(57)【要約】  精子における運動性、及び／又は、完全な先体の割合（ＰＩＡ）を増加させる物質の組成物が記述されている。当該組成物は、ある量のＦＡＡ及びある量のＴＩＭＰ−２を組み合わせて含み、前記量は、当該組成物に接触した精子の運動性、ＰＩＡ、又は、運動性及びＰＩＡを増加させるのに効果的である。当該組成物を、精子の凍結保存培地として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子における運動性又は完全な先体の割合（ＰＩＡ）を増加させる物質の組成物であって、当該組成物が、ある量のＦＡＡ及びある量のＴＩＭＰ−２を組み合わせて含み、前記量が、当該組成物に接触した精子の運動性、ＰＩＡ、又は、運動性及びＰＩＡを増加させるのに効果的である、組成物。
【請求項２】
精液保存培地をさらに組み合わせて含み、前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２が前記精液保存培地に配置される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記精液保存培地が、タイロードアルブミンラクテートピルベート培地（ＴＡＬＰ）を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬに及び、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬに及ぶ、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬに及び、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬに及ぶ、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬに及び、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬに及ぶ、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約２５μｇ／ｍＬであり、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約２５μｇ／ｍＬである、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２が組換え蛋白質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
当該組成物が凍結乾燥される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
精子の機能性を改善する方法であって、
（ａ）外因性量のＦＡＡ及び外因性量のＴＩＭＰ−２を組み合わせて含む物質の組成物に精子を接触させるステップを含み、前記量が、前記組成物に接触した精子の運動性、ＰＩＡ、又は、運動性及びＰＩＡを増加させるのに効果的である、方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において、前記物質の組成物が精液保存培地をさらに含み、前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２が前記精液保存培地に配置される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記精液保存培地が、タイロードアルブミンラクテートピルベート培地（ＴＡＬＰ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）において、約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＦＡＡの濃度、及び、約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＴＩＭＰ−２の濃度を生じる物質の組成物と、前記精子が接触される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）において、約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＦＡＡの濃度、及び、約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＴＩＭＰ−２の濃度を生じる物質の組成物と、前記精子が接触される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）において、約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＦＡＡの濃度、及び、約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＴＩＭＰ−２の濃度を生じる物質の組成物と、前記精子が接触される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）において、約２５μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＦＡＡの濃度、及び、約２５μｇ／ｍＬという前記精子と接触するＴＩＭＰ−２の濃度を生じる物質の組成物と、前記精子が接触させられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２が組換え蛋白質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）が、性別により分けられた精子を前記物質の組成物と接触させるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）が、性別により分けられていない精子を前記物質の組成物と接触させるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）の後に：
（ｂ）前記物質の組成物の存在下で、前記精子を凍結又は凍結保存するステップ
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
精子における運動性又は完全な先体の割合（ＰＩＡ）を増加させるためのキットであって、当該キットが：
適切な容器内に配置される物質の組成物であり、該組成物がある量のＦＡＡ及びある量のＴＩＭＰ−２を含み、前記組成物は適切な容器内に配置され、さらに、前記量が、前記組成物に接触した精子の運動性、ＰＩＡ、又は、運動性及びＰＩＡを増加させるのに、組み合わせで効果的である、組成物；及び、
当該キットを使用するための指示；
を組み合わせて含むキット。
【請求項２２】
精液保存培地をさらに組み合わせて含み、前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２が前記精液保存培地に配置される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記精液保存培地が、タイロードアルブミンラクテートピルベート培地（ＴＡＬＰ）を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬに及び、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬに及ぶ、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬに及び、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬに及ぶ、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬに及び、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬに及ぶ、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
前記精液保存培地におけるＦＡＡの量が約２５μｇ／ｍＬであり、前記精液保存培地におけるＴＩＭＰ−２の量が約２５μｇ／ｍＬである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２が組換え蛋白質である、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受精能関連抗原（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＦＡＡ）と２型組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ−２）との組合せを含む組成物に向けられている。本発明は、一般に、哺乳動物の精子機能性を増加させるため、及び、より具体的に言えば、凍結保存された精液に含有された精子の機能性を増加させるために前記組成物を使用する方法にさらに向けられている。
【背景技術】
【０００２】
精液が、雄における生殖の副器官、すなわち、精嚢、前立腺及び尿道球腺の分泌物からなる複雑な混合物であることは、文書により十分に立証されている。今日までに発見及び特徴づけられている精液の成分のうち、一部はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得を阻害し、残りはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得を刺激すると示されてきている。
【０００３】
受精能獲得を刺激する精液の成分は、射精に結びつけられ、ヘパリン誘起受精能獲得を導くヘパリン結合蛋白質（ＨＢＰ）の系統群を含む（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）１９９０）。精製ＨＢＰによる免疫化によって生じるマウス単クローン抗体（ｍＡｂ）Ｍ１により、ウシの精液抽出物の免疫ブロットにおいて３種類の異なる蛋白質が認識された（べリン（Ｂｅｌｌｉｎ）等、１９９６、１９９８）。前記３種類のＨＢＰのうち１つは、３１−ｋＤａの単一質量であるということが明白であり、受精能関連抗原として記述された（ＦＡＡ；ベリン等、１９９８）。ＦＡＡと名付けられたヘパリン結合蛋白質のポリヌクレオチドコード配列、及び、ＦＡＡのアミノ酸配列は、他の精液蛋白質とは明瞭に区別される。ヒト以外のＦＡＡをコードする単離されたポリヌクレオチドが記述されている。２００５年５月１０日に出願した米国特許第６，８９１，０２９号を参照されたい。
【０００４】
２型組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ−２）は、雄ウシ（カルヴィート（Ｃａｌｖｅｔｅ）等、１９９６；マッカリー（ＭｃＣａｕｌｅｙ）等、２００１）、ヒト（バウムガート（Ｂａｕｍｇａｒｔ）等、２００２；シモカワ（Ｓｉｍｏｋａｗａ）等、２００３）、ネズミ（スー（Ｓｉｕ）及びチェン（Ｃｈｅｎｇ）、２００４）、並びに、雄ヒツジ及び雄馬（メタイヤー（Ｍｅｔａｙｅｒ）等、２００２）由来の精液の通常成分である。ＴＩＭＰ−２は、精巣及び副生殖腺を含めた種々の細胞型において産生される。ＴＩＭＰ−２は、ＦＡＡのように、これらの腺から分泌される。ＴＩＭＰ−２は、射精中に泌尿生殖器官を横断する精子に結合する。そのうち４種類が記載されているＴＩＭＰ蛋白質は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の触媒活性を阻害する（ナガセ（Ｎａｇａｓｅ）等、１９９９）。ＭＭＰは、排卵、着床、分娩、退縮、並びに、前立腺及び精巣の機能を含めた種々の生殖過程のメディエーターである（ハルボーイ（Ｈｕｌｂｏｙ）等、１９９７）。ＭＭＰは、正常及び異常なヒト精子の先体並びに中片に局在化している（バックマン−シェイクド（Ｂｕｃｈｍａｎ−Ｓｈａｋｅｄ）等、２００２）。ＴＩＭＰ−２は、卵割、又は、不活性なｐｒｏ−ＭＭＰ−２酵素前駆体のその活性化状態への転換を阻害することにより、ＭＭＰ−２を優先的に調節する（ブリュー（Ｂｒｅｗ）等、２０００）。後向き分析において、ドーソン（Ｄａｗｓｏｎ）等（２００２）は、精子の界面活性剤による抽出物内にＴＩＭＰ−２を持った雄ウシは、ＴＩＭＰ−２陰性の雄ウシよりも１３％以上受精力があることを報告した。ＴＩＭＰ−２は、ヘパリン結合蛋白質である（マッカリー等、２００１）。
【０００５】
受精能関連抗原（ＦＡＡ）は、ウシの副生殖腺において産生される精液蛋白質である。ＦＡＡは、射精にて精子に結合する（マッカリー等、１９９９）。ＤＮａｓｅ−Ｉ−ｌｉｋｅ蛋白質の拡張している系統群（ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆａｍｉｌｙ）と高度な相同性を共有する、約３１ｋＤａの非グリコシル化塩基性蛋白質である。ウシのＦＡＡｃＤＮＡ配列は、ヒト肝臓発現配列タグ（ＥＳＴ）からクローン化された遺伝子であるＤＮａｓｅ−１−ｌｉｋｅ−３（ＤＮａｓｅ１Ｌ３）に対して８８％の同一性を表す（ロドリゲズ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）等、１９９７）。文献におけるＤＮａｓｅ１Ｌ３という専門用語は、ＬＳ−ＤＮａｓｅ及びＤＮａｓｅＩｈｏｍｏｌｏｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ２を含む。ＤＮａｓｅ１Ｌ３は、主として肝臓及び脾臓細胞内で発現される。ＦＡＡは、ウシ精液のＨＢＰ中の微量成分として同定される（マッカリー等、１９９９）。ＦＡＡの発現は、精嚢、前立腺、及び、尿道球腺において始まる。ＦＡＡは、雄ウシ、雄ブタ、雄ヒツジ、ヤギ、イヌ、及びヒト由来の精液において検出され、精子頭部の先体部分に主として局在化されている（ドーソン等、２００３）。
