(57)【要約】  バリア構造５（１１、１２’、１１１）で分離された第１の流体チャンバ（４、４’、１０４）及び第２の流体チャンバ（８、８’’、１０８）を有する電解質系（２、２’、２‘’）内で時変イオン電流を検知するための装置及び方法であって、バリア構造（１１、１２’、１１１）は、厚壁（１２．１１２）と、オリフィス（２２、２２’、１２２）を有する基板（１４、１１４）とを含み、第１（４、４１’、１０４）の流体チャンバ及び第２（８、８’、１０８）の流体チャンバが、オリフィス（２２、２２’、１２２）を介して連通する、装置及び方法が提供される。電位が、第１（４、４’、１０４）の流体チャンバ及び第２（８、８’、１０８）の流体チャンバの各流体チャンバ内の電極（１８、１９、１１８、１１９）の間に印加され、それによって、電流がオリフィス（２２、２２’、１２２）を通じて電極間で駆動される。システムの総静電容量は１０ｐF未満である。
2009540332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電解質系内の時変イオン電流を検知するための装置であって、
第１の電解質流体を含む電解質槽を画定する第１の流体チャンバと、
第２の電解質流体を含む検知ボリュームを画定する第２の流体チャンバと、
壁部、及びオリフィスが配置された基板を含むバリア構造であって、該バリア構造は、前記第１の流体チャンバ及び前記第２の流体チャンバを分離し、該第２の流体チャンバは、前記オリフィスを介して該第１の流体チャンバと連通する、バリア構造と、
前記オリフィスを通るイオン電流を駆動するために、前記バリア構造の両端に電位差を確立するための電圧源と、
前記第１の流体チャンバから前記第２の流体チャンバまで前記オリフィスを通過する前記時変イオン電流を検知し、それによってイオン電流信号を生成するように位置決めされる電極と、
配線によって前記電極に接続されると共に前記バリア構造の近傍に配置される増幅器であって、該増幅器は前記イオン電流信号を増幅し、該増幅器の入力における総静電容量は１０ｐＦ未満である、増幅器と
を備える、装置。
【請求項２】
前記第１の流体チャンバと前記第２の流体チャンバとを結合する総静電容量は２ｐＦ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１の流体チャンバと前記第２の流体チャンバとを結合する総静電容量は０．２５ｐＦ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記配線の長さは５ｃｍ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記基板は少なくとも２５μｍの厚さを有し、前記基板の前記流体に曝露される部分の面積は１ｍｍ２未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記基板は１μｍ未満の厚さを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記壁部は少なくとも０．２ｍｍの厚さを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記壁部は少なくとも０．４ｍｍの厚さを有する、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記バリア構造は管状であり、一端でシールされる、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記バリア構造はシリコンウェーハである、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記オリフィスをシールする膜をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記オリフィスの直径は１０μｍ未満である、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記オリフィスの直径は５０μｍ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記膜を通って延在するイオンチャネルをさらに備える、請求項１１に記載の装置。
【請求項１５】
前記膜は細胞膜である、請求項１１に記載の装置。
【請求項１６】
前記膜は、前記基板の検知ボリューム側で前記オリフィスをシールする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１７】
前記オリフィス上への前記膜のシールを支援するようになっている前記基板上のコーティングをさらに備える、請求項１１に記載の装置。
【請求項１８】
前記イオンチャネルは、前記基板の内壁によって前記オリフィス内にトラップされる、請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
検体を前記オリフィスに輸送するようになっているマイクロ流体チャネルをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
