(57)【要約】本明細書に記載されるのは、細胞または細胞培養における細胞を突然変異する方法、細胞培養中の細胞をスクリーニングする方法、細胞培養中の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子病変をマッピングする方法、薬物開発のための標的を特定する細胞培養ベースの方法、本明細書に記載される方法によって特定される遺伝型または表現型の変動を処置するのに有効な治療剤についての細胞培養ベースのスクリーニングの方法、、細胞のライブラリー、ベクター、核酸構築物、および本明細書に記載される方法によって特定される遺伝子配列を用いる方法である。
2009532021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞において、劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する方法であって、該遺伝子配列は、２つの挿入された部位特異的な組み換え部位の間に位置し：
（ａ）遺伝子型もしくは表現型の変動に相関する変異をさらに含む、染色体上の２つの挿入された部位特異的な組み換え部位を含む細胞を得る工程であって、該変異が、相同染色体上であり、かつ該ホモログ上の部位特異的な組み換え部位の位置に結合される工程と；
（ｂ）（ａ）の細胞の集団において、２つの部位特異的組み換えの間の既知の位置に第三の部位特異的組み換え部位を挿入する工程と；
（ｃ）部位特異的なリコンビナーゼに対して（ａ）の細胞を曝して少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する行程と；
（ｄ）部位特異的リコンビナーゼに対して（ｂ）の細胞を曝して、少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する工程と；
（ｅ）培養細胞またはエキソビボにおいて、（ｄ）の欠失含有細胞に対して（ｃ）の欠失含有細胞を、該表現型または遺伝子型の変動の有無についてスクリーニングする工程と；
（ｆ）（ａ）〜（ｃ）の工程を繰り返して、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して、第三の部位特異的組み換え部位を変更する工程と；
（ｆ）培養細胞またはエキソビボにおいて、劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記第三の部位特異的組み換え部位が、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して変更され、前記細胞における遺伝子型または表現型の変動に相関する欠失のサイズが狭められる、方法。
【請求項３】
遺伝型または表現型の変動を特定する方法であって：
（ａ）培養された細胞の染色体ＤＮＡにおいて２つの挿入された部位特異的組み換え部位の間にリコンビナーゼ誘導性欠失を有する、半数体細胞よりも大きい細胞であって、該細胞のＤＮＡがリコンビナーゼ誘導性欠失部位の少なくとも一部と相同な染色体においてさらなる変異を含み、該さらなる変異がリコンビナーゼ誘導性欠失以外の方法で導入された、細胞と、
（ｂ）以下の群：
（ｉ）染色体ＤＮＡにおけるリコンビナーゼ誘導性欠失もさらなる欠失もない（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉ）染色体ＤＮＡにおいてリコンビナーゼ誘導性欠失を有するがさらなる変異は欠く（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉｉ）さらなる変異が導入されているが、染色体ＤＮＡにおいてリコンビナーゼ誘導性欠失は欠く、（ａ）の細胞の前駆細胞、および
（ｉｖ）（ａ）の細胞の前駆細胞以外の細胞
からなる群より選択される細胞と、
の間の遺伝型または表現型の変動について、培養細胞またはエキソビボでスクリーニングする工程を包含し、
該遺伝型または表現型の変動の位置または同一性が、請求項２に記載の方法を用いて、該遺伝型または表現型の変動に関連する遺伝子配列の領域に位置決めされる、方法。
【請求項４】
前記さらなる変異が化学的突然変異誘発を介する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記（ａ）の培養細胞の変異のさらなる方法が、前記リコンビナーゼ誘導性欠失の前、同時、または後のいずれかに行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記（ａ）の細胞が、前記２つの組み換え部位に対して内部である１つ以上のレポーターまたは選択マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、前記２つの組み換え部位に対して外部である１つ以上のレポーターまたは選択マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記部位特異的リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記突然変異誘発前の細胞が二倍体核型に密接に接着する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記さらなる突然変異誘発が、電磁放射線、ＤＮＡ修復のインヒビターでの処理、または挿入突然変異のうちの１つ以上による、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記表現型の変動が、半固体培地中でコロニーを増殖する能力の変化、化学療法剤に対する耐性の変化、血管新生の誘導の変化、および転移能の変化からなる群より選択されるメンバーである、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ａ）の細胞が、ＤＶ９０、ＨＬＦ−ａ、Ｈ５２２、Ｈ４６０、Ｈ４６０ＳＭ、ＳＣＬＣ−Ｒ１、ＳＣＣ−３７、Ｍａ−４、Ｍａ−１０、Ｍａ−１２、Ｍａ−１５およびｌａ  １６２細胞からなる群由来のメンバーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ａ）の細胞が、パーキンソン病、アルツハイマー病およびＨＩＶからなる群由来のメンバーに関連する特徴を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
培養された細胞またはエキソビボにおいて、劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する方法であって、
（ａ）遺伝型または表現型の変動に相関する変異をさらに含む、挿入された部位特異的な組み換え部位を含む細胞を得る工程と；
（ｂ）（ａ）の細胞の集団において、第一の部位特異的組み換え部位を含む、染色体上に第二の部位特異的組み換え部位を導入する工程と；
（ｃ）部位特異的リコンビナーゼに対して（ｂ）の細胞を曝して、少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する工程と；
（ｄ）（ａ）の細胞に対して表現型または遺伝子型の変動について（ｃ）の細胞を培養細胞またはエキソビボにおいてスクリーニングする工程と；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す行程であって、該劣性の遺伝型または表現型の変動を含む遺伝子配列の領域が、工程（ｂ）〜（ｄ）の第一の反復の部位に対して変化される工程と；
（ｆ）培養細胞またはエキソビボにおいて、該遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記第二の部位特異的組み換え部位の位置が、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して変更され、前記細胞における遺伝子型または表現型の変動に相関する欠失のサイズが狭くなる、方法。
【請求項１６】
劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列を特定する方法であって：
（ａ）導入された組み換え部位を以前には含んでいる細胞であって、該配列の領域が、リコンビナーゼ誘導性ではない方法によって欠失されている導入された組み込み部位を含み、該細胞のＤＮＡが、第二の方法で導入された相同染色体上に変異をさらに含む、細胞と
（ｂ）以下の群：
（ｉ）染色体ＤＮＡにおける非リコンビナーゼ誘導性欠失なしで、かつ第二の方法でのさらなる欠失なしの（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉ）染色体ＤＮＡにおいて組み換え部位の非リコンビナーゼ誘導性欠失を有するがさらなる変異は欠く（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉｉ）さらなる変異が導入されているが、染色体ＤＮＡにおいて組み換え部位の非リコンビナーゼ誘導性欠失は欠く、（ａ）の細胞の前駆細胞、および
（ｉｖ）（ａ）の細胞の前駆細胞以外の細胞
からなる群より選択される細胞と、
の間の遺伝型または表現型の変動について、培養細胞またはエキソビボにおいてスクリーニングする工程を包含し、
該（ａ）の細胞における劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列が、請求項１５に記載の方法を用いて、該遺伝型または表現型の変動に関連する遺伝子配列の領域にマッピングされる、方法。
【請求項１７】
前記変異の第二の方法が化学的突然変異誘発である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非リコンビナーゼ誘導性欠失が電磁放射線を介する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、１つ以上のレポーターまたは選択マーカーを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記表現型の変動が、半固体培地中でコロニーを増殖する能力の変化、化学療法剤に対する耐性の変化、血管新生の誘導の変化、および転移能の変化からなる群より選択されるメンバーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記（ａ）の細胞が、ＤＶ９０、ＨＬＦ−ａ、Ｈ５２２、Ｈ４６０、Ｈ４６０ＳＭ、ＳＣＬＣ−Ｒ１、ＳＣＣ−３７、Ｍａ−４、Ｍａ−１０、Ｍａ−１２、Ｍａ−１５およびｌａ  １６２細胞からなる群由来のメンバーである、請求項１４または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ベクターであって、実現可能な組み合わせで以下：
（ａ）マーカーを発現する細胞の特定をし得る該マーカーをコードする第一の核酸配列と、
（ｂ）部位特異的な組み換え部位と、
（ｃ）第二のマーカーを発現する細胞を特定し得る該第二のマーカーをコードする第二の核酸配列と、
（ｄ）第三のマーカーを発現する細胞を特定し得る該第三のマーカーをコードする第三の核酸配列と、
を包含する、ベクター。
【請求項２３】
細胞の集団であって：
（ａ）単一の染色体上に、３つの導入された部位特異的な組み換え部位を有する、より大きい半数体の培養細胞の集団
（ｂ）細胞の相同染色体上のさらなる突然変異誘発、
を含む、細胞集団。
【請求項２４】
染色体ＤＮＡにおいて、３つの導入された部位特異的組み換え部位のうち２つの間の部位特異的組み換えによって生じる欠失を有する、請求項２３の細胞。
【請求項２５】
前記部位特異的組み換えが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、またはＩｎｔリコンビナーゼからなる群より選択される部位特異的リコンビナーゼに対して細胞を曝した後に生じる、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
前記部位特異的リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞が二倍体核型に密接に接着する、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２８】
前記さらなる突然変異誘発が、化学処理、電磁放射線、ＤＮＡ修復のインヒビターでの処理、または挿入突然変異からなる群より選択される１つ以上のメンバーによる、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞の集団における細胞が、ＤＶ９０、ＨＬＦ−ａ、Ｈ５２２、Ｈ４６０、Ｈ４６０ＳＭ、ＳＣＬＣ−Ｒ１、ＳＣＣ−３７、Ｍａ−４、Ｍａ−１０、Ｍａ−１２、Ｍａ−１５およびｌａ  １６２細胞からなる群由来のメンバーである、請求項２３に記載の細胞。
【請求項３０】
請求項２３に記載の細胞を含む細胞ライブラリー。
【請求項３１】
請求項２９に記載の細胞を含む細胞ライブラリー。
【請求項３２】
培養細胞またはエキソビボにおける１つ以上の効果について治療剤をスクリーニングする方法であって、該細胞が遺伝型または表現型の変動を有し、該遺伝型または表現型の変動が、遺伝子産物の量または遺伝子産物の機能における変化と相関し、該遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性が、請求項１または１４のいずれかに記載の方法に従ってマッピングされる、方法。
【請求項３３】
培養細胞またはエキソビボにおける１つ以上の効果について治療剤をスクリーニングする方法であって、該細胞が遺伝型または表現型の変動を有し、該遺伝型または表現型の変動が、遺伝子産物の量または遺伝子産物の機能における変化に対応する細胞挙動と相関し、該遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性が、請求項１または１４のいずれかに記載の方法に従ってマッピングされる、方法。
【請求項３４】
請求項３２または３３のいずれかに記載の方法であって、前記スクリーニングが、前記遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の２次元または３次元の構造のうちの１つ以上を予測し、かつ遺伝子配列の活性に影響することについて可能性のありそうなまたは有望な治療剤を予測する、ソフトウェアプログラムで行われる方法。
【請求項３５】
請求項３２または３３のいずれかに記載の方法であって、前記スクリーニングが、本明細書に記載の方法を用いて、遺伝型または表現型の変動に基づいて特定された前記配列の野性型配列と相関する遺伝子配列の２次元または３次元の構造のうちの１つ以上を予測し、かつ該遺伝子配列の活性に影響することについて可能性のありそうなまたは有望な治療剤を予測するソフトウェアプログラムで行われる、方法。
【請求項３６】
請求項１または１４のいずれかに記載の方法に従って遺伝型または表現型の変動に相関するとして特定された１つ以上の遺伝子配列を含む、コンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項３７】
請求項１または１４のいずれかに記載の方法に従って遺伝型または表現型の変動に相関するとして特定された１つ以上の遺伝子配列を含む、データベース。
【請求項３８】
第一および第二の相同な染色体の各々に対して欠失を含む培養細胞またはエキソビボの細胞を含む組成物であって、該第一の染色体における欠失が、第二の染色体における欠失に重複し、そして少なくとも１つの欠失が導入された、組成物。
【請求項３９】
前記細胞が培養細胞である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第一および第二の相同な染色体の両方に欠失が導入された、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
相同染色体上に欠失を導入する工程を包含する、請求項３８に記載の組成物を調製する方法。
【請求項４２】
第一および第二の相同な染色体の両方に対して欠失が導入された、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの導入された欠失が無作為に導入された、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの導入された欠失が標的された欠失であった、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
遺伝型または表現型の変動を特定する方法であって、請求項３８に記載の組成物中の培養された細胞をまたはエキソビボにおいて、ある条件に供する工程と、該組成物における該細胞の応答を分析する工程とを包含する、方法。
【請求項４６】
遺伝型または表現型の変動を特定する方法であって：
（ａ）第一の導入された部位特異的組み換え部位を有する半数体細胞より大きく、該細胞のＤＮＡが、該第一の導入された部位特異的組み換え部位と相同な染色体領域の欠失を含む、細胞と
（ｂ）該第一の導入された部位特異的組み換え部位と第二の導入された部位特異的組み換え部位との間に欠失を有する、細胞と、
の間の遺伝型または表現型の変動について、培養細胞またはエキソビボにおいてスクリーニングする工程を包含し、
該（ｂ）の細胞における遺伝型または表現型の変動の有無の相関が、該第一の導入された部位特異的組み換え部位と該第二の導入された部位特異的組み換え部位との間に欠失の領域と相関する、方法。
【請求項４７】
培養細胞またはエキソビボにおいて、遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する方法であって：
（ａ）染色体上に第二の部位特異的組み換え部位を導入する工程であって、細胞の集団において第一の部位特異的組み換え部位を含み、該細胞が、相同な染色体領域に欠失を含み、該欠失された領域に対して相同な領域の少なくとも一部の欠失が、ある遺伝子型もしくは表現型の変動に相関する工程と；
（ｂ）部位特異的なリコンビナーゼに対して（ａ）の細胞を曝して、該第一および第二の組み換え部位を含む染色体上に少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する行程と；
（ｃ）培養細胞またはエキソビボにおいて、（ａ）の細胞に対して（ｂ）の細胞を、該表現型または遺伝子型の変動についてスクリーニングする工程と；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の工程を繰り返す行程であって、第二の部位特異的組み換え部位を含む遺伝子配列の領域が、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して、変更される工程と；
（ｅ）培養細胞またはエキソビボにおいて、（ａ）の細胞の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する工程と、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
努力の分野
本明細書で記載されるのは、遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置を培養細胞中で決定する方法、薬物開発のための標的を特定する方法、細胞または細胞培養中の細胞を突然変異する方法、細胞培養中の細胞をスクリーニングする方法、細胞のライブラリー、ベクター、および核酸構築物である。
【背景技術】
【０００２】
背景
遺伝子変異および化学処理は、細胞および生物体の変化された表現型についてスクリーニングするために用いられるツールである。しかし、二倍体の生物体または細胞では、１染色体上の単一の変異は、表現型の結果がなしであって、相同な染色体に野性型対立遺伝子が存在するものであってもよい。劣性の対立遺伝子の表現型は、培養細胞において検出困難であり得る。
【０００３】
遺伝性の先天性ヒト疾患または劣性の疾患形質を研究するために、科学者は、同系交配の集団または連鎖不均衡を研究することに依拠する。これらの技術の各々は、限られた遺伝子プールに固定されている表現型形質を当てにしている。単離された育種集団の希少度によって、ヒトの遺伝の研究は制限される。培養された細胞ベースのスクリーニングシステムは、限定はしないがヒト疾患を含む、疾患の原因を研究する能力を増強する。
【０００４】
遺伝モデルシステムが、ヒトの生物学を研究するための代用として用いられる。モデル生物体の遺伝型を、操作および変異誘発させて、表現型の異常についてスクリーニングする。二倍体の生物体、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍａｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓでは、遺伝学スクリーニングにおいて染色体の欠損を利用して、ヘミ接合性であるゲノムの部分で新規な変異を特定する。表現型の相違を有する動物を育種して、ゲノムのディスクリート（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）な部分に対して原因となる遺伝子変更をマッピングしてもよい。しかし、モデルの生物体またはモデル動物で行われるスクリーニングはしばしば、コストがかさみ、かつ時間を浪費し、そして必ずしもその実験生物体がモデルである現実の生物体の代表ではない。
【０００５】
胚性幹（ＥＳ）細胞を用いて、単一の対立遺伝子上でディスクリートな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）遺伝学的変異を作成してもよく、そしてこれらの変異は、ホモ接合性に育種され得る動物を産生するために生殖系列を通じて渡され得る。マウスが劣性対立遺伝子についてホモ接合性に育種される場合、劣性対立遺伝子の表現型が観察され得る。３〜４センチモルガン（ｃＭ）程度の大きさのいくつかの欠失が、マウスＥＳ細胞で報告されており、そしてマウス生殖系列を通じて渡されている。これらの大きい欠失を担持するマウスを、化学的に変異誘発されたマウスに交雑して、動物の子孫での遺伝子スクリーニングを補助している。目的の遺伝子病変のマッピングは代表的には、同じ種の遺伝学的に異なる生物体との変異生物体を育種することによって行われる。遺伝的交雑は、遺伝子的相補性をアッセイし得、または遺伝型もしくは表現型の変動の同時分離、またはキャリア状態を、可視のマーカーまたは物理的マーカーとともにアッセイし得る。上記のとおり、生物体でのマッピングは、費用がかさみ、かつ時間浪費的であり得、そして培養細胞ベースシステムのマッピングでは、限定はしないがヒト疾患を含む疾患の原因を研究する能力が向上される。
【０００６】
電磁放射線、例えば、ＵＶ照射、Ｘ線またはγ線を用いる細胞の処理は、欠損を含むいくつかのタイプの変異を生じる（図１〜Ａ）。化学的変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターでの培養細胞の処理は、さらにディスクリートな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）変異、代表的には、塩基の置換、付加または欠失を生じる（図１〜Ｂ）。電磁放射線、化学的変異誘発物質、またはＤＮＡ修復インヒビターでの処理は代表的には、ゲノム全体にわたってヘテロ接合性の欠失を生じる。従って、このような方法では、単独で用いられる場合、劣性変異を見つけ出す可能性は低い。これらの変異誘発物質に対する暴露の量または時間の増大は、ヘテロ対立遺伝子的な変異を生じ得、これによって、遺伝子の機能の損失が生じる。しかし、同じ遺伝子の２つの対立遺伝子の損失を生じる変異誘発物質のレベルでは、死亡率が増大し、そしてゲノムにおける二重の対立遺伝子変異の数が増大し、スクリーニングが複雑になり、かつ任意の１対立遺伝子の影響を分析することが困難になる。多数の二重対立遺伝子変異によってまた、研究者らにとっては、遺伝型または表現型の変動を生じる特定の遺伝子病変を特定することがさらに困難になり得る。
【０００７】
挿入突然変異誘発（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、ゲノムを無作為にまたは作為的に変異誘発する別の方法である。挿入突然変異としては限定はしないが、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルス、プロ・ウイルス構築物、導入遺伝子、プラスミド、反復配列エレメントおよび遺伝子トラップが挙げられる。挿入突然変異誘発は、ポジティブ選択マーカーまたは可視マーカーを含むように操作されてもよい。これらの変異誘発物質の多くについて挿入の位置はいくらかランダムであるので、それらは、ゲノムへの組み込みの際、遺伝子を破壊し得る（図１−Ｃ）。挿入突然変異は通常、単一の対立遺伝子のみを破壊し、野性型対立遺伝子をインタクトなままで残す。ここでもこのような方法は単独で用いられる場合、劣性の変異を見出す可能性は低い。挿入突然変異がポジティブ選択マーカー、例えば、薬物選択マーカーを含むならば、その細胞は、より高濃度の薬物で両方の対立遺伝子の破壊について選択され得る。しかし、これは通常、ゲノムでさらなる付随的な再配列を生じる。これは、ゲノムにおいて、遺伝型または表現型の変動を担う、他の未知の変異を生じ得る。これによって、スクリーニングは複雑になり、かつ任意の１遺伝子病変の影響を分析することが困難になる。
【０００８】
ゲノムを変異誘発させることに対するいくつかのバリエーションでは、ポジティブおよびネガティブな薬物選択マーカーの挿入を利用する。細胞は、例えば、ゲノムのいずれかにおけるポジティブ選択マーカーの挿入について、化合物または試薬での処理によって選択され得る（図１〜Ｄ）。次いで、これらの細胞は、電磁放射線、化学的変異誘発物質、または欠失を生じるＤＮＡ修復のインヒビターで処理されてもよい（図１〜Ｅ）。その欠失は、細胞を、ネガティブ選択マーカーの存在に対して選択するために別の薬物で処理することによって、選択され得る。誘導性の欠失は、ランダムであって、各々の欠失の限界点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）をマッピングする必要がある。またしてもこれは代表的には１つの対立遺伝子上で欠失を生じるが、野性型の対立遺伝子はインタクトなままで残る。
【０００９】
ゲノム全体にわたってランダムな変異を誘導する代わりに、正確に規定された変異を導入してもよい。相同組み換えによる伝統的な遺伝子標的化（図１〜Ｆ）はしばしば、小さい欠失、代表的には、ただ１つの遺伝子のみの欠失を生じる（図１〜Ｇ）。他の方法と同様に、これは、単一の対立遺伝子しか破壊せず、野性型対立遺伝子をインタクトなままで残す。標的カセットにポジティブ薬物選択マーカーを含むことによって、両方の対立遺伝子の破壊について、より高濃度の薬物で細胞を選択することが可能になる。これは一般には、ゲノムにおいてさらなる付随性の再配列を生じる。これによって、遺伝型または表現型の変動を生じる、ゲノムにおける他の未知の変異が生じ得、それによってスクリーニングが複雑になり、かつ任意の１対立遺伝子の影響を分析することが困難になる。
【００１０】
別の代替法は、標的カセットに部位特異的な組み換え部位を含むこと、および同じ染色体を２回標的化することである（図１〜Ｈ）。次いで、この細胞を部位特異的なリコンビナーゼで処理してもよく、これによって、介在性配列の欠失が生じる（図１〜Ｉ）。かなり大きい欠失が、単一の標的行程を通じるよりもこの方式で実際的に達成され得る。しかし、これは、１つの染色体で１欠失のみを生じるが、他の染色体は野性型である。両方の対立遺伝子の欠失では、他の染色体の引き続く標的化を要する。通常、相同組み換えによって作成されたディスクリートな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）変異は、ＥＳ細胞で行う。成体動物は、ホモ接合性に対する変異を育種するか、または他の成体動物に交雑することによって遺伝子スクリーニングにおいて利用するために、ＥＳ細胞に由来する。生物体または動物におけるスクリーニングは、かなり高価であって、細胞培養におけるスクリーニングよりも時間を浪費する。
【００１１】
遺伝型または表現型の変動についてスクリーニングするために培養された細胞を用いるという別の制限のせいで現在、ディスクリートな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）遺伝子病変に対して遺伝型または表現型の変動を効率的にマッピングできない。変異哺乳動物細胞は、表現型改変体のための遺伝子スクリーニングにおいて以前に見出されているが、多くのこのような細胞における原因病変は未知のまま残っている。
【００１２】
改良された細胞培養ベースの方法、ならびに遺伝型および表現型の変動、例えば、劣性の遺伝子型および表現型の変動に相関する遺伝子配列をスクリーニングおよび特定するためのツールが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
要約
本明細書に記載されるのは、細胞または細胞培養における細胞を突然変異する方法、細胞培養中の細胞をスクリーニングする方法、細胞培養中の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子病変をマッピングする方法、薬物開発のための標的を特定する細胞培養ベースの方法、本明細書に記載される方法によって特定される遺伝型または表現型の変動を処置するのに有効な治療剤についての細胞培養ベースのスクリーニングの方法、、細胞のライブラリー、ベクター、核酸構築物、および本明細書に記載される方法によって特定される遺伝子配列を用いる方法である。
【００１４】
