(57)【要約】本発明は、糖尿病に関連する血管合併症、高脂血症、ならびにそれに限定されるものではないが、難治性高血圧、冠動脈疾患、肺動脈高血圧、うっ血性心不全、および溶血性貧血を含む様々な心血管障害の治療的介入のための新規な方法および組成物に関する。より具体的には、本明細書は、ＢＨ４およびその誘導体を含む組成物を使用してこのような血管障害を治療するための方法および組成物を記載する。ＢＨ４および他の治療レジメンの併用療法が意図される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮機能不全を治療する方法であって、該内皮機能不全を治療するのに有効な量の（６Ｒ）−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を、それを必要としているヒトに投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記内皮機能不全が高血圧である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトが２型糖尿病に罹患している、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記投与が経口で行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
治療有効量が、１日当たり３ｍｇ／ｋｇ超〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
治療有効量が、１日当たり３ｍｇ／ｋｇ超〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＨ４が、１日当たり総用量約５ｍｇ／ｋｇで経口投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＢＨ４が、１日当たり総用量約１０ｍｇ／ｋｇで経口投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＨ４が、１日当たり総用量約４００ｍｇで経口投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＢＨ４が１日２回投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒトにＢＨ４以外の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療薬がＰＤＥ５阻害剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＤＥ５阻害剤が、シルデナフィル、シルデナフィルの医薬として許容可能な塩、シルデナフィルの溶媒和物、タダラフィル、タダラフィルの医薬として許容可能な塩、タダラフィルの溶媒和物、バルデナフィル、バルデナフィルの医薬として許容可能な塩、バルデナフィルの溶媒和物、ウデナフィル、ウデナフィルの医薬として許容可能な塩、ウデナフィルの溶媒和物、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＤＥ５阻害剤が、シルデナフィルまたはその医薬として許容可能な塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
鎌状赤血球症を治療する方法であって、該鎌状赤血球症を治療するのに有効な量の（６Ｒ）−テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を、それを必要としているヒトに投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年１２月５日に出願された米国仮特許出願番号第６０／７４２，５７８、２００６年２月３日に出願された米国仮特許出願番号第６０／７６４，９７９、および２００６年６月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６０／８１７，８４７の優先権を主張し、これらの各々は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、血管疾患の治療的介入を対象とする。より具体的には本発明は、血管機能不全に関連する内皮機能不全を治療するための方法および組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病およびその心血管系合併症は、米国および西欧諸国の死亡および罹患の主な原因となっている。幾つかの原因因子は、疾患への遺伝的素因、性別、喫煙および食事などの生活習慣の要因、年齢、インスリン耐性、高血圧、ならびに高コレステロール血症を含む高脂血症を含むこれらの疾患の発症に関連しているとされる。
【０００４】
糖尿病および関連の心疾患の治療選択肢には、コレステロール低下薬（例えばスタチン）、血管作用剤（例えばＰＰＡＲγリガンド、βブロッカー）、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシンＩＩレセプターブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ビタミン、および抗酸化物質（例えばナイアシン、アスコルビン酸、またはビタミンＣ）などの様々な治療剤が含まれる。血漿コレステロールを低下するためにスタチン薬物を使用するという論理的根拠は、重篤ではない閉塞を有する個体に冠状動脈の心臓発作が一般に発症する理由、および閉塞が毛細血管または静脈に発症しない理由に説明をつけることができない。スタチン薬物を使用する場合、該薬物は、肝動脈イベント再発の危険性を３０〜４０％しか低減しない。血管作用薬を使用する論理的根拠は、血管および／または心臓平滑筋に直接的または間接的に作用することによって血圧を低下し、それによって血管の流れ抵抗を抑えることにある。但しかかる薬物は、高血圧および異常血流の一次的原因を治療するものではなく、該障害の結果として生じる作用を低減しようとするものである。かかる薬物は、圧受容器反射によって交感神経系を活性化して、有益なまたは望ましい効果ではない心拍および心筋収縮の増大をもたらす。ビタミンＥ、ビタミンＣ、プロブコール、およびβカロテンは、近年糖尿病の治療に適用されている抗酸化物質の多くを構成している。しかし残念ながら、これらの薬剤が単独でまたは他の薬剤と組み合わせて投与される場合には、いずれも細胞（即ち、皮膚または内皮）機能不全および他の酸化ストレス媒介性病理に適切に対処することができない。近年利用可能な全ての抗酸化物質は、それらの作用「機序」、組織内取込み、および関連する他の特徴が理由となり、内皮由来の弛緩因子代謝物質および作用に間接的にしか影響を与えることができず、特定の活性酸素種（ＲＯＳ）にのみ作用する。さらにそれらは、誤って服用されると疾患の経過に悪影響を及ぼす恐れがある。
【０００５】
さらに、かかる障害に対する現在の治療は短期的であり、長期的有効性に対して深刻な欠点を有している。糖尿病、ならびに関連する心臓の中枢および末梢血管系の急性および慢性閉鎖性血管疾患への治療薬の使用は、今までに長期的な好ましい結果に関して効果が無く、根本的な病態生理を治療せず、血管の構造および機能も正常状態には修復していない。
【０００６】
治療剤のそれぞれは、患者に対していくらか有益な効果を有する一方、深刻な副作用があり、しばしば非生理学的投与量で摂取される必要がある。副作用は、しばしば用量関連性のものである。上記クラスの治療剤に関する副作用には、低血糖、腎機能不全、および横紋筋融解症を含むミオパシー、肝毒性、気道抵抗、ならびに妊婦によって摂取された場合の催奇形作用が含まれる。かかる薬物に関する他の副作用には、頭痛、心臓の動悸、不安症、軽度鬱病、心筋梗塞、うっ血性心不全、倦怠感、および衰弱が含まれる。さらに薬理量では、疾患活動分子による一次的な原因に対するその作用に特効がなく、該疾患において治療できる作用が限られており、それらは幾つかの因子に依存して決まる。幾つかの場合、副作用は、紅潮および消化不良のように簡単なものであり得るが、治療レジメンへの患者の順守の深刻な欠如をもたらす恐れがある。薬物の副作用を相殺するために、様々な併用療法が治療選択肢として提案されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、重篤な副作用を生じることなく血管疾患の根本にある内皮機能不全を管理するための、一貫して有効な特異的薬剤が依然として必要とされている。本発明は、このような必要性に対処することを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
一般に本発明は、血管疾患を生じる内皮機能不全の治療的介入を記載するものである。本発明は、内皮機能不全を特徴とする疾患または障害を有する対象を治療するための方法および組成物を企図し、その方法は、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその前駆体もしくは誘導体を含む組成物を単独で、または治療剤と組み合わせて対象に投与することを含み、前記投与は、前記ＢＨ４含有組成物なしの前記内皮機能不全と比較して、前記対象の内皮機能不全を緩和するのに効果がある。本発明はさらに、内皮機能不全の対象を治療する方法を企図し、その方法は、血管拡張剤としての一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増大する因子または因子の組合せを単独で、または治療剤と組み合わせて投与することを含む。
【０００９】
一態様では、本発明は、糖尿病関連血管合併症を有すると診断された対象を治療する方法を提供し、その方法は、ＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体を単独で、または血管拡張剤としての一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増大する治療剤もしくは因子であるもう１つの薬剤と組み合わせて投与することを含む。
【００１０】
一実施形態では、糖尿病関連血管合併症には、それに限定されるものではないが、異常血管コンプライアンス、内皮機能不全、および高血圧などの一般的血管機能の障害、難治性高血圧、ならびにインスリン感受性およびグルコース制御の障害が含まれる。別の実施形態では、糖尿病関連血管合併症には、それに限定されるものではないが間欠性跛行、末梢循環低下、皮膚血流低下、および創傷治癒欠陥などの異常末梢循環が含まれる。さらなる一実施形態では、糖尿病関連血管合併症には、それに限定されるものではないがうっ血性心不全、うっ血性心不全を伴うまたは伴わない肺高血圧症、運動関連狭心症、冠動脈疾患、および関連のアテローム性動脈硬化症などの心疾患；視神経委縮および糖尿病性網膜疾患などの眼疾患；ならびに糖尿病性腎疾患の微量アルブミン尿、腎不全、および糸球体濾過量低下などの腎疾患が含まれる。
【００１１】
関連の一実施形態では、治療剤は、それに限定されるものではないがＰＰＡＲγリガンド（チアゾリジンドン、グリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン）などのインスリン感受性を改善する薬剤、スルホニル尿素（グリキドン、トルブタミド、グリメプリド、クロルプロパミド、グリピザイド、グリブリド、アセトヘキサミド）およびメグリチニド類（メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド）などのインスリン分泌刺激薬、ならびにメトホルミンなどの肝臓のグルコース生成を低減する薬剤を含む、糖尿病を治療するために使用される薬剤である。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、糖尿病に関連しない血管疾患を有すると診断された対象を治療する方法を提供し、その方法は、ＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体を単独で、または血管拡張剤としての一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増大する治療剤もしくは因子であるもう１つの薬剤と組み合わせて投与することを含む。かかる糖尿病に関連しない血管疾患は、肺血管疾患、溶血性貧血、卒中および関連の虚血性血管疾患（卒中、心疾患または冠状動脈疾患、動脈硬化症、または末梢血管疾患など）、血栓症、移植関連内皮機能不全、ならびに心疾患または冠状動脈疾患からなる群から選択される。一実施形態では、肺血管疾患には、それに限定されるものではないが、鎌状赤血球貧血および他の異常血色素症における肺圧、特発性肺高血圧、新生児の持続性肺高血圧（ＰＰＨＮ）が含まれる。さらなる一実施形態では、溶血性貧血には、遺伝性溶血性貧血および後天性溶血性貧血が含まれる。遺伝性溶血性貧血には、それに限定されるものではないが、鎌状赤血球貧血、サラセミア、Ｇ６ＰＤ欠乏による溶血性貧血、ピルビン酸キナーゼ欠乏、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性球状赤血球症、遺伝性有口赤血球症、遺伝性卵形赤血球症、発作性夜間血色素尿症、およびヘモグロビンＳＣ疾患が含まれる。後天性溶血性貧血には、それに限定されるものではないが、微小血管症性溶血性貧血、特発性自己免疫性溶血性貧血、化学的または物理的薬剤または装置（左心補助循環装置）、機械弁およびバイパス装置）によって生じる非免疫性溶血性貧血、および二次免疫性溶血性貧血が含まれる。
【００１３】
別の実施形態では、卒中および関連の虚血性血管疾患には、それに限定されるものではないが脳卒中後の脳血管痙縮などの血管痙縮が含まれる。血栓症には、それに限定されるものではないが血管形成、血栓症、血餅形成、および凝血が含まれる。さらなる一実施形態では、移植関連内皮機能不全には、それに限定されるものではないが固形臓器移植後の血管機能不全およびシクロスポリンＡ誘発性内皮機能不全が含まれる。さらに別の実施形態では、心疾患または冠状動脈疾患には、それに限定されるものではないが高コレステロール血症に関連するうっ血性心不全、血管機能不全、および狭心症、ならびに喫煙に関連する血管機能不全および狭心症が含まれる。
【００１４】
関連の一実施形態では、治療剤は、それに限定されるものではないが、ボセンタン、ダルセンタン、エンラセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アンブリセンタンシタクスセンタンなどの、高血圧および他の内皮機能不全関連障害を治療するために一般に使用されるエンドセリンレセプターアンタゴニスト；ＰＤＥ５阻害剤（間接作用型）およびミノキシジル（直接作用型）などの平滑筋弛緩薬；カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル、ラミプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタンなどのアンギオテンシンＩＩレセプターブロッカー；アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ビソプロロール、ピンドロール、アセブトロール、ベタキソロール、プロプラノロールなどのβブロッカー；ヒドロクロロチアジド、フロセミド、トルセミド、メトラゾンなどの利尿薬；アムロジピン、フェロジピン、ニソルジピン、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼムなどのカルシウムチャネルブロッカー；αレセプターブロッカードキサゾシン、テラゾシン、アルフゾシン、タムスロシン；ならびにクロニジンなどの中枢αアゴニストを含む、血管疾患を治療するために使用される薬剤である。
【００１５】
一実施形態では、ＢＨ４またはＢＨ４の前駆体もしくは誘導体とＰＤＥ５阻害剤との組合せは、血管圧パラメータ（複数）に予想外に有益な効果をもたらす。したがってＢＨ４または前駆体もしくは誘導体は、かかる薬物の副作用を軽減すること、例えば血圧上昇を軽減することが期待される。
【００１６】
関連の一態様では、本発明は、精製６Ｒ  ＢＨ４の量を１日に少なくとも２００ｍｇ（例えば、１００ｍｇを１日に２回与える）、または１日に少なくとも１５０ｍｇ、または１日に少なくとも１００ｍｇの用量で高血圧に罹患しているヒトに投与することによって、ヒトの高血圧を治療する方法を提供する。かかる例示的実施形態では、ＢＨ４の用量範囲は１日に５００ｍｇ未満、または１日に４００ｍｇ未満、または１日に３００ｍｇ未満であってもよい。一実施形態では、ＢＨ４は、少なくとも１日に５ｍｇ／ｋｇもしくは少なくとも１日に１０ｍｇ／ｋｇまたは１日に最大２０ｍｇ／ｋｇもしくは１日に最大３０ｍｇ／ｋｇの１日当たりの用量で投与される。ＢＨ４は単独で、または前記もしくは下記のいずれかなどの血管疾患もしくは高脂血症を治療するために使用される他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、高脂血症を有すると診断された対象を治療する方法を提供し、その方法は、ＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体を単独で、または血管拡張剤としての一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増大する治療剤もしくは因子であるもう１つの薬剤と組み合わせて投与することを含む。関連の一実施形態では、治療剤は、それに限定されるものではないがスタチン（アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンカルシウム、シンバスタチン）およびニコチン酸などのＬＤＬを低下する薬剤、コレステリルエステル転送タンパク質阻害剤（トルセトラピブなど）、フィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラートなどのＰＰＡＲαを刺激する薬剤、胆汁酸抑制剤、コレスチラミン、およびコレスチポールなどの、胆汁酸と結合しその再吸着を防止し、コレステロール濃度を低下する薬剤、ならびにコレステロール吸収阻害剤を含む高脂血症を治療するために使用される薬剤である。ＢＨ４または前駆体もしくは誘導体は、かかる薬剤との組合せで投与することができ（スタチン／コレステリルエステル転送タンパク質阻害剤の組合せなど）、血圧上昇に関係する副作用を軽減することが期待される。
【００１８】
第４の態様では、本発明は、内皮機能不全を有する対象を治療する方法をさらに企図し、その方法は、血管拡張剤としての一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増大するまたは正常化する因子または因子の組合せを単独で、または治療剤と組み合わせて投与することを含む。一実施形態では、かかる因子（複数）は、ＢＨ４のデノボ生合成の活性または発現を増大し、グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰＣＨ１）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）、およびセピアプテリン還元酵素からなる群から選択される。本発明の好ましい一実施形態では、ＢＨ４合成は、任意の１つまたは複数の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）類似体またはアゴニスト、例えばホルスコリン、８−ブロモｃＡＭＰ、またはｃＡＭＰ媒介性の細胞シグナリングを増大するように機能する他の薬剤、例えばインターロイキン−１、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ｃ反応性タンパク質、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（アトルバスタチンなどのスタチン）神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含むサイトカインおよび成長因子、アドレノメデュリンおよび安息香酸エストラジオールを含むホルモン、ならびにＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ類似体、カフェイン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含むシクロスポリンＡメチルキサンチン、テオフィリン、レセルピン、過酸化水素などの他の化合物を使用してＧＴＰＣＨ１発現の発現を増大することによって高まる。
【００１９】
したがって本発明の一実施形態は、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ５を含む１１のホスホジエステラーゼファミリー（ＰＤＥ１〜１１）の阻害剤を使用して３’５’−環状ヌクレオチドの分解を抑制することによって、ＧＴＰＣＨ１レベルを増大することに関する。本発明のＰＤＥ阻害剤には、バイアグラ（Ｖｉａｇｒａ）／シルダネフィル（ｓｉｌｄａｎｅｆｉｌ）、シアリス（ｃｉａｌｉｓ）／タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）／レビトラ（ｌｅｖｉｔｒａ）、ウデナフィル（ｕｄｅｎａｆｉｌ）、８−メトキシメチル−ＩＢＭＸ、ＵＫ−９０２３４、デキサメタゾン、ヘスペレチン、ヘスペレジン、イルソグラジン、ビンポセチン、シロスタミド、ロリプラム、エチルβ−カルボリン−３−カルボン酸塩（β−ＣＣＥ）、テトラヒドロ−β−カルボリン誘導体、３−Ｏ−メチルケルセチン等が含まれる。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、ＢＨ４の合成機構のポリヌクレオチドの遺伝子治療または内皮標的送達によってＢＨ４合成酵素レベルを増大することによって、ＢＨ４レベルを増大することに関する。本発明のさらに別の実施形態は、ＢＨ４合成酵素ＧＴＰＣＨ１、ＰＴＰＳ、ＳＲ、ＰＣＤ、ＤＨＰＲ、およびＤＨＦＲを補給することによって、ＢＨ４レベルを増大することに関する。ＢＨ４合成酵素は、タンパク質の変異体を含む酵素の天然および非天然形態の全てを包含することを企図される。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、ＡＰ活性を抑制することによって、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の代わりに基質７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸をＢＨ４合成酵素ＰＴＰＳに転換することによりＢＨ４レベルを増大することに関する。ＡＰ活性を抑制する薬剤または化合物には、リン酸類似体、レバミゾール、およびＬ−Ｐｈｅが含まれる。本発明の別の実施形態は、アルカリフォスファターゼの合成を抑制するための低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、小分子、中和抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗体フラグメントを含む、アルカリフォスファターゼを抑制する薬剤または化合物に関する。
【００２２】
本発明の別の実施形態には、ＢＨ４合成のデノボ合成経路の酵素合成のために必要な触媒または補因子の活性を増大する薬剤または化合物が含まれる。
【００２３】
本発明の別の実施形態には、ＢＨ４の合成に必要な酵素の分解を防止する薬剤または化合物が含まれる。本発明のさらに別の実施形態には、ＢＨ４の合成およびその合成酵素、例えばＧＴＰＣＨ１、ＰＴＰＳ、およびＳＲに必要な触媒の分解を防止する薬剤または化合物が含まれる。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、サルベージ経路を介してＢＨ２の還元を増大することによってＢＨ４のレベルを高めることに関する。ＢＨ４は、Ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＨ２に酸化する。キノイド形態（ｑＢＨ２）および７，８−ジヒドロプテリンとして存在するＢＨ２は、それぞれＤＨＰＲおよびＤＨＦＲによってＢＨ４に還元される。本発明の好ましい一実施形態は、ＮＡＤＰＨ、チオール、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、過酸化水素等を経路とする薬剤または化合物を使用して酵素ＰＣＤ、ＤＨＰＲ、およびＤＨＦＲの活性および合成を調整することによって、ＢＨ２からのＢＨ４の再生成またはサルベージを増大することに関する。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、αトコフェロール（ビタミンＥ）、トコフェロール（例えばビタミンＡ）、セレン、βカロテン、カロチノイド、フラボン、フラボノイド、葉酸塩、フラボン、フラバノン、イソフラボン、カテキン、アントシアニジン、およびカルコンを含む抗酸化物質などの薬剤または化合物を使用してＢＨ４の酸化を低減することによって、ＢＨ４を安定化する薬剤に関する。
【００２６】
さらなる一実施形態では、かかる因子（複数）は、一酸化窒素シンターゼの活性または発現を増大し、それによってＮＯの生成を増大することができる。
【００２７】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＧＴＰＣＨフィードバック調節タンパク質、ＧＦＲＰを抑制する因子を企図する。本発明の好ましい一実施形態は、ＧＴＰＣＨ１／ＧＦＲＰ複合体へのＢＨ４の結合を抑制し、それによってＢＨ４によるフィードバック阻害を防止する薬剤または化合物に関する。本発明の薬剤または化合物には、複合体、構造類似体等に合わせて変えられた親和性を有するＢＨ４の代替形態などの競合阻害剤が含まれる。さらに本発明の別の実施形態には、ＢＨ４の合成を誘発するＣＴＰＣＨ１／ＧＦＲＰへのＬ−フェニルアラニンの結合を増大する薬剤または化合物が含まれる。本発明の別の実施形態には、Ｌ−フェニルアラニンの前駆体などのＬ−Ｐｈｅレベルを増大し、それによってＧＦＲＰおよびＢＨ４によるＧＴＰＣＨ１のフィードバック阻害を抑制する働きをする薬剤または化合物が含まれる。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態は、ＧＦＲＰの活性または合成を調整する薬剤または化合物に関する。本発明の好ましい一実施形態には、ＧＦＲＰの活性を抑制する薬剤または化合物が含まれる。本発明の別の実施形態には、ＧＦＲＰの合成を抑制するための、ｓｉＲＮＡ、小分子、抗体、抗体フラグメント等の使用が含まれる。
【００２９】
本発明はさらに、グアノシン三リン酸、７，８−ジヒドロ−ネオプテリン三リン酸、および６−ピルボイルテトラヒドロビオプテリンを含むＢＨ４の前駆体である薬剤または化合物を企図する。
【００３０】
ＢＨ４は、１日に約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば約５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。ＢＨ４は、単回用量または多回用量で日々投与することができる。幾つかの実施形態では、ＢＨ４療法は連続的ではなく、ＢＨ４は、臨床的エンドポイントの改善（例えば、難治性高血圧の患者における正常血圧）が維持されるまで日々投与される。
【００３１】
本発明のさらに別の態様では、ＢＨ４誘導体の投与は、やはり治療効果を達成する予想外の低用量で実施される。かかるＢＨ４誘導体は、天然のＢＨ４と比較して改善された生物学的特性を有することが企図される。一実施形態では、高血圧、血管疾患、または本明細書に記載の疾患のいずれかに合わせたＢＨ４誘導体の有効量を、高フェニルアラニン血症などの他のＢＨ４反応性障害の治療に合わせたＢＨ４の通常用量未満にすることが企図される。特に本発明は、本明細書に記載の１’，２’−ジアシル−（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−Ｌ−ビオプテリンまたは類脂質性テトラヒドロビオプテリンのいずれかが、改善された生物学的特性を低用量で示すことを企図する。
【００３２】
また、室温で８時間を超えて安定なＢＨ４の安定化結晶形態および医薬として許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物が企図される。投与されるＢＨ４は、非結晶の安定化ＢＨ４よりも可溶性の高いＢＨ４の安定化結晶形態であることが好ましい。より好ましくは、ＢＨ４の安定化結晶形態は、少なくとも９９．５％または９９．９％の純粋な６Ｒ  ＢＨ４を含む。ジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）およびセピアプテリンなどの前駆体を投与することもできる。ＢＨ４は経口投与することができる。
【００３３】
ＢＨ４は、筋肉内、皮下、または静脈内、肺内投与によってそれ単独で、またはそれに限定されるものではないが、恒常性を維持するために使用される薬剤および介入、アジュバント療法、ならびに特異的療法を含む内皮機能不全を治療するために近年使用されている他の治療剤もしくは介入と組み合わせて投与することができる。特異的療法には、それに限定されるものではないが、ＰＰＡＲγリガンド（チアゾリジンドン、グリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン）などのインスリン感受性を改善する薬剤、スルホニル尿素（グリキドン、トルブタミド、グリメプリド、クロルプロパミド、グリピザイド、グリブリド、アセトヘキサミド）およびメグリチニド類（メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド）などのインスリン分泌刺激薬、ならびにメトホルミンなどの肝臓のグルコース生成を低減する薬剤を含む、糖尿病を治療するために使用される薬剤が含まれ得る。特異的療法には、それに限定されるものではないが、ボセンタン、ダルセンタン、エンラセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アンブリセンタンシタクスセンタンなどの、高血圧および他の内皮機能不全関連障害を治療するために一般に使用されるエンドセリンレセプターアンタゴニスト；ＰＤＥ５阻害剤（間接作用型）およびミノキシジル（直接作用型）などの平滑筋弛緩薬；カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル、ラミプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタンなどのアンギオテンシンＩＩレセプターブロッカー；アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ビソプロロール、ピンドロール、アセブトロール、ベタキソロール、プロプラノロールなどのβブロッカー；ヒドロクロロチアジド、フロセミド、トルセミド、メトラゾンなどの利尿薬；アムロジピン、フェロジピン、ニソルジピン、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼムなどのカルシウムチャネルブロッカー；αレセプターブロッカードキサゾシン、テラゾシン、アルフゾシン、タムスロシン；ならびにクロニジンなどの中枢αアゴニストを含む、血管疾患を治療するために使用される薬剤が含まれ得る。特異的療法には、それに限定されるものではないが、スタチン（アトバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンカルシウム、シンバスタチン）およびニコチン酸などのＬＤＬを低下する薬剤、フィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラートなどのＰＰＡＲαを刺激する薬剤、胆汁酸抑制剤、コレスチラミン、およびコレスチポールなどの、胆汁酸と結合しその再吸着を防止し、コレステロール濃度を低下する薬剤、ならびにコレステロール吸収阻害剤を含む高脂血症を治療するために使用される薬剤が含まれ得る。ＢＨ４および／またはＮＯ生成の恒常性レベルを維持するために使用される薬剤には、グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰＣＨ１）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰ��）、およびセピアプテリン還元酵素などのＢＨ４のデノボ生合成の活性または発現を増大する因子（複数）；ビタミンＣ、アスコルビン酸、αトコフェロールなどのＢＨ４を安定化するように作用し得る因子（複数）；一酸化窒素シンターゼの活性または発現を増大し、それによってＮＯの生成を増大する因子（複数）；ならびにＧＴＰＣＨフィードバック調節タンパク質、ＧＦＲＰを抑制する因子が含まれ得る。
