(57)【要約】本発明は、癌特異的転写複合体（CSTC）1を標的とする分子、ならびにCSTC標的化分子を含む組成物およびキットを提供し、かつ癌の処置、検出、およびモニタリングのためにCSTC標的化分子を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2のアミノ酸配列を有するペプチドにより結合される癌特異的転写複合体（CSTC）に対して特異的に結合する分子。
【請求項２】
小分子である、請求項1記載の分子。
【請求項３】
ペプチドである、請求項1記載の分子。
【請求項４】
SEQ ID NO：1のアミノ酸配列またはその保存的に改変された変異体を含む、請求項3記載のペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO：2のアミノ酸配列またはその保存的に改変された変異体を含む、請求項3記載のペプチド。
【請求項６】
細胞透過性ペプチド（CPP）をさらに含む、請求項1記載の分子。
【請求項７】
CPPがアミノ酸配列RRRRRRRを有する、請求項6記載の分子。
【請求項８】
核局在シグナル（NLS）をさらに含む、請求項1記載の分子。
【請求項９】
NLSがアミノ酸配列PKKRKVを有する、請求項8記載の分子。
【請求項１０】
ペプチドがアミノ酸配列
2009543559.tif 000045
または
2009543559.tif 000046
を有する、請求項3記載の分子。
【請求項１１】
転写因子複合体（TFC）の生物活性を妨害する、前記請求項のいずれか一項に記載の分子。
【請求項１２】
アポトーシスを誘導する、癌細胞の増殖を阻害する、および/または腫瘍成長を阻害する、請求項11記載の分子。
【請求項１３】
請求項11記載の分子と癌細胞とを接触させる段階を含む、TFCの生物活性を妨害する方法。
【請求項１４】
請求項12記載の分子と癌細胞とを接触させる段階を含む、癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
【請求項１５】
請求項12記載の分子と癌細胞とを接触させる段階を含む、癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１６】
請求項12記載の分子と腫瘍とを接触させる段階を含む、腫瘍成長を阻害する方法。
【請求項１７】
接触させる段階が、癌細胞の核に分子を送達することを含む、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項3〜10のいずれか一項に記載のペプチドをコードする、オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項18記載のオリゴヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項10記載の分子または請求項18記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２１】
請求項20記載の組成物と癌細胞とを接触させる段階を含む、TFCの生物活性を妨害する方法。
【請求項２２】
分子がsiRNA分子である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞が黒色腫細胞である、方法に関する前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞がヒト細胞である、方法に関する前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項20記載の組成物を対象に投与する段階を含む、対象において癌を処置するための方法。
【請求項２５】
CSTCに対して特異的に結合する検出可能な分子と組織標本とを接触させる段階、および検出可能な分子の結合を検出する段階を含む、組織標本において癌を検出するための方法であって、検出可能な分子の結合が癌を示す、方法。
【請求項２６】
癌が黒色腫である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
表1に示されたアイソフォームから選択される転写補助制御因子（transcriptional co-regulator）のアイソフォーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の全体を通じて、様々な刊行物を参照する。これらの刊行物の開示内容はそれらの全体が、本発明が属する技術分野の水準をより詳細に記載する目的で、参照により本出願に組み入れられる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は一般に、検出および治療法に関する。本発明はより具体的には、癌特異的転写複合体に向けられた新規分子に関する。本発明の分子は、標的とされる転写複合体を発現する様々な癌の処置のためのワクチンおよび薬学的組成物において、ならびにそのような癌の検出およびその悪性度の評価のための方法において用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は依然として、全世界を通じて重大な健康上の問題である。化学療法または外科手術と放射線療法との組み合わせに概して基づく現行の治療法は、多くの患者では不十分であることが判明している。
【０００４】
癌の中でも、黒色腫は、その発生率が急に上昇しつつあること、および、外科療法を除く事実上すべての治療法に対して抵抗性があることという両方の点でよく知られている。黒色腫は、皮膚および眼にある神経堤由来の色素細胞であるメラノサイトから生じる。黒色腫の発癌過程では、メラノサイト系譜の通常のマーカーの多くが失われる。黒色腫細胞およびメラノサイトにおける遺伝子発現パターンには、黒色腫の癌としての性質を反映して大きな違いがある。一般に、遺伝子発現はDNA結合性転写因子および補助制御因子（co-regulator）という2種類の因子によって制御され、それらはRNAポリメラーゼ2（pol II）の活性を調節するメディエーター複合体およびクロマチン再構築複合体を含む細胞型特異的な複合体を形成する。補助因子複合体は、DNA結合性転写因子からの、さらには異なるシグナル伝達系からのシグナルを統合して、RNA合成を調節する。補助因子複合体は細胞および刺激に関して非常に特異的であり、生理学的な段階毎に様々である。癌細胞は、いくつか例を挙げるならば突然変異、翻訳後修飾、選択的スプライシング、複数の異なるタンパク質の異なる断片の融合の結果として、構造が変化した転写補助因子を発現する。
【０００５】
黒色腫およびメラノサイトの発生の転写調節
遺伝子発現パターンの変化にも関わらず、すべてではないにしてもほとんどの黒色腫は、メラノサイトに特徴的な塩基性/ヘリックス-ループ-ヘリックス/ロイシンジッパー（bHLhzip）転写因子である小眼球症（Microphthalmia）関連転写因子（MITF）（King et al., 1999）の発現を保持している。発表されているデータは、神経堤細胞の遊走の前および/または最中でのメラノサイトの拘束（commitment）、増殖および生存におけるMITFの役割を示唆している（Opdecamp et al., 1997）。数多くの研究も、MITFが、色素沈着などの分化経路におけるその役割に加えて、発生中のメラノサイトの増殖および/または生存にも重要な役割がある可能性を示唆している。色素沈着のない腫瘍を含むヒト原発性黒色腫の大多数におけるMITF発現の保持はこの可能性と一致し、この悪性腫瘍における診断マーカーとしてのMITFの幅広い利用にもつながっている（King et al., 1999；Salti et al., 2000；Chang and Folpe, 2001；Miettinen et al., 2001）。Wntシグナル伝達経路およびβ-カテニンは黒色腫細胞の成長の重要な制御因子であり、MITFは決定的な下流標的である。重要なことに、正統的なWnt経路の妨害は黒色腫細胞の成長を阻止し、MITFの恒常的な過剰発現はその成長抑制を解除させる。
【０００６】
本明細書に開示する本発明は、MITFが細胞周期機構の維持には寄与するが有糸分裂誘起反応にはおそらく直接的には関与しないという可能性を検討するための、細胞周期の進行に影響を及ぼすMITF標的遺伝子の探索から生まれた。c-Myc、サイクリンD1といったWntシグナル伝達の細胞周期標的（He et al., 1998；Tetsu and McCormick, 1999；Shtutman et al., 1999）および他のものが、β-カテニンの有糸分裂促進作用をより直接的に媒介すると考えられる。加えて、MITFはCDK2、p21（Cip1）、INK4Aといった種々の増殖関連遺伝子の上流制御因子の役を果たすことも示されている。MITFは、Rb、TFEB、ITF2、PIAS3、およびSTAT3を含むいくつかの転写因子（TF）と相互作用して、メラノサイトおよび黒色腫の発生の様々な局面に関係する下流遺伝子のネットワークを制御する。
【０００７】
MITF経路に加えて、NOTCH、インターフェロン、核内ホルモン受容体、および免疫調節経路を含むいくつかの他のシグナル伝達経路も、黒色腫細胞と関連があることが報告されている。差異を伴って発現されるいくつかの遺伝子は、黒色腫に共通した喪失もしくは獲得を呈する染色体領域に存在しており、またはCpGプロモーターのメチル化によって制御されることが知られている。いくつかのデータはまた、転写補助因子が、メラノサイトと比較して黒色腫において差異を伴って発現されることも示している。Goldbergら（Goldberg et al., 2003）は、転移性黒色腫において下方制御される腫瘍抑制遺伝子TXNIPおよびKISS1が、転写因子DRIP130/CRSP3によって調節されることを報告している。DRIP130/CRSP3は、第6番染色体の中の、黒色腫において高頻度に欠失している領域に位置する。
【０００８】
転写調節
RNAポリメラーゼII（pol II）による、タンパク質をコードする遺伝子の転写の正確な時間的および空間的な制御は、成長、発生、およびホメオスタシスのシグナルに反応した複雑な遺伝子発現プログラムの遂行のために極めて重要である。協調的な遺伝子発現を可能にする分子回路は、制御上の情報を標的遺伝子に運ぶDNA結合性転写因子（TF）に主として基づく。原則として、DNA結合性TFは、pol IIおよび他の基礎転写複合体の構成要素と直接的には相互作用しない。コアクチベーター、コリプレッサー、およびメディエーター複合体を含む、補助制御因子と呼ばれる一群の因子は、転写の過程において中心的な役割を果たすものとして登場してきた。これらの補助制御因子は、DNA結合性TFおよびpol II複合体が特定の遺伝子の転写活性を調節するのを媒介する。
【０００９】
補助制御因子がほとんどすべての遺伝子の発現のために普遍的に必要であることは認識されてきているが、多サブユニットの補助制御因子複合体の必要性に関する詳細な意味合いはまだ直ちに明らかというわけではない。それ自体をDNA結合性TFと基礎転写機構との間に挿入することにより、メディエーター複合体はおそらく、DNA結合性因子からの、さらに最も高い可能性としては他のシグナルからのという両方の多様な制御性入力を調節して、適切に較正された出力をpol II機構に対して提示する、さらなる機会を与えると考えられる。メディエーターは、それに作用するアクチベーターおよびリプレッサーの形態にある多様なシグナルの処理装置としてのその能力からみて、ならびにpol IIと基本転写因子（GTF）との境界面にあるその位置からみて、pol II転写が実際に開始する前の最終的なチェックポイントである。補助制御因子複合体は転写調節におけるの中心的な役割により、興味深い薬剤標的となっている。転写機構のこの箇所での妨害により、研究者らおよび臨床医らが多数の遺伝子の発現を調節または是正することが可能になると考えられる。70〜80個のサブユニットを含む転写複合体は、異なる細胞型において、および異なるプロモーター上で、異なる組成を有する。転写複合体のこの細胞特異的な差異により、転写機構を標的とする潜在的な処置の特異性が保証される。
【００１０】
