(57)【要約】  本発明は、ＴＰＴＥ遺伝子のタンパク質産物が生産されないように、またはその生産量が低下するように、ＴＰＴＥ遺伝子由来のｍＲＮＡを特異的にターゲットとし、そのＲＮＡｉ誘導分解を引き起こすｓｉＲＮＡ分子に関する。本発明のｓｉＲＮＡ化合物および組成物は、その処置にＴＰＴＥ発現の阻害が要求される疾患、特にがん病変を処置するのに役立つ。本発明は、がん疾患の転移挙動および／またはがんの再発の発生を評価しかつ／または予後判定することを可能にする方法も包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、そのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二重鎖を形成し、およびセンスＲＮＡ鎖がＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ中の約１９から約２５連続ヌクレオチドのターゲット配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
単離される、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡが、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列に相補的な核酸配列、および
（ｅ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、その一部または誘導体、
からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡ分子が二つの核酸フラグメントから構築され、第１のフラグメントはｓｉＲＮＡ分子のセンス領域を含み、第２のフラグメントはｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む、請求項１から３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
ＲＮＡ二重鎖を形成するセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖が一本鎖ヘアピンによって共有結合している、請求項１から３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡは、非ヌクレオチド物質をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がヌクレアーゼ分解に対して安定化している、請求項１から６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
３'−オーバーハングをさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
３'−オーバーハングが１から約６個のヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
３'−オーバーハングが約２個のヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１１】
センスＲＮＡ鎖が第１の３'−オーバーハングを含み、アンチセンスＲＮＡ鎖が第２の３'−オーバーハングを含む、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１２】
第１および第２の３'−オーバーハングが、独立して、１から約６個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
第１の３'−オーバーハングがジヌクレオチドを含み、第２の３'−オーバーハングがジヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
ジヌクレオチドがジデオキシチミジル酸またはジウリジル酸である、請求項１３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１５】
３'−オーバーハングがヌクレアーゼ分解に対して安定化している、請求項８から１３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１６】
前記ターゲット配列が、配列番号１５のヌクレオチド位置３から２１、配列番号１８のヌクレオチド位置３から２１、配列番号２１のヌクレオチド位置３から２１、配列番号２４のヌクレオチド位置３から２１、配列番号２７のヌクレオチド位置３から２１、配列番号３０のヌクレオチド位置３から２１、および配列番号３３のヌクレオチド位置３から２１からなる群より選択される核酸配列を持つ、請求項１から１５のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１７】
前記センスＲＮＡ鎖が配列番号１６の配列を有し、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号１７の配列を有する、請求項１から１６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１８】
前記センスＲＮＡ鎖が配列番号１９の配列を有し、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２０の配列を有する、請求項１から１６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
前記センスＲＮＡ鎖が配列番号２２の配列を有し、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２３の配列を有する、請求項１から１６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２０】
前記センスＲＮＡ鎖が配列番号２５の配列を有し、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２６の配列を有する、請求項１から１６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２１】
前記センスＲＮＡ鎖が配列番号２８の配列を有し、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２９の配列を有する、請求項１から１６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２２】
前記センスＲＮＡ鎖が配列番号３１の配列を有し、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号３２の配列を有する、請求項１から１６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２３】
前記センスＲＮＡ鎖が配列番号３４の配列を有し、アンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号３５の配列を有する、請求項１から１６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖、または両方を発現させるための核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項１から２３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖、または両方を発現させるための核酸配列を含む組換えウイルスベクター。
【請求項２６】
請求項１から２３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、請求項２４に記載の発現ベクター、および／または請求項２５に記載の組換えウイルスベクターを含む医薬組成物。
【請求項２７】
がんおよび／またはがん転移の処置または予防に使用することができる、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
がんが肺腫瘍、乳腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫、大腸腫瘍、胃腫瘍、膵腫瘍、ＥＮＴ腫瘍、腎細胞がんまたは子宮頸がん、大腸がんまたは乳がんである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＴＰＴＥの発現を阻害する方法であって、ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡが分解されるように、請求項１から２３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、請求項２４に記載の発現ベクター、請求項２５に記載の組換えウイルスベクターおよび／または請求項２６から２８のいずれかに記載の医薬組成物の有効量を、対象に投与することを含む方法。
【請求項３０】
対象におけるがんを処置しかつ／または対象におけるがん転移を阻害する方法であって、請求項１から２３のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、請求項２４に記載の発現ベクター、請求項２５に記載の組換えウイルスベクターおよび／または請求項２６から２８のいずれかに記載の医薬組成物の有効量を、対象に投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記がんまたはがん転移が、
（ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸
からなる群より選択される核酸、および／または
（ｉｉ）（ｉ）における核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド、
の発現または異常発現を特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）における核酸が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列、その一部または誘導体を含み、かつ／または（ｉｉ）におけるタンパク質またはペプチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｓｉＲＮＡ、発現ベクター、組換えウイルスベクターおよび／または医薬組成物が、放射線療法、化学療法または外科手術と組み合わせて投与される、請求項２９から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
対象がヒトである、請求項２９から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ｓｉＲＮＡが組換えプラスミドまたは組換えウイルスベクターから発現される、請求項２９から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ｓｉＲＮＡが経腸投与経路および／または非経口投与経路によって投与される、請求項２９から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
がんの転移挙動および／またはがんの再発の存在を診断し、監視しかつ／または予後判定するための方法であって、患者から単離した生体試料において、
（ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸、
からなる群より選択される核酸を検出し、またはその量を決定すること、および／または
（ｉｉ）（ｉ）における核酸によってコードされるタンパク質もしくはペプチド、またはその一部もしくは誘導体を検出し、またはその量を決定すること、および／または
（ｉｉｉ）（ｉｉ）におけるタンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体に特異的な抗体を検出し、またはその量を決定すること、および／または
（ｉｖ）（ｉｉ）におけるタンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、任意にＭＨＣ分子と複合体を形成しているものに特異的なＴリンパ球を検出し、またはその量を決定すること
を含む方法。
【請求項３８】
（ｉ）における核酸が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列、その一部または誘導体を含み、かつ／または（ｉｉ）におけるタンパク質またはペプチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
核酸、タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、抗体またはＴリンパ球の存在、および／または前記がんを持たない対象、前記がんのリスクを持たない対象、前記がんの転移を持たない対象、前記がんの転移のリスクを持たない対象、前記がんの再発を持たない対象、および／または前記がんの再発のリスクを持たない対象における量と比較して増加している核酸、タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、抗体またはＴリンパ球の量が、前記がんの転移挙動もしくは前記がんの転移挙動の可能性および／または前記がんの再発もしくは前記がんの再発の可能性を示す、請求項３７または３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
学際的なアプローチおよび古典的治療手法の網羅的使用にもかかわらず、がんは、いまなお死亡の主原因である。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞はその起源である非悪性細胞とは生物学的にかなり異なる。これらの相違は腫瘍発生中に獲得される遺伝子変化によるものであり、その結果、がん細胞では、とりわけ、定性的または定量的に変化した分子構造の形成も起こる。この種の腫瘍関連構造は、特に、悪性形質転換の過程でその発現が誘導または強化される遺伝子産物である。
【０００３】
ＲＮＡ干渉（以下「ＲＮＡｉ」）は、ほとんどの真核生物に保存されている転写後遺伝子調節方法である。ＲＮＡｉは、細胞内に存在する短い（すなわち＜３０ヌクレオチドの）二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘導される（Ｆｉｒｅ  Ａら（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１）。「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれるこれらの短いｄｓＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡと１ヌクレオチド分解能での配列ホモロジーを共有するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の分解を引き起こす（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭら（２００１），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１５：１８８−２００）。ｓｉＲＮＡおよびターゲットｍＲＮＡは、ターゲットｍＲＮＡを切断する「ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体」、すなわち「ＲＩＳＣ」に結合する。ｓｉＲＮＡは多代謝回転酵素のように再利用されるらしく、１分子のｓｉＲＮＡはｍＲＮＡ約１０００分子の切断を誘導する能力を持つ。したがって、ｓｉＲＮＡを介したｍＲＮＡのＲＮＡｉ分解は、現在利用することができる技術よりも効果的にターゲット遺伝子の発現を阻害することができる。
【０００４】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭら（２００１）は、短い３'−オーバーハングを持つ２１および２２ヌクレオチド長の合成ｓｉＲＮＡが、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞溶解物において、ターゲットｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導できるということを示した。培養哺乳動物細胞も合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ分解を示し（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭら（２００１），Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８）、生きているマウスでも、合成ｓｉＲＮＡによってＲＮＡｉ分解が誘導されることが示されている（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ＡＰら（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８−３９；Ｘｉａ  Ｈら（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０）。ｓｉＲＮＡ誘導ＲＮＡｉ分解の治療面での可能性は、ｓｉＲＮＡを介した（ｓｉＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＨＩＶ−１感染の阻害（Ｎｏｖｉｎａ  ＣＤら（２００２），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６８１−６８６）および神経毒性ポリグルタミン病タンパク質発現の減少（Ｘｉａ  Ｈら（２００２），前掲）など、最近行われたいくつかのインビトロでの研究で実証されている。
【０００５】
ＲＮＡ干渉は、細胞中に二本鎖ＲＮＡを導入することまたは、ヘアピン構造型ｓｉＲＮＡ発現カセットを、Ｕ６、Ｈ１またはサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターなどの適切なプロモーターの制御下に保持するプラスミドを細胞にトランスフェクトすることによって、効果を発揮させることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
がん（特にがん転移）を治療、予防および診断するための組成物および方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの目的は本願請求項の主題によって達成される。
【０００８】
本明細書に記載する研究は、がん関連ＤＮＡの低メチル化による悪性形質転換の過程で、ＴＰＴＥ転写が開始されることを証明する。さらにまた、本明細書に記載する研究は、ＴＰＴＥががんの進行およびがん細胞の転移拡散を促進することを示す。特にＴＰＴＥは、効率のよい走化性、がんの浸潤および転移を含むがん進行の複数の局面に関与して、腫瘍細胞のホーミングおよび転移先に影響を及ぼす過程には不可欠である。本明細書に記載する発見は、ＴＰＴＥ発現腫瘍の予後分類および処置に関して、臨床的意味を持つ。初期(ｐｒｉｍａｒｙ)腫瘍におけるＴＰＴＥ発現は有意に高い転移性疾患率と関連づけられるので、ＴＰＴＥは予後マーカーとすることができる。ｓｉＲＮＡを使って、ＴＰＴＥの発現をベースラインレベルの１５％未満に阻害することができた。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、ＴＰＴＥ遺伝子のタンパク質産物が生産されないように、またはその生産量が低下するように、ＴＰＴＥ遺伝子由来のｍＲＮＡを特異的にターゲットとし、そのＲＮＡｉ誘導分解を引き起こすｓｉＲＮＡ分子に関する。本発明のｓｉＲＮＡ化合物および組成物は、疾病、特に、がんの転移などのがん病理の処置および／または予防にＴＰＴＥ発現の阻害が必要とする疾患を処置および／または予防するために役立つ。
【００１０】
本発明のｓｉＲＮＡは、ターゲットｍＲＮＡにターゲティングされる約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチド長、好ましくは約１９から約２５ヌクレオチド長の短鎖二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準ワトソン−クリック型塩基対相互作用によって一つにアニールした（以下「塩基対を形成した」という）センスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。