【０００６】
予測されたＤＮａｓｅ１Ｌ３蛋白質は、良く特徴づけられた膵臓の酵素である標準的なＤＮａｓｅ−Ｉに対して４５％同一であった（キンシ（Ｋｉｎｓｈｉ）等、１９８９）。ＤＮａｓｅ−Ｉ−ｌｉｋｅのファミリーメンバーは、酵素活性、発現の調節及び遺伝子座に関してＤＮａｓｅ−Ｉとは異なり、その生物学上の役割はいまだに定義されていない。ＦＡＡは、雄ウシにおけるより高い受精能の蛋白質マーカーであり；ウエスタンブロットにより検出可能なＦＡＡを含有する精子抽出物は、検出可能なＦＡＡ無しの精子抽出物に比べて、より高いウシの受精能を示した。この観察には、複数の種雄の放牧地において、本来の奉仕に使用され、２５匹の雌ウシあたり１匹の雄ウシという比で雌ウシに曝露された雄ウシ（べリン等、１９９４；１９９６；１９９８）、又は、１回の人工授精を利用して若い雌ウシ及び雌ウシに交配される雄ウシが含まれている（スプロット（Ｓｐｒｏｔｔ）等、２０００）。ＦＡＡは、そのヘパリン結合特性のため、受精能獲得の調節、及び／又は、先体反応の誘発に関与していると仮定されている。ヘパリン捕捉培地に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの精子の反応は、適切な誘発物質（Ｃａ２＋イオノフォア、透明帯、又は、リゾホスファチジルコリン等の膜融合剤）への曝露後に生じる先体反応における用量反応の増加より特徴づけられ、そのような状況下で先体反応を受けるという精子の能力は、雄ウシの受精能に正に相関している（アックス（Ａｘ）及びレンズ（Ｌｅｎｚ）、１９８７）。
ヘパリン結合蛋白質は、精漿から単離された場合、ヘパリン誘起受精能獲得を増強した（ミラー等、１９９０）。
【０００７】
精液試料におけるＦＡＡの検出は、Ｍ１と名付けられた単クローン抗体（ベリン等、１９９８）、又は、最近記載された多クローン性非組換えＦＡＡ抗血清を用いて可能である（マッカリー等、２００４）。９１４匹の雄ウシ由来の精液試料がＦＡＡの検査を受けた際、２６％の試料からＦＡＡが検出されなかった（マッカリー等、２００４）。ＦＡＡ陰性の雄ウシに類似の発生が、近頃報告された（スプロット等、２００６）。より低い受精能の雄ウシは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヘパリンに応じた受精能獲得を経るための能力が乏しい精子を産生している（アックス等、１９８５；アックス及びレンズ、１９８７、レンズ等、１９８８）。
【０００８】
（ヒトにとっても、他の哺乳動物にとっても）人工授精産業に対する重大な関心は、成功率である。成功において重要な測定とは、当然ながら、１つの人工授精の事象あたりに産出され生き延びる子孫の数である。このように、高い受精能獲得率に寄与し、次に、より大きな割合の、射精において卵母細胞を受精させる能力を持つ精子を生じる条件は、ヒト及び動物の受精能処置、人工授精手順、及び体外受精を用いた畜産業等の非常に競争的な分野において、極度に価値のある利点を与えている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、人工授精に使用される精液試料の受精能を改善する組成物及び対応する方法に向けられている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、新しい精液及び凍結保存した精液両方における性別により分けられていない精子及び性別により分けられた精子の機能性を改善するために機能する。従って、本発明の第１の態様は、精子における運動性又は完全な先体の割合（ＰＩＡ）を増加させる物質の組成物に向けられており、当該組成物は、ある量のＦＡＡ及びある量のＴＩＭＰ−２を組み合わせて含み、前記量は、当該組成物に接触した精子の運動性、ＰＩＡ、又は、運動性及びＰＩＡを増加させるのに効果的である。前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２は、タイロードアルブミンラクテートピルベート培地（ＴＡＬＰ）等の精液保存培地に配置することができる。当該組成物における前記ＦＡＡ及び前記ＴＩＭＰ−２の濃度は、接触の際に、精子が、約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬのＦＡＡ、及び、約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬのＴＩＭＰ−２、より好ましくは、約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬのＦＡＡ、及び、約５μｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬのＴＩＭＰ−２、さらにより好ましくは、約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬのＦＡＡ、及び、約１０μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬのＴＩＭＰ−２に及ぶ環境に配置されるような濃度である。前記ＦＡＡも前記ＴＩＭＰ−２も、組換え蛋白質であることが好ましい。本発明による物質の組成物は凍結乾燥することができ、その場合、その組成物は、精子と接触する前に適切な培地で水和される。
【００１１】
本発明の別の態様は、（使用する前に精子を極低温で保存するだけでなく）精子の機能性を改善する方法に向けられている。当該方法は、すぐ前の段落において記述された物質の組成物に精子を接触させるステップを含む。当該方法を使用して、性別により分けられた精子及び／又は性別により分けられていない精子の機能性を改善することができる。当該方法は、前記精子を本発明の物質の組成物に接触させた後、任意選択で、前記物質の組成物の存在下で前記精子を凍結させるステップ又は凍結保存するステップをさらに含む。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、精子における運動性又は完全な先体の割合（ＰＩＡ）を増加させるためのキットである。当該キットは、前述の段落において記述されている物質の組成物を組み合わせて含み、前記組成物は、適切な容器内に配置される。当該キットに含まれる前記ＦＡＡ及びＴＩＭＰ−２の量は、前記組成物と接触させられた精子の運動性、ＰＩＡ、又は、運動性及びＰＩＡを増加するのに、組み合わせで効果的な量である。当該キットは、当該キットの使い方の指示を任意選択で含む。
【００１３】
本発明は、ＦＡＡとＴＩＭＰ−２との組合せを含んだ組成物を単位剤形で含む。すなわち、ＦＡＡとＴＩＭＰ−２との組合せが濃縮した（例えば、濃厚溶液の、又は、凍結乾燥した）形状で提供及び包装され、その包みの内容物が適切な量の精液保存培地に添加された場合に、その包みの全内容物が、適切な濃度のＦＡＡ及びＴＩＭＰ−２を有する溶液を産出するようになっている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
略語及び定義：  以下の略語及び定義は、明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される。ここに明確な定義が与えられていない用語は、酵素学、生化学、及び／又は、人工授精技術の分野における、その分野で受け入れられている定義が与えられることになる。
【００１５】
ＡＮＯＶＡ＝群間における分散分析
ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン
ＥＳＴ＝発現配列タグ
ＦＡＡ及びｒＦＡＡ＝それぞれ、受精能関連抗原及び組換え受精能関連抗原
ＨＢＰ＝ヘパリン結合蛋白質
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピロノシド、ｌａｃオペロンの一般的な誘発物質
ＬＢ培地＝溶原性液体培地（ルリア−ベルターニ培地又はルリア液体培地とも呼ばれることが多い）。ＬＢは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の一般的な維持及び増殖に広く使用される商業的に入手可能な培地（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。（「ＬＢ」の意味に対する興味深い歴史的な補足説明については、Ｂｅｒｔａｎｉ，Ｇ．（２００４），“Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ａｔ  Ｍｉｄ−Ｔｗｅｎｔｉｅｔｈ  Ｃｅｎｔｕｒｙ：Ｐ１，Ｐ２，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６（３）：５９５−６００を参照されたい）
ＬＰＣ＝リゾホスファチジルコリン
ＭＭＰ＝マトリックスメタロプロテイナーゼ
ＰＢＳ−Ｔ＝３％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸緩衝生理食塩水
ＰＩＡ＝完全な先体のパーセント
ＲＡＣＥ＝レース法
ＲＴ−ＰＣＲ＝逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。多数の従来ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ手順が当業界において既知であり、本明細書においてはどのような詳細も記述されない。同様に、多数の市販用キットが、所望の核酸配列をクローン化及び発現するため、並びに、生成した蛋白質を分離、同定、及び単離するために入手可能である。他に示されていない限り、本明細書において言及されている全ての分子生物学的操作及び手順は、参照により本明細書に引用する、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌによる“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，”著作権２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＩＳＢＮ：０−８７９６９−５７６−５において見ることができる。
【００１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＭ＝平均値の標準誤差
精液保存培地＝新しい又は凍結した（すなわち凍結保存された）精液を保存するように設計された、それだけに限らないがＴＡＬＰ培地を含めたいかなる培地
ＳＯＣ培地＝頭字語の語源はあいまいであるが、一般的に、  “非常に最適な液体培地−異化産物抑制（ｓｕｐｅｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｂｒｏｔｈ−ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）”と名付けられたと解釈されている。ＳＯＣ培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カタログナンバー１５５４４−０３４）を含めた多くの供給業者から商業的に入手可能である。Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（４）：５５７−５８０も参照されたい。
【００１７】
ＴＡＬＰ培地＝タイロードアルブミンラクテートピルベート培地。ＴＡＬＰ培地は、精子を調製するために、体外受精のために、並びに、卵母細胞及び胚を洗浄するため等に使用される。ＴＡＬＰ培地は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ社（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から商業的に入手可能である。
【００１８】
ＴＩＭＰ−２及びｒＴＩＭＰ−２＝それぞれ、２型組織メタロプロテアーゼ阻害物質及び組換え２型組織メタロプロテアーゼ阻害物質
本発明は、そのままの（ｎｅａｔ）精液及び／又は性別により分けられた精子の凍結保存の後、精子の運動性及び完全な先体のパーセントという点で精子の機能を高める物質の組成物及び対応する方法である。ＴＩＭＰ−２及びＦＡＡｃＤＮＡをウシ精嚢からクローン化し、組換え融合蛋白質を原核生物発現システムを用いて操作及び発現して、さらに、精製された組換え体をウシ精液に対する治療上の添加剤として評価した。ｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡは、用量反応の様式で、ヘパリン誘起受精能獲得に続き先体反応を受けるという精子の能力を刺激した。ＦＡＡとＴＩＭＰ−２との組合せを含んだ組成物も、解凍後の３８℃での３時間の培養の後に完全な先体を有する精子の運動性及び割合を増加させることにより、凍結保存後のそのままの精液及び性別により分けられた精液の質を改善した。このように、本発明の有用性は、哺乳動物の精液の受精能を改善することである。そのような治療上の測定値は、標準的な用量の授精、又は、性別により分けられた精子の商業上の使用において等の低用量の授精を必要とする状況に適用できる。本発明は、雄ウシ由来の精液試料に特に利益を与え、さもなければ、その精子は凍結保存に対して不十分に反応する。
