(57)【要約】本発明は、βラクタム系抗生物質と任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との抗菌効果のある組み合わせを、それを必要とするヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトおよび動物における細菌感染症の治療に有用な薬学的組成物を提供する。以下の段階を含む抗生物質の相乗剤を発見する方法がさらに提供される：ａ）細胞内における遺伝子産物の活性または量を低減するように、遺伝子産物をコードする核酸に対するアンチセンス核酸を細胞内で発現し、それによって抗生物質に感作された細胞を産生する段階；ｂ）抗生物質に対する細胞の感作を特徴付け、アンチセンス遺伝子の非存在下において必要とされる濃度の５分の１またはそれ未満で抗生物質の効力をもたらす抗生物質と遺伝子との対を選択する段階；ｃ）選択された相乗的遺伝子に対応する遺伝子産物を阻害する化学化合物をスクリーニングする段階；およびｄ）阻害が細菌中で起こるように、選択された相乗的遺伝子に対応する遺伝子産物を阻害する化学的類似体を選択または作成する段階。【特許請求の範囲】
【請求項１】
βラクタム系抗生物質と細菌性ＭｕｒＢ酵素の阻害剤との抗菌効果のある組み合わせを、それを必要とするヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトおよび動物における細菌感染症の治療に有用な薬学的組成物。
【請求項２】
βラクタム系抗生物質と任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との抗菌効果のある組み合わせを、それを必要とするヒトまたは動物に投与する段階を含む、ヒトおよび動物における細菌感染症の治療に有用な薬学的組成物。
【請求項３】
βラクタム系抗生物質に対して＜０．２のフラクショナル阻止濃度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）指数（ＦＩＣＩ）をもたらす、βラクタムとＭｕｒＢ酵素の阻害剤との組み合わせ。
【請求項４】
グラム陽性およびグラム陰性病原菌に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、セファロスポリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項５】
抗グラム陽性細菌剤としての、セファロスポリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項６】
炭疽病の治療用の、セファロスポリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項７】
グラム陽性およびグラム陰性病原菌に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、セファロスポリンと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項８】
抗グラム陽性剤に対する抗菌剤としての、セファロスポリンと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項９】
炭疽病の治療用の広域スペクトルの抗菌剤としての、セファロスポリンと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項１０】
グラム陽性およびグラム陰性病原菌に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、カルバペネムとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項１１】
抗グラム陽性剤としての、カルバペネムとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項１２】
炭疽病の治療用の、カルバペネムとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項１３】
グラム陽性およびグラム陰性病原菌に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、カルバペネムと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項１４】
抗グラム陽性剤に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、カルバペネムと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項１５】
炭疽病の治療用の広域スペクトルの抗菌剤としての、カルバペネムと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項１６】
グラム陽性およびグラム陰性病原菌に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、ペニシリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項１７】
抗グラム陽性剤としての、ペニシリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項１８】
炭疽病の治療用の、ペニシリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項１９】
グラム陽性およびグラム陰性病原菌に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、ペニシリンと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項２０】
抗グラム陽性剤に対する広域スペクトルの抗菌剤としての、ペニシリンと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項２１】
炭疽病の治療用の広域スペクトルの抗菌剤としての、ペニシリンと任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤との組み合わせ。
【請求項２２】
メチシリン耐性感染症の治療用の、ペニシリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項２３】
インビトロでＦＩＣＩ≦０．３をもたらす、ペニシリンとＭｕｒＢ阻害剤との組み合わせ。
【請求項２４】
インビトロでＦＩＣＩ≦０．３をもたらす、ムピロシンとｒｅｌＡ阻害剤との組み合わせ。
【請求項２５】
インビトロでＦＩＣＩ≦０．３をもたらす、ＭｅｔＲＳ阻害剤とｒｅｌＡ阻害剤との組み合わせ。
【請求項２６】
以下の段階を含む、抗生物質の相乗剤を発見する方法：
ａ．細胞内における遺伝子産物の活性または量を低減するように、遺伝子産物をコードする核酸に対するアンチセンス核酸を細胞内で発現し、それによって抗生物質に感作された細胞を産生する段階、
ｂ．抗生物質に対する細胞の感作を特徴付け、アンチセンス遺伝子の非存在下において必要とされる濃度の５分の１またはそれ未満で抗生物質の効力をもたらす抗生物質と遺伝子との対を選択する段階、
ｃ．選択された相乗的遺伝子に対応する遺伝子産物を阻害する化学化合物をスクリーニングする段階、
ｄ．阻害が細菌中で起こるように、選択された相乗的遺伝子に対応する遺伝子産物を阻害する化学的類似体を選択または作成する段階。
【請求項２７】