癌の処置において有用な分子に対する需要は依然としてある。本明細書に開示する本発明は、癌において認められる転写複合体を特異的に標的とする転写因子および分子のアイソフォームを提供することによって、この需要に応える。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、黒色腫細胞における個々の補助因子のアイソフォームを含む、癌特異的転写複合体（CSTC）を同定している。黒色腫特異的アイソフォームに関連した転写複合体（TFC）は、野生型TFCと比較して機能が変化しており、悪性転換の原因となる分子機構の一部である。このため、黒色腫特異的TFCは、黒色腫の処置のための興味深い薬剤標的である。加えて、これらの特異的TFCを、診断用および予後判定用のバイオマーカーとして用いることもできる。個々の黒色腫は補助因子およびTFCの異なるセットを発現するため、多くの現行および新規の薬剤の有効性はTFCの組成に依存する可能性が高い。改変型TFCは、治療的診断法（theranostics）のための、すなわち、特定の処置に対して良好に反応すると考えられる患者を選択するためのツールを与える。さらに、本明細書に記載した転写補助制御因子（transcriptional co-regulator）の癌特異的アイソフォームは、種々の他の癌でも発現されることから、開示された分子および方法の有用性は黒色腫以外にも及ぶ。
【００１２】
本発明は、癌特異的転写複合体（CSTC）を標的とする分子、ならびにCSTC標的化分子（CSTC-targeting molecule）を含む組成物およびキットを提供し、かつ癌の処置および検出のためにCSTC標的化分子を用いる方法を提供する。1つの態様において、本発明は、発現調節配列に機能的に連結されたCSTC標的化分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提供する。別の態様において、本発明は、CSTC標的化分子をコードするオリゴヌクレオチドを提供する。核酸分子は、意図した用途に応じて、センス配向またはアンチセンス配向でCSTC標的化分子をコードしうる。同じく提供されるのは、そのような発現ベクターを含む宿主細胞であり、これをCSTC標的化分子の生産のために用いることができる。いくつかの態様において、核酸分子は検出マーカーによって標識されるか、または薬学的に許容される担体との組成物として提供される。
【００１３】
本発明はさらに、転写補助制御因子の癌特異的アイソフォームによって改変された転写複合体を標的とするペプチドを含む、CSTC標的化ペプチドおよび小分子も提供する。より具体的には、本発明のCSTC標的化分子には、MED24/TRAP100およびそのアイソフォームを含む癌特異的メディエーター複合体ならびにBAF57およびそのアイソフォームを含む癌特異的クロマチン修飾複合体の活性を調節する分子が含まれる。CSTC標的化分子は、個々の用途に適切であるような様々な形態で提供することができ、例えば、可溶性形態にある分子、基質上に固定化されている分子、または薬学的に許容される担体と組み合わされている分子を含む。いくつかの態様において、CSTC標的化分子は検出マーカーによって標識されるか、または薬学的に許容される担体との組成物として提供される。
【００１４】
本発明によって提供される方法には、癌細胞の増殖を阻害するための方法であって、本発明のCSTC標的化分子と癌細胞とを接触させる段階を含む方法が含まれる。典型的には、この分子には、MED24/TRAP100およびそのアイソフォームを含む癌特異的メディエーター複合体ならびにBAF57およびそのアイソフォームを含む癌特異的クロマチン修飾複合体の活性を調節する、ペプチド、オリゴヌクレオチド（例えば、siRNA）、または小分子が含まれる。1つの態様において、ペプチドは、それぞれTRAP100およびBAF57の癌特異的アイソフォームの機能を妨害する、アミノ酸配列
2009543559.tif 000002
を含む。1つの典型的な態様において、ペプチドはさらに、細胞内および核内への送達を容易にするために選択された付加的な配列を含む。例えば、以下のアミノ酸配列のような細胞透過性ペプチド（CPP）を付加することができる：RRRRRRR（SEQ ID NO：3）。核内送達を容易にするペプチドの一例は、アミノ酸配列PKKRKV（SEQ ID NO：4）を有する核局在性シグナル（NLS）である。本発明のペプチドは、
2009543559.tif 000003
のアミノ酸配列を有するペプチドによって例示される。
【００１５】
提供されるその他の方法には、本発明のCSTC標的化分子を対象に投与することによって対象における癌を処置するための方法、腫瘍成長を阻害する方法、癌を検出するための方法、およびアポトーシスを誘導するための方法が含まれる。腫瘍増成長を阻害するための方法、およびアポトーシスを誘導するための方法は、CSTC標的化分子と腫瘍または癌細胞とを接触させる段階を含む。癌を検出するための方法は、CSTCに対して特異的に結合する検出可能な分子と組織標本とを接触させる段階、および検出可能な分子の結合を検出する段階を含む。検出可能な分子の結合は癌を示す。検出可能な分子の例には、CSTCと結合するペプチド、抗体、または他の分子が含まれる。典型的には、癌は黒色腫である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトの癌に対して特異的な転写補助制御因子のアイソフォームを含む癌特異的転写複合体（CSTC）の発見に基づく。これらの分子は、癌の処置および検出のための新規な標的を提供する。さらに、本明細書に記載したデータは、本発明のCSTCに向けられた分子が、癌細胞の増殖の阻害、アポトーシスの誘導および腫瘍成長の阻害に有効であることを示している。本発明はしたがって、様々な癌の検出、モニタリング、および処置のための診断薬および治療薬としてのCSTC標的化分子を提供する。
【００１７】
有望な新規薬剤標的としての転写複合体
転写制御因子は、遺伝子特異的な転写を調節する制御性ネットワークを決定づける。これらのネットワークの制御不全は、遺伝子発現パターンの変化によって特徴づけられる、その数を増しつつある多くのヒト疾患と相関している。このことは、影響を受けた遺伝子の発現を是正して「正常な」発現を回復させるためにTFCを改変する、人工的な転写制御因子および/または分子の開発に向けた盛んな取り組みを促した。数多くの研究グループおよび企業が、遺伝子発現を調節して細胞の分裂および分化を制御する、シグナル伝達系、ほとんどはキナーゼおよびホスファターゼ、ならびに細胞表面分子を標的とした処置戦略の開発に的を絞っている。シグナル伝達分子および細胞表面分子を標的とするすべての潜在的な処置には、細胞型特異性という1つの決定的な問題がある。有効でしかも副作用が最小限であるためには、処置は罹患細胞のみに影響を与えなければならない。シグナル伝達系および表面分子は非常に様々な細胞集団で発現されて機能するため、局在的/限局的な効果を達成することは極めて困難である。
【００１８】
個々の遺伝子の転写調節が細胞型特異的であること、および異なる転写因子複合体がこの特異性の原因であることはよく知られている。本発明者らは、TFCの細胞型特異性を利用して、癌の発生のために極めて重要なタンパク質の発現を調節することを提案する。この目標を達成することは、本発明者らが癌細胞の成長およびアポトーシスを操作することを可能にする。長い間、TFは有効な薬剤の開発のためには困難な標的であるとみなされてきた。最近、数多くの報告が、特定のTFと相互作用して特定のTFCの活性を調節する小分子を開発しうることを示している。
【００１９】
ペプチド薬剤‐転写複合体の標的化
部位特異的なDNA結合の後の、標的遺伝子に対するTFの最終的な作用は、同族のコアプロモーターエレメントに対して基本転写機構（RNAポリメラーゼIIおよび基本転写因子TFII-A、-B、-D、-E、-F、および-H；Roeder, 1996）の動員および/または機能を強化することである。最近の研究では、メディエーターの1つである大型の多サブユニット性コアクチベーター複合体が、DNA結合性TFと基本転写機構との間の直接的な情報交換のための主な経路であると関係づけられている（Malik and Roeder, 2000の総説）。多数のタンパク質/タンパク質相互作用が、メディエーター複合体の特異性および機能を決定づける。種々の転写因子の相互作用表面に相当するペプチドが、標的遺伝子の発現を操作するため（Kalinichenko et al., 2004, Chinmay et al., 2005, Gail et al., 2005）、および疾患を管理するために設計され、使用されている。
【００２０】
多分子複合体の構造の予測への取り組みはほとんど行われていないが、これはおそらく問題の組み合わせによる複雑度の大きさのためである。分子間のペアワイズ相互作用（pairwise interaction）の予測のためにはドッキングアプリケーションが伝統的に用いられている。ドッキングの適用範囲を多分子集合体へと拡張するいくつかのアルゴリズムが開発されている。本発明者らは、これらのアルゴリズムを、オリゴマーおよび多タンパク質複合体の両方の四次構造を予測するために適用している。これらのアルゴリズムは、メディエーター複合体のサブユニットの本来に近い配置を良好に予測した。本発明者らは、これらのコンピュータ計算ツールを利用して、それぞれMED24/TRAP100およびBAF57の癌特異的アイソフォームを含む癌特異的メディエーター複合体および癌特異的クロマチン修飾複合体と相互作用するペプチドの小規模ライブラリーを設計した。これらのライブラリーのスクリーニングにより、黒色腫細胞の成長およびアポトーシスに影響を与えるペプチドが同定された。
【００２１】
別の重要な課題は、転写因子複合体が局在し、それらがその機能を遂行する場所である細胞核への治療用ペプチドの送達である。細胞膜は、生細胞によって能動的には輸入されないペプチドを中に入れないための防御壁として作用する。膜非透過性ペプチドの有効な送達のためにこの障壁を克服する目的で、電気穿孔法およびカチオン性脂質/リポソームを含む、いくつかの化学的および物理的な方法が開発されている。これらの方法は、疎水性高分子を送達するために有効であることが示されている。これらの過酷な方法の欠点は、第1に、それらによって及ぼされる望ましくない細胞効果があることであり、第2に、インビトロ適用に限定されることである。自らの100倍ものサイズのカーゴを伴って、見たところエネルギー非依存的な過程を介して、様々な細胞株の細胞膜を越えて自ら移行する細胞透過性ペプチド（CPP）に関する最近10年間の発見は、インビトロおよびインビボ両方での、細胞へのタンパク質、ペプチド、および小分子の効率的な送達の可能性を切り開いた。すべてのCPPに存在し、一貫して認められる唯一の特徴は、塩基性アミノ酸の含有率が高く、正の実効電荷をもたらすという点である。Rothbardら（2000）は、シクロスポリンAが皮膚Tリンパ球に効率的に送達され、ヘプタ-アルギニンセグメントと連結することによって炎症を阻害したことを示しており、このことは正の電荷が細胞への移行のために必要とされる特徴であることを示唆する。CPPは、インビボにおける効果的な送達、核の標的化、すべての細胞型への適用可能性、カーゴの明らかなサイズ制限がないこと、ならびに外見的には免疫原性、抗原性、および炎症性がないことというような、細胞標的化のために望ましい興味を引く一連の特徴を有する。
【００２２】
細胞透過性ペプチドは、送達ベクターとしての価値があることが明確に実証されている。顕著なレベルの細胞傷害性を伴うことなく、インビトロならびにインビボにおいて疎水性高分子を実際上すべての種類の細胞に効果的に送達するというその能力は印象的である。
【００２３】
CPPとTFC干渉性ペプチドとの組み合わせは、治療用ペプチドによる転写複合体の標的化のための、新しくより効果的なアプローチを切り開く。
【００２４】
癌および転写調節
癌は極めて複雑度の高い疾患である。今日までに、遺伝子の事実上あらゆるサブグループに相当する数千もの遺伝子が、癌と関係づけられている。現在、癌は、突然変異した遺伝子または再編成した染色体を有する増殖性の幹細胞または前駆細胞から発生すると考えられている。これらの遺伝的変化の結果として、腫瘍細胞も非悪性細胞と比較して遺伝子およびタンパク質の発現に変化を有する。遺伝子発現に関する全ゲノム分析により、正常細胞と癌性細胞との間の、さらには癌のタイプ間での特異な違いが明らかに示されている。このことは、特定の遺伝子の発現を決定する制御性ネットワークが悪性細胞と非悪性細胞では異なることを示唆する。
【００２５】
癌患者は、非常に多様な臨床的な経過および転帰を有する。原発性腫瘍の固有の遺伝的異質性は、この多様性に役割を果たすことが示唆されており、それを部分的に説明する可能性がある（Chang, et al., 2003）。病理学的および臨床的な因子は、腫瘍の臨床的挙動を主導する事象の複雑なカスケードを捉えるには不十分である。種々の腫瘍の遺伝子発現パターンに関する広範囲にわたる分析により、組織学的に類似した腫瘍が異なる遺伝子発現パターンを有するという理解がもたらされた。オリゴヌクレオチドおよびcDNAマイクロアレイの手法により、特定のタイプの癌の分子サブグループが同定されている（Perou et al., 2000, Hedenfalk et al., 2001, West et al., 2001, Zajchowski et al., 2001）。腫瘍の分子プロファイリングは、患者の生存性を予測するため、およびアジュバント療法に向けて患者を選択するためにも用いられている（van't Veer et al., 2002, van de Vijever et al., 2002）。
