(57)【要約】眼の障害のある患者の治療、特に眼内圧、高い眼圧、および緑内障の治療を目的として、ＲｈｏキナーゼｍＲＮＡ発現を抑制するためにＲＮＡ干渉が提供される。ＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの標的としては、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２が含まれる。本発明は、被験体のＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を弱める方法を提供し、この方法は、長さが１９〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を被験体へ投与することを含む。
2009532325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、前記方法は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記被験体へ投与すること
を含み、前記干渉性ＲＮＡは、
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しており、
それによりＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの前記発現が弱められる、方法。
【請求項２】
前記被験体がヒトであり、該ヒトが高い眼圧を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体がヒトであり、該ヒトが、高い眼圧を発症する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖が、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域
を含む第２の干渉性ＲＮＡを前記被験体に投与することをさらに含み、
前記第２の干渉性ＲＮＡの前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの第２の部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記アンチセンス鎖は、それぞれ、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記第２のハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
高い眼圧の治療を必要とする被験体において高い眼圧を治療する方法であって、前記方法は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記被験体の眼へ投与すること
を含み、前記干渉性ＲＮＡは、
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しており、
それにより前記高い眼圧が治療される、方法。
【請求項９】
被験体のＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、前記方法は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記発現系へ投与すること
を含み、
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しているか、あるいは
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しており、
それによりＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの前記発現が弱められる、方法。
【請求項１０】
被験体における高い眼圧の標的ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、前記方法は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記発現系へ投与すること
を含み、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含んでおり、
それにより前記高い眼圧の標的ｍＲＮＡの前記発現が弱められる、方法。
【請求項１１】
前記高い眼圧の標的ｍＲＮＡがＲＯＣＫ１  ｍＲＮＡであり、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８または配列番号７９のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記高い眼圧の標的ｍＲＮＡがＲＯＣＫ２  ｍＲＮＡであり、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１または配列番号７２のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
高い眼圧の治療を必要とする被験体における高い眼圧を治療する方法であって、前記方法は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を前記被験体の眼へ投与すること
を含み、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含み、
それにより前記高い眼圧が治療される、方法。
【請求項１７】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８または配列番号７９のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１または配列番号７２のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が緑内障を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２８】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が、干渉性ＲＮＡ発現ベクターからインビボ発現を介して投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、干渉性ＲＮＡ発現ベクターからインビボ発現を介して投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３５】
高い眼圧の治療を必要とする被験体において高い眼圧を治療する方法であって、前記方法は、
ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を前記被験体へ投与すること
を含み、前記ｓｉＲＮＡの各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＲＯＣＫ１遺伝子または前記ＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、
方法。
【請求項３６】
前記組成物が、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮の投与を介して投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記干渉性ＲＮＡが、前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターからインビボ発現を介して投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む干渉性ＲＮＡと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項４２】
前記干渉性ＲＮＡはｓｈＲＮＡである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記干渉性ＲＮＡはｓｉＲＮＡである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記干渉性ＲＮＡはｍｉＲＮＡである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、組成物。
【請求項４６】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
被験体の高い眼圧の標的ｍＲＮＡの発現を弱める組成物の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、使用。
【請求項４９】
被験体における高い眼圧を治療する医薬の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含んでおり、
それにより前記高い眼圧が治療される、使用。
【請求項５０】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３、配列番号９〜配列番号３０および配列番号７３〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３１〜配列番号７２のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５３】
前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５４】
前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５５】
被験体における高い眼圧を治療するための医薬の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有している、使用。
【請求項５６】
被験体のＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を弱める組成物の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとの使用であって、
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しているか、あるいは
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有している、
使用。
【請求項５７】
前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項４８、４９または５５に記載の使用。
【請求項５９】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項４８、４９または５５に記載の使用。
【請求項６０】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４８、４９または５５に記載の使用。
【請求項６１】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の投与のために調製される、請求項４９または５５に記載の使用。
【請求項６２】
前記組成物が前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターを含む、請求項４９または５５に記載の使用。
【請求項６３】
前記医薬が高い眼圧の治療のためのものである、請求項４９または５５に記載の使用。
【請求項６４】
被験体において高い眼圧を治療する医薬の調製における、ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物の使用であって、
前記ｓｉＲＮＡの各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＲＯＣＫ１遺伝子または前記ＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、
使用。
【請求項６５】
前記組成物が、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮の投与のために調製される、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
前記組成物が前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターを含む、請求項６４に記載の使用。
【請求項６７】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項６４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、眼の障害におけるＲｈｏキナーゼｍＲＮＡ標的の発現を抑制するため、特に、高い眼圧および緑内障の治療において眼内圧を低下させるための、干渉性ＲＮＡ組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
緑内障は、特定の臨床上の特徴を共有する眼神経障害の雑多な群である。緑内障における視力の喪失は、視野の特徴的な変化、神経線維層の欠陥および視神経乳頭（ＯＮＨ）の進行性の杯形成によって臨床上診断される神経網膜における網膜神経節細胞の選択的な死によるものである。緑内障の発症の主要な危険因子のうちの１つは、高い眼圧（ｏｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ＯＨＴ）、即ち、眼内圧（ＩＯＰ）上昇の存在である。適切なＩＯＰは、眼の形状を維持するため、そして、無血管の角膜およびレンズへの眼房水の流出を可能にするための圧力勾配を提供するために必要とされる。ＩＯＰを低下させる医薬から利益を受ける患者によって実証されるように、ＩＯＰのレベルもまた、正常圧緑内障（ＮＴＧ）の病理に関与し得る。ＮＴＧ患者におけるＩＯＰの読み値に対して角膜の中心厚の調節がなされると、これらの患者の多くは、高い眼圧であることが分かる。
【０００３】
緑内障に伴うＩＯＰの上昇は、前眼房の虹彩−角膜角に位置する小さな特殊組織である小柱網（ＴＭ）における眼房水の流出抵抗の増大によるものである。ＴＩＭに対する緑内障性の変化としては、ＴＭ細胞の喪失、細胞外細胞片（タンパク質性プラーク（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｐｌａｑｕｅ）様の物質を含む）の堆積および蓄積が挙げられる。さらに、緑内障性のＯＮＨにおいて生じる変化もまた生じる。緑内障の眼において、ＯＮＨグリア細胞における形態および移動性の変化が生じる。ＩＯＰの上昇および／または一過性の虚血傷害に応じて、ＯＮＨの細胞外マトリクスの組成の変化、ならびに、グリア細胞および網膜神経節細胞の軸索の形態における変化が生じる。
