(57)【要約】  プルーフリーディング(3'-5')エキソヌクレアーゼ活性、ニックトランスレーション(3'-5')ヌクレアーゼ活性、合成プライマー開始性ポリメラーゼ活性、ニック開始性ポリメラーゼ活性、逆転写酵素活性、鎖置換活性、及び／又はヌクレオチド類似体の取込みに対する低い識別性、から選択される活性の組み合わせを示す、耐熱性ウィルスポリメラーゼ。該ポリメラーゼを含む組成物、該ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリメラーゼの使用方法も提供される。
2009511019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号 18、配列番号20又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ活性を示す、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項３】
配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号16又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項２記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ポリメラーゼが、実質的にエキソヌクレアーゼ活性を欠く、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項５】
配列番号4、配列番号8、配列番号14、配列番号25、配列番号26、配列番号27又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項４記載のポリメラーゼ。
【請求項６】
標準的なデオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも10%である、ヌクレオチド類似体の相対取り込み効率を有する、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項７】
配列番号27又はその配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項６記載のポリメラーゼ。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、実質的にエキソヌクレアーゼ活性を欠き、標準的なデオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも10%である、ヌクレオチド類似体の相対取り込み効率を有する、請求項１記載のポリメラーゼ
【請求項９】
配列番号27又はその配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項８記載のポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが、逆転写活性を示す、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項１１】
配列番号6、配列番号25、配列番号26、配列番号27又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項１０記載のポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼが、鎖置換活性を示す、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項１３】
配列番号6、配列番号25、配列番号26、配列番号27又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項１２記載のポリメラーゼ。
【請求項１４】
配列番号6又はその配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項１５】
配列番号６又はその配列変異体の第30番目の残基ないし第190番目の残基のアミノ酸の配列中に、少なくとも1つのアミノ酸置換又は欠失を含むポリメラーゼであって、ここで、該ポリペプチドが、実質的にエキソヌクレアーゼ活性を欠く、請求項１記載のポリメラーゼ。
【請求項１６】
第49番目の残基又は第51番目の残基の置換を含む、請求項１５記載のポリメラーゼ。
【請求項１７】
配列番号25に示す配列又はその配列変異体を含む、請求項１６記載のポリメラーゼ。
【請求項１８】
配列番号26に示す配列又はその配列変異体を含む、請求項１６記載のポリメラーゼ。
【請求項１９】
第418番目の残基の置換を更に含む、請求項１６記載のポリメラーゼ。
【請求項２０】
配列番号27に示す配列又はその配列変異体を含む、請求項１９記載のポリメラーゼ。
【請求項２１】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号 10、配列番号12、配列番号 14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号25、配列番号26、配列番号27及びこれらの配列変異体から成る群からの、1又は2種類以上のポリメラーゼを含む組成物。
【請求項２２】
配列番号6と、配列番号25、配列番号26、配列番号27及びこれらの配列変異体から成る群からの、1又は2種類以上のポリメラーゼとを含む、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１記載のポリメラーゼをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１４記載のポリメラーゼをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号5に示す配列又はその配列変異体を含む、請求項２４記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２６】
プロモーターに機能的に連結された請求項２３記載のポリヌクレオチドを含む構築物。
【請求項２７】
請求項２６記載の構築物を含む、組換え宿主細胞。
【請求項２８】
ポリヌクレオチド鋳型のコピー又は相補体の合成を十分に促進する条件下で、該鋳型を請求項１記載のポリメラーゼと接触させることを含む、ポリヌクレオチド鋳型のコピー又は相補体の合成方法。
【請求項２９】
前記鋳型が、RNAである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記鋳型が、DNAである、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記条件が、実質的に等温性の条件を維持することを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記条件が、サーマルサイクルを行うことを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
前記条件が、少なくとも1組のプライマー対の存在を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
前記条件が、マンガンを排除する、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチド鋳型が、増幅抵抗性配列を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅抵抗性配列が、正方向反復（direct repeat）、逆方向反復（inverted repeat）、少なくとも65%のG + C残基若しくはA + T残基、又は約2キロベースを超える配列を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記条件が、ニック誘発剤（nick-inducing agent）の存在を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３８】
前記条件が、プライマーを排除する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
ヌクレオチド類似体の存在下で、ポリヌクレオチドの鋳型を請求項２０記載のポリペプチドと接触させることを含む、ポリヌクレオチド中にヌクレオチド類似体を取り込む方法。
【請求項４０】
前記ヌクレオチド類似体が、連鎖停止類似体である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレオチド類似体が、アシクロヌクレオチド（acyclonucleotide）又はジデオキシヌクレオチドである、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドのシーケンス方法において、連鎖停止ヌクレオチド類似体の存在下で、該ヌクレオチドを請求項２０記載のポリペプチドと接触させる工程。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、合衆国法典第35巻第119条の規定に基づき、2005年10月6月に提出した米国仮出願第60/724,207号、及び2006年6月23日に提出した米国仮出願第60/805,695号に基づく優先権の利益を主張する。各出願は、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の助成による研究に関する宣言
本発明は、米国国立科学財団（National Science Foundation）から付与され（認可番号第0109756号及び同第0215988号）、そして米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）から付与された（認可番号第R43 HG002714-01号）、合衆国政府の助成により、完成された。合衆国は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
共同研究契約に対する当事者の名称
適用無し。
【０００４】
配列表の参照
本出願には、本明細書の添付物として、そして(1)コンピューターにより解読可能なディスクとして提出された配列表が含まれる。配列表の内容は、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。
（背景技術）
【０００５】
導入部
A、B、C、D、X、Y及びRTを含む、7種類の既知のDNAポリメラーゼのファミリーが存在する。最も広く使用されるDNAポリメラーゼは、A及びBファミリーのポリメラーゼであり、特に、90℃を超えても安定であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法又はサーマルサイクルDNAシーケンシング法等のDNA検出法及び解析法で一般的に使用される、低くとも70℃の温度で活性を示すポリメラーゼが使用される。これらのDNAポリメラーゼは、「耐熱性（thermostable）」DNAポリメラーゼと呼ばれる。
