(57)【要約】インスリンプロモーターの下流に、ジフテリア毒素受容体遺伝子としてヒトＨＢ−ＥＧＦ前駆体ｃＤＮＡを配置したトランスジーンを調製し、これをマウス受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作製した。このマウスは、膵島β細胞特異的にヒトＨＢ−ＥＧＦ前駆体を発現し、ジフテリア毒素の投与によりβ細胞が選択的に破壊され、投与後２、３日で糖尿病を誘導することができるため、糖尿病治療薬の探索などに利用できる。
2009527217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島β細胞特異的に機能するプロモーターの制御下に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするＤＮＡを配置した発現ユニットを宿主に導入して、該受容体を膵島β細胞に特異的に発現させ、該化合物の投与により膵島β細胞が選択的、かつ所望の時期にその全部または一部を破壊され、高血糖状態を呈するように作製された糖尿病モデル動物。
【請求項２】
請求項１記載の糖尿病モデル動物又はその子孫に対する該化合物の投与により膵島β細胞が選択的に破壊された糖尿病モデル動物。
【請求項３】
膵島β細胞特異的に機能するプロモーターがインスリンプロモーターである、請求項１又は２記載の糖尿病モデル動物。
【請求項４】
受容体がジフテリア毒素受容体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖尿病モデル動物。
【請求項５】
ジフテリア毒素受容体が、ヒト由来ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）前駆体である、請求項４記載の糖尿病モデル動物。
【請求項６】
マウス又はラットである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖尿病モデル動物。
【請求項７】
請求項６記載の糖尿病モデル動物の作製方法であって、膵島β細胞特異的に機能するプロモーターの制御下に、野生型のマウス又はラットに対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするＤＮＡを配置した発現ユニットを、マウス又はラットの受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞などの個体形成能をもつ細胞に導入後、得られた卵又は胚を偽妊娠雌マウス（又はラット）の卵管に移植し、産まれた仔マウス（又は仔ラット）から前記ＤＮＡを有する仔マウス（又は仔ラット）を選抜する工程を含む、糖尿病モデル動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖尿病モデル動物を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法であって、高血糖状態のモデル動物に被検物質を投与又は移植した後、該モデル動物の血糖値、血中インスリン濃度、尿糖値又は生存率などを調べて糖尿病に対する有効性を評価することを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病モデル動物に関し、より詳細には、ジフテリア毒素等の投与により膵島β細胞が選択的に破壊され、所望の時期に糖尿病症状を誘導することができる糖尿病モデル動物、その作製方法、及び、該モデル動物を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、生活習慣病の１つに挙げられ、現在日本には６００万人以上の糖尿病患者がおり、糖尿病予備軍を加えると１４００万人にものぼることが報告されている国民病である。糖尿病は、血中のブドウ糖濃度が高い状態が持続する病気であるが、失明や尿毒症を引き起こすだけでなく、糖尿病性の神経障害、高血圧症、動脈硬化症などの様々な合併症を引き起こすことが大きな問題になっている。
【０００３】
糖尿病には２つのタイプが知られている。１つは、インスリンを分泌する膵臓ランゲルハンス島（膵島）のβ細胞が自己免疫などにより破壊され、インスリンを分泌できなくなる１型糖尿病であり、インスリン依存型糖尿病ともいわれる。もう１つの２型糖尿病は、インスリンの分泌が低下しやすい体質を持っている人に、肥満、運動不足、ストレスなどの要素が加わり、分泌されたインスリンがうまく働かなくなるというものである。
【０００４】
糖尿病の治療法や治療薬の開発、合併症の研究などに糖尿病モデル動物の開発は重要であり、現在までにいくつかのモデル動物が開発され利用されている。２種類の代表的な１型糖尿病モデルマウスについて説明すると、１つは、ストレプトゾトシンという膵島β細胞に特異的に作用する薬剤を投与して得られるマウスであり、他の１つは白内障を多発するマウスから、糖尿病に類似する症状を呈するマウスを樹立したもの（ＮＯＤマウス）である。
【０００５】
