(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病で観察されるような、認知機能が変化した神経変性疾患の治療のための組成物および方法に関するものである。さらに特定すれば、本発明は、ある血小板パラメーターの生化学アッセイに基づくことから採血により行うことができる、神経保護治療の活性および／または有効性をヒト臨床的にモニタリングするための戦略を提示する。本発明は、これらの戦略を実行するために適した方法、ツール、構成および組成物にもまた関するものである。
2009544964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を熱処理する工程および免疫学的に定量する工程を含む、試料中のｓＡＰＰαの免疫学的定量のための方法。
【請求項２】
試料が、血液試料であるか、または血液もしくは他の生物学的液体から得られることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
熱処理工程が、約６０℃〜７０℃の間に含まれる温度でｓＡＰＰαエピトープをアンマスキングするために十分な時間、典型的には約３０秒〜１０分の間に含まれる時間、試料を処理することを含むことを特徴とする、請求項１または２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
免疫学的定量工程が特異的抗体により行われることを特徴とする、請求項１または２のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ヒト血液試料（派生物）中のｓＡＰＰαの定量のための、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項６】
アルツハイマー病を有するヒト対象に由来する血液（派生物）試料中のｓＡＰＰαの定量のための、請求項５記載の使用。
【請求項７】
アルツハイマー病を有するヒト対象における治療の有効性を評価するための、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項８】
哺乳動物における神経保護治療の有効性を評価またはモニタリングするための方法であって、該治療を受けた該哺乳動物からの生物学的試料中のｓＡＰＰαの産生をインビトロまたはエクスビボで測定する工程を含み、該試料が血小板を含有し、ｓＡＰＰαの該産生が治療の有効性の指標である、方法。
【請求項９】
神経保護治療が、ピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物であることを特徴とする、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
哺乳動物が神経変性疾患を有することを特徴とする、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
生物学的試料が血液試料または血液派生物試料であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ｓＡＰＰαの産生が、免疫学的試験、好ましくはＥＬＩＳＡにより測定されることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物において測定されたｓＡＰＰαの産生が、参照レベルと、または治療前にもしくは治療の初期段階で測定された値と比較されることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物における血小板によるＡＰＰα産生を刺激または誘導するための医薬の調製のための、ピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物の使用。
【請求項１５】
哺乳動物における血栓形成のリスクを低減するための医薬の調製のための、ピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物の使用。
【請求項１６】
神経変性疾患を有する患者における血管合併症を軽減するための医薬の調製のための、ピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物の使用。
【請求項１７】
哺乳動物、特に神経変性疾患を有する患者における血小板凝集を阻害するための医薬の調製のための、ピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病で観察されるような、認知機能が変化した神経変性疾患の治療のための組成物および方法に関するものである。さらに詳細には、本発明は、ある血小板パラメーターの生化学アッセイに基づくことから採血により行うことのできる、神経保護治療の活性および／または有効性のヒトの臨床的なモニタリングのための戦略を提示する。本発明は、これらの戦略を実行するために適した方法、ツール、構成および組成物にもまた、関するものである。
【０００２】
アルツハイマー病は、認知症の主因および最もよくみられる神経変性疾患に相当する。この進行性疾患は、記憶喪失ならびに言語能力、見当識および判断の低下を特徴とする。この疾患を患う患者の脳検査は、重要な記憶中枢である海馬、ならびに理性、言語および記憶に関与する大脳皮質のニューロン損失を示す。コリン作動性ニューロンは、この枯渇により特に影響される。
【０００３】
アルツハイマー病を患う患者の脳に観察される主な異常は、細胞内および細胞外のタンパク質凝集物の蓄積である。ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）の切断により生じるアミロイドβペプチド（Ａβ）の細胞内および細胞外凝集により形成する老人斑は、ニューロンおよびグリア細胞に波及する変化領域の特徴を示す。他の細胞内凝集物、神経原線維濃縮体、およびタウタンパク質は、認知症の深刻さと密接に関連すると思われる。
【０００４】
家族性アルツハイマー病に実施された遺伝的研究は、四つの遺伝子、すなわちＡＰＰ、プレセニリン１および２（ＰＳ１およびＰＳ２）ならびにアポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）がこの疾患の発生に関連することを示した。これらの遺伝子のそれぞれにおける突然変異または多型はＡβペプチドの産生増加を導くものの、シナプスおよびニューロンの損失を支配するメカニズムは、あまり理解されていないままである。したがって、特にＡβペプチドにより著しく誘導されうる酸化ストレス、炎症現象および免疫現象、またはさらに性ホルモン欠損、インスリン欠損および甲状腺機能低下症などの現象を伴ういくつかの仮説およびメカニズムが共存すると思われる。カルシウム流入および興奮毒性における変化の役割を強調する仮説もある。しかし、コリン作動性ニューロンの特別な脆弱性を完全な説明できる事象はなかった。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の使用に基づく、現在利用できる治療は、患者の認知機能を一時的に改善するだけであり、ましてアルツハイマー病の進行を減速することができる治療アプローチがアルツハイマー病と闘うことを意味しない。
