(57)【要約】発現を増強されたＧＰＲ２２核酸、ならびにコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸を産生する方法が提供される。これらの方法を実行する場合は、核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチド（例えば、野生型核酸）ＧＰＲ２２アミノ酸配列のコード領域の種々のコドンを同定し、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドのアミノ酸配列を変更せずに発現を増強するようにヌクレオチドを置換することにより、核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチド（例えば、野生型核酸）が発現を増強される。ＧＰＲ２２の調節剤を選別するために、方法、組成物および同じ方法、組成物を用いたキットも提供される。
2009511063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を真核宿主細胞において増強するために哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードしている第１核酸を改変する方法であって、前記方法は、
（ａ）標的ヌクレオチドを含む前記第１核酸の前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体コード領域におけるコドンを同定するステップであって、前記標的ヌクレオチドは前記コドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはチミンにより置換されうるアデニンであり、あるいは前記標的ヌクレオチドはコドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換されうるチミンであるステップと、
（ｂ）前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性の核酸を産生するために、アデニンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはチミンにより、またはチミンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換するステップとを含み、
前記置換された非内因性核酸の前記産生は前記真核宿主細胞における前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強し、前記増強された発現とは前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記第１核酸または野生型核酸との比較した上でのものである方法。
【請求項２】
アデニンである前記標的ヌクレオチド、チミンである前記標的ヌクレオチド、アデニンまたはチミンである前記標的ヌクレオチドが、グアニンまたはシトシンで置換される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＧＰＲ２２  Ｃ４２５アミノ酸配列である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、配列番号２または配列番号６である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記第１核酸が、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＧＰＲ２２  Ｃ４２５核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１核酸が、配列番号１または配列番号５である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記置換された非内因性核酸が、配列番号３または配列番号７である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＧＰＲ２２  Ｃ４２５核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、配列番号１または配列番号５である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記真核宿主細胞が、哺乳類の細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核宿主細胞が、メラノフォア細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核宿主細胞が、酵母細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、同定されたコドンを含むあらゆる標的ヌクレオチドについて反復される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が、一度反復される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が、標的ヌクレオチドを含む前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域のあらゆるコドンに至るまで反復される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域におけるすべてのコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％またはそれ以上が、置換された少なくとも１つの標的ヌクレオチドを有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって標的ヌクレオチドを含む前記コード領域のコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％のアデニンまたはチミンがグアニンまたはシトシンで置換される請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性核酸コード領域のＧＣ含有量が、前記哺乳類ＧＰＲ２２アミノ酸配列をコードする前記第１核酸のコード領域と比較すると、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、またはそれ以上増加する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性核酸のコード領域のＧＣ含有量が、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ヌクレオチドが、前記コード領域内の３つ以上の連続したアデニンまたはチミンの１つである請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を真核宿主細胞において増強するように哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする第１核酸を改変する方法であって、請求項１から２５までのいずれか１つに記載の方法の前記ステップ群を含み、前記方法はさらに、
（ｃ）前記置換された非内因性核酸によりコードされた前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第１レベルを、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードする前記第１核酸または前記野生型核酸によりコードされた前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第２レベルと前記真核宿主細胞において比較するステップを含み、
前記第１核酸の前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルまたは前記野生型核酸の前記哺乳類受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルよりも、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第１レベルが大きければ、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記真核宿主細胞において前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強することを示す方法。
【請求項２７】
前記比較が、受容体の機能性のレベルを測定することを含むプロセスによる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロセスが、第２メッセンジャーのレベルの測定を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロセスが、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロセスが、細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロセスが、細胞内ＩＰ３の蓄積の増加の測定を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加が、前記野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加が、前記野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％であれば、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示す請求項３０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
前記プロセスが、Ｇｑ（ｄｅｌ）/ＧｉキメラＧタンパク質を含む細胞における細胞内ＩＰ３蓄積の測定を含む請求項３０〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
前記プロセスが、細胞内のＣａ２＋レベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロセスが、細胞内のｃＡＭＰのレベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロセスが、細胞内のｃＡＭＰ蓄積の低減の測定を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の前記低下が、前記野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の前記低下の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、または少なくとも約５．０倍である請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下が、前記野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、または少なくとも約５．０倍であれば、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示す請求項３６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
前記プロセスが、信号エンハンサーを含む細胞における細胞内ｃＡＭＰ蓄積の測定を含む請求項３６〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
前記比較が、定常状態ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記比較が、定常状態ＧＰＲ２２受容体ｍＲＮＡの発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体をコードする置換された非内因性核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記置換された非内因性核酸が請求項１〜４２のいずれか１つに記載の方法により産生される単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項４３または４４に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４６】
前記ベクターが発現ベクターであり、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項４５に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４６に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４９】
組換え宿主細胞を産生する方法であって、
（ａ）請求項４６に記載の発現ベクターを真核宿主細胞内にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされた宿主細胞を産生するステップ、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を発現するのに十分な条件下で、前記トランスフェクトされた宿主細胞を培養するステップ、
を含む方法。
【請求項５０】
前記宿主細胞が哺乳類の細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞がメラノフォア細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞が酵母細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項４９〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５４】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤として候補化合物を同定する方法であって、前記方法は
（ａ）前記候補化合物を、請求項４９〜５３のいずれか１つの方法によって産生された組換え宿主細胞またはＧタンパク質に連結した前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む該細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体の機能性を阻害または刺激する能力を判断するステップ、
を含み、
前記候補化合物が前記機能性を阻害または刺激する能力があればこれは、前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤であることを示す方法。
【請求項５５】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｉである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｑ（ｄｅｌ）／ＧｉキメラＧタンパク質である請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記判断が第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記判断が、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記プロセスが細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記プロセスが細胞内Ｃａ２＋レベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記プロセスが、細胞内ｃＡＭＰのレベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６２】
前記方法が、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストの同定を含む請求項５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が、医薬品として前記アゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストを処方するステップをさらに含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニストまたは部分アゴニストを同定することを含む請求項５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６５】
前記方法が、医薬品として前記アゴニストまたは部分アゴニストを処方するステップをさらに含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記置換された非内因性核酸が、配列番号３または配列番号７である請求項５４〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６７】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドとして候補化合物を同定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記候補化合物を、請求項４９〜５３のいずれか１つに記載の方法により産生された組換え宿主細胞または前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む該細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）前記化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体に結合する能力を測定するステップを含み、
前記結合は前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドであることを示している方法。
【請求項６８】
前記方法が、医薬品として前記リガンドを処方するステップをさらに含む請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項６７または請求項６８の方法。
【請求項７０】
請求項４３に記載のポリヌクレオチドから発現されるヒトＧＰＲ２２受容体に対してトランスジェニックされた非ヒト哺乳類。
【請求項７１】
置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である、請求項７０に記載の非ヒト哺乳類。
【請求項７２】
候補化合物が哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害を予防または処置する効果を有するかどうか同定するために請求項７０または７１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類を用いる方法であって、前記方法が前記候補化合物を前記トランスジェニック非ヒト哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項７３】
候補化合物が哺乳類の心保護または神経保護の効果を有するかどうか同定するために請求項７０または７１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類を用いる方法であって、前記方法が前記候補化合物を前記トランスジェニック非ヒト哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項７４】
前記候補化合物が前記ヒトＧＰＲ２２受容体の調節剤またはリガンドである、請求項７２または７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
アメリカでは、約５００万人がうっ血性心不全（ＣＨＦ）に罹り、毎年うっ血性心不全と診断される新患は５０万人以上になる。ＣＨＦは、心拍出量を低減し、静脈圧を上げる臨床的な症候群であり、心不全の進行性悪化および早期筋細胞死を引き起こす分子異常を伴う。
【０００２】
心筋細胞死を抑制するか、または生存経路を直接活性化するようにデザインされ、臨床的に利用できる医薬品は、現在、ほとんどない。この種の医薬品があれば心筋機能を改善し、生存を推進するのに役立つと思われる。したがって、ヒトの心不全を処置および予防するための治療方法の開発は大いに期待されている。
【０００３】
ＧＰＲ２２は、心筋細胞により発現されたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であり、心臓保護において役割を果たしていることが証明されている。心筋細胞におけるＧＰＲ２２の下方制御は、虚血およびＣＨＦなどの心筋細胞アポトーシスと関連する他の心臓疾患に関連している。ＧＰＲ２２は、単一エクソンによりコードされ、Ｇｉに連結されているＧＰＲ２２と一致して恒常的に検出可能な活性を示す。
【０００４】
この種の薬剤は、心拍出量、静脈圧心筋梗塞、ＣＨＦ、虚血性心疾患、筋細胞アポトーシスなどに対して治療および予防の効果を有することができるので、ＧＰＲ２２の調節剤の同定は興味深い。この種のＧＰＲ２２調節剤を同定するためのアッセイは、一般に、細胞をベースにしたシステムで行われる。したがって、ＧＰＲ２２ポリペプチドの調節剤をスクリーニングする細胞ベースのアッセイ・システムにおいて利用し易いようにするために、十分高いレベルにおいてＧＰＲ２２ポリペプチドを発現させることは有効である。その上、ＧＰＲ２２の細胞表面上の発現を増加させることは、この種のアッセイの効率を高めることになる。
【０００５】
本発明はその目的を満たす。
【０００６】
（文献）
特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６。
【特許文献１】国際公開第２００４／０１３２８５号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，９９４，０９７号明細書
【非特許文献１】Ｏ’Ｄｏｗｄら，  Ｇｅｎｅ（１９９７）１８７：７５−８１
【非特許文献２】Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉら，  Ｇｅｎｅ（２００１）２６５：１１−２３
【非特許文献３】Ｃｅｌｌｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９７：１０１６−１０１８
【非特許文献４】Ｂｅｒｎａｌ，Ｇｅｎｅ（２００５）ＰＭＩＤ：１５９２２５１６
【非特許文献５】Ｆｕｊｉｍｏｒｉら，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００５）６（１）：２６
【非特許文献６】Ｓｅｍｏｎら，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．（２００５）１４（３）：４２１−４２７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
発現増強ＧＰＲ２２核酸、ならびにコードＧＰＲ２２ポリペプチドのコードされた発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸を産生する方法が提供される。この方法を実施するときは、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチド（例えば、野生型核酸）をコードする核酸は、ＧＰＲ２２アミノ酸配列のコード領域の種々のコドンを同定し、コードＧＰＲ２２ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく発現を増強するようにヌクレオチドを置換することにより発現が増強される。ＧＰＲ２２の調節剤を選別するために、方法、組成物、および同じ方法、組成物を用いるキットも提供される。
【０００８】
第１の態様では、本発明は、真核宿主細胞においてコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強するために哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードしている第１核酸を改変する方法に特徴があり、前記方法は、
（ａ）標的ヌクレオチドはコドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはチミンにより置換されうるアデニンであり、あるいは前記標的ヌクレオチドはコドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換されうるチミンである、前記標的ヌクレオチドを含む前記第１核酸の哺乳類ＧＰＲ２２受容体コード領域におけるコドンを同定するステップと、
（ｂ）哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性核酸を産生するために、アデニンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはチミンにより、またはチミンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換するステップとを含み、
前記置換された非内因性核酸の産生は真核宿主細胞におけるコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強し、前記増強された発現は哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている第１核酸または野生型核酸に匹敵している。
【０００９】
一部の実施形態では、アデニンである標的ヌクレオチドは、グアニンまたはシトシンにより置換される。
【００１０】
一部の実施形態では、チミンである標的ヌクレオチドは、グアニンまたはシトシンにより置換される。
【００１１】
一部の実施形態では、アデニンまたはチニンである標的ヌクレオチドは、グアニンまたはシトシンにより置換される。
【００１２】
一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列は野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である。一部の実施形態では、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列は野生型ヒトＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である。一部の実施形態では、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列は野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＧＰＲ２２  Ｃ４２５アミノ酸配列である。一部の実施形態では、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列は配列番号２または配列番号６である。
【００１３】
一部の実施形態では、第１核酸は野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体核酸である。一部の実施形態では、第１核酸は野生型ヒトＧＰＲ２２受容体核酸である。一部の実施形態では、第１核酸は野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＣ４２５核酸である。一部の実施形態では、第１核酸は配列番号１または配列番号５である。
【００１４】
一部の実施形態では、置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００１５】
一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードする野生型核酸は野生型ヒトＧＰＲ２２核酸である。一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードする野生型核酸は野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＧＰＲ２２  Ｃ４２５核酸である。一部の実施形態では、野生型核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドは配列番号１または配列番号５である。
【００１６】
一部の実施形態では、真核宿主細胞は哺乳類の細胞である。
【００１７】
一部の実施形態では、真核宿主細胞はメラノフォア細胞である。
【００１８】
一部の実施形態では、真核宿主細胞は酵母細胞である。
【００１９】
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は同定されたコドンを含むあらゆる標的ヌクレオチドについて反復される。
【００２０】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は標的ヌクレオチドを含む哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域のあらゆるコドンについて反復される。
【００２１】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域におけるすべてのコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％以上が、置換された少なくとも１つの標的ヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域におけるすべてのコドンの少なくとも約６０％は、少なくとも１つの置換された標的ヌクレオチドを有する。
【００２２】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、標的領域を含む前記コード領域のコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のアデニンまたはチミンが、グアニンまたはシトシンにより置換されている。一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、標的領域を含む前記コード領域のコドンの少なくとも約７／５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％のアデニンまたはチミンが、グアニンまたはシトシンにより置換されている。一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、標的領域を含む前記コード領域のコドンの１００％のアデニンまたはチミンが、グアニンまたはシトシンにより置換されている。
【００２３】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、置換された非内因性核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列のコード領域のＧＣ含有量は、第１核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列のコード領域に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、またはそれ以上増加する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、置換された非内因性核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列のコード領域のＧＣ含有量は、第１核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列のコード領域に比べて、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％増加する。
【００２４】
一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、置換核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列のコード領域のＧＣ含有量は、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％である。一部の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｂ）は反復されるので、置換された核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列のコード領域のＧＣ含有量は、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％である。
【００２５】
一部の実施形態では、前記標的ヌクレオチドは、前記コード領域内で３またはそれ以上の連続したアデニンまたはチミンの１つである。
【００２６】
第２の態様では、本発明は、前記第１態様に記載の複数のステップを含み、真核宿主細胞におけるコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強するために、第１核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列を改変する方法に特徴があり、前記方法は、
（ｃ）真核宿主細胞において置換された非内因性核酸によりコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第１レベルを、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている第１核酸または野生型核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第２レベルとを比較するステップを、
さらに含み、
第１核酸の哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルまたは野生型核酸の哺乳類受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルよりも大きい哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第１レベルは、置換された非内因性核酸が、真核宿主細胞においてコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強していることを示している。
【００２７】