検体を前記オリフィスに輸送するようになっている毛細管をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
前記毛細管は前記検知電極を支持する、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
電解質系内の時変電流を検知するための装置であって、
第１の電解液を含む電解質槽を画定する第１の流体チャンバと、
第２の電解液を含む検知ボリュームを画定する第２の流体チャンバと、
オリフィスが配置された基板を含むバリア構造であって、該バリア構造は、前記第１の流体チャンバ及び前記第２の流体チャンバを分離し、該第２の流体チャンバは、前記オリフィスを介して該第１の流体チャンバと連通する、バリア構造と、
前記バリア構造の両端に電位差を確立し、前記オリフィスを通るイオン電流を駆動するための手段と、
前記第１の流体チャンバから前記第２の流体チャンバまで前記オリフィスを通過する前記時変イオン電流を検知する手段であって、それによってイオン電流信号を生成する、手段と、
配線によって前記電極に接続されると共に前記バリア構造の近傍に配置される増幅器であって、該増幅器は前記イオン電流信号を増幅し、該増幅器の入力における総静電容量は６ｐＦ未満である、増幅器と
を備える、装置。
【請求項２３】
オリフィスを含むバリア構造によって第２の流体チャンバから分離された第１の流体チャンバを含む電解質系内の時変イオン電流を検知する方法であって、前記第２の流体チャンバは、前記オリフィスを介して前記第１の流体チャンバと連通し、該方法は、
検体を前記第１の流体チャンバ内に配置すること、
前記バリア構造の両端に電位差を確立し、前記オリフィスを通る時変イオン電流を駆動すること、及び
前記第１の流体チャンバから前記第２の流体チャンバまで前記オリフィスを通過する前記時変イオン電流を検知することであって、増幅器入力での総静電容量は１０ｐＦ未満である、検知すること、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記オリフィスを膜でシールすることであって、それによって、前記膜の部分を前記オリフィス上に懸架する、シールすること、及び
前記バリア構造をガイドとして使用して、イオンチャネルを前記膜の前記部分上に配置すること、
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検体に対する前記イオンチャネルの反応を記録することをさらに含む、請求項２４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電解質検知システムの技術に関し、より詳細には、改良された感度及び帯域幅を有する、電解質環境内で時変イオン電流を検知する装置及び方法に関する。
[関連出願の相互参照]
本願は、２００６年６月１５日に出願された「System for Improved Ion Channel Recordings and Related Measurement of Objects and Analytes in Solution」と題する米国仮特許出願第６０／８１３，７１２号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
小流体領域の導電性の測定は、多くの用途において重要なものである。例えば、流体中に懸濁したウィルスのような小さな粒子を、抵抗性パルス法（resistive pulse technique）を使用して、すなわち、ウィルスがオリフィスを通過するときに平均流体導電率に発生させる瞬間的な変化を測定して計数することができる。近年、細胞の膜壁を通って延在する実体の導電率の変動を測定することが科学的及び技術的に極めて重要になった。このような実体は、タンパク質細孔、イオンチャネル、トランスポータ、及び関連する実体（以下、イオンチャネルというグループ名で示す）を含み、細胞への及び／又は細胞からの特定のイオンの通過を制御する。イオン束が運ぶ電流によるイオン束の測定は、放射性トレーサ等のような他の方法よりも容易、高速、且つ基礎的である。
【０００３】
イオンチャネル活動の電気測定は、Hodgkin及びHuxleyによる、「イオン伝導」と呼ばれるチャネルの同種集団を通じて流れる電流の特定に遡る。１度に１分子ずつ単一チャネルタンパク質を通る電流測定は、Haydon及びHladkyの研究から開始された。彼らは、単一のグラミシジンチャネルを通る電流が矩形経時変化を有し、開期間（duration of opening）がHodgkin及びHuxleyによって研究された時間依存プロセスに対応するのに対して、チャネルを通る電流の振幅が彼らによって記録された「瞬間電流」に対応することを発見した。
【０００４】
今日まで、数百種のイオンチャネルが電気的方法によって調べられており、数千のイオンチャネル及びトランスポータが未研究である。チャネル電流は、現在測定不能（〜０．２ピコアンペア（ｐＡ））から数百ｐＡまで様々である。実際には、生物学的及び医学的に重要なイオンチャネルの多くは測定不能の単一チャネル電流を有し、その伝導性は、多くのイオンチャネルの巨視的測定から推定しなくてはならない。小さな電流変化を記録可能である必要がある上に、多くのイオンチャネルの移動速度は既存の記録システムの応答時間よりも速いため、これらのチャネルが測定不能になってしまうと一般に考えられている。