【０００５】
最近の観察がＡβペプチドに対する免疫療法アプローチにより薬理学的に介入する可能性を強調しているとはいえ、ＡＰＰの代謝およびＡβペプチド産生に関与するプロテアーゼであるセクレターゼを直接ターゲティングする方が、なおさら適切である。
【０００６】
Ａβペプチドは、アミロイド形成経路において、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）およびγ−セクレターゼ（プレセニリン）と呼ばれる二つのプロテアーゼによるＡＰＰタンパク質の連続切断を経由して産生される４０／４２残基のフラグメントである。Ａβペプチドに関する配列は、ＡＰＰの膜内ドメインと細胞外ドメインとの間の接合部に位置する。非アミロイド形成経路では、ＡＰＰはＡβドメインの中でＡβ領域のアミノ酸１６（Ｌｙｓ）と１７（Ｌｅｕ）との間でα−セクレターゼにより切断され、細胞外媒質中で塩析する可溶性ＡＰＰα部分（ｓＡＰＰα、１０５〜１２５kDa、ＡＰＰ７７０型の残基１〜６８８）と、Ｃ８３（１０kDa）と呼ばれる膜に保持されるフラグメント（膜貫通ドメインの部分およびＣ末端細胞内部分を有する）とを発生させ、Ｃ８３自体は、γ−セクレターゼにより切断されて「ＡＰＰ細胞内ドメイン」ペプチド（ＡＩＣＤ）およびＰ３ペプチド（３kDa）を発生させる。したがって、α−セクレターゼの作用は、アミロイドペプチドの形成を妨げるだけでなく、ＡＰＰの大型の細胞外Ｎ末端フラグメント（エクトドメイン）の発生も刺激する。α−セクレターゼにより発生するＡＰＰの可溶性Ｎ末端フラグメント、すなわちｓＡＰＰαは、小胞の内腔および細胞表面で構成的に塩析する。このようなＡＰＰ種は、ＡＰＰを発現している細胞により馴化された培地にインビトロで分泌され、血漿および脳脊髄液中にインビボでみられる。
【０００７】
α−セクレターゼの活性を刺激してｓＡＰＰαのレベルを増加させると記載されたアプローチは、Ｐ２Ｙ２ヌクレオチドレセプター、ＰＡＣＡＰ  ＰＡＣ１レセプター、または様々な神経伝達物質に対するレセプター、例えばムスカリンレセプター、代謝型グルタミン酸レセプターもしくはさらにセロトニンレセプターなどのＧタンパク質共役レセプターの活性化を伴う（概説についてはｉｉｉ節を参照のこと）。神経伝達物質により刺激される経路は、ｓＡＰＰα産生モデュレーターとして文献で詳しく記載されているプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）系およびホスホリパーゼ系、ならびにＭＡＰキナーゼを伴うが、例えばホルボールエステルによる、またはさらにセロトニン５−ＨＴ２ａレセプターアゴニストおよびセロトニン５−ＨＴ２ｃレセプターアゴニストによるＰＫＣ依存性経路の刺激などである。ｃＡＭＰの産生およびＲａｃ１  ＧＴＰアーゼの動員を経由した、認知および記憶に役割を果たすことが知られているセロトニン５−ＨＴ（４）レセプターを伴う経路、あるいはさらにＰＫＣおよび／もしくはＭＡＰキナーゼを経由したアセチルコリン阻害剤、エストロゲン（１７β−エストラジオールなど）またはさらにテストステロンを伴う経路もある。ＥＧＦおよびインスリンなどのある種のホルモンおよび成長因子は、一般にそれぞれＫＰＣまたはＰ１３Ｋを経由したｓＡＰＰαの産生を刺激することで知られている。他の薬理学的薬剤もｓＡＰＰαの産生を刺激することが最近になって記載されており、ｃＡＭＰ−プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）経路によるものは、例えばフォルスコリンであり、またＰＫＣ／ＭＡＰキナーゼ経路によるものは、例えばシクロオキシゲナーゼＣＯＸ阻害剤のような非ステロイド系抗炎症剤（イブプロフェン）、スタチン系ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（ロバスタチン）、ラサギリン誘導体またはさらに（−）−エピガロカテキン−３−ガレートのようなポリフェノールである。しかし、全てのこれらアプローチは、薬理学的ツールによりｓＡＰＰαの産生を刺激しようと努める戦略の妥当性を実証することを可能にするが、ヒトの臨床的に使用するために適した新しい化合物をもたらさなかった。
【０００８】
本発明は、ｓＡＰＰαフラグメントの産生を刺激することを意図した、エタゾレートを含めたピラゾロピリジンのクラスに属する化学化合物などの薬剤を使用するための理論的根拠を提供する。
【０００９】
本発明は、ｓＡＰＰαの産生増加と、エタゾレートがＲＯＳ（「活性酸素種」）により誘導される作用を、すなわち酸化ストレスを阻害する能力との間の関連についてもまた記載する。
【００１０】
この酸化ストレス現象は、アルツハイマー病のいくつかの局面、すなわちニューロンの変性およびアストロサイトの炎症だけではなく、血小板の活性化および凝集にも不可欠な役割を果たす。これらの後者の現象は、アルツハイマー病の血管合併症に関与し、血管性認知症の原因である。
【００１１】
結果として、血小板活性化のレベルで酸化ストレスにより開始する経路に及ぼすエタゾレートの阻害剤効果をモニタリングすることが可能である。さらに一般的には、血小板活性化レベルで神経保護化合物の阻害剤効果をモニタリングすることが可能である。
【００１２】
したがって、初めて本発明は、神経保護化合物の有効性を臨床的または治療的にモニタリングするために、血小板の活性化または凝集に関連した任意の生物学的現象の測定を提案することを可能にする。ＡＰＰからＡβペプチドおよびｓＡＰＰαペプチドを発生させる能力は、神経系および血小板によって共有される。結果として、エタゾレートが酸化ストレスに及ぼす阻害作用がｓＡＰＰαの産生増加に変換されることから、本発明は、血小板試料から、またはさらに一般的には血液試料からエタゾレートがＡＰＰの成熟に及ぼす作用をモニタリングするための理論的根拠を提供する。
【００１３】
本発明は、ピラゾロピリジンファミリーの任意の化合物の有効性を臨床的または治療的にモニタリングするための、血小板活性化または凝集に関連する任意の生物学的現象の測定もまた請求する。さらに、本発明は、ピラゾロピリジンファミリーの任意の化合物の有効性を確実に臨床的または治療的にモニタリングするための、血液中のＡＰＰ成熟における任意の変化の測定、特に血液試料または血小板調製物からのｓＡＰＰα濃度の測定を主張することを可能にする。
【００１４】
したがって、本発明の目的事項は、哺乳動物における神経保護治療の有効性を評価またはモニタリングする方法にあり、この方法は、前記治療を受けた哺乳動物からの生物学的試料中のｓＡＰＰαの産生を（好ましくはインビトロまたはエクスビボで）測定する段階を含み、前記試料は血小板を含有し、ｓＡＰＰαの産生は、治療有効性の指標である。
【００１５】
本発明の別の目的は、試料中のｓＡＰＰαを免疫学的に定量する（immunological dosing）のための工程にあり、この工程は、（ｓＡＰＰαをアンマスキングするために）試料を熱処理する段階および免疫学的に定量する段階を含む。この工程は、任意の試料、特に血液もしくは血液派生物試料（血清、血小板など）、または他の生物学的液体からｓＡＰＰαを定量するために適する。試料は、特に希釈、濃縮、濾過などにより前処理してもよい。
【００１６】
神経保護治療