一部の実施形態では、前記比較は受容体機能性のレベルの測定を含むプロセスによるものである。一部の実施形態では、前記プロセスは第２メッセンジャーのレベルの測定を含む。一部の実施形態では、前記プロセスは環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含む。一部の実施形態では、前記測定は細胞内Ｃａ２＋のレベルの測定を含む。一部の実施形態では、前記プロセスは細胞内ｃＡＭＰのレベルの測定を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、前記プロセスは、細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激の測定を含む。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激は、野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％である。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激は、野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激の、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％である。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激は、野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激の、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％である。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激は、野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％であることは、置換された非内因性核酸がコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示している。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激は、野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激の、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％であることは、置換された非内因性核酸がコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示している。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激は、野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加または刺激の、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％であることは、置換された非内因性核酸がコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示している。特定の実施形態では、前記プロセスは、Ｇｑ（ｄｅｌ）/ＧｉキメラＧタンパク質を含む細胞内の細胞内ＩＰ３蓄積の測定を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、前記プロセスは細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制の測定を含む。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制は、野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍である。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制は、野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制の、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍である。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制は、野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍であることは、置換された非内因性核酸がコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示している。特定の実施形態では、置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制は、野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下または抑制の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍であることは、置換された非内因性核酸がコードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示している。特定の実施形態では、前記プロセスは信号エンハンサー細胞の細胞内ｃＡＭＰの蓄積の測定を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、前記比較は定常状態のＧＰＲ２２受容体ポリペプチド発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである。
【００３１】
一部の実施形態では、前記比較は定常状態ＧＰＲ２２受容体ｍＲＮＡ発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである。
【００３２】
第３の態様では、本発明は、第１または第２の態様の方法に記載され、説明されているか、または該方法により産生された、置換された内因性の核酸を含む単離ポリヌクレオチドに特徴がある。一部の実施形態では、単離された該ポリヌクレオチドは、第１または第２の態様の方法に記載され、説明されているか、または該方法により産生された、置換された内因性の核酸を含む。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは置換された非内因性核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含み、置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００３３】
第４の態様では、本発明は第３の態様の単離ポリヌクレオチドを含むベクターに特徴がある。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、ポリヌクレオチドはプロモーターに操作可能にリンクすることができる。
【００３４】
特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、哺乳類ＧＰＲ２２受容体をコードする置換された非内因性核酸を含み、置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００３５】
第５の態様では、本発明は、前記第４の態様によるベクターを含む組換え宿主細胞に特徴がある。一部の実施形態では、このベクターは発現ベクターであり、ポリヌクレオチドはプロモーターに操作可能にリンクすることができる。
【００３６】
特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、置換された非内因性核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含み、置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００３７】
第６の態様では、本発明は
（ａ）第４の態様に記載の発現ベクターを真核宿主細胞内にトランスフェクトし、トランスフェクトされた宿主細胞を産生するステップ、および
（ｂ）発現ベクターから哺乳類ＧＰＲ２２受容体を発現するのに十分な条件下でトランスフェクトされた宿主細胞を培養するステップ、
を含む組換え宿主細胞を産生する方法に特徴がある。
【００３８】
一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳類の細胞である。
【００３９】
一部の実施形態では、宿主細胞はメラノフォア細胞である。
【００４０】
一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。
【００４１】
一部の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、哺乳類ＧＰＲ２２受容体をコードする置換された非内因性核酸を含み、置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００４２】
第７の態様では、本発明は、哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤として候補化合物を同定する方法に特徴があり、前記方法は
（ａ）候補化合物を、第６の態様に記載の組換え宿主細胞またはこの宿主細胞の膜を含むこの哺乳類ＧＰＲ２２受容体あるいは第６の態様の方法により産生された組換え宿主細胞またはＧタンパク質に連結する哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含むこの宿主細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）候補化合物が哺乳類ＧＰＲ２２受容体の機能性を抑制するか、または活性化する能力を決めるステップ、
を含み、
候補化合物が前記機能性を抑制するか、または活性化する能力は、この候補化合物が哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤であることを示している。
【００４３】
特定の実施形態では、この方法は、第６の態様による方法により組換え宿主細胞の産生をさらに含む。
【００４４】
特定の実施形態では、この方法は、第６の態様に記載の方法により産生された組換え宿主細胞の供給をさらに含む。
【００４５】
一部の実施形態では、Ｇタンパク質はＧｉである。
【００４６】
一部の実施形態では、Ｇタンパク質はＧｑ（ｄｅｌ）/ＧｉキメラＧタンパク質である。
【００４７】
一部の実施形態では、前記決定は第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである。一部の実施形態では、前記決定は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである。一部の実施形態では、前記プロセスは細胞内ＩＰ３蓄積のレベルの測定を含む。一部の実施形態では、前記プロセスは、細胞内Ｃａ２＋のレベルの測定を含む。一部の実施形態では、前記プロセスは、細胞内ｃＡＭＰのレベルの測定を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、候補化合物は小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子はポリペプチドではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子が抗体または抗体の抗原結合フラグメントではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子は脂質ではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子はポリペプチドまたは脂質ではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物はポリペプチドである。一部の実施形態では、候補化合物はポリペプチドであるが、ポリペプチドは抗体または抗体の抗原結合フラグメントではないという条件付きである。一部の実施形態では、候補化合物は脂質である。一部の実施形態では、候補化合物は、抗体または抗体の抗原結合フラグメントではない。一部の実施形態では、候補化合物は、抗体または抗体の抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、候補化合物は、哺乳類ＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドではない。
【００４９】
一部の実施形態では、候補化合物は小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、抗体または抗体の抗原結合フラグメントではない。
【００５０】
一部の実施形態では、調節剤は、アゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される。特定の実施形態では、この方法は、哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストの同定を含む。特定の実施形態では、この方法は、医薬品として前記アゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストを処方するステップをさらに含む。特定の実施形態では、この方法は、哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニスト、部分アゴニストの同定を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、置換された非内因性核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含み、この置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００５２】
第８の態様では、本発明は哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドとして候補化合物を同定する方法に特徴があり、前記方法は
（ａ）この候補化合物を、第６の態様に記載の組換え宿主細胞または宿主細胞の膜を含む哺乳類ＧＰＲ２２受容体あるいは第６の態様に記載の方法により産生された組換え宿主細胞または哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む宿主細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）哺乳類ＧＰＲ２２受容体に結合するこの化合物の能力を測定するステップ、
を含み、
前記結合は候補化合物が哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドであることを示している。
【００５３】
特定の実施形態では、この方法は、第６の態様に記載の方法による組換え宿主細胞の産生をさらに含む。
【００５４】
特定の実施形態では、この方法は、第６の態様に記載の方法により産生された組換え宿主細胞の供給をさらに含む。
【００５５】
本発明は、哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドとして候補化合物を同定する方法にも特徴があり、前記方法は
（ａ）哺乳類ＧＰＲ２２受容体の随意に標識した既知のリガンドを、第６の態様に記載の組換え宿主細胞または宿主細胞の膜を含む哺乳類ＧＰＲ２２受容体と、あるいは第６の態様に記載の方法により産生された組換え宿主細胞またはこの候補化合物が存在するか、または存在しない場合に哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む宿主細胞の膜と接触させるステップ、
（ｂ）前記既知のリガンドと哺乳類ＧＰＲ２２受容体との間の錯体を検出するステップ、および
（ｃ）候補化合物が存在しない場合よりも該化合物が存在する場合に前記錯体が少なく形成されるかどうか決定するステップ、
を含み、
前記決定はこの候補化合物が哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドであることを示している。
【００５６】
特定の実施形態では、この方法は第６の態様に記載の方法による組換え宿主細胞の産生をさらに含む。
【００５７】
特定の実施形態では、この方法は第６の態様に記載の方法により産生された組換え宿主細胞の供給をさらに含む。
【００５８】
一部の実施形態では、随意に標識した既知のリガンドは放射性標識されている。
【００５９】
一部の実施形態では、候補化合物は小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子はポリペプチドではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子は抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子は脂質ではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は、小分子はポリペプチドまたは脂質ではないという条件付きで小分子である。一部の実施形態では、候補化合物はポリペプチドである。一部の実施形態では、候補化合物は、ポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントではないという条件付きでポリペプチドである。一部の実施形態では、候補化合物は脂質である。一部の実施形態では、候補化合物は抗体またはその抗原結合フラグメントではない。一部の実施形態では、候補化合物は抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、候補化合物は哺乳類ＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドではない。
【００６０】
一部の実施形態では、候補化合物は小分子である。一部の実施形態では、候補化合物は抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【００６１】
特定の実施形態では、この方法は、医薬品として前記リガンドを処方するステップをさらに含む。
【００６２】
特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、哺乳類ＧＰＲ２２受容体をコードしている置換された非内因性核酸を含み、置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００６３】
第９の態様では、本発明は、医薬品組成物に調節剤またはリガンドを処方するステップをさらに含む第７または第８の態様に記載の方法に特徴がある。本発明は、調節剤またはリガンドを再合成するステップをさらに含む第７または第８の態様に記載の方法にも特徴がある。
【００６４】
第１０の態様では、本発明はヒトＧＰＲ２２受容体のためのヒト以外のトランスジェニック哺乳類に特徴があり、ヒトＧＰＲ２２受容体は、第３の態様に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか、または該ポリヌクレオチドから発現される。
【００６５】
一部の実施形態では、ヒト以外の哺乳類はマウス、ラット、またはブタである。
【００６６】
ヒト以外のトランスジェニック哺乳類を作る方法は、当該技術分野では周知の方法である。例えば、Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９２）４９：１１３−１２０；Ｈｏｇａｎら，ｉｎ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．実験室マニュアル．（１９８６）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，コールド・スプリング・ハーバー；Ｃｏｓｔａら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ（１９９９）１３：１７６２−１７７３；国際公開第９１/０８２１６号；米国特許第４，７３６，８６６および６，５０４，０８０号を参照のこと。これら各々の開示内容は、引用により全体が本明細書に組み込まれている。
【００６７】
一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ２２受容体の発現は心筋細胞選択性である。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ２２受容体の前記心筋細胞選択的発現は、アルファ・ミオシン重鎖プロモーターにより与えられる［Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９１）２６６：２４６１３−２４６２０；これらの文献各々の開示は、引用により全体が本明細書に組み込まれている］。
【００６８】
一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ２２の発現はニューロン選択的である。
【００６９】
特定の実施形態では、第３の態様に記載のポリヌクレオチドは、置換された非内因性核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含み、置換された非内因性核酸は配列番号３または配列番号７である。
【００７０】
第１１の態様では、本発明は、候補化合物をヒト以外のトランスジェニック哺乳類に投与するステップを含む哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害を予防または処置する場合に、候補化合物が効果を有するかどうかを確認するために第１０の態様に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳類を用いる方法に特徴がある。特定の実施形態では、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類における前記効果が哺乳類における効果を示している。
【００７１】
特定の実施形態では、候補化合物はヒトＧＰＲ２２受容体の調節剤またはリガンドである。一部の実施形態では、候補化合物はヒトＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドではない。
【００７２】
一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害は、心筋虚血または心筋梗塞を含むこれに関連した状態があるが、これらにに限定されるものではない。一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害はうっ血性心不全である。一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害は、脳虚血または虚血性脳梗塞を含むこれに関連した状態があるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
ヒト以外の哺乳類への候補化合物の投与ルートは、当該技術分野では周知のルートであり、経口、腹腔内、皮下および静脈の各投与を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
一部の実施形態では、この化合物の用量は０．１−１００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。
【００７５】
候補化合物が哺乳類の心筋梗塞に対して効果があるかどうか確認する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｆｒｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（１９９９）８４：８４６−８５１を参照のこと；この文献の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）。候補化合物が哺乳類のうっ血性心不全に対して効果があるかどうか確認する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００４）５０：１６３−１７４を参照のこと；この文献の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）。候補化合物が哺乳類の虚血性脳梗塞に対して効果があるかどうか確認する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９８７）４９：８４６−８５１を参照のこと；この文献の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）。
【００７６】
特定の実施形態では、候補化合物は、第７の態様に記載のヒトＧＰＲ２２受容体の調節剤または第８の態様に記載のヒトＧＰＲ２２受容体のリガンドである。
【００７７】
第１２の態様では、本発明は、候補化合物をヒト以外のトランスジェニック哺乳類に投与するステップを含む哺乳類の心臓保護または神経保護に、候補化合物が効果を有するかどうかを確認するために第１０の態様に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳類を用いる方法に特徴がある。特定の実施形態では、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類における前記効果が哺乳類における効果を示している。
【００７８】
特定の実施形態では、候補化合物はヒトＧＰＲ２２受容体の調節剤またはリガンドである。一部の実施形態では、候補化合物はヒトＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドではない。
【００７９】
ヒト以外の哺乳類への候補化合物の投与ルートは、当該技術分野では周知のルートであり、経口、腹腔内、皮下および静脈の各投与を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
一部の実施形態では、この化合物の用量は０．１−１００ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。
【００８１】
候補化合物が哺乳類の心臓保護に対して効果があるかどうか確認する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｆｒｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（１９９９）８４：８４６−８５１；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００４）５０：１６３−１７４を参照のこと；これらの文献各々の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）。候補化合物が哺乳類の神経保護に対して効果があるかどうか確認する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９８７）４９：８４６−８５１を参照のこと；この文献の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）。
【００８２】
特定の実施形態では、候補化合物は、第７の態様に記載のヒトＧＰＲ２２受容体の調節剤または第８の態様に記載のヒトＧＰＲ２２受容体のリガンドである。
【００８３】
本出願は、米国の速達郵便で米国特許商標庁に届け出た次の仮特許出願、即ち２００５年１０月１４日に届け出た米国仮特許出願第６０/７２７，２０３号からの優先権の利益を主張している。前述の仮特許出願の開示内容は、引用により全体が本明細書に組み込まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、コードされたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの増強された発現（例えば、「発現増強」ＧＰＲ２２コード核酸）を供給するＧＰＲ２２受容体コード核酸を産生する方法に特徴がある。本発明は、ＧＰＲ２２受容体の調節剤を選別する場合にこの種のＧＰＲ２２受容体コード核酸を巧みに利用するキット、方法および組成物にも特徴がある。特定の好ましい実施形態では、ＧＰＲ２２受容体は哺乳類ＧＰＲ２２受容体である。
【００８５】
本発明のさらなる説明では、まずこの方法の代表的な実施形態をより詳細に説明し、次いで、これらの方法が使われる種々の適用について再検討する。さらに、これらの方法の特定の実施形態において使える組成物およびキットについてより詳細に説明する。
【００８６】
本発明についてさらに説明する前に、本発明は説明した特定の実施形態に限定されず、変形してもよいことは明らかである。本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使われる用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定する意図はない。
【００８７】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲内にある値は、明確に指示されない限り、下限のユニットの１／１０まで、その範囲の上限と下限との間の、即ち表示された範囲における値が本発明に包含されることは当然である。これら比較的小さな範囲の上限と下限とは、独立に、この比較的小さな範囲に含まれ、表示された範囲から明確に排除された限界に従って本発明にも包含される。表示された範囲が１つまたは２つの限界値を含む場合は、これらの限界値のいずれか１つまたは両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
【００８８】
実施形態が一組の具体的な値（例えば、パーセンテージ）として出される場合は、個々の値（例えば、パーセンテージ）またはその組み合わせは本発明の範囲内の付加的な別々の実施形態であると考えられる。
【００８９】
特に明記しない限り、本明細書で用いたすべての科学・技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が普通に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書で説明した方法および物質と類似または等価な方法および物質も本発明の実行またはテストにおいて使用することができるが、好ましい方法および物質についても後で説明する。本明細書で言及したすべての刊行物は、その刊行物が引用されたことと関連した方法および／または物質を開示し、説明するための引用により本明細書に組み込まれている。
【００９０】
本明細書および添付した特許請求の範囲で使われた単数形「１つの」、「および」ならびに「前記」は、特に明記しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つのヌクレオチド」は複数のヌクレオチドを含み、「前記コドン」は１つ以上のコドンおよび当業者に周知のコドンの等価物を含むことを指摘しなければならない。さらに、特許請求の範囲は随意のエレメントを排除するために作成してよいことを指摘する。元来、この説明は、請求項のエレメントを詳述すること、または「負の」限定の使用と関連して「もっぱら」、「単に」などの排他的な専門用語を使用する根拠として役立たせるためのものである。
【００９１】
本明細書に記載した刊行物は、本出願の出願日より前にこれらが開示されたことを示しているだけである。先行発明により本発明がこの種の刊行物を先行する資格がないことを承認するものとして解釈すべきものは本明細書にはない。さらに、提示された発行日は、独立に、確認する必要がある実際の発行日と異なっていてもよい。
【００９２】
（定義）
本明細書で使われるアミノ酸の略語を表Ａに示す。
【００９３】
【表１−１】
2009511063.tif 000003
本明細書で使われるヌクレオチドの略語は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、およびＴ（チミン）である。
【００９４】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書では置き替え可能に使われ、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形を指している。本発明のポリヌクレオチドは、一般に、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み、組換えまたは合成により産生されうる。用語ポリヌクレオチドは、単一鎖、二重鎖および三重らせんの分子を含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、単一鎖または二重鎖のＤＮＡの約３と約１００個のヌクレオチドとの間のポリヌクレオチドを指している。しかし、この開示では、オリゴヌクレオチドの長さの上限はない。オリゴヌクレオチドは、オリゴマーまたはオリゴとしても知られており、遺伝子から単離されるか、または当該技術分野で周知の方法により化学合成される。
【００９５】
本明細書をとおして、ヌクレオチド配列によりポリヌクレオチドが引用される場合は、この種の配列は一般にＤＮＡ配列として示される。本発明は、ポリヌクレオチドがＲＮＡであることも考慮していることは明らかであり、代表的なＲＮＡ配列はチミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）で置換することにより本明細書において供給された代表的なＤＮＡ配列から容易に導くことができる。
【００９６】
本明細書で使われている用語「コドン」は、タンパク質鎖に組み込まれるか、または終結信号として役立つ特定のアミノ酸をコードする遺伝子情報を提供するＤＮＡまたはＲＮＡの鎖において３つ連続した一組のヌクレオチドを指している。
【００９７】
本明細書で使われている用語「コード領域」は、ポリペプチド遺伝子産生物に関する遺伝子情報を与える核酸鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡ）における一連の連続したヌクレオチドを指している。
【００９８】
本明細書において置き替え可能に使われる用語「ポリペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸のあらゆる長さのポリマー形を指し、このポリマー形は本発明の文脈においてアミノ酸が遺伝子的にコードされている。この用語は融合タンパク質、免疫学的に標識されたタンパク質などを含む。
【００９９】
用語「内因性」は、脊椎動物、例えば哺乳類、が自然に産生する物質を意味する。限定するものではないが、実例として、ＧＰＲ２２核酸またはＧＰＲ２２ポリペプチドに関して内因性は、脊椎動物、例えば哺乳類（例えば、ヒト、ただし限定するものではない）により自然に産生されるＧＰＲ２２核酸またはＧＰＲ２２ポリペプチドを意味する。本明細書で使われている「内因性」および「野生型」は置き替え可能に使われる。対照的に、この文脈における用語「非内因性は、脊椎動物、例えば哺乳類（例えば、ヒト、ただし限定するものではない）により自然に産生されないＧＰＲ２２核酸またはＧＰＲ２２ポリペプチドを意味する。
【０１００】
用語「変異体」は、それぞれ、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な特性は保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。ポリヌクレオチドの代表的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリペプチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変えることもあるし、変えないこともある。ポリペプチドの代表的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとはアミノ酸配列が異なる。変異体および基準ポリペプチドは、何らかの組み合わせにおける１つ以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列に違いがあってよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの自然に生じる変異体であってよいし、または自然に生じることが知られていない変異体であってよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの自然に生じない変異体は、突然変異生成技法または直接合成により作られる。
