(57)【要約】感染症及び炎症の診断において使用するための、１個または５個を超える内部リジン及び／またはＮ末端アミノ酸に部位特異的に結合体化される１つ以上のヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）部分を介して標識されるインターロイキン−８またはその類似体もしくは誘導体が、提供される。ＩＬ−８は、好ましくは放射性標識によって標識される。より好ましくは、放射性標識は９９ｍＴｃ及び９４ｍＴｃから選択される。最も好ましくは、放射標識は９９ｍＴｃである。
2009511565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の内部リジン及び／またはＮ末端アミノ酸に部位特異的に結合体化される１つ以上のヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）部分を介して標識されるインターロイキン−８またはその類似体もしくは誘導体。
【請求項２】
前記Ｎ末端アミノ酸及び１つ以上の内部リジンに部位特異的に結合体化されるＨＹＮＩＣ部分を含む、請求項１に記載のインターロイキン−８。
【請求項３】
前記Ｎ末端アミノ酸及び１つの内部リジンに部位特異的に結合体化されるＨＹＮＩＣ部分を含む、請求項２に記載のインターロイキン−８。
【請求項４】
前記Ｎ末端アミノ酸にのみ結合体化されるＨＹＮＩＣ部分を含む、請求項１に記載のインターロイキン−８。
【請求項５】
１つ以上の内部リジンにのみ部位特異的に結合体化されるＨＹＮＩＣ部分を含む、請求項１に記載のインターロイキン−８。
【請求項６】
前記インターロイキン−８が放射性標識によって標識される、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−８。
【請求項７】
前記放射性標識が９９ｍＴｃである、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−８。
【請求項８】
前記インターロイキン−８の７２アミノ酸アイソフォームを含む、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−８。
【請求項９】
約８０％を超える量の、１つの特定のＨＹＮＩＣに結合体化したインターロイキン−８を含む、前記請求項の何れかに記載のインターロイキン−８。
【請求項１０】
１つ以上のＨＹＮＩＣ部分をインターロイキン−８に部位特異的に結合体化する方法であって、
ａ）保護、固定されたインターロイキン−８を提供する；
ｂ）ヒドラジノニコチン酸を固定されたインターロイキン−８にカップリングする；
ｃ）該ＨＹＮＩＣに結合体化したインターロイキン−８を脱保護する；
ｄ）脱保護したＨＹＮＩＣに結合体化したインターロイキン−８を固体支持体から切断する、
ことを含む、方法。
【請求項１１】
手順（ａ）で提供される前記保護、固定されたインターロイキン−８が、１つ以上のＨＹＮＩＣ部分によって予め部位特異的に結合体化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
約８０％を超える量の、１つの特定の十分に規定されたＨＹＮＩＣに結合体化したインターロイキン−８を含む、ＨＹＮＩＣに結合体化したインターロイキン−８生成物を生成する、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１つのＨＹＮＩＣ部分が、前記インターロイキン−８のＮ末端アミノ酸にのみ結合体化される、請求項１０〜請求項１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、固相ペプチド合成を使用して実施される、請求項１０〜請求項１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
手順（ｄ）により得られた生成物を標識源と接触させることを更に含む、請求項１０〜請求項１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
前記標識源が放射性標識を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記放射性標識が９９ｍＴｃである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
