(57)【要約】  メリフィールドタイプの樹脂に結合された環状ペプチドを提供し、メリフィールドタイプの樹脂から、エステル交換によって環状ペプチドを切断することを含む、環状ペプチドを製造するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）メリフィールドタイプの樹脂に結合された環状ペプチドを提供し、
（ｂ）前記メリフィールドタイプの樹脂から、エステル交換によって前記環状ペプチドを切断すること
を含む、環状ペプチドを製造するための方法。
【請求項２】
Ｃ１〜Ｃ３アルコール、好ましくはメタノールを用いて前記エステル交換を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルキルチオール、好ましくはエタンチオールまたはこれらの塩を用いて前記エステル交換を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｐＨ８〜１０で前記エステル交換を実施する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記環状ペプチドの環状構造が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸で形成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記環状ペプチドが、環状構造の一部を形成するアミノ酸によって前記メリフィールドタイプの樹脂に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記環状ペプチドが、アミノ基とのカルボン酸基の分子内反応によって形成されるアミド結合を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記メリフィールド樹脂に結合された前記環状ペプチドが、
（ａ）遊離アミノ基を有する第１のアミノ酸と遊離カルボン酸基を有する第２のアミノ酸とを含む、前記メリフィールドタイプの樹脂に結合された直鎖ペプチドを提供し、
（ｂ）前記アミノ基との前記カルボン酸基の分子内反応によって、前記メリフィールドタイプの樹脂に結合された前記直鎖ペプチドを環化すること
で得られるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記直鎖ペプチドが、混合無水物、活性化エステル、酸ハロゲン化物、カルボジイミド、活性化ベンゾトリアジン−誘導体ならびに、ベンゾトリアゾールのウロニウム塩誘導体またはホスホニウム塩誘導体から選択されるアミド結合形成試薬の存在下で環化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
保護されたアミノ基と保護されたカルボン酸基とを有する、前記メリフィールドタイプの樹脂に結合された前駆物質直鎖ペプチドを提供することをさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミノ基が、たとえば、ｔ．ブトキシカルボニル、ｐａｒａ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニルならびに、好ましくは、ベンジルオキシカルボニルから選択される酸分解によって除去可能なアミノ保護基から選択される第１の保護基で保護され、前記カルボン酸基が、たとえば、ｐａｒａ−メトキシベンジル、ベンズヒドリルならびに、好ましくは、ｔ．ブチルから選択される酸分解によって除去可能なカルボキシル保護基から選択される第２の保護基で保護される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
トリフルオロ酢酸との反応によって前記保護基を除去する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ基が、金属または金属化合物を用いる還元によって除去可能なアミノ保護基から選択される第１の保護基で保護され、前記カルボン酸基が、金属または金属化合物を用いる還元によって除去可能なカルボキシル保護基から選択される第２の保護基で保護される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
