(57)【要約】  本発明は、代謝機能に影響を及ぼす代謝調節因子、例えば、筋肉量、筋再生、筋肥大、体脂肪量、インスリンおよびグルコース感受性、血管新生、および心血管機能に影響を及ぼす代謝調節因子に関する。特に、本発明は、代謝調節因子の活性および／または遺伝子発現を活性化または阻害する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することによる代謝機能の調節に関する。本発明の代謝調節因子は、例えば、ＭＳＰ１（２１６００２８Ｆ０８Ｒｉｋ；配列番号１６）；ＭＳＰ２（２３１００４３Ｉ０８Ｒｉｋ；配列番号１７）；ＭＳＰ３（ＮＭ_０２６７５４；１１１００１７Ｉ１６Ｒｉｋ；配列番号１）；ＭＳＰ４（４７３２４６６Ｄ１７Ｒｉｋ；配列番号１８）；ＭＳＰ５（ＮＭ_０２４２３７；１６０００１５Ｈ２０Ｒｉｋ；配列番号１２）；Ｉｎｓｌ６（ＡＦ_１５６０９４；配列番号２０）である。本発明は、本発明の代謝調節因子に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングするための方法も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において代謝機能を調節する方法であって、代謝調節因子の活性および／または発現に影響を及ぼす薬剤を含む医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、ここで、代謝調節因子は、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログまたはその発現産物またはその機能性フラグメントの群から選択され、代謝調節因子の発現または細胞におけるそのレベルの変化が、少なくとも１つの代謝機能を調節する、方法。
【請求項２】
代謝機能が、筋肉量、体脂肪量、血管新生、体重、インスリンおよび／またはグルコース感受性またはその組み合わせの群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬剤が、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
薬剤が、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
薬剤が、低分子、核酸、核酸アナログ、ペプチド、タンパク質、リボソーム、抗体、阻害核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびその変異体およびフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
薬剤が、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログまたは変異体の発現産物である、請求項１または３に記載の方法。
【請求項７】
アンタゴニストが、低分子、核酸、核酸アナログ、ペプチド、タンパク質、リボソーム、抗体、阻害核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびその変異体およびフラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
薬剤が筋肉に標的化される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＭＳＰ１が、配列番号１６の核酸配列またはそのフラグメントまたは機能性変異体またはホモログによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＳＰ２が、配列番号１７の核酸配列またはそのフラグメントまたは機能性変異体またはホモログによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＳＰ３が、配列番号１または配列番号２の核酸配列またはそのフラグメントまたは機能性変異体またはホモログによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＳＰ４が、配列番号１８の核酸配列またはそのフラグメントまたは機能性変異体またはホモログによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＳＰ５が、配列番号１２の核酸配列またはそのフラグメントまたは機能性変異体またはホモログによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｉｎｓｌ６が、配列番号２０の核酸配列またはそのフラグメントまたは機能性変異体またはホモログによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
対象が、筋変性、インスリン関連障害、筋萎縮、肥満または血管損失またはその組み合わせの群から選択される状態または疾患に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
インスリン抵抗性障害が、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤ）または肥満である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象が、眼の新生血管形成に関連する血管新生、腫瘍血管新生、関節炎、網膜症、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性症、糖尿病関連網膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化巣における毛細血管増殖に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
調節される代謝機能がインスリン感受性および／またはグルコース感受性または体重または血管新生またはその組み合わせの群から選択され、そして薬剤がＭＳＰ３用の薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
代謝機能がインスリン感受性の増加および／またはグルコース感受性の増加または体重減少または血管新生の増加またはその組み合わせであり、そして薬剤がＭＳＰ３のアゴニストである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
代謝機能がインスリン感受性の減少および／またはグルコース感受性の減少または体重の増加または血管新生の減少またはその組み合わせであり、そして薬剤がＭＳＰ３のアンタゴニストである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
調節される代謝機能が筋肉量、肥大または血管新生またはその組み合わせの群から選択され、そして薬剤がＭＳＰ５用の薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
代謝機能が筋肉量の増加および／または肥大の増加および／または体重の増加、血管新生の増加またはその組み合わせであり、そして薬剤がＭＳＰ５のアゴニストである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
代謝機能が筋肉量の減少および／または肥大の減少および／または体重の減少および／または血管新生の減少またはその組み合わせであり、そして薬剤がＭＳＰ５のアゴニストである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
調節される代謝機能が筋肉量または筋再生またはその組み合わせの群から選択され、そして薬剤がＩｎｓｌ６用の薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
代謝機能が筋肉量の増加または筋再生の増加または体重減少の増加またはその組み合わせであり、そして薬剤がＩｎｓｌ６のアゴニストである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
代謝機能が筋肉量の減少または筋再生の減少または体重減少の低下またはその組み合わせであり、そして薬剤がＩｎｓｌ６のアンタゴニストである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
対象において少なくとも１つの代謝機能を調節するための、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログ、またはその発現産物またはその機能性フラグメントの群から選択される薬剤の使用。
【請求項２８】
対象において少なくとも１つの代謝機能を調節するための、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のアゴニストである薬剤の使用。
【請求項２９】
対象において少なくとも１つの代謝機能を調節するための、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のアンタゴニストである薬剤の使用。
【請求項３０】
薬剤が、低分子、核酸、核酸アナログ、ペプチド、タンパク質、リボソーム、抗体、阻害核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびその変異体およびフラグメントである、請求項２９に記載の薬剤。
【請求項３１】
代謝機能が、筋肉量、体脂肪量、血管新生、体重、インスリンおよび／またはグルコース感受性、またはその組み合わせの群から選択される、請求項２７、２８または２９に記載の薬剤の使用。
【請求項３２】
薬剤が筋肉に標的化される、請求項２７、２８または２９に記載の薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年２月２８日出願の米国仮特許出願、出願番号第６０／７７７，６５４号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）の米国特許法第１１９条（ｅ）の下の恩典を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、代謝調節因子およびその使用（治療的使用を含む）に関する。特に、本発明は、代謝機能に影響を及ぼす代謝調節因子、例えば、筋肉量、筋再生、筋肥大、体脂肪量、インスリンおよびグルコース感受性、血管新生および心血管機能に影響を及ぼす代謝調節因子の使用を提供する。特に、本発明は、代謝調節因子の活性および／または遺伝子発現を活性化または阻害する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することによる代謝機能の調節に関する。
【０００３】
背景
全身性筋萎縮は、絶食に際して、そして種々の疾患、例えば悪液質、癌、エイズ、長期床上安静、および糖尿病（１）および筋ジストロフィーにおいて生じる。萎縮の処置のための１つのストラテジーは、通常骨格筋肥大を導く経路を誘発することである。
【０００４】
特に、筋肉量の減少、または萎縮は、種々の生理学的および病理学的状況に関連する。例えば、筋萎縮は、神経外傷に起因する除神経；変性性、代謝性または炎症性ニューロパシー、例えば、ギヤンバレー症候群；末梢ニューロパシー；または環境毒素または薬物によって引き起こされる神経障害から生じ得る。筋萎縮は、例えば、成人運動ニューロン疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリック病）；乳児および若年性脊髄性筋萎縮症；および多巣性導体ブロックを伴う自己免疫運動ニューロパシーを含む、運動ニューロパシーに起因する除神経からも生じ得る。筋萎縮は、例えば、脳卒中または脊髄損傷に起因する麻痺；外傷、例えば骨折、靭帯または腱の損傷、捻挫または脱臼に起因する骨格固定；または長期床上安静から生じる慢性疾患からも生じ得る。同様に筋萎縮を生じ得る代謝性ストレスまたは栄養不良には、とりわけ、癌および他の慢性疾患の悪液質（エイズ、絶食または横紋筋融解症、および内分泌障害、例えば甲状腺の障害および糖尿病を含む）が含まれる。筋萎縮はまた、デュシェンヌ型、ベッカー型、筋緊張性、顔面肩甲上腕、エメリ−ドレフュシュ型、眼咽頭型、肩甲上腕型、肢帯型、および先天性型などの筋ジストロフィー症候群、および遺伝性遠位型ミオパシーとして知られているジストロフィーにも起因し得る。筋萎縮は、先天性ミオパシー、例えば、良性先天性筋緊張低下、中心コア病、ネマリンミオパシー、および筋細管（中心核）ミオパシーにも起因し得る。筋萎縮は老化過程の間にも生じる。
【０００５】
骨格筋肥大は、正常な生後発育および身体運動への適応応答において重要な役割を果たす（２）。この過程は血管動因に関連し、その結果、毛細血管密度は成長中の筋肉において維持されるかまたは増加する（３〜６）。逆に、加齢、廃用、および筋障害性疾患で生じる筋線維萎縮は、毛細血管損失に関連する（７、８）。血管新生および代償性筋肥大は時間的に結びついていることが示されており、このことはこれら２つの過程が共通の調節メカニズムによって制御され得ることを示唆する（９）。
【０００６】
筋肉の蓄積は、体脂肪量と逆相関する。例えば、ＩＧＦ−１（１０）、ｓｋｉ（１１）またはＡｋｔ１（１２）の骨格筋特異的発現。しかし、それによって骨格筋が脂肪分解および脂肪酸動員および筋肉による取り込みを制御するホルモン性調節メカニズムは十分には理解されていない。さらに、適切な骨格機能も、正常なグルコース代謝の維持のために重要である（１３〜１５）。インスリン刺激性グルコース取り込みに対する骨格筋の抵抗性は、非インスリン依存性（２型）糖尿病の最も早くから知られている徴候である（１６、１７）。骨格筋活動の増加は、インスリン感受性を改善し、そして大部分の２型糖尿病患者における損なわれたインスリン抵抗性の進行を防止することができる（１８）。
【０００７】
それゆえ、これらの疾患を個々にまたは一緒に標的化するための有用な治療ストラテジーは、種々の疾患および／または障害の処置または予防のために、筋肥大、血管新生を増加させ、そして体脂肪量を減少させ、そしてインスリン感受性を改善するように筋肉によって内因性に分泌される分子を使用することである。
【０００８】
発明の概要
本発明は、筋消耗性疾患、インスリン関連障害、肥満、糖尿病、組織虚血および骨疾患、および筋変性疾患を含むいくつかの病理学的状態の処置のための筋肉由来の代謝調節因子を見出したことに関する。
【０００９】
骨格筋中でＡｋｔを過剰発現するトランスジェニックマウスモデルを使用することによって、本発明者らは、本明細書において「代謝調節因子」と称する代謝機能に影響を及ぼすいくつかの筋肉分泌タンパク質、例えば、筋肉量、筋肥大、筋再生、インスリン感受性およびグルコース感受性、血管新生、および体脂肪量に影響を及ぼす代謝調節因子を見出した。本発明者らは、代謝機能に影響を及ぼす以下の代謝調節因子、例えば、筋肉分泌タンパク質（ＭＳＰ）；ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびインスリン様タンパク質６（Ｉｎｓｌ６）を見出した。従って、本発明は、本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤の有効量を投与することによる、代謝機能を調節するための方法を提供する。
【００１０】
従って、本発明は、筋肉関連疾患、血管新生、肥満、糖耐性およびインスリン依存性障害および筋変性に関連する疾患および／または障害を処置するための方法であって、本発明の代謝調節因子の薬剤の治療有効量の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
特に、本発明は、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、代謝調節因子ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびインスリン様タンパク質６（Ｉｎｓｌ６）の機能を活性化または阻害する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することによって代謝機能を調節するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、薬剤は、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６のタンパク質を活性化し、そして／またはその遺伝子発現を増加させるアゴニストであり、そしていくつかの実施態様では、薬剤は、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログまたは変異体またはフラグメントをコードするポリペプチドまたは核酸である。別の実施態様では、薬剤は、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６のタンパク質を阻害し、そして／またはその遺伝子発現を減少させるアンタゴニストであり、そしていくつかの実施態様では、薬剤は、阻害ポリペプチド、例えば、ドミナントネガティブポリペプチドまたは中和抗体または阻害核酸、例えば、それらに限定されないが、アンチセンス核酸および／またはＲＮＡｉである。
【００１２】
本発明者らは、ＭＳＰ３が、血管新生の調節およびグルコース感受性の調節の両方をするように機能することも見出し、従って、本発明者らは、ＭＳＰ３が、ニ機能性ミオカインとして血管形成を促進し、そして代謝調節因子として感受性を増加させるように機能することを見出した。従って、本発明は、血管の損失に関連する障害、例えば、それらに限定されないが、虚血の処置に関し、方法は、ＭＳＰ３のアゴニストとして機能する薬剤、例えばＭＳＰ３の活性および／または発現に影響を及ぼす薬剤の有効量を投与する工程を含む。そのようなＭＳＰ３のアゴニストの一例は、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３をコードする核酸、またはＭＳＰ３タンパク質またはそのフラグメントまたは機能性誘導体またはＭＳＰ３のアゴニストを含む薬剤である。別の実施態様では、本発明は、および／またはインスリン抵抗性に関連する障害、例えば、それらに限定されないが、糖尿病および肥満の処置に関し、方法は、ＭＳＰ３のアゴニスト、例えばＭＳＰ３またはそのホモログまたは変異体をコードする核酸、ＭＳＰ３タンパク質またはそのフラグメントまたは機能性誘導体またはＭＳＰ３のアゴニストの有効量を投与する工程を含む。
【００１３】
本発明者らは、ＭＳＰ５が、血管新生および筋肥大および筋肉量を調節するように機能することも見出し、それゆえ、本発明者らは、ＭＳＰ５が、ニ機能性ミオカインとして血管形成を促進し、そして筋肥大を促進するように機能することも見出した。従って、本発明は、血管損失に関連する障害の処置に関し、方法は、アゴニストとして機能する薬剤、例えば、ＭＳＰ５の活性および／または発現に影響を及ぼす薬剤の治療有効量を投与する工程を含む。そのような薬剤の一例は、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ５をコードする核酸、ＭＳＰ５タンパク質またはそのフラグメントまたは機能性誘導体および／またはＭＳＰ５のアゴニストである。別の実施態様では、本発明は、筋萎縮に関連する障害または筋肉量の増加が望まれる障害の処置に関し、方法は、ＭＳＰ５のアゴニストとして機能する薬剤、例えば、ＭＳＰ５の活性および／または発現に影響を及ぼす薬剤、例えば、ＭＳＰ５またはその機能性誘導体をコードする核酸、ＭＳＰ５タンパク質またはそのフラグメントまたは機能性誘導体またはＭＳＰ５のアゴニストの有効量を投与する工程を含む。
【００１４】
本発明者らは、インスリン様タンパク質６（Ｉｎｓｌ６）が、筋肉筋原線維への衛星細胞動員の量を調節することによって筋再生を調節するように機能することも見出した。従って、本発明は、筋変性、例えば、それらに限定されないが、筋ジストロフィーに関連する障害の処置、または筋肉量の増加が所望される障害、例えば加齢性萎縮の処置に関し、方法は、アゴニストとして機能する薬剤、例えば、Ｉｎｓｌ６の活性および／または発現を増加させる薬剤の有効量を投与する工程を含む。そのような薬剤の一例は、それらに限定されないが、Ｉｎｓｌ６またはそのホモログまたは誘導体をコードする核酸、Ｉｎｓｌ６タンパク質またはそのフラグメントまたは機能性誘導体であるアゴニスト、またはＩｎｓｌ６のアゴニストである。
【００１５】
１つの態様では、本発明は、疾患または状態の処置のための方法であって、それを必要とする対象、またはその疾患または状態を発達させる危険がある対象に、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６遺伝子をコードする核酸、または本発明のその機能性誘導体または変異体をコードする核酸を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のタンパク質またはポリペプチドであり、別の実施態様では、そのフラグメントまたはその誘導体である薬剤を含む。別の実施態様では、医薬組成物は、アゴニストとして機能する、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の遺伝子発現を活性化するか、またはＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の転写後遺伝子産物および／またはペプチドを活性化する薬剤を含む。
【００１６】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、筋肉関連状態を処置するために使用することができる。疾患または状態が萎縮などの筋肉関連状態または障害であるような実施態様では、本発明の方法は、それを必要とする対象に、本発明の代謝調節因子、例えば、本発明のＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６、またはその機能性誘導体または変異体の活性および／または発現に影響を及ぼす薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含み、ここで、筋肉関連疾患または状態は寛解されまたは阻害される。本発明の医薬組成物によって処置される筋肉関連状態または障害は、例えば、それらに限定されないが、除神経；変性性、代謝性または炎症性ニューロパシー；乳児および若年性脊髄性筋萎縮症；自己免疫運動ニューロパシーを含む多くの原因から；癌、エイズ、絶食または横紋筋融解症から生じる悪液質を含む慢性疾患から；そしてデュシェンヌ型などの筋ジストロフィー症候群から生じ得る。
【００１７】
本発明の方法は、本発明の代謝調節因子の少なくとも１つ、例えば、以下のＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の少なくとも１つの欠損の結果であるか、またはＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の活性および／または遺伝子発現の増加によって改善され得る任意の状態（小人症および心疾患、例えば、心筋梗塞後の心臓組織生存の改善を含む）を処置するためにも有用である。
【００１８】
本発明の１つの態様は、生物において筋肉量を増加させるための方法を提供する。本発明は、筋萎縮を発達させる危険があるかまたは筋萎縮を有する対象、または筋肥大が必要とされる対象を処置するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施態様では、方法は、それを必要とする対象に、アゴニスト、すなわち、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子の活性を増加させ、そして／またはその遺伝子発現を増加させるアゴニストである薬剤、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体またはホモログを活性化するアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子のアゴニスト、例えば、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、対象に、少なくとも１つの代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ５（配列番号１２）および／またはＩｎｓｌ６（配列番号２０）またはそのホモログまたはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することによって筋萎縮を有するかまたはその危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、それを必要とする対象において、筋肥大を増加させるかまたは萎縮を阻害することによって筋肉成長を増加させるための方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、対象に、アンタゴニストとして機能する薬剤、例えば阻害薬、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ５の阻害薬を投与することによって筋肥大を防止しそして筋肉量を減少させ、そして／または体重を減少させることができる。そのような阻害薬の例には、例えば、ＭＳＰ５のドミナントネガティブ形態、またはＭＳＰ５の阻害核酸、例えば、ＭＳＰ５ ＲＮＡｉまたはＭＳＰ５アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００１９】
別の実施態様では、本発明は、生物において筋再生および筋肉量を調節するための方法を提供する。１つの実施態様では、本発明は、対象において、筋再生および／または筋肉量を増加させるための方法および組成物を提供する。例えば、本発明の方法は、筋変性を発達させる危険があるかまたは筋変性を有する対象、または筋再生を必要とする対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、アゴニストとして機能する薬剤、例えば、それらに限定されないが、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子を活性化しそして／またはその遺伝子発現を増加させる薬剤、例えば、それらに限定されないが、Ｉｎｓｌ６またはその機能性誘導体を活性化する薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子のアゴニスト、例えばＩｎｓｌ６のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、対象に、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子、例えば、それらに限定されないが、Ｉｎｓｌ６（配列番号２０）またはそのホモログまたは変異体、またはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することによって筋変性を有するかまたはそれを発達させる危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、例えば、それを必要とする対象において衛星細胞動員を増加させそして筋再生を増加させることによって、筋肉量を増加させるための方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、対象に、例えばＩｎｓｌ６のアンタゴニストまたは阻害薬として機能する薬剤を投与することによって過剰な筋肉量を防止しそして筋肉量を減少させ、そして／または体重を減少させるために使用することができる。そのようなアンタゴニストは、例えば、Ｉｎｓｌ６のドミナントネガティブ形態、またはＩｎｓｌ６の阻害核酸、例えばＩｎｓｌ６ ＲＮＡｉ、またはＩｎｓｌ６アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２０】
さらに別の実施態様では、本発明は、生物においてグルコースおよび／またはインスリン感受性を調節するための方法に関する。本発明は、インスリンおよび／またはグルコース非感受性を発達させる危険があるかまたはそれを有する対象、またはグルコースを調節または代謝調節を必要とする対象、例えばインスリン関連障害またはインスリン抵抗性が関与する障害を有する対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、アゴニストとして機能する薬剤、例えば、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子の活性化を増加させ、そして／またはその遺伝子発現を増加させる薬剤、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３またはその機能性誘導体を活性化する薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、本発明の代謝調節因子のアゴニスト、例えばＭＳＰ３のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、対象に、本発明の代謝調節因子をコードする核酸、例えばＭＳＰ３（配列番号１）またはそのホモログまたは変異体またはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することによってインスリン依存性障害または肥満を有するかまたはその危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、それを必要とする対象において、グルコース感受性を増加させそして／またはインスリン感受性を増加させまたは肥満を処置するための方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、対象に、アンタゴニストとして機能する薬剤、例えばＭＳＰ３の阻害薬を含む医薬組成物を投与することによって体脂肪量を増加させそして／または体重を増加させることができる。そのようなアンタゴニストの例には、それらに限定されないが、ＭＳＰ３のドミナントネガティブ形態、またはＭＳＰ３の阻害核酸、例えばＭＳＰ３ ＲＮＡｉまたはＭＳＰ３アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはＭＳＰ３の中和抗体が含まれる。
【００２１】
さらに別の実施態様では、本発明は、生物において血管新生を調節する方法に関する。１つの実施態様では、本発明は、対象において血管新生を増加させるための方法および組成物を提供する。例えば、本発明の方法は、虚血を発達させる危険があるかまたは血管新生および／または血管形成の欠如を有する対象、または血管新生の増加を必要とする対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、少なくとも１つの、アゴニストとして機能する、例えば、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子の活性を増加させそして／またはその遺伝子発現を増加させる薬剤、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５、またはその機能性誘導体を活性化する薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。さらなる実施態様では、医薬組成物は、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子のアゴニスト、例えばＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５またはそのホモログのアゴニストである薬剤を含むことができる。いくつかの実施態様では、血管新生を増加させるための方法は、対象への、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子、例えばＭＳＰ３（配列番号１）および／またはＭＳＰ５（配列番号１２）またはそのホモログまたは変異体またはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物の投与である。従って、本発明は、それを必要とする対象において血管新生を増加させるための方法を提供する。
【００２２】
別の実施態様では、本発明は、血管新生の減少を必要とする対象または過剰な血管新生を発達させる危険がある対象、例えば癌を有するかまたはそれを発達させる危険がある対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子のアンタゴニストまたは阻害薬、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３の阻害薬および／またはＭＳＰ５の阻害薬またはその機能性誘導体として機能する薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。血管新生を阻害するために有用なそのような代謝調節因子の阻害薬の例は、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５のドミナントネガティブ形態、またはＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５の阻害核酸、例えばＭＳＰ３ ＲＮＡｉまたはＭＳＰ５ ＲＮＡｉまたはＭＳＰ３またはＭＳＰ５アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５の中和抗体である。従って、本発明は、それを必要とする対象において血管新生を減少させるための方法を提供する。
【００２３】
さらに別の実施態様では、本発明は、生物において肥満を調節するための方法に関する。１つの実施態様では、本発明は、対象において肥満を減少させそして／または処置するための方法および組成物を提供する。例えば、本発明の方法は、肥満を発達させる危険がある対象または肥満対象を処置するための組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、アゴニストとして機能する少なくとも１つの薬剤、例えば、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子の活性を増加させ、そして／またはその発現を増加させる薬剤、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３またはその機能性誘導体を活性化する薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、本発明の代謝調節因子のアゴニスト、例えばＭＳＰ３のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、対象に、本発明の代謝調節因子またはそのホモログをコードする核酸、例えばＭＳＰ３（配列番号１）またはそのホモログまたは変異体またはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することによってインスリン依存性障害または肥満を有するかまたはその危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、それを必要とする対象において肥満を処置しそして体重を減少させるための方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、対象に、例えばＭＳＰ３、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６のアンタゴニストまたは阻害薬として機能する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することによって体脂肪量を増加させそして／または体重を増加させることができる。そのようなアンタゴニストの例は、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６のドミナントネガティブ形態、またはＭＳＰ３、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６の阻害核酸、例えばＭＳＰ３、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６のＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド分子および／またはＭＳＰ３、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の中和抗体である。
【００２４】
他の目的および利点は、確実な詳細な説明の精査から明白になるであろう。
【００２５】
発明の詳細な説明
一般的説明
本発明は、成長中の骨格筋が、筋肉成長、血管新生、肥満、インスリン感受性、グルコース感受性、体重、体脂肪量、筋肉量および心血管機能に影響を及ぼす代謝調節因子を分泌するという知見に基づいている。本発明者らが見出した代謝調節因子は、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６である。従って、本発明は、そのような代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６を活性化または阻害する薬剤の有効量を投与することによって代謝機能を調節する方法であって、種々の疾患および障害、例えば、それらに限定されないが、筋肉成長、筋変性、筋萎縮、血管新生、肥満、インスリン依存性疾患および心血管機能に関連する障害の処置に有用である方法を提供する。
【００２６】
定義
本明細書で定義しない限り、本明細書で使用する用語は、それらの通常の意味を有し、そして本明細書の関連でさらに理解され得る。
【００２７】
「トランスジェニック動物」（例えば、マウスまたはラット）は、その細胞の一部または全ての中にトランスジーンを有する動物であり、このトランスジーンは、出生前、例えば胚期に動物または動物の祖先に導入されている。「トランスジーン」は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれるＤＮＡである。
【００２８】
本明細書で使用する「作動的に連結」という用語は、２つ以上の核酸（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係をさす：例えば、プロモーターまたはエンハンサーが適切な宿主細胞または他の発現系中でコード配列の転写を刺激する場合、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作動的に連結している。一般に、作動的に連結している配列は近接している。しかし、エンハンサーは、エンハンサーがその転写を増強するコード配列に近接して配置される必要はない。さらに、第２のプロモーターによって転写される因子によってトランスに調節されるプロモーターから転写される遺伝子は、第２のプロモーターに作動的に連結していると言われ得る。そのような場合、第１の遺伝子の転写は、第１のプロモーターに作動的に連結していると言われ、そして第２のプロモーターに作動的に連結しているとも言われる。
【００２９】
本明細書で使用する「筋肉」または「筋細胞」は、筋組織に寄与する任意の細胞をさす。筋芽細胞、衛星細胞、筋管、および筋原線維組織は、全て「筋細胞」という用語に含まれる。筋細胞は、骨格筋、心筋および平滑筋内の細胞を含み得る。
【００３０】
本明細書で使用する「薬剤」または「化合物」という用語は、疾患または状態を処置、予防または制御するために対象に投与される、化学的物体または生物学的産物、または化学物質または生物学的産物の組み合わせをさす。化学的物体または生物学的産物は、好ましくは低分子量化合物であるが、必ずしもそうではなく、より大きな化合物、または任意の有機または無機分子であってもよく、修飾および未修飾の核酸、例えばアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、受容体、リガンド、および抗体、アプタマー、ポリペプチド、核酸アナログまたはその変異体を含む。例えば、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物（それらに限定されないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、およびその修飾体および組み合わせを含む）。
【００３１】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子のフラグメントを意味する。抗体は、免疫学の科学の当業者に周知である。本明細書で使用する「抗体」という用語は、インタクトな抗体分子のみならず、抗原結合能力を保持している抗体分子のフラグメントも意味する。そのようなフラグメントも当技術分野において周知であり、そしてインビトロおよびインビボの両方で通常用いられている。特に、本明細書で使用する「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）のインタクトな免疫グロブリン分子のみならず、周知の活性フラグメントＦ（ａｂ'）（２）、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｖ（Ｈ）およびＶ（Ｌ）をも意味する。抗体フラグメントについては、例えば"Immunochemistry in Practice" (Johnstone and Thorpe, eds., 1996; Blackwell Science), p. 69を参照されたい。
【００３２】
本明細書で使用する「筋肉成長に関連する因子」は、本発明の方法によって同定された遺伝子または遺伝子産物をさす。遺伝子産物は、タンパク質、例えば、分泌タンパク質、膜結合タンパク質などであってもよい。あるいは、遺伝子産物は、機能性ＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ、リボザイムなどであってもよい。
【００３３】
「核酸」という用語は、当技術分野で周囲である。本明細書で使用する「核酸」は、一般に、核酸塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体またはアナログの分子（すなわち鎖）をさす。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見出される天然のプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。「核酸」という用語は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を、各々「核酸」という用語の亜属として包含する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さ約３〜約１００核酸塩基の分子をさす。「ポリヌクレオチド」という用語は、長さ約１００核酸塩基より大きな少なくとも１つの分子をさす。「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドもさす。その用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのアナログ、および記載する実施態様に適用可能な場合、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むとも理解すべきである。「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語はまた、本明細書で互換的に使用される。
【００３４】
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、エクソン配列および（任意に）イントロン配列の両方を含む、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸をさす。「遺伝子」は、遺伝子産物のコード配列、および遺伝子産物の非コード領域（５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲ領域、イントロンおよび遺伝子産物のプロモーターを含む）をさす。これらの定義は一般に一本鎖分子をさすが、特定の実施態様では、一本鎖分子に部分的に、実質的にまたは完全に相補的な追加の鎖も包含する。従って、核酸は、二本鎖分子、または分子を含む特定の配列の１つ以上の相補鎖または「相補物」を含む二本鎖分子を包含しうる。本明細書で使用する場合、一本鎖核酸は接頭辞「ｓｓ」によって、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」によって、そして三本鎖核酸は接頭辞「ｉｓ」によって示され得る。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントをさし、それは、コード領域の前後の領域、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。「プロモーター」は、そこで転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。それは、核酸配列の特異的転写を開始するために、そこに調節タンパク質および分子が結合しうるエレメント（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子）を含んでもよい。「エンハンサー」という用語は、核酸配列の転写活性化に関与するシスに作用する調節配列をさす。エンハンサーは、いずれの方向にも機能することができ、そしてプロモーターの上流または下流にあってもよい。
【００３５】
本明細書で使用する「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されるＲＮＡ、または遺伝子によってコードされるかまたはＲＮＡから翻訳されるポリペプチドを含むことをいうように使用する。