感染症及び炎症を診断するための薬学的組成物の調製における、請求項１〜請求項９の何れかに記載のインターロイキン−８の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ末端アミノ酸に、及び／あるいはインターロイキン−８（ＩＬ−８）またはその類似体もしくは誘導体の１つ以上の内部リジンに選択的に結合体化される、１つ以上のヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）部分を介して標識される新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性、亜急性及び慢性の感染症及び炎症の局在化のシンチグラフィーによる検出は、感染性または炎症性疾患患者の管理に重要な影響をもたらす可能性があることから、臨床診療における困難な問題となっている。臨床医が最適な処置を早急に開始できるようにするには、これらの患者における炎症性病巣の適切な描写が臨床上重要となる。臨床歴及び理学的検査が決定的でない場合、臨床医は、疾患の局在化、範囲及び重症度を測定するために幾つかの診断法から選択することができる。磁気共鳴イメージング及びスパイラルコンピュータ断層撮影のような新しい高感度の放射線検査は、比較的小さな病巣の異常を位置決定することが可能である。しかし、これらの放射線法は形態変化に依存する。従って、これらは感染の初期段階では精度が低く、感染の治癒によるまたは外科手術後（瘢痕組織）の解剖学的変化と活発なプロセスを区別することができない。
【０００３】
核医学では、放射性標識化合物（放射性医薬品）が注射され、体全体にわたる放射能の分布が、専用のガンマカメラを使用して視覚化される。シンチグラフィー画像は、形態的変化に依存せず、組織内の生理化学的なプロセスに基づく。従って、シンチグラフィー技術は又、形態変化がまだはっきり見えない初期段階に感染病巣を視覚化することもできる。更に、シンチグラフィーによるイメージングは、体全体にわたる感染性または炎症性疾患の程度を測定することできる、優れた非侵襲性の全身スキャニング方法である。
【０００４】
ヒトＩＬ−８は、小さな走化性タンパク質であり、好中球上の受容体に高い親和性で結合する。ヒトＩＬ−８には２種類のアイソフォームが天然に存在する。最も豊富な形状は、単球によって産生される７２アミノ酸の改変型である。ＩＬ−８の７７アミノ酸の改変型は、内皮細胞によって産生され、Ｎ末端で５個のアミノ酸によって伸長される。短い形状の方が長い形状よりも好中球の誘引及び活性化が強力であるが、何れの形状もナノモル濃度で活性を有する。以前に感染症及び炎症のイメージングの前臨床及び臨床研究で使用されていたのは、ＩＬ−８の７２アミノ酸アイソフォームだけであった。放射性標識ＩＬ−８が炎症をイメージングする潜在能力については、非特許文献１において最初に報告された。クロラミンＴ法により放射性ヨウ素標識されたＩＬ−８の、ラットにおけるカラゲナン誘発無菌炎症における取り込みは、注射後１〜３時間でピークに達し、その後低下した。８名の糖尿病患者による予備実験では、１２３Ｉ−ＩＬ−８が活動性の足の感染症を視覚化できることを研究者等が示した［非特許文献２］。
【０００５】
この標識法は、放射性ヨウ素標識ＩＬ−８のｉｎ  ｖｉｖｏにおける生体内分布に大きな影響を与えるように思われた。ボルトンハンター法により標識されたＩＬ−８のシンチグラフィーイメージングの特性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞結合特性が類似するのにもかかわらず、ヨードジェン法により標識されたＩＬ−８よりも明らかに優れていた［非特許文献３］。このＩＬ−８製剤の比放射能は比較的低く、１２３Ｉ−ＩＬ−８のイメージング線量（２５μｇ／ｋｇ）は、末梢白血球数を４５％まで一時的に低下させた後、数時間にわたって白血球増加（注射前レベルの１７０％）が生じた。
【０００６】
最近になって、キレート剤としてＨＹＮＩＣを使用する９９ｍＴｃ標識ＩＬ−８製剤の開発が報告された［非特許文献４〜非特許文献９］。この製剤は、ウサギの４種類の感染症及び炎症モデルにおいて感染症をイメージングするに当たり優れた特性を示した。大腸菌により誘発された筋肉内感染症に罹患するウサギでは、膿瘍内における９９ｍＴｃ標識ＩＬ−８の取り込みが早く且つ多かった。更に、９９ｍＴｃ標識ＩＬ−８では、非標的組織からの除去が著しく早いことが示された。膿瘍対筋肉比は、注射から６時間後に２００を越えた。
【０００７】