本明細書に記載されるのは、遺伝子配列における変化を生成する他の方法と組み合わせてゲノム欠失を用いて、限定はしないが真核生物細胞もしくは生物体を含む細胞もしくは生物体における表現型の変動、限定はしないが変異誘発物質、薬物、ＤＮＡ修復のインヒビターを介することを含む遺伝子産物の量、または遺伝子産物の機能についてスクリーニングする方法、あるいはＲＮＡもしくはタンパク質の量もしくは活性に影響する方法である。本明細書に記載されるのは、本明細書に記載されるスクリーニングで特定される細胞を用いる遺伝型または表現型の変動と関連する遺伝子配列をマッピングする方法である。
【００１５】
本明細書に記載されるのは、培養された細胞において、劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する方法であって、この遺伝子配列が、２つの挿入された部位特異的な組み換え部位の間に位置し：
（ａ）遺伝子型もしくは表現型の変動に相関する変異をさらに含む、染色体上の２つの挿入された部位特異的な組み換え部位を含む細胞を得る工程であって、この変異が、相同染色体上であり、かつこのホモログ上の部位特異的な組み換え部位の位置に結合される工程と；
（ｂ）２つの部位特異的組み換え部位の間の既知の位置に第三の部位特異的組み換え部位を、（ａ）の細胞の集団において挿入する工程と；
（ｃ）部位特異的なリコンビナーゼに対して（ａ）の細胞を曝して少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する行程と；
（ｄ）部位特異的リコンビナーゼに対して（ｂ）の細胞を曝して、少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する工程と；
（ｅ）培養細胞またはエキソビボにおいて、（ｄ）の欠失含有細胞に対して（ｃ）の欠失含有細胞を、この表現型または遺伝子型の変動の有無についてスクリーニングする工程と；
（ｆ）（ａ）〜（ｃ）の工程を繰り返して、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して、第三の部位特異的組み換え部位を変更する工程と；
（ｆ）培養細胞またはエキソビボにおいて、劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する工程と、
を包含する、方法。
【００１６】
本明細書に記載されるのは、第三の部位特異的組み換え部位が、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して変更され、上記細胞における遺伝子型または表現型の変動に相関する欠失のサイズが狭くなる、方法である。
【００１７】
本明細書に記載されるのは、遺伝型または表現型の変動を特定する方法であって：
（ａ）培養された細胞の染色体ＤＮＡにおいて２つの挿入された部位特異的組み換え部位の間のリコンビナーゼ誘導性欠失を有する、半数体細胞よりも大きい細胞であって、この細胞のＤＮＡがリコンビナーゼ誘導性欠失配列の少なくとも一部と相同な染色体においてさらなる変異を含み、このさらなる変異がリコンビナーゼ誘導性欠失以外の方法で導入された、細胞と、
（ｂ）以下の群：
（ｉ）染色体ＤＮＡにおけるリコンビナーゼ誘導性欠失もまたはさらなる欠失もなしの（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉ）染色体ＤＮＡにおいてリコンビナーゼ誘導性欠失を有するがさらなる変異は欠く（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉｉ）さらなる変異が導入されているが、染色体ＤＮＡにおいてリコンビナーゼ誘導性欠失は欠く、（ａ）の細胞の前駆細胞、および
（ｉｖ）（ａ）の細胞の前駆細胞以外の細胞
からなる群より選択される細胞と、
の間の遺伝型または表現型の変動について、培養細胞またはエキソビボでスクリーニングする工程を包含し、
この遺伝型または表現型の変動の位置または同一性が、本明細書に記載の方法を用いて、この遺伝型または表現型の変動に関連する遺伝子配列の領域に位置決めされる、方法である。
【００１８】
いくつかのバリエーションでは、さらなる変異は、化学的突然変異誘発を介する。あるバリエーションでは、（ａ）の培養細胞の変異のさらなる方法は、前記リコンビナーゼ誘導性欠失の前、同時、または後のいずれかに行われる。いくつかのバリエーションでは、細胞は動物、植物、真菌または原生生物である。あるバリエーションでは、この細胞は１つ以上のレポーターまたは選択マーカーを含む。あるバリエーションでは、（ａ）の細胞は、上記２つの組み換え部位に対して内部である１つ以上のレポーターまたは選択マーカーを含む。あるバリエーショでは、この細胞は、上記２つの組み換え部位に対して外部である１つ以上のレポーターまたは選択マーカーを含む。
【００１９】
あるバリエーションでは、上記部位特異的リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、またはＩｎｔリコンビナーゼである。いくつかのバリエーションでは、部位特異的リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。
【００２０】
あるバリエーションでは、突然変異誘発前の細胞は、二倍体核型に密接に接着する。
【００２１】
あるバリエーションでは、上記さらなる突然変異誘発は、電磁放射線、ＤＮＡ修復のインヒビターでの処理、または挿入突然変異のうちの１つ以上による。
【００２２】
あるバリエーションでは、上記表現型の変動は、半固体培地中でコロニーを増殖する能力の変化、化学療法剤に対する耐性の変化、血管新生の誘導の変化、および転移能の変化からなる群より選択されるメンバーである。
【００２３】
あるバリエーションでは、上記培養細胞は、哺乳動物細胞である。あるバリエーションでは、この培養された哺乳動物細胞は、霊長類、ヒト、マウスまたはラットの細胞である。あるバリエーションでは、上記培養された哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００２４】
あるバリエーションでは、上記（ａ）の細胞は、疾患状態に関連する特徴を示す。
【００２５】
あるバリエーションでは、この（ａ）の細胞は、ガンに関連する特徴を示す。あるバリエーションでは、この（ａ）の細胞は、肺ガンに関連する特徴を示す。あるバリエーションでは、この（ａ）の細胞は、ＤＶ９０、ＨＬＦ−ａ、Ｈ５２２、Ｈ４６０、Ｈ４６０ＳＭ、ＳＣＬＣ−Ｒ１、ＳＣＣ−３７、Ｍａ−４、Ｍａ−１０、Ｍａ−１２、Ｍａ−１５およびｌａ  １６２細胞からなる群由来のメンバーである。
【００２６】
あるバリエーションでは、この（ａ）の細胞は、パーキンソン病、アルツハイマー病およびＨＩＶからなる群由来のメンバーに関連する特徴を示す。
【００２７】
あるバリエーションでは、この変動は、（ａ）の細胞によって提示される表現型の損失である。あるバリエーションでは、この変動は、（ａ）の細胞によって提示される遺伝型の損失である。
【００２８】
本明細書に記載されるのは、培養された細胞またはエキソビボにおいて、劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する方法であって、
（ａ）遺伝型または表現型の変動に相関する変異をさらに含む、挿入された部位特異的な組み換え部位を含む細胞を得る工程であって、この変異が、相同な染色体上であり、かつホモログ上の部位特異的な組み換えの位置に結合される工程と；
（ｂ）（ａ）の細胞の集団において、第一の部位特異的組み換え部位を含む染色体上に、第二の部位特異的組み換え部位を導入する工程と；
（ｃ）部位特異的リコンビナーゼに対して（ｂ）の細胞を曝して、少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する工程と；
（ｄ）（ａ）の細胞に対して表現型または遺伝子型の変動について（ｃ）の細胞を培養細胞またはエキソビボにおいてスクリーニングする工程と；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す行程であって、この劣性の遺伝型または表現型の変動を含む遺伝子配列の領域が、工程（ｂ）〜（ｄ）の第一の反復の部位に対して変化される工程と；
（ｆ）培養細胞またはエキソビボにおいて、この遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する工程と、
を包含する、方法である。
【００２９】
あるバリエーションでは、上記第二の部位特異的組み換え部位の位置が、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して変更され、上記細胞における遺伝子型または表現型の変動に相関する欠失のサイズが狭められる。
【００３０】
本明細書に記載されるのは、劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列を特定する方法であって、
（ａ）導入された組み換え部位を以前には含んでいる細胞であって、この配列の領域が、リコンビナーゼ誘導性ではない方法によって欠失されている導入された組み込み部位を含み、この細胞のＤＮＡが、第二の方法で導入された相同染色体上に変異をさらに含む、細胞と
（ｂ）以下の群：
（ｉ）染色体ＤＮＡにおける非リコンビナーゼ誘導性欠失なしで、かつ第二の方法でのさらなる欠失なしの（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉ）染色体ＤＮＡにおいて組み換え部位の非リコンビナーゼ誘導性欠失を有するがさらなる変異は欠く（ａ）の細胞の前駆細胞；
（ｉｉｉ）さらなる変異が導入されているが、染色体ＤＮＡにおいて組み換え部位の非リコンビナーゼ誘導性欠失は欠く、（ａ）の細胞の前駆細胞、および
（ｉｖ）（ａ）の細胞の前駆細胞以外の細胞
からなる群由来の細胞と、
の間の遺伝型または表現型の変動について、培養細胞においてスクリーニングする工程を包含し、
この（ａ）の細胞における劣性の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列が、本明細書に記載の方法を用いて、この遺伝型または表現型の変動に関連する遺伝子配列の領域にマッピングされる、方法である。
【００３１】
あるバリエーションでは、上記変異の第二の方法は、化学的突然変異誘発である。あるバリエーションでは、非リコンビナーゼ誘導性欠失は、電磁放射線を介した。
【００３２】
あるバリエーションでは、上記細胞は、動物、植物、真菌または原生生物である。あるバリエーションでは、この細胞は、１つ以上のレポーターまたは選択マーカーを含む。
【００３３】
あるバリエーションでは、上記（ａ）の細胞は、上記導入された組み込み部位に対して５’側に１つ以上の導入されたレポーターまたは選択マーカーを含む。あるバリエーションでは、上記（ａ）の細胞は、上記導入された組み換え部位に対して３’側に１つ以上の導入されたレポーターまたは選択マーカーを含む。
【００３４】
あるバリエーションでは、上記部位特異的リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、またはＩｎｔリコンビナーゼである。いくつかのバリエーションでは、部位特異的リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。
【００３５】
あるバリエーションでは、突然変異誘発前の細胞は、二倍体核型に密接に接着する。
【００３６】
あるバリエーションでは、上記さらなる突然変異誘発は、ＤＮＡ修復のインヒビターでの処理、または挿入突然変異のうちの１つ以上による。
【００３７】
あるバリエーションでは、上記表現型の変動は、半固体培地中でコロニーを増殖する能力の変化、化学療法剤に対する耐性の変化、血管新生の誘導の変化、および転移能の変化からなる群より選択されるメンバーである。
【００３８】
本明細書に記載されるのは、ベクターであって、実現可能な組み合わせで以下：
（ａ）マーカーを発現する細胞の特定をし得るこのマーカーをコードする第一の核酸配列と、
（ｂ）部位特異的な組み換え部位と、
（ｃ）第二のマーカーを発現する細胞を特定し得る第二のマーカーをコードする第二の核酸配列と、
（ｄ）第三のマーカーを発現する細胞を特定し得るこの第三のマーカーをコードする第三の核酸配列と、
を包含する、ベクターである。
【００３９】
あるバリエーションでは、この第一、第二または第三の核酸配列は、可視のマーカーをコードする。いくつかのバリエーションでは、この第一の核酸配列は、可視のマーカーをコードする。いくつかのバリエーションでは、この可視のマーカーは蛍光タンパク質、フルオロフォア（発蛍光団に供給し得るペプチド）、発色基質もしくは蛍光基質を変換し得る酵素、基質を発色生成物もしくは蛍光生成物に変換し得る酵素、または抗体のペプチドもしくはタンパク質標的である。
【００４０】
あるバリエーションでは、部位特異的な組み換え部位とは、ｌｏｘＰ部位、可視スペーサー領域を有するｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、またはａｔｔＲ部位である。
【００４１】
あるバリエーションでは、この第一、第二または第三の核酸配列は、ポジティブ選択マーカーをコードする。いくつかのバリエーションでは、この第二の核酸配列は、ポジティブ選択マーカーをコードする。いくつかのバリエーションでは、このポジティブ選択マーカーは、ネイマイシン耐性遺伝子、βガラクトシダーゼおよびネオマイシン耐性遺伝子融合物、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシチジン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼおよび外部因子の処理に依拠しない代謝のまたは競合的な利点を付与する遺伝子からなる群由来のメンバーをコードする。
【００４２】
いくつかのバリエーションでは、この第一、第二または第三の核酸配列は、ネガティブ選択マーカーをコードする。いくつかのバリエーションでは、この第三の核酸配列は、ネガティブ選択マーカーをコードする。いくつかのバリエーションでは、このネガティブ選択マーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、シチジンデアミナーゼ、およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼからなる群由来のメンバーである。
【００４３】
あるバリエーションでは、このベクターは、ネガティブ選択マーカーをコードする第四の核酸配列を含む。いくつかのバリエーションでは、このネガティブ選択マーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、シチジンデアミナーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジフテリア毒素またはリシン毒素である。
【００４４】
いくつかのバリエーションでは、マーカーをコードする核酸配列は、単一の転写ユニットを含む。
【００４５】
いくつかのバリエーションでは、マーカーをコードする第二の核酸配列およびマーカーをコードする第三の核酸配列は、単一の転写ユニットを含む。
【００４６】
本明細書に記載されるのは、細胞の集団であって、これには以下を含む：
（ａ）染色体ＤＮＡにおける３つの導入された部位特異的組み換え部位を含む、半数体より大きい培養細胞の集団
（ｂ）細胞の相同な染色体上のさらなる突然変異誘発
いくつかのバリエーションでは、この細胞は、単一の染色体上の３つの導入された部位特異的な組み換え部位のうちの２つの間の部位特異的な組み換えによって生じる欠失を有する。あるバリエーションでは、この部位特異的な組み換えは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼまたはＩｎｔリコンビナーゼからなる群より選択される部位特異的リコンビナーゼに対する細胞の暴露後に生じた。いくつかのバリエーションでは、この部位特異的なリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであった。
【００４７】
あるバリエーションでは、この細胞は、二倍体核型に密接に接着する。
【００４８】
あるバリエーションでは、前記さらなる突然変異誘発は、化学処理、電磁放射線、ＤＮＡ修復のインヒビターでの処理、および挿入突然変異からなる群由来の１つ以上のメンバーによった。
【００４９】
あるバリエーションでは、この細胞は動物、植物、真菌または原生生物である。あるバリエーションでは、この細胞は動物細胞である。あるバリエーションでは、この動物細胞は、霊長類、ヒト、マウスまたはラット細胞である。あるバリエーションでは、この動物細胞はヒト細胞である。
【００５０】
あるバリエーションでは、このヒト細胞は、その前駆体細胞株が疾患状態に関連する特徴を示す細胞株を含む。
【００５１】
あるバリエーションでは、この前駆体細胞株は、ガンに関連する特徴を示す。あるバリエーションでは、この前駆体細胞株は、肺癌細胞株である。あるバリエーションでは、この肺癌細胞株は、ＤＶ９０、ＨＬＦ−ａ、Ｈ５２２、Ｈ４６０、Ｈ４６０ＳＭ、ＳＣＬＣ−Ｒ１、ＳＣＣ−３７、Ｍａ−４、Ｍａ−１０、Ｍａ−１２、Ｍａ−１５およびｌａ  １６２細胞からなる群由来のメンバーである。
【００５２】
あるバリエーションでは、この前駆体細胞株は、パーキンソン病、アルツハイマー病およびＨＩＶからなる群由来の１つ以上のメンバーに関連する特徴を示す。
【００５３】
本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される細胞を含む細胞ライブラリーである。
【００５４】
本明細書に記載されるのは、培養された細胞またはエキソビボに対する１つ以上の効果について治療剤をスクリーニングする方法であって、この細胞が遺伝型または表現型の変動を有し、この遺伝型または表現型の変動が、遺伝子産物の量または遺伝子産物の機能における変化と相関しており、この遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性が、本明細書に記載される方法に従ってマッピングされる、方法である。
【００５５】
本明細書に記載されるのは、培養細胞またはエキソビボに対する１つ以上の効果について治療剤をスクリーニングする方法であって、この細胞が遺伝型または表現型の変動を有し、この遺伝型または表現型の変動が、遺伝子産物の量または遺伝子産物の機能における変化に対応する細胞挙動と相関し、この遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性が、本明細書に記載される方法に従ってマッピングされる、方法である。
【００５６】
本明細書に記載されるのは、スクリーニングの方法であって、上記遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の２次元または３次元の構造のうちの１つ以上を予測し、かつこの遺伝子配列の活性に影響することについて可能性のありそうなまたは有望な治療剤を予測するソフトウェアプログラムを用いるスクリーニングの方法である。本明細書に記載されるのは、スクリーニングの方法であって、本明細書に記載の方法を用いて、遺伝型または表現型の変動に基づいて特定された配列の野性型配列と相関する遺伝子配列の２次元または３次元の構造のうちの１つ以上を予測し、かつこの遺伝子配列の活性に影響することについて可能性のありそうなまたは有望な治療剤を予測するソフトウェアプログラムを用いる、スクリーニングの方法である。
【００５７】
本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される方法に従って、遺伝型または表現型の変動に相関するとして特定された１つ以上の遺伝子配列を含む、コンピューター読み取り可能な媒体である。
【００５８】
本明細書に記載されるのは、本明細書に記載される方法に従って、遺伝型または表現型の変動に相関するとして特定された１つ以上の遺伝子配列を含む、データベースである。
【００５９】
本明細書に記載されるのは、第一および第二の相同な染色体の各々に対して欠失を含む培養細胞またはエキソビボの細胞を含む組成物であって、この第一の染色体における欠失が、第二の染色体における欠失に重複し、そして少なくとも１つの欠失が導入された、組成物である。あるバリエーションでは、この細胞は培養された細胞である。あるバリエーションでは、この第一および第二の相同な染色体の両方に欠失が導入された。あるバリエーションでは、この培養された細胞またはエキソビボ細胞は、相同な染色体上に欠失を導入することによって調製される。あるバリエーションでは、この第一および第二の相同な染色体の両方に欠失が導入された。あるバリエーションでは、この導入された欠失のうちの少なくとも１つは無作為に導入された。あるバリエーションでは、この少なくとも１つの導入された欠失は、標的された欠失であった。
【００６０】
本明細書に記載されるのは、遺伝型または表現型の変動を特定する方法であって、本明細書に記載の細胞を、培養でまたはエキソビボで、ある条件に供する工程と、この組成物におけるこの細胞の応答を分析する工程とを包含する、方法である。
【００６１】
本明細書に記載されるのは、遺伝型または表現型の変動を特定する方法であって、
（ａ）第一の導入された部位特異的組み換え部位を有する半数体細胞より大きく、この細胞のＤＮＡが、この第一の導入された部位特異的組み換え部位と相同な染色体領域の欠失を含む、細胞と
（ｂ）この第一の導入された部位特異的組み換え部位と第二の導入された部位特異的組み換え部位との間に欠失を有する、細胞と、
の間の遺伝型または表現型の変動について、培養細胞またはエキソビボにおいてスクリーニングする工程を包含し、
この（ｂ）の細胞における遺伝型または表現型の変動の有無の相関が、この第一の導入された部位特異的組み換え部位と第二の導入された部位特異的組み換え部位との間の欠失の領域と相関する、方法である。
【００６２】
本明細書で記載されるのは、培養細胞またはエキソビボにおいて、遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する方法であって：
（ａ）染色体上に第二の部位特異的組み換え部位を導入する工程であって、細胞の集団において第一の部位特異的組み換え部位を含み、この細胞が、相同な染色体領域に欠失を含み、この欠失された領域に対して相同な領域の少なくとも一部の欠失が、遺伝子型もしくは表現型の変動に相関する工程と；
（ｂ）部位特異的なリコンビナーゼに対して（ａ）の細胞を曝して、この第一および第二の組み換え部位を含む染色体上に少なくとも１つの欠失を含む細胞を生成する行程と；
（ｃ）培養細胞またはエキソビボにおいて、（ａ）の細胞に対して（ｂ）の細胞を、この表現型または遺伝子型の変動についてスクリーニングする工程と；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の工程を繰り返す行程であって、第二の部位特異的組み換え部位を含む遺伝子配列の領域が、工程（ａ）〜（ｃ）の第一の反復の部位に対して、変更される工程と；
（ｅ）培養細胞またはエキソビボにおいて、（ａ）の細胞の遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子配列の位置または同一性を決定する工程と、
を包含する、方法である。
【００６３】
本明細書に記載されるいくつかのバリエーションでは、第一の部位特異的組み換え部位が、続いて第二の部位特異的組み換え部位が細胞に導入される。あるバリエーションでは、ゲノムへの部位特異的組み換え部位の導入は、従来の相同組み換え方法による。他のバリエーションでは、導入の方法としては、限定はしないが、ランダム組み込み（ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、プロ・ウイルス挿入（ｐｒｏ−ｖｉｒａｌ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、遺伝子トラップ（ｇｅｎｅ  ｔｒａｐ）、または遺伝子転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）が挙げられる。あるバリエーションでは、部位特異的組み換え部位の間に欠失を生じる部位特異的リコンビナーゼについては、両方の部位の組み込みが、同じ染色体上に特定の方向で存在する（図２〜Ａ）。このようなバリエーションでは、部位特異的リコンビナーゼは、細胞クローンに導入されてもよく、そして欠失の存在（図２〜Ｂ）は、標準的な手段によって欠失され得、この手段としては、限定はしないが、サザンブロット、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、分光染色体解析（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）、比較ゲノムハイブリダイゼーションまたは分子コーミング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｂｉｎｇ）が挙げられる。
【００６４】
あるバリエーションでは、実質的な欠失がないが、同じ染色体上に正確に標的された部位特異的組み換え部位を有する細胞クローン（図２−Ａ）を、化学的変異誘発物質、例えば、エチレンメタンスルホナート（ＥＭＳ）もしくはエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）を用いて無作為に突然変異するか、またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理する。あるバリエーションでは、このような突然変異生成から生じる複数の個々のクローンを分離して増殖させる（図２−Ｃ）。さらなるバリエーションでは、次いでクローンを部位特異的なリコンビナーゼで処理して、２つの部位特異的な組み換え部位の間で欠失を生成する。次いで、変異および欠失を含むクローンを、任意の表現型変動についてスクリーニングしてもよい（図２−Ｄ）。
【００６５】
あるバリエーションでは、表現型改変クローンを選択し、そして第三の部位特異的組み換え部位を親の細胞株（変異あり、欠失なし）（図３−Ａ）に、必要に応じて以前の２つの部位の間で導入する（図３−Ｂ）。この変動では、細胞を、部位特異的なリコンビナーゼで処理して、より小さい欠失を作成する（図３−Ｃ、３−Ｄ）。次いで、細胞クローンを、表現型の変動について再スクリーニングする。さらなるバリエーションでは、相同な染色体上の欠失によって変異が明らかにされない細胞クローン（図３−Ｃ）は、表現型の変動を提示するとは予期されなかった。相同な染色体上の欠失によって変異が明らかになる細胞クローン（図３−Ｄ）は、表現型の変動を提示すると期待される。あるバリエーションでは、欠失領域は、第三の部位特異的な組み換え部位の位置を変更することによって反復して狭められる（図３−Ｂ）。この方式では、欠失領域は、表現型の改変体由来の染色体のこの間隔および非突然変異誘発の親細胞をコントロールとして配列決定することが望まれるかまたは実際的であるまで、狭められ得る。配列の相違は、表現型変動を担う遺伝子病変と相関することが予想される。
【００６６】
あるバリエーションでは、欠失の導入された細胞クローン（図２−Ｂ）を変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理する。さらなるバリエーションでは、欠失および変異を含む細胞クローン（図２−Ｄ）を遺伝型または表現型の変動についてスクリーニングする。個々の細胞クローン（図２−Ｄ）は、部位特異的な組み換え部位によって結合される間隔内で各々の遺伝子における変異についてスクリーニングされ得る。いくつかのバリエーションでは、この遺伝子配列は、配列決定によって、またはハイブリダイゼーション方法によって比較される。
【００６７】
あるバリエーションでは、欠失は、電子放射線によって生じる。
【００６８】
あるバリエーションでは、変異は、他の挿入突然変異によって生成され（図６）、これには、限定はしないが、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルス、プロ・ウイルス構築物、導入遺伝子、プラスミド、反復配列エレメントおよび遺伝子トラップが挙げられる。
【００６９】
あるバリエーションでは、欠失を含む細胞（図７−Ｂ）を、限定はしないが、化学ライブラリー由来の化合物を含む化合物を用いて直接処理して、表現型改変体細胞を特定する。欠失領域は、遺伝子産物標的を特定するために狭められ得る（図７−Ｃ、７−Ｄ、７−Ｅ）。
【００７０】
あるバリエーションでは、欠失を含む細胞（図７−Ｂ）を、ＲＮＡまたはタンパク質の量または活性に影響する方法を用いて処理する。あるバリエーションでは、参照細胞（図７−Ａ）における１つ以上のＲＮＡの量は１００％であるが、欠失を含有する細胞（図７−Ｂ）は、この間隔で欠失された遺伝子から１００％未満の量を有し得る。あるバリエーションでは、欠失含有細胞は、参照細胞に比較した場合、１つ以上のＲＮＡの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％の蓄積を有する。これによって、変更するＲＮＡまたはタンパク質の量もしくは活性をスクリーニングする効率が改善される。
【００７１】
あるバリエーションでは、欠失を含有する細胞（図７−Ｂ）を用いて、化合物の変異原性を検出する。
【００７２】
あるバリエーションでは、欠失含有細胞を用いて、限定はしないが化合物、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質などを含む１つ以上の治療剤の治療効果を検出する。
【００７３】