【００３６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用され、そして最小の長さに限定されない。従って、生物学的に、組換えで、または合成で生成されたにせよ、そして天然または非天然のアミノ酸から構成されているにせよ、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などが定義内に含まれる。定義によって、全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が包含される。この用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、タンパク質分解切断（例えば、フューリンまたはメタロプロテアーゼによる切断）などの、ポリペプチドの同時翻訳修飾（例えば、シグナルペプチド切断）および翻訳後修飾も含む。さらに、本発の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持している限り、ネイティブな配列への欠失、付加、および置換などの（一般に、当業者には公知であるような本来保存的な）修飾を含むタンパク質をさす。これらの修飾は、部位特異的変異誘発を介してのように計画的であってもよく、または、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅もしくは他の組換えＤＮＡ方法に起因するエラーを介してのように偶発的であってもよい。核酸分子について記載するために本明細書で使用する組換えは、その起源または操作により、本来それが結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に結合していない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成および／または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用する組換えという用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。宿主細胞に関して使用する組換えという用語は、その中に組換えポリヌクレオチドが導入されている宿主細胞を意味する。
【００３７】
「タンパク質フラグメント」という用語は、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の天然アミノ酸配列に由来可能な、合成および天然両方のアミノ酸配列を含むことを意味する。ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の天然の選択配列を断片化することによって得られ得る場合、または天然アミノ酸配列またはこの配列をコードする遺伝子物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列の知見に基づいて合成することができる場合、タンパク質は、「ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の天然アミノ酸配列に由来可能」であると言われる。
【００３８】
本明細書で使用する「筋肉成長の正の調節因子」は、その発現の結果、筋肉成長が生じ、そしてその発現の欠如の結果、筋肉成長が生じない、遺伝子および／または遺伝子産物をさす。
【００３９】
本明細書で使用する「筋肉成長の負の調節因子」は、その発現の結果、筋肉成長が生じず、そしてその発現の欠如の結果、筋肉成長が生じる、遺伝子および／または遺伝子産物をさす。
【００４０】
分子の「ドミナントネガティブ形態」という用語は、野生型タンパク質に比較して細胞に対して反対の表現型作用を発揮する、構造的に変化したタンパク質である。例えば、ＭＳＰ３のドミナントネガティブ形態は、その分子の正常なシグナリングを阻害できるＭＳＰ３の変異体である。
【００４１】
「機能性誘導体」および「模倣体」という用語は、互換的に使用され、そしてそれの機能性誘導体である物体または分子の生物活性に実質的に類似する生物活性（機能的または構造的のいずれか）を有する化合物をさす。機能性誘導体という用語は、分子のフラグメント、変異体、アナログ、または化学的誘導体を含むことが意図される。
【００４２】
「機能性誘導体」という用語は、分子の「フラグメント」、「変異体」、「アナログ」または「化学的誘導体」を含むことが意図される。分子の「フラグメント」は、分子の任意のポリペプチドサブセットをさすことを意味する。活性を有し、そして可溶性である（すなわち膜結合しない）代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のフラグメントも、本発明での使用のために包含される。分子ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の「変異体」は、分子全体またはそのフラグメントのいずれかに構造および機能が実質的に類似する分子をさすことを意味する。両方の分子が実質的に類似の構造を有する場合、または両方の分子が類似の生物活性を有する場合、分子は別の分子と「実質的に類似する」と言われる。従って、２つの分子が類似の活性を有するという条件で、たとえ分子の一方の構造が他方において見出されなくても、またはアミノ酸残基の配列が同一ではなくても、それらは本明細書でその用語が使用される変異体とみなされる。分子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の「アナログ」は、分子全体またはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に類似する分子をさすことを意味する。本明細書で使用する場合、分子が通常はその分子の一部ではない追加の化学的部分を含む場合、分子は別の分子の「化学的誘導体」であると言われる。そのような部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。あるいは、部分は、分子の毒性を減少させること、分子の任意の所望されない副作用を排除または減弱することなどができる。そのような効果を媒介できる部分は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA(1990)に開示されている。
【００４３】
「対象」および「個体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、本発明による医薬組成物での処置（予防的処置を含む）が提供される動物、例えばヒトをさす。本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物をさす。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えばマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、および非哺乳動物、例えば、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。１つの実施態様では、対象はヒトである。別の実施態様では、対象は、実験動物、または疾患モデルとしての代用動物である。用語は、特定の年齢または性別を指示しない。従って、雄性であろうと雌性であろうと、成体および新生仔対象ならび胎仔が包含されることが意図される。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、およびマウスが含まれる。対象という用語は、さらに、トランスジェニック種を含むことが意図される。
【００４４】
「組織」という用語は、インタクトな細胞、血液、血液調製物（例えば血漿および血清）、骨、関節、筋肉、平滑筋、および器官を含むことが意図される。
【００４５】
「疾患」または「障害」という用語は、本明細書で互換的に使用され、そして機能の遂行を中断または妨害し、そして／または罹患している人または人と接触するものに、不快、機能異常、苦悩などの症状または死さえも引き起こす、身体または器官のいくつかの状態の任意の変化をさす。疾患または障害は、ジステンパー、不調（ailing）、不快（ailment）、病弊（amlady）、障害、病（sickness）、疾病（illness）、故障（complaint）、軽い病（inderdisposion）、異常（affection）にも関連し得る。
【００４６】
「組成物」または「医薬組成物」は、本明細書で互換的に使用され、当技術分野で慣用的でありそして細胞への投与に適している賦形剤、例えば医薬的に許容される担体を通常含む組成物をさす。細胞は、例えば、治療、診断または予防目的の対象の一部であってもよい。細胞はまた、培養されていてもよく、例えば、潜在的な医薬組成物をスクリーニングするためのアッセイの一部としての細胞であってもよく、そして細胞は、研究目的のトランスジェニック動物の一部であってもよい。組成物は、細胞培養物であってもよく、ここで、本発明の代謝調節因子をコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、細胞中および／または培地中に存在する。さらに、当技術分野で公知でありそして本明細書に記載するように、局所（例えば、口腔粘膜、呼吸粘膜）および／または経口投与用の組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤、洗口剤、または粉末を形成することができる。組成物はまた、安定剤および防腐剤を含むこともできる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、University of the Sciences in Philadelphia (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons,21st Ed.。
【００４７】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、疾患または障害の症状の少なくとも１つまたはいくつかを緩和する医薬組成物の治療剤の量をさす。
【００４８】
「インスリン抵抗性障害」は、外来性インスリンの作用に対する末梢組織の正常な代謝応答の不全（非感受性）から生じる疾患、状態または障害であり、すなわち、それは、インスリンの存在が正常を下回る生物学的応答を生じさせる状態である。臨床に関しては、正常なまたは上昇したインスリンのレベルにもかかわらず、正常なまたは上昇した血糖値が持続される場合、インスリン抵抗性が存在する。それは、本質的に、それによって基底またはインスリン刺激性いずれかのグリコーゲン合成またはその両方が正常レベルより低く減少させられる、グリコーゲン合成阻害を表す。インスリン抵抗性は、２型糖尿病で主要な役割を果たしており、これはインスリンに対する末梢組織の感受性を回復するのに、見かけ上、十分な食事または体重減少によって、２型糖尿病に存在する高血糖が時折逆転され得るという事実によって実証されている。その用語には、耐糖能異常、およびインスリン抵抗性が重要な役割を果たす多くの障害、例えば、肥満、糖尿病、卵巣高アンドロゲン症および高血圧症が含まれる。「糖尿病」は、慢性的な高血糖の状態、すなわち、相対的または絶対的なインスリン作用の欠如の結果として起こる血液中の過剰な糖をさす。糖尿病の３つの基本的な型、Ｉ型またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、ＩＩ型または非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、およびＡ型インスリン抵抗性が存在するが、Ａ型は比較的まれである。Ｉ型またはＩＩ型糖尿病患者は、種々のメカニズムを通じて、外来性インスリンの効果に非感受性になり得る。Ａ型インスリン抵抗性は、インスリン受容体遺伝子中の変異、またはグルコース代謝に重要な受容体後作用部位の欠陥から生じる。糖尿病対象は、医師によって容易に認識され得、そして高血糖、耐糖能障害、グリコシル化ヘモグロビンおよび、いくつかの場合、外傷または疾病に関連するケトアシドーシスによって特徴付けられる。
【００４９】
「非インスリン依存性糖尿病」または「ＮＩＤＤＭ」という用語は、ＩＩ型糖尿病をさす。ＮＩＤＤＭ患者は、絶食時に異常に高い血糖濃度を有し、そして食後または糖耐性試験として知られる診断試験後にグルコースの細胞取り込みの遅延を有する。ＮＩＤＤＭは、認定された基準に基づいて診断される(American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988；American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988）。
【００５０】
本明細書で使用する「癌」という用語は、ヒトまたは動物対象における細胞増殖性疾患をさす。本明細書で互換的に使用する「腫瘍」または「腫瘍細胞」という用語は、制御されない増殖をしている、組織塊または組織型または細胞型をさす。
【００５１】
「アンタゴニスト」または「阻害薬」という用語は、本明細書で互換的に使用され、タンパク質、そのポリペプチド部分、またはポリヌクレオチドの発現または活性を阻害または抑制することができる任意の薬剤または物体をさす。従って、アンタゴニストは直接的または間接的いずれかの作用を介して、転写、翻訳、転写後または翻訳後プロセシングを防止するように、またはそうでなければ何らかの方法でタンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの活性を阻害するように働きうる。アンタゴニストは、例えば、核酸、ペプチド、または他の任意の適切な化学化合物または分子またはこれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を間接的に損なう際に、アンタゴニストが、次に調節因子またはタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド自体として作用しうるうる細胞分子の活性に影響を及ぼし得ることが理解される。同様に、アンタゴニストは、それ自体がタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドによる調節または調整に供される分子の活性に影響を及ぼしうる。
【００５２】
本明細書で使用する「阻害」という用語は、必ずしも、発現および／または活性の完全な阻害を意味しない。むしろ、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは核酸の発現または活性は、所望の効果を生じるのに十分な程度および／または時間で阻害される。
【００５３】
「アゴニスト」という用語は、タンパク質、そのポリペプチド部分、またはポリヌクレオチドの発現または活性を活性化または増強することができる任意の薬剤または物体をさす。従って、アゴニストは、直接的または間接的いずれかの作用を介して、遺伝子発現を促進する、例えば、遺伝子の転写、翻訳、転写後または翻訳後プロセシングを促進するように、またはそうでなければ、なんらかの方法でタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を活性化するように働きうる。アゴニストは、例えば、核酸、ペプチド、または他の任意の適切な化学化合物または分子またはこれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を間接的に促進する際に、アゴニストは、次に調節因子またはタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド自体として作用しうる細胞分子の活性に影響を及ぼし得ることが理解される。同様に、アゴニストは、それ自体がタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドによる調節または調整に供される分子の活性に影響を及ぼしうる。アゴニストは、そのような薬剤を添加する前にそれが細胞中に存在してもまたは細胞中に存在しなくても、細胞で遺伝子および／または遺伝子産物の活性の増加を引き起こすことができる任意の薬剤もさす。例えば、ＭＳＰ１を活性化する薬剤またはＭＳＰ１のアゴニストは、細胞中に既に存在するＭＳＰ１核酸の発現を活性化できる薬剤であり、または薬剤はＭＳＰ１をコードする核酸またはその機能性誘導体であることができ、または薬剤はＭＳＰ１のポリペプチドであることができ（ＭＳＰ１が細胞中に既に存在するかどうかに関わらず）、または薬剤はＭＳＰ１模倣体または機能性誘導体、例えばＭＳＰ１のアナログであることができる。
【００５４】
「活性化」または「活性化する」という用語は、本明細書で互換的に使用され、タンパク質、そのポリペプチド部分またはポリヌクレオチドまたは本発明の代謝調節因子の活性の一般的な増加をさす。活性化は、必ずしも代謝調節因子の発現および／または活性の完全な活性化を意味するわけではなく、むしろ、所望の効果を生じるのに十分な程度および／または時間での、活性化されるタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現または活性の一般的なまたは全体的な増加を意味する。
【００５５】
「物体」という用語は、任意の構造分子または分子の組み合わせをさす。
【００５６】
本明細書で使用する「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、遺伝子発現を阻害するＲＮＡベースの分子をさす。ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）による特異的ｍＲＮＡの破壊による、選択的転写後遺伝子サイレンシングの手段をさす。ｓｉＲＮＡは典型的には二本鎖ＲＮＡの切断によって生じ、ここで一方の鎖は不活化しようとするメッセージと同一である。
【００５７】
本明細書で使用する「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉおよび／またはｓｉＲＮＡ種として機能するが、安定性の増加のためにｓｈＲＮＡｉ種が二本鎖ヘアピン様構造であるという点で異なる、低分子ヘアピン型ＲＮＡをさす。
【００５８】
「抗体」という用語は、抗原と結合できる免疫グロブリンタンパク質であることを意味する。本明細書で使用する抗体は、目的の抗原または抗原フラグメントと結合できる抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂを含むことを意味する。「ヒト化抗体」という用語は、完全な、すなわち、２つの完全な軽鎖および２つの完全な重鎖から構成される抗体分子、および抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖのみからなる抗体について記載するために本明細書で使用され、ここで、ＣＤＲは非ヒト供給源に由来し、そしてＩｇ分子またはそのフラグメントの残りの部分はヒト抗体（好ましくはヒト抗体をコードする核酸配列から産生される）に由来する。「ヒト抗体」および「ヒト化抗体」という用語は、その抗体分子の全ての部分がヒト抗体をコードする核酸配列に由来する抗体について記載するために本明細書で使用される。そのようなヒト抗体は抗体療法での使用のために最も望ましい。なぜなら、そのような抗体は、ヒト患者においてほとんどまたはまったく免疫反応を引き起こさないからである。
【００５９】
「キメラ抗体」という用語は、「ヒト化抗体」という用語の定義において上記したような、抗体分子および抗体フラグメントについて記載するために本明細書で使用する。「キメラ抗体」という用語は、ヒト化抗体を包含する。キメラ抗体は、第１の哺乳動物種に由来する配列の重鎖または軽鎖アミノ酸の少なくとも１つの部分、および第２の異なる哺乳動物種に由来する配列の重鎖または軽鎖アミノ酸の別の部分を有する。
【００６０】
本明細書で使用する「細胞」という用語は、植物、酵母、蠕虫、昆虫および哺乳動物を含む任意の細胞（原核細胞または真核生物）をさす。哺乳動物細胞には、それらに限定されないが、霊長類、ヒトおよび目的の任意の動物由来の細胞が含まれ、それらに限定されないが、マウス、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、家畜、例えば、ウマ、ウシ、マウス、ヒツジ、イヌ、ネコなどが含まれる。細胞は、それらに限定されないが、多様な組織型のもの、例えば、筋細胞、肝臓細胞、肝細胞、脂肪細胞、造血、神経、間葉、皮膚、粘膜、間質、筋肉、脾臓、細網内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺、Ｔ細胞などであってもよい。幹細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、ＥＳ由来細胞および幹細胞前駆体も含まれ、それらに限定されないが、造血、神経、間質、筋肉、心血管、肝臓、肺、胃腸幹細胞などが含まれる。酵母細胞も本発明で細胞として使用してもよい。その結果その子孫は実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、依然として本発明の範囲内に含まれる、特定の修飾または環境的影響、例えば分化の故に、細胞は、特定の対象細胞をさすのではなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫もさす。
【００６１】
本発明で使用する細胞はまた、例えば、インビトロまたはエキソビボでの培養細胞であることができる。例えば、培地中でインビトロで培養された細胞。あるいは、エキソビボ培養細胞については、細胞を対象から得ることができ、ここで対象は健康である、そして／または疾患に罹患している。細胞は、非限定的な例として、バイオプシーまたは当業者に公知の他の外科的手段によって得ることができる。本発明で使用する細胞は、対象中に、例えばインビボで存在することができる。インビボで細胞を使用する本発明では、細胞は、好ましくは対象中に見出され、そして疾患、障害または悪性病理の特性を示す。
【００６２】
本明細書で使用する「処置」という用語には、不適切な増殖に関連する状態、疾患または障害（例えば癌）の少なくとも１つの副作用または症状の低減または緩和が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用する「投与」および「導入」という用語は、本明細書で互換的に使用され、そして所望の部位で代謝調節因子の薬剤の少なくとも部分的な局在化を生じる方法または経路による対象中への本発明の代謝調節因子の薬剤の配置をさす。本発明の化合物は、対象において有効な処置を生じる任意の適切な経路によって投与することができる。
【００６４】
本明細書で使用する「非経口投与」および「非経口での投与」という語句は、通常注射による、経腸および局所の投与以外の投与様式を意味し、そしてそれらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射および注入を含む。本明細書で使用する「全身投与」、「全身に投与」、「末梢投与」および「末梢に投与」という語句は、その結果動物の系に入り、従って代謝および他の同様な過程に供される、中枢神経系中に直接以外の、心血管幹細胞および／またはその子孫および／または化合物および／または他の物質の投与、例えば皮下投与を意味する。
【００６５】
本明細書で用いる「医薬的に許容される」という語句は、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題または合併症なしに、適切な医学判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用に適切であり、合理的な利益／危険比に相応する化合物、物質、組成物、および／または剤形をさす。
【００６６】
本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」という語句は、１つの器官または身体の部分から、別の器官または身体の部分への対象薬剤の運搬または輸送に関与する、医薬的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化物質を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合するという意味で、「許容」されなければならない。
【００６７】
「再生」という用語は、細胞集団、器官または組織の再成長を意味し、そしていくつかの実施態様では疾患または外傷の後のものである。
【００６８】
「プラスミド」と互換的に使用する「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。それが作動的に連結している遺伝子および／または核酸配列の発現を指示できるベクターを本明細書で「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形態であり、プラスミドは、そのベクター形態では染色体に結合しない、環状二本鎖ＤＮＡループをさす。他の発現ベクター、例えば、それらに限定されないが、プラスミド、エピゾーム、バクテリオファージまたはウイルスベクターを、本発明の様々な実施態様で使用することができ、そのようなベクターは宿主のゲノムに組み込まれ得るか、または特定の細胞中で自律的に複製し得る。同等の機能を果たす当業者に公知の発現ベクターの他の形態を使用することもできる。発現ベクターは、ＤＮＡをコードする、安定または一過性発現用の発現ベクターを含む。
【００６９】
「ウイルスベクター」という用語は、細胞中への核酸構築物の担体としての、ウイルスまたはウイルス関連ベクターとしての使用をさす。構築物は、細胞中への感染または形質導入のために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはその他（レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを含む）のような非複製性の欠陥ウイルスゲノム中に組み込まれそしてパッケージングされ得る。ベクターは、細胞ゲノム中に組み込まれてもまたは組み込まれなくてもよい。所望であれば、構築物は、トランスフェクション用にウイルス配列を含みうる。あるいは、構築物は、エピソーム性複製可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクターに組み込まれ得る。
【００７０】
本明細書で使用する「プロモーター」または「プロモーター領域」または「プロモーターエレメント」は本明細書で互換的に使用され、それが作動的に連結している核酸配列の転写を制御する核酸配列（典型的には、それらに限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそのアナログ）のセグメントをさす。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始のために十分な特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモーターという。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始の活性を調節する配列を含む。これらの配列は、シス作用性であってもよくまたはトランス作用性因子に応答性であってよい。調節の性質に依存して、プロモーターは構成的または調節的であってよい。
【００７１】
「調節配列」という用語は、本明細書では「調節エレメント」と互換的に使用され、それが作動的に連結している核酸配列の転写を調節し、従って転写モジュレーターとして作用する核酸（典型的には、それらに限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそのアナログ）のセグメントまたはエレメントをさす。調節配列は、それが作動的に連結している遺伝子および／または核酸配列の発現を調節する。調節配列はしばしば「調節エレメント」を含み、調節エレメントは、転写結合ドメインでありそして転写タンパク質および／または転写因子、リプレッサーまたはエンハンサーなどの核酸結合ドメインによって認識される核酸配列である。典型的な調節配列には、それらに限定されないが、転写プロモーター、誘導性プロモーターおよび転写エレメント、転写を制御する任意の作動性配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および／または翻訳の停止を制御する配列が含まれる。
【００７２】
調節配列は、単一の調節配列または複数の調節配列、または改変調節配列またはそのフラグメントであってもよい。改変調節配列は、核酸配列が、何らかの手段、例えば、それらに限定されないが、変異、メチル化などによって変化または改変されている調節配列である。
【００７３】
本明細書で使用する「作動的に連結した」という用語は、ヌクレオチドの調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列との核酸配列の機能的関係をさす。例えば、核酸配列（典型的にはＤＮＡ）の調節配列またはプロモーター領域への作動的連結は、該ＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、結合しそして転写するＲＮＡポリメラーゼによって調節配列またはプロモーターから開始されるような、ＤＮＡと調節配列またはプロモーターとの間の物理的および機能的関係をさす。発現および／またはインビトロ転写を至適化するためには、そのためにそれが発現させられる細胞型における核酸またはＤＮＡの発現のために調節配列を改変する必要があり得る。そのような改変の所望性または必要性は経験的に決定され得る。
【００７４】
本明細書では、冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法的目的語の１つのまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）ものをさすように使用される。例として、「an element」は、１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントを意味する。
【００７５】
代謝調節因子
本発明は、代謝機能を調節する代謝調節因子、例えば、筋肉量、体脂肪量、血管新生、インスリン感受性およびグルコース感受性、および心血管機能に影響を及ぼす代謝調節因子の使用に関する。以下にさらに詳細に記載するように、本発明の代謝調節因子は、ＭＳＰ１（配列番号１６）、ＭＳＰ２（配列番号１７）、ＭＳＰ３（配列番号１および配列番号２）、ＭＳＰ４（配列番号１８）、ＭＳＰ５（配列番号１２）およびインスリン様タンパク質６（Ｉｎｓｌ６）（配列番号２０）の群から選択される少なくとも１つである。
【００７６】
１つの実施態様では、本発明の代謝調節因子は、筋肉分泌タンパク質１（ＭＳＰ１）であり、これは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＢＣ５２８４４として、またはＲｉｋｉｎクローン２１６００２８Ｆ０８Ｒｉｋ（配列番号１６）として同定することができる。いくつかの実施態様では、ＭＳＰ１は、ＭＳＰ１のヒトホモログまたはＭＳＰ１のヒト同族体であり、そしていくつかの実施態様では、ＭＳＰ１は、ＭＳＰ１のげっ歯類アイソフォームまたはＭＳＰ１の任意の哺乳動物アイソフォーム、例えば霊長類ＭＳＰ１である。ＭＳＰ１の全ての変異体およびホモログ、およびＭＳＰ１の機能性誘導体、例えば、ＭＳＰ１の突然変異体および／またはオルタナティブアイソフォーム、例えば、ＭＳＰ１のオルタナティブスプライスアイソフォーム、ＭＳＰ１のフラグメント、またはＭＳＰ１の組換え形態もＭＳＰ１という用語に包含される。
【００７７】
別の実施態様では、本発明の代謝調節因子は、筋肉分泌タンパク質２（ＭＳＰ２）であり、これは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＡＫ００９７７９として、またはＲｉｋｉｎクローン２３１００４３Ｉ０８Ｒｉｋ（配列番号１７）として同定することができる。いくつかの実施態様では、ＭＳＰ２は、ＭＳＰ２のヒトホモログまたはＭＳＰ２のヒト同族体であり、そしていくつかの実施態様では、ＭＳＰ２は、ＭＳＰ２のげっ歯類アイソフォームまたはＭＳＰ２の任意の哺乳動物アイソフォーム、例えば霊長類ＭＳＰ２である。ＭＳＰ２の全ての変異体およびホモログ、およびＭＳＰ２の機能性誘導体、例えば、ＭＳＰ２の突然変異体および／またはオルタナティブアイソフォーム、例えば、ＭＳＰ２のオルタナティブスプライスアイソフォーム、ＭＳＰ２のフラグメント、またはＭＳＰ２の組換え形態もＭＳＰ２という用語に包含される。
【００７８】
別の実施態様では、本発明の代謝調節因子は、筋肉分泌タンパク質２（ＭＳＰ３）であり、これは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０２６７５４として、またはＲｉｋｉｎクローン１１１００１７Ｉ１６Ｒｉｋ（配列番号１）またはアミノ酸配列ＮＰ＿６６０３５７（配列番号５）として同定される。いくつかの実施態様では、ＭＳＰ３は、ＭＳＰ３のヒトホモログまたはＭＳＰ３のヒト同族体であり、そしていくつかの実施態様では、ＭＳＰ３は、ＭＳＰ３のげっ歯類アイソフォーム、例えば、アミノ酸配列Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０８１０３０（配列番号３）またはＸＰ＿００１０６６２５８（配列番号４）またはＭＳＰ３の任意の哺乳動物アイソフォーム、例えば霊長類ＭＳＰ３である。ＭＳＰ３の全ての変異体およびホモログ、およびＭＳＰ３の機能性誘導体、例えば、ＭＳＰ３の突然変異体および／またはオルタナティブアイソフォーム、例えば、ＭＳＰ３のオルタナティブスプライスアイソフォーム、例えば、図１６に示すようなＭＳＰ３の長鎖アイソフォーム（配列番号１）またはＭＳＰ３の短鎖アイソフォーム（配列番号２）、またはＭＳＰ３のフラグメント、例えばシグナルペプチドを欠くＭＳＰ３、またはＭＳＰ３の組換え形態もＭＳＰ３という用語により包含される。
【００７９】
別の実施態様では、本発明の代謝調節因子は、筋肉分泌タンパク質４（ＭＳＰ４）であり、これは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＢＣ０２５８８０またはアクセッション番号：ＡＫ０２８８８３（配列番号１８）として、またはＲｉｋｉｎクローン４７３２４６６Ｄ１７Ｒｉｋ（配列番号１８）として同定することができる。いくつかの実施態様では、ＭＳＰ４は、ＭＳＰ４のヒトホモログまたはＭＳＰ４ヒト同族体であり、そしていくつかの実施態様では、ＭＳＰ４は、ＭＳＰ４のげっ歯類アイソフォームまたはＭＳＰ４の任意の哺乳動物アイソフォーム、例えば霊長類ＭＳＰ４である。ＭＳＰ４の全ての変異体およびホモログ、およびＭＳＰ４の機能性誘導体、例えば、ＭＳＰ４の突然変異体および／またはオルタナティブアイソフォーム、例えば、ＭＳＰ４のオルタナティブスプライスアイソフォーム、ＭＳＰ４のフラグメント、またはＭＳＰ４の組換え形態もＭＳＰ４という用語により包含される。
【００８０】
別の実施態様では、本発明の代謝調節因子は、筋肉分泌タンパク質５（ＭＳＰ５）であり、これは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＡＫ００５４６５またはＮＭ＿０２４２３７として、またはＲｉｋｉｎクローン１６０００１５Ｈ２０Ｒｉｋ（配列番号１２）またはアミノ酸配列ＮＰ＿６９４９４６（配列番号１５）として同定される。いくつかの実施態様では、ＭＳＰ５は、ＭＳＰ５のヒトホモログまたはＭＳＰ５のヒト同族体であり、そしていくつかの実施態様では、ＭＳＰ５は、ＭＳＰ５のげっ歯類アイソフォーム、例えば、アミノ酸配列ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＸＰ＿００１０８１１２４（配列番号１３）またはＮＰ＿０７７１９９（配列番号１４）、またはＭＳＰ５の任意の哺乳動物または非哺乳動物アイソフォーム、例えば、無脊椎動物ＭＳＰ５または霊長類ＭＳＰ５である。ＭＳＰ５の全ての変異体およびホモログ、およびＭＳＰ５の機能性誘導体、例えば、ＭＳＰ５の突然変異体および／またはオルタナティブアイソフォーム、例えば、ＭＳＰ５のオルタナティブスプライスアイソフォーム、またはＭＳＰ５のフラグメント、例えばシグナルペプチドを欠くＭＳＰ５、またはＭＳＰ５の組換え形態もＭＳＰ５という用語により包含される。
【００８１】
別の実施態様では、本発明の代謝調節因子は、インスリン様タンパク質６（Ｉｎｓｌ６）であり、これは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００７１７９（配列番号２０）として、またはアクセッション番号：ＡＦ＿１５６０９４（配列番号２０）、またはアミノ酸配列ＮＰ＿００９１１０（配列番号１５）として同定されるリラキシンファミリーのメンバーである。いくつかの実施態様では、Ｉｎｓｌ６は、Ｉｎｓｌ６のヒトホモログまたはＩｎｓｌ６のヒト同族体であり、そしていくつかの実施態様では、Ｉｎｓｌ６は、Ｉｎｓｌ６のげっ歯類アイソフォーム、またはＩｎｓｌ６の任意の哺乳動物または非哺乳動物アイソフォーム、例えば、無脊椎動物Ｉｎｓｌ６または霊長類ＭＳＰ５である。Ｉｎｓｌ６の全ての変異体およびホモログ、およびＩｎｓｌ６の機能性誘導体、例えば、Ｉｎｓｌ６の突然変異体および／またはオルタナティブアイソフォーム、例えば、Ｉｎｓｌ６のオルタナティブスプライスアイソフォーム、またはＩｎｓｌ６のフラグメント、例えばシグナルペプチドを欠くＭＳＰ５、またはＩｎｓｌ６の組換え形態もＩｎｓｌ６という用語により包含される。
【００８２】
本発明の１つの態様は、本発明の代謝調節因子を活性化する薬剤を含む組成物に関する。いくつかの実施態様では、薬剤は、本発明の代謝調節因子をコードする核酸配列であり、例えば、薬剤は、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６、またはその変異体またはホモログまたはフラグメントまたは機能性誘導体をコードする外来性または内在性遺伝子の核酸である。いくつかの実施態様では、薬剤は、内在性代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の発現を活性化する。別の実施態様では、薬剤は、代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体またはホモログまたは変異体、または代謝調節因子の組換え変異体のペプチドまたはポリペプチドである。別の実施態様では、薬剤は、代謝調節因子のアゴニスト、例えば、代謝調節因子の発現を誘導する薬剤、または代謝調節因子のペプチドまたは遺伝子産物を活性化する薬剤、例えば、それらに限定されないが、不活性代謝調節因子タンパク質を活性化するかまたは代謝調節因子タンパク質前駆体を活性化する薬剤、または転写後産物または代謝調節因子遺伝子を活性化する、例えば、転写物、例えば、代謝調節因子をコードするｍＲＮＡ転写物を活性化する薬剤である。いくつかの実施態様では、薬剤が代謝調節因子をコードする核酸である場合、核酸は、代謝調節因子の機能性誘導体または変異体または組換え型をコードすることができる。
【００８３】
いくつかの実施態様では、代謝調節因子をコードする核酸は、機能性の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６（例えば、全長タンパク質）、または例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６タンパク質の機能的活性フラグメントをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡまたはそのフラグメントの部分である。「機能的活性」という用語は、全長（野生型）ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６ポリペプチドに関連する１つ以上の機能を有するフラグメント、誘導体またはアナログをさす。
【００８４】
いくつかの実施態様では、薬剤が代謝調節因子をコードする核酸である場合、代謝調節因子は代謝調節因子をコードする薬剤が投与される対象と同じ種に由来し、例えば、代謝調節因子はヒトのものであり、そして対象はヒトである。別の実施態様では、代謝調節因子をコードする核酸は異なる種に由来し、例えば、核酸は非ヒト哺乳動物、例えば霊長類またはマウスに由来する代謝調節因子をコードし、そして対象はヒトであり、または別の例では、核酸はヒト代謝調節因子をコードし、そして対象は非ヒト動物、例えばトランスジェニック動物、またはげっ歯類、または非哺乳動物、例えば無脊椎動物、例えばゼブラフィッシュであり、いくつかの実施態様では、対象はトランスジェニック動物である（例えば、マウスで過剰発現されたマウス代謝調節因子）。いくつかの実施態様では、代謝調節因子は、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の同族異種遺伝子である。同族異種ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６遺伝子は、別の種由来の対応遺伝子をさし、従って、マウスＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６が基準である場合、ヒトＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６遺伝子は同族異種遺伝子である（ブタ、ヒツジ、またはラットの関連筋肉と同様に、他の種由来の筋肉関連遺伝子とともに）。いくつかの実施態様では、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６遺伝子は、ヒトＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはその機能的活性フラグメントをコードすることができる。
【００８５】
代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６タンパク質は、「相同」または「異種（heterologous）ポリペプチド」であることができる。「異種間（xenogenic）ポリペプチド」ともいう「異種ポリペプチド」は、トランスジェニック非ヒト動物からなるのではない生物において見出されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーおよびその等価物をさし、そして産物の特定の長さをさすものではなく；従って、ポリペプチドの定義内には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。誘導体は、別の配列と比較して、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドである。誘導体には、さらに、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの修飾体を含む、タンパク質の他の修飾が含まれる。
【００８６】
同族異種タンパク質配列をコードする種々の遺伝子セグメントを含む、代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６遺伝子は、例えば、ハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定によって、トランスジェニック動物以外の生物の種からのものであることを容易に同定しうる。いくつかの実施態様では、同族代謝調節因子は、相同筋肉関連トランスジーンに、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である。本明細書で使用する「同一」または「％同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定して、最大の対応について比較し整列させた場合に、同じであるか、または同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を明記した割合で有する、２つ以上の配列またはサブ配列（subsequence）をさす。「実質的に同一」という語句は、２つの核酸またはポリペプチドに関して、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定して、最大の対応について比較し整列させた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性が、少なくとも６０％、典型的には８０％、最も典型的には９０〜９５％である、２つ以上の配列またはサブ配列をさす。２つのポリペプチド配列が「実質的に同一」であることの指標は、１つのポリペプチドが、第２のポリペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であるということである。
【００８７】
いくつかの実施態様では、代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６タンパク質は、相同ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６タンパク質と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％類似する。本明細書で使用する「類似性」または「％類似性」は、２つ以上のポリペプチド配列に関して、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定して、最大の対応について比較し整列させた場合に、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基またはその保存的置換を明記した割合で有する、２つ以上の配列またはサブ配列をさす。例として、以下に論じるように、第１の配列に含まれている数と同数のアミノ酸と比較した場合、または当技術分野で公知のコンピューター類似性プログラムによって整列させたポリペプチドのアラインメントと比較した場合、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％さえも同一であるか、または保存的に置換されている場合に、第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列と類似するとみなし得る。
【００８８】
「実質的類似性」という用語は、ポリペプチド配列に関して、ポリペプチドが、約１０〜２０アミノ酸残基の比較ウインドウにわたって、参照配列に対して少なくとも６０％の配列同一性、または参照配列に対して７０％、または８０％、または８５％の配列同一性、または最も好ましくは９０％の同一性を有する配列を含むということを示す。アミノ酸配列に関して、「実質的類似性」は、さらに、アミノ酸の保存的置換を含む。従って、例えば、２つのペプチドが１つ以上の保存的置換によって異なる場合、ポリペプチドは第２のポリペプチドに実質的に類似する。
【００８９】