【０１０１】
本明細書で使われる用語「発現を増強された」は、第１哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸を指しており、該核酸は同じ型の宿主細胞（例えば、哺乳類またはメラノフォアの宿主細胞などの真核宿主細胞）に対してコードされた哺乳類ＧＰＲ２２の発現を増強する置換された非内因性核酸を産生するように改変されており、前記発現を増強されたは、第１核酸または野生型核酸でコードしている哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドと比較している。
【０１０２】
「発現ベクター」は、発現ベクターの適切な宿主細胞組換えにおける転写ｍＲＮＡの翻訳およびクローン化ＤＮＡの転写に必要なＤＮＡ配列を意味するものとする。適切に造られた発現ベクターは、宿主細胞の自律増殖のための複製の起点、選択可能なマーカー、限定された数の有効な制限酵素部位、高いコピー数の可能性、および活性プロモーターを含むはずである。転写されるクローン化ＤＮＡは、発現ベクター内で恒常的にまたは条件的に活性プロモーターに操作可能にリンクされる。
【０１０３】
「宿主細胞」は、その中に組み込まれたベクターを有することができる細胞を意味するものとする。現在の文脈では、ベクターはＧＰＲ２２受容体の発現を可能にする適切なプロモーター配列との操作可能な関係において核酸コードＧＰＲ２２受容体を通常含むものである。好ましい実施形態では、宿主細胞は哺乳類の細胞、酵母細胞、またはメラノフォア細胞などの真核細胞である。
【０１０４】
用語「調節する」は、特定の活性、機能または分子の量、質、または効果の増加または減少を意味するためのものである。
【０１０５】
「ＧＰＲ２２受容体調節剤」は物質、例えば、調節剤がＧＰＲ２２受容体に結合する時の、細胞内反応を調節または変えるリガンドまたは化合物である。
【０１０６】
フレーズ「候補化合物」または「テスト化合物」に関連した「直接同定する」または「直接同定された」は、Ｇタンパク質共役型受容体への周知のリガンド（例えば、周知のアゴニスト）が存在しない場合、Ｇタンパク質共役型受容体への候補化合物の選別を意味するものとする。
【０１０７】
「アゴニスト」は物質、例えば、リガンドまたは化合物であり、この物質がＧＰＣＲへの結合により、ＧＰＣＲにより媒介された細胞内反応を刺激する。本明細書で使われるアゴニストは、特に明記しない限り、アゴニスト全体および部分アゴニストを包含する。
【０１０８】
「部分アゴニスト」は物質、例えば、リガンドまたは化合物であり、この物質がＧＰＣＲへの結合により、ＧＰＣＲにより媒介された細胞内反応を刺激するが、度合いまたは範囲はアゴニスト全体よりも小さい。
【０１０９】
「インバース・アゴニスト」は物質、例えば、リガンドまたは化合物であり、この物質はＧＰＣＲに結合し、アゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合に観察される正常なベースレベルの活性以下で受容体の活性形により開始されたベースライン細胞内反応を抑制する。
【０１１０】
「恒常的に活性なＧＰＣＲ」は、アゴニストまたは部分アゴニストへの受容体の結合を介する以外の手段により活性状態に安定化されたＧＰＣＲである。恒常的に活性なＧＰＣＲは、内因性でもあるいは非内因性でもよい。
【０１１１】
「アンタゴニスト」は物質、例えば、リガンドまたは化合物であり、この物質は、アゴニストまたは部分アゴニストとしてほぼ同じ部位においてＧＰＣＲに結合、好ましくは競合的に結合するが、ＧＰＣＲの活性形により開始された細胞内反応を活性化せず、それによりアゴニストまたは部分アゴニストが存在しない場合にベースライン細胞内反応を低減しない。
【０１１２】
ＧＰＣＲに関連して本明細書で使われている「調節剤」は、以上で規定されたアゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストおよびアンタゴニストを包含するものと理解される。
【０１１３】
「リガンド」は、ＧＰＣＲに特異的に結合する化合物である。内因性リガンドは、内因性ＧＰＣＲに結合する内因性化合物である。ＧＰＣＲのリガンドは、以上で規定されたアゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストでよいが、これらに限定されない。
【０１１４】
用語「反応」に関連した用語「抑制する」または「抑制している」は、化合物が存在しないとは反対の、化合物が存在する場合に反応が低減または防止されることを意味するものとする。
【０１１５】
用語「反応」に関連した用語「刺激する」または「刺激している」は、化合物が存在しないとは反対の化合物が存在する場合に反応が促進されることを意味するものとする。
【０１１６】
「受容体機能性は、本明細書では、遺伝子転写の制御、イオンの流入または流出の制御、触媒反応の生成、および／または第２メッセンジャー反応の誘発などのＧタンパク質を介した活性の調節を含むがこれらに限定されない細胞内の作用を抑え、刺激を受け入れるＧＰＣＲの正常な操作を指すものとする。
【０１１７】
用語「第２メッセンジャー」は、ＧＰＣＲ活性化の結果として産生された細胞内反応に関連しているものとする。第２メッセンジャーの非限定的な例には、イノシトール  １，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、ＭＡＰキナーゼ活性およびＣａ２＋がある。第２メッセンジャー反応は、例えば、受容体のインバース・アゴニスト、部分アゴニスト、アゴニスト、およびアンタゴニストのような候補化合物を同定する場合に測定することができる。特定の実施形態では、第２メッセンジャー反応はＧＰＲ２２受容体発現のレベルを評価する場合に測定することができる。
【０１１８】
「化合物効率」は、受容体結合親和性の反対の受容体機能性を抑制または刺激する化合物の能力の測定を意味するものとする。化合物効率を測定する代表的な手段は、本特許文書の実施例のセクションで開示される。
【０１１９】
ＧＰＲ２２ポリペプチドの文脈において本明細書で使われている「細胞表面の発現」は、細胞表面にＧＰＲ２２ポリペプチドが存在し、例えば、ＧＰＲ２２活性に影響を及ぼす薬剤を同定するアッセイにおいて使用することができる機能性ＧＰＲ２２を供給することを指している。
【０１２０】
「小分子」は、ペプチド、ペプチド模倣薬、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機化合物または無機化合物（即ち、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物を含む）、および塩類、エステル類およびこれら他の医薬品として許容できる形を含む、約１０，０００グラム/モルより少ない分子量を有する化合物を意味するものと解釈する。特定の好ましい実施形態では、小分子は約５，０００グラム/モルより少ない分子量を有する有機または無機化合物である。特定の好ましい実施形態では、小分子は約１，０００グラム/モルより少ない分子量を有する有機または無機化合物である。特定の好ましい実施形態では、小分子は約５００グラム/モルより少ない分子量を有する有機または無機化合物である。
【０１２１】
本明細書で置き替え可能に使われている用語「候補化合物」および「テスト化合物」は、選別技法の影響を受けやすい分子（例えば、非限定の化合物）を意味するものとする。
【０１２２】
用語「接触する」または「接触している」は、インビトロ系であろうとインビボ系であろうと、少なくとも２つの部分を一緒にすることを意味している。
【０１２３】
用語「医薬品組成物」は、少なくとも１つの活性成分を含む組成物を意味するものとする。この組成物は、哺乳類（例えば、非限定のヒト）における特定の、有効な結果を求める研究の影響を受けやすい。当業者は、例えば、熟練技能者のニーズに基づいて、活性成分が所望の有効な結果を有するかどうかを判断するのに適切な技法を理解し、正当に評価するものである。
【０１２４】
化合物を引用した医薬品分野の文脈において本明細書で使われる用語「有効性」は、研究者、獣医、医師または臨床医が求めている組織、システムまたは個体における生物学的または医薬的反応を引き出す化合物の能力を指すものとする。この化合物の能力には、次の項目の１つ以上を含む。
【０１２５】
（１）疾患の予防、例えば、疾患、状態または障害にかかりやすいが、まだこの疾患の病理学または総体症状を経験または示していない個体における疾患、状態または障害を予防する。
【０１２６】
（２）疾患の抑制、例えば、疾患、状態または障害を経験しているか、または示している個体における疾患、状態または障害を抑制する。
【０１２７】
（３）疾患の改善、例えば、疾患、状態または障害を経験しているか、または示している個体における疾患、状態または障害を改善する（即ち、病理学および／または総体症状を回復に向かわせる）。
【０１２８】
（４）心筋細胞または神経細胞の細胞死に対する保護。
【０１２９】
本明細書で使われている「哺乳類」は、哺乳類の家畜、哺乳類の娯楽用動物、哺乳類のペット、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヒト以外の霊長類、霊長類を含むがこれらに限定されないようにするためのものであり、最も好ましいのはヒトである。
【０１３０】
（要旨）
セオリーに固執することなく、本発明は、哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸のコード配列を改変すると、改変がタンパク質のアミノ酸配列を変えない場合でさえ細胞表面の発現を含むコードされたポリペプチドの発現を増強させるのに役立たせることができることを発見したことに基づいている。本発明の方法を実行する場合、核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域を分析してコード領域配列の標的ヌクレオチドを同定する。本明細書で使われている「標的ヌクレオチド」は、アデニンまたはチミンであり、これらは標的ヌクレオチドが存在するコドンにより特定されたアミノ酸を変えずにヌクレオチド置換を受けることができる。次いで、標的ヌクレオチドは、哺乳類ＧＰＲ２２コード領域を含む「置換された核酸」を作るためにコドンにより特定されたアミノ酸を変えずに別のヌクレオチドにより置換される。なお、該コード領域はコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する。好ましい実施形態では、置換された核酸は非内因性である。
【０１３１】
したがって、本発明は、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強するＧＰＲ２２コード核酸（例えば、「発現を増強する」ＧＰＲ２２コード核酸）を作る方法を提供する。本発明は、この種のＧＰＲ２２受容体コード核酸を巧みに利用するキット、方法および組成物にも特徴がある（例えば、細胞をベースにしたアッセイにおけるＧＰＲ２２の調節剤を選別する場合に）。
【０１３２】
本発明のさらなる説明では、まずこれらの方法の代表的な実施形態をより詳細に説明し、次いで、これらの方法が使われる種々の適用について再検討する。さらに、標記方法の特定の実施形態において使える組成物およびキットについてより詳細に説明する。
【０１３３】
（方法）
上で要約したように、本発明は、真核細胞（哺乳類細胞、酵母細胞またはメラノフォア細胞）においてＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換された非内因性核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２を産生するように第１哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸を改変する方法を提供する。したがって、増強された発現は、同じ型の宿主細胞（例えば、哺乳類またはメラノフォアの宿主細胞などの真核宿主細胞）において、第１の核酸または野生型ＧＰＲ２２核酸によりコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現に比べて、非内因性核酸によりコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現の増加（例えば、ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現またはＧＰＲ２２受容体機能性活性により測定したように）を意味するものである。本明細書では以下でより詳細に説明するように、発現の増強は、本明細書で説明した方法により産生された置換された非内因性ＧＰＲ２２核酸によりコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現と、第１の核酸または野生型ＧＰＲ２２核酸によりコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現とを比較することにより評価することができる。前記比較は、当該技術分野において周知のあらゆる適切な方法による比較でよく、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性などの第２メッセンジャーのレベルを測定する細胞をベースにしたアッセイを含むがこれらに限定されない。
【０１３４】
一般に、これらの方法を実行する場合、コード領域および該領域内のコドンは、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドについて決められる。コドンが同定された後、コドンによりコードされたアミノ酸を変えることなく置換されうる、本明細書では「標的ヌクレオチド」と呼ばれるこれらのヌクレオチドが同定される。次いで、１つ以上の標的ヌクレオチドは、コードされたアミノ酸配列を保存する別のヌクレオチドで置換される。このような置換を行うことにより、コドンにより特定されたアミノ酸が変化しない限り、標的ヌクレオチドはいかなるヌクレオチドにより置換されてもよいが、特定の実施形態では、置換されたヌクレオチドはコード領域のＧＣ含有量を増加させるヌクレオチドである。このように、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する、置換された非内因性核酸は産生されてよい。
【０１３５】
（ＧＰＲ２２コード核酸）
本発明のＧＰＲ２２コード核酸は、核酸配列コードＧＰＲ２２ポリペプチドを含み、ＧＰＲ２２は哺乳類ＧＰＲ２２であることが好ましい。開示された方法は、自然に発生するすべての対立遺伝子変異体を含むあらゆる哺乳類種から導かれた、核酸配列コードＧＰＲ２２ポリペプチドの改変に適用できる。例えば、これにより決して限定されるものではないが、ヒト（配列番号１または配列番号５）、マウス（配列番号９）、ラット（配列番号１０）、またはウシ（配列番号１１）の核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドは、改変して、一般に好まれる組換え宿主細胞、例えば、組換え哺乳類またはメラノフォア宿主細胞におけるコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を改善することができる。出発物質（例えば、ＧＰＲ２２核酸）は、自然に発生する核酸（例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸配列）、組換え核酸、合成核酸などでよいことも理解されている。したがって、あらゆる形の哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸は、本明細書で説明した方法に従って改変し、発現されるべきＧＰＲ２２ポリペプチドのアミノ酸配列が既知であるか、既知でありうることが可能であり、且つそのポリペプチドをコードする根底にあるポリヌクレオチド配列への改変により変化しない限り、哺乳類の細胞におけるコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強することができる。核酸配列コードＧＰＲ２２ポリペプチドを含む本発明のＧＰＲ２２コード核酸は、ＧＰＲ２２が哺乳類ＧＰＲ２２であることが好ましく、さらに、５’および／または３’非翻訳ヌクレオチド配列を含めてもよいことは明らかである。核酸配列コードＧＰＲ２２ポリペプチドを含む本発明のＧＰＲ２２コード核酸は、ＧＰＲ２２が哺乳類ＧＰＲ２２であることが好ましく、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードしてよいことも当然である。
【０１３６】
特に興味のある１つの実施態様では、改変されるべき核酸はヒトＧＰＲ２２ポリペプチドの対立遺伝子の変異体をコードする。ヒトＧＰＲ２２ポリペプチドの対立遺伝子の変異体は、いくつかよく知られたものがある。この種の２つの変異体は、ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５（アミノ酸位置４２５において、それぞれ、アルギニンまたはシスティンの残基を含むヒトＧＰＲ２２受容体ポリペプチド）である。ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５の代表的なアミノ酸配列は、よく知られており、この明細書の別表の配列番号２および６において、それぞれ、説明されている。ジェンバンク受入れ番号ＡＡＩ０７１２９のＧＰＲ２２アミノ酸配列は、さらなる例示のために提示され、配列番号６のアミノ酸位置５３におけるバリン残基の変わりにグリシン残基を含むことで配列番号６とは異なる野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｃ４２５アミノ酸配列の限定ではない。しかし、本発明は、野生型核酸配列（即ち、配列番号１および５）によりコードされたポリペプチドの観察された発現に比べて、コードされたポリペプチドの発現（例えば、ポリペプチド発現の増加または機能活性の増加により評価されるように）を増強するように核酸コードＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドのコード領域の改変について説明しているが、開示された方法はコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強するようにあらゆる核酸変異体コードＧＰＲ２２ポリペプチドの改変に同等に適用できることは理解できる。
【０１３７】
したがって、特定の実施形態では、「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」は内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体であることは当然である。限定ではなく例示として、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体である「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」は、配列番号２のヒトＧＰＲ２２受容体、配列番号６のヒトＧＰＲ２２受容体、配列番号１０のマウスＧＰＲ２２受容体、配列番号１２のラットＧＰＲ２２受容体、および配列番号１４のウシＧＰＲ２２受容体を包含する。特定の実施形態では、「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」は、配列番号２のヒトＧＰＲ２２受容体、配列番号６のヒトＧＰＲ２２受容体、配列番号１０のマウスＧＰＲ２２受容体、配列番号１２のラットＧＰＲ２２受容体、および配列番号１４のウシＧＰＲ２２受容体からなる群から選択された内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体である。
【０１３８】
特定の実施形態では、「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」は、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲであることが、さらに、考えられる。特定の実施形態では、「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲであることが、さらに、考えられる。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、非内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、心筋細胞の生存率を増加させることを示すことができる。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、アポトーシスから心筋細胞を救出すること（心筋細胞のアポトーシスを低減すること）を示すことができる。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有し、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示すＧＰＣＲはＧｉに連結する。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体または配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択された哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体（内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体は、ＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；テキサス州サンアントニオのＧｅｎｅＴｅｘ；およびＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯから商業的に入手することができる）に特異的に結合するか、または内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドに特異的に結合する。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知の調節剤である。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドである。
【０１３９】
特定の実施形態では、「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」は、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲであることも、さらに、考えられる。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、非内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、心筋細胞の生存率を増加させることを示すことができる。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、アポトーシスから心筋細胞を救出すること（心筋細胞のアポトーシスを低減すること）を示すことができる。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有し、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示すＧＰＣＲは、Ｇｉに連結する。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号６の内因性ヒトＧＰＲ２２受容体に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体（内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体は、ＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；テキサス州サンアントニオのＧｅｎｅＴｅｘ；およびＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯから商業的に入手することができる）に特異的に結合するか、または内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドに特異的に結合する。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知の調節剤である。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドである。
【０１４０】
特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」は、配列番号２または配列番号６に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％のアイデンティティー、または１００％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲであることが、さらに、考えられる。特定の実施形態では、「マウスＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１０に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％のアイデンティティー、または１００％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ラットＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１２に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％のアイデンティティー、または１００％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ウシＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１４に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％のアイデンティティー、または１００％のアイデンティティーを有するＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」は、配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠失または付加により配列番号２または配列番号６から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「マウスＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１０のアミノ酸配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠失または付加により配列番号１０から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ラットＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１２のアミノ酸配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠失または付加により配列番号１２から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ウシＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１４のアミノ酸配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠失または付加により配列番号１４から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」は、配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列におけるわずか１０個のアミノ酸の同類置換および／またはわずか３個のアミノ酸の非同類置換により配列番号２または配列番号６から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「マウスＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１０のアミノ酸配列におけるわずか１０個のアミノ酸の同類置換および／またはわずか３個のアミノ酸の非同類置換により配列番号１０から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ラットＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１２のアミノ酸配列におけるわずか１０個のアミノ酸の同類置換および／またはわずか３個のアミノ酸の非同類置換により配列番号１２から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ウシＧＰＲ２２受容体」は、配列番号１４のアミノ酸配列におけるわずか１０個のアミノ酸の同類置換および／またはわずか３個のアミノ酸の非同類置換により配列番号１４から導かれたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは保存的に互いの代わりをしてよい、グルタミン酸およびアスパラギン酸は保存的に互いの代わりをしてよい、グルタミンおよびアスパラギンは保存的に互いの代わりをしてよい、ロイシン、イソロイシンおよびバリンは保存的に互いの代わりをしてよい、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは保存的に互いの代わりをしてよい、およびグリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニンは保存的に互いの代わりをしてよい。アミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸付加は、あらゆる位置（例えば、Ｃ−末端またはＮ−末端、あるいは内部の位置）で行われてよい。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、非内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、心筋細胞の生存を促進（生存率を高める）することを示すことができる。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、心筋細胞をアポトーシスから救出（心筋細胞のアポトーシスを低下させる）することを示すことができる。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示し、Ｇｉに連結する。特定の実施形態では、「ヒトＧＰＲ２２受容体」、「マウスＧＰＲ２２受容体」、「ラットＧＰＲ２２受容体」、または「ウシＧＰＲ２２受容体」は、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体（内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体は、ＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；テキサス州サンアントニオのＧｅｎｅＴｅｘ；およびＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯから商業的に入手することができる）に特異的に結合するか、または内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドに特異的に結合する。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知の調節剤である。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドである。
【０１４１】
特定の実施形態では、パーセント・アイデンティティーは、当該技術分野でよく知られているベーシック・ローカル・アラインメント・サーチツール（”ＢＬＡＳＴ”）を用いて評価される［例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌｌ，）３：２６６−２７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２；これらの文献各々の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている］。ＢＬＡＳＴプログラムは、利用者が提供したデフォルト・パラメータまたは改変パラメータと共に使われる。これらのパラメータは、デフォルト・パラメータの方が好ましい。
【０１４２】
問い合わせ配列（例えば、配列番号２または６のアミノ酸配列）と全体的配列アラインメントとも呼ばれる調査対象配列との間の最良の全体的一致を決める好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータ・プログラムを用いて決めることができる［Ｃｏｍｐ  Ａｐｐ  Ｂｉｏｓｃｉ（１９９０）６：２３７−２４５；その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている］。配列アラインメントでは、問い合わせおよび調査対象の配列は両方ともアミノ酸配列である。前記全体的配列アラインメントの結果は、パーセント・アイデンティティーにある。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントの結果は、次のとおりである。即ち、マトリックス＝ＰＡＭ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチ・ペナルティ＝１、接合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ＝２５、長さ＝０、カットオフ・スコア＝１、ウインドウ・サイズ＝配列長さ、ギャップ・ペナルティ＝５、ギャップサイズ・ペナルティ＝０．０５、ウインドウ・サイズ＝２４７または調査されたアミノ酸配列の長さのいずれか短い方である。
【０１４３】
