(57)【要約】【課題】ラマン散乱のような光散乱を用いる検出器又は光吸収に対する蛍光を使用する検出器を提供する。【解決手段】サンプル内の検体の有無を検出する方法は、金属表面の近くの領域に保持された較正色素を有する検体キャリアを使用する。レポーター色素が、金属表面の近くの領域から離れて保持され、かつ選択薬剤に対して置換可能に付着される。選択薬剤は、検体が選択薬剤に結合すると、レポーター色素が脱離して金属表面の近くの領域に移動するように検体に結合することができる。レポーター色素及び較正色素からの照明に対する応答の差を使用して、検体サンプルの存在、量、又は欠如を検出することができる。【選択図】図４
2009511891.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル内の検体の有無を検出する方法であって、
金属表面の近くの領域に保持された較正色素と、検体を拘束することができる選択薬剤に置換可能に付着し、そのために該検体が該選択薬剤に結合する時に脱離して金属表面の近くの領域に移動する、金属表面の近くの領域から離れて保持されたレポーター色素とを有する検体キャリアを準備する段階と、
前記検体キャリアにサンプルを導入する段階と、
前記検体キャリアを照明する段階と、
前記較正色素からの前記照明に対する応答と比較した前記レポーター色素からの前記照明に対する応答の差を測定することによって検体の存在を検出する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記照明は、レーザ光であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
照明に対する前記応答は、ラマン散乱に起因する波長の変化であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
照明に対する前記応答は、ＳＥＲＳであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
照明に対する前記応答は、蛍光であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項６】
照明に対する前記応答は、蛍光消光であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記較正色素は、前記選択薬剤に付着されていることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記選択薬剤は、前記較正色素の機能を実行することを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記検体キャリアは、金属層を含み、前記較正色素は、該金属層の近くの領域に保持され、
前記選択薬剤は、前記レポーター色素が前記金属層から離れて脱離可能に保持されるように該金属層において固定化される、
ことを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記レポーター色素は、検体によって置換された時に前記金属層の近くの領域に移動することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検体キャリアは、第２の金属層を含み、
前記レポーター色素は、検体によって置換された時に前記第２の金属層の近くの領域に移動する、
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択薬剤は、コロイド金属粒子懸濁液内にあり、そのために各選択薬剤分子は、コロイド金属粒子の金属表面に付着していることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
所定の選択薬剤分子の前記レポーター色素は、該所定の選択薬剤が付着している前記コロイド金属粒子の近くの領域に移動することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検出器アセンブリ装置に使用するための検体キャリアであって、
金属表面と、該金属表面の近くの領域に保持された較正色素と、該金属表面にあって検体を拘束することができる選択薬剤と、該選択薬剤に置換可能に付着し、そのために該選択薬剤へのサンプル内の検体の結合の際に脱離して金属表面の近くの領域に移動する、金属表面の近くの領域から離れて保持されたレポーター色素とを含み、
それによって前記検体の存在は、前記較正色素からの照明に対する応答と比較した前記レポーター色素からの照明に対する応答の差によって測定することができる、
ことを特徴とするキャリア。
【請求項１５】
前記較正色素は、前記選択薬剤に付着していることを特徴とする請求項１４に記載の検体キャリア。
【請求項１６】
前記選択薬剤は、前記較正色素の機能を実行することを特徴とする請求項１４に記載の検体キャリア。
【請求項１７】
金属層を含み、前記較正色素は、該金属層の近くの領域に保持され、
前記選択薬剤は、前記レポーター色素が前記金属層から離れて脱離可能に保持されるように該金属層において固定化される、
ことを特徴とする請求項１４から請求項１６のいずれか１項に記載の検体キャリア。
【請求項１８】
請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載の検体キャリアを含み、
金属表面の近くの領域を照明するように配置されたレーザ光源と、較正色素からの照明に対する応答と比較したレポーター色素からの照明に対する応答の差を測定することによって検体の存在を検出するように配置された検出器とを更に含む、
ことを特徴とする検出器アセンブリ。
【請求項１９】
