(57)【要約】  任意選択的にエストロゲン療法と組み合された、ポリ（アミノ酸）ポリマーにコンジュゲートされた抗癌薬の送達を含む、男性および女性における多様な種類の癌に対する治療を選択し、その後それらを治療するための方法が開示される。
2009518406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌がエストロゲン受容体を有する癌細胞の存在によって特徴付けられ、前記癌がエストロゲン受容体を有する細胞を含有する組織または臓器で発生する癌の治療の方法であって、閉経前のエストロゲンレベルを有する癌患者、または閉経後のエストロゲンレベルを有する患者を識別するステップと、前記患者に抗癌薬にコンジュゲートされたポリ（アミノ酸）ポリマーを含むコンジュゲートを投与するステップとを含み、閉経後のエストロゲンレベルを有する前記患者が任意選択的にエストロゲン療法も投与される方法。
【請求項２】
前記患者が閉経前のエストロゲンレベルを有すると識別される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が女性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記女性が５５歳未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記患者がホルモン補充療法を受けている閉経後の女性である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記患者がホルモン補充療法を受けている男性である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が抗アンドロゲン療法を受けている男性である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が閉経後のエストロゲンレベルを有すると識別され、前記治療が前記患者に抗癌薬にコンジュゲートされたポリ（アミノ酸）ポリマーを含む抗癌剤と、エストロゲン療法とを投与するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が男性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が女性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記女性が少なくとも５５歳である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリ（アミノ酸）ポリマーがポリ（グルタミン酸）である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記抗癌薬がタキサンである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記抗癌薬がパクリタキセルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗癌薬がパクリタキセルであり、前記ポリマーがポリ（グルタミン酸）を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記コンジュゲートがＰＰＸを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コンジュゲートが約１７５〜約２５０ｍｇ／ｍ２パクリタキセル当量の量で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コンジュゲートが静脈内に送達される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が肺癌である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
エストラジオールレベルに基づいて癌の治療レジメンを選択するための方法であって、
癌患者のエストロゲンの血清中レベルまたは血漿中レベルが、閉経前であるか、または閉経後であるかどうかを判定するステップを含み、閉経前のエストロゲンレベルがポリグルタメートにコンジュゲートされたパクリタキセルによる治療が非コンジュゲートパクリタキセルよりも有効であることを示し、血清中または血漿中の低い閉経後のエストロゲンレベルが、ポリグルタメートにコンジュゲートされたパクリタキセルを用いた治療が非コンジュゲートパクリタキセルよりも有効でないことを示す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１２月６日に出願された米国特許仮出願第６０／７４２，７２５号および２００６年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６０／８１４，２２１号の出願日の利益を主張し、本開示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
水溶性パクリタキセルコンジュゲート、それを作製する方法、およびタキサン応答性疾患を治療するためにそれを使用する方法は、米国特許第５，９７７，１６３号および米国特許第６，２６２，１０７号に開示されている。そこで報告されているように、薬物のコンジュゲートされた形態を含有する組成物は、典型的な腫瘍モデルに対して抗癌剤として驚くほど有効であることが見出され、タキサンまたはタキソイドが有効であることが既知である疾患または状態のいずれかに対して、パクリタキセルまたはドセタキセルと少なくとも同程度に有効であることが予想された。それらは、（薬物自体の不溶性に関連する欠点を克服することによって）製剤の容易さ、放出制御、およびより少ない副作用（少なくとも一部は、従来のパクリタキセル組成物について観察された副作用に関連する溶媒が必要ないことによる）の観点で有利な点を与えた。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の第１の態様は、閉経前のエストロゲンレベルを有すると識別され、癌と診断されている患者を治療する方法であって、抗癌薬にコンジュゲートされたポリ（アミノ酸）ポリマーを含むコンジュゲート（本明細書ではコンジュゲート薬または薬物コンジュゲートと呼ぶ）を、その必要がある女性に送達するステップを含み、エストロゲン受容体を有する癌細胞、または癌が発生する臓器もしくは組織のエストロゲン受容体を有する正常（非罹患）細胞の存在によって癌が特徴付けられる方法に関する。
【０００４】
本発明の第２の態様は、閉経後のエストロゲンレベルを有すると識別され、癌と診断されている患者を治療する方法であって、エストロゲン受容体を有する癌細胞、または癌が発生する臓器もしくは組織のエストロゲン受容体を有する正常（非罹患）細胞の存在によって癌が特徴付けられ、前記治療が患者にコンジュゲート薬およびエストロゲン療法を送達するステップを含む方法に関する。
【０００５】
本発明の様々な実施形態において、ポリ（アミノ酸）ポリマーはポリ（グルタミン酸）またはポリ（リジン）であり、抗癌薬はタキサンであり、他の実施形態において、抗癌薬はパクリタキセルである。別の実施形態において、抗癌薬はパクリタキセルであり、ポリマーはポリ（グルタミン酸）を含む。別の実施形態において、エストロゲン療法は１７−β−エストラジオールの投与を含む。別の実施形態において、癌は肺癌であり、さらなる実施形態において、癌は非小細胞肺癌である。
【０００６】
本発明のさらなる態様は、血清中エストロゲンレベルに基づいて癌の治療レジメンを選択する方法に関する。
【０００７】
いずれかの特定の作用理論に縛られるものではないが、本出願人はエストロゲンの存在（すなわち内因性、または外部から供給されたエストロゲン療法）が、癌組織（例えば腫瘍）に送達される薬物の量を増加させることによってコンジュゲート薬の有効性を向上させると信じている。エストロゲンは、ポリマー担体の骨格からの活性薬の分離に関連する酵素であるカテプシンＢのアップレギュレーションも引き起こして、癌組織における非コンジュゲート（または遊離）の抗癌薬の量の増加をもたらし得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、癌治療に関する。本明細書で使用するように、「エストロゲン受容体を有する癌」という用語は、エストロゲン受容体を有する癌細胞、またはエストロゲン受容体を有する正常（非罹患）細胞を含有する臓器または組織で発生する癌の存在を特徴とする、腫瘍形成する、またはそうでない（例えば白血病などの造血器癌）任意の癌を指す。エストロゲン受容体は一時的に発現され得、および／またはエストロゲン受容体を有する細胞は細胞（癌細胞または非罹患細胞）の全集団の一部に相当し得る。多少言い方を変えれば、特定の癌に関連付けられる細胞、または発生組織における細胞全てが必ずしもエストロゲン受容体を有するわけではない。癌細胞が疾患進行の経過で常にエストロゲン受容体を発現するわけでもない。発生組織における正常細胞が必ずしもその全寿命にわたってエストロゲンを発現するわけでもない。
【０００９】
２つのタイプのエストロゲン受容体、すなわちα受容体およびβ受容体がある。癌細胞に対するどちらかの受容体の普及率は、癌の特定の種類および／または癌の進行の特定の段階に関連付けることができる。従って癌細胞は、疾患の進行中の異なる時点でそれぞれのタイプを発現し得る。例えばＬｅａｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５９：７９−９２（２００１）を参照されたい。エストロゲン受容体βを有する癌は、これに限定されるわけではないが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、子宮上皮癌および肉腫、結腸癌、グリオーマ、前立腺癌、精巣癌、およびメラノーマが挙げられる。エストロゲンβ受容体は、肺組織およびＮＳＣＬＣにおいて発現される唯一の機能性受容体であるため、この利用について、特に興味深い。Ｐａｔｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．２３：８５４２−８５５２（２００３）を参照されたい。
【００１０】