本発明は、哺乳動物における任意の神経保護治療の有効性を評価またはモニタリングするためにもまた使用してもよい。本発明の意味では、神経保護治療により、神経系に影響する疾患、特に神経変性疾患の治療に使用することができるか、または使用される任意の治療が意味される。この文脈で、ピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択された化合物を挙げることができる。
【００１７】
本発明の意味では、ピラゾロピリジンファミリーの化合物は、任意の位置で置換または非置換された下記式（Ｉ）の任意の化合物を好都合に意味する。
【００１８】
【化１】
2009544964.tif 000003
【００１９】
本発明に使用されるピラゾロピリジンファミリーの化合物は、特に以下の化合物の中から選択される：
−  下記式（ＩＩ）のエタゾレート：
【００２０】
【化２】
2009544964.tif 000004
【００２１】
エタゾレートは、本発明の好ましい態様を構成する。
【００２２】
−  ４−ブチルアミノ−１−エチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル（トラカゾラート）、
−  ４−ブチルアミノ−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  １−（４−アミノ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−１−イル）−β−Ｄ−１−デオキシ−リボフラノース
−  １−エチル−４−（Ｎ’−イソプロピリデン−ヒドラジノ）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル（ＳＱ  ２００９）
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ｎ−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
−  ４−アミノ−１−エチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル（デスブチルトラカコラート）
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボキサミド、
−  １−エチル−６−メチル−４−メチルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、−  １−エチル−４−エチルアミノ−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−アミノ−１−ブチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル
−  ５−（４−アミノ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−１−イル）−２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−３−オール、
−  １−アリル−４−アミノ−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸、
−  ４−アミノ−１−エチル−３，６−ジメチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−ジメチルアミノ−１−エチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、−  １−エチル−６−メチル−４−プロピルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−アミノ−１−ブタ−３−エニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−アリルアミド、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イソプロピルアミン、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−Ｎ−ｎ−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボキサミド、
−  ４−アミノ−１−ブチル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−プロパ−２−イニルアミド
−  ４−アミノ−１−（３−メチル−ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−Ｎ−（２−プロペニル）カルボキサミド、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−ブチルアミド、
−  ４−アミノ−１−ブタ−３−イニル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−１−ブタ−３−エニル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−アリルアミド、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−（３−メチル−ブチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸イソブチルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−ブチルアミド、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−（３−メチル−ブタ−２−エニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−シクロプロピルアミド、
−  エチル４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−ヒドロキサマート、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸プロパ−２−イニルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−エニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−プロピルアミド、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−シクロプロピルメチル−アミド、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸２−メチルアリルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−アリルアミド（ＩＣＩ１９０，６２２）、
−  ４−アミノ−１−ペンタ−４−イニル−Ｎ−２−プロペニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボキサミド、
