(57)【要約】非標識対照物の分離特性と実質的に同一の整合性のある鮮明な分離特性を有する、電気泳動に有用な前標識されたタンパク質標準を提供する。本発明は、第１のアミノ酸上において標識された複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットであって、標識用には標的とされないアミノ酸と標識との副反応を減少させたタンパク質標準セットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の標識タンパク質を含む前標識された（ｐｒｅ−ｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質標準セットであって、該複数の標識タンパク質の１つ以上が、第１のアミノ酸上に標識化合物を含む選択的に標識されたタンパク質であり、該選択的に標識されたタンパク質が、標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を、該選択的に標識されたタンパク質の分子量１０キロダルトン（ｋＤａ）あたり１つ未満有する、前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２】
選択的に標識されたタンパク質が、標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を欠いている、請求項１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３】
第１のアミノ酸がリジンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がシステインでありかつ第２のアミノ酸がリジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がグルタミン酸でありかつ第２のアミノ酸がアスパラギン酸であるか；第１のアミノ酸がアスパラギン酸でありかつ第２のアミノ酸がグルタミン酸であるか；第１のアミノ酸がヒスチジンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がトリプトファンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはアスパラギンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がアスパラギンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；または第１のアミノ酸がチロシンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；または第１のアミノ酸がメチオニンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、チロシン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上である、請求項１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４】
第１のアミノ酸がリジンであり、かつ第２のアミノ酸がシステインである、請求項３に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５】
第１のアミノ酸がシステインであり、かつ第２のアミノ酸がリジンである、請求項３に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６】
複数の標識タンパク質のうちの２つ以上が、選択的に標識されたタンパク質であり、該選択的に標識されたタンパク質が、第１のアミノ酸上に標識化合物を含み、かつ該選択的に標識されたタンパク質が、標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を、該選択的に標識されたタンパク質の分子量１０キロダルトン（ｋＤａ）あたり１つ未満有する、請求項１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項７】
３つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットであって、該選択的に標識されたタンパク質が、第１のアミノ酸上に標識化合物を含み、かつ該選択的に標識されたタンパク質が、標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を、該選択的に標識されたタンパク質の分子量１０キロダルトン（ｋＤａ）あたり１つ未満有する、請求項４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項８】
４つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットであって、該選択的に標識されたタンパク質が、第１のアミノ酸上に標識化合物を含み、かつ該選択的に標識されたタンパク質が、標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を、該選択的に標識されたタンパク質の分子量１０キロダルトン（ｋＤａ）あたり１つ未満有する、請求項４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項９】
５つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットであって、該選択的に標識されたタンパク質が、第１のアミノ酸上に標識化合物を含み、かつ該選択的に標識されたタンパク質が、標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を、該選択的に標識されたタンパク質の分子量１０キロダルトン（ｋＤａ）あたり１つ未満有する、請求項４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１０】
少なくとも１つの選択的に標識されたタンパク質が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４０個の連続したアミノ酸の配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１１】
少なくとも１つの選択的に標識されたタンパク質が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも５０個の連続したアミノ酸の配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１２】
少なくとも２つの選択的に標識されたタンパク質が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４０個の連続したアミノ酸の配列の１つ以上のコピーを含む、請求項６に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１３】
少なくとも２つの選択的に標識されたタンパク質が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４０個の連続したアミノ酸の同じ配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１２に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１４】
第１のアミノ酸がリジンであり、かつ第２のアミノ酸がシステインである、請求項１０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１５】
天然に存在するタンパク質が、ＡＤＰリボシル化因子または巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）胞子タンパク質である、請求項１４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１６】
第１のアミノ酸がシステインであり、かつ第２のアミノ酸がリジンである、請求項１０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１７】
天然に存在するタンパク質が、種子貯蔵タンパク質、ＨＩＶウイルスもしくはエボラウイルスのＬドメイン、またはＷＮＫタンパク質である、請求項１６に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１８】
アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比較して減少した数の第２のアミノ酸の残基を有する、請求項１０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、第２のアミノ酸の残基を欠いている、請求項１８に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２０】
第１のアミノ酸上において選択的に標識された１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つが、発色団で標識されている、請求項１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２１】
第１のアミノ酸上において選択的に標識された１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つが、織物染料で標識されている、請求項１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２２】
織物染料が、ｒｅｍａｚｏｌブリリアントブルーＲ、ｕｎｉｂｌｕｅ  Ａ、マラカイトグリーンイソチオシアネート、またはオレンジ１６である、請求項２１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２３】
第１のアミノ酸上において選択的に標識された１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つが、フルオロフォアで標識されている、請求項１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２４】
フルオロフォアが、Ａｌｅｘａ蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、フルオレセインもしくはその誘導体、エオシンもしくはその誘導体、テトラメチルローダミン、ローダミンもしくはその誘導体、テキサスレッドもしくはその誘導体、ピリジルオキサゾールもしくはその誘導体、塩化ＮＢＤ、フッ化ＮＢＤ、ＡＢＤ−Ｆ、ルシファーイエローもしくはその誘導体、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ＡＮＳ）もしくはその誘導体、またはオレゴングリーンもしくはその誘導体である、請求項２３に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２５】
