(57)【要約】本発明はヒト脂肪組織由来の成体幹細胞である多能性幹細胞に関するもので、より具体的には、スフィア(sphere)形成を通じて未分化状態で長期間維持が可能で、増殖率が優秀なヒト乳房脂肪組織由来の多能性成体幹細胞及び前記成体幹細胞の分離及び維持方法、前記多能性成体幹細胞から神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨形成細胞及びインシュリン分泌膵臓ベータ細胞への分化方法、及び前記分化された細胞または前記成体幹細胞を含む骨関節炎、骨粗鬆症及び糖尿病治療用細胞治療剤と乳房組織形成用細胞治療剤に関するものである。本発明による多能性幹細胞は成体幹細胞にもかかわらず、骨形成細胞、神経細胞、星状細胞、脂肪細胞、軟骨形成細胞、骨形成細胞、またはインシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化する能力を持ち、骨粗鬆症、骨関節炎、神経疾患、糖尿病などの治療に有効で、乳房組織形成に有用である。また、ＣＯＲＭ−２含有無血清培地でスフィアを形成し、未分化状態で長期間維持が可能なだけでなく、増殖率が非常に優秀で細胞治療剤として有用である。
2009527221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト脂肪組織由来のペレットを、ＮＡＣ(N-acetyl-L-cysteine)含有培地で培養し、回収することを含む成体幹細胞の製造方法であって、前記成体幹細胞が、
（ａ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ１０５に対して全て陽性の免疫学的特性を示して、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対して全て陰性の免疫学的特性を示すこと；
（ｂ）プラスチックに附着して成長して、スピンドル形の形態学的特性を示して、ＣＯＲＭ−２含有培地でスフィアを形成して未分化状態で長期間維持ができること；及び
（ｃ）中胚葉由来の細胞に分化する能力を持つこと、
を特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
前記ＮＡＣ含有培地は、アスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、ＢＰＥ、インシュリン及びハイドロコーチゾンをさらに含む培地であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法によって製造された成体幹細胞を、ＣＯＲＭ−２含有培地で培養してスフィアを形成させることを特徴とする成体幹細胞を未分化状態で維持する方法。
【請求項４】
前記ＣＯＲＭ−２含有培地は、抗菌抗真菌溶液、ハイドロコーチゾン、インシュリン、ｒＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｂ２７及びβ−メルカプトエタノールをさらに含む無血清培地であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法によって製造され、次のような特性を持つ成体幹細胞：
（ａ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ１０５に対して全て陽性の免疫学的特性を示して、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対して全て陰性の免疫学的特性を示す；
（ｂ）プラスチックに附着して成長して、スピンドル形の形態学的特性を示して、ＣＯＲＭ−２含有培地でスフィアを形成して未分化状態で長期間維持ができる；及び
（ｃ）中胚葉由来の細胞に分化する能力を持つ。
【請求項６】
前記成体幹細胞は、未分化状態で少なくとも１６継代維持されることを特徴とする、請求項５に記載の成体幹細胞。
【請求項７】
中胚葉由来の細胞は、軟骨細胞、骨形成細胞、神経細胞、星状細胞、脂肪細胞及びインシュリン分泌膵臓ベータ細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の成体幹細胞。
【請求項８】
次の段階を含む、成体幹細胞を神経細胞に分化させる方法：
（ａ）請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、ＢＭＥ及びＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に前培養する段階；及び
（ｂ）前記前培養液をＤＭＳＯ及びＢＨＡで処理して神経分化を誘導する段階。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって分化された神経細胞を、有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞をＴＦＧ−β１、Ｌアスコルビン酸２リン酸及びインシュリンを含むα−ＭＥＭ培地で培養することを含む、成体幹細胞を軟骨細胞に分化させる方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法によって分化された軟骨細胞を、有効成分として含む骨関節炎治療用細胞治療剤。
【請求項１２】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、ＴＣＰ(tricalcium phosphate)と混合して同種移植(isotransplanting)することを含む、成体幹細胞を骨形成細胞に分化させる方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって分化された骨形成細胞を、有効成分として含む骨欠損治療用細胞治療剤。
