(57)【要約】  ＥＧＦＲアンタゴニストと化学療法薬を投与することによる、小児腫瘍を処置する併用療法の方法が開示される。本方法はまた、難治性小児腫瘍を治療することも含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニストおよび化学療法薬によって、小児患者を処置するステップを含む、小児患者において腫瘍の増殖を阻害する方法。
【請求項２】
腫瘍が難治性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍が神経膠腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍が神経芽腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アンタゴニストが抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗体またはそのフラグメントが、ＥＧＦＲの細胞外ドメインと特異的に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗体またはそのフラグメントが、ＥＧＦＲリガンドとＥＧＦＲの結合を阻害し、その活性化を中和する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗体がセツキシマブである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
抗体またはそのフラグメントがモノクローナルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
抗体またはそのフラグメントがキメラである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
抗体またはそのフラグメントがヒト化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
抗体またはそのフラグメントがヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
化学療法薬がイリノテカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
小児患者に放射線を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００６年７月２７日出願の米国特許仮出願第６０／８３３，４８７号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストと化学療法薬の組合せを投与することによる、小児患者において腫瘍を処置することに関する。
【背景技術】
【０００３】
米国において、２００１年に１１，９００人の小児および２０歳未満の青年が、がんと診断され、約２，２００人がその疾病で死亡した。固形腫瘍は、小児がんのおよそ３０％の症例を占める。浸潤性脳腫瘍および神経系がんは全ての小児がんの１７％を占め、急性リンパ性白血病に次いで第２位である。脳腫瘍の診断症例の約半数は悪性である。その他の一般的な小児がんとしては、ユーイング肉腫、白血病、神経芽腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０００４】
小児の脳腫瘍を処置する際の主な障害の一つは、脳がまだ急速な成長を迎え、処置、例えば放射線または化学療法などからの毒性に対して脆弱であることである。障害は、その他の種類の小児がんを処置する際にも生じる。したがって、小児患者において腫瘍を処置するための新規な治療法が必要とされている。
【０００５】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、様々ながんにおいて発現または過剰発現され、一般に腫瘍形成に関与する。ＥＧＦＲファミリーには、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−１／ＨＥＲ１としても知られている）、ＨＥＲ２（ｃ−ｎｅｕ／ｅｒＢ−２としても知られている）、ｅｒｂＢ−３／ＨＥＲ３、およびｅｒｂＢ−４／ＨＥＲ４が含まれる。例えば、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、腫瘍細胞増殖および生存を調節するプロセスにおいて重要な役割を果たすと考えられている。特に、ＥＧＦＲは、生存ならびにアポトーシス、脱分化、および転移（細胞遊走および浸潤を含む）からの保護に影響を及ぼすいくつかの経路に関与してきた。ＥＧＦＲを発現するこれらのがんの中には、頭頚部がん、結腸直腸がん、膵がん、卵巣がん、腎細胞がん、非小細胞肺がん、および神経膠腫を含む、最も一般的ながんがいくつかある。早期に診断されていなければ、これらのがんのうち多くの予後は不良であり、進行した疾病の治療は制限される。
【０００６】
これらのがんのいくつかの処置のための様々なＥＧＦＲ阻害剤が現在、臨床試験中である。このような例の１つは、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製造）であり、これはリガンドがＥＧＦＲと結合することを妨げ、受容体の活性化を防ぎ、培養中の細胞の増殖を阻害する、キメラ（ヒト／マウス）モノクローナル抗体である。別の例は、ＡＢＸ−ＥＧＦであり、これは、報告によると、ＥＧＦＲと結合することが知られている２つのリガンドである、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−ａ）と上皮増殖因子（ＥＧＦ）の結合を妨げる、ＥＧＦＲに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体である。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２陽性転移性乳がんの治療のために認可されたヒト化抗体であり、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現の機能をターゲットとし、阻害するよう設計されている。
【０００７】