【００１１】
具体的に、本発明は、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、そのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二重鎖を形成し、センスＲＮＡ鎖がＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ中の約１９から約２５連続ヌクレオチドのターゲット配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡに関する。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは単離される。
【００１２】
１つの実施形態において、前記ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡは、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸配列、（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列に相補的な核酸配列、および（ｅ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、その一部または誘導体、からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、二つの核酸フラグメントから構築され、第１のフラグメントは該ｓｉＲＮＡ分子のセンス領域を含み、第２のフラグメントは該ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。本発明のｓｉＲＮＡ分子のさらにもう１つの実施形態では、ＲＮＡ二重鎖を形成するセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖が、一本鎖ヘアピンによって共有結合している。
【００１４】
本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、非ヌクレオチド物質をさらに含む。本発明のｓｉＲＮＡのさらにもう１つの実施形態では、センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖がヌクレアーゼ分解に対して安定化している。
【００１５】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは１から約６個のヌクレオチド、より好ましくは約２個のヌクレオチドを含む３'−オーバーハングを、さらに含む。
【００１６】
本発明のｓｉＲＮＡの１つの実施形態において、センスＲＮＡ鎖は第１の３'−オーバーハングを含み、アンチセンスＲＮＡ鎖は第２の３'−オーバーハングを含み、好ましくは、第１および第２の３'−オーバーハングは、独立して、１から約６個のヌクレオチドを含む。より好ましくは、第１の３'−オーバーハングはジヌクレオチドを含み、第２の３'−オーバーハングはジヌクレオチドを含み、好ましくはジデオキシチミジル酸またはジウリジル酸を含む。
【００１７】
本発明のｓｉＲＮＡの１つの実施形態では、３'−オーバーハングがヌクレアーゼ分解に対して安定化している。
【００１８】
本発明のｓｉＲＮＡの特定実施形態では、ターゲット配列が、配列番号１５のヌクレオチド位置３から２１、配列番号１８のヌクレオチド位置３から２１、配列番号２１のヌクレオチド位置３から２１、配列番号２４のヌクレオチド位置３から２１、配列番号２７のヌクレオチド位置３から２１、配列番号３０のヌクレオチド位置３から２１、および配列番号３３のヌクレオチド位置３から２１からなる群より選択される核酸配列を有する。本発明のｓｉＲＮＡのさらなる特定実施形態では、センスＲＮＡ鎖が配列番号１６の配列を有し、かつアンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号１７の配列を有するか、センスＲＮＡ鎖が配列番号１９の配列を有し、かつアンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２０の配列を有するか、センスＲＮＡ鎖が配列番号２２の配列を有し、かつアンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２３の配列を有するか、センスＲＮＡ鎖が配列番号２５の配列を有し、かつアンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２６の配列を有するか、センスＲＮＡ鎖が配列番号２８の配列を有し、かつアンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号２９の配列を有するか、センスＲＮＡ鎖が配列番号３１の配列を有し、かつアンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号３２の配列を有するか、センスＲＮＡ鎖が配列番号３４の配列を有し、かつアンチセンスＲＮＡ鎖が配列番号３５の配列を有する。
【００１９】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖、または両方を発現させるための核酸配列を含む発現ベクターに関する。好ましくは、発現ベクターは、本発明のｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖、または両方を発現させるための核酸配列に機能的に連結されたプロモーター、好ましくは誘導性プロモーターまたは調節可能プロモーターを含む。
【００２０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖、または両方を発現させるための核酸配列を含む組換えウイルスベクターに関する。好ましくは、組換えウイルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖、アンチセンスＲＮＡ鎖、または両方を発現させるための核酸配列に機能的に連結されたプロモーター、好ましくは誘導性プロモーターまたは調節可能プロモーターを含む。特定の実施形態において、本発明の組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される。
【００２１】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡ、発現ベクター、および／または組換えウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、がんおよび／またはがん転移の処置または予防に使用することができ、そのがんとしては好ましくは肺腫瘍、乳腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫、大腸腫瘍、胃腫瘍、膵腫瘍、ＥＮＴ腫瘍、腎細胞がんまたは子宮頸がん、大腸がんまたは乳がんである。
【００２２】
本発明の医薬組成物は医薬適合性担体および／またはアジュバントを含んでもよい。
【００２３】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ＴＰＴＥの発現を阻害する方法であって、ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡが分解されるように、本発明のｓｉＲＮＡ、発現ベクター、組換えウイルスベクターおよび／または医薬組成物の有効量を、対象に投与することを含む方法に関する。
【００２４】
さらにもう一つの態様において、本発明は、対象におけるがんを処置する方法であって、本発明のｓｉＲＮＡ、発現ベクター、組換えウイルスベクターおよび／または医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法に関する。
【００２５】
さらにもう一つの態様において、本発明は、対象におけるがん転移を阻害する方法であって、本発明のｓｉＲＮＡ、発現ベクター、組換えウイルスベクターおよび／または医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法に関する。
【００２６】
本発明の方法において、がんまたはがん転移は、好ましくは、（ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸からなる群より選択される核酸、および／または（ｉｉ）（ｉ）における核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド、の発現または異常発現を特徴とする。
【００２７】
好ましくは、（ｉ）における核酸は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列、その一部または誘導体を含み、かつ／または（ｉｉ）におけるタンパク質またはペプチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む。
【００２８】
本発明の方法において、ｓｉＲＮＡ、発現ベクター、組換えウイルスベクターおよび／または医薬組成物は、好ましくは、放射線療法、化学療法または外科手術と組み合わせて投与され、その化学療法剤は、好ましくは、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、およびタモキシフェンからなる群より選択される。
【００２９】
好ましくは、投与対象はヒトである。
【００３０】
好ましくは、投与されるｓｉＲＮＡの有効量は約１ｎＭから約１００ｎＭである。
【００３１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡが送達剤と一緒に投与され、その送達剤は、好ましくは、リポフェクチン、リポフェクトアミン、セルフェクチン、ポリカチオン、およびリポソームからなる群より選択される。好ましくは、リポソームは、ＴＰＴＥを発現させる細胞に対するリポソームをターゲティングするリガンドを含み、その場合、リガンドは、好ましくは、抗体を含む。
【００３２】
本発明の方法の一実施形態では、ｓｉＲＮＡが組換えプラスミドまたは組換えウイルスベクターから発現され、その組換えウイルスベクターは、好ましくは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターを含む。
【００３３】
１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡが経腸投与経路によって投与され、その経腸投与経路は、好ましくは、経口、直腸、および鼻腔内からなる群より選択される。
【００３４】
さらにもう１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡが非経口投与経路によって投与され、その非経口投与経路は、好ましくは、血管内投与、組織周囲投与および組織内投与、皮下注射または皮下デポジション、および皮下注入からなる群より選択される。好ましくは、血管内投与は、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および脈管構造へのカテーテル点滴からなる群より選択され、組織周囲投与および組織内投与は、好ましくは、腫瘍周囲注射および腫瘍内注射からなる群より選択される。
【００３５】
本発明は、がん疾患の転移挙動および／またはがんの再発の発生を評価および／または予後判定することを可能にする方法も包含する。好ましくは、本発明の方法では、悪性状態を良性状態と識別することが可能である。特定の実施形態では、本発明の方法により、既に投与されたがん療法または今後投与されるがん療法の成功を評価および／または予後判定することが可能になる。特に、本発明の方法は、例えば外科手術、化学療法および／または放射線療法などのがん療法後に、がんの再発の発生を評価および／または予後判定することが可能である。
【００３６】
この態様において、本発明は、がんの転移挙動および／またはがんの再発の存在を、決定し、例えば診断し、監視し、例えばその退縮、進行、経過および／または発生を決定し、および／または予後判定する方法であって、患者から単離した生体試料において、（ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、および（ｄ）（ａ）（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸、からなる群より選択される核酸を検出し、またはその量を決定すること、および／または（ｉｉ）（ｉ）における核酸によってコードされるタンパク質もしくはペプチド、またはその一部もしくは誘導体を検出し、またはその量を決定すること、および／または（ｉｉｉ）（ｉｉ）におけるタンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体に特異的な抗体を検出し、またはその量を決定すること、および／または（ｉｖ）（ｉｉ）に記載のタンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、任意にＭＨＣ分子と複合体を形成しているものに特異的なＴリンパ球を検出し、またはその量を決定することを含む方法に関する。
【００３７】
好ましくは、（ｉ）における核酸は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列、その一部または誘導体を含み、かつ／または（ｉｉ）におけるタンパク質またはペプチドは、好ましくは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む。
【００３８】
１つの実施形態では、核酸、タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、抗体またはＴリンパ球の存在、および／または前記がんを持たない対象、前記がんのリスクを持たない対象、前記がんの転移を持たない対象、前記がんの転移のリスクを持たない対象、前記がんの再発を持たない対象、および／または前記がんの再発のリスクを持たない対象における量と比較して増加している核酸、タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、抗体またはＴリンパ球の量が、前記がんの転移挙動もしくは前記がんの転移挙動の可能性および／または前記がんの再発もしくは前記がんの再発の可能性を示す。
【００３９】
さらにもう一つの好ましい実施形態では、検出または量の決定が、（ｉ）生体試料を、前記核酸、前記タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、前記抗体または前記Ｔリンパ球に結合する薬剤と接触させること、および（ｉｉ）前記薬剤と前記核酸、前記タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体、前記抗体または前記Ｔリンパ球との複合体を検出すること、またはその量を決定することを含む。
【００４０】
本発明の方法の特定実施形態では、患者ががんを持つか、がんを持つ疑いもしくはがんを発生させる疑いがあるか、またはがんを発生させるリスクを持つ。本発明の方法のさらなる実施形態では、患者ががん転移を持つか、がん転移を持つ疑いもしくはがん転移を発生させる疑いがあるか、またはがん転移を発生させるリスクを持つ。本発明の方法の特定実施形態では、患者が腫瘍切除、放射線療法および／または化学療法などのがん治療を既に受けているか、またはそのような治療を受ける予定である。
【００４１】
前記検出および／または量の決定を達成するための手段は本明細書に記述され、当業者にとって明らかとなっている。
【００４２】
さらなる実施形態では、患者から単離された生体試料を、比較可能な正常生体試料、例えば健常個体から単離された試料と比較する。
【００４３】
本発明に従ってがんの転移挙動および／またはがんの再発の存在を診断し、監視し、かつ／または予後判定する方法は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸からなる群より選択される核酸、および／または配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸を使用して、好ましくはその非コード領域内、より好ましくはそのプロモーター領域内での、メチル化パターンおよび／またはメチル化度を測定することを含んでもよい。
【００４４】
対照、例えば前記がんを持たない対象、前記がんのリスクを持たない対象、前記がんの転移を持たない対象、前記がんの転移のリスクを持たない対象、前記がんの再発を持たない対象、および／または前記がんの再発のリスクを持たない対象と比較して、より低いメチル化度、またはメチル化されていないことは、好ましくは、前記がんの転移挙動もしくは前記がんの転移挙動の可能性および／または前記がんの再発もしくは前記がんの再発の可能性を示す。
【００４５】
メチル化パターンおよび／またはメチル化度の決定は、例えばＰＣＲに基づく方法により、制限酵素を利用して、または配列決定によって行うことができる。好ましい実施形態の一つでは、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩含有試薬で処理してから選択的に増幅する。そのような増幅で使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、亜硫酸水素塩含有試薬で処理された核酸に結合する配列を持ち、好ましくはその核酸に完全に相補的である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、メチル化度の異なる核酸に適合し、区別することが可能な増幅産物をもたらす。これに適した試験として以下の例を挙げることができる：（１）例えばパラフィン包埋材料を使って、患者の組織試料からのＤＮＡ抽出、（２）（例えばＣｌａｒｋ  Ｓ．Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１５）：２９９０−７，１９９４に記述されているように）ＤＮＡを亜硫酸水素塩含有試薬で処理、（３）ＰＣＲを利用したＤＮＡ増幅、および（４）（例えば定量ＰＣＲ、マイクロアレイ法などのハイブリダイゼーション技法を利用した）配列特異的増幅産物の量の解析。
【００４６】
本発明に従ってがんの転移挙動および／またはがんの再発の存在を診断し、監視し、および／または予後判定する方法では、好ましくは、疾患の悪化過程の予後判定が可能であり、それにより、特に、より積極的な治療計画が可能になる。これらの予後判定方法では、まだ良性な変化、例えば過形成と、既に好ましくないと判定されるべき腫瘍前駆体との境界を定めることも可能であり、それゆえに、浸潤腫瘍が形成されてしまう前に、前もってがんの素因を予測することも可能になる。
【００４７】
本発明によれば、核酸の検出または核酸量の決定は、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブを使って行うことができ、あるいは例えばＰＣＲ増幅を用いて、前記核酸を選択的増幅することで行うこともできる。１つの実施形態では、プローブが、前記核酸の６から５０個、特に１０から３０個、１５から３０個および２０から３０個の連続ヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
本発明によれば、タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体の検出、あるいはタンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体の量の決定は、前記タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体に特異的に結合する抗体を使って行うことができる。特定の実施形態では、本発明の方法において検出されるべき、または本発明の方法においてその量を決定されるべき、タンパク質もしくはペプチドまたはその一部もしくは誘導体は、ＭＨＣ分子との複合体として存在する。
【００４９】
本発明によれば、抗体の検出または抗体量の決定は、前記抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチドを使って行うことができる。
【００５０】