調査対象配列が、内部欠失ではなく、Ｎ−またはＣ−末端基欠失により問い合わせ配列よりも短い場合、全体の同一性のパーセントを計算するときに、ＦＡＳＴＤＢプログラムでは調査対象配列のＮ−およびＣ−末端基の切断がわからないので、同一性のパーセントで得た結果を手作業で修正しなければならない。Ｎ−およびＣ−末端基で切断された調査配列の場合、問い合わせ配列に比べて、問い合わせ配列の総アミノ酸のパーセントとして、対応する調査配列残基と一致しないか、または整列しない調査配列のＮ−およびＣ−末端基である問い合わせ配列の残基数を計算することにより、パーセント・アイデンティティーは修正される。残基が一致しているか／整列しているかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決められる。次いで、このパーセンテージは、最終的なパーセント・アイデンティティー・スコアに到達するために特定されたパラメータを用いて上のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント・アイデンティティーから差し引かれる。この最終的なパーセント・アイデンティティー・スコアは、本発明で使われるものである。問い合わせ配列と一致しないか／整列しないかは、調査配列のＮ−およびＣ−末端基に対する唯一の残基は、パーセント・アイデンティティー・スコアを手作業で調節するためであると考えられる。それは調査配列の最も遠いＮ−およびＣ−末端残基の外側の唯一の問い合わせアミノ酸残基である。
【０１４４】
例えば、９０個のアミノ酸残基からなる調査配列を、１００個の残基からなる問い合わせ配列と整列するパーセント・アイデンティティーを決める。欠失は、調査配列のＮ−末端基で生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ−末端基における第１残基と一致しないか／整列しない。ペアを形成しない残基が１０個あることは、配列の１０％を表し（Ｎ−およびＣ−末端の残基の数は、問い合わせ配列の残基の総数と一致しない）、１０％はＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント・アイデンティティー・スコアから差し引かれる。残りの９０個の残基が完全に一致したならば、最終パーセント・アイデンティティーは９０％になるであろう。
【０１４５】
別の例では、９０個の残基からなる調査対象の配列を、１００個の残基からなる問い合わせ配列と比較する。今度は内側に欠失があるので、調査対象の配列のＮ−またはＣ−末端には残基はなく、該配列は問い合わせ配列と一致しないか／整列しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント・アイデンティティーは、手作業で修正することはない。やはり、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて示したように、問い合わせ配列と一致しないか／整列しない配列のＮ−およびＣ−末端部の外側の残基位置のみが手作業で修正される。本発明では他の修正はなされない。
【０１４６】
特定の実施形態では、「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」は、野生型ポリヌクレオチド・コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲである。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲであると考えられる。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、非内因性ＧＰＣＲである。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、心筋細胞の生存を促進（生存率を高める）することを示すことができる。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、心筋細胞をアポトーシスから救出（心筋細胞のアポトーシスを低下させる）することを示すことができる。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示す。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを下げる検出可能な恒常的活性を示し、Ｇｉに連結する。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている野生型ポリヌクレオチドの補体または配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されたポリヌクレオチドの補体に対してポリヌクレオチドを極めて厳密にハイブリッド形成することによりコードされたＧＰＣＲは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体（内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体を認識する抗体は、ＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；テキサス州サンアントニオのＧｅｎｅＴｅｘ；およびＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯから商業的に入手することができる）に特異的に結合するか、または内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドに特異的に結合する。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知の調節剤である。特定の実施形態では、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドは、内因性哺乳類ＧＰＲ２２受容体の内因性リガンドである。ハイブリッド形成技法は、熟練技能者にはよく知られている。一部の実施形態では、厳しいハイブリッド形成条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ/ｍｌ  変性剪断サーモン精子ＤＮＡを含む溶液における、４２℃一晩のインキュベーションを含み、次いで、約６５℃における０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する。
【０１４７】
特許請求の範囲は、「哺乳類ＧＰＲ２２受容体」の何か適切なサブセットを排除するように作成してよいと考えられる。
【０１４８】
本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両ポリペプチドを考慮しているのは当然である。しかし、明細書全体をとおして、単に明確にし且つ便宜上の理由で、核酸配列および本発明に従ってなされる置換に関する指針は、デオキシリボヌクレオチド（例えば、本明細書で提供された配列はＤＮＡ配列である）により提供される。ＲＮＡ分子に関する代表的な配列、ならびに本発明のＲＮＡ分子を産生する改変に関する指針は、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）で置換することにより本発明の開示から容易に導くことができる。
【０１４９】
この方法における第１ステップは、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域を決めることである。これは、当該技術分野でよく知られた手段によりなされうる。例えば、これは、選択された哺乳類試料（例えば、ヒト）から得られた興味深い核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドを単離、増幅および配列決定することによりなされる。このように、核酸の遺伝子配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列が導かれ、翻訳を開始および停止する部位が決められ、それにより、コード領域が決められる。
【０１５０】
あるいは、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域は、ジェンバンクで公表されたものなど周知の核酸配列コードＧＰＲ２２ポリペプチドを参照することにより決められる。例えば、配列番号１は、ジェンバンク受入れ番号ＮＭ＿００５２９５を参照して決められた、野生型核酸配列コードヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５ポリペプチドを表す。配列番号５は、ジェンバンク受入れ番号ＡＣ００２３８１．１を参照して決められた、野生型核酸配列コードヒトＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドを表す。
【０１５１】
興味深い核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域が一旦同定されると、コドンコードＧＰＲ２２ポリペプチドを決めることができる。遺伝子コードの縮退により、コドンは、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更せずに、ヌクレオチド配列の変動をしばしば可能にする。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４つのヌクレオチド（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）に限定されているので、ヌクレオチドの可能な組み合わせは６４であり、その内の６１はアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは翻訳終了の信号をコードする）。どのアミノ酸をどのコドンがコードするかを示している「遺伝子コード」は、表１のように本明細書で再現されている。その結果、多くのアミノ酸が１つ以上のコドンにより命名されている。例えば、アミノ酸であるアラニンおよびプロリンは、４種類のコドンにより、セリンおよびアルギニンは６つのコドンにより各々コードされ、一方、トリプトファンおよびメチオニンは１つのトリプレット・コドンによりコードされる。この縮退は、ＤＮＡによりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えずに、広範囲にわたりＤＮＡ塩基組成の変動を可能にする。したがって、本発明では、改変されるべきＧＰＲ２２核酸によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列は固定されたままであるが、コドンコードのこれらのアミノ酸を含むヌクレオチドは変化を受け入れる。
【０１５２】
（表１）
【０１５３】
【表１−２】
2009511063.tif 000004
したがって、本発明のコードＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強された核酸配列は、根底にあるアミノ酸配列を変えずに、別のヌクレオチドにより置換されうるコドン内の標的ヌクレオチドを同定することにより産生されうる。これは当該技術分野で周知の何らかの方法を用いて行うことができ、例えば、発現を増強されたＧＰＲ２２核酸配列は、任意のアミノ酸に対して使われる種々のコドンを規定するために表１に示した標準遺伝子コード表を用い、種々のヌクレオチドを有するコドン内で少なくとも１つのヌクレオチドを置換して手作業でデザインすることができる。あるいは、これは、カリフォルニア州サンジエゴのＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，から入手できるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐの逆翻訳ソフトウエア・パッケージなどのコンピュータを使った方法を用いることにより達成することができる。さらに、ＧＰＲ２２ポリペプチドをコードする本発明により発現を増強された置換された核酸を産生する他の種々のアルゴリズムおよびコンピュータ・ソフトウエア・プログラムは、当業者には容易に入手でき、例えば、ウィスコンシン州マジソンのＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，から入手できるＬａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｅの”ＥｄｉｔＳｅｑ”機能、およびメリーランド州ベセスダのＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，から入手できるＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅの逆翻訳機能を参照のこと。
【０１５４】
置換することによりコドンにより特定されたアミノ酸が変わらない限り、あらゆるヌクレオチドは標的ヌクレオチドを置換してよい。便宜上、標的ヌクレオチドを置換するヌクレオチドは、本明細書では「代用ヌクレオチド」と呼び、得られる改変された核酸は本明細書では「置換された核酸」と呼ぶ。例えば、特定されたコドンによりコードされたアミノ酸がロイシンであり、コドンの最初の２つのヌクレオチドがＣＴであるならば（即ち、ＴＴでなく）、コドンの第３の位置のＡ，Ｃ，ＧまたはＴヌクレオチドは、根底にあるコードされたアミノ酸を変更せずに、他の何らかのヌクレオチドと交換してもよい。表１を参照のこと。したがって、ロイシン・コドン内の標的ヌクレオチドがＡであるならば、代用ヌクレオチドはＣ，ＧまたはＴでよい。ロイシン・コドン内の標的ヌクレオチドがＴであるならば、代用ヌクレオチドはＣ，ＧまたはＡでよい。この例では置換されたヌクレオチドがコドンの位置３にあったとしても、これは全く限定的ではないことを指摘できる。コドンのあらゆる位置（１，２または３）のあらゆるヌクレオチドは、コードされたアミノ酸が変更されない限り互いに交換されうる。例えば、ＴＴＧおよびＣＴＧの両方のコドンはロイシンをコードする。さらに、コドンの１つより多い標的ヌクレオチドは置換されてよく、例えば、ＴＴＡおよびＣＴＧの両方がロイシンをコードする。コドン内の標的ヌクレオチドが代用ヌクレオチドで置換されるコドンは、本明細書では「改変コドン」と呼ばれる。当業者には当然であるが、本発明の方法は、コードされたアミノ酸が同じままであるならば、コード配列の改変されたコドンの分布が顕著に変われるように適用されうる。
【０１５５】
コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する少なくとも１つの代用ヌクレオチドを作れるように、核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２アミノ酸配列を改変する方法は、本発明の範囲内にあることは当然である。しかし、置換された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、置換する前の核酸とは配列に違いがあることを指摘する必要がある。例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸、即ち、未改変の核酸および置換された核酸によりコードされたＧＰＲ２２アミノ酸配列は同じものになるであろう。
【０１５６】
特に興味深い１つの実施形態では、代用ヌクレオチドはコード領域のＧＣ含有量を増加させるヌクレオチドである（したがって、コード領域のＡＴ含有量を低下させる）。別の実施形態では、代用ヌクレオチドはコード領域のＧＣ含有量を維持するヌクレオチドである（したがって、コード領域のＡＴ含有量を維持する）。
【０１５７】
１つの実施形態では、特に興味深い標的ヌクレオチドは、コード領域においてあまり望ましくない、少なくとも３つ以上連続したヌクレオチドの配列のコード領域に存在するヌクレオチドである。例えば、その場合に限定されないが、コード領域のＡＴ含有量を低減することが望ましい場合を含み、特に興味深い標的ヌクレオチドは、３つ以上のＡまたはＴの連続配列（例えば、ＡＴＡＴ）、または３つ以上のＡの連続配列（例えば、ＡＡＡＡ）、または３つ以上のＴの連続配列（例えば、ＴＴＴＴ）にＡまたはＴが存在する置換である。このようにして、哺乳類ＧＰＲ２２コード領域を含む発現を増強された核酸配列がデザインされてよい。他の関連した実施形態では、標的ヌクレオチドは、３，４，５，６，７，８，９，１０またはそれ以上のＡおよび／またはＴの配列に存在している。
【０１５８】
核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンのヌクレオチド置換は発現を増強するために作られるが、これは、本発明によりＧＰＲ２２の発現を増強する核酸の産生において可能なすべての標的領域が代用ヌクレオチドにより置換されねばならないことを意味するものではない。即ち、本発明によるＧＰＲ２２の発現を増強する核酸の産生は、コドン内で変化されうるあらゆるヌクレオチドまたはコード領域内で変化されうるあらゆるコドンが変化させられることを必要としない。１つの実施形態では、ＧＣ含有量は増加する。例えば、コード領域のＧＣ含有量は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、またはそれ以上増加させられうる。特定の実施形態では、置換された核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列のコード領域のＧＣ含有量は、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％である。
【０１５９】
１つの非限定的な実施形態では、図２Ａに描かれているように、置換されたヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５ポリペプチドが供給されると、ＧＣ含有量は少なくとも６０％、具体的に述べると、約６４％増加する。具体的に述べると、図１Ａの野生型ＧＰＲ２２  Ｒ４２５ヌクレオチド配列は、約３６％のＧＣ含有量を有するが、一方では、これらから導かれた置換されたＧＰＲ２２  Ｒ４２５ヌクレオチド配列のＧＣ含有量（図２Ａ）は約５９％で、これはＧＣ含有量の約６４％の増加に等しい。別の非限定的な実施形態では、図４Ａに描かれているように、置換されたヒトＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドが供給されると、ＧＣ含有量は少なくとも６０％、具体的に述べると、約６４％増加する。具体的に述べると、図３Ａの野生型ＧＰＲ２２  Ｃ４２５ヌクレオチド配列は、約３６％のＧＣ含有量を有するが、一方では、これらから導かれた置換されたＧＰＲ２２  Ｃ４２５ヌクレオチド配列のＧＣ含有量（図４Ａ）は約５９％で、これはＧＣ含有量の約６４％の増加に等しい。図２Ａおよび４Ａを参照すると知ることができるように、置換されたＧＰＲ２２  Ｒ４２５配列におけるヌクレオチド置換は、置換されたＧＰＲ２２  Ｃ４２５における置換と同一であるが、コードされたタンパク質は位置４２５における１つのアミノ酸に違いがあり、ＧＰＲ２２  Ｒ４２５では位置４２５におけるアミノ酸はアルギニン（Ｒ）であり、ＧＰＲ２２  Ｃ４２５では位置４２５におけるアミノ酸はシスティン（Ｃ）である。これは、ヌクレオチド位置１２７３におけるＣ/Ｔヌクレオチド多型によるものであり、これはアミノ酸位置４２５におけるＲ/Ｃアミノ酸多型に原因がある。
【０１６０】
上の置換された２つの核酸は、例示のためにのみ説明しているものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５には４３３のコドン（停止コドンを除いて）がある。例示された置換ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドでは、４３３のコドンの２７８（即ち、約６４％）は、核酸のＧＣ含有量を変える（増加させる）少なくとも１つのヌクレオチド置換を有する。追加の３つのコドンは、ＧＣ含有量を変えずに改変された。核酸のＧＣ含有量を変えるために置換がなされることがありうる標的ヌクレオチドを含む１６のコドンは、核酸のＧＣ含有量を変えるために置換されることがありうる標的ヌクレオチドを含むコドンの約９／５％が改変されたように、改変されなかった（配列番号２と６のアミノ酸位置４０におけるフェニルアラニン、位置４１におけるグルタミン、位置４３および３８０におけるセリン、位置１１８におけるヒスチジン、位置１２０におけるアラニン、位置１２１におけるシスティン、位置１４０および２９６におけるアルギニン、位置１５１、１６２および１６４におけるイソロイシン、位置２３５におけるロイシン、位置２５３におけるリジン、位置３９１におけるグルタミン酸、および位置４２８におけるプロリンをコードするコドン）。その結果得られた置換された作成物が、ＧＰＲ２２受容体の発現の増強を証明している（図５−７に描写されているように）。したがって、図２Ａまたは４Ａにおいて置換されなかったヌクレオチドのあらゆる位置は、発現を増強するために置換する必要がない、ただしこの種の置換はさらなる正の効果があり、したがって、本発明の範囲内にある。配列番号３および７では、３０２のヌクレオチド置換があり、これらのヌクレオチド置換の内２９５は、ＧＣ含有量を変え（図２Ａおよび４Ａのフォーマットされなかった小文字）、残りの７つの置換はＧＣ含有量を変えない（図２Ａおよび４Ａのイタリック体または肉太の小文字、例えば、図２Ａおよび４Ａのヌクレオチド位置２２９および９４３）。わずか１または２つのヌクレオチド位置が置換され、結果として発現を増強する（いずれにせよ、このような置換は核酸のＧＣ含有量またはＡＴ含有量を変える）ことは当然であり、したがって、本発明の範囲内にあるであろう。
【０１６１】
したがって、完全な最適化の厳密な順守からの逸脱、例えば、（ｉ）制限部位の導入または維持を受け入れること、（ｉｉ）望ましくないヌクレオチド・ストレッチを分裂させること、（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅部位を提供または維持すること、などもなされてよい。
【０１６２】
１つの実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約１０％のＡ（アデニン）またはＴ（チミン）がＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）ヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約１／５％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約２０％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約２／５％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約３０％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約３５％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約４０％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約４５％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約５０％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約５５％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。別の実施形態では、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約６０％のＡまたはＴヌクレオチドがＧまたはＣヌクレオチドで置換される。しかし、ＡＴＧはメチオニンをコードする、ただ１つのコドンであるので、このコドンではＡでもなくＴでもないメチオニンをコードし、コードされたアミノ酸を変えずに変更されうる。同様に、トリプトファンをコードするただ１つのコドンである、ＴＧＧは、コードされたアミノ酸を変更せずにＴを変えることはできないように、トリプトファンをコードする。
【０１６３】
１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約１０％のＡ（アデニン）またはＴ（チミン）が、Ｇ（グアニン）またはＣ（シトシン）ヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約２０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約３０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約４０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約５０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約６０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約７０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約７／５％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約８０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約８５％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約９０％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約９５％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、ＧＣ含有量を増加させるために置換がなされうる標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域のコドンの少なくとも約１００％のＡまたはＴヌクレオチドが、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。
【０１６４】
１つの実施形態では、Ａ（アデニン）である標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約１０％のＡヌクレオチドが、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）またはＣ（シトシン）ヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約２０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約３０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約４０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約５０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約６０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約７０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約７５％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約８０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約８５％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約９０％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約９５％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ａである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約１００％のＡヌクレオチドが、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。
【０１６５】
１つの実施形態では、Ｔ（チミン）である標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約１０％のＴヌクレオチドが、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）またはＣ（シトシン）ヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約２０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約３０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約４０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約５０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約６０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約７０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約７５％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約８０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約８５％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約９０％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約９５％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。１つの実施形態では、Ｔである標的ヌクレオチドを含む、核酸コードＧＰＲ２２ポリペプチドのコード領域の少なくとも約１００％のＴヌクレオチドが、Ａ、ＧまたはＣヌクレオチドで置換される。
【０１６６】
例えば、１つの実施形態では、配列番号２のＧＰＲ２２  Ｒ４２５タンパク質をコードする配列番号１の野生型核酸配列は、非内因性発現増強核酸配列コードＧＰＲ２２  Ｒ４２５タンパク質をデザインする鋳型として使われる。特異な例では、置換された核酸は、配列番号４のＧＰＲ２２  Ｒ４２５ポリペプチドをコードする配列番号３の核酸である。配列番号１と３とは互いに異なっているが、コードされたタンパク質（即ち、配列番号２および４）は異ならない（即ち、配列番号２は配列番号４と同一である）ことに留意する必要がある。別の実施形態では、配列番号６のＧＰＲ２２  Ｃ４２５タンパク質をコードする配列番号５の野生型核酸配列は、ＧＰＲ２２  Ｃ４２５タンパク質をコードする非内因性発現増強核酸配列をデザインする鋳型として使われる。特異な例では、置換された核酸は、配列番号８のＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドをコードする配列番号７の核酸である。配列番号５と７とは互いに異なっているが、コードされたタンパク質（即ち、配列番号６および８）は異ならない（即ち、配列番号６は配列番号８と同一である）ことに留意する必要がある。
【０１６７】
ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５のタンパク質の野生型および置換されたコード配列の比較を図１−４に示している。これらの図は、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドのアミノ酸配列を変更せずに置換がなされうる、ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５の野生型コード領域内の多くのヌクレオチドは、変性されて、これらの図に例示された置換された核酸を与えることを実証している。これらの図に例示された置換された核酸の場合、本発明によるコドンの改変は、ＧＣ含有量を増加させ、ＡＴ（Ｕ）含有量を低下させる結果になった。
【０１６８】
（ＧＰＲ２２コード核酸の合成）
コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸のデザインに従うと、置換されたＧＰＲ２２核酸は非内因性が好ましく、当業者によく知られた標準およびルーチンの分子生物学的操作を用いて置換された核酸を合成するのに多数の選択肢が利用できる。例えば、これにより限定されないが、野生型ＧＰＲ２２コード核酸は、鋳型として使われ、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ（商標）変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ（商標）変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて部位特異的変異誘発の影響を受けて鋳型核酸配列により作られ、両方とも製造者の使用説明書に記載されている。このようにして、望ましくないあらゆる標的ヌクレオチドは、コドンにより特定されたアミノ酸がこの種の置換を行うことにより変わらない限り、より望ましいヌクレオチドにより置換されてよい。
【０１６９】
あるいは、一旦デザインされた、発現増強ＧＰＲ２２コード核酸の全長は、約８０−９０個のヌクレオチドからなる一連の相補的オリゴヌクレオチド・ペアを合成して作ることができ、各ヌクレオチドの長さは標準的方法を用いた望ましい配列の全長に及ぶ。これらのオリゴヌクレオチド・ペアは、例えば、各オリゴヌクレオチド・ペアがペア内の他のオリゴヌクレオチドに対して相補性である領域を超えて３，４，５，６，７，８，９，１０，またはそれ以上に延長して合成される付着端を含む、８０−９０塩基ペアの二重鎖フラグメントをこれらが形成し、アニーリングして合成される。オリゴヌクレオチドの各ペアの単一鎖端は、オリゴヌクレオチドの別のペアの単一鎖端と共にアニールするようにデザインされる。オリゴヌクレオチド・ペアはアニールすることが可能であり、これらの二重鎖フラグメントの約５〜６個は、次いで、付着単一鎖端を介して一緒にアニールすることが可能であり、次いで、これらは一緒に連結され、標準の細菌クローン化ベクター内にクローン化される。
【０１７０】
作成物は、次いで、標準的方法により配列を作成される。８０〜９０塩基ペア・フラグメントの５〜６個からなるこれらの作成物のいくつかは一緒に連結され、望ましい全体配列が一連のプラスミド作成物で表されるように約５００塩基ペアのフラグメントが調製される。これらのプラスミドの挿入断片は、次いで、適切な制限酵素でカットされ、一緒に連結されて最終的合成作成物を形成する。最終作成物は、次いで、ベクター内にクローン化され、配列を形成して配列同一性を確認する。追加の方法は、熟練技能者には直ちに明らかになるであろう。さらに、遺伝子合成は、商業的に容易に利用できる。例えば、Ｊ．Ｃｅｌｌｏ，Ａ．Ｖ．Ｐａｕｌ，Ｅ．Ｗｉｍｍｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７，１０１６（２００２）を参照のこと。したがって、説明された方法を用いると、ポリペプチドの全体配列またはフラグメント、変異体またはそれらの誘導体は発現を増強される。種々の望ましいフラグメント、変異体または誘導体は、デザインされ、各々は、次いで、個別に発現を増強される。
【０１７１】
