(57)【要約】【課題】新規なｍｉＲＮＡ配列及びその前駆体及び相補物の提供。様々なｍｉＲＮＡ、及びそれらの元となる少なくとも幾つかの大分子ＲＮＡ種の提供。特定のｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの存在を決定することに基づく、核酸を含有する細胞由来のサンプルの分析方法の提供。細胞に由来する核酸含有サンプルの解析方法の提供。【解決手段】セットＡ、セットＢ、セットＣからなる群から選択され、セットＡが図９で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＢがセットＡの配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＣが図９で同定されるオリゴヌクレオチドのセットである、オリゴヌクレオチドのコレクション又はその核酸アナログ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セットＡ、セットＢ、セットＣからなる群から選択され、セットＡが図９で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＢがセットＡの配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＣが図９で同定されるオリゴヌクレオチドのセットである、オリゴヌクレオチドのコレクション又はその核酸アナログ。
【請求項２】
セットＤからＲからなる群から選択され、セットＤが図４で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＥが図５で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＦが図６で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＧが図７で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＨが図８で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＩが図４で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＪが図５で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＫが図６で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＬが図７で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＭが図８で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、オリゴヌクレオチドセットＮ、Ｏ、Ｐ、Ｑ及びＲ又はその核酸アナログが、それぞれセットＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭの全ての配列に対する相補配列を含む、オリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのコレクション。
【請求項３】
細胞に由来する核酸含有サンプルの特徴を描写する方法であって、前記サンプルが、本発明の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）若しくはその哺乳類アナログの少なくとも最小限の配列を含むか否かを決定するステップ、及び／又は、前記サンプルが、本発明の前記ｍｉＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）若しくはその哺乳類アナログの前駆体を含むか否かを決定するステップと、前記ｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの存在、相対的な貧富度を基礎として前記サンプルを特徴づけるステップを含んでなる、前記方法。
【請求項４】
前記サンプルが少なくとも図１の少なくとも５つのｍｉＲＮＡ又はその哺乳類アナログの最小限配列を含むか否かを決定することを含んでなる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも５つのｍｉＲＮＡが、各々異なる前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に由来し、前記ｍｉＲＮＡの有無を基礎として前記サンプルを特徴づけている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが分化細胞の核酸を含む、請求項３から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが胚細胞又は幹細胞の核酸を含む、請求項３から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが異所の増殖表現型を有する細胞の核酸を含む、請求項３から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が腫瘍細胞及び／又は細胞株である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が肺細胞、皮膚細胞、脳細胞、肝細胞、胚細胞、心臓の細胞又は胚細胞株である、請求項３から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の細胞が対照細胞と異なるか否かを決定する方法であって、前記細胞中の図１の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ発現若しくはその哺乳類アナログ、及び／又は図１のヘアピンＲＮＡ若しくはその哺乳類アナログが異なるか否かを、前記対照細胞におけるその発現と比較することにより決定するステップを含んでなる方法。
【請求項１２】
前記細胞が分化細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が胚細胞又は幹細胞である、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が異所の増殖表現型を有する細胞である、請求項１１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞は腫瘍細胞及び／又は細胞株である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が肺細胞、皮膚細胞、脳細胞、肝細胞、胚細胞、心臓の細胞又は胚細胞株である、請求項１３から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ａ）図１で示す核酸配列、及び／又はｂ）ａ）の相補物である核酸配列、及び／又はｃ）図１のｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも８０％、又は図１のヘアピンＲＮＡに対して７０％の同一性を有する核酸配列、及び／又はｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）の配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１８】
図１の配列に対する配列ｃ）の同一性が少なくとも９０％である、請求項１７記載の核酸分子。
【請求項１９】
ｍｉＲＮＡ分子又はそのアナログである、請求項１７又は１８記載の核酸分子。
【請求項２０】
１８〜２６ヌクレオチド長を有する、請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２１】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はＤＮＡ分子をコードする、請求項１７から２０のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２２】
６０〜１１０ヌクレオチド長を有する、請求項２１記載の核酸分子。
【請求項２３】
一本鎖である、請求項１７から２２のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２４】
少なくとも部分的に二本鎖の状態にある、請求項１７から２２のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２５】
ＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸アナログ分子又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１７から２４のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項２６】
少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドアナログを含有する分子である、請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２７】
治療用途及び／又は診断用途への、請求項１７から２６のいずれか１項記載の核酸分子の使用。
【請求項２８】
図１に示す核酸配列を有する、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０の核酸分子からなる核酸分子のコレクション。
【請求項２９】
少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０の核酸分子であって、図１で示す核酸配列の相補物である核酸配列を有するか、又は図１に示す核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を有する、前記核酸分子のコレクション。
【請求項３０】
癌、心疾患、ウイルス性感染症、疾患感受率の診断用途への、請求項２８記載の核酸分子のコレクションの使用。
【請求項３１】
癌、心疾患、ウイルス性感染症の診断用途への、請求項２９記載の核酸分子のコレクションの使用。
【請求項３２】
請求項１７から２６のいずれか１項記載の核酸分子を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項３３】
請求項２８又は請求項２９記載の核酸分子のコレクション、又はそれらの組み合わせを含んでなるプローブのセット。
【請求項３４】
請求項３３記載のプローブのセットを含んでなるアレイ。
【請求項３５】
マイクロアレイである、請求項３４記載のアレイ。
【請求項３６】
請求項３３記載のプローブのセット、及び／又は請求項３４若しくは請求項３５記載のアレイの、診断検査への使用。
【請求項３７】
活性薬剤としての請求項１７から２６のいずれか１項記載の少なくとも１つの核酸分子、及び任意に薬理学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項３８】
発生障害若しくは病原体による障害のためのモジュレータとしての、請求項３７記載の医薬組成物又は請求項１７から２６のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項３９】
前記障害が癌である、請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
遺伝子の下方制御発現のための、請求項１７から２６のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項４１】
細胞のクロマチンのリモデリングための、請求項１７から２６のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項４２】
細胞の転写調節のための、請求項１７から２６のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項４３】
細胞内において、遺伝子によって産生されるタンパクの量を減少させるための、請求項１７から２６のいずれか１項記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸分子及びそのコレクションに関する。本発明は更に、治療及び診断用途への核酸分子の使用に関する。本発明は更に、ｍｉＲＮＡ分子又はその前駆体分子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）は転写後のレベルで遺伝子の発現を調節する非コードＲＮＡである（Ｂａｒｔｅｌ，２００４を参照）。発見されて間もないが、それらは多種多様な生物学的プロセス（細胞の運命づけ、細胞死、増殖及び脂肪の貯蔵）において鍵となる役割を演ずることがとわかっている（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ，２００３，Ｐｏｙら、２００４，ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ａｍｂｒｏｓ，２００４）。現在、マウス及びヒトの、約２００の異なるｍｉＲＮＡｓが報告されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，２００４）。ｍｉＲＮＡｓが遺伝子発現を調節する際の分子生物学的な要件及び機構が現在までに明らかにされているが（Ｂａｒｔｅｌ，２００４）、個々の生物学的機能は、その多くが未だ明らかにされていない。ｍｉＲＮＡｓの時間的及び空間発現が、細胞特異性の鍵となる特徴であると考えられる。
【０００３】
ＭｉＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓなど）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の分野で公知である。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の管理による遺伝子発現のサイレンシングである。内在性ＲＮＡｉは、ウイルス及びトランスポゾンなどの分子寄生体に対するゲノムの防御を目標とした、原始的な種類の免疫系のようである。ＲＮＡｉのプロセスの間に、ｄｓＲＮＡは短鎖型（ｓｉＲＮＡ）に変換される。ｓｉＲＮＡは、「短鎖干渉ＲＮＡ」の略語であり、これらの２１ヌクレオチド長の分子の合成品が、哺乳類細胞系でＲＮＡｉを誘導するのに広く使用される。これは、ｄｓＲＮＡに対するこれらの細胞の非特異的インターフェロン応答を回避するからである。ｍｉＲＮＡは、小分子ＲＮＡの別の種である。しかしｍｉＲＮＡは、ゲノム自体によりヘアピン構造として常にコード化され、一方ｓｉＲＮＡは、人工的であることも内在性であることもできる（Ｈａｍｉｌｔｏｎ及びＢａｕｌｃｏｍｂｅ  １９９９；Ａｒａｖｉｎら、２００１；Ｒｅｉｎｈａｒｔ及びＢａｒｔｅｌ  ２００２；Ａｍｂｒｏｓら、２００３）。両分子とも、ｍＲＮＡ分解、又は蛋白質合成の阻害のいずれかに導くことができる全く同一のプロセスに、ほとんどが送り込まれる。通例、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡの破壊を引き起こすが、これに対してｍｉＲＮＡは、植物ではｍｉＲＮＡの殆どが切断を導き、一方動物では殆どの場合ｍｉＲＮＡが翻訳阻害を誘導するという、両方を行えるが、植物での翻訳阻害と動物での切断の例も認められている（Ｃｈｅｎ  ２００４；Ｙｅｋｔａら、２００４）。
【０００４】
ｍｉＲＮＡ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され、転写物はその後、キャッピングされてポリアデニル化される（Ｃａｉら、２００４）。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでのｍｉＲＮＡの発現パターンは、上流配列に緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を融合することによって簡単に調べることができる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００３；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ及びＨｏｂｅｒｔ  ２００３）。ｍｉＲＮＡの新生転写物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（一次ｍｉＲＮＡ）と命名されており、１以上のｍｉＲＮＡを含むことができる。個々のｍｉＲＮＡ含有ヘアピン前駆体（又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）は、核内でこのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから酵素Ｄｒｏｓｈａ（Ｌｅｅら、２００３）により切り出され、ｄｓＲＮＡ結合蛋白質、グリッパ（ｇｒｉｐｐｅｒ）によって補助される（Ｇ．Ｈａｎｎｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）。Ｄｒｏｓｈａは、動物に特異的なＲＮａｓｅＩＩＩ酵素であり、核から搬出されることのできるｍｉＲＮＡ前駆体構造の生産に必須である。植物では、Ｄｉｃｅｒアナログの１つがこの役割を果たすようである（ＤＣＬ１；Ｐａｒｋら、２００２；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、２００２；Ｘｉｅら、２００４）。
【０００５】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは次いで、細胞質ゾルに搬出され（Ｙｉら、２００３；Ｂｏｈｎｓａｃｋら、２００４；Ｌｕｎｄら、２００４）、ここでさらにＤｉｃｅｒによるプロセッシングを受ける（Ｇｒｉｓｈｏｋら、２００１；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら、２００１；Ｋｅｔｔｉｎｇら、２００１）。この酵素は基本的に、どのｄｓＲＮＡでも捉えて、それをｓｉ／ｍｉＲＮＡに変換でき（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１）、これがどのようにして成し遂げられるかについて、多くのモデルがある。しかし、現時点では、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素によって生産されるｄｓＲＮＡ端部を特異的に認識する（Ｍａら、２００４）と思われるＰＡＺ（＝Ｐｉｗｉ−Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−Ｚｗｉｌｌｅ）ドメインを介してｄｓＲＮＡの一端に単量体として結合することにより、ヒトＤｉｃｅｒ酵素がこれを行うことは明らかなようである（Ｌｉｎｇｅｌら、２００３；Ｓｏｎｇら、２００３；Ｙａｎら、２００３）。これにより、Ｄｉｃｅｒ単量体の２つのＲＮａｓｅＩＩＩドメインが、およそ２１塩基対離れて活性部位を形成するように位置付けられる（Ｚｈａｎｇら、２００４）。ｍｉＲＮＡの場合、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの対合端部のみ認識されることが可能なので、この作用様式により、通常、特異的配列の唯一のｍｉＲＮＡが生産されることになる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの核酸配列に基づいて特異的ｍｉＲＮＡを予測できないことから、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡの生産の作用様式は予測不可能である。
【０００６】
サイレンシングを究極的に担う複合体は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と命名されており、これにはｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの両者が組み込まれている。単鎖ＲＮＡしか組み込まれないが、その２本の鎖のうちのどちらで、それがＲＩＳＣになるかは、ｓｉＲＮＡの熱力学的対称性によって決まり、殆どの場合で、最も緩く塩基対合した５’端を備えた鎖が組み込まれる（Ｋｈｖｏｒｏｖａら、２００３；Ｓｃｈｗａｒｚら、２００３）。Ｐ．Ｚａｍｏｒｅ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、この対称性がｄｓＲＮＡ結合蛋白質Ｒ２Ｄ２との複合体にてＤｉｃｅｒにより感知されると報告しているが、それが実際に、この鎖をＲＩＳＣ複合体に取り入れさせる（Ｌｅｅら、２００４；Ｐｈａｍら、２００４；Ｔｏｍａｒｉら、２００４）。次に起こることは、小ＲＮＡの起源（すなわち、Ｄｒｏｓｈａ及び／又はＤｉｃｅｒによってプロセッシングを受けているか否か）と、関連蛋白質と、標的ｍＲＮＡとｓｉ／ｍｉＲＮＡの間の塩基対合の程度、との因子の組み合わせによって決定される。
【０００７】
その結果の１つが、ｍＲＮＡの切断である。この切断を行う蛋白質（「Ｓｌｉｃｅｒ（スライサ）」）は、未だ把握し得ないままであるが、何の化学的作用をこの酵素が用いるはずなのかについては判っており、３’ヒドロキシル及び５’ホスフェート基が、切断産物を特徴付ける（Ｍａｒｔｉｎｅｚ及びＴｕｓｃｈｌ  ２００４；Ｓｃｈｗａｒｚら、２００４）。また、ＲＩＳＣは真の酵素のように挙動するので、多くの回数の切断を触媒する。他の結果である翻訳阻害も、完全には解明されていない。実際に阻害される翻訳の工程は、開始及び／又は伸長であり得る。あるいは、翻訳のプロセスは全く阻害され得ないこともある。翻訳でのサイレンシングの一様式には、新生鎖分解が関わるかもしれない。
【０００８】
現在では約２００の異なる哺乳類のｍｉＲＮＡｓが公知である。ヒトゲノムのｍｉＲＮＡ遺伝子の総数は、報告ではヒトゲノムでは最高２５５のｍｉＲＮＡ遺伝子が含まれると推定されている（Ｌｉｍら、２００３）。本発明は驚くべきことに、哺乳動物細胞で発現する様々なｍｉＲＮＡが存在することを発見した。少なくとも、ヒトゲノムにおける〜１０００のｍｉＲＮＡｓ（推定）が少なくとも幾つかの他の脊椎動物において保存され、相当な数の種特異的ｍｉＲＮＡｓも存在する。
【０００９】
【非特許文献１】Ａｂｂｏｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ａｌｖａｒｅｚ−Ｓａａｖｅｄｒａ，Ｅ．，Ｍｉｓｋａ，Ｅ．Ａ．，Ｌａｕ，Ｎ．Ｃ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．，Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．（２００５）．Ｔｈｅ  ｌｅｔ−７  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｍｉｒ−４８，ｍｉｒ−８４  ａｎｄ  ｍｉｒ−２４１  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｔｉｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ９，４０３−４１４．
【非特許文献２】Ａｌｖａｒｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，Ｉ．＆Ｍｉｓｋａ，Ｅ．Ａ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２，４６５３−６２（２００５）．
【非特許文献３】Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．（２００４）．Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，３５０−３５５．
【非特許文献４】Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．，Ｌｅｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｌａｖａｎｗａｙ，Ａ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ｔ．ａｎｄ  Ｊｅｗｅｌｌ，Ｄ．（２００３）．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｔｉｎｙ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １３：８０７−１８．
【非特許文献５】Ａｒａｖｉｎ，Ａ．＆  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７９，５８３０−４０（２００５）．
【非特許文献６】Ａｒａｖｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｎａｕｍｏｖａ，Ｎ．Ｍ．，Ｔｕｌｉｎ，Ａ．Ｖ．，Ｖａｇｉｎ，Ｖ．Ｖ．，Ｒｏｚｏｖｓｋｙ，Ｙ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｖｏｚｄｅｖ，Ｖ．Ａ．（２００１）．Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１０１７−２７．
【非特許文献７】Ｂａｇｇａ，Ｓ．，Ｂｒａｃｈｔ，Ｊ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓ．，Ｍａｓｓｉｒｅｒ，Ｋ．，Ｈｏｌｔｚ，Ｊ．，Ｅａｃｈｕｓ，Ｒ．，Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．（２００５）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｅｔ−７  ａｎｄ  ｌｉｎ−４  ｍｉＲＮＡｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｍＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １２２，５５３−５６３．
【非特許文献８】Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００４）．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １１６，２８１−２９７．
【非特許文献９】Ｂｅｎｔｗｉｃｈ  Ｉ，Ａｖｎｉｅｌ  Ａ，Ｋａｒｏｖ  Ｙ，Ａｈａｒｏｎｏｖ  Ｒ，Ｇｉｌａｄ  Ｓ，Ｂａｒａｄ  Ｏ，Ｂａｒｚｉｌａｉ  Ａ，Ｅｉｎａｔ  Ｐ，Ｅｉｎａｖ  Ｕ，Ｍｅｉｒｉ  Ｅ，Ｓｈａｒｏｎ  Ｅ，Ｓｐｅｃｔｏｒ  Ｙ，Ｂｅｎｔｗｉｃｈ  Ｚ．（２００５）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｎｄｒｅｄｓ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３７，７６６−７７０．