本明細書に記載するように、選択された患者集団に応じて、本発明の方法はエストロゲン療法の実施も含み得る。本発明のある実施形態において、選択された患者集団は、内因性エストロゲンの閉経前（または高い）レベルを有する女性で構成される。本明細書で使用する表現としての「内因性エストロゲンの閉経前レベル」を有する女性は典型的には、血清中または血漿中に約３０〜約１０００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）、例えば約３０〜約３００ｐｇ／ｍｌの、血清中または血漿中エストロゲンレベルを有する（典型的には、生物活性ホルモンエストラジオール（エストラジオール−１７β、すなわちＥ２について、例えば市販の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キット、例えばＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）のＲＤＩ部門によるキットを利用して、測定される。）。内因性エストロゲンの閉経前レベルは典型的には、思春期後であり、月経閉止を受けておらず、エストロゲンレベルを劇的に変化させる他の軽減健康因子（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ  ｈｅａｌｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）を有さない女性に見出される。この集団は典型的には、年齢が７から、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、約５４歳までの女性と、その中のいずれかの小集団の範囲を含み得る。加えて、まれではあるが、男性が時には閉経前の女性と同様の血清中または血漿中エストロゲンレベルを有することがある。従って「閉経前の」という用語は本明細書で使用するように、血清中または血漿中エストロゲンレベルと関連して、男性も含む。
【００１１】
本発明の他の実施形態において、選択された患者集団は、低レベルのエストロゲンを有する患者、一般に男性および閉経後の女性で構成される。これらの実施形態において、患者は、薬物コンジュゲートおよびエストロゲン療法の送達または投与を伴う併用療法で治療される。これらの患者は典型的には、定量限界よりも低い血清中または血漿中エストロゲンレベル、一般に３０ｐｇ／ｍｌ未満の、例えば約２０からちょうど３０ｐｇ／ｍｌ未満の血清中または血漿中エストロゲンレベルを有する。男性は「月経閉止」を経験しないことが認識されるが、本明細書で使用するように、血清中または血漿中エストロゲンレベルに関連して、「閉経後」という用語は男性も含む。閉経後の女性は典型的には、５５歳を超えている。しかしながら一部の例では、５５歳よりも若い女性が閉経後のエストロゲンレベルを有し得る。これらの例は、外科的卵巣摘出を受けた女性、あるいは癌の細胞傷害性化学療法の投与、または卵巣機能もしくは下垂体機能に影響する他の薬物の投与によって卵巣機能を失った女性、あるいは原発性卵巣障害を有する女性を含む。この群は、年齢が１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４歳のより若い女性を含み得る。
【００１２】
本発明で有用なポリマーはアミノ酸を含む。このようなポリマーの例は、米国特許第５，９７７，１６３号および米国特許第６，２６２，１０７号に記載されている。「ポリ（アミノ酸）ポリマー」という用語は、本明細書で使用されるように、天然型アミノ酸または合成アミノ酸を含むコポリマーおよびホモポリマーを指す。アミノ酸は、ペプチド結合によって重合される必要はないが、アミノ酸モノマーを連続して結合させる任意の方法で結合され得る。
【００１３】
本発明で有用であり得るポリマーは、これらに限定されるわけではないが、ポリ（ｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリ（ｄｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｌ−リジン）、ポリ（ｄ−リジン）、ポリ（ｄｌ−リジン）、ポリ（ｌ−セリン）、ポリ（ｄ−セリン）、ポリ（ｄｌ−セリン）、ポリ（ｌ−グリシン）、ポリ（ｄ−グリシン）、ポリ（ｄｌ−グリシン）、ポリ（ｌ−アラニン）、ポリ（ｄ−アラニン）、ポリ（ｄｌ−アラニン）、ポリ（ｌ−チロシン）、ポリ（ｄ−チロシン）、ポリ（ｄｌ−チロシン）、ポリ（ｌ−トレオニン）、ポリ（ｄ−トレオニン）、ポリ（ｄｌ−トレオニン）、ポリ（ｄ−システイン）、ポリ（１−システイン）、およびポリ（ｄｌ−システイン）を含む。他の実施形態において、ポリマーは、上記に列挙したポリ（アミノ酸）と非アミノ酸ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸およびポリ乳酸とのブロック、グラフトまたはランダムコポリマーなどのコポリマー、ならびにポリ（２−ヒドロキシエチル１−グルタミン）、キトサン、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸、ヒト血清アルブミンおよびアルギン酸でもある。ポリグルタミン酸およびポリリジンが特に好ましい。任意のポリ（アミノ酸）、例えばポリ（グルタミン酸）への言及は、異性に関して限定していないので、ｄ型、ｌ型およびｄｌ型を含む全ての異性体を含む。
【００１４】
ある実施形態において、「水溶性ポリアミノ酸（ａ  ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」、「複数の水溶性ポリアミノ酸（ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」または「アミノ酸の水溶性ポリマー」が使用される。これらの用語よって、ポリマーが、ｄ型および／またはｌ型の異性体配座のいずれかのグルタミン酸および／またはアスパラギン酸および／またはリジンの組み合せを含むアミノ酸鎖を含むことを意味する。ある実施形態において、このような「水溶性ポリアミノ酸」は、１つ以上のグルタミン酸、アスパラギン酸、および／またはリジン残基を含有する。好ましい実施形態において、ポリマーはポリ（アニオン性アミノ酸）ポリマーである。ポリ（アニオン性アミノ酸）ポリマーの例としては、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、およびｐＨ７で負の正味電荷を有する他のホモアミノ酸ポリマーまたはヘテロアミノ酸ポリマーが挙げられる。
【００１５】
他の実施形態において、ポリマーは、グルタミン酸を含有するブロック、グラフトまたはランダムコポリマーなどのコポリマーである。従ってグルタミン酸と少なくとも１つの他の（好ましくは生分解性）モノマー、オリゴマーまたはポリマーとのコポリマーが含まれる。これらは例えば、少なくとも１つの他のアミノ酸、例えばアスパラギン酸、セリン、チロシン、グリシン、エチレングリコール、エチレンオキシド（またはこれらのいずれかのオリゴマーまたはポリマー）またはポリビニルアルコールを含有するコポリマーを含む。グルタミン酸残基は、１個以上の置換基を有することがあり、ポリマーは、グルタミン酸モノマーの一部または全部が置換されているポリマーを含む。置換基としては、例えば一般に基１つ当たり炭素原子１８個までのアルキル、ヒドロキシアルキル、アリールおよびアリールアルキル、またはエステル結合によって結合されたポリエチレングリコールを含む。「ポリ（グルタミン酸）」という表現および関連した表現は、本明細書では、文脈が別なように要求しない限り、上述の可能性のいずれも含むものとして構成されるものである。
【００１６】
天然型アミノ酸、異常アミノ酸、または化学修飾アミノ酸の各種の置換は、ポリ（アミノ酸）ポリマーのアミノ酸組成を含み得る。
【００１７】
本発明でアミノ酸として、またはポリ（アミノ酸）の置換として使用するための天然型アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シトルリン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ヒドロキシプロリン、ε−カルボキシグルタメート、フェニルグリシン、またはＯ−ホスホセリンである。
【００１８】
本発明での使用のための非天然型アミノ酸としては、例えば、β−アラニン、α−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、γ−（アミノフェニル）酪酸、α−アミノイソ酪酸、シトルリン、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、β−アスパラギン酸、アミノ安息香酸、アミノフェニル酢酸、アミノフェニル酪酸、γ−グルタミン酸、ε−リジン、メチオニンスルホン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｄ−オルニチン、ｐ−ニトロ−フェニルアラニン、ヒドロキシプロリン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、およびチオプロリンが挙げられる。
【００１９】
アミノ酸の置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および種類の分析は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが全て正に帯電した残基であることと、アラニン、グリシンおよびセリンが全て同じくらいのサイズであることと、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが全て一般に同じ形状を有することとを明らかにしている。従ってこれらの考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書では生物学的機能同等物と定義される。
【００２０】
偽ポリ（アミノ酸）も本発明で使用され得る。偽ポリ（アミノ酸）は、ジペプチドモノマーが正常なペプチド結合以外によって共有結合されるという点で、上に記載したポリ（アミノ酸）とは異なる。本発明による使用に適切な偽ポリ（アミノ酸）は、例えばＫｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：９１７（１９８７）およびＰｕｌａｐｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，３１：２３（１９９０）における偽ポリ（アミノ酸）であり、これらのそれぞれは引用することにより本明細書の一部をなすものとする。偽ポリ（アミノ酸）は、本発明に従って、単独でまたは古典的なポリ（アミノ酸）および偽ポリ（アミノ酸）との混合物と組み合せて使用され得る。
【００２１】
ポリ（アミノ酸）は、アミノ酸置換範囲の下端において、本明細書に記載する天然型アミノ酸、修飾アミノ酸、または異常アミノ酸のいずれかによってそれぞれ置換された、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、またはこれ以上のグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、チロシンまたはグリシン残基を有し得る。
【００２２】
本発明の他の態様において、ポリ（アミノ酸）ホモポリマー、例えばポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリセリン、ポリチロシン、ポリグリシン、またはこれらの５つのアミノ酸の一部または全部の混合物を含むポリ（アミノ酸）コポリマーは、下端において、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％までのグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、チロシンまたはグリシン残基をそれぞれ有し得るか（重量％または残基％）、および／または本明細書に記載する任意の天然型アミノ酸、修飾アミノ酸、または異常アミノ酸によって置換され得る。
