(57)【要約】本発明は、生物分子の拡散を可能にする孔を有する多孔性基材を含む核酸増幅のための方法、基材、キットおよびシステムに関する。より具体的に、本発明は、核酸増幅が多孔性基材の孔内で起こる方法、基材、キットおよびシステムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）区画を提供するように構造化された多孔性基材を提供する工程、
b)該多孔性基材に、核酸含有試料および増幅混合物を添加する工程、
c)該多孔性基材を温度サイクルに曝露する工程
を含み、核酸増幅が該多孔性基材の孔内で起こる、核酸増幅のための方法。
【請求項２】
工程a)における該多孔性基材は、少なくとも1つの結合プライマーを提供され、および／または該増幅混合物は酵素、ヌクレオチドおよびバッファを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該少なくとも1つの結合プライマーは該温度サイクルを実施する前に該多孔性基材から切断される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該区画のそれぞれにおいて、個々の核酸増幅が実施される、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
該区画が該多孔性基材の化学官能化によって提供される、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
該区画が流体のスポッティングによって提供される、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項７】
さらなるプレハイブリダイゼーション工程が、該多孔性基材を温度サイクルに曝露する前および該多孔性基材からのプライマーの任意の切断の前に実施される、請求項２〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
該多孔性基材が区画間のクロストークを回避するために密封される、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
該多孔性基材が、ガラスフリース、セルロースのような有機ポリマー、またはナイロン、ポリエステル、ポリプロピレン(PP)、ポリエチレン(PE)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリアクリルニトリル(PAT)、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)もしくはポリスチレンのような無機ポリマーである、請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
a)複数の個々の核酸増幅を並行して実施するための区画、
b)多孔性基材の孔内での核酸増幅のために核酸分子およびポリメラーゼの拡散を可能にする孔、ならびに
c)該多孔性基材の表面に結合した少なくとも１つのプライマー
を含む、核酸増幅のための多孔性基材。
【請求項１１】
該プライマーが多孔性基材に共有結合される、請求項１０記載の多孔性基材。
【請求項１２】
該区画が化学障壁で規定され、好ましくは該化学障壁が該多孔性基材の化学官能化である、請求項１０〜１１いずれか記載の多孔性基材。
【請求項１３】
核酸増幅のためのマルチウェルプレートであって、該マルチウェルプレートの各ウェルは、核酸増幅が該多孔性基材の該孔内で起こるように請求項１０〜１２いずれか記載の多孔性基材を含む、マルチウェルプレート。
【請求項１４】
a)請求項１０〜１２いずれか記載の多孔性基材、および
b)増幅混合物
を含む、核酸増幅のためのキット。
【請求項１５】
a）請求項１０〜１２いずれか記載の多孔性基材、および
b)サーモサイクラー
を備える、核酸増幅のためのシステム。
【請求項１６】
該サーモサイクラーが照明手段および検出手段を備える、請求項１５記載のシステム。
【請求項１７】
該核酸増幅がリアルタイムPCRである、請求項１６記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物分子の拡散を可能にする孔を有する多孔性基材を含む核酸増幅のための方法、基材、キットおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
核酸の増幅は、核酸分析に基づいたほとんど全ての診断試験または分析試験の本質的な部分である。目的の核酸は非常に低い濃度でのみよく存在するため、これらの試験は検出可能な量の核酸分子を生成するために少なくとも1つの増幅工程を含む。2つのオリゴヌクレオチドプライマーの選択結合を伴う周知のアッセイは、US4,683,195に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。この方法は、デオキシヌクレオチド3リン酸の存在下での熱安定性ポリメラーゼによって、検出可能なレベルまで特定の核酸領域の選択的増幅を数サイクルで可能にする。
【０００３】
スループットおよび費用は、産業のためだけでなく科学適用のためにも重要であるために、PCR系試験の並列化および小型化のための高い要求がある。PCR増幅の並列化のための周知のアプローチは、サーマルブロックを用いることによって全体として温度サイクルに曝露され得るマルチウェルプレートの使用である。なお、マルチウェルプレート内で直接的に（例えば、蛍光によって）、または例えば、ゲル電気泳動もしくは質量分析測定法を用いることによって外部的にPCR結果を分析することが可能である。このようなマルチウェルプレートは、並行して数100反応を可能にし、それぞれは数μlの反応体積を有する。1536ウェルまでを有するマルチウェルプレートにおけるPCR増幅のためのシステムが、数社から市販されている。
【０００４】
より最近、固体支持体中の10,000までの均一に分布した穴がそれぞれわずか50nlの体積を有する特別な支持体が、利用可能であり（Brenan et al, Proc.SPIE, Vol. 4626, p.560-569）、数千の異なるPCR適用を並行して実施する。しかし勿論、通し穴を有するこのような支持体の製造、液体の取り扱い、蒸発および隣接ウェル間の交差汚染はこのようなシステムにおいて大変な労力を要する。
【０００５】
Applied Biosystems Inc.(Foster City, CA/USA)は、ユーザーが試料あたり48の異なるPCRアッセイを有する使い捨てプラスチック中で8試料までのPCR反応を実施することを可能にする微小流体カードを売り出した。プライマーおよび加水分解プローブがプレ合成され、異なるウェルにスポットされ、その後乾燥される。実験のために、ユーザーは、PCR反応が起こる前にPCR混合物が異なるウェルにチャネル系を介して拡散し得るように、試料を含むPCRマスターミックスを１つのウェルにピペッティングし、密封ホイルでカードを密封し、カードを遠心しなければならない。
【０００６】
Fluidigm(San Francicso, CA/USA)は、全2.304実験のために48試料と48アッセイを合わせるためのナノ流体チップを用いるリアルタイムPCRのためのシステムを開発した。ナノ流体チップは、試料、プライマーセットおよびFRETプローブで充填された後、装置が自動的に試料を合わせ、別々の10nl反応チャンバー内で可能な全ての対合にアッセイする。
【０００７】
（発明の要約）
先行技術を考慮して、本発明は、核酸増幅が多孔性基材の孔内で起こる核酸増幅のための方法、基材、キットおよびシステムに関する。
【０００８】
本発明の1つの側面は、
a)区画を提供するように構造化された多孔性基材を提供する工程、
b)該多孔性基材に、核酸含有試料および増幅混合物を添加する工程、
c)該多孔性基材を温度サイクルに曝露する工程
を含み、核酸増幅が該多孔性基材の孔内で起こる、核酸増幅のための方法である。
【０００９】
本発明を通して、核酸増幅は、当業者に公知の全ての種類の増幅手順、例えば、US 4,683,195に記載されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を要約する。他の可能な増幅反応は、リガーゼ連鎖反応（LCR, Wu, D.Y.およびWallace,R.B., Genomics 4 (1989）560-569ならびにBarany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)189-193);ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応(Barany, PCR Methods and Applic.1(1991)5-16);ギャップ-LCR(PCT特許公開第WO 90/01069号);修復連鎖反応(欧州特許公開第439 182 A2)、3SR(Kwoh, D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989)1173-1177;Guatelli, J.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990)1874-1878;PCT特許公開第WO 92/08800号)、ならびにNASBA(米国特許第5,130,238号)である。さらに、鎖置換増幅(SDA)、転写媒介増幅（TMA）、およびQβ増幅（概説について、例えば、Whelen, A.C.およびPersing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50(1996)349-373;Abramson;R.D.およびMyers, T.W., Current Opinion in Biotechnology 4(1993)41-47を参照）がある。