【００１９】
実施例において記述された実験は、ウシ精液を用いて行ったけれども、ＴＩＭＰ−２及びＦＡＡ発現は、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、及びヒトを含めた多数の経済的に重要な種において実証されている。これらの種類のうち全ての哺乳動物由来の精子も、本明細書において記述された組成物から利益を得ている。
【００２０】
実施例に記述されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、５８５ｂｐセグメントのＴＩＭＰ−２遺伝子を増幅し、クローン化（４つの同一のクローンが生じた）及び配列決定した。ＳＥＱ  ＩＤ番号：１は、ＴＩＭＰ−２遺伝子のコード領域を示し；ＳＥＱ  ＩＤ番号：２は、対応する蛋白質を示している。実際の２２５個のアミノ酸が翻訳された遺伝子産物は、ＳＥＱ  ＩＤ番号：１１に示されている。ＳＥＱ  ＩＤ番号：１１は、ベクター自体の３’末端によりコードされた２４個の残基、及び、６個のＣ末端ヒスチジン残基を含有するということにおいてのみ、ＳＥＱ  ＩＤ番号：２とは異なる。ベクターがコードされた残基及びＨｉｓ６タグのＣ末端テイルの位置及び配列は、配列表に示されている。ｒＴＩＭＰ−２発現クローンは、ウシＴＩＭＰ−２遺伝子の成熟ペプチド（ｇｂ：Ｍ３２３０３）全体を含み、ベクター由来のＣ末端Ｈｉｓ６タグを含む２２５個のアミノ酸の蛋白質産物（２５．２ｋＤａ）を生じる（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１１）。
【００２１】
ＰＣＲを使用して、精嚢のｃＤＮＡから６０３ｂｐ断片のウシＦＡＡを増幅した。ＳＥＱ  ＩＤ番号：３は、ＦＡＡ遺伝子のコード領域を示し、ＳＥＱ  ＩＤ番号：４は、対応する蛋白質を示している。遺伝子を発現ベクター（ｐＣＲ（登録商標）Ｔ７／ＣＴ−ＴＯＰＯ（登録商標））内にクローン化し、個々のクローンをスクリーニング及び配列決定した。６個のｒＦＡＡクローンが生じて：そのうち４個（Ａ１−５、Ａ１−９、Ａ２−１、及びＡ２−３）が互いに同一で、全く設計された通りであり；その他の２個は、ＰＣＲ中に導入した塩基置換をそれぞれ１個含んだ。クローンＡ１−６は、「Ａ５６２→Ｇ」のヌクレオチド置換を有し、翻訳された蛋白質において「Ｋ１８８→Ｅ」の突然変異を生じた。クローンＡ１−１０は、「Ａ２５６→Ｃ」のヌクレオチド置換を有し、翻訳された蛋白質において「Ｔ８６→Ｐ」の突然変異を生じた。４個の同一のクローンにおける６０３ｂｐのコンセンサスヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ番号：３に示され、翻訳された遺伝子産物は、ＳＥＱ  ＩＤ番号：４に示されている。クローンＡ１−５を原核生物発現細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）に形質転換し、ｒＦＡＡをＨｉｓ６タグの融合蛋白質として作製した。実際の２３１個のアミノ酸が翻訳された遺伝子産物は、ＳＥＱ  ＩＤ番号：１２に示されている。ＳＥＱ  ＩＤ番号：１２は、ベクター自体の３’末端によりコードされた２４個の残基、及び、６個のＣ末端ヒスチジン残基を含有するということにおいてのみ、ＳＥＱ  ＩＤ番号：４とは異なる。組換えＦＡＡ産物は、Ｈｉｓ６タグを含んだ２６．７ｋＤａという分子質量を有する総計２３１個のアミノ酸になる（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１２を参照されたい）。
【００２２】
細菌ライセートの可溶性及び不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ｒＴＩＭＰ−２が不溶性画分において封入体の形状で優勢的に発現したことが実証された。２時間培養し誘発された培養物と比較して、明白なｒＴＩＭＰ−２発現の上方調節は、４時間培養し誘発された培養物ではなかった（図５を参照）。従って、ｒＴＩＭＰ−２発現培養物は、ＩＰＴＧを用いた２時間の後誘発（ｐｏｓｔ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を続けた。（さらに低い）ｒＦＡＡの発現と同様に、ｒＴＩＭＰ−２は、不溶性細菌ライセートにおいて優勢的に発現した（図６Ａ及び６Ｂを参照）。抗Ｈｉｓ６抗体を用いたウエスタンブロット法により、Ｈｉｓタグの組換え蛋白質の同一性を検証した（図６Ｂを参照）。ｒＴＩＭＰ−２を、コバルトベースの金属アフィニティ樹脂（抗Ｈｉｓ６）を用いて、ほぼ均質になるまで細胞ライセートから精製した。図７Ａ及び７Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７Ａ）及びウエスタンブロット法（抗Ｈｉｓ６）（図７Ｂ）により観察したｒＴＩＭＰ−２の典型的な精製図を示している。ｒＴＩＭＰ−２を含有するライセート（図７Ａにおいても７ＢにおいてもレーンＳ）全体を、金属アフィニティ樹脂と混合し、精製したｒＴＩＭＰ−２をその樹脂から溶出した（図７Ａ及び７Ｂ；Ｅ１〜Ｅ２）。アフィニティ精製した変性ｒＴＩＭＰ−２を、実施例において記述された手順を用いた複数ステップの透析法により再び折り畳んだ。最終の精製し再び折り畳まれた産物（図８に示されているゲル）を、機能的な精子のアッセイに使用した。本明細書に記載された条件下において、組換えＴＩＭＰ−２及びＦＡＡを比較的高いレベル（≧５０〜７５ｍｇ／Ｌ）で発現した。精製し再び折り畳まれた組換え蛋白質の回収率は、いくつかの実験バッチにわたって約１５〜２５ｍｇ／Ｌ培地（〜３０％回収）であった（実験に基づく詳細のための実施例を参照）。
【００２３】
細菌ライセートの可溶性及び不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ｒＦＡＡが不溶性画分において封入体の形状で優勢的に発現したことが実証された。図１Ａ（可溶性画分）を図１Ｂ（不溶性画分）に比較されたい。最適なｒＦＡＡ発現の時間経過は、２７ｋＤａバンドの刺激された発現レベルにより示されているように、４時間の後誘発であった。図１Ｂのレーン「４ｈｉ」（４時間、誘発）を図１Ｂのレーン「２ｈｉ」（２時間、誘発）又は「ｕｉ」（誘発されていない対照）と標識されたレーンのうちどれにでも比較されたい。従って、全てのｒＦＡＡ発現培養物は、ＩＰＴＧを用いた４時間の後誘発を続けた。
【００２４】
ｒＦＡＡの発現を、抗Ｈｉｓ６抗体を用いた４時間の培養物のウエスタンブロット法により確証した（図２Ｂを参照）。低レベルの恒常的に発現したｒＦＡＡを、誘発されていない試料（可溶性及び不溶性）において抗体により検出し、そのレベルは、誘発された可溶性の試料で検出したレベルに類似していた（図２Ａを参照）。不溶性の誘発されたライセートは、ウエスタンブロットにおける抗体の激しい交差反応により実証されているように、明らかに、ｒＦＡＡを優勢的に含有していた（図２Ｂを参照）。
【００２５】
ｒＦＡＡを、変性条件の下、コバルトベースの金属アフィニティ樹脂（抗Ｈｉｓ６）を用いて、ほぼ均質になるまで細胞ライセートから精製した。図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により観察した典型的な精製図を示している。ｒＦＡＡを含有するライセート（図３のレーンＳ）全体を、金属アフィニティ樹脂と混合し、その樹脂にｒＦＡＡを特異的に結合させた。複数回洗浄した後、５総容積の溶出バッファーを連続して用いて、精製したｒＦＡＡを樹脂から溶出した（図３、レーンＥ１からＥ５）。アフィニティ精製された変性ｒＦＡＡを、複数ステップの透析法により、非変性バッファー内に再び折り畳み、最終の精製し再び折り畳まれた産物（図４に示されているゲル）を、機能的な精子のアッセイに使用した。
【００２６】
ｒＴＩＭＰ−２は、用量依存的な様式でヘパリン誘起受精能獲得を増した。ｒＴＩＭＰ−２の添加により、先体反応した精子の割合における用量反応が、ヘパリンのみ、又は、ヘパリンとリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）による処理後に観察した用量反応より上に増加した（Ｐ＜０．０５）。ｒＴＩＭＰ−２濃度（μｇ／ｍＬ）の関数として先体反応した精子の割合を示すグラフである図１０を参照されたい。先体反応の最大の刺激（５７％）には、２００μｇ／ｍＬのｒＴＩＭＰ−２の添加が必要とされた。しかし、２５μｇ／ｍＬで観察した反応は、５０又は１００μｇ／ｍＬと有意に異なってはいなかった。空のベクターライセートを有する対照の培養は、ヘパリンとＬＰＣのみにより誘発された培養（データは示されていない）と異なってはいなかった。
【００２７】
ｒＦＡＡも、用量依存的な様式でヘパリン誘起受精能獲得を増した。ＬＰＣによる刺激はなく、ヘパリンのみを用いた４時間の培養により（図９、「Ｈｅｐ」）、精子の母集団のうち約１６％において先体反応の誘発（すなわち、自然先体反応）が生じた。４時間の培養の終わりに、ヘパリンと共にＬＰＣを添加することにより（図１４、「０」）、約３０％の先体反応細胞が生じた。ｒＦＡＡの添加により、先体反応した精子の割合における用量依存が増加した（Ｐ＜０．０５）。約６０％の精子が反応したという最大の反応は、２５μｇ／ｍＬのｒＦＡＡで達成した（図９を参照）。空のベクターで形質転換された培養発現細胞由来の細菌抽出物（挿入のない負の対照）を用いた処理後に先体反応した精子の割合は、ヘパリンとＬＰＣのみにより誘発されたもの（データは示されていない）と異なってはいなかった。
【００２８】
ｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡは、２５μｇ／ｍＬの濃度で先体反応を独立して刺激したので、先体反応に対するｒＴＩＭＰ−２とｒＦＡＡとの併用効果を検査するために実験を行った。０、２５、及び５０μｇ／ｍＬのｒＴＩＭＰ−２並びにＦＡＡの交差処理は、処理間に有意な相互作用を示さなかった。独立したｒＴＩＭＰ−２の効果は、ｒＦＡＡ処理無しでは観察されず、ｒＴＩＭＰ−２の効果は雄ウシにより異なることを示した。しかし、ｒＦＡＡを添加することにより、ｒＴＩＭＰ−２の効果は各用量で増し（図１１を参照）、ｒＦＡＡ及びＴＩＭＰ−２それぞれの用量反応実験で観察した先体反応の割合と類似の増加した先体反応の割合を誘発した。２５μｇ／ｍＬという濃度のｒＴＩＭＰ−２は、５０μｇ／ｍＬというより多い用量で観察した効果とは違いのない効果を生んだ。
【００２９】
次に、ｒＴＩＭＰ−２とｒＦＡＡとの組合せを含んだ組成物で精子を処理した。特に、処理した精子及び未処理の精子の凍結保存後の運動性及び先体完全性を評価した。従って、新たに回収した精液試料を、凍結保存を受ける前に、２５μｇ／ｍＬのｒＦＡＡとｒＴＩＭＰ−２との組合せで処理した。凍結保存は、業界標準に従い行った。運動性（％）及び先体完全性（完全な先体のパーセント、ＰＩＡ）を、解凍直後（０時間）に盲検的に評価した。次に、試料を３８℃で３時間培養した後、測定を繰り返した。３時間のインキュベーション時間は、どれくらいよく精液試料が凍結保存及び解凍に不随する侵襲に耐えることができるかを決定するために使用される人工授精産業の標準品質管理試験を表している。
【００３０】
３時間の解凍後の処理された試料と対照試料との比較により、運動性が処理によって有意に改善されたことが示されている。運動性は、処理された試料（５５．７±１．６）と比べて、対照試料において（５０．４±１．７）３時間のインキュベーション時間の後減少した（ｐ＜０．０００１）（表１を参照）。同様に、解凍後に完全な先体を有する精子の割合は、処理された試料（７０．９±１．３）と比べて、対照試料において（６６．９±１．６）３時間後有意に減少し（ｐ＜０．０１）（表１を参照）、組換え蛋白質が、凍結保存中、細胞の原形質膜を保護したことを示して（信じられて）いる。図１２に示されているグラフも参照されたい。グラフに示されているように、ｒＦＡＡとｒＴＩＭＰ−２との組合せで精液を処理することにより、凍結保存にかけられた雄ウシ精子のＰＩＡ（■）も運動性のパーセント（−−◆−−）も改善された。効果は、より低い精子濃度（１０×１０６精子／ストロー）で特に宣告された。
【００３１】
さらに、組換え蛋白質がそのままの精液に直接添加された場合に、ｒＦＡＡもｒＴＩＭＰ−２も精子の膜に結合することを確立した。結合効果を実証したゲルである図１３を参照されたい。新たに回収したそのままの雄ウシ精液を、２５μｇ／ｍＬの空のベクター（図１３のレーン１及び３）、又は、２５μｇ／ｍＬのｒＦＡＡ（図１３のレーン２及び４）で補い、工業的な凍結保存の前に２０分間培養した。次に、精液を解凍して、精子細胞を３回洗浄し、さらに、抗Ｈｉｓ６Ｘ抗体を使用したウエスタンブロット法により細胞ライセートを評価した。図１３に示されているように、ｒＦＡＡで補った試料において単一のバンドを検出し、組換え蛋白質を直接そのままの精液に添加することは、精子細胞による取り込みを可能にするのに十分であることが示された。類似の結果を、ｒＴＩＭＰ−２を用いて観察した（データは示されていない）。これらの結果は、処理をそのままの精液に（並びに、精液から分離され、異なる培地において再懸濁している精子細胞に）直接適用できることを確立したという点で重要である。
【００３２】
【表１】
2009528269.tif 000002
