(57)【要約】  本発明は、生細胞および死細胞を含有する混合物由来の死細胞のＤＮＡを、分子検出から選択的に除外するための、新規な化学物質および方法を提供する。【選択図】  図１
2009528058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のフェナントリジウム誘導体
【化１】
2009528058.tif 000013
［式中、
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ−アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ−アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される］
またはそのモノもしくはビスハライド塩に生細胞および死細胞の混合物を暴露することを含む、死細胞を生細胞と区別する方法。
【請求項２】
前記フェナントリジウム誘導体が、式（ＩＩ）の構造
【化２】
2009528058.tif 000014
［式中、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ−アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ−アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される］
を有するか、またはそのモノもしくはビスハライド塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フェナントリジウム誘導体が、式（ＩＩＩ）の構造
【化３】
2009528058.tif 000015
［式中、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ−アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、水素または１から６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ−アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される］
を有するか、またはそのモノもしくはビスハライド塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フェナントリジウム誘導体が、３−アミノ−８−アジド−５−エチル−６−フェニルフェナントリジウムヨウ化物、３−アミノ−８−アジド−５−エチル−６−フェニルフェナントリジウム臭化物、３−アミノ−８−アジド−５−エチル−６−フェニルフェナントリジウム塩化物、３−アミノ−８−アジド−５−（３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）−６−ファニルフェナントリジウム二ヨウ化物、３−アミノ−８−アジド−５−（３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）−６−フェニルフェナントリジウム二臭化物、および３−アミノ−８−アジド−５−（３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）−６−フェニルフェナントリジウム二塩化物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記フェナントリジウム誘導体がＰＭＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記混合物からゲノムＤＮＡを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲが、前記混合物に対して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、前記混合物からＲＮＡを単離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＲＴ−ＰＣＲが、前記単離されたＲＮＡに対して行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．細胞培養物を候補消毒剤および／または抗生物質に暴露すること、
ｂ．前記細胞培養物をフェナントリジウム誘導体にさらに暴露すること、
ｃ．前記試料を、前記フェナントリジウム誘導体含有試料と共に光源に暴露すること、
ｄ．前記試料からゲノムＤＮＡを単離すること、ならびに
ｅ．前記単離されたＤＮＡにＰＣＲを行うこと、
次に、ＰＣＲの結果を前記消毒剤で処理した培養物と未処理培養物の間で比較すること
を含む、消毒剤および／または抗生物質を試験する方法。
【請求項１１】
前記フェナントリジウム誘導体がＰＭＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞培養物が、サルモネラ・エンテリカ、リステリア菌、大腸菌、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群からの生物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養物が、１種を超える細菌生物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記消毒剤が、膜の完全性を破壊する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ａ．細胞培養物を候補消毒剤および／または抗生物質に暴露すること、
ｂ．前記細胞培養物をフェナントリジウム誘導体にさらに暴露すること、
ｃ．前記細胞培養物を前記フェナントリジウム誘導体含有試料と共に光源に暴露すること、
ｄ．細胞培養物からＲＮＡを単離すること、ならびに
ｅ．単離されたＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを行うこと、
次に、ＲＴ−ＰＣＲの結果を前記消毒剤で処理した培養物と未処理培養物との間で比較すること
を含む、消毒剤および／または抗生物質を試験する方法。
【請求項１６】
前記フェナントリジウム誘導体がＰＭＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養物が、サルモネラ・エンテリカ、リステリア菌、大腸菌、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群からの生物を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞培養物が、１種を超える細菌生物を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記消毒剤および／または抗生物質が、膜の完全性を破壊する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ａ．試料を収集すること、
ｂ．前記試料をフェナントリジウム誘導体に暴露すること、
ｃ．前記フェナントリジウム誘導体含有試料を光源に暴露すること、
ｄ．前記試料からゲノムＤＮＡを単離すること、および
ｅ．前記単離されたＤＮＡにＰＣＲを行うこと
を含む、試料を微生物プロファイリングする方法。
【請求項２１】
前記試料が、土壌、水、下水、食品、農作物、医薬品、および化粧品からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記フェナントリジウム誘導体がＰＭＡである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年２月２８日に出願された米国出願第６０／７７６，９２７号への優先権を主張し、この出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府後援の研究開発に関する記載
本研究は、陸軍研究局(Army Research Office)からの助成金（ＤＡＡＤ  １９−０３−１−０１９８）に支援された。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００３】
生細胞と死細胞との区別は、微生物診断における重要な課題である。代謝活性および増殖活性、ならびに病原性微生物の場合には潜在的な健康上のリスクは、混合微生物集団の中の生きている部分に限られる。蛍光染色を使用したフローサイトメトリーで、４つの生理状態、すなわち繁殖的に生存可能な細胞、代謝活性細胞、無傷細胞、および透過化細胞(permeabilized cell)が識別される。状態に応じて、透過化細胞以外の全ての段階は、蘇生により回復する潜在性を有しうるため、潜在的に生きているとみなさねばならない８。細胞死の後に、数日から３週間までの範囲でＤＮＡが比較的長期間残留することから４、６、ＤＮＡに基づく診断は、生細胞数を過大評価する傾向にある。試料から抽出されたＤＮＡは、死んだ透過化細胞を包含する、言及した４つの生理状態のうち任意の状態の細胞に由来することがある。しかし、死んだ透過化細胞の検出は望まれていない。
【０００４】
生存可能な細胞と不可逆的に損傷した細胞とを識別するために最も重要な基準は、膜の完全性である。膜損傷細胞由来のノイズを選別することは、細菌群集の無傷で生存可能な部分に代謝活性および健康上のリスクを割り付けるのに役立つ。死細胞または膜損傷細胞には容易に浸透するＤＮＡ結合色素を、無傷の膜を有する生細胞は排除できることから、識別される。この原理は、顕微鏡的な生死の判別に日常的に適用され、フローサイトメトリーにますます適用されている。最も一般的な膜不透過色素はヨウ化プロピジウムである。
【０００５】
ここ数年、ＥＭＡ−ＰＣＲが、顕微鏡またはフローサイトメトリーによる生細胞と死細胞との識別の、使用しやすい代替法であると報告された１１、１３、１４。このＤＮＡに基づく診断法は、生死判別色素の使用をリアルタイムＰＣＲの速さおよび感度と組み合わせたものである。エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）は、明るい可視光（４６０ｎｍで最大吸光度）に暴露すると、この化学物質をＤＮＡに共有結合させるアジド基を有するＤＮＡインターカレート色素である。細胞をＥＭＡに５分間暴露し、損傷した細胞壁／細胞膜を有する死細胞に色素を浸透させ、そのＤＮＡに結合させる。明るい可視光を用いたＥＭＡの光分解によりニトレンが生成し、このニトレンは、ＤＮＡおよび他の分子と共有結合を形成することができる１、２。光誘導架橋結合形成は、死細胞由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅を阻害すると報告された。最近の文献では、ＤＮＡへのＥＭＡの架橋結合形成が、実際にＤＮＡを不溶性にし、ゲノムＤＮＡ抽出の間に細胞の破片と一緒にそのＤＮＡの損失をもたらしたことを示すことができた１０。溶液中に遊離状態のまま残った未結合のＥＭＡは、水分子と反応することによって同時に不活性化される２。その結果として生じたヒドロキシルアミンは、ＤＮＡともはや共有結合することはできない５。したがって、光暴露前に無傷の細胞膜／細胞壁によって反応性ＥＭＡから保護された生存可能な細胞由来のＤＮＡは、細胞溶解後は不活性化ＥＭＡの作用は受けない。したがって、生存可能な細胞と死細胞の混合物からなる細菌培養物をＥＭＡ処理すると、死細胞からのＤＮＡが選択的に除去される。試験された種は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７１１、ネズミチフス菌１１、リステリア菌１１、１３、１４、およびカンピロバクター・ジェジュニ１３であった。しかし、これらの研究は、死細胞からのＤＮＡの選択的損失については検討しなかった。
【０００６】
この技法は有望であるが、ＤＮＡ抽出前にＥＭＡを使用することには大きな欠点があることが分かった。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の場合には、死細胞由来のゲノムＤＮＡ全体が除去されたが、この処理は、対数期に採集された生存可能な細胞のゲノムＤＮＡの約６０％の損失もまた招いた１０。この研究では、ＥＭＡが、他の細菌種の生存可能な細胞にもまた容易に浸透し、部分的なＤＮＡの損失を招くことが観察された。この選択性および全体的な適用性の欠如から、新たに開発された代替化学物質であるプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）を試験することになった。ＰＭＡは、追加に存在する１つのアジド基が光暴露時にＤＮＡへの架橋を可能にすること以外は、ＰＩと同一である。ＰＩは高度に膜不透過性で、一般に生存可能な細胞から排除されるので、ＰＩは、混合集団中の死細胞を同定するために広く使用されてきた。損傷した細胞膜に浸透すると、ＰＩは、ほとんどまたは全く配列選好性をもたずに、ＤＮＡの４〜５塩基対あたり１つの色素分子という化学量論で塩基の間にインターカレートすることによってＤＮＡに結合する１７。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＰＭＡ分子の電荷が高いこと（ＥＭＡの場合は正電荷数１であるのに対して正電荷数２）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた生存可能でない細胞の選択的染色が、多様な種類の細胞でうまく行われたという事実は、ＰＭＡの使用が、ＥＭＡで観察された欠点を軽減することができるという確信を与えた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＭＡが所定の生細胞および死細胞の部分を有する細菌培養物から死細胞のゲノムＤＮＡの検出を選択的に除く適性を検討したものである。これは、新たに開発された分子であることから、方法の最適化が必要であった。ＤＮＡ結合のための光暴露時間および遊離未結合ＰＭＡの同時不活性化は、精製ＤＮＡを用いて最適化した。１種のグラム陰性菌および１種のグラム陽性菌を用いて、ＰＭＡ濃度およびインキュベーション時間を最適化してから、広域スペクトルの異なる細菌種の研究にこれらのパラメーターを適用した。
【０００９】
本発明は、無傷細胞膜を有する微生物群集の部分に、分子診断を限定する方法を含む。これは、無傷細胞および膜損傷細胞の混合物をフェナントリジウム誘導体に暴露することによって達成される。一実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体は、フェナントリジウム(phenanthridium)、３−アミノ−８−アジド−５−［３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル］−６−フェニル二塩化物である。別の実施形態では、前記方法は、前記混合物からゲノムＤＮＡを単離することを含む。別の実施形態では、混合物由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲが行われる。
【００１０】
本発明は、細胞培養物を候補消毒剤および／または抗生物質に暴露すること、前記細胞培養物をフェナントリジウム誘導体にさらに暴露すること、前記試料を前記フェナントリジウム誘導体含有試料と共に光源に暴露すること、前記試料からゲノムＤＮＡを単離すること、および前記単離されたＤＮＡにＰＣＲを行うこと、次に、ＰＣＲの結果を前記消毒剤で処置した培養物と未処置培養物との間で比較することを含む、消毒剤および／または抗生物質を用いた処置の有効性を試験する方法もまた含む。一実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体はＰＭＡである。別の実施形態では、培養物は、サルモネラ・エンテリカ、リステリア菌、大腸菌、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群からの生物を含む。別の実施形態では、前記細胞混合物は、１つを超える生物を含む。別の実施形態では、前記方法は、広範囲の細菌種および細胞膜の穿孔が核酸インターカレート色素を取り込ませる任意の他の細胞に適用することができる。
【００１１】
本発明は、消毒剤および／または抗生物質を試験する方法もまた含み、その方法は、細胞培養物を候補消毒剤および／または抗生物質に暴露すること、前記細胞培養物をフェナントリジウム誘導体にさらに暴露すること、前記細胞培養物を前記フェナントリジウム誘導体含有試料と共に光源に暴露すること、前記細胞培養物からＲＮＡを単離すること、ならびに単離されたＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを行うこと、次にＲＴ−ＰＣＲの結果を前記消毒剤処置培養物未処置培養物と未処置培養物との間で比較することを含む。別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体はＰＭＡである。
【００１２】
本発明は、試料をフェナントリジウム誘導体に暴露すること、前記フェナントリジウム誘導体含有試料を光源に暴露すること、前記試料からゲノムＤＮＡを単離すること、および前記単離されたＤＮＡにＰＣＲを行うことの、試料の遺伝子型プロファイリングの方法もまた含む。別の実施形態では、前記試料は、土壌、水、下水、食品、農作物、医薬品、および化粧品からなる群から選択される（一般的には、て在的に死細胞および／または生細胞の混合物を含む任意の試料）。この方法は、ヨウ化プロピジウムおよび誘導体が膜の完全性を評価するように作用する任意の生物で作用すると考えられる。これには、真核細胞および真菌が包含されよう。別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体はＰＭＡである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