【００３４】
本発明は、結晶多形Ａ、結晶多形Ｂ、結晶多形Ｆ、結晶多形Ｊ、結晶多形Ｋ、結晶水和形態Ｃ、結晶水和形態Ｄ、結晶水和形態Ｅ、結晶水和形態Ｈ、結晶水和形態Ｏ、溶媒和結晶形態Ｇ、溶媒和結晶形態Ｉ、溶媒和結晶形態Ｌ、溶媒和結晶形態Ｍ、溶媒和結晶形態Ｎ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、１種または複数種のＢＨ４の結晶形態を投与することを企図する。
【００３５】
他の実施形態では、ＢＨ４は、任意選択で葉酸塩前駆体、葉酸、および葉酸塩誘導体を含む葉酸塩と共に投与することができる。かかる葉酸塩には、それに限定されるものではないが、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩、５，１０−メチレン−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩、５，１０−メテニル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩、１０−ホルミル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５−ホルムイミノ−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸その塩、（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸およびその塩、ならびに前記の組合せであるテトラヒドロ葉酸塩が含まれる。さらなる一実施形態では、ＢＨ４は、任意選択でアルギニンと共に投与することができる。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。但し、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい実施形態を示しているものの、この詳細な説明から本発明の精神および範囲における様々な変更および改変が当業者に明らかになるという理由から、これらは単なる例示のみよって与えられることを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下の図は、本発明の明細書の一部を形成し、本発明の態様をさらに例示するために含まれる。本発明で提供する特定の実施形態の詳細な説明と共に図を参照することによって、本発明をよりよく理解することができる。
【００３８】
（好ましい実施形態の説明）
Ｉ．内皮機能不全におけるＢＨ４の役割
ＢＨ４は図１に示すように、酵素内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）によるアルギニンからのＮＯ生合成において必須の補因子である。アルギニンおよびＢＨ４からのＮＯの産生不能は内皮に局在し、したがって内皮機能不全と呼ばれる。
【００３９】
内皮機能不全は図２に示すように、内皮ｅＮＯＳを使用して血管拡張剤としてのＮＯを生成する内皮（血管壁と血管の間のバリアを形成する単一細胞層上皮）の異常性不能を特徴とする（Ａｌｐら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３年；１１２（５）：７２５〜７３５頁；  Ｋａｔｕｓｉｃ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１年；２８１（３）：Ｈ９８１〜Ｈ９８６頁；Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００年；３４９（Ｐｔ１）：３５３〜３５６頁；Ｐｉｅｐｅｒ、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９７年；２９（１）：８〜１５頁；Ｆｕｋｕｄａら、Ｈｅａｒｔ  ２００２年；８７（３）：２６４〜２６９頁；Ｕｅｄａら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２０００年；３５（１）：７１〜７５頁；Ｍａｉｅｒら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００年；３５（２）：１７３〜１７８頁；Ｋａｋｏｋｉら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０００年；１１（２）：３０１〜３０９頁；ｄｅ  Ｖｒｉｅｓｅら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００年；１３０（５）：９６３〜９７４頁；Ｐａｎｎｉｒｓｅｌｖａｍら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２年；１３６（２）：２５５〜２６３頁；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２０００年；８７（７）：５６６〜５７３頁；Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏら、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １９９８年；１９  Ｓｕｐｐｌ  Ｇ：Ｇ３〜Ｇ８頁）。
【００４０】
このＮＯの欠乏によって直接作用として過度の血管収縮が生じ、第２の作用として産生されるフリーラジカルが増大し（Ｃｈａｎｎｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００４年；１４（８）：３２３〜３２７頁；Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００年；３４９（Ｐｔ１）：３５３〜３５６頁；Ｂｅｒｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４年；４３（４１）：１３１３７〜１３１４８頁；Ｖａｓｑｕｅｚ−Ｖｉｖａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００２年；３６２（Ｐｔ３）：７３３〜７３９頁；Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １９９９年；４３（２）：２７４〜２７８頁；Ｇｕｚｉｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２年；１０５（１４）：１６５６〜１６６２頁）、血管損傷およびアテローム性動脈硬化症が促進され（Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏら、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １９９８年；１９  Ｓｕｐｐｌ  Ｇ：Ｇ３〜Ｇ８頁；Ｖａｓｑｕｅｚ−Ｖｉｖａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００２年；３６２（Ｐｔ３）：７３３〜７３９頁）、血栓形成および凝血が増大する。全体的データは、ＮＯが血流を支え、ＮＯが無いと血流が減少し、アテローム性動脈硬化症および血餅の潜在的可能性が増大することを示している。したがって内皮機能不全は、血管収縮／高血圧、不適切な膨張、アテローム性動脈硬化症の促進、血管形成の増大、選択の増大、および高い心イベント率に関連している。
【００４１】
鎌状赤血球症のトランスジェニックマウスモデルを使用した試験は、組織のＮＯＳレベルおよび基底ＮＯＳ活性が増大する一方、アセチルコリンなどの内皮依存性アゴニストへの血管拡張反応が低下したことを一貫して示している（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １０：９９〜１０７頁（２００３年））。したがって動物実験からの知見によって、ＮＯが鎌状赤血球症に関連する慢性血管損傷に応答して代償的役割を担っていることが提示される。しかしヒトの実験では、他の因子がＮＯの生体利用能に影響すると思われる。鎌状赤血球症を有する女性では、卵巣により生成されるエストロゲンが、ＮＯＳ発現および基底内皮ＮＯ生成を増大することによって内皮機能を保護する。したがって鎌状赤血球症を有する女性では、正常な基底ＮＯおよび刺激ＮＯが生成されていた。しかし、鎌状赤血球症を有する男性、ならびに血管閉塞クリーゼおよび急性胸部症候群を有する全ての患者は、基底ＮＯおよび刺激ＮＯの生成が少なかった。循環血漿ヘモグロビンおよびスーパーオキシドの組合せの作用によって、ＮＯの破壊が生じる。鎌状赤血球症では、ＮＯ生成の増大が、接着分子の内皮発現ならびにその後の赤血球および白血球の接着を低減し、それによって血管閉塞クリーゼの発症が防止される（Ｓｐａｃｅら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６３：２００〜２０４頁（２０００年））。ＮＯはまた、血小板活性化およびトロンビン生成を低減し、それによって凝血が防止される。鎌状赤血球症の管理におけるＮＯの他の有益な作用には、喘息および鎌状赤血球症を有する対象の活性酸素種（ＲＯＳ）の不活化および平滑筋の弛緩が含まれる。
【００４２】
内皮機能不全へのＢＨ４の関与の基本はここ数年で明らかになっており、表１に示すように、２次的ＢＨ４欠乏に起因して重要な病態生理学的工程となっていることが、様々な機構により明らかである（Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００年；３４９（Ｐｔ１）：３５３〜３５６頁；Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００４年）。ＢＨ４は、アルギニンからＮＯを生成するためのｅＮＯＳの酵素反応（図１）における補因子としてモル対モルベースで必要とされ、多くの場合、様々な因子によって生じるＢＨ４の欠乏は、ＮＯ生成不能の根本的原因となっていることが示されている。図３は、２次的ＢＨ４欠乏の病態生理の図を示すものである。
【００４３】
【表１】
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第２の機能として、正常に機能するｅＮＯＳの結合二量体形を安定化するためにもＢＨ４が必要であることが、最近のデータによって示されている（図４）。ＢＨ４が欠乏している場合、ｅＮＯＳは機能不全の単量体に解離し、非結合状態になり、ペルオキシ亜硝酸などのフリーラジカル種が生成され、次いで根本的欠乏を悪化するＢＨ４プールがさらに破壊される（Ｃｈａｎｎｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００４年；１４（８）：３２３〜３２７頁；Ｗｅｒｎｅｒら、Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）２００３年；２２８（１１）：１２９１〜１３０２頁；Ｖａｓｑｕｅｚ−Ｖｉｖａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００２年；３６２（Ｐｔ３）：７３３〜７３９頁；Ｗｅｉ、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ２００３年；１０３（６）：２３６５〜２３８３頁）。
【００４４】
糖尿病患者では、グルコース濃度がより高いと、第１酵素ＧＴＰシクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）の発現の低減によってＢＨ４生合成が直接抑圧され（Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００年；３４９（Ｐｔ１）：３５３〜３５６頁；Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００４年；Ｃａｉら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２００５年；６５（４）：８２３〜８３１頁）、動物において血管機能不全に至るが、ＢＨ４での代替に応答し（Ａｌｐら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３年；１１２（５）：７２５〜７３５頁；Ｙｕら、Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００１年；１７（２）：１２３〜１２９頁；Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００年；３４９（Ｐｔ１）：３５３〜３５６頁；Ｐｉｅｐｅｒ、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９７年；２９（１）：８〜１５頁；Ｐａｎｎｉｒｓｅｌｖａｍ．ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２年；１３６（２）：２５５〜２６３頁；Ｈａｍｏｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  １９８９年；１８１（３）：２４９〜２５３頁）、ヒトにおいて血管機能不全に至るが、ＢＨ４での代替に応答する（Ｎｙｓｔｒｏｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００４年；Ｃｈａｎｎｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００４年；１４（８）：３２３〜３２７頁；Ｗｅｒｎｅｒら、Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）２００３年；２２８（１１）：１２９１〜１３０２頁；Ｈｅｉｔｚｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２０００年；４３（１１）：１４３５〜１４３８頁；Ｇｕｚｉｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２年；１０５（１４）：１６５６〜１６６２頁）。高コレステロール血症の過度のコレステロールもＧＴＰＣＨを抑制すると思われるが、ＢＨ４投与によって改善する（Ｆｕｋｕｄａら、Ｈｅａｒｔ  ２００２年；８７（３）：２６４〜２６９頁）。心不全および冠動脈疾患を有する患者も、ＢＨ４欠乏による内皮機能不全を有すると思われる（Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２年；３９（３）：３６３〜３６８頁；Ｍａｉｅｒら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００年；３５（２）：１７３〜１７８頁）。喫煙では、喫煙による過度の酸化化合物がＢＨ４プールを破壊するが、ＢＨ４での代替によって機能が改善する（Ｋａｔｕｓｉｃ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１年；２８１（３）：Ｈ９８１〜Ｈ９８６頁；Ｕｅｄａら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２０００年；３５（１）：７１〜７５頁）。溶血性貧血では、遊離ヘムがフリーラジカルを生成し、それがＢＨ４プールを激減する恐れもある（Ｒｏｔｈｅｒら、ＪＡＭＡ  ２００５年；２９３（１３）：１６５３〜１６６２頁）。ＢＨ４欠乏の結果、ＮＯ生成不能に至る。鎌状赤血球症を有する対象では、ＢＨ４での代替が、肺動脈高血圧、虚血再かん流障害、ならびに血流低下による臓器障害、赤血球および白血球による閉塞および／または接着、および凝血による血管閉塞クリーゼの管理に有効となろう。
【００４５】
最近の文献に基付いた６Ｒ−ＢＨ４の使用が可能な徴候の一覧には、以下が含まれる。糖尿病（Ｎｙｓｔｒｏｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００４年；Ｃｈａｎｎｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００４年；１４（８）：３２３〜３２７頁；Ｗｅｒｎｅｒら、Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）２００３年；２２８（１１）：１２９１〜１３０２頁；Ａｌｐら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３年；１１２（５）：７２５〜７３５頁；Ｋａｔｕｓｉｃ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１年；２８１（３）：Ｈ９８１〜Ｈ９８６頁；Ｙｕら、Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００１年；１７（２）：１２３〜１２９頁；Ｈｅｉｔｚｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２０００年４３（１１）：１４３５〜１４３８頁；Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００年；３４９（Ｐｔ１）：３５３〜３５６頁；Ｐｉｅｐｅｒら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９７年；２９（１）：８〜１５頁）、高コレステロール血症（Ｆｕｋｕｄａら、Ｈｅａｒｔ  ２００２年；８７（３）：２６４〜２６９頁）、喫煙（Ｌｏｗｅら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２００４年；Ｕｅｄａら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２０００年；３５（１）：７１〜７５頁）、うっ血性心不全（Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２年；３９（３）：３６３〜３６８頁）、アテローム性動脈硬化症（Ｃｈａｎｎｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００４年；１４（８）：３２３〜３２７頁；Ｋａｔｕｓｉｃ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１年；２８１（３）：Ｈ９８１〜Ｈ９８６頁；Ｍａｉｅｒら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００年；３５（２）：１７３〜１７８頁）、肺高血圧（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５年；１１１（１６）：２０２２〜２０２４頁；Ｋｈｏｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５年；１１１（１６）：２１２６〜２１３３頁）、冠動脈疾患（Ｎｙｓｔｒｏｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００４年；Ｍａｉｅｒら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００年；３５（２）：１７３〜１７８頁；Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２００１年；３８（２）：４９３〜４９８頁）、臓器移植後の再かん流障害／血管機能不全（Ｙａｍａｓｈｉｒｏら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ（Ｔｏｒｉｎｏ）２００３年；４４（１）：３７〜４９頁；Ｋａｋｏｋｉら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０００年；１１（２）：３０１〜３０９頁；Ｄｕｒａｎｓｋｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００５年）、脳卒中後の血管痙縮（Ｐｌｕｔａら、ＪＡＭＡ  ２００５年；２９３（１２）：１４７７〜１４８４頁）、および鎌状赤血球症を含む溶血性貧血（米国特許出願第２００３／００７８２３１号；Ｗｏｏｄら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４０：１４４３〜１４５３頁（���００６年））。これら徴候の全てにおいてＢＨ４欠乏が生じ、一酸化窒素（ＮＯ）生成が欠乏し、遅れがちな信号を正常化するための血管系の応答が不能になる。
【００４６】
一般に本発明は、血管疾患を生じる内皮機能不全の治療的介入を記載するものである。本発明は、内皮機能不全を特徴とする疾患または障害を有する対象を治療するための方法および組成物を企図し、その方法は、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその前駆体もしくは誘導体を含む組成物を単独で、または治療剤と組み合わせて対象に投与することを含み、前記投与は、前記ＢＨ４含有組成物なしの前記内皮機能不全と比較して、前記対象の内皮機能不全を緩和するのに効果がある。本発明は、内皮機能不全を有する対象を治療する方法をさらに企図し、その方法は、血管拡張剤としての一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増大する因子または因子の組合せを単独で、または治療剤と組み合わせて投与することを含む。
【００４７】
１．糖尿病関連血管合併症
糖尿病および他の心疾患状態は、内皮での血管拡張剤と血管収縮剤との平衡性を変え、内皮機能不全に寄与する一酸化窒素（ＮＯ）生物活性の喪失を特徴とする。高血圧をもたらす血管収縮の増大、血流または他の信号に応答する不適切な拡張、血管形成および血小板凝集の増大、セレクチンなどの細胞表面接着分子の増大、活性酸素種（ＲＯＳ）、例えばスーパーオキシド分子などの過度のフリーラジカル生成による凝血因子および加速性アテローム性動脈硬化症の増大の根底には、内皮機能不全がある。ＮＯは、血管の恒常性の維持に中心的役割を担うので、ＮＯ生物活性の喪失は血管疾患の病因に寄与し、該疾患の負の転帰のマーカーとなる。
【００４８】
酸化ストレスに曝露された動脈のＢＨ４の加速性異化作用は、糖尿病患者の動脈に存在することが知られている内皮機能不全の病因に寄与することが、最近の知見によって示唆されている。さらに高グルコースが、ＢＨ４の細胞レベルの増大を防止する。糖尿病患者に認められるアスコルビン酸の欠乏も、ｅＮＯＳに対するＢＨ４レベルの実用性を低減することに寄与する。幸い、動物およびヒトでのＢＨ４の実験的な補充は、内皮機能への有益な効果を示している。糖尿病またはアテローム性動脈硬化症を有する動物の血管輪を使用する高濃縮ＢＨ４の補充研究、および糖尿病を有する患者の哺乳類動脈環における高濃縮ＢＨ４の補充研究によって、ＢＨ４が内皮機能不全を潜在的に改善し、血管機能を修復し得ることが支持される。心臓血管および糖尿病の対象へのＢＨ４の好ましい効果の幾つかの例には、以下が含まれる。ＢＨ４投与は、糖尿病または高コレステロール血症を有する患者の前腕の血流へのＮＯ媒介性効果を増大するが、正常な対象への効果は増大しないと思われること（Ｈｅｉｔｚｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４３（１１）：１４３５〜８頁（２０００年））。急性ＢＨ４は、冠動脈バイパスグラフト術を受けている糖尿病の対象の静脈グラフトおよび動脈の血管機能を修復すること（Ｇｕｚｉｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５（１４）：１６５６〜１６６２頁（２００２年））。ＢＨ４は、対照である対象と比較して、ＩＩ型糖尿病および冠状動脈性心疾患を有する患者のインスリン感受性を増大すること（Ｎｙｓｔｒｏｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００４年１１月；２８７（５）：Ｅ９１９〜２５頁．Ｅｐｕｂ（２００４年））。生合成経路におけるＢＨ４前駆体の補充が、細胞内のＢＨ４レベルを増大する助けとなり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＯ合成を改善し、内皮機能を改善することも示されている。図５は、糖尿病におけるＢＨ４欠乏の役割を示している。
【００４９】
２．制御されない高血圧
ＢＨ４の効果を、高血圧を有するヒトで研究した。制御されにくい高血圧（収縮期ＢＰ＞１３５ｍｍＨｇ）を有し、従来の降圧療法での治療を受けている８人の患者に、経口用ＢＨ４（１日当たり５ｍｇ／ｋｇ、１日当たり１０ｍｇ／ｋｇ）を８週間与えた。上腕動脈流媒介性の血管拡張（ＦＭＤ）および各拡張については、ベースラインであるニトログリセリン舌下投与後および治療の８週間後および治療後１週間、ならびに血圧変化については９週間および治療後６週間の毎週、患者を評価した。ＦＭＤは、ＢＨ４治療の８週間後に有意に増大し、ＢＨ４使用終了の１週間後には、ベースラインに戻った。経口用ＢＨ４は、収縮期および拡張期血圧を有意に低下し、血圧は、療法停止後６週間でベースライン値に戻った。血圧降下は治療の３週間後に有意であり、ＢＨ４の両方の用量は類似の効果をもたらした。これらの知見は、ＢＨ４が、制御されにくい高血圧を有する患者の内皮依存性血管拡張を改善することを示している（Ｌｅｆｅｖｅｒら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｓｓｉｏｎｓ  ２００３年、Ｓｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＯＰ．４３．３、Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２３７８）。
【００５０】
３．冠動脈疾患
冠動脈疾患は、内皮機能不全および加速性アテローム性動脈硬化症の組合せとして特徴付けることができる。ＢＨ４は、様々な研究で血管機能を修復することが示されている。ＢＨ４は冠動脈流を増大した（Ｆｕｋｕｄａら、２００２年）。血管造影中に注入されたＢＨ４は、冠血流速度の変化に基付く内皮機能不全を有する患者において、アセチルコリンに対する異常血管収縮を防止した（Ｍａｉｅｒら（２０００年）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３５：１７３〜１７８頁）。ＢＨ４療法は、冠血流の改善およびアテローム性動脈硬化症／血栓形成の低減の両方をもたらした。糖尿病患者のＭＩの反復による死亡率は非常に高い。
【００５１】
４．肺血管疾患−肺動脈高血圧
ＮＯ欠乏は肺動脈高血圧（ＰＡＨ）に存在するという幾つかの証拠がある。（１）ＰＡＨを有する患者は、呼気のＮＯレベルが低いことが示された。（２）ＢＨ４生合成の欠陥およびＢＨ４欠乏を有するノックアウトマウスは、それらの大症状として肺高血圧を発症する（Ｎａｎｄｉら２００５年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１：２０８６）。（３）シルデナフィル（ＰＤＥ５阻害剤）に関する最近のデータは、ＰＡＨではＮＯシグナリングが欠乏していることを示唆している。しかし、ヒトにおけるＢＨ４での代替データは未だ見つかっていない。
【００５２】
５．鎌状赤血球症を含む溶血性貧血
内皮機能不全は溶血性貧血を有する患者に生じ、その問題の根底にはＮＯの欠失があることを示す幾つかのデータが存在する。ＢＨ４欠乏は、ＢＨ４プールの酸化破壊による原因である可能性が高い。動物実験は、鎌状赤血球症に関連する慢性血管損傷に応答する代償的役割をＮＯが担うことを示唆している。循環血漿ヘモグロビンおよびスーパーオキシドの組合せの作用によって、ＮＯの破壊が生じる（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １０：９９〜１０７頁（２００３年））。ＮＯの生体利用能を増大するか、または鎌状赤血球症に関連する酸化ストレスおよび制御されないフリーラジカルの増殖を妨害する新しい治療手法が考慮されている。アルギニンとヒドロキシ尿素との併用投与によって、ＮＯの生成を増大し、定常状態でＳＣＤを有する患者におけるアルギニンの使用を改善することができる（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２５（８）：６２９〜６３４頁（２００３年））。ヒドロキシ尿素およびアルギニンに加えて、ＮＯレベルを増大するための吸入ＮＯなどの他の療法、ＮＯ破壊を低減するためのアロプリノール、ならびにＮＯ応答を増幅するためのスタチンおよびシルデナフィルが考慮されている（Ｍａｃｋら、Ｉｎｔｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ（２００６年））。米国特許出願第２００３／００７８２３１号には、鎌状赤血球貧血を含む、酸化ストレスおよび制御されないフリーラジカルの増殖から生じる幾つかの疾患を治療するための、抗酸化特性を有する栄養または食品補助剤としての正常生体分子のスルホアデノシルメチオニン誘導体の使用が記載されている。米国特許出願第２００５／０２３９８０７Ａ１には、鎌状赤血球貧血などの酸化ストレスに関連する疾患を治療するための、ＮＯドナー生物活性（例えばアロプリノール）を提供する群を含む反応性酵素を生成する酵素の阻害剤の使用が記載されている。
【００５３】