表１に示されている結果は、本発明の有用性を例示している。ＦＡＡとＴＩＭＰ−２との組合せを含んだ組成物は、凍結保存及び解凍にかけた精子において、統計学的に有意な増加を運動性に、並びに、統計学的に有意な増加をＰＩＡに与えている。両方のパラメータ（運動性及びＰＩＡ）が、人工授精における成果に正比例する。精子は、運動性でも、卵子に突入するために完全な先体を有しているものでもなければならない。
【００３３】
Ｘ染色体を含んだ精子をＹ染色体を含んだ精子から単離するために、前もって性別により分類した精液試料も、凍結保存に続いて３時間のストレス試験にかけた。予備データは、ｒＦＡＡとｒＴＩＭＰ−２との組合せを含んだ組成物に精子を接触させることにより、精子の運動性（％）及びＰＩＡがそれぞれ３３．１％及び４２．５％という平均値分改善されたと示している。表２を参照されたい。
【００３４】
【表２】
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表２は、３匹の雄ウシからのデータを示している。性別により分けられた精子を用いたさらなる実験が、それらの特定化された種類の精液試料におけるｒＦＡＡ及びｒＴＩＭＰ−２の凍結保護効果を確証するために進行中である。小さい試料サイズにもかかわらず、表２に示されたデータは納得できるものである。そのデータは、ＦＡＡとＴＩＭＰ−２との組合せを含んだ凍結保存液が、凍結保存された精子の運動性もＰＩＡも著しく上げていることを強く示唆している。表２に示されているように、処理した精子の運動性は、未処理の対照と比較して３３．１％増加した。処理した精子のＰＩＡは、未処理の対照と比較して４２．５％増加した。これらの著しい改善は、凍結保存された精子の機能性を上げるための本発明の有用性を実証している。
【００３５】
従って、本発明は、組換え融合蛋白質（ｒＦＡＡ及びｒＴＩＭＰ−２）として２つ別々の精液蛋白質を大量生産する能力を持つ形質転換された培養細胞株を含む。これらの蛋白質は、特に凍結保存された精液における精子機能を改善するための精液の添加剤として有用である。これら２つの蛋白質による組換え蛋白質の組合せを含んだ組成物は、凍結保存を受けている細胞におけるヘパリン誘起受精能獲得への反応により、及び、先体完全性によりアッセイされているように、精子機能を改善する。（実施例及び上記の考察を参照されたい）。先体反応がこれらの精液の添加剤により増加され、さらに、精子の膜が保護されて、解凍後の精液産物はより機能的になる。有利な効果が、標準的な凍結保存された精子においても、性別により分けられ凍結保存された精子においても示されている。
【００３６】
性別により分けられた精子は、細胞集団の分類に付随するストレスのために、従来の（分けられていない）精子よりも生存の可能性が低く、より繁殖性が低いと既知であるため、本発明は、性別により分けられた精子の分野において特に適している。本発明の組成物及び方法は、解凍後の運動性及び完全な先体に対する負の影響を減少する能力を持っているため、性別が判定された精液試料は、本発明で非常に利益を得ている。現代の精子雌雄鑑別技術により、従来の性別を判定されていない凍結精液と比較して、１つの授精ストローあたりの性別を判定された精子の量が少なくなっているため、有利な効果はさらに高められる。従って、各ストローに存在する精子の機能性を上げる本発明は、従来の凍結に対して不十分に反応する雄ウシ由来の精液の受精能も改善する。本発明は、精子の数が減少したストロー及び性別により分けられたストローにおける精子の機能性も増加する。要するに、本発明は、性別が判定されたストローにおける精子の機能性を上げる能力を持っており、これらの性別により分けられた精液試料をその分けられていない対応物と同じくらい繁殖性にしている。
【００３７】
本明細書に記述されている組換え蛋白質をコードするＦＡＡ及びＴＩＭＰ−２遺伝子は、哺乳動物全てにわたって高い相同性を示している。このように、本発明は、全ての経済的に重要な家畜、絶滅の危機に瀕した動物、及びヒトを含めた広範囲の哺乳類種にわたり適用できる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、単に、本明細書において記述及び請求されている本発明のより完全な開示を提供するためだけに含まれている。実施例は、いかなる様式でも本発明の範囲を限定しない。
【００３９】
化学薬品及び試薬は、他に述べられていない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から商業的に入手した。
１．       
クローン化及び配列解析
（ａ）２型組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ−２）：
２４ｋＤａの精液ヘパリン結合蛋白質（ＨＢＰ−２４）の精製は、以前に報告された（マッカリー等、２００１）。精液から精製されたＨＢＰ−２４の小配列分析により、２０個のＮ末端アミノ酸残基が同定され、その残基は、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２として同定されたウシのメタロプロテアーゼ阻害物質のＮ末端に対して９０％の同一性を示した（ＴＩＭＰ−２；デクラーク（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｋ）等、１９８９）。精液ＴＩＭＰ−２遺伝子をクローン化するために、ウシＴＩＭＰ−２遺伝子特異的プライマーを、発表されたウシ大動脈ｃＤＮＡ配列（ブーン（Ｂｏｏｎｅ）等、１９９０）に基づき設計した。全ＲＮＡを、ウシの副生殖腺組織（精嚢、尿道球腺、及び前立腺）から抽出した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順を、マッカリー等（２００１）により記載されているように行った。部分的なＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡの増幅は成功し、ウシ副生殖腺のそれぞれからＲＴ−ＰＣＲ産物を生じた。３種類全ての腺からのＲＴ−ＰＣＲ産物におけるＤＮＡ配列の分析により、それらの腺にわたり、及び、発表されたｃＤＮＡ配列（ブーン等、１９９０）に対して９５％を超える相同性が示された。後に、ＴＩＭＰ−２遺伝子のうち全体のコード領域を、以下に記述されているようにクローン化及び配列決定した。
（ｂ）ＰＣＲ増幅：
逆転写ＰＣＲを行い、精嚢ＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を増幅した。５μｇの全ＲＮＡで鋳型にされたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＲｎａｓｅＨＲＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により、ｃＤＮＡ合成を触媒した。マッカリー等（２００１）により記載されているウシ大動脈ＴＩＭＰ−２配列（Ｍ３２３０３）に基づき設計されたＴＩＭＰ−２遺伝子の部分的なｃＤＮＡセグメントのＰＣＲ増幅における鋳型として、第１のｃＤＮＡ鎖の産物を使用した。精嚢からウシＴＩＭＰ−２遺伝子のうち全体のコード配列を増幅するために、遺伝子特異的プライマーを設計した。使用したプライマーは、順方向：５’−ａｔｇｇｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃａｇｃｃｔｇｃｃｇｃｔｃｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇ−３‘（ＳＥＱ  ＩＤ番号：５）、及び、逆方向：５’−ｔｃａａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔｇｃｇｇｇｔｃｃｔｃｇａｔｇｔｃｃａｇａａａｃｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ番号：６）であった。ＰＣＲサイクル条件は、９４℃で４５秒、５７℃で４５秒、及び、７２℃で１分を３５サイクルであった。増幅したＰＣＲ産物を、製造者の指示に従いｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内にクローン化し、ＤｙｅＤｅｏｘｙブランドのターミネーター化学を利用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３Ａ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡシーケンサーを用いて配列決定した。全ての配列データを、（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅソフトウエアとしても既知である）（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  Ｈｅａｌｔｈによりオンラインで公的に利用可能にされた、Ｖｅｒｓｉｏｎ１０．０）ＧＣＧソフトウエアで分析した。
【００４０】
２つの異なるクローン、ｂＴＩＭＰ−２  １５Ｌ及びｂＴＩＭＰ−２  ２５を単離及び特徴づけた。第１のクローン、ｂＴＩＭＰ−２  １５Ｌは、ｂＴＩＭＰ−２の完全な前駆体のための全てのコドンを含んだ関心のある遺伝子を保有した。ｂＴＩＭＰ−２  ２５クローンは、成熟ＴＩＭＰ−２ペプチドをコードした。ＴＩＭＰ−２配列に加えて、各クローンはｃＤＮＡの３’末端に取り込まれた終始コドン、及び、６ｘＨｉｓタグを含有した。この実施例では、ｂＴＩＭＰ−２  ２５クローンを、組換えＴＩＭＰ−２作製のためにサブクローニングした。成熟ＴＩＭＰ−２ペプチド（１９５個のアミノ酸、ＳＥＱ  ＩＤ番号：２）をコードする５８５ｂｐのＴＩＭＰ−２断片（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１）を増幅するための鋳型として、ＴＩＭＰ−２ｃＤＮＡを使用した。ｐＣＲＴ７／ＣＴ−ＴＯＰＯベクターが取り込まれたＨｉｓタグが蛋白質のＣ末端に付加される確証的なＴＩＭＰ−２翻訳（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１１）のために、ＰＣＲ産物をインフレームに残るよう設計した。順方向プライマーの配列は：５’−ａｔｇｇｃａｇｃｔｇｃｔｃｃｃｃｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ番号：７）であり；逆方向プライマーの配列は：５’−ｃｇｇｇｔｃｃｔｃｇａｔｇｔｃｃａｇａａａｃｔｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ番号：８）であった。ＰＣＲに使用したサイクル条件は：「ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ」（登録商標）ブランドのグラジエントサークルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって、９５℃で２分間の後に、９４℃で１分；５８℃で１分；及び７２℃で１分が３５サイクル続き、最後の延長部分が７２℃で１０分続いた。「ＴＯＰＯ  ＴＡ」ブランドのクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造者の指示に従い、新しいＰＣＲ産物をｐＣＲ  Ｔ７／ＣＴ−ＴＯＰＯベクター内にクローン化した。
２．       
受精能関連抗原（ＦＡＡ）
ＦＡＡの化学的同一性は、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及びミクロシークエンシング分析により未変性蛋白質が精漿から精製された後初めて記載された（マッカリー等、１９９９）。完全な蛋白質のＮ末端配列、並びに、Ｌｙｓ−Ｃで消化したＦＡＡの２つの内部ペプチドを獲得し、ヒトＤＮａｓｅＩ−ｌｉｋｅの蛋白質（ＤＮａｓｅ１Ｌ３；Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ：Ｕ５６８１４）の推定ペプチド配列と一致するよう決定した。ＤＮａｓｅＩＬ３の５’及び３’セグメントを用いて設計したオリゴヌクレオチドにより、ウシ副生殖腺ＲＮＡから転写された５９２ｂｐのＰＣＲ産物が生じた。そのＰＣＲ産物を単離し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内に連結され、さらに、５’ＲＡＣＥ（すなわち、レース法；参照により本明細書に引用するＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００５），ｖｏｌ．２，ｐａｇｅｓ６２９−６３０を参照）により伸長される。これにより、ＦＡＡの９００ｂｐｃＤＮＡが同定された（米国特許第６，８９１，０２９号に記載）。開始コドンは９２ｂｐの５’ＵＴＲにより先立ち、終止コドンはＯＲＦ内に存在しなかった。従って、単離したｃＤＮＡ配列は、部分的なＦＡＡｃＤＮＡを意味した。ＳｉｇｎａｌＰ３．０（Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を利用した予測された蛋白質の検査により、アミノ酸残基１〜２０がシグナルペプチドを意味していたことが明らかになった（ベンドセン（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ）等、２００４）。成熟ペプチド配列は、従って、ペプチド切断部位の後１５３ｂｐで始まった。
【００４１】