較正色素と、検体キャリアの金属表面への薬剤の固定化のための金属表面結合基とに付着されたことを特徴とする選択薬剤。
【請求項２０】
前記較正色素及び金属表面結合基に共有結合的に付着していることを特徴とする請求項１９に記載の選択薬剤。
【請求項２１】
較正色素の機能を実行し、かつ検体キャリアの金属表面への選択薬剤の固定化のための金属表面結合基に好ましくは共有結合的に付着されたことを特徴とする選択薬剤。
【請求項２２】
較正色素が付着し、かつレポーター色素が置換可能に付着し、そのために薬剤への検体の結合の際に該較正色素でなく該レポーター色素が薬剤から脱離することを特徴とする選択薬剤。
【請求項２３】
較正色素の機能を実行し、かつレポーター色素が置換可能に付着し、そのために薬剤への検体の結合の際に該レポーター色素が薬剤から脱離することを特徴とする選択薬剤。
【請求項２４】
検体キャリアの金属表面への選択薬剤の固定化のための金属表面結合基に付着していることを特徴とする請求項２２又は請求項２３に記載の選択薬剤。
【請求項２５】
前記レポーター色素は、選択薬剤結合基及び金属表面結合基を更に含むレポーターの一部であり、そのために選択薬剤への検体の結合の際に該レポーターは、選択薬剤から脱離することを特徴とする請求項２２から請求項２４のいずれか１項に記載の選択薬剤。
【請求項２６】
サンプル内の検体の存在を試験するために較正色素が付着し、かつレポーター色素が置換可能に付着した選択薬剤の使用。
【請求項２７】
サンプル内の検体の存在を試験するために較正色素の機能を実行し、かつレポーター色素が置換可能に付着した選択薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子検出器と、分子検出器に用いるキャリアと、キャリア及び検出器の分子検出器アセンブリとに関する。本発明は、特に、ラマン散乱のような光散乱を用いる検出器又は光吸収に対する蛍光を使用する検出器に関連する。
【背景技術】
【０００２】
検体分子の作用又は存在を検知する多くの技術が存在することは公知である。こうした技術の1つは、「ラマン散乱（ＲＳ）」効果を利用するものである。分子に入射した光は散乱し、エネルギの移動の結果、周波数及び従って波長のシフトが散乱光に発生する。この非弾性散乱をもたらす過程は、ラマン効果と呼ばれる。周波数のシフトは検体分子に固有である。しかし、ＲＳ効果は非常に弱く、従って、この効果を強調するために好ましくはコロイドを用いる技術が使用されることは公知である。銀、金、銅、又は他のそのような材料のような金属表面の数オングストローム内に置かれた検体分子は、様々な機構によって金属表面からエネルギの伝達を受ける。これは、「表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）」として知られ、従来型の分光検出器を用いて測定することができる。
【０００３】
表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）及びその拡張である表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）は、定量生物分析手段として普及している。両技術は、金属の表面での移動性伝導電子の「プラズマ」（プラズモン）とその表面の近くの分子種との相互作用に高度に依存する。この相互作用は、特定の振動エネルギでのラマン散乱の大幅な増強をもたらし、ラマン散乱光に強いスペクトル信号が生じる。
【０００４】
最近まで、増強機構の理解は議論に包まれていた。化学的増強機構と電磁的増強機構の間の１０6を超える増強係数の分配について、２つの主要な派閥が意見を異にしていた。現在１０2の増強係数に寄与すると考えられている化学的増強機構は、電荷移動状態が金属と吸着分子の間に生成されると主張する。この機構は、部位特定であり、かつ検体依存性である。分子は、化学増強を受けるために表面に直接吸着される必要がある。電磁的増強機構は、普通のラマン散乱と比べて１０4倍を超える増強に寄与する。電磁的増強を理解するためには、表面のナノスケール粗度特徴部の大きさ、形状、及び材料を考慮すべきである。適正な波長の光が金属粗度特徴部に当たる場合、伝導電子のプラズマが集合的に振動することになる。この集合的振動は、電子のプラズマの表面に局所化しているので、それは、局所表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）として公知である。ＬＳＰＲは、共鳴波長を吸収かつ散乱させて、粗度特徴部の周囲に大きい電磁場を生成する。分子が電磁場内に置かれた場合、増強ラマン信号が測定される。
【０００５】
場の強度及び局所密度は、様々なパラメータによって判断される。反射光の波長は、そのエネルギを決め、金属の組成及び形態は、表面プラズモンがフォトンエネルギに結合する強度及び効率を決める。金属と検体溶液の比誘電特性のような他の因子も、この効果に強い寄与を有する。加えて、場と金属表面に接近したいずれかの分子との間のエネルギ移動の効率も、例えば、赤外線スペクトル領域の特定の振動モード及び紫外線内の電子エネルギ遷移を含む分子自体における共鳴エネルギ状態によって判断される。これが、従来型ＳＥＲＳを超える性能をＳＥＲＲＳが獲得する機構である。
【０００６】
本発明者は、ラマン散乱効果が、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用する場合でさえも、通常の散乱と比較して少量のラマン散乱放射しかもたらさない（事実上、ＳＮ比が低い）という問題を認めている。本発明者は、更に、ラマン信号がノイズと比較して弱いので、ラマン信号をノイズから識別するのに役立つ機構を導入する必要があることも認めている。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ９９／９９４０６５