【００２６】
癌特異的TFC‐高い特異性を有する新規薬剤標的
癌細胞のよく知られた特徴は、転写因子を含む種々の制御性分子における突然変異、転写因子の発現不全、タンパク質の特定のアイソフォームをコードするmRNAスプライス変異体の発現、および正常細胞に存在しない翻訳後修飾の存在である。突然変異、および融合タンパク質の発現が、ほとんどあらゆる個々のタイプの癌において記載されている（Leroy H, Roumier C, Huyghe P, Biggio V, Fenaux P, Preudhomme C., CEBPA point mutations in hematological malignancies. Leukemia. 2005 Mar;19(3):329-34；Xia and Barr, Chromosome translocations in sarcomas and the emergence of oncogenic transcription factors. Eur J Cancer. 2005 Nov;41 (16):2513-27）。多数の論文が、癌に特異的な、または癌において豊富なmRNAの選択的スプライス変異体の同定を報告している。例えば、3,471,622種のヒト発現配列タグ（EST）配列を用いた11014種の遺伝子のゲノムワイドコンピュータスクリーニングにより、26,258種の選択的スプライス転写物/mRNAが同定されており、そのうち845種は癌と有意に相関した（Wang et al., 2003）。遺伝子特異的スプライス変異体のいくつかは、予後判定上の価値があることが示されている。ヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子ARNTの選択的スプライス変異体の高発現を伴う患者は、低発現の患者よりも無再発生存率および全生存率が不良である（Qin et al., 2001）。原則として、癌に特異的な、または癌において豊富な選択的スプライスmRNAの発現は、スプライスドナー部位またはアクセプター部位における突然変異とは関係なく、スプライシング因子の発現の変化に起因する。
【００２７】
種々の遺伝子発現データベースおよびESTデータベースを用いた本発明者らのコンピュータでの（in silico）分析により、細胞型および疾患に特異的な発現を有する、メディエーター複合体を含む転写コアクチベーターの多数の選択的スプライス変異体が明らかになった。これらのスプライス変異体のすべてが機能の変化を伴うタンパク質アイソフォームを生じるわけではなく、mRNAの分解を招く潜在性スプライシングとなるものもある。しかし、多くのスプライス変異体が機能性タンパク質へと翻訳されて、癌特異的TFCの一部になると考えられる。これらの変化したTFCは癌の発生に寄与する可能性がある。本発明者らは、MED24/TRAP100およびBAF57のアイソフォームを含むTFCに特異的に影響を与え、黒色腫細胞の増殖を阻止してアポトーシスを誘導するペプチドを作製した。
【００２８】
治療的アプローチ
本発明者らの治療的アプローチは、翻訳後修飾および/もしくは選択的スプライシングによる突然変異および/もしくは変化、ならびに/またはゲノム再編成によって改変されたTFC構成要素を含む、癌特異的転写因子複合体（TFC）の同定に基づく。これらの癌特異的TFCは、正常な非癌性細胞におけるTFCの構造および機能とは異なる構造および機能を有する。
【００２９】
本発明者らのアプローチの一例として、本発明者らは、メディエーター複合体およびクロマチン再構築複合体を非限定的に含む癌特異的TFCの構成要素である転写補助制御因子の数多くの新規アイソフォームを明確に同定した。本発明者らは、これらの変化した複合体のうち2つに的を絞った。
1．MED24/TRAP100の癌特異的アイソフォームを含むメディエーター複合体。
2．BAF57の癌特異的アイソフォームを含むクロマチン修飾複合体。
【００３０】
種々のモデル化ツール、ならびにメディエーター複合体およびクロマチン再構築複合体の組成物、構造および機能に関する最新の知識を用いて、本発明者らは、MED24およびBAF57の癌特異的アイソフォームを含む複合体において特有な潜在的な相互作用を同定し、治療用ペプチドの可能性のあるものを同定した。これらのペプチドはMED複合体およびクロマチン再構築複合体と相互作用し、結果として黒色腫細胞のアポトーシスおよび成長停止をもたらす転写機構を変化させる。
【００３１】
MED24アイソフォーム含有複合体
メディエーター複合体は、異なる機能を有するおよそ30個のタンパク質からなり、種々のシグナル伝達経路に関わって種々の制御シグナル応答を行う。MED24は、特定のMED複合体に存在するMED複合体「尾部」サブユニットの一部である。MED24は、「尾部」モジュールの他のサブユニットであるMED16、MED23、およびMED25と共沈澱する。「尾部」サブユニットへのMED24アイソフォームの組み入れにより、サブユニット構成要素の相互作用が改変され、MED24アイソフォーム特異的複合体を標的とする干渉性分子を設計するという機会が広がる。治療用ペプチドTRAP100 P05は、MED16、MED23、MED24、およびMED25で構成される「尾部」複合体構造と相互作用する可能性が高い。
【００３２】
これらの潜在的な相互作用に基づき、本発明者らは、MED24/TRAP100の癌特異的アイソフォームを含む癌特異的メディエーター複合体「尾部」サブユニットと相互作用する、ペプチドの小規模ライブラリーを設計した。これらのライブラリーのスクリーニングにより、黒色腫細胞の成長およびアポトーシスに影響を与えるペプチドが同定された。このペプチドはMED24アイソフォームの配列を有しておらず、MED複合体の「尾部」サブユニットの変化した構造との結合を介して転写に影響を与えることが見いだされた。
【００３３】
クロマチン修飾複合体
クロマチン修飾複合体は、多数のSWI/SNF/SMARC/BAFタンパク質、ヒストンアセチラーゼ（HAT）、およびヒストンデアセチラーゼ（HDAC）からなる。BAF57はBAF複合体の特定のメンバーであり、これはBAF155、BAF170、ステロイドホルモン受容体コアクチベーター、およびいくつかのHDACタンパク質と直接相互作用する。BAF57の黒色腫特異的アイソフォームは、クロマチン修飾複合体の構造および機能を改変する。本発明者らはモデル化ツールを利用して、BAF57のアイソフォームを含むクロマチン修飾複合体の構造および相互作用における変化を予測した。この情報に基づき、本発明者らはペプチドライブラリーを設計し、このライブラリーのスクリーニングの結果、黒色腫細胞の成長およびアポトーシスに影響を与えるペプチドが同定された。具体的には、本発明者らがBAF57 P12と命名した治療用ペプチドは、BAF155、BAF170、および1つまたは複数の異なるHDAC分子を含むクロマチン修飾複合体サブユニットと相互作用する可能性が高い。
【００３４】
定義
本出願において用いられるすべての科学用語および技術用語は、別途指定する場合を除き、当技術分野で一般に用いられているものと同じ意味を有する。本出願において用いる場合、以下の用語および語句は指定された意味を有する。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」には、天然の源から単離されたか、組換え法によって作製されたか、または化学合成されたかに関わらず、タンパク質の断片およびペプチドが含まれる。本発明のポリペプチド（およびペプチド）は、典型的には少なくとも約6アミノ酸を含む。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「CSTC標的化分子」には、CSTC標的化ペプチド、CSTC標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチド、CSTC標的化ペプチドをコードするものに対して相補的なポリヌクレオチド、CSTCを特異的に認識して結合する抗体、および同じ標的指向活性（targeting activity）を示す他の小分子が含まれる。
【００３７】
「小分子」とは、分子量が2000ダルトン未満、いくつかの態様においては1000ダルトン未満、さらに他の態様においては500ダルトン未満、またはそれ未満である分子を意味する。そのような分子には、例えば、複素環式化合物、カルボキシル化合物、ステロール、アミノ酸、脂質、および核酸が含まれる。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「CSTC標的化」とは、CSTC標的化分子と癌特異的転写複合体との特異的な結合を指し、ここで特異なこととは、CSTC標的化分子が正常または本来の（native）転写複合体とは本質的に結合しないようなことである。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「ベクター」とは、関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を宿主細胞に送達し、好ましくはそこで発現させることが可能な構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNAの発現ベクター、プラスミド、コスミドベクターまたはファージベクター、陽イオン性縮合剤と会合したDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクター、リポソーム中に封入されたDNA発現ベクターまたはRNA発現ベクター、およびプロデューサー細胞などのある種の真核細胞が非限定的に含まれる。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「発現調節配列」とは、核酸の転写を指令する核酸配列を意味する。発現調節配列は、構成性もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーターでもよく、またはエンハンサーでもよい。発現調節配列は、転写させようとする核酸配列に機能的に結合している。
【００４１】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態にあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を指し、別途限定しない限り、天然のヌクレオチドと類似した様式で核酸にハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの公知の類似体も含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「腫瘍タンパク質」とは、腫瘍細胞によって発現されるタンパク質のことである。腫瘍タンパク質は、それが非腫瘍性細胞で発現されなければ、腫瘍特異的である。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」には、有効成分と組み合わせた場合に成分の生物活性を保持し、しかも対象の免疫系との反応性がない、任意の材料が含まれる。その例には、リン酸緩衝生理食塩液、水、水中油型エマルジョンなどのエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤といった標準的な薬学的担体の任意のものが非制限的に含まれる。エアロゾル投与または非経口投与にとって好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または通常の（0.9％）生理食塩水である。
【００４４】
そのような担体を含む組成物は、周知である従来の方法によって製剤化される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990を参照のこと）。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、別途明示する場合を除き、少なくとも1つであることを意味する。
【００４６】
CSTC標的化ペプチド
本明細書に記載したCSTC標的化ペプチドおよびポリペプチドは任意の長さであってよい。本来のタンパク質および/または異種配列に由来する付加的な配列が存在してもよく、そのような配列は転写複合体を調節する能力を保持している。好ましいペプチドは、それぞれTRAP100 P05およびBAF57の癌特異的アイソフォームを含むCSTCの機能に干渉するペプチドである、アミノ酸配列