【０００４】
原発性の緑内障は、解剖学上または生理学上の理由から来る、眼内液の流れの不均衡から生じる。続発性の緑内障は、眼に対する損傷もしくは外傷、または、既存の疾患の結果として生じる。慢性緑内障または単純緑内障としても知られる、原発性の開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、全ての原発性の緑内障の大部分を占める。ＰＯＡＧは、小柱網の変性により特徴付けられ、眼からの流体の廃液に対する異常に高い抵抗を生じる。このような抵抗の結果が、眼により正常に産生される流体を増加した抵抗を越えて駆動させるために必要とされるＩＯＰの増加である。
【０００５】
プロテインキナーゼを含むＲｈｏ結合コイルドコイル（ＲｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫとしても知られる）は、低分子ＧＴＰ結合タンパク質のＲｈｏファミリーのエフェクター（Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ）である。Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅシグナル伝達経路は、例えば、小柱網（ＴＭ）および／または毛様体筋（ＣＭ）細胞の細胞骨格の構成を変えることによって、眼房水の流出量の調節において役割を担うようである。Ｒｈｏキナーゼの低分子阻害剤は、ＴＭ細胞の形状および細胞骨格の構成において可逆的な変化を起こし、単離されたＣＭ組織の収縮性を低下させ、そして、器官培養における眼房水の流出量を増加させる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。同様の作用が、ドミナントネガティブなＲｈｏ結合ドメインの発現により生じる。しかし、Ｒｈｏキナーゼの低分子阻害剤を用いた治療は、血管拡張および結膜の充血も引き起こすようである。さらに、低分子ベースの治療の効果は、比較的短く、毎日の繰り返し投薬を必要とし、そして場合によっては、その効果が時間と共に減少する。
【非特許文献１】Ｗａｋｉ  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２２：４７０−４（２００１）
【非特許文献２】Ｈｏｎｊｏ  Ｍ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４２：１３７−４４（２００１）
【非特許文献３】Ｒａｏ  ＰＶ．ら、ＭｏＩ  Ｖｉｓ．１１：２８８−９７（２００５）
【非特許文献４】Ｒａｏ  ＰＶ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．４２：１０２９−３７（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
緑内障における高い眼圧の重要性および先行技術における治療方法の副作用を鑑みて、高い眼圧の治療方法の改善を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を沈黙させ、したがって高い眼圧もしくは緑内障を有する患者、または、高い眼圧もしくは緑内障を発症する危険性のある患者において眼圧を低下させる干渉性ＲＮＡを対象とする。Ｒｈｏキナーゼの標的は、ＲＯＣＫ１（ＲＯＣＫＩ、ＲＯＫβまたはｐ１６０ＲＯＣＫとしても知られる）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＣＫＩＩまたはＲＯＫαとしても知られる）を含む。本発明の干渉性ＲＮＡは、高い眼圧または緑内障（例えば、正常眼圧緑内障および開放隅角緑内障）を有する患者を治療するのに有用である。
【０００８】
本発明の一実施形態は、被験体におけるＲｈｏキナーゼｍＲＮＡ標的の発現を弱める方法を提供する。この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡなどの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体へ投与することを含む。一実施形態では、投与は、ヒトにおける高い眼圧の標的の発現を弱めるために、その被験体の眼に対してなされる。
【０００９】
本発明の一実施形態では、該干渉性ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。さらに、該アンチセンス鎖は、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２をコードするセンスｃＤＮＡ配列である配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５４０６）または配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４８５０）に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、それぞれ配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの該ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。このような組成物の投与は、該被験体のＲｈｏキナーゼの発現を弱める。
【００１０】
本発明の一実施形態では、干渉性ＲＮＡは、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される。本発明の別の実施形態では、干渉性ＲＮＡは、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される。
【００１１】
本発明は、第１の干渉性ＲＮＡに加えて、第２の干渉性ＲＮＡを被験体にさらに投与する方法を提供する。この方法は、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む第２の干渉性ＲＮＡをその被験体に投与することを含み、第２の干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの第２の部分に生理条件下でハイブリッド形成し、該アンチセンス鎖は、それぞれ配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの該第２のハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。第２の干渉性ＲＮＡは、第１の干渉性ＲＮＡとして同じｍＲＮＡを標的としても、異なるｍＲＮＡを標的としてもよい。さらに、第３、第４または第５などの干渉性ＲＮＡを同様に投与してもよい。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、被験体におけるＲｈｏキナーゼの発現を弱める方法であって、この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体へ投与することを含む。
【００１３】
ＲＯＣＫ１の発現を弱めるために、該１本鎖干渉性ＲＮＡは、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、該干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの該ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。ＲＯＣＫ１の発現は、それにより弱められる。
【００１４】
ＲＯＣＫ２の発現を弱めるために、該１本鎖干渉性ＲＮＡは、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、該干渉性ＲＮＡは、配列番号２に対応するｍＲＮＡの該ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。ＲＯＣＫ２の発現は、それにより弱められる。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、高い眼圧または緑内障の治療をその治療が必要な被験体において行う方法である。この方法は、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体の眼に投与することを含む。該アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、それぞれ配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの該ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。高い眼圧は、それにより治療される。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、高い眼圧または緑内障の治療をその治療が必要な被験体において行う方法であって、この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体の眼に投与することを含み、該干渉性ＲＮＡが、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含み、高い眼圧または緑内障がそれにより治療される。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、被験体におけるＲｈｏキナーゼ標的ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、この方法は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物をその被験体へ投与することを含み、該干渉性ＲＮＡが、以下のような配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む。
【００１８】
Ｒｈｏキナーゼ標的ｍＲＮＡがＲＯＣＫ１  ｍＲＮＡである場合、干渉性ＲＮＡは、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号  １８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８または配列番号７９に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む。
【００１９】
Ｒｈｏキナーゼ標的ｍＲＮＡがＲＯＣＫ２  ｍＲＮＡである場合、干渉性ＲＮＡは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１または配列番号７２に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態では、連続ヌクレオチドの該領域は、当該配列識別子の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域である。本発明のさらに別の実施形態では、連続ヌクレオチドの該領域は、当該配列識別子で識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からのそれぞれ１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域である。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、高い眼圧の治療をその治療が必要な被験体において行う方法であって、この方法は、ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物をその被験体へ投与することを含み、該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対してそれぞれ実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してｍＲＮＡの切断を誘導する。
【００２２】
１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体を有する干渉性ＲＮＡと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物は、本発明の一実施形態である。一実施形態では、該干渉性ＲＮＡが単離されている。「単離されている」という用語は、該干渉性ＲＮＡがその全自然環境から解放されていることを意味する。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物であって、この組成物において、該ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、該ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対してそれぞれ実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、該ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してｍＲＮＡの切断を誘導する。
【００２４】
本発明は、眼圧を低下させる所望の作用から、現行の小分子療法の望ましからざる副作用、例えば、充血を引き離すことができるので、Ｒｈｏキナーゼの小分子阻害剤を凌ぐ利点を提供する。
【００２５】
ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｍＲＮＡの発現を弱める医薬の調製における本明細書記載の実施形態のいずれかの使用も、本発明の一実施形態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して遺伝子発現を沈黙させる方法である。理論に拘ることは望まないが、ＲＮＡｉは、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）による、より長いｄｓＲＮＡの短分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への切断から始まる。ｓｉＲＮＡは、長さが普通約１９ヌクレオチド〜２８ヌクレオチド、または２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチド、または２１ヌクレオチド〜２２ヌクレオチドであり、ヌクレオチド２個の３’オーバーハングならびに５’リン酸末端および３’ヒドロキシル末端をしばしば含有するｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体中に組み込まれる。ＲＩＳＣは、このｓｉＲＮＡ鎖を使用して、組み込まれたそのｓｉＲＮＡ鎖に少なくとも部分的に相補的なｍＲＮＡ分子を特定し、次いでこうした標的ｍＲＮＡを切断するか、またはその翻訳を抑制する。したがって、ＲＩＳＣ中に組み込まれるｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖の名で知られている。パッセンジャー鎖またはセンス鎖の名で知られている他方のｓｉＲＮＡ鎖は、ｓｉＲＮＡから除かれ、標的ｍＲＮＡに少なくとも部分的に相同的である。当業者であれば、原理的には、ｓｉＲＮＡのいずれの鎖もＲＩＳＣ中に組み込まれ、ガイド鎖として機能できることを認識されよう。しかし、ｓｉＲＮＡの設計（例えば、アンチセンス鎖の５’末端におけるｓｉＲＮＡ二重鎖安定性の減少）により、アンチセンス鎖のＲＩＳＣ中への組込みを促進し得る。
【００２７】
ガイド鎖に少なくとも部分的に相補的な配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断は、そのｍＲＮＡおよびこのｍＲＮＡがコードする対応タンパク質の定常状態量を減少させる。あるいは、ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡを切断せずに、翻訳抑制を介して対応タンパク質の発現を減少させることもできる。他のＲＮＡ分子およびＲＮＡ様分子も、ＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現を沈黙させ得る。ＲＩＳＣと相互作用できる他のＲＮＡ分子の例には、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、１本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびダイサー−基質２７マーの二重鎖が含まれる。本明細書で使用する場合の用語「ｓｉＲＮＡ」とは、別途注記しない限り２本鎖干渉性ＲＮＡを指す。ＲＩＳＣと相互作用できるＲＮＡ様分子の例には、１個もしくは複数の化学修飾ヌクレオチド、１個もしくは複数のデオキシリボヌクレオチド、および／または１個もしくは複数の非ホスホジエステル結合を含有するＲＮＡ分子が含まれる。本考察のために、ＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現のＲＩＳＣ媒介変化に関与できるすべてのＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を、「干渉性ＲＮＡ」と呼称することとする。したがって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびダイサー−基質２７マーの二重鎖は、「干渉性ＲＮＡ」のサブセットである。
【００２８】
本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断のために触媒的に作用するようである、即ち、干渉性ＲＮＡは、化学量論的量未満で標的ｍＲＮＡの阻害を起こし得る。アンチセンス療法と比較して、有意に少ない干渉性ＲＮＡで、このような切断条件下で治療効果を得るのに十分である。
【００２９】
本発明は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）ｍＲＮＡの発現を抑制し、従って、緑内障を有する患者における眼内圧を低下させるための干渉性ＲＮＡの使用に関連する。Ｒｈｏキナーゼには２つのアイソフォームが存在する。すなわち、ＲＯＣＫ１（ＲＯＣＫＩ、ＲＯＫβまたはｐ１６０ＲＯＣＫとしても知られる）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＣＫＩＩまたはＲＯＫαとしても知られる）。本発明によれば、内因性に提供されるか、または、外因性に発現される本明細書中に記載の干渉性ＲＮＡは、ＲＯＣＫ  ｍＲＮＡを沈黙させることにおいて特に効果的である。
【００３０】
ＲＯＣＫの低分子阻害剤は、小柱網の細胞形状および細胞骨格の構成において可逆的な変化を起こし、単離された毛様体筋組織の収縮性を低下させ、そして、器官培養における眼房水の流出量を増加させる。同様の作用が、ドミナントネガティブなＲｈｏ結合ドメインの発現により生じる。ＲＯＣＫの低分子阻害剤を用いた治療は、ＩＯＰを低下させるが、このような治療はまた、充血も引き起こすようである。今日までに試験されているＲＯＣＫの低分子阻害剤は、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２に加えて、複数のキナーゼを抑制する。ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｍＲＮＡに対して特異性を有する本発明の干渉性ＲＮＡの使用は、治療の望ましからぬ充血作用から、治療の所望のＩＯＰ低下作用を引き離すことが期待される。
【００３１】
本明細書で引用した核酸配列は、別途指示しない限り、５’から３’の方向に書かれる。本明細書で使用する場合の用語「核酸」とは、ＤＮＡ中（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）もしくはＲＮＡ中（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）に存在するプリンもしくはピリミジン塩基を含む、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその改変形を指す。本明細書に示す干渉性ＲＮＡは、「Ｔ」塩基が天然にはＲＮＡ中に存在しないとしても、特に３’末端に「Ｔ」塩基を含んでもよい。「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、１本鎖分子または２本鎖分子を指すことができる。２本鎖分子は、Ａ塩基とＴ塩基、Ｃ塩基とＧ塩基、およびＡ塩基とＵ塩基とのワトソン−クリック塩基対形成により形成される。２本鎖分子の各鎖は、相互に部分的、実質的または完全な相補性を有してもよく、塩基配列の相補性の性質および程度にその結合強度が依存する、二重鎖ハイブリッドを形成することになろう。
【００３２】
ｍＲＮＡ配列は、対応するＤＮＡ配列の配列から容易に導かれる。例えば、配列番号１は、ＲＯＣＫ１のｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。このｍＲＮＡ配列は、「Ｔ」塩基を「Ｕ」塩基で置き換えたＤＮＡセンス鎖配列と同一である。したがって、ＲＯＣＫ１のｍＲＮＡ配列は配列番号１から分かり、ＲＯＣＫ２のｍＲＮＡ配列は配列番号２から分かる。
【００３３】
ＲｈｏキナーゼｍＲＮＡ（ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２）：プロテインキナーゼを含むＲｈｏ結合コイルドコイル（Ｒｈｏキナーゼまたは単にＲＯＣＫとしても知られる）は、低分子ＧＴＰ結合タンパク質のＲｈｏファミリーのエフェクター（Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ）である。Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅシグナル伝達経路は、例えば、小柱網（ＴＭ）および／または毛様体筋（ＣＭ）細胞の細胞骨格の構成を変えることによって、眼房水の流出量の調節において役割を担うようである。
【００３４】
ＲＯＣＫは、ＧＴＰ結合Ｒｈｏにより活性化されるセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＲＯＣＫの活性化は、アクチンフィラメントの組み立ておよび細胞の収縮性に関与するいくつかの物質（例えば、ミオシン軽鎖、ミオシン軽鎖ホスファターゼ、ＬＩＭキナーゼ、アデューシン（ａｄｄｕｃｉｎ）、ＥＲＭが挙げられる）のリン酸化をもたらす。従って、ＲＯＣＫは、張線維の形成、収縮、接着、移動、食作用、アポトーシスおよび細胞質分裂を含む、広範囲な種々の細胞プロセスを調節する。２つのＲＯＣＫのアイソフォームは、ＲＯＣＫ１（ＲＯＣＫＩ、ＲＯＫβまたはｐ１６０ＲＯＣＫとしても知られる）およびＲＯＣＫ２（ＲＯＣＫＩＩまたはＲＯＫαとしても知られる）である。この２つのアイソフォームは、特に、そのキナーゼドメインにおいて高度に類似している（アミノ酸レベルで９２％の同一性）が、これらは、その組織分布および細胞内での局在に差異が認められ、これらが、別個の重複しない機能をもつ可能性があることが示唆される。ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２は共に、ヒトの眼の前区域において発現される。
【００３５】
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号１で示したＲＯＣＫ１のＤＮＡ配列を受入番号ＮＭ＿００５４０６として示している。配列番号１は、ＲＯＣＫ１をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を示す（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基であることを別として）。ＲＯＣＫ１のコード配列は１番〜４０６５番のヌクレオチドである。
【００３６】
前記のＲＯＣＫ１  ｍＲＮＡ配列の同等配列は、スプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはその同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）である。同族体とは、別の哺乳動物種由来で、配列番号１に相同のＲＯＣＫ１  ｍＲＮＡ（オーソロガス体）である。
【００３７】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、「配列表」に配列番号２で示したＲＯＣＫ２のＤＮＡ配列を受入番号ＮＭ＿００４８５０として示している。配列番号２は、ＲＯＣＫ２をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を示す（「Ｕ」塩基の代わりに「Ｔ」塩基であることを別として）。ＲＯＣＫ２のコード配列は４５０番〜４６１６番のヌクレオチドである。
【００３８】
前記のＲＯＣＫ２  ｍＲＮＡ配列の同等配列は、スプライシング型、対立遺伝子型、アイソザイムまたはその同族体である。同族体とは、別の哺乳動物種由来で、配列番号２に相同のＲＯＣＫ２  ｍＲＮＡ（オーソロガス体）である。
【００３９】
ｍＲＮＡ発現の弱化：本明細書で使用する場合の語句「ｍＲＮＡ発現の弱化」とは、ある量の干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）を投与または発現することにより、ｍＲＮＡ切断または翻訳の直接抑制のいずれかを介して、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低減することを意味する。標的ｍＲＮＡまたは対応タンパク質の発現の低減は、通常「ノックダウン」と称し、非標的指向性コントロールＲＮＡ（例えば、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ）の投与または発現後の存在量に比して報告されている。５０％以上１００％以下の発現量のノックダウンが、本発明における実施形態で想定されている。しかし、本発明の目的のためにこのようなノックダウン量を実現することは、必要ではない。一実施形態では、Ｒｈｏキナーゼの標的のうちの１つを標的とする単一の干渉性ＲＮＡを投与することにより、ＩＯＰを低下させる。他の実施形態では、同じＲｈｏキナーゼの標的（例えば、ＲＯＣＫ１）を標的とする２種以上の干渉性ＲＮＡを投与することにより、ＩＯＰを低下させる。さらに他の実施形態では、両方のＲｈｏキナーゼ標的（例えば、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２）を標的とする２種以上の干渉性ＲＮＡを投与することにより、ＩＯＰを低下させる。
【００４０】
ノックダウンは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の増幅を用いたｍＲＮＡ量の測定、またはウェスタンブロットもしくは酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるタンパク質量の測定により、通常評価される。タンパク質量の分析により、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制双方の評価がなされる。ノックダウンを測定するさらなる技法には、ＲＮＡ溶液ハイブリッド形成、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリッド形成、マイクロアレイを用いる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、放射免疫アッセイおよび蛍光活性化細胞分析が含まれる。
【００４１】
ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２の阻害はまた、例えば、本明細書において以下に記載されるような、ＲＯＣＫ１−干渉性ＲＮＡまたはＲＯＣＫ２−干渉性ＲＮＡのトランスフェクション後にヒトＴＭ細胞において標的ｍＲＮＡ量または標的タンパク質量を評価することによって、インビトロで決定され得る。
【００４２】
本明細書で言及した標的の阻害は、例えば、眼内圧の改善、視野の喪失の改善、または視神経乳頭の変化における改善などの緑内障の症状の改善を観察することにより、ヒトまたは哺乳動物においても推測される。
【００４３】