前者のマウスは、ストレプトゾトシンの投与により簡便な方法で得られるが、欠点として糖尿病惹起の効率及び再現性に問題があり、また腎障害など他臓器への副作用が生じることが挙げられる。一方、後者のＮＯＤマウスは、１型糖尿病発症に類似しているため発症機構の解明には向いていると考えられるが、（１）長時間の飼育が必要（７０〜８０％発症させるためには８ヶ月以上の飼育が必要）であり、またいつ発症するかは予測できない、（２）雌雄差があり、メスマウスしか使用できない、という問題がある。
【０００６】
ところで本発明者は、ＴＲＥＣＫ法（Toxin Receptor Mediated Cell Knockout）と名付けた目的の標的細胞群だけを任意の時に破壊できる独自の方法を開発した（下記の非特許文献１・２参照）。この方法により実際、肝細胞特異的プロモーターであるアルブミンエンハンサー／プロモーターの下流に、ジフテリア毒素受容体遺伝子をつないだ発現ユニットを用いてトランスジェニックマウスを作製し、その後、このマウスにジフテリア毒素を投与することによって肝細胞を選択的に破壊することができた（下記の特許文献１・２参照）。
【０００７】
【非特許文献１】「蛋白質  核酸  酵素」Vol.43 No.1 (1998) 11-24頁
【非特許文献２】「Nature Biotechnology」Vol.19 (2001) 746-750頁
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９８／３３８９９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，５７６，８１３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来の糖尿病モデル動物の問題点を解決した新たな糖尿病モデル動物を提供すること、即ち、所望の時に効率よく短期間にしかも雌雄の差なく糖尿病を発症させることができ、膵島β細胞以外の臓器や細胞に対する副作用も殆どない糖尿病モデル動物、および、該モデル動物を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法を提供することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、前記ＴＲＥＣＫ法を用いて膵島β細胞にジフテリア毒素受容体を特異的に発現させたマウスを作製し、その後ジフテリア毒素を投与したところ、（１）β細胞のみが選択的に破壊され、投与後２、３日で高血糖状態を呈すること、（２）血中インスリン濃度が顕著に低下し、低インスリン産生となり、インスリンを投与すると血糖値が正常に回復すること、（３）ジフテリア毒素の投与量によってマウス生存率などに違いが生じること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、産業上および医療・医学研究上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｈ）の発明を包含するものである。
Ａ）  膵島β細胞特異的に機能するプロモーターの制御下に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするＤＮＡを配置した発現ユニットを宿主に導入して、該受容体を膵島β細胞に特異的に発現させ、該化合物の投与により膵島β細胞が選択的、かつ所望の時期にその全部または一部を破壊され、高血糖状態を呈するように作製された糖尿病モデル動物。
上記化合物は、宿主に対し本質的に毒性を示さないが、受容体を発現する膵島β細胞に対しては毒性を発揮するため、該化合物を少量投与することで膵島β細胞を選択的に破壊し、低インスリン産生状態に陥らせ、糖尿病症状を誘導することができる。膵島β細胞はその全部が破壊される必要は無く、その一部が破壊されることによって糖尿病症状を呈するものであってもよい。
【００１１】
Ｂ）  上記Ａ）記載の糖尿病モデル動物又はその子孫に対する該化合物の投与により膵島β細胞が選択的に破壊された糖尿病モデル動物。
「子孫」とは換言すれば交配により後代に生まれる動物すべてを意味し、数世代に限定されるものではない。化合物の投与量を調節することで、糖尿病症状を呈した後も長期間生存させることができ、その間各種検査等の用に供することができる。
【００１２】
Ｃ）  膵島β細胞特異的に機能するプロモーターがインスリンプロモーターである、上記Ａ）又はＢ）記載の糖尿病モデル動物。
インスリンプロモーターとしては、好適にはヒト、ラット又はマウス由来のものが挙げられるが、特に限定されるものではない。使用するプロモーターの長さ・領域についても、β細胞特異的にプロモーター活性を発揮する限りにおいて特に限定されるものではない。
【００１３】
Ｄ）  受容体がジフテリア毒素受容体である、Ａ）〜Ｃ）のいずれかに記載の糖尿病モデル動物。
ジフテリア毒素に対し、ヒトやサル等は高感受性であるが、マウスやラット等は本来非感受性である。そこで、マウスやラット等のβ細胞にジフテリア毒素受容体を特異的に発現させ、その後所望の時期にジフテリア毒素を投与することによってインスリン産生細胞であるβ細胞のみ選択的に壊死させ、糖尿病症状を誘導することができる。
【００１４】