詳細な説明
生細胞と死細胞とを識別する新しい方法が開発された。この方法は、生細胞と死細胞との両方を含む混合群集のうち生きている部分に診断分析を限定する新規な化学物質（プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ））を用いて、試料の迅速かつ実施容易な処置を行うことからなる。病原体からの潜在的リスクは、細菌群集の生きている画分に通常限定されることから、この識別は、例えば微生物病原体の診断に不可欠である。生死の識別の定義は、膜の完全性に基づき、これは、生細胞と死細胞とを識別する十分に受け入れられた基準である。無傷細胞膜を有する細胞は、（代謝反応を行う潜在性または複製する潜在性をもつことから）「生きている」とみなされ、損傷した膜を有する細胞は「死んでいる」とみなされる。
【００１４】
従来、リスク評価は、培養に基づくアプローチまたは平板計数を用いて行われた。計数されたコロニーが多いほど、多くの病原体が元の試料中に存在すると推定された。しかし、長いインキュベーション時間（数日の範囲）から問題が生じ、この方法を適時の警告および予防措置を行うには不適切にする。さらに、一部の生物がまだ生存可能であっても、ある状況で複製する能力を失うことがあることが、研究から近年発見された。これらの「生存可能であるが培養可能ではない」（ＶＢＮＣ）細菌は、従来の培養を用いて検出することができないが、より適切な環境に移行すると増殖する能力を再獲得しうる。これらの生物の遺伝物質／ＤＮＡの検出に基づく分子アプローチを適用することによって、これらの２つの欠点を理論的に解決することができた。分子診断の近年の進歩は、研究者が数日どころか数時間以内に標的ＤＮＡの有無を分析することを可能にする。これらの技法は、ＶＢＮＣ状態の細菌を標的にすることもまたできる。しかし、主な欠点の１つは、ＤＮＡに基づく方法が生細菌と死細菌とを判別できないことである。この問題は、多数の分野にこれらの方法を適用することを妨害した。細胞が死んだ後のＤＮＡの残留が原因で、ＤＮＡに基づく定量は、病原体のリスクの実質的な過大評価をもたらすことがあるし、偽陽性の結果を与えることもある。細胞が死んだ後にＲＮＡが急速に分解することから、さらに不安定なバージョンの遺伝物質であるＲＮＡの検出によりこの問題は回避されるであろうが、分子標的として使用する場合には、まさにその不安定性が技術的問題を招く。分子技法を用いた細菌の迅速同定と、生生物と死生物とを識別する能力とを組み合わせることが最適であろう。本発明は、生細胞および死細胞を含有する混合物由来の死細胞のＤＮＡを、分子検出から選択的に排除するための新規な化学物質および方法を提供する。言い換えると、本発明は、混合細胞の無傷の未損傷細胞膜を有する部分に、分子診断を選択的に限定させる。
【００１５】
本発明は、膜完全性が損傷した「死」細菌細胞にのみ浸透し、無傷細胞膜／細胞壁を有する生細胞には浸透しないことにおいて高度に選択的な、新規なフェナントリジウム誘導体を提供する。本明細書に使用する「誘導体」という用語は、フェナントリジウムを１つまたは複数の化学試薬と反応させることによって、フェナントリジウムから作られる任意の化合物を表す。この用語は、フェナントリジウム環を種々の官能基で置換して、例えばアジド、酸、エステル、アミド、またはその任意の他の生成物を形成させることによって得ることができる任意の生成物もまた表す。フェナントリジウム誘導体には、１つまたは複数の芳香環、典型的には炭素環式芳香環が包含されることがある。芳香環は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、または３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルでありうる。本明細書において、アリールは、フェニルまたはナフチル基であり、ヘテロアリール置換基は、５または６員ヘテロ芳香環であり、ここで、そのヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳである。フェナントリジウム誘導体は、ハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルで置換されていてもよく、ここで、各アルキル基は、１〜６個の炭素を有する。フェナントリジウム誘導体は、アジド基、置換もしくは非置換のフェニル、フェニルナフチル、または３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルで好ましくは置換されている。さらに好ましくは、フェナントリジウム誘導体は、１つまたは複数のアジド部分を含み、６位がフェニルで置換されている。有用なフェナントリジウム誘導体の具体例は、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）およびエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）である。さらに好ましくは、この化合物は、フェナントリジウム、３−アミノ−８−アジド−５−［３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル］−６−フェニル二塩化物である。本発明に利用される化合物の重要な一特徴は、それがＤＮＡなどの核酸を改変できることである。この改変の性質は、共有架橋結合であると考えられるが、そのような改変された核酸のＰＣＲ増幅を妨害する任意の他の性質の改変でもまたありうる。この改変は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）が関与する他の酵素過程を妨害する可能性もまた有する。
【００１６】
したがって、本発明の一実施形態は、死細胞を生細胞から識別する方法を含み、その方法は、生細胞および死細胞の混合物を式（Ｉ）のフェナントリジウム誘導体暴露  
【００１７】
【化１】
2009528058.tif 000003
【００１８】
［式中、
環Ａは、少なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環を含む縮合多環式環であり、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ−アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ−アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される］
またはそのモノもしくはビスハライド塩に暴露することを含む。
【００１９】
別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体は、式（ＩＩ）の構造：
【００２０】
【化２】
2009528058.tif 000004
【００２１】
［式中、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ−アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３は、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、またはカルボキシアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ−アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される］
を有するか、またはそのモノもしくはビスハライド塩である。
【００２２】
別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体は、式（ＩＩＩ）の構造：
【００２３】
【化３】
2009528058.tif 000005
【００２４】
［式中、
Ｒ１は、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、またはテトラ−アルキルアンモニウムであり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、または３から１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のシクロアルキルであり、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立して、水素または１から６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、水素、ハライド、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、アルコキシ、カルボキシアルキル、１から６個の炭素原子を有するアルキル、１から６個の炭素原子を有するペルフルオロアルキル、アジド、およびテトラ−アルキルアンモニウムからなる群から独立して選択される］
を有するか、またはそのモノもしくはビスハライド塩である。
【００２５】
別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体は、３−アミノ−８−アジド−５−エチル−６−フェニルフェナントリジウムヨウ化物、３−アミノ−８−アジド−５−エチル−６−フェニルフェナントリジウム臭化物、３−アミノ−８−アジド−５−エチル−６−フェニルフェナントリジウム塩化物、３−アミノ−８−アジド−５−（３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）−６−フェニルフェナントリジウム二ヨウ化物、３−アミノ−８−アジド−５−（３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）−６−フェニルフェナントリジウム二臭化物、および３−アミノ−８−アジド−５−（３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル）−６−フェニルフェナントリジウム二塩化物からなる群から選択される。別の実施形態では、フェナントリジウム誘導体は、式ＩＶに示すＰＭＡ（プロピジウムモノアジド）である。
【００２６】
【化４】
2009528058.tif 000006
【００２７】
この誘導体には、改変された電荷を有する、既述の化学物質または分子の二量体および多量体もまた包含される。電荷の前記改変は、対イオンを用いて達成することができる。対イオンは、陰イオン、例えばヨウ化物イオン、臭化物イオン、塩化物イオンを形成することができる任意の原子でありうる。
【００２８】
別の実施形態では、前記方法は、前記混合物からゲノムＤＮＡを単離することを含む。別の実施形態では、前記混合物に対してＰＣＲが行われる。別の実施形態では、前記方法は、前記混合物からＲＮＡを単離することを含む。別の実施形態では、前記単離されたＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲが行われる。
【００２９】
死細胞のＤＮＡにインターカレートすると、明るい光への光暴露によって光誘導性アジド基がＰＭＡを共有架橋結合させる。このプロセスは、ＤＮＡを不溶性にして、その後のゲノムＤＮＡ抽出時にその損失を招くおそれがあるし、ＰＭＡ処置が損傷した膜を有する細胞由来のＤＮＡの改変を招き、その改変がそのＰＣＲ増幅の阻害を招くこともある。したがって、生細胞および死細胞の両方からなる細胞集団をＰＭＡ処置に供することで、死細胞由来のＤＮＡが検出不可能になる。本発明は、この方法が、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）に比べて大きな長所を示して、細菌界にわたる広範囲な種に適用することができるという事実を提供する。同じ一般原理がＥＭＡでも効くことが近年示されたが、この化学物質が一部の細菌種の生細胞にもまた透過しうるという事実によって、その全体的な適用は阻まれている。代謝的に活性な細胞からＥＭＡを能動的に搬出している輸送ポンプがあるにもかかわらず、残留ＥＭＡレベルは、これらの細胞からのＤＮＡの実質的な損失をもたらすおそれがある。ＰＭＡの高い電荷は、無傷細胞膜への高い不透過性の根拠となって、ＤＮＡの損失を回避する可能性がある。
【００３０】
本発明は、ＤＮＡ診断を伴う任意および全ての方法、手順、およびプロセスに適用を有する。そのような適用の例には、非限定的に、食品、水の安全、バイオテロ、医療／医薬に関するもの、および／または病原体の検出に関する任意のものが包含される。本発明は、塩化物を用いたモデル病原体の消毒効率のモニターに、ＰＭＡを使用する方法もまた提供し、水工業に主な適用を有する。食品工業では、本発明は、保存料の有効性をモニターするために使用することができる。この方法は、フェナントリジウム誘導体が細胞に進入するのを無傷の膜が排除する限り、および損傷した細胞膜を有する細胞にフェナントリジウム誘導体が進入することができる限り、全ての種類の細胞に適用することができる。ヨウ化プロピジウムが動物、真菌、および寄生生物細胞で作用することが示されたことから、本発明の方法は、全ての細胞に適用できる潜在性を有する。細菌細胞が実施例に例示されているが、本発明の方法は、他の種類の細胞にも適用することができる。
【００３１】
本発明は、膜を破壊し、かつ／または細胞、例えば細菌細胞を死滅させることができる物質の同定のためにもまた使用することができる。保健施設および患者において、多剤耐性生物が隆盛を極め、蔓延していることから、新しい消毒剤および／または抗生物質の同定が今や優先事項である。したがって、本発明は、
ａ．細胞培養物を候補消毒剤および／または抗生物質に暴露すること、
ｂ．前記細胞培養物をフェナントリジウム誘導体にさらに暴露すること、
ｃ．前記試料を前記フェナントリジウム誘導体含有試料と共に光源に暴露すること、
ｄ．前記試料からゲノムＤＮＡを単離すること、ならびに
ｅ．前記単離されたＤＮＡにＰＣＲを行うこと、
次に、ＰＣＲの結果を前記消毒剤処置培養物と未処理培養物との間で比較することを含む、消毒剤および／または抗生物質を試験する方法を包括的に含む。一実施形態では、前記細胞培養物は、細菌細胞培養物、真菌細胞培養物、または動物細胞培養物である。別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体はＰＭＡである。ＰＭＡの濃度は、試料の性質によって（細胞数、細胞の種類、細胞の膜の特性、純度、化学物質に対する試料の透過性などに応じて）調整することができる。インキュベーション時間は、試料の性質によって（細胞数、細胞の種類、細胞の膜の特性、純度、化学物質に対する試料の透過性などに応じて）調整することができる。一実施形態では、約２０μＭから約２４０μＭのＰＭＡが、前記細胞培養物に添加される。別の実施形態では、約５０μＭのＰＭＡが、前記細胞培養物に添加される。別の実施形態では、前記細胞培養物は、約１．０から約６０分間ＰＭＡに暴露される。別の実施形態では、前記細胞培養物は、約５分間（または試料の性質に応じていくらか異なる時間）ＰＭＡに暴露される。使用される任意の光源は、化学物質の活性化に必要な波長を含むべきである。別の実施形態では、前記光源は６５０ワットのハロゲンランプである。別の実施形態では、前記細胞培養物からの前記光源の距離は、最小距離から１００ｃｍの範囲である。別の実施形態では、前記細胞培養物は病原体を含むことができる。別の実施形態では、前記細胞培養物は、サルモネラ・エンテリカ、リステリア菌、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群からの生物を含む。別の実施形態では、前記細胞培養物は、１つを超える生物を含む。別の実施形態では、前記消毒剤および／または抗生物質は膜の完全性を損傷する。
【００３２】
この方法は、ツールとして定量ＰＣＲと組み合わせると、細胞を培養して増殖を待つ時間を費やす必要なしに、消毒剤および／または抗生物質の影響を迅速に首尾よく同定することができる。場合によっては、生物を培養するのに数日から数週間かかるため、候補物質が、微生物などの細胞を死滅させることができたかを知るためにかなりの時間がかかることがある。別の場合では、ある種の生物は細胞培養で増殖しないことから、物質が有効であるかどうかを判定することが困難になる。したがって、本発明の方法を適用することは、新規な消毒剤および／または抗生物質を同定するための時間および資源を節約する。本発明の方法は、次亜塩素酸塩、ベンザルコニウム、および熱がいくつかのモデル病原体に及ぼす消毒効力を首尾よくモニターした（下記参照）。
【００３３】
ＤＮＡを改変することに加えて、ＰＭＡはＲＮＡを改変することが示された。したがって、本発明の一実施形態は、
ａ．細胞培養物を候補消毒剤および／または抗生物質に暴露すること
ｂ．前記細胞培養物をフェナントリジウム誘導体にさらに暴露すること
ｃ．前記試料を前記フェナントリジウム誘導体含有試料と共に光源に暴露すること
ｄ．細胞培養物からＲＮＡを単離すること、ならびに
ｅ．単離されたＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを行うこと、
