(57)【要約】  本発明は、ＲＬ５ラッカーゼと名付けられた、反芻胃由来の新規ラッカーゼに関する。特に、本発明は、図１１に示すアミノ酸配列を包含するポリペプチドに関し、図１１に示すアミノ酸配列の少なくともＮｏ．８０からＮｏ．１５０のアミノ酸をそれぞれ含む。本発明は、また、図１８に示すコア配列を有するＤＵＦ１５２ドメインのアミノ酸配列を、ラッカーゼとしてさらに包含するポリペプチドの使用方法に関する。さらに、本発明は、本発明に係るポリペプチドの製造方法をよびこれらの利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１１に示すアミノ酸配列の第８０位アミノ酸から第１５０位アミノ酸、その機能性断片またはその機能性誘導体を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
図１１に示すアミノ酸配列の第８０位アミノ酸から第１５０位アミノ酸、好ましくは第７５位アミノ酸から第１７０位アミノ酸、より好ましくは第６０位アミノ酸から第１９５位アミノ酸、最も好ましくは第５０位アミノ酸から第２１０位アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
図１１に示すアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列から成るか、または図１１に示すアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでいることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
図１１に示すアミノ酸配列から成るか、または図１１に示すアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ラッカーゼ活性を示すものであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
芳香族基質および／または非芳香族基質を酸化するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
上記芳香族基質は、フェノール、ポリフェノール、芳香族アミン、および多環式芳香族炭化水素からなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
上記芳香族基質は、２，６−ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）、グアヤコール、および４−メトキシベンジルアルコールからなる群から選択されることを特徴とする請求項６または７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
上記非芳香族基質は、非フェノール物質から選択されるものであり、
該非フェノール物質は、特に、ベンジルアルコール、シリンガルダジン（syringaldazine）（ＳＧＺ）、ベラトリルアルコール（veratryl alcohol）、および２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）であることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第２の機能性ペプチド部分（例えば、標識配列）と結合していることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
最適Ｋｍ値において活性を示すポリペプチドであって、
該Ｋｍ値が、好ましくは０．２０μＭから３５．０μＭの範囲内であり、より好ましくは０．３０μＭから２８．０μＭの範囲内であり、最も好ましくは０．４０μＭから２μＭの範囲内であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
最適ｋｃａｔ値において活性を示すポリペプチドであって、
該ｋｃａｔ値が、好ましくは８００ｍｉｎ−１から８０，０００ｍｉｎ−１の範囲内であり、より好ましくは１，０００ｍｉｎ−１から６０，０００ｍｉｎ−１の範囲内であり、さらに好ましくは１０，０００ｍｉｎ−１から４０，０００ｍｉｎ−１の範囲内であり、最も好ましくは４０，０００ｍｉｎ−１から８０，０００ｍｉｎ−１の範囲内であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
最適ｋｃａｔ／Ｋｍ率において活性を示すポリペプチドであって、
該ｋｃａｔ／Ｋｍ率が、好ましくは４０ｍｉｎ−１μＭ−１から１７０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１の範囲内であり、より好ましくは１，０００ｍｉｎ−１μＭ−１から１６５，０００ｍｉｎ−１μＭ−１の範囲内であり、さらに好ましくは５０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１から１６０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１の範囲内であり、最も好ましくは９０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１から１５５，０００ｍｉｎ−１μＭ−１の範囲内であることを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
最適ｐＨ条件において活性を示すポリペプチドであって、
該ｐＨの値が、好ましくは３．０から９．５の範囲内であり、より好ましくは３．５から９．０の範囲内であることを特徴とする請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
最適温度条件において活性を示すポリペプチドであって、
該温度が、好ましくは２０℃から７５℃の範囲内であり、より好ましくは４０℃から７０℃の範囲内であり、さらに好ましくは５０℃から６５℃の範囲内であり、最も好ましくは６０℃であることを特徴とする請求項１から１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
基質に対して高い安定性を示すものであることを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
基質に対する活性および高い安定性を、長期間、好ましくは少なくとも４時間に亘って示すものであることを特徴とする請求項１から１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１１から１７に記載の特徴のうち、少なくとも２つの特徴、好ましくは少なくとも３つの特徴、より好ましくは少なくとも４つの特徴、さらに好ましくは少なくとも５つの特徴、さらに好ましくは少なくとも６つの特徴、最も好ましくは少なくとも７つの特徴の組み合わせを示すものであることを特徴とする請求項１から１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
反芻胃（rumen）、特にルーメン生態系の反芻胃、好ましくはウシの反芻胃、より好ましくはニュージーランド乳牛の反芻胃に由来するものであることを特徴とする請求項１から１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１項に記載のポリペプチド、または該ポリペプチドの機能性断片もしくは機能性誘導体をコードしていることを特徴とする核酸。
【請求項２１】
図１１に示すアミノ酸配列をコードしていることを特徴とする請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の核酸を含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項２３】
請求項２０または２１に記載の核酸、および／または請求項２２に記載のベクターを含んでいることを特徴とする宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１から１９のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
（ａ）請求項２３に記載の宿主細胞を培養する工程、および最適条件において核酸を発現させる工程、
（ｂ）適切な方法によってポリペプチドを単離する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１から１９のいずれか１項に記載のポリペプチド、または該ポリペプチドの機能性断片もしくは機能性誘導体のラッカーゼとしての使用。
【請求項２６】
請求項２０または２１に記載の核酸、請求項２２に記載のベクター、もしくは請求項２３に記載の宿主細胞の、ラッカーゼ活性を有するポリペプチドを調製するための使用。
【請求項２７】
図２０−１から図２０−３６までに示す１から７０３のタンパク質配列からなる群から選択されるポリペプチド、または該ポリペプチドの機能性断片もしくは機能性誘導体から選択されるいずれかのポリペプチドのラッカーゼとしての使用。
【請求項２８】
図２０−１から図２０−３６までに示す１から７０３のタンパク質配列からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドの機能性断片もしくは該ポリペプチドの機能性誘導体から選択されるいずれかのポリペプチドをコードしている核酸、該核酸を含んでいるベクター、または該ベクターを含んでいる細胞の、ラッカーゼ活性を有するポリペプチドの調製のための使用。
【請求項２９】
請求項２５から２８に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞の、食品添加物、好ましくは動物食品添加物、より好ましくは動物に摂取させる穀物飼料のための動物食品添加物としての使用。
【請求項３０】
請求項２５から２８に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞の、セルロース繊維あるいはファイバーの処理、繊維染色、しみの脱色、綿繊維の白色化、染料の表面処理、染料の脱色、無毒化、および／または洗濯洗浄のための、使用。
【請求項３１】
請求項２５から２８に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞の、パルプおよび紙を処理するための使用。
【請求項３２】
請求項２５から２８に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞の、環境保護、特にバイオリメディエーション（bioremediation）、微生物分解（biodegradation）、生物による解毒作用（biodetoxification）、および／または環境汚染物質の生物浄化（biodecontamination）のための使用。
【請求項３３】
請求項２５から２８に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞の、バイオセンサーとしての使用。
【請求項３４】
請求項２５から２８に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞の、飲料の調製、特にワインの調整のための、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ラッカーゼ活性を有するポリペプチドに関するものである。特に、本発明は、図１１に示すアミノ酸配列のうち、第８０位アミノ酸から第１５０位アミノ酸をそれぞれ含むポリペプチドに関するものである。さらに、本発明は、新規のラッカーゼファミリーに関するものである。
【０００２】
ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）は、ベンゼンジオール酸素酸化還元酵素として指定されている。また、ラッカーゼは、真核生物（すなわち、菌類および（それほど多くはないが）植物（「Mayer, A.M.ら, 2002; Ruijssenaars, H.J. ら, 2003; Claus, H., 2003）」）、および原核生物（「Claus, H., 2004; Solanoら, 2001; Martinsら, 2002; Mayer and Staples, 2002; Valderramaら, 2003」）の広範囲で検出されている。
【０００３】
ラッカーゼは、生物の病原性、免疫性および形態形成、ならびに複雑な有機基質（例えば、リグニンまたは腐植物）の代謝回転（metabolic turnover）に関与する。例えば、ラッカーゼは、真菌胞子の色素沈着過程、タバコ植物の再生過程、および細胞壁の木質化過程に関与するとともに、樹木の白腐れ期間の脱木質化にも関与しており、そこでは真菌の毒性因子として働く。
【０００４】
ラッカーゼは、幅広い基質特異性および高い非特異的酸化能をもつ、複数の銅酵素である。この非特異的酸化能をもつラッカーゼは、様々な芳香族化合物（例えば、フェノール、ポリフェノール、芳香族アミン、多環式芳香族炭化水素、および非芳香族化合物）、ならびに非芳香族化合物（例えば、ヘキサシアノ鉄酸塩などの非フェノール基質）を酸化するために、酸素分子（ジオキシゲン（dioxygen））を使用する。ラッカーゼは、一電子輸送によってそれらの基質を酸化し、酸素分子を水に還元する。また、ラッカーゼは、重合反応、脱重合反応、メチル化反応、およびジメチル化反応を行うことができる（「Sariaslani, 1989; Kawaiら, 1988; Bourbonnais and Price, 1990; Eggertら, 1996; Solomonら, 1996; Stolz, 2001 ; Shah and Nerud, 2002; Claus, 2004」）。
【０００５】
ラッカーゼは、Ｘ線結晶学（「Antoriniら, 2002; Bertrandら, 2002a,b; Hakulinenら, 2002; Piontekら, 2002」）によって、それらの三次元構造を含めて十分に研究されている。ラッカーゼ内での比較検討は、ヒスチジン残基の保存領域が豊富であり、酵素活性にとって必要不可欠な２つの部分に分散された４つの銅原子と結合することが重要であることを示す（Solomonら, 1996）。主に、この酵素はサブユニット当り、タイプ１（Ｔ１）銅部位、タイプ２（Ｔ２）銅部位、およびタイプ３（Ｔ３）銅部位の各タイプのうち１つを含む。最大酸化電位を有するＴ１銅部位は、第１の電子受容体と考えられている。他の３つの銅イオンは、２つの部位に配置される。すなわち、１つの銅イオンはＴ２銅部位に配置され、２つの銅イオンは二核のＴ３銅部位に配置される。Ｔ２およびＴ３の銅部位は互いに近接しており、これら３つの銅イオンはＴ２／Ｔ３と称される三核の塊を形成する。ここで、Ｔ１部位において受け取った電子は、基質酸化および水への酸化還元として作用する（「Solomonら, 1996; McGuirl and Dooley, 1999」）。
【０００６】
自身の高い非特異的酸化能および幅広い基質特異性のために、ラッカーゼは大いに工業的および生物工学的な利益がある。ラッカーゼの応用分野は、主に以下のように分けられる。
【０００７】
工業技術的な利用としては、例えば、樹木組織を脱木化する脱木化剤として、クラフトパルプの生物脱色において、木製合成材料の製造において、エタノール製造において、繊維用途（例えば、綿繊維組織の白色化、色素表面処理、色素の脱染色および無毒化、ならびに洗濯洗浄）において、洗浄剤用途（例えば、洗濯染みまたは洗浄中に異なる色の衣類間でのいわゆる「色移り」を防ぐため）においての利用が挙げられる。
【０００８】
食品利用としては、例えば、食品改良としての利用が挙げられる。食品改良としては、例えば、パン製造用途のため、または透明度、色の見栄え、匂い、香り、味、または安定性を改良するために、濁りのないフルーツジュースまたは発酵させたアルコール飲料（例えば、ワインおよびビール）から、問題のあるフェノール糖を除去または変性するための利用を含む。
【０００９】
環境保護のための利用としては、例えば、微生物分解において、生物による環境修復技術（bioremediation）において、生物による解毒作用において、および生物浄化においての利用を含む。
【００１０】
バイオセンサー（biosensors）およびバイオリポーター（bioreporters）として利用は、発色物質、蛍光発生物質、化学発光物質または電気活性物質のうち、いずれかの物質同士の組み合わせによるものである。
【００１１】
有機合成のための利用としては、例えば、非対称キラル合成（例えば、プロキラルアルデヒドまたはケトンをキラルアルコール、ヒドロキシル酸、およびアミノ酸などに変換する）において使用するため、ポリマー（例えば、ポリフェノールポリマー）合成のため、薬剤（トリアゾロ（ベンゾ）シクロアルキルチアジアジン（triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines）、ビンブラスチン、抗生物質、および二量化ビンドリン（vindoline）を含む）合成のための利用を含む。
【００１２】
医療および個人用ケアの利用としては、例えば、消毒、スキンケア、ヘアケア、およびデンタルケア製品における使用のため、家庭用衛生製品（例えば、歯磨き粉、うがい薬、チューイングガム、洗浄剤、および石鹸）のための防臭剤としての利用を含む。
【００１３】
ラッカーゼは、上述の応用分野における利用のために、基質特異性が限定されることがなく、幅広いｐＨ範囲において高い安定性、最適な動的パラメータ、および活性を有するものを適用することが望ましい。理想的には、ラッカーゼは一定期間、所定の環境下において安定しているはずである。
【００１４】
しかしながら、幅広いｐＨ範囲および温度範囲に亘って活性を有するには、さらにラッカーゼの強度が必要とされる。いくつかの公知のラッカーゼは、酸性（ｐＨ３．０〜５．０）、中性、または弱アルカリ性（ｐＨ７．０〜８．０）の環境下において活性を示す（Machczynskiら, 2004、およびそこに記載される引例を参照のこと）。公知のラッカーゼがアルカリ活性（ｐＨ９．２まで）を示す場合、より酸性の環境下（例えば、ｐＨ６．０）ではその機能を損なう（「Machczynskiら, 2004; Ruijssenaars and Hartmans, 2004」を参照のこと）。
【００１５】