2009543559.tif 000004
を含む。典型的な態様において、ペプチドはさらに、細胞内および核内への送達を容易にするように選択された付加的な配列を含む。例えば、以下のアミノ酸配列のような細胞透過性ペプチド（CPP）を付加することができる：RRRRRRR（SEQ ID NO：3）。当業者は、Ulo Langel, ed., Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications, Culinary & Hospitality Industry Publications Services (CHIPS), Weimar, Texas, 2002に記載されたもののような、本発明とともに用いるのに適する可能性のある他のCPPを承知している。核内送達を容易にするペプチドの一例は核局在シグナル（NLS）である。典型的には、このシグナルは、正に荷電したリジンまたはアルギニンの少数の短い配列、例えばPPKKRKV（SEQ ID NO：9）からなる。1つの態様において、NLSはアミノ酸配列PKKRKV（SEQ ID NO：4）を有する。本発明のペプチドは、
2009543559.tif 000005
のアミノ酸配列を有するペプチドによって例示される。
【００４７】
当業者は、それらのある種の変異体が癌の処置および検出に有用であることを理解すると考えられる。ペプチド「変異体」とは、本明細書で用いる場合、ペプチドの転写複合体標的指向活性が実質的に減じないような1つまたは複数の置換、欠失、付加、および/または挿入がある点で、本来のCSTC標的化ペプチドと異なるペプチドのことである。言い換えれば、変異体が転写複合体と結合する能力は、本来のタンパク質と比べて高くても変わらなくてもよく、または本来のタンパク質と比べて50％未満、好ましくは20％未満低くてもよい。そのような変異体は一般に、上記のペプチド配列の1つを改変し、改変されたペプチドと標的対象の転写複合体との結合を本明細書に記載した通りに評価することによって同定しうる。好ましい変異体は、同定されたペプチドに対して好ましくは少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％の同一性（上記のようにして決定される）を示す。
【００４８】
好ましくは、変異体には保存的置換が含まれる。「保存的置換」とは、ペプチド化学の当業者であればペプチドの二次構造および疎水性親水性指標の性質（hydropathic nature）が実質的に変化しないと考えるような、あるアミノ酸が類似した特性を有する別のアミノ酸に置換されることである。アミノ酸置換は一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および/または両親媒性における類似性に基づいて作製される。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ；かつ同程度の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。保存的変化に相当しうるアミノ酸の他の群には以下のものが含まれる：（1）ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；（2）cys、ser、tyr、thr；（3）val、ile、leu、met、ala、phe；（4）lys、arg、his；および（5）phe、tyr、trp、his。変異体がまた、追加的または代替的に、非保存的な変化を含んでもよい。好ましい態様において、変異体ペプチドは、5つまたはそれ未満のアミノ酸の置換、欠失、または付加の点で、本来のアミノ酸と異なる。
【００４９】
具体的には、本発明のペプチドのアミノ酸残基は、以下の通りに変異しうる。
MED24 P05に関する変異体残基：
2009543559.tif 000006
BAF57 P12に関する変異体残基：
2009543559.tif 000007
式中、表記された本来の各残基の後に続けて括弧内に代替物が記されている。表記された本来の各残基は、任意でその代替的な残基によって置換することができる。表記された代替物の1つまたは複数を、所与の変異体ペプチド中に用いることができる。そのような変異体ペプチドは、本明細書において「保存的に改変された変異体」と呼ばれる。
【００５０】
本明細書に記載したDNA配列によってコードされる組換えペプチドは、当業者に公知の種々の発現ベクターのうちの任意のものを用いて、DNA配列から容易に調製することができる。発現は、組換えペプチドをコードするDNA分子を含む発現ベクターによる形質転換またはトランスフェクションを受けた任意の適切な宿主細胞において達成されうる。適切な宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞、および高等真核細胞が含まれる。用いる宿主細胞は、大腸菌（E. coli）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、またはCOSもしくはCHOなどの哺乳動物細胞株であることが好ましい。組換えタンパク質またはペプチドを培地中に分泌する適切な宿主/ベクター系から上清を得、市販のフィルターを用いてまず濃縮する。濃縮後に、濃縮物をアフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂などの適切な精製マトリックスに適用する。最後に、組換えペプチドをさらに精製するために、1回または複数回の逆相HPLC段階を行うことができる。
【００５１】
約100アミノ酸未満、一般には約50アミノ酸未満である部分およびその他の変異体を、当業者に周知の手法を用いた合成手段によって生成させることもできる。例えば、そのようなペプチドは、伸長中のアミノ酸鎖にアミノ酸を逐次的に付加するMerrifieldの固相合成法のような、市販の固相法の任意のものを用いて合成してもよい。Merrifleld, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963を参照のこと。ペプチドの自動合成のための装置は、Perkin Elmer/Applied BioSystems Division（Foster City, CA）から市販されており、製造元の指示に従って動作させることができる。
【００５２】
ペプチドは、Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430Aペプチド合成装置にて、FMOC化学物質をHPTU（O-ベンゾトリアゾールN,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）による活性化とともに用いて合成することができる。接合（conjugation）の方法、固定化された表面との結合の方法、またはペプチドの標識の方法を得るために、Gly-Cys-Gly配列をペプチドのアミノ末端に結合させることもできる。固体支持体からのペプチドの切断は、以下の切断用混合物を用いて行いうる：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（40：1：2：2：3）。2時間かけて切断した後に、ペプチドを冷メチル-t-ブチル-エーテル中で沈殿させる。続いて、ペプチドのペレットを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含む水中に溶解し、凍結乾燥させた後に、C18逆相HPLCによる精製を行う。ペプチドを溶出させるには、水中の0％〜60％アセトニトリル勾配（0.1％TFAを含む）を用いるとよい。純粋な画分を凍結乾燥した後に、エレクトロスプレー法または他の種類の質量分析法およびアミノ酸分析により、ペプチドの特徴を調べることができる。
【００５３】
一般に、本明細書に記載したペプチド（融合タンパク質を含む）およびポリヌクレオチドは単離されている。「単離された」ペプチドまたはポリヌクレオチドとは、その元の環境から取り出されたもののことである。例えば、天然のタンパク質は、それが天然の系において共存する材料の一部またはすべてから分離されていれば、単離されている。好ましくは、そのようなペプチドの純度は少なくとも約90％であり、より好ましくは少なくとも約95％、最も好ましくは少なくとも約99％である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部ではないベクター中にクローニングされていれば、単離されているとみなされる。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチド
本発明は、上記のように、1つまたは複数のCSTC標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましいポリヌクレオチドは、CSTC標的化ペプチドをコードする、少なくとも15個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも30個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも35個の連続したヌクレオチドを含む。そのような配列のいずれかに対して完全に相補的なポリヌクレオチドも本発明に含まれる。ポリヌクレオチドは一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）でも二本鎖でもよく、DNA（ゲノム、cDNA、または合成）分子でもRNA分子でもよい。RNA分子には、イントロンを含んでいてDNA分子と一対一に対応するHnRNA分子、およびイントロンを含まないmRNA分子が含まれる。その他のコード配列または非コード配列が、必ずしも存在しているわけではないものの、本発明のポリヌクレオチドの内部に存在していてもよく、ポリヌクレオチドは、必ずしも結合しているわけではないものの、他の分子および/または支持材料と結合していてもよい。そのようなCSTC標的化ペプチドの部分は、組織標本におけるCSTC標的化分子の増幅および検出のためのプライマーおよびプローブとして有用と考えられる。
【００５５】
ポリヌクレオチドは、本来の配列（すなわち、上記のCSTC標的化ペプチドまたはその一部分をコードする配列）を含んでもよく、またはそのような配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチド変異体は、コードされるペプチドの特異的なCSTC結合性が本来のペプチドと比べて減じないような1つまたは複数の置換、付加、欠失、および/または挿入を含む。変異体は、本来のCSTC標的化ペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％の同一性、より好ましくは少なくとも約80％の同一性、最も好ましくは少なくとも約90％の同一性を示すことが好ましい。
【００５６】
2つのポリヌクレオチド配列またはペプチド配列は、下記のように、最大限の対応関係が得られるようにアラインメントを行った時に、2つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、「同一である」と言われる。2つの配列間の比較は典型的には、配列類似性を有する局所領域の同定および比較のために、ある比較ウィンドウ（comparison window）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書で用いる「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約20個、通常は30〜約75個、40〜約50個の一続きの位置を有するセグメントを指し、その比較ウィンドウにおいて、ある配列は、同数の一続きの位置を有する参照配列に対して、2つの配列の最適なアラインメント後に比較されうる。
【００５７】
比較のための配列の最適なアラインメントは、Lasergeneスイート・バイオインフォマティクスソフトウエア（Lasergene suite of bioinformatics software）（DNASTAR, Inc., Madison, WI）に含まれるMegalignプログラムをデフォルトのパラメーターで用いて行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載された、いくつかのアラインメント方式を組み入れている：Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358；Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153；Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17；Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor. 11:105；Santou, N., Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