アンチセンス核酸は、誘導性プロモータから転写される、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
アンチセンス核酸を亜致死レベルに誘導する濃度の誘導因子に、細胞を接触させる段階をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項２９】
亜致死濃度の誘導因子は、抗生物質に対する感受性が少なくとも５倍に増大されている、請求項３記載の方法。
【請求項３０】
遺伝子産物はポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子産物はＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
細胞は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｕｓ）、およびクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、または上記の種のいずれかの属に含まれる任意の種からなる群より選択される生物に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
細胞は炭疽菌細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
候補化合物は天然産物である、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
以下の段階を含む、微生物の繁殖の阻害に使用するために候補化合物をスクリーニングする方法：（ａ）第１の微生物において繁殖に必要とされる遺伝子または遺伝子産物を同定する段階、（ｂ）第２の微生物において該遺伝子または遺伝子産物のホモログを同定する段階、（ｃ）該第２の微生物において該ホモログの活性を阻害する阻害性核酸配列を同定する段階、（ｄ）繁殖阻害量の該阻害性核酸に該第２の微生物を接触させ、それによって該第２の微生物を感作する段階、（ｅ）段階（ｄ）の感作された微生物を候補化合物に接触させる段階、および（ｆ）該候補化合物が、該感作された微生物ほど感作されていない微生物の繁殖を阻害するより大きな程度で、該候補化合物が該感作された微生物の繁殖を阻害するか否かを決定する段階。
【請求項３７】
ＭｕｒＢの阻害剤を得るために化合物ライブラリまたは天然産物ライブラリをスクリーニングし、その後、抗生物質を用いて化合物の相乗活性を試験することによる、相乗剤としての化合物の同定法。
【請求項３８】
任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤を得るために化合物ライブラリまたは天然産物ライブラリをスクリーニングし、その後、抗生物質を用いて化合物の相乗活性を試験することによる、相乗剤としての化合物の同定法。
【請求項３９】
濃度２０％または抗生物質のＭＩＣ未満の抗生物質の存在下において、細菌培養物を使用して化合物ライブラリまたは天然産物ライブラリから化合物を選択すること、ＭＩＣ下レベルの抗生物質の存在下においてのみ細菌を死滅させる化合物をスコアリングすること、および選択された化合物のＭｕｒＢ阻害をインビトロ酵素アッセイにおいて試験することによる、ＭｕｒＢ阻害剤としての化合物の同定法。
【請求項４０】
濃度２０％または抗生物質のＭＩＣ未満の抗生物質の存在下において、細菌培養物を使用して化合物ライブラリまたは天然産物ライブラリから化合物を選択すること、ＭＩＣ下レベルの抗生物質の存在下においてのみ細菌を死滅させる化合物をスコアリングすること、および選択された化合物の、任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害をインビトロ酵素アッセイにおいて試験することによる、任意の細菌性ペプチドグリカン生合成酵素、特にＧｌｍＵ、ＭｕｒＡ、ＭｕｒＢ、ＭｕｒＣ、ＭｕｒＤ、ＭｕｒＥ、ＭｕｒＦ、ＭｕｒＧ、ＭｒａＹ、およびＵｐｐＳの阻害剤としての化合物の同定法。
【請求項４１】
βラクタムの抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４２】
細菌細胞壁に対する作用機序を有する化合物を伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４３】
細胞壁阻害抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４４】
ＤＮＡジャイレースに対する作用機序を有する化合物を伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４５】
タンパク質合成に対する作用機序を有する化合物を伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４６】
ダプトマイシンを伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４７】
バンコマイシンを伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４８】
シプロフロキサシンを伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項４９】
トリメトプリムを伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項５０】
細菌細胞壁に対する作用機序を有する化合物を伴う抗感染症療法用の相乗化合物を同定するための、アンチセンス遺伝子の使用。
【請求項５１】
抗生物質と遺伝子標的との相乗的組み合わせを同定するプロセス：
ａ．細菌遺伝子を長さ２００塩基以下のランダムな断片に分割する段階、
ｂ．誘導性プロモータおよび選択可能なマーカーを含有する適切なプラスミドに、断片をライゲーションする段階、
ｃ．誘導因子の存在下において増殖阻害を呈する形質転換細胞を選択する段階、
ｄ．誘導因子の非存在下において選択されたクローンの抗生物質感受性と比較して、１つまたは複数の抗生物質に対する感作をもたらす誘導因子の用量を決定する段階、
ｅ．抗生物質の種々のクラスおよび抗生物質の作用機序の範囲を示す抗生物質のパネルに対する感受性について、誘導因子の存在下におけるクローンをプロファイリングする段階。
【請求項５２】
所与の抗生物質の相乗剤を同定するプロセス：
ａ．（２７）において同定された遺伝子の産物に基づいて、インビトロ酵素アッセイを使用して化合物ライブラリをスクリーニングする段階、
ｂ．阻害活性を示す化合物を同定する段階、
ｃ．細菌中の遺伝子産物を阻害する（ｂ）の化学的類似体を作成する段階、
ｄ．化学的類似体を抗生物質と組み合わせて、相乗抗菌活性について試験する段階。
【請求項５３】
抗生物質の相乗剤を同定するプロセス：
ａ．最小発育阻止濃度の８分の１の抗生物質を含有する培地の存在下および非存在下において増殖する細菌を使用して、化合物ライブラリをスクリーニングする段階、
ｂ．抗生物質の最小発育阻止濃度の８分の１の抗生物質の存在下においてのみ阻害活性を示す化合物を同定する段階。
【請求項５４】
微生物遺伝子または関心対象の遺伝子であるＤＮＡ断片を生成、検出、および使用するための方法であって、ある特定の標的微生物内においてアンチセンス配向で異所的に発現した場合、微生物内の関心対象の遺伝子に特異的な転写後発現阻害を引き起こすことができる、方法。
【請求項５５】
転写後発現阻害は、アンチセンス配向のＤＮＡ断片における発現レベルの増加または減少を受けて直接的に強度が増加または減少され得る、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