当分野における別の問題は、昇温された環境下において、安定性および活性を長期間示すラッカーゼが欠如していることである。とりわけ、幅広いｐＨ範囲にわたる安定性／活性と、温度感受性のなさとを示すラッカーゼが必要である。一般に、ラッカーゼは、４０℃から５０℃において温度最適条件を示す（例えば、「Korolevaら, Biochemistry (Moscow), 2001 , vol. 66, No. 6, pp. 618 - 622(5)」を参照のこと）。一方、ボゴス・デドヤン（Boghos Dedeyan）らは、７５℃で最適活性を有するラッカーゼについて述べている（基質をＳＧＺに変更している）が、この酵素の利用は酸性ｐＨ条件（ｐＨ４．５）に限定される。さらに、その安定性はたった１時間に限定される。
【００１６】
多種多様なラッカーゼが特定されているとはいえ、あらゆる産業用途における使用のために、幅広い性質を示すものはない。今日、広範囲の温度およびｐＨにおいて、長期にわたる安定性および活性を兼ね備えるラッカーゼは知られていない。それゆえ、本発明の目的は、多様な処理環境に対する感受性がないために、あらゆる産業用途に使用され得るラッカーゼを提供することにある。
【００１７】
この目的は、図１１に示すアミノ酸配列のうち第８０位アミノ酸から第１５０位アミノ酸、その機能性断片またはその機能性誘導体によって解決される。このポリペプチドは、図１１に示すアミノ酸配列のうち、好ましくは第７５位アミノ酸から第１７０位アミノ酸、より好ましくは第６０位アミノ酸から第１９５位アミノ酸、および最も好ましくは第５０位アミノ酸から第２１０位アミノ酸を含む。また、該ポリペプチドは、図１１に示すすべてのアミノ酸配列により構成されているか、もしくは含んでいることが最も好ましい。
【００１８】
また、この目的は、当分野において機能未知のＤＵＦ１５２ドメインを含んでいる、多くの既知タンパク質の一部を同定することによって解決される。本発明によれば、これらのタンパク質は、酸化的ラッカーゼ様活性を示すラッカーゼとみなされる。
【００１９】
本発明は、微生物の多様性が、生体触媒の処理過程において有効に活用され得る新規の酵素のための、主として未開拓な供給源を構成する、という発見に基づいている。とりわけ、共生ルーメン生態系（symbiotic rumen ecosystem）は、主に偏性嫌気性微生物（例えば、菌類、原虫、古細菌、および細菌を含む）からなる。共生ルーメン生態系は、高分子植物基質の補充数によって特徴づけられる、嫌気性環境または微好気性環境を意味する。ペルオキシダーゼ（リグニンペルオキシダーゼ）およびラッカーゼ（フェノールオキシダーゼ）は、植物高分子リグニン消化の中核をなす（Krauseら., 2003）。同様に、多くの線維酵母が植物細胞壁（例えば、ヘミセルロース）の成分（例えば、キシラーゼ、β−キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セルラーゼ、グルカノヒドロラーゼ（glucanohydrolases）、グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびエステラーゼ）を分解するために必要とされる。
【００２０】
本発明によれば、ウシ・ルーメンの微小植物のメタゲノムライブラリーは設計され、バクテリオファージ・ラムダに基づく発現ライブラリーが、ウシ・ルーメンの体液より抽出されるＤＮＡから構築される。発現ライブラリーはラッカーゼ活性に対して選別され、ラッカーゼ活性を有し、この機能のあるいずれかの公知ラッカーゼと著しい相同のない、本発明のポリペプチドをコードしている遺伝子（ＲＬ５と称される）が、単離される。
【００２１】
本発明のＲＬ５ラッカーゼは、タンパク質として同定される。このラッカーゼは、機能未知な、いわゆるＤＵＦ１５２を含んでいる多くの既知（仮定上の）タンパク質と関連がある。ＲＬ５ラッカーゼは、分子量５７ｋＤａの二量体タンパク質を形成する、２６８のアミノ酸長、分子量２８．２８ｋＤａ、およびｐＩ５．１９のタンパク質である。それゆえ、本発明のモノマーの分子量（〜２８ｋＤａ）は、５０ｋＤａから１１０ｋＤａの分子量を有する公知の細菌、植物、および菌類ラッカーゼのモノマーの大きさに比して、非常に小さい（例えば、「Solomon, 1996; Claus, 2003」を参照のこと）。これまでに報告されている最小のラッカーゼは、分子量３６ｋＤａのモノマー（分子量６９ｋＤａのダイマー）であり、ストレプトミセス・コエリコール（Streptomyces coelicor）から単離される（Mach- cynskiら, 2004）。本発明に係るＲＬ５ラッカーゼの触媒活性は解析されており、大腸菌（Escherichia coli）における組み換え体の発現は、非常に広範囲なｐＨ（ｐＨ３．５〜９．０）における、様々なラッカーゼ基質に対する酸化多能性を明白に実証する。さらに、銅結合部位が同定されるとともに、温度感受性、力学的特性、および電気化学的性質が分析される。生化学的分析および分光分析は、ＲＬ５が機能未知のＤＵＦ１５２ドメインを含んでいる、新規のラッカーゼファミリーに属していることを明らかにする。ＤＵＦ１５２ドメインは、通常、共通の核ペプチド配列（１語をコードする（one-letter-code））Ｈ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｗ／Ｒ／Ｙ）（Ｒ／Ｑ／Ｋ）Ｇによって特徴づけられる。ここで、ＲＬ５ラッカーゼはＤＵＦ１５２ドメイン配列のうち、ＨＡＧＶＶＲＧというよりは、むしろＨＡＧＷＲＧＴＶによって特徴づけられる。
【００２２】
上述した新規のラッカーゼファミリーのうち、その他のラッカーゼを同定するため、および機能未知のＤＵＦ１５２ドメインを含んでいる既知の仮定タンパク質が、ラッカーゼ活性を有する複数の銅タンパク質であることを証明するために、Ｂ．テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）から得られるタンパク質ＢＴ４３８９（遺伝子バンク受入番号ＮＤ＿８１３３００）、および大腸菌（Escherichia coli）から得られるＹｆｉＨ（遺伝子バンク受入番号ＡＡＧ５７７０６）を含んでいる、仮定ＤＵＦ１５２ドメインが分析される。ＢＴ４３８９およびＹｆｉＨは、それぞれＲＬ５ラッカーゼと５７％および６８％の配列類似性を共有する。ＢＴ４３８９は、２７０のアミノ酸長、分子量約３０ｋＤａ（予測される分子量は３０，１１８ｋＤａ）、およびｐＩ５．８４である。また、ＹｆｉＨは、２４３のアミノ酸長、分子量２５ｋＤａ（予測される分子量は２６，３３７ｋＤａ）、およびｐＩ５である。天然タンパク質の分析では、それらがダイマー（それぞれ〜６０ｋＤａおよび５５ｋＤａ）として存在し、モノマー当り４．０の銅分子を含むことが明らかとなった。これは、本発明のＲＬ５タンパク質に対して検出された値に類似している。
【００２３】
ＢＴ４３８９およびＹｆｉＨの触媒活性は解析されており、大腸菌（Escherichia coli）における組み換え体の発現は、非常に広範囲なｐＨ（ｐＨ４．０〜９．０）における、様々なラッカーゼ基質に対する酸化多能性を明白に実証する。これは、ＲＬ５ラッカーゼに対して検出される値に相当する。それゆえ、タンパク質ＢＴ４３８９およびＹｆｉＨを含んでいるＤＵＦ１５２ドメインもまた、ラッカーゼとして同定される。これらをもとに、（仮定の）タンパク質ＢＴ４３８９およびＹｆｉＨのクローニングおよび発現、ならびに生化学分析および分光分析は、ＤＵＦ１５２ドメインを含んでいるタンパク質がラッカーゼであるということを見出すための補助を明白に提供する。このように、本発明によれば、ラッカーゼ活性を示す、多くの既知（仮定）細菌タンパク質の機能が特定される。ラッカーゼとしての該ポリペプチドの使用は、本明細書に開示されている。
【００２４】
本明細書において、用語「ＲＬ５」、「ＲＬ５ラッカーゼ」、「ラッカーゼＲＬ５」、および「ＲＬ５タンパク質」は同義語として用いられており、ラッカーゼ機能を有する本発明によるポリペプチドを指定することを意味する。また、「ＢＴ４３８９」、「ＢＴ４３８９ラッカーゼ」、「ラッカーゼＢＴ４３８９」、および「ＢＴ４３８９タンパク質」、ならびに「ＹｆｉＨ」、「ＹｆｉＨラッカーゼ」、「ラッカーゼＹｆｉＨ」、および「ＹｆｉＨタンパク質」も同様である。
【００２５】
本発明によるポリペプチドは、上述の条件において酸化的ラッカーゼ活性を示す。用語「ポリペプチド」は、好ましくは３００以下のアミノ酸からなるアミノ酸配列を包含することを意図する。主に、ポリペプチドは７０以上のアミノ酸を含み、より好ましくは１００、１２０、または１５０以上のアミノ酸を含み、さらに好ましくは２００以上のアミノ酸を含む。このアミノ酸は、近接するアミノ酸のうちＣ末端カルボキシル基、およびＮ末端アルファ−アミノ基の間のアミド結合によって互いに結合している。本発明のポリペプチドは、ＲＬ５ラッカーゼを含む。ＤＵＦ１５２ドメインを含んでいるポリペプチド（上述した一般式に準じるものであり、より具体的にはモチーフＨＡＧＷＲＧ、さらに好ましくはＨＡＧＷＲＧＴＶを有する）は、本発明と一致するラッカーゼとして利用し得る（および、本明細書に開示されているラッカーゼに関するすべての利用）ラッカーゼとして同定される。特に、図２０−１から図２０−３６までに示す配列番号１から７０３の配列すべては（本発明の目的におけるラッカーゼであり、且つ本明細書に開示されている用途に使用するのに適したラッカーゼのすべて）、ＤＵＦ１５２配列モチーフを一般式Ｈ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｗ／Ｒ／Ｙ）（Ｒ／Ｑ／Ｋ）Ｇと共有する。より具体的には、図２０−１から図２０−３６までに示すほとんどの配列は、配列モチーフＨＡＧＷＲＧを含む。さらに、図２０−１から図２０−３６までに示す９０％以上の配列は、特徴的な特定のモチーフＨＡＧＷＲＧＴＶを含む。
【００２６】
ラッカーゼ活性を示す本発明のポリペプチドは、主に基質である芳香族化合物および／または非芳香族化合物を酸化する。芳香族基質は、（置換された）フェノール（例えば、メトキシフェノール化合物、ポリフェノール、芳香族アミン、および多環式芳香族炭化水素）からなる群から選択される。
【００２７】
本明細書において、「多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）」とは、２つ以上の芳香環、好ましくは２から７の芳香環を含む芳香剤のことを言う。本発明によれば、多環式芳香族炭化水素は、アントラセン（anthracene）、ベンゾ［ａ］ピレン（benzo[a]pyrene）、ベンゾ[ｇｈｉ]ピレン（benzo[ghi]pyrene）、クリセン（chrysene）、コロネン（coronene）、フルオランテン（fluoranthene）、ナフタセン（naphthacene）（テトラセン（tetracene））、ナフタレン、ペンタセン、フェナントレン、ピレン、トリフェニレン、ペリレン、ベンゾ［ａ］アントラセン（benzo[a]anthracene）、ベンゾ［ｂ］フルオランテン（benzo[b]fluoranthene）、オバレン（ovalene）、ベンゾ［ｊ］フルオランテン（benzo[j]fluoranthene）、ベンゾ［ｋ］フルオランテン（benzo[k]fluoranthene）、およびベンゾ［ｇｈｉ］ペリレン（benzo[ghi]perylene）から選択されることが好ましい。
【００２８】
芳香族基質は、（２，６）−ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）、グアヤコール、（２−メトキシフェノール）、４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ桂皮酸（sinapinic acid）、４−ヒドロキシ−３−メトキシ桂皮酸（フェルラ酸）、４−メトキシベンジルアルコール、アントラセン、ベンゾ［ａ］ピレン（benzo [a] pyrene）、およびポリＲ−４７８からなる群から選択されることがより好ましい。非芳香族基質は、非フェノール基質、特に脂肪族アミン、ベンジルアルコール、シリンガルダジン（syringaldazine）（ＳＧＺ）、ベラトリルアルコール（veratryl alcohol）、および２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）から選択されることが好ましい。本発明のラッカーゼのうち、特徴的な天然基質はリグニンである。また一方、ＤＭＰは本発明に係るポリペプチドのラッカーゼ活性を分析するのに好ましい試験化合物である。
【００２９】
本発明に係るポリペプチドの動的パラメータ（例えば、Ｋｍ値、ｋｃａｔ値、およびｋｃａｔ／Ｋｍ値）は、当分野において公知のラッカーゼの動的パラメータよりも非常に優れている。例えば、本発明のＲＬ５ラッカーゼは、公表された他のラッカーゼ酵素よりも約５倍低いＫｍを有するのに対し、ＲＬ５ラッカーゼのｋｃａｔは著しく高い（４０ファクター）。ＲＬ５ラッカーゼのｋｃａｔ／Ｋｍ率は、公知の値をはるかに超える（例えば、刊行された「Solomonら, 1996」、およびそこに引用される「Chefetsら, 1998; Klonowskaら, 2002; Machczynskiら, 2004」を参照のこと）。
【００３０】
それゆえ、本発明に係るポリペプチドは、Ｋｍ値が主に０．２０μＭから３５．０μＭの間、より好ましくは０．３０μＭから２８．０μＭの間、および最も好ましくは０．４０μＭから２μＭの間にあることを特徴とする。また、本発明に係るポリペプチドは、ｋｃａｔ値が、好ましくは８００ｍｉｎ−１から８０，０００ｍｉｎ−１、より好ましくは１，０００ｍｉｎ−１から６０，０００ｍｉｎ−１、さらに好ましくは１０，０００ｍｉｎ−１から４０，０００ｍｉｎ−１、および最も好ましくは２０，０００ｍｉｎ−１から４０，０００ｍｉｎ−１であることを特徴とする。したがって、ｋｃａｔ／Ｋｍ率は本発明に係るポリペプチドに対して算出され、好ましくは４０ｍｉｎ−１μＭ−１から１７０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１、より好ましくは１，０００ｍｉｎ−１μＭ−１から１６５，０００ｍｉｎ−１μＭ−１、さらに好ましくは５０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１から１６０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１、および最も好ましくは９０，０００ｍｉｎ−１μＭ−１から１５５，０００ｍｉｎ−１μＭ−１である。
【００３１】
本発明に係るポリペプチドは、主に３．５から９．０の広いｐＨ範囲内で、主として活性を示す。ｐＨ最適条件である間、本発明のポリペプチドはｐＨ３．５から９．０までの全範囲にわたって最大活性のうち５０％以上、好ましくは７０％以上を維持する。本発明のポリペプチドがｐＨ３．５から９．０の間で主として活性を維持するとはいえ、酸性条件（ｐＨ＜７）、より好ましくはｐＨ４．０から６．０まで、最も好ましくはｐＨ５．０から６．０までにおいて最適活性を有するラッカーゼを提供することが好ましい。
【００３２】
また、本発明のポリペプチドは、主に、広範囲な温度（好ましくは２０℃から７０℃）においてそれらの三次構造を保存することによって、安定且つ活性である。主に、高い活性は高い温度において観察される。それゆえ、本発明のポリペプチドは２０℃から７５℃まで、より好ましくは４０℃から７０℃まで、さらに好ましくは５０℃から６５℃まで、最も好ましくは６０℃付近で活性最適条件を示す。
【００３３】
さらに、本発明のポリペプチドは、規定された特定の条件（温度、ｐＨ）にかかわらず、比較的長期間の安定性および酵素的活性を維持する。これは、特に上述した好ましい温度およびｐＨ範囲に対して有効である。本発明のポリペプチドは、主に、少なくとも４時間触媒反応を続ける（例えば、６０℃と同じ高さの温度条件において）。用語「高い安定性（high stability）」は、基本的に一定水準（ポリペプチド最大活性のうち、５０％以上の損失がない）において、酵素的に活性している本発明のポリペプチドを包含することを意図する。用語「長期間（long period of time）」は、本発明のポリペプチドが少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、および最も好ましくは少なくとも７２時間、酵素的に活性である（規定の条件において、初期活性のうち少なくとも５０％）ことを意図する。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、ルーメン生態系、好ましくはウシのルーメン、より好ましくはニュージーランド乳牛から単離すればよいか、もしくは当分野における公知の合成方法、または好ましくは当分野における公知の組み換え方法によって、天然配列または機能性非天然配列に相当するどちらかを合成されればよい。
【００３５】
また、本発明の方法は、ラッカーゼ活性を示す本発明に係るポリペプチドの、機能性断片および／または機能性誘導体を包含する。「機能性（Functional）（例えば、本発明に基づく機能性断片または機能性誘導体）」とは、本発明のポリペプチドがラッカーゼ活性を示し、好ましくはラッカーゼ様酸化活性、とりわけラッカーゼ基質（例えば、ＤＭＰまたはＡＢＴＳ）のための酸化活性、または触媒重合、解重合、メチル化反応および／または脱メチル化反応を示すことを意味する。ラッカーゼ活性を測定するためのいくつかの方法は、当業者に知られるところである。それら測定方法のいくつかは、本明細書の実施例において述べる（例えば、印をつけた基質を用いた酵素アッセイ、酵素と基質を分けるためのクロマトグラフィー法による基質分析（ＨＰＬＣ、ＴＬＣなど）、およびエステロリティック（esterolytic）活性を測定するための分光光度アッセイ）（例えば、「Maniatisら. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY」を参照のこと）。例えば、本発明に係るポリペプチドが同一の条件において図１１に示すラッカーゼ活性のうち、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％を示すのであれば、該ポリペプチドは機能性（functional）として定義される。用語「活性」とは、酵素活性（例えば、構成単位に発現される酸化活性対数）について述べるものであり、図１１に示す配列と同一の天然ラッカーゼ、および該ラッカーゼの断片または誘導体のいずれかのために、同一の条件において比較すればよい。
【００３６】