加えて、様々な小分子ＥＧＦＲ阻害剤の臨床試験が現在行われている。チロシンキナーゼ阻害剤の一例は、ＩＲＥＳＳＡ（商標）であり、これは、報告によると、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害する小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり、機能性ＥＧＦＲを発現する一連のヒトがん細胞に対して細胞増殖抑制性であり、ｐ２７のアップレギュレーションによって腫瘍細胞増殖を阻害することができる。
【発明の概要】
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、小児患者を有効量のＥＧＦＲアンタゴニストおよび化学療法薬で処置することによる、小児患者において腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。好ましい実施形態では、このＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインと特異的に結合し、その活性化を中和するＥＧＦＲ抗体である。好ましい実施形態では、この化学療法薬はイリノテカンである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、有効量のＥＧＦＲアンタゴニストおよび化学療法薬を投与することによる、小児患者において腫瘍を処置する方法を提供する。本発明によれば、小児患者は、出生時から１８歳までの患者である。処置には、（１）該疾病にかかりやすい可能性があるがまだ該疾病の症状を経験していないか示していない患者において、疾病が生じることを予防すること、例えば、臨床症状の発生の予防、（２）腫瘍の増殖を阻害すること、例えば、その進行を抑止すること、または（３）腫瘍を軽減すること、例えば、腫瘍の症状の退縮をもたらすことが含まれる。腫瘍増殖を阻害することには、増殖を遅延または停止させること、ならびに腫瘍の退縮をもたらすことが含まれる。疾病を処置及び治療するための有効量とは、それを必要とする患者に投与される場合に、上記に定義されるように疾病の治療をもたらすために十分な量を意味する。
【００１０】
本発明に従って処置される腫瘍は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍のいずれでもある。このような腫瘍としては、芽細胞腫（肝芽腫および神経芽腫を含む）、癌腫（腺がんを含む）、神経膠腫（上衣細胞腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫および混合膠腫を含む）、肉腫（横紋筋肉腫および腺肉腫を含む）、ならびに腺腫が挙げられる。腫瘍は実質的には身体の全ての部位で起こり得、例えば、乳房、心臓、肺、食道、小腸、結腸、直腸、胃、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、喉頭、卵巣、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頚部、または肝臓が含まれる。好ましい実施形態では、腫瘍は、神経系の腫瘍、例えば神経膠腫および神経芽腫である。治療される腫瘍としては、原発性腫瘍および転移性腫瘍、ならびに難治性腫瘍が挙げられる。「難治性腫瘍」には、化学療法薬単独で、抗体単独で、放射線単独でまたはそれらの組合せを用いた治療に応答しないか、抵抗性である腫瘍が含まれる。また、難治性腫瘍は、このような薬剤を用いた治療により阻害されると思われるが、治療を中止した後５年までに、時には１０年までに、またはそれよりも後に再発する腫瘍を包含する。
【００１１】
ＥＧＦＲアンタゴニストは、本発明によれば、細胞外アンタゴニストまたは細胞内アンタゴニストであってよく、１より多くのアンタゴニストが用いられてよい。細胞外アンタゴニストとしては、ＥＧＦＲと結合するタンパク質またはその他の生体分子が挙げられるが、これに限定されない。本発明の特定の実施形態では、細胞外アンタゴニストはＥＧＦＲの細胞外ドメインと結合し、ＥＧＦＲと１以上のそのリガンドの結合を阻害し、および／またはリガンドにより誘導されるＥＧＦＲの活性化を中和する。ＥＧＦＲのリガンドとしては、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、アンフィレギュリン、ヘパリン結合ＥＧＦＲ（ＨＢ−ＥＧＦ）およびベータセルリンが挙げられる。また、細胞外ＥＧＦＲアンタゴニストには、その他のＥＧＦＲ受容体サブユニットとのＥＧＦＲ二量体化（すなわち、ＥＧＦＲホモ二量体）またはその他の成長因子受容体（例えば、ＨＥＲ２）とのヘテロ二量体化を阻害する物質が含まれ得る。
【００１２】
好ましい実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲと結合し、リガンド結合を妨げる抗体である。ＥＧＦＲ抗体の一例は、キメラ（ヒト／マウス）ＩｇＧモノクローナル抗体である、セツキシマブ（ＩＭＣ−Ｃ２２５）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１ＮＱＬＡ）である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９４３，５３３号（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第６，２１７，８６６号（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許出願第０８／９７３，０６５号（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ）および同第０９／６３５，９７４号（Ｔｅｕｆｅｌ）；ＷＯ９９／６００２３（Ｗａｋｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．）およびＷＯ００／６９４５９を参照のこと。セツキシマブは、ＥＧＦＲと特異的に結合し、リガンド、例えばＥＧＦの結合を妨げる。セツキシマブＦａｂは、セツキシマブのＦａｂ断片、すなわちネズミ抗体Ｍ２２５の重鎖および軽鎖可変領域配列（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００４／０００６２１２号）とヒトＩｇＧ１  ＣＨ１重鎖およびκ軽鎖定常ドメインを含む（セツキシマブには３つ全てのＩｇＧ１重鎖定常ドメインが含まれる）。セツキシマブの重鎖のＣＤＲ領域は、次の配列を有する。ＮＹＧＶＨの配列を含むＣＤＲ１領域（配列番号１）、ＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳの配列を含むＣＤＲ２領域（配列番号２）、およびＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹの配列を含むＣＤＲ３領域（配列番号３）。セツキシマブの軽鎖のＣＤＲ領域は、次の配列を有する。ＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨの配列を含むＣＤＲ１領域（配列番号４）、ＹＡＳＥＳＩＳの配列を含むＣＤＲ２領域（配列番号５）、およびＱＱＮＮＮＷＰＴＴの配列を含むＣＤＲ３領域（配列番号６）。