複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットであって、該複数の標識タンパク質の１つ以上が、第１のアミノ酸上に標識化合物を含む選択的に標識されたタンパク質であり、該選択的に標識されたタンパク質が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含み、該天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４０個の連続したアミノ酸を含み、該アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比較して減少した数の第２のアミノ酸の残基を有し、該第２のアミノ酸が標識化合物と反応する、前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２６】
第１のアミノ酸がリジンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がシステインでありかつ第２のアミノ酸がリジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がグルタミン酸でありかつ第２のアミノ酸がアスパラギン酸であるか；第１のアミノ酸がアスパラギン酸でありかつ第２のアミノ酸がグルタミン酸であるか；第１のアミノ酸がヒスチジンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がトリプトファンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはアスパラギンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がアスパラギンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；または第１のアミノ酸がチロシンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；または第１のアミノ酸がメチオニンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、チロシン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上である、請求項２５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２７】
第１のアミノ酸がリジンであり、かつ第２のアミノ酸がシステインである、請求項２６に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２８】
第１のアミノ酸がシステインであり、かつ第２のアミノ酸がリジンである、請求項２６に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項２９】
複数の標識タンパク質のうちの２つ以上が、第１のアミノ酸上に標識化合物を含む選択的に標識されたタンパク質であり、かつ該２つ以上の選択的に標識されたタンパク質の各々が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含み、該天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４０個の連続したアミノ酸を含み、該アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比較して減少した数の第２のアミノ酸の残基を有し、該第２のアミノ酸が標識化合物と反応する、請求項２５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３０】
少なくとも２つの選択的に標識されたタンパク質が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同な同じアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む、請求項２９に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３１】
天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列が、１０ｋＤａあたり１つ未満の第２のアミノ酸の残基を有する、請求項３０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３２】
天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列が、第２のアミノ酸の残基を欠いている、請求項３１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３３】
前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識された別個のタンパク質が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同な配列に由来するアミノ酸配列のコピーを異なる数含む、請求項２９に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３４】
天然に存在するタンパク質がヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素である、請求項２５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３５】
ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素が、リポアミドデヒドロゲナーゼ、グルタチオン還元酵素、またはチオレドキシンである、請求項３４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３６】
ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素がチオレドキシンである、請求項５４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３７】
ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素が細菌チオレドキシンである、請求項３６に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３８】
ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のチオレドキシンである、請求項３７に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項３９】
天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列が、短縮されたチオレドキシン配列に相同である、請求項３６に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４０】
１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つが、１つ以上の更なるアミノ酸配列をさらに含む、請求項９または請求項２５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４１】
１つ以上の更なるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つが、第２の天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同である、請求項４０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４２】
１つ以上の更なるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つが、ペプチドまたはタンパク質のタグ配列である、請求項４０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４３】
ペプチドまたはタンパク質のタグ配列が、複数のヒスチジン（ｈｉｓ）配列、ＨＡＴ配列、Ｔ７遺伝子１０配列、血球凝集素配列、ＦＬＡＧタグ配列、ｍｙｃタグ配列、グルタチオン−Ｓ−転移酵素配列、マルトース結合タンパク質配列、カルモジュリン結合ペプチド配列、またはキチン結合配列である、請求項４２に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４４】
少なくとも５つの標識タンパク質を含む、請求項１または請求項２５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４５】
少なくとも１２個の標識タンパク質を含む、請求項４４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４６】
少なくとも２つの選択的に標識されたタンパク質が、少なくとも２つの異なる色素で標識されている、請求項４５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４７】
複数の標識タンパク質のうちの少なくとも３つのタンパク質が、少なくとも３つの異なる色素で標識されている、請求項４５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４８】
複数の標識タンパク質のうちの少なくとも４つのタンパク質が、少なくとも４つの異なる色素で標識されている、請求項４５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項４９】
選択的に標識されたタンパク質のうちの２つ以上が、互いに１０％以内の、タンパク質分子量に対する第１のアミノ酸残基の数の比を有する、請求項６または請求項２９に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５０】
選択的に標識されたタンパク質のうちの２つ以上が、互いに５％以内の、タンパク質分子量に対する第１のアミノ酸残基の数の比を有する、請求項４９に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５１】
選択的に標識されたタンパク質のうちの２つ以上が、タンパク質分子量に対する第１のアミノ酸残基の残基数について同じ比を有する、請求項５０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５２】
選択的に標識されたタンパク質の全てが、タンパク質分子量に対する第１のアミノ酸の残基の数について同じ比を有する、請求項５１に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５３】