あるバリエーションでは、部位特異的組み換え部位ならびに／またはポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含むＤＮＡを細胞に組み込む。欠失は、例えば、部位特異的なリコンビナーゼの導入を通じて、または電磁放射線での処理によって導入されてもよい。細胞は、例えば、ネガティブ選択マーカーに対する選択を介して、薬物または他の適切な刺激に対して変化した応答についてスクリーニングされ得る。欠失を含む細胞は、部位特異的組み換え部位ならびに／またはポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含む対応する相同な染色体セグメント上で標的化され得る。あるバリエーションでは、相同な染色体セグメントの欠失は、部位特異的なリコンビナーゼの導入によって、または電磁放射線での処理によって、導入され、そして薬物または他の適切な刺激を用いて、ネガティブ選択マーカーに対して選択する。あるバリエーションでは、ヘテロ対立遺伝子的な欠失を含む細胞クローンは、遺伝型または表現型の変動についてスクリーニングされ得る。
【００７４】
本明細書に記載されるのは、各々の遺伝子において変異を有する細胞のライブラリーを生成する方法である。全体的なゲノムがこの方式で標的される場合、あらゆる遺伝子における変異を有する細胞のライブラリーが達成され得る。理論的には、このライブラリーは、あらゆる遺伝子に変異を集団的に有する細胞を含み、そして、このクローンは、目的の任意の遺伝子型または表現型の変動についてスクリーニングされてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７５】
詳細な説明
本明細書で提供されるのは、細胞培養物において細胞の遺伝型または表現型の変動をスクリーニングし、マッピングする細胞および方法である。本明細書に記載される方法は、培養された細胞におけるゲノムの飽和突然変異誘発を促進し、培養された細胞において原因の遺伝子病変をマッピングし、細胞培養物中で細胞をスクリーニングすることによって薬物治療のための標的を特定し、そして細胞培養物において細胞をスクリーニングすることによる疾患または状態の処置のための治療剤を特定する。
【００７６】
細胞培養ベースの方法の利点
生物体まるごととは対照的に、遺伝子病変を特定してマッピングするために培養細胞を用いる能力によって、生物体または動物まるごとの使用を上回る強力な利点がもたらされる。１つの利点は、疾患に関連する治療についての標的の同定のような回答を得るために要する時間の短縮である。培養された細胞は生物体または動物まるごとよりも迅速に形質転換または変異誘発される。培養された細胞は容易にクローニングされ、そして倍加時間は、マウスの場合の数ヶ月、またはヒトの場合の数十年と比較して、数時間で測定される。別の利点は、回答を得るのにかかるお金である。培養細胞の費用は、マウスまたは遺伝子モデル系として伝統的に用いられる他の生物体を維持する費用のうちわずかである。培養物中で細胞のスクリーニングを行う費用は、遺伝子型または表現型の変動について全生物体をスクリーニングするよりもかなり少ない。他の利点は簡便性および柔軟性である。培養された細胞は、低温で凍結され、必要に応じて解凍され、そして数日内の実験に利用可能である。また、細胞クローンは、操作の各ステップで保管されてもよく、そのため親または祖父母世代のクローンがさらなる分析のために再解凍されてもよい。さらに、必要に応じて、トランスジェニック生物体を、突然変異誘発された細胞から生成して、その生物体における変異の影響を分析してもよい。変異体細胞を回収するための例示的な方法は、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第４，８１８，６７９号に記載される。
【００７７】
本明細書に記載される突然変異誘発方法の組み合わせにより、細胞培養物中で細胞をスクリーニングすることによって、そして培養された細胞中で遺伝型または表現型の変動に相関する遺伝子病変をマッピングすることによって、劣性の遺伝型または表現型の変動を含む、遺伝型または表現型の変動の特定が可能になる。
【００７８】
限定はしないがガンを含む、特定の疾患または状態に関与すると特定された遺伝子の配列または病変（損傷）は、限定はしないが１つ以上の低分子治療または遺伝子治療を含む治療剤についてのスクリーニングにおいて標的として用いられ得る。従って、他の利点の中でも、本明細書に記載される方法では、ヒトおよび獣医の疾患および状態について、より早く、簡単で、かつ安価な治療のための能力が得られる。
【００７９】
あるプロセスに関与する全ての遺伝学的変動を特定する能力は、「飽和突然変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」である。世代時間が短く、低コストで、かつ飼育に要するスペースが小さいショウジョウバエのような遺伝モデル生物体によって、飽和突然変異誘発の利点が得られる。しかし、飽和突然変異誘発は、マウスのような他のモデル生物体においては、世代時間、産子数、および飼育の費用のせいで、実際は現実的ではない。本明細書に記載される方法によって、限定はしないが、真核生物生物体を含む、かなり膨大な数の生物体で可能な飽和突然変異誘発が作成される。なぜなら突然変異誘発および表現型のスクリーニングが多細胞生物体ではなく細胞培養物でおこなわれ得、かつ遺伝子病変がより簡単に特定され得るからである。
【００８０】
遺伝子病変のスクリーニングは時には、幹細胞、または生殖系列を通じて継代することが可能になるように操作され得る細胞で行われ、これによって、従来の遺伝的増殖を用いてこの変異をマッピングすることが可能になる。しかし、これは費用が嵩みかつ時間を浪費する。いくつかのバリエーションでは、本明細書に記載の方法によって突然変異誘発された細胞、またはその親細胞を、培養された細胞において反復する欠失プロセスに供して、ゲノムにおけるディスクリートな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）損傷をマッピングする。これによって、遺伝型または表現型の変動を担う病変（損傷）をマッピングする時間および費用を減らすことができる。表現型として改変体の細胞は代表的には、１つの染色体上に欠失を有するので、その原因の病変（損傷）は、欠失の限界点に結合される相同染色体に限定され得る。ゲノムのこの部分を配列決定して、原因の変異を特定することができる。あるバリエーションでは、欠失と組み合わせた挿入変異誘発物質の使用によって、表現型の変動を生じる破壊された遺伝子の正確な位置決めおよび特定が可能になる。あるいは、ゲノムのＤＮＡセグメントまたは発現されたｃＤＮＡを細胞に導入して、変更された表現型のレスキューについて分析してもよい。
【００８１】
解明の目的で、文脈が明確に対立遺伝子を示すのでない限り、本明細書において用いる場合、「相同染色体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）」とは、同じ、類似または匹敵する対立遺伝子を有する染色体を意味する。
【００８２】
本明細書に記載されるのは、ゲノム、特にヒトのゲノムの直接の機能的な表現型スクリーニングを、培養細胞中で可能にする方法である。これによって、ヒトの生物学に近いモデルの遺伝学的生物体を用いるのではなく、ヒト細胞で直接試験することが可能になる。本明細書に記載される突然変異誘発方法の組み合わせを用いる場合、遺伝子病変は、より容易にかつ費用効果的に培養細胞においてマッピングされ得る。
【００８３】
本明細書に記載される細胞培養ベースの方法における使用のための細胞のタイプ
本明細書に記載されるのは、劣性の遺伝型または表現型の変動について、限定はしないが、培養された真核生物細胞を含む培養された細胞をスクリーニングする方法、このような変動を遺伝子配列のある領域に対してマッピングする方法、およびそれによって得られる情報の使用である。一般には、そのゲノムに外因性のＤＮＡを組み込み得る任意の細胞であって、一次組織中の細胞または細胞株を含む細胞を、本明細書に記載の方法によって分析してもよい。本明細書に記載される方法は、限定はしないが真核生物細胞および生物体を含む、多くの異なるタイプの生物体または細胞を遺伝的に操作することに広範に適用可能である。本明細書に記載される方法における使用のための細胞および生物体の非限定的な例は、原生生物界、菌類、植物界、および動物界における細胞および生物体である。細胞としては、専門的な分化した細胞、および多能性または全能性の細胞の両方を含む。
【００８４】
一般には、分析されるべき領域が少なくとも二倍体である任意の細胞または生物体は、「半数体（単相体）よりも大きい（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｈａｐｌｏｉｄ）」ゲノムを有し、そして本明細書に記載される方法において用いられ得る。本明細書において用いられる場合、「半数体よりも大きい（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｈａｐｌｏｉｄ）」とは、複数の全体的な染色体セット、例えば、二倍体、三倍体または四倍体、１つ以上の染色体のより少ない（例えば、低倍数性）またはより多い（例えば、高倍数性）数を有することによって、染色体の半数体数の正確な倍数から逸脱する倍数を指してもよい。本明細書において用いる場合、「半数体よりも大きい（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｈａｐｌｏｉｄ）」とはまた、単一の染色体に基づくものを超える遺伝子配列の所定のストレッチの１つ以上のさらなるコピーを有する細胞または生物体を指してもよい。半数体状態よりも大きい非限定的な例としては、細胞が遺伝子配列の単一のコピーよりも多くくを有する場合が挙げられ、すなわち：（ａ）単一遺伝子であって、その必須の調節エレメント、（２）調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、（３）変異が疾患状態に関連する領域、または（４）染色体の一部に相当する領域、を含む単一遺伝子をコードする、場合が挙げられる。単一コピーよりも大きいとは、限定はしないが、外因性の核酸が挙げられる。あるバリエーションでは、外因性の核酸は、プラスミド、ウイルスまたは任意の他の外因性の供給源由来である。
【００８５】
あるバリエーションでは、二倍体核型に密接に接着する細胞または生物体が、本明細書に記載の方法で用いられる。二倍体核型に密接に接着する細胞または生物体は、各々の常染色体の２つのコピーを有する細胞または生物体であって、その種についての性染色体の正常な相補体を有し、実体がないかもしくは非部分的な染色体、または染色体全体の欠失もしくは重複を有する。１つの非限定的な例としては、ヒト細胞では、二倍体核型は、各々の常染色体、そして２つの性染色体の２つのコピーに相当し、全部で４６個の染色体について、最小または非部分的な染色体の欠失または重複を含む。
【００８６】
あるバリエーションでは、細胞は本明細書において、「前駆体細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」と記載される。前駆体とは、所定の細胞に対して前駆体である細胞である。非限定的な例として、リコンビナーゼ誘導性の欠失およびさらなる変異を有する細胞は、３つ以上の前駆体細胞を有し得る：リコンビナーゼ誘導性欠失も、さらなる変異も有さない前駆体、リコンビナーゼ誘導性欠失を有するが、さらなる欠失は有さない前駆体、またはさらなる変異を有するが、リコンビナーゼ誘導性欠失は有さない前駆体。
【００８７】
原生生物は、真菌、植物または動物の特徴を有さない真核生物細胞の集団的な分類である。原生動物のライフサイクルは、交互する半数体および二倍体の段階からなる。本明細書に記載される方法は特に、原生動物の二倍体段階を操作する工程に関する。ヒト疾患原因の原生動物としては、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍが挙げられ、これらは、本明細書において記載される方法によって遺伝的に操作され得る原生動物の非限定的な例である。
【００８８】
真菌は、真核生物であって、そのライフサイクルは、半数体、二核型および二倍体の段階からなる。あるバリエーションでは、この二倍体の真菌の段階は、本明細書に記載される方法によって遺伝子操作され得る。ヒト疾患は、限定はしないが、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｉｅｄｒａｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、およびＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓを含む、種々の属の真菌の感染によって生じる。免疫無防備状態のヒト患者における疾患はまた、限定はしないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｚｙｇｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、ＭｕｃｏｒおよびＡｂｓｉｄｉａを含む、いくつかの属の日和見性の真菌によっても生じる。
【００８９】
多くの菌類病原体が、市販の食用作物に、例えば、収量を減少させ作物に混入汚染することによって影響する。ウドンコ病およびサビ病は、植物および花の栽培に通常影響する真菌である。他の真菌は、ヒトによって重視される。商業上有用なかびの非限定的な例としては、限定はしないが、チーズを生成するのに用いられるＰｅｎｃｉｌｌｉｕｍ種、ダイズ製品を発酵させるのに用いられるＲｈｉｚｏｐｕｓ種、および免疫抑制剤サイクロスポリンの供給源としてＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍのようなカビが挙げられる。Ｓａｃｃｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母は、限定はしないが、ワインおよびビールの発酵、およびパンの作成を含む種々の料理の作業に用いられる。マッシュルーム、トリュフおよびトウモロコシのキノコ（ｃｏｒｎ  ｆｕｎｇｕｓ）（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）のような真菌が消費可能である。さらに、いくつかの真菌は、燃料源のような汚染物質を触媒するか、または望ましくない混入物質を良性またはより良性の副産物に変換し得る。これらおよび他の真菌は、本明細書に記載の方法を用いて操作および分析され得る。
【００９０】
植物は、光合成独立栄養生物である多細胞性の真核生物である。植物としては、非維管束植物および維管束植物、種無し植物および種子植物、ならびに裸子植物（針葉樹、ソテツなど）、および被子植物（ラン、バラ、チューリップなど）、および単子葉植物および双子葉植物が挙げられる。あるバリエーションでは、農業的意義の植物としては、限定はしないが、単子葉植物、イネ、コムギ、コーン、オオムギ、ソバ、キビ（アワ）（ｍｉｌｌｅｔ）、カラスムギ、ライムギ、キノア、スペルト（ｓｐｅｌｔ）、ワイルド・ライスなど、マメ科植物（黒豆、インゲンマメ（ｐｉｎｔｏ  ｂｅａｎｓ）、インゲンマメ（ｋｉｄｎｅｙ  ｂｅａｎｓ）、ダイズ、ヒヨコマメ、レンズマメ（ｌｅｎｔｉｌｓ）など）、ナッツ（アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピーナッツ、クリ、ペカン、クルミなど）、果実（オレンジ、イチゴ、バナナ、ブドウ、アボガド、トマト、カボチャなど）、塊茎（ジャガイモ、サツマイモ、ヤムイモ、タロイモ、葛芋など）、根菜（ビート、ニンジン、ダイコンなど）、鱗茎（タマネギ、ニンニク、エシャロットなど）、葉物（レタス、ホウレンソウ、オランダガラシ、ルッコラ（ａｒｕｇｕｌａ）、キャベツ）、トウガラシ、植物性食品、草、ワタ、麻、サトウキビ、茶、コーヒー、ココア、タバコ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラナ（ｃａｎｏｌａ）、アブラナ（ｒａｐｅｓｅｅｄ）、オリーブ、ココナツ、ヤシ、オーク、マホガニー、カエデ、アメリカスギ（レッドウッド）（ｒｅｄｗｏｏｄ）、ならびに他の常緑樹および落葉樹が挙げられる。園芸および観賞用の植物種も、本明細書に記載の方法による操作および分析になじみやすい。これらおよび他の植物は、本明細書に記載の方法で操作され得る。植物は、植物の繁殖または大規模のクローニングのいくつかの方法によって繁殖され得るので、植物は理想的には、本明細書に記載の方法に適している。
【００９１】
動物は、多細胞の従属栄養性の真核生物である。多くの動物の二倍体段階は、ライフサイクルを占めるので、動物は理想的には、本明細書に記載の方法を用いる遺伝子操作に適切である。一次組織または細胞、そしていくつかのバリエーションでは、不死化または形質転換された細胞株は、本明細書に記載の方法によって分析され得る。あるバリエーションでは、分析される動物は、限定はしないが哺乳動物（ヒト、霊長類、げっ歯類、ウシなど）、鳥類（ニワトリ、シチメンチョウなど）、爬虫類（イグアナ、カメなど）および両生類（カエル、サンショウウオ、イモリなど）を含む、脊椎動物に相当する動物細胞である。あるバリエーションでは、動物由来の一次細胞または細胞株は、大きい器官または腺（心臓、肺、皮膚、胃、脳、膵臓、精巣、卵巣、乳房、前立腺、腸、下垂体、副腎など）、または任意の胚葉（外胚葉、内胚葉または中胚葉）由来である。本明細書に記載の方法による操作および分析になじみやすい動物細胞のタイプとしては、限定はしないが、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、島細胞、間葉細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、線維芽細胞、中皮細胞、中胚葉細胞が挙げられる。本明細書に記載の方法による操作および分析になじみやすい動物細胞としては、限定はしないが、最終分化した細胞タイプが挙げられるが、これは多能性または全能性の幹細胞を包含し、これには限定はしないが、胚性幹細胞、胎児性胚細胞、臍帯幹細胞、成体幹細胞、造血性幹細胞、神経幹細胞、間充織幹細胞、嗅覚幹細胞、歯の幹細胞、腸の幹細胞、生殖系列の幹細胞が挙げられる。
【００９２】
本明細書に記載される方法は、例えば、全能性または多能性の細胞で用いられてもよい。あるバリエーションでは、本明細書に記載の方法は、ＥＳ細胞のような幹細胞で用いられる。あるバリエーションでは、幹細胞は、細胞特異的な表現型改変体または発生能を分析するために１つ以上の細胞タイプに分化される。あるバリエーションでは、マウスのＥＳ細胞を、ＥＳ細胞またはそれらの誘導体における大規模な遺伝子スクリーニングに用いる。さらに変異体マウスＥＳ細胞は、生殖系列を通じて伝達され得、これによって、この動物における変異の研究が可能になる。この特徴のみで、マウスの遺伝的特徴は、多くの遺伝子スクリーニングから、飽和遺伝がＥＳ細胞でおこなわれ得るポイントに対して進展させられ得る。
【００９３】
細胞培養ベースのスクリーニング
本明細書において記載される場合、生物体全体よりも培養された細胞をスクリーニングすることに多くの利点がある。本明細書に記載される細胞調製の方法およびスクリーニングの方法は一般に、任意の劣性の遺伝型または表現型の変動を特定して、マッピングするために用いられ得る。
【００９４】
図１は、染色体において欠失および変異を作製する方法のいくつかのバリエーションを示す。あるバリエーションでは、染色体の全体の領域を除去する欠失は、遺伝子スクリーニングにおいて開発される。図１−Ａは、ゲノム全体にわたってランダムな方式で欠失を作成する、電磁放射線を用いて真核生物の細胞のような細胞または生物体を処理する結果を示す。全ての図面にあるとおり、頂部の線は、１染色体の一部に相当し、そして底部の線は、相同染色体の同じ部分に相当する。カッコの間に示される領域は、欠失される染色体の一部である。
【００９５】
図１−Ｂは、限定はしないが、化学的突然変異またはＤＮＡ修復のインヒビターを含む変異誘発物質で細胞を処理する結果のいくつかのバリエーションを示す。星印（＊）は、単一の染色体のＤＮＡにおける病変（欠損）（ｌｅｓｉｏｎ）の位置を記す。
【００９６】
図１−Ｃは、挿入変異誘発物質（１４）で細胞を処理した結果のいくつかのバリエーションを示す。挿入変異誘発物質は物理的には、それ自体を染色体のＤＮＡに挿入し、時には、ある遺伝子のエンハンサー、プロモーター、非翻訳領域、またはコード領域を破壊する。挿入変異誘発物質としては限定はしないが、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルス、プロ・ウイルス構築物、導入遺伝子、プラスミド、反復配列エレメントおよび遺伝子トラップが挙げられる。
【００９７】
図１−Ｄは、細胞培養物における表現型改変体についてスクリーニングするために用いられ得る欠失を作成するためのいくつかのバリエーションを示す。規定の遺伝子座に対するポジティブ（１２）およびネガティブ（１６）選択マーカーの標的化によって、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，９９４，６２０号に記載されるとおり、その欠失のための選択プロセスが可能になる。標的された細胞は、電磁放射線で処理されてもよく、そして欠失は、ネガティブ選択マーカーの存在に対して薬物処理によって選択され得る（図１−Ｅ）。
【００９８】
図１−Ｆは、ポジティブ選択マーカー（１２）に対して５’側および３’側の両方の相同配列を用いる遺伝子標的化の使用のいくつかのバリエーションを示す。組み換えは、交差線によって示される、相同配列で生じる。この方式では、染色体の小さい領域が、カッコの間の領域によって図１−Ｇで示されるように欠失され得る。従来の遺伝子標的化は一般に、１遺伝子程度の大きさの欠失しか生じず、そして他の染色体は、野性型対立遺伝子を有する。より大きい欠失を作成するためには、染色体は、２つの部位特異的な組み換え部位（１０）を同じ方向で配置するように２回標的されてもよい（図１−Ｈ）。従来の遺伝子標的化を通じて、単一の染色体を、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第４，９５９，３１７号に記載されるように、予め決定された遺伝子座で２回標的してもよい。あるいは、部位特異的組み換え部位（１０）は、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，３９５，４８７号に記載のようにランダムに標的されてもよい。いずれかの方法により、これらの細胞に部位特異的なリコンビナーゼを導入して欠失を触媒することによって、図１−Ｉに示されるように、欠失を誘導する機会が得られる。
【００９９】
全てのこれらの方法に対する１つの制限は、各々が代表的には、１染色体でのみ病変（損傷）を生じるが、他の染色体は、野性型であり、かつあらゆる遺伝子座でインタクトであるということである。劣性の表現型は、ある遺伝子の両方の対立遺伝子での遺伝子座からの、遺伝子産物、またはそれらの機能の損失または減少によって生じるので、図１の方法は単独では、細胞中の劣性表現型について直接スクリーニングするためには容易に用いられ得ない。そのため、伝統的には、これらの方法の多くは、成体動物を作成するためにＥＳ細胞で用いられるか、またはそれらは動物に直接導入される。繁殖を通じて、病変（損傷）は、ホモ接合性であってもよい。染色体欠損を有する動物を、通常、他の突然変異した動物に育てて、得られた子孫の表現型変動についてスクリーニングする。このプロセスは、時間を浪費しかつ費用が嵩む。
【０１００】
染色体ＤＮＡまたは核酸配列の欠失と、例えば、さらなる欠失、化学的突然変異、挿入突然変異、ＲＮＡまたはタンパク質の量もしくは活性に影響する方法、または薬物処理とを組み合わせることによって、遺伝学的にまたは表現型的に改変体の細胞が、欠失または変異を欠く親細胞から識別され得る。いくつかのバリエーションでは、欠失生成方法を、主に１タイプの変異を生成する単一の方法を用いることと対照的に、変異を導入する種々の方法と組み合わせて、全てのタイプの変異を生成する。例えば、ポイントミューテーション（点変異）を高頻度に生じる変異誘発物質は、遺伝子トラップが誘導されない特定のタイプの変異を誘導する可能性が高く、逆もまた真である。あるバリエーションでは、細胞ライブラリーは、導入された欠失を含み、そしてさらに導入された欠失もしくは変異を含む細胞を含み、この細胞ライブラリー中の異なるクローンは、欠失または突然変異誘発方法の１つまたは両方の異なる方法を用いて生成された。
【０１０１】
本明細書に記載されるのは、当該分野で公知の広範な種々の方法のうちの１つにより、限定はしないが真核生物の生物体または細胞を含む生物体または細胞にＤＮＡを導入することによって、ゲノムの所望の領域内で欠失を作製するための方法である。細胞にＤＮＡを導入する方法としては限定はしないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃法（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ウイルスまたはレトロウイルス感染または形質導入、遺伝子転移、レトロ転移（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）およびＤＮＡ沈殿によるトランスフェクション、リポフェクチン、陽イオン性脂質複合体、裸のＤＮＡトランスフェクション、または限定はしないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むキャリア剤との投与が挙げられる。生物体または細胞へのＤＮＡの導入後、ゲノムへのＤＮＡの挿入は、標的化染色体と呼ばれる。挿入ポイントは、例えば、相同組み換えの場合は、予め決定されてもよいし、または例えば、非相同挿入の場合にはランダムであってもよい。あるバリエーションでは、相同組み換えを用いて予め決定された部位にＤＮＡを標的する。ランダムな挿入が用いられる。あるバリエーションでは、ＤＮＡ挿入の相同組み換えおよび第二のＤＮＡの非相同挿入の組み合わせが用いられる。
【０１０２】
図２は、本明細書に記載される方法のいくつかのバリエーションを図示する。図２−Ａでは、１染色体が、２つの部位特異的組み換え部位（１０）を同じ方向で挿入するように、連続して標的化される。部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入して、欠失が作成され得ることを確認する（図２−Ｂ）。この欠失は検出され得る。親の細胞クローン（図２−Ａ）は、化学的変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理されて、星印で示される変異をランダムに導入されてもよい（図２−Ｃ）。次いで、部位特異的なリコンビナーゼを細胞に導入して、欠失および変異誘発物質誘発性の変異を有する細胞クローンを作成してもよい（図２−Ｄ）。図２−Ｄにおける細胞のクローンを、表現型の変動について図２−Ｃまたは図２−Ａにおいて親の細胞クローンと比較してもよい。
【０１０３】
図２−Ｄのいくつかのバリエーションで生成される欠失した領域は、大規模であり得るので、図２−Ｄおよび図２−Ａにおけるゲノム領域の比較配列決定は費用がかさみ得る。本明細書に記載される方法を用いて、比較配列決定されるべきゲノムの領域を費用効果的である程度まで、容易にかつ急速に狭くしてもよい。
【０１０４】
別の非限定的なバリエーションは、図６に図示される。図６−Ｂでは、挿入変異誘発物質（１４）が化学的変異誘発物質のかわりに用いられる。図６−Ｃにおける相同染色体の一部の引き続く欠失によって、細胞中の劣性変異のスクリーニングが可能になる。
【０１０５】
さらなる非限定的なバリエーションを図７に図示する。２つの部位特異的な組み換え部位（１０）を正確な方向（図７−Ａ）に含む標的化染色体を有する細胞を、部位特異的リコンビナーゼで処理して、ゲノム欠失を生じてもよい（図７−Ｂ）。あるバリエーションでは、欠失含有細胞は、遺伝的に感作された基質であって、ＲＮＡまたはタンパク質の量または活性に影響するための薬物処理または方法に関与するスクリーニングのために用いられる。欠失含有細胞は、特定の遺伝子について野性型細胞に対して遺伝的相補体の半分しか含まないので、ＲＮＡまたはタンパク質の量または活性に影響する薬物処理または方法は、表現型の変動についてスクリーニングすることにおいて、より効果的であり得る。ＲＮＡまたはタンパク質の量または活性に影響する方法としては限定はしないが、ＲＮＡ干渉、アンチセンス核酸、ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）およびリボザイムが挙げられる。
【０１０６】
また、限定はしないが挿入変異誘発物質を含む変異誘発物質処理と組み合わされた電磁放射線処理により欠失を誘導して、遺伝型または表現型の変動と相関する遺伝子病変を特定する方法も本明細書において記載される。その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，９９４，６２０号に記載の方法を、変異誘発物質処理と組み合わせて、成体マウスでのスクリーニングの代わりに細胞または細胞培養物を比較スクリーニングしてもよい。あるバリエーションでは、導入された欠失は、細胞における導入された変異と組み合わされ、そして細胞は表現型の変動について直接スクリーニングされる。あるバリエーションでは、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを有する細胞（図８−Ａ）を、変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理する（図８−Ｂ）。この方法では、ネスト化した欠失を作成するので、ホモ接合性変異体である細胞（図８−Ｃ）は、表現型の変動を示し得るが、相同染色体上の変異に重複しない欠失を有する細胞（図８−Ｄ）は、野性型として出現し得る。これらの細胞での欠失の限界点をマッピングすることで、変異を含む領域を狭める。
【０１０７】