【００１０】
十分な寸法の孔は核酸増幅が該多孔性基材の孔内で起こり得るように提供される限り、多孔性基材として、全ての物質が本発明に適用可能である。該孔の配置は関連性がなく、基材は均一またはランダムに分布した孔および均一または分散した寸法を有する孔を有し得ることに注意されたい。すなわち、孔は、流体で充填され得る多孔性基材の物質内の空の空間であり、核酸のような分子および酵素の拡散を可能にする。
【００１１】
該多孔性基材の孔内で核酸増幅を可能にするために、基材とその周囲との間での流体交換が可能であることが勿論必要であり、従って物質はその内部においてだけでなく、その界面にも孔を有さなければならない。核酸増幅が多孔性基材の孔内で起こるために、該多孔性基材は、該核酸含有試料および該増幅混合物と物理接触しなければならない。次のPCR増幅のために、周囲との交換が回避されるように多孔性基材を密封することが好まれ得る。
【００１２】
核酸含有試料は、本発明を通して溶液中のあらゆる種類の核酸を要約する。該試料は、任意に他の生物学的分子と共に、１つ以上の種類の核酸分子を含み得る。用語核酸は、DNA、RNA、もしくはロックされた核酸（LNA）のような核酸アナログまたはこれらの組み合わせを要約する。
【００１３】
核酸増幅反応に必要な全ての試薬は、本発明を通して句増幅混合物によって要約される。増幅混合物は、例えば、適切なバッファ、溶媒および界面活性剤と共に、酵素、プライマー、およびヌクレオチドを含み得る。
【００１４】
熱安定性および化学安定性に関する特定の要件のほかに、他の物理的パラメーターは本発明のための物質の適用可能性を制限しない。物質は、有機または無機、非晶質または結晶、固体状態またはプラスチックおよび弾性または非弾性であり得る。例は、ガラスフリース、ガラス繊維、プラスチック、金属酸化物、シリコン誘導体、セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリプロピレン(PP)、ポリエチレン(PE)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリアクリルニトリル(PAT)、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)またはポリスチレンである。
【００１５】
物質の熱安定性は、例えばPCR増幅に必要な温度差のために必要とされる。1つのPCR増幅サイクルは、加熱、冷却の段階、および一定温度の段階を含むが、１つのサイクルの開始時の温度は、該サイクルの終了時の温度と同じである。経時的にこれらの温度変化は、句温度サイクルによって要約され、該多孔性基材の温度のサイクル変化を例示する。ほとんどの核酸増幅反応はバッファまたは溶媒のような特定の試薬を必要とし、本発明の多孔性基材が該化学物質に関して耐性でなければならないために、化学安定性が必要である。
【００１６】
本発明の別の側面は、
a)複数の個々の核酸増幅を並行して実施するための区画、
b)多孔性基材の孔内での核酸増幅のために核酸分子およびポリメラーゼの拡散を可能にする孔、ならびに
c)該多孔性基材の表面に結合した少なくとも１つのプライマー
を含む、核酸増幅のための多孔性基材である。
【００１７】
多孔性基材の表面は、多孔性基材の周囲との全ての界面、すなわち、基材の外側および孔の内部を要約する。本発明を通して、少なくとも1つの結合プライマーを有する多孔性基材は、壊れやすい物質の場合の多孔性基材を支持する手段または多孔性基材との制御された流体連絡を提供する手段のような特定の更なる要素と共に得られ得る。
【００１８】
本発明のなお別の側面は、核酸増幅のためのマルチウェルプレートであって、該マルチウェルプレートの各ウェルは、核酸増幅が該多孔性基材の該孔内で起こるように本発明による多孔性基材を含む。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、
a)本発明による多孔性基材、および
b)増幅混合物
を含む、核酸増幅のためのキットである。
【００２０】
本発明のさらに別の側面は、
a)本発明による多孔性基材、および
b)サーモサイクラー
を備える、核酸増幅のためのシステムに関する。
【００２１】
サーモサイクラーは、該核酸増幅用デバイスを温度サイクルに曝露する装置である。温度サイクルは、ほとんどの核酸増幅反応に必要であり、従って該サーモサイクラーは、増幅反応が該多孔性基材の孔で起こるような方法で、多孔性基材内の温度を変更する。
【００２２】
任意に、該サーモサイクラーは、多孔性基材内での核酸増幅を分析するために更なる手段を有し得る。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明の1つの側面は、
a)区画を提供するように構造化された多孔性基材を提供する工程、
b)該多孔性基材に、核酸含有試料および増幅混合物を添加する工程、
c)該多孔性基材を温度サイクルに曝露する工程
を含み、核酸増幅が該多孔性基材の孔内で起こる、核酸増幅のための方法である。
【００２４】
核酸増幅に必要な増幅混合物に関して、本発明の方法は、少なくとも２つの異なる方法で実施され得る。適切なバッファ、溶媒および／または界面活性剤と共に、酵素、プライマーおよびヌクレオチドが核酸増幅を実施するために必要とされることを当業者は知っている。
【００２５】
従って、本発明による好ましい方法において、該増幅混合物は、酵素、プライマー、ヌクレオチドおよびバッファを含む。
【００２６】
核酸増幅が多孔性基材の孔内で起こるために、該多孔性基材は、該核酸含有試料および該増幅混合物と物理接触しなければならない。これは、例えば、該核酸含有試料および該増幅混合物を含む溶液に多孔性基材を浸漬すること、または該核酸含有試料および該増幅混合物を多孔性基材の規定領域にスポッティングもしくはピペッティングすることにより、確実にされ得る。もちろん、スポッティングまたはピペッティングする態様の利点は、より少ない量の試料および試薬が必要とされ、1つより多くの試料を1つの多孔性基材に適用し得ることである。該核酸含有試料および該増幅混合物を該多孔性基材に連続して、またはピペッティング、インクジェットピン印刷もしくはマイクロチャネル堆積のようないくつかの技術によって１段階で添加することが可能である。
【００２７】
本発明による別の好ましい方法において、工程a)における該多孔性基材は、少なくとも１つの結合プライマーを提供され、および／または該増幅混合物は酵素、ヌクレオチドおよびバッファを含む。
【００２８】
本発明のこの態様において、増幅反応に必要なプライマーは、増幅混合物の添加前に多孔性基材上に既に存在している。該プライマーは、多孔性基材の表面に結合されることが好ましい。以前に言及したように、多孔性基材の表面は、多孔性基材の周囲との全ての界面、すなわち、基材の外側および孔の内部を要約する。
【００２９】
結合プライマーは、多孔性基材の表面に結合するプライマーである。本発明の範囲内で、当業者に公知のあらゆる種類の結合がある。例は、例えば、シランカップリング、アミド結合またはエポキシド結合のような共有結合、例えば、His-tagとキレート剤との間のような配位結合、例えば、ビオチン/ストレプトアビジン結合のようなバイオアフィン結合である。あるいは、プライマーの多孔性基材への結合は、物理吸着であり得る。この態様において、プライマーは、例えば該プライマーを基材にスポッティングまたはピペッティングし、続いて溶媒の蒸発によって単純に多孔性基材に適用される。
【００３０】
本発明によるより好ましい方法において、該少なくとも1つの結合プライマーが、多孔性基材上で合成される。
【００３１】
本発明による別のより好ましい方法において、該少なくとも1つの結合プライマーが、多孔性基材にスポットされる合成プライマーである。
【００３２】
主に、多孔性基材に少なくとも1つの結合プライマーを提供するための2つの異なる戦略、要するにプライマー全体の基材への結合（オフチップ合成）またはプライマーの基材上での合成（オンチップ合成）がある。
【００３３】