複数の標識タンパク質のうちの少なくとも４つの各々と、複数の標識タンパク質の別のタンパク質との間の分子量増分が、１０ｋＤａの倍数である、請求項４４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５４】
複数の標識タンパク質のうちの少なくとも５つの各々と、複数の標識タンパク質の別のタンパク質との間の分子量増分が、１０ｋＤａの倍数である、請求項５３に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５５】
複数の標識タンパク質のうちの少なくとも１０個の各々と、複数の標識タンパク質の別のタンパク質との間の分子量増分が、１０ｋＤａの倍数である、請求項５３に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５６】
少なくとも２つの選択的に標識されたタンパク質が、１０ｋＤａあたり１〜１０個の第１のアミノ酸の残基を含む、請求項６または請求項２９に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５７】
選択的に標識されたタンパク質のうちの少なくとも２つのタンパク質が、１０ｋＤａあたり２〜７個の第１のアミノ酸の残基を含む、請求項５６に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５８】
選択的に標識されたタンパク質のうちの少なくとも２つのタンパク質が、１０ｋＤａあたり３〜５個の第１のアミノ酸の残基を含む、請求項５７に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項５９】
選択的に標識されたタンパク質のうちの少なくとも２つのタンパク質が、１０ｋＤａあたり３．５〜４．５個の第１のアミノ酸の残基を含む、請求項５８に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６０】
選択的に標識されたタンパク質のうちの少なくとも３つのタンパク質が、１０ｋＤａあたり３．５〜４．５個の第１のアミノ酸の残基を含む、請求項５９に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６１】
選択的に標識されたタンパク質のうちの少なくとも５つのタンパク質が、１０ｋＤａあたり３．５〜４．５個の第１のアミノ酸の残基を含む、請求項６０に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６２】
複数の標識タンパク質の分子量が、１０ｋＤａ以下〜１００ｋＤａ以上の間の範囲にわたる、請求項１または請求項２５に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６３】
複数の標識タンパク質の分子量が、５ｋＤａ以下〜１５０ｋＤａ以上の間の範囲にわたる、請求項６２に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６４】
複数の標識タンパク質の分子量が、５ｋＤａ以下〜２００ｋＤａ以上の間の範囲にわたる、請求項６３に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６５】
複数の標識タンパク質の分子量が、５ｋＤａ以下〜２５０ｋＤａ以上の間の範囲にわたる、請求項６４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６６】
５ｋＤａを超える分子量を有する前記セットの電気泳動にかけられたタンパク質の各々のゲル上のバンドの幅に、２倍を超える変化がない、請求項４４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６７】
タンパク質標準セットがゲル上で電気泳動にかけられた場合に、１０ｋＤａ以上の分子量を有する５つ以上のタンパク質の各々が、非標識型の同じタンパク質標準が移動する距離から起算して５％以内に移動する、請求項４４に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６８】
複数の標識タンパク質が１つ以上の溶液中に提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項６９】
１つ以上の溶液が、少なくとも１つの緩衝液、少なくとも１つの界面活性剤、少なくとも１つの還元剤、少なくとも１つのアルコール、または少なくとも１つの色素を含む、請求項６８に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項７０】
少なくとも１つのチューブまたはバイアル中の少なくとも１つの溶液中に、前記請求項のいずれか一項に記載の前標識された標準セットを提供する段階を含む、前標識されたタンパク質標準セットを顧客に提供する方法。
【請求項７１】
金銭と引きかえに、前記請求項のいずれか一項に記載の前標識された標準セットを顧客に提供する段階を含む、収入を生み出す方法。
【請求項７２】
前記請求項のいずれか一項に記載の前標識された標準セットを販売する段階を含む、収入を生み出す方法。
【請求項７３】
複数の標識タンパク質のうちの２つ以上のタンパク質が、第１のアミノ酸の残基上に標識を含み、かつ標識に対して反応する第２のアミノ酸の残基を欠いている、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セット；および
１つ以上のゲルカセット、ゲルローディング緩衝液、ゲルローディング色素、還元剤、ブロット膜、溶解緩衝液、精製マトリックス、または非標識タンパク質標準セットのうちの１つ以上
を含むキット。
【請求項７４】
複数の標識タンパク質のうちの２つ以上のタンパク質が、第１のアミノ酸の残基上に標識を含み、かつ標識に対して反応する第２のアミノ酸の残基を欠いている、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セット；および
１つ以上のゲルカセット
を含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
２つ以上のタンパク質において、分子量に対する第１のアミノ酸残基の数の比が互いに５％以内にある、請求項７３に記載のキット。
【請求項７６】
複数の標識タンパク質のうちの２つ以上タンパク質が、分子量１０ｋＤａあたり同じ数の第１のアミノ酸残基を有する、請求項７４に記載のキット。
【請求項７７】
複数の標識タンパク質のうちの２つ以上タンパク質が、分子量１０ｋＤａあたり２〜７個の第１のアミノ酸残基を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７８】
５つ以上の標識タンパクを含むキットであって、タンパク質標準セットがゲル上で電気泳動にかけられた場合に、１０ｋＤａ以上の分子量を有する該５つ以上のタンパク質の各々が、非標識型の同じタンパク質標準が移動する距離から起算して１０％以内に移動する、請求項７０に記載のキット。
【請求項７６】
５〜１２個の標識タンパク質を含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７７】
標識タンパク質が、１０ｋＤａ以下〜１００ｋＤａ以上の分子量の範囲にわたる、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
複数のタンパク質が、少なくとも２つの異なる色素で染色されている、請求項７６に記載のキット。
【請求項７９】
複数のタンパク質が、少なくとも４つの異なる色素で染色されている、請求項７６に記載のキット。
【請求項８０】
複数の標識タンパク質が１つ以上の溶液中に提供される、請求項７３に記載のキット。
【請求項８１】
標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を１０ｋＤａあたり１つ未満含むタンパク質の第１のアミノ酸の１つ以上の残基に、標識化合物を付着させる段階を含む、タンパク質標準を作製する方法。
【請求項８２】
第１のアミノ酸がリジンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がシステインでありかつ第２のアミノ酸がリジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がグルタミン酸でありかつ第２のアミノ酸がアスパラギン酸であるか；第１のアミノ酸がアスパラギン酸でありかつ第２のアミノ酸がグルタミン酸であるか；第１のアミノ酸がヒスチジンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がトリプトファンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはアスパラギンのうちの１つ以上であるか；第１のアミノ酸がアスパラギンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；または第１のアミノ酸がチロシンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上であるか；または第１のアミノ酸がメチオニンでありかつ第２のアミノ酸がシステイン、リジン、ヒスチジン、チロシン、もしくはトリプトファンのうちの１つ以上である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
第１のアミノ酸がリジンであり、かつ第２のアミノ酸がシステインである、請求項８２に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項８４】
第１のアミノ酸がシステインであり、かつ第２のアミノ酸がリジンである、請求項８２に記載の前標識されたタンパク質標準セット。
【請求項８５】
請求項１または請求項２５に記載の前標識されたタンパク質標準セットを電気泳動ゲルに適用して、該前標識されたタンパク質標準セットの２つ以上のタンパク質標準を分離する段階を含む、２つ以上の前標識されたタンパク質標準を分離する方法。
【請求項８６】
請求項６または請求項２９に記載の前標識されたタンパク質標準セットを電気泳動ゲルに適用して、該前標識されたタンパク質標準セットの２つ以上のタンパク質標準を分離する段階を含む、２つ以上の前標識されたタンパク質標準を分離する方法。
【請求項８７】
１０ｋＤａ以上の分子量を有する２つ以上のタンパク質標準のうちの少なくとも２つが、非標識型の同じタンパク質標準が移動する距離から起算して５％以内に移動する、請求項８５または請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
１０ｋＤａ以上の分子量を有する前記セットの電気泳動にかけられたタンパク質の各々のゲル上のバンドの幅に、２倍を超える変化がない、請求項８５または請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
１０ｋＤａ以上の分子量を有する前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質のバンド強度に、２．５倍を超える変化がない、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
