(57)【要約】Ｓｈｈを用いて星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物および方法を開示する。脱分化した神経幹細胞は、星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｈｈ（sonic hedgehog）タンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物。
【請求項２】
Ｓｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、Ｓｈｈタンパク質を発現するベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｓｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、Ｓｈｈタンパク質を発現するウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記脱分化した神経幹細胞が、星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
星状細胞をＳｈｈタンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法。
【請求項６】
前記脱分化した神経幹細胞が、星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、（i）星状細胞を培地で培養する段階と、（ii）前記星状細胞を前記Ｓｈｈタンパク質または前記核酸で処理する段階と、（iii）星状細胞を神経幹細胞への脱分化に誘導する段階とを含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（i）段階で星状培養を培養する培地が、ｂＦＧＦを含む培地である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項５の方法で生産された神経幹細胞。
【請求項１０】
請求項５の方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞に分化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
神経幹細胞（Neural stem cells：ＮＳＣｓ）は、神経系に存在する前駆細胞（progenitor cell）のサブタイプであって、星状細胞、希突起膠細胞およびニューロンへの分化能を持っている。中枢神経系（Central nervous system：ＣＮＳ）と抹消神経系（peripheral nervous system：ＰＮＳ）から分離してマルチセルラーニューロスフェア（Multicellular neurospheres）を作ることができ、この細胞がそれぞれの条件でグリアリニージ（glial lineage）とニューラルリニージ（neural lineage）に分化する（Sally Temple et al. 2001）。このような神経幹細胞は、難治病の治療に応用されて現在細胞治療の一つの方法として研究されており、倫理的な問題が殆どない成体幹細胞であるから多く研究されている実情である。最近、脱分化に関連した研究が行われている状況で成体幹細胞の重要性がさらに強調されている。このような成体幹細胞は、胚芽幹細胞より得易いが、実際適用するには未だ難しい部分が多い。また、別の人の成体幹細胞を使用するときには免疫拒否反応という問題も提起されるおそれがある。よって、自分の細胞を用いて脱分化を誘導する場合、現在提起されている問題を解決することができる。このような趣旨で、既に分化の進んだ細胞を用いて脱分化を誘導することが重要である。現在、細胞融合（Cell fusion）や核移植（Nuclear transfer）などの方法を用いて脱分化を誘導する研究が進行中にある。別の方法を用いたグループとして、Ａｌｅｘｉｓ Ｊ（Lancet 2004）は、皮膚から分離した細胞を神経幹細胞培養条件で培養したときに神経幹細胞の特性を持っていると報告した。また、Ｔｏｒｕ Ｋ．（Genes & Development 2004）は、希突起膠細胞前駆体（oligodendrocyte precursors）を神経幹細胞に脱分化させたことを報告した。このグループは、これに関連した論文を２０００年から研究して発表し、２００４年の論文では各分化段階で遺伝子の発現がクロマチン再構築（chromatin remodeling）とヒストン修飾（histone modification）に関連していると報告した。
【０００２】
〔背景技術〕
本研究では、既存の様々な方法の問題点を解決し、より使用に適した方法を確立しようとした。発生プログラムで重要な役割を果たすものと知られているｈｅｄｇｅｈｏｇ ｆａｍｉｌｙの中でも、神経幹細胞に作用するＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）を使用した。Ｓｈｈは、Ｇｌｉ１からＢｍｉ−１、Ｎ−ｍｙｃに繋がるシグナル経路（signaling pathway）の上位段階調節因子である。Ｓｈｈは、発生上で神経幹の形成に作用し、濾胞上皮（follicular epithelium）の遠位端（distal tips）で発現されている。また、神経前駆細胞の増殖を増加させると知られている（Pleasantin Mill et al., 2005）。
【０００３】
このような背景の下に、本発明者らは、Ｓｈｈを既に分化したマウス星状細胞に処理すると、星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞への分化能を有する神経幹細胞様の細胞に脱分化させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００４】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、Ｓｈｈタンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸からなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物を提供することにある。
【０００５】
