡＧ（アラビノガラクタン）の溶液を４℃で一晩インスリンと反応させることにより、アミンまたはイミン結合を通して酸化ＡＧ（アラビノガラクタン）に複合した。透明な溶液を、セルロース透析膜を通して透析し、溶液を凍結乾燥して、白色固体１１５ｍｇを生成した。
【０００９】
米国特許第６，０２２，５２４号（Ｍａｉｓａｎｏら）では、ＤＴＰＡおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の溶液中のブタインスリンとＧｄ−ＤＴＰＡの複合を報告しており、加熱して攪拌することによって調製し、その後室温に冷却して、ＤＭＳＯ３００ｍ
ｌ中のＮＨＳ１１．７３ｇ（０．１０２ｍｏｌ）の溶液を添加し、次にＤＭＳＯ４００ｍｌ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド１９．６ｇ（０．０９７ｍｏｌ）の溶液を１滴ずつ添加した。混合物を１６時間攪拌し、その後ろ過して、ろ液を５０℃および５Ｐａでの蒸発によって約１６０ｍｌ容量の濃厚油に濃縮する。
【００１０】
米国特許第６，３０９，６３３号（Ｅｋｗｕｒｉｂｅら）は、室温でトリエチルアミンおよびＤＭＳＯの存在下にラウリン酸ＰＥＧ５とインスリンを複合するための固体インスリンの使用を報告する。３０分ごとにＨＰＬＣによって反応を観測した。分取ＨＰＬＣを用いて複合体を精製した。
【００１１】
米国特許第６，８２８，２９７号（Ｅｋｗｕｒｉｂｅら）では、活性化オリゴマーとの複合およびＢ２９修飾ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンの精製のために亜鉛含有または亜鉛不含ヒトインスリンを使用することによってＰＥＧ７−ヘキシル−インスリンを製造するための方法を報告する。ジメチルスルホキシドおよびトリエチルアミン中のインスリンを２２±４℃で活性化オリゴマーと反応させた。有機溶媒と低分子量不純物を除去するために粗反応混合物を透析またはダイアフィルタし、酢酸アンモニウム緩衝液に対して交換して、凍結乾燥する；それをさらに、０．５％トリエチルアミン／０．５％リン酸緩衝液（ＴＥＡＰ  Ａ）で平衡化させたＲＰ−ＨＰＬＣに供する。カラムを、ＴＥＡＰ  ＡおよびＴＥＡＰ  Ｂ（８０％アセトニトリルおよび２０％ＴＥＡＰ  Ａ）溶媒系を使用して勾配流で溶出した。複合体を含む画分をプールし、溶出緩衝液と溶媒を酢酸アンモニウム緩衝液に対する透析またはダイアフィルトレーションによって除去し、凍結乾燥して、ＰＥＧ７−ヘキシル−インスリン、Ｂ２９モノコンジュゲートの白色粉末（純度＞９７％）を生成した。現在、既存の先行技術は、使用されるインスリンが生物学的に活性な形態である複合インスリンを製造するための出発物質として純粋なインスリン粉末または結晶の使用を教示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、式Ｚ−［Ｂ鎖］−Ｑ−［Ａ鎖］（式中、Ｚはリーダーペプチド配列であり、Ｂ鎖はヒトインスリンまたはその類似体のＢ鎖であり、ＱはＡ鎖とＢ鎖の間のリンカーペプチド配列であり、Ａ鎖はヒトインスリンまたはその類似体のＡ鎖である）の前駆体ＩＰ−Ｘからのインスリン−オリゴマー複合体の製造を容易にする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前駆体ＩＰ−Ｘを、Ｂ鎖上のＬｙｓＢ２９位置およびリーダーペプチドＺのＮ末端アミノ酸でオリゴマーと複合する。その後、ＩＰ−Ｘ−オリゴマー複合体をプロテアーゼ処理、ついで精製に供して、活性インスリン−オリゴマー複合体を得る。
【００１４】
出発物質は前駆体ＩＰ−Ｘを含む発酵ブロスである。ＩＰ−Ｘを含むブロスを、イオン交換、ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣのようなクロマトグラフィと結晶化の組合せに供し、ＩＰ−Ｘを精製する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、インスリン−オリゴマー複合体を製造する上でより簡単で経済的であり、生物学的に活性な形態の純粋なインスリン結晶を得ることに関わるいくつかの工程、たとえば活性インスリンを得るためのインスリン前駆体のトランスペプチド化およびインスリン前駆体の切断ならびに純粋なインスリン結晶を得るためのいくつかのクロマトグラフィ精製工程、たとえばイオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣが回避される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、式Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｒ−［Ｂ鎖］−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｄ−Ｒ−［Ａ鎖］のＩＮ−１０５前駆体ＩＰ−Ｆを発現すること、ＩＰ−ＦのＬｙｓＢ２９位置およびリーダーペプチドＧＡＶＲのＮ末端アミノ酸Ｇｌｙ１で複合する活性化オリゴマーでＩＰ−Ｆを処理することを含む、インスリン−オリゴマー複合体ＩＮ−１０５を製造する方法に関する。