【０００６】
耐熱性DNAポリメラーゼは、既知及び未知の標的配列の両方からポリヌクレオチド配列を作り出す組換えDNA技術において一般的に用いられる。任意の酵素の生化学的属性は、特定の反応条件及び所望の機能に応じて、その有用性を増大させるか又は制限する場合があることが認識されている。一般的に、耐熱性ポリメラーゼの有用性に影響を与えるものとして考えられる特性には、鎖置換活性(strand displacement activity)、進行性(processivity)、3'-5'及び5'-3'の両方向のエキソヌクレアーゼ活性、鋳型DNA及びヌクレオチド（標準及び修飾の両方）に対する親和性、エラー率及び耐熱性度が含まれる。新規なポリメラーゼを発見するための包括的な研究及びポリメラーゼ活性を最適化するためにバッファーの配合を調節する試みにも関わらず、特定の用途のための上記属性の適切な組み合わせを有する耐熱性DNAポリメラーゼに対する需要が依然として存在する。
【０００７】
Taq、VENTR及びBstを含む、数多くの細菌性及び古細菌性耐熱性DNAポリメラーゼが知られ、そして使用されている。これら酵素のそれぞれは、特定の用途での使用においては効果的ではあるが、限界を有するものである。例えば、BstとTaqは、プルーフリーディング活性を欠いており、それ故に、比較的高いエラー率を示す。新規な耐熱性DNAポリメラーゼを単離する包括的な尽力により、多数の代替的な酵素が提供されたが、僅かな生化学的特性の改善が生じたにすぎない。
【０００８】
ウィルス性DNAポリメラーゼ（ファージのポリメラーゼを含む）は、その細菌性の同等物と同様に、鋳型依存的なDNA合成を触媒する。しかしながら、ウィルス性ポリメラーゼは、現在大部分のDNA解析とRNA解析に使用される細菌性ポリメラーゼと、その生化学的特性において著しく異なっている。例えば、T5、T7及びphi29DNAポリメラーゼ等は、既知の最高の進行性を有する酵素（processive enzyme）の中でも抜きん出ている。RB49DNAポリメラーゼは、高活性のプルーフリーディング機能に加え、最初の取込みにおいて、知られる限り最も高いフィデリティーを示す。T7及びphi29DNAポリメラーゼは、高い進行性により、最も低い複製のずれ（replication slippage）の実測値を示す。T7DNAポリメラーゼは、効率的にジデオキシヌクレオチドを取り込むことが可能であり、これによって、連鎖停止DNA配列解析を容易に可能にする。また、ウィルス性逆転写酵素は、RNAの鋳型を用いてDNA産物を合成する能力において、試薬の中でも珍しいものである。
【０００９】
その利点にも関わらず、利用可能なウィルス性酵素の欠点は明らかである。とりわけ、広く利用可能なウィルス性ポリメラーゼには、耐熱性のものが存在していない。米国特許公開公報第2003/0087392号には、RM378バクテリオファージから単離された、中程度の耐熱性ポリメラーゼが記載されている。このポリメラーゼは、「T4バクテリオファージ（のポリメラーゼ）よりも、より一層熱安定性を示すことが予想される」と記載され、3'-5'及び5'-3'の両方向のエキソヌクレアーゼ活性を欠くと述べられているが、RM378ポリメラーゼは、サーマルサイクルによる増幅又はシーケンシングに十分な程の耐熱性を有していない。DNA検出法及び解析法での使用には、より大きなウィルス性試薬DNAポリメラーゼの候補のプールが必要とされる。
（発明の開示）
【００１０】
まとめ
本発明は、一般的に、試薬酵素としての使用に適したポリメラーゼに関する。本明細書に記載するポリメラーゼは、好熱性ウィルスから単離されたものであるから、これらのポリメラーゼは、大腸菌のT4バクテリオファージのような、他のウィルス（例えば、中温性の）のポリメラーゼよりも、著しい熱安定性を示す。本明細書に記載されるポリメラーゼの向上した安定性により、他の酵素には禁じられるような熱条件下でのこれらポリメラーゼの使用が可能になり、利用可能な条件の範囲が拡大され、これによって増幅特異性が改善され、サーマルサイクルで使用可能な耐熱性ウィルス性酵素が提供される。
【００１１】
従って、本発明の1の局面では、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又はその配列変異体を含むアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリメラーゼが提供される。
【００１２】
本発明の1の局面では、ニック開始性ポリメラーゼ活性（nick-initiated polymerase activity）、プライマー開始性ポリメラーゼ活性（primer-initiated polymerase activity）、3'-5'エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性、逆転写酵素活性及び/又は鎖置換活性を示す、実質的に精製されたポリメラーゼも提供される。本発明のいくつかの態様においては、前記精製されたポリメラーゼは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。本発明の他のポリメラーゼは、ヌクレオチド類似体の取り込みを識別しない。
【００１３】
本発明の他の局面では、前記ポリメラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物、該ポリヌクレオチド構築物を含む組換え宿主細胞、及び耐熱性ポリメラーゼの製造方法が提供される。
【００１４】
他の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド鋳型のDNAコピー又はその相補体の合成方法を提供する。該方法は、前記コピー又は相補体の合成を十分に促進する条件下で、前記鋳型を本発明のポリペプチドと接触させることを含む。ある態様では、前記鋳型はRNAであり、そして別の態様では、前記鋳型はDNAである。
【００１５】
本発明のその他の局面は、複数の態様の詳細な説明を考慮することにより、そして請求項からも、明らかとなるであろう。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
複数の態様についての詳細な説明
本発明のいかなる態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の記載に説明されるか、又は以下の図面及び実施例に例示される、構築物の詳細並びに成分の配合への本発明の適用に限定されるものではないことが理解されるべきである。本発明は、他の態様でも可能であり、そして種々の方法で実施又は実行することが可能である。また、本明細書で用いる表現及び専門用語は、説明を目的とするものであり、本発明を限定するものとして考慮されるべきではないことが、理解されるべきである。「含む（including）」、「含む（comprising）」又は「有する（having）」という用語、及びこれらの変化形は、その後ろに列挙される項目及びその同等物並びに追加的項目を包含することを意味する。
【００１７】
本明細書及び添付する請求項で使用する場合、単数形の「1つ（a）」、「1つ（an）」、及び「前記（the）」には、他に文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象物も包含される。従って、例えば、「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」を含む組成物に対する言及には、2又は3種類以上のポリヌクレオチドの混合物が含まれる。また、「又は（or）」という用語は、他に文脈が明確に指示しない限り、一般的に「及び/又は（and/or）」を含む意味で用いられることにも注意すべきである。本明細書で参照する全ての刊行物、特許及び特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者の技術水準を示すものである。全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が、参照によって具体的かつ個別に表示されるのと同程度の範囲で、参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。本開示と、組み込まれた特許、刊行物及び参考文献の間に矛盾が生じた場合、本開示により統御される。
【００１８】
本明細書中に列挙されるあらゆる数値には、より低い値からより高い値までの全ての値が含まれ、即ち、列挙された最低値ないし最高値の間の数値の全ての可能な組み合わせが、本出願に明示的に記載されているものとして考慮されるべきことが、特に理解されるべきである。例えば、仮に、濃度範囲が1%ないし50%として記載されている場合、2%ないし40%、10%ないし30%、又は1%ないし3%等の値も、本明細書中に明示的に列挙されているものとして意図されている。これらは、具体的に意図されることの単なる例示にすぎない。
【００１９】
本発明は、ポリメラーゼ、該ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド及び構築物、並びに該ポリメラーゼの使用方法に関する。本発明のポリメラーゼは、PCRを含む配列特異的な方法、並びに全ゲノムの核酸の増幅にも適している。本明細書に記載されるポリメラーゼは、典型的にポリメラーゼがDNAの解析、検出又は増幅に用いられる、あらゆる研究又は商業関係において有用なことが認識されるであろう。
【００２０】
本明細書において、「ポリメラーゼ」は、以下に限定されるものではないが、ニック開始性ポリメラーゼ活性（nick-initiated polymerase activity）、プライマー開始性ポリメラーゼ活性（primer-initiated polymerase activity）、3'-5'エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性、逆転写酵素活性及び/若しくは鎖置換活性を含む更なる活性を示すことが可能又は不可能な、ポリメラーゼ活性を有する酵素を指す。本発明のポリメラーゼは、適切には、ポリメラーゼ活性、プルーフリーディング(3'-5')エキソヌクレアーゼ活性、ニックトランスレーション(5'-3')ヌクレアーゼ活性、プライマー開始性ポリメラーゼ活性（primer-initiated polymerase activity）、逆転写酵素活性、鎖置換活性、及び/又は連鎖停止類似体を取り込む高い傾向、から選択される1又は2種類以上の活性を示す。当業者であれば、適切なポリメラーゼは、目的の用途に応じて、上記の活性及び他の活性、又はこれらの組み合わせのあらゆるものに基づいて、本明細書に記載されるポリメラーゼから選択可能なことを理解するであろう。