【非特許文献１０】Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ，Ｅ．，Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ  Ｃｕｐｐｅｎ，Ｅ．（２００２）．ＧＥＮＯＴＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ＧＥＮＯｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｒｏｍ  ＴＲＡＣＥ  ａｒｃｈｉｖｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８，１３９６−１３９７．
【非特許文献１１】Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ，Ｅ．，Ｇｕｒｙｅｖ，Ｖ．，ｖａｎ  ｄｅ  Ｂｅｌｔ，Ｊ．，Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ，Ｅ．，Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｕｐｐｅｎ，Ｅ．（２００５）．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ  １２０，２１−２４．
【非特許文献１２】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，Ｃａｕｄｙ，Ａ．Ａ．，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）．Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａ  ｂｉｄｅｎｔａｔｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−６．
【非特許文献１３】Ｂｏｆｆｅｌｌｉ，Ｄ．，ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ，Ｊ．，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ，Ｄ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ，Ｉ．，Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎ，Ｅ．Ｍ．（２００３）．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｈａｄｏｗｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，１３９１−１３９４．
【非特許文献１４】Ｂｏｈｎｓａｃｋ，Ｍ．Ｔ．，Ｃｚａｐｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｇｏｒｌｉｃｈ，Ｄ．（２００４）．Ｅｘｐｏｒｔｉｎ  ５  ｉｓ  ａ  ＲａｎＧＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｓＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ．Ｒｎａ  １０：１８５−９１．
【非特許文献１５】Ｂｏｎｎｅｔ，Ｅ．，Ｗｕｙｔｓ，Ｊ．，Ｒｏｕｚｅ，Ｐ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅ，Ｐ．ｅ．Ｙ．（２００４）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｕｎｌｉｋｅ  ｏｔｈｅｒ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ，ｈａｖｅ  ｌｏｗｅｒ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｉｅｓ  ｔｈａｎ  ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０，２９１１−２９１７．
【非特許文献１６】Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ，Ｊ．，Ｈｉｐｆｎｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｔａｒｋ，Ａ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．（２００３）．ｂａｎｔａｍ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｈｉｄ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｃｅｌｌ  １１３：２５−３６．
【非特許文献１７】Ｃａｉ，Ｘ．，Ｈａｇｅｄｏｒｎ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．（２００４  Ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃａｐｐｅｄ，ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ａｌｓｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｍＲＮＡｓ．ＲＮＡ  １０，１９５７−１９６６．
【非特許文献１８】Ｃａｌｉｎ，Ｇ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３，１７９３−８０１（２００５）．
【非特許文献１９】Ｃｈｅｎ，Ｘ．（２００４）．Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ＡＰＥＴＡＬＡ２  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｌｏｗｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：２０２２−５．
【非特許文献２０】Ｅｗｉｎｇ，Ｂ．，Ｈｉｌｌｉｅｒ，Ｌ．，Ｗｅｎｄｌ，Ｍ．Ｃ．＆  Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．Ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｔｒａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｒｅｄ．Ｉ．Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ８，１７５−８５（１９９８）．
【非特許文献２１】Ｆａｒｈ，Ｋ．Ｋ．，Ｇｒｉｍｓｏｎ，Ａ．，Ｊａｎ，Ｃ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｗ．Ｋ．，Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００５）．Ｔｈｅ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｏｎ  ｍＲＮＡ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１８１７−１８２１．
【非特許文献２２】Ｆｉｒｅ，Ａ．，Ｘｕ，Ｓ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｋｏｓｔａｓ，Ｓ．Ａ．，Ｄｒｉｖｅｒ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ  Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．（１９９８）．Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−１１．
【非特許文献２３】Ｇｉｒａｌｄｅｚ，Ａ．Ｊ．，Ｃｉｎａｌｌｉ，Ｒ．Ｍ．，Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｅｎｒｉｇｈｔ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｓ．，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．，Ｓｃｈｉｅｒ，Ａ．Ｆ．（２００５）．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｂｒａｉｎ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８，８３３−８３８．
【非特許文献２４】Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．，Ａｂａｊｉａｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｐ．（１９９８）．Ｃｏｎｓｅｄ：ａ  ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ８，１９５−２０２．
【非特許文献２５】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．（２００４）．Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−１１．
【非特許文献２６】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｇｒｏｃｏｃｋ，Ｒ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ，Ｓ．，Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．＆  Ｅｎｒｉｇｈｔ，Ａ．Ｊ．ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．２００６．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４，Ｄ１４０−４．
【非特許文献２７】Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．，Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．，Ｃｏｎｔｅ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｎ．，Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｓ．，Ｈａ，Ｉ．，Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｄ．Ｌ．，Ｆｉｒｅ，Ａ．，Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．（２００１）．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｔｉｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １０６：２３−３４．
【非特許文献２８】Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｄ．Ｃ．（１９９９）．Ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−２．
【非特許文献２９】Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ（２００５）．
【非特許文献３０】Ｈｅ  Ｌ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＭ，Ｈｅｍａｎｎ  ＭＴ，Ｈｅｒｎａｎｄｏ−Ｍｏｎｇｅ  Ｅ，Ｍｕ  Ｄ，Ｇｏｏｄｓｏｎ  Ｓ，Ｐｏｗｅｒｓ  Ｓ，Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ  Ｃ，Ｌｏｗｅ  ＳＷ，Ｈａｎｎｏｎ  ＧＪ，Ｈａｍｍｏｎｄ  ＳＭ．（２００５）  Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｕｍａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３５，８２８−３３．
【非特許文献３１】Ｈｏｆａｃｋｅｒ，Ｉ．Ｌ．Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｅｒｖｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，３４２９−３１（２００３）．
【非特許文献３２】Ｈｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｈ．，Ｙｅｋｔａ，Ｓ．，Ｋｕａｎｇ−Ｈｓｉｅｎ  Ｈｕ，Ｊ．，Ｈａｒｆｅ，Ｂ．Ｄ．，ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｓ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．（２００５）．Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉＲ−１９６  ａｃｔｓ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  Ｈｏｘｂ８  ａｎｄ  Ｓｈｈ  ｉｎ  ｌｉｍｂ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３８，６７１−６７４．
【非特許文献３３】Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．，Ｍｃｌａｃｈｌａｎ，Ｊ．，Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．，Ｂａｌｉｎｔ，Ｅ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．（２００１）．Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｔ−７  ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４−８．
【非特許文献３４】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｌｅｔ−７  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５９：３６４−７９．
【非特許文献３５】Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｏｂｅｒｔ，Ｏ．（２００３）．Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｌｅｆｔ／ｒｉｇｈｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２６：８４５−９．
【非特許文献３６】Ｋａｐｒａｎｏｖ，Ｐ．，Ｃａｗｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｄｒｅｎｋｏｗ，Ｊ．，Ｂｅｋｉｒａｎｏｖ，Ｓ．，Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．，Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．ａｎｄ  Ｇｉｎｇｅｒａｓ，Ｔ．Ｒ．（２００２）．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ２１  ａｎｄ  ２２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，９１６−９１９．
【非特許文献３７】Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．Ｆ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，Ｓｉｊｅｎ，Ｔ．，Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．（２００１）．Ｄｉｃｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｔｉｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２６５４−９．
【非特許文献３８】Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．ａｎｄ  Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．（２００３）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｍｉＲＮＡｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｉａｓ．Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−１６．
【非特許文献３９】Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．，Ｒａｕｈｕｔ，Ｒ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．＆  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＲＮＡｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５３−８（２００１）．
【非特許文献４０】Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．，Ｔａｍ，Ｂ．，Ｒｕｂｉｎ，Ｇ．Ｍ．（２００５）．Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｏｔｃｈ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＧＹ−ｂｏｘ−，Ｂｒｄ−Ｂｏｘ−，ａｎｄ  Ｋ−ｂｏｘ−ｃｌａｓｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９，１０６７−１０８０．
【非特許文献４１】Ｌｅｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｆｅｉｎｂａｕｍ，Ｒ．Ｌ．，Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．（１９９３）．Ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｅｎｅ  ｌｉｎ−４  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｌｉｎ−１４．Ｃｅｌｌ  ７５，８４３−８５４．
【非特許文献４２】Ｌｅｅ，Ｃ．，Ｇｒａｓｓｏ，Ｃ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｌｏｗ，Ｍ．Ｆ．（２００２）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ｐａｒｔｉａｌ  ｏｒｄｅｒ  ｇｒａｐｈｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８，４５２−４６４．
【非特許文献４３】Ｌｅｅ，Ｙ．，Ａｈｎ，Ｃ．，Ｈａｎ，Ｊ．，Ｃｈｏｉ，Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｊ．，Ｙｉｍ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｐ．，Ｒａｄｍａｒｋ，Ｏ．，Ｋｉｍ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｖ．Ｎ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  Ｄｒｏｓｈａ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：４１５−９．
【非特許文献４４】Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｍ．，Ｈａｎ，Ｊ．，Ｙｅｏｍ，Ｋ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｖ．Ｎ．（２００４）．ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２３，４０５１−４０６０．
【非特許文献４５】Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．，Ｎａｋａｈａｒａ，Ｋ．，Ｐｈａｍ，Ｊ．Ｗ．，Ｋｉｍ，Ｋ．，Ｈｅ，Ｚ．，Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．（２００４）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｄｉｃｅｒ−１  ａｎｄ  Ｄｉｃｅｒ−２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｅｌｌ  １１７：６９−８１．
【非特許文献４６】Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００５）．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｅｄ  ｐａｉｒｉｎｇ，ｏｆｔｅｎ  ｆｌａｎｋｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ，ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｅｌｌ  １２０，１５−２０．
【非特許文献４７】Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｙｅｋｔａ，Ｓ．，Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．Ｂ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００３）．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，１５４０．
【非特許文献４８】Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，Ｌａｕ，Ｎ．Ｃ．，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ，Ｐ．，Ｇｒｉｍｓｏｎ，Ａ．，Ｓｃｈｅｌｔｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．，Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００５）．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈａｔ  ｓｏｍｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｍＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３３，７６９−７７３．
【非特許文献４９】Ｌｉｎｇｅｌ，Ａ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｂ．，Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｍ．（２００３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ−ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ  ２  ＰＡＺ  ｄｏｍａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２６：４６５−９．
【非特許文献５０】Ｌｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｃｌａｓｓｉｆｙ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３５，８３４−８（２００５）．
【非特許文献５１】Ｌｕｎｄ，Ｅ．，Ｇｕｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｃａｌａｄｏ，Ａ．，Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｋｕｔａｙ，Ｕ．（２００４）．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：９５−８．
【非特許文献５２】Ｍａ，Ｊ．，Ｙｅ，Ｋ．ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，Ｄ．（２００４）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｈａｎｇ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＰＡＺ  ｄｏｍａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献５３】Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００５  Ｓｅｐ  １５；  ４３７（７０５７）：３２６−７．
【非特許文献５４】Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００４）．ＲＩＳＣ  ｉｓ  ａ  ５’  ｐｈｏｓｐｈｏｍｏｎｏｅｓｔｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＲＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．