本発明による用語「ポリペプチドの断片（fragment of a polypeptide）」は、本発明のポリペプチドの一部を含むということを意図しており、とりわけ図１１のアミノ酸配列のうち、全長が少なくとも６０の連続的なアミノ酸、好ましくは少なくとも８０の連続的なアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００の連続的なアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５０の連続的なアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２００の連続的なアミノ酸、またはそれ以上長いアミノ酸を含む。ラッカーゼ活性を維持する（ＲＬ５ラッカーゼの最大活性のうち少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％）ポリペプチドの機能性断片は、特に有用である。
【００３７】
本発明による「ポリペプチドの誘導体（derivative of a polypeptide）」、とりわけ図１１に示す配列と同一の「ポリペプチドの誘導体」は、本発明に係る（天然）ポリペプチド由来のポリペプチドを示すことを意味しており、本明細書に記載しているように、（天然）アミノ酸配列のうち１つの部位、または２つ以上の異なる部位における１つ以上のアミノ酸の置換、（天然）アミノ酸配列のどちらかまたは両方の末端、もしくは該配列内の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失、および／または、（天然）アミノ酸配列の１つ以上の部位における、１つ以上のアミノ酸の組み込みによって、特徴的な活性特に、ラッカーゼ活性）を維持している。
【００３８】
このように誘導体化された本発明のポリペプチドは、天然ラッカーゼに比して改変された性質を有し得る（例えば、図１１〜１７と一致するか、または図２０−１から図２０−３６までにおいて特定されたように）。このような性質は、ある種の用途にとって有利となることもある（例えば、改変されたｐＨ最適条件、向上された温度安定性、改良された動的特性など）。
【００３９】
本発明によるポリペプチドの誘導体では、例えば図１１に開示されるように、ラッカーゼ活性を示す本発明のポリペプチドのうち、天然アミノ酸配列と実質的な同一性を有するポリペプチドについて述べる。天然ラッカーゼ配列、特にＲＬ５（またはラッカーゼ活性を有する天然タンパク質を含むその他ＤＵＦ１５ドメインのすべて）と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性のあるアミノ酸を有する誘導体は、とりわけ好ましい。したがって、天然天然塩基性タンパク質配列から、アミノ酸１００当たりたった５つの修飾（置換、組み込みおよび／または欠失）でもある誘導体は、本発明の最も好ましい実施形態からはずれる。
【００４０】
２つのアミノ酸配列の比率同一性（percent identity）を測定するために、配列は最適な比較対照物に対して調整され得る（例えば、第一のアミノ酸配列内の配列にずれ（gaps）が導入される可能性がある）。対応するアミノ酸配置におけるアミノ酸は、その後比較され得る。第１の配列における配置が、第二の配列において対応する配置と同じアミノ酸によって占められるのであれば、その配置における分子は同一である。２つの配列間の比率同一性は、配列によって共有される多くの同一な配置の作用である。２つの配列間における比率同一性の測定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。２つの配列を比較するために利用される数学アルゴリズムの例は、特に限定されないが、「Karlin ら. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877」のアルゴリズムが好ましい。該アルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。このＮＢＬＡＳＴプログラムは、本発明のアミノ酸配列にとって、望ましい同一性を有する配列を同定するために使用され得る。比較対照ととしてずらせた照準を得るために、「Altschulら. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402」に開示されているような、照準をずらしたＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよび照準をずらしたＢＬＡＳＴを用いる場合、各プログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の初期設定値が使用され得る。２つの配列間における比率同一性の測定について記載された方法は、核酸配列に対して同様に利用され得る。
【００４１】
本発明に係るポリペプチドの機能性断片または機能性誘導体の製造方法は公知であり、当分野における当業者に知られる標準的な方法によって実施され得る（例えば、「Maniatisら. (2001 ) supra」）。主に、本発明に係るポリペプチドの機能性誘導体の調製は、本発明の天然ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を修飾すること、ポリペプチドの機能性誘導体を形成するための適切な宿主への該ＤＮＡ配列の形質転換、およびポリペプチドの機能性誘導体を形成するための修飾されたＤＮＡの発現によって達成され得る。なお、ポリペプチドの機能性誘導体は、ＤＮＡの修飾が特徴的な活性（特にラッカーゼ活性）を妨げないと推定されるものである。ＤＮＡ配列の修飾は、任意の突然変異誘発技術（例えば、化学的突然変異誘発要因を用いる技術）か、またはオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発のどちらかによって生じさせればよい。ＤＮＡ配列を改変するために、最も広く採用される技術の１つとしては、オリゴヌクレオチドを標的とした部位特異的突然変異誘発の方法である（「Comack B, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 8.01 -8.5.9, Ausubel F,ら, eds. 1991」を参照のこと）。この技術において、重要な突然変異を含む配列を有するオリゴヌクレオチドは、スープラ（supra）に記載されるように合成される。このオリゴヌクレオチドは、その後野生型の核酸配列を含む鋳型と交雑される。この技術の好ましい実施形態における鋳型としては、一本鎖の鋳型である。とりわけ好ましいのはプラスミドであり、例えば、ｆ１の遺伝子間領域などの領域を含む。ヘルパーファージがファージミド（phagemid）を提供する培養基に加えられると、この領域では１本鎖鋳型が生成され得る。鋳型へのオリゴヌクレオチドのアニーリングの後、ＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドから２本鎖を合成するために用いられる。生成された産物は、オリゴヌクレオチドにおける突然変異のために誤差を含んでいる、ヘテロ２本鎖分子である。ＤＮＡが宿主細胞によって複製された後、２種類のプラスミドの混合体（野生型および新たに構成された突然変異体）が存在している。単離は、標準的な方法を用いて実施され得る。この方法としては、例えば、遠心分離、ろ過、またはクロマトグラフィーおよび沈殿法による細胞もしくは培養基からの分離が挙げられる（例えば、「Maniatisら. (2001) supra」を参照のこと）。この技術では、制限部位に都合よく導入することができる。核酸配列をコードしている上記混合体は、速やかに当業者に使用される転写調節因子または翻訳調節因子のどちらかと、隣接して配置されればよい。大腸菌（E.coli）のために用いられる設計方法は、単なる置換（必要であれば、当業者にとって公知技術を用いた適切な調節因子）によって、別の有機体のための類似ベクターを構成すればよい。
【００４２】
また、本発明のポリペプチド、ならびにその機能性断片および機能性誘導体は、第２の部分の少なくとも１つと接合する可能性がある。第２の部分またはそれ以上（further）の部分は、天然ラッカーゼにおいて生じないことが望ましい。第２の部分のうち、少なくとも１つがアミノ酸、オリゴヌクレオチド、またはポリペプチドである可能性があり、本発明のポリペプチドのいずれかの相応する配置（例えば、アミド結合、エステル結合、またはエーテル結合を介する、Ｎ−末端、Ｃ−末端、またはその内側）と結合される可能性がある。リンカー配列は、本発明のポリペプチドと、それ以上（further）の部分うち少なくとも１つとを接合するために使用され得る。本発明の一実施形態によれば、リンカー配列は、好ましくは５から５０残基、より好ましくは５から１５残基の順応性のある配列を形成する。好ましい実施形態において、リンカー配列は、少なくとも２０％、より好ましくは４０％、およびさらに好ましくは５０％のＧｌｙ残基を含む。適切なリンカー配列は、当分野における当業者によって容易に選択され、且つ調製され得る。必要であれば、付加部分が本発明の配列と結合されてもよい。例えば、本発明のポリペプチドが接合タンパク質として製造されるのであれば、この接合対（例えば、ＨＡ、ＨＳＶ−Ｔａｇ、特にＨｉｓ６）は、精製および／または単離を円滑にするために使用することができる。必要であれば、その後、接合対は製造工程の終わりに（例えば、タンパク質分解的切断、または他の技術的に知られる方法によって）ポリペプチドから取り除くことができる。
【００４３】
別の実施形態において、本発明では、本発明のポリペプチドをコードしている核酸を提供する。なお、本発明のポリペプチドは、上述したように、状況に応じて第２の部分の少なくとも１つと接合されるＲＬ５、もしくはその機能性断片または機能性誘導体をコードしている。この核酸は、図１５に示す核酸配列により構成されているか、もしくは含んでいることが好ましい。
【００４４】
本発明の核酸は、単離された核酸であることが好ましい。「単離された（isolated）」核酸分子配列またはヌクレオチド配列とは、そのゲノム形態においてヌクレオチド配列に挟まれていない、および／または、（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーに存在するように）核酸を単離するために、全体または部分的に取り除かれている核酸分子配列またはヌクレオチド配列を指すことを意図する。例えば、本発明の単離された核酸は、天然に発生する複雑な細胞環境から十分に単離されればよい。場合によっては、単離された物質は、組成物（例えば、別の物質を含む天然の抽出物）、緩衝系（buffer system）、または試薬混合物の成分であればよい。さらに、この物質は、例えばＰＡＧＥまたはカラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって測定される場合に、実質的に均一になるよう精製されればよい。
【００４５】
本発明の核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。核酸分子は２重鎖または１重鎖である可能性がある。つまり、１重鎖ＲＮＡまたは１重鎖ＤＮＡは、コードしている（センス）鎖、またはコードしていない（アンチセンス）鎖のいずれかであり得る。必要に応じて、単離された核酸のヌクレオチド配列は、もう一方のコードしていない配列（例えば、調節配列を含む、３’−配列および５’−配列）を含むことができる。特に指定がないのであれば、すべての核酸配列は５’−末端から３’−末端の方向へ書き込まれる。本発明に係る核酸は、例えば、マーカー配列またはヌクレオチド配列をコードする核酸配列と接合することができる。なお、ヌクレオチド配列は、例えば、ポリペプチドの単離または精製において補助するためのポリペプチドをコードしている。主な配列としては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、ポリ−ヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）、血球凝集素（hemagglutinin）、およびＨＳＶ−タグを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
また、本発明には、本発明に係る核酸断片を包含する。これにより、上記「断片（fragments）」は、少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２０ヌクレオチド、最も好ましくは好ましくは少なくとも１８０ヌクレオチドの長さで示す核酸配列の一部を包含することを意図する。特に、本発明に準じる短い核酸断片（好ましくは、２０から６０ヌクレオチド）は、プローブおよび／またはプライマーとして有用である。とりわけ好ましいプライマーおよびプローブは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードしている核酸分子と選択的に交雑される。「プライマー」は、酵素伸張または合成伸張のための開始基質として機能する、核酸断片である。「プローブ」は、本発明の核酸配列、断片、またはそれらの相補的な核酸配列と交雑する核酸配列である。これらプライマーまたはプローブは、別の生態系から別の天然のラッカーゼを同定するために用いられてもよい。
【００４７】
交雑（hybridization）は、特定の断片、または本発明のラッカーゼに相当する遺伝子のどちらかを分析するために本明細書において利用することが可能であり、このように本発明の範囲内である。交雑では、核酸の鎖が塩基対によって相補鎖に接着する処理について説明する。
非常に類似してはいるが、同一ではない２つの相補的な核酸の交雑において用いられる条件は、２本の鎖の相補性度、および鎖の長さによって変わる。この条件および交雑技術は、当該技術における当業者に公知であり、標準的な交雑アッセイによって実施され得る（例えば、「Maniatisら. (2001 ) supra」を参照のこと）。したがって、厳しい条件（stringent conditions）において本発明の核酸またはそれらの断片と接合するすべての核酸配列は、本発明に包含される。当業者は、本発明のポリペプチド（または断片、もしくはそれらの誘導体）が、アミノ酸コードの縮重のために、多数の核酸配列によってコードされ得るということを理解されたい。これらすべての核酸もまた、本発明に包含される。
【００４８】
本発明の核酸（図１５を参照）およびそれらの断片の製造および単離は、当分野における当業者に公知である標準的な方法によって実施され得る（例えば、「Maniatisら. (2001 ) supra」を参照のこと）。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、本発明の核酸を含んでいるベクターについて言及する。本明細書において使用される用語「ベクター」、「構造体」、および「組み換え構造体」は、同じ意味を有することを意図しており、別の配列のそばに本発明の核酸配列（またはそれらの断片）を含んでいるヌクレオチド配列として定義する。ベクターは、本発明の核酸を発現させるために、適切な宿主細胞の中で形質転換させる際に使用され得る。ベクターとしては、プラスミド、ファージ小片、または単に潜在的なゲノムの組み込みであってもよい。一旦適切な宿主の中で形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムと切り離して複製し、且つ機能すればよく、または適切な条件において、ゲノム自身に一体化させてもよい。本発明の好ましいベクターは、ｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドである。
【００５０】
上述したベクターの「別の配列」は、以下の配列と関連がある。主に、適切なベクターには、複製の起点（例えば、Ｏｒｉ  ｐ、ｃｏｌＥｌ  Ｏｒｉ）、発現される（転写される、および／または翻訳される）組み込まれた核酸を包含する配列、および／または選択的ゲノムマーカーを含む。なお、選択的ゲノムマーカーは、蛍光性タンパク質をコードしている遺伝子、ＧＦＰと同等の遺伝子、および／または抗生物質に対して抵抗する遺伝子（例えば、Ｔｎ３から得られるｐ−ラクタマーゼ遺伝子、Ｔｎ９０３から得られるカナマイシン−抵抗性遺伝子、またはＴｎ９から得られるクロラムフェニコール−抵抗性遺伝子）を含む。
【００５１】
用語「プラスミド」とは、通常、自己複製する染色体外の遺伝因子を意味する。プラスミドは、主に、文字ならびに数に先行する、および／または後に続く下位の「ｐ」によって指定される。本明細書において開始プラスミドは、市販されているか、制限のない基準で公的に利用可能であるか、または公知の方法によって入手可能なプラスミドから設計され得る。さらに、本明細書に記載されているプラスミドに相当するプラスミドは、当分野における当業者に周知である。本発明のベクターを調整するために使用される開始プラスミドは、例えば、標準的な方法（例えば、塩化セシウムＤＮＡ単離法）を用いて、これらプラスミドを含んでいる適切な大腸菌（E.coli）から単離されればよい。
【００５２】
主に、本発明に相当するベクターは、ベクターをクローニングする（組み換え）ＤＮＡ、およびベクターの（組み換え）発現に関わる。ＤＮＡクローニングベクターでは、特に限定されないが、プラスミドおよびファージを含む自己複製成分について述べる。なお、自己複製成分には、本発明に係る１つ以上の付加核酸が加えられているＤＮＡ分子を含む。発現ベクターは、本発明の核酸配列を含む、ベクター組み換え構造体をクローニングするＤＮＡのいずれかと関連しており、この核酸配列は、発現に影響を及ぼし得る適切な調節配列と結合する働きをする。また、発現ベクターは、適切な宿主において、本発明の組み込まれる核酸の転写を調節することにも関連している。また、本発明のプラスミドは、発現ベクターを構成するために、直ちに修飾されればよい。この発現ベクターは、様々な有機体において本発明のポリペプチドを製造しており、この有機体としては、例えば、大腸菌（E.coli）、Ｓｆ９（細菌の宿主として）、スポドプテラ（Spodoptera）、およびサッカロミセス（Saccharomyces）を含む。本明細書には、ＡＶ１２発現ベクターを構成する技術、およびＡＶ１２宿主細胞を形質転換する技術を含む。米国特許出願第４，９９２，３７３号明細書は、本明細書において参考として引用しており、これら技術を記載する多くの参考文献の１つである。
【００５３】
「操作可能な連結（Operably linked）」とは、核酸配列がある方法において調節配列と連結されることを意味する。これは、核酸配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を可能にする。「転写」とは、ＤＮＡの核酸配列に含まれる情報による処理が、相補的なＲＮＡ配列に移されることを意味する。