以下の段階を含む、１つ以上のタンパク質を特徴づける方法：
（ａ）１つ以上のタンパク質および請求項１または請求項２５に記載の少なくとも１つの前標識されたタンパク質標準セットをゲル中で電気泳動にかける段階；ならびに
（ｂ）１つ以上のタンパク質の移動と、前標識された標準セットの少なくとも１つのタンパク質標準の移動とを比較する段階。
【請求項９１】
（ｃ）１つ以上のタンパク質の分子量を測定する段階をさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
１０ｋＤａ以上の分子量を有する２つ以上のタンパク質標準のうちの少なくとも２つが、非標識型の同じタンパク質標準が移動する距離から起算して５％以内に移動する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
１０ｋＤａ以上の分子量を有する前記セットの電気泳動にかけられたタンパク質標準の各々のゲル上のバンドの幅に、２倍を超える変化がない、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
１０ｋＤａ以上の分子量を有する前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質標準のバンド強度に、２．５倍を超える変化がない、請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年７月２１日出願の米国仮出願第６０／８２０，１０１号、および２００６年１２月１５日出願の米国仮出願第６０／８７０，２５２号に対する優先権の恩典を主張する。これらの特許出願は共に参照によりその全体が本願明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照
本願は、２００７年７月２１日に作成され、８７．３キロバイトのサイズを有する、本願と同時にテキストファイルＩＶＧＮ  ５６３＿ＷｏｒｋＦｉｌｅ．ｔｘｔとして提出した配列表を、参照により組み入れるものとする。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、生化学的分離に用いられる標識タンパク質標準に、そして、より詳しくはゲル電気泳動において使用するための標識タンパク質標準に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
新薬および新しい医療診断法の開発を支援するツール、ならびにある診断そのものには、タンパク質試料の正確かつ効率よい分析が必要である。これには、分離方法を使用して分離されるタンパク質試料中のタンパク質のサイズの同定を正確に可能にする標識を必要とする。タンパク質の精製、同定および特性解析のために生化学において一般に行われる分離方法としては、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動および溶液電気泳動が挙げられる。これらの方法は、通常、分子量測定または電荷測定のための標準を使用する。特にゲル電気泳動は、分子量マーカーを用いて通常実行される新薬および新しい医学診断法の開発のための一般的ツールである。
【０００５】
電気泳動用の前標識された（ｐｒｅ−ｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質標準は非標識標準ほどには鮮明に分解しないことで知られており、しばしば、標識されたマーカーの分子量は不正確であり、量を変化させると、非標識タンパク質と相違する。変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動した前染色タンパク質マーカーのバンドは、例えば、前標識されておらずその代わりに電気泳動の終了後に染色される同じタンパク質から生じるバンドよりも著しく広がり拡散する可能性がある。これは、特定のタンパク質標準を一様に標識することの困難さに主に起因する。
【０００６】
タンパク質の標識は、通常、標識をタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の化学基に付着させることによって行われる。アミノ酸の重要な反応性基は、化学反応において求核剤として作用する。例えば、システインのスルフヒドリル基、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基またはリジン、ヒスチジン、トリプトファンもしくはアルギニンのアミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基、チロシンのフェノレート、そして、メチオニンのチオエーテルなどがそうである。タンパク質に結合される色素上の特定の反応性化学基の選択、および化学的結合が行われる反応条件（例えばｐＨなど）の操作は、概して１つ以上の特定のアミノ酸への色素の結合に有利なように行われる。
【０００７】
標識の標的とされない１つ以上のアミノ酸との副反応を減らすように反応条件下を調整することができるにもかかわらず、副反応を完全に排除するかまたは制御することは困難である。副反応による特定のタンパク質の様々な数の部位への標識の付加は、タンパク質に付着させる標識の量の均一性を低下させる。そうすると、所与の標識タンパク質標準は、集団の異なるメンバーが異なる移動特性を有する標識タンパク質分子の集団を構成する。従って前標識された標準は、通常、分離の際、非標識タンパク質ほど良好に分解せず、例えば、非標識の形で電気泳動にかけられる同じタンパク質によって生成されるバンドよりもはるかに鮮明でないバンドを電気泳動ゲル上に生成する。前標識された標準の標識のばらつきのために、前標識された標準を使用した分子量の測定は信頼できないものとなることが多い。
【０００８】
電気泳動ゲル上の前標識されたタンパク質の劣った分解能に寄与する他の要因は、分子量に対する付着させた色素分子の数の比がタンパク質ごとに変動しやすいことである。異なる分子量を表すためにタンパク質標準セットは異なるマーカータンパク質を使用するため、そしてそのセットの異なるタンパク質において分子量に対する標的アミノ酸残基の数の比が変動するため、マーカータンパク質の視覚化のために同程度の強度を有するタンパク質を有する前標識マーカーセットを提供するために、異なる量の個々の標識タンパク質標準を混合することがしばしば必要である。多くの場合、これは、電気泳動ゲル上の生成したバンドのための望ましい強度を実現するために、１つ以上の標識されたタンパク質が、タンパク質量に関してゲルレーンにおいて「過充填される（ｏｖｅｒｌｏａｄｅｄ）」ことが必要である。標準セットのタンパク質の過充填は、ゲル上のバンドが広くなって輪郭がくっきりと見えない状態につながり、特定の分子量のタンパク質の移動距離を評価することが困難になる。
【発明の概要】
【０００９】
非標識対照物の分離特性と実質的に同一の整合性のある分離特性を有する、電気泳動またはクロマトグラフィにおいて有用な標識タンパク質標準が、本願明細書において提供される。本発明は、複数の標識タンパク質を含み、その標識タンパク質の１つ以上は第１のアミノ酸上において選択的に標識されている前標識されたタンパク質標準セットを提供する。第１の（または標的）アミノ酸上で標識化合物により選択的に標識されたタンパク質は、第１のアミノ酸に結合される標識化合物を有し、かつ、以下のいずれかのものである：標識化合物と反応することができる第２の（または非標的）アミノ酸の残基を欠失しているか；または天然に存在するタンパク質に対する相同性を有するが、それが由来する野生型タンパク質配列よりも少ない、標識化合物と反応できる第２のアミノ酸の残基を有するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
副反応で標識化合物を結合できるアミノ酸の残基の数を減らすことによって、所与のタンパク質分子に付着させる標識化合物の量のばらつきは、小さくなる。さもなければこの標識のばらつきから生じるであろう標識タンパク質の複数の種の減少は、より正確な分離特性を提供する。本発明は、電気泳動にかけられたときに、非標識型で電気泳動にかけられた標準セットのタンパク質の移動距離と整合した移動距離を有する鮮明なバンドを与える、前標識されたタンパク質標準セットを提供する。
【００１１】
ある態様では、第１のアミノ酸に結合される標識化合物は、色素である。この色素は、発色団またはフルオロフォアを含むことができる。標識のための標的とされない１つ以上のアミノ酸の残基に色素が結合するのを減らすまたは排除することで、マーカータンパク質に結合した色素の量および位置のばらつきは小さくなる。本発明で提供される方法を用いて成し遂げられる標識の特異性は、分離手順（例えば変性ゲル上での電気泳動）において、高い分解能を有する標識タンパク質を生成する。
【００１２】
１つの局面では、本発明は、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットであって、前記複数の標識タンパク質の１つ以上が選択的に標識されており、選択的に標識されたタンパク質が第１の（標識）アミノ酸に標識化合物を含み、かつ前記標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基をタンパク質１０キロダルトン（ｋＤａ）あたり１つ未満有する、前標識されたタンパク質標準セットを提供する。いくつかの態様では、本発明の選択的に標識されたタンパク質は、標識化合物と反応できる第２のアミノ酸の残基を欠く。
【００１３】
本発明の本局面のいくつかの態様において、選択的に標識されたタンパク質は、天然で非標的アミノ酸を欠失しているかまたは欠損している天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を含む。前標識されたタンパク質標準セットのいくつかの例示的な態様において、前記セットの１つ以上の選択的に標識されたタンパク質標準は、第１の（標的）アミノ酸で標識され、第２の（非標的）アミノ酸を欠く天然に存在するタンパク質またはその断片を含む。いくつかの例示的な態様において、前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識されたタンパク質標準は、第１のアミノ酸で標識され、かつ第２のアミノ酸を欠く天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列またはその一部分の１つ以上のコピーを含む。
【００１４】
前標識されたタンパク質標準が天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を含み、その配列が非標的アミノ酸を欠失しているかまたは欠損している態様において、前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０個より多いコピーを有することができる。
【００１５】
いくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質が、非標的アミノ酸を欠失しているかまたは欠損している天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。
【００１６】