【００２３】
ポリ（アミノ酸）ホモポリマー、例えばポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリセリン、ポリチロシン、またはポリグリシンは、アミノ酸置換範囲の上端において、２５％未満、２６％未満、２７％未満、２８％未満、２９％未満、３０％未満、３１％未満、３２％未満、３３％未満、３４％未満、３５％未満、３６％未満、３７％未満、３８％未満、３９％未満、４０％未満、４１％未満、４２％未満、４３％未満、４４％未満、４５％未満、４６％未満、４７％未満、４８％未満、４９％未満、５０％未満くらいまでのグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、チロシンまたはグリシン残基をそれぞれ有し得るか（重量％または残基％）、本明細書に記載する任意の天然型アミノ酸、修飾アミノ酸、または異常アミノ酸によって置換され得る。好ましくは、残基の大部分がグルタミン酸および／またはアスパラギン酸および／またはセリンおよび／またはチロシンおよび／またはグリシンを含む。
【００２４】
本発明のポリマーは、一般に約１，０００ダルトンから１０，０００，０００ダルトン未満に及ぶ分子量を有する。本発明のポリマーは、ある実施形態において、約１０ダルトン〜約５，０００ダルトンの分子量であって、この範囲内の全ての整数値を含み、例えば１００、２００、３００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、および４，５００ダルトンを含む分子量を有し、ある他の実施形態において、約６００ダルトン、約３２，０００ダルトンまたは約３３，０００ダルトンの分子量を有する。
【００２５】
ポリ（アミノ酸）ポリマーは、化学プロセスおよび組み換えプロセスを含む、複数の種類の標準的な方法に従って合成され得る。例えばグルタミン酸のホモポリマーは、（ｉ）グルタミン酸をホスゲンまたは同等の試薬、例えばジホスゲンによって１５℃〜７０℃の温度で処理して、Ｎ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を生成するステップと、（ｉｉ）Ｎ−カルボン酸無水物の開環重合を塩基によって実施して、ポリ（グルタミン酸）を得るステップとの、２つのステップのプロセスで調製され得る。適切な塩基としては、アルコキシド、例えばナトリウムメトキシドなどのアルカリ金属アルコキシド、有機金属化合物および１級アミン、２級アミンまたは３級アミン、例えばブチルアミンまたはトリエチルアミンが挙げられる。例えば米国特許第５，４７０，５１０号を参照されたい。ポリ（アミノ酸）を化学的に合成するための他の多数の方法がある。
【００２６】
本発明のアミノ酸ポリマーは、例えば形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを利用することによって組み換えによって産生され得る。ポリ（グルタミン酸）の限定された細菌による産生は、例えば、ＥＰ−Ａ−４１０，６３８に記載されている。細菌を使用して実施される組み換えプロセスは普通、ポリ（ｌ−グルタミン酸）を産生するが、細菌はｄ型を与えることが既知である。
【００２７】
ある実施形態において、ポリマーにコンジュゲートされた抗癌薬はタキサンである。タキサンとしては、パクリタキセル、ドセタキセルおよびタキサン骨格を有する他の化学物質が挙げられる。Ｃｏｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：２６４３−２６５５（１９９５）を参照されたい。タキサン化合物およびその調製方法の例は、米国特許第４，９４２，１８４号に記載されている。
【００２８】
好ましい実施形態において、パクリタキセルはポリ−（１−グルタミン酸）にコンジュゲートされる。本発明のコンジュゲート薬は、複数のタキサン骨格の分子であるのに対して、非コンジュゲート薬（例えば在来のパクリタキセル）は１個のタキサン骨格の分子である。コンジュゲート薬と非コンジュゲート薬との少なくとも１つの意味のある比較を与えるために、コンジュゲート薬中の各タキサン骨格分子を、１パクリタキセル（すなわち非コンジュゲートパクリタキセル）当量として計算する。一つの実施形態において、薬物コンジュゲート、すなわちポリグルタメートパクリタキセルコンジュゲートは、α−ポリ−ｌ−グルタミン酸の（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニル−イソセリン）２’，ガンマカルボキシラートエステルを含む、化学名５−β，２０−エポキシ−１，２−α、４，７−β，１０−β，１３−α−ヘキサヒドロキシ−タキサ−１１−エン−９−オン４，１０−ジアセテート２−ベンゾアート１３−エステルの複数タキサン骨格分子である。
【００２９】
有用なポリグルタメートパクリタキセルコンジュゲートの例としては、パクリタキセルポリグルメックス（ＰＰＸ；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｎａｍｅ（ＵＳＡＮ）Ｃｏｕｎｃｉｌによって採用された一般名（商標名はジオタックス（商標））が挙げられる。ＰＰＸは、約３５％〜約３７％重量対重量（Ｗ／Ｗ）のパクリタキセルの負荷を含む、約３５，０００〜約４０，０００Ｄａの範囲であるが、７５，０００Ｄａを超えない平均ＭＷを有する。
【００３０】
他の実施形態において、抗癌薬または抗癌剤はカンプトテシン、またはその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグである。カンプトテシン（ＣＰＴ）化合物としては、各種の２０（Ｓ）−カンプトテシン、２０（Ｓ）−カンプトテシンの類似体、および２０（Ｓ）−カンプトテシンの誘導体が挙げられる。カンプトテシンとしては、本発明の文脈で使用するとき、植物アルカロイド２０（Ｓ）−カンプトテシン、置換カンプトテシンおよび非置換カンプトテシンの両方、およびその類似体が挙げられる。カンプトテシン誘導体の例としては、これに限定されるわけではないが、９−ニトロ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、９−アミノ−２０  （Ｓ）−カンプトテシン、９−メチル−カンプトテシン、９−クロロカンプトテシン、９−フルオロ−カンプトテシン、７−エチルカンプトテシン、１０−メチルカンプトテシン、１０−クロロ−カンプトテシン、１０−ブロモ−カンプトテシン、１０−フルオロ−カンプトテシン、９−メトキシ−カンプトテシン、１１−フルオロ−カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、および１０，１１−エチレンジオキシカンプトテシン、および７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシンが挙げられる。カンプトテシンのプロドラッグは、これに限定されるわけではないが、米国特許第５，７３１，３１６号に記載されているようなエステル化カンプトテシン誘導体、例えばカンプトテシン２０−Ｏ−プロピオナート、カンプトテシン２０−Ｏ−ブチラート、カンプトテシン２０−Ｏ−バレラート、カンプトテシン２０−Ｏ−ヘプタノアート、カンプトテシン２０−Ｏ−ノナノアート、カンプトテシン２０−０−クロトナート、カンプトテシン２０−Ｏ−２’，３’−エポキシ−ブチラート、ニトロカンプトテシン２０−Ｏ−アセテート、ニトロカンプトテシン２０−Ｏ−プロピオナート、およびニトロカンプトテシン２０−Ｏ−ブチラートが挙げられる。２０（Ｓ）−カンプトテシンの特定の例としては、９−ニトロカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、または７、９、１０、１１、もしくは１２位の少なくとも１つにて置換される別の置換カンプトテシンが挙げられる。これらのカンプトテシンは、場合により置換され得る。
【００３１】
置換はカンプトテシン骨格に対して行われ得るが、なお活性を保持している。ある実施形態において、カンプトテシン骨格は７、９、１０、１１、および／または１２位において置換される。このような置換は、非置換カンプトテシン化合物を超える特異的な活性を提供する役目をし得る。置換カンプトテシンの例としては、９−ニトロカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、または７、９、１０、１１、もしくは１２位の少なくとも１つにおいて置換された別の置換カンプトテシンが挙げられる。
【００３２】
天然の非置換のカンプトテシンは、天然抽出物の精製によって得られ得るか、またはＳｔｅｈｌｉｎ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｘ）より入手され得る。
【００３３】
置換カンプトテシンは、文献で既知の方法を使用して得ることができ、または市販品供給業者から入手され得る。例えば９−ニトロカンプトテシンはＳｕｐｅｒＧｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）より入手でき、９−アミノカンプトテシンはＩｄｅｃ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手できる。カンプトテセシンおよび各種の類似体は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの標準的な精製化学製品供給業者からも入手できる。
【００３４】
タキサンおよびカンプトテシンのほかに、本発明の組成物および方法で有用であり得る他の抗癌薬としては、エトポシド、テニポシド、フルダラビン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エモジン、５−フルオロウラシル、ＦＵＤＲ、エストラジオール、カンプトテシン、レチノイン酸、ベラパミル、エポチロンおよびシクロスポリンが挙げられる。さらに一般的には、コンジュゲーション部位を与え得る遊離ヒドロキシル基を有する抗癌薬が使用され得る。
【００３５】
本発明は、単一のポリマー、ならびに２つ以上の異なるポリマーの使用も意図している。異なるポリマーは例えば、異なる長さの同様のポリマー、ならびに実質的に異なるポリマーも含む。本発明は、単一のポリマーにコンジュゲートされた薬物および複数の異なるポリマーにコンジュゲートされた薬物の使用を含む。同様に本発明は、それぞれ同じ種類のポリマーにコンジュゲートされた２つ以上の薬物、ならびにそれぞれ異なるポリマーにコンジュゲートされた２つ以上の薬物の混合物の使用も含む。ある実施形態において、２つ以上の異なる薬物部分が単一のポリマーにコンジュゲートされ得る。本発明は、薬物コンジュゲートおよび／またはエストロゲン療法に加えて、他の抗癌薬（例えばカルボプラチン）の投与も意図している。