【００５４】
「調節配列」は当分野において公知であり、本発明に係る核酸を発現するため、および転写を調節するために選択される。該調節配列としては、特に限定されないが、転写を誘発するためのポリアデニル化シグナル、プロモーター（例えば、天然または合成プロモーター）またはエンハンサー、転写を調節するための選択的調節配列、組織特異的転写を可能にする遺伝子座調節領域またはサイレンサー、ｍＲＮＡ上に適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ｍＲＮＡを安定化することができる配列、および転写および翻訳の末端を調節する配列を含む。これらの調節配列は、例えば１つ以上の核酸の欠失、付加、組み込み、または置換によって修飾されることもあるが、それらの調節機能を保持している。その他の適切な調節配列も当分野において公知であり、例えば、「Goeddel (1990), Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA」に記載されている。とりわけ、様々な生物に対する多数の異なるプロモーターが知られている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）に用いられるベクターにとって好ましいプロモーターは、ＡｐｒＥプロモーターであり、大腸菌（E coli）において使用するのに好ましいプロモーターは、Ｔ７／Ｌａｃプロモーターであり、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）において使用するのに好ましいプロモーターは、ｇｌａＡであり、また、トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）（レーセイ（reesei））において使用するのに好ましいプロモーターは、ｃｂｈｌである。また、原核生物宿主とともに使用するのに適しているプロモーターには、ベータ−ラクタマーゼ（レプリコンおよびベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいるベクターｐＧＸ２９０７（ＡＴＣＣ３９３４４））、ラクトースプロモーター機構（「Changら. (1978), Nature (London), 275:615; Goeddelら. (1979), Nature (London), 281:544」）、アルカリ・ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター機構（ｔｒｐプロモーターの制御下において、開始読み枠であるｔｒｐＥ融合タンパク質の発現を容易にするために作製される、ベクターｐＡＴＨ１（ＡＴＣＣ３７６９５））、およびハイブリッドプロモーター（例えば、プラスミドｐＤＲ５４０  ＡＴＣＣ−３７２８２から単離可能なｔａｃプロモーター）を含む。また一方、ヌクレオチド配列を有する別の機能的な細菌プロモーターが主に知られている。これにより、当業者は必要とされるいずれかの制限部位を提供するために、リンカーまたはアダプターを使用する本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡと、該細菌プロモーターとを連結（ligate）することが可能である。また、細菌系において使用するためのプロモーターは、所望のポリペプチドをコードしているＤＮＡと操作可能に（operably）連結されるシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列を含むこともある。
【００５５】
有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０のあらゆる既知の誘導体）のセグメントと、次のものとで構成されてもよい。すなわち、既知の細菌プラスミド（例えば、ｃｏｌ  Ｅ１，ｐＢＫ，ｐＣＲ１，ｐＢＲ３２２，ｐＭｂ９，ｐＵＣ１９、およびそれらの誘導体を含んでいる大腸菌（E coli）から得られるプラスミド）、幅広い宿主域のプラスミド（例えば、ＲＰ４）、ファージＤＮＡｓ（例えば、ＮＭ９８９など、ファージラムダの多数の誘導体）、別のＤＮＡファージ（例えば、Ｍ１３）、糸状一本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド、真核細胞において有用なベクター（例えば、動物細胞において有用なベクター、およびプラスミドとファージＤＮＡｓとの組み合わせに由来するベクター（例えば、ファージＤＮＡまたは別の発現調節配列を使用するために修飾されているプラスミド））が挙げられる。本発明が意味するところの、発現ベクターを用いた発現技術は当分野において周知であり、例えば、「Maniatisら. (2001 ) supra」に主に記載されている。
【００５６】
本発明に係る別の実施形態は、本発明のベクターまたは核酸（もしくはその断片）を含んでいる宿主細胞に関するものである。
【００５７】
本明細書において「宿主細胞」とは、本発明に係る核酸またはベクターのための、宿主および発現媒体として機能することが可能な細胞を意味する。宿主細胞は、例えば、原核、真核、または始原（archaeon）細胞であり得る。本発明に準じる好ましい実施形態において、宿主細胞とは大腸菌（E coli）細胞であることを意図する。宿主細胞は、例えば、形質転換、トランスフェクション（transfection）、またはトランダクション（tranduction）の結果、本明細書において記載されるベクターまたは核酸を含んでいる。そのような宿主細胞としては、特に限定されないが、細菌細胞（例えば、Ｒ．マリナス（R. marinus）、大腸菌（E coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、バチルス（Bacillus）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium））、酵母を含む菌類（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycies cerevisie）、ピッチーナ・パストリス（Pichia pastoris））、かび（例えば、アスペルギルスｓｐ．（Aspergillus sp.））、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ）を含む。
【００５８】
様々な真核宿主細胞は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）などの保管機関から入手可能であり、本発明のベクターに使用するのに適している。特定の宿主細胞の選択は、本発明の核酸を発現させるために用いられる、特定の発現ベクター上のある範囲によって決まる。不完全菌類であるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycies cerevisie）は、最も一般的に使用される真核微生物であるが、その他多数の菌株が通常利用可能である。サッカロミセスｓｐ．（Saccharomyces sp.）における発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ−４００５３）が通常使用される（例えば、「Stinchcomb L.ら. (1979) Nature, 282:39; Kingsman J. al. (1979), Gene, 7:141 ; S. Tschemperら. (1980), Gene, 10:157」を参照のこと）。このプラスミドは、すでにｔｒｐ遺伝子を含んでおり、トリプトファンにおける成長能を欠いている酵母の変異株のための選択的マーカーを提供する。宿主細胞とともに使用するための適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセラートキナーゼ（3-phosphoglycerate kinase）または別の糖分解酵素のためのプロモーターを含む。３−ホスホグリセラートキナーゼは、プラスミドｐＡＰ１２８Ｄ（ＡＴＣＣ５３２３１）において検出され、本明細書に参考として引用されている、１９９０年６月１９日に特許された米国特許出願第４，９３５，３５０号に記載されている。また、糖分解酵素としては、例えば、エノラーゼ（enolase）（プラスミドｐＡＣ１（ＡＴＣＣ３９５３２）において検出された）、グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣＩ（ＡＴＣＣ５７０９０、５７０９１）由来）、ヘキソキナーゼ（hexokinase）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（pyruvate decarboxylase）、ホスホフルクトキナーゼ（phosphofructokinase）、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（glucose-6-phosphate isomerase）、３−ホスホグリセラートムターゼ（3-phosphoglycerate mutase）、ピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase）、トリオースリン酸イソメラーゼ（triosephosphate isomerase）、グルコースリン酸イソメラーゼ（phosphoglucose isomerase）、およびグルコキナーゼ（glucokinase）が挙げられる。同様に、糖分解酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼおよびジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が挙げられる（本明細書に参考として引用されている、１９９０年６月１９日に特許された米国特許出願第４，９３５，３５０号を参照のこと）。別の酵母プロモーターは誘導プロモーターであり、様々な成長条件によって制御可能であるそれら転写の付加効果を有している。この酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２（alcohol dehydrogenase 2）、イソシトクロムＣ（isocytochrome C）、酸性ホスファターゼ（acid phosphatase）、窒素代謝に関わる分解酵素、金属結合性タンパク質（プラスミドベクターｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ（ＡＴＣＣ３９４７５）に含まれており、本明細書において参考によって引用される米国特許出願第４，８４０，８９６号に記載されている）、グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、ならびにマルトースおよびガラクトース（例えば、プラスミドｐＲＹ１２１（ＡＴＣＣ３７６５８��において検出されたＧＡＬ１）の利用に関与する酵素のためのプロモーター領域である。酵母エンハンサーとしては、例えば、プラスミドＹＥｐｓｅｃ−ｈＨ  ｂｅｔａ  ＡＴＣＣ６７０２４上のＣＹＣ１プロモーターとの接合時に検出されるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から得られるＵＡＳ  Ｇａ１が挙げられる。また、これは、宿主プロモーターとともに有利に用いられる。
【００５９】
ベクターは、適切な方法のいずれかを用いて宿主細胞に組み込むことができる。そのような方法としては、例えば、形質転換、電気せん孔法、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、または別の物質を用いたトランスフェクション（transfection）、マイクロプロジェクト照射（microprojectile bombardment）、リポフェクション（lipofection）、感染、またはトランスダクション（transduction）が挙げられる。ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体融合によって複製可能であるがゆえに、形質転換は有機体へのＤＮＡの導入と関連がある。細菌および真核生物の宿主を形質転換する方法は、当分野において公知である。多くの方法が「Maniatisら. (2001 ) supra」に要約されており、例えば、核注入、原形質融合、またはカルシウム処理による方法が記載されている。トランスフェクションでは、いずれかのコード配列が発現するかに関わりなく、宿主細胞によるベクターの取り込みについて述べる。いずれかの指示または操作、もしくはこのベクターが宿主細胞内に生じる場合、トランスフェクションが成功したとみなされる。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、本発明に係るポリペプチドの製造方法を提供しており、該方法には、（ａ）適切な条件において本発明の宿主細胞を培養し、本発明の核酸を発現させる工程、および（ｂ）適切な方法によってポリペプチドを単離する工程を含む。
【００６１】
本発明に係るポリペプチドは、主として組み換え法によって製造されればよい。組み換え法は、高い収率を望む場合に好ましい。所望するいずれかのＤＮＡ配列構成のための主な方法は、例えば、「Brown J.ら. (1979), Methods in Enzymology, 68:109; Maniatis (1982), supra」に提供されている。本発明によれば、メタゲノムライブラリーにおける活性に基づいたスクリーニングが、ルーメン生態系（rumen ecosystem）において検出される様々な微生物から本発明のラッカーゼを単離するための効果的な方法として利用される（「Lorenz, P ら. (2002), Current Opinion in Biotechnology 13:572-577」）。
【００６２】
主にこの方法は、いずれかの生態系から得られる、ラッカーゼ活性を有するその他の天然ポリペプチドを特定および単離するために利用されればよい。特に、いずれかの動物生態系、またはいずれかの動物のルーメンから得られるラッカーゼ活性がより好ましい。
【００６３】
培養基からのポリペプチドの単離は、遠心分離またはろ過によって培養基から細胞を分離させる方法を含む、従来の方法によって実施され得るものである。細胞の分離後、必要であれば、塩（例えば、硫酸アンモニウム）を用いて上澄みまたはろ過液のタンパク成分を沈殿し、その後様々なクロマトグラフ法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、または類似の技術とみなされる方法）によって精製される。また、本発明のポリペプチドを単離するための効果的な方法には、ポリペプチドをコードしている、本明細書において提供される核酸またはベクターを有する、適切な宿主細胞を形質転換することによる、遺伝子組み換え技術を用いる工程、ならびに宿主細胞の成長および核酸発現に適した環境において、合成組み換え微生物（好ましくは大腸菌（E.coli））を培養する工程を含む。当該環境としては、誘導物質、適切な塩によって補われた好ましい培地、成長因子、抗生物質、栄養補助剤などの存在することが挙げられる。
【００６４】
当業者は、本発明に係るポリペプチドが、当分野において公知である多数の異なる方法によって製造され得ることを理解されたい。したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードしている核酸のインビボにおける翻訳、化学合成（例えば、固相ペプチド合成）、または別の適切な方法のいずれかによって製造されればよい。組み換え方法および化学合成方法は、例えば、米国特許出願第４，６１７，１４９号に記載されており、その全体が本明細書において参考として組み込まれる。ポリペプチドの固相化学合成法の適切な説明は、「Dugas H. and Penney C. (1981 ), Bioorganic Chemistry, pages 54-92」に見受けられる。例えば、ポリペプチドは、応用生物系４３０Ａペプチドシンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, Califから市販されている）、および応用生物系によって提供される合成サイクルを利用した固相合成法によって合成されればよい。必要とされる既知のアミノ酸（例えば、既知のｔ−ブトキシカルボニル（t-butoxycarbonyl）アミノ酸およびその他の試薬）は、多くの化学薬品の供給元から市販されている。ラッカーゼ活性を示す本発明のポリペプチド、それらペプチドをコードする核酸、それらを含むベクターおよび／または細胞（以下、「本発明の物質（inventive substances）」と称する）は、様々な産業分野およびバイオ技術分野において利用され得る。とりわけ、本発明のポリペプチドは、食品添加物として、好ましくは動物食品添加物として、より好ましくは、動物に与えられる穀物飼料のための動物食品添加物として利用され得る。動物食品へのポリペプチドの添加は、リグニン含有量の高い植物（例えば、ライグラス（ryegrass））を消化する動物にとって、特に有利となることもある。動物の摂食における主な問題、とりわけ、例えばウシの摂食に関する問題としては、リグニン含有量の高い植物の消化効率が悪い、または部分的にしか消化できないことである。このため、摂取したエネルギーを損失する結果となる。このように、本発明の物質は、例えば、ライグラス中のリグニン消化を改善するために、動物に摂食させる穀物飼料に対する食品添加物として使用可能である。したがって、本発明の物質は、腸内の適切な部位において、時間をかけてリグニン分解反応を触媒することが可能な持続放出カプセルとして作製され得る。このカプセルの形態および投与量は、例えば、摂食する動物に応じて適宜選択される。さらに、植物の葉緑体において発現するための本発明のポリペプチド、核酸および／またはベクターの使用は、本発明に包含される。
【００６５】
また、本発明の目的のうち食品利用としては、例えば、食品成分の製造における利用、またはそれ自身の食品成分としての利用を含む。例えば、パン製造用途のため、または透明度、色の見栄え、匂い、香り、味、または安定性を改良するために、濁りのないフルーツジュースまたは発酵させたアルコール飲料（例えば、ワインおよびビール）から、問題のあるフェノール糖を除去または変性するための利用を含む。飲料品にラッカーゼ活性を有する本発明のポリペプチドを利用することは、特に好ましい。公知のラッカーゼは、醸造ビールにおいて利用するために認可されている。例えば、腐臭化合物であるトランス−２−ノンナル（trans-2-nonenal）の形態が存在しているすり潰し工程において、該ラッカーゼが利用される。また、ラッカーゼは銅キレート担体に固定化されていればよく、例えば、ワインの清澄化時に白ブドウのマストからフェノールを取り除くために用いられる。それゆえ、本発明のポリペプチドは、これらすべての用途のために使用してもよい。