（ベクターおよび宿主細胞）
コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換された非内因性ＧＰＲ２２核酸が、一旦、デザインされ、産生されると、置換された核酸はベクター内でクローン化され、以下で説明する方法などの当該技術分野で周知の方法により適切な制御配列、プロモーター、転写終結配列、などに操作可能に連結されうる。そのようにして産生されたベクターは、興味深い宿主細胞の遺伝子改変に使用することができ、コードされたタンパク質の発現レベルが評価される。したがって、１つの実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチド発現作成物、ベクター、およびコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドまたはそのフラグメントの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸を含む宿主細胞に関する。
【０１７２】
したがって、本発明は、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸を含むベクター（「作成物」とも呼ばれる）を提供する。本発明の多くの実施形態では、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸は、鋳型として置換された核酸を用いるＧＰＲ２２  ｍＲＮＡの転写を命じるプロモーターなどの発現調節配列に操作可能に連結される。
【０１７３】
適切なプロモーターは、ウイルスプロモーターおよび真核遺伝子から導かれたプロモーターを含む、真核宿主細胞として機能するあらゆるプロモーターでよい。さらに適切なプロモーターは、ウイルスプロモーターおよび動物遺伝子から導かれたプロモーターを含む、動物宿主細胞（例えば、昆虫、哺乳類、魚、両生類、小鳥またはは虫類宿主細胞）として機能するあらゆるプロモーターでよい。代表的なプロモーターには、マウス・メタロチオネインＩ遺伝子配列（Ｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペス・ウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０早期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０，１９８１）；酵母胆汁遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２）；ＣＭＶプロモーター，ｔｈｅ  ＥＦ−１プロモーター，エクジソン応答性プロモーター，テトラサイクリン応答性プロモーター，などを含むが、これらに限定されない。ウイルス・プロモーターは、一般に特に強いプロモーターであるので特に興味深い。本発明で使用するプロモーターは、これらが導入される細胞型（および／または哺乳類）において機能を発揮するように選択される。
【０１７４】
さらに、本発明の方法により産生され置換されたＧＰＲ２２核酸は、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および転写ターミネーターも含めることができる転写ユニットの一部でよい。次いで、転写ユニットは、例えば、宿主細胞（例えば、哺乳類、酵母またはメラノフォア細胞）の一時的または安定なトランスフェクシヨンの方法において使用されうる発現ベクターに置かれてもよい。発現ベクターは、このＧＰＲ２２核酸配列によりトランスフェクトされたこれらの細胞の検出を可能にするために、選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン抵抗遺伝子を含むことができる（例えば、米国特許出願第４，７０４，３６２号を参照のこと。その開示内容は引用により本明細書に組み込まれている）。単一および二重発現カセット・ベクターを含むベクターは、当該技術分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：実験室マニュアル，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。適切な発現ベクターには、宿主細胞に導入することができ、コードされたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を命ずることができる、ウイルス・ベクター、プラスミドなどがある。レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス・ベクターも使える。ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドは、バクロウイルス（例えば、カリフォルニア州サンジエゴのＰｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ）を用いた本発明の方法により産生された、置換されたＧＰＲ２２核酸から昆虫細胞において発現されうる。種々の真核発現ベクターは、当業者に利用され、商業的に利用できる（例えば、カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州マウンテンビューのＣｌｏｎｔｅｃｈ；カリフォルニア州ラホラのＳｔｒａｔａｇｅｎｅから）発現ベクターを含む。商業的に利用できる発現ベクターには、非限定的な例として知られているＣＭＶプロモーター・ベースのベクターがある。本発明の方法により産生された、置換されたＧＰＲ２２核酸は、通常、ＧＰＲ２２発現カセットの作成を容易にするために、制限部位、複数のクローン化部位、プライマー結合部位、連結端部、組換え部位なども含めてよい。該発現カセットは、次いで、特定の宿主細胞に導入される。
【０１７５】
細胞内にＧＰＲ２２コード核酸を導入する方法は、当該技術分野でよく知られている。適切な方法には、電気穿孔法、粒子ガン技術、リン酸カルシウムの沈殿、直接マイクロ注入、トランスフェクション、形質導入、などがある。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の型および形質転換が生じる環境に依存する（即ち、インビトロ形質転換）。これらの方法に関する一般的な論議は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５に記載されている。一部の実施形態では、リポフェクタミンおよびカルシウム媒介遺伝子移動技術が使われる。
【０１７６】
本発明の適切な宿主細胞には、本発明の方法により産生された、置換されたＧＰＲ２２核酸によりコードされたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを発現しうるあらゆる真核細胞が含まれる。真核細胞は、動物細胞（昆虫、哺乳類、魚、両生類、小鳥またはは虫類の細胞）、または真菌細胞（例えば、酵母細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）でよい。通常、動物宿主細胞系が使われ、その非限定的な例は次のとおりである。即ち、モンキー腎細胞（ＣＯＳ細胞）；ＳＶ４０により変換されたモンキー腎ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５  １）；ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ−２９３［”２９３”］細胞，Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ＨＥＫ−２９３Ｔ［”２９３”］細胞；ベビー・ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）；シリアのゴールデン・ハムスターの細胞ＭＣＢ３９０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９５９５）；マウス・セルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；モンキー腎細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカ・グリーン・モンキー腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒトの子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファロ・ラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒトの肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；スポドプテラ・フルギペルダ昆虫Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１）；ヒトの肝細胞（ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウスの乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ３８３：４４−６８（１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）；およびマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１）。特定の実施形態では、動物の宿主細胞は哺乳類の宿主細胞である。特定の実施形態では、メラノフォアが使われる。メラノフォアは、両生類などの下等脊椎動物の皮膚細胞である。メラノフォアの使用に関連した物質および方法は、引用により全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５，４６２，８５６および６，０５１，３８６号の開示内容をフォローすればよい。特定の実施形態では、心筋細胞が使われる。特定の実施形態では、心筋細胞は哺乳類であり、特定の実施形態では、心筋細胞は新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）であり、これは当該技術分野で周知の方法［例えば、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１：１１７９−１１８６；その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている］により得ることができる。追加の細胞株は当業者には明らかになるであろう。多種多様な細胞株は、２０１１０−２２０９バージニア州マナサスの１０８０１Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ大学のｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから利用できる。
【０１７７】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞を産生するために、上で説明したように、コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強する置換された哺乳類ＧＰＲ２２核酸を含み、発現ベクターから哺乳類ＧＰＲ２２受容体を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培養する発現ベクターを用いて適切な宿主細胞（例えば、哺乳類、酵母またはメラノフォア細胞）のトランスフェクションを含む組換え宿主細胞を産生する方法に関する。下でより詳細に説明するように、このようにしてトランスフェクトされた宿主細胞は、本明細書で説明した方法により産生された、置換された哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸が、発現増強核酸であることを証明する方法において使用されてよい。下でより詳細に説明するように、このようにしてトランスフェクトされた宿主細胞は、哺乳類ＧＰＲ２２受容体を調節する化合物を同定する方法において使用してよい。一般に、これらの方法は、コードされたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強する、置換されたＧＰＲ２２核酸を含み、発現されたＧＰＲ２２受容体の機能性を抑制または刺激する化合物の能力を測定する発現ベクターをトランスフェクトされた組換え宿主細胞と候補化合物との接触を含み、機能性の抑制または刺激は、候補化合物がＧＰＲ２２受容体の調節剤であることを示している（その非限定的な例には、アゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニスト、およびアンタゴニストがある）。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを産生する方法は、適切な宿主細胞への一時的なトランスフェクションを含む。特定の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを産生する方法は、適切な宿主細胞への安定したトランスフェクションを含む。
【０１７８】
さらに、１つの実施形態では、本発明は、ヒト以外の哺乳類のヒトＧＰＲ２２受容体のトランスジェニックに関し、ＧＰＲ２２受容体は、本発明の方法により産生された、置換された核酸によりコードされる。別の実施形態では、候補化合物が、哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害を予防するか、または処置する効能を有するかどうかを確認するためにヒト以外のトランスジェニック哺乳類を用いる方法を提供する。一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２に関連した疾患または障害は、心筋梗塞およびうっ血性心不全を含むがこれらに限定されない、心筋虚血またはこれに関連した状態である。一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害は、虚血発作を含むがこれらに限定されない、脳虚血またはこれに関連した状態である。一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害は、アルツハイマー病である。別の実施形態では、候補化合物が哺乳類の心筋保護の効果を有するかどうかを確認するために、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類を用いる方法が提供される。別の実施形態では、候補化合物が哺乳類の神経保護の効果を有するかどうかを確認するために、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類を用いる方法が提供される。
【０１７９】
（ＧＰＲ２２コード核酸の発現レベルの評価）
一時的または安定な発現の場合、安定な宿主細胞（例えば、哺乳類またはメラノフォア宿主細胞）内にＧＰＲ２２コード核酸が一旦導入されると、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現レベルは、当該技術分野でよく知られたあらゆる方法により評価される。例えば、本発明の方法により第１の核酸から産生された、置換された非内因性ＧＰＲ２２核酸により増強された発現の供給は、トランスフェクトされたＤＮＡの固定された量について、第１核酸によりコードされたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現または置換されたＧＰＲ２２核酸によりコードされたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現とを比較することにより示すことができる。一部の実施形態では、野生型核酸は野生型ヒトＧＰＲ２２核酸である。一部の実施形態では、野生型核酸は、配列番号１または配列番号５を有する野生型ヒトＧＰＲ２２核酸である。前記比較は、当該技術分野で周知の適切なあらゆる方法でなされてよい。一部の実施形態では、前記比較は、第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものであり、その非限定的な例には、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性がある。
【０１８０】
限定ではなく、例示として、ＧＰＲ２２  ｍＲＮＡのレベル、特に定常状態ｍＲＮＡのレベル（例えば、実施例１３を参照のこと）を測定することにより、またはＧＰＲ２２  ｍＲＮＡの翻訳またはＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を評価（例えば、定常状態ＧＰＲ２２ポリペプチド発現のレベルを測定する、実施例１２を参照のこと）することにより発現レベルを決めることができる。ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを認識、またはＧＰＲ２２受容体ポリペプチドに融合したエピトープ・タグを認識する抗体が、定常状態ＧＰＲ２２ポリペプチド発現のレベルを測定する方法において使えることは当然である（代表的な商業的に利用できる抗体は下に提示している）。特定の実施形態では、定常状態ＧＰＲ２２ポリペプチド発現のレベルは、ＧＰＲ２２ポリペプチドの細胞表面発現のレベルである。定常状態ポリペプチド発現のレベルを評価するために抗体を用いる当該技術分野でよく知られた方法は、固定細胞の免疫染色、フロー・サイトメトリー、放射免疫アッセイ、細胞ベースのＥＬＩＳＡ、および定量的ウエスタン・ブロットを含むが、これらに限定されない。さらに、下および実施例のセクションで説明するように、ＧＰＲ２２ポリペプチドの発現は、ＧＰＲ２２の機能性の測定を含むプロセス、例えば、細胞内ＩＰ３のレベルの測定、細胞内ｃＡＭＰのレベルの測定、細胞内Ｃａ２＋のレベルの測定、などを含むプロセスにより評価される。（例えば、実施例１０と１１とを参照のこと。）代表的な機能分析については下でより詳細に説明する。
【０１８１】
（第２メッセンジャーをベースにしたアッセイを用いたＧＰＲ２２発現の評価）
ＧＰＲ２２は、検出可能な恒常的活性を示すＧｉ共役型受容体である。
ａ．  ｃＡＭＰアッセイ
Ｇｉは、酵素アデニリル・シクラーゼを抑制する。アデニリル・シクラーゼは、ＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒し、したがって、Ｇｉタンパク質に連結している活性化されたＧＰＲ２２受容体は、ｃＡＭＰの低下した細胞レベルと関係している。［一般に、”Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，編集者，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）．］したがって、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、ＧＰＲ２２の恒常的活性のレベルを測定することによりＧＰＲ２２発現の評価に利用することができる（即ち、細胞内ｃＡＭＰのレベルは恒常的に低下する）。ｃＡＭＰを測定する場合、当該技術分野で知られた種々のアプローチは、例えば、一部の実施形態で、利用することができ、１つのアプローチはＥＬＩＳＡベースのフォーマットにおいて抗ｃＡＭＰ抗体の使用に依存している。
【０１８２】
しかし、ｃＡＭＰの形成を抑制するようにＧｉに連結されるＧＰＲ２２などの活性化された受容体の場合、ｃＡＭＰレベルを測定するアッセイは、測定される変数が活性化すると低減する信号なので、難しいこともある。したがって、一部の実施形態では、活性化するとＧｉに連結するＧＰＲ２２受容体の活性化の兆候としてｃＡＭＰの産生の低減を測定する効果的な技法は、信号エンハンサー、例えば、活性化するとＧｓに連結する非内因性で、恒常的に活性化された受容体（またはアゴニストが知られている内因性連結受容体）を同時にトランスフェクトすることにより達成することができる。
【０１８３】
Ｇｓ共役型受容体を活性化すると、ｃＡＭＰの産生を増加させる。Ｇｉ共役型受容体の活性化は、ｃＡＭＰの産生を低下させる。したがって、同時トランスフェクション・アプローチはこれらの「反対の」作用を有利にしようとするものである。例えば、恒常的で非内因性の活性化されたＧｓ共役型受容体（｛信号エンハンサー」）と空の発現ベクターとを、同時にトランスフェクトすると、ベースラインｃＡＭＰ信号（即ち、Ｇｉ共役型受容体はｃＡＭＰレベルを下げるが、この「低下」は、恒常的に活性化されたＧｓ連結信号エンハンサーにより確立された実質的なｃＡＭＰレベルの増加と比べたものである）が得られる。信号エンハンサーをＧＰＲ２２受容体と同時にトランスフェクトすることにより、Ｇｉ連結受容体のインバース・アゴニストは測定されたｃＡＭＰ信号を増加させ、一方、Ｇｉ共役型受容体のアゴニスト（またはアゴニストが存在しない場合の恒常的に活性なＧｉ共役型受容体）は、この信号を低下させるであろう。本発明の方法により産生された、置換されたＧＰＲ２２核酸によりコードされたＧＰＲ２２ポリペプチド受容体の一旦増強された発現は、このようにして同定され、このシステムは、ＧＰＲ２２受容体を調節する候補化合物の同定に使われる。
【０１８４】
特定の実施形態では、置換された非内因性ＧＰＲ２２核酸は、信号エンハンサーを含むか、含まない前述のアッセイにおいて、置換されたＧＰＲ２２核酸による細胞内ｃＡＭＰ蓄積のレベルの抑制または低減が野生型ＧＰＲ２２核酸による抑制または低減の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、であるならば、発現増強ＧＰＲ２２核酸である。一部の実施形態では、野生型ＧＰＲ２２核酸は野生型ヒトＧＰＲ２２核酸である。一部の実施形態では、野生型ＧＰＲ２２核酸は、配列番号１または配列番号５の野生型ヒトＧＰＲ２２核酸である。（例えば、下の実施例１０を参照のこと。）
ｂ．  ＩＰ３アッセイ
さらに、異なる同時トランスフェクション・アプローチは、ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドのＧｉ信号をＧｇ信号に変換するように作用するＧｑ（ｄｅｌ）/ＧｉキメラＧタンパク質と同時に宿主細胞をトランスフェクトすることにより、Ｇｉ信号のＧｇ信号への変換を含む。Ｇｑは、ホスホ脂質をＰＩＰ２を加水分解して２つの細胞内メッセンジャー、即ち、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール  １，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）を生じる酵素ホスホリパーゼＣと関係がある。Ｇｑ共役型受容体の活性化は、細胞内ＩＰ３の蓄積の増加および細胞内Ｃａ２＋のレベルの増加と関係がある。［一般に、”Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，編集者，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。］したがって、Ｇｑ（ｄｅｌ）/ＧｉキメラＧタンパク質は、第２メッセンジャーであるイノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）またはジアシルグリセロール（ＤＡＧ）またはＣａ２＋が、例えば、ｃＡＭＰ産生の代わりに測定できるように、Ｇｉ信号をＧｑ信号に変換する。
【０１８５】
したがって、ＧＰＲ２２受容体が検出可能な恒常的活性のレベルを示すように、このアッセイは細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルおよび細胞内Ｃａ２＋のレベルを測定することによりＧＰＲ２２受容体の発現を測定できる。限定ではなく例示として、高いレベルの細胞内ＩＰ３蓄積は、高いレベルのＧＰＲ２２受容体の発現と関係がある。このアプローチは、本発明の方法により産生され、置換された非内因性ＧＰＲ２２核酸が発現増強ＧＰＲ２２核酸であることを証明するのに使用してよい（例えば、下の実施例１１を参照のこと）。
【０１８６】
本発明の方法により産生された、置換されたＧＰＲ２２核酸によりコードされたＧＰＲ２２ポリペプチド受容体の一旦増強された発現は、このようにして確認され、次いで、このシステムは、ＧＰＲ２２受容体を調節する候補化合物の同定に使える。例えば、Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ連結ＧＰＲ２２受容体のアゴニストは、細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルおよび細胞内Ｃａ２＋のレベルを高め、一方、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストは、細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルおよび細胞内Ｃａ２＋のレベルを低下させるであろう。限定ではなく例示として、細胞内Ｃａ２＋のレベルは、下で説明したように、蛍光イメージング・プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）により測定することができる。
【０１８７】
特定の実施形態では、Ｇｑ（ｄｅｌ）／ＧｉキメラＧタンパク質との同時トランスフェクションを含む前述のアッセイにおいて置換された核酸によりコードされたＧＰＲ２２によるＩＰ３蓄積の刺激または増加のレベルが、野生型核酸によりコードされたＧＰＲ２２のＩＰ３蓄積の刺激の少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１０００％であるならば、置換された非内因性ＧＰＲ２２核酸は発現増強ＧＰＲ２２核酸である。一部の実施形態では、野生型ＧＰＲ２２核酸は野生型ヒトＧＰＲ２２核酸である。一部の実施形態では、野生型ＧＰＲ２２核酸は、配列番号１または配列番号５を有する野生型ヒトＧＰＲ２２核酸である。（例えば、下の実施例１１を参照のこと。）
（本発明の合成ＧＰＲ２２コード核酸を用いた調節剤アッセイ）
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド発現作成物、ベクターおよび本発明の方法により産生された、置換されたＧＰＲ２２核酸を含む宿主細胞は、ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの調節剤として候補化合物を選別するアッセイにおいて使われる。ＧＰＲ２２受容体活性を調節する（例えば、増加または低減する）薬剤は、本発明の方法により産生された核酸によりコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と候補化合物とを接触させることにより同定されている。
【０１８８】
したがって、本発明は、ＧＰＲ２２ポリペプチドのリガンドを同定するためにテスト化合物を選別する方法を提供する。以下本明細書で数種類のアッセイが説明されているが、これらは例示だけのためのものであり、決して本発明を限定するものと解釈してはならない。多くの実施形態では、これらの方法は、発現増強ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを産生する細胞をテスト化合物と接触させ、適切な対照と関連した観察可能な細胞内活性（例えば、ｃＡＭＰまたはＩＰ３またはＣａ２＋の蓄積）に対するテスト化合物の効果の決定を含むインビトロな方法である。多くの実施形態では、適切な対照は、テスト化合物が存在しない場合の発現増強ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドである。例えば、検出可能な薬剤が細胞内第２メッセンジャー（即ち、ｃＡＭＰまたはＩＰ３またはＣａ２＋）である場合、ＧＰＲ２２受容体調節剤はこの第２メッセンジャーの細胞内蓄積を増加させるか、または低減させる。（下の実施例１０と１１とを参照のこと。）特定の実施形態では、ＧＰＲ２２受容体調節剤として同定されたテスト化合物は、検出可能な薬剤の量を、対照に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％低下させる。特定の実施形態では、ＧＰＲ２２受容体調節剤として同定されたテスト化合物は、検出可能な薬剤の量を、対照に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約１０倍または少なくとも約２０倍、またはそれ以上増加させる。
【０１８９】
代表的な実施形態では、本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸は適切な宿主細胞に導入され、該細胞はコードＧＰＲ２２ポリペプチドを発現する条件下でインキュベートされる。検出可能な薬剤（例えば、ｃＡＭＰまたはＩＰ３またはＣａ２＋）の量は、テスト化合物の存在および非存在の場合に、発現増強ＧＰＲ２２ポリペプチドを産生する細胞、またはこの種の細胞の群について決められる。特定の実施形態では、発現増強ＧＰＲ２２ポリペプチドを産生する細胞における検出可能な薬剤（例えば、ｃＡＭＰまたはＩＰ３またはＣａ２＋）の量は、該細胞をテスト化合物と接触させる前および該細胞がテスト化合物と接触後、即ち、候補化合物と接触後、通常、少なくとも約１０分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間またはそれ以上後に測定される。特定の実施形態では、前記決定は、直列よりむしろ並列になされる。上で説明したように、発現増強ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを産生する場合、検出可能な薬剤の検出は、適切なあらゆる方法により行ってよい。
【０１９０】
多種多様なテスト化合物は、上の方法により選別される。テスト化合物は、多数の化学種を包含するが、通常、これらの化合物は有機分子、好ましくは５０ドールトンを超え、約２５００ドールトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。テスト化合物は、タンパク質と構造的相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含み、通常少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能基グループの少なくとも２つを含む。テスト化合物は、上の官能基の１つ以上で置換された環状炭素原子または複素環構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含むことが多い。テスト化合物は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはこれらの組み合わせを含む生体分子の中にも存在する。
【０１９１】
テスト化合物は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な源から得られる。候補化合物は、ＧＰＲ２２受容体の活性を調節、例えば、抑制、拮抗、またはアゴナイズする分子の化学ライブラリーを選別することによりテストすることができる。化学ライブラリーは、ペプチド・ライブラリー、ペプチド模倣薬ライブラリー、化学合成ライブラリー、組換え、例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、インビトロ翻訳ベース・ライブラリー、および生物学的活性を有することが知られた内因性化合物のライブラリーなどの他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどでよい。血漿および組織抽出物などの生物学的物質などを含むがこれらに限定されない内因性候補化合物も選別されうる。
【０１９２】
一部の実施形態では、候補化合物の直接同定は、組み合わせ化学の技法を介して産生された化合物と共に行われ、このような分析のために数千の化合物がランダムに調製される。候補化合物は、便利な数の個々のメンバー（例えば、適切な化合物の数十〜数百〜数千〜数百万）を含んでよく、例えば、ペプチド、ペプトイド、他のオリゴマー化合物（環状または線状）、および鋳型ベースの比較的小さな分子、例えば、低分子量で医薬品の可能性がある（例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、環状炭素化合物、ポリ環状化合物、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイド、炭水化物およびアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンツヒドリルおよび複素環類、トリジン、インドール、チアゾリジン、など）化学ライブラリーのメンバーでよい。リストに載せた化合物のタイプは、例示的であり、非限定的である。
【０１９３】
代表的な化学ライブラリーは、数社から市販されている（ＡｒＱｕｌｅ，Ｔｒｉｐｏｓ/ＰａｎＬａｂｓ，ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）。一部のケースでは、これらの化学ライブラリーは、メンバー化合物が付着している基板上のライブラリーの各メンバーのアイデンティティーをコードする組み合わせ方法を用いて作られ、有効な調節剤である分子の同定を直ぐに直接行うことができる。したがって、多くの組み合わせアプローチにおいて、プレート上の化合物の位置が、その化合物の組成を特定する。このような方法により、多くの候補分子を選別することができる。
【０１９４】
（医薬品組成物）
さらなる開発のために選択された候補化合物（本発明の方法により哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤として、またはリガンドとして同定された候補化合物を含む）は、当業者によく知られた技法を用いて医薬品組成物を処方することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｏｓｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，編集者）。
【０１９５】
（キット）
上で説明したように、本発明の方法を実行する場合に使用する、試薬を含むキットも提供される。例えば、一部の実施形態では、本発明の方法により作られた発現増強ＧＰＲ２２核酸を含む組成物を含み、適切な宿主細胞プロモーターに操作可能に連結された、ＧＰＲ２２調節剤を同定するキットが提供される。別の実施形態では、発現増強ＧＰＲ２２核酸は、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および転写ターミネーターの１つ以上を含む転写ユニットの一部を形成してよい。別の実施形態では、発現増強ＧＰＲ２２核酸は、宿主細胞においてコードされたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを発現させることができる発現ベクター内に置かれてよい。
【０１９６】
キット部品は、貯蔵容器および／またはキットがデザインされたアッセイを実行する間に使われる容器内に存在してよい。上の部品に加えて、本発明のキットは、さらに、本発明の方法を実行するための使用説明書を含む。これらの使用説明書は、本発明のキット内にいろいろな形で存在し、その内の１つ以上はキット内に存在してよい。これらの説明書が存在してよい１つの形は、適当な培地または基板上にプリントされた情報として存在してよく、例えば、キットのパッケージにおいて、パッケージ・インサートにおいて、情報が１枚または数枚の紙にプリントされる。さらに別の手段は、コンピュータが読める培地、例えば、ディスケット、ＣＤなどで、情報はその上に記録されている。さらに、別の手段は、ウエブサイト・アドレスで、これはインターネットを介して離れたサイトにおいて情報にアクセスするために使われる。キット内には何か便利な手段が存在してよい。