【０００５】
イオンチャネルの記録における大きな進歩が、薄壁の延伸ガラスピペットを細胞膜に押しつけることで単一チャネル電流の記録を可能にしたパッチピペット法（patch pipette method）を開発したSakmann及びNeherによってもたらされた。このようなシステムの一例を図１に示す。図示されていないが、通常、パッチクランプ装置全体は、拾われる電磁ノイズを最低限に抑えるために、導電性シールド内に収容される。吸引によって膜をピペット内に数ミクロン引き込み、それによって、ガラス表面に接する膜の面積を増大させることで、測定忠実度を大幅に増大させることができることが分かった。基本的に、ピペットは手で位置決めされる。自動細胞パッチシステムでは、細胞は吸引によってガラス又はシリコンの表面にあるミクロンスケールのオリフィスに引き込まれる。いずれにせよ、細胞が付着すると、先鋭な電極を使用して細胞膜を突き通すか、又は測定領域に付着した細胞膜のパッチを引きはがして、細胞の内表面側のイオンチャネルの部分を槽内で電解液に曝露させることによって、イオンチャネルを通る電気回路を完成されなければならない。
【０００６】
代替のより直接的な手段は、イオンチャネルを組み込んだ膜を作り、その膜をテフロン（登録商標）のような固体材料にあるオリフィス（通常、直径１００ミクロン又はマイクロメートル（μｍ）程度）上に膜を懸架するか、又は場合によってはポリマーテザー（polymer tether）を介して固体電極表面で膜を支持することである。このように懸架された人工膜システムの一例を図２に示す。図示されていないが、通常、このシステムは導電性シールドによって囲まれる。前者の方法では、膜の両側から巨視的にアクセスすることができるが、非常に脆い。後者は頑強であるが、脂質又はポリマーテザーの化学的性質によって、電解質に対して主に容量性（すなわち、交流電流（ＡＣ））の結合を有する不活性電極（例えば、金）を使用しなければならない。これに加えて、膜と固体表面との間の領域内の非常に小さな流体ボリュームが、膜を横切るイオン濃度勾配の蓄積によって、チャネル電流の測定に従来の直流電流（ＤＣ）方法を使用することを妨げる。
【０００７】
測定の感度及び帯域幅の点で、従来のイオンチャネル記録は第１段増幅器の電流ノイズによって制限され、第１段増幅器の電圧ノイズによって発生する実効電流ノイズが、増幅器入力での総静電容量に作用する。
【０００８】
図１を参照すると、膜２０１及び電解質槽２０２を含む典型的なパッチクランプシステム２００は、以下の性質を有する。第１段増幅器２０４の入力静電容量は１５ピコファラッド（ｐＦ）である。ピペットホルダ２０８の静電容量は１〜５ｐＦで変化し、ピペット２１２の静電容量も１〜５ｐＦである。金属シールド（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を有するホルダには、より大きなピペット静電容量が関連付けられる。しかし、パッチピペットの薄壁先端を槽２０２内に浸すと、１ｐＦ／ｍｍ程度のさらなる静電容量が発生する。ピペット先端をごくわずかな距離だけ浸すことが可能であるが、それはセットアップが面倒であると共に、蒸発に起因して流体の液位が変化するため、任意の時間長にわたって実施することが難しい。先端の浸される典型的な距離である５ミリメートル（ｍｍ）の場合、追加される静電容量は５ｐＦであり、非常に薄い壁を有するピペット先端の基本的な結果である。電極２２４からシステム電子回路に延びる配線２２０の静電容量は、配線の直径及び長さに依存する。配線が直径１ｍｍであり、２０センチメートル（ｃｍ）長であり、シールド（図示せず）が１０ｃｍ〜１メートル（ｍ）離れていると仮定すると、配線の静電容量は１．５〜２．１ｐＦである。まとめると、増幅器入力における総静電容量は２５〜３０ｐＦの範囲である。
【０００９】
通常、人工膜装置２２８の静電容量はより高い。図２を参照すると、第１段増幅器２３０、及び当該第１段増幅器２３０を電極２３６に繋ぐ接続配線２３４に対しては、同じ静電容量値が見られるが、２つの流体ボリューム２４０及び２４２を分けるテフロンシート２３９上に懸架される膜２３８は、パッチピペットシステムの膜２０１よりも１，０００〜１０，０００倍大きな面積を有する。これは、５〜１００ｐＦの範囲の追加のシャント静電容量を発生させる。これに加えて、電解質槽の測定側、すなわち流体ボリューム２４０の静電容量は、槽の半径に伴って線形的に増減する静電容量を発生させ、通常、少なくとも１ｐＦである。全体的に、従来技術の人工膜装置の増幅器入力における総静電容量は２２〜１２０ｐＦである。
【００１０】