ＩＰ−Ｆを、一般式−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−ＯＣＨ３（式中、ｎは１〜８の整数であり、２つのｎは異なるかまたは同じである）を有するオリゴマーとの複合に供する；好ましい実施形態では、活性化オリゴマーは、ために分子式Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ８（ＣＡＳ．Ｎｏ．６２２４０５−７８−１）を有し、式インスリン−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３のＩＮ−１０５を得る。
【００１７】
本発明は、式Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｒ−［Ｂ鎖］−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｄ−Ｒ−［Ａ鎖］の生合成前駆体配列ＩＰ−Ｆの使用を含む。本発明において使用されるリーダー配列Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｒは、文献において開示されているような酵母におけるインスリンの発現増強のために必要な負に帯電したアミノ酸を有さない。本発明の方法は、インスリン複合体を製造する上でより簡単で経済的であり、生物学的に活性な形態の純粋なインスリンを得るためのいくつかの工程が回避される。本発明は、ＩＮ−１０５前駆体ＩＰ−ＦのＡ鎖上またはＣペプチド（ＲＤＡＤＤＲ）での複合を含まず、複合がＢ鎖上（ＬｙｓＢ２９）およびリーダー鎖Ｇ−Ａ−Ｖ−ＲのＧｌｙで起こる生成物を生じ、それを、プロテアーゼ処理に供し、インスリン−オリゴマー複合体ＩＮ−１０５を得る。この方法の結果として複合インスリンの生産の全体的費用が最小限に抑えられる。
【００１８】
詳細な説明
ＩＰ−Ｘは、式Ｚ−［Ｂ鎖］−Ｑ−［Ａ鎖］（式中、Ｚはリーダーペプチド配列であり、Ｂ鎖はヒトインスリンまたはその類似体のＢ鎖であり、ＱはＡ鎖とＢ鎖の間のリンカーペプチド配列であり、Ａ鎖はヒトインスリンまたはその類似体のＡ鎖である）のインスリン−オリゴマー前駆体である。リーダーペプチドは、たとえばペプチド、ＧＡＶＲ、ＡＲＲ、ＡＡＲＡＡＲＧＲ，ＨＨＨＨＨＨＡＡＲおよびＨＨＡＨＡＨＡＨＡＡＲを含む。リンカーペプチドＱは、たとえばＲＤＡＤＤＲ、ＲＤＡＬＱＲ、ＲＥＥＡＥＡＥＡＥＰＲ、ＲＰＧＲ、ＲＡＲ、ＲＲおよびＲを含む。
【００１９】
ＩＰ−Ｘ前駆体は、大腸菌、ピシア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＣＨＯ細胞等のような適切な発現系によって生産され得る。
【００２０】
本発明においてＩＰ−Ｘの最も好ましい実施形態は、リーダー配列ＺがＧＡＶＲであり、Ｂ鎖がヒトインスリンのＢ（１〜３０）であり、リンカーペプチドＱがＲＤＡＤＤＲであり、およびＡ鎖がヒトインスリンのＡ（１〜２１）である場合である。式Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｒ−［Ｂ鎖］−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｄ−Ｒ−［Ａ鎖］によって表わされるＩＰ−Ｘ前駆体を以下ＩＰ−Ｆと称する。ＩＰ−Ｆを、ピシア・パストリス発現ベクター、ｐＰＩＣ９ＫにおいてＭａｔ−αシグナルペプチドと共にインフレームでクローニングする。ピシア・パストリス宿主菌株、ＧＳ１１５を組換えプラスミドで形質転換し、ＩＰＦを発現するピシアクローンを得る。分泌されたＩＰ−Ｆをトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢおよびＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステル（活性化オリゴマー）で処理して、ＩＮ１０５を生成する。
【００２１】
ＩＮ−１０５前駆体ＩＰ−Ｆについての配列
【００２２】
【化１】
2009511039.tif 000002
【００２３】
配列：ピシア・パストリスにおける発現のために最適化されたコドン