本発明の遺伝子のヒトホモログの決定は、当業者によって容易に確認され得る。「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性をさす。相同性および同一性は、各々、比較の目的のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の等価な位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置で同一であり；同じまたは類似のアミノ酸残基（例えば、立体的および／または電子的性質で類似）によって等価な部位が占有されている場合、分子はその位置で相同（類似）ということができる。相同性／類似性または同一性の割合としての表現は、比較される配列によって共有される位置における同一または類似のアミノ酸数の関数をさす。「無関係」または「非相同」である配列は、本出願の配列と４０％未満の同一性を共有するが、２５％未満の同一性が好ましい。
【００９０】
１つの実施態様では、代謝調節因子に関連するとして同定された遺伝子転写物の「ヒトホモログ」という用語は、ヒト、または動物、例えば、マウスまたはトランスジェニック動物のゲノムによってコードされるＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６遺伝子の配列の全長ヌクレオチド配列に対して、少なくとも約５５％の相同性を有するＤＮＡ配列をさす。１つの実施態様では、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６に関連するとして同定されたタンパク質の「ヒトホモログ」という用語は、本発明のトランスジェニック動物のゲノムによってコードされるＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６に関連するとして同定されたタンパク質の全長アミノ酸配列に対して、４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、よりさらに好ましくは少なくとも約６０％の相同性、よりさらに好ましくは少なくとも約７０％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約７５％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約８０％の相同性、よりさらに好ましくは少なくとも約８５％の相同性、よりさらに好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するアミノ酸配列をさす。上記ように、相同性は、少なくとも約５０％〜１００％、およびその間の全ての間隔（すなわち、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％など）である。
【００９１】
「保存的置換」という用語は、ポリペプチドについて記載する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変化させない、ポリペプチドのアミノ酸組成物の変更をさす。従って、特定のアミノ酸配列の「保存的置換」は、ポリペプチド活性に重要でないアミノ酸の置換、または重要なアミノ酸の置換であっても活性を実質的に変化することはないような類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正または負の電荷、極性または非極性など）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換をさす。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。例えば、以下の６つの群は、各々互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)も参照）。さらに、コードされた配列において単一のアミノ酸またはアミノ酸の少しの割合を変化、付加または欠失させる、個々の置換、欠失または付加もまた「保存的置換」である。
【００９２】
配列の比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として作用し、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であればサブ配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、指定したプログラムパラメーターに基づいて、配列比較アルゴリズムが、参照配列と比較しての試験配列についての％配列同一性を算出する。
【００９３】
比較のための配列の至適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)（参照により本明細書に組み入れる）の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970)（参照により本明細書に組み入れる）の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)（参照により本明細書に組み入れる）の類似性探索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（例えば、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis. 中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって実施することができる。（一般的に、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999)を参照されたい）。
【００９４】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、％配列同一性を示すために、累進的対アラインメント（progressive, pairwise alignment）を使用して、関連配列の群から多重配列アラインメントを作成する。それは、アラインメントを作成するために使用されるクラスター形成関係を示す樹形図（tree or dendogram）もプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Feng and Doolittle (J. Mol. Evol. 25:351-60 (1987)、参照により本明細書に組み入れる）の累進的アラインメント法の簡素化を使用する。使用する方法は、Higgins and Sharp (Comput. Appl. Biosci. 5:151-53 (1989)、参照により本明細書に組み入れる）により記載される方法に類似する。プログラムは、各々が最大５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸長の３００個までの配列を整列させることができる。多重アラインメント手順は、２つの最も類似する配列の対アラインメントから始まり、２つの整列した配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターを、整列した配列の次に最も関連する配列またはクラスターと整列させる。２つの個々の配列の対アラインメントの単純な伸展によって、２つの配列のクラスターを整列させる。最終アラインメントは、一連の累進的対アラインメントによって達成される。配列比較の領域のために特定の配列、およびそのアミノ酸またはヌクレオチドの座標を指定し、そしてプログラムパラメーターを指定することによって、プログラムを実行する。例えば、以下のパラメーター：デフォルトギャップ加重（default gap weight）（３．００）、デフォルトギャップ長加重（default gap length weight）（０．１０）、および加重末端ギャップ（weighted end gap）を使用して、参照配列を他の試験配列と比較して、％配列同一性の関係を決定することができる。
【００９５】
％配列同一性および配列類似性の決定に適切なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)、参照により本明細書に組み入れる）によって記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Zhang et al., Nucleic Acid Res. 26:3986-90 (1998)；Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997)も参照、これらを参照により本明細書に組み入れる）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationのインターネットウェブサイトを通じて、公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、ある正の値の閾値スコアＴに適合するかまたはこれを満たす、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称する（Altschul et al.（1990）、先出）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための探索を開始するためのシーズとして作用する。次いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向にワードヒットを伸展させる。各方向へのワードヒットの伸展は、以下の場合に中止する：累積アラインメントスコアが、量Ｘだけその最大到達値から降下する；１つ以上の負のスコア残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロ以下に落ちる；または、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸによって、アラインメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9 (1992)参照、参照により本明細書に組み入れる）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００９６】
％配列同一性の算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばKarlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)参照、参照により本明細書に組み入れる）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約０．１未満、より典型的には約０．０１未満、最も典型的には約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似すると考えられる。
【００９７】
本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のホモログも、本発明での使用に包含され、例えば、発現ライブラリーからのＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の発現によって同定することもできる。（例えばSambrook et al., (2001). Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. (Cold Spring Harbor, N. Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Ausubel et al.（先出）を参照）。変異した内在性遺伝子配列は、異種トランスジーンと呼ぶことができ、例えば、天然マウスゲノム中では知られていないマウス筋肉関連遺伝子中の変異をコードするトランスジーンは、マウス種および非マウス種に関して異種トランスジーンである。ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６遺伝子はまた、例えば、米国特許公開第２００４／００４８２５５号および同第２００４／０１３２１５６号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れる）に開示されているもののような、改変されたＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６タンパク質をコードすることができる。
【００９８】
薬剤
本発明で有用な薬剤は、本発明の代謝調節因子の活性を標的化する任意の物体（生物学的または化学的）である。薬剤は、代謝調節因子を活性化するためのとしてアゴニスト、または代謝調節因子の活性を抑制しまたは阻害するためのアンタゴニストとして機能することができる。薬剤は、低分子、タンパク質、ポリペプチド、核酸、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、受容体、リガンド、および抗体、アプタマー、ポリペプチド、核酸アナログまたはその変異体（核酸、アミノ酸、または炭水化物のオリゴマーを含む）であってよく、それらに限定されないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、およびその修飾および組み合わせを含む。
【００９９】
薬剤は、直接的または間接的いずれかの作用を介して、転写、翻訳、転写後または翻訳後プロセシングを防止するように、またはそうでなければ、何らかの方法でタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすように働き得る。薬剤は、例えば、核酸、ペプチド、または任意の他の適切な化学化合物または分子またはこれらの任意の組み合わせでありうる。さらに、薬剤は、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性に間接的に影響を及ぼすことができ、例えば、それらに限定されないが、薬剤は、次に調節因子またはタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド自体として作用しうる細胞分子の活性に影響を及ぼし得ることが理解される。同様に、薬剤は、それ自体が、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドによる調節または調整に供される分子の活性に影響を及ぼし得る。
【０１００】
いくつかの実施態様では、薬剤は、遺伝子発現を調節するように遺伝子転写のレベルで作用し、例えば、アゴニストは遺伝子発現を活性化し、そしてアンタゴニストは遺伝子転写を阻害する。いくつかの実施態様では、薬剤は、タンパク質の機能を調節するようにタンパク質のレベルで作用し、例えば、アゴニストは、タンパク質の活性を活性化および／または増強し、一方アンタゴニストは、タンパク質の活性を阻害および／または抑制することができる。別の実施態様では、薬剤は、代謝調節因子をコードする核酸または核酸アナログである。さらに別の実施態様では、薬剤は、ペプチドまたはポリペプチドであり、例えば、アゴニストは、タンパク質の生物学的に活性なまたは機能性の誘導体であり、一方アンタゴニストは、例えば、阻害ポリペプチドまたはドミナントネガティブポリペプチドであり得る。
【０１０１】
本発明の代謝調節因子のポリペプチド、そのフラグメントおよび誘導体は、任意の適切な方法によって得ることができる。例えば、ポリペプチドは、従来の組換え核酸技術、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを使用して、産生することができる。組換えＤＮＡ技術を使用したポリペプチドの産生のための方法および材料に関する指針および情報は、多数の専門書および参考手引き書に見出すことができる。例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press；Ausubel et al. (eds.), 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.；Innis et al. (eds.), 1990 PCR Protocols, Academic Pressを参照されたい。
【０１０２】
あるいは、本発明の代謝調節因子のポリペプチドまたはそのフラグメントは、化学合成によって、例えば、販売者の使用説明書に従って市販のペプチドシンセサイザーを使用して、直接得ることができる。ポリペプチドの化学合成のための方法および材料は、当技術分野で周知である。例えばMerrifield, 1963, "Solid Phase Synthesis," J. Am. Chem. Soc. 83:2149-2154を参照されたい。
【０１０３】
本発明の代謝調節因子のポリペプチドは、タンパク質をインタクトな細胞に輸送するための従来の技術を使用して、例えば、ポリペプチドを、アンテナペディア由来のインターナライゼーションペプチド配列（Bonfanti  et al., Cancer Res. 57:1442-1446）またはＨＩＶ ｔａｔペプチドなどの核局在化タンパク質（米国特許第５，６５２，１２２号）に融合することによって、細胞に導入することができる。
【０１０４】
あるいは、本発明の代謝調節因子のポリペプチドは、タンパク質をコードするＤＮＡ、例えば、代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログまたは機能性誘導体をコードする核酸の、例えば、従来の発現ベクター中でのまたはカテーテルによるまたはエキソビボ移植による導入の後に細胞中で発現させることができる。
【０１０５】
いくつかの実施態様では、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのフラグメントまたはホモログまたはその変異体のポリペプチドまたはペプチドである薬剤は、切断可能なペプチドである。切断可能なペプチドは、細胞によって発現されそして周囲の組織中に見出されるか、または哺乳動物において感染を確立することができる微生物によって産生されるプロテアーゼまたはペプチダーゼまたは他の切断薬剤によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチドである。酵素切断可能ペプチドは、必要というわけではないが、アミノ酸認識配列に加えて、１つ以上のアミノ酸を含むことができる；追加のアミノ酸は、認識配列のアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノおよびカルボキシ末端の両方に付加することができる。アミノ酸をアミノ酸配列に付加する手段（例えば、自動ペプチドシンセサイザーで）、およびペプチドの切断を検出する手段（例えば、該切断のアミノ酸産物用のクロマトグラフィー分析による）は、本発明の教示を得た当業者に周知である。酵素切断可能ペプチドは、典型的には約２〜２０アミノ酸長である。
【０１０６】
本発明で有用なペプチドまたはポリペプチド薬剤は、例えば、その親水性を増加させるために、そのアミノ末端で修飾することができる。疎水性の増加は、その中に親ペプチド−脂質コンジュゲートが組み込まれた脂質ベースの担体の表面でのペプチドの曝露を増強する。その親水性を増加させるためにペプチドへ結合するのに適した極性基は周知であり、例えば、それらに限定されないが、アセチル（「Ａｃ」）、３−シクロヘキシルアラニル（「Ｃｈａ」）、アセチル−セリン（「Ａｃ Ｓｅｒ」）、アセチル−セリル−セリン（「Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−」）、スクシニル（「Ｓｕｃ」）、スクシニル−セリン（「Ｓｕｃ−Ｓｅｒ」）、スクシニル−セリル−セリン（「Ｓｕｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ」）、メトキシスクシニル（「ＭｅＯ−Ｓｕｃ」）、メトキシスクシニル−セリン（「ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ｓｅｒ」）、メトキシスクシニル−セリル−セリン（「ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ」）およびセリル−セリン（「Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−」）基、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリアクリルアミド、ポリアクリロモルホリン、ポリビニルピロリジン、ポリヒドロキシル基およびカルボキシ糖類、例えば、ラクトビオン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、およびシアル酸基を含む。これらの糖類のカルボキシ基は、アミド結合を介して、ペプチドのＮ末端に連結される。ここで、好ましいＮ末端修飾は、メトキシ−スクシニル修飾である。
【０１０７】
遺伝子治療
特定の実施態様では、核酸配列はインビボで直接投与され、ここで核酸配列はコードされている産物を産生するように発現させられる。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって、例えば、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与すること、例えば、欠陥または弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用する感染（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または裸のＤＮＡの直接的注射、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）の使用、または脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト剤でのコーティング、リポソーム、微小粒子、またはマイクロカプセル中のカプセル化、または核に進入することが知られているペプチドに連結してそれを投与すること、受容体媒介エンドサイトーシスに供されるリガンドに結合してそれを投与すること（例えばWu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照）（受容体を特異的に発現する細胞型を標的化するために使用することができる）などによって達成することができる。別の実施態様では、核酸−リガンド複合体を形成することができ、ここで、リガンドはエンドソームを破壊するために膜融合ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソームの分解を回避することを可能にする。さらに別の実施態様では、特異的受容体を標的化することによって、核酸を、細胞特異的取り込みおよび発現のために、インビボで標的化することができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８、ＷＯ９３／２０２２１を参照）。あるいは、相同組換えによって、核酸を発現のために細胞内に導入しそして宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989)；Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)）。
【０１０８】
特定の実施態様では、本発明の代謝調節因子のヒトホモログをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要な成分を含む。遺伝子治療で使用しようとする筋肉成長に関連する因子のヒトホモログをコードする核酸配列を、患者への遺伝子の送達を促進する１つ以上のベクター中にクローン化する。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出すことができ、これには、化学療法に対してより抵抗性の幹細胞を作製をするためにｍｄｒｌ遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療でのレトロウイルスベクターの使用を示す他の参考文献は、Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)；Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994)；Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)；およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)である。
【０１０９】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用することができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸上皮に送達するために特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、自然に呼吸上皮に感染し、ここで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を有する。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)には、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概説が示されている。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)は、遺伝子をアカゲザルの呼吸上皮に移入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証している。別の好ましいウイルスベクターは、ワクシニアなどのポックスウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、鶏痘ポックスまたはカナリヤポックスなどのトリポックスである。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991)；Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)；Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91 :225-234 (1993)；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９；およびWang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)に見出すことができる。１つの好ましい実施態様では、アデノウイルスベクターが使用される。別の実施態様では、米国特許第６，１４３，５２０号；同第５，６６５，５５７号；および同第５，９８１，２７６号（参照により本明細書に組み入れる）に記載されているＨＩＶベースのベクターなどの、レンチウイルスベクターが使用される。
【０１１０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も企図される（Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０１１１】
遺伝子治療の別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法による組織培養中の細胞への遺伝子の移入を含む。通常、移入の方法は、細胞への選択マーカーの移入を含む。次いで、移入された遺伝子を取り込みそして発現している細胞を単離するために、細胞を選択下に置く。次いで、それらの細胞を患者に送達する。
【０１１２】
米国特許第５，６７６，９５４号（参照により本明細書に組み入れる）は、カチオン性リポソーム担体と複合体を形成した遺伝材料のマウスへの注射について報告している。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開ＷＯ９４／９４６９（これらを参照により本明細書に組み入れる）は、細胞および哺乳動物へのＤＮＡのトランスフェクションにおいて使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開ＷＯ９４／９４６９（参照により本明細書に組み入れる）は、哺乳動物にＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を送達するための方法を提供する。そのようなカチオン性脂質複合体またはナノ粒子を使用して、タンパク質を送達することもできる。タンパク質は、好ましくｈあ核局在化配列を含む。
【０１１３】
遺伝子治療およびタンパク質治療の方法の一般的概説については、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)；Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)を参照されたい。当技術分野で一般に知られている使用することができる方法は、Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０１１４】
遺伝子または核酸配列は、任意の適切な方法によって標的細胞に導入することができる。例えば、代謝調節因子は、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション）、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション（例えば、裸のＤＮＡの直接注射による）、微粒子銃、筋肉関連トランスジーンを含むウイルスベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、マイクロセル媒介遺伝子移入、核移入などにより細胞に導入することができる。代謝調節因子をコードする核酸薬剤は、エレクトロポレーション（例えばWong and Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-87 (1982)を参照）および微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Johnston and Tang, Methods Cell Biol.43 Pt A:353-65 (1994)；Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478-82 (1993)）によって細胞に導入することができる。
【０１１５】
特定の実施態様では、代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体をコードする遺伝子または核酸配列を、トランスフェクションまたはリポフェクションにより標的細胞に導入することができる。トランスフェクションまたはリポフェクションに適切な薬剤には、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、lipofectin、lipfectamine、ＤＩＭＲＩＥ Ｃ、Superfect、およびEffectin（Qiagen）、unifectin、maxifectin、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ（Transfectam；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などが含まれる。（例えば、Banerjee et al., Med. Chem. 42:4292-99 (1999)；Godbey et al., Gene Ther. 6:1380-88 (1999)；Kichler et al., Gene Ther. 5:855-60 (1998)；Birchaa et al., J. Pharm. 183:195-207 (1999)をそれぞれ参照されたい。
【０１１６】
代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体をコードする遺伝子または核酸配列を、細胞の感染によって細胞中に、または突然変異遺伝子を含む感染性ウイルスとの接合体の細胞中に導入することもできる。適切なウイルスには、レトロウイルス（一般的に、Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-64 (1976)を参照）；欠陥または弱毒化レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号；Miller et al., Meth. Enzymol.217:581-99 (1993)；Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)を参照、これらの参考文献の全体を本明細書に組み入れる）、レンチウイルスベクター（例えば、Naldini et al., Science 272:263-67 (1996)を参照、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、Ali et al., Gene Therapy 1 :367-84 (1994)；米国特許第４，７９７，３６８号および同第５，１３９，９４１号、Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993)；Grimm et al., Human Gene Therapy 10:2445-50 (1999)を参照、これらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れる）が含まれる。
【０１１７】
ウイルスベクターは、例えば、胚幹細胞、始原生殖細胞、卵母細胞、卵、精母細胞、精子細胞、受精卵、接合体、割球、または他の任意の適切な標的細胞に導入することができる。例示的な実施態様では、分裂細胞を形質導するレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス由来ベクター；例えばMiller and Baltimore, Mol. Cell. Biol. 6:2895 (1986)を参照）を使用することができる。典型的には、目的の遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターの生成は２段階で達成される。まず、代謝調節因子を、代謝調節因子の効率的な発現に必要な配列（ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）または内部プロモーター／エンハンサーによって提供され得るプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントおよび関連のスプライシングシグナルを含む）、ウイルスＲＮＡを感染性ビリオンに効率的にパッケージングするのに必要な配列（例えば、パッケージングシグナル（Ｐｓｉ）、ｔＲＮＡプライマー結合部位（−ＰＢＳ）、逆転写に必要な３’調節配列（＋ＰＢＳ）、およびウイルスＬＴＲ）を含む、レトロウイルスベクター中に挿入することができる。ＬＴＲは、ウイルスゲノムＲＮＡの会合、逆転写酵素およびインテグラーゼ機能に必要な配列、およびウイルス粒子中にパッケージングしようとするゲノムＲＮＡの発現の指示に関与する配列を含む。
【０１１８】
組換えベクターの構築後、ベクターＤＮＡをパッケージング細胞株に導入する。パッケージング細胞株は、所望の宿主域を有するウイルス粒子にウイルスゲノムＲＮＡをパッケージングするためにトランスに必要とされるウイルスタンパク質を提供する（例えば、ウイルスにコードされるコア（ｇａｇ）、ポリメラーゼ（ｐｏｌ）およびエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質）。宿主域は、ウイルス粒子の表面に発現されたエンベロープ遺伝子産物の型によって、部分的に、制御される。パッケージング細胞株は、エコトロピック、アンホトロピックまたはゼノトロピックエンベロープ遺伝子産物を発現することができる。あるいは、パッケージング細胞株は、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質をコードする配列を欠くことができる。この場合は、パッケージング細胞株は、膜結合タンパク質（例えば、ｅｎｖタンパク質）を欠く粒子中にウイルスゲノムをパッケージングすることができる。細胞へウイルスを侵入させる膜結合タンパク質を含むウイルス粒子を産生するために、レトロウイルス配列を含むパッケージング細胞株を、膜結合タンパク質（例えば、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質）をコードする配列を用いてトランスフェクトすることができる。次いで、トランスフェクトしたパッケージング細胞株は、トランスフェクトされたパッケージング細胞株によって発現される膜結合タンパク質を含むウイルス粒子を産生することができる；別のウイルスのエンベロープタンパク質によってキャプシド形成されている１つのウイルスに由来するウイルスゲノムＲＮＡを含むこれらのウイルス粒子は、シュードタイプウイルス粒子であると言われる。
【０１１９】
タンパク質および／または核酸などの薬剤の治療送達のための当技術分野で公知の方法（例えば、細胞トランスフェクション、遺伝子治療、送達ビヒクルまたは医薬的に許容される担体による直接投与、本発明の標的化融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組換え細胞の提供による間接送達）を、対象において代謝機能を調節するための、本発明の代謝調節因子をコードする薬剤ポリペプチドまたは薬剤核酸の送達のために使用することができる。
【０１２０】
種々の送達システム（例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル中のカプセル化、化合物を発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えばWu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）が公知であり、そして本発明の薬剤ポリペプチドを投与するために使用することができる。導入方法は、腸内または非経口であることができそして、それらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺、鼻腔内、眼内、硬膜外、および経口経路を含む。薬剤は、任意の好都合な経路、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮層または粘膜皮膚層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収によって投与してもよく、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身的または局所的であることができる。さらに、本発明の医薬組成物を、脳室内およびくも膜下腔内注射を含む任意の適切な経路によって、中枢神経系に導入することが所望され得る；脳室内注射は、例えばオンマヤ槽などのリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルによって容易にしうる。例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤を用いる製剤によって、肺投与を用いることもできる。
【０１２１】
特定の実施態様では、本発明の医薬組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましくあり得；これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入、局所適用、例えば注射によって、カテーテルによって、またはインプラントによって達成し得、インプラントは、シラスティック（sialastic）膜、線維、または市販の代用皮膚などの膜を含む、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質物質である。
【０１２２】
別の実施態様では、活性薬剤を、小胞、特にリポソーム中で送達することができる（Langer (1990) Science 249:1527-1533を参照）。さらに別の実施態様では、活性薬剤を、制御放出システム中で送達することができる。１つの実施態様では、ポンプを使用し得る（Langer（1990）（先出）参照）。別の実施態様では、ポリマー物質を使用することができる（Howard et al., (1989) J. Neurosurg. 71:105を参照）。本発明の活性薬剤がタンパク質をコードする核酸である別の実施態様では、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築しそしてそれが細胞内になるように投与すること、例えば、レトロウイルスベクターの使用（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注射、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）の使用、または脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト剤でのコーティング、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結してそれを投与すること（例えば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照）などによって、そのコードされたタンパク質の発現を促進するように核酸をインビボで投与することができる。あるいは、相同組換えによって、発現にために、核酸を細胞内に導入し、そして宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１２３】
抗体。いくつかの実施態様では、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６の薬剤は、例えば、抗体（モノクローナル抗体、キメラヒト化抗体および組換え抗体およびそのフラグメントを含む）を含む。いくつかの実施態様では、中和抗体を、本発明の代謝調節因子のアンタゴニストである薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログの阻害薬として使用することができる。抗体は、遺伝子産物での免疫化によって、ウサギまたはマウスなどの動物中で容易に惹起され、その遺伝子産物は、不活化されると、抗菌剤の効果を増強する。免疫化したマウスは、ハイブリドーマの製造のためのＢ細胞の供給源を提供するために特に有用であり、次に、ハイブリドーマは大量のモノクローナル抗体を産生するために培養される。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する２つ以上のセグメントまたは部分によって特徴付けられる免疫グロブリン分子である。一般に、キメラ抗体の可変領域は、マウスモノクローナル抗体などの非ヒト哺乳動物抗体に由来し、そして免疫グロブリン定常領域は、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましくは、両方の領域および組み合わせは、ルーチンに決定した場合低い免疫原性を有する。ヒト化抗体は、マウス抗原結合領域を保持しつつ、マウス定常領域がヒト対応物で置換されている遺伝子工学技術によって作製された免疫グロブリン分子である。得られたマウス−ヒトキメラ抗体は、ヒトにおいて、免疫原性が低く、そして薬物動態が改善されているはずである。本発明の方法で有用な高親和性モノクローナル抗体およびそのキメラ誘導体のいくつかの例は、欧州特許出願ＥＰ１８６，８３３；ＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１６５５３；および米国特許第６，０９０，９２３号に記載されている。
【０１２４】
抗体は、広範囲の標的抗原およびハプテンに対する高い結合力および特有の特異性を提供する。本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は、抗体全体およびそのフラグメントを含み、そしてハイブリドーマ合成、組換えＤＮＡ技術およびタンパク質合成などの従来技術に従って生成される。有用なモノクローナル抗体およびフラグメントは、任意の種（ヒトを含む）に由来してもよく、または１つより多い種由来の配列を用いるキメラタンパク質として形成してもよい。ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」マウス抗体も、本発明に従って使用される。例えば、マウスモノクローナル抗体を、マウスＦｖ領域（すなわち抗原結合部位を含む）をコードするヌクレオチド配列またはその相補性決定領域を、ヒト定常ドメイン領域およびＦｃ領域をコードするヌクレオチド配列と遺伝子組換えすることによって「ヒト化」しうる。ヒト化された標的化部分は、宿主レシピエントで抗体またはポリペプチドの免疫反応性を減少させると認識されており、欧州特許出願０，４１１，８９３，Ａ２に開示されるのと同様に半減期を増加させ、そして有害な免疫反応の可能性を減少させる。マウスモノクローナル抗体はヒト化形態で好適に使用されるはずである。抗原結合活性は、抗体の可変部分（Ｆｖ）の軽鎖および重鎖に位置する（各々３つ）６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸の配列および立体配座によって決定される。短いペプチドスペーサー配列を介して連結された軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶＨ）から構成される２５kDaの単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子は、現在までに開発された最小の抗体フラグメントである。ｓｃＦｖの遺伝子を含む線維状ファージの表面にｓｃＦｖ分子を提示させるための技術が開発されている。広範な抗原特異性を有するｓｃＦｖ分子が、ｓｃＦｖ−ファージライブラリーの単一の大きなプールに存在しうる。
【０１２５】