−  ４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−プロパ−２−イニルアミド、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−ブタ−２−イニルアミド、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−１−（２−シクロプロピル−エチル）−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−１−ヘキソ−５−イニル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸アリルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−シクロプロピルメチル−アミド、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸ブタ−３−エニルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸シクロプロピルメチルエステル、
−  ４−ブチルアミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−アリルアミド、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［２，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸２−シクロプロピルエチルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−３−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸シクロプロピルメチルエステル、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンタ−４−イニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸シクロプロピルメチルエステル、
−  ４−アミノ−１−ベンジル−６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−ベンジルアミド、
−  ４−アミノ−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−フェニルアミド、
−  ４−アミノ−６−メチル−１−ペンチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸ベンジルエステル、
−  ４−アジド−１−β−Ｄ−リボフラノシルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン、
−  １−ペンタ−３−イニル−Ｎ−２−プロペニル−４−プロピオンアミド−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボキサミド、
−  ２−（４−アミノ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−１−イル）−５−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−フラン−３，４−ジオール、
−  ２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イルアミノ）−エタノール、
−  ３−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イルアミノ）−プロパン−１−オール、
−  ３−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イルアミノ）−酢酸プロピルエステル、
−  ２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イルアミノ）−プロピオン酸エチルエステル、
−  ２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イルアミノ）−ペンタン酸エチルエステル、
−  ２−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イルアミノ）−安息香酸エチルエステル、
−  ３−（６−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イルアミノ）−ペンタン酸プロピルエステル、
−  Ｎ−ベンジリデン−Ｎ’−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−ヒドラジン、
−  Ｎ−フラン−２−イルメチレン−Ｎ’−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（４−フルオロ−ベンジリデン）−Ｎ’−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（３−フラン−２−イル−アリリデン）−Ｎ’−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（４−メトキシ−ベンジリデン）−Ｎ’−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−ヒドラジン、
−  ４−［（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−ヒドラゾノメチル］−ベンゾニトリル、
−  Ｎ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルメチレン−Ｎ’−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−Ｎ’−（４−ニトロ−ベンジリデン）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−Ｎ’−（２−ニトロ−ベンジリデン）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−Ｎ’−（４−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−Ｎ’−（５−ニトロ−フラン−２−イルメチレン）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−Ｎ’−（２−トリフルオロメチル−ベンジリデン）−ヒドラジン、
−  Ｎ−（３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル）−Ｎ’−（６−ニトロ−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルメチレン）−ヒドラジン、
−  ４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸
−  ４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−（ピリジン−４−イルメチル）−アミド、