化学的に急性結腸炎を誘発させたウサギでは、９９ｍＴｃ標識したＩＬ−８または精製顆粒球の何れかを注射した後、シンチグラフィーにより炎症性病変を視覚化した。注射後数時間以内に、９９ｍＴｃ標識ＩＬ−８では、炎症を起こした結腸の適切な評価が可能となった。結腸の炎症巣における絶対取り込みは、９９ｍＴｃ標識顆粒球よりも９９ｍＴｃ標識ＩＬ−８の方が遥かに高かった。
【０００８】
第３の研究では、９９ｍＴｃ標識ＩＬ−８の能力がウサギの急性骨髄炎実験モデルで評価された。これらの評価結果を、従来の十分に確立された薬剤である１１１Ｉｎ−顆粒球、６７Ｇａ−クエン酸塩、及び９９ｍＴｃ−ＭＤＰ（ＭＤＰ＝メチレンジホスホネート）を使用して得た結果と比較した。この骨髄炎ウサギモデルでは、９９ｍＴｃ−ＩＬ−８が骨髄炎の病巣をはっきりと描写した。骨髄炎領域における絶対取り込みは、６７Ｇａ−クエン酸塩及び９９ｍＴｃ−ＭＤＰで得た取り込みよりも低かったが、標的対バックグラウンド比は、９９ｍＴｃ−ＩＬ−８の方が有意に高かった。
【０００９】
そして最後に、３種類のウサギ実験モデル（免疫無防備状態ウサギのアスペルギルス症モデル、免疫応答性ウサギの肺炎球菌性（グラム陽性）肺炎モデル及び大腸菌誘発性（グラム陰性）肺炎モデル）で、肺感染をイメージングする９９ｍＴｃ標識ＩＬ−８の潜在能力を試験した。９９ｍＴｃ−ＩＬ−８は、３つの肺感染実験モデルそれぞれで、肺感染の局在化及び範囲の早期（注射後２時間以内）且つ優れた視覚化を可能にした。感染巣における９９ｍＴｃ−ＩＬ−８の取り込みは、殆どの場合で高く、大腸菌モデルでは、感染巣における取り込みが、主要な除去器官である腎臓における取り込みを遥かに上回った。
【００１０】
ＩＬ−８は、炎症促進性の走化性サイトカインである。シンチグラフィーの用途では、投与するタンパク質の用量を、副作用を生じるレベル未満にしなければならない。ニコチン酸をコリガンドとして使用した場合、高比放射能（８０ＭＢｑ／μｇ）及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの高安定性を有する製剤を調製することができたことを示した。投与するタンパク質の用量は、わずか７０ｎｇ／体重ｋｇであった。このような低用量のタンパク質での副作用は、ヒトの系では予想されない。感染性及び炎症性障害の患者に９９ｍＴｃ−ＩＬ−８を使用した初期の結果により、９９ｍＴｃ−ＩＬ−８が実際にこれらの用量レベルで安全に投与できることが証明された。
【００１１】
９９ｍＴｃ−ＩＬ−８は、標的組織内における迅速な蓄積、並びに血液及び非標的組織からの迅速な除去といった、感染症の造影剤として長所を有する。放射能は主として腎臓を介して除去され、これは肝胆道における除去を上回る利点である。肝臓及び腸の放射能が高いと、この薬剤が腹部のイメージングに好適でなくなると考えられてきた。
【００１２】
９９ｍＴｃ−ＩＬ−８には、感染症のイメージングに最も一般的に使用される２つの放射性医薬品である６７Ｇａ−クエン酸塩及び放射性標識白血球に優る利点が幾つかある。放射性核種９９ｍＴｃは、その実質的に理想的な物理的特性（短い半減期、理想的なエネルギー、及び低い放射線負荷）、費用対効果、並びに一般的な可用性ゆえに、６７Ｇａよりも好まれる。６７Ｇａは、より長い物理的半減期及び高エネルギーガンマ線を有し、高い放射線吸収線量を引き起こし、且つ低解像度の画像を生成する。通常、６７Ｇａ−クエン酸塩は、比較的遅効性の薬物動態を示す。その結果、放射性医薬品の注射とイメージングの間には長い間隔が必要となる。一般的に、６７Ｇａのイメージングは、注射後４８〜７２時間の間に行われる。９９ｍＴｃ−ＩＬ−８を使用するウサギのイメージングでは、注射とイメージングの間に２時間の間隔があれば十分であった。
【００１３】
放射性標識白血球に比べて、９９ｍＴｃ−ＩＬ−８の調製は、簡単且つ短時間に行うことができ、３０分以内に準備ができ、更なる精製の必要がない。１１１Ｉｎまたは９９ｍＴｃの何れかを使用する放射性標識白血球の準備は、煩雑で、時間を要し、顆粒球減少患者には使用できない。患者からの採血、白血球の精製、及びこれらの細胞の標識化の手順には、訓練を受けた技術者でも約３時間を要する。細胞は、再注射の際、炎症部位に移動するそれらの能力を保つために、慎重に扱われなければならない。更に、汚染された可能性がある血液を扱わなければならない必要性があることから、ＨＩＶ等の血液感染病原体の感染をもたらす可能性があり、職員及び患者の双方に深刻な危険をもたらす。９９ｍＴｃ−ＩＬ−８を使用して白血球をｉｎ  ｖｉｖｏで標識化する簡便な方法は、上に詳述した新規の方法の利点全てを利用して、従来のｅｘ  ｖｉｖｏにおける標識化方法を反映する。