ｓｃＦｖ分子の１つの制限は、標的抗原とのその一価の相互作用である。ｓｃＦｖのその標的抗原への結合を改善する最も容易な方法の１つは、多量体の作製を通してその機能的親和性を増加させることである。ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、およびテトラボディ（tetrabody）を形成するための同一ｓｃＦｖ分子の会合は、いくつかの同一Ｆｖモジュールを含みうる。それゆえ、これらの試薬は多価であるが、単一特異性である。各々が異なる親Ｉｇに由来するＶＨおよびＶＬドメインを含む、２つの異なるｓｃＦｖ分子の会合は、完全に機能的な二重特異性のディアボディを形成する。二重特異性ｓｃＦｖの特有の適用は、２つの（隣接する）表面エピトープを介して、同時に同じ標的分子上の２つの部位に結合することである。これらの試薬は、単一のｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを上回る有意な結合力の利点を獲得する。例えば、ミニ抗体、二量体ミニ抗体、ミニボディ、（ｓｃＦｖ）２、ディアボディおよびトリアボディを含むいくつかの多価ｓｃＦｖベースの構造が設計されている。これらの分子は、一定範囲の価（２〜４個の結合部位）、大きさ（５０〜１２０kDa）、可動性および産生の容易さにわたる。単鎖Ｆｖ抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）は、ＶＨおよびＶＬドメインが、少なくとも１２残基のポリペプチドリンカーによって連結されている場合、主に単量体である。単量体ｓｃＦｖは、全ての条件下で、１２および２５アミノ酸長のリンカーを有して熱力学的に安定である。非共有結合性ディアボディおよびトリアボディ分子は、加工が容易であり、そして単一ｓｃＦｖ分子の可変重鎖および可変軽鎖を結合するペプチドリンカーを短縮することによって産生される。ｓｃＦｖ二量体は、高度の可動性を与える両親媒性へリックスによって連結され、そしてミニ抗体構造は、二重らせんを介して結合される２つのミニ抗体（４つのｓｃＦｖ分子）を含む、二量体の二重特異性（ＤｉＢｉ）ミニ抗体を作製するように改変され得る。遺伝子融合したかまたはジスルフィド結合したｓｃＦｖ二量体は、中程度の可動性を提供し、そしてＣ末端のＧｌｙ４Ｃｙｓ配列を付加する直接的クローニング技術によって生成される。ｓｃＦｖ−ＣＨ３ミニボディは、直接的に（ＬＤミニボディ）、または非常に可動性のヒンジ領域を介して（Ｆｌｅｘミニボディ）、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインに連結された、２つのｓｃＦｖ分子から構成される。分子量約８０kDaを有して、これらの二価の構築物は、抗原と有意に結合することができる。Ｆｌｅｘミニボディは、マウスにおいて印象的な腫瘍局在化を示す。二重特異性および三重特異性多量体は、異なるｓｃＦｖ分子の会合によって形成され得る。Ｆａｂまたは単鎖Ｆｖ抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）が、二量体、三量体またはより大きな凝集体に複合体化されると、機能的親和性の増加が達成され得る。一価ｓｃＦｖおよびＦａｂフラグメントを上回る多価ｓｃＦｖの最も重要な利点は、標的抗原への機能的結合親和性（結合力）の獲得である。高結合力には、ｓｃＦｖ多量体が、別個の標的抗原に同時に結合できることが要求される。ｓｃＦｖ単量体と比較してのｓｃＦｖディアボディに対する機能的親和性の獲得は有意であり、そして主としてオフ率��off-rate）の減少に見られ、これは、２つ以上の標的抗原への複数の結合、および１つのＦｖが解離した場合の再結合から生じている。そのようなｓｃＦｖ分子を多量体に会合させる場合、それを、単一標的抗原に対する高結合力、または異なる標的抗原に対する複数の特異性のいずれかを有して設計することができる。抗原への複数の結合は、正しいアラインメントおよびＦｖモジュールの配向に依存する。多価ｓｃＦｖ標的における完全な結合力のためには、抗原結合部位は同じ方向を向いていなければならない。複数の結合が立体的に可能でない場合は、機能的親和性の見かけの獲得は、再結合の増加の効果（これは、拡散速度および抗原濃度に依存する）に起因するものと思われる。それらの特性を改善する部分とコンジュゲートされた抗体も本発明に企図される。例えば、それらのインビボでの半減期を増加させるＰＥＧとの抗体コンジュゲートを本発明のために使用することができる。免疫ライブラリーは、ナイーブのまたは免疫化した動物または患者のＢリンパ球由来の可変抗体フラグメントをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅に供することによって調製される。免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子ファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用する。免疫グロブリン生殖系列遺伝子を使用して、半合成抗体レパートリーを調製することができ、可変フラグメントの相補性決定領域は縮重プライマーを使用するＰＣＲによって増幅される。これらの単一ポットライブラリーには、多数の抗原に対する抗体フラグメントを、単一のライブラリーから単離できるという利点がある。ファージディスプレイ技術を、抗体フラグメントの親和性を増加させるために使用することができ、新たなライブラリーは、ランダムな、コドンに基づくまたは部位特異的な変異誘発によって、個々のドメインの鎖をナイーブレパートリー由来のフラグメントのものとシャッフルすることによって、または細菌ミューテーター株の使用によって、既存の抗体フラグメントから調製される。
【０１２６】
あるいは、抗体またはそのフラグメントを産生するために、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス、例えば、Genpharmによって開発されたモデルを使用することができる。１つの実施態様では、多価相互作用の効果を利用することによって作製された、ペプタボディ（peptabody）と称する新たな型の高結合力結合分子が企図される。半硬性（semirigid）ヒンジ領域を介して、短いペプチドリガンドが軟骨オリゴマー基質タンパク質のコイルドコイルアセンブリドメインと融合させられ、五量体多価結合分子が得られた。本発明の好ましい実施態様では、リガンドおよび／またはキメラ阻害薬は、例えば、抗リガンド抗体（Ａｂ）および特異的標的に対するＡｂの化学的連結によって産生された二重特異性抗体を使用することによって、組織または腫瘍特異的標的に標的化され得る。化学的コンジュゲートの制限を回避するために、抗体の分子的コンジュゲートを、細胞表面分子のリガンドおよび／またはキメラ阻害薬を指向させる組換え二重特異性単鎖Ａｂの産生のために使用することができる。あるいは、標的化部分に結合した２つ以上の活性薬剤および／または阻害薬を投与することができ、ここで、各コンジュゲートは、標的化部分、例えば異なる抗体を含む。各抗体は、異なる標的部位エピトープと反応性である（同じかまたは異なる標的部位抗原と結合している）。薬剤が結合した異なる抗体は、所望の標的部位で相加的に蓄積する。以下でより詳細に記載するように、標的部位に薬剤を送達するために、抗体ベースのまたは非抗体ベースの標的化部分を用い得る。好ましくは、この目的のために、未制御の抗原についての天然結合薬剤を使用する。
【０１２７】
抗体である薬剤は、アゴニストおよび／またはアンタゴニストであり得、例えば、アゴニストとして機能する抗体は、ポリペプチドの活性および／または遺伝子の発現を増加させ、一方アンタゴニストとして機能する抗体は、ポリペプチドの活性および／または遺伝子の発現を減少させる。アンタゴニストとして機能するそのような抗体の例は、例えば、それらに限定されないが、中和抗体である。
【０１２８】
本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログを、タンパク質のアミノ酸配列を変化させるように容易に操作し得ることは、当業者によって理解される。本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログをコードする遺伝子を、とりわけ、インビトロ変異誘発のための種々の周知技術によって操作して、本明細書で変異体またはムテインという、天然ヒトタンパク質またはそのフラグメントの変異体を産生することができ、本発明に従って使用し得る。
【０１２９】
本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログの変異体の一次構造の変形は、本発明で有用であり、例えば、欠失、付加および置換を含みうる。置換は、保存的または非保存的であり得る。天然タンパク質（または野生型タンパク質）と変異体の間の差異は、一般に、所望の特性を保存し、所望されない特性を軽減または排除し、そして所望のまたは新たな特性を付加する。例えば、代謝調節因子の変異体は、野生型代謝調節因子と比較して優れた活性を有し得、そしてこれはアゴニストとして機能し、一方、野生型代謝調節因子と比較して活性を減少または阻害し、または反対の機能を有する変異体は、アンタゴニストとして機能し、例えば、それらに限定されないが、代謝調節因子のドミナントネガティブ形態である。
【０１３０】
アンタゴニスト薬剤。同様に、それらが由来したより大きなタンパク質を不活化し、そして／またはそのドミナントネガティブ型（すなわち不活性型）として機能する、低分子オリゴペプチドおよびポリペプチドを作製するための技術は周知であり、そして当技術分野でルーチンになっている。従って、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログを不活化、または阻害する本発明の遺伝子産物のペプチドアナログも本発明で有用である。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」を、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログのアンタゴニストとして機能する薬剤として使用することができる。そのような実施態様では、本発明の代謝調節因子、例えば、本発明のＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログの発現を負に調節するＲＮＡｉ分子を、代謝機能を調節するために使用することができる。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が蠕虫に導入されたときに遺伝子発現をブロックできるという観察を記載するために、当初Fireおよび共同研究者が新たに作った用語である（Fire et al., (1998) Nature 391, 806-811）。ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物で遺伝子特異的な転写後サイレンシングを指示し、そして遺伝子機能の研究のための新たなツールを提供した。ＲＮＡｉは標的遺伝子のｍＲＮＡ分解を含む。結果から、ＲＮＡｉは、ＡＴＰ依存性であるが、ｍＲＮＡ翻訳とは共役していないことが示された。すなわち、インビトロにおいてＲＮＡｉのためにタンパク質合成は必要とされない。ＲＮＡｉ反応では、ｄｓＲＮＡの両鎖（センスおよびアンチセンス）が約２１〜約２３ヌクレオチド（ｎｔ）長の小ＲＮＡフラグメントまたはセグメントにプロセシングされる（２１〜２３ｎｔ長のマーカーに相当する配列決定ゲル中の移動度を有するＲＮＡ、任意に２１〜２３ｎｔ ＲＮＡと称される）。ｄｓＲＮＡの小ＲＮＡフラグメントへのプロセシングには、標的化ｍＲＮＡは必要とされず、それによって、小ＲＮＡ種がｄｓＲＮＡのプロセシングによって生成され、そしてｄｓＲＮＡ標的化ｍＲＮＡ分解の生成物として生成されるのではないことが実証される。ｍＲＮＡは、ｄｓＲＮＡと同一の領域内でのみ切断される。切断は、ｄｓＲＮＡ自体について観察されるのと同じ間隔である２１〜２３ヌクレオチド離れた部位で生じ、このことは、ｄｓＲＮＡ由来の２１〜２３ヌクレオチドフラグメントがｍＲＮＡ切断を導くことを示唆する。約２１〜約２３ヌクレオチドの単離されたＲＮＡ分子（二本鎖、一本鎖）がＲＮＡｉを媒介する。すなわち、それにｍＲＮＡが対応する遺伝子のｍＲＮＡの分解を、単離されたＲＮＡが媒介する（遺伝子（標的遺伝子ともいう）の転写産物であるｍＲＮＡの分解を媒介する）。ＲＮＡｉを媒介する、Ｇ６ＰＤ ｍＲＮＡに特異的な単離されたＲＮＡ分子は、本発明の方法において有用なアンタゴニストである。別の核酸および核酸アナログ、例えば、オリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸構築物、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを、抗菌ペプチドのエンハンサーとして使用することができる。
【０１３２】
本発明のいくつかの実施態様では、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログのアンタゴニストとして機能する薬剤を、ベクター中で対象に投与してもよい。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または外来配列の挿入および真核細胞への導入に適応させた任意の他の適切なビヒクルであり得る。ベクターは、アゴニストまたはアンタゴニスト核酸分子のＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を指示することができる発現ベクターであることができる。ウイルス発現ベクターは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、エプスタインバーウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ベースのベクターまたは上記のいずれかのハイブリッドウイルスを含む群から選択することができる。１つの実施態様では、ベクターはエピソーム性である。適切なエピソーム性ベクターの使用によって、高コピー数の染色体外ＤＮＡ中で対象においてアゴニストまたはアンタゴニスト核酸分子を維持する手段が提供され、それによって染色体組込みの潜在的影響が排除される。
【０１３３】
本発明の別の実施態様では、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログのアンタゴニストとして機能する薬剤は、リボザイムなどの触媒性アンチセンス核酸構築物を導入することによって達成され得、これはＲＮＡ転写物を切断し、それによって野生型タンパク質の産生を防止することができる。リボザイムは、リボザイム触媒部位に隣接する標的に相補的な配列の２つの領域によって特定の配列を標的化しそしてその配列とアニーリングする。結合後、リボザイムは、部位特異的に標的を切断する。本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５およびＩｎｓｌ６またはそのホモログの配列を特異的に認識しそして切断するリボザイムの設計および試験は、当業者に周知の技術によって達成できる（例えば、Lleber and Strauss, (1995) Mol Cell Biol 15:540.551、その開示を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１３４】
標的化。いくつかの実施態様では、本発明の薬剤は、標的化リガンドを介して筋肉に標的化される。標的化リガンドは、予め選択した細胞上の標的に、例えば、他のいかなる身体組織よりも予め選択した細胞標的上に高程度で存在する受容体などの表面タンパク質に、高親和性で特異的に結合する分子、例えば、タンパク質またはそのフラグメントである。例えば、米国特許第５，８１４，４７８号および同第６，４１３，７４０号に記載されているように、ＭｕＳＫ受容体は筋肉に高度に特異的である。従って、同族リガンドアグリン、およびそのＭｕＳＫ結合部分は、薬剤を筋肉に標的化するのに有用な標的化リガンドの例である。いくつかの実施態様では、標的化リガンドを本発明の薬剤に融合される、例えば本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログ、変異体またはフラグメントのポリペプチドに融合させる。いくつかの実施態様では、標的化リガンドを本発明のヌクレオチド薬剤に融合させることができる。標的化リガンドの別の例は、ヒトカドヘリン由来のカドヘリンドメインの群である。従って、例えば、ヒト筋肉カドヘリン由来のヒトカドヘリンドメインを、本発明の薬剤、例えば、それらに限定されないが、筋細胞を標的化するための本発明のポリペプチド薬剤の標的化において使用しうる。本発明の薬剤ポリペプチドの標的化リガンド成分は、予め選択した標的細胞と結合することができる天然または組換えまたは加工したリガンド、またはそのフラグメントを含みうる。
【０１３５】
本発明の別の実施態様では、標的化リガンドは、同種親和性カドヘリンを発現する標的細胞と特異的に結合できる少なくとも３個、４個または５個の筋肉カドヘリン（Ｍ−カドヘリン）ドメイン、またはその誘導体またはフラグメントからなりうる。（Shimoyama et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(16): 1001 1-10018；Shibata et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(8):5236-5270）。いくつかの実施態様では、標的化リガンドは、本発明の薬剤に融合させた、ヒトＭ−カドヘリンの細胞外ドメイン（または、同種親和性Ｍ−カドヘリンと結合できるその生物学的に活性なフラグメントまたは誘導体）由来の少なくとも３つのカドヘリンドメインを含む。
【０１３６】
標的化リガンドのさらなる例には、それらに限定されないが、予め選択した細胞表面タンパク質を高親和性で結合する、抗体およびその部分も含まれる。「高親和性」は、  当技術分野で公知のアッセイ法、例えば、BiaCore分析によって決定した場合、少なくともモルの平衡解離定数を意味する。１つの実施態様では、標的化リガンドはまた、選択した組織特異的表面タンパク質、または標的組織特異的受容体に対して生成された抗体から単離された、１つ以上の免疫グロブリン結合ドメインを含んでもよい。本明細書で使用する「免疫グロブリンまたは抗体」という用語は、抗原（本発明の場合には、組織特異的表面タンパク質、標的組織特異的受容体、またはその部分である）に特異的に結合しそしてそれを認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントのフレームワーク領域を含む、哺乳動物（ヒトを含む）ポリペプチドをさす。意図する標的化融合ポリペプチドを哺乳動物の治療薬として使用する場合、免疫グロブリン結合領域は、対応する哺乳動物免疫グロブリンに由来するべきである。標的化融合ポリペプチドが、診断薬およびＥＬＩＳＡなどの非治療的使用に意図されている場合、免疫グロブリン結合領域は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばマウス）に由来してよい。ヒト免疫グロブリン遺伝子または遺伝子フラグメントには、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域、および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それは次に、それぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。各ＩｇＧクラス内には、様々なアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）が存在する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、特異性および結合親和性の決定に最も重要である。
【０１３７】
ヒトＩｇＧの例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各々の四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各々の対は１つの軽鎖（約２５ｋＤ）と１つの重鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担う、約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。「可変軽鎖」（ＶＬ）という用語および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をさす。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化によって産生される十分に特徴付けられたいくつかのフラグメントとして存在する。例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、それ自体はジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨに連結された軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を産生する。Ｆ（ａｂ）’２はヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊するように穏やかな条件下で還元され、それによってＦ（ａｂ）’２二量体はＦａｂ'単量体に転換されうる。Ｆａｂ’単量体は、本質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、そのようなフラグメントが化学的にまたは組換えＤＮＡ方法の使用によって新規に合成されうることを理解する。従って、本明細書で使用する免疫グロブリンまたは抗体という用語には、抗体全体の改変によって産生された抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法を使用して新規に合成されたもの（例えば、単鎖Ｆｖ）（ｓｃＦｖ））またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定されたものも含まれる（例えば、McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554を参照）。さらに、本発明の融合ポリペプチドには、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）の可変領域、および組織特異的表面タンパク質およびその標的受容体結合部分が含まれる。そのような可変領域を生成するための方法は、Reiter, et al. (1999) J. Mol. Biol. 290:685-698に記載されている。
【０１３８】
抗体を調製するための方法は当技術分野で公知である。例えば、Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497；Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY）を参照されたい。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローン化することができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローン化し、そして組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーも、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製することができる。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせは、様々な抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生じさせる。単鎖抗体または組換え抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号；同第４，８１６，５６７号）を、本発明の方法および融合ポリペプチドで使用する抗体の産生に適合させることができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の哺乳動物をヒト抗体またはヒト化抗体を発現するために使用しうる。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択した抗原に特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、例えば可変ドメイン、およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる。
【０１３９】
好ましい免疫グロブリン（抗体）のスクリーニングおよび選択は、当技術分野で公知の種々の方法によって実施することができる：組織特異的なまたは標的の受容体に対して特異的なモノクローナル抗体の存在についての初期スクリーニングは、例えばＥＬＩＳＡベースの方法またはファージディスプレイを使用して実施しうる。本発明の組織特異的融合ポリペプチドの構築に使用するための所望のモノクローナル抗体を同定しそして選択するために、好ましくは二次スクリーニングを実施する。二次スクリーニングは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって実施しうる。「バイオセンサ改変支援プロファイリング」（Biosensor Modification-Assisted Profiling:「ＢｉａＭＡＰ」）（米国特許公開第２００４／１０１９２０号）と称する１つの方法によって、所望の特性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの迅速な同定が可能になる。より詳細には、モノクローナル抗体は、抗体：抗原相互作用の評価に基づいて異なるエピトープ関連群に選別される。
【０１４０】
疾患および障害の処置
本発明の方法は、いくつかの障害および疾患、例えば、それらに限定されないが、筋肉関連疾患および障害、筋肉成長、血管新生、肥満、インスリン感受性、インスリン依存性疾患、体重、筋肉量、体脂肪量および／または心血管機能の処置のための代謝調節因子の使用に関する。１つの実施態様では、そのような障害の処置方法は、本発明の代謝調節因子を活性化または阻害する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６を活性化または阻害する薬剤の有効量の投与を含む。
【０１４１】
本発明者らは、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６が、（ｉ）筋肉成長（すなわち筋肥大）、例えばＭＳＰ５（実施例６を参照）、（ｉｉ）血管新生、例えばＭＳＰ３およびＭＳＰ５（実施例５および６を参照）、（ｉｉｉ）グルコース感受性およびインスリン感受性、例えばＭＳＰ３（実施例５を参照）、および（ｉｖ）筋再生および衛星細胞動員、例えば、Ｉｎｓｌ６（実施例７を参照）に影響を及ぼすことを見出した。
【０１４２】
従って、本発明は、血管新生、インスリン感受性、筋変性、筋肉量、および／または体脂肪量に関連する疾患および／または障害の処置のための、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログまたは変異体の使用に関する。
【０１４３】
筋肉の量および／または肥大を調節するための組成物
本発明者らは、実施例６に開示するように、筋線維の大きさをインビボおよびインビトロで増加させ、筋線維の大きさおよび／または幅を増加させ、そしてタンパク質合成を増加させるその能力に基づいて、代謝調節因子ＭＳＰ５が筋原性因子および／または筋肥大因子であることを見出した。従って、本発明は、ＭＳＰ５のアゴニストとして機能する薬剤、例えばＭＳＰ５の発現を活性化する薬剤、例えば対象において筋肥大および筋肉量を増加させるためにＭＳＰ５または機能性誘導体をコードする核酸を含む薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１４４】
本発明者らはまた、Ｉｎｓｌ６が、筋組織中の衛星細胞数を増加させ、そして筋原線維周囲の衛星細胞におけるＢｒｄＵ取り込みを増加させるその能力に基づいて、筋再生因子として、また抗炎症因子として同定されることを見出した。Ｉｎｓｌ６はさらに、実施例７で実証されるように、活性化衛星マーカーＭｙｏＤの免疫染色を増加させたので、筋再生を増加させると特徴付けられた。Ｉｎｓｌ６は、実施例７において図３１および３２に示すように、心臓毒（ＣＴＸ）の筋肉内投与後に炎症性細胞数を減少させるその能力に基づいて、抗炎症因子として機能することが見出された。さらに、Ｉｎｓｌ６は、筋肉成長を促進する遺伝子の非存在下の筋肉と比較して、筋変性損傷後、例えば、心臓毒（ＣＴＸ）の筋肉内投与後に、筋再生を改善する（例えば、図３８および３８を参照）。筋組織中の衛星細胞の活性化は、対象における新たな筋細胞の産生を生じ得る（例えば、図１２、３０および４０を参照）。筋肉成長（本明細書では筋再生ともいう）は、それによって筋肉前駆細胞から新たな筋線維が形成されるプロセスをさす。従って、本発明は、対象において、筋再生および筋肉量を増加させるための、Ｉｎｓｌ６またはその機能性誘導体またはアゴニストの遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）を含む医薬組成物を提供する。
【０１４５】
本発明の１つの実施態様は、生物において筋肉量を増加させるための方法を提供する。本発明は、筋萎縮を発達させる危険がある対象または筋萎縮を有する対象、または筋肥大を必要とする対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、代謝調節因子ＭＳＰ５またはその機能性誘導体またはアゴニストを標的化する薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、ＭＳＰ５のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、ＭＳＰ５のアゴニストとして機能する薬剤、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ５（配列番号１２）またはそのホモログまたはフラグメントをコードする核酸である薬剤を含む医薬組成物を対象に投与することによって、筋萎縮を有する対象またはその危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、それを必要とする対象において、筋肥大を増加させるかまたは萎縮を阻害することによって、筋肉成長を増加させるための方法を提供する。
【０１４６】
別の実施態様では、本発明は、生物において筋再生を増加させるための方法を提供する。本発明は、筋変性を発達させる危険がある対象または筋変性を有する対象、または筋再生を必要とする対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、Ｉｎｓｌ６またはその機能性誘導体またはアゴニストの遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、Ｉｎｓｌ６のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、対象に、Ｉｎｓｌ６（配列番号２０）またはそのホモログまたはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することによって、筋萎縮を有する対象またはその危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、それを必要とする対象において、衛星細胞動員を増加させ、そして筋再生を増加させることによって、筋肉量を増加させるための方法を提供する。
【０１４７】
ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体またはアゴニストのアゴニストとして機能する薬剤含む医薬組成物は、筋肉成長および／または筋再生をもたらす。Ｉｎｓｌ６の非存在と比較してＩｎｓｌ６の存在下で、少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも５０％の新たな線維数の増加が生じる。本明細書で使用する「筋肉成長」という用語は、線維の大きさの増加および／または線維の数の増加をさす。筋肉の成長は、湿重量の増加、タンパク質含有量の増加、筋線維数の増加、筋線維直径の増加などによって測定しうる。筋線維の成長の増加は、直径の増加として定義することができ、ここで、直径は、横断面の楕円の短軸として定義される。
【０１４８】
いくつかの実施態様では、Ｉｎｓｌ６および／またはＭＳＰ５によって誘発された筋肉成長は、ポジティブコントロールに関連する筋肉成長と比較することができる。いくつかの実施態様では、ポジティブコントロールは、ミオスタチンの阻害薬、例えばミオスタチンの中和抗体、またはミオスタチンの阻害核酸、例えばミオスタチンのＲＮＡｉ、またはミオスタチンのドミナントネガティブ形態である。
【０１４９】
筋肉成長は、筋肉の分裂指数によってモニターしてもよい。例えば、細胞を２倍加時間に等価な時間、標識薬剤に曝露しうる。分裂指数は、Ｓ期の間のみに取り込まれるトレーサー（すなわちＢｒｄＵ）の存在下で増殖させたときに標識された核を有する培養物中の細胞の割合であり、そして倍加時間は、培養物中の細胞数が２倍増加するのに必要な平均Ｓ時間として定義される。増殖性筋再生はまた、筋肉強度および敏捷性の増加によってモニターされ得る。
【０１５０】
筋肉成長は、筋形成（すなわち筋管を生じる筋芽細胞の融合）の定量によっても測定しうる。筋形成に対する効果は、筋芽細胞の融合の増加、および筋肉分化プログラムの実施可能性をもたらす。例えば、筋形成は、存在する核の総数に対して相対的な多核細胞中に存在する核の割合によって測定しうる。筋形成は、筋管中の面積当たりの核の数のアッセイによって、またはウェスタン分析による筋肉特異的タンパク質のレベルの測定によっても決定しうる。
【０１５１】
筋線維の生存は、壊死またはアポトーシスによって証明される筋線維の損失の防止、または筋線維損失の他のメカニズムの防止をさし得る。筋肉は、損傷、萎縮などによって損失され得、ここで、筋肉の萎縮は、筋線維周囲寸法の有意な損失をさす。
【０１５２】
ＭＳＰ３および／またはＩｎｓｌ６を含む医薬組成物の投与が有用であるような障害は、対象が、筋肉量の増加（筋肥大の増加、または筋再生の増加のいずれかまたはその両方による）を必要とする場合であり、ここで、ＭＳＰ３および／またはＩｎｓｌ６を含む医薬組成物は疾患症状を寛解させる。そのような疾患には、例えば、対象が筋萎縮または筋変性を有する場合が含まれる。例えば、筋肉量の減少または萎縮は、種々の生理学的および病理学的状態に関連する。例えば、筋萎縮は、神経外傷に起因する除神経；変性性、代謝性または炎症性ニューロパシー、例えば、ギヤンバレー症候群；末梢ニューロパシー；または環境毒素または薬物によって引き起こされる神経傷害から生じうる。
【０１５３】
筋萎縮は、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリック病）などの成人運動ニューロン疾患；乳児および若年性脊髄性筋萎縮症；および多巣性導体ブロックを伴う自己免疫運動ニューロパシーを含む、運動ニューロパシーに起因する除神経からも生じうる。筋萎縮は、例えば、脳卒中または脊髄損傷に起因する麻痺；外傷、例えば、骨折、靭帯または腱の損傷、捻挫または脱臼に起因する骨格固定；または長期床上安静の結果もたらされた慢性疾患からも生じうる。これもまた筋萎縮を生じ得る代謝性ストレスまたは栄養不良には、癌および他の慢性疾病（ＡＩＤＳ、絶食または横紋筋融解症、および甲状腺の障害および糖尿病などの内分泌疾患を含む）の悪液質が含まれる。
【０１５４】
筋萎縮はまた、デュシェンヌ型、ベッカー型、筋緊張性、顔面肩甲上腕、エメリ−ドレフュシュ型、眼咽頭型、肩甲上腕型、肢帯型、および先天性型などの筋ジストロフィー症候群、および遺伝性遠位型ミオパシーとして知られているジストロフィーにも起因し得る。筋萎縮は、先天性ミオパシー、例えば、良性先天性筋緊張低下、中心コア病、ネマレンミオパシー、および筋細管（中心核）ミオパシーにも起因し得る。筋萎縮は老化過程の間にも生じる。種々の病理学的状況の筋萎縮は、タンパク質分解の増強および筋肉タンパク質の産生の低下に関連する。
【０１５５】
対象が筋萎縮または筋変性を有する疾患の他の例は、例えば、それらに限定されないが、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型ジストロフィーを含む筋肉疾患；ベッカー型筋ジストロフィー；ネマリンミオパシーまたはリアノジン受容体の遺伝子中の変異によって引き起こされるミオパシーを含む先天性ミオパシー；ミトコンドリアおよび核の両方にコードされる遺伝子における変異に起因するミトコンドリアミオパシー（進行性外眼筋麻痺、ケアーンズセイヤー症候群、ＭＥＬＡＳ、ＭＥＲＦＦ症候群、乳児性ミオパシーを含む）；ポンペ病を含む筋肉の糖原病；チャネル病；筋緊張性ジストロフィー（シュタイネルト病）；先天性筋強直症（トムセン病）；低カリウム血症（染色体１ｑ上のジヒドロピリジン受容体関連カルシウムチャンネル遺伝子中の変異に起因する）および高カリウム血症（染色体１７ｑ上のＳＣＮ４Ａ中の変異に起因する）形態を含む家族性周期性四肢麻痺である。
【０１５６】
ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物の投与は、例えば悪液質などのより全身的な体重消耗の設定で、対象が筋肉量の増加を必要とする場合にも有用である。悪液質は、それらに限定されないが、筋肉量を含む体重減少を引き起こす状態である。悪液質の設定には、癌誘発悪液質、ＡｌＯＳ誘発悪液質、敗血症誘発悪液質、腎不全誘発悪液質、および鬱血性心不全が含まれる。また、低身長の原因であるサラセミアを含む多くの設定において成長遅滞が存在する。一般に、低身長は、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物の投与のための設定である。
【０１５７】
筋萎縮は老化過程の間にも生じる。種々の病理学的状況の筋萎縮は、タンパク質分解の増強および筋肉タンパク質産生の減少に関連する。ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を含む医薬組成物の投与は、成長ホルモン欠乏症、熱傷を含む組織消耗、骨格外傷、感染、癌、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型ジストロフィー、常染色体劣性ジストロフィー、多発性筋炎、ならびにミオパシーおよびＡＩＤＳに罹患した対象の処置にも有用でありうる（米国特許第５，６２２，９３２号）。
【０１５８】
グルコースおよび／またはインスリン感受性および体重を調節するための組成物
本発明者らは、肥満のマウスモデルにおいてグルコースおよび／またはインスリン感受性を調節するその能力に基づいて、ＭＳＰ３が、代謝調節因子、例えば、グルコース感受性および／またはインスリン感受性の調節因子であることを見出した。特に、ＭＳＰ３は、肥満を誘発するためにマウスに高脂肪高スクロース食餌（ＨＦ／ＨＳ）を給餌する、肥満のマウスモデルでの糖耐性試験（ＧＴＴ）において、血糖値およびインスリン血清レベルを測定することによって決定したところ、グルコースおよびインスリンに対する感受性を増加させることが示された。例えば、実施例１および図５、１７および１８に記載されるように、ＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したＭＳＰ３処置マウスは、ＭＳＰ３非存在下のマウスと比較して、注射の後のより低い血糖値および／または減少した絶食時血清グルコースおよび／またはインスリンレベルを有し、これは、ＭＳＰ３がグルコースおよび／またはインスリンに対する感受性を増加させるという知見を導いた。
【０１５９】
従って、本発明は、対象においてインスリン非感受性またはインスリン抵抗性を減少させるための、ＭＳＰ３またはその機能性誘導体またはアゴニストの遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）の薬剤を含む医薬組成物を提供する。従って、ＭＳＰ３またはその機能性誘導体のアゴニストとして機能する薬剤は、本発明において肥満および／または体脂肪量を減少させるために有用である。
【０１６０】
本発明の別の実施態様は、生物においてグルコースおよび／またはインスリン非感受性を調節するための方法に関する。本発明は、インスリンおよび／またはグルコース非感受性を発達させる危険があるかまたはそれを有する対象、またはグルコース調節または代謝調節を必要とする対象、例えば、インスリン抵抗性が関与する障害を有する対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、アゴニストとして機能する薬剤、例えば、ＭＳＰ３またはその機能性誘導体またはアゴニストの遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）である薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。いくつかの実施態様では、医薬組成物はＭＳＰ３のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、対象に、ＭＳＰ３（配列番号１）またはそのホモログまたはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することによって、筋萎縮を有するかまたはその危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、それを必要とする対象において、グルコース感受性を増加させ、そして／またはインスリン感受性を増加させるための方法を提供する。
【０１６１】
ＭＳＰ３のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物の投与が有用である障害は、対象が、インスリン抵抗性障害を有するかまたはそれを発達させる危険があり、そして／または異常な糖耐性を有する場合であり、ここで、ＭＳＰ３を含む医薬組成物は疾患症状を寛解する。そのような疾患には、例えば、外来性インスリンの作用に対する末梢組織の通常の代謝応答の不全（非感受性）から生じる疾患（すなわち、インスリンの存在下で正常を下回る生物学的応答を生じる状態）が含まれる。臨床に関しては、正常または上昇したレベルのインスリンにもかかわらず、正常なまたは上昇した血糖値が持続される場合、インスリン抵抗性が存在する。それは、本質的に、それによって基底またはインスリン刺激性いずれかのグリコーゲン合成またはその両方が正常レベルより低くに減少させられる、グリコーゲン合成阻害を示す。インスリン抵抗性は、２型糖尿病における主要な役割を果たしており、これはインスリンに対する末梢組織の感受性を回復するのに、見かけ上、十分な食事または体重減少によって、２型糖尿病に存在する高血糖が時折逆転され得るという事実によって実証されている。
【０１６２】
いくつかの実施態様では、ＭＳＰ３のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物は、対象が、異常な耐糖能障害（これは、インスリン抵抗性が重要な役割を担う多くの障害、例えば、それらに限定されないが、肥満、糖尿病、卵巣高アンドロゲン症、および高血圧症、インスリン依存性および非インスリン依存性糖尿病に関連する）を有するかまたはそれを発達させる危険がある場合に有用である。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、ＭＳＰ３のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物は、糖尿病の症状および合併症、例えば、それらに限定されないが、高血糖、不満足な血糖コントロール、ケトアシドーシス、インスリン抵抗性、上昇した成長ホルモンレベル、グリコシル化ヘモグロビンの上昇したレベルおよび最終糖化産物（ＡＧＥ）、暁現象、不満足な脂質プロフィール、血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、微小血管疾患、網膜障害（例えば、増殖性糖尿病性網膜症）、腎障害、ニューロパシー、妊娠合併症（例えば、成熟前終結および先天性欠陥）などを有する対象の処置に有用である。処置の定義には、例えば、インスリン感受性の増加、血糖コントロールを維持しながらのインスリン投薬の減少、ＨｂＡｌｃの減少、血糖コントロールの改善、血管性、腎臓性、神経性、網膜性、および他の糖尿病合併症の減少、「暁現象」の防止または減少、脂質プロフィールの改善、妊娠合併症の減少、およびケトアシドーシスの減少などの終点が含まれる。
【０１６４】
血管新生を調節するための組成物
本発明者は、実施例５および６に開示するような（図２７もまた参照のこと）、マウスが片側後肢手術に供される、虚血のマウスモデルにおいて、血管再生を促進するその能力に基づいて、ＭＳＰ３およびＭＳＰ５の両方が血管新生を促進することを見出した（J. Biol. Chem. 2004;279:28670-28674；Circ. Res. 2005;96(8):838-846；Circ. Res. 2006;98(2):254-61）。
【０１６５】
従って、本発明は、それを必要とする対象において血管新生を促進するための、ＭＳＰ３のアゴニストとして機能し、そして／またはＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５またはその機能性誘導体またはアゴニストを活性化する薬剤を含む医薬組成物を提供する。別の実施態様では、本発明は、それを必要とする対象において血管新生を阻害するための、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５遺伝子および／または遺伝子産物またはその機能性誘導体の阻害薬またはアンタゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１６６】