次に、ＲＴ−ＰＣＲの結果を前記消毒剤処理培養物との間で未処置培養物との間で比較することを含む、消毒剤を試験する方法を含む。一実施形態では、前記細胞培養物は、細菌細胞培養物、真菌細胞培養物、または動物細胞培養物である。別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体はＰＭＡである。ＰＭＡの濃度は、試料の性質によって（細胞数、細胞の種類、細胞の膜の特性、純度、化学物質に対する試料の透過性などに応じて）調整することができる。一実施形態では、約２０μＭから約２４０μＭのＰＭＡが、前記細胞培養物に添加される。別の実施形態では、約５０μＭのＰＭＡが前記細胞培養物に添加される。インキュベーション時間は、細胞培養物の性質によって（細胞数、細胞の種類、細胞の膜の特性、純度、化学物質に対する試料の透過性などに応じて）調整することができる。一実施形態では、前記細胞培養物は、約１．０から約６０分間ＰＭＡに暴露される。別の実施形態では、前記細胞培養物は、約５分間（または試料の性質に応じて何か異なる時間）ＰＭＡに暴露される。使用される任意の光源は、化学物質の活性化に必要な波長を含むべきである。一実施形態では、前記光源は６５０ワットのハロゲンランプである。別の実施形態では、前記試料から前記光源の距離は、最小距離から１００ｃｍの範囲である。別の実施形態では、前記培養物は、サルモネラ・エンテリカ、リステリア菌、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群からの生物を含む。別の実施形態では、前記培養物は、１つを超える生物を含む。別の実施形態では、前記消毒剤は、膜の完全性を損傷する。ツールとしてＲＴ−ＰＣＲと組み合わせると、この方法は、細胞を培養して増殖を待つ時間を費やす必要なしに、消毒剤および／または抗生物質を迅速にうまく同定することができる。
【００３４】
本発明による方法の利点は、使用が容易なことである。例えば、これらの方法を使用して、生存可能な細胞、例えば細菌の存在について大量の試料を容易に試験することができる。本発明による方法は、様々なやり方で使用することができる。例えば、無傷細胞膜を有する潜在的な生菌の存在について食品試料（例えば、鶏肉、新鮮な肉、乳、チーズ、野菜、果物、魚など）を試験することができる。別の実施形態では、生存可能な細胞、例えば細菌の存在について環境試料を試験することができる。これらの試料は、例えば土壌から収集することができるし、植物の一部のこともある。本発明による方法は、処理された廃水を放出前後に試験するために、さらに使用することができる。
【００３５】
本発明による方法は、医学的試料、例えば便試料、血液培養物、痰、組織試料（切断片も）、創傷材料、尿、呼吸器からの試料、インプラント、およびカテーテル表面を試験するためにも使用することができる。
【００３６】
本発明による方法の別の適用分野は、食料の管理である。他の実施形態では、食品試料は、乳または乳製品（ヨーグルト、チーズ、スイート・チーズ、バター、およびバターミルク）、飲料水、飲料（レモネード、ビール、およびジュース）、パン製品、または肉製品から得られる。本発明の方法は、食品中の保存料または食品の抗菌処理（低温殺菌など）が、細胞の増殖を阻止したかどうかを判定することができる。本発明による方法のさらなる適用分野は、医薬品、化粧品、例えば、軟膏、クリーム、チンキ、ジュース、液剤、ドロップなどの分析である。
【００３７】
したがって別の実施形態では、本発明は、試料を微生物プロファイリングする方法を含み、その方法は、
ａ．試料を収集すること、
ｂ．前記試料をフェナントリジウム誘導体に暴露すること、
ｃ．前記フェナントリジウム誘導体含有試料を光源に暴露すること、
ｄ．前記試料からゲノムＤＮＡを単離すること、および
ｅ．前記単離されたＤＮＡにＰＣＲを行うこと
を含む。別の実施形態では、前記試料は、土壌、水、下水、食品、農作物、医薬品、および化粧品からなる群から選択される。別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体はＰＭＡである。ＰＭＡの濃度は、試料の性質によって（細胞数、細胞の種類、細胞の膜の特性、純度、化学物質に対する試料の透過性などに応じて）調整することができる。一実施形態では、約２０μＭから約２４０μＭのＰＭＡが、前記試料に添加される。別の実施形態では、約５０μＭのＰＭＡが前記試料に添加される。インキュベーション時間は、試料の性質によって（細胞数、細胞の種類、細胞の膜の特性、純度、化学物質に対する試料の透過性などに応じて）調整することができる。一実施形態では、前記試料は、約１．０から約６０分間ＰＭＡに暴露される。別の実施形態では、前記試料は、約５分間（または試料の性質に応じて何か異なる時間）ＰＭＡに暴露される。使用される任意の光源は、化学物質の活性化に必要な波長を含むべきである。一実施形態では、前記光源は６５０ワットのハロゲンランプである。別の実施形態では、前記試料から前記光源の距離は、最小距離から１００ｃｍの範囲である。別の実施形態では、前記試料は、サルモネラ・エンテリカ、リステリア菌、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群からの生物を含む。別の実施形態では、前記試料は、１つを超える生物を含む。この方法は、土壌、水、下水、食品、農作物、医薬品、および化粧品中の生存可能な生物の迅速検出に使用することができる。
【００３８】
本発明の方法は、適時の警告および予防処置を行うには古い方法を不適切にする、長いインキュベーション時間（数日の範囲）の問題を解決する。加えて、現在のＰＣＲに基づく方法は、偽陽性（ある生物が生存可能でなくてもその生物について陽性の試験結果となる）を与えるおそれがある。さらに、一部の生物がまだ生存可能であっても、ある状況で複製する能力を失うことがあることが、近年研究から発見された。これらの「生存可能であるが培養可能ではない」（ＶＢＮＣ）細菌は、従来の培養を用いて検出することができないが、より適切な環境に移行すると、それらの細菌は増殖する能力を再獲得しうる。これらの欠点は、これらの生物の遺伝物質／ＤＮＡの検出に基づく分子アプローチを、本発明の方法と組み合わせて適用することによって解明される。したがって、試料、例えば汚染された水、下水、食品、医薬品、および／または化粧品中の生存可能な生物に関する素早く正確な結果によって、汚染された製品が公共に放出されることを防止することができる。本発明の方法は、偽陽性（ある病原体が生存可能でなくてもその病原体について陽性の試験結果となる）を最小限にすることおよび試料を迅速に試験することによって、現行の時間のかかる方法に比べて資源を節約することができる。
【００３９】
加えて、本発明の方法は、生態学的研究のため、農業および／または生態系のための特異的な土壌の健康状態のために、微生物群集の潜在的に生存可能なメンバーを同定することができる。伝統的に、細菌群集の同定は、培養に基づくアプローチまたは平板計数を用いて行われてきた。計数されるコロニーが多いほど、多くの細菌が本来の(original)試料に存在すると推定される。しかし、問題は、この方法を適時で正確な結果のためには不適当にする、ときには長いインキュベーション時間（数日の範囲）から生じる。これらの欠点は、本発明の方法でこれらの生物の遺伝物質／ＤＮＡを検出することに基づく分子アプローチを適用することによって解明される。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、試料の微生物プロファイリングの方法を含み、その方法は、
ａ．試料を収集すること、
ｂ．前記試料をフェナントリジウム誘導体に暴露すること、
ｃ．前記フェナントリジウム誘導体含有試料を光源に暴露すること、
ｄ．前記試料からＲＮＡを単離すること、および
ｅ．前記単離されたＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを行うこと
を含む。
【００４１】
別の実施形態では、前記試料は、土壌、水、下水、食品、農作物、医薬品、および化粧品からなる群から選択される。別の実施形態では、前記フェナントリジウム誘導体はＰＭＡである。別の実施形態では、約２０μＭから約２４０μＭのＰＭＡが、前記試料に添加される。別の実施形態では、約５０μＭのＰＭＡが前記試料に添加される。別の実施形態では、前記試料は、約１．０から約２０分間ＰＭＡに暴露される。別の実施形態では、前記試料は、約５分間ＰＭＡに暴露される。別の実施形態では、前記光源は６５０ワットのハロゲンランプである。別の実施形態では、前記光源は、前記試料から約１．０から約１００ｃｍである。別の実施形態では、前記培養物は、サルモネラ・エンテリカ、リステリア菌、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群からの生物を含む。
【００４２】
被験候補消毒剤および／もしくは抗生物質を試験するために、ならびに／または本発明の方法を用いて試料中の潜在的生存能を検出するために使用することができる細菌の非限定的な例は、百日咳菌、レプトスピラ・ポモナ、パラチフス菌ＡおよびＢ、ジフテリア菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、Ｃ．フェゼリおよび他のガス壊疽菌、炭疽菌、ペスト菌、Ｐ．マルトシダ、髄膜炎菌、淋菌、インフルエンザ菌、放線菌属（例えばノカルディア）、アシネトバクター属、バチルス科（例えば炭疽菌）、バクテロイデス属（例えばバクテロイデス・フラジリス）、ブラストミセス、ボルデテラ属、ボレリア属（例えばボレリア・ブルグドルフェリ）、ブルセラ属、カンピロバクター属、クラミジア属、コクシジオイデス属、コリネバクテリウム属（例えばジフテリア菌）、大腸菌（例えば腸毒素原性大腸菌および腸管出血性大腸菌）、エンテロバクター属（例えばアエロゲネス菌）、腸内細菌科（クレブシエラ属、サルモネラ属（例えば腸チフス菌、腸炎菌、セラチア属、エルシニア属、赤痢菌属）、エリジペロスリックス属、ヘモフィルス属（例えばインフルエンザ菌Ｂ型）、ヘリコバクター属、レジオネラ属（例えばレジオネラ・ニューモフィラ）、レプトスピラ属、リステリア属（例えばリステリア菌）、マイコプラズマ属、マイコバクテリウム属（例えばライ菌および結核菌）、ビブリオ属（例えばコレラ菌）、パスツレラ科、プロテウス属、シュードモナス属（例えば緑膿菌）、リケッチア科、スピロヘータ（例えばトレポネーマ種、レプトスピラ種、ボレリア種）、赤痢菌種、髄膜炎菌、肺炎球菌および連鎖球菌属（例えば肺炎球菌ならびにＡ、Ｂ、およびＣ群連鎖球菌）、ウレアプラスマ属、梅毒トレポネーマ、黄色ブドウ球菌、パスツレラ・ヘモリティカ、ジフテリア菌トキソイド、髄膜炎菌多糖、百日咳菌、肺炎球菌、破傷風菌トキソイド、およびウシ型結核菌を含む。上記リストは、説明を意図し、特定の細菌生物の検出に本発明を限定することを決して意図しない。
【００４３】
微生物を検出するための一実施形態はＰＣＲによる。ＰＣＲの一般手順は、米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）および米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）に教示されている。しかし、各増幅反応に使用される最適なＰＣＲ条件は、一般に経験的に決定されるか、または当業者により通常採用されるコンピューターソフトウェアを用いて推定される。いくつかのパラメーターが反応の成功に影響する。それらの中には、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。一般に、ポリメラーゼ反応の前に少なくとも約９５℃で１から１０分間加熱することによって、テンプレート核酸を変性される。９０℃から９６℃の範囲で０．０５から１分間の変性、４８℃から７２℃の範囲の温度で０．０５から２分間のアニーリング、および６８℃から７５℃で少なくとも０．１分間の伸長を用いた約２０〜９９サイクルの増幅が、最適な最終サイクルと共に実行される。一実施形態では、ＰＣＲ反応物は、テンプレート核酸約１００ｎｇ、２０ｕＭの上流および下流プライマー、ならびに０．０５から０．５ｍｍの各種ｄＮＴＰ、ならびに０．５から５ユニットの市販の熱安定ＤＮＡポリメラーゼを含有することができる。
【００４４】
従来のＰＣＲの変形は、逆転写ＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）であり、ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素が最初にＲＮＡ分子を一本鎖ｃＤＮＡ分子に変換し、次に、そのｃＤＮＡ分子をテンプレートとして採用し、ポリメラーゼ連鎖反応のその後の増幅に供する。ＲＮＡの単離は、当技術分野において十分に公知である。ＲＴ−ＰＣＲを実施するときに、一般に標的核酸を熱変性させた後の反応試料に逆転写酵素を添加する。次に、反応物を適切な温度（例えば３０〜４５℃）で十分な時間（１０〜６０分間）維持して、ｃＤＮＡテンプレートを作製してから、予定した増幅サイクルを行う。定量的な結果を望むならば、増幅された核酸の相対コピーを維持または管理する方法を使用するように注意しなければならないことを、当業者は認識しているであろう。「定量」増幅の方法は当業者に十分に公知である。例えば、定量ＰＣＲは、同じプライマーを使用して公知量の対照配列を同時増幅することを伴うことができる。これは、ＰＣＲ反応を較正するために使用することができる内部標準を提供する。
【００４５】
ＰＣＲの別の代替は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。ｑＰＣＲは、小さな挿入または欠失により標的とサイズが異なる内部相同対照を採用する競合技法によって運転することができる。しかし、非競合的動態的定量ＰＣＲもまた使用することができる。リアルタイム、動態的ＰＣＲ検出と、標的配列と並行して同時に検出することができる内部相同対照との組合せである。
【００４６】
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、および／またはｑＰＣＲ用のプライマーは、特異的細菌の領域内から選択され、そのプライマーは、その特異的生物について選択されるＤＮＡ領域を専ら増幅する。あるいは、全ての生物で共通のＤＮＡ区域にハイブリダイズし、それを増幅するプライマーが選択される。プライマーの選択および構築は、一般に当技術分野において公知である。一般に、１つのプライマーは増幅される配列の各末端に局在する。そのようなプライマーは、通常は１０から３５ヌクレオチド長であり、１８から２２ヌクレオチドの好ましい長さを有する。増幅することができる最短の配列は、約５０ヌクレオチド長である（例えば、配列中の局在位置が、少なくとも１０ヌクレオチドで分離されている共に２０ヌクレオチド長のフォワードおよびリバースプライマー）。さらに長い配列も増幅することができる。１つのプライマーは、「フォワードプライマー」と呼ばれ、増幅される領域の左端に局在する。フォワードプライマーは、（慣例的に二本鎖ＤＮＡを図示し、上側鎖を５’から３’方向の方向性で示したとき）ＤＮＡの上側鎖の領域と配列が同一である。フォワードプライマーの配列は、ＤＮＡの上側鎖に相補的なＤＮＡ鎖にハイブリダイズする配列である。もう一方のプライマーは、「リバースプライマー」と呼ばれ、増幅される領域の右端に局在する。リバースプライマーの配列は、ＤＮＡの上側鎖の領域と配列が相補的な配列であり、すなわち、リバースプライマーの配列は、ＤＮＡの上側鎖の領域における配列の逆相補体である。リバースプライマーは、ＤＮＡの上端にハイブリダイズする。
【００４７】
いくつかの他の条件に従うようにもまた、ＰＣＲプライマーを選択するべきである。ＰＣＲプライマーは、テンプレート中の１つを超える領域へのハイブリダイゼーションを最小にするために十分長い（好ましくは１０から３０ヌクレオチド長）べきである。単一の塩基の長い連なりを有するプライマーは、可能ならば避けるべきである。プライマーは、好ましくは４０から６０％の間のＧ＋Ｃコンテントを有するべきである。可能であれば、プライマーの３’末端のＧ＋Ｃコンテントは、プライマーの５’末端のＧ＋Ｃコンテントよりも高いべきである。プライマーは、そのプライマー内の別の配列にハイブリダイズすることができる配列（すなわちパリンドローム）を含有してはならない。同じＰＣＲ反応で使用される２つのプライマーは、相互にハイブリダイズできてはならない。ＰＣＲプライマーは、上記推奨に従うように好ましくは選択されるが、プライマーがこれらの条件を満たすことは不必要である。他のプライマーも機能し得るが、よい結果を得るチャンスは低い。
【００４８】
所与の配列内のＤＮＡを増幅するために使用することができるＰＣＲプライマーは、利用できるいくつかのコンピュータープログラムの１つを用いて選択することができる。そのようなプログラムは、所与の配列の増幅に最適なプライマーを選択する（すなわち、そのようなプログラムは、上に言及した条件に、かつＰＣＲプライマーの機能性を最大にしうる他の条件に従うプライマーを選択する）。１つのコンピュータープログラムは、ＰＣＲプライマー選択のためのルーチンを有するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧは最近Ａｃｃｅｌｒｙｓに改名した）解析パッケージである。
【００４９】
下記に開示するオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、いくつかの方法で作ることができる。これらのオリゴヌクレオチドを作る一方法は、市販の核酸合成装置を使用してそれらを合成することである。そのような多様な合成装置が存在し、当業者に十分に公知である。
【００５０】