干渉性ＲＮＡ：本発明の一実施形態では、干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、該センスおよびアンチセンス鎖は、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、それぞれについて、該アンチセンス鎖は、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｍＲＮＡの標的配列に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、該センス鎖は、それぞれＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｍＲＮＡの標的配列に対して、少なくともほぼ完全に連続して同一の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、該干渉性ＲＮＡは、連続ヌクレオチドが少なくとも１３個、１４個、１５個、１６個、１７個または１８個の領域であって、あるｍＲＮＡ内の対応標的配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からのそれぞれ１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、配列相補性比率（％）を有するか、または配列同一性比率（％）を有する該領域を含む。
【００４４】
該干渉性ＲＮＡの各鎖の長さは、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドを含み、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチドまたは４９ヌクレオチドの長さを含んでもよい。
【００４５】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、該アンチセンス鎖がＲＩＳＣ中に組み込まれ、従って、該ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に少なくとも部分的に相補的な標的ｍＲＮＡを、切断または翻訳抑制のためにＲＩＳＣが特定できるので、ｓｉＲＮＡの活性なガイド剤である。
【００４６】
本発明の実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列内の干渉性ＲＮＡ標的配列（例えばｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを用いて選択される。次いで、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２の標的配列に対応する干渉性ＲＮＡを、該標的配列を発現する細胞のトランスフェクションで試験し、その後、前記の通りノックダウンの評価を行う。
【００４７】
ｓｉＲＮＡ用に標的配列を選択する技法は、ロックフェラー大学のウェブサイト上で入手できるＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら、「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」、２００４年５月６日改訂；ＡｍｂｉｏｎのウェブサイトにあるＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃５０６、「ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．；および例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｅｎｓｃｒｉｐｔまたはＰｒｏｌｉｇｏのウェブサイトにある他のウェブ準拠設計ツールによって提供されている。最初のサーチパラメーターには、３５％と５５％との間のＧ／Ｃ含量および１９ヌクレオチドと２７ヌクレオチドとの間のｓｉＲＮＡ鎖長を含み得る。標的配列は、ｍＲＮＡのコード領域または５’もしくは３’非翻訳領域中に位置してもよい。
【００４８】
ＲＯＣＫ１  ｍＲＮＡ用の１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列の一実施形態は、配列番号１の６０５番〜６２３番のヌクレオチドに次のように存在する。
【００４９】
【化１】
2009532325.tif 000003
配列番号３の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、２１ヌクレオチド鎖およびヌクレオチド２個の３’オーバーハングを有する本発明のｓｉＲＮＡは、次の通りである。
【００５０】
【化２】
2009532325.tif 000004
各「Ｎ」残基は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ）または修飾ヌクレオチドでもよい。その３’末端は、個数１、２、３、４、５および６を含むいくつかの「Ｎ」残基を有し得る。各鎖上の「Ｎ」残基は、同一残基でも（例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧもしくはＴＴ）、または異なってもよい（例えば、ＡＣ、ＡＧ、ＡＵ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＵ、ＵＡ、ＵＣもしくはＵＧ）。３’オーバーハングは同じでもよく、異なってもよい。一実施形態では、両鎖は３’ＵＵオーバーハングを有する。
【００５１】
配列番号３の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、２１ヌクレオチド鎖および各鎖上に３’ＵＵオーバーハングを有する本発明のｓｉＲＮＡは、次の通りである。
【００５２】
【化３】
2009532325.tif 000005
該干渉性ＲＮＡは、ヌクレオチドの５’オーバーハングを有してもよく、または平滑末端を有してもよい。配列番号２の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、１９ヌクレオチド鎖および平滑末端を有する本発明のｓｉＲＮＡは、次の通りである。
【００５３】
【化４】
2009532325.tif 000006
２本鎖干渉性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の鎖同士は、連結してヘアピン即ちステム−ループ構造（例えばｓｈＲＮＡ）を形成してもよい。配列番号２の対応ｍＲＮＡ配列を標的とし、１９ｂｐ２本鎖ステム領域および３’ＵＵオーバーハングを有する本発明のｓｈＲＮＡは、次の通りである。
【００５４】
【化５】
2009532325.tif 000007
Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、または当業者に公知の修飾形である。ループ中のヌクレオチドＮの個数は、３以上２３以下、もしくは５以上１５以下、もしくは７以上１３以下、もしくは４以上９以下、もしくは９以上１１以下であるか、またはヌクレオチドＮの個数は９である。ループ中のヌクレオチドの一部は、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。このループの形成に使用できるオリゴヌクレオチドの例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６巻、５５０頁）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ら（２００２年）ＲＮＡ、８巻、１４５４頁）が挙げられる。生成する単鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構部と相互作用できる２本鎖領域を含むステム−ループ即ちヘアピン構造を形成することは、当業者により認識されよう。
【００５５】
前記に特定したｓｉＲＮＡ標的配列は、３’末端を伸長することによりダイサー−基質２７マーの二重鎖の設計を促進し得る。ＲＯＣＫ１  ＤＮＡ配列（配列番号１）中に特定した１９ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列（配列番号３）をヌクレオチド６個伸長すると、配列番号１の６０５番〜６２９番のヌクレオチドに存在する２５ヌクレオチドのＤＮＡ標的配列が次の通り得られる。
【００５６】
【化６】
2009532325.tif 000008
配列番号１０の対応ｍＲＮＡ配列を標的とする本発明のダイサー−基質２７マーの二重鎖は、次の通りである。
【００５７】
【化７】
2009532325.tif 000009
センス鎖の３’末端にあるヌクレオチド２個（即ち、配列番号８３のＧＡヌクレオチド）は、プロセシングを促進するためにデオキシヌクレオチドでもよい。ここに示すような１９ヌクレオチド〜２１ヌクレオチドの標的配列からのダイサー−基質２７マーの二重鎖の設計は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のウェブサイト、およびＫｉｍ，Ｄ．−Ｈ．ら、（２００５年２月）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３巻、２号、２２２〜２２６頁によりさらに考察されている。
【００５８】
化学合成により干渉性ＲＮＡを作製する際、一方または両方の鎖（存在する場合）の５’末端にあるヌクレオチドの５’位でリン酸化すると、結合型ＲＩＳＣ複合体のｓｉＲＮＡとしての効果および特異性を増強できるが、リン酸化は細胞内で起こり得るので必要ではない。
【００５９】
表１は、上記のようにして本発明のｓｉＲＮＡがそれから設計される、配列番号１および配列番号２のＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２のＤＮＡ標的配列の例を列挙している。ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２は、上記の通り２つのＲｈｏキナーゼアイソフォームをコードする。
【００６０】
【表１−１】
2009532325.tif 000010
【００６１】
【表１−２】
2009532325.tif 000011
【００６２】
【表１−３】
2009532325.tif 000012
。
【００６３】
上記の例で言及したように、当業者は、表１に示した標的配列情報を使用して、配列番号１または配列番号２における配列位置を参照し、それぞれ配列番号１または配列番号２に相補的またはほぼ相補的なヌクレオチドを付加または削除することにより、表１に示した配列より長いか短い長さを有する干渉性ＲＮＡを設計することができる。
【００６４】
ｓｉＲＮＡおよび他種の干渉性ＲＮＡにより導かれる標的ＲＮＡ切断反応は、非常に配列特異的である。一般に、標的ｍＲＮＡの一部分と配列が同一のセンスヌクレオチド鎖、および標的ｍＲＮＡの一部分に厳密に相補的なアンチセンスヌクレオチド鎖を含有するｓｉＲＮＡは、本明細書に言及するｍＲＮＡ阻害のためのｓｉＲＮＡの具体化である。しかし、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖と標的ｍＲＮＡとの間、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖とセンスｓｉＲＮＡ鎖との間の１００％配列相補性は、本発明の実施に必要ではない。したがって、例えば、本発明は、遺伝子変異、系統多型または進化的分岐により予想し得る配列変異を受け容れる。
【００６５】
本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡと少なくとも１９ヌクレオチドのほぼ完全な連続した相補性を有している。本明細書で使用する場合の「ほぼ完全な」とは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分と「実質的に相補的」であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖が同部分と「実質的に同一」であることを意味している。当業者に知られている「同一性」とは、配列同士間のヌクレオチドの順序および同一性を一致させることにより決定した際の、ヌクレオチド配列同士間の配列関連性の程度である。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列に対して、８０％の相補性および８０％から１００％までの相補性、例えば８５％の相補性、９０％の相補性または９５％の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ほぼ完全な相補性と見なされ、本発明に使用し得る。「完全な」連続した相補性は、連続する塩基対の標準的ワトソン−クリック塩基対形成である。「少なくともほぼ完全な」連続した相補性は、本明細書で使用する場合「完全な」相補性を包含する。同一性または相補性を決定するコンピュータ法が、ヌクレオチド配列同士の最大の一致度を特定するために設計されており、ＢＬＡＳＴＮが一例である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３〜４１０頁）。
【００６６】
用語「一致率（％）」とは、第１の核酸分子中にある連続ヌクレオチドが、第２の核酸分子中にある同じ長さの１組の連続ヌクレオチドに対して同じである比率（％）について示す。用語「相補率（％）」とは、第１の核酸分子中にある連続ヌクレオチドが、第２の核酸分子中にある１組の連続ヌクレオチドとワトソン−クリック式に塩基対を形成できる比率（％）について示す。
【００６７】
標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの一方の鎖（そのセンス鎖）との関係は、同一性の関係である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、存在する場合、パッセンジャー鎖とも称する。標的ｍＲＮＡ（センス鎖）とｓｉＲＮＡの他方の鎖（そのアンチセンス鎖）との関係は、相補性の関係である。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、存在する場合、ガイド鎖とも称する。
【００６８】