予測分子量：６９０７．８２Ｄａ
推定ｐＩ値：５．４６
ヌクレオチド（１８３ｂｐ）およびアミノ酸（６１ａａ）
ＩＮ−１０５前駆体ＩＰ−ＦはＰ．パストリスによって培地中に分泌される。ブロスを遠心分離し、細胞を上清から分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィを含む、前駆体ＩＰ−Ｆの捕獲に使用可能な多くの選択肢がある。本発明では、ＩＰ−Ｆを捕獲するために陽イオン交換クロマトグラフィとＨＩＣを使用する。
【００２４】
ＩＮ−１０５前駆体ＩＰ−Ｆの結晶化は、発酵ブロスからＳＰ−セファロース溶出プールへと運ばれる不純物を除去し、これはＲＰ−ＨＰＬＣ−１段階でのカラムの汚損を低減するのを助ける。生成物をイオン交換カラムから溶出するために使用される酢酸アンモニウム塩も結晶化によって除去される。純粋な結晶前駆体はまた、その後の複合工程におけるコストを低減するのに役立ち、反応の効率を高める。結晶形態は凍結して保存することができ、−２０℃で保存したとき何日間にもわたって実質的に安定である。
【００２５】
ＩＮ−１０５は、最初に活性化オリゴマーを使用してＩＰ−ＦをＢ２９リシンで複合し、ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体を生成する反応によって生産される。ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体をプロテアーゼ処理に供し、この処理でリンカーペプチド（ＲＤＡＤＤＲ）およびリーダー配列（ＧＡＶＲ）が切断され、活性インスリン−オリゴマー複合体が得られる。使用される２つのプロテアーゼはトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢである。ＬｙｓＢ２９におけるトリプシン切断の確率はきわめて低い。しかしトリプシン切断のためのその他の可能性の高い部位は、Ｂ−２２（Ａｒｇ）、Ｃ−１（Ａｒｇ）およびＣ−６（Ａｒｇ）のＣ末端である。２番目のプロテアーゼ（カルボキシペプチダーゼＢ）処理は、Ｂ鎖からの遊離塩基（Ａｒｇ）アミノ酸を除去するために実施され、この処理で１個の余分なＡｒｇがＢ−３０（Ｔｈｒ）と結合して、最終生成物ＩＮ−１０５が得られる。２つのプロテアーゼ処理は、生成物関連不純物の生成を最小限に抑えつつ収率を最大化する最適反応条件下で１回の操作において実施される。
【００２６】
酵素切断反応が完了した後、たとえば最初のＲＰ−ＨＰＬＣ工程で、不純物をＩＮ−１０５から分離してもよい。本発明では、最初のＲＰを低いｐＨで実施し、最終精製を高いｐＨで実施するときに不純物が除去される。低い負荷および２０〜３５から出発する勾配を１５ｇ／Ｌの樹脂負荷で実施した。１回目のＲＰ−ＨＰＬＣ工程は９３〜９５％未満の純度を与えた。除去する必要のある多くの不純物が存在し、１回目のＲＰ−ＨＰＬＣ工程後に残存する不純物は、溶出プールを別の回のＲＰ−ＨＰＬＣに供することによって精製される。ＩＮ−１０５の最終生成物は９７〜９８％の純度を有していた。
【００２７】
ＲＰ−ＨＰＬＣは密接に関連する不純物の精製のための最も好ましい工程の１つであるが、イオン交換、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィ）等のような種々の精製手法を用いた低圧クロマトグラフィも使用できる。
【実施例】
【００２８】
実施例１
ピシア・パストリスにおけるＩＮ−１０５前駆体ＩＰ−Ｆの発現
ｐＰＩＣ９Ｋ／ＩＰ−ＦプラスミドをＢｇｌＩＩで消化し、使用して、Ｐ．パストリスＧＳ１１５のエレクトロコンピテント細胞を形質転換した（ｈｉｓ４）。再生混合物をＹＮＢＤ寒天（アミノ酸を含まない１．３４％酵母窒素塩基、２％デキストロース、２％寒天）プレートに接種し、３０℃で４８時間インキュベートした。コロニーを、適切な対照と共にマイクロタイタープレートにおいてＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース）ブロス中で増殖させた。次にプレートを、ゲネチシン（Ｇ４１８）を含むＹＰＤ寒天（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース、２％寒天）プレートに押し付け（ｓｔａｍｐｅｄ）、３０℃で４８時間インキュベートした。１〜３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８に耐性のクローンを発現試験のために使用した。
【００２９】