【非特許文献５５】Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １，１５５−６１（２００４）．
【非特許文献５６】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ＫＡ，Ｗｅｎｔｚｅｌ  ＥＡ，Ｚｅｌｌｅｒ  ＫＩ，Ｄａｎｇ  ＣＶ，Ｍｅｎｄｅｌｌ  ＪＴ．（２００５）  ｃ−Ｍｙｃ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ｅ２Ｆ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８３９−４３
【非特許文献５７】Ｏｈｌｅｒ，Ｕ．，Ｙｅｋｔａ，Ｓ．，Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．Ｂ．（２００４）．Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｍｏｔｉｆ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＲＮＡ  １０，１３０９−１３２２．
【非特許文献５８】Ｏｋａｚａｋｉ，Ｙ，Ｆｕｒｕｎｏ，Ｍ．，Ｋａｓｕｋａｗａ，Ｔ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｊ．，Ｂｏｎｏ，Ｈ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｓ．，Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｉ．，Ｏｓａｔｏ，Ｎ．，Ｓａｉｔｏ，Ｒ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｎａｋａ，Ｉ．，Ｋｉｙｏｓａｗａ，Ｈ．，Ｙａｇｉ，Ｋ．，Ｔｏｍａｒｕ，Ｙ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｙ．，Ｎｏｇａｍｉ，Ａ．，Ｓｃｈｏｎｂａｃｈ，Ｃ．，Ｇｏｊｏｂｏｒｉ，Ｔ．，Ｂａｌｄａｒｅｌｌｉ，Ｒ．ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｐ．（２００２）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ６０，７７０  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，５６３−５７３．
【非特許文献５９】Ｐａｒｋ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｓｏｎｇ，Ｒ．，Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｘ．（２００２）．ＣＡＲＰＥＬ  ＦＡＣＴＯＲＹ，ａ  Ｄｉｃｅｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ，ａｎｄ  ＨＥＮ１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｃｔ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：１４８４−９５．
【非特許文献６０】Ｐｈａｍ，Ｊ．Ｗ．，Ｐｅｌｌｉｎｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．，Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．（２００４）．Ａ  Ｄｉｃｅｒ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ８０ｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍＲＮＡｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｃｅｌｌ  １１７：８３−９４．
【非特許文献６１】Ｐｉｌｌａｉ，Ｒ．Ｓ．，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｓ．Ｎ．，Ａｒｔｕｓ，Ｃ．Ｇ．，Ｚｏｌｌｅｒ，Ｔ．，Ｃｏｕｇｏｔ，Ｎ．，Ｂａｓｙｕｋ，Ｅ．，Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｅ．，Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．（２００５）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｅｔ−７  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１５７３−１５７６．
【非特許文献６２】Ｐｏｙ，Ｍ．Ｎ．，Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ｌ．，Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ，Ｊ．，Ｋｕｗａｊｉｍａ，Ｓ．，Ｍａ，Ｘ．，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｐ．Ｅ．，Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｓ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎ．，Ｒｏｒｓｍａｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｍ．（２００４）．Ａ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３２，２２６−２３０．
【非特許文献６３】Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００２）．Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１８３１．
【非特許文献６４】Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．Ｊ．，Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．，Ｂａｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．，Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｏｕｇｖｉｅ，Ａ．Ｅ．，Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．（２０００）．Ｔｈｅ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｅｔ−７  ＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｔｉｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，９０１−９０６．
【非特許文献６５】Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．Ｊ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｇ．，Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｍ．Ｗ．，Ｂａｒｔｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００２）．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：１６１６−２６．
【非特許文献６６】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ａｓｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（２００４）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈｏｓｔ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １４，１９０２−１９１０．
【非特許文献６７】Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｄ．Ｓ．，Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．，Ｄｕ，Ｔ．，Ｘｕ，Ｚ．，Ａｒｏｎｉｎ，Ｎ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．（２００３）．Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡｉ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８．
【非特許文献６８】Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｏｍａｒｉ，Ｙ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．（２００４）．Ｔｈｅ  ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉｓ  ａ  Ｍｇ（２＋）−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １４：７８７−９１．
【非特許文献６９】Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｔｏｌｉａ，Ｎ．Ｈ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｊｏｓｈｕａ−Ｔｏｒ，Ｌ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２  ＰＡＺ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ＲＮＡｉ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １０：１０２６−１０３２．
【非特許文献７０】Ｓｔａｒｋ，Ａ．，Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ，Ｊ．，Ｂｕｓｈａｔｉ，Ｎ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ｂ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．（２００５）．Ａｎｉｍａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｃｏｎｆｅｒ  ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈａｖｅ  ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ３’−ＵＴＲ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １２３，１１３３−１１４６．
【非特許文献７１】Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｐ．，Ｖｏｓｓ，Ｂ．，Ｒｅｈｍｓｍｅｉｅｒ，Ｍ．，Ｒｅｅｄｅｒ，Ｊ．，Ｇｉｅｇｅｒｉｃｈ，Ｒ．２００６．ＲＮＡｓｈａｐｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐａｃｋａｇｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｂｓｔｒａｃｔ  ｓｈａｐｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２：５００−３．
【非特許文献７２】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２，４６７３−８０（１９９４）．
【非特許文献７３】Ｔｏｍａｒｉ，Ｙ．，Ｄｕ，Ｔ．，Ｈａｌｅｙ，Ｂ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．，Ｃｏｏｋ，Ｈ．Ａ．，Ｋｏｐｐｅｔｓｃｈ，Ｂ．Ｓ．，Ｔｈｅｕｒｋａｕｆ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．（２００４）．ＲＩＳＣ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＲＮＡｉ  ｍｕｔａｎｔ  ａｒｍｉｔａｇｅ．Ｃｅｌｌ  １１６：８３１−４１．
【非特許文献７４】Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ，Ｅ．，Ｋｌｏｏｓｔｅｒｍａｎ，Ｗ．Ｐ．，Ｍｉｓｋａ，Ｅ．，Ａｌｖａｒｅｚ−Ｓａａｖｅｄｒａ，Ｅ．，Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ，Ｅ．，ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ，Ｅ．，Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．Ｒ．，Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，Ｓ．，Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．（２００５）．ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，３１０−３１１．
【非特許文献７５】Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ，Ｅ．，Ｋｏｕｄｉｊｓ，Ｍ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｅｅｄｅｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｃｕｐｐｅｎ，Ｅ．，Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉｃｅｒ  １  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３５，２１７−２１８．
【非特許文献７６】Ｘｉｅ，Ｚ．，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｋａｓｓｃｈａｕ，Ｋ．Ｄ．，Ｌｅｌｌｉｓ，Ａ．Ｄ．，Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ，Ｄ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．（２００４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２：Ｅ１０４．
【非特許文献７７】Ｙａｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｙａｎ，Ｓ．，Ｆａｒｏｏｑ，Ａ．，Ｈａｎ，Ａ．，Ｚｅｎｇ，Ｌ．ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，Ｍ．Ｍ．（２００３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＡＺ  ｄｏｍａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２６：４６８−７４．
【非特許文献７８】Ｙｅｋｔａ，Ｓ．，Ｓｈｉｈ，Ｉ．Ｈ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２００４）．ＭｉｃｒｏＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ＨＯＸＢ８  ｍＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：５９４−６．
【非特許文献７９】Ｙｉ，Ｒ．，Ｑｉｎ，Ｙ．，Ｍａｃａｒａ，Ｉ．Ｇ．ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．（２００３）．Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７：３０１１−６．
【非特許文献８０】Ｙｏｏ，Ａ．Ｓ．，Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｉ．（２００５）．Ｌｉｎ−１２／Ｎｏｔｃｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｖ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０，１３３０−１３３３．
【非特許文献８１】Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｋｏｌｂ，Ｆ．Ａ．，Ｊａｓｋｉｅｗｉｓｚ，Ｌ．，Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｅ．ａｎｄ  Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．（２００４）．Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｄｉｃｅｒ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ．Ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は新規なｍｉＲＮＡ配列及びその前駆体及び相補物を提供する。切除されてｍｉＲＮＡとなる前の大分子ＲＮＡ種は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、及び本発明で用いられているようなヘアピンＲＮＡなどの様々な名称を有する。本発明は様々なｍｉＲＮＡ、及びそれらの元となる少なくとも幾つかの大分子ＲＮＡ種の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明により提供されるｍｉＲＮＡ及びヘアピンＲＮＡを図１に列挙する。この図はｍｉＲＮＡ、クローン化ソース、ヘアピンＲＮＡ構造、その哺乳類アナログ及び図２の実験結果から抽出されたデータに関する情報など、膨大な量のデータを示す。図１の様々な要素を図１Ａに詳述する。異なる細胞タイプを、それぞれのｍｉＲＮＡｓの存在に関して分析した。ｍｉＲＮＡが細胞によって産生される場合に、ｍｉＲＮＡの構造及び核酸配列を決定した。すなわち、本発明は更に、図１の特定のｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの存在を決定することに基づく、核酸を含有する細胞由来のサンプルの分析方法の提供に関する。検出されたｍｉＲＮＡｓとｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓとの相関は、直接ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの核酸配列を基礎としたｍｉＲＮＡの正確な予想が不可能であることを示すものである。結果は修飾されたＲＡＫＥ−アプローチによって得られ（図２Ａに詳述）、例えば、１つの例では、予測されたｍｉＲＮＡ前駆体の１つの鎖から得られるｍｉＲＮＡを示し、他の例では、前駆体の２つの鎖から得られるものを示している。更に、ｍｉＲＮＡの位置の顕著な可変性がヌクレオチドの予測された前駆体中に存在し、その大部分及び配列は鎖の両端に存在した。
【００１２】
本発明のｍｉＲＮＡｓ及びヘアピンＲＮＡは、様々な起源の細胞においてディファレンシャルに発現することが解っている。ゆえに、個々のｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡに特異的なプローブが、それぞれのｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの発現を基礎として、それぞれのサンプルに使用できる。ゆえに本発明は、細胞に由来する核酸含有サンプルの解析方法の提供に関する。前記方法は、前記サンプルが、本発明の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）若しくはその哺乳類アナログの少なくとも最小限の配列を含むか否かを決定するステップ、及び／又は、前記サンプルが、本発明の前記ｍｉＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）若しくはその哺乳類アナログの前駆体を含むか否かを決定するステップと、前記ｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの存在、相対的な貧富度を基礎として前記サンプルを特徴づけるステップを含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図１は本発明にかかるｍｉＲＮＡ及びその前駆体（更に本明細書においてヘアピンＲＮＡと称される）を示す。図１において提供されるヘアピンＲＮＡは、典型的には、細胞中に存在する実際の前駆型ＲＮＡより短い。それはｍｉＲＮＡが切り出される元となるステム−ループ構造を形成する配列を有する。
【００１４】
ＭｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ及び生物学的給源に依存して様々な生物学的給源において検出されている。ｍｉＲＮＡの構造の解析により、ヘアピンＲＮＡから生じたｍｉＲＮＡがヘテロなグループであり、個々のｍｉＲＮＡが典型的には中心の配列を共有することが明らかとなっている。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから生じた個々のｍｉＲＮＡは、５’末端、３’末端又は両端で各々と異なる。本発明のｍｉＲＮＡの最小限配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの半体に由来する、全ての同定されたｍｉＲＮＡ変異体により共有される配列である。当該半体は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡの５’末端を有する半体、又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡの３’末端を有する半体でもよい。奇数のヌクレオチドを含有するｍｉＲＮＡの最小限配列は典型的には、少なくとも１０のヌクレオチド配列であり、それはｍｉＲＮＡの中央部ヌクレオチド、並びに、中央部ヌクレオチドに隣接する、当該中央部ヌクレオチドの５’若しくは３’側に位置する少なくとも４ヌクレオチドを含有する。偶数のヌクレオチドを含有するｍｉＲＮＡの場合、最小限配列は典型的には、１０のヌクレオチド配列であり、それは２つのｍｉＲＮＡの中央部ヌクレオチド、並びに、中央部ヌクレオチドに隣接する、当該２つの中央部ヌクレオチドの５’若しくは３’側に位置する少なくとも４ヌクレオチドを含有する。他の実施形態では図１のｍｉＲＮＡの最小限配列は少なくとも前記ｍｉＲＮＡ（すなわち図１のｍｉＲＮＡのヌクレオチド２から８）の「種（ｓｅｅｄ）」配列を含む。
【００１５】
様々なｍｉＲＮＡが様々な細胞タイプ又は組織において様々に発現するため、本発明の方法は、サンプルの給源を特徴づける目的にしようできる。例えば、心臓組織において発現し、胚の細胞では発現しないｍｉＲＮＡに特異的なプローブを用いることにより、心臓由来のＲＮＡを含まないサンプルの分類、またその逆に胚の細胞に由来する核酸を含まないサンプルの分類が可能となる。他の組織又は細胞で発現するｍｉＲＮＡを用いることにより、同様の特徴づけも可能となる。
【００１６】
天然の給源から得られる核酸はＤＮＡかＲＮＡであってもよい。本発明において、前記核酸はＲＮＡを含むことが好ましい。核酸は好ましくは細胞に直接由来する。しかしながら、核酸は限定されないが化学修飾などの１つ以上の処理を施されてもよい。本発明のｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はその相補物は例えば、ＤＮＡサンプルを分析するために用いてもよく、得られた（ｐｒｅ−）ｍｉＲＮＡ配列を分析することによって、解析用の核酸を提供した細胞が属する種を決定することができる。
【００１７】
特定のｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの存在、相対的な貧富度を基礎としたサンプルの特徴づけを行うことにより、疾患（例えば癌）の有無を示すマーカーとして使うことができる。例えば、組織に由来するサンプルがｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの異なる発現パターンを含むとき、健常者からのそれに対応する組織と比較したとき、又は同じ個人のそれに対応する前記組織中の、正常な組織部分と比較したときに利用できる。１つのｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの存在下における相違により、この種の解析において指標となりうる。しかしながら、解析の精度（すなわち適中率）は典型的には、異なるｍｉＲＮＡの数及び／又は分析されるヘアピンＲＮＡの増加と共に増加する。すなわち、本発明の試料の特徴づけのための方法は、好ましくは、前記サンプルが少なくとも図１の５つの異なるｍｉＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡの最小限配列、又はそれらの哺乳類アナログを含むか否かについて決定することを含む。好ましくは図１の少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、更に好ましくは少なくとも６０の異なるｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの最小限配列又はその哺乳類アナログである。本発明の方法はもちろん、当該技術で公知のｍｉＲＮＡの検出及び／又はヘアピンＲＮＡを更に含んでもよい。少なくとも図１のｍｉＲＮＡの最小限配列の有無が、本発明の方法で測定されることが好ましい。細胞における発現調節の機能を有するのは、典型的にはｍｉＲＮＡである。サンプルのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの存在はもちろん、少なくとも前記サンプルの対応するｍｉＲＮＡの最小限配列の存在を示すのもではあるが、これは必ずしも真である必要はない。好ましくは本発明の方法は、前記サンプルが、少なくとも図１の少なくとも５つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はその哺乳類アナログの最小限配列を含むか否かを決定するステップ（前記少なくとも５つのｍｉＲＮＡが少なくとも５つの異なるヘアピンＲＮＡに由来する）と、前記ｍｉＲＮＡの有無を基礎として前記サンプルを特徴づけるステップとを更に含んでなる。