【請求項１４】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、デキサメタゾン、インドメタシン、インシュリン及びＩＢＭＸを含むα−ＭＥＭ培地で培養することを含む、成体幹細胞を脂肪細胞に分化させる方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって分化された脂肪細胞を、有効成分として含む乳房組織形成用細胞治療剤。
【請求項１６】
次の段階を含む成体幹細胞をインシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化させる方法：
（ａ）請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、ニコチンアミド、β−メルカプトエタノール及びＦＢＳを含む低濃度グルコース含有のＤＭＥＭ培地で１２〜７２時間培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞を、ニコチンアミド、β−メルカプトエタノール及びＦＢＳを含む高濃度グルコース含有のＤＭＥＭ培地で４〜７日間培養する段階。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって分化されたインシュリン分泌膵臓ベータ細胞を、有効成分として含む糖尿病治療用細胞治療剤。
【請求項１８】
神経細胞に分化する特性を持つ請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤。
【請求項１９】
軟骨細胞に分化する特性を持つ請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、有効成分として含む骨関節炎治療用細胞治療剤。
【請求項２０】
骨形成細胞に分化する特性を持つ請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、有効成分として含む骨欠損治療用細胞治療剤。
【請求項２１】
脂肪細胞に分化する特性を持つ請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、有効成分として含む乳房組織形成用細胞治療剤。
【請求項２２】
インシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化する特性を持つ請求項５〜７のいずれか一項に記載の成体幹細胞を、有効成分として含む糖尿病治療用細胞治療剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明はヒト脂肪組織由来の成体幹細胞である多能性幹細胞に関するもので、より具体的には、スフィア(sphere)形成を通じて未分化状態で長期間維持が可能で、増殖率が優秀なヒト乳房脂肪組織由来の多能性成体幹細胞及び前記成体幹細胞の分離及び維持方法、前記多能性成体幹細胞から神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨形成細胞及びインシュリン分泌膵臓ベータ細胞への分化方法及び前記分化した細胞、または前記成体幹細胞を含む骨関節炎、骨粗鬆症、糖尿病治療用細胞治療剤及び乳房組織形成用細胞治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀のバイオテクノロジーは人間福祉を最終目標として食糧、環境、健康問題に新しい解決策の可能性を提示しているし、最近、幹細胞の利用技術は難病治療の新しい分野と考えられている。従来は人間の難病治療のために、臓器移植や遺伝子治療などが提示されたが、免疫拒絶と供給臓器の不足、ベクター開発や疾患遺伝子に関する知識不足から、効率的な実用化が進展しなかった。
【０００３】
そこで、幹細胞研究について関心が高まって、増殖と分化を通じてすべての器官の形成能を持つ全能性幹細胞が、大部分の疾病治療はもちろん臓器損傷を根源的に解決することができると認識された。また、多くの科学者らが人体のほとんどすべての臓器再生はもちろん、難病であったパーキンソン病、各種癌、糖尿病と脊髓損傷等の治療に至るまで多様な幹細胞の適用可能性を提示してきた。
【０００４】
幹細胞(stem cells)というのは自己複製能力を持ち、二つ以上の細胞に分化する能力を持つ細胞をいい、全能性幹細胞(totipotent stem cells)、万能性幹細胞(pluripotent stem cells)、多能性幹細胞(multipotent stem cells)に分類することができる。
【０００５】
全能性幹細胞(totipotent stem cells)は一つの完全な個体として発生していくことができる、全能性の特性を持った細胞であり、卵子と精子の受精以後８細胞期までの細胞がこのような特性を持ち、この細胞を分離して子宮に移植すると、一つの完全な個体に発生していくことができる。
【０００６】
万能性幹細胞(pluripotent stem cells)は外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の多様な細胞と組織として発生することができる細胞であり、受精の４〜５日後に現われる胚盤胞(blastocyst)の内側に位置する内細胞塊(inner cell mass)から由来して、これを胚芽幹細胞といい、多様な他の組織細胞に分化するが新しい生命体を形成することはできない。
【０００７】
多能性幹細胞(multipotent stem cells)は、この細胞が含まれている組織及び器官に特異的な細胞だけに分化することができる幹細胞で、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達はもちろん、成体組織の恒常性維持と組織損傷時の再生を誘導する機能に関与しているし、組織特異的多能性細胞を総称して成体幹細胞という。
【０００８】
成体幹細胞は、人体の各種臓器ですでに存在している細胞を採取、幹細胞へ展開させたもので、特定組織だけに分化する特徴がある。しかし、最近は成体幹細胞を利用して、肝細胞など各種の組織に分化させる実験が成功して、注目されている。