図９は、本明細書に記載される方法のいくつかのバリエーションを図示する。図９−Ａでは、ポジティブ選択マーカー（１２）、部位特異的組み換え部位（１０）およびネガティブ選択マーカー（１６）を含むＤＮＡを細胞に導入する。いくつかのバリエーションでは、ポジティブ選択マーカー（１２）、部位特異的組み換え部位（１０）および可視マーカー（１８）を含むＤＮＡをこの細胞に導入する（図９−Ａ）。あるバリエーションでは、この導入されたＤＮＡは、細胞中の配列に相同な配列によって隣接され得、そして細胞は相同組み換えのために選択され得る。このバリエーションでは、１つの利点は、導入されたＤＮＡが一体化する特定の遺伝子座を知ることにある。あるバリエーションでは、ＤＮＡはゲノムに無作為に一体化する。このバリエーションでは、１つの利点は、各々がゲノムへの独立した組み込み部位を含む複数の細胞クローンを、急速に生成する能力である。
【０１０８】
あるバリエーションでは、導入されたＤＮＡの組み込み部位は、限定はしないがスプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、または逆転写酵素ＰＣＲを含む、当業者に公知の種々の方法によって決定され得る。細胞クローンを変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理して、星印で示される変異をランダムに誘発してもよい。あるバリエーションでは、ＤＮＡ構築物を細胞クローンに最初に導入し（図９−Ａ）、次いで変異誘発物質で処理して、ランダム変異を誘導する（図９−Ｃ）。あるバリエーションでは、細胞クローンを変異誘発物質で処理して、ランダム変異を誘導し（図９−Ｂ）、その後にＤＮＡ構築物を細胞に導入する（図９−Ｃ）。変異誘発物質および導入されたＤＮＡ構築物の両方から誘導された変異を含む細胞（図９−Ｃ）を、限定はしないが、電磁放射線を含む欠失誘導処理で処理して、ゲノム欠失を誘導してもよい（図９−Ｄ、９−Ｅ）。あるバリエーションでは、組み込まれたネガティブ選択マーカー（１６）を含む細胞クローンを、組み込みの部位で欠失についてスクリーニングしてもよい。なぜなら生存している細胞クローンは、ネガティブ選択マーカーを欠失し得るからである。あるバリエーションでは、このネガティブ選択マーカーは、化合物または試薬に対する感受性を付与する。あるバリエーションでは、組み込まれた可視マーカー（１８）を含む細胞クローンを、可視マーカー（１８）の非存在についてスクリーニングすることにより組み込みの部位で欠失についてスクリーニングしてもよい。電磁放射線処理から誘導された欠失および変異誘発物質処理から誘導された変異の両方を含む細胞クローン（図９−Ｄ、９−Ｅ）を、操作なしの親の細胞クローンに対して、組み込まれたＤＮＡ構築物を有する親の細胞クローンに対して（図９−Ａ）、または誘導された変異を有する親の細胞クローンに対して、遺伝型または表現型の変動について比較してもよい。あるバリエーションでは、遺伝型または表現型の変動を示す細胞クローンは、１染色体上の欠失を有し、これによって相同染色体上の変異（＊）が明らかになる（図９−Ｄ）。あるバリエーションでは、相同染色体上の変異（＊）を明らかにしない、１染色体の一部上の欠失を有する細胞クローン（図９−Ｅ）は、遺伝型または表現型の変動を示し得ない。
【０１０９】
あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法は、２つの相同染色体のうちの各々において欠失を含む細胞で用いられ得る。あるバリエーションでは、少なくとも１つの欠失が導入される。あるバリエーションでは、２つ以上の欠失が２つ以上の相同染色体に導入される。あるバリエーションでは、第二の欠失が、欠失を含む細胞または細胞集団であって、第一の欠失が天然に存在した細胞に導入される。あるバリエーションでは、第二の欠失が、欠失を含む細胞または細胞集団であって、第一の欠失が以前に導入された細胞に導入される。
【０１１０】
図１２は、本明細書に記載される方法のいくつかのバリエーションを図示する。図１２−Ａでは、ポジティブ選択マーカー（１２）、およびネガティブ選択マーカー（１６）を含むＤＮＡを細胞に導入する。いくつかのバリエーションでは、ポジティブ選択マーカー（１２）、部位特異的組み換え部位（１０）およびネガティブ選択マーカー（１６）を含むＤＮＡをこの細胞に導入する。あるバリエーションでは、このマーカーを含む細胞を、電磁放射線で処理し、そして組み込みのポイントでの欠失を、ネガティブ選択マーカーの包含に対して薬物処理によって選択する（図１２−Ｂ）。あるバリエーションでは、欠失含有細胞（図１２−Ｂ）に、ポジティブ選択マーカー（１２）、部位特異的組み換え部位（１０）およびネガティブ選択マーカー（１６）または可視マーカー（１８）を含有するＤＮＡを導入する（図１２−Ｃ）。あるバリエーションでは、組み込みは相同組み換えによる。あるバリエーションでは、対応する相同染色体セグメントに欠失およびネガティブ選択マーカーを含む細胞（図１２−Ｃ）を、電磁放射線で処理して、組み込み部位での欠失を、ネガティブ選択マーカーに対する薬物処理によって選択する（図１２−Ｄ、１２−Ｅ）。あるバリエーションでは、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む細胞を、表現型または遺伝子型のバリエーションについてスクリーニングする。
【０１１１】
図１３は、表現型または遺伝子型の変動をもたらす遺伝子病変を位置決めさせるためのいくつかのバリエーションを図示する。あるバリエーションでは、対応する相同な染色体セグメント上で１対立遺伝子の欠失および部位特異的組み換え部位を含む細胞に（図１３Ａ）、部位特異的な組み換え部位（１０）およびポジティブ選択マーカー（１２）を含むＤＮＡを導入する。部位特異的リコンビナーゼを、２つの部位特異的な組み換え部位（１０）を含む細胞に導入して（図１３−Ｂ、１３−Ｄ）、より小さいヘテロ対立遺伝子欠失を生じる（図１３−Ｃ、１３−Ｅ）。あるバリエーションでは、染色体セグメントにヘテロ対立遺伝子欠失の組み合わせを有する細胞クローン（図１３−Ｃ）は、表現型の変動を示し得るが、隣接する染色体セグメントにおけるヘテロ対立遺伝子欠失組み合わせを有する細胞クローン（図１３−Ｅ）は、表現型の変動を示さない。図１３に図示されるプロセスを、ヘテロ対立遺伝子欠失を含有する領域を狭めるように反復して、表現型の変動に相関する遺伝子配列を決定してもよい。
【０１１２】
図１４は、本明細書に記載の方法のいくつかのバリエーションを図示する。図１４−Ａでは１染色体を、２つの部位特異的組み換え部位（１０）を同じ方向で挿入するように連続して標的する。部位特異的リコンビナーゼを、細胞に導入して、欠失を誘導する（図１４−Ｂ）。あるバリエーションでは、欠失含有細胞（図１４−Ｂ）に、ポジティブ選択マーカー（１２）、部位特異的な組み換え部位（１０）およびネガティブ選択マーカー（１６）または可視マーカー（１８）を含むＤＮＡを導入する（図１４−Ｃ）。あるバリエーションでは、その組み込みを、相同組み換えによって選択する。あるバリエーションでは、欠失およびネガティブ選択マーカーを、対応する相同な染色体セグメントにおいて含有する細胞を（図１４−Ｃ）、電磁放射線で処理して、組み込み部位の欠失を、そのネガティブ選択マーカーに対する薬物処理によって選択する（図１４−Ｄ）。あるバリエーションでは、欠失および可視マーカーを含む細胞を、電磁放射線で処理して、組み込み部位の欠失を、その可視マーカーの非存在について選択する（図１４−Ｄ）。あるバリエーションでは、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む細胞を、表現型または遺伝子型の変動についてスクリーニングする。
【０１１３】
図１５は、表現型または遺伝子型の変動をもたらす遺伝子病変を位置決めさせるためのいくつかのバリエーションを図示する。ヘテロ対立遺伝子欠失を含む表現型改変体細胞（図１４−Ｄ）は、対応する相同な染色体セグメント上で欠失および部位特異的組み換え部位を含む細胞に由来する（図１５−Ａ）。これらの細胞に、ポジティブ選択マーカー（１２）および部位特異的な組み換え部位（１０）を含むＤＮＡを導入する（図１５−Ｂ、１５−Ｄ）。あるバリエーションでは、部位特異的リコンビナーゼを、２つの部位特異的な組み換え部位（１０）を同じ方向で含む細胞に導入して（図１５−Ｂ、１５−Ｄ）、より小さいヘテロ対立遺伝子欠失を生じる（図１５−Ｃ、１５−Ｅ）。あるバリエーションでは、染色体セグメントにヘテロ対立遺伝子欠失の組み合わせを有する細胞クローン（図１５−Ｃ）は、表現型の変動を示し得るが、隣接する染色体セグメントにおけるヘテロ対立遺伝子欠失組み合わせを有する細胞クローン（図１５−Ｅ）は、表現型の変動を示さない。図１５に図示されるプロセスを、ヘテロ対立遺伝子欠失を含有する領域を狭めるように反復して、表現型の変動に相関する遺伝子配列を決定してもよい。
【０１１４】
あるバリエーションでは、限定はしないが電磁放射線を含む欠失発生性の変異誘発物質に細胞を曝すことによって第一の欠失を誘導する。あるバリエーションでは、親の細胞クローンと娘の細胞クローンとの間のゲノム比較を用いて、誘導された欠失の位置を決定する。ゲノム比較方法としては、限定はしないが、比較ゲノムハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、分光による染色体解析、ギムザ染色染色体解析、サザンブロットならびに遺伝子およびゲノムアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１１５】
あるバリエーションでは、相同染色体上の欠失に対応する領域に標的化されるか、または（ｂ）無作為に挿入される、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含むＤＮＡを導入した後に、第二の欠失を誘導する。次いで細胞を電磁放射線で処理して、欠失を誘導し、そして薬物および他の刺激物質を加えて、ネガティブ選択マーカーに対して選択する。生き残っている細胞は、ネガティブ選択マーカーの挿入部位で染色体欠失を有する可能性が高い。
【０１１６】
いくつかのバリエーションでは、相同染色体上の欠失に相当する一般的領域において同じ方向で２つの部位特異的組み込み部位を挿入するように、１染色体を連続して標的したのち、第二の欠失を誘導する。部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入して第二の欠失を誘導する。
【０１１７】
あるバリエーションでは、欠失の順序が逆転される。あるバリエーションでは、挿入されたポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含む細胞を電磁放射線を用いて処理すること、およびネガティブ選択マーカーに対する薬物で選択することによって、第一の欠失を導入する。あるバリエーションでは、１染色体上の同じ方向に２つの部位特異的な組み換え部位を含む細胞に部位特異的なリコンビナーゼを導入することによって第一の欠失を導入する。あるバリエーションでは、限定はしないが電磁放射線を含む、欠失発生変異誘発物質を用いて欠失含有細胞を処理することによって、第二の欠失を誘導する。
【０１１８】
あるバリエーションでは、ヘテロ突然変異欠失を含む細胞クローンを、遺伝子型または表現型の変動についてスクリーニングしてもよい。
【０１１９】
細胞および細胞培養ベースのスクリーニングの詳細な考察
以下は、劣性の遺伝子型または表現型のバリエーションを特定するために用いられ得るスクリーニング方法の非限定的な例である；文脈が明確に他を示すのでない限り、劣性の遺伝子型または表現型の変動に相関する遺伝子配列は、本明細書に記載される任意の方法を用いてマッピングされ得る。
【０１２０】
あるバリエーションでは、細胞を、限定はしないが、ウイルスまたは細菌の病原体を含む、限定はしないがＨＩＶ、ライノウイルス、インフルエンザまたは気道もしくは肺の上皮に感染する呼吸器合胞体ウイルス、およびＢ細胞に感染するエプスタイン・バーウイルスを含む、種々の病原体に対するその応答についてスクリーニングしてもよい。あるバリエーションでは、正確なウイルス侵入レセプターおよび共同レセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を発現する遺伝子操作されたヒトＴ細胞株を、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を用いて細胞培養物中で感染させる。さらなるバリエーションでは、このような細胞クローンを、ＨＩＶが細胞中に侵入するか、感染するか、複製するか、殺傷するか、出るかまたは抜け落ちる能力についてスクリーニングしてもよい。ＨＩＶが細胞中に侵入するか、感染するか、複製するか、殺傷するか、出るかまたは抜け落ちることができない細胞クローンは、そのウイルスのライフサイクルに必須であるヒト遺伝子に変異を含む可能性が高い。あるバリエーションでは、、これらのホスト遺伝子は、例えば、阻害のための標的である。これによって、ＨＩＶの治療が得られ得る。
【０１２１】
いくつかのヒトのガンは、際限のない増殖、他の組織への侵襲性の増殖、血管系の補充、および転移による散在性の増殖のうちの１つ以上によって特徴づけられる。あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法でガン細胞株を遺伝子操作することによって、クローンを、細胞培養物において、および動物に注入された場合の両方において、ガン細胞表現型の抑制についてスクリーニングしてもよい。あるバリエーションでは、ガン細胞を、化学療法薬物に対する感受性の増大についてスクリーニングする。感受性の細胞クローンは、低分子薬物に対して耐性を付与するヒト遺伝子における変異を含む可能性が高い（例えば、細胞毒性分子を排除するタンパク質のポンプまたはチャネル）。これらの遺伝子は阻害の標的であり、化学療法薬物の力価を増大し得、これによって次に、毒性の低下および低い用量で同等の力価がもたらされ得る。これらの遺伝子に対するインヒビターと組み合わせた場合、ヒト患者は、悪心および他の副作用を減らしながら、化学療法薬物のより有効な用量を投与され得る。あるバリエーションでは、ガン細胞を、それが軟寒天でコロニーを形成する能力についてスクリーニングする。軟寒天中で増殖する能力の低下を示すガン細胞クローンは、際限のない増殖を可能にする遺伝子に変異を含む可能性が高い。これらの遺伝子は阻害の標的であり、患者においてガン細胞が際限のない増殖をする能力を制限し得る。あるバリエーションでは、ヒトガン細胞は、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスのような実験動物に異種移植される。あるバリエーションでは、実験動物で異所性または同所性位置で異種移植されたヒトガン細胞を、増殖、他の組織への侵襲性の増殖、血管系の補充、および転移による散在性の増殖について可視化する。任意のこれらのガン表現型の抑制を示すガン細胞クローンは、ガンの進行に必須であるヒト遺伝子において変異を含む可能性が高い。これらの遺伝子およびそれらの下流エフェクター分子は、阻害または変更の標的であり、これによって、ガンの治療を得ることができる。同様に、ガン様の遺伝子型または表現型を有する細胞の、任意の他の公知の遺伝子型または表現型の変動が、本明細書に記載の方法を用いて分析され得る。
【０１２２】
アルツハイマー病は、βアミロイドと呼ばれるタンパク質のプラークに関する。特異的な神経細胞タイプによって、疾患進行に直接寄与し得ると考えられるプロセシングされたタンパク質βアミロイドが生じる。βアミロイド前駆体タンパク質を発現する（生理学的なレベル以上で、または発現構築物から上昇したレベルで）細胞クローンを、直接細胞培養物でのβアミロイド産生の抑制についてスクリーニングしてもよい。アミロイド前駆体タンパク質をもはや発現もプロセシングもせず、βアミロイドを産生も分泌もせず、βアミロイド蓄積の結果として死滅もしない細胞クローンは、βアミロイドプラークの形成について必須であるヒト遺伝子において変異を含む可能性が高い。これらの遺伝子は、アルツハイマー病の治療を得ることができる、阻害または変更のための標的である。同じストラテジーを用いて、アルツハイマー病のプラークにおけるτタンパク質の関与を検査してもよい。同様に、アルツハイマー様の遺伝子型または表現型を有する細胞の任意の他の公知の遺伝子型または表現型の変動を、本明細書に記載の方法を用いて分析してもよい。
【０１２３】
パーキンソン病は、αシヌクレイン（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）と呼ばれるタンパク質のプラークに関連する。特定の神経細胞タイプは、疾患進行に直接寄与し得ると考えられるプロセシングタンパク質αシヌクレインを生成する。αシヌクレインを発現する（生理学的なレベル以上で、または発現構築物から上昇したレベルで）細胞クローンを、直接細胞培養物でのαシヌクレイン産生の抑制についてスクリーニングしてもよい。αシヌクレインを発現もせず、分泌もせず、またはその蓄積の結果として死滅もしない細胞クローンは、αシヌクレインプラークの形成について必須であるヒト遺伝子において変異を含む可能性が高い。これらの遺伝子およびそれらの下流のエフェクター分子は、パーキンソン病の治療を得ることができる、阻害または変更のための標的である。同様に、パーキンソン病様の遺伝子型または表現型を有する細胞の任意の他の公知の遺伝子型または表現型の変動を、本明細書に記載の方法を用いて分析してもよい。
【０１２４】
骨粗鬆症は、部分的には、骨量および骨密度の漸進的な減少によって特徴付けられ、このせいで、罹患した患者は、骨折し易くなる。骨は破骨細胞と呼ばれる細胞によって異化される。骨は骨芽細胞と呼ばれる細胞によって同化される。遺伝子操作された破骨細胞および骨芽細胞のクローンは、機能の増強または抑制についてスクリーニングされ得る。破骨細胞の機能を抑制するかまたは骨芽細胞の機能を増強する細胞クローンは骨代謝におけるそれらの機能に必須であるヒト遺伝子に変異を含む可能性が高い。これらの遺伝子は、骨粗鬆症の治療を提供し得る、阻害のための標的である。同様に、骨粗鬆症様の遺伝子型または表現型を有する細胞の任意の他の公知の遺伝子型または表現型の変動は、本明細書に記載の方法を用いて分析され得る。
【０１２５】
本明細書に記載される方法は、ヒトまたは動物細胞には限定されない。本明細書に記載される方法は、半数体ゲノムよりも大きい任意の生物体のゲノムを操作し得る。染色体上へ部位特異的組み換え部位を導入する方法は、種の間で異なり得るが、変異と組み合わせてゲノム欠失を作成する方法は、限定はしないが二倍体ゲノムを含む半数体ゲノムよりも大きい任意の細胞で用いられ得る。
【０１２６】
Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属に属する原生動物を含む原生動物は、下痢性ランブル鞭毛虫症（ｄｉａｒｒｈｅａｌ  Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ）、トキソプラズマ症、シャーガス病、およびマラリアというそれぞれのヒト疾患の原因である。あるバリエーションでは、原生動物のライフサイクルの二倍体段階の間、またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉの場合には異数体の間、その原生動物は、本明細書に記載の方法によって操作される。原生動物は、減数分裂、またはそれらのライフサイクルの他の段階への移行を受けるかまたは完了することができないことについてスクリーニングされ得る。それらのライフサイクルを継続できない原生動物は、必須の細胞プロセスを破壊する変異を含む可能性が高い。これらの遺伝子およびそれらの下流のエフェクター分子は、ヒト疾患原因の原生動物の生存を妨げる治療をもたらし得る、阻害または変更の標的である。
【０１２７】
ヒト疾患は、限定はしないが、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｉｅｄｒａｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｗｎ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｚｙｇｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、ＭｕｃｏｒおよびＡｂｓｉｄｉａを含むいくつかの属由来の真菌の病原体の感染によって生じる。これらの真菌の病原体は、本明細書に記載される方法によって操作され得る、そのライフサイクルの二倍体または二核共存段階を有する。減数分裂、胞子形成、またはそれらのライフサイクルにおける他の段階を受けることも完了することもできない真菌は、必須の細胞プロセスを破壊する変異である可能性が高い。これらの遺伝子およびそれらの下流のエフェクター分子は、阻害または変更の標的であり、ヒト疾患原因真菌の生存を妨げる治療をもたらし得る。
【０１２８】
変異した真菌はまた、所望の特徴についてスクリーニングしてもよく、そしてこのような特徴についての遺伝的基礎は、他の真菌または生物体に移行され得る。
【０１２９】
いくつかのタイプの真菌は植物病原体である。これらの真菌は、作物の損失、食品安全性の脅威をもたらし、かつ真菌が感染した作物でマイコトキシンを生じる場合には、ヒトに危険なリスクをもたらし得る。真菌はまた、市販で装飾用の顕花植物、樹木および草の健康に影響し得る。これらの真菌の病原体は、本明細書に記載の方法によって操作され得る、それらのライフサイクルの二倍体または二核共存段階を有する。葉片およびインビトロのアッセイを用いて、これらの真菌病原体の増殖の抑制についてスクリーニングしてもよい。植物組織で増殖できない真菌は、必須の細胞プロセスを破壊する変異を含む可能性が高い。これらの遺伝子は、植物病の原因の真菌の生存および増殖を防止する処置をもたらし得る、阻害の標的である。
【０１３０】
植物細胞のプロトプラストは、本明細書に記載の方法によって操作され得、そして得られた植物は、任意の所望の表現型改変体についてスクリーニングされ得る。表現型としては、限定はしないが、成長速度、種々の土壌条件（例えば、高い塩または金属濃度、極端なｐＨまたは温度）での成長、水の欠乏、洪水または低温ストレス下での成長、果実の大きさまたは味の変化、栄養価の増強、花の大きさまたは色、熟成速度、繊維の強度または色が挙げられ得る。特徴は、１つの植物種からほかに移行され得る。例えば、本明細書に記載される方法で、１種の植物で色を生じるのに必要な遺伝子の特定が可能になる。次いで、その遺伝子（単数または複数）は、ワタ線維特異的なプロモーターなどによって、別の植物で遺伝子組み換え的に発現されて、有色素のワタが産生され得る。マメ科植物は、窒素固定を生じるＲｈｉｚｏｂｉａ細菌との共生関係を維持する根粒を有する。本明細書に記載される方法によって、マメ科植物を遺伝子操作して、Ｒｈｉｚｏｂｉａ細菌感染、感染糸（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｅａｄ）の形成、ヘモグロビンの産生、および根粒の形成のうちの１つ以上に必要な遺伝子を決定することが可能になる。これらの遺伝子を、他の市場作物で窒素を固定するために非マメ科植物の根で遺伝子組み換え的に発現してもよい。
【０１３１】
遺伝子型および表現型の変動は、本明細書に記載される例に限定されない。当業者は、本明細書に記載される方法を用いて、任意の細胞の遺伝型または表現型について検索する能力を有する。
【０１３２】
表現型変動を示すクローンは、欠失または変異への依存について試験され得る。あるバリエーションでは、各々の欠失含有クローンは、突然変異された、クローニング細胞由来である。このバリエーションでは、親のクローンは、全ての同じ導入された変異を含むが、導入された欠失は有さない。この親のクローンは、同じ表現型の変動について試験され得る；欠失の非存在下における表現型の非存在によって、限定はしないが、欠失の境界に結合される、劣性の変異を含む関連の変異が存在することが示される。あるバリエーションでは、全領域のＤＮＡを配列決定する。あるバリエーションでは、この領域は最初に狭められる。あるバリエーションでは、この第三の特異的な組み換え部位は、前の２つの部位に加えて、またはその間において、正確な方向で染色体に標的される。部位特異的なリコンビナーゼの引き続く導入によって、非限定的に図３−Ｃ、３−Ｄ、３−Ｅに図示されるように、少なくとも３つの異なる欠失可能性が可能になる。図３−Ｃにおける細胞は、１染色体上に変異を有するが、相同染色体上の他の対立遺伝子は、インタクトおよび野性型であり、そのためその細胞は、表現型の変動を示さないかもしれない。図３−Ｄ、３−Ｅにおける細胞は、１染色体上に変異を有し、そして相同な染色体は、その遺伝子座で欠失され、そのため、これらの細胞は表現型の相違を示す可能性がさらに高い。あるバリエーションでは、図３に図示されるプロセスは、２回以上並行して行われるか、または、染色体領域を比較して配列決定するのに費用効果的または所望されるポイントまで、変異を含む領域を狭めるように連続して反復される。
【０１３３】
生成される欠失のタイプは、例えば、薬物選択マーカーの使用によって直接選択され得る。図４−Ａに示されるあるバリエーションでは、ネガティブ選択マーカーが部位特異的な組み換え部位の間に存在する。あるバリエーションでは、介在配列を欠く細胞（図４−Ｂ）は、部位特異的なリコンビナーゼが添加される場合、この培地に添加された薬物によって影響されない。介在配列を保持する細胞は、例えば、細胞死を生じる毒性の中間体へと薬物を変換するネガティブ選択マーカーを有する。この方式では、欠失を作製する細胞のうちわずかが直接選択され得る。相同染色体上に変異をマッピングするために欠失領域を狭めるため、第三の部位特異的組み換え部位を染色体に標的化してもよい（図５−Ａ）。各々のポジティブおよびネガティブ選択マーカーは、独立して作用し得るので、薬物の異なる組み合わせは所望の欠失について選択し得る。この方式では、例えば、図５−Ｂ、５−Ｃ、５−Ｄに示される欠失を含む細胞は、部位特異的リコンビナーゼが細胞に加えられる時点について特異的に選択され得る。
【０１３４】
あるバリエーションでは、挿入突然変異を用いて変異を誘導する。あるバリエーションでは、部位特異的組み換え部位を含む細胞を、挿入変異誘発物質で処理する（図６−Ａ）。いくつかの挿入は、相同染色体上の部位に結合される染色体領域に組み込む（図６−Ｂ）。引き続く欠失によって劣性の表現型が明らかになり得る（図６−Ｃ）。
【０１３５】
あるバリエーションでは、表現型改変体についてスクリーニングするために、他の誘導された変異を有するかまたは有さない、欠失含有細胞の使用を、ＲＮＡまたはタンパク質の量または活性に影響する薬物処理または方法と組み合わせてもよい。あるバリエーションでは、薬物ライブラリーを用いて、遺伝子産物または細胞プロセスの特異的インヒビターを見出す。ＲＮＡまたはタンパク質の量または活性に影響する方法は、細胞プロセスに対する遺伝子産物の特異的な阻害を分析するために用いられ得る。野性型二倍体細胞は、２つの相同染色体上に２つの機能的な遺伝子コピーを有する。特定の染色体セグメントにおける遺伝子量の半分を欠失することによって、細胞はさらなる動揺（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）に対して遺伝的に感作される。従って、ＲＮＡまたはタンパク質の量または活性に影響する薬物のスクリーニングまたは方法は、野性型二倍体細胞よりも欠失含有細胞に効果的であり得る。
【０１３６】
あるバリエーションでは、細胞において欠失を生成するために部位特異的組み換え部位および部位特異的リコンビナーゼを用いるのではなく、例えば、電磁放射線処理を用いて、細胞欠失をランダムに行う。あるバリエーションでは、得られた細胞を、本明細書に記載される方法によって分析して、細胞をスクリーニングするのに用いる。あるバリエーションでは、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーは染色体に標的されるかまたはランダムに挿入される（図１−Ｄ）。次いで、細胞を電磁放射線で処理して、欠失を誘導し、そして薬物または他の適切な刺激を与えて、ネガティブ選択マーカーに対して選択する。生き残っている細胞は、ネガティブ選択マーカーの組み込み部位で染色体欠失を有する可能性が高い（図１−Ｅ）。あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法の、導入された欠失は、細胞における導入された変異と組み合わされて、その細胞が、表現型の変動について直接スクリーニングされる。ポジティブおよびネガティブ選択マーカーで処理した細胞（図８−Ａ）を、変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理する（図８−Ｂ）。あるバリエーションでは、この方法は、ネスト化された欠失を作成するので、ホモ接合性変異体である細胞（図８−Ｃ）は、表現型変動を示すが、相同染色体上の変異に重複しない欠失を有する細胞（図８−Ｄ）は、野性型である。これらの細胞における欠失限界点をマッピングすることで、変異を含む領域を狭める。
【０１３７】
あるバリエーションでは、細胞を、局所的な変異を誘導するようにコンピテントにする。次いで、細胞を変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理する。次いで細胞中で欠失を誘導する。次いで細胞を表現型のバリエーションについて試験する。あるバリエーションでは、細胞の欠失を、他の変異を誘導する前に生成する。これは、本明細書に記載されるマッピングストラテジーを複雑にし得るが、染色体領域の比較の配列決定は、変異を特定する。変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターでの処理の前に欠失を作成することでまた、各々の個々のクローンについて欠失を誘導する労力を省ける。
【０１３８】