オフチップ合成について、多孔性基材は、該プライマーを含む溶液に浸漬され得るか、例えば該プライマーを多孔性基材の規定領域にスポッティングまたはピペッティングすることによってであり得る。物理吸着以外も必要とされる場合、次のカップリングが使用された基材物質およびプライマーの結合部分に依存して達成され、いくつかの代替が当業者に公知である。可能な表面改変は、例えばエポキシシラン誘導体のようなエポキシ官能化またはアルデヒド官能化またはヒドロキシル官能化またはチオール官能化または例えばアミノプロピルトリエトキシシランのようなアミノ官能化または多官能性アミノコーティングであり得る（例えば、Schott Nexterionからの市販製品を参照）。スポットされるプライマーを表面に共有結合させるために、例えばUV媒介架橋を介した光化学カップリング、適切な試薬を用いた湿式化学補助カップリング、例えば、レドックスカップリングのような電気化学媒介カップリングまたは例えばディールス-アルダー反応を介したクロスカップリングのような、異なる技術を使用し得る。
【００３４】
オンチップ合成中に、プライマーは、多孔性基材上で1つより多くの工程において単一のヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから合成される（本発明を通してヌクレオチド構成単位と呼ばれる）。この手順のどの工程も本発明を通して合成サイクルと呼ばれる。
【００３５】
好ましくは、プライマーの多孔性基材上での合成または結合は、本発明を通して電気化学手順により実施される。結合プライマーを有するこのような多孔性基材の電気化学生成を実現するために、多孔性基材および／またはヌクレオチド構成単位が保護基で保護される結合部位を有さなければならないが、これらの保護基は電気化学的に不安定である。従って、電気化学生成の各合成サイクルは、電位が多孔性基材に印加され、印加電位に電気化学的に不安定であり、かつ多孔性基材の特定の部分および／または多孔性基材に既に結合した特定のヌクレオチド構成単位に位置する、これらの保護基の結合部位を電気化学的に脱保護する少なくとも１つの状態を含む。保護基の脱保護は、保護基全体を切断し、保護基の一部を切断し、または保護基内のコンホメーション変化により起こり得る。電気化学的に不安定な保護基の電気化学的脱保護は、印加電位による直接脱保護および印加電位による電極配列の特定の電極の表面で生じるメディエータによる脱保護を含む。特定の保護基の脱保護の後に、単一のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドが該脱保護結合部位に結合し得る。
【００３６】
また、電極は、結合プライマーを有するこのような多孔性基材の電気化学生成を実現するために電位を印加することが必要である。好ましくは、該電極は、固体支持体および1つより多くの個々の電極の配置を含む電極配列の形態で配置される。任意の物質は、適切な電気伝導率を有し、かつ特定のポテンシャル範囲にわたって電気化学的に安定であり、すなわち、金属物質または半導体物質である限り、これらの個々の電極に使用され得る。個々の電極の固体支持体について、任意の物質が、個々の電極間の短い回路を回避する特性を有する限り、使用され得る。
【００３７】
個々の電極の配置は、どの電極も選択的にアドレス可能な電極であるように、設計される。従って、個々の電極の配置の設計は、それら自身の電位によって同時に群における特定の数の電極または各電極をアドレスする選択肢を提供する。
【００３８】
該電極配列のどの電極も、電気化学反応が該電極での印加電位によって起こり得る特定の領域を多孔性基材上に規定する。従って、どの電極も多孔性基材の個々のスポットに対応するが、各個々のスポットは、電気化学生成後に生成手順で規定され得るプライマー配列をもたらす特定のプライマーを含む。
【００３９】
本発明を通して、好ましい保護基は、酸に不安定な保護基、好ましくはピクシル基またはトリチル基、最も好ましくは4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル（DMT）または4-モノメトキシトリフェニルメチル（MMT）であるか、塩基に不安定な保護基、好ましくはレブリニル基またはシリル基、最も好ましくはtert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）またはtert-ブチルジフェニルシリル（TBDPS）である。
【００４０】
本発明によるより好ましい方法において、該結合プライマーは、該温度サイクルを実施する前に該多孔性基材から切断される。
【００４１】
本発明によるこの好ましい方法において、多孔性基材に結合されたプライマーは核酸増幅の前に放出され得る。従って、プライマーの多孔性基材への結合は、特定の条件下で不安定でなければならない。プライマーの多孔性基材からの切断は、電位、放射（例えば、UV光）、熱処理または化学処理を用いて実施され得る。プライマー用の可能で切断可能なリンカーは、スクシニルリンカー、オキサリルリンカー、もしくはヒドロキノンリンカー（Qリンカー）のような塩基に不安定な部分、または2-ニトロベンジル-スクシニルリンカーもしくはベラトロール-カーボネート(carbonat)リンカーのような光に不安定な部分、またはチオ-スクシニル-リンカーのような還元条件下で切断可能なリンカー、またはトリチル基の誘導体、例えば、4,4'-ジメトキシトリチル基の誘導体のような酸に不安定な部分である。
【００４２】
核酸増幅は、切断されるプライマーおよび結合されるプライマーを有する該多孔性基材の孔内で実施され得ることに注意されたい。核酸増幅は、加熱、冷却の段階、および一定温度の段階を含む温度サイクル中に起こるが、1つのサイクルの開始時の温度は該サイクルの終了時の温度と同じである。最後の温度サイクルの後に、増幅された核酸の特定の量が多孔性基材の孔内に存在する。ユーザーの要求に依存して、主に、多孔性基材内で増幅産物を検出または分析する2つの異なる手順がある。
【００４３】
本発明のなお別の好ましい態様において、該増幅核酸は、遠心分離によって該多孔性基材から抽出される。
【００４４】
本発明による多孔性基材を用いて、例えば、ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーションアッセイまたは質量分光測定法を用いた外部分析のために、増幅産物を除去することが可能である。
【００４５】
区画を有さずに構造化されていない多孔性基材が使用される場合、基材全体は、増幅核酸を抽出する遠心分離容器に置かれ得る。区画を有する構造化された多孔性基材が使用される場合、各区画からの増幅核酸が別々の容器に回収されることを確実にしなければならない。これは、多孔性基材が該マイクロタイタープレートの上に置かれる場合に各区画がマイクロタイタープレートのウェルの上にあるような方法で、多孔性基材の区画のサイズおよび分布に調整されたマイクロタイタープレートを用いることによって達成され得る。
【００４６】
あるいは、多孔性基材は、いくつかの部分に切断され得、それぞれは1つの区画だけを含む。その後、該多孔性基材部分のそれぞれは、それぞれの核酸を抽出するための別々の遠心分離容器に置かれ得る。
【００４７】
さらに、増幅核酸の抽出は、圧力差を適用すること（例えば、真空）、または膜から液体を吸い出すこと（例えば、ピペットを用いて）により行われ得る。
【００４８】
本発明の好ましい態様は、増幅核酸が該多孔性基材内で検出される方法である。
【００４９】
あるいは、増幅産物は多孔性基材内で直接検出され得、PCR増幅物を分析する標準技術はインターカレーティング色素または標識ハイブリダイゼーションプローブのような蛍光色素に基づくために該検出は蛍光に基づくことが好ましい。この態様において、増幅混合物は、それぞれの増幅産物を検出するための蛍光化合物を含む。例えば、増幅混合物は、FRETハイブリダイゼーションプローブ、TaqManプローブ、分子ビーコンおよび単一標識プローブからなる群より選択される数種類の標識ハイブリダイゼーションプローブを含み得る。あるいは、二重鎖核酸に結合する場合のみに蛍光を放出するSYBR Green等のdsDNA結合蛍光実体が、使用され得る。
【００５０】
さらに、多孔性基材内の増幅核酸の検出は、電気化学技術を用いて実施され得る。この態様において、電極は電位を印加する多孔性基材の下に置かれ、ハイブリダイゼーションプローブは、フェロセン誘導体またはオスミウム複合体のような電気化学部分で標識される。
【００５１】
さらに、多孔性基材内の増幅核酸の検出は、化学発光技術を用いて実施され得る。
【００５２】
本発明のより好ましい態様は、増幅核酸が蛍光によって、好ましくはリアルタイムで検出される方法である。
【００５３】
増幅混合物が蛍光プローブを含む場合、増幅の終わりに一度だけでなく増幅サイクル毎に少なくとも一度蛍光の増幅をモニターすることが好ましい。すなわち、多孔性基材の孔内でリアルタイムPCRを実施することが好ましい。
【００５４】
本発明の方法は、区画を提供するように構造化された多孔性基材を提供する。
【００５５】