【０００９】
前記多能性幹細胞は成体骨髓から最初に分離され(Jiangら, Nature, 418:41, 2002)、その後、他の多数成体組織でも確認された(Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002)。すなわち、骨髓は一番広く知られた幹細胞のソースであるが、多能性幹細胞は肌、血管、筋肉及び脳からも確認された(Tomasら, Nat. Cell Biol., 3:778, 2001； Sampaolesiら, Science, 301:487, 2003； Jiangら, Exp. Hematol., 30:896, 2002)。しかし、骨髓のような成体組織内に幹細胞は非常に少量しか存在せず、このような細胞は分化誘導なしで培養するのが困難であり、特異にスクリーンされた培地がないと、その細胞を培養するのは難しい。すなわち、幹細胞を分離して体外で保存するのは、非常に難しいという問題がある。
【００１０】
これに対して、最近、脂肪組織が多能性幹細胞の新しいソースであるのが明かになった(Cousinら, BBRC., 301:1016, 2003； Miranvilleら, Circulation, 110:349, 2004； Gronthosら, J. Cell Physiol., 189:54, 2001； Seoら, BBRC., 328:258, 2005)。すなわち、脂肪吸引(liposuction)によって得られたヒト脂肪組織に未分化細胞群が含まれていて、これはin vitro状態で脂肪細胞、骨形成細胞、根源細胞及び軟骨母細胞への分化能を持つ細胞であるという事実が報告された(Zukら, Tissue Eng., 7:211, 2001； Rodriguezら, BBRC., 315:255, 2004)。このような脂肪組織は大量に抽出することができる利点があって、既存の問題を解決する新しい幹細胞のソースとして注目されている。
【００１１】
また、最近の研究では脂肪組織由来の細胞が筋肉再生能及び神経血管分化を促進する能力を有することが動物モデル実験を通じて知られ、幹細胞の新しいソースとして頭角を現わしている。
【００１２】
今まで知られた脂肪由来幹細胞としては、上皮細胞に分化可能なヒト脂肪由来の成体幹細胞(Brzoskaら, BBRC, 330:142, 2005)、骨形成及び脂肪細胞に分化可能なヒト脂肪由来の成体幹細胞(Caoら, BBRC, 332:370, 2005)、神経細胞に分化可能なヒト脂肪由来の成体幹細胞(Saffordら, BBRC, 294:371, 2005)、脂肪細胞に分化可能なラット脂肪由来の幹細胞(Ogawaら, BBRC, 319:511, 2004)、骨形成及び軟骨形成細胞に分化可能なラット脂肪由来の幹細胞(Ogawaら, BBRC, 313:871, 2004)、軟骨細胞に分化可能なヒト脂肪由来の幹細胞(Biomaterials, 25:3211, 2004)、神経細胞に分化可能なラット脂肪由来の幹細胞(Fujimuraら, BBRC, 333:116, 2005)及び骨細胞、軟骨細胞、神経細胞または筋肉細胞に分化可能な脂肪由来の幹細胞(アメリカ特許6,777,231)などがある。
【００１３】
しかし、現在まで大部分の脂肪由来の幹細胞は、ヒト以外の動物脂肪組織由来の幹細胞か、あるいはヒト脂肪組織由来の幹細胞であっても、腹部脂肪の脂肪吸引によって得られた組織由来に限られ、幹細胞から分化される細胞の種類も制限的であった。特に分離した幹細胞の増殖率が低く、未分化状態で長期間維持するのが難しく、その応用が制限されていた。
【００１４】
そこで、本発明者らは増殖率が優秀で、スフィア(sphere)を形成して未分化状態で長期間維持され、より多様な細胞に分化が可能な多能性成体幹細胞を開発しようと鋭意努力した結果、ヒト脂肪組織から多能性幹細胞を分離して、前記分離した成体幹細胞が骨形成細胞、軟骨形成細胞、神経細胞、星状細胞、脂肪細胞、インシュリン分泌膵臓ベータ細胞などの多様な形態の細胞に分化することができるだけでなく、非常に優秀な増殖率を持って、スフィア形成を通じて未分化状態で長期間維持が可能であることを確認して、本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、増殖率が優秀で、スフィアを形成して未分化状態で長期間維持が可能なヒト脂肪組織由来の多能性成体幹細胞及びその製造方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記多能性幹細胞から神経細胞、星状細胞、軟骨細胞、骨形成細胞、脂肪細胞及びインシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化させる方法及び前記分化された細胞または前記成体幹細胞を含む細胞治療剤を提供することにある。
【００１７】
前記の目的を果たすために、ヒト脂肪組織由来のペレットを、ＮＡＣ(N-acetyl-L-cysteine)含有培地で培養し、回収することを含む成体幹細胞の製造方法であって、前記成体幹細胞が、
（ａ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ１０５に対して全て陽性の免疫学的特性を示して、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対して全て陰性の免疫学的特性を示すこと；
（ｂ）プラスチックに附着して成長して、スピンドル形(spindle-shape)の形態学的特性を示して、ＣＯＲＭ−２含有培地でスフィア(sphere)を形成して未分化状態で長期間維持ができること；及び
（ｃ）中胚葉由来の細胞に分化する能力を持つこと、
を特徴とする、前記製造方法を提供する。
【００１８】