ＰＣＲの別の代替は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を検出するための等温核酸増幅アッセイである。核酸の等温増幅についての非限定的な例は、ＤＮＡ分析物の同種リアルタイム鎖置換増幅、ＤＮＡ配列決定用のテンプレートのＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼに基づくローリングサークル増幅、ＰＮＡオープナーにより支援される二本鎖ＤＮＡ配列のローリングサークル増幅、またはループ介在性等温増幅である。
【００５１】
核酸は、ハイブリダイゼーション法によってもまた検出することができる。これらの方法では、標識または未標識核酸プローブを含有する支持体に標識核酸を添加することができる。あるいは、標識核酸プローブを含有する支持体に未標識または未標識核酸を添加することができる。ハイブリダイゼーション法は、例えばＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｒｃ  Ｓｃｈｅｎａ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニュージャージー州ホーボーケン、２００３年に開示されている。
【００５２】
核酸を検出する方法は、標識の使用を包含することができる。例えば、放射性標識は、写真フィルムまたは（放射性リン酸の取込みを検出および定量するための）フォトイメージャーを使用して検出することができる。光検出器を使用して蛍光マーカーを検出および定量して、放射した光を検出することができる（装置の例については米国特許第５，１４３，８５４号参照）。酵素標識は、典型的には酵素に基質を供給し、基質に及ぼす酵素の作用により生成した反応産物を測定することによって検出する。比色標識は、呈色した標識を単に視覚化することによって検出する。
【００５３】
一実施形態では、増幅した核酸分子は、核酸インターカレート色素で増幅生成物を直接染色することによって視覚化する。当業者に明らかなように、色素の例には、非限定的に、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、および臭化エチジウムが包含される。増幅したＤＮＡ分子にインターカレートした発光色素の量は、増幅生成物の量に直接比例し、増幅生成物の量は、ＦｌｕｒｏＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）または他の等価の装置を製造業者の説明書通りに使用して好都合に定量することができる。そのようなアプローチの変形は、増幅生成物のゲル電気泳動後に染色を行い、選択したインターカレート色素を視覚化することである。あるいは、標識したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ（例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブなどの蛍光プローブおよび比色プローブ）を使用して、増幅を検出することができる。所望であれば、配列決定によって、または増幅生成物が推定されるサイズを有すること、推定される制限消化パターンを示すこと、もしくは正しくクローニングされたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを実証することによって、試験される生物学的実体を代表するゲノム配列の特異的増幅を検証することができる。
【００５４】
本発明は、キットもまた含む。例えばキットは、生物に特異的または全般的に対応する核酸分子を増幅するために有用なプライマー、フェナントリジウム誘導体（例えばＰＭＡ）、ＤＮＡを単離するための緩衝剤および試薬、ならびにＰＣＲ用試薬を含むことができる。このキットは、関心対象の生物に対応するポリペプチドをコードしている核酸配列にハイブリダイズする、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドもまた包含することができる。このキットは、対照試料または一連の対照試料もまた含有することができ、その対照試料をアッセイし、含有される被験試料と比較することができる。キットの各構成要素は、個別の容器の中に封入することができ、単一のパッケージ内に、様々な容器の全てが、そのキットを使用して行うアッセイの結果を解釈するための説明書と共に入っていてもよい。
【００５５】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、この実施例は、限定と解釈されてはならない。本出願全体にわたり引用された全ての参考文献、特許、および公開された特許出願、ならびに図および配列リストの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００５６】
材料および方法
細菌株および培養条件。本研究に使用した細菌株はグラム陰性菌４種およびグラム陽性菌５種を含むが、それらを対応する培地および増殖温度と共に表１に挙げる。典型的には、寒天画線平板からの単一コロニーを、対応する培地約１０ｍｌを含有する５０ｍｌ培養管に継代した。この培養物を１８０ｒｐｍの振盪培養器で所与の増殖温度で対数期まで増殖させた。定量ｑＰＣＲを伴う実験では、ＬＢ液体培地で希釈することによって大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７培養物の吸光度をＯＤ６００が１になるように調整した。
【００５７】
死滅条件。５００μｌの一定分量中の細胞を、イソプロパノール（終濃度７０％）に１０分間暴露することによって死滅させた。５０００ｇで５分間の遠心分離を用いて細胞を採集することによってイソプロパノールを除去し、それから対応する培地５００μｌに再懸濁した。イソプロパノール処理の代わりとして、それぞれ８５℃および７２℃に１５分間加熱することによって、マイコバクテリウム・アビウムおよびミクロコッカス・ルテウスの細胞を死滅させた。所定の比の生存可能な細胞および死細胞に及ぼすＰＭＡの影響を検討するために（図４）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を７２℃に１５分間暴露することによって加熱死滅させてから、未処理細胞と所与の比率で混合した。生存能の減少は、細胞懸濁液５μｌを対応する寒天平板に画線し、続いて最適増殖温度でインキュベーションすることによって検討した。
【００５８】
ＰＭＡおよびＥＭＡの架橋結合形成。ＰＭＡ（フェナントリジウム、３−アミノ−８−アジド−５−［３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル］−６−フェニル二塩化物、Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード））およびＥＭＡ（フェナントリジウム、３−アミノ−８−アジド−５−エチル−６−フェニル臭化物、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ヘイワード））を２０％ＤＭＳＯに溶かし、２０ｍＭの濃縮原液またはその希釈液を作り、暗条件で−２０℃で保存した。ＰＭＡを５００μｌ分量の培養液に終濃度３、３０、５０、または２４０μＭまで添加した。ＰＭＡ希釈液のＤＭＳＯ含量は、暴露された細胞についての最終ＤＭＳＯ濃度が同一になるように選択した。時々混合しながら暗条件で１から１５分間のインキュベーション時間の後で、試料管から２０ｃｍの所に置いた６５０Ｗハロゲン光源を使用して、試料を５秒から２分間光暴露した。暴露の間は、過度に加熱することを避けるために試料を氷上に置いた。光誘導性架橋結合形成後に、５０００ｇで５分間細胞をペレットにしてからＤＮＡを単離した。最適化実験を完了した後で、ＰＭＡを終濃度５０μＭになるまで添加し、５分間インキュベートしてから２分間光暴露した。結果をＰＭＡ実験との比較に値するようにするために、ＥＭＡを用いた実験に同じ濃度（５０μＭ）および手順を適用した。
【００５９】
ＤＮＡの単離および定量。ゲノムＤＮＡは、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ土壌キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を製造業者の説明書通りに使用して抽出した。ＦａｓｔＰｒｅｐ機（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用した速度設定４．５ｍ／ｓで２５秒間のビーズ撹拌によって純粋培養物の細胞溶解を達成した。ＤＮＡは、標準として大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（中間範囲のＧＣコンテント）由来ゲノムＤＮＡを使用して、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、米国オレゴン州ユージーン）およびＴＢＳ−３８０蛍光光度計（Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サニーヴェール）を用いてＤＮＡを定量した。蛍光光度計で得られた定量結果を、臭化エチジウム染色した１％アガロースゲルで視覚化した高分子量ゲノムＤＮＡのバンド強度と比較した。対応する合計溶出体積の７から１０％をゲルに負荷した。
【００６０】
定量ＰＣＲ。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７培養物から抽出したＤＮＡの相対定量のために、志賀様毒素１をコードするｓｔｘ１遺伝子を遺伝子標的として使用した。１μｌの抽出ゲノムＤＮＡならびに終濃度で１×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧＯＬＤ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３μＭのプライマーｓｔｘ１−フォワード（５’−ＧＡＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＧ−３’、１６、配列番号１）、０．３μＭのプライマーｓｔｘ１−リバース（５’−ＡＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣ−３’、１６、配列番号２）、０．１５μＭのｓｔｘ１−プローブ（５’−ＴＧＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＧＣＴＣＴＧＣＡＡＴＡＧＧＴＡＣＴＣ−３’、１６、配列番号３）、および２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する合計体積２５μｌでｑＰＣＲを行った。ｓｔｘ１プローブは、５’−レポーターとして６−ＦＡＭを、３’−クエンチャーとしてＢＨＱ１を有した。サイクリング・パラメーターは、９５℃で８分間、続いて９５℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２５秒間を４５サイクルであった。
【００６１】
ｑＰＣＲおよびデータ解析は、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、カリフォルニア州サニーヴェール）を用いて行った。サイクル閾値（Ｃｔ）は、二次導関数法を用いたＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアによって自動的に計算した。
【００６２】
統計解析。図の誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。
【００６３】
蛍光顕微鏡法。１．２５μｌの色素ＳＹＴＯ９（ＤＭＳＯ中３．３４ｍＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、１．２５μｌのＰＭＡまたはＥＭＡ（共に２０％ＤＭＳＯ中２０ｍＭ、Ｂｉｏｔｉｕｍ  Ｉｎｃ．）のいずれかと共に、５００μｌ分量の培養液に添加することによって、顕微鏡用に細胞を染色した。ＳＹＴＯ９は、一般に全ての細菌を緑色の集団に染色するが、ＰＭＡおよびＥＭＡは、これらの色素が細胞壁／膜を浸透することができるならば細胞を赤色に染色する。混合後、試料を顕微鏡用スライドに載せた。色素を添加してから５分後に、１００×１．４ＮＡ油浸対物レンズならびにＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣ蛍光フィルターセット（それぞれｅｘ４８０／３０、ＤＭ５０５、ｅｍ５３５／４０、およびｅｘ５４６／１０、ＤＭ５７５、ｅｍ５９０）を使用して、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００顕微鏡で顕微鏡写真を撮った。視覚化用に使用したソフトウェアは、ＭｅｔａＶｕｅバージョン６．１（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ、米国ペンシルベニア州ダウンニングトン）であった。
【実施例２】
【００６４】
純粋なＤＮＡを使用したＰＭＡ／ＤＮＡ架橋結合形成の最適化
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７から抽出したゲノムＤＮＡ溶液にＰＭＡを添加し、続いて０秒から１２０秒までの漸増する時間、光暴露させた。ｓｔｘ１遺伝子を標的とするプライマーおよびプローブを使用した定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）用のテンプレートとして、１．０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液１．０μｌを使用した。漸増する光暴露時間は高い閾値サイクル（Ｃｔ値）をもたらしたが、これは、バックグラウンドを超えたシグナルを検出するにはより多くサイクルが必要であったことを意味している。このＣｔ値の増加は、ＰＣＲ増幅の阻害が漸増することを示した。図１は、ＰＭＡ処理ＤＮＡのシグナル減少を光暴露時間の関数として、未処理ＤＮＡの増幅に比べて図示したものである。シグナル減少の最も大きな増大は、最大３０秒間の光暴露で観察され、それよりも長い暴露時間では阻害曲線が平らになった。３および３０μＭ両方のＰＭＡ濃度では同一の傾向が観察された。３μＭのＰＭＡが３０μＭのＰＭＡよりもＰＣＲ増幅の大きな阻害をもたらしたという事実は、単にＭｇ２＋濃度に依存した。この特定のＰＣＲ反応について、種々のＭｇ２＋濃度がＣｔ値に大きな影響を及ぼした（データは示さず）。６０μＭ以上のＰＭＡ濃度は、光暴露時間とは無関係にＰＣＲ反応の完全阻害を招いた（データは示さず）。
【００６５】
光分解（すなわちＤＮＡに結合していない遊離ＰＭＡの不活性化）の効率は、漸増する時間３および３０μＭのＰＭＡ溶液を光暴露してからＤＮＡを添加することによって検討した。ＤＮＡの添加後に、この混合物をもう１分間光暴露し、ＤＮＡへの残りの活性ＰＭＡの架橋結合形成を達成し、続いてｑＰＣＲを行った。遊離ＰＭＡの不活性化時間が漸増すると、ＰＭＡ不在下の同一試料に比べて漸減するシグナル減少が生じた（図２）。３μＭの場合、１２０秒の不活性化時間で、ＰＭＡおよび非ＰＭＡ含有試料の間の差が縮小した。
【００６６】
上記結果を考慮して、ＤＮＡへのＰＭＡの最大結合を保証すると同時に、ＤＮＡに結合しなかった遊離ＰＭＡの最大不活性化を達成するために、１２０秒間の光暴露時間を選択した。後者の遊離ＰＭＡの最大不活性化は、ＰＭＡで細胞を処理した場合に、活性なＰＭＡが溶液中に残存していないことを確実にするために重要である。残存した活性ＰＭＡは、細胞溶解ステップの後に生存可能な細胞由来のＤＮＡに結合するおそれがある。
【実施例３】
【００６７】
細胞を使用したＰＭＡアッセイの最適化
モデル生物として大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（代表的グラム陰性細菌として）およびストレプトコッカス・ソブリヌス（代表的グラム陽性細菌として）を選択し、細胞を処理するためのＰＭＡ濃度およびインキュベーション時間を最適化した。対数期の培養物を分割し、半分を７０％イソプロパノールに供して、生存能を完全に失わせた。死滅効率は、生存可能な陽性対照と一緒に適切な培地で平板培養することによって検討した。ＰＭＡは、３、３０、または２４０μＭの終濃度まで添加した。３０μＭは、ＢａｃＬｉｇｈｔ生死染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に使用するＰＩ濃度に対応し、２４０μＭは、以前の研究に使用されたＥＭＡ濃度に等しい１０、１１、１３、１４。図３Ａおよび３Ｂは、一定分量のＰＭＡ処理培養物のＤＮＡ収率を、対応する一定分量の未処理性細胞または死細胞からのＤＮＡ収率に対して示したものである。３０および２４０μＭは効率的に死細胞からＤＮＡを除去したが、３μＭでも有意なＤＮＡバックグラウンドがあった。インキュベーション時間（１、５、または１５分間）は、ゲノムＤＮＡの収率に余り影響しなかったが、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を２４０μＭのＰＭＡに暴露した場合には、１５分間は中程度のＤＮＡ損失を招くと思われた。以下の実験について、５０μＭのＰＭＡ濃度および５分間のインキュベーション時間を選択した。
【実施例４】
【００６８】
生存可能な細胞および死細胞の所定の比に及ぼすＰＭＡの影響
