(57)【要約】マイコバクテリウム属関連疾患を検出および処置するための方法であって、マイコバクテリアの病原性を低下させる工程、ＲＶ３１３３ｃ二量体化を減少させる工程、および特定された化合物を用いてマイコバクテリアの感染をともなう被験体を処置する工程を包含する方法が開示される。マイコバクテリウム属関連疾患の処置に有用な化合物の例としては、Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミド；１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−イミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１イル）エタノン塩酸塩；および１−（１，３−ベンズオキサゾール−２−イル）−３−（｛４−［（２−ヒドロキシエチル）スルホニル］フェニル｝アミノ）アクリルアルデヒドが挙げられる。
2009528545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、結核菌感染を検出する方法であって、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つ以上を、該被験体由来のサンプルにおいて検出する工程を包含し、該ポリペプチドのうちの１つ以上の検出が結核菌感染を示す、方法。
【請求項２】
被験体において結核菌の存在を検出する方法であって、以下の工程：
被験体から得られた、抗体を含む生物学的なサンプルを、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃ、またはそのフラグメントのうちの１つ以上に対して接触させる工程と；
該サンプル中において、１つ以上の該ポリペプチドに結合する抗体の量を検出する工程であって、該サンプルにおける抗体に対する、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つ以上の結合が、該被験体における結核菌の存在を示す工程と、
を包含する、方法。
【請求項３】
被験体における結核の進行をモニタリングする方法であって、以下の工程：
（ａ）被験体から得られた、抗体を含む生物学的なサンプルを以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃ、Ｃｆｐ−１０、Ｅｓａ−６またはそのフラグメントのうちの１つ以上と接触させる工程と；
（ｂ）該サンプル中において、該ポリペプチドに結合する抗体の量を検出する工程と；
（ｃ）１以上の引き続く時点で該被験体から得られた生物学的サンプルを用いて（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返す工程であって；結合された抗体の量の増大が、該被験体における結核の進行を示す工程と、
を包含する、方法。
【請求項４】
被験体における結核菌感染の重篤度を検出する方法であって：
以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つ以上の量を検出する工程と；
該ポリペプチドの該量と標準とを比較する工程であって、該結核菌感染の重篤度が、該ポリペプチドの量によって決定され得る工程と、
を包含する、方法。
【請求項５】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記被験体がヒトである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む、キット。
【請求項８】
以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つ以上を備えており、該ポリペプチドが固体支持体上に固定されている、キット。
【請求項９】
以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上の活性を調節する工程を包含する、細胞中の細菌感染を減少させる方法。
【請求項１０】
被験体が哺乳動物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体がヒト細胞である、請求項９または１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって：
ａ）Ｃｆｐ−１０および、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃの存在下において該因子を投与する工程と；
ｂ）Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程であって、相互作用における変化が相互作用を調節する化合物を示している工程と、
を包含する、方法。
【請求項１３】
Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって：
Ｃｆｐ−１０およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃを発現する細胞と、該因子とを接触させる工程と；
Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程であって、相互作用における変化が、相互作用を調節する化合物を示している工程と；
を包含する、方法。
【請求項１４】
Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって：
Ｅｓａｔ−６およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃの存在下において該因子を投与する工程と；
Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程であって、相互作用における変化が相互作用を調節する化合物を示している工程と；
を包含する、方法。
【請求項１５】
Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって：
Ｅｓａｔ−６およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃを発現する細胞と、該因子とを接触させる工程と；
Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程であって、相互作用の変化が相互作用を調節する化合物を示している工程と、
を包含する方法。
【請求項１６】
細胞における細菌感染を軽減する因子を特定する方法であって：
Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃを発現する細胞と、該因子とを接触させる工程と；
Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃの発現または活性における変化を検出する工程であって、発現または活性における変化は、該因子が細菌感染を軽減する因子であることを示す工程と、
を包含する、方法。
【請求項１７】
酵素の別のフラグメントの再アセンブリを含むマイコバクテリウム属における分子相互作用の検出のためのアッセイであって、該酵素フラグメントの再アセンブリが、各々の酵素フラグメントに融合された分子ドメインの相互作用によって操作され、ここで該酵素フラグメントの再アセンブリが、他の分子プロセスと独立しており、かつ該再アセブリが、該酵素の活性の再構成によって検出される、アッセイ。
【請求項１８】
前記分子ドメインがマイコバクテリウム属のポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
酵素フラグメントに融合された第一の分子ドメインが、Ｃｆｐ−１０、Ｅｓａｔ−６、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそれらのフラグメントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
酵素フラグメントに融合された第二の分子ドメインが、Ｃｆｐ−１０、Ｅｓａｔ−６、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそれらのフラグメントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素がＤＨＦＲを含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＤＨＦＲの第一のフラグメントがフラグメントＦ［３］である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＨＦＲの第二のフラグメントがフラグメントＦ［１，２］である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素の活性がトリメトプリム耐性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
マイコバクテリウム属における生体分子相互作用を検出するための方法であって：
酵素レポーター分子の第一のフラグメントと第一のポリペプチドとを含む第一の融合タンパク質と、該酵素レポーター分子の第二のフラグメントと第二のポリペプチドとを含む第二の融合タンパク質とを合わせる工程であって、該第一のポリペプチドと該第二のポリペプチドとの会合が、酵素レポーター分子の再アセンブリおよび酵素レポーター活性の再構成を生じる工程と；
酵素レポーター活性を検出し、これによって、該第一のポリペプチドと該第二のポリペプチドとの間の生体分子相互作用が示される工程と；
を包含する、方法。
【請求項２６】
マイコバクテリウム属において生体分子相互作用を調節する因子を特定するための方法であって：
酵素レポーター分子の第一のフラグメントと第一のポリペプチドとを含む第一の融合タンパク質と、該酵素レポーター分子の第二のフラグメントと第二のポリペプチドとを含む第二の融合タンパク質であって、該第一のポリペプチドが該第二のポリペプチドと会合して、これが酵素レポーター分子の再アセンブリおよび酵素レポーター活性の再構成を生じる融合タンパク質と；
因子と；を合わせる工程と、
該酵素レポーター活性を検出し、該因子の非存在下におけるコントロールに対する、該因子の付加を伴う酵素レポーター活性の減少は、該因子が該第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の生体分子相互作用を妨害することを示す工程と、
を包含する、方法。
【請求項２７】
マイコバクテリウム属における生体分子相互作用を検出するための方法であって：
酵素レポーター分子の第一のフラグメントと第一のポリペプチドとを含む第一の融合タンパク質と、該酵素レポーター分子の第二のフラグメントと第二のポリペプチドとを含む第二の融合タンパク質と、因子とを合わせる工程であって、該因子と、該第一のポリペプチドおよび該第二のポリペプチドとの会合が、該酵素レポーター分子の再アセンブリおよび該酵素レポーター活性の再構成を生じる工程と、
該酵素レポーター活性を検出し、これによって該因子と該第一のポリペプチドおよび該第二のポリペプチドとの間の生体分子相互作用が示される工程と、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記第一のポリペプチドが、マイコバクテリウム属のポリペプチドである、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記第一のポリペプチドがＣｆｐ−１０、Ｅｓａｔ−６、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントである、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記第二のポリペプチドがマイコバクテリウム属のポリペプチドである請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記第二のポリペプチドがＣｆｐ−１０、Ｅｓａｔ−６、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントである、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記酵素レポーター分子の第一のフラグメントが、ＤＨＦＲフラグメントＦ［３］を含む、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素レポーター分子の第二のフラグメントが、ＤＨＦＲフラグメントＦ［１，２］を含む、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記酵素レポーター活性がトリメトプリム耐性である、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法であって、さらに、前記因子に架橋された結合分子を含み、該結合分子が該第一のポリペプチドと会合し、かつ該因子と該第二のポリペプチドとの会合が、酵素レポーター分子の再アセンブリおよび酵素レポーター活性の再構成を生じ、そして酵素レポーター活性の検出が、該因子と該第二のポリペプチドとの間の生体分子相互作用を示す、方法。
【請求項３６】
前記因子が前記結合分子に共有結合される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記因子が架橋剤によって前記結合分子に連結される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記結合分子がラパマイシンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記因子がラパマイシン分子に共有結合される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記因子が、架橋剤によって前記ラパマイシン分子に結合される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記第一のポリペプチドがＦＲＢまたはＦＫＢＰである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
キットであって：
第一のポリペプチドおよび第一の酵素レポーターフラグメントを含む第一の融合タンパク質；ならびに
第二の酵素レポーターフラグメント、
のうちの１つ以上を備える、キット。
【請求項４３】
請求項４２に記載のキットであって、さらに結合分子を備え、前記第一の融合タンパク質が該結合分子に親和性を有する、キット。
【請求項４４】
架橋剤が前記結合分子に結合される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記結合分子がラパマイシンである、請求項４３に規定されるようなキット。
【請求項４６】
被験体においてハンセン病を検出する方法であって、該被験体由来のサンプルにおいて、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つまたは組み合わせを検出することによって、免疫細胞によって生成される応答を検出する工程を包含し、該ポリペプチドの１つ以上の検出がハンセン病を示す、方法。
【請求項４７】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染によって生成される免疫応答と、被験体においてワクチン接種によって生成される記憶応答との間を区別する方法であって、該被験体由来のサンプルにおいて、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つまたは組み合わせを検出することによる、免疫細胞によって生成される応答を検出する工程を包含し、免疫細胞によって生成される応答の検出が、ワクチン接種ではなく結核菌感染を示す、方法。
【請求項４８】
免疫原性組成物であって以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つ以上、ならびに抗原および適切なキャリアを含む、免疫原性組成物。
【請求項４９】
結核菌感染を検出するための診断アッセイであって、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上を検出する手段を含む、診断アッセイ。
【請求項５０】
Ｅｓａｔ−６および／またはＣｆｐ−１０の改変を検出するための診断アッセイであって、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上を含む、診断アッセイ。
【請求項５１】
結核菌感染の重篤度を決定するための診断アッセイであって、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上の量を決定する工程を包含する、診断アッセイ。
【請求項５２】
Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５３】
以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上をコードする核酸についてのプローブを含むマイクロアレイ。
【請求項５４】
マイコバクテリアの病原性を軽減する方法であって、マイコバクテリウム属と、以下の構造式の化合物：
【化１】
2009528545.tif 000014
とを接触させる工程を包含し、ここで：
Ｒ１がＮＨ−ＸまたはＣ（＝Ｏ）−Ｘであり、ここでＸが、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；
Ｒ４がＯＨ；ＳＯ２−Ｙであって、ここでＹが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール；またはＳＯ２−ＮＨ−Ｚであって、ここでＺが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；そして
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６の各々が独立して、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール、ならびにその薬学的に受容可能な塩および誘導体であり、
ここで該化合物が、該化合物の非存在下におけるマイコバクテリウム属と比較して病原性を軽減させる、方法。
【請求項５５】
マイコバクテリウム属におけるＲｖ３１３３ｃ二量体化を軽減する方法であって、マイコバクテリウム属と、以下の構造式の化合物：
【化２】
2009528545.tif 000015
とを接触させる工程を包含し、ここで：
Ｒ１がＮＨ−ＸまたはＣ（＝Ｏ）−Ｘであり、ここでＸが、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；
Ｒ４がＯＨ；ＳＯ２−Ｙであって、ここでＹが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール；またはＳＯ２−ＮＨ−Ｚであって、ここでＺが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；そして
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６の各々が独立して、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール、ならびにその薬学的に受容可能な塩および誘導体であり、
ここで該化合物が、該化合物の非存在下におけるマイコバクテリウム属のＲｖ３１３３ｃ二量体化と比較してＲｖ３１３３ｃ二量体化を軽減させる、方法。
【請求項５６】
被験体におけるマイコバクテリウム属感染を処置する方法であって、該被験体に対して以下の構造式の化合物：
【化３】
2009528545.tif 000016
を薬学的に受容可能な形態で投与する工程を包含し、ここで：
Ｒ１がＮＨ−ＸまたはＣ（＝Ｏ）−Ｘであり、ここでＸが、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；
Ｒ４がＯＨ；ＳＯ２−Ｙであって、ここでＹが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール；またはＳＯ２−ＮＨ−Ｚであって、ここでＺが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；そして
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６の各々が独立して、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール、ならびにその薬学的に受容可能な塩および誘導体であり、
ここで該化合物が、該化合物の非存在下におけるマイコバクテリウム属感染と比較してマイコバクテリウム属感染を軽減させる、方法。
【請求項５７】
Ｘがベンゾオキサゾール基で置換される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
Ｘが、１−メチル−１，３−ジヒドロ−ベンゾイミダゾール−２−イリデンアミン基で置換される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
Ｘがフェニル基で置換される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
Ｘがカルボキシル基で置換される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
Ｙがヒドロキシル基で置換される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
Ｚがカルボニル部分で置換される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
Ｒ１が以下の構造式：
【化４】
2009528545.tif 000017
から選択される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
Ｒ４が以下の構造式：
【化５】
2009528545.tif 000018
から選択される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記化合物が、Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミド；１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−イミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１イル）エタノン塩酸塩；および１−（１，３−ベンズオキサゾール−２−イル）−３−（｛４−［（２−ヒドロキシエチル）スルホニル］フェニル｝アミノ）アクリルアルデヒド；ならびにその薬学的に受容可能な塩および誘導体からなる群より選択される、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
キットであって：
以下の構造式の化合物であり：
【化６】
2009528545.tif 000019
ここで：
Ｒ１がＮＨ−ＸまたはＣ（＝Ｏ）−Ｘであり、ここでＸが、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；
Ｒ４がＯＨ；ＳＯ２−Ｙであって、ここでＹが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール；またはＳＯ２−ＮＨ−Ｚであって、ここでＺが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アリールであり；そして
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６の各々が独立して、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール、ならびにその薬学的に受容可能な塩および誘導体と、
請求項５４〜５６のいずれかに規定される方法を行うための説明書と、
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年３月２日に出願された米国仮特許出願第６０／７７８，３０７号；および２００６年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６０／８７２，３６６号に対する優先権を主張する。これらは、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
背景