亜鉛金属との反応によって前記保護基を除去する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記前駆物質直鎖ペプチドの保護基を単一の反応で除去して前記直鎖ペプチドを得る、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記メリフィールドタイプの樹脂に結合された前記直鎖ペプチドが、アミノ基を含有する側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アミノ基を含有する側鎖を有する前記アミノ酸がリジンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記直鎖ペプチドが、アミノ基を含有する側鎖を有する前記アミノ酸によってメリフィールド樹脂に結合される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記直鎖ペプチドが、カルボン酸基を含有する側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記エステル交換に続いて、特に前記環状ペプチド酸を得るための鹸化など、前記エステルを切断するための操作を行う、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記メリフィールド樹脂に結合された前記環状ペプチドが、
【化１】
2009544652.tif 000006
である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
メリフィールドタイプの樹脂に結合された、環状ペプチド。
【請求項２３】
【化２】
2009544652.tif 000007
（式中、Ｐはアミノ保護用基である）である、請求項２２に記載の環状ペプチド。
【請求項２４】
Ｐがアセチルである、請求項２３に記載の環状ペプチド。
【請求項２５】
メリフィールドタイプの樹脂に結合され、式
Ｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−メリフィールド樹脂
（式中、Ｐはアミノ保護用基である）を有する直鎖ペプチド。
【請求項２６】
Ｐがアセチルである、請求項２４に記載の直鎖ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／８３２，６４９号明細書（その内容を本出願に援用する）の優先権の利益を主張するものである。
本発明は、ペプチドを製造するための方法ならびに、その製造時に有用な中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは潜在的に生物学的に活性であり、昨今は極めて多数の有用なペプチドベースの薬剤が周知である。生物学的に活性なペプチドの特定の一例が、勃起不全の治療に有用な候補薬の
【化１】
2009544652.tif 000002
（ＰＴ−１４１）である（Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ  ２００４、２９（６）、第６４５ページ）。この分子に対しては、異なる合成手法が開発されている。たとえば、フローラ（Ｆｌｏｒａ）ら  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００５（１０６５〜１０６８）には、この分子のペプチド固相合成法が説明されている。しかしながら、この方法は、高価なワン（Ｗａｎｇ）樹脂ならびに極めて高価な保護・脱保護技術を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、環状生成物の収率を改善した、環状ペプチドを製造するための工業化可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
このため、本発明は、
（ａ）メリフィールドタイプの樹脂に結合された環状ペプチドを提供し、
（ｂ）メリフィールドタイプの樹脂から、エステル交換によって環状ペプチドを切断すること
を含む、環状ペプチドを製造するための方法に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
驚くべきことに、本発明による方法では、低価格の試薬を用いて環状ペプチドまたはペプチド誘導体を工業規模で製造できることが見いだされた。本発明による方法で得られる環状ペプチドは純度が高く、一層簡単に精製可能であって、一般にメリフィールドタイプの樹脂からのペプチド除去に用いられるＨＦの使用が、本発明による方法では必要ない。ＨＦの使用は、メリフィールドタイプの樹脂を用いる工業規模のペプチド合成での障害になっているため、このことは特に有利である。
本発明の目的で、「メリフィールドタイプの樹脂」は、特にクロロメチル化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーを示すことを意図したものであり、このコポリマーは、任意に置換基で置換可能である。未置換のクロロメチル化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーのほうが、より一層好ましい。
【０００６】
本発明による方法では、環状ペプチドの環状構造は通常、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸で形成される。環状ペプチドの環状構造は、好ましくは、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸で形成され、より一層好ましくは、６または７のアミノ酸で形成される。