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、特許請求の範囲で規定されており、それを参照されたい。本発明の実施形態は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用して、表面の近くの領域内の検体の存在を検出する。公知の構成と異なり、この実施形態は、抗体のような選択薬剤と関連してレポーター色素及び較正色素を使用し、これらは、較正色素が、表面の近くの領域に位置し、レポーター色素が、検体分子が選択薬剤に結合してその時点でレポーター色素が変位しかつ表面の近くの領域に位置するようになるまで選択薬剤によって表面から離れて保持されるように構成される。この構成は、検体から散乱されるラマン信号の較正を実質的に提供する。検体分子が存在しない時、表面増強ラマン効果に起因するラマン散乱は、較正色素からのみのものが大部分である。検体分子が結合する時に、レポーター色素は、それも表面増強ラマン信号への寄与を提供するように表面の近くの領域に変位する。これは、レポーター色素及び較正色素からの信号の比率が、未知のノイズの寄与を必然的に含む散乱光の絶対強度とは無関係の尺度として使用されることを可能にする。この構成は、従って、検体分子の検出のための較正構成と考えることができる。
【０００９】
「色素」は、当然ながら当業者に公知であり、本明細書では特定の光学特性を有し、「発色団」とも称されている群を網羅するのに使用される。用語「色素」は、従って、「ラマン活性発色団」を含む。「色素」は、表面増強のために適切な波長での励起レーザを強く吸収すべきである（最も普通のラマンレーザは、５１４ｎｍ、５３２ｎｍ、及び７８５ｎｍである）。これは、緑−赤の可視範囲にあり、そのために従来型の鮮やかな色の色素は、特に良好なラマン活性発色団である。
【００１０】
検体は、検出するか又は定量することが望ましいあらゆる化学物質である。適切な検体の一例としては、生体分子（タンパク質、抗体、核酸、炭水化物、プロテオグリカン、脂質、又はホルモンのような）、医薬品又は他の治療のための薬剤及びそれらの代謝物、乱用薬物（例えば、アンフェタミン、阿片剤、ベンゾジアゼピン、バルビツール酸塩、カンナビノイド、コカイン、ＬＳＤ、及びそれらの代謝物）、爆発物（例えば、ニトログリセリン、並びにＴＮＴ、ＲＤＸ、ＰＥＴＮ、及びＨＭＸを含むニトロトルエン類）、及び環境汚染物質（例えば、除草剤、殺虫剤）が挙げられる。
【００１１】
検体サンプルは、検体の存在又は量について試験することが望ましいあらゆるサンプルである。検体の有無又は量について試験されることが望ましい多くの状況がある。一例としては、臨床用途（例えば、血液又は尿サンプルのような生体サンプル内の抗原又は抗体の存在の検出）、乱用薬物の検出（例えば、違法サンプル、又は体液又は呼気サンプルのような生体サンプル内で）、爆発物の検出、又は環境汚染の検出（例えば、液体、大気、土壌、又は植物サンプル）が挙げられる。
【００１２】
本発明の方法は、検体サンプル内のいくつかの異なる種類の検体を同時に検出するために使用することができる。これは、異なる種類の検体について、異なる選択薬剤及びレポーター色素の使用によって達成することができる。このような同時検出には、単一の較正色素を使用することができ、又は複数の較正色素（例えば、各々の異なる種類の検体について異なる較正色素）を使用することもできる。
【００１３】
一部の状況では、検体サンプルは、あらゆる検体を含有しなくてもよいことが認められるであろう。例えば、特定の化学物質が浄化作用によって除去されたこと、又は感染性因子（又は感染性因子のマーカ）が、被験者の処置の後に被験者から得られた生体サンプルにもはや存在しないことを示すことが望ましい場合がある。
選択薬剤は、サンプル内の検体の存在（又は量）を検出することができるように、検体サンプルの他の成分の存在下で、かつこの検出方法が行われる条件下で検体に選択的に結合するあらゆる薬剤である。選択薬剤の性質は、勿論、検体のアイデンティティに依存することになる。多くの場合に、選択薬剤は、抗体であることになる。しかし、他の適切な検体結合相手を使用することもできる。例えば、検体が抗体である時、選択薬剤は、この抗体によって選択的に結合される抗原又は抗原誘導体とすることができる。検体が核酸である時、選択薬剤は、検体核酸にハイブリッド形成する核酸又は核酸類似物とすることができる。
用語「抗体」は、検体に選択的に結合して検体の検出を可能にする抗体、又はフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖Ｆｖ分子、又はＣＤＲ領域）、又は抗体又はフラグメントの誘導体を含むように本明細書で使用される。
【００１４】
本発明の一部の好ましい実施形態では、レポーター色素は、レポーターの一部とすることができる。通常、レポーターは、レポーター色素、選択薬剤結合基、及び金属表面結合基を含むことになる。レポーターは、検体サンプルがキャリアに導入される前に選択薬剤に結合される（選択薬剤結合基により）。選択薬剤への検体の結合は、レポーターを置換し、レポーターは、次に、金属表面に結合し（金属表面結合基により）、それによってレポーター色素を金属表面の近くの領域に移動させる。
検体それ自体が本質的にラマン活性であることは可能である。こうした実施形態では、レポーター色素は、検体と化学的に同一とすることができる。レポーターが使用される場合には、従って、別の選択薬剤結合基の必要性はない。
【００１５】