Ｍｔｂ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、毎年２〜３百万例の死亡の原因である（ＷＨＯ，２００４）。ゲノム配列から情報を抽出するのにおける多くの技術的な前進にもかかわらず、遺伝子機能は、ＭｔｂのＯＲＦの約５８％にしか帰せられず、これによって、遺伝子機能、従って病原性をさらによく理解するための新規でかつ創造的なアプローチを開発するという重要性が強調される。ポストゲノム時代の重要な課題は、Ｍｔｂの病原性の分子機構をさらによく理解するための機能的なストラテジーを統合するということである。病原性経路は分子コネクションのマルチパートネットワークによって媒介されるということ、そしてＭｔｂはそれが他のタンパク質と相互作用する限りその機能を遂行できないということがますます明確になってきている。機能が未知のタンパク質と公知のタンパク質との間の物理的な会合によって、前者がしばしば後者の機能に関連する機能を有することが示されるということも認識されてきている。さらに、遺伝子的に解決しにくい病原体、例えばＭｔｂにおけるタンパク質間会合を研究するインビボの技術の開発は、疾患の機構の理解に有意に影響し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
要旨
被験体において、マイコバクテリウム属関連の感染、例えば、結核菌を検出および処置するための方法、材料およびキット、ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ（マイコバクテリア、放線菌）のタンパク質、薬物および薬物標的を特定するための方法が、本明細書に開示される。
【０００４】
特定されたタンパク質およびタンパク質間の相互作用を利用する、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂｃｔｅｒｉａｌ）の感染を検出し、そしてマイコバクテリアの感染を示す因子を特定するための方法が開示される。例えば、マイコバクテリア感染の検出のために有用な特定のタンパク質としては、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃ、Ｃｆｐ−１０  （Ｒｖ３８７４）、およびＥｓａｔ−６（Ｒｖ３８７５）が挙げられる。
【０００５】
以下の一般式を有する化合物：
【０００６】
【化７】
2009528545.tif 000003
であって、ここで：
Ｒ１がＮＨ−ＸまたはＣ（＝Ｏ）−Ｘであり、ここでＸが、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；
Ｒ４がＯＨ；ＳＯ２−Ｙであって、ここでＹが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール；またはＳＯ２−ＮＨ−Ｚであって、ここでＺが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；そして
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６の各々が独立して、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールである、化合物、
を用いて、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）の病原性を軽減し、ＲＶ３１３３ｃの二量体化を軽減し、そしてマイコバクテリアの感染を有する被験体を処置するための方法が開示される。
【０００７】
このような化合物の例としては、Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミド；１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−イミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１イル）エタノン塩酸塩；および１−（１，３−ベンズオキサゾール−２−イル）−３−（｛４−［（２−ヒドロキシエチル）スルホニル］フェニル｝アミノ）アクリルアルデヒドが挙げられる。
【０００８】
さらに開示されるのは、マイコバクテリウム属の細胞においてポリペプチドと相互作用する因子を特定するための方法である。この方法では、酵素レポーター分子の第一のフラグメントと第一のポリペプチドとを含む第一の融合タンパク質と、酵素レポーター分子の第二のフラグメントを含む第二の融合タンパク質とを合わせる。合わせた後、この第一および第二のポリペプチドの会合が、この酵素レポーター分子の再アセンブリおよびこの酵素レポーター活性の再構成を生じる。最終的に、酵素レポーター活性が検出される。レポーター分子の活性の変化によって、この因子が第二のポリペプチドと相互作用していることが示される。このシステムを用いれば、第一と第二のポリペプチドの間の相互作用を促進または阻害する因子が特定され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
結核菌感染の検出および処置は、特に先進工業国における、この伝染病との戦いにおける重要な手段である。ツベルクリン皮膚試験（ＴＳＴ）は、潜在性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出する、前世紀の唯一の実用的手段であった。不幸にも、ＴＳＴは、多数の十分に証明された能力および理論的な問題を被り、その最も重大なものは非結核性マイコバクテリア（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）での感染によって、またはカルメット・ゲランウシ型結核菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）ワクチン接種によって生じる反応性に起因する偽陽性である。結核菌精製タンパク質誘導性（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（ＰＰＤ）に対するＩＦＮ応答を測定することによってＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出するインビトロの全血液試験は、米国で承認された。このアッセイは、ＴＳＴよりもＢＣＧワクチン接種による影響が少ないかもしれないが、いくつかのＢＣＧワクチン接種個体では偽陽性である。なぜなら多くのＰＰＤ抗原がＢＣＧおよびＮＴＭにおいて抗原と類似または同一であるからである。全てのＢＣＧ亜系統およびほとんどのＮＴＭのゲノムが存在しないＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムの一部が特定されている。これらのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的な領域は、Ｃｆｐ−１０およびＥｓａｔ−６を含む多数のタンパク質をコードする。これらの抗原に対する細胞媒介性の応答は、証明されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染および高リスクの感染の両方と相関することが示されている。しかし、全血ＩＦＮ−アッセイに対するＣｆｐ−１０およびＥｓａｔ−６の適用は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染のさらに鋭敏な診断を可能にするが、やはり限界を有している。なぜなら、それでは感染の重篤度を区別できず、やはり偽陰性および偽陽性を生じるからである。さらに、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染についての試験の感度および特異性の評価は、ゴールデン・スタンダードを欠くことによって妨げられ；当業者は、潜在性の結核菌（ＴＢ）感染の有無を証明できない。
【００１０】
マイコバクテリアの感染の検出および処置のための方法および組成物が本明細書に開示される。さらに、マイコバクテリア感染の検出および処置に有用な因子を特定するための方法もまた本明細書において開示される。マイコバクテリア疾患および病原性を研究するために、マイコバクテリアにおけるタンパク質間の会合の研究を可能にするマイコバクテリアのシステムが開発されている。このシステムは、マイコバクテリアのタンパク質フラグメントの相補性（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｍ−ＰＦＣ）システムと呼ばれ、２つの相互作用するタンパク質に対して独立して融合された２つの小型のマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｍＤＨＦＲ）ドメインのモデル生物体であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｍｓｍ）における機能的な再構成に基づく。Ｍ−ＰＦＣを用いて、酵母ＧＣＮ４の二量体化、ＭｔｂヒスチジンキナーゼＫｄｐＤと応答調節因子ＫｄｐＥとの間の相互作用、および分泌された抗原Ｅｓａｔ−６とＣｆｐ−１０との間の会合が首尾よく実証されている。膜貫通センサーキナーゼと、ＤｅｖＳと応答調節因子ＤｅｖＲとの間の会合もまた、首尾よく示されており、それによってＭ−ＰＦＣがマイコバクテリアの膜におけるタンパク質会合を明らかにする能力が実証されている。Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒｖライブラリーを、主要な分泌抗原Ｃｆｐ−１０と会合するタンパク質についてスクリーニングしたところ、Ｅｓａｔ−６（Ｃｆｐ−１０と会合することが公知のタンパク質）が、このスクリーニングにおいて一貫して見出された。
【００１１】
Ｃｆｐ−１０はまた、以下のタンパク質と会合することが見出された：（１）Ｒｖ０６８６およびＲｖ２１５１ｃ（ＦｔｓＱ）、進化上保存されたシグナル認識経路（ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）（ＳＲＰ）のそれぞれ成分および基質；（２）Ｒｖ３５９６ｃ（ＣｌｐＣ１）、タンパク質の転座および品質管理に関与するＡＡＡ−ＡＴＰａｓｅシャペロン；（３）Ｒｖ２２４０ｃ、これは機能が未知；ならびに（４）Ｒｖ３８００ｃ（ｐｋｓ１３）、ミコール酸生合成の最終工程を触媒するポリケチド合成酵素。これらの結果は直接、Ｍｔｂシグナルペプチド独立分泌（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）（ＳＰＳ）経路と進化的に保存されたＳＲＰおよびＳｅｃＡ／ＳｅｃＹＥＧ経路とを結びつけ、それらが分泌成分を共有し得ることを示している。
【００１２】
Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃと、Ｃｆｐ−１０およびＥｓａｔ−１０との会合のおかげで、これらのタンパク質は、結核菌の検出に関連する種々の方法、キットおよびアッセイで用いられ得る。これらのタンパク質はまた、らい病（ハンセン病）および他のマクィコバクテリア疾患を検出するために用いられ得る。結核、ハンセン病および他のマイコバクテリア属関連の疾患および障害の検出および処置に対するこれらのタンパク質のこのような適用は下に考察される。
【００１３】
被験体における結核菌感染を検出する方法は、その被験体由来のサンプルにおいて、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうち１つまたは組み合わせを検出することに関与する。これらのポリペプチドのうちの１つ以上の検出は、結核感染を示す。Ｃｆｐ−１０（Ｒｖ３８７４）および／またはＥｓａｔ−６（Ｒｖ３８７５）の検出はまた、結核菌感染を示す。このような検出は、例えば、全血のＩＦＮ−γアッセイを用いて、または核酸検出システムを用いて行われてもよい（例えば、ポリペプチドをコードする核酸は、ＰＣＲ検出システムを用いて検出される）。
【００１４】
本明細書において用いる場合、被験体は個体である。従って、被験体は、限定はしないが、飼っている動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、およびトリであってもよい。さらなる例としては、この被験体は、哺乳動物、例えば、霊長類、またはヒトであってもよい。
【００１５】
本明細書に記載される方法およびアッセイは、潜伏性（ＬＴＢＩ）および活動性の結核（ＴＢ）感染の両方を有する個体を診断および処置することに有用である。極めて若齢の小児について以外は、初回感染の直後に結核症状を示すのはわずかな小児である。しかし、潜伏性の感染では、この細菌はマクロファージにかくまわれる。マクロファージでは、この細菌は長年にわたって休眠状態で生残可能であり、小さな瘢痕の内側に囲まれる。９０〜９５％の例では、この細菌は、さらなる問題を全く生じないが、感染した人の約５〜１０％では、増殖を開始する（活動性疾患）。この活動期には、感染した人は実際に病気になり、そして疾患を伝播し得る。
【００１６】
活動性感染は、小児、きわめて高齢者、またはコルチコステロイドの使用によって、さらに高頻度にもたらされる。多くの感染性疾患と同様、結核はさらに急速に伝播し、そして免疫系が弱体化しているヒトではさらに危険である。従って、ＨＩＶ感染を有するヒトは、活動性の結核を発症するリスクが増大している。潜伏性の結核感染（ｌａｔｅｎｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ＬＴＢＩ）の処置はまた、予防的治療または化学的予防とも呼ばれ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陰性の集団において活動性疾患への進行を予防することを補助する。
【００１７】
インビトロ試験を用いて、潜伏性の結核菌感染（ＬＴＢＩ）および結核（ＴＢ）症の両方を含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を診断してもよい。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）試験によって、感作されたヒト由来の新鮮なヘパリン処理全血におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の放出を、これを合成ペプチドの混合物とともにインキュベートしたとき、検出して、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに存在するタンパク質、例えば、上記のような、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃ、ならびに早期分泌抗原性標的−６（ＥＳＡＴ−６）および培養濾過タンパク質−１０（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｉｌｔｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１０）（ＣＦＰ−１０）の存在をシミュレートする。
【００１８】
本明細書に記載される全ての方法およびアッセイについては、任意の以下のタンパク質（Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃ）を個々に、または任意の組み合わせで検出してもよい。列挙したタンパク質の１つで結核感染の存在を検出するのに十分であるが、それらを同様に種々の組み合わせで用いてもよい。本明細書において用いる場合、組み合わせという用語は、同時または連続を意味する。以下の列挙は、限定はしないが、可能な組み合わせのいくつかの例となる。例えば、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃの各々のタンパク質は、本明細書に開示される方法およびアッセイを用いて単独で検出され得る。Ｒｖ０６８６はまた、Ｒｖ２１５１ｃとともに検出され得る。Ｒｖ０６８６はまた、Ｒｖ２２４０ｃとともに検出され得る。Ｒｖ０６８６はまた、Ｒｖ３５９６ｃとともに検出され得る。Ｒｖ０６８６はまた、Ｒｖ３８００ｃとともに検出され得る。さらに、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、およびＲｖ２２４０ｃが、一緒に検出されてもよい。Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、およびＲｖ３５９６ｃも、一緒に検出されてもよい。Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃも、一緒に検出されてもよい。Ｒｖ０６８６、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃも一緒に検出されてもよい。Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃも一緒に検出されてもよい。Ｒｖ０６８６、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃも一緒に検出されてもよい。Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃも一緒に検出されてもよい。Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃも一緒に検出されてもよい。Ｒｖ３５９６ｃおよびＲｖ３８００ｃも一緒に検出されてもよい。Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃも一緒に検出されてもよい。上記のリストは完全ではなく、そして限定はしないが、可能な組み合わせのいくつかの例となる。
【００１９】
タンパク質の上記の組み合わせの上に、Ｃｆｐ−１０およびＥｓａｔ−１０も、結核感染を検出するために用いられる方法およびアッセイで用いられ得る。Ｃｆｐ−１０およびＥｓａｔ−１０は、お互いと組み合わせて、そして可能な他の種々のタンパク質組み合わせで用いられてもよいし、または個々に用いられても、そして可能な種々のタンパク質の組み合わせで用いられてもよく、例えば、Ｒｖ０６８６およびＣｆｐ−１０が検出されてもよく、またはＲｖ０６８６、Ｃｆｐ−１０、およびＥｓａｔ−６が検出されてもよい。これは、可能な多くの組み合わせのうちの１例でしかない。
【００２０】
また本明細書には、被験体における結核菌の存在を検出する方法も開示され、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）被験体から得られる生物学的なサンプルであって、抗体を含む生物学的サンプルを、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃ、またはそのフラグメントのうちの１つ以上に対して接触させる工程と；ｂ）このサンプル中において、１つ以上のポリペプチドに結合する抗体の量を検出する工程であって、このサンプルにおける抗体に対する、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つ以上の結合が、この被験体における結核菌の存在を示す工程と。例えば、Ｒｖ３５９６ｃは、抗体アッセイによって検出可能であることが示されている。Ｃｆｐ−１０および／またはＥｓａｔ−６も、例えば、検出され得る。
【００２１】
これらのＲｖタンパク質（Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃ）と、Ｅｓａｔ−６および／またはＣｆｐ−１０との相互作用は、ＩＦＮ−γのレベルに影響し得る。リンホカインＩＦＮ−γは、主にＴ細胞およびＮＫ細胞によって生成され、多数の細胞内病原体を制御するのにおけるマクロファージ活性化の重要なメディエーターであることが示されている。ＩＦＮ−γのｍＲＮＡは、結核患者由来の胸膜組織において、そしてハンセン病の自己治癒型の病変において見出されている。癩腫癩患者における病変への組み換えＩＦＮ−γの注入によって、注射部位への多数のＴｈ細胞および単球の遊走、ならびに抗酸菌の減少が生じた。病原性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓチャレンジに対する防御を養子性に移動させるＴ細胞は、インビトロで刺激された場合にＩＦＮ−γを生じる。
【００２２】
また本明細書では、被験体において結核の進行をモニタリングする方法も開示され、この方法は、被験体から得られる生物学的なサンプルであって、抗体を含む生物学的サンプルを、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃ、Ｃｆｐ−１０  Ｅｓａ−ｏまたはそのフラグメントのうちの１つ以上と接触させる工程と；このサンプル中において、このポリペプチドに結合する抗体の量を検出する工程と；１以上の引き続く時点でこの被験体から得られた生物学的サンプルを用いて、前の工程を繰り返す工程とを包含し；結合された抗体の量の増大が、この被験体における結核菌の進行を示している。ＩＦＮ−γ産生は、本明細書において上記される方法を用いて測定され得る。
【００２３】
本明細書において開示されるのは、ある被験体における結核菌感染の重篤度を検出する方法であって、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つ以上の量を検出する工程と；このポリペプチドの量と標準とを比較する工程であって、この結核菌感染の重篤度が、このポリペプチドの量によって決定され得る工程と、を包含する。
【００２４】
また本明細書で開示されるのは、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上の活性を調節する工程を包含する、細胞中の細菌感染を減少させる方法である。この細菌感染は、マイコバクテリウム属によって生じ得る。詳細には、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ，またはＭ．ｍａｒｉｎｕｍである。このポリペプチドの活性は、この細胞と、ある組成物であって、化学物質、化合物、低分子または高分子、有機分子、無機分子、ペプチド、薬物、タンパク質、抗体、モルホリノ、三重らせん分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸またはリボザイムを含む組成物とを接触させることによって調節され得る。１例では、この細菌感染は、このポリペプチドに特異的に結合する抗体によって調節される。このような実施形態は、下にさらに詳細に考察される。さらに、この細胞は、被験体中であっても、またはインビトロであってもよい。
【００２５】
開示されるのは、Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって、この方法は、Ｃｆｐ−１０および、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃの存在下においてこの因子を投与する工程と；Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程とを包含しており、相互作用における変化が相互作用を調節する化合物を示している。
【００２６】
また開示されるのは、Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって、この方法は、Ｃｆｐ−１０およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃを発現する細胞と、この因子とを接触させる工程と；Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程とを包含しており、相互作用における変化（例えば、結合のレベルにおける変化）が、相互作用を調節する化合物を示している。
【００２７】
また開示されるのは、Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって、この方法は、Ｅｓａｔ−６およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃの存在下においてこの因子を投与する工程と；Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程とを包含しており、相互作用における変化が相互作用を調節する化合物を示している。
【００２８】
また開示されるのは、Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって、この方法は、Ｅｓａｔ−６およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃを発現する細胞と、この因子とを接触させる工程と、Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃとの間の相互作用を検出する工程とを包含しており、相互作用の変化が相互作用を調節する化合物を示している。
【００２９】
本明細書に開示されるのは、細胞における細菌感染を軽減する因子を特定する方法であって、この方法は、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃを発現する細胞と、この因子とを接触させる工程と；Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃの発現または活性における変化を検出する工程とを包含しており、発現または活性における変化は、この因子が細菌感染を軽減する因子であることを示している。この細胞は被験体中であっても、またはインビトロであってもよい。