Ｅ）  ジフテリア毒素受容体が、ヒト由来ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（heparin-binding EGF-like growth factor（ＨＢ−ＥＧＦ））前駆体である、上記Ｄ）記載の糖尿病モデル動物。
上記ヒト由来ＨＢ−ＥＧＦ前駆体がジフテリア毒素受容体として好適であるが、そのほか、サル、ハムスター、モルモット等ジフテリア毒素に対して高感受性の動物種由来のＨＢ−ＥＧＦ前駆体の使用も考えられる。
なお、ＨＢ−ＥＧＦ前駆体とは換言すれば膜結合型ＨＢ−ＥＧＦのことであり、以下では単に「ＨＢ−ＥＧＦ」という。
【００１５】
Ｆ）  マウス又はラットである、上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載の糖尿病モデル動物。
本発明の糖尿病モデル動物は非ヒト哺乳動物であればよいが、実験動物として多用されているマウス及びラットが、特に上述のようにジフテリア毒素を用いて糖尿病症状を誘導する場合に好適なモデル動物となる。
【００１６】
Ｇ）  上記Ｆ）記載の糖尿病モデル動物の作製方法であって、膵島β細胞特異的に機能するプロモーターの制御下に、野生型のマウス又はラットに対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするＤＮＡを配置した発現ユニットを、マウス又はラットの受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞などの個体形成能をもつ細胞に導入後、得られた卵又は胚を偽妊娠雌マウス（又はラット）の卵管に移植し、産まれた仔マウス（又は仔ラット）から前記ＤＮＡを有する仔マウス（又は仔ラット）を選抜する工程を含む、糖尿病モデル動物の作製方法。
【００１７】
Ｈ）  上記Ａ）〜Ｆ）のいずれかに記載の糖尿病モデル動物を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法であって、高血糖状態のモデル動物に被検物質を投与又は移植した後、該モデル動物の血糖値、血中インスリン濃度、尿糖値又は生存率などを調べて糖尿病に対する有効性を評価することを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
「糖尿病治療薬」には再生医療に用いられる細胞などの生物材料が含まれ、このような細胞を被検物質として移植することによって、糖尿病に対する有効性を評価する方法も含まれる。有効性を評価する方法は、上記例示の血糖値、血中インスリン濃度、糖尿などを調べる方法のほか、組織学的検査、生理学的検査、行動観察など、有効性を評価しうるあらゆる解析方法の使用が可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の糖尿病モデル動物は、以下の特徴・利点を有しており、糖尿病の治療法や治療薬の開発、合併症の研究、膵島β細胞の再生やその幹細胞の同定など様々な研究用ツールとして有用である。
（１）任意の時期にジフテリア毒素等を投与することにより、非常に効率よく、かつ短期間（投与後２〜３日程度）に糖尿病症状を誘導することができる。
（２）雌雄の差なく糖尿病を発症させることができ、検査用の個体数を確保することができる。
（３）β細胞特異的に受容体を発現させるため、他の臓器や細胞に対する影響・副作用は殆どみられない。
（４）ジフテリア毒素等の投与量を調節することにより、β細胞への障害度をコントロールすることができ、生存率、回復力など性質が異なる様々な糖尿病モデル動物を提供することができる。
（５）本発明の糖尿病モデル動物のβ細胞は受容体を発現するため、例えば野生型の動物から細胞移植を行う場合、その細胞と糖尿病モデル動物の細胞とを容易に区別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の一形態について説明する。
本発明の糖尿病モデル動物の実施形態として、後述の実施例に記載の第１及び第２の糖尿病モデルマウスを挙げることができる。いずれもヒトＨＢ−ＥＧＦを膵島β細胞に特異的に発現するよう当該ヒトＨＢ−ＥＧＦ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスである。以下、その作製方法およびその変更態様等について説明する。
【００２０】
［１］トランスジーン（発現ユニット）の作製
図１及び図９には、それぞれ第１及び第２の糖尿病モデルマウスの作製に使用したトランスジーンの構造が模式的に示される。第１の糖尿病モデルマウスの作製に使用したトランスジーンは、ヒトインスリンプロモーター（human Insulin promoter）−β-グロビンイントロン（β-globin intron）−ヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡ（human HB-EGF cDNA）−β-グロビンポリＡシグナル（polyA）の順に配列され、ヒトインスリンプロモーターの下流にヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡを配置した構造になっている。
【００２１】