本発明において、前記ＮＡＣ含有培地はアスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、ＢＰＥ、インシュリン及びハイドロコーチゾン(hydrocortisone)をさらに含む培地であることを特徴とする。
【００１９】
本発明はまた、前記方法によって製造された成体幹細胞をＣＯＲＭ−２含有培地で培養し、スフィアを形成させることを特徴で、成体幹細胞を未分化状態で維持する方法を提供する。
【００２０】
本発明において、前記ＣＯＲＭ−２含有培地は抗菌抗真菌溶液（antibiotic antimycotic solution）、ハイドロコーチゾン(hydrocortisone)、インシュリン、ｒＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｂ２７及びβ−メルカプトエタノールをさらに含む無血清培地であることを特徴とする。
【００２１】
本発明はまた、前記方法によって製造され、（ａ）ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ１０５に対して全て陽性の免疫学的特性を示し、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対して全て陰性の免疫学的特性を示す；（ｂ）プラスチックに附着して成長し、スピンドル形(spindle-shape)の形態学的特性を示し、ＣＯＲＭ−２含有培地でスフィアを形成して未分化状態で長期間維持ができる；及び（ｃ）中胚葉由来の細胞への分化能を持つことを特徴とする成体幹細胞を提供する。
【００２２】
本発明において、前記成体幹細胞は未分化状態で少なくとも１６継代培養されることを特徴とし、前記中胚葉由来の細胞は軟骨細胞、骨形成細胞、神経細胞、星状細胞、脂肪細胞及びインシュリン分泌膵臓細胞であることを特徴とする。
【００２３】
本発明はまた、（ａ）前記成体幹細胞をＢＭＥ及びＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で前培養する段階；及び（ｂ）前記前培養液をＤＭＳＯ及びＢＨＡで処理して神経分化を誘導する段階を含む、成体幹細胞を神経細胞に分化させる方法及び前記分化された神経細胞を有効成分として含む、神経疾患治療用細胞治療剤を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記成体幹細胞をＴＦＧ−β１、Ｌアスコルビン酸２リン酸（Ｌ−ascorbate−２−phosphate）及びインシュリンを含むα−ＭＥＭ培地で培養することを含む成体幹細胞を軟骨細胞に分化させる方法及び前記分化された軟骨細胞を有効成分として含む、骨関節炎治療用細胞治療剤を提供する。
【００２５】
本発明はまた、前記成体幹細胞をＴＣＰ(tricalcium phosphate)と混合して、同種移植(isotransplanting)することを含む、成体幹細胞を骨形成細胞に分化させる方法及び前記分化された骨形成細胞を有効成分として含む骨欠損治療用細胞治療剤を提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記成体幹細胞をデキサメタゾン(dexamethasone)、インドメタシン(indomethacin)、インシュリン及びＩＢＭＸを含むα−ＭＥＭ培地で培養することを含む前記成体幹細胞を脂肪細胞に分化させる方法及び前記分化された脂肪細胞を有効成分として含む乳房組織形成用細胞治療剤を提供する。
【００２７】
本発明はまた、（ａ）前記成体幹細胞をニコチンアミド、β−メルカプトエタノール及びＦＢＳを含む低濃度グルコース含有のＤＭＥＭ培地で１２〜７２時間培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞をニコチンアミド、β−メルカプトエタノール及びＦＢＳを含む高濃度グルコース含有のＤＭＥＭ培地で４〜７日間培養する段階を含む前記成体幹細胞をインシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化させる方法及び前記分化されたインシュリン分泌膵臓ベータ細胞を有効成分として含む糖尿病治療用細胞治療剤を提供する。
【００２８】
本発明はまた、神経細胞に分化する特性を持つ前記成体幹細胞を、有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤を提供する。
【００２９】
本発明はまた、インシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化する特性を持つ成体幹細胞を、有効成分として含む糖尿病治療用細胞治療剤を提供する。
【００３０】
本発明はまた、軟骨細胞に分化する特性を持つ成体幹細胞を、有効成分として含む骨関節炎治療用細胞治療剤を提供する。
【００３１】
本発明はまた、骨形成細胞に分化する特性を持つ成体幹細胞を、有効成分として含む骨欠損治療用細胞治療剤を提供する。
【００３２】
本発明はまた、脂肪細胞に分化する特性を持つ成体幹細胞を、有効成分として含む乳房組織形成用細胞治療剤を提供する。
【００３３】
本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞を１００倍の倍率で撮影した写真である。
【図２】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞のＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を示したものである（Ａ−１及びＡ−２：本発明による脂肪組織由来の成体幹細胞；Ｂ及びＣ：従来の脂肪由来の幹細胞）。
【図３】本発明によるヒト乳房の脂肪組織由来の多能性幹細胞をスフィア培養した後、７日後に形成されたスフィアを２００倍の倍率で示したものである。
【図４】寒天で一つの幹細胞が増殖してスフィアを形成したのを２００倍の倍率で示した写真である。