−  ４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−（テトラヒドロ−フラン−２−イルメチル）−アミド、
−  ４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−（５−ヒドロキシ−ペンチル）−アミド、
−  ４−（３−クロロ−４−メトキシ−ベンジルアミノ）−１−エチル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−［３−（２−オキソ−ピロリジン−１−イル）−プロピル］−アミド、
−  ４−tert−ブチルアミノ−１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  １−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−シクロプロピルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  １−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−プロピルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  １−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−フェニルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−ブチルアミノ−１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  １−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−（２−エトキシ−エチルアミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  ４−ベンジルアミノ−１−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、
−  １−（２−クロロ−２−フェニル−エチル）−４−フェネチルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル。
【００２３】
これらの化合物は、塩、エステル、ラセミ体、活性異性体などの形であってもよい。特定の一態様では、神経保護化合物は、エタゾレート、トラカゾレート（tracazolate）またはカルタゾレート（cartazolate）の中から、さらに好ましくはエタゾレートから選択される。
【００２４】
ＧＡＢＡ（Ａ）モデュレーターは、フリーラジカル（ＲＯＳ）の発現または活性をモデュレーションすることのできる天然または合成起源の任意の化学化合物、特に、植物、細菌、ウイルス、動物、真核生物、合成または半合成起源の有機または無機分子であってもよい。特定の例として、ベンゾジアゼピンを特に挙げることができる。
【００２５】
本発明の範囲内で使用される化合物または治療は、異なる方法で処方または投与することができる。投与は、当業者に公知の任意の方法により、好ましくは経口的に、または全身もしくは局所注射により行ってもよい。注射は、典型的には眼内、腹腔内、脳内、静脈内、動脈内、皮下または筋肉内である。経口または全身投与が好ましい。投与される用量は、当業者が調整してもよい。典型的には、化学化合物について約０．０１mg〜１００mg/kgが注射される。特定の単位投薬量は、例えば１回あたり０．５〜４０mgである。場合により他の活性薬剤または任意の薬学的に許容される賦形剤（例えば安定化剤の存在下の緩衝液、食塩水または等張溶液など）と組み合わせて、繰り返し注射を行ってもよいことが了解されている。
【００２６】
薬学的に許容される担体または賦形剤は、緩衝液の溶質、溶媒、結合剤、安定化剤、乳化剤などの中から選択することができる。緩衝液または希釈液の溶質は、特にリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、乳糖、セルロース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、デンプン、粉砂糖およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（持続放出用）である。結合剤は、例えばデンプン、ゼラチン、およびスクロース、グルコース、デキストロース、ラクトースなどの増量性溶質である。特にアルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの天然ゴムまたは合成ゴムもまた使用してもよい。他の賦形剤は、例えばセルロースおよびステアリン酸マグネシウムである。安定化剤は、例えば多糖（アラビアゴム、寒天、アルギン酸、グアーガムおよびトラガカント、キチンまたはその誘導体、ならびにセルロースエーテル）などの処方に組み入れてもよい。溶媒または溶質は、例えばリンゲル液、水、蒸留水、リン酸緩衝液、リン酸食塩水、および他の通常の液体である。
【００２７】
試料
上記方法を実行するために、治療された対象に由来する、血小板を含有する任意の試料を使用することが可能である。実際に本発明は、神経保護化合物が血小板中におけるｓＡＰＰαの産生を誘導することができることを示す。したがって、治療の有効性は、血小板を含有する任意の試料からｓＡＰＰαアッセイにより評価およびモニタリングしてもよい。
【００２８】
特定の一態様では、生物学的試料は、血液試料または血液由来の試料である。血液「由来の」試料とは、例えば試料の血小板を濃縮するため、他の細胞集団を除去するため、可能性のある病原体を不活性化するため、アッセイを較正するためなどの、例えば希釈、濾過、精製などにより処理された任意の血液試料と理解される。
【００２９】
上記方法は、全ての哺乳動物、特にアルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、ハンチントン病などの神経変性疾患を患う、好ましくはヒトに適用することができる。
【００３０】
ｓＡＰＰαアッセイ
当業者にそれ自体公知の様々な技法を、ｓＡＰＰαをアッセイするために使用することができる。したがって、特に、ｓＡＰＰαに特異的な抗体の使用に基づく免疫学的技法を挙げることができる。このような抗体は、文献から得ることができるし（Exp. Neurol. 2003 Sep; 183(1):74-80）、当業者自身に公知の技法により産生させることもできる。したがって、非ヒト哺乳動物にｓＡＰＰαまたはｓＡＰＰαの任意のエピトープもしくはフラグメントを免疫処置することにより、このような抗体を産生させ、次にインビトロでｓＡＰＰαと結合することができるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を単離および／または選択することが可能である。次いで、抗体の特異性は、ＡＰＰタンパク質全体ならびに／またはＡＰＰタンパク質由来の他のペプチド、例えばフラグメントＣ８３、ＡＩＣＤペプチドおよびＰ３ペプチドに対する抗体の結合試験の判定により確認してもよい。好ましくは、ｓＡＰＰαと特異的に結合することができ、Ｃ８３フラグメント、ＡＩＣＤペプチドおよびＰ３ペプチドと特異的に結合できない抗体が使用される。結合の「特異性」は、ｓＡＰＰαへの結合を、他のタンパク質またはペプチドへの可能性のある結合と区別することができることを示す。
