(57)【要約】  本発明は、ＡＢＬチロシンキナーゼのＡＴＰポケットに対して高い親和性を示す低分子量化合物、即ち１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール、を提供する。従って、これらの化合物は、特にＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対して、顕著な阻害効力を示す、ＡＴＰ競合チロシンキナーゼ阻害剤である。本発明の化合物は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性ＡＢＬ介在性疾患（イマチニブ耐性慢性骨髄性白血病など）の治療において有用な適用がある。さらに、本発明は、キナーゼタンパク質、特にＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬキナーゼのＡＴＰポケットに結合することができる化合物の同定のためのスクリーニング法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼポリペプチドを式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2009534307.tif 000014
（式中、Ｒは場合によっては置換されているアリール又はヘテロアリール基であり；
Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、互いに独立に、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキルを表すか、又はこれらが結合される炭素原子と一緒になっており、Ｒ１及びＲ２は、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基を形成し得；ただしＲ１及びＲ２の少なくとも１つが水素原子以外であり；
Ｒ３は、水素もしくはハロゲン原子又はヒドロキシ、シアノ、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル又はＣ１−Ｃ３アルコキシから選択される基である。）
の有効量と接触させることを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼ活性を阻害するための方法。
【請求項２】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼポリペプチドがＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤がイマチニブである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
治療を必要とする哺乳動物に請求項１で定義されるような式（Ｉ）による化合物又は医薬的に許容可能なその塩の有効量を投与することを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患を治療する方法。
【請求項５】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患がＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性白血病である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該疾患が、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性慢性骨髄性白血病である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤がイマチニブである、請求項４から請求項６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
2009534307.tif 000015
（式中、Ｒ４は、アゼチジン−１−イル、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、（１−メチル−ピペラジン−４−イル）、（モルホリノ−４−イル）、（アゼチジン−１−イル）メチル、（ピロリジン−１−イル）メチル、（ピペリジン−１−イル）メチル、（１−メチル−ピペラジン−４−イル）メチル、（モルホリノ−４−イル）メチル、（１−メチル−ピペリジン−４−イルオキシ）メチル、（イソプロピルアミノ）メチルから選択される基であり；Ｒ３は、水素又はフッ素もしくは塩素原子である。）
を用いて行われる、請求項１から請求項７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
該化合物が、
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−［（４−モルホリン−４−イルベンゾイル）アミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−［（４−モルホリン−４−イルベンゾイル）アミノ］−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−エチル−１−フェニルプロピル）−３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−Ｎ−（１−フェニルシクロペンチル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−エチル−１−フェニル−プロピル）−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−フェニル−シクロペンチル）−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−クロロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−アゼチジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−アゼチジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ジメチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロプロピルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロブチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−｛４−［（イソプロピル−メチル−アミノ）−メチル］−ベンゾイルアミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロペンチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−｛４−［（ジイソプロピルアミノ）−メチル］−ベンゾイルアミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−メチル−１−（２−フルオロ−フェニル）−エチル］−アミド；
３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−メチル−１−（２−フルオロ−フェニル）−エチル］−アミド；
３−（４−シクロプロピルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−ベンゾイルアミノ−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−アゼパン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−アゼパン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドからなる群から選択される、請求項１から請求項７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該化合物が、
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
該化合物が３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
キナーゼタンパク質と、該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対する親和性を有し該ＡＴＰポケットに結合した際に蛍光シグナルを生じることができるインドリノン誘導体と、試験化合物の連続希釈液と、を含む反応混合物を与え、試験化合物非存在下で生じた蛍光シグナルを試験化合物の様々な濃度の存在下で生じた蛍光シグナルと比較する段階を含み、それによる蛍光の低下レベルが試験化合物のインドリノン誘導体置換能を示す、該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに結合できる化合物の同定のためのスクリーニング法。
【請求項１３】
該キナーゼタンパク質及び該インドリノン誘導体が前もって混合される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該キナーゼタンパク質及び該試験化合物が前もって混合される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該キナーゼタンパク質がＡＢＬキナーゼである、請求項１２から請求項１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該ＡＢＬキナーゼがＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬキナーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該インドリノンが式（ＩＩＩ）の化合物
【化３】
2009534307.tif 000016
（式中、Ｒ１は、水素又はメチルアミノ−スルホニルもしくはベンジル−スルホニルであり、Ｒ２は水素又はメチルであり、Ｒ３はメチル又は４−クロロフェニルもしくは２，４−ジフルオロフェニルである。）である、請求項１２から請求項１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該インドリノンが：
２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−［（Ｚ）−（４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１又は請求項４で定義されるような式（Ｉ）の化合物又は医薬的に許容可能なその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ−競合性小分子キナーゼ阻害剤の使用を介した、突然変異ＡＢＬ介在性疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、骨髄細胞系列の悪性の増殖を特徴とする、成人白血病の約１５％を構成する血液疾患である。ＣＭＬの遺伝学的特徴は、染色体の９番と２２番との間の相互転座であり、その結果としてフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体と呼ばれるものが生じる。この染色体間交換の結果として、分子的には、チロシンキナーゼドメインが構成的に活性化されているチロシンキナーゼポリペプチドをコードするキメラ遺伝子ＢＣＲ−ＡＢＬが生じる。この融合タンパク質の発現は、ＣＭＬ細胞の転換形質に必要十分であることが分かっている（ＦＡＤＥＲＬ、Ｓら、Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９９、３４１巻、第３号、１６４−１７２頁。ＳＡＷＹＥＲＳ、Ｃ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９９、３４０巻、第１７号、１３３０−１３４０頁）。ＣＭＬに加えて、Ｐｈ染色体転座による無秩序なＡＢＬキナーゼ活性もまた成人リンパ芽性白血病（ＡＬＬ）患者の２０％以下で検出される（ＯＴＴＭＡＮＮ、Ｏ．Ｇ．ら、Ａ  ｐｈａｓｅ  ２  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｂｌｏｏｄ、２００２、１００巻、第６号、１９６５−１９７１頁。）。