本発明の他の目的は、星状細胞をＳｈｈタンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の別の目的は、前記方法で生産された神経幹細胞を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞に分化させる方法を提供することにある。
【０００８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。
【０００９】
図１はＳｈｈタンパク質処理による星状細胞の神経幹細胞への脱分化を示す。Ａ、Ｂはマウス星状細胞にＳｈｈを処理した後に形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを示し、Ｃは神経幹細胞にＳｈｈを処理した後に形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを示す。
【００１０】
図２は神経幹細胞特異的なマーカーの発現を免疫細胞化学方法を用いて確認した結果である。
【００１１】
図３は神経細胞様細胞のインビトロ分化を誘導したときに星状細胞、ニューロン、 希突起膠細胞にそれぞれ分化することを示す。Ａ〜Ｃは神経幹細胞を、Ｄ〜Ｇは神経幹細胞様の細胞を示す。
【００１２】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、Ｓｈｈタンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸からなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物に関する。
【００１３】
本発明において、用語「神経幹細胞様の細胞（neural stem cell-like cell）」とは、ニューロン、星状細胞、希突起膠細胞などの細胞に分化できる多能性幹細胞（multipotent stem cell）であって、体細胞の脱分化に起源した神経幹細胞である。本発明において、神経幹細胞様の細胞は神経幹細胞として記述されることもある。
【００１４】
本発明は、星状細胞でＳｈｈを過発現させる場合、既に分化した細胞タイプの星状細胞が、多能性神経幹細胞様の細胞に脱分化することを開示する。
【００１５】
本発明のＳｈｈは、タンパク質の形で提供される。
【００１６】
本発明の組成物に使用されるＳｈｈは、ヒト、馬、羊、豚、山羊、駱駝、レイヨウ、犬などの動物に由来した全てのＳｈｈを含む。また、神経細胞への脱分化に使用される本発明のＳｈｈタンパク質は、その野生型のアミノ酸配列を持つタンパク質だけでなく、Ｓｈｈタンパク質の変異体を含む。
【００１７】
用語「Ｓｈｈタンパク質の変異体」は、Ｓｈｈの天然アミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的もしくは保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を有するタンパク質を意味する。前記変異体は、天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であってもよく、必要に応じてタンパク質の物理化学的性質が変形された変異体であってもよい。好ましくは、前記変異体は物理、化学的環境に対する構造的安定性または生理学的活性が増大した変異体である。
【００１８】
好ましくは、Ｓｈｈタンパク質の形で提供される。例えば、Ｓｈｈを処理して星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導するために通常用いられる培地にＳｈｈタンパク質を処理すれば済む。
【００１９】
Ｓｈｈタンパク質は、前記培地に有効濃度で含ませる。培地の種類や培養の方法など当該分野でよく知られている要素によって、Ｓｈｈタンパク質の有効濃度は影響を受けることができる。本発明の具体的な実施では、５００ｎｇ／ｍＬの量で処理した。
【００２０】
また、前記Ｓｈｈは、Ｓｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の形で提供できる。
【００２１】
Ｓｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、野生型または前述したような変異体型のＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、少なくとも一つの塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異でき、天然から分離されるか、或いは化学的合成法を用いて製造できる。
【００２２】
前述したＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子からなる単鎖または二重鎖であってもよい。
【００２３】
一つの好適な様態において、Ｓｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｓｈｈタンパク質を発現するベクターとしての組成物である。
【００２４】
本発明において、用語「ベクター」とは、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能な発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００２５】
本発明において、用語「作動可能に連結された（operably linked）」とは、一般な機能を行うように、核酸発現調節配列と目的のタンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組み換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて実現することができ、部位特異的ＤＮＡ切断および連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを用いて実現することができる。
【００２６】
本発明のベクターは、プロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどの発現調節要素の他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に調節できる。ベクターのプロモータは構成的または誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合には複製起源を含む。ベクターは、自己複製し、或いは宿主ＤＮＡに統合できる。