細胞溶解のためにザイモリアーゼを使用して選択した組換えピシアクローンからゲノムＤＮＡを作製した。遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲを実施し、ゲノムへのＩＰ−Ｆの組込みを確認した。ＧＳ１１５宿主菌株を陰性対照として使用した。
【００３０】
Ｐ．パストリスにおける発現試験を実施し、クローンをＢＭＧＹ（１％ペプトン、２％酵母抽出物、１．３４％酵母窒素塩基、２％グリセロール、４×１０−５％ビオチン、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）中３０℃で増殖させた。これに続き、ＢＭＭＹ（１％ペプトン、２％酵母抽出物、１．３４％酵母窒素塩基、０．５％メタノール、４×１０−５％ビオチン、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）中のメタノールで誘導した。メタノールによる誘導を合計３日間実施した。各々のクローンからの粗上清を、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＩＰ−Ｆは〜７ｋＤａタンパク質として分泌された。
【００３１】
振とうフラスコ内でのメタノール誘導後３日間、クローンをＩＰ−Ｆの分泌に関して分析した。Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５ミクロン、Ｗａｔｅｒｓ）および緩衝液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）およびＢ（１００％アセトニトリル）を使用して、ＨＰＬＣ法を分析のために用いた。試料を注入する前にカラムを２５％緩衝液Ａで平衡化させる。試料の評価のためにプログラムされた勾配を１ｍｌ／分の流速で適用する：試料注入後プログラムされた勾配の最初の１５分間に２５％緩衝液Ａから４０％緩衝液Ａまでの直線勾配をかける；プログラムの１５分目と１６分目の間は４０％緩衝液Ａを維持する；次に１６分目から１８分目までの勾配を使用することによって緩衝液Ａの濃度を２５％に戻す；次の通過のためにカラムを平衡化させるため、最後の５分間の通過中は緩衝液Ａの濃度を一定に保持する。
【００３２】
実施例２
接種培地（１％酵母抽出物、０．５％ペプトン、２％寒天および２０％デキストロース１水和物）で増殖させた単一単離コロニーからの培養物を満たしたループを、ＢＹＹＧ培地（１％ペプトン、２％酵母抽出物、１．３４％酵母窒素塩基、２％グリセロールおよびｐＨ６．０の１０％１Ｍリン酸緩衝液）５０ｍｌを含む２５０ｍｌ振とうフラスコ中、３０±１℃および２３０±１０ｒｐｍで培養する。４８〜５０時間のインキュベーション後、６００ｎｍで測定した光学密度は１０±２に達する。５０％ｗ／ｖ細胞懸濁液を作製するため、細胞を１００ｍｌフラスコ中の生産培地（１％ペプトン、２％酵母抽出物、１．３４％酵母窒素塩基、０．５％メタノールおよびｐＨ６．０の１０％１Ｍリン酸緩衝液）６ｍｌに再懸濁した。フラスコを３０℃でインキュベートした。メタノール３０μＬを２日目から毎日、全てのフラスコに添加した。４日目のアッセイは０．０６９ｇ／Ｌである。
【００３３】
実施例３
増殖培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、ｐＨ６．０の１０％１Ｍリン酸緩衝液、０．６７％酵母窒素塩基および０．１％グリセロール）５０ｍｌを含む２５０ｍｌフラスコ中、３０±１℃および２３０±１０ｒｐｍでピシアの凍結（−８５℃）細胞を培養することによって接種フラスコを調製した。２０〜２８時間のインキュベーション後、ＯＤ（６００ｎｍ）は１０〜１２に達する。これらの細胞を、４％グリセロール、０．００９３％硫酸カルシウム、１．８２％硫酸カリウム、１．４９％硫酸マグネシウム、０．０４１３％水酸化カリウムから成る発酵培地１Ｌを含む２Ｌ発酵槽においてさらに培養した。発酵槽を３０℃およびｐＨ５．０で運転した。通気速度は０．１〜１．０ｖｖｍに設定した。攪拌速度は、１０％以上の溶解酸素を維持するように調整した。５０％グリセロール供給によってバイオマスを３００〜４００ｇ／Ｌに増加させた。誘導のため、メタノールを供給した。メタノール供給の５日目のアッセイは０．７６ｇ／Ｌである。
【００３４】
実施例４（選択的複合）
ＩＮ−１０５を、ＩＮ−１０５前駆体を含む無細胞発酵ブロスから、以下を含む工程によって調製する：
ａ）ＳＰ−セファロースカラムを緩衝液Ａ（２Ｃ．Ｖ）で平衡化させ、無細胞ブロスのｐＨを氷酢酸で４．０に調整して、上清を樹脂４５ｇ／Ｌでカラムに充填した。緩衝液Ａ（１．５Ｃ．Ｖ）を用いて洗浄を実施し、生成物を６０％緩衝液Ｂで溶出した。溶出プールを８倍に濃縮し、収率は９５％であった［緩衝液Ａ−１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０；緩衝液Ｂ−１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０］。