【非特許文献１】Ｈａｙ，ら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，１８；３６７−３７８
【非特許文献２】Ｇｒｏｓｓ，ら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００１；４２；１６５６−１６５９
【非特許文献３】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａｋｅｎ，ら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００；４１；４６３−４６９
【非特許文献４】Ｒｅｎｎｅｎ，ら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２００１；４２；１１７−１２３
【非特許文献５】Ｒｅｎｎｅｎ，ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２；１３；３７０−３７７
【非特許文献６】Ｒｅｎｎｅｎ，ら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２００３；４４；１５０２−１５０９
【非特許文献７】Ｇｒａｔｚ，ら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２００１；４２；９１７−９２３
【非特許文献８】Ｇｒａｔｚ，ら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２００１；４２；１２５７−１２６４
【非特許文献９】Ｒｅｎｎｅｎ，ら，Ｃｈｅｓｔ．２００４  Ｄｅｃ，１２６（６），１９５４−１９６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
現在までにＨＹＮＩＣを９９ｍＴｃキレート基として使用して実施、発表された研究では、ＨＹＮＩＣ基が、ＩＬ−８分子の第１級アミノ基に無作為に結合された。ＩＬ−８は、１つのαアミノ基（Ｎ末端）と９つのεアミノ基（リジン側鎖）を含んでいる。ペプチドの活性部位が化学的に改変されると、ＩＬ−８の受容体結合親和性が低下する可能性があった。本発明者等は、異なる結合体モル比（ＩＬ−８：ＨＹＮＩＣ＝１：１〜１：１０）及び異なる反応時間（３〜６０分）を使用して、一連のＨＹＮＩＣ−ＩＬ−８結合体を調製した。それにより、より多くのＨＹＮＩＣ部分がＩＬ−８に結合体化されると、９９ｍＴｃ標識ＨＹＮＩＣに結合体化したＩＬ−８の白血球受容体結合能力が大幅に低下することが示された。このことは、ＩＬ−８分子のεアミノ基のいくつかは、受容体結合時に悪影響を及ぼすことなくこのように改変できないことを示している。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
それゆえ、本発明に従って、所定の方法で改変されたＩＬ−８であって、前記ＩＬ−８が、内部リジン及び／またはＩＬ−８分子のＮ末端アミノ酸に部位特異的に結合体化された１つ以上のヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）部分を介して標識されている、ＩＬ−８、またはその類似体もしくは誘導体を提供する。
【００１６】
本発明によれば、ＨＹＮＩＣ部分は、Ｎ末端アミノ酸に結合体化され、そして１つ以上の内部リジンに部位特異的に結合体化される場合がある。或いは、ＨＹＮＩＣ部分は、Ｎ末端アミノ酸または１つ以上の内部リジンにのみ結合体化される場合がある。好ましくは、ＨＹＮＩＣ部分は、少なくともＮ末端アミノ酸に、及び０、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の内部リジンの何れかに結合体化される。
【００１７】
本発明は、既存の無作為の結合体化よりもむしろ、特異的で十分に規定されたＨＹＮＩＣ  ＩＬ−８結合体の合成を可能にする。十分に規定されたＨＹＮＩＣ−ＩＬ−８結合体が全体生成物の約８０％を超える量を構成する、ＨＹＮＩＣ−ＩＬ−８結合体の合成が可能である。選択性は、好ましくは約８５％を超え、より好ましくは約９０％を超え、更に好ましくは約９５％を超える。最も好ましくは、ＨＹＮＩＣ−ＩＬ−８結合体は、９８％を超える量の十分に規定されたＨＹＮＩＣに結合体化されるＩＬ−８生成物を含む。