【００２７】
ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクターなどを含む。好ましくは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えばＨＩＶ（Human immunodeficiency virus）、ＭＬＶ（Murine leukemia virus）、ＡＳＬＶ（Avian sarcoma/leukosis）、ＳＮＶ（Spleen necrosis virus）、ＲＳＶ（Rous sarcoma virus）、ＭＭＴＶ（Mouse mammary tumor virus）などのレトロウイルス、アデノウイルス（Adenovirus）、アデノ関連ウイルス（Adeno-associated virus）、ヘルペスシンプレックスウイルス（Herpes simplex virus）などに由来したベクターを含むが、これに限定されない。
【００２８】
Ｓｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、当該分野における公知の方法、例えばベクター型のネイキッドＤＮＡとして細胞内に伝達し（Wolff et al. Science,  247:1465-8, 1990: Wolff et al. J. Cell Sci. 103:1249-59, 1992）、或いはリポソーム、陽イオン性高分子などを用いて細胞内に伝達することができる。リポソームは、遺伝子伝達のためにＤＯＴＭＡやＤＯＴＡＰなどの陽イオン性リン脂質を混合して製造したリン脂質膜であって、陽イオン性のリポソームと陰イオン性の核酸とを一定の割合で混合すると、核酸−リポソーム複合体が形成される。
【００２９】
別の好適な様態として、Ｓｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｓｈｈタンパク質を発現するウイルスとしての組成物である。
【００３０】
本発明において、用語「ウイルス」は、Ｓｈｈタンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターをパッケージング細胞に形質転換および感染させて製作した、Ｓｈｈを発現するウイルスを意味する。
【００３１】
本発明のＳｈｈタンパク質を発現するウイルスの製造に使用できるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルスなどを含み、これに限定されない。
【００３２】
別の様態として、本発明は、Ｓｈｈタンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法に関する。
【００３３】
より具体的に、本発明は、（i）星状細胞を培地で培養する段階と、（ii）前記培養物をＳｈｈタンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階と、（iii）星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する段階とを含む。
【００３４】
前記方法の（i）段階で星状細胞を培養する培地は、当該分野で神経幹細胞の培養に通常用いられる培地を全て含む。培養に使用される培地は、一般に、炭素源、窒素源および微量元素の成分を含む。また、培地は、ペニシリン（penicillin）、ストレプトマイシン（streptomycin）、ゲンタマイシン（gentamicin）などの抗生剤を含むことができる。好ましくは、ｂＦＧＦを含む培地である。
【００３５】
前記方法の（ii）段階で処理されるＳｈｈタンパク質、またはＳｈｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、前述したとおりである。
【００３６】
別の様態として、本発明は、前記方法で製造された神経幹細胞に関する。
【００３７】
本発明の脱分化方法で製造された神経幹細胞は、神経幹細胞特異的なマーカーである、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２が神経幹細胞と同じ水準で発現し、一般な神経幹細胞と同一の分化能を有することを確認した。
【００３８】
別の様態として、本発明は、前記方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞に分化させる方法に関する。
【００３９】
本発明の組成物と方法によって製造された神経幹細胞の分化を、当該分野における通常の星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞分化条件で誘導する場合、それぞれの細胞への分化が誘導されることを各細胞特異的なマーカーの発現検出によって確認することができた。
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ところが、これらの実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００４１】
（実施例１：研究方法）
１．マウス星状細胞（mouse astrocyte）とマウス神経幹細胞（mouse neural stem cell）の培養
マウス星状細胞は、Ｅ１３．５日齢の胎児の脳から分離してＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）１０％、ペニシリン／ストレプトマイシン１％、Ｌ−グルタミン１％（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）（高グルコース、ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。対照群として使用された神経幹細胞は、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、ａｐｏ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、セレニウム（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｎ２）に血清代替物（serum-replacement）としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、ヒト組み換えベイシックＦＧＦおよびヒト組み換えＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を添加して培養した。