ある態様では、選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質の配列に相同ではなく、非標的アミノ酸を欠失しているかまたは欠損しているアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。例えば、前標識されたタンパク質標準セットのいくつかの態様では、前記セットの１つ以上の選択的に標識されたタンパク質標準は、天然に存在するタンパク質に対して相同性を有することは公知でないアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含み、前記１つ以上の選択的に標識されたタンパク質は、第１または標的アミノ酸で標識され、第２の（非標的）アミノ酸を欠失している。いくつかの例示的な態様において、前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識されたタンパク質標準は、非標的アミノ酸を欠く天然に存在するタンパク質に存在することは公知でないアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。例えば、公知の天然に存在するタンパク質に関連していないタンパク質は、非標的アミノ酸を欠失しているかまたは好ましくは欠損しているように設計することができ、組換え技術によって、または化学的ペプチド合成により合成することができる。
【００１７】
前標識されたタンパク質標準が、天然に存在するタンパク質に由来しないアミノ酸配列を含み、その配列が非標的アミノ酸を欠失しているかまたは欠損している態様において、前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質に由来しないアミノ酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多くのコピーを有することができる。
【００１８】
いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質の各々が、天然に存在するタンパク質に相同ではない、非標的アミノ酸を欠失しているかまたは欠損している配列の異なる数のコピーを含む、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。
【００１９】
本発明の別の局面において、本発明は、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットであって、前記複数のタンパク質の１つ以上が選択的に標識されており、選択的に標識されたタンパク質が第１のアミノ酸に標識化合物を含み、前記選択的に標識されたタンパク質が天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列が、天然に存在するタンパク質の野生型アミノ酸配列と比較して少ない数の、標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を有する、前標識されたタンパク質標準セットを提供する。これらの本発明の局面のいくつかの例示的な態様において、選択的に標識されたタンパク質標準は、標的アミノ酸で標識され、天然に存在するタンパク質の配列に相同なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含み、天然に存在するタンパク質の配列のアミノ酸配列に対する相同性を有する前記配列が非標的アミノ酸を欠く、タンパク質である。このように本発明は、標識タンパク質の１つ以上が、天然に存在するタンパク質の少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個またはこれより多くの連続したアミノ酸に少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％相同であってかつ前記標識化合物と反応できる第２のアミノ酸の残基を欠くアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含み、かつ第１のアミノ酸に結合される標識化合物を含む選択的に標識されたタンパク質である、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準のセットを包含する。
【００２０】
いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質が各々、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、各々ヌクレオチド−ジスルフィド還元酵素のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。いくつかの例示的な態様において、前標識されたタンパク質標準の選択的に標識されたタンパク質は、チオレドキシンの少なくとも一部に相同なアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む。
【００２１】
前標識されたタンパク質標準が、天然に存在するタンパク質に由来する配列を含み、その配列が天然に存在するタンパク質配列と比較して少ない数の非標的アミノ酸の残基を有する態様において、前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識されたタンパク質は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多くの、天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列のコピーを有することができる。前標識されたタンパク質標準のセットは、２つ以上のタンパク質が、天然に存在するタンパク質に由来する配列であって、非標的アミノ酸の残基の数が天然に存在するタンパク質の配列と比較して減少している配列の異なる数のコピーを含む、２つ以上の標識タンパク質を含むことができる。
【００２２】
本発明の一局面は、リジンで選択的に標識されたタンパク質である。本発明は、選択的にリジンに標識され、かつシステインを欠失した１つ以上のタンパク質を含むタンパク質標準セットを包含する。いくつかの態様では、リジンで選択的に標識されたタンパク質は、システイン残基を欠く。本発明は、標識タンパク質の１つ以上がシステイン残基を欠失しており、かつ１つ以上のリジン残基に結合された標識化合物を含む、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを包含する。リジンで選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質の公知のアミノ酸配列に相同ではないアミノ酸配列を含んでいてもよいし、または天然に存在するタンパク質の配列に対して相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００２３】
いくつかの態様では、リジンで選択的に標識されたタンパク質標準は、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列であって、この天然に存在するタンパク質の配列と比較して少ない数のシステイン残基を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。本発明は、標識タンパク質の１つ以上が天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列であって、天然に存在するタンパク質の配列と比較して少ない数のシステイン残基を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む複数の標識タンパク質を含む、前標識されたタンパク質標準のセットを包含する。
【００２４】
一態様において、リジンで選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質配列の少なくとも２０個、３０個、４０個、または５０個のアミノ酸に、６０％、７０％、８０％またはこれより高い相同性を有するアミノ酸配列であって、システインを欠くアミノ酸配列の２つ以上のコピーを含む。一態様において、リジンで標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質配列に由来するアミノ酸配列であって、前記天然に存在するタンパク質の配列のシステイン残基の全てが取り除かれたかまたはシステイン以外のアミノ酸に変更されたアミノ酸配列の２つ以上のコピーを含む。本発明はまた、天然に存在するタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列の２つ以上のコピーを含むタンパク質をコードし、かつシステインコドンの全てが削除されたかまたは非システインコドンに変更されている、核酸構築物を含む。
【００２５】
本発明の一局面は、システインで標識されたタンパク質である。本発明は、選択的にシステインで標識され、かつリジンを欠失した１つ以上のタンパク質を含むタンパク質標準セットを包含する。いくつかの態様では、システインで選択的に標識されたタンパク質は、リジン残基を欠く。本発明は、標識タンパク質の１つ以上がリジン残基を欠失しており、かつ１つ以上のシステイン残基に結合された標識化合物を含む、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを包含する。システインで選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質の公知のアミノ酸配列に相同ではないアミノ酸配列を含んでいてもよいし、または天然に存在するタンパク質の配列に相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００２６】
いくつかの態様では、システインで選択的に標識されたタンパク質標準は、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列であって、この天然に存在するタンパク質の配列と比較して少ない数のリジン残基を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。本発明は、標識タンパク質の１つ以上が天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列であって、前記天然に存在するタンパク質の配列と比較して少ない数のリジン残基を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準のセットを包含する。
【００２７】
一態様において、システインで選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列であって、リジンを欠くアミノ酸配列の２つ以上のコピーを含む。一態様において、システインで標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質配列に相同なアミノ酸配列であって、前記天然に存在するタンパク質の配列のリジン残基の全てが取り除かれたかまたはリジン以外のアミノ酸に変更されたアミノ酸配列の２つ以上のコピーを含む。本発明はまた、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列の２つ以上のコピーを含むタンパク質をコードする核酸構築物であって、リジンコドンの全てが削除されているかまたは非リジンコドンに変更されている、核酸構築物を含む。