さらに別の実施態様では、本発明は、生物において血管新生を増加させるための方法に関する。本発明は、虚血を発達させる危険があるかまたは血管新生および／または血管形成の欠如を有する対象、または血管新生を必要とする対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、アゴニストとして機能する薬剤、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ３またはその機能性誘導体またはアゴニストの遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。別の実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、ＭＳＰ５またはその機能性誘導体またはアゴニストの遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。さらなる実施態様では、医薬組成物は、ＭＳＰ３およびＭＳＰ５またはその機能性誘導体またはアゴニストの遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）を含むことができる。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５のアゴニストを含む。別の実施態様では、本発明は、対象に、ＭＳＰ３（配列番号１）および／またはＭＳＰ５（配列番号１２）またはそのホモログまたはフラグメントをコードする核酸を含む医薬組成物を投与することによって、筋萎縮を有するかまたはその危険がある対象を処置するための手段を提供する。従って、本発明は、それを必要とする対象において血管新生を増加させるための方法を提供する。
【０１６７】
血管新生を増加させること、および従って本発明のＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物の投与が所望される疾患および障害は、例えば、それらに限定されないが、虚血および／または急性心筋梗塞に罹患したかまたはそれを有する危険のある対象を含む。虚血および／または心筋梗塞の前に、それと同時に、またはその後に、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物を投与することにより、心筋における壊死および炎症が減少され、そして器官機能が保存される。
【０１６８】
本明細書で使用する「虚血」という用語は、血液の流入の減少に起因する任意の局在化した組織虚血をさす。いくつかの実施態様では、虚血は、組織虚血または脳虚血、例えば、組織へのまたは脳への（脳卒中の場合）血餅である。「心筋虚血」という用語は、冠動脈アテローム性硬化症および／または心筋への不適切な酸素供給によって引き起こされる循環器障害を表す。例えば、急性心筋梗塞は、心筋組織への不可逆性虚血性傷害を表す。この傷害は、冠循環での閉塞的（例えば、血栓性または塞栓性）事象を生じ、そして心筋代謝要求が、心筋組織への酸素供給を越える環境を作り出す。心筋梗塞の症状には、疼痛、膨満、および／または胸部の圧迫感、顎痛、歯痛、頭痛、息切れ、嘔気、嘔吐、および／または一般的心窩部（中上腹部）不快感；発汗、胸やけおよび／または消化不良、腕痛（より一般的には左腕であるが、いずれの腕でもありうる）、上背部痛、および全身性倦怠感（漠然とした疾病感）が含まれる。
【０１６９】
急性心筋梗塞（ＭＩ）は、大多数の罹患者を、事前の警告なしにそして臨床上検出可能な素因危険因子の非存在下で襲う（Braunwald E. Heart Disease: a Textbook of Cardiovascular Medicine. 1997）。急性ＭＩの症状を示して患者が病院の集中治療室に来た場合、（１）心筋酵素の血漿濃度の増加および（２）典型的臨床所見および／または典型的ＥＣＧ変化をモニタリングすることによって、急性ＭＩの診断を行うことができる。以下のパラメーターのいずれかによって、心筋酵素の増加についての要件が満たされる：正常範囲の上限の少なくとも２倍の全クレアチン−キナーゼ（ＣＫ）、または正常範囲の上限を超えるＣＫ−ＭＢ（筋肉−脳）および正常ＣＫの少なくとも５％。全ＣＫまたはＣＫ−ＭＢが入手可能でない場合は、以下が急性ＭＩの基準を満たすために受け入れられている：正常範囲の上限の少なくとも３倍のトロポニンＴ；正常範囲の上限の少なくとも３倍のトロポニンＩ。ＭＩ用の血清マーカーとしてトロポニンＴの使用は、V. V. Murthy and A. Karmen, J. Clin. Labor. Analys. 11:125-128 (1997)に開示されている。心筋トロポニンＩの決定のための高感度イムノアッセイの分析性能および臨床的有用性は、E. Davies et al., Clin. Biochem. 30: 479-490 (1997)から得ることができる。典型的ＥＣＧ変化には、２つ以上の近接したＥＣＧ所見における徐々に発展するＳＴ部分またはＴ波の変化、２つ以上の近接したＥＣＧ所見における新たな病理学的Ｑ／ＱＳ波の発達、または新たな左脚ブロックの発達が含まれる。
【０１７０】
別の実施態様では、本発明は、血管新生を減少させる必要がある対象または過剰な血管新生を発達させる危険がある対象、例えば癌を有するかまたは癌を発達させる危険がある対象を処置するための方法および組成物を提供する。そのような実施態様では、方法は、それを必要とする対象への、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５またはその機能性誘導体の遺伝子および／または遺伝子産物（すなわちタンパク質）に対するアンタゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物の有効量の投与を含む。従って、本発明は、それを必要とする対象において血管新生を減少させるための方法を提供する。
【０１７１】
血管新生を減少させること、および従って本発明のＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５に対する阻害薬として機能する薬剤を含む医薬組成物の投与が所望される疾患および障害は、例えば、それらに限定されないが、癌または腫瘍に罹患しているかまたはそれを発達させる危険がある対象を含む。血管新生を阻害するために、医薬組成物の投与が、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５の活性および／または発現を阻害する薬剤を含む他の疾患には、例えば、それらに限定されないが、リューマチ性関節炎、網膜症、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再狭窄などが含まれる。
【０１７２】
本発明のＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５に対する阻害薬を含む医薬組成物の投与が血管新生の減少に有用である他の疾患および／または障害には、例えば、血管新生疾患、例えば、それらに限定されないが、炎症性障害、例えば、免疫および非免疫炎症、慢性関節リウマチおよび乾癬、不適切または不都合な血管の侵入に関連する障害、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄、アテローム性動脈硬化巣における毛細血管増殖および骨粗鬆症、および癌関連障害、例えば、固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポジ肉腫および腫瘍増殖を支持するために新生血管形成を必要とする癌などが含まれる。
【０１７３】
肥満モデリング用組成物
本発明者らは、筋肉量およびインスリン感受性に影響を及ぼすいくつかの代謝調節因子、例えば、それらに限定されないが、ＭＳＰ５、Ｉｎｓｌ６およびＭＳＰ３を見出した。従って、アンタゴニストとして機能する、そして／または少なくとも１つの本発明の代謝調節因子の活性を阻害する薬剤、例えば、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を阻害するように機能する薬剤、および／またはＭＳＰ３のアゴニストとして機能する薬剤を含む医薬組成物の対象への投与もまた本発明の方法に包含され、ここで、対象は、筋肉量の減少または体重の減少を必要とするか、または肥満に罹患しているかまたは肥満を発達させる危険がある。
【０１７４】
体重および体脂肪量を減少させる薬剤の能力を分析するための例示的な方法は実施例１に記載されており、方法は、肥満の動物モデル、例えば、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６を標的化する薬剤の存在下または非存在下で、肥満を誘発するために高脂肪高スクロース（ＨＦ／ＨＳ）食餌を給餌したマウスにおける、全体重、ＭＲＩによる過剰な脂肪のレベル、脂肪細胞の大きさの定量、筋肉重量、および鼠径部脂肪パッド重量の評価を含む。例えば、実施例１および図４に記載するように、肥満動物モデル、例えば、ＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したマウスにおいて、グルコースおよび／またはインスリンに対する感受性を増加させるように機能する遺伝子の非存在下のマウスと比較して、より低い体重、および／または例えばＭＲＩによって検出されるより低い過剰脂肪、および／またはより小さな脂肪細胞の大きさ、および／または減少した筋肉重量、および／または減少した鼠径部脂肪パッド重量を動物が有する場合に、薬剤は、体重および／または体脂肪量を減少させると同定される。体重を減少させ、そして／または過剰脂肪蓄積を逆転させる薬剤の能力を評価するためのさらなる特徴付けは実施例１（図６参照）に記載されており、それは、図６に記載するように、肥満の動物モデル、例えば、遺伝子または遺伝子産物（例えば、遺伝子のウイルス媒介発現）の存在下または非存在下で、肥満を誘発するために高脂肪高スクロース食餌（ＨＦ／ＨＳ）を給餌したマウスにおいて、食物摂取およびエネルギー支出などのエネルギー平衡を分析することによって実施できる。食物および水の摂取などのエネルギー摂取、全身Ｏ２消費（ＶＯ２）および呼吸交換率（ＲＥＲ）（これは、炭水化物の脂肪酸酸化に対する比率を反映する）によるエネルギー支出の測定、および定量分析（例えば、骨格筋および／または肝臓における脂肪酸酸化およびミトコンドリア生合成に関連する遺伝子の定量的ＰＣＲまたはＱＲＴ−ＰＣＲによる）を行うことができる。さらに、肝臓の形態および脂質酸化機能、および肝臓中のＨＦ／ＨＳ食餌に誘発される脂質沈着に対する効果を分析することができ、そして肝臓で合成されそして肝臓脂肪酸酸化の間接的マーカーとして使用できる血清ケトン体の分析、および肝臓で脂肪酸酸化を刺激する分子（例えば、ＨＮＦ４α、Ｌ−ＣＰＴ１およびＰＧＣ１−α）の定量分析を行うことができる。例えば、実施例１および図４に記載するように、肥満動物モデル、例えばＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したマウスにおいて、グルコースおよび／またはインスリンに対する感受性を増加させるように機能する遺伝子の非存在下のマウスと比較して、燃料源としての脂肪酸のより高い使用率を示す増加したＶＯ２および／または減少したＲＥＲ、および／または減少した脂質沈着、および／または増加した脂肪酸酸化、および／または増加した肝臓中の血清ケトン体、および肝臓および／または骨格筋中の脂肪酸酸化についてのマーカーの増加した発現を動物が有する場合に、遺伝子および／または遺伝子産物は、体重および／または体脂肪量を減少できると同定される。
【０１７５】
さらに別の実施態様では、本発明は、生物において肥満を処置するための方法に関する。方法は、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６を標的化し、そして筋肉量および／または体脂肪量を減少させ、そして／またはＶＯ２を増加させ、そして／または脂肪酸を増加させるように機能すると特徴付けられた薬剤を含む医薬組成物の投与を含む。
【０１７６】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象、またはその疾患または状態を発達させる危険がある対象に、本発明の代謝調節因子、例えば、本発明のＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６、または本発明のその機能性誘導体または変異体を標的化する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、疾患または状態の処置のための治療法を特徴とする。疾患または状態が、萎縮などの筋肉の状態である場合、本発明の方法は、それを必要とする対象に、アゴニストとして機能する、例えば、ＭＳＰ３および／またはＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６、またはその機能性誘導体または変異体を活性化する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することを含み、ここで、筋肉関連疾患または状態は寛解しまたは阻害される。本発明の医薬組成物によって処置される筋肉関連状態または障害は、例えば：除神経；変性性、代謝性または炎症性ニューロパシー；乳児および若年性脊髄性筋萎縮症；自己免疫運動ニューロパシー；癌、ＡＩＤＳ、絶食または横紋筋融解症から生じる悪液質を含む慢性疾患；およびデュシェンヌ型などの筋ジストロフィー症候群を含むいくつかの原因から生じうる。
【０１７７】
本発明の方法は、本発明の代謝調節因子の欠損から生じる任意の状態、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の欠損に起因するか、またはＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のレベルの増加によって改善され得る任意の状態を処置するためにも有用であり、方法は、少なくとも１つの代謝調節因子のアゴニストとして機能する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログの少なくとも１つを活性化する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することを含み、ここで、有効量は、代謝調節因子の１つの欠如に関連する症状、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の欠如に関連する症状の少なくとも１つまたはいくつかを緩和するのに十分である。そのような疾患には、例えば、それらに限定されないが、小人症および心疾患、例えば、それらに限定されないが、心筋梗塞後の心臓組織生存の改善が含まれる。
【０１７８】
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の代謝調節因子の上昇したレベルから生じる任意の状態、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の発現および／または活性の増加に起因するか、またはＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６のレベルの減少によって改善され得る任意の状態の処置に有用な方法も包含し、方法は、少なくとも１つの代謝調節因子のアンタゴニストまたは阻害薬として機能する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６またはそのホモログの少なくとも１つを阻害する薬剤を含む医薬組成物の有効量を投与することを含み、ここで、有効量は、代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６の１つの発現および／または活性の増加に関連する症状の少なくとも１つまたはいくつかを緩和するのに十分である。そのような疾患には、例えば、それらに限定されないが肥満および癌が含まれる。
【０１７９】
医薬組成物の投与
いくつかの実施態様では、本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤は、個々の患者の臨床状態、投与の部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重および医師に公知の他の要因を考慮して良好な医療行為に従って投与および投薬される。従って、本明細書の目的での薬学的「有効量」は、当技術分野で公知のような考慮によって決定される。量は、それらに限定されないが、生存率の改善またはより迅速な回復、または症状および当業者により適切な尺度として選択されるような他の指標の改善または除去を含む改善を達成するのに有効でなければならない。
【０１８０】
本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤を、化合物としてまたは医薬的に許容される塩として投与することができ、そして単独で、または医薬的に許容される担体、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせて活性成分として投与することができることに留意すべきである。
【０１８１】
ヒトは一般に本明細書で例示するマウスまたは他の実験動物よりも長く処置され、その処置は、疾患過程の長さおよび薬物の有効性に比例する長さを有することにも留意されたい。用量は、単一用量であってもよく、または数日の期間にわたる複数用量であってもよいが、単一用量が好ましい。
【０１８２】
本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤を非経口で投与する場合、一般に、単位投薬注射用形態（例えば、溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤化される。注射に適切な医薬製剤には、滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液中に再構成するための滅菌粉末が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。
【０１８３】
医師または獣医の当業者は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要なものよりも低いレベルで医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の用量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増加し得る。
【０１８４】
所望の投薬量の適切な医薬的に許容される担体を用いた製剤化の後に、本発明の医薬組成物を対象に投与することができる。本発明の医薬組成物は、任意の適切な手段を使用して対象に投与することができる。一般に、適切な投与手段には、それらに限定されないが、局所、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下または筋肉内）、直腸、大槽内、腟内、腹腔内、眼球、または鼻経路が含まれる。
【０１８５】
本明細書で使用する「非経口投与」および「非経口での投与」という語句は、通常注射による、経腸および局所の投与以外の投与様式を意味し、そして、それらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射および注入が含まれる。
【０１８６】
本明細書で使用する「全身投与」、「全身に投与」、「末梢投与」および「末梢に投与」という語句は、その結果患者の系に入り、従って代謝および他の同様な過程に供される、中枢神経系中に直接以外の、化合物、薬物または他の物質の投与を意味し、例えば、皮下投与を意味する。
【０１８７】
本発明の化合物、例えば、化合物（Ｉ）を医薬品として、ヒトおよび哺乳動物に投与する場合、それを、それ自体で、または医薬的に許容される担体と組み合わせて、活性成分、すなわち少なくとも１つの化合物Ｉおよび／またはその誘導体を例えば０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）含む医薬組成物として与えることができる。
【０１８８】
一般に、本発明の化合物の適切な一日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物の量である。そのような有効用量は、一般に上記の要因に依存する。
【０１８９】
所望であれば、活性化合物の有効な一日用量は、任意に単位剤形で、一日を通して適切な間隔で別々に投与される、２、３、４、５、６回またはそれ以上の分用量（sub-dose）として投与され得る。
【０１９０】
本発明の医薬組成物には、１つ以上の、本発明のレゾルビンおよび／またはプロテクチンまたはそのアナログの「治療有効量」または「予防有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療的結果、例えば、種々の疾患状況または状態に関連する影響の減少または防止を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量をさす。レゾルビンおよび／またはプロテクチンまたはそのアナログの治療有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別および体重、および対象において所望の応答を誘起する治療化合物の能力などの要因に従って変動しうる。治療有効量はまた、治療上有益な効果が治療剤のいかなる有毒なまたは有害な影響にも勝る量である。
【０１９１】
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに必要な投薬量および期間で有効な量をさす。典型的には、予防的用量は、疾患の前または早期の対象に使用されるので、予防有効量は治療有効量より少なくあり得る。予防または治療有効量はまた、有益な効果が、化合物のいかなる有毒なまたは有害な影響にも勝る量である。
【０１９２】
投与計画を、至適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）を提供するように調整し得る。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または用量を治療状況の緊急性によって示されるものに相対的に減少させまたは増加させてよい。投与の容易性および投薬の均一性のために、単位剤形の非経口組成物に製剤化するのが特に有利である。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象、組成物、および投与様式のために所望される治療応答を、患者に有毒ではなしに、達成するのに有効な活性成分の量を得るために変動し得る。
【０１９３】
本明細書で使用する「単位剤形」は、処置しようとする哺乳動物対象のための単位投薬量として適する物理的に分離した単位をさし；各単位は、必要な医薬用担体と共同して所望の治療効果を生じるように算出された事前に決定された量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）化合物、例えば化合物（Ｉ）またはその誘導体の特有の特性および達成しようとする特定の治療効果または予防効果、および（ｂ）個体における感受性の処置のための活性化合物の配合の技術分野で固有の制限によって指示され、そしてそれに直接依存する。
【０１９４】
治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイで、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタにおいて評価することができる。動物モデルは、所望の濃度範囲および投与経路を達成するためにも使用される。次いで、そのような情報を使用して、他の対象における投与に有用な用量および経路を決定することができる。一般に、治療有効量は、所望の治療効果に依存する。例えば、ＭＳＰ３を活性化する薬剤の治療有効量は、例えば、実施例５および６に開示されるように、虚血のモデルにおいて血管成長および／または血管新生を増加させるのに十分であり、そして／または例えば実施例５に開示されるように、肥満のモデルにおけるＧＴＴ試験においてグルコース感受性を増加させるのに、または肥満のモデルにおいて体重を減少させるのに十分である。例示のみの例として、ＭＳＰ５を活性化する薬剤の治療有効量は、例えば実施例５および６に開示されるように、虚血のモデルにおいて血管成長および／または血管新生を増加させるのに十分であり、そして／または実施例１および実施例６に開示されるように、筋肉量および／または筋肥大を増加させるのに十分である。別の例示のみのみの例として、Ｉｎｓｌ６を活性化する薬剤の治療有効量は、筋変性のモデル、例えば、実施例７に開示されるような筋肉内ＣＴＸ注射、または筋ジストロフィーのモデルにおいて、筋肉量および／または筋再生を増加させるのに十分である。
【０１９５】
これらの化合物は、ヒトおよび他の動物に、治療のために、経口、経鼻（例えばスプレーによる）、経直腸、膣内、非経口、大槽内および局所（粉末、軟膏または液滴による、頬側および舌下を含む）を含む任意の適切な投与経路によって投与してもよい。
【０１９６】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式のために所望される治療応答を、患者に有毒ではなしに、達成するのに有効な活性成分の量を得るために変動し得る。
【０１９７】
選択される投薬量レベルは、用いる特定の本発明の化合物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および以前の病歴、および医学分野で周知の要因などを含む種々の要因に依存する。
【０１９８】
投薬量の値は、緩和しようとする状態の型および重篤度によって変動しうることに留意されたい。さらに、いかなる特定の対象についても、個々の必要性、および組成物を投与するかまたは組成物の投与を監督する人の専門的判断に従って、具体的投薬計画は経時的に調整すべきであり、本明細書に記載した投薬量範囲は例示のみであり、本発明の組成物の範囲または実施を限定することを意図するものではないことが理解される。
【０１９９】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、またはピーナッツ油などの非水性ビヒクル、およびミリスチン酸イソプロピルなどのエステルも、化合物組成物のための溶媒系として使用しうる。さらに、組成物の安定性、無菌性、および等張性を増強する種々の添加物（抗菌防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、および緩衝液を含む）を添加することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸によって確実にすることができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどを含めることが所望される。注射用医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかし、本発明によれば、使用する任意のビヒクル、希釈剤、または添加物は、化合物と適合しなければならない。
【０２００】
滅菌注射溶液は、本発明の実施において利用される化合物を、必要量の適切な溶媒中に、種々の他の成分とともに（所望であれば）組み入れることによって調製することができる。
【０２０１】
本発明の薬理学的製剤は、任意の適合する担体、例えば、種々のビヒクル、アジュバント、添加物、および希釈剤を含む、注射用製剤中で患者に投与することができ；または本発明で利用する化合物は、患者に非経口的で、遅延放出皮下インプラントまたは標的化送達システム、例えば、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン泳動、ポリマーマトリックス、リポソーム、およびミクロスフェアの形態で投与することができる。本発明で有用な送達システムの例には、米国特許第５，２２５，１８２号；同第５，１６９，３８３号；同第５，１６７，６１６号；同第４，９５９，２１７号；同第４，９２５，６７８号；同第４，４８７，６０３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４４７、２２４号；同第４，４３９，１９６号；および同第４，４７５，１９６号に示されているものが含まれる。他のインプラント、送達システム、およびモジュールは当業者に周知である。
【０２０２】
本発明で利用する化合物の薬理学的製剤は、患者に経口投与することができる。錠剤、懸濁液、溶液、乳濁液、カプセル、粉末、シロップなどの中で化合物を投与するような従来の方法を使用できる。経口的にまたは静脈内に化合物を送達し、そして生物活性を保持する公知の技術が好ましい。
【０２０３】
別の実施態様では、医薬的に許容される製剤は、脂質ベースの製剤を含む。任意の公知の脂質ベースの薬物送達システムを、本発明の実施において使用することができる。例えば、カプセル化した活性化合物の持続放出速度が確立できる限り、多胞体リポソーム、多重膜リポソームおよび単層リポソームは全て使用することができる。制御放出多胞体リポソーム薬物送達システムの作製方法は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９７０３６５２、ＷＯ９５１３７９６、およびＷＯ９４２３６９７（これらの内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載されている。
【０２０４】
合成膜小胞の組成物は、通常、ステロイド、特にコレステロールと通常組み合わせた、リン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質も使用しうる。合成膜小胞の生成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが含まれ、好ましい実施態様では、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、およびジオレオイルホスファチジルグリセロールが含まれる。
【０２０５】
活性化合物を含む脂質ベースの小胞の調製においては、活性化合物カプセル化の効率、活性化合物の不安定性、得られた小胞集団の均質性および大きさ、活性化合物対脂質の割合、透過性、調製物の不安定性、および製剤の医薬的許容性などの変量を考慮すべきである。
【０２０６】
導入する前に、製剤を、多数の利用可能な当技術分野の技術のいずれか、例えば、γ線照射または電子ビーム滅菌法により滅菌することができる。
【０２０７】
薬剤を患者に送達するときに、薬剤を、例えば、経口（例えば、カプセル、懸濁液、または錠剤中）または非経口投与を含む任意の適切な経路によって投与することができる。非経口投与には、例えば、筋肉内、静脈内、関節内、動脈内、くも膜下腔内、皮下、または腹腔内投与が含まれ得る。薬剤は、経口で、経皮で、局所で、吸入によって（例えば、気管支内、鼻腔内、経口吸入または点鼻剤）または経直腸で投与することもできる。投与は、示したように、局所的または全身的であることができる。薬剤は、当業者に周知のウイルスベクターを使用し送達することもできる。
【０２０８】
医薬的に許容される製剤は、水性ビヒクル中に懸濁し、そして従来の皮下針を介してまたは注入ポンプを使用して導入することができる。
【０２０９】
医薬組成物
本発明の別の実施態様では、代謝調節因子を標的化する１つ以上の薬剤を、任意の組み合わせで、そして他の任意の治療剤との組み合わせで含む医薬組成物が開示される。投与の目的のために、代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体を標的化する薬剤は、医薬組成物として好適に製剤化される。本発明の医薬組成物は、本発明の化合物および医薬的に許容される担体を含み、ここで、化合物は、目的の状態を処置するのに有効な量で組成物中に存在する。適切な濃度および投薬量は、当業者が容易に決定することができる。
【０２１０】
医薬的に許容される担体は、当業者によく知られている。液体溶液として製剤化する組成物については、許容される担体は、生理食塩水および滅菌水を含み、そして所望により、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および他の一般的な添加物を含んでもよい。組成物は、本発明の化合物に加えて、希釈剤、分散剤および界面活性剤、結合剤、および滑沢剤を含む、丸剤、カプセル、顆粒、または錠剤として製剤化することもできる。当業者は、適切に、そしてRemington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1990に開示されものなどの容認されている慣例に従って、本発明の化合物をさらに製剤化し得る。
【０２１１】
代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を標的化する薬剤を単独で投与することは可能であるが、医薬組成物として、ＭＳＰ３またはＭＳＰ５またはＩｎｓｌ６または機能性誘導体を活性化し、そして／またはその活性を抑制する薬剤を投与することが好ましい。
【０２１２】
本発明の製剤を当業者に公知のいくつかの手段によって調製することができる。いくつかの実施態様では、製剤を、（ｉ）複数の治療有効用量を提供するのに十分な量の、代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体を標的化する薬剤；（ｉｉ）製剤の各々を安定化させるのに有効な量の水添加；（ｉｉｉ）エアロゾルキャニスターから複数の用量を噴霧するのに十分な量の噴霧剤；および（ｉｖ）任意のさらなる成分、例えば共溶媒としてのエタノールを合わせ；そして成分を分散させることによって調製することができる。成分を、従来のミキサーまたはホモジナイザーを使用し、振盪によってまたは超音波エネルギーによって分散させることができる。バルク製剤を、バルブツーバルブ移送法（valve to valve transfer method）、圧力充填または従来の低温充填法の使用によって、より小さな個々のエアロゾルバイアルに移すことができる。懸濁エアロゾル製剤中で使用される安定剤が噴霧剤に可溶性である必要はない。十分に可溶性でないものは、適量を薬物粒子上にコーティングすることができ、次いでコーティングした粒子を上記のように製剤中に組み込むことができる。
【０２１３】
本発明の組成物は、任意の形態であり得る。これらの形態には、それらに限定されないが、１つ以上の本発明のレゾルビンおよび／またはプロテクチンまたはそのアナログを含む、溶液、懸濁液、分散液、軟膏（口腔用軟膏を含む）、クリーム、ペースト、ゲル、粉末（歯磨き粉を含む）、練り歯磨き、ロゼンジ、膏薬、チューインガム、マウススプレー、香錠、サシェ、洗口剤、エアロゾル、錠剤、カプセル、経皮パッチが含まれる。
【０２１４】
特定の実施態様では、本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を標的化する薬剤、例えば、核酸薬剤またはポリペプチド薬剤を、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物として対象に投与する。特定の実施態様では、これらの医薬組成物は、所望によりさらに１つ以上の追加の治療剤を含む。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗肥満薬、インスリン非感受性用薬物、例えばインスリン、および筋肉の萎縮および変性を防止するために投与する薬物である。このリストを包括的または限定的であるとみなすべきではないので、もちろん、当業者に公知であるそのような治療剤は容易に置換可能である。
【０２１５】
特定の実施態様では、内在性化合物を本明細書に記載するかまたは当業者に公知の１つ以上の精製方法によって単離および／または精製または実質的に精製する。一般に、純度は、少なくとも９０％、特に９５％であり、しばしば９９％超である。特定の実施態様では、天然化合物は、より広範な属の一般的説明から除外される。
【０２１６】
本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」という語句は、その意図される機能を果たすことができるように、対象内でのまたは対象への本発明の化合物の運搬または輸送に関与する、医薬的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化物質を意味する。「医薬的に許容される担体」という用語は、所望の特定の剤形に適している、全ての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤などを含むことが意図される。典型的には、そのような化合物は、１つの器官または身体の部分から、別の器官または身体の部分に運搬または輸送される。各担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容」されなければならず、そして患者に傷害性であってはならない。医薬的に許容される担体として作用しうる物質のいくつか例には、糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；澱粉、例えばコーンスターチおよびバレイショ澱粉；セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバターおよび坐薬ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝化剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質不含水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；および医薬製剤において用いられる他の無毒の適合する物質が含まれる。
【０２１７】
特定の実施態様では、本発明の化合物、例えば、本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体を標的化する薬剤、例えば、核酸薬剤またはポリペプチド薬剤は、１つ以上の酸性官能基を含んでもよく、従って、医薬的に許容される塩基と医薬的に許容される塩を形成することができる。本明細書で使用する「医薬的に許容される塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ」という用語は、適切な医学判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなしに患者の組織と接触しての使用に適切であり、合理的な利益／危険比を有して相応し、そして本発明の化合物の意図される使用に有効である、本発明の化合物のカルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミド、およびプロドラッグをさす。「塩」という用語は、本発明の化合物の比較的無毒の無機および有機酸付加塩をさす。
【０２１８】
これらの塩は、化合物の最終的な単離および精製の間にin situで、またはその遊離塩基形態の精製化合物を適切な有機または無機酸と別々に反応させ、そしてそのようにして形成された塩を単離することによって調製することができる。これらには、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに基づくカチオン、および無毒のアンモニウム、四級アンモニウムおよびアミンカチオン（それらに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む）が含まれ得る（例えば、Berge S. M. et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 1977;66:1-19（参照により本明細書に組み入れる）を参照）。
【０２１９】
「医薬的に許容されるエステル」という用語は、本発明の化合物の比較的無毒のエステル化した生成物をさす。これらのエステルは、化合物の最終的な単離および精製の間にin situで、またはその遊離酸形態またはヒドロキシルの精製化合物を適切なエステル化剤と別々に反応させることによって調製することができる。カルボン酸を、触媒の存在下でのアルコールでの処理を介してエステルに変換することができる。その用語は、さらに、生理的条件下で溶媒和され得る低級炭化水素基、例えば、アルキルエステル、メチル、エチルおよびプロピルエステルを含ことが意図される。
【０２２０】
本明細書で使用する「医薬的に許容される塩またはプロドラッグ」は、適切な医学判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなしに患者の組織との接触しての使用に適切であり、合理的な利益／危険比を有して相応し、そしてそれらの意図される使用に有効である塩またはプロドラッグである。これらの化合物には、可能である場合、本発明の化合物の双性イオン形態が含まれる。
【０２２１】
「塩」という用語は、本発明の化合物の比較的無毒の無機および有機酸付加塩をさす。これらの塩は、化合物の最終的な単離および精製の間にin situで、またはその遊離塩基形態の精製化合物を適切な有機または無機酸と別々に反応させ、そしてそのようにして形成された塩を単離することによって調製することができる。これらには、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに基づくカチオン、および無毒のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオン（それらに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む）が含まれ得る（例えばBerge S. M., et al., (1977) J. Pharm. Sci. 66, 1（参照により本明細書に組み入れる）を参照）。
【０２２２】
「プロドラッグ」という用語は、インビボで迅速に変換されて、本発明の化合物、例えば、本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を標的化する薬剤を生じ、加水分解によって血液中で活性化され得る化合物または薬剤をさす。詳細な考察が、T. Higachi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series、およびBioreversible Carriers in: Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987（その両方を本明細書により参照により組み入れる）に提供されている。本明細書で使用するプロドラッグは、インビボ投与に際して、代謝されるか、またはそうではければ化合物の生物学的、薬学的または治療的活性形態に転換される化合物である。プロドラッグは、化合物の代謝安定性または輸送特性を変化させ、副作用または毒性を遮蔽し、化合物の香味を改善し、または化合物の他の特徴または特性を変化させるように設計し得る。薬力学的過程およびインビボでの薬物代謝の知見により、一旦、医薬的に活性な化合物が同定されれば、医薬の当業者は一般に化合物のプロドラッグを設計することができる（例えば、Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, N. Y., pages 388-392を参照）。適切なプロドラッグを選択し調製するための従来の手順は、例えば、"Design of Prodrugs," ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載されている。プロドラッグの適切な例には、対応する酸のメチル、エチル、およびグリセロールエステルが含まれる。
【０２２３】
本発明の他の実施態様では、本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体を標的化する薬剤は、別の標的化薬剤とコンジュゲートされるかまたは共有結合されて、その組織特異性を増加させ、そして細胞、例えば筋細胞を標的化することができる。「標的化」と題する節に記載するように、標的化薬剤は、例えば、それらに限定されないが、抗体、サイトカインおよび受容体リガンドを含み得る。いくつかの実施態様では、標的化薬剤は、標的化しようとする細胞、例えば、非筋細胞と比較して筋細胞で過剰発現される。
【０２２４】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、および着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤もまた組成物中に存在し得る。
【０２２５】
医薬的に許容される酸化防止剤の例には、水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【０２２６】
本発明の製剤には、静脈内、経口、経鼻、局所、経皮、頬側、舌下、経直腸、経膣および／または非経口投与に適切な製剤が含まれる。製剤は、単位剤形で好都合に提供され得、そして薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単回剤形を生成するために担体物質と合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、約１％〜約９９％の活性成分、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲である。
【０２２７】
経口投与に適切な本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（着香した基材、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形態で、または水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油型または油中水型液体乳濁液として、またはエリキシルまたはシロップとして、または香錠（不活性基材、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを使用）として、および／または洗口剤としてなどであり得、各々が活性成分として事前に決定された量の本発明の化合物を含む。本発明の化合物は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【０２２８】