ＰＭＡ処理後の、生存可能な細胞の比率、ＤＮＡの収率、およびｑＰＣＲシグナルの間の関係を解明するために、所定の比の生存可能な細胞および死細胞を有する混合物を使用した。一定分量の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を７２℃で１５分間の熱処理に供し、培養可能な細胞数をゼロに減少させた。加熱死滅した細胞を元の未処理培養物と所定の比で混合し、培養可能で生存可能な細胞が総細菌細胞のそれぞれ０、０．１、１、１０、５０、および１００％に相当するようにした（図４Ａ）。混合物ＩからＶＩからのＤＮＡ収率は、ＰＭＡ未処理と比較可能であり、ＰＭＡ暴露後、未ストレス細胞および生存可能な細胞の比率の増加により、ゲノムＤＮＡ収率の実質的な増加（図４Ｂおよび４Ｃ）およびｑＰＣＲにおけるＣｔ値の減少がもたらされた（図４Ｄ）。最高のＣｔ値、すなわち最大のシグナル減少は、加熱死滅大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のみを含有する試料Ｉで観察された。ＤＮＡ収率（最高値に対するパーセント）の自然対数をＣｔ値に対してプロットすると、０．９７４２のＲ２値の対応する趨勢線で一次相関することが明らかになった（図４Ｅ）。これは、生細胞からの全てのＤＮＡが増幅可能であると思われたことを示唆した。
【実施例５】
【００６９】
ＰＭＡとＥＭＡとの間の比較およびさらに多数の種を用いたＰＭＡ生死アッセイの評価
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７について、ＰＭＡおよびＥＭＡ処理により死細胞からゲノムＤＮＡを効率的に除去することが、それぞれこの研究および以前の研究で説明された１０。２つの化学物質の間の差は、主にそれらの選択性にある。生きている大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＥＭＡ処理がゲノムＤＮＡの６０％超の損失をもたらしたが１０、ＰＭＡはこの問題を回避すると思われる。この結果を、色素ＳＹＴＯ９／ＰＭＡまたはＳＹＴＯ９／ＥＭＡの組合せを用いた顕微鏡観察によって確証した（図５Ａ）。ＳＹＴＯ９は、無傷細胞膜および損傷細胞膜を有する細胞の両方を全て緑色に染色することが公知である。細胞が対応する色素を取り込む場合には、この緑色は、ＥＭＡまたはＰＭＡに由来する赤色と混じる。死細胞はＰＭＡおよびＥＭＡの両方で赤色に染まった。対照的に、生細胞は、ＥＭＡを用いた５分間暴露が赤色染色をもたらしたが、ＰＭＡ処理後に細胞がまだ緑色であった点で差を示した。これは、無傷の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞膜がＰＭＡを効率的に排除できるがＥＭＡは排除できないことを示唆している。この説明は、ＥＭＡ処理後に生細胞からＤＮＡが減少するが、ＰＭＡはその収率に影響しないことを説明する。
【００７０】
より広いスペクトルの細菌種にこの方法の適用することをさらに検討するために、表２に示す細菌について生細胞および死細胞に及ぼすＰＭＡの影響を（ＥＭＡに比べて）試験した。試験した全ての種について、ＰＭＡは生細胞由来のＤＮＡの収率に影響しなかったが、死細胞由来のＤＮＡは、ＤＮＡ抽出手順の間に効率的に除去された（図５Ｂ）。他方でＥＭＡは、死細胞からＤＮＡを除去するのに等しく効率的であったが、未処理細胞またはＰＭＡ処理細胞に比べて生細胞からのＤＮＡの収率もまた部分的に減少させた。
【００７１】
検討した全ての種からの死細胞は、ＰＭＡまたはＥＭＡの両方で効率的に赤色に染まった（データは示さず）。ＳＹＴＯ９／ＰＭＡの組合せまたはＳＹＴＯ９／ＥＭＡの組合せで処理した生細胞から得られた顕微鏡写真は、検討した任意の種でＰＭＡが生細胞に透過しなかったことを示した（図５Ｂ）。他方でＥＭＡは、（赤色で見られるように）死細胞および生細胞の両方を部分的に透過することができたが、染色は死細胞の場合の方が効率的に見えた。霊菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス・シリンゲは、ＥＭＡ取込みに最も抵抗性の種であった。ＳＹＴＯ９／ＥＭＡで染色されたこれらの種の生細胞は、５分後に緑色に見えた。
【００７２】
本発明は、明るい可視光への短時間暴露で有機分子に化学的架橋を形成することができる、フェナントリジン環に付加したアジド基を有する、化学的に改変されたバージョンのヨウ化プロピジウムを紹介する。ＰＭＡは、ＰＩと同様に、生細胞の膜に透過しないと思われ、透過化細胞によって効率的に取り込まれる。一度細胞内に入ると、この色素は二本鎖核酸にインターカレートする。結合すると、光誘導性架橋がＤＮＡを不溶性にし、細胞の破片と共にＤＮＡ抽出手順の間にその損失を招き、あるいは、ＰＭＡ処理は、損傷した膜を有する細胞由来のＤＮＡの改変を招き、その結果そのＰＣＲ増幅が阻害される。生細胞および死細胞を含有する細菌混合物の場合には、生細胞由来の残りのＤＮＡは、定量、ｑＰＣＲ、またはおそらくマイクロアレイ分析を包含するさらなる下流の分析に従う。
【００７３】
生細胞由来のＤＮＡの選択的分析は、モデル生物として大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、ネズミチフス菌、リステリア菌、およびカンピロバクター・ジェジュニを使用してＥＭＡについて最初に記載されたが１１、１３、１４、ＰＭＡは、選択性の増加の点から見てＥＭＡに勝る。この研究で検討した大部分の様々な細菌種の生細胞は、以前の研究で使用した濃度の約４．８分の１のＥＭＡ濃度を用いたときにＥＭＡで赤色に染まった１１、１３、１４。この知見は、ＥＭＡが一般に膜不透過性とみなすことができないことの基礎となる。ＥＭＡは、死細胞または損傷した細胞にのみ優先的に透過することが報告されたが１１、１３、１４、これは、選択された細菌種について、短い暴露時間でのみ当てはまる可能性がある。本明細書に提示したデータは、生きている大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞のＥＭＡ処理が、ＤＮＡ抽出手順の間にゲノムＤＮＡの６０％超の損失をもたらすことを示す以前の結果と一致する１０。さらに、ＥＭＡは、アノキシバチルスの生死の区別に適さないことが最近示された１２。生存可能なアノキシバチルスをＥＭＡで処理し、続いてＤＮＡを抽出した後に、ＰＣＲ阻害が観察されたが、これは、この薬剤がこれらの細胞の膜に透過し、光分解時にＤＮＡと共有結合的に架橋したことを示している。加えて本明細書に論じるように、黄色ブドウ球菌、リステリア菌、ミクロコッカス・ルテウス、マイコバクテリウム・アビウム、およびストレプトコッカス・ソブリヌスについて生細胞のＥＭＡ処理によるＤＮＡの顕著な損失。
【００７４】
生細胞によるＥＭＡの取込みは、野生型大腸菌における同一構造の臭化エチジウム（ＥＢ）の取込みを検討する研究と一致する。純取込みは、完全透過化細胞の純取込みのわずか数パーセントにしか達しなかったものの、ＥＢもまた生存可能な細胞によって取り込まれることが示された４。この理由は、代謝的に駆動される流出ポンプの活性から分かる。代謝阻害剤は、流出活性を低下することが示された。ＴＲＩＳまたはＥＤＴＡの存在下での寒冷ショックへの細胞の暴露（０℃で３０分間）は、ＥＢの純取込みを完全透過化細胞の取込みに類似したものに導いた４。この理由から、化学物質を能動排除することができる代謝的に活性な細菌を同定するためのフローサイトメトリー研究に、ＥＢが使用される８、９。
【００７５】
ＥＭＡに関して同じメカニズムを仮定すると、これらの成果から、対数期培養物由来の生存可能な細胞がＥＭＡで赤色に染まったという観察が説明されよう。そのような搬出システムによるＥＭＡの能動排出を用いても、かなりの量の色素が細胞中にまだ残存しているおそれがある。このことで、未処理またはＰＭＡ処理細胞に比べたＥＭＡ処理生細胞由来のＤＮＡの有意な損失が説明されよう。ネズミチフス菌および霊菌は、ＤＮＡを全く損失せずにＥＭＡ処理に供することができる、検討された種のうちわずかな種と思われた。この理由は、流出メカニズムがより効率的であること、または細胞膜の透過性が低いことである可能性がある。これらは、ＥＭＡ染色に最も抵抗性の種でもあった。シュードモナス・シリンゲは、ＥＭＡで極く穏やかに染まり、これは、抽出時のある程度のＤＮＡ損失と相関すると思われた。しかし、様々な種の膜透過性が明らかに変動することから、微生物診断における生死の区別にＥＭＡを全般に適用することが妨げられる。ＰＭＡは、ＥＭＡに比べて生細胞に浸透しないという重大な利点を有すると思われる。ＰＭＡの有意に高い選択性の理由は、分子の高い電荷に関連するという見込みが最も高い（ＥＭＡは１つの正電荷を有し、ＰＭＡは２つ有する）。
【００７６】
本発明は、ＰＩ分子へのアジド基の付加が、その透過特性を変化させないことを示している。ＰＩは、顕微鏡での生死の判別に最も通常使用されている色素であり、この研究に使用した細菌を包含する広域スペクトルの細菌で専ら試験されてきた。ＰＩは、さらにフローサイトメトリーに広く使用されている８、９、１５。繁殖的に生存可能、代謝的に活性、無傷細胞、および透過化細胞という４つの生理学的状態が、蛍光染色を使用してフローサイトメトリーで識別されることは指摘する価値がある８。後者の透過化細胞のみがヨウ化プロピジウムを取り込む。無傷細胞膜を有さないことに加えて、これらの細胞は脱分極し、エネルギーを断たれる。透過化細胞以外の全ては、適切な条件で蘇生することができると示されたが、ＰＩ陽性の細胞は回復しなかった８。後者の亜集団からＤＮＡを排除することは、回復の潜在性を有する細胞に分析を限定することを助けるであろう。
【実施例６】
【００７７】
消毒剤を試験するための材料および方法
この研究の目的は、異なる消毒法を用いて死滅効力をモニターするＰＭＡ法の適用性を評価することであった。一般的なヒト病原体であるネズミチフス菌、リステリア菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、およびマイコバクテリウム・アビウムの純粋培養物をモデル生物として使用した。次亜塩素酸塩、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、ＵＶ、および熱による処理を典型的な消毒法として選択した。高い酸化能を有する塩素は、飲料水および廃水処理の両方で最も一般に使用されている抗菌消毒法の１つである。塩素は、食品および食品加工環境の表面衛生ならびに健康管理にもまた広く使用されている。塩素がその致死効果を発揮するメカニズムは完全には解明されていないが、細菌細胞に塩素を暴露すると細胞膜の穿孔をもたらされることが認められている。
【００７８】
次亜塩素酸塩消毒。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｅａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（環境単離株、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、モンタナ州立大学）は、１８０ｒｐｍの振盪器で３７℃で１２時間、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）液体培地で増殖させた。ＬＢ液体培地で希釈して細胞密度を１．０のＯＤ６００に調整し、その後５０００ｇで７分間遠心分離することによって細胞を採集した。培地を除去した後、細胞のペレットを等体積のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に再懸濁した。１．５ｍｌマイクロ遠沈管の中に再懸濁した５００μｌ分量の細胞に、漸増する体積の１０００ｐｐｍ次亜塩素酸ナトリウム原液（４〜６％ＮａＯＣｌを希釈することによって調製、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＳ２９０−１）を、５から４０ｐｐｍの終濃度に到達するように添加した。塩素原液濃度は、デジタル塩素比色キット（ＤＰＤ法、ＬａＭｏｔｔｅモデルＤＣ１１００、メリーランド州チェスタータウン）で測定した。（時々はじき混ぜながら）１５分間インキュベーションした後で、同一体積のチオ硫酸ナトリウム原液（１０００ｐｐｍ）を添加し、瞬間的に脱塩素させた後に細胞を採集（５０００ｇ、５分間）した。非塩素暴露対照試料には約４０ｐｐｍのチオ硫酸塩を添加して、この化学物質による生存能への影響を排除した。上清を慎重に除去してから、１ｍｌのＰＢＳで細胞ペレットをすすいだ。もう１回の遠心分離ステップの後でＰＢＳを慎重に除去し、細胞を５００μｌのＰＢＳに再懸濁してから、系列希釈したものをＬＢ寒天上で平板培養し（３７℃で一晩２０インキュベーション）、一定分量をＰＭＡ処理に供した。
【００７９】
ベンザルコニウム消毒。リステリア菌（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、モンタナ州立大学）をブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）培地で１２時間（３０℃、１８０ｒｐｍ）増殖させてから、同一の培地で希釈することによって１．０のＯＤ６００に調整した。塩化ベンザルコニウム（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｇｅｅｌ、ベルギー）原液（５０００ｐｐｍ）を５００μｌ分量の培養物に添加して、１５から６０ｐｐｍの範囲の終濃度を達成した。３０分インキュベーション後に、遠心分離（５０００ｇ、５分間）によって細胞を採集した。上清を慎重に除去し、細胞のペレットを同一体積の新鮮ＢＨＩに再懸濁してから、ＢＨＩ寒天培地上で系列希釈物を平板培養し、一定分量の試料をＰＭＡ処理に供した。
【００８０】
ＵＶ消毒。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（９３２株）は、ＬＢ培地中で３７℃で１２時間増殖させ、１．０のＯＤ６００に標準化した。約１５ｍｌの細胞を遠心分離によって採集し（５０００ｇ、５分間）、同一体積のＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液をディスポーザブルの２５ｍｍペトリ皿（蓋なし）に移し、細胞懸濁液の上方２０ｃｍに置いたＳｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ殺菌ＵＶランプＥＦ１８０（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州ウェストベリー）を用いた短波長ＵＶ光（２５４ｎｍ）を照射した。漸増する暴露時間の後で約５００μｌ分量を採取し、最終試料を採取するまでそれを氷上に置き、それから系列希釈物をＬＢ寒天上で平板培養し（３７℃で一晩インキュベーション）、ＰＭＡ処理に供した。
【００８１】
水道水が含有する残留塩素の影響下でのＵＶ後の膜の完全性を研究するために大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（上記のように調製した、１．０のＯＤ６００のもの）を５分間ＵＶ暴露した。両側を１．０μｍのＳｕｐｏｒ（登録商標）−１００メンブランフィルター（Ｐａｌｌ、米国ミシガン州アナーバー）で封をした滅菌細菌ケージ（２３）に、細胞懸濁液（約１．５×１０９細胞／ｍｌ）の２０ｍｌ分量を２つそれぞれ充填した。合計体積１．０リットルの普通の水道水を有し、水のターンオーバーが１．０体積／時間の貫流リアクターに、充填したケージを浸した。残留塩素濃度は、上記のように測定した。試料は、時間０から開始し、２４時間毎に最大１２０時間まで採取し、ＰＭＡ処理または無処理のいずれかとして、続いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００８２】
熱の影響下でのＵＶ後の膜の完全性を研究するために、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７懸濁液（前記のように調製）を５分間ＵＶ処理し、０．５ｍｌ分量で普通の研究室用サーモブロック中で５８℃の熱ストレスに暴露した。試料は、時間０から最大５時間まで毎時間採取し、ＰＭＡで処理または無処理のいずれかとし、続いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００８３】
熱消毒。マイコバクテリウム・アビウム複合体（Ｗ２００１株）は、０．２％（ｗ／ｖ）グリセロールおよび２％Ｂａｃｔｏ  Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ＡＤＣ強化剤（Ｄｉｆｃｏ）を補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９液体培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）中で３７℃（１００ｒｐｍ）で増殖させた。同一の培地で希釈することによってＯＤ６００を０．３に調整した。１２５μｌ分量の培養液を０．２ｍｌ  ＰＣＲ管に移し、ＰＣＲ機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＥＰ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用して異なる温度に１５分間暴露した。一定分量を合わせて、体積５００μｌにしてから、ＰＭＡ処理を行い、さらに加工した。ＰＭＡ無処理の一定分量の連続希釈物は、１０％ＯＡＤＣおよび０．５％（ｗ／ｖ）グリセロールを補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天培地（ＯＡＤＣと共にＤｉｆｃｏ製）で平板培養し、３７℃で約１０日間増殖させた。
【００８４】