本発明によれば、Ｔリンパ球の検出またはＴリンパ球量の決定は、そのＴリンパ球が特異性を示すタンパク質またはペプチドとＭＨＣ分子の複合体を提示する細胞、好ましくは抗原提示細胞を使って行うことができる。Ｔリンパ球の検出またはＴリンパ球量の決定は、そのＴリンパ球が特異性を示すタンパク質またはペプチドとＭＨＣ分子の複合体による特異的刺激によって引き起こされうるその増殖、サイトカイン生産、および／または細胞傷害活性を検出することによって行うこともできる。Ｔリンパ球の検出またはＴリンパ球量の決定は、一または二以上のタンパク質またはペプチドが負荷された組換えＭＨＣ分子または二つ以上のＭＨＣ分子の複合体を利用して行うこともできる。
【００５１】
本発明の方法において検出または量の決定に使用される薬剤、例えばオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブ、抗体、タンパク質もしくはペプチドまたは細胞は、好ましくは、検出可能な方法、特に、放射性マーカー、蛍光マーカーまたは酵素マーカーなどの検出可能マーカーによって標識される。
【００５２】
本発明によれば、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合を指す。「特異的結合」とは、抗体などの薬剤が、それが特異性を示すエピトープなどのターゲットに対して、他のターゲットへの結合よりも強く結合することを意味する。ある薬剤が、第１ターゲットに対して、第２ターゲットの解離定数（ＫＤ）よりも低い解離定数で結合する場合、その薬剤は第２ターゲットよりも第１ターゲットに強く結合する。好ましくは、その薬剤が特異的に結合するターゲットの解離定数（ＫＤ）は、その薬剤が特異的には結合しないターゲットの解離定数（ＫＤ）よりも、１０分倍、より好ましくは２０倍、一層好ましくは５０倍、さらに好ましくは１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍より低い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
「ＴＰＴＥ」という用語は「テンシン(ｔｅｎｓｉｎ)ホモロジーを有する膜貫通ホスファターゼ」を指し、細胞が自然に発現する、またはＴＰＴＥ遺伝子トランスフェクト細胞によって発現される、ＴＰＴＥの任意の変異体、特にスプライス変異体、コンフォメーション、アイソフォームおよび種ホモログを包含する。好ましくは「ＴＰＴＥの核酸」、「ＴＰＴＥをコードする核酸」または「ＴＰＴＥ遺伝子」とは、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択される核酸配列、その一部または誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸に対して縮重している核酸、および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸からなる群より選択される核酸を指す。好ましくは、「ＴＰＴＥ」タンパク質または単に「ＴＰＴＥ」は、上述の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む。上述したＴＰＴＥのｃＤＮＡ配列はＴＰＴＥ  ｍＲＮＡと等価であり、本発明においては同じ目的つまりＴＰＴＥの発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの作製に使用できることは、当業者に理解されるだろう。
【００５４】
「ＴＰＴＥ」という用語は、細胞が自然に発現する、またはＴＰＴＥ遺伝子トランスフェクト細胞によって発現される、ヒトＴＰＴＥの翻訳後修飾変異体、アイソフォームおよび種ホモログも包含する。
【００５５】
本発明によれば、核酸は、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸には、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成分子が含まれる。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の線状分子または共有結合で閉環した分子として存在できる。
【００５６】
本発明における「核酸」という用語は、核酸の「誘導体」も包含する。核酸の「誘導体」とは、本発明において、単一または複数、例えば少なくとも２個、少なくとも４個、または少なくとも６個、および好ましくは３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、１０個まで、１５個まで、または２０個までのヌクレオチド置換、欠失および／または付加が、前記核酸中に存在することを意味する。さらにまた、「誘導体」という用語には、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸基における核酸の化学的誘導体化も含まれる。「誘導体」という用語には、自然発生しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸も含まれる。
【００５７】
本発明に従って記述される核酸は、好ましくは単離されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、増幅されたこと、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産されたこと、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動分画などによって精製されたこと、または（ｉｖ）例えば化学合成などによって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技法基づく操作に利用することができる核酸である。
【００５８】
本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡ」は、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノース部分の２'位にヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。この用語は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産ＲＮＡ、ならびに一または二個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって自然発生ＲＮＡとは異なっている改変ＲＮＡを包含する。そのような改変として、例えばＲＮＡの末端への、または内部、例えばＲＮＡの一または二個以上のヌクレオチドに、非ヌクレオチド物質を付加することを含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば自然発生しないヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなども含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、類似体または自然発生ＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。
【００５９】
本明細書で用いる「相補性」または「相補的」という用語は、一つの核酸が、従来のワトソン−クリック型相互作用または他の非従来型相互作用によって、もう一つの核酸配列と水素結合を形成できることを意味する。本発明の核酸分子に関して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能（例えばＲＮＡｉ活性）が開始するのに十分である。例えば、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖とアンチセンス鎖の間の相補性度は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とターゲットＲＮＡ配列の間の相補性度と同じであるか、異なることができる。相補性率は、もう一つの核酸配列と水素結合を形成（例えばワトソン−クリック塩基対形成）することができる一つの核酸分子中の連続残基の百分率を示す（例えば、１０ヌクレオチド中５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドであれば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、一つの核酸配列中の連続残基のすべてが、もう一つの核酸配列中の同じ数の連続残基と水素結合できることを意味する。
【００６０】
好ましくは、二つの配列が互いにハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することができる場合、一方の核酸は他方の核酸に「相補的」であり、そのハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間で特異的ハイブリダイゼーションが可能な条件（ストリンジェントな条件）下で行われる。ストリンジェント条件は、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに述べられており、たとえばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションが参照できる。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後は、ＤＮＡを転写した膜を、例えば２×ＳＳＣ中、室温で洗浄し、次に０．１から０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中、６８℃までの温度で洗浄する。
【００６１】
本発明によれば、相補的核酸は、好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチドを有する。
【００６２】
「同一性パーセンテージ」は最良アラインメント後に得られ、このパーセンテージは純粋に統計的であって、２つの配列の間の相違はランダムにおよびそれらの長さ全体にわたって分布する。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列比較は、それらを最適に整列した後これらの配列を比較することによって慣例的に実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためのセグメントによってまたは「比較のウインドウ」によって実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手動操作に加えて、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラムによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）作成し得る。
【００６３】
同一性パーセンテージは、比較する２つの配列の間の同一位置の数を測定し、この数を比較した位置の数で除して、これら２つの配列の間の同一性パーセンテージを得るために、得られた結果に１００を乗じることによって算定される。
【００６４】
本明細書において、ターゲット配列（例えばターゲットｍＲＮＡ内に含まれるターゲット配列）と「実質的に同一な」核酸配列とは、ターゲット配列と同一である核酸配列または一または個以上のヌクレオチドがターゲット配列と異なっている核酸配列である。ターゲット配列と実質的に同一な核酸配列を含む本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、そのようなセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、ターゲット配列を含有するｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することを特徴とする。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、ターゲットｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解がそのｓｉＲＮＡによって誘導される限り、１個、２個または３個以上のヌクレオチドがターゲット配列とは異なるセンス鎖を含むことができる。
【００６５】
核酸は、本発明によれば、単独でまたは、相同または異種であり得る、他の核酸と組み合わせて存在し得る。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に関して相同または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結されている。「相同」という用語は、核酸が天然でも発現制御配列に機能的に連結されていることを意味し、「異種」という用語は、核酸が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないことを意味する。
【００６６】
ＲＮＡおよび／またはタンパク質またはペプチドを発現する核酸などの核酸と発現制御配列は、それらが、前記核酸の発現または転写が前記発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が、その後、コード配列に機能的に連結された発現制御配列により機能的タンパク質へと翻訳されるはずである場合、前記発現制御配列の誘導は、コード配列内のフレームシフトを引き起こさずにまたは前記コード配列が所望タンパク質またはペプチドへと翻訳されることができない事態を引き起こさずに、前記核酸の転写を生じさせる。
【００６７】
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定実施形態では、発現制御配列は調節され得る。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写および５'および３'非翻訳配列を含む。より詳細には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含有するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化配列を含み得る。
【００６８】
本発明によれば、「プロモーター」または「プロモーター領域」という用語は、発現される核酸配列に対して上流（５'側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼのための認識および結合部位を提供することによって配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモーター領域」はさらに、遺伝子の転写の調節に関わるさらなる因子のための認識および結合部位を含み得る。プロモーターは、原核または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。さらに、プロモーターは「誘導性」であり得、誘導物質に応答して転写を開始させ得るか、または転写が誘導物質によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導物質が存在しない場合は発現されないかまたはわずかだけ発現される。誘導物質の存在下では、遺伝子のスイッチが入るかまたは転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
【００６９】
本発明において好ましいプロモーターは、ＳＰ６、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼのプロモーター、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーター、およびＣＭＶプロモーターなどを含む。
【００７０】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質／ペプチドの生産を含む。これはまた、核酸の部分的発現を包含する。さらに、発現は一過性または安定に実施され得る。
【００７１】
好ましい実施形態では、核酸分子は、適切な場合はプロモーターと共に、核酸の発現を制御するベクター内に本発明に従って存在する。「ベクター」という用語は、ここではその最も一般的な意味で使用され、前記核酸が、たとえば原核および／または真核細胞に導入され、適切な場合は、ゲノム内に組み込まれることを可能にする、核酸のための全ての中間媒体を包含する。この種のベクターは、好ましくは細胞において複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。ここで使用する「プラスミド」という用語は、一般に染色体ＤＮＡと独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
【００７２】
本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外来核酸を使って形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞を指す。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を包含する。特に好ましいのは哺乳動物細胞、例えばヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、または霊長類に由来する細胞である。細胞は多数の組織タイプに由来し、初代細胞および細胞株を含むことができる。具体例としてケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚性幹細胞が挙げられる。さらなる実施形態では、宿主細胞が抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は宿主細胞中に単一コピーまたは、２個以上のコピーのとして存在することができ、１つの実施形態では、宿主細胞中で発現される。
【００７３】
ＭＨＣ分子がタンパク質またはペプチドを提示する本発明の場合、発現ベクターが前記ＭＨＣ分子をコードする核酸配列も含むことができる。ＭＨＣ分子をコードする核酸配列は、タンパク質またはペプチドをコードする核酸と同じ発現ベクター上に存在してもよいし、両核酸が異なる発現ベクター上に存在してもよい。後者の場合、二つの発現ベクターを細胞にコトランスフェクトすることができる。宿主細胞がタンパク質またはペプチドおよびＭＨＣ分子を発現しない場合は、それらをコードする両核酸を、同じ発現ベクター、または異なる発現ベクターにのせて、細胞にトランスフェクトすることができる。細胞がＭＨＣ分子を既に発現している場合は、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列のみを細胞にトランスフェクトすることができる。
【００７４】
核酸の増幅は、核酸にハイブリダイズする一対の増幅プライマー、例えばオリゴヌクレオチドを使って行うことができる。プライマーは好ましくは当該核酸の６から５０、特に１０から３０、１５から３０および２０から３０連続ヌクレオチドの配列を含み、プライマー二量体の形成を避けるために、オーバーラップしない。一方のプライマーは、増幅対象の核酸の一本鎖にハイブリダイズし、他方のプライマーは、その核酸の増幅を可能にするような配置で、相補鎖にハイブリダイズすることができる。
【００７５】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであることができる。
【００７６】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは一つのヌクレオチドの５'末端と、もう一つのヌクレオチドの３'末端とが、ホスホジエステル結合によって互いに連結したその組み合わせからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、慣例の方法で合成するか、組換え生産することができる。