【０００３】
ＡＢＬは、細胞骨格構造を制御するために細胞表面増殖因子及び接着受容体からシグナルを変換する。多くのシグナリングタンパク質が、一連のシグナリング経路を活性化するＡＢＬと相互作用することが示されている。従って、ＡＢＬの阻害は、ＣＭＬの患者に対する治療を改善するための新しいアプローチとなる。
【０００４】
ＣＭＬの発病機序にＢＣＲ−ＡＢＬが必要であるということ及びＡＢＬのチロシンキナーゼ活性がＢＣＲ−ＡＢＬ介在性形質転換に必須であるという発見によって、ＡＢＬキナーゼは治療的介入のための魅力的な標的となった。イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（Ｒ）、ＳＴＩ５７１、ＥＰ５６４４０９Ａとしても知られている。）は、そのチロシンキナーゼ活性を強く阻害するＢＣＲ−ＡＢＬのＡＴＰ競合阻害剤である。イマチニブの高い選択性及び効率は、酵素の触媒不活性立体構造においてＢＣＲ−ＡＢＬに結合し阻害するその能力によるものである。前臨床及び臨床試験から、現在、全ての新規に診断されたＣＭＬ患者に対する第一選択薬であるイマチニブの顕著な効率及び高い忍容性が示された（ＤＥＩＮＩＮＧＥＲ、Ｍ．ら、Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍａｔｉｎｉｂ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２００５、１０５巻、第７号、２６４０−２６５３頁。）。しかし、イマチニブは疾患の初期には非常に有効である一方で、ＣＭＬの加速期及び芽球期の患者ならびにＰｈ＋ＡＬＬの患者はイマチニブ耐性となることが多い（ＤＲＵＫＥＲ、Ｂ．Ｊ．ら、Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌａｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１、３４４巻、第１４号、１０３８−１０４２頁。ＳＡＷＹＥＲＳ、Ｃ．Ｌ．ら、Ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｂｌａｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００２、９９巻、第１０号、３５３０−３５３９頁）。イマチニブ耐性の主要な機構は、ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシンキナーゼ触媒ドメイン内で点突然変異が起こり、阻害剤との相互作用を直接妨害するか又は減弱させる、クローンの進化である。これらの殆どが、イマチニブ結合に必要とされる閉じた不活性立体構造をＡＢＬキナーゼドメインがとることを妨害する構造変化を誘導する一方（ＳＨＡＨ、Ｎ．Ｐ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＳＴＩ５７１  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３、２２巻、第４７号、７３８９−７３９５頁）、ある種の突然変異、例えばスレオニン３１５からイソロイシンへの置換（本明細書中で以後Ｔ３１５Ｉと呼ぶ。）などは、ＡＴＰ結合ポケットでのイマチニブ相互作用を直接妨害する。
【０００５】
イマチニブ耐性の分子的基礎の理解によって、臨床で観察されるイマチニブ耐性ＡＢＬ介在性疾患に対して有効な新規のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤に対する探索が促進された。ＢＣＲ−ＡＢＬの多くの第二世代ＡＴＰ競合阻害剤、例えばＡＭＮ１０７（ＷＥＩＳＢＥＲＧ、Ｅ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＭＮ  １０７、ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００５、７巻、１２９−１４１頁）及びＢＭＳ−３５４８２５（デザチニブとしても知られる。）（ＳＨＡＨ、Ｎ．Ｐ．ら、Ｏｖｅｒｒｉｄｉｎｇ  Ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４、３０５巻、第５６８２号、３９９−４０１頁）など、が開発され、現在、早期臨床試験で評価中である。これらの化合物はイマチニブ耐性ＡＢＬ突然変異体の大部分に対して活性であるが、イマチニブ耐性の患者で２番目に多い突然変異であるＴ３１５Ｉ突然変異体に対して活性であるものはない（Ｏ’ＨＡＲＥ、Ｔ．ら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ＡＭＮ  １０７  ａｎｄ  ＢＭＳ−３５４８２５  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｉｍａｔｉｎｉｂ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５、６５巻、第１１号、４５００−４５０５頁）。ＡＴＰ−競合化合物でＴ３１５ＩＡＢＬ突然変異体を抑制するのは特に困難であると結論することができる。実際に、ごく最近まで、Ｔ３１５Ｉ突然変異体に対しても活性であると報告されていた阻害剤は唯一ＯＮ１２３８０のみであり、これは実際は基質競合性（即ち非ＡＴＰ競合）阻害剤である（ＧＵＭＩＲＥＤＤＹ、Ｋ．ら、Ａ  ｎｏｎ−ＡＴＰ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｏｖｅｒｒｉｄｅｓ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５、１０２巻、第６号、１９９２−１９９７頁）。
【０００６】
最近、２種類のＡＴＰ競合分子、ＶＸ−６８０（ＨＡＲＲＩＮＧＴＯＮ、Ｅ．Ａ．ら、ＶＸ−６８０、ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅｓ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００４、１０巻、第３号、２６２−２６７頁）及びＢＩＲＢ−７９６（ＰＡＲＧＥＬＬＩＳ、Ｃら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００２、９巻、第４号、２６８−２７２頁）が、低いナノモルＫｄでＡＢＬのＴ３１５Ｉ突然変異チロシンキナーゼドメインにインビトロで結合できることが報告されたが、細胞でのＴ３１５Ｉ  ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害に対する有効性が低いことが示された（ＣＡＲＴＥＲ、Ｔ．Ａ．ら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ＡＢＬ，ＫＩＴ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５、１０２巻、第３１号、１１０１１−１１０１６頁）。
【０００７】
現在、イマチニブ耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患に罹患している患者（この疾患は、イマチニブ治療後に再発する全患者の２０％を構成すると推定される。）に対する、キナーゼを標的とする有効な治療はなく、上述の次世代阻害剤での治療のために選択されることが期待される。これは、ＢＣＲ−ＡＢＬのＴ３１５Ｉ突然変異体の新規の強力なＡＴＰ競合阻害剤に対する満たされていない医学的ニーズに見合うものである。本発明はこの問題に取り組む。
【発明の開示】
【０００８】
（発明が解決しようとする課題）
（課題を解決するための手段）
本発明は、ＡＢＬチロシンキナーゼのＡＴＰポケットに対して高い親和性を示す低分子量化合物を提供する。従って、これらの化合物は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体、特にイマチニブ耐性Ｔ３１５ＩＡＢＬ突然変異体に対して顕著な阻害能を示すＡＴＰ競合チロシンキナーゼ阻害剤である。チロシンキナーゼ活性の阻害の結果、ＡＢＬ及びＴ３１５Ｉ突然変異体が介在するシグナリングカスケードが遮断される。
【０００９】
所望の活性を示す本発明の化合物は、タンパク質キナーゼのＡＴＰポケットを標的とするように設計された１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾールである。この化学物質群の化合物は、Ａｕｒｏｒａキナーゼの強力なＡＴＰ競合阻害剤であることが明らかになっている（ＰＣＴ／ＷＯ２００５０７４９２２）。思いがけず、同じ化学骨格を持つ化合物が、ＡＢＬに対して顕著な阻害能を示し、特に、それらがインビトロでＡＢＬのＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ突然変異体型も阻害できることが分かった。
【００１０】
これらの生物学的活性の観点において、本発明の化合物は、ＡＢＬ介在性疾患に罹患しているイマチニブ耐性患者集団に対する治療の開発のための新しい経路を与える。
【００１１】
本発明はまた、標的タンパク質キナーゼ、特にＡＢＬチロシンキナーゼのＡＴＰポケットに結合するさらなる化合物の同定のためのアッセイも提供する。このアッセイは、標的ＡＴＰポケットへの結合の結果を検出する能力に依存し、ＡＴＰポケットへの化合物の結合親和性を調べることができるように、定量的条件で行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
第一の態様において、本発明は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼポリペプチドを式（Ｉ）の化合物：
【００１３】
【化４】
2009534307.tif 000002
（式中、Ｒは場合によっては置換されているアリール又はヘテロアリール基であり；Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、互いに独立に、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキルを表すか、又はこれらが結合される炭素原子と一緒になっており、Ｒ１及びＲ２は、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基を形成し得；ただしＲ１及びＲ２の少なくとも１つが水素原子以外であり；
Ｒ３は、水素もしくはハロゲン原子又はヒドロキシ、シアノ、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキルもしくはＣ１−Ｃ３アルコキシから選択される基である。）の有効量と接触させることを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼ活性を阻害するための方法に関する。
【００１４】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、不斉炭素原子を有し、従って、個々の光学異性体として、ラセミ混合物として又は２種類の光学異性体の一方を主に含む何らかのその他の混合物として存在し得るが、これらは全て本発明の範囲内であるものとする。