上記従来技術のシステムは、測定ノイズに対する内部寄与がおおよそ等しいという意味で適切に最適化されている。例えば、総入力静電容量に対して作用する電流ノイズ及び電圧ノイズはおおよそ等しい。しかし、これは、第１段増幅器設計における既知の入力インピーダンスとのトレードオフを表し、２つの従来の種類の測定装置は最終的に、それらの機械設計に固有の限界に達する。パッチピペットの場合、この限界はピペットそれ自体である。テフロンカップの場合、この限界は膜の面積である。結果として、パッチピペット及び関連する人工二重層測定が行われてきた約２０年間、感度及び帯域幅の改良はほんのわずかしかなく、そういった改良はほぼすべて、電子技術の進歩によるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記に基づき、イオンチャネル記録を実質的に改良するシステムに対する需要が存在する。このようなシステムは、適切に最適化された既存の技術によって得られる感度及び帯域幅を改良するために必要とされる電気的性質を提供しなければならず、且つ現行技術よりも使用し易さが同等以上であると共に、費用が同等以下でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、電解質検知装置又は時変イオン電流を検知するシステム及び方法を対象とする。本発明によれば、装置は、電解質で充填され、１つ又は複数のオリフィスを内部に有する基板によって隔てられた第１及び第２の流体ボリューム又はチャンバを含む。対象の検体（複数可）が一方又は両方のチャンバ内に導入される。装置は、第１のチャンバ又は電解質槽内に位置決めされる第１の電極と、第２のチャンバ又は検知ボリューム内に位置決めされる第２の電極とをさらに含む。第１の電極と第２の電極との間に電位差を確立することによって、電界が発生する。この電界は、流体ボリュームを結ぶ１つ又は複数のオリフィスを通じてイオン電流を流す。高感度電気読出し回路が、各オリフィスを横切って接続され、第１段増幅器の入力に接続された主に抵抗性（例えば、ファラデー性）の電極又は主に容量性の電極のいずれかを使用して第１のチャンバ及び第２のチャンバに結合される。次に、この増幅器は、続く増幅器段に接続される。
【００１３】
好ましくは、オリフィスは、１つ又は複数のイオンチャネルを挿入することができる１つ又は複数の膜によって覆われる。膜が付着したオリフィスの電気抵抗は、１ギガオーム（ＧΩ）程度であり、イオンチャネル電流と並列に流れる電流を最低に抑えるために、好ましくは１ＧΩより高い。代替的に、例えば、オリフィスを通過する粒子に起因する電流変化を検出するために、装置は、オリフィスが膜でシールされない状態で動作する。しかしこの場合、本発明は、好ましくは、より高い周波数で利用される。例えば、直径２０ナノメートル（ｎｍ）を有するオリフィス（ガラス及びシリコンにナノスケールのオリフィスを作成するに当たってのおおよその最新技術）は、１０メガオーム（ＭΩ）程度の１モル（Ｍ）塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液で充填されたときに伝導性を有する。この場合、本発明は、好ましくは、１キロヘルツ（ｋＨｚ）を超える信号を測定するために利用される。より大きなオリフィス又は複数のオリフィスの場合、装置が最適に動作する周波数は、総導電率の変化に線形比例して高くなる。
【００１４】
膜は、ペイント法、小胞融合、又は当該技術分野において既知の他の方法によってオリフィス上に形成することができる。膜の形態は基板表面の疎水性に依存する。膜は、脂質二重層、又は同様の性質を有する任意の材料、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成することができる。これに加えて、膜は、パッチクランプに使用されるように生体細胞から抽出することもできる。
【００１５】
上述した従来技術のシステムとは対照的に、本発明によって構築されるシステムは、２〜１０ｐＦという、増幅器自体を含む増幅器入力における総静電容量を有する。この静電容量の劇的な低減は、システムの内部ノイズ又は電流ノイズの低減を提供し、それによって、感度の大幅な増大を提供する。この改良は、抵抗パルス技法が粒子の数及びサイズの測定に利用される場合でのようにシステムオリフィスが開いているか否かに関わらず、又は膜及びイオンチャネルがオリフィスをわたって存在するか否かに関わらず、利用することが可能である。さらに、内部ノイズの低減によって、測定を従来技術のシステムの範囲をはるかに超えた帯域幅で行うことが可能になる。感度の向上に起因して、装置では、より低いイオンイオン電流の使用が可能である。これによって、より低いバイアス電圧を使用しての実施、又はより低濃度の電解質を使用しての実施が可能になる。有利なことに、本発明のシステムは、使用のし易さが従来技術の同等以上であるとともに、費用が同等以下である。
【００１６】
本発明は、３つの特定の手法を組み合わせて、第１段増幅器入力に結び付けられる静電容量を最低に抑えることによって高い測定感度及び帯域幅を提供する。第１に、装置は、１０μｍ未満、膜がオリフィスをシールしない場合には５０ｎｍ未満の横寸法を有するオリフィスを含む。第２に、非常に小さなオリフィスの静電容量を利用して、１つ又は複数のオリフィスを含む基板を横切って現れる第１の流体ボリュームと第２の流体ボリュームとを結ぶ静電容量は、１ｐＦ未満であり、好ましくは０．２５ｐＦ未満である。これは、流体に曝される基板の面積を最低限に抑えると共に、基板を十分に厚くすることによって達成される。第３に、測定電極及び第１段増幅器は、ナノスケールオリフィスの５ｃｍ以内に集積され、新規の回路設計及びパッケージングが、小さな全体ボリューム内の非常に高い入力インピーダンスに対して非常に高い感度を提供する。