【００７７】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドが「修飾」オリゴヌクレオチドである。ここでは、オリゴヌクレオチドを、例えばその安定性などを増加させる目的で、そのターゲットに結合するというその能力を損なわずに、極めてさまざまな方法で修飾することができる。本発明によれば、「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、（ｉ）少なくとも二つのヌクレオチドが、合成ヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステル結合ではないヌクレオシド間結合）によって互いに連結され、かつ／または（ｉｉ）核酸中に通常は見出されない化学基がオリゴヌクレオチドに共有結合しているオリゴヌクレオチドを意味する。好ましい合成ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミダイト、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００７８】
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、一または二個以上の共有結合的に修飾された塩基および／または１個以上の共有結合的に修飾された糖を有するオリゴヌクレオチドも包含する。例えば「修飾オリゴヌクレオチド」には、３'位のヒドロキシル基および５'位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖残基を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾オリゴヌクレオチドは、例えば２'−Ｏ−アルキル化リボース残基またはリボースの以外の他の糖、例えばアラビノースなどを含むことができる。。
【００７９】
本明細書で用いられる「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、ターゲット遺伝子または分解されるｍＲＮＡを同定するために用いられ、好ましくは１０ヌクレオチド長より大きい、より好ましくは１５ヌクレオチド長より大きい、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長の単離されたＲＮＡ分子を意味する。１９から２５ヌクレオチドの範囲がｓｉＲＮＡにとって最も好ましいサイズである。
【００８０】
本発明のｓｉＲＮＡは、部分精製ＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換え生産ＲＮＡ、ならびに一または二個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって自然発生ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。そのような改変として、例えばｓｉＲＮＡの末端への、またはｓｉＲＮＡの一または二個以上の内部ヌクレオチドへの、非ヌクレオチド物質の付加；ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ分解に対して耐性する修飾（例えば２'−置換リボヌクレオチドの使用または糖−リン酸骨格への修飾）；またはデオキシリボヌクレオチドを用いたｓｉＲＮＡ中の一または二個以上のヌクレオチドの置換を挙げることができる。さらにまた、ｓｉＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドに関して上述したように、その安定性を増加させるために、特に一または二個以上のホスホロチオエート結合を導入することによって修飾することもできる。
【００８１】
本発明の一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖は３'−オーバーハングを含むこともできる。本明細書で用いる「３'−オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３'末端から突き出した少なくとも一つの非対合ヌクレオチドを指す。
【００８２】
したがって、ある実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、１から約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）長、好ましくは１から約５ヌクレオチド長、より好ましくは１から約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２から約４ヌクレオチド長の３'−オーバーハングを少なくとも一つ含む。
【００８３】
両方のｓｉＲＮＡ分子鎖が３'−オーバーハングを有する実施形態では、オーバーハングの長さは各鎖で同じであっても異なってもよい。最も好ましい実施形態では、３'−オーバーハングが両方のｓｉＲＮＡ鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば各本発明のｓｉＲＮＡ鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３'−オーバーハングを含むことができる。
【００８４】
本発明ｓｉＲＮＡの安定性を強化するために、３'−オーバーハングを分解に対して安定化させることもできる。１つの実施形態では、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることによって、オーバーハングは安定化する。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２'−デオキシチミジンを用いた３'−オーバーハング中のウリジンヌクレオチドの置換は許容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２'−デオキシチミジンにおける２'−ヒドロキシルをなくすことで、組織培養培地における３'−オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を著しく強化させることができる。
【００８５】
本発明ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は二つの相補的一本鎖ＲＮＡ分子、または二つの相補部分が塩基対を形成し、それらが一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合している単一分子を含むことができる。すなわち、センス領域とアンチセンス領域を、リンカー分子を介して、共有結合でつなぐことができる。リンカー分子はポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーでもよい。どんな理論に束縛されることも望まないが、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、細胞内では「ダイサー」タンパク質（またはその等価物）によって切断されて、二つの個別の塩基対形成したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
【００８６】
本明細書で用いる、「ターゲットｍＲＮＡ」とは、ダウンレギュレーションのターゲットであるＲＮＡ分子、特にヒトＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ、ヒトＴＰＴＥ  ｍＲＮＡの突然変異型もしくは選択的スプライス型、または同族ＴＰＴＥ遺伝子からのｍＲＮＡを指す。本明細書にはヒトＴＰＴＥ  ｍＲＮＡはｃＤＮＡ等価物として記載されている。ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と等価であり、本発明においては同じ目的すなわちＴＰＴＥの発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの作製に使用できることは、当業者には理解されるだろう。
【００８７】
本明細書で用いる、ヒトＴＰＴＥと「同族（ｃｏｇｎａｔｅ）」である遺伝子またはｍＲＮＡは、ヒトＴＰＴＥと相同な他の哺乳動物種由来の遺伝子またはｍＲＮＡである。
【００８８】
ヒトＴＰＴＥ遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、当技術分野で周知の技法を使って、選択的スプライス型に関して解析することができる。そのような技法として、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法およびインサイチューハイブリダイゼーション法が挙げられる。
【００８９】
「ＲＮアーゼプロテクション」と呼ばれる技法も、選択的スプライス型ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡを同定するために使用することができる。ＲＮアーゼプロテクションでは、遺伝子配列を合成ＲＮＡに転写し、それを他の細胞（例えばＴＰＴＥを発現するように誘導される細胞）に由来するＲＮＡとハイブリダイズさせることを含む。次に、ハイブリダイズさせたＲＮＡを、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートする。予想より小さいフラグメントは、選択的スプライス型ｍＲＮＡの存在を示す。その推定選択的スプライス型ｍＲＮＡは、当業者に周知の方法によって、クローニングし、配列決定することができる。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的スプライス型ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡを同定するために使用することができる。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＴＰＴＥ発現が既知の細胞由来のｍＲＮＡを、当業者に周知の方法を使って、逆転写酵素でｃＤＮＡに変換する。次に、３'非翻訳領域に位置するフォワードプライマーと、５'非翻訳領域に位置するリバースプライマーとを使って、ｃＤＮＡのコード配列全体をＰＣＲによって増幅する。例えば増幅産物のサイズをｍＲＮＡが通常のスプライシングを受けたときの予想産物のサイズと、例えばアガロースゲル電気泳動を用いて比較することなどにより、増幅産物を選択的スプライス型に関して解析することができる。増幅産物のサイズの変化はいずれも、選択的スプライシングを示すことができる。
【００９１】
突然変異型ＴＰＴＥ遺伝子から生産されるｍＲＮＡも、ＴＰＴＥ選択的スプライス型の同定に関して上述した技法を使って、容易に同定することができる。本明細書で用いる「突然変異型」ＴＰＴＥ遺伝子またはｍＲＮＡは、本明細書に記載するＴＰＴＥ配列とは配列が異なるヒトＴＰＴＥ遺伝子またはｍＲＮＡを含む。したがって、ＴＰＴＥ遺伝子の対立遺伝子型、およびそれらから生産されるｍＲＮＡを、本発明の趣旨から「突然変異体」とみなせる。
【００９２】
ヒトＴＰＴＥ  ｍＲＮＡは、その各選択的スプライス型、同族体または突然変異体と共通するターゲット配列を含有しうると考えられる。したがって、そのような共通ターゲティング配列を含む単一ｓｉＲＮＡは、共通ターゲティング配列を含有するさまざまなｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を誘導することができる。
【００９３】
本明細書で用いる「減少させる」または「阻害する」とは、レベルの、例えば基準試料（例えばｓｉＲＮＡで処理していない試料）と比較したときのタンパク質またはｍＲＮＡのレベルなどのレベルにおける、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の総合的減少を引き起こす能力を意味する。ＲＮＡまたはタンパク質発現のこの減少または阻害は、ターゲットにしたｍＲＮＡの切断または分解によって起こりうる。タンパク質発現または核酸発現に関するアッセイは当技術分野では知られており、例えばＥＬＩＳＡ、タンパク質発現に関するウェスタンブロット解析、およびＲＮＡに関するノーザンブロットアッセイまたはＲＮアーゼプロテクションアッセイなどがある。
【００９４】
ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現は、転写される最初のヌクレオチドがプリンである場合に効率がよいとだけ考えられているので、ｓｉＲＮＡは、ターゲティング部位を変化させずに、ｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターから発現させることができる。
【００９５】
本発明のｓｉＲＮＡは、任意のターゲットｍＲＮＡ配列中の任意の約１９から２５連続ヌクレオチドのひと配列(ｓｔｒｅｔｃｈ)（「ターゲット配列」）にターゲティングすることができる。ｓｉＲＮＡ用のターゲット配列を選択するための技法は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．ら「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」（２００２年１０月１１日改訂）に記載されており、その開示内容はすべて参照により本明細書に組み入れられている。「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」は、ワールドワイドウェブ上、米国ニューヨーク州のロックフェラー大学ＲＮＡ分子生物学研究室のＴｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ博士によって維持されているウェブサイトで入手することができ、ロックフェラー大学のウェブサイトにアクセスして「ｓｉＲＮＡ」というキーワードで検索することにより、見つけることができる。したがって、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ターゲットｍＲＮＡ中の約１９から約２５ヌクレオチドの任意の連続ひと配列と実質上同一なヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
一般に、ターゲットｍＲＮＡ上のターゲット配列は、好ましくは開始コドンの５０から１００ｎｔ下流（すなわち３'方向）から始まる、ターゲットｍＲＮＡに一致する既知のｃＤＮＡ配列から選択することができる。しかしターゲット配列は５'−またはは３'−非翻訳領域、または開始コドン近くの領域に位置することもできる。例えば、ＴＰＴＥ  ｃＤＮＡ配列中の適切なターゲット配列は、以下のターゲット配列群から選択される：
（ｉ）ＴＣＧＧＴＡＣＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＡＣＡ（配列番号１５）
（ｉｉ）ＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＴＡＧＣＡ（配列番号１８）
（ｉｉｉ）ＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡ（配列番号２１）
（ｉｖ）ＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＣＴＡＡ（配列番号２４）
（ｖ）ＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴ（配列番号２７）
（ｖｉ）ＡＡＴＧＡＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴ（配列番号３０）
（ｖｉｉ）ＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＴＴ（配列番号３３）。
【００９７】
配列（ｉ）をターゲットとし、各鎖上に３'−オーバーハング（オーバーハングは太字で示す）を有する、本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇｇｕａｃｕｕｇａｕａａｃａｕｕａｃａＴＴ
ＡＧｃｃａｕｇａａｃｕａｕｕｇｕａａｕｇｕ
である。
【００９８】
配列（ｉｉ）をターゲットとし、各鎖上に３'−オーバーハング（オーバーハングは太字で示す）を有する、本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇａｃｕｕｇｕｇｕｕａｕｕｃｕａｇｃａＴＴ
ＧＴｃｕｇａａｃａｃａａｕａａｇａｕｃｇｕ
である。
【００９９】
配列（ｉｉｉ）をターゲットとし、各鎖上に３'−オーバーハング（オーバーハングは太字で示す）を有する、本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇａａａｕａｕｇｕｕｃａａｃｕｇｃａａＴＴ
ＧＡｃｕｕｕａｕａｃａａｇｕｕｇａｃｇｕｕ
である。
【０１００】
配列（ｉｖ）をターゲットとし、各鎖上に３'−オーバーハング（オーバーハングは太字で示す）を有する、本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇａｕｕｇｇｃａａｃｃａａｇａｃｕａａＴＴ
ＧＴｃｕａａｃｃｇｕｕｇｇｕｕｃｕｇａｕｕ
である。
【０１０１】
配列（ｖ）をターゲットとし、各鎖上に３'−オーバーハング（オーバーハングは太字で示す）を有する、本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、
ｃｃｃｕｇｃｃａｃａｕｇｕｕｃａｕａｕＴＴ
ＴＴｇｇｇａｃｇｇｕｇｕａｃａａｇｕａｕａ
である。
【０１０２】
配列（ｖｉ）をターゲットとし、各鎖上に３'−オーバーハング（オーバーハングは太字で示す）を有する、本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、
ｕｇａｃａｇｕｃｃａｃａｇａｃａａｇｕＴＴ
ＴＴａｃｕｇｕｃａｇｇｕｇｕｃｕｇｕｕｃａ
である。
【０１０３】
配列（ｖｉｉ）をターゲットとし、各鎖上に３'−オーバーハング（オーバーハングは太字で示す）を有する、本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇｃｕｇａｕａａｇａａｇｇｃｇｇｇｕｕＴＴ
ＴＴｃｇａｃｕａｕｕｃｕｕｃｃｇｃｃｃａａ
である。
【０１０４】
上記のリストでは、核酸配列中のすべてのデオキシリボヌクレオチドが大文字で表され（例えばデオキシチミジンは「Ｔ」である）、核酸配列中のリボヌクレオチドは小文字で表される（例えばウリジンは「ｕ」である）。
【０１０５】
本明細書に記載するターゲット配列はヒトＴＰＴＥ  ｃＤＮＡに関し、上述の通りこれらの配列は「Ｔ」で表されるデオキシチミジンを含有するとことが分かる。ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡの実際のターゲット配列では、デオキシチミジンがウリジン（「ｕ」）で置き換えられるであろうことは、当業者には理解されるだろう。同様に、本発明のｓｉＲＮＡ内に含まれるターゲット配列も、デオキシチミジンの代りにウリジンを含有することができる。
【０１０６】
本発明のｓｉＲＮＡは当業者にいくつかの公知技法を使って得ることができる。例えばｓｉＲＮＡは、化学合成するか、開示内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる、例えばＴｕｓｃｈｌらの米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）インビトロ系など、当技術分野で知られる方法を使って、組換え生産することができる。
【０１０７】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適宜保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使って、化学合成される。ｓｉＲＮＡは二つの別個の相補的ＲＮＡ分子として合成するか、二つの相補的領域を持つ単一のＲＮＡ分子として合成することができる。
【０１０８】
あるいは、任意の適切なプロモーターを使って、組換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから、ｓｉＲＮＡを発現させることもできる。本発明のｓｉＲＮＡをプラスミドから発現させるための適切なプロモーターとしては、例えばＵ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターなどが挙げられる。
【０１０９】
他の適切なプロモーターの選択は当技術分野内で可能である。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境でｓｉＲＮＡを発現させるための誘導性プロモーターまたは調節可能プロモーターを含むこともできる。
【０１１０】