【００１８】
サンプルは細胞を含んでもよい。しかしながら典型的には、当該サンプルは、本発明の方法によってｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの有無を分析する前に、数種類の処理を受ける。かかる処理は典型的には、必須ではないが、少なくとも細胞由来の一部の核酸の単離操作を含んでなる。サンプル中の核酸は、本発明の方法による解析の前に、増幅及び／又は転換などの操作を若干受けてもよい。前記ｍｉＲＮＡに特異的な相補的なプローブを通して、直接に、又は間接的にｍｉＲＮＡを検出できる。間接的な方法は、ＤＮＡ又はタンパクへの転換、及びそれに続く、転換により得られた生成物の特異的な検出を含むが、これらに限定されない。転換処理においては、幾つかの転換が必要となることもある。例えば、ＲＮＡをＤＮＡに変換、またその後ＲＮＡに変換し、更にタンパクに翻訳することができる。もちろん、かかる転換の際に、適当なシグナル配列（例えばプロモータ、翻訳開始部位など）を付与することが必要となる場合もある。他の非限定的な例としては、前記ｍｉＲＮＡの転換の有無にかかわらず、例えばＰＣＲ又はＮＡＳＢＡによる前記サンプルの増幅、又は他の核酸増幅方法などが挙げられる。全てのこれらの間接的な方法では通常、変換による生成物が元のｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの少なくとも特異性情報の一部（例えば核酸配列、アミノ酸配列又は他の配列）が保持される。間接的な方法においては、非天然のヌクレオチド又はアミノ酸を変換及び／又は増幅された生成物に添加してもよい。かかる生成物は当然ながら、それらが少なくとも元のｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの特異性情報の一部を含む限り、本発明の範囲内である。元のｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡの少なくとも一部の特異性情報とは、変換生成物（又はその基本的な一部）がｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡに特徴的な情報のことを意味し、本発明においてはその有無が決定される。
【００１９】
前記核酸を含んでなる細胞はいかなるタイプの細胞であってもよい。上記したように、それは胚細胞、胎児の細胞又は他の出産前の細胞であってもよく、又は出生後の個人（たとえば青年又は成人）の細胞であってもよい。それは哺乳類の身体の特定の部分又は組織に由来する細胞であってもよい。好ましくは前記細胞は異所の細胞、好ましくは異所の増殖表現型を有する細胞であってもよく、例えば腫細胞又は組織培養細胞である。好ましくは、当該細胞は癌細胞又は癌細胞と考えられる細胞である。好適な実施形態では、前記癌細胞は膠腫細胞である。他の好適な実施形態では、前記癌細胞は肺癌細胞である。他の好適な実施形態では、前記細胞は腺腫細胞（好ましくは肺腺腫細胞）である。他の好適な実施形態では、前記細胞は病原体に感染した細胞である。好ましくは前記病原体はウイルス又は（マイコ）バクテリアである。本発明の方法は、前記異所の細胞の段階を決定することに特に適している。例えば、腫瘍の元となる細胞は様々な悪性の程度を有することができる。様々な悪性の程度が進行すると共に、（ｐｒｅ−）ｍｉＲＮＡの発現パターンの変化が検出されうる。すなわちかかるパターンは悪性の程度と相関しうる。本発明の方法はすなわち、前記癌に罹患する個人の予後の測定に使用できる。
【００２０】
細胞は好ましくは肺細胞、皮膚細胞、脳細胞、肝細胞、胚細胞、心臓細胞、胚細胞株又はそれらに由来する異所の細胞である。
【００２１】
試験サンプルを参照と比較した場合に、発現の変化が良好に検出される。すなわち本発明の１つの態様は、サンプル中の細胞が対照細胞と異なるか否かを決定する方法の提供に関し、当該方法は、前記細胞において、図１の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ若しくはその哺乳類アナログ、又は図１の少なくとも１つのヘアピンＲＮＡ若しくはその哺乳類アナログの発現が、前記対照細胞と比較したとき異なるか否かを決定するステップを含んでなる。好ましくは、対照細胞と比較したとき、少なくとも５つのｍｉＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡの発現が、前記サンプルの前記細胞において異なるか否かが決定される。少なくとも２つの違いが発現のレベルにおいて存在するとき、発現は異なる。好ましくは、その違いは、検出可能なｍｉＲＮＡ発現と、検出不可能な発現との違いである。好ましくは、図１の前記少なくとも５つのｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。発現量の比較は、定常時のレベルの比較によってもよく、又は合成速度の比較によって行ってもよい。
【００２２】
本明細書で用いられる細胞は、哺乳類（好ましくはマウス、ラット、霊長類又はヒト）の細胞である。サンプルは例えば、疾患の有無、特定の種に属するか又は属しないか、又は特定の発生段階にあるか否かに関して特徴づけられる。しかしながら、多くの例においては、生物体のサンプルは、多様なパラメータにおいて天然及び／又は病理学的変動を通常示すため、サンプルは本発明のｍｉＲＮＡｓ及び／又はヘアピンＲＮＡのコレクションの存在、相対的な貧富度を測定することによって特徴づけるのが最適である。
【００２３】
サンプルが好ましくはｍｉＲＮＡｓ及び／又はヘアピンＲＮＡのコレクションを基礎として特徴づけられる他の理由としては、障害が個人ごとに異なる様式で現れることが挙げられる。しかしながらこれらの可変性の２つの原因は、ｍｉＲＮＡｓ及び／又はヘアピンＲＮＡのコレクションの検出情報を提供することによって算出できる。例えば、疾患に特徴的な発現プロファイルは、ｍｉＲＮＡｓ及び／又はヘアピンＲＮＡのコレクションから構成される。サンプル中の、前記コレクションの発現プロファイルを、前記疾患に特徴的な前記コレクションの対照発現プロファイルと比較することによって、このサンプルが由来する個人を、前記疾患の有無に関して試験することができる。サンプルが、疾患あるいは種の発現プロファイルにマッチするか否かを決定する方法は、多くの要因に依存する。例えば、ｍｉＲＮＡ自体は障害又は種の中では多少特徴的な力を有する。更に、コレクションの一部としてのｍｉＲＮＡは、全コレクションのパーセンテージを表す。サンプルを特徴づけることは好ましくは、１つのｍｉＲＮＡの欠如又は存在を決定することとは別に、多くのｍｉＲＮＡｓの欠如又はより存在を決定することを含んでなる。ｍｉＲＮＡの欠如又は存在は例えば、疾患又は種を示す、陽性若しくは陰性インディケーターである。好ましくはコレクション又は発現プロフファイルには、１つ以上の陽性及び／又は陰性のインディケーターが含まれる。前記陽性及び／又は陰性のインディケーターは、例えばｍｉＲＮＡｓの総数に対するパーセンテージとして、又はｍｉＲＮＡｓの絶対数として表す。インディケーターをパーセンテージで表すとき、インディケーターに任意にウエイトを付与してもよい。好ましくは本発明では、高い特徴的な力を有するインディケーターは、低い特徴的な力を有するインディケーターより高いウエイトを与えられる。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、前記サンプルが、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくは少なくとも５つの図１のｍｉＲＮＡｓの少なくとも最小限配列、又はその哺乳類アナログを含むか否か（好ましくは前記ｍｉＲＮＡが異なる前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に由来する）を決定するステップと、前記ｍｉＲＮＡの有無を基礎として前記サンプルを特徴づけるステップを含んでなる方法の提供に関する。図１にて図示する異なるヘアピンＲＮＡの、又はその異なる哺乳類のホモログの存在は、異なる前駆体ｍｉＲＮＡの存在の指標となる。好適な実施形態では、前記サンプルの前記特徴づけは、疾患の検査である。多くの例においては、多数のｍｉＲＮＡｓを含んでなる試験は、高い診断的活を有するが、必ずしもそうである必要はない。他の本発明の好適な実施形態では、１つ以上の他のｍｉＲＮＡｓとの組合せで、本発明に係る１つ以上のｍｉＲＮＡｓが、サンプルにおいて解析される。更なる好適な実施形態では、本発明に係る少なくとも１つのｍｉＲＮＡを、１つ以上の他のｍｉＲＮＡｓとの組合せでサンプルにおいて解析され、合計少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、又は最も好ましくは少なくとも２５のｍｉＲＮＡｓを測定することとなる。好適な実施形態では、サンプルにおいて解析される前記他のｍｉＲＮＡｓは、前記サンプルにおいて解析される本発明の前記ｍｉＲＮＡと同じ障害タイプに関与する。あるいは試験は２つ以上の疾患又は２つ以上の種のマーカーとして機能するｍｉＲＮＡｓを含んでなる。
【００２５】
好ましくは、前記サンプルは分化細胞の核酸を含んでなる。本願明細書において用いられる区別とは、細胞レベルでの区別、又は進化的なレベルでの区別であってもよい。好ましくは、当該区別とは細胞レベルでの区別である。分化細胞は生物体のいかなる部分に由来してもよい。好ましくは前記細胞は疾患を伴う生物体の一部に由来する。例えば、癌のサンプルを特徴づける場合には、前記細胞は好ましくは腫瘍に由来する。他の好適な実施形態では、前記サンプルは胚細胞の核酸を含む。胚細胞はいかなる生物体に由来してもよいが、好ましくは哺乳類に由来する。胚細胞に由来する核酸を含有するサンプルは、例えば生物体の疾患の早期診断に利用できる。一実施形態では、胚細胞は胚幹細胞である。更なる好適な実施形態では、前記サンプルは異所の増殖表現型を有する細胞の核酸を含む。異所の増殖表現型は、増殖プロセスが何らかの形で破壊されていることを示す。当該破壊は、内部因子、外部因子又はそれらの組み合わせによって生じる。異所の増殖表現型は、例えば肝炎、腸疾患又は癌に存在する。好ましくは、異所の増殖表現型を有する細胞は腫細胞及び／又は細胞株である。腫瘍細胞は例えば白血病細胞（例えば白血病のＢ細胞）である。前記腫瘍細胞株は例えば、生物体（好ましくは哺乳類）の腫瘍に由来する細胞に由来する培養細胞株から得られる。あるいは、前記腫瘍細胞株は腫特性が人工的に（例えば化学物質により）誘導された細胞に由来する培養細胞株から得られる。好適な実施形態では、本発明は本発明に係る細胞に由来する核酸含有サンプルを特徴づける方法の提供に関し、前記細胞は、肺細胞、皮膚細胞、脳細胞、肝細胞、胚細胞、心臓の細胞又は胚細胞株である。
【００２６】
一実施形態では、本発明は対照細胞と比較したとき、サンプルの細胞が修飾されているか否かを決定する方法の提供に関し、当該方法は、前記細胞における、図１の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ若しくはその哺乳類アナログ、及び／又は、図１のヘアピンＲＮＡ若しくはその哺乳類アナログの発現が、前記対照細胞と比較したときに変化しているか否かを決定することを含んでなる。本明細書で用いられる対照細胞とは、例えば、それぞれ、病気の細胞に対する健康な細胞、又は健康な細胞に対する病気の細胞を意味する。対照細胞は例えば、前記サンプルの由来となる同じ生物体の同じ細胞タイプの他の細胞である、他の生物体由来であるのが好ましい。他の生物体は好ましくは同等の種、及び／又は構造、及び／又は発生、及び／又は齢である。好適な実施形態では、前記細胞は分化細胞である。他の好適な実施形態では、胚細胞である。更なる実施形態では、前記細胞は異所の増殖表現型を有する細胞である。好ましくは前記細胞は、異所の増殖表現型を有する腫瘍細胞及び／又は細胞株である。一実施形態では、本発明は、本発明に係る対照細胞と比較したとき、サンプルの細胞が修飾されているか否かを決定する方法の提供に関し、前記細胞は肺細胞、皮膚細胞、脳細胞、肝細胞、胚細胞、心臓の細胞又は胚細胞株である。
【００２７】
図１にて図示するヘアピンＲＮＡの哺乳類アナログとは、図１の対応するヘアピンＲＮＡとして、類似のステムループ（ヘアピン）構造を形成できる、図１のヘアピンＲＮＡと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列である（図３で図示する）。図１にて図示するｍｉＲＮＡの哺乳類アナログとは、図１の少なくとも２０（好ましくは連続的）の対応するｍｉＲＮＡのヌクレオチドと、９０％の配列同一性を呈する配列である（図３で図示する）。好ましくは図１のｍｉＲＮＡの前記哺乳類アナログは、対応するヘアピンＲＮＡの哺乳類アナログとして存在する。好ましくは前記ｍｉＲＮＡアナログは、ステム構造を形成できる前記ヘアピンアナログの一部として存在する。
【００２８】
サンプル中の、図１のｍｉＲＮＡ及び／又はヘアピンＲＮＡ、又はその哺乳類アナログその図１又は哺乳類アナログの存在、相対的な貧富度は、様々な検出方法を用いて測定できる。典型的には、核酸の特異的検出方法が、用いられる。現在、多くの核酸の特異的検出方法が存在する。典型的には、これらは試験対照の核酸の少なくとも一部を特異的に認識するプローブを用いるが、必須ではない。かかるプローブは通常核酸であるが、そのアナログであってもよい。例えば、現在様々なヌクレオチドアナログが利用でき、それらは「標準的な」ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵの塩基対形成の少なくとも一部の特性を擬態する。あるいはイノシンのようなヌクレオチドアナログを、かかるプローブに組み込んでもよい。他のタイプのアナログとしては、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノなどが挙げられる。更なる核酸の特異的検出方法としては、特異的な核酸増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）及びＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限られない。かかる増幅方法は、典型的には１つ以上の特異的プライマーを使用する。プライマー又はプローブは好ましくは、図１にて図示する配列又はその相補物に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１２のヌクレオチドを含む。
【００２９】
本発明は、以下を含んでなる、単離された核酸分子の提供に関する：
ａ）図１で示す核酸配列、及び／又は
ｂ）ａ）の相補物である核酸配列、及び／又は
ｃ）ａ）又はｂ）の配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列、及び／又は
ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）の配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列。
【００３０】
本明細書で用いられる核酸配列の相補物は、必然的ではないが、ほとんど全ての塩基が、それらの相補性の塩基（チミジン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）とアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、並びにその逆）で置換されている配列である。配列同一性（パーセンテージ）は好ましくは、所与の配列と及び比較配列の間での同一ヌクレオチドの数を、比較配列の長さで除算することによって決定される。好適な実施形態では、本発明は、ａ）又はｂ）の配列に対する配列ｃ）の同一性が少なくとも９０％である、本発明に係る核酸分子の提供に関する。より多くの好適な実施形態では、ａ）又はｂ）の配列に対する配列ｃ）の前記同一性は、少なくとも９５％である。好ましくは、図１のｍｉＲＮＡ又はその相補物に対する前記配列同一性は、前記ｍｉＲＮＡの好ましくは２０のヌクレオチド長において９０％である。本発明で用いられているヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ及びＵは、いかなるリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び／又は他のヌクレオチドアナログ（例えば合成ヌクレオチドアナログ）であってもよい。本発明で用いられてるヌクレオチドアナログは例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）又はあるいは骨格又は糖修飾でされたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。更に、当該ヌクレオチドは、相補的な核酸配列とアナロガスな水素結合を形成できる対応するヌクレオチドで任意に置換されてもよい。かかる置換の例としては、ＴによるＵの置換である。核酸配列が本発明に係る配列にハイブリダイズするストリンジェントな条件は、厳密に制御された条件である。実験室におけるストリンジェントなハイブリッド形成条件は、当業者に公知である。
【００３１】
好適な実施形態では、本発明は、ｍｉＲＮＡ分子又はそのアナログである、本発明に係る核酸分子の提供に関する。更なる本発明の好ましい実施例は、ｍｉＲＮＡ又はヘアピン分子をコードしているヘアピンＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子の提供に関する。他の実施形態では、本発明は、図１のｍｉＲＮＡアナログ又は図１のｍｉＲＮＡの哺乳類アナログの提供に関する。本明細書で用いられるアナログは、２つ以上の種の共通の祖先から進化した、この遺伝子の配列（好ましくは遺伝子）又は生成物である。
【００３２】
本発明に係る単離された核酸は、１８〜１００のヌクレオチド、好ましくは１８〜８０ヌクレオチド長さを有するのが好ましい。成熟ｍｉＲＮＡは通常、１８〜２６ヌクレオチド長（大部分は約２２のヌクレオチド長）を有する。好適な実施形態では、本発明は、１８〜２６のヌクレオチド長、好ましくは１９〜２４ヌクレオチド長、最も好ましくは２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド長の核酸分子の提供に関する。本発明では、ＭｉＲＮＡｓを前駆体分子として提供してもよい。したがって、本発明は更に、図１にて図示するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ分子である、本発明に係る核酸分子の提供に関する。前駆体又はヘアピン分子は通常、５０〜９０ヌクレオチド長である。本発明は、図１のヘアピンＲＮＡの５０〜９０ヌクレオチド長を有する、本発明に係る核酸分子の提供に関する。ゆえに好適な実施形態では、本発明はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ分子であって、６０〜１１０ヌクレオチド長の、本発明に係る核酸分子の提供に関する。本発明は更に、例えば一次転写産物のプロセシングによって前駆体ｍｉＲＮＡが生じたときに、１１０以上のヌクレオチド長である、本発明に係る核酸分子の提供に関する。好適な実施形態では、本発明は、前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは図１のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はその哺乳類アナログ若しくはオルトログである、本発明に係る核酸分子の提供に関する。
【００３３】
上記したように、一本鎖のｍｉＲＮＡはＲＩＳＣに取り入れられる。ｍｉＲＮＡ前駆体分子は通常、部分的に二本鎖である。通常、ｍｉＲＮＡ前駆体分子は少なくとも部分的に自己相補的で、二本鎖部分（例えばループ及びステム構造）を形成する。本発明の一実施形態では、一本鎖である、本発明にかかる核酸分子の提供に関する。他の実施形態では、本発明は、少なくとも部分的に二本鎖の状態である、本発明に係る核酸分子の提供に関する。本発明の一実施形態では、本発明による核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は核酸アナログ分子又はそれらの組み合わせから選択される。本発明の他の実施形態では、上述した核酸分子は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドアナログを含有する分子である。更なる実施形態では、本発明は治療及び／又は診断用途への、本発明に係る前記核酸分子の使用の提供に関する。
【００３４】
本発明に係る核酸分子の一実施形態は、核酸分子のコレクションの一部である。かかるコレクションは好ましくは、限定されないが試験に用いられる。核酸分子のコレクションを上記の通り試験に使用する場合は、例えば、個人から採取したサンプルを試験することによって、個人における疾患の欠如又は存在を測定することができる。核酸分子のコレクションは、本願明細書において提供される核酸分子の数が多い場合、いかなる実験の設定においても、通常高い適中率を示す。すなわち、一実施形態では、本発明は、図１に示すように核酸配列を有する少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０の核酸分子を含んでなる、核酸分子のコレクションの提供に関する。一実施形態では、本発明による核酸分子のコレクションは、疾患（例えば癌、心疾患、ウイルス性感染症又は疾患感受率）の診断のために用いられる。
【００３５】
本発明は更に、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の、図１に示されるｍｉＲＮＡｓに相補性、又は図１に示されるｍｉＲＮＡｓにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列の核酸分子を含んでなる、核酸分子のコレクションの提供に関する。核酸分子のコレクションは好ましくは、癌、心疾患、ウイルス性感染症及び他の疾患の診断において用いられる。
【００３６】
本発明に係る核酸分子は、いかなる方法によって調製してもよい。非限定的な例としては、化学合成方法又は組換え方法が挙げられる。本発明に係る核酸分子は、一実施形態では修飾される。前記修飾は、例えばヌクレオチド置換である。前記修飾は例えば、細胞のターゲッティングのための標的特異性（たとえばオンコジーンのための特異性）を修飾するために実施される。前記修飾された核酸分子は、元のｍｉＲＮＡに対して、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。他の実施形態では、本発明に係る核酸分子を修飾し、ｓｉＲＮＡ分子を形成させる。例えば、ｍｉＲＮＡ分子を対称形の形となるように作製し、その後二本鎖ｓｉＲＮＡとして発生させる。好適な実施形態では、本発明は、それは好ましくは少なくとも１ヌクレオチドアナログを更に含んでなる、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は核酸アナログ分子から選択されることを特徴とする、本発明に係る核酸分子の提供に関する。一実施形態では、本発明の核酸分子は組換え発現ベクターに存在する。例えば本発明に係る組換え発現ベクターには、発現制御配列と制御可能に連結された組換え核酸が存在する。前記ベクターは生物体（好ましくは哺乳類）の核酸発現を可能とするいかなるベクターであってもよい。前記ベクターは好ましくはウイルスベクター又はプラスミドである。好適な実施形態では、生物体への前記ベクターの導入により、前記核酸の転写が可能となる。好適な実施形態では、前記転写後の転写物はプロセシングされ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子及び／又はヘアピン分子、更にｍｉＲＮＡ分子となる。
【００３７】
本発明に係る核酸は、一実施形態ではプローブとして提供される。様々な種類のプローブが従来公知である。プローブは通常核酸であるが、当業者であれば、同じ結合特異性（定性的な意味であり、必ずしも定量的な意味でなくてもよい）を有する代替物を利用でき、かかる代替物としては、ヌクレオチドアナログが挙げられるが、これに限定されない。一実施形態では、本発明は、本発明に係る少なくとも１つの核酸分子を含有するプローブのセットの提供に関する。好適な実施形態では、本発明は、前記核酸分子が図１のｍｉＲＮＡ分子、又はその機能性部分、誘導体及び／若しくはアナログである、本発明に係るプローブのセットの提供に関する。更なる好適な実施形態では、本発明は、前記核酸分子がｍｉＲＮＡ分子の相補物、又はその機能性部分、誘導体及び／又はアナログである、本発明に係るプローブのセットの提供に関する。更なる好適な実施形態では、本発明は、本発明に係る核酸分子のコレクションを含有するプローブのセットの提供に関する。本実施例におけるコレクションは好ましくは、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の、図１で示す核酸配列の核酸分子又はその哺乳類アナログを含んでなる核酸分子のコレクションであるか、又は、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の、図１で示す核酸配列と相補的な核酸配列の核酸分子、又は図１に示す核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、又はそれらの組み合わせである核酸配列である。
【００３８】
本発明は更に、本発明の１つ以上の核酸を含有するアレイの提供に関する。アレイは、同時に１つ以上のサンプルを分析するために用いる。好ましくは、前記アレイは少なくとも２つのプローブを含み、少なくとも１つのプローブは本発明に係る核酸分子を含んでなる。好適な実施形態では、前記アレイは、本発明に係る核酸分子のコレクション又は本発明に係る核酸分子のコレクションの組合せを含んでなるプローブのセットを含んでなる。一実施形態では、本発明のアレイはマイクロアレイである。好ましくは、前記マイクロアレイはオリゴヌクレオチドを含んでなる。好適な実施形態では、本発明に係るプローブのセット、又はアレイ若しくはマイクロアレイは、診断検査において用いられる。