未変性ＦＡＡ蛋白質のために以前に報告されたアミノ酸配列（マッカリー等、１９９９）を、ＦＡＡｃＤＮＡの推定された蛋白質配列内に埋め込み、従って、未変性のＦＡＡに対応する確証的なｃＤＮＡがクローン化されたと確証した。ブラストサーチエンジンを用いた配列分析（アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）等、１９９０）により、７６３ｂｐセグメントのＤＮａｓｅＩ−ｌｉｋｅＩＩＩ（Ｕ５６８１４）、３０５個のアミノ酸のＯＲＦを有する１０７９ｂｐのｃＤＮＡ（シグナルペプチドの切断後２８５個のアミノ酸）に対する同一性（８８％）が明らかになった。Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（アメリカの全国バイオテクノロジー情報センター、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄを介して利用可能）、及び、ＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）プロテオミクスサーバー配列分析手段（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄを介して利用可能）を用いて、蛋白質一次構造を分析した。部分的なＦＡＡｃＤＮＡ（〜９０％完全）は、２６９個のアミノ酸蛋白質をコードし、推定分子量は３０．８ｋＤａ（シグナルペプチドの切断後は２８．７ｋＤａ）、及び、予測された等電点（ｐＩ）は９．０であった（ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）等、１９９８）。それらの予測は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより３１ｋＤａとして明らかな未変性ＦＡＡの分子量、及び、２−Ｄ電気泳動法により検出された最低レベルのｐＩと一致している（マッカリー等、１９９９）。
【００４２】
ウシＦＡＡｃＤＮＡクローン（米国特許第６，８９１，０２９号を参照）を鋳型として利用し、ｒＦＡＡを作製するための発現クローンとして使用することになる新たな組換えヌクレオチド断片（６０３ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ番号：３）をＰＣＲにより増幅した。新たに設計された、順方向が５’−ａｔｇｇａｇａａｇｃｔａａａｃｇｇａａａｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ番号：９）、及び、逆方向が５’−ｇｃｔｇａｃａｔｃｃａｇｇｇｃｃｔｔｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１０）であるオリゴヌクレオチドポリマーは、ＦＡＡ遺伝子の６０３ｂｐの産物を増幅することに成功した（ＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ番号：３に、コードされた蛋白質はＳＥＱ  ＩＤ番号：４に示されている）。ＰＣＲに使用したサイクル条件は：マスターサイクラーグラジエントサークルサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって、９４℃で２分間の後に、９４℃で１分；５５℃で１分；及び７２℃で１分が３５サイクル続き、最後の延長部分が７２℃で１０分続いた。ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、上記のように製造者の勧告に従い、新しいＰＣＲ産物をｐＣＲ  Ｔ７／ＣＴ−ＴＯＰＯ発現ベクター内に直接クローン化した。クローン化した産物を、ＴＯＰ１０Ｆ’  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて形質転換した。形質転換反応を、氷上で（３０分）培養し、４２℃で３０秒間ヒートショックした。２５０μｌのＳＯＣ培地を添加した後、各形質転換反応を、３７℃で１時間、２００ｒｐｍでＥｎｖｉｒｏｎ  Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  ｓｈａｋｅｒ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｄｕｂｕｑｕｅ，Ｉｏｗａ）内に配置した。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンで補い、一晩中３７℃で培養して予め温めておいた選択ＬＢプレート（１．０％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１．０％ＮａＣｌ、１．５％アガロース、ｐＨ７．０）上に、各形質転換の一定分量（５０μｌ）を広げた。次に、各形質転換から細菌のコロニーを１つ選択し、追加の１６時間、３７度のシェーキングインキュベーターにおいて、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を有するＬＢ培地内に接種した。細胞を回収し、ミニプレップ法（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｃｏｌｕｍｎｓ；Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により、製造者の指示に従い、ＤＮＡを精製した。プラスミドＤＮＡ調製において挿入されたＦＡＡの存在又は非存在を確証するために、上記と同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｒｅ−ＰＣＲを行った。陽性のクローンを、アリゾナ大学ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆａｃｉｌｉｔｙで選択及び配列決定した（ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）ターミネーター化学を利用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３Ａ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡシーケンサー）。臭化エチジウム（ＥｔＢｒ；５μｇ／ｍＬ）を含有するＴＢＥバッファー（９０ｍＭトリス、９０ｍＭホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）において、アガロースゲル（２％ｗｔ／ｖｏｌ）電気泳動により、ＰＣＲ産物を分析し、紫外線照明により視覚化した。ゲルを、水平ゲル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）において、７５Ｖで２０分電気泳動にかけた後、完了するまで１００Ｖで続けた。１００ｂｐＰＣＲ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ（ＥＺ  Ｌｏａｄ  １００ｂｐ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｕｌｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）が、標準品として役立った。Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅ（商標）ソフトウエア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）に連結したＣＣＤカメラ及び紫外線ボックスを用いて、ゲル画像を分析並びに捕獲した。ヌクレオチド配列の分析及び比較を、ＧＣＧソフトウエア（Ｖｅｒｓｉｏｎ１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、及び、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｓｕｐｅｒ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からオンラインで入手可能なＴｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２ソフトウエアを用いて行った。
３．       
ｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡの形質転換及び発現：
ｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡのコンストラクト（１０ｎｇ）を、ＯｎｅＳｈｏｔＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内に、製造者の指示に従い個々に形質転換した。その細胞を、ＤＮＡと混合し、３０分間氷上で培養して、さらに、４２℃で３０秒間ヒートショックした。培地（２５０μｌのＳＯＣ）を添加し、シェーキングインキュベーター（Ｉｎｎｏｖａ４０００、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．社、Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）において３７℃で３０分間培養した。次に、その溶液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する１０ｍＬのＬＢ培地に添加し、細胞を、３７℃で一晩揺り動かしながら増殖した。ＤＮＡを使わず（空のベクターで）形質転換したＯｎｅＳｈｏｔＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は、蛋白質発現の研究における負の対照として役立った。一晩培養したものを、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する５００ｍＬから１ＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１．０％ＮａＣｌ）に接種し、約０．６のＯ．Ｄ．に達するまで（〜２、３時間）増殖した。ｒＦＡＡ又はｒＴＩＭＰ−２の発現を誘発するために、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）を０．５ｍＭという最終濃度で添加し、追加の４時間３７℃で揺り動かしながら培養物を増殖した。細胞を、遠心分離（３，０００ｘｇを４℃で２０分間）により回収し、精製するまで−２０℃で保管した。
【００４３】
最適な蛋白質発現の時間経過を決定するため、及び、組換え蛋白質が、封入体の形状で、不溶性の物質として、又は、可溶性の蛋白質として発現したかどうかを決定するために、予備実験を行った。ＩＰＴＧを用いた誘発の０、２、及び４時間後に、０．５ｍＬ液体培養物からの細菌細胞ペレットを回収し、０．５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  ＫＰＯ４、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．８）内に抽出した。試料を３回、溶解バッファーにおいて再懸濁し、ドライアイス上で凍結して、４２℃で解凍した。不溶性の蛋白質を、１３，０００ｘｇを１分間という遠心分離によりペレット状にし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９７０）を、１２％ポリアクリルアミドゲルを有する可溶性画分及び不溶性画分上で行った。着色分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＰｌｕｓブランドのＤｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を１つのレーンに加えた。平行ゲルを電気泳動にかけ、そのうちの１つをクーマシーブルー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０）で染色して、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、３％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を有するリン酸緩衝食塩水において１：５０００で希釈した）抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）ＨＲＰ接合抗体で探索したニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ（０．２μｍ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に残りのゲルの蛋白質を移した。両方の組換え蛋白質の検出は、発現した蛋白質のＣ末端上に組み込まれたＣ末端ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６タグ）の存在に基づいた。（ＳＥＱ  ＩＤ番号：１１及び１２を参照）。抗体を用いた培養の前に、ブロットした膜をＰＢＳ−Ｔ＋５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）において遮断した。膜をＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡにおいて３回すすぎ、ブロットをＨＲＰ基質（ＴＭＢ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）における培養により展開した。