【００３５】
ｂ）ＩＮ−１０５前駆体を含む溶出プールを水で１：１希釈し、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで５．０に調整した。０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加した。６〜８時間低温条件下に保持し、混合物を結晶化した。ＩＮ−１０５前駆体の回収率は９５％であった。
【００３６】
ｃ）ＩＮ−１０５前駆体結晶を含む湿潤ペレット６ｇを取り、ｐＨ８．１の５００ｍＭホウ酸緩衝液３２ｍｌをそれに添加した。ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで１０．５に調整した。アセトニトリル１１ｍｌに溶解したオリゴマー３７０ｍｇを添加し、内容物を攪拌した。総複合生成物の収率は約７８％であった。
【００３７】
ｄ）等量の工程（ｃ）からの複合生成物と水を取った。溶液のｐＨを氷酢酸で５．０に調整し、次に０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を混合物に添加して、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで５．１に調整した。一晩４℃に保持し、混合物を結晶化した。この工程の収率は９０％であった。
【００３８】
ｅ）工程（ｄ）からの湿潤結晶ペレットを０．５Ｍトリス塩基溶液に溶解し、生成物濃
度を１６ｇ／ｌにした。１Ｎ  ＮａＯＨを使用して溶液のｐＨを７．４にした。次に０．０２７ｍＭトリプシンおよび０．３×１０−３ｍＭカルボキシペプチダーゼＢを反応混合物に添加し、１２時間２４℃に保持した。形成された生成物はＩＮ−１０５であり、工程収率は８０％であった。
【００３９】
ｆ）粒径：１０〜１５μ、孔径：１２０Åの樹脂を詰めたカラムを、１５％Ｂを用いて平衡化させ、工程（ｅ）からの反応混合物を１：１０希釈して、ｐＨを７．０に調整した後充填し、１５％Ｂで洗浄した。２０Ｃｖｓで１５〜２５％Ｂを使用して溶出を実施した。９５％純度の画分を得た［緩衝液Ａ：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０；緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル］。
【００４０】
ｇ）工程（ｆ）からの溶離液をさらに希釈し、ｐＨを８．５に調整した後充填して、２０％Ｂで洗浄した。１５ＣＶｓで２０〜３５％Ｂを使用して溶出を実施した。９７％純度の画分を得た［緩衝液Ａ：１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５；２０ｍＭ塩化マグネシウム；緩衝液Ｂ：アセトニトリル］。
【００４１】
ｈ）工程（ｇ）からの溶出プールを取り、水で希釈することによってＩＮ−１０５の濃度を６ｍｇ／ｍｌに低下させた。試料のｐＨを氷酢酸で４．５に調整した。０．６％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加し、ｐＨを最終的に５にして、混合物を一晩４℃に保持し、結晶を形成した。遠心分離後、工程収率９０％で結晶を収集した。
【００４２】
実施例５（選択的複合）
ＩＮ−１０５を、ＩＮ−１０５前駆体を含む無細胞発酵ブロスから、以下を含む工程によって調製する：
ａ）ｐＨ７の無細胞ブロスを取り、ＰＬＲＰ  Ｓ５０−７０  ＭＩＣＲＯＮを詰めたカラムに充填した。ブロスを５％ＭｅＣＮにして、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０と５％ＭｅＣＮで平衡化させたカラムに充填した。４ｇ／Ｌの充填から９０％の回収率を得た。
【００４３】
ｂ）ＩＮ−１０５前駆体を含む溶出プールを水で１：１希釈し、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで５．０に調整した。０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加した。６〜８時間低温条件下に保持し、混合物を結晶化した。ＩＮ−１０５前駆体の回収率は９５％であった。
【００４４】
ｃ）ＩＮ−１０５前駆体結晶を含む湿潤ペレット２０ｇを取り、ｐＨ８．１の５００ｍＭホウ酸緩衝液９２ｍｌを添加した。１０Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを１０．５に調整した；反応混合物を攪拌しながら、アセトニトリル４０ｍｌに溶解したオリゴマー１．１３ｇを添加した。総複合生成物の収率は約７７％であった。