【００１８】
ＩＬ−８は、好ましくは放射性標識によって標識される。より好ましくは、放射性標識は９９ｍＴｃ及び９４ｍＴｃから選択される。最も好ましくは、放射標識は９９ｍＴｃである。
【００１９】
７２及び７７アミノ酸の両アイソフォームを本発明に従って改変することができるが、好ましいのは７２アミノ酸アイソフォームである。
【００２０】
ＩＬ−８の類似体及び誘導体とは、ヒト天然ＩＬ−８１−７２の残基１〜３及び６７〜７２に改変、欠失または交換を有するＩＬ−８を意味する。ＩＬ−８の生物活性に必須なのは、ＩＬ−８４−６６コア（ｃｏｒｅ）である。従って、残基１〜３及び６７〜７２は、ＩＬ−８の生物学的機能に重要な影響を与えることなく、欠失、改変または交換することができる。
【００２１】
又、本発明に従って、１つ以上のＨＹＮＩＣ部分をインターロイキン−８に部位特異的に結合体化する方法であって、
ａ）保護、固定されたＩＬ−８を提供する；
ｂ）ヒドラジノニコチン酸を固定されたＩＬ−８にカップリングする；
ｃ）ＨＹＮＩＣに結合体化したＩＬ−８を脱保護する；
ｄ）脱保護したＨＹＮＩＣに結合体化したＩＬ−８を固体支持体から切断する、
ことを含む、方法も提供する。
【００２２】
この方法は又、１つより多くのＨＹＮＩＣ部分をＩＬ−８に段階的且つ部位特異的に結合体化するのにも使用できる。これは、手順（ａ）で、１つ以上のＨＹＮＩＣ部分によって既に部位特異的に結合体化され、保護、固定されたＩＬ−８を提供することにより達成することができる。
【００２３】
好ましくは、この方法を使用して、１つのＨＹＮＩＣ部分をＮ末端アミノ酸と結合体化する。この方法は、好ましくは固相ペプチド合成を使用して実施される。
【００２４】
本発明の方法は、結果として得られる生成物が、約８０％を超える量、好ましくは約８５％を超える量、より好ましくは約９０％を超える量、更により好ましくは約９５％を超える量、及び最も好ましくは約９８％を超える量の、所望のＨＹＮＩＣに結合体化したＩＬ−８有するように、ＨＹＮＩＣ結合体化の選択性を達成することができる。
【００２５】
この方法は、最も好ましくは、Ｎ末端アミノ酸のみへの１つのＨＹＮＩＣ部分の結合体化のために使用される。
【００２６】
好ましくは、この方法は更に、手順（ｄ）により得られた生成物を標識源と接触させることも含む。標識源は、好ましくは、９９ｍＴｃ等の放射性標識を含む。９９ｍＴｃの好ましい線源は、９９ｍＴｃＯ４−である。
【００２７】
ペプチドＩＬ−８は、自動ペプチドシンセサイザーで合成される。ペプチドＩＬ−８は、任意の好適な支持体上に固定することができる。ヒドラジノニコチン酸（これはヒドラジン基を保護するのに必須である）をＩＬ−８にカップリングした後、固定させたＨＹＮＩＣに結合体化したペプチドを脱保護して、固体支持体から切断する。
【００２８】
ＩＬ−８の活性化は、好ましくは１つ以上のカップリング剤の存在下で実施される。その他のカップリング剤も使用できるが、好ましく使用されるカップリング剤は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル  ウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、または１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）である。
【００２９】
ＩＬ−８の脱保護は、ピペリジン等の任意の好適な第２級アミンを使用した後、例えばＮ−メチル−２−ピロリジン（ＮＭＰ）で洗浄してアミンを除去することにより実施することができる。
【００３０】
脱保護、固定されたＨＹＮＩＣに結合体化したＩＬ−８の固体支持体からの切断は、例えばトリフルオロ酢酸、水、１，２−エタンジチオール、及びトリイソプロピルシランの混合物を使用することにより行うことができる。ＩＬ−８は次いで精製される。
【００３１】
手順（ａ）で提供されるＩＬ−８は、樹脂等の任意の好適な固体支持体上に固定される場合がある。
【００３２】
ＩＬ−８は、好ましくは、ＦｍｏｃまたはＢｏｃを保護基として使用して保護される。固相合成時にＨＹＮＩＣをＩＬ−８に結合体化することが必須である。
【００３３】
本発明は又、感染症及び炎症を診断するための薬学的組成物の調製におけるＩＬ−８の使用も含む。
【００３４】