４．       
ｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡの精製
ｒＴＩＭＰ−２又はｒＦＡＡ発現培養物から回収した細菌細胞ペレットを、培養物（１２．５倍の濃縮抽出物）１Ｌあたり８０ｍＬの変性抽出バッファー（８Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に溶解し、上記のように細胞の完全な破壊を確実にするために、凍結融解サイクルに３回かけた。抽出物を１３，０００ｘｇの遠心分離により浄化し、組換え蛋白質をＢＤ  Ｔａｌｏｎブランドの固定化金属アフィニティクロマトグラフィー樹脂（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、製造者の指示に従い精製した。浄化した抽出物を平衡化したＴａｌｏｎ樹脂（１ｍＬの樹脂あたり８ｍＬの濃縮抽出物）と２０分間混合し、吸着していない物質を遠心分離により除去して、さらに、その樹脂を変性抽出バッファーで２回洗浄した。組換え蛋白質を、２５０ｍＭのイミダゾールを抽出バッファーに添加することにより樹脂から溶出した。一定分量を電気泳動のために採取した後、３総容積を回収及び貯蔵した。組換え蛋白質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、蛋白質の同一性を、本明細書に記載の抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット法により検証した。
５．       
復元
（ａ）ｒＴＩＭＰ−２：
精製したｒＴＩＭＰ−２を複数ステップの透析法により復元した。ｒＴＩＭＰ−２再折りたたみのために、最初の再折りたたみ中の二硫化物の架橋結合を防ぐための還元剤の存在下で、溶出した画分を貯蔵及び透析した（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析管、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。還元剤を透析により除去し、チオール酸化還元試薬を添加して、正しい二硫化物の結合形成を触媒し、Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により説明された手順の修正を用いて非生産的な二流化物の中間体の形成を抑制した。最初の透析は５０倍の容積の変性還元バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、６Ｍ尿素、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｂ−ＭＥ）、ｐＨ  ８．５）において、２５℃で４時間行った。バッファーを新しい変性還元バッファーと交換し、透析を２５℃で４時間続けた。次に、透析バッファーを非変性還元バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ  β−ＭＥ、ｐＨ８．５）に変え、透析を４℃で少なくとも４時間行った。今度は、バッファーを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５と交換し、透析を４℃で少なくとも４時間続けた。次に、蛋白質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＧＳＨ（還元型グルタチオン）、０．２ｍＭ  ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）、ｐＨ８．５を含有する、２５倍の容積の冷却した酸化還元再折りたたみバッファーに対して、４℃で一晩透析した。誤って折り畳まれた蛋白質の不溶性凝集物を遠心分離により除去し、浄化した。再び折り畳まれた蛋白質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４に対して４℃で３時間透析した。可溶性蛋白質を限外濾過（ＩＣＯＮ濃縮機、９ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ社）により濃縮し、蛋白質アッセイ（ＢＣＡ  ａｓｓｅｙ、Ｐｉｅｒｃｅ社）により定量化した。吸光度をＢｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で決定し、最後の透析バッファーにおいて調製したＢＳＡ基準を用いた非線形回帰多点検量線により濃度を算出した。蛋白質試料は分注し、−２０℃で保存した。
（ｂ）ｒＦＡＡ：
第１に５０ｍＭ  ＮａＰｏ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、０．２ＭＬのアルギニン、ｐＨ８．０を含有する、５０倍の容積のバッファーに対して、複数ステップの透析法により、精製したｒＦＡＡを徐々に復元した。４時間後、透析バッファーを、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４Ｍ尿素、０．２ＭＬアルギニン、ｐＨ８．０を含有するバッファーと交換し、４時間後、５０ｍＭ  ＮａＰｏ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、０．１ＭＬのアルギニン、ｐＨ８．０に対する透析が一晩続いた。透析の後、誤って折り畳まれた蛋白質の不溶性凝集物を遠心分離により除去した。可溶性蛋白質を限外濾過により濃縮し、上記のように蛋白質アッセイにより定量化した。
６．       
ヘパリン誘起受精能獲得
精製した組換え蛋白質を、受精能を獲得する条件下で培養した精液試料に添加し、ｒＴＩＭＰ−２及び／又はｒＦＡＡが、ヘパリンによる受精能獲得に続く先体反応を増強したかどうかを決定した。凍結保存した精液を、３７℃の水浴において１５秒解凍し、１ｍＬのＴＡＬＰ（タイロード、アルブミン、ラクテート、ピルベート）培地（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３．１ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２１．６ｍＭ乳酸Ｎａ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭピルピン酸塩、６ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、ｐＨ７．４）において３回洗浄した。４匹の雄ウシ由来の洗浄した精子を、ヘパリン（１０μｇ／ｍＬ；ブタの腸粘膜由来のナトリウム塩；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗａｕｎａｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の存在下で、増加する濃度の精製したｒＴＩＭＰ−２又はｒＦＡＡ（ＴＡＬＰ培地において０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００又は２００μｇ／ｍＬ）と共に、３８℃にて４時間培養し、以前に記載されているように（パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）等、１９８８）、受精能獲得を誘発した。組換え体の受精能獲得に対する相加効果又は相乗効果を検査するために、両方の組換え蛋白質を、クロスオーバー用量反応実験において０、２５、又は５０μｇ／ｍＬという濃度で添加した。空のベクターで形質転換した細胞由来の細菌細胞ライセート（２００μｇ／ｍＬ）は、負の対照として役立った。
【００４４】
予め受精能を獲得した精子に先体反応を誘発するために、４時間の培養の後、１００μｇ／ｍＬの膜融合剤リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を添加した。自発的な先体反応の発生率を決定するために、各用量反応アッセイにおける１つの試料を、ＬＰＣを添加することなくヘパリンのみで４時間培養した。ＬＰＣ処理に続いて、精子を遠心分離し、ペレットをＰＢＳにおいて再懸濁して、精子を遠心分離により再びペレット状にした。すぐに精子を冷たいエタノールにおいて２０分間固定し、ＰＢＳ内ですすぎ、さらに、予め温めておいたスライド（Ｅｓｃｏ  ｆｌｕｏｒｏ  ｓｌｉｄｅｓ、Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）上で空気乾燥した。先体の内容物を染色するために、精子を５μｇ／ｍＬのフルオレセインが結合したＰＳＡ（ＦＩＴＣ−ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に暗闇の中４℃にて３０分間培養した。スライドを２回蒸留したＨ２Ｏですすぎ、ベクタシールド封入剤を添加して、カバーガラスを当て、さらに、マニキュア液で封をした。ノマルスキーオプティクスを装備したＬｅｉｃａ（Ｌｅｉｔｚ  Ｄｉａｐｌａｎ）落射蛍光顕微鏡を４００Ｘという倍率で用いて、スライドの先体反応を検査した。完全な先体を有する未反応の精子を、精子の先体帽に蛍光染色を有する細胞として観察した一方で、先体反応した精子を、水平方向に延びたバンド形成、又は、頭部に蛍光のない蛍光染色パターンにより示した。
７．       
膜安定性
２５匹の雄ウシから新たに射精されたそのままの精液を、ｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡ（各２５μｇ／ｍＬ）（上記の先体反応の用量反応研究に基づく用量）で、又は、誘発されていない細胞ライセート（負の対照）で３８℃にて２０分間補った。２５匹の雄ウシのサブセットから反復された射精を分析したので、全６５回の射精を評価した。乳用種も肉用種も、データセットに示した。精液をワンステップトリス卵黄クエン酸伸長剤において希釈し、水ジャケットにおいて５℃まで冷却し；ストローを包装して、静止蒸気（ｓｔａｔｉｃ  ｖａｐｏｒ）において液体窒素タンク内のラック上で凍結した（６０ストロー／ラック）。精液を、１つのストローあたり全１０、２０、又は２５×１０６精子で包装した。ストローを解凍し、精子を３８℃で３時間培養した。次に、運動性の精子の数、及び、先体膜を失った精子の数を、ノマルスキーオプティクスを装備したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡上で決定した。
【００４５】
３匹の雄ウシ由来の性別により分けられた精子を、上記のように、ｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡ（各０又は２５μｇ／ｍＬ）で補い、凍結保存して、解凍し、さらに、３時間培養した。記述したように、運動性（％）及び完全な先体（％）を記録した。
８．       
受精能試験
人工授精に使用される精液へのｒＴＩＭＰ−２及びｒＦＡＡの添加が受精能を改善するかどうかを決定するために、分割した精液を受精能試験に利用した。新たな精液を等しく分け、半分をｒＴＩＭＰ−２＋ｒＦＡＡ（各２５μｇ／ｍＬ）で強化し、さらに、試料の残りは、負の対照として役立たせるために処理しなかった。
【００４６】
精液を、一定濃度の精子（標準技法を用いて、２０×１０６精子／ストロー）にてバッチで凍結保存した。品質管理の基準により、試験に使用した精子が、解凍後≧５０％運動性を実証したことが確証された。５匹のホルスタイン雄ウシが、精液ドナーとして働いた。受精能に対する処理効果を検知するための十分な検定力を生じるために、２つの場所で、少なくとも３００回の授精を１匹の雄ウシの処理あたり設けた（全１２００回の授精）。受精能は、授精約４５〜６０日後の獣医師群によって行われる直腸の触診による妊娠診断に基づき計算される。受精能において統計学的に有意な増加が予想される。
【００４７】
追加の受精能試験が、同じ組換え物質を用いて行われる。しかし、この第２の受精能試験において、強化されることになる試料は、そのままの精液の代わりに性別により分けられた精子を含むであろう。Ｘ染色体を含んだ精子及びＹ染色体を含んだ精子の分離に続き、組換え蛋白質が上記の型式で試料に添加され、１つのストローあたり種々の濃度の精子で精液が凍結保存される。
９．       
統計的分析
Ｅｘｃｅｌ及びＳＡＳ／ＳＴＡＴソフトウエアを用いてデータ分析を行った。対照及び組換え体で処理された精子の完全な先体膜を有する精子の割合（ＰＩＡ）又は運動性における差を、対になった２標本のＴ検定を用いて分析した。受精能獲得処理間にある差を、ＡＮＯＶＡ及びＦｉｓｈｅｒ‘ｓＬＳＤテストにより分析した。全てのデータにおいて、最小二乗平均値を計算した。有意水準をｐ＜０．０５で設定した。計画にそって行われた受精能試験から生じる受精能のカテゴリカルデータ（成功した授精ｖｓ失敗した授精）が、ＳＡＳにおいてＣＡＴＭＯＤ手順を用いて分析され、処理群にわたる等しくない数の授精における有害な効果を最小限にする。主効果は、雄、処理、精子濃度、バッチ（射精）、及び全ての相互作用を含む。
【００４８】
本出願は、２００６年１月１９日に出願した米国仮特許出願第６０／７６０，３１２号に基づく優先権を主張するものであり、全内容を本出願に援用する。
【参考文献】
【００４９】
