(57)【要約】  本開示は、ｉｎｌＢ又はｉｎｌＢとの結合特性に関して選択された新規の試薬の単離に関する。ｉｎｌＢは、受容体チロシンキナーゼＭｅｔと結合し活性化させるリステリア・モノサイトゲネスの表面局在タンパク質である。ｉｎｌＢは、肝細胞、内皮細胞株及び上皮細胞株を含む多くの細胞の浸潤を促進し、細菌のアクチン介在性の内在化を活性化する。ｉｎｌＡは、リステリア菌のゲノムで同定された表面局在ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）タンパク質の大グループに属する。ｉｎｌＡは、リステリア・モノサイトゲネスをヒト腸上皮等の非食細胞に侵入させることができ、上皮細胞に付着するのに、及び上皮細胞への取り込みを誘導するのに十分である。本開示のｉｎｌＢ及びｉｎｌＡに対する核酸リガンドは、食品サンプル、臨床サンプル又は環境サンプル中のｉｎｌＢ、ｉｎｌＡ、又はリステリア菌の有無を決定するのに有用となり得る。これらは、感染促進ｉｎｌＢ又はｉｎｌＡと結合し、これらを不活性化させることによって、リステリア菌の感染と競合する作用因子としても有用となり得る。１つの目的は、食品サンプル、臨床サンプル又は環境サンプル中のｉｎｌＢ、ｉｎｌＡ、又はリステリア菌の有無を検出するように設計した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断又はバイオセンサプラットフォームにこれらの核酸リガンドを組み込むことである。もう１つの目的は、リステリア菌の感染を治療又は予防する方法に、これらの核酸リガンドを用いることである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア・モノサイトゲネスの存在に関してサンプルを分析する方法であって、
リステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＢタンパク質及びリステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＡタンパク質から成る群から選択されるタンパク質と特異的に結合するアプタマーに、前記サンプルを曝露すること、及び
前記アプタマーが前記サンプル中に存在する前記タンパク質と結合する場合に、リステリア・モノサイトゲネスが該サンプル中に存在すると決定することを含む方法。
【請求項２】
前記アプタマーが、配列ｇｇｇｎzｇｇｇｈxｇｇｇｎｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（「ｎ」はａ、ｃ、ｇ、又はｔを示し、「ｈ」はａ、ｃ、又はｔを示し、ｚは１又は２であり、ｘは１又は２である）を含む核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アプタマーが、配列番号１及び配列番号２から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アプタマーが、配列番号１３及び配列番号１６から成る群から選択される配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アプタマーが、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アプタマーが、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５から成る群から選択される配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アプタマーが、配列番号５の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アプタマーが、配列番号１２の配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記アプタマーが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アプタマーが、配列ｇｇｇｙａｇｇｇｇｒｇｇｇｗｇｇｇ（配列番号１８）（「ｙ」はｃ又はｔを示し、「ｒ」はｇ又はａを示し、「ｗ」はｔ又はａを示す）を含む核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アプタマーが、配列番号２４及び配列番号２５から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物においてリステリア・モノサイトゲネスの感染を治療する方法であって、リステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＢタンパク質及びリステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＡタンパク質から成る群から選択されるタンパク質と特異的に結合するアプタマーを、前記哺乳動物にリステリア・モノサイトゲネスの感染を低減するのに十分な濃度で投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記アプタマーが、配列ｇｇｇｎzｇｇｇｈxｇｇｇｎｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（「ｎ」はａ、ｃ、ｇ、又はｔを示し、「ｈ」はａ、ｃ、又はｔを示し、ｚは１又は２であり、ｘは１又は２である）を含む核酸分子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アプタマーが、配列番号１及び配列番号２から成る群から選択される配列を含む、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アプタマーが、配列番号１３及び配列番号１６から成る群から選択される配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アプタマーが、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択される配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記アプタマーが、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５から成る群から選択される配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アプタマーが、配列番号５の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記アプタマーが、配列番号１２の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アプタマーが、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記アプタマーが、配列ｇｇｇｙａｇｇｇｇｒｇｇｇｗｇｇｇ（配列番号１８）（「ｙ」はｃ又はｔを示し、「ｒ」はｇ又はａを示し、「ｗ」はｔ又はａを示す）を含む核酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記アプタマーが、配列番号２４及び配列番号２５から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はａであり、ｚは１であり、ｈはｃであり、ｘは１であり、ｎ2はｇである）を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項２４】
配列番号１１の配列を含む、請求項２３に記載のアプタマー。
【請求項２５】
配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はａであり、ｚは１であり、ｈはａであり、ｘは２であり、ｎ2はｔである）を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項２６】
配列番号１２の配列を含む、請求項２５に記載のアプタマー。
【請求項２７】
配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はｃ又はｔであり、ｚは２であり、ｈはａであり、ｘは１であり、ｎ2はｔである）を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項２８】
配列番号１３の配列を含む、請求項２７に記載のアプタマー。
【請求項２９】
配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はｔであり、ｚは１であり、ｈはａであり、ｘは１であり、ｎ2はａである）を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項３０】
配列番号１４の配列を含む、請求項２９に記載のアプタマー。
【請求項３１】
配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はｇであ
り、ｚは１であり、ｈはｔであり、ｘは１であり、ｎ2はａである）を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項３２】
配列番号１５の配列を含む、請求項３１に記載のアプタマー。
【請求項３３】
配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はｔであり、ｚは２であり、ｈはａであり、ｘは１であり、ｎ2はｃである）を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項３４】
配列番号１６の配列を含む、請求項３３に記載のアプタマー。
【請求項３５】
配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３から成る群から選択される配列を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項３６】
配列ｇｇｇｙａｇｇｇｇｒｇｇｇｗｇｇｇ（配列番号１８）（「ｙ」はｃ又はｔを示し、「ｒ」はｇ又はａを示し、「ｗ」はｔ又はａを示す）を含む核酸分子を含むアプタマー。
【請求項３７】
配列番号２４及び配列番号２５から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項３６に記載のアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、リステリア菌で標的となるインターナリンＢ（ｉｎｌＢ）及びインターナリンＡ（ｉｎｌＡ）及び他の特定の外部膜タンパク質と結合する新規の核酸リガンド（アプタマー）に関する。記載のアプタマー試薬は、インターナリンＢ、インターナリンＡ、及び他の特定のタンパク質の存在に関して、食品サンプル、臨床サンプル及び環境サンプル等のサンプルをスクリーニングするのに用いることができる。新規のＤＮＡアプタマーは、リステリア菌の有無の判定が必要とされる様々な用途でも潜在的に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