【００２１】
本明細書に記載されるポリメラーゼは、ウィルス由来のものである。本記載のためには、「ウィルス」とは、子孫の生産に関して宿主細胞に依存した核タンパク質性の存在物である。前記用語は、真核細胞、細菌又は古細菌の宿主に感染するウィルスを包含し、その宿主に応じて、「バクテリオファージ」、「古細菌ファージ（archaeaphage）」又は「ファージ」と相互に交換して使用することができる。
【００２２】
本発明の精製されたポリメラーゼを既知のポリメラーゼと比較したところ、1又は2箇所以上の保存された酵素ドメインが発見された。酵素ドメイン及び他のドメイン（例えば、シグナルペプチド、リンカードメイン等）は、ClustalW (欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）)等の公的機関から入手可能な比較用プログラムを用いたウィルス性ポリメラーゼの配列と他のポリメラーゼの配列の解析及び比較から直ちに同定することが可能である。
【００２３】
本発明のポリメラーゼは、実質的に精製されたポリペプチドである。本発明で用いる、「精製された（purified）」という用語は、その物質の天然状態において通常該物質に付随する成分から、少なくとも部分的に分離された物質を指す。ポリペプチドの純度は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような分析技術により測定される。試料中に存在する主な種であるポリペプチドは、「実質的に精製されている（substantially purified）」。「精製された（purified）」という用語は、そのポリペプチドを含む試料が、電気泳動ゲル中に本質的に1本のバンドを生じさせることができることを表す。適切には、本発明のポリメラーゼは、少なくとも約85%の純度を有し、より適切には、少なくとも約95%の純度を有し、最も適切には少なくとも約99%の純度を有する。
【００２４】
本発明のポリメラーゼは、耐熱性を示す。「耐熱性」という用語は、本明細書中で用いた場合に、比較的高温、即ち50-100℃でインキュベートした後に、少なくと1の活性の一部分を保持するポリメラーゼを指す。場合によっては、耐熱性酵素は、比較的高温、即ち約50-100℃で最大の活性を示す。ある態様では、耐熱性ポリメラーゼは、約60℃ないし70℃で最大の活性を示す。最も適切には、耐熱性酵素は、各暴露が数分以下の、約90℃ないし約98℃の温度への暴露の反復の後に、少なくとも1種類の活性の少なくとも一部分を保持することができる。
【００２５】
本発明のポリメラーゼは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20を含むアミノ酸配列を有するか、又はこれらの配列変異体、即ち、先に列挙した配列のいずれかの変異体であってもよい。「配列変異体」という用語は、少なくとも1種類の活性を保持し、そして、提供されたアミノ酸配列と、少なくとも約80%の同一性、より適切には、少なくとも約85%の同一性、より適切には、少なくとも約90%の同一性、より適切には、少なくとも約95%の同一性、そして最も適切には、少なくとも約98%又は99%の同一性を有するポリメラーゼを指す。同一性の百分率は、Karlin及びAltschulのアルゴリズムを用いて決定することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264-68 (1990), 修正Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873-77 (1993))。このようなアルゴリズムは、当該技術分野において知られるように、BLASTxプログラムに組み込まれており、これを用いることで、基準のポリペプチドに対して相同的なアミノ酸配列を得ることができる。
【００２６】
「配列変異体」という用語は、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する耐熱性ポリメラーゼを指示するように用いることもできる。このような置換は、当該技術分野においてよく知られている。また、「配列変異体」という用語は、例えば、下記のように、1又は2個以上の置換、付加又は欠失を導入して、所望の機能性を提供できる部位特異的変異導入に付されたポリメラーゼも指し示す。
【００２７】
特に適切な1の態様では、本発明のポリメラーゼは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む。このポリメラーゼは、本明細書において「ポリメラーゼ3173」とも称される。他の態様において、本発明のポリメラーゼには、配列番号25-27に示される配列を有する変異型を含む、ポリメラーゼ3173の変異型が含まれる。ポリメラーゼ3173の変異型は、適切には、更に下記で説明するように、鎖置換活性、十分に低いエキソヌクレアーゼ活性、低いヌクレオチド類似体の識別力、又はこれらの組み合わせを示す。適切には、ポリメラーゼ3173は、例えば、VENTR (ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）社)等の市販のポリメラーゼと比較して、高いフィデリティーを示す。
【００２８】
ポリメラーゼ活性は、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって測定することができる。活性の測定は、例えば、鋳型上でプライマーを伸長する活性等に基づくものであってもよい。例えば、標識された合成プライマーを、該標識プライマーの3'末端を超えて複数ヌクレオチド分伸びた鋳型にアニールさせることができる。DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレチド3リン酸、マグネシウム等の2価カチオン、及びpHを中性又は弱アルカリ性に維持するバッファー、並びに必要な塩の存在下でインキュベーションした後に、前記標識プライマーを、例えば、キャピラリー電気泳動等によって分離して検出することができる。次いで、DNAポリメラーゼ活性を、プライマーの伸長に対応する前記標識プライマーの移動度シフトとして検出することができる。
【００２９】
ある態様では、本発明のポリメラーゼは、実質的に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。実質的に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く、適切なポリメラーゼが、配列番号4、8及び14に示されている。ある態様において、前記ポリメラーゼは、部位特異的変異導入に付すことができ、即ち、置換、付加又は欠失を導入して、天然ポリペプチドの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を低下させるか又は消去することが可能である。適切な変異には、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメイン中の荷電アミノ酸を中性アミノ酸に置換する変異が含まれる。例えば、配列番号6に示すポリメラーゼでは、天然ポリペプチドの第30番目のアミノ酸残基ないし第190番目の残基を包含する領域に、適切に変異が導入されている。適切には、この領域中にある1又は2個以上の酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）が、脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシン）により置換される。適切には、配列番号6の第49番目の位置にあるアスパラギン酸及び/又は第51番目の位置にあるグルタミン酸が置換される。適切には、これら残基の一方又は両方が、アラニンにより置換される。変異導入に付されて十分に低下した3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリメラーゼが、配列番号25、26及び27に示されている。
【００３０】
ポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を示すか否か、又はある態様では、十分に低いエキソヌクレアーゼ活性を示すか否かの決定は、標準的方法によって直ちに決定することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、該ヌクレオチドの検出可能な比率が放射性物質で標識されるように合成することができる。これらのポリヌクレオチドは、試験されるポリペプチドの存在下において、適切なバッファー中でインキュベートされる。インキュベーション後、ポリヌクレオチドを沈殿させると、上清中の遊離ヌクレオチドにより、放射能のカウントとしてエキソヌクレアーゼ活性を検出することができる。
【００３１】
例えば、ポリメラーゼ3173及びその配列変異体等の、本発明のいくつかのポリメラーゼは、ニック開始性ポリメラーゼ活性（nick-initiated polymerase activity）を示す。本明細書で用いる場合、「ニック開始性ポリメラーゼ活性（nick-initiated polymerase activity）」は、外来性のプライマーの不存在下で、鋳型の1本鎖切断により開始されるポリメラーゼ活性を指す。これらの態様においては、合成は、外来性の合成プライマーの末端ではなく、DNAの一本鎖切断箇所で開始する。ニック開始性合成では、プライマーの除去が不要であり、コスト、作業時間及び産物の喪失又は分解の可能性が低減されることが認められるであろう。加えて、ニック開始性合成では、プライマーの自己伸長によって生じる偽性の増幅信号が減少される。ニック開始性ポリメラーゼ活性は、ポリヌクレオチドの「配列非依存的な（sequence-independent）」合成に特に適している。ここで用いられる「配列非依存的増幅（sequence-independent amplification）」は、「全ゲノム増幅（whole genome amplification）」と相互に交換して用いられ、試料中の全ポリヌクレオチドの全般的な増幅を指すものである。当業者であれば、「全ゲノム増幅（whole genome amplification）」という用語が、例えば、サンプル中のプラスミド又は他のエピソーム要素の増幅のように、増幅されるDNAが実際に「ゲノム」を意味するか否かに関わらず、あらゆる一般的な増幅方法を指すことを理解するであろう。適切には、ニック開始性ポリメラーゼ活性は、例えば、アガロースゲル上で、反応に切断酵素（nicking enzyme）が存在しない場合に合成された最小量の産物又は無産物と比較した、切断酵素（nicking enzyme）存在下での合成によるDNA産物量の増加量として検出することができる。