【００３６】
薬物とポリマーとの間の結合または会合の性質は重要でない。例えばコンジュゲートされた薬物−ポリマーの相互作用は共有結合を通じてであるが、会合は電荷間相互作用、ファンデルワールス力などを通じてである。共有結合は合成によって、または組み換えポリマー−薬物融合タンパク質を生成するための遺伝子融合によって産生され得る。ポリマーを薬物にコンジュゲートする典型的な方法は、例えば、米国特許第５，９７７，１６３号、米国特許第６，２６２，１０７号、および米国特許第６，４４１，０２５号、ならびに国際公開ＷＯ  ９９／４９９０１、ＷＯ  ９７／３３５５２、ＷＯ  ０１／２６６９３、およびＷＯ  ０１／７０２７５に記載されている。
【００３７】
ポリマーおよび薬物は、直接に、またはリンカーもしくはスペーサなどの第２の分子を介してコンジュゲートまたは会合され得る（例えばＷＯ  ０１／７０２７５を参照、そこで開示された技術は任意の薬物コンジュゲートに、特にポリアミノ酸コンジュゲートに適用され得る）。好ましいリンカーは、循環における加水分解に対して比較的安定であるリンカーである。典型的なリンカーとしては、アミノ酸、ヒドロキシ酸、ジオール、アミノチオール、ヒドロキシチオール、アミノアルコール、βアラニン、グリコールおよびその組み合せが挙げられる。さらに、薬物は、コンジュゲート前の修飾、例えば新たな官能基の導入、既存の官能基の修飾、またはスペーサ分子の付着を必要とし得る。
【００３８】
化学的結合は、当分野で既知および利用可能な方法、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、および、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１に記載された方法に従って、市販のホモまたはヘテロの２官能性架橋化合物を使用して達成され得る。
【００３９】
ポリマーを薬物または他の分子に結合する方法の追加の例は、Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７０：５７５−５８２（１９８９）；Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ７：２９−３３（１９８９）；Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０：２５５−２６０（１９９２）；Ｄｅｆｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：３８７９−３８８３（１９９２）；Ｔｏｈｏｋｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３９５−３９６（１９９４）；Ｒａｃｈｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｏｎ．２０８７−２０８８（１９９７）；Ｋａｍｉｔａｋａｈａｒａ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：１５２４−１５２８（１９９８）；およびＤｕｌｌｅｎｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｔｃ．Ｊ．５：２４３２−２４３８（１９９９）に記載されている。
【００４０】
ある実施形態において、米国特許第５，９７７，１６３号に記載されているように、ポリマーは化学的コンジュゲーションによって薬物にコンジュゲートされる。この方法では、ポリグルタミン酸コンジュゲートはナトリウム塩として調製され、低分子量汚染物質および過剰な塩を除去するために透析され、次に凍結乾燥される。他の化学的コンジュゲーションの方法は、ＷＯ  ０１／２６６９３  Ａ２に記載されている。この方法により、ポリグルタミン酸ポリマーは、ポリグルタミン酸のカルボン酸残基と薬物の官能基との間の直接結合によって、または１個以上の２官能性基を介した間接結合によって、薬物に共有結合される。他の方法は、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，４ｔｈ  ｅｄ．，１９９２に開示されている。
【００４１】
一つの実施形態において、ポリグルタメート担体は、次のような方法によって薬物に結合される。
（ａ）ポリグルタミン酸ポリマーのプロトン化形、およびそれへのコンジュゲーションのための薬物を提供するステップと、
（ｂ）ポリグルタミン酸−薬物コンジュゲートを形成するために、不活性有機溶媒中で前記薬物を前記ポリグルタミン酸ポリマーに共有結合させるステップと、
（ｃ）過剰量の塩水溶液の添加によって、前記ポリグルタミン酸−薬物コンジュゲートを溶液から沈殿させるステップと、
（ｄ）前記コンジュゲートをプロトン化固体として収集するステップ。
【００４２】
ステップ（ａ）のポリグルタミン酸ポリマーのプロトン化形は、開始物質として使用されるポリグルタミン酸の塩を含有する溶液を酸性化して、塩をその酸性形に変換することによって得られる。固体を遠心分離によって分離した後、固体を水で洗浄して、次に所望の薬物へのコンジュゲーション（ｂ）の前に、ポリグルタミン酸を、好ましくは凍結乾燥によって、好ましくは、約２％〜約２１％の水を、約７％〜約２１％の水を、または７％〜２１％の水を含む一定重量になるまで乾燥させる。
【００４３】
コンジュゲートは、組み換えＤＮＡ技術を使用して全部または一部において生成され得る。例えばポリマーもしくは薬物、またはそれらの両方が組み換え手段によって生成されて、その後に会合またはコンジュゲートされ得る。あるいは、例えばポリマーおよび薬物の両方を含む単一のポリペプチドが、融合タンパク質として生成され得る。組み換え発現ベクターを構築する方法は、細菌および酵母などの各種の生物において組み換えポリペプチドを発現させる方法と同様に、当分野で既知である。
【００４４】
ポリマーにコンジュゲートされた薬物の量は可変である。下端において、薬物ポリマーコンジュゲートは、コンジュゲートの質量に対して薬物を約１％から、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％（ｗ／ｗ）まで含み得る。上端において、薬物ポリマーコンジュゲートは、コンジュゲートの質量に対して薬物を約２６％から、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約５０％（ｗ／ｗ）以上まで含み得る。
【００４５】
同様に、ポリマー１分子当たりにコンジュゲートされる薬物の分子の数も変化し得る。下端において、薬物ポリマーコンジュゲートは、ポリマー１分子当たり約１から、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０個以上までの薬物分子を含み得る。上端において、薬物ポリマーコンジュゲートは、ポリマー１分子当たり約２１から、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５以上までの薬物分子を含み得る。
【００４６】
ポリマーは薬物分子の１個以上の別々の部位または重複する部位と会合され得る。反対にある実施形態において、薬物分子はポリマーの１個以上の別々の部位と会合され得る。従ってある実施形態において、本発明の組成物は、薬物の異なる部位によって薬物と会合されたポリマー、ならびにポリマーの異なる部位によってポリマーと会合された薬物も含む。各部位に存在する特定の官能基に応じて、異なる部位を通じた会合を導くために異なるリンカーが使用されてもよく、または単一のリンカーが使用されてもよい。ある実施形態では、本発明は、各薬物または各ポリマーの１個以上の異なる部位または重複する部位を通じて１個以上の薬物と会合された１個以上のポリマーの混合物を含む組成物を含む。
【００４７】
本発明の薬物コンジュゲートは、任意の治療的に適切な手段によって送達または投与され得る。例えば投与は非経口または経口であり得る。好ましい実施形態において、投与は静脈内（ｉ．ｖ．）である。
【００４８】
組成物はコンジュゲートおよび製薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用するように、製薬学的に許容される担体としては、溶媒（例えば緩衝水性媒体）、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤（例えばグルコース）などが挙げられる。静脈内使用に適切なコンジュゲートを含有する製薬組成物としては、滅菌水溶液または分散剤、ならびに水溶液中で再構成され得る滅菌粉末も挙げられる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な注射溶液は、コンジュゲートの適量を適切な溶媒中に、任意選択的に上記に列挙したような各種の他の成分と共に組み込むことによって調製され得る。溶液は濾過によって滅菌され得る。分散剤は、分散媒および上記に列挙したものからの他の任意の成分を含有する滅菌媒体中にコンジュゲートを組み込むことによって調製され得る。滅菌粉末は、真空乾燥技術およびフリーズドライ技術によって調製でき、コンジュゲートおよび任意の追加の所望の成分の粉末が、先に滅菌濾過したその溶液から得られる。
【００４９】
製薬組成物は、適切な投薬量ならびに適切な期間および頻度で、送達および投与され得る。投与の用量および期間は典型的に、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度、活性成分の特定の形態および投与方法などの要因によって決定される。適切な投薬量および治療レジメンは、治療的有用性（例えば改善された臨床結果、例えばより頻繁な完全寛解もしくは部分寛解、またはより長期の無病および／またはＯＳ）を達成するように設計されている。投薬量および投与スケジュールの様々な範囲の例は、米国特許第５，６７０，５３７号に与えられている（タキソールの投薬量および投与スケジュールを開示している）。
【００５０】
本発明のある実施形態において、このような治療が必要な患者は、ＰＰＸなどの薬物コンジュゲートを隔週または他の臨床的に有用なスケジュールで、関連する特定のコンジュゲートに典型的に使用される用量レベルで投与される。複数のタキサン骨格の分子による治療と他の単一のタキサン骨格の分子による治療との間の有意な比較を与えるために、タキサンコンジュゲートの投薬は、「パクリタキセル当量」として表現され得る。例えば投薬目的で、タキサンコンジュゲート分子中の各タキサン骨格は、１パクリタキセル当量として計算される。用量レベルは一般に、約１７５〜約２５０ミリグラム／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）パクリタキセル当量の範囲で変化する。好ましい実施形態において、患者はＰＰＸによって、約２００〜約２５０ｍｇ／ｍ２パクリタキセル当量の量で、２１日ごとにまたは約３週間に１回治療される。最も好ましい実施形態において、患者はＰＰＸによって、約１７５ｍｇ／ｍ２パクリタキセル当量の量で、２１日ごとにまたは約３週間に１回治療される。他の実施形態において、患者はタキサンコンジュゲート、例えばＰＰＸによって、約２５０ｍｇ／ｍ２パクリタキセル当量を超える量で２１日ごとに、または約２７５ｍｇ／ｍ２パクリタキセル当量を超える量で２１日ごとに治療される。