【００４２】
２．脱分化の誘導
脱分化は、神経幹細胞培養条件と同様に培養しながら誘導した。この際、２つの方法を用いて培養した。その一つの方法は、６ウェルプレートに１×１０５の細胞をプレイティングした後、１２時間後にＳｈｈ（sonic hedgehog）（Ｒ＆Ｄ）処理を開始する方法であって、処理濃度は５００ｎｇ／ｍＬとした。２、４、６日間、マウス星状細胞培養条件の下にＳｈｈを添加して培養した後、神経幹細胞培養条件に変えて培養した。もう一つの方法は、神経幹細胞培養条件に変えた後にも、Ｓｈｈを処理し続ける方法である。
【００４３】
３．免疫細胞化学法によるそれぞれのマーカー確認
Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒは、４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ）で１時間４℃で固定した後、２０％スクロースを添加して４℃で一晩シェーキングを行った。その後、ＯＣＴ化合物を用いて８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に低温保存した。８〜１０μｍでセクションした後、染色を行った。１０％正常山羊血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）＋０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）が含まれているＰＢＳによってブロッキングをした後、ａｎｔｉ−ｎｅｓｔｉｎ（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ａｎｔｉ−ＣＤ１３３（ＭＡＣＳ）、ａｎｔｉ−Ｓｏｘ２（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃で一晩反応させた後、ＲＴでａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ｃｙ３（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）、ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−ｃｙ３（Ｚｙｍｅｄ）で反応させた後、最後にＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて核染色（nuclear stain）を行った。染色の後、Ｚｅｉｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で確認した。分化した細胞の場合、前述の方法で染色を行った。この際、使用した抗体は、ａｎｔｉ−ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ）、ａｎｔｉ−Ｓ１００β（Ｚｙｍｅｄ）、ａｎｔｉ−β−ｔｕｂｕｌｉｎIII（Ｃｏｖａｎｃｅ）、ａｎｔｉ−Ｍａｐ２ａ（ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ−ＴＨ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ−Ｏ４（Ｒ＆Ｄ）、ａｎｔｉ−ＣＮＰａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）であった。
【００４４】
４．インビトロ分化
ＰＬＯ（poly-L-ornithine）（Ｓｉｇｍａ）とラミニン（laminin）或いはフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした後、下記の分化条件で培養した。
【００４５】
星状細胞への分化は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）が含まれているＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、高グルコース）にヒト組み換えｂＦＧＦとＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を添加し、或いはＣＮＴＦ（recombinant rat ciliary neurotrophic factor（Upstate））で５〜７日間培養することにより誘導した。
【００４６】
ニューロン（neuron）への分化は、血清代替物としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）が含まれているＮ２培養液にヒト組み換えＦＧＦを４日間処理した後、８日間はＦＧＦのない培地で培養することにより誘導した。他の方法では、濃度１〜１０μＭのＲＡ（retinoic acid）（Ｓｉｇｍａ）を添加して７〜１４日間培養することにより、分化を誘導した。別の方法では、濃度１〜１０ＭｍのＶＰＡ（Valproic acid）（Ｓｉｇｍａ）を濃度１〜１０μＭのＲＡ（Ｓｉｇｍａ）と共に添加して７〜１４日間培養することにより、分化を誘導した。
【００４７】
希突起膠細胞への分化は、血清代替物としてのＢ２７が添加されているＮ２培養液にＰＤＧＦ−ＡＡ（platelet derived growth factor-AA）（Ｒ＆Ｄ）、Ｔ３（3,3,5-triiodo-L-thyronine）（Ｓｉｇｍａ）、およびヒト組み換えベイシックＦＧＦとＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を共に添加して２０日間培養することにより誘導した。
【００４８】
前述した条件で培養を行い、それぞれの分化した細胞の形態を観察しながら、それぞれの分化マーカーとして使用される抗体を用いて免疫細胞化学法（immunocytochemstry）によって確認した。
【００４９】