本発明による方法では、環状ペプチドは、好ましくは、アミノ基とのカルボン酸基の分子内反応によって形成されるアミド結合を有する。
【０００７】
本発明による方法では、アルコールまたはメルカプタンを用いて、特にＣ１〜Ｃ３アルコール、好ましくはメタノールおよびエタノールから選択される、特定のアルキルアルコールまたはアルキルメルカプタンで、エステル交換が有利に行われる。メタノールが特に好ましい。メタンチオールまたはエタンチオール、特にそのアルカリ金属塩の形態が、メルカプタンとして好ましい。
アルコールとのエステル交換を行う場合、環化支持（ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ）ペプチドを、好ましくはアルコールに懸濁させるか、アルコールと好適な補助溶媒との混合物に懸濁させる。
メルカプタンとのエステル交換を行う場合、好ましくはメルカプタンの塩を好適な溶媒に加えた溶液に環化支持ペプチドを懸濁させる。
【０００８】
本発明による方法では、たとえば、塩基、特にアミン（特に第三級アミン）または立体障害アルコキシド（カリウムｔｅｒｔ．−ブトキシドなどのｔｅｒｔ．アルコキシドなど）といった求核塩基と、アニオン交換樹脂、特に第四級アニオン交換樹脂と、特にシアニドおよびフルオリドから選択されるアルカリ金属塩（シアン化カリウムまたはフッ化カリウムなど）などの求核（ｎｕｃｌｅｐｈｉｌｉｃ）アニオンのアルカリ金属塩と、から選択可能なエステル交換触媒を適宜利用してもよい。第三級アミン、特にジイソプロピルエチルアミンが好ましく、最も好ましくはトリエチルアミンである。
エステル交換触媒を用いる場合、混合触媒／溶媒中におけるその濃度は通常、０．５〜３モル／リットル、好ましくは１〜２．５モル／リットル、最も好ましくは約２モル／リットルである。
【０００９】
特定の実施形態では、アミノアルコール、特に第三級アミン官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）および第一級アルコール官能基（特に２−ジメチルアミノエタノールなど）を有するアミノアルコールとのエステル交換を実施する。この実施形態では、アミノ官能基が反応を触媒するため、補助触媒の使用は必要とされない。この実施形態では、サボア（Ｓａｖｏｉｅ）ら  Ｃａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９７４、２８３２〜９ページに記載されたようなタリウム誘導体などの有毒な触媒を使用せずにすむ。
【００１０】
本発明による方法では、エステル交換は通常、０℃から１００℃、好ましくは１０℃から６０℃の温度で実施される。約２５℃の温度が特に好ましい。
本発明による方法では、エステル交換は通常、大気圧で実施される。
本発明による方法では、たとえば、アルカリ、第四級アンモニウムまたはアルカリ土類金属水酸化物または炭酸塩から選択される塩基との反応によってステップ（ｂ）で得られる環状ペプチドエステルから遊離環状ペプチド酸を好適に得ることが可能である。特定の例としては、テトラブチル水酸化アンモニウム、炭酸カリウムおよび水酸化リチウムがあげられる。水酸化リチウムが好ましい。
本発明による方法では、切断は通常ｐＨ８から１０で実施される。
本発明による方法では、任意の切断が通常、０℃から１００℃、好ましくは１０℃から６０℃の温度で実施される。約２５℃の温度が特に好ましい。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明は、
（ａ）遊離アミノ基を有する第１のアミノ酸と遊離カルボン酸基を有する第２のアミノ酸とを含む、メリフィールドタイプの樹脂に結合された直鎖ペプチドを提供し、
（ｂ）アミノ基とのカルボン酸基の分子内反応によって、支持ペプチドを環化し、
（ｃ）メリフィールドタイプの樹脂から、エステル交換によって環化支持ペプチドを切断すること
を含む、アミノ基とのカルボン酸基の分子内反応によって形成されるアミド結合を有する環状ペプチドを製造するための方法に関する。
この実施形態では、直鎖ペプチドは通常、アミド結合形成試薬の存在下で環化される。このアミド結合形成試薬は、ボダンツキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ），Ｍ．著、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ペプチド合成の原理）、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン／ハイデルベルグ、１９９３に記載されているものなどの従来技術において周知のペプチド合成用カップリング試薬から好適に選択される。アミド結合形成剤の特定の例としては、混合無水物および他のアシル化剤（たとえば、クロロギ酸イソブチルまたは塩化ピバロイルなどの活性化エステルまたは酸ハロゲン化物など）から選択される。これらは、カルボジイミド（ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）、活性化ベンゾトリアジン−誘導体（ＤＥＰＢＴ：３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンなど）あるいは、ベンゾトリアゾールのウロニウム塩誘導体またはホスホニウム塩誘導体であってもよい。