５’から３’の方向に書かれる核酸配列中の最後から２番目の塩基は、最後の塩基の次、即ち３’塩基の次の塩基である。５’から３’の方向に書かれる核酸配列の最後から２番目からの１３塩基は、３’塩基の次にあって３’塩基を含まない、最後の１３塩基配列である。同様に、５’から３’の方向に書かれる核酸配列の最後から２番目からの１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基または１８塩基は、３’塩基の次にあって３’塩基を含まない、最後のそれぞれ１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基または１８塩基の配列である。
【００６９】
「（配列識別子）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドと、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド」という語句は、１つのヌクレオチド置換を受け容れる。２つのヌクレオチド置換（即ち、１１／１３＝８５％の同一性／相補性）は、このような語句に含まれない。
【００７０】
本発明の一実施形態では、連続ヌクレオチドの領域は、各配列識別子で特定される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドと、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチドの領域である。２つのヌクレオチド置換（即ち、１２／１４＝８６％の同一性／相補性）が、このような語句に含まれる。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態では、連続ヌクレオチドの領域は、各配列識別子の配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドと、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチドの領域である。３つのヌクレオチド置換がこのような語句に含まれる。
【００７２】
配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡ中の標的配列は、そのｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域、ならびにそのｍＲＮＡのコード領域にあってもよい。
【００７３】
２本鎖干渉性ＲＮＡの鎖の一方または両方は、ヌクレオチド１〜６個の３’オーバーハングを有してもよく、そのヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはその混合物でもよい。オーバーハングのヌクレオチドは、塩基対を形成していない。本発明の一実施形態では、該干渉性ＲＮＡはＴＴまたはＵＵのオーバーハングを含む。本発明の別の実施形態では、該干渉性ＲＮＡは少なくとも１つの平滑末端を含む。末端は普通、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖が５’リン酸基を有し、センス鎖が５’ヒドロキシル基を有する。さらに他の実施形態では、末端は、他の分子または官能基の共有結合的付加によりさらに修飾される。
【００７４】
２本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、前記のように２本の単鎖で二重鎖を形成してもよく、または相補性の領域が、塩基対を形成し、ヘアピンループで共有結合的に連結することにより、１本鎖を形成する単一分子でもよい。ヘアピンはダイサーという名称のタンパク質により細胞内で切断され、塩基対をなす２個の個別分子からなる干渉性ＲＮＡを形成すると考えられている。
【００７５】
干渉性ＲＮＡは、ヌクレオチド１個または複数個の付加、欠失、置換または修飾により、天然ＲＮＡとは異なり得る。非ヌクレオチド性物質が、５’末端、３’末端、内部のいずれかで干渉性ＲＮＡと結合してもよい。このような修飾は、干渉性ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を高め、細胞取込を改善し、細胞標的の設定を増強し、干渉性ＲＮＡの追跡を補助し、安定性をさらに改善し、またはインターフェロン経路が活性化する可能性を低下させるために、通常設計される。例えば、干渉性ＲＮＡは、オーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端へピロリジンリンカーによりコレステロールを結合体することも、ｓｉＲＮＡに安定性を付与する。
【００７６】
さらなる修飾には、例えば、細胞浸透性を有することが知られている３’末端ビオチン分子、ナノ粒子、ペプチド模倣物質、蛍光色素、またはデンドリマーが挙げられる。
【００７７】
ヌクレオチドは、分子の塩基部分、糖部分またはリン酸部分上で修飾を受け、本発明の実施形態において機能し得る。修飾には、例えば、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ、ハロ、ヒドロキシル、チオールの各基、またはその組合せによる置換が含まれる。ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで代替すること、または２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋で代替した２’ＯＨ基などの糖修飾を有することなどの、安定性が増加するアナログで代用してもよい。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジンアナログの例には、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシン、Ｏ修飾およびＮ修飾ヌクレオチドなどが挙げられる。ヌクレオチドのリン酸基は、リン酸基の１個または複数の酸素を窒素または硫黄（ホスホロチオエート）で置換することにより、修飾してもよい。修飾は、例えば、機能の強化、安定性もしくは透過性の改善、または局在化もしくは標的誘導の指向に有用である。
【００７８】
干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖には、配列番号１または配列番号２の一部に相補的でない１つまたは複数の領域があってもよい。非相補領域は、相補領域の３’末端、５’末端もしくは両末端、または２つの相補領域の間にあってもよい。
【００７９】
干渉性ＲＮＡは、化学合成、インビトロ転写、またはダイサーもしくは類似活性の別の適当なヌクレアーゼによる、より長い２本鎖ＲＮＡの切断によって、外因的に生成してもよい。保護したリボヌクレオシドホスホロアミダイトから、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて作製される化学合成干渉性ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）などの商業的供給業者から入手することもできる。干渉性ＲＮＡは、例えば、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはその組合せによって、精製してもよい。あるいは、干渉性ＲＮＡは、試料処理による損失を避けるために、ほとんど精製せずに使用してもよい。
【００８０】
干渉性ＲＮＡは、例えば、プラスミドもしくはウイルス発現ベクターから、または１個もしくは複数のプロモーターおよび該干渉性ＲＮＡに対する１個もしくは複数の適当な鋳型を含むＰＣＲ生成フラグメントである、最小発現カセットから、内因的に生成することもできる。ｓｈＲＮＡ用の市販プラスミド系発現ベクターの例には、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズのもの（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、およびｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。干渉性ＲＮＡの発現用ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡＶ）ならびにヘルペスウイルスを含めた、多様なウイルスから誘導し得る。ｓｈＲＮＡ発現用の市販ウイルスベクターの例には、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒアデノ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。ウイルスベクターの選択、該ベクターから干渉性ＲＮＡを発現させる方法、およびウイルスベクターを送達する方法は、当業者の通常の技術内に入る。ＰＣＲ生成ｓｈＲＮＡ発現カセットを作製するキットの例には、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、およびｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｒｕｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が含まれる。第１の干渉性ＲＮＡは、第１の干渉性ＲＮＡを発現できる第１の発現ベクターからインビボで発現させることを介して投与してもよく、第２の干渉性ＲＮＡは、第２の干渉性ＲＮＡを発現できる第２の発現ベクターからインビボで発現させることを介して投与してもよく、または両方の干渉性ＲＮＡを発現できる単一の発現ベクターからインビボで発現させることを介して、両方の干渉性ＲＮＡを投与してもよい。
【００８１】
干渉性ＲＮＡは、Ｕ６プロモーターもしくはＨ１プロモーターなどのｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、またはサイトメガロウイルスプロモーターなどのｐｏｌ  ＩＩプロモーターを含めた、当業者に公知の様々な真核プロモーターから発現し得る。当業者であれば、こうしたプロモーターも、干渉性ＲＮＡの誘導発現を可能とするように適合できることを認識されよう。
【００８２】
生理条件下でのハイブリッド形成：本発明のある種の実施形態では、干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体の一部としてインビボでｍＲＮＡとハイブリッド形成をする。
【００８３】
「ハイブリッド形成」とは、相補的またはほぼ相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸同士が、相互作用してハイブリッドと称する水素結合複合体を形成する過程を指す。ハイブリッド形成反応は、感度良く選択的である。インビトロでのハイブリッド形成の特異性（即ち、ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ））は、例えば、予備ハイブリッド形成およびハイブリッド形成各溶液中の塩またはホルムアミドの濃度、ならびにハイブリッド形成温度で制御されるが、このような操作は当技術分野で周知のことである。詳細には、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリッド形成温度の上昇により、ストリンジェンシーが増加する。
【００８４】
例えば、高ストリンジェンシーの条件は、約５０％のホルムアミド、３７℃〜４２℃で起こることができよう。低ストリンジェンシーの条件は、約３５％〜２５％のホルムアミド、３０℃〜３５℃で起こることができよう。ハイブリッド形成に対するストリンジェンシー条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に示されている。ストリンジェントなハイブリッド形成条件のさらなる例には、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃もしくは７０℃、１２〜１６時間の後、洗浄、または１ＸＳＳＣ中７０℃もしくは１ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでハイブリッド形成の後、０．３ＸＳＳＣ中７０℃で洗浄、または４ＸＳＳＣ中７０℃もしくは４ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでハイブリッド形成の後、１ＸＳＳＣ中６７℃で洗浄が含まれる。ハイブリッド形成の温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約５℃〜１０℃低く、Ｔｍは、次式の計算を用いて長さ１９塩基対と４９塩基対との間のハイブリッドについて決定され、Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である。
【００８５】
上記のインビトロハイブリッド形成アッセイは、候補ｓｉＲＮＡと標的との結合が特異性を有するか否かを予測する方法を提供する。しかし、ＲＩＳＣ複合体に関しては、標的の特異的切断が、インビトロのハイブリッド形成で高ストリンジェンシーを示さないアンチセンス鎖でも起こり得る。
【００８６】
１本鎖干渉性ＲＮＡ：上記のように、干渉性ＲＮＡは最終的に１本鎖として機能する。１本鎖（ｓｓ）干渉性ＲＮＡは、２本鎖ｓｉＲＮＡほどに有効ではないが、ｍＲＮＡの沈黙を起こすことが判明した。したがって、本発明の実施形態は、生理条件下で配列番号１または配列番号２の一部分とハイブリッドを形成し、配列番号１または配列番号２のそのハイブリッド形成部分と少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、ｓｓ干渉性ＲＮＡの投与も提供する。該ｓｓ干渉性ＲＮＡは、上記のｄｓ  ｓｉＲＮＡについては１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有する。該ｓｓ干渉性ＲＮＡは、５’リン酸を有するか、または５’位でインサイチュもしくはインビボでリン酸化される。「５’リン酸化」という用語は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端に、糖（例えば、リボース、デオキシリボースまたはそのアナログ）のＣ５ヒドロキシルへエステル結合を介して結合するリン酸基を有する、該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドについて述べるために使用される。