【００３０】
本明細書に開示されるのは、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃのうちの１つ以上を含む免疫原性組成物、またはその免疫原性フラグメントである。この組成物はさらに、キャリアおよび／またはアジュバントを含んでもよい。
【００３１】
また開示されるのは、結核菌感染を検出するための診断アッセイであって、このアッセイは、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上を検出する手段、またはＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃが、Ｅｓａｔ−６および／もしくはＣｆｐ−１０を改変してＩＦＮ−γ（ＥＬＩＳＡによって測定され得る）に影響する方法を検出する手段を包含する。このアッセイでは、Ｃｆｐ−１０および／またはＥｓａｔ−６も検出され得る。１実施例では、検出の手段はＥＬＩＳＡであってもよい。
【００３２】
また本明細書で開示されるのは、結核菌感染の重篤度を決定するための診断アッセイであって、このアッセイは、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上の量を検出する手段、またはＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃもしくはＲｖ３８００ｃが、Ｅｓａｔ−６および／もしくはＣｆｐ−１０を改変する方法を検出する手段を包含する。このアッセイでは、Ｃｆｐ−１０および／またはＥｓａｔ−６も検出され得る。１実施例では、検出の手段はＥＬＩＳＡであってもよい。
【００３３】
また本明細書で開示されるのは、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはその免疫原性フラグメントに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントである。例えば、この抗体は、中和抗体であってもよい。
【００３４】
また本明細書で開示されるのは、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上をコードする核酸についてのプローブを含むマイクロアレイである。Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃに対する抗体を検出するために用いられ得るマイクロアレイも提供され、これは、列挙されたポリペプチドまたはそのフラグメントのうちの１つ以上を含む。また、本明細書で提供されるのは、列挙されるポリペプチドに対する抗体、またはその列挙されたポリペプチドのうちの１つ以上に結合する抗体フラグメントを含むマイクロアレイである。
【００３５】
上記の方法、アッセイおよびキットの全てはまた、ハンセン病（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）および他のマイコバクテリア疾患で用いられ得る。特に、本明細書で開示されるのは、被験体でハンセン病を検出する方法であって、この方法は、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントの組み合わせのうちの１つ以上を用いて、免疫細胞によって生成される応答を；その被験体由来のサンプル中で検出する工程を包含し、ここで免疫細胞によって生成される応答は、ハンセン病を示す。
【００３６】
また本明細書で開示されるのは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染によって生成される免疫応答と、被験体においてワクチン接種によって生成される記憶応答との間を区別する方法であって、この方法は、以下のポリペプチド：Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはそのフラグメントのうちの１つまたは組み合わせを用いて、この被験体由来のサンプルにおいて、免疫細胞によって生成される応答を検出する工程を包含し、ここでこのポリペプチドの１つ以上の検出が、ワクチン接種ではなく結核菌感染を示す。例えば、ワクチン接種は、Ｍ．ｂｏｖｉｓワクチン接種であってもよい。
【００３７】
また開示されるのは、開示された組成物を調製するために用いられるべき成分、および本明細書に開示される方法内でそれ自体が用いられるべき組成物である。これらおよび他の材料および方法は、本明細書に開示されており、そしてこれらの材料または方法の工程の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物または工程の各々の種々の個々のそして総合的な組み合わせおよび順列の特定の言及は明確には開示されえないが、各々が特異的に意図されそして本明細書に記載されることが理解される。例えば、ポリペプチドのリストが開示され、かつ考察され、そしてこのポリペプチドが単独でまたは組み合わせて用いられ得る場合、特に意図されるのは、特に反対に示されない限り、可能なポリペプチドの各々のかつあらゆる組み合わせおよび順列である。従って、あるクラスの分子または工程Ａ、ＢおよびＣが開示され、同様に、あるクラスの分子または工程Ｄ、ＥおよびＦならびに組み合わせの例が開示される場合、Ａ−Ｄが開示され、各々が個々に言及されない場合でさえ、各々が個々にかつ総称的に意図され、これは組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが意図され開示されるということを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが開示され考慮される。この概念は、この適用の全ての局面にあてはまり、これには限定はしないが、開示される組成物を作成および使用する方法の工程が挙げられる。従って、行われ得る種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々が、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで行われてもよいことが理解される。
【００３８】
本明細書に開示されるこれらのタンパク質、例えば、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃ、Ｃｆｐ−１０およびＥｓａｔ−６は、改変体、誘導体を有してもよく、そして本明細書に記載される方法およびアッセイでやはり有用であるそのフラグメントとして用いられてもよい。本明細書において開示された遺伝子およびタンパク質の、任意の公知の改変体および誘導体、またはそのような遺伝子およびタンパク質を生じ得るものを規定する１方法は、特定の公知の配列に対する相同性の観点から改変体および誘導体を規定することによる。詳細に開示されるのは、これらの改変体、ならびに言及される配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの相同性を有する、本明細書に開示される他の遺伝子およびタンパク質である。当業者は、２つのタンパク質または遺伝子のような核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルになるように２つの配列を整列させた後に計算され得る。
【００３９】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって行われてもよい。比較のための配列の最適のアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の局所相同性アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のコンピューター処理の実行によって、または検閲によって行われてもよい。
【００４０】
同じタイプの相同性は、核酸について、例えば、核酸アラインメントに関する少なくとも材料についての参照によって本明細書に援用される、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６，１９８９に開示されるアルゴリズムによって得られてもよい。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、ハイブリダイゼーションという用語は、少なくとも２つの核酸分子、例えば、プライマーまたはプローブおよび遺伝子の間の配列に由来する相互作用を意味する。配列に由来する相互作用とは、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド誘導体の間で、ヌクレオチド特異的な方式で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは、配列に由来する相互作用である。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多数の条件およびパラメーターによって影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨおよび温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするか否かに影響する。
【００４２】
２つの核酸分子の間の選択性のハイブリダイゼーションについてのパラメーターは、当業者に周知である。例えば、ある実施形態では、選択性のハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として規定され得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程のいずれかまたは両方の、温度および塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択性のハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（それらのハイブリダイゼーションパートナーから分子の半分が解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度で高いイオン強度の溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）でのハイブリダイゼーション、続いて洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低くなるように選択された温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄を包含し得る。温度および塩の条件は、予備実験において経験的に容易に決定され、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルが目的の標識核酸にハイブリダイズされ、次いで異なるストリンジェンシー条件下で洗浄される。ハイブリダイゼーション温度は代表的には、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションについては高い。より高い、増大する、上昇する、または上昇という用語は、基礎またはコントロールのレベルを上回る増大をいう。コントロールという用語は、本明細書において用いる場合、変化を測定する標準である。例えば、コントロールは、試験の変数に供されないが、代わりに、規定のセットのパラメーターに供されるか、またはコントロールは、前のまたは後の処置レベルに基づく。条件は、ストリンジェンシーを達成するために上記されたとおり、または当該分野で公知のとおり用いられ得る。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７、これは、その全体が参照によって、そして少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関する材料について、本明細書に援用される）。本明細書において用いる場合、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーションという用語は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液中）、続いて６８℃での洗浄である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、必要に応じて、所望される相補性の程度が減るに応じて低下されてもよく、そしてさらに、変動が検索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存する。低下する、低下した、低下、減少、低いまたはより低いという用語は、基本のレベルまたはコントロールのレベルよりも下に下がることをいう。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、必要に応じて、所望される相補性が増大するに応じて増大されてもよく、そしてさらに、全てが当該分野で公知のように、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存する。
【００４３】
より高い、増大する、上昇する、または上昇という用語は、本明細書において用いる場合、基礎のレベルまたはコントロールのレベルを上回る増大をいう。コントロールという用語は、本明細書において用いる場合、変化が測定される標準である。例えば、コントロールは、試験の変数に供されないが、代わりに、規定のセットのパラメーターに供されるか、またはコントロールは、前のまたは後の処置レベルに基づく。
【００４４】
選択性のハイブリダイゼーションを規定するための別の方法は、他の核酸に結合された核酸の１つの量（割合）を見出すことによる。例えば、ある実施形態では、選択性のハイブリダイゼーション条件とは、限定核酸（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントが非限定核酸に結合されるときである。代表的には、非限定的なプライマーは、例えば、１０または１００または１０００倍過剰である。このタイプのアッセイは、限定および非限定的なプライマーの両方が例えば、それらのｋｄよりも１０倍または１００倍もしくは１０００倍低い条件下で、または核酸分子の１つだけが１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍である条件下で、または核酸分子の１つもしくは両方がそれらのｋｄを上回る条件下でおこなわれてもよい。
【００４５】
選択性のハイブリダイゼーションを規定する別の方法は、所望の酵素操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で酵素的に操作されたプライマーの割合を見出すことによる。例えば、ある実施形態では、選択性のハイブリダイゼーション条件は、このプライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントが、酵素的な操作を促進する条件下で酵素的に操作されるときであり、例えば、酵素的な操作がＤＮＡ伸長であるならば、選択性のハイブリダイゼーション条件は、プライマー分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントが伸長されるときである。好ましい条件としてはまた、製造業者によって示唆されるか、またはその操作を行う酵素について適切であると当該分野で示される条件が挙げられる。
【００４６】
ある組成物または方法が、ハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のいずれか１つを総合的にまたは個々に、満たす場合、これは本明細書で開示される組成物または方法であることを当業者は理解するということが理解される。
【００４７】
本発明は、マイコバクテリア抗原に関連するポリペプチドを提供する。本明細書において用いる場合、ポリペプチドという用語は、従来の意味で、すなわちアミノ酸の配列として用いられる。このポリペプチドは、特定の長さの生成物には限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれ、そしてこのような用語は、他に特に示されない限り、本明細書において交換可能に用いられ得る。この用語はまた、天然に存在し、天然には存在しない両方の、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該分野で公知の他の修飾を指すこともなく、または除外することもない。ポリペプチドは、タンパク質全体であっても、またはその小配列であってもよい。本発明の文脈における目的の特定のポリペプチドは、エピトープ、すなわち、ポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担い、かつ免疫応答を惹起し得る抗原性決定基を含むアミノ酸配列である。
【００４８】
従って、細菌のポリペプチドもしくは細菌のタンパク質、またはさらに詳細には、マイコバクテリアのポリペプチドまたはマイコバクテリアのタンパク質とは、本明細書に開示される疾患を有する被験体のかなりの割合から単離されたサンプルに存在する本発明のポリペプチド配列を一般にいう。本発明のポリペプチド配列は、感染された細胞におけるその発現に基づいて、本明細書に開示される疾患を有する個体から単離され、下にさらに記載されるように、診断マーカーとして、そして治療剤としての両方で特定の有用性を有する。薬剤及び標的という用語は、選択されたタンパク質または他の分子と相互作用する能力について試験されるべき化合物または他の分子を指す。標的という用語の使用についての変動の例としては、限定はしないが、標的分子、標的基質、標的核酸分子、標的領域、標的細胞が挙げられ、そして各々の場合に、標的のタイプを指す。本発明の１つの特定の実施形態では、細菌ポリペプチドまたは細菌タンパク質は、Ｒｖ３８７４（Ｃｆｐ−１０）、Ｒｖ３８７３（Ｅｓａｔ−６）、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃを含む。
【００４９】
本明細書に記載されるポリペプチドは、罹患していない個体由来のサンプルに比較した場合、結核または他のマイコバクテリア疾患を有する被験体由来のサンプルと、それらのポリペプチドとの種々の反応性によって特定され得る。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドは、罹患していない個体由来のサンプルに対する反応性の欠如と比較した場合、結核または他のマイコバクテリア疾患を有する被験体由来のサンプルと、それらのポリペプチドとの反応性によって特定され得る。本明細書において用いる場合、反応性の欠如という用語は、所定のアッセイ方法についてのバックグラウンドよりも１．５倍低い任意の反応性を意味する。本明細書において用いる場合、反応性またはより高い反応性という用語は、所定のアッセイについてバックグラウンドを少なくとも１．５倍こえた反応性を指す。さらに、本明細書に記載されるポリペプチドは、罹患していない個体由来のサンプルに対するそれらの高い反応性に比較した場合、結核または他のマイコバクテリア疾患を有する被験体由来のサンプルとのそれらの反応性によって特定され得る。さらに、本明細書に記載されるポリペプチドは、罹患していない個体由来のサンプルに対するそれらの低い反応性に比較した場合、結核を有する被験体由来のサンプルとのそれらのポリペプチドとの反応性によって特定され得る。本明細書において用いる場合、反応性が低いという用語は、比較ポイントより小さくてもよく、そして反応性の欠如を包含してもよい。
【００５０】
必要に応じて、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントは、免疫原性である。免疫原性活性のスクリーニングは、当業者に周知の技術を用いておこなわれ得る。例えば、このようなスクリーニングは、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載される方法などの方法を用いて行われてもよい。１つの例示的な例では、ポリペプチドは、固体支持体上に固定されてもよく、そして被験体血清と接触されて、免疫されたポリペプチドに対するこの血清内の抗体の結合が可能にさせられる。
【００５１】
固体支持体は、固体状態の基板または支持体であり、ここに分子、例えば、分析物および分析物結合分子が会合され得る。分析物、例えば、石灰化ナノ粒子およびタンパク質が、固体支持体と直接または間接的に会合され得る。例えば、分析物は、固体支持体上に直接固定されてもよい。分析物捕獲剤、例えば、捕獲化合物も、固体支持体上に固定され得る。固体支持体の好ましい形態はアレイまたはチップである。別の形態の固体支持体はアレイ検出器である。アレイ検出器は、固体支持体であり、これに複数の異なる捕獲化合物または検出化合物がアレイ、格子または他の組織化されたパターンで結合されている。
【００５２】
固体支持体における使用のための固体状態基板は、任意の固体材料を含んでもよく、ここに分子が結合され得る。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコン・ラバー、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸などの物質を挙げることができる。固体状態の基板は、薄膜、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織り線維、成型ポリマー、粒子、ビーズ、マイクロ粒子または組み合わせを含む任意の有用な形態を有し得る。固体状態の基板および固体支持体は、多孔性であっても、非多孔性であってもよい。固体状態基板のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュ、例えば、標準の９６ウェル型である。好ましい実施形態では、通常１ウェルあたり１アレイを含むマルチウェルガラススライドが使用され得る。この特徴によって、アッセイ再現性のさらに優れた制御、処理能力の向上、およびサンプル取り扱い、ならびに容易な自動化が可能になる。
【００５３】
種々の化合物をセットとして一緒に用いてもよい。このセットは、別々の反応で別々に用いられる化合物の全てまたはサブセットの混合物として用いられても、またはアレイに固定されてもよい。別々に用いられるかまたは混合物として用いられる化合物は、例えば、固体支持体との会合またはその上の固定を通じて物理的に分けることが可能であり得る。アレイは、そのアレイ上の特定された位置または予め規定された位置に固定された複数の化合物を含み得る。アレイ上の各々の予め規定された位置は一般に、１つのタイプの成分を有し得る（すなわち、その位置の全ての成分が同じである）。各々の位置は、複数のコピーの成分を有する。アレイ中の異なる成分の空間的分離によって、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの別々の検出および特定が可能になる。
【００５４】
固体状態の基板に対して抗体（および他のタンパク質）を固定するための方法は十分確立されている。固定は、標準的な固定化学を用いて、例えば、アミノ化表面、カルボキシル化表面または水酸化表面に対する結合によって達成され得る。結合剤の例は、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジン−ビオチン、光架橋剤、エポキシドおよびマレイミドである。好ましい結合剤は、異種二機能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋剤Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）である。これらおよび他の結合剤、および結合でそれらを使用するための方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ，編（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８７）頁２０９〜２１６および２４１〜２４２，ならびにＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ；Ｃｒａｉｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）に記載されており、これらは、固体状態の基板に対して抗体を結合する方法についてその全体が参照によって援用されている。
【００５５】
固体支持体上に固定された各々の成分は好ましくは、固体支持体の異なる所定の領域に位置する。各々の異なる所定の領域は、お互いの異なる領域とは物理的に隔てられ得る。固体支持体の異なる所定の領域の間の距離は、固定であっても可変であってもよい。例えば、アレイでは、各々の成分は、お互いから固定距離に配列され得るが、ビーズと会合された成分は、固定された空間関係ではない。詳細には、複数の固体支持体ユニット（例えば、複数のビーズ）の使用によって、距離は可変になる。
【００５６】