【００１２】
好ましいアミド結合形成試薬のひとつに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）がある。この安価な試薬によって、環化時に良好な結果が得られることが見いだされている。
好都合な一実施形態では、本発明による方法はさらに、保護されたアミノ基と保護されたカルボン酸基とを有する前駆物質直鎖ペプチドを提供することを含む。
この実施形態では、アミノ基を第１の保護基で保護する。第１の保護基は、たとえば、メリフィールド樹脂に対する直鎖ペプチドの結合を実質的に何ら変えることなく残す条件下で除去可能な保護基から選択される。このような保護基の好ましい例としては、たとえば、ｔ．ブトキシカルボニル、ｐａｒａ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニルならびに、好ましくは、ベンジルオキシカルボニルから選択される酸分解によって除去可能なアミノ保護基があげられる。このような保護基の他の例としては、たとえばトリクロロエトキシカルボニルなどの金属または金属化合物を用いる還元によって除去可能なアミノ保護基があげられる。
【００１３】
この実施形態では、カルボン酸基を第２の保護基で保護する。第２の保護基は、たとえば、メリフィールド樹脂に対する直鎖ペプチドの結合を実質的に何ら変えることなく残す条件下で除去可能な保護基から選択される。このような保護基の好ましい例としては、たとえば、ｐａｒａ−メトキシベンジル、ベンズヒドリルならびに、好ましくは、ｔ．ブチルから選択される酸分解によって除去可能なカルボキシル保護基があげられる。このような保護基の他の例としては、たとえばトリクロロエチルなどの金属または金属化合物を用いる還元によって除去可能な保護基があげられる。
【００１４】
この実施形態では、第１および第２の保護基は、好ましくは単一の反応ステップで除去可能なように選択される。このため、前駆物質ペプチドの保護基を単一の反応で除去し、直鎖ペプチドを提供することが可能である。単一の反応ステップで（ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）酸分解によって除去可能な第１および第２の保護基の好適な組み合わせ例としては、ベンズヒドリルオキシカルボニル／ベンズヒドリル；ｐａｒａ−メトキシベンジルオキシカルボニル／ｐａｒａ−メトキシベンジルならびに、好ましくは、ｔ．ブトキシカルボニル／ｔ．ブチルがあげられる。金属または金属化合物を用いる還元によって単一の反応ステップで除去可能な第１および第２の保護基の好適な組み合わせ例としては、トリクロロエトキシカルボニル／トリクロロエチルがあげられる。
【００１５】
酸分解によって保護基を除去する場合、好適な試薬は、たとえば、パーフルオロアルキルカルボン酸ならびに、有機溶媒、好ましくはジオキサンまたは酢酸エチルなどの極性有機溶媒にＨＣｌを入れた溶液から選択される。酸分解用の試薬としてはトリフルオロ酢酸が好ましい。
金属または金属化合物との反応によって保護基を除去する場合、好適な試薬は、たとえば、亜鉛金属である。
【００１６】
本発明による方法は、直鎖ペプチドが、アミノ基を含有する側鎖を有するアミノ酸を含む場合に特に好適である。アミノ基を含有する側鎖を有するアミノ酸の例としては、リジン、オルニチン、ジアミノ酪酸およびジアミノプロピオン酸があげられる。アミノ基を含有する側鎖を有するアミノ酸の好ましい一例がリジンである。
特に好ましい実施形態では、直鎖ペプチドは、アミノ基を含有する側鎖を有するアミノ酸を介してメリフィールド樹脂に結合される。
本発明による方法では、直鎖ペプチドは、カルボン酸基を含有する側鎖を有するアミノ酸を好適に含み得る。カルボン酸基を含有する側鎖を有するアミノ酸の例としては、グルタミン酸およびアスパラギン酸があげられる。好ましい一例がアスパラギン酸である。
【００１７】
特に好ましい態様では、直鎖ペプチドは、カルボン酸基を含有する側鎖を有するアミノ酸とアミノ基を含有する側鎖を有するアミノ酸の両方を含む。
配列
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−メリフィールド樹脂
が、特に好ましい。
側鎖カルボン酸基または側鎖アミノ基は、上述したそれぞれの保護基によって好適に保護可能なものである。
【００１８】
本発明は、特に、
【化２】
2009544652.tif 000003
を製造するための方法に関するものであり、この方法は、