【００４５】
ｄ）等量の工程（ｃ）からの複合生成物と水を取った。溶液のｐＨを氷酢酸で５．０に調整し、次に０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を混合物に添加して、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで５．１に調整した。一晩４℃に保持し、混合物を結晶化した。この工程の収率は９０％であった。
【００４６】
ｅ）工程（ｄ）からの湿潤結晶ペレットを０．５Ｍトリス塩基溶液に溶解し、生成物濃度を２０ｇ／ｌにした。溶液のｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで７．４に調整した。０．０２ｍＭトリプシンおよび１３×１０−３ｍＭカルボキシペプチダーゼＢを反応混合物に添加した。１２時間後、形成された生成物はＩＮ−１０５であり、工程収率は８５％であった。
【００４７】
ｆ）粒径：１０〜１５μ、孔径：１２０Åの樹脂を詰めたカラムを、１０％緩衝液Ｂを用いて平衡化させ、工程（ｅ）からの反応混合物を、３３％のＭｅＣＮ濃度で１：１０希釈し、ｐＨを３．５に調整して、１５％Ｂで洗浄した。段階勾配を用いて溶出を行った。５８．６％の収率を得た。緩衝液Ａ：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０；緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル。
【００４８】
ｇ）工程（ｆ）からの溶離液をさらに希釈し、ｐＨを７．５に調整した後充填して、２０％緩衝液Ｂで洗浄した。２０ＣＶｓで２２〜３２％緩衝液Ｂを使用して溶出を実施した。９７％純度の画分を得た［緩衝液Ａ：１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５；２０ｍＭ塩化マグネシウム；緩衝液Ｂ：アセトニトリル］。
【００４９】
ｈ）工程（ｇ）からの溶出プールを取り、水で希釈することによってＩＮ−１０５の濃度を６ｍｇ／ｍｌに低下させた。試料のｐＨを氷酢酸で４．５に調整した。０．６％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加し、ｐＨを最終的に５にして、混合物を一晩４℃に保持し、ＩＮ−１０５結晶を形成した。遠心分離後、工程収率９０％で結晶を収集した。
【００５０】
実施例６（包括的複合）
ａ）ＳＰ−セファロースカラムを緩衝液Ａ（２Ｃ．Ｖ）で平衡化させ、無細胞ブロスのｐＨを氷酢酸で４．０に調整して、上清を２０ｇ／ｌでカラムに充填した。緩衝液Ａ（１．５Ｃ．Ｖ）を用いて洗浄を実施し、生成物を１０Ｃ．Ｖ中０〜１００％Ｂで溶出した。溶出プールを８倍に濃縮し、収率は９８％であった［緩衝液Ａ−１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０；緩衝液Ｂ−１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０］。
【００５１】
ｂ）ＩＮ−１０５前駆体を含む溶出プールを水で１：１希釈し、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで５．０に調整した。０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加した。６〜８時間低温条件下に保持し、混合物を結晶化した。ＩＮ−１０５前駆体の回収率は９５％であった。
【００５２】
ｃ）湿潤結晶ペレットをＤＭＳＯに溶解し、生成物濃度を６０ｇ／ｍｌにした。反応混合物に０．００１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミンを添加した。オリゴマーを０．４Ｍの濃度でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、反応混合物に添加した。１５時間の経過後、包括的に複合した生成物を８０％の収率で回収した。
【００５３】
ｄ）等量の工程（ｃ）からの複合生成物と水を取った。溶液のｐＨを氷酢酸で５．０に調整し、次に０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を混合物に添加して、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで５．１に調整した。一晩４℃に保持し、混合物を結晶化した。この工程の収率は９０％であった。