【００３２】
ある態様では、本発明のポリメラーゼは、プライマー開始性ポリメラーゼ活性（primer-initiated polymerase activity）を示し、ポリヌクレオチドの配列依存的合成に適している。「配列依存的合成（Sequence-dependent synthesis）」又は「配列依存的増幅（sequence-dependent amplification）」は、サンプル中に存在する非標的配列に対する標的配列の増幅を指す。ポリヌクレオチドの配列依存的合成に最も多用される技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。増幅される配列は、反応中に2種類の合成ヌクレオチド、又は「プライマー」が含まれることにより定義され、該合成ヌクレオチド、又はプライマーにより、合成が該プライマーと同種の配列間に介在するポリヌクレオチド配列に導かれる。サーマルサイクルを利用することで、前記配列の指数関数的増幅が可能になる。本明細書で用いる場合、配列依存的増幅は、「プライマー開始性（primer-initiated）」とも称される。当業者には、特定の鋳型配列を増幅するようにプライマーを設計することが可能であること、又は、例えば、全ゲノムを増幅させるにはランダムプライマーを用いることが適切であることが認識されている。プライマー開始性ポリメラーゼ活性を示す例示的ポリメラーゼは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する。
【００３３】
ある態様では、本発明のポリペプチドは、適切には、下記に例示されるように、逆転写活性を示す。「逆転写活性」とは、ポリメラーゼの、RNA鋳型から相補的DNA（cDNA）産物を作り出す能力を指す。典型的には、cDNAは、逆転写PCR又はRT-PCRと呼ばれるRCPの改変型において、RNAから作り出される。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス又はトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素のようなレトロウィルス由来の逆転写酵素とは対照的に、本発明のポリメラーゼは、逆転写及び増幅の両方において有用であり、反応スキームを簡略化して、定量的RT-PCRを容易化することができる。例えば、高度好熱性細菌（Thermus thermophilus）のDNAポリメラーゼ等の細菌性DNAポリメラーゼとは対照的に、ある態様で本発明を用いた場合には、RT-PCR反応バッファーにマンガンが含まれることを要しない。認識されるように、マンガンにより、フィデリティーの著しい低下が生じる可能性がある。逆転写酵素活性を示す例示的ポリメラーゼは、配列番号6、配列番号25、配列番号26、配列番号27又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、適切には、鎖置換活性（strand displacement activity）を示す。本明細書で用いる場合、「鎖置換活性（strand displacement activity）」は、ポリメラーゼが、合成中に遭遇する下流のDNAを置換する能力を指す。例えば、鎖置換増幅法（strand displacement amplification）（SDA）等のプロトコルでは、この活性を利用することができる。鎖置換活性は、プライマー開始性合成（primer-initiated synthesis）により測定することができる。本発明のポリメラーゼは、プラスミドとランダムプライマーの存在下でインキュベートされる。本発明のポリメラーゼは、前記プライマーの5'末端に遭遇するように、プラスミドの完全な円周にプライマーを伸長させることができる。ポリメラーゼが鎖置換活性を有する場合、新生DNA鎖が押しのけられ、該ポリメラーゼはDNA合成を継続する。鎖置換活性の存在により、元となる鋳型よりも大きな分子量を有する産物が生じる。より大きな分子量の産物は、アガロースゲル電気泳動で簡単に検出することができる。鎖置換活性を示す適切なポリメラーゼは、配列番号6、配列番号25、配列番号26、配列番号27又はこれらの配列変異体を含むアミノ酸配列を有する。
【００３５】
ある態様において、本発明は、ヌクレオチド類似体を取り込む能力を有する精製されたポリメラーゼ、即ち、ヌクレオチド類似体の取込みに対して識別性を有しないか、又は低い識別性を示すポリメラーゼを提供する。ヌクレオチド類似体には、acyNTP、ddNTP、フルオレセイン誘導体又はローダミン誘導体等の蛍光標識ヌクレオチドを含む検出を容易化する部分を有する類似体、を含む連鎖停止類似体、及び/又は、ダイターミネーター（dye terminator）等の検出可能な部分を有する連鎖停止剤の組み合わせが含まれる。ヌクレオチド類似体は、O-メチル結合又は2'アジド結合等の別の骨格化学、別の環化学、及び/又はデオキシリボヌクレオチドではなくリボヌクレオチドを有していてもよい。
【００３６】
ポリメラーゼによるヌクレオチド類似体の識別は、取り込み反応のキネティクス、即ち、リン酸基転移の速度及び/又はヌクレオチド類似体に対する結合親和力を決定することにより、測定することが可能になる。適切には、本発明のポリメラーゼは、デオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも10%である、ヌクレオチド類似体の相対取り込み効率を有していてもよく、即ち、本発明のポリメラーゼ並びに等モル量のヌクレオチド類似体及びこれに対応する標準デオキシリボヌクレオチドを含む反応において、該ポリメラーゼは、90%の確率で前記デオキシリボヌクレオチドをより取り込む傾向を示す。この態様は、シーケンシング用途並びに1塩基多型の検出での使用に特に適していることが認められる。他の態様において、ヌクレオチド類似体の取り込みは、例えば、マイクロアレイ等におけるハイブリダイゼーションによる特定配列の検出、ヌクレアーゼ感受性、ハイブリダイゼーション強度、合成ポリヌクレオチドの選択性又は化学官能性を変化させることによる特定配列の検出において役立つであろう。適切には、本発明のポリメラーゼは、デオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも約10%、より適切には、デオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも約20%、より適切には、デオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも約50%、より適切には、デオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも約75%、更により適切には、デオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも約90%、そして最も適切には、デオキシヌクレオチドの取込み効率の少なくとも約98-99%の、ヌクレオチド類似体の相対取り込み効率を有する。
【００３７】
ヌクレオチド類似体を取り込むことが可能な適切なポリメラーゼには、本明細書に記載されるポリメラーゼが、dNTP結合ドメイン内に変異を有することで連鎖停止類似体に対する識別能が低下した、該ポリメラーゼの配列変異体が含まれる。当該技術分野において知られるように、殆どのポリメラーゼのdNTP結合ドメインは、K N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 Y G/Qという配列を有することで特徴付けられるが、ここで、N1-N7は、独立して、あらゆるアミノ酸であり、そしてN7は、ポリメラーゼによっては、存在していても又は存在していなくてもよい。最も適切には、置換は、dNTP結合ドメインのN4に導入される。最も適切には、N4の位置にあるアミノ酸は、チロシン、又はルーチンな実験によって選択可能な、機能的に同等のアミノ酸へと置換される。一例としては、置換は、ポリメラーゼ3173の第418番目のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置に導入することができる。適切には、ポリメラーゼ3173の第418番目の位置に天然状態で存在するフェニルアラニンが、チロシンによって置換される（「F418Y」）。最も適切には、前記ポリメラーゼは、実施例に示すように、連鎖停止ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体）とその天然同等物との間で十分に低い識別能を示す。場合によっては、本発明のポリメラーゼは、その天然同等物よりも、50倍低く、又は100倍低く、又は500倍低く、又は1000倍低く識別する。
【００３８】
他の態様では、前記ポリメラーゼは、二重変異体である。適切には、配列番号6に示す天然ポリペプチドは、該天然ポリペプチド配列の第30番目のアミノ酸残基ないし第190番目の残基を包含する領域内に1の変異を有し、第2の変異を第418番目のアミノ酸位置に有する。適切には、前記二重変異体は、上記のような低いエキソヌクレアーゼ活性と、ヌクレオチド類似体の取込みに対する低い識別性の両方を示す。ポリメラーゼ3173の二重変異体の一例は、D49A及びF418Yの両方の変異を有しており、その配列は、配列番号27に示されている。
【００３９】
本発明は、更に、本発明のポリメラーゼを含む組成物を提供する。ある態様では、本発明の組成物には、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号25、配列番号26、配列番号27及びこれらの配列変異体から選択される、1又は2種類以上のポリメラーゼが含まれる。特定の態様では、前記組成物は、配列番号6と、配列番号25、配列番号26、配列番号27及びこれらの配列変異体から選択される、1又は2種類以上のポリメラーゼとを含む。他の態様では、本発明のポリメラーゼは、別の市販のポリメラーゼと共に組成物に含まれていてもよい。
【００４０】
本発明のある態様では、前記ポリメラーゼをコードする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。「単離されたポリヌクレオチド」という用語には、例えば、以下のものが包含される：(a)天然ゲノムDNA分子の一部分のコーディング配列であって、天然の状態ではその生物のゲノム中で該DNA部分に隣接するはずのコーディング配列が隣接していないコーディング配列を含むポリペプチド；(b)生じる分子が、いかなる天然のベクター又はゲノムDNAとも同一にならないように、ベクター又は原核細胞若しくは真核細胞のゲノムDNAに組み込まれたポリヌクレオチド；及び(c)cDNA分子、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応により生産された断片、又は制限酵素処理断片。「ベクター」は、標準的なクローニング技術により複製可能な、あらゆるポリヌクレオチド性の存在物である。