成分は、任意の密度で固体支持体に会合されるか、または固定されてもよい。成分は好ましくは、１立方センチメートルあたり４００を超える異なる成分という密度で固体支持体に固定される。成分のアレイは、多数の成分を有し得る。例えば、アレイは、固体支持体上に固定された少なくとも１，０００個の異なる成分、固体支持体上に固定された少なくとも１０，０００個の異なる成分、固体支持体上に固定された少なくとも１００，０００個の異なる成分、または固体支持体上に固定された少なくとも１，０００，０００個の異なる成分を有し得る。
【００５７】
必要に応じて、固体支持体上の少なくとも１つのアドレスを、本明細書に開示されるタンパク質またはそのタンパク質をコードする核酸配列のいずれかに示される配列または配列の一部から選択する。固体支持体はまた、本明細書に開示されるタンパク質またはそのタンパク質をコードする核酸配列のいずれかに示される配列または配列の一部の改変体である少なくとも１つのアドレスを含んでもよい。
【００５８】
また開示されるのは、抗体応答の複数の特徴付けのための抗原マイクロアレイである。例えば、開示されるのは、マイクロリットル未満の量の生物学的なサンプルを用いる、構造的に多様な抗原に対する抗体応答の大規模複数特徴づけを行うために、抗原アレイを構築および用いる技術についてその全体が参照によって本明細書に援用される、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，８（３）：２９５−３０１（２００２）に記載されるような、マイクロリットル未満の量の生物学的なサンプルを用いる、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体に対する抗体応答の大規模な複数の特徴付けを行うための、抗原アレイおよび小型化抗原アレイである。
【００５９】
Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃ、Ｃｆｐ−１０（Ｒｖ３８７４）、およびＥｓａｔ６（Ｒｕ３８７５）をコードするタンパク質配列およびそれぞれの核酸が本明細書に開示される。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ遺伝子およびそれらの関連のタンパク質に関与する情報は、例えば、ウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｅ−ｍｂｉ．ｕｃｌａ．ｅｄｕ／ＴＢ／ＰＵＢＬＩＣ／ｑｓ／ａｎｎｏｔ  ｓｅａｒｃｈ．ｐｈｐ？ａｎｎｏｔ＝に見出すことが可能で、これは、その全体が参照によって本明細書に援用される。このウェブサイトは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ（ＵＣＬＡ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって運営されており、これは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノム全体を含み、そしてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの遺伝子についての情報、そして公知の場合は、それらの関連タンパク質の機能についての情報を含む。このような情報としては、限定はしないが、ゲノム情報（例えば、核酸配列）、プロテオミクス情報（例えば、タンパク質配列）、機能的情報、相同配列、モチーフおよびドメインが挙げられる。本発明の保存的置換および相同性の説明は、任意の組み合わせ、例えば、特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有し、この改変体が１つ以上の保存的置換を含む実施形態で一緒に合わされてもよい。
【００６０】
さらに、開示された組成物に組み込まれ得る多数のアミノ酸およびペプチドアナログが存在することが理解される。アミノ酸アナログおよびアナログおよびペプチドアナログはしばしば、増強されたまたは所望される特性、例えば、より経済的な生成、より大きい化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、力価、有効性など）、特異性の変更（例えば、生物学的な活性の広いスペクトル）、低下または増強された抗原性、などを有する。
【００６１】
Ｄ−アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために用いられ得る。なぜならＤアミノ酸は、ペプチダーゼなどでは認識されないからである。同じタイプのＤアミノ酸を有するコンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の体系的な置換（例えば、Ｌリジンの代わりにＤリジン）を用いて、より安定なペプチドを生成してもよい。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化または結合するために用いられ得る。これは、ペプチドを特定の構成に強制するために有益であり得る（参照によって本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１  ：３８７（１９９２））。
【００６２】
また開示されるのは、融合ポリペプチドである。ポリペプチドは、本明細書に記載されるような複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載されるような少なくとも１つのポリペプチドおよび無関係の配列、例えば、公知の細菌タンパク質を含む融合ポリペプチドであってもよい。融合のパートナーは例えば、ヘルパーＴエピトープ（免疫学的な融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供することを補助してもよいし、またはネイティブな組み換えタンパク質よりも高収率でタンパク質（発現エンハンサー）を発現することを補助してもよい。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解度を増大するように選択されても、またはポリペプチドが所望の細胞内区画に標的されることを可能にするように選択されてもよい。なおさらなる融合パートナーとしては、ポリペプチドの精製を容易にするアフィニティータグが挙げられる。
【００６３】
本明細書は、種々のポリペプチドおよびポリペプチド配列を考察するので、それらのポリペプチド配列をコードし得る核酸も開示されることが理解される。これは、特定のポリペプチド配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のポリペプチド配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびにタンパク質配列の開示された改変体および誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸を包含する。従って、各々の特定の核酸配列は、本明細書に記載されなくてもよいが、各々のそしてあらゆる配列は、実際には開示されており、そしてその開示されたポリペプチドを通じて本明細書に記載されていることが理解される。
【００６４】
本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるタンパク質、特にＲｖタンパク質、例えば、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃをコードするポリヌクレオチド内で相互作用し得る機能的な核酸である。機能的な核酸は、特定の機能、例えば、標的分子もしくは因子に結合すること、または特定の反応を触媒することを有する核酸分子である。機能的な核酸分子は、限定は意味しないが、以下のカテゴリーに分けられてもよい。例えば、機能的な核酸としては、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、リボサイム、三重らせん形成分子、および外部ガイド配列が挙げられる。機能的な核酸分子は、標的分子または因子によって保有される特定の活性のエフェクター、インヒビター、モジュレーター（調節因子）およびスティミュレーター（刺激因子）として作用してもよいし、または機能的な核酸分子は、任意の他の分子と独立した新規な（ｄｅ  ｎｏｖｏ）活性を保有してもよい。
【００６５】
本明細書に開示されるのは、制御エレメントに作動可能に連結された本明細書に開示されるタンパク質に相当するポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。また、本明細書に開示されるタンパク質に相当するポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞も本明細書に開示される。また、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に送達する方法も本明細書に開示される。また、発現ベクター用いて形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞も開示される。
【００６６】
細胞に対して、インビトロまたはインビボのいずれかで核酸を送達するために用いられ得る、多数の組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は大きく２つのクラスに分けられる：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系。例えば、核酸は、多数の直接送達系、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リン酸カルシウム沈澱、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドを通じて、または陽イオン性リポソームのような細胞もしくはキャリアにおけるゲノム物質の移入を介して送達され得る。トランスフェクションのための適切な手段としては、ウイルスベクター、ケミカル・トランスフェクタント、または物理化学的方法、例えば、エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散が挙げられ、これは、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，らＳｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）に記載される。このような方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書に記載される組成物および方法での使用に容易に適合可能である。特定の場合には、この方法は、大きいＤＮＡ分子で特異的に機能するように改変される。さらに、これらの方法は、キャリアの特徴を標的することを用いることによって、特定の疾患および細胞集団を標的するために用いられ得る。
【００６７】
発現ベクターを用いて、例えば、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、またはＲｖ３８００ｃの発現を調節するために有用な本明細書に開示される組成物を発現してもよい。発現ベクターは真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは核のある細胞）で用いてもよいし、そしてまた、ｍＲＮＡ発現に影響し得る転写の終止に必要な配列も含んでもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終止部位を含む。転写ユニットはまた、ポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１利点は、転写ユニットがプロセシングされ、そしてｍＲＮＡのように輸送される確率を増大させるということである。発現構築物におけるこの同定およびポリアデニル化シグナルの使用は、十分確立されている。相同なポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物で用いられることが好ましい。特定の転写ユニットでは、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル由来であり、そして約４００塩基からなる。
【００６８】
この開示されたベクターは、実質的な毒性なしに哺乳動物染色体へ組み込み得るＤＮＡ分子を提供する。
【００６９】
ウイルスおよびレトロウイルスベクターにおいて挿入された核酸は通常、所望の遺伝子産物の発現を制御することを補助するためのプロモーターまたはエンハンサーを含む。プロモーターは一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるとき機能する配列またはＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、そして上流エレメントおよび応答エレメントを含んでもよい。
【００７０】
本明細書において用いる場合、抗体という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、また開示されるのは、それらが本明細書に開示されるポリペプチドと相互作用する能力について選択される限り、それらの免疫グロブリン分子の抗体フラグメントまたはポリマー、ならびにその免疫グロブリン分子またはフラグメントのヒトバージョンまたはヒト化バージョンである。
【００７１】
本明細書において用いる場合、抗体フラグメントという用語は、完全な抗体の一部を意味するものとする。完全な抗体とは、２つの完全な軽鎖および２つの完全な重鎖を有する抗体をいう。抗体フラグメントは、１つ以上の鎖の全てまたは一部を欠く。抗体結合体における使用のための抗体フラグメントは、抗原に結合し得る。好ましくは、この抗体フラグメントは、抗原に特異的である。抗体または抗体フラグメントは、他のエピトープよりもあるエピトープに有意に大きい親和性で結合する場合、その抗原に特異的である。この抗体または抗体フラグメントは、本明細書に記載されるインビトロアッセイを用いて、または類似の方法によって、それらの所望の活性について試験され得、その後、それらのインビボの治療または予防活性を公知の化学的試験方法に従って試験する。
【００７２】
本明細書において用いる場合、抗体（単数または複数）という用語はまた、ヒト抗体またはヒト化抗体を指してもよい。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ由来の抗体）はヒトでは当然ながら抗原性であり、従って、ヒトに投与される場合、所望されない免疫応答を惹起し得る。従って、この方法でのヒト抗体またはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が所望されない免疫応答を惹起する機会を減らすように機能する。
【００７３】
開示されたヒト抗体は任意の技術を用いて調製され得る。ヒトモノクローナル抗体生成のための技術の例としては、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）によって、そしてＢｏｅｒａｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（ｌ）：８６−９５，１９９１）によって記載される技術が挙げられる。ヒト抗体（およびそのフラグメント）はまた、ファージディスプレイライブラリーを用いて生成されてもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１，１９９１）。
【００７４】
開示されたヒト抗体はまた、トランスジェニック動物から得られてもよい。例えば、免疫に応答して、ヒト抗体のフルレパートリーを生成し得る、トランスジェニックの変異マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：３３（１９９３）を参照のこと）。詳細には、これらのキメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性の抗体産生の完全な阻害を生じ、そしてこのような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列抗体遺伝子アレイの首尾よい移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。
【００７５】
本明細書に開示されるのは、細胞または被験体に対する投与のための薬学的に受容可能なキャリア中に、単独で、または治療の１つ以上の他の様式と組み合わせた、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞、ＴＣＲまたはＡＰＣ組成物である。例えば、本明細書で開示されるのは、本明細書に記載されるような薬学的に受容可能なキャリアおよびポリペプチドを含む組成物である。このような組成物はインビボで投与され得る。本明細書において用いる場合、薬学的に受容可能なという用語は、生物学的ではないか、そうでなければ所望されない物質を含むことを意味する。すなわち、この物質は、被験体に対して、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドまたはベクターとともに、含まれる薬学的組成物の任意の他の成分と有害な方式でいかなる所望されない生物学的効果も相互作用も生じることなく、投与されてもよい。このキャリアは通常は、当業者に周知であるとおり、活性成分の任意の分解を最小化するように、そして被験体における任意の有害な副作用を最小化するように選択される。
【００７６】
この組成物は経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内に、腹腔内に、経皮的に、体外で、局所に、または吸入薬によって投与され得る。吸入薬による組成物の投与は、噴霧または滴下機構による送達を介して鼻または口を通じてもよい。
【００７７】
必要な組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、体重および全身状態、処置されている疾患の重篤度、用いられる特定の核酸またはベクター、その投与方式などに依存して被験体間で変化する。従って、あらゆる組成物についての正確な量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、本明細書における技術を与える慣用的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【００７８】
この組成物の非経口投与が用いられるならば、一般には、注射によって特徴づけられる。注射液は、従来の形態で、液体溶液または懸濁液として、注射前の液体における懸濁液の溶液に適切な固体形態で、またはエマルジョンとして調製されてもよい。非経口投与のためのさらに最近修正されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるような緩徐な放出または徐放性のシステムの使用に関する。例えば、非経口投与のためのアプローチの教示のためにその全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。
【００７９】
非経口投与のための調製としては、滅菌の水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性キャリアとしては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、これには生理食塩水および緩衝化媒体を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム水溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補給物、電解質補給物（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）、などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加物も存在してもよい。
【００８０】
局所投与のための処方物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末を挙げることができる。従来の薬学的なキャリア、水溶液、粉末または油状基剤、増粘剤などが必要であるかまたは所望され得る。
【００８１】
経口投与のための組成物は、粉末または顆粒、懸濁液または溶液を、水または非水性の媒体、カプセル、子袋（ｓａｃｈｅｔｓ）または錠剤に含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が所望され得る。
【００８２】
マイコバクテリア属関連疾患を処置、阻害または予防するための、抗体のような開示された組成物の投与後に、治療抗体の有効性は、当業者に周知の種々の方法で評価され得る。例えば、本明細書に開示される抗体のような組成物は、この組成物が疾患の症状またはマーカーを減らすことを観察することによって被験体でのマイコバクテリア関連疾患を処置または阻害するのに有効であることを、当業者は理解する。
【００８３】
本明細書に開示されるマイコバクテリア属関連疾患を阻害する組成物は、マイコバクテリア属関連疾患のリスクがある被験体に予防的に投与され得る。
【００８４】
この開示された組成物および方法はまた、例えば、種々のマイコバクテリア属関連疾患の新規な薬物候補物を単離および試験するためのツールとして用いられ得る。
【００８５】
さらに、本明細書に記載されるタンパク質は、マイコバクテリア属感染の進行についてマーカーとして用いられ得る。マイコバクテリア属関連疾患の診断のための上記のアッセイは、経時的に行われてもよく、そして相対的なポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヵ月〜１年の期間にわたって２４〜７２時間ごとに行われてもよく、その後に必要に応じて行われてもよい。一般には、結核は、例えば、検出されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する被験体では進行している。さらに、本明細書に記載される組成物は、例えば、結核菌に特異的な抗体のレベルをモニターするために用いられ得る。
【００８６】
本明細書において注記されるとおり、感度を改善するためには、複数の細菌タンパク質を所定のサンプル内でアッセイしてもよい。本明細書において提供される種々のポリペプチドまたは抗体に特異的な結合因子は、単一のアッセイ内で組み合わされてもよい。さらに、複数のプライマーまたはプローブを同時に用いてもよい。細菌ポリペプチドの選択は、最適の感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的な実験に基づいてもよい。さらに、あるいは、本明細書に提供される細菌のポリペプチドまたは抗体のアッセイは、他の公知の細菌抗原、例えば、Ｃｆｐ−１０またはＥｓａｔ−６についてのアッセイと組み合わされてもよい。
【００８７】
また本明細書に開示されるのは、固体支持体に必要に応じて結合されたＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、およびＲｖ３８００ｃからなる群に対する少なくとも１つの抗体、またはそれらの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを備える、またはさらに固体支持体への結合のための手段を備えるキットである。このキットは必要に応じて、抗体のフラグメントまたはポリペプチドを含んでもよい。このキットは必要に応じて、Ｃｆｐ−１０を特異的に認識する抗体、もしくはＥｓａｔ−６を特異的に認識する抗体を備えてもよく、またはポリペプチド（Ｃｆｐ−１０および／またはＥｓａｔ−６）もしくはそのフラグメントを備えてもよい。また、Ｃｆｐ−１０および／またはＥｓａｔ−６ならびに本明細書に開示されるＲｖタンパク質によるその任意の改変の存在に応答してＩＦＮ−γ（または任意の他のサイトカイン）を測定するキットも開示される。
【００８８】
Ｒｖタンパク質は、潜伏性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出するために用いられ得る、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ試験（ＱＦＴ）またはＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ試験（ＱＦＴ−Ｇ）（Ｃｅｌｌｅｓｔｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；Ｃａｒｎｅｇｉｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）などの市販のキットと組み合わせて用いられてもよい。これらの試験は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する細胞媒介性の免疫反応の構成要素を測定するインビトロの診断補助である。この試験は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびコントロールの抗原由来の精製タンパク質誘導体（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（ＰＰＤ）とともに一晩インキュベートされた全血中で感作されたリンパ球から放出されるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の定量に基づく。