【００１７】
この好ましい構成を使用すれば、小さな流体オリフィス又はイオンチャネルを通じて流れるイオン電流は、従来の方法をはるかに超える感度及び帯域幅で測定される。対象の基本パラメータは、イオン電流の時間に伴う変動である。しかし、場合によっては、膜の漏れ電流のような他の物理的な変動、又は別の定常状態若しくは準定常状態の性質が対象パラメータであってもよい。膜を通って延在するイオンチャネルの好ましい実施形態では、イオンチャネルはその自然な形態であってもよく、又は特定の性質に対する要望に応じて設計するか若しくは他の態様に変更してもよい。本発明の特別の用途は、イオンチャネル内の離散した導電状態を測定することである。これらの状態は、濃度及び種を別個に特定することができるように、検体の存在下で確率的に変化する。本発明の別の用途は、従来のクールター計数器のように、オリフィス内の検体の存在によって発生する抑圧効果によって導電率が簡単に測定される場合、チャネル電流を測定することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的、特徴、及び利点が、好ましい実施形態の以下の詳細な説明を図面と共に理解すれば容易に明白になるであろう。同様の参照番号は、いくつかの図の対応する部分を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】従来技術のパッチクランプ検知システムを示す図である。
【図２】従来技術の人工膜検知システムを示す図である。
【図３】本発明によって構築される装置の断面図である。
【図４】脂質膜を含む、図３のオリフィスの部分断面図である。
【図５】本発明の装置の代替の実施形態の断面図である。
【図６】細胞膜を含む、図３のオリフィスの部分断面図である。
【図７】図３の検知ボリューム及び毛細器具の部分断面図である。
【図８】毛細器具が電極である、図７の代替の実施形態の部分断面図である。
【図９】本発明の装置の連続サンプリング実施形態の図である。
【図１０】本装置の感度と従来のパッチクランプ及び人工膜システムの感度とを比較する表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
最初に図３を参照すると、本発明によって構築される電解質検知装置又はシステムは、全体的に２で示される。検知システム２は、内部に第１の電解質６が提供される第１の流体チャンバすなわち電解質槽４と、第２の電解質１０が提供される第２の流体チャンバすなわち検知ボリューム８とを備える。検知ボリューム８は、少なくとも１ＧΩ、好ましくは１ＧΩを超える電気抵抗を有するシール（図示せず）を使用して接合される厚壁バリア１２及び基板１４で構成されるバリア構造１１によって電解質槽４から分離される。代替的に、基板１１は、鋳込み又は成形等によって単一のユニットとして形成してもよい。図示の実施形態では、構造１１は管の形態である。しかし、構造１１が様々な幾何学的形状であってもよいことを理解されたい。
【００２１】
取り付け基板１６が、電解質槽４及び検知ボリューム８の上部にわたって延在する。測定電極１８及び１９が、取り付け基板１６を通って電解質槽４及び検知ボリューム８内にそれぞれ延在する。本発明によれば、壁１２は、導電率の非常に低い材料で作られ、好ましくは、少なくとも０．２ｍｍの厚さであり、内径は１ｍｍである。このような壁の厚さ及び直径は、式Ｃ＝２πε／ｌｎ（ｄｏｕｔｅｒ／ｄｉｎｎｅｒ）によって与えられるように、壁１４の沈められる長さ１ｍｍ当たりで０．１ｐＦ／ｍｍの静電容量を発生させる。より好ましくは、壁１２の厚さは少なくとも０．４ｍｍであり、これは、単位長さ当たりで、０．０６ｐＦ／ｍｍの静電容量を発生させる。
【００２２】
内径１ｍｍを有する構造１１では、基板１４を横切って電解質槽４に面する電解質１０の面積は０．７８ｍｍ２である。基板１４は、好ましくは、少なくとも２５μｍの厚さであり、これは式Ｃ＝εＡ／ｔに従って１ｐＦの静電容量を提供する。式中、ｔは基板１４の厚さである。基板１４の平均厚は、より好ましくは少なくとも５０μｍであり、２つの電解質ボリューム４と８とを結合する静電容量を０．５ｐＦ以下に制限する。これらの計算では、便宜上、円形断面が仮定されているが、正方形断面又は他の任意の幾何学的形状を利用してもよいことを理解されたい。全体的に、構造１１を通って内部電解質ボリューム８を外部電解質ボリューム４に結合する静電容量は、好ましくは、２ｐＦ未満であり、より好ましくは０．２５ｐＦ未満である。
【００２３】
基板１４はオリフィス２２を含む。オリフィス２２は、好ましくは、膜ありで利用される場合には１０μｍ未満であり、膜なしで利用される場合には５０ｎｍ未満である。両事例において、性能は、オリフィスの面積の低減に伴って向上する。しかし、膜シールの場合に直径３μｍ未満であると、膜の両端の静電容量は、入力における他の静電容量と比較して小さく、それ以上の有意な向上は達成されない。膜なしの場合、オリフィスの直径は可能な限り小さくあるべきであり、好ましくは２０ｎｍ未満であり、より好ましくは１０ｎｍ未満であるべきである。このナノスケール型オリフィス２２は、トラックエッチング法、従来のシリコン加工、又は配線をガラス内にシールし配線を取り出す方法によって構築することができる。オリフィス２２は、オリフィス２２の狭窄に続く流体（電解質）の電気抵抗を最低に抑えるために、円錐形に示されている。しかし、オリフィス２２が円錐形であることは重要なことではなく、オリフィス２２の上方に位置決めされるイオンチャネルに続く電気抵抗がイオンチャネル抵抗のおおよそ１０倍未満である限り、円筒形又は他の任意の形状を使用してよい。