【００４１】
本発明のポリメラーゼをコードする適切なポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17又は配列番号19に示すヌクレオチド配列を有する。
【００４２】
また、本発明は、本発明のポリペプチドの調製に有用なDNA構築物を提供する。該DNA構築物には、本明細書に記載するポリペプチドをコードして、プロモーターと機能的に連結した、少なくとも1つのポリヌクレオチドが含まれる。該プロモーターは、前記コーディング配列に天然状態で付随するものであってもよく、又は異種のものであってもよい。適切なプロモーターは、恒常的な誘導性プロモーターである。「恒常的（constitutive）」なプロモーターとは、殆どの環境条件及び発生条件下において活性なプロモーターである。「誘導性（inducible）」のプロモーターとは、環境的又は発生的制御下にあるプロモーターである。「機能的に連結した（operably connected）」という用語は、プロモーターと第2の核酸配列間の機能的結合を指しており、ここでは、該プロモーターにより、該第2の配列に対応する核酸の転写が支配されている。本発明のポリメラーゼを生産するために、前記構築物を、大腸菌（E. coli）又は当該技術分野で公知の他の適切な宿主といった宿主細胞に適切に導入することが可能である。発現系は、当該技術分野においてよく知られている。
【００４３】
本発明は、更に、ポリヌクレオチド鋳型のコピー又は相補体を合成する方法を提供する。該方法には、コピー又は相補体の合成を十分に促進させる条件下で、鋳型を本発明のポリペプチドと接触させる工程が含まれる。ある態様では、鋳型はRNAである。他の態様では、鋳型はDNAである。
【００４４】
ポリヌクレオチド鋳型のコピー又は相補体は、例えば、PCR、RT-PCR等のサーマルサイクル反応で本発明のポリメラーゼを用いるか、又はこれに代わるものとして、実質的に等温性の条件を用いることにより、合成することが可能である。本明細書で用いる場合、「実質的に等温性（substantially isothermal）」とは、サーマルサイクルを含まない条件を指す。本発明のポリペプチドは、その耐熱性により、鎖置換増幅法（strand-displacement amplification）(SDA法)、ループ介在性等温増幅法（loop-mediated isothermal amplification）(LAMP法)、ローリングサークル増幅法（rolling circle amplification）（RCA法）及び/又は多重置換増幅法（multiple displacement amplification）(MDA法)等において、特に有用であることが証明されるであろう。これらの技術を用いることで、ヒト細胞を含有する臨床分離株由来の核酸を、ジェノタイピング用に増幅することができる。また、ウィルス又は細菌細胞を含有する臨床分離株由来の核酸は、病原体検出用に増幅することができる。大量に単離することが困難であろう微生物細胞由来の核酸は、ジーンマイニング（gene mining）又は酵素若しくは治療用タンパク質の発見のために増幅することができる。
【００４５】
本発明のいくつかの方法においては、例えば特定の標的配列を増幅するために、少なくとも1組のプライマー対の存在下で増幅を行う。他の態様においては、ランダムプライマーを添加して、配列非依存的増幅を促進する。更なる態様では、プライマーを除外して、随意にニック誘発剤（nick-inducing agent）を添加してポリメラーゼ活性を促進する。本明細書においては、「ニック誘発剤（nick-inducing agent）」とは、2本鎖の核酸の1つの鎖の中の隣接する2つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合に切れ目を導入する、あらゆる酵素試薬若しくは化学試薬、又は物理的処理として定義される。ニックは、適切には認識配列に切れ目を付ける酵素を用いて、特定部位に導入してもよく、又は標的ポリペプチド中にランダムに導入してもよい。ニック誘発酵素（nick-inducing enzyme）の例には、Nb.Bpu1OI (ファーメンタスライフサイエンス（Fermentas Life Sciences）), Nt.BstNB I, Nt.Alw I, Nb.BbvC I, NtBbvC I, Nb.Bsm I, Nb.BsrD (ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）)及び大腸菌（E. coli）エンドヌクレアーゼIが含まれる。
【００４６】
本発明のポリメラーゼは、その独特の生化学的特性により、従来では増幅が困難であった配列の増幅に特に適しているであろう。本明細書では、これらの配列は「増幅抵抗性配列（amplification-resistant sequence）」と称される。例えば、いくつかの困難な配列は、その配列中に、DNAの2次構造の形成を促進する逆向きの反復を有する。他の配列は、新生鎖を誤って再アニールさせ、そしてヌクレオチドの誤った挿入又は欠失を生じさせる正方向反復（direct repeat）を有する。他の場合では、増幅抵抗性配列は、高含有量のグアニン及びシトシン(G + C)を有するか、又は反対に、高含有量のアデニン及びチミジン(A + T)残基を有する。配列の少なくとも約65%が、G + C残基又はA + T残基を含む場合に、その配列は高含有量のG + C又はA + Tを有する。また、ある態様では、所望の産物が、少なくとも約2kbである場合に、配列が増幅抵抗性であると認められる。下記に例示されるように、場合によっては、本発明のポリメラーゼは、PCRの通常の範囲よりも長い配列、即ち、10kb程度の配列を増幅することができる。
【００４７】
本発明のポリメラーゼは、その耐熱性、最適温度、ヌクレオチドの取込みのフィデリティー、補因子の必要性、鋳型の必要性、反応速度、鋳型に対する親和性、天然ヌクレオチドに対する親和性、合成ヌクレオチド類似体に対する親和性、並びに/又は種々のpH、塩濃度及び他のバッファー成分中での活性により特徴付けることができる。当業者であれば、適切なポリメラーゼ又はポリメラーゼの組み合わせは、目的の用途に応じて、上記のあらゆる特徴又はその組み合わせに基づいて選択可能であることを理解するであろう。
【００４８】
本発明の更なる理解を助けるために、以下の実施例を提供する。使用する特定の材料及び条件は、本発明の更なる例示を意図するものであり、添付する請求項の正当な範囲を制限するものではない。
（実施例）
【００４９】
実施例１．温泉からの非培養ウィルス粒子の単離
ウィルス粒子は、一般的にオクトパススプリング（Octopus Spring）として知られる、イエローストーン国立公園（Yellowstone National Park）のローワーゲイザーベイジン（Lower Geyser Basin）のホワイトクリークグループ（White Creek Group）内の温泉(北緯44.53416°、西経110.79812°; 温度8O℃、pH 8)から単離した。100キロダルトン分子量カットオフ（mwco）タンジェンシャルフローフィルター（100 kiloDalton molecular weight cut-off (mwco) tangential flow filter）(A/G テクノロジー（A/G Technology）、アマシャムバイオサイエンス（Amersham Biosciences）)を用いて、毎分7リットルの速度で90分間以上かけてろ過し（全体で630リットル）、そしてウィルスと微生物を2リットルまで濃縮した。得られた濃縮物を、0.2 μmタンジェンシャルフローフィルター（0.2 μm tangential flow filter）に通してろ過することで微生物細胞を除去した。100 kDタンジェンシャルフローフィルターを用いて、ウィルスのフラクションを更に100 mlにまで濃縮した。100 mlのウィルス濃縮物のうち、40 mlを更なる処理に付した。ウィルスを更に400 μlまで濃縮して、30 kD mwcoスピンフィルター(セントリコン（Centricon）、ミリポア（Millipore）)中でろ過することにより、SMバッファー（0.1 M NaCl、8 mM MgSO4、50 mM TrisHCl 7.5）へと移した。
【００５０】
実施例２．ウィルスDNAの単離
セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens）のエンドヌクレアーゼ（シグマ(Sigma)、10 U）を、実施例１に記載するウィルス試料に添加して、キャプシドに包まれていない（非ウィルス性の）DNAを取り出した。反応を、23℃で30分間インキュベートした。続いてEDTA (20 mM)と硫酸ドデシルナトリウム (SDS)(0.5%)を添加した。ウィルスのDNAを単離するためにプロテイナーゼK (100 U)を添加して、該反応を56℃で3時間インキュベートした。塩化ナトリウム(0.7M)と臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)(1%)を添加した。DNAを、クロロホルムで1回、フェノールで1回、フェノール:クロロホルム(1:1)混合物で1回づつ抽出し、そしてクロロホルムで再度抽出した。1 mlのエタノールでDNAを沈殿させ、70%エタノールで洗浄した。DNAの収量は、20ナノグラムであった。
【００５１】
実施例３．ウィルスDNAライブラリーの構築
実施例２に記載するように単離したウィルスDNAの10ナノグラムを、ハイドロシヤーデバイス（HydroShear Device）(ジーンマシーン（Gene Machines）)を用いて、2ないし4キロベース（kb）に物理的にせん断した。これらの断片を、標準的手法により、配列番号21と22に示すヌクレオチド配列を有する2本鎖リンカーにライゲーションした。ライゲーション混合物を、アガロースゲル電気泳動により分離して、2-4 kbのサイズの範囲にある断片を単離した。これらの断片を標準的PCR法で増幅した。増幅産物をpcrSMARTベクター(ルシジェン（Lucigen）、ミドルトン（Middleton）、ウィスコンシン州)のクローニング部位に挿入し、これを用いてE. CLONI 1OG細胞(ルシジェン、ミドルトン、ウィスコンシン州)を形質転換した。
【００５２】
実施例４．配列類似性によるスクリーニング
実施例３に記載するライブラリーからの21,797種類のクローンを、標準的手法を用いてシーケンスした。これらの配列を、概念上で翻訳し、BLASTxプログラム(NCBI)を用いてGenBank(NCBI)の非冗長タンパク質配列のデータベースと比較した。これらの中で、9,092種類が、前記データベース中の既知のタンパク質のコーディング配列に対する有意な類似性を示した。2,036種類が、既知のウィルスのコーディング配列に対する類似性を示した。148種類が、既知のDNAポリメラーゼのコーディング配列に対して、少なくとも部分的な類似性を示した。34種類が、完全なポリメラーゼのコーディング配列であると考えられる。