【図５】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞をＣＯＲＭ−２含有ＭＥＢＭ培地でスフィア培養した後、免疫染色を利用してＮｅｓｔｉｎ、Ｏｃｔ４、ＳＨ２、ＳＨ３／４が発現した結果を１００倍の倍率で示した写真である。
【図６】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞が神経細胞と星状細胞に分化したことを示したものである。
【図７】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞から分化された脂肪細胞を２００倍の倍率で示しものである（Ａ：分化された状態の位相差（phase contrast）、Ｂ：Oil Red O染色法で染色したもの)。
【図８】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞から分化された軟骨細胞を１００倍の倍率で示したものである（Ａ：分化された状態の位相差（phase contrast）、Ｂ：軟骨細胞に分化された状態をアルシアンブルー（Alcian blue）染色法で確認したもの）。
【図９】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞から分化された骨形成細胞を示したものである（Ａ：ＴＣＰ単独処理群；Ｂ：ＴＣＰと骨髓幹細胞混合群；及びＣ：ＴＣＰと脂肪由来の幹細胞混合群）。
【図１０】本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞から分化されたインシュリン分泌膵臓ベータ細胞を免疫染色によって確認したものである。
【発明の詳細な説明及び望ましい具現例】
【００３５】
本発明はヒト乳房の脂肪組織から分離した多能性幹細胞に関するものである。
【００３６】
本発明ではまず、次のような方法を通じて、ヒト乳房の脂肪組織から多能性幹細胞を分離及び精製した。分離したヒト脂肪組織をＰＢＳで洗浄し、組織を細く切った後コラゲナーゼタイプ１（collagenase type１）（１ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地を利用して３７℃から２時間消化（digestion）した。ＰＢＳで洗浄後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層液を吸引し、底に残ったペレットはＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍメッシュ(mesh)でろ過してデブリー(debris)をとり除いた後、ＰＢＳで洗浄した。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸）培地にインキュベーションした。一夜経過後、付着しなかった細胞はＰＢＳで洗浄して、Ｋ−ＮＡＣ培地(Keratinocyte−ＳＦＭ培地  ＋  ２ｍＭ  ＮＡＣ  ＋  ０．２ｍＭアスコルビン酸  ＋  ０．０９ｍＭカルシウム  ＋  ５ｎｇ／ｍＬｒＥＧＦ  ＋  ５０μｇ／ｍＬＢＰＥ  ＋  ５μｇ／ｍＬインシュリン  ＋  ７４ｎｇ／ｍＬハイドロコーチゾン）を２日ごとに交換しながら培養して、ヒト乳房の脂肪組織由来の多能性幹細胞液を取得した。
【００３７】
前記分離したヒト乳房の脂肪組織由来の多能性幹細胞の増殖率を調査した結果、継代数(passage number)が１６に至るまで、ＣＰＤＬが漸次的に増加して優秀な増殖率を持つことが分かった。
【００３８】
一方、幹細胞のスフィア培養(sphere culture)のために、分離した脂肪組織由来の多能性幹細胞をＣＯＲＭ−２(tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer)１０μＭ、Ｂ２７、抗菌抗真菌溶液（antibiotic antimycotic solution）（１００Ｘ）５ｍＬ、ハイドロコーチゾン１μｇ／ｍＬ、インシュリン５μｇ／ｍＬ、ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦ４０ｎｇ／ｍＬ及びβ−メルカプトエタノールを含むＭＥＢＭ培地が入っている６ウェルの夫々のウェルに５×１０４〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞をシーディング(seeding)した結果、３日目から球(sphere)の形態を形成し始めた。この事実から、未分化状態を維持して優秀な増殖率を持つことが分かった。
【００３９】
前記のように得られたヒト脂肪組織由来の幹細胞液から目的の表面抗原を発現している多能性幹細胞を取得する方法としてはソーティング機能を持つフローサイトメータを用いるＦＡＣＳ法(Int. Immunol., 10:275, 1998)、磁気ビーズを用いる方法、多能性幹細胞を特異的に認識する抗体を用いるパンニング法(J. Immunol., 141:2797, 1998)などがある。また、大量の培養液などから多能性幹細胞を取得する方法としては、細胞の表面に発現されて分子(以下、表面抗原と称する)を特異的に認識する抗体を単独または組み合わせて、これをカラムとして使う方法がある。
【００４０】
フローサイトメータのソーティング方式としては、水滴荷電方式、セル捕獲方式などがあげられる。いずれかの方法も、細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光にて標識して、標識された抗体と抗原の結合体に対する蛍光を測定して蛍光強度を電気信号として変換することで、細胞の抗原発現量を定量することができる。また、使われる蛍光物質の種類を組み合わせることで、複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。これに使用可能な蛍光物質では、ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)、ＰＥ(phycoerythrin)、ＡＰＣ(allo-phycocyanin)、ＴＲ(TexasRed)、Ｃｙ３、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、Ｒｅｄ６１３、Ｒｅｄ６７０、ＴＲＩ−Ｃｏｌｏｒ、ＱｕａｎｔｕｍＲｅｄなどがある。