一般的に、レポーターの成分は、別のリンカーによって互いに結合されることが期待される。使用することができると考えられる多くの可能で適切なリンカーの存在は、当業者には明らかであろう。リンカーのアイデンティティは、レポーターの成分のアイデンティティに依存することになる。選択薬剤結合基がペプチドを含む時は、リンカーは、通常のペプチド結合化学的性質に適合する場合に有利である。例えば、リンカーは、好ましくは、ペプチドのＮ末端と反応するための単一のカルボン酸基を含むことができる。
【００１６】
一部の状況では、使用される特定の成分に基づいて、別のリンカーの使用なしに、例えば、レポーターの異なる成分の化学基の間の反応により、レポーターの２つ又はそれよりも多くの成分を互いに結合することが可能であろう。
レポーターの成分は、レポーターがその金属表面結合基によって表面に結合される時に、レポーター色素が金属表面の近くの領域内にあるという条件で、あらゆる順序で互いに結合することができる。
【００１７】
レポーターの金属表面結合基は、金属表面に優先的に結合する基（典型的には吸着により）でなければならない。一部の状況においては、金属表面への金属表面結合基の結合は、レポーターを金属表面に固定化するのに十分に強いことが望ましい場合がある。金属表面結合基の化学的性質は、使用される金属に依存することになる。適切な銀結合官能基としては、オキサゾール、チアゾール、ジアゾール、トリアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、オキサチアゾール、チアトリアゾール、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、ベンズイミダゾール、インダゾール、イソインダゾール、ベンゾジアゾール、又はベンズイソジアゾールのような複素環窒素を有する基が挙げられる。他の適切な官能基としては、アミン、アミド、チオール、サルフェート、チオサルフェート、フォスフェート、チオフォスフェート、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシレート、及びチオカルバメートが挙げられる。システイン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、又はアルギニンのようなアミノ酸も銀結合を与える。
【００１８】
較正色素への選択薬剤の付着は、選択薬剤への検体の結合が較正色素を選択薬剤から変位させないほど十分に安定であるべきであることが認められるであろう。典型的には、較正色素は、選択薬剤に共有結合的に付着されることになる。
較正色素は、較正色素又は選択薬剤に付着される（好ましくは、共有結合的に）金属表面結合基により、金属表面の近くの領域に保持することができる。金属表面結合基の例は上述している。較正色素又は選択薬剤に付着された金属結合基は、レポーターの金属表面結合基と同じ種類のものとすることができ、又は異なる種類のものとすることができるが、それは、較正色素及び選択薬剤が金属表面に固定化されるほど金属表面に十分に強く結合すべきである。選択薬剤、較正色素、及び金属表面結合基は、選択薬剤が金属表面に固定化される時に、較正色素が金属表面の近くの領域内にあるという条件で、あらゆる順序で互いに結合することができる。
代替的な実施形態では、選択薬剤は、選択薬剤が較正色素の機能を実行するように本質的にラマン活性とすることができる。このような実施形態では、別の較正色素を必要としない。
本発明の実施形態を単に例示的に添付図面を参照して以下に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
説明する実施形態は、「表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）」の技術を使用するが、本発明は、蛍光発光法又は蛍光消光法にも適用することができる。本発明の実施形態は、２つの主要構成要素、すなわち、分析される分子を担持する検体領域を提供する検体キャリアと、このキャリア上の検体領域にレーザ放射線を提供し、かつ検体領域から受光した放射線を検知するセンサを有する検出器とを含む。検体キャリアと検出器は、一緒に検出器アセンブリを構成する。
【００２０】
検出器それ自体は、様々な形態のレーザ源及び以下のようなセンサを含むことができる。検出器に適切な検体キャリアの実施形態は、様々な形態を取ることができる。好ましい実施形態は、マイクロ流体チップであるが、他の実施形態としては、以下のような適切に修正されたマイクロタイタープレートが含まれる。この検体キャリアは、このようにいわゆる「ラボ・オン・チップ」である。実施形態の説明の前に、背景的知識のために、まずＳＥＲＳ効果が簡潔を説明する。
【００２１】
上述のように、光が分子から散乱する時、殆どのフォトンは弾力的に散乱する。散乱フォトンの大部分は、入射フォトンと同じエネルギ（従って周波数及び波長）を有する。しかし、光の僅かな部分（約１０7フォトンのうちの１フォトン）は、図１に示すように入射フォトンの周波数と異なり、通常それより低い周波数で散乱される。散乱フォトンが分子にエネルギを取られる時、それは、入射光よりも長い波長を有する（ストークス散乱と呼ばれる）。逆に、散乱フォトンがエネルギを取得する時、それは、より短い波長を有する（反ストークス散乱と呼ばれる）。
【００２２】
この非弾性散乱をもたらす過程は、そのことを１９２８年に発見したＣ．Ｖ．ラマン卿にちなんでラマン散乱と呼ばれる。これは、分子の振動、回転、又は電子エネルギの変化と結びつき、フォトンから分子に移動したエネルギは、通常熱として消散される。熱エネルギが散乱フォトンに移動され、従って、フォトンの波長が短くなることも可能である。古典的な用語では、この相互作用は、分子の電界の摂動と見ることができ、それは、分子の特定の化学構造のみでなく、その厳密な配座及び周囲状況にも依存する。入射フォトンとラマン散乱フォトンの間のエネルギ差は、散乱分子の振動状態のエネルギに等しく、量子化エネルギ値での散乱フォトンが生じる。エネルギ（波長）差に対する散乱光の強度のプロットは、ラマンスペクトル［ＲＳ］と呼ばれる。異なるエネルギ状態の説明が図１に示されている。