【００１３】
ＥＧＦＲ抗体のもう一つの例は、ＥＧＦＲに特異的な完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である、ＡＢＸ−ＥＧＦである。ＡＢＸ−ＥＧＦは高い特異性でＥＧＦＲと結合し、ＥＧＦＲとその両方のリガンド、ＥＧＦおよびＴＧＦ−ａとの結合を妨げる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００１年５月１２〜１５日、カリフォルニア州サンフランシスコにて、ＡＳＣＯの第３７回年次総会で発表されたＦｉｇｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．のＡｂｓｔｒａｃｔ  １１０２を参照のこと。以前はクローンＥ７．６．３の名前で知られていた、このＡＢＸ−ＥＧＦの配列および特性決定は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２３５，８８３号（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）の第２８欄第６２行から第２９欄第３６行および図２９〜３４中に開示されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ．，３８（１）：１７−２３，２００１も参照のこと）。
【００１４】
ＥＧＦＲ抗体のもう一つの例は、細胞系アッセイ（５ｎＭのＫｄ）においてヒトＥＧＦＲ２タンパク質の細胞外ドメイン、ＨＥＲ２と高い親和性で選択的に結合する組換え型ＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体である、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）である。この抗体は、ヒトフレームワーク領域をＨＥＲ２と結合するネズミ抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域とともに含むＩｇＧ１κである。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開公報第ＷＯ０１／８９５６６号（Ｍａｓｓ）を参照のこと。
【００１５】
その他のＥＧＦＲ抗体としては、ネズミ抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体ＥＭＤ  ５５９００のヒト化形態であるＥＭＤ  ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）、ヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるｈ−Ｒ３（ＴｈｅｒａＣＩＭ）、ネズミモノクローナル抗体であり、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異のネズミ相同体に対して作られたＹ１０、およびＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ）が挙げられる。その全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５５８，８６４号（Ｂｅｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．）、同第５，８８４，０９３号（Ｋｅｔｔｅｋｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）、および同第５，８９１，９９６号（Ｍａｔｅｏ  ｄｅ  Ａｃｏｓｔａ  ｄｅｌ  Ｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと。
【００１６】
細胞内ＥＧＦＲアンタゴニストは生体分子であってよいが、通常小分子、例えばＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用してＥＧＦＲに媒介されるシグナル伝達を阻害する合成キナーゼ阻害剤などである。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの一例は、ＡＴＰ模倣物の役割を果たしＥＧＦＲを阻害するキノザリン誘導体である、ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ＺＤ  １９３９）である。米国特許第５，６１６，５８２号（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）；ＷＯ９６／３３９８０号（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）の４頁を参照のこと；また、２００１年５月１２〜１５日、カリフォルニア州サンフランシスコにて、ＡＳＣＯの第３７回年次総会で発表されたＲｏｗｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．のＡｂｓｔｒａｃｔ  ５；２００１年５月１２〜１５日、カリフォルニア州サンフランシスコにて、ＡＳＣＯの第３７回年次総会で発表されたＡｎｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．のＡｂｓｔｒａｃｔ  １７１２も参照のこと。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの別の例は、４−（置換フェニルアミノ）キノザリン誘導体［６，７−ビス（２−メトキシ−エトキシ）−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニル−フェニル）アミンヒドロクロライド］ＥＧＦＲ阻害剤である、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（ＯＳＩ−７７４）である。