【００３１】
ｓＡＰＰαの産生を測定するための方法は、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ技法、特異的抗体でコーティングされた基質、磁気ボール、カラム、いくつかの抗体（捕捉抗体および検出抗体）などの使用を伴うことがある。好ましくは、ＥＬＩＳＡ試験が使用される。
【００３２】
典型的には、測定されたｓＡＰＰαの産生を、参照レベルと、または前記哺乳動物における治療前にもしくは治療の初期段階で測定された値と比較する。したがって、治療に続いて、または治療の間に、患者においてｓＡＰＰαの産生レベルが漸進的に変化したかどうかを判定することが可能である。ｓＡＰＰαレベルの維持または増加は、治療の有効性の指標を構成する。
【００３３】
さらに、本発明者らは、任意の試料に適用することができる、ｓＡＰＰαを免疫学的に定量するための改良法を開発した。この方法は、特に可溶性ｓＡＰＰαフラグメントの特異的エピトープをアンマスキング（することで利用可能に）できるようにする試料処理段階に依存する。実際に、本発明者らによって提示される結果は、適切なプロトコールがなければ、ＥＬＩＳＡにより特異的および定量可能な方法でｓＡＰＰαを検出することができないことを示す。
【００３４】
したがって、本発明の別の目的は、試料中のｓＡＰＰαの免疫学的定量のための工程にあり、この方法は、（ｓＡＰＰαエピトープをアンマスキングするために）試料を熱処理する段階および免疫学的定量の段階を含む。この工程は、任意の試料、特に血液試料もしくは血液派生物試料（血清、血小板など）、他の生物学的液体、または培養上清からのｓＡＰＰαの定量に適する。試料は、特に希釈、濃縮、濾過などにより前処理してもよい。
【００３５】
好ましくは、熱処理段階は、約６０℃〜７０℃の間に含まれる温度でｓＡＰＰαエピトープをアンマスキングするために十分な時間、典型的には約３０秒〜１０分の間に含まれる時間、試料を処理することを含む。実施例に示すように、このような方法は、ヒト血液試料からの、信頼でき、再現性があり、かつ特異的なｓＡＰＰαアッセイを可能にする。
【００３６】
免疫学的アッセイは、ｓＡＰＰαに特異的な任意の試薬、特に上記のもののような任意の特異的抗体を用いた、特にＥＬＩＳＡなどのそれ自体公知の様々な技法により行うことができる。これらの抗体の中で、ＡＰＰのアミノ酸残基１〜１７に含有されるエピトープを認識する任意の抗体を特に挙げることができる。さらに具体的には、このような抗体またはキットは、SigmaもしくはBiosourceが販売するＥＬＩＳＡ  ＡＰＰキットのように市販されているか、または（ＡＰＰの切断レベルで）ｓＡＰＰαに特異的なある種の抗体もしくはｓＡＰＰαおよびＡＰＰを認識する抗体である：
−  モノクローナル抗体６Ｅ１０（ｓＡＰＰαに特異的）
−  モノクローナル抗体２Ｂ３（ＩＢＬ  ｓＡＰＰαキットに包含される）、ｓＡＰＰαに特異的
−  モノクローナル抗体ＢＡＮ５０、Ａβペプチド１−１６（ＰＭＩＤ：１０４８０８８７）に対する免疫処置により産生される
−  モノクローナル抗体２２Ｃ１１（ｓＡＰＰαを認識する抗ＡＰＰ抗体）
−  ポリクローナルｐｏｌｙＣ１１抗体（Upstate/Millipore、カタログ番号ＡＢ５３６８、Chemicon製）
−  ｓＡＰＰ（ポリ）、ＯＹＣ製（カタログ番号ＡＰＰ−ＫＰＩ−抗血清）
−  ｓＡＰＰａ（ポリ）、Signet Covance製（カタログ番号ＳＩＧ−３９１３９）
−  ウサギ抗ｓＡＰＰ抗体３３２９、リコンビナント型ｓＡＰＰαを特異的に認識する（ＰＭＩＤ：９４６５０９２）。
【００３７】
治療への応用
上に定義した神経保護治療が血小板におけるｓＡＰＰα産生の誘導または刺激を可能にすると予想外に立証されたことから、この種の化合物の新しい治療的使用を構想することができる。
【００３８】
したがって、本発明の目的は、哺乳動物における血小板によるｓＡＰＰα産生を刺激または誘導するための医薬の調製にピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物を使用することにある。
【００３９】
本発明は、哺乳動物における血栓形成のリスクを低減させるための医薬の調製にピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物を使用することにもまた関する。
【００４０】
本発明は、神経変性疾患を患う患者における血管合併症を軽減するための医薬の調製にピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物を使用することにもまた関する。
【００４１】
本発明は、哺乳動物、特に神経変性疾患を患う患者における血小板凝集を阻害するための医薬の調製にピラゾロピリジンおよびＧＡＢＡ（Ａ）レセプターモデュレーターの中から選択される化合物を使用することにもまた関する。
【００４２】
例示的および非限定的とみなされうる以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】未処置血清におけるｓＡＰＰαアッセイを示す図である。
【図２】熱処理がＥＬＩＳＡによるｓＡＰＰαの検出に及ぼす効果を示す図である。
【図３】ヒト血清中のｓＡＰＰαの検出を示す図である。
【図４】血清中のリコンビナントｓＡＰＰαの検出を示す図である。
【図５】エタゾレートがｓＡＰＰαのインビトロ産生を刺激することを示す図である。
【図６】エタゾレートがニューロンにおけるｓＡＰＰα産生を刺激することを示す図である。
【図７】エタゾレートがｓＡＰＰαのインビトロ産生を刺激することを示す図である。
【図８】エタゾレートがアミロイドペプチドの毒性に及ぼす効果およびＧＡＢＡA阻害剤がエタゾレートにより誘導される神経保護に及ぼす効果を示す図である。統計:Wilcoxon検定：＃＃＃、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図９】α−セクレターゼがエタゾレートにより誘導される神経保護に及ぼす阻害剤効果を示す図である。統計：Wilcoxon検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図１０】抗ｓＡＰＰα中和抗体がエタゾレートにより誘導される神経保護に及ぼす効果を示す図である。統計：Wilcoxon検定：＃＃、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【００４４】
実施例
実施例１：ｓＡＰＰαのアッセイのための工程
血中を循環しているＡＰＰ可溶性フラグメント（ｓＡＰＰα）は血小板細胞および関連するα−セクレターゼ活性から生じる。このフラグメントは、年齢と共に、そしてアルツハイマー病（ＡＤ）の生理病理学的過程の間に減少することが示された。血中を循環しているｓＡＰＰαは、ＡＰＰのプロセシングにおける変化をモニタリングするためのバイオマーカーとみなすことができ、この変化は、年齢と共に、そしてアルツハイマー病の生理病理学的過程の間に出現し、医療を受けることにより修正することができる。