【００２３】
図２は、金属表面の数十ナノメートル以内の化合物又はイオンからのラマン散乱が、溶液におけるよりも１０3から１０6倍大きくなる可能性がある状態を示している。この「表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）」は、銀上で最も強いが、金及び銅上でも同様に容易に観察することができる。最近の研究は、様々な遷移元素も有用なＳＥＲＳ増強を生じさせることができることを示している。ＳＥＲＳ効果は、分子と、金属内の電子によって生じる金属の表面の近くの電磁場との間のエネルギ移動によって基本的に発生する。ＳＥＲＳを使用してラマン散乱の増強をもたらす正確な機構は、ここに説明することは要せず、金属内の電子への検体分子の画像のカプリングのような様々なモデルは当業者に公知である。結局、金属層６内の電子がこの分子にエネルギを供給し、それによってラマン散乱が増強される。
【００２４】
特定の分子の存在は、散乱ビーム４によって示された散乱放射線の波長を検出することによるＳＥＲＳを用いて検出される。散乱は指向性ではなく、そのためにセンサ（図示せず）は、散乱放射線の波長及び従ってエネルギ変化の測定のために散乱放射線を捕捉するいずれかの妥当な位置に置くことができる。エネルギ変化は、分子状態のバンドギャップに関連し、従って、特定の分子の存在を判断することができる。公知の構成においては、レポーター色素が、抗体のような選択薬剤８に最初に結合される。検体１０の選択薬剤への結合が、レポーター色素を変位させ、レポーター色素を金属表面に移動させＳＥＲＳ信号が生じる。レポーター色素は、図１に示すようなその特徴的なラマンシフトによって検出することができる。
【００２５】
本発明の実施形態により検体の存在を検出するのに使用するキャリアは、図３ａ及び図３ｂに示されており、金属表面６を含む。抗体のような選択薬剤８は、金属表面結合基３１によって表面６に保持される較正色素３０に付着される。較正色素３０は、それがＳＥＲＳ効果を増強する表面６からのエバネセント場の影響の範囲内にあるように領域３４内にある。レポーター３８は、金属表面結合基３３及び選択薬剤結合基３５（例えば、この抗体によって選択的に結合されるペプチド）に結合されているレポーター色素３２を含む。レポーター３８（従って、レポーター色素３２）は、レポーター色素３２が領域３４の外側にあるように、抗体８によって表面から離れて保持される。検体３６が選択薬剤８に結合すると、レポーター３８は、選択薬剤８から離される。次に、レポーター３８の金属表面結合基３３は、図３ｂに示すように、レポーター３８を表面６に結合させる。表面６へのレポーター３８の結合は、レポーター色素３２を、ＳＥＲＳ効果を増強する表面６からのエバネセント場の影響の範囲にあるように領域３４内に持ち込む。
【００２６】
検出器のＳＮ比は、２つのラマン活性基（すなわち、較正色素及びレポーター色素）、すなわち、表面から離れて保持されて検体が存在すると放出されるもの３２（レポーター色素）と、永続的にエバネセント場内に位置し、それによって内部較正信号として機能する他のもの３０（較正色素）との使用によって改善される。定量化測定基準を提供するためにラマン散乱光の絶対強度に依存するのではなく、この構成は、各々の色素からの散乱光の比率を使用する。色素の初期比率は、常に既知の常数であるので、この比率におけるあらゆる測定された変化は、絶対強度から実質的に独立している定量化測定基準を提供し、それによって検出器の変動、センサデバイス製造の再現性、又は他のノイズ源に基づくノイズに非常に影響を受けにくい内部較正信号がもたらされる。
【００２７】
検体分子３６が選択薬剤８に結合すると、レポーター色素３２は、選択薬剤から放出されてエバネセント場内に移動し、右図に示すようにその表面に結合される。最初は、レポーター３８のレポーター色素３２が表面から離れて保持されているので、較正色素３０からの信号のみが生成される。検体が存在する時、信号は、両方の色素から見られ、その２つの比率は、レポーターの分子が置換された度合を定量化するのに使用することができ、それによって存在する検体の量が定量化される。
【００２８】
好ましいスペクトル比較は、所定のラマンシフトで測定された強度の単純な比率ではないが、これは、妥当な第１近似として役立たせることができる。色素からのスペクトル信号は加法的であり、それは、色素の間のスペクトルピークにいずれかの重複がある場合に、あらゆる所定のラマンシフトでの強度が両方の色素からの寄与を有し、定量的関係が強度に関して非線形になることを意味する。これは、ピーク強度それら自体が強い強度について特に非線形である事実（ベール−ランバート法則）によって更に複雑である。このスペクトルを解析する最良の方法は、ニューラルネットワーク、遺伝的プログラム、部分最小２乗解析、又はサポートベクトルマシンのような非線形多変量較正技術を使用することである。これらは、当業技術でよく研究されており、以下で更に説明しない。
【００２９】
解析する好ましいデータセットは、典型的に２００−４０００ｃｍ-1の範囲にわたって収集された完全ラマンスペクトルを含む。色素内の個別化学基は、これらのスペクトル内部に特定のラマンシフトでのピークを有することになり、これらは、較正色素に対するレポーター色素の定量化を可能にするように、多変量較正ソフトウエアによって使用することができる。定量モデルが見出された状態で、それは、全スペクトルの一部のみを使用することができ、そのためにこれらのラマンシフトのみをモニタする簡素化検出器を設計することが可能になるであろうが、それは、従って、それらの色素に特異的であり、汎用技術プラットホームにはより適さないであろう。