【００５１】
静脈内注入は、当業者が容易に決定できる任意の適切な期間にわたり得る。例えば注入は、約１〜約２４時間続き得るが、より短い注入時間またはより長い注入時間も本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
本発明の一部の実施形態は、薬物コンジュゲートと併用されたエストロゲン療法の使用を意図している。エストロゲン療法は、本明細書で使用するように、患者のエストロゲンレベルを上昇させ、または非癌組織（肺癌の場合、骨および肝臓を含む）と比較して癌組織、例えば肺において抗癌薬のより高い蓄積をもたらすエストロゲン物質の投与を指す。従って本明細書で使用するように、「エストロゲン」としては、これに限定されるわけではないが、任意の天然哺乳類エストロゲンおよびその同族体、例えばエストラジオールおよびその有機エステル（例えばエストラジオールベンゾアート、エストラジオールシピオナート、およびエストラジオールバレレート）、エストロン、ジエチルスチルベストロール、ピペラジンエストロンサルフェート、エチニルエストラジオール、メストラノール、ポリエストラジオールホスフェート、エストリオール、エストリオールヘミスクシナート、キネストロール、エストロピペート、ピネストロール（ｐｉｎｅｓｔｒｏｌ）、エストロンカリウムサルフェート、およびチボロン、エストロゲン代謝産物、例えば１７−β−エストラジオール、エストロゲン類似体、エストロゲン活性を有する天然化合物、例えばフィトエストロゲン、例えばゲニステインまたはイソフラボン、エストロゲンアゴニスト、例えば多少のアゴニスト活性を備えた選択的エストロゲン受容体モジュレータ（例えばタモキシフェン）、および細胞表面エストロゲン受容体との相互作用が可能な他の物質が挙げられる。これらのエストロゲンおよびエストロゲン性物質は天然または合成である。
【００５３】
エストロゲンまたはエストロゲン性物質は、哺乳類生理および選択された送達経路に適合する任意の手段によって製剤化され得る。これらの方法は当分野で周知である。Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．５３０−５４１（１９９０）を参照されたい。
【００５４】
エストロゲン療法は、局所的、経口的、全身的、静脈内、筋肉内、粘膜的、または経皮的（例えばパッチ）などのいずれの適切な経路によっても投与され得る。エストロゲン療法は、定期的に（例えば毎日／毎週）投与され得、薬物コンジュゲート療法に関して断続的または実質的に連続的であり得る。代表的な用量の範囲は、化合物および患者の特徴によって変わる。エストロゲンの１日の用量は典型的には、エストロゲンまたはその代謝産物が使用されるときに３０ｐｇ／ｍｌ以上の血清中または血漿中のエストロゲンレベルを維持するのに必要な所定の調製物の量に基づく。
【００５５】
治療レジメンとしては、これに限定されるわけではないが、ホルモン補充療法、例えば毎日０．３ｍｇ／１．５ｍｇ、０．４５ｍｇ／１．５ｍｇ、０．６２５ｍｇ／２．５ｍｇ、または０．６２５ｍｇ／５．０ｍｇでのエストロゲン／プロゲステロン療法が挙げられる。別の実施形態において、療法は、１日１回または２回の０．１５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．６２５ｍｇまたは１．２５ｍｇでのエストロゲン療法を含み得る。好ましい実施形態において、療法は、１日３回のエストロゲン１０ｍｇを含む。エストロゲンの例は、Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＰＡ）である。ある実施形態において、エストロゲン／プロゲステロン併用は、Ｐｒｅｍｐｒｏ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＰＡ）の投与によって達成される。代わりの療法としては、１日当たり複数回の１０ｍｇ用量での１日２０〜４０ｍｇで、または１回用量で１日２０ｍｇで投与されるタモキシフェンが挙げられる。
【００５６】
本発明の方法は、併用療法の各成分が同じ経路で送達されること、または同時に送達されることさえ必要としない。しかしながら本発明のある実施形態においては、薬物コンジュゲートおよびエストロゲン療法は同時に同じ投与経路によって与えられる。さらに好ましい実施形態において、エストロゲン療法は、薬物コンジュゲートによる治療の経過の期間にわたって実質的に連続的であるように、経皮的（例えばパッチにより）または経口的に（例えば毎日の錠剤、カプセル剤または丸剤）投与される。
【００５７】
本発明は、血清中または血漿中のエストロゲンレベルに基づいて癌治療を選択または選定する方法にも関する。閉経前のエストロゲンレベルを有する患者は、抗癌薬のコンジュゲート形、例えばＰＰＸによる治療に対して好ましく応答する傾向が高いが、低い（例えば閉経後の）エストロゲンレベルを有する患者はＰＰＸまたは別の癌療法、例えば非コンジュゲートパクリタキセルによって治療され得る（実施例１および実施例２、特に図３および図４を参照されたい）。
【００５８】
癌治療を選択または選定する方法は、癌患者から入手した血液サンプルの血清中または血漿中のエストロゲンレベルを測定するステップと、エストロゲンレベルを治療法の選択肢と相関させるステップとを含む。閉経前のエストロゲンレベルは、ＰＰＸの投与を含む癌治療と相関付けられる。閉経後エストロゲンレベルは、ＰＰＸまたはパクリタキセルのどちらかを含み得る癌治療と相関付けられる。この方法は、癌を有するエストロゲン受容体と関連して特に有用であり、癌は上述したようにエストロゲン受容体を有する癌細胞の存在によって特徴付けられる任意の癌、またはエストロゲン受容体を有する正常（非罹患）細胞を含有する臓器または組織で発生する癌を含み、エストロゲン受容体は一時的に発現され得、および／またはエストロゲン受容体を有する細胞が細胞の全集団の一部を表す。
【００５９】
本発明およびその有利な点を十分に例証するために、以下の具体的な実施例が与えられ、それが例証のためのみであり、決して限定的でないことが理解される。
【実施例１】
【００６０】
実施例１に示す実験および結果は、全生存率（ＯＳ）によって測定されたように、エストロゲンレベルとＣＴ−２１０３対パクリタキセルによる治療との間の相関を示す。図１および図２に示したデータは、多国籍、第ＩＩＩ期、非盲検試験に由来する。最初に、ＮＳＣＬＣを有する患者４００名を２つの治療選択肢のうち１つへ等しく無作為に選択し、１９９名の患者がカルボプラチン（ＡＵＣ６）と併用した用量２１０ｍｇ／ｍ２の選択肢１（ＣＴ−２１０３、すなわちＰＰＸ）であり、２０１名の患者がカルボプラチン（ＡＵＣ６）と併用した用量２２５ｍｇ／ｍ２の選択肢２（非コンジュゲートパクリタキセル）であった。無作為な選択は、２つの治療法の選択肢の間の潜在的な不均衡を最小化するために階層化された。患者は試験について選択された後に、疾患の段階（ＩＶ対その他）、性別、地理的位置（米国対西欧、およびカナダ対世界のその他の国々）、脳転移の病歴（あり対なし）によって階層化された。
【００６１】
初期サンプルのセットから、高エストロゲンまたは低エストロゲンの女性のどちらかからなる小集団を分析した。選択肢１より、２９名の高エストロゲンの女性および１５名の低エストロゲンの女性を試験して、選択肢２より、２５名の高エストロゲンの女性および１７名の低エストロゲンの女性を試験した。女性のエストロゲンレベルは、競合免疫測定法（例えばＤＰＣ  ＩＭＭＵＬＩＴＥ  ２０００  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＮＹ；ＤＰＣ  ＩＭＭＵＬＩＴＥ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によって測定した。比較は低エストロゲン群では選択肢１および選択肢２の間で（図１）、高エストロゲン群では選択肢１および選択肢２の間で（図２）実施した。
【００６２】
試験対象患者の選定基準は、
１．ＮＳＣＬＣの組織学的または細胞学的に確認された診断、
２．疾患状態について次の基準の１つを満足する
ａ．放射線および／または外科手術によって以前に治療された局所進行疾患または再発疾患、
ｂ．集学的治療の候補でなかった第ＩＩＩＢ期の患者、または
ｃ．第ＩＶ期の疾患を有する患者、
３．ＥＣＯＧの状態スコアが２、
４．十分な骨髄、腎臓、および肝臓機能。さらに、既知の脳転移を有する患者は、標準的な抗癌治療を受けたはずであり（放射線と併用された全身化学療法なし）、患者は療法から十分に回復して、無作為な選択の前に２週間にわたって安定した神経機能を示したに違いない。
【００６３】
患者には、合計６サイクルにわたる２１日サイクルの第１日に、ＣＴ−２１０３／カルボプラチンまたはパクリタキセル／カルボプラチンを静脈内注入で与えた。毒性は各患者来診時に評価した。血液学、臨床化学、および凝固パラメータは試験期間の前と最中に評価した。全身腫瘍組織量は、固形癌の応答基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）に従って評価し、疾患関連症状は、癌治療の機能的評価肺癌スコア（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｏｒｅ）（ＦＡＣＴ−ＬＣＳ）によって測定して、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を一定の間隔で評価した。患者は、疾患進行、耐え難い毒性、患者の中止同意、または患者を中止させる調査者の決定のために中止させられた。治療終了評価は、最終試験治療完了後２２〜２６日に実施し、追加的な生存率および疾患状態情報を得るために、治療終了来診後８週間の間隔で、患者に接触もした。本試験の有効性および安全性の結果は、独立したデータ監視委員会（Ｄａｔａ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＤＭＣ）によって監視された。
【００６４】
治療の有効性は、ＲＥＣＩＳＴに従った全身腫瘍組織量の評価によって決定した。さらに、ＣＴスキャンをベースライン時に、各偶数サイクルの第３週にて実施した。疾患関連症状は、癌治療の機能的評価肺癌スコア（ＦＡＣＴ−ＬＣＳ）によって各試験治療前の３日以内に測定した。
【００６５】
ログランク統計解析を実施して、高エストロゲン女性の選択肢１および選択肢２、ならびに低エストロゲン女性の選択肢１および選択肢２を比較した。
【００６６】