毎年、推定７６００万の食品媒介性の病気が米国で発生しており、３２５０００人の入院患者及び５０００人の死者を出している（Mead他「米国における食品関連の病気及び死亡」 Emerg. Infect. Dis. 5, 607-625（1999）を参照されたい）。リステリア・モノサイトゲネスは、世界中で少なくとも１１件のヒトの食品媒介性伝染病に関与しており、調理することなく摂取することができる調理済み食品に関係がある（Ben Embarek, P.K.「シーフードにおけるリステリア・モノサイトゲネスの存在、検出及び増殖：概説」 Int. J. Food Microbiol. 23, 17-34（1994）を参照されたい）。リステリア・モノサイトゲネスは、１年当たりわずか２５００症例の食品媒介性の病気の原因となるに過ぎないが、これは全食品関連死の１０％を占める。大多数のヒトリステリア症の症例は新生児で起こり、高齢者及び免疫不全者の致死率は２０％〜４０％になる（Farber他「食品媒介性病原菌リステリア・モノサイトゲネス」 Microbiol. Rev. 55, 476-511（1991）；Schuchat他「ヒトリステリア症の疫学」 Clin. Microbiol. Rev. 4, 169-183（1991）；「最新情報−多州にわたるリステリア症の大発生」 Centers for Disease Control & Prevention Morbid. Mortal. Weekly Rep. 47, 1117-1118（1999）；Jacquet他「１９９２年におけるフランスリステリア症大発生に関与した流行株に関する研究」 Appl. Environ. Microbiol. 61, 2242-2246（1995）を参照されたい）。病気の重症度、及び加熱処理せずに摂取することができる食品との関連のために、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）及び食品安全検査局（ＦＳＩＳ）が、１９８９年に調理済み（ＲＴＥ）食品におけるリステリア・モノサイトゲネスの存在に対してゼロトレランス方式を定めた。
【０００３】
政府の規制強化、食品加工及び製造の様態変化が、病原菌検出のためのより迅速で、より感度が高く、かつ費用効率が高い技術の開発に拍車をかけた。現在、市場ではリステリア・モノサイトゲネス又はリステリア種の検出に利用可能な多くの異なる方法が存在する。コスト及び感度の点から最も広く用いられている方法論は、従来の微生物学的な平板培養方法である。これらの方法は、様々なサンプルからリステリア・モノサイトゲネスを回収するのには効果的であるが、陽性結果がでるまでにサンプル採取後５日〜７日の時間がかかる。核酸増幅及び免疫化学技法を利用する迅速な方法によって、培養ベースの方法に比べて結果を得るまでの時間が改善され、ハイスループット自動化の可能性が与えられる。市場における現在の迅速な方法は、ＰＣＲ、プローブハイブリダイゼーション、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫蛍光測定法（ＥＬＦＡ）、ラテラルフロー及び磁性ビーズに基づく方法から成る。これらの測定法では、結果を得るまでの時間が２日〜４日に短縮するが、ほとんどが、感度を良好にするための、また、損傷又はストレス生物を回復させるための培養工程を必要とする。
【０００４】
結果を得るまでの時間が早くなれば、ハイスループット能による食品検査へのＰＣＲ法の採用が増大するが、従来の培養法に比べて、それらの使用に関わるコストが大きくなり、普遍的に受け入れられず、現在、一般に分子法の広範な使用は制限されている。ＰＣＲ
に基づく方法にも幾つかの制限がある。理論上は、ＰＣＲに基づく技術は、ゼロトレランス規制で義務付けられている、食品サンプル２５ｇ当たり１ＣＦＵ以下の検出レベルを提供する必要がある。しかし、多くの要因（低汚染レベル、小さい反応量に対する大きいサンプル量、及び食品マトリクス成分によるＰＣＲ反応の阻害を含む）によって、分析感度が悪化することによって、理論値には達しない（Norton, D.M.（2002） J AOAC Int. 85,
505-515を参照されたい）。また、ＰＣＲはＤＮＡの存在を検出するだけであり、病原菌の生死を示すことはできない。
【０００５】
これに対して、免疫学的方法は特異的抗体間の相互作用に依存し、標的生物を選択的に捕捉、標識又は検出して、特定の微生物の検出及び確認に広く用いられ、認められている。免疫学に基づく方法の広範な使用及び許容によって、食品における一般的な食品媒介性細菌（サルモネラ菌、リステリア菌、カンピロバクター菌、及び大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を含む）の検出用のありとあらゆる市販の試験キットがもたらされている。免疫学的検出に用いられる最も一般的なフォーマットであるＥＬＩＳＡの検出限界は１０3ｃｆｕ／ｍＬ〜１０5ｃｆｕ／ｍＬである（Churchill他「食品中のリステリア・モノサイトゲネス及び毒素リステリオリシンＯの検出」 J. Microbiol. Meth. 64, 141-170（2006）を参照されたい）。この検出限界を達成するには、サンプルをＥＬＩＳＡによる検出に適合させる前に、少なくとも２４時間、病原菌を増殖させることが必要であることが多い（de Boer他「食品媒介性微生物の検出及び分類の方法論」 Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130（1999）を参照されたい）。
【０００６】
多くの迅速な検出系で結果を得るまでの時間が改善されたにも拘らず、これらの方法の重大な限定特性のために、従来の培養増殖の必要条件が依然として残っている。また、これらの方法では、リアルタイムで生体分子を検出することができない。食品サンプルを分析するための、単純で、安価でかつ信頼性が高い検査に対する要求が増している。バイオセンサ技術は、リアルタイム又はほぼリアルタイムでのこれらの要求を満たす可能性がある（Alocilja他「食品安全性に関するバイオセンサの市場分析」 Biosensors and Bioelectronics 18, 841-846 (2003)；Hall「微生物学的食品媒介性ハザードを検出するためのバイオセンサ技術」 Microbes and Infection 4, 425-432（2002）；Deisingh他「細菌検出のためのバイオセンサ」 Can. J. Microbiol. 50, 69-77（2004）を参照されたい）。研究によって、バイオセンサは、最小限のサンプルの事前処理で複合サンプルにおいて広範囲の分析物を検出することができることが示されている（Hall「微生物学的食品媒介性ハザードを検出するためのバイオセンサ技術（Biosensor technologies for detecting microbiological foodborne hazards）」 Microbes and Infection 4, 425-432 (2002)；Deisingh他「細菌の検出のためのバイオセンサ（Biosensors for the detection of bacteria）」 Can. J. Microbiol. 50, 69-77 （2004）を参照されたい）。
【０００７】
生物学的検出用のバイオセンサは一般的に、物理的又は化学的トランスデューサーと接触する、受容体、核酸又は抗体等の生物学的認識成分を含む。シグナル伝達方法によって、バイオセンサを電気化学型、光学型、圧電型、熱型及び磁気型の５つの基本型に分けることができる。近年、リステリア・モノサイトゲネスの検出用のセンサが開発されている（Geng他「光ファイバー免疫センサを用いることによる低レベルのリステリア・モノサイトゲネス細胞の検出」Applied and Environmental Microbiology 70, 6138-6146（2004）；Leonard, P., Hearty, S., Wyatt, G., Quinn, J., O'Kennedy, R.（2005） J. Food Prot. 68, 728-735；Leonard他「表面プラズモン共鳴を用いる、汚染サンプル中の全リステリア・モノサイトゲネス細胞の検出のための一般的なアプローチ」 Biosensors and Bioelectronics 19 1331-1335（2004）；Tims, T.B., Dickey, S.S., Demarco, D.R., Lim,
D.V.「エバネセント波バイオセンサを用いる、２０時間以内の低レベルのリステリア・モノサイトゲネスの検出」（2001） Am. Clin. Lab. 20, 28-29を参照されたい）。これらの分析の感度及び特異性は、検出に用いる抗体に依存する。光ファイバー免疫センサ（
Ａｎａｌｙｔｅ２０００；Research International、ワシントン州ウッジンビル）の閾値感度は、リステリア・モノサイトゲネスの純培養では約１０3ＣＦＵ／ｍＬ、及び乳酸菌と培養した場合、１０4ＣＦＵ／ｍＬと測定された（Geng他「光ファイバー免疫センサを用いることによる低レベルのリステリア・モノサイトゲネス細胞の検出」 Applied and Environmental Microbiology 70, 6138-6146 （2004））。抗体がトランスデューサーと接触する捕捉因子であったので、予想通り、検出レベルは免疫学的方法に匹敵する。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方がバイオセンサ研究に利用されている。数十年間、ポリクローナル抗体は、検出試薬として用いられている（Breitling, F., Dubel, S.（1999）「組み換え抗体」 John Wiley and Sons Inc., New York, p. 154を参照されたい）。供給は制限されており、枯渇した在庫を補充するのには反復免疫付与が必要である。一方で、モノクローナル抗体については、同質の十分に特徴付けられた抗体の連続供給が可能である。モノクローナル抗体産生に関する幾つかの問題は、コストが高く、収率が低く、また熟練労働者が必要となることである。
【０００８】
１９９０年に始めて報告されたアプタマー（Tuerk, C., Gold, L.（1990） Science 249, 505-510；Ellington他「特異的なリガンドと結合するＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション」 Nature 346, 818-822（1990）を参照されたい）は、バイオセンサにおける生物学的認識成分として用いるのに理想的な候補物質として現れ、センサで用いられる従来の抗体を上回る利点を有する（Jayasena「アプタマー：診断において抗体と競合する新たな分類の分子」 Clin. Chem. 45:9, 1628-1650（1999）を参照されたい）。アプタマーは、アミノ酸、薬物、タンパク質及び細胞等の複雑な標的に対して生成することができる核酸リガンドである（Gopinath, S.C., Misono, T.S., Kawasaki, K., Mizuno, T., Imai, M., Odagiri, T., Kumar, P.K.「密接に関連したヒトインフルエンザウイルスを識別し、ヘマグルチニン媒介性膜融合を阻害するＲＮＡアプタマー」（2006） J. Gen. Virol. 87, 479-487；Cerchia, L.他「全細胞のＳＥＬＥＸ由来の中和アプタマーがＲＥＴ受容体チロシンキナーゼを阻害する」 PLoS Biol. 3, e123（2005）；Duconge, F., Pestourie, C., Boulay, J., Aissouni, Y., Gombert, K., Tavitian, B., de Franciscis, V., Libri, D.（2005） PLos Biol. 3, e123；Mori,T.他「ＮＦ−ｋＢの受容体アクチベータに対して選択されるＲＮＡアプタマーは、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのタンパク質に対する一般的な親和性を獲得する」 Nuc. Acids Res. 32, 6120-6128（2004）；Daniels, D.A.他「腫瘍細胞のＳＥＬＥＸによって同定されるＡテネイシン−Ｃアプタマー：指数関数的増殖によるリガンドの系統的進化」 Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 15416-15421（2003）を参照されたい）。抗体と同等の、又は場合によっては抗体よりも優れた選択性、特異性及び親和性を有する広範な標的に対してこの技法を用いて、数多くのアプタマーが選択されている。これらのオリゴヌクレオチドリガンドを得る技法は、米国特許第５，４７５，０９６号及び米国特許第５，２７０，１６３号に記載され、ＳＥＬＥＸ（指数関数的増殖によるリガンドの系統的進化）と呼ばれた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析にアプタマーを用いることの従来の抗体を上回る利点としては、１）複数回の変性／復元能（再利用性）、２）長期保存に対する安定性及び周囲温度で輸送することができること、３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析で所望の特性を有するアプタマーを得るのに、選択条件を調整すること、４）化学合成によって生成され、バッチ間変動をほとんどもたらさないこと、５）ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスで選択され、動物の使用を不要にすること、６）正確な位置でのレポーター分子との結合能が挙げられる（O'Sullivan, C.K.「アプタセンサ−バイオセンシングの未来？」 Anal. Bioanal. Chem. 372, 44-48（2002）を参照されたい）。