ＷＯ９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）の例えば、第２頁第１２行から第４頁第３４行および第１９頁第１４〜１７行を参照のこと。また、Ｍｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４８３８−４８（１９９７）；Ｐｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２９１：７３９−４８（１９９９）も参照のこと。ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）は、ＥＧＦＲのリン酸化およびその下流のＰＩ３／ＡｋｔおよびＭＡＰ（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼシグナル伝達経路を阻害することにより機能し、その結果ｐ２７を介する細胞周期停止がもたらされ得る。２００１年５月１２〜１５日、カリフォルニア州サンフランシスコにて、ＡＳＣＯの第３７回年次総会で発表されたＨｉｄａｌｇｏ  ｅｔ  ａｌ．のＡｂｓｔｒａｃｔ  ２８１を参照のこと。
【００１７】
その他の小分子もＥＧＦＲを阻害すると報告され、その多くはＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインに特異的であると考えられている。このような小分子ＥＧＦＲアンタゴニストのいくつかの例は、ＷＯ９１／１１６０５１、ＷＯ９６／３０３４７、ＷＯ９６／３３９８０、ＷＯ９７／２７１９９（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＷＯ９７／３００３４（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＷＯ９７／４２１８７（Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＷＯ９７／４９６８８（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＷＯ９８／３３７９８（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＷＯ００／１８７６１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、およびＷＯ００／３１０４８（Ｗａｒｎｅｒ  Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている。具体的な小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、チロシンキナーゼ、特にＥＧＦＲのキノザリン（Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イル−プロポキシ）−キナゾリン−６−イル］−アクリルアミド）阻害剤であり、ＷＯ００／３１０４８の第８頁第２２〜６行に記載されている、Ｃｌ−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＧＦＲのピロロピリミジン阻害剤であり、ＷＯ９７／２７１９９の１０〜１２頁に記載されている、ＰＫＩ１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の阻害剤である、ＧＷ２０１６（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；インビトロおよびインビボでＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害すると報告されている、ＥＫＢ５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＥＧＦＲとｅｒｂＢ−２の両方からのシグナル伝達を阻害するキナゾリン小分子である、ＡＧ−１４７８（Ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎ）；プロテインキナーゼＣＫ２をも阻害する二基質阻害剤である、ＡＧ−１４７８（Ｓｕｇｅｎ）；ＥＧＦＲキナーゼ活性および腫瘍増殖を阻害し、培養細胞においてアポトーシスを誘導し、かつ細胞毒性化学療法薬の細胞毒性を強化すると報告されている、ＰＤ  １５３０３５（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）；前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）がんの処置に標的化されたチロシンキナーゼ阻害剤である、ＳＰＭ−９２４（Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｐｈａｒｍａ）；伝えられるところによると、固形腫瘍の処置のための脈管形成の阻害剤である、ＣＰ−５４６，９８９（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；がんの処置のために標的化されたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤である、ＡＤＬ−６８１；マウスにおいてＡ４４３１異種移植片の腫瘍増殖速度を阻害すると報告されているピリドピリミジンである、ＰＤ  １５８７８０；マウスにおいてＨＮ５異種移植片での自己リン酸化を阻害すると報告されているキンゾリン（ｑｕｉｎｚｏｌｉｎｅ）である、ＣＰ−３５８，７７４；外陰がん、ＮＳＣＬＣ、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）がん、卵巣がん、および結腸直腸がんを含むマウス異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を有すると報告されているキンゾリン（ｑｕｉｎｚｏｌｉｎｅ）である、ＺＤ  １８３９；マウスにおいてＥＧＦＲ−陽性の異種移植片の増殖を阻害すると報告されているピロロピリミジンである、ＣＧＰ  ５９３２６Ａ；ＰＤ  １６５５５７（Ｐｆｉｚｅｒ）；ジアニ��ノフタルイミド（ｄｉａｎｉｌｎｏｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）であるＣＧＰ５４２１１およびＣＧＰ５３３５３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。天然由来のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤としては、ゲニステイン、ハービマイシンＡ、ケルセチン、およびエルブスタチンが挙げられる。