【００５８】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、最適なアラインメントが行われた2つの配列を少なくとも20個の位置を有する比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、この際、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列またはペプチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加も欠失も含まないもの）と比較して20％またはそれ未満、通常は5〜15％または10〜12％の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。パーセンテージは、同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）で除算し、その結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００５９】
変異体がさらに、または代替的に、本来の遺伝子またはその一部分もしくは相補体に対して実質的に相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、本来のタンパク質をコードする天然のDNA配列（または相補的配列）にハイブリダイズすることができる。
【００６０】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」には、5×SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA（pH 8.0）溶液中での予洗；50℃〜65℃、5×SSでの一晩のハイブリダイゼーション；その後に0.1％ SDSを含む2×、0.5×、および0.2×SSCのそれぞれにより65℃で20分間の洗浄を行うことが含まれる。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は以下のものである：（1）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを50℃で用いる；（2）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤、例えば、50％（v/v）ホルムアミドを、0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％ポリビニルピロリドン/750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）とともに、42℃で用いる；または（3）50％ホルムアミド、5×SSC（0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子DNA（50μg/ml）、0.1％SDSおよび10％硫酸デキストランを42℃で用い、0.2×SSC（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム）により42℃、および50％ホルムアミドにより55℃で洗浄した後に、EDTAを含む0.1×SSC、55℃による高ストリンジェンシー洗浄を行う。当業者は、プローブ長などの要因に対応させるために温度、イオン強度などを必要に応じて調整する方法を認識していると考えられる。
【００６２】
遺伝暗号の縮重性の結果として、本明細書に記載したペプチドをコードするヌクレオチド配列が数多く存在することは当業者に理解されると考えられる。これらのポリヌクレオチドの中には、どの本来の遺伝子のヌクレオチド配列に対してもわずかな相同性しか有していないものがある。しかし、コドンの使用法の違いが理由で異なるポリヌクレオチドは、本発明により明確に想定されている。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子とは、ヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換などの1つまたは複数の変異の結果として変化した内因性遺伝子のことである。その結果生じるmRNAおよびタンパク質は、必ずしも有するわけではないが、変化した構造または機能を有しうる。対立遺伝子は、標準的な手法（ハイブリダイゼーション、増幅、および/またはデータベースの配列の比較）を用いて同定することができる。
【００６３】
ポリヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチド合成を含む、当技術分野で公知の様々な手法のうちの任意のものを用いて調製することができる。関心対象の遺伝子またはそれによってコードされるペプチドを同定するために設計されたプローブを用いて、ライブラリーをスクリーニングすることができる。選択されたプローブによるcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に記載されたもののような標準的な手順を用いて行うことができる。
【００６４】
プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性が最小限に抑えられるように十分に長くかつ十分に非多義的（unambiguous）であるべきである。オリゴヌクレオチドは、スクリーニング対象のライブラリー中のDNAとのハイブリダイゼーション後にそれを検出しうるように、標識されることが好ましい。標識の方法は当技術分野で周知であり、これには32P標識ATPなどの放射性標識、ビオチン化、または酵素標識の使用が含まれる。中程度のストリンジェンシーおよび高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、前記に提示されている。
【００６５】
ポリヌクレオチド変異体は一般に、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成による化学合成を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法（Adelman et al., DNA 2: 183, 1983を参照）などの標準的な突然変異誘発法を用いて、ポリヌクレオチド配列に改変を導入することもできる。または、適切なRNAポリメラーゼプロモーター（T7またはSP6など）を有するベクターにDNAが組み入れられる条件では、CSTC標的化ペプチドまたはその一部分をコードするDNA配列のインビトロまたはインビボ転写によって、RNA分子を生成させることもできる。本明細書に記載したように、コードされるペプチドを調製するために、ある特定の部分を用いることができる。追加的または代替的に、コードされるペプチドがインビボにおいて生成されるように、一部分を患者に投与することもできる（例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞に対して、CSTC標的化ペプチドをコードするcDNA構築物をトランスフェクトし、そのトランスフェクト細胞を患者に投与することによる）。
【００６６】
任意のポリヌクレオチドを、インビボにおける安定性を高めるためにさらに修飾することもできる。考えられる修飾には、5'末端および/もしくは3'末端での隣接配列の付加；骨格にホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを用いること；ならびに/またはイノシン、キューオシン（queosine）、およびウィブトシン（wybutosine）といった通常とは異なる塩基、さらにはアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル化形態、メチル化形態、チオ化形態、および類似の修飾形態を含めることが非限定的に含まれる。
【００６７】
確立された組換えDNA法を用いて、ヌクレオチド配列を様々な他のヌクレオチド配列に連結することができる。例えば、ポリヌクレオチドを、プラスミド、ファージミド、λファージ派生物、およびコスミドを含む、様々なクローニングベクターの任意のものの中にクローニングすることができる。特に関心が持たれるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシークエンシングベクターが含まれる。一般に、ベクターは、少なくとも1つの生物において機能する複製起点、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択マーカーを含むと考えられる。その他の因子は所望の用途に依存すると考えられ、これは当業者には明らかであると考えられる。
【００６８】
ある態様の範囲においては、ポリヌクレオチドが哺乳動物細胞に進入できるように、およびその中で発現できるように、ポリペプチドを製剤化することができる。そのような製剤は、以下に述べるように、治療の目的に特に有用である。当業者は、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現を実現するには多くの方法があること、および任意の適切な方法を用いうることを認識していると考えられる。例えば、ポリヌクレオチドを、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアウイルス、または他のポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルス）などの、ただしこれらには限定されないウイルスベクターに組み入れることもできる。DNAをこの種のベクターに組み入れるための手法は当業者に周知である。レトロウイルスベクターにはさらに、ベクターに標的特異性を付与するために、選択マーカー（形質導入を受けた細胞の同定または選択を補助するため）および/または標的指向部分としての遺伝子、例えば、特定の標的細胞上にある受容体に対するリガンドをコードする遺伝子を導入すること、または組み入れることができる。標的指向化は、当業者に公知の方法によって、抗体を用いて達成することもできる。本発明のペプチドのいくつかの態様は、細胞への侵入の促進のためにペプチド中に組み入れられた細胞透過性ペプチド（CPP）とともに、本明細書において記載されている。
【００６９】
治療目的のその他の製剤には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系が含まれる。インビトロおよびインビボにおける送達媒体として用いるのに好ましいコロイド系には、リポソーム（すなわち、人工的な膜小胞）がある。この種の系の調製および使用法は当技術分野で周知である。
【００７０】
アンチセンス分子および阻害性核酸分子
本発明のアンチセンス分子は、本明細書に記載したようなCSTC標的化ペプチドおよび/または転写モジュレーターの癌特異的アイソフォームをコードする核酸分子の全体または断片に対して実質的に相補的な、または好ましくは完全に相補的な配列が含まれる。これには、コード配列内部のオリゴヌクレオチドの断片、ならびにCSTCおよび/または転写モジュレーターの癌特異的アイソフォームの発現を阻害する阻害性ヌクレオチドも含まれる。特定の遺伝子の新たに生成された核RNA転写物が転写用のmRNAへと成熟するのを防止するために、イントロンとエクソンとの境界にある配列に対して相補的なDNAまたはRNAのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。特定の遺伝子に対して相補的な、siRNAを含むアンチセンスRNAは、その遺伝子のmRNAにハイブリダイズしてその翻訳を防止することができる。アンチセンス分子は、DNA、RNA、またはそれらの誘導体もしくはハイブリッド体でありうる。そのような誘導体分子の例には、ペプチド核酸（PNA）、ならびにホスホロチオエートを基盤とする分子、例えばデオキシリボ核酸性グアニジン（DNG）またはリボ核酸性グアニジン（RNG）などが非限定的に含まれる。
【００７１】
アンチセンスRNAは、インビトロにおいて合成された「そのまま使える（ready-to-use）」RNAとして、または転写後にアンチセンスRNAが生成される、細胞内に安定的にトランスフェクトされたアンチセンス遺伝子として、細胞に与えることができる。mRNAとのハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズした分子のRNアーゼHによる分解および/または翻訳複合体形成の阻害が起こる。これらはいずれも、元の遺伝子の産物が産生されないという結果をもたらす。