【００６６】
さらに、ラッカーゼ酵素活性を有する本発明のポリペプチドは、ブレス・フレッシング（breath-freshening）製品（例えば、ブレスミントおよびチューイングガム）における調製剤として利用してもよい。このように、直接的な食品成分としてのラッカーゼ酵素調製剤の利用は、ラッカーゼ酵素調整剤に存在する全ての有機固体のうち、１日に成人１人当り約１４ミリグラムまでの摂取になるであろうと推定される。
【００６７】
別の実施形態は、セルロース繊維またはファイバー、繊維染色、染色液の脱色、綿繊維の白色化、染料表面処理、染料の脱色化（dye decolourisation）、無毒化および／または洗濯洗浄の処理のために本発明の物質を利用することに関するものである。また、本発明の物質は、洗浄利用において利用することが好ましい。洗浄利用としては、例えば、しみを漂白するため、または洗浄中に異なる色の衣服間のいわゆる「色移り（dye-transfer）」を防ぐための利用がある。
【００６８】
別の実施形態は、パルプおよび紙における処理（好ましくは、クラフトパルプの生物脱色における処理）および／またはパルプのカッパ数を低下させることによって、本発明の物質を利用することに関するものである。ラッカーゼが、いくつかの原材料に見られるリグニンとフェノール化合物との重合を補助することによって、パルプおよび紙製品の湿潤強度性が増加する。リグニンを改変するため、および強度性を増加させるために利用する酵素の効果としては、（１）強度を増進する化学物質の消費を減少させること、（２）紙製造機の稼動能力を改善させること、（３）製品の能力を向上させることが可能であること、および／または（４）廃液処理が容易で安価であることを含む。本発明のポリペプチドは、これらの性質を満たす。よって、本発明の物質は、パルプおよび色彩を含有する木材を処理するために用いればよく、さらに、例えば、固定化した本発明のポリペプチドによって、消費水流におけるＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）／ＣＯＤ（化学的酸素要求量）を減少させればよい。したがって、工場廃水（例えば、紙およびパルプ、ならびに石油化学工業から出る）の無毒化は、本発明のポリペプチドのために利用されるようにすればよいことが想定される。
【００６９】
ファイバーを改変する酵素的な方法は、化学物質の使用が少ないために探し求められている。この方法は、化学的な方法と比べてより制御可能であると考えられており、且つファイバーを傷つけることが少ない傾向にある。リグニンおよび関連するフェノール化合物は、酸素消費量（ＣＯＤ／ＢＯＤ）および染色に起因する排水に望ましくなく、またそれらを取り除くことが困難である。この問題は、最終的に別の物質（特に、例えばペルオキシダーゼ）と結合される本発明の物質が解決する。本発明の物質は、次々に重合するフェノール化合物のラジカルを形成する。その後、安定性の低いポリマーが化合物を沈殿させる。固形物の沈殿は、簡便且つ安価に排水から取り除くことができる。
【００７０】
本発明の物質には、例えば、ラッカーゼ活性を示す（特にＲＬ５ラッカーゼにおいて）ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードしている核酸、これらの核酸を含んでいるベクター、およびこれらのベクターを含んでいる細胞を含む。これらのうち、特に本発明のポリペプチドは、例えば、土壌中の除草剤、農薬、およびある種の火薬類を処理するための、バイオリメディエーション（bioremediation）剤として主に用いられてもよい。また、ある種の浄水システムのための洗浄剤として用いられてもよい。それゆえ、環境保護を目的とした本発明の物質の利用は、本明細書において開示されており、特に、生物による環境修復技術（bioremediation）、例えばリグニンなどの生物解毒作用（biodetoxification）、および／または環境汚染物質の生物浄化を目的とした本発明の物質の利用が開示されている。本発明の物質は、極性汚染物質を測定するため（例えば、「Duranら., Enzyme and Microbial Technol. 31 (2002) 907-931」を参照のこと）、および扱い難い芳香族化合物のバイオリメディエーションのための２つの分析手段（bianalytical tool）として、幅広く利用されるペルオキシドに対して優れ、且つ改良されたものであることを示す。
【００７１】
さらに、本発明の物質（特に、ポリペプチド）は、特に限定されないが、例えば、以下に示す用途において利用可能である。すなわち、発色物質、蛍光発生物質、化学発光物質または電気活性物質のうち、いずれかの物質同士の組み合わせによるバイオセンサー（biosensors）およびバイオリポーター（bioreporters）として利用可能である。この利用には、例えば、水性試料（より具体的には、フルーツジュース、お茶、およびその他飲料）のフェノール成分を測定するための固定化酵素電極、または気相酸素測定のためのバイオセンサー、もしくは酵素連結免疫測定（enzyme-linked immunoassays）におけるマーカー酵素であるホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）（ＨＲＰ）の代替物としての利用を含む。
【００７２】
また、有機合成を目的とした用途には、例えば、エタノール製造、不斉合成またはキラル合成（例えば、プロキラルアルデヒドまたはケトンをキラルアルコール、ヒドロキシル酸、アミノ酸などに変換するため）、芳香族化合物（例えば、アントラセン（anthracene））の酸化、ポリマー（例えば、ポリフェノールポリマー）の合成、治療薬（トリアゾロ（ベンゾ）シクロアルキルチアジアジン（triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines）、ビンブラスチン（vinblastine）、抗生物質、およびジメライズド・ビンドリン（dimerized vindoline）を含む）の合成のための利用が挙げられる。
【００７３】
また、医療および個人用ケアの利用としては、消毒製品における利用がある。例えば、化粧品（例えば、スキンケア、ヘアケア、デンタルケア）の成分として、家庭用衛生製品（例えば、歯磨き粉、うがい薬、チューイングガム、洗浄剤、および石鹸）のための防臭剤として、医学診断の手段（例えば、アルカプトン尿症を検出するための、例えば、芳香族ジアミン、アミノフェノール、カテコール、カテコールアミン、ヒドロキノン、およびホモゲンチジン酸（ＨＧＡ））として利用される。
【００７４】
その他、抗がん剤製造のための触媒として、生化学的および生物工学的方法ための作用因子として、毒性または発がん性物質のバイオリメディエーションのため、染料の脱色が必要な用途において、例えば、ワイン中のフェノールの酸化において利用される。
【００７５】
本発明の物質は、広範囲の利用に適した生体触媒としての機能を果たし得る、ということを理解されたい。
【００７６】
端的に言えば、本発明では、天然酵素（ＲＬ５ラッカーゼと称された）に基づくラッカーゼ活性を有する、本発明のポリペプチドを開示する。このポリペプチドは、ルーメンメタゲノム（特に、ニュージーランド乳牛のルーメンメタゲノム）より単離されたＤＮＡから作製された、バクテリオファージ・ラムダに基づく発現ライブラリーから検索される。ＲＬ５ラッカーゼは、非常に高い酸化能を示し、公表されているすべてのデータベース（「Altschulら.,1997」）が提供する、公知のラッカーゼに類似した核酸配列がないことを示す。ＲＬ５  ＯＲＦ１、ＲＬ５  ＯＲＦ２、およびＲＬ５  ＯＲＦ３遺伝子産物の推定されるアミノ酸配列配置には、公知のラッカーゼおよび別のフェノールオキシダーゼとの顕著な類似が見られない。さらに、ＲＬ５ラッカーゼは、事前に予測された機能性ラッカーゼモチーフを含まない。ＲＬ５は新規であり、様々な新規の構造的特徴を有する、多種多様な物質の形質転換を目的とした高性能触媒である。
【００７７】
さらに、本発明では、ラッカーゼのように機能未知のＤＵＦ１５２ドメイン（上述した一般式に基づくか、またはより具体的には配列モチーフＨＡＧＷＲＧ、もしくはより好ましくはＨＡＧＷＲＧＴＶを有する）をそれぞれ含んでいる多数の仮定タンパク質のうち、一部の機能を開示する。したがって、ラッカーゼのようにＤＵＦ１５２ドメインを有するいずれかのポリペプチド（および、これらのポリペプチドをコードしている、例えば、核酸、ベクター、宿主細胞などの内在性物質）が本明細書において開示されている。本発明によれば、これらのタンパク質はラッカーゼ活性を有するタンパク質として同定される。例えば、ＤＵＦ１５２ドメインを有するポリペプチドが、図２０−１から図２０−３６まで（ポリペプチド１から７０３）に記載される。それらはラッカーゼとして利用され、より具体的には、本明細書の詳細に記載した用途のために利用することが、本明細書に開示されている。また、ポリペプチド１から７０３（またはそれらの誘導体または断片）の利用には、それらを基にした核酸配列、該核酸配列を含んでいるベクター、および上述したポリペプチドの調製のための該ベクターを含んでいる細胞を包含する。本明細書において提供したいずれかの定義（例えば、「断片（fragments）」、「誘導体（derivatives）」、「ポリペプチド」、「機能性（functional）」、「活性（activity）」など）には、図２０−１から図２０−３６までに相当する配列群から選択されるポリペプチドを含むことを意味しており、ラッカーゼとしての使用は、本明細書において最初に開示される。とりわけ、ＢＴ４３８９タンパク質およびＹｆｉＨタンパク質は、図２０−１から図２０−３６までにおいて特定されたポリペプチド群に属する。
【００７８】
本発明の物質（特に、図２０−１から図２０−３６までの配列番号１から７０３に基づくポリペプチド）は、以下の用途に用いてもよいが、本発明はこれらの用途に限定されるものではない。すなわち、発色物質、蛍光発生物質、化学発光物質または電気活性物質のうち、いずれかの物質同士の組み合わせによるバイオセンサー（biosensors）およびバイオリポーター（bioreporters）として利用可能である。この利用には、例えば、水性試料（より具体的には、フルーツジュース、お茶、およびその他飲料）のフェノール成分を測定するための固定化酵素電極、または気相酸素測定のためのバイオセンサー、もしくは酵素連結免疫測定（enzyme-linked immunoassays）におけるマーカー酵素であるホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）（ＨＲＰ）の代替物としての利用を含む。また、有機合成を目的とした用途には、例えば、エタノール製造、不斉合成またはキラル合成（例えば、プロキラルアルデヒドまたはケトンをキラルアルコール、ヒドロキシル酸、アミノ酸などに変換するため）、芳香族化合物（例えば、アントラセン（anthracene））の酸化、ポリマー（例えば、ポリフェノールポリマー）の合成、治療薬（トリアゾロ（ベンゾ）シクロアルキルチアジアジン（triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines）、ビンブラスチン（vinblastine）、抗生物質、およびジメライズド・ビンドリン（dimerized vindoline）を含む）の合成のための利用が挙げられる。また、医療および個人用ケアの利用としては、消毒製品における利用がある。例えば、化粧品（例えば、スキンケア、ヘアケア、デンタルケア）の成分として、家庭用衛生製品（例えば、歯磨き粉、うがい薬、チューイングガム、洗浄剤、および石鹸）のための防臭剤として、医学診断の手段（例えば、アルカプトン尿症を検出するための、例えば、芳香族ジアミン、アミノフェノール、カテコール、カテコールアミン、ヒドロキノン、およびホモゲンチジン酸（ＨＧＡ））として利用を含む。また、その他、抗がん剤製造のための触媒として、生化学的および生物工学的方法ための作用因子として、毒性または発がん性物質のバイオリメディエーションのため、染料の脱色が必要な用途において、例えば、ワイン中のフェノールの酸化における利用を含む。
【００７９】
図２０−１から図２０−３６までに示す１から７０３のポリペプチド（またはそれらの誘導体または断片）、それらを基にした核酸配列、該核酸配列を含んでいるベクター、および該ベクターを含んでいる細胞は、食品添加物、好ましくは動物食品添加物、より好ましくは動物に摂取させる穀物飼料のための動物食品添加物として、本発明に従って使用され得る。その他にも、セルロース繊維またはファイバー、繊維染色、染色液の脱色、綿繊維の白色化、染料表面処理、染料の脱色化（dye decolourisation）、無毒化および／または洗濯洗浄の処理のため、パルプおよび紙における処理のため、環境保護（特にバイオリメディエーション（bioremediation）、微生物分解（biodegradation）、生物による解毒作用（biodetoxification）、および／または環境汚染物質の生物浄化（biodecontamination））のために利用することが可能であり、さらにバイオセンサーとして、または飲料の調製（特に、ワインの調製）のための利用され得るとともに、ＲＬ５ラッカーゼに関する上述したその他の用途のどれに利用してもよい。
【００８０】
以下に示す図および実施例は、この範囲に限定されるものではなく、本発明を説明するにすぎないと考えられる。本発明の詳細において引用したすべての参考文献は、その全体が援用される。
【００８１】
〔図の説明〕
図１Ａ〜１Ｃは、ＲＬ５  ＯＲＦのアライメントに基づき、枝分かれしたアミノ酸ツリーを、関連するホモログ配列と共に示す図である。
【００８２】
以前に行われた新規遺伝子ＲＬ５のコード領域の調査によって、有意な長さ（＞７００塩基対）を有する以下に示す３つの異なる転写ＯＲＦ（ＲＬ５  ＯＲＦ１，  ＲＬ５  ＯＲＦ２  および  ＲＬ５  ＯＲＦ３）が、複製された全長ＲＬ５  ＤＮＡフラグメント配列の中央において、明らかにされた。
【００８３】
ＲＬ５  ＯＲＦ１（１，４７３  から２，３４８に位置する８７６塩基対）は、予想される分子量が３２．２４ｋＤａで２９１アミノ酸長のタンパク質をコードしている。この産物は予想ｐＩ（等電点）が４．９７である強親水性であり、細胞質ゾル酵素に典型的な特徴である、膜貫通可能ドメインをただ１つ含んでいる。
【００８４】
ＲＬ５  ＯＲＦ２は、３，１９９から、２，４１１に位置するＴＡＡ終止コドンまでの間から相補的に伸長され、２６２アミノ酸長の産物をコードしている。この２８．２８ｋＤａのポリペプチドは、また、予想ｐＩ値が５．２９であり、細胞質ゾルの特徴を示している。
【００８５】
ＲＬ５  ＯＲＦ３（１，１１３塩基対）は、ＯＲＦ２のＡＴＧコドンから７２塩基対下流に位置している。この遺伝子の産物は、ｐＩ値が６．４６である、３７０アミノ酸長のポリペプチドであり、ＤＮＡ結合タンパク質に典型的なヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフをいくつか含んでいる。
ＲＬ５  ＯＲＦの同定に引き続いて、ホモログタンパク質とのアミノ酸アライメントを行った。Ｆａｓｔａ３．３ホモロジーを用いて、ＢＬＯＳＵＭ５０マトリックスと共にＵｎｉＰｒｏｔタンパク質データベース（ｒｅｌｅａｓｅ２．３）に対する検索によって、ＲＬ５  ＯＲＦとのアライメントによって選択したタンパク質を、ホモログとして見出した。複数の配列アライメントを、ＢＬＯＳＵＭ５０マトリックスと共に、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ７．２．２  ソフトウエア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて構築し、１０．０および０．０５のギャップペナルティでそれぞれ開き、伸長させた。距離マトリックスを算出するために、アライメントファイルを同一のソフトウエアを用いて分析した。近隣結合法およびポワソンコレクション（ＰＣ）距離を、図１Ａ〜１Ｃに示す系統発生図を構築するために用いた。棒は、１アミノ酸つき０．２の変化を表している。
【００８６】
図１Ａは、金属プロテアーゼを有する、ＲＬ５−ＯＲＦ１の推定亜鉛ペプチターゼの系統発生における関連性を示す。ＲＬ５  ＯＲＦ１産物が、金属依存ペプチド結合開裂に含まれる亜鉛ペプチターゼファミリーに属することが、結果より明らかになった。また、ＲＬ５  ＯＲＦ１産物が、サイトファガハッチインソニイ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ）の推定金属プロテアーゼに非常によく似ていることも、結果より明らかになった（４２％同一、および６２％ポジティブ）。
【００８７】
図１Ｂは、ＲｅｃＦを有する、ＲＬ５  ＯＲＦ３の組換えＤＮＡ修復ＡＴＰａｓｅ（ＲｅｃＦ）の系統発生における関連性を示す。アライメントの結果として、ＲＬ５  ＯＲＦ３産物の機能を予測した。ＲＬ５  ＯＲＦ３は、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）およびバクテロイデスフラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）の組換えＤＮＡ修復ＡＴＰａｓｅ（ＲｅｃＦ）と高いホモロジーを示した（４９％同一および６９％ポジティブ）。また、ＲＬ５  ＯＲＦ３は、このファミリーに属する他の多くのタンパク質と高いホモロジーを示したが、狭い範囲であった。
【００８８】
図１Ｃは、ＤＵＦ１５２ドメインを有するＲＬ５  ＯＲＦ２（ラッカーゼ）の系統発生における関連性を示す。ＲＬ５  ＯＲＦ２タンパク質が、ＤＵＦ１５２（機能未知ドメイン１５２）ファミリーに属する既知の仮定タンパク質（ＣＨＰ）に程度の高い同一性を示すことが、結果から明らかになった。また、ＲＬ５  ＯＲＦ２タンパク質が、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデスフラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびサイトファガハッチインソニイ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ）と特に強く関連していることも、結果から明らかになった（それぞれ、５７％、５３％および５２％同一）。