本発明を通して、区画は、不浸透性境界(boarders)によって互いに分離される多孔性基材の領域である。すなわち、多孔性基材の区画を取り囲む不浸透性境界は、隣接する区画間での液体交換を回避する。従って、不浸透性境界は区画間のクロストークを回避するために1つの多孔性基材だけを用いていくつかのアッセイを並行して実施することが可能である。
【００５６】
本発明を通して、区画を提供する多孔性基材の構造は、任意に区画自体だけでなく、膜の外部での区画間の液体連絡のためのチャネル構造も含む。さらに、2つ以上の区画を連絡するチャネル構造を有する多孔性基材を提供することは、これが特定の利用に望ましい場合に可能である。流体は、例えば、重力、毛管力、圧力または遠心分離によってチャネル構造に侵入し得る。
【００５７】
本発明の別のより好ましい態様は、該区画のそれぞれにおいて、個々の核酸増幅が実施される方法である。
【００５８】
構造化された多孔性基材を用いて、区画のそれぞれにおいて個々の核酸増幅を実施することがもちろん可能であるが、この目的のために主に2つの異なる代替がある。
【００５９】
本発明のより好ましい方法において、該個々の核酸増幅物は、同じまたは異なる。
【００６０】
本発明の別のより好ましい方法において、該異なる核酸増幅物は、該区画内で異なる試料および／または異なるプライマーに基づく。
【００６１】
全ての区画で同じ核酸増幅を実施する1つの理由は、増幅結果に関して増大した信頼性を生み出すことであり得る。各区画で異なる核酸増幅を実施することは、試料分析のスループットを増大する。異なる核酸増幅は、同じ試料を分析する各区画における異なるプライマーまたは多くの同じ区画で分析される異なる試料のいずれかによって確立され得る。それぞれが1つ以上の異なるプライマーを該区画内で孔の表面に結合させる区画を有する多孔性基材を提供することが好ましい。
【００６２】
本発明による方法の好ましい態様において、多孔性基材は、１×１０−２ｃｍ２〜２×１０２ｃｍ２の面積と１×１０−２ｃｍ〜０．５ｃｍの高さ、好ましくは１×１０−１ｃｍ２〜１×１０２ｃｍ２の面積と３×１０−２ｃｍ〜０．３ｃｍの高さ、最も好ましくは１ｃｍ２〜１×１０２ｃｍ２の面積と５×１０−２ｃｍ〜０．２ｃｍの高さを有する。
【００６３】
多孔性基材のサイズおよび高さに関して、いくつかの側面が考慮されなければならない。第一に（Fist of all）、多孔性基材の面積は、区画の形成を十分に実現し、かつ必要な数の該区画の配置を可能とするほど大きくなければならない。従って、多孔性基材の面積はまた、各区画の意図されるサイズおよび周囲障壁に依存している。多孔性基材の高さは、PCR増幅を実施するために特定の体積の区画を提供するほど大きくなければならないが、他方で蛍光技術が増幅産物の分析に用いられる場合に全体積から蛍光検出を可能にするほど薄くなければならない。
【００６４】
本発明による方法の別の好ましい態様において、多孔性基材は少なくとも２区画、好ましくは２〜１×１０６区画、最も好ましくは１×１０２〜１×１０５区画を有する。
【００６５】
本発明による別の好ましい方法は、該区画が該多孔性基材の化学官能化によって提供される方法である。
【００６６】
区画を有する多孔性基材を提供するいくつかの可能性がある。句化学官能化は、多孔性基材の表面特性を化学改変する全ての手順を要約する。湿式化学処理、光化学処理、イオン衝撃、温度または電気化学によって多孔性基材の表面特性を改変することが可能である。多孔性基材の化学官能化は、上記の技術によって直接的にまたは間接的に実施され得、そこで上記の技術は、更なる部分が後で該活性化結合部位に結合し得るように表面活性化を実施するだけであることに注意されたい。
【００６７】
本発明によるさらに別の好ましい方法は、該化学官能化が電気化学手段を用いて実施される方法である。
【００６８】
多孔性基材の表面改変は、上記に説明したような電極配列を用いて制御されたやり方で実施され得るために、電気化学手段を使用することが好ましい。
【００６９】
区画における核酸増幅のために、該区画は親水性であり、疎水性周囲に埋め込まれることが好ましい。一般に、親水性／疎水性パターンを生み出す手順は、多孔性基材の異なる領域を区別しなければならない。
【００７０】
このようなパターンの発生を可能にする技術は、例えば多孔性基材の特定の領域に特定の電流または電圧を適用することによる電気化学、多孔性基材の特定の領域に特定の波長の光を適用することによる光化学、または多孔性基材の特定の領域に特定の体積の試薬を適用することによるスポッティング技術である。
【００７１】
多孔性基材の構造化のための起点は、例えばカルボキシ、エポキシ、アルデヒド、ヒドロキシルアミノ基のような遊離官能部分を有する前処理された多孔性基材であるか、例えば、化学残基でブロックされるプライマーのオンチップ合成に関して以前に言及した基のような保護官能部分を有する前処理された多孔性基材であるか、または官能基を有さない前処理されていない多孔性基材であり得る。
【００７２】
遊離官能基を有する前処理された多孔性基材を用いて、電気化学、光化学、またはスポッティング技術は親水性部分または疎水性部分を結合するために多孔性基材の特定の領域をアドレスしなければならない。
【００７３】
保護官能基を有する前処理された多孔性基材を用いて、電気化学、光化学またはスポッティング技術は、親水性部分または疎水性部分を結合または脱保護するために化学反応を可能にする多孔性基材の特定の領域をアドレスしなければならない。例えば、疎水性基で保護された官能部分を有する多孔性基材は、親水性領域を作り出すために脱保護され得、未処理領域は、疎水性のままである。親水性基で保護された官能部分を用いる反対のプロセスは、親水性保護基を切断することでパターンを生み出すために使用され得る。疎水性領域を作り出すために、さらなる疎水性残基を該脱保護後の脱保護領域に結合させることが有用であり得る。
【００７４】
官能基を有さない前処理されていない多孔性基材を用いて、親水性／疎水性パターンが官能基を有する多孔性基材の特定の領域の改変によって生み出され得る。
【００７５】
親水性／疎水性パターンを生み出すために、異なる基が使用され得る。親水性領域について、例えば、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、チオール、ホスフェートのような親水性基が適用可能である。疎水性領域について、例えば、コレステロール、炭素アルコール（例えばドデカノール）、トリチル誘導体またはパルミトイルのような疎水性基が適切である。親水性／疎水性特性を高めるためにデンドリマーまたは分枝誘導体のような多官能性残基がまた、使用され得る。次の増幅反応のための十分な安定性を提供するために、親水性残基／疎水性残基は共有的なやり方で多孔性基材に結合されることが好ましい。
【００７６】
該区画が流体のスポッティングによって提供される、本発明による方法がさらに好ましい。
【００７７】
区画を提供するように多孔性基材を構造化するのに適切な流体は、大気圧で蒸発する溶媒中の物質であり、それによって該物質のフィルムを形成する。この戦略の例は、テトラヒドロフラン（THF）中の塩化ポリビニル（PVC）の溶液である。
【００７８】
区画あたり１種類より多くのプライマー分子を有する多孔性基材を提供することが可能であることに注意されたい。これはプライマー配列の生成のための直交保護基(orthogonal protective group)を有する区画を用いて行われ得るが、該直交保護基は、異なる条件、例えば、異なる電位、酸／塩基不安定性または電気化学、湿式化学および光化学の任意の他の組み合わせの下で不安定である少なくとも２つの異なる保護基である。例えば、多孔性基材の結合部位の保護のためにこのような直交保護基を用いることは、多孔性基材の１つの個々の区画において1種類より多くのプライマーの混合物を生み出す機会を提供する。少なくとも2つの異なる保護基は、それぞれ、個々の表面改変としてまたは2つ以上の該異なる保護基を含む単一の分枝表面改変として提供され得る。
【００７９】
本発明による好ましい方法は、さらなるプレハイブリダイゼーション工程が、該多孔性基材を温度サイクルに曝露する前および該多孔性基材からのプライマーの任意の切断の前に実施される方法である。
【００８０】
プライマー配列を提供することは、構造化された多孔性基材の対応する区画に適用された試料の特定の核酸を蓄積するために、プレハイブリダイゼーション工程が増幅反応前に実施され得るというさらなる利点を有する。このプレハイブリダイゼーション工程は、試料内の核酸がそれぞれの区画の共有結合したプライマーと接触している場合に生じるハイブリダイゼーション工程である。すなわち、試料内の各標的核酸は、次の増幅反応前に相補配列を有する結合プライマーと出会う。このようなプレハイブリダイゼーション工程によって、検出限界が配列の全ての区画の全域で各核酸の統計分布にもはや依存しないために、かなり低い濃度で検出することが可能である。
【００８１】
本発明によるより好ましい方法において、該多孔性基材が区画間のクロストークを回避するために密封される。
【００８２】