【００８７】
ｓｓ干渉性ＲＮＡは、化学的に、もしくはインビトロ転写により合成され、またはｄｓ干渉性ＲＮＡについてはベクターもしくは発現カセットから内因的に発現される。５’リン酸基はキナーゼにより付加してもよいし、または５’リン酸はＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果でもよい。送達は、ｄｓ干渉性ＲＮＡの場合と同じである。一実施形態では、保護末端およびヌクレアーゼ耐性修飾を有するｓｓ干渉性ＲＮＡが、沈黙のために投与される。ｓｓ干渉性ＲＮＡは、保存のために乾燥し、または水溶液中に溶解してもよい。該溶液は、アニーリング抑制または安定化のために緩衝剤または塩を含有してもよい。
【００８８】
ヘアピン干渉性ＲＮＡ：ヘアピン干渉性ＲＮＡは、ステム−ループ即ちヘアピン構造中に干渉性ＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖双方を含む単分子である（例えばｓｈＲＮＡ）。例えば、ｓｈＲＮＡは、センス干渉性ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが、その逆方向相補的なアンチセンス干渉性ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドと、短いスペーサーにより連結されているＤＮＡベクターから発現させることができる。選定した発現ベクターに必要であれば、３’末端Ｔおよび制限酵素部位を形成するヌクレオチドを付加してもよい。生成するＲＮＡ転写物は、折り返されてステム−ループ構造を形成する。
【００８９】
投与方式：干渉性ＲＮＡは、例えば、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮投与で送達してもよい。
【００９０】
干渉性ＲＮＡは、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、眼房内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内への注入などの眼組織注入；カテーテル、もしくは網膜ペレット、眼内インサート、坐剤などの他の留置用具、または多孔質、非多孔質もしくはゼラチン質材料から構成されるインプラントを用いた眼への直接施用；局所的な点眼用液滴または軟膏；あるいは盲管内の、または強膜に隣接して（経強膜）もしくは眼内に埋植した徐放用具により、眼に直接送達してもよい。眼房内注入は、角膜から前眼房内に薬剤が小柱網に到達できるように行い得る。涙管内注入は、シュレム管に排液する静脈集涙道またはシュレム管内に行い得る。
【００９１】
被験体：高い眼圧の治療が必要であるか、または高い眼圧を発現する危険性のある被験体は、本明細書で言及するような標的（即ち、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２）の不要もしくは不適当な発現もしくは活性に関連する高い眼圧を有する、または高い眼圧を有する危険性のあるヒトまたは他の哺乳動物である。このような障害に関係する眼の構造には、例えば、眼、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、前眼部もしくは後眼部、または毛様体を包含し得る。被験体は、眼の細胞、細胞培養物、器官、またはエクスビボでの器官もしくは組織でもよい。
【００９２】
処方物および投薬量：医薬処方物は、本発明の干渉性ＲＮＡまたはその塩９９重量％までを、水、緩衝液、塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどの生理的に受容可能なキャリアとの混合物として含む。
【００９３】
本発明の干渉性ＲＮＡは、溶液、懸濁液または乳濁液として投与される。以下の表は、本発明により具体化される考えられ得る処方物の例である。
【００９４】
【表２】
2009532325.tif 000013
。
【００９５】
一般的に、本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡの有効量は、標的細胞表面において１００ｐＭ〜１μＭ、または１ｎＭ〜１００ｎＭ、または５ｎＭ〜５０ｎＭ、または約２５ｎＭまでの細胞外濃度を生じる。この局所濃度の実現に必要な用量は、送達法、送達部位、送達部位と標的細胞または組織との間の細胞層数、送達の局所性または全身性如何などのいくつもの要因に依存して変化することになろう。送達部位における濃度は、標的細胞または組織の表面における濃度よりかなり高くなり得る。局所用組成物は、熟練臨床医の裁量に従って、毎日１〜４回、または毎日、毎週、隔週、毎月もしくはそれより長い頻度などの長期送達日程で標的器官の表面に送達される。処方物のｐＨは、約ｐＨ４〜９またはｐＨ４．５〜ｐＨ７．４である。
【００９６】
ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｍＲＮＡに対する干渉性ＲＮＡを用いた患者の治療的処置は、作用の持続期間を増加させ、したがって投薬頻度の減少および患者コンプライアンスの増大を可能とすることによって、小分子処置より有益であると予想される。
【００９７】
処方物の有効量は、例えば、被験体の年齢、人種および性別、高い眼圧の重度、標的遺伝子転写物／タンパク質代謝回転の速度、干渉性ＲＮＡの効力、干渉性ＲＮＡの安定性などの要因に依存し得る。一実施形態では、干渉性ＲＮＡは、局所の標的器官に送達され、網膜や視神経乳頭などのＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｍＲＮＡ含有組織に治療用量で到達することにより、高い眼圧に関連する疾患過程を軽減する。
【００９８】
受容可能なキャリア：受容可能なキャリアとは、ひどくてもほとんどないしまったく眼の刺激を起こさず、必要であれば適切な保護をもたらし、本発明の１種または複数の干渉性ＲＮＡを均一な用量で送達するようなキャリアを指す。本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡを投与するための受容可能なキャリアには、カチオン性脂質系トランスフェクション試薬のＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、もしくはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）；ポリエチレンイミンなどのポリカチオン；Ｔａｔ、ポリアルギニン、もしくはＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ａｎｔｐペプチド）などのカチオン性ペプチド；またはリポソームが含まれる。リポソームは、標準的な小胞形成脂質およびコレステロールなどのステロールから形成され、例えば、内皮細胞表面抗原に結合親和性を有するモノクローナル抗体などの標的指向分子を含み得る。さらに、リポソームはＰＥＧ化リポソームでもよい。
【００９９】
干渉性ＲＮＡは、溶液中、懸濁液中、または非生体浸食性送達用具中で送達してもよい。干渉性ＲＮＡは、単独で、または所定の共役結合性結合体の成分として送達することができる。干渉性ＲＮＡは、カチオン性脂質、カチオン性ペプチドもしくはカチオン性ポリマーと複合することもでき、タンパク質、融合タンパク質、もしくは核酸結合性のタンパク質ドメイン（例えば、プロタミン）と複合することもでき、またはナノ粒子もしくはリポソーム中に封入することもできる。組織特異的または細胞特異的送達は、抗体や抗体フラグメントなどの適当な標的指向性構成成分を含めることにより、実現させることができる。
【０１００】
眼への送達については、干渉性ＲＮＡは、眼科的に許容できる防腐剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウムまたは水を併用することにより、眼科用滅菌水性懸濁液または溶液を形成してもよい。溶液処方物は、生理的に受容可能な等張水性緩衝液中に干渉性ＲＮＡを溶解することにより、調製し得る。さらに、該溶液は、該阻害剤の溶解を補助するために、受容可能な界面活性剤を含んでもよい。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤を本発明の組成物に添加することにより、当該化合物の保持力を改善してもよい。
【０１０１】
眼科用滅菌軟膏処方物を調製するために、干渉性ＲＮＡは、鉱油、液体ラノリン、白色ワセリンなどの適当な媒体中の防腐剤と併用される。眼科用滅菌ゲル処方物は、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）などの組合せから調製される親水性基剤中に、当技術分野で公知の方法に従って干渉性ＲＮＡを懸濁することにより、調製し得る。眼内注入のために、例えばＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を使用してもよい。本発明の他の組成物は、干渉性ＲＮＡの眼内浸透性が不十分な場合、クレモフォア、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの浸透促進剤を含有してもよい。
【０１０２】
キット：本発明の実施形態は、本明細書に記載のようなｍＲＮＡの細胞内発現を弱めるために、そのための試薬を含むキットを提供する。該キットは、ｓｉＲＮＡか、またはｓｈＲＮＡ発現ベクターを含有する。ｓｉＲＮＡ、および非ウイルス性のｓｈＲＮＡ発現ベクターについては、該キットは、トランスフェクション試薬または他の適切な送達媒体も含有する。ウイルス性のｓｈＲＮＡ発現ベクターについては、該キットは、ウイルスベクター、および／またはウイルスベクター産生用の必要成分を含有し得る（例えば、パッケージング細胞株、ならびにパッケージング用のウイルスベクター鋳型および追加のヘルパーベクターを含むベクター）。該キットは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも含有する（例えば、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ、または無関係ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）。該キットは、狙った標的遺伝子のノックダウンを評価する試薬を含有してもよい（例えば、標的ｍＲＮＡを検出する定量的ＰＣＲ用のプライマーとプローブ、および／または対応タンパク質に対するウェスタンブロット用の抗体）。あるいは、該キットは、ｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列と、インビトロ転写によるｓｉＲＮＡの生成またはｓｈＲＮＡ発現ベクターの構築に必要な使用説明書および材料とを含んでもよい。
【０１０３】
包装式組合せで、収容手段を密接に詰めて受け容れるようになされた搬送手段と、干渉性ＲＮＡ組成物および受容可能なキャリアを含む第１の収容手段とを含んだ、キット形式の医薬用組合せもさらに提供される。このようなキットは、当業者であれば容易に明らかであろうが、例えば、薬学的に受容可能なキャリアを１種または複数有する容器、追加の容器などの従来からの多様な医薬キット構成要素を１種または複数、所望であればさらに含むこともできる。投与すべき成分の量、投与指針、および／または成分混合の指針を示す、折込みあるいはラベルいずれかの使用説明書も、該キットの中に含み得る。
【０１０４】
例えばヒト小柱網（ＴＭ）細胞における内因的標的遺伝子の発現量をノックダウンする、干渉性ＲＮＡの能力は、インビトロで以下のように評価される。ヒト形質転換ＴＭ細胞（例えば、ＧＴＭ−３またはＨＴＭ−３と称される細胞（Ｐａｎｇ，Ｉ．Ｈ．ら、１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１３：５１−６３を参照のこと））をトランスフェクションの２４時間前に標準増殖培地（例えば、１０％ウシ胎児血清補充ＤＭＥＭ）中に播種する。０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の干渉性ＲＮＡ濃度で、製造業者の教示に従ってＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  １（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を用いてトランスフェクションを行う。ＳｉＣＯＮＴＲＯＬＴＭの非標的指向性コントロールのｓｉＲＮＡ  ＃１およびｓｉＣＯＮＴＲＯＬＴＭのシクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、それぞれ、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用する。標的ｍＲＮＡ量およびシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡ（ＰＰＩＢ、ＮＭ＿０００９４２）の量は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）順方向および逆方向プラマーと、標的部位を包含するプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とを用いて、トランスフェクションの２４時間後にｑＰＣＲによって評価される。ポジティブコントロールのｓｉＲＮＡは、トランスフェクション効率が１００％のときに、シクロフィリンＢ  ｍＲＮＡの本質的に完全なノックダウンを与える。従って、標的ｍＲＮＡのノックダウンは、シクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＴＭ細胞におけるシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡの量を参照して、トランスフェクション効率について補正される。標的タンパク質量は、例えばウェスタンブロットにより、トランスフェクションのおよそ７２時間後（実際の時間はタンパク質の代謝回転速度に依存する）に評価し得る。培養細胞からのＲＮＡおよび／またはタンパク質の標準的分離技法は、当業者に周知である。非特異的な標的外効果を減ずるために、標的遺伝子発現における所望のノックダウン量を生成するできる限り低濃度の干渉性ＲＮＡが使用される。