（実施例２：研究結果）
既に分化の進んだマウス星状細胞に、神経前駆細胞の増殖を増加させる役割を果たすＳｈｈを処理した。マウス星状細胞培養条件の下にＳｈｈを５００ｎｇ／ｍＬずつ毎日添加した後、神経幹細胞培養条件で培養を開始した。神経幹細胞培養条件で培養を開始した後、細胞の形態が神経幹細胞と類似の形態に変わっていくことを観察することができた。ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅが形成された後には、それ以上Ｓｈｈを添加しなかった。一応ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅが形成された後には、そのまま保持された（図１）。
【００５０】
このような方法でマウス星状細胞の脱分化を誘導した。Ｓｈｈ処理を２、４、６日間施し、神経幹細胞の培養条件に変えた後で脱分化が進んだかを確認した。Ｓｈｈ処理開始後６日目から、神経幹細胞培養条件に変えた場合にｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅがさらに形成されていた。こうして作られた細胞はそのまま保持された。
【００５１】
この細胞が神経幹細胞と同一の特性を持つ細胞であるかを確認するために、それぞれのマーカーを用いて免疫細胞化学方法を行った。神経幹細胞で最も多く発現されているマーカーＮｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２を用いて染色した結果、神経幹細胞で発現されているのと同様に、神経幹細胞様の細胞でも発現されていることが観察された。この際、作られたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅをｃｒｙｏ−ｓｅｃｔｉｏｎして確認した結果、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２の発現を確認することができた（図２）。
【００５２】
神経幹細胞様の細胞が神経幹細胞のように分化能力を持つかを確認するために、星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞への分化を誘導した。まず、幾つかの条件を用いて分化を前述の方法で誘導し、分化有無をそれぞれの分化マーカーに特異的な抗体を用いて確認した結果、神経幹細胞のように３つのタイプに分化がなされることを確認することができた。まず、星状細胞への分化を誘導したとき、ＧＦＡＰ、Ｓ１００が発現されており、ニューロンへの分化はβ−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｔｕｊ１）とＭａｐ２ａの発現によって確認した。また、希突起膠細胞のマーカーであるＯ４とＣＮＰａｓｅも希突起膠細胞への分化条件を与えたときに発現されていることを確認することができた（図３）。
【００５３】
この研究によって、Ｓｈｈはマウス星状細胞を神経幹細胞様の細胞（neural stem cell-like cell）に脱分化させることに関与する重要な役割を果たし、このように脱分化した神経幹細胞様の細胞は星状細胞、ニューロン、 希突起膠細胞にさらに分化することを確認することができた。
【００５４】
〔産業上の利用可能性〕
前述したように、Ｓｈｈを用いて星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導することができ、脱分化した神経幹細胞は多様な疾病治療に使用できる。
【００５５】
〔従来の技術の文献情報〕
1. Toru Kondo, Martin Raff. Chromatin remodeling and histone modification in the conversion of oligodendrocyte precursors to neural stem cells. Genes & Development 2004;18: 2963-2972.
2. Alexis Joannides, Phil Gaughwin, Chistof Shwiening, Henry Majed, Jane Sterling, Alastair Compston, Siddharthan Chandran. Efficient generation of neural precursors from adult human skin: astrocytes promote neurogenesis from skin-derived stem cells. Lancet 2004;363:172-178.
3. Sally Temple. The development of neural stem cells. Nature 2001;414:112-117.
4. Hsieh J, Nakashima K, Kuwabara T, Mejia E, Gage FH. Histone deacetylase inhibitor-mediated neuronal differentiation of multipotent adult neural progenitor cells. PNAS 2004;101:16659-16664.
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ｓｈｈタンパク質処理による星状細胞の神経幹細胞への脱分化を示す。Ａ、Ｂはマウス星状細胞にＳｈｈを処理した後に形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを示し、Ｃは神経幹細胞にＳｈｈを処理した後に形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを示す。
【図２】神経幹細胞特異的なマーカーの発現を免疫細胞化学方法を用いて確認した結果である。
【図３】神経細胞様細胞のインビトロ分化を誘導したときに星状細胞、ニューロン、 希突起膠細胞にそれぞれ分化することを示す。Ａ〜Ｃは神経幹細胞を、Ｄ〜Ｇは神経幹細胞様の細胞を示す。
【図１】
2009528049.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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