【００５４】
ｅ）工程（ｄ）からの湿潤結晶ペレットを０．５Ｍトリス塩基溶液に溶解し、生成物濃度を２５ｇ／ｌにした。１Ｎ  ＮａＯＨで溶液のｐＨを７．４に上昇させた。０．０２ｍＭトリプシンおよび０．３×１０−３ｍＭカルボキシペプチダーゼを反応混合物に添加した。１４時間の経過後、形成されたＩＮ−１０５は８０％の工程収率を有していた。
【００５５】
ｆ）粒径：１０〜１５μ、孔径：１２０Åの樹脂を詰めたカラムを、１５％緩衝液Ｂを用いて平衡化させた；工程（ｅ）からの反応混合物を１：１０希釈して、ｐＨを７．０に調整した後充填した。１５％緩衝液Ｂで洗浄し、２０Ｃｖｓで２７−３７％緩衝液Ｂを使用して溶出を実施した。９０％純度の画分を得た。
緩衝液Ａ：１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０；２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．５。緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル。
【００５６】
ｇ）工程（ｆ）からの溶離液をさらに希釈し、ｐＨを９．０に調整した後充填して、２０％緩衝液Ｂで洗浄した。１５ＣＶｓで２０〜３５％緩衝液Ｂを使用して溶出を実施した。９７％純度の画分を得た［緩衝液Ａ：１００ｍＭトリス、ｐＨ９．０；２０ｍＭ塩化マグネシウム；緩衝液Ｂ：アセトニトリル］。
【００５７】
ｈ）工程（ｇ）からの溶出プールを取り、水で希釈することによってＩＮ−１０５の濃度を６ｍｇ／ｍｌに低下させた。試料のｐＨを氷酢酸で８．３から４．５に調整した。０．６％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加し、ｐＨを最終的に５にして、混合物を一晩４℃に保持し、結晶を形成した。遠心分離後、工程収率９０％で結晶を収集した。
【００５８】
実施例７（包括的複合）
ａ）ＳＰ−セファロースカラムを緩衝液Ａ（２Ｃ．Ｖ）で平衡化させ、無細胞ブロスのｐＨを氷酢酸で４．０に調整して、上清を４５ｇ／ｌでカラムに充填した。緩衝液Ａ（１．５Ｃ．Ｖ）を用いて洗浄を実施し、生成物を６０％Ｂで溶出した。溶出プールを８倍に濃縮し、収率は９５％であった［緩衝液Ａ−１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０；緩衝液Ｂ−１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０］。
【００５９】
ｂ）ＩＮ−１０５前駆体を含む溶出プールを水で１：１希釈し、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨで５．０に調整した。０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加した。６〜８時間低温条件下に保持し、混合物を結晶化した。ＩＮ−１０５前駆体の回収率は９５％であった。
【００６０】
ｃ）湿潤結晶ペレットをＤＭＳＯに溶解し、生成物濃度を６０ｇ／ｍｌにした。反応混合物に０．００１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミンを添加した。オリゴマーを０．４Ｍの濃度でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、反応混合物に添加した。１５時間の経過後、包括的に複合した生成物を８０％の収率で回収した。
【００６１】
ｄ）等量の工程（ｃ）からの複合生成物と水を取った。溶液のｐＨを氷酢酸で５．０に調整し、次に０．４％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を混合物に添加して、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで５．１に調整した。一晩４℃に保持し、混合物を結晶化した。この工程の収率は９０％であった。
【００６２】
ｅ）工程（ｄ）からの湿潤結晶ペレットを０．５Ｍトリス塩基溶液に溶解し、生成物濃度を２５ｇ／ｌにした。１Ｎ  ＮａＯＨで溶液のｐＨを７．４に上昇させ、反応混合物に０．０２ｍＭトリプシンおよび０．３×１０−３ｍＭカルボキシペプチダーゼＢを添加した。１４時間の経過後、形成されたＩＮ−１０５は８０％の工程収率を有していた。
【００６３】
ｆ）粒径：１０〜１５μ、孔径：１２０Åの樹脂を詰めたカラムを、１０％緩衝液Ｂを用いて平衡化させた；工程（ｅ）からの反応混合物をＭｅＣＮ濃度１５％で１：１０希釈し、ｐＨを３．５に調整して充填し、５ミクロンフィルターを通してろ過した；１５％Ｂで洗浄を行った。２０Ｃｖｓで１７〜２３％緩衝液Ｂを使用して溶出を実施した。９４．２％純度のタンパク質を７７％の収率で得た［緩衝液Ａ：２５０ｍＭ酢酸、緩衝液Ｂ：アセトニトリル］。