【００２８】
いくつかの態様では、システインで選択的に標識された前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、リジン残基を欠失したヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素（例えばリポアミドデヒドロゲナーゼ、グルタチオン還元酵素またはチオレドキシン）のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい態様において、アミノ酸配列は、チオレドキシンのアミノ酸配列に相同であり、例えば短縮されたチオレドキシン配列に相同である。いくつかの好ましい態様において、チオレドキシンのアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列は、リジン残基を欠くことだけが天然に存在するチオレドキシン配列と異なる。いくつかの好ましい態様において、選択的に標識された前標識されたタンパク質標準は、リジン残基を欠いており、１つ以上のシステイン残基で標識され、少なくともチオレドキシンの一部に相同なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。
【００２９】
いくつかの局面において、本発明は、標識タンパク質のうちの２つ以上が、第１のアミノ酸に結合される標識化合物を含み、かつ２つ以上の標識タンパク質において、分子量に対する第１のアミノ酸の残基の数の比が互いに１０％、５％、２．５％または１％以内にある、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを提供する。いくつかの好ましい態様において、分子量に対する第１のアミノ酸の比を互いに１０％、５％、２．５％または１％の範囲内で有する前記タンパク質は、第１のアミノ酸上において選択的に標識されている。いくつかの例示的な態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、標識タンパク質のうちの２つ以上が第１のアミノ酸上に標識化合物を含みかつ第２のアミノ酸の残基を欠き、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質において、分子量に対する第１のアミノ酸の残基の数の比が互いに１０％、５％、２．５％または１％以内にある、複数の標識タンパク質を含む。
【００３０】
前標識されたタンパク質標準セットのいくつかの好ましい態様において、第１のアミノ酸上に標識化合物を含む少なくとも２つのタンパク質は、１０ｋＤａあたり１〜１０個の第１のアミノ酸の残基、例えば１０ｋＤａあたり２〜７個の第１のアミノ酸の残基、例えば３〜５個の第１のアミノ酸の残基、例えば３．５〜４．５個の第１のアミノ酸の残基を有する。前標識されたタンパク質標準セットのいくつかの好ましい態様において、第１のアミノ酸で標識された少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは、少なくとも１０個のタンパク質は、１０ｋＤａあたり１〜１０個の第１のアミノ酸の残基、例えば１０ｋＤａあたり２〜７個の第１のアミノ酸の残基、例えば３〜５個の第１のアミノ酸の残基、例えば３．５〜４．５個の第１のアミノ酸の残基を有する。
【００３１】
本発明のいくつかの局面において、前標識されたタンパク質標準セットは、天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列であって、標識用に標的とされる第１のアミノ酸の数または間隔を変える１つ以上のアミノ酸の変更を含むアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む第１のアミノ酸で標識された１つ以上のタンパク質を含むことができる。
【００３２】
本発明の局面のいくつかの好ましい態様において提供される選択的に標識されたタンパク質は、変性アクリルアミド電気泳動ゲルでのそれらの移動において、非標識型の同じタンパク質の移動とは実質的には相違しない。いくつかの好ましい態様において、好ましい態様において提供される選択的に標識されたタンパク質は、変性アクリルアミド電気泳動ゲルでのそれらの移動において、非標識型の同じタンパク質の移動から１０％を超える、７％を超える、または５％を超える相違はない。いくつかの好ましい態様において、１０ｋＤａ以上を超える分子量を有する選択的に標識されたタンパク質は、変性アクリルアミド電気泳動ゲルでのそれらの移動において非標識型の同じタンパク質の移動から５％を超える相違はない。
【００３３】
本発明の局面のいくつかの好ましい態様において提供される前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられた場合に、１０ｋＤａ以上の分子量を有する前記セットの異なるタンパク質との間で２倍超の相違はない幅を有するバンドを生成する。いくつかの好ましい態様において、２０ｋＤａ〜１００ｋＤａの間の分子量を有する前標識されたタンパク質標準セットの標識タンパク質は、５０％超の相違はない幅を有する電気泳動ゲル上の視覚的に検出可能なバンドを生成する。いくつかの好ましい態様において、標準セットの少なくとも５つの前標識されたタンパク質によって生成される視覚的に検出可能なバンドの幅には、３０％を超える相違はない。
【００３４】
本願明細書において開示される前標識されたタンパク質標準セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはこれより多くの標識タンパク質が第１のアミノ酸上において選択的に標識されている、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはこれより多くの標識タンパク質を含むことができる。本発明の好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットの少なくとも２つの異なるタンパク質は、異なる標識化合物を用いて、好ましくは２つの異なる色素を用いて標識されている。前標識されたタンパク質標準セットが２つ以上、３つ以上、４つ以上または５つ以上の標識タンパク質を含む場合、前標識されたタンパク質標準は２つ以上、３つ以上、４つ以上または５つ以上の異なる色素を用いて標識された異なるタンパク質を含むことができる。
【００３５】
好ましい態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１０ｋＤａ以下〜約１００ｋＤａ以上、または約１０ｋＤａ以下〜約１５０ｋＤａ以上、または約５ｋＤａ以下〜約１５０ｋＤａ以上、または約１０ｋＤａ以下〜約２００ｋＤａ以上、または約５ｋＤａ以下〜約２００ｋＤａ以上、または約１０ｋＤａ以下〜約２５０ｋＤａ以上、または約５ｋＤａ以下〜約２５０ｋＤａ以上の分子量範囲にわたる。
【００３６】
いくつかの態様では、本発明は、セットの中の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはこれより多くの標識タンパク質が５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは５０ｋＤａの倍数である分子量増分だけサイズが互いと異なる、前標識された分子量標準セットを提供する。いくつかの態様において、少なくとも５、６、７、８、９、または１０個の分子量マーカーは、５ｋＤａの倍数である増分だけサイズが異なっていてもよい。いくつかの態様において、少なくとも５、６、７、８、９、または１０個の分子量マーカーは、１０ｋＤａの倍数である増分だけサイズが異なっていてもよい。いくつかの好ましい態様において、前記２つ以上の標識タンパク質は、第１のアミノ酸に結合された標識化合物を含み、かつ天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列またはそれに由来するアミノ酸配列であって、前記天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列またはそれに相同なアミノ酸配列が標識化合物と反応できる第２のアミノ酸の残基を欠く、アミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。
【００３７】
本発明はまた、複数の標識タンパク質が１つ以上の溶液として提供される、前述の態様のいずれかのような前標識されたタンパク質標準セットを包含する。溶液は、１つ以上の緩衝液、還元剤、キレート剤、アルコール、界面活性剤または色素を含むことができる。
【００３８】
別の局面においては、本発明は、システイン残基を欠くタンパク質の１つ以上のリジン残基に標識を付着させることを含む、タンパク質を標識する方法を提供する。前記方法は、色素がリジンと結合することを許容する条件下で、システイン残基を欠くタンパク質に標識化合物を加えることを含む。これらの方法では、標識化合物は、少なくとも１つのアミノ反応性基を含む。
【００３９】
更なる局面において、本発明は、リジン残基を欠くタンパク質の１つ以上のシステイン残基に標識を付着させることを含む、タンパク質を標識する方法を提供する。前記方法は、リジン残基を欠くタンパク質のシスチンを還元することと、色素がシステインと結合することを許容する条件下で標識化合物を前記タンパク質に加えることと、を含む。これらの方法では、標識化合物は、少なくとも１つのスルフヒドリル反応性基を有する。
【００４０】
更なる局面において、本願明細書において提供される前標識されたタンパク質標準セットを使用して試料タンパク質の分子量を測定するための方法が提供される。この方法は、１つ以上のタンパク質を含む試料をゲルの第１のレーンで電気泳動にかけることと、第１のアミノ酸上において選択的に標識された少なくとも２つの標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットをゲルの第２のレーンで電気泳動にかけることと、前記標準の２つ以上の標識タンパク質のうちの少なくとも２つの移動距離を測定することと、１つ以上の試料タンパク質のうちの少なくとも１つの移動距離を測定することと、前記標準の少なくとも２つの標識タンパク質の移動距離および分子量に基づいて前記少なくとも１つの試料タンパク質の分子量を算出することを含む。前記方法は、前記少なくとも２つの標識された標準の移動に基づいてカーブフィットもしくはポイントツーポイント較正を使用するか、または色素先端（ｄｙｅ  ｆｒｏｎｔ）の移動に対して規格化されたタンパク質標準の移動の較正によって、行うことができる。
【００４１】