図１は、区画間でクロストークを回避するために密封される多孔性基材の一態様を例示する概略図を示す。多孔性基材１が区画２を提供するように構造化される場合に、多孔性基材内だけでなくその周囲を介しても区画間のクロストークを回避することが重要である。従って、試料および／または増幅混合物が適用された後にならびにPCR増幅前に多孔性基材を密封することが好ましい。本発明を通して、当業者に公知である水溶液のためのあらゆる種類の密封５、６が、可能である。例は、例えば、多孔性基材の表面に接着され得る可塑性ホイル、または耐水接触を提供するように多孔性基材に機械力によって押し付けられ得るガラススライドである。ガラススライドが多孔性基材を密封するために使用される場合、疎水性ガラススライド（例えば、シラン化ガラス）または中間オイルフィルムを使用することが好ましい。あるいは、多孔性基材全体は、オイル、例えばPCRオイル中に浸漬され得る。さらに、蒸発してそれによって表面上にフィルムを形成する流体、例えば、テトラヒドロフラン（THF）中のポリビニルクロライド（PVC）のようなものが、多孔性基材を密封するために適切である。例えば、多孔性基材内のPCRの蛍光検出が必要とされる場合に光学透過物質が使用されなければならず、増幅核酸の次の抽出が意図される場合に可逆密封が必要であることに注意されたい。
【００８３】
本発明による好ましい方法において、サーマルベース6は、多孔性基材の一面を密封するために使用される。サーマルベースは、Therma-BaseTMとしてThermacore(Lancester, USA)から市販されているプレート様形状の特別な熱パイプである。熱パイプは、内部作用流体の蒸発および凝縮によって熱を移動する内部灯心構造を有する密封された真空容器である。特別な流体が凍結適用および高温適用に使用されるが、アンモニア、水、アセトン、またはメタノールが典型的に使用される。熱が熱パイプの一面で吸収されるので、作用流体が蒸発し、熱パイプ内で圧力勾配を作り出す。蒸気はパイプの冷えた端に流されて、そこでこれは凝縮し、その潜熱を灯心構造、次に例えば熱シンクを介して周囲環境に与える。凝縮された作用流体は内部灯心構造内で重力または毛管作用を介してエバポレーターに戻る。熱パイプは作用流体の潜熱効果を利用するために、これらは周囲条件に近い成分を保持するように設計され得る。これらは、凝縮された流体が重力で作用する場合に最も有効であるが、熱パイプは任意の配向で機能し得る。
【００８４】
従って、多孔性基材の一面を密封するためのサーマルベースの使用は、多孔性基材内でのPCR増幅に必要なサーモサイクリングに関してさらなる陽性効果がある。サーマルベースを含む本発明の態様に関するいくつかのさらなる詳細が後の記載に見出され得る。
【００８５】
多孔性基材が区画およびチャネル構造を提供するように構築される場合、試料および増幅混合物が適用された後、多孔性基材を密封する順序を変更し得ることに留意のこと。この場合、多孔性基材は、例えば、プライマーを区画内の孔に結合した後、密封され得る。その後、増幅混合物および試料は、チャネル構造を介して該区画に適用され、増幅反応を実施する。
【００８６】
多孔性基材に区画を提供するためのさらなる手順は、孔が閉じられるかまたは最小化され、液体の拡散が妨げられるように基材を部分的に圧縮するための機械的圧力の使用である。
【００８７】
さらに、多孔性基材を部分的に溶解する温度処理またはレーザー処理を使用することによって区画を提供するように、多孔性基材が構築され得、多孔性基材の孔が処理された領域において閉じられる。
【００８８】
本発明に従うなお別の好ましい方法において、該多孔性基材は、ガラスフリース、セルロースのような有機ポリマー、またはナイロン、ポリエステル、ポリプロピレン(PP)、ポリエチレン(PE)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリアクリルニトリル(PAT)、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)もしくはポリスチレンのような無機ポリマーである。
【００８９】
さらに、ガラス、金属酸化物またはシリコン誘導体等の他の材料は、これらが、核酸増幅を可能にする孔を提供する様式で処理される限り、本発明に適切である。
【００９０】
本発明の別の側面は、
ａ）複数の個々の核酸増幅を並行して実施するための区画、
ｂ）多孔性基材の孔内での核酸増幅のために核酸分子およびポリメラーゼの拡散を可能にする孔、ならびに
ｃ）多孔性基材の表面に結合した少なくとも１つのプライマー
を含む、核酸増幅のための多孔性基材である。
【００９１】
プライマーは、当業者に公知の任意の手順によって多孔性基材に結合され得る。例は、例えば、シランカップリング、アミド結合、アルデヒドまたはエポキシドカップリング等の共有結合、例えば、ディールス−アルダー反応を介した架橋結合、Hisタグとキレート剤の間等の配位結合、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン結合等のバイオアフィン結合である。あるいは、プライマーの多孔性基材に対する結合は、物理吸着であり得る。この態様において、プライマーは、例えば、単純に、該プライマーを基材にスポッティングまたはピペッティングし、その後、溶媒をエバポレーションすることによって多孔性基材に適用される。
【００９２】
本発明による好ましい多孔性基材において、該プライマーが多孔性基材に共有結合される。
【００９３】
本発明による多孔性基材は、複数の個々の核酸増幅を並行して実施するための区画を有する。
【００９４】
チャネル構造を有するまたは有さない区画を有する多孔性基材に対する種々の可能性および要件は、前記で説明した。種々の核酸増幅が多孔性基材の区画において実施される場合、試料、プライマーおよび／またはプローブの充填の後、ならびに増幅反応の前に多孔性基材を密封するのが好ましい。あるいは、チャネル構造が提供される場合、試料および増幅混合物の充填の前に密封され得る。
【００９５】
本発明に従うさらに別の好ましい多孔性基材において、該区画は、化学障壁で規定され、好ましくは、該化学障壁が該多孔性基材の化学官能化である。
【００９６】
前記のように、多孔性基材を構築する１つの可能性は、多孔性基材の材料の化学的官能化である。例えば、親水性多孔性基材の特定の部分は、後で疎水性であるように変更され得る。言い換えると、親水性多孔性基材の官能化された疎水性部分は、水溶液に対する化学障壁を形成する。
【００９７】
本発明によるより好ましい多孔性基材において、該化学官能化は、電気化学的官能化である。
【００９８】
本発明によるさらに別の好ましい多孔性基材において、該区画は、流体のスポッティングによって規定される。
【００９９】
チャネル構造を有するまたは有さない区画を提供するための多孔性基材を構築するための電気化学的官能化および流体のスポッティングに関する本発明の選択肢は、既に前記に概略した。
【０１００】
本発明による別の好ましい多孔性基材は、各区画が同じまたは異なる結合されたプライマーを有する基材である。
【０１０１】
一般的に、多孔性基材の区画化は、複数の異なる増幅反応を並行して実施するように提供され、主に２つの異なる選択肢、すなわち、同じプライマーのセットと異なる試料、または異なるプライマーのセットと同じ試料がある。従って、多孔性基材は、複数の試料をスクリーニングするために各区画に同じプライマーのセットと、またはいくつかの材料について試料をスクリーニングするために各区画に異なるプライマーとのいずれかで提供され得る。
【０１０２】
本発明の別の側面は、核酸増幅のためのマルチウェルプレートであって、該マルチウェルプレートの各ウェルは、核酸増幅が該多孔性基材の該孔内で起こるように、本発明による多孔性基材を含む。
【０１０３】
複数の多孔性基材を取り扱うためにマルチウェルプレートを使用することは、制御され、高度に並行の様式で増幅反応を実施するためのブロックサイクラー等の多くの市販の装置に、この設定が応用可能であるという利点を有する。さらに、マルチウェルプレートは、例えば、ロボット装置を使用する自動ピペッティグ技術等のスクリーニング目的のための処理量を増加するための技術、標準検出装置を用いる分析技術に適合可能である。
【０１０４】
本発明のさらに別の側面は、
ａ）本発明による多孔性基材、および
ｂ）増幅混合物
を含む、核酸増幅のためのキットである。
【０１０５】
本発明をとおして、増幅混合物は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の形態で核酸増幅反応を実施するために必要な全ての化合物、即ち、熱安定性DNAポリメラーゼ、少なくとも１つの核酸化合物、デオキシヌクレオチド、少なくとも１種の二価カチオン、好ましくはＭｇ２＋を有するバッファを含む。さらに、増幅混合物は、例えば、「ホットスタート」PCRのための二価カチオン結合部位を有する合成ペプチドまたは他のPCR添加物を含み得る。
【０１０６】
本発明による好ましいキットにおいて、該増幅混合物は、酵素、プライマー、ヌクレオチドおよびバッファを含む。
【０１０７】