【００１８】
ＥＧＦＲを阻害することが報告され、したがって本発明の範囲内であるさらなる小分子は、三環系化合物、例えば米国特許第５，６７９，６８３号に記載される化合物；キナゾリン誘導体、例えば米国特許第５，６１６，５８２号に記載される誘導体；およびインドール化合物、例えば米国特許第５，１９６，４４６号に記載される化合物である。
【００１９】
本発明での使用に有用な小分子はＥＧＦＲの阻害剤であるが、ＥＧＦＲに完全に特異的である必要のないことは理解される。
【００２０】
好ましい実施形態では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、以下の特性の１以上を示す抗ＥＧＦＲ抗体である。
【００２１】
１）抗体はＥＧＦＲの外部ドメインと結合し、リガンド結合を阻害する。阻害は、例えば、精製もしくは膜結合受容体を用いる直接結合アッセイにより決定することができる。本実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、ＥＧＦＲの天然リガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ）と少なくとも同程度に強く、ＥＧＦＲと結合することが好ましい。
【００２２】
２）抗体はＥＧＦＲを中和する。リガンドと外部のＥＧＦＲの細胞外ドメインの結合は、チロシンキナーゼ活性および受容体リン酸化ならびに／または様々なシグナル伝達経路に関与するその他のタンパク質のリン酸化を刺激する。ＥＧＦＲの中和には、シグナル伝達に通常関連する１以上の活性の阻害、減少、不活性化および／または崩壊が含まれる。中和は、インビボ、エキソビボ、またはインビトロで、例えば、組織、培養細胞、または精製された細胞成分を用いて決定することができる。
【００２３】
ＥＧＦＲ中和の一つの尺度は、受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法を用いて決定することができる；例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または天然もしくは合成基質のリン酸化を測定することによる。従って、リン酸化アッセイは、本発明の文脈において、抗体を中和することを決定する際に有用である。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウエスタンブロットにおいてホスホチロシンに特異的な抗体を用いて検出することができる。チロシンキナーゼ活性のアッセイのいくつかがＰａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．２８３：１４３３−４４（１９９７）およびＢａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２：１４３−５０（１９９８）に記載されている。本発明の抗体は、リガンドに応答する細胞において、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％の低下をもたらす。
【００２４】
ＥＧＦＲ中和のもう一つの尺度は、ＥＧＦＲの下流基質のリン酸化の阻害である。したがって、ＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化のレベルが測定され得る。リン酸化の低下は、少なくとも約４０％であり、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％であってよい。
【００２５】
さらに、タンパク質発現を検出するための方法を利用してＥＧＦＲ中和を決定することができ、この場合、測定されるタンパク質はＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性により調節されている。これらの方法には、タンパク質発現の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合的放射性リガンド結合アッセイ、固体マトリックスブロッティング法、例えばノザンブロットおよびサザンブロット、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡなどが挙げられる。例えば、Ｇｒａｎｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，７８：１２８４−９２（１９９６）；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８５：５６７−７１（１９９４）；Ｓａｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４８：１０４７−５３（１９９６）；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｌｉａ  １５：２８９−９６（１９９５）；Ｒａｄｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１９−３１（１９９５）；Ｐｅｔｒｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：３９３４−３９（１９９０）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：４４１９−２６（１９９７）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３１４０−４８（１９９５）参照。
【００２６】