鎌状赤血球症では、ＮＯが、接着分子の内皮発現ならびにその後の赤血球および白血球の接着を低減し、それによって血管閉塞クリーゼの発症を防止する（Ｓｐａｃｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６３：２００〜２０４頁（２０００年））。細胞関連ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、スーパーオキシドの供給源であることが示された（ＷｏｏｄらＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９（８）：９８９〜９９１頁（２００５年））。鎌状赤血球症に関連するスーパーオキシドラジカルの急速な生成は、ＢＨ４を酸化し、それによってＢＨ４の欠乏を生じることが知られているＯＨおよびＯＮＯＯなどの第２の反応性酸素および窒素代謝産物の生成が誘発される恐れがある。ある研究では、鎌状赤血球トランスジェニック（βＳ）マウスへのＢＨ４の前駆体セピアプテリンの投与は、血球接着の減衰に関連していた（Ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４０：１４４３〜１４５３頁（２００６年））。本発明と一致しているが、この筆者らはセピアプテリンによって外因性ＢＨ４の抗酸化特性および自動酸化特性が欠失することを具体的に示唆しており、本発明ではその使用が企図される。さらに上記のように、トランスジェニック鎌状赤血球マウスモデルは、ヒトにおいて観測されるＮＯＳ、ＮＯ、およびＢＨ４のレベルを制御する複合体の恒常性維持機構を正確には反映することができない（Ｒｅｉｔｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １０：９９〜１０７頁（２００３年））。
【００５４】
６．間欠性跛行
間欠性跛行は、末梢動脈疾患の最も顕著な症候である。間欠性跛行は、しばしば脚部の遠位動脈の病巣と相まって、腸骨動脈および大腿動脈を狭めるアテローム硬化性によって生じることが最も多い。間欠性跛行において血流は、安静時のヒトの必要量に対しては十分である。しかしこのようなヒトが運動する場合、血管が閉塞され、したがって血流が制限され、運動筋の必要を満たすには不十分なレベルまで酸素供給が低下する。それに応じて身体は、血管を拡張するＮＯなどの因子の放出を低減し、トロンボキサン、セロトニン、アンギオテンシンＩＩ、エンドセリン、ノルエピネフリンなどの、血管を収縮する因子の放出を増大する。また、血球が異常をきたし血餅を形成しやすいという証拠がある。間欠性跛行の症候には、腓腹筋の委縮、足指先および足部にかけての体毛喪失、足指爪の肥厚、てかり突っ張りのある皮膚（ｓｈｉｎｙ  ｔｉｇｈｔ  ｓｋｉｎ）、黒色に変色した非流血性の足指先の有痛性潰瘍、および幾つかの場合、脚部動脈の血餅形成が含まれる。間欠性跛行は、５０歳以上の男性の５％もの数に影響を及ぼす恐れがある。影響を受けた１０〜２０％では症候が悪化し、四肢壊死の発症により１２人に１人が切断に至ることがある。間欠性跛行の療法には、生活習慣の変化（運動、喫煙およびアルコール摂取の停止）、運動療法、投薬（ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｉｎｅ）、ナフロニル（ｎａｆｒｏｎｙｌ）、抗血栓剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤シロスタゾール）、および補助剤（ビタミンＥ、Ｂ、およびＣ）、低コレステロール食、ならびに血管内修復が含まれる（Ｈｉａｔｔ、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（２００５年）ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；Ｗｏｌｏｓｋｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃｓ  ６０（３）：１９３〜２００頁（２００５年））。糖尿病患者の研究によって、ＢＨ４投与が、虚血誘発性血流およびＦＭＤの改善に関連していたことが示されている。
【００５５】
７．新生児の持続性肺高血圧
新生児の持続性肺高血圧（ＰＰＨＮ）を有する満期出産乳児は、高い死亡率を有し、その数は恐らく年４０，０００人となる。死亡率は非常に高く、恐らく２０〜５０％の範囲である。これらの乳児の多くは、高血糖によるＢＨ４欠乏の関係に合致するＬＧＡおよび糖尿病の母親の乳幼児である。
【００５６】
８．卒中および関連の虚血性血管疾患
犬の卒中モデルからのデータは、脳卒中後の血餅部位周辺の血管痙縮が伸展し、元のイベントよりも大きな損害を生じるが、亜硝酸塩溶液の注入によって防止できることを示している。
【００５７】
ＩＩ．ＢＨ４および血管障害の治療
本発明は、ＢＨ４の投与に基付く血管障害の薬剤介入を記載するものである。本発明ではさらに、安定形態または他の形態の任意のタイプのＢＨ４を使用して、様々な形態の血管疾患、それに限定されるものではないが、糖尿病がある場合およびない場合の、難治性または制御されない高血圧、間欠性跛行、冠動脈機能、肺動脈高血圧、および鎌状赤血球症を含む溶血性貧血を有する対象を含む患者集団を治療できることが企図される。かかるＢＨ４系組成物は単独で、あるいは血管障害の治療に一般に使用される任意の他の治療剤および／または治療的介入と組み合わせて投与することができる。かかる薬剤には、それに限定されるものではないが、ＰＰＡＲγリガンド（チアゾリジンドン、グリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン）などのインスリン感受性を改善する薬剤、スルホニル尿素（グリキドン、トルブタミド、グリメプリド、クロルプロパミド、グリピザイド、グリブリド、アセトヘキサミド）およびメグリチニド類（メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド）などのインスリン分泌刺激薬、ならびにメトホルミンなどの肝臓のグルコース生成を低減する薬剤を含む、糖尿病を治療するために使用される薬剤が含まれる。かかる薬剤には、それに限定されるものではないが、ボセンタン、ダルセンタン、エンラセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アンブリセンタンシタクスセンタンなどの、高血圧および他の内皮機能不全関連障害を治療するために一般に使用されるエンドセリンレセプターアンタゴニスト；ＰＤＥ５阻害剤（間接作用型）およびミノキシジル（直接作用型）などの平滑筋弛緩薬；カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル、ラミプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタンなどのアンギオテンシンＩＩレセプターブロッカー；アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ビソプロロール、ピンドロール、アセブトロール、ベタキソロール、プロプラノロールなどのβブロッカー；ヒドロクロロチアジド、フロセミド、トルセミド、メトラゾンなどの利尿薬；アムロジピン、フェロジピン、ニソルジピン、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼムなどのカルシウムチャネルブロッカー；αレセプターブロッカードキサゾシン、テラゾシン、アルフゾシン、タムスロシン；ならびにクロニジンなどの中枢αアゴニストを含む、血管疾患を治療するために使用される薬剤が含まれる。かかる薬剤には、それに限定されるものではないが、スタチン（アトバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンカルシウム、シンバスタチン）およびニコチン酸などのＬＤＬを低下する薬剤、フィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラートなどのＰＰＡＲαを刺激する薬剤、胆汁酸抑制剤、コレスチラミン、およびコレスチポールなどの、胆汁酸と結合しその再吸着を防止し、コレステロール濃度を低下する薬剤、ならびにコレステロール吸収阻害剤を含む高��血症を治療するために使用される薬剤が含まれる。
【００５８】
本発明の幾つかの実施形態は、血管機能不全の治療を対象とし、その治療は、ＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体を含む組成物を単独で、または通常の血管治療と組み合わせて対象に投与することを含み、ＢＨ４を単独でまたは通常の血管療法と組み合わせて投与することは、単独でも通常の血管療法との組合せでもＢＨ４を用いない場合の前記濃縮物と比較して、前記対象の臨床的に関連のあるエンドポイントを改善するのに有効である。
【００５９】
本発明の一実施形態は、ＢＨ４組成物を、値を正常化するのに有効な量で異常エンドポイントを有する任意の患者に投与するものである。好ましい一実施形態では、かかる個体は特定の血管疾患を有すると診断されている。本発明は、本明細書に記載の安定化ＢＨ４組成物を、エンドポイントを正常レベルに改善するのに有効な量で、特定の症候によって、および／または特定の血管疾患を診断するために使用される一般的な試験によって特徴付けられる特定の血管疾患を有すると診断された患者に投与することを企図する。
【００６０】
本発明は、典型的な症候を有する患者をＢＨ４で治療して、臨床的に関連のあるエンドポイントの正常値をもたらすことを企図していることが当業者には理解されよう。さらに、臨床的に関連のあるエンドポイントの最小限の正常範囲内にあるエンドポイント値の任意変化は、患者の治療レジメンの治療転帰であると解釈されよう。
【００６１】
１．併用療法
本発明はさらに、ＢＨ４を単独で、または血管機能不全を治療するために一般に使用される薬剤もしくは介入と組み合わせて投与することによる、様々なタイプの血管機能不全の治療的介入を企図する。ＢＨ４療法を、血管機能不全を治療するための通常の薬剤または介入と組み合わせて、かかる患者のかかる疾患の臨床的に関連のあるエンドポイントを治療によって高められることを理解されたい。上記のように血管機能不全の治療は、恒常性を維持し、アジュバント療法を提供し、特異的療法を提供して臨床的に関連のあるエンドポイントを改善することを対象とする。恒常性は、有害なフリーラジカルの生成を増大することなしに、ＢＨ４およびＮＯ生成のレベルを含む、血管機能不全に罹患しやすくなる因子を修正することによって維持される。アジュバント療法は、一次療法の有効性を増大する薬剤を投与するか、または介入を施すことからなる。特異的療法は、臨床的に関連のある正常なエンドポイントの維持を対象とする。血管機能不全を治療するために現在使用されている通常の薬剤および介入は既に論じた。血管機能不全を管理または治療するために使用される通常の介入の幾つかには、抗糖尿病薬、様々なタイプの血管疾患を治療するために使用される薬剤、および抗高脂血症療法が含まれる。糖尿病を治療するために使用される薬剤には、それに限定されるものではないが、ＰＰＡＲγリガンド（チアゾリジンドン、グリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン）などのインスリン感受性を改善する薬剤、スルホニル尿素（グリキドン、トルブタミド、グリメプリド、クロルプロパミド、グリピザイド、グリブリド、アセトヘキサミド）およびメグリチニド類（メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド）などのインスリン分泌刺激薬、ならびにメトホルミンなどの肝臓のグルコース生成を低減する薬剤が含まれる。血管疾患を治療するために使用される薬剤には、それに限定されるものではないが、ボセンタン、ダルセンタン、エンラセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アンブリセンタンシタクスセンタンなどの、高血圧および他の内皮機能不全関連障害を治療するために一般に使用されるエンドセリンレセプターアンタゴニスト；ＰＤＥ５阻害剤（間接作用型）およびミノキシジル（直接作用型）などの平滑筋弛緩薬；カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランドラプリル、ベナゼプリル、ラミプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタンなどのアンギオテンシンＩＩレセプターブロッカー；アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ビソプロロール、ピンドロール、アセブトロール、ベタキソロール、プロプラノロールなどのβブロッカー；ヒドロクロロチアジド、フロセミド、トルセミド、メトラゾンなどの利尿薬；アムロジピン、フェロジピン、ニソルジピン、ニフェジピン、ベラパミル、ジルチアゼムなどのカルシウムチャネルブロッカー；αレセプターブロッカードキサゾシン、テラゾシン、アルフゾシン、タムスロシン；ならびにクロニジンなどの中枢αアゴニストが含まれる。高脂血症を治療するために使用される薬剤には、それに限定されるものではないが、スタチン（アトバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンカルシウム、シンバスタチン）およびニコチン酸などのＬＤＬを低下する薬剤、フィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラートなどのＰＰＡＲαを刺激する薬剤、胆汁酸抑制剤、コレスチラミン、およびコレスチポールなどの、胆汁酸と結合しその再吸着を防止し、コレステロール濃度を低下する薬剤、ならびにコレステロール吸収阻害剤が含まれる。
【００６２】
血管機能不全を管理および／または治療するために単独で、または治療剤および介入と組み合わせて投与されるＢＨ４は、必ずしも本明細書に記載の安定化ＢＨ４組成物である必要はない。当業者には、室温および光の下で不安定なＢＨ４組成物を生成する方法が知られている。かかる組成物を使用する療法は、ＢＨ４組成物の不安定性によって妨害されるが、その使用は、血管疾患を治療するために使用されるＢＨ４治療および通常の療法の工程を用いて血管機能不全に罹患している患者が治療される幾つかの併用療法に、なおも企図されている。
【００６３】
かかる安定化ＢＨ４組成物を生成するための方法および組成物をさらに詳細に記載する。本発明の安定化ＢＨ４組成物は、８時間超、または少なくとも２４時間、３カ月、６カ月、９カ月、１２カ月もしくはそれ以上室温で安定なＢＨ４単独の結晶を含む。本発明の方法および組成物は、通常の任意の投与経路によって、それに限定されるものではないが、経口、筋肉内注入、皮下注入、静脈内注入等によって送達することができる安定化ＢＨ４の医薬組成物を企図する。本発明の組成物はさらに、ＢＨ４組成物の安定性を延長する助けとなる抗酸化物質と組み合わせてＢＨ４組成物を含むことができる。
【００６４】
本発明の幾つかの方法には、血管疾患を有する患者に治療転帰をもたらすために、ＢＨ４と通常の薬剤および介入とを組み合わせて使用することが含まれる。本明細書に企図される併用療法の適切な治療転帰を実現するために、ＢＨ４組成物および薬剤／介入は、一般に所望の治療転帰をもたらすように組み合わせた有効な量で対象に投与されることになる。このプロセスには、同時にＢＨ４組成物および薬剤／介入を投与することが含まれ得る。このことは、治療剤およびＢＨ４の両方を組み合わせた１つの製剤として含む単一組成物または薬理作用のある製剤を投与することによって、あるいは介入の実施と同時にＢＨ４製剤を投与することによって実現できる。あるいは薬剤／介入は、ＢＨ４の薬理作用のある製剤（錠剤、注入、または飲料）とおよそ同時に摂取される。他の代替では、ＢＨ４治療は、数分から数時間の範囲の間隔で、薬剤／介入の先または後に行うことができる。薬剤／介入およびＢＨ４組成物が別々に投与される実施形態では、一般に、両方の薬剤がそれらの効果を同時に発揮して、その後もＢＨ４が患者に有利な効果を確実に発揮できるようにされよう。このような場合、薬剤／介入の約２〜６時間内（前または後）に、最も好ましくはわずか約１時間の遅延時間でＢＨ４を投与するように企図される。しかし、２〜６時間という２種類の薬剤の投与間隔は単に例示的なものであり、さらに間隔が長くてもよく、例えば２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、１週間、またはそれ以上のＢＨ４および第２の薬剤／介入の投与間隔も企図され得ることを理解されたい。幾つかの実施形態では、ＢＨ４療法を、ＢＨ４の１日当たりの用量が患者に無期限に投与される連続療法とすることが企図される。
【００６５】
２．療法で使用するためのＢＨ４組成物
本発明は、本明細書に企図する治療で使用できる組成物について論じる。
【００６６】
米国特許第５，６９８，４０８号、第２，６０１，２１５号、第３５０５３２９号、第４，５４０，７８３号；第４，５５０，１０９号、第４，５８７，３４０号、第４，５９５，７５２号、第４，６４９，１９７、第４，６６５，１８２号、第４，７０１，４５５号、第４，７１３，４５４号、第４，９３７，３４２号、第５，０３７，９８１号、第５，１９８，５４７号、第５，３５０，８５１号、第５，４０１，８４４号、第５，６９８，４０８号、およびカナダ特許出願第２４２０３７４号（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる）には、それぞれ、本発明の組成物として使用できるジヒドロビオプテリン、ＢＨ４およびその誘導体の生成方法が記載されている。かかる任意の方法を使用して、本発明の治療方法に使用するためのＢＨ４組成物を生成することができる。
【００６７】
米国特許第４，７５２，５７３号、第４，７５８，５７１号、第４，７７４，２４４号、第４，９２０，１２２号、第５，７５３，６５６号、第５，９２２，７１３号、第５，８７４，４３３号、第５，９４５，４５２号、第６，２７４，５８１号、第６，４１０，５３５号、第６，４４１，０３８号、第６，５４４，９９４号、および米国特許公開第２００２０１８７９５８号、第２００２０１０６６４５号、第２００２／００７６７８２号、第２００３００３２６１６号（それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる）それぞれには、様々な治療のためのＢＨ４の投与方法が記載されている。これらの特許のそれぞれは、本明細書に記載の血管疾患治療に適合できることが当業者に知られているＢＨ４組成物の投与方法の一般的教示を提供するものとして、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６８】
特に米国特許第４，５４０，７８３号には、本発明の治療方法によれば有用な１’，２’−ジアシル−（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−Ｌ−ビオプテリンであるＢＨ４誘導体、およびその無機塩または有機塩が記載されている。好ましくは、医薬として許容可能な塩は、本発明の治療方法に合わせて使用される。米国特許第４，５４０，７８３号に記載の化合物は、一般式（Ｉ）を有する。
【００６９】
【化１】
2009518415.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２は、同じかまたは異なっており、それぞれがアシル基である。
【００７０】
アシル基は、好ましくは１〜１０個の炭素原子、特に３〜１０個の炭素原子を有する。好ましくは、アシル基は一般式Ｒ５ＣＯによって表され、式中、Ｒ５は水素であるか、または１個もしくは複数の炭素原子、特に２〜９個の炭素原子を有する炭化水素残基である。Ｒ５で表される炭化水素残基の好ましい例は、例えば飽和または不飽和の、１個または複数の炭素原子、好ましくは２〜９個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキル基、次の一般式で表される置換または非置換のフェニル基である。
【００７１】
【化２】
2009518415.tif 000004
式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は水素であるか、または直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基（但し、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０の炭素原子の総数が好ましくは３以下になる）、次の一般式で表される置換もしくは非置換のベンジル基である。
【００７２】
【化３】
2009518415.tif 000005
式中、Ｒ１１およびＲ１２は、水素、メチル、またはエチル（但し、Ｒ１１およびＲ１２の炭素原子の総数が好ましくは２以下になる）、ならびに次の一般式で表される置換もしくは非置換のアリールアルキル基である。
【００７３】
【化４】
2009518415.tif 000006
式中、Ｒ１３は、水素またはメチル基である。上記アシル基の中でも、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、およびベンゾイルが最も好ましい。Ｒ１およびＲ２が同じであることが好ましい。
【００７４】
一般式（Ｉ）の化合物は、２つのジアステレオマー、即ち１’，２’−ジアシル−（６Ｒ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−Ｌ−ビオプテリンおよび１’，２’−ジアシル−（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−Ｌ−ビオプテリンを有し、それらは６位でジアステレオマーになっている。本発明の化合物には、その２つのジアステレオマーおよびそれらの混合物が含まれる。
【００７５】
本発明の化合物（Ｉ）は、塩酸塩、硫酸塩、またはリン酸塩などの無機塩、酢酸塩、シュウ酸塩、または錯塩などの有機塩の形態であってよい。
【００７６】
米国特許第４，５５０，１０９号には、類脂質性ビオプテリンおよびテトラヒドロビオプテリンであるＢＨ４誘導体が記載されている。これらの類脂質性ＢＨ４誘導体は、本発明の治療方法に従って、医薬として許容可能な塩として投与することができる。米国特許第４，５５０，１０９号に記載の化合物は、以下の構造によって表される。
【００７７】
【化５】
2009518415.tif 000007
式中、
Ｒは、環Ｂに２つの２重結合がある場合は存在せず、
Ｒは、環Ｂに２つの２重結合が無い場合は水素であり、
Ｒ’およびＲ”は、独立に、飽和または不飽和の脂肪族炭化水素基であり、これらは類脂質性化合物に類脂質性を付与するような分子量で平衡を保つ。
【００７８】
一般に、Ｒ’およびＲ”は、１〜３１個の炭素単位を有する炭化水素から選択され、Ｒ’＋２Ｒ”の炭素単位の合計は１０を超え３３未満に制限される。
【００７９】
これらの誘導体では、２−Ｎ−アシル基は、望ましくは最終生成物に類脂質性を付与するために９〜３２個、好ましくは９〜２０個の炭素単位とする。２−Ｎ−アシル基は、デカノイル、パルミトイル、ステアロイル、およびリノレイルによって例示される。２−Ｎ−アシル基は、ステアロイルのように飽和であっても、リノレイルのように不飽和であってもよい。さらに、フェニルアセチルのような非毒性の芳香族２−Ｎ−アシル基は、最終生成物に望ましい類脂質性を付与することもできる。１’，２’−ジ−Ｏ−アシル基は、望ましくは２〜８個、好ましくは２〜４個の炭素単位を有する低分子量のアルキルおよびアルケニル、例えばアセチルである。
【００８０】
米国特許第４，５５０，１０９号には、次式のビオプテリン化合物も記載されている。
【００８１】
【化６】
2009518415.tif 000008
式中、Ｒは、飽和または不飽和であってよい天然に存在する脂肪酸であり、ＡｃはＣＯＣＨ３である。これらのビオプテリン化合物を水素化して、本発明の治療方法によれば有用な、対応するテトラヒドロビオプテリンを形成することができる。基Ｒ脂肪酸の例示的な鎖長は、Ｃ１０〜Ｃ１８単位の範囲である。例示的化合物には、２Ｎ−アセチル−１’，２’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｌ−ビオプテリン、２−Ｎ−デカノイル−１’，２’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｌ−ビオプテリン、２−Ｎ−パルミトイル−１’，２’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｌ−ビオプテリン、２−Ｎ−ステアロイル−１’，２’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｌ−ビオプテリン、２−Ｎ−リノレイル−１’，２’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｌ−ビオプテリン、および２−Ｎ−フェニルアセチル−１’，２’−ジ−Ｏ−アセチル−Ｌ−ビオプテリン、ならびに対応するテトラヒドロビオプテリンが含まれる。
【００８２】
ＢＨ４を生成する上記の一般法に加えて、本発明は特に、安定化ＢＨ４組成物、好ましくは９９．５％または９９．９％の純粋な６Ｒ  ＢＨ４であるＢＨ４組成物を生成し使用することを企図する。ＢＨ４それ自体が投与される場合、米国特許出願第１１／１４３，８８７号（およびそれに相当する、ＷＯ２００５／０４９０００として公開されている２００４年１１月１７日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／３８２９６）および米国特許出願第１０／９９０，３１６号（およびそれに相当する、ＷＯ２００５／０６５０１８として公開されている２００４年１１月１７日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ０４／０４４４７）に記載の塩または多形または結晶形態のいずれかを、精製された形態として投与することができる。様々な結晶形態を、錠剤、粉剤、または経口投与用の他の固体に好都合に形成することができる。結晶形態は、食品への通常の添加剤として有用であることも分かっている。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００６／０５５５１１として公開されている２００５年１１月１６日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／４１２５２に記載のように、ＢＨ４は、安定な固体製剤として投与することができる。ＢＨ４の投与形態および経路を、以下にさらに詳細に論じる。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明の方法によって、患者の必要に応じてＢＨ４の１日用量約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇをその患者に提供することを企図する。当然のことながら当業者は、投与によって実現される効果に応じてこの用量を増減して調節することができる。１日の用量は、単位用量として投与することができ、あるいは好都合な間隔で多回用量として投与することもできる。例示的実施形態では、１日の用量は、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上（ｍｇ／ｋｇ）であってよい。
【００８４】
本発明の低用量での治療方法では、低用量、例えば１日当たり０．１〜５ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、それには０．１〜２ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量が含まれる。１日当たり５ｍｇ／ｋｇ未満の用量が好ましい。本発明によれば、かかる用量は、研究による関連のあるエンドポイントに改善をもたらすと予想され、ＢＨ４誘導体は、かかる用量の天然ＢＨ４と比較して、改善された生物学的特性を有すると予想される。特に本発明は、１’，２’−ジアシル−（６Ｒ，Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ−Ｌ−ビオプテリンまたは本明細書に記載の類脂質性テトラヒドロビオプテリンのいずれかが、低用量で改善された生物学的特性を示すことを企図する。
【００８５】
本発明は特に、ＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体を、１日当たり体重１ｋｇにつき０．１〜５ｍｇの範囲の用量で任意の投与経路を介して、それに限定されるものではないが経口投与によって、１日当たりの用量を１回で、または１日当たりの用量を多数回に分割して（例えば２、３、または４回）、少なくとも１、２、３、または４週もしくはそれ以上、または１、２、３、４、５、６カ月もしくはそれ以上の期間、本願で言及する症状のいずれか、またはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００５年６月１日出願の米国特許出願第１１／１４３，８８７号（およびそれに相当する、ＷＯ２００５／０４９０００として公開されている２００４年１１月１７日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／３８２９６）に言及されている血管の病状のいずれかを治療するために使用することを企図する。例示的用量には、１日に５ｍｇ／ｋｇ未満、１日に４．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に４ｍｇ／ｋｇ以下、１日に３．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に３ｍｇ／ｋｇ以下、１日に２．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に２ｍｇ／ｋｇ以下、１日に１．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に１ｍｇ／ｋｇ以下、または１日に０．５ｍｇ／ｋｇ以下が含まれる。体表面積当たりの同等の用量も企図される。
【００８６】
平均的な体重／体表面積（例えば７０ｋｇ）のヒトについて、本発明は、４００ｍｇ未満の１日の総用量も企図する。かかる例示的な１日の総用量には、３６０ｍｇ／日、３５０ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、２８０ｍｇ／日、２１０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、１７５ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、または１４０ｍｇ／日が含まれる。例えば３５０ｍｇ／日または１７５ｍｇ／日は、１７５ｍｇの経口用製剤で１日１回または２回、容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、３２０ｍｇ／日以下、１６０ｍｇ／日以下、または８０ｍｇ／日以下が含まれる。かかる用量は、８０または１６０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、４５、９０、１３５、１８０、２２５、２７０、３１５、または３６０ｍｇ／日もしくはそれ以下が含まれ、これらは４５または９０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。さらに他の例示的な１日の総用量には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０ｍｇ／日が含まれ、これらは６０または１２０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、７０、１４０、２１０、２８０、または３５０ｍｇ／日が含まれ、これらは７０または１４０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。例示的な１日の総用量には、５５、１１０、１６５、２２０、２７５、または３３０ｍｇ／日も含まれ、これらは５５ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、例えば６５ｍｇまたは７５ｍｇの製剤としての、６５、１３０、１９５、２６０、もしくは３２５ｍｇ／日、または７５、１５０、２２５、３００、もしくは３７５ｍｇ／日が含まれる。