アンチセンス配向のＤＮＡ断片の発現レベルは、実験的に調節され得る、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
転写後発現阻害の強度の増加または減少は、標的微生物において観察できる表現型変化の計測可能な強度に、直接的且つ依存的な増加または減少をもたらす、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
ＤＮＡ断片を画定するためのスクリーニングは、アンチセンス配向のＤＮＡ断片の高レベル発現により引き起こされるがアンチセンス配向のＤＮＡ断片の低レベル発現からは明白でない、標的微生物における計測可能な表現型変化の検出に依存する、請求項５４〜５６のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
アンチセンス配向断片の発現によって関心対象の遺伝子に引き起こされる表現型変化は、関心対象の遺伝子の特異的な転写後発現阻害に伴う、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
関心対象の遺伝子の転写後発現阻害は、ＲＴ‐ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、マイクロアレイ法、またはその他適切な方法による関心対象の遺伝子のｍＲＮＡの定量化によって計測され、機能的および／または遺伝的に無関係な対照遺伝子の、同様に計測されたｍＲＮＡレベルと比較される、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｕｒＢ‐２の断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｕｒＢ２‐Ｃ１に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｕｒＢ‐２の断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｕｒＢ２‐Ｈ１に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｕｒＢ‐２の断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｕｒＢ２‐Ｄ１に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｕｒＢ‐２の断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｕｒＢ２‐Ｄ２に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６５】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｅｔＳの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｅｔＲＳ‐Ｈ１に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６６】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｅｔＳの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｅｔＲＳ‐Ｈ２に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６７】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｅｔＳの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｅｔＲＳ‐Ｈ６に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６８】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｍｅｔＳの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｍｅｔＲＳ‐Ｅ４に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６９】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｕｐｐＳの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｕｐｐＳ‐ＵＧ９に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項７０】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｕｐｐＳの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｕｐｐＳ‐ＵＡ３に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項７１】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｄｆｒＡの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｄｆｒＡ‐２Ｇ１に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項７２】
アンチセンス配向断片は、炭疽菌遺伝子ｄｆｒＡの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｂａ‐ｄｆｒＡ‐２Ｇ６に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項７３】
アンチセンス配向断片は、黄色ブドウ球菌遺伝子ｍｕｒＢの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｓａ‐ｍｕｒＢ‐Ｅ９に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項７４】
アンチセンス配向断片は、黄色ブドウ球菌遺伝子ｍｕｒＢの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｓａ‐ｍｕｒＢ‐Ｆ７に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【請求項７５】
アンチセンス配向断片は、黄色ブドウ球菌遺伝子ｍｕｒＢの断片であり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｓａ‐ｍｕｒＢ‐Ｂ９に明記される配列を含む、請求項５９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して細菌性疾患に関し、より具体的には、単独投与される化合物のいずれよりも極めて低い化合物の用量で細菌感染症の治療制御を可能にする化合物の組み合わせ、特に、βラクタム系抗生物質と組み合わせたＭｕｒＢの阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