熱安定性ポリメラーゼとして、非常にいろいろな酵素が使用され得る。好ましくは、該熱安定性DNAポリメラーゼは、エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アーキオグロブス・フルジダス（Archaeoglobus fulgidus）、デスルフロコッカス（Desulfurococcus）種Tok．、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、メタノコッカス（Methanococcus）種（例えば、ヤニシ（jannaschii）、ボルタエ（voltae））、メタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）、パイロコッカス（Pyrococcus）種（フリオサス（furiosus）、GB-D種、ウーゼイ（woesii）、アビシ（abysii）、ホリコシ（horikoshii）、KOD、Deep  Vent、Proofstart）、パイロディクティウム・アビシ（Pyrodictium abyssii）、パイロディクチウム・オカルタム（Pyrodictium occultum）、スルホロバス（Sulfolobus）種（例えば、アシドカルダリアス（acidocaldarius）、ソルファタリカス（solfataricus））、サーモコッカス（Thermococcus）種（ジリギ（zilligii）、バロッシ（barossii）、ファミコランス（fumicolans）、ゴルゴナリアス（gorgonarius）、JDF-3、コダカラエンシス（kodakaraensis）  KODI、リトラリス（litoralis）、９デグリー  ノース−７（9 degrees North-7）種、JDF-３種、ゴルゴナリアス、TY）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）、テルモシフォ・アフリカナス（Thermosipho africanus）、サーモトガ（Thermotoga）種（例えば、マリティマ（maritima）、ネアポリタナ（neapolitana））、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、サーマス（Thermus）種（例えば、アクアティカス（aquaticus）、ブロキアナス（brockianus）、フィリフォルミス（filiformis）、フラバス（flavus）、ラクテウス（lacteus）、ルーベンス（rubens）、ルーバー（ruber）、サーモフィラス（thermophilus）、ZO5またはダイナザイム（Dynazyme））からなる群から選択される。その変異体、バリアントもしくは誘導体、キメラまたは「融合−ポリメラーゼ」、例えばPhusion（FinnzymesまたはNew England Biolabs、カタログ番号F-530S）またはiProof（Biorad、カタログ番号172-5300）、Pfx Ultima（Invitrogen、カタログ番号12355012）またはHerculase II Fusion（Stratagene、カタログ番号600675）も、本発明の範囲内である。さらに、本発明による組成物は、上記ポリメラーゼの１つ以上の混合物を含み得る。
【０１０８】
１つの態様において、熱安定性DNAポリメラーゼは、DNA依存性ポリメラーゼである。別の態様において、熱安定性DNAポリメラーゼは、さらなる逆転写酵素活性を有し、RT-PCRに使用され得る。かかる酵素についての１つの例は、サーマス・サーモフィラス（Roche Diagnostics、カタログ番号11480014001）である。上記にまとめたポリメラーゼの１つ以上と、レトロウイルス逆転写酵素、例えばMMLV、AMV、AMLV、HIV、EIAV、RSVおよびこれらの逆転写酵素の変異体からのポリメラーゼとの混合物もまた、本発明の範囲内である。
【０１０９】
DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドおよび他のバッファ成分の濃度は、標準量で存在し、その濃度は、当該分野で周知である。Ｍｇ２＋濃度は、０．１ｍＭ〜３ｍＭで変化し得、好ましくは適合され、実験的に最適化される。しかし、最適濃度は、通常、使用される実際のプライマー配列に依存するので、理論的には予測され得ない。
【０１１０】
増幅混合物の少なくとも１つの核酸化合物は、核酸増幅反応を実施するために少なくとも１対の増幅プライマーを含む。
【０１１１】
さらに、増幅混合物は、それぞれの増幅産物をリアルタイムで検出するために蛍光化合物を含み得、２〜６の異なって標識されたハイブリダイゼーションプローブは、それぞれ、限定されないが、FRETハイブリダイゼーションプローブ、TaqManプローブ、分子ビーコンおよび単一標識プローブからなる群から選択される。あるいは、かかる増幅混合物は、二本鎖DNAに結合した場合のみに蛍光を発する、SYBR Green等のdsDNA結合蛍光実体を含み得る。
【０１１２】
さらに、増幅混合物は、ワンステップRT-PCRを実施するために適合され得、Taq DNAポリメラーゼとAMV逆転写酵素等の逆転写酵素の混合物を含む。さらに例示的で具体的な態様において、かかる増幅混合物は、ワンステップリアルタイムRT-PCRを実施するために特に適合され、SYBRグリーン等の核酸検出実体または蛍光標識された核酸検出プローブを含む。
【０１１３】
本発明による別の好ましいキットにおいて、少なくとも１つのプライマーは、該多孔性基材の表面に結合され、該増幅混合物は、酵素およびヌクレオチドを含む。
【０１１４】
キットのこの態様において、プライマーは、既に、該多孔性基材の表面に結合され、従って、増幅混合物は、プライマー分子を含んではいけない。
【０１１５】
本発明のなお別の側面は、
ａ）本発明による多孔性基材、および
ｂ）サーモサイクラー
を備える、核酸増幅のためのシステムである。
【０１１６】
本発明をとおして、サーモサイクラーは、多孔性基材を用いて熱サイクルを実施するために必要な全ての成分を要約する（summarize）。サーモサイクラーは、少なくとも１つのヒートポンプ、例えば、多孔性基材の温度を上昇するためのペルチェ素子、多孔性基材の冷却の間熱を放散するヒートシンク、および複数の試料の該同時のサーモサイクリングを制御する制御ユニットを備える。前記したように、温度変化の速度および正確さを増大するために多孔性基材とヒートシンクの間にさらなるサーマルベースを提供すること、ならびに多孔性基材の全断面領域にわたる均一の加熱／冷却手順を提供することは好ましい。
【０１１７】
本発明による好ましいシステムにおいて、該サーモサイクラーは、少なくとも１つのヒートポンプ、ヒートシンクおよび／または制御ユニットを備える。
【０１１８】
本発明による別の好ましいシステムにおいて、該サーモサイクラーが照明手段および検出手段を備える。
【０１１９】
多孔性基材で直接増幅結果を分析するためのさらなる検出手段を備えるシステムを提供することが好ましい。PCR増幅を分析するための標準的な技術がインターカレーティング色素または標識されたハイブリダイゼーションプローブ等の蛍光色素に基づいているので、該検出手段は、蛍光検出器であることが好ましい。増幅結果が蛍光技術で分析される場合、本発明の増幅混合物は、さらに蛍光プローブを含む。蛍光技術が蛍光色素の励起のための光を必要とするため、本発明による好ましいシステムは、照明手段をさらに備える。
【０１２０】
多孔性基材の断面積の大きさに依存して、蛍光検出器および照明手段は、特別な要件を満たさなければならない。本発明の多孔性基材がその断面領域に分布する区画を有する場合、多孔性基材の中心の区画およびその境界の区画が同じ照度を得、蛍光強度が比較できる様式で記録されることを確実にしなければならない。これは、テレセントリック光学を備えた蛍光検出器および／または照明手段を使用することによって達成され得る。
【０１２１】
本発明の範囲において、テレセントリック光学は、非常に小さなアパーチャを有する光学であり、従って、高い焦点深度を提供する。言い換えると、テレセントリック光学のテレセントリック光は、対象および／または画像空間における光学軸に平行である対象を横切る全ての点に対する主光線と準平行である。従って、対象空間におけるテレセントリシティーを使用する照明手段または検出手段の質は、特定の対象点から光学までの距離に影響されない。
【０１２２】
テレセントリック光学のアパーチャは、無限遠に像を結ぶ。さらにテレセントリック光を使用すると、光ビームの全域で良好な側方均質性が確実になり、アセンブリの中央に位置する部位は、アセンブリの境界に位置する部位と同等である。本発明をとおして、テレセントリック光学は、いつも、対物レンズを備える。本発明の背景において、対物レンズは、装置の視野を決定する対象に最も近く、１つ以上の構成要素（色消しレンズ）を備え、さらなる装置の光学構成要素と共同して対象および／または画像空間におけるテレセントリシティーに寄与する単一のレンズである。
【０１２３】