【００２４】
基板１４は、ポリイミドのようなプラスチック、導電性の非常に低いシリコン、ガラス、石英、サファイア、又は任意の等価の材料で作られる。基板１４に対する主な要件は、導電率が低く、誘電正接が低く、且つ好ましくは、高抵抗電気シールを有する膜を支持するのに十分に平坦であることである。基板１４及び分離壁１２は、好ましくは、同じ材料から作られる。シリコンのようなウェーハ基板が使用される場合、従来の半導体加工方法によって電解質に曝される基板１４の面積を実質的に低減することが可能である。面積が低減されれば、基板１４をはるかに薄くすることができ、それでもなお、十分に小さな静電容量を提供することができる。オリフィス２２を従来のフォトリソグラフィ方法によって製造する場合、電解質に曝される基板面積は、基板１４が、好ましくは、１μｍ未満の厚さを有するように選択される。
【００２５】
厚壁１２及び電解質槽４の外壁２４は、取り付け基板１６によって共に接続される。上述したように、測定電極１８及び１９は取り付け基板１６に接続され、電解質槽４内の電解質６及び検知ボリューム８内の電解質１０にそれぞれ接する。電極１８及び１９は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）のような従来の不分極型であってもよく、又は全体的にＡＣ方法が使用される場合には白金（Ｐｔ）のような非反応性材料のものであってよい。
【００２６】
第１段増幅器２６が、増幅器２６を電極１９に接続する配線２７の長さを最小限に抑えるために、取り付け基板１６上に直接取り付けられる。好ましくは、配線２７は５ｃｍ以下であり、より好ましくは２ｃｍ未満である。さらに、増幅器２６に関連付けられる回路は、浮遊容量をさらに最小に抑えるためにガード回路及び接地回路（図示せず）並びに関連するフィードバック制御ループ（別個に記されない）を備える。１つ又は複数の穴２８が取り付け基板１６に作られて、電解質６、１０及び検体２９を出し入れすることができるようにする。
【００２７】
電極１８と電極１９との間でイオン電流を駆動するための電圧は、図３に示すように印加することができる。好ましくは、電圧源１７が槽電極１８に接続され、システム電気接地を基準とする。読出し増幅器２６は、正の入力が接地に接続された電流−電圧変換器モードで接続される。代替的に、電圧源１７を増幅器２６の正の入力端子に接続することがより好都合なこともある。これに加えて、高インピーダンスバッファに接続された別個の電極（図示せず）を槽４内に浸すことができる。この基準電極の出力は、槽４の電位のより直接的な測定を提供するために、別個に記録することができる。
【００２８】
電極６及び１０は、通常、０．１Ｍ  ＫＣｌのような従来の生体適合溶液（biocompatible solution）であるが、非生物学的用途の場合、多種多様な導電性流体又は溶液を使用してよい。使用に際して、電圧源１７が利用されて、電位が電極１８と電極１９との間に印加され、電極１８と電極１９との間に電流が駆動され、ナノメータサイズのオリフィス２２を通る。駆動電圧は、イオンチャネル電流の測定に使用される従来の慣例でのようにＤＣであってもよく、又はＡＣ駆動を使用してもよく、結果として得られる電流は、当業者に既知の方法によって実証されている。対象基本パラメータは、図４に示すように、ターゲット検体２９に応答して、槽４から検知チャンバ８にオリフィス２２を通過する時変イオン電流Ｉｃである。
【００２９】
図示のように、基板１４は、電解質槽４と検知ボリューム８とを分離する。場合によっては、オリフィス近傍の物体の存在を、オリフィスを通過する電流に対するそれらの影響によって検出するために、さらなる変更なしでそのままオープンオリフィス２２を使用してもよい。しかし、オリフィス２２は、好ましくは、（図４に示されるように）脂質二重層若しくは二脂質膜３０、ＰＤＭＳのような同等の材料、液膜、又はさらには何らかの様式でイオンチャネル挿入が可能な固体材料を通って延在する。膜は、ペイント法、小胞融合、又は当分野において既知の別の方法によってオリフィスの上方に形成することができる。膜の形態は、基板表面の疎水性に依存する。好ましくは、膜３０は、電解質槽４と電解質１０との間に１０ＧΩ程度の電気抵抗（シール抵抗）を発生させる。特に、ガラス上の脂質膜が１０ＧΩ以上のシールを生成することが分かっている。
【００３０】
膜３０の場合、二重層の構成は基板１４の表面性質に依存する。ガラスのような親水性基板の場合、膜３０は、図４及び図６〜図８に示すように、基板１４の表面全体にわたって小さな水３１のクッション上に単一の二重層として形成される。しかし、基板１４がテフロン（登録商標）のような疎水性材料から作られる場合、又は基板１４の外表面が疎水性材料でコーティングされる場合、二重層はオリフィス２２上の領域にのみ形成される。