上記の試験による結果は、ＮＳＣＬＣと診断され、ＣＴ−２１０３＋カルボプラチンまたはパクリタキセル＋カルボプラチンのどちらかで治療した閉経後（すなわち低エストロゲン）の女性のＯＳにおいて統計的に有意な差を示さなかった（図１）。著しく対照的に、ＣＴ−２１０３＋カルボプラチンをＮＳＣＬＣ（すなわち高エストロゲン）の思春期後であって、閉経前の女性に投与したときには、パクリタキセル＋カルボプラチンに対して、生存率において統計的に有意な上昇があった（図２）。図２に示した試験結果の統計的な有意差は、少ないサンプルサイズを考慮すると、なおさらに驚きであった。
【００６７】
これらの結果は、ＮＳＣＬＣと診断され、閉経前のエストロゲンレベルを所有する女性が、ＣＴ−２１０３（すなわちＰＰＸ）を含む癌治療から利益を得るが、一方閉経後のエストロゲンレベルを有する女性はＣＴ−２１０３またはパクリタキセルのどちらかによって治療され得ることを示唆している。
【実施例２】
【００６８】
実施例２に示す実験および結果は、全生存率（ＯＳ）によって測定されたように、エストロゲンレベル、ジェンダー（すなわち性別）、ＰＰＸ対パクリタキセルによる治療との間の相関を示す。ＮＳＣＬＣおよび一般状態（ＰＳ２）を有する合計７８１名の患者を含む２つの第ＩＩＩ期試験を実施した。一方の試験（ＳＴＥＬＬＡＲ  ３）において、患者を２つの治療群に分けて、実験群にはＰＰＸ（２１０ｍｇ／ｍ２およびカルボプラチンＡＵＣ  ６、３週間ごと）を投与して、対照群にはパクリタキセル（２２５ｍｇ／ｍ２およびカルボプラチンＡＵＣ  ６、３週間ごと）を投与した。もう一方の試験（ＳＴＥＬＬＡＲ  ４）において、実験群にはＰＰＸ（１７５ｍｇ／ｍ２、３週間ごと）を投与して、対照群にはゲムシタビン（第１日、８日、および１５日に１０００ｍｇ／ｍ２、４週間ごと）またはビノレルビン（第１日、８日、および１５日に３０ｍｇ／ｍ２、３週間ごと）を投与した。各種の治療群間での生存率に対する性別およびエストロゲンの効果を試験するために、第ＩＩＩ期臨床試験からの結果を組み合せて、複合解析を実施した。
【００６９】
生存率の結果に対する性別の効果の結果を下の表１に示す。これらの結果は、対照群の女性と比較して、統計的により多数のＰＰＸによって治療された女性が１年生存点に到達することを示した。これに対して、ＰＰＸ群の男性と対照群の男性との間で１年生存のこのような差はなかった。
【００７０】
【表１】
2009518406.tif 000003
【００７１】
ＰＰＸによって治療された女性の生存率に対するエストロゲンの影響を評価するために、データを閉経状態によって遡及的に解析した。機能的閉経状態は、年齢と、入手可能なときには治療前のエストラジオールレベルとに基づいて割り当てた。本試験は、両方の臨床試験の結果の複合物であった。年齢が５５歳未満の女性では、ＰＰＸを投与された患者について対照の選択肢の患者と比較するとＯＳが長期にわたった（図３）。年齢が５５歳を超える女性では、ＯＳは治療群間で同様であった（図４）。
【００７２】
ＳＴＥＬＬＡＲ  ３において、一部の女性でエストロゲンレベルが入手できた。閉経前のエストロゲンレベルの女性は、ＰＰＸで治療したときに対照と比較して改善された結果を有した（図５）。対照的に、治療群は、閉経後のエストロゲンレベルの患者での生存率に対する明白な影響を有さなかった（データを示さず）。
【実施例３】
【００７３】
実施例３に示す実験および結果は、ＰＰＸが細胞に取り込まれる機構を示す。ＰＰＸの細胞取り込みはインビボで、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した２つの細胞系、ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト肺癌  （Ｈ４６０；ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７７）およびＲＡＷ  ２６４．７マウス単球／マクロファージ（ＲＡＷ；ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−７１）に対して試験を行い、それらを培養して、別個にＰＰＸによって処置した。
【００７４】
実験の１つのセットにおいて、ＰＰＸの取り込みは、次のように作製した放射性標識ＰＰＸを利用して測定した。放射性標識ＰＰＸは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸の標準的な調製物に、２−ベンゾイル環に１４Ｃで均一に標識されたパクリタキセルをコンジュゲートすることによって作製した（１４Ｃ−ＰＰＸ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１．７６２マイクロキュリー（μＣｉ）／ｍｇ比放射能）。細胞は０．０１〜１０μＭの１４Ｃ−ＰＰＸで２分間または３〜４時間処置した。次にシンチレーション計数によって、培地中で放射能を定量した。収集した細胞を酢酸エチルで抽出して、上部有機相（非コンジュゲートパクリタキセルおよび低分子量代謝産物（すなわちモノグルタミルパクリタキセルおよびジグルタミルパクリタキセル）を含有）および下部水相（グルタミル−パクリタキセル代謝産物および無傷のＰＰＸを含有）をカウントした。
【００７５】
ＰＰＸの分布を試験するために、ＲＡＷ細胞を１μＭまたは１０μＭの放射能標識されたＰＰＸ（１４Ｃ−ＰＰＸ）で処置した。２分後、および３時間または４時間後にサンプルを収集した。放射性標識を上記のように定量した。３つのサンプルからの結果を、壊変毎分（ＤＰＭ）±標準偏差として表した。
【００７６】
表２（下記）に示した結果は、１０μＭの１４Ｃ−ＰＰＸによって３時間処置した細胞における無傷のＰＰＸの統計的に有意な増加（ｐ＜０．００１）を示す。
【００７７】
【表２】
2009518406.tif 000004
【００７８】
別の実験において、ＲＡＷ細胞またはＨ４６０細胞のどちらかの２つの集団を、１４Ｃ−ＰＰＸによって２分間、または３時間処置した。集団の１つは、エネルギー依存性エンドサイトーシスの阻害物質（２０μＭのサイトカラシンＤ（Ｃｙｔｏ  Ｄ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または１μＭのフェニルアルシンオキシド（ＰＯＡ，Ｓｉｇｍａ））によってさらに処置した。放射性標識を上記のように定量した。ＤＰＭは、酢酸エチル抽出細胞層コンパートメントの水相における３時間インキュベーションのＤＰＭから２分間インキュベーションのＤＰＭを引くことによって計算した。
【００７９】
表３（下記）に示した結果は、エンドサイトーシスの阻害物質による細胞の前処置が水相で測定した１４Ｃ−ＰＰＸ（無傷のＰＰＸ）の統計的に有意な結果を生じることを示す。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
１４Ｃ−ＰＰＸ取り込み試験による結果は、無傷のＰＰＸがＲＡＷ培養マクロファージおよびＨ４６０腫瘍細胞の細胞コンパートメント中にエネルギー依存性エンドサイトーシスによって用量依存的および時間依存的に取り込まれることを示した。
【００８２】
実験のもう一つのセットでは、ＰＰＸ取り込みを間接免疫蛍光法によって試験した。抗ＰＰＸモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は次のように調製した。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ペプチド（ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＧＬＬ  ＧＮＶ  ＳＴＶ  ＬＬＧ  ＧＶ；Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．）は、ＰＰＸ分子を免疫原性とするために、ジイソプロピルカルボジイミド反応を介して、ＰＰＸ（ＣＴＩ；ｌｏｔ＃  １１１６−９１）にコンジュゲートさせた。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍペプチド−ＰＰＸ抗原を使用して、専売のＲａｐｉｄ  Ｐｒｉｍｅ（登録商標）免疫化手順（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌｔｄ．）によってＭＡｂを生成した。陽性ハイブリドーマクローンは、固定化Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍペプチド−ＰＰＸ抗原を用いた固相ＥＬＩＳＡを使用して選択した。１つのハイブリドーマクローン、ＣＴ−２Ｄ５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスへの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって拡大した。ＣＴ−２Ｄ５はプロテインＧクロマトグラフィーによって腹水から精製した。結合親和性は、固相ＥＬＩＳＡ法によって評価した。ＭＡｂアイソタイプは、Ｉｎｓｔａｎｔ  ＣｈｅｋＴＭ−ＩＳＯＴＹＰＥキット（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）によってＩｇＧ−２ｂであると決定された。ＣＴ−２Ｄ５の結合エピトープは、競合ＥＬＩＳＡ法を使用してマッピングした。
【００８３】
コンフルエント細胞層を１０ｎＭ〜１０μＭのＰＰＸで４時間インキュベートした後に、細胞を固定して、次の方法によって免疫蛍光法のための処理をした。固定された細胞をＣＴ−２Ｄ５、１°抗体（Ａｂ）、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識されたヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２  ２°Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５０００の希釈物によって染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ蛍光顕微鏡、ＣｏｏｌＳｎａｐ  ＨＱカメラによって画像を取り込んだ。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像処理ソフトウェア（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  ｖ．６．２  ｒ６）を利用して、画像を処理および格納した。
【００８４】
ＲＡＷ細胞層は記載したように処理して、次に抗初期エンドソーム抗原−１  Ａｂ（ＥＥＡ−１，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって同時染色した。Ｈ４６０細胞層は上記のように処理した。Ｈ４６０細胞層の追加の集団は、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染料および抗α−チューブリンＡｂによって同時染色した。