エキソビボアッセイを利用してＥＧＦＲ中和を決定することもできる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤の存在下および不在下で、受容体リガンドにより刺激された細胞株を用いる細胞分裂促進アッセイにより観察することができる。そのような細胞分裂促進アッセイの一例は、３Ｔ３細胞分裂促進アッセイ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からの３Ｔ３（クローンＡ３１−７１４）細胞）である。別の方法は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞またはＥＧＦＲを発現するようトランスフェクトされた細胞の増殖の阻害についての試験を含む。また、阻害は腫瘍モデル、例えば、マウスに注入されたヒト腫瘍細胞を用いて観察することもできる。
【００２７】
本発明の抗体は、ＥＧＦＲ中和の任意の特定の機構に制限されるものではない。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、外部からＥＧＦＲ細胞表面受容体と結合し、リガンドの結合およびそれに続く受容体関連チロシンキナーゼにより媒介されるシグナル伝達を妨げ、ＥＧＦＲおよびシグナル伝達カスケードにおけるその他の下流タンパク質のリン酸化を予防することができる。
【００２８】
３）抗体は、ＥＧＦＲを下方調節する。細胞の表面に存在するＥＧＦＲの量は、受容体タンパク質生成、内部移行、および分解によって決まる。細胞の表面に存在するＥＧＦＲの量は、間接的に、受容体または該受容体と結合している分子の内部移行を検出することにより、測定することができる。例えば、受容体の内部移行は、ＥＧＦＲを発現する細胞を標識された抗体と接触させることにより測定することができる。次に、膜結合抗体を剥がし、回収し、計数する。内部移行した抗体は、細胞を溶解し、溶解物中の標識を検出することにより決定される。
【００２９】
別の方法は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその他の基質で処置した後、細胞上に存在する受容体の量を直接測定することである（例えば、ＥＧＦＲの表面発現について染色した細胞の蛍光活性化セルソーティング分析）。染色した細胞を３７℃にてインキュベートし、蛍光強度を経時的に測定する。対照として、染色した集団の一部を、４℃にて（受容体内部移行が停止する条件下で）インキュベートしてもよい。
【００３０】
下方調節のもう一つの尺度は、細胞中に存在する総受容体タンパク質の減少であり、内部受容体の分解を反映する。したがって、細胞（特にがん細胞）を本発明の抗体により処理することにより、総細胞ＥＧＦＲの減少がもたらされる。好ましい実施形態では、この減少は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％である。
【００３１】
ヒト被験体の処置のため、本発明に従う抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。あるいは、抗体は非ヒト霊長類またはその他の哺乳類由来であるか、またはヒト化もしくはキメラ抗体であってよい。
【００３２】
本発明に従う抗体フラグメントは、全抗体を切断することにより、またはフラグメントをコードするＤＮＡを発現させることにより作製することができる。抗体のフラグメントは、Ｌａｍｏｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５６：２３５−２４３（１９８３）およびＰａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３１：２８９５−２９０２（１９８３）に記載される方法により調製されてよい。このようなフラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの一方または両方を含み得る。このようなフラグメントはまた、一本鎖フラグメント可変領域抗体、すなわちｓｃＦｖ、ダイアボディー（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、またはその他の抗体フラグメントを含み得る。このような機能同等物を作製する方法は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／２１３１９号、欧州特許出願第ＥＰ２３９４００号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０９６２２号；欧州特許出願第ＥＰ３３８７４５号；および欧州特許出願第ＥＰ３３２４２４号に開示されている。
【００３３】
ベクターの形質転換および本発明の抗体の発現のために好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびリンパ系起源、例えばリンパ腫、骨髄腫（例えばＮＳ０）、またはハイブリドーマ細胞などの培養細胞株である。その他の真核生物宿主、例えば酵母なども、その代わりに使用されてよい。
【００３４】
形質転換宿主細胞は、炭素（炭水化物、例えばグルコースまたはラクトースなど）、窒素（アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはそれらの分解産物、例えば、ペプトン、アンモニウム塩など）、および無機塩（硫酸塩、リン酸塩ならびに／または、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの炭酸塩）の同化できる供給源を含有する液体培地中で、当分野で公知の方法により培養される。この培地は、例えば、増殖促進物質、例えば微量元素など、例えば鉄、亜鉛、マンガンなどをさらに含有する。
【００３５】
本発明に従う高親和性抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子から構築されたファージディスプレイライブラリーから単離することができる。例えば、本発明の可変ドメインは、再配列された可変領域遺伝子を含有する末梢血リンパ球から得ることができる。あるいは、可変ドメイン部分、例えばＣＤＲおよびＦＷ領域などは、異なる供給源から得て、組み換えてよい。さらに、可変ドメインの部分（例えば、ＦＷ領域）は合成コンセンサス配列であってよい。
【００３６】