利用可能な別個のクラスの抗微生物化合物はほとんどなく、抗生物質耐性菌を伴う感染症を含む、細菌感染症の単独および併用薬物治療の範囲を限定する。したがって、抗菌化学療法研究は、新たな抗菌薬の開発のための新規標的の発見に重点的に取り組んできた。新たな抗菌化合物の発見への代替的アプローチは、抗生物質の相乗剤の発見である。抗微生物療法における相乗効果は周知であり、組み合わせて使用される抗生物質の超相加的活性を説明するために使用される。例えば、細菌感染症の治療において、ペニシリンまたはアンピシリンとストレプトマイシンまたはゲンタマイシン等の組み合わせは、腸球菌感染症に対して超相加的効果を有することが示されている。同様に、カルベニシリンまたはチカルシリンをゲンタマイシンまたはトブラマイシン等のアミノグリコシド剤と組み合わせると、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染症の治療において相乗効果を呈する。ストレプトマイシンをテトラサイクリンと共に使用する併用療法は、いずれかの単独の薬剤よりもブルセラ症の治療において効果的であり、クロラムフェニコールにスルホンアミドを加えた混合物は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）による髄膜炎に対してより効果的である。
【０００３】
抗菌剤の効力を予測するために使用される一方法は、Ｓｃｒｉｂｎｅｒら（１９８２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２１（６）：９３９‐９４３）（非特許文献１）によって、およびＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ（１９８０，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１０９７‐１０９８）（非特許文献２）において説明されており、チェッカーボードアッセイと称される。このアッセイは、培養液中に、個別のおよび両方を組み合わせた抗生物質の連続２倍希釈液を伴い、続いて試験される微生物がこれに接種される。インキュベーション後、個別にまたは組み合わせて使用された各薬物の最小発育阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＭＩＣ）が決定される（注記：ＭＩＣは、培地中における増殖を阻害する薬物の最低濃度である）。相乗効果は、組み合わせて使用した場合、各薬物のＭＩＣの減少によって示される。拮抗作用は、組み合わせて使用した場合、いずれかまたは両方の薬物におけるＭＩＣの増加によって示される。
【０００４】
上記の例において、相乗効果は、抗生物質対の経験的試験によって発見される。相乗剤は、代謝的解毒によって抗生物質を不活性化する病原体の能力を阻害する化合物、抗生物質を搬出する細胞ポンプを阻害する化合物、および抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を別の手法で減少させる化合物を含んでもよい。アモキシシリンおよびクラブラン酸を含有する組み合わせの開発は、そのような取り組みを説明する最たる例である。アモキシシリンはアミノペニシリンであり、ベータラクタマーゼ産生細菌によって分解される。クラブラン酸は、ベータラクタマーゼの活性を阻害するが、それ自身の抗菌活性を欠くことが発見された（Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｃ＆Ｃｏｌｅ  Ｍ，１９７７．Ａ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｂｅｔａ‐ｌａｃｔａｍ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｎｕｓ；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１１，ｐ‐８５２‐８５７（非特許文献３）；Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｃ，Ｆａｒｍｅｒ  Ｔ＆Ｃｏｌｅ，Ｍ  １９８３，Ｔｈｅ  Ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ａｍｏｘｙｃｉｌｌｉｎ  ｗｉｔｈ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ  ａｃｉｄ，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１１，ｐ‐２７‐３２（非特許文献４）；Ｔｏｄｄ  Ｐ  Ａ＆Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  Ｐ  １９９０．Ａｍｏｘｙｃｉｌｌｉｎ／Ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ  ａｃｉｄ，ａｎ  ｕｐ‐ｄａｔｅ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ，Ｄｒｕｇｓ  ３９，ｐ‐２６４‐３０７（非特許文献５））。
【０００５】
クラブラン酸の場合、ベータラクタム系抗生物質に対する耐性を与える上での、ベータラクタマーゼの重要性が十分に理解された。この理解により、ベータラクタマーゼ阻害剤の標的開発が可能となった。
【０００６】
任意の特定の抗生物質の有効性を限定する上で重要なその他のプロセスもあり得る。異なるプロセスを理解することは、クラブラン酸の場合とほぼ同様に、相乗剤開発のための標的の同定をもたらし得る。したがって、標的相乗剤開発が可能となるように、抗生物質活性を限定するプロセスを見いだす一般的手法を有することは、有用であると考えられる。
【０００７】
細菌細胞壁生合成は細菌における必須プロセスであり、該プロセスにおいては、細菌の内部でペプチドグリカンが産生され、外膜へ移送され、架橋され合って細胞壁を形成する。ペニシリンおよびセファロスポリンを含む重要な治療抗生物質は、ペニシリン結合タンパク質によって触媒される架橋プロセスを阻害する。図１は、該プロセスの図である。特に関心が寄せられているのは、ＭｕｒＡ酵素（ＵＤＰ‐Ｎ‐アセチルグルコサミンエノールピルビル転移酵素、ＥＣ２．５．１．７としても公知である）によって触媒される段階であり、これはｍｕｒＡ遺伝子によってコードされ、ホスホマイシンによって阻害される。ＭｕｒＢ酵素によって触媒され、ｍｕｒＢ遺伝子（ＵＤＰ‐Ｎ‐アセチルエノールピルビルグルコサミン還元酵素、ＥＣ１．１．１．１５８）によってコードされる次の段階にも関心が寄せられている。
【０００８】
細胞膜の外部で起こるプロセス（トランスグリコシル化およびペプチド転移）により、ペプチドグリカンモノマーが架橋される。これらの反応は、ペニシリンおよびセファロスポリン系抗生物質の標的部位であるペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）によって触媒される。細菌中には複数のＰＢＰがあり、それぞれの種が独自の分類を有している。ＰＢＰは、細胞１個あたり数百から千または二千の少数のコピーにおいて存在し、低分子量（低Ｍｒ）ＰＢＰ、高ＭｒＰＢＰ、およびβラクタマーゼを含む。これら３つのクラスはすべて、それらの触媒機能において重要な活性部位セリン残基を有する。ペニシリンおよびセファロスポリンは、ＰＢＰを不活性化する自殺基質として作用することによって細胞壁生合成の最終段階を阻害する。βラクタマーゼは、ペニシリンおよびセファロスポリンに作用する活性部位セリンを有するＰＢＰに構造的に関係している。しかしながら、βラクタマーゼの場合、ペニシリンまたはセファロスポリンとの相互作用によって抗生物質の加水分解をもたらし、ＰＢＰと相互に作用するそれらの能力を失わせてしまう。
【０００９】