【００３０】
好ましい実施形態では、レポーター分子の選択薬剤結合基は、選択薬剤内での検体と同じ部位に結合する。これを達成する１つの方法は、レポーターの選択薬剤結合基を、選択薬剤によって選択的に結合される検体の構造部分に基づくものとすることである。例えば、検体がタンパク質であって、選択薬剤が抗体である場合、レポーターの選択薬剤結合基は、この抗体によって認識される検体の領域に対応するペプチドを含むことができる。代替的に、検体は、特定の核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）とすることができる。レポーターの選択薬剤結合基は、次に、その塩基配列が選択薬剤によって選択的に結合される検体の部分に対応するオリゴヌクレオチドを含むことができる。同様に、炭水化物又はプロテオグリカンの検体は、選択薬剤によって選択的に結合される検体の糖基を含む選択薬剤結合基を含むレポーターを用いて検出することができる。脂質検体については、レポーターの選択薬剤結合基は、選択薬剤によって選択的に結合される検体の構造から導かれた１つ又はそれよりも多くの脂肪酸鎖を含むことができる。
他の実施形態では、レポーターは、アロステリック機構によって置換される。そのような実施形態では、選択薬剤結合基は、検体が結合する部位とは異なる選択薬剤上の部位に結合する。選択薬剤結合基のその部位への結合は、検体によって結合されている部位に変化を生じさせ、それによって検体の選択薬剤親和性が低下し、従って検体が放出される（すなわち、置換される）。
【００３１】
本発明の代替の好ましい実施形態によれば、検体は、基質（核酸又はペプチド基質のような）を切断することができる酵素（プロテアーゼ又はヌクレアーゼのような）とすることができる。そのような実施形態では、選択薬剤は、この酵素によって選択的に結合することができる認識部位と、この酵素によって切断され選択薬剤に付着したレポーター色素を放出させる（置換する）切断部位とを含む。反応速度をモニタして、それをその酵素／基質の組合せの既知のターンオーバー数と比較することにより、存在する検体酵素の量を測定するためにこの実施形態を使用することが可能であることが認められるであろう。
【００３２】
金属表面へのレポーター分子の移動は、様々な機構によることができるが、最も単純なものは単なる拡散によるものである。レポーター分子が金属表面にある状態で、金属結合基は、それを所定の位置に保持する。言うまでもなく、多くのレポーター分子は、表面から離れてバルク溶液内に単に拡散する。非マイクロ流体チャンバにおいては、これは、再生可能な割合のレポーター分子が所定の時間内に表面に付着するので、より低感度であるが、依然として生存可能なものを検出器にもたらすであろう。マイクロ流体環境においては、検出器チャンバ壁は、分子を拘束するように作用し、そのために分子は、急速に跳ね返って金属に「付着する」ことになり（金属結合基への結合により）、それによって感度が大幅に高まる。最後に（チャンバ寸法及び拡散速度に基づいて）、レポーターの大部分又は全部でさえも金属に付着されることになる。
【００３３】
分子の存在を測定するための他の技術があり、その１つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）として公知である。ＳＰＲにおいては、励起レーザビームの電気ベクトルが、金属層の表面内に双極子を誘起する。陽分極電荷からの復元力は、この励起の共鳴周波数での振動電磁場をもたらす。レーリー限界において、この共鳴は、いわゆる「プラズマ波長」を決める金属層の表面での自由電子（プラズモン）の密度、並びに金属及びその周囲の誘電定数によって主として判断される。
【００３４】
この層の表面上に吸着されるか又は極めて接近している検体内の分子は、表面に垂直な振動モードが最も強く増大されている巨大な電磁場を体験する。これは、金属層内のプラズモンと表面の近くのこの分子との間の空間経由エネルギ移動を可能にする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果である。散乱フォトンは、そこで従来型の分光検出器（図示せず）を用いて測定することができる。平面偏光の励起レーザビームは、臨界角近くで金属表面上に衝突するように構成される。この臨界角は、金属の屈折率によって判断される。ＳＰＲ効果は、金属表面から約４００ｎｍ延びる電磁場であるエバネセント波を生成する。この場と検体分子の間のエネルギ移動は、層の有効屈折率の変化をもたらし、臨界角の変化、及び従って屈折光の強度の変化が生じ、これは、従来型分光デバイスを用いて検出することができる。
【００３５】
検体を検出する別の技術は、単一の検出器内でＳＥＲＳ効果とＳＰＲ効果を組み合わせることである。この構成においては、ＳＰＲビームの励起波長が変えられた時（例えば、同調可能レーザの使用により）、又は金属層の組成及び厚みが変更された時、ＳＰＲ効果は、特定の検体分子からのＳＥＲＳ信号を最大にするように選択的に最適化することができる。この利点は、ＳＥＲＳ信号の強度が所定の分子について実質的に増大することができ（より高感度の検出を可能にする）、かつある一定の領域内のＳＰＲ電磁場が複雑な生体混合物の特定の成分からの信号を選択的に増強するように調整することができることである。この複合、検出器は、検体分子からの蛍光を増強するために擬似ＳＰＲ場を使用するので、本発明者は、この技術を表面プラズモン支援ラマン分光（ＳＰＡＲＳ）と名付けた。実質的に、第１のレーザによって生成された励起内にエネルギを注入するために、第２のレーザが使用される。