【００８７】
３．医薬組成物
本発明による投与のための医薬組成物は、医薬として許容可能な形態のＢＨ４を、任意選択で医薬として許容可能な担体と組み合わせて含む第１の組成物を含むことができる。これらの組成物は、所期の目的を実現する任意の手段によって投与することができる。本発明による組成物の投与のための量およびレジメンは、血管疾患を治療するために当業者によって容易に決定され得る。上記のように当業者は、ある医療状況で近年提案されているＢＨ４の量およびレジメン、例えばＮＯＳ活性の調整を目的とする組成物を最初に使用することができる。負荷試験でＢＨ４を投与するために使用されている記載の処方、製剤、投与経路等のいずれも、本発明で使用するために容易に改変することができる。
【００８８】
本発明の範囲内の組成物には、所期の目的を実現するために有効な量のＢＨ４、その類似体および誘導体を含む本発明の全ての組成物が含まれる。同様に、本発明の幾つかの治療方法が、血管疾患を治療するために一般に使用される薬剤および介入に加えてＢＨ４系組成物が投与される併用療法を企図される場合、本発明の医薬組成物は、血管疾患を治療するために使用される通常の薬剤および介入と組み合わせて投与する際、血管疾患の症候の１つまたは複数の改善を実現するのに有効な量の少なくともＢＨ４系治療剤、その類似体または相同体を含む全ての組成物も企図する。当然のことながら、緩和され得る最も明白な症候とは、併用療法が臨床的に関連のあるエンドポイントを改善する症候であるが、他の症候等も監視され得る。かかる徴候は、当業者に知られている技術を使用して監視される。
【００８９】
（６Ｒ）Ｌ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の結晶多形
ＢＨ４、特にＢＨ４の二塩酸塩は結晶多形性を示すことが見出されている。ＢＨ４の構造を以下に示す。
【００９０】
【化７】
2009518415.tif 000009
ＢＨ４の（６Ｒ）形態は、既知の生物活性形態であるが、ＢＨ４は周囲温度で不安定であることも知られている。ＢＨ４のある結晶多形はより安定であり、周囲条件下での分解に対して安定であることが見出されている。
【００９１】
ＢＨ４は取扱いが困難であり、したがってその二塩酸塩（Ｓｃｈｉｒｃｋｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｊｏｎａ、スイス）として生成され、その吸湿性および酸化への感受性に起因する物質の分解を防止するために窒素下で封止したアンプルで提供される。米国特許第４，６４９，１９７号には、（６Ｒ）−および６（Ｓ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を、そのジアステレオマーに分離することは、６（Ｒ，Ｓ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の低い結晶化度に起因して困難であると開示されている。欧州特許第００７９５７４号には、テトラヒドロビオプテリンの調製が記載されており、固体のテトラヒドロビオプテリン二塩酸塩は中間体として得られる。Ｓ．Ｍａｔｓｕｕｒａらは、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８４年、７３５〜７３８頁、およびＨｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ、２３巻、Ｎｏ．１２、１９８５年、３１１５〜３１２０頁に、無色針状形態の結晶固体としての６（Ｒ）−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を記載しており、それらはＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８、１３４１〜１３４８頁（１９８５年）に開示されているＸ線分析によって特徴付けられる。結晶生成物には旋光度６．８１°が見られたが、それは欧州特許Ａ２−０１９１３３５、実施例６の白色結晶形態の結晶固体について報告されている旋光度６．５１°に類似している。
【００９２】
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の作製中に得られた結果によって、該化合物が、多形および溶媒和物を含む様々な結晶形態で存在できることが示された。この分野での継続的な関心には、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の個々の結晶形態の効果的で信頼性のある調製方法、ならびに好ましくは製剤の製造および調製における取扱いおよび処理が容易で、その際に安定であり、物質形態または配合済み生成物として高い保存安定性をもたらし、あるいは安定形態の製造での制御結晶化のための中間体として適したそれより不安定な形態をもたらす結晶形態を提供する制御された結晶化条件が必要とされる。
【００９３】
多形Ｂ
最も安定であることが見出された結晶多形は、本明細書では「形態Ｂ」あるいは「多形Ｂ」と呼ばれる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩作製の研究および作製中に得られた結果によって、以前調製されてはいたが多形性およびそのＢＨ４結晶の安定性への効果は認識されていなかった幾つかの結晶固体が存在することが明らかになった。
【００９４】
多形Ｂは、約２０℃超の最も高い熱力学的安定性を有するわずかに吸湿性の無水物である。さらに形態Ｂは、その熱安定性、標的条件による調製の可能性、その適切な形態および粒経に起因して、容易に処理し取り扱うことができる。融点は約２６０℃（ΔＨｆ＞１４０Ｊ／ｇ）であるが、溶融の前およびその最中の分解に起因して、明確な融点を検出することができない。これらの際立つ特性によって、多形Ｂは高温で調製される医薬適用分野で特に実現可能なものとなる。多形Ｂは、０．２μｍ〜５００μｍの範囲であってよい粒経を有する微粉として得ることができる。
【００９５】
形態Ｂは、以下のｄ値（Å）で表されるＸ線粉末回折パターンを示す。８．７（ｖｓ）、６．９（ｗ）、５．９０（ｖｗ）、５．６３（ｍ）、５．０７（ｍ）、４．７６（ｍ）、４．４０（ｍ）、４．１５（ｗ）、４．００（ｓ）、３．９５（ｍ）、３．５２（ｍ）、３．４４（ｗ）、３．３２（ｍ）、３．２３（ｓ）、３．１７（ｗ）、３．１１（ｖｓ）、３．０６（ｗ）、２．９９（ｗ）、２．９６（ｗ）、２．９４（ｍ）、２．８７（ｗ）、２．８４（ｓ）、２．８２（ｍ）、２．６９（ｗ）、２．５９（ｗ）、２．４４（ｗ）。図６は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｂによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【００９６】
本明細書で使用されるように、以下の括弧内の略記は、（ｖｓ）＝非常に強い強度、（ｓ）＝強い強度、（ｍ）＝中程度の強度、（ｗ）＝弱い強度、および（ｖｗ）＝非常に弱い強度を意味している。特徴的なＸ線粉末回折パターンを図６に示す。
【００９７】
ＢＨ４の他の多形は、製造および配合中の安全な取扱いのために十分な化学的および物理的安定性を有すると同時に、その純粋形態または製剤として高い保存安定性を実現することが見出された。さらに、形態ＢおよびＢＨ４の他の多形は、非常に多量に調製することができ（例えば１００キロ規模）、長時間にわたって保存できることが見出された。
【００９８】
結晶形態Ｂを含めた全ての結晶形態（多形、水和物、および溶媒和物）は、最も安定な多形Ｂの調製に使用することができる。多形Ｂは、適切な極性の非水性溶媒中の非晶質形態または多形Ｂ以外の形態、例えば多形Ａの懸濁液の相を平衡化することによって得ることができる。したがって本明細書に記載の医薬調製物は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｂの調製物を指す。
【００９９】
ＢＨ４の他の形態は、室温でＢＨ４の他の形態を溶媒に分散し、多形Ｂを生成するのに十分な時間をかけてその懸濁液を周囲温度で撹拌し、その後結晶形態Ｂを単離し、単離形態Ｂから溶媒を除去することによって形態Ｂに変換することができる。本明細書で使用する周囲温度は、０℃〜６０℃、好ましくは１５℃〜４０℃の範囲の温度を意味する。適用温度は、処理および撹拌中に、その温度を段階的または継続的に低下することによって変更してもよい。他の形態を形態Ｂに変換するのに適切な溶媒には、それに限定されるものではないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、他のＣ３−およびＣ４−アルコール、酢酸、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メチル−ｔ−ブチルエーテル、１，４−ジオキサン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、他のＣ３〜Ｃ６−酢酸塩、メチルエチルケトン、ならびに他のメチル−Ｃ３〜Ｃ５アルキル−ケトンが含まれる。相の均衡化を完了するための時間は、最大３０時間、好ましくは最大２０時間または２０時間未満であってよい。
【０１００】
多形Ｂは、最大約５％の水を含有する溶媒混合物から、特にエタノール、酢酸、および水の混合物から結晶化することによって得ることもできる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形（Ｂ）は、任意選択で高温にて、エタノール、酢酸、および水を含む溶媒混合物に好ましくは形態Ｂよりも低エネルギーの固体形態を溶解するか、または（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｂを溶解し、該溶液に種を添加し、得られた懸濁液を冷却し、形成した結晶を単離することによって調製できることが見出された。溶解は室温で、または最大７０℃、好ましくは最大５０℃で実施することができる。溶解のために最終溶媒混合物を使用してよく、または出発材料を最初に水に溶解し、次いで他の溶媒を両方もしくは順に添加してもよい。溶媒混合物の組成物は、体積比が１：３：２〜１：９：４、好ましくは１：５：４の水：酢酸：テトラヒドロフランを含むことができる。該溶液は、好ましくは撹拌される。冷却とは、−４０℃〜０℃、好ましくは１０℃〜３０℃に下げた温度を意味し得る。適切な種は、類似または同一の形態を有するもう１つのバッチまたは結晶からの多形Ｂである。単離後、結晶形態Ｂを、アセトンまたはテトラヒドロフランなどの非溶媒で洗浄し、通常の方式で乾燥することができる。
【０１０１】
多形Ｂは、メタノール、エタノール、および酢酸などの非溶媒を添加し、水溶液から結晶化することによって得ることもできる。結晶化および単離手順は、有利には溶液を冷却することなく室温で実施することができる。したがってこのプロセスは、工業規模での実施に非常に適している。
【０１０２】
本明細書に記載の組成物および方法の一実施形態では、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｂを含む組成物は、形態Ｂ以外の固体形態または（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｂを周囲温度で水に溶解し、懸濁液を形成するのに十分な量の非溶媒を添加し、任意選択で懸濁液を一定時間撹拌し、その後形成した結晶を単離することによって調製される。該組成物はさらに、以下に記載の医薬組成物に改変される。
【０１０３】
水溶液中の（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃度は、溶液に対して１０〜８０重量パーセント、より好ましくは２０〜６０重量パーセントであってよい。好ましい非溶媒（即ち、ＢＨ４の懸濁液を調製するのに有用な溶媒）は、メタノール、エタノール、および酢酸である。非溶媒は水溶液に添加することができる。より好ましくは、水溶液を非溶媒に添加する。懸濁液の形成後の撹拌時間は、最大３０時間、好ましくは最大２０時間、または２０時間未満とすることができる。濾過および乾燥による単離は、上記の既知の方式で実施される。
【０１０４】
多形Ｂは非常に安定な結晶形態であり、容易に濾別し乾燥し、粉砕して製剤に所望の粒経にすることができる。これらの際立つ特性によって、多形Ｂは医薬適用分野に特に実現可能なものとなる。
【０１０５】
多形Ａ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ａ」または「多形Ａ」と呼ぶものとする。多形Ａはわずかに吸湿性であり、約３重量パーセントの含有量まで水を吸着し、それを１０℃／分の速度で加熱して５０℃〜２００℃で連続的に放出する。多形Ａは吸湿性無水物であり、形態Ｂに対して準安定形態である。しかし、密封容器で保存すれば周囲条件で数カ月にわたって安定である。形態Ａは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ａは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１０６】
特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す多形Ａを、以下のｄ値（Å）で表した。１５．５（ｖｓ．）、１２．０（ｍ）、６．７（ｍ）、６．５（ｍ）、６．３（ｗ）、６．１（ｗ）、５．９６（ｗ）、５．４９（ｍ）、４．８９（ｍ）、３．７９（ｍ）、３．７０（ｓ）、３．４８（ｍ）、３．４５（ｍ）、３．３３（ｓ）、３．２６（ｓ）、３．２２（ｍ）、３．１８（ｍ）、３．０８（ｍ）、３．０２（ｗ）、２．９５（ｗ）、２．８７（ｍ）、２．７９（ｗ）、２．７０（ｗ）。図７は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ａによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１０７】
多形Ａは、波数（ｃｍ−１）で表される特徴的なラマンスペクトル帯を示す。２９３４（ｗ）、２８８０（ｗ）、１６９２（ｓ）、１６８３（ｍ）、１５７７（ｗ）、１４６２（ｍ）、１３６０（ｗ）、１２３７（ｗ）、１１０８（ｗ）、１００５（ｖｗ）、８８１（ｖｗ）、８１３（ｖｗ）、７１７（ｍ）、６８７（ｍ）、６７３（ｍ）、６５９（ｍ）、５５０（ｗ）、５３０（ｗ）、４９２（ｍ）、３７１（ｍ）、２５８（ｗ）、２０７（ｗ）、１０１（ｓ）、８７（ｓ）ｃｍ−１．
多形Ａは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水溶液を凍結乾燥するか、または水除去することによって得ることができる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ａは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を周囲温度で水に溶解し、（１）溶液を凝固するために溶液を低温に冷却し、減圧下で水を除去するか、または（２）前記水溶液から水を除去することによって調製することができる。
【０１０８】
結晶形態Ａは、濾過によって単離し、次いで乾燥して、吸収された水を生成物から蒸発させることができる。乾燥条件およびその方法は知られており、単離生成物の乾燥または本明細書に記載の変形（２）に従う水除去は、真空下で、例えば最大８０℃、好ましくは３０℃〜８０℃の範囲の高温を適用するか、または高温および真空状態を適用して実施することができる。変形（２）で得られる沈殿物の単離の前に、相の平衡化のために、懸濁液を一定期間撹拌することができる。水溶液中の（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃度は、溶液に対して５〜４０重量パーセントであってよい。
【０１０９】
急速冷却は、出発材料としての固溶液を得るのに好ましい。溶媒が完全に除去されるまで、減圧が適用される。凍結乾燥は、当技術分野で周知の技術である。溶媒除去を完了するための時間は、０．０１〜１ｍｂａｒで適用され得る真空状態、使用される溶媒、および凍結温度に依存して決まる。
【０１１０】
多形Ａは、室温または室温未満において実質的に水が存在しない条件下で安定であり、それは窒素下の室温で５日間と１８時間、それぞれ撹拌したテトラヒドロフランまたは第３ブチルメチルエーテル中懸濁液の相の平衡化試験で実証される。濾過および室温での空気乾燥によって、未変化の多形Ａが産出される。
【０１１１】
多形Ｆ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｆ」または「多形Ｆ」と呼ぶものとする。多形Ｆはわずかに吸湿性であり、約３重量パーセントの含有量まで水を吸着し、それを１０℃／分の速度で加熱して５０℃〜２００℃で連続的に放出する。多形Ｆは、準安定形態および吸湿性無水物であり、低い周囲温度では形態Ａよりも安定であり、高温では形態Ｂよりも不安定であり、形態Ｆは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｆは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１１２】
多形Ｆは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１７．１（ｖｓ．）、１２．１（ｗ）、８．６（ｗ）、７．０（ｗ）、６．５（ｗ）、６．４（ｗ）、５．９２（ｗ）、５．７２（ｗ）、５．１１（ｗ）、４．９２（ｍ）、４．８６（ｗ）、４．６８（ｍ）、４．４１（ｗ）、４．１２（ｗ）、３．８８（ｗ）、３．８３（ｗ）、３．７０（ｍ）、３．６４（ｗ）、３．５５（ｍ）、３．４９（ｓ）、３．４６（ｖｓ）、３．３９（ｓ）、３．３３（ｍ）、３．３１（ｍ）、３．２７（ｍ）、３．２１（ｍ）、３．１９（ｍ）、３．０９（ｍ）、３．０２（ｍ）、および２．９６（ｍ）。図８は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｆによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１１３】
多形Ｆは、前記低エネルギー形態をほとんど溶解しない適切な極性の非水性溶媒、特にメタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールなどのアルコール中の多形Ａの懸濁液の相を平衡化することによって得ることができる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｆは、室温未満では（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をほとんど溶解しない非水性溶媒中に、前記（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の固体形態Ａの粒子を分散し、多形Ｆを生成するのに十分な時間をかけて前記温度でその懸濁液を撹拌し、その後結晶形態Ｆを単離し、単離形態Ｆから溶媒を除去することによって調製することもできる。溶媒の除去および乾燥は、大気下、乾燥下、または窒素ガスもしくは希ガスなどの乾燥保護ガスの下、室温以下で、例えば０℃に下げて実施することができる。相の平衡化中の温度は、好ましくは５〜１５℃であり、最も好ましくは約１０℃である。
【０１１４】
多形Ｊ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｊ」または「多形Ｊ」と呼ぶものとする。多形Ｊはわずかに吸湿性であり、空気湿度で取り扱う場合、水を吸着する。多形Ｊは、準安定形態および吸湿性無水物であり、相対湿度７５％超などの高い相対湿度条件に曝露してそれから得られる下記の形態Ｅに逆変換することができる。形態Ｊは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｊは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１１５】
形態Ｊは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１４．６（ｍ）、６．６（ｗ）、６．４（ｗ）、５．４７（ｗ）、４．８４（ｗ）、３．２９（ｖｓ）、および３．２１（ｖｓ）。図９は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｊによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１１６】
多形Ｊは、真空下、中程度の温度で形態Ｅを脱水することによって得ることができる。特に（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｊは、形態Ｅを取り出し、真空乾燥機中で形態Ｅを処理することによって形態Ｅから水を除去して、中程度の温度で形態Ｊを得ることによって調製することができる。中程度の温度とは、２５〜７０℃の範囲、最も好ましくは３０〜５０℃の範囲の温度を意味し得る。
【０１１７】
多形Ｋ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の結晶多形は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｋ」または「多形Ｋ」と呼ぶものとする。多形Ｋはわずかに吸湿性であり、約２．０重量パーセントの含有量まで水を吸着し、それを１０℃／分の速度で加熱して５０℃〜１００℃で連続的に放出する。多形Ｋは、準安定形態および吸湿性無水物であり、高温では形態Ｂよりも不安定であり、形態Ｋは、安定な多形、特に形態Ｂを生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｋは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１１８】
形態Ｋは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１４．０（ｓ）、９．４（ｗ）、６．６（ｗ）、６．４（ｗ）、６．３（ｗ）、６．１（ｗ）、６．０（ｗ）、５．６６（ｗ）、５．３３（ｗ）、５．１３（ｖｗ）、４．７３（ｍ）、４．６４（ｍ）、４．４８（ｗ）、４．３２（ｖｗ）、４．２２（ｗ）、４．０８（ｗ）、３．８８（ｗ）、３．７９（ｗ）、３．５４（ｍ）、３．４９（ｖｓ）、３．３９（ｍ）、３．３３（ｖｓ）、３．１３（ｓ）、３．１０（ｍ）、３．０５（ｍ）、３．０１（ｍ）、２．９９（ｍ）、および２．９０（ｍ）。図１０は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の形態Ｋによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１１９】
多形Ｋは、少量の水を含有する極性溶媒の混合物から、少量のアスコルビン酸の存在下で結晶化することによって得ることができる。溶媒混合物用の溶媒は、酢酸およびメタノール、エタノール、ｎ−、またはイソプロパノールなどのアルコールから選択することができる。特に、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｋは、少量の水および少量のアスコルビン酸を含有する酢酸およびアルコールまたはテトラヒドロフランの混合物に、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を高温で溶解し、室温未満の温度に下げて前記二塩酸塩を結晶化し、沈殿物を単離し、単離沈殿物を任意選択で真空下にて、高温で乾燥することによって調製することができる。適切なアルコールは、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールであるが、エタノールが好ましい。酢酸対アルコールまたはテトラヒドロフランの比は、２：１〜１：２であってよく、好ましくは約１：１である。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶解は、高い含水量の存在下で実施することができ、より多量の貧溶媒（ａｎｔｉ−ｓｏｌｖｅｎｔ）混合物を添加して、完全な沈殿を得ることができる。最終組成物の含水量は、溶媒混合物に対して０．５〜５重量パーセントであってよく、アスコルビン酸の量は、溶媒混合物に対して０．０１〜０．５重量パーセントであってよい。溶解のための温度は３０〜１００℃の範囲であってよく、好ましくは３５〜７０℃であり、乾燥温度は３０〜５０℃の範囲であってよい。沈殿物は、単離後、例えば濾過後にエタノールなどのアルコールで洗浄することができる。多形Ｋは、例えばイソプロパノール中で相を平衡化し、任意選択で３０〜４０℃などの室温を超える温度で形態Ｂの結晶を播種することによって、最も安定な形態Ｂに容易に変換することができる。
【０１２０】
（６Ｒ）Ｌ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態
以下でさらに述べるように、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩は、幾つかの結晶性水和物として存在することが見出され、本明細書ではこれを形態Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、およびＯと記載し定義するものとする。これらの水和形態は、本明細書に記載の医薬調製物のためのＢＨ４の安定な形態として、ＢＨ４の安定な結晶多形を含む組成物の調製において有用である。
【０１２１】
水和形態Ｃ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｃ」または「水和物Ｃ」と呼ぶものとする。水和形態Ｃはわずかに吸湿性であり、約５．５重量パーセントの含水量を有しており、このことは形態Ｃが一水和物であることを示している。水和物Ｃは、約９４℃（ΔＨｆは約３１Ｊ／ｇ）の融点を有し、水和形態Ｃは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｃは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１２２】
形態Ｃは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１８．２（ｍ）、１５．４（ｗ）、１３．９（ｖｓ）、１０．４（ｗ）、９．６（ｗ）、９．１（ｗ）、８．８（ｍ）、８．２（ｗ）、８．０（ｗ）、６．８（ｍ）、６．５（ｗ）、６．０５（ｍ）、５．７７（ｗ）、５．６４（ｗ）、５．４４（ｗ）、５．１９（ｗ）、４．８９（ｗ）、４．７６（ｗ）、４．７０（ｗ）、４．４１（ｗ）、４．２５（ｍ）、４．００（ｍ）、３．８８（ｍ）、３．８０（ｍ）、３．５９（ｓ）、３．５０（ｍ）、３．４４（ｍ）、３．３７（ｍ）、３．２６（ｓ）、３．１９（ｖｓ）、３．１７（ｓ）、３．１１（ｍ）、３．０６（ｍ）、３．０２（ｍ）、２．９７（ｖｓ）、２．９３（ｍ）、２．８９（ｍ）、２．８３（ｍ）、および２．４３（ｍ）。図１１は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｃによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１２３】
水和形態Ｃは、溶媒に対して好ましくは約５重量パーセントの量の水を含有する非溶媒中の多形Ｂなどの多形の懸濁液の相を周囲温度で平衡化することによって得ることができる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｃは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を非溶媒に、例えばヘプタン、メタノール、エタノール、１−もしくは２−プロパノールなどのＣ１〜Ｃ４−アルコール、酢酸エチルなどの酢酸塩、アセトニトリル、酢酸もしくはテトラヒドロフランなどのエーテル、ジオキサン、第３ブチルメチルエーテル、またはかかる非溶媒の二元もしくは三元混合物に懸濁し、それに十分な水を添加して一水和物を形成し、一水和物を形成するのに十分な時間をかけて周囲温度以下（例えば０〜３０℃）で懸濁液を撹拌することによって調製することができる。十分な水とは、溶媒の量に対して１〜１０重量パーセント、好ましくは３〜８重量パーセントの水を意味し得る。固体は濾別し、大気下でおよそ室温にて乾燥することができる。固体は幾らかの水を吸収し、したがって５．５重量パーセントの理論値よりも多い含水量を有することがある。水和形態Ｃは、形態ＤおよびＢに対して不安定であり、大気下および相対的な低湿度の下、約４０℃の温度で多形Ｂに容易に変換される。形態Ｃは、室温で懸濁液を平衡化することによって、より安定な水和物Ｄに変換することができる。
【０１２４】
水和形態Ｄ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｄ」または「水和物Ｄ」と呼ぶものとする。水和形態Ｄはわずかに吸湿性であり、約５．０〜７．０重量パーセントの含水量を有することができ、このことは形態Ｄが一水和物であることを示している。水和物Ｄは、約１５３℃（ΔＨｆは約１１１Ｊ／ｇ）の融点を有し、形態Ｃよりもかなり安定であり、周囲温度で空気湿度に曝露される場合にも安定である。したがって水和形態Ｄは、製剤を調製するために使用することができ、または安定な多形を生成するための中間体および出発材料として使用することもできる。多形Ｄは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１２５】
形態Ｄは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。８．６（ｓ）、６．８（ｗ）、５．５６（ｍ）、４．９９（ｍ）、４．６７（ｓ）、４．３２（ｍ）、３．９３（ｖｓ）、３．８８（ｗ）、３．６４（ｗ）、３．４１（ｗ）、３．２５（ｗ）、３．１７（ｍ）、３．０５（ｓ）、２．９４（ｗ）、２．９２（ｗ）、２．８８（ｍ）、２．８５（ｗ）、２．８０（ｗ）、２．７９（ｍ）、２．６８（ｗ）、２．６５（ｗ）、２．５２（ｖｗ）、２．３５（ｗ）、２．３４（ｗ）、２．３０（ｗ）、および２．２９（ｗ）。図１２は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｄによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１２６】