【００８５】
間接免疫蛍光試験による結果は、ＰＰＸ免疫染色がエンドソームマーカと同時局在化されたことを示した（データは示さず）。エンドソームはリソソームと融合して、ＰＰＸを、薬物を代謝するリソソーム酵素、主にカテプシンＢに露出させた。
【実施例４】
【００８６】
実施例４に示した実験および結果は、ＰＰＸのインビボにおける輸送を示す。従ってＰＰＸの分布を腫瘍を有するＰＰＸで処置された雌ヌードマウスで試験した。雌ヌードマウスの左側腹部にＨ４６０ヒト腫瘍断片を皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍塊が１００〜１５０ｍｍ３のサイズに達したとき、マウスをＰＰＸの単回ｉ．ｖ．投与（ＰＴＸ当量として９０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。マウスは処置２４時間後に安楽死させた。肺、肝臓、脾臓および腫瘍サンプルを収集して、１０％緩衝ホルマリンで固定して、パラフィン包埋した。組織切片（４マイクロメートル（μｍ））を複数の抗体：ＣＴ−２Ｄ５（実施例３に上述）、  ＣＤ４５ラット抗マウス（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ  Ｎｏ：５５０３９，Ｃｌｏｎｅ：３０−Ｆ１１）、Ｆ４／８０ラット抗マウス（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｃａｔ  ＮＢ  ６００−４０４  Ｃｌｏｎｅ  ＣＩ：Ａ３−）、ＭＨＣＩＩ（ＨＬＡ）マウス抗ヒトモノクローナルＡｂ  ＨＬＡ−ＤＲ  α鎖（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃｌｏｎｅ  ＴＡＬ．１Ｂ５，ＲＥＦ：Ｍ  ０７４６，ＬＯＴ：００００６５１５）、リソザイムポリクローナルウサギ抗ヒト（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，ＥＣ  ３．２．１．１７，Ｃｏｄｅ  Ａ  ００９９）、およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）ポリクローナルウサギ抗ヒト（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃｏｄｅ  ＮＰ０８２）によって染色した。
【００８７】
ＣＴ−２Ｄ５染色は、Ｄａｋｏ−ＡＲＫ  マウス・オン・マウスキットを使用して実施した。ＣＤ４５およびＦ４／８０染色は、Ｖｅｃｔｅｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−アルカリホスファターゼキットを使用して実施した。ＭＨＣＩＩ、リソザイムおよびＭＰＯの染色は、Ｖｅｃｔｅｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ペルオキシダーゼキットを使用して実施した。非特異的な染色を検出するために、陰性の対照切片を次のように調製した。ＣＴ−２Ｄ５、ＣＤ４５、Ｆ４／８０およびＭＨＣＩＩによる免疫染色の間、陰性の対照切片を一次抗体として正常なブロッキング血清を用いてインキュベートした。リソザイムおよびＭＰＯによる免疫染色の間、陰性の対照切片を無関係なウサギポリクローナル一次抗体によってインキュベートした。
【００８８】
デジタルカメラを取り付けた光学顕微鏡を使用して、組織学的検査を実施した。顕微鏡検査は盲検で実施した。正の免疫反応の強度は、任意のスケール（最小からに顕著まで）に従って記録した。ＩＨＣ陽性比率の半定量的評価は、ランダムに選択した１０個の視野において高い倍率（４００倍）で陽性細胞をカウントすることによって実施した。１００倍の代表的視野は、組織における陽性の分布を例証するために取り込んだ。
【００８９】
ＰＰＸによる処置の２４時間後に、細網内皮系の臓器において強い細胞質内染色が見出された。肝臓において、１つの視野当たり形態的にクッパー細胞と適合する約２０細胞（ｃｐｆ）が強い陽性であった。肝細胞は陰性と思われた。脾臓において、マクロファージ形態を有する細胞は陽性（≒１０〜１５ｃｐｆ）であったのに対して、リンパ濾胞は陰性であった。肺において、陽性細胞（＜１ｃｐｆ）はＩＩ型肺細胞と形態学的に適合していた。
【００９０】
腫瘍細胞において、強い細胞質内染色が腫瘍カプセル内に見出された（≒２ｃｐｆ）；陽性細胞の形態は浸潤マクロファージの形態と一致していた。生存細胞と壊死との間の縁は、中程度から強度の粒状の、細胞外、および場合により細胞内（細胞質内および核内）の染色によって特徴付けられた。この区域の組織構造は、壊死プロセスによって激しく損なわれ、従ってＣＴ−２Ｄ５陽性細胞の形態学的分析による信頼性のある同定は不可能であった。
【００９１】
脾臓において、赤脾髄におけるほぼ全ての細胞が、ＣＤ４５に対する強い細胞質内陽性を示し、白脾髄においてもわずかから中程度の陽性が見出された。Ｆ４／８０の中程度の細胞質内染色は赤脾髄においてより少数の細胞（≒１０〜１５ｃｐｆ）で見られた。肝臓において、わずかから中程度の細胞質内染色がＣＤ４５およびＦ８／４０の両方で見られた（≒２０ｃｐｆ）。肺において、中程度から強度の細胞質内染色がＣＤ４５について見られた（≒２〜５ｃｐｆ）。Ｆ４／８０に対するわずかな細胞質内染色が少数の細胞で見られた（＜１ｃｐｆ）。肝臓、脾臓および肺のＦ４／８０陽性細胞の形態および分布パターンは、同じ組織内のそのＣＴ−２Ｄ５陽性細胞と一致した。
【００９２】
腫瘍において、強い細胞質内染色が腫瘍カプセル内のＣＤ４５およびＦ４／８０（≒それぞれ６および４ｃｐｆ）の両方に見られた。まれにＣＤ４５およびＦ４／８０の陽性細胞が生存腫瘍組織内に局在化していた。生存腫瘍細胞と壊死との間の縁は、ＣＤ４５に対しての中程度から強度の細胞外粒状染色、および場合により細胞内染色によって特徴付けられた。これらの細胞の形態は、核溶解−核崩壊顆粒球の形態と一致していた。壊死区域は、ＣＤ４５の顕著な陽性によって特徴付けられた。壊死周囲および壊死区域は、Ｆ４／８０に対して陰性であった。
【００９３】
ＭＨＣＩＩの特異的免疫反応性（≒１０ｃｐｆ）は、腫瘍の外部カプセルに局在化していた。腫瘍の生存部分にまれな（≦１ｃｐｆ）および点在した陽性細胞が見出された。免疫反応性細胞の形態学的分析は、組織球起源であることを示している。壊死区域には陽性染色は見出されなかった。
【００９４】
リソザイムの陽性免疫反応性（≒１０ｃｐｆ）は、腫瘍の外部カプセルに局在化していた。強度の陽性染色（微細粒状細片）が腫瘍の壊死区域で見出された。
【００９５】
核溶解−核崩壊顆粒球と形態的に一致する多数のＭＰＯ免疫反応性細胞が、腫瘍の壊死区域で見出された。
【００９６】
本試験の結果は、注射の２４時間後にＰＰＸの摂取および蓄積が別の臓器および腫瘍組織で検出され得ることを確認する。
【００９７】
ＣＤ４５（白血球共通抗原）およびＦ４／８０（特異的マウスマクロファージ抗原）のシグナルの共局在化によって裏付けられる形態評価は、ＣＴ−２Ｄ５陽性細胞が肝臓、脾臓、肺、および腫瘍カプセル内において全て骨髄組織球起源であることを証明した。これらはＰＰＸが、肝細胞、肺の肺胞内膜細胞、または脾臓の白脾髄への著しい分布なしに、主に細網内皮系の組織関連マクロファージに摂取されたことを確認する。
【００９８】
壊死区域および壊死周辺区域におけるＣＴ−２Ｄ５陽性の評価は、生存細胞の制限された数によって複雑にされた。それにもかかわらずＣＤ４５、ＭＰＯおよびリソザイムの陽性ならびに形態検査は、腫瘍のこれらの区域へのＰＰＸ蓄積が多形核（ＰＭＮ）白血球浸潤に関連し、細胞内ＰＰＸがその区域でのそれらの食作用活性によることを示唆している。
【００９９】
この腫瘍モデルの中心部におけるマクロファージの蓄積の欠如は、潜在的に重要な腫瘍内ＰＰＸ代謝の源、およびＴＡＭ機能に対する細胞内の遊離パクリタキセルＰＰＸの高く長期にわたる濃縮の潜在的な効果の両方としての、ＰＰＸと腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）との潜在的な相互作用の評価を妨げる。
【０１００】
Ｈ４６０腫瘍の異種移植腫瘍組織の壊死区域にて検出されたＰＰＸの蓄積は、腫瘍脈管構造の増強された浸透性および保持（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ：ＥＰＲ）の効果によるＰＰＸの分布増強と矛盾がない。
【０１０１】
Ｈ４６０異種移植片の腫瘍カプセル内の高レベルのＰＰＸの存在は、従来の体内分布試験と一致し、ＰＰＸの優先的な腫瘍蓄積を確認する。
【０１０２】
ＰＰＸの細胞内局在化は主に、食細胞、すなわち組織関連マクロファージ（肝臓、脾臓）または腫瘍浸潤マクロファージで観察される。
【０１０３】
腫瘍組織において、細胞内ＰＰＸおよび細胞外ＰＰＸは、リソソーム活性のマーカと共局在化する。
【０１０４】
同時にこれらの観察は、ＰＰＸが腫瘍組織に優先的に蓄積して、リソソーム酵素のタンパク質分解活性によるパクリタキセルの放出が続くモデルと一致している。
【実施例５】
【０１０５】
ヒト腫瘍異種移植片におけるカテプシンＢおよびＰＰＸ活性に対するエストロゲンの効果を調査するための試験を実施した。本効果を試験するために、ＨＴ−２９ヒト直腸結腸癌（ＣＲＣ）およびＨ４６０ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＬＣＬ）（どちらもＡＴＣＣより）細胞を雌ＣＤ  ｎｕ／ｎｕマウスにｓ．ｃ．移植した。プラセボ、または０．１７、０．３６、０．７２ｍｇ／６０日の１７βエストラジオール（Ｅ２）制御放出ペレット（ＩＲＡ）を、第０日にｓ．ｃ．インプラントして、５日後にヒト腫瘍断片を移植した。ペレットのインプラント後の第５、２１、２８および３５日に、血液および腫瘍を収集した（マウス５匹／時点）。
【０１０６】
ＨＴ−２９ヒトＣＲＣ異種移植腫瘍モデルでのＰＰＸおよびパクリタキセルの抗腫瘍活性に対するエストロゲン処置の効果を次の方法によって分析した。腫瘍が１２０〜１５０ｍｇ（すなわち進行腫瘍）であるとき、ＰＰＸ（ｉ．ｖ．／ｑｄｌ  ９０ｍｇ／キログラム（ｋｇ）ＰＴＸ当量）およびＰＴＸ（ｉ．ｖ．／ｑｄｌ  ９０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を腫瘍およびプラセボ（Ｐ）またはＥ２ペレットを有するマウスに投与した。薬物処置後の第１日（２４時間）および第７日（１６８時間）に、腫瘍を収集して、切開直後に液体窒素で高速凍結させた。
【０１０７】
抗腫瘍活性パラメータを次のように決定した。
１．腫瘍重量阻害％（ＴＷＩ％）は、１００−（対照のＴＷで割った処置のＴＷ）×１００に等しく、ペレットのインプラントから６０日目に評価した。
２．腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）：ＴＧＤは、ＴＧ処置−ＴＧ対照と等しく、ＴＧは、腫瘍が１グラム（ｇ）の重量に達する平均時間（日）である。