【００４５】
したがって、アルツハイマー病を治療するためにＡＰＰのプロセシングを改変することを目的とする治療の有効性を評価するために、血液凝固および血小板活性化後の血中の、さらに特定すれば血清中のｓＡＰＰαレベルを正確に定量することに現実的な関心がある。
【００４６】
下記の方法は、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ技法により高親和性抗体−抗原を検出するために、ｓＡＰＰα可溶性フラグメントの特異的エピトープをアンマスキングして利用可能にするために開発された。
【００４７】
実際に、血清試料を処理するために適したプロトコールなしでは、ｓＡＰＰαはＥＬＩＳＡにより定量可能かつ特異的に検出することはできないであろう。図１に示すように、前処理を行わない血清単独は、ｓＡＰＰα（３．５ng/mL）の非常にはっきりと定量可能に検出されるが、これは、リコンビナントｓＡＰＰα（＋１０ng/mL）が添加と共に増加するようには見えず、その一方で、添加された同量のｓＡＰＰαは、およそ予想された量（１０ng/mL）で検出される（８．７ng/mL）。特別な処理を行わない純粋な血清におけるＥＬＩＳＡ検出は、可溶性で循環しているｓＡＰＰαに特異的とは思われない。
【００４８】
血清中の可溶性ｓＡＰＰαを利用し、それを信頼でき、特異的で、かつ再現性のある方法で定量可能とするために、本発明者らは、熱処理により、血清中に存在するｓＡＰＰαが特異的ＥＬＩＳＡ抗体に利用できるようにする試料の調製および処理方法を開発した。血清試料は、ｐＨ７．４のダルベッコ（Dulbecco）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Sigma＃Ｄ８５３７）、５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に最初希釈する。次に、希釈した試料を６６℃で１０分間熱処理し、次に４℃で冷却する。次に、試料を、ｓＡＰＰαに特異的なキットを使ったＥＬＩＳＡ技法により分析する。
【００４９】
図２に示すように、ＥＬＩＳＡによる血清からのｓＡＰＰαの検出は、加熱温度および熱処理時間（温度範囲６０〜７０℃；Ｘ＝６６℃）の関数として顕著に増加する。
【００５０】
この血清試料調製物および熱処理法を、３回の別々の実験で７個の異なるヒト血清から評価した。図３が示すように、ＥＬＩＳＡによるヒト血清からのｓＡＰＰαの検出は、この方法で再現性があるように見えることを示す（Ｘ＝６６℃）。
【００５１】
血清中のｓＡＰＰαに関してこの方法をよりよく評価するために、本発明者らは、三つの漸増する量のｓＡＰＰα（５、７．５および１０ng/mL）を使用することにより、ヒト血清中のｓＡＰＰα検出の直線性を評価した。図４は、異なる３日に同じ血清に行った３回の別々の実験の平均を示す。
【００５２】
図４が示すように、調製および熱処理後の生物学的マトリックス（血清）において添加／追加（spike）されたｓＡＰＰαの量とＥＬＩＳＡにより検出されたｓＡＰＰαの量との間に非常に良好な比例関係がある。これらの結果は、処理後の血清に添加されたｓＡＰＰαがその血清の遊離ｓＡＰＰαと競合しないことを示す。これらの結果は、異なる３日に行われた３回の実験にわたり良好な再現性を示す。
【００５３】
これらの結果から、処理後の血清中のリコンビナントｓＡＰＰαの回収率は、内因性ｓＡＰＰαを有さず、かつ同量のｓＡＰＰが添加された生物学的マトリックスに対応する試料と比較して計算することができよう。
【００５４】
下記表に示すように、三つの漸増する量での血清中リコンビナントｓＡＰＰαの回収率（予想値に対する％で表現）は、１００％±２５％の許容される限界内にある。
【００５５】
【表１】
2009544964.tif 000005
【００５６】
ＦＤＡは、文書US Food And Drug Administration Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation（２００１年５月）における診断工程に適用されるＥＬＩＳＡアッセイについての作業基準を規定している。以下の文書は、イムノアッセイのための許容基準および実証基準を具体的に述べている。
- Findlay et al. Validation of immunoassays for bioanalysis: a pharmaceutical industry perspective. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21 (2000) 1249-1273
- Viswanathan et al. Workshop/Conference Report - Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays. The AAPS Journal 2007; 9 (1) Article 4 (http://www. aapsj.org)
【００５７】
下記データは、ＩＢＬが販売するｓＡＰＰαキットにより実行される本発明のアッセイ法の性能が、ＦＤＡにより勧告される基準を満たすことを示す。
【００５８】
【表２】
2009544964.tif 000006
【００５９】
実施例２：エタゾレートはｓＡＰＰαの産生を刺激する
ヒトＡＰＰを過剰発現している、安定的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を、アール塩を含有し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２mM Ｌ−グルタミン（Sigma, Lyon, France）、１×可欠アミノ酸および抗生物質を補充した改変イーグル培地中で維持した。表示した様々な濃度の分子を１０cmプレート上に広げてから４８時間、または担体としてＤＭＳＯを用いて２４時間、細胞を処理した。ｓＡＰＰαは、市販の抗体によるＥＬＩＳＡよびウエスタンブロットにより測定されていた。
【００６０】
得られた結果を図５に示すが、この結果は、エタゾレートがｓＡＰＰαの分泌を誘導することを示す。
【００６１】
実施例３：エタゾレートは皮質ニューロンによるｓＡＰＰαの産生を刺激する
１７日齢のWistarラット胚から単離した皮質ニューロン中のｓＡＰＰαの産生を測定した。細かく切り分けて０．２５％トリプシンを含有する溶液に入れた皮質構造から細胞を得る。解離した細胞は、６μg/mLのポリオルニチンでコーティングした培養皿中の添加物を含有する神経基本培地（１×Ｂ２７、２mM Ｌ−グルタミン、０．６％グルコース、抗生物質および抗真菌剤、ならびに２％ウマ血清）に１cm2あたり５００，０００個の密度で蒔く。細胞は３７℃および５％ＣＯ2で維持する。蒔いてから２４時間後に、細胞を抗真菌剤として５μM ＡｒａＣ（５−シトシンアラビノフラノシド）で処理する。インビトロで４日後に、培地の半分を、ウマ血清を有さない培地に交換し、成熟させるためにこの培地中で７〜１０日間、培養物を維持する。
【００６２】