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４．  Ｂａｕｍｇａｒｔ，  Ｅ．，  Ｓ．Ｖ．  Ｌｅｎｋ，  Ｓ．Ａ．  Ｌｏｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｊｕｎｇ．  Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  １  ａｎｄ  ２  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｎｄｒｏｌ．，  ２００２；  ２５（６）：３６９−３７１．
５．  Ｂｅｌｌｉｎ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｈ．Ｅ．  Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒａｎｇｅ  ｂｅｅｆ  ｂｕｌｌｓ  ｇｒｏｕｐｅｄ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ．  Ｊ．  Ａｎｉｍ．  ＳｃＬ，  １９９４；  ７２：２４４１−２４４８．
６．  Ｂｅｌｌｉｎ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｈ．Ｅ．  Ｈａｗｋｉｎｓ，  Ｊ．Ｎ．  Ｏｙａｒｚｏ，  ＲＪ．  Ｖａｎｄｅｒｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｕｌｌｓ．  Ｊ．  Ａｎｉｍ．  ＳｃＬ，  １９９６；  ７４：１７３−１８２．
７．  Ｂｅｌｌｉｎ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｊ．Ｎ．  Ｏｙａｒｚｏ，  Ｈ．Ｅ．  Ｈａｗｋｉｎｓ，  Ｈ．Ｍ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｒ．Ｇ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．  Ｆｏｒｒｅｓｔ，  Ｌ．Ｒ．  Ｓｐｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｂｕｌｌ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．  Ｊ．  Ａｎｉｍ．  ＳｃＬ，  １９９８；  ７６：２０３２−２０３９．
８．  Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｈ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｇ．  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｂｒｕｎａｋ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ＳｉｇｎａｌＰ３．０．  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００４；  ３４０：７８３−７９５．
９．  Ｂｌｏｍ，  Ｎ．，  Ｓ．  Ｇａｍｍｅｌｔｏｆｔ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｂｒｕｎａｋ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ．  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９９；  ２９４：１３５１−１３６２．
１０．  Ｂｏｏｎｅ，  Ｔ．Ｃ．，  ＭＪ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｙ．Ａ．  ＤｅＣｌｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｋ．Ｅ．  Ｌａｎｇｌｅｙ．  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＬ，  １９９０；  ８７：２８００−２８０４．
１１．  Ｂｒｅｗ，  Ｋ．，  Ｄ．  Ｄｉｎａｋａｒｐａｎｄｉａｎ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｎａｇａｓｅ．  Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ２０００；  １４７７：２６７−２８３．
１２．  Ｂｕｃｈｍａｎ−Ｓｈａｋｅｄ，  Ｏ．，  Ｚ．  Ｋｒａｉｅｍ，  Ｙ．  Ｇｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｇｏｌｄｍａｎ．  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ．  Ｊ．  Ａｎｄｒｏｌ．，  ２００２；  ２３（５）：７０２−７０８．  
１３．  Ｃａｌｖｅｔｅ，  ＪＪ．，  Ｐ．Ｆ．  Ｖａｒｅｌａ，  Ｌ．  Ｓａｎｚ，  Ａ．  Ｒｏｍｅｒｏ，  Ｋ．  Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｔｏｐｆｅｒ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ．  Ａ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．，  １９９６；  ８：４８−５６．
１４．  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｇ．Ｒ．，  Ｍ．Ｅ．  Ｂｅｌｌｉｎ，  Ｊ．Ｎ．  Ｏｙａｒｚｏ，  Ｈ．Ｅ．  Ｈａｗｋｉｎｓ，  ＭＪ．  Ａｒｎｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＴＩＭＰ−２  ｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒａｎｇｅ  ｂｅｅｆ  ｂｕｌｌｓ．  ２７ｔｈ  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ａｎｄｒｏｌ．  Ｍｔｎｇ．，  ２００２；  Ｓｅａｔｔｌｅ，  ＷＡ  （Ａｂｓｔｒ．  １２１）．
１５．  ＤｅＣｌｅｒｃｋ，  Ｙ．Ａ．，  Ｔ．Ｄ．  Ｙｅａｎ，  ＢＪ．  Ｒａｔｚｋｉｎ，  Ｈ．Ｓ．  Ｌｕ  ａｎｄ  Ｋ．Ｅ．  Ｌａｎｇｌｅｙ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｕｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｂｏｖｉｎｅ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８９；  ２６４：１７４４５−１７４５３．
１６．  Ｈｕｌｂｏｙ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｌ．Ａ．  Ｒｕｄｏｌｐｈ  ａｎｄ  Ｌ．Ｍ．  Ｍａｔｒｉｓｉａｎ．  Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｓ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  ＭｏＩ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．，  １９９７；  ３（ｌ）：２７−４５．
１７．  Ｋｉｓｈｉ，  Ｋ．５  Ｔ．  Ｙａｓｕｄａ，  Ｓ．  Ａｗａｚｕ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍｉｚｕｔａ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９８９；  ８１：２９５−２９７．
１８．  Ｌｅｎｚ，  Ｒ．  Ｗ．，  Ｊ．Ｌ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍ．Ｅ．  Ｂｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｂｕｌｌｓ  ｂｙ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ａｃｒｏｓｏｍｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｐｅｒｍ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ．  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  ＳｃＬ，  １９８８；  ７１：１０７３−１０７７．
１９．  ＭｃＣａｕｌｅｙ，  Ｔ．Ｃ．，  Ｈ．Ｍ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．Ｅ．  Ｂｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ−  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  （ＦＡＡ）  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ．  ＭｏＩ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．，  １９９９；  ５４：１４５−１５３．
２０．  ＭｃＣａｕｌｅｙ，  Ｔ．Ｃ．，  Ｈ．Ｍ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．Ｅ．  Ｂｅｌｌｉｎ，  ａｎｄ  ＲＸ．  Ａｘ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｈｅｐａｒｉｎ−  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ−２．  ＭｏＩ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．，  ２００１；  ５８：３３６−３４１．
２１．  ＭｃＣａｕｌｅｙ，  Ｔ．Ｃ．，  Ｇ．Ｒ．  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｊ．Ｎ．  Ｏｙａｒｚｏ，  Ｊ．  ＭｃＶｉｃｋｅｒ，  Ｓ．Ｈ．Ｆ．  Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  ＲＸ．  Ａｘ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ  ａ  ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｏｒ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｂｕｌｌｓ．  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２００４；  １０：３５−４０．
２２．  Ｍｅｔａｙｅｒ，  Ｓ．，  Ｆ．  Ｄａｃｈｅｕｘ，  ＪＸ．  Ｄａｃｈｅｕｘ  ａｎｄ  ＪＸ．  Ｇａｔｔｉ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ  ｆｌｕｉｄｓ  ｏｆ  ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｒｅ  ｍａｊｏｒ  ｆｌｕｉｄ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅｓ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ２００２；  ６６（５）：１２１９−１２２９．
２３．  Ｎａｇａｓｅ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．  Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，  Ｊｒ．  Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９９；  ２７４：２１４９１−２１４９４．
２４．  Ｐａｒｒｉｓｈ，  ＪＪ．，  ＪＸ．  Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ，  Ｍ．  Ａ．  Ｗｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＮＸ．  Ｆｉｒｓｔ．  Ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｅｒｍ  ｂｙ  ｈｅｐａｒｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  １９８８；  ３８：１１７１−１１８０．  
２５．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ａ．Ｍ．，  Ｄ．  Ｒｏｄｉｎ，  Ｈ．  Ｎｏｍｕｒａ，  ＣＣ．  Ｍｏｒｔｏｎ，  Ｓ．  Ｗｅｒｅｍｏｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １９９７；  ４２：５０７−５１３．