文献中には、ホスホマイシンの、セファロスポリンおよびペニシリンとの組み合わせに関する多くの研究がある。Ａｌｖａｒｅｚら（１９８５年）（非特許文献６）は、ホスホマイシン‐セファマンドールを伴う株の６６％およびホスホマイシン‐メチシリンを伴う株の４６％において、相乗効果が観察されたことを報告した。この研究において報告された相乗効果は、両方の薬物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）が４分の１減少した場合に定義された。Ｕｔｓｕｉら（１９８６年）（非特許文献７）は、インビトロおよびインビボにおけるセフメタゾールおよびセフォタキシム単独の場合、ならびにホスホマイシンと組み合わせた場合の、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のメチシリンおよびセフェム耐性株に対する抗菌活性について報告した。この研究は、両方の薬物のＭＩＣにおける４分の１の低減を相乗効果の尺度として示すものであった。この研究はまた、併用治療における細菌の死滅加速という、別の形態の相乗効果も実証した。
【００１０】
Ｕｔｓｕｉらの研究は、ホスホマイシンによって誘導された特異的なＰＢＰプロファイルの検出を含むものであった。
【００１１】
いくつかのＰＢＰのレベルは、ホスホマイシンに対する曝露時に著しく低減された。セファロスポリンはＰＢＰを不活性化することによって作用するため、研究者らは、ＰＢＰの低減は、阻害すべき標的タンパク質数を低減させることにより、セファロスポリンをより効果的にするであろうとの結論を下した。研究者らはさらに、ペプチドグリカンモノマーがＰＢＰ転写の誘導因子であると推測した。ホスホマイシンによるペプチドグリカン生合成の阻害は、ペプチドグリカンのレベルを低減させ、それによってＰＢＰの転写を阻害すると考えられた。
【００１２】
ペプチドグリカン生合成酵素とベータラクタマーゼ阻害剤との相互作用についての遺伝学的研究は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌におけるｍｕｒＥまたはｍｕｒＦへの干渉が、ベータラクタム系オキサシリンに対する感受性を増大させたことを実証している（Ｓｉｅｒａｄｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（非特許文献８）；Ｓｏｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（非特許文献９）；Ｇａｒｄｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（非特許文献１０））。これらの研究が含意するのは、ベータラクタム耐性の発現にはＭｕｒＥおよびＭｕｒＦ活性が必要であるということである。したがって、ＭｕｒＥまたはＭｕｒＦの阻害剤が、オキサシリンおよびその他のベータラクタム系抗生物質に対するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の感受性も増大させ得ることは当然である。
【００１３】
これらの研究のいずれも、ペプチドグリカン生合成酵素の化学阻害剤が、ベータラクタム系抗生物質に対する非耐性細菌の感受性を増大させるとは予期していない。
【００１４】
アンチセンスは、細菌中において新たな抗生物質の標的を同定する際に有用である。そのような標的を発見するため、およびアンチセンスクローンを感作細胞として使用してアンチセンス標的の阻害剤を検出するための、アンチセンスの使用を実証する多くの出版物がある。
【００１５】
これらの発明の背後にある概念は、（１）アンチセンス発現は、細菌に「必須の要素」に特異的に関連する遺伝子を区別し、それによって抗生物質発見に使用するための標的のセットを定義することができること、および（２）アンチセンス発現は、アンチセンスによって標的とされるｍＲＮＡに対応するタンパク質を特異的に阻害する化合物に対して感作された細胞をもたらし得ることである。このアンチセンスの後者の使用は、化学ライブラリまたは天然産物コレクションから標的特異的阻害剤を見いだす際における感作細胞の使用をもたらし得る。
【００１６】
これらの参考文献のいずれも、相乗剤発見のための標的を同定するためのアンチセンスの使用については記述していない。
【００１７】
抗生物質の対の体系的な試験によって、病原体による抗生物質代謝を減少させる化合物の標的研究によって、または、特定の抗生物質を用いる化学物質または抽出物のランダムまたは合理的スクリーニングによって、抗生物質の有用な相乗的組み合わせを発見することができる。
【００１８】
アンチセンスは、必須遺伝子を発見するため、および、新規抗生物質化合物の発見用のツールを開発するために使用されている。
【００１９】
【非特許文献１】Ｓｃｒｉｂｎｅｒら（１９８２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２１（６）：９３９‐９４３）
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ（１９８０，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１０９７‐１０９８）
【非特許文献３】Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｃ＆Ｃｏｌｅ  Ｍ，１９７７．Ａ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｂｅｔａ‐ｌａｃｔａｍ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｎｕｓ；Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１１，ｐ‐８５２‐８５７
【非特許文献４】Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｃ，Ｆａｒｍｅｒ  Ｔ＆Ｃｏｌｅ，Ｍ  １９８３，Ｔｈｅ  Ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ａｍｏｘｙｃｉｌｌｉｎ  ｗｉｔｈ  ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ  ａｃｉｄ，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１１，ｐ‐２７‐３２
【非特許文献５】Ｔｏｄｄ  Ｐ  Ａ＆Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  Ｐ  １９９０．Ａｍｏｘｙｃｉｌｌｉｎ／Ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ  ａｃｉｄ，ａｎ  ｕｐ‐ｄａｔｅ  ｏｆ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ，Ｄｒｕｇｓ  ３９，ｐ‐２６４‐３０７
【非特許文献６】Ａｌｖａｒｅｚら（１９８５年）
【非特許文献７】Ｕｔｓｕｉら（１９８６年）
【非特許文献８】Ｓｉｅｒａｄｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献９】Ｓｏｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献１０】Ｇａｒｄｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【発明の開示】
【００２０】
発明の概要
概して、本発明は、抗生物質の相乗的遺伝子を発見する方法であって、
ａ．細胞内における遺伝子産物の活性または量を低減するように、遺伝子産物をコードする核酸に対するアンチセンス核酸を細胞内で発現し、それによって抗生物質に感作された細胞を産生する段階、および