【実施例】
【０１９７】
次の実施例は、当業者に本発明の調製方法および使用方法を完全な開示および説明を提示するために出したものであり、発明者らが彼らの発明と見なしているものの範囲を限定するためのものではなく、発明者らが以下の実験がなされたすべてであるとか、なされた唯一の実験であると述べるためのものでもない。用いた数（例えば、量、温度、など）については正確になるように努力したが、一部の実験誤差および偏差については説明する必要がある。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は℃であり、圧力は常圧またはそれに近い圧力である。標準略語は使用されてよく、例えば、ｂｐは塩基ペア、ｋｂはキロベース、ｐｌはピコリッター、ｓまたはｓｅｃは秒、ｍｉｎは分、ｈまたはｈｒは時間、ａｎはアミノ酸、ｋｂはキロベース、ｂｐは塩基ペア、ｎｔはヌクレオチド、ｉ．ｍ．は筋肉内に、ｉ．ｐ．は腹腔内に、ｓ．ｃ．は皮下に、など。
【０１９８】
本発明の実行は、特に明記しない限り、当該技術分野のスキルに入る、細胞生物学の普通の技法、細胞培養、分子生物学（ＰＣＲを含む）、ワクチン学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学を用いることになる。この種の技法は、文献で十分に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第１および第２巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集  １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；専門書，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４および１５５巻（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．編集）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドン，１９８７）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，メリーランド州ボルチモアのＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，（１９８９）を参照のこと。
【０１９９】
（実施例１：受容体の発現）
タンパク質を発現させる場合、当該技術分野に対して種々の細胞が利用できるが、真核細胞の利用が好ましく、動物細胞（例えば、哺乳類の細胞またはメラノフォア細胞）の利用がより好ましい。その主な理由は、実用性に基づくものである。即ち、ＧＰＣＲの発現の場合、酵母細胞などを利用し、例えば、哺乳類系で発達している受容体結合、遺伝子メカニズムおよび分泌経路を含まない（実際に酵母の場合には含まない）非動物細胞をプロトコルに導入することは可能であるが、使用可能な非動物細菌で得られた結果は、哺乳類細胞またはメラノフォア細胞で得られたものほどは好ましくない。哺乳類細胞の内、ＣＨＯ，ＣＯＳ−７，ＭＣＢ３９０１，２９３および２９３Ｔ細胞は、特に好ましい。ただし、用いられる特定の哺乳類細胞については、当業者の特定のニーズに基づけばよい。一部の実施形態では、哺乳類から得られた心筋細胞を使用すればよい。メラノフォアに関連して以下を参照のこと。
ａ．一時的なトランスフェクション
１日目、１０ｃｍの皿につき４×１０６の２９３細胞がプレート培養される。２日目、２つの反応管が用意される（各管について示された比率はプレートあたりの値である）：管Ａは０．５ｍｌの血清フリーのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）において４μｇＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；ＧＰＲ２２を有するｐＣＭＶベクター（「ＧＰＲ２２」は、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸または他の哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸）など）を混合して調製され、管Ｂは０．５ｍｌの血清フリーのＤＭＥＭにおいて２４μｌのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合して調製する。管ＡとＢとは、倒置して（数回）混合し、次いで、室温で３０−４５分間インキュベーションした。この混合物は、「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。蒔かれた２９３細胞は、１ＸＰＢＳで洗浄し、次いで、５ｍｌの血清フリーのＤＭＥＭを添加する。１ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、次いで、３７℃／５％ＣＯ２において４時間インキュベートする。トランスフェクション混合物は、吸引により除去し、次いで、１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を添加する。細胞は３７℃／５％ＣＯ２においてインキュベートする。４８時間インキュベーション後、細胞を収集し、分析に利用する。
ｂ．安定な細胞株
約１２×１０６の２９３細胞を１５ｃｍの組織培養プレート上に蒔き、１０％のウシ胎仔血清および１％のピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を含むＤＭＥ高グルコース培地中で培養する。２９３細胞を蒔いて２４時間後（または細胞密度が約８０％になるまで）、細胞は１２μｇのＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；ＧＰＲ２２を有するｐＣＭＶ−ｎｅｏｒベクター（「ＧＰＲ２２」は、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸または他の哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸））を用いてトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡは、６０μｌのリポフェクタミンおよび血清なしの２ｍｌのＤＭＥ高グルコース培地と合わせる。この培地は、プレートから吸引され、これらの細胞は血清を含まない培地で一度洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミン、および培地混合物は、血清を含まない１０ｍＬの培地と共にプレートに添加する。３７℃で４〜５時間インキュベーション後、培地は吸引され、血清を含む２５ｍｌの培地が添加される。トランスフェクションして２４時間後、培地は再度吸引され、血清を含む新鮮な培地が添加される。トランスフェクションして４８時間経過後、培地を吸引し、血清を含む培地を、５００μｇ/ｍｌの最終濃度にてジェネティシン（Ｇ４１８ドラッグ）を含めて添加する。トランスフェクトされた細胞では、Ｇ４１８抵抗遺伝子を含むポジティブにトランスフェクトされた細胞について選択を行う。培地は、選択時の４〜５時間毎に交換される。選択の間に、細胞は増殖して安定なプール、または安定なクローン選択のためのスプリットを作る。
【０２００】
（実施例２：ＧＰＣＲ活性化を測定するアッセイ（例えば、選別アッセイ））
選別アッセイなどのＧＰＣＲの活性化を評価するために種々のアプローチを利用できる。以下は例示であり、当業者は、技能者のニーズにとって優先的に有利であるこれらの技法を決定する能力があると信じている。
ａ．膜結合アッセイ：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質共役型受容体がその活性状態にある場合は、リガンド結合の結果としてまたは恒常的活性化の結果として、受容体はＧタンパク質に連結し、ＧＤＰの放出、次いで、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質−受容体錯体のアルファ・サブユニットはＧＴＰａｓｅとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰに徐々に加水分解し、その時点で受容体は通常失活する。活性化された受容体は、ＧＴＰとＧＤＰの交換を続ける。非加水分解性ＧＴＰ類似体、即ち［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、膜発現活性化受容体への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの増強結合を実証するために利用することができる。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いる利点は、（ａ）該結合はすべてのＧタンパク質共役型受容体へ一般的に適用でき、（ｂ）細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を該結合が拾い上げないようにする膜表面に近接している、ことである。
【０２０１】
このアッセイは、Ｇタンパク質共役型受容体が、関連受容体を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激する能力を利用している。したがって、このアッセイは、ＧＰＲ２２受容体、例えば、本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２受容体の調節剤として候補化合物を選別するために使われる。このアッセイは、一般的であり、すべてのＧタンパク質共役型受容体において薬剤発見の適用を有する。
【０２０２】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳにおいてインキュベートされ、１と約２０ｍＭのＭｇＣｌ２との間（この量は結果を最適化するために調節することができるが、２０ｍＭが好ましい）でｐＨ７．４、約０．３と約１．２ｎＭの間の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は結果を最適化するために調節することができるが、1.２ｎＭが好ましい）の結合緩衝液および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（例えば、ＧＰＲ２２受容体を発現する２９３細胞、例えば、本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２受容体、この量は最適化のために調節することができる）および１０μＭのＧＤＰ（この量は最適化のために変えることができる）を１時間用いてインキュベートする。小麦麦芽凝集素ビーズ（２５μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、次いで、添加し、この混合物をさらに３０分間室温でインキュベートした。これらのチューブは、次いで、室温で５分間１５００×ｇにて遠心分離し、シンチレーション・カウンターでカウントした。
ｂ．  Ｇｉ結合型ＧＰＣＲの細胞をベースにしたｃＡＭＰアッセイ
ＴＳＨＲは、活性化するとｃＡＭＰの蓄積を生じるＧｓ結合型ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を変異することにより恒常的に活性化されるであろう（即ち、アラニン残基をイソロイシン残基に変える）。Ｇｉ共役型受容体は、アデニリル・シクラーゼを抑制すると期待され、したがって、ｃＡＭＰ産生のレベルを低下させ、これがｃＡＭＰレベルの評価を挑戦的にすることができる。Ｇｉ共役型受容体の活性化の兆候としてｃＡＭＰの産生の低下を測定する有効な技法は、例えば、「信号エンハンサー」として恒常的に活性化された非内因性コード核酸ＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３１）（または恒常的に活性化されたＧｓ共役型受容体）を有する、同時トランスフェクション核酸コードＧｉ共役型受容体により達成することができる。核酸コード「信号エンハンサー」のトランスフェクションのみが、ｃＡＭＰの基準レベルを確立している。したがって、核酸コードＧＰＲ２２、例えば、野生型ＧＰＣＲ核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＣＲ核酸が、核酸コード信号エンハンサーと共に同時トランスフェクトされ、ＧＰＣＲ受容体発現のレベルの評価または選別に使用できるのはこの物質である。この種のアプローチは、ｃＡＭＰアッセイが使われる場合に、信号を効率的に産生するために利用できる。一部の実施形態では、このアプローチは、ＧＰＣＲ受容体発現のレベルを評価する場合、またはＧＰＣＲ受容体の調節剤として候補化合物の同定に使用するのは好ましい。ＧＰＲ２２などのＧｉ結合型ＧＰＣＲでは、このアプローチが使われる場合、ＧＰＣＲのインバース・アゴニストはｃＡＭＰ信号を高め、アゴニストはｃＡＭＰ信号を低下させるであろう。
【０２０３】
１日目、１０ｃｍのプレートにつき４×１０６の２９３細胞が板上で培養される。２日目、２つの反応管が、調製され（各反応管はプレートにつきこの比率に従う）、チューブＡは、０．５ｍｌ血清フリーＤＭＥＭ（カリフォルニア州アービンのＩｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてトータル４μｇのＤＮＡの場合（例えば、ｐＣＭＶベクター；変異されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３１）を有するｐＣＭＶベクター）；ＴＳＨＲ−Ａ６２３１およびＧＰＲ２２、例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸；など）哺乳類の細胞にトランスフェクトされた各受容体の２μｇのＤＮＡを混合して調製し、チューブＢは、０．５ｍｌ血清フリーＤＭＥＭ中２４μｌのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合して調製する。次いで、チューブＡとＢとは、倒置（数回）により混合され、室温で３０−４５分間インキュベートする。この混合物は、「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。プレート上に蒔かれた２９３細胞は１ＸＰＢＳで洗浄し、次いで、５ｍｌの血清フリーＤＭＥＭを添加する。トランスフェクション混合物１．０ｍｌを、次いで、細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ２において４時間インキュベートする。トランスフェクション混合物は、吸引により除去し、次いで、１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を添加する。細胞は３７℃／５％ＣＯ２においてインキュベートする。２４時間インキュベート後、細胞を収集し、分析に利用する。
【０２０４】
Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリル・シクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は細胞をベースにしたアッセイに用いるためにデザインされるが、熟練技能者のニーズにより粗製血漿膜を用いて使用するために改変することができる。フラッシュ・プレート・ウエルは、キラキラ光るコーティングを含み、このコーティングはｃＡＭＰを認識する特定抗体も含む。ウエルで産生されたｃＡＭＰは、放射性ｃＡＭＰトレーサーがｃＡＭＰ抗体に結合する直接競争により定量することができる。以下はＧＰＲ２２、例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸を発現する全細胞におけるｃＡＭＰレベルの変化を測定する短期プロトコルとして役立つ。
【０２０５】
トランスフェクトされた細胞は、一時的なトランスフェクションの後約２４〜４８時間かけて収集する。培地は注意深く吸引し、廃棄する。各細胞皿に１０ｍｌのＰＢＳを徐々に添加し、注意深く吸引する。１ｍｌのシグマ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰＢＳを各プレートに添加する。細胞はプレートからピペットで取り出し、細胞懸濁液は５０ｍｌの円錐遠心チューブに集める。次いで、細胞は、１１００ｒｐｍにて５分間室温で遠心分離する。細胞ペレットは、適切な容量のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）に注意深く再懸濁する。次いで、細胞は血球計算器を用いてカウントし、ＰＢＳを追加し適切な数の細胞を得る（約５０μｌ/ウエルの最終容量を有する）。
【０２０６】
ｃＡＭＰスタンダードおよび検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］）ｃＡＭＰ（５０μｌを含む）を、メーカーの説明書に従って調製し、維持する。アッセイ緩衝液は、選別するために新鮮なものを調製する必要があり、５０μｌの刺激緩衝液、３μｌのテスト化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μｌの細胞を含み、アッセイ緩衝液は使用するまで氷上に貯蔵することができる。このアッセイは、適切なウエルに５０μｌのｃＡＭＰスタンダードを添加して開始し、次いで、ウエルＨ−１１およびＨ−１２に５０μｌのＰＢＳを添加することができる。５０μｌの刺激緩衝液をすべてのウエルに添加する。３μｌの化合物溶液を分注しうるピンツールを用いて適切なウエルに選択された化合物（例えば、ＴＳＨ）を添加し、最終的には、テスト化合物の濃度は１２μＭになり、総アッセイ容積は１００μｌになる。次いで、細胞をウエルに添加し、室温で６０分間インキュベートした。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含む１００μｌの検出ミックスをウエルに添加する。次いで、これらのプレートをさらに２時間インキュベートし、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーション・カウンターで計数する。ｃＡＭＰ/ウエルの値は、各アッセイ・プレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から外挿する。
ｃ．  レポーターベースのアッセイ
１．  Ｃｒｅ−Ｌｕｃレポーター・アッセイ（Ｇｓ関連受容体）
２９３および２９３Ｔ細胞をウエルにつき２×１０４細胞の密度において９６ウエルのプレート上で培養し、メーカーの説明書に記載の次の日、リポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトする。ＤＮＡ／脂質の混合物を６ウエルの各トランスフェクションについて次のようにして調製する。即ち、１００μｌのＤＭＥＭ中２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌのＤＭＥＭ中２μｌの脂質（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター・プラスミド、５０ｎｇのｐＣＭＶ−ＧＰＲ２２（ＧＰＲ２２核酸、例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸を含むｐＣＭＶ）またはｐＣＭＶ単独、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３中のＧＰＲＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と弱く混合する。８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター・プラスミドは、次のようにして調製した。即ち、ｐβｇａｌベーシック・ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中ＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにおけるラット・ソマトスタチン・プロモーター（−７１／＋５１）をクローン化することによりベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌが得られた。アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８［Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（１９９６）７：１８８３−１８９３を参照のこと；その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）からＰＣＲにより、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶサイトにおいてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにクローン化され、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーター・ベクターを得ることによりｃＡＭＰ応答エレメントの８コピーが得られた。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター・プラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトにおけるｐＧＬ３−ベーシック・ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られたルシフェラーゼ遺伝子を用いて８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーター・ベクターにおいてベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子を置換することにより産生された。室温で３０分間インキュベーション後、ＤＮＡ／脂質混合物は４００μｌのＤＭＥＭで希釈し、１００μｌの該希釈混合物を各ウエルに添加する。細胞培養インキュベーターにおいて４時間インキュベーション後、各ウエルに１０％のＦＣＳを含む１００μｌのＤＭＥＭを添加する。次の日、トランスフェクトされた細胞を、１０％のＦＣＳを含む２００μｌ／ウエルのＤＭＥＭを用いて変性する。８時間後、ＰＢＳで1回洗浄後、フェノールレッドなしに、これらのウエルを１００μｌ／ウエルのＤＭＥＭで変える。メーカーの説明書に従い次の日ＬｕｃＬｉｔｅ（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）用いてルシフェラーゼ活性化を測定し、１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）シンチレーションおよびルミネッセンス・カウンター（Ｗａｌｌａｃ）で読みとる。
２．  ＡＰＩレポーター・アッセイ（Ｇｑ関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出する方法は、これらのプロモーターにＡＰＩエレメントを含む遺伝子の活性化を生じるＧｑ依存性ホスホリパーゼの周知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＡＰ−１  ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号２１９０７３）は、リン酸カルシウム沈殿の成分が４１０ｎｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ，８０ｎｇのｐＣＭＶ−ＧＰＲ２２発現プラスミド（ＧＰＲ２２核酸、例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸を含むｐＣＭＶ）および２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリ性ホスファターゼ発現プラスミド；アルカリ性ホスファターゼ活性は、試料間のトランスフェクション効率の変動を調節するためにトランスフェクトされた細胞の培地中で測定される）であることを除いて、ＣＲＥＢレポーター・アッセイについて上で説明したプロトコルに従って利用することができる。
３．  Ｓｒｆ−Ｌｕｃレポーター・アッセイ（Ｇｑ関連受容体）
Ｇｑ刺激を検出する１つの方法は、これらのプロモーターに血清応答因子を含む遺伝子の活性化を生じるＧｑ依存性ホスホリパーゼＣの周知の特性に依存する。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、例えば、ＣＯＳ７細胞におけるＧｑ結合型活性のアッセイに利用することができる。細胞は、このシステムのプラスミド成分およびメーカーの説明書によりＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号２００２８５）を用いて指示された発現プラスミドコーティングＧＰＲ２２ポリペプチドによりトランスフェクトされる。要するに、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ，８０ｎｇのｐＣＭＶ−ＧＰＲ２２（ＧＰＲ２２核酸、例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸を含むｐＣＭＶ）発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰは、メーカーの説明書のようにリン酸カルシウム沈殿内で合体される。沈殿の半分は、９６ウエル・プレート内の３つのウエル上に均等に分布させ、血清フリー培地中の細胞上に２４時間保持する。最後の５時間これらの細胞は、例えば、１μＭのテスト化合物と共にインキュベートする。次いで、これらの細胞は溶解し、メーカーの説明書のとおりに、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ，カタログ番号６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ｝液体シンチレーションおよびルミネッセンス・カウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いてアッセイした。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて分析することができる。
ｄ．細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ関連受容体）
１日目、本発明の方法により産生されたＧＰＲ２２受容体ポリペプチドを含む細胞（例えば、Ｇｑ（ｄｅｌ）／ＧｉキメラＧタンパク質および野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸または他の哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸と同時トランスフェクトされた細胞）は、通常１×１０５細胞／ウエルにて２４ウエルのプレート上に蒔くことができる（ただし、この数は最適化することができる）。２日目に細胞は、５０μｌ血清フリーＤＭＥＭ／ウエル中の０．２５μｇＤＮＡと５０μｌ血清フリーＤＭＥＭ／ウエル中の２μｌリポフェクタミンとをまず混合してトランスフェクトすることができる。この溶液を静かに混合し、室温で１５−３０分間インキュベートする。これらの細胞は、０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４００μｌの血清フリー培地はトランスフェクション培地と混合し、これらの細胞に添加した。次いで、これらの細胞は、３７℃／５％ＣＯ２において３〜４時間インキュベートし、トランスフェクション培地は除去し、１ｍｌ／ウエルのレギュラー増殖培地で置換する。３日目に細胞は３Ｈ−ミオ−イノシトールで標識する。短時間で、培地を除去し、０．５ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄する。次いで、０．５ｍｌイノシトール・フリー/血清フリーの培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を、３Ｈ−ミオ−イノシトール/ウエルの０．２５μＣｉを有するウエルに添加し、細胞は３７℃／５％ＣＯ２において１６−１８時間ｏ／ｎインキュベートする。４日目に細胞は、０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、イノシトール・フリー/血清フリーの培地１０μＭ、パーギリン１０ｍＭ塩化リチウムを含む０．４５ｍｌのアッセイ培地または０．４ｍｌのアッセイ培地および随意に５０μｌのテスト化合物を添加する。細胞は、次いで、３７℃で３０分間インキュベートする。細胞は、０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２００μｌのフレッシュな氷冷ストップ溶液（１ＭＫＯＨ；１８ｍＭのＮａ−ボレート；３．８ｍＭのＥＤＴＡ）をウエルに添加する。この溶液は、５−１０分または細胞が溶けるまで氷上に保持し、次いで、２００μｌのフレッシュな氷冷中和溶液（７．５％ＨＣｌ）により中和する。次いで、溶解物は、１．５ｍｌのエッペンドルフ・チューブに移し、１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）をチューブに添加する。この溶液を１５秒間渦流にして混合し、上の相をＢｉｏｒａｄ  ＡＧ１−Ｘ８（商標）アニオン交換樹脂（１００−２００メッシュ）に通す。第１に、樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖの水で洗浄し、０．９ｍｌの上の相をカラムに装填する。カラムは、５ｍＭのミオ−イノシトール１０ｍｌおよび５ｍＭのＮａ−ボレート／６０ｍＭのＮａ−ホーメートの１０ｍｌで洗浄する。イノシトール・トリスホスフェートを、２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍのアンモニウム・ホーメートを２ｍｌ含む１０ｍｌのシンチレーション・カクテルを含むシンチレーション小瓶に溶離させる。これらのカラムは、１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍのアンモニウム・ホーメートで洗浄して再生し、ｄｄ  Ｈ２Ｏで２度すすぎ、４℃の水に貯蔵する。
【０２０７】
（実施例３：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
１．  膜の調製
一部の実施形態では、本発明の方法により産生されたＧＰＲ２２受容体ポリペプチド（例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸または他の哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸によりトランスフェクトされた細胞）を含み、例えば、インバース・アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストのような候補化合物の同定に使われる膜は、次のようにして調製するのが好ましい。
ａ．  物質
「膜スクレープ緩衝液」は２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含み、ｐＨ７．４、「膜洗浄緩衝液」は２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡを含み、ｐＨ７．４、「結合緩衝液」は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含み、ｐＨ７．４である。
ｂ．  操作
すべての物質は、操作をとおして氷上に保持する。第１に、培地は細胞のコンフルエント単層から吸引し、次いで、１０ｍｌの冷却ＰＢＳですすぎ、吸引する。その後、５ｍｌの膜スクレープ緩衝液を添加して、細胞をスクレープし、次いで、細胞抽出液を５０ｍｌの遠心管に移す（４℃で１７分間２０，０００ｒｐｍにて遠心分離した）。その後、上澄み液を吸引し、ペレットを３０ｍｌの膜洗浄緩衝液に再懸濁し、４℃で１７分間２０，０００ｒｐｍにて遠心分離する。上澄み液を吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁する。次いで、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを用いて均質化する（１５−２０秒するとはじけてすべての物質が懸濁される）。本明細書では、これは「膜タンパク質」と呼ばれる。
２．  ブラッドフォードタンパク質アッセイ
均質化後、膜のタンパク質濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（タンパク質は約１．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、等分し、後で使用するために凍結（−８０℃）し、凍結した場合使用する際のプロトコルは次のとおりである、即ち、アッセイの当日凍結膜タンパク質は室温で解凍し、渦流により混合し、約１２×１，０００ｒｐｍにて約５−１０秒間Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いて均質化し、複数の調製では1回毎にホモジナイザーを完全に浄化する必要がある）を用いて測定する。
ａ．  物質
メーカーの説明書（Ｂｉｏｒａｄ，カタログ番号５００−０００６）に従って、結合緩衝液（上のように）、ブラッドフォード染料試薬、ブラッドフォードタンパク質スタンダードを使用する。
ｂ．  操作
二重管を用意し、１つは膜を含み、１つは対照として「ブランク」を含む。各々は８００μｌの結合緩衝液を含む。その後、１０μｌのブラッドフォードタンパク質スタンダード（１ｍｇ／ｍｌ）を各チューブに添加し、次いで、１０μｌの膜タンパク質を１つのチューブ（ブランクではない）に入れる。その後２００μｌのブラッドフォード染料試薬を各チューブに添加し、各々渦流にして混合させる。５分後、チューブを再び渦流にして混合させる、チューブ内の物質をキュベットに移す。次いで、ＣＥＣＩＬ３０４１分光光度計を用いて、波長５９５においてキュベットを読みとる。
３．同定アッセイ
ａ．物質
ＧＤＰ緩衝液は、３７．５ｍｌの結合緩衝液と２ｍｇのＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ−７１２７）とからなり、次いで、結合緩衝液における一連の希釈により０．２μＭのＧＤＰが得られ（各ウエルにおけるＧＤＰの最終濃度は０．１μＭＧＤＰである）、候補化合物を含む各ウエルは２００μｌの最終容積を有し、これは１００μｌのＧＤＰ緩衝液（最終濃度０．１μＭのＧＤＰ，結合緩衝液中の５０μｌの膜タンパク質、および結合緩衝液中の５０μｌの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ））（１０ｍｌの結合緩衝液につき２．５μｌの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）からなる。