あるバリエーションでは、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを染色体に標的されるかまたはランダムに挿入させる（図１−Ｄ、１２−Ａ）。次いで、細胞を電磁放射線で処理して、欠失を誘導し、そして薬物または他の適切な刺激を与えて、ネガティブ選択マーカーに対して選択する。生き残っている細胞は、ネガティブ選択マーカーの組み込み部位で染色体欠失を有する可能性が高い（図１−Ｅ、１２−Ｂ）。あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法の、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーは、染色体に標的されるかまたは導入された欠失を含む細胞にランダムに挿入される（図１２−Ｃ）。次いで、細胞を電磁放射線で処理して、欠失を誘導し、そして薬物または他の適切な刺激を与えて、ネガティブ選択マーカーに対して選択する。生き残っている細胞は、ネガティブ選択マーカーの組み込み部位で染色体欠失を有する可能性が高い（図１２−Ｄ、１２−Ｅ）。あるバリエーションでは、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む細胞（図１２−Ｄ、１２−Ｅ）を、表現型の変動についてスクリーニングする。あるバリエーションでは、欠失含有細胞（図１２−Ｂ、１３−Ａ）を、部位特異的組み換え部位（図１２−Ｃ、１３−Ａ、１３−Ｂ、１３−Ｄ）で標的化して、後に部位特異的リコンビナーゼで誘導し、相同染色体上に欠失を生じてもよい（図１３−Ｂ、１３Ｅ）。あるバリエーションでは、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む細胞（図１３−Ｂ、１３Ｅ）を表現型の変動についてスクリーニングする。
【０１３９】
あるバリエーションでは、１染色体を、２つの部位特異的な組み換え部位（１０）を同じ方向で組み込むように連続して標的する（図１４−Ａ）。部位特異的リコンビナーゼを、細胞に導入して、欠失を誘導する（図１４−Ｂ）。あるバリエーションでは、欠失含有細胞（図１４−Ｂ）に、ポジティブ選択マーカー（１２）、部位特異的な組み換え部位（１０）およびネガティブ選択マーカー（１６）または可視マーカー（１８）を含むＤＮＡを導入する（図１４−Ｃ）。あるバリエーションでは、その組み込みを、相同組み換えによって選択する。あるバリエーションでは、欠失およびネガティブ選択マーカーを、対応する相同な染色体セグメントにおいて含有する細胞を（図１４−Ｃ）、電磁放射線で処理して、組み込み部位の欠失を、そのネガティブ選択マーカーに対する薬物処理によって選択する（図１４−Ｄ）。あるバリエーションでは、欠失および可視マーカーを含む細胞を、電磁放射線で処理して、組み込み部位の欠失を、その可視マーカーの非存在について選択する（図１４−Ｄ）。あるバリエーションでは、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む細胞を、表現型または遺伝子型の変動についてスクリーニングする。あるバリエーションでは、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む表現型改変体細胞（図１４−Ｄ）は、対応する相同な染色体セグメント上で欠失および部位特異的組み換え部位を含む細胞に由来する（図１５−Ａ）。これらの細胞に、ポジティブ選択マーカー（１２）および部位特異的な組み換え部位（１０）を含むＤＮＡを導入する（図１５−Ｂ、１５−Ｄ）。あるバリエーションでは、部位特異的リコンビナーゼを、２つの部位特異的な組み換え部位（１０）を同じ方向で含む細胞に導入して（図１５−Ｂ、１５−Ｄ）、より小さいヘテロ対立遺伝子欠失を生じる（図１５−Ｃ、１５−Ｅ）。あるバリエーションでは、染色体セグメントにヘテロ対立遺伝子欠失の組み合わせを有する細胞クローン（図１５−Ｃ）は、表現型の変動を示し得るが、隣接する染色体セグメントにおけるヘテロ対立遺伝子欠失組み合わせを有する細胞クローン（図１５−Ｅ）は、表現型の変動を示さない。図１５に図示されるプロセスを、ヘテロ対立遺伝子欠失を含有する領域を狭めるように反復して、表現型の変動に相関する遺伝子配列を決定してもよい。
【０１４０】
本明細書の方法は、哺乳動物培養細胞に向かって特に重点をおいて記載されている。しかし、限定はしないが二倍体の真核生物細胞または生物体を含む、半数体の細胞または生物体よりも大きい任意のものが本明細書に記載される方法に従って操作され得る。
【０１４１】
本明細書に記載される方法で用いられ得る細胞の非限定的な例は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する細胞である：半数体含量よりも多くを有するか、ほぼ二倍体含量を含むか、半固体培地中でコロニーを増殖するか、種々のタイプの化学療法に耐性であるか、血管新生を誘導するか、実験動物で異種移植された場合増殖するか、または実験動物内で転移し得る、ガン細胞を含むがこれに限定されない細胞。
【０１４２】
本明細書に記載の方法によって操作され得る細胞としては、ヒト肺ガン細胞株が挙げられる。ガン細胞は頻繁に、染色体の一部の欠失もしくは重複、または染色体全体の欠損もしくは増加を含む。二倍体核型に最も緊密に接着するガン細胞株が理想的な基質であるが、半数体核型よりも大きい任意の細胞株が利用されてもよい。ヒト細胞では、二倍体核型は、染色体欠失または重複が最小であるかまたは有さない、全部で４６の染色体について、各々の常染色体および２つの性染色体のうちの２つのコピーに相当する。ほとんどの二倍体核型を含むヒト肺ガン細胞株としては、限定はしないが、ＤＶ９０、ＨＬＦ−ａ、Ｈ５２２、Ｈ４６０、Ｈ４６０ＳＭ、ＳＣＬＣ−Ｒ１、ＳＣＣ−３７、Ｍａ−４、Ｍａ−１０、Ｍａ−１２、Ｍａ−１５、およびＩａ１６２が挙げられる。ガン細胞または腫瘍由来の細胞株を用いる代わりは、一次細胞または細胞株を形質転換することである。細胞を形質転換するための方法の非限定的な例としては限定はしないが、連続培養、メタクリル酸グリシジルまたは他の変異誘発物質での細胞の処理、ならびにＳＶ−４０ラージＴ抗原、テロメラーゼ触媒性サブユニット、およびＨ−Ｒａｓ腫瘍性タンパク質の同時発現が挙げられる。
【０１４３】
あるバリエーションでは、肺ガン細胞株を個々にクローニングして、細胞の出発集団を同質遺伝子にさせる。細胞を個々にクローニングするための方法の非限定的な例としては、蛍光活性化細胞選別および限界希釈細胞培養が挙げられる。あるバリエーションでは、同質遺伝子になった細胞クローンのアリコートを低温で保存して、操作された娘細胞に対する遺伝子比較のために親集団を維持する。あるバリエーションでは、第一の部位特異的な組み換え部位を含むＤＮＡを、同質遺伝子の細胞クローンに導入する。部位特異的な組み換え部位としては、限定はしないが、ｌｏｘＰ部位、可変スペーサー領域を有するｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、およびａｔｔＲ部位が挙げられる。
【０１４４】
Ｃｒｅリコンビナーゼ部位の非限定的な例は、以下の考察で用いられる；しかし、任意の部位特異的な組み換え部位が、本明細書に記載の方法で用いられてもよい。
【０１４５】
細胞にＤＮＡを導入する方法の非限定的な例としては、限定はしないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃法（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ウイルスまたはレトロウイルスの感染または形質導入、遺伝子転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、レトロ転位（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、およびＤＮＡ沈殿によるトランスフェクション、リポフェクション、陽イオン性脂質複合体、裸のＤＮＡトランスフェクション、または限定はしないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むキャリア剤との投与が挙げられる。
【０１４６】
あるバリエーションでは、ＤＮＡを、同質遺伝子の細胞クローン中に、ランダムな方式での組み込み、例えば、ランダムなプラスミドまたは導入遺伝子の組み込み、プロウイルスまたはウイルス構築物、トランスポゾンまたはレトロトランスポゾン、または遺伝子トラップ構築物によよって導入する。第一のＣｒｅリコンビナーゼ部位のランダムな組み込みでのバリエーションは、固有の組み込み部位を含む多数の個々のクローンが容易に単離できるという利点を有し得る。細胞を個々にクローニングする方法としては限定はしないが、蛍光活性化細胞分取法および限外希釈細胞培養が挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ部位を含む個々の細胞クローンを、十分な量で増殖して低温保存アリコートにしてもよく、そして細胞クローンからＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出してもよい。あるバリエーションでは、宿主ゲノムへのランダム組み込み部位の位置決めは、スプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、インバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ、または逆転写酵素ＰＣＲによって特定される。あるバリエーションでは、Ｃｒｅ組み換え部位の単一の組み込み部位を含む細胞クローンをさらなる操作のために用いる。
【０１４７】
プラスミドまたは導入遺伝子のランダム組み込みの場合には、導入されたＤＮＡ構築物のいくつかのコピーを含むヘッド・ツーテール・コンカテマーが一般的である。あるバリエーションでは、コピー数は、Ｃｒｅリコンビナーゼの導入によって減少され得る。あるバリエーションでは、コピー数は１まで減らされる。Ｃｒｅリコンビナーゼを導入するための方法としては限定はしないが、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質のマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃法、ウイルスまたはレトロウイルスの感染または形質導入、およびＤＮＡ沈殿によるトランスフェクション、リポフェクション、陽イオン性脂質複合体、裸のＤＮＡトランスフェクション、またはＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現するプロモーターを含むＤＮＡ構築物の限定はしないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むキャリア剤との投与が挙げられる。
【０１４８】
あるバリエーションでは、ＤＮＡを、同質遺伝子の細胞クローン中に、導入して、そのゲノムのあらかじめ決定された部位にＣｒｅリコンビナーゼを組み込む。ゲノムへの部位特異的なリコンビナーゼ部位を標的する非限定的な例では、相同組み換えを用いてもよい。あるバリエーションでは、標的されるべきＤＮＡベクターは最小限、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、および内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列を含む。あるバリエーションでは、さらなる機能的なエレメントを含むＤＮＡベクターは、順に、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、可視マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質発現カセット、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、１つ以上の選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットまたは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列、および任意のジフテリア毒素、または他のネガティブ選択マーカー発現カセットを含む。ジフテリア毒素発現カセットまたは他のネガティブ選択マーカーは任意である、なぜなら、それは代表的には、わずか５〜１０倍までしか相同組み換え事象を富化しないからである。このバリエーションでは、ＤＮＡ構築物が導入された細胞クローンを、選択マーカーに基づいて、例えば、Ｇ４１８のようなネオマイシンアナログによって選択する。さらなるバリエーションでは、個々の細胞クローンは、蛍光活性化細胞分取法または限外希釈細胞培養によって単離される。さらなるバリエーションでは、複数の細胞クローンを単離して、アリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖させる。さらなるバリエーションでは、個々のクローンを、各々の個々のベクター内で隣接する相同配列によって決定される遺伝子座で、相同組み換えについて試験する。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては、サザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。クローンは、予め決定された遺伝子座でゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むと認定される。
【０１４９】
あるバリエーションでは、予め決定された遺伝子座でランダムな組み込みまたは相同組み換えのいずれを用いても、さらなる遺伝子操作のために、単一のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローンを利用する。あるバリエーションでは、第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むＤＮＡを、組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローン中に導入する。あるバリエーションでは、標的されるべきＤＮＡベクターは最小限、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、および内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列を含む。あるバリエーションでは、さらなる機能的なエレメントを含む核酸ベクターは、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、ネガティブ選択マーカー、例えば、シチジンデアミナーゼ、およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、ポジティブ選択マーカー、例えば、βガラクトシダーゼ発現カセット、内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列、および任意のジフテリア毒素発現カセットのうちの１つ以上を含む。ジフテリア毒素発現カセットまたは匹敵するネガティブ選択マーカーは任意である、なぜなら、それは代表的には、わずか５倍までしか相同組み換え事象を富化しないからである。このバリエーションでは、核酸構築物が導入された細胞クローンを、ハイグロマイシン含有培地のようなポジティブ選択マーカーに基づいて選択してもよい。あるバリエーションでは、個々の細胞クローンは、蛍光活性化細胞分取法または限界希釈細胞培養によって単離する。あるバリエーションでは、複数の細胞クローンを単離して、アリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖させる。あるバリエーションでは、個々のクローンを、各々の個々のベクター内で隣接する相同配列によって決定される遺伝子座で、相同組み換えについて試験する。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては、サザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。あるバリエーションでは、クローンは、公知の遺伝子座または予め決定された遺伝子座においてゲノムに組み込まれた第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むと認定される。
【０１５０】
二倍体細胞では、第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位は、第一のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む同じ染色体中に組み込まれる確率が５０％であり、そして相同な染色体に組み込まれる確率が５０％である。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の同じ方向での組み換えによって、介在配列の欠失が生じ得る。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の反対方向での組み換えは、介在配列の反転を生じ得る。相同な染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えは、相互転座を生じ得る。
【０１５１】
あるバリエーションでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含むＤＮＡを、公知の遺伝子座でゲノムに組み込まれた２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローンに導入する。欠失を含む細胞クローンを、それぞれ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットならびにシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットの包含に対して、例えば、ガンシクロビルおよび５−フルオロシトシン薬物選択によって、ネガティブ選択マーカーに対して薬物選択によって富化する。同じ染色体上で同じ方向で２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えによって、ネガティブ選択マーカー、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットならびにシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットを含む介在配列の欠失が生じ得る。薬物耐性クローンは、アリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖され得る。介在配列の欠失、および複製のような全体的な染色体の再配列の非存在は、種々の方法、例えば、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、分光による核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いて決定され得る。あるバリエーションでは、さらなる染色体再配列のない単一の欠失を含む細胞クローンを多量に増殖して、アリコートで低温保存する。
【０１５２】
あるバリエーションでは、同じ染色体上にＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローンを、変異誘発物質で処理する。変異誘発物質としては限定はしないが以下が挙げられる：限定はしないが、メタンスルホン酸エチル、エチルニトロソ尿素、ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸メチル、ブロモウラシル、アミノプリン、亜硝酸、アクリジンオレンジ、臭化エチジウムおよびプロフラビンを含む、化学的変異誘発物質；限定はしないが、Ｘ線照射、γ線照射、ＵＶ照射を含む電磁放射線；ならびに、限定はしないが５’遺伝子トラップ、３’遺伝子トラップ、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルス、プロウイルス構築物、導入遺伝子、プラスミド、および反復配列エレメントを含む挿入変異誘発物質。変異誘発物質は、種々の変異効率およびバイアスを有するので、あるバリエーションでは、いくつかの変異誘発物質を別々に、組み合わせて、または変化した用量で用いる。変異誘発物質処理から生残する個々の細胞を単離して、別々に増殖してもよい。細胞を個々にクローニングするための方法としては限定はしないが、蛍光活性化細胞分取法および限外希釈細胞培養が挙げられる。複数の細胞クローンを、十分な量で増殖してアリコートで低温保存してもよく、そしてさらなる遺伝子操作のために培養してもよい。
【０１５３】
あるバリエーションでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含むＤＮＡを、２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む各々の変異誘発された細胞クローンに導入する。欠失を含む細胞クローンを、それぞれ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、ならびにシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットの包含に対して、例えば、ガンシクロビルおよび５−フルオロシトシン薬物選択によって、ネガティブ選択マーカーに対して薬物選択によって富化する。あるバリエーションでは、薬物耐性クローンは、アリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出し、そして表現型改変体クローンを決定するのに十分な量で増殖させる。あるバリエーションでは、介在配列の欠失、および複製のような全体的な染色体の再配列の非存在は、限定はしないが、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、分光による核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションを含む方法によって決定される。さらなる染色体再配列なしの単一欠失を含む変異誘発された細胞クローンを、低温保存して、表現型変動をアッセイするために培養中で増殖する。
【０１５４】
あるバリエーションでは、本明細書に記載されるか、そうでなければ当業者に公知である任意の方法を用いて、ＤＮＡを、ランダムな組み込みのために、同質遺伝子にされた細胞クローンに導入する。あるバリエーションでは、ＤＮＡは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットを含む。あるバリエーションでは、このＤＮＡは、部位特異的な組み込み部位を含む。ＤＮＡのランダムな組み込みを有での変動は、固有の組み込み部位を含む多数の個々のクローンが容易に単離され得るという利点を有し得る。細胞を個々にクローニングするための方法としては限定はしないが、蛍光活性化細胞分取法および限外希釈細胞培養が挙げられる。選択マーカーを含む個々の細胞クローンを、十分な量で増殖して、低温保存アリコートにしてもよく、そして細胞クローンからＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出してもよい。あるバリエーションでは、宿主細胞へのランダムな組み込み部位の位置は、スプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、インバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ、または逆転写酵素ＰＣＲによって特定される。あるバリエーションでは、選択マーカーの単一の組み込み部位を含む細胞クローンを、さらなる操作のために用いる。
【０１５５】
あるバリエーションでは、ＤＮＡを、同質遺伝子にされた細胞クローンに導入して、そのゲノムにおける予め決定された部位に組み込む。ゲノムへの選択マーカーまたは部位特異的なリコンビナーゼ部位を標的する非限定的な例では、相同組み換えを用いてもよい。あるバリエーションでは、標的されるべきＤＮＡベクターは最小限、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、ネイマイシン耐性遺伝子発現カセット、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、および内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列を含む。あるバリエーションでは、さらなる機能的なエレメントを有するＤＮＡベクターは、順に、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅ組み換え部位、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列、および任意のジフテリア毒素、または他のネガティブ選択マーカー発現カセットを含む。ジフテリア毒素発現カセットまたは他のネガティブ選択マーカーは任意である、なぜなら、それは代表的には、わずか５〜１０倍までしか相同組み換え事象を富化しないからである。このバリエーションでは、ＤＮＡ構築物が導入された細胞クローンを、選択マーカーに基づいて、例えば、Ｇ４１８のようなネオマイシンアナログによって選択する。さらなるバリエーションでは、個々の細胞クローンは、蛍光活性化細胞分取法または限外希釈細胞培養によって単離される。さらなるバリエーションでは、複数の細胞クローンを単離し、そして、アリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖させる。さらなるバリエーションでは、個々のクローンを、各々の個々のベクター内で隣接する相同配列によって決定される遺伝子座で、相同組み換えについて試験する。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては、限定はしないがサザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。クローンは、予め決定された遺伝子座でゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むと認定される。
【０１５６】
あるバリエーションでは、予め決定された遺伝子座でランダムな組み込みまたは相同組み換えのいずれを用いても、さらなる遺伝子操作のために、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットを含む細胞クローンを利用する。あるバリエーションでは、組み込まれたＤＮＡ構築物を含む個々の細胞クローンを、欠失発生変異誘発物質で処理する。欠失発生の変異誘発物質としては限定はしないが、以下が挙げられる：限定はしないが、Ｘ線照射、ＵＶ照射、γ線照射を含む電磁放射線；限定はしないがホルムアルデヒド、ジエポキシオクタン、エチルニトロソ尿素、メタンスルホン酸エチル、およびＵＶ活性化トリメチルソラレンを含む、化学的変異誘発物質。個々の細胞クローンを、ＤＮＡ構築物の組み込みのポイントで欠失について選択してもよい。この非限定的な例では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットの包含に対するガンシクロビル薬物選択は、組み込みのポイントで欠失を含む細胞クローンについて選択する。あるバリエーションでは、薬物耐性クローンを、十分な量で増殖して、低温保存アリコートにし、細胞クローンからＤＮＡを抽出し、そして表現型改変体クローンを決定する。
【０１５７】
あるバリエーションでは、親細胞クローンと娘の表現型の改変細胞クローンとの間のゲノム比較を用いて、誘導された欠失の位置を決定してもよい。ゲノム比較手段としては、限定はしないが、比較ゲノムハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、分光核型分析、ギムザ染色核型分析、サザンブロット、ならびに遺伝子およびゲノムのアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１５８】
あるバリエーションでは、予め決定された遺伝子座でランダムな組み込みまたは相同組み換えのいずれを用いても、さらなる遺伝子操作のために、単一のＣｒｅ組み換え部位を含む細胞クローンを利用する。あるバリエーションでは、第二のＣｒｅ組み換え部位を含むＤＮＡを、組み込まれたＣｒｅ組み換え部位を含む細胞クローンに導入する。あるバリエーションでは標的されるべきＤＮＡベクターは最小限、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、Ｃｒｅ組み換え部位、および内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列を含む。あるバリエーションでは、さらなる機能的なエレメントを有する核酸ベクターは、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、ネガティブ選択マーカー、例えばシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅ組み換え部位、可視マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質発現カセット、内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列、および任意のジフテリア毒素発現カセットのうちの１つ以上を含む。このジフテリア毒素発現カセットまたは匹敵するネガティブ選択マーカーは任意である、なぜなら、それは代表的には、わずか５倍までしか相同組み換え事象を富化しないからである。このバリエーションでは、核酸構築物が導入された細胞クローンを、ポジティブ選択マーカーに基づいて、例えば、ハイグロマイシン含有培地について選択し得る。あるバリエーションでは、個々の細胞クローンは、蛍光活性化細胞分取法または限外希釈細胞培養によって単離される。さらなるバリエーションでは、複数の細胞クローンを単離し、そしてアリコートを低温で保存し、そして細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖させる。あるバリエーションでは、個々のクローンを、各々の個々のベクター内で隣接する相同配列によって決定される遺伝子座で、相同組み換えについて試験する。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては、限定はしないがサザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。あるバリエーションでは、クローンは、公知の遺伝子座または予め決定された遺伝子座においてゲノムに組み込まれた第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むと認定される。