【００３６】
他の検出技術も、較正色素を有する技術に伴って使用することができる。例えば、検体分子によって置換された時にのみ第２の色素が蛍光を生じるようにして蛍光法を使用することができる。代替的に、蛍光消光法を使用することができる。
信号を発生する色素基は、使用される検出技術に従って選択される。ラマン分光法が選択された検出法である場合、増強は、可視／赤外線スペクトル領域内に発生することを要する。従って、強いラマン分光学特性を示す色素基が好ましく、センサの材料及び形態構造は、このスペクトル範囲でのエネルギ移動を最適化することができるように選択される。蛍光発光法が好ましい検出法である場合、関連のスペクトル領域は、可視／紫外である。この場合も、センサの材料及び形態構造は、このスペクトル領域内のそれらの有効性を最適化するように合理的に選択することができ、適切な蛍光性色素基は、市販されているものから選択されるか、又は特定の用途の要求に適合するように特別に合成することができる。蛍光発光法への代替は、蛍光消光法であると考えられる。上述のように、表面吸着分子と電磁場の間のエネルギ移動は、双方向過程である。従って、エバネセント場は、励起蛍光性分子からエネルギを抽出するエネルギシンクとして使用することができ、それによって金属表面の近くの分子からの蛍光を低減する消光効果が生じる。従って、センサは、レポーター分子の放出での蛍光消光の増大を検出することになる。全ての場合に、結合イベントを伝えるものと較正基準として機能するものとの２色素の使用が利用される。
【００３７】
ＳＥＲＳ又はＳＥＲＲＳによって検出することができる多くの色素が公知であり、関連文献（例えば、ＷＯ９９／９９４０６５）で言及されている。一例としては、蛍光色素、ローダミン色素、フタロシアニン、アゾ色素、シアニン、キサンチン、及びサクシニル蛍光色素が挙げられる。大きい有機システムを有して金属との表面プラズモン共鳴に適する波長（例えば、銀について＞４００ｎｍ）で蛍光を発するあらゆる化合物が適切であろう。
較正色素とレポーター色素は、使用される個々の検出技術によって識別可能でなければならないことが認められるであろう。
【００３８】
ラマンスペクトルで観察される特定の波長シフトは、分子のラマン活性振動モードの周波数によって判断される。何らかの化学基（例えば、カルボキシレート、芳香環、メチル基）は、少数の原子内の局所運動による特性振動モードを提供する。他のものは、分子全体に拡がる大規模な振動運動に基づいている。ラマン活性振動は、多くの場合、赤外線活性波長と同じ波長で発生する。その違いは、強度にラマン活性の振動が、この基の分極可能性の変化（大きさ）を誘起するのに対して、赤外線活性のものは、双極子の変化（電荷分布）を誘起することである。
一部の状況では、レポーターの選択薬剤結合基又は金属表面結合基は、それ自体色素を含むことができ、それによって別々のレポーター色素の必要性が避けられる。
【００３９】
検体キャリアの実施形態を以下に説明し、同様に全体的キャリア及び検出器アセンブリも説明する。
検体キャリアの好ましい実施形態は、図４に示されており、マイクロ流体チップの形態である。選択された波長での放射線に対して透明で適切なプラスチック、ガラス、又は他の好ましい材料の基板１１上にチャンネル２２を有するチャンネル層１３が形成される。溶液内の検体は、矢印で示す方向でチャンネルに導入される。チャンネルの領域１７に導体層又は半導体層１６が形成される。この層は、好ましくは、銅、アルミニウム、銀、又は特に金のうちの１つである。上述のように、金層は、約８０ｎｍの粒径のコロイドとすることができ、金属コロイド内の粒径は、上述のように適切なプラズモン波長を提供するように選択される。
【００４０】
このチップの主要用途は、タンパク質検体の検出におけるものである。この用途に対しては、検体タンパク質に結合することができる抗体（又は、他の選択薬剤）に付着された較正色素は、金表面１６に保持される。較正色素は、金表面からのエバネセント場の作用領域２０の範囲にある。レポーターは、それに抗体が結合することができる検体タンパク質の一部を模倣することができるペプチド又は類似のフラグメントに付着されたレポーター色素を含む。レポーター色素は、抗体へのレポーターのペプチドの結合により、最初は表面から離れて保持される。抗体にタンパク質検体が結合すると、レポーターは、移動して金表面からのエバネセント場の作用領域２０の範囲に達する。レポーター色素は、分析されるタンパク質に基づいて選択される。ＳＥＲＳ散乱のような光学的効果を提供するのは、較正色素及びレポーター色素である。
【００４１】
検体キャリアチップがその中に挿入される検出器は、金層１６の表面領域１７で検体及びレポーター分子にビーム２を提供するＳＥＲＳレーザ２８を含む。ＳＥＲＳレーザ２８は、レポーター分子のバンドギャップに適合するように選択された波長での放射線を提供し、分子によって変化することになる。柔軟性のある検出器を提供するために、ＳＥＲＳレーザは、好ましくは同調可能である。ＳＥＲＳ散乱４は、指向性ではないので、散乱放射線のためのセンサ２６は、あらゆる位置にあることができる。しかし、このセンサは、レーザからの直接の放射線がセンサに達するのを避けるために、好ましくは、ＳＥＲＳレーザに対向していない。
【００４２】