一方、第２の糖尿病モデルマウスの作製に使用したトランスジーンは、ラットインスリンＩＩプロモーター（Insulin promoter）−β-グロビンイントロン（図中省略）−ジフテリア毒素受容体であるヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡ（DTr（human HB-EGF））−ＩＲＥＳ（Internal Ribosome Entry Site）―ｐＴｉｍｅｒ（色が経時変化する蛍光タンパク質。Clontech社）―β-グロビンポリＡシグナル（図中省略）の順に配列されたものであり、ヒトではなくラット由来インスリンプロモーターの下流にヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡを配置した構造になっている。しかし、いずれのトランスジーンともインスリンプロモーターの下流にヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡを配置した構造で共通しており、こうした構造のトランスジーンをマウスに導入することにより、インスリン産生細胞である膵島β細胞の表面に特異的にヒトＨＢ−ＥＧＦを発現させることができる。
【００２２】
トランスジーンは、常法（Molecular Cloning 2nd edition chapter 16,17 Cold Spring Harbor Laboratory Press記載の方法等）により調製することが可能である。また、ヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡ配列、インスリンプロモーター配列等については、公知の配列情報等に基づいて調製することが可能である（例えば、Cell Vol.69, 1051-1061 (1992)；J. Exp. Med. Vol.188, 1445-1451 (1998)）。
【００２３】
［２］糖尿病モデルマウスの作製と糖尿病症状の誘導
上記構造のトランスジーンをマウスの受精卵等に導入してトランスジェニックマウスを作製する。通常行われる方法として、トランスジーン（導入遺伝子）をマウスの受精卵、初期胚または胚性幹細胞などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞に導入し、得られた卵又は胚を偽妊娠マウスに移植し、生まれた仔マウスから前記トランスジーンを有する仔マウスを選別するステップを含む作製方法を挙げることができる（「実験医学別冊  新訂  新遺伝子工学ハンドブック  改訂第３版」（羊土社、１９９９年９月１０日発行）の２３４−２３８頁等）。後述の実施例に記載の第１及び第２の糖尿病モデルマウスも、基本的にこの方法にしたがって作製した。
【００２４】
トランスジーンの導入方法としては、例えば、微分干渉顕微鏡下で前核期卵の核に微小ピペットでトランスジーンを直接注入する方法（マイクロインジェクション法／Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77，7380-7384(1980)）、組換えレトロウイルスベクターを用いてトランスジーンを導入する方法（レトロウイルス法／Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82，6148-6152，6927-6931，8587-8591(1985)）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83，9065-9069(1986)）等が挙げられる。これらの方法においては、例えば、受精卵を採取し、トランスジーンをマイクロマニュピレーターを用い、受精卵の雄性前核中に注入し、得られた受精卵を卵管へ移入する方法が用いられる。また、ＥＳクローンに電気穿孔法を用いてトランスジーンを導入し目的細胞を薬剤で選抜し、マイクロマニュピレーターを用い、受精卵に注入しキメラ胚を作製して同様にトランスジェニックマウスを作製することも可能である。
【００２５】
上記方法により作製したトランスジェニックマウスは、実際にインスリン産生細胞である膵島β細胞にのみ特異的にヒトＨＢ−ＥＧＦの発現が観察された（図２）。また、ジフテリア毒素を投与すると、投与後２〜３日で明らかな高血糖症状を示した（図３、図１０）。血中インスリン濃度についても、野生型マウスと比較して顕著に低下していた（図４）。組織学的解析により、β細胞のみ選択的に破壊され（図６、図１１）、インスリンを投与すると血糖値が正常に回復した（図５）。
【００２６】
このように、本糖尿病モデルマウスは、膵島β細胞特異的にジフテリア毒素受容体を発現するトランスジェニックマウスであり、そのままでは正常であるが、ジフテリア毒素の一回投与によりβ細胞が特異的に破壊され、短期間に糖尿病症状（高血糖／低インスリン産生）を誘導することができる。また、β細胞以外の臓器や細胞に異常や副作用などは認められなかった。
【００２７】
ジフテリア毒素の投与方法は、静注、腹腔注射のような非経口投与が好適であるが、特に限定されるものではない。ジフテリア毒素の投与量については、５０ｎｇ／ｋｇ（体重）という低量投与によっても、効率よく短期間に糖尿病症状を誘導することができた（図８）。野生型マウスがこの千倍量である５０μｇ／ｋｇを投与されても全く影響なく非感受性であることを考慮すると、本発明の糖尿病モデルマウスは毒素投与に対して非常に感受性が高く、低量の毒素投与に応答して速やかに糖尿病を発症することがわかる。