【０１５９】
二倍体細胞については、第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位は、第一のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む同じ染色体中に組み込まれる確率が５０％であり、そして相同な染色体に組み込まれる確率が５０％である。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の同じ方向での組み換えによって、介在配列の欠失が生じ得る。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の反対方向での組み換えは、介在配列の反転を生じ得る。相同な染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えは、相互転座を生じ得る。
【０１６０】
あるバリエーションでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含むＤＮＡを、公知の遺伝子座でゲノムに組み込まれた２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローンに導入する。欠失を含む細胞クローンを、それぞれ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットならびにシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットの包含に対して、例えば、ガンシクロビルおよび５−フルオロシトシン薬物選択によって、ネガティブ選択マーカーに対して薬物選択によって富化する。同じ染色体上で同じ方向で２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えによって、ネガティブ選択マーカー、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットならびにシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットを含む介在配列の欠失が生じ得る。薬物耐性クローンは、アリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖され得る。介在配列の欠失、および複製のような全体的な染色体の再配列の非存在は、種々の方法、例えば、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、分光による核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いて決定され得る。あるバリエーションでは、さらなる染色体再配列のない単一の欠失を含む細胞クローンを多量に増殖して、アリコートで低温保存する。
【０１６１】
あるバリエーションでは、細胞は、限定はしないが電磁放射線による欠失を含む欠失変異誘発物質によって誘導される欠失を含む。あるバリエーションでは、細胞は、部位特異的リコンビナーゼによって誘導される欠失を含む。あるバリエーションでは、欠失を含む細胞は、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅ組み換え部位、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットを含むＤＮＡを導入される。あるバリエーションでは、このＤＮＡの組み込みはランダムである。あるバリエーションでは、このＤＮＡの組み込みは、欠失境界内の予め決定された部位にある。選択マーカーをゲノムの標的する非限定的な例では、相同組み換えが用いられ得、そして本明細書に記載されるような、ＤＮＡ中の機能的なエレメントを含む。各々の遺伝子座での相同組み換えを決定する方法としては限定はしないが、サザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。クローンは、予め決定された遺伝子座においてゲノムに組み込まれたＤＮＡカセットを含むと認定される。
【０１６２】
あるバリエーションでは、組み込まれたＤＮＡ構築物を含む個体細胞クローンを、限定はしないが、Ｘ線照射、ＵＶ照射、およびγ線照射のような電磁放射線を含む、本明細書に記載される欠失発生変異誘発物質で処理する。個々の細胞クローンは、ＤＮＡ構築物の組み込みのポイントで欠失について選択してもよい。この非限定的な例では、それぞれ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、ならびにシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットの包含に対するガンシクロビルおよび５−フルオロシトシン薬物選択は、組み込みのポイントで欠失を含む細胞クローンについて選択する。あるバリエーションでは、薬物耐性クローンを、十分な量で増殖して、低温保存アリコートにし、細胞からＤＮＡを抽出し、そして表現型改変体クローンを決定する。
【０１６３】
あるバリエーションでは、欠失を含む、ガン細胞クローンまたは肺細胞クローンを含むがこれに限定されない突然変異細胞クローンを、限定はしないが、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、トポテカン、イリノテカン、ビノレルビン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、エトポシド、シクロホスファミド、マスタージェン・ナイトロジェン・マスタード（ｍｕｓｔａｒｇｅｎ−ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ）、メルファラン、クロラムブシル、カルムスチン、チオテパ、ブスルファン、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ブレオマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、メトトレキセート、６−チオグアニン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、シトシンアラビノシド、Ｌ−アスパラキナーゼ、ヒドロキシウレア、プロカルバジンを含む１つ以上の化学療法剤に対する細胞毒性感受性について試験する。あるバリエーションでは、単一の化学療法剤または処置の組み合わせにさらに感受性である細胞クローンは、標準的な化学療法剤と組み合わせて潜在的な薬物標的に相当する遺伝子において変異を含む。あるバリエーションでは、単一の化学療法剤または処置の組み合わせに対して感受性の低い細胞クローンは、疾患の処置または進行についての潜在的な診断マーカーに相当する遺伝子に変異を含む。
【０１６４】
軟寒天中でのヒト肺細胞のインビトロでのコロニーの増殖は、インビボにおけるヒト腫瘍の固定独立増殖をモデリングするアッセイである。あるバリエーションでは、欠失を含む突然変異された肺癌細胞を、それらが軟寒天中でコロニーを増殖する能力について試験する。あるバリエーションでは、軟寒天中で形成できるコロニーが少ない細胞クローンは、ヒト腫瘍の増殖についての潜在的な薬物標的に相当する遺伝子に変異を含み得る。あるバリエーションでは、軟寒天中で可能なコロニー形成の多い細胞クローンは、疾患の処置または進行についての潜在的な診断マーカーに相当する遺伝子に変異を含み得る。
【０１６５】
腫瘍は、増殖を維持するために血管新生を補充する必要があると仮説されている。あるバリエーションでは、欠失を含む変異誘発された肺癌細胞を、発育中のニワトリの絨毛尿膜上に置く。このようなバリエーションの１つでは、血管を細胞移植片のまわりで可視化して、定量する。あるバリエーションでは、欠失を含む変異誘発された肺癌細胞クローンを、実験動物の側頭角膜輪部（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｉｍｂｕｓ）に隣接する角膜間質に移植した場合、新血管形成を補充する能力について試験する。実験動物としては、限定はしないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタが挙げられる。あるバリエーションでは、眼の移植された領域における血管の増殖を直接可視化する。あるバリエーションでは、補充できる新血管形成が少ない細胞クローンは、腫瘍の新血管新生の阻害のための潜在的な薬物標的に相当する遺伝子に変異を含み得る。あるバリエーションでは、補充できる新血管新生が多い細胞クローンは、疾患の処置または進行についての潜在的な診断マーカーに相当する遺伝子に変異を含み得る。
【０１６６】
あるバリエーションでは、欠失を含有する変異誘発された肺癌細胞クローンを、実験動物中に異種移植する。実験動物としては限定はしないが、免疫のコンピテントな（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）、または免疫力の低下した（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌまたはブタが挙げられる。あるバリエーションでは、免疫力の低下した実験動物とは、宿主の免疫監視機構が腫瘍拒絶を、そして移植された細胞が宿主と同系でない場合は、異質性をもたらす、参考となる実験宿主である。免疫力の低下した動物としては、限定はしないが、重篤な複合免疫不全を有する動物、外科的にまたは遺伝子的に無胸腺の動物、胸腺痕跡を有する動物、一時的免疫欠損を生じる致死量未満の電磁放射線で処理された動物、および適応性の免疫細胞または応答を欠く動物が挙げられる。あるバリエーションでは、異種移植片を、１つ以上の異所性の位置または同所性の位置におく。他のバリエーションでは、肺細胞の皮内注射または皮下注射によって、腫瘍サイズおよび自然な転移の測定が可能になり得る。あるバリエーションでは、静脈内注射によって、転移の観察が可能になり得る。
【０１６７】
同所性異種移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）の方法としては、限定はしないが、エラスターゼまたはエチレンジアミン四酢酸での肺癌細胞の経口気管内挿管同時投与、肺癌細胞を気管内に滴下注入するための経口気管内カニューレの使用、肺癌の細胞または組織の気管支内移植が挙げられる。あるバリエーションでは、同所性異種移植片によって、腫瘍増殖、新血管形成の補充、および転移の観察を可能にし得る。
【０１６８】
あるバリエーションでは、可視マーカーを発現する肺癌細胞を、観察して、腫瘍の増殖、密度および転移を検出する。観察の方法としては限定はしないが、ポジトロン放出断層撮影および蛍光顕微鏡が挙げられる。あるバリエーションでは、腫瘍異種移植片は、腫瘍細胞増殖速度に依存して所定の期間にわたって実験動物中で増殖させられる。あるバリエーションでは、腫瘍増殖は、実験動物が生きているままでモニターされる。あるバリエーションでは、動物を屠殺して、もとの腫瘍および器官への転移を外科的に取り出して、測定し、そして病理学的に検査する。あるバリエーションでは、腫瘍部位を観察し、測定し、定量し、そして新血管形成の補充および基底膜の浸潤についてスコア付けする。
【０１６９】
あるバリエーションでは、腫瘍増殖、新血管形成の補充、基底膜侵入、および異所性部位への転移が少ないといううちの１つ以上を示す細胞クローンは、腫瘍の増殖および挙動の阻害のための潜在的な薬物標的に相当する遺伝子において変異を含む。あるバリエーションでは、腫瘍増殖、新血管形成の補充、基底膜侵入、および異所性部位への転移が多いといううちの１つ以上を示す細胞クローンは、疾患の処置または進行のための潜在的な診断マーカーに相当する遺伝子において変異を含み得る。
【０１７０】
あるバリエーションでは、欠失を含む突然変異した肺癌細胞クローンを、親の同質の肺癌細胞株と比較する。この方法では、遺伝子操作した細胞クローンを表現型変動について、腫瘍増殖または他の挙動の増強または抑制としてアッセイしてもよい。
【０１７１】
あるバリエーションでは、欠失を含む突然変異した肺癌株における遺伝子の変異の特定を、親の同質遺伝子にされた肺癌細胞株における遺伝子配列に比較する。遺伝子配列比較の方法としては、限定はしないが、突然変異された表現型改変の肺癌細胞株と、親の同質遺伝子の肺癌細胞株との間の核酸配列のハイブリダイゼーション、ならびに、突然変異された表現型改変の肺癌株および親の同質遺伝子の肺癌細胞株のＤＮＡを、部位特異的組み換え部位に結合される領域で配列決定する工程が挙げられる。
【０１７２】
治療剤についてのスクリーニング
あるバリエーションでは、１つ以上の潜在的な治療剤を、本明細書に記載の培養細胞に対する１つ以上の影響についてスクリーニングする。あるバリエーションでは、１つ以上の潜在的な治療剤を、限定はしないが導入された部位特異的組み換え部位および必要に応じて１つ以上の選択マーカーまたはレポーターマーカーを含む、本明細書に記載の導入された核酸を含む培養細胞に対する１つ以上の効果についてスクリーニングする。あるバリエーションでは、１つ以上の潜在的な治療剤を、遺伝子産物の量、遺伝子産物の機能、または細胞挙動に対する１つ以上の効果についてスクリーニングする。
【０１７３】
あるバリエーションでは、１つ以上の潜在的な治療剤を、本明細書に記載の１つ以上の方法を用いて生成された遺伝子型または表現型のバリエーションを有する培養細胞に対する１つ以上の効果についてスクリーニングする。あるバリエーションでは、１つ以上の潜在的な治療剤を、本明細書に記載の１つ以上の方法を用いてマッピングされた遺伝子型または表現型のバリエーションを有する培養細胞に対する１つ以上の効果についてスクリーニングする。
【０１７４】
あるバリエーションでは、限定はしないが、核酸または化合物因子を含む１つ以上の治療剤を、本明細書に記載の１つ以上の方法を用いてマッピングされた遺伝子型または表現型のバリエーションを有する培養細胞に対する有益な効果についてスクリーニングする。有益な効果としては限定はしないが、（１）ＲＮＡ転写物レベル、安定性、転写または翻訳速度における変化；（２）ペプチドまたはタンパク質のレベル、安定性、または活性のうちの１つ以上における変化；あるいは、ある疾患または状態に関連する表現型の変化のうちの１つ以上における変化、が挙げられる。
【０１７５】
あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法を用いることによって、ある疾患または状態に相関していると特定された遺伝子配列を、遺伝型または表現型のバリエーションに関連する遺伝子配列の２次元または３次元の構造のうちの１つ以上を予測し、そして遺伝子配列の活性に影響する可能性が高いかまたは可能性のある治療剤を予測する、ソフトウェアプログラムを用いてスクリーニングする。あるバリエーションでは、本明細書に記載の方法を用いることによって、ある疾患または状態に相関すると特定される遺伝子配列を、本明細書に記載される方法を用いて遺伝型または表現型のバリエーションに基づいて特定された配列の野性型配列と相関する遺伝子配列の２次元または３次元の構造のうちの１つ以上を予測し、そして遺伝子配列の活性に影響する可能性が高いかまたは可能性のある治療剤を予測する、ソフトウェアプログラムを用いてスクリーニングする。
【０１７６】
本明細書に記載される方法によって得られる情報の使用
あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法を用いて、ある疾患または状態と相関すると特定された遺伝子配列を、デジタル方式で記憶する。あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法を用いて、ある疾患または状態と相関すると特定された遺伝子配列を、コンピューター読み取り可能な媒体に記憶する。あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法を用いて、ある疾患または状態と相関すると特定された遺伝子配列を、機械読み取り可能な媒体に記憶する。あるバリエーションでは、本明細書に記載される方法を用いて、ある疾患または状態と相関すると特定された遺伝子配列を、データベースに記憶する。
【０１７７】
培養された細胞のライブラリー
文脈が明確に他を示すのでない限り、本明細書に記載の方法によって調製または特定される任意の細胞は、１つ以上の細胞ライブラリーに集積され得るもととする。
【０１７８】
本明細書に記載されるのは、１つ以上の部位特異的リコンビナーゼ部位を含む核酸配列を含む、本明細書に記載されるような細胞のライブラリーである。本発明に記載されるのは、部位特異的組み換えによって、または限定はしないが電磁放射線を含む変異誘発物質によって生成される１つ以上の欠失を有する細胞のライブラリーである。本発明に記載されるのは、部位特異的組み換えによって、または限定はしないが電磁放射線を含む変異誘発物質によって生成される欠失、ならびに本明細書に記載の別の変異方法によって生じる１つ以上のさらなる変異を含む細胞のライブラリーである。
【０１７９】
あるバリエーションでは、細胞のライブラリーを、インビボまたはインビトロで、表現型および遺伝子マッピングのために用いる。あるバリエーションでは、遺伝的に関連するクローンを有するインデックス付き細胞クローン（限定はしないが、遺伝子変化なしのクローン、標的された染色体を有するが、欠失なしのクローン、１欠失のみを有するクローン、変異を有するが欠失を有さないクローン、変異および１欠失を有するクローンが挙げられる）を、表現型パターン確認および遺伝子マッピングに用いる。個々の細胞クローンは、別々にそしてクローンとして増殖され得る。
【０１８０】
あるバリエーションでは、変異誘発の程度は、細胞ライブラリー内の特定の細胞または生物体における遺伝子のセット全体をカバーする。あるバリエーションでは、個々のクローンにおける欠失ポイントの重複するセットを用いることによって、集団的な細胞ライブラリーは、ゲノムの約５〜１０％、約１０〜２０％、約２０〜３０％、約３０〜４０％、約４０〜５０％、約５０〜６０％、約６０〜７０％、約７０〜８０％、約８０〜９０％、約９０〜１００％において欠失を含み得る。
【０１８１】
あるバリエーションでは、細胞の無作為に変異誘発された集団からの各々の細胞は、１つ以上の別個のヘテロ接合性の変異を有する。細胞ライブラリー内で無作為に変異誘発されている細胞クローンを組み合わせることによって、遺伝子の全体のセットのすべての対立遺伝子上の変異は、細胞ライブラリー内で集団として提示され得る。あるいは、細胞の集団を含むライブラリーを無作為に変異誘発することによって、遺伝子の全体のセットの全対立遺伝子上の変異は、細胞ライブラリー内で集団として変異されてもよい。細胞ライブラリーは、遺伝的に関連するクローンを含むようにインデックス付されてもよい。例えば、クローンとして同質遺伝子にされた細胞クローンは、適宜選択された参照状態（例えば、ガン細胞、類似の細胞と比較して表現型的に変異体とみなされる細胞、１つ以上の変異を含む細胞、１つ以上の導入遺伝子を発現する細胞、レポーター構築物を含む細胞、野性型細胞など）に相当し得る。当業者は参照クローンを遺伝的に改変して、染色体を標的し得（例えば、部位特異的組み換え部位、またはポジティブおよびネガティブ選択マーカーで）、そして標的化が遺伝子を破壊しないか、または表現型的に改変体である限り、得られたクローンは、「標的化参照（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」とみなされ得る。この「標的化参照」クローンは、例えば、部位特異的リコンビナーゼを導入すること、または電磁放射線で処理することによって、染色体の一部を欠失するように誘導され得、そして得られたクローンは、「欠失によるヘテロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｂｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」とみなされ得る。あるバリエーションでは、「欠失によるヘテロ接合性」クローンは、部位特異的組み換え部位および／またはポジティブおよびネガティブ選択マーカーで標的化され、そして「標的された欠失によるヘテロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｂｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ）」クローンとみなされ得る。「標的された欠失によるヘテロ接合性」クローンは、例えば、部位特異的リコンビナーゼを誘導すること、または電磁放射線での処理によって染色体の一部を欠くように誘導されてもよく、そして得られたクローンは、「欠失によるヘテロ接合性」とみなされ得る。あるバリエーションでは、「標的された参照（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」クローンは、１つ以上の変異を生じる、変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理され、その得られたクローンは、「変異誘発物質によるヘテロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｂｙ  ｍｕｔａｇｅｎ）」とみなされ得る。「変異誘発物質によるヘテロ接合性」クローンは、染色体の一部を欠失するように誘導されてもよい（部位特異的リコンビナーゼを導入すること、または電磁放射線で処理することによる）、そして得られたクローンは「ホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）」とみなされ得る。あるいは、「欠失によるヘテロ接合性」クローンは、１つ以上の変異を生じる、変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理され得、そしてその得られたクローンはまた、「ホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）」とみなされ得る。「野性型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」、「標的化参照���ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」、「欠失によるヘテロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｂｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」、「変異誘発物質によるヘテロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｂｙ  ｍｕｔａｇｅｎ）」、「欠失によるホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｂｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」、および「ホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）」細胞クローンは、別のライブラリーでインデックス付され得る。
【０１８２】
インデックス付された細胞ライブラリーにおける個々のクローンの数は変化し得る。他のクローンとの表現型または遺伝子型比較のためには１クローン程度の少なさで十分である。細胞ライブラリーにおける「野性型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」クローンのいくつかの同一のコピーを維持することで、重複する供給源が得られ得る。あるバリエーションでは、細胞ライブラリーにおける、「標的化参照」、「欠失によるヘテロ接合性」、「変異誘発物質によるヘテロ接合性」、「欠失によるホモ接合性」、および「ホモ接合性」細胞クローンの数は、各々の標的細胞におけるゲノムのサイズおよび遺伝子の数に依存して変化する。あるバリエーションでは、細胞ライブラリーにおける個々の細胞クローンの数は、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１，０００個、少なくとも約５，０００個、少なくとも約１０，０００個、少なくとも約２０，０００個、少なくとも約５０，０００個、少なくとも約１００，０００個、少なくとも約２００，０００個、または少なくとも約２，０００，０００個を含む。
【０１８３】
あるバリエーションでは、ライブラリー中の個々の細胞クローンの数は、約１〜１０、約１０〜２０、約２０〜３０、約３０〜４０、約４０〜５０、約５０〜１００、約１００〜２００、約２００〜３００、約３００〜４００、約４００〜５００、約５００〜１，０００、約１，０００〜５，０００、約５，０００〜１０，０００、約１０，０００〜２０，０００、約２０，０００〜５０，０００、約５０，０００〜１００，０００、約１００，０００〜２００，０００、約２００，０００〜２，０００，０００の間である。
【０１８４】
あるバリエーションでは、細胞ライブラリーは、集団として、標的細胞内に遺伝子の全体のセット中にホモ接合性の変異を含む。これによって、あらゆる遺伝子が変異することを確実にするように配列遺伝子についてスクリーニングすることが可能になる。あるバリエーションでは、各々の標的細胞の飽和突然変異誘発がある。飽和突然変異誘発とは、集団的にゲノム中の各々の遺伝子が標準的なポアソン分布で測定した場合変異される確率が高い（７０〜９９％）統計学的状態を指す遺伝的な用語である。本発明に記載されるのは、細胞ライブラリー中の細胞および細胞クローンであって、この細胞ライブラリーにはゲノムの１０〜９０％、２０〜５０％、５０〜７０％、７０〜９０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９０〜１００％を含む。
【０１８５】
あるバリエーションでは、種々の種について別の細胞ライブラリーを維持する。あるバリエーションでは、別の細胞ライブラリーを異なる組織または細胞タイプについて維持する（例えば、肺細胞対乳房細胞）。あるバリエーションでは、同じ細胞タイプについて別の細胞ライブラリー（例えば、目的の遺伝子を発現するか、または目的の遺伝子の発現を欠くレポーター遺伝子の有無）を維持する。
【０１８６】
あるバリエーションでは、細胞ライブラリー中の細胞は、遺伝子型または表現型の変動を有すると特定され、そして遺伝子病変は、本明細書に記載の方法を用いてマッピングされる。
【０１８７】
細胞培養ベースのマッピングの方法
誘導された欠失を含む個々の細胞クローンは、過度のゲノム欠失を含み得る。欠失の境界がマッピングされ得、そしてゲノム間隔が、遺伝子型または表現型の改変体クローンおよび親のクローンから配列決定され得る。しかし、ゲノムの大きい部分の比較配列決定は費用がかさみ得る。あるバリエーションでは、比較して配列決定されるべき遺伝子配列の領域を、本明細書に記載の１つ以上の方法を用いて狭くする。あるバリエーションでは、比較して配列決定されるべき遺伝子医配列の領域を、その比較して配列決定されるべき領域が配列決定の費用効果を得るのに十分小さくなるまで、本明細書に記載の１つ以上の方法を用いて狭くする。
【０１８８】
あるバリエーションでは、表現型変動を示す細胞クローンは、１染色体上にリコンビナーゼ誘導性の欠失、および相同染色体上に変異（＊）を有する（図２−Ｄ）。欠失に対する表現型変動の依存性は、１染色体上の変異（＊）を有するが相同染色体上に欠失を有さない細胞を試験することによって実証され得る（図２−Ｃ）。
【０１８９】
あるバリエーションでは、細胞は、２つの部位特異的組み換え部位を染色体上に含む細胞を、部位特異的リコンビナーゼに対して暴露することによって生じる欠損を有する。このバリエーションでは、欠失保有細胞はまた、限定はしないが化学的変異誘発物質に対する暴露を含む、別の突然変異誘発工程によって生じる１つ以上のさらなる遺伝子病変を含む。欠失に依存する表現型変動を示している細胞（図３−Ａ）は、２つの以前の部位の間で正確な方向で別の部位特異的組み換え部位（１０）で標的され得る（図３−Ｂ）。部位特異的リコンビナーゼの誘導によって、図３−Ｃ、３−Ｄ、３−Ｅに図示されるように３つの異なる欠失が生じ得る。図３−Ｃの細胞は、１染色体上に変異（＊）を有するが、相同染色体上の他の対立遺伝子はインタクトかつ野性型であり、そのため細胞は、表現型の変動を示さない。図３−Ｄ、３−Ｅにおける細胞は、１染色体上に変異（＊）を有し、そして相同染色体はその遺伝子座で欠失され、そのためこれらの細胞は、表現型の相違を示す。図３に図示されるプロセスは、ゲノム領域を比較して配列決定するために費用効果的であるポイントまで、変異を含む領域を狭くするように反復されてもよい。