【０１０５】
Ｒｈｏキナーゼタンパク質の発現量をノックダウンする、本発明の干渉性ＲＮＡの能力は、以下のように実施例１および実施例２でさらに例示される。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）
小柱網細胞においてＲＯＣＫ１を特異的に沈黙させるために干渉性ＲＮＡ
本試験では、培養ヒト緑内障子柱網（ＴＭ）細胞における内因性ＲＯＣＫ１の発現量に対するＲＯＣＫ１−干渉性ＲＮＡのノックダウン能を調べる。
【０１０７】
ＧＴＭ−３細胞（Ｐａｎｇ，Ｉ．Ｈ．ら、１９９４  Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１３：５１−６３）のトランスフェクションは、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｓｉＲＮＡの標準的インビトロ濃度（１００ｎＭ）、または、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ、およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて行った。すべてのｓｉＲＮＡを、１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液としての２０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２の水溶液中に溶解した。トランスフェクションの７２時間後に、ウェスタンブロット解析によりＲＯＣＫ１タンパク質の発現を評価した。ＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡは、以下の標的に対して特異性を有する２本鎖干渉性ＲＮＡである。即ち、ｓｉＲＯＣＫ１＃１は、配列番号２３を標的とし、ｓｉＲＯＣＫ１＃２は配列番号２９を標的とし、ｓｉＲＯＣＫ１＃３は配列番号１０を標的とし、ｓｉＲＯＣＫ１＃４は配列番号９を標的とする。ｓｉＲＯＣＫ２配列は以下の実施例２に示される。１００ｎＭにおいて、４つのＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡの各々は、図１のウェスタンブロットデータが示すように、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡに比して、ＲＯＣＫ１の発現を低下させた。配列番号２９を標的とするｓｉＲＯＣＫ１＃２および配列番号１０を標的とするｓｉＲＯＣＫ１＃３が、特に有効であるようであった。ＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡは、ＲＯＣＫ１の発現に対して、たとえあったとしても、ごくごくわずかな作用しか有さず、ＲＯＣＫ２標的に対するＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡの特異性が確認された。
【０１０８】
より低い濃度のｓｉＲＮＡを用いてさらなる試験を行った。ＧＴＭ−３細胞を、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭのＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡまたは非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、そして、トランスフェクションの７２時間後にウェスタンブロット解析により標的遺伝子の発現を評価した。コントロール試料には、ｓｉＲＮＡの容量を１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液の等容量で代用した緩衝液コントロールを含めた（−ｓｉＲＮＡ）。図２のデータが示すように、４つのＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡの各々は、濃度１０ｎＭおよび１ｎＭでＲＯＣＫ１タンパク質の発現を有意に低下させたが、ｓｉＲＯＣＫ１＃２はまた、０．１ｎＭでもＲＯＣＫ１タンパク質の発現を比較的効果的に沈黙させた。
【０１０９】
（実施例２）
小柱網細胞においてＲＯＣＫ２を特異的に沈黙させるために干渉性ＲＮＡ
本試験では、培養ヒト緑内障子柱網（ＴＭ）細胞における内因性ＲＯＣＫ２の発現量に対するＲＯＣＫ２−干渉性ＲＮＡのノックダウン能を調べる。
【０１１０】
ＧＴＭ−３細胞（Ｐａｎｇ，Ｉ．Ｈ．ら、１９９４  Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１３：５１−６３）のトランスフェクションは、標準的インビトロ濃度（１００ｎＭ）のＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２のｓｉＲＮＡ、または、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ、およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて行った。トランスフェクションの７２時間後に、ウェスタンブロット解析によりＲＯＣＫ２タンパク質の発現を評価した。ＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡは、以下の標的に対して特異性を有する２本鎖干渉性ＲＮＡである。即ち、ｓｉＲＯＣＫ２＃１は、配列番号３３を標的とし、ｓｉＲＯＣＫ１＃２は配列番号３８を標的とし、ｓｉＲＯＣＫ１＃３は配列番号３４を標的とし、ｓｉＲＯＣＫ１＃４は配列番号３９を標的とする。１００ｎＭにおいて、４つのＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡの各々は、図３のウェスタンブロットデータが示すように、非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡに比して、そして、ＲＯＣＫ１特異的ｓｉＲＮＡのプールに比してＲＯＣＫ２の発現を低下させた。ＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡは、ＲＯＣＫ２の発現に対して、たとえあったとしても、ごくごくわずかな作用しか有さず、ＲＯＣＫ１標的に対するＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡの特異性が確認された。
【０１１１】
より低い濃度のｓｉＲＮＡを用いてさらなる試験を行った。ＧＴＭ−３細胞を、１０ｎＭ、１ｎＭおよび0.1ｎＭのＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡまたは非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、そして、トランスフェクションの７２時間後にウェスタンブロット解析により標的遺伝子の発現を評価した。コントロール試料には、ｓｉＲＮＡの容量を１ＸｓｉＲＮＡ緩衝液の等容量で代用した緩衝液コントロールを含めた（−ｓｉＲＮＡ）。図４のデータが示すように、４つのＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡの各々は、濃度１０ｎＭおよび１ｎＭでＲＯＣＫ２タンパク質の発現を有意に低下させたが、ｓｉＲＯＣＫ２＃３は、他のものよりもわずかに高い効力を示した。
【０１１２】
本明細書で引用した参考文献は、本明細書に提示した例示的な手順上または他の詳細を補足する程度に、明確に参考として援用される。
【０１１３】
本開示に鑑みると、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本明細書に開示した実施形態の明白な改変をなし得ることを理解されよう。本明細書に開示した実施形態はすべて、本開示に鑑みると、過度の実験をせずになし、実行することができる。本発明の全範囲は、この開示およびその等価な実施形態において明示されている。本明細書は、本発明がその資格を有する保護の全範囲を過度に狭めるものと見なすべきではない。
【０１１４】
本明細書に使用する場合で別途指示しない限り、用語「ａ」および「ａｎ」は、「１」、「少なくとも１」または「１もしくは複数」を意味するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、ＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡの＃１、＃２、＃３および＃４；ＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡの＃１、＃２、＃３および＃４；ＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡプール；非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ；ならびに緩衝液コントロール（−ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトしたＧＴＭ−３細胞のＲＯＣＫ１ウェスタンブロットを提供する。ｓｉＲＮＡの濃度は１００ｎＭであった。矢印は、１６０ｋＤａのＲＯＣＫ１タンパク質および４２ｋＤａのアクチンタンパク質の各バンドの位置を示す。
【図２】図４は、各々１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭの濃度のＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡの＃１、＃２、＃３および＃４；ならびに非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ；ならびに緩衝液コントロール（−ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトしたＧＴＭ−３細胞のＲＯＣＫ１ウェスタンブロットを提供する。矢印は、１６０ｋＤａのＲＯＣＫ１タンパク質および４２ｋＤａのアクチンタンパク質の各バンドの位置を示す。
【図３】図１は、各々１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭの濃度のＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡの＃１、＃２、＃３および＃４；ＲＯＣＫ１プール；ならびに非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ；ならびに緩衝液コントロール（−ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトしたＧＴＭ−３細胞のＲＯＣＫ２ウェスタンブロットを提供する。矢印は、１６０ｋＤａのＲＯＣＫ２タンパク質および４２ｋＤａのアクチンタンパク質の各バンドの位置を示す。
【図４】図４は、各々１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭの濃度のＲＯＣＫ２  ｓｉＲＮＡの＃１、＃２、＃３および＃４；ならびに非標的指向性コントロールｓｉＲＮＡ；ならびに緩衝液コントロール（−ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトしたＧＴＭ−３細胞のＲＯＣＫ２ウェスタンブロットを提供する。矢印は、１６０ｋＤａのＲＯＣＫ２タンパク質および４２ｋＤａのアクチンタンパク質の各バンドの位置を示す。
【図１】
2009532325.tif 000014
【図２】
2009532325.tif 000015
【図３】
2009532325.tif 000016
【図４】
2009532325.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月8日(2008.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を弱めるための組成物であって、前記組成物は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含み、前記組成物が前記被験体に投与されることを特徴とし、前記干渉性ＲＮＡは、
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、組成物。
【請求項２】
前記被験体がヒトであり、該ヒトが高い眼圧を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記被験体がヒトであり、該ヒトが、高い眼圧を発症する危険性がある、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖が、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さと、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域とを有する第２の干渉性ＲＮＡとともに投与されることを特徴とし、
前記第２の干渉性ＲＮＡの前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの第２の部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記アンチセンス鎖は、それぞれ、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記第２のハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、
請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
高い眼圧の治療を必要とする被験体において高い眼圧を治療するための組成物であって、前記組成物は、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含み、前記組成物が前記被験体の目に投与されることを特徴とし、
前記干渉性ＲＮＡは、
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、組成物。
【請求項９】