【００６４】
ｇ）工程（ｆ）からの溶離液をさらに希釈し、ｐＨを９．０に調整した後充填して、２０％緩衝液Ｂで洗浄した。１５ＣＶｓで２２〜３２％Ｂを使用して溶出を実施した。９７％純度の画分を得た。
［緩衝液Ａ：１００ｍＭトリス、ｐＨ９．０；２０ｍＭ塩化マグネシウム；緩衝液Ｂ：ア
セトニトリル］。
【００６５】
ｈ）工程（ｇ）からの溶出プールを取り、水で希釈することによってＩＮ−１０５の濃度を６ｍｇ／ｍｌに低下させた。試料のｐＨを氷酢酸で８．３から４．５に調整した。０．６％（ｖ／ｖ）のフェノールおよび４％（ｖ／ｖ）の０．３Ｎ塩化亜鉛を添加し、ｐＨを最終的に５にして、混合物を一晩４℃に保持し、ＩＮ−１０５結晶を形成した。遠心分離後、工程収率９０％で結晶を収集した。
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月24日(2006.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン複合体ＩＮ−１０５の調製のための方法であって、
ｉ）式ＩＰ−Ｆによって表わされる合成ポリペプチド前駆体Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｒ−［Ｂ鎖］−Ｒ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｄ−Ｒ−［Ａ鎖］のクローニングおよび酵母における発現
ｉｉ）ＩＰ−Ｆを発現する酵母クローンの発酵
ｉｉｉ）ＩＰ−Ｆの単離および精製
ｉｖ）オリゴマーとＩＰ−Ｆの複合
を含む方法。
【請求項２】
酵母がメチロトロピック酵母である、請求項１のｉ）に記載の方法。
【請求項３】
メチロトロピック酵母がピシア属である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前駆体ＩＰ−Ｆが、イオン交換クロマトグラフィ、ついで結晶化によってブロスから単離される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
結晶化がフェノール、ＺｎＣｌ２中で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前駆体ＩＰ−Ｆが活性化オリゴマーで処理される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
活性オリゴマーがＣ１４Ｈ２３ＮＯ８のスクシンアミド誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
活性化オリゴマーとＩＰ−Ｆの複合が、ホウ酸緩衝液、アセトニトリル、ＤＭＳＯから選択される１またはそれ以上の溶媒中で実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
オリゴマーがＩＰ−Ｆ内のＢ鎖のＬｙｓ−Ｂ２９で複合される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体がＩＰ−Ｆ−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体がさらに結晶化に供される、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＰ−Ｆ−オリゴマー複合体が、活性インスリン−オリゴマー複合体を得るためにプロテアーゼで処理される、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
プロテアーゼが、トリプシンもしくはカルボキシペプチダーゼＢまたはそれらの混合物から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
活性インスリン−オリゴマー複合体がＲＰ−ＨＰＬＣおよび結晶化によって精製される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
活性インスリン−オリゴマー複合体が、インスリン−ＯＣ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＣＨ３である、請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
2009511039.tif 000003
2009511039.tif 000004
2009511039.tif 000005
2009511039.tif 000006