【００３１】
最も好ましくは、膜３０は、個々に又は他のイオンチャネルとの何らかの組み合わせで膜３０に広がる、挿入されたイオンチャネル３２を有する。最も好ましい場合、イオンチャネル３２は、オリフィス２２の真上の膜３０の領域を通って延在する。膜３０が基板１４に広がる場合、図４に示すように、膜３０から突出する物理的構造を有するイオンチャネル３２を、オリフィス２２の内壁部３４によってトラップし、それによって、イオンチャネル３２がオリフィス２２から離れて拡散しないようにすることができる。これは、オリフィス２２を介して検知ボリューム８からイオンチャネル３２を挿入することによって達成される。しかし、結果として、イオンチャネル３２を厳密にこの特定の領域に配置することはあまり重要ではなく、二重層膜３０が基板１４を覆う場合、イオンチャネル３２が、基板１４に直接隣接する（すなわち真上の）膜３０の一部に挿入された又は移動した場合に発生するように、膜３０のオリフィス２２の近傍領域にあるイオンチャネル３２からチャネル電流を測定することができることが分かった。
【００３２】
別の可能な構成では、膜３０は電解質槽４ではなく基板１４の内側、すなわち検知ボリューム８内に配置される。この実施形態は、シリコンウェーハのような固体材料に検知素子配列を生成するために特に適した構造である図５に示す装置２’に関連する。装置２’は、大きな固体材料（例えば、Ｓｉ）を使用して、底部に基部４０を有する厚壁バリア１２’を提供し、それによって、検知ボリューム８’にアクセス出来るようにする小さな充填ライン４２を作成する。イオンチャネル（図５に示されないが、第１の実施形態のイオンチャネル３２に対応する）は、槽側４’からバリア１２’のナノ孔又はオリフィス２２’を介して膜３０’内に挿入される。所望であれば、電気泳動性又は導電性のリング４８が、バリア１２’上にオリフィス２２’領域の周囲に作られ、チャネルアドレッシングを支援する静電力を提供するために所望の電位まで上げられる。図５の膜構成の一つの利点は、図４のように、膜３０’から突出する構造を有するイオンチャネル３２が、オリフィス２２’の内壁３４’によってオリフィス２２’内にトラップされることになり、それによって、イオンチャネル３２が拡散を防止されることである。第２の利点は、槽ボリューム４’を介してシステムに導入される任意の検体に曝露される膜３０’の面積が最小であり、それによって、検体による膜３０’に対する潜在的な化学的ストレスが最小限に抑えられる。第３に、脂質のような本質的に可溶性の膜３０’の場合、より小容積の検知ボリューム８’が、すべての脂質が電解質中に溶解するのを制限する。
【００３３】
膜が細胞から抽出される事例は図６に示す構成に近い。この場合、基板１４は細胞に押し付けられ（完全には示されていない）、膜５０が細胞膜それ自体であるため、少なくとも１つの細胞イオンチャネル５２が膜５０に既に存在する。この場合、基板１４は電解質槽４の外側構造２４に接続されず、むしろ、関連する電子回路を有する装置構造１１及び取り付け基板１６は、要望に応じて細胞に対して配置するために、電解質槽４内で自由に移動することができる。膜５０の接着を支援するために、基板１４の表面は、図６に示すように、任意選択的に、ポリリシン又はフィブロネクチンのような材料５４でコーティングすることができるが、このような接着層を使用しても、水の層３１’’が依然として存在すると考えられる。これに加えて、細胞のパッチクランプ手法でのように吸引が検知ボリューム８に適用される。本発明によって提供される感度は高いため、従来技術では小さすぎて測定できない導電性を有するイオンチャネル５２のような細胞イオンチャネルのスクリーニングが可能である。
【００３４】
本システムの設計の１つの利点は、増幅器入力での総静電容量が１０ｐＦに、より好ましくは６ｐＦに、最も好ましくは２ｐＦに低減されることである。この総静電容量は、膜が存在する場合には膜の両端の静電容量、壁１２及び基板１４の静電容量、検知電極１９を増幅器２６に、そして有効回路接地に接続する配線２７の静電容量、及び増幅器回路内の浮遊容量を含むトランジスタ及び他の回路素子（図示せず）の静電容量の総和である。
【００３５】
本発明のナノスケールオリフィスから生じる別の利点は、オリフィスサイズが低減するにつれて、膜は機械的且つ電気的にはるかに頑強になることである。電気的頑強性の増大は、１５０ミリボルト（ｍＶ）程度の従来の限度よりも大きな印加電圧に耐えることができるイオンチャネルの測定感度の効果的な増大に関連する。一般に、電圧の増大は、正比例で増大するチャネル電流を増大させ、実測信号対雑音比の線形的な増大を提供する。
【００３６】