【００２８】
また、ジフテリア毒素の投与量によって糖尿病モデルマウスの生存率に違いが生じ（図７）、１００ｎｇ／ｋｇ程度以下の投与量とすることによって長期間生存可能であることが見出された。モデルマウスは、長期間生存することが望ましく、この点からも、低量の毒素投与で糖尿病を発症し、しかも長期間生存可能な本発明の糖尿病モデルマウスは優れているといえる。
【００２９】
５０μｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇのジフテリア毒素を投与した場合、いずれの場合も短期間（投与後１０日過ぎ）にすべて死亡した。勿論、このような投与量で糖尿病を発症させたマウスもモデルマウスとして十分利用可能であり、インスリンその他有効な被検物質を投与すれば長期間の生存も可能である。
【００３０】
上述のように、ジフテリア毒素の投与量によってマウスの生存率に違いが生じるのは、ジフテリア毒素の投与量に応じてβ細胞の破壊される割合・程度も異なってくるためと考えられる。つまり、ジフテリア毒素の投与量を調節することによって、β細胞への障害度が異なり、生存率、回復力などが異なる様々な糖尿病モデルマウスを提供することができる。また、ジフテリア毒素の一回投与により、高血糖状態の誘導が可能であるが、移植再生効果を調べる場合などは、長期間生存させつつ徐々にβ細胞を破壊すべく、数回にわたってモデルマウスに毒素を投与するという利用法も可能である。
【００３１】
［３］変更態様
（１）  常法に従って導入するヒトＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の元の塩基配列中の１個または数個の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加させ、このように人為的に改変した遺伝子を対象動物に導入することにしてもよい。例えば、毒素結合能を向上させた変異型遺伝子、あるいは、毒素結合能は維持したまま、増殖因子の機能を失わせた変異型遺伝子を調製し、これを対象動物に導入することは好ましい方法である。
【００３２】
（２）  ヒトＨＢ−ＥＧＦ遺伝子以外に、サルＨＢ−ＥＧＦ遺伝子など他のジフテリア毒素受容体遺伝子を用いてもよい。
【００３３】
（３）  「宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物」として、ジフテリア毒素以外に、緑膿菌、百日咳菌、コレラ菌、ボツリヌス菌、など他の細菌由来の毒素の使用が考えられる。ただし例えば、緑膿菌外毒素はラットやマウスに対して強い毒性を示すため、ラットやマウス以外のモデル動物を使用するなど、使用する毒素に対して感受性の低いモデル動物を使用するよう留意する。上記ジフテリア毒素以外の毒素を使用する場合は、上述の方法と同様に該毒素に対する受容体をβ細胞の表面に特異的に発現させればよい。
【００３４】
（４）  モデル動物は、マウスに限定されるものではなく、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サルなどが例示されるが、上記のように、糖尿病症状を誘導するのに使用する「化合物」に対して本来的に感受性の低いモデル動物を使用するよう留意する。
【００３５】
［４］本発明の糖尿病モデル動物の利用方法（有用性）
前述のように、本発明の糖尿病モデル動物は、糖尿病の治療法や治療薬の開発に利用することができ、例えば、高血糖状態のモデル動物に被検物質を投与又は移植した後、該モデル動物の血糖値、尿糖値又は生存率などを調べて糖尿病に対する有効性を評価する方法に利用できる。これにより、糖尿病の治療・予防・症状改善に有効な物質の探索が容易になり、糖尿病に対する医薬、食品の開発に非常に有用である。
【００３６】
また最近は、膵島移植など移植によりβ細胞を再生させて糖尿病を治療するといった移植再生治療も試みられるようになっている。本発明の糖尿病モデル動物は、この移植再生治療の研究開発に有用であり、例えば、骨髄細胞、脾臓細胞、臍帯血由来の細胞、その他様々な細胞（又は組織）を投与してβ細胞の再生を評価するためのレシピエントとして利用できる。再生したβ細胞は毒素耐性であるので評価が容易であり、この点からも本発明のモデル動物の有用性は高い。
【００３７】
β細胞の幹細胞の探索は、移植再生治療への応用の面からも重要であるが、本発明のモデル動物はこのような幹細胞の探索に利用できる。例えば、胎児期又は成体期の本発明のモデル動物にジフテリア毒素等を投与してβ細胞を破壊し、その後、内因性幹細胞からのβ細胞の再生評価に利用する方法が考えられる。
【００３８】
また、本発明の糖尿病モデル動物から合併症モデルを効率よく作製することで、神経障害、高血圧症、動脈硬化症など様々な糖尿病の合併症の研究、及びその治療法の開発に本発明のモデル動物を利用できる。さらに、肥満、運動不足、ストレスなどの要因と糖尿病との関わりを調査する研究用ツールとしても有用である。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の糖尿病モデル動物として、独立した２つの方法により糖尿病モデルマウスを作製した実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１：第１の糖尿病モデルマウスの作製と機能評価〕