【００１５】
化合物が互変異性型で存在し得る場合、各型は、等しく存在するにせよ又はある１つの型が主に存在するにせよ、本発明内に含まれるものとする。
【００１６】
このように、別段の断りがない限り、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の次の互変異性型のただ１つが示される場合、残りのものも本発明の範囲内に含まれるものとする：
【００１７】
【化５】
2009534307.tif 000003
【００１８】
本記述において、別段の断りがない限り、アリール基という用語について、発明者らは、単結合を介して互いに融合しているか又は連結されているかの何れかの、１又は２個の環部分のあらゆる芳香族炭素環系を意図し、例えば、フェニル、ａ−もしくはｂ−ナフチル又はビフェニル基が含まれる。
【００１９】
ヘテロアリールという用語について、発明者らは、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される１から３個のヘテロ原子を有する、場合によってはベンゾ縮合した５又は６員複素環を含み得る何れかの芳香族複素環を意図する。
【００２０】
従って、本発明によるヘテロアリール基の非限定例には、例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、フェニル−ピロリル、フリル、フェニル−フリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、チエニル、ベンゾチエニル、イソインドリニル、ベンゾイミダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、１，２，３−トリアゾリル、１−フェニル−１，２，３−トリアゾリルなどが含まれ得る。
【００２１】
直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル又はＣ１−Ｃ３アルコキシに関して、発明者らは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ及びイソプロポキシなどの基の何れかを意図する。
【００２２】
ハロゲン原子という用語について、発明者らは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意図する。
【００２３】
Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルという用語について、発明者らは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルなどの何れかの基を意図する。
【００２４】
明らかに、これらの同じシクロアルキル基が形成され得る場合と同様に、Ｒ１及びＲ２がそれらが結合する炭素原子と一緒になっている場合、環状スピロ化合物が得られ得る。
【００２５】
明らかに、これらの同じシクロアルキル基が形成され得る場合と同様に、Ｒ１及びＲ２がそれらが結合する炭素原子と一緒になっている場合、環状スピロ化合物が得られ得る。単なる例として、Ｒ１及びＲ２が一緒になってシクロペンチル基を形成する場合、次の一般式を有する誘導体がこれにより考えられる：
【００２６】
【化６】
2009534307.tif 000004
【００２７】
Ｒ１又はＲ２が基−ＣＨ２ＮＲ’Ｒ’’を表し、Ｒ’及びＲ’’がそれらが結合する窒素原子と一緒に連結されている式（Ｉ）の誘導体を考慮するとき、それ故に、複素環部分が一般式のように形成され得る。単なる例として、Ｒ１が水素でありＲ２が基−ＣＨ２ＮＲ’Ｒ’’（ピロリジニル−１−イル基を形成するようにＲ’及びＲ’’は一緒に連結される。）であるとみなすことによって、次の一般式を有する化合物がこれにより考えられる：
【００２８】
【化７】
2009534307.tif 000005
【００２９】
上述の全てから、本発明の式（Ｉ）の化合物が、本明細書中で以後、簡単にベンジルアミノ部分と呼ぶ部分（水素とは異なる、基Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つによって、メチレン基が必ず置換されている。）の存在を特徴とすることは、当業者にとって明らかである。
【００３０】
Ｒに対して与えられる意味に従い、上記のアリール又はヘテロアリール基の何れも、ハロゲン、ニトロ、オキソ基（＝Ｏ）、カルボキシ、シアノ、アルキル、ポリフッ素化アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル；アリール、複素環、アルキル−複素環、複素環−アルキル、アミノ基及びその誘導体、例えば、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ウレイド、アルキルウレイド又はアリールウレイドなど；カルボニルアミノ基及びその誘導体、例えば、ホルミルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノなど；ヒドロキシ基及びその誘導体、例えば、アルコキシ、ポリフッ素化アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、シクロアルケニルオキシ又はアルキリデンアミノキシなど；カルボニル基及びその誘導体、例えば、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニルなど；硫化誘導体、例えば、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニルオキシ、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル又はジアルキルアミノスルホニルなどから選択される、例えば１から６個の基など、１以上の基によってそれらの自由位置の何れかにおいて場合によってはさらに置換され得る。
【００３１】
これらの点において、適切な場合は、上述の置換基のそれぞれが、上述の基の１以上によりさらに置換され得る。
【００３２】
アルキル又はアルコキシ基という用語について、発明者らは、別段の断りがない限り、何れかの直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシ基、故に上述のＣ１−Ｃ３アルキル又はアルコキシ基の全体を意図し、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシなども含まれる。
【００３３】
アルケニル又はアルキニル基という用語について、発明者らは、別段の断りがない限り、何れかの不飽和直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２−Ｃ６アルケニル又はアルキニル基、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−、２−又は３−ブテニル、ペンテニル、へキセニル、エチニル、１−又は２−プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを意図する。
【００３４】
ポリフッ素化アルキル又はアルコキシという用語について、発明者らは、複数の水素原子がフッ素原子で置換される、上記で定義されるような何れかの直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシ基を意図する（ここでは、例えば、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエトキシ、１，２−ジフルオロエチル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロピル−２−イルなど、複数の水素原子がフッ素原子により置換されている。）。
【００３５】
複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅ）、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）又は複素環基（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｇｒｏｕｐ）という用語について、発明者らは、また、場合によってはベンゾ縮合した４から７員複素環も意図し、故に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１から３個のヘテロ原子を有する、飽和又は部分的に不飽和の何れかのヘテロアリール基として知られる芳香族複素環基が包含される。
【００３６】
これらの４又は７員複素環基の例は、例えば、１，３−ジオキソラン、ピラン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、テトラヒドロフラン、ヘキサメチレンイミン、１，４−ヘキサヒドロジアゼピン、アゼチジンなどである。
【００３７】
シクロアルケニルという用語について、発明者らは、二重結合をさらに含む上述のＣ３−Ｃ６シクロアルキル基の何れか、例えば、２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、１−シクロへキセン−１−イル、２−シクロへキセン−１−イル、３−シクロへキセン−１−イルなど、を意図する。
【００３８】
上述の全てから、例えば、シクロアルキルアルキル、アリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルチオ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルキルカルボニルオキシなどの複合名称として名称が識別される何れの基も、それらが由来する部分から慣習的に解釈されるとおりであると解釈すべきであることは、当業者にとって明らかである。今までのところ、例として、アルコキシ−複素環−アルキルという用語は、アルコキシによりさらに置換されている複素環によって置換されている直鎖又は分枝鎖アルキル基を意味する（アルキル、複素環及びアルコキシは上述で定義されるようなものである。）。同様に、アルキル−ヘテロシクリルオキシという用語は、アルキルによりさらに置換されているヘテロシクリルオキシ基を意味する。
【００３９】
国際特許出願ＷＯ２００５／０７４９２２において式（Ｉ）の化合物が記載され、請求されているが、そこで開示されるプロセスに従いこれを調製することができる。
【００４０】
本発明の方法をインビトロ又はインビボで行い得る。全長チロシンキナーゼポリペプチドを使用することができ；あるいは、又はその断片、一部又は類似体を使用することができる。
【００４１】
とりわけ、ゲル−キナーゼアッセイを通じて、本発明の選択された化合物の阻害活性を調べる。このアッセイは、試験化合物存在下での、ＡＢＬキナーゼによる放射性標識リン酸部分の基質への移動からなる。反応が終わったら、反応混合物をポリアクリルアミドゲルに添加し、放射性シグナルを検出する。この阻害アッセイは実施例セクションでさらに詳しく説明する。
【００４２】
さらに、本発明の選択された化合物の阻害活性を細胞系で調べる。適切な細胞は、ＢＣＲ−ＡＢＬ染色体転座が天然に生じているもの（例えばヒト白血病細胞Ｋ−５６２など）及びＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異遺伝子を担う組み換えコンストラクトで遺伝子移入された細胞である。本発明の化合物で細胞を処理し、実施例セクションでさらに詳しく説明するような免疫ブロッティングによって阻害活性を検出する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼポリペプチドは、ＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体である。