水和形態Ｄは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を、過剰の非溶媒、例えばヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、１−もしくは２−プロパノール、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、第３ブチルメチルエーテルなどの他のもの、またはかかる非溶媒の混合物におよそ室温で添加し、その懸濁液を周囲温度で撹拌することによって得ることができる。結晶固体は濾別し、次いで乾燥窒素下、周囲温度で乾燥することができる。好ましい非溶媒はイソプロパノールである。水溶液の添加は、急速な沈殿を回避するために滴加で実施することができる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｄは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を、過剰の非溶媒におよそ室温で添加し、その懸濁液を周囲温度で撹拌することによって調製することができる。過剰の非溶媒とは、水対非溶媒の比が１：１０〜１：１０００であることを意味し得る。形態Ｄは、一水和物に関連する小過剰の水を含有しており、この結晶性水和物のわずかな吸湿性に起因して水を吸収すると考えられる。水和形態Ｄは、周囲温度および７０％未満の相対湿度で、既知の水和物の中で最も安定なものと思われる。水和形態Ｄは、この水和物が安定な条件下で調製される製剤に使用することができる。周囲温度とは２０〜３０℃を意味し得る。
【０１２７】
水和形態Ｅ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｅ」または「水和物Ｅ」と呼ぶものとする。水和形態Ｅは、約１０〜１４重量パーセントの含水量を有し、そのことは形態Ｅが二水和物であることを示している。水和物Ｅは室温未満の温度で形成される。水和形態Ｅは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。水和物Ｅは、窒素下または任意選択により真空下で、乾燥によって非含水形態Ｊを生成するのに特に適している。形態Ｅは非吸湿性であり、かなり高い相対湿度の下、即ち約６０％を超え最大約８５％の相対湿度で安定である。多形Ｅは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１２８】
形態Ｅは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１５．４（ｓ）、６．６（ｗ）、６．５（ｗ）、５．９５（ｖｗ）、５．６１（ｖｗ）、５．４８（ｗ）、５．２４（ｗ）、４．８７（ｗ）、４．５０（ｖｗ）、４．２７（ｗ）、３．９４（ｗ）、３．７８（ｗ）、３．６９（ｍ）、３．６０（ｗ）、３．３３（ｓ）、３．２６（ｖｓ）、３．１６（ｗ）、３．０８（ｍ）、２．９８（ｗ）、２．９５（ｍ）、２．９１（ｗ）、２．８７（ｍ）、２．７９（ｗ）、２．７４（ｗ）、２．６９（ｗ）、および２．６２（ｗ）。図１３は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｅによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１２９】
水和形態Ｅは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を、約１０〜−１０℃、好ましくは０〜１０℃の温度に冷却した過剰の非溶媒に添加し、その懸濁液を前記温度で撹拌することによって得ることができる。結晶固体は濾別し、次いで乾燥窒素下、周囲温度で乾燥することができる。非溶媒は、例えばヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、１−もしくは２−プロパノール、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、第３ブチルメチルエーテルなどの他のもの、またはかかる非溶媒の混合物などである。好ましい非溶媒はイソプロパノールである。水溶液の添加は、急速な沈殿を回避するために滴加で実施することができる。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｅは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の濃縮水溶液を過剰の非溶媒に添加し、それを約１０〜−１０℃の温度に冷却し、その懸濁液を周囲温度で撹拌することによって調製することができる。過剰の非溶媒とは、水対非溶媒の比が１：１０〜１：１０００であることを意味し得る。好ましい非溶媒はテトラヒドロフランである。別の調製プロセスは、多形Ｂを相対湿度７０〜９０％、好ましくは約８０％の空気雰囲気に曝露することを含む。水和形態Ｅは二水和物であると思われ、幾らかの追加の水が吸収され得る。多形Ｅは、真空下０〜１００ｍｂａｒの圧力で、２０℃〜５０℃を意味し得る中程度の温度で、乾燥によって多形Ｊに変換することができる。形態Ｅは、高い相対湿度でのその安定性が理由となり、半固体形態の製剤に特に適している。
【０１３０】
水和形態Ｈ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｈ」または「水和物Ｈ」と呼ぶものとする。水和形態Ｈは、約５．０〜７．０重量パーセントの含水量を有し、そのことは形態Ｈが吸湿性一水和物であることを示している。水和形態Ｈは室温未満の温度で形成される。水和形態Ｈは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｈは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１３１】
形態Ｈは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。８．６  １５．８（ｖｓ）、１０．３（ｗ）、８．０（ｗ）、６．６（ｗ）、６．０７（ｗ）、４．８１（ｗ）、４．３０（ｗ）、３．８７（ｍ）、３．６０（ｍ）、３．２７（ｍ）、３．２１（ｍ）、３．１３（ｗ）、３．０５（ｗ）、２．９６（ｍ）、２．８９（ｍ）、２．８２（ｗ）、および２．６７（ｍ）。図１４は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｈによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１３２】
水和形態Ｈは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を、酢酸および水の混合物に周囲温度で溶解し、次いで非溶媒を添加して結晶固体を沈殿させ、得られた懸濁液を冷却し、冷却した懸濁液を一定期間撹拌することによって得ることができる。結晶固体を濾別し、次いで真空下、周囲温度で乾燥する。非溶媒は、例えばヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、１−もしくは２−プロパノール、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリル、酢酸、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン、第３ブチルメチルエーテルなどの他のもの、またはかかる非溶媒の混合物などである。好ましい非溶媒はテトラヒドロフランである。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｈは、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を、酢酸と酢酸よりも少量の水との混合物に周囲温度で溶解し、非溶媒を添加し、得られた懸濁液を−１０〜１０℃、好ましくは−５〜５℃の範囲の温度に冷却し、懸濁液を前記温度で一定期間撹拌することによって調製することができる。一定期間とは１〜２０時間を意味し得る。酢酸と水との重量比は２：１〜２５：１、好ましくは５：１〜１５：１であってよい。酢酸／水と非溶媒との重量比は１：２〜１：５であってよい。水和形態Ｈは、その吸湿性に起因して、吸収されたわずかな過剰の水を含む一水和物であると思われる。
【０１３３】
水和形態Ｏ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の水和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｏ」または「水和物Ｏ」と呼ぶものとする。水和形態Ｏは、およそ室温の温度で形成される。水和形態Ｏは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｏは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１３４】
形態Ｏは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１５．９（ｗ）、１４．０（ｗ）、１２．０（ｗ）、８．８（ｍ）、７．０（ｗ）、６．５（ｗ）、６．３（ｍ）、６．００（ｗ）、５．７５（ｗ）、５．６５（ｍ）、５．０６（ｍ）、４．９８（ｍ）、４．９２（ｍ）、４．８４（ｗ）、４．７７（ｗ）、４．４２（ｗ）、４．３３（ｗ）、４．００（ｍ）、３．８８（ｍ）、３．７８（ｗ）、３．６９（ｓ）、３．６４（ｓ）、３．５２（ｖｓ）、３．４９（ｓ）、３．４６（ｓ）、３．４２（ｓ）、３．３２（ｍ）、３．２７（ｍ）、３．２３（ｓ）、３．１８（ｓ）、３．１５（ｖｓ）、３．１２（ｍ）、３．０４（ｖｓ）、２．９５（ｍ）、２．８１（ｓ）、２．７２（ｍ）、２．６７（ｍ）、および２．６１（ｍ）。図１５は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の水和形態Ｏによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１３５】
水和形態Ｏは、得られる相対湿度が約５２％となる水蒸気を含む窒素雰囲気に、多形Ｆを約２４時間曝露することによって調製することができる。わずかに吸湿性無水物の形態Ｆを使用して、相対湿度５２％の下で形態Ｏを調製できるということは、形態Ｏが水和物であり、周囲温度および湿度条件下で形態Ｆよりも安定であることを示している。
【０１３６】
（６Ｒ）Ｌ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和形態
以下でさらに述べるように、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩は、幾つかの結晶溶媒和形態として存在することが見出され、本明細書ではこれを形態Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、およびＮと記載し定義するものとする。これらの溶媒和形態は、本明細書に記載の医薬組成物のためのＢＨ４の安定形態として、ＢＨ４の安定な結晶多形を含む組成物の調製において有用である。
【０１３７】
溶媒和形態Ｇ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩のエタノール溶媒和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｇ」または「水和物Ｇ」と呼ぶものとする。エタノール溶媒和形態Ｇは、約８．０〜１２．５重量パーセントのエタノール含量を有しており、このことは形態Ｇが吸湿性のモノエタノール溶媒和物であることを示している。溶媒和形態Ｇは室温未満の温度で形成される。形態Ｇは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｇは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１３８】
形態Ｇは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１４．５（ｖｓ）、１０．９（ｗ）、９．８（ｗ）、７．０（ｗ）、６．３（ｗ）、５．７４（ｗ）、５．２４（ｖｗ）、５．０４（ｖｗ）、４．７９（ｗ）、４．４１（ｗ）、４．０２（ｗ）、３．８６（ｗ）、３．７７（ｗ）、３．６９（ｗ）、３．６３（ｍ）、３．５７（ｍ）、３．４９（ｍ）、３．４１（ｍ）、３．２６（ｍ）、３．１７（ｍ）、３．０７（ｍ）、２．９７（ｍ）、２．９５（ｍ）、２．８７（ｗ）、および２．６１（ｗ）。図１６は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和形態Ｇによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１３９】
エタノール溶媒和形態Ｇは、水に溶解したＬ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を結晶化し、大過剰のエタノールを添加し、得られた懸濁液を周囲温度以下で撹拌し、単離固体を、空気または窒素下、およそ室温で乾燥することによって得ることができる。ここで大過剰のエタノールとは、水を１０％未満、好ましくは約３〜６％を含む、エタノールおよび水の生成混合物を意味する。（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩のエタノール付加形態Ｇは、およそ室温から７５℃の温度で（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を水または水とエタノールの混合物に溶解し、加熱した溶液を室温に冷却し、５〜１０℃に冷却し、完全な沈殿のために任意選択でエタノールを添加し、得られた懸濁液を２０〜５℃の温度で撹拌し、白色結晶固体を濾別し、その固体を空気下または窒素などの保護ガスの下、およそ室温の温度で乾燥することによって調製することができる。このプロセスは、およそ室温で（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を少量の水に溶解し、次いで過剰のエタノールを添加し、次いで相の平衡化のために十分な時間をかけて、得られた懸濁液を撹拌する、第１の変形で実施することができる。第２の変形では、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をエタノールに懸濁し、任意選択で少量の水を添加し、その懸濁液を加熱し（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を溶解し、その溶液を約５〜１５℃の温度に冷却し、追加のエタノールを懸濁液に添加し、次いで相の平衡化のために十分な時間をかけて、得られた懸濁液を撹拌することができる。
【０１４０】
溶媒和形態Ｉ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の酢酸溶媒和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｉ」または「水和物Ｉ」と呼ぶものとする。酢酸溶媒和形態Ｉは、約１２．７重量パーセントの酢酸含量を有しており、このことは形態Ｉが吸湿性酢酸一溶媒和物であることを示している。溶媒和形態Ｉは室温未満の温度で形成される。酢酸溶媒和形態Ｉは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｉは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１４１】
形態Ｉは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１４．５（ｍ）、１４．０（ｗ）、１１．０（ｗ）、７．０（ｖｗ）、６．９（ｖｗ）、６．２（ｖｗ）、５．３０（ｗ）、４．７９（ｗ）、４．４４（ｗ）、４．２９（ｗ）、４．２０（ｖｗ）、４．０２（ｗ）、３．８４（ｗ）、３．８０（ｗ）、３．６７（ｖｓ）、３．６１（ｍ）、３．５６（ｗ）、３．４４（ｍ）、３．２７（ｗ）、３．１９（ｗ）、３．１１（ｓ）、３．００（ｍ）、２．９４（ｗ）、２．８７（ｗ）、および２．８０（ｗ）。図１７は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和形態Ｉによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１４２】
酢酸溶媒和形態Ｉは、Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を酢酸および水の混合物に高温で溶解し、さらなる酢酸を溶液に添加し、約１０℃の温度に冷却し、次いで形成した懸濁液を約１５℃に温め、次いで相の平衡化のために十分な時間をかけて、得られた懸濁液を撹拌することによって得ることができるが、その撹拌は最長３日間続くことがある。次いで結晶固体を濾別し、空気下または窒素などの保護ガスの下、およそ室温の温度で乾燥する。
【０１４３】
溶媒和形態Ｌ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩のエタノール溶媒和物／水和物の混合結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｌ」または「水和物Ｌ」と呼ぶものとする。形態Ｌは、４％から最大１３％のエタノールおよび０％〜約６％の水を含有することができる。形態Ｌは、エタノール中、約０℃〜２０℃の温度で処理される場合、形態Ｇに変換することができる。さらに形態Ｌは、有機溶媒中、周囲温度（１０℃〜６０℃）で処理される場合、形態Ｂに変換することができる。多形Ｌは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１４４】
形態Ｌは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１４．１（ｖｓ）、１０．４（ｗ）、９．５（ｗ）、９．０（ｖｗ）、６．９（ｗ）、６．５（ｗ）、６．１（ｗ）、５．７５（ｗ）、５．６１（ｗ）、５．０８（ｗ）、４．７１（ｗ）、３．８６（ｗ）、３．７８（ｗ）、３．４６（ｍ）、３．３６（ｍ）、３．０６（ｗ）、２．９０（ｗ）、および２．８２（ｗ）。図１８は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和形態Ｌによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１４５】
形態Ｌは、水和形態Ｅをエタノールに室温で懸濁し、相の平衡化のために１０〜２０時間という十分な時間をかけてその懸濁液を０〜１０℃、好ましくは約５℃の温度で撹拌することによって得ることができる。次いで結晶固体を濾別し、好ましくは３０℃の減圧下または窒素下で乾燥する。ＴＧ−ＦＴＩＲによる分析は、形態Ｌが不定量のエタノールおよび水を含有できること、即ち形態Ｌが多形（無水物）として、混合エタノール溶媒和物／水和物として、または水和物としても存在し得ることを示している。
【０１４６】
溶媒和形態Ｍ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩のエタノール溶媒和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｍ」または「水和物Ｍ」と呼ぶものとする。形態Ｍは、４％から最大１３％のエタノールおよび０％〜約６％の水を含有することができ、このことは形態Ｍがわずかに吸湿性のエタノール溶媒和物であることを示している。溶媒和形態Ｍは室温で形成される。形態Ｍは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。というのは、形態Ｍがエタノール中、約−１０°〜１５℃の温度で処理される場合には形態Ｇに変換され、エタノール、Ｃ３およびＣ４アルコール、またはＴＨＦおよびジオキサンといった環式エーテルなどの有機溶媒中で処理される場合には形態Ｂに変換され得るからである。多形Ｍは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１４７】
形態Ｍは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１８．９（ｓ）、６．４（ｍ）、６．０６（ｗ）、５．６６（ｗ）、５．２８（ｗ）、４．５０（ｗ）、４．２３（ｗ）、および３．２２（ｖｓ）。図１９は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和形態Ｍによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１４８】
エタノール溶媒和形態Ｍは、Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩をエタノールに溶解し、その溶液を窒素下の周囲温度で、即ち１０℃〜４０℃で蒸発させることによって得ることができる。形態Ｍは、速度約２０〜１００ｍｌ／分の少量の乾燥窒素流の下で形態Ｇを乾燥することによって得ることもできる。窒素下の乾燥度に依存してエタノールの残量は変わり、即ち約３％〜１３％となり得る。
【０１４９】
溶媒和形態Ｎ
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の別の溶媒和結晶形態は、本明細書に記載の医薬調製物に使用するためのＢＨ４の安定な好ましい形態であることが見出され、本明細書ではこれを「形態Ｎ」または「水和物Ｎ」と呼ぶものとする。形態Ｎは、イソプロパノールを合計最大１０％と水を含有することができ、このことは形態Ｎがわずかに吸湿性のイソプロパノール溶媒和物であることを示している。形態Ｎは、形態Ｄをイソプロパノールで洗浄し、その後真空下約３０℃で乾燥することによって得ることができる。形態Ｎは、安定な多形を生成するための中間体および出発材料として特に適している。多形Ｎは、一般に１μｍ〜約５００μｍの範囲の中程度の所望の粒経範囲を有する固体粉末として調製することができる。
【０１５０】
形態Ｎは、以下のｄ値（Å）で表される特徴的なピークを有する特徴的なＸ線粉末回折パターンを示す。１９．５（ｍ）、９．９（ｗ）、６．７（ｗ）、５．１５（ｗ）、４．８３（ｗ）、３．９１（ｗ）、３．５６（ｍ）、３．３３（ｖｓ）、３．１５（ｗ）、２．８９（ｗ）、２．８１（ｗ）、２．５６（ｗ）、および２．３６（ｗ）。図２０は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の溶媒和形態Ｎによって示される特徴的なＸ線回折パターンのグラフである。
【０１５１】
イソプロパノール形態Ｎは、Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩を、イソプロパノールおよび水の混合物（例えば４：１の体積比で混合する）４．０ｍｌに溶解することによって得ることができる。この溶液に、イソプロパノール（ＩＰＡ、例えば約４．０ｍｌ）をゆっくり添加し、得られた懸濁液を０℃に冷却し、この温度で数時間（例えば約１０〜１８時間）撹拌する。この懸濁液を濾過し、固体残渣をイソプロパノールで室温にて洗浄する。次いで、得られた結晶材料を周囲温度（例えば約２０〜３０℃）および減圧下（約２〜１０ｍｂａｒ）で数時間（例えば約５〜２０時間）乾燥する。ＴＧ−ＦＴＩＲによって、２５〜２００℃で９．０％の重量喪失が示されるが、これはイソプロパノールおよび水の両方に帰するものである。この結果は、形態Ｎがイソプロパノール溶媒和物の形態または混合イソプロパノール溶媒和物／水和物の形態で、あるいは少量の水を含有する非溶媒和形態として存在できることを示している。
【０１５２】
多形の調製については、懸濁液の撹拌（相の平衡化）、沈殿、再結晶化、蒸発、溶媒様水分収着法、または溶媒和物の分解などの当技術分野で周知の結晶技術を使用することができる。希釈した飽和または過飽和の溶液を、適切な核形成剤を用いた播種での結晶化、またはそれなしの結晶化に使用することができる。最大１００℃の温度を適用して、溶液を形成することができる。結晶化および沈殿を開始するために、−１００℃、好ましくはマイナス３０℃に冷却することができる。準安定多形または疑似多形を使用して、より安定な形態の調製のための溶液または懸濁液を調製し、溶液濃度をより高めることができる。
【０１５３】
驚くべきことに、水和形態Ｄは水和物の中で最も安定な形態であり、形態ＢおよびＤは製剤に使用するのに特に適していることが見出された。形態ＢおよびＤは、目的とする製造、好都合な結晶寸法および形態に起因する良好な取扱い、様々なタイプの製剤の生成条件下での非常に良好な安定性、保存安定性、高い可溶性、および高い生体利用能などの幾つかの利点を提供する。したがって、本明細書に開示の組成物および方法の一実施形態は、（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の多形Ｂおよび／または水和形態Ｄならびに医薬として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物である。
【０１５４】
（６Ｒ）−Ｌ−エリスロ−テトラヒドロビオプテリン二塩酸塩の結晶形態は、葉酸もしくはテトラヒドロ葉酸、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはアンモニウム塩などのその医薬として許容可能な塩のそれぞれ単独と一緒に、またはさらにアルギニンと一緒に使用することができる。結晶形態：葉酸またはその塩：アルギニンの重量比は、約１：１０：１０〜約１０：１：１であってよい。
【０１５５】
本発明は、本明細書に記載のテトラヒドロビオプテリン多形のいずれか、またはかかる多形のいずれかを含む安定な医薬組成物を、内皮機能不全に関連する状態の治療のために使用する方法を提供する。葉酸塩前駆体、葉酸、または葉酸塩誘導体を含む葉酸塩との併用治療も企図されており、テトラヒドロビオプテリンまたはＢＨ４前駆体もしくはＢＨ４誘導体と葉酸塩の両方を含む医薬組成物または食品を用いる治療も同様に企図される。例示的な葉酸塩は、共に参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１１，０４０号および第６，５４４，９９４号に開示されており、それには葉酸（プテロイルモノグルタミン酸）、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、５−メチルテトラヒドロ葉酸、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸、５，１０−ホルムイミノテトラヒドロ葉酸、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸（ロイコボリン）、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、１０−メチルテトラヒドロ葉酸、１つもしくは複数の葉酸ポリグルタミン酸、葉酸のプテリン部分もしくは葉酸ポリグルタミン酸のピラジン環が還元されてジヒドロ葉酸塩もしくはテトラヒドロ葉酸塩を与える化合物、またはＮ−５もしくはＮ−１０位が、酸化の様々なレベルで１つの炭素単位を担持する前記化合物全ての誘導体、またはそれらの医薬として相溶性のある塩、またはそれらの２つ以上の組合せが含まれる。例示的なテトラヒドロ葉酸塩には、５−ホルミル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５−メチル−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、５，１０−メチレン−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５，１０−メテニル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−（６Ｒ）−テトラヒドロ葉酸、５−ホルムイミノ−（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、または（６Ｓ）−テトラヒドロ葉酸、およびその塩が含まれる。
【０１５６】
４．製剤
本明細書に記載の製剤は、好ましくは経口製剤として投与される。経口製剤は、好ましくはカプセル剤、錠剤、ピル剤、およびトローチ剤などの固体製剤、または水性懸濁剤、エリキシル剤、およびシロップ剤などの液体製剤である。本明細書に記載のＢＨ４の様々な形態は、粉剤（微粒子）、顆粒剤、懸濁剤、もしくは溶剤として直接使用することができ、あるいは他の医薬として許容可能な成分と組み合わせて成分を混合し、任意選択でそれらを微粉砕し、次いで例えば硬質もしくは軟質ゼラチンから構成されるカプセルに充填するか、錠剤、ピル剤、もしくはトローチ剤に圧縮するか、または懸濁剤、エリキシル剤、およびシロップ剤用の担体にそれらを溶解することができる。コーティングは、ピル剤を形成するための圧縮後に適用することができる。
【０１５７】
医薬として許容可能な成分は、様々なタイプの製剤について周知であり、様々な製剤のタイプに合わせた、例えば天然または合成ポリマーなどの結合剤、賦形剤、潤滑剤、界面活性剤、甘味剤および矯味剤、コーティング材料、保存剤、色素、増粘剤、助剤、抗菌剤、抗酸化物質、および担体であってよい。本明細書に記載の組成物に有用な結合剤の非限定的例には、ガムトラガカント、アカシア、デンプン、ゼラチン、および生分解性ポリマー、例えばジカルボン酸、アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、および／または脂肪族ヒドロキシカルボン酸のホモまたはコポリエステル；ジカルボン酸、アルキレンジアミン、および／または脂肪族アミノカルボン酸のホモまたはコポリアミド；対応するポリエステル−ポリアミド−コポリマー、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、およびポリカーボネートが含まれる。生分解性ポリマーは、直鎖、分岐、または架橋であってよい。幾つかの例は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびポリ−ｄ，ｌ−ラクチド／グリコリドである。ポリマーの他の例は、水溶性ポリマー、例えばポリオキサアルキレン（ポリオキサエチレン、ポリオキサプロピレン、およびそれらの混合ポリマー、ポリアクリルアミドおよびヒドロキシルアルキル化ポリアクリルアミド、ポリマレイン酸およびそのエステルまたはアミド、ポリアクリル酸およびそのエステルまたはアミド、ポリビニルアルコールおよびそのエステルまたはエーテル、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピロリドン、ならびにキトサンなどの天然ポリマーである。
【０１５８】
本明細書に記載の組成物に有用な賦形剤の非限定的な例には、第２リン酸カルシウムなどのリン酸塩が含まれる。本明細書に記載の組成物に使用される潤滑剤の非限定的例には、天然または合成油、脂肪、ワックス、またはステアリン酸マグネシウムなどの脂肪酸塩が含まれる。