【０００９】
アプタマーは、未だ食品媒介性病原菌の検出用の診断アプローチ又はバイオセンサアプローチに用いられていない。リステリア菌における外膜タンパク質に対して単離されたアプタマーは、食品サンプル、臨床サンプル又は環境サンプルに対する診断及びバイオセンサ検出技術に用いてもよい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一実施例は、リステリア・モノサイトゲネスの存在に関してサンプルを分析する方法であって、リステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＢタンパク質及びリステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＡタンパク質から成る群から選択されるタンパク質と特異的に結合するアプタマーにサンプルを曝露すること、及びアプタマーがサンプル中に存在するタンパク質と結合する場合に、リステリア・モノサイトゲネスがサンプル中に存在することを確定することを含む方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列ｇｇｇｎzｇｇｇｈxｇｇｇｎｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（「ｎ」はａ、ｃ、ｇ、又はｔを示し、「ｈ」はａ、ｃ、又はｔを示し、ｚは１又は２であり、ｘは１又は２である）を含む核酸分子を含む。
【００１２】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１及び配列番号２から成る群から選択される配列を含む。
【００１３】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１３及び配列番号１６から成る群から選択される配列を含む。
【００１４】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択される配列を含む。
【００１５】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５から成る群から選択される配列を含む。
【００１６】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号５の配列を含む。
【００１７】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１２の配列を含む。
【００１８】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３から成る群から選択される核酸配列を含む。
【００１９】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列ｇｇｇｙａｇｇｇｇｒｇｇｇｗｇｇｇ（配列番号１８）（「ｙ」はｃ又はｔを示し、「ｒ」はｇ又はａを示し、「ｗ」はｔ又はａを示す）を含む核酸分子を含む。
【００２０】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号２４及び配列番号２５から成る群から選択される核酸配列を含む。
【００２１】
実施の形態において、哺乳動物においてリステリア・モノサイトゲネスの感染を治療する方法であって、リステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＢタンパク質及びリステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＡタンパク質から成る群から選択されるタンパク質と特異的に結合するアプタマーを、リステリア・モノサイトゲネスの感染を低減するのに十分な濃度で哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。
【００２２】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列ｇｇｇｎzｇｇｇｈxｇｇｇｎｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（「ｎ」はａ、ｃ、ｇ、又はｔを示し、「ｈ」はａ、ｃ、又はｔを示し、ｚは１又は２であり、ｘは１又は２である）を含む核酸分子を含む。
【００２３】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１及び配列番号２から成る群から
選択される配列を含む。
【００２４】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１３及び配列番号１６から成る群から選択される配列を含む。
【００２５】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号３及び配列番号４から成る群から選択される配列を含む。
【００２６】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５から成る群から選択される配列を含む。
【００２７】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号５の配列を含む。
【００２８】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１２の配列を含む。
【００２９】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３から成る群から選択される核酸配列を含む。
【００３０】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列ｇｇｇｙａｇｇｇｇｒｇｇｇｗｇｇｇ（配列番号１８）（「ｙ」はｃ又はｔを示し、「ｒ」はｇ又はａを示し、「ｗ」はｔ又はａを示す）を含む核酸配列を含む。
【００３１】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号２４及び配列番号２５から成る群から選択される核酸配列を含む。
【００３２】
一実施例において、配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はａであり、ｚは１であり、ｈはｃであり、ｘは１であり、ｎ2はｇである）を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００３３】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１１の配列を含む。
【００３４】
一実施例において、配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はａであり、ｚは１であり、ｈはａであり、ｘは２であり、ｎ2はｔである）を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００３５】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１２の配列を含む。
【００３６】
一実施例において、配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はｃ又はｔであり、ｚは２であり、ｈはａであり、ｘは１であり、ｎ2はｔである）を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００３７】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１３の配列を含む。
【００３８】
一実施例において、配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はｔであり、ｚは１であり、ｈはａであり、ｘは１であり、ｎ2はａである）を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００３９】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１４の配列を含む。
【００４０】
一実施例において、配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号
５）（ｎ1はｇであり、ｚは１であり、ｈはｔであり、ｘは１であり、ｎ2はａである）を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００４１】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１５の配列を含む。
【００４２】
一実施例において、配列ｇｇｇｎ1zｇｇｇｈxｇｇｇｎ2ｇｇｇ（配列番号１〜配列番号５）（ｎ1はｔであり、ｚは２であり、ｈはａであり、ｘは１であり、ｎ2はｃである）を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００４３】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号１６の配列を含む。
【００４４】
一実施例において、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３から成る群から選択される配列を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００４５】
一実施例において、配列ｇｇｇｙａｇｇｇｇｒｇｇｇｗｇｇｇ（配列番号１８）（「ｙ」はｃ又はｔを示し、「ｒ」はｇ又はａを示し、「ｗ」はｔ又はａを示す）を含む核酸分子を含むアプタマーが提供される。
【００４６】
さらなる態様において、前記アプタマーは、配列番号２４及び配列番号２５から成る群から選択される核酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】インターナリンＢに対して高親和性のアプタマーを得るための１５回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択手順（２９、米国特許出願第２００５０１４２５８２号）後に得られたＤＮＡ配列表である。それぞれの配列における３つのＧの４つの反復を強調表示している。