【００４４】
本発明のより好ましい実施形態において、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤はイマチニブである。
【００４５】
第二の態様において、本発明は、治療を必要とする哺乳動物に上記で定義されるような式（Ｉ）による化合物の有効量を投与することを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患を治療する方法に関する。
【００４６】
本発明で主張される治療の方法の範囲内で、これは、全ての可能な異性体及びその混合物の使用ならびに式（Ｉ）の化合物の代謝産物及び医薬的に許容可能な生体前駆体（プロドラッグとも呼ばれる。）の両方の使用である。プロドラッグは、何らかの共有結合化合物であり、インビボで、式（Ｉ）による活性のある親薬物を放出する。
【００４７】
本発明の２つの上記の方法は、好ましくは、式（ＩＩ）の化合物を用いて行う：
【００４８】
【化８】
2009534307.tif 000006
（式中、Ｒ４は、アゼチジン−１−イル、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、（１−メチル−ピペラジン−４−イル）、（モルホリノ−４−イル）、（アゼチジン−１−イル）メチル、（ピロリジン−１−イル）メチル、（ピペリジン−１−イル）メチル、（１−メチル−ピペラジン−４−イル）メチル、（モルホリノ−４−イル）メチル、（１−メチル−ピペリジン−４−イルオキシ）メチル、（イソプロピルアミノ）メチルから選択される基であり；Ｒ３は水素又はフッ素又は塩素原子である。）。
【００４９】
より好ましくは、本発明の方法において使用されるべき化合物は、
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−［（４−モルホリン−４−イルベンゾイル）アミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−［（４−モルホリン−４−イルベンゾイル）アミノ］−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−エチル−１−フェニルプロピル）−３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−Ｎ−（１−フェニルシクロペンチル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−エチル−１−フェニル−プロピル）−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−フェニル−シクロペンチル）−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−クロロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−アゼチジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−アゼチジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ジメチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロプロピルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロブチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−｛４−［（イソプロピル−メチル−アミノ）−メチル］−ベンゾイルアミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロペンチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−｛４−［（ジイソプロピルアミノ）−メチル］−ベンゾイルアミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−メチル−１−（２−フルオロ−フェニル）−エチル］−アミド；
３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−メチル−１−（２−フルオロ−フェニル）−エチル］−アミド；
３−（４−シクロプロピルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−ベンゾイルアミノ−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−アゼパン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−アゼパン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドからなる群から選択される。
【００５０】
本発明の方法において使用されるべき化合物の最も好ましい一部分は、
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドからなるものである。
【００５１】
本発明の２つの上記の方法において使用されるべき最も好ましい化合物は、３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド（本明細書中で以後、「化合物１」と呼ぶ。）である。
【００５２】
式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容可能な塩には、例えば、硝酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸及びサリチル酸など、無機酸又は有機酸との酸付加塩が含まれる。
【００５３】
「Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患」という用語は、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬチロシンキナーゼの活性を直接又は間接的に阻害することが望ましい疾患を包含するものとする。
【００５４】
「ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤」という用語は、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の酵素活性を阻害する能力を有するＡＴＰ競合分子を包含するものとする。このような分子の非限定例はイマチニブ、デザチニブ及びＡＭＮ１０７である。
【００５５】
上述の方法の好ましい実施形態において、疾患は、ＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体により起こるＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性白血病である。より好ましい実施形態において、白血病は慢性骨髄性白血病である。
【００５６】
上述の方法の別の好ましい実施形態において、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤はイマチニブである。
【００５７】
前記化合物での治療により恩恵を受ける疾患又は望ましくない状態を有するとして対象を決定した時点で対象に式（Ｉ）による化合物を投与し得る。医療従事者は、対象における疾患又は状態の診断の一部として、この決定を行い得る。また、このような状態の予防（対象が状態の１以上を有する可能性を低下させるものとみなされ得る。）においても本化合物を使用し得る。
【００５８】
Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体の活性の１以上を阻害する式（Ｉ）の化合物に細胞を接触させることにより、本発明の方法を行うことができる。インビトロ（例えば、本化合物とともに細胞を培養することによる。）又はインビボ（例えば対象に本化合物を投与することによる。）でこの方法を行うことができる。また、細胞を対象から得てインビトロで処置した後にその細胞を対照に戻す場合のように、これをエクスビボでも行い得る。
【００５９】
インビボで、適切な動物モデルにおいて、治療組成物を阻害する標的タンパク質の影響を評価することができる。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、化合物の有効量とは、その意図する目的を達成するのに十分な量を指す。有効量の決定は、所望の効果の達成に基づき、十分に当業者の能力の範囲内である。有効量は、以下に限定されないが、対象の大きさ及び／又は対象が罹患している疾患もしくは望ましくない状態の進行度を含む因子に依存する。有効量はまた、化合物が対象に単回投与で投与されるか又は定期的に長期にわたり投与されるかにも依存する。
【００６１】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、対象の治療を目的とする。本明細書中で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、以下に限定されないが、哺乳動物の種類のあらゆるもの：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジーなど及びその他の類人猿及びサル種；家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど；愛玩動物、例えばウサギ、イヌ及びネコなど；げっ歯類（ラット、マウス及びモルモットなど）を含む実験動物などが含まれる。非哺乳動物の例には、以下に限定されないが、鳥類、魚類などが含まれる。
【００６２】
「処置する」という用語は、本明細書中で使用する場合、治療効果を達成することを含む。治療効果は、処置される基礎疾患の排除又は改善を意味する。例えば、癌患者において、治療効果には、基礎的な癌の排除又は改善が含まれる。また、患者が基礎疾患に依然として罹患しているとしても、患者において改善が観察されるように、基礎疾患と関連する生理的症状の１以上の排除又は改善によっても、治療効果が達成される。
【００６３】
本発明の方法は、単剤としての、又は本明細書中で開示されるような疾患もしくは望ましくない状態の治療に適切な１以上のその他の分子もしくはその他の薬剤と組み合わせた、式（Ｉ）の化合物の投与を含む。併用療法に適切である典型的な分子及び薬剤は、細胞増殖抑制剤又は細胞毒性剤、抗生物質型の薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、免疫薬、インターフェロン型薬剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばＣＯＸ−２阻害剤）、マトリクスメタロプロテアーゼ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖因子受容体剤、抗ＨＥＲ剤、抗ＥＧＦＲ剤、抗血管形成剤（例えば血管形成阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害剤、細胞周期阻害剤、その他のｃｄｋｓ阻害剤、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などである。
【００６４】
本発明はまた、医薬的に許容可能な賦形剤（担体又は希釈剤であり得る。）とともに式（Ｉ）の化合物又は医薬的に許容可能なその塩を含む医薬組成物も含む。