【０１５９】
本明細書に記載の組成物に使用するための界面活性剤は、アニオン性、アニオン性、両性、または中性であってよい。本明細書に記載の組成物に有用な界面活性剤の非限定的な例には、レシチン、リン脂質、硫酸オクチル、硫酸デシル、硫酸ドデシル、硫酸テトラデシル、硫酸ヘキサデシル、および硫酸オクタデシル、オレイン酸Ｎａ、またはカプリン酸Ｎａ、１−アシルアミノエタン−２−スルホン酸、例えば１−オクタノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−デカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−ドデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−テトラデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、１−ヘキサデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、および１−オクタデカノイルアミノエタン−２−スルホン酸、ならびにタウロコール酸およびタウロデオキシコール酸、胆汁酸およびそれらの塩、例えばコール酸、デオキシコール酸、およびグリココール酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、塩酸化ヒマシ油およびジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、コカミドプロピルベタインおよびラウリルベタイン、脂肪アルコール、コレステロール、グリセロールモノまたはジステアリン酸、グリセロールモノまたはジオレイン酸およびグリセロールモノまたはジパルミチン酸、ならびにステアリン酸ポリオキシエチレンが含まれる。
【０１６０】
本明細書に記載の組成物に有用な甘味剤の非限定的な例には、スクロース、フルクトース、ラクトース、またはアスパルテームが含まれる。本明細書に記載の組成物に使用するための嬌味剤の非限定的な例には、ペパーミント、冬緑樹の油またはチェリーもしくはオレンジ風味などの果実の風味が含まれる。本明細書に記載の組成物に使用するためのコーティング材料の非限定的な例には、ゼラチン、ワックス、セラック、糖類、または他の生分解性ポリマーが含まれる。本明細書に記載の組成物に使用するための保存剤の非限定的例には、メチルまたはプロピルパラベン、ソルビン酸、クロロブタノール、フェノール、およびチメロサールが含まれる。
【０１６１】
本明細書に記載の水和形態Ｄは、飲料用溶液を提供するために水性環境下で崩壊する、発泡性の錠剤または粉剤として配合することもできる。シロップ剤またはエリキシル剤は、本明細書に記載の多形、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、メチルパラベンのような保存剤、色素、および嬌味剤を含有することができる。
【０１６２】
消化管の体液と接触する活性薬剤の制御放出を実現し、血漿中の活性な薬剤の実質的に不変で効果的なレベルを提供するために、本明細書に記載の多形から徐放製剤を調製することもできる。本目的では、結晶形態は、生分解性ポリマー、水溶性ポリマー、またはその両方の混合物、および任意選択で適切な界面活性剤のポリマーマトリックスに埋め込むことができる。この状況における埋込みとは、ポリマーのマトリックスへの微粒子の組込みを意味し得る。制御放出製剤は、既知の分散または乳化コーティング技術を介して、分散微粒子または乳化微細液滴を封入することによって得ることもできる。
【０１６３】
個々の必要性は様々であるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者によってなされる。ＢＨ４の一般的用量は、１日に体重１ｋｇ当たり約１〜約２０ｍｇを含み、通常は約５（１ｍｇ／ｋｇ×体重５ｋｇ）〜３０００ｍｇ／日（３０ｍｇ／ｋｇ×体重１００ｋｇ）の量になろう。かかる用量は、単回用量で投与することができ、または多回用量に分割することもできる。継続的な連日投与が企図されると同時に、幾つかの臨床指標が改善されて特定の閾値を超える場合には、ＢＨ４療法を停止することが望ましい。当然のことながらこの療法は、臨床上の改善指標が低下するイベントでは再び開始することができる。
【０１６４】
本発明の組成物の適切な用量は、受容者の年齢、健康状態、および体重、ある種の併用療法、もしあれば治療頻度および所望の効果の性質（即ち、所望の肺動脈圧の低下量）によって決まることを理解されよう。投与の頻度は、動脈酸素圧への薬力学的効果にも依存して決まる。しかし最も好ましい用量は、当業者によって理解または決定されるように、過度の実験なしに個々の対象に合わせて調整することができる。このことには一般に、標準的な用量の調節、例えば患者が低体重である場合には用量を低減することが含まれる。
【０１６５】
上記のように、各治療に必要とされる総用量は、多回用量または単回用量で投与することができる。ＢＨ４組成物は単独で、または疾患もしくは他のその症候を対象とする他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
【０１６６】
本明細書に記載の開示から明らかなように、幅広い態様において本願は、結晶化ＢＨ４製剤を含有する組成物の臨床適用を企図する。本組成物は、適切な医薬組成物に、即ちかかる併用療法におけるｉｎ  ｖｉｖｏ適用に適した形態に配合されるべきである。これには一般に、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害となり得る他の不純物を基本的に含まない組成物を調製することが含まれよう。好ましくは、結晶化ＢＨ４組成物を含む製剤は、血管疾患の治療に直接使用できるようなものであり得る。
【０１６７】
一般には、ＢＨ４を摂取に適するようにする適切な塩および緩衝液を使用することが望ましいであろう。本発明の水性組成物は、医薬として許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散した有効量のＢＨ４を含む。かかる組成物は、経口または注入によって投与することができる。
【０１６８】
「医薬として許容可能なまたは薬理学的に許容可能な」という用語は、動物またはヒトに投与する場合に、副作用、アレルギー、または他の有害な反応をもたらさない分子の存在および組成物を指す。本明細書で使用される「医薬として許容可能な担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等が含まれる。医薬活性のある物質へのかかる媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体または薬剤が治療組成物と相溶性がない場合以外、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分も、組成物に組み込むことができる。例示的実施形態では、医薬としてのタンパク質製剤は、固形コーンシロップ、高オレイン酸ベニバナ油、カカオ脂、大豆油、Ｌ−ロイシン、リン酸三カルシウム、Ｌ−チロシン、Ｌ−プロリン、酢酸Ｌ−リシン、ＤＡＴＥＭ（乳化剤）、Ｌ−グルタミン、Ｌ−バリン、リン酸水素二カリウム、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−セリン、クエン酸カリウム、Ｌ−トレオニン、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アスパラギン酸、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、硫酸第一鉄、パルミチン酸アスコルビル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、酢酸αトコフェリル、塩化ナトリウム、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミン塩化物塩酸塩、ビタミンＡパルミテート、硫酸マンガン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、βカロテン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミンを含むことができる。補助剤中のアミノ酸、ミネラル、およびビタミンは、成分のそれぞれの１日推奨用量を実現する量で提供されるべきである。
【０１６９】
本明細書で使用される「医薬として許容可能な担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等が含まれる。医薬活性のある物質へのかかる媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体または薬剤が治療組成物と相溶性がない場合以外、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分も、組成物に組み込むことができる。
【０１７０】
本発明の活性組成物にはＢＨ４の従来の医薬調製物が含まれ、これは本明細書で論じられており、当業者にも知られているものである。本発明のこれらの組成物の投与は、食事補給のための一般的な任意の経路を介して行われよう。タンパク質は、好ましくはＢＨ４と同様に経口投与される。
【０１７１】
幾つかの実施形態では、血管疾患の治療に使用されるＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体を、吸入によって投与される吸入可能な製剤として配合することが企図される。ＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体それ自体は、エアロゾル製剤として調製することができる。吸入可能な組成物を使用して肺高血圧を治療する方法は当業者に知られており、例えば米国特許第６，７５６，０３３号（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されており、プロスタグランジン調製物の吸入送達による肺高血圧の治療を教示している。プロスタグランジンに関する前記特許に記載されている吸入技術は、ＢＨ４および／またはその前駆体および誘導体の吸入調製物の生成にも有用となろう。さらに、ＢＨ４系組成物およびプロスタグランジン調製物の併用投与によって、内皮機能不全を治療できることが企図される。
【０１７２】
活性化合物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩の水溶液として投与するために調製することができる。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物、ならびに油中で調製することもできる。保存および使用の通常条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
【０１７３】
ＢＨ４組成物は、注入使用に適切な製剤として調製することができる。かかる組成物は、滅菌注入溶液または分散液を即時調製するための、滅菌水溶液または分散液と滅菌粉末を含む。全ての場合において、この製剤は滅菌されなければならず、シリンジ適用が容易な程度まで流体でなければならない。この製剤は、製造および保存条件下で安定でなければならず、バクテリアおよび菌類などの微生物の汚染作用を受けないよう保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えばレシチンなどのコーティングを使用し、分散液の場合には必要な粒経を維持し、界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸マグネシウム、およびゼラチンを組成物に使用することによって実現することができる。
【０１７４】
注入可能な滅菌溶剤は、必要量の活性化合物を先に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に組み込み、次いで必要に応じて滅菌濾過することによって調製される。一般に分散剤は、ベースとなる分散媒および先に列挙したものから他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。注入可能な滅菌溶剤の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先の滅菌濾過溶液から、有効成分と所望の追加の任意成分との粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１７５】
本明細書に記載の方法で使用するためのＢＨ４組成物の好ましい製剤は、錠剤製剤である。驚くべきことに、錠剤製剤にアスコルビン酸を添加することによって製剤の安定性が増大することが見出されている。特定の安定化機構に限定するものではないが、ＢＨ４を様々な賦形剤と共に製剤に混合する場合、少量のアスコルビン酸でも（例えば２重量％未満）ＢＨ４との複合体が生成され、ＢＨ４が分解される１つまたは複数の経路が抑制されると思われる。したがって、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００６／０５５５１１として公開されている２００５年１１月１６日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／４１２５２により詳細に述べられているように、本明細書で使用するためのＢＨ４のある例示的な錠剤製剤は、アスコルビン酸を含む。
【０１７６】
例示的な安定な経口製剤は、製剤の安定性または他の特徴を改善する以下の追加成分、結合剤、崩壊剤、酸性抗酸化物質もしくは潤滑剤、またはそれらの組合せの１つまたは複数を含有する。例示的な安定な錠剤製剤は、結合剤および崩壊剤、任意選択で酸性抗酸化物質、さらに任意選択で潤滑剤を含む。結合剤の例示的な濃度は約１ｗｔ％〜約５ｗｔ％または約１．５〜３ｗｔ％であり、結合剤対ＢＨ４の例示的な重量比は、約１：１０〜約１：２０の範囲である。崩壊剤の例示的濃度は約１ｗｔ％〜約２０ｗｔ％であり、崩壊剤対ＢＨ４の例示的重量比は、約１：５〜約１：１０の範囲である。抗酸化物質の例示的濃度は約１ｗｔ％〜約３ｗｔ％であり、抗酸化部物質対ＢＨ４の例示的重量比は、約１：５〜１：３０の範囲である。一例では、アスコルビン酸が抗酸化物質であり、ＢＨ４との比が１：１未満、例えば１：２以下、または１：１０以下で使用される。本発明の安定な錠剤製剤の潤滑剤の例示的濃度は約０．１ｗｔ％〜約２ｗｔ％であり、潤滑剤対ＢＨ４の例示的重量比は、約１：２５〜１：６５の範囲である。
【０１７７】
安定な固体製剤は、治療される状態にとって適切な他の治療剤、例えば葉酸塩前駆体、葉酸、または葉酸塩誘導体を含む葉酸塩；ならびに／あるいはアルギニン；ならびに／あるいはビタミンＣおよび／またはビタミンＢ２（リボフラビン）および／またはビタミンＢ１２などのビタミン；ならびに／あるいはＬ−ドーパまたはカルビドパなどの神経伝達物質前駆体；ならびに／あるいは５−ヒドロキシトリプトファンを任意選択で含むことができる。
【０１７８】
本明細書に記載の組成物に使用されるＢＨ４は、好ましくは二塩酸塩として配合されるが、ＢＨ４の他の形態が所望の生物活性を有し、その結果ＢＨ４の他の塩形態を使用できることが企図される。
【０１７９】
医薬として許容可能な塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンを用いて形成することができる。化合物の医薬として許容可能な塩は、医薬として許容可能なカチオンを用いて調製することもできる。適切な医薬として許容可能なカチオンは当業者には周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、および第４級アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄等である。適切なアミンの例には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、Ｎ，Ｎ’ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎメチルグルカミン、およびプロカインが含まれる。
【０１８０】
医薬として許容可能な酸付加塩には、無機または有機酸塩が含まれる。適切な酸塩の例には、塩酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、リン酸塩が含まれる。他の適切な医薬として許容可能な塩は当業者に周知であり、例えば酢酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸；および有機カルボン酸、スルホン酸、スルホもしくはリン酸またはＮ置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４アミノサリチル酸、２フェノキシ安息香酸、２アセトキシ安息香酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ニコチン酸、もしくはイソニコチン酸；およびタンパク質の天然合成に関与する２０αアミノ酸などのアミノ酸、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸、ならびにフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン１，２ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン２スルホン酸、ナフタレン１，５ジスルホン酸、２もしくは３ホスホグリセリン酸塩、グルコース６リン酸塩、Ｎシクロヘキシルスルファミン酸（チクロ形成を伴う）、またはアスコルビン酸などの他の酸有機化合物が含まれる。
【０１８１】
特に、無機または有機酸とのＢＨ４塩が好ましい。代替のＢＨ４塩形態の非限定的例には、酢酸、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、フマル酸、およびマンデル酸のＢＨ４塩が含まれる。
【０１８２】
ＢＨ４投与の頻度は、薬剤の薬物動態パラメータおよび投与経路に依存して決まることになろう。最適な製剤は、投与経路および所望の用量に依存して当業者によって決定されよう。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８巻（１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  １８０４２）１４３５  １７１２頁参照。かかる製剤は、投与薬剤の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与え得る。投与経路に依存して、適切な用量は、体重、体表面積、または臓器寸法に従って算出することができる。適切な治療用量を決定するのに必要な算出のさらなる改良は、特に本明細書に開示の投与情報およびアッセイ、ならびに動物またはヒトの臨床試験で観測される薬物動態データに照らして、過度の実験なしに当業者によって定期的に行われる。
【０１８３】
適切な投与量は、Ｐｈｅの血中濃度を決定するために確立されたアッセイの使用と、関連する用量反応データを併用して確定することができる。最終投与レジメンは、薬物作用を改変する因子、例えば薬物の特定の活性、患者の障害の重篤度および応答性、患者の年齢、状態、体重、性別、および食事、任意感染症の重篤度、投与時間、ならびに他の臨床因子を考慮して、担当医によって決定されよう。研究が実施される際、特定の疾患および状態に対する適切な投与レベルおよび治療期間に関してさらなる情報が明らかとなろう。
【０１８４】
本発明の医薬組成物および治療方法は、人間医学および獣医学分野に有用となり得ることを理解されよう。したがって、治療される対象は哺乳類であり、好ましくはヒトまたは他の動物であり得る。動物目的では、対象には、例えば牛、羊、豚、馬、およびヤギを含む家畜、犬および猫などのペット、外来動物および／または動物園の動物、マウスラット、ウサギ、モルモット、およびハムスターなどの実験動物；ならびに鶏、七面鳥アヒル、およびガチョウなどの家禽が含まれる。
【０１８５】
本発明の幾つかの態様では、ＢＨ４を単独で、またはかかる疾患の治療のために従来使用されているもう１つの薬剤または介入と組み合わせて使用して本明細書に記載の疾患を治療するために必要な全ての成分は、キット内にパッケージすることができる。特に本発明は、本明細書に記載の疾患の治療的介入に使用するためのキットを提供し、そのキットは、ＢＨ４またはその誘導体もしくは前駆体、ならびに送達可能な形態の医薬品を調製するための緩衝液および他の成分を含む医薬品のパッケージ一式、および／またはかかる医薬品を送達するための装置、および／またはかかるＢＨ４系医薬品との併用療法に使用される任意の薬剤、および／または医薬品と共にパッケージされる本明細書に記載の疾患の治療のための指示物を含む。この指示物は、印刷紙などの任意の有形表現媒体、またはコンピュータ読取り可能な磁気もしくは光媒体、またはインターネットを介して接続可能な世界規模のウェブページなどの遠隔コンピュータデータを参照するための指示物に固定することができる。
【０１８６】
ＩＩＩ．ＢＨ４合成および／またはＮＯ生成を変更する因子
本発明は、内皮機能不全を特徴とする疾患または障害を治療する方法を企図し、その方法は、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはその前駆体もしくは誘導体を増大する薬剤を含む組成物を単独で、または治療剤と組み合わせて前記対象に投与することを含み、前記投与は、前記ＢＨ４含有組成物を用いない内皮機能不全と比較して、前記対象の前記内皮機能不全を緩和するのに有効である。
【０１８７】
本発明の一実施形態は、第１の速度制御酵素ＧＴＰＣＨ１、ＰＴＰＳ、およびＳＲを含む、ＢＨ４合成経路の酵素の発現もしくは合成または活性を増大することによって、ＢＨ４のレベルを増大する１つまたは複数の薬剤を含む。本発明の好ましい一実施形態では、ＢＨ４合成は、任意の１つまたは複数の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）類似体またはアゴニスト、例えばホルスコリン、８−ブロモｃＡＭＰ、またはｃＡＭＰ媒介性の細胞シグナリングを増大するように機能する他の薬剤、例えばインターロイキン−１、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ｃ反応性タンパク質、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（アトルバスタチンなどのスタチン）神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含むサイトカインおよび成長因子、アドレノメデュリンおよび安息香酸エストラジオールを含むホルモン、ならびにＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ類似体、カフェイン、３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含むシクロスポリンＡメチルキサンチン、テオフィリン、レセルピン、過酸化水素などの他の化合物を使用してＧＴＰＣＨ１発現の発現を増大することによって高まる。
【０１８８】
ホスホジエステラーゼはｃＧＭＰおよびｃＡＭＰなどの３’５’−環状ヌクレオチドを分解することが、当技術分野で十分に確立されている。ｃＡＭＰは、ＧＴＰＣＨ１の既知の活性化因子、ＢＨ４合成のための速度制御酵素、ｅＮＯＳに必要な補因子である。したがってホスホジエステラーゼファミリーの阻害剤は、ＢＨ４合成酵素ＧＴＰＣＨ１への第２の活性化作用を有する。したがって本発明の一実施形態は、ＰＤＥ１、ＰＤＥ３、ＰＤＥ５を含む１１のホスホジエステラーゼファミリー（ＰＤＥ１〜１１）の阻害剤を使用して３’５’−環状ヌクレオチドの分解を抑制することによって、ＧＴＰＣＨ１レベルを増大することに関する。本発明のＰＤＥ阻害剤には、バイアグラ（Ｖｉａｇｒａ）／タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、シアリス（ｃｉａｌｉｓ）／シルダネフィル（ｓｉｌｄａｎｅｆｉｌ）、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）／レビトラ（ｌｅｖｉｔｒａ）、８−メトキシメチル−ＩＢＭＸ、ＵＫ−９０２３４、デキサメタゾン、ヘスペレチン、ヘスペレジン、イルソグラジン、ビンポセチン、シロスタミド、ロリプラム、エチルβ−カルボリン−３−カルボン酸塩（β−ＣＣＥ）、テトラヒドロ−β−カルボリン誘導体、３−Ｏ−メチルケルセチン等が含まれる。
【０１８９】
本発明の別の実施形態は、遺伝子治療またはＢＨ４合成機構のポリヌクレオチドの内皮標的送達によりＢＨ４合成酵素のレベルを増大することによって、ＢＨ４のレベルを増大することに関する。遺伝子治療に使用されるＢＨ４合成遺伝子を特許請求している出願済み特許には、米国特許第２００３０１９８６２０号が含まれる。本発明のさらに別の実施形態は、ＢＨ４合成酵素ＧＴＰＣＨ１、ＰＴＰＳ、ＳＲ、ＰＣＤ、ＤＨＰＲ、およびＤＨＦＲを補充することによってＢＨ４のレベルを増大することに関する。ＢＨ４合成酵素によって、活性および不活性なタンパク質の変異体を含む酵素の全ての天然および非天然形態が含まれることが確立されていることが企図される。
【０１９０】
本発明の別の実施形態は、ＡＰ活性を抑制することによって、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の代わりに基質７，８−ジヒドロネオプテリン三リン酸をＢＨ４合成酵素ＰＴＰＳに転換することによりＢＨ４レベルを増大することに関する。ＡＰ活性を抑制する薬剤または化合物には、リン酸類似体、レバミゾール、およびＬ−Ｐｈｅが含まれる。本発明の別の実施形態は、アルカリフォスファターゼの合成を抑制するための低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、小分子、中和抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗体フラグメントを含む、アルカリフォスファターゼを抑制する薬剤または化合物に関する。
【０１９１】
本発明の別の実施形態には、ＢＨ４合成のデノボ合成経路の酵素合成のために必要な触媒または補因子の活性を増大する薬剤または化合物が含まれる。
【０１９２】
本発明の別の実施形態には、ＢＨ４の合成に必要な酵素の分解を防止する薬剤または化合物が含まれる。本発明のさらに別の実施形態には、ＢＨ４の合成およびその合成酵素、例えばＧＴＰＣＨ１、ＰＴＰＳ、およびＳＲに必要な触媒の分解を防止する薬剤または化合物が含まれる。
【０１９３】
本発明の別の実施形態は、ＢＨ４によりＧＴＰＣＨ１／ＧＦＲＰ複合体のフィードバック調整を抑制することによって、ＢＨ４のレベルを増大することに関する。本発明の好ましい一実施形態は、ＧＴＰＣＨ１／ＧＦＲＰ複合体へのＢＨ４の結合を抑制し、それによってＢＨ４によるフィードバック阻害を防止する薬剤または化合物に関する。本発明の薬剤または化合物には、複合体、構造類似体等に合わせて変えられた親和性を有するＢＨ４の代替形態などの競合阻害剤が含まれる。さらに本発明の別の実施形態には、ＢＨ４の合成を誘発するＣＴＰＣＨ１／ＧＦＲＰへのＬ−フェニルアラニンの結合を増大する薬剤または化合物が含まれる。本発明の別の実施形態には、Ｌ−Ｐｈｅの前駆体などの、Ｌ−Ｐｈｅレベルを増大する薬剤または化合物が含まれる。
【０１９４】
本発明のさらに別の実施形態は、ＧＦＲＰの活性または合成を調整する薬剤または化合物に関する。本発明の好ましい一実施形態には、ＧＦＲＰの活性を抑制する薬剤または化合物が含まれる。本発明の別の実施形態には、ＧＦＲＰの合成を抑制するための、ｓｉＲＮＡ、小分子、抗体、抗体フラグメント等の使用が含まれる。
【０１９５】
本発明の別の実施形態は、サルベージ経路を介してＢＨ２の還元を増大することによってＢＨ４のレベルを増大することに関する。ＢＨ４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＨ２に酸化する。キノイド形態（ｑＢＨ２）および７，８−ジヒドロプテリンとして存在するＢＨ２は、それぞれＤＨＰＲおよびＤＨＦＲによってＢＨ４に還元される。本発明の好ましい一実施形態は、ＮＡＤＰＨ、チオール、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、過酸化水素等を経路とする薬剤または化合物を使用して酵素ＰＣＤ、ＤＨＰＲ、およびＤＨＦＲの活性および合成を調整することによって、ＢＨ２からのＢＨ４の再生成またはサルベージを増大することに関する。
【０１９６】
本発明の別の実施形態は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビタミンＥ、トコフェロール（例えばビタミンＡ）、セレン、βカロテン、カロチノイド、フラボン、フラボノイド、葉酸塩、フラボン、フラバノン、イソフラボン、カテキン、アントシアニジン、カルコン等を含む抗酸化物質などの薬剤または化合物を使用してＢＨ４の酸化を低減することによって、活性ＢＨ４のレベルを増大することに関する。米国特許および特許出願第６５４４９９４号、第２００５０１１９２７０号、第２００３０００７９６１号、および第２００２００５２３７４号には、ＢＨ４および抗酸化物質の使用が記載されている。
【０１９７】
本発明のさらに別の実施形態には、グアノシン三リン酸、７，８−ジヒドロ−ネオプテリン三リン酸、および６−ピルボイルテトラヒドロビオプテリンを含むＢＨ４の前駆体である薬剤または化合物が含まれる。
【実施例】
【０１９８】
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者が本発明の実施に十分機能することを発見した技術を示すものであり、したがってその実施に好ましい態様を構成すると考え得ることを、当業者は理解すべきである。但し、開示されている幾つかの実施形態において多くの変更を加えることができるが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを、当業者は本開示に照らして理解すべきである。
【０１９９】
実施例１
６Ｒ−テトラヒドロビオプテリンを用いた臨床評価
以下の実施例は、本発明の治療方法におけるＢＨ４の臨床評価に使用するためのパラメータに対する指針を提供する。全体を通して本明細書で論じられるように、ＢＨ４は、糖尿病関連および非糖尿病性の心血管系合併症、例えばそれに限定されるものではないが、抵抗性高血圧、間欠性跛行、冠動脈高血圧、冠動脈機能、肺動脈高血圧、および鎌状赤血球症を含む溶血性貧血の治療に使用されよう。安全性、薬物動態、ならびにサロゲートおよび明確化臨床エンドポイント両方の最初の応答に関してＢＨ４の１日の経口用量を評価することになる臨床試験が行われよう。この試験は、関連の試験によるエンドポイント、例えば間欠性跛行に関しては歩行中の疼痛発症の改善における有効性を評価し、３０人の評価可能な患者に関する十分な安全性の情報を収集するために、最短期間、それに限定する必要はないが各患者につき１週間行われることになろう。