オリフィスを非常に小さくすることの大きな１つの問題は、イオンチャネルを挿入するために必要な時間である。１００μｍ直径のオリフィスから１μｍ直径のオリフィスへの規模変更は、イオンチャネルを挿入するために必要な時間を１０，０００倍程度増大させる。標準パッチピペットに使用される膜よりもはるかに小さな膜の場合、挿入時間は法外に長くなり得る。例えば、２５ｎｍ直径の膜の場合、挿入時間は、従来の人工膜実験よりも１６，０００，０００倍長い。挿入時間を低減するための一解決策は、イオンチャネルをオリフィス領域に可能な限り近づけることである。図３の検知システム構成を特に利用する、これを行う一方法を図７に示す。小型毛細管６０が、イオンチャネル又はテストされる検体をオリフィス２２のすぐ近くに注入するために、検知ボリューム８内に挿入される。比較的小容積の検知ボリューム８が、毛細管６０をオリフィス２２と位置合わせするための自然のガイドとして機能する。図８に示すさらなる実施形態では、毛細管６０’は導電体６４で覆われ、別個の電極１９が必要ないように、電極として使用される。さらに、イオンチャネルをオリフィスに送る速度を増大させるために、電気泳動又は電気浸透を利用することもできる。イオンチャネルがオリフィスの近傍に来ると、密閉された幾何学的形状によって電界が増大し、それによって、駆動力が増大する。
【００３７】
本発明の連続サンプリング実施形態２’’を利用する方法について、これより図９を参照して考察する。システム２’’は、電解質槽又は流体送出要素１０４と、電解質１１０を備える電解質槽１０８とを備える。流体送出要素１０４は、厚壁バリア１１２及び基板１１４で構成される構造１１１によって電解質槽１０８から分離される。さらに、取り付け基板１１６が、電解質槽１０８の上部にわたって延びる。測定電極１１８及び１１９が、流体送出素子１０４及び電解質槽１０８内にそれぞれ延びる。基板１１４はオリフィス１２２を含む。記録電子回路１２６が、導電性配線１２７によって電極１１９に接続される。電圧源１１７が槽電極１１８に接続され、システム電気接地を基準とする。送出要素１０４は、流密的に基板１１４に取り付けられ、対象流体サンプルをオリフィス１２２のエリアに送出するためにオリフィス１２２上を通る流体充填チャネル１５４を含む。流体は、アクセスポート１５６から送出要素１０４内に入れられ、排出ポート１５８から除去される。測定電極１１８は、図示のようにチャネル１５４内に取り付けられるか、又は低電気インピーダンスによってチャネル１５４に接続された流体ボリューム内に取り付けられる。チャネル１５４は、サンプルの出し入れ要件によって決まる任意の都合のよいサイズであってよい。場合によっては、チャネル１５４の断面積及び／又はその長さは、収集しなければならない検体量を最小にするために、可能な限り小さく作られる。こういった場合、チャネル１５４の断面は、好ましくは、１ｍｍ２未満であり、最も好ましくは、チャネル１５４は、マイクロ流体技術によって送出要素１０４内に作られ、オリフィス１２２のエリアでは１０μｍ幅×１０μｍ高程度の断面を有し、１ｃｍ程度の長さを有する。
【００３８】
本発明は、非常に小さな（ナノスケール）膜面積（すなわち、オリフィスにわたる）の使用、大半の従来の測定に使用される「パッチピペット」と比較して比較的厚い壁バリア構造の使用、及び導電体の長さをさらに最小化する高度に一体化された設計を介してイオンチャネルに並列する静電容量を低減することによって、既存の技術からの鍵となる進歩を可能にする。さらに、オリフィスが非常に小さいと、使用される印加電圧を大きくすることが可能であり、より大きなチャネル電流を発生させる。さらに、従来技術では、電解質の導電率は、イオン電流を最大限にするために、慣例上許容レベルの上限に設定される。場合によっては、電解質濃度を低減すること、又は濃度範囲にわたって性質を測定することが望ましいであろう。しかし、これは、信号対雑音比（ＳＮＲ）の配慮に起因して、従来技術では一般に行われない。本システムの優れた感度によって、低減されたイオン電流の使用が可能になる。これは、より低いバイアス電圧を使用して、又はより低濃度の電解質を使用しての実施を可能にする。例えば、システム感度を５倍に向上させると、バイアス電圧を１００ｍＶから２０ｍＶに低減することが可能になるか、又は電解質濃度を１Ｍから０．２Ｍに低減することが可能になる。
【００３９】
図１０は、感度及び帯域幅の改良と従来のテフロンオリフィス（人工膜）及びパッチピペットシステムとを比較する。増幅器入力又は記録電子回路において、同じ感度で、印加されるバイアス電圧を１０倍に増大することの影響も示される。
【００４０】
図１０に示すように、現在使用されている測定周波数２〜１０ｋＨｚでは、感度は２〜４倍に増大し、１０倍高い電圧が使用される場合には２０〜４０倍増大する。これに加えて、システムは、第１段増幅器がより高い周波数での性能向けに最適化されているか否かに応じて、標準感度レベルの従来技術の５〜１０倍の測定帯域幅の増大を提供する。この帯域幅の増大は、チャネルを通過するＤＮＡのような非常に高速な電流変化を発生させるイベントの検出に即座に適用することができる。今日まで、このような高速変化は直接測定することができなかった。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の趣旨から逸脱することなく、本発明に対する様々な変形形態及び／又は変更形態が可能なことは容易に理解されるはずである。例えば、図示される様々な実施形態は単一のイオンチャネルシステムを示すが、本発明は検知素子配列と併せて利用することも可能なことを理解されたい。一般に、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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