【００３９】
本発明において用いられる診断検査は、本発明に係る核酸分子を用いて生物体のサンプルを解析することに基づく試験である。前記生物体は、好ましくは哺乳類（好ましくはヒト）である。本発明において用いられる前記サンプルは、好ましくは生体サンプルである。前記生体サンプルは、例えば体液である。好適な生体サンプルは組織サンプルである。組織サンプルは例えば、分化の段階又は細胞の発生の解析に用いられる。あるいは細胞タイプ又は組織タイプを、障害の有無において分類する。前記障害は、例えば、ｍｉＲＮＡ分子の典型的な発現量又はｍｉＲＮＡ分子の典型的な発現パターンによって特徴づけられる。本発明はまた、治療用途、及び診断用途への、本発明に係る核酸分子の提供に関する。本発明に係る、医療的診断は、障害（例えばウイルス性感染症又は癌）に関する診断である。近年、ｍｉＲＮＡｓは、癌の重要な偶然の因子（Ｌｕその他、２００５、Ｈｅその他、２００５、Ｏ‘ｄｏｎｎｅｌその他、２００５、Ａｌｖｅｒｅｚ−Ｇａｒｃｉａ及びＭｉｓｋａ（２００５））、又は癌の予後及び進行に関する有力なインディケーター（Ｃａｌｉｎその他、２００５）であると報告されている。癌は例えば白血病である。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、活性薬剤として本発明に係る少なくとも１つの核酸分子、並びに任意に薬理学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物の提供に関する。本発明による医薬組成物には、更に任意に他の添加剤を添加してもよい。他の添加剤は、例えば保存剤又は着色剤であってもよい。あるいは、添加剤は周知の薬理学的に活性の化合物である。担体は、いかなる適切な薬剤担体であってもよい。好適な担体は、核酸分子の標的細胞への効率的な取り込みを促進できる化合物である。かかる化合物の例としてはリポソーム（特にカチオン性リポソーム）である。組成物は、例えば錠剤、軟膏剤又はクリームである。好ましくは、組成物は注射溶液又は注射用懸濁液である。一実施形態では、本発明は、診断用の、本発明に係る医薬組成物の提供に関する。他の実施形態では、本発明は、治療用の、本発明に係る医薬組成物の提供に関する。好適な実施形態では、本発明は、発生における障害又は病原体による障害のモジュレータとしての、本発明に係る医薬組成物の提供に関する。好適な実施形態では、前記発生における障害又は病原体による障害は、癌である。ｍｉＲＮＡ分子は例えば、差プレッサー遺伝子、又は遺伝子の翻訳レギュレータとして機能する。
【００４１】
本発明に係る核酸分子は、いかなる適切な周知の方法によって投与してもよい。医薬組成物の投与様式は、当然ながらその剤形に依存する。好適な実施形態では、溶液を組織中に注入する。本発明に係る核酸分子は、いかなる周知の方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、標的細胞中に導入する。前記の導入は、当業者に公知の遺伝子導入方法（例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム、カチオンリポソーム又はウイルス的手法）によって実施できる。
【００４２】
一実施形態では、本発明に係る核酸分子は、遺伝子のマーカーとして用いられる。マーカーを用いて、遺伝子（例えば癌又は他の発生的な障害に関係する遺伝子）を同定する。マーカーは例えば、障害時に典型的にディファレンシャルに発現するｍｉＲＮＡであるか、又は障害時に典型的な発現パターンを示す２つ以上のｍｉＲＮＡｓのセットである。核酸分子は、例えば蛍光若しくは放射性標識される。他の実施形態では、本発明に係る核酸分子は、診断用若しくは治療用の標的である。例えば、本発明に係るｍｉＲＮＡ分子を阻害又は活性化し、当該阻害又は活性化の効果は、細胞タイプによる変化を測定することにより決定される。他の実施形態では、本発明に係る核酸はそれ自体標的でなくともよく、あるいは細胞内の標的を検出するものであってもよい。細胞の標的は、好ましくは遺伝子である。好ましくは、前記遺伝子は前記核酸分子と少なくとも部分的に相補性である。例えば、本発明に係るｍｉＲＮＡを用いて、細胞中の、前記ｍｉＲＮＡの配列と少なくとも部分的に相補性である配列を有する遺伝子を検出する。好適な実施形態では、本発明は、遺伝子発現のマーカー又はモジュレータとしての医薬組成物の提供に関する。他の好適な実施形態では、本発明は、前記遺伝子が前記核酸分子に少なくとも部分的に相補性である、本発明に係る医薬組成物の提供に関する。遺伝子発現のモジュレータは、例えばｍｉＲＮＡである。腫瘍サプレッサとして機能するｍｉＲＮＡを、例えば腫瘍細胞に提供し、発現させ、及び／又は輸送し、それにより腫瘍の発達を抑止する。好適な実施形態では、本発明は、遺伝子発現の下方制御のための、本発明に係る核酸分子の使用の提供に関する。遺伝子発現の下方制御は、例えば癌において重要である。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡを、前記ｍｉＲＮＡを発現しない組織の細胞で誘導し、及び／又は発現させてもよい。その結果、前記組織の前記細胞では、例えば異なる分化タイプを示す。かかる手順は、例えば組織の再プログラミング手順として用いられる。
【００４３】
現在、基本的には、新規なｍｉＲＮＡ遺伝子の２つの同定方法が存在する：サイズ断片化（１８−２５ｎｔ）されたＲＮＡのクローニング、並びに、ｍｉＲＮＡｓの異なる構造特徴に基づくコンピュータ予想及びその後の実験検証。サイズ分画されたＲＮＡのクローニングは困難な手順であって、同定されるｍｉＲＮＡｓの量が非常に少なくなる。予測されたｍｉＲＮＡ遺伝子の確立されたバリデーション方法は、サイズ断片化されたｃＤＮＡライブラリの構造に依存する。これはスケールアップの技術的な困難性から、実施が困難である。更に、それは多くの組織及び発生時点において試験することを必要とする。予測されたｍｉＲＮＡｓの確立されたバリデーション方法はこのように、何千もの候補部位の解析には適当でない。本発明者は、驚くべきことに、候補ｍｉＲＮＡ部位を試験するハイスループット方法を見出した。本発明は、候補ｍｉＲＮＡ部位のハイスループット発現の研究に対して、修飾ＲＡＫＥアッセイを提供するものである。提供されたアッセイは成熟ｍｉＲＮＡｓの３’末端の正確な遺伝地図作製を可能とし、すなわち、新規なｍｉＲＮＡ遺伝子の構造及び発現プロファイルの両方に関する情報を提供するものである。ＲＡＫＥアッセイなどの、様々なマイクロアレイ技術が、公知のｍｉＲＮＡｓの発現プロファイルに適用されていた。しかしながら、マイクロアレイはこれまで、新規な、コンピュータ予測されたｍｉＲＮＡｓの検出には用いられていなかった。本発明により提供される修飾ＲＡＫＥアッセイとコンピュータによる方法とを併用するユニークな方法により、多数の新規なｍｉＲＮＡｓの発見をもたらした。更に、本発明の方法は、更なるｍｉＲＮＡｓを発見する機会を提供する。
【００４４】
異種間配列比較は、機能的ゲノム要素を同定する強力な方法であるが、特に短い配列の場合は、その感度は系統的距離の増加と共に減少する。更に、分類群特異的なエレメントは次第に失われてゆく。古典的な系統的フットプリント法の限界を克服するため、本発明では、系統的シャドーイング方法（Ｂｏｆｆｅｌｌｉその他、２００３）を適用し、それにより、１ヌクレオチド解像度レベルで、明白な配列のアラインメント及び正確な保存度の定量が可能となった。この方法は、系統学的に密接に関連する種間のアラインメントに基づく。なぜなら、これらがほんのわずかの配列の相違を示さないからであり、様々な（しかし関連する）ゲノムのアラインメントをとり、不変（保存）部分を同定する作業を必要とする。本発明において、１０の異なる霊長類種（オランウータン、ゴリラ、２種のチンパンジー及び２種マカク、タマリン、クモザル、ウーリーモンキー及びキツネザルなど）の１２２ｍｉＲＮＡｓを包囲する、７００塩基対部位が配列決定された。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを覆う部位の他に、異なるｍｉＲＮＡｓに共通の更なる保存部位は検出されず、線虫（オーラーその他、２００４）とは対照的に、一般のシス活性エレメントが哺乳類のｍｉＲＮＡｓにおいては直ちに認識できないことが示唆された。本発明では、意外にも、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ部位に隣接している１箇所の顕著保存箇所が存在することを見出した。この特徴的な保存パターンはまた、より分岐した種属（ヒトとマウス）間におけるペアワイズなアラインメントにおいて認識することもでき、それを用いることにより、この典型的な保存プロフィールにおけるマウス−ヒト及びラット−ヒトの全ゲノム配列アラインメントをスクリーニングすることによる、新規なｍｉＲＮＡ遺伝子の同定が可能となる。Ｒａｎｄｆｏｌｄソフトウェア（ボンネットその他、２００４）により算出される、熱力学的に好ましい、安定なヘアピン型のフォールディング候補部位の性能の更なるストリンジェントなフィルタリングを行うことにより、９７６の候補ｍｉＲＮＡｓが同定された（全ての周知のヒトｍｉＲＮＡｓの８３％、１８９中１５８、ｍｉＲＮＡレジストリｖ．３．１に基づく）。
【００４５】
更なる脊椎動物（ゼブラフィッシュ、チキン、フクロネズミ、乳牛及びイヌ）のゲノムのホモログをスクリーニングした結果、６７８の候補が、げっ歯類を除く、少なくとも１つの他の種において保存されていることが分かった。予想された相当な部分は、哺乳類特有のｍｉＲＮＡｓを含んでなる。ゲノム中の分配と、その発現を支持するデータ範囲は、哺乳類特異的なサブセット及び少なくとも１つの非哺乳類の種においても保存される候補セットに対して適合性を有していた。比較において、ゲノム適用範囲の程度が、使用する種に応じて変化する場合であっても、このデータは、有意な数の系統特異的ｍｉＲＮＡｓの存在を示唆し、急速、及び徐々に進化するｍｉＲＮＡｓが存在することを示す（ｌｅｔ−７は遅い進化を示す典型例である）。
【００４６】
１４の新規な候補は、周知のｍｉＲＮＡｓと相同性を有し、更なる６０の候補は少なくとも１つの他の候補と相同性を有し、新規なサブファミリーを形成する。ｍｉＲＮＡｓ（バーテル２００４、ロドリゲスその他、２００４）の確立したクラスター形成反応に加えて、遺伝子間及び遺伝子内の部位のｍｉＲＮＡ遺伝子の数量比は、周知の、及び新規なｍｉＲＮＡｓの場合と同程度である。適切な一部の候補がアノテーションされた転写物の反対側の鎖に存在すると予測されるにもかかわらず、イントロン中におけるｍｉＲＮＡ遺伝子の不適当な存在は以外であり、また、ホスト遺伝子との同時転写及びスプライシングされたイントロンのプロセシングによって、発現機構を反映するとも考えられる。予測された新規なｍｉＲＮＡｓのうちの１７１は、エクソンとしてアノテーションされたゲノム中部位に存在する。実験において、かかる候補は顕著なクローニングアーティファクトとして通常廃棄されるが、これらの部位は成熟ｍｉＲＮＡｓに加工されうる。Ｃｕｌｌｅｎら（Ｃａｉその他、２００４）に研究は同時に、ｍｉＲＮＡ及びＯＲＦを収容している転写物が、ｍｉＲＮＡ及びタンパク生成のために能率的に使われることを証明している。エキソンの候補の約２５％（４４）は、非コーディング部分に存在し、１２７の候補は、タンパク質コード配列とアノテーションされた配列と重複するにもかかわらず、７５は逆の鎖上において予測された。
【００４７】
候補ｍｉＲＮＡｓの発現のサポートは、様々なソースにより提供される。３つの候補は、公表されているＦＡＮＴＯＭ２データベースの配列に存在し、１１の候補は、１つ以上の周知のｍｉＲＮＡｓを含有する遺伝子クラスターに存在していた。これらのｍｉＲＮＡｓは同じ転写一次産物（バーテル、２００４、ロドリゲスその他、２００４）から共発現されると考えられる。高密度オリゴヌクレオチドタイリングアレイ（Ｋａｐｒａｎｏｖその他、２００２）を使用した系統的なヒトのトランスクリプトーム解析が進行中であり、本発明では、公知の６４及び２１４の新規なｍｉＲＮＡｓをコードするゲノム領域がカバーされていることが判明した。このセットから、公知の１３（２０％）及び新規な７２（３４％）のｍｉＲＮＡｓは、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞株で発現し、そのデータは一般公開されている。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡがこれらの実験に用いられ、ｍｉＲＮＡ含有転写物の特性があまり明らかになっていないにもかかわらず、遺伝子間及び介在配列のｍｉＲＮＡｓが検出された。様々な研究成果から、少なくとも若干のｍｉＲＮＡｓがポリアデニル化されたＲＮＡからプロセシングされることが支持されている（Ｃａｉその他、２００４、リーその他、２００４）。
【００４８】
予測されたｍｉＲＮＡｓを実験的にサポートするため、本発明では、ノーザンブロット試験を、６９の候補に対して実施し、１６の成熟ｍｉＲＮＡｓ（２３％）の発現を確認した。これらの確認速度は、クローニング及びＰＣＲベースの方法を使用した、既に発表されている速度より低かった（９３中３８、Ｌｉｍその他、２００３）。ただしそれらは、すでに周知のｍｉＲＮＡｓのセットと、最も容易に検出可能なｍｉＲＮＡｓにおいて見られるバイアス、検出法の感度、及び使用するＲＮＡサンプルの空間時間的限界のため、明確なものとはいえないと考えられる。したがって、本発明者らは、ＲＡＫＥ（ＲＮＡプライム、アレイベースのＫｌｅｎｏｗ伸長、ネルソンその他、２００４）アッセイに基づく候補ｍｉＲＮＡのバリデーションのための、他のより高感度のストラテジーを開発した。
【００４９】
このアッセイは、ＲＮＡ分子が、一本鎖のＤＮＡ分子と完全に塩基対を形成するときに、クレノウポリメラーゼ酵素による延長のためのプライマーとして機能するという性能に基づく。良好な延長のためにはｍｉＲＮＡの正確な３’末端が公知でなければならず、またコンピュータ予想では、成熟したｍｉＲＮＡの正しい開始部位及び末端を予測するには最適でないため、我々は周知の及び予測されたｍｉＲＮＡ前駆体に相補的なプローブのタイリングパスをデザインした。かかるタイル経路ＲＡＫＥアッセイは、ｍｉＲＮＡの完全にマッチしている３’末端の存在に依存し、それ故、それらの３’配列において異なるｍｉＲＮＡファミリーとは区別されるため、標準的なハイブリダイゼーションアッセイより偽陽性の傾向がない。フランキングタイリングパスのプローブは、ネガティブコントロールとして機能する。ステムのどの鎖をＲＩＳＣ複合体の成熟ｍｉＲＮＡとして優先的にロードするかについて決定するための若干のルールが提案されているにもかかわらず（Ｋｈｖｏｒｏｖａその他、２００３、シュヴァルツその他、２００３）、かかるコンピュータ予測は、被処理ｍｉＲＮＡ二重鎖の正確な端が公知のときにのみ可能である。更に、ヘアピン配列の性質を有するため、ゲノムＤＮＡのどの鎖が前駆体をコードするかがしばしば予測困難である。完全にバイアスのない方法をとるため、発明者らは、ステム−ループ構造の各アームをカバーしている１１本のプローブのタイリングパスを、センス及びアンチセンスのゲノム配列ごとにデザインし、候補ｍｉＲＮＡ遺伝子あたり４４本のプローブセットを調製した。ＲＮＡフォールディング中のＧ−Ｕペア及び相補ＤＮＡ鎖の異なるヌクレオチド組成により、アンチセンス転写物が安定なステム−ループ構造に必ずしもフォールディングせず、またかかる候補の場合には、２２本のプローブのみが含まれる。タイリングパスの中央部分は、二次構造ヘアピン情報を基に、最も見込みのあるＤｉｃｅｒ／Ｄｒｏｓｈａプロセシング部位を予測することにより決定された。発明者らは、２７１の周知のマウスｍｉＲＮＡｓ及びマウス及びヒトとの間に保存される予測されたｍｉＲＮＡｓのうちの６７６をカバーする、４４，０００の特徴的なカスタムバリデーションマイクロアレイをデザインし、ストリンジェントなランダムフォールド基準（Ｂｏｎｎｅｔその他、２００４）及びマウス及びラットのゲノム保存に基づいて、更に１９９の候補でアレイを満たした。これらの配列は、小分子ＲＮＡの４つの異なる給源（マウス胚（８．５日及び１６．５日）、成体マウス脳及び胚性幹（ＥＳ）細胞（図２））から探索された。成熟ｍｉＲＮＡｓは、カスタムスクリプトを使用して生のマイクロアレイ出力データを前処理した後、半手動でアノテーションした。周知のｍｉＲＮＡｓのうちの２２１（８２％）の縮退のセット、候補となる保存されたｍｉＲＮＡｓのうちの４２９（６３％）及び余分の１２６（６３％）のセットが陽性であった（図２）。異なるゲノムの座位は、異なるヘアピン（例えばｍｉＲ−１−１及びｍｉＲ−１−２）から同一の成熟ｍｉＲＮＡを生じさせることができるため、非縮退の成熟ｍｉＲＮＡｓの総数はより少ない。興味深いことに、周知のｍｉＲＮＡｓの大半の場合、ＲＡＫＥアッセイで観察される最も顕著な３’末端はアノテーションされている形と異なり（ヘアピンの他のアームに存在する８つの成熟ｍｉＲＮＡｓを含む）、最初は星の配列がアノテーションされていたことが示唆される。更に、様々な候補及び周知のｍｉＲＮＡｓの場合、複数の次のプローブ（２又は３）はポジティブなシグナルの発生をもたらし、ｍｉＲＮＡｓの３’末端処理が、１ヌクレオチドレベルの完全に正確な方法でないことを示した。これらの発見は、クローニングされたｍｉＲＮＡｓの末端において観察された変動と一致するものであった（Ａｒａｖｉｎ及びＴｕｓｃｈｌ、２００５）。
【００５０】
我々が実験的に新規なｍｉＲＮＡｓを確認するために追跡した第２の方法は、単離されたヒト及びマウス組織の、サイズ断片化された小分子ＲＮＡライブラリの深いシークエンシングである。かかる方法論は既に限界に達している（Ｌｉｍその他、２００３）ことが以前示唆されたにもかかわらず、脊椎動物組織の選択されたセットからのライブラリクローンの極わずかな数が配列決定された（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００１ｍ、Ｌｉｍら、２００３，Ｂｅｎｔｗｉｃｈら、２００５）。更に、我々のコンピュータ予測及びマイクロアレイ（ＲＡＫＥ）−ベースの確認により、多くの新規なｍｉＲＮＡｓが発見されることが示唆された。したがって、発明者らはマウス脳及び様々なヒトの胎児の組織（脳、皮膚、心臓、肺及び複合組織）から、サイズ分画された小分子ＲＮＡの７つの高力価の非コンカテマーライブラリを調製し、８３，０４０クローンを配列決定した。ベクター及び良質なトリミングの後、１７塩基長以上の５１，０４４のインサートをリカバリーし、それぞれ、８，７６８及び７，３０６の非縮退のマウス及びヒト配列を表していた。発明者は、クローニング配列の自動化アノテーションのためのコンピュータパイプラインを開発し、その際、固有の染色体位置、反復エレメント又はｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ遺伝子、９つの脊椎動物ゲノム（ヒト、マウス、ネズミ、イヌ、乳牛、チキン、フクロネズミ、ゼブラフィッシュ及びフグ）からの保存データ、及びｒａｎｄｆｏｌｄ（Ｂｏｎｎｅｔその他、２００４）を用いた二次構造情報を考慮に入れた。この解析を、マウス及びヒトのクローニング断片、並びに、全ての周知のヒトの及びマウスｍｉＲＮＡｓ、並びにＲＡＫＥアッセイを使用して同定される陽性候補に関して適用した。ｍｉＲＢａｓｅ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、２００４）において寄託されている、２３８のマウスのうちの２１４（９０％）、及び３１９のうちの３０６（９６％）のヒトｍｉＲＮＡｓを、自動化したフィルタリング及びアノテーションに供し、偽陰性率が周知のｍｉＲＮＡｓと比べて低いことが示された。配列決定された小分子ＲＮＡ（２１，５３７のマウスクローン（６９％）、及び１３，１２０のヒトクローン（６６％））を、このフィルタリングを通過させた。周知の豊富なｍｉＲＮＡ配列はこのセットを占めていたが、興味深いことに、約２％は１１５の新規なマウス、及び１１１の新規なヒトｍｉＲＮＡ遺伝子を表していた（図１）。
【００５１】
以上から、本発明では５３５の新規なマウス（ＲＡＫＥ及びクローニング）及び１１１の新規なヒト（クローニングのみ）ｍｉＲＮＡ遺伝子を同定した。１７のｍｉＲＮＡｓのみがヒト及びマウス両方のサンプルからクローニングされたにもかかわらず、大部分の新規なマウスｍｉＲＮＡｓは、明白なヒトのアナログ（成熟ｍｉＲＮＡと９０％以上の同一性、及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと７０％以上の同一性）を有し、それぞれ最高４０１及び５４２のヒト及びマウスゲノムの新しく発見されたｍｉＲＮＡ遺伝子が追加された。
【００５２】
大多数の新規なｍｉＲＮＡｓは一度でクローニングされ、またクローニングの際の労力が、全ての周知のｍｉＲＮＡｓのわずか約２／３であることがわかったため、クローニングの際の労力はあまり大きくないと結論した。したがって、発明者らはヒト、チンパンジ及びマカクの脳サンプルから、更に３２のサイズ分画された小分子ＲＮＡライブラリを生成した。これらのライブラリは細菌にクローニングせず、エマルジョンＰＣＲで増幅してクローンとし、更に大規模なパラレルピロシークエンス（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓその他、２００５）を実施した。合計１６０万以上のシークエンスを、前述のバイオインフォマティックス解析パイプラインを使用して評価した。更に脊椎動物のゲノムがこの解析時に利用できたため、発明者らはｍｉＲＮＡｓのこのセットにおいて、他の種の相同ｍｉＲＮＡ遺伝子の識別のための代替方法を使用した。ヒト、チンパンジ及びマカクによる試験の結果、それぞれ８７８、２２７及び、１９７３の新規なｍｉＲＮＡｓが同定された（図１Ｃ）。相同性の解析により、２３８４の新規なヒトのマイクロＲＮＡのセットが得られた。６５のマイクロＲＮＡがヒト特異的であることがわかったが、１７及び５１９がそれぞれチンパンジ及びマカクのゲノムに限定されていた。
【００５３】
一実施形態では、本発明はヒトのｍｉＲＮＡ又はマウスｍｉＲＮＡを同定する方法の提供に関する。更なる実施形態では、本発明による方法は更なるステップを含む。前記ステップは、遺伝子のオルトログ又はホモログを測定することを含んでなる。オルトログ又はホモログは、配列の比較により決定される。ヒトのホモログ又はオルトログは、例えばマウス配列の中で決定され、又はその逆に、マウスオルトログはヒト配列の中で決定される。図１のｍｉＲＮＡのホモログは、好ましくは哺乳類ホモログである。図１のｍｉＲＮＡの哺乳類ホモログは、図１のｍｉＲＮＡの少なくとも２０の連続するヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくは、前記ｍｉＲＮＡの対応するヘアピンＲＮＡと７０％の配列同一性を有する大分子ＲＮＡ上に位置する。なお、適当なコンピュータモデルにより予測した場合、前記の大分子ＲＮＡはステムループ構造を形成することが好ましく、前記ホモログは好ましくは前記の大分子ＲＮＡの予測されたステム部位に位置する。
【００５４】
ＭｉＲＮＡｓは長いステム−ループ前駆体に由来する単鎖生成物であり、それらはメッセンジャーＲＮＡと塩基対を形成でき、それによりそれらの発現を防止する。動物ゲノムは何百ものｍｉＲＮＡ遺伝子、及びそれらにより標的にされる何千もの遺伝子を有する。ｍｉＲＮＡｓはしばしば器官特異的な発現を示し、すなわち異なる細胞タイプの識別に使用できる。
【００５５】
歴史的に、ｍｉＲＮＡｓは、プラナリアの異常なレギュレータとして発見された。ネマトーダ線虫の幼生の細胞分裂のタイミングにおいて不完全なミュータントでは、遺伝子ｌｉｎ−４（ｌｉｎ−１４  ｍＲＮＡと結合して、翻訳をサイレンシングする小分子ＲＮＡをコードしている）を欠損していることが明らかとなっている（Ｌｅｅら（１９９３））。第２の小分子ＲＮＡ（ｌｅｔ−７）が虫からハエ及びヒトにおいて安定に保存されていることが明らかとなった（Ｒｅｉｎｈａｒｔその他、２０００）こと、及びその後更なるｍｉＲＮＡｓが発見されたことから、この特筆すべき発見が一般的なものであることが明白になった。現在では、ヒトゲノム中におそらく少なくとも５００のｍｉＲＮＡ遺伝子が含まれ（Ｂａｒｔｅｌ、２００４、Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖその他、２００５）、それらが何千もの標的遺伝子を調節する（Ｌｉｍその他、２００５、Ｌｅｗｉｓその他、２００５）ことが解明されている。７塩基の種配列（５’端からの位置２〜８）のみが動物細胞におけるｍｉＲＮＡの活性に必要とされると考えられるが、ではなぜ、全ｍｉＲＮＡがこれ程安定に保存されているのだろうか。確かに他の位置は、小さいが有意な効果をｍｉＲＮＡ活性に付与するにもかかわらず、更なる説明としては、ｍｉＲＮＡが成熟する前に、ｍｉＲＮＡの他の配列が前駆体のプロセシングに必要とされることが考えられる。また、ｍｉＲＮＡｓが、これらの他の配列が必要とされる細胞内において、他の未知の機能を発揮すると結論づけることができない。
【００５６】
ｍｉＲＮＡｓの発見とは別に、ｓｉＲＮＡｓによる遺伝子サイレンシングが見出された。すなわちＲＮＡ干渉（Ｆｉｒｅその他、１９９７）である。類似性は直ちに認識されなかったが、ＲＮＡｉの中央部はｍｉＲＮＡｓと同一サイズのＲＮＡ分子であった。また、長い二重鎖ＲＮＡからｓｉＲＮＡｓを調製するＲＮａｓｅが発見された（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎその他、２００１）ため、おそらく、Ｄｉｃｅｒもまた、ｍｉＲＮＡｓを調製する役割を果たすと考えられる（それは実際、ＤｉｃｅｒミュータントではｍｉＲＮＡ合成ができないことを示す結果が、ほぼ同時期に報告されている）。それ以来、遺伝子的及び生物化学的な解析の結果、ｍＲＮＡをサイレンシングし、小分子ＲＮＡ（ＲＩＳＣ、ＲＮＡにより誘発されたサイレンシング複合体）によって誘導される複合体が、生物ごと、組織ごとに異なりうるという結論に至った。また、１つの細胞の中に平行した経路が存在することも考えられるが、本質的には、ｍｉＲＮＡｓ及びｓｉＲＮＡｓはかなり類似する複合体介して作用し、それは常にＡｒｇｏｎａｕｔタンパク質のファミリーの少なくとも１つのメンバーを含む。
【００５７】
ｍｉＲＮＡｓがｍＲＮＡをサイレンシングする正確な機構は、他の幾つかの問題と共に不明である。最初のｍｉＲＮＡ  ｌｉｎ−４の発見は、標的ｍＲＮＡが無処置のままにされ、定常状態のレベルが維持される（Ｌｅｅその他、１９９３）ことを示し、すなわちｍｉＲＮＡはサイレンシングされるが、分解されてはいないと考えられる。それ以来、ｍｉＲＮＡサイレンシングが実は標的ｍＲＮＡのレベルの低下を伴うことが分かっており、当該低下はしばしば適度であり、２〜３の因子は共通であり、それは完全にタンパク質レベルの低下を説明するには不十分と考えられ、また、未処理のｍＲＮＡがサイレンシングされる（Ｂａｇｇａその他、２００５）ことを示唆する。以前のデータとの矛盾は、最初の研究がノーザンブロットではなく、ＲＮＡレベルをＲＮａｓｅ保護により測定した（ＲＮＡの部分的な分解に影響されない技術）ことから説明できる。解明が必要とされている第２の点は、ｍｉＲＮＡｓの翻訳抑止効果が、翻訳の誘導又は伸長であるどうか否かであり、最近の研究では、ＩＲＥＳ（内部リボソームエントリー部位）の導入により、ｍｉＲＮＡ抑制が損なわれ、すなわちその活性は誘導であることを示唆している（Ｐｉｌｌａｉその他、２００５）。