組換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的技法によって培養細胞発現系から単離するか、細胞内で発現させることができる。本発明のｓｉＲＮＡをインビボの細胞に送達するための組換えプラスミドの使用については、後に詳しく説明する。本発明のｓｉＲＮＡは、二つの別々の相補的ＲＮＡ分子として、または二つの相補的領域を持つ単一のＲＮＡ分子として、組換えプラスミドから発現させることができる。
【０１１１】
本発明のｓｉＲＮＡを発現させるのに適したプラスミド、ｓｉＲＮＡを発現させるための核酸配列をプラスミドに挿入するための方法、および組換えプラスミドを対象細胞に送達する方法は、当技術分野内で選択可能である。
【０１１２】
本発明のｓｉＲＮＡは、インビボの細胞内で組換えウイルスベクターから発現させることもできる。組換えウイルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列と、そのｓｉＲＮＡ配列を発現させるための任意の適切なプロモーターとを含む。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内環境でｓｉＲＮＡを発現させるための誘導性プロモーターまたは調節可能プロモーターを含むこともできる。本発明のｓｉＲＮＡをインビボの細胞に送達するための組換えウイルスベクターの使用については、後に詳しく説明する。本発明のｓｉＲＮＡは、二つの別々の相補的ＲＮＡ分子として、または二つの相補的領域を持つ単一のＲＮＡ分子として、組換えウイルスベクターから発現させることができる。
【０１１３】
本発明によれば「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共有結合した２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上、好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０個、特に１００個までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きいペプチド、好ましくは１００個以上のアミノ酸残基を持つペプチドを指すが、一般的には用語「ペプチド」および「タンパク質」は同義であり、本明細書では可換的に使用される。
【０１１４】
本発明に従って記述されるタンパク質およびペプチドは、好ましくは、単離されている。「単離されたタンパク質」または「単離されたペプチド」という用語は、タンパク質またはペプチドが、その自然環境から分離されていることを意味する。単離されたタンパク質またはペプチドは、本質的に精製された状態にあることができる。「本質的に精製された」という用語は、そのタンパク質またはペプチドが、自然界またはインビボでそれに結合している他の物質を本質的に含まないことを意味する。
【０１１５】
そのようなタンパク質およびペプチドは、例えば抗体の産生、および免疫学的アッセイまたは診断アッセイなどに使用することができる。本発明に従って記述されるタンパク質およびペプチドは、組織または細胞ホモジネートなどの生体試料から単離することができ、多くの原核または真核発現系で組換え発現させることもできる。
【０１１６】
本発明に関して、タンパク質もしくはペプチドまたはアミノ酸配列の「誘導体」には、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体が含まれる。
【０１１７】
アミノ酸挿入変異体にはアミノ−および／またはカルボキシ−末端融合物が含まれ、特定のアミノ酸配列における１個または２個以上のアミノ酸の挿入も含まれる。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合は、１個または２個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列中の特定部位に挿入されるが、得られた産物の適当なスクリーニングによってランダムに挿入することも可能である。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個または２個以上のアミノ酸が除去されることを特徴とする。アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも一つの残基が除去され、その代りに別の残基が挿入されることを特徴とする。好ましいのは、相同タンパク質または相同ペプチド間で保存されていないアミノ酸配列中の位置にある修飾、および／または類似する性質、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の体積などを有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置き換え（保存的置換）である。保存的置換とは、例えば、あるアミノ酸を、以下に列挙する置換されるアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸でと交換することをいう：
１．小さい脂肪族非極性または弱極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．負電荷残基およびそれらのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きい脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【０１１８】
三つの残基は、タンパク質構造におけるその特定の役割ゆえに、カッコ内に示されている。Ｇｌｙは側鎖を有しない唯一の残基であり、これにより、鎖に柔軟性を付与する。Ｐｒｏは鎖を著しく制限する特異な形状を有する。Ｃｙｓはジスルフィド橋を形成することができる。
【０１１９】
上述のアミノ酸変異体は、既知のペプチド合成技法を利用して、例えば固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４）および類似の方法により、または組換えＤＮＡ操作により、容易に製造することができる。置換、挿入または欠失を有するタンパク質およびペプチドを製造するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に詳述されている。
【０１２０】
本発明によれば、タンパク質およびペプチドの「誘導体」には、そのタンパク質またはペプチドに関連する任意の分子、例えば糖質、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどの単一または複数の置換、欠失および／または付加も含まれる。「誘導体」という用語の範囲は、アミノ酸構成要素だけでなく、糖およびリン酸基構造などの非アミノ酸構成要素も含有する前記タンパク質およびペプチドのあらゆる機能的化学等価物にも及び、また、エステル、チオエーテルおよびジスルフィド結合などの結合を含有する物質にも及ぶ。
【０１２１】
本発明によれば、タンパク質またはペプチドの一部またはフラグメントは、好ましくは、その由来となったタンパク質またはペプチドの機能的性質を有する。そのような機能的性質には、抗体との相互作用、および他のペプチドまたはタンパク質との相互作用が含まれる。特定の性質の一つは、ＭＨＣ分子との複合体を形成し、好ましくは細胞傷害性細胞またはＴヘルパー細胞を刺激することによって、適宜免疫応答を生じさせる能力である。タンパク質またはペプチドの一部またはフラグメントは、好ましくは、そのタンパク質またはペプチドの少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、および好ましくは８個まで、特に１０個まで、１２個まで、１５個まで、２０個まで、３０個まで、または５０個までのアミノ酸の連続配列を含む。
【０１２２】
タンパク質またはペプチドをコードする核酸の一部またはフラグメントとは、好ましくは、上で定義した少なくともそのタンパク質またはペプチド、および／または前記タンパク質もしくはペプチドの一部もしくはフラグメントをコードする核酸部分を指す。タンパク質またはペプチドをコードする核酸の一部またはフラグメントは、好ましくは、オープンリーディングフレームに対応する核酸部分である。
【０１２３】
ターゲットタンパク質に特異的に結合する特異抗体を含有する抗血清は、さまざまな標準的プロセスで製造することができる。例えば「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ，ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２）および「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」（Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，ＩＳＢＮ  ０８７９６９５４４７）を参照されたい。それにより、複雑な膜タンパク質を未変性な形態で認識する高親和性の特異的抗体を生成させることもできる（Ａｚｏｒｓａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２９：３５−４８，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４，１９８９；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３４：１０７−１１６，２０００）。これは特に、治療的に使用される抗体の製造に関連するが、多くの診断用途にも関連する。この態様において、免疫化は、タンパク質全体、細胞外部分配列、および生理的に折りたたまれた形態のターゲット分子を発現させる細胞を使って行うことができる。
【０１２４】
モノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使って製造される（技術の詳細については「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ，ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２）；「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ」（Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７）を参照されたい）。
【０１２５】
抗体のそのエピトープへの結合に関与するのは、抗体分子の一部分であるパラトープだけであることが知られている（Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第７版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，オックスフォード参照）。例えば、ｐＦｃ'領域およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ'領域が酵素的に除去された抗体、またはｐＦｃ'領域を有しないように製造された抗体は、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントと呼ばれ、完全な抗体の両抗原結合部位を持っている。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に除去された抗体、または該Ｆｃ領域を有しないように製造された抗体は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、無傷抗体分子の抗原結合部位を一つ有している。さらにまた、Ｆａｂフラグメントは、共有結合された、抗体の軽鎖と、Ｆｄと呼ばれる前記抗体の重鎖の一部とからなる。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体の特異性を変化させずに、１０個までの異なる軽鎖と会合することができる）、Ｆｄフラグメントは、単離されても、エピトープに結合する能力を保っている。
【０１２６】
抗体の抗原結合部分には、抗原エピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが配置されている。重鎖のＦｄフラグメントと、ＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖は、どちらも、４個のフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）を含有し、それらはそれぞれ３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によって隔てられている。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらに特に重鎖のＣＤＲ３領域は、抗原特異性の大部分を担っている。
【０１２７】
哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域は、初期抗体のエピトープ特異性を保ったまま、同じ特異性または異なる特異性を有する抗体の類似する領域で置き換え可能であることが知られている。これにより、機能的抗体が産生されるように非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ'領域に共有結合した「ヒト化」抗体の開発を可能となる。
【０１２８】
もう一つの例として、国際公開公報第ＷＯ  ９２／０４３８１号には、マウスＦＲ領域の少なくとも一部がヒト由来のＦＲ領域で置き換えられているヒト化マウスＲＳＶ抗体の製造および使用が記述されている。この種の抗体は、抗原結合能を有する無傷抗体のフラグメントを含めて、しばしば「キメラ」抗体と呼ばれる。
【０１２９】
本発明によれば、「抗体」という用語は、さらに抗体のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄフラグメント、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられているキメラ抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられているキメラＦ（ａｂ'）２フラグメント抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられているキメラＦａｂフラグメント抗体、ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置き換えられているキメラＦｄフラグメント抗体を包含する。「抗体」という用語には「単鎖」抗体も含まれる。
【０１３０】
抗体は、特定のタンパク質またはペプチドを発現させる細胞および組織を表示するために、特異的診断物質と共役させることもできる。
【０１３１】
診断物質としては、（ｉ）検出可能なシグナルを出す機能、（ｉｉ）第２のラベルと相互作用して、第１ラベルまたは第２ラベルによって出される検出可能シグナルを修飾する機能、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状、または他の物理的パラメータによって、移動度、例えば電気泳動移動度に影響を及ぼす機能、または（ｉｖ）捕捉部分、例えばアフィニティ、抗体／抗原、またはイオン錯体形成を与える機能を果たす任意のラベルが挙げられる。ラベルとして適しているのは、例えば蛍光ラベル、発光ラベル、発色団ラベル、放射性同位体ラベル、同位体ラベル、好ましくは安定同位体ラベル、同重核ラベル、酵素ラベル、粒子ラベル、特に金属粒子ラベル、磁気粒子ラベル、ポリマー粒子ラベル、ビオチンなどの小さな有機分子、受容体のリガンドまたは細胞接着タンパク質もしくはレクチンなどの結合分子、結合剤の使用によって検出することができる核酸および／またはアミノ酸残基を含むラベル配列などの構造である。診断物質には、限定するわけではないが、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、イオパノ酸、カルシウムイポデート、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、ナトリウムチロパノエート、ならびに放射性診断剤、例えばフッ素−１８および炭素−１１などの陽電子放射体、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１などのガンマ放射体、フッ素およびガドリニウムなどの核磁気共鳴用核種が含まれる。
【０１３２】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、すべての脊椎動物中に存在する遺伝子の複合体を指す。ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子は、正常な免疫反応において、ペプチドを結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識のためにそれらを提示することにより、リンパ球と抗原提示細胞の間のシグナリングに関与する。ＭＨＣ分子は、細胞内プロセシング区画においてペプチドを結合し、Ｔ細胞による認識のためにこれらのペプチドを抗原提示細胞の表面に提示する。ＨＬＡとも呼ばれるヒトＭＨＣ領域は第６番染色体上に位置し、クラスＩ領域およびクラスＩＩ領域を含む。本発明のすべての態様の好ましい１つの実施形態では、ＭＨＣ分子がＨＬＡ分子である。
【０１３３】
「患者」または「対象」という用語は、本発明によれば、ヒト、非ヒト霊長類または他の動物、特に哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはマウスおよびラットなどの齧歯類を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【０１３４】
「異常な発現」とは、本発明によれば、健常個体の状態と比較して発現が変化し、好ましくは増加することを意味する。本発明によれば、「増加した」または「増加した量」という用語は、好ましくは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の増加を指す。試験試料では検出可能であるが、参照試料には存在しないか、参照試料では検出不可能である場合も、生体試料などの試験試料における物質の量は、参照試料と比較して増加している。
【０１３５】
本発明によれば「疾患」という用語は、特にがんを含む任意の病理学的状態を指し、この場合、本発明によれば「がん」という用語には、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝がん、大腸がん、胃がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、直腸結腸がん、膵がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮のがん、卵巣がんおよび肺がんならびにそれらの転移が含まれる。その例は、肺がん、乳がん、前立腺がん、大腸がん、腎細胞がん、子宮頸がん、または上述したがんタイプまたは腫瘍の転移である。本発明によれば「がん」という用語はがんの転移も包含する。
【０１３６】
「腫瘍」とは、迅速で制御されない細胞増殖によって増殖し、新しい増殖を開始する刺激が途絶えた後も増殖し続ける異常な細胞または組織群を意味する。腫瘍は、正常組織との構造的組織化および機能的協調の部分的なまたは完全な欠如を示し、通常は明確な組織塊を形成するが、それは良性である場合も、悪性である場合もある。
【０１３７】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、上述のがんに関連する固形腫瘍の増殖または転移を阻害するために使用される。
【０１３８】
「転移」とは、その最初の部位から身体の別の部分への癌細胞の拡大を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、一次腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスへの浸潤、内皮基底膜に侵入して体腔および脈管に入り込むこと、およびその後、血液によって運搬された後、標的器官への浸潤に依存する。最後に、標的部位での新しい腫瘍の増殖は血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば一次腫瘍の除去後にも起こり、これは、腫瘍細胞または成分が残存し、転移の潜在的可能性を発現し得るからである。
【０１３９】