【００５３】
実施例５．DNAポリメラーゼ遺伝子の発現
実施例３及び４に記載するライブラリーからの34種類の完全なポリメラーゼ遺伝子、並びに同様に調製した3種類の別のライブラリーからの24種類の更なるウィルス遺伝子を、E. CLONI 1OG細胞(ルシジェン、ミドルトン、ウィスコンシン州)内で恒常的に発現させた。タンパク質を抽出し、70℃で10分間加熱し、以下のように、プライマー伸長アッセイを用いてDNAポリメラーゼ活性を試験した。
【００５４】
配列番号23に示す配列を有し、その5'末端がROXで標識された37個のヌクレオチドから成るプライマーを、配列番号24に示す配列を有する41個のヌクレオチドから成る鋳型にアニールさせた。20 mM Tris-HCl、1O mM (NH4)2SO4、1O mM KCl、2 mM MgSO4、0.1 % Triton X-1OO（25℃、pH 8.8）、並びに各250 μMのデオキシシチジン三リン酸 (dCTP)、デオキシアデニン三リン酸 (dATP)、デオキシグアニジン三リン酸 (dGTP)、及びチミジン三リン酸 (TTP)へ、上記で抽出したタンパク質及び鋳型を添加した。反応物を70℃で10分間インキュベートした。該反応物をABI 310ジェネティックアナライザー（ABI 310 Genetic Analyzer）を用いて分析した。プライマーの伸長により、ヌクレオチド4個分の伸長に相当する移動度シフトが生じ、該シフトは、ABI 310ジェネティックアナライザーで検出可能であった。試験した58種類のクローンのうち、全部で10種類のクローンが、検出可能なDNAポリメラーゼ（DNAP）活性を示した。下記の表１に、これらポリメラーゼのクローンの番号及び対応するポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、配列類似性及びE（予測）値を示す。3'-5'又は5'-3'のいずれの方向のエキソヌクレアーゼ活性の存在も、反応産物をキャピラリー電気泳動中にヌクレオチド37個未満分だけ移動させた。
【表１】
2009511019.tif 000003
【００５５】
実施例６．ウィルスライブラリー中に同定されたウィルスDNAポリメラーゼの精製及びキャラクタリゼーション
実施例４に記載される配列類似性スクリーニングにより決定されたように、配列番号5に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、細菌のDNAポリメラーゼIをコードする多数の配列に対する有意な類似性を示す領域を含んでいた。完全遺伝子に対するE値は、たったの2x10-37であり、該配列が、真生のDNAポリメラーゼ遺伝子の配列であるという非常に高い可能性を示している。このコーディング配列を、tac-プロモーターに基づく発現ベクター(ルシジェン)に移し、これを用いて、製造元の推奨（ルシジェン）に従って、E. CLONI 1OG細胞中で高濃度の耐熱性DNAポリメラーゼを生産した。該タンパク質をカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００５６】
ポリメラーゼの活性を測定するため、前記精製されたタンパク質を、0.25 mg/mlの活性子ウシ胸腺DNA (シグマ)、各200 μMのデオキシシチジン三リン酸 (dCTP)、デオキシアデニン三リン酸 (dATP)、デオキシグアニジン三リン酸 (dGTP)、及びチミジン三リン酸 (TTP)、100 μCi/mlの[α P-33] デオキシシチジン三リン酸(パーキン-エルマー（Perkin-Elmer）)、20 mMのTris-HCl、1O mMの(NH4)2SO4、1O mMのKCl、2 mMのMgSO4、0.1 %のTriton X-1OO（pH 8.8、25℃）を含む混合物50 μlとインキュベートした。該反応物を、60℃で30分間インキュベートした。反応産物(5 μl)をDE81フィルター(ワットマン（Whatman）)に移して乾燥させた。該フィルターを5Mのリン酸ナトリウム (pH 7.0)、水及びエタノールの3交替で洗浄した。フィルターを乾燥させて取り込まれた標識をシンチレーションカウンター内で測定した。DNAポリメラーゼを添加しなかったブランク反応物を用いてバックグラウンド活性を測定した。ポリメラーゼの活性は、当該技術分野で広く用いられる以下の等式により算定し、標準単位で報告した：
活性 = (サンプル数値-ブランク) X (8 nmol dNTP/反応) X (1 ユニット/10 nmolの取り込まれたdNTP) 
100 cpm未満の典型的なバックグラウンドと比較して、1,000 cpmを超える数値が測定されたので、DNAポリメラーゼの存在が確認された。
【００５７】
実施例７．エキソヌクレアーゼが欠損したポリメラーゼ3173変異体の作製
DNAポリメラーゼ3173中の3'-5'エキソヌクレアーゼの存在は、5'蛍光標識オリゴヌクレオチドの分子量の低下により検出された。実施例５に記載されるプライマー/鋳型複合体の、同条件下でのインキュベーションにより、プライマー産物の一部は、見かけの分子量が減少していた。このサイズ減少は、ABI 310ジェネティックアナライザーをジーンスキャン（GeneScan）モードで操作して用いたキャプラリー電気泳動により検出された。エキソヌクレアーゼドメインの存在は、配列アラインメント、並びに該ポリメラーゼと放射性物質で標識したポリヌクレオチドとのインキュベーションと、これに続く消化及びトリクロロ酢酸による沈殿により、確認した。上清中の遊離ヌクレオチドによる放射活性を測定した。
【００５８】
ポリメラーゼ3173をNCBIの保存ドメインのデータベースcdd.v2.07 (公的機関より入手可能)中に同定される配列と比較した配列アラインメントに基づいて、活性部位と見かけ上の金属キレート化アミノ酸（アミノ酸D49及びE51）を同定した。この情報に基づいて、ポリメラーゼ3173の2種類の変異体を作製した。1の変異体D49Aは、野生型タンパク質の第49番目の位置のアスパラギン酸をアラニンへ変異させたことにより生じたものである。第2の変異体E51Aは、天然タンパク質の第51番目の位置のグルタミン酸をアラニンへ変異させたことにより生じたものである。変異体D49AとE51Aは、標準的手法を用いて作製した。
【００５９】
エキソヌクレアーゼアッセイを行って、前記変異体からエキソヌクレアーゼ活性が排除されたことを確認した。野生型の0.1%未満のエキソヌクレアーゼ活性レベルを検出可能な上記の放射性ヌクレオチド放出アッセイを用いて、D49AとE51Aの各変異体のエキソヌクレアーゼ活性について試験した。野生型のポリメラーゼ3173は、強力なヌクレアーゼ活性を示したが、両変異体は、いずれも検出可能なヌクレアーゼ活性を示さなかった。
【００６０】
実施例８：ポリメラーゼ3173変異体D49Aの進行性（processivity）
1本鎖のM13鋳型(各50 nM)へ蛍光標識したプライマーをアニールさせることで進行性（processivity）を測定した。ポリメラーゼ3173変異体D49Aを添加して(0.5 nM)、プライマーがアニールした鋳型と会合させた。過剰量の活性子ウシ胸腺DNA (シグマ) (終濃度0.6 mg/ml)から構成される「酵素トラップ（enzyme trap）」と同時にヌクレオチドを添加し、該反応物を70℃でインキュベートした。サンプルを取り出して、反応を、1分間、3分間、10分間、及び30分間で、EDTA (10 mM)によりクエンチした。解離前までのプライマーの伸長は、伸長産物を、ジーンスキャン（GeneScan）モードのABI 310ジェネティックアナライザーで分析することで測定した。より長い時点での産物の取り出しは、最大分子量に達するまでは、より大きな分子量の産物を生じていた。最大産物サイズを生じる最も早い時点を計算に用いた。電気泳動図のピークをジーンスキャン（GeneScan）ソフトウェアにより統合して、以下の等式により進行性（processivity）を測定した：
進行性（processivity）= [[(1 x I(1))]+[(2 x I(2))]+...[(n) x (I(n))]] / [1(1) + I(2)...+I(n)]]
ここで、I = 各ピークの強度、n = 添加したヌクレオチドの個数。
ポリメラーゼ3173 D49Aの進行性は、47ntと測定された。
【００６１】
実施例９：ポリメラーゼ3173のキャラクタリゼーション
実施例７に記載するように、ポリメラーゼ3173のエキソヌクレアーゼ活性を測定した。
【００６２】
ポリメラーゼ3173によるヌクレオチドに対する結合定数（Kmで報告され、反応速度が最大の50%にある濃度）を、活性子ウシ胸腺DNAを鋳型として用いて測定した。酵素とヌクレオチドを除いた全ての成分を過剰モル濃度で用いた疑似1次条件下で反応を維持した。反応物(50 μl)を7O℃でインキュベートして、サンプル(各5 μl)を種々の時点で取り出して、DE81ペーパー上にスポットした。活性は、実施例６に記載したように測定した。ヌクレオチドを過剰量で供給し、プライマーがアニールした鋳型（プライマーがアニールした1本鎖化M13 DNA）の濃度を変化させた点を除いては、プライマーがアニールした鋳型に対する結合定数を同様に測定した。結果を以下の表にまとめる。
【００６３】
【表２】
2009511019.tif 000004
【００６４】
ローリングサイクル増幅法（rolling circle amplification）（RCA）プロトコルにおいてプライマー開始性合成を用いることで、鎖置換活性を測定した。簡潔に言うと、ポリメラーゼ3173を、プラスミドとランダムプライマーの存在下でインキュベートした。ポリメラーゼ3173により、プライマーは、該プライマーの5'末端に遭遇するように、プラスミドの完全な円周に亘って伸長された。ポリメラーゼ3173は、DNAの新生鎖を置換して、DNA合成を継続した。鎖置換活性の存在により、元の鋳型を超える分子量を有する産物が生じた。図５と図６に示すように、より大きな分子量の産物は、アガロースゲル電気泳動により容易に検出された。
実施例１０に記載するようにフィデリティーを測定した。
【００６５】
実施例１０：ポリメラーゼ3173を用いた高フィデリティーPCR