ＰＭＡの架橋結合形成。ＰＭＡ（フェナントリジウム、３−アミノ−８−アジド−５−［３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル］−６−フェニル二塩化物、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ヘイワード）を２０％ＤＭＳＯに溶解し、２０ｍＭの濃縮原液を作り、暗条件で−２０℃で保存した。約１．２５μｌのＰＭＡを５００μｌの一定分量の培養物に添加し、終濃度５０μＭとした。暗条件で時々混合しながら５分間のインキュベーション時間の後で、試料管から２０ｃｍの所に置いた６５０Ｗハロゲン光源を使用して、試料を２分間光暴露した。暴露の間に、試料を氷上に置き、過度の加熱を避けた。光誘導性架橋結合形成の後で、５０００ｇで５分間細胞をペレットにしてから、ＤＮＡを単離した。
【００８５】
ＤＮＡの単離および定量。ゲノムＤＮＡは、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ土壌キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を使用して抽出した。ＦａｓｔＰｒｅｐ機（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用した速度設定５ｍ／ｓで３０秒間のビーズ撹拌によって純粋培養物の細胞溶解を達成した。細胞の破片は、ビーズ撹拌の直後、およびビーズ撹拌後の上清に２５０μｌのＰＰＳ溶液（キットに用意されている）を添加した後の両方に、１３０００ｇで５分間遠心分離することによって除去した。ＤＮＡは、体積１２０μｌのＤＥＳ緩衝液（キットに用意されている）で溶出し、臭化エチジウム染色した１％アガロースゲルで視覚化した。対応する合計溶出体積の約１０％をアガロースゲルに負荷した。
【００８６】
定量ＰＣＲ。相対定量ＰＣＲおよびデータ解析は、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、米国カリフォルニア州サニーヴェール）を用いて行った。サイクル閾値（Ｃｔ）は、３０蛍光単位の閾値を用いたＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアによって自動的に計算した。全ての実験に関して、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）および１０ｐｍｏｌの各プライマーを含有する２４μｌのＰＣＲ混合物に、１μｌの抽出したゲノムＤＮＡを添加した。定量に使用したプライマーを表１に示す。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  ｓｔｘ１遺伝子の増幅に関して、２５μｌのＰＣＲ混合物に２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を１．５μｌ補った。ネズミチフス菌の定量のためのサイクリング・パラメーターは、９５℃で９分間（最初のポリメラーゼ活性化および変性）、それに続いて９５℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で２５秒間を４５サイクルであり、リステリア菌については、９５℃で９分間、それに続いて９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１５秒間を４５サイクルであり、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７については、９５℃で９分間、それに続いて９５℃で２０秒間、５５℃で２５秒間、および７２℃で２５秒間を４５サイクルであり、マイコバクテリウム・アビウムについては、９５℃で９分間、それに続いて９５℃で３０秒間、６０℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間を４５サイクルであった。融解曲線の解析については、温度は６０から９４℃まで０．２℃刻みで増加させた。
【実施例７】
【００８７】
次亜塩素酸塩消毒からの結果
サルモネラ培養物の一定分量を、漸増濃度の次亜塩素酸塩に供した。１５分間のインキュベーション時間の後に、チオ硫酸塩の添加により塩素を不活性化し、瞬間的な脱塩素をもたらした。平板の計数は、１０ｐｐｍまでの濃度でわずかな影響のみを示唆した（図６Ａ）。濃度を漸増させると、２５ｐｐｍ以上の濃度でコロニー計数の鋭い降下が生じ、培養性が完全に失われた。チオ硫酸塩対照（４０ｐｐｍのチオ硫酸塩を有するが次亜塩素酸塩は添加しない）は、どちらの化学物質も添加しなかった試料と比較に値するコロニー計数を示し、培養性にチオ硫酸塩が及ぼす影響を排除した。ＰＭＡ処理試料からのゲノムＤＮＡの抽出により、約２５ｐｐｍで開始した漸増する消毒剤濃度について漸増する赤色の細胞破片のペレットが示された（図６Ｂ）。最も強い赤色は、４０ｐｐｍの次亜塩素酸塩濃度で可視であった。結果として生じたＤＮＡを、臭化エチジウム染色したアガロースゲルで視覚化した。非ＰＭＡ処理細胞から抽出したＤＮＡは、全ての試料について類似の収率を示したが、ＰＭＡ処理は、次亜塩素酸塩の濃度が増加するほど、可視のＤＮＡが少なくなった。（図６Ｃ）。この傾向は、侵入Ａ遺伝子（ｉｎｖＡ）のコピー数の差を検出するｑＰＣＲに反映された。一定分量のＰＭＡ処理物のＣｔ値を、対応する一定分量の無処理物から差し引くと、次亜塩素酸塩濃度が増加するほど強いシグナル減少が生じたことが示された（図６Ｄ）。シグナル減少は、２０ｐｐｍの次亜塩素酸塩濃度で有意になり始めた。およそ１４回の増幅サイクルの最大のシグナル減少は、４０ｐｐｍの次亜塩素酸塩処理で観察された。
【００８８】
これらのデータは、細胞エンベロープが化学相互作用の起こる可能性の高い部位であると思われることを示している１８。塩素誘導性変化の観察から、細胞膜が可能性のある重要な標的となった１９。したがって、塩素は、細胞膜の完全性に直接影響することから、消毒のモニターのためのＰＭＡ適用を可能にする。
【実施例８】
【００８９】
塩化ベンザルコニウム消毒の結果
塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）は、様々なアルキル鎖長のアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩化物の混合物であり、広く使用されている第四アンモニウム化合物である２０。この合成殺生物剤は、多数の家庭用洗浄剤／清浄剤に見出され、食品工業の肉および乳加工環境の表面消毒に広く使用されているが、医学における防腐剤としても使用されている。第四アンモニウム化合物は、低濃度で細胞溶解性漏出を、および高濃度で細菌細胞質の全般凝集を起こして、膜透過性全般に作用することが知られている。
【００９０】
リステリア菌を、漸増濃度のＢＡＣに３０分間暴露した。３０ｐｐｍを超える濃度では、培養性がますます減少した（図７Ａ）。５５および６０ｐｐｍのベンザルコニウム濃度でコロニーは得られなかった。ＰＭＡ処理試料からのゲノムＤＮＡ抽出物は、消毒剤濃度が高いほど、ますます赤い細胞の破片のペレットを生じた（図７Ｂ）。培養性の喪失は、ＰＭＡ処理およびＤＮＡ抽出後のアガロースゲル上のＤＮＡのバンドの薄れの増強をさらに伴ったが、非ＰＭＡ処理細胞のＤＮＡバンド強度は、ＢＡＣの暴露に影響されなかった（図７Ｃ）。同時に、リステリオリシンＯ遺伝子（ｈｌｙ）のコピー数の差を検出するｑＰＣＲは、非ＰＭＡ処理の一定分量およびＰＭＡ処理した一定分量からのＣｔ値を比べた場合に、シグナル減少の拡大を示した（図７Ｄ）。ＰＣＲ約１７サイクルの最大のシグナル減少が６０ｐｐｍのＢＡＣで得られた。
【００９１】
ＢＡＣによるリステリア菌の処理が、それぞれ平板計数およびｑＰＣＲでのシグナル減少によって測定した培養可能性の喪失と膜完全性の喪失との間の非常によい相関を明らかにしたことを、これらのデータは示している。塩素とは対照的に、両方の「生存可能性」指標は、消毒剤濃度が増加すると同時に降下した。これは、ＢＡＣの作用様式が主に膜の損傷（共に透過性の制御を損ない漏出を誘導する、分子間相互作用の破壊および膜二重層の解離など）に基づくことが原因の可能性があり、塩素の場合には、複数の他の被膜関連因子が細胞死を引き起こすもととなるおそれがある。
【実施例９】
【００９２】
ＵＶ消毒からの結果
ＵＶ処理は、飲料水の消毒に広く使用されており、ＤＮＡの損傷によりその致死的作用を発揮すると一般に考えられている２１。しかし、膜損傷は、全般的な細胞劣化の間接的な結果であるおそれがある。ＵＶ暴露した細胞にＰＭＡ処理が及ぼす影響を研究することで、膜の完全性にＵＶが及ぼす影響を明らかにし、原理のさらなる証明として役立てることを意図した。
【００９３】
上記条件でのＵＶ光への大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の暴露は、５秒以内に培養性の完全な喪失をもたらした。しかし、この短いＵＶ暴露時間は、細胞ペレットの白い色により示されるように、これらの細胞によるＰＭＡ取込みに影響しなかった（非暴露細胞と比較）。志賀様毒素１遺伝子（ｓｔｘ１）のコピーにおける差を検出すると（データは示さず）、ＵＶ暴露していない同一試料と比べたＰＭＡ処理後のＣｔ値は同一であった。それよりも長時間の暴露は、ＰＭＡ処理試料および非ＰＭＡ処理試料の両方についてＣｔ値の増加を招いた（図８Ａ）。Ｃｔ値の増加は、アガロースゲルで視覚化したゲノムＤＮＡの薄れの増強と相関し、これもまたＰＭＡ処理には依存しなかった（図８Ｂ）。３０分以上ＵＶに暴露された試料については、ゲル上にゲノムＤＮＡを肉眼で見ることができなかった。
【００９４】
暴露された細胞をＰＭＡ処理しても、培養可能細胞と非培養可能細胞とを区別することができなかったこと、および暴露時間の漸増に伴うＣｔ値の増加は、ＰＭＡ処理に依存しなかったという事実から、細胞の損傷が細胞膜の透過性から生じたのではなかったという結論を導いた。４５分間を超える長いＵＶ暴露だけが、ＰＭＡ処理細胞の漸増する赤色の染色および推定される膜損傷を生じた（データは示さず）。しかし、そのような長時間暴露は工業的には滅多に適用されない。
【００９５】
膜に影響する他のストレス因子の存在下で、ＵＶ暴露がＵＶ後の膜の完全性に影響するかどうかを検討するために、残留塩素濃度０．５ｐｐｍを含有する水道水に、未処理（生きている）およびＵＶ死滅した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を暴露した。試料は、０時間から開始し、２４時間毎に最大１２０時間まで採取し、ＰＭＡ処理するかＰＭＡ処理しないかのいずれかとした。経時的なＣｔ値の直線的な増加が、生細胞およびＵＶ死滅細胞の両方について観察された（データは示さず）。両方の場合で、ＰＭＡ処理は、非ＰＭＡ処理試料に比べて経時的にＣｔ値の差の増加を招いた。非ＵＶ暴露細胞の場合には、これは、培養性の喪失と相関した。漸増するＰＭＡ取込み（塩素誘導性膜損傷によっておそらく起こる）が、ＵＶ暴露に依存しなかったという事実は、この実験においてＵＶ死滅細胞の膜が非ＵＶ暴露細胞の膜よりも速く劣化することが全くなかったという結論を導いた。したがって、亜致死熱ストレス（５８℃）にＵＶ死滅細胞を供することが、ＵＶ暴露されていない生細胞に比べて膜の破壊促進をもたらすかどうかを検討した。０時間から開始して最大５時間まで、試料を毎時間採取した。この実験では、非ＵＶ暴露細胞ではなくＵＶ死滅細胞についてのＣｔ値のＰＭＡ誘導性増加を経時的に観察した（データは示さず）。Ｃｔ値の差は中程度であり、５時間加熱した試料について約２サイクルの増加があった。この成果は、ＵＶ死滅細胞のペレットがＰＭＡにより漸増的に赤みを帯びて染まったが、生細胞のペレットは熱暴露の５時間後でもまだ白色であったという観察と相関した。
【００９６】
ＰＭＡ法は、消毒後の塩素またはＢＡＣが起こす膜損傷を検出することができると思われるが、ＵＶにより起こる細胞損傷は、ＵＶ暴露直後にモニターすることができなかった。短波長ＵＶ−Ｃ線の主な細胞標的が膜ではなく核酸であることを考えると、これは驚くべきことではない２２、２３。我々は、４５分間を超える長いＵＶ暴露のみが細胞の赤色染色をもたらしたことを観察したが、これは、それらの細胞が非ＵＶ暴露細胞よりも容易にＰＭＡを取り込んだことを意味している。そのような長期暴露時間は、膜の完全性の破壊を明らかに導き、ＵＶ暴露の直接の結果として、または細胞の完全性の全般的な破壊により間接的にＰＭＡの取込みを可能にする。しかし、結果として生じたＰＭＡ取込みの増加は、非ＰＭＡ処理試料に比べたＣｔ値に影響しないか、または非常に穏やかに影響する。それは、長期ＵＶ暴露がすでにＤＮＡの増幅能を最小まで減少させたからである。興味深いことに、漸増するＵＶ暴露時間の間のＣｔ値の増加は、臭化エチジウム染色アガロースゲルの蛍光の損失増加と相関した。塩素およびＢＡＣ実験とは対照的に、薄れたバンド強度は、鎖破断および架橋を包含するＤＮＡ損傷が原因である可能性が最も高い。結合した臭化エチジウムの蛍光は、通常は二本鎖ＤＮＡ濃度に比例する。しかし、臭化エチジウムは、ＵＶ光によって起こるピリミジン二量体（その形成はコンフォメーション変化を招く）、水和した塩基、または一本鎖領域に結合しないことが報告された２４。したがって、ＤＮＡ損傷の蓄積は、蛍光の喪失に至る、ＤＮＡへの臭化エチジウムのインターカレーションをますます防止する。この「エチジウム蛍光アッセイ」は、照射によって起こるＤＮＡ損傷を高感度に好都合に測定するために確立された２５。エチジウム蛍光を減少させるこの因子は、ＰＣＲ増幅もまた阻害するであろう。膜に影響する他のストレス因子の存在下で、ＵＶ暴露がＵＶ後の膜の完全性に影響するかどうかを検討するために、塩素処理水道水および亜致死温度（５８℃）に対する細胞の抵抗性について、ＵＶ死滅大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞を非ＵＶ暴露細胞と比較した。貫流リアクターでの水道水暴露は、ＵＶ暴露細胞および非ＵＶ暴露細胞の両方について比較に値する、経時的に増加する細胞膜損傷を招いた。ＵＶ死滅細胞の迅速な膜劣化が修復の欠如によると予想されたことから、この成果は、驚くべきことであった。他方で熱暴露は、非ＵＶ暴露細胞に比べてＵＶ暴露細胞について経時的にＰＭＡ取込みの増加を招いた。しかし、細胞の赤色染色は、熱暴露の５時間後でもわずか中程度であった。この観察は、約２サイクルの中程度のｑＰＣＲシグナル減少を反映した。これらの結果は、ＵＶ死滅細胞が驚くことに膜劣化に抵抗性であることを示唆したが、これは、複数のＵＶ後ストレス因子を同時に組み合わせることで、細胞が修復の欠如による膜損傷に感受性になるという可能性を排除していない。膜透過化の促進は、ＵＶ後の処理へのＰＭＡ法の適用を可能にするであろう。
【実施例１０】
【００９７】
熱消毒の結果
熱消毒は、その実際性から選択した。高温で細菌を死滅させることまたは細菌の生存能を減少させることは、最も古く最も通常に適用されている消毒法であろう。致死量の熱に暴露された細菌のＰＭＡ処理が、これらの細胞からのＤＮＡの選択的シグナル喪失をもたらすことは、以前の研究から示された２６、２７。ここで研究する亜致死から致死温度の範囲の熱勾配で、ＰＭＡ法の感受性を解明および洗練することを意図した。
【００９８】
マイコバクテリウム・アビウムを漸増する熱ストレスに１５分間供すると、約６０℃で培養性に劇的な損失が生じた（図９Ａ）。７０℃以上の温度に暴露後にはコロニーは得られなかった。これは、６０℃から７０℃の間でトレハロース合成酵素遺伝子（ｔｒｅＳ）のコピー数の差を検出するｑＰＣＲシグナル減少が強く増強することとよく相関した（図９Ｂ）。７０℃を超える温度は、ＰＭＡ処理後のＣｔ値にさらなる有意な増加を全くもたらさなかった。ＤＮＡ抽出から得られたＤＮＡの収率は、臭化エチジウム染色アガロースゲルで視覚化するには低すぎた（データは示さず）。この低いＤＮＡ濃度は、溶解マトリックス管（ｌｙｓｉｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｕｂｅ）がＰＭＡ処理熱殺菌細胞の場合に遠心分離後に赤色ペレットを示さなかった理由でもありうる（データは示さず）。
【００９９】
熱による細菌の膜の損傷についての証拠は、細胞内物質の熱誘導性漏出およびリポ多糖の損失についての報告によって提供されている。高温は、大腸菌について外膜の膜ブレブ形成および小胞形成を誘導すると報告された。この研究から、熱が膜透過性に直接作用を有し、ＰＭＡを細胞に進入させることが確認された。培養性の喪失とｑＰＣＲシグナル減少の間によい相関を観察することができた。最も劇的な変化は、６０℃から７０℃の間の温度範囲で起こった。
【０１００】
したがって、この研究は、ｑＰＣＲと組み合わせたＰＭＡ処理が、膜透過性に直接影響する消毒剤の殺菌作用を首尾よくモニターすることを示している。この技法は、透過化細胞を包含する全ての細胞由来のＤＮＡを無差別に増幅する代わりに、ＤＮＡに基づく分子診断を、無傷細胞膜を有する細胞に効果的に限定する。ＰＭＡ処理は迅速、簡便、かつ使用が容易であり、確立された下流のＤＮＡ検出アッセイと組み合わせることができる。ここに記載した消毒法に加えて、ＰＭＡの取込みおよびｑＰＣＲによる死滅効力のモニタリングは、イソプロパノール暴露によって死滅した細胞にもまたうまく適用された２６。しかし、この方法は、膜損傷を起こす消毒剤に限定される。ＵＶ−Ｃ線は増幅能の喪失（おそらくＤＮＡ損傷によって起こる）を実際にもたらすものの、ＰＭＡ処理はＣｔ値には影響しなかった。非常に長いＵＶ暴露時間だけが、ＰＭＡを取り込ませる膜損傷をもたらすおそれがあろう。そのような長い暴露時間は、細胞死がずっと短い暴露時間で起こると仮定することができることから、殺菌処理に関して重要性がありそうにない。しかし、細胞死および細胞の完全性の全般的な喪失がついには膜損傷に至り、これらの細胞をＰＭＡ取込みに従うようにすると仮定することができる。過酸化水素、フェノール、アルデヒド、界面活性剤、物理的圧力、または銀および銅などの重金属を用いた処理を包含する他の消毒法をモニターするためのＰＭＡの潜在性ならびに従来の培養に基づくスクリーニングとの相関は、これから試験されることになるであろう。