【００６５】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、通常、次の従来の方法により調製され、適切な医薬形態で投与される。
【００６６】
例えば、固形の経口剤型は、活性化合物とともに、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、スクロース、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモデンプン；潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム及び／又はポリエチレングリコール；結合剤、例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウム；泡立ち混合物（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ）；染料；甘味料；湿潤剤、例えば、レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸など；及び、一般に、医薬製剤中で使用される無毒性及び医薬的に不活性の物質を含有し得る。既知の方式で、例えば、混合、造粒、錠剤化、糖衣処理又はフィルム被覆プロセスによって、これらの医薬品を製造し得る。
【００６７】
経口投与のための分散液は、例えば、シロップ、乳剤又は懸濁液であり得る。
【００６８】
例として、シロップは、担体として、サッカロース又はうサッカロースとグリセリン及び／又はマンニトール及びソルビトールを含有し得る。
【００６９】
懸濁液及び乳剤は、担体の例として、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを含有し得る。
【００７０】
筋肉内注射用の懸濁液又は溶液は、活性化合物とともに、医薬的に許容可能な担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、エチルオレエート、グリコール（例えばプロピレングリコール）及び、必要に応じて、塩酸リドカインの適量を含有し得る。
【００７１】
静脈注射又は点滴用の溶液は、担体として、滅菌水を含有し得るか、又は好ましくは、これらは滅菌、水性、等張性の塩溶液の形態であり得るか、又はこれらは、担体としてプロピレングリコールを含有し得る。１から６週の周期の週ごとの治療計画の後、約１時間から約１０時間の時間間隔で静脈内点滴を行い得る。
【００７２】
坐薬は、活性化合物とともに、医薬的に許容可能な担体、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル界面活性剤又はレシチンを含有し得る。
【００７３】
本発明での使用に適切な医薬組成物には、活性成分が有効量で、即ち治療される状態において治療及び／又は予防効果を達成するのに有効な量で存在する組成物が含まれる。特定の適用に有効な実際の量は、治療される状態、対象の状態、製剤及び投与経路、ならびに当業者にとって公知のその他の因子に依存する。本発明の化合物の有効量の決定は、本明細書中の開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内であり、通常の最適化技術を用いて決定される。
【００７４】
治療の用途において、１日あたりの約３０ｍｇ／ｍ２（体表面）から約３０００ｍｇ／ｍ２の投与量レベルで本発明の化合物を対象に投与する。約１００ｍｇ／ｍ２から１０００ｍｇ／ｍ２の投与量レベルは、特に適切な範囲である。成人ヒト対象の場合、非限定例として、１日１回から５回、投与あたり約５０ｍｇから約５０００ｍｇの投与量、より好ましくは投与あたり約１５０ｍｇから約１０００ｍｇの投与量を使用し得る。必要に応じて、本明細書中で開示されるものよりも低いか又は高い用量を使用し得る。しかし、このような投与量は、可変要素の数（以下に限定されないが、使用する化合物の活性、治療すべき状態、投与方式、個々の対象の必要条件、治療する状態の重症度及び医師の判断）に依存して、変更され得る。個々の治療計画に関する可変要素の数が大きく、これらの推奨値からの大きな逸脱はまれなものではないので、前述の範囲は単なる例である。
【００７５】
ヒトでの使用のための有効量は、動物モデルから決定することができる。例えば、動物において有効であることが分かっている、循環、肝臓、局所及び／又は胃腸濃度を達成するために、ヒトに対する用量を処方することができる。
【００７６】
第三の態様において、本発明は、
−キナーゼタンパク質と、
−このキナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対する親和性を有し、このＡＴＰポケットに結合した際に蛍光シグナルを生じることができるインドリノン誘導体と、
−試験化合物の連続希釈液と、
を含む反応混合物を与え、試験化合物非存在下で生じた蛍光シグナルを試験化合物の様々な濃度の存在下で生じた蛍光シグナルと比較する段階を含み、それによる蛍光の低下レベルが試験化合物のインドリノン誘導体置換能を示す、キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに結合することができる化合物の同定のためのスクリーニング法に関する。
【００７７】
スクリーニング法の好ましい実施形態において、キナーゼタンパク質及びインドリノン誘導体を前もって混合する。
【００７８】
スクリーニング法の別の好ましい実施形態において、キナーゼタンパク質及び試験化合物を前もって混合する。
【００７９】
スクリーニング法のさらなる好ましい実施形態において、キナーゼタンパク質は、ＡＢＬキナーゼである。より好ましい実施形態において、ＡＢＬキナーゼは、Ｔ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬキナーゼである。
【００８０】
「キナーゼタンパク質」という用語は、全長ネイティブタンパク質ならびに、その断片がキナーゼタンパク質のＡＴＰポケットを含む限り、その断片を包含する。
【００８１】
「ＡＴＰポケット」という用語は、キナーゼタンパク質内のＡＴＰ結合部位を示す。
【００８２】
インドリノン誘導体は、好ましくは下記の式（ＩＩＩ）の化合物である：
【００８３】
【化９】
2009534307.tif 000007
（式中、Ｒ１は、水素又はメチルアミノ−スルホニル又はベンジル−スルホニルであり、Ｒ２は水素又はメチルであり、Ｒ３はメチル又は４−クロロフェニル又は２，４−ジフルオロフェニルである。）。
【００８４】
より好ましくは、インドリノン誘導体は、２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド（これは国際特許出願ＷＯ０２／０９６３６１で開示されている。）；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−［（Ｚ）−（４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドからなる群から選択される化合物である。
【００８５】
キナーゼタンパク質へのプローブの親和性に対して、アッセイのロバスト性に対して、及び既知のＡＢＬ阻害剤（例えばイマチニブ）における公開データに従って、ＡＢＬの野生型及び突然変異型両方のＡＴＰ−ポケット結合能についてインドリノン誘導体を選択した。
【００８６】
例えば、Ｆｕｓｉｏｎ  α−ＦＰ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）などのプレートリーダーによって、蛍光シグナルを測定することができる。試験化合物の置換能は、キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対する化合物親和性と直接相関する。実施例セクションで説明するように、試験化合物の親和結合定数（ＫＤ）を求めることができる。
【００８７】
本発明のアッセイは、キナーゼタンパク質へのインドリノン誘導体の結合の際に蛍光強度の顕著な上昇が観察されるという新規の知見に基づく。今までのところ、この基は、蛍光シグナルに対して与えられる標的部分に結合できる親和性プローブへ化学的に連結されいた。しかし、このような方法には、キナーゼポケットへの低親和性に関連する欠点があり、これによって高感度アッセイ設定の可能性が妨げられる。使用されてきた代替的アプローチは、典型的な固相アッセイの制限がある（例えば立体障害及び洗浄の必要）、固定化プローブリガンド又はキナーゼタンパク質に依存する。
【００８８】
本発明は、インドリノンが標的キナーゼに対して比較的高い親和性を示し、結合時に生じるシグナルが結合に直接依存し、これにより均一なアッセイが行えるので、これらの欠点を克服する。
【００８９】
本スクリーニングアッセイは本明細書によりＡＢＬキナーゼを用いて例示されるが、キナーゼタンパク質がＡＴＰポケットを含有するならば、当業者は必要以上の実験をせずに、その他のキナーゼタンパク質でもそれを行うことができよう。実際、本発明者らは、インスリン様増殖因子（非リン酸化及び三リン酸化）インスリン受容体（非リン酸化及び三リン酸化）、ｃ−Ｍｅｔ、Ａｌｋ、Ｃｈｋ１及びＰＤＫ１を用いてアッセイを行う場合、蛍光シグナルの変化を検出することができた。従って、本発明のアッセイにおいてさらなるタンパク質キナーゼを適切に使用できることが予想される。
【００９０】
最終的に、本発明は、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患を治療するための医薬品の製造における、上記で定義されるような式（Ｉ）の化合物又は医薬的に許容可能なその塩の使用に関する。
【００９１】
本発明をより詳しく説明する目的で、いかなる制限もそれに与えることなく、ここで次の実施例を与える。
【００９２】
実施例
次の実施例において、アミノ酸残基の数は、ＡＢＬタンパク質のアイソフォーム１ａに対するＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＢ６０３９４を参照する。
【実施例１】
【００９３】
組み換えＡｂＩキナーゼドメインの、クローニング、発現及び精製
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリからＡＢＬキナーゼドメイン（残基２２９−５１２に対応）をＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＧ−３’［配列番号１］及びリバースオリゴヌクレオチド５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＣ−３'［配列番号２］を用いて増幅を行った。
【００９４】
クローニング目的のために、オリゴヌクレオチドには、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたクローニングに適切なａｔｔＢ−隣接ＰＣＲ産物を得るために、ａｔｔＢ部位が含まれた。さらに、精製目的のために、フォワードプライマーには、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（Ｒ）切断部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれた。Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）修飾されたバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、得られたＰＣＲ産物をクローニングした。発現及び精製目的のために、ＡＢＬキナーゼドメインのＮ−末端にＧＳＴタグを付加した。Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）マニュアルに記載されたプロトコルに従い、クローニングを行った。