被験体のＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を弱めるための組成物であって、前記組成物は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含み、前記組成物は、前記被験体に投与されることを特徴とし、
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しているか、あるいは
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、組成物。
【請求項１０】
被験体における高い眼圧の標的ｍＲＮＡの発現を弱めるための組成物であって、前記組成物は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含み、前記組成物は、前記被験体に投与されることを特徴とし、
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、組成物。
【請求項１１】
前記高い眼圧の標的ｍＲＮＡがＲＯＣＫ１  ｍＲＮＡであり、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８または配列番号７９のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記高い眼圧の標的ｍＲＮＡがＲＯＣＫ２  ｍＲＮＡであり、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１または配列番号７２のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
高い眼圧の治療を必要とする被験体における高い眼圧を治療するための組成物であって、前記組成物は、
長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含み、前記組成物は前記被験体に投与されることを特徴とし、
前記干渉性ＲＮＡは、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、組成物。
【請求項１７】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８または配列番号７９のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１または配列番号７２のいずれかに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目から１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記被験体が緑内障を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項８に記載の組成物。
【請求項２５】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２８】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与されることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、干渉性ＲＮＡ発現ベクターからインビボ発現を介して投与されることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の経路を介して投与されることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、干渉性ＲＮＡ発現ベクターからインビボ発現を介して投与されることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項３５】
高い眼圧の治療を必要とする被験体において高い眼圧を治療するための組成物であって、前記組成物は、
ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を含み、前記組成物は前記被験体に投与されることを特徴とし、
前記ｓｉＲＮＡの各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＲＯＣＫ１遺伝子または前記ＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、
組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮の投与を介して投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記干渉性ＲＮＡが、前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターからインビボ発現を介して投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む干渉性ＲＮＡと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項４２】
前記干渉性ＲＮＡはｓｈＲＮＡである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記干渉性ＲＮＡはｓｉＲＮＡである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記干渉性ＲＮＡはｍｉＲＮＡである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする、２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、組成物。
【請求項４６】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２１ヌクレオチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
被験体の高い眼圧の標的ｍＲＮＡの発現を弱める組成物の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、使用。
【請求項４９】
被験体における高い眼圧を治療する医薬の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含んでおり、
それにより前記高い眼圧が治療される、使用。
【請求項５０】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３、配列番号９〜配列番号３０および配列番号７３〜配列番号７９のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記干渉性ＲＮＡは、
配列番号３１〜配列番号７２のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域
を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記干渉性ＲＮＡが、配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５３】
前記干渉性ＲＮＡが、前記配列識別子により識別される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端から２番目からの１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチドまたは１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５個、１６個、１７個または１８個の連続ヌクレオチド領域を含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５４】
前記組成物がさらに、１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号３および配列番号９〜配列番号７９のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端から２番目からの少なくとも１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３個の連続ヌクレオチド領域を含む、第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５５】
被験体における高い眼圧を治療するための医薬の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物の使用であって、前記干渉性ＲＮＡは、
センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
前記アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、配列番号１または配列番号２に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有している、使用。
【請求項５６】
被験体のＲｈｏキナーゼｍＲＮＡの発現を弱める組成物の調製における、長さが１９ヌクレオチド〜４９ヌクレオチドの１本鎖干渉性ＲＮＡの有効量と薬学的に受容可能なキャリアとの使用であって、
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、６０５、６５３、６５９、１２４８、１５６２、１８７６、２２６６、２４７４、２４８５、２７４０、２８０８、２８３４、３００７、３１４６、３１９９、３２４５、３３７９、３４５３、３５１１、３５１３、３５１９、３７８１、３７８２、９９８、１１３２、１２００、１６４８、１６７４、１７０８または２０７７のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有しているか、あるいは
前記１本鎖干渉性ＲＮＡは、１１０２、１８６５、２０００、２２２９、２５１４、２５８４、２７３８、３３０５、４１１１、４６５２、５１８４、５１８７、５２５５、５３１５、５４３９、５４５０、５５７８、５５７９、５６１１、５６２５、５７９５、６０００、６２２８、６２６４、５８４、１３３７、１６７８、２７７３、２８１４、２９４１、３３５７、３３９８、３４８１、３６３３、３６４４、３６４５、３７６７、３８３６、４０２３、４０９７、５２０２または５４４０のいずれかの番号のヌクレオチドを含む配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理条件下でハイブリッド形成し、前記干渉性ＲＮＡは、配列番号１に対応するｍＲＮＡの前記ハイブリッド形成部分に対して、少なくともほぼ完全に連続して相補的な少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有している、
使用。
【請求項５７】
前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がヘアピンループにより連結される、請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである、請求項４８、４９または５５に記載の使用。
【請求項５９】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項４８、４９または５５に記載の使用。
【請求項６０】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項４８、４９または５５に記載の使用。
【請求項６１】
前記組成物が、局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、内側眼瞼靭帯下、眼房内、網膜下、結膜下、眼球後部または涙管内の投与のために調製される、請求項４９または５５に記載の使用。
【請求項６２】
前記組成物が前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターを含む、請求項４９または５５に記載の使用。
【請求項６３】
前記医薬が高い眼圧の治療のためのものである、請求項４９または５５に記載の使用。
【請求項６４】
被験体において高い眼圧を治療する医薬の調製における、ＲＮＡ干渉を介してＲＯＣＫ１遺伝子またはＲＯＣＫ２遺伝子の発現をダウンレギュレートする２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物の使用であって、
前記ｓｉＲＮＡの各鎖は独自に長さが約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、
前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、それぞれ前記ＲＯＣＫ１遺伝子または前記ＲＯＣＫ２遺伝子に対応するｍＲＮＡに対して実質的な相補性を有するヌクレオチド配列を含むことにより、前記ｓｉＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して前記ｍＲＮＡの切断を誘導する、
使用。
【請求項６５】
前記組成物が、エアロゾル、口腔、皮膚、皮内、吸入、筋肉内、鼻腔内、眼内、肺内、静脈内、腹腔内、経鼻、経眼、経口、経耳、非経口、パッチ、皮下、舌下、局所または経皮の投与のために調製される、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
前記組成物が前記干渉性ＲＮＡを発現し得る発現ベクターを含む、請求項６４に記載の使用。
【請求項６７】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである、請求項６４に記載の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009532325000001.app
【国際調査報告】
2009532325.tif 000018
2009532325.tif 000019
2009532325.tif 000020
2009532325.tif 000021
2009532325.tif 000022
2009532325.tif 000023
2009532325.tif 000024
2009532325.tif 000025
2009532325.tif 000026