「再発」という用語は、例えば腫瘍切除、化学療法および／または放射線療法などの治療後に、患者が寛解を享受した後の、疾患の兆候および症状が再び現れることを指す。とくに、「再発」という用語は、無病期間後のがんの再発現を指す。例えば治療後に、がんを持つ患者が腫瘍の兆候も症状も示さない寛解状態になり、しばらくの間は寛解状態を保ったが、その後、再発を起して、再びがんの治療を受ける必要が生じる。
【０１４０】
本発明によれば、生体試料は、体液を含む組織試料および／または細胞試料であることができ、パンチ生検を含む組織生検、および血液、気管支吸引液、喀痰、尿、糞便または他の体液の採取などの通常の方法によって、取得することができる。
【０１４１】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は本明細書では可換的に使用され、Ｔヘルパー細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞を含む細胞溶解性Ｔ細胞を包含する。
【０１４２】
本発明に従って記述される医薬組成物および処置方法は、本明細書に記載する疾患を予防するための免疫化またはワクチン接種に使用することもできる。
【０１４３】
本発明の方法では、本発明のｓｉＲＮＡを対象に、裸のｓｉＲＮＡとして、送達試薬と一緒に投与するか、ｓｉＲＮＡを発現させる組換えプラスミドまたはウイルスベクターとして投与することができる。本発明では、ターゲット制御リポソームを使って核酸をインビボ投与することもできる。
【０１４４】
インビボで細胞にｓｉＲＮＡを送達するには、発現対象のｓｉＲＮＡ分子のコード配列を受容する能力を持つ任意のウイルスベクター、例えばアデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを使用することができる。ウイルスベクターの親和性は、ベクターを他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原でシュードタイピングするか、適宜、異なるウイルスキャプシドタンパク質を代用することによって修飾することができる。
【０１４５】
リポソームは、腫瘍組織などの特定組織へのｓｉＲＮＡの送達を促進することができ、ｓｉＲＮＡの血中半減期を増加させることもできる。本発明での使用に適したリポソームは、一般に、中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般的には、所望のリポソームサイズおよび血流におけるリポソームの半減期などの因子を考慮してなされる。例えばＳｚｏｋａら（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、米国特許第４，８３７，０２８号および米国特許第５，０１９，３６９号に記述されているように、さまざまなリポソーム製造方法が知られており、これらの開示内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４６】
特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に向かわせることが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）が、結合されたターゲット制御分子を有することができる。例えば、ターゲット細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体、またはターゲット細胞上にある受容体のリガンドなどの分子を、核酸担体に組み込むか、取付けることができる。好ましい抗体には、腫瘍細胞関連抗原を選択的に結合する抗体が含まれる。リポソームを介した核酸の投与が望ましい場合は、ターゲット制御および／または取り込みを可能にするために、エンドサイトーシス関連表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込むことができる。そのようなタンパク質には、特定の細胞タイプに特異的なキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内部位に向かうタンパク質などが含まれる。
【０１４７】
所与のターゲット配列を含有するｓｉＲＮＡが有する、ターゲットｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を引き起こす能力は、細胞中のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定するための標準的技法を使って評価することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡを培養細胞に送達し、ターゲットｍＲＮＡのレベルをノーザンブロットまたはドットブロット法で測定するか、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定することができる。あるいは、培養細胞中のＴＰＴＥタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって測定することもできる。
【０１４８】
ターゲットｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解は、上述のｍＲＮＡまたはタンパク質を単離し定量するための標準的技法を使って、対象の細胞におけるターゲットｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することによって、検出することができる。
【０１４９】
本発明の治療組成物は医薬適合性製剤の形態で投与することができる。そのような製剤は、通常、医薬適合濃度の塩、緩衝物質、保存剤、担体、アジュバントなどの補助的免疫強化物質、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＲＮＡ、ならびに適宜、他の治療活性化合物を含有しうる。
【０１５０】
本発明の治療活性化合物は、注射または注入による投与経路を含めて、任意の通常経路で投与することができる。投与は、例えば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経皮などの方法で行うことができる。
【０１５１】
本発明のｓｉＲＮＡをＴＰＴＥ発現細胞に送達するための適切な技法として、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ナノ粒子、マイクロカプセル化などによって、または非経口投与経路および経腸投与経路によって、ｓｉＲＮＡを対象に投与することが挙げられる。
【０１５２】
適切な経腸投与経路として、経口、直腸、または鼻内送達が挙げられる。
【０１５３】
適切な非経口投与経路として、血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および脈管構造へのカテーテル点滴）、組織周囲および組織内投与（例えば腫瘍周囲注射および腫瘍内注射）、皮下注入を含む皮下注射または皮下デポジション（例えば浸透圧ポンプによるもの）、例えばカテーテルまたは他の設置デバイス（例えば坐剤、または多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン様物質を含むインプラント）などによる患部領域の部位またはその近くへの直接（例えば局所外用）適用、および吸入が挙げられる。
【０１５４】
本発明の組成物は有効量で投与される。「有効量」とは、単独で、またはさらなる投薬と合わせて、望ましい反応または望ましい作用を達成する量を指す。特定疾患または特定状態の処置において、望ましい反応とは、好ましくは、その疾患の経過の阻害を指す。これには、疾患の進行を遅らせること、そして特に、疾患の進行を中断または反転させることが含まれる。疾患または状態の処置における望ましい反応として、前記疾患もしくは前記状態の発生の遅延または前記疾患もしくは前記状態の発生の予防も挙げられる。本明細書で用いるｓｉＲＮＡの「有効量」は、好ましくは、対象におけるターゲットｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を引き起こすのに十分な量である。
【０１５５】
本発明の組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個別パラメータ、処置の継続期間、併用治療が存在する場合はそのタイプ、特定投与経路および同様の因子に依存する。
【０１５６】
当業者は、所与の対象に投与されるべき本発明のｓｉＲＮＡの有効量を、その対象のサイズおよび体重、疾患浸透度、対象の年齢、健康状態および性別、投与経路、ならびに投与が局所的であるか全身的であるかなどの因子を考慮して、容易に決定することができる。一般に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、ＴＰＴＥの発現が阻害されるべき部位において、約１ナノモル濃度（ｎＭ）から約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭから約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭから約１０ｎＭの細胞間濃度を含む。この量より多いまたは少ないｓｉＲＮＡを投与することもできると考えられる。
【０１５７】
本発明のｓｉＲＮＡは、病変を処置するために設計された他の治療方法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡは、がんを処置するためまたは腫瘍転移を予防するために現在使用されている治療方法（例えば放射線療法、化学療法、および外科手術）と組み合わせて投与することができる。腫瘍を処置する場合、本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、放射線療法と組み合わせて、またはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンもしくはタモキシフェンなどの化学療法剤と組み合わせて対象に投与される。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、好ましくは滅菌状態にあり、望ましい反応または望ましい作用を生じさせるために有効量の治療活性物質を含有する。
【０１５９】
投与される本発明の組成物の用量は、投与のタイプ、患者の状態、所望する投与期間などのさまざまなパラメータに依存しうる。患者における反応が初回用量では不十分である場合は、より多くの用量、またはより局在化した別の投与経路によって効率的により多くの用量を使用することができる。
【０１６０】
本発明の医薬組成物は、一般に、医薬適合量かつ医薬適合組成物の形態で投与される。「医薬適合性」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない無毒性物質を指す。この種の製剤は、通常、塩、緩衝物質、保存剤、担体、そして適宜、他の治療活性化合物を含有してもよい。医薬に使用する場合、塩は医薬適合性でなければならない。しかし、医薬適合性でない塩も、医薬適合性塩の製造に使用することができ、本発明に包含される。この種の薬理学的および医薬的に適合する塩として、限定するわけではないが、以下の酸から製造されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。医薬適合性塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として製造することもできる。
【０１６１】
本発明の医薬組成物は医薬適合性担体を含んでもよい。本発明によれば「医薬適合性担体」という用語は、ヒトへの投与に適した、一または二以上の適合性固形または液状充填剤、希釈剤または封入物質を指す。「担体」という用語は、適用が容易になるように活性成分が混合される天然または合成天然の有機または無機成分であって、ものを指す。本発明の医薬組成物の成分は、通常、望ましい医薬的効力を実質的に損なう相互作用が起こらないような成分である。
【０１６２】
本発明の医薬組成物は、酢酸の塩、クエン酸の塩、ホウ酸の塩およびリン酸の塩など、適切な緩衝物質を含有しうる。
【０１６３】
医薬組成物は、適宜、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適切な保存剤も含有しうる。
【０１６４】
医薬組成物は、通常、均一な剤形で提供され、それ自体公知の方法で製造することができる。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル剤、錠剤、トローチ剤(ｌｏｚｅｎｇｅ)、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤またはエマルションなどの形状をとりうる。
【０１６５】
非経口投与に適した組成物は、通常、活性化合物の滅菌水性または非水性製剤を含み、これは受容者の血液と等張であることが好ましい。適合性担体および適合性溶剤の例は、リンゲル液および等張食塩溶液である。また、通常は滅菌された固定油が、溶液または懸濁媒として使用される。
【０１６６】
以下に図面および実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらの図面および実施例は例示のために使用するに過ぎず、限定を意図するものではない。この説明および実施例により、当業者は、本発明に同様に包含される他の実施形態にも到達することができる。
【実施例１】
【０１６７】
材料および方法
組織および細胞株
この研究は、現地の倫理審査委員会（「Ｅｔｈｉｋｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｒ  Ａｒｚｔｅｋａｍｍｅｒ  ｄｅｓ  Ｌａｎｄｅｓ  Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ−Ｐｆａｌｚ」）によって承認されている。組換えＤＮＡ作業は、当局の許可を得て、ラインラント・プファルツ(Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ−Ｐｆａｌｚ)州政府の規則に従って行った。組織はルーチン診断ワークアップまたは治療処置中にヒト余剰物質として取得し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。別段の明示がない場合、細胞株は供給業者から入手した。脱メチル化研究の場合、細胞を２０から３０％密集度に分割し、２μＭまたは１０μＭ  ５−アザ−２'−デオキシシチジン（５−Ａｚａ−ｄＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に７２時間培養した。大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６ＷＴ、ＨＣＴ１１６ＤＮＭＴ１−／−、ＨＣＴ１１６ＤＮＭＴ３ｂ−／−およびＨＣＴ１１６ＤＫＯは、Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの厚意で譲り受けた。
【０１６８】
ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出、第１鎖ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは以前記述したように行った（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５（２００２）、Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３（２００４））。ＲＴ−ＰＣＲには、ＴＰＴＥ特異的オリゴヌクレオチド（センス５'−ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＴＴＧ−３'；アンチセンス５'−ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＣＴＧ−３'、６３℃アニーリング）を、３５サイクルＰＣＲで使用した。リアルタイム定量発現解析は、３重に行った。ＴＰＴＥ特異的オリゴヌクレオチド（センス５'−ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  ＧＴＧ−３'；アンチセンス５'−ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＣＴＧ−３'、６３℃アニーリング）を使って、４０サイクルＰＣＲで行った。１８ｓＲＮＡ（センス５'−ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＧＴＣ−３'；アンチセンス５'−ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ−３'、６５℃アニーリング）に対する標準化後に、腫瘍試料中のＴＰＴＥ転写物を、正常組織と対比して、ΔΔＣＴ算出法で定量した。
【０１６９】
抗血清、免疫化学およびウェスタンブロット
ＴＰＴＥのＮ末端（ａａ１から５１）に対して生じさせたポリクローナル抗血清ｐＡＫ２０９１を、カスタム抗体サービス（ＳｅｑＬａｂ）から入手した。免疫組織化学はホルマリン固定パラフィンおよび包埋組織切片で抗原回復後に行った。抗原回復操作は、スライドをクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で１５分間煮沸した後、室温で１５分間冷却することからなった。ウェスタンブロット解析には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した細胞から抽出した総タンパク質６０μｇを使用した。抽出物を還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ）で希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｐａｌｌ）上に電気的に転写した。免疫染色には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ａｂｃａｍ）、ｐＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびβ−アクチン（Ａｂｃａｍ）に反応する抗体を使用した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ)複合ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ）を使用した。抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）を製造者の説明書に従って使用することにより、抗ＴＰＴＥ  ｐＡＫ２０９１一次抗体の検出を行った。
【０１７０】
真核細胞におけるｅＧＦＰタグ付きＴＰＴＥの発現
二つのＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するセンスプライマー５'−ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  Ｔ−３'およびアンチセンスプライマー５'−ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＣ−３'を使ってＴＰＴＥ−ＯＲＦを増幅した。増幅されたフラグメントをベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１およびｐＥＧＦＰ−Ｎ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にライゲートした。ホスファターゼドメインの活性部位に突然変異を有する変異型ＴＰＴＥＣ３３８Ｓを、ＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発法によって作製した。
【０１７１】
免疫蛍光および共局在研究