【０１９０】
欠失の作成を容易にするために、１つ以上のさらなる特徴を染色体中で標的してもよい。図４は、本明細書に記載の方法を用いる詳細な例示的バリエーション方式を示す。
【０１９１】
１例として、１つ以上のポジティブ選択マーカー（１２）を用いて、ゲノムへの標的構築物の組み込みについて選択してもよい。ポジティブ選択マーカーとしては限定はしないが、ネオマイシン耐性遺伝子、βガラクトシダーゼおよびネオマイシン耐性遺伝子の融合、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシチジン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、または外部因子での処理に依拠することなく代謝性または競合的な利点を付与する遺伝子が挙げられる。
【０１９２】
部位特異的組み換え部位（１０）を用いて、ゲノムにおいて大きい欠失を生じてもよい；部位特異的な組み換え部位としては限定はしないが、ｌｏｘＰ部位、可変スペーサー領域を伴うｌｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、またはａｔｔＲ部位が挙げられる。
【０１９３】
１つ以上のネガティブ選択マーカー（１６）は、以下に対して選択され得る；これによって、当業者は、部位特異的なリコンビナーゼで細胞を処理した後、マーカーを含む染色体部分の欠失について選択することが可能になる（図４−Ｂ）。ネガティブ選択マーカーとしては、限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、シチジンデアミナーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０１９４】
別の特徴は、可視マーカー（１８）のような１つ以上のレポーター遺伝子の使用である；このクラスとしては限定はしないが、蛍光タンパク質、発蛍光団（フルオロフォア）に結合し得るペプチド、発色基質または蛍光基質を変換し得る酵素、基質を発色生成物または蛍光生成物に変換し得る酵素、および抗体のペプチドまたはタンパク質標的が挙げられる。
【０１９５】
標的化染色体上でのマーカーおよび部位の順序の１つの非限定的な例を図４−Ａに示すが、いくつかの特徴の追加または差し引き、ならびにこれらの特徴の順序付における多くの順序によって同様の結果が得られ得る。可視マーカーのようなレポーター遺伝子（１８）は、部位特異的組み換え部位（１０）の領域より外部に存在する。これらの可視マーカーによって、当業者は生きた培養細胞を特定し、個々の細胞クローンを分離または分別し、変異誘発物質処理から突然変異誘発の率を見積もり、インビトロまたはインビボのモデルで任意の実験においた場合、細胞の存在および数を特定することが可能になり得る。部位特異的組み換え部位（１０）に対して内部は、各々の標的化ベクターの組み込みの際の薬物または代謝性の選択を可能にするポジティブ選択マーカー（１２）である。さらに内側は、ネガティブ選択マーカー（１６）および／または別の可視マーカー（１８）である。部位特異的リコンビナーゼを導入した後、欠失含有細胞を、薬物処理で選択してもよい。なぜなら、生きている細胞クローンのみが、ネガティブ選択マーカーを含む介在染色体部分を欠失するからである（図４−Ｂ）。あるいは、可視マーカー（１８）を用いて、染色体部分を欠く少数の細胞についてスクリーニングしてもよく、そして細胞クローンを、可視マーカーの非存在に基づいて分離してもよい。図４は、染色体欠失を作成する１方法を示す。
【０１９６】
図５は、第三の適合する部位特異的組み換え部位（１０）で正確な方向で標的された染色体のさらなるバリエーションを示す。この第三の標的された部分は、同様の特徴を有する。ポジティブ選択マーカー（１２）によって、各々の標的ベクターの組み込みの際、薬物または代謝性の選択が可能になる。隣接するネガティブ選択マーカー（１６）または可視マーカー（１８）によって、部位特異的なリコンビナーゼでの処理後、薬物処理による欠失の選択、または薬物処理の非存在による欠失の特定が可能になる。第三の内部の部位特異的な組み換え部位（１０）の染色体に対する追加によって、部位特異的リコンビナーゼが導入された場合、３つの可能性のある欠失事象が可能になる。図５−Ｂでは、左側の側面は欠けているが、右側の側面はインタクトである。図５−Ｃでは、右側の側面は欠失されるが、左側の側面はインタクトである。図５−Ｄでは、最も極端に配置された部位特異的組み換え部位（１０）の間の全体領域が、欠失によって除去される。欠失は小さいほど好ましい。なぜなら、部位特異的リコンビナーゼは、部位特異的組み換え部位（１０）が一緒に近接しているほど、さらに効率的であるからである。より小さい欠失の両方のセットを用いて、表現型変動を生じる病変（損傷）を含む相同染色体の領域を狭くしてもよい。ポジティブ選択マーカー（１２）の包含について、そしてネガティブ選択マーカー（１６）の欠失について、選択するための薬物の使用は、細胞クローンにおける特異的なクラスの欠失を富化し得る。
【０１９７】
標的化染色体における機能的エレメントのバリエーションは、本明細書の教示に基づいて当業者に明確になる。これらのバリエーションはまた、本明細書に記載の方法の範囲内に包含される。
【０１９８】
あるバリエーションでは、遺伝型または表現型の変動を担う遺伝子損失をマッピングする方法は以下のとおりである。遺伝型または表現型の変動を示す、非リコンビナーゼ誘導性の欠失および変異を含む個々の細胞クローン（図９−Ｄ）は、欠失なしの変異を含む親の細胞クローン（図９−Ｃ、１０−Ａ）由来である。親の細胞クローン（図１０−Ａ）は、部位特異的組み換え部位（１０）を最小限含むＤＮＡの導入によってさらに操作され得る。ＤＮＡ構築物中のポジティブ選択マーカー（１２）またはネガティブ選択マーカー（１６）の任意の包含によって、その組み込みの選択が補助され得る。あるバリエーションでは、ＤＮＡは、相同組み換えを通じて組み込み、そしてＤＮＡは、特定の遺伝子座に標的される。あるバリエーションでは、ＤＮＡはゲノムに無作為に組み込む。
【０１９９】
あるバリエーションでは、固有の配列タグが、標的化染色体において挿入された機能的エレメントに追加され得る。これによって、クローンを組み合わせて、表現型変動についてスクリーニングすることが可能になり得る。引き続き、クローンの存在、非存在または量は、限定はしないが、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイおよびＰＣＲを含む方法によって検出され得る。
【０２００】
細胞クローンは、第一の部位特異的組み換え部位（１０）と同じ染色体に組み込まれたさらなる部位特異的な組み換え部位（１０）を含むことについてスクリーニングされ得る（図１０−Ｂ、図１０−Ｄ）。これらの細胞クローンへの部位特異的なリコンビナーゼの導入（図１０−Ｂ、１０−Ｄ）によって、部位特異的組み換え部位の間の配列の欠失が生じ得る（図１０−Ｃ、１０−Ｅ）。部位特異的組み換え部位の間のネガティブ選択マーカー（１６）または可視マーカー（１８）の存在は（図１０−Ｂ）、欠失の選択またはスクリーニングを補助し得る。部位特異的リコンビナーゼの導入後、細胞を、例えば、化合物もしくは試薬に対する感受性に基づく選択によって、ネガティブ選択マーカー（１６）の包含に対して選択してもよいし、可視マーカー（１８）の非存在についてスクリーニングしてもよい。あるバリエーションでは、相同染色体上の変異（＊）を明らかにする１染色体上に欠失を有する細胞クローン（図１０−Ｃ）は、遺伝子型または表現型の変動を示し得る。あるバリエーションでは、相同染色体上の変異（＊）を明らかにしない１染色体上の一部に欠失を有する細胞クローン（図１０−Ｅ）は、遺伝子型または表現型の変動を示さない。図１０に図示されるプロセスは、ゲノム領域を比較して配列決定して、遺伝子型または表現型の変動に関連する遺伝子配列を決定するために、費用効果的であるポイントまで、変異を含む領域を狭くするように反復されてもよい。
【０２０１】
あるバリエーションでは、遺伝子型または表現型の変動を担う遺伝子病変をマッピングする方法は以下のとおりである。遺伝型または表現型の変動を示す、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む個々の細胞クローン（図１２−Ｄ、１２−Ｅ）は、１染色体上に欠失を含む親の細胞クローン（図１２−Ｃ、１３−Ａ）由来である。親の細胞クローン（図１３−Ａ）は、部位特異的組み換え部位（１０）を最小限含むＤＮＡの導入によってさらに操作され得る。ＤＮＡ構築物中にポジティブ選択マーカー（１２）またはネガティブ選択マーカーを任意に包含することによって、その組み込みの選択が補助され得る。あるバリエーションでは、ＤＮＡは、相同組み換えを通じて組み込み、そしてＤＮＡは、特定の遺伝子座に標的される。あるバリエーションでは、ＤＮＡはゲノムに無作為に組み込む。
【０２０２】
細胞クローンは、第一の部位特異的組み換え部位（１０）と同じ染色体に組み込まれたさらなる部位特異的な組み換え部位（１０）を含むことについてスクリーニングされ得る（図１３−Ｂ、図１３−Ｄ）。これらの細胞クローンへの部位特異的なリコンビナーゼの導入（図１３−Ｂ、１３−Ｄ）によって、部位特異的組み換え部位の間の配列の欠失が生じ得る（図１３−Ｃ、１３−Ｅ）。部位特異的組み換え部位の間のネガティブ選択マーカー（１６）または可視マーカー（１８）の存在によって（図１３−Ｂ、１３−Ｄ）、欠失の選択またはスクリーニングが補助され得る。部位特異的リコンビナーゼの導入後、細胞を、例えば、化合物もしくは試薬に対する感受性に基づく選択によって、ネガティブ選択マーカー（１６）の包含に対して選択してもよいし、可視マーカー（１８）の非存在についてスクリーニングしてもよい。あるバリエーションでは、染色体セグメントにヘテロ対立遺伝子欠失組み合わせを有する細胞クローン（図１３−Ｃ）は、表現型の変動を示し得るが、隣接する染色体セグメントにおけるヘテロ対立遺伝子欠失組み合わせを有する細胞クローン（図１３−Ｅ）は、表現型の変動を示さない。図１３に図示されるプロセスは、表現型の変動に相関する遺伝子配列を決定するために、ヘテロ対立遺伝子的欠失を含む領域を狭くするように反復されてもよい。
【０２０３】
あるバリエーションでは、遺伝子型または表現型の変動を担う遺伝子病変をマッピングする方法は以下のとおりである。ヘテロ対立遺伝子欠失を含む個々の細胞クローンは、対応する相同染色体セグメント上に欠失および部位特異的組み込み部位を含む細胞（図１５−Ａ）由来である。これらの細胞に、ポジティブ選択マーカー（１２）および部位特異的組み込み部位（１０）を含むＤＮＡを導入する（図１５−Ｂ、１５−Ｄ）。あるバリエーションでは、部位特異的リコンビナーゼを、２つの部位特異的組み換え部位（１０）を含む細胞に、同じ方向で（図１５−Ｂ、１５−Ｄ）導入し、これによって、より小さいヘテロ対立遺伝子欠失を生じる（図１５−Ｃ、１５−Ｅ）。あるバリエーションでは、染色体セグメントにヘテロ対立遺伝子欠失組み合わせを有する細胞クローン（図１５−Ｃ）は、表現型の変動を示し得るが、隣接する染色体セグメントにヘテロ対立遺伝子欠失組み合わせを有する細胞クローン（図１５−Ｅ）は、表現型の変動を示さない。図１５に図示されるプロセスは、表現型の変動に相関する遺伝子配列を決定するために、ヘテロ対立遺伝子的欠失を含む領域を狭くするように反復されてもよい。
【０２０４】
本明細書に記載される遺伝子型または表現型の変動に相関する遺伝子配列を特定する方法としてはまた、ＤＮＡエレメントを含む部位特異的組み換え部位が挙げられ、これには限定はしないが、遺伝子トラップ、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルス、プロ・ウイルス構築物、導入遺伝子、プラスミド、および反復性配列レメントが挙げられる。これらの方法は、遺伝子トラップ突然変異誘発に適合され得る。なぜなら、挿入されたＤＮＡエレメントは一般に、部位特異的組み換え部位（１０）、ポジティブ選択マーカー（１２）、可視マーカー（１８）、またはポジティブ選択マーカーおよび可視マーカーの融合（１２：１８）を含むからである。遺伝子トラップを含む細胞は、変異をランダムに誘導するために変異誘発物質またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理されてもよい。遺伝子トラップおよび無作為に導入された変異を含む細胞クローンは、欠失を含むように電磁放射線で処理されてもよい。遺伝子トラップ組み込みのポイントでの欠失は、遺伝子トラップにおけるネガティブ選択マーカー（１６）の欠失について薬物選択してもよいし、または遺伝子トラップにおける可視マーカー（１８）の非存在についてスクリーニングされてもよい。誘導性欠失および変異を含む細胞クローンは、細胞培養物において遺伝子型または表現型の変動についてスクリーニングされ得る。遺伝子型または表現型の改変細胞クローンの親の細胞クローンは、部位特異的な組み換え部位（１０）を含むＤＮＡ構築物を導入されてもよい。細胞クローンは、第一の部位特異的組み換え部位（１０）と同じ染色体に組み込まれたさらなる部位特異的な組み換え部位（１０）を含むことについてスクリーニングされ得る。これらの細胞クローンへの部位特異的なリコンビナーゼの導入によって、部位特異的組み換え部位の間の配列の欠失が生じ得る。欠失含有クローンは、遺伝子型または表現型の変動についてスクリーニングされてもよい。この方法を繰り返すことによって、欠失を用いて、表現型変動を担うランダムに導入された変異を含む間隔をマッピングしてもよい。
【０２０５】
さらなる特徴は、限定はしないが本明細書に記載されるＤＮＡ構築物を含む、図９および図１０に例示されるＤＮＡ構築物に含まれ得る。この最初の組み込まれたＤＮＡ構築物は、例えば、部位特異的な組み換え部位（１０）の各々の側に、別個のネガティブ選択マーカー（１６）および／または可視マーカー（１８）を含んでもよい（図１１−Ａ、図１１−Ｃ）。細胞クローンに引き続き組み込まれるＤＮＡ構築物は、部位特異的組み換え部位（１０）の間の片側に別個のネガティブ選択マーカー（１６）または可視マーカー（１８）を含んでもよい（図１１−Ａ、１１−Ｃ）。これらの別個のマーカーの存在によって、引き続く部位特異的リコンビナーゼ誘導性欠失について５’方向（図１１−Ｂ）または３’方向（図１１−Ｄ）で選択またはスクリーニングが補助され得る。
【０２０６】
あるバリエーションでは、相同な５’配列、部位特異的組み換え部位を最小限含む内部配列、および相同３’配列を用いて、部位特異的組み換え部位を誘導するために、相同組み換えを用いる。あるバリエーションでは、この内部配列はまた、必要に応じて、１つ以上のポジティブ選択マーカー、必要に応じて１つ以上のネガティブ選択マーカー、必要に応じて１つ以上のレポーター遺伝子、および／または必要に応じて１つ以上の可視マーカーを含む。あるバリエーションでは、このようなさらなる配列は、３’相同配列の３’側上であり、そして標的効率を補助する。あるバリエーションでは、２つ以上の事象により配列を誘導することが可能であり、そして低率の相同組み換えを有する細胞タイプ中でさらに望ましい。あるバリエーションでは、この第一の事象は、ポジティブ選択マーカーの相同な５’配列および不完全な５’部分を含む内部配列を導入する工程を包含する。あるバリエーションでは、この第二の事象は、ポジティブ選択マーカーのまだ不完全な３’部位の重複、内部配列の残り、相同な３’配列、またはネガティブ選択マーカーのうちの１つ以上を導入する工程を包含する。２つの事象におけるポジティブ選択マーカーを導入する工程は、相同組み換えによりゲノムへの配列の正確な組み込みを富化し得る、完全なポジティブ選択マーカーを修復するために相同組み換えを利用する細胞について選択することを補助し得る。相同組み換えは、ゲノムへの部位特異的組み換え部位を導入する１方法である；しかし他の方法も利用されてもよい。
【０２０７】
あるバリエーションでは、部位特異的組み換え部位を含む配列のランダム組み換えを用いて、１つ以上の部位特異的組み換え部位を導入する。
【０２０８】
あるバリエーションでは、１染色体上に２つの部位特異的組み換え部位を含むように細胞を標的化する。２つの部位の間の距離に厳密な制限はないが、ある報告によれば、３〜４ｃＭより大きい配列の欠失は、複製を含む染色体全体の再配列を生じ得ることが示されている。あるバリエーションでは、２つの部位を各々の染色体にそった正確な方向で対で標的して、異なる細胞クローンにおいてゲノム全体をカバーする。あるバリエーションでは、１染色体上に２つの組み換え部位を有する細胞を、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）もしくはエチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）のような化学的変異誘発物質で変異誘発するか、またはＤＮＡ修復のインヒビターで処理する。あるバリエーションでは、複数の変異誘発した個々のクローンを別の細胞培養物中で増殖する。あるバリエーションでは、各々のクローンは、染色体にそった変異の異なるコレクションを含む。部位特異的リコンビナーゼは、欠失を生成する各々のクローンに導入され得る。相同染色体で欠失される染色体セグメント上の遺伝子に影響する変異が存在するクローンでは、劣性の表現型が出現することが期待される。
【０２０９】
次いで細胞クローンを遺伝子型または表現型の変動についてスクリーニングしてもよく、そしてその遺伝子型または表現型の変動に相関する遺伝子の病変（損傷）をマッピングしてもよい。
【０２１０】
遺伝子型変動としては限定はしないが、遺伝子の挿入、欠失、変異、反転、多形性、重複またはエピジェネティック（後成的）な現象が挙げられる。
【０２１１】
「表現型変動（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞クローンの間で観察され得る任意の定性的または定量的な相違を包含する。観察可能な表現型の非限定的な例としては以下が挙げられる：参照細胞または野性型に比較した場合の内因性の細胞産物の量における変化；ある刺激または状態に対する細胞の応答または挙動の存在、非存在または相違；あるいは、レポーター遺伝子を導入された参照細胞に比較した場合のレポーター遺伝子応答のレベルの変化。あるバリエーションでは、表現型は、構成的、発生的な、または外部的に誘導されたレポーター遺伝子応答のいずれかの有無に関与する。あるバリエーションでは、表現型としては、ｍＲＮＡ、タンパク質、脂質、または炭水化物の細胞レベルであって、参照または野性型の細胞に対するこのようなレベルの変化を含む、細胞レベル；これらの分子の改変、あるいはそれらの生物学的活性が挙げられる。あるバリエーションでは、表現型は、細胞の発達能力、または専門的な細胞タイプの特異的な機能を包含する。例えば、欠失を含む、突然変異した幹細胞は、膵臓のβ島細胞に分化する能力について、またはインスリンを分泌する能力について評価され得る。あるバリエーションでは、ヒト細胞を、疾患関連アッセイでスクリーニングする。あるバリエーションでは、細胞を、特異的な疾患の遺伝子型または表現型に相関する表現型または特徴の増強または抑制についてスクリーニングする。
【０２１２】
細胞培養に基づくマッピングの詳細な考察
あるバリエーションでは、原因性の遺伝子病変をより小さい配列間隔までマッピングすることによって、比較されるべき核酸配列の量を減少させる。あるバリエーションでは、表現的に改変体の肺癌細胞は、突然変異誘発由来の変異および相同染色体の欠失を含む。このバリエーションでは、細胞は、突然変異誘発由来の変異および少なくとも２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を有する相同染色体を含む、がリコンビナーゼを介する欠失はない、親細胞クローン由来である。このバリエーションでは、親の細胞クローンをさらなる遺伝子操作に用いる。あるバリエーションでは、第三のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むＤＮＡを、２つの組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む変異誘発された細胞クローンに導入する。このバリエーションでは、標的されるべきＤＮＡベクターは最小限、内因性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、および内因性ゲノム配列に相同な３’隣接配列を含む。あるバリエーションでは、ＤＮＡベクターは、さらなる機能的エレメント、例えば、内在性のゲノム配列に相同な５’隣接配列、ネガティブ選択マｑ−カー、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセット、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、ポジティブ選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット、内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列、およびジフテリア毒素遺伝子発現カセットのうちの１つ以上を含む。このジフテリア毒素発現カセットまたは匹敵するネガティブ選択マーカーは、任意である。なぜなら、これは代表的には相同組み換え事象を５倍までしか富化しないからである。あるバリエーションでは、ＤＮＡ構築物を導入された細胞クローンを、ピューロマイシン含有培地のような選択培地によって選択する。さらなるバリエーションでは、ポジティブ選択細胞を個々にクローニングする。さらなるバリエーションでは、個々の細胞クローンを、蛍光活性化細胞分取、または限外希釈細胞培養によって単離し、そして複数の細胞クローンを単離し、そしてアリコートを低温保存してそれからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖させる。あるバリエーションでは、個々のクローンを、各々の個々のベクター内の隣接する相同配列によって決定された遺伝子座で相同組み換えについて試験する。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては限定はしないが、サザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。クローンは、予め決定された遺伝子座においてゲノムに組み込まれた第三のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むと特定される。
【０２１３】
二倍体細胞では、第三のＣｒｅリコンビナーゼ部位は、他の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む同じ染色体中に組み込まれる確率が５０％であり、そして相同な染色体に組み込まれる確率が５０％である。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の同じ方向での組み換えによって、介在配列の欠失が生じ得る。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の反対方向での組み換えは、介在配列の反転を生じ得る。相同な染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えは、相互転座を生じ得る。
【０２１４】
あるバリエーションでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含むＤＮＡを、公知の遺伝子座でゲノムに組み込まれた３つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローンに導入する。このようなバリエーションでは、欠失を含む細胞クローンを、ネガティブ選択マーカーの包含に対して、薬物選択によって、富化する。あるバリエーションでは、２つの極端の部位特異的組み換え部位に対して内部の別個のネガティブ選択マーカーを有するクローンを、特定の欠失について富化するように、両方ではないが、どちらか一方の対応する薬物を用いて選択する。あるバリエーションでは、同じ染色体上で同じ方向で第一および第二の部位特異的組み換え部位での組み換えによって、１つのネガティブ選択マーカーを含む介在配列の欠失が生じるが、他のネガティブ選択マーカーを含む第二と第三の部位特異的組み換え部位の間の配列はインタクトなまま維持される。あるバリエーションでは、同じ染色体上で同じ方向で第二および第三の部位特異的組み換え部位での組み換えによって、１つのネガティブ選択マーカーを含む介在配列の欠失が生じるが、他のネガティブ選択マーカーを含む第一と第二の部位特異的組み換え部位の間の配列はインタクトなまま維持される。例えば、上記の特定のバリエーションでは、同じ染色体上で同じ方向で第一および第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えによって、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットを含む介在配列の欠失が生じるが、インタクトな配列は、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、およびハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセットを含む；この欠失を含む細胞クローンは、Ｇ４１８感受性、ガンシクロビル耐性、ヒポキサンチン感受性、６−チオグアニン耐性、ピューロマイシン耐性、５−フルオロシトシン感受性、およびハイグロマイシン耐性である。同じ染色体上で同じ方向で第二および第三のＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えによって、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットを含む介在配列の欠失が生じるが、インタクトな配列は、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットを含む；この欠失を含む細胞クローンは、Ｇ４１８耐性、ガンシクロビル感受性、ヒポキサンチン耐性、６−チオグアニン感受性、ピューロマイシン感受性、５−フルオロシトシン耐性、およびハイグロマイシン感受性である。
【０２１５】
このように、お互いに別個の選択マーカーに特異的な薬物での選択によって特定の欠失を富化する。欠失は小さいほど好ましい可能性が高い。なぜなら、部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位の間の距離に依存することが示されているからである。あるバリエーションでは、含む欠失がさらに小さい細胞クローンを、複製プレーティングによって決定する。このバリエーションでは、クローンは薬物選択に耐性であり、ネガティブ選択マーカー配列が欠失され、そしてポジティブ選択マーカー配列がインタクトなまま残る；同じクローンを、薬物選択に対する感受性について複製培養で試験してもよく、ここではポジティブ選択マーカー配列が欠失され、そしてネガティブ選択マーカー配列がインタクトなまま残る。薬物耐性クローンは、アリコートを低温保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖してもよい。あるバリエーションでは、介在配列の欠失、および複製のような全体的な染色体の再配列の非存在は、限定はしないが、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、分光による核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションを含む方法によって決定される。あるバリエーションでは、さらなる染色体再配列のない単一の欠失を含む細胞クローンを、表現型変動について試験するために多量に増殖して、アリコートで低温保存する。
【０２１６】
あるバリエーションでは、１染色体に変異および相同染色体の対応する部分に欠失を含む細胞クローンは表現型的に改変体である。このバリエーションでは、１染色体上に変異を含むが、相同な染色体のインタクトな対応する部分を有し、さらに離れた部分に欠失を含む細胞クローンは、同質遺伝子の親の細胞クローンから表現型的に改変体ではない。この方式では、原因の遺伝子病変を含む配列の間隔を狭くする。あるバリエーションでは、このプロセスを並行して行うか、または連続して反復して、突然変異誘発された改変体細胞クローンともとの同質遺伝子の細胞クローンとの間の核酸配列を比較するために都合のよいサイズまで、間隔を狭める。
【０２１７】
あるバリエーションでは、細胞は、別個の手段によって遺伝子操作され得る。以下の非限定的な例は、欠失を誘導する別の手段および変異をマッピングする別のストラテジーを考察する。
【０２１８】
あるバリエーションでは、肺癌細胞を個々にクローニングして、上記のような細胞の出発集団を同質遺伝子にする。
【０２１９】
あるバリエーションでは、本明細書のいずれかに記載のような第一の部位特異的組み換え部位を含むＤＮＡを、本明細書に記載であるかそうでなければ当業者に公知の任意の方法を用いて、同質遺伝子の細胞クローン中に導入する。ここでも、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位の非限定的な例を以下の考察で用いる；しかし、任意の部位特異的なリコンビナーゼ部位が、本明細書に記載の方法で用いられてもよい。
【０２２０】