【００８９】
図２は、組換えＲＬ５ラッカーゼのｐＨ依存および温度依存活性プロファイルを示す。
【００９０】
図２Ａは、組換え精製ＲＬ５ラッカーゼの活性における種々のｐＨ値の効果を表す。基質として１ｍＭ  ＳＧＺ（シリンガルダジン）またはＤＭＰを用いて４０℃において、活性を測定した。クエン酸塩（ｐＨ  ３．０〜５．５）、ＭＥＳ（ｐＨ  ５．５〜７．０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０〜８．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０〜９．０）およびグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ  ９．０〜１２）を含むバッファ（１００ｍＭ）を使用した。ＤＭＰに対するＲＬ５の活性は、ｐＨ広範囲３．５〜９．０において最高に達し、４．０〜５．０において最良であったが、ｐＨ３．５〜９．０において７０％以上の活性が維持された（図２Ａ）。
【００９１】
図２Ｂは、ｐＨ４．５のクエン酸ナトリウム（○で示す）、またはｐＨ９．０のグリシンＮａＯＨ（●で示す）における、２４０分間に亘る精製ＲＬ５ラッカーゼのｐＨ不活性化を表す。精製タンパク質サンプルにおける１００％活性は、７．２ユニット／ｍｇ（４０℃において測定）と同等である。ＲＬ５はこれらのｐＨにおいて長時間に亘って高い安定性を示し、それゆえに広いｐＨ範囲であることが、結果から確認された
図２Ｃは、組換え精製ＲＬ５ラッカーゼの活性における温度効果を表す。酵素活性を、示された各温度において、１ｍＭ  ＳＧＺまたはＤＭＰの存在下、ｐＨ４．５のクエン酸ナトリウム中において分析した。活性を、４２０ｎｍにおいて観察した。６０℃において最大まで上昇した温度において、タンパク質活性が上昇した。それゆえに、ＲＬ５は高温で安定である。
【００９２】
図２Ｄは、精製ＲＬ５ラッカーゼの熱不活性化を表す。精製した酵素を６０℃（●で示す）または６５℃（○で示す）において、バイアル中でインキュベートした。インキュベート時にサンプルを取り出し、基質としてＳＧＺまたはＤＭＰを用いて４０℃でラッカーゼ活性をテストした。精製タンパク質サンプルにおける１００％活性は、１７．２ユニット／ｍｇと同等であった。ＲＬ５は、少なくとも４時間の長時間に亘って、当該温度において高い安定性を示すことを、理解することができる。
【００９３】
関連する実験を、図２Ａから２Ｄにおいて上述した条件下で、ＢＴ４３８９およびＹｆｉＨについて行った（データは示さず）。これらの酵素の活性は、ＢＴ４３８９においては５２℃、およびＹｆｉＨにおいては４４℃で、最高に達した。また熱活性は、ＢＴ４３８９においては５５℃、およびＹｆｉＨにおいては５０℃で、８０％以上維持された。両方の酵素の活性は、ＢＴ４３８９においてはｐＨ範囲４．５から６．０、ＹｆｉＨにおいてはｐＨ範囲５．５から８．４において最高に達した。また、ＢＴ４３８９においてｐＨ４．０から７．５、ＹｆｉＨにおいては５．０から９．０で、８０％活性が維持された。
【００９４】
図３は、基質として１０ｍＶ／ｓのＤＭＰ存在下（図３Ａおよび３Ｂ）、または基質の非存在下（図３Ｃおよび３Ｄ）におけるＲＬ５ラッカーゼの電気化学的分析の結果を示す。ＲＬ５をＢＡＳガラス質カーボン電極（図３Ｂおよび３Ｄ）、または金電極（図３Ａおよび３Ｃ）に固定した。両方の材料を、異なる酵素方向に供給した。
【００９５】
（１）カーボン電極の表面には、ラッカーゼ基質様構造を提供するヒドロキシル基が存在し、これにより、電極表面に面する活性部位に酵素を好適に固定させる。
【００９６】
（２）金は、酵素の高疎水性密集アミノ酸ドメインと電極との接触を避ける、高い疎水性表面を提供する。親水性ドメインが金表面に向くことが好ましい。
【００９７】
基質（ＤＭＰ）存在下で（図３Ａおよび３Ｂ）、電極において酵素の向きが異なることによる、電気化学測定におけるいくつかの相違点が観察された。それゆえに、ＲＬ５ラッカーゼが金に固定されているとき（図３Ａ）、酸素存在下での活性は０．３８マイクロアンペア（破線）である一方で、酸素非存在下での活性は０．６９マイクロアンペアであった（点線）。おそらく、酵素が、基質の減少による電子を約半分使用し、他方の半分は溶液中の酸素から使用するが、酸素の非存在下において、全ての電子は電極から用いられることが、より高度な測定により得られた。カーボン電極を用いたとき（図３Ｂ）、酸素の存在下で測定された方法における酵素の方向は、２．８マイクロアンペアであった（破線）。これは、電子の９３％が電極から用いられるという事実によって説明することができる。酵素の方向の相違すること、またはカーボン状の固定がより高いラッカーゼ活性量（約７倍）を維持することのいずれかが理由である。カーボン電極において、Ｔ２銅酸化ポテンシャル部位＋５００対標準水素電極（ＮＨＥ）が決定された。
【００９８】
基質非存在下における、ＲＬ５ラッカーゼが付与された電極における電子化学情報を得た（図３Ｃおよび３Ｄ）。再度本発明者らは、電極材料を金またはガラス質のカーボンにしたとき、いくつかの相違点を見出した。このように、電極が金の場合（図３Ｃ）、＋２５０ｍＶにおいて酸素の電子減少が始まる。一方、電極がガラス質のカーボンの場合（図３Ｄ）、＋５００ｍＶにおいて酸素の電子減少が始まる。本発明者らは、ガラス質のカーボン電極と金電極とを比較して、さらなる情報を見出した。つまり、溶液から酸素を取り除いたとき、７４０ｍＶのＴ１銅部位酸化ポテンシャル対ＮＨＥが登録された。加えて、酸素の再活性化が行われたとき、３つの酸化ポテンシャルピークが登録された。７４５ｍＶのＴ１対ＮＨＥが最も高かった。また５００ｍＶのＴ３部位対ＮＨＥが２つの銅イオンを有しており、これによりより高いピークであった。さらに、Ｔ２部位は、４００ｍＶ対ＮＨＥを有していた。Ｔ１の酸化還元ポテンシャルは、かびラッカーゼの範囲内（４８０〜７８５ｍＶ）になるように登録された（Ｓｏｌｏｍｏｎら（１９９６）、Ｋｌｏｎｏｗｓｋａら（２００２））。
【００９９】
図４は、ＲＬ５ラッカーゼのヒスチジン（Ｈ）からアラニン（Ａ）およびシステイン（Ｃ）からグルタミン（Ｑ）変異体における銅含有量（図４Ａ）および２次構造含有量（図４Ｂ）のグラフを表す。銅含有量は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＣＰ−ＭＳを用いて決定した。野生型ＲＬ５および変異体を、ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ６ｘＨｉｓ  ｔａｇカルボキシル末端６×ヒスチジンタグと共に発現した後、Ｎｉ−セファロースカラムを用いて精製した。以前に行った配列分析によって、ラッカーゼにおいて銅原子が結合する典型的な保存ヒスチジン領域を、ＲＬ５ラッカーゼが有していないことが明らかとなった（Ｓｏｌｏｍｏｎら（１９９６）参照のこと）。銅結合に重要なＲＬ５のアミノ酸を決定するために、モデルを誘発する合理的なデザインとつながった部位特異的突然変異誘発を行った後、吸収分光測光法による測定および二次構造の決定を行った。初めに、Ｈ７３、Ｈ１３５、Ｈ１９０、Ｈ２０７、Ｈ２３３およびＨ２３９と名付けたＲＬ５タンパク質における６つの全てのヒスチジン残基を、アラニン（Ａ）に置き換えた。そして、Ｈ７３Ａ、Ｈ１３５ＡおよびＨ２３３Ａの置換によって銅結合が約２５％に減少したが（図４Ａ）、二次構造において実質的な変化はなかった（図４Ｂ）。一方、Ｈ１９０Ａ、Ｈ２０７ＡまたはＨ２３９Ａ変異を含む変異体の金属含有量は、野生型酵素の金属含有量の７５％であったが（図４Ａ）、二次構造においては全体的に大きな変化がもたらされた。
【０１００】
図５は、ＲＬ５ラッカーゼ構造の三次元図を示す。図５Ａは、ホモロジーモデリングによって得られたＲＬ５ラッカーゼの全三次元構造を表している。図５Ｂは、Ｔ１銅部位および銅配位を含む残基を示す。
【０１０１】
図４において同定した銅配位を含むアミノ酸残基とは別のアミノ酸残基を決定するために、ＲＬ５ラッカーゼの三次元モデルを作製した（図５Ａ）。このモデルによって、Ｔ１部位は、図５Ｂに示すように、Ｈ７３，、Ｃ７５、Ｃ１１８およびＨ１３５に形成されるはずである。これらの残基が確かに銅リガンドであることを証明するために、Ｃ７５ＱおよびＣ１１８Ｑ変異体を作製した。変異体のみを含むものにおいて、銅配位の可能性を分析した（実施例参照のこと）。図４に示すように、両方の変異ＲＬ５タンパク質にモノマーあたり３つの銅分子が存在しており（図４Ａ参照のこと）、これらの一方は野生型酵素よりもすくなかった。また、二次スペクトルにおいては全く変化が検出されなかった（図４Ｂ参照のこと）。この結果から、Ｈ７３、Ｃ７５、Ｃ１１８およびＨ１３５が、Ｔ１銅部位を含む残基として明白に同定されたことが確認された。
【０１０２】
図６は、ＲＬ５  ＤＮＡフラグメントにおけるＲＬ５ラッカーゼの横側に位置する遺伝子と、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ゲノムにおいて見られる同様の遺伝子との間における構造機構の比較を表す。
【０１０３】
図１Ａ〜１Ｃに示すように、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種（図１Ｂに示すＯＲＦ３）またはサイトファガハッチインソニイ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ）（図１Ａに示すＯＲＦ１）のいずれかに非常によく似た、ＲｅｃＦ遺伝子（図１Ｂに示すＯＲＦ３）および推定金属プロテアーゼ遺伝子（図１Ａに示すＯＲＦ１）の存在によって、ＲＬ５ラッカーゼの横側のＲＬ５  ＤＮＡフラグメントの配列は明らかにされた。サイトファガハッチインソニイ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ）は、非常に多様なサイトファガフレキシバクタバクテロイデス（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（ＣＦＢ））門に属する微生物である。ＣＦＢは、反芻胃微小生物の中心である３つの微生物門の１つであることがよく知られている。それゆえに、発明に係るクローンＲＬ５がＣＦＢ区分に属する可能性は非常に高い。この主張を証明するために、推定ｒｅｃＦ遺伝子（ＯＲＦ３）の直下の領域を分析し、同一方向に転写された２つのさらなるＯＲＦがｒｅｃＦとして見出された。推論されたＯＲＦ４タンパク質およびＯＲＦ５タンパク質は、ＣＯＧ５５１２ファミリーの推定Ｚｎリボン含有ＲＮＡ結合タンパク質およびバクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）由来のチオエステラーゼに、それぞれ６２％および６０％類似していた。さらに、図６に示すように、ＲＬ５ゲノムフラグメント内のＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４遺伝子の構造機構は、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ゲノムにおける同様のゲノムの位置と主要な特徴を共有することが理解される。バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）の推定金属プロテアーゼおよびＤＵＦ１５２遺伝子は、ＲＬ５ゲノムフラグメントにおいても示されているように、近接して逆オペロンに構成されている。ＲｅｃＦおよびＣＯＧ５５１２遺伝子は、また、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）およびＲＬ５フラグメントの両方に共に現れている。ただ１つの相違点は、ＲＬ５フラグメントにおいてはこれらの２つの遺伝子が直列に繋がっているが、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）においては、これらの２つの遺伝子がほぼ３５０，０００塩基対離れていることである。
【０１０４】
図７は、本発明に係るＲＬ５ラッカーゼによって触媒される種々の化合物の酸化反応の結果を表す表１を示す。ＲＬ５ラッカーゼの基質を、より好ましい順に示すと、ＳＧＺ＞ＤＭＰ＞ベラトリルアルコール＞グアヤコール＞テトラメチルベンジジン＞４−メトキシベンジルアルコール＞２ＡＢＴＳ＞フェノールレッドの順である。３，４−ジメトキシベンジルアルコール、１−ＨＢＴおよびビオルル酸のような他の基質は、ＲＬ５の基質ではなかった。
【０１０５】
種々の芳香族化合物に対する特定の基質もまた、ＢＴ４３８９およびＹｆｉＨについて測定した（データ示さず）。ＢＴ４３８９ラッカーゼはＳＧＺ＞ＤＭＰ＞ベラトリルアルコール＞＞グアヤコール＞  ＡＢＴＳ  （６００：２５５：１１３：６０：２８：１７ユニット／ｇタンパク質）を酸化した。一方、ＹｆｉＨはＳＧＺ＞ＤＭＰ＞＞ベラトリルアルコール＞＞グアヤコール（５．６：４：２．１：０．５ユニット／ｇタンパク質）を酸化した。
【０１０６】
図８は、本発明に係るＲＬ５ラッカーゼの速度パラメータを示す表２を示す。ラッカーゼの速度パラメータＫｍ、値ｋｃａｔ値およびｋｃａｔ／Ｋｍ値を、濃度範囲０から１ｍＭのＡＢＴＳ、ＳＧＺおよびＤＭＰの主に用いられる３つのラッカーゼ基質と共に評価した。呈上状態速度測定を、４０℃、ｐＨ４．５、１４ｎＭタンパク質の存在下、ＡＢＴＳ、ＳＧＺおよびＤＭＰそれぞれに対する見かけＫｍ  ２６．２、０．４３および０．４５μＭ、ｋｃａｔ１０８３、３９８０７および７０４４３  ｍｉｎ−１の降伏値で行った。これらのＫｍ値は、同様の酵素で報告されている値よりも〜５倍小さかった一方で、ｋｃａｔ値は４０倍であり、ＲＬ５ラッカーゼｋｃａｔ／Ｋｍの比率は、ＡＢＴＳ（最大３００  ｍｉｎ−１ｍＭ−１）、特にＳＧＺ（最大９７００  ｍｉｎ−１ｍＭ−１）およびＤＭＰ（最大１５０００  ｍｉｎ−１ｍＭ−１）の酸化に対して発表された値よりもはるかに上回った（例として、Ｓｏｌｏｍｏｎら（１９９６）を参照し、その参考としてＣｈｅｆｅｔｓら（１９９８）、Ｋｌｏｎｏｗｓｋａら（２００２）およびＭａｃｈｃｚｙｎｓｋｉら（２００４）参考のこと）。
【０１０７】
図９は、ＲＬ５ラッカーゼによるアントラセンおよびベンゾ［ａ］ピレンの酸化の結果を示す。酸化反応を以下のように行った。アセトニトリル  １５μＬ、２ｍＭ  アントラセン  ２．５μＬ、１ｍＭ  ベンゾ［ａ］ピレン  ５μＬ、をアセトニトリル（芳香族化合物の終濃度５０μＭ）中に添加して溶解し、２０％エタノール、酵素（ＡＢＴＳ  ［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）  １．１ユニット］  ２０μＬ中に、６０ｍＭ  ＨＯＢｔ（１−ハイドロキシベンゾトリアゾール）  １．３μＬを溶解した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ  酢酸ナトリウムバッファで１００ｍＬ量にして完成させた。反応液を一晩室温で混合した。反応を止めるために、１容積のアセトニトリルを添加し、混合液を−２０℃で保管した。ラッカーゼのクローニング、発現および精製方法は、本明細書の開示の一部となる参考文献（Ｂｅｌｏｑｕｉ，  Ａら（２００６））に記載されている。
【０１０８】
図９ＡはＲＬ５ラッカーゼで処理したアントラセンのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。ＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ  ９０１２）を自動インジェクター（Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ  Ｌ２２００，  ＶＷＲ  日立社製）と共に準備した。サンプル反応液１０μＬをＣ１８  ヌクレオシル  ３μｍ、８０×４ｍｍカラム（ＡＶ−２４８６，  Ａｎａｌｉｓｉｓ  Ｖｉｎｉｃｏｓ  Ｓ．Ａ．）に注入した。移動層はアセトニトリル：水＝７０：３０（ｖ／ｖ）から構成した。流速を１ｍＬ／分に調整した。２５１ｎｍに固定されたＵＶランプと共に、フォトダイオード配列検出器（Ｐｒｏｓｔａｒ  ３３５，  Ｖａｒｉａｎ）を、抽出された化合物を検出するために用いた。図９Ａに示すように、ＲＬ５ラッカーゼはアントラセンを９，１０−アントラキノンへと効果的に酸化することができた。
【０１０９】
図９Ｂは、ＲＬ５ラッカーゼで処理したアントラセン溶液のＧＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す（上図はｔ＝０ｈ、下図はｔ＝２４ｈ）。これらのデータは図９Ａの結果を確証している。
【０１１０】
図９Ｃは、ＲＬ５ラッカーゼで処理したベンゾ［ａ］ピレンのＨＰＬクロマトグラムを示す。ベンゾ［ａ］ピレンは酸化されたが、酸化産物は未だ同定されていない。
【０１１１】
図１０は、不反応染料Ｐｏｌｙ  Ｒ−４７８の酸化の結果を示す。ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）（０．９ｍＭ）の存在下または非存在下におけるＰｏｌｙ  Ｒ−４７８の脱色を、室温でｐＨ４．５の１００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファ中において、分光光度法（５２０ｎｍ）により決定した。示されたのとは異なり、ＡＢＴＳ酸化に記載されているように、ごく一般的に、３５００分の分析時間に亘って、０．２  ｕｎｉｔｓの精製酵素と共に分析が測定された。図１０に示すように、ＲＬ５ラッカーゼはまた、Ｐｏｌｙ  Ｒ−４７８溶液（０．０２５％）の７０％以上を酸化することができた。
【０１１２】
図１１は、本発明に係るＲＬ５ラッカーゼのアミノ酸配列を示す。純タンパク質のＮ末配列が、ＲＬ５ラッカーゼ遺伝子の翻訳配列の１〜１７アミノ酸残基に対応するＭＩＥＬＥＫＬＤＦＡＫＳＶＥＧＶＥになることが見出された。
【０１１３】
図１２は、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８１３３００）由来のＢＴ４３８９ラッカーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１４】
図１３は、大腸菌（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ５７７０６）由来のＹｆｉＨラッカーゼのアミノ酸配列を示す。