【００７２】
本発明のアンチセンスRNA分子およびアンチセンスDNA分子ならびにリボザイムはいずれも、RNA分子の合成を目的とする当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。これらには、固相ホスホルアミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学合成のための手法が含まれる。またはアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のインビトロまたはインビボ転写によって、RNA分子を生成させることもできる。そのようなDNA配列を、T7またはSP6といった適切なRNAポリメラーゼプロモーターを有する多種多様のベクター中に組み入れてもよい。または、アンチセンスRNAを構成性または誘導性に合成するアンチセンスcDNA構築物を、細胞系、細胞、または組織に導入することもできる。
【００７３】
細胞内での安定性および半減期を増大させるために、DNA分子を修飾することもできる。考えられる修飾には、5'末端および/もしくは3'末端に隣接配列を付加すること、または分子の骨格内にホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートもしくは2' O-メチルを用いることが含まれる。その他の修飾には、キメラ性アンチセンス化合物を用いることが含まれる。本発明のキメラ性アンチセンス化合物は、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および/またはオリゴヌクレオチド模倣物による複合構造物として形成されうる。そのような化合物は当技術分野でハイブリッドまたはギャップマー（gapmer）とも呼ばれる。この種のハイブリッド構造の調製について教示している代表的な米国特許には、米国特許第5,700,922号および第6,277,603号が非限定的に含まれる。
【００７４】
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の手法によって首尾良くかつ日常的に作製することができる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems（Foster City, Calif.）を含む、いくつかの製造供給元から市販されている。当技術分野で公知であるそのような合成のための任意の他の手段を追加的または代替的に用いてもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体といったオリゴヌクレオチドを調製するための同様の手法も周知である。
【００７５】
本発明のアンチセンス組成物には、DNA二重らせんにおけるホモプリンの局所的な連鎖を認識し、主溝におけるそれと結合して三重らせんを形成することができるホモピリミジンで構成されたオリゴヌクレオチドが含まれる。Helen, C and Toulme, J J. Specific regulation of gene expression by antisense, sense, and antigene nucleic acids. Biochem. Biophys Acta, 1049:99-125, 1990を参照のこと。三重らせんの形成は、RNAポリメラーゼによる転写を受けるその特定の遺伝子の能力を妨げると考えられる。myc特異的オリゴヌクレオチドを用いた三重らせんの形成が観察されている。Cooney, M, et al. Science 241:456-459を参照のこと。
【００７６】
DNAまたはRNAのアンチセンス配列を細胞に送達することができる。これらの分子が特異的配列を認識する能力を損なわずに、その安定性を延長させ、機能を向上させるための化学的修飾がいくつか開発されている。これらには、DNアーゼによる分解に対するその抵抗性を高めること、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、α-アノマーを含めること、ソラレンなどの種々のインターカレート剤との共有結合によって結合パートナーに対する親和性を高めること、およびポリリジンを含む種々の基との結合によって細胞による取り込みを増加させることが含まれる。これらの分子はmRNA中にコードされている特定の配列を認識し、それらのハイブリダイゼーションはこれらのメッセージの翻訳を妨げるとともにその分解を増加させる。
【００７７】
転写および翻訳の阻害のための、オリゴヌクレオチド、その誘導体および類似体を含むアンチセンス組成物、接合プロトコール、ならびにアンチセンス戦略は以下に全般的に記載されている：Antisense Research and Applications, Crooke, S. and B. Lebleu, eds. CRC Press, Inc. Boca Raton Fla. 1993；Nucleic Acids in Chemistry and Biology Blackburn, G. and M. J. Gait, eds. IRL Press at Oxford University Press, Inc. New York 1990；and Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach Eckstein, F. ed., IRL Press at Oxford University Press, Inc. New York 1991；これらはそれぞれ、その中に参照により組み入れられる引用されたすべての参考文献を含め、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７８】
薬学的組成物およびワクチン
本発明は、薬学的組成物中に組み入れられた、CSTC標的化ペプチド、転写モジュレーターの癌特異的アイソフォーム、ポリヌクレオチド、T細胞、および/または抗原提示細胞を提供する。薬学的組成物は1つまたは複数のそのような化合物を含み、任意で、生理学的に許容される担体も含む。ワクチンは、1つまたは複数のそのような化合物と、非特異的な免疫応答増強物質としての役割を果たすアジュバントとを含む。アジュバントは外因性抗原に対する免疫応答を増強する任意の物質であってよい。アジュバントの例には、従来のアジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（polylactic galactide））、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびリポソーム（その内部に化合物が組み入れられる；例えば、Fullerton、米国特許第4,235,877号を参照）が含まれる。ワクチン調製に関しては、例えば、M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995)を参照のこと。本発明の範囲に含まれる薬学的組成物およびワクチンは他の化合物を含んでもよく、それは生物活性があってもなくてもよい。例えば、他の腫瘍抗原の1つまたは複数の免疫原性部分が、融合ポリペプチドに組み入れられた状態または単独の化合物として、組成物またはワクチンの内部に存在してもよい。
【００７９】
薬学的組成物は、本明細書に記載したようなペプチドの1つまたは複数をコードするDNAを、そのペプチドがインサイチューで生成されるように含むことができる。上記のように、DNAは、核酸発現系、細菌性およびウイルス性発現系を含む、当業者に公知の様々な発現系の任意のものの内部に存在してよい。Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998およびその中に引用された参考文献に記載されたもののような、数多くの遺伝子送達法が当技術分野で周知である。適切な核酸発現系は、患者における発現のために必要なDNA配列（適切なプロモーターシグナルおよび終結シグナルなど）を含む。細菌送達系は、ポリペプチドの免疫原性部分を細胞表面に発現する、またはそのようなエピトープを分泌する細菌（カルメット・ゲラン桿菌（Bacillus-Calmette-Guerrin）など）の投与を伴う。
【００８０】
好ましい態様において、DNAはウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて導入することができ、これには非病原性（欠損性）で複製能のあるウイルスの使用が含まれうる。適切な系は、例えば以下に開示されている：Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989；Flexner et al., Ann. N. Y. Acad Sci. 569:86-103, 1989；Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990；米国特許第4,603,112号、第4,769,330号および第5,017,487号；WO 89/01973；米国特許第4,777,127号；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques 6:616-627,1988；Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991；Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994；Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993；Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993；およびGuzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993。そのような発現系にDNAを組み入れるための手法は当業者に周知である。DNAは「裸の」状態であってもよく、これは例えば、Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692, 1993によって総説されている。裸のDNAの取り込みは、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズの表面にDNAをコーティングすることによって向上させることができる。
【００８１】
当業者に公知の任意の適切な担体を本発明の薬学的組成物に用いることができるが、担体の種類は投与の様式に依存すると考えられる。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式のために製剤化しうると考えられ、これには例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、皮内、または筋肉内投与が含まれる。皮下注射などの非経口投与のための担体には好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、蝋状物質、または緩衝液が含まれる。経口投与のためには、以上の担体または固体担体の任意のもの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムを用いうる。生分解性ミクロスフェア（例えば、乳酸グリコール酸重合体）を、本発明の薬学的組成物のための担体として用いることもできる。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号および第5,075,109号に開示されている。
【００８２】
さらに担体は、製剤のpH、容量オスモル濃度、粘度、透明性、色調、無菌性、安定性、溶解速度、または匂いを改変または維持するための他の薬学的に許容される添加剤を含みうる。同様に、担体は、送達される分子の安定性、溶解速度、放出、または脳血液関門を介した吸収もしくは浸透を改変または維持するためのさらに別の薬学的に許容される添加剤も含みうる。そのような添加剤は、単回投与もしくは多回投与の形態での非経口投与のために、または埋め込んだポンプからの連続的もしくは定期的な注入によるCSF中への直接注入のために通常および慣例的に用いられている物質である。
【００８３】
そのような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化物質、EDTAもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および/または保存料も含みうる。または、本発明の組成物を凍結乾燥物として製剤化することもできる。周知の技術を用いて化合物をリポソーム中に封入することもできる。