Ｎ末端アミノ酸及び／または１つ以上の内部リジンに結合体化されるＨＹＮＩＣ部分を介して、例えば９９ｍＴｃで標識されるヒトＩＬ−８類似体は、以下の異なる利点の１つ以上を提供する場合がある：
−  ９９ｍＴｃ−キレートＨＹＮＩＣ基は、十分に規定された部位特異的様式でＩＬ−８に結合する；
−  導入されるＨＹＮＩＣ基は、受容体の相互作用に干渉しないような位置に配置されることで、ＩＬ−８の高い受容体結合親和性を維持する；及び
−  ＨＹＮＩＣ−ＩＬ−８結合体は、ＨＹＮＩＣ部分の所定量（例えば、Ｎ末端だけが標識される場合の正確な量）を含み、この量は、より高い比放射能（ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）の９９ｍＴｃ−ＩＬ−８製剤の調製を可能にする量であり、患者にペプチド低用量の投与を可能にする量であって、それによって望ましくない副作用の発生を低減する。
【００３５】
本発明のＨＹＮＩＣ−ＩＬ−８化合物は、７０％を超える、好ましくは８０％を超える、より好ましくは８５％を超える、更に好ましくは９０％を超える、及び最も好ましくは９５％を超える受容体結合能を達成することができる。
【００３６】
本発明を更に、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を一切制限することなく、単に説明を目的としたものである。
【実施例】
【００３７】
（実施例１  Ｎ末端に結合体化されるＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８の合成：）
ヒト７２アミノ酸ＩＬ−８のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００３８】
【化１】
2009511565.tif 000003
ＨＹＮＩＣ基を、ペプチドの受容体結合能に影響を与えることなく化学的に改変が可能な分子のＮ末端のセリン残基（Ｓｅｒ１）において、ＩＬ−８に導入する。
【００３９】
（ペプチドＩＬ−８の合成：）
ＡＢＩ  ＦａｓｔＭｏｃ０．２５ｍｍｏｌプロトコル（参考文献１、２）（但し、カップリング時間は２０分ではなく４５分）を使用し、ＡＢＩ  ４３３Ａ自動ペプチドシンセサイザーで固定化ペプチドを構築した。合成はＡｒｇｏＧｅｌ−Ｗａｎｇ樹脂（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、容量０．３７ｍｍｏｌ／ｇ）上で行った。
【００４０】
Ｎ−メチル−２−ピロリドン（＝ＮＭＰ）中の２０％ピペリジン溶液によってＦｍｏｃ基を切断した後（３分及び７．６分）、樹脂をＮＭＰで洗浄した（５回）。その後、４当量（１ｍｍｏｌ）の適切なアミノ酸をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解した後、ＮＭＰ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（１ｍｍｏｌ、０．３６Ｍの２．７８ｍＬ）を加えた。この混合物にＮＭＰ中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（＝ＤｉＰＥＡ）（１ｍＬ、２Ｍ）を加えた後、活性化されたアミノ酸を反応槽に移した。４５分後、この反応槽の液体を捨て、樹脂をＮＭＰで洗浄した（３回）。脱保護及びカップリング反応が行われたら、３０１ｎｍでジベンゾフルベン−ピペリジン付加物のモニタリングを行った。最後のアミノ酸カップリングサイクルの後、Ｆｍｏｃ基を除去して、樹脂に結合した保護ペプチドの遊離Ｎ末端にＦｍｏｃ−６−ヒドラジノニコチン酸をカップリングさせた（４当量、ＮＭＰ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（４当量）、ＤｉＰＥＡ（８当量）、４５分間）。Ｆｍｏｃ−６−ヒドラジノニコチン酸のカップリングをもう一度繰り返し、確実に反応を完了させた。最後のカップリングサイクル後、ピペリジン溶液でＦｍｏｃ基を除去し、樹脂をＮＭＰ（５回）及びジクロロメタン（ＤＣＭ）（６回）で洗浄した。最後に、樹脂を反応槽から取り出し、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ、及びエーテルで洗浄して、Ｐ２Ｏ５上で真空乾燥させた。
【００４１】