構成的にまたは異種的にプラスミドでトランスフェクションした後にＴＰＴＥ発現細胞をスライド上で１２から２４時間増殖させ、２％パラホルムアルデヒド／０．１％サポニン／ＰＢＳで固定した。ｐＡＫ２０９１ポリクローナルウサギ抗血清と、ウサギＩｇＧに対する蛍光タグ付き二次抗体とを使って、ＴＰＴＥに関する間接的免疫蛍光染色を行った。ＴＰＴＥのＦ−アクチンとの共局在研究では、透過処理した固定細胞をローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。膜結合型ＰＩＰ２およびＰＩＰ３を可視化するためのＰＬＣ−ｄ１およびＡＫＴのｅＧＦＰタグ付きＰＨドメイン用の発現プラスミドは、それぞれＭａｒｉｏ  Ｊ．Ｒｅｂｅｃｃｈｉ（Ｔａｌｌ，Ｅ．Ｇ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０，７４３−７４６（２０００））およびＪｕｌｉａｎ  Ｄｏｗｎｗａｒｄ（Ｗａｔｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．およびＤｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９，４３３−４３６（１９９９））の厚意で提供を受けた。免疫蛍光顕微鏡法による解析のためにカバースリップをスライド上でＳｌｏｗ−Ｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）にマウント(ｍｏｕｎｔ)した。
【０１７２】
ｅＧＦＰ融合タンパク質の免疫精製
ｅＧＦＰ融合タンパク質発現細胞を、氷上、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびプロテアーゼインヒビター（８μＭロイペプチン、３．３μＭキモスタチン、２．９μＭペプスタチンＡ、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ−塩酸塩）を含有する緩衝液で、１５分間溶解した。４℃で５分間の遠心分離によって溶解物を清澄化した。プレクリア(ｐｒｅｃｌｅａｒ)するために、溶解物をプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で１時間インキュベートした。プレクリアした溶解物を抗ｅＧＦＰ抗体（Ｄｅｌｔａ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に４℃で２時間インキュベートした後、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂと共に４℃で１時間インキュベートし、２分間の遠心分離によって沈殿させた。免疫複合体をＩＰ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄し、反応緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロット法で解析した。
【０１７３】
インビトロホスファターゼアッセイ
１１０μＭ水溶性ホスファチジルイノシトールリン酸（Ｅｃｈｅｌｏｎ）および免疫沈降タンパク質を含有する反応緩衝液で、ＰＴＥＮおよびＴＰＴＥのホスファターゼ活性を測定した。試料を３７℃で９０分間インキュベートし、基質から放出されたリン酸基の量を、マラカイトグリーンアッセイ（Ｅｃｈｅｌｏｎ）を使って決定した。１５分間の発色後に、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅリーダーを使って試料の吸光度を６２０ｎｍで測定した。各試料を３重に解析した。
【０１７４】
ｓｉＲＮＡ二重鎖
共通規則に従ってｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８（２００１））。ＴＰＴＥ  ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１３３１５．１）のヌクレオチド１７２２−１７４２をターゲットとし、センス５'−ｒ（ＧＧＵ  ＡＣＵ  ＵＧＡ  ＵＡＡ  ＣＡＵ  ＵＡＣ  Ａ）ｄＴｄＴ−３'およびアンチセンス５'−ｒ（ＵＧＵ  ＡＡＵ  ＧＵＵ  ＡＵＣ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  Ｃ）ｄＧｄＡ−３'から構成される。対照として、センス５'−ｒ（ＵＡＡ  ＣＵＧ  ＵＡＵ  ＡＡＵ  ＣＧＡ  ＣＵＡ  Ｇ）ｄＴｄＴ−５'およびアンチセンス５'−ｒ（ＣＵＡ  ＧＵＣ  ＧＡＵ  ＵＡＵ  ＡＣＡ  ＧＵＵ  Ａ）ｄＧｄＡ−３'から構成されるスクランブルｓｉＲＮＡ二重鎖を使用した。ＴＰＴＥサイレンシング研究のために、ＲＮＡｉＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用することにより、細胞に１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ二重鎖をトランスフェクトした。機能アッセイはすべて、ｓｉＲＮＡ二重鎖をトランスフェクトした２４時間後に行った。
【０１７５】
細胞遊走
８．０μｍポアメンブレンを有するトランスウェルチャンバ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って細胞遊走アッセイを行った。遊走アッセイで使用する細胞は実験開始前に無血清培地で１２時間培養した。ｓｉＲＮＡ実験ではｓｉＲＮＡ二重鎖を上述のようにトランスフェクトしてから２４時間後に細胞を無血清条件に移した。無血清培養培地４００μｌ中の４×１０４個の細胞を上室に加えた。下室は、化学誘引物質としてＦＣＳ、ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＳＤＦ−１ａ／ＣＸＣＬ１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した培養培地８００μｌを含有した。細胞を２４時間遊走させた。メンブレンの底側に遊走した細胞を氷冷メタノール中で固定し、メンブレンを切り出し、顕微鏡スライド上に置き、蛍光顕微鏡法のためにヘキスト（Ｄａｋｏ）でマウントした。ランダムな５視野（倍率１００倍）中の細胞を各メンブレンについて計数した。すべての実験を３重に行った。
【０１７６】
細胞増殖
ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用することにより、増殖を解析した。ｓｉＲＮＡ二重鎖をトランスフェクトした２４時間後に、さまざまな濃度のＦＣＳを添加した培地で１×１０４個の細胞を４８時間培養した。アッセイをＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
【０１７７】
細胞周期解析およびアポトーシス
さまざまな濃度のウシ胎仔血清を添加した培地で細胞を培養し、４８時間後に収集し、ヨウ化プロピジウムで染色してから、フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量解析を行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使ってアポトーシス細胞およびＳ／Ｇ２／Ｍ期の細胞を定量した。
【０１７８】
カルシウム動員アッセイ
ＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ３  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使って細胞内カルシウムの動員を解析した。透明底９６穴プレートで２×１０４個の細胞を無血清培地中で１２時間培養した。蛍光色素分子標識を製造者の説明書に従って行った後、細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１ａ／ＣＸＣＬ１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で３重に刺激した。オリンパスＩＸ７１倒立顕微鏡およびＴＩＬＬｖｉｓＩＯＮソフトウェア（ＴＩＬＬ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を使って、カルシウム動員を記録した。
【０１７９】
インビボ腫瘍増殖解析および実験的転移アッセイ
腫瘍増殖解析のために、５×１０６個の細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２−ｅＧＦＰ、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２−ＴＰＴＥ−ｅＧＦＰ、およびＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２−ＴＰＴＥＣ３３８Ｓ−ｅＧＦＰ）を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（各群５匹）の側腹部に皮下注射した。腫瘍を定期的にはさみ尺で測定し、腫瘍体積を算出した（Ｖ＝ａ×ｂ×ｂ／２）。腫瘍細胞の血管外遊出を評価するために、ＣＦＳＥ（Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＦＤＡ  ＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅｒ  Ｋｉｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）で標識した１×１０６個の細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（各群３匹）の尾静脈に注射した。マウスを６時間後に犠牲(ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ)にし、肺のヘキスト３３２５８標識凍結切片（２０μＭ）を血管外遊出した腫瘍細胞について蛍光顕微鏡法で解析した（Ｖｏｕｒａ，Ｅ．Ｂ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０，９９３−９９８（２００４））。肺あたり５０個のランダムな視野中の腫瘍細胞を計数した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（各群４匹）の肺における腫瘍負荷の定量を、２×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をｉ．ｖ．注射した５週間後に、リアルタイムＰＣＲによって行った。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＤＮＡを抽出した。ヒト第１７番染色体のａサテライト領域の２２６ｂｐフラグメント（センス５'−ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＡＧ−３'；アンチセンス５'−ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  Ｇ−３'）を、それぞれ１μｇのＤＮＡを使って増幅した。腫瘍負荷は、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞にＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞を連続希釈することによって作成した標準曲線と比較して定量した。
【０１８０】
統計解析
患者の転移率に関して、腫瘍におけるＴＰＴＥ発現の統計解析を、ＳＰＳＳソフトウェア（フィッシャーの正確確率検定）を使って行った。
【実施例２】
【０１８１】
ＴＰＴＥはヒト腫瘍において異所性発現される
本発明者らはまず、一組の多数の正常および新生物組織標本で、ＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ発現を調べた。ＴＰＴＥ発現は精巣に限定され、他のすべての正常組織標本では、転写物量が高感度ＲＴ−ＰＣＲの検出限界未満である（図１ａ、ｂ）。対照的に、本発明者らは、１５５の腫瘍試料のうち５９の試料（３８％）で、悪性黒色腫（５０％）、乳がん（４７％）および肺がん（５５％）を含むさまざまながんのタイプならびに、一組の多数のがん細胞株（６２％）に強いＴＰＴＥ発現を検出した（表１）。
【０１８２】
【表１】
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【０１８３】
発現データをタンパク質レベルで確認するために、ＴＰＴＥのＮ末端（ａａ１から５１）に対するポリクローナルウサギ抗体（ｐＡＫ２０９１）を使用した。ＴＰＴＥの予想サイズと一致して、ウェスタンブロット解析により、精巣組織、ＲＴ−ＰＣＲにより構成的ＴＰＴＥ発現に関して陽性型のいくつかの腫瘍細胞株、ならびに抗体の特異性を裏付けるＴＰＴＥ−ｃＤＮＡトランスフェクト細胞に、６５ｋＤａバンドが検出された（図１ｃ、左）。ＲＴ−ＰＣＲデータと合致して、正常体組織はウェスタンブロットではＴＰＴＥに関して陰性と記録されたが、ＴＰＴＥ  ＲＴ−ＰＣＲ陽性がん組織は、かなりの量のＴＰＴＥタンパク質を含有する（図１ｃ、右）。ｐＡＫ２０９１を使った精巣組織での免疫組織化学は、マウスオルソログについて最近記載されたインサイチューハイブリダイゼーションデータと合致して、ＩＩ型精母細胞および精娘細胞(ｐｅｒｓｐｅｒｍａｔｉｄ)で特異的免疫反応性を示した（Ｗｕ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２１７４５−２１７５３（２００１））（図１ｄ）。肺、乳房および前立腺のがんおよび悪性黒色腫から得た組織標本は、免疫組織化学において強い腫瘍細胞特異的染色を示した。対照的に、隣接するストロマ細胞および非新生物上皮細胞（図１ｄ）ならびに患者適合正常組織は反応性を示さなかった（図示せず）。分子腫瘍マーカーとしてのＴＰＴＥが確証されたので、本発明者らは、がん細胞におけるその異所性活性化に関与する機構を調べることにした。ＣｐＧリッチプロモーターにおけるＤＮＡメチル化は、体細胞組織における生殖細胞系特異的遺伝子のサブセットのサイレンシングに関する主要機構であると報告されている。そしてまた、ゲノムの脱メチル化は、腫瘍細胞におけるこれらの遺伝子の異常な活性化には十分であると思われる（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３（２００４）、Ｄｅ  Ｓｍｅｔ，Ｃ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９，７３２７−７３３５（１９９９）、Ｄｅ  Ｓｍｅｔ，Ｃ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２４，４７８１−４７９０（２００４））。実際、いくつかの非発現がん細胞株をＤＮＡメチル化阻害剤５−アザ−２'−デオキシシチジンで処理すると、ＴＰＴＥ転写が強く誘導された（図１ｅ）。ＴＰＴＥ転写のメチル化依存的調節を、野生型ＨＣＴ１１６大腸がん細胞およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）遺伝子が破壊されている子孫で、さらに評価した。ＨＣＴ１１６ＷＴ細胞、ならびにほとんど正常な、またはかわずかしか低下していない総ＤＮＡメチル化量を示すことが知られているＤＮＭＴ３ｂ−／−およびＤＮＭＴ１−／−単一ノックアウト変異体（Ｒｈｅｅ，Ｉ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１６，５５２−５５６（２００２））は、ＴＰＴＥを発現させない。対照的に、両方のメチルトランスフェラーゼを欠き著しく低下した総ＤＮＡメチル化量を示すＨＣＴ１１６ＤＫＯ細胞は、ＴＰＴＥ発現の強い誘導を示した（図１ｅ）。どちらのアッセイも、ＤＮＡのメチル化がＴＰＴＥサイレンシングにとって必要であること、および腫瘍において頻繁に観察されるゲノムの脱メチル化（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，５４０��−５４１３（２００２）、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０１，８９−９２（１９８３））は、その活性化にとって十分であることを、それぞれ独立して裏付けた。
【実施例３】
【０１８４】
ＴＰＴＥは形質膜ＰＩＰ３−ホスファターゼである
ＴＰＴＥはホスファターゼおよび脂質結合性Ｃ２ドメインを含有する。どちらの構造的特徴も、そのホモログＰＴＥＮの脂質ホスファターゼ活性にとっては不可欠でありかつ十分であることが示されている（Ｗｕ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２１７４５−２１７５３（２００１）、Ｌｅｅ，Ｊ．Ｏ．ら，Ｃｅｌｌ  ９９，３２３−３３４（１９９９））。ＰＩＰ３およびＰＩ（３，４）Ｐ２に対して基質特異性を有する脂質ホスファターゼ活性は、インビトロで、ＴＰＴＥのマウスオルソログについて既に示されているが（Ｗｕ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２１７４５−２１７５３（２００１））、ヒトＴＰＴＥについては、有意な酵素活性の欠如が報告されている（Ｗａｌｋｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６０，２７７−２８３（２００１））。後者の研究では細菌由来の組換えタンパク質が使用されたので、本発明者らは、真核細胞によって生産されたタンパク質を使ってヒトＴＰＴＥの酵素活性を再評価した。この目的を達成するために、本発明者らは、ｅＧＦＰに融合したＴＰＴＥおよびＰＴＥＮのホスファターゼおよびＣ２ドメインをＨＥＫ−２９３細胞で発現させ、それらのタンパク質を抗ｅＧＦＰ抗体結合プロテインＡビーズによる免疫沈降によって精製し、それらをマラカイトグリーンアッセイに使用した。共精製されるホスファターゼによる汚染の可能性を除外するために、推定ホスファターゼ活性にとって不可欠な部位を突然変異させたＴＰＴＥ変異体であるｅＧＦＰまたはＴＰＴＥＣ３３８Ｓ−ｅＧＦＰトランスフェクト細胞から得た等モル量の免疫沈降物を対照とした。驚いたことに、本発明者らは、ＴＰＴＥがＰＴＥＮに匹敵する速度でＰＩＰ３から特異的にリン酸を放出させることを見出した。ＴＰＴＥＣ３３８Ｓ−ｅＧＦＰ対照およびｅＧＦＰ対照におけるホスファターゼ活性の欠如により、このアッセイの特異性が裏付けられた（図２ａ）。この発見は、ヒトのがんにおけるＴＰＴＥの異常活性化と合わせて、ＴＰＴＥが、腫瘍細胞において、ホスホイノシチド媒介性形質膜シグナリングイベントに関与することを示している。
【０１８５】
ＴＰＴＥ−ｅＧＦＰをトランスフェクトしたＴＰＴＥ陰性細胞と、ＴＰＴＥを構成的に発現させるがん細胞株とを、抗ＴＰＴＥ抗体で標識し、免疫蛍光顕微鏡法で調べた。先に記述されたゴルジ装置および小胞体への局在（Ｗｕ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２１７４５−２１７５３（２００１））に加えて、本発明者らは、ＴＰＴＥの大部分を形質膜に見出した（図２ｂ、２ｃ）。ＴＰＴＥは膜ラッフル部ならびに仮足および糸状仮足を含む膜突起の外側縁部に目立つが、そのような構造の先端部はＴＰＴＥを含まないままである（図２ｄ）。これらの細胞をＦ−アクチンのマーカーであるローダミン−ファロイジンで共染色することにより、形質膜ＴＰＴＥと繊維状アクチンとの共局在が示された（図２ｅ）。ＴＰＴＥと形質膜ホスホイノシチドとの空間的関係を精査するために、本発明者らは、それぞれＰＩＰ（４，５）Ｐ２または３'−リン酸化リン脂質に選択的に結合するＰＬＣ−ｄ１−ＰＨ（ホスホリパーゼＣ−ｄ１プレクストリンホモロジー）ドメイン（Ｔａｌｌ，Ｅ．Ｇ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０，７４３−７４６（２０００））およびＡＫＴ−ＰＨドメイン（Ｗａｔｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．およびＤｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９，４３３−４３６（１９９９））を使って、プレクストリンドメイン−ｅＧＦＰ融合タンパク質との共局在研究を行った。注目すべきことに、ＴＰＴＥ  ｃＤＮＡとｅＧＦＰタグ付きＰＨドメインとを同時発現させる細胞をｐＡＫ２０９１で染色したところ、ＰＬＣ−ｄ１−ＰＨ−ｅＧＦＰではＴＰＴＥとのほぼ完全なオーバーラップしていることが示されたが（図２ｆ）、ＡＫＴ−ＰＨ−ｅＧＦＰではそうならなかった（図示せず）ことから、ＴＰＴＥがＰＩＰ２と共局在することが証明された（図２ｆ）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ形質転換線維芽細胞において、ＴＰＴＥ  ｃＤＮＡを同時トランスフェクトすると、形質膜から細胞質へとＡＫＴ−ＰＨ−ｅＧＦＰの完全な再分布が起こったが、ＴＰＴＥＣ３８８Ｓ−ｃＤＮＡではそのような再分布は起こらなかったことから（Ｓｃｈｉｆｆｅｒ，Ｉ．Ｂ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３，７２２１−７２３１（２００３））、ＴＰＴＥが形質膜ＰＩＰ３レベルを減少させることが証明された。これらの知見を総合すると、ＰＴＥＮについて先に実証されたように（Ｉｉｊｉｍａ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１６６０６−１６６１３（２００４））、ＴＰＴＥは形質膜ホスホイノシチドの空間的制御に関与し、ＰＩＰ３を代謝してＰＩＰ２に結合することが示唆される。