【００８４】
様々なアジュバントのうち任意のものを本発明のワクチン中に用いることができる。ほとんどのアジュバントは、抗原を急速な異化作用から防御するように意図した物質、例えば水酸化アルミニウムまたは鉱油など、および免疫応答の賦活物質、例えばリピドA、百日咳菌（Bortadella pertussis）または結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のタンパク質などを含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）；Merckアジュバント65（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオン性または陰イオン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびクィルA（quil A）として市販されている。GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7、もしくは-12などのサイトカインもアジュバントとして用いることができる。
【００８５】
本明細書において提供されるワクチンの範囲において、アジュバント組成物は、主としてTh1型の免疫応答を誘導するように設計されることが好ましい。高レベルのTh1型サイトカイン（例えば、IFN-α、IL-2、およびIL-12）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を促す傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン（例えば、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、およびTNF-β）は体液性免疫応答の誘導を促す傾向がある。本明細書に提供するワクチンの適用後に、患者はTh1型応答およびTh2型応答を含む免疫応答を維持すると考えられる。応答が主としてTh1型である好ましい態様において、Th1型サイトカインのレベルはTh2型サイトカインのレベルを上回る程度で上昇すると考えられる。これらのサイトカインのレベルは標準的なアッセイを用いて容易に評価しうる。サイトカインファミリーに関する総説については、Mosmann and Coffman, Ann. Rev. lmmunol. 7:145-173, 1989を参照されたい。
【００８６】
本明細書に記載した組成物を、持続放出製剤（すなわち、投与後に化合物の緩徐な放出を生じるカプセルまたはスポンジなどの製剤）の一部として投与することもできる。そのような製剤は公知の技術を用いて一般に調製され、例えば、経口的、直腸内、もしくは皮下移植によって、または腫瘍の外科的切除部位のような所望の標的部位への移植によって投与される。持続放出製剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を、担体マトリックス中に分散された状態、および/または律速性の膜に囲まれている貯蔵部内に包含された状態で含みうる。そのような製剤の内部に用いるための担体は生体適合性があり、さらに生分解性であってもよい；製剤により、有効成分の比較的一定したレベルの放出が得られることが好ましい。持続放出製剤内に含まれる活性化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予想される持続期間、ならびに処置または予防しようとする状態の性質に依存する。
【００８７】
治療法および予防法
処置には予防法および治療法が含まれる。予防法または治療法は、1つの部位に1回の時点で単回の直接注射により行ってもよく、または複数の部位に複数回の時点で行ってもよい。投与を複数の部位にほぼ同時に行ってもよい。患者または対象には、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジなどの哺乳動物が含まれる。対象は好ましくはヒトである。
【００８８】
癌は、当技術分野で一般に認められている基準を用いて診断することができ、悪性腫瘍の存在を含む。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的切除および/または放射線療法もしくは従来の化学治療薬の投与のような処置の前または後のいずれかに投与されうる。
【００８９】
ある態様の範囲において、免疫療法は能動免疫療法であり、この場合の処置は内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依拠し、免疫応答修飾物質（本明細書に開示するペプチドおよびポリヌクレオチドなど）の投与により、内因性宿主免疫系を腫瘍または感染細胞に対して反応させる。
【００９０】
他の態様の範囲において、免疫療法は受動免疫療法であり、この場合の処置は、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介しうる腫瘍免疫反応性が確立された作用物質（エフェクター細胞または抗体）の送達を伴い、完全な宿主免疫系には必ずしも依存しない。エフェクター細胞の例には、以上に考察したT細胞のほか、Tリンパ球（CD8+細胞傷害性Tリンパ球およびCD4+ Tヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球など）、キラー細胞（ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞など）、本明細書で提供するペプチドを発現するB細胞および抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージなど）が含まれる。好ましい態様においては、ペプチドを提示するように樹状細胞をインビトロにおいて改変し、これらの改変APCを対象に投与する。本明細書に列挙したペプチドに対して特異的なT細胞受容体および抗体受容体をクローニングし、発現させ、他のベクターまたは養子免疫療法のためのエフェクター細胞に移入することもできる。受動免疫療法に向けて、本明細書で提供するペプチドを、抗体または抗イディオタイプ抗体を作製するために（上記および米国特許第4,918,164号における記載のように）用いることもできる。
【００９１】
投与および投与量
組成物は任意の適切な様式で、しばしば、薬学的に許容される担体とともに投与される。本発明の状況下で対象に細胞を投与するのに適した方法を利用することができる。特定の細胞組成物の投与には複数の経路を用いることができるが、特定の経路によって他の経路よりも迅速かつ有効な反応を得ることができる。
【００９２】
患者に対して投与される投与量は、本発明の状況下では、患者にある期間にわたって有益な治療反応をもたらす、または疾患の進行を抑制するのに十分である必要がある。したがって、組成物は、疾患による症状および/もしくは合併症を緩和、軽減、治癒、もしくは少なくとも部分的に制止するのに、および/または、特異的抗原に対する有効な免疫応答を誘発するのに十分な量として、対象に投与される。これを達成するのに十分な量は「治療的有効量」と定義される。
【００９３】
本明細書に開示した治療用組成物の投与の経路および頻度ならびに投与量は個人によって異なると考えられ、これは標準的な手法を用いて容易に確定することができる。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、注射により（例えば、皮内、腫瘍内、筋肉内、静脈内、または皮下）、鼻腔内（例えば、吸引による）または経口的に投与しうる。1〜10回の投与を52週間にわたって行うことが好ましい。6回の投与を1カ月間隔で行い、その後に追加免疫処置を定期的に行うことが好ましい。個々の患者に対して代替的なプロトコールが適切な場合もある。1つの態様においては、組成物の皮内注射を2回、10日間隔で行う。別の態様においては、長期間、例えば数週間または数カ月にわたって、毎日または2〜3日毎に投薬物の投与を行う。
【００９４】
適切な用量とは、上記のように投与した場合に、抗腫瘍免疫応答を促し、基礎（すなわち、未処置）レベルよりも少なくとも10〜50％高くすることができる化合物の量のことである。そのような応答は、例えば、患者における腫瘍サイズもしくは抗腫瘍抗体のレベルの低下を測定することにより、または患者の腫瘍細胞をインビトロにおいて死滅させうる細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存的な生成により、モニタリングが可能である。そのような治療法はまた、未処置患者と比べて患者における臨床成績の向上（例えば、完全寛解もしくは部分寛解の頻度の上昇、または無病生存期間の延長）をもたらす免疫応答を生じさせることもできるはずである。一般に、1つまたは複数のペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンに関して、1回分の用量に存在する各ペプチドの量は宿主体重1kg当たり約100μg〜5mgの範囲である。適切な容量は患者の大きさによって異なるが、典型的には約0.1mL〜約5mLの範囲と考えられる。
【００９５】
一般に、適切な投与量および処置レジメンは、治療的および/または予防的な利益を得るのに十分な量の有効化合物を提供する。そのような応答は、未処置患者と比べて向上した処置患者の臨床成績（例えば、完全寛解もしくは部分寛解の頻度の上昇、または無病生存期間の延長）を確かめることにより、モニタリングが可能である。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増大は、臨床成績の向上と一般に相関する。そのような免疫応答は一般に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、またはサイトカインアッセイを用いて評価することができ、これらは患者から処置前後に入手した試料を用いて行うことができる。
【００９６】
診断法
本発明は、組織中の癌を検出するための方法であって、本明細書に記載したCSTCまたは転写モジュレーターの癌特異的アイソフォームを認識して結合する分子と組織とを接触させることを含む方法を提供する。分子は例えば、CSTC標的化ペプチド、CSTCまたは転写モジュレーターの癌特異的アイソフォームに向けられた抗体、または癌特異的分子に向けられたオリゴヌクレオチドプローブもしくはアンチセンス分子でありうる。組織は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジ組織などのように哺乳動物に由来するものでよい。組織はヒトのものであることが好ましい。組織には腫瘍標本、脳脊髄液、またはその他の適切な標本が含まれる。1つの態様において、本方法は、ELISA型アッセイの使用を含む。当業者は、標本中の癌特異的分子の検出によって組織中の癌を検出する方法に関する、その他の適切な変法も認識していると考えられる。この方法を、癌に対する処置を受けている患者の組織中の癌特異的分子のレベルのモニタリングに用いることもできる。CSTCを標的とする治療レジメンの初期処置または継続的処置に対しての適切さは、この方法を用いてそのようなレベルをモニタリングすることによって判定することができる。
【００９７】
本発明はさらに、癌細胞の増殖を阻害する分子を同定するための方法も提供する。本方法は、CSTCと候補分子とを接触させる段階、および候補分子がCSTCの生物活性を妨げるか否かを判定する段階を含む。CSTCの生物活性の妨害により、癌細胞の増殖を阻害する分子が示される。代表的な分子には抗体、タンパク質、およびヌクレオチドが含まれる。
【００９８】
キット
本明細書に記載した診断的および治療的な用途に用いるためのキットも本発明の範囲に含まれる。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの1つまたは複数の容器を収容するために区画化されている運搬容器、パッケージまたは容器を含むことができ、容器のそれぞれは本方法に用いるための別個の要素のいずれかを含む。例えば、容器は、検出可能な、または検出可能なように標識しうるプローブを含みうる。プローブは、本発明の癌特異的分子に対して特異的な抗体またはポリヌクレオチドでありうる。キットはまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを含む容器、および/または検出可能な標識、例えば酵素標識、蛍光標識もしくは放射性同位体標識と結合したビオチン結合タンパク質、例えばアビジンもしくはストレプトアビジンなどのレポーター手段を含む容器も含みうる。キットは、本明細書に記載された配列のアミノ酸配列の全体もしくは一部、またはそのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子を含みうる。