３．ｌｏｇ細胞死滅（ＬＣＫ）を式：ＬＣＫ＝（（ＴＧＤ１ｇ）／３．３２）×ＤＴによって計算し、式中、ＤＴは、対照群および実験群において腫瘍の体積が２倍になるのに必要な時間（日）である。
【０１０８】
一元配置分散分析ボンフェローニの事後検定を使用して統計分析を実施した。
【０１０９】
エストロゲンの血漿中レベルは、ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  ＫＩＴ（ＤｉａＳｏｒｉｎ）によって決定した。
【０１１０】
腫瘍組織における非コンジュゲートパクリタキセルおよび全パクリタキセルの分析は、次の方法によって決定した。組織の適切なホモジネーションの後、非コンジュゲートパクリタキセル濃度をメチル−ｔｅｒｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）による液体／液体抽出によって決定した。全パクリタキセルは、ＰＰＸのメタノリシス反応後の、放出されたパクリタキセルのＭＴＢＥ抽出の後に測定した。処理サンプル中のパクリタキセル含量は、選択した反応の監視における最適化された条件の下でＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってアッセイした。
【０１１１】
ＥＲα、ＥＲβ、Ｅ−カドヘリンおよびＩｄ−２の遺伝子発現は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現にそのＲＮＡ発現を関連付けるＲＴ−ＰＣＲによって決定した。腫瘍から抽出した全ＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）によって逆転写した。生成されたｃＤＮＡは、ＥＲαおよびβ、Ｅ−カドヘリンおよびＩｄ−２に特異的なプライマーを用いたＰＣＲのテンプレートとして使用した。
【０１１２】
ウェスタンブロット分析は次のように実施した。タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液中でのホモジネーションによって抽出して、その含量をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって決定した。タンパク質のアリコートを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズにより分離して、ニトロセルロース膜に移した。免疫検出は、抗ＥＲαポリクローナル抗体（ＨＣ−２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗ＥＲβポリクローナル抗体（０６−６２９、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗α−アクチン（Ｓｉｇｍａ）、および抗α−チューブリン（Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。
【０１１３】
カテプシンＢ活性アッセイを次のように実施した。タンパク質を、組織１００ｍｇ当たり緩衝液１ｍｌの比で、カテプシンＢ緩衝液中でのホモジネーションによって抽出した。試験は、カテプシンＢが合成基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣを消化する能力を利用した。放出されたＡＭＣは、励起波長３９０ｎｍおよび放射波長４６０ｎｍにて蛍光定量的に決定した。カテプシンＢの活性をＡＭＣ標準曲線に対して定量した。
【０１１４】
ヒト腫瘍細胞系、ならびにＨＴ−２９およびＨ４６０ヒトの異種移植腫瘍モデルにおけるＥＲαおよびＥＲβの発現は、ウェスタンブロット分析によって証明した（図６）。
【０１１５】
腫瘍増殖およびカテプシンＢ活性に対する算出されたエストロゲンレベルの効果をＨＴ−２９ヒトＣＲＣ異種移植腫瘍モデルで証明した。結果は、エストロゲン（１７βエストラジオール）のレベル上昇が腫瘍重量およびカテプシンＢ活性の両方の増加をもたらすことを示した（図７）。同様の効果がＨ４６０ヒトＮＳＣＬＣ異種移植腫瘍モデルで観察された（図８）。
【０１１６】
ＨＴ−２９ヒトＣＲＣおよびＨ４６０ヒトＮＳＣＬＣでのＥＲβ発現に対するエストラジオールの効果をウェスタンブロットによって分析した（それぞれ図９および１０）。
【０１１７】
ＨＴ−２９ヒトＣＲＣ細胞およびＨ４６０ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるＥＲβ活性化に対するエストラジオールの効果をＲＴ−ＰＣＲによって分析したところ、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現上昇（ＨＴ−２９細胞において）およびＩｄ−２遺伝子の発現上昇（Ｈ４６０細胞において）が、ＥＲβの活性化を示している（それぞれ図１１および１２）。
【０１１８】
ＨＴ−２９ＣＲＣ異種移植腫瘍モデルを利用して、ＰＰＸ代謝に対するエストロゲン処置の効果が証明された。結果を表４（下記）に示す。（＋（Ｅ２）は、１７βエストラジオール０．７２ｍｇを添加した腫瘍を有するマウスであり、−（Ｐ）は、添加しなかった腫瘍を有するマウスである。３つの腫瘍のプールからのデータである）。ＰＰＸ投与後には、腫瘍において非コンジュゲートパクリタキセル自体を投与したときに達成された濃度よりも、より高い非コンジュゲートパクリタキセルの濃度が観察された。
【０１１９】
【表４】
2009518406.tif 000006
【０１２０】
全体的に見て、実施例５で示した結果は、エストロゲン媒介シグナル伝達がＥＲβに主に依存して、Ｅ２の添加がＥＲβの活性化および／または発現を誘発することと、カテプシンＢ活性の上昇がＨＴ−２９細胞におけるＰＰＸ抗腫瘍活性の強化と関連付けられていることとを示している。
【実施例６】
【０１２１】
実施例６に示した実験および結果は、ラットモデルを利用する、エストロゲンの存在および非在下での各種組織における遊離パクリタキセルおよび全パクリタキセルについて述べる。これらの試験では、ラットを３つの群、１）雄、２）偽手術（すなわち無処置）雌、および３）卵巣摘出雌に分けた。ラットに１４Ｃ−ＣＴ２１０３（１４Ｃ標識コンジュゲートパクリタキセル、すなわち１４Ｃ標識ＰＰＸ）を２５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内注射として与えた。
【０１２２】
各種の注射後の時点で、１群当たり３匹のラットを安楽死させて、各種の組織（すなわち肺、肝臓および骨髄）中の非コンジュゲートパクリタキセルおよび全パクリタキセルをアッセイした。
【０１２３】
本試験による結果は、非コンジュゲートパクリタキセルおよび全パクリタキセルの両方が、偽手術雌ラットの肺組織で、雄ラットまたは子宮摘出雌ラットにおけるレベルに対して、統計的により高いレベルで蓄積したことを示している。対照的に、雄ラット、偽手術雌ラット、または子宮摘出雌ラット間で肝臓または骨髄への薬物蓄積には統計的な差はなかった（図１３）。まとめると、これらのデータは、エストロゲンの存在下でパクリタキセルが肺組織に統計的により高いレベルで蓄積することを確立している。
【０１２４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許刊行物および非特許刊行物のどちらも、本発明が関係する当業者のレベルを示す。これら全ての刊行物は、各刊行物それぞれが引用することにより一部をなすと特別および個別に示されているのと同じ程度まで、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１２５】
本発明は本明細書で特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態が単に本発明の原理および利用を示すことが理解されるはずである。従って添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、例証的な実施形態に多数の改良を行えることと、他のアレンジが考案されることとが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】コンジュゲートパクリタキセル＋カルボプラチン（ＣＴ−２１０３＋カルボ（すなわちカルボプラチン）、実線に白丸）または非コンジュゲートパクリタキセル＋カルボプラチン（パクリタキセル＋カルボ（すなわちカルボプラチン）、点線に白正方形）のどちらかで治療した、閉経後（すなわち低い）の血漿中エストロゲンレベルの女性についての、生存を日数で示す線グラフである。
【図２】コンジュゲートパクリタキセル＋カルボプラチン（ＣＴ−２１０３＋カルボ、実線に白丸）または非コンジュゲートパクリタキセル＋カルボプラチン（パクリタキセル＋カルボ、点線に白正方形）のどちらかで治療した、閉経前（すなわち高い）の血漿中エストロゲンレベルの女性についての、生存を日数で示す線グラフである。
【図３】パクリタキセルポリグルメックス（ＰＰＸ）で治療した５５歳未満の女性における全生存率（ＯＳ）を対照と比べて示す線グラフである。
【図４】ＰＰＸで治療した５５歳を超える女性におけるＯＳを対照と比べて示す線グラフである。
【図５】ＰＰＸで治療した閉経前の女性におけるＯＳを対照と比べて示す線グラフである。
【図６】ヒト腫瘍細胞系ならびにＨＴ−２９腫瘍モデルおよびＨ４６０腫瘍モデルにおけるＥｒαおよびＥＲβの発現を示すウェスタンブロットである。
【図７】ＨＴ−２９腫瘍モデルにおける腫瘍重量およびカテプシンＢ活性に対するエストロゲンの効果を示す線グラフのセットである。
【図８】Ｈ４６０腫瘍モデルにおける腫瘍重量およびカテプシンＢ活性に対するエストロゲンの効果を示す線グラフのセットである。
【図９】ＨＴ−２９腫瘍モデルにおけるエストロゲン受容体β（ＥＲβ）の発現に対するエストラジオールの効果を示すウェスタンブロットである。
【図１０】Ｈ４６０腫瘍モデルにおけるＥＲβの発現に対するエストラジオールの効果を示すウェスタンブロットである。
【図１１】エストロゲン受容体シグナル経路のＥ−カドヘリン下流遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。
【図１２】エストロゲン受容体シグナル経路の下流遺伝子（Ｉｄ−２）のＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。
【図１３】雄ラット（Ａ）、雌ラット（Ｂ）または卵巣摘出雌ラット（Ｃ）の肝臓、肺または骨髄のいずれかにおける非コンジュゲートパクリタキセルまたは全パクリタキセルのレベルを、ｎｇ薬物／ｇ組織で示す線グラフのセットであり、（Ａ）は黒実線に白正方形であり、（Ｂ）は青実線に白正方形であり、（Ｃ）は赤実線に白正方形である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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