［１］方法
［1-1］トランスジェニックマウス作製のためのトランスジーンの構築
トランスジーン（発現ユニット）を調製するために、プラスミドpRcHBEGF（EMBO J. 13, 1994 2322-2330）よりヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡを制限酵素Hind III-Not Iで切り出し、TaKaRa社のDNA Blunting Kitを用いて平滑末端とした。これを、プラスミドpIns-1（J. Exp. Med. Vol.188, Oct19, 1998 1445-1451）のヒトインスリンプロモーター（１．９ｋｂ）の下流（Eco RI切断部位）に挿入し、プラスミドpIns-TR1を得た。
【００４１】
上記プラスミドpIns-TR1より制限酵素Sph I-Xho Iで３．８ｋｂの断片を切り出し、ＱＩＡＧＥＮ社のQIAquick Gel Extraction Kitを用いて精製し、トランスジーンとして用いた（図１）。
【００４２】
［1-2］トランスジェニックマウスの作製
上記トランスジーンを、C57BL/6J Jcl x C57BL/6J Jclから得られた受精卵に導入し、レシピエントマウス（ICR Jcl）の卵管に移植してトランスジェニックマウスを得た。トランスジェニックマウスの同定は、ヒトインスリンプロモーターとヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡとをはさむ下記プライマーを用いたＰＣＲ解析にて行った。
フォワードプライマーIns-F001： 5’-tgcctgtctcccagatcactgtg-3’（配列番号１）
リバースプライマーHBEGF-30R： 5’-ttcagcaccaccgacggcagca-3’（配列番号２）
【００４３】
［1-3］トランスジェニックマウスにおけるヒトＨＢ−ＥＧＦの発現解析
マウスをペントバルビタールにて麻酔し、４％パラフォルムアルデヒドを用いて環流固定した。同じ固定液を用いて一晩後固定した後、30% sucroseに置換した。クリオモルトで凍結後、クライオスタットにて１０μｍの切片を作製した。
【００４４】
１次抗体（Goat anti-HB-EGF（GT，１０００倍希釈）、Rabbit anti-Glucagon（Dako，１００倍希釈）、Guinea Pig anti-Insulin（DAKO，２００倍希釈））室温２時間、２次抗体（Jackson）で室温１時間反応させた。二重染色の場合は洗浄後、同様に次の１次抗体、２次抗体を反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、VECTASheild with DAPI （Vector）を用いて封入、観察を行った。
【００４５】
［1-4］血中グルコース濃度、インスリン濃度の測定
尾静脈を剃刀でカットし、グルコカードダイアメーター（アークレイ）を用いてグルコース濃度を測定した。もしくは、尻尾もしくは眼窩より採血を行い、５０００ｒｐｍ，５分，４℃にて遠心し血清を得、この血清を用いて、グルコースＣＩＩ-テストワコー（ムタロターゼ・ＧＯＤ法）（和光純薬）にて血清中グルコース濃度の測定を行った。インスリン濃度は、インスリン測定キット（ＭＯＲＩＮＡＧＡ）を用いて測定した。
【００４６】
［1-5］インスリン負荷試験
インスリン（ヒューマリンＲ注Ｕ−１００）（日本イーライイリリー株式会社）溶液を２Ｕ／ｋｇになるように腹腔内投与し、０，３０，１００分で採血を行った。
【００４７】
［２］結果
［2-1］トランスジェニックマウスの作製とヒトＨＢ−ＥＧＦの発現確認
１００９個の受精卵に１．５〜２ｎｇ／μｌのトランスジーンをインジェクションし、８１匹のマウスを得た。離乳後、尻尾よりＤＮＡを回収し、ＰＣＲ解析を行ったところ８匹（雌５匹、雄３匹）にトランスジーンの導入が確認された。このうち系統として確立されたのは２ラインのみであった。これらのヒトＨＢ−ＥＧＦの発現を確認するため、ヒトＨＢ−ＥＧＦの抗体を用いて膵臓の組織染色を行った。β細胞での特異的発現を確認するため、抗インスリン抗体との二重染色を行ったところ、２ラインのうち１ライン（系統名「６Ｆ６」）のみが、インスリン陽性細胞でヒトＨＢ−ＥＧＦを共発現していることが確認された（図２）。
【００４８】
［2-2］ジフテリア毒素投与による血糖値の上昇
以下の実験は、上記ライン「６Ｆ６」を使用することとし、ジフテリア毒素投与を行った。野生型マウスは、５００μｇ／ｋｇ（体重）の投与量で受容体非依存的な毒素の取り込みにより死亡するが、その１／１０の濃度では影響がない。この野生型マウスで影響のない５０μｇ／ｋｇの毒素を、得られたトランスジェニックマウスに腹腔内投与した。投与は午前１１時前後に行い、投与直前に眼窩より採血、以後毎日１１時から１３時の間に採血を行った。採血した血液から血清を回収し、その血糖値とインスリン濃度を測定した。血糖値は２日目から明らかに上昇し始め、３日目には毒素投与した５匹すべての個体において血糖値が５００ｍｇ／ｄｌを超えた（図３）。