【００９９】
本発明のキットは典型的には、上記の容器と、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用上の指示が記載された添付文書を含む、商業上および利用者の観点から望ましい材料を含む1つまたは複数の他の容器とを含むと考えられる。さらに、本組成物が特定の治療的または非治療的な用途に用いられることを示すための標示を容器の表面に用意することもでき、これは上記のもののような、インビトロまたはインビボにおける使用のための指示も示しうる。指示および/またはその他の情報を、キットに同封される挿入物に含めることもできる。
【０１００】
実施例
以下の実施例は、本発明を例示するため、ならびに当業者がそれを実行および利用することを補助するために提示される。これらの実施例は決して本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
【０１０１】
実施例1：転写補助制御因子のアイソフォームの同定
本実施例は、転写補助制御因子の構成要素に関するコンピュータでの（in silico）広範な分析の結果、および活性の変化した新規アイソフォームを同定するために設計されたPCRプライマーの使用を示す。
【０１０２】
材料および方法
原発性腫瘍
外科手術標本を、黒色腫に対する外科手術を受けているヒト患者から入手した。従来の方法を用いて、標本をトリプシン処理し、分析用に調製した。RNAの単離は以下に記載した通りに行った。
【０１０３】
細胞培養
ヒト黒色腫細胞株SK-MEL-28およびWM-266-4は、American Type Culture Collectionから入手した（ATCC；Manassas, Virginia；SK-MEL-28はT. Takehashiにより寄託され、The Memorial Sloan-Kettering Cancer Centerにより設定された譲渡条件の規制を受ける；WM-266-4はM. Herlynにより寄託）。細胞はATCCの推奨に従って培養し（DMEM、10％ FCS、ペニシリン＋ストレプトマイシン）、研究室での2回の継代後に実験に用いた。細胞はそれぞれの処置に関して3連ずつ、24ウェルプレート中で成長させた。細胞を播種して16時間後に処置を開始した。ペプチドを培地に添加し、7日間の実験中は培地を毎日交換した。CPP濃度は10μMであった。
【０１０４】
細胞の計数のために、細胞をCa+2、Mg+2非含有PBS中でトリプシン処理した（0.25％トリプシン、2mM EDTA）。細胞を沈殿させ、100μlのPBS中に再懸濁させて、5μlを計数のために取り出した。
【０１０５】
アポトーシスについては、Biovision Annexin V-Cy3アポトーシスキットを製造元のプロトコールに従って用いて分析した。
【０１０６】
黒色腫細胞における転写補助制御因子のアイソフォームの同定
ヒト黒色腫細胞株SK-MEL-28およびWM 266-4ならびに原発性腫瘍から、RNA単離キット（Qiagen）を用いてRNAを単離した。補助制御因子のアイソフォームを同定するためにRT-PCRを用いた。アイソフォームを分析するために用いたプライマーは表1に提示されている。
【０１０７】
種々の細胞株からの5〜10μgのmRNAをテンプレートとして用いて、第一鎖cDNAを逆転写酵素（SuperscriptII, Life Technologies Inc.）によって合成した。PCR反応は、テンプレートとしてのRT反応物の1割とGC-Rich PCR SystemまたはExpand（商標）Long Distance PCR Systemキット（Roche）とを含む25μlの容量中で、製造元の指示に従って行った。転写補助制御因子の新規な機能性アイソフォームを同定するために、増幅されたすべてのPCR産物のシークエンシングを行って、配列を解析した。
【０１０８】
（表１）ヒト黒色腫細胞における転写補助制御因子のアイソフォームの単離および特徴決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
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【０１０９】
ペプチド
本発明者らは、黒色腫で発現されるTFC（補助制御因子タンパク質BAF57およびTRAP100のアイソフォームを含む）と相互作用する可能性のある、CPP-NLS干渉性ペプチドの小規模ライブラリーを作製した。これらのライブラリーの初期スクリーニングにより、以下の2つのペプチドが同定され、それらをさらに分析した。
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赤‐NLS、青‐CPP、および黒‐模倣ドメイン
CPP‐細胞透過性ペプチド
NLS‐核局在シグナル
【０１１０】
結果
転写補助制御因子のアイソフォーム
本発明者らは、転写補助制御因子の構成要素に関するコンピュータでの（in silico）広範な分析を実施し、機能（活性）の変化した新規アイソフォームを同定するためのPCRプライマーを設計した。同定されたアイソフォームは表1に提示されている。
【０１１１】
TFCの公知の構成および組成ならびにTFCの個々の構成要素の機能に基づき、本発明者らは、MED24のアイソフォームを含むTFCにおける変化を予想した。これらのアイソフォームおよび対応するTFCは黒色腫細胞において特異的に発現されるため、これらのTFCは薬剤開発に適した標的となる。本発明者らはこのため、黒色腫特異的TFCと相互作用し、そのようにしてその機能を妨害して、細胞死（アポトーシス）および/または細胞増殖の停止を招くペプチドを設計した。
【０１１２】
実施例2：黒色腫細胞の増殖およびアポトーシスに対する干渉性ペプチドの効果
BAF57およびTRAP100のアイソフォームを含むTFCのモデル化によって特異的な相互作用が同定され、それは本発明者らが小規模なペプチドライブラリーを合成することを可能にした。黒色腫細胞株SK-MEL-28を用いたこれらのライブラリーのスクリーニングの結果、インビトロにおいて黒色腫細胞のアポトーシスを刺激して成長を阻害する、本発明者らによりBAF57 P12およびTRAP100 P05と命名された2つのペプチドが得られた。
【０１１３】
SMARCE1/BAF57およびTRAP100のアイソフォームのアミノ酸配列。アイソフォーム特異的な独自の配列に下線が施されている。
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【０１１４】
細胞増殖およびアポトーシスに対するペプチド薬剤候補BAF57 P12およびTRAP100 P05の効果を、ヒト黒色腫細胞株SK-MEL-28およびWM 266-4を用いて分析した。治療用ペプチドを10μMの濃度で培地に直接添加した。治療用ペプチドのインターナリゼーションおよび細胞核への移行について、蛍光標識したペプチドを用いて調べた。ペプチドは、細胞との8時間のインキュベーション後に顕著な核移行を示した。このパターンは、アポトーシス化しない細胞では7日間にわたって不変のままであった。対照として、本発明者らはスクランブルペプチド（scrambled peptide）を用いた。これらの実験の結果（表2）は、ペプチドBAF57 P12およびTRAP100 P05が増殖を有意に抑制し、アポトーシスを誘導することを明らかに示している。黒色腫細胞と両方のペプチドとの同時インキュベーションは、処置したほぼすべての細胞において、増殖の完全な阻害およびアポトーシスの誘導を引き起こした。
【０１１５】
（表２）ヒト黒色腫SK-MEL-28細胞およびWM 266-4細胞の増殖およびアポトーシスに対するペプチドBAF57 P12およびTRAP100 P05の効果
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【０１１６】
本発明者らのペプチド薬剤候補の試験および検証により、本発明者らの治療用ペプチドが、表皮内黒色ならびに転移性黒色腫の処置のための実用的な薬剤候補であることが実証された。
【０１１７】
実施例3：CSTC標的化ペプチドを用いたヒト黒色腫異種移植片の処置
本実施例は、4週齡BALB/cOlaHsd-nuマウス（Harlan, UK）におけるヒト黒色腫の発生に対する治療用ペプチドの効果を示す。黒色腫細胞の注射から7日後に、マウスを無作為にそれぞれ10匹ずつの2つの群に分けた。対照動物には、50μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の静脈内（尾静脈）注射を1日おきに3週間行った。被験動物には、ペプチドBAF57 P12およびTRAP100 P05（共に）のそれぞれ50μlのPBS中での濃度0.5mMでの静脈内（尾静脈）注射を1日おきに3週間行った。最後の2回の注射は、フルオレセインで標識したペプチドを用いて行った。
【０１１８】
治療用ペプチド
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最初の部分‐NLS、下線部‐CPP；最後の部分‐模倣ドメイン
NLS‐核局在シグナル；CPP‐細胞透過性ペプチド
【０１１９】
最後の注射から1日後に、マウスを屠殺して皮下腫瘍を取り出し、秤量して、寸法を測定した。腫瘍組織試料を入手して、分子分析に供した。
【０１２０】
結果
皮膚にヒト黒色腫を保有するSCIDマウスにおいて、本発明者らのペプチド薬剤候補の静脈内（全身性）処置は、PBSの静脈内注射を受けた、条件を合わせた対照動物と比較して、黒色腫腫瘍の重量およびサイズを57±18％（33〜85％）減少させた（表3）。
【０１２１】
（表３）インビボにおける腫瘍成長に対するBAF57 P12およびTRAP100 P05の効果
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【０１２２】
皮膚にヒト黒色腫を有する免疫機能低下マウスの、本発明者らの2つのペプチド候補BAF57 P12およびTRAP100 P05による処置により、前記治療用ペプチドが表皮内黒色ならびに転移性黒色腫の処置のための実用的な薬剤候補であることが実証された。
【０１２３】
実施例4：様々な種類の癌におけるBAF57およびMED24のアイソフォームの発現
本実施例は、本明細書に記載したBAF57およびMED24の癌特異的アイソフォームが、黒色腫には限定されず、結腸直腸癌、乳癌、および脳悪性腫瘍を含む他の種類の癌でも発現されることを示す。この検討においては、21例の黒色腫、25例の結腸直腸癌、27例の乳癌、および11例の神経膠芽腫の患者からの外科手術で切除された腫瘍試料を用いて、RNAを単離し、BAF57およびMED24のアイソフォームの発現についてRT-PCR法を用いて分析した。この分析の結果は表4に提示されている。
【０１２４】
外科手術に切除された腫瘍試料から、RNA単離キット（Qiagen）を用いてRNAを単離した。補助制御因子のアイソフォームを同定するためにRT-PCRを用いた。第一鎖cDNAは、5〜10μｇのmRNAを用いて、逆転写酵素（SuperscriptII, Life Technologies Inc.）により合成した。PCR反応は、テンプレートとしてのRT反応物の1割とGC-Rich PCR SystemまたはExpand（商標）Long Distance PCR Systemキット（Roche）とを含む25μlの容量中で、製造元の指示に従って行った。
【０１２５】
（表４）腫瘍試料におけるBAF57およびMED24のアイソフォームの発現
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【０１２６】
参考文献
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【０１２７】
本発明の具体的な態様を本明細書において例示の目的で説明してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更を加えうることは、前記のことから理解されると考えられる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲以外により制限されることはない。
【配列表】
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【国際調査報告】
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