対象のDNAポリメラーゼでlacIq遺伝子を増幅して、これを機能性lacZαペプチドと選択可能なマーカーをコードした遺伝子を有するプラスミドに挿入するような、標準的アッセイを変更したアッセイにより、フィデリティーを測定した。配列番号28と29に示すプライマーを用いてlacIq及びKanR遺伝子の両方を含む配列を増幅した。この遺伝子をpUC19のEco109I部位に挿入することで、カナマイシンとアンピシリンに対する2重耐性が生じた。この構築物を含むクローンをX-Gal上に播種した場合には、通常白色の表現型が観察される。lacIqの変異により、X-Gal上に播種した場合でも、青色の表現型のコロニーが生じた。野生型(プルーフリーディング) DNAポリメラーゼ3173及びそのエキソヌクレアーゼ欠損誘導体のE51AとD49A、並びに、比較のため、Taq とVENTR DNAポリメラーゼの2種類の標準DNAポリメラーゼを試験した。
【００６６】
高フィデリティーPCR増幅のため、以下の混合物を用いて、5ユニットの野生型(プルーフリーディング) DNAポリメラーゼ3173（配列番号6）を試験した：50 mMのTris HCl (pH 9.0、25℃)、50 mMのKCl、10 mMの(NH4)2SO4、1.5 mMのMgSO4、1.5 mMのMgCl2、0.1%のtriton-X1OO、250 mMのエクトイン、並びに各0.2 mMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTP。配列番号28と29に示す対を成すプライマー(各1 μM)は、配列番号30の鋳型(10 ng)から、推定2k kbの産物を増幅した。サーマルサイクル(94℃で1分間、(94℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で2.5分間)を25サイクル、そして72℃で7分間)の後、アガロースゲル電気泳動により、反応産物を定量して「増幅倍数（fold amplification）」（下記参照）を測定した。両プライマーにはEco109I部位が含まれる。PCR産物をEco109Iで処理して、pUC19のEco109I部位に挿入した。該構築物で形質転換した10 G細胞を、アンピシリン(100 μg/ml)、カナマイシン(30 μg/ml)及びX-Gal(50 μg/ml)を含むLBプレート上に播種した。フィデリティーの測定に、青色と白色のコロニー数を用いた。比較のため、ポリメラーゼ3173エキソヌクレアーゼ欠損変異体のE51AとD49A、並びにTaq とVENTR DNAポリメラーゼの2種類の標準DNAポリメラーゼを、同様に試験した。
【００６７】
当該技術分野での標準的技法として、フィデリティーは、以下の等式を用いて青色-白色コロニーの比率に基づいて測定した：
フィデリティー = -lnF / d x t
ここで、F= 白色コロニーの比率、d = PCR中の複製の数 (log2の増幅倍数) 、そしてtは、効果的な標的のサイズ (lacIqでは349)である。該フィデリティーアッセイの結果を下記の表にまとめる。
【表３】
2009511019.tif 000005
【００６８】
実施例１１．ポリメラーゼ3173変異体D49Aを用いたポリメラーゼ連鎖反応
pUC19のbla遺伝子に特異的なプライマーを用い、ポリメラーゼ3173変異体D49Aと比較用の市販の酵素を用いて1 kbの産物を増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応には、50 mMのTris HCl (pH 9.0、25℃)、50 mMのKCl、10 mMの(NH4)2SO4、1.5 mMのMgSO4、1.5 mMのMgCl2、0.1%のtriton-X1OO、0.02 mg/mlのウシ血清アルブミン、250 mMのエクトイン、並びに各0.2 mMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTPが含まれていた。pUC19プラスミドのbla遺伝子中に1 kb離れてアニールする、対をなすプライマー、及びD49A変異ポリメラーゼを添加した。サーマルサイクル(94℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で60秒間の25サイクル)の後、アガロースゲル電気泳動によって反応物を分離した。
【００６９】
結果を図１に示す。レーンは以下の通りである：鋳型DNA無し（レーン2）又は40ナノグラムのpUC19 DNA (レーン3-8)；酵素なし(レーン2及び3)、2、4又は8ユニットのポリメラーゼ3173変異体D49A (P、それぞれレーン4、5及び6), 5 UのVENTR (V、NEB、レーン7)又は5 UのTaq DNAポリメラーゼ(T、ルシジェン（Lucigen）、レーン8)。他に示されるものは、分子量マーカーである（レーン1）。
【００７０】
図１に認められるように、D49A変異体を用いたPCR増幅では、市販の酵素と同様に、予想されたサイズの産物が生じた。
【００７１】
実施例１２．ポリメラーゼ3173とポリメラーゼ3173変異体E51Aを用いたポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ3173とポリメラーゼ3173変異体E51Aの種々の混合物(1:5、1:25、1:100、1:500 U/U)、並びに配列番号28及び配列番号29に示すプライマーを用いて、環状合成鋳型の2259個のヌクレオチドの領域を増幅した。50 mMのTris HCl (pH 9.0、25℃)、50 mMのKCl、10 mMの(NH4)2SO4、1.5 mMのMgSO4、1.5 mMのMgCl2、0.1%のtriton-X1OO、15%のスクロース、各0.2 mMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTP、1μMの対を成す各プライマー、並びに20 ngの鋳型を含む増幅用混合物を、以下の条件下でインキュベートした：94℃で2分間、(94℃で15秒間、69℃で15秒間、72℃で2分間)の25サイクル、そして72℃で10分間。図２に認められるように、該増幅反応では、予想された分子量まで移動する産物が、異種産物を含むことなく生じた。
【００７２】
実施例１３．バシルスステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のcyc遺伝子のPCR増幅
バシルスステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のcyc遺伝子は、試験した市販のDNAポリメラーゼの全てに関して、増幅抵抗性配列であることが証明されていた。この配列を、ポリメラーゼ3173変異体D49Aを用いて、実施例１０に記載する条件で増幅した。比較のため、Taq、Phusion (フィンザイム（Finnzymes）)、VENTR, Tfl (プロメガ（Promega）)、KOD (タカラ（TaKaRa）)を含む、他の市販のDNAポリメラーゼによる、この遺伝子の増幅も、各製造元の推奨に従って行った。
【００７３】
結果を図３に示す。レーンは以下の通りである：Taq (レーン2-4)、Phusion (レーン5-7)、VENTR (レーン8-10)、Tfl (レーン11-13)、KOD (レーン14-16)及びポリメラーゼ3173変異体D49A (レーン17-19)。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、標準的手法を用いて画像化した。推定増幅産物は、1 kbマーカー(レーン1及び20)と共に移動した。鋳型を欠いたネガティブコントロール反応(レーン2、5、8、11、14及び17)又は酵素を欠いたネガティブコントロール反応(レーン3、6、9、12、15及び18)も、図３に示す。
【００７４】
図３に示すように、増幅は、D49A変異体と同様に市販の酵素を用いた場合にも観察されたが、しかしながら、これらの市販の酵素のいずれも、変異体D49Aを用いて得られた別格な高収量を生じることはなかった。
【００７５】
実施例１４．逆転写活性並びにポリメラーゼ3173及びポリメラーゼ3173変異体を用いたRT-PCR 
リボ核酸鋳型を用いたポリデオキシリボヌクレオチドへの放射性標識デオキシリボヌクレオチド3リン酸の取込みにより、逆転写活性を測定した。pH 8.3で25℃の5OmM Tris-HCl、75mM KCl、3mM MgCl2、2mM MnCl2、200 μM dTTP、0.02 mg/mlのポリrA：オリゴdT (アマシャム（Amersham）)、及び10 μCi の[P-32]αdTTPを含む反応混合物を、1 Uのポリメラーゼ3173又はポリメラーゼ3173変異体D49Aと共に60℃で20分間インキュベートした。dTTPの取り込みは、DE81フィルターペーパーへ付着した放射能値として検出した。同様の逆転写反応は、1ユニットのTth (プロメガ（Promega）)と1ユニットのMMLV逆転写酵素 (ノバジェン（Novagen）)を、それぞれの製造元の推奨条件に従って用いて、ポリrA鋳型上での標識dTTPの取込みによって測定した。市販の酵素と比較したポリメラーゼ3173及び変異体D49Aの取込み速度を以下の表にまとめる。
【表４】
2009511019.tif 000006
更に、Tthのマンガン依存的活性とは対照的に、ポリメラーゼ3173及び変異体D49Aの逆転写は、反応をマンガン又はマグネシウムのいずれかの存在下で進めた場合にも同じであった。
【００７６】
次に、2O mMのTris-HCl (pH 8.8、25℃)、1O mMの(NH4)2SO4、10 mMのKCl、2 mMのMgSO4、0.1 %のTriton X-100、0.25Mのエクトイン、各200 μMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTP、1 μgの全マウス肝臓RNA (アンビオン(Ambion))、QuantumRNA β-アクチビン・インターナルスタンダードキット（QuantumRNA β-actin Internal Standards kit）(アンビオン)のプライマー0.4 μM、並びに 5ユニットのポリメラーゼ3173変異体E51A DNAポリメラーゼ、を含む50 μlの反応物を、以下の温度サイクル下でインキュベートした：60℃で60分間、94℃で2分間、(94℃で15秒間、57℃で15秒間、72℃で1分間)の35サイクル、次いで72℃で10分間。前記プライマーは、294塩基の産物の合成を導くものと予想される。5 μlの反応物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。図４に示すように、予想された分子量まで移動した顕著なバンドが観察され；他にはバンドが観察されなかった。
【００７７】
実施例１５．高温等温RCA増幅法 
5ユニットのポリメラーゼ3173を用いて、各1ナノグラムの1本鎖M13mp18と2本鎖pUC19プラスミドDNAを増幅した。反応には、20 mM Tris-HCl、1O mM (NH4)2SO4、1O mM KCl、2 mM MgSO4、0.1 % Triton X-1OO（pH 8.8 、25℃）、並びに各250 μMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTPが含まれていた。0.5μM又は5μMの10ヌクレオチドから成るランダムプライマーを各鋳型に添加した。反応を、酵素の添加前に95℃でインキュベートし、次いで酵素と共に55℃で16時間インキュベートした。各反応の5分の1を、1%アガロースゲル上で分離した。