経口投与用の本発明の固形剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）においては、活性成分を、１つ以上の医薬的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかと混合する：充填剤または増量剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸；結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア；湿潤剤、例えば、グリセロール；崩壊剤、例えば、寒天−寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；溶液遅延剤、例えば、パラフィン；吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物；湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土；滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物；および着色剤。カプセル、錠剤および丸剤の場合には、医薬組成物は緩衝化剤を含んでもよい。同様な型の固体組成物も、ラクトースまたは乳糖類などの賦形剤、および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用い得る。
【０２２９】
錠剤は、所望により１つ以上の補助成分とともに圧縮または成形することによって作製し得る。圧縮した錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤、または分散剤を使用して調製し得る。成形した錠剤は、不活性液体希釈剤により湿潤化した粉末化化合物の混合物を、適切な機械で成形することによって作製しうる。
【０２３０】
本発明の医薬組成物の錠剤および他の固形剤形、例えば、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒は、所望により、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティングおよび他の医薬製剤分野で周知のコーティングを用いて刻みを付けるかまたは調製し得る。例えば、所望の放出プロフィールを提供するような種々の比率でのヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム、および／またはミクロスフェアを使用して、その中の活性成分の遅延または制御放出を提供するように、それを製剤化してもよい。それは、例えば、細菌保持フィルターを通したろ過により、または使用直前に滅菌水または他の何らかの滅菌注射用媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより滅菌し得る。これらの組成物はまた所望により不透明化剤を含んでよく、そして活性成分を胃腸管の特定の部分のみでまたはそこで優先的に、所望により遅延して放出する組成物であり得る。使用可能な包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。活性成分は、適切であれば上記賦形剤の１つ以上を含むマイクロカプセル化形態にすることもできる。１つの態様では、レゾルビンおよび／またはプロテクチンまたはその前駆体またはアナログの溶液を、眼の新生血管形成用の目薬としてまたは耳炎を処置するための点耳薬として投与することができる。
【０２３１】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形には、医薬的に許容される乳濁液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。
【０２３２】
活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用されている不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、ピーナッツ、コーン、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびその混合物を含んでもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物には、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味料、着色料、芳香剤および防腐剤を含めることもできる。
【０２３３】
活性化合物に加えて、懸濁液は、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天およびトラガカント、およびその混合物を含みうる。
【０２３４】
いくつかの場合、本発明の代謝調節因子を標的化する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはその機能性誘導体の少なくとも１つを標的化する薬剤は、直腸または膣投与に適した製剤（例えば坐薬として）であり得、これは、１つ以上の本発明の化合物を１つ以上の適切な非刺激性賦形剤または担体（例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチル酸塩を含む）と混合することによって調製され得、そして室温では固体であるが、体温では液体であり、それゆえ活性化合物を放出する。そのような投与に適切な担体および製剤は当技術分野で公知である。
【０２３５】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与用剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬が含まれる。活性化合物は、滅菌条件下で、医薬的に許容される担体と、そして必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝液、または噴霧剤と混合してもよい。
【０２３６】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはその混合物を含んでもよい。粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。スプレーはさらに、慣用の噴霧剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを含むことができる。
【０２３７】
経皮パッチは、身体に、本発明の化合物（レゾルビンおよび／またはプロテクチンおよび／またはその前駆体またはアナログ）の制御送達を提供するという追加の利点を有する。そのような剤形は、化合物を適切な媒体に溶解または分散することによって作製することができる。吸収増強剤を、皮膚を横切る化合物の流動を増加させるために使用することもできる。この流動の速度は、速度制御膜の提供または活性化合物のポリマーマトリックスまたはゲル中の分散によって制御することができる。
【０２３８】
非経口投与に適切な本発明の医薬組成物は、１つ以上の本発明の化合物を、１つ以上の医薬的に許容される滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、または滅菌粉末（使用直前に滅菌注射用溶液または分散液中に再構成し得る）と組み合わせて含み、これは酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤または増粘剤を含んでもよい。
【０２３９】
本発明の医薬組成物において用いられ得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０２４０】
これらの組成物は、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含んでもよい。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって確実にしうる。等張化剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることも所望され得る。さらに、注射用医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【０２４１】
いくつかの場合、薬物の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅くすることが所望される。これは、水溶解性が低い結晶質または非結晶物質の液体懸濁液の使用によって達成されうる。次いで、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、これは次に、結晶の大きさおよび結晶の形態に依存し得る。あるいは、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、油ビヒクル中に薬物を溶解または懸濁させることによって達成される。
【０２４２】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に、対象化合物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の割合、および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ酸無水物が含まれる。デポー注射用製剤は、身体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによっても調製される。
【０２４３】
選択した投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用し得る本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、医薬的に許容される剤形に製剤化される。
【０２４４】
Remington's Pharmaceutical sciences Ed. Germany, Merk Publishing, Easton, PA, 1995（その内容を本明細書に参照により組み入れる）は、医薬組成物の製剤化に使用される種々の担体、およびその調製のための公知技術を開示している。医薬的に許容される担体として作用し得る物質のいくつかの例には、それらに限定されないが、糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；澱粉、例えば、コーンスターチおよびバレイショ澱粉；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバターおよび：坐薬ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油；紅花油；ゴマ油；オリーブ油；コーン油および大豆油；グリコール；例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；水；等張食塩水；リンゲル液、エチルアルコール、およびリン酸緩衝液、および他の無毒の適合する滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤が含まれ、これらもまた製剤者の判断に従って組成物中に存在し得る。
【０２４５】
本発明の遺伝子の他の使用
本発明は、ｍＲＮＡ、機能性ＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡの同定を含む、筋肉成長、肥満、インスリン感受性、筋肉量、体脂肪量、筋肉成長および心血管機能に関連する他の因子を同定するための、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を使用する方法も提供する。そのような方法は、当業者に公知であり、そして下記の方法を含み得る。
【０２４６】
本発明は、代謝因子を選択的に活性化または阻害する薬剤を同定するための、例えば、筋肉成長、肥満、インスリン感受性および心血管機能に関連する障害および状態の処置のための本発明の方法によって使用されるべき薬剤を同定するためのアッセイにおいて、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を使用するための方法も提供する。
【０２４７】
本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはそのホモログは、同定された遺伝子および遺伝子産物の筋肉の成長および生物学、および血管新生、インスリン感受性および体脂肪量の減少／成長に対する効果を検討するためのさらなる特徴付けに有用である。
【０２４８】
本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６は、トランスジェニック動物、例えば、ノックアウト動物、例えば、外因性発現を伴う動物の作製に使用しうる。さらに、トランスジェニック動物（ノックアウト動物を含む）は、疾患および障害の動物モデル、例えば、肥満モデル、筋ジストロフィーマウスモデル、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連動物モデル、グルコース非感受性およびインスリン非感受性モデルとして、例えば、実施例に開示するような方法を使用するか、またはそのようなマウスをそのような疾患のトランスジェニックマウスモデルとともに育種することによって使用し得る。
【０２４９】
例えば、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の少なくとも１つについての、例えば、少なくとも１つの代謝調節因子を過剰発現する、それをノックインした、および／またはそれをノックアウトしたそのようなトランスジェニック動物は、目的の表現型、例えば、肥満、糖尿病、血管新生欠陥、心血管欠陥を有する動物を含む、種々の遺伝的背景の動物に育種し得る。そのような動物は、当業者に公知であり、そして例えば、Mouse Genome Database (Blake JA, Richardson JE, Bult CJ, Kadin JA, Eppig JT, and the members of the Mouse Genome Database Group. 2003. MGD: The Mouse Genome Database. Nucleic Acids Res 31: 193-195；Eppig JT,. Blake, JA, Burkhart DL, Goldsmith CW, Lutz CM, Smith CL. 2002．Corralling conditional mutations: a unified resource for mouse phenotypes. Genesis 32:63-65）またはthe Oak Ridge National Laboratory変異体マウスデータベースに見出すことができる。
【０２５０】
別の実施態様では、少なくとも１つの代謝調節因子の細胞および／またはトランスジェニック動物、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の少なくとも１つを過剰発現する、それをノックインした、および／またはそれをノックアウトした動物は、筋肉成長、血管新生、肥満、インスリン感受性、および／または心血管機能に影響を及ぼすタンパク質を同定するためのアッセイにおいて使用される。
【０２５１】
本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を、目的の特性についてコンピューターでまたは実験的に分析しうる。１つの実施態様では、本発明の代謝調節因子に関連するとして同定された遺伝子、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６に関連する遺伝子を、分泌された因子として遺伝子を同定する特性、すなわち、推定シグナル配列の保持および推定膜貫通型ドメインの欠如についてコンピューターでスクリーニングする。任意の他の目的のドメインまたは配列特性、例えば、核酸またはアミノ酸配列は、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の少なくとも１つを標的化するための治療的使用に適切な薬剤の設計において使用されうる。
【０２５２】
代謝調節因子についてのトランスジェニック動物、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を過剰発現する、それをノックインした、および／またはそれをノックアウトした動物を、筋肉発達、筋肉成長、肥満、インスリン感受性および心血管機能に対する効力について薬剤を試験するためのアッセイにおいて使用することもできる。いくつかの実施態様では、アッセイは、試験動物またはトランスジェニック動物に対して、該トランスジェニック動物由来の代謝調節因子または試料または検体（例えばバイオプシー）について実施される。いくつか場合、動物を屠殺することなく試験動物から得ら得る試料、血液において筋肉成長、肥満、インスリン感受性、および心血管機能のマーカーを測定することは有利である。
【０２５３】
本発明の代謝調節因子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック非ヒト動物を作製することができ、例えば、当業者に公知であるＣｒｅ／Ｌｏｘ誘導性発現系を使用することができる。
【０２５４】
トランスジェニック動物、例えば無脊椎動物、例えばショウジョウバエ、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯類、例えばマウスまたはラットは、出生前、例えば胚期に動物または動物の祖先に導入されたトランスジーンを含む細胞を有する動物である。トランスジーンは、それからトランスジェニック動物が発生する細胞の核ゲノム中に組込まれるＤＮＡ、例えば、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはそのホモログまたは変異体である。トランスジーンは、動物の生殖系列への組み込みも含めて、動物中の全ての細胞に組み込み得る。あるいは、動物は、トランスジーンについてキメラであってもよい。トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットなどの動物を作製するための方法は、当技術分野では慣習的になっており、そして例えば、Ausubel et al.（eds）"Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons, Inc., Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)および米国特許第５，６１４，３９６号、同第５，４８７，９９２号、同第５，４６４，７６４号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３４７，０７５号、同第５、２９８，４２２号、同第５，２８８，８４６号、同第５，２２１，７７８号、同第５，１７５，３８４号、同第５，１７５，３８３号、同第４，８７３，１９１号、同第４，８７０，００９号、同第４，７３６，８６６号に記載されており、そしてBurke and Olson, Methods in Enzymology, 194:251-270, 1991；Capecchi, Science 244:1288-1292, 1989；Davies et al., Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693-2698, 1992；Dickinson et al., Human Molecular Genetics, 2(8):1299-1302, 1993；Duff and Lincoln, "Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells", Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, 1995；Huxley et al., Genomics, 9:742-750 1991；Jakobovits et al., Nature, 362:255-261 1993；Lamb et al., Nature Genetics, 5: 22-29, 1993；Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10578-82；Rothstein, Methods in Enzymology, 194:281-301, 1991；Schedl et al., Nature, 362: 258-261, 1993；Strauss et al., Science, 259:1904-1907, 1993、国際公開第９４／２３０４９号、同第９３／１４２００号、同第９４／０６９０８号および同第９４／２８１２３号も情報も提供する。
【０２５５】
本発明は、特定の動物に限定されない。種々のヒトおよび非ヒト動物が企図される。例えば、いくつかの実施態様では、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）または霊長類が、脂肪代謝の変化および化合物のスクリーニングのための動物モデルとして提供される。
【０２５６】
他の実施態様では、本発明は、本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６にについてトランスジェニックである商業的に有用なトランスジェニック動物（例えば、ブタ、ウシ、またはヒツジなどの家畜動物）、すなわち例えば、少なくとも１つの本発明の代謝調節因子を過剰発現する、それをノックインした、および／またはそれをノックアウトした動物を提供する。そのような動物由来の食肉は、より低い脂肪含有量およびより高い筋肉含有量などの所望される特性を有することが企図される。トランスジェニック家畜の作製のための任意の適切な技術を利用し得る。いくつかの好ましい実施態様では、レトロウイルスベクター感染が利用される（例えば、米国特許第６，０８０，９１２号および国際公開第／００３０４３７号を参照、その各々の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０２５７】
同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック樹立系統動物は、そのゲノム中のトランスジーンの存在および／または動物の組織または細胞におけるトランスジーンｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。次いで、トランスジェニック樹立系統動物を使用して、トランスジーンを有するさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、トランスジーンを有するトランスジェニック動物を、他のトランスジーンを有する他のトランスジェニック動物とさらに交配することができる。
【０２５８】
発現可能な、本発明の代謝調節因子をコードする核酸、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはそのフラグメントまたはホモログをコードする核酸を、動物の哺乳動物系統を作製するために動物中に導入するために、当技術分野で公知の任意の技術を使用しうる。該技術には、それらに限定されないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入［Van der Putten, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 6148-6152］；胚幹細胞におけるジーンターゲティング、例えば相同組換え媒介ジーンターゲティング［Thompson, et al., 1989, Cell 56, 313-321および米国特許第５，６１４，３９６号］；胚のエレクトロポレーション［Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814］；および精子媒介遺伝子移入［Nakanishi and Iritani, Mol. Reprod. Dev. 36:258-261 (1993)；Maione, Mol. Reprod. Dev. 59:406 (1998)；Lavitrano et al., Transplant. Proc. 29:3508-3509 (1997)；Lavitrano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14230-5 (2002)；Lavitrano et al., Mol. Reprod. Dev. 64-284-91 (2003)）が含まれる。同様の技術は、米国特許第６，３７６，７４３号；米国特許公開第２００１００４４９３７号、同第２００２０１０８１３２号、および同第２００５０２２９２６３号にも記載されている。他のトランスジェニック動物調製方法は、例えば、米国特許第５，６３３，０７６号または同第６，０８０，９１２号；および国際特許公開ＷＯ９７／４７７３９、ＷＯ９９／３７１４３、ＷＯ００／７５３００、ＷＯ００／５６９３２、およびＷＯ００／０８１３２に開示されている（それらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０２５９】
さらに目的とするのは、本発明の代謝調節因子を発現する細胞および／またはトランスジェニック動物、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を発現する細胞および／またはトランスジェニック動物におけるタンパク質の発現の検討であり、例えば、そのような細胞および／またはトランスジェニックマウスは、血管新生、グルコース感受性、体脂肪量および肥大および筋再生に対するその効果を分析するための、代謝調節因子の誘導（一過性または構成的）に際して細胞中で発現されるタンパク質の検討のために有用である。本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６についてトランスジェニックな動物および／またはトランスジェニック細胞と比較しての、非トランスジェニック細胞および／または動物の組織および細胞のタンパク質発現の分析。そのような方法は、他の代謝調節因子を同定するのに有用であり、そしてこれもまた本発明における代謝調節因子としての使用に包含される。
【０２６０】
筋肉成長に関連する因子を調節する薬剤をスクリーニングするための方法
本発明は、本発明の代謝調節因子を調節する薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６またはそのホモログを調節する薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。代謝調節因子を発現するトランスジェニック動物モデルおよび／または細胞は、試験動物、または試験動物由来の試料または検体（例えばバイオプシー）における筋肉発達、筋肉成長、肥満、インスリン感受性および心血管機能に対する効力について、試験化合物（例えば薬物候補）をアッセイするために使用することもできる。いくつかの場合、動物を屠殺することなく試験動物から得られ得る試料、例えば血液において、筋肉成長、肥満、インスリン感受性および心血管機能のマーカーを測定することが有利である。
【０２６１】
試験化合物
本明細書および本明細書全体にわたって使用する「薬剤」または「化合物」という用語は、修飾および未修飾の核酸、例えば、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ペプチド、ペプチド模倣体、受容体、リガンド、および抗体を含む、任意の有機または無機分子を意味する。
【０２６２】
本発明の方法では、種々の供給源由来の種々の試験薬剤および身体状態を、本発明の代謝調節因子の活性および／または発現を変化させる薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を調節する薬剤の能力についてスクリーニングすることができる。
【０２６３】
一般に、代謝調節因子についての細胞またはトランスジェニック細胞および／または動物に対する薬剤の効果について、動物は試験化合物の非存在下の比較細胞または動物と比較されるる。動物を屠殺する場合には、いかなる試験薬剤の投与も受けていないコントロール動物の平均値または典型値に基づいてベースラインを確立することができる。一旦、そのようなベースラインが決定されれば、試験薬剤をさらなる細胞または試験動物に投与することができ、ここで、ベースラインからの偏差は、試験薬剤が、本発明の代謝調節因子の活性および／または発現に対して効果を有したことを示す。
【０２６４】
試験薬剤は、細胞または試験動物に投与できる、任意の分子、薬剤、または他の物質であり得る。いくつかの場合、薬剤は、細胞または動物において代謝調節因子の活性に実質的に干渉しない。適切な試験薬剤は、低分子、生物学的ポリマー、例えばポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチドなどであってもよい。試験薬剤は、典型的には、１ng/kg〜１０mg/kg、通常１０μg/kg〜１mg/kgの投薬量で動物に投与される。試験薬剤は、代謝調節因子の発現および／または活性の所望される調節を有する、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の少なくとも１つに対して所望の効果を有する薬剤として、本発明の治療方法において有用であると同定され得る。
【０２６５】
いくつかの実施態様では、試験薬剤は、多様なライブラリー、例えば、ランダムまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーに由来し得る。例えば、化学合成ライブラリー、組換えファージディスプレイライブラリー、およびインビトロ翻訳ベースライブラリーなど、多くのライブラリーが当技術分野で公知である。
【０２６６】
化学合成ライブラリーの例は、Fodor et al. (Science 251:767-73 (1991))、Houghten et al. (Nature 354:84-86 (1991))、Lam et al. (Nature 354:82-84 (1991))、Medynski (Bio/Technology 12:709-10 (1994))、Gallop et al. (J. Med. Chem. 37:1233-51 (1994))、Ohlmeyer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-26 (1993))、Erb et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-26 (1994))、Houghten et al. (Biotechniques 13:412-21 (1992))、Jayawickreme et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-18 (1994))、Salmon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-12 (1993))、国際特許公開ＷＯ９３／２０２４２、およびBrenner and Lerner （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-83 (1992)）に記載されている。
【０２６７】
ファージディスプレイライブラリーの例は、Scott and Smith (Science 249:386-90 (1990))、Devlin et al. (Science 249:404-06 (1990))、Christian et al. (J. Mol. Biol. 227:711-18 (1992))、Lenstra (J. Immunol. Meth. 152:149-57 (1992))、Kay et al. (Gene 128:59-65 (1993))、および国際特許公開ＷＯ９４／１８３１８に記載されている。
【０２６８】
インビトロ翻訳ベースライブラリーには、それらに限定されないが、国際特許公開ＷＯ９１／０５０５８、およびMattheakis et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-26 (1994))に記載されるものが含まれる。非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば（Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-12 (1994)）を参照）を使用のために適応させることができる。ペプチドライブラリー（例えばSimon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71(1992))を参照）も使用することができる。化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーを生成するためにペプチド中のアミド官能基が過剰メチル化（permethylated）された、使用できるライブラリーの別の例は、Ostresh et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-42 (1994))に記載されている。
【０２６９】
以下の例は、単に、本発明の種々の態様を例示するものとして提供され、決して本発明を限定するものではない。
【０２７０】
スクリーニングしようとする薬剤は、天然または合成分子であり得る。スクリーニングしようとする薬剤は、天然供給源、例えば、海洋微生物、藻類、植物、および真菌から得ることもできる。試験薬剤は、ミネラルまたはオリゴ薬剤（oligo agent）であり得る。あるいは、試験薬剤は、ペプチドまたは低分子を含む薬剤のコンビナトリアルライブラリーから、または産業において、例えば、化学、医薬、環境、農業、海洋、美容、薬物、およびバイオテクノロジー産業によって合成された化学薬剤の既存のレパートリーから得ることができる。試験薬剤には、例えば、医薬、治療剤、農薬または工業薬物、環境汚染物質、化粧品、薬物、有機および無機薬剤、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖類、炭水化物、キメラ分子、およびその組み合わせを含めることができる。
【０２７１】
コンビナトリアルライブラリーは、段階的様式で合成することができる多くの型の薬剤のために生成することができる。そのような薬剤には、ポリペプチド、タンパク質、核酸、βターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族薬剤、複素環式薬剤、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換グリシンおよびオリゴカルバミン酸塩が含まれる。本発明の方法において、好ましい試験薬剤は、低分子、核酸および修飾核酸、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、糖タンパク、炭水化物、脂質、または糖脂質である。好ましくは、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０２７２】
Affymax、国際公開第９５／１２６０８号、Affymax、国際公開第９３／０６１２１号、Columbia University、国際公開第９４／０８０５１号、Pharmacopeia、国際公開第９５／３５５０３号およびScripps、国際公開第９５／３０６４２号（全ての目的のために各々の全体を参照により本明細書に組み入れる）に記載されているコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）方法によって、薬剤の大きなコンビナトリアルライブラリーを構築することができる。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ方法によっても生成できる。例えば、Devlin、国際公開第９１／１８９８０号を参照されたい。スクリーニングしようとする薬剤は、例えば、ChemBridge Corporation（San Diego, CA）のDIVERSet Eライブラリー（１６，３２０個の薬剤）、the National Cancer Institute（NCI）のNatural Product Repository，Bethesda, MD、the NCI Open Synthetic Compound Collection, Bethesda, MD、ＮＣＩのDevelopmental Therapeutics Program、などを含む行政機関または民間の供給源からも得ることができる。
【０２７３】
さらに、天然のおよび合成で生成したライブラリーおよび薬剤は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に改変される。さらに、既知の薬理学的薬剤を、方向付けされたまたはランダムな化学的修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などに供し得る。
【０２７４】
薬剤製剤は、単位剤形、例えば錠剤および徐放カプセル中で、そしてリポソーム中で好都合に提供され得、そして薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy by Alfonso R. Gennaro (Ed.) 20th edition, December 15, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins; ISBN: 0683306472.を参照）。
【０２７５】
本発明の代謝調節因子の転写および／またはタンパク質発現の調節における潜在的有効性についての、薬剤、例えばＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６を調節する薬剤のスクリーニングは、当業者に周知の種々の手段によって達成される。
【０２７６】
本発明の代謝調節因子、例えば、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の転写および／または発現を調節する能力について上記のような薬剤をスクリーンするために、試験薬剤を試験対象に投与すべきである。１つの実施態様では、試験対象は、筋肉、例えば骨格筋由来の細胞から構成される細胞の培養物である。筋肉由来の細胞は、正常筋肉または腫瘍筋肉由来の初代細胞培養物または不死化細胞株であってもよい。別の実施態様では、試験対象は、筋肉、例えば骨格筋を有する動物である。筋肉を有する動物は、それらに限定されないが、ミバエ、カエル、げっ歯類、例えばマウスまたはラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトであり得る。筋肉由来細胞は、それらに限定されないが、ミバエ、カエル、げっ歯類、例えばマウスまたはラット、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒト含む動物の筋肉から得ることができる。
【０２７７】
試験薬剤は、例えば、細胞が維持される培地中に薬剤を希釈すること、試験薬剤を筋肉を有する動物の食餌または液体と混合すること、筋肉を有する動物に医薬的に許容される担体中の薬剤を局所投与すること、試験薬剤を浸した三次元基材（例えば、徐放ビーズ）を使用しそして該基材を動物に包埋すること、薬剤を筋肉内投与すること、薬剤を非経口投与することによって投与することができる。
【０２７８】
混合物中に種々の他の試薬も含めてよい。これらには、至適のタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸結合を促進し、そして／または非特異的またはバックグラウンド相互作用を減少させるなどのために使用され得る、塩、緩衝液、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などの試薬が含まれる。また、別の点でアッセイの効率を改善する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ阻害薬、抗菌剤なども使用しうる。
【０２７９】
「医薬的に許容される担体」という用語には、薬剤と同時投与することができる物質であって、活性成分が神経系の疾患を防止、寛解、抑止、または排除するというその意図される機能を果たすことを可能にする物質を含むことが意図される。そのような担体の例には、溶媒、分散媒、アジュバント、遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。薬剤と適合する任意の従来の媒体および薬剤を本発明内で使用し得る。
【０２８０】
薬剤は、選択した投与経路に従って製剤化することができる。経口適用のために、ゼラチン、香味剤、またはコーティング物質の添加を使用できる。溶液または乳濁液については一般に、担体には、水性またはアルコール性／水性溶液、乳濁液または懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）が含まれ得る。非経口ビヒクルには、とりわけ、塩化ナトリウム、塩化カリウムが含まれ得る。さらに、静脈内ビヒクルには、とりわけ、液体および栄養補給剤、電解質補給剤が含まれ得る。
【０２８１】
防腐剤および他の添加物も存在し得る。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスを添加することができる（一般的に、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Mack, 1980を参照）。
【０２８２】
本発明の代謝調節因子の転写またはタンパク質発現の増加を引き起こす薬剤、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の少なくとも１つを調節する薬剤のスクリーニングは、目的の代謝調節因子の、遺伝子転写の測定および／またはタンパク質発現の測定を使用して達成することができる。遺伝子転写の測定は、筋肉成長に関連する因子の遺伝子転写の直接的な測定またはレポーター遺伝子の測定を含み得る。同様に、タンパク質発現の測定は、筋肉成長に関連する因子のタンパク質発現の測定またはレポーター遺伝子の測定を含み得る。
【０２８３】
上記のように、スクリーニングアッセイは一般にインビトロで、例えば、培養細胞、生物試料、例えば筋肉、例えば骨格筋、またはその画分において実施される。記載の容易さのために、細胞培養物、生物試料、および画分を以下で「試料」という。一般に試料は動物（例えば、上記の研究動物のいずれか）、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。
【０２８４】
レポーター遺伝子アッセイ（Tamura, et al., Transcription Factor Research Method, Yodosha, 1993）は、マーカーとしてレポーター遺伝子の発現を使用する、遺伝子発現の調節をアッセイするための方法である。
【０２８５】
筋肉成長に関連する因子の遺伝子発現の検出および定量は、筋肉成長に関連する因子の同定に関して上記した方法のいずれかによって実施し得る。当業者に公知の任意の遺伝子転写およびポリペプチドまたはタンパク質発現アッセイを、筋肉成長に関連する因子の転写および／または発現を検出するために使用することができる。あるいは、レポーター遺伝子を使用する場合、増幅に基づく、ハイブリダイゼーションに基づく、および／またはポリペプチドに基づくアッセイを利用して、筋肉成長に関連する因子の代わりに、レポーター遺伝子の転写および／または発現を検出してもよい。
【０２８６】
適切な増幅に基づく方法には、それらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren et al. (1988) Science 241: 1077、およびBarringer et al. (1990) Gene 89: 117；転写増幅（Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173）、自家持続配列複製（Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874）；ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲなどが含まれる。
【０２８７】
核酸ハイブリダイゼーション技術を使用してポリヌクレオチドを検出および／または定量する方法（例えばノーザンブロット）は当業者に公知である（Sambrook et Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.，vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989を参照）。ハイブリダイゼーション技術は、Hames and Higgins (1985) Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press；Gall and Pardue (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 378-383；およびJohn et al. (1969) Nature 223: 582-587に一般的に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を至適化する方法は、例えばTijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier, N. Y.）に記載されている。
【０２８８】
代謝調節因子のポリペプチドは、当業者に周知のいくつかの方法のいずれかによって検出しそして定量することができる。タンパク質の検出に適切な分析的生化学的方法の例には、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（hyperdiffusion）クロマトグラフィーなど、または種々の免疫学的方法、例えば、液体またはゲル沈降素反応、免疫拡散法（一重または二重）、免疫組織化学、アフィニティクロマトグラフィー、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティングなどが含まれる。
【０２８９】
筋肉成長に関連する因子に対する抗体（好ましくは抗哺乳動物；より好ましくは抗ヒト）は、当業者に周知の方法によって生成しうる。筋肉成長に関連する因子に対する抗体のフラグメントは、当技術分野で周知の方法に従って、抗体の切断によって生成し得る。例えば、免疫学的に活性なＦ（ａｂ'）およびＦ（ａｂ'）２フラグメントは、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって生成し得る。