ｂ．  操作
候補化合物は、９６ウエルのプレート・フォーマット（これらは−８０℃で凍結することができる）を用いて選別するのが好ましい。膜タンパク質（または対照として標的ＧＰＣＲを除く発現ベクターを有する膜）は、懸濁液になるまで短時間均質化する。次いで、タンパク質濃度は、上で説明したブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて測定することになるであろう。次いで、膜タンパク質（および対照）は、結合緩衝液中で０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈される（最終アッセイ濃度は１２．５μｇ／ウエル）。その後、１００μｌのＧＤＰ緩衝液はＷａｌｌａｃ  Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ（商標）（Ｗａｌｌａｃ）の各ウエルに添加する。次いで、５ｕｌのピンツールはこのようなウエル内の５μｌの候補化合物に移す（即ち、トータルアッセイ容積２００μｌの５μｌは、候補化合物の最終選別濃度が１０μＭになるように、１：４０の比率である）。やはり、汚染を回避するために、各移送ステップの後ピンツールは水（１Ｘ）、エタノール（１Ｘ）および水（２Ｘ）を含む３つの容器中ですすぐ必要がある、即ち、過剰の液体は各すすぎの後ツールから振り切り、紙およびキムワイプで乾燥する必要がある。その後、５０μｌの膜タンパク質を、各ウエルに添加し（ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドなしに膜を含む対照ウエルも利用される）、室温で５−１０分間予めインキュベートする。その後、結合緩衝液中［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）の５０μｌを各ウエルに添加し、次いで、室温で６０分間シェーカーでインキュベーションする（やはり、この実施例でもプレートはフォイルでカバーした）。次いで、２２℃で１５分間４０００ＲＰＭにてプレートを回転させてアッセイを停止する。次いで、これらのプレートは８チャンネルのマニホールドで吸引し、プレートカバーで密封した。次いで、これらのプレートは、設定”Ｐｒｏｔ．＃３７”（メーカーの説明書のように）を用いてＷａｌｌａｃ１４５０で読みとる。
【０２０８】
（実施例４：環状ＡＭＰのアッセイ）
例えば、インバース・アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニスト、のような候補化合物を同定する別のアッセイ・アプローチは、シクラーゼをベースにしたアッセイを利用することにより達成される。候補化合物のそのような同定に加えて、このアッセイ・アプローチは、上の実施例３で説明した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳからの結果を同定する独立したアプローチとして利用することができる。
【０２０９】
改変されたＦｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリル・シクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、ＧＰＲ２２の調節剤として候補化合物の同定に利用するのが好ましく、次のプロトコルによれば、本発明の方法により産生されたＧＰＲ２２が好ましい、（例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸または他の哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸によりトランスフェクトされた細胞）。
【０２１０】
トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションの約３日後に収集する。膜は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳと１０ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む、ｐＨ７．４の緩衝液に懸濁された細胞を均質化して調製する。均質化は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（商標）を用いて約１０秒間氷上で行う。得られるホモジネートは、４℃で１５分間４９，０００Ｘｇにて遠心分離する。次いで、得られるペレットは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳと０．１ｍＭのＥＤＴＡとを含む、ｐＨ７．４の緩衝液に再懸濁され、１０秒間均質化され、次いで、４℃で１５分間４９，０００×ｇにて遠心分離する。次いで、得られるペレットは、利用するまで−８０℃で貯蔵する。選別を直接確認する当日に、膜ペレットは、室温で徐々に解凍し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳと１０ｍＭのＭｇＣｌ２とを含む、ｐＨ７．４の緩衝液に再懸濁され、０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を得る（再懸濁された膜は使用するまで氷上に置かれる）。
【０２１１】
ｃＡＭＰスタンダードおよび検出緩衝液（２μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）乃至１１ｍｌの検出緩衝液を含む）を、メーカーの説明書により調製し、維持する。アッセイ緩衝液は選別のためにフレッシュなものを調製し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４で１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ユニット／ｍｌのクレアチン・ホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭのＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含み、次いで、アッセイ緩衝液は利用するまで氷上に貯蔵する。
【０２１２】
候補化合物（３μＬ／ウエル；１２μＭ最終アッセイ濃度）を、好ましくは、例えば、９６ウエルのプレートウエルに、４０μｌの膜タンパク質（３０μｇ／ウエル）および５０μｌのアッセイ緩衝液と共に添加する。次いで、この混合物を、ゆっくり振とうしながら、室温で３０分間インキュベートする。
【０２１３】
インキュベーションの後、１００μｌの検出緩衝液を各ウエルに添加し、次いで、２−２４時間インキュベーションする。次いで、”Ｐｒｏｔ．＃３１”を用いてＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（商標）プレート・リーダーでプレートをカウントする（メーカーの説明書のように）。
【０２１４】
（実施例５：Ｇｑ（ｄｅｌ）Ｇｉ融合作成物）
Ｇｑ（ｄｅｌ）Ｇｉ融合作成物は、キメラＧタンパク質であり、Ｇｑタンパク質α−サブユニット（”Ｇαｑ”）の最初の６個のアミノ酸は欠失され、ＧαｑのＣ末端基の５個のアミノ酸は、Ｇαｉサブユニットの対応するアミノ酸により置換されている。Ｇｑ（ｄｅｌ）ＧｉキメラＧタンパク質は、第２のメッセンジャーであるイノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）またはジアシルグリセロール（ＤＡＧ）またはＣａ２＋がｃＡＭＰ産生の代わりに測定されうるように、Ｇｉ信号をＧｑ信号に変換する。
【０２１５】
Ｇｑ（ｄｅｌ）Ｇｉ融合作成物は次のようにしてデザインされ、即ち、Ｎ末端の６個アミノ酸（ＧαｑサブユニットのＴＬＥＳＩＭ（配列番号１５）の配列を有するアミノ酸２から７）は欠失し、配列ＥＹＮＬＶ（配列番号１６）を有するＣ末端の５個のアミノ酸は、配列ＤＣＧＬＦ（配列番号１７）を有するＧαｉタンパク質の対応するアミノ酸により置換された。この融合作成物は、次のプライマーを用いてＰＣＲにより得られた。次のプライマーとは、５’−ｇａｔｃａａｇｃｔｔｃＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１８）および５’−ｇａｔｃｇｇａｔｃｃＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１９）およびプラスミド６３３１３（ＡＴＣＣ（登録商標）ナンバー６３３１３）であり、これは鋳型として血球凝集素タグを有するマウスＧαｑ野生型バージョンを含む。小文字のヌクレオチドは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩのクローン化サイトおよびスぺーサを含む。
【０２１６】
ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、次のサイクルによる増幅に利用した、即ち、９５℃２分、９５℃２０秒、５６℃２０秒、７２℃２分、および７２℃７分のステップ２から４までを３５回繰り返す。ＰＣＲ産生物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化し、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列した。融合作成物の配列を含むＴＯＰＯクローンからのインサートは、２ステップ・クローン化プロセスによりＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトにおける発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）内へ往復させた。核酸配列の配列番号２０およびＧｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ融合作成物のコードアミノ酸配列の配列番号２１を参照のこと。
【０２１７】
（実施例６：細胞内カルシウム濃度の測定に関する蛍光イメージング・プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ）
ｐＣＭＶ−ＧＰＲ２２（ＧＰＲ２２核酸、例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸または哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸を含むｐＣＭＶ；実験）またはｐＣＭＶ（負の対照）のいずれかにより安定に同時トランスフェクト細胞およびそれぞれのクローン化系からのＧｑ（ｄｅｌ）／ＧｉキメラＧタンパク質が、次の日のアッセイのために完全な培養培地（１０％ＦＢＳ，２ｍＭのＬ−グルタミン，１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ）を有する５．５×１０４細胞/ウエルにおいてポリ−Ｄ−リジン予備処理９６ウエル・プレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃３５６４０）に蒔かれる。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｆ１４２０２）インキュベーション緩衝液ストックを調製するために、１ｍｇのＦｌｕｏ４−ＡＭを、４６７μｌのＤＭＳＯおよび４６７μｌのＰｌｕｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｐ３０００）に溶解し、１ｍＭの原液を得る。この原液は−２０℃で１ヶ月貯蔵することができる。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指示染料である。
【０２１８】
候補化合物は、洗浄緩衝液（ｐＨ７．４の１ＸＨＢＳＳ／２．５ｍＭのＰｒｏｂｅｎｉｃｉｄ／２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）中で調製される。
【０２１９】
アッセイの時点で、培養培地はウエルから除去され、細胞はｐＨ７．４において１００μｌの４μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭのＰｒｏｂｅｎｉｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭのＨＥＰＥＳ/完全培地と共に充填される。３７℃／５％ＣＯ２におけるインキュベーションは、６０分間進めることが可能になる。
【０２２０】
１時間のインキュベーションの後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーション緩衝液は除去され、これらの細胞は１００μｌの洗浄緩衝液で２度洗浄される。各ウエルには１００μｌの洗浄緩衝液が残される。このプレートは、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターに６０分間戻される。
【０２２１】
ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージング・プレートリーダー；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）は、３０番目の秒に５０μｌの候補化合物を添加し、候補化合物によりさらに１５０秒間呼び起こされた細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の一時的変化を記録するようにプログラムされる。総蛍光変化カウントは、ＦＬＩＰＲのソフトウエアを用いてアゴニスト活性の測定に使われる。機器のソフトウエアは、蛍光読み取り値を正規化し、ゼロにおける等価な読み取り値を与える。
【０２２２】
一部の実施形態では、細胞は、ｐＣＭＶ−ＧＰＲ２２（ＧＰＲ２２核酸、例えば、野生型ＧＰＲ２２核酸または本発明の方法により産生された発現増強ＧＰＲ２２核酸または他の哺乳類ＧＰＲ２２コード核酸；実験的）またはｐＣＭＶ（負の対照）のいずれか、およびＧα１５かＧα１６いずれかの乱交雑Ｇタンパク質により安定して同時にトランスフェクトされる。
【０２２３】
前記事項は、安定してトランスフェクトされた細胞を用いてアゴニスト活性についてＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者はアンタゴニストの活性をキャラクタイズするためにアッセイを容易に改変することができる。当業者は、一方では、一時的にトランスフェクトされた細胞が使えることも認識するであろう。
【０２２４】
（実施例７：ＭＡＰキナーゼアッセイ）
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）は、受容体活性化を評価するためにモニターされてよい。ＭＡＰキナーゼは、いくつかのアプローチにより検出することができる。１つのアプローチは、ホスホリル化状態、即ち、ホスホリル化されていないか（不活性）、それともホスホリル化されているか（活性）の評価に基づいている。ホスホリル化タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動が遅く、したがって、ウエスタン・ブロットを用いた刺激を受けていないタンパク質と比較することができる。あるいは、ホスホリル化タンパク質に特異的な抗体が利用され（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、該抗体はホスホリル化キナーゼの増加の検出に使用することができる。いずれの方法でも、細胞はテスト化合物により刺激を受け、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液により抽出される。可溶性画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに塗布され、タンパク質は、電気泳動でニトロセルロースまたはＩｍｍｏｂｉｌｉｎに移動させられる。免疫反応帯は、スタンダード・ウエスタン・ブロット技法により検出される。可視または化学発光信号は、フィルム上に記録され、デンシトメトリーにより定量化される。
【０２２５】
別のアプローチは、ホスホリル化アッセイを介したＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づいている。細胞はテスト化合物により刺激を受け、可溶性抽出物が調製される。抽出物は、ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生システム、およびインスリン、またはＰＨＡＳ−Ｉにより制御された熱および酸に安定なホスホリル化されたタンパク質などのＭＡＰキナーゼに対して特異的な基板と共に３０℃で１０分間インキュベートされる。この反応は、Ｈ３ＰＯ４の添加により終結させられ、試料は氷上に移される。アリコートは、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１クロマトグラフィ紙上に斑点を付けられ、該紙はホスホリル化タンパク質を保持する。クロマトグラフィ紙は洗浄し、３２Ｐをカウントするのは液体シンチレーション・カウンターである。あるいは、細胞抽出物は、ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生システム、およびフィルター支持体にストレプタビディンにより結合されたビオチニル化ミエリン塩基性タンパク質と共にインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は、活性化されたＭＡＰキナーゼの基板である。ホスホリル化反応は、３０℃で１０分間行われる。次いで、抽出物は、フィルターを介して吸引され、該フィルターはホスホリル化ミエリン塩基性タンパク質を保持する。フィルターは洗浄し、３２Ｐは液体シンチレーション・カウンターでカウントする。
【０２２６】
（実施例８：メラノフォア技術）
メラノフォアは、両性類などの下等脊椎動物の皮膚細胞である。これらは、メラノソームと呼ばれる色素化細胞小器官を含む。メラノフォアは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を活性化すると、微小管ネットワークに沿ってこれらのメラノソーム再分散することができる。この色素移動の結果は、明らかに、細胞の色を明るくしたり、暗くすることである。メラノフォアでは、Ｇｉ共役型受容体の活性化から生じる細胞内ｃＡＭＰのレベルの低下が、メラノソームの細胞の中心への移動を引き起こし、色が劇的に明るくなる。次いで、ｃＡＭＰのレベルが上がると、Ｇｓ共役型受容体の活性化後、メラノソームは再分散され、細胞は再び暗くなる。Ｇｑ共役型受容体の活性化から生じるジアシルグリセロールのレベルの増加は、この再分散も誘発することができる。メラノフォアの応答は、受容体活性化の数分内に起き、単純で強い色の変化を生じる結果になる。この応答は、普通の吸光度マイクロプレート・リーダーまたは適当なビデオ画像化システムを用いて容易に検出することができる。他の皮膚細胞とは異なり、メラノフォアは神経的な頂点から導かれ、タンパク質の信号を補体全体が発現するように思われる。特に、これらの細胞は極端に広い範囲のＧタンパク質を発現するので、ほとんどすべてのＧＰＣＲを機能的に発現することができる。
【０２２７】
メラノフォアは、ＧＰＣＲに対して自然のリガンドを含めて化合物の同定に利用することができる。この方法は、特定の刺激に応じてこれらの色素を分散または凝集しうる色素細胞株のテスト細胞を導入、および哺乳類のＧＰＣＲ受容体などの外因性ＧＰＣＲを発現することにより行うことができる。刺激薬、例えば、メラトニンは、色素配置の初期状態をセットし、この色素はＧＰＣＲの活性化が色素分散を誘発するならば、テスト細胞内に凝集する。しかし、刺激薬を用いて細胞を刺激すると、色素配置の初期状態をセットし、この色素はＧＰＣＲの活性化が色素凝集を誘発するならば、色素は分散する。次いで、テスト細胞が化合物と接触し、細胞内の色素配置が色素配置の初期状態から変化するかどうかを決められる。リガンドを含むがこれに限定されない候補化合物による色素染料の分散は、ＧＰＣＲに連結すると、ペトリ皿の上で暗くなるようであり、色素細胞の凝集は明るくなるようである。
【０２２８】
物質および方法は、米国特許第５，４６２，８５６および６，０５１，３８６号の開示によりフォローすることができる。これらの特許の開示内容は、引用により全体が本明細書に組み込まれている。
【０２２９】
これらの細胞は、例えば、９６ウエルのプレートに蒔かれる（プレートにつき１つの受容体）。トランスフェクションの４８時間後、各プレート上の細胞の半分は、１０ｎＭのメラトニンで処理する。メラトニンは、メラノフォア内の内因性Ｇｉ共役型受容体を活性化し、該受容体がそれらの色素を凝集させる。細胞の残りの半分は、血清フリーの培地０．７ＸＬ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移される。１時間後、血清フリー培地内の細胞は、色素分散状態に留まり、メラトニンで処理された細胞は色素凝集状態にある。この点において、これらの細胞はテストまたは候補の化合物の用量反応で処理される。蒔かれたＧＰＣＲがテストまたは候補の化合物に結合すると、メラノフォアはこの化合物に応じて変色させられると予想される。受容体がＧｓまたはＧｑいずれかの共役型受容体であるならば、メラトニン凝集メラノフォアは色素を分散させられるであろう。対照的に、受容体がＧｉ共役型受容体であるならば、色素分散細胞は用量依存性の凝集をさせられるであろう。
【０２３０】
（実施例９：発現増強ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５の核酸の調製）
ＧＰＲ２２ポリペプチドの自然に生じるいくつかの変異体が、ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５を含めて同定されている。野生型核酸コードＧＰＲ２２  Ｒ４２５またはＧＰＲ２２  Ｃ４２５は、本発明の方法によりヌクレオチド置換をさせられ、コードＧＰＲ２２ポリペプチドの発現増強が置換された核酸によることを示すために下で説明された発現アッセイで使われた。
【０２３１】
野生型ＧＰＲ２２  Ｒ４２５コード領域のヌクレオチド配列は配列番号１として提示され、コードＧＰＲ２２  Ｒ４２５アミノ酸配列は配列番号２として提示される。コードされたＧＰＲ２２  Ｒ４２５ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２  Ｒ４２５コード領域のヌクレオチド配列は配列番号３として提示され、コードされたＧＰＲ２２  Ｒ４２５アミノ酸配列は配列番号４として提示される。配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列は同一である。
【０２３２】
野生型ＧＰＲ２２  Ｃ４２５コード領域のヌクレオチド配列は配列番号５として提示され、コードされたＧＰＲ２２  Ｃ４２５アミノ酸配列は配列番号６として提示される。コードされたＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２  Ｃ４２５コード領域のヌクレオチド配列は配列番号７として提示され、コードされたＧＰＲ２２  Ｃ４２５アミノ酸配列は配列番号８として提示される。配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列は同一である。
【０２３３】
ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５の野生型領域は、鋳型として用いた。コード領域内の個々のコドンを決定し、なされるべき個々のヌクレオチド置換を同定した。個々のヌクレオチド置換は、野生型ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５コード領域に導入され、合成ＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５コードポリペプチドが産生され、次いで、配列された。例えば、一旦デザインされた、全長発現増強ＧＰＣＲコード核酸は、制限部位を有する長さ約１５０ｂｐまでの一連の連続したセグメントに解体し、２つの隣接セグメントの間で操作した。各セグメントは、一組または二組の相補性オリゴヌクレオチドからなり、これらのオリゴヌクレオチドはそれをアニーリングすると特定の制限部位と適応した末端部を有する二重鎖ＤＮＡフラグメントを産生するようにデザインされたのでアニールされたフラグメントは標準細菌クローニング・ベクター内にクローン化された。この配列は、上で説明した同様に産生された隣接セグメントが制限部位に挿入される前に標準配列法により同定した。核酸およびコードＧＰＲ２２  Ｒ４２５ポリペプチドの発現を増強する置換された代表的なＧＰＲ２２  Ｒ４２５核酸およびコードＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドの発現を増強する置換された代表的なＧＰＲ２２  Ｃ４２５核酸の推定アミノ酸配列は、同定され、この特許文書の別表として添付した「配列リスト」に、それぞれ、配列番号３および配列番号７として載せている。
【０２３４】
（実施例１０：トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ２２受容体のシクラーゼ・アッセイによる発現増強ＧＰＲ２２核酸と野生型ＧＰＲ２２核酸の比較）
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ，またはサイロトロピン）受容体（ＴＳＨＲ）は、そのリガンドＴＳＨにより活性化すると細胞内ｃＡＭＰの蓄積を生じる。ＧＰＲ２２などの恒常的に活性なＧｉ共役型受容体に対応するｃＡＭＰの産生の低減を測定する有効な技法は、Ｇｉ共役型受容体とＴＳＨＲとの同時トランスフェクトであり、基礎ｃＡＭＰのレベルを上げるためにＴＳＨの存在下でアッセイを行い、ＴＳＨＲは「信号ウインドウ・エンハンサー」として作用する。ここでは、この種のアプローチを用いた。
【０２３５】
ＨＥＫ２９３細胞は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ，またはサイロトロピン）受容体（ＴＳＨＲ）およびｐＣＭＶベクターまたはｐＣＭＶと同時にトランスフェクトされた。該ｐＣＭＶはコードＧＰＲ２２  Ｒ４２５ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２（Ｒ４２５）［「ｓＧＰＲ２２（Ｒ４２５）」］核酸（配列番号３）、野生型ＧＰＲ２２（Ｒ４２５）［「ｗｔ」ＧＰＲ２２（Ｒ４２５）］核酸（配列番号１）、コードされたＧＰＲ２２  Ｃ４２５ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２（Ｃ４２５）［「ｓＧＰＲ２２（Ｃ４２５）」］核酸（配列番号７）、野生型ＧＰＲ２２（Ｃ４２５）［「ｗｔ」ＧＰＲ２２（Ｃ４２５）］核酸（配列番号５）からなる群から選択された核酸を含む。トランスフェクションはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞は１００ｎＭのＴＳＨ（Ｓｉｇｍａ）により刺激を受けるか１時間刺激を受けずに残され（「基礎」）、全細胞のｃＡＭＰを下で説明したようにＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒのカタログ番号＃ＳＭＰ００４Ｂからのアデニリル・シクラーゼ・フラッシュプレート・アッセイキットを用いて測定した。結果は図５に提示する。
【０２３６】
トランスフェクトされた細胞は、１００ｎＭのＴＳＨまたはビークルを含む抗ｃＡＭＰ抗体を塗布したウエルに入れた。すべての条件は、三重にテストした。ｃＡＭＰの刺激を可能にする室温における１時間のインキュベーションの後、１２５Ｉ−ｃＡＭＰを含む検出ミックス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒのキットに用意された）を各ウエルに添加し、このプレートを室温でもう１時間インキュベートすることができた。次いで、これらのウエルは結合していない１２５Ｉ−ｃＡＭＰを除去するために吸引した。結合した１２５Ｉ−ｃＡＭＰはＷａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて検出した。各試料中のｃＡＭＰの量は、既知濃度のｃＡＭＰをプレート上のいくつかのウエルに入れて得られた標準曲線と比較して測定した。
【０２３７】
図５に示したように、野生型核酸によりコードされたＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５は弱いＧｉ活性のみを示したが、置換された核酸によりコードされたＧＰＲ２２  Ｒ４２５およびＧＰＲ２２  Ｃ４２５は強いＧｉ活性を示し、ＴＳＨで刺激を受けたｃＡＭＰの蓄積を約８０％抑制した。図５に示した実験では、置換されたＧＰＲ２２核酸による細胞内ｃＡＭＰ蓄積のレベルの抑制は、野生型核酸による抑制の約３．４倍であった。これらの結果は、置換された核酸はコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強することを証明している。アミノ酸４２５における多型性（Ｒ対Ｃ）は、野生型または置換形のいずれでもＧｉ活性に対する効果はないように思われた。
【０２３８】
（実施例１１：Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ２２受容体のＩＰ３アッセイによる発現増強ＧＰＲ２２核酸と野生型ＧＰＲ２２核酸の比較）
ＨＥＫ２９３細胞はＧｑ（ｄｅｌ）／ＧｉキメラＧタンパク質およびｐＣＭＶまたはコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換されたヒトＧＰＲ２２（「ｓＧＰＲ２２」）または野生型ヒトＧＰＲ２２（「ｗｔＧＰＲ２２」）核酸を含むｐＣＭＶのいずれかと同時トランスフェクトされた。ＧＰＲ２２作成物は、Ｇｉ信号をＧｑ信号に換えるためにＧｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉキメラと同時トランスフェクトされた。Ｇｑ信号は、代わりの値として総イノシトール・ホスフェート蓄積のレベルを用いて、細胞内ＩＰ３蓄積のレベルを測定することにより評価した。
【０２３９】
ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に、１０ｃｍの皿につき３×１０６細胞の密度で蒔いた。ＨＥＫ２９３細胞は、２μｇのＧｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉおよび２μｇのリポフェクタミン（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１６６８−０２７）を用いて２μｇのＧＰＲ２２／ｐＣＭＶまたは空のｐＣＭＶのいずれかと共にトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、トランスフェクトされた細胞をウエルにつき８×１０５細胞にてポリ−Ｌ−リジンで処理した１２ウエルのプレートに再度蒔き、細胞が４〜６時間固着できるようにした。
【０２４０】
３Ｈミオ・イノシトールで細胞を標識するために、培地を除去し、細胞をイノシトール・フリー培地で洗浄し、次いで、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムおよび０．５ｕＣｉの３Ｈミオ・イノシトール（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充した、１ｍｌのイノシトール・フリー、血清フリーの培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ/Ｇｉｂｃｏフォーミュラ０２−５０９２ＥＡ；Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、およびピリドキシンＨＣｌを含むＤＭＥＭ、および、イノシトールを含まない、重炭酸ナトリウム、およびピルビン酸ナトリウム）を各ウエルに添加し、細胞を１６−１８時間インキュベートした。
【０２４１】
ここで説明したように、トランスフェクションの約４８時間後にＩＰ３アッセイに、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。この培地を除去し、１ｍｌのアッセイ培地（上で１０μＭのパーグリンおよび１０ｍＭの塩化リチウムを用いて補ったイノシトール・フリーの培地）で置換し、これらの細胞を３７℃で３時間インキュベートした。（ＧＰＲ２２の調節剤としてテスト化合物を選別するために、テスト化合物はこの３時間のインキュベーションの間に加える。）
インキュベーション後、吸引により培地を除去し、３００ｕｌの新たに調製したばかりの１ＭのＫＯＨ，１８ｍＭのＮａ−ボレート，および３．８ｍＭのＥＤＴＡを含む氷冷停止溶液で置換した。これらのプレートは、５−１０分間または細胞が溶解するまで氷上でインキュベートした。溶解物は、新たに調製した３００ｕｌの７．５％ＨＣｌを含む氷冷中和溶液で中和し、２ｍｌのマイクロ遠心管に移し、１ｍｌのクロロホルム：メタノール（１：２）を１５秒間渦流にすることにより抽出し、５分間高速で遠心分離した。１ｍｌの上の水相を予め樹脂（Ｂｉｏｒａｄ，ＡＧ１−Ｘ８  １００−２００メッシュ、ホーメート形）を充填したアニオン交換カラムに通した。
【０２４２】
カラムは、１０ｍｌの５ｍＭミオ・イノシトール、次いで、５ｍＭのＮａ−ボレート，および６０ｍＭのＮａ−ホーメートを含む１０ｍｌの溶液で洗浄した。総イノシトール・ホスフェートは、次いで、０．１Ｍのギ酸と１Ｍのギ酸アンモニウムを含む２ｍｌの溶離液で直接シンチレーション小瓶内に溶離した。１０ｍｌのシンチレーション・カクテルを小瓶に入れ、放射性イノシトール・ホスフェートをシンチレーション・カウンティングにより測定した。
【０２４３】
置換された核酸によりコードされたＧＰＲ２２は、媒介ＩＰ３蓄積において、野生型核酸によりコードされたＧＰＲ２２よりも、はるかに強い活性を示した（図６）。図６に示した実験では、置換された核酸によりコードされたＧＰＲ２２によるＩＰ３蓄積の刺激のレベルは、野生型核酸によりコードされたＧＰＲ２２によるＩＰ３蓄積の刺激のレベルの約８３％であった。これらの結果は、置換された核酸は、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強することを証明している。これは、図５でシクラーゼ・アッセイを用いて示した野生型ＧＰＲ２２によりコードされたＧＰＲ２２のＧｉ活性に比べて、置換された核酸によりコードされたＧＰＲ２２のはるかに強いＧｉ活性と一致している。
【０２４４】
（実施例１２：一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の免疫染色）