【００５８】
ｍｉＲＮＡｓの機能は何であろうか？上記のミュータントに存在するｍｉＲＮＡミュータントの完全な欠如は、ショウジョウバエ又は線虫などの遺伝系においては、変異誘導の標的としての小型のｍｉＲＮＡｓに部分的に起因すると考えられ、更に、ｍｉＲＮＡｓは、それが７ヌクレオチドの「種配列」に影響を及ぼさない限り、一塩基変異に対してかなり寛容であると考えられる。更に、突然変異をタンパク翻訳領域にマップしようとしている研究者は、非コードｍｉＲＮＡ配列の突然変異を無視する方を選択すると考えられる。しかしながら、ｍｉＲＮＡｓが変異体スクリーニングにおいて失われた最も有力な説明はおそらく、それらのノックアウトがしばしば表現型を有しないということであろう。最近の研究において、線虫ゲノムのｍｉＲＮＡｓはノックアウトされ、その結果、単一のミュータントでは、複数のミュータントのように表現型となって現れなかった（アボットその他、２００５）ことが報告されている。発明者らはまた、モルホリノを使用したゼブラフィッシュ胚のｍｉＲＮＡｓのノックダウンにより、この現象を観察した。結論としては、多くの縮退が存在した。おそらく、細胞内の高いｍｉＲＮＡｓレベル（しばしば５０，０００のコピー超）が、関連するｍｉＲＮＡコード遺伝子のセットにより実現され、それらの１つの損失により、顕著な表現型の変化に直ちに結びつかない程度の適度な上記レベルの減少が生じたと考えられる。生物学においてしばしば生じるが、これは、選択圧がほとんどない場合、それほど多くのｍｉＲＮＡ遺伝子の保存がなぜ生じるのかという疑問を生じさせるが、それに明確に回答するだけのデータは、実験室条件下では目下得られていない。
【００５９】
種配列がｍｉＲＮＡの標的特異性を決定すると考えられるため、本発明は更に、図１に図示するｍｉＲＮＡの少なくともヌクレオチド２−８を有する核酸配列、又は図１に図示するｍｉＲＮＡの哺乳類アナログの種配列を提供する。好適な実施形態では、図１のｍｉＲＮＡの少なくともヌクレオチド２−８を有する前記核酸配列は、約１８〜２６ヌクレオチドを含んでなる。好ましくは約２０〜２４ヌクレオチド、より好ましくは２２ヌクレオチドを含んでなる。
【００６０】
上記のように、１つのｍｉＲＮＡｓのノックアウト変異体は、ｍｉＲＮＡｓの機能に関する手がかりをほとんど与えない。機能に関する１つの示唆は、ｍｉＲＮＡｓの発現パターンの研究から得られた。すなわち、本発明者らは多くのｍｉＲＮＡｓが器官特異的に発現すること、またその発現が１つの器官内であっても１つの組織層に制限されることを最近見出した。これは、それらが細胞内の代謝などの、細胞の生存に必要な一般的な役割ではなく、分化細胞間の違いという意味での態様でしか、役割を演じないことを示している（Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓその他、２００５）。かかる発現パターンの例は、筋肉におけるｍｉＲ−２０６及び小脳におけるｍｉＲ−３４Ａである。可能な限りの粗ｍｉＲＮＡノックアウト実験から第２のヒントが得られる。すなわち、Ｄｉｃｅｒ遺伝子（ｍｉＲＮＡｓを作るヌクレアーゼをコードする）の破壊による、全てのｍｉＲＮＡｓ（＋ｓｉＲＮＡｓ）のノックアウトである（Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓその他、２００３）。予想では、この突然変異は致命的である。マウスにおいては、Ｄｉｃｅｒの機能は幹細胞形成においても必要とされる。しかしながら、ゼブラフィッシュにおいてはそうではない。すなわち、２匹のＤｉｃｅｒヘテロ接合体魚を交雑し、同型接合の子孫を解析した結果、生後ほぼ１週間までは通常発生するが、その時点で成長が停止し、動物が死に至る。魚の胚では、大部分のそれらの器官が２４〜４８時間で形成され、１週間泳いた後、それを摂取し、成体となる（全てＤｉｃｅｒを必要としない）。ｍｉＲＮＡレベルの解析により、母性レスキューが一部考えられる。発生の第１日において、Ｄｉｃｅｒ変異胚でも新規な接合体ｍｉＲＮＡｓが形成され、これは母性Ｄｉｃｅｒの機能（卵母細胞のＤｉｃｅｒ  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク）によってなされるはずである。注目に値することとしては、若干のｍｉＲＮＡｓを除いて、発生の初期の２４〜４８時間では、野生型においても、低レベルの発現がみられることである（Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓその他、２００５）。すなわち、ｍｉＲＮＡ発現の時間的パターンは、大部分の細胞が分化し、組織が形成された後で、長い時間にわたり見られるということである。このレベルの遅い上昇は、時間とともに蓄積した結果であるはずである。多くのｍｉＲＮＡ遺伝子はタンパクコーディング遺伝子のイントロンに埋没しており、それらの宿主ｍＲＮＡ、したがっておそらくｍＲＮＡと等モルで初期に転写され、一方、ｍＲＮＡレベルは中程度のままであり、ｍｉＲＮＡレベルは時間と共に増加する。その理由は、ｍｉＲＮＡｓはそれらの宿主ｍＲＮＡよりターンオーバーが著しく低いことである。更なる線虫により実験（Ｇｉｒａｌｄｅｚその他、２００５）により、ｍｉＲＮＡｓは、初期発生において大きな役割を果たさないことが示された。Ｄｉｃｅｒの母性発現は、同じ発生段階の野生型の胚に、Ｄｉｃｅｒミュータント胚からの生殖細胞を移植することによって除去することができる。魚が育つと、それらは稔性を有するが、それらの生殖細胞系は遺伝的にＤｉｃｅｒミュータントである。この状況において、魚は母性のＤｉｃｅｒを有さず、実際、動物は早い段階で発生を停止するが、それらはまだ幾つかの組織を形成���る。これらの実験の結論は、ｍｉＲＮＡｓが完全な発達のために必要とされ、発達における役割を示唆する発現パターンを有するが、初期の組織分化には必要でないということである。発生におけるｍｉＲＮＡｓ発現の新規な標的が現在利用できるようになったため、上述の研究は、図１のｍｉＲＮＡｓの発見によって、更に洗練されることとなるだろう。
【００６１】
近年の幾つかの研究では、発生時においてｍｉＲＮＡｓがいかに遺伝子発現を調整するかに関して報告している。ある研究では、ｍｉｒ−６１の、フィードバックループを介した、ネマトーダの産卵口の発生における細胞の運命を決定する役割に関して報告している。細胞運命は１つの遺伝子又はもう一方の排他的な発現で決定され、１つのタンパクはｍｉＲＮＡの発現をオンにし、第２のタンパクの発現レベルを低下させる（Ｙｏｏ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，２００５）。他の研究では、ｍｉＲ−１９６がどのようにＨｏｘ遺伝子の上流で作用するかについて報告している（Ｈｏｒｎｓｔｅｉｎその他、２００５）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達カスケードの遺伝子は、ｍｉＲＮＡｓのセットにより調節される（Ｌａｉその他、２００５）。これらの全てのケースは、プログラムされたｍｉＲＮＡ活性と呼ばれる。すなわちｍｉＲＮＡｓの活性は発生において不可欠な部分である。その結論としては、その活性はポジティブな進化的圧力下にあり、実際、Ｎｏｔｃｈ−経路に関する研究により、昆虫種における標的部位の、遺伝子の３’ＵＴＲにおける進化的な保存が解明されている。
【００６２】
かかる発生におけるスイッチの必要条件は、時間内のいくつか瞬間に、ｍｉＲＮＡ及びその標的ｍＲＮＡが同じ組織で発現するということである。その結果、ｍｉＲＮＡはその活性を発揮でき、その標的の発現をサイレンシングできる。直観的に、ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡの「真の標的」である場合、この２つは共発現されるべきである、というルールが予想される。換言すれば：生物学的に関連するｍｉＲＮＡ／標的のペアを発見する単純な方法は以下のとおりである：全ての周知の遺伝子の３’ＵＴＲに、各ｍｉＲＮＡの重大な７塩基対の「種」配列をスクリーニングし、ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡペアのセットを取得し、ｍｉＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡが同じ組織で発現する場合に、ペアを受け入れることにより、全セットをフィルタリングする。それらが同じ細胞において発現されない場合、その２つはどのように相互作用できるかという意味で、これは論理的であると考えられる。興味深いことに、近年の２つの研究結果では、状況はそれより複雑であることを示している。すなわち、ショウジョウバエ（Ｓｔａｒｋその他、２００５）においてなされた結果と、他の哺乳類（Ｆａｒｈその他、２００５）においてなされた結果では、本質的に同じであったことである。第１の驚くべき結果である。特定のタイプ組織の（即ち筋肉）で発現することが公知のｍｉＲＮＡｓを調製し、３’ＵＴＲがかかるｍｉＲＮＡ（完全にマッチした７塩基の種配列として操作上は定義される）の（強力な）目的部位を有する遺伝子の発現量を観察する場合、目的部位を有する遺伝子は、ｍｉＲＮＡを発現しない組織よりも高いレベルで組織中で発現する。真のパートナー（ｍｉＲＮＡｓ＋標的）が必ずしも共発現されるわけではない。この効果は原因か結果であるか？これらの研究の両方とも、ｍｉＲＮＡレベルとｍＲＮＡ転写物レベルとを比較し、ｍｉＲＮＡｓが転写物レベル（上記参照）を低下させることができるため、原因／結果の関係が全てのケースにおいて完全に明白であるというわけではない。すなわち、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡｓの同時発現が回避するという考えは誇張である。なぜなら、ｍＲＮＡの減少はｍｉＲＮＡの作用の結果と考えられ、転写レベルの減少の結果でないからである。Ｂａｒｔｅｌらは、この点を見事に解明した。すなわち、彼らはｍｉＲＮＡ標的を有しないマウスの遺伝子に注目した（ヒトのオルトログは有するが）。にもかかわらず、これらのマウス遺伝子はｍｉＲＮＡを発現する組織における発現を依然として顕著に抑制している。これは、その抑制が実際は転写レベルで生じることを示唆し、ｍｉＲＮＡ活性の結果としての抑制でないことを示唆する（マウスの当該遺伝子は、その組織においてｍｉＲＮＡ活性を生じさせないからである）。
【００６３】
更に、第二の効果が存在する。両方の論文では、「抗標的」の証拠を解明している。すなわち、ｍｉＲＮＡｓが発現する組織において高発現する遺伝子中の目的部位への選択的抑制の存在である。遺伝子発現がｍｉＲＮＡｓによって減少しているため、その組織で発現するｍｉＲＮＡｓのための新規なｍｉＲＮＡ標的部位の獲得（進化の過程ではまれな減少ではない。なぜなら重要な種配列は７ヌクレオチドだけだからである。）は悪い知らせであって、望ましくない当該遺伝子のノックダウンが生じる場合には淘汰される。
【００６４】
では、プログラムされたｍｉＲＮＡ活性は例えばいかに行われ、発生のスイッチとして機能し、共発現の回避に関与するのだろうか？ｍｉＲＮＡがダストに対する掃除機としてその標的に関与する場合、上記の２つは微妙な発生スイッチにおいて微調整されたパートナーとしてみなされるのだろうか？答えは美しい特徴によりＢａｒｔｅｌら（Ｆａｒｈその他、２００５）の研究において見出された。すなわち、ｍｉＲＮＡｓの標的は２つのクラス（保存、非保存）に分けられるということである。これは、ヒト対オルトログマウス遺伝子の３’ＵＴＲｓにおいて保存され又は保存されない標的として操作上定義される。大多数は保存されないが、少数は保存される。本発明で見出されたことは、保存された標的は、それらのｍｉＲＮＡｓと共に同時発現を抑制しない遺伝子中に存在し、保存されないものは逆にそれを抑制する。
【００６５】
保存された標的の種類は、ｍｉＲＮＡが発生スイッチ（例えば上記ｖｕｌｖａ及びＮｏｔｃｈ経路で述べた）で演ずる基本的役割により説明され、発明者らはそれらのケースを、プログラムされたｍｉＲＮＡサイレンシングと称することができる。第２のタイプの保存された標的は、発達の１つのフェーズにおいて、必要とされる遺伝子発現であるが、細胞運命決定の後、ｍｉＲＮＡｓは、その組織で発現するはずでないこれらのｍＲＮＡの発現の残留分を一掃するために細胞を走査する。ｍｉＲＮＡシステムは、望まれない転写物の残留を除去する掃除機の役割を果たす。あるいは当該システムは、それらの標的を下方制御できるが、故意に閉鎖することはできないと考えられる。多くのｍｉＲＮＡｓの遅発性及び忍耐、及び全てのｍｉＲＮＡｓが欠けている魚の胚組織の分化の発現を踏まえると、多くのｍｉＲＮＡｓの主要な機能が細胞運命を切替えることではなく、むしろ望ましくない遺伝子の発現を弱め、以前決定づけられた細胞に運命を思い出させること（「筋細胞であることを思い出せ！他の遺伝子を高発現させる神経を持つな！」）と考えられる。
【００６６】
保存されていない大多数については、完全に異なる説明ができる。すなわち、３’ＵＴＲｓの遺伝子は、明らかにｍｉＲＮＡｓが結合できる配列で満ちておち、唯一の真の基本的特徴が７ヌクレオチドの種配列に対して相同であってもこれは驚くべきことではなく、１０００〜２０００塩基対の３’ＵＴＲと、及び何百もの異なるｍｉＲＮＡｓとマッチすることが多いということである。進化において、かかる新規な“ｍｉＲＮＡ”認識配列は常にポップアップし、それらによって何らの不都合もない。当該標的が、正確に対応するｍｉＲＮＡが高度に存在する組織において顕著に発現する必要がある遺伝子においてのみ存在し、その種配列にマッチするいかなるｍｉＲＮＡをもサイレンシングする場合に、不都合が生じる。これらの遺伝子にとり、このｍｉＲＮＡとのマッチは好ましくなく、結果的に負のフィットとなり、ゆえにこれらのマッチは避けるべきである。新規に生じるｍｉＲＮＡ標的配列（機能を有さず、ゆえに進化的な圧力下になく、保持される）は選択されず、それらと結合できるｍｉＲＮＡが同じ組織において発現されない場合、基本的に中立的なフィットネス効果を示す。これらの標的配列には生理学的な関連がなく、したがって、それらがｍｉＲＮＡｓを発現する組織において発現されない限り、選択されるか否かに関わらず、進化により無視される。これらの７つの塩基配列は、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位のようなＤＮＡ中の部位（ＧＡＡＴＴＣ）に存在する（ＥｃｏＲＩが周辺にない限り）。
【００６７】
ｍｉＲＮＡｓとそれらの標的との組合せは、このように少なくとも３つのグループ（陽性選択、中性及び陰性選択）に分類できる。
１．  陽性選択された、若しくはプログラムされた相互作用は、真の細胞運命スイッチ（例えば線虫のｍｉＲ−６１による第２の産卵口の細胞運命のスイッチ）であってもよい。この場合、適切なフェーズ（時間）で、細胞は選択をすることを必要とする。第２のタイプのプログラムされた標的は、細胞運命決定の後、以前の発生段階において必要とされたｍＲＮＡの全てのトレースが除去されることを必要とするか、又は遺伝子の濃度が顕著に低いレベルに抑制されることを必要とする。かかる相互作用は保存されると考えられる。なぜなら、それらは明らかに細胞運命の安定的な決定又は維持に関与するからである。
【００６８】
２．  第２の組合せの種類は中性である。２つの可能性がある。第１は些細であり、ｍｉＲＮＡｓ及び標的は同じ組織において発現されないことである。遺伝子が腸上皮において独自に発現する場合、筋ｍｉＲＮＡの標的の存在は無関係である。第２の種類のペアが本質的であり、ｍｉＲＮＡ及びその標的が実生活において相互作用することを意味するが、その効果は進化的には中性である。遺伝子は少し下方制御されても、又はそうでなくともよく、生物体には関係がない。これらの相互作用が進化的な意味で中性であり、選択性効果でなく、しかし生物化学的な意味ではないことに注意されたい。なぜなら、ｍｉＲＮＡｓは下方制御（およびｍｉＲＮＡの実験的なノックアウトは従って標的遺伝子発現に対する上方への効果に結びつく）をするからである。中性であるが活性なｍｉＲＮＡ−標的相互作用の種類は非常に大きいことがわかる。第１のクラス（プログラムされた相互作用）は種の中で保存されるが、第２のクラスはそうではない。
【００６９】
３．  第３のｍｉＲＮＡ−標的相互作用の分類は、ｍＲＮＡと同じ組織で発現するｍｉＲＮＡであり、発現される必要のある遺伝子の発現を遮断する。かかるデータは、かかる共発現に対する選択圧の存在を示唆し、それらは抗標的と呼ばれている。抗標的遺伝子には、生じたばかりの目的部位が定常レベルで必然的に存在するが、これらは選択圧によって結局排除される。
【００７０】
これらの特徴を踏まえ、ｍｉＲＮＡ−標的相互作用の突然変異により疾患が引き起こされうる幾つかのルートが存在する。ｍｉＲＮＡでは官能基の突然変異や喪失が生じ、多くの場合幾つかのレベルの縮退があるが、これは総レベル（研究室において観察できる）の話であり、その一方で、１つのｍｉＲＮＡ遺伝子の損失でさえ、負の病原性効果を生じさせることもある。また、プログラムされたｍｉＲＮＡの標的部位も突然変異し、ｍｉＲＮＡの制御から遺伝子が開放される。最後に、遺伝子は新規かつ望ましくないｍｉＲＮＡ標的配列を得ると考えられ、１つの突然変異だけを有する多数の配列が、同じ組織で発現する１つのｍｉＲＮＡｓの標的になることから回避される。これらの突然変異は、遺伝子活性の望ましくない減少をもたらし、疾患を引き起こしうる。ゆえに、考えられる３つの病因は：
１．  ｍｉＲＮＡ遺伝子の突然変異、
２．  プログラムされたｍｉＲＮＡ標的部位
３．  抗標的遺伝子中の新規な標的部位を生じさせる突然変異、である。
【００７１】
良い意味においては、しばしば複数のｍｉＲＮＡによる遺伝子調節における組合せ効果が存在することより、それぞれは遺伝子発現に巧みな影響を及ぼし、ｍｉＲＮＡ標的の多型現象は、進化における小さい変動のための理想的な基礎となりうると考えられ、それにより、進化において自然淘汰が作用することが可能となる。タンパク質のコーディングの変化は、タンパクの機能全体をしばしば完全に崩壊させることもあり（適合性に関しては正の効果を生じさせることは滅多にない）、それらはタンパクを不変のままにするか、又はコードされたタンパクの活性を低下させる。一方では、ｍｉＲＮＡ標的の変化は、多様な発現パターンを生じさせる。マウス接合子及びからマウス胚、魚接合子から魚へと発生する際に増加する多くの漸進的な相違は、確実に、（タンパク質の活性の違いよりもむしろ）大部分は基本的に同一の生物化学的活性を実行する因子の発現のタイミング及びレベルの違いである。従って、ｍｉＲＮＡ標的配列の増加又は損失による遺伝子発現の微調整は、進化及び疾患プロセスの主な機構であると考えられる。
【００７２】
本発明において、図１のｍｉＲＮＡの発現が本発明の方法で測定されるとき、又は、図１のｍｉＲＮＡのコレクション、その相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列若しくはその相補物が提供されるとき、又は、図１のｍｉＲＮＡを含んでなる（ｍｉｃｒｏ−）アレイ、その相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列若しくはその相補物が提供されるとき、発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の５つのｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことが好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の１０のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の２０のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の４０のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の６０のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の１００のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の２００のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の４００のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の６００のｍｉＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。
【００７３】
本発明において、図１のｍｉＲＮＡの発現が本発明の方法で測定されるとき、又は、図１のｍｉＲＮＡのコレクション、その相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列若しくはその相補物が提供されるとき、又は、図１のｍｉＲＮＡを含んでなる（ｍｉｃｒｏ−）アレイ、その相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列若しくはその相補物が提供されるとき、発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の５つのヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことが好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の１０のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の２０のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の４０のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の６０のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の１００のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の２００のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の４００のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。当該発現、コレクション又はアレイは、少なくとも図１の６００のヘアピンＲＮＡ若しくはその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ配列若しくはその相補物を測定するか、又は含むことがより好ましい。好ましくは、細胞が前記ｍｉＲＮＡ若しくはヘアピンＲＮＡを含むか否か決定することによって、発現を測定できる。これはまた、細胞又はサンプルの特徴づけにも用いられる。
【００７４】
好適な実施形態では、ヒトのｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの発現又は存在は、本発明の方法を使用して、細胞又はサンプルにおいて測定されるか又は特徴づけられる。すなわち、好ましい実施形態では、前記コレクション及び／又は（マイクロ−）アレイは少なくとも１、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも４００、より好ましくは少なくとも６００の、ヒトのｍｉＲＮＡ及び／又は図１のヒトのヘアピンＲＮＡ、又はその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列又はその相補物である。
【００７５】
好適な実施形態では、霊長類ｍｉＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡの発現又は存在は、本発明の方法を使用して細胞又はサンプルにおいて測定されるか又は特徴づけられる。すなわち、好ましい実施形態では、前記コレクション及び／又は（マイクロ−）アレイは少なくとも１、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも４００、好ましくは少なくとも６００の霊長類ｍｉＲＮＡ及び／又は図１の霊長類ヘアピンＲＮＡ又はその相補物、又はそれに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列又はその相補物である。好適な実施形態では、前記霊長類はヒトである。他の好適な実施形態では、前記霊長類はチンパンジ又はマカクである。
【００７６】
本発明においては、図１に示す核酸配列及び／又はその相補物である核酸配列、及び／又は前記核酸配列に対する少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列又はその相補物、及び／又はかかる核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでなる核酸分子が提供される場合、好適には、図１に示す核酸配列、及び／又はその相補物である核酸配列、及び／又は前記核酸配列に対する少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列又はその相補物、及び／又はかかるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、を含んでなる少なくとも５つの異なる核酸分子が提供される。好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは有する少なくとも６００の異なる核酸分子であって、図１に示す核酸配列、及び／又はその相補物である核酸配列、及び／又は前記核酸配列に対する少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列又はその相補物、及び／又はかかるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでなる核酸分子が提供される。この実施形態の好適な態様において、図１の前記配列はｍｉＲＮＡ配列（好ましくはヒトのｍｉＲＮＡ配列）である。この実施形態の更に好適な態様において、図１の前記配列はヘアピンＲＮＡ配列、好ましくは霊長類ヘアピン配列、好ましくはヒト配列である。他の好適な実施形態では、前記ヘアピンＲＮＡ配列はチンパンジ配列又はマカク配列である。
【００７７】