【０１１５】
図１４Ａ〜１４Ｃは、本発明に係るＲＬ５ラッカーゼ遺伝子の逆方向における核酸配列を示す。コード領域に下線を付す。
【０１１６】
図１５は、本発明に係るＲＬ５ラッカーゼ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の核酸配列を示す。
【０１１７】
図１６は、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８１３３００）由来のＢＴ４３８９ラッカーゼ遺伝子の核酸配列を示す。
【０１１８】
図１７は、大腸菌（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ５７７０６）由来のＹｆｉＨラッカーゼ遺伝子の核酸配列を示す。
【０１１９】
図１８は、ＤＵＦ１５２ドメイン（ＨＡＧＷＲＧＴＶ）の特徴的な中心アミノ酸配列を示す。
【０１２０】
図１９は、ＲＬ５ラッカーゼに対する複数の配列のアライメントおよびＴ１銅リガンドの同定（＊印で示す）を示す。複数の配列のアライメントを、タンパク質配列に対して、ＣｌｕｓｔａｌＷオンラインツール（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて作製した。各略称は以下を示す。ＲＬ５：反芻胃メタゲノム由来ラッカーゼ、ＢＴ４３８９、Ｂ．ｆｒａおよびＣ．ｈｕｔ：それぞれ、バクテロイデステタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）由来およびサイトファガハッチインソニイ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ）由来の仮定タンパク質（Ａｃｃ．  ｎｏ．  ＡＥ０１６９４５．１，  ＡＰ００６８４１．１およびＮＺ  ＡＡＢＤ０３００００１０．１）。＊印は、Ｔ１銅部位に属するアミノ酸残基を表す。
【０１２１】
図２０−１から図２０−３６までには、本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ）のアクセッション番号を示す。これらのポリペプチドの機能は、当該技術分野において未だ分かっていない。これらのポリペプチドはＤＵＦ１５２ドメインを包含している。本発明によれば、ＤＵＦドメインは、ポリペプチド１から７０３にラッカーゼ活性を付与する。これらのいずれのポリペプチドもラッカーゼとして使用可能であり、特に応用例として個々に記載した。
【０１２２】
〔実施例〕
（材料）
＜化学物質および酵素＞
２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）、２，６−ジメトキシフェノール（ＤＭＰ）、４−ヒドロキシベンジルアルコール、ベラトリルアルコール、グアヤコール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＢＴ）およびビオルロニック酸（ｖｉｏｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，  ＵＳＡ）から購入した。３，４−ジメトキシベンジルアルコール、シリンガルダジン（ＳＧＺ）およびフェノールレッドをＡｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，  Ｃａｎａｄａ）から購入した。全ての他の化学物質は分析等級であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための分子量マーカーは、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ）から得た。制限酵素および修飾酵素をＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）から得た。ＤＮａｓｅＩ等級ＩＩをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  （Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。クロマトグラフ媒体を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  ＵＫ）から得た。ＤＮＡ操作をＳａｍｂｒｏｏｋら（１９９８）に従って行った。酵素および材料のための製造者の指示を採用した。
【０１２３】
＜微生物株＞
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（ライブラリ構築およびスクリーニングのため）、ＸＬＯＬＲ（ファージ実度からのラッカーゼの発現のため）（何れもＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得た，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）、およびＴＯＰ  １０  （部位特異的変異および変異体発現のため）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を、供給者が推奨する標準的なプロトコールの記載にしたがって維持し、培養した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９））。
【０１２４】
（実施例１：ＲＬ５ラッカーゼの再生）
組換えラッカーゼを、他の文献（Ｆｅｒｒｅｒら（２００５））に記載されたように、ウシ反芻胃流動物から抽出したＤＮＡから構築した、ラムダベース発現ライブラリのバクテリオファージから再生した。詳細には、総反芻胃含有物（流動相および固相）の代表的なサンプルを、１頭のニュージーランド乳牛から得た。サンプルを回収し、ＤＮＡ抽出を行うまで−７０℃で保存した。全ゲノムＤＮＡの反芻胃サンプルからの抽出を、ビードビーディング（ｂｅａｄ−ｂｅａｔｉｎｇ）ＤＮＡ抽出方法により、Ｓｏｉｌ用ＤＮＡキット（Ｑｂｉｏｇｅｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。ラッカーゼ収集のために、感染細胞を５０μＭ  シリンガルダジンを含むＮＺＹ軟寒天と混合した。収集したファージ、すなわちｐＢＫ−ＣＭＶファージミドを、以下ｐＢＫ−ＲＬ５と称する。ｐＢＫ−ＲＬ５を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）に従って、ヘルパーファージと共に共感染することで摘出した。一般的なプライマーとプライマーウォーキング法とを用いて、両端から挿入ＤＮＡの配列を得た。
【０１２５】
（実施例２：部位特異的変異）
ＲＬ５ラッカーゼを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ（登録商標）部位特異的変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って、適切なオリゴヌクレオチドを用いて準備した。７３、１３５、１９０、２０７、２３３および２３９の位置の８個のヒスチジン残基（ＨｉｓまたはＨ）を、アラニン（ＡｌａまたはＡ）によって置換した。７５および１１８に位置するシステイン（ＣｙｓまたはＣ）残基を、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）によって置換した。変異を有するＲＬ５誘導プラスミドを、エレクトロポレーションによって大腸菌ＴＯＰ１０に導入した。野生型および変異遺伝子を含むプラスミドは、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｓ（ＣＳＩＣ，  Ｍａｄｒｉｄ）において、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７  自動蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を得た。配列化プライマーとして、Ｆ１プライマー（  ５’−ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＧＣ−３’）を用いた。
【０１２６】
（実施例３：タンパク質精製）
＜ＲＬ５変異体の精製＞
野生型および変異ＲＬ５タンパク質の全長遺伝子を以下に示すように増幅し、Ｃ末端においてヘキサヒスチジンＨｉｓ６タグと融合した。遺伝子を、オリゴヌクレオチドプライマーＲＬ５Ｆ−Ｎｄｅ（５´−  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＧＣ  −３’）およびＲＬ５Ｒ−Ｋｐｎ（５´−ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  Ｇ−３’）（下線はヒスチジンタグのために導入したヌクレオチドを示す。）を用いて、ｐＢＫＲＬ５プラスミドからＰＣＲ増幅した。総量５０μＬにおいて、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ  ）２ユニットの存在下で、９４℃、１時間反応を行った。その後、９４℃で２０秒間の反応を２５サイクル、４０℃で６０秒間の反応、７２℃で１分間の反応、７２℃で５分間および１０℃で１５分間の最終伸長工程を行った。増幅物を０．７５％アガロースゲルにおける電気泳動によって精製し、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ハイブリッドプラスミドを、供給元が推奨する方法であるエレクトロポレーションによって、大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。そして、当該細胞を、カナマイシン（５０  μｇ／ｍｌ）が添加されたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上に置いた。
【０１２７】
形質転換クローンを、５０  μｇ／ｍｌのカナマイシンと、０．１から１ｍＭの異なる濃度範囲のＣｕＳＯ４とが添加された、１Ｌ浸とうフラスコ中のＬＢ寒天培地上で、３７℃で培養された。５００μＭ  ＣｕＳＯ４が高い活性の酵素において得られた。１０μＭのＣｕＳＯ４がわずか１０％、１ｍＭのＣｕＳＯ４が４０％より少量得られた。培地におけるＯＤ６００が０．６に達したとき、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、インキュベーションを４時間続けた。その後、細胞を遠心分離（３０分間、  ８，０００ｇ、４°Ｃ）によって収集し、リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を添加した、ｐＨ  ６．１の５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０  ｍＭ  イミダゾール中に懸濁した。細胞懸濁液を氷上において３０分間インキュベートした後、３０秒間の超音波処理を４回行った。細胞溶解物を４℃、２５，０００ｇで２０分間遠心分離し、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  ＵＫ）において２５℃で、Ｈｉｓ６タグで標識された酵素を精製した。ｐＨ７．４の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ４  ｍｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  イミダゾールを用いてカラムを洗浄した後、ｐＨ７．４の２０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  １０  ｍｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  および５００ｍＭ  イミダゾールを用いて、組換え酵素を抽出した。精製中の酵素活性の観察を、５３０ｎｍにおけるＳＧＺの酸化を分光光度測定によって行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｌａｅｍｍｌｉ（３０）に記載されているように、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎシステムにおいて、１２％（ｖ／ｖ）アクリルアミドゲルを用いて行った。ＢＳＡを標準としてＢｒａｄｆｏｒｄ  （３１）に従って、タンパク質濃度を決定した。
【０１２８】
＜ＤＵＦ１５２仮定タンパク質のクローニングおよび精製＞
Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ＤＳＭ  ２０７９および大腸菌由来の全長ＤＵＦ１５２仮定タンパク質の遺伝子を以下に示すように増幅し、ヘキサヒスチジンＨｉｓ６タグと融合した。オリゴヌクレオチドプライマーＢＴ４３８９ＦｎｄｅＩ（５’−ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＡＡＧ−３’）およびＢＴ４３８９ＲＫｐｎ（５’−ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＡＴＴ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ−３’）をＢＴ４３８９の増幅のために用い、オリゴヌクレオチドプライマーＤＵＦ１５２ＮｄｅＩ  Ｆ（５’−ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＧＣ−３’）およびＤＵＦ１５２  ＸｈｏＩ  Ｒ（５’−ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  Ｇ−３’）をＹｆｉＨの増幅のために用いて、Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）由来の仮定タンパク質ＢＴ４３８９遺伝子、および大腸菌由来のＹｆｉＨ遺伝子を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１２９】
増幅を、９５°Ｃで１２０秒間行い、９５°Ｃで４５秒間、５０°Ｃで６０秒間、および７２°Ｃで１２０秒間を３０サイクル行い、７２°Ｃで５００秒間行う条件とした。約８００〜７３０塩基対のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＱｉａＥｘＩＩ  ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた方法によって抽出し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）を用いて、供給元によって推奨された方法によって、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングした。ついで、当該ｐＣＲ２．１プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａエレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエレクトロポレーションによって導入した。ポジティブクローンを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天において選抜した。ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントを有するプラスミドｐＣＲＢＴ４３８９およびｐＣＲＹｆｉＨを、プラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、Ｍ１３およびｒＭ１３オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列化した。ＢＴ４３８９およびＹｆｉＨをコードする配列を含むフラグメントを、エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＫｐｎをＢＴ４３８９の摘出のため、エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＸｈｏＩをＹｆｉＨの摘出のために用いて、当該プラスミドから摘出した。ゲル精製を上述したとおりに行い、１４°Ｃで１６時間、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）を用いて、ｐＥＴ−３ａプラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。ｐＥＴ−３ａプラスミドベクターは、同じエンドヌクレアーゼを用いて前もって切断しておき、Ｒｏｃｈｅ  （Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）エビアルカリフォスファターゼを用いて、３７℃で１時間脱リン酸化した。ライゲーション混合物を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天上の大腸菌ＤＨ５ａエレクトロコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。培養条件およびタンパク質精製をＲＬ５ラッカーゼのために準備した（上記参照のこと）。
【０１３０】
（実施例４：Ｎ末端配列）
Ｎ末端配列を決定するために、純タンパク質（２０ｎｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で、変性ＰＡＧＥ（１０〜１５％ポリアクリルアミド）にかけた。ついでセミドライブロット転写装置を用いて、製造者による使用説明書に従って、タンパク質バンドをポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロットした。ブロットした膜を、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、４０％メタノール／１０％酢酸で脱色した後、バンドを切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列として処理した。
【０１３１】
（実施例５：高解像度高周波誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ））
野生型ＲＬ５およびその変異体が含有する金属イオンを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＣＰ−ＭＳ  （ｍｏｄｅｌ  ＰＥ  ＥＬＡＮ  ６１００  ＤＲＣ）を用いて決定した。０．５％  （ｖ／ｖ）  ＨＮＯ３  ５ｍｌを有する酵素５０μｇで希釈することによって、タンパク質を消化し、金属イオンを放出させて、金属含有量を決定した。この溶液は、何れの処置も全く行わずに用いた。