ｂ．抗生物質に対する細胞の感作を特徴付け、アンチセンス遺伝子の非存在下において必要とされる濃度の５分の１またはそれ未満で抗生物質の効力をもたらす抗生物質と遺伝子との対を選択する段階
を含む、方法を提供する。
【００２１】
本発明は、抗生物質の相乗剤を発見する方法であって、
ａ．選択された相乗的遺伝子に対応する遺伝子産物を阻害する化学化合物をスクリーニングする段階、
ｂ．阻害が細菌中で起こるように、選択された相乗的遺伝子に対応する遺伝子産物を阻害する化学的類似体を選択または作成する段階、および
ｃ．相乗的阻害剤を抗生物質と組み合わせ、それぞれの種々の濃度における組み合わせの抗微生物活性を決定する段階
を含む、方法も提供する。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、ベータラクタム系抗生物質の抗菌能を増大させ、それによって動物における細菌感染症を予防または治療するための方法において有用性を有する方法を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ＭｕｒＢの阻害剤と細胞壁阻害抗生物質、特にベータラクタム系抗生物質との組み合わせを含む。
【００２４】
微生物遺伝子断片を同定するための改良法によって、アンチセンス配向で異所的に発現した場合、関心対象の微生物遺伝子の転写後発現阻害をもたらし、それによって微生物中において観察および計測され得る表現型変化を引き起こすことができる。首尾よく同定されると、そのようなアンチセンス配向断片の条件発現を使用して、細胞内における特定の遺伝子産物の濃度を低下させ、それによって該細胞を、それ自体が遺伝子産物の特異的阻害剤である第２の物質に過剰感作させることができる。観察された表現型が、繁殖する能力の損失を構成する場合、この過感受性は、抗微生物活性を有する化合物の作用機序を試験するためのアッセイの基礎となり得る。そのようなアッセイにより、繁殖の損失を引き起こす能力が、関心対象の標的遺伝子産物およびそれらの化合物に対する特定の効果と関連付けられている抗微生物化合物と、観察される関連がない化合物とを区別することができるであろう。該改良法は、最も適切なアンチセンスＤＮＡ断片を明確に同定することにより、そのようなアッセイの開発を加速すると考えられる。
【００２５】
２つの先行特許、米国特許第６２２８５７９号および米国特許第６９２４１０１号では、微生物ゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片を、微生物中においてアンチセンス配向で発現した場合に繁殖を低減または妨害するそれらの能力を調査したプロセスを記述している。手短に述べると、ゲノムＤＮＡを断片化し、その断片をプラスミド上の誘導性プロモータの後にクローニングし、該プラスミドを関心対象の微生物に導入し、その後、クローニングされた断片の発現の依存的存在または非存在をもたらす誘導因子化合物または刺激剤の存在下および非存在下で、繁殖を計測および比較する。
【００２６】
断片は、センス配向またはアンチセンス配向のいずれかで、プロモータに対してクローニングされ得る。断片がアンチセンス配向である場合、微生物の繁殖の低減または妨害を引き起こすそれらの断片は、該断片の由来源である遺伝子の機能に特異的な機序によって該低減または妨害を行うことが想定され、この遺伝子が、コードする細胞機能が正常な繁殖のために必要とされる遺伝子であることが示唆される。
【００２７】
しかしながら、標的遺伝子の特異的阻害に至るアンチセンス断片を同定するための改良法を使用することにより、本発明者らは、上記の記述が真実ではないことを示した。実際に、本発明者らは、上記のようなプロモータから発現する断片は、示されている遺伝子および遺伝子産物に特異的でない多数の手段によって繁殖を低減し得ると認識している。見せかけのセンスまたはアンチセンス配向のいずれかで発現される断片は、１）細胞中における別の無関係な機能に対してアプタマーまたはその他の種類の阻害剤として作用し得るＲＮＡ種、２）元の遺伝子のものとは別のリーディングフレームにおいて発現し得、非特異的な毒性を有するペプチドを産生するＲＮＡ種をもたらし得る。このため、上記の特許において記述されているようなアンチセンスベースのスクリーニングは偽陽性をもたらし得る、すなわち、繁殖に必須である機能をコードしない遺伝子が、その遺伝子の増殖阻害アンチセンス断片のスクリーニングにおいて見かけ上のみ、そのようなものとして同定され得る。これは、繁殖等に必須なものとして、およびそのような可能性のある抗生物質の開発標的としての、遺伝子の誤同定につながる場合がある。
【００２８】
生物のゲノム全体ではなく、１つの遺伝子または関心対象の遺伝子に焦点を当てる。これは、標的特異的表現型効果を引き起こす断片のスクリーニングにおいて、該遺伝子または関心対象の遺伝子のはるかに優れた描写を可能にする。特定の遺伝子または関心対象の遺伝子に対するアンチセンス断片を見出すために、ゲノムＤＮＡ全体を使用することにより、結果としてスクリーニングが長くなる。
【００２９】
表現型変化を引き起こすアンチセンス断片を同定するための発見プロセスへの検証段階の組み込みは、該アンチセンス断片の由来源である遺伝子から発現した無傷のｍＲＮＡの特異的低減に伴う。
【００３０】
発明の詳細な説明
「ベータラクタム」ベータラクタム（βラクタム）は、３つの炭素原子および１つの窒素原子からなる、ヘテロ原子環状構造を有するラクタムである。ベータラクタム環は、ペニシリン等、いくつかの抗生物質の一部であることから、それらはベータラクタム系抗生物質とも称される。これらの抗生物質は、細菌細胞壁合成を阻害することによって働く。ベータラクタム系抗生物質クラスの例としては、ペニシリン、セファロスポリン、およびカルバペネムが含まれる。
2009523120.tif 000002
【００３１】
「抗生物質」は、感染症を制御するために使用される化合物である。抗生物質の例としては、以下が含まれる。
細胞壁阻害剤
ベータラクタム（ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ナフシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、アモキサシリン、カルベニシリン、チカルシリン、アゾシリン、メズロシリン、ピペラシリン、セファロスポリン、セファロチン、セファゾリン、セファレキシン、セフロキシム、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロル、モキサラクタム、セフォペラゾン、セフタジジム、セフトリアキソン、クラブラン酸、スルバクタム、イミペネム、アズトレオナム、セフォキシチン、セフォゾリン、セファクロル）
ペプチドグリカン生合成の阻害剤は、以下を含むがこれらに限定されない。
１．ＧｌｍＵ、ＭｕｒＡの阻害剤（ホスホマイシン）
２．ＭｕｒＢの阻害剤（ジヒドロピロロン）
３．ウンデカプレニルピロリン酸合成酵素の阻害剤（ヒダントイン、スルホンアミド）
４．ＬｐｘＣの阻害剤（ＵＤＰ‐３‐Ｏ‐アシルＮ‐アセチルグルコサミン脱アセチル化酵素）
リポペプチド（ダプトマイシン）
イソプレノイド生合成阻害剤（バシトラシン、ホスミドマイシン）
脂肪酸生合成阻害剤（セルレニン、トリクロサン、イソニアジド）
タンパク質合成阻害剤
１．アミノグリコシド（ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、およびカナマイシン）、
２．テトラサイクリン
３．クロラムフェニコール、