更なる本発明はセットＡ、セットＢ及びセットＣからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのコレクションの提供に関し、セットＡは図９で同定される配列の全てに対する相補配列を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのセットであり、セットＢはセットＡの配列の全てに対する相補配列を含んでなるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのセットであり、セットＣは図９で同定されるオリゴヌクレオチドのセットである。これらのコレクションは、特に細胞の分化状態を測定することに適している。前記細胞のサンプルを含有するＲＮＡは、図９で同定されるマイクロＲＮＡの存在に関して精査されうる。これらのマイクロＲＮＡは、プリミティブ対分化細胞において、ディファレンシャルに発現する。腫瘍化へ向かう途中で１つ以上の修飾を受けた細胞は又は腫瘍細胞自身は、それらが由来する細胞タイプと比較したとき、脱分化されていることが多い。したがって、セットＡ、Ｂ又はＣは、細胞のサンプルが脱分化された細胞（好ましくは腫瘍細胞）を含むか否かを決定するのに非常に適している。関連するｍｉＲＮＡは、脱分化された組織においてしばしば発現する。好適な実施形態では、本発明はセットＡ、セットＢ及びセットＣからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのコレクションの提供に関し、セットＡは、少なくとも図９で同定されるｍｉＲＮＡ配列の全ての最小限配列及び／又は種配列に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのセットであり、セットＢは、少なくともセットＡのｍｉＲＮＡ配列の全ての最小限配列及び／又は種配列に対する相補配列を含んでなるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのセットであり、セットＣは、少なくとも最小限配列及び／又は図９で同定されるｍｉＲＮＡｓの種配列を有するオリゴヌクレオチドのセットである。セットＡは、図９で同定される配列の全てに対する相補配列を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのセットである。したがって、セットＡは好ましくは、図９において特定されるように、オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドアナログと同じ数である。同様に、セットＢは少なくともセットＡのｍｉＲＮＡ配列の全ての最小限配列及び／又は種配列に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログのセットである。すなわち、セットＢは好ましくは、図９において特定されるように、オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドアナログと同じ数である。オリゴヌクレオチドアナログは、オリゴヌクレオチドの配列に対応する配列を有する核酸アナログである。本発明のオリゴヌクレオチドのセットは好ましくは、本発明（好ましくは本発明のｍｉＲＮＡ）の核酸配列の長さを有する、又はそれに対応する、オリゴヌクレオチド又はその核酸アナログを含んでなる。すなわち、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、１８〜２６のヌクレオチド長、好ましくは１９〜２４のヌクレオチド長、最も好ましくは２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド長の核酸分子として、本願明細書において定義される。現在様々なタイプの核酸の修飾及び代替構造が存在し、それらは核酸配列の擬態をするが、それ自身は通常核酸とは呼ばれない。かかる核酸アナログの非限定的な例は、１つ以上のヌクレオチドアナログを含有するアナログであり、それらはヌクレオチドの塩基対形成特性を模倣する。かかるヌクレオチドアナログを含有する核酸分子は、それらが本発明の前記核酸分子と同じハイブリッド形成特性又は塩基対形成特性（質的、必ずしも量的でなくともよい）を有する場合、本発明の核酸分子の核酸類似体であると考えられる。核酸分子アナログの他の非限定的な例は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノである。しかし、本発明の核酸分子アナログの非限定的な例としては、分子の安定度を変質する糖骨格の修飾であり、かかる修飾は通常そのような塩基対形成特性を変化させない。かかる修飾の非限定的な例は、オリゴヌクレオチドでしばしば使用する２−Ｏ−メチル修飾である。
【００７８】
本発明の好適な実施形態は、オリゴヌクレオチドのコレクション又はその核酸アナログの提供に関し、それらはセットＡ、セットＢ、セットＣからなる群から選択され、セットＡが図９で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＢがセットＡの配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＣが図９で同定されるオリゴヌクレオチドのセットである、
【００７９】
更なる本発明は、セットＤからＲからなる群から選択される、オリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのコレクションの提供に関し、セットＤが図４で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＥが図５で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＦが図６で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＧが図７で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＨが図８で同定されるオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＩが図４で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＪが図５で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＫが図６で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＬが図７で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、セットＭが図８で同定される配列の全てに対する相補配列を含むオリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのセットであり、オリゴヌクレオチドセットＮ、Ｏ、Ｐ、Ｑ及びＲ又はその核酸アナログが、それぞれセットＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭの全ての配列に対する相補配列を含む。すなわちセットＮはセットＩ、セットＯはセットＪ、セットＰはセットＫ、セットＱはセットＬ、セットＲはセットＭに対応する。
【００８０】
更なる本発明は、セットＤからＲからなる群から選択される、オリゴヌクレオチド又はその核酸アナログのコレクションの提供に関し、セットＤは少なくとも最小限配列及び／又は図４で同定されるマイクロＲＮＡの種配列を有するオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＥは少なくとも最小限配列及び／又は図５で同定されるマイクロＲＮＡの種配列を有するオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＦは少なくとも最小限配列及び／又は図６で同定されるマイクロＲＮＡの種配列を有するオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＧは少なくとも最小限配列及び／又は図７で同定されるマイクロＲＮＡの種配列を有するオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＨは少なくとも最小限配列及び／又は図８で同定されるマイクロＲＮＡの種配列を有するオリゴヌクレオチドのセットであり、セットＩは少なくとも最小限配列及び／又は図４で同定されるマイクロＲＮＡの全ての種配列に対する相補配列を含む、オリゴヌクレオチド又は核酸アナログのセットであり、セットＪは少なくとも最小限配列及び／又は図５で同定されるマイクロＲＮＡの全ての種配列に対する相補配列を含む、オリゴヌクレオチド又は核酸アナログのセットであり、セットＫは少なくとも最小限配列及び／又は図５で同定されるマイクロＲＮＡの全ての種配列に対する相補配列を含む、オリゴヌクレオチド又は核酸アナログのセットであり、セットＬは少なくとも最小限配列及び／又は図６で同定されるマイクロＲＮＡの全ての種配列に対する相補配列を含む、オリゴヌクレオチド又は核酸アナログのセットであり、セットＭは少なくとも最小限配列及び／又は図７で同定されるマイクロＲＮＡの全ての種配列に対する相補配列を含む、オリゴヌクレオチド又は核酸アナログのセットであり、オリゴヌクレオチドセットＮ、Ｏ、Ｐ、Ｑ及びＲ又はその核酸アナログが、それぞれセットＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭの全ての配列に対する相補配列を含む。すなわちセットＮはセットＩ、セットＯはセットＪ、セットＰはセットＫ、セットＱはセットＬ、セットＲはセットＭに対応する。
【実施例】
【００８１】
材料及び方法
霊長類のｍｉＲＮＡ領域の配列決定及び解析１４４の既知ｍｉＲＮＡ遺伝子に対するおよそ７００塩基対（ｂｐ）の領域のＰＣＲ増幅のためのネステッドプライマーセットを、プライマー３ソフトウェアに対するカスタムインターフェース（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｓ．ｎｉｏｂ．ｋｎａｗ．ｎｌ）を用いて設計した。プライマーの選択は、ヒト配列のみに基づくものとした。１０の霊長類種のゲノムＤＮＡ（ＮＩＡ  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ＤＮＡ  Ｐａｎｅｌ  ＰＲＰ００００１）を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から購入した。ＰＣＲ反応は全て、１０μｌの総容量にて、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を用い、製造業者の条件及び万能サイクリング条件（６０秒９４℃、その後９４℃で２０秒間、５８℃で２０秒間及び７２℃で６０秒間の３０サイクル）に従って行なった。ＰＣＲ産物は、ＡＢＩ３７００キャピラリシーケンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて両端から配列決定した。配列は、ｐｈｒｅｄ／ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｅｗｉｎｇら、１９９８、Ｇｏｒｄｏｎら、１９９８）を用いて質的トリミングとアセンブリングを行ない、ＰＯＡ（Ｌｅｅら、２００２）を用いてアラインメントした。
【００８２】
ｍｉＲＮＡ遺伝子の、計算上の予測分析は全て、特に明記しない限り、社内で開発したソフトウェア（Ｐｅｒｌ）を用いて実施した。ヒト（２００３年７月のアセンブリ）、マウス（２００３年１０月のアセンブリ）及びラット（２００３年６月のアセンブリ）に対する全体のゲノムアラインメント（ＷＧＡ）を、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｓｃｓｃ．ｅｄｕ）からダウンロードした。我々は先ず、ｍｉＲＮＡ様の保存プロファイルに適合する、すなわち、およそ１００ヌクレオチドの保存ステムループ領域及びおよそ５０ヌクレオチドの非保存隣接部を有するブロックについて、ＷＧＡをスクリーニングした。技術的には、あらゆる位置につき、我々は先ず、１５ヌクレオチドのスライディングウィンドウにわたる保存のパーセンテージを算出し、０から９までの数値と「ｏ」を割り当てた。ここで「ｏ」は、１００％の同一性を表し、９は９０％から１００％の間、等々である。次に、得られた保存列を以下の正規表現によって検索し、保存プロファイルを規定した：／（［０−８］｛５０，６０｝）（［ｏ９８］｛５３，２６０｝）（［０−８］｛５０，６０｝）／。次の工程で、我々はＲＮＡｆｏｌｄソフトウェア（Ｈｏｆａｃｋｅｒ、２００３）を用いて、保存領域が折り返し（ｆｏｌｄ−ｂａｃｋ）構造を形成する潜在性を評価した。以下の正規表現に整合する二次構造を認容した：
／（（￥（（？：￥．＊￥（）｛２４，｝）（￥．｛２，１７｝｜￥．＊￥（｛１，８｝￥．＊￥）｛１，８｝￥．＊￥（｛１，８｝￥．＊￥）｛１，８｝￥．＊）（￥）（？：￥．＊￥））｛５０，｝））／ｘ
（詳細なスクリプトは、要請があれば著者らより入手できる）。
この工程の結果、ヒト／マウスのアラインメントから１２９５８の候補領域が得られ、ヒト／ラットのアラインメントから１２５３０の候補領域が得られ、これらはそれぞれ、１６７及び１５４の既知のヒトｍｉＲＮＡを含んでいた。元のヒト／マウス及びヒト／ラットＷＧＡはそれぞれ、１８７及び１７２のアノテーションしたヒトｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡレジストリｖ．３．１）を含んでいた。従って、保存プロファイリングと折り返し構造選択工程との組み合わせによる感度は、ほぼ９０％である。第一の保存プロファイリング工程の、候補ｍｉＲＮＡ領域のフィルタリングに対する寄与は、直接的には算出しなかった。しかし、約８０００００のステムループが、ヒト／マウス非コード保存領域で同定できたことが、以前に報告されている（Ｌｉｍら、２００３）。従って、保存プロファイリングは、真のｍｉＲＮＡの９０％を保持しながらも、全ての潜在的な折り返し構造の９８％より多くを除去する、非常に効率的なフィルターであると推定できる。異なるＤＮＡ鎖で重複する候補領域が予測される場合には、折り畳み自由エネルギーの低い候補を選択した。この「ナイーブ」アプローチは、試験した１６５のうち１４４の既知ｍｉＲＮＡ（８７％）の配向を正しく同定した。
【００８３】
第三のフィルタリング工程として、同じヌクレオチド含有量のランダム配列よりも低い折り畳み自由エネルギーをｍｉＲＮＡが有するという、最近発見された特徴（Ｂｏｎｎｅｔら、２００４）を用いた。Ｒａｎｄｆｏｌｄプログラム（ｐ＜＝０．００５の領域に対するフィルタリング）の適用で、ヒト／マウスで７１６、そしてヒト／ラットデータセットで６３９へと、候補の数が更に１８倍低減した。このフィルタリング工程の感度は、Ｒａｎｄｆｏｌｄ値に対しｐ＜＝０．００５のカットオフを用いると、約８５％である（ヒト／マウスのデータセットで１６７の既知ｍｉＲＮＡのうち１４３が保持され、ヒト／ラットのデータセットで１５４のうち１３４が保持されていた）。０．００５のカットオフ値は非常に厳密であるが、フィルタリングに対して至適な感度／特異性比をもたらす。
【００８４】
次に、ヒトゲノム協調及び配向を用いて、ヒト／マウス及びヒト／ラット予測分の交差を行なった。１１９の既知ｍｉＲＮＡを含むわずか３７９の候補領域が、両者のデータセットで予測されるらしく、予測分の相当な画分がセットに特異的であった。すなわち、２４の既知ｍｉＲＮＡを含む３３７の候補がヒト／マウスＷＧＡに認められたが、ヒト／ラットＷＧＡには認められなかった。また、２６０の候補（１５の既知ｍｉＲＮＡを含む）がヒト／ラットデータセットで認められたが、ヒト／マウスデータセットでは認められなかった。非重複予測の詳細な解析で、それらの約３分の２が実際に、第二の齧歯類種の対応するゲノム領域にマッピングできる（ラットゲノムに対するマウス予測、その逆も同じ）ことが明らかになったが、保存プロファイリング若しくはＲａｎｄｆｏｌｄ基準（齧歯類配列に対して）のいずれかを満たせず、又は単に最初のＷＧＡに存在しておらず、そのため特定のデータセットで我々の計算ルートにより拾い上げられなかった。この解析は、例えばヒト／マウスのように１つのデータセットに集中するのでなく、２種の齧歯類種からの組み合わせのデータの数値を示す。
【００８５】
まとめると、以下の基準を満たす９７６の候補ｍｉＲＮＡ領域を同定している。（１）ヒト／マウス又はヒト／ラットアラインメントで、特徴的なｍｉＲＮＡ様の保存プロファイルを有する。（２）折り返し構造を形成する。（３）ヒト及び齧歯類配列の双方につき、Ｒａｎｄｆｏｌｄ値（ｐ＜＝０．００５）を有する。これらの９７６の候補領域は、１５８の既知ｍｉＲＮＡを含んでいた（ｍｉＲＮＡレジストリｖ．３．１からのデータに基づく）。その後、最初の全ゲノムヒト／マウスアラインメントを組み合わせて、１８９の既知ｍｉＲＮＡが網羅された。従って、我々の解析の感度は、このデータセットに基づくと８３％（１５８／１８９）である。同時に、予測分の特異性は理想的には、全ての予測分の実験検証から推測されるべきである。しかし、予測の確実性の間接的な指標として、更なるゲノムの候補領域の保存を使用することが可能である。我々は、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、オポッサム、ウシ及びイヌゲノムを使用して、我々の予測候補のオルソログを検索している。オポッサム及びウシゲノムは、解析の時点でアセンブリングされていなかったので、Ｇｅｎｏｔｒａｃｅソフトウェア（Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖら、２００２）を利用して、トレースデータから目的の領域の部分的なアセンブリを作製した。ゲノム由来の領域は、以下の場合に候補領域とオルソロガスなものと考えた。（１）少なくとも１８ｂｐ長のヒットで、候補配列と少なくとも１６が完全一致であった。（２）ヘアピンに折り畳まれていた。（３）Ｒａｎｄｆｏｌｄ自由エネルギーの基準にパスした。９７６の候補のうち６７８（およそ７０％）は、齧歯類に加えて少なくとももう１つの種で保存されているようであった。
【００８６】
更なる候補ｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子を産生するために、１００ヌクレオチドのスライディングウィンドウを用い、潜在的なヘアピンについてマウスゲノムを走査し、得られたヘアピンについてＲａｎｄｆｏｌｄ値を算出した（モノヌクレオチド・シャフリング、１０００反復）。低Ｒａｎｄｆｏｌｄ値を有するが他の種では必ずしも保存されていないヘアピンの大きなセットから、１９９のサブセットを無作為に選択した。
【００８７】
候補ｍｉＲＮＡ領域の特徴付け予測したｍｉＲＮＡ候補をゲノム構成に入れるために、ヒトゲノムのＥｎｓｅｍｂｌ（バージョン２４）アノテーションを使用した。ＦＡＮＴＯＭデータベース（Ｏｋａｚａｋｉら、２００２）のｎｃＲＮＡサブセットに対して我々の候補を検索し、３つの領域（ｃａｎｄ４２８、ｃａｎｄ５２３、及びｃａｎｄ４２０）が非コードＲＮＡに重複又はその隣に存在することを見出した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ高分解能タイリングアレイ（Ｋａｐｒａｎｏｖら、２００２）に対するデータを、ＵＣＳＣゲノムウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／１０ａｐｒｉｌ２００３／ｄａｔａｂａｓｅ／ａｆｆｙＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ｔｘｔ．ｇｚ  ａｎｄ  ａｆｆｙＴｒａｎｓｆｒａｇｓ．ｔｘｔ．ｇｚ）からダウンロードし、２００３年７月のヒトゲノムアセンブリに再マッピングして、候補領域予測分との交差を行なった。アノテーションしたＴｒａｎｓｆｒａｇ領域からの５０ｂｐと重複又はその中に存在する候補領域を、所定のＴｒａｎｓｆｒａｇ断片と会合させた。
【００８８】
予測したｍｉＲＮＡ領域のノザンブロット分析広く（ゼブラフィッシュ）又は狭く（齧歯類のみ）保存された、クラスター形成した又はファミリー内の、或いはイントロン、エキソン又は遺伝子間に位置する、などといった、候補の異なるサブグループを表す６９の候補のノザンブロット分析を実施した。我々の分析は、３つのマウスの胎生期（８．５、１２．５及び１６．５ｄｐｃ）、マウスＥＳ細胞、及びマウス脳でのｍｉＲＮＡの発現を調べることに限定した。幹での成熟ｍｉＲＮＡの正確な位置を予測できないので、ヘアピンアーム部の殆どに及ぶ３５ヌクレオチド長のプローブを使用した。成熟ｍｉＲＮＡ配列を含むアームは、保存レベルに基づいて予測した。いくつかの候補領域につき、ヘアピンのアームの両方を調べた。ゼブラフィッシュで保存領域につき、ゼブラフィッシュ胚（７、１４、２１及び２８日）及びＤｉｃｅｒ変異体（Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓら、２００３）由来のＲＮＡでのノザンブロット分析も実施した。ＲＮＡは、ｍｉｒＶａｎａのｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）を用いて単離し、ＲＮＡ  Ｄｅｃａｄｅ&auml;マーカー（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）と並べて１２％変性ポリアクリルアミドゲルにて分離し、正電気を帯びたナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ）に電気ブロッティングすることによって転写した。ブロットを、放射活性（３２Ｐ）標識したＤＮＡオリゴプローブと改変Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液中で３７℃にて一晩ハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３７℃にて３回洗浄し、ホスホイメージング（Ｔｙｐｈｏｏｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を用いて可視化した。ある場合では（ｃａｎｄ１８１及びｃａｎｄ７０７）、ブロットを１週間にわたり露光した後に始めて成熟バンドが検出され、ノザンブロット分析の感度限界を示唆していた。
【００８９】
ＲＡＫＥマイクロアレイ設計及び解析ＲＡＫＥアッセイを用いた候補ｍｉｃｒｏＲＮＡの検証のためのマイクロアレイを、４４Ｋカスタムマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ、ＵＳＡ）として設計した。予測したｍｉｃｒｏＲＮＡに相補的な２５ヌクレオチドの完全に整合したプローブ配列を、各側部の万能スペーサと共に含むようにして、それらの３’端部でガラス表面に付着する６０マーのプローブを設計した（５’端部、５’−スペーサ：ＣＧＡＴＣＴＴＴ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ候補領域に相補的な２１ヌクレオチドの配列（タイリングパス）、３’−スペーサ：ＴＡＧＧＧＴＣＣＧＡＴＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡ、ガラス表面に付着する３’端部）。５’−スペーサに含まれる３つのＴは、ビオチン−ｄＡＴＰを用いたＫｌｅｎｏｗが媒介するｍｉｃｒｏＲＮＡ伸長に対する鋳型として機能する。１１ヌクレオチドのタイリングパスは、少なくとも１１の非対合ヌクレオチドを含むように伸長した末端ループから２２ヌクレオチド上流と下流に定めた、最も見込みのあるＤｉｃｅｒ／Ｄｒｏｓｈａ切断部位を網羅するように設計した。すべての場合につき、ヘアピン配列の両アームに対してプローブを設計し、そして６４８の候補に対して、そのアンチセンスゲノム配列が安定なヘアピン構造に効率的に折り畳むことができるように、２×１１プローブの更なるセットを設計した。候補ｍｉｃｒｏＲＮＡに対する全ての２２／４４プローブは、領域のバックグラウンド効果を排除するよう、アレイのクラスター内に位置付けした。植物ｍｉｃｒｏＲＮＡに相補的な１０の異なるハイブリダイゼーションコントロール（ｍｉＲ−４０２、ＵＵＣＧＡＧＧＣＣＵＡＵＵＡＡＡＣＣＵＣＵＧ；ｍｉＲ−４１８、ＵＡＡＵＧＵＧＡＵＧＡＵＧＡＡＣＵＧＡＣＣＵ；ｍｉＲ−１６７、ＵＧＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＣＡＵＧＡＴＣＵＧＧ；ｍｉＲ−４１６、ＧＧＵＵＣＧＵＡＣＧＵＡＣＡＣＵＧＵＵＣＡＵ；ｍｉＲ−１７３、ＵＵＣＧＣＵＵＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＡＣ；ｍｉＲ−４１７、ＧＡＡＧＧＵＡＧＵＧＡＡＵＵＵＧＵＵＣＧＡＣ；ｍｉＲ−１６３、ＧＡＡＧＡＧＧＡＣＵＵＧＧＡＡＣＵＵＣＧＡＵ；ｍｉＲ−４１９、ＵＵＡＵＧＡＡＵＧＣＵＧＡＧＧＡＵＧＵＵＧＵ；ｍｉＲ−４０５、ＧＡＧＵＵＧＧＧＵＣＵＡＡＣＣＣＡＵＡＡＣＵ；ｍｉＲ−４２０、ＵＡＡＡＣＵＡＡＵＣＡＣＧＧＡＡＡＵＧＣＡＣ）を、１０倍現させ、アレイ上に無作為に分布させた。マイクロアレイを１０μｍの分解能でＡｇｉｌｅｎｔスキャナＧ２５６５Ｂ型にて走査し、スポットの同定と強度の定量をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  バージョンＡ．７．５．１）を用いて標準設定で行った。手動検測及び成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列のアノテーションを許容すべく、カスタムスクリプトを用いて生画像及びスポット強度データを処理し、タイリングパス配列情報と共に可視化した。Ｗｅｂベースのインターフェースを、単一実験のアノテーション用、及び全実験の総括用に設計した。手動検測の後、陽性の新規成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列を全て、クローニングした小ＲＮＡの評価用に構成した生物情報解析ルートに送り、反復エレメント及び構造ＲＮＡに由来する信号を除去して、他の種における相同ｍｉＲＮＡを見出した。
【００９０】