【００４９】
ジフテリア毒素投与後のトランスジェニックマウスは多尿になり、尿糖値も上昇し、毛並みも悪くなった。インスリン濃度は８日目には１００ｐｇ／ｍｌ以下まで低下した（図４）。
【００５０】
［2-3］インスリン投与による血糖値降下
ジフテリア毒素投与後のトランスジェニックマウスにおける血糖値上昇がインスリン依存的であるかどうかを調べるため、５０μｇ／ｋｇの毒素投与で血糖値の上昇したマウスにインスリン負荷試験を行った。２Ｕ／ｋｇのインスリン（ヒューマリンＲ１００）を腹腔内投与し、投与前（０分とする），３０，１００分後に採血、血糖値測定を行ったところ、すべての個体において血糖値が野生型と同じ２００ｍｇ／ｄｌ前後まで減少した（図５）。
【００５１】
［2-4］膵島β細胞の破壊
毒素投与から１０日後、マウスをホルマリンで固定し、抗インスリン（β細胞）、抗グルカゴン（α細胞）で免疫染色を行った。トランスジーンが導入されなかったマウス「Ｔｇ（−）」に毒素を投与した個体では、野生型と同様の染色像が見られたが、トランスジーンが導入された本発明の糖尿病モデルマウス「Ｔｇ（+）」に５０μｇ／ｋｇジフテリア毒素を投与した個体では、明らかにインスリン陽性細胞が減少した（図６）。
【００５２】
［2-5］各毒素濃度における生存率
本発明の糖尿病モデルマウスに対し、５０μｇ／ｋｇ，５００ｎｇ／ｋｇ，１００ｎｇ／ｋｇの各濃度において毒素投与を行い、生存率を調べた。雌雄の差も確認するため、雌５匹、雄５匹を用いて毒素投与を行った。
【００５３】
その結果、図７に示すように、５０μｇ／ｋｇの毒素投与では投与後１０〜１２日目にすべての個体が死亡、５００ｎｇ／ｋｇの毒素投与では１０〜１５日目ですべての個体が死亡した。
【００５４】
１００ｎｇ／ｋｇ毒素投与群では１５日目で１０匹中２匹が死亡、２１、４０、４１、５３、５６日目でそれぞれ１匹ずつ死亡した。残り３匹は、高血糖、高尿糖値、多尿、の状態を維持したまま２ヶ月以上生存した。
【００５５】
また本発明の糖尿病モデルマウスに対し、５００ｎｇ／ｋｇ，１００ｎｇ／ｋｇ，５０ｎｇ／ｋｇの各濃度において毒素投与を行い、血糖値の変化を調べた結果を図８に示す。
【００５６】
５０ｎｇ／ｋｇ毒素投与群では、他の濃度と同様に２〜３日目で血糖値が上昇し、その状態をしばらく維持するが、１ヶ月半をすぎると血糖値、尿糖値が正常マウスと同程度まで下がった。この１ヵ月半から２ヶ月の間、死亡したマウスはいなかった。
【００５７】
〔実施例２：第２の糖尿病モデルマウスの作製と機能評価〕
図９に示すように、第２の糖尿病モデルマウスの作製に使用したトランスジーンは、ラットインスリンＩＩプロモーター（約６００ｂｐ）−ラビットβ-グロビンイントロン（図中省略）−ヒトＨＢ−ＥＧＦ ｃＤＮＡ−IRES―ｐＴｉｍｅｒ―ラビットβ-グロビンポリＡシグナル（図中省略）の順に配列されたものである。
【００５８】
このトランスジーンを用いて常法にしたがってトランスジェニックマウスを作製した。その結果、上記トランスジーンの配列を有する７つの系統を得た。これらのマウスのうち２系統にジフテリア毒素を２５０ｎｇ、腹腔内に一回投与すると、投与後２−３日目にはこれら２系統で明らかな血糖値の上昇が認められ、その後も高血糖状態は数週間にわたって継続した（図１０）。血糖値が上昇したマウスは、多尿（polyuria）、糖尿（glycosuria）、過食症（hyperphagia）、多飲症（polydipsia）、悪液質（cachexia，カヘキシー）などの若年性糖尿病（１型糖尿病）にみられる各種症状が観察され、やがて死亡した。
【００５９】
組織学的観察の結果、第２の糖尿病モデルマウスにジフテリア毒素を投与すると、膵島においてインスリン陽性細胞の数が顕著に減少し、β細胞の選択的な破壊が観察された（図１１Ｂ・Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上のように、本発明は、ジフテリア毒素等の投与により所望の時期に糖尿病症状を誘導することができる糖尿病モデル動物に関するものであり、前述したとおり、糖尿病の治療法や治療薬の開発、合併症の研究、膵島β細胞の再生やその幹細胞の同定など様々な研究用ツールとして利用することができ、産業上種々の利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】第１の糖尿病モデルマウスの作製に使用したトランスジーンの構造を模式的に示す図である。
【図２】第１の糖尿病モデルマウスにおいて、インスリン産生細胞である膵島β細胞に特異的にヒトＨＢ−ＥＧＦが発現していることを示す図面に代わる写真である。
【図３】第１の糖尿病モデルマウスにおいて、ジフテリア毒素投与により血糖値が上昇したことを示すグラフである。実線は第１の糖尿病モデルマウスの結果、破線は野生型マウスの結果である。
【図４】第１の糖尿病モデルマウスにおいて、ジフテリア毒素投与により血中インスリン濃度が顕著に低下したことを示すグラフである。右側Ｔｇは第１の糖尿病モデルマウスの結果、左側ＷＴは野生型マウスの結果である。