４．マクロライド（エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン）
５．リンコサミド（リンコマイシンおよびクリンダマイシン）
６．オキサゾリジノン（リネゾリド）
ムピロシン等のｔＲＮＡ合成酵素阻害剤
１．ＭｅｔＲＳ阻害剤（カテコール、プロリン、キノロン）
２．ペプチド脱ホルミル酵素阻害剤（ヒドロキサマート）
リファンピシン等のＲＮＡ合成阻害剤
キノロン等のＤＮＡジャイレース阻害剤（ナリジクス酸、シプロフロキサシン）
抗葉酸剤（トリメトプリムおよびスルファメトキサゾール）
【００３２】
「相乗効果」は、≦０．５のフラクショナル阻止濃度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）指数（ＦＩＣＩ）として定義され、ここでＦＩＣＩは、２つの化合物を組み合わせた場合の個々の構成要素のフラクショナル阻止濃度（ＦＩＣ）の和として定義され、ＦＩＣは組み合わせた場合の化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を化合物単独のＭＩＣで割った比率として定義される。
【００３３】
「アンチセンス相乗効果」は、誘導因子の存在下における化合物の５０％発育阻止濃度（ＩＣ５０）を、誘導因子の非存在下におけるＩＣ５０で割った比率≧５として定義される。
【００３４】
本発明者らのアンチセンスへの関心は、新たな抗生物質候補の作用機序を追跡する際に使用するための、炭疽菌の特定のアンチセンス株の開発にあった。本発明者らの標的の１つはＭｕｒＢ、つまりペプチドグリカン生合成の第２の段階である（図１）。すべての病原菌はＭｕｒＢを必要とするが、現在ＭｕｒＢを阻害することによって作用する抗生物質はない。
【００３５】
その機能的ｍｕｒＢ遺伝子（ｍｕｒＢ‐２）に対する誘導性アンチセンスを有する炭疽菌株の作成は、誘導因子の存在下において増殖減弱された株をもたらした。選択された株は、ｍｕｒＢ遺伝子の種々の部分に対応するアンチセンス挿入断片を有することが決定された。続いて、増殖減弱および抗生物質のパネルに対する感受性の誘導因子依存性の観点から、それらの株を特徴付けた。予想に反して、株のいくつかは抗生物質に対する感受性において相違を示さなかった。したがって、抗生物質発見のためのアンチセンスベースのツールを作成する際における重大な付加的段階は、ある特定の抗生物質に対する感受性増大の実証である。本発明者らは、他者らによって作成されたアンチセンス株の多くは、阻害剤に対して過感受性でないため、スクリーニングまたは作用機構決定において有用ではないのではないかとの疑念を抱いている。
【００３６】
確認されたｍｕｒＢアンチセンス株の、細胞壁阻害抗生物質について、予想外且つ劇的なアンチセンス相乗効果が観察された。４つの場合（セフェピム、セフトリアキソン、セフォキシチン、またはセフォタキシム）において、ｍｕｒＢアンチセンス発現は、非誘導条件にある細胞に対して、１００〜６００倍低い濃度の抗生物質に対して感受性のある細胞をもたらした（図３）。その他の細胞壁阻害抗生物質に対する感受性は、増大されたが程度の低いものであった。タンパク質合成、ＤＮＡ合成、またはＲＮＡ合成等、その他の経路を標的とする抗生物質に対する感受性は、増大されなかった。その他の遺伝子を標的とするアンチセンス株は、試験したいかなる抗生物質に対しても感受性におけるこのような異例の増大がなかったことから、該効果はペプチドグリカン生合成経路内の遺伝子に特異的であると考えられる。
【００３７】
図４は、抗生物質のパネルに対するｍｕｒＡアンチセンス株の感受性を示す。ｍｕｒＢアンチセンス株に観察されたように、ｍｕｒＡアンチセンス発現は、細胞壁阻害抗生物質に対する感受性は何倍にもなったが、その他の経路を標的とする抗生物質に対してはそうでない細胞をもたらした。ペプチドグリカン生合成におけるその他の遺伝子を標的とするアンチセンス株にも同様の結果が得られた。
【００３８】
標的間における限られた相乗的な相互作用については前例があるが、ＭｕｒＢアンチセンス株とセファロスポリンとの間における相乗効果の大きさについては前例がない。本発明者らには、アンチセンスの代わりに標的阻害剤を使用して相乗効果が達成され得ることを示す、セフォタキシムと組み合わせたいくつかの弱ＭｕｒＢ阻害剤についての限定的なデータがある（図５）。本発明者らはまた、この現象が炭疽菌に限定されるものでなく、黄色ブドウ球菌中におけるｍｕｒＢアンチセンス発現が、ベータラクタム系抗生物質に対して細胞を過剰感作させることも示した（図６）。最後に、本発明者らは、抗生物質化学療法における重要なパラメータである「死滅時間（Ｔｉｍｅ‐ｔｏ‐ｋｉｌｌ）」の観点から、この相乗効果を特徴付けるプロセスにある。本発明者らは、セファロスポリンとＭｕｒＢ阻害との組み合わせが、セファロスポリン単独での殺菌結果にかかる時間に対して、殺菌効果にかかる時間を短くすると期待している。
【００３９】
本発明者らはさらに、ＭｕｒＢ阻害が、そうしなければそのような感染症の治療時に効果のないメチシリンおよびその他のペニシリンに対して、メチシリン耐性細菌を再感作すると期待している。
【００４０】
炭疽菌におけるＭｕｒＢおよびセファロスポリンに関するこの観察により、本発明者らは、この方法論を用いて発見され得る抗生物質と遺伝子標的とのその他の組み合わせを期待している。本発明者らは、これらの観察は、その他の重要な病原体、特に黄色ブドウ球菌に移し変えることができると期待している。図６は、ｍｕｒＢに対する誘導性アンチセンスで操作された黄色ブドウ球菌の株におけるセフォキシチンおよびジクロキサシリンの効能の増大を示す。抗生物質のパネルに対する黄色ブドウ球菌株の感受性は、ベータラクタム系抗生物質の誘導因子の存在下において増大したが、その他の作用機構の抗生物質では増大しなかった。
【００４１】
本発明者らは、抗生物質と遺伝子との、その他の予想外の相乗的対を明らかにする能力も期待している。これらの対は、その他の抗生物質に対する相乗剤の開発のための標的部位の発見を可能にし得る。菌類および哺乳動物細胞を含むその他の生物におけるアンチセンスは、抗癌剤、向精神薬等を含む多くのクラスの薬物の有効性を増強するための、相乗的標的部位および最終的には相乗化合物の発見のために、同様の様式で活用され得る。
【００４２】
したがって、任意の所与の抗生物質と任意の特定の標的の阻害剤との間における相乗的な相互作用の潜在性を決定できることが有用であると考えられる。そのような決定は、所与の抗生物質の効能を増大させる化学化合物のスクリーニングの構成を可能にすると考えられる。誘導性アンチセンスは、相乗剤の発見および開発用の標的を決定するためのシステムの基礎となり得る。アンチセンスのこの使用は、遺伝子の必要性を発見する際におけるその使用と対照をなす。遺伝子の必要性を発見するためのアンチセンスの使用については他者らによって記述されているが、アンチセンスのこの使用は、必須遺伝子、または必須ではないが抗生物質の効能を何らかの手法で限定する遺伝子のいずれかの検出をもたらし得る。
【００４３】
薬物の相乗的組み合わせの使用は、使用される用量の低下または化学療法の時間が短くなることによる薬物の副作用低下、感染症のより迅速な治癒によって入院が短くなること、制御される病原体のスペクトルの増大、抗生物質に対する耐性発現の発生率の減少を含む、従来の単一化合物化学療法よりも多くの利点を有し得る。
【００４４】
抗生物質の相乗剤発見のための関心対象の遺伝子を決定するためのアンチセンスツールの重要性は、それが、抗生物質の作用機序に関する特定の知識を持たずに、および相乗的標的用に特定の化合物を使用することなく、新規スクリーニングを開発するための経験的方法を提供することである。このアンチセンスの使用は、遺伝子と任意の所与の病原体に対する抗生物質感受性との間の予想外の関係を明らかにすることができる。図７は、抗生物質のための相乗的標的の発見についてのプロセスの流れを示す。