ＳＰＲ効果のための平面偏光ビーム１２を提供するレーザ２７も、表面１６に対する臨界角で提供することができ、センサアレイ２４が反射ビーム１４を受光するように配置される。ＳＰＲレーザ２７は、表面プラズモン共鳴に適合する波長を有するように選択され、それ自体は、レポーター色素分子のバンドギャップに結合するように設定される。従って、ＳＰＲレーザ２７は、これも好ましくは同調可能である。センサアレイ２４は、各々が反射ビームに対して僅かに異なる角度にある複数のセンサを含む。従って、レポーター分子が表面１６からのエバネセント波と相互作用すると、それは、ＳＰＲ屈折放射線を変化させ、それは、屈折光の角度の変化として検出することができる。また、ＳＰＲレーザが同調可能であるので、ＳＰＲ効果は、レーザの同調を走査して検体分子が抗体に結合する時に所定の位置で屈折が発生する波長の変化に注意することによって測定することができる。
１つのチャンネルのみで示されているが、チップは、好ましくは、その各々が異なるレポーター色素及び／又は抗体（又は他の選択薬剤）を金属層の上に含むことができる複数のチャンネルを有する。
【００４３】
第２の具現化する検体キャリアは、図５に示されており、修正マイクロタイタープレートを含む。マイクロタイタープレートは、当業者に公知であり、通常、プラスチック製の基板内に一連のウェルを含む。検体のサンプルは、分析のためにマイクロタイタープレートのウェルに導入される。本発明の実施形態によれば、各ウェルの底部又は側部は、導体表面１６を含むように修正されている。選択薬剤に付着した較正色素は、この表面に保持される。レポーター色素を含むレポーターは、上述のように選択薬剤に結合される。次に、溶液内の検体が各ウェル内に導入され、プレートは、図４に関して上述したように検出器内に挿入される。導体表面は、好ましくは、上述のように通常５０から８０ｎｍも厚みの金である。検出器構成は、各ウェルを順に照明することができるが、好ましくは、プレート内の複数のウェルの各々からの同時照明及び検出を可能にするように検出器のアレイを有する。
【００４４】
上述の「ラボ・オン・チップ」デバイスのいずれに対しても、金属層１６の精密な組成を制御する付加的な可能性がある。様々なドーパント原子による金属表面１６の改質は、プラズマ波長を調節する付加的な手段を提供し、電子的に制御可能なＳＰＲ場でさえももたらすであろう。
更に別の代替的な実施形態は、図６に示されており、較正色素とレポーター色素は、上述と同じく存在するが、異なるのは、検体キャリアが２つの表面を有することである。選択薬剤に付着した較正色素３０は、上述のように第１の表面６に保持される。また、レポーター色素３２は、検体分子が存在する時に置換されるレポーター３８の一部である。この代替的な実施形態では、レポーター色素３２を含むレポーター３８が選択薬剤８から外される時に、それは、第２の表面４６に移動する。説明したラボ・オン・チップ実施形態では、これは、検体溶液を収容するチャンネルの反対側とすることができるであろう。従って、検出器は、第２の表面４６、並びに第１の表面６を照明するように構成することができる。これは、各々が選択された色素のラマンスペクトルに最も良く適合するように選択された異なるレーザを使用することができるであろう。
【００４５】
レポーターのＳＥＲＲＳ検出が行われる金属表面（すなわち、レポーター分子が最後に付着するもの）は、抗体／較正色素が位置する場所であることを必要としない。しかし、これは、較正がキャリブラント及びレポーターのＳＥＲＲＳ信号の両方の同時定量化を必要とするので、検出器（検出のために２つの金属スポットを必要とする）を複雑化するであろう。これは、単一の検出スポットを使用し、かつ単一のラマンスペクトルの解析によって個別に分離することができる色素を使用することによって有効に達成することができ、従って、単一表面領域の使用が好ましい。
【００４６】
本発明はまた、選択薬剤及び色素が、図示のような表面にではなく、コロイド粒子に結合される構成においても実施することができる。この構成において、較正色素は粒子に保持され、レポーター色素を含むレポーターは、検体が存在すると置換される。この置換は、同じコロイド粒子に対してでもよく、又は異なる粒子に対してでもよい。原則は、検体分子によって置換されるまでは、レポーター色素があらゆるコロイド金属表面から離れて保持されることである。
ＳＥＲＲＳのための金属表面の選択には、入射レーザと化学システムのカプリングのための適切な波長を有するプラズモンをサポートすることができる金属が必要である。実際には、金、銀、及び銅が可視波長レーザに、かつアルミニウムがＵＶレーザに好適である。他の金属もＳＥＲＲＳをサポートすることができるが、本明細書に示したものが好ましい実施形態である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ラマン散乱のエネルギ準位を示す図である。
【図２】「表面増強ラマン散乱」の原理を使用する検出器を示す説明図である。
【図３】選択薬剤によって表面に結合された較正色素及びレポーター色素の構成を示す図である。
【図４】本発明を具現化することができる検出器アセンブリを一緒に形成する第１の検体キャリア及び検出器を示す図である。
【図５】本発明を具現化することができる代替検体キャリアを示す図である。
【図６】本発明を具現化することができる更に別の代替検体キャリアを示す図である。
【符号の説明】
【００４８】
１１  基板
１３  チャンネル層
１６  導体層又は半導体層
【図１】
2009511891.tif 000003
【図２】
2009511891.tif 000004
【図３】
2009511891.tif 000005
【図４】
2009511891.tif 000006
【図５】
2009511891.tif 000007
【図６】
2009511891.tif 000008
【国際調査報告】
2009511891.tif 000009
2009511891.tif 000010
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