【図２】マイクロプレートに固定されたヒスチジンでタグ付けしたインターナリンＢと結合した、選択オリゴヌクレオチドに関してスクリーニングするのに用いられるＥＬＩＳＡの結果を示すチャート図である。転写因子ＴＴＦに対してこれまでに同定されたアプタマー（ＴＴＦａｐｔ）を対照として用いた（２９、米国特許出願第２００５０１４２５８２号）。マイクロプレートに固定された、ヒスチジンでタグ付けしたＴＴＦ、及びヒスチジンでタグ付けしたｉｎｌＢタンパク質を用いた、最初のオリゴヌクレオチドライブラリ（ＴＴＦ  ＡＬ、ｉｎｌＢ  ＡＬ）を陰性対照として用いた。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。
【図３】選択アプタマーの特異性を試験するのに用いられたＥＬＩＳＡの結果を示すチャート図である。ヒスチジンでタグ付けしたＴＴＦ、ｉｎｌＢ又はペプチドＤ（アミノ酸配列：ＱＱＱＴＡＰＫＡＰＴＥＨＨＨＨＨＨ、配列番号１７）がマイクロプレートに固定された。吸光測定によって、ｉｎｌＢ又はペプチドＤと結合した選択アプタマーの量を求めた。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。
【図４】インターナリンＢのアプタマークローン３．２に関して、競合ＥＬＩＳＡを用いて得られたデータを示す図である。Ｓ字モデル方程式（ａ＋（ｂ−ａ）／（１＋１０(x-c)））にデータを入力し、ＥＣ５０＝８２．７μＭを得た。
【図５】精製ｉｎｌＢ  ５μｇ及びリステリア・モノサイトゲネス抽出物１０ｍＬについて、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行い、ビオチン化インターナリンＢのアプタマークローン３．２でプローブした、ウェスタンブロット解析を示す図である。ストレプトアビジン標識ＨＲＰ及び化学発光基質でアプタマーを検出した。
【図６】マイクロプレートに固定されたヒスチジンでタグ付けしたインターナリンＡと結合した、選択オリゴヌクレオチドに関してスクリーニングするのに用いられたＥＬＩＳＡの結果を示すチャート図である。最初のアプタマーライブラリを陰性対照として用いた。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。
【図７】アプタマーライブラリとの結合に対して、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおける強いシグナルに基づいて得た、インターナリンＡと結合したアプタマー配列（配列番号２１〜配列番号２５）を示す図である。
【図８】配列番号２１のＤＮＡ配列を有するＡ８と表された選択アプタマーと、全細胞との結合を試験するのに用いられたＥＬＩＳＡの結果を示すチャート図である。約１０7ｃｆｕのリステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）、リステリア・イノキュア（ＬＩ）及びリステリア・ウェルシュメリ（ＬＷ）を炭酸緩衝液中で再懸濁し、ウェルに吸着させた。アプタマーなし（Ｂ）又は２．５ｎｇ／μＬの濃度のＡ８アプタマー若しくはアプタマーライブラリ（ＡＬ）を適切なウェルに添加した。ＴＭＢ及びＨＲＰを用いて、結合を検出した。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。Ａ８アプタマーは、ＬＩ及びＬＷに比べて、ＬＭとの選択的結合を示している。
【図９】オリゴヌクレオチドなし、アプタマーライブラリ（ＡＬ）、インターナリンＡ８アプタマー（Ａ８、配列番号２１）に関して、ヒスチジンでタグ付けしたｉｎｌＡタンパク質、０６１０タンパク質及びペプチドＤ（ｐ６０タンパク質から得られたアミノ酸配列：ＱＱＱＴＡＰＫＡＰＴＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７））との結合実験であるＥＬＩＳＡデータを示す図である。吸光測定によって、特定のタンパク質と結合した選択アプタマーの量を求めた。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。Ａ８アプタマーでは、０６１０タンパク質及びペプチドＤに比べて、ｉｎｌＡとインキュベートした際により高いシグナルが得られたことから、幾らかの特異性を示している。
【図１０】インターナリンＡ８アプタマー（配列番号２１）に関して、競合ＥＬＩＳＡを用いて得られたデータを示す図である。Ｓ字モデル方程式（ａ＋（ｂ−ａ）／（１＋１０(x-c)））にデータを入力し、ＥＣ５０＝５４３．５ｎＭを得た。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本開示は、インターナリンＢタンパク質及びインターナリンＡタンパク質との結合特性に関して選択された新規の試薬の単離に関する。ｉｎｌＢは、受容体チロシンキナーゼＭｅｔと結合し活性化させるリステリア・モノサイトゲネスの表面局在タンパク質である（Shen, Y他「リステリア菌のｉｎｌＢ依存性内在化は、Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼによって媒介される」 Cell 103, 501-510（2000）を参照されたい）。ｉｎｌＢは、肝細胞、内皮細胞株及び上皮細胞株を含む多くの細胞の浸潤を促進し（Bierne, H.他「ｉｎｌＢ、浸潤因子及び増殖因子として挙動するリステリア・モノサイトゲネスの表面タンパク質」 J. Cell Sci. 115, 3357-3367（2002）；Cabanes, D.他「リステリア・モノサイトゲネスの表面タンパク質及び病原可能性」 Trends Microbiol. 10, 238-245（2002）を参照されたい）、細菌のアクチン介在性の内在化を活性化する。ｉｎｌＡは、リステリア菌のゲノムで同定された表面局在ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）タンパク質の大グループに属する。ｉｎｌＡは、リステリア・モノサイトゲネスをヒト腸上皮等の非食細胞に侵入させることができ（Gaillard, J.L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P.「リステリア・モノサイトゲネスの細胞への侵入が、グラム陽性球菌由来の表面抗原に似た反復タンパク質であるインターナリンによって媒介される」（1991） Cell 65, 1127-1141を参照されたい）、上皮細胞に付するのに、及び上皮細胞への取り込みを誘導するのに十分である（Schubert W.D., Urbanke, C., Ziehm, T., Beier, V., Machner, M.P., Domann, E., Wehland, J., Chakraborty, T., Heinz, D.W.「ヒト受容体Ｅカドヘリンと複合した、リステリア・モノサイトゲネスの主要な浸潤タンパク質であるインターナリンの構造」（2002） Cell 111, 825- 836を参照されたい）。
【００４９】
本開示のインターナリンＢ及びインターナリンＡに対する核酸リガンドは、食品サンプル、臨床サンプル又は環境サンプル中のインターナリンＢ、インターナリンＡ又はリステリア菌の有無を確定するのに有用となり得る。これらは、感染促進ｉｎｌＢタンパク質又はｉｎｌＡタンパク質と結合し、これらを不活性化させることによって、リステリア菌の感染と競合する作用因子としても有用となり得る。１つの目的は、食品サンプル、臨床サ
ンプル又は環境サンプル中のインターナリンＢ、インターナリンＡ、又はリステリア菌の有無を検出するように設計された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断又はバイオセンサプラットフォームにこれらの核酸リガンドを組み込むことである。もう１つの目的は、リステリア菌の感染を治療又は予防する方法に、これらの核酸リガンドを用いることである。
【００５０】
インターナリンＢタンパク質及びインターナリンＡタンパク質と結合するオリゴヌクレオチドを開示する。インターナリンＢに特異的なアプタマーの特定のオリゴヌクレオチド配列を、配列番号１１〜配列番号１６として図１に示す。さらに、インターナリンＡに特異的なアプタマーの特定のオリゴヌクレオチド配列を、配列番号２１〜配列番号２５として表１に示す。これらのオリゴヌクレオチドは、バイオセンサプラットフォーム及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断分析における生物学的認識因子として、又はリステリア症の症状に対する治療剤として有用となり得る。インターナリンＢに関するオリゴヌクレオチドは１８〜４１個のヌクレオチドを含み、一方、インターナリンＡに関するオリゴヌクレオチドは４７個のヌクレオチドを含む。オリゴマーは、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せから成る。ヌクレオチドの修飾としては、ビオチン基、チオ基、ヨード基、ブロモ基、リン酸基、フルオロ基又はアミノ基の付加が挙げられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＤＮＡから成るが、ＲＮＡ又は合成ヌクレオチド類似体であってもよい。オリゴヌクレオチドがバイオセンサ用途で用いられる場合、ヌクレオチドに対する５’修飾、３’修飾又は内部修飾を用いて、オリゴヌクレオチドを、電気化学、光学、圧電、磁性又は熱量測定的なバイオセンサプラットフォームと結合することができる。
【００５１】
Ｉ．インターナリンＢに対するアプタマー
インターナリンＢに対するアプタマーの単離した配列はそれぞれ、図１で強調表示された３つのｄＧＴＰの４つの反復形態でＧを多く含む配列を含有する。ＥＬＩＳＡを用いたアプタマー３．２の切断試験によると、Ｇを多く含む配列は、インターナリンＢタンパク質との結合に必須であると考えられる。結合親和性に基づき、ｉｎｌＢに対する高レベルの結合親和性を与える幾つかのＧを多く含む配列を推定し、以下に開示する。
ｇｇｇｎzｇｇｇｎxｇｇｇｎｇｇｇ
ｇｇｇｎzｇｇｇｈxｇｇｇｎｇｇｇ
ｇｇｇｄｇｇｇｈxｇｇｇｄｇｇｇ
ｇｇｇｙｙｇｇｇｒｇｇｇｙｇｇｇ（配列番号１）
ｇｇｇｙｔｇｇｇａｇｇｇｙｇｇｇ（配列番号２）
ｇｇｇｎｇｇｇｈｇｇｇｒｇｇｇ（配列番号３）
ｇｇｇｄｇｇｇｈｇｇｇｒｇｇｇ（配列番号４）
ｇｇｇｒｇｇｇｒｒｇｇｇｙｇｇｇ（配列番号５）
これらの配列において、「ｎ」は、ａ、ｃ、ｇ又はｔを示し、「ｙ」は、ｃ又はｔを示し、「ｄ」は、ｇ、ｔ又はａを示し、「ｈ」は、ａ、ｃ又はｔを示し、ｘ及びｚは、１又は２である。
【００５２】
Ａ．アプタマー試薬の単離及び特徴付け
記載のインターナリンＢアプタマー試薬を単離し、特徴付けるのに用いられる方法を以下に記載する。
【００５３】
１．組み換えインターナリンＢの調製
ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ０１２３４６のリステリア・モノサイトゲネスの配列を用いて、ｉｎｌＢに対するプライマーを設計した。プライマー配列の５’末端には、後の工程での単純クローニングのためのＬＩＣ配列が含まれる。ＰＣＲプライマーの配列は以下の通りである：ｉｎｌＢ−Ｓ、５’−ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＣＧＣ  ＧＣＧ
ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＣＧ−３’（配列番号６）、ｉｎｌＢ−ＡＳ、５’−ＡＧ