２６．  ＳＡＳ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  １９９９．  ＳＡＳ  Ｉｎｓｔ．，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ．
２７．  Ｓｈｉｍｏｋａｗａ，  Ｋ，  Ｍ．  Ｋａｔａｙａｍａ，  Ｙ．  Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｈ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｉ．  Ｈａｒａ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓａｔｏ．  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．  Ｊ．  ＡｎｄｒｏＬ，  ２００３；  ２４（ｌ）：７３−７７．
２８．  Ｓｉｕ，  Ｍ．Ｋ．  ａｎｄ  ＣＹ．  Ｃｈｅｎｇ．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｅｔａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ／ｌａｍｉｎｉｎ  ｇａｍｍａ３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｃｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｔｅｓｔｉｓ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ２００４；  ７０（４）：９４５−９６４．
２９．  Ｓｐｒｏｔｔ，  Ｌ．Ｒ．，  Ｍ．Ｄ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｄ．Ｗ．  Ｆｏｒｒｅｓｔ，  Ｊ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｈ．Ｍ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．Ｎ．  Ｏｙａｒｚｏ，  Ｍ．Ｅ．  Ｂｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｂｅｅｆ  ｆｅｍａｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｅｒｍ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．，  ２０００；  ７８：７９５−７９８．
３０．  Ｓｐｒｏｔｔ，  Ｌ．Ｒ．，  Ｄ．Ｗ．  Ｆｏｒｒｅｓｔ，  Ｊ．  Ｇａｌｌｉｎｏ，  Ａ．  Ｎｏｖａｓｏｄ，  Ｇ．  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｔ．  Ｃ．  ＭｃＣａｕｌｅｙ，  Ｊ．  ＭｃＶｉｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ａｘ．  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｕｂｅｒｔａｌ  ｂｅｅｆ  ｂｕｌｌｓ−  Ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｐｒｏｆ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．，  ２００６；  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ．
３１．  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｅ．  Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，  Ａ．  Ｂａｉｒｏｃｈ，  Ｊ．−Ｃ  Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｋ．Ｌ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｒ．Ｄ．  Ａｐｐｅｌ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｆ．  Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｓｅｒｖｅｒ  Ｉｎ：  ２−Ｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （１９９８）．  Ｅｄｉｔｏｒ  Ａ．Ｊ．  Ｌｉｎｋ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ．
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】組換えＦＡＡ（ｒＦＡＡ）誘発の時間経過。本明細書に記述されているように、細菌培養をＩＰＴＧで誘発した。１ｍＬの試料を、誘発蛋白質発現に相対して０、２、及び４時間で回収した。非変性（５０ｍＭ  ＫＰＯ４、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．８）溶解バッファーで調製した抽出物（図１Ａ、可溶性）、又は、変性８Ｍ尿素バッファーで調製した抽出物（図１Ｂ、不溶性）を、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により別々に分析した。各時点で誘発された（「ｉ」）及び誘発されていない（「ｕｉ」）画分が示されている。ｒＦＡＡは、不溶性画分において、誘発された試料由来の優勢な蛋白質として発生した（図１Ｂ、レーン「４ｈｉ」）。Ｍ＝分子量マーカー。
【図１Ｂ】図１Ａと同じである。
【図２Ａ】ｒＦＡＡの発現及び検出。Ｓｏｌ＝非変性溶解バッファーで抽出した可溶性のライセート；Ｉｎｓｏｌ＝Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーにおいて溶解した不溶性の封入体；ＵＩ＝誘発されていない対照ライセート；Ｉ＝誘発された（０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ）ライセート。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。図２Ｂは、ウエスタンブロットを示している。ウエスタンブロットを、抗Ｈｉｓ（６ｘ）抗体結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：５０００の希釈度）を用いて行った。抗体により、ｒＦＡＡを適切な分子量で特異的に認識し、非常に誘発性のｒＦＡＡ発現を検証した。Ｍ＝分子量マーカー。
【図２Ｂ】図２Ａと同じである。
【図３】ｒＦＡＡの精製。２５ｍＬの液体培養由来の細菌細胞のペレットを、４ｍＬの変性バッファー（８Ｍ尿素）で溶解し（Ｓ＝出発物質）、１ｍＬ（０．５ｍＬ総容積）のＢＤ  Ｔａｌｏｎブランドの金属アフィニティ樹脂と２０分間混合した。非結合の（ＵＢ）物質を回収し、樹脂を５ｍＬ（１０倍の総容積）のバッファーで１０分間洗浄し（Ｗ１）、洗浄を繰り返して（Ｗ２）、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する０．５ｍＬ（１倍の総容積）の変性バッファーでｒＦＡＡを溶出した（Ｅ１〜５）。高度に精製した組換えＦＡＡは、溶出した画分において、単一のバンドとして可視である。Ｍ＝分子量マーカー。
【図４】アフィニティ精製され、再び折り畳まれたｒＦＡＡ。詳細な説明において記述されているように、精製したｒＦＡＡを透析及び再び折り畳んだ。Ｍ＝分子量マーカー；ｒＦＡＡ＝最終の精製された産物。
【図５】ｒＴＩＭＰ−２誘発の時間経過。詳細な説明に記述されているように、細菌培養をＩＰＴＧで誘発した。１ｍＬの試料を、誘発蛋白質発現に相対して２及び４時間で回収した。抽出物を、変性８Ｍ尿素バッファーで調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。各時点で誘発されていない（「ｕｉ」）及び誘発された（「ｉ」）画分が示されている。誘発性のｒＴＩＭＰ−２を、２及び４ｈ（ｉ）において２及び４ｈ（ｕｉ）と比較して明白に検出した。Ｍ＝分子量マーカー。
【図６Ａ】ｒＴＩＭＰ−２の発現及び検出。誘発された（０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ）ライセートを、発現培養の２時間後に調製した。可溶性及び不溶性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ａ）及びウエスタンブロット法（図６Ｂ）により分析した。図６Ａは、クーマシーブルーで染色されたゲルを示し、図６Ｂは、抗Ｈｉｓ（６ｘ）抗体結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：５０００の希釈度）で行ったウエスタンブロットを示している。Ｓｏｌ＝可溶性のライセート；Ｉｎｓｏｌ＝不溶性の封入体。Ｍ＝分子量マーカー。（図６Ａ及び６Ｂにおいて矢印により示された）ｒＴＩＭＰ−２を、不溶性画分においてクーマシーブルー染色により容易に検出した。ウエスタンブロット法の感度が、可溶性画分においてｒＴＩＭＰ−２を検出した一方で、はるかに強いｒＴＩＭＰ−２のバンドが不溶性画分において存在し、クーマシーブルー染色により検出した差を反映した。
【図６Ｂ】図６Ａと同じである。
【図７Ａ】２時間の発現培養からのｒＴＩＭＰ−２の精製。細菌細胞のペレットを、変性バッファーで溶解し（Ｓ＝出発物質）、ＢＤ  Ｔａｌｏｎブランドの金属アフィニティ樹脂と２０分間混合した。非結合の（ＵＢ）物質を回収し、樹脂をバッファーで洗浄し（Ｗ１、Ｗ２）、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する０．５ｍＬ（１倍の総容積）の変性バッファーでｒＴＩＭＰ−２を溶出した（Ｅ１、Ｅ２）。Ｍ＝分子量マーカー。精製した物質の純度を実証するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７Ａ；クーマシーブルー染色）及びウエスタンブロット法（図７Ｂ；抗Ｈｉｓ６）を行った。
【図７Ｂ】図７Ａと同じである。
【図８】アフィニティ精製され、再び折り畳まれたｒＴＩＭＰ−２。詳細な説明において記述されているように、精製したｒＴＩＭＰ−２を透析及び再び折り畳んだ。Ｍ＝分子量マーカー；１及び２＝２種類の異なるバッチの調製物の再折りたたみ後のｒＴＩＭＰ−２の産物。
【図９】組換えＦＡＡにより増強した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるウシ精子のヘパリン誘起受精能獲得。データを、群間における分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析した。最小二乗平均値及び平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が示されている。実験は４回繰り返した。共通の文字による指示がない値は有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図１０】組換えＴＩＭＰ−２により増強した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるウシ精子のヘパリン誘起受精能獲得。データを、ＡＮＯＶＡにより分析した。最小二乗平均値及びＳＥＭが示されている。実験は４回繰り返した。共通の文字による指示がない値は有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図１１】先体反応に対するｒＦＡＡとｒＴＩＭＰ−２との併用効果。処理間に有意な相互関係はなかった。ｒＴＩＭＰ−２の用量内で、異なる文字による指示は、有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図１２】併用したｒＦＡＡとｒＴＩＭＰ−２は、凍結保存に、特により低い精子濃度（１０×１０６精子／ストロー）でかけた雄ウシ精子の先体完全性（完全な先体のパーセント、ＰＩＡ、■）及び運動性のパーセント（−−◆−−）を改善する。
【図１３】ｒＦＡＡは精子の膜に結合する。新たに回収したそのままの雄ウシ精液を、２５μｇ／ｍｌの空のベクターで（レーン１及び３）、又は、２５μｇ／ｍｌのｒＦＡＡで（レーン２及び４）補い、工業的な凍結保存の前に２０分間培養した。精液を解凍し、精子細胞を３回洗浄し、さらに、抗Ｈｉｓ６ｘ抗体を用いたウエスタンブロット法により細胞ライセートを評価した。ｒＦＡＡで補った試料において単一のバンドを検出し、組換え蛋白質をそのままの精液に直接添加することは、精子細胞により取り込まれるのに十分であることを示した。ｒＴＩＭＰ−２を用いて類似の結果を観察した（データは示されていない）。
【００５１】
（配列表）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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