【０２００】
この試験の最初の用量は、約２〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１〜２０ｍｇ／ｋｇで変わることになる。この用量が患者に臨床的エンドポイントの改善をもたらさないか、または直接的な有意の臨床的利益をもたらさないイベントにおいては、必要に応じて用量を増加し、最小限の追加期間中、それに限定する必要はないが１週間それを維持して安全性を確立し、さらなる有効性を評価すべきである。低用量、例えば０．１〜２ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量も同様である。かかる用量は、関連の試験によるエンドポイント、それに限定されるものではないがアテローム硬化性合併症または肺高血圧に関係するエンドポイントに改善をもたらすことが期待される。
【０２０１】
本発明は特に、ＢＨ４またはその前駆体もしくは誘導体を、１日当たり体重１ｋｇにつき１〜５ｍｇの範囲の用量で任意の投与経路を介して、それに限定されるものではないが経口投与によって、１日当たりの用量を１回で、または１日当たりの用量を多数回に分割して（例えば２、３、または４回）、少なくとも１、２、３、または４週間もしくはそれ以上、または１、２、３、４、５、６カ月もしくはそれ以上の期間、本願で言及する血管の病状のいずれか、またはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００５年６月１日出願の米国特許出願第１１／１４３，８８７号に言及されている血管の病状のいずれかを治療するために使用することを企図する。例示的用量には、１日に５ｍｇ／ｋｇ未満、１日に４．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に４ｍｇ／ｋｇ以下、１日に３．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に３ｍｇ／ｋｇ以下、１日に２．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に２ｍｇ／ｋｇ以下、１日に１．５ｍｇ／ｋｇ以下、１日に１ｍｇ／ｋｇ以下、または１日に０．５ｍｇ／ｋｇ以下が含まれる。体表面積当たりの同等の用量も企図される。
【０２０２】
平均的な体重／体表面積（例えば７０ｋｇ）のヒトについて、本発明は、４００ｍｇ未満の１日の総用量も企図する。かかる例示的な１日の総用量には、３６０ｍｇ／日、３５０ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、２８０ｍｇ／日、２１０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、１７５ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、または１４０ｍｇ／日が含まれる。例えば３５０ｍｇ／日または１７５ｍｇ／日は、１７５ｍｇの経口用製剤で１日１回または２回、容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、３２０ｍｇ／日以下、１６０ｍｇ／日以下、または８０ｍｇ／日以下が含まれる。かかる用量は、８０または１６０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、４５、９０、１３５、１８０、２２５、２７０、３１５、または３６０ｍｇ／日もしくはそれ未満が含まれ、これらは４５または９０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。さらに他の例示的な１日の総用量には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、または３６０ｍｇ／日が含まれ、これらは６０または１２０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、７０、１４０、２１０、２８０、または３５０ｍｇ／日が含まれ、これらは７０または１４０ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。例示的な１日の総用量には、５５、１１０、１６５、２２０、２７５、または３３０ｍｇ／日も含まれ、これらは５５ｍｇの経口用製剤で容易に投与することができる。他の例示的な１日の総用量には、例えば６５ｍｇまたは７５ｍｇの製剤としての、６５、１３０、１９５、２６０、もしくは３２５ｍｇ／日、または７５、１５０、２２５、３００、もしくは３７５ｍｇ／日が含まれる。
【０２０３】
ＢＨ４それ自体が投与される場合、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１１／１４３，８８７号に記載の塩または多形、および２００５年１１月１６日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／４１２５２に記載の安定な固体製剤のいずれかを投与することができる。その有益な活性を保持するＢＨ４の例示的な前駆体および誘導体は、米国特許出願第１１／１４３，８８７号に記載されている。
【０２０４】
安全性の測定には、有害イベント、アレルギー反応、完全な臨床化学パネル（腎臓および肝臓機能）、検尿、および分類を伴うＣＢＣが含まれる。さらに、他のパラメータも監視されよう。本発明は、血流の循環ならびに６Ｒ−ＢＨ４の一般分布および半減期における薬物の薬物動態パラメータの決定も企図する。これらの測定は、用量を臨床反応と関連付ける助けになろう。
【０２０５】
方法
糖尿病関連および非糖尿病関連の血管障害を有する患者は、ベースライン、病歴および健康検査、ならびに臨床状態における特定の徴候（例えば、間欠性跛行の患者におけるトレッドミル試験中の疼痛の発症）を診断するために一般に使用される、それに限定されるものではないが血圧測定、６分間歩行試験、および心エコー検査試験を含む様々な診断試験を受けることになる。提案されるヒトのＢＨ４用量である２〜約１０ｍｇ／ｋｇは、１日１〜３回の用量に分割して投与されよう。臨床的エンドポイントは、頻繁に監視されることになる。完全な評価は、治療期間終了の１週間後に実施されよう。用量増加が必要ならば、患者は先に概説した同じスケジュールに従うことになる。安全性は、試験全体を通して監視されよう。
【０２０６】
診断および対象／非対象基準
対象は、性別、年齢、および一般的な診断試験によって確認された特定血管障害の立証済み診断に基付いて選択されることになる。
【０２０７】
用量、経路、およびレジメン
患者は、１日当たり５ｍｇ／ｋｇの用量のＢＨ４を摂取することになる。臨床的エンドポイントが十分な量で改善されず、臨床的利益が観測されないイベントでは、２０ｍｇ／ｋｇの１日の総用量が投与されるまで、必要に応じて用量を増加することができる。１日のＢＨ４投与は、液剤、粉剤、錠剤、またはカプセル剤として経口投与されるか、または経鼻胃チューブを介して投与されよう。１日の総用量は、単回用量として、または場合により１日用量を２回もしくは３回に分割して与えることができる。患者は臨床的に観測されると同時に、任意の有害反応についても監視されよう。任意の異常な症候が観測される場合、治験薬投与は直ちに停止され、試験継続に関する決定がなされよう。
【０２０８】
ＢＨ４の安定性
ＢＨ４療法は、試験過程中に有意な急性または慢性薬物反応が生じない場合に安全であると決定されよう。薬物の長期投与は、臨床試験、臨床検査、または他の適切な試験において有意な異常性が観測されない場合に安全であると決定されよう。
【０２０９】
実施例２
糖尿病患者における６Ｒ−テトラヒドロビオプテリンでの臨床評価
糖尿病患者の第１／２相または第２ａ相における用量効果、投与間隔、および安全性の確立
任意の第２ａ相の投与／有効性試験を開始する前に、様々な糖尿病集団で第１／２短相の用量増加試験を実施して、血管コンプライアンスへの用量効果を確立し、安全性を考慮すべきである。最初の試験によって、用量範囲およびレジメン、ならびに臨床的エンドポイントを支持するために監視され得る血管機能エンドポイントの範囲が確立されよう。最初の試験の対象は、有意な血管疾患（微小血管コンプライアンスの減少）および高血圧を有する糖尿病患者であり、ＢＨ４の１日の経口用量０、１、２、５、１０、および２０ｍｇ／ｋｇは、１日１回または１日２回の投与レジメンで投与されることになる。患者は、投与で安定化したら１日の間に、血管コンプライアンス、かん流／再かん流／前腕血流および血圧について、治療の１週間かけて監視されよう。この試験によって、第２相の適切な用量範囲および１日のレジメンが評価され、臨床開発ならびにこの集団の安全性を支持するために使用される定量的な有効性の測定値の存在が確立されよう。
【０２１０】
糖尿病集団の第２ａ相および第２ｂ相における徴候の調査
適切な集団、用量／レジメン、および徴候は、２つ以上の試験における第２ａ相プログラムで、３０〜６０日という比較的短い生命治療期間で評価されることになる。任意の第２ａ相試験に含まれる特定の医療を必要とする、かなり焦点を絞った糖尿病患者の任意の群では、血管機能不全の変化の他の臨床的インパクトと同時に、内皮機能およびインスリン耐性の生化学的マーカーの評価を評価するために、様々な他の測定値が同時に評価されることになる。
【０２１１】
適切な集団／徴候における第２ｂ相試験は、より長期間の治療を試験して、より大きな集団での第３相試験を設計し、特定用量を評価するために実施されよう。
【０２１２】
選択糖尿病における選定された第１徴候の第３相試験
第３相試験は、非常に重要な徴候に焦点を当てるものであるが、第２または第３のエンドポイントとしての血管機能の支持情報の発生も含まれよう。最小限２つの制御された第３相試験が実施されることになるが、多様な併用薬を用いている患者、腎不全などの特定の医療問題を有する患者、または疾患範囲内の他の結果にある患者などのリスクのある他の集団を含むために、追加の第２相または第３相の設計が考慮されよう。
【０２１３】
一般的血管機能
血管コンプライアンス／内皮機能不全／ＨＴＮ：血管コンプライアンスおよびＣ２異常およびＨＴＮの変化の証拠がある様々な糖尿病患者は、用量を０、１、２、５、１０、および２０ｍｇ／ｋｇと増量する１週間の間に、小血管における血管コンプライアンスのＣ２測定値について評価されることになる。血管コンプライアンスおよびＨＴＮへのＢＨ４増大の効果が評価され、ＢＨ４の用量効果が患者の様々な集団で確立されることになる。１日の間の薬物効果が決定され、レジメンを確立する一助にされよう。
【０２１４】
難治性高血圧：第２ａ相試験は、無作為化二重盲検プラシーボ試験設計に基づいて開始されることになる。この試験は、血圧が１４０ｍｍＨｇ／９０ｍｍＨｇより高く、３種の医薬品を使用している患者８０人を必要とするものである。総患者数には、糖尿病患者４０人が含まれる。１群当たり患者２０人とし、プラシーボ群を含む４群とする。非対象基準には、重篤な肢虚血、心不全、および整形外科的合併症が含まれよう。ＢＨ４は、０〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で４週間患者に投与されよう。患者は、収縮期および拡張期血圧の測定値について評価され、歩行時の血圧について監視されることになる。
【０２１５】
インスリン感受性／グルコース制御：グルコースが制御されにくく、一般的な経口用抗糖尿病薬に不応症であるかまたは応答しにくい糖尿病患者は、グルコース／インスリン濃度、ＨｇｂＡ１ｃの測定値に基付いて評価されることになる。ＢＨ４の投与は、グルコース耐性試験およびグルコース制御（ＨｇｂＡ１Ｃの減少）の結果を改善することが期待される。かかる患者は、様々な処方において評価され得る。
【０２１６】
末梢潅流
特定の糖尿病関連徴候の試験
間欠性跛行：第２ａ相試験は、１：１の二重盲検プラシーボ試験設計に基付いて実施されることになる。この試験は、糖尿病患者４０人を含む間欠性跛行の患者８０人を含むことになる。非対象基準には、重篤な肢虚血、心不全、および整形外科的合併症が含まれよう。患者は、１０ｍｇ／ｋｇの用量のプラシーボまたはＢＨ４を１２週間投与されよう。腓腹筋痛を有し、長距離歩行能力が制限された患者は、疼痛が始まるまでの一定期間および距離を歩行する能力についてトレッドミルで評価されることになる。特に、傾斜トレッドミルでの最長歩行時間、疼痛のない歩行距離、血圧、血流、血流依存性拡張（ＦＭＤ）、および生活の質（ＱｏＬ）の臨床的に関連のあるエンドポイント。ＢＨ４の投与は、末梢潅流の最も臨床的に関連のあるエンドポイントである運動への遅れがちな血管反応および長距離にわたる歩行能力を改善することが期待される。
【０２１７】
末梢潅流の低下：四肢への血流が低下した患者は、ＢＨ４用量の増加による四肢への血流改善に関して評価され、切断の頻度を低減されよう。
【０２１８】
皮膚血流および創傷治癒の低下：糖尿病性潰瘍または皮膚血流低下を有する患者は、皮膚への血流改善に関して評価され、ＢＨ４療法での創傷治癒を高められよう。
【０２１９】
心疾患
うっ血性心不全（ＣＨＦ）または肺高血圧：血圧上昇および血管機能低下を合併するＣＨＦを有する糖尿病患者は、心エコー検査、心拍出量／心臓駆出分、および６分間歩行試験によって得られる測定値に基付いて評価されることになる。ＢＨ４療法は、血圧を低下し、心血流を増大して心臓機能を相乗的に改善し、６分間歩行試験を改善することが期待される。
【０２２０】
運動時の狭心症：運動限定的な狭心症を有し、硝酸塩療法を必要とする糖尿病患者は、対象がＢＨ４を投与された状態で狭心症を発症するまでトレッドミルで歩行できる時間を測定し、冠血流を監視することによって評価されることになる。ＢＨ４療法は、冠血流を改善し、それによってトレッドミルで試験する際に狭心症を遅延するか、または排除することが期待される。
【０２２１】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）および関連するアテローム性動脈硬化症：以前１度心筋梗塞（ＭＩ）または虚血イベントを経た、初期または後期アテローム性動脈硬化症および冠動脈疾患を有する糖尿病患者は、アテローム性動脈硬化症の進行の防止および／またはＭＩ／卒中／死亡の減少に関して評価されることになる。第２ａ相試験は、無作為化二重盲検プラシーボ試験設計に基付いて実施されることになる。この試験は、冠動脈バイパスグラフト術（ＣＡＢＧ）を必要とするＣＡＤを示す糖尿病患者４０人を含む患者８０人を含むことになる。１群当たり患者２０人とし、プラシーボ群を含む４群とする。非対象基準は、心不全および不安定な狭心症の発症とする。患者は、０〜１０ｍｇ／ｋｇのＢＨ４またはプラシーボを４週間投与されよう。患者は、冠動脈機能不全、大血管機能不全、ＣＡＤ、活性酸素種の組織レベル、およびＢＨ４レベルについて評価されることになる。ＢＨ４療法は、アテローム性動脈硬化症の進行速度、ＭＩの頻度、および他の血管イベントを低減することが期待される。急性的には、血管拡張の改善および血栓形成の低減によって、冠動脈機能が増大することが期待され、その後のアテローム性動脈硬化症の低減によって、血管疾患の進行が改善することが期待される。
【０２２２】
眼科疾患
視神経委縮または糖尿病性網膜疾患：網膜血管機能不全に起因する視力低下を有する糖尿病患者は、視力および網膜への血流測定に関して評価されることになる。ＢＨ４は、血流を改善して視力を改善することが期待される。
【０２２３】
腎疾患
糖尿病性腎疾患の微量アルブミン尿または腎不全／糸球体濾過量（ＧＦＲ）減少：腎臓の血管疾患に合致する尿へのタンパク質の流出またはクレアチニンレベルの上昇を有する糖尿病患者は、２４時間内の標本の尿へのタンパク質の流出およびＧＦＲの測定に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、タンパク尿を低減し、ＧＦＲを改善することが期待される。
【０２２４】
糖尿病患者の肺高血圧
うっ血性心不全のある肺高血圧またはうっ血性心不全のない肺高血圧を有する糖尿病患者は、６分間歩行試験の実施能力、ＣＨＦの発症、および肺動脈圧の測定値に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、肺動脈圧および心血管系機能を改善することが期待される。動物モデルにおいて、ＢＨ４欠乏および肺高血圧が関係している幾つかのデータが存在する。
【０２２５】
実施例３
糖尿病に関連しない他の心血管系徴候の試験
肺血管疾患
原発性肺動脈高血圧（ＰＡＨ）：第１ｂ相試験は、非盲検用量暫定試験設計に基付いて実施されよう。この試験は、原発性ＰＡＨを有する１０〜２０人の患者を含むことになる。非対象基準には、医薬品への不安定な応答が含まれよう。ＢＨ４の用量は、０〜１０ｍｇ／ｋｇで４〜１２週間滴定されることになる。患者は、６分間歩行試験、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）スコア、ボルグ呼吸困難スコア、肺動脈および心臓機能の心電図による評価に関して評価されることになる。
【０２２６】
鎌状赤血球の肺高血圧または他の異常血色素症（Ｈｂ）：うっ血性心不全のある肺高血圧またはうっ血性心不全のない肺高血圧を有するＨｂ−Ｓ患者は、６分間歩行試験の実施能力、ＣＨＦの発症、および肺動脈圧の測定値に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、肺動脈圧および心血管系機能を改善することが期待される。
【０２２７】
特発性肺高血圧（ＩＰＨ）：その疾患に関して既知の心血管系の原因が無いＩＰＨ患者、特に４０歳未満の若年の患者は、６分間歩行試験、ＣＨＦの発症、肺動脈圧の測定値に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、肺動脈圧およびＣＶ機能を改善することが期待される。
【０２２８】
新生児の持続性肺高血圧（ＰＰＨＮ）：ＰＰＨＮである満期妊娠者の乳児は、肺圧の解決、酸素化の回復、および死亡率に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、酸素化を改善する肺動脈圧およびシャントの急速で完全な改善をもたらすことが期待される。非実用的であり毒性のある一酸化窒素吸入療法とは異なり、ＢＨ４は非毒性であり、有効となろう。
【０２２９】
卒中および関連の虚血性血管疾患
脳卒中後の脳血管痙縮：対象には、入院中で急性脳卒中の治療を受けている脳卒中後の患者が含まれることになる。患者は、梗塞面積および脳かん流の治療前後に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、痙縮に弛緩をもたらし、梗塞面積を低減することが期待される。犬の卒中モデルからのデータによって、血餅部位周辺の脳卒中後の血管痙縮が伸展し、元のイベントよりも大きな損害を生じるが、亜硝酸塩溶液の注入によって防止できることが示される。
【０２３０】
移植関連内皮機能不全
固形臓器移植後の血管機能不全：この試験には、固形臓器移植を受けた患者が含まれることになる。対象は、移植後の血管機能不全によって生じた臓器機能不全について評価されることになる。ＢＨ４は、移植後の臓器機能を改善し、移植された臓器の損失を低減することが期待される。
【０２３１】
シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）誘発性内皮機能不全：臓器移植後のＣｓＡの患者は、移植後の血管機能不全によって生じた臓器機能不全に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、臓器機能を改善し、血管合併症の頻度を減少することが期待される。
【０２３２】
Ｂｒａｎｄａｃｈｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、８１（４）：５８３（２００６年）には、同種移植の生着が、テトラヒドロビオプテリンおよびシクロスポリンＡによって有意に延長されたことが報告されている。同種異系の非治療対照と比較して、全ての群において移植組織内のペルオキシ亜硝酸の形成が低下した。簡潔には、近交系雄性ラットの２つの完全な同種異系を得た。頸部異所性心臓移植を実施し、心臓同種移植の生着を毎日の触診および検査によって決定し、重篤な拒絶反応を示す完全な心拍停止を組織学によって確認した。移植後、５〜１０匹の動物の群を７日間ＢＨ４で治療した（８時間毎に５０ｍｇ／ｋｇを新たにリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、筋肉内投与した）。ラットを術後１日後または６日後に屠殺し、組織学的評価のために移植片を除去した。ＨＰＬＣによる硝酸塩および亜硝酸塩測定のために、対応する血漿サンプルを収集した。組織サンプルを液体窒素で直ちに凍結し、−７５Ｃで保存するか、またはホルマリンに浸漬しパラフィンに埋め込んだ後、Ｈ＆Ｅ染色もしくは免疫組織化学によって分析した。治療を受けていない同種移植は、移植後およそ７日および８日に拒否反応を示した（平均グラフト生着率７．１±０．７日）のに対し、テトラヒドロビオプテリンは、１２．３±４．９日に生着を延長した（治療を受けていない同種移植との差異ｐ＜０．０５）。組織学的評価の際、ＢＨ４治療を受けた心臓は、単核細胞の浸潤およびいくらかの炎症性浸潤の病巣を示した。治療を受けていない動物およびＢＨ４で治療した動物において、６日目に硝酸塩および亜硝酸塩濃度が増大した。データは、テトラヒドロビオプテリンが同種移植生着を有意に延長することを示した。
【０２３３】
心疾患または冠状動脈疾患
血管機能不全／狭心症：高コレステロール血症患者および喫煙者は、アテローム性動脈硬化症の進行の防止および／またはＭＩ、卒中、死亡の低減に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、アテローム性動脈硬化症の進行速度を低下し、冠動脈血管拡張を改善し、血栓形成を低減することが期待される。
【０２３４】
うっ血性心不全：ＣＨＦを有する非糖尿病患者は、心エコー検査、心拍出量／心臓駆出分、および６分間歩行試験を使用して、ＣＨＦの発症に関して評価されることになる。ＢＨ４療法は、血圧を低下し、心血流を改善して心臓機能を相乗的に改善し、６分間歩行試験を改善することが期待される。
【０２３５】
溶血性貧血−鎌状赤血球症
溶血性貧血は、赤血球の早期破壊から生じる不適切な数の循環赤血球（貧血）を特徴とする。溶血性貧血の原因の幾つかには、感染症、薬物療法、自己免疫性障害、および遺伝的障害が含まれる。それに限定されるものではないが、鎌状赤血球貧血、発作性夜間血色素尿症、ヘモグロビンＳＣ疾患、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性卵形赤血球症、特発性自己免疫性溶血性貧血、化学薬剤または物理薬剤によって引き起こされる非免疫性溶血性貧血、二次免疫性溶血性貧血、およびサラセミアを含む、様々なタイプの溶血性貧血がある。溶血性貧血の幾つかの一般的治療には、葉酸、鉄補充、およびコルチコステロイド、ならびに緊急時の輸血が含まれる。治療のタイプ、予後、および合併症は、溶血性貧血のタイプによって変わり得る。合併症には、心血管虚脱および既存の心疾患、肺疾患、または脳血管疾患の悪化が含まれる。
【０２３６】
患者は、悪寒、疲労、蒼白、息切れ、頻脈、黄疸、暗色尿、および拡大脾腫を含む症候について評価されることになる。溶血の存在は、間接的ビリルビンレベルの上昇、低血漿ハプトグロビン、尿中ヘモグロビン、尿中ヘモシデリン、尿中および糞中ウロビリノーゲンの増加、網状赤血球絶対数の増加、低赤血球数（ＲＢＣ）および低ヘモグロビン、ならびに血清ＬＤＨの上昇の検出によって決定されよう。同位体標識技術による赤血球の寿命の直接的測定を使用して、寿命を測定することになる。溶血であることが確立されると、より具体的な試験を使用して、溶血性貧血の特定のタイプを同定することになる。該疾患によって影響を受ける他の関連測定値には、尿酸、ＴＩＢＣ、ＲＢＣ指数、タンパク質電気泳動−血清、カリウム試験、血小板数、末梢血液塗抹、白血球アルカリフォスファターゼ、血清鉄、ヘマトクリット、フェリチン、熱性または寒冷凝集素、Ｄｏｎａｔｈ−Ｌａｎｓｔｅｉｎｅｒ試験、直接および間接クームス試験、ＣＢＣ、血液分類、ＡＳＴ、および２４時間尿タンパク質が含まれよう。
【０２３７】
鎌状赤血球症
鎌状赤血球貧血またはヘモグロビンＳＳ疾患（ＨｂＳＳ）としても知られる鎌状赤血球症は、半月型の異常赤血球を特徴とする遺伝性障害であり、この赤血球が小型血餅を異常に生じる機能を果たし、「鎌状赤血球の疼痛クリーゼ」と呼ばれる痛みを伴う発現症状の再発性発症に寄与している。鎌状赤血球症は、赤血球を重合しその形状を変形するものであり、赤血球の早期崩壊および／または破裂に至るヘモグロビンＳと呼ばれる異常なタイプのヘモグロビンによって引き起こされる。脆性の鎌状赤血球は、身体組織への送達酸素が少なく、血流を妨害する小片に細分化する恐れがある。鎌状赤血球貧血は、常染色体劣性遺伝し、約５００人に１人のアフリカ系アメリカ人ならびに幾つかの他の民族に影響を及ぼしている。鎌状赤血球症は出生時に存在しているが、症候は、一般に月齢４カ月後に発症し、命に関わる恐れがある。血管の閉塞および障害を受けた臓器は、痛みを伴う急性発現症状、または溶血性クリーゼ（障害を受けた赤血球の崩壊）、脾臓による捕捉クリーゼ（血球の蓄積に起因する脾臓膨張）、および形成不全クリーゼ（感染症誘発性の骨髄赤血球生成の停止）を含む「クリーゼ」を引き起こす恐れがある。これらの痛みを伴うクリーゼは、背骨、長骨、および胸骨に影響を及ぼす恐れがあり、疼痛制御および静脈内輸液のために入院を必要とするに十分重篤なものとなり得る。度重なるクリーゼによって、腎臓、肺、骨、目、および中枢神経系に障害を引き起こす恐れがある。
【０２３８】
治療は長期的となり、葉酸の補充を含み、急速な赤血球の代謝回転を理由として、細胞生成に不可欠な要素が必要とされる。療法は、症候の管理および制御に焦点を当て、クリーゼの頻度を制限しようとするものである。痛みを伴う発現症状は、鎮痛薬および適切な水分摂取を伴って治療される。ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ）は、痛みを伴うクリーゼおよび急性胸部症候群の発現症状の頻度を減少し、輸血の必要性を低減することによって、ある患者の一助となることが見出された。しかし幾らか懸念があり、ヒドロキシ尿素が白血病を引き起こす恐れがあることが確立されている。身体が胎児性ヘモグロビンをより多く生成するように誘導して鎌状赤血球の量を低減する薬剤、または鎌状赤血球への酸素の結合を増大する薬剤を含む、より新しい他の療法が検討されている。骨髄移植は治癒をもたらし得るが、移植管理に使用する薬物の毒性、適切なドナーの検出困難、およびコスト高に起因して、少数の患者にしか適応されない。抗菌剤およびワクチンは、鎌状赤血球症を有する子どもに一般的な細菌感染症を防止するために使用できる。さらなる治療には、急性胸部症候群のための部分的交換輸血、卒中などの神経系イベントのための輸血もしくは手術、腎疾患のための透析もしくは腎臓移植、持続勃起症のための洗浄もしくは手術、眼疾患のための手術、股関節壊死のための人工股関節置換手術、有意な胆石症の存在による胆嚢摘出、創傷治癒、酸化亜鉛、または下腿潰瘍のための手術、薬物更生および心理社会的合併症のためのカウンセリングが含まれ得る。
【０２３９】
過去において、鎌状赤血球症を有する患者は、鎌状赤血球の大部分の患者は２０〜４０歳で臓器不全によってしばしば死亡していたが、管理の改善によって生存率が改善され、患者は４０〜５０歳の年齢まで生存するようになった。死亡原因には、臓器不全、感染症、および肺動脈高血圧が含まれる。合併症には、貧血および胆石をもたらす形成不全および溶血性クリーゼの再発、多系統疾患（腎臓、肝臓、肺）、麻薬乱用、脾臓による捕捉症候群、急性胸部症候群、持続勃起症の結果としての勃起機能不全、失明／視覚障害、神経学的症候および卒中、関節破壊、胆石、感染症、例えば肺炎、胆嚢炎、骨髄炎、および尿路感染症、形成不全クリーゼ、腎臓の組織死、脾臓機能喪失、および下腿潰瘍をもたらすパルボウィルスＢ１９感染症が含まれる。
【０２４０】
鎌状赤血球貧血は、鎌状赤血球形質を有する２種のキャリアから生じ、鎌状赤血球形質の全てのキャリアについて遺伝カウンセリングが推奨される（アフリカ系アメリカ人の約１２人に１人が鎌状赤血球形質を有する）。鎌状赤血球貧血の出生前診断が利用可能である。感染症の迅速な治療、適切な酸素化、および脱水症防止によって、赤血球の鎌状化を防止することができる。抗生物質およびワクチン接種によって、感染症を防止することができる。組織の脱酸素を防止するために患者は、激しい身体活動、特に脾臓が膨張している場合、情緒的ストレス、高高度および非加圧の航空飛行などの低酸素含有量を伴う環境、感染症および脱水症の既知の発生源を避けるよう助言される。
【０２４１】
患者は、蒼白、黄色皮膚／目、疲労、息切れ、頻脈、成長および思春期遅発症、感染症への感受性、下腿潰瘍、黄疸、骨痛、腹痛発作、および発熱を含む一般的症候について評価されることになる。血尿（血尿症）、頻尿、過度の口渇、痛みを伴う勃起（該疾患を有する１０〜４０％の男性に生じる持続勃起症）、胸痛、および視力低下／失明を含む他の症候も監視されよう。
【０２４２】
鎌状赤血球貧血を有する患者を診断し監視するための試験には、完全血球算定（ＣＢＣ）、ヘモグロビン電気泳動、および鎌状赤血球試験が含まれよう。他の試験には、鎌状赤血球を示す末梢血液塗抹、尿円柱または血尿、血清ヘモグロビンの低下、ビリルビン増加、高白血球数、血清カリウムの増加、血清クレアチニンの上昇、および血中酸素飽和状態の低減が含まれよう。ＣＴスキャンまたはＭＲＩは、特定の環境下の卒中を露呈し得る。
【０２４３】
実施例４
臨床試験における高血圧のためのＢＨ４投与
予備試験
先の試験は、ＢＨ４の非経口注入または単回経口投与を使用した。したがって、数日から数週間にわたる長期の経口用ＢＨ４が内皮機能不全に持続的改善をもたらすかどうかは知られていなかった。この試験は、高血圧患者におけるＢＨ４での長期的経口療法が、内皮機能不全改善の結果としての動脈圧（ＢＰ）の低下をもたらすかどうかを評価するものである。経口用ＢＨ４の作用期間およびＢＨ４の様々な用量に対する高血圧患者の応答を研究するために、２つの試験を実施した。
【０２４４】
制御されない高血圧を有し、従来の安定な降圧療法を受けていた場合（ＢＰ≧１３５／８５）、または新規に高血圧と診断された場合（ＢＰ≧１４０／９０）で、１８〜７５歳の年齢の対象を採用した。患者は、現在の降圧療法を継続され、それを変更なしに維持した。非対象基準は、妊娠の可能性がある女性対象、高血圧の第２の原因であることが既知の症候性冠状動脈または末梢血管疾患の近年の病歴、制御されない重篤な高血圧（ＢＰ＞収縮期１８０ｍｍＨｇおよび／または拡張期１１０ｍｍＨｇ）、平均余命を６カ月未満に制限すると思われる重篤な合併症、腎臓または肝臓の機能不全、最近６週間以内の任意の降圧併用療法の変更、および任意の出血性障害とした。ＢＨ４粉末をＳｃｈｉｒｃｋｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｊｏｎａ、スイス）から得た。ＢＨ４がビタミンＣと併用投与される場合、ビタミンＣを１ｍｇ／ＢＨ４を１ｍｇの比でＢＨ４をビタミンＣと混合して、適切な寸法のカプセルに入れた。対象には、そのピル剤を冷蔵庫または冷凍庫で保存するように助言した。