【００９５】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた部位特異的突然変異誘発により、イマチニブ耐性Ｔ３１５ＩＡＢＬ突然変異体を作製した。突然変異誘発反応で使用したオリゴヌクレオチドは、５'−ＣＣＣＣＧＴＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧ−３'［配列番号３］であった。
【００９６】
ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（Ｒ）遺伝子移入キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、Ｓｆ９昆虫細胞に発現ベクター及びウイルスＤＮＡを同時遺伝子移入することによって、バキュロウイルスを作製した。５日後にウイルスの上清を回収し、ウイルスタイターを向上させるために増幅を３回行った。１０億個の細胞あたり３ｍＬのウイルス上清を用いて、１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの密度でＨｉｇｈ５昆虫細胞に感染させることにより、組み換えタンパク質を作製した。感染から４８時間後、細胞を回収し、ペレットにして−８０℃で凍結した。組み換えタンパク質の精製のために、ペレットを凍結融解し、細胞溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＣＨＡＰＳ  ０．２％、ＤＴＴ  ２０ｍＭ、グリセロール１０％）中で再懸濁し、超音波処理により細胞溶解した。２００００ｇでの３０分間の遠心により細胞溶解液を透明化し、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ｒ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに添加した。徹底的に洗浄した後、組み換えタンパク質を切断し、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（Ｒ）プロテアーゼとともに温置することにより溶出させた。
【実施例２】
【００９７】
キナーゼアッセイ：
組み換え野生型及びＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬキナーゼドメインによるミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を測定するゲルキナーゼアッセイにおいて、化合物の活性を評価した。組み換え酵素の１５ｎＭ、基質としてミエリン塩基性タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０μＭ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５ｎＭ  Ｎａ３ＶＯ４、４％ＤＭＳＯ、３ｎＭ  ＡＴＰ、γＰ３２−ＡＴＰ  ０．１μキュリーを含有する反応混合液２０μＬ中でキナーゼアッセイを行った。上記で定義されるような化合物１及び化合物２を試験し、参照として平行してイマチニブも試験した。阻害剤濃度は１０ｎＭから１０μＭの範囲であった。室温にて１５分間、阻害剤とともに酵素及び基質を前もって温置した後、ＡＴＰを添加し、３０℃にて３０分間反応を行い、ゲルローディング緩衝液の添加により停止させ、５分間沸騰させた。次に、反応混合液を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。分離後、ゲルを乾燥させ、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて放射性シグナルを明らかにした。
【００９８】
予想されるように、イマチニブは、野生型ＡＢＬキナーゼドメインのキナーゼ活性のみを阻害することができる一方、Ｔ３１５Ｉ突然変異体においては完全に不活性であった。一方、試験した２種類の化合物は、同じ効力で、野生型及びＴ３１５Ｉ突然変異体の両方において活性であった。
【実施例３】
【００９９】
ＡＴＰ部位依存的置換アッセイの設定及び確認
試験した化合物の定量的親和性評価に対し、ＡＴＰ部位依存的置換アッセイを設定した。
【０１００】
このアッセイは、キナーゼタンパク質に対するインドリノンの結合の際に観察される蛍光強度の顕著な上昇を活用する。ここで、発明者らは、ＡＢＬへの結合の際の蛍光上昇の大きさに基づき潜在的なプローブとして選択された２種類の異なるインドリノンを用いて得られた結果を下記で示す。
【０１０１】
３．１  インドリノンプローブ  ２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド
インドリノン  ２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミドを、滴定実験において野生型ＡＢＬキナーゼドメイン及びＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体への結合能について評価した。アッセイ性能（Ｚ’因子）ならびにＡＴＰγＳ及びイマチニブによるプローブの置換を評価した。全実験において、Ｆｕｓｉｏｎ  α−ＦＰ  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて蛍光シグナルを測定した。Ｄｙｎａｆｉｔソフトウェアを用いてデータ分析を行った。
【０１０２】
特に、滴定データを次の平衡に適合させ：酵素＋プローブ＜＝＝＞複合酵素−プローブ、一方、置換データを次の平衡に適合させ：酵素＋プローブ＜＝＝＞複合酵素−プローブ、酵素＋化合物＜＝＝＞複合酵素−化合物、これによって、酵素におけるプローブ及び化合物の結合は相互排他的である（純粋競合機構）。
【０１０３】
滴定実験を次のように行った：１０ｎＭ  ＡＢＬキナーゼドメイン（野生型又はＴ３１５Ｉ突然変異体）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％ＤＭＳＯ、３μＭ  Ｎａ３ＶＯ４（緩衝液１）中での１：１．５希釈段階による、３μＭから０のインドリノン濃度。得られた結果（下記表１で示す。）から、このプローブが、ＡＢＬキナーゼドメインの試験した全ての型と結合できることが示される。Ｚ’因子（Ｚ’＝１−（３＊（ＳＤプローブ＋タンパク質＋ＳＤプローブ）／（平均プローブ＋タンパク質−平均プローブ））を次のように求めた：１０及び５ｎＭタンパク質の存在下（プローブ＋タンパク質）又は非存在下（プローブ）で、飽和プローブ濃度（それぞれＡＢＬ野生型非リン酸化（０Ｐ）、野生型及びＴ３１５Ｉに対して、０．１５、０．１２及び０．４２μＭ）を評価した。全ての場合において、Ｚ’は０．８より大きく、このことから、このアッセイがロバストであることが示された。
【０１０４】
次のように行われた置換アッセイにおいてＡＴＰγＳ及びイマチニブを用いて、このアッセイを確認した：７％ＤＭＳＯ中で試験化合物の連続希釈液（希釈段階１：２）を最初に調製し、１％最終ＤＭＳＯ濃度にするためにアッセイ緩衝液１中でさらに希釈した。最高濃度として２５０μＭでＡＴＰγＳを試験し、一方でイマチニブの最高濃度は１０μＭであった。１０ｎＭの最終濃度で酵素が存在した。プローブの最終濃度は、それぞれＡＢＬ野生型非リン酸化（０Ｐ）、野生型及びＴ３１５Ｉに対して、０．１５、０．１２及び０．４２μＭであった。前もって希釈した化合物に酵素及びプローブの混合液を添加した。結果（表１）から、試験したＡＢＬコンストラクトの全てからＡＴＰγＳによりプローブが完全に置換され得ることが示され、このことから、インドリノンがＡＴＰポケットで結合することが示唆される。同調して、純粋競合機構と適合させることによって、親和結合定数（ＫＤ）を求めた。ＫＤ値は３回の独立した実験の平均である。
【０１０５】
予想されるように、イマチニブは、ＡＢＬのリン酸化型よりも非リン酸化型に対してより高い親和性を示し、一方、Ｔ３１５ＩＡＢＬ突然変異体では置換は観察されなかった。
【０１０６】
【表１】
2009534307.tif 000008
【０１０７】
総合すれば、これらの結果から、置換アッセイはＡＴＰ部位依存性であり、測定された親和性はイマチニブにおいて公開されているデータと一致することが示される（ＣＡＲＴＥＲ、Ｔ．Ａ．ら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ＡＢＬ，ＫＩＴ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５、１０２巻、第３１号、１１０１１−１１０１６頁。ＦＡＢＩＡＮ、Ｍｉｌｅｓ  Ａ．ら、Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｐ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５、２３巻、第３号、３２９−３３６頁）。
【０１０８】
組み換えＡＢＬキナーゼドメインを用いたＡＴＰ部位依存性置換アッセイ
置換アッセイにおいて、組み換え野生型及びＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬキナーゼドメインとの化合物結合親和性を評価した。比較に含まれるイマチニブとともにイソ−チエノピラゾール化学物質群の化合物を試験した。
【０１０９】
表２は、様々なＡＢＬコンストラクトに対する親和結合定数の決定（ＫＤ）を示す。ＶＸ−６８０は、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対してインビトロ結合能を有することが最近報告された、ＶｅｒｔｅｘからのＡＴＰ競合チロシンキナーゼ阻害剤であり；上記で定義されるような化合物１及び２及び化合物３、即ち３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドは、本発明の典型的な化合物である。
【０１１０】
【表２】
2009534307.tif 000009
【０１１１】
本発明のさらなる典型的化合物についてもまた、Ｔ３１５ＩＡＢＬ突然変異体に対する親和結合定数（ＫＤ）を求めた。結果を下記表３で報告するが、ここで、化合物４は３−［４−（１−メチル−ピペリジン−４−イルオキシ）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミドであり、化合物５は３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミドであり、化合物６は３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドであり、化合物７は３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル−アミドであり、化合物８は３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドであり、化合物９は３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−クロロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドであり、化合物１０は３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミドであり、化合物１１は３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミドであり、化合物１２は３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミドであり、化合物１３は３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドである。