このようにして得た固定ペプチドを脱保護して、４５ｍＬのトリフルオロ酢酸（＝ＴＦＡ）、２．５ｍＬの水、１．２５ｍＬの１，２−エタンジチオール（＝ＥＤＴ）、及び１．２５ｍＬのトリイソプロピルシラン（＝ＴＩＳ）により室温にて３時間処置することによって、固体支持体から切断させた。次いで、混合物をろ過し、残渣をＴＦＡで完全に洗浄した（５ｍＬで３回）。この反応混合物を約１０ｍＬの容積まで真空濃縮し、残渣を９０ｍＬのＭＴＢＥ／ｎ−ヘキサン溶液（１／１、容積／容積）に滴加した。そして沈澱物を遠心分離（３０００ｒｐｍで１０分間）によって回収し、上澄みをデカントし、ペレットをＭＴＢＥ（１００ｍＬ）溶液で再懸濁させて、再び遠心分離させた。これを２回繰り返した。その後ペレットをアセトニトリル／水溶液（１／１、容積／容積）（約６０ｍＬ）に溶解して凍結乾燥させ、線毛状の白色固体である粗ペプチドを得た。
【００４２】
５０ｍｇのバッチで、この粗ペプチドを４ｍＬの６Ｍ  グアニジンＨＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２０％メルカプトエタノールによりｐＨ８．５で溶解して処置し、４５℃で２時間攪拌した後、１ｍＬの酢酸で酸性化した。
【００４３】
還元した粗ペプチドを含むこの混合物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ分取カラム（２５０×２１．２ｍｍ、Ｃ１８、１１０Å、１０μｍ）に充填し、島津自動分取ＬＣＭＳシステムを使用して、１２．５ｍＬ／分の流速で２４０分間にわたり、保持した物質を０．１％  ＴＦＡ中で０〜６０％の水−アセトニトリル勾配にて溶出させた。正しい質量ピークを含む画分を、純度評価のためにＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム（２５０×４．６ｍｍ、Ｃ１８、１１０Å、５μｍ）上に再度通し、主要ピークを含む画分をプールして、凍結乾燥させた。ペプチドを折りたたみ及び酸化させるため、この物質をリン酸緩衝化生理食塩水中で一晩再構成させた。
【００４４】
（参照文献：）
【００４５】
【化２】
2009511565.tif 000004
（使用した略語：）
ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＭＴＢＥ＝ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
（Ｎ末端に結合体化したＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８の９９ｍテクネチウムによる標識化）
凍結乾燥させたコリガンドキットを、３０μｇのＳｎＳＯ４、４５ｍｇのトリシン、及び４ｍｇのニコチン酸を含有させて、調製した。放射性標識の開始直前に６００μＬの０．９％  ＮａＣｌ溶液をコリガンドキットに加えた。
【００４６】
１０μｇのＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８試料に、４００μＬの再構成させたコリガンドキットを生理食塩水中の４００ＭＢｑの９９ｍＴｃＯ４−と共に加えた。この混合物を７０℃で３０分間インキュベートした。この製剤の放射化学的純度を、移動相の０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ６．０）と共にＩＴＬＣ−ＳＧストリップ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［米国ミシガン州アン・アーバー］）で、インスタント薄層クロマトグラフィー法（ＩＴＬＣ）により測定した。
【００４７】
標識反応の後、反応混合物をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で４０ＭＢｑ／ｍＬの終濃度に希釈し、ウサギに静脈内投与できる状態にした。
【００４８】
（実施例２  １つ以上の内部リジンに結合体化したＨＹＮＩＣを有するＩＬ−８の合成：）
ＨＹＮＩＣ基を９個の内部リジン（ＩＬ−８のアミノ酸配列では「Ｋ」に省略）の１つ以上に結合体化する。ここで、ＨＹＮＩＣｘ−ＩＬ−８の特定の位置「Ｘ」にＨＹＮＩＣ基を導入するために、固相ペプチド合成のアミノ酸の構築ブロックとして、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＨＹＮＩＣ−ＢＯＣ）−ＯＨを使用する。
【００４９】
更に、（実施例１と同様に）Ｎ末端に並びに（実施例２と同様に）1つ以上の内部リジンに結合体化したＨＹＮＩＣを使用して、固相ペプチド合成によりＩＬ−８の誘導体を合成することも可能である。