【０２４５】
試験１：経口用ＢＨ４の作用の開始時間および期間
８人の対象を採用し、３人は男性で、平均年齢は６０．５±１０．９歳であった。対象は２群の一方に割り当てられた。１群は、１日にＢＨ４を１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）８週間摂取し、他方の群は１日にＢＨ４を２分割して経口用量で与えられる５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）を８週間摂取した。これらの用量は、フェニルケトン尿症に使用されるＢＨ４の用量をベースにした。治療期間中は毎週、ならびに終了の１週間後および６週間後にＢＰ測定を実施した。平均血圧を（ＳＢＰ＋２×ＤＢＰ）／３として算出した。
【０２４６】
上腕動脈内皮依存および非依存関数を、超音波を使用して、ベースライン、ＢＨ４治療の８週間後、および療法終了の１週間後に測定した。この技術は、Ｐｒａｓａｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０００年１０１（２０）：２３４９〜５４頁に記載されているように実施した。簡潔には、１１ＭＨｚの高解像度超音波振動子（Ａｃｕｓｏｎ  Ｉｎｃ）を使用して、温度制御された室内で、利き手ではない腕の肘前窩上方の上腕直径を測定した。前腕のＢＰカフを＞２００ｍｍＨｇまで５分間膨張し、急速に収縮させ、充血開始１分後に上腕直径を測定することによって、血流依存性血管拡張（ＦＭＤ）を測定した。全ての測定について３つの直径を、３つの個別の拡張終期フレームで測定し平均した。ＦＭＤを示す最大上腕動脈拡張を得るために、以下の方程式を使用した。（充血した平均直径−平均ベースライン直径）÷平均ベースライン直径×１００。内皮依存性血管拡張性の応答を測定するために、対象はニトログリセリン０．４ｍｇを舌下投与され、５分後に上腕直径を上記のように測定した。内皮依存性血管拡張を得るために、以下の方程式を使用した。（ニトログリセリン後の平均直径−ベースライン平均直径）÷ベースライン平均直径×１００。
【０２４７】
試験１および試験２の両方について、統計的分析後の第１のエンドポイントは、ＢＨ４療法中の収縮期、平均、および拡張期ＢＰの低下であった。第２のエンドポイントには、ＦＭＤとしての内皮機能の改善が含まれる。反復した測定データの線形混合効果モデルを使用して、ベースラインから治療期間終了までのＢＰの変化および１００ｍｇ用量群と２００ｍｇ用量群との間の変化の差を分析した。週に関する二次項は、治療期間にわたって非線形トレンドを占めるモデルに含まれていた。用量、週、および週の２乗は、該モデルの主効果項であり、用量割る週および用量割る週の２乗は、該モデルの相互作用項であった。相互作用項は、２つの用量群の間の変化パターンの差を示している。ＦＭＤデータは、ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ−検定を使用して分析した。全ての結果を平均±ＳＤとして表し、ｐ値＜０．０５は統計的に有意であるとみなす。
【０２４８】
試験１の結果は、両群において、ＢＨ４による収縮期（ｐ＝０．００５二次トレンド）および平均動脈ＢＰ（ｐ＝０．０１）の有意な低下があったことを示した。図Ａは血圧応答を示す。各値は、平均±標準誤差である。ＳＢＰ＝収縮期血圧、ＭＢＰ＝平均血圧、ＤＢＰ＝拡張期血圧；ｐ値はＡＮＯＶＡによって決定した。
【０２４９】
結果は、収縮期ＢＰが平均で３週間後に１３±９ｍｍＨｇ（ｐ＝０．００４）および５週間後に１５±１５ｍｍＨｇ（ｐ＝０．０４）だけ低下し、この低下が治療の８週間持続したことを示した。ＢＰは、療法終了の６週間後に治療前のレベルに戻った（ｐ＝ｎｓ、ベースラインと比較）。ＢＨ４で心拍には有意な変化がなく、拡張期ＢＰの変化は、統計的有意性に達しなかった。ＢＨ４用量５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの間にも、統計的に有意な差はなかった。
【０２５０】
上腕動脈の血流依存性血管拡張は、平均でＢＨ４の８週間後に３．４±１％〜８．２±３．４％（ｐ＝０．０５、ｎ＝６）上昇し、療法終了の６週間後にベースラインレベルに戻った（３．７±１．３％、ｐ＝ｎｓ、ベースラインと比較）。ニトログリセリン媒介性血管拡張には依然として変化がなかった（ＢＨ４の前１１．９±３％およびＢＨ４の後１６．１±５％、ｐ＝０．１）。
【０２５１】
試験２：経口用ＢＨ４の用量反応の研究
参加に適するとされた２０人の対象のうち、経過観察の採用に関して返答が得られなかったために４人をならし期間（ｒｕｎ−ｉｎ  ｐｈａｓｅ）中に排除した。男性の対象は６人であり、平均年齢は５９．５±８．３歳であった。８人の対象が、経口用ＢＨ４を２００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．（１日２回）摂取し、８人が経口用ＢＨ４を１００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．摂取した。２群間にベースラインの特徴の有意な差はなかった。ＢＨ４は１：１の比でビタミンＣと混合されたので、全ての対象は、最初の２週間は１日２回、割り当てられたＢＨ４用量でビタミンＣを摂取した。２週間のならし期間後、対象は割り当てられた用量のＢＨ４だけをその後４週間摂取した。ならし期間および治療期間の間に、心拍およびＢＰ測定を毎週行った。平均血圧は（ＳＢＰ＋２×ＤＢＰ）／３として算出した。次いでＢＨ４を終了し、終了後１週目および４週目に経過観察を実施し、そこでＢＰおよび心拍測定を行った。ＢＨ４療法の終了時およびＢＨ４終了の１カ月後、薬物治療を開始する前に、定期的化学検査およびＬＦＴ’ｓを行った。
【０２５２】
試験２では、２週間のビタミンＣならし期間の終了時、４週間の経口用ＢＨ４療法の終了時、およびＢＨ４終了の４週間後に、上腕動脈内皮依存性および非依存性関数を上記のように測定した。
【０２５３】
ビタミンＣでのならし期間中、いずれの群にも心拍またはＢＰに有意な変化はなかった。１６人の対象における収縮期、拡張期、および平均動脈ＢＰは、それぞれビタミンＣの２週間前は１５２±１１、８４±１３、１０６±１０ｍｍＨｇであり、ビタミンＣの２週間後は１４８±１９、８６±１１、および１０６±１２ｍｍＨｇであった（全てｐ＝ｎｓ）。
【０２５４】
２００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．の経口用ＢＨ４を与えられた対象は、収縮期（ｐ＝０．０３）および平均ＢＰ（線形トレンド分析によりｐ＝０．０４）が有意に上昇した。図Ｂは、２００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．のＢＨ４で治療を受けた群の血圧応答の図である。値は平均±標準誤差である。ＳＢＰ＝収縮期血圧、ＭＢＰ＝平均血圧、ＤＢＰ＝拡張期血圧；ｐ値はＡＮＯＶＡによって決定した。拡張期ＢＰの低下は、統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．０８）。平均ＢＰは、１週間後有意に低かった（ｐ＝０．０２）。その後数週間ＢＰはさらに有意に低下し、収縮期ＢＰが平均１６ｍｍＨｇ低下した３週間後に底に達した。ｐ＝０．０４（図Ｂ）。療法の終了１週間後、ＢＰは依然として低かったが、ＢＨ４の終了４週間後にはＢＰは上昇し、ベースラインレベルに戻った。
【０２５５】
２００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．のＢＨ４で、ＦＭＤに有意な改善があった（ｎ＝７）。ＦＭＤは、ＢＨ４療法の開始時の３．７±３％から療法４週間後の７．１±４．９％まで改善した（ｐ＝０．０１６）。ＢＨ４療法の終了１カ月後、ＦＭＤはベースラインレベルに戻った（ベースラインと比較して３．２±１．１％、ｐ＝０．６）。
【０２５６】
１００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．のＢＨ４を与えられた対象では、ＢＰに統計的に有意な変化が観測されなかった。図Ｃは、１００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．のＢＨ４で治療を受けた群の血圧応答の図である。値は平均±標準誤差である。ＳＢＰ＝収縮期血圧、ＭＢＰ＝平均血圧、ＤＢＰ＝拡張期血圧。１００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．または２００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．で治療を受けたいずれの群にも、ＢＨ４での心拍の有意な変化はなかった。
【０２５７】
１００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．のＢＨ４を与えられた対象ではＦＭＤに有意な変化がなかった（５．３±２．５％対６．２±３．５％；ｐ＝０．５５）。試験中いずれの群にも、ニトログリセリン媒介性の内皮依存性血管拡張の有意な変化はなかった。
【０２５８】
いずれの試験中も有意な有害イベントはなかった。結果は、制御されにくい高血圧または新規に診断された高血圧のいずれかを有する対象の動脈ＢＰを低下するのに、経口用ＢＨ４での長期治療が有効であることを示している。この効果は２００ｍｇｂ．ｉ．ｄ．以上の用量で観測され、心拍に変化はなかった。対象には、やはりＢＰの低下をもたらす用量でのＢＨ４療法後に、内皮機能不全の有意な改善があった。ＢＰの低下は、療法の１週間以内に明らかとなり、最大８週間の継続療法の間、タキフィラシーなしに持続した。血圧は、療法終了後少なくとも１週間は依然として低かったが、４週間後にはベースラインに戻った。経口用ＢＨ４は、任意の重篤な副作用なしに十分耐えられると思われた。
【０２５９】
さらなる臨床試験
第２相の多施設無作為化二重盲検プラシーボ制御平衡試験を開始して、制御されにくい全身性高血圧の対象の血圧に対する、１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）８週間投与される１日に１０ｍｇ／ｋｇの６Ｒ  ＢＨ４の効果を評価した。動脈収縮期血圧（ＳＢＰ）、動脈拡張期血圧（ＤＢＰ）、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）活性、および内皮機能不全を含む幾つかのパラメータを評価した。２型糖尿病および制御されにくい高血圧の両方を有する患者で、インスリン感受性への効果も評価する。この試験中、降圧療法および適用可能ならば糖尿病療法には、依然として変更は加えられない。
【０２６０】
この試験の対象基準には、無作為化前の少なくとも３カ月間同時に一貫して摂取される作用機序が異なる少なくとも２種の通常の降圧剤を使用しても制御されにくい立証済み本態性高血圧の病歴（２つの場合を個別に測定したＢＰ収縮期少なくとも１４０ｍｍＨｇおよび／または拡張期９０ｍｍＨｇ）、最初の２週間のスクリーニング期間中、平均ＳＢＰが少なくとも１３５ｍｍＨｇであり１６０ｍｍＨｇ以下、平均ＤＢＰが少なくとも８５ｍｍＨｇであり１１０ｍｍＨｇ以下の範囲内である平均ＳＢＰおよび平均ＤＢＰが含まれる。さらに糖尿病の患者は、少なくとも３カ月間同じ療法を使用して治療を受けていた２型糖尿病の立証済み病歴を有していなければならない。
【０２６１】
試験の非対象基準には、妊娠の計画または可能性があること；ＢＨ４の任意の製剤を用いた前治療；６Ｒ  ＢＨ４の任意の賦形剤に対する既知のアレルギーまたは過敏性；高血圧について既知の第２の原因；出血性障害、失神もしくは眩暈の病歴、胃腸の重篤な逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、症候性冠状動脈もしくは末梢血管疾患、不整脈、臓器移植、臓器不全、または１型糖尿病などの、試験への参加または安全性を妨害すると思われる合併症または状態；平均余命を６カ月未満に制限すると思われる任意の重篤な合併症；血清クレアチニン＞２．０ｍｇ／ｄＬまたは正常値上限の２倍を超える肝酵素レベル；（ａ）葉酸塩代謝を抑制することが知られている任意の薬物（例えばメトトレキサート）、（ｂ）レボドパ、または（ｃ）任意のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）５阻害剤（例えば、Ｖｉａｇｒａ（登録商標）、Ｃｉａｌｉｓ（登録商標）、Ｌｅｖｉｔｒａ（登録商標）、またはＲｅｖａｔｉｏ（商標））もしくは任意のＰＤＥ３阻害剤（例えばシロスタゾール、ミルリノン、またはベスナリノン）との併用療法が含まれる。
【０２６２】
対象基準を満たし非対象基準によって排除されなかった対象は、６Ｒ  ＢＨ４またはプラシーボを８週間の治療期間中に摂取し、第９週および第１２週に経過観察訪問を行うことになる（即ち、１週間後および４週間後の経過観察）。治療期間中、ＢＰトラフおよび心拍（ＨＲ）を毎週測定し、両方の経過観察訪問でＢＰおよびＨＲを測定する。ＢＰを得るための方法は、全試験を通して標準化され、ＢＰ測定のタイミングは、各対象に合わせて標準化される。定期的臨床検査およびバイオマーカーのための血液および尿サンプルを、第０、４、８、および１２週に収集する。糖尿病コホートについて、空腹時のインスリンおよびグルコース濃度、ならびにＨｇｂ  Ａ１Ｃのための血液を、第０、８、および１２週に収集する。ＥＣＧを第８週および第１２週に評価する。
【０２６３】
各訪問時に生体徴候を記録する。ｍｍＨｇとして測定するＳＢＰおよびＤＢＰ、１分当たりの脈拍としての心拍（ＨＲ）、ならびに１分当たりの呼気としての呼吸数（ＲＲ）。健康診断には、体重、一般的な外観、頸部、胸部／肺、心音、腹部、および下肢の評価が含まれる。
【０２６４】
２週間のスクリーニング期間の間、各３回の訪問時にＢＰを３回測定する（１０分間内に３回反復）。これらの９つの測定値を使用してＢＰが対象基準を満たすかどうかを決定することによって、平均ＳＢＰおよびＤＢＰ値を算出する。無作為化の後、ＢＰを再度３回測定し（第０週の訪問）、これら３つの値の平均をベースライン値とする。
【０２６５】
第１週で始まる治療期間中、週毎のＢＰトラフ測定値を朝の試験薬投与の前に得る。ＢＰは、１日のうちおよそ同じ時に測定すべきである（約９０分以内）。
【０２６６】
標準の１２誘導心電図を記録し、以下の測定値を収集する。心拍、心調律、間隔測定（即ちＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴ、ＱＴｃ）、および軸。完全自動の自由行動下２４時間ＢＰ監視（ＡＢＰＭ）装置を、第０週および第８週の治療で２４時間適用する。ＡＢＰＭによって、収縮期および拡張期ＢＰを測定し記録する。多数のＢＰ測定値をプロットして、ＢＰプロファイルを表示することができる。血液（血漿）および尿サンプルを収集して、内皮機能不全および酸化ストレスの標準的バイオマーカーを評価する。また数人の対象が、超音波検査を使用してＦＭＤ、体血管抵抗、および動脈コンプライアンスの追加測定を受ける。
【０２６７】
血液および尿サンプルでの臨床検査評価には、以下が含まれる。
血液学：白血球数と分類、赤血球数、血小板数、ヘモグロビン、およびヘマトクリット
血液生化学検査：アルブミン、アルカリフォスファターゼ、ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）、ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）、総ビリルビン、ＢＵＮ、カルシウム、塩化物、総コレステロール、クレアチニン、ＧＧＴ、グロブリン、グルコース、ＬＤＨ、リン、カリウム、総タンパク質、ナトリウム、および尿酸
空腹時（４〜６時間）血清脂質：トリグリセリド、総コレステロール、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）
２型糖尿病を有する対象における追加の血液生化学検査：空腹時グルコースおよびインスリン、ならびにＨｇｂＡ１Ｃ
検尿：定期検査：外観、色、ｐＨ、比重、ケトン、タンパク質、グルコース、ビリルビン、亜硝酸塩、ウロビリノーゲン、および顕微鏡検査
標準バイオマーカー（以下）に対して収集される朝一番の排尿サンプル：微量アルブミン尿
内皮機能不全および酸化ストレスのバイオマーカー：標準的バイオマーカー（血漿および尿）：硝酸塩／亜硝酸塩、ｃＧＭＰ、およびイソプラスタン
肥満度指数（ＢＭＩ）ならびに空腹時血清インスリンおよびグルコース濃度の結果を使用して、２型糖尿病の対象のインスリン感受性を評価する。ＨｇｂＡ１Ｃも測定する。
【０２６８】
試験の完了時、１日１０ｍｇ／ｋｇの経口用ＢＨ４での治療の、血圧、内皮機能、およびインスリン感受性への効果を評価する。本発明は、収縮期および／または拡張期血圧の統計的に有意な減少が観測されることを企図する。内皮機能および／またはインスリン感受性の測定値も、ＢＨ４での治療後に改善し得る。１日当たり２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内の追加用量の効果を、さらなる試験で評価する。
【０２６９】
実施例５
ＰＤＥ５阻害剤と組み合わせたＢＨ４のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
この試験によって、ＰＤＥ５阻害剤クエン酸シルデナフィルと組み合わせた高用量の６Ｒ−ＢＨ４の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心血管系効果を評価した。処理済みおよび未処理の研究用純血種の雄ビーグル犬８匹に、以下の表に記載の２重ラテン方格クロスオーバーデザインで投与した。全ての動物は、強制経口投与によって投与された。試験物質は５ｍＬ／ｋｇの用量で投与され（併用投与については総用量１０ｍＬ／ｋｇ）、対照動物には１０ｍＬ／ｋｇの用量で投与した。３００ｍｇの錠剤として提供された６Ｒ−ＢＨ４（サプロプテリン二塩酸塩）（錠剤１個当たり１００ｍｇの有効な６Ｒ−ＢＨ４）を、乾燥材を用いて室温で保存した。
【０２７０】
【表２】
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治療の開始時、動物は月齢約７〜１０カ月であり、投与前のそれらの体重は、７．８〜１２．０ｋｇの範囲であった。
【０２７１】
治療開始の少なくとも２週間前に、動物を終夜絶食させ、麻酔をし、心電図（ＥＣＧ）および血圧送信機を腹部に移植し、腹壁を縫合した。血圧カテーテルを動脈に配置し、腹大動脈に向かって進めた。動物を、死亡、異常性、ならびに疼痛および苦痛の徴候について１日２回（午前および午後）チェックした。観測されるさらなる知見を記録した。全ての動物が、計画されていた試験終了まで生存した。
【０２７２】
投与前の期間中（投与の前日を含む）に３回、投与期間の３日目、１０日目に詳細な観察を行った。各投与日には、投与の少なくとも９０分前にＥＣＧおよび血圧測定値を記録し、投与後は少なくとも８時間継続し、次いで投与後少なくとも２４時間通して各１時間に一定期間中、少なくとも１５分間記録した。血圧測定値には、収縮期、拡張期、ならびに平均動脈圧および脈圧（収縮期−拡張期）が含まれていた。各投与日には、投与前ならびに投与の約２、４、８、１２、および２４時間後に血圧評価を行った。
【０２７３】
ＲＲ間隔、ＱＴ、および心拍修正したＱＴ（Ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａ法を使用するＱＴｃ）を含むＥＣＧ測定値の定量的評価を実施した。
【０２７４】
陽性変力作用（＋ｄＰ／ｄｔ最大値）および心拍を、投与前ならびに投与の約２、４、８、１２、および２４時間後の左室圧信号から算出した。
【０２７５】
心血管系作用および毒性の評価は、死亡、臨床徴候、体重、腹部温度測定、心電図分析および血行動態データ（収縮期、拡張期、および平均動脈圧）、変力状態（＋ｄＰ／ｄｔ最大値）、ならびに心拍を含む心血管系パラメータをベースにした。様々な治療について投与後２４時間にわたる平均収縮期圧を、図Ｄに示す。様々な治療について投与後２４時間にわたる平均拡張期圧を、図Ｅに示す。様々な治療について投与後２４時間にわたる平均動脈圧を、図Ｆに示す。様々な治療について投与後２４時間にわたる平均動脈脈拍圧を、図Ｇに示す。平均（＋ｄＰ／ｄｔ最大値）を図Ｈに示す。平均心拍を図Ｉに示す。
【０２７６】
ＥＣＧで測定したＱＴ間隔は、クエン酸シルデナフィルを単独で、または６Ｒ−ＢＨ４と組み合わせて与えられた動物において投与の２時間後および４時間後に減少した。ＱＴ間隔は、クエン酸シルデナフィル単独と、６Ｒ−ＢＨ４との組合せとの間で異なっていた。６Ｒ−ＢＨ４を単独で与えられた動物において、対照からはＱＴ変化は見られなかった。したがってＱＴ変化は、クエン酸シルデナフィル投与のみに帰するものであった。心拍修正されたＱＴ間隔（ＱＴｃ）に変化は観測されなかった。ＱＴｃによってＱＴ間隔データが正規化されたことは、ＱＴ間隔の減少がクエン酸シルデナフィル投与後に見られた心拍上昇（ＲＲ間隔の減少）の結果であったことを示している。試験物質投与の前および後の両方で、２匹の動物が発作性心室頻拍を示し、他の動物が単独の一過性不整脈を示した。不整脈は、試験物質の結果ではなく、血圧測定のために左心室内に埋め込まれたカテーテルに帰するものであった。
【０２７７】
治療関連収縮期圧、平均動脈圧、または＋ｄＰ／ｄｔ最大値の変化は観測されなかった。拡張期圧は、全ての時点にわたって対照と比較した場合、組合せ投与またはクエン酸シルデナフィル単独を与えられた動物において有意に低下した。この効果は、６Ｒ−ＢＨ４単独での投与後には観測されなかった。クエン酸シルデナフィル単独と、６Ｒ−ＢＨ４との組合せとの効果の間には有意な差が見られなかったが、これは主にクエン酸シルデナフィルの効果であったことを示す。６Ｒ−ＢＨ４とクエン酸シルデナフィルとの併用投与は、この効果を増大することなく、抑制することもなかった。
【０２７８】
心拍は、全ての時点にわたって、クエン酸シルデナフィル単独または６Ｒ−ＢＨ４との組合せを与えられた動物において有意に上昇した。クエン酸シルデナフィル単独と、６Ｒ−ＢＨ４と組み合わせたクエン酸シルデナフィルとの間に有意な差は認められなかったが、これは主にクエン酸シルデナフィルの効果であり、６Ｒ−ＢＨ４がこの効果を増大することなく、軽減することもなかったことを示す。
【０２７９】
動脈脈拍圧は、クエン酸シルデナフィル単独を与えられた動物で、投与の２、４、および８時間後に有意に上昇した。動脈脈拍圧は、クエン酸シルデナフィルを投与し、６Ｒ−ＢＨ４と組み合わせて投与した２時間後および４時間後に有意に上昇した。これらの変化は、これらの治療後に見られた拡張期圧の低下に続発したものと考えられる。
【０２８０】
動脈脈拍圧は、２時間および８時間の時点において、クエン酸シルデナフィル単独の投与と比較して、クエン酸シルデナフィルおよび６Ｒ−ＢＨ４の組合せを与えられた動物で有意に低下したが、これはクエン酸シルデナフィルによって引き起こされた脈圧上昇に対して、６Ｒ−ＢＨ４が軽減作用を及ぼし得ることを示す。
【０２８１】
試験の結果は、クエン酸シルデナフィルおよび６Ｒ−ＢＨ４と組み合わせたクエン酸シルデナフィルが、犬の拡張期圧の低下をもたらしたことを示した。この血圧低下には、心拍の上昇および動脈脈拍圧の低下が伴っていた。血圧の低下および心拍の上昇は、犬におけるクエン酸シルデナフィルの効果であることが立証される。心拍および脈圧の上昇は、血圧の上昇に続発することが結論付けられた。６Ｒ−ＢＨ４単独の効果は、測定された心血管系パラメータのいずれにも認められなかった。
【０２８２】
記載のようにこれらの結果は、ＰＤＥ５阻害剤と６Ｒ−ＢＨ４との組合せが、これらの犬においてシルデナフィル単独でも観測されたであろう、クエン酸シルデナフィル誘発性の観測された脈圧上昇を軽減するという予想外の効果を示唆するものであった。
【０２８３】
１ｋｇ当たり１００ｍｇの６Ｒ−ＢＨ４を、１ｋｇ当たり３０ｍｇのクエン酸シルデナフィルに添加しても、これらの犬におけるクエン酸シルデナフィルの心血管系作用に悪影響を及ぼさなかった。
【０２８４】
本明細書に開示または請求される組成物および／または方法の全ては、過度の実験なしに本開示に照らして生成し実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して述べてきたが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および／または方法、ならびにその方法のステップまたは一連のステップに変形形態を適用できることが、当業者には理解されよう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関係する幾つかの薬剤で本明細書に記載の薬剤を代替できるとともに、同一または類似の結果が達成されることが明らかとなろう。全てのかかる類似の代替および改変は、添付の請求項の範囲で定義される本発明の精神、範囲、および概念に含まれるとみなされることが、当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】図１は、ＮＯの生成の図である。
【図２】図２は、内皮機能不全およびＢＨ４欠乏の図である。
【図３】図３は、二次的ＢＨ４欠乏の病態生理の図である。
【図４】図４は、二次的ＢＨ４欠乏および非結合ｅＮＯＳの図である。
【図５】図５は、糖尿病およびＢＨ４欠乏の図である。
【図６】図６は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｂによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図７】図７は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ａによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図８】図８は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｆによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図９】図９は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｊによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１０】図１０は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｋによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１１】図１１は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｃによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１２】図１２は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｄによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１３】図１３は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｅによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１４】図１４は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｈによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１５】図１５は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｏによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１６】図１６は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｇによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１７】図１７は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｉによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１８】図１８は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｌによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図１９】図１９は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｍによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図２０】図２０は、（６Ｒ）−ＢＨ４形態Ｎによって示される特徴的なＸ線回折パターンの図である。
【図２１】図２１は、１日に５ｍｇ／ｋｇの用量のＢＨ４を投与されたヒトの血圧応答の図である。
【図２２】図２２は、２００ｍｇの用量のＢＨ４を１日に２回投与されたヒトの血圧応答の図である。
【図２３】図２３は、１００ｍｇの用量のＢＨ４を１日に２回投与されたヒトの血圧応答の図である。
【図２４】図２４は、ＢＨ４およびシルデナフィルをそれぞれ単独で、または組み合わせて治療した後の、投与後２４時間にわたる平均収縮期圧の図である。
【図２５】図２５は、ＢＨ４およびシルデナフィルをそれぞれ単独で、または組み合わせて治療した後の、投与後２４時間にわたる平均拡張期圧の図である。
【図２６】図２６は、ＢＨ４およびシルデナフィルをそれぞれ単独で、または組み合わせて治療した後の、投与後２４時間にわたる平均動脈圧（ａｒｔｅｒｉａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の図である。
【図２７】図２７は、ＢＨ４およびシルデナフィルをそれぞれ単独で、または組み合わせて治療した後の、投与後２４時間にわたる平均動脈脈拍圧（ａｒｔｅｒｉａｌ  ｐｕｌｓｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の図である。
【図２８】図２８は、ＢＨ４およびシルデナフィルをそれぞれ単独で、または組み合わせて治療した後の、投与後２４時間にわたる平均（＋ｄＰ／ｄｔ最大値）の図である。
【図２９】図２９は、ＢＨ４およびシルデナフィルをそれぞれ単独で、または組み合わせて治療した後の、投与後２４時間にわたる平均心拍の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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2009518415.tif 000041
2009518415.tif 000042
2009518415.tif 000043
2009518415.tif 000044
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