【図５】第１の糖尿病モデルマウスにおいて、インスリン投与により血糖値が野生型と同じ程度まで降下したことを示すグラフである。
【図６】免疫染色の結果、第１の糖尿病モデルマウスに５０μｇ／ｋｇジフテリア毒素を投与すると、膵島β細胞が破壊された（下２段）ことを示す図面に代わる写真である。上段は野生型マウスにジフテリア毒素を同濃度投与した結果である。
【図７】第１の糖尿病モデルマウスの各毒素濃度投与後の生存率を示すグラフである。ＷＴは、野生型マウスにジフテリア毒素を５０μｇ／ｋｇ量投与した結果である。
【図８】第１の糖尿病モデルマウスの各毒素濃度投与後の血糖値の変化を示すグラフである。「Ｔｇ−」は、トランスジーンが導入されなかったマウスにジフテリア毒素を５００ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した結果である。
【図９】第２の糖尿病モデルマウスの作製に使用したトランスジーンの構造を模式的に示す図である。
【図１０】第２の糖尿病モデルマウスにおいて、ジフテリア毒素投与により２系統（丸印および四角印）で血糖値（glycemia（mmol/L））が上昇したことを示すグラフである。他の２系統（Ｔｇ−）では、ジフテリア毒素を投与しても変化はなかった。投与０日目（Ｄ０）から９日目（Ｄ９）までの結果が示される。
【図１１】免疫染色の結果、第２の糖尿病モデルマウスにジフテリア毒素を投与すると、膵島β細胞が破壊された（Ｂ・Ｃ）ことを示す図面に代わる写真である。Ａはジフテリア毒素を投与していない同腹マウスの膵島を免疫染色した結果である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図６】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月6日(2007.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島β細胞特異的に機能するプロモーターの制御下に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするＤＮＡを配置した発現ユニットを宿主に導入して、該受容体を膵島β細胞に特異的に発現させ、該化合物の投与により膵島β細胞が選択的、かつ所望の時期にその全部または一部を破壊され、高血糖状態を呈するように作製された糖尿病モデル動物。
【請求項２】
請求項１記載の糖尿病モデル動物又はその子孫に対する該化合物の投与により膵島β細胞が選択的に破壊された糖尿病モデル動物。
【請求項３】
膵島β細胞特異的に機能するプロモーターがインスリンプロモーターである、請求項１又は２記載の糖尿病モデル動物。
【請求項４】
膵島β細胞特異的に機能するプロモーターの制御下に、宿主に対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードするＤＮＡを配置した発現ユニットを宿主に導入して、該受容体を膵島β細胞に特異的に発現させ、該化合物の投与により膵島β細胞が選択的、かつ所望の時期にその全部または一部を破壊され、高血糖状態を呈するように作製された糖尿病モデル動物であって、該プロモーターがインスリンプロモーターであり、該化合物がジフテリア毒素であり、該受容体が、ジフテリア毒素受容体であるヒト由来ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）前駆体であり、５０ｎｇ／ｋｇ（体重）のジフテリア毒素の投与によっても高血糖状態を呈する、糖尿病モデル動物。
【請求項５】
請求項４記載の糖尿病モデル動物又はその子孫に対するジフテリア毒素の投与により膵島β細胞が選択的に破壊された糖尿病モデル動物。
【請求項６】
マウス又はラットである、請求項４又は５記載の糖尿病モデル動物。
【請求項７】
請求項６記載の糖尿病モデル動物の作製方法であって、膵島β細胞特異的に機能するプロモーターの制御下に、野生型のマウス又はラットに対し本質的に毒性を示さない化合物に対する受容体をコードする遺伝子を配置した発現ユニットを、マウス又はラットの受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞などの個体形成能をもつ細胞に導入後、得られた卵又は胚を偽妊娠雌マウス（又はラット）の卵管に移植し、産まれた仔マウス（又は仔ラット）から前記遺伝子を有する仔マウス（又は仔ラット）を選抜する工程を含む、糖尿病モデル動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖尿病モデル動物を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法であって、高血糖状態のモデル動物に被検物質を投与又は移植した後、該モデル動物の血糖値、血中インスリン濃度、尿糖値又は生存率などを調べて糖尿病に対する有効性を評価することを特徴とする、糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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