【００８９】
本明細書に開示されるタンパク質はまた、活動性および潜伏性の両方の結核感染を診断するのにおける補助として長年用いられており、かつＰＰＤの皮内注射の４８〜７２時間後の遅延型過敏症反応の測定を包含するツベルクリン皮膚試験（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｓｋｉｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ）（ＴＳＴ）と組み合わせて用いられてもよい。
【００９０】
このキットは、本明細書に開示されるか、または開示された方法の実施において必要であるかもしくは有益であると理解される任意の試薬もしくは試薬の組み合わせ、および容器またはアッセイのプラットフォームを備えてもよい。例えば、本明細書に開示されるのは、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃまたはＲｖ３８００ｃのうちの１つ以上に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含むキットである。また本明細書で開示されるのは、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃ、またはその改変体もしくはフラグメントのうちの１つ以上を備えるキットであって、ここでこのポリペプチドは、固体支持体に結合されるか、またはこのキットは固体支持体に対する結合のための手段を備える。このキットは、Ｃｆｐ−１０またはＥｓａｔ−６に関連するポリペプチドまたは抗体を備えてもよい。
【００９１】
また、化合物、試薬、容器または装置を備えるキットも開示される。試薬としてはアッセイで用いられるべき緩衝液が挙げられ得る。このようなキットはまた、あるいは、直接または間接的な検出に適切なレポーター基を含む検出試薬を備えてもよい。必要に応じて、キットは、生物学的サンプル中で細菌ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを検出するように設計されてもよい。このようなキットは一般には、細菌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイ内で用いられてもよい。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、細菌タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするための第二のオリゴヌクレオチドまたは診断の試薬もしくは容器が挙げられる。
【００９２】
必要に応じて、キットは、生物学的サンプルにおける細菌タンパク質に特異的な抗体のレベルを検出するように設計されてもよい。
【００９３】
また、マイコバクテリアにおいてタンパク質間会合を研究するためのシステムである、Ｍ−ＰＦＣシステムも本明細書において開示される。このシステムは、Ｍｔｂの病原性機構およびタンパク質間の会合を通じた他の機能的経路の研究を可能にするように開発されている。このアプローチでは、２つのマイコバクテリア相互作用タンパク質との、ｍＤＨＦＲ相補性フラグメント（［Ｆ１，２］および［Ｆ３］）などの酵素レポーターの独立した遺伝的カップリングによって、内因性のマイコバクテリアＤＨＦＲ活性が阻害される濃度で、インビボで、酵素レポーター活性、この例では、ｍＤＨＦＲ活性の再構成がもたらされる。この相補性事象の読み出しは、ＴＲＩＭに抵抗性のマイコバクテリアクローンの選択を可能にするｍＤＨＦＲフラグメント［Ｆ１，２］および［Ｆ３］のインビボ再構成である。重要なことに、Ｆ［１，２］およびＦ［３］を２つの相互作用タンパク質と融合するときだけ、ヘテロ二量体化がｍＤＨＦＲの再構成を生じる。酵母およびＥ．ｃｏｌｉなどの代用宿主ではなくマイコバクテリアでタンパク質会合を研究することの重要な利点は、適切な修飾（例えば、リン酸化）、補因子および天然の宿主に固有の排他的な細胞内環境が、相互作用の結果を調節し得るということである。
【００９４】
ｍＤＨＦＲは、２つのドメイン；アデニン結合ドメイン（Ｆ［２］）および不連続ドメイン（Ｆ［１］およびＦ［３］）を含む３つの構造的なフラグメント（Ｆ［１］、Ｆ［２］およびＦ［３］）を含む小さい２１ｋＤａのモノマータンパク質である。この特性は、Ｍ−ＰＦＣシステムを形成するように開発されてもよい。このＭ−ＰＦＣシステムは、宿主としてモデル生物体Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｍｓｍ）を用いてインビボでタンパク質間会合を精査する。このストラテジーは、２つのマイコバクテリア相互作用タンパク質ＡおよびＢが、それぞれｍＤＨＦＲ相補性フラグメントＦ［１，２］およびＦ［３］に独立して融合され、そしてマイコバクテリア中に同時形質転換される場合、ＡＦ［１，２］およびＢＦ［３］のインビボ会合によって、活性なｍＤＨＦＲ酵素へのこのフラグメントの機能的な再アセンブリが容易になるという事実に基づく。相互作用タンパク質に対する小さいタグ（Ｆ［１，２］、１０５  ａａおよびＦ［３］，８０  ａａ）の付加は、タンパク質間会合にごく最小限に影響するだけである。原核生物および真核生物のＤＨＦＲが抗葉酸薬物ＴＲＩＭの標的であるという事実にかかわらず、哺乳動物のＤＨＦＲは、細菌のＤＨＦＲが有するよりもＴＲＩＭに１２，０００倍低い親和性を有する。ＴＲＩＭによるマイコバクテリアＤＨＦＲのこの選択的な標的化は、Ｍ−ＰＦＣシステムの基礎であり、これによって内因性Ｍｓｍ  ＤＨＦＲを阻害するＴＲＩＭ濃度の存在下でｍＤＨＦＲを発現する組み換えマイコバクテリアの増殖をスクリーニングできる（図１に図示されるとおり）。相互作用タンパク質に融合されたｍＤＨＦＲの相補性フラグメントを発現するマイコバクテリア細胞は、ＴＲＩＭを含む媒体中で生存し得る。Ｍｓｍを、Ｍ−ＰＦＣ実験のための宿主として選択した。なぜなら、この系統は、ＴＲＩＭ（７Ｈ１１では約４０μｇ／ｍｌ）に感受性であり、かつ非病原性の急速な増殖であり、Ｍｔｂ遺伝子調節および分泌を研究するための優れた代用宿主であることが示されたからである。
【００９５】
図１に示されるとおり、相互作用タンパク質ＡおよびＢは、相補的なｍＤＨＦＲフラグメントＦ［１，２］およびＦ［３］に融合される。Ｍｓｍ中でのＡ−Ｆ［１，２］およびＢ−Ｆ［３］の融合の同時形質転換によって、ＴＲＩＭプレート上でのｍＤＨＦＲ活性の機能的な再構成および引き続く増殖が生じるが、相互作用しないタンパク質（ＡおよびＣ）はＦ［１，２］およびＦ［３］を再構成せず、そして、ＴＲＩＭプレート上で形質転換体が生存することを可能にしない。
【００９６】
毒性の経路は、分子相互作用の複雑な経路によって媒介され、この破壊の際には、タンパク質間の会合が変化する。従って、タンパク質間相互作用によって直接のリンクまたは役割が示されるが、一方遺伝子破壊実験は間接的な指標である。
【００９７】
Ｍ−ＰＦＣによって、Ｍｔｂにおけるタンパク質分泌の機構に対する知識が生じ得、そしてＣｆｐ−１０分泌経路のいくつかの新規な成分が特定された。Ｍ−ＰＦＣは、マイコバクテリアでのタンパク質間会合を研究するように首尾よく実行されている。Ｍｓｍでのいくつかの公知のタンパク質間相互作用が研究されており、そして相互作用の強度を可視化かつ定量するためにアッセイが開発された（実施例１）。Ｍ−ＰＦＣは、Ｃｆｐ−１０と会合するタンパク質のＭｔｂライブラリーをスクリーニングすることによって試験されかつ確認されている。Ｍ−ＰＦＣシステムは、Ｍｔｂの持続性および病原性に関与する新規な毒性の経路を特定かつ特徴づけする能力を有する。
【００９８】
さらに開示されるのは、酵素の別々のフラグメントの再アセンブリを含むマイコバクテリウム属での分子相互作用の検出のためのアッセイであって、この酵素フラグメントの再アセンブリは、各々の酵素フラグメントに融合された分子ドメインの相互作用によって作動され、この酵素フラグメントの再アセンブリは、他の分子プロセスとは独立しており、そしてこの再アセンブリは、この酵素の活性の再構成の方法によって検出される。マイコバクテリウム属は、例えば、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓであっても、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであっても、またはＭ．ａｖｉｕｍであってもよい。
【００９９】
また、マイコバクテリウム属で生体分子相互作用を検出するための方法であって、この方法は、酵素のレポーター分子の第一のフラグメントと第一のポリペプチドとを含む第一の融合タンパク質と、この酵素レポーター分子の異なるフラグメントと第二のポリペプチドとを含む第二の融合タンパク質との間の会合をマイコバクテリウム属の細胞において検出する工程を包含し、この融合タンパク質の会合が、酵素レポーター分子の再アセンブリおよび酵素レポーター活性の再構成を生じ、そしてこの第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の生体分子相互作用が、この酵素レポーター分子の活性を検出することによって測定される、方法も開示される。
【０１００】
また、第一の酵素分子のフラグメントが、第二の分子に融合され、そしてフラグメントの会合が第一の酵素分子の活性の再構成によって検出される、マイコバクテリウム属におけるアッセイを含む方法も開示される。
【０１０１】
また、マイコバクテリウム属のポリペプチドと相互作用するペプチドについてマイコバクテリア属ペプチドのＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法も開示され、この方法はＤＮＡライブラリー由来のペプチドとマイコバクテリウム属のポリペプチドとの間の相互作用が、酵素活性の再構成によって検出される酵素相補性アッセイを行う工程を包含する。
【０１０２】
本明細書に開示されるのは、Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはその改変体もしくはフラグメントとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって、この方法は、Ｃｆｐ−１０に融合された酵素レポーター分子のフラグメントを含む第一の融合タンパク質およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはその改変体もしくはフラグメントのうちの１つに融合された酵素レポーター分子の第二のフラグメントを含む第二の融合タンパク質を発現するマイコバクテリウム属の細胞と、この因子とを、この因子の非存在下において酵素レポーター分子活性を再構成するようにこの第一および第二の融合タンパク質が正常に会合する条件下で接触させる工程と；この酵素レポーター分子の活性における変化を検出する工程と、を包含する。この酵素レポーター分子の活性における変化は、この因子が、Ｃｆｐ−１０と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはその改変体もしくはフラグメントとの間の相互作用を調節する因子であるということを示す。
【０１０３】
開示されるのは、Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはその改変体もしくはフラグメントとの間の相互作用を調節する因子を特定する方法であって、この方法は、Ｅｓａｔ−６に融合された酵素レポーター分子のフラグメントを含む第一の融合タンパク質およびＲｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはその改変体もしくはフラグメントのうちの１つに融合された酵素レポーター分子の第二のフラグメントを含む第二の融合タンパク質を発現するマイコバクテリウム属の細胞と、この因子とを、この因子の非存在下において酵素レポーター分子活性を再構成するようにこの第一および第二の融合タンパク質が正常に会合する条件下で接触させる工程と；この酵素レポーター分子の活性における変化を検出する工程と、を包含し、この酵素レポーター分子の活性における変化は、この因子が、Ｅｓａｔ−６と、Ｒｖ０６８６、Ｒｖ２１５１ｃ、Ｒｖ２２４０ｃ、Ｒｖ３５９６ｃ、Ｒｖ３８００ｃまたはその改変体もしくはフラグメントとの間の相互作用を調節する因子であるということを示す。
【０１０４】
上記の例では、この酵素は、マウスのジヒドロ葉酸還元酵素（ｍＤＨＦＲ）であってもよい。非限定的な例の目的で、マイコバクテリウム属は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍまたはＭ．ａｖｉｕｍであってもよい。
【０１０５】
従って、本明細書に開示されるのは、他のタンパク質、核酸、炭水化物を含む他の分子とのマイコバクテリウム属における相互作用を検出するため、または潜在的な治療価値の化合物について低分子ライブラリーをスクリーニングするためのストラテジーである。好ましい実施形態では、本発明は、モノマー酵素のフラグメントのオリゴマー形成補助相補性（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）であって、それらの活性の検出のために他のタンパク質を必要としない相補性を得ようとする。１つのこのような実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉにおける酵素の規定のフラグメントの相補性によるジヒドロ葉酸還元酵素活性の再構成に基づくタンパク質−フラグメント相補性アッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＰＣＡ）がこれによって提供される。このアッセイは、特定のタンパク質間相互作用（すなわち、ロイシンジッパー相互作用）を検出するためのさらなる内因性の要素を必要とせず、かつ分子相互作用についてのｃＤＮＡ、核酸、低分子またはタンパク質の設計ライブラリーをスクリーニングするように都合よく拡張され得る。さらに、このアッセイはまた、任意の細胞状況または区画におけるタンパク質相互作用の検出のために適合され得、そして誘導性タンパク質相互作用と構成的なタンパク質相互作用との間を識別するために用いられ得る。
【０１０６】
タンパク質相補性アッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＰＣＡ）を設計するための１つの特定のストラテジーは、以下の特徴を用いることに基づく：１）比較的小さくかつモノマー性であるタンパク質または酵素、２）それについて構造的または機能的な情報の多数の文献が存在する、３）それについて、インビボおよびインビトロの両方で、酵素のタンパク質または活性の再構成について簡易なアッセイが存在する、そして４）それについて、真核生物細胞および原核生物細胞における過剰発現が実証されている。これらの基準を満たせば、酵素の構造を用いて、以下の基準に基づいて、２つの中で遺伝子を分けるポリペプチド鎖の最適の位置を決定する：１）このフラグメントは、連続的なポリペプチドのサブドメインを生じなければならない；すなわち、得られたフラグメントは、タンパク質のサブドメイン構造を破壊しない、２）酵素的および補因子結合部位は全てが、１フラグメントに含まれなければならない、そして３）長いペプチドリンカーの必要性を回避して、かつタンパク質結合の方向依存性の研究を可能にするために、新規なＮ末端およびＣ末端を得るのはタンパク質の同じ表面上でなければならない。
【０１０７】
上述の基準は全てが、適切な作業アッセイ方法について満たされる必要はない。酵素は小さく、好ましくは１０〜４０ｋＤａであることが有利である。単量体の酵素が好ましいが、多量体の酵素も、本発明の範囲内であると予想され得る。二量体タンパク質チロシナーゼは、即時的なアッセイで用いられ得る。酵素の構造についての情報は、ＰＣＡを設計するのにさらなる利点を提供するが、必須ではない。実際、エキソヌクレアーゼ消化生成したタンパク質フラグメント、続いて酵素アミノグリコシドキナーゼに対する適用における指向性のタンパク質進化の組み合わせに基づいて、ＰＣＡを開発するさらなるストラテジーが存在する。原核生物細胞における過剰発現は好ましいが、それは必須ではない。（選択された酵素の）酵素触媒部位は、絶対に同じ分子上であるという必要はない。
【０１０８】
本出願は、ＰＣＡにおいて特定の酵素を用いるための論拠および基準を説明する。タンパク質または酵素の遺伝子は、２つ以上のフラグメントへ合理的に分析される。分子生物学的技術を用いて、選択したフラグメントをサブクローニングして、各々の５’末端（または３末端）に対して、相互作用することが公知であるかまたは相互作用すると考えられるタンパク質を融合する。次いで、細胞へのこれらのＤＮＡ構築物の同時トランスフェクトまたは形質転換を行う。プローブのタンパク質またはそのフラグメント由来の酵素の再アセンブリは、お互いに対する試験タンパク質の結合によって触媒され、そして再構成は、いくつかのアッセイで観察される。これらのアッセイは融合する場合に機能して、相互作用するタンパク質がこの酵素の再アセンブリを触媒する。すなわち、再構成された酵素活性の観察は、融合されたタンパク質の相互作用の指標である。
【０１０９】
本明細書で開示される方法は、酵素ジヒドロ葉酸還元酵素に基づくＰＣＡに集中する。優性または劣性の薬物選択または代謝のサルベージ経路として機能し得る、酵素に基づくアッセイを含むさらなるアッセイが開示される。さらに、着色されるかまたは蛍光の生成物を生じる酵素に基づくＰＣＡも開示される。本明細書において開示されるとおり、ＰＣＡストラテジーは、新規な遺伝子の機能的な試験について一般化されかつ自動化され得、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは炭水化物と相互作用する新規な遺伝子産物の生理学的活性および特定のための新規な生成物または化合物のライブラリーのスクリーニングが開示される。ＰＣＡストラテジーはまた、このような分子相互作用を阻害するか活性化し得る潜在的な治療価値の化合物ライブラリーから天然の生成物または低分子を特定すること、そして酵素基質および酵素の低分子インヒビターが特定され得る方法に適用され得る。結局、ＰＣＡストラテジーを用いて、タンパク質操作実験を行うことが可能で、これによって、工業的な適用を有する意図的な酵素または生物学的な活性を有するペプチドがもたらされ得る。
【０１１０】
本明細書に開示される方法は、提示されるＤＨＦＲまたは他のＰＣＡに限定されないものとし、そうではなく、タンパク質マイコバクテリウム属相補性アッセイの非限定的な実施形態のわずかな例しかない。さらに、ＰＣＡは、それらが用いられ得る文脈には限定されないものとする。シグナル伝達ペプチド配列の付加によって細胞における特異的な区画に対するＰＣＡ融合物を標的するために、かなりの構築物が設計され得る。さらに、誘導性のタンパク質間相互作用と構成的なタンパク質間相互作用とは、生化学的な事象によって標的化される相互作用の場合には、ＰＣＡの真核生物バージョンによって識別され得る。また、このシステムは、標的タンパク質と発現ライブラリーとの間の新規な誘導性のタンパク質−分子会合についてスクリーニングするのにおける使用に適合され得る。
【０１１１】
さらに本明細書に記載されるのは、活性について薬物候補（因子）をスクリーニングするために用いられ得るＭ−ＰＦＣシステムを用いるマイコバクテリウム属における生体分子相互作用を検出するためのシステムおよび方法であって、ポリペプチドと相互作用するマイコバクテリア属細胞における因子（標的）を特定するための方法は、酵素レポーター分子の第一のフラグメントおよび第一のポリペプチドを含む第一の融合タンパク質、酵素レポーター分子の第二のフラグメントおよび第二のポリペプチドを含む第二の融合タンパク質、および標的分子に架橋された結合分子を合わせる工程であって、この結合分子が、第一のポリペプチドと会合し、そして標的分子と第二のポリペプチドとの会合が、酵素レポーター分子の再アセンブリおよび酵素レポーター活性の再構成をもたらす工程と；酵素レポーター活性を検出する工程とを包含する。レポーター分子の活性の変化によって、この標的が、第二のポリペプチドと相互作用していることが示される。この標的分子は、２つの間の共有結合によって結合分子に直接連結されてもよいし、または結合分子に対して標的分子を連結するために連鎖分子が用いられてもよい。
【０１１２】
図２Ａおよび２Ｂは、この方法の１実施形態を模式的に図示する。第一の融合タンパク質は図２ＡにＦＲＢ−ＤＦＨＲ［３］組み合わせとして示され、ここでＦＲＢはラパマイシンに対して公知の親和性を有するペプチドであり、そしてＤＨＦＲ［３］は酵素レポーター分子の第一のフラグメントである。この第二の融合タンパク質は、図２Ａにおいて、Ｌｉｂｒａｒｙ−ＤＦＨＲ［１，２］の組み合わせとして示され、ここでＬｉｂｒａｒｙはポリペプチドであって、ＤＦＨＲ［１，２］は、酵素レポーター分子の第二のフラグメントである。標的分子に架橋されたこの結合分子は、図２Ａにおいて［（候補薬物）Ｄｒｕｇ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ］−架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）−［Ｒａｐ］として示され、ここで「候補薬物（Ｄｒｕｇ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）」は、標的分子であり、そして「Ｒａｐ」はラパマイシンである。図２に示されるシステムでは、ＦＲＢはラパマイシンに親和性を有するので、標的（「候補薬物（Ｄｒｕｇ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）」）は、融合タンパク質を含むＦＲＢと会合される。標的（「候補薬物（Ｄｒｕｇ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）」）に親和性を有するポリペプチドを含む融合タンパク質が存在する場合、この融合タンパク質は、ＦＲＢ含有融合タンパク質との複合体を形成する。標的分子に架橋された結合分子によって媒介されるこの融合タンパク質：融合タンパク質の複合体（図２Ｂに示されるとおり）は、再構成されたレポーター分子活性を有する。この再構成されたＤＦＨＲレポーター活性によって、選択された標的分子を含む細胞がトリメトプリムの存在下で増殖することが可能になる。
【０１１３】
レポーター酵素活性は、限定はしないが、分光光度法、蛍光、酵素活性、分光測定または視覚的方法などの当業者に公知である複数のシステムによって検出され得る。
【０１１４】
選ばれた結合分子に対する親和性を有するポリペプチドの選択は、検討されているシステムに、そして当業者に容易に明白となる他の要因に依存して変化し得る。例えば、ラパマイシンが結合分子として用いられる場合、ラパマイシンに親和性を有するＦＲＢおよびＦＫＢＰ  １２などのポリペプチド（実施例３を参照のこと）を用いてもよい。融合タンパク質のポリペプチドはまた、マイコバクテリアのポリペプチドであってもよい。
【０１１５】
広範な種々の架橋剤が利用可能であり、架橋剤の選択は、行われるスクリーニングに依存し得る。この架橋は、当該分野で公知の任意の方法によって行われてもよい（Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５）ｐｕｂ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．；Ｈｏｕｓｅ，Ｈ．Ｈ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（１９７２）ｐｕｂ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ）。連結化学の説明はまた、米国特許第７，０８３，９１８号、米国特許出願公開第２００４／０１０６１５４号、米国特許出願公開第２００２／０１６８６８５号、ＷＯ  ９４／１８３１７、ＷＯ  ９５／０２６８４、ＷＯ  ９６／１３６１３、Ｗ０９６／０６０９７、およびＷＯ  ０１／５３３５５（本明細書に教示される、化合物および方法について少なくとも、その全体が参照によって本明細書に援用される）によって提供される。連鎖、連結（「リンカー（ｌｉｎｋｅｒｓ）」）として機能し得る分子は、市販されているか、または容易に調製され得る。疎水性、長さおよび可塑性において変化するリンカーが利用可能であり、または調製されてもよい。
【０１１６】