【００４５】
本発明者らは、ＭｕｒＢとベータラクタム系抗生物質との間の相乗的な相互作用を発見した。この発見は、治療法の投薬量を低減すること、治療時間を減少させること、または病原体制御のスペクトルを増大させることによって、抗感染症化学療法を増強することができる、ＭｕｒＢ阻害剤とベータラクタムとの組み合わせの開発を予期するものである。
【００４６】
本発明者らは、特定の遺伝子のための誘導性アンチセンスを使用し、誘導因子の存在下および非存在下における生物の抗生物質感受性を比較して、任意の所与の抗生物質の相乗的標的を発見するための一般法を開発した。
【００４７】
本発明者らは、薬物と相乗作用のある標的を発見し、それによって薬効を増大させることを可能にするための、アンチセンスの一般的使用を予期している。この使用は、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗腫瘍剤、殺虫剤、除草剤、および化学療法によって処置が施されるその他の生物系にまでおよび得る。
【００４８】
実施例
以下の例は、本発明を例示することを意図し、限定することを意図しない。
【００４９】
以下は、本発明の方法を表す説明的例である。
１）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、関心対象の遺伝子（例えば、オペロン）をＰＣＲ増幅する。調査する遺伝子のいずれかの末端の約２００ｂｐを含むように注意する。
２）該ＰＣＲ断片を超音波処理によって断片化し、結果として生じた断片を平滑末端化し、約３５０〜４００ｂｐより大きくないようにサイズ選択し、次いで本発明者らの発現プラスミドであるｐＢＡＸ‐２内の誘導性プロモータの直ぐ下流のポリリンカーにクローニングする。このライブラリの作成は、通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において為される。
３）続いて、ライブラリのＤＮＡを、関心対象の遺伝子が由来する生物、例えば、炭疽菌または黄色ブドウ球菌に形質転換する。ピッキングによって個々のコロニーを収集し、プラスミドの存在を選択する成長培地中で、９６ウェル培養皿において培養する。
４）細胞が増殖した後、誘導化合物キシロースが含まれるかまたは含まれないかのいずれかの元の成長培地の固体版に、該細胞をレプリカプレーティングする（例えば、ピンツールを使用して）。
５）これらのレプリカプレートを一晩増殖させ、続いて、プラスとマイナスのキシロース対として比較し、キシロースプレート上においてのみ著しい増殖感受性を示すコロニーを、さらなる研究のために非キシロースプレートから選択する。
６）キシロース成長感受性株のｐＢＡＸ‐２プラスミドの挿入断片を、ＤＮＡ配列決定法によって分析する。これにより、ＰＣＲ増幅した関心対象の遺伝子において断片が何処に由来するかを同定し、該関心対象の遺伝子および誘導性プロモータの両方に対してセンスまたはアンチセンス配向であるかを確定する。
７）センスおよびアンチセンスの相対数を記録する。本発明者らは、遺伝子が必須である場合、キシロース増殖感受性株のプールにおいて、アンチセンス配向断片を主に得ることを見出した。遺伝子が必須でない場合、スクリーニングされる同等数のコロニーにおいて増殖感受性が見られない傾向があるか、または、より同等な数のアンチセンスおよびセンスが見られる。キシローススクリーニングを適用する前に形質転換細胞を無作為に選択する場合、得られるアンチセンス対センスの数は、ほぼ等しいままであることを見出すであろうことに留意されたい。
８）さらなる分析のために、多数のアンチセンスクローンを選択する。これらは、関心対象の遺伝子における相対的位置（本発明者らのｍＲＮＡレベルを分析する現在の能力では、さらなる３’断片に制限される）および相対的サイズについて選択する。多くの場合、断片が大きくなるにつれて、非特異的な増殖感受性を引き起こす可能性が大きくなる。
９）続いて、これらのアンチセンスクローンに対して２つの研究を行う。アンチセンス断片の発現の誘導を受けて、関心対象の遺伝子からの転写物の内因性レベルを計測する。関心対象の遺伝子に対応し、対照遺伝子のものには対応しないメッセージにおける特異的な分解または低減は、アンチセンスが、関心対象の遺伝子の特異的な転写後発現阻害剤として働いていることの指標である。
１０）もう１つのアッセイは、アンチセンス断片の発現の誘導を受けて、一般的な増殖効果とは異なる特異的な表現型変化を計測することである。本発明者らのＤＨＦＲアンチセンスの場合、試験はアンチセンスがチミジンの栄養要求性を引き起こし得るか否かを見るものであった。チミジンの生合成はＤＨＦＲによって合成されるテトラヒドロ葉酸塩の大部分を要するものであり、栄養要求性はＤＨＦＲ突然変異の古典的効果である。もう１つの行うべきことは、特定の抗生物質等、関心対象の遺伝子の細胞産物に特異的なアンチセンスの誘導による、阻害化合物に対する過感受性を計測することである。アンチセンスは、関心対象の遺伝子に特異的でなく、無関係な細胞標的に特異的である、阻害剤または抗生物質に対する過感受性を引き起こさないはずである。
【００５０】
上記の例を参照して本発明を説明したが、本発明の精神および範囲には、改変および変形が包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】細菌中におけるペプチドグリカンモノマー単位の生合成経路を示す。
【図２】阻止濃度下のアンチセンス誘導因子の存在下および非存在下における、セフォタキシムへのｍｕｒＢ２アンチセンスクローンの応答を示す。左パネル：ｍｕｒＢ２アンチセンスクローン。上部線：誘導因子なし。下部線：＋４０ｍＭキシロース。右パネル：ｍｅｔＲＳアンチセンスクローン。ＥＣ５０＋キシロース／ＥＣ５０（−キシロース）の比率により、「ＩＣ５０推移」が求められる。この例において推移を計算すると、（２０９６／６．１）＝３４３である。
【図３】（ａ）セファロスポリン、ならびに（ｂ）ベータラクタム系クロキサシリン、オキサシリン、およびジクロキサシリンを含むその他の抗生物質に対する、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ｍｕｒＢ‐２アンチセンス株の感受性を示す。
【図４】種々の抗生物質に対する炭疽菌ｍｕｒＡｌアンチセンス株の感受性を示す。
【図５】セフォタキシムおよびジヒドロピロロン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｒｏｌｏｎｅ）ＭｕｒＢ阻害剤Ｒｘ０００１０６またはＲｘ０００１０７を使用した、野生型炭疽菌におけるＦＩＣＩ実験を示す。チェッカーボード実験においては、化合物のフラクショナル阻止濃度（ＦＩＣ）は、単独および組み合わせた化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の比率として計算される。ＦＩＣ指数（ＦＩＣＩ）は、２つの化合物のＦＩＣの和である。
【図６】ｍｕｒＢアンチセンスを用いて操作された炭疽菌を示す。
【図７】相乗的標的および相乗剤の発見のためのプロセスを示す。
【図８】標的配列の表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月27日(2008.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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