Ａ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  Ｔ−３’（配列番号７）。リステリア・モノサイトゲネスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ、１９１１５Ｄ）を鋳型としたＰＣＲによって、ｉｎｌＢを増幅した。ＬＩＣクローニング用にＰＣＲ産物を処理して、ｐＥＴ−３０  Ｘａ／ＬＩＣベクター（Novagen）中のＨｉｓでタグ付けした配列の上流にフレーム単位で挿入した。増幅ｉｎｌＢ断片のヌクレオチド配列をシークエンシングによって確認した。組み換えタンパク質を発現させるため、得られたプラスミドｐＥＴ３０／ｉｎｌＢで大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。
【００５４】
２．組み換えインターナリンＢの精製
ｐＥＴ３０／ｉｎｌＢで形質転換した大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を、ＯＤ６００が０．７になるまで３７℃で培養し、それから１ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導した。誘導後の細菌を遠心分離によって回収し、ペレットを−８０℃で一晩保存した。カラム結合緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、５ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ）及びプロテアーゼ阻害剤でペレットを再懸濁した後、氷上で超音波処理を行った。遠心分離によって残屑を除去し、金属アフィニティクロマトグラフィ（Novagen）によってタンパク質を精製した。ＢＣＡ分析によってタンパク質の濃度を求め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを用いて精製度を分析した。
【００５５】
３．アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択
以下の方法は、Murphy, M.D., Fuller, S.T., Richardson, P.M. & Doyle, S.A.「アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化に関して改善された方法、並びにタンパク質の検出及び精製への用途」（2003） Nuc. Acids Res. 31, No. 18 e100で、及び米国特許出願公開第２００５／０１４２５８２号（参照により本明細書に援用される）で詳しく記載される。要約すると、この方法は、（ａ）磁性ビーズに対するポリヒスチジン親和性タグを有する標的分子を調製すること、（ｂ）標的分子を磁性ビーズと結合させ、標的分子をアプタマー配列のライブラリに接触させて、縮重配列から成るアプタマー配列と標的分子とを結合させることによって、ビーズ−標的分子−アプタマー配列複合体を形成すること、（ｃ）そのビーズ上に標的分子を維持し、非結合アプタマー配列を除去することによって、ビーズ−標的分子−アプタマー配列複合体を非結合アプタマー配列から分離すること、それから（ｄ）結合アプタマー配列のプールを形成するのに、標的結合アプタマー配列を上記磁性ビーズから分離すること、（ｅ）結合アプタマー配列を増幅すること、及び（ｆ）標的分子に対して高い親和性を有する少なくとも１つのアプタマー配列を同定するのに十分な回数、工程（ｂ）〜工程（ｄ）を反復することを伴う。
【００５６】
以下に記載されるように幾つか修正して、Dr. Sharon Doyle（Murphy, M.B., Fuller, S.T., Richardson, P.M. & Doyle, S.A.「アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化に関して改善された方法、並びにタンパク質の検出及び精製への用途」（2003） Nuc. Acids Res. 31, No. 18 e110、米国特許出願公開第２００５／０１４２５８２号を参照されたい）からｉｎｌＢに対してアプタマーを単離するＳＥＬＥＸプロトコルを得た。Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズ（Qiagen、カルフォルニア州バレンシア）１５０μＬをＰＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で平衡化して、タンパク質結合Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズを調製した。平衡化ビーズをＰＢＳ−Ｔ
８００μＬ中で再懸濁し、３．２ｍｇ／ｍＬの精製インターナリンＢ  １６μＬを添加し、４℃で３０分間、回転させながら混合した。それから、ビーズ結合インターナリンＢをＰＢＳ−Ｔ  １ｍＬで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで５ｐｍｏｌ／μＬに希釈して、４℃で保存した。
【００５７】
最初の選択のために、１ｎｍｏｌのアプタマーライブラリ（５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＣ−４０Ｎ−ＧＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＴＣＣＴＣＴ、配列番号８）を９５℃まで２分間加熱し、その直後４℃に冷却して、３７℃で３０分間、１μｇ／ｍ
ＬのＢＳＡ、０．１μｇ／ｍＬのｄＩｄＣを含有する１０ｍＬ容量のＰＢＳ−Ｔで１００ｐｍｏｌの磁性ビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズ、Qiagen）結合ｉｎｌＢタンパク質とハイブリダイズした。ｉｎｌＢ被覆ニッケル磁性ビーズは、１回ごとの選択に対して新たに調製し、これは選択を維持するのに必要であった。２回目からは、単離したオリゴヌクレオチドと、ｉｎｌＢ被覆磁性ビーズとのハイブリダイゼーションは、３７℃で１５分だけとした。タンパク質の量は、２回目の１００ｐｍｏｌから、１２回目の２０ｐｍｏｌへと減少させた。Dynalの磁性スタンドを用いて、ｉｎｌＢタンパク質と結合したオリゴヌクレオチドを非結合オリゴヌクレオチドから単離した。ＰＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）１ｍＬで、ビーズを３回洗浄し、１０μＬの２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのイミダゾールで再懸濁した。ＬＩＣ−Ｆ（５’−ｇｇｔａｔｔｇａｇｇｇｔｃｇｃａｔｃ−３’、配列番号９）プライマー及びビオチン化ＬＩＣ−Ｒ（５’−ａｇａｇｇａｇａｇｔｔａｇａｇｃｃａｔｃ−３’、配列番号１０）プライマーを含む１００μＬ容量のＰＣＲ反応液に全サンプルを添加した。増幅条件は、９５℃で２分の後、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、及び６８℃で３０秒を１１〜１５サイクル、その後６８℃で２分であった。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液１０μＬを臭化エチジウムで染色した１．２％アガロースゲルで解析し、残りの９０μＬを非ビオチン化アプタマー鎖の単離に用いた。それから、室温で１０分間、ＰＣＲ産物９０μＬ及び５ＭのＮａＣｌ  ２３μＬを、Ｍ−２８０ストレプトアビジン磁性ビーズ（Invitrogen、カルフォルニア州カールズバッド）１ｍｇと混合し、その後ＰＢＳ−Ｔ  １ｍＬで３回洗浄した。新たな１００ｍＭのＮａＯＨ  ５０μＬと５分間インキュベートして、一本鎖アプタマーを固定された相補鎖から分離した。試験管を磁石に当てて、ｓｓＤＮＡを除去し、１００ｍＭの一塩基リン酸緩衝液１０μＬを含有するＰＢＳ−Ｔ  １ｍＬで希釈し、ｐＨを７．５に調整した。最後に、試料を９５℃まで２分間加熱し、その直後、次回の選択まで４℃に置いた。Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズと結合するアプタマーを除去するために、３、６、９及び１２回目の後に対抗選択を行った。一定分量のＮｉ−ＮＴＡ磁性ビーズの５％スラリー２０μＬをＰＢＳ−Ｔ中のｓｓＤＮＡ  １ｍＬに添加し、回転させながら１０分間インキュベートして、それから磁石に当て、次回のために上清を除去した。１５回目の後に、ｐＥＴ３０／Ｘａベクターに増幅ＰＣＲ産物をクローニングし、シークエンシングした。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、配列をアライメントした（Higgins, D., Thompson, J., Gibson, T.「ＣＬＵＳＴＡＬＷ：配列重み付け、位置特異的なギャップペナルティ及び重みマトリクス選択による進歩的な複数の配列アライメントの感度の改善」（1994） Nuc. Acids Res. 22, 4673-4680）。このプロセスの結果得られた幾つかのアプタマー配列を、配列番号１１〜配列番号１６として図１に示す。図中で、インターナリンＢとの結合に関与すると思われる、それぞれの配列における３つのＧの４つの反復が強調表示されている。
【００５８】
４．アプタマーのＥＬＩＳＡスクリーニング
ニッケル被覆マイクロプレート（ＨｉｓＳｏｒｂ、Qiagen）を用いて、製造業者の指示に従い、５００ｎｇのｈｉｓでタグ付けしたＴＴＦ１、ペプチドＤ又はｉｎｌＢをプレートに付着させた。ビオチン化アプタマー（５ｎｇ／μＬ）を９５℃まで３分間加熱し、４℃まで５分間急冷した後、それぞれのウェルに添加した。４℃で一晩、ゆっくりと振盪しながら、ビオチン化アプタマーを、ＨｉｓＳｏｒｂプレート中で結合タンパク質とインキュベートした。それから、ＰＢＳ−Ｔ  ２００μＬで４回、ウェルを洗浄した。室温で３０分間、ゆっくりと振盪しながら、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼをウェルに添加した。これまでに記載されたように、ウェルを洗浄した後、ＴＭＢ（Pierce）を添加し発色させた。１ＭのＨ2ＳＯ4で反応を停止させ、ＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて、４５０ｎｍで吸光を測定した。結果を図２に示す。図２では、転写因子ＴＴＦに対してこれまでに同定されたアプタマー（ＴＴＦａｐｔ）を対照として用いた（Murphy, M.B., Fuller, S.T., Richardson, P.M. & Doyle, S.A.「アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化に関して改善された方法、並び
にタンパク質の検出及び精製への用途」（2003） Nuc. Acids Res. 31, No.18 e110、米国特許出願第２００５／０１４２５８２号を参照されたい）。マイクロプレートに付着された、ヒスチジンでタグ付けしたＴＴＦタンパク質及びヒスチジンでタグ付けしたｉｎｌＢタンパク質による最初のオリゴヌクレオチドライブラリ（ＴＴＦ  ＡＬ、ｉｎｌＢ  ＡＬ）を陰性対照として用いた。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。さらに、図３は、選択アプタマーの特異性を試験するのに用いられるＥＬＩＳＡの結果を示す。ヒスチジンでタグ付けしたＴＴＦ、ｉｎｌＢ又はペプチドＤ（アミノ酸配列：ＱＱＱＴＡＰＫＡＰＴＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７））をマイクロプレートに付着させた。吸光測定によって、ｉｎｌＢ又はペプチドＤと結合した選択アプタマーの量を求めた。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。