【００４１】
フローサイトメータを用いたＦＡＣＳ法としては、前記で得られた幹細胞溶液を収集して、遠心分離などの方法で細胞を分離した後、直接抗体で染色する方法と、一度適当な培地で培養、増殖させた後、抗体で染色する方法を利用することができる。細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的細胞のサンプルを混合して、氷上で３０分〜１時間インキュベーションする。一次抗体が蛍光にて標識されている場合には、洗浄後フローサイトメータで分離を実施する。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後、一次抗体に対して結合活性を持つ蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞を混合して、さらに氷水で３０分〜１時間インキュベーションする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメータで分離する。
【００４２】
各種表面抗原としては、造血関連抗原、中間葉系細胞の表面抗原、または神経系ニューロンの特異抗原などがあげられる。前記の造血関連抗原としてはＣＤ３４、ＣＤ４５などがあって、中間葉系細胞の表面抗原としてはＳＨ−２、ＳＨ−３などがあげられるし、神経系ニューロンの特異抗原としてはＮＳＥ、ＧＦＡＰなどがあげられる。前記の各種表面抗原を認識する抗体を単独あるいは組み合わせて使うことで、目的する細胞を取得することができる。
【００４３】
本発明による、前記分離した多能性成体幹細胞を、フローサイトメータを利用して分析した結果、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５に対しては陽性反応を示した。また、他の抗原に対する免疫表現型を確認した結果、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対して全て陰性の免疫学的特性を示した。
【００４４】
また、本発明による、前記分離した多能性成体幹細胞は神経細胞、星状細胞、骨形成細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及びインシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化が可能な多能性幹細胞であるのを確認した。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を具体的な実施例によってより詳しく説明する。しかし、本発明は下記実施例によって限定されることではなく、本発明の思想と範囲内で、さまざまな変形または修正することができることは、この分野で当業者に明らかである。
【００４６】
実施例１：脂肪組織から多能性幹細胞の分離
ソウル大学校の乳癌センター（大韓民国）から分譲された、女性の乳房組織から脂肪組織を分離してＰＢＳで洗浄した後、組織を細かく切って、コラゲナーゼタイプ１（collagenase type１）（１ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地を利用して３７℃で２時間消化(digestion)させた。次に、ＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層液を吸引し、底に残ったペレットはＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍメッシュでろ過してデブリーをとり除いた後、ＰＢＳで洗浄した。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸）培地でインキュベーションした。一夜経過後、付着しなかった細胞はＰＢＳで洗浄して、２ｍＭ  ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍＬｒＥＧＦ、５０μｇ／ｍＬＢＰＥ、５μｇ／ｍＬインシュリン及び７４ｎｇ／ｍＬハイドロコルチソンを含むKeratinocyte-SFM培地を２日ごとに交換しながら培養して多能性幹細胞を分離した。図１は前記方法で分離した、ヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞を１００倍の倍率で撮影した写真である。
【００４７】
実施例２：脂肪組織由来の幹細胞の増殖率の調査
実施例１のような分離方法を通じて、それぞれ異なるヒト個体の乳房組織サンプルから脂肪組織を得て、前期分離したヒト乳房の脂肪組織由来の多能性幹細胞の増殖率を調査するために、７５−フラスコに２×１０５ずつシーディングした後、継代数に応じＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)値を調査した。ＣＰＤＬは細胞の増殖率を意味する指数で、次のような式で表現される。
ＣＰＤＬ＝ｌｎ（Ｎｆ／Ｎｉ）／ｌｎ２
（Ｎｉ：初期シーディングした細胞数；Ｎｆ：最終細胞数）
その結果、図２のＡ−１及びＡ−２に示したように、本発明による成体幹細胞（ｈＭＡＤ−ＭＣＳ１及びｈＭＡＤ−ＭＣＳ２）は継代数(passage number)が１６の場合、ＣＰＤＬ値が約５０を示した。
一方、図２のＢ及びＣは従来ヒト脂肪組織由来の幹細胞(Linら, Stem Cells and Development, 14:92, 2005； Zukら, Tissue Eng., 7:211, 2001)の継代数によるＣＰＤＬ値を示したものであり、ＣＰＤＬ値がそれぞれ継代数７及び１３で３０〜３５及び２１を示した。この結果から、本発明による成体幹細胞は増殖率が非常に優秀であるのが分かった。