本発明の抗体および抗体フラグメントは、例えば、天然に存在する抗体から、またはＦａｂもしくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーから得ることができる。ＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体から単一ドメイン抗体を作成するため、ＣＤＲの外部での特定のアミノ酸置換が結合、発現または溶解度を増強するために望まれ得ることは当然理解される。例えば、本来ならＶＨ−ＶＬの界面で埋没するはずのアミノ酸残基を修飾することは望ましいことであり得る。
【００３７】
さらに、本発明の抗体および抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリンγ重鎖およびκ軽鎖を作製するトランスジェニックマウス（例えば、カリフォルニア州サンノゼのＭｅｄａｒｅｘのＫＭマウス）を用いる標準的なハイブリドーマ技術（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２１１−２１３（１９９８））により得ることができる。好ましい実施形態では、ヒト抗体産生ゲノムの実質的な部分が、マウスのゲノムに挿入され、内因性ネズミ抗体の産生を欠乏させる。このようなマウスは、必要に応じて追加免疫でＰＤＧＦＲａ（通常完全フロイントアジュバント中）を用いて皮下に（ｓ．ｃ．）免疫化されてよい。免疫化法は当分野で周知である。
【００３８】
本発明に従って使用することのできる抗体としては、完全な免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、ならびに免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質が挙げられる。免疫グロブリンの抗原結合フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２が挙げられる。結合特異性を保持するが、例えば、二重特異性、多価性（２以上の結合部位）、小型（例えば、結合ドメインのみ）を含む、望ましい可能性のあるその他の特性を有するその他の抗体フォーマットが開発されている。
【００３９】
一本鎖抗体は、それが由来する全抗体の定常ドメインの一部または全部を欠く。したがって、一本鎖抗体は、全抗体の使用に関連するいくつかの問題を克服することができる。例えば、一本鎖抗体は、重鎖定常領域とその他の生体分子との間の特定の望ましくない相互作用が取り除かれる傾向がある。その上、一本鎖抗体は全抗体よりも相当に小さく、全抗体よりも大きい透過性を有し得、一本鎖抗体を局在させ、標的抗原結合部位とより効率的に結合させる。さらに、比較的小型の一本鎖抗体は、レシピエントにおいてそれらを全抗体よりも不要な免疫応答を誘発し難くする。
【００４０】
各々の一本鎖が第１のペプチドリンカーにより共有結合された、１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインを有する、複数の一本鎖抗体は、少なくとも１以上のペプチドリンカーにより共有結合されて多価の一本鎖抗体を形成することができ、それは単一特異性であっても多重特異性であってもよい。多価の一本鎖抗体の各鎖には可変軽鎖フラグメントおよび可変重鎖フラグメントが含まれ、ペプチドリンカーにより少なくとも１つのその他の鎖と連結されている。このペプチドリンカーは、少なくとも１５アミノ酸残基からなる。アミノ酸残基の最大数は、約１００である。
【００４１】
２つの一本鎖抗体は、合成されて二価二量体としても知られているダイアボディーを形成することができる。ダイアボディーは２本の鎖と２つの結合部位を有し、単一特異性であっても二重特異性であってもよい。ダイアボディーの各鎖には、ＶＬドメインと連結されたＶＨドメインが含まれる。これらのドメインは、同じ鎖上のドメイン間の対形成を防ぐために十分短く、よって異なる鎖上の相補ドメイン間の対形成を推進して２つの抗原結合部位を再形成する、リンカーで連結されている。
【００４２】
３つの一本鎖抗体は、合成されて、三価三量体としても知られているトリアボディーを形成することができる。トリアボディーは、ＶＬまたはＶＨドメインのカルボキシル末端と直接融合した、すなわちリンカー配列を何ら含まない、ＶＬまたはＶＨドメインのアミノ酸末端で構築される。このトリアボディーは、ポリペプチドが環状の頭−尾の様式で配置された３つのＦｖ頭部を有する。トリアボディーの起こり得る立体構造は、その３つの結合部位が互いに１２０度の角度で一平面内に位置している平面である。トリアボディーは単一特異性、二重特異性、または三重特異性であってよい。
【００４３】
よって、本発明の抗体およびそのフラグメントとしては、天然に存在する抗体、（Ｆａｂ’）２などの二価フラグメント、Ｆａｂなどの一価フラグメント、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、ダイアボディー、トリアボディー、および抗原と特異的に結合する同種類のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明によれば、ＥＧＦＲアンタゴニストは、１以上の抗悪性腫瘍薬と組み合わせて投与される。本明細書で用いられる用語「抗悪性腫瘍」薬には、特に断りのない限り、ＥＧＦＲアンタゴニストは除外される。任意の適した抗悪性腫瘍薬、例えば、化学療法薬、放射線、またはそれらの組合せを用いることができる。抗悪性腫瘍薬は、アルキル化剤または代謝拮抗薬であってもよい。アルキル化剤の例としては、シスプラスチン（ｃｉｓｐｌａｓｔｉｎ）、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンが挙げられる。代謝拮抗薬の例としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン（ｄｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル、およびゲムシタビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
好ましい実施形態では、抗悪性腫瘍薬は、化学療法薬である。好ましい化学療法薬としては、アミフォスチン（エチヨル）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポソーマル（ｌｉｐｏ）（ドキシル）、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーム（ｌｉｐｏ）（ダウノキソーム）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルおよびそれらの組合せが挙げられる。より好ましい実施形態では、化学療法薬はイリノテカンである。