【００５０】
（動物試験）
動物試験は現地の動物愛護委員会のガイドラインに従って実施した。１０匹の雌のニュージーランド白ウサギ（２．４〜２．７ｋｇ）の左大腿筋に、０．５ｍＬ中の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の１０１１のコロニー形成単位（ｃｆｕ）で膿瘍を誘発させた。処置の間に、ウサギを０．３１５ｍｇ／ｍＬのフェンタニル及び１０ｍｇ／ｍＬのフルアニソン（Ｈｙｐｎｏｒｍ、Ｊａｎｓｓｅｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ［英国バッキンガムシャー］）の混合物０．６ｍＬを皮下注射することによって鎮静させた。
【００５１】
２４時間後、筋肉の腫張が見て取れた際に、５匹のウサギに耳静脈から４０ＭＢｑの９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８を注射した。そのうち３匹のウサギをガンマカメライメージングに使用した。イメージングに当たっては、ウサギを固定して、ガンマカメラ上に腹臥位に置き、耳側部の静脈に９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８または９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣｘ−ＩＬ−８（ｘ＝２〜１０）の何れかを注射した。注射後（ｐ．ｉ．）１分、１時間、３時間及び５時間の段階で、平行孔・低エネルギーの汎用コリメーターを搭載したシングルヘッド型ガンマカメラ（Ｏｒｂｉｔｅｒ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．［米国ホフマンエステート］）で画像を記録した。画像（１画像当たり２００，０００〜３００，０００カウント）は２５６×２５６マトリックスにて、デジタル形式で、収集し保存した。
【００５２】
最後のイメージング及び採血（注射５時間後）が完了したら、ウサギを致死量のフェノバルビタールナトリウムで安楽死させた。血液、感染した大腿筋、非感染の対側大腿筋、肺、脾臓、肝臓、腎臓及び腸の試料を、収集した。解剖した組織の重量を測り、ガンマカウンターで測定した。又、放射性崩壊の補正のために、注射標準を同時に測定した。試料で測定した放射能の量は、組織１ｇ当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表した。そして膿瘍対対側筋及び膿瘍対血液の比率を算出した。
【００５３】
（結果）
（ＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８の９９ｍＴｃ標識化）
インスタント薄膜クロマトグラフィーで測定した９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８の放射化学的純度は、９８％であった。本試験で使用した製剤の比放射能は、ＩＬ−８  １μｇ当たり４０ＭＢｑであった。
【００５４】
（動物試験）
筋肉内感染症のウサギにおける９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣ１−ＩＬ−８の生体内分布を、以下の表に要約する。
【００５５】
【化３】
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（ＳＤ＝標準偏差；ｓ．ｅ．ｍ．＝平均値の標準誤差）
注射１時間後、３時間後及び５時間後における代表的な筋肉内感染症を有するウサギ（ウサギ５匹の群の内の１匹）のシンチグラフィー画像を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
又、本発明を、添付の図を参照して説明する。
【図１】図１は、Ｎ末端でＩＬ−８に結合体化されるＨＹＮＩＣの構造を示す。
【図２】図２は、注射から１時間、３時間及び５時間後における代表的な筋肉内感染症を有するウサギ（ウサギ５匹の群の内の１匹）のシンチグラフィー画像を示す。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月16日(2008.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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