【０１１２】
【表３】
2009534307.tif 000010
【０１１３】
試験した最高阻害剤濃度として３μＭを用いて以前に記載のように置換アッセイを行った。表２及び３で示す結果から、試験した化合物の全てがＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体において活性であったことが示される。
【０１１４】
３．２  インドリノンプローブ  Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５-［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド
上述のように、滴定実験において、インドリノン  Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドを野生型ＡＢＬキナーゼドメイン及びＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体へのその結合能について評価した。適用した条件は、飽和プローブ濃度（ＡＢＬ野生型非リン酸化（０Ｐ）、野生型及びＴ３１５Ｉに対してそれぞれ２、３．３及び０．２μＭ）及びプローブ最終濃度（ＡＢＬ野生型非リン酸化（０Ｐ）、野生型及びＴ３１５Ｉに対してそれぞれ２、３．３及び０．２μＭ）を除き同じであった。
【０１１５】
この場合もまた、試験したＡＢＬコンストラクトの全てからＡＴＰγＳにより完全にプローブが置換され得ることが結果（表４）から示され、このことから、インドリノンがＡＴＰポケットで結合することが示唆される。予想されるように、イマチニブは、ＡＢＬのリン酸化型よりも非リン酸化型に対してより高い親和性を示し、一方、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体では置換は観察されなかった。
【０１１６】
【表４】
2009534307.tif 000011
【０１１７】
総合すれば、これらの結果から、置換アッセイがＡＴＰ部位依存性であり、測定された親和性がイマチニブにおいて公開されているデータと一致することが示される（ＣＡＲＴＥＲ、Ｔ．Ａ．ら、ｉｂｉｄ．；ＦＡＢＩＡＮ、Ｍｉｌｅｓ  Ａ．ら、ｉｂｉｄ．）。
【０１１８】
組み換えＡＢＬキナーゼドメインを用いたＡＴＰ部位依存的置換アッセイ
３．１下で報告されるように、及び同じピロロピラキソール（Ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒａｘｏｌｅ）化合物を試験して、置換アッセイにおいて組み換え野生型及びＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬキナーゼドメインとの化合物結合親和性を評価した。表５は、様々なＡＢＬコンストラクトに対する親和結合定数決定（ＫＤ）を示す。
【０１１９】
【表５】
2009534307.tif 000012
【０１２０】
さらなる典型的な本発明の化合物に対してもまた、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体に対する親和結合定数（ＫＤ）を求めた（上記で定義されるような化合物４から１３）。
【０１２１】
下記表６で結果を報告する。
【０１２２】
【表６】
2009534307.tif 000013
【０１２３】
試験した最高阻害剤濃度として３μＭを用いて、前記のように置換アッセイを行った。表５及び６で示される結果は、独立した３回の実験の平均である。これらから、試験した化合物全てがＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体において活性があったことが示される。
【実施例４】
【０１２４】
細胞におけるＡＢＬ活性の阻害
材料及び方法
ＡＢＬポリペプチドのクローニング
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリからＡＢＬ  ｃＤＮＡ（残基２７−１１３０に対応）をＰＣＲ増幅した。フォワードオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号４）及びリバースオリゴヌクレオチド：
５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号５）を用いて増幅を行った
クローニング目的のため、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたクローニングに適切なａｔｔＢ隣接ＰＣＲ産物を得るために、オリゴヌクレオチドにはａｔｔＢ部位が含まれた。哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｎＶ５  ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、得られたＰＣＲ産物をクローニングした。Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）マニュアルに記載のプロトコルに従い、クローニングを行った。
【０１２５】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた部位特異的突然変異誘発により、イマチニブ耐性突然変異Ｔ３１５Ｉを作製した。突然変異誘発反応で使用したオリゴヌクレオチドは：
５’−ＣＣＣＣＧＴＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧ−３’（配列番号６）であった。
【０１２６】
免疫ブロッティング
標準的方法に従い、免疫ブロッティングを行った。１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８及び２％ＳＤＳ中で細胞を調製した。試料を超音波処理し、９５℃で５分間加熱した。タンパク質抽出物１０μｇ（ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で測定した場合）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を検出のために使用した。次の抗体を用いて免疫ブロット分析を行った：抗ＡＢＬ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ａ５８４４）；抗ｐＹ４１２−ＡＢＬ（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ、カタログ番号２８６５）；抗Ｓｔａｔ−５（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ、カタログ番号９３５２）；抗ｐＳｔａｔ−５、抗Ｃｒｋｌ、抗ｐ−Ｃｒｋｌ、抗ＥＩＦ４ｅ（ＢＣＲ／ＡＢＬ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ、カタログ番号７１３０）。
【０１２７】
結果
内因性に発現するＢＣＲ−ＡＢＬ細胞において、ある典型的な本発明の化合物の阻害活性を確認するために、３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド（化合物１）をＫ−５６２白血病細胞（ＢＣＲ−ＡＢＬの転座に関連するＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体を有する。）で試験した。化合物１又はイマチニブで細胞を１時間処理した。細胞を回収し、ＡＢＬのキナーゼ活性化ループに存在する位置４１２チロシン残基（Ｙ４１２）のＡＢＬ自己リン酸化の阻害について免疫ブロッティングにより分析した。リン酸化状態について、Ｓｔａｔ−５又はＣｒｋｌなどの既知の下流シグナリングタンパク質も分析した。化合物１及びイマチニブ（臨床的に意義のある濃度で）は、Ｙ４１２のリン酸化及びＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｓｔａｔ-５及びＣｒｋｌの下流の介在因子のリン酸化を阻害し（図２）、このことから、予想される作用機構が確認され、一方、タンパク質リン酸化における一般的な影響を除き、Ｓｒｃでの影響は見られなかった。
【０１２８】
Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体における細胞でのイマチニブ及び化合物１の細胞性活性を試験するために、野生型又は突然変異体発現コンストラクトを用いてＨＣＴ−１１６細胞に対する遺伝子移入を行い、５μＭでイマチニブ及び化合物１について阻害活性を試験した。予想されるように、イマチニブは、野生型ＡＢＬコンストラクトでのみ阻害活性を示し、一方、Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異コンストラクトは耐性であった。対して、化合物１は、野生型及びＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体の両方に対して強い阻害活性を示した（図３）。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、野生型ＡＢＬ及びＴ３１５ＩＡＢＬ突然変異キナーゼドメインのキナーゼ活性における、化合物１、３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド（化合物２）及びイマチニブの阻害活性を示す。化合物の漸増濃度存在下でのゲルキナーゼアッセイにより、阻害活性を測定した。基質としてミエリン塩基性タンパク質を用いた。
【図２】図２は、化合物１（レーン１）又はイマチニブ（レーン２）で処理したＫ−５６２白血病細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬの阻害を示す免疫ブロッティングである。下流標的ＳＴＡＴ５又はＣＲＫＬのリン酸化状態を分析して、ＢＣＲ−ＡＢＬシグナリングの阻害を監視した。レーン１は未処理Ｋ−５６２細胞を示す。
【図３】図３は、ＨＣＴ−１１６遺伝子移入細胞での化合物１による野生型及びＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬの阻害を示す免疫ブロッティングである。ＡＢＬ野生型（レーン１）又はＴ３１５Ｉ  ＡＢＬ突然変異体発現コンストラクト（レーン２）を用いて、ＨＣＴ−１１６結腸直腸腫瘍細胞の遺伝子移入を行った。トータルＡＢＬタンパク質（α−ＡＢＬ）に対する抗体又は位置Ｙ４１２でリン酸化が起こった場合にＡＢＬ（α−ｐＹ４１２−ＡＢＬ）を認識するリン酸−特異的抗体を用いて、免疫ブロッティングによって、細胞溶解液を分析した。未処理（−）細胞と処理（＋）細胞との間の比較から、化合物１が野生型ならびにＴ３１５Ｉ突然変異ＡＢＬの両方を阻害できることが示される。
【図１】
2009534307.tif 000017
【図２】
2009534307.tif 000018
【図３】
2009534307.tif 000019
【配列表】
2009534307000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月27日(2008.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼポリペプチドを式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2009534307.tif 000022
（式中、Ｒは場合によっては置換されているアリール又はヘテロアリール基であり；
Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、互いに独立に、水素原子、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキルを表すか、又はこれらが結合される炭素原子と一緒になっており、Ｒ１及びＲ２は、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基を形成し得；ただしＲ１及びＲ２の少なくとも１つが水素原子以外であり；
Ｒ３は、水素もしくはハロゲン原子又はヒドロキシ、シアノ、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ３アルキル又はＣ１−Ｃ３アルコキシから選択される基である。）
の有効量と接触させることを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼ活性を阻害するための方法。
【請求項２】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性チロシンキナーゼポリペプチドがＡＢＬチロシンキナーゼのＴ３１５Ｉ突然変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤がイマチニブである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
治療を必要とする哺乳動物に請求項１で定義されるような式（Ｉ）による化合物又は医薬的に許容可能なその塩の有効量を投与することを含む、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患を治療する方法。
【請求項５】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患がＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性白血病である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該疾患が、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性慢性骨髄性白血病である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤がイマチニブである、請求項４から請求項６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
2009534307.tif 000023
（式中、Ｒ４は、アゼチジン−１−イル、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、（１−メチル−ピペラジン−４−イル）、（モルホリノ−４−イル）、（アゼチジン−１−イル）メチル、（ピロリジン−１−イル）メチル、（ピペリジン−１−イル）メチル、（１−メチル−ピペラジン−４−イル）メチル、（モルホリノ−４−イル）メチル、（１−メチル−ピペリジン−４−イルオキシ）メチル、（イソプロピルアミノ）メチルから選択される基であり；Ｒ３は、水素又はフッ素もしくは塩素原子である。）
を用いて行われる、請求項１から請求項７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
該化合物が、
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−［（４−モルホリン−４−イルベンゾイル）アミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−［（４−モルホリン−４−イルベンゾイル）アミノ］−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−エチル−１−フェニルプロピル）−３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−Ｎ−（１−フェニルシクロペンチル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−Ｎ−（１−フェニルシクロプロピル）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−エチル−１−フェニル−プロピル）−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−フェニル−シクロペンチル）−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−クロロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−アゼチジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（４−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（３−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−アゼチジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−（４−ジメチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロプロピルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロブチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−｛４−［（イソプロピル−メチル−アミノ）−メチル］−ベンゾイルアミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−シクロペンチルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−｛４−［（ジイソプロピルアミノ）−メチル］−ベンゾイルアミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−ピロリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−メチル−１−（２−フルオロ−フェニル）−エチル］−アミド；
３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−メチル−１−（２−フルオロ−フェニル）−エチル］−アミド；
３−（４−シクロプロピルアミノメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−［４−（イソプロピルアミノ−メチル）−ベンゾイルアミノ］−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミド；
３−ベンゾイルアミノ−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−アゼパン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
３−（４−アゼパン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドからなる群から選択される、請求項１から請求項７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該化合物が、
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（１−メチルピペリジン−４−イル）オキシ］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾイル］アミノ｝−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
Ｎ−（１−メチル−１−フェニルエチル）−３−（｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンゾイル｝アミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボキサミド；
３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸［１−（２−フルオロ−フェニル）−１−メチル−エチル］−アミドからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
該化合物が３−（４−ピペリジン−１−イルメチル−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラゾール−５−カルボン酸（１−メチル−１−フェニル−エチル）−アミドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
キナーゼタンパク質と、該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに対する親和性を有し該ＡＴＰポケットに結合した際に蛍光シグナルを生じることができるインドリノン誘導体と、試験化合物の連続希釈液と、を含む反応混合物を与え、試験化合物非存在下で生じた蛍光シグナルを試験化合物の様々な濃度の存在下で生じた蛍光シグナルと比較する段階を含み、それによる蛍光の低下レベルが試験化合物のインドリノン誘導体置換能を示す、該キナーゼタンパク質のＡＴＰポケットに結合できる化合物の同定のためのスクリーニング法。
【請求項１３】
該インドリノンが式（ＩＩＩ）の化合物
【化３】
2009534307.tif 000024
（式中、Ｒ１は、水素又はメチルアミノ−スルホニルもしくはベンジル−スルホニルであり、Ｒ２は水素又はメチルであり、Ｒ３はメチル又は４−クロロフェニルもしくは２，４−ジフルオロフェニルである。）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該インドリノンが：
２，４−ジメチル−５−［２−オキソ−５−フェニルメタンスルホニル−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−５−（（Ｚ）−｛５−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン｝メチル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；
４−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−メチル−５−［（Ｚ）−（４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミドからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤耐性Ｔ３１５Ｉ  ＡＢＬ介在性疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１又は請求項４で定義されるような式（Ｉ）の化合物又は医薬的に許容可能なその塩の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月18日(2008.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009534307000001.app
【国際調査報告】
2009534307.tif 000025
2009534307.tif 000026
2009534307.tif 000027
2009534307.tif 000028
2009534307.tif 000029
2009534307.tif 000030