本発明の対物レンズは、励起光を光源から多孔性基材に伝達し、蛍光シグナルを多孔性基材から検出器に伝達する。これは、さらなる光学構成要素が、ビーム経路、例えば、光源と対物レンズの間、対物レンズと検出器の間、または対物レンズと多孔性基材の間に導入されることを排除しない。
【０１２４】
本発明による別の好ましいシステムにおいて、該核酸増幅がリアルタイムPCRである。
【０１２５】
本発明によるシステムが蛍光検出器および照明手段を備える場合、増幅の最後に一度だけでなく、全ての増幅サイクルにおいて少なくとも１回蛍光の増幅をモニターすることが好ましい。言い換えると、多孔性基材の孔の中でリアルタイムＰＣＲを実施することが好ましい。
【０１２６】
本発明によるさらに別の好ましいシステムは、核酸増幅のための該装置から増幅された核酸を抽出するための手段をさらに備える。
【０１２７】
本発明によるシステムの別の態様において、システムは、多孔性基質から増幅された核酸を抽出するためのさらなる手段を備える。特定の態様において、続いての分析のために多孔性基材から増幅された核酸を抽出することが望ましくあり得る。かかる外部分析は、例えば、質量分析またはゲル分析である。
【０１２８】
本発明によるより好ましいシステムにおいて、増幅された核酸を抽出するための該手段は遠心分離手段である。
【０１２９】
区画を有するおよび有さない多孔性基材から増幅された核酸を抽出するための異なる手順を、既に前記に詳細に説明した。
【０１３０】
以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。改変が、本発明の精神から逸脱することなく示される手順においてなされ得ることが理解される。
【０１３１】
実施例１：
電気化学的手順を使用した多孔性基材上の親水性／疎水性パターンの生成および基材への標識オリゴヌクレオチドの分配
疎水性基材上に２つの親水性位置を含む親水性／疎水性パターンの作製を、図３に示す電気化学的手順を使用して作り出した。本実施例において、疎水性部分の親水性官能化多孔性基材への結合を記載する。この実験のために、２つの金電極を有する電極アレイ、無機多孔性基材、標準DNA合成試薬、疎水性部分のホスホロアミダイト、および活性化電極で酸媒体を電気化学的に生成するためのバッファ溶液を含む自作の反応チャンバを使用した。
【０１３２】
多孔性基材（PolyAn、Berlin/Germany製のPE-Sinter膜、孔サイズ：10μm、厚さ：0.6mm；ヒドロキシル基の荷重密度：1.7μmol/cm２）を、反応チャンバにおいて電極の近傍に配置する。多孔性基材それ自体は、いかなる保護基を有さずに結合部位のみを有するので、5'-DMT-T-3'-ホスホロアミダイトを、開始基として多孔性基材に結合した。この目的のために、5'-DMT-T-3'-ホスホロアミダイトを、アクチベーター（アセトニトリル中のジシアノイミダゾール）と一緒に、チャンバに充填し、膜の官能基と反応させた。
【０１３３】
溶液を後で除去し、酸化工程を、第１の結合工程からの三価リン分子をより安定な五価リン分子に酸化するために実施した。次いで、酸化溶液を、反応チャンバから濯ぎ出し、キャッピング工程を、さらなる反応のために、第１の結合工程由来の多孔性基材の全ての未反応のヒドロキシル基をブロックするために実施した。その後、キャッピング溶液を、除去し、バッファ溶液をチャンバに充填した。多孔性基材を親水性スポットおよび疎水性周囲で修飾する（図２ａ）ために、以下の手順を使用した（図３に示される）。電位（60秒間、−300μＡ）を、活性化電極の近傍にある多孔性基材のこれらの部分上の保護基を切断するために２つの電極の両方に連続的に印加した。その後、バッファ溶液を再度チャンバから濯ぎ出し、ピリジン中のトリメチルクロロシランの溶液を、10分間添加し、その前に脱保護されたヒドロキシル基と反応させた。従って、ヒドロキシル基を、電極の上の位置がシリル保護ヒドロキシル基を有し、電極の傍の位置がトリチル保護ヒドロキシル基を有する特徴に導くシリル基によってブロックする。従って、ジクロロメタン（DMT-除去試薬、Roth, Karlsruhe/Germany、カタログ番号2257,1）中の３％トリクロロ酢酸の酸性溶液を２分間添加し、電極の傍の全ての残存DMT基を除去した。従って、脱ブロックされたヒドロキシル基は、ここで、疎水性部分と反応し、膜上に疎水性領域を与えるように接近可能であった。従って、アクチベーターと共にコレステロールホスホロアミダイト（テトラエチレングリコールコレステロールホスホロアミダイトのアセトニトリル中0.1M溶液、ChemGenes Corp., Wilmington, MA/USA、カタログ番号CLP-2704）を、チャンバに充填し、多孔性基材の脱保護結合部位で反応させた。２分のインキュベーションの後、ホスホロアミダイト溶液を、濯ぎ出し、別の酸化工程を、三価リン部分を安定化させるために実施した。酸化溶液の交換の後、アンモニア水溶液を、60分のインキュベーション時間で、反応チャンバに流し、電極の上の位置からシリル保護基を遊離し、リン酸部分から全てのリン酸保護基を脱保護した。アセトニトリルおよび水での数回の続く洗浄工程の後、電極の上に親水性特性および電極の傍に疎水性特性を有する親水性／疎水性パターンを得た。
【０１３４】
疎水性スポットおよび親水性周囲で多孔性基材を修飾する（図２ｂ）ために、以下の手順を使用することによって反対のパターンを有する第２の基材を、類似した条件下で作製した。基材上への5'-DMT-T-3'-ホスホロアミダイトの第１の結合を用いて開始層を生成した後、バッファ溶液を、チャンバに充填し、電位（60秒間、−300μＡ）を、活性化電極の近傍に存在する多孔性基材のこれらの部分上の保護基を切断するために、２つの電極の両方に連続的に印加した。次いで、アクチベーターと共にコレステロールホスホロアミダイト（テトラエチレングリコールコレステロールホスホロアミダイトのアセトニトリル中0.1M溶液、ChemGenes Corp., Wilmington, MA/USA、カタログ番号CLP-2704）を、チャンバに充填し、多孔性基材の脱保護結合部位で反応させた。２分のインキュベーションの後、ホスホロアミダイト溶液を、濯ぎ出し、別の酸化工程を、三価リン部分を安定化させるために実施した。その後、溶液を除去し、キャッピング反応を、さらなる反応のために、コレステロール結合工程由来の多孔性基材の全ての未反応ヒドロキシル基をブロックするように実施した。次いで、キャッピング溶液を除去し、ジクロロメタン（DMT-除去試薬、Roth, Karlsruhe/Germany、カタログ番号2257,1）中３％トリクロロ酢酸の酸性溶液を、２分間添加し、電極の傍の全ての残存DMT基を除去した。酸性溶液の交換の後、アンモニア水溶液を、60分のインキュベーション時間で、反応チャンバに流し、リン酸部分から全てのリン酸保護基を脱保護した。最後に、アセトニトリルおよび水での数回の洗浄工程を実施し、電極の上に疎水性特性および電極の傍に親水性特性を有する親水性／疎水性パターンを得た。
【０１３５】
２つの異なる官能化パターンの作製の後、膜の物理的特性を、5'-Cy3-(T)15オリゴヌクレオチドの水溶液に適用することによって試験した。５分のインキュベーション時間の後、膜を0.5×SSPEバッファ溶液中で洗浄し、次いで、標準デジタルカメラで画像化した。
【０１３６】
親水性オリゴヌクレオチドは、膜の親水性領域に動き、疎水性領域を避けようとする。図２の写真は、赤のオリゴヌクレオチドが官能化パターンに依存して電極の上（図２ａ）または電極の傍（図２ｂ）いずれかの親水性領域にある、この挙動を示す。
【０１３７】
実施例２：
水中の親水性／疎水性パターンを有する多孔性基材
膜（PolyAn、Berlin/Germany製のPE-Sinter膜、孔サイズ：7〜16μm、厚さ：0.6mm；ヒドロキシル基の荷重密度：0.8μmol/cm2）に、電極の上のコレステロール部分を用いる実施例１に記載される電気化学的手順（電流−300μA、脱保護時間：60秒）に従って、親水性／疎水性パターンを作製した。この作製の後、膜を、反応チャンバを形成する２つのガラススライドの間に配置し、水を、この配置に流した。水は、膜の親水性部分に拡散したが、疎水性部分には拡散しなかった。図４は、520nmチャネルでLumiImager装置（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）で画像化されたそのように処理された膜の写真を示す。
【０１３８】
実施例３：
SYBR Green Iを使用する多孔性基材におけるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる蛍光強度の変化
２つの膜（PolyAn製のPE-Sinter膜、孔サイズ：80〜130μm、厚さ：0.6mm；ヒドロキシル基の荷重密度：1.3μmol/cm2）に、膜の縁のまわりのプラスチック枠を作製し、液体の漏れを避けた。この目的のために、テトラヒドロフラン(THF)中の塩化ポリビニル(PVC)の溶液を調製し、膜の縁を、この溶液に浸した。有機溶媒THFは蒸発し、PVCは、薄いフィルムとして膜上に残る。従って、かかる膜の真ん中に分配された液体を、捕捉する。