改変ＲＡＫＥアッセイＡｇｉｌｅｎｔプラットフォームにおける高密度カスタム印刷マイクロアレイでの使用のために、本来のＲＡＫＥアッセイ（Ｎｅｌｓｏｎら、２００４）を改変した。最も重要なのは、最もカスタムにスポットされるマイクロアレイと対照的に、カスタム印刷プローブはそれらの３’端でガラス表面に付着することである。これにより本来のプロトコルに含まれていたエキソヌクレアーゼの必要がなくなり、Ｋｌｅｎｏｗ伸長用の鋳型として機能でき、その結果、非特異的バックグラウンド信号を招く可能性のある二本鎖ＤＮＡ構造を生じさせるプローブの３’自由端の折り返しからのバックグラウンド信号が低減される。更に、ハイブリダイゼーション、洗浄、及びインキュベーション条件を適応させた。全てのハイブリダイゼーション及び洗浄用緩衝液は、フィルター滅菌して予備加熱したＤＥＰＣ処理水を用いて、オートクレーブをかけた原液から新たに作製した。マイクロアレイスライド及びカバーガラスは、予備加熱した洗浄用緩衝液（２×ＳＳＰＥ、０．０２５％Ｎ−ラウロイルサルコシン）を用いて３７℃にて２分間２回予備洗浄し、次いでプレハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＰＥ、４０％ホルムアミド、０．０２５％Ｎ−ラウロイルサルコシン）と５分間インキュベートした。次に、Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーションチャンバーをハイブリダイゼーションミックスで完全に満たし、混合のための通常の気泡は、低温で、且つ使用したハイブリダイゼーションミックスでは動き回らないので、気泡が残らないようにした。ハイブリダイゼーションミックス（スライド１枚当たり計７５０μｌ）は、５００μｌの１．５×ハイブリダイゼーション緩衝液（７．５×ＳＳＰＥ、６０％ホルムアミド、０．０３７５％Ｎ−ラウロイルサルコシン）、１０μｌスパイクイン（ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）ＲＮＡ（コントロール植物ｍｉｃｒｏＲＮＡ貯蔵液：ｍｉＲ−４０２、１×１０−６Ｍ；ｍｉＲ−４１８、３．３×１０−７Ｍ；ｍｉＲ−１６７、１×１０−７Ｍ；ｍｉＲ−４１６、３．３×１０−８Ｍ；ｍｉＲ−１７３、１×１０−８Ｍ；ｍｉＲ−４１７、３．３×１０−９Ｍ；ｍｉＲ−１６３、１×１０−９Ｍ；ｍｉＲ−４１９、３．３×１０−１０Ｍ；ｍｉＲ−４０５、１×１０−１０Ｍ；ｍｉＲ−４２０、３．３×１０−１１Ｍ）、及びＭｉｒＶａｎａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）を用いて単離した２０μｇの小ＲＮＡ試料（８．５ｄｐｃ及び１６．５ｄｐｃのマウス胎仔、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞及び脳全体）からなり、２４０μｌになるようにＤＥＰＣ処理水を補充した。ハイブリダイゼーションミックスは、アレイに付す前に７５℃に５分間加熱して、氷上で冷却した。アレイは３７℃で一晩インキュベートし、その後洗浄用緩衝液で２分間４回洗浄して、及び１×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．９、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、０．０２５％Ｎ−ラウロイルサルコシン）で２分間１回洗浄した。Ｋｌｅｎｏｗ伸長のために、３７５μｌの２×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液、３６５μｌのＤＥＰＣ処理水、２．５μｌのＫｌｅｎｏｗ  Ｅｘｏ−（５０，０００Ｕ／μｌ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、��ＳＡ）、７．５μｌのビオチン−１４−ｄＡＴＰ（４μＭ貯蔵液、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ  ＭＡ、ＵＳＡ）を含有する酵素ミックス（スライド１枚当たり計７５０μｌ）を、クリーンインキュベーションチャンバー内のアレイに付し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、そのアレイを洗浄用緩衝液で２分間４回洗浄し、そして１×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液で２分間１回洗浄した。次に、３７５μｌの２×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液、３６８μｌのＤＥＰＣ処理水及び２０μｌのストレプトアビジン接合Ａｌｅｘａ蛍光−６４７（２ｍｇ／ｍｌ貯蔵液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）からなる色素接合ミックス（総容量７５０μｌ）を３７℃で３０分間、新しいインキュベーションチャンバーに付し、その後洗浄用緩衝液で３７℃にて２分間４回洗浄して、塩を除くためにＤＥＰＣ水に５回、短時間浸けた。スライドは、５０ｍｌチューブ内で１０００ｒｐｍ（１８０×ｇ）にて５分間回転することによる遠心で乾燥させた。
【００９１】
細菌クローニング、及びインサートのジデオキシ配列決定による小ＲＮＡライブラリー構築７つの高力価小ＲＮＡライブラリーを作製した。概説すると、マウス成体脳（１２週齡）、及び様々なヒト胎児組織（発生１７週：脳；心臓；皮膚；肺；ミックス１：複数胎児組織；ミックス２：肝臓、胃、腸）からの小ＲＮＡ画分を、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して単離し、その後ポリアクリルアミドゲルから１５〜３０ヌクレオチドの画分を切り出すことによって更に集積した。ｃＤＮＡ合成のため、この画分のＲＮＡ分子を、先ず酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリＡテイル化し、その後ｍｉＲＮＡの５’ホスフェートへのＲＮＡリンカーオリゴのライゲーションを行なった。次いでｃＤＮＡ第一鎖の合成を、オリゴ（ｄＴ）−リンカープライマー及びＭ−ＭＬＶ−ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素を用いて実施した。得られたｃＤＮＡは次いで、１５〜２２サイクル（出発材料の質と量による）ＰＣＲ増幅し、その後制限ヌクレアーゼ処理をして、９５〜１１０ｂｐ画分をゲルを利用して精製し、そしてｐＢＳＩＩ  ＳＫ＋プラスミドベクターのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ライゲーション産物をＴ１ファージ耐性ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘＴＭＥＣ１００ＴＭエレクトロコンピテント細胞（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）内へ電気穿孔して、１ライブラリーにつき１．２から３．３×１０６の間の力価の組換えクローンを得た。計８３３２８のコロニーを、７５μｌのＬＢ−Ａｍｐを含有する３８４ウェルのプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＱＰｉｘ２、Ｎｅｗ  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＫ）に自動的に拾い出し、継続的に振盪しながら３７℃にて一晩生育した。続く全てのピペッティング工程は、液体搬送ロボット（ＢｅｎｃｈＣｅｌｌ  ４ｘを備えＶｅｌｏｃｉｔｙ１１（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ、ＵＳＡ）Ｖｐｒｅｐ及びＴｅＭｏ９６を統合したＴｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＳＰ２００）を用いて実施した。５μｌの培養液を、２０μｌの水を含有する３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、ＰＣＲ機の中で９５℃にて１５分間加熱することにより細胞を溶解した。溶解懸濁液１μｌを４μｌのＰＣＲミックス（総容量１０μｌ中、終濃度：０．２μＭのＭ１３順方向、ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ；０．２μＭのＭ１３逆方向、ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴ、４００μＭの各ｄＮＴＰ、２５ｍＭトリシン、７．０％グリセロール（重量／容量）、１．６％ＤＭＳＯ（重量／容量）、２ｍＭＭｇＣｌ２、８５ｍＭ酢酸アンモニウム  ｐＨ８．７、及び０．２Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ）を含む３８４ウェルの新たなプレートに移し、２０秒９４℃、１０秒５８℃、３０秒７２℃の３５サイクルによってインサートを増幅した。３０μｌの水を添加した後、４μｌの配列決定用ミックス（０．０２７μｌのＢｉｇＤｙｅターミネータミックスｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、１．９６μｌの２．５×希釈用緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．０１μｌの配列決定用オリゴ（１００μＭ貯蔵液Ｔ７、ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ）、及び２μｌの水）を含む新しい３８４ウェルのＰＣＲプレートに、１μｌのＰＣＲ産物を写すことにより、ジデオキシ配列決定に直接使用した。熱サイクリングを１０秒９４℃、１０秒５０℃、２０秒６０℃の３５サイクルで実施し、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の推奨に従い最終産物を３８４ウェルのプレート内でのエタノール沈殿によって精製して、ＡＢＩ３７３０ＸＬ配列決定装置にて、およそ１００ヌクレオチドの配列決定読み取り結果を生じさせるための改変プロトコルを用いて分析した。
【００９２】
広範囲平行配列決定用のライブラリー構築高力価小ＲＮＡライブラリーをＶｅｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ（Ｆｒｅｉｓｉｎｇ−Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ヒト雄性胎児脳及び若年雄性チンパンジー脳（７歳）から作製した。ヒト胎児組織については、標準インフォームドコンセント手順を用いた個々の同意と、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｕｔｒｅｃｈｔの倫理委員会の事前承認を得た。チンパンジー材料は、凍結保存リソース（ＢＰＲＣ）から得た。概説すると、チンパンジー成体脳切片（側頭部、前頭部、及び後頭葉並びに脳幹）から、そしてヒト胎児脳（混合組成）からの小ＲＮＡ画分をｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して単離し、その後ポリアクリルアミドゲルから１５〜３０ヌクレオチド画分を切り出すことによって更に集積した。ｃＤＮＡ合成用に、この画分のＲＮＡ分子を先ず、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリＡテイル化し、その後ｍｉＲＮＡの５’ホスフェートへの合成ＲＮＡアダプタのライゲーションを行なった。次いでｃＤＮＡ第一鎖の合成を、オリゴ（ｄＴ）−リンカープライマー及びＭ−ＭＬＶ−ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素を用いて実施した。アダプタ特異的プライマーでｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、単一分子配列決定に使用した。広範囲平行配列決定は、４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＵＳＡ）により、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ２０システムを用いて実施した。
【００９３】
クローニングした小ＲＮＡ配列決定読み取り結果の計算解析配列クロマトグラムの塩基呼び出し及び質的トリミングは、ｐｈｒｅｄソフトウェア（Ｅｗｉｎｇら、１９９８）によって行なった。ベクター及びアダプタ配列をマスキングし、重複を除いた後に、１８塩基以上の長さのインサートを、ゲノム（ヒト用にはｎｃｂｉ３５アセンブリ、及びマウス用にはｎｃｂｉｍ３４アセンブリ）にｍｅｇａｂｌａｓｔソフトウェア（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を用いてマッピングした。ゲノムに全てのインサートが完全に整合したわけではなく、非整合配列の詳細解析により、それらの多くは、端部の一方に付加したいくつかの更なるヌクレオチドを備えたｒｍｉｃｒｏＲＮＡを現すことが示唆された。これらの非ゲノム配列は、クローニング手順の人為的結果、又は成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの非テンプレート化改変（Ａｒａｖｉｎら、２００５）の結果であり得る。このような配列を、ゲノムへの最高ブラスト（ｂｌａｓｔ）ヒットに従って補正した。次に、インサートへのあらゆるゲノム座位整合につき、反復アノテーションをＥｎｓｅｍｂｌデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から引き出し、反復領域は、以下の反復：ＭＩＲ、ＭＥＲ、Ｌ２、ＭＡＲＮＡ、ＭＯＮ、Ａｒｔｈｕｒ及びｔｒｆを例外として、さらなる解析より切り捨てたが、その理由はこれらの反復アノテーションがいくつかの既知ｍｉｃｒｏＲＮＡと重複しているためである。１００ヌクレオチド側腹部を備えたインサートを含むゲノム領域をＥｎｓｅｍｂｌから引き出し、１００ヌクレオチドのスライディングウィンドウを用いてＲＮＡｆｏｌｄ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ、２００３）によりＲＮＡ二次構造を求めた。ヘアピンに折り畳まれ、そのヘアピンアームの１つにインサートを含む領域のみを、更なる解析に使用した。この段階では、あらゆる非重複性インサートが独立したヒットを生じるので、重複しているゲノム協調を備えたヘアピンを一つの領域に併合させて、整合しているインサートの位置を追跡した。いくつかのインサートが重複する場合、重複しているインサートが及ぶ完全な領域を、成熟配列として下流での算出に使用した。次に、ヘアピンゲノム領域に対する遺伝子及び反復アノテーションを、Ｅｎｓｅｍｂｌから引き出し、反復領域（例外は前記に同じ）、更にはリボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡは切り捨てた。他のゲノムでの相同ヘアピンを見出すために、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウシ、オポッサム、ニワトリ、ゼブラフィッシュ及びフグゲノムに対して成熟領域をブラストした。少なくとも２０ヌクレオチドの長さと少なくとも７０％の同一性のヒットを、特定の成熟クエリ配列が属する元のヘアピンで観察されるものと類似の長さの隣接配列と共にゲノムから抽出した。抽出した配列を、ＲＮＡｆｏｌｄを用いてヘアピン構造につき確認し、陽性のヘアピンを、ｃｌｕｓｔａｌｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）を用いて元のヘアピンと整列化した。全体で少なくとも７０％の同一性、及び成熟配列内で９０％の同一性を備えた相同体のみを考慮した。一つの種でいくつかの相同なヘアピンが同定された場合、最高のｃｌｕｓｔａｌｗスコアのヘアピンを保持した。次に、異なる生物からの相同体を、ｃｌｕｓｔａｌｗによって元のヘアピンと整列化し、ヘアピン領域の最終多重アラインメントを生成した。相同配列の染色体位置を用いて、それぞれの種のＥｎｓｅｍｂｌデータベースから遺伝子及び反復アノテーションを引き出した。種のうちの一つで反復／ＲＮＡアノテーションを含むヘアピンや、２５ヌクレオチドより長い成熟領域を含むか又は８５％を上回るＧＣ含有量を有するヘアピンは切り捨てた。ヘアピンを残すために、モノヌクレオチド・シャフリング及び１０００反復を用い、アラインメントにおけるあらゆる配列についてＲａｎｄｆｏｌｄ値を算出した。Ｒａｎｄｆｏｌｄには０．０１のカットオフを使用し、アラインメントで少なくとも一つの種についてこのカットオフを下回るヘアピンを含む領域のみを、ｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子と考えた。最後に、陽性のヘアピンをアノテーションに従い既知ｍｉｃｒｏＲＮＡと新規ｍｉｃｒｏＲＮＡとに分けた。これらのアノテーションを円滑化し、ルートの性能の追跡も行うために、ｍｉＲＢａｓｅ  ｖ．８．０（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、２００４）からの既知ｍｉｃｒｏＲＮＡの成熟配列を解析に加えた。
【００９４】
広範囲平行ピロシーケンシングによって得られた配列は、同じ計算ルートで解析したが、他のゲノムでの相同体は、同様のパラメータを使用してもわずかに異なるように同定された。他のゲノムでの相同のヘアピンはヒト、チンパンジー、マカク、マウス、ラット、イヌ、ウシ、オポッサム、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、フグ、テトラオドン、ツメガエル、アノフェレス、ショウジョウバエ、ミツバチ及びユウレイボヤゲノムに対するＢＬＡＳＴを用いて成熟ｍｉＲＮＡ領域を比較することにより同定した。得られる場合、ＢＬＡＳＴＺ＿ＮＥＴ整列化領域も、Ｅｎｓｅｍｂｌから引き出した。成熟配列の第１、第２又は第３ヌクレオチドから始まる少なくとも７つの連続するヌクレオチドに整合する全てのヒットを抽出し、ＲＮＡｓｈａｐｅｓプログラム（Ｓｔｅｆｆｅｎら、２００５；８０、１００及び１２０ヌクレオチドのスライディングウィンドウ）を用いて折り畳んだ。
１）抽象的な形状「［］」を有するヘアピンに畳まれており、
２）０．８よりも大きい折り畳みの確立を有し、且つ
３）ヘアピンアームの１つに相同配列が含まれた領域のみを、更なる解析に用いた。
次に、あらゆる潜在的な相同ヘアピンと、元のヘアピンとの間の相同性を、ＲＮＡｆｏｒｅｓｔｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｂｉｓｅｒｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉ−ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｒｎａｆｏｒｅｓｔｅｒ）を用いて算出した。ＢＬＡＳＴＺ＿ＮＥＴ整列化領域がヘアピンに折り畳まれており、０．３を上回るＲＮＡｆｏｒｅｔｓｒｅスコアを有していれば、これは特定の種でオルソロガスなヘアピンとして割り当て、そうでなくても、０．３のスコアを上回る最高スコアのヘアピンは、オルソログと規定した。次に、異なる生物からの相同体を、ｃｌｕｓｔａｌｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）によって元のヘアピンと整列化し、ヘアピン領域の最終多重アラインメントを生成した。相同配列の染色体位置を用いて、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースのそれぞれの種から遺伝子及び反復アノテーションを引き出した。種のうちの一つで反復／ＲＮＡアノテーションを含むヘアピンや、２５ヌクレオチドより長い成熟領域を含むか又は８５％を上回るＧＣ含有量を有するヘアピンは切り捨てた。ヘアピンを残すために、モノヌクレオチド・シャフリング及び１０００反復を用い、アラインメントにおけるあらゆる配列についてＲａｎｄｆｏｌｄ値を算出した（Ｂｏｎｎｅｔら、２００４）。Ｒａｎｄｆｏｌｄには０．００５のカットオフを使用し、アラインメントで少なくとも一つの種についてこのカットオフを下回るヘアピンを含む領域のみを、ｍｉｃｒｏＲＮＡ遺伝子と考えた。最後に、陽性のヘアピンをアノテーションに従い既知ｍｉｃｒｏＲＮＡと新規ｍｉｃｒｏＲＮＡとに分けた。これらのアノテーションを円滑化し、ルートの性能の追跡も行うために、ｍｉＲＢａｓｅ  ｖ．８．０（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、２００６）からの既知ｍｉｃｒｏＲＮＡの成熟配列を解析に加えた。組織試料でのｍｉＲＮＡの発現
【００９５】
カスタムマイクロアレイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ）を、既知及び新規成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの全てを検出するために、３’アミノ結合オリゴヌクレオチド（６０マー、カスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイにつき前記したと同様）をスポットすることによって作製した。この時点で、タイリングパスはもはや不要であり、８倍の全長ヒト、マウス及びラットｍｉＲＮＡレパートリーを現す約１５，０００のスポットのスライドが得られた。これらのスライドを、カスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイについて前記したと同様に、マウス心臓及びマウス胸腺からの小ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ  ＭｉｒＶａｎａ小ＲＮＡ単離キットを用いて単離）とハイブリダイズした。以下の表に、胸腺及び心臓に対して規準化した強度（任意の数値、８つのスポットの平均、１試料当たりｍｉｃｒｏＲＮＡ分子の一定総量を想定することにより規準化）を、２倍を上回る程度に差動的に発現されるそれらのｍｉＲＮＡについて示す。数値が小さいことは、バックグラウンド信号、及び試料中にこの特定のｍｉＲＮＡが存在しないことを示唆し得る点に注意すべきである。明らかに、胸腺と心臓との間で差動的に発現され、従ってそれぞれの組織の特徴的なサインをもたらす２４のｍｉＲＮＡのうち８つが、図１に示すように新規なｍｉＲＮＡである。
【００９６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】図１は、ｍｉＲＮＡ及びヘアピンＲＮＡの組合せ及びその発現を示す。（Ａ）はフォーマットの説明を含む図である。
【図１Ｂ】ｍｉＲＮＡ及びヘアピンＲＮＡの組合せ及びその発現を示す。
【図２】修飾されたＲＡＫＥマイクロアレイの結果を示す。単一のポジティブな組織（マウス８．５ｄｐｃ胚、１６．５ｄｐｃ胚、脳又は胎仔の幹（ＥＳ）細胞）における、全ての新規なｍｉＲＮＡに対する、タイリングパスにおけるハイブリッド形成結果を示す。ヘアピン配列を示し、数字はＲＡＫＥマイクロアレイ上のそれぞれのプローブの３’末端を示す。小さい画像はそれぞれのプローブのための生の結果を示す。アノテーション（ｃａｎｄ＊＊＊プローブ％％）とは、図１の成熟ｍｉＲＮＡｓのための陽プローブ及びマッチ試験確認アノテーションを指す。
【図３】成熟ｍｉＲＮＡ及び対応するヘアピンＲＮＡを図示する。ｍｉＲＮＡは明るいボックスとして示し、残りを暗い（箱／線）として示す。図は一定の比率ではない。
【図４】最もリッチであるか、最も長いヒトの成熟配列を列記した、配列番号の配列リスト（クローニングによって定義される）。
【図５】最もリッチであるか、最も長いマウスの成熟配列を列記した、配列番号の配列リスト（クローニングによって定義される）。
【図６】図２からのヒト成熟配列からの配列リストの配列番号リストを示す。そこにおいて、マウスオルトログはＲＡＫＥ実験（８．５ｄｐｃマウス胚、１６．５ｄｐｃマウス胚、マウス脳、マウス胚性幹細胞）により差動的な発現が証拠された。ヒトにおいてクローニングされた成熟配列は、ここでのみ含まれる。
【図７】図３からのヒト成熟配列からの配列リストの配列番号リストを示す。そこにおいて、マウスオルトログはＲＡＫＥ実験（８．５ｄｐｃマウス胚、１６．５ｄｐｃマウス胚、マウス脳、マウス胚性幹細胞）により差動的な発現が証拠された。マウスにおいて必ずしもクローニングされる必要のないプローブ配列が含まれる。
【図８】ヒトの熟成マイクロＲＮＡ配列の配列ＩＤ番号のリスト。それらは神経グリア芽細胞腫対通常の脳組織、又は腺腫対正常胚組織、又はその両方（図１１及び１２）において、ディファレンシャルに発現する（２倍以上の変化を示す）。
【図９】ヒトの熟成マイクロＲＮＡ配列の配列ＩＤ番号のリスト。それらは神経グリア芽細胞腫対通常の脳組織、並びに腺腫対正常胚組織の両方（図１１及び１２）において、ディファレンシャルに発現する（２倍以上の変化を示す）。
【図１０】生のマイクロアレイ発現の一部の二色画像により、腺腫腫瘍材料（緑色）と正常胚組織（赤色）とで区別される。腫瘍材料において上方制御又は下方制御されるマイクロＲＮＡが、それぞれ緑及び赤として現れる。発現が変化しないマイクロＲＮＡは黄色であり、発現されないマイクロＲＮＡは黒色である。
【図１１】神経グリア芽細胞腫及び通常のコントロール脳組織との間でディファレンシャルに発現するマイクロＲＮＡ。全ＲＮＡは、ヒト腫瘍及び通常のコントロールの脳組織から、Ｔｒｉｚｏｌベースの方法を用いて単離した。サンプルを、Ｋｒｅａｔｅｃｈ  ＵＬＳマイクロＲＮＡ試薬を用いて標識し、カスタムでスポットしたＣｏｄｅｌｉｎｋマイクロアレイにハイブリダイズさせた（８４７の異なるマイクロＲＮＡプローブ（ＤＮＡバックボーン、１５０の公知のマイクロＲＮＡを含む）。各プローブを、全てのスライドに８回アプライした。マイクロアレイのイメージングは、ＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃｔｏｒソフトウェアを用いて行い、そのデータはｌｉｍｍａ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）を用いて解析した。Ｎ／Ｄ：算出できず。
【図１２ａ】腺腫及び通常のコントロール肺組織との間でディファレンシャルに発現するマイクロＲＮＡ。
【図１２ｂ】図１２ａの続きを示す。全ＲＮＡは、ヒト腫瘍及び通常のコントロールの脳組織から、Ｔｒｉｚｏｌベースの方法を用いて単離した。サンプルを、Ｋｒｅａｔｅｃｈ  ＵＬＳマイクロＲＮＡ試薬を用いて標識し、カスタムでスポットしたＣｏｄｅｌｉｎｋマイクロアレイにハイブリダイズさせた（８４７の異なるマイクロＲＮＡプローブ（ＤＮＡバックボーン、１５０の公知のマイクロＲＮＡを含む）。各プローブを、全てのスライドに８回アプライした。マイクロアレイのイメージングは、ＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃｔｏｒソフトウェアを用いて行い、そのデータはｌｉｍｍａ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）を用いて解析した。Ｎ／Ｄ：算出できず。
【図１】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図５】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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