【実施例１１】
【０１０１】
混合細菌群集における生存可能な細胞を検出するための材料および方法
無傷細胞および損傷細胞の両方を含む混合細菌群集のＰＭＡ処理の有用性を、エンドポイントＰＣＲと組み合わせて研究するために、以下の４回の実験を行った。（１）ランダムな環境単離株の純粋培養物からの生細胞およびイソプロパノール死滅細胞の所定の混合物のプロファイリング、（２）所定の比の生細胞および死細胞を加えた廃水処理プラント流入水試料のプロファイリング、（３）選択された環境群集のプロファイリング、ならびに（４）漸増する熱ストレスに曝された水堆積物試料のプロファイリング。抽出したゲノムＤＮＡから１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の領域をＰＣＲ増幅し、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してＰＣＲ産物を分析した。
【０１０２】
細菌環境単離株の所定の混合物。モンタナ州立大学のダック・ポンドからの水試料をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１０倍希釈し、トリプトソイ寒天（ＴＳＡ）平板に広げた。平板を室温で５日間インキュベートした。ランダムに釣り上げたコロニーを再度画線した。単一のコロニーを、１８０ｒｐｍの振盪器を用いてトリプトソイ液体培地（ＴＳＢ）中で室温で増殖させ、純粋培養物を得た。これらを、クローニングした１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によってその後同定した。ＴＳＢで希釈することによって吸光度を１のＯＤ６００に調整した。イソプロパノール（終濃度７０％）に１０分間暴露することによって、５００μｌ分量の細胞を死滅させた。５０００×ｇで５分間遠心分離して、細胞を採集し、上清を取り出すことによってイソプロパノールを除去した。死滅した細胞のペレットを５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。異なる種の未処理細胞またはイソプロパノール暴露細胞いずれかの１２５μｌ分量を図１０の通りに混合し、終体積５００μｌとした。
【０１０３】
ＷＷＴＰ流入水試料への、所定の比の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の生菌および死菌の添加。廃水流入水試料は、ボーズマンの廃水処理プラント（ＷＷＴＰ）で１００ｍｌ分量を収集した。５０００ｇで１０分間遠心分離することによって、廃水から細菌を採集した。デカンテーションおよびピペット操作により上清を除去し、最後に７ｍｌが残った。再懸濁後に、４３４μｌ分量を、その後添加するために１．５ｍｌ微量遠沈管に分注した。２８０ｒｐｍの振盪器を用いて大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（９３２株）をルリアニ・ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃で対数期まで増殖させた。ＬＢで希釈することによって、培養物を１のＯＤ６００まで希釈した。遠心分離によって細胞を採集し、ＰＢＳに再懸濁した。マイクロ遠沈管に入れた５００μｌ分量は、標準的な実験室用熱ブロックを用いて７５℃で１５分間暴露することによって殺菌した。平板培養によって示されるように、この熱処理は培養性をゼロまで減少させた。添加(spiking)実験のために、（体積６６μｌ中の）異なる比の生細胞および死細胞の合計１０７細胞（１０６倍に希釈した一定分量の平板計数によって確認）を、濃縮した廃水４３４μｌに添加して合計体積５００μｌにした。
【０１０４】
選択された環境微生物群集。都市廃水、河口底泥、および海洋堆積物の微生物群集を使用した。ＷＷＴＰボーズマンの通気汚泥池から１００ｍｌ分量の水試料を収集した。５０００ｇで１０分間遠心分離することによって、廃水から細菌を採集した。デカンテーションおよびピペット操作により上清を除去し、最後に３ｍｌを残した。５００μｌ分量をマイクロ遠沈管に分注した。
【０１０５】
河口底泥および海洋堆積物を塩水（フロリダ州ガルフ・ブリーズ）と共に５０ｍｌ管に収集した。何回も逆さにして試料を混合してから、泥粒子、石、および砂を１分間沈降させた。濁った上清１ｍｌをきれいな管に移し、５０００ｇで５分間遠心分離することによって、細胞を採集した。ペレットを１．０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、続いて各試料について５００μｌ分量２つに分割した。一方の分量をＰＭＡ処理に供し（下記参照）、もう一方は供さなかった。
【０１０６】
水貯水槽の堆積物試料の漸増する熱ストレスへの暴露。非光暴露水貯水槽から堆積物試料を収集した。約１．０〜２．０ｇの試料（乾燥重量）は、細胞塊を分解するためのピペット操作、ボルテックス撹拌（１０秒間）、および超音波処理（５秒間、Ｊａｎｋｅ  ＆  Ｋｕｎｋｅｌ  ＧｍｂＨ（ドイツ・シュタウフェン）からのＴ２５  Ｓ１機で低速の設定）により同じ水５ｍｌに再懸濁した。５００μｌの同一分量をマイクロ遠沈管に分注し、実験室用熱ブロック中で種々の温度に１５分間暴露した。
【０１０７】
ＰＭＡの架橋結合形成。ＰＭＡ（フェナントリジウム、３−アミノ−８−アジド−５−［３−（ジエチルメチルアンモニオ）プロピル］−６−フェニル二塩化物、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ヘイワード）を２０％ＤＭＳＯに溶解し、２０ｍＭの濃縮原液を作り、暗条件で−２０℃で保存した。典型的には１．２５μｌのＰＭＡを５００μｌ分量の培養物に添加し、終濃度５０μＭとした。暗条件で時々混合しながら５分間のインキュベーション時間の後で、試料管から２０ｃｍの所に置いた６５０Ｗハロゲン光源を使用して、試料を２分間光暴露した。暴露の間に、試料を氷上に置き、過度の加熱を避け、静かにかき混ぜた。光誘導性架橋結合形成の後に、５０００ｇで５分間細胞をペレットにしてから、ＤＮＡを単離した。
【０１０８】
ゲノムＤＮＡの抽出。ゲノムＤＮＡは、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ土壌キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を使用して抽出した。ＦａｓｔＰｒｅｐ機（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用した速度設定５．５ｍ／ｓで３０秒間のビーズ撹拌によって細胞溶解を達成した。細胞の破片は、ビーズ撹拌の直後およびビーズ撹拌後の上清への２５０μｌのＰＰＳ溶液（キットに用意されている）添加後の両方で、１３０００ｇで５分間遠心分離することによって除去した。ＤＮＡは、体積１２０μｌのＤＥＳ緩衝液（キットに用意されている）を用いて溶出させた。
【０１０９】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅。抽出したゲノムＤＮＡ約５ｎｇは、プライマー１０７０Ｆ（５’−ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴ−３’、配列番号１２）および１３９２Ｒ（５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ−３’、配列番号１３）をそれぞれ１０ｐｍｏｌ使用した、１６Ｓ  ｒＲＮＡコード遺伝子の内部断片の増幅のためのテンプレートとして役立った。１３９２Ｒは、５’末端にＧＣクランプを有した（５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣ−３’、配列番号１４）。ＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を含有する合計体積５０μｌで行った。全ての実験に共通のサイクリング・パラメーターは、９５℃で２分間の初回変性、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の様々な数のサイクル、ならびに７２℃で５分間の最終伸長ステップであった。増幅サイクルの数は実験間で多様であり、所定の４種混合物からの１６Ｓ  ｒＲＮＡの増幅については２８サイクル（図１０）、添加または未添加のＷＷＴＰ流入水試料からのＤＮＡ増幅については３０サイクル（図１１）、通気廃水試料からのＤＮＡ増幅については２５サイクル、および河口底および海洋堆積物試料については３０サイクルであった（全て図１２）。水貯水槽堆積物試料から抽出したＤＮＡの増幅のために、２段階アプローチを選択した。すなわち、１０サイクルのＰＣＲ反応からの３．０μｌを、２５サイクルの第２のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。
【０１１０】
クローニングおよび配列決定用の、ダック・ポンドからの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、プライマー２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’、配列番号１５）、ユニバーサルプライマー１３９２Ｒ（５’−ＡＣＧＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ−３’、配列番号１６）、およびテンプレートとして約１０ｎｇの対応するゲノムＤＮＡを使用して増幅した。ＰＣＲ混合物は前記と同様であった。サイクリング・パラメーターは、９４℃で２分間（初回変性）に続いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を３０サイクル、続いて７２℃で７分間の最終伸長ステップであった。
【０１１１】
１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）のＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定。個別のダック・ポンド単離株の増幅から得たＰＣＲ産物は、０．８％アガロースゲルで分離し、続いて約１４００ｂｐ長のバンドを切り出した。ＤＮＡは、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）を製造業者の説明書通りに使用して精製した。ＤＮＡ生成物は、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）を製造業者の説明書通りに使用してクローニングした。連結用混合物は、コンピテント大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換するために使用した（クローニングキットに供給されている）。リコンビナントは、５０μｇ・ｍｌ−１のカナマイシンを含有するＬＢアガロース平板を使用して選択した。１６Ｓ  ｒＤＮＡ挿入物を有するプラスミドを有する大腸菌形質転換体は、５０μｇ・ｍｌ−１のカナマイシンを有するＬＢ液体培地中で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐスピン・ミニプレップ・キット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の説明書通りに使用して単離した。配列決定は、Ｍ１３Ｆ−２０プライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’、配列番号１７）を用いてＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ミシガン・ステート・ユニバーシティー、米国ミシガン州イーストランシング）で実施した。密接に関連する系統学的配列を得るために、約７００塩基の配列を国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ検索プログラムに入力した。
【０１１２】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動。ＤＧＧＥを使用してＰＣＲ産物１００〜１５０ｎｇを分析した。ゲルは、８％ポリアクリルアミドおよび３０％から７０％の変性剤濃度勾配を有した。ここで、１００％変性剤は、７Ｍ尿素および４０％ホルムアミドと定義される（全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）からのものであった）。電気泳動は、ＤＣｏｄｅシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して６０Ｖで１６ｈ実施した。ゲルは、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、米国オレゴン州ユージーン）で染色し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ８８００蛍光撮像装置（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンリアンドロ）を使用して記録した。
【０１１３】
定量ＰＣＲ。廃水試料に添加するために使用した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の相対定量のために、１×Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）、１０ｐｍｏｌのプライマーｓｔｘ１−フォワード（５’−ＧＡＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＴＣＧ−３’、配列番号１）およびプライマーｓｔｘ１−リバース（５’−ＡＴＣＴＡＴＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣ−３’、配列番号２）、ならびに１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（マスターミックスに含有されるＭｇＣｌ２に加えて）を含有する２４μｌのＰＣＲ混合物に、抽出した１μｌのゲノムＤＮＡを添加した。定量ＰＣＲおよびデータ解析は、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、カリフォルニア州サニーヴェール）を用いて行った。サイクル閾値（Ｃｔ）は、３０蛍光単位の閾値を使用して、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアによって自動的に計算した。サイクリング・パラメーターは、９５℃で９分間に続いて、９５℃で２０秒間、５５℃で２５秒間、および７２℃で２５秒間を４５サイクルであった。融解曲線の解析については、温度を６０℃から９４℃まで０．２℃刻みで増加させた。
【実施例１２】
【０１１４】
生きている環境単離株およびイソプロパノールで死滅した環境単離株の所定の混合物のプロファイリング
ダック・ポンドからの４つの細菌単離株をランダムに選択し、培養した。クローニングした１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列決定は、系統学的に最も近い近隣属の同定を可能にした（図１０）。図１０に示すピペット操作のスキーム通りに、未処理の純粋培養物またはイソプロパノールで死滅した純粋培養物のそれぞれの同一体積を所定の比率で混合した。混合物Ｉは未処理生細胞のみを含有したが、混合物ＩＩは死滅した細胞のみを含んでいた。残りの混合物は、３つの生きている種および１つの死滅した種をそれぞれ含んでいた。非ＰＭＡ処理混合物Ｉ〜ＶＩについての部分的１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ産物から得られたＤＧＧＥプロファイルは、４つの単離株を反映している４つの優占的なバンドを有した。ＰＭＡ処理は、イソプロパノール死滅単離株のバンドの抑制を招いた。一方で、混合物Ｉ（生細胞のみ）は、４つの優占的なバンドを依然として生成したが、混合物ＩＩ（死滅細胞のみ）は、バンドを全く生成しなかった。混合物ＩＩＩ〜ＩＶのＰＭＡ処理は、３つの生きている種に相当する３つの優占的なバンドを生成した。
【実施例１３】
【０１１５】
所定の比の生細胞および死細胞を添加したＷＷＴＰ流入水試料のプロファイリング