【０２９０】
結合パートナーの同定
本発明の代謝調節因子を調節する薬剤を同定するための１つの方法は、代謝調節因子の結合パートナーを同定することである。本発明の代謝調節因子と結合しそしてその活性を調節するそのようなタンパク質、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６の結合パートナーの同定は、例えば、ライブラリーの提供、および代謝調節因子抗原と結合するタンパク質をコードする１つ以上のメンバーのライブラリーからの選択を含む。選択は、いくつかの方法で実施することができる。例えば、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーであり得る。代謝調節因子は、タグを付け、そして組換え発現させることができる。代謝調節因子を精製し、そして支持体、例えば親和性ビーズまたは常磁性ビーズまたは他の磁気応答性粒子に付着させる。代謝調節因子を細胞の表面上で発現させることもできる。細胞に特異的に結合するディスプレイライブラリーのメンバーを選択することができる。
【０２９１】
１つの実施態様では、ディスプレイライブラリーを使用して、本発明の代謝調節因子と結合するタンパク質、例えば、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＭＳＰ３、ＭＳＰ４、ＭＳＰ５および／またはＩｎｓｌ６と結合するタンパク質を同定する。ディスプレイライブラリーは物体のコレクションであり；各物体は、アクセス可能タンパク質成分およびタンパク質成分をコード化または同定する回収可能成分（例えば核酸）を含む。タンパク質成分は、任意の長さ、例えば、３アミノ酸〜３００アミノ酸超であり得る。選択では、ライブラリーの各メンバーのタンパク質成分を代謝調節因子タンパク質を用いてプローブし、ｓおしてタンパク質成分が代謝調節因子と結合する場合、ディスプレイライブラリーメンバーが、例えば担体上の保持によって同定される。ディスプレイライブラリーは、本発明のトランスジェニック動物由来の組織由来のｃＤＮＡから構築することができ、ここで、アクセス可能タンパク質成分はｃＤＮＡによってコードされている。ディスプレイライブラリー中に含まれるｃＤＮＡは、ｃＤＮＡサブトラクションまたは上記のような他のｃＤＮＡの同定手順の結果であってよい。従って、ｃＤＮＡは、非誘発トランスジェニックに対する誘発トランスジェニックの比較の結果、または種々の遺伝的背景の誘発トランスジェニックの比較、または本発明の方法に関連する遺伝子発現の任意の他の比較の結果であってよい。
【０２９２】
保持されたディスプレイライブラリーメンバーを支持体から回収し、そして分析する。分析は、増幅およびそれに続く類似または非類似条件下での選択を含み得る。例えば、ポジティブおよびネガティブの選択を交互に行うことができる。分析はまた、詳細な特徴付けのために、タンパク質成分のアミノ酸配列の決定およびタンパク質成分の精製を含み得る。
【０２９３】
ディスプレイライブラリーのために種々のフォーマットを使用することができる。例には、以下のものが含まれる。
【０２９４】
ファージディスプレイ。１つのフォーマットは、ウイルス、特にバクテリオファージを利用する。このフォーマットは「ファージディスプレイ」と称する。タンパク質成分は、典型的には、バクテリオファージコートタンパク質に共有結合される。結合は、コートタンパク質に融合したタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じる。結合は、可動性ペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドンのサプレッションの結果として組み込まれたアミノ酸を含み得る。ファージディスプレイは、例えば、Ladner et al., 米国特許第５，２２３，４０９号、Smith (1985) Science 228:1315-1317；国際公開第９２／１８６１９号；同第９１／１７２７１号；同第９２／２０７９１号；同第９２／１５６７９号；同第９３／０１２８８号；同第９２／０１０４７号；同第９２／０９６９０号；同第９０／０２８０９号；de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274: 18218-30；Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20；Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281；Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896；Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628；Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580；Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49；Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137；およびBarbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982に記載されている。
【０２９５】
ファージディスプレイシステムは、線維状ファージ（ファージｆｌ、ｆｄ、およびＭ１３）、および他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージおよびラムドイドファージ、例えば、Santini (1998) J. Mol. Biol. 282:125-135；Rosenberg et al. (1996) Innovations 6:1-6；Houshm et al., (1999) Anal Biochem 268:363-370）を参照されたい）について開発されている。線維状ファージディスプレイシステムは、典型的には、遺伝子ＩＩＩタンパク質などのマイナーコートタンパク質、およびメジャーコートタンパク質である遺伝子ＶＩＩＩタンパク質との融合を使用するが、他のコートタンパク質、例えば遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質、またはそのドメインとの融合を使用することもできる（例えば、国際公開第００／７１６９４号を参照）。１つの実施態様では、融合は、遺伝子ＩＩＩタンパク質のドメイン、例えば、アンカードメインまたは「スタンプ（stump）」とである（例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質アンカードメインの記載については、米国特許第５，６５８，７２７号を参照）。非ペプチド結合、例えば、非共有結合または非ペプチド共有結合を使用して、コートにディスプレイされたタンパク質と物理的に会合させることも可能である。例えば、ジスルフィド結合および／またはｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎコイルドコイルを物理的会合のために使用することができる（例えば、Crameri et al. (1993) Gene 137:69および国際公開第０１／０５９５０号を参照）。
【０２９６】
タンパク質成分を提示するバクテリオファージを増殖させ、そして標準的ファージ調製方法、例えばＰＥＧ沈殿を使用して増殖培地から回収することができる。個々のディスプレイファージの選択後、選択したファージを使用して細胞を感染させることによる選択したタンパク質成分をコードする核酸。個々のコロニーまたはプラークを選抜し、核酸を単離しそして配列決定することができる。
【０２９７】
細胞に基づくディスプレイ。さらに別のフォーマットでは、ライブラリーは細胞ディスプレイライブラリーである。タンパク質は、細胞、例えば、真核または原核細胞の表面に提示される。例示的な原核細胞には、E.coli細胞、B. subtilis細胞、および胞子（例えばLu et al. (1995) Biotechnology 13:366を参照）が含まれる。例示的な真核細胞には、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ハンゼヌラ（Hanseula）、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris））が含まれる。酵母表面ディスプレイは、例えば、Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557および国際公開第０３／０２９４５６号記載されており、これは、Ｆａｂフラグメントなどの免疫グロブリンタンパク質を提示するのに使用できる酵母ディスプレイシステム、および重鎖および軽鎖の組み合わせを生成するための接合の使用について記載している。
【０２９８】
１つの実施態様では、多様な核酸配列を酵母ディスプレイ用のベクター中にクローン化する。クローニングは、斑状（variegated）配列と、ドメイン（または完全）酵母細胞表面タンパク質、例えば、Ａｇａ２、Ａｇａ１、Ｆｌｏ１、またはＧａｓ１とを連結する。これらのタンパク質のドメインは、膜貫通型ドメインによって（例えばＦｌｏ１）、またはリン脂質二重層との共有結合によって（例えばＧａｓ１）、斑状核酸配列によってコードされたポリペプチドをアンカーすることができる。鎖の一方が酵母細胞表面タンパク質に連結するようにベクターを形成して、細胞表面上に２つのポリペプチド鎖を発現させることができる。例えば、２つの鎖は免疫グロブリン鎖であり得る。
【０２９９】
リボソームディスプレイ。ＲＮＡ、およびＲＮＡによってコードされるポリペプチドを、ＲＮＡを翻訳しておりそして新生ポリペプチドがなお付着しているリボソームを安定化することによって物理的に会合させ得る。典型的には、高二価Ｍｇ２＋濃度および低温を使用する。例えばMattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022およびHanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92；Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30；およびSchaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35を参照されたい。
【０３００】
ポリペプチド−核酸融合体。別のフォーマットはポリペプチド−核酸融合体を利用する。例えば、Roberts and Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302、および米国特許第６，２０７，４４６号に記載されているように、ポリペプチド−核酸融合体を、共有結合したピューロマイシン基を含むｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって生成することができる。次いで、ｍＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、そしてポリペプチドと架橋することができる。
【０３０１】
他のディスプレイフォーマット。さらに別のディスプレイフォーマットは、タンパク質成分がポリペプチドを同定する非核酸タグに付着されている非生物学的ディスプレイである。例えば、タグは、ポリペプチドを提示するビーズに付着された化学的タグまたは高周波タグであり得る（例えば、米国特許第５，８７４，２１４号を参照）。
【０３０２】
ＥＬＩＳＡ。ディスプレイライブラリーによってコードされているタンパク質を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して結合特性についてスクリーニングすることもできる。例えば、その底の表面が、標的、例えば制限量の標的でコーティングされているマイクロタイタープレートに、各タンパク質を接触させる。プレートを緩衝液で洗浄して、非特異的に結合しているポリペプチドを除去する。次いで、ポリペプチド、例えばポリペプチドのタグまたは定常部分を認識できる抗体でプレートをプローブすることによって、プレートに結合しているタンパク質の量を決定する。適切な基質が提供されると比色生成物を生成するアルカリホスファターゼなどの酵素に抗体を結合させる。タンパク質を細胞から精製するか、または例えば、線維状バクテリオファージコートとの融合体として、ディスプレイライブラリーフォーマットでアッセイすることができる。あるいは、標的分子、例えば代謝調節因子Ａｋｔ１、例えばＡｋｔ１の構成的活性アイソフォームを発現する細胞（例えば、生細胞または固定細胞）をマイクロタイタープレートにプレーティングし、そしてディスプレイライブラリー中に存在するかまたはディスプレイライブラリーからの選択によって得られた抗体／ペプチドの親和性を試験するために使用することができる。
【０３０３】
ＥＬＩＳＡアッセイの別の型では、多様性鎖ライブラリーの各ポリペプチドを使用して、マイクロタイタープレートの異なるウェルをコーティングする。次いで、各ウェルを照会（query）するために、一定の標的分子を使用して、ＥＬＩＳＡが進行する。
【０３０４】
ホモジーナス結合アッセイ。候補タンパク質の標的との結合相互作用は、ホモジーナスアッセイ（すなわち、アッセイの全成分を添加した後に追加の液体操作を必要としない）を使用して分析することができる。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）をホモジーナスアッセイとして使用することができる（例えば、Lakowicz et al., 米国特許第５，６３１，１６９号；Stavrianopoulos et al., 米国特許第４，８６８，１０３号を参照）。第２の分子（例えば標的）が第１の分子（例えば、画分中で同定される分子）に近接している場合に、その発せられた蛍光エネルギーが第２の分子上の蛍光標識により吸収され得るように、第１分子上のフルオロフォア標識を選択する。第２の分子上の蛍光標識は、転移されたエネルギーへそれが吸収されると、蛍光を発する。標識間のエネルギー転移の効率は分子を分離する距離に関連するので、分子間の空間的関係を評価することができる。分子間で結合が生じる状況では、アッセイにおいて「アクセプター」分子標識の蛍光発光が最大になるはずである。ＦＲＥＴによってモニタリングするために構成された結合事象を、当技術分野で周知の標準的蛍光定量検出手段によって（例えば、蛍光計を使用して）好都合に測定することができる。第１または第２の結合分子の量をタイトレートすることによって、結合曲線を生成して、平衡結合定数を推定することができる。
【０３０５】
ホモジーナスアッセイの別の例は、Alpha Screen（Packard Bioscience, Meriden Conn.）である。Alpha Screenは２つの標識ビーズを使用する。一方のビーズは、レーザーによって励起されると一重項酸素を生成する。他方のビーズは、第１のビーズからの一重項酸素が拡散しそしてそれと衝突すると光シグナルを生成する。シグナルは、２つのビーズが近接しているときにのみ生成する。１つのビーズをディスプレイライブラリーメンバーに付着させ、他方を標的に付着させることができる。シグナルを測定して、結合の程度を定量する。
【０３０６】
候補タンパク質をディスプレイライブラリービヒクル、例えば、バクテリオファージに付着させて、または候補タンパク質を遊離分子として使用して、ホモジーナスアッセイを実施することができる。
【０３０７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。ディスプレイライブラリーから単離された分子と標的との結合相互作用を、ＳＰＲを使用し分析することができる。ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は、いずれの相互作用物も標識することなく、リアルタイムで生体分子特異的相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面での質量の変化（結合事象の指標となる）は、表面付近の光の屈折率の変化を生じる（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）。屈折率の変化は検出可能なシグナルを生成し、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定する。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag；Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345；Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705、およびBIAcore International AB (Uppsala, Sweden)によって提供されるオンラインリソースに記載されている。
【０３０８】
ＳＰＲからの情報を使用して、生体分子の標的への結合についての平衡解離定数（Ｋｄ）、および動力学的パラメーター（ＫｏｎおよびＫｏｆｆを含む）の正確かつ定量的な尺度を提供することができる。このデータを、異なる生体分子を比較するために使用することができる。例えば、多様性鎖のライブラリーから選択された核酸によってコードされるタンパク質を比較して、標的に対する高い親和性を有するか、または遅いＫｏｆｆを有する個体を同定することができる。この情報を使用して、構造−活性関係（ＳＡＲ）を明らかにすることもできる。例えば、親タンパク質の成熟型の動力学および平衡結合パラメーターを、親タンパク質のパラメーターと比較することができる。特定の結合パラメーター、例えば高い親和性および遅いＫｏｆｆと相関する、所定の位置の変異アミノ酸を同定することができる。この情報を、構造モデリング（例えば、ホモロジーモデリング、エネルギー極小化、または結晶学またはＮＭＲによって決定される構造を使用する）と組み合わせることができる。その結果、タンパク質とその標的との間の物理的相互作用の理解を明確に表し、そして他の設計プロセスを導くために使用することができる。
【０３０９】
タンパク質アレイ。ディスプレイライブラリーから同定されたポリペプチドを、固体支持体、例えばビーズまたはアレイ上に固定化することができる。タンパク質アレイについては、ポリペプチドの各々を支持体上の特有のアドレスに固定化する。典型的には、アドレスは二次元アドレスである。例えば、MacBeath et al., 2000, Science, 289:1760-1763およびBertone et al., 2005, FEBS Journal, 272:5400-5411を参照されたい。
【０３１０】
細胞アッセイ。候補ポリペプチドを、ライブラリーを宿主細胞中に形質転換することによって、ライブラリーから選択することができ；ライブラリーを、ディスプレイライブラリーから予め同定しておくことができる。例えば、ライブラリーは、例えばポリペプチドが、細胞内で産生され、細胞から分泌され、または細胞表面に結合されるように、ポリペプチドをコードしそして発現を指示するセグメントを含むベクター核酸配列を含むことができる。細胞は、例えば、細胞表現型または細胞媒介活性の変化によって検出される、Ａｋｔ１に結合するポリペプチドについてスクリーニングまたは選択することができる。例えば、Ａｋｔ１と結合する抗体の場合には、活性は、細胞浸潤のためのインビトロアッセイであり得る。１つの実施態様では、抗体を浸潤性哺乳動物細胞、例えば癌細胞、例えばＪＥＧ−３（絨毛癌）細胞と接触させる。マトリックスを浸潤する細胞の能力を評価する。マトリックスは、人工マトリックス、例えば、Matrigel、ゼラチンなど、または天然マトリックス、例えば、組織試料の細胞外マトリックス、またはその組み合わせであり得る。例えば、マトリックスは、細胞の層によってインビトロで生成することができる。
【０３１１】
実施例
本明細書に示す実施例は、疾患の処置のためのＭＳＰ３、ＭＰ５および／またはＩｎｓｌ６およびその誘導体、およびまたはそのアゴニストまたはアンタゴニストの、血管新生、筋変性、筋萎縮、肥満、糖耐性および／またはインスリン非感受性に関連する疾患および障害の処置のための使用に関する。ＭＳＰ３、ＭＰ５および／またはＩｎｓｌ６およびその誘導体、またはアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、単独で、任意の組み合わせでそして他の治療剤と組み合わせて一緒に使用することができる。刊行物およびそれらの刊行物内に引用されている参考文献の全ての開示の全体を、本発明が関連する技術分野の水準をより十分に記載するために、本明細書において参照により本出願中に組み入れる。以下の実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定するものではなく、むしろ特定の実施態様を例示するものである。当業者が想到する例示した方法の任意の変形は本発明の範囲内に入るものとする。
【０３１２】
方法
骨格筋特異的コンディショナルＡｋｔ１ ＴＧマウス。ＭＣＫ−ｒｔＴＡ ＴＧマウス（Grill et al., 2003）をＴｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１ ＴＧマウス（Shiojima et al., 2005）と交配して、ＤＴＧマウスを作製した。Ａｋｔ１トランスジーンの発現のために、ＤＴＧマウスを飲料水中のＤＯＸ（０．５mg/ml）で処置し、そしてトランスジーンの発現を抑制するためにＤＯＸ水を除去した。ＭＣＫ−ｒｔＴＡ単一ＴＧ同腹仔を、コントロールとして使用し、そしてＤＴＧマウスと同様にＤＯＸで処置した。
【０３１３】
動物の世話および食餌処置。研究プロトコルは、Boston Universityのthe Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。マウスを、２４℃で固定した１２時間明／暗サイクルで飼育した。示すように、マウスに、通常の固形食餌または高脂肪／スクロース食餌（ＨＦ食餌：Diet No. F1850, BIO-SERV）（Harte et al., 1999）のいずれかを給餌した。別々のケージに入れたマウスにおける食物消費および体重を毎日モニターした。
【０３１４】
生理学的測定。Ｏ２消費、ＣＯ２放出速度、および歩行活動レベルを、以前に記載されるように（Yu et al., 2000）、４−チャンバーOxymaxシステム（Columbus Instruments）を１マウス／チャンバーで使用することによって決定した。強制トレッドミル運動試験を、以前に記載されるように（Shalom-Barak et al., 2004）、トレッドミル（Columbus Instruments）を使用することによって実施した。マウスの筋肉強度を、以前に記載されるように（Acakpo-Satchivi et al., 1997）、自動握力計（Columbus Instruments）を使用して測定した。
【０３１５】
ＭＲＩ測定。ＭＲＩを、画像化のために勾配増幅器を取り付けたBruker Avance 500広口径分光計（１１．７Ｔ；プロトン用に５００MHz）で実施した（Viereck et al., 2005）。データを、販売者によって提供されるParavisionソフトウェアを用いて処理した。
【０３１６】
代謝測定。血糖を、Accu-checkグルコースモニター（Roche Diagnostics Corp.）を用いてアッセイした。血清インスリンを、標準としてマウスインスリン（Crystal Chem Inc.）を使用して、酵素結合免疫吸着測定法によって決定した。糖耐性試験（ＧＴＴ）を、６時間絶食したマウスに対して実施した。マウスにＤ−グルコース（１g/kg体重）を腹腔内注射し、そして注射の直前および３０、６０、９０および１２０分後に血糖値を決定した。インビボでの骨格筋のグルコース取り込みを、以前に記載されるように決定した（Koh et al., 2006）。肝臓における脂肪酸β酸化の速度を、以前に記載されるように検討した（Nemoto et al., 2000）。
【０３１７】
後肢虚血モデル。マウスをケタミン（８０mg/kg）およびキシアリン（xyaline）（１０mg.kg）の混合物を用いて麻酔した。左大腿動脈を、鼠径部靭帯を通る侵入点、膝窩動脈の起点、および伏在動脈を通る中途で結紮した。小さなブランチを焼灼し、そして結紮間の動脈の部分を除去した。血流を、腓腹筋上に直接配置した深部貫入レーザードップラープローブ（Perimed）を使用して測定した。流量測定を、大腿動脈切除の直前、直後、２週間後、および４週間後に行った。大腿切除の４週間後に、虚血およびコントロールの肢由来の腓腹筋およびヒラメ筋をメタノールを用いて固定し、そしてパラフィン中に包埋した。５μｍの切片をＴＲＩＴＣ標識レクチン（Bandeiraea Simplicifolia；Sigma-Aldrich）で染色した。
【０３１８】
組織学。骨格筋および肝臓組織を、ＯＣＴ化合物（Sakura Finetech USA Inc）中に包埋し、そして液体窒素中で急速冷凍した。白色脂肪組織を１０％ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィン中に包埋した。組織切片を、標準的方法によって、全体の形態についてはＨ＆Ｅで、線維症についてはマッソントリクローム（ＭＴ）で、そして脂質沈着についてはＯｉｌ  ｒｅｄ−Ｏで染色した。
【０３１９】
ウェスタンブロッティング。ウエスタンブロット分析を、以前に記載されるように実施した（Shiojima et al., 2002）。使用した抗体は以下のとおりであった：Cell Signaling Technology社製ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（ｓｅｒ−４７３）；Santa Cruz Biotechnology Inc.社製Ａｋｔ１およびＶＰ１６；Roche Diagnostics Corp.社製ＨＡ（１２ＣＡ５）；およびCalbiochem社製チューブリン。
【０３２０】
定量的リアルタイムＰＣＲ。全腓腹筋および肝臓由来の全ＲＮＡを、製造業者によって提供されるプロトコルを使用して、Qiagenによって調製した。ｃＤＮＡを、ThermoScript RT-PCR System（Invitrogen）を使用して生成した。リアルタイムＰＣＲを、以前に記載されるように実施した（Izumiya et al., 2006）。転写物レベルを、１８Ｓ ｒＲＮＡのものに対して相対的な転写物数として決定し、そしてコントロール試料の平均値に対して標準化した。プライマー配列は、要求に応じて入手可能である。
【０３２１】
統計分析。全てのデータを平均±ＳＥＭとして示す。２つの実験群由来のデータの統計的比較を、スチューデントｔ検定を使用することによって行った。複数の群由来のデータの比較を、フィッシャーＰＬＳＤ検定を用いるＡＮＯＶＡによって行った。Ｐ＜０．０５のレベルを、統計的有意として受け入れた。
【０３２２】
実施例１：
骨格筋特異的Ａｋｔ１トランスジェニックマウス
骨格筋特異的誘導性ＡＫＴ１ ＴＧマウスの作製：２系統のＴＧマウス（Ｔｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１およびＭＣＫ−ｒｔＴＡ）を使用して、骨格筋特異的コンディショナルＡｋｔ１ ＴＧマウスを作製した（図１Ａ）。Ｔｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１ ＴＧ系統は、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下のＡｋｔ１（ｍｙｒＡｋｔ１）トランスジーンの活性形態を有し（Shiojima et al., 2005）、そしてＭＣＫ−ｒｔＴＡ ＴＧ系統は、変異ＭＣＫプロモーターによって駆動されて、骨格筋中で逆テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ：ＴＲＥおよびＶＰ１６トランス活性化ドメインの融合タンパク質）を発現する（Grill et al., 2003）。２つのトランスジーンの両方を有する二重トランスジェニック（ＤＴＧ）マウスのドキシサイクリン（ＤＯＸ）での処置は、ＤＯＸがｒｔＴＡと会合してＴＲＥへの結合を可能にするので、ｍｙｒＡｋｔ１トランスジーンの発現を生じる。他方、ＤＯＸの中止は、ｒｔＴＡがＴＲＥに結合するのを阻害し、そして骨格筋中でのｍｙｒＡｋｔ１の発現を抑制する。Ｔｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１マウスとＭＣＫ−ｒｔＴＡマウスの交配によって、４つの異なる遺伝子型を有するマウス（野生型（ＷＴ）、Ｔｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１ ＴＧマウス、ＭＣＫ−ｒｔＴＡ ＴＧマウス、およびＤＴＧマウス）が、予想される頻度で生じた。Ａｋｔ１トランスジーンの調節された発現を検討するために、これらのマウスをＤＯＸ（−）群およびＤＯＸ（＋）群に分割した：ＤＯＸ（＋）群は、８週齢まで通常の水で処置し、続いて２週間ＤＯＸ処置し、そしてＤＯＸ（−）群は、１０週齢まで通常の水で処置した（図１Ｂ）。１０週齡で回収した腓腹筋溶解物のウエスタンブロット分析によって、抗ＨＡブロットによって検出されるトランスジーンの発現は、ＤＯＸを用いたＤＴＧマウスにおいてのみ観察されることが判明し、このことは骨格筋におけるＡｋｔ１トランスジーンの発現がＤＯＸ依存性に堅固に調節されていることを示す。Ａｋｔ１トランスジーンの誘導された発現は、Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔのリン酸化レベルの顕著な増加、全Ａｋｔタンパク質レベルの中程度の増加に関連する（図１Ｂ）。図１Ｃに示すように、Ａｋｔ１トランスジーンの発現は骨格筋においてのみ検出され、このことはトランスジーンの発現が骨格筋特異的に調節されたことを示す。本発明者らは、Ａｋｔ１トランスジーンの比較的低い発現レベルを示す第２のＴｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１トランスジェニックマウス系統も樹立した（データは示さず）。第１のＴｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１系統は、より強い成長調節効果を示し、そして骨格筋の成長および機能のより良好な評価を可能にしたので、さらなる実験をＴｅｔ−ｍｙｒＡｋｔ１マウスのこの系統を使用して実施した。
【０３２３】
骨格筋におけるＡＫＴ１の活性化は機能性ＩＩ型筋線維肥大を引き起こす：骨格筋におけるＡｋｔ１トランスジーン発現の結果を検討するために、マウスを８週齡でＤＯＸで処置し、そして２週間トランスジーンを誘導し、そして２週間ＤＯＸを除去することによってそれを抑制した。図２Ａに示すように、２週間のＡｋｔ１シグナリングの活性化は、強い筋肉成長を誘発した。Ａｋｔ１に誘発される筋肉成長は、ＤＯＸの中止の２週間後に完全に逆転した。トランスジーン発現および腓腹筋重量の経時変化を検討した（図２Ｂ）。Ａｋｔ１トランスジーンの発現は、３日目に初めて検出され、これは最初のトランスジーンの発現がＤＯＸ処置の直後に生じたことを示す。トランスジーン発現は、１４日目にその最大レベルに達した。トランスジーン発現の顕著な抑制が、ＤＯＸの中止の２日後という早さで観察され、そしてトランスジーン発現はＤＯＸの中止の１４日後までに完全に抑制された。腓腹筋重量は、７日目に有意に増加し、そしてそれは１４日目にさらに増加した。ＤＯＸを中止すると、ＤＯＸの中止の２日後に肥大の劇的な抑制が観察された。そして、腓腹筋重量は、ＤＯＸの中止の７日後に、ほぼ完全に基底レベルに逆戻りした。
【０３２４】
組織学的分析によって、個々の筋線維の大きさが見かけ上増加し、そしてそれがトランスジーン抑制後に逆転したことが判明した（図２Ｃ）。個々の線維の大きさの分析によって、腓腹筋における右への有意な移動が実証された。平均断面積は、Ａｋｔ１活性化の２週間後で約２倍増加した（２６５７±１９５対１３３８±８０μｍ２、ｐ＜０．０１）。６週間のトランスジーン発現の維持は、さらなる骨格筋肥大を誘発した（図２Ｄ）。Ａｋｔ１トランスジーン発現のレベルは、誘導後２週間と６週間との間、同程度であった。腓腹筋重量は、両方の時点でコントロールのものよりも有意に多かった。組織学によって示されるように、骨格筋における延長したＡｋｔ１活性化は、間質性線維症または炎症などのいかなる病理学的変化もなしに、より顕著な筋肥大を誘発した。
【０３２５】
ＡＫＴ媒介肥大化成体骨格筋の物理的性能：どの筋線維がＡｋｔ１トランスジーンを優先的に発現するかを検討するために、腓腹筋切片を抗ＨＡおよびＭＨＣアイソフォーム抗体で染色した。図３Ａに示すように、抗ＨＡ抗体によって検出されたＡｋｔ１トランスジーンは、ＩＩｂ型線維において優先的に発現されていた。ＩＩｂ型線維は、力の生成を担う速／解糖筋肉として分類されている。Ａｋｔ１トランスジーン発現プロフィールに一致して、ＤＴＧについてのピーク握力は、Ａｋｔ１誘導の２週間後に、コントロールのものより約５０％高かった（１０４．７±３．７対６９．８±０．８g、ｐ＜０．０５）。他方、強制トレッドミル運動試験によって、ＤＴＧは、コントロールより少ない走行能力を有することが判明した（図３Ｂ）。これらの結果は、ＩＩ型筋線維におけるＡｋｔ１活性化が、「抵抗性訓練」表現型を有するマウス株の作製を可能にすることを示す。
【０３２６】
ＡＫＴ１媒介ＩＩ型筋線維成長は食餌誘発肥満および肥満関連代謝障害を退行させる：ＩＩ型筋肉成長と肥満との間の相関を調べるために、マウスに高脂肪／スクロース（ＨＦ／ＨＳ）食餌を給餌して、肥満を誘発した。Ａｋｔ１活性化抑制の条件下では、ＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したコントロールおよびＤＴＧマウスにおいて、体重獲得に有意な差異は観察されなかった（図４Ａ）。しかし、一旦肥満マウスのＩＩ型骨格筋においてＡｋｔ１が活性化されると、体重はコントロールマウスと比較して劇的に減少した。ＭＲＩ分析によって、脂肪の過剰量の蓄積がＤＴＧマウスにおいて有意に減少したことが判明した（図４Ｂ）。組織学的分析によって、筋線維肥大がＤＴＧマウスにおいて明白であることが判明した（図４Ｃ）。脂肪細胞の大きさは、コントロールマウスにおいてはＨＦ／ＨＳ食餌によって拡大したが、しかし、それはＤＴＧマウスにおいて見かけ上、より小さかった。腓腹筋重量は、コントロールマウスと比較して、ＤＴＧマウスにおいて有意に増加した（図４Ｄ）。鼠径部脂肪パッド重量は、コントロールマウスにおいてＨＦ／ＨＳ食餌によって増加したが、しかし、それはＤＴＧマウスにおいては劇的に減少した（図４Ｄ）。
【０３２７】
本発明者らは、次に、Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長の全身グルコース代謝に対する効果を検討した。絶食期間中には各群において血糖値の差は存在しないが、しかし給餌期間中は、ＨＦ／ＨＳ食餌給餌コントロールマウスにおいて有意に、より高かった（図５Ａ）。絶食時血清インスリンレベルはＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したコントロールマウスにおいてのみ有意に増加し、このことはこれらのマウスがインスリン抵抗性を発達させ、Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長によってインスリン抵抗性が改善されたこと示す（図５Ｂ）。この点をさらに調べるために、本発明者らは糖耐性試験（ＧＴＴ）を実施した。図５Ｃに示すように、ＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したＤＴＧマウスは、ＧＴＴ後に通常の食餌を与えたマウスと同様のグルコースレベルを維持し、一方ＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したコントロールマウスは、注射後により高いグルコースレベルを示した。これらの結果は、ＨＦ／ＨＳ食餌に誘発される性重篤な耐糖能障害がＩＩ型骨格筋におけるＡｋｔ１活性化の後に明らかに改善されたことを示す。改善された糖耐性が、骨格筋におけるグルコース処分の増加によるのかどうかを検討するために、本発明者らは、インビボでの骨格筋グルコース取り込みを測定し、そして筋肉グルコース取り込みが、通常の食餌およびＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したＤＴＧにおいて、それぞれ１．６倍および２．０倍高かったことを見出した（図５Ｄ）。
【０３２８】
それによって過剰な脂肪蓄積がＩＩ型筋肉成長によって逆転されるメカニズムを調べるために、本発明者らは、エネルギー平衡：食物摂取およびエネルギー支出を検討した。コントロールおよびＤＴＧ両方のマウスは、実験期間全体にわたって類似の食物摂取を示す（図６Ａ）。ＨＦ／ＨＳ食餌給餌ＤＴＧマウスの歩行活動レベルは、コントロールマウスのものよりも約４０％低かったが（図６Ｂ）、全身Ｏ２消費（ＶＯ２）によって推定されたエネルギー支出は、コントロールマウスのものよりも有意に高かった（図６Ｃ）。炭水化物の脂肪酸酸化に対する比率を反映する呼吸交換率（ＲＥＲ）は、ＨＦ／ＨＳ食餌給餌ＤＴＧマウスにおいて有意に減少し、このことは、これらのマウスが、絶食期間の間に相対的に高い割合の脂肪酸を燃料源としてを使用することを示す。しかし、定量的リアルタイムＰＣＲ分析によって、脂肪酸酸化およびミトコンドリア生合性に関連する遺伝子の大部分が、骨格筋においてアップレギュレートされなかったことが判明した（表１）。骨格筋と同様に肝臓は代謝的に活性な器官なので、本発明者らは、肝臓の形態および脂質酸化機能をチェックした。組織学によって示されるように、肝臓におけるＨＦ／ＨＳ食餌に誘発される脂質沈着は、ＤＴＧマウスにおいて劇的に解消した（図７Ａ）。なぜ脂質沈着がＤＴＧマウスにおいて減少したかを調べるために、本発明者らは、インビボでの肝臓の脂肪酸酸化を測定し、そしてＨＦ／ＨＳ食餌給餌ＤＴＧマウスの肝臓において、より多くの脂肪酸が酸化されたことを見出した（図７Ｂ）。肝臓において合成され、そして肝臓脂肪酸酸化の間接的マーカーとして使用できる血清ケトン体は、ＨＦ／ＨＳ食餌給餌ＤＴＧマウスにおいて有意に増加した（図７Ｃ）。最後に、定量的リアルタイムＰＣＲ分析によって、ＨＦ／ＨＳ食餌給餌ＤＴＧマウスの肝臓におけるＨＮＦ４α、Ｌ−ＣＰＴ１およびＰＧＣ１−αの発現の有意な増加が示され、このことはＡｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が、肝臓における脂肪酸酸化の刺激に関与する分子を活性化することを示唆する。
【０３２９】
表１。ＨＦ／ＨＳ給餌コントロールまたはＤＴＧマウスの骨格筋におけるエネルギー支出に関連する遺伝子発現。値は通常食餌コントロールに対する変化倍率である。＊＝ＨＦ／ＨＳ食餌コントロールに対してｐ＜０．００５。
【０３３０】
【表１】
2009528355.tif 000003
【０３３１】
要約すると、肥満マウスにおける筋原性Ａｋｔトランスジーン活性化は、以下の表現型を与える：１）筋肉の量および強度の増加、２）体脂肪量の減少、３）体重の減少、４）インスリン感受性の改善、５）脂肪肝の減少、６）骨格筋における血管新生の増加、および７）衛星細胞の取り込みを介する筋肉成長の増加（図１１）。これらの効果は、一定レベルの食物摂取および身体活動にかかわらず生じる。
【０３３２】
本研究において、本発明者らは、ＩＩ型骨格筋成長が、肥満マウスにおける肥満および肥満関連代謝障害を退行させることを見出した。ＩＩ型骨格筋におけるＡｋｔ１の活性化は筋肥大を劇的に誘発し、これは、ＨＦ／ＨＳ食餌により誘発された耐糖能障害の改善および体重、特に体脂肪量の見かけの減少を伴った。これらの効果は、食餌および行動の改変なしに達成された。さらに、ＩＩ型骨格筋成長によって、肝臓における脂質沈着の減少および脂肪酸酸化の増加が導かれた。ＩＩ型筋線維は加齢と共に劇的に減少し（Larsson, 1983）、そして断面研究によって、筋肉強度はメタボリックシンドロームの有病率と逆相関することが判明しているので（Jurca et al., 2005；Jurca et al., 2004）、本発明者らは、ＩＩ型筋線維の増加を目指した抵抗性訓練が、肥満および肥満関連代謝の患者、特に高齢者のために有益な介入であることを見出した。
【０３３３】
本研究において、本発明者らは、ＩＩ型筋線維成長によって、肥満マウスにおいて、身体活動レベルとは独立して、全身的エネルギー支出の増加が導かれることを見出した（図６Ｂ、Ｃ）。この知見は、ＩＩ型筋肉の構築および維持自体がエネルギー消費することを示す。大きな骨格筋からのエネルギー要求の増加の結果としての脂肪組織へのエネルギー供給の減少は、肥満の退行に寄与し得る。さらに、本発明者らは、ＩＩ型筋線維におけるＡｋｔ１活性化が骨格筋中へのグルコース取り込みを有意に増加させ、そしてＨＦ／ＨＳ食餌により誘発された耐糖能障害がＩＩ型筋肉におけるＡｋｔ１活性化によって劇的に改善されることを見出した（図５）。それゆえ、本発明者らは、Ａｋｔ１媒介ＩＩ型線維成長によって、ＨＦ／ＨＳ食餌に誘発される耐糖能障害の改善が導かれることを見出した。本明細書に開示した別の顕著な知見は、ＤＴＧマウスの肝臓においてＨＦ／ＨＳ食餌に誘発される脂肪肝が劇的に解消し、そして脂肪酸酸化が有意に増加したことであり（図７）、このことは骨格筋におけるＡｋｔ１シグナリングの活性化が、何らかの分泌因子を産生し、そしてパラクラインに肝臓に直接影響を及ぼすことを示す。以前の研究において、本発明者らは、骨格筋または心筋におけるＡｋｔ１の活性化が、筋細胞から放出される血管新生促進因子を分泌することによって、筋肥大および協調的血管動員を誘発したことを以前に報告している（Shiojima et al., 2005；Takahashi et al., 2002）。本明細書における知見は、Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が、他の器官とのグルコース／脂質代謝の協調的調節を誘発することを示す。
【０３３４】
結論として、本発明者らは、ＩＩ型骨格筋成長が、肝臓における脂質酸化を調節することによって、肥満関連代謝を改善することを初めて見出した。この知見は、ＩＩ型骨格筋線維が、遠隔の器官と連絡することによって、グルコース／脂質代謝を調節するという新規の概念を提供する。
【０３３５】
実施例２
骨格筋におけるＡＫＴ１の活性化の詳細な特徴付け
図９〜１２に示すように、筋肉におけるＡｋｔの誘導性発現を有するトランスジェニックマウスをさらに特徴付けた。飲料水へのＤＯＸの投与によってＡｋｔの発現を誘導すると（ＤＴＧ）、ＩＩｂ型筋線維、典型的には解糖／速攣縮線維の肥大が、野生型マウスと比較して見られ、そしてＤＯＸ処置したＡｋｔマウスにおいて、コントロールと比較して少ないＩ型およびＩＩａ型線維が生じた。
【０３３６】
脂肪酸酸化およびミトコンドリア生合成に関連するｍＲＮＡ数の定量的遺伝子発現分析（図１０Ａ）、およびパルミチン酸の全脂肪酸β酸化の増加（図１０Ｃ）、またｏｉｌ  ｒｅｄ−Ｏ染色を使用する肝臓の形態分析（図７Ａおよび１０Ｂ）によって検出されるように、ＤＯＸを給餌し、高脂肪および高糖類（ＨＦ／ＨＳ）を給餌したトランスジェニックＡｋｔマウスはまた、ＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したコントロールマウスと比較して、肝臓において脂質過酸化の増加を有するが、筋肉においては有しない。ＨＦ／ＨＳ給餌コントロールマウスと比較して、ＨＦ／ＨＳ食餌を給餌したＡｋｔトランスジェニックマウスにおいては、脂肪酸酸化に関連する遺伝子であるＰＧＣ−１、ＨＮＦ４−αおよびＣＰＴ−１が増加し（図１０Ｄ）、同様に血清および尿ケトン体（図１０Ｅ）および血清乳酸レベルが増加し（図１０Ｆ）、このことは筋肉におけるＡｋｔの活性化が肝臓における脂肪酸代謝も同様に増加させることを示す。
【０３３７】
筋肉におけるＡｋｔ発現の誘導の、他の組織に対する効果の分析は、例えば、肝臓、脂肪細胞、および他の器官、例えば、腎臓、脾臓、膵臓、神経系組織など由来の組織を使用し、ディファレンシャル遺伝子発現分析を使用して評価することができる（図１２参照）。
【０３３８】
実施例３
インビトロでのＡＫＴ１の誘導性発現：本発明者らは、Ａｋｔ２（Fujio Y. et al., 2001 Cell Death Duff 8: 1207-1212）およびＡｋｔ３（Y. Taniyama 2005 J Mol Cell Cardiol 38:375-385）がＡｋｔ１と機能特性を共有することを以前に示したので、インビトロでの細胞のまたはインビボでの組織の、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、またはＡｋｔ３（構成的活性形態またはドミナントネガティブ形態）での形質導入は、転写物レベルで同様の変化を導くはずである。
【０３３９】
インビトロでの骨格細胞におけるＡｋｔの活性化が、遺伝子発現の同様の変化を導くかどうかを検討するために、筋原細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を、Ａｋｔ１を発現するアデノウイルス（Ａｄｖ−ｍｙｒＡｋｔ）を用いて形質導入した。１日後のＡｄｖ−ｍｙｒＡｋｔトランスフェクト細胞の遺伝子発現の、マウスの骨格筋におけるＡｋｔ１の誘導性発現の骨格筋細胞との比較は、高度に類似した遺伝子発現プロフィールを有しており、このことはインビトロで培養されたＡｋｔ１を発現する細胞骨格筋が、筋肉分泌タンパク質（ＭＳＰ）またはミオカインの研究のために有効なツールであることを示す。
【０３４０】
図８に示すように、骨格筋細胞株、例えば、Ｃ２Ｃ１２においてｍｙｒＡｋｔを発現させることによって、インビトロアッセイにおいて筋肉分泌タンパク質（ＭＳＰ）を同定するためのプロトコルを考案した。他の骨格筋細胞株、例えば、ヒト骨格筋細胞株を利用することができる。
【０３４１】
実施例４