酵素活性に応答するリンカーが利用可能である（かまたは設計され得る）。例えば、リンカーは、グリコシダーゼ酵素によって切断され得、そしてグリコシルトランスフェラーゼ酵素によって形成され得るグリコシダーゼ結合を含んでもよい。酵素活性を有するリンカー成分の他の例としては、プロテアーゼによって切断されて、ペプチダーゼまたはトランスペプチダーゼによって形成され得る、アミド結合；レトロ−アルドラーゼによって切断されてアルドラーゼによって形成されるアルドール生成物結合；エステル結合；およびホスホジエステル結合が挙げられる。これらのタイプのリンカーは、細菌ベースのスクリーニング（ＷＯ０１／５３３５５に記載される酵母ベースのスクリーニングにおけるそれらの使用と同様）において用いられてもよい。他の酵素的に活性なリンカー成分およびそれらのそれぞれの酵素は、本開示の範囲内であるものとする。
【０１１７】
スクリーニングのための化合物ライブラリーは、コンパイルされても合成されてもよく、そしてこのようなライブラリーは、商業的な供給源から生成されても、または購入されてもよい。このようなライブラリーは、コンパイルされた（または完全に特徴づけられた）ライブラリーの場合は公知の分子のセットを含んでもよく、またはコンビナトリアルに生成されたライブラリーなどに由来する未知の分子セットを含んでもよい。
【０１１８】
また本明細書に開示されるのは、結合分子に親和性を有するポリペプチドを含む第一の融合タンパク質を含むキットである。このようなキットはさらに、１つ以上の第一の酵素レポーターフラグメント、結合された架橋との結合分子、および第二の酵素レポーターフラグメントを含んでもよい。このようなキットはさらに、化合物、試薬または試薬の組み合わせ、開示された方法の実施に必要であるかまたは有益であることが理解される容器または装置、および容器またはアッセイプラットフォームを備えてもよい。試薬は、アッセイで用いられるべき緩衝液を含んでもよい。これらのキットはまた、マルチウェルプレートなどの固体支持体、またはビーズなどの可動性の支持体を備えてもよい。このキットはさらに説明書を備えてもよい。
【０１１９】
さらに本明細書に記載されるのは、Ｍ−ＰＦＣシステムを用いて特定された化合物を用いて、マイコバクテリアの病原性を軽減すること、マイコバクテリアにおけるＲｖ３１３３ｃの二量体化を減少させること、およびマイコバクテリウム属感染を有する被験体を処置することの方法である。
【０１２０】
Ｍ−ＰＦＣシステムを用いて、マイコバクテリウム属におけるＲｖ３１３３ｃ（ＤｏｓＲおよびＤｅｖＲとしても公知）二量体化相互作用を軽減および／または阻害する、上記のような化合物を特定している。これらの化合物としては、以下の一般式：
【０１２１】
【化８】
2009528545.tif 000004
を有する化合物が挙げられ、
ここで：
Ｒ１はＮＨ−ＸまたはＣ（＝Ｏ）−Ｘであり、ここでＸは、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；
Ｒ４はＯＨ；ＳＯ２−Ｙであって、ここでＹが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリール；またはＳＯ２−ＮＨ−Ｚであって、ここでＺが置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールであり；そして
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６の各々は独立して、Ｈ、ＯＨ、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルケニル、置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ１２アルキニル、または置換もしくは非置換のアリールである。
【０１２２】
本明細書に記載される化合物において有用なアルキル基は、１〜約１２個の炭素原子、１〜約８個の炭素原子、１〜約６個の炭素原子、または１、２、３もしくは４個の炭素原子を有する。メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピル基は、この化合物で用いられ得るアルキル基の例である。このアルキルという用語は、他に改変しない限り、環状、非環式およびハイブリッドの環状／非環式基をいう。非環式基としては直鎖および分枝基が挙げられる。環状基としては、１つ以上の置換基を有する基が挙げられる。ハイブリッドの環状／非環式基としては環状部分および非環状部分、例えば、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサンおよびプロピルシクロヘキサンが挙げられる。
【０１２３】
本明細書に記載される化合物で有用なアルケニルおよびアルキニル基は、１つ以上の不飽和結合および２〜約１２個の炭素原子、２〜約８個の炭素原子、２〜約６個の炭素原子、または２、３もしくは４個の炭素原子を有する。アルケニルおよびアルキニルという用語は、他に改変しない限り、環状、非環式およびハイブリッドの環状／非環式基の両方をいう。非環式基としては直鎖および分枝基が挙げられる。環状基としては、１つ以上の置換基を有する基が挙げられる。ハイブリッドの環状／非環状基としては環状部分および非環状部分が挙げられる。
【０１２４】
本明細書に記載される化合物で有用なアルコキシ基は、１つ以上の酸素結合、および１〜約１２個の炭素原子、１〜約８個の炭素原子、１〜約６個の炭素原子、または１、２、３もしくは４個の炭素原子を有する基を含む。
【０１２５】
本明細書に記載される化合物で有用なアミノアルキル基としては、１つ以上の一級、二級および／または三級のアミン基、および約１〜約１２個の炭素原子、１〜約８個の炭素原子、１〜約６個の炭素原子、または１、２、３もしくは４個の炭素原子を有する基が挙げられる。
【０１２６】
本明細書に記載される化合物で有用なアルキルチオ基は、１つ以上のチオエステル結合および１〜約１２個の炭素原子、１〜約８個の炭素原子、１〜約６個の炭素原子、または２、３もしくは４個の炭素原子を有する。
【０１２７】
本明細書に記載される化合物で有用なアルキルスルホニル基としては、１つ以上のスルホニル（ＳＯ２）基、および１〜約１２個の炭素原子、１〜約８個の炭素原子、１〜約６個の炭素原子、または１、２、３もしくは４個の炭素原子を有する基が挙げられる。
【０１２８】
本明細書に記載される化合物において有用な複素芳香族基は、Ｎ、ＯまたはＳ原子から選択される１、２または３つのヘテロ原子を含み、そして、例えば、８−クマリニルを含むクマリニル、８−キノリニルを含むキノリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニルおよびベンゾチアゾリルを含む。適切な複素脂肪環式基は、Ｎ、ＯまたはＳ原子から選択される１、２または３つのヘテロ原子を含み、そして、例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノおよびピロリニジニル基を含む。
【０１２９】
本明細書に記載される化合物で有用な適切な炭素環式アリール基としては、単一および複数の環の化合物、ならびに別々のおよび／または縮合されたアリール基を含む複数の環の化合物が挙げられる。有用な炭素環式アリール基は、例えば、１〜３個の別々のまたは縮合された環、そして６〜約１８個の炭素環原子を含む。炭素環式アリール基の例としては、フェニル基、ナフチル基（１−ナフチルおよび２−ナフチルを含む）、ビフェニル基、フェナントリル基およびアントラシル基が挙げられる。フェニル基の例としては、置換フェニル、例えば、２−置換フェニル、３−置換フェニル、２，３−置換フェニル、２，５−置換フェニル、２，３，５−置換および２，４，５−置換フェニルが挙げられ、これは、フェニル置換基の１つ以上が電子求引性基、例えば、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルカノイル、スルフィニル、スルホニルなどである。
【０１３０】
本明細書に記載される化合物での置換基についての言及は、置換された基の１つ以上の利用可能な位置に結合される１つ以上のさらなる基を有する基をいう。ある基に付加され得るこのようなさらなる基の例としては、ハロゲン、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード；シアノ；ヒドロキシル；ニトロ；アジド；アルカノイル、例えば、Ｃ１−６アルカノイル基、例えば、アシルなど；カルボキサミド；アルキル基であって、１〜約１２個の炭素原子、１〜約６個の炭素原子、または１〜約３個の炭素原子を含むもの；アルケニルおよびアルキニル基であって、１つ以上の不飽和結合、および２〜約１２個の炭素原子、２〜約６個の炭素原子、または２〜約４個の炭素原子を有する基を含むもの；酸素、例えば、置換基上のカルボニルの形成またはヒドロキシル基の付加；１つ以上の酸素結合および１〜約１２個の炭素原子、または１〜約６個の炭素原子を有するアルコキシ基；アリールオキシ、例えば、フェノキシ；アルキルチオ基であって、１つ以上のチオエーテル結合および１〜約１２個の炭素原子、または１〜約６個の炭素原子を有する基を含むもの；アルキルスルフィニル基であって、１つ以上のスルフィニル結合および１〜約１２個の炭素原子、または１〜約６個の炭素原子を有する基を含むもの；アルキルスルホニル基であって、１つ以上のスルホニル結合および１〜約１２個の炭素原子、または１〜約６個の炭素原子を有する基を含むもの；アミノアルキル基、例えば、１つ以上の窒素原子および１〜約１２個の炭素原子、または１〜約６個の炭素原子を有する基；６個以上の炭素を有する炭素環式アリール、例えば、フェニルまたはビフェニル；アラルキル基、例えば、ベンジル；ならびにニトリル基が挙げられる。さらに、置換基は、バリンまたはＢｏｃバリンなどで、トリフルオロメチルシンナモイル基またはアミノ酸アシル基においてのように、それ自体置換されてもよい。さらに、複数の置換基が、単一の基に存在してもよく、例えば、シクロアルキル基は、１つ以上の酸素結合および１つ以上のチオエーテル結合を有してもよい。
【０１３１】
置換基の置換に利用可能なさらなる部分としては、改変および未改変のイミダゾールおよびイミダゾールアナログ基が挙げられる。イミダゾールは、以下の式：
【０１３２】
【化９】
2009528545.tif 000005
を有する複素環芳香族有機化合物である。
イミダゾール基の環は、イミダゾールアナログ基を作製するために置換されてもよい。イミダゾールアナログ基の例としては、ベンズイミダゾールおよび修飾されたベンズイミダゾール基が挙げられる。ベンズイミダゾールは以下の一般的な構造：
【０１３３】
【化１０】
2009528545.tif 000006
を有する。ベンズイミダゾールは、上記で考察されるように置換されてもよい。ベンズイミダゾールはまた、例えば、酸素でイミダゾールの環窒素の１つを置換することによって改変され得る。修飾されたベンズイミダゾールの例としては、ベンズオキサゾールが挙げられる。ベンゾオキサゾールは以下の構造：
【０１３４】
【化１１】
2009528545.tif 000007
を有する。置換されたベンズイミダゾールの例としては、１−メチル−１，３−ジヒドロ−ベンゾイミダゾール−２−イリデンアミンが挙げられる。１−メチル−１，３−ジヒドロ−ベンゾイミダゾール−２−イリデンアミンは以下の構造：
【０１３５】
【化１２】
2009528545.tif 000008
を有する。置換基として用いられる場合、ベンズイミダゾールおよびベンズイミダゾールアナログは、例えば、イミダゾール環上の開放炭素を通じて、またはイミダゾール環窒素の１つを通じて、この置換された基に連結され得る。
【０１３６】
マイコバクテリウム属におけるＲｖ３１３３ｃ二量体化相互作用を軽減および／または阻害する化合物のさらなる例としては、Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミド；ｌ−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−イミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１イル）エタノン塩酸塩；および１−（１，３−ベンズオキサゾール−２−イル）−３−（｛４−［（２−ヒドロキシエチル）スルホニル］フェニル｝アミノ）アクリルアルデヒドが挙げられる。
【０１３７】
Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミドは以下の構造：
【０１３８】
【化１３】
2009528545.tif 000009
を有する。
【０１３９】
１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−イミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１イル）エタノン塩酸塩は、以下の構造を有する：
【０１４０】
【化１４】
2009528545.tif 000010
２−（１，３−ベンズオキサゾール−２−イル）−３−（｛４−［（２−ヒドロキシエチル）スルホニル］フェニル｝アミノ）アクリルアルデヒドは以下の構造：
【０１４１】
【化１５】
2009528545.tif 000011
を有する。
【０１４２】
本明細書に記載される化合物は、薬学的に受容可能な塩およびその誘導体を含む薬学的に受容可能な形態で提供され得る。これらの組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは安定化剤を含んでもよい。薬学的に受容可能な酸塩およびその誘導体という用語は、記載される化合物の生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的にもそうでなくても望ましくないことがない、本明細書に記載される化合物の塩および誘導体をいう。薬学的に受容可能な塩は、例えば、無機の酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などと形成され得る。
【０１４３】
本明細書に記載される化合物を用いる方法としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌの病原性を軽減する方法、ＲＶ３１３３ｃ二量体化を軽減する方法、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌの感染を有する被験体を処置する方法が挙げられる。
【０１４４】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌの病原性を軽減する方法は、マイコバクテリウム属と、本明細書に記載される化合物であって、この化合物の非存在下でのマイコバクテリウム属の病原性に比較して病原性を軽減する化合物とを接触させる工程を包含する。
【０１４５】
ＲＶ３１３３ｃ二量体化を軽減する方法は、マイコバクテリウム属と、本明細書に記載の化合物であって、この化合物の非存在下でのマイコバクテリウム属におけるＲｖ３１３３ｃ二量体化に比較してＲｖ３１３３ｃの二量体化を軽減する化合物とを接触させる工程を包含する。
【０１４６】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌの感染を有する被験体を処置する方法は、薬学的に受容可能な形態で本明細書に記載の化合物であって、この化合物の非存在下に比較してマイコバクテリウム属感染の１つ以上の症状を軽減する化合物をこの被験体に投与する工程を包含する。症状としては、例えば、咳、疲労、息切れ、体重減少、熱、および胸痛を挙げることができる。
【０１４７】
本明細書に開示されるのはまた、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌの病原性を軽減し、Ｒｖ３１３３ｃ二量体化を軽減し、そしてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ感染を有する被験体を処置するためのキットである。これらのキットは、本明細書に記載される１つ以上の化合物を、必要に応じて固体支持体、例えば、ビーズなどの可動性の支持体のマルチウェルプレートとともに含む。このようなキットはさらに、開示された方法の実施において必要であるかもしくは有益であると理解される、化合物、試薬または試薬の組み合わせ、容器または装備、ならびに容器またはアッセイのプラットフォームを備えてもよい。試薬とは、アッセイに用いられる緩衝液を含んでもよい。このキットはさらに装置を備えてもよい。
【０１４８】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をさらに図示することを意図しており、特許請求の範囲を限定する意図ではない。
【実施例】
【０１４９】
実施例１：タンパク質間の会合を通じたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性の経路を分析する
Ｍ−ＰＦＣシステムを用いて、マイコバクテリアでのタンパク質会合を研究した。Ｅ．ｃｏｌｉ−マイコバクテリアのシャトルベクターｐＵＡＢ１００およびｐＵＡＢ２００（図２）を構築して、Ｍ−ＰＦＣ融合タンパク質を生成した。以前には、ｍＤＨＦＲフラグメントは、その相互作用するタンパク質の対ならびにＦ［１，２］およびＦ［３］が１０アミノ酸の可塑性のグリシンリンカーペプチドによって分けられ（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｖａｌｏｉｓ，Ｆ．Ｘ．＆  Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１２１４１−６）、それによってほぼ全てのタンパク質の流体力学半径にまたがるように設計された８０Åの距離にまたがる相互作用の研究を可能にするように（Ｃｏｄｙ，Ｖ．，Ｌｕｆｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｉｓｚａｋ，Ｅ．，Ｋａｌｍａｎ，Ｔ．Ｉ．＆  Ｆｒｅｉｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｈ．（１９９２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ７，４８３−９１）操作された。Ｍｓｍにおける多様な範囲のタンパク質間の会合を検出するためのＭ−ＰＦＣの実現可能性を実証するために、いくつかの十分特徴付けられた相互作用パートナーすなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＣＮ４（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１２１４１〜６）、Ｍｔｂ２成分のタンパク質ＫｄｐＤ（Ｒｖ１０２８ｃ）／ＫｄｐＥ（Ｒｖ１０２７ｃ）（Ｓｔｅｙｎら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７，１０７５〜８９）およびＭｔｂ分泌抗原Ｅｓａｔ−６（Ｒｖ３８７５）／Ｃｆｐ−１０（Ｒｖ３８７４）（Ｒｅｎｓｈａｗら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，２１５９８−６０３）を選択した。これらの餌（ｂａｉｔ）および獲物（ｐｒｅｙ）プラスミドをｍＤＨＦＲの相補的なフラグメントとのＣ末端融合物として生成して、相互作用するタンパク質対ＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ＧＣＮ４［Ｆ３］、ＫｄｐＤ［Ｆ１，２］／ＫｄｐＥ［Ｆ３］およびＥｓａｔ−６［Ｆ１，２］／Ｃｆｐ−１０［Ｆ３］を生成した。完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、材料および方法に記載されたような構成的なマイコバクテリアプロモーター（ｈｓｐ６０）の制御下でｐＵＡＢ１００およびｐＵＡＢ２００の中にクローニングした。ｍＤＨＦＲフラグメントＦ［１，２］およびＦ［３］に独立して融合された相互作用するタンパク質対をコードするプラスミドをＭｓｍに同時形質転換して、７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ上で選択した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌのＴＲＩＭ（７Ｈ１１ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭ）を含有する７Ｈ１１ＫＡＮ／ＨＹＧプレートでサブクローニングして、３７℃で３〜６日間インキュベートした（図４）。増殖を全ての場合に観察したところ、これはＭｓｍ中でＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ＧＣＮ４［Ｆ３］、ＫｄｐＤ［Ｆ１，２］／ＫｄｐＥ［Ｆ３］およびＥｓａｔ−６［Ｆ１，２］／Ｃｆｐ−１０［Ｆ３］が会合することを示している。重要なことに、Ｆ［１，２］およびＦ［３］のみを生成する空のプラスミドに融合された１つのタンパク質（ＧＣＮ４［Ｆ１，２］、またはＫｄｐＤ［Ｆ１，２］、またはＥｓａｔ−���［Ｆ１，２］）のみをコードするコントロールクローンは、ＴＲＩＭプレート上で増殖を示さなかった。さらに、関連のないタンパク質（例えば、Ｅｓａｔ６およびＫｄｐＤ）またはスワッピングＦ［１，２］またはＦ［３］を有する対合クローンは、［Ｆ１，２］および［Ｆ３］の会合が自然に生じないこと、そして両方のｍＤＨＦＲフラグメントに独立して融合された相互作用ドメインのみが［Ｆ１，２］およびＦ［３］を再構成するということを示す。従って、Ｍ−ＰＦＣシステムは、Ｍｓｍ中のタンパク質間会合を特異的に検出できる。増殖は比較的短期間（３〜４日）で検出されるので、Ｍ−ＰＣＦは、広範な範囲の相互作用を検出するのに十分堅調である。
【０１５０】
タンパク質会合および折り畳みが、原核生物の細胞質および膜で示差的に調節されるということは周知である。Ｍ−ＰＦＣがＭｔｂの細胞質タンパク質と膜シグナル伝達タンパク質との間の相互作用を検出し得るか否かを評価するために、Ｍｔｂ膜貫通センサーヒスチジンキナーゼと、ＤｅｖＳ（Ｒｖ３１３２ｃ）と、その対応する応答調節因子ＤｅｖＲ（Ｒｖ３１３３ｃ）との間の相互作用、（Ｆｉｇ．５Ａ）を研究した。ＭｔｂのＤｅｖＲ／ＤｅｖＳタンパク質は、インビボでの潜伏性に寄与し得る２つの環境信号である低酸素および一酸化窒素に対するＭｔｂの遺伝的応答の再プログラミングに必要であることが示されている２成分のシグナル伝達システムを含む（Ｒｏｂｅｒｔｓら、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，２３０８２〜７；Ｐａｒｋら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４８，８３３〜４３）。ＭｔｂのｄｅｖＲおよびｄｅｖＳのＯＲＦを、ｐＵＡＢ１００およびｐＵＡＢ２００中にクローニングして、それぞれＦ［３］およびＦ［１，２］とのＣ末端融合を生成し、ＤｅｖＲＦ［３］およびＤｅｖＳＦ［１，２］を生成する。ＭｓｍへのＤｅｖＲＦ［３］およびＤｅｖＳＦ［１，２］をコードするプラスミドの同時形質転換、ならびに７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭでの形質転換体の引き続く増殖によって、ＤｅｖＲＦ［１，２］とＤｅｖＳＦ［３］との間の会合がＦ［１，２］およびＦ［３］を機能的に再構成し、それによってＴＲＩＭ（図５Ａ）に対するＭｓｍ耐性が生じることが実証された。対照的に、空のコントロールのプラスミド、または無関係のタンパク質（例えば、ＫｄｐＥ）を含むクローンは、７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭプレートでは増殖を示さず、このことは、この相互作用が特異的であることを示している。ＤｅｖＲＦ［３］およびＤｅｖＳＦ［１，２］を産生するクローンは、ＫｄｐＤＦ［３］／ＫｄｐＥＦ［１，２］およびＥｓａｔ−６Ｆ［３］／Ｃｆｐ−１０Ｆ［１，２］を産生するクローンに比較して、７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭ上でわずかに緩徐に増殖したので、このデータは、ＤｅｖＲＦ［３］／ＤｅｖＳＦ［１，２］相互作用が、ＫｄｐＤＦ［３］／ＫｄｐＥＦ［１，２］、およびＥｓａｔ−６Ｆ［３］／Ｃｆｐ−１０Ｆ［１，２］相互作用に比較して弱いことを示す（下に示す）。従って、Ｍ−ＰＦＣは、膜貫通タンパク質と、対応する細胞質応答調節因子との間の会合を検出するのに有効である。
【０１５１】
Ｍ−ＰＦＣが、小型のＦ［１，２］またはＦ［３］融合物のＮ末端またはＣ末端方向によって影響されるか否かを決定するために、Ｅｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０をｐＵＡＢ１００、ｐＵＡＢ３００およびｐＵＡＢ２００、ｐＵＡＢ４００中にクローニングして、それぞれ、Ｅｓａｔ−６Ｆ［１，２］，Ｆ［１，２］Ｅｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０Ｆ［３］，Ｆ［３］Ｃｆｐ−１０融合物を生成した。図５Ｂに示されるとおり、Ｅｓａｔ−６Ｆ［１，２］／Ｃｆｐ−１０Ｆ［３］およびＦ［１，２］Ｅｓａｔ−６／Ｆ［３］Ｃｆｐ−１０を生成するプラスミドで同時形質転換されたクローンは、堅調な増殖を示したが、コントロールは、７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭでは増殖を示さなかった。従って、Ｍ−ＰＦＣは、少なくともＥｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０について、ＤＨＦＲペプチドの方向によってごくわずかに影響される可塑性でかつ堅調なシステムである。