【００５９】
５．競合ＥＬＩＳＡ
ＥＣ５０（５０％有効濃度）を測定するのに、競合ＥＬＩＳＡを用いた。特定量のインターナリンＢ（５００ｎｇ）をプレートに被覆した。５ｎｇ／μＬのビオチン化アプタマー３．２を増加量の非ビオチン化アプタマー３．２とインキュベートし、それから被覆プレートに添加した。これらの実験で用いられるインターナリンＢ及びビオチン化アプタマー３．２の量を用量応答曲線の線形範囲から求めた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを用いて、Ｓ字モデル（方程式：ａ＋（ｂ−ａ）／（１＋１０(x-c)））を用いて、ＥＣ５０を求めた。ＥＣ５０の最適値は８２μＭと求められた。結果を図４に示す。
【００６０】
６．ウェスタンブロット解析
精製組み換えｉｎｌＢ及びリステリア・モノサイトゲネスのタンパク質抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した。リステリア・モノサイトゲネスの単一コロニーをＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地１０ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。細胞をペレット状にし、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液５０μＬで回収した。精製組み換えｈｉｓでタグ付けしたｉｎｌＢ  ５μｇ及びリステリア・モノサイトゲネス抽出物２５μＬをゲルに充填して、１６０Ｖで１時間泳動した。１００Ｖで１時間、タンパク質を０．４５μｍニトロセルロースに移した。Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓを用いて、タンパク質輸送を確認した後、５％ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）でブロッキングした。５％ＮＦＤＭ中で１時間、ブロットを５ｎｇ／μＬのビオチン化アプタマー３．２とインキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びスーパーシグナルウェストピコ化学発光基質（Pierce）によって、結合ビオチン化アプタマーを検出した。結果を図５に示す。
【００６１】
ＩＩ．インターナリンＡに対するアプタマー
インターナリンＡタンパク質と結合するオリゴヌクレオチドをも開示する。これらのオリゴヌクレオチドは、バイオセンサプラットフォーム及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断分析における生物学的認識因子として有用となり得る。本開示のオリゴヌクレオチドは、４７個のヌクレオチドを含む。オリゴマーは、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せから成る。ヌクレオチドの修飾としては、ビオチン基、チオ基、ヨード基、ブロモ基、リン酸基、フルオロ基又はアミノ基の付加が挙げられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＤＮＡから成るが、ＲＮＡ又は合成ヌクレオチド類似体であってもよい。オリゴヌクレオチドがバイオセンサ用途で用いられる場合、ヌクレオチドに対する５’修飾、３’修飾又は内部修飾を用いて、オリゴヌクレオチドを、電気化学、光学、圧電、磁性又は熱量測定的なバイオセンサプラットフォームと結合することができる。
【００６２】
単離した配列はそれぞれ、３つのｄＧＴＰの４つの反復形態でＧを多く含む配列を含有する。結合親和性に基づき、ｉｎｌＡに対する高レベルの結合親和性を与える１つのＧを多く含むコンセンサス配列が推定され、以下に開示される。
ｇｇｇｙａｇｇｇｇｒｇｇｇｗｇｇｇ（配列番号１８）
これらの配列において、「ｙ」は、ｃ又はｔを示し、「ｒ」は、ｇ又はａを示し、「ｗ」はｔ又はａを示す。
【００６３】
Ａ．アプタマー試薬の単離及び特徴付け
以下に、記載のアプタマー試薬を単離し特徴付けるのに用いられる方法を記載する。
【００６４】
１．組み換えインターナリンＡの調製
リステリア・モノサイトゲネスのインターナリンＡタンパク質をコードする細菌ＤＮＡ：残基３０〜７６６をゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号１９１１５Ｄ）を鋳型としたＰＣＲ増幅した。Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＣＡＣ９８５１２の配列を用いて、ウェブプライマー（http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer）でプライマーを設計した。プライマーは以下の配列を有していた：ｉｎｌＡ−Ｓ、５’−ｇｇｔ  ａｔｔ  ｇａｇ  ｇｇｔ  ｃｇｃ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＣＴ−３’（配列番号１９）；ｉｎｌＡ−ＡＳ、５’−ａｇａ  ｇｇａ  ｇａｇ  ｔｔａ  ｇａｇ  ｃｃｔ  ｔＡ
ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＡＴＴ−３’（配列番号２０）。プライマーの５’領域（小文字）には、ライゲーション独立クローニング（ＬＩＣ）法に必要な配列が含まれる。ＬＩＣクローニング用にＰＣＲ産物を処理して、ｐＥＴ−３０  Ｘａ／ＬＩＣベクター（Novagen）中のＨｉｓでタグ付けした配列の上流にフレーム単位で挿入させた。増幅ｉｎｌＡ断片のヌクレオチド配列をシークエンシングによって確認した。組み換えタンパク質を発現させるため、得られたプラスミドｐＥＴ３０／ｉｎｌＡで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳを形質転換した。
【００６５】
２．組み換えインターナリンＡの精製
ｐＥＴ３０／ｉｎｌＡで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳを、ＯＤ６００が０．７になるまで３７℃で培養し、それか１ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導した。誘導後の細菌を遠心分離によって回収し、ペレットを−２０℃で一晩保存した。３００００Ｕのｒリゾチーム（組み換えリゾチーム、EMD Biosciences）、１２５Ｕのベンゾナーゼヌクレアーゼ（EMD Biosciences）及びSigmaのＰ１プロテアーゼ阻害剤５０μＬを含有する５．０ｍＬのＢｕｇｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（EMD Biosciences）でペレットを再懸濁した。細胞懸濁液を室温で１０分間、インキュベートした。遠心分離によって細胞残屑を除去し、Ｎｉセファロース６高速流を用いて、金属アフィニティクロマトグラフィによってタンパク質を精製した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭの塩化ナトリウム、及びSigmaのＰ１プロテアーゼ阻害剤５０μＬから成る緩衝液をカラム洗浄に用い、５ｍＬの５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭの塩化ナトリウム、及びSigmaのＰ１プロテアーゼ阻害剤５０μＬで結合タンパク質を溶離した。Bio-Radのタンパク質分析（ブラッドフォード法）によってタンパク質の濃度を求め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて精製度を分析した。
【００６６】
３．組み換えインターナリンＡに対するアプタマー選択
以下の方法は、Murphy, M.B., Fuller, S.T., Richardson, P.M. & Doyle, S.A.「アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化に関して改善された方法、並びにタンパク質の検出及び精製への用途」（2003） Nuc. Acids Res. 31, No. 18 e110で、及び米国特許出願公開第２００５／０１４２５８２号（参照により本明細書に援用される）で詳しく記載される。要約すると、この方法は、（ａ）磁性ビーズに対するポリヒスチジン親和性タグを有する標的分子を調製すること、（ｂ）標的分子を磁性ビーズと結合させ、標的分子をアプタマー配列のライブラリに接触させて、縮重配列から成るアプタマー配列と標的分子とを結合させることによって、ビーズ−標的分子−アプタマー配列複合体を形成すること、（ｃ）そのビーズ上に標的分子を維持し、非結合アプタマー配列を除去することによって、ビーズ−標的分子−アプタマー配列複合体を非結合アプタマー配列から分離すること、それから
（ｄ）結合アプタマー配列のプールを形成するのに、標的結合アプタマー配列を上記磁性ビーズから分離すること、（ｅ）結合アプタマー配列を増幅すること、及び（ｆ）標的分子に対して高い親和性を有する少なくとも１つのアプタマー配列を同定するのに十分な回数、工程（ｂ）〜工程（ｄ）を反復することを伴う。
【００６７】
以下に記載されるように幾つか修正して利用される、Dr. Sharon Doyle（Murphy, M.B., Fuller, S.T., Richardson, P.M. & Doyle, S.A.「アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化に関して改善された方法、並びにタンパク質の検出及び精製への用途」（2003） Nuc. Acids Res. 31, No. 18 e110を参照し、また米国特許出願公開第２００５／０１４２５８２号も参照されたい）によって記載されたＳＥＬＥＸ手順でアプタマーを選択した。Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズ（Qiagen、カルフォルニア州バレンシア）１５０μＬをＰＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で平衡化して、タンパク質結合Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズを調製した。平衡化ビーズをＰＢＳ−Ｔ  １２５０μＬ中で再懸濁し、２ｍｇ／ｍＬの精製インターナリンＡ  ２５μＬを添加し、４℃で３０分間、回転させながら混合した。それから、ビーズ結合インターナリンＡをＰＢＳ−Ｔ  １ｍＬで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで５ｐｍｏｌ／μＬに希釈して、４℃で保存した。
【００６８】
最初の選択のために、１ｎｍｏｌのアプタマーライブラリ（５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＣ−４０Ｎ−ＧＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣＴＣＣＴＣＴ、配列番号８）を９５℃まで２分間加熱し、その直後４℃に冷却して、３７℃で３０分間、１μｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１μｇ／ｍＬのｄＩｄＣを含有する１０ｍＬ容量のＰＢＳ−Ｔで１００ｐｍｏｌの磁性ビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズ、Qiagen）結合ｉｎｌＡタンパク質とハイブリダイズした。ｉｎｌＡ被覆ニッケル磁性ビーズは、毎日新たに調製し、２回の選択に用いた。Dynalの磁性スタンドを用いて、ｉｎｌＡタンパク質と結合したオリゴヌクレオチドを非結合オリゴヌクレオチドから単離した。ＰＢＳ−Ｔ  １ｍＬで、ビーズを３回洗浄し、１０μＬの２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのイミダゾールで再懸濁した。