本発明はまた、記載されている前標識されたタンパク質標準セットを含み、さらに１つ以上の緩衝液、ローディング色素、還元剤、非標識タンパク質標準、ブロット膜、プレキャストゲルまたは電気泳動緩衝液のうちの１つ以上を含むキットを含む。前記キットの構成要素は、１つ以上の容器に入っていてよく、前記キットの構成要素のうちの２つ以上は共通のパッケージ（例えば箱、ラックまたはジャー）で提供されてもよい。前記キットは、取扱説明書またはインターネットで使用のための手順にアクセスするための説明書を含むこともできる。
【００４２】
前記キットの前標識されたタンパク質標準のセットは、凍結乾燥された固体として、または液体または冷凍された形の溶液として提供されてもよい。セットの１つ以上の標識されたタンパク質標準を含む溶液は、１つ以上の緩衝液、還元剤、キレート剤、アルコール、界面活性剤または色素を含むことができる。キットの前標識されたタンパク質標準のセットは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはこれより多い、２つ以上の標識された標準の１つ以上の混合物として提供される標準タンパク質を含むことができる。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質の全ては、キットの単一の混合物（それは、１つ以上のアリコートで提供されていてもよい）において、提供される。キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上の分子量範囲にわたることが好ましく、５ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたることができる。
【００４３】
さらに他の局面では、本発明は、本願明細書において開示される前標識された標準セットおよびキットのいずれかを含む前標識されたタンパク質標準のセットを、顧客に提供する方法を提供する。一態様において、前記方法は、標準セットの標識タンパク質の少なくとも１つが第１のアミノ酸上において選択的に標識されている前標識されたタンパク質標準セットを、収入と引きかえに顧客に提供することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】リジンコドンの全てがアルギニンコドンに変異しており、２つのシステインが加えられており、かつＣ末端ｈｉｓタグを有する改変した短縮された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌チオレドキシンＯＲＦの同じ配列（配列番号１０）（第１行）と並べて、Ｃ末端ｈｉｓタグを有する短縮された大腸菌の細菌チオレドキシンＯＲＦの核酸配列（配列番号９）（第２行）を示す図である。
【図１Ｂ】リジンの全てがアルギニンに変更され、２つのシステインが加えられた同じ配列（配列番号１２）（第１行）と並べて、Ｃ末端ｈｉｓタグを有する短縮された大腸菌の細菌チオレドキシンの翻訳されたアミノ酸配列（配列番号１１）（第２行）を示す図である。
【図２Ａ】ユニークな制限部位により分離されたリジンを欠く短縮されたチオレドキシン配列の６つのコピーを有する核酸構築物（ＢＨ６量体  ＯＲＦ）の略図である。
【図２Ｂ】ＢＨ６量体  ＯＲＦの核酸配列（配列番号１３）である。
【図３Ａ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋＤａの「リジンを有しない」構築物のマップを示す図である。
【図３Ｂ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋＤａの発現産物のアミノ酸配列（配列番号１４）である。
【図４Ａ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ３０ｋＤａの「リジンを有しない」構築物のマップを示す図である。
【図４Ｂ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ３０ｋＤａの発現産物のアミノ酸配列（配列番号１５）である。
【図５Ａ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ４０ｋＤａの「リジンを有しない」構築物のマップを示す図である。
【図５Ｂ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ４０ｋＤａの発現産物のアミノ酸配列（配列番号１６）である。
【図６Ａ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ５０ｋＤａの「リジンを有しない」構築物のマップを示す図である。
【図６Ｂ】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ５０ｋＤａの発現産物のアミノ酸配列（配列番号１７）である。
【図７】ｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋＤａから生成した「リジンを有しない」５０ｋＤａのＯＲＦ挿入断片の核酸配列（配列番号３７）である。
【図８Ａ】ｐＴｒｃ  １１０ｋｄのマップを示す図である。
【図８Ｂ】ｐＴｒｃ  １１０ｋｄの発現産物の推定アミノ酸配列（配列番号３８）である。
【図９Ａ】ｐＴｒｃ  １６０ｋｄのマップを示す図である。
【図９Ｂ】ｐＴｒｃ  １６０ｋｄの発現産物の推定アミノ酸配列（配列番号３９）である。
【図１０】ｐＴｒｃ  ２６０ｋｄのプラスミドを合成するために用いた短縮Ｌａｃ  Ｚ遺伝子の配列（配列番号４０）を示す図である。
【図１１Ａ】ｐＴｒｃ  ２６０ｋｄのマップを示す図である。
【図１１Ｂ】ｐＴｒｃ  ２６０ｋｄの発現産物の推定アミノ酸配列（配列番号４１）である。
【図１２】８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸−アミノフェニルビニルスルホン（８−ＡＮＳ−ＡＰＶＳ）を合成するためのスキームを表す図である。
【図１３】オレンジ１６のビニルスルホン体を生成するための反応スキームを表す図である。
【図１４Ａ】１×ＭＥＳ泳動緩衝液を用いて４〜１２％のビストリスゲル上で電気泳動にかけた本発明の前標識されたタンパク質標準セットを示す図である。
【図１４Ｂ】ＭＥＳ泳動緩衝液を用いて４〜１２％のビストリスゲル上で電気泳動にかけた、非標識型のマーカーの同一セットを示す図である。
【図１５Ａ】前標識されたタンパク質標準のセット（鮮明な前染色標準、レーン４）が以下の他の市販の前染色標識と一緒に電気泳動にかけられた、１×ＭＥＳ泳動緩衝液を用いた４〜１２％のビストリスゲルを示す図である：１−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｕａｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、３−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、４−鮮明な前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５−Ｒａｉｎｂｏｗ（ＧＥ）、６−ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）前染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７−ＭｕｌｔｉＭａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８−ＳｅｅＢｌｕｅ＋２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【図１５Ｂ】前標識されたタンパク質標準のセット（鮮明な前染色標準、レーン４）が以下の他の市販の前染色標識と一緒に電気泳動にかけられた、１×ＭＯＰＳ泳動緩衝液を用いた４〜１２％のビストリスゲルを示す図である：１−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｕａｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、３−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、４−鮮明な前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５−Ｒａｉｎｂｏｗ（ＧＥ）、６−ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）前染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７−ＭｕｌｔｉＭａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８−ＳｅｅＢｌｕｅ＋２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【図１５Ｃ】前標識されたタンパク質標準のセット（鮮明な前染色標準、レーン４）が以下の他の市販の前染色標識と一緒に電気泳動にかけられた、４〜２０％のトリス−グリシンゲルを示す図である：１−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｕａｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、３−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、４−鮮明な前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５−Ｒａｉｎｂｏｗ（ＧＥ）、６−ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）前染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７−ＭｕｌｔｉＭａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８−ＳｅｅＢｌｕｅ＋２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【図１６Ａ】前標識された標準のバンド幅を測定するために本発明の前標識されたタンパク質標準を電気泳動にかけたゲルと共に並べた定規を表す図である。
【図１６Ｂ】前標識されたタンパク質のバンド強度に対応するピーク２〜１３を有するゲル画像から抽出されるトレースを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
定義
この後に続く説明において、組換えＤＮＡ技術およびタンパク質化学において使用する多くの用語は、広範囲に利用される。かかる用語が与える範囲を含めて本願明細書および特許請求の範囲の明瞭かつ筋が通った理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００４６】
本願明細書で使用する場合、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「１つの（ｏｎｅ）」は、明記されない限り、またはそれらが本願明細書で記載される文脈によって明確にそうではないとされない限り、それらが参照する目的物の「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００４７】