【０１３９】
２つの膜をガラススライド上に配置し、LightCycler 2.0装置（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）で実施されるSYBR Green Iアッセイ由来の２つの異なるPCR終点溶液で処理した。２つの異なるPCR反応を、パック挿入物に記載される標準条件に従って、LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I（Roche Applied Science, Mannheim, Germany、カタログ番号03515885）と組み合わせたUniversal ProbeLibrary Control Set（Roche Applied Science, Mannheim, Germany、カタログ番号04696417001；詳細な配列情報を、配列の部に列挙する）からのSYBR Green Iアッセイを用いて実施した。
【０１４０】
第１のPCRは、プライマー対（配列番号１および配列番号２）および上記のキットからの合成テンプレート（Universal ProbeLibrary Control Set（Roche Applied Science, Mannheim, GermanyからのコントロールＦ）を用いるポジティブ反応であり、もう一方のPCRは、同じプライマーを用いるがテンプレートを用いないネガティブコントロール実験であった（いわゆるテンプレートなしのコントロール、NTC）。PCR終点溶液を、両方の膜の真ん中にピペッティングした。図５の左の膜は、ポジティブPCR実験を得、図５の右の第２の膜は、ネガティブコントロール(NTC)を得た。PCR溶液を分配した後、次いで、膜を、別のガラススライドで覆い、一方で、この反応チャンバを、クリップで固定し、粘着ホイルで密封した。
【０１４１】
その後、ガラススライドの蛍光強度を、２つの異なる温度、すなわち、室温および80℃で520nmのチャネルでLumiImager装置（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）を用いて記録した。二本鎖DNAがインターカレートしている色素SYBR Green Iと共同で蛍光シグナルを導くという原則によって、大きな蛍光シグナルがポジティブPCR実験の間室温で存在し、一方で、より小さいシグナルのみがコントロール実験で得られ得る（図５ａを参照）。上昇した温度（80℃）で、二本鎖DNAは融解され、SYBR Green I色素のシグナルは消失し、その結果、両方の膜が、より小さな蛍光強度を有する（図５ｂを参照）。反応チャンバのその後の冷却および二本鎖DNAの形成の後、蛍光シグナルは、ポジティブPCR実験の間増加する（図５ｃを参照）。
【０１４２】
実施例４：
SYBR Green IアッセイからのPCR終点溶液で膜を処理することによる蛍光強度の変化
ここで、実施例３に記載されるのと同じ実験設定を使用したが、テトラヒドロフラン(THF)中のポリビニルクロリド(PVC)からのさらなる分離線によって２つの区画に分けられた１つのみの膜（PolyAn製のPE-Sinter膜、孔サイズ：80〜130μm、厚さ：0.6mm；ヒドロキシル基の荷重密度：1.3μmol/cm2）を使用した。
【０１４３】
実施例３の終点PCR実験由来の２つの溶液を、膜の２つの別々の区画にピペッティングした。再度、膜を、２つのガラススライドの間に配置し、クリップで固定し、粘着性ホイルで密封し、室温または80℃に調整した。蛍光強度を、520nmチャネルでLumiImager装置（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）によって検出した。図６は、対応する蛍光挙動を示す実施例３に概略された温度サイクルの間のこの膜の画像を示す（左区画：ポジティブPCR実験、右区画：NTC；a）室温、b)90℃、c)60℃、d)室温）。
【０１４４】
実施例５：
プローブベースの検出形式を使用することによる膜内のβ−２−ミクログロブリンのPCR反応
β−２−ミクログロブリンのPCR反応混合物の溶液を、パック挿入物に記載される標準条件に従って、Universal ProbeLibraryアッセイおよびTranscriptor第１鎖cDNA合成キット（Roche Applied Sciecne, Mannheim, Germany、カタログ番号4379012）で前に逆転写されたインビトロRNA転写物（LightCycler hβ2M Housekeeping Gene Set, Roche Applied Science, Mannheim, Germany、カタログ番号3146081）を用いて調製した。最終PCR反応のために、約105コピーの得られたcDNAを、プライマー（配列番号３および配列番号４）、Universal ProbeLibraryプローブ（Universal ProbeLibraryのプローブNr.42）、およびPCRマスターミックス（LightCycler TaqMan Master, Roche Applied Science、カタログ番号04535286001）と混合した。PCR混合物中の全てのPCR試薬の最終濃度は、パック挿入物からの標準条件に比べて上昇した。最終濃度は、以下のとおりであった：プライマー  1000nM、UPLプローブ  850nM、PCRミックス  2.1×。
【０１４５】
この溶液を、膜（PolyAn製のPE-Sinter膜、孔サイズ：80〜130μm、厚さ：0.6mm；ヒドロキシル基の荷重密度：1.3μmol/cm2、大きさ17×14mm）上にピペッティングし、次いで、プラスチックホイル（Tropix Bedford, MA/USAから商品名「development folder」で入手可能、カタログ番号XF030）で密封した。次いで、膜を、２つのガラススライドの間に配置し、該スライドを、クリップで固定し、PCR反応を、以下の条件下で実施した：初期変性95℃10分、次いで、それぞれ変性工程95℃60秒、その後の増幅工程65℃90秒の45増幅サイクル。
【０１４６】
PCR反応後、膜をプラスチックホイルから除去し、液体を、膜の遠心分離によってプラスチックキャップに得た。得られた溶液を、既製の４％アガロースゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA/USA、カタログ番号G501804）にピペッティングし、LightCycler 2.0装置（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）上で同じPCR反応混合物で実施される参照としてのPCR反応と比較した。LightCycler 2.0装置上で、以下のPCRプロトコルを使用した：初期変性95℃10分、次いで、それぞれ変性工程95℃10秒、その後増幅工程65℃30秒および72℃1秒、その後最終冷却工程40℃30秒を有する45増幅サイクル。図７は、対応するゲルを示し、一方で、２つの異なる膜PCR反応（ＩＩで示される）のバンドが、参照PCR反応（Ｉで示される四重複製物）と同じアンプリコン長を与える。
【０１４７】
ゲル分析に加えて、UPL加水分解プローブの蛍光団の切断による膜の蛍光強度の増加を、増幅の最初（サイクル1）および最後（サイクル45）に520nmチャネルでLumiImager装置（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）によるPCRの間に測定した。予想されたように、シグナル強度は、PCR反応の間に、520nmチャネルで、１つの膜について最初の９．８×１０６〜１．１×１０７まで増加し、もう１つの膜について最初の９．６×１０６〜１．１×１０７まで増加した。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
（図面の説明）
【図１】図１は、PCR増幅に適用可能な設定において、電極３を用いる電気化学で構築され、多孔性基材の孔に核酸４を有する区画２およびクロストークを回避する密封５、６を含む多孔性基材1の一態様を例示する概略図である。
【図２】図２は、標識オリゴヌクレオチドに浸漬した異なる官能化を有する2つの多孔性基材の写真である。
【図３】図３は、電極３を用いて多孔性基材１上に親水性／疎水性パターンを電気化学的に生成する一態様の概略図である（x:疎水性部分;U:印加電位）。
【図４】図４は、水に浸漬した官能化多孔性基材の写真である。
【図５】図５は、ハイブリダイゼーションサイクルの蛍光画像である。
【図６】図６は、ハイブリダイゼーションサイクルの蛍光画像である。
【図７】図７は、標準PCRおよび多孔性基材の孔内で実施されたPCRで得られたPCR産物のゲルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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