【０１５２】
この結果によって、Ｍｓｍでのタンパク質間会合に起因するｍＤＨＦＲの再構成は、７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭプレート上での生存ベースのアッセイによって容易にモニターされ得ることが示された。しかし、タンパク質間会合またはドメインマッピング実験を行うことに対する、単一のａａ置換または修飾（例えば、リン酸化）の影響を研究するためには、より鋭敏かつ定量的なアッセイを必要とする。結果として、比色定量及び蛍光のプレートベースのアッセイを開発して最適化した。このアッセイは、抗菌化合物に対するマイコバクテリアの感度を評価するための定量的および定性的なアッセイで広範に用いられている酸化／還元の指示薬Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（ＡＢ）に基づく（ＭｃＮｅｒｎｅｙら（２０００）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｕｂｅｒｃ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ  ４，６９−７５）。このＡＢアッセイはヒトおよび動物の細胞株、細菌および真菌の増殖を定量的に測定し（Ｂａｃｋら（１９９９）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９１，４７−５４；Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４１，１００４−９）、そして９６ウェルの形式で容易におこなわれ得る。相互作用クローンＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ＧＣＮ４［Ｆ３］、ＫｄｐＤ［Ｆ１，２］／ＫｄｐＥ［Ｆ３］、Ｅｓａｔ−６［Ｆ１，２］／Ｃｆｐ−１０［Ｆ３］およびＤｅｖＲＦ［３］／ＤｅｖＳＦ［１，２］を保有するＭｓｍを７Ｈ９／ＨＹＧ／ＫＡＮで培養して、７Ｈ９／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭを含有する９６ウェルマイクロタイタープレート中に新鮮に接種した。非蛍光の青（暗い方の影付き）から蛍光のピンク色（明るい方の影つき）への変化は、ＡＢの減少を示し、そしてピンク色の強度は細菌増殖の程度と直接関連し、これが次に、相互作用タンパク質によって駆動されるＦ［１，２］およびＦ［３］の再構成の程度に依存する（図６）。相互作用するパートナーを含むＭｓｍクローンは、ＡＢの減少に起因してピンク色の発色（明るい方の影付き）によって証明されたとおり、７Ｈ９／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭ培地で増殖した（図６）。さらに重要なことに、ベクターコントロールで観察された色の変化はなく、このアッセイの特異性が確認された。さらに、相互作用の強度を正確に測定するために、蛍光を５３０ｎｍの励起波長および５８０ｎｍの放射波長で定量した。図６に示されるとおり、ＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ＧＣＮ４［Ｆ３］が最強に相互作用し、続いてＥｓａｔ−６［Ｆ１，２］／Ｃｆｐ−１０［Ｆ３］およびＫｄｐＤ［Ｆ１，２］／ＫｄｐＥ［Ｆ３］、そして最後がＤｅｖＲＦ［３］／ＤｅｖＳＦ［１，２］であることが見出された。Ｍ−ＰＣＦシステムは、マイコバクテリアにおいて広範な範囲のタンパク質間の会合を検出するために利用され得る。
【０１５３】
タンパク質相互作用技術は、特定の病原性経路またはシグナル伝達カスケードに関与する遺伝子と、それらが必須であるか否かにかかわらず、直接関連する。標準的なマイコバクテリアの方法に以前には受け入れられない毒性機構を研究するための、Ｍ−ＰＦＣの適用性を確証および試験するために、Ｍｔｂ  Ｃｆｐ−１０／Ｅｓａｔ−６分泌経路を分析した。Ｅｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０は両方とも、シグナルペプチド独立分泌（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）（ＳＰＳ）システムとして公知の未定義のＭｔｂ分泌機構を通じて分泌される。Ｃｆｐ−１０は、ＲＤ１領域に存在するｅｓｘＢ（Ｒｖ３８７４）によってコードされる主要なＴ細胞抗原であり、そしてＭｔｂの完全な病原性に必要である。Ｍ−ＰＦＣが、Ｅｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０の分泌に関与するさらなる必須の遺伝子産物を特定し得、かつＭｔｂにおけるＳＰＳの機構の理解に対して寄与し得るという仮説を試験した。引き続き、全長のｃｆｐ−１０を、安定な、組み込みのＭ−ＰＦＣ餌（ｂａｉｔ）ベクター中でＦ［３］とインフレームでクローニングして、ｐＵＡＢ４００−Ｃｆｐ１０を生成した。５×１０５個の独立したクローンからなるＭｔｂ  Ｈ３７ＲｖゲノムＤＮＡライブラリーを、ｐＵＡＢ３００中で作成し、ｐＵＡＢ４００−Ｃｆｐ１０を含むＭｓｍ細胞中に形質転換して、７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭ上にプレートした。７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭプレート上で増殖を示したクローンを溶解して、プラスミドＤＮＡを単離して、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖して、ｐＵＡＢ４００−Ｃｆｐ１０を含むＭｓｍ中に再度形質転換した。クローンを再度、７Ｈ１１／ＫＡＮ／ＨＹＧ／ＴＲＩＭプレート上にストリークして、増殖について評価した。ＴＲＩＭプレート上で増殖を示すクローン由来のライブラリープラスミドを配列決定した。予想どおり、Ｍｔｂ  ｄｆｒＡ（Ｒｖ２７６３ｃ）を含有するＴＲＩＭ耐性クローンが、ライブラリー中で観察された。好都合にも、これらのＴＲＩＭ耐性クローンは、ライブラリーの複雑性および形質転換効率についての内部クローンとして機能し、そしてコロニー−ＰＣＲを用いてこれらのクローンを排除した。さらに、Ｃｆｐ−１０の公知のパートナーであるＥｓａｔ−６を、このライブラリーのスクリーニングにおいて６回特定した。これらの結果によって、Ｍ−ＰＦＣがＭｔｂライブラリー由来の相互作用クローンを特定するために効率的に活かされ得ることが実証される。また、これらの相互作用の特異性は、（ｉ）個々のＣｆｐ−１０［Ｆ１，２］相互作用タンパク質が無関係のタンパク質（例えば、ＫｄｐＥ）と会合する能力を決定すること、および（ｉｉ）対応する空のベクターとのＣｆｐ−１０［Ｆ１，２］相互作用クローンとの同時形質転換によって確認した。全ての場合に、７Ｈ１１／ＴＲＩＭプレートでは増殖は観察されず、それによって、相互作用の特異性が確認された。Ｃｆｐ−１０と会合するタンパク質を表１に列挙する。このスクリーニングでは、同じ遺伝子の複数の重複するクローンを特定し、それによって、会合が実際に真実であるという支持が得られた。ｓｎｍ２（Ｒｖ３８７１）の引き続くクロー���ングおよびＭ−ＰＦＣ分析によって、Ｓｎｍ２は、Ｃｆｐ−１０（Ｆｉｇ．７）と強力に会合することが実証された（図７）。Ｅｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０は、緊密な複合体を形成するので、Ｃｆｐ−１０相互作用タンパク質はまた、Ｅｓａｔ−６と会合し得ると仮説された。実際、６つのＣｆｐ−１０相互作用クローンのうち、Ｐｋｓ１３、ＣｌｐＣ１、ＦｔｓＱ（およびＣｆｐ−１０）はＥｓａｔ−６（表２）と特異的に会合する。興味深いことに、このデータによってＥｓａｔ−６がオリゴマー化することが示される（図７）。ＣｌｐＣ１の役割をさらに検討するために、ＣｌｐＣ１が、タンパク質分解性成分ＣｌｐＰ２とは会合するが、ＣｌｐＰ１とは会合しないことを実証した（図７）。まとめると、推定の相互作用クローンの５６％が、Ｍｔｂ  ｄｈｆｒを含み、２４％のクローンが、アンチセンスおよびフレーム外のクローンであり、そしてクローンの約２０％がインフレームのクローンを含んだ。
【０１５４】
【表１−１】
2009528545.tif 000012
【０１５５】
【表１−２】
2009528545.tif 000013
ａ重複するクローンの２つのクラスを特定した；Ｅｓａｔ−６のａａ９およびａａ１３での融合接合部。
ｂ重複するクローンの２つのクラスを特定した；Ｒｖ０６８６のａａ２０１およびａａ３３４での融合接合部。
ｃ相互作用するクローンの１つのクラスを特定した；ＦｔｓＱのａａ２２０での融合接合部。
ｄ重複するクローンの４つのクラスを特定した；ＡＴＧの２９、３８、５９および１１７ｂｐ上流の融合接合部は、ＣｌｐＣ１とのインフレーム融合を生成した。
ｅ相互作用するクローンの１つのクラスを特定した；Ｐｋｓ１３のａａ１３４０での融合接合部。
ｆ相互作用するクローンの１つのクラスを特定した；Ｒｖ２２４０ｃのａａ１２７での融合接合部。
【０１５６】
本明細書に開示されるようなＭ−ＰＦＣシステムによって、Ｍｔｂ病原性機構の研究およびタンパク質間会合を通じた他の機能的経路の研究が可能になる。このアプローチでは、ｍＤＨＦＲ相補性フラグメント（［Ｆ１，２］および［Ｆ３］）と２つのマイコバクテリア相互作用タンパク質の独立した遺伝子カップリングによって、インビボにおいて、内因性のマイコバクテリアＤＨＦＲ活性が阻害される濃度で、ｍＤＨＦＲ活性の再構成がもたらされる。この相補性事象の読み出しは、ＴＲＩＭに対して耐性のマイコバクテリアクローンの選択を可能にするｍＤＨＦＲフラグメントＦ［１，２］およびＦ［３］のインビボでの再構成である。重要な事に、Ｆ［１，２］およびＦ［３］が２つの相互作用タンパク質と融合される場合のみ、ヘテロ二量体はｍＤＨＦＲの再構成を生じる。真核生物のＧＣＮ４などの十分証明されかつ公知のタンパク質間相互作用、ならびにＭｔｂ  ＫｄｐＤ／ＫｄｐＥ、およびＤｅｖＲ／ＤｅｖＳ、および分泌性抗原Ｅｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０のタンパク質相互作用を用いて、Ｍ−ＰＦＣシステムを徹底的に試験した。無関係のタンパク質および空のベクターを含む多数のコントロールを用いて、これらのタンパク質がマイコバクテリアにおいて特異的に会合することを確認した。このシステムは、それぞれ、膜に位置するセンサーキナーゼ（ＫｄｐＤおよびＤｅｖＳ）とそれらの対応する応答調節因子（ＫｄｐＥおよびＤｅｖＲ）との間の推定の一過性の会合を研究するために十分に鋭敏かつ堅調であることが証明されている。さらに、融合の方向は、少なくともＥｓａｔ−６／Ｃｆｐ−１０について、Ｆ［１，２］およびＦ［３］の再折り畳みにほとんど影響がないかまたは全くないと思われる。しかし、いくつかのタンパク質は個々に試験されなければならない相互作用のために遊離のＮ末端またはＣ末端を必要とし得ると予想される。酵母およびＥ．ｃｏｌｉのような代用の宿主ではなくマイコバクテリアでのタンパク質会合を研究するという重要な利点は、天然の宿主に固有である適切な修飾（例えば、リン酸化）、補因子および排他的な細胞内環境が、相互作用の転帰を調節し得るということである。
【０１５７】
病原性の経路は、破壊の際にタンパク質間の会合を変化させる分子相互作用の複雑なナットワークによって媒介される。従って、タンパク質間の相互作用は代表的には、直接のリンクまたは役割を示唆するが、遺伝子破壊実験は、間接的な方法である。結果として、この研究の中心的な目的の１つは、Ｍ−ＰＦＣが未定義のＭｔｂ病原性機構を研究するための能力を試験することであった。いくつかの研究（Ｆｏｒｔｕｎｅら（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，１０６７６−８１；Ｂｒｏｄｉｎら（２００６）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７４，８８〜９８；Ｐｙｍら（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４６，７０９〜１７）によって、ＭｔｂのＲＤ１領域の内側および外側のタンパク質が、免疫原性抗原であるＥｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０の分泌に関与しているということが示されている。ＳＰＳシステムの重要な特徴は、これらの小さいタンパク質がシグナルペプチドを含まないということである。引き続き、ＭｔｂのＳＰＳ経路は、Ｃｆｐ−１０相互作用クローンについてゲノムワイドなスクリーニングを行うことによって特徴付けられる。Ｅｓａｔ−６は、以前の研究（Ｒｅｎｓｈａｗら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，２１５９８−６０３；Ｓｔａｎｌｅｙら（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１３００１−６；Ｏｋｋｅｌｓら（２００４）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４，２９５４〜６０）と一致して、その相互作用パートナーの１つとして繰り返し特定されており、そしてＭ−ＰＦＣは、相互作用タンパク質についてＭｔｂのゲノムをスクリーニングするための有効なツールとして確証される。さらに重要なことに、Ｍｔｂ分泌経路のいくつかの成分が特定された。例えば、ＳＲＰ−ＧＴＰａｓｅファミリーのメンバーであるＲｖ０６８６は、Ｃｆｐ−１０と特異的に相互作用することが示された。このファミリーのメンバーとしては、ＳＲＰおよびそのレセプターが挙げられ、ＳＲは、分泌または膜の挿入のための細菌の原形質膜および真核生物ＥＲ膜におけるタンパク質の同時転位的な標的化に関与する（Ｋｅｅｎａｎら（２００１）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７０，７５５〜７５）。グラム陽性の細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓでは、ＳＲＰおよびＳＲの両方とも、Ｓｅｃ転位酵素に対して分泌タンパク質のほとんどを標的化することに関与する（Ｙａｍａｎｅら（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８，２００７〜２３）。このデータによって、ＳＲＰ−ＧＴＰａｓｅオルソログ（Ｒｖ０６８６）は、ＳＲＰ経路を介して膜に対してＣｆｐ−１０を標的化することを容易にし得るということが示される。上記の結果を支持するように、ＳＲＰ経路の第二の基質である細胞分裂タンパク質ＦｔｓＱ（Ｒｖ２９２１ｃ）が特定されており、これは、一体型の膜タンパク質のＳＲＰ依存性の転位を分析するためのモデルタンパク質として広範に用いられている（Ｕｒｂａｎｕｓら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ２，５２４〜９）。重要なことに、膜挿入プロセスの間、ＦｔｓＱはＳｅｃＹＥＧトランスロコン（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ）の成分と相互作用することが公知��ある。従って、ＦｔｓＱはＳｅｃＹＥＧトランスロコン（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ）に対するＣｆｐ−１０の送達に関与する可能性がある。さらに、Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００ファミリーのタンパク質に属するＣｆｐ−１０とＡＡＡ−ＡＴＰａｓｅシャペロンＣｌｐＣ１との間の正の相互作用も検出された。Ｃｌｐファミリーのメンバーは、分泌、遺伝子調節、タンパク質折り畳み、および分解を含む多様な機能に関与する（Ｂｏｌｈｕｉｓら、（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，２４５８５−９２；Ｐｏｒａｎｋｉｅｗｉｃｚら、（１９９９）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３２，４４９〜５８）。興味深い事に、ＣｌｐＣホモログは、クロロプラスト膜において転位機構と会合することによって、植物中のタンパク質輸送経路において重要な役割を果たすことが示されている（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９７）Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，９３５〜４６）。ＭｔｂのＣｌｐＣ１は、膜において転位複合体と会合することによってＣｆｐ−１０分泌を促進し得る。さらに、ＣｌｐＣはまた、タンパク質分解性のサブユニット、分解のためのＣｌｐＰのチャンバ中に誤って折り畳まれたタンパク質を標的することによって、翻訳されたタンパク質の品質管理に重要な役割を果たし得る（Ｐａｎ，Ｑ．＆  Ｌｏｓｉｃｋ、Ｒ．（２００３）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８５，５２７５〜８）。ＣｌｐＣ１が選択的にＣｌｐＰ２（Ｒｖ２４６０ｃ）プロテアーゼサブユニットと会合する（図６）が、他のタンパク質分解性サブユニット（例えば、ＣｌｐＰ１）または無関係のコントロールのタンパク質とは会合しないという事実によって、この会合が特異的であることが示される。
【０１５８】
Ｐｋｓ１３とのＥｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０の会合によって、この相互作用が生理学的に特に関連することが特に示される。なぜなら、アセチル化はＣｆｐ−１０とＥｓａｔ−６との相互作用に影響することが以前に実証されているからである。Ｐｋｓ１３におけるアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインは、アシル化によってＣｆｐ−１０を改変し得ると仮説された。興味深い事に、真核生物タンパク質のＮ末端アシル化は、頻繁に生じて、認識可能な分泌シグナル配列を欠くタンパク質の適切な転位に必要である。Ｃｆｐ−１０は、Ｎ末端においてＭｅｔの後にＡｌａを含むが、Ｃｆｐ−１０の公知のパートナーであるＥｓａｔ−６は、Ｎ末端Ｔｈｒ残基でアセチル化される。真核生物では、これらのアミノ酸は、Ｎ末端アセチル化残基の約９５％を占める。
【０１５９】
まとめると、Ｍ−ＰＦＣによって、Ｍｔｂにおけるタンパク質分泌の機構に対する認識が生じ得、そしてＣｆｐ−１０分泌経路のいくつかの新規な成分が特定された。この結果は、Ｍｔｂ  ＳＰＳ経路と進化的に保存されたＳＲＰおよびＳｅｃＡ／ＳｅｃＹＥＧ経路とを直接関連させ、そしてこれらの経路の間の重複の強力な証拠を提供し、これによってそれらは分泌成分を共有し得ることが示されている。また、Ｍ−ＰＦＣがＦｔｓＱ、ＣｌｐＣ１およびＳｅｃＹＥＧ複合体のような必須の遺伝子産物とＭｔｂ  ＳＰＳ経路において関係し得るという事実によって、遺伝子破壊ストラテジーによって受け入れられない病原性の機構をＭ−ＰＦＣが分析する能力が実証される。
【０１６０】
（方法）
株および培地。Ｍｔｂ  Ｈ３７ＲｖおよびＭｓｍ  ｍｃ２１５５の培養および形質転換は、前に記載されたとおりに行った（Ｗａｒｄｓ，Ｂ．Ｊ．＆  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｄ．Ｍ．（１９９６）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １４５，１０１〜５）。必要な場合、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ｍｅｄｉａ（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ培地）（ＭＢ）に、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、またはトリメトプリム（４０〜５０μｇ／ｍｌ）を補充した。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ１０Ｂは、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）またはハイグロマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ中で増殖した。
【０１６１】
Ｍ−ＰＦＣについてのプラスミド構築物。プラスミドｐＫＳＦＲ（１，２）およびｐＫＳＦＲ（３）は、それぞれ、１０アミノ酸の可塑性Ｇｌｙリンカー（Ｇｌｙ１０）およびＧＣＮ４ロイシンジッパーコード配列とインフレームで融合された、ｍＤＨＦＲＦ（１，２）（Ｆ［１，２］）およびｍＤＨＦＲＦ（３）（Ｆ［３］）を含み、Ｍ−ＰＦＣプラスミドを生成するためのテンプレートとして用いた。制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＡｃｃＩを含む相補性のオリゴヌクレオチドを用いて、可塑性のＧｌｙリンカーおよびロイシンジッパー（ＧＣＮ４）配列とともにＦ［１，２］をＰＣＲ増幅した（ＧＣＮ４−［Ｇｌｙ］１０−Ｆ［１，２］）。そのＰＣＲフラグメントを消化して、ＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ消化したｐＭＶ２６１に連結して、エピソームベクターｐＵＡＢ１００を生成した。同様に、可塑性のグリシンリンカーおよびＧＣＮ４配列とともにＦ［３］を含むＰＣＲアンプリコン（ＧＣＮ４−［Ｇｌｙ］１０−Ｆ［３］）を消化して、ＭｆｅＩ／ＨｐａＩ消化したｐＭＶ３６１に連結して、組み込みベクターｐＵＡＢ２００を生成した。これらの構築物は、ｍＤＨＦＲフラグメントのＮ末端に融合されたＧＣＮ４ホモ二量体化ドメインを含む。必要に応じて、ｐＵＡＢ１００およびｐＵＡＢ２００由来のＧＣＮ４ドメインを、餌（ベイト）（ｂａｉｔ）ＤＮＡおよび獲物（プレイ）（ｐｒｅｙ）ＤＮＡ配列で置換した。ライブラリースクリーニングのために、Ｍ−ＰＦＣベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ−マイコバクテリアシャトルベクターｐＭＶ７６１中へＦ［３］−［Ｇｌｙ］１０配列をクローニングすることによって改変して、組み込ベクターｐＵＡＢ４００を生成した。同様に、ｍＤＨＦＲの相補性フラグメント、すなわち、Ｆ［１，２］を、可塑性のグリシンリンカー（Ｆ［１，２］−［Ｇｌｙ］１０）とともに、ＰＣＲ増幅して、ｐＭＶ７６２にクローニングして、エピソームプラスミドｐＵＡＢ３００を作成した。
【０１６２】
ｐＵＡＢ１００およびｐＵＡＢ３００は、エピソームのマイコバクテリア−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルプラスミドであるが、ｐＵＡＢ２００およびｐＵＡＢ４００は、マイコバクテリア−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルプラスミドを組み込んでいる。ＤＮＡライブラリーを作成するための好ましいプラスミド選択は、ｐＵＡＢ３００である。Ｆ［１，２］およびＦ［３］は、ｍＤＨＦＲの相補性フラグメントであり、ＧＣＮ４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのロイシンジッパー配列であり、（ＧＬＹ）１０は、可塑性の１０アミノ酸Ｇｌｙリンカーであり、ａｐｈは、カナマイシンに対する耐性を付与し、ｈｙｇは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与し、ｈｓｐ６０ｐは、ｈｓｐ６０プロモーターであり、ｏｒｉＭは、マイコバクテリアにおける増殖の複製起点であり、ｏｒｉＥは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増殖の複製の起点であり、そしてｉｎｔおよびａｔｔＰは、マイコバクテリオファージＬ５由来である。
【０１６３】
Ｍ−ＰＦＣのライブラリースクリーニング。５×１０５個の独立したクローンを含むＭｔｂのゲノムＤＮＡライブラリーを調製して、ｐＵＡＢ３００の固有のＣｌａＩ部位にクローニングした。餌（ベイト）プラスミドを、ｃｆｐ−１０をＰＣＲ増幅することおよび引き続くＭｕｎＩ／ＣｌａＩ直線化ｐＵＡＢ４００への連結によって構築して、ｐＵＡＢ３００−ｃｆｐ１０を作成した。餌（ｂａｉｔ）プラスミドをＭｓｍ中に形質転換して、ＭｔｂライブラリーＤＮＡとともにエレクトロポレーションした。組み込みクローンを、ＫＡＮ、ＨＹＧおよびＴＲＩＭ（５０μｇ／ｍｌ）を含む７Ｈ１１培地上に形質転換体をプレートすることによって選択した。
【０１６４】