ｓＡＰＰαは、培地を１回交換し、新鮮培地中で２４時間蓄積させた後に、市販されている抗体を使ったウエスタンブロットにより測定した。定量は、スキャンしたオートラジオグラフィー画像のデンシトメトリー解析により行った。図６が示すように、エタゾレート（０．２および２μMで２４時間）は、皮質ニューロンからのｓＡＰＰαの塩析を刺激する。示したデータは、２回の繰り返しで行った独立した３回の実験の平均±ＳＥＭであり、対照（未処理培養物）に対するパーセントの形で表す。
【００６３】
実施例４：エタゾレートはｓＡＰＰαのインビボ産生を刺激する
脳内のＡＰＰプロセシングの生理学的モデルであるモルモットにおいてインビボでｓＡＰＰαの産生を研究した。エタゾレートまたは賦形剤（生理食塩水）は、実験開始時に体重２５０〜２７０ｇの雄性Hartley白色種モルモットに用量１０mg/kgを１日１回１５日間連続で経口投与した。最終投与の１時間後に、モルモットを屠殺し、直ちに脳を抜き取り、窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０μg/mLゲンタマイシンおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するｐＨ７．５の２０mM Ｔｒｉｓ塩基溶液に皮質を４℃でホモジナイズした。可溶性ｓＡＰＰαはＥＬＩＳＡ試験により測定し、結果は、抽出物中に存在するタンパク質の量に関して基準化した。
【００６４】
図７は、賦形剤で処置した対照動物と比較したときの、エタゾレートで処置した動物の脳から測定されたｓＡＰＰα量の増加を示す。エタゾレートにより誘導される３倍の増加は、統計的に非常に有意である（＊＊＊：Wilcoxon検定によりｐ＜１Ｅ−４）。
【００６５】
得られた結果は、エタゾレートがｓＡＰＰαの分泌を誘導することを示す。
【００６６】
実施例５：エタゾレートの神経保護作用はインビボでのｓＡＰＰαの産生を必要とする
Ａβ２５−３５ペプチドは、アミロイドペプチドの神経毒性フラグメントを有し、化合物の神経保護作用を研究するために古典的に使用されるツールである。各実験の初めに、７〜１０日経たニューロン培養物を新鮮培地と交換し、濃度３３．５μMのＡβ２５−３５アミロイドペプチドを添加する６時間前にエタゾレート阻害化合物で処理する。古典的および再現的に、この濃度は神経培養物に３０％〜４０％の毒性を発生する。
【００６７】
エタゾレートの神経保護作用を特徴付けるためにいくつかの実験を行う。神経保護がＧＡＢＡＡレセプターを伴うかどうかを実証するために、エタゾレートの１時間前に、それぞれ濃度５０μM、２０μMおよび１０μMのＧＡＢＡＡレセプターアンタゴニストであるピクロトキシン（ＰＴＸ）、ガバジン／ＳＲ９５５３１、およびビククリン（ＢＩＣ）を予備インキュベーションする。
【００６８】
最近、いくつかの研究は、ｓＡＰＰαが、特にインビトロおよびインビボでアミロイドペプチドに対して神経栄養機能および神経保護機能を有することを示したが、これは、エタゾレートがαセクレターゼ経路を経由してその神経保護作用を仲介できることを示唆している。アミロイドペプチドに対してエタゾレートの神経保護作用を提供するのがｓＡＰＰαの阻害であるか、それともその産生の阻害であるかを判定するために、抗ｓＡＰＰα中和抗体（３Ｅ９抗体）およびα−セクレターゼ阻害剤をそれぞれ使用する。ｓＡＰＰαの中和のために、皮質細胞にエタゾレートと同時に３Ｅ９抗体（５μg/ml）を添加する。二つのα−セクレターゼ阻害剤、すなわち化合物であるフューリン阻害剤Ｉ（Hwang EM, Kim SK, Sohn JH, Lee JY, Kim Y, Kim YS, Mook-Jung I。Furin is an endogenous regulator of alpha-secretase associated APP processing. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Oct 20; 349(2):6 54-9.）およびＴＡＰＩ（Slack BE, Ma LK, Seah CC. Constitutive shedding of the amyloid precursor protein ectodomain is up-regulated by tumour necrosis factor-alpha converting enzyme. Biochem J. 2001 Aug 1; 357(Pt 3): 787-94）を、エタゾレート添加の１時間前に前処理に使用する。
【００６９】
全ての処理は、少なくとも２回、少なくとも二つの異なる培養物で実施される。４８時間インキュベーション後に、ＭＴＴ試験により毒性を測定する。未処理平均に対して基準化した結果をWilcoxon検定により統計解析する。０．０５以下のｐで有意な値を決定する。
【００７０】
ＭＴＴ：
毒性は、ＭＴＴ試験を使用することにより測定する。化合物と共にインキュベーション後に、最終濃度０．５mg/mLのＭＴＴをウェル毎に添加する。次に、プレートを夜間に３７℃で３０分間インキュベートする。培地を抜き取り、結晶を５００μLのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に再懸濁する。５５０nmでの吸光度を読み取り、生存率を計算する。
【００７１】
結果：
得られた結果を図８〜１０に示す。これらの結果は、アミロイドペプチドＡβ２５−３５により誘導されたニューロンの死滅に本発明の化合物が及ぼす保護作用を例示する。
【００７２】
エタゾレートによりニューロンを同時処理する間に、用量依存的保護作用が観察されるが（図８）、特に用量０．２μMで９０％の細胞生存率が得られる。この作用は、三つのＧＡＢＡA阻害剤の使用により遮断され、統計解析は、この作用が高度に有意であることを示している（０．２μM  ＥＨＴ０２０２を０．２μM ＥＨＴ０２０２およびアンタゴニストと比較した後のWilcoxon検定でｐ＜１ｅ−４）。結果は、７回の独立した実験の平均±ＳＥＭに対応する。
【００７３】
図９および１０は、ｓＡＰＰαの産生または活性の阻害剤の存在下で皮質ニューロンに及ぼすエタゾレートにより得られた結果を示す。表示した結果により、エタゾレートがこれらの細胞に保護作用を達成することが可能で、この保護作用が、二つのα−セクレターゼ阻害剤である化合物フューリン阻害剤ＩおよびＴＡＰＩを用いた処理により阻害されることが示される（図９）。これらのデータは、ｓＡＰＰαの産生を担うα−セクレターゼ活性が、エタゾレートにより誘導される神経保護に必要であることを示す。
【００７４】
図１０は、抗ｓＡＰＰα中和抗体を培地に添加した場合に、エタゾレートの神経保護作用が失われることから、エタゾレートにより誘導される神経保護がｓＡＰＰαの産生を必要とすることを示す。
【００７５】
本発明は、ＧＡＢＡAレセプターを経由して作用するアミロイドペプチドにより誘導される毒性に及ぼすエタゾレートの神経保護作用を記録する。この神経保護作用は、α−セクレターゼ経路の活性化およびｓＡＰＰαの産生に関連する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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