あるバリエーションでは、ＤＮＡを、同質遺伝子の細胞クローン中に、ランダムな方式での組み込みのために導入する。細胞を個々にクローニングする方法としては限定はしないが、蛍光活性化細胞分取法および限外希釈細胞培養が挙げられる。Ｃｒｅ組み換え部位を含む個々の細胞クローンは、アリコートを低温保存し、そして細胞クローンからＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出するために十分な量で増殖されてもよい。あるバリエーションでは、遺伝子トラップ構築物を用いて、スプライスアクセプター部位、またはスプライスドナー部位を、Ｄｒｅリコンビナーゼ部位を含むＤＮＡ構築物内に含んでもよい。さらなるバリエーションでは、ホストゲノム中へのランダム組み込み部位の位置は、スプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、インバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ、または逆転写酵素ＰＣＲによって特定される。あるバリエーションでは、Ｃｒｅ組み換え部位の単一の組み込み部位を含む細胞クローンをさらなる操作のために用いる。
【０２２１】
あるバリエーションでは、組み込まれたプラスミドまたは導入遺伝子のコピー数が低下し、この低下とは単一コピーへの減少を含む。あるバリエーションでは、コピー数は、Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導によって減少され得る。あるバリエーションでは、組み込みは、Ｃｒｅリコンビナーゼによっても、または任意の他の機構によってもコピー数を減少するようには操作されない。
【０２２２】
導入されたＤＮＡ構築物のランダムな組み込みの場合には、ＤＮＡ構築物の非限定的な例は最小限、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットを含む。あるバリエーションでは、さらなる機能的なエレメントを有するＤＮＡベクターは、順に、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットを含んでもよい。このようなバリエーションでは、核酸構築物を導入された細胞クローンは、本明細書に記載される変異をマッピングするために用いられる指向性欠失について選択され得る。非限定的な例では、ＤＮＡ構築物を導入された細胞クローンは、ピューロマイシン含有培地のような、ポジティブ選択マーカーに基づいて選択され得る。あるバリエーションでは、個々の細胞クローンは、蛍光活性化細胞分取、または限外希釈細胞培養によって単離される。あるバリエーションでは複数の細胞クローンを単離し、そしてアリコートを低温保存して細胞クローンからＤＮＡを抽出するために十分な量で、そしてさらなる増殖のために増殖させる。
【０２２３】
あるバリエーションでは、当業者に公知であるかまたは本明細書に記載の方法の１つ以上を用いて、ゲノムの予め決定された部位においてＣｒｅリコンビナーゼ部位を組み込むように、同質遺伝子の細胞クローン中にＤＮＡを導入する。ゲノムへの部位特異的なリコンビナーゼ部位を標的する非限定的な例では、相同組み換えを用いてもよい。あるバリエーションでは、標的されるべきＤＮＡベクターは最小限、内因性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、および内因性ゲノム配列に相同な３’隣接配列を含む。あるバリエーションでは、さらなる機能的エレメントを有するＤＮＡベクターは、順に、内在性のゲノム配列に相同な５’隣接配列、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、内因性ゲノム配列に相同な３’隣接配列、および任意のジフテリア毒素または他のネガティブ選択マーカー発現カセットを含み得る。このジフテリア毒素発現カセットまたは他のネガティブ選択マーカーは任意である、なぜなら、それは代表的には、わずか５倍〜１０倍までしか相同組み換え事象を富化しないからである。このバリエーションでは、ＤＮＡ構築物が導入された細胞クローンを、選択マーカーに基づいて、例えば、ピューロマイシン含有培地について選択する。さらなるバリエーションでは、個々の細胞クローンは、蛍光活性化細胞分取法または限外希釈細胞培養によって単離される。さらなるバリエーションでは、複数の細胞クローンを単離し、そしてアリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖させる。さらなるバリエーションでは、個々のクローンを、各々の個々のベクター内で隣接する相同配列によって決定される遺伝子座で、相同組み換えについて試験する。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては、限定はしないがサザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。クローンは、予め決定された遺伝子座においてゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むと認定される。
【０２２４】
あるバリエーションでは、組み込まれたＤＮＡ構築物を含む個々の細胞クローンを変異誘発物質で処理する。変異誘発物質としては、本明細書に記載されるか、または当業者に公知の変異誘発物質のうち１つ以上が挙げられる。変異誘発物質は、種々の変異効率およびバイアスを有するので、あるバリエーションでは、いくつかの変異誘発物質を別々に、組み合わせて、または変化した用量で用いる。変異誘発物質処理から生残する個々の細胞を単離して、別々に増殖してもよい。細胞を個々にクローニングするための方法としては限定はしないが、蛍光活性化細胞分取法および限外希釈細胞培養が挙げられる。複数の細胞クローンを、十分な量で増殖して、アリコート中で低温保存してもよく、そしてさらなる遺伝子操作のために培養してもよい。あるバリエーションでは、ポジティブ選択マーカー、部位特異的組み換え部位およびネガティブ選択マーカーを含むＤＮＡ構築物の導入の前に変異誘発物質で細胞を処理してもよい。
【０２２５】
あるバリエーションでは、組み込まれたＤＮＡ構築物および無作為に誘導された変異体を含む個々の細胞クローンを、欠失発生変異誘発物質で処理する。欠失発生の変異誘発物質としては限定はしないが、以下が挙げられる：限定はしないが、Ｘ線照射、ＵＶ照射、γ線照射を含む電磁放射線；限定はしないがホルムアルデヒド、ジエポキシオクタン、エチルニトロソ尿素、メタンスルホン酸エチルおよびＵＶ活性化トリメチルソラレンを含む、化学的変異誘発物質。個々の細胞クローンを、ＤＮＡ構築物の組み込みのポイントで欠失について選択してもよい。この非限定的な例では、それぞれ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセット、ならびにシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットの包含に対するガンシクロビルおよび５−フルオロシトシン薬物選択は、組み込みのポイントで欠失を含む細胞クローンについて選択する。あるバリエーションでは、薬物耐性クローンを、十分な量で増殖して、低温保存アリコートにし、細胞クローンからＤＮＡを抽出し、そして表現型改変体クローンを決定する。
【０２２６】
あるバリエーションでは、欠失を含む、癌細胞クローンまたは肺細胞クローンを含むがこれに限定されない、変異誘発された細胞クローンを、本明細書に上記されるように細胞毒性感度について試験する。
【０２２７】
あるバリエーションでは、インビトロシステムを用いて、限定はしないが、軟寒天増殖のようなモデルまたは系を含む、本明細書に記載のように欠失についてスクリーニングする。あるバリエーションでは、欠失を含む変異誘発された肺癌細胞クローンを、本明細書に記載されるようなインビボモデルにおいて１回以上試験し、この試験としては限定はしないが、実験動物における側頭角膜輪部（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｉｍｂｕｓ）に隣接する角膜間質に、または発育中のニワトリの絨毛尿膜に移植した場合、新血管形成を補充する能力について試験することを含む。
【０２２８】
あるバリエーションでは、欠失を含む変異誘発された肺癌細胞クローンを、実験動物中に異種移植する。この実験動物としては限定はしないが、当業者に公知のまたは本明細書に記載される、種々の免疫のコンピテントな（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）、または免疫力の低下した（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）実験動物が挙げられる。あるバリエーションでは、異種移植片を、１つ以上の異所性の位置または同所性の位置におく。他のバリエーションでは、肺細胞の皮内注射または皮下注射によって、腫瘍サイズおよび自然な転移の測定が可能になり得る。あるバリエーションでは、静脈内注射によって、転移の観察が可能になり得る。このような系またはモデルを観察して、本明細書に記載のような遺伝子型または表現型の変動のうちの１つ以上を検出する。
【０２２９】
あるバリエーションでは、可視マーカーを発現する肺細胞を観察して、当業者に公知の、または本明細書に記載の任意の方法のうちの１つ以上を用いて、腫瘍の増殖、密度および転移を検出する。
【０２３０】
あるバリエーションでは、欠失を含有する変異誘発された肺癌細胞クローンを、親の同質遺伝子の肺癌細胞株と比較する。この方法では、遺伝子操作された細胞クローンを、表現型変動について、腫瘍増殖または他の挙動の増強または抑制としてアッセイしてもよい。あるバリエーションでは、欠失を含む突然変異した肺癌株における遺伝子の変異の特定を、当該分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の１つ以上の方法を用いて、親の同質遺伝子にされた肺癌細胞株における遺伝子配列に比較する。
【０２３１】
あるバリエーションでは、原因性の遺伝子病変をより小さい配列間隔までマッピングすることによって、比較されるべき核酸配列の量を減少させる。あるバリエーションでは、表現的に改変体の肺癌細胞は、突然変異誘発由来の変異および相同染色体の欠失を含む。細胞は、ＤＮＡ構築物組み込み部位、またはこの部位での引き続く欠失の境界の知識なしに、表現型改変について試験され得る。このバリエーションでは、細胞は、突然変異誘発由来の変異およびＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む組み込まれたＤＮＡ構築物を有する相同染色体を含むが、欠失はない、親細胞クローン由来である。このバリエーションでは、親の細胞クローンをさらなる遺伝型比較および遺伝子操作に用いる。ＤＮＡ構築物取り込みの部位は、限定はしないがスプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、インバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ、または逆転写酵素ＰＣＲ、サザンブロットを含むがそれに限定されない方法によって親の細胞クローン中で決定され得る。あるバリエーションでは、親細胞クローンと娘の表現型の改変細胞クローンとの間のゲノム比較が決定され得る。ゲノム比較手段としては、限定はしないが、比較ゲノムハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、分光核型分析、ギムザ染色核型分析、サザンブロット、ならびに遺伝子およびゲノムのアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０２３２】
あるバリエーションでは、ＤＮＡ構築物組み込みの部位または欠失の部位を特定することによって、表現型改変を担う変異の引き続くマッピングを補助し得る。この非限定的な例では、Ｃｒｅリコンビナーゼ部位を含むさらなるＤＮＡ構築物が、表現型改変体細胞クローンの親細胞クローンに導入される。あるバリエーションでは、この組み込みは、相同組み換えによって標的される。このバリエーションでは、ＤＮＡベクターは、順に、内在性ゲノム配列に相同な５’隣接配列、ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅ組み換え部位、内在性ゲノム配列に相同な３’隣接配列、およびジフテリア毒素遺伝子発現カセットを含む。このジフテリア毒素発現カセットまたは匹敵するネガティブ選択マーカーは任意である、なぜなら、それは代表的には、わずか５倍までしか相同組み換え事象を富化しないからである。このバリエーションでは、ＤＮＡ構築物が導入された細胞クローンを、ハイグロマイシン含有培地のような選択培地によって選択する。さらなるバリエーションでは、ポジティブ選択した細胞を個々にクローニングする。さらなるバリエーションでは、個々の細胞クローンを、蛍光活性化細胞分取法または限外希釈細胞培養によって単離し、そして複数の細胞クローンを単離し、そしてアリコートを低温で保存して、それからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖させる。あるバリエーションでは、個々のクローンを、各々の個々のベクター内で隣接する相同配列によって決定される遺伝子座で、相同組み換えについて試験する。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては、サザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。クローンは、予め決定された遺伝子座においてゲノムに組み込まれた第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含むとして特定され得る。
【０２３３】
二倍体細胞については、第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位は、他のＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む同じ染色体中に組み込まれる確率が５０％であり、そして相同な染色体に組み込まれる確率が５０％である。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の同じ方向での組み換えによって、介在配列の欠失が生じ得る。同じ染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位の反対方向での組み換えは、介在配列の反転を生じ得る。相同な染色体上の２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えは、相互転座を生じ得る。
【０２３４】
あるバリエーションでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含むＤＮＡを、公知の遺伝子座でゲノムに同じ方向で組み込まれた２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローンに導入する。このようなバリエーションでは、欠失を含む細胞クローンを、ネガティブ選択マーカーの包含に対して薬物選択によって富化する。あるバリエーションでは、２つの極端の部位特異的組み換え部位に対して内部の別個のネガティブ選択マーカーを有するクローンを、特定の欠失について富化するように、両方ではないが、どちらか一方の対応する薬物を用いて選択する。この非限定的な例では、選択のための５−フルオロウラシルまたはガンシクロビルの使用は、第二のＣｒｅリコンビナーゼが、第一のＣｒｅリコンビナーゼ部位組み込みに関してそれぞれ５’または３’のいずれに組み込むかに依存する。あるバリエーションでは、この第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位は、もとのＣｒｅリコンビナーゼ組み込みに対して５’側に組み込み、そしてシチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットが両側のＣｒｅリコンビナーゼ部位に隣接する；このバリエーションでは、欠失は、５−フルオロシトシンで選択され得る。いくつかのバリエーションでは、この第二のＣｒｅリコンビナーゼ部位は、もとのＣｒｅリコンビナーゼ組み込みに対して３’側に組み込み、そして単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットが両側のＣｒｅリコンビナーゼ部位に隣接する；このバリエーションでは、欠失は、ガンシクロビルで選択され得る。薬物耐性細胞クローンは、限定はしないが、ポリメラーゼ連鎖反応、比較ゲノムハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、分光による核型分析、ギムザ染色核型分析、サザンブロット、ならびに遺伝子およびゲノムアレイのハイブリダイゼーションを含む方法によって、Ｃｒｅリコンビナーゼ誘導性欠失について試験され得る。Ｃｒｅリコンビナーゼ誘導性欠失および誘導性変異を含む細胞クローンを、表現型変動についてスクリーニングするため、そしてクローンをアリコートで低温保存するために十分な量で増殖してもよい。
【０２３５】
あるバリエーションでは、１染色体に変異を、そして相同染色体の対応する部分に欠失を含む細胞クローンは表現型として改変体である。このバリエーションでは、１染色体に変異を含むが、相同染色体のインタクトな対応する部分を有し、さらに離れた部分に欠失を有する細胞クローンは、同質遺伝子の親細胞クローンからは表現型として改変体ではない。この方式では、原因の遺伝子病変を含む配列の間隔が狭められる。あるバリエーションでは、このプロセスを並行して行うか、または連続して反復して、突然変異誘発された改変体細胞クローンともとの同質遺伝子の細胞クローンとの間の核酸配列を比較するために都合のよいサイズまで、間隔を狭める。
【０２３６】
あるバリエーションでは、表現型変動を示す細胞クローンは、ヘテロ対立遺伝子欠失を含む。あるバリエーションでは、この細胞は、１染色体上に欠失を、そして相同染色体領域において部位特異的組み換え部位およびネガティブ選択マーカーを含む組み込まれたＤＮＡカセットを含む、親細胞クローン由来である。１つの非限定的な例では、細胞は、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット、Ｃｒｅ組み換え部位、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットを含む。ポジティブ選択マーカー、例えば、ピューロマイシン耐性発現カセットおよびＣｒｅ組み換え部位を含むＤＮＡをこれらの細胞中に導入してもよい。あるバリエーションでは、ＤＮＡの組み込みはランダムである。あるバリエーションでは、ＤＮＡの組み込みは欠失境界内の予め決定された部位にある。ゲノム中に選択マーカーを標的する非限定的な例では、相同組み換えを用いてもよく、そして本明細書に記載のように、ＤＮＡ中に機能的なエレメントを含む。各々の遺伝子座で相同組み換えを決定する方法としては、限定はしないがサザンブロットおよびポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。クローンは、予め決定された遺伝子座においてゲノムに組み込まれたＤＮＡカセットを含むと認定される。
【０２３７】
あるバリエーションでは、第二のＣｒｅ組み換え部位は、もとのＣｒｅリコンビナーゼ組み込みに対して５’側に組み込まれるが、あるバリエーションでは、この第二のＣｒｅ組み換え部位は、もとのＣｒｅリコンビナーゼ組み込みに対して３’側に組み込まれる。
【０２３８】
あるバリエーションでは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含むＤＮＡを、公知の遺伝子座でゲノムに組み込まれた２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位を含む細胞クローンに導入する。より小さい欠失を含む細胞クローンを、それぞれ、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセット、ならびに単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットの包含に対して、例えば、５−フルオロシトシンおよびガンシクロビル薬物選択によって、ネガティブ選択マーカーに対して薬物選択によって富化する。この非限定的な例では、同じ染色体上で同じ方向で２つのＣｒｅリコンビナーゼ部位での組み換えによって、シチジンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合発現カセットを含む介在配列の小さい５’欠失、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ発現カセットを含む介在配列の小さい３’欠失が生じ得る。薬物耐性クローンは、アリコートを低温で保存して、細胞クローンからＤＮＡを抽出するのに十分な量で増殖され得る。介在配列の欠失、および複製のような全体的な染色体の再配列の非存在は、本明細書に記載の種々の方法を用いて決定され得る。あるバリエーションでは、さらなる染色体再配列のないヘテロ対立遺伝子欠失を含む変異誘発された細胞クローンを、低温で保存し、そして表現型変動をアッセイするために培養中で増殖させる。この非限定的な例では、含んでいる５’欠失がより小さい細胞は、表現型変動を示し得ないが、含んでいる３’欠失がより小さい細胞は、表現型変動を示し得る。別のＣｒｅ組み換え部位を組み込み、そして欠失を誘導するプロセスが反復されてもよく、これによって表現型変動を担う欠失された遺伝子エレメントを含む領域が狭められる。
【０２３９】
上記の詳細な説明は、多くの実施例を含み、これは、本発明の範囲を限定するものではなく；むしろ、それらは、記載される方法を実施するいくつかの方法を示している。多くのバリエーションが可能である。
【０２４０】
特許、特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用される全ての引用文献は、以前に詳細に援用されようとされまいと、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１は、ＤＮＡにおける病変（損傷）を生成する方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図２】図２は、１染色体上の欠失と、相同染色体における化学的に導入された変異とを組み合わせるための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図３】図３は、相同染色体におけるより小さい欠失を用いることによって１染色体における遺伝子病変の位置決めする方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図４】図４は、染色体上の欠失の導入を促進するための、１染色体上に標的された改変の詳細な表示のいくつかのバリエーションを示す。
【図５】図５は、染色体上で、より小さい欠失の導入を促進するために、図６における染色体に標的されるさらなる改変のいくつかのバリエーションを示す。
【図６】図６は、相同染色体上の欠失と組み合わせた１染色体上の挿入突然変異を用いる方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図７】図７は、薬物処理と組み合わせて、ＲＮＡまたはタンパク質の量もしくは活性に影響する非限定的な例示的な方法と組み合わせて、培養された細胞において表現型変動についてスクリーニングするための、欠失含有細胞を用いる代替法のための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図８】図８は、電磁放射線を用い、それとともに選択マーカーを用いて、細胞中で欠失を作成する別の方法についての方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図９】図９は、相同染色体において標的された欠失を用いることによる、１染色体における遺伝子病変の位置決めのための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図１０】図１０は、相同染色体において標的された欠失を用いることによる、１染色体における遺伝子病変の位置決めのための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図１１】図１１は、相同染色体において標的された欠失を用いることによる、１染色体における遺伝子病変の位置決めのための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図１２】図１２は、１染色体における欠失と、相同染色体における欠失とを組み合わせるための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図１３】図１３は、１染色体における欠失を相同染色体における欠失で作成する代替法のため、そして相同染色体において、より小さい欠失を用いることによる、１染色体における遺伝子病変の位置決めのための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図１４】図１４は、１染色体における欠失と、相同染色体における欠失とを組み合わせる別の方法のための方法のいくつかのバリエーションを示す。
【図１５】図１５は、相同染色体において、より小さい欠失を用いることによる、１染色体における遺伝子病変の位置決めのための別の方法についての方法のいくつかのバリエーションを示す。
【符号の説明】
【０２４２】
１０  部位特異的組み換え部位
１２  ポジティブ選択マーカー
１４  挿入変異誘発物質
１６  ネガティブ選択マーカー
１８  可視マーカー
＊変異
（  ）欠失
【図１Ａ】
2009532021.tif 000003
【図１Ｂ】
2009532021.tif 000004
【図１Ｃ】
2009532021.tif 000005
【図１Ｄ】
2009532021.tif 000006
【図１Ｅ】
2009532021.tif 000007
【図１Ｆ】
2009532021.tif 000008
【図１Ｇ】
2009532021.tif 000009
【図１Ｈ】
2009532021.tif 000010
【図１Ｉ】
2009532021.tif 000011
【図２Ａ】
2009532021.tif 000012
【図２Ｂ】
2009532021.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2009532021.tif 000015
【図３Ａ】
2009532021.tif 000016
【図３Ｂ】
2009532021.tif 000017
【図３Ｃ】
2009532021.tif 000018
【図３Ｄ】
2009532021.tif 000019
【図３Ｅ】
2009532021.tif 000020
【図４Ａ】
2009532021.tif 000021
【図４Ｂ】
2009532021.tif 000022
【図５Ａ】
2009532021.tif 000023
【図５Ｂ】
2009532021.tif 000024
【図５Ｃ】
2009532021.tif 000025
【図５Ｄ】
2009532021.tif 000026
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2009532021.tif 000029
【図７Ａ】
2009532021.tif 000030
【図７Ｂ】
2009532021.tif 000031
【図７Ｃ】
2009532021.tif 000032
【図７Ｄ】
2009532021.tif 000033
【図７Ｅ】
2009532021.tif 000034
【図８Ａ】
2009532021.tif 000035
【図８Ｂ】
2009532021.tif 000036
【図８Ｃ】
2009532021.tif 000037
【図８Ｄ】
2009532021.tif 000038
【図９Ａ】
2009532021.tif 000039
【図９Ｂ】
2009532021.tif 000040
【図９Ｃ】
2009532021.tif 000041
【図９Ｄ】
2009532021.tif 000042
【図９Ｅ】
2009532021.tif 000043
【図１０Ａ】
2009532021.tif 000044
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2009532021.tif 000046
【図１０Ｄ】
2009532021.tif 000047
【図１０Ｅ】
2009532021.tif 000048
【図１１Ａ】
2009532021.tif 000049
【図１１Ｂ】
2009532021.tif 000050
【図１１Ｃ】
2009532021.tif 000051
【図１１Ｄ】
2009532021.tif 000052
【図１２Ａ】
2009532021.tif 000053
【図１２Ｂ】
2009532021.tif 000054
【図１２Ｃ】
2009532021.tif 000055
【図１２Ｄ】
2009532021.tif 000056
【図１２Ｅ】
2009532021.tif 000057
【図１３Ａ】
2009532021.tif 000058
【図１３Ｂ】
2009532021.tif 000059
【図１３Ｃ】
2009532021.tif 000060
【図１３Ｄ】
2009532021.tif 000061
【図１３Ｅ】
2009532021.tif 000062
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2009532021.tif 000064
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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