【００６９】
結合／洗浄条件をより厳しくするために、表１に示すプロセスのとおり、タンパク質の量及びインキュベート時間を低減させ、洗浄回数は増加させた。４回〜９回後、Ｎｉ−ＮＴＡ磁性アガロースビーズ２０μＬを用いた対抗選択を行った。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
ビーズを１０μＬの２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのイミダゾールで再懸濁した後、ＬＩＣ−Ｆ（５’−ｇｇｔａｔｔｇａｇｇｇｔｃｇｃａｔｃ−３’、配列番号９）プライマー及びビオチン化ＬＩＣ−Ｒ（５’−ａｇａｇｇａｇａｇｔｔａｇａｇｃｃａｔｃ−３’、配列番号１０）プライマーを含む１００μＬ容量のＰＣＲ反応液にサンプルを添加した。増幅条件は、９５℃で２分の後、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、及び６８℃で３０秒を１２〜１５サイクル、その後６８℃で２分であった。ＰＣＲ後、ＰＣＲ反応液５μＬを臭化エチジウムで染色した１．２％アガロースゲルで解析し、残りの９０μＬを非ビオチン化アプタマー鎖の単離に用いた。それから、室温で１０分間、ＰＣＲ産物９０μＬ及び５ＭのＮａＣｌ  ２３μＬを、Ｍ−２８０ストレプトアビジン磁性ビーズ（Invitrogen、カルフォルニア州カールズバッド）１ｍｇと混合し、その後ＰＢＳ−Ｔ
１ｍＬで３回洗浄した。新たな１００ｍＭのＮａＯＨ  ５０μＬと５分間のインキュベートを利用して、一本鎖アプタマーを固定された相補鎖から分離した。試験管を磁石に当てて、ｓｓＤＮＡを除去し、１００ｍＭの一塩基リン酸緩衝液１０μＬを含有するＰＢＳ−Ｔ  １ｍＬに希釈し、ｐＨを７．５に調整した。最後に、試料を９５℃まで２分間加熱し、その直後、次回の選択まで４℃に置いた。１５回目の後に、ｐＥＴ３０／Ｘａベクターに増幅ＰＣＲ産物をクローニングし、シークエンシングした。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（Drummond AJ, Kearse M, Heled J, Moir R, Thierer T, Ashton B, Wilson A, Stones-Havas S（2006）のhttp://www.geneious.com/から利用可能なＧｅｎｅｉｏｕｓ  ｖ２．５）を用いて、配列をアライメントした。インターナリンＡに対する５つのアプタマーの配列は図７に示される（配列番号２１〜配列番号２５）。
【００７２】
４．アプタマーのＥＬＩＳＡスクリーニング
ニッケル被覆マイクロプレート（ＨｉｓＳｏｒｂ、Qiagen）を用いて、製造業者の指示に従い、５００ｎｇのｈｉｓでタグ付けしたｉｎｌＡ、ペプチドＤ又は０６１０タンパク質（リステリア・モノサイトゲネス特異的非インターナリン細胞壁タンパク質）をプレートに結合させた。ビオチン化アプタマー又はアプタマーライブラリ（５ｎｇ／μＬ）を９５℃まで３分間加熱し、４℃まで５分間急冷した後、それぞれのウェルに添加した。４℃で一晩、ゆっくりと振盪しながら、ビオチン化アプタマー又はアプタマーライブラリを、ＨｉｓＳｏｒｂプレート中で結合タンパク質とインキュベートした。それから、ＰＢＳ−Ｔ  ２００μＬで４回、ウェルを洗浄した。室温で３０分間、ゆっくりと振盪しながら、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼをウェルに添加した。これまでに記載されたように、ウェルを洗浄した後、ＴＭＢ（Pierce）を添加し発色させた。１ＭのＨ2ＳＯ4で反応を停止させ、ＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて、４５０ｎｍで吸光を測定した。結果を図６に示す。図６では、最初のアプタマーライブラリを陰性対照として用いて、データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。さらに、図９は、ヒスチジンでタグ付けしたｉｎｌＡタンパク質、０６１０タンパク質及びペプチドＤ（ｐ６０タンパク質から得られるアミノ酸配列：ＱＱＱＴＡＰＫＡＰＴＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７））と結合する、オリゴヌクレオチドなし、アプタマーライブラリ（ＡＬ）、及びインターナリンＡ８アプタマー（Ａ８、配列番号２１）に関するさらなるＥＬＩＳＡデータを示す。吸光測定によって、特定のタンパク質と結合した選択アプタマーの量を求めた。データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。Ａ８アプタマーは、０６１０タンパク質及びペプチドＤと比べて、ｉｎｌＡとインキュベートした際に得られたより高いシグナルに基づき幾らかの特異性を示す。
【００７３】
５．競合ＥＬＩＳＡ
ＥＣ５０（５０％有効濃度）を測定するのに、競合ＥＬＩＳＡを用いた。特定量のインターナリンＡ（５００ｎｇ）をプレートに被覆した。５ｎｇ／μＬのビオチン化アプタマーＡ８（配列番号２１）を増加量の非ビオチン化アプタマーＡ８とインキュベートし、それから被覆プレートに適用させた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを用いて、Ｓ字モデル（方程式：ａ＋（ｂ−ａ）／（１＋１０(x-c)））を用いて、ＥＣ５０を求めた。ＥＣ５０の最適値は５４３．５ｎＭと求められた。結果を図１０に示す。
【００７４】
６．全細胞のＥＬＩＳＡ
リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）、リステリア・イノキュア（ＬＩ）及びリステリア・ウェルシュメリ（ＬＷ）を３７℃で一晩、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培養液で培養した。約１０7ｃｆｕを炭酸緩衝液で再懸濁し、４℃で一晩、Ｉｍｍｕｌｏｎ１Ｂ平底ポリスチレンマイクロタイターストリップ（Thermo Labsystems、番号６３０１）に吸着させた。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、２．５ｎｇ／μＬのビオチン化アプタマーライブラリ（ＡＬ）、配列番号２１のＤＮＡ配列を有しＡ８と表された選択アプタマー、又はアプタマーなし（Ｂ）をウェルに添加した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を用いて、結合ライブラリ又はアプタマーを検出した。１ＭのＨ2ＳＯ4で反応を停止させ、ＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）を用いて、４５０ｎｍで吸光を測定した。結果を図８に示す。図８では、データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）で表す。Ａ８アプタマーは、ＬＩ及びＬＷに比べて、ＬＭとの選択的結合を示している。
【００７５】
７．ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器（BIAcore、ニュージャージー州ピスカタウェー）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して、インターナリンＡに対するＡ８アプタマーの親和性を測定した。ビオチン化アプタマーを９５℃まで加熱して、使用前に４℃で急冷した。約１００ＲＵのビオチン化アプタマーをストレプトアビジン被覆センサチップの１つのフローセルに固定した。精製インターナリンＡをＰＢＳ−Ｔで希釈し、一連の濃度のイ
ンターナリンＡタンパク質（７．８、１５．６、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、４００ｎＭ）を得て、３０μＬ／分の流速で２分間表面上に注入した。参照フローセルからの応答を用いて、ストレプトアビジンとの非特異的な相互作用を差し引いた。２分間、オフレートを測定した後、０．０６％ＳＤＳで表面の完全再生が達成された。ラングミュア（１：１）結合と仮定して、同時動態ｋd／ｋaモデルに適合させることによって、平行解離定数（ＫD）で示される親和性を全体的に決定した。インターナリンＡに対するＡ８アプタマーのＫDは８．３５×１０-8Ｍであり、ｋa（１／Ｍｓ）は４．５３×１０4であり、ｋd（１／ｓ）は３．７８×１０-3であった。
【００７６】
＜バイオセンサ用途におけるアプタマーの使用＞
上記のようなアプタマーは、バイオセンサ用途で用いるのに非常に有益な品質を有している。アプタマー合成は潜在的に抗体ベースの診断試験よりもはるかに安価であり、再現性が高い。製造バッチ間で一貫した、正確でかつ再現性のあるプロセスである固相化学合成によって、アプタマーを作製してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、アプタマーを大量生産することができ、本明細書で開示されるような既知の配列を有するアプタマーを個々の天然ヌクレオチド及び／又は合成ヌクレオチドから集合化することができる。アプタマーは、抗体にはない特性として、室温での長期保存に対して安定であり、変性した場合でも容易に復元することができる。さらに、アプタマーは、抗体ベースの診断試験よりも数桁小さい（１兆分の１又はさらに１０００兆分の１の）リガンドの濃度を測定する潜在性がある。アプタマーのこれらの固有の特徴のために、アプタマーはバイオセンサ等の診断用途に魅力的である。
【００７７】
多くの「分子標識」（蛍光化合物であることが多い）を開示のアプタマーに付着させ、標的となる化学的又は生物学的因子の存在をシグナル伝達する、及びこれを定量する手段を提供することができる。例えば、近年、コカインに特異的なアプタマーが合成されている（Stojanovic; M. N.他「コカインに対するアプタマーベースのフォールディング蛍光センサ」 J. Am. Chem. Soc., 123（21）:4928:31（2001））。コカインがアプタマーと可逆的に結合すると消光する蛍光標識を光検出器と共に用いて、存在するコカインの濃度を定量する。１回だけしか用いることができない抗体ベースの試験に対して、アプタマーベースのバイオセンサは、繰り返し用いることができる。
【００７８】
標識が増幅蛍光ポリマー（ＡＦＰ）であると、特に興味深い。ＴＮＴ及びＤＮＴに対する特異性が高いＡＦＰが開発されている。ＴＮＴ及びＤＮＴに対する特異性が高い、ＡＦＰ技術に基づく検出器は、極めて低濃度で静脈麻酔剤であるプロポフォールを検出することもできると指摘されている。ＡＦＰとアプタマー技術との組合せには、微量濃度で特異性が高い化合物を検出することができる強固で再利用可能なバイオセンサの見込みがある。
【００７９】