【００４６】
化学療法薬および／または代謝拮抗薬を含む、抗悪性腫瘍薬は、パッケージの指示および／または患者の臨床応答に従う用量およびスケジュールで投与される。そのような用量は、当業者には明白であり、過度の説明は必要ではない。例えば、イロノテカン（Ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）は、推奨される約５０〜約３５０ｍｇ／ｍ２の用量範囲を超えて投与されることが好ましいが、この用量は患者の臨床応答によって多くても低くてもよい。その他の薬剤の投薬範囲は、１回の投与および／または治療計画あたり約１〜約１，０００ｍｇ／ｍ２である。放射線治療は、適当な臨床治療プロトコールおよび／または当業者の臨床経験に基づいて投与される。
【００４７】
併用療法では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、別の薬剤での治療開始前、治療期間中、または治療後に、ならびにその任意の組合せ、すなわち抗悪性腫瘍薬治療を開始する前および治療期間中、治療前および治療後、治療期間中および治療後、あるいは、治療前、治療期間中および治療後に投与される。例えば、ＥＧＦＲ抗体は、放射線療法を開始する前の１〜３０日の間、好ましくは３〜２０日、より好ましくは５〜１２日の間に投与されてよい。本発明の好ましい実施形態では、化学療法は、抗体療法と同時に、または、より好ましくは、抗体療法に続いて投与される。
【００４８】
本発明では、任意の適した方法または経路を用いて本発明のアンタゴニストを投与し、かつ、所望により抗悪性腫瘍薬および／またはその他の受容体のアンタゴニストを同時投与することができる。本発明に従って利用される抗悪性腫瘍薬の投薬計画には、患者の腫瘍の処置に最も有利に適していると考えられる任意の投薬計画が含まれる。異なる腫瘍は、特異的な抗腫瘍抗体および特異的な抗悪性腫瘍薬の使用を必要とする可能性があるが、それらは患者ごとに決定される。投与の経路としては、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が挙げられる。投与されるアンタゴニストの用量は多数の因子によって決まり、それには、例えば、アンタゴニストの種類、処置される腫瘍の種類および重篤度ならびにアンタゴニストの投与経路が含まれる。しかし、本発明が任意の特定の投与の方法または経路に限定されないことは強調されるべきである。
【００４９】
当業者であれば、投薬量および処置の頻度は、個々の患者の耐性、ならびに用いる遮断薬もしくは阻害剤の薬理学的特性および薬物動態特性によって決まることを理解する。理想的には、用いる薬剤に関して飽和薬物動態を達成したいと願う。抗ＥＧＦＲ抗体に関する負荷用量は、例えば、約１０〜約１０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２００〜約４００ｍｇ／ｍ２の範囲であってよい。この後に、例えば、約２００〜約４００ｍｇ／ｍ２の範囲の数回のさらなる１日投与量または週投与量が続いてよい。患者は副作用についてモニターされ、このような副作用が重篤な場合は処置が停止される。
【００５０】
また、当業者であれば、有効量を決定するために処置の進展をどのようにモニターするかを知っている。例えば、そのような一方法は、ＭＲＩ、ＣＴ、またはその他の脳スキャンをモニターすることである。
【実施例】
【００５１】
実施例１：以下の実施例は、イリノテカンとＥＧＦＲ抗体の組合せを投与することによる難治性固形腫瘍を治療する方法を開示する。
【００５２】
２００５年８月から２００６年３月まで、難治性固形腫瘍を有し、平均余命が少なくとも８週の２０名の小児患者にイリノテカンおよび異なる用量レベルのセツキシマブを投与した。患者は２つの群に分けられ（年齢１〜１２＝アームＡ、１３〜１８＝アームＢ）、次の腫瘍型を有した。脳幹神経膠腫／星状細胞腫（１０）、肝芽腫、骨肉腫（１）、上衣細胞腫（１）、神経芽腫（１）、横紋筋肉腫（１）およびその他（５）。イリノテカンを２０ｍｇ／ｍ２／日の用量で６０分の点滴を５日間×２週間として２１日おきに投与した。用量スケジュールおよび用量規定毒性（ＤＬＴ）の被験体の数を表１に記載する。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
アームＡ、用量レベル２中の６名の患者のうち２名の経験したＤＬＴのため（イリノテカンに関連するとみなされた）、イリノテカンは１６ｍｇ／ｍ２に減少された。アームＢ中の１名の被験体がグレード３の点滴反応を経験し、処置を中断した。その他の観察された毒性にはグレード１の発疹が含まれた。
【００５５】
１名のＥＧＦＲ陰性の高悪性度の神経膠腫の被験体（Ａ群用量レベル１）は部分応答を達成し、現在１３周期である。１名の神経芽腫の被験体（Ａ群用量レベル１）は、軽微な応答を経験し、現在９周期を受けている。７名の被験体は平均３．４ヶ月間の安定な疾病という最高の応答を有した（２〜７＋月の範囲）。
【００５６】
結論として、セツキシマブとイリノテカンの組合せは、小児固形腫瘍において有望な抗がん活性を示す。
【００５７】
以上の説明および実施例は、単に本発明を説明するために示されているものであり、制限することを意図するものではない。開示された本発明の態様および実施形態の各々は、個々に、または本発明のその他の態様、実施形態、および変形形態と組み合わせて考慮されてよい。さらに、本発明の実施形態の特定の特徴は特定の図にのみ示されているが、このような特徴は、本発明の範囲内にある間は、その他の図に示されるその他の実施形態に組み込むことができる。さらに、特に断りのない限り、本発明の方法のステップはいずれも、任意の特定の実行順序に制限されない。本発明の精神および物質を組み込んでいる、開示される実施形態の変更形態は、当業者に思い当たるものであってよく、このような変更形態は本発明の範囲内である。さらに、本明細書において引用されたすべての参照文献は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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