【０１３２】
（実施例６：精製ラッカーゼの分析）
温度自動調節分光光度計  （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、４０℃で、ｐＨ４．５の１００ｍＭ  クエン酸ナトリウムバッファ  １ｍｌ中において、ラッカーゼ活性を分光光度法で決定した。標準分析を、酸化基質としてＳＧＺ（ｅ５３０＝６４，０００Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて、５３０ｎｍにおいて行った。メタノール中のストック溶液から、終濃度２０μＭになるまでＳＧＺを追加して反応を開始した。ラッカーゼ活性を測定するための他の基質は、終濃度１ｍＭにおいて、ＡＢＴＳ（ｅ４２０＝３８，０００Ｍ−１ｃｍ−１）、ＤＭＰ（ｅ４６８＝１４，８００Ｍ−１ｃｍ−１）、テトラメチルベンジジン  （ｅ６５５  ｎｍ＝３９，０００Ｍ−１ｃｍ−１）、ベラトリルアルコール（ｅ３１０＝９，０００  Ｍ−１ｃｍ−１）、グアヤコール  （ｅ４７０＝２６，６００Ｍ−１ｃｍ−１）、３，４−ジメトキシベンジルアルコール（ｅ３１０＝９，５００  Ｍ−１ｃｍ−１）および４−メトキシベンジルアルコール（ｅ５００  ＝３８，０００Ｍ−１ｃｍ−１）である。フェノールレッド（７５μＭ）の酸化を、４３２ｎｍにおける吸収の減少により決定した。活性ｐＨと活性温度との関係を、種々のｐＨ値および一定温度（４０℃）、ならびに種々の温度（１５〜８０℃）および一定ｐＨ（４．５）において、それぞれ酵素基質混合液をインキュベートすることによって決定した。触媒持続性をミカエリス・メンテンモデル上の実験データに当てはめて導き出した。酵素を用いないコントロール測定を、基質の可能な化学酸化の修正によって行った。
【０１３３】
（実施例７：電子化学分析）
電子化学測定を、ＢＡＳ  ＣＶ−５０Ｗ  電解電量分析器を用いて行った。金属表面実験のために、金ＢＡＳディスク電極を用いた。電極を以下の方法により洗浄した。まず、電極を、過酸化水素３３％ｖを１部および硫酸９８％を３部含む、ピラニア溶液（“ｐｉｒａｎｈａ”  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に、５分間浸漬した。ｍｉｌｌｉＱを用いて十分に電極をすすぎ洗いした後、０．０５ミクロンサイズのＢｕｅｈｌｅｒ（登録商標）マイクロポリッシュガンマアルミナＮｏ．３を用いて、研磨布上で５分間研磨した。さらに、ｍｉｌｌｉＱ水溶液に浸漬し、１５分間超音波に曝した。それから電極を硫酸酸化循環ボルタンメトリーを用いて３０分間洗浄した。電極をｍｉｌｌｉＱ水溶液をを用いて３回すすぎ洗いし、さらに５分間同様のアルミナ粉末を用いてサイド研磨した。次の音波処理を１５分間行った後、電極を最後に還元した０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液に３０分間浸漬し、ｍｉｌｌｉＱ水溶液ですすぎ洗いした。５ｍｇ／ｍｌの濃度で酵素溶液１５μＬを、上向きの金表面上に滴下することによって、ラッカーゼ酵素を固定し、蒸発を避けるために蓋をした。９０分後、２回目めの滴下を加えた。最初の滴下から１８０分後、ラッカーゼにより修飾された金電極を、酸素の存在下で、ｐＨ６．０の１００ｍＭ  リン酸塩バッファにおいて測定した。嫌気性条件下での測定のために、電気化学セル中に１５分間Ｎ２を注入した。同様の方法で、テスト基質として用いる２，６−ジメトキシフェノールの存在下で測定を繰り返した。カーボン電極への固定を、ＢＡＳガラス質カーボン電極上で行った。電極をグラファイト研磨布において、鏡面様表面に達するまで５分間研磨した。電極を水で十分にすすぎ洗いし、上向きに、ラッカーゼ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを、ガラス質カーボン表面上に滴下した。電極に蓋をし、２０分間固定させた。金電極に対して行った全ての電極測定を、この電極にたいして繰り返した。  
【０１３４】
（実施例８：分子モデリング）
ＲＬ５の構造既知ホモログタンパク質のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋにおける検索によって、２つの候補１Ｔ８Ｈおよび１ＲＶ９がもたらされた。１Ｔ８Ｈおよび１ＲＶ９はそれぞれ、ＲＬ５と３３．２％および３１．８％の配列同一性を示した。これらの両方は、生物学的機能が未知の微生物タンパク質である。１つめは、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から得られ、２つ目はネイセリアメニンジチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）から得られた（公開されていない）。本発明者らは、好ましいテンプレートとして、１Ｔ８Ｈを選択した。ＲＬ５および１Ｔ８Ｈの配列の構造アライメントを、ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ  （Ｊｏｎｅｓ  １９９９）から得て、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌサーバー（ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ（１９９７）、Ｇｕｅｘら（１９９９））からＲＬ５を取り出すために用いた。予測ＲＬ５構造のラマチャンドランプロットが好ましい領域における９２％の残基と、許容される領域の７％の残基とをもたらし、モデルの質がよいことを示した。
【０１３５】
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】ＲＬ５  ＯＲＦのアライメントに基づき、枝分かれしたアミノ酸ツリーを、関連するホモログ配列と共に示す図である。
【図１Ｂ】ＲＬ５  ＯＲＦのアライメントに基づき、枝分かれしたアミノ酸ツリーを、関連するホモログ配列と共に示す図である。
【図１Ｃ】ＲＬ５  ＯＲＦのアライメントに基づき、枝分かれしたアミノ酸ツリーを、関連するホモログ配列と共に示す図である。
【図２】組換えＲＬ５ラッカーゼのｐＨ依存および温度依存活性プロファイルを示す図である。
【図３】基質として１０ｍＶ／ｓのＤＭＰ存在下（ＡおよびＢ）、または基質の非存在下（ＣおよびＤ）におけるＲＬ５ラッカーゼの電気化学的分析の結果を示す図である。
【図４】ＲＬ５ラッカーゼのヒスチジン（Ｈ）からアラニン（Ａ）およびシステイン（Ｃ）からグルタミン（Ｑ）変異体における銅含有量（Ａ）および２次構造含有量（Ｂ）のグラフを表す図である。
【図５】ＲＬ５ラッカーゼ構造の三次元図である。
【図６】ＲＬ５  ＤＮＡフラグメントにおけるＲＬ５ラッカーゼの横側に位置する遺伝子と、バクテロイデステタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）ゲノムにおいて見られる同様の遺伝子との間における構造機構の比較を表す図である。
【図７】本発明に係るＲＬ５ラッカーゼによって触媒される種々の化合物の酸化反応の結果を表す表１を示す図である。
【図８】本発明に係るＲＬ５ラッカーゼの速度パラメータを示す表２を示す図である。
【図９Ａ】ＲＬ５ラッカーゼで処理したアントラセンのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図９Ｂ】ＲＬ５ラッカーゼで処理したアントラセン溶液のＧＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図９Ｃ】ＲＬ５ラッカーゼで処理したベンゾ［ａ］ピレンのＨＰＬクロマトグラムを示す図である。
【図１０】不反応染料Poly R-478の酸化の結果を示す図である。
【図１１】本発明に係るＲＬ５ラッカーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】バクテロイデステタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）(Gene Bankアクセッション番号NP_813300)由来のＢＴ４３８９ラッカーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１３】大腸菌(Gene Bankアクセッション番号．AAG57706)由来のＹｆｉＨラッカーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１４Ａ】本発明に係るＲＬ５ラッカーゼ遺伝子の逆方向における核酸配列を示す図である。
【図１４Ｂ】本発明に係るＲＬ５ラッカーゼ遺伝子の逆方向における核酸配列を示す図である。
【図１４Ｃ】本発明に係るＲＬ５ラッカーゼ遺伝子の逆方向における核酸配列を示す図である。
【図１５】本発明に係るＲＬ５ラッカーゼ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の核酸配列を示す図である。
【図１６】バクテロイデステタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）(Gene Bankアクセッション番号NP_813300)由来のＢＴ４３８９ラッカーゼ遺伝子の核酸配列を示す図である。
【図１７】大腸菌(Gene Bankアクセッション番号AAG57706)由来のＹｆｉＨラッカーゼ遺伝子の核酸配列を示す図である。
【図１８】ＤＵＦ１５２ドメイン(HAGWRGTV)の特徴的な中心アミノ酸配列を示す図である。
【図１９】ＲＬ５ラッカーゼに対する複数の配列のアライメントおよびＴ１銅リガンドの同定を示す図である。
【図２０−１】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−４】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−５】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−６】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−７】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−８】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−９】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１０】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１１】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１２】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１３】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１４】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１５】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１６】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１７】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１８】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−１９】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２０】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２１】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２２】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２３】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２４】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２５】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２６】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２７】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２８】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−２９】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３０】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３１】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３２】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３３】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３４】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３５】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図２０−３６】本発明に係るポリペプチド（１から７０３）と、その配列が与えられたデータベース（Gene Bank）のアクセッション番号を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
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【図２０−８】
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【図２０−９】
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【図２０−１０】
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【図２０−１１】
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【図２０−１２】
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【図２０−１３】
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【図２０−１４】
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【図２０−１５】
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【図２０−１６】
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【図２０−１７】
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【図２０−１８】
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【図２０−１９】
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【図２０−２０】
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【図２０−２１】
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【図２０−２２】
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【図２０−２３】
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【図２０−２４】
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【図２０−２５】
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【図２０−２６】
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【図２０−２７】
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【図２０−２８】
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【図２０−２９】
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【図２０−３０】
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【図２０−３１】
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【図２０−３２】
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【図２０−３３】
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【図２０−３４】
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【図２０−３５】
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【図２０−３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009527236.tif 000065
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