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−メリフィールド樹脂
を提供し、
アミノ基とのカルボン酸基の分子内反応によって、支持ペプチドを環化し、メリフィールドタイプの樹脂から、エステル交換によって環化支持ペプチドを切断することを含む。エステル交換の後には通常、エステルを切断するための操作、特に環状ペプチド酸を得るための鹸化が行われる。
【００１９】
また、本発明は、メリフィールドタイプの樹脂に結合された環状ペプチドに関するものである。本発明による支持環状ペプチドは、好ましくは上述したようなものである。
また、本発明は、
【化３】
2009544652.tif 000004
（式中、Ｐはアミノ保護用基、特にアシル基であり、好ましくはアセチル基（Ａｃ）である）に関するものである。
また、本発明は、
Ｐ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−メリフィールド樹脂
（式中、Ｐは上述したようなものである）に関するものである。
【００２０】
以下の実施例は、本発明を非限定的に例示することを意図したものである。
本明細書で使用する略語は以下のとおりである。
Ａｃ      アセチル
Ｎｌｅ    ノルロイシン
Ａｓｐ    アスパラギン酸
Ｈｉｓ    ヒスチジン
Ｐｈｅ    フェニルアラニン
Ａｒｇ    アルギニン
Ｔｒｐ    トリプトファン
Ｌｙｓ    リジン
ＨＦ      フッ化水素
Ｆｍｏｃ  ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｂｏｃ    ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＲＣＭ    樹脂クロロメチル（メリフィールド樹脂）
ＳＰＰＳ  ペプチド固相合成
Ｐｂｆ    ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
Ｔｒｔ    トリチル
ｔＢｕ    ｔ−ブチル
ＴＦＡ    トリフルオロ酢酸
ＤＩ      蒸留
ＴＩＰＳ  トリイソプロピルシラン
ＤＴＥ    ジチオエリスリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｅｉｔｏｌ）
ＤＣＭ    ジクロロメタン
ＩＰＡ    イソプロパノール
ＤＩＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ    ジメチルホルムアミド
ＨＯＢＴ  ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＣＣ    ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＥＡＰ  トリエチルリン酸アンモニウム
ＬｉＯＨ  水酸化リチウム
【実施例】
【００２１】
配列：
【化４】
2009544652.tif 000005
合成：
合成には５０ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＲＣＭ樹脂（およそ０．８ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。合成にはＦｍｏｃ  ＳＰＰＳ法を１０ｍｌ／ｇｍの濃度で用いた。
【００２２】
合成には以下のアミノ酸誘導体を用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ
【００２３】
脱保護
酢酸無水物を用いるアセチル化
以下の試薬を用いる樹脂上ペプチドの脱保護：
８４％ＴＦＡ、５％アニソール、５％ＤＩ水、３％チオアニソール、２％ＤＴＥを含有する３％ＴＩＰＳ。１〜２時間で切断。
【００２４】
切断後の洗浄方法：
２×ＤＣＭ
１×ＩＰＡ
２×５％ＤＩＥＡ（ＤＣＭ中）で４分ずつ（ｐＨ紙を確認）
１×ＤＣＭ
２×メタノール
２×ＤＣＭ
１×ＤＭＦ
５当量のＨＯＢＴ／１０当量のＤＣＣ（ＤＭＦ中）を用いて樹脂上で４８時間〜７２時間環化。
【００２５】
以下の手法を用いて樹脂からペプチドを切断した。
１５％ＴＥＡ（メタノール中）にてペプチド樹脂を周囲温度で２日間攪拌した。樹脂からの切断後、５％ＤＩ水および５当量のＬｉＯＨを加え、引き続き２時間攪拌した。酢酸を加えて反応混合物を酸性化した。樹脂を濾別し、３０％アセトニトリルを含有するＴＦＡ  Ａ緩衝液で洗浄した。有機溶媒成分が２０％未満になるまで濾液を蒸発させるかＴＦＡ  Ａ緩衝液で希釈した。溶液を濾過し、精製した。
精製：
５．０４８６ｇの純粋なＣＳ３４１（ＨＰＬＣ＞９９％）を得るためのＴＥＡＰ系ならびに、続いて酢酸系
全体としての収率：１２．３％
【国際調査報告】
2009544652.tif 000008
2009544652.tif 000009
2009544652.tif 000010
2009544652.tif 000011