アラマーブルーアッセイ（ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙ）。相互作用プラスミドを含むＭｓｍクローンを、ＨＹＧおよびＫＡＮを含むＭＢ  ７Ｈ９培地中において、０．８のＯＤ６００ｎｍまで培養した。細胞を、新鮮な７Ｈ９培地中で希釈して、約１０６個の細胞を、透明な底の９６ウェルマイクロタイタープレートに添加した。アウター・ペリメータ（ｏｕｔｅｒ  ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）ウェルを、滅菌水で満たして、脱水を防いだ。ＴＲＩＭをジメチルスルホキシドに溶解して、薬物の２倍階段希釈を、マイクロタイタープレート中で０．１ｍｌの７Ｈ９中で行った。薬物のみを含みＭｓｍ細胞を含まないウェルが自己蛍光コントロールであった。さらなるコントロールは、細胞および培地のみを含むウェルから構成した。プレートを１２時間インキュベートして、その後に３０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）溶液（ＭＢ  ７Ｈ９−ツイーン培地中で１：１希釈）を、細胞のみを含有するウェルに添加して、インキュベートし、ピンク色の出現について観察した。アラマー・ブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）を、細胞にピンク色の出現後のウェルにのみ、各々のウェルに添加した。プレートをさらに、３７℃でインキュベートして、その結果を６時間後に記録した。蛍光強度を、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ＩＩマイクロプレート蛍光光度計（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）中で、ボトム・リーディングモード（ｂｏｔｔｏｍ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｍｏｄｅ）で、５３０ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光で測定した。空のベクターｈｓｐ６０［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］を含むＭｓｍ形質転換体は、低レベルのバックグラウンド蛍光を示す。
【０１６５】
Ｙｅｄグラフ・エディター（ｇｒａｐｈ  ｅｄｉｔｏｒ）。Ｃｆｐ−１０と会合するタンパク質のネットワークを、Ｙｅｄグラフ・エディター・ソフトウェア（ｗｗｗ．ｙＷｏｒｋｓ．ｃｏｍ；Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて生成した。
【０１６６】
Ｙ２Ｈ分析。相互作用が生物学的に有意であることを強力に示す知見である、複数の重複クローンがＣｆｐ−１０スクリーニングで特定されたという事実にかかわらず、Ｙ２Ｈシステムを用いて、Ｃｆｐ−１０／ＣｌｐＣ１、Ｃｆｐ−１０／Ｐｋｓ１３、Ｃｆｐ−１０／ＦｔｓＱ  Ｃｆｐ−１０／Ｒｖ２２４０ｃおよびＣｆｐ−１０／Ｒｖ０６８６の相互作用を独立して確証する（図８）。Ｙ２Ｈデータによって、Ｃｆｐ−１０／ＣｌｐＣ１、Ｃｆｐ−１０／ＦｔｓＱ、Ｃｆｐ−１０／Ｒｖ２２４０ｃ、およびＣｆｐ−１０／Ｒｖ０６８６は実際に会合するということが確認された。Ｍ−ＰＦＣスクリーニングで特定されたクローンも、Ｃｆｐ−１０も、Ｙ２Ｈシステムで自己会合できなかったことに注意のこと。
【０１６７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株（ＰＪ６９−４ＡおよびＰＪ６９−４α）を、前に記載のとおり培養した。餌（ｂａｉｔ）および獲物（ｐｒｅｙ）のプラスミドｐＧＢＫＴ７およびｐＧＡＤＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を用いて、２つのハイブリッド融合構築物を生成した。制限酵素部位ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを含む相補性オリゴヌクレオチドを用いて、全長ｃｆｐ−１０（餌）および獲物をＰＣＲ増幅した。餌および獲物の融合構築物を配列決定によって確証して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＪ６９−４α中に同時形質転換した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＪ６９−４では、ＧＡＬ４は、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３およびαガラクトシダーゼをコードするＭＥＬ１を調節し、これによって、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−α−Ｇａｌ）（２０μｇ／ｍｌ）を含有し、ＡｄｅおよびＨｉｓを欠く合成完全（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（ＳＣ）プレート上の青色形成についてスクリーニングすることによって、相互作用の特異性の確証が可能になる。酵母形質転換体を、ＳＣ−Ｌｅｕ  Ｔｒｐ上で３０℃で選択した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、ＳＣ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｄｅプレートを含有するＸ−α−ｇａｌプレート上にプレートした（図８）。
【０１６８】
（実施例２：Ｍ−ＰＦＣを用いて低分子化合物ライブラリーをスクリーニングする）
本明細書に記載されるＭ−ＰＦＣスクリーニングシステムを用いて、上記されるＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイを用い、ＤｅｖＲ（ＤｏｓＲまたはＲｖ３１３３ｃとも呼ばれる）二量体化の低分子インヒビターについて検索した。このアッセイは、コントロールと比較した場合の４９０ｎｍで放射された蛍光での有意な低下（３×標準偏差）に基づく生存度および／またはタンパク質間相互作用に対するインヒビターの影響を反映した。生存度をもたらす化合物を、スクリーニングのために化合物から分離した。
【０１６９】
Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）ライブラリーから分離した１０００の化合物のライブラリーを、Ｒｖ３１３３ｃ二量体化相互作用に対して１２．５μｇ／ｍＬで最初にスクリーニングした。このスクリーニングによって、細胞の生存度に影響しなかった１７の候補物を得た。図９Ａおよび９Ｂは、このスクリーニングについてのデータを示す。図９Ａでは、スクリーニングで得られたデータを、コントロールのスクリーニングで得たデータで正規化した。図９Ｂは、スキャンしたコントロールプレートおよび発見プレートのセグメントを示す。図９Ｂでは、白丸は、図９Ａにおける丸印のデータポイントに相当するヒットを示している（この図で交差斜線によって示される陽性ヒットを有するプレートにおいてそれぞれのウェルの蛍光強度における相違によって特定されるとおり）。図９Ｂにおける白の矢印は、ＤｅｖＲ二量体化を標的しないが、コントロールプレートおよび発見プレートの両方において細胞を殺傷する化合物を示す。
【０１７０】
広範なカウンター・スクリーニングを、公知の相互作用対であるＥｓａｔ６−Ｃｆｐ１０（Ｒｖ３８７５−Ｒｖ３８７４）を用いて行って、レポーター酵素（ＤＦＨＲ）を標的した候補物を排除した。図１０は、Ｍ−ＰＦＣ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ＴＲＩＭカウンタースクリーニングアッセイについての設定の図を示す。図１０では、破線は、タンパク質間の会合のインヒビターの仮説の例を示す。図１０では、ＤｅｖＲ：ＤｅｖＲスクリーニングは、Ｅｓａｔ６−Ｃｆｐ１０スクリーニングについてのカウンター・スクリーニングとして作用する（そして逆も真）。図１０の固体の青色カラム（レーン１および１２；濃い方の陰影付）は、混入物およびエッジ効果についてのＡＢ単独コントロールである。図１０のレーン１１は、ＴＲＩＭを含むが化合物のない相互作用クローンである。図１０のピンク色（薄い方の影付き）は、生存している細胞を示すが、青（濃い方の影付き）は、死んだ細胞を示す。
【０１７１】
３つの化合物をこのスクリーニングによって特定した：Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミド；１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−イミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１イル）エタノン塩酸塩；および１−（１，３−ベンズオキサゾール−２−イル）−３−（｛４−［（２−ヒドロキシエチル）スルホニル］フェニル｝アミノ）アクリルアルデヒド（これらの化合物についての構造は上記に示す）。これらの化合物の各々は、低濃度でＤｅｖＲ二量体化に対する疎外性の影響を示した。図１１は、これらの化合物についての滴定曲線を示す。３つ全ての化合物は、１２．５μｇ／ｍｌでＤｅｖＲ二量体化に最も劇的な影響を有する。１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−イミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１イル）エタノン塩酸塩および１−（１，３−ベンズオキサゾール−２−イル）−３−（｛４−［（２−ヒドロキシエチル）スルホニル］フェニル｝アミノ）アクリルアルデヒドは、高濃度で細胞生存度に影響することが見出された。
【０１７２】
さらに、ＤｅｖＲ二量体化の阻害が、マイコバクテリウム属休眠状態経路に関与する対応するセンサーヒスチジンキナーゼである、ＤｅｖＲおよびＤｅｖＳ（Ｒｖ３１３２ｃ）との上流の相互作用に影響するか否かを検討した。Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミドは、図１２に示されるとおり、ＤｅｖＳ（ＨＫＤ）−ＤｅｖＲ相互作用を破壊し得ることが見出された。図１２では、Ｎ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミドは、１０および２５μｇ／ｍＬの濃度でＤｅｖＳ（ＨＫＤ）−ＤｅｖＲ相互作用を破壊することが示され、一方、Ｅｓａｔ６−Ｃｆｐ１０相互作用は、発効されないままである。図１２はまた、ＴＲＩＭの非存在下でＤｅｖＳ（ＨＫＤ）−ＤｅｖＲおよびＥｓａｔ６−Ｃｆｐ１０の両方の株が増殖することを示す（右側のプレート）。
【０１７３】
（実施例３：マイコバクテリア細胞におけるラパマイシン誘導性タンパク質相互作用）
Ｍ−ＰＦＣ実験は、Ｍ−ＰＦＣ融合タンパク質のポリペプチド成分としてＦＲＢおよびＦＫＢＰ１２フラグメントを用いて行った。ＦＲＢおよびＦＫＢＰは、ラパマイシンと相互作用して、三元複合体を形成することが公知である。Ｌａｕｒａ  Ａ．Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ、Ｃｏｒｅｙ  Ｗ．Ｌｉｕ、およびＴｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｗａｎｄｌｅｓｓ，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＫＢＰ・Ｒａｐａｍｙｃｉｎ・ＦＲＢ  Ｔｅｒｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２７（１３），４７１５−４７２１，２００５を参照のこと。ＦＲＢおよびＦＫＢＰ  １２に対するラパマイシンの結合領域を示すラパマイシンの化学構造は図１３Ａに示される。このシステムでは、図１３Ｂに図示されるとおり、ＦＫＢＰ  １２およびＦＲＢ融合タンパク質は、ラパマイシンが存在する場合複合体を形成し、一緒になってＤＨＦＲフラグメントをもたらし、それによってトリメトプリム耐性が付与される。
【０１７４】
この実験では、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ  １２フラグメントは、６．２５ｎｇ／ｍＬ程度の少ないラパマイシンの付加の際に会合するが、これは２０μｇ／ｍＬのトリメトプリムを用いてＭ−ＰＦＣ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ＴＲＩＭアッセイにおいて測定され得る。Ｍ−ＰＦＣ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ＴＲＩＭアッセイ実験データを図１４に示す。図１４Ｂは、種々のラパマイシン濃度で（ＴＲＩＭ、２０μｇ／ｍＬで）の実験およびコントロールのプレートを示す（薄い方の影付きは、細胞生存を示している）。図１４Ａは、図１４Ｂで示されるプレートからのラパマイシン滴定曲線データのプロットを示す。図１４Ａでの滴定曲線に示されるとおり、ラパマイシンは、６．２５ｎｇ／ｍＬ程度の小さい相互作用を誘導する。マイコバクテリア細胞の生存は、２００μｇ／ｍｌ程度の高さのラパマイシン濃度では発効されなかった。従って、この実験によって、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ  １２についてのラパマイシン親和性が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ細胞で保持されること、そして、トリメトプリム耐性が、ＦＲＢ：ラパマイシン：ＦＫＢＰ  １２三元複合体を含むＭ−ＰＦＣシステムで付与され得ることが実証される。
【０１７５】
ラパマイシンがＦＲＢおよびＦＫＢＰ  １２との三元複合体を形成することを考慮すれば、図８および上記に示されるシステムによって、有用な薬物候補スクリーニングアッセイを提供する。このアッセイは、この実験と同様であり、ここではＦＲＢまたはＦＲＢＰ  １２が別のポリペプチドで置換され（図２Ａおよび図２Ｂにおける「ライブラリー（Ｌｉｂｒａｒｙ）」または「Ｘ」）、そして薬物候補物は、ラパマイシンに関連付けられる。このアッセイでは、ラパマイシンは、ＦＲＢ（またはＦＫＢＰ  １２）ポリペプチドとの複合体を形成し、そして「ライブラリー（Ｌｉｂｒａｒｙ）」または「Ｘ」ポリペプチドが、薬物候補物に親和性を有する場合、ＤＨＦＲフラグメントを再構成する複合体を形成し、これによってトリメトプリム耐性が付与される。
【０１７６】
本明細書に言及される任意の特許または刊行物は、本発明が属する当業者のレベルの指標である。これらの特許および刊行物は、あたかも各々の個々の刊行物が参照によって援用されることが詳細にかつ個々に示されるのと同じ程度まで参照によって本明細書に援用される。
【０１７７】
本発明は、本発明の２〜３の局面の例示として意図される実施例に開示される実施形態、および本発明の範囲内である機能的に等価である任意の実施形態による範囲には限定されない。本明細書に示されかつ記載されるものに加えて本発明の種々の改変が当業者に明確になるものであり、そして添付された特許請求の範囲内におさまるものとする。さらに、本明細書に開示される組成物のわずかな特定の代表的な組み合わせが、上記の実施形態に詳細に考察されるが、この組成物の他の組み合わせは、当業者に明白になり、そしてまた添付の特許請求の範囲内におさまるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】マイコバクテリアのタンパク質フラグメント相補性（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｍ−ＰＦＣ）技術を示す図である。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは概して、ポリペプチド：因子の相互作用を特定するための方法における工程を図示する。
【図３】図３は、Ｍ−ＰＦＣにおいて用いられるプラスミドの概略図を示す。
【図４】図４Ａは、Ｍ−ＰＦＣが、ＧＣＮ４タンパク質の間のタンパク質間会合を示すために用いられ得るということを実証している細胞培養結果を示す：（１）ＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ＧＣＮ４［Ｆ３］、（２）ＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］、（３）ＧＣＮ４［Ｆ３］／ｈｓｐ６０［Ｆ１，２］（４）ｈｓｐ６０［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］。図４Ｂは、Ｍ−ＰＦＣが、ＬｄｐＤとＫｐｄＥタンパク質の間のタンパク質間会合を示すために用いられ得るということを実証している細胞培養結果を示す：（１）ＫｄｐＤ［Ｆ１，２］／ＫｄｐＥ［Ｆ３］、（２）ＫｄｐＤ［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］、（３）ＫｄｐＥ［Ｆ３］／ｈｓｐ６０［Ｆ１，２］（４）ｈｓｐ６０［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］。図４Ｃは、Ｍ−ＰＦＣが、Ｅｓａｔ６とＣｆｐ−１０タンパク質の間のタンパク質間会合を示すために用いられ得るということを実証している細胞培養結果を示す：（１）Ｅｓａｔ−６［Ｆ１，２］／Ｃｆｐ−１０［Ｆ３］、（２）Ｅｓａｔ−６［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］、（３）Ｃｆｐ−１０［Ｆ３］／ｈｓｐ６０［Ｆ１，２］、（４）ｈｓｐ６０［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］。
【図５】図５Ａは、脂質二重層（左）および７Ｈ１１／ＨＹＧ／ＫＡＮ／ＴＲＩＭ細胞培養物（右）におけるＤｏｓＳ／ＤｏｓＲ（これはＤｅｖＳ／ＤｅｖＲとも呼ばれる）相互作用の図を示しており、これは、ＤｅｖＲＦ［３］およびＤｅｖＳＦ［１，２］が会合するが、その他の融合タンパク質の組み合わせは会合しないことを示す：（１）ＤｅｖＲＦ［３］およびＤｅｖＳＦ［１，２］、（２）ＤｅｖＲＦ［３］およびｈｓｐ６０Ｆ［１，２］（３）ｈｓｐ６０Ｆ［３］およびＤｅｖＳＦ［１，２］、ならびに（４）ｈｓｐ６０Ｆ［１，２］／ｈｓｐ６０Ｆ［３］。図５Ｂは、［Ｆ１，２］および［Ｆ３］（左）ならびに７Ｈ１１／ＨＹＧ／ＫＡＮ／ＴＲＩＭ細胞培養物（右）でのＥｓａｔ−６およびＣｆｐ−１０のＣ末端よびＮ末端融合タンパク質の両方の図を示しており、これはＥｓａｔ−６Ｆ［１，２］／Ｃｆｐ−１０Ｆ［３］、およびＦ［１，２］Ｅｓａｔ−６／Ｆ［３］Ｃｆｐ−１０が堅調な増殖を示したことを示している：（１）Ｅｓａｔ−６Ｆ［１，２］／Ｃｆｐ−１０Ｆ［３］、（２）Ｆ［１，２］Ｅｓａｔ−６／Ｆ［３］Ｃｆｐ−１０、（３）ＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ＧＣＮ４［Ｆ３］、および（４）ｈｓＰ６０［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］。
【図６】図６Ａは、タンパク質パートナーを生成するプラスミドで同時形質転換されたＭｓｍ細胞について９６ウェルマイクロタイタープレートにおける適合したＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ蛍光アッセイを示す（１）ｈｓｐ６０［Ｆ１，２］／ｈｓｐ６０［Ｆ３］（２）ＧＣＮ４［Ｆ１，２］／ＧＣＮ４［Ｆ３］、（３）ＤｅｖＳ［Ｆ１，２］／ＤｅｖＲ［Ｆ３］，（４）Ｅｓａｔ−６［Ｆ１，２］／Ｃｆｐ−１０［Ｆ３］および（５）ＫｄｐＤ［Ｆ１，２］／ＫｄｐＥ［Ｆ３］（ここで非蛍光のブルー（濃い方の影付き）から蛍光のピンク（薄い方の影付き）への変化は、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの減少を示し、そしてタンパク質間相互作用の指標である）。図６Ｂは、図５Ａで示されるマイクロタイタープレートにおける色強度の変化を示す（５３０ｎｍの励起波長を用いて５８０ｎｍで測定した場合）。
【図７】図７は、グラフ（Ｙｅｄグラフ・エディター・ソフトウェアを用いて作成した）を示しており、これはＭ−ＰＦＣ技術によって特定および／または確認されたタンパク質会合を示している。破線の矢印は、自己会合を示す。外側の節は、Ｙ２Ｈ研究を指すが、内側の節は本明細書で見いだされた新規な相互作用を指す。
【図８】図８Ａは、Ａｄｅ、ＬｅｕおよびＴｒｐを欠くが、ｘ−・−Ｇａｌを補充されたＳＣ培地で増殖されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのクローンにおいてＭ−ＰＦＣスクリーニングで特定されたタンパク質とのＭｔｂ  Ｃｆｐ−１０の相互作用を実証するＹ２Ｈのデータを示す。組み合わせは以下であった：１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｃｆｐ−１０／ＣｌｐＣ１］、２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｃｆｐ−１０／Ｒｖ０６８６］、３）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［ｐＧＢＫＴ７／ＣｌｐＣ１］、４）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［ｐＧＢＫＴ７／Ｒｖ０６８６］。図８Ｂは、Ａｄｅ、ＬｅｕおよびＴｒｐを欠くが、ｘ−・−Ｇａｌを補充されたＳＣ培地で増殖されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのクローンにおいてＭ−ＰＦＣスクリーニングで特定されたタンパク質とのＭｔｂ  Ｃｆｐ−１０の相互作用を実証するＹ２Ｈのデータを示す。組み合わせは以下であった：１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｃｆｐ−１０／ＦｔｓＱ］、２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｃｆｐ−１０／Ｒｖ３８００ｃ］、３）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［ｐＧＢＫＴ７／Ｒｖ３８００ｃ］、４）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｃｆｐ−１０／ｐＧＡＤＴ７］。図８Ｃは、Ａｄｅ、ＬｅｕおよびＴｒｐを欠くが、ｘ−・−Ｇａｌを補充されたＳＣ培地で増殖されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのクローンにおいてＭ−ＰＦＣスクリーニングで特定されたタンパク質とのＭｔｂ  Ｃｆｐ−１０の相互作用を実証するＹ２Ｈのデータを示す。組み合わせは以下であった：１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｃｆｐ−１０／Ｒｖ２２４０ｃ］、２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｃｆｐ−１０／ＦｔｓＱ］、３）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［ｐＧＢＫＴ７／ＦｔｓＱ］、４）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［ｐＧＢＫＴ７／Ｒｖ２２４０ｃ］。
【図９】図９Ａは、ＤｅｖＲ二量体化を阻害する低分子を特定するためのライブラリースクリーニング実験からのデータを示しており、そして図９Ｂは、例のコントロール／発見プレート設定を示しており、ここで矢印は発見プレート上の擬陽性を示し、そして白丸が発見プレート上の陽性のヒットを示す（ここで陽性のヒットは図９Ｂで斜影線として示される）。
【図１０】図１０は、Ｍ−ＰＦＣ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ＴＲＩＭカウンタースクリーニングアッセイについて設定された２つのプレートの例を示す。
【図１１】図１１は、ＤｅｖＲ二量体化を阻害する低分子を特定するためのスクリーニング実験で特定された分子の滴定曲線を示す。
【図１２】図１２は、実験プレートを示しており、これはＮ−（４−［（アセチルアミノ）スルホニル］フェニル）−３−フェニルプロパンアミドが、ＤｅｖＳ（ＨＫＤ）−ＤｅｖＲ相互作用を破壊し得るということを示している。
【図１３】図１３Ａは、ラパマイシンの化学構造を示しており、そして図１３Ｂは、Ｍ−ＰＦＣシステム内で形成されたラパマイシン媒介性ＦＲＰ：ラパマイシン：ＦＫＢＰ１２複合体を示す。
【図１４】図１４Ａは、ＦＲＰとＦＫＢＰ１２との間のラパマイシン誘発性の相互作用の滴定プロットを示す。その実験データは、図１４Ｂに示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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