【００４８】
実施例３：脂肪由来の多能性幹細胞の免疫学的特性
実施例１で得られた脂肪組織由来の多能性幹細胞を、ＰＢＳで洗浄して、トリプシンで処理した後、細胞を回収して５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上層液を捨て、２％ＦＢＳ及びＰＢＳの混合液を入れて洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層液を捨て、細胞をＰＢＳに浮遊させてサンプル当り１×１０５ｃｅｌｌｓをウェルプレートに分注した。各ウェルに抗体(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody）を入れ、氷上で４０分間インキュベーションした。インキュベーションの後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層液をとり除き、ＰＢＳで洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。もう一回、前記の上層液の除去後、ＰＢＳで洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する過程を繰り返した。上層液をとり除き、１％パラホルムアルデヒドを入れて固定し、フローサイトメータを利用して分析した。
【表１】
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その結果、表１に示したように、本発明の脂肪組織由来の成体幹細胞はＣＤ７３に９１％、ＣＤ９０に９７％、ＣＤ２９に９６％、ＣＤ４４に８３％、ＣＤ１０５に８０％の陽性反応をそれぞれ示した。また、他の抗原に対する免疫表現型を確認した結果、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対しては、全て陰性の免疫学的特性を示した。
【００４９】
実施例４：脂肪組織多能性幹細胞のスフィア形成
実施例１で得られたヒト乳房の脂肪組織由来の多能性幹細胞を、ＣＯＲＭ−２  １０μＭ、抗菌抗真菌溶液（antibiotic antimycotic solution）（１００Ｘ）５ｍＬ、hydrocortisone１μｇ／ｍＬ、インシュリン５μｇ／ｍＬ、ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ、ＦＧＦ４０ｎｇ／ｍＬ、Ｂ２７及びβ−メルカプトエタノールを含む無血清ＭＥＢＭ培地が入っている６ウェルの夫々のウェルに５×１０４〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞をシーディングした結果、３〜７日目からスフィアの形状を形成し始め、図３及び図４に示したように、７〜１０日目にも幹細胞が増殖してスフィアを形成した。
また、本発明による幹細胞を寒天で培養した結果、図４に示したように、スフィアを形成した。
一方、実施例１で得られた幹細胞５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬを２４ウェルの夫々のウェルにシーディングした後、継代回数に応じでスフィア数を調査した（表２）。その結果、表２に示したように、スフィアを継代することで長期間増殖及び維持が可能であることを確認することができた。また、図５に示したように、Ｏｃｔ４が陽性発現したことから、未分化状態を維持して優秀な増殖率を持つことが分かった。
【表２】
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【００５０】
実施例５：脂肪組織由来幹細胞の免疫染色分析
前記実施例４で得られた脂肪組織由来の幹細胞スフィアを、ＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで３０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで１０分間透過処理（permeabilization）した。ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ＮＧＳで１時間反応させ、一次抗体を含むＰＢＳに一夜反応させた。ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体にて暗室で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、マウントした。
その結果、図５に示したように、本発明による多能性幹細胞スフィアは神経前駆細胞のマーカーといえるＮｅｓｔｉｎ、未分化状態の細胞マーカーといえるＯｃｔ４及び中間葉幹細胞のマーカーであるＳＨ２（ＣＤ１０５）とＳＨ３／４（ＣＤ７３）に対して、全て陽性反応を示した。
【００５１】
実施例６：脂肪由来の多能性幹細胞の神経及び星状細胞への分化
実施例１で得られた脂肪組織由来の多能性幹細胞を、１ｍＭ  ＢＭＥ及び１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて２４時間前培養(preincubation)した。前培養後１％ＤＭＳＯ及び１００μＭ  ＢＨＡ(butylated hydrxyanisole)を含む神経細胞分化誘導培地で９０分間培養して神経細胞への分化を誘導した後、免疫染色を実施した（図６）。その結果、図６に示したように、本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞は、神経系星状細胞の特異抗原であるＧＦＡＰ(glial fibrillary acidic protein)と神経細胞特異物質であるＭＡＰ２(microtubule-associated protein2)に対して陽性反応を示した。