本開示は、サンプル中のｉｎｌＢタンパク質及びｉｎｌＡタンパク質の存在を検出することによって、サンプル中のリステリア菌の存在を診断する方法に関する。本開示によれば、ナノ構造ベースの集合体は、例えば、Melker他、米国特許第７，０５２，８５４号で開示される方法に従って作製され、その検出機構は、ｉｎｌＢタンパク質若しくはｉｎｌＡタンパク質、又はその両方との集合体を特異的に検出及び局在化させるように設計する。中空であり、第１の開口端及び第２の閉口端を有するナノチューブ形態のナノ粒子が用いられる。代理マーカー（好ましくは、ＤＭＳＯ等の揮発性化合物）は、ナノチューブの中空内部に封入される。アプタマー末端キャップで第１の開口端を塞ぎ、ナノチューブの中空内部に位置する代理マーカーの放出を防ぐ。末端キャップに付着したアプタマーで標的となる分析物／バイオマーカーを検出する際に、ナノ粒子のキャップが取れ、代理マーカーが放出される。脱キャップ機構には、以下に限定されないが、アクチンベースのシステム（Dickinson, R. B.及びD. L. Purich「アクチンベースのモーターに関する固定フィ
ラメント伸長モデル」 Biophys. J., 82:605 617（2002））等のエネルギー担持生体分子モーターの使用を必要としてもよい。ナノ粒子のキャップが取れると、以下に限定されないが、ガスクロマトグラフィ、電子鼻、代理マーカーの赤外（ＩＦ）、紫外（ＵＶ）若しくは可視の吸光若しくは蛍光を検出するための分光光度計、又は質量分析計を含む、当該技術分野で既知のセンサ技術を用いて、その後放出された代理マーカーを検出することができる。
【００８０】
好ましい実施形態において、検出機構は、ｉｎｌＢタンパク質若しくはｉｎｌＡタンパク質、又はその両方と結合するように設計されたアプタマーである。例えば、食品源又は患者の体液由来のサンプルを、Melkerの‘８５４号特許に記載のナノ構造ベースの集合体を含有する密封バイアルに入れる。
【００８１】
一実施形態において、サンプルを高温でインキュベートし、ナノ構造ベースの集合体から放出された任意の代理マーカーを、液相から密封バイアル内の「ヘッドスペース」（気相）に拡散させる。一定条件下の温度、圧力及び平衡時間で、サンプルバイアル中の蒸気相をサンプリングし、好適なガスクロマトグラフィカラムで分離する。炎イオン化検出器又は窒素リン検出器を用いて、代理マーカーを検出する。
【００８２】
別の実施形態において、「電子鼻」は、サンプルで放出された代理マーカーの量を検出及び測定して、リステリア菌が食品サンプル又は身体サンプルに存在するかどうかを評価するのに用いられる。電子鼻は以下の成分を含むことができる：（ａ）バイアルのヘッドスペースにおいて代理マーカーの存在を検出することができるポリマーアレイを有するセンサであって、それぞれのポリマーにおける抵抗を変えることによって代理マーカーに対して反応し、センサのアレイパターンの変化をもたらすセンサ）；（ｂ）抵抗の変化を受けて、抵抗の変化をこれまでに測定した抵抗の変化と比較して、パターン変化から代理マーカーの存在、及び（必要に応じて）振幅から代理マーカーの濃度を特定するためのプロセッサ。関連の実施例では、センサは測定回路を含むことができ、出力装置が含まれていてもよい（すなわち、スクリーンディスプレイ、音声出力、プリンタ）。プロセッサは、抵抗の変化をこれまでに測定された抵抗の変化と比較し、最適値を見出すためのニューラルネットワークを含むことができる。
【００８３】
本開示のナノ構造ベースの集合体を用いて、ｉｎｌＢ若しくはｉｎｌＡ、又はその両方のレベルを測定することによって、臨床医は、現在、サンプルがリステリア菌に汚染されているか否かを確認するだけでなく、リステリア症の臨床診断の場合には、臨床医が感染経路を追跡することもできる。さらに、本開示による体液サンプルを連続試験することによって、リステリア症の治療に関してリアルタイムで診療の有効性を評価することが可能になる。したがって、本開示の方法は、個体の薬物診療に関する薬力学及び薬物動態を評価することもできる。
【００８４】
本明細書で開示されるアプタマーを用いてバイオセンサを製造するのに用いられ得る他の技法としては、例えば、米国特許第７，０２９，８５２号、同第６，９７４，７０６号、同第６，８９７，０７３号、同第６，８９０，７１９号、及び同第６，３９９，３０２号（参照により本明細書に援用される）で開示されるものが挙げられる。
【００８５】
細菌の免疫磁性捕捉を組み込む技法と共に、バイオセンサ技術を用いてもよい。この手順では、対象の細菌に対する抗体を磁性ビーズに固定する。抗体又はアプタマーが付着したビーズは、標的生物と相互作用し、磁界で他のサンプル材料及び微生物から分離することができる。この手順は、従来必要とされてきた試験サンプルで標的細菌を濃縮するための２４時間〜４８時間の培養期間を低減又は排除することを意図する。磁性ビーズの製造及び使用は、米国特許第３，９７０，５１８号、同第４，２３０，６８５号、同第４，６
７７，０５５号、同第４，６９５，３９３号、及び同第５，６９５，９４６号（参照により本明細書に援用される）に記載されている。免疫磁性ビーズは、食品からサルモネラ菌（Vermunt他, J. Appl. Bact. 72, 112, 1992）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（Johne他, J. Clin. Microbiol. 27, 1631, 1989）及びリステリア菌（Skjerve他, Appl. Env. Microbiol. 56, 3478, 1990）を単離することや、糞サンプルから大腸菌（Lund他, J. Clin. Microbiol. 29, 2259, 1991）を単離することに用いられている。感度を改善するために、バイオセンサプラットフォームに適用する前に、免疫磁性ビーズを用いて細菌を捕捉することができる。
【００８６】
＜リステリア症の治療又は予防におけるアプタマーの使用＞
リステリア菌の感染の促進に関与するｉｎｌＢタンパク質又はｉｎｌＡタンパク質の活性部位と特異的に結合する開示のアプタマーは、リステリア症の進行を阻害する効果を有すると予想される。
【００８７】
アプタマーの治療組成物は注射によって非経口で投与してもよいが、他の効果的な投与形態（例えば関節内注射、吸入霧、経口活性製剤、経皮イオントフォレーシス又は坐薬）も想定されている。１つの好ましい担体は生理食塩溶液であるが、他の薬学的に許容可能な担体を用いてもよいことが考慮される。１つの好ましい実施例では、担体及びリガンドは、生理学的に適合性がある徐放製剤を構成することが想定される。このような担体における一次溶媒は、事実上、水溶性であっても水溶性でなくてもよい。さらに、製剤のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色度、滅菌性、安定性、溶解速度、又は臭気を、変える又は維持するために、担体は他の薬理学的に許容可能な賦形剤を含有してもよい。同様に、リガンドの安定性、又は溶解、放出若しくは吸収の速度を変える又は維持するために、担体はさらに他の薬理学的に許容可能な賦形剤を含有してもよい。このような賦形剤は、単位投与又は複数回投与形態のいずれかの非経口投与のために調剤を作製するのに通常及び慣習的に用いられる物質である。
【００８８】
一度、治療組成物を作製すれば、これは、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体又は脱水化粉末若しくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルで保存することができる。このような製剤は、使用可能な形態、又は投与の直前に再構築が必要な形態のいずれかで保存することができる。全身輸送のための核酸リガンドを含有する製剤の投与様式は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は膣坐剤若しくは肛門坐剤によるものでもよい。
【００８９】
これらのアプタマー等の核酸配列自体が酵素分解に感受性がある場合がある。これは、保護形態でアプタマーを投与することによって防ぐことができる。
【００９０】
これを行い得る１つの方法は、例えば、米国特許第７，００５，１３２号で開示されたように、分解を防ぐためにアプタマーを保護分子と結合させることである。例えば、ｉｎｌＢ又はｉｎｌＡと特異的に結合し、これを阻害するアプタマーは、特異的な結合形態での投与によって、酵素分解に対して保護される。抗ｉｎｌＢ又は抗ｉｎｌＡのアプタマーの特異的な結合パートナーは、コンビナトリアル型ライブラリから選択される合成受容体、又はｉｎｌＢ又はｉｎｌＡの存在下で解離できる準安定ハイブリッドを得るのに好適な程度の相補性で、ワトソンクリック塩基対合によってアプタマーとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのいずれかとしてもよい。抗ｉｎｌＢ又は抗ｉｎｌＡアプタマーの異なるヌクレオチド配列と相補的な最初の配列領域からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化によって、これらのオリゴヌクレオチドを生成する。この実施例では、ランダム化プール、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化によって生成したオリゴヌクレオチドを含むコンビナトリアル型ライブラリからｉｎｌＢ又はｉｎｌＡの相対的に保存された領域との特異的な結合に対して、ｉｎｌＢ又はｉｎｌＡアプタマーの少なくとも１つが選択される。潜在的に有用なコンビナトリアル型ライブラリとしては、アミノ酸、ヌクレオチド、炭水化物及び他の有機モノマー
のランダムな組合せから調製されるポリマーコンフォーマー集団が挙げられるが、これらに限定されない。選択された合成受容体はまず、対応するプロドラッグ複合体及び対照（非結合）アプタマーの安定性試験によって、酵素分解に対するアプタマーの保護の有効性に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価する。それから、保護を与える合成受容体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアプタマーの治療標的への効果的な送達能に関して試験される。それぞれ選択された合成受容体と特異的に結合した選択アプタマーをそれぞれ含むプロドラッグ複合体を単独で、及びｉｎｌＢ又はｉｎｌＡの単離調製物と組合せてインキュベートし、感染阻害の速度、程度及び期間を対照条件と比較する（ｉｎｌＢ又はｉｎｌＡ単独、ｉｎｌＢ又はｉｎｌＡ＋アプタマー（複数可）、ｉｎｌＢ又はｉｎｌＡ＋合成受容体（複数可））。それから、前臨床研究及び臨床研究における安全性及び有効性に関して、選択されたプロドラッグ複合体及び組合せを試験する。
【実施例】
【００９１】
＜実施例１＞
リステリア症の臨床的適応を有する患者に、１５日間、１日当たり５ｍｇ／ｋｇの用量で、図１又は図７で示された１回分のアプタマーを静脈投与する。これは、単一用量で投与してもよいし、又はより少ない用量で２４時間にわたって複数回（例えばより少ない用量で８時間間隔で３回）投与してもよい。処置後、かなりの割合のｉｎｌＢタンパク質又はｉｎｌＡタンパク質がアプタマーと結合し、リステリア症の感染が緩和される。
【００９２】
＜実施例２＞
リステリア症を発症する危険性がある患者（例えばリステリア・モノサイトゲネスで汚染されたことが知られている食品の摂取の結果として）に、１５日間、１日当たり５ｍｇ／ｋｇの用量で、図１又は図７で示された１回分のアプタマーを静脈投与する。これは、単一用量で投与してもよいし、又はより少ない用量で２４時間にわたって複数回（例えばより少ない用量で８時間間隔で３回）投与してもよい。処置後、かなりの割合のｉｎｌＢタンパク質又はｉｎｌＡタンパク質がアプタマーと結合する。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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