【実施例４】
【０１８６】
ＴＰＴＥ発現のサイレンシングにおけるｓｉＲＮＡの使用
本発明者らは、腫瘍関連ホスファターゼＴＰＴＥを内在性に発現させる乳がん、前立腺がんおよび悪性黒色腫細胞株において、ＴＰＴＥの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）誘導遺伝子サイレンシングの作用を解析した。定量ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットにより、ＴＰＴＥ特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞ＰＴＥＮレベルに影響を及ぼすことなく、ＴＰＴＥ転写物およびタンパク質の強いノックダウンを誘導することが実証された（図３ａ、３ｂ）。
【０１８７】
また本発明者らは、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性なＴＰＴＥＣ３３８Ｓ変異体を安定にトランスフェクトした形質転換線維芽細胞を使って、この分子のホスファターゼ活性によって直接誘導される作用を明らかにした。まず最初に、本発明者らは、細胞ＰＩＰ３シグナリングの尺度としてＳｅｒ４７３リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）のレベルを定量した。ｓｉＲＮＡ媒介ＴＰＴＥノックダウンは、試験したすべての腫瘍株で細胞ｐＡＫＴの実質的アップレギュレーションをもたらし（図３ｃ）、内在性ＴＰＴＥはがん細胞における構成的ＰＩ３Ｋ過剰活性化を抑制(ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔ)することが証明された。この知見と合致して、腫瘍細胞におけるＴＰＴＥを抑制すると、ｐＡＫＴシグナリングによって制御される細胞プロセスに、かなり大きな影響を与える。ＴＰＴＥサイレンシングは、腫瘍細胞の低下した増殖因子依存性と関連づけられ、それは、持続的増殖速度を持ち（図３ｄ）かつ血清枯渇下でもアポトーシスから保護される（図３ｅ）という自律的表現型(ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ)をもたらす。持続的ＡＫＴ活性化の生物学的帰結と合致して（図３ｆ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２）は、アポトーシスに対する抵抗性を発揮し、増殖因子枯渇下でも持続的増殖を示す。これらの形質転換線維芽細胞におけるＴＰＴＥの発現は、増殖および生存自律性をリセットし、ｐＡＫＴレベルの低下（図３ａ）、厳密に血清依存的な増殖および増殖因子除去時のＧ０／Ｇ１細胞周期ブロックの迅速な発生（図３ｈ）をもたらすが、突然変異したＴＰＴＥＣ３３８Ｓでは、これらの変化は起こらない。注目すべきことに、ＴＰＴＥを発現させるＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞は、免疫不全マウスでは依然として腫瘍原性である。しかし、腫瘍増殖はホスファターゼ活性を欠く対照と比較して著しく減少した（図３ｉ）。これらの発見は、ＴＰＴＥが上流のがん遺伝子誘導ＰＩ３Ｋ過剰活性化のバランスをとり、腫瘍原性を打ち消すことなく腫瘍細胞の増殖および生存を外部増殖因子依存性にすることを証明している。
【実施例５】
【０１８８】
ＴＰＴＥは腫瘍細胞走化性を促進する
ＴＰＴＥ特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖は、トランスウェル遊走アッセイで試験したすべての腫瘍細胞株において、ＰＤＧＦおよびＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２勾配に対する腫瘍細胞遊走を減少させたが、対照二重鎖はそうでなかったことから（図４ａ）、ＴＰＴＥはさまざまなクラスの化学誘引物質に対する腫瘍細胞走化性に本質的な役割を持つことが示された。さらにまた、本発明者らは、細胞遊走に対するＨＥＲ−２／ｎｅｕの作用はＴＰＴＥによって増強されるが、触媒的に不活性なその変異体では増強されないことも観察した。このがん遺伝子による形質転換に起因するＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞のベースライン遊走速度の増加（ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ，Ｐ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２３，３０４−３０９（１９９７））は、ＴＰＴＥを同時発現させると、さらに増強された（図４ｂ）。このような二重陽性細胞は、化学誘引物質の最も低い勾配にさえ、効率よく遊走したことから（図４ｃ）、ＰＩ３Ｋ過剰発現とＴＰＴＥ発現の組み合わせは、ケモカイン感知と効率のよい走化遊走との両方を促進することが示された。これと一致して、ＴＰＴＥの発現は著しい形態変化、すなわち丸い細胞形状から極性を持つ多型的表現型への遷移ならびに仮足および糸状仮足の誘導をもたらすが、ＴＰＴＥＣ３３８Ｓではそのような形態変化は起こらない。構成的に発現させるがん細胞株について本発明者らが示したとおり（図２ｄ）、ＴＰＴＥはこれらの突起部に強く濃縮されることから、脂質ホスファターゼは糸状仮足伸長の生成に直接関与することが示唆される。ケモカインおよび増殖因子シグナリングの変化をさらに探究するために、本発明者らは、化学誘引物質に応答して腫瘍細胞で起こるカルシウム動員動態を決定した。細胞内カルシウム濃度の蛍光色素分子補助可視化により、ｓｉＲＮＡが誘導するＴＰＴＥダウンレギュレーションは、がん細胞においてＰＤＧＦおよびＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２が誘導するカルシウム動員をほぼ完全に打ち消すことが証明され（図４ｄ）、これにより、腫瘍細胞の適正な走化応答におけるＴＰＴＥの決定的な役割がさらに確証された。ＥＧＦ（Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，５４７５−５４７８（１９９９））およびＰＤＧＦ（Ｈｅｌｄｉｎ，Ｃ．Ｈ．およびＷｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｂ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．７９，１２８３−１３１６（１９９９））のような増殖因子受容体またはＣＸＣＲ４およびＣＣＲ７などのケモカイン受容体（Ｍｕｌｌｅｒ，Ａ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，５０−５６（２００１））によって媒介される走化性は、がんの浸潤および転移を促進する。本発明者らは、インビトロで観察されたＴＰＴＥの強い遊走促進活性が、インビボでの悪性疾患の自然経過に、特に腫瘍の転移拡散に関して関連するかどうかを評価した。この目的を達成するために、本発明者らは、十分に特徴づけられたコホートの乳がん患者３４人から得た試料（Ａｈｒ，Ａ．ら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９，１３１−１３２（２００２））および２４の非小細胞肺がん標本を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ＴＰＴＥ発現に関して型別した。ＴＰＴＥ発現と腫瘍病期または分化度との間に有意な相関関係はなかった。しかし本発明者らは、ＴＰ��Ｅの発現と転移性疾患との間に統計的に著しく有意な際立った相関関係を見出した（表２）。
【０１８９】
【表２】
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【０１９０】
注目すべきことに、ＴＰＴＥ陽性初期腫瘍を持つ患者の１２％は、診断時に他の臓器への転移を持っていたが、ＴＰＴＥ陰性腫瘍を持つ患者は全員が転移を持たなかった（Ｐ＜０．０２）。リンパ節転移に関する相関関係はさらに有意性が高く、ＴＰＴＥ陰性群における３６％に対して陽性群では７６％だった（Ｐ＜０．００３）。最後に、転移におけるＴＰＴＥの直接的役割を確証するために、本発明者らは、走化性によって媒介される腫瘍細胞の転移性播種にとって極めて重要なステップである腫瘍細胞の血管外遊出を調べた。ｓｉＲＮＡで処理し蛍光色素分子で標識したＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７乳がん細胞を、免疫不全マウスの尾静脈に注射した。６時間後に動物を犠牲にし、肺中に血管外遊出した腫瘍細胞の数を、蛍光顕微鏡法により、全載肺切片で定量した。どちらの腫瘍細胞株でも、ｓｉＲＮＡによるＴＰＴＥのノックダウンは、血管外遊出した細胞の数を著しく減少させた（図４ｅ）。さらにまた、転移形成性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、およびＭｅｌＪｕｓｏ細胞を接種した数週間後にマウスの肺を調べたところ、ＴＰＴＥ  ｓｉＲＮＡトランスフェク細胞では、対照と比較して、転移性腫瘍負荷の著しい減少が明らかになった（図４ｆ）。これとは独立して、巨視的病巣を生じるヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使った実験的転移アッセイでも、これらの驚くべき発見が裏付けられ、ＴＰＴＥは転移性播種に決定的役割を果たすことが証明された（図４ｇ）。
【０１９１】
これらの実験は全体として、ＴＰＴＥががん細胞の血管外遊出および転移拡散を本質的に促進することを実証している。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１ａ】悪性組織およびがん細胞株におけるＴＰＴＥ発現の選択的活性化ａ，（ａ）通常のＲＴ−ＰＣＲによる、正常ヒト組織、腫瘍標本およびがん細胞株におけるＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ発現の解析。
【図１ｂ】悪性組織およびがん細胞株におけるＴＰＴＥ発現の選択的活性化ｂ，（ｂ）定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる、正常ヒト組織、腫瘍標本およびがん細胞株におけるＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ発現の解析。
【図１ｃ】悪性組織およびがん細胞株におけるＴＰＴＥ発現の選択的活性化ｃ，正常組織、構成的にＴＰＴＥを発現させるがん細胞株、およびがん組織からそれぞれ得られるタンパク質溶解物のウェスタンブロット解析。対照は、ＴＰＴＥ  ｃＤＮＡトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞（＋）およびモックトランスフェクト対照細胞（−）とした。
【図１ｄ】悪性組織およびがん細胞株におけるＴＰＴＥ発現の選択的活性化ｄ，ＴＰＴＥに関する精巣および悪性組織の免疫組織化学的染色。免疫化に使用した組換えタンパク質フラグメントによるブロッキング（＋）を緩衝液対照（−）と比較することにより、ポリクローナル抗血清ｐＡＫ２０９１の特異性が確認された。
【図１ｅ】悪性組織およびがん細胞株におけるＴＰＴＥ発現の選択的活性化ｅ，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析によって示される、メチル化阻害剤５−アザ−２'−デスオキシシチジンで処理した細胞およびＨＣＴ１１６細胞のＤＮＡメチルトランスフェラーゼノックアウト変異体におけるＴＰＴＥ  ｍＲＮＡ発現の誘導。
【図２ａ】ＴＰＴＥは形質膜に局在化したホスホイノシトール３'−ホスファターゼである。ａ，ＰＩ（３，４，５）Ｐ３またはＰＩ（４，５）Ｐ２を基質として用いる、組換えタンパク質によるインビトロホスファターゼアッセイ。
【図２ｂ】ＴＰＴＥは形質膜に局在化したホスホイノシトール３'−ホスファターゼである。ｂ，ポリクローナルウサギ抗血清の特異性を立証するためのＴＰＴＥ−ｅＧＦＰ蛍光とｐＡＫ２０９１染色の共局在。
【図２ｃ】ＴＰＴＥは形質膜に局在化したホスホイノシトール３'−ホスファターゼである。ｃ，ＴＰＴＥを構成的に発現させるがん細胞株の免疫蛍光解析。
【図２ｄ】ＴＰＴＥは形質膜に局在化したホスホイノシトール３'−ホスファターゼである。ｄ，ＰＣ−３前立腺がん細胞の糸状仮足および仮足における内在性ＴＰＴＥの局在；矢印，細胞突起の外側縁部におけるＴＰＴＥの蓄積；星印，突起部の先端はＴＰＴＥを含まないように見える。
【図２ｅ】ＴＰＴＥは形質膜に局在化したホスホイノシトール３'−ホスファターゼである。ｅ，ＰＣ−３細胞における内在的に発現されたＴＰＴＥの（ｅ）ファロイジン染色によって可視化されたＦ−アクチンとの共局在。
【図２ｆ】ＴＰＴＥは形質膜に局在化したホスホイノシトール３'−ホスファターゼである。ｆ，ＰＣ−３細胞における内在的に発現されたＴＰＴＥの（ｆ）ＰＬＣ−ｄ１−ＰＨ−ｅＧＦＰによって可視化されたＰＩＰ２との共局在。
【図３ａ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ａ，トランスフェクションの２４時間後にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した、ＴＰＴＥ特異的ｓｉＲＮＡによるさまざまながん細胞株における内在性ＴＰＴＥ転写物レベルのダウンレギュレーション。
【図３ｂ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｂ，ＴＰＴＥ  ｓｉＲＮＡ（＋）によるさまざまながん細胞株におけるＴＰＴＥタンパク質発現のダウンレギュレーション。このダウンレギュレーションは対照としてのスクランブルｓｉＲＮＡ二重鎖（−）では起こらない。
【図３ｃ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｃ，ＴＰＴＥ  ｓｉＲＮＡ（＋）による細胞ホスホＡＫＴレベルの増加。この増加は、対照としてのスクランブルｓｉＲＮＡ二重鎖（−）では起こらない。
【図３ｄ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｄ，ｓｉＲＮＡによるＴＰＴＥのノックダウン後にさまざまな濃度の血清を添加した培地で培養した細胞株の増殖速度およびアポトーシス分率。
【図３ｅ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｅ，ｓｉＲＮＡによるＴＰＴＥのノックダウン後にさまざまな濃度の血清を添加した培地で培養した細胞株の増殖速度およびアポトーシス分率。
【図３ｆ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｆ，野生型ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞およびＨＥＲ２／ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２）におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現およびＡＫＴリン酸化のウェスタンブロット解析。
【図３ｇ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｇ，ＴＰＴＥ−ｅＧＦＰトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞および対照におけるＡＫＴリン酸化。
【図３ｈ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｈ，触媒的に活性なＴＰＴＥ−ｅＧＦＰの安定発現はＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞の自律的増殖を妨げることを、フローサイトメトリーによる細胞周期解析で決定した。
【図３ｉ】ＴＰＴＥはがん細胞において増殖因子依存的な表現型を樹立する。ＡＫＴリン酸化、細胞増殖および増殖因子枯渇によって誘導されるアポトーシスに対する耐性にＴＰＴＥが及ぼす影響を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株（ａからｅ）、ならびに対照として、ＴＰＴＥまたは触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳおよびｅＧＦＰを異所的に発現させる形質転換細胞（ｆからｉ）において解析した。ｉ，免疫低下マウスにおける安定トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞のｓ．ｃ．接種後の腫瘍増殖動態。
【図４ａ】ＴＰＴＥの発現は細胞走化性および腫瘍細胞の転移拡散を促進する。ａ，細胞にｓｉＲＮＡオリゴをトランスフェクトした４８時間後に、ＰＤＧＦ−ＢＢ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびＳＤＦ−１ａ／ＣＸＣＬ１２＊（２００ｎｇ／ｍｌ）を化学誘引物質として使用して、トランスウェル遊走アッセイを実施した；（＊ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、ＣＸＣＬ１２の受容体であるＣＸＣＲ４を発現しない）。
【図４ｂ】ＴＰＴＥの発現は細胞走化性および腫瘍細胞の転移拡散を促進する。ｂ，化学誘引物質としてＦＣＳを用いたトランスウェル遊走アッセイによりＮＩＨ−３Ｔ３−ｈｅｒ２トランスフェクタントの走化性を解析した。
【図４ｃ】ＴＰＴＥの発現は細胞走化性および腫瘍細胞の転移拡散を促進する。ｃ，トランスウェル遊走アッセイにより、さまざまな濃度のＰＤＧＦ−ＢＢのＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２トランスフェクタントの走化性感知を解析した。
【図４ｄ】ＴＰＴＥの発現は細胞走化性および腫瘍細胞の転移拡散を促進する。ｄ，ｓｉＲＮＡによるＴＰＴＥのノックダウンを行った２４時間後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１がん細胞におけるＰＤＧＦ誘導カルシウム動員の蛍光色素分子補助可視化；星印，細胞の応答性を確認するために、カルシウムイオノフォア（イオノマイシン）刺激により、細胞内カルシウム貯蔵を細胞から放出させた。
【図４ｅ】ＴＰＴＥの発現は細胞走化性および腫瘍細胞の転移拡散を促進する。ｅ，ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）マウスまたはヌード（ＭＣＦ−７，ＭｅｌＪｕｓｏ）マウスの尾静脈へのＴＰＴＥ  ｓｉＲＮＡ処理および標識転移形成細胞の注射に基づく実験的転移アッセイ。接種の数週間後にマウスの肺における腫瘍負荷をリアルタイムＰＣＲで定量した（ｆ）。
【図４ｆ】ＴＰＴＥの発現は細胞走化性および腫瘍細胞の転移拡散を促進する。ｆ，ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）マウスまたはヌード（ＭＣＦ−７，ＭｅｌＪｕｓｏ）マウスの尾静脈へのＴＰＴＥ  ｓｉＲＮＡ処理および標識転移形成細胞の注射に基づく実験的転移アッセイ。接種の数週間後にマウスの肺における腫瘍負荷をリアルタイムＰＣＲで定量した（ｆ）。
【図４ｇ】ＴＰＴＥの発現は細胞走化性および腫瘍細胞の転移拡散を促進する。ｇ，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を接種した４週間後のヌードマウスから独立実験によって得た代表的な肺およびＨＥ染色肺組織切片。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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