図６で、最も上のラインの写真は、分化された細胞自体ではＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ蛍光を見せないことを示した負の対照群である。二番目のラインの左側のＭＡＰ２写真はＴＲＩＴＣの赤色蛍光を見せ、これはＭＡＰ２が発現されたことを示し、右側の位相差（phase contrast）写真とマージ(merge)させた写真から、この赤色蛍光が、ＭＡＰ２が発現された細胞から出る蛍光であることが分かった。
また、三番目のラインの左側、ＧＦＡＰ写真はＦＩＴＣの緑蛍光を示し、右側位相差（phase contrast）写真とマージさせた写真から、この緑色蛍光が、ＧＦＡＰが発現された細胞から出る蛍光であることが分かった。前記結果から、本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞が神経細胞及び星状細胞に分化したことが分かった。
【００５２】
実施例７：脂肪由来の多能性幹細胞の脂肪細胞への分化
実施例１で得られた脂肪組織由来の多能性幹細胞を、５％ＦＢＳ、１μＭデキサメタゾン、２００μＭインドメタシン、１０μｇ／ｍＬインシュリン、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）を含むα−ＭＥＭ培地で２週の間培養して、多能性幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導して、Oil red O染色法を利用して分析した。その結果、図７に示したように、本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞が、脂肪細胞に分化したことを確認することができた。
【００５３】
実施例８：脂肪由来の多能性幹細胞の軟骨細胞への分化
実施例１で得られた脂肪組織由来の多能性幹細胞１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、２４well plateの中心に１０μｌずつ分注し、次いで５％ＦＢＳ、ＴＦＧ−β１  １０ｎｇ／ｍＬ、Ｌアスコルビン酸２リン酸（Ｌ−ascorbate−２−phosphate）５０μＭ及びインシュリン６．２５μｇ／ｍＬを含むα−ＭＥＭ培地で２週間培養して多能性幹細胞の軟骨細胞への分化を誘導し、アルシアンブルー（Alcian blue）染色法を利用して軟骨細胞への分化の可否を分析した。その結果、図８に示したように、本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞が軟骨細胞に分化したことを確認することができた。
【００５４】
実施例９：脂肪由来の多能性幹細胞の骨形成細胞への分化
実施例１で得られた脂肪組織由来の成体幹細胞１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬをＴＣＰ(tricalcium phosphate)と混合して、イヌの皮下に同種移植した後、１４日後に前記組織を処理し、Ｈ＆Ｅ染色法で分析した。
その結果、図９に示したように、ＴＣＰ単独処置群（Ａ）ではＴＣＰの周りに炎症細胞の浸潤が確認され、ＴＣＰと骨髓幹細胞混合群（Ｂ）ではＴＣＰ周りに炎症反応がそのまま残っていたが、ＴＣＰと脂肪由来の幹細胞混合群（Ｃ）ではＴＣＰが大部分吸収され、典型的な初期骨形成が観察され、骨芽細胞様細胞、多核を持つ破骨細胞様細胞及び骨基質も観察された。この結果から、本発明によるヒト脂肪組織由来の多能性幹細胞が、骨形成細胞に分化したことを確認することができた。
【００５５】
実施例１０：脂肪由来の多能性幹細胞のインシュリン分泌膵臓ベータ細胞への分化
実施例１で得られた脂肪組織由来の多能性幹細胞を、１０ｍｍｏｌ／Ｌニコチンアミド、１ｍｍｏｌ／Ｌβ−メルカプトエタノールを含む、１０％ＦＢＳを添加した低グルコースＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌニコチンアミド、１ｍｍｏｌ／Ｌβ−メルカプトエタノール及び５％ＦＢＳを添加した高グルコースＤＭＥＭ培地で５日間培養して、インシュリン分泌膵臓ベータ細胞への分化を誘導した。分化誘導後免疫染色を通じて確認した結果、図１０で示したように、細胞内にＣ−ペプチド及びインシュリンが存在した。インシュリン分泌膵臓ベータ細胞でインシュリンの原形であるプロインスリンが生成され、これはインシュリンとＣ−ペプチドに分かれる。従って、前記結果から、本発明による脂肪組織由来の多能性幹細胞が、インシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化したことを確認することができた。
以上本発明の内容の特定部分を詳述したが、当業係の通常の知識を持つ者にとって、単に望ましい実施様態であり、またこれによって本発明の範囲が限られることではない。本発明の実質的な範囲は添付された特許請求の範囲及びそれらの均等物によって定義されるものとする。
【産業上利用可能性】
【００５６】
以上詳述したように、本発明による多能性幹細胞は成体幹細胞にもかかわらず、既存の脂肪由来の成体幹細胞に比べてより多い細胞への分化が可能で、特に神経細胞、星状細胞、脂肪細胞、軟骨形成細胞、骨形成細胞、またはインシュリン分泌膵臓ベータ細胞に分化する能力を持っているし、骨粗鬆症、骨関節炎、神経疾患、糖尿病などの治療に有効であって、また、乳房組織形成にも有用である。また、本発明による成体幹細胞は、無血清培地でスフィアを形成することによって、純粋に脂肪由来の幹細胞の分離ができ、未分化状態で長期間維持するのが可能であり、また増殖率が非常に優秀であるので、細胞治療剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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