【００７８】
結果を図５のパネルAに示す。レーンは以下の通りである：5ユニットの3173野生型DNAポリメラーゼを用いてM13mp18の1本鎖DNA鋳型を増幅したもの(レーン2及び3)、及びpUC19の2本鎖DNAを増幅したもの(レーン4及び5)又は鋳型無し(レーン6)。10個のヌクレオチドから成るランダムオリゴマープライマーを、5 μM (レーン2、4及び6)又は0.5 μM (レーン3及び5)の濃度で添加する。
【００７９】
図５のパネルAに示すように、ポリメラーゼ3173は、1本鎖DNA鋳型と2本鎖DNA鋳型の両方を増幅した。推定上の全収量は、両鋳型について約50 μgであり、最大で50,000倍の増幅を示唆するものである。鋳型を欠くネガティブコントロール反応では、有意な収量の増幅産物が得られなかった。
【００８０】
前記増幅が、鋳型DNAに特異的なものであったかどうかを決定するため、陽性のpUC19反応の増幅産物1 μlを、元のプラスミド鋳型のbla遺伝子中の1kbの配列に特異的なプライマーを用いたPCR反応で試験した。ネガティブコントロールとして、デオキシヌクレオチドを欠いた反応を、PCRにより分析した。ポジティブコントロールとしては、前記1 kbの配列を1 ngのpUC19から直接増幅した。
【００８１】
結果を図５のパネルBに示す。レーン1は、pUC19の1 kbのbla遺伝子配列のポジティブコントロール増幅を示す。レーン2は、上記で増幅した産物からのbla遺伝子の増幅を示す。レーン3は、ネガティブコントロールの結果を示す。
【００８２】
予想通り、ポリメラーゼ3173を用いることで、真の増幅産物が得られた。PCRにより、1 kbの増幅産物が、試験増幅反応とポジティブコントロール反応において検出されたが、ネガティブコントロール増幅反応では検出されなかった。
【００８３】
実施例１６．添加プライマーの非存在下での等温RCA 
10 ngのプラスミドDNA、20 mMのTris-HCl、1O mMの(NH4)2SO4、1O mMのKCl、2 mMのMgSO4、0.1 %のTriton X-100（pH 8.8 、25℃）、並びに各200 μMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTPを含む反応物を、10ユニットのニックを生じさせる酵素N.Bst NBl (NEB)有り又は無しで、かつDNAポリメラーゼ無しで、又は200ユニットの3173野生型、若しくは400ユニットの3173(D49A)変異体酵素と共に、56℃で2時間インキュベートした。切断酵素（nicking enzyme）、ポリメラーゼ、又はその両者の非存在下で、並行反応を行った。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００８４】
結果を図６に示す。レーンは、以下の通りである：切断酵素（nicking enzyme）の存在下(レーン2-4)又は非存在下(レーン5-7)。ポリメラーゼ3173(レーン3及び6)又はD49A変異体(レーン4及び7)。
【００８５】
図６に示すように、切断酵素（nicking enzyme）が存在する場合には、ポリメラーゼ3173及びポリメラーゼ3173変異体D49Aの両方の存在下で、数マイクログラムの収量のDNA産物が得られたが、DNAポリメラーゼ又は切断酵素の非存在下では、得られなかった。
【００８６】
実施例１７．ヌクレオチド識別を低下させるポリメラーゼドメインの変異導入
M13mp18の6532番目ないし6571番目のヌクレオチドに相補的な、5'が Rox標識されたプライマー(5nM)を、20 mMのTris-HCl、1O mMの(NH4)2SO4、1O mMのKCl、2 mMのMgSO4、0.1 %のTriton X-100（pH 8.8 、25℃）、並びに各50 μMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTPを含むバッファー中の1本鎖M13mp18 DNA (1OnM)にアニールさせた。また、別の反応では、各50、500及び5000 μMの濃度にあるddGTP、ddATP、ddTTP、及びddCTPを上記混合物に添加した。5ユニットのポリメラーゼ3173変異体D49Aを添加して、該反応を70℃で30分間インキュベートした。プライマーの伸長は、ABI 310ジェネティックアナライザーによりジーンスキャン（Gene Scan）モードで検出した。本実験においては、100倍過剰モル濃度の連鎖停止剤でも、プライマー伸長の阻害が検出されず、ポリメラーゼ3173変異体D49Aによる、類似体に対する強力な識別力が示唆される。
【００８７】
第2の実験においては、2本鎖特異的蛍光色素のピコグリーン（Pico Green）（インビトロジェン（Invitrogen））を用いたDNA合成の検出により、取り込みを試験した。非標識M13プライマー(2 μM)を、20 mMのTris-HCl、1O mMの(NH4)2SO4、1O mMのKCl、2 mMのMgSO4、0.1 %のTriton X-100（pH 8.8 、25℃）、並びに各2 mMのdGTP、dATP、dTTP及びdCTPを含むバッファー中のM13mp18 ssDNA (1.2 μM)に添加した。別の反応では、ddGTP、ddATP ddTTP、ddCTP (各2 mM)の混合物、及び4種類のacyNTP (各2mM)の混合物を、伸長反応に添加し、次いでDNAポリメラーゼを添加した。コントロールとして、連鎖停止類似体を添加せずに同一の反応を行った。ポリメラーゼ3173変異体D49Aを試験し、そして比較のため、非常に低い識別性でddNTPを取り込むT7 DNAポリメラーゼ、並びに、両社とも高い識別能を示す、大腸菌（E. coli）ポリメラーゼIのクレノウ（Klenow）断片及びVENTR DNAポリメラーゼ(ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）)も試験した。プライマーの伸長は、ピコグリーン色素の蛍光により検出した。
【００８８】
結果を下記の表にまとめる。連鎖停止剤によるポリメラーゼ3173変異体D49Aの阻害は、最小のものであった。
【００８９】
【表５】
2009511019.tif 000007
【００９０】
ファミリーAのDNAポリメラーゼとのアラインメントに基づき、ポリメラーゼ3173変異体D49Aのアミノ酸418を、フェニルアラニンからチロシンへと変異させた。変異体タンパク質を発現させて、細胞を溶解し、そして70℃で10分間熱処理して、宿主タンパク質を不活性化させた。放射性ヌクレオチドの取込みの阻害について、非標識デオキシリボヌクレオチドと同様の混合物中の連鎖停止ヌクレオチド類似体を用いて、ポリメラーゼ3173変異体D49A/F418Yを試験した。20 mMのTris-HCl、1O mMの(NH4)2SO4、1O mMのKCl、2 mMのMgSO4、0.1 %のTriton X-100（pH 8.8 、25℃）、0.25 mg/mlの活性化ct DNA, 各40 μMのdGTP, dATP, dTTP 及びdCTP、並びに0.1 μCiの[α P-33] dCTPを含む反応を用いた。別の反応においては、各4 mMのddNTP及び各4 mMのアシクロNTP(acycloNTP)による阻害に関して、D49A/F418Y変異体と精製したポリメラーゼ3173変異体D49Aの両方を試験した。連鎖停止剤不含のコントロールを含むようにした。50 μlの反応を70℃で30分間インキュベートした。各反応のうち15 μlをDE81ペーパー上にスポットし、洗浄してカウントし、そして活性の単位を実施例６に記載するように測定した。ジデオキシヌクレオチド及びアシクロヌクレオチドの取込みによる阻害の程度を、下記の表にまとめる。
【表６】
2009511019.tif 000008
【００９１】
ポリメラーゼ3173二重変異体D49A/F418Yについても、上記の蛍光プライマー伸長アッセイで試験した。2Xの比率のddGTP:dGTPでは、あらゆる伸長がほぼ完全に阻害された。0.2Xの比率のddGTP:dGTPでは、完全に近いプライマー伸長の阻害が生じ、4番目のG残基を超えて続く伸長は見られなかった。以上をまとめると、このデータは、試験した連鎖停止ヌクレオチドに対するポリメラーゼ3173変異体D49A/F418Yによる識別性は、殆どゼロであることを示している。
【００９２】
種々の具体的態様と技術を参照して本発明を記載した。しかしながら、本発明の趣旨と範囲内に留まりながらも、多くの変更を改変を行うことが可能なことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、本発明のポリメラーゼ、及び2種類の市販のポリメラーゼを用いた、1 kbのpUC19配列のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅の結果を示す電気泳動ゲルの写真画像である。
【図２】図２は、本発明のポリメラーゼを用いた、PCR増幅の結果を示す電気泳動ゲルの写真画像である。
【図３】図３は、本発明のポリメラーゼ、及び5種類の市販のポリメラーゼを用いた、1 kbのバシルス（Bacillus）由来のcyc遺伝子配列（グアニン/シトシンリッチな鋳型）のPCR増幅の結果を示す電気泳動ゲルの写真画像である。
【図４】図４は、特異的プライマーと本発明のポリメラーゼを用いて、マウスの全RNAから294 bpのcDNAを逆転写して増幅させた、RT-PCR反応産物の分離に用いた電気泳動ゲルの写真画像である。
【図５】図５には、2種類の電気泳動ゲルの写真画像が示されており、1つは、本発明のポリメラーゼを用いて1本鎖及び2本鎖の鋳型を増幅した等温増幅反応物（パネルA）の分離に用いられ、1つは、該等温増幅産物の同一性の確認に用いたPCR増幅反応物（パネルB）である。
【図６】図６は、市販の切断酵素（nicking enzyme）の存在下又は非存在下で、2種類の本発明のポリメラーゼを用いて、プライマーを加えずに行った増幅反応の分離に用いた電気泳動ゲルの写真画像である。
【図１】
2009511019.tif 000009
【図２】
2009511019.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2009511019.tif 000014
【配列表】
2009511019000001.app
【国際調査報告】
2009511019.tif 000015
2009511019.tif 000016
2009511019.tif 000017