筋肉成長、血管新生、肥満、インスリン感受性および心血管機能に関連する因子の同定：表現型、例えば、それらに限定されないが、グルコース感受性およびインスリン感受性の増加、体脂肪量の減少および脂肪細胞の大きさの減少、肝臓沈着の減少、毛細血管密度の増加、および衛星細胞動員および衛星細胞の線維中への取り込みの増加を与える新規の筋肉分泌タンパク質（ＭＳＰ）を同定するためのプロトコルを考案した。最初に、本発明者らは、コントロールおよびＤＴＧマウスの筋肉に対してマイクロアレイ分析を実施した。誘導性Ａｋｔトランスジェニックマウス（３群；トランスジーンの誘導なし（コントロール）、２週間誘導（２w on）、および２週間誘導／２日抑制（２w on／２d off））の腓腹筋由来の全ＲＮＡをAffymetrix GeneChip（登録商標）Mouse Expression Set 430マイクロアレイによって分析した。Ａｋｔ誘導によってアップレギュレートされた転写物のうち、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて入手可能な全長オープンリーディングフレームｃＤＮＡを有する未知の遺伝子を選択した。次いで、予測アミノ酸配列を推定シグナル配列についてSignal IPソフトウェアを使用して検討した。次いで、予測シグナル配列を有する未知の転写物をSOSUI signal βバージョンソフトウェアを用いて分析して、それらが分泌タンパク質か内在性膜タンパク質をコードするかどうかを予測した。次いで、このｃＤＮＡのサブセットを、ＤＯＸの存在下または非存在下のＤＴＧマウスの腓腹筋におけるリアルタイムＰＣＲによって検証した。
【０３４２】
上記検討に基づいて、８つの選択したｃＤＮＡを、遺伝子産物が哺乳動物細胞によって分泌されるかどうかを試験をするためにさらに分析した。全長ｃＤＮＡをＰＣＲによって得、そしてＮ末端のＶ５エピトープおよび検出用のＣ末端のＨｉｓタグへの融合体として未知のタンパク質を発現するｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ中にサブクローン化した。次いで、これらの発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。２日後に、細胞ペレットおよび培地画分を採取し、そして抗Ｖ５抗体を使用するウエスタンブロットによって分析した。ここで、組換えタンパク質を細胞ペレットおよび培地両方の中に検出することができ、このことはこのｃＤＮＡが分泌タンパク質をコードすることを示す。全部で、８つのｃＤＮＡのうち６つが、このＨＥＫ２９３細胞トランスフェクションアッセイによって評価したところ、分泌タンパク質をコードし、一方２つのｃＤＮＡはそうではなかった（すなわち、タンパク質は、細胞ペレット中に検出することはできたが、培地中には検出できなかった）。
【０３４３】
要約すると、上記のようなマイクロアレイ分析およびトランスフェクションアッセイに基づいて、本発明者らは、Ａｋｔ媒介筋肉成長の間にアップレギュレートされる分泌タンパク質をコードする６つの新規のｃＤＮＡを同定した（表２）。これらの因子を筋肉分泌タンパク質１〜６（ＭＳＰ１〜６）と称する。ＭＳＰ１〜５のRiken識別番号およびGenBankアクセッション番号を表２に記載する。ＭＳＰ６は、糖尿病および肥満のための有用性を有し得る代謝因子ＦＧＦ２１である（J. Clin. Invest. 2005;115:1627-1635）。
【０３４４】
【表２】
2009528355.tif 000004
【０３４５】
ＭＳＰ１は、２６１００２８Ｆ０８Ｒｉｋ（GenBankアクセッション番号ＢＣ０５２８４４）（配列番号１６）に対応し、ＭＳＰ２は、２３１００４３Ｉ０８Ｒｉｋ（GenBankアクセッション番号ＡＫ００９７７９）（配列番号１７）に対応し、ＭＳＰ３は、１１１００１７Ｉ１６Ｒｉｋ（GenBankアクセッション番号ＮＭ_０２６７５４）（配列番号１）に対応し、ＭＳＰ４は、４７３２４６６Ｄ１７Ｒｉｋ（GenBankアクセッション番号ＢＣ０２５８３０、ＡＫ０２８８８３）（配列番号１８）に対応し、そしてＭＳＰ５は、１６０００１５Ｈ２０Ｒｉｋ（GenBankアクセッション番号ＡＫ００５４６５）（配列番号１２）に対応する。
【０３４６】
実施例５
代謝調節因子としてのＭＳＰ３
ＭＳＰを発現するアデノウイルスベクターの産生および虚血後肢血管新生アッセイにおける効力：６個全てのＭＳＰ ｃＤＮＡのアデノウイルス発現ベクターを、以前に記載されるようにＨＥＫ２９３細胞における相同組換えによって作製した（Mol. Cell. Biol. 2002;22:680-691）。手短に言えば、ＭＳＰ ｃＤＮＡをＡｄｅｎｏ−ＭＳＰと名付けたアデノウイルスシャトルベクター中にサブクローン化した。ＭＳＰ ｃＤＮＡを含むシャトルベクターを線状にし、そしてアデノウイルスバックボーンプラスミドｐＡｄＥａｓｙ−１を有するEscherichia coli中に同時形質転換した。得られたＭＳＰ ｃＤＮＡを有する組換えアデノウイルスＤＮＡをパッケージング細胞株２９３細胞中にトランスフェクトして、組換えアデノウイルスベクターを産生した。全てのウイルス構築物を２９３細胞中で増幅し、そしてＣｓＣｌ超遠心分離によって精製した（これは研究室でルーチンである）（Mol. Cell. Biol. 2002;22: 680-691；J. Biol. Chem. 2005;280:20814-20823）。
【０３４７】
ＭＳＰ３は、１１１００１７Ｉ１６Ｒｉｋ（GenBankアクセッション番号ＮＭ_０２６７５４）（配列番号１）に対応し、そして筋肉関連トランスジーンの発現および筋肉成長に応答してディファレンシャルに調節されることが見出された。２つのＭＳＰ、ＭＳＰ３およびＭＳＰ６（ＦＧＦ−２１）のインビボでの潜在的血管新生特性を評価するために、１０週齢のマウスを片側後肢手術に供した（J. Biol. Chem. 2004;279:28670-28674；Circ. Res. 2005;96(8):838-846；Circ. Res. 2006;98(2):254-61）。アデノウイルス媒介遺伝子移入を、ＭＳＰ３およびＭＳＰ６を発現するアデノウイルスベクターを用いて、手術の３日前に虚血肢中の内転筋の５つの異なる部位に直接注射することによって実施した。手術直前および手術後０、３、７、１４、および２８日目に、脚部および足部に対するレーザードップラー分析によって、血管成長をモニターした（図１３）。図１３に示すように、ａｄｅｎｏ−ＭＳＰ３処置マウスは、レーザードップラー血流分析によって決定したところ、後肢手術の７、１４、および２８日後に、流量回復の有意な増加を示した。他方、ａｄｅｎｏ−ＭＳＰ６は、コントロールマウスと比較して流量回復に対する影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＭＳＰ３は血管新生調節タンパク質として機能するが、ＭＳＰ６（すなわちＦＧＦ２１）はそうではないことを示唆する。このことは、図１４においても示され、ここでＡｄｖ−ＭＳＰ３は、ＣＤ３１免疫染色および毛細血管密度の定量分析によって同定したところ、Ａｄｖ−ＦＧＦ２１またはコントロールＡｄｖ−β−ｇａｌ処置マウスと比較して、毛細血管密度および微小血管形成を改善している。
【０３４８】
グルコース感受性の代謝調節因子としてのＭＳＰ３、食餌誘発肥満および肥満関連代謝障害を退行させる：
ＭＳＰの代謝機能を試験する食餌誘発肥満モデルを評価するためのプロトコルを確立した。ここで、高脂肪高スクロース食餌を給餌したマウスに、ＭＳＰ３を発現するアデノウイルス（Ａｄｖ）を筋肉内注射し（１×１０１０pfu）、そしてＡｄｖ注射の７、１４、２１および２８日後に体重を評価し、そして１４および２８日目に血糖を評価する。
【０３４９】
Ａｄｅｎｏ−ＭＳＰ３の筋肉内注射に際して、食餌誘発肥満マウスは、Ａｄｖ−β−ｇａｌ注射マウスと比較して、代謝応答およびグルコース感受性の改善を有した（図１５ＡおよびＢ）。グルコース注射の１２０分後までに血糖（ｍｇ/ｄｌ）がＡｄｖ−ＭＳＰ３およびＡｄｖ−ＦＧＦ２１について同じレベルに戻り、アデノウイルスにコードされるＭＳＰ３は、アデノウイルス送達ＦＧＦ−２１（ＭＳＰ６としても知られる）と機能的に等価物であるようである。さらに、この改善した代謝応答およびグルコース感受性は、他のＭＳＰ（ＭＳＰ５、ＭＳＰ２、ＭＳＰ４およびＭＳＰ１）については観察されなかった（図１５Ｄ）。
【０３５０】
第２染色体に位置し（図１７）、そして２つのオルタナティブスプライスアイソフォーム；長鎖アイソフォーム（配列番号１）および短鎖アイソフォーム（配列番号２）（図１６）として存在するＭＳＰ２の発現プロフィールを分析するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。そして、アミノ酸配列の分析から、ＭＳＰ３はシグナル配列を有し、そしてげっ歯類アイソフォームとヒトアイソフォームとの間の高い相同性を有することが予測される；マウス（配列番号３）とラット（配列番号４）との間の配列同一性は９４％であり、マウスとヒト（配列番号５）との間の配列同一性は７９％である（図１８）。長鎖および短鎖アイソフォームの両方を検出するように設計したプライマーを使用する全ＭＳＰ３発現の分析は（配列番号１０および１１、図１９）、ＭＳＰ３が心臓、脳、肺、胸腺、リンパ節、眼および骨格筋における制限された発現を有することを示す（図２０Ａ）。さらに、ＭＳＰ３は、筋細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞において発現しており、そしてこの発現は、構成的活性Ａｋｔ（ＭｙｒＡｋｔ）を発現するアデノウイルスでのＣ２Ｃ１２細胞のトランスフェクトによってさらに誘導された（図２０Ａ）。ＭＳＰ３の長鎖および短鎖アイソフォームの発現の分析を、長鎖および短鎖アイソフォームの各々に対するアイソフォーム特異的プライマーを使用して行い（配列番号６〜９、図２１）、これはＭＳＰ３の長鎖形態（上のバンド）が、短鎖形態（下のバンド）と比較して優勢に発現していることを示す（図２０Ｂ）。
【０３５１】
要約すると、ＭＳＰ３は、血管新生因子として機能し（図１３および１４）そして肥満マウスモデルにおいてグルコースに対する感受性も調節し（図１５）、一方ＦＧＦ２１はグルコースに対する感受性を調節するように機能するのみであるので、本発明者らは、ＭＳＰ３がＦＧＦ２によって共有されない代謝調節因子としての二重の機能を有することを見出した。
【０３５２】
実施例６
筋肥大因子（筋原性因子）としてのＭＳＰ５
ＭＳＰ５は、筋肉関連トランスジーンの発現および筋肉成長に応答して、ディファレンシャルに調節されることが見出された。ＭＳＰ５は、１６０００１５Ｈ２０Ｒｉｋ（GenBankアクセッション番号ＡＫ００５４６５）（配列番号１２）に対応する。
【０３５３】
ＭＳＰ５の潜在的血管新生特性を評価するために、１０週齢のマウスを片側後肢手術に供した（J. Biol. Chem. 2004;279:28670-28674；Circ. Res. 2005;96(8):838-846；Circ. Res. 2006;98(2):254-61）。アデノウイルス媒介遺伝子移入を、ＭＳＰ５およびＭＳＰ１を発現するアデノウイルスベクターを用いて、手術の３日前に、虚血肢中の内転筋の５つの異なる部位に直接注射することによって実施した。以前の実験のように、手術直前および手術後０、３、７、１４、および２８日目に、脚部および足部に対するレーザードップラー分析によって血管成長をモニターし、そしてＡｄｖ−ＭＳＰ５トランスフェクトマウスは、β−ｇａｌコントロールまたはＡｄｖ−ＭＳＰ１トランスフェクトマウスと比較して、改善された虚血／正常ＬＤＢＦ比を有しており（図２２）、このことはＭＳＰ５は血管新生を増加させるように機能するが、ＭＳＰ１はそうではないことを示す。
【０３５４】
インビトロでの骨格筋細胞の増殖に対するＭＳＰ５の効果を評価するために、筋細胞への分化の４日後にＣ２Ｃ１２細胞をＡｄｖ−ＭＳＰ５、Ａｄｖ−ＭＳＰ３、ａｄｖ−β−ＧａｌまたはＡｄｖ−ｍｙｒＡｋｔを用いてトランスフェクトし、そしてそれらの形態および管直径を評価した。Ａｄｖ−ＭＳＰ５またはａｄｖ−ｍｙｒＡｋｔを用いてトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞は、Ａｄｖ−ＭＳＰ３またはコントロールＡｄｖ−β−ｇａｌトランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞と比較して拡大し（図２３Ｂ）、そして増加した管直径を有する（図２３Ｃ）。さらに、タンパク質合成および筋原線維の成長の尺度として３Ｈ−ロイシン取り込みを評価し、Ａｄｖ−ＭＳＰ３およびＡｄｖ−β−ｇａｌトランスフェクトと比較して、Ａｄｖ−ＭＳＰ５およびＡｄｖ−ｍｙｒＡｋｔトランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞においてタンパク質合成が増加している（図２４）。Ａｄｖ−ＭＳＰ５またはＡｄｖ−ｍｙｒＡｋｔを用いてトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞は、血管新生因子であるＶＥＧＦの発現を促進し、これは、Ａｄｖ−ＭＳＰ３またはＡｄｖ−β−ｇａｌトランスフェクト細胞においては観察されなかった（図２５）。
【０３５５】
要約すると、ＭＳＰ５は、筋肥大因子または筋原性因子として機能し、そして骨格筋における肥大を促進する。ＭＳＰ５はまた、虚血肢における血管新生を刺激し、そしてＣ２Ｃ１２細胞におけるＶＥＧＦの発現を増加させる。Ａｄｖ−ＭＳＰ５形質導入虚血肢の血管再生は、筋肉成長の増加およびＶＥＧＦの分泌の増加の結果であり得る。
【０３５６】
実施例７
インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）は、筋再生を促進する
インスリン様６もまた、筋肉関連トランスジーンの発現および筋肉成長に応答してディファレンシャルに発現することが同定された。インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）はリラキシンファミリーに属し、そしてGenBankアクセッション番号ＮＭ_００７１７９（配列番号２０）に対応する。
【０３５７】
筋原線維が成長するにつれての前駆細胞の動員を示す、筋細胞中で中心に集まった核によって決定したところ、衛星増殖の増加が、筋肉関連タンパク質の誘導性発現を有するトランスジェニックマウス、例えば、構成的活性を発現するマウスの骨格筋において、Ａｋｔ１の活性化の２、４、６、８および１０週間（ｗ）後に観察され、これは、コントロールマウスにおいては観察されなかった（図１１）。トランスジーン活性化の２週間後の衛星細胞の増殖を、ＢｒｄＵのＤＮＡ中への取り込みの免疫組織化学によって示し、これは、誘導されたＡｋｔを有するマウス由来の筋肉組織切片においては明白であったが、コントロールマウス（cont）においてはそうではなかった。ＢｒｄＵを取り込む細胞は多核性であり、そして筋細胞の周囲に位置しており、このことは筋原線維が衛星細胞を動員していることを示す（データは示さず）。活性化衛星マーカー（ｍｙｏ−Ｄ）についての免疫染色によるさらなる分析では、二重（ホモ接合性）Ａｋｔトランスジェニックマウスは、ｍｙｏＤ陽性衛星細胞の増加を示し、これはコントロールマウス由来の筋肉においては検出されなかった（データは示さず）。ＭｙｏＭｏｕｓｅの腓腹筋の断面当たり約２〜４個のＭｙｏＤ陽性衛星細胞が見られたが、コントロールマウス由来の筋肉においてはＭｙｏＤ細胞は検出されなかった（データは示さず）。
【０３５８】
Ａｋｔの誘導性発現を有するトランスジェニックマウス、またはＡｄｖ−Ａｋｔを発現するアデノウイルスを用いてトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞のいずれかを使用すると、Ａｋｔの誘導後のマウスにおいてＩｎｓｌ６は約９倍有意にアップレギュレートされ、そしてまたＡｄｖ−Ａｋｔを発現するＣ２Ｃ１２細胞においてアップレギュレートされ（図２６）、このことはインスリン様６が、インビトロおよびインビボの両方で、筋肉においてＡｋｔによって調節されることを示す。興味深いことに、Ｉｎｓｌ３、Ｉｎｓｌ５、リラキシンおよびｉｎｓｌ７を含む、他のリラキシンファミリーメンバーは、Ａｋｔによって調節されない（図２７）。さらに、インスリン様６転写物は、Ａｋｔ発現の誘導の２週間後のトランスジェニックマウスにおいて２４倍劇的にアップレギュレートされ、そしてＡｄｅｎｏ−ｍｙｒＡｋｔ１での形質導入後のＣ２Ｃ１２細胞において１０倍アップレギュレートされる（図２６）。別の実験において、Ｉｎｓｌ６の発現を筋再生のモデルにおいて分析した。ここで、心臓毒の前脛骨（ＴＡ）筋への投与は、筋肉の再生および修復を刺激した。心臓毒の前脛骨（ＴＡ）筋への投与後に、ＡｋｔおよびＩｎｓｌ６両方の転写物は筋再生の間にアップレギュレートされ、一方ＶＥＧＦはダウンレギュレートされ、そしてリラキシンファミリーの他のメンバー（図４１に示す）、例えば、Ｉｎｓｌ３、Ｉｎｓｌ５、リラキシン、Ｉｎｓｌ７（リラキシン３）は、心臓毒損傷マウス筋肉において調節されない（図２８）。
【０３５９】
Ｉｎｓｌ６の機能的役割を調べるために、本発明者らは、Ｉｎｓｌ６を発現するアデノウイルスを作製し、そしてインビトロでのＣ２Ｃ１２細胞に対するその効果を評価した。図３６は、２４０のＭＯＩ（感染多重度）でＡｄｖ−Ｉｎｓｌ６またはＡｄｖ−βＧａｌを用いてトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞では、Ａｄｖ−β−ｇａｌトランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞と比較して、Ｃ２Ｃ１２細胞の筋原線維の肥大または分化などの形態変化は生じず（図２９Ａおよび２９Ｅ）、筋小管数の増加もクレアチンキナーゼ発現またはロイシンの取り込みの変化も生じなかった（図２９Ｂ〜Ｅ）。興味深いことに、Ｉｎｓｌ６についてのこれらの結果は、ＭＳＰ５について観察されたもの（上記実施例６）とは対照的である。さらなる実験において、骨格筋におけるチミジン（３Ｈ−チミジン）取り込みの増加によって示されるように（図３０Ａ）、Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６は、骨格筋細胞における衛星細胞の増殖を刺激し、これは、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質およびリン酸化Ｒｂ（ｐ−Ｒｂ）の増加を伴った（図３０Ｂ）。
【０３６０】
心臓毒（ＣＴＸ）の筋肉内注射を使用する筋再生のインビボモデルにおいて、Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６は、Ａｄｖ−βＧａｌコントロール注射マウスと比較して、心臓毒（ＣＴＸ）損傷後のＴＡ筋再生を促進する（図３１および３２）。再生の改善は、組織切片において７日目および１４日目に最も顕著である（図３２にも示す）。Ｉｎｓｌ６はまた、心臓毒（ＣＴＸ）の筋肉内投与後に炎症性細胞数を減少させるその能力に基づいて、抗炎症因子として機能することが見出された（図３１および３２）。７日目に、Ｉｎｓｌ６の過剰発現は血清中へのクレアチンキナーゼの放出を抑制し（左下パネル）、これは１４日目には観察されなかった（右下パネル）。心臓毒媒介筋変性の転写物レベルの定量分析は、Ｉｎｓｌ６がいくつかの転写物レベルの変化を媒介することを示す。Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６トランスフェクト筋肉では、Ｉｎｓｌ６は２００倍増加し（ｐ＜０．０５）、そしてＡｄｖ−Ｉｎｓｌ６発現はＴＮＦα（０．２倍、ｐ＜０．０３）およびＴＮＦβ１（０．９倍、ｐ＞０．８）を減少させ、そしてコラーゲン３の発現を増加させる（１．８倍、ｐ＞０．６）（図３３）。
【０３６１】
【表３】
2009528355.tif 000005
【０３６２】
【表４】
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本明細書に記載する全ての参考文献を参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０３６３】
【図１Ａ】骨格筋特異的コンディショナルＡｋｔ１ ＴＧマウスの作製を示す。バイナリーＴＧシステムの模式図。
【図１Ｂ】骨格筋特異的コンディショナルＡｋｔ１ ＴＧマウスの作製を示す。Ａｋｔ１トランスジーンのＤＯＸ依存性発現を示す。上：ＤＯＸ処置の時間的プロフィール。下：腓腹筋におけるトランスジーン発現のウエスタンブロット分析。
【図１Ｃ】骨格筋特異的コンディショナルＡｋｔ１ ＴＧマウスの作製を示す。異なる組織におけるトランスジーン発現のウエスタンブロット分析を示す。
【図２Ａ】骨格筋におけるＡｋｔ１のコンディショナル活性化が可逆性筋肥大を引き起こしたことを示す。上：ＤＯＸ処置の時間的プロフィールを示す。下：ＤＴＧマウスの代表的肉眼外観を示す。
【図２Ｂ】骨格筋におけるＡｋｔ１の条件的活性化が可逆性筋肥大を引き起こしたことを示す。上：トランスジーン発現の経時変化を示す。下：腓腹筋重量の経時変化を示す。結果を平均±ＳＥＭとして示す（各々ｎ＝４〜１２）。＊０日目に対してＰ＜０．０５；＃１４日目に対してＰ＜０．０５。
【図２Ｃ】骨格筋におけるＡｋｔ１の条件的活性化が可逆性筋肥大を引き起こしたことを示す。組織学的分析を示す。上：腓腹筋切片のＨ＆Ｅ染色。スケールバー：１００μｍ。下、左：筋線維の平均断面積の分布。右：筋線維の平均断面積。結果を平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝６）。＊コントロールに対してＰ＜０．０５。
【図２Ｄ】骨格筋におけるＡｋｔ１の条件的活性化が可逆性筋肥大を引き起こしたことを示す。上：Ａｋｔ１活性化の２または６週間後のＤＴＧにおける腓腹筋の代表的ウエスタンブロットおよび組織学的分析を示す。スケールバー：１００μｍ。下：腓腹筋重量および筋線維の平均断面積。結果を平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝６）。＊コントロールに対してＰ＜０．０５。
【図３Ａ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長がピーク力出力の増加を導いたことを示す。抗ＨＡ抗体およびＭＨＣアイソフォーム抗体、ＭＨＣ Ｉ型、ＭＨＣ ＩＩａ型およびＭＨＣ ＩＩｂ型で染色したＡｋｔ１活性化の２週間後のコントロールおよびＤＴＧマウス由来の腓腹筋切片の代表的画像を示す。Ａｋｔ１トランスジーン発現がＭＨＣ ＩＩｂ型線維の成長および肥大を誘発することを示し（パネル）、そしてヒストグラムで定量化する。
【図３Ｂ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長がピーク力出力の増加を導いたことを示す。前腕握力測定を示す。結果を平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝６）。＊コントロールに対してＰ＜０．０５。
【図３Ｃ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長がピーク力出力の増加を導いたことを示す。強制トレッドミル運動試験を示し、左のグラフは走行時間を示し、右は走行距離を示す。結果を平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４）。＊コントロールに対してＰ＜０．０５。
【図４Ａ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発肥満を退行させたことを示す。左：ＨＦ食餌を給餌したコントロールおよびＤＴＧマウスの代表的肉眼外観および腹側面を示す。右：コントロールおよびＤＴＧマウスの体重を示す（ｎ＝１２）。
【図４Ｂ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発肥満を退行させたことを示す。左：右腎盂のレベルで示されたマウスの各群の代表的ＭＲＩ画像を示す。右：全脂肪体積の定量化測定を示す（ｎ＝４）。
【図４Ｃ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発肥満を退行させたことを示す。組織学的分析を示す。Ｈ＆Ｅ染色した腓腹筋切片（上）および白色脂肪組織切片（下）。スケールバー：２００μｍ。
【図４Ｄ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発肥満を退行させたことを示す。腓腹筋および鼠径部脂肪パッドの重量を示す。結果を平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝６）。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ａ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発重篤インスリン抵抗性を改善したことを示す。絶食期間（左）および給餌期間（右）における血糖値を示す。
【図５Ｂ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発重篤インスリン抵抗性を改善したことを示す。絶食時血清インスリンレベルを示す。
【図５Ｃ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発重篤インスリン抵抗性を改善したことを示す。糖耐性試験。
【図５Ｄ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が食餌誘発重篤インスリン抵抗性を改善したことを示す。インビボでの骨格筋のグルコースの取り込み。結果を平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝８）。＊ＨＦ食餌給餌コントロールマウスに対してＰ＜０．０５。
【図６Ａ】Ａｋｔ１媒介ＩＩｂ型筋肉成長が食物摂取または活動レベルと独立したエネルギー消費の増加を導いたことを示す。骨格筋におけるＡｋｔ１活性化後６週間にわたって食物消費を測定した（各群ｎ＝１２）。
【図６Ｂ】Ａｋｔ１媒介ＩＩｂ型筋肉成長が食物摂取または活動レベルと独立したエネルギー消費の増加を導いたことを示す。歩行活動レベル（各群ｎ＝６）。
【図６Ｃ】Ａｋｔ１媒介ＩＩｂ型筋肉成長が食物摂取または活動レベルと独立したエネルギー消費の増加を導いたことを示す。左：Ｏ２消費（ＶＯ２）、右：ＤＯＸ処置の４週間後にコントロール（白棒）およびＤＴＧ（黒棒）マウスにおいて食餌なしで２４時間代謝測定システムによって測定した呼吸交換率（各群ｎ＝６）。結果を平均±ＳＥＭとして示す：。ＤＴＧ＝ＭｙｏＭｏｕｓｅ。
【図７Ａ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が肝臓における脂質酸化を増加させたことを示す。組織学的分析。Ｏｉｌ  ｒｅｄ−Ｏ染色した肝臓切片。スケールバー：２００μｍ。
【図７Ｂ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が肝臓における脂質酸化を増加させたことを示す。肝臓におけるパルミチン酸の全脂肪酸β酸化を示す。
【図７Ｃ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が肝臓における脂質酸化を増加させたことを示す。絶食時血清ケトン体レベルを示す。
【図７Ｄ】Ａｋｔ１媒介ＩＩ型筋肉成長が肝臓における脂質酸化を増加させたことを示す。肝臓における定量的リアルタイムＰＣＲ分析を示す。結果を平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝６）。
【図８】ミオカインの単離のための別のアプローチを示す：Ａｋｔの活性化形態を用いて形質導入された筋原性細胞株。
【図９】飲料水中でのＤｏｘの投与によるＡｋｔ１誘導が、解糖／速攣縮として特徴付けられるＩＩｂ型筋線維の肥大を優勢に導くことを示す。酸化的／速攣縮筋線維（Ｉ型、ＩＩ型ａ）のより少ない成長が明白である。
【図１０Ａ】Ａｋｔ媒介ＩＩｂ型筋肥大が肝臓においては脂質酸化を増加させたが、筋肉では増加させなかったことを示す。腓腹骨格筋における脂肪酸酸化およびミトコンドリア生合成に関連する相対的ｍＲＮＡ発現を示す（各群ｎ＝４。＊ＨＦ／ＨＳ食餌給餌コントロールに対してＰ＜０．０５。通常食給餌コントロールに対して〜０．０５）。
【図１０Ｂ】Ａｋｔ媒介ＩＩｂ型筋肥大が肝臓においては脂質酸化を増加させたが、筋肉では増加させなかったことを示す。組織学的分析である。Ｏｉｌ  ｒｅｄ−Ｏ染色した肝臓切片。スケールバー：１００ｐｍ。
【図１０Ｃ】Ａｋｔ媒介ＩＩｂ型筋肥大が肝臓においては脂質酸化を増加させたが、筋肉では増加させなかったことを示す。肝臓におけるパルミチン酸の全脂肪酸〜３酸化である（各群ｎ＝８）。
【図１０Ｄ】Ａｋｔ媒介ＩＩｂ型筋肥大が肝臓においては脂質酸化を増加させたが、筋肉では増加させなかったことを示す。肝臓における脂肪酸〜３酸化に関連する遺伝子の発現（各群ｎ＝４）。
【図１０Ｅ】Ａｋｔ媒介ＩＩｂ型筋肥大が肝臓においては脂質酸化を増加させたが、筋肉では増加させなかったことを示す。血清（左）および尿（右）ケトン体レベル（各群ｎ＝９〜１２）。
【図１０Ｆ】Ａｋｔ媒介ＩＩｂ型筋肥大が肝臓においては脂質酸化を増加させたが、筋肉では増加させなかったことを示す。血清乳酸レベルを示す（各群ｎ＝６）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。ＤＴＧ＝ＭｙｏＭｏｕｓｅ。
【図１１】ＭｙｏＭｏｕｓｅにおけるＡｋｔ１活性化後の衛星細胞増殖の証拠を示す。トランスジーン活性化の２週間後の衛星細胞増殖の証拠を示す。ＤＮＡ中へのＢｒｄＵ取り込みが、Ａｋｔ１の活性化の２、４、６、８および１０週間（ｗ）後の組織学的切片においては明白であったが、コントロール（cont）マウスではそうではなかった。トランスジーン誘導の２週間後のＭｙｏＭｏｕｓｅにおけるＭｙｏＤ陽性衛星細胞数の増加の証拠も検出された（示さず）。
【図１２】ディファレンシャル遺伝子発現分析用の組織の模式図である。Ａｋｔトランスジーン発現の前後での食餌誘発肥満Ａｋｔ１媒介骨格筋発現（ＭｙｏＭｏｕｓｅ）の筋肉、肝臓および脂肪組織に対するマイクロアレイ分析。該組織の分析は、骨格筋成長に応答して肝臓および脂肪組織から分泌される潜在的受容体およびタンパク質の同定を可能にする。
【図１３Ａ】ＭＳＰ３を発現するアデノウイルスの、野生型マウスにおける虚血誘発血管新生応答に対する効果を示す。
【図１３Ｂ】ＭＳＰ３を発現するアデノウイルスの、野生型マウスにおける虚血誘発血管新生応答に対する効果を示す。マウス後肢虚血モデル、および図１３Ａに示すように手術直前および手術後０、３、７、１４および２８日目に脚部および足部に対するレーザードップラー分析（図１３Ｂ）によりモニターしたところアデノウイルス発現ＭＳＰ３は虚血肢において血管成長を促進することを示す。
【図１３Ｃ】ＭＳＰ３を発現するアデノウイルスの、野生型マウスにおける虚血誘発血管新生応答に対する効果を示す。ＭＳＰ３（ＭＳＰ６（ＦＧＦ−２１）またはβ−ガラクトシダーゼではなく）を発現するアデノウイルスベクターの筋肉内注射が、レーザードップラー分析によって評価したところ、マウスの虚血後肢における再灌流を刺激することを示す。
【図１４】ＷＴマウスにおける毛細血管密度に対するＡｄｖ−ＭＳＰ３の効果を示す。アデノウイルス発現クローン２（ＭＳＰ３）は、虚血肢由来の組織学的切片におけるＣＤ３１染色によって評価される微小血管形成を促進する。ＦＧＦ２１を発現するアデノウイルスベクターはこの活性を示さない。
【図１５Ａ】糖耐性試験を示す。ＭＳＰ３は候補代謝調節因子である。Ａｄｅｎｏ−ＭＳＰ３の筋肉内注射は食餌誘発肥満マウスモデルにおいてグルコース感受性を改善する。アデノウイルスにコードされるＭＳＰ３が、アデノウイルス送達ＦＧＦ−２１（ＭＳＰ６としても知られる）と機能的に等価であるようであることを示す。
【図１５Ｂ】糖耐性試験を示す。ＭＳＰ３は候補代謝調節因子である。Ａｄｅｎｏ−ＭＳＰ３の筋肉内注射は食餌誘発肥満マウスモデルにおいてグルコース感受性を改善する。アデノウイルスのコードされるＭＳＰ３が、アデノウイルス送達ＦＧＦ−２１（ＭＳＰ６としても知られる）と機能的に等価であるようであることを示す。
【図１５Ｃ】糖耐性試験を示す。ＭＳＰ３は候補代謝調節因子である。Ａｄｅｎｏ−ＭＳＰ３の筋肉内注射は食餌誘発肥満マウスモデルにおいてグルコース感受性を改善する。ＭＳＰ３が、グルコース感受性および代謝応答を改善することを示す。これは、他のＭＳＰ；ＭＳＰ５、ＭＳＰ２、ＭＳＰ４およびＭＳＰ１については観察されない。β−ｇａｌはネガティブコントロールである。
【図１５Ｄ】糖耐性試験を示す。ＭＳＰ３は候補代謝調節因子である。Ａｄｅｎｏ−ＭＳＰ３の筋肉内注射は食餌誘発肥満マウスモデルにおいてグルコース感受性を改善する。ＭＳＰ３が、グルコース感受性および代謝応答を改善することを示す。これは、他のＭＳＰ；ＭＳＰ５、ＭＳＰ２、ＭＳＰ４およびＭＳＰ１については観察されない。β−ｇａｌはネガティブコントロールである。
【図１６】ＭＳＰ３の全長ヌクレオチド配列を示す。「長鎖」（配列番号１）および「短鎖」（配列番号２）のオルタナティブスプライス形態を示すＭＳＰ３のヌクレオチド配列。
【図１７】第２染色体上のＭＳＰ３長鎖（配列番号１）および短鎖（配列番号２）の位置を示す。
【図１８】マウス（配列番号３）、ラット（配列番号４）、およびヒト（配列番号５）の間のＭＳＰ３アミノ酸配列のアラインメントを示す。マウスとラットとの間のアミノ酸配列同一性は９４％であり、そしてマウスとヒトとの間の配列同一性は７９％である。四角で囲んだ領域は予想シグナル配列である。
【図１９】ＭＳＰ３の全発現を検出するための（すなわち、ＭＳＰ３の長鎖（配列番号１）および短鎖（配列番号２）アイソフォームの両方を検出するための）ＰＣＲプライマーを示す。フォワードプライマー３の位置は配列番号１０であり、リバースプライマー３は配列番号１１であり、配列番号１および配列番号２上に示す。。
【図２０Ａ】成体マウス組織におけるＭＳＰ３の組織特異的発現プロフィールを示す。ＲＴ−ＰＣＲによる全ＭＳＰ３の（長鎖形態と短鎖形態とを合わせた）発現プロフィールを示す。心臓、脳、肺、胸腺、リンパ節、眼および骨格筋における発現。Ｃ２Ｃ１２筋原細胞におけるＡｋｔ発現によるアップレギュレーション。
【図２０Ｂ】成体マウス組織におけるＭＳＰ３の組織特異的発現プロフィールを示す。ＲＴ−ＰＣＲによる成体マウス組織におけるＭＳＰ３の長鎖形態および短鎖形態の発現プロフィールを示す。
【図２１】オルタナティブスプライスアイソフォーム特異的ＰＣＲプライマーを示す：ＭＳＰ３の長鎖形態および短鎖形態をディファレンシャルに検出するためのＰＣＲプライマーの設計。（ＭＳＰ３）クローン２の長鎖形態および短鎖形態を検出するためのプライマーの位置および設計を示し、ＭＳＰ３の長鎖形態（配列番号１）および短鎖形態（配列番号２）上にフォワードプライマー１（配列番号６）、フォワードプライマー２（配列番号８）、リバースプライマー１（配列番号９）およびリバースプライマー２（配列番号１０）の位置を示す。
【図２２Ａ】レーザードップラー分析によって図２２Ｄに示すようにＭＳＰ５が、虚血後肢修復において血管新生を促進することを示す。野生型マウスにおける虚血誘発血管新生応答に対するＭＳＰ５（クローン５）発現アデノウイルスの効果。
【図２２Ｂ】レーザードップラー分析によって図２２Ｄに示すようにＭＳＰ５が、虚血後肢修復において血管新生を促進することを示す。野生型マウスにおける虚血誘発血管新生応答に対するＭＳＰ５（クローン５）発現アデノウイルスの効果。
【図２２Ｃ】レーザードップラー分析によって図２２Ｄに示すようにＭＳＰ５が、虚血後肢修復において血管新生を促進することを示す。野生型マウスにおける虚血誘発血管新生応答に対するＭＳＰ５（クローン５）発現アデノウイルスの効果。
【図２２Ｄ】レーザードップラー分析によって図２２Ｄに示すようにＭＳＰ５が、虚血後肢修復において血管新生を促進することを示す。野生型マウスにおける虚血誘発血管新生応答に対するＭＳＰ５（クローン５）発現アデノウイルスの効果。レーザードップラー分析によって評価したところ、ＭＳＰ５（ＭＳＰ１またはβ−ガラクトシダーゼではなく）を発現するアデノウイルスベクターの筋肉内注射がマウスの虚血後肢における再灌流を刺激することを示す。
【図２３Ａ】ＭＳＰ５が筋線維肥大を促進することを示す。インビトロでのＣ２Ｃ１２筋細胞のＭＳＰ５媒介肥大を評価するためのプロトコルを示す。これは、Ｃ２Ｃ１３筋細胞の分化の４日後にＭＳＰ５またはＭＳＰ３またはＭｙｒＡｋｔまたはβ−ｇａｌを発現するアデノウイルスをトランスフェクトすることによって実施した。
【図２３Ｂ】ＭＳＰ５が筋線維肥大を促進することを示す。トランスフェクション後４日目の細胞の形態を示す。
【図２３Ｃ】顕微鏡検査した、ＭＳＰ５、ＭＳＰ３、ＭｙｒＡｋｔまたはβ−ｇａｌを発現するＡｄｖでのトランスフェクションの４日後（図２３Ｂに示す）の筋線維幅の定量分析を示す。ＭＳＰ５またはｍｙｒＡｋｔでの形質導入は筋管の大きさの検出可能な増加を導くが、ＭＳＰ３またはβガラクトシダーゼを発現するアデノウイルスベクターは効果を有しない。
【図２４】β−ｇａｌまたはＭＳＰ３を発現するアデノウイルスを用いてトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞またはウイルスの非存在下でのベースライン取り込みと比較して、ＭＳＰ５またはｍｙｒＡｋｔ１を発現するアデノウイルスベクターでの形質導入が、タンパク質中への３Ｈ−ロイシン取り込みを促進することを示す。二連の実験（左および右のパネル）からの代表的な結果を示す。
【図２５】ＭＳＰ５トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞がＶＥＧＦ発現を促進することを示す。ＭＳＰ５またはｍｙｒＡｋｔ１（ＭＳＰ３（クローン２）ではなく）を発現するアデノウイルスベクターでのＣ２Ｃ１２細胞の形質導入は、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＶＥＧＦ発現を活性化する。
【図２６Ａ】インスリン様６がインビトロ（図２６Ｂ）およびインビボ（図２６Ａ）で、筋肉においてＡｋｔによって調節されることを示す。インスリン様６転写物が、トランスジーン誘導の２週間後にＭｙｏＭｏｕｓｅにおいて２４倍劇的にアップレギュレートされることを示す。
【図２６Ｂ】インスリン様６がインビトロ（図２６Ｂ）およびインビボ（図２６Ａ）で、筋肉においてＡｋｔによって調節されることを示す。Ａｄｅｎｏ−ｍｙｒＡｋｔ１での形質導入後のＣ２Ｃ１２細胞において１０倍アップレギュレートされることを示す。
【図２７Ａ】転写物発現レベルのＲＴ−ＰＣＲによって決定したところ、他のリラキシンファミリーメンバー、例えばＩｎｓｌ３、Ｉｎｓｌ５、リラキシン、Ｉｎｓｌ７（リラキシン３）が、ＭｙｏＭｏｕｓｅにおいてＡｋｔトランスジーン誘導後に調節されないことを示す。
【図２７Ｂ】転写物発現レベルのＲＴ−ＰＣＲによって決定したところ、他のリラキシンファミリーメンバー、例えばＩｎｓｌ３、Ｉｎｓｌ５、リラキシン、Ｉｎｓｌ７（リラキシン３）が、ＭｙｏＭｏｕｓｅにおいてＡｋｔトランスジーン誘導後に調節されないことを示す。
【図２７Ｃ】転写物発現レベルのＲＴ−ＰＣＲによって決定したところ、他のリラキシンファミリーメンバー、例えばＩｎｓｌ３、Ｉｎｓｌ５、リラキシン、Ｉｎｓｌ７（リラキシン３）が、ＭｙｏＭｏｕｓｅにおいてＡｋｔトランスジーン誘導後に調節されないことを示す。
【図２７Ｄ】転写物発現レベルのＲＴ−ＰＣＲによって決定したところ、他のリラキシンファミリーメンバー、例えばＩｎｓｌ３、Ｉｎｓｌ５、リラキシン、Ｉｎｓｌ７（リラキシン３）が、ＭｙｏＭｏｕｓｅにおいてＡｋｔトランスジーン誘導後に調節されないことを示す。
【図２８Ａ】前脛骨（ＴＡ）筋への心臓毒の投与後、筋再生の間に、インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）転写物がアップレギュレートされることを示す。この損傷によってＡｋｔもアップレギュレートされ、一方ＶＥＧＦ−Ａ転写物はダウンレギュレートされることを示す（上パネル）。
【図２８Ｂ】前脛骨（ＴＡ）筋への心臓毒の投与後、筋再生の間に、インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）転写物がアップレギュレートされることを示す。他のリラキシンファミリーメンバー、Ｉｎｓｌ３、Ｉｎｓｌ５、リラキシン、Ｉｎｓｌ７（リラキシン３）は、心臓毒損傷マウス筋肉において調節されないことを示す（下パネル）。
【図２９Ａ】アデノウイルス発現インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）がＣ２Ｃ１２の分化または肥大に影響を及ぼさないないことを示す。Ｃ２Ｃ１２細胞を感染多重度（ＭＯＩ）２４０でＡｄｖ−Ｉｎｓｌ６またはβｇａｌ（Ｇａｌ）を用いてトランスフェクトしたこと、および形態を示す。
【図２９Ｂ】アデノウイルス発現インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）がＣ２Ｃ１２の分化または肥大に影響を及ぼさないないことを示す。多核性筋管数を示す。
【図２９Ｃ】アデノウイルス発現インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）がＣ２Ｃ１２の分化または肥大に影響を及ぼさないないことを示す。クレアチンキナーゼレベルを示す。
【図２９Ｄ】アデノウイルス発現インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）がＣ２Ｃ１２の分化または肥大に影響を及ぼさないないことを示す。Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６またはＡｄｖ−βｇａｌコントロール（Ｇａｌ）を用いてトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞においてロイシン取り込みも比較したことを示す。
【図２９Ｅ】アデノウイルス発現インスリン様６（Ｉｎｓｌ６）がＣ２Ｃ１２の分化または肥大に影響を及ぼさないないことを示す。筋管幅がＡｄｖ−Ｉｎｓｌ６での形質導入で影響されないことを示す。
【図３０Ａ】アデノウイルス発現インスリン様６がラット骨格筋衛星細胞の増殖を刺激したことを示す。β−ｇａｌコントロールトランスフェクト細胞と比較して、Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６トランスフェクト細胞においてチミジン（３Ｈ−チミジン）取り込みが増加することを示す。
【図３０Ｂ】アデノウイルス発現インスリン様６がラット骨格筋衛星細胞の増殖を刺激したことを示す。衛星細胞増殖の活性化がＲｂタンパク質（ｐ−Ｒｂ）増殖の増加を伴うことがウエスタンブロット（ＷＢ）によって示されることを示す。
【図３１Ａ】Ｉｎｓｌ６が、心臓毒（ＣＴＸ）損傷後のＴＡ筋再生を促進することを示す。心臓毒投与の４日後のＡｄｅｎｏ−Ｉｎｓｌ６の投与が、β−ｇａｌコントロールと比較して、前脛骨（ＴＡ）筋再生を改善することを示す。再生の改善は、組織学的切片において７および１４日目に最も顕著である（図３１Ａ）。
【図３１Ｂ】Ｉｎｓｌ６が、心臓毒（ＣＴＸ）損傷後にＴＡ筋再生を促進することを示す。７日目にＩｎｓｌ６の過剰発現がクレアチンキナーゼの血清中への放出を抑制したが（左下パネル）、これは１４日目には観察されなかった（右下パネル）ことを示す。
【図３２】図３１Ａと同様であり、ここで、心臓毒（ＣＴＸ）投与の３日後にＡｄｅｎｏ−Ｉｎｓｌ６を投与し、β−ｇａｌコントロールと比較して、Ｉｎｓｌ６は、損傷の１週間後に前脛骨（ＴＡ）の筋再生を有意に促進する。
【図３３Ａ】Ｉｎｓｌ６が、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ１の発現を減少させ、コラーゲン３の発現を促進することを示す。損傷後、Ａｄｅｎｏ−Ｉｎｓｌ６の投与は、筋肉においてＩｎｓｌ６発現を２００倍増加させ（図３３Ａ）、そして筋肉においてＴＮＦα（０．２倍、ｐ＜０．０３）（図３３Ｂ）およびＴＮＦβ１（０．９倍、ｐ＞０．８）（図３３Ｄ）を減少させ、そしてコラーゲン３を増加させる（１．８倍、ｐ＞０．６）（図３３ＤＣ）。Ｉｎｓｌ６およびＴＮＦαは、Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６注射後１週目である（ｎ＝２）。
【図３３Ｂ】Ｉｎｓｌ６が、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ１の発現を減少させ、コラーゲン３の発現を促進することを示す。損傷後、Ａｄｅｎｏ−Ｉｎｓｌ６の投与は、筋肉においてＩｎｓｌ６発現を２００倍増加させ（図３３Ａ）、そして筋肉においてＴＮＦα（０．２倍、ｐ＜０．０３）（図３３Ｂ）およびＴＮＦβ１（０．９倍、ｐ＞０．８）（図３３Ｄ）を減少させ、そしてコラーゲン３を増加させる（１．８倍、ｐ＞０．６）（図３３ＤＣ）。Ｉｎｓｌ６およびＴＮＦαは、Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６注射後１週目である（ｎ＝２）。
【図３３Ｃ】Ｉｎｓｌ６が、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ１の発現を減少させ、コラーゲン３の発現を促進することを示す。損傷後、Ａｄｅｎｏ−Ｉｎｓｌ６の投与は、筋肉においてＩｎｓｌ６発現を２００倍増加させ（図３３Ａ）、そして筋肉においてＴＮＦα（０．２倍、ｐ＜０．０３）（図３３Ｂ）およびＴＮＦβ１（０．９倍、ｐ＞０．８）（図３３Ｄ）を減少させ、そしてコラーゲン３を増加させる（１．８倍、ｐ＞０．６）（図３３ＤＣ）。Ｉｎｓｌ６およびＴＮＦαは、Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６注射後１週目である（ｎ＝２）。
【図３３Ｄ】Ｉｎｓｌ６が、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ１の発現を減少させ、コラーゲン３の発現を促進することを示す。損傷後、Ａｄｅｎｏ−Ｉｎｓｌ６の投与は、筋肉においてＩｎｓｌ６発現を２００倍増加させ（図３３Ａ）、そして筋肉においてＴＮＦα（０．２倍、ｐ＜０．０３）（図３３Ｂ）およびＴＮＦβ１（０．９倍、ｐ＞０．８）（図３３Ｄ）を減少させ、そしてコラーゲン３を増加させる（１．８倍、ｐ＞０．６）（図３３ＤＣ）。Ｉｎｓｌ６およびＴＮＦαは、Ａｄｖ−Ｉｎｓｌ６注射後１週目である（ｎ＝２）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
2009528355.tif 000079
【図２９Ｅ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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