ＣＯＳ−７細胞は、ｐＣＭＶ（負の対照）またはＮ−末端ヘマグルチニン（ＨＡ）のタグを付けたβ２−アドレナリン作動性受容体（「β２−アドレナリン作動性」、正の対照）に対応するプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトし、野生型ＧＰＲ２２核酸（「野生型ＧＰＲ２２核酸」）によりコードされたＮ−末端ＨＡのタグを付けたヒトＧＰＲ２２、またはコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸（発現増強ＧＰＲ２２核酸）によりコードされたＮ−末端ＨＡのタグを付けたヒトＧＰＲ２２を、トランスフェクション２４時間後、ポリ−Ｄリジンを塗布したチェンバースライド上に蒔いた。トランスフェクションの４８時間後、これらの細胞は、４％パラホルムアルデヒド中室温で１５−２０分間固定し、室温で１５分間０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過させた。次いで、これらの細胞は、２％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むブロッキング緩衝液と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、第１の抗体（マウス抗ＨＡ抗体またはウサギ抗ヒトＧＰＲ２２ペプチド抗体）溶液と共に１時間インキュベートした。これらの細胞は、蛍光標識した第２の抗体（ＦＩＴＣ標識した抗マウスＩｇＧまたはＲＩＴＣ標識した抗ウサギＩｇＧ）およびＤＡＰＩ（核染色用）を用いて洗浄し、暗所で３０分間インキュベートした。これらの細胞は洗浄し、スライドを蛍光顕微鏡に取り付けた。
【０２４５】
図７に示したように、置換されたＧＰＲ２２核酸を用いてトランスフェクトした細胞は、野生型ＧＰＲ２２核酸を用いてトランスフェクトした細胞よりもはるかに高いレベルのＧＰＲ２２ポリペプチド発現を示し、置換された核酸はコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強することを証明している。これは、いずれかの抗ＨＡ抗体（インディアナ州インディアナポリス、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いると、まさにＮ−末端そのものにおいてＨＡタグを検出し、またはＧＰＲ２２のＣ−末端細胞質尾部においてペプチド配列を認識しているＧＰＲ２２特異性抗体を検出していることは明らかである。ＧＰＲ２２  Ｃ−末端抗体の特異性は、ベクター・トランスフェクト細胞またはβ２アドレナリン受容体トランスフェクト細胞ではなく、ＧＰＲ２２トランスフェクト細胞のみが、ＧＰＲ２２  Ｃ−末端抗体により染色されることを示すことにより実証された。さらに、共同染色実験が、ＧＰＲ２２  Ｃ−末端抗体が、抗ＨＡ抗体によっても染色されたＧＰＲ２２トランスフェクト細胞のみを標識したことを示した。
【０２４６】
（実施例１３：トランスフェクト細胞における発現増強ＧＰＲ２２  ｍＲＮＡの発現）
ＣＯＳ−７細胞は、トランスフェクションの前日に１０ｃｍの皿につき３×１０６個の細胞密度で蒔いた。ＣＯＳ−７細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１６６８−０２７）を用いて、発現増強ヒトＧＰＲ２２核酸（「ｓＧＰＲ２２」）を含むｐＣＭＶまたは空のｐＣＭＶ（「ｐＣＭＶ」）のいずれかの４μｇにより、トランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、すべてのＲＮＡは、メーカーの説明書によりＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から収集した。ノーザンブロット分析では、全部で２０μｇのＲＮＡは、ホルムアルデヒド含有アガロース・ゲル上で電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。次いで、膜を、配列番号２２として提供された、配列番号７のヌクレオチド３９１−０３５に対応する３２Ｐ−標識したｓＧＰＲ２２  ｃＤＮＡフラグメントで精査した。
【０２４７】
ハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％デキストラン・サルフェート、５０ｍＭ  トリス（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，＃９２３０）（ｐＨ７．５）、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１００μｇ/ｍｌの変性サーモン精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃で一晩行った。次いで、膜を０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを用いた６５℃における最終洗浄を含む一連の洗浄にかけた。洗浄した膜は、室温で２５分間フィルムに露出させた。得られた結果は、図８に示している。
【０２４８】
図８から、ｓＧＰＲ２２  ｍＲＮＡが室温で短期の露出後容易に検出されたことは明らかである。類似のノーザンブロット分析は、野生型ＧＰＲ２２  ＣＤＮＡから産生された適切なプローブを用いて野生型ＧＰＲ２２核酸について行い、等価な露出条件下で検出可能な信号は再現性よくは得られなかったが、露出時間を延長すると再現性よく得られた（図示していない）。何か特定のセオリーに拘束されたくないが、定常状態ｍＲＮＡレベルにおけるこの差は、野生型ＧＰＲ２２  ｍＲＮＡよりも安定であるｓＧＰＲ２２  ｍＲＮＡと一致している。
【０２４９】
（実施例１４：放射性標識付き化合物）
本発明は、ＧＰＲ２２受容体に結合したリガンドを検出するのに役立つテストリガンドの放射性同位元素を標識したバージョンにも関係している。一部の実施形態では、本発明はＧＰＲ２２受容体に結合したリガンドを検出するのに役立つ前記放射性標識したテストリガンドのライブラリーを明らかに考慮している。特定の実施形態では、前記ライブラリーは、少なくとも約１０、少なくとも約１０２、少なくとも約１０３、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６個の前記放射性標識したテスト化合物を含む。この種の前記放射性標識したテストリガンドを含む新規なＧＰＲ２２受容体アッセイを開発することは、本発明のもう１つの目的である。
【０２５０】
本発明は、ＧＰＲ２２受容体のリガンドとして候補化合物を同定するために競合結合の方法において使用するＧＰＲ２２受容体の既知のリガンドの放射性同位元素を標識したバージョンにも関係している。
【０２５１】
一部の実施形態では、化合物の放射性同位元素を標識したバージョンはその化合物と同一であるが、１つ以上の原子が、通常自然に存在する原子質量または原子番号とは異なる原子質量または原子番号を有する原子により置換されることは事実である。本発明の化合物に組み込まれる適切な放射性核種には、２Ｈ（重水素），３Ｈ（トリチウム），１１Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１３Ｎ，１５Ｎ，１５Ｏ，１７Ｏ，１８Ｏ，１８Ｆ，３５Ｓ，３６Ｃｌ，８２Ｂｒ，７５Ｂｒ，７６Ｂｒ，７７Ｂｒ，１２３Ｉ，１２４Ｉ，１２５Ｉおよび１３１Ｉがあるが、これらに限定されない。この放射性標識化合物に組み込まれる放射性核種は、放射性標識化合物の特定の用途に依存するであろう。例えば、インビトロＧＰＲ２２受容体標識付きおよび競合アッセイでは、３Ｈ，１４Ｃ，１８Ｆ，１２５Ｉ，１３１Ｉ，３５Ｓは一般に、最も役立つであろう。放射性画像化に使う場合は、１１Ｃ，１８Ｆ，１２５Ｉ，１２３Ｉ，１２４Ｉ，１３１Ｉ，７５Ｂｒ，７６Ｂｒまたは７７Ｂｒが一般に、最も役立つであろう。一部の実施形態では、放射性核種は、３Ｈ，１１Ｃ，１８Ｆ，１４Ｃ，１２５Ｉ，１２４Ｉ，１３１Ｉ，３５Ｓおよび８２Ｂｒからなる群から選択される。
【０２５２】
放射性同位元素を有機化合物に組み込む合成方法は、本発明の化合物に適用でき、当該技術分野でよく知られている。例えば、トリチウムの活性レベルを標的分子に組み込むこれらの合成方法は、次のとおりである。
【０２５３】
Ａ．トリチウムガスを用いた接触還元−この操作は通常比放射能の高い生成物が得られ、ハロゲン化または不飽和前駆体を必要とする。
【０２５４】
Ｂ．ナトリウム水素化ホウ素［３Ｈ］を用いた還元−この操作は費用は低いが、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステル、などの還元性官能基を含む前駆体を必要とする。
【０２５５】
Ｃ．水素化リチウムアルミニウム［３Ｈ］を用いた還元−この操作はほぼ理論的な比放射能の生成物を得る。アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステル、などの還元性官能基を含む前駆体も必要とする。
【０２５６】
Ｄ．トリチウムガス露出標識付け−この操作は適切な触媒の存在下でトリチウムガスに交換可能なプロトンを含む前駆体の露出を含む。
【０２５７】
Ｅ．ヨウ化メチル［３Ｈ］を用いたＮ−メチル化−この操作は通常高い比放射能のヨウ化メチル［３Ｈ］を用いた適切な前駆体を処理することにより、Ｏ−メチルまたはＮ−メチル［３Ｈ］生成物を調製するために用いる。この方法は、例えば、約７０−９０Ｃｉ／ｍｍｏｌなどの高い比活性を一般に可能にする。
【０２５８】
１２５Ｉの放射能レベルを標的分子に組み込む合成方法は、以下の方法を含む。
【０２５９】
Ａ．Ｓａｎｄｍｅｙｅｒおよび同様の反応−この操作は、アリールまたはヘテロアリール・アミンをテトラフルオロボレート塩などのジアゾニウム塩に変換し、次いで、Ｎａ１２５Ｉを用いて１２５Ｉ標識化合物に変換する。説明した操作は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８においてＺｈｕ，Ｄ．−Ｇ．および共同研究者により報告された。
【０２６０】
Ｂ．フェノール類のオルソ１２５ヨウ素化−この操作は、Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｍ．１９９９，４２，Ｓ２６４−Ｓ２６６においてＣｏｌｌｉｅｒ，Ｔ．Ｌ．および共同研究者により報告されたようにフェノールのオルソ位置における１２５Ｉの組み込みを可能にしている。
【０２６１】
Ｃ．アリールおよびヘテロアリール臭化物は１２５Ｉと交換する−この方法は、一般に２ステップ・プロセスである。第１のステップは、アリールまたはヘテロアリール臭化物の、例えば、トリアルキルスズハライドまたはヘキサアルキルスズ［例えば、（ＣＨ３）３ＳｎＳｎ（ＣＨ３）３］の存在下におけるＰｄ触媒反応［即ち、（Ｐｈ３Ｐ）４］を用いたまたはアリールまたはヘテロアリール・リチウムによる、対応するトリ−アルキルスズ中間体への変換である。説明された操作は、Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２においてＢａｓ，Ｍ．−Ｄ．および共同研究者により報告された。
【０２６２】
一部の実施形態では、化合物の放射性同位元素標識バージョンは放射性核種を含む１つ以上の置換基が追加されていることを除いて、その化合物と同一である。一部追加の実施形態では、この化合物はポリペプチドである。一部追加の実施形態では、この化合物は抗体またはこれらの抗原結合フラグメントである。一部追加の実施形態では、前記抗体はモノクローナル抗体である。適切な前記放射性核種には、２Ｈ（重水素），３Ｈ（トリチウム），１１Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１３Ｎ，１５Ｎ，１５Ｏ，１７Ｏ，１８Ｏ，１８Ｆ，３５Ｓ，３６Ｃｌ，８２Ｂｒ，７５Ｂｒ，７６Ｂｒ，７７Ｂｒ，１２３Ｉ，１２４Ｉ，１２５Ｉおよび１３１Ｉがあるが、これらに限定されない。この放射性標識化合物に組み込まれる放射性核種は、放射性標識化合物の特定の用途に依存するであろう。例えば、インビトロＧＰＲ２２受容体標識付きおよび競合アッセイでは、３Ｈ，１４Ｃ，１８Ｆ，１２５Ｉ，１３１Ｉ，３５Ｓは一般に、最も役立つであろう。放射性画像化に使う場合は、１１Ｃ，１８Ｆ，１２５Ｉ，１２３Ｉ，１２４Ｉ，１３１Ｉ，７５Ｂｒ，７６Ｂｒまたは７７Ｂｒが一般に、最も役立つであろう。一部の実施形態では、放射性核種は、３Ｈ，１１Ｃ，１８Ｆ，１４Ｃ，１２５Ｉ，１２４Ｉ，１３１Ｉ，３５Ｓおよび８２Ｂｒからなる群から選択される。
【０２６３】
放射性核種を含む１つ以上の置換基を追加する方法は、熟慮技能者の視野に入り、酵素方法［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｃ  ＪＪ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６９）１１３：２９９−３０５；Ｔｈｅｏｒｅｌｌ  ＪＩ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ＢＧ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９６９）２５１：３６３−９；これらの文献各々の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている］による放射性同位元素のヨウ素の追加および／またはクロラミン−Ｔ／ヨードゲン／ヨードビーズ方法［Ｈｕｎｔｅｒ  ＷＭ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣ，Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）１９４：４９５−６；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６３）８９：１１４−２３；これらの文献各々の開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている］を含むが、これらに限定されない。
【０２６４】
（実施例１５：ＧＰＲ２２アゴニスト活性の酵母レポーターアッセイ）
酵母細胞をベースとするレポーター・アッセイは、すでに文献で説明されている（例えば、Ｍｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：６８８１−６８８７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（１９９９）９：２４１３−２４１８；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１２１−１２３；国際公開第９９/１４３４４号，国際公開第００／１２７０４号，および米国特許第６，１００，０４２号を参照のこと）。要するに、酵母細胞は、内因性酵母Ｇ−アルファ（ＧＰＡ１）が欠失され、複数の技法を用いて作られたＧ−タンパク質キメラで置換されるように操作された。さらに、内因性酵母アルファ−細胞ＧＰＣＲ、Ｓｔｅ３が欠失され、最適な哺乳類ＧＰＣＲの相同的発現を可能にした。酵母では、真核細胞に保護されるフェロモン信号形質導入経路のエレメント（例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路）はＦｕｓ１の発現を操縦する。Ｆｕｓ１プロモーター（Ｆｕｓ１ｐ）の制御の下にβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）を置くことによりシステムが開発され、受容体の活性化が酵素による読み出しに導く。
【０２６５】
酵母細胞は、Ａｇａｔｅｐらにより説明された酢酸リチウム法（Ａｇａｔｅｐ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（ＬｉＡｃ／ｓｓ−ＤＮＡ／ＰＥＧ）プロトコル。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｔｉｐｓ  Ｏｎｌｉｎｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｊｏｕｒｎａｌｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）の適応により変換される。要するに、酵母細胞は、酵母トリプトン・プレート（ＹＴ）上で一晩増殖させる。キャリアー単一鎖ＤＮＡ（１０μｇ）、２つのＦｕｓｌｐ−ＬａｃＺレポーター・プラスミド（１つはＵＲＡ選択マーカーおよび１つはＴＲＰを含む）の各２μｇ、酵母発現ベクター（２μｇの複製起点）中のＧＰＲ２２（例えば、ヒト受容体）の２μｇおよび酢酸リチウム／ポリエチレングリコール／ＴＥ緩衝液はエッペンドルフ・チューブにピペツトで入れる。受容体または受容体ではない対照を含む酵母発現プラスミドは、ＬＥＵマーカーを有する。酵母細胞は、この混合物中に播種し、反応は３０℃で６０分間進行させる。次いで、酵母細胞は、４２℃で１５分間熱ショックを受ける。選択プレートは、合成規定酵母培地マイナスＬＥＵ，ＵＲＡおよびＴＲＰ（ＳＤ−ＬＵＴ）である。３０℃で２−３日インキュベートした後、選択プレート上で増殖させたコロニーは、次いで、ＬａｃＺアッセイにおいてテストする。
【０２６６】
β−ガラクトシダーゼの蛍光酵素アッセイを行うために、対象ＧＰＲ２２受容体を担持している酵母細胞は、液体ＳＤ−ＬＵＴ培地中で不飽和濃度（即ち、細胞はまだ分裂し、まだ固定相に到達していない）まで一晩増殖する。これらは最適アッセイ濃度のフレッシュな培地中で希釈され、９６ウエルの黒いポリスチレン・プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に９０μｌの酵母細胞を添加する。ＤＭＳＯに溶解され、１０％ＤＭＳＯ溶液中で１０Ｘ濃度に希釈されたテスト化合物は、プレートに添加され、これらのプレートは３０℃で４時間放置する。４時間後、β−ガラクトシダーゼの基質を各ウエルに添加する。これらの実験で、蛍光計の読み込みが可能になるフルオレセインを放出する酵素の基質である、フルオレセイン・ジ（β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）（ＦＤＧ）が使われる。ウエルにつき２０μｌの５００μＭＦＤＧ／２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００が添加される（細胞を透過させるのに洗剤が必要である）。基質を用いて６０分間細胞をインキュベーション後、ウエルに付き２０μｌの１Ｍの炭酸ナトリウムを添加、反応を停止し、蛍光信号を増強する。これらのプレートは、４８５／５３５ｎｍにおいて蛍光計で読みとる。
【０２６７】
空のベクターで変換した酵母細胞の蛍光信号を越えて、ＧＰＲ２２変換酵母細胞における蛍光信号が増加することは、ＧＰＲ２２受容体の機能性を刺激する化合物であるテスト化合物を示している。特定の実施形態では、本発明の化合物は、バックグラウンド信号の増加よりもさらに上に蛍光信号を増加させる（ビークルの存在下で得られた信号）。
【０２６８】
（実施例１６：受容体結合アッセイ）
テスト化合物は、本発明のＧタンパク質共役型受容体のリガンドであると知られた化合物と受容体との間の錯体の形成を低減させるテスト化合物の能力を評価することができる。特定の実施形態では、既知のリガンドは放射性標識されている。放射性標識された既知のリガンドは、化合物を同定または評価する選別アッセイにおいて使用することができる。一般論としては、新たに合成されたか同定された化合物（即ち、テスト化合物）は、放射性標識した既知のリガンドと受容体との間の錯体の形成を低減させる該化合物の能力により、受容体への放射性標識した既知リガンドの結合を低下させる該化合物の能力を評価することができる。
【０２６９】
他の態様では、テスト化合物は放射性標識することができ、対象ＧＰＣＲを含む細胞または対象ＧＰＣＲを含む膜へ結合する該化合物の能力を評価することにより本発明の対象ＧＰＣＲのリガンドであることを示すことができる。
【０２７０】
テスト化合物が存在しない場合の放射性標識した既知リガンドの特定の結合のレベルよりも低い、テスト化合物が存在する場合の放射性標識した既知リガンドの特定の結合のレベルは、テスト化合物が存在する場合に形成されている前記放射性標識した既知リガンドと前記受容体との間の錯体が、テスト化合物が存在しない場合より少ないことを示している。
【０２７１】
（本発明のＧタンパク質共役型受容体のリガンドであると知られた化合物と受容体との間の錯体を検出するアッセイ・プロトコル）
Ａ．受容体の調製
２９３細胞を本発明のＧタンパク質共役型受容体をコードしているポリヌクレオチドを含む１０ｕｇの発現ベクターと共に、６０ｕｌのリポフェクタミン（１５ｃｍの皿につき）を用いて、一時的にトランスフェクトした。これらの一時的にトランスフェクトされた細胞は、培地を取替えながら２４時間皿の中で増殖させ（培養密度７５％）、１０ｍｌ／皿のＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を除去した。次いで、これらの細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ遠心分離機で２０分間、１７，０００ｒｐｍ（ＪＡ−２５．５０ｒｏｔｏｒ）にて遠心分離する。次いで、ペレットを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に再懸濁し、５０ｍｌのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで均質化し、再度遠心分離した。上澄み液を除去後、結合アッセイに使用するまで、ペレットは−８０℃に貯蔵する。アッセイで使用した場合、膜は氷上で２０分間解凍し、次いで、１０ｍＬのインキュベーション緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，１００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を加えた。次いで、膜は渦流状に混合し、粗製膜ペレットを再懸濁させ、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＰＴ−３１００  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを用いて、１５秒間、設定６にて均質化する。膜タンパク質の濃度は、ＢＲＬ  Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて測定する。
Ｂ．結合アッセイ
結合全体では、総容積５０ｕｌの適切に希釈した膜（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭのＭｇＣｌ２，および１ｍＭのＥＤＴＡ；５−５０ｕｇのタンパク質を含むアッセイ緩衝液に希釈した）に９６ウエルのポリプロピレン・マイクロタイター・プレートに添加し、次いで、１００ｕｌのアッセイ緩衝液および５０ｕｌの放射性標識した既知のリガンドを添加する。非特異的な結合では、１００ｕｌの代わりに、５０ｕｌのアッセイ緩衝液を添加し、５０ｕｌの前記放射性標識した既知のリガンドを添加する前に、放射性標識していない１０ｕＭの前記既知リガンドを５０ｕｌ追加する。次いで、プレートを室温で６０−１２０分間インキュベートする。結合反応は、Ｂｒａｎｄｅｌｌの９６ウエル・プレート・ハーベスターを備えたＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＧＦ／Ｃ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒろ過プレートを介したアッセイ・プレートでろ過することにより終結し、次いで、０．９％ＮａＣｌを含む冷却５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄する。次いで、ろ過プレートの底を密封し、各ウエルに５０ｕｌのＯｐｔｉｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを添加し、プレートのトップを密封し、Ｔｒｉｌｕｘ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーション・カウンターでプレートをカウントする。テスト化合物が存在する場合、前記放射性標識した既知のリガンドと前記受容体の間で形成される錯体が少ないかどうかを決める場合は、１００ｕｌのアッセイ緩衝液を加える代わりに、１００ｕｌの適切に希釈した前記テスト化合物を適切なウエルに添加し、次いで、５０ｕｌの前記放射性標識した既知のリガンドを添加する。
【０２７２】
（実施例１７：心筋細胞生存の促進）
本発明の対象となる哺乳類ＧＰＲ２２受容体は、ここで説明したように、心筋細胞の生存を促進（増加）することを示すことができる。特に、本発明の対象となる哺乳類ＧＰＲ２２受容体は、ここで説明したように、血清フリー培地中で心筋細胞の生存を促進（増加）することを示すことができる。
【０２７３】
新生仔ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）は、Ａｄａｍｓら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１：１１７９−１１８６；その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）が説明したように調製する。要するに、心臓は、１〜２日生きたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの仔から得られ、コラゲナーゼと共に消化され、筋肉細胞はＰｅｒｃｏｌｌ勾配を通過させて浄化する。これらの細胞はラミニン被覆（３．５ｍｇ／ｃｍ２）したチェンバー・スライド（Ｎｕｎｃ）上で血清の存在下で一晩培養し、洗浄し、アデノウイルスに感染する前に、血清フリー培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ）中でさらに８時間インキュベートする。
【０２７４】
アデノウイルス発現ベクターによるＮＲＶＭの感染は、Ａｄａｍｓら（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（２０００）８７：１１８０−１１８７；その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）が説明したように行われる。哺乳類ＧＰＲ２２受容体をコードしているポリヌクレオチドは、組換えＧＰＲ２２アデノウイルス（ＡｄＧＰＲ２２）の産生より前にｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）内にサブクローニングされる。ＮＲＶＭは、血清フリー培地中でＡｄＧＰＲ２２により、またはＧＰＲ２２ポリペプチドを含まない空の対照アデノウイルス・ベクターにより、４８時間で１００ＰＦＵ／細胞の多重度で感染する。
【０２７５】
細胞の生存は、テキサスレッド共役ファロイジンおよびヘキスト３３３４２によるＮＲＶＭ共同染色により４８時間で評価する。哺乳類ＧＰＲ２２受容体は、ＡｄＧＰＲ２２グループの場合に得られた結果を対照アデノウイルス・グループまたは非感染細胞について得られた結果を比較することにより心筋細胞の生存を促進（増加）することを示すことができる。
【０２７６】
（実施例１８：アポトーシスから心筋細胞の救助）
本発明の対象哺乳類ＧＰＲ２２受容体は、ここで説明したように、アポトーシスから心筋細胞を救助することを示すことができる。特に、本発明の対象哺乳類ＧＰＲ２２受容体は、ここで説明したように、低酸素（８時間）に次ぐ再酸素負荷（２４時間）により刺激された血清欠乏により誘発されたアポトーシスまたは増加アポトーシスから心筋細胞を救助することを示すことができる。
【０２７７】
新生仔ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）は、Ａｄａｍｓら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１：１１７９−１１８６；その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）が説明したように調製する。実施例１７も参照のこと、上記。
【０２７８】
アデノウイルス発現ベクターによるＮＲＶＭの感染は、Ａｄａｍｓら（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（２０００）８７：１１８０−１１８７；その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）が説明したように行われる。実施例１７も参照のこと、上記。組換えＧＰＲ２２アデノウイルス（ＡｄＧＰＲ２２）および組換え緑色蛍光タンパク質アデノウイルス（ＡｄＧＦＰ）が産生される。ＮＲＶＭの第１群は、ＡｄＧＰＲ２２により感染する。第２に、ＮＲＶＭの対照群はＡｄＧＦＰにより感染する。
【０２７９】
血清フリー培地ＤＭＥＭまたは感染後のＦ１２中で１６時間培養すると、ＡｄＧＰＲ２２感染ＮＲＶＭの半分およびＡｄＧＦＰ感染ＮＲＶＭの半分は、低酸素処理を８時間受ける。低酸素は、９５％Ｎ２および／５％ＣＯ２を用いて注入した気密インキュベーターを用いて達成された（Ｖａｎ  Ｈｅｕｇｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９４）２６：１５１３−２４，その開示内容は引用により全体が本明細書に組み込まれている）。低酸素処理後、これらの細胞を周囲空気の環境に移し、血清フリーの培地をリフレッシュする。
【０２８０】
感染の４８時間後、細胞を収集する。アポトーシスは、オリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメント化（ａｋａ  ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）の分析により評価される。ＤＮＡは、メーカーの説明書（Ｇｅｎｔｒａ）によりＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キットを用いてＮＲＶＭから単離する。２％アガロース・ゲル上で等量のＤＮＡを分割し、紫外光の下で臭化エチジウムにより染色してフラグメント化を検出する。
【０２８１】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体は、低酸素処理を受けていないＡｄＧＰＲ２２感染細胞について得られた結果を低酸素処理を受けていない対照ＡｄＧＦＰ感染細胞について得られた結果と比較することにより、血清欠乏により誘発されたアポトーシスから心筋細胞を救出することを示すことができる。
【０２８２】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体は、低酸素処理を受けたＡｄＧＰＲ２２感染細胞について得られた結果を低酸素処理を受けた対照ＡｄＧＦＰ感染細胞について得られた結果と比較することにより、低酸素（８時間）後の再酸素負荷（２４時間）により刺激されたアポトーシスの増加から心筋細胞を救助することを示すことができる。
【０２８３】
本発明は、その特定の実施形態を参照しながら説明しているが、当業者には、本発明の真の意図と範囲とから逸脱することなく種々の変化がなされたり、等価なものが置換されることは当然である。さらに、本発明の目的、意図および範囲に対して多くの改変がなされてよい。この種の改変は、すべて、本明細書に添付された特許請求の範囲内でなされるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１Ａ】図１Ａは、野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５コード領域のヌクレオチド配列（配列番号１）を概略示している。コード領域を含むコドンは交互増強表示により示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａのヌクレオチド配列によりコードされたヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５（配列番号２；米国のジェンバンク受入れ番号ＮＰ＿００５２８６）のアミノ酸配列を概略示している。
【図２Ａ】図２Ａは、典型的な発現増強ヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５コード領域のヌクレオチド配列（配列番号３）を概略示している。コード領域を含むコドンは交互増強表示により示している。小文字は、配列番号１を参照することによるヌクレオチド置換を示している。未フォーマットの小文字は、グアニンまたはシトシンによるアデニンまたはチミンの置換を示している。イタリック体の小文字は、チミンによるアデニンの置換またはアデニンによるチミンの置換を示している。肉太の小文字は、シトシンによるグアニンの置換またはグアニンによるシトシンの置換を示している。未フォーマットのヌクレオチド置換は、コード領域のＧＣ含有量を増加させる。イタリック体および肉太のヌクレオチド置換は、コード領域のＧＣ含有量を変えない。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａのヌクレオチド配列によりコードされたヒトＧＰＲ２２  Ｒ４２５のアミノ酸配列（配列番号４）を概略示している。
【図３Ａ】図３Ａは、野生型ヒトＧＰＲ２２  Ｃ４２５コード領域のヌクレオチド配列（配列番号５）を概略示している。コード領域を含むコドンは交互増強表示により示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａのヌクレオチド配列によりコードされたヒトＧＰＲ２２  Ｃ４２５（配列番号６；米国のジェンバンク受入れ番号ＡＡＢ６３８１５）のアミノ酸配列を概略示している。
【図４Ａ】図４Ａは、典型的な発現増強ヒトＧＰＲ２２  Ｃ４２５コード領域のヌクレオチド配列（配列番号７）を概略示している。コード領域を含むコドンは交互増強表示により示している。小文字は、配列番号５を参照することによるヌクレオチド置換を示している。未フォーマットの小文字は、グアニンまたはシトシンによるアデニンまたはチミンの置換を示している。イタリック体の小文字は、チミンによるアデニンの置換またはアデニンによるチミンの置換を示している。肉太の小文字は、シトシンによるグアニンの置換またはグアニンによるシトシンの置換を示している。未フォーマットのヌクレオチド置換は、コード領域のＧＣ含有量を増加させる。イタリック体および肉太のヌクレオチド置換は、コード領域のＧＣ含有量を変えない。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａのヌクレオチド配列によりコードされたヒトＧＰＲ２２  Ｃ４２５のアミノ酸配列（配列番号８）を概略示している。
【図５】図５は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ２２のシクラーゼ・アッセイによる発現増強ＧＰＲ２２核酸と野生型ＧＰＲ２２核酸との比較を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｇｑ（ｄｅｌ）/Ｇｉ同時トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞におけるＧＰＲ２２受容体のＩＰ３アッセイによる、発現増強ＧＰＲ２２核酸と野生型ＧＰＲ２２核酸との比較を示すグラフである。
【図７】図７は、一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の免疫染色を描く一連の写真である。
【図８】図８は、トランスフェクトされた細胞におけるＧＰＲ２２  ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロットである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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