同一分量のＷＷＴＰ流入水試料に、ヒト病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（未処理または熱死滅のいずれか）の１０７細胞を添加した。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の細胞の合計数は一定であったが、添加した細胞は、０から１００％の範囲の漸増する比率の生細胞を含んでいた。増幅した１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子からのＤＧＧＥプロファイルを図１１Ａに示す。ＷＷＴＰ流入水試料の群集のフィンガープリントは、６つの顕著なバンドを示し、ＰＭＡ処理に影響されなかった。ＰＭＡ処理を行わないそれぞれの添加された試料は、純粋な大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７培養物から得られたバンドと長さが同一の追加のバンドを示した。バンド強度は、生細胞の比率に依存せず、比較に値した。ＰＭＡ処理は、０、０．１、および１％生細胞を添加した試料について大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のシグナルの消失をもたらした。生細胞１０％を添加したＰＭＡ処理試料について、添加のバンドがかすかに見えるようになった。この病原体シグナルのバンド強度は、５０および１００％生細胞を添加した試料について漸増的に強くなった。生細胞のみを添加したＰＭＡ処理試料の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のバンド強度は、非ＰＭＡ処理試料における対応するバンドの強度と比較に値した。
【０１１６】
ＰＭＡ処理後のＤＧＧＥにおける生細胞の比率漸増に伴う病原体のバンドの可視性漸増は、志賀毒素Ｉ遺伝子（ｓｔｘ１）のコピーに相対的な差を検出する定量ＰＣＲから得られたデータと相関した（図１１Ｂ）。ＰＭＡ処理した、添加した試料から得たＣｔ値を、ＰＭＡ処理していない添加した試料の対応するＣｔ値から差し引いた。得られた負の値を「シグナル減少」と呼ぶ。シグナル減少は、死細胞のみを添加して試料について−１２．７サイクルで最大であった。生細胞の比率を増加させると、漸減するｑＰＣＲシグナル減少を招いた。生細胞のみを添加した試料については、シグナル減少は最小（−０．３サイクル）であったが、これは、ＰＭＡ処理がｓｔｘ１遺伝子コピーの定量に最小の影響だけを有したことを意味する。
【実施例１４】
【０１１７】
選択された環境微生物群集のプロファイリング
以前の実験からの結果に力を得て、自然環境試料に及ぼすＰＭＡ処理の影響を研究した。以下の３つの異なる群集を選択した。（１）廃水処理プラントからの通気汚泥槽由来の試料、（２）河口底試料、および（３）海洋堆積物試料。試料は、ＰＭＡ処理するか、または処理しないかのいずれかとした。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づくＤＧＧＥプロファイルを図１２に示す。ＰＭＡ処理は、通気汚泥または海洋堆積物試料の群集プロファイルを可視的に変化させなかったが、河口試料に著しい差が１つあり、非ＰＭＡ処理試料中の１つの顕著なバンドがＰＭＡ処理試料には有意に弱く出現した。
【実施例１５】
【０１１８】
漸増するストレスに曝された水貯水槽堆積物試料のプロファイリング
水貯水槽堆積物試料を選択して、熱ストレスへの暴露がＤＧＧＥの群集プロファイルに影響するかどうかを検討した。試料の一定分量を５５℃に１５分間暴露し、ＰＭＡ処理またはＰＭＡ未処理のいずれかとした。結果として生じたＤＧＧＥプロファイルを、対応する非加熱試料からのプロファイルと比較した（図１３）。ＰＭＡは非加熱試料のフィンガープリントに影響しなかったが、熱暴露試料におけるいくつかのバンドの喪失を招いた。この成果を強固なものにするために、別の水堆積物試料を４５から６０℃の範囲の熱勾配（それぞれ１５分間）に暴露し、続いてＰＭＡ処理に供した。４５℃への暴露は、ＰＭＡ処理または非ＰＭＡ処理いずれかの非加熱試料に比べてＤＧＧＥプロファイルに影響しなかった。しかし、温度の増加はＤＧＧＥバンドの漸増する喪失をさらに招いた。
【０１１９】
上記の実験は、ＰＭＡ処理が、所定の混合物中において、または生細胞および死滅細胞の所定の混合物を添加した環境試料中において、死滅細胞からのシグナルを効率的に抑制することができることを示している。試料のＰＭＡ処理が分析から膜損傷細胞を排除するよい方法でありうることに気づくこともまた重大である。以前に述べたように、無傷細胞に分析を限定することは、群集全体のうちより関連のある画分を分析するために漸進する一歩となるであろう。
【０１２０】
上記をまとめると、本発明は、損傷した細胞膜を有する細胞からのゲノムＤＮＡを除去する新規な化学物質を提供する。ＤＮＡ抽出前に細菌集団の迅速かつ実施容易な前処理を行うことは、さらなる下流の分析に適合性である。「現実世界」の試料へのその適用には、さらなる評価がまだ必要であるが、この方法は、病原体の診断、バイオテロ、および微生物生態学を包含する様々な分野において、ＤＮＡに基づく診断に大きな影響を有しうる。
【０１２１】
本明細書における全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれていると示されたが如く、それと同程度に参照により組み込まれている。
【０１２２】
前述の詳細な説明は、理解を明確にするためにのみ与えられたものであり、それから不必要な限定を理解してはならず、当業者に改変は明らかであろう。これは、本明細書に提供される任意の情報が、従来技術であるか、もしくは目下請求されている発明に関連するか、または具体的もしくは言外に参照される任意の刊行物が従来技術である、ということの承認ではない。
【０１２３】
別に定義しない限り、本明細書に使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者に通常理解されるものと同じ意味を有する。
【０１２４】
本発明をその具体的な実施形態と共に記載したが、さらなる改変が可能であると了解され、また、本出願は、概して本発明の原則に従い、そして本発明が属する技術分野の公知または慣例的な実用の範囲内であり、上述に示す本質的な特徴に適用でき、添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からの逸脱を包含する、本発明の任意の変形、使用、または適用に及ぶことを意図するものである。
【０１２５】
【表１−１】
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【０１２６】
【表１−２】
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【０１２７】
【表１−３】
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【０１２８】
【表１−４】
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【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＰＭＡによるＰＣＲ増幅阻害に及ぼす漸増する光暴露時間の影響を示す図である。ＰＭＡは大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７から抽出した１ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡに３および３０μＭの濃度で添加し、続いて最大２分間光暴露した。シグナルの減少は、増幅可能なｓｔｘ１遺伝子コピーにおける相対差を検出するｑＰＣＲによって判定した。ＰＭＡ処理した試料から得たＣｔ値は、ＰＭＡ処理していない同一試料由来の対応するＣｔ値から差し引いた。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。
【図２】ＰＭＡ不活性化に及ぼす漸増する光暴露時間の影響を示す図である。３および３０μＭの濃度のＰＭＡを最大２分間光暴露してから、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムＤＮＡ（終濃度１ｎｇ／μｌ）を添加した。混合後に、ＤＮＡへの残りの活性ＰＭＡの架橋を、追加の１分間の光暴露で達成した。シグナル減少は、増幅可能なｓｔｘ１遺伝子コピーにおける相対差を検出するｑＰＣＲによって決定した。ＰＭＡ処理試料から得られたＣｔ値を、ＰＭＡ処理していない同一試料由来の対応するＣｔ値から差し引いた。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。
【図３】大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（Ａ）およびストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｂ）の生菌およびイソプロパノール死滅菌のゲノムＤＮＡの収率に及ぼす漸増するＰＭＡインキュベーション時間および異なるＰＭＡ濃度の影響を示す図である。濃度３、３０、および２４０μＭのＰＭＡに１、５、または１５分間細胞を暴露した。ゲノムＤＮＡの収率は、ＰＭＡ処理していない対応する試料（生菌または死菌）の率として表現した。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。
【図４】所定の比の生存可能な細胞および熱死滅細胞のゲノムＤＮＡ収率およびＰＣＲ定量に及ぼすＰＭＡ処理の影響を示す図である。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。（Ａ）大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の生存可能な菌および熱死滅菌の混合比を示す表。数字は体積をμｌ単位で表す。（Ｂ）ＰＭＡ処理していない（上）、およびＰＭＡ処理した（下）混合物からのゲノムＤＮＡをアガロースゲル上で視覚化したもの。（Ｃ）得られた最高値のゲノムＤＮＡの収率（％）。蛍光比色計を用いてＤＮＡを定量した。（Ｄ）増幅したゲノムＤＮＡのＣｔ値を生存可能な細胞の率の関数として示したもの。ｑＰＣＲは、ｓｔｘ１遺伝子に特異的なプライマーを使用して行った。（Ｅ）基準化したＤＮＡ濃度の自然対数と、ｓｔｘ１の増幅から得られた対応するＣｔ値の間との相関。直線的趨勢線のＲ２値を示す。
【図５−１】ＰＭＡおよびＥＭＡの膜透過性の特性の比較ならびに蛍光顕微鏡による細菌９種を用いたＰＭＡ生／死アッセイの評価を示す図である。（Ａ）それぞれＳＹＴＯ９／ＰＭＡおよびＳＹＴＯ９／ＥＭＡ（複合画像）の組合せで染色した、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の生菌および死菌による色素取込みの顕微鏡的比較。緑色は、ＳＹＴＯ９のみの取込みを示し、赤色は、ＰＭＡまたはＥＭＡについての膜透過性を示す。（Ｂ）細菌８種からの生細胞（白棒線）および死細胞（灰色棒線）の相対ゲノムＤＮＡ収率に及ぼすＰＭＡおよびＥＭＡ処理の影響、ならびにＳＹＴＯ９／ＰＭＡまたはＳＹＴＯ９／ＥＭＡのいずれかで染色後の膜透過性の顕微鏡検査。ＴＢＳ−３８０蛍光比色計で測定したＤＮＡ収率を、処理していない対応する試料（１００％と定義）からの収率に対して示す。加えて、アガロースゲル上にゲノムＤＮＡを視覚化した。暗条件で濃度５０μＭで５分間色素をインキュベートしてから、２分間光暴露した。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。
【図５−２】図５（Ｂ）の続きである。
【図６】漸増濃度の次亜塩素酸塩（ｐｐｍ単位）へのサルモネラの暴露のモニタリングを示す図である。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。（Ａ）平板計数により判定した培養性の喪失。Ｃは、最高の次亜塩素酸塩濃度を有する試料の脱塩素処理に使用した４０ｐｐｍのチオ硫酸塩に細胞を暴露する対照を表す。（Ｂ）事前のＰＭＡ処理後の、漸増する次亜塩素酸塩濃度についての細胞の破片のペレットを有する溶解マトリックス管。１４０００ｇで５分間遠心分離後に、細胞の破片が上方に向いている溶解マトリックス管を示す。（Ｃ）アガロースゲル上で視覚化した、ＰＭＡ処理していない（上）またはＰＭＡ処理した（下）細胞からのゲノムＤＮＡ。（Ｄ）インベイシンＡ遺伝子（ｉｎｖＡ）のコピーにおける相対差を検出するｑＰＣＲによって決定したシグナル減少。ＰＭＡ処理した培養物から得たＣｔ値を、処理していない培養物についての対応するＣｔ値から差し引いた。
【図７】漸増濃度の塩化ベンザルコニウム（ｐｐｍ単位）へのリステリア菌の暴露のモニタリングを示す図である。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。（Ａ）平板計数により判定した培養性の喪失。（Ｂ）事前のＰＭＡ処理後の、漸増するベンザルコニウム濃度について細胞の破片のペレットを有する溶解マトリックス管。１４０００ｇで５分間遠心分離後に、細胞の破片が上方に向いている溶解マトリックス管を示す。（Ｃ）アガロースゲル上で視覚化した、ＰＭＡ処理していない（上）またはＰＭＡ処理した（下）細胞からのゲノムＤＮＡ。（Ｄ）リステリオリシンＯ遺伝子（ｈｌｙ）のコピーにおける相対差を検出するｑＰＣＲによって決定したシグナル減少。ＰＭＡ処理した培養物の一定分量から得たＣｔ値を、未処理培養物についての対応するＣｔ値から差し引いた。
【図８】漸増する時間での大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＵＶ暴露のモニタリングを示す図である。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。（Ａ）志賀様毒素Ｉ遺伝子（ｓｔｘ１）のコピーにおける相対差を検出するｑＰＣＲにより決定したＰＭＡ処理した一定分量およびＰＭＡ処理していない一定分量からのＣｔ値の増加。（Ｂ）アガロースゲル上で視覚化した、ＰＭＡ処理していない細胞（上）およびＰＭＡ処理した（下）細胞からのゲノムＤＮＡ。
【図９】異なる温度にマイコバクテリウム・アビウムを１５分間暴露したことのモニタリングを示す図である。誤差の縦棒は、３回の独立した繰り返しからの標準偏差を表す。（Ａ）平板計数により判定した培養性の喪失。（Ｂ）トレハロースシンターゼ遺伝子（ｔｒｅＳ）のコピーにおける相対差を検出するｑＰＣＲにより決定したシグナル減少。ＰＭＡ処理した培養物の一定分量から得たＣｔ値を、未処理培養物の対応するＣｔ値から差し引いた。
【図１０】ダック・ポンドからの細菌単離株の生存可能な菌および死菌の所定の細菌混合物の遺伝子型プロファイルに及ぼすＰＭＡの影響を示す図である。個別の単離株から得られた部分的１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のＢｌａｓｔ検索の結果を、それらに対応する系統学的な最も近い近隣属に対する類似度と共に示す。同一体積の未処理培養物またはイソプロパノール殺菌純粋培養物の一定分量を、示したスキーム通りに混合した。混合物Ｉ〜ＶＩは、ＰＭＡ処理するか、または処理しないかのいずれかとし、続いてゲノムＤＮＡを抽出し、部分的１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。混合物から得られたＰＣＲ産物のＤＧＧＥプロファイルを、純粋な個別の単離株から得られたバンドと比較する。
【図１１】漸増する比率の生細胞を有する１０７個の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞を添加したＷＷＴＰ流入水試料の分析を示す図である。（Ａ）ＰＭＡ処理に供したか、または供さなかった試料のＤＧＧＥプロファイル。添加した試料からの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子プロファイルを、未添加試料からの対応するプロファイルと比較する。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の純粋培養物から得たバンドは参照として役立つ。（Ｂ）志賀毒素１（ｓｔｘ１）遺伝子のコピーにおける相対差を検出するｑＰＣＲにより決定したシグナル減少。ＰＭＡ処理した添加試料から得られたＣｔ値を、ＰＭＡ処理していない添加試料の対応するＣｔ値から差し引いた。ここに示すシグナル減少は、同一のテンプレートを使用した２回のｑＰＣＲ運転の平均である。
【図１２】予備ＰＭＡ処理を行っていない、および行った通気汚泥、河口底、および海洋堆積物試料の増幅された部分１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥプロファイルを示す図である。矢印は、河口底プロファイルにＰＭＡが起こした差を示す。
【図１３】水堆積物試料の増幅された部分的１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥプロファイルを示す図であり、その試料は、熱暴露しなかったか、または５５℃で１５分間加熱したかのいずれかであった。試料は、ＰＭＡで処理したか、または処理しなかったかのいずれかであり、その後ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅した。矢印は、バンド形成パターンでの最もはっきりした差を示す。
【図１４】水堆積物試料の増幅された部分的１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥプロファイルを示す図であり、その試料は、熱暴露しなかったか、または表示した温度で１５分間加熱したかのいずれかであった。１つの試料以外の全てをＰＭＡで処理してから、ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅した。矢印は、プロファイルにおける強度にはっきりした温度誘導性変化を受けるバンドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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