本願明細書で使用する場合、いかなる数値に参照する際にも「約」または「ほぼ」という用語は、明記した値の±１０％の値を意味することを意図している。例えば、「約５０℃」（または「ほぼ５０℃」）は、４５℃と５５℃とを含む４５℃〜５５℃の温度の範囲を包含する。同様に、「約１００ｍＭ」（または「ほぼ１００ｍＭ」）は、９０ｍＭと１１０ｍＭとを含む９０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度の範囲を包含する。
【００４８】
本願明細書で使用する場合の「標識」という用語は、標的または化合物に付着させて本発明の方法で使用される場合に、（例えばそのスペクトル特性、形態または活性に起因して）直接または間接的に検出できる化学的部分またはタンパク質を指す。標識は、直接検出可能であってもよく（フルオロフォア、発色団）、間接的に検出可能であってもよい（ハプテンまたは酵素）。かかる標識としては、放射線計数装置で測定することができる識別用放射性同位元素；分光光度計で視覚的に観察または測定できる色素（ｐｉｇｍｅｎｔ）、色素（ｄｙｅ）または他の発色団；スピン標識分析計によって測定できるスピン標識；および、（出力信号が、適切な分子付加物の励起によって生成され、それを色素により吸収される光を用いて励起することによって視覚化できるか、または例えば標準的な蛍光光度計または画像化システムによって測定することができる、蛍光標識（フルオロフォア）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。標識は、信号化合物の化学的変性によって出力信号が発生する化学発光物質；金属含有物質；または酵素（この場合、無色の基質からの着色した産物の形成のような、酵素に依存する信号の二次生成が発生する）であってもよい。標識という用語は、結合された分子と選択的に結合できる「タグ」またはハプテンを指すこともある。この場合、この結合された分子は、その後基質と共に加えられるときに、検出可能な信号を生成するために使用される。例えば、タグとしてビオチンを使用することができ、この場合、タグと結合するためのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジン結合体またはストレプトアビジン結合体を使用することができて、ＨＲＰの存在を検出するための発色基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））または蛍光発生基質（例えばＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社））を使用することができる。多数の標識は当業者には公知であり、粒子、色素、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの発色基質、蛍光発生基質および化学発光基質ならびにＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（第９版、ＣＤ−ＲＯＭ、２００２年９月）（前出）に記載されているその他標識を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
本願明細書で使用する場合の「直接検出可能な」という用語は、物質の存在またはその物質から発生する信号が、化学的変性または更なる物質を必要とすることなく観察、機器分析またはフィルムによって、直ちに検出できることを指す。
【００５０】
「肉眼で検出可能な」とは、例えば光を拡大するかまたはフィルターに通す拡大鏡、または顕微鏡（または拡大を提供するいかなる種類のレンズも）の助けを借りずに、そして標準的な実験室内蛍光照明または白熱照明より大きな強度の照明を用いずに、標準的な実験室内蛍光照明または白熱照明より狭い波長の照明を用いずに、あるいは標準的な実験室内蛍光照明または白熱照明の外側の波長を有する照明を用いずに、参照された実体が正常な視力を有するヒトによって直接見えることを意味する。
【００５１】
「色素（ｄｙｅ）」は、視覚的に検出可能な標識である。色素は、例えば、発色団またはフルオロフォアであってもよい。フルオロフォアは、可視光または非可視光（例えば紫外線）で励起することができる。
【００５２】
「発色団」は、選択的な光吸収ができ、有機化合物の呈色をもたらす化学基または化合物である。
【００５３】
本願明細書で用いられる場合の「フルオロフォア」という用語は、本質的に蛍光性であるかまたは、生物学的化合物または金属イオンと結合すると蛍光の変化を示す（すなわち、蛍光発生性である）組成物を指す。多くの場合、フルオロフォアは、それらが光を吸収するときに観察可能な色を有する発色団でもある。フルオロフォアは、フルオロフォアの溶解性、スペクトル特性または物理的性質を変える置換基を含むことができる。多数のフルオロフォアは、当業者に公知であり、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンズアゾール、ボラポリアザインダセンおよびキサンテン（フルオレセイン、ローダミンおよびロドール（ｒｈｏｄｏｌ）を含む）、ならびにＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（第９版、ＣＤ−ＲＯＭ、２００２年９月）に記載されている他のフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
「織物染料」は、布生地および布生地を作製するための材料（例えば繊維、撚り糸、糸）（例えば、（例えば綿、ウール、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル、ビスコース、アクリル、アセテート、トリアセテートなどを含む布生地）を染色するために通常用いる色素である。織物染料は、布地および布地を作製するための材料以外の材料および化合物を染色するために用いることもできる。織物染料は、多くの商業的な供給元（例えば、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ノースカロライナ州、バーリントン）、Ｈａｒｎｅｅｔ  Ｅｘｐｏｒｔｓ（インド、ムンバイ）、Ｊａｇｓｏｎ  Ｃｏｌｏｒｃｈｅｍ社（インド、Ａｈｍａｄａｂｅｄ）、Ｊａｙｃｈｅｍ（インド、Ｓａｎａｎｄ）、Ｏｍｅｇａ  Ｄｙｅｓ（英国、Ｇｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ）、Ｄｙｓｔａｒ  Ｔｅｘｔｉｌｆａｒｂｅｎ（ドイツ、フランクフルト）、Ｋｅｍｔｅｘ（英国、チョーリー）から入手できる。織物染料の非限定的な例は、Ｒｅｍａｚｏｌ染料、Ｋｅｍｏｚｏｌ染料、Ｄｉｒｅｃｔ染料、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ染料、Ｄｉｓｃｈａｒｇｅａｂｌｅ酸性染料、Ｋｅｎａｎｔｈｏｌ染料、Ｋｅｎａｍｉｄｅ染料、Ｃｉｂａｃｒｏｎ染料、アゾイック（ａｚｏｉｃ）染料、Ｄｙａｃｉｄ染料、Ｋｅｍｔｅｘ反応性染料、Ｋｅｍｔｅｘ酸性染料、Ｋｅｍｔｅｘ  Ｅａｓｉｄｙｅ酸性染料、Ｃａｌｅｄｏｎ染料、Ｃａｓｓｕｌｆｏｎ染料、Ｉｓｏｌａｎ染料、Ｓｉｒｉｕｓ染料、Ｉｍｐｅｒｏｎ染料、フタロゲン（ｐｈｔａｌｏｇｅｎ）染料、ナフトール（ｎａｐｈｔｏｌ）染料、Ｌｅｖａｆｉｘ染料、Ｐｒｏｃｉｏｎ染料およびイソチオシアネート染料である。
【００５５】
「前標識された」生体分子は、生体分子を用いた分離または実験を実行する前に標識を備えた生体分子である。例えば、前標識された標準は、生化学技術（例えば、電気泳動（溶液相電気泳動およびゲル電気泳動を含む）、等電点電気泳動、分光測定法またはクロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない）によって、その標準の分離の前に標識される。
【００５６】
本発明の文脈において、「選択的に標識された」は、生体分子の特定の部位に主に標識されたことを意味する。特に、［第１の］アミノ酸で「選択的に標識された」タンパク質は、［第１の］アミノ酸に特異的である反応性化学基を有する標識化合物と結合され、かつ同様に標識化合物と反応することもできる１つ以上の他の（第２）アミノ酸残基を１０ｋＤａあたり１つ未満有するか、または同様に標識化合物と反応することができる１つ以上の他の（第２）アミノ酸の化学的変性を有するタンパク質である。タンパク質の選択的な標識は、タンパク質上の１つ以上のアミノ酸に存在する１つ以上の特定の化学基に特異的である反応性化学基を有する標識化合物を用いることによって、そしてその色素の反応性基と反応できる１つ以上の他のアミノ酸と色素の反応性基との副反応を減少させることにより達成される。副反応を減少させることは、タンパク質を標識するために用いる反応条件下で標識化合物と反応することがもはやできないように、色素の反応性基と反応できる１つ以上の化学基を修飾すること、およびタンパク質を標識するために使用する色素と反応できる化学基を有するアミノ酸を欠失した標識のためのタンパク質を選択することのいずれかまたはその両方によって行うことができる。
【００５７】
「アミノ酸」とは、２０個の天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在するかまたは化学的誘導体化もしくは酵素による誘導体化または化学的合成もしくは酵素による合成によって生きている有機体の外側に産生するこれらのアミノ酸の誘導体（例えばヒドロキシプロリン、セレノメチオニン、アジド標識アミノ酸など）をいう。
【００５８】
本願の文脈において、「標的アミノ酸」または「標識用に標的とされるアミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質への標識（例えば色素）の共有結合のために用いられるアミノ酸である。「標的アミノ酸」は、アミノ酸種（例えばリジン）を指す。この場合、リジンはタンパク質の全てのリジン残基を意味し、タンパク質の１つの特定のリジン残基を指すために用いられない。本発明の標識されたタンパク質標準を作製する際には、標的アミノ酸は標識が意図されるアミノ酸である。標的アミノ酸上でタンパク質を標識することは、標的アミノ酸上の反応性化学基と反応する反応性化学基を有する標識化合物を選択することによって、成し遂げられる。
【００５９】
「非標的アミノ酸」は、タンパク質標準の標的アミノ酸に結合される標識化合物と反応できる反応性基を有するが、標識化合物に対する結合が所望されない、タンパク質標準上のアミノ酸である。「非標的アミノ酸」は、標的アミノ酸と同じ反応性化学基を有することもできるし、異なる反応性化学基を有することもできる。非標的アミノ酸は、標識化合物に対して、標的アミノ酸よりも大きい、小さい、または実質的に同じ親和性を有することができる。
【００６０】
「アミノ酸を欠失している」タンパク質とは、そのタンパク質が１０ｋＤａあたり１個未満のそのアミノ酸残基を有することを意味する。いくつかの本発明の好ましい態様において、非標的アミノ酸を欠失したタンパク質標準は、非標的アミノ酸の残基を有しない（非標的アミノ酸を欠く）。
【００６１】
「アミノ酸を欠損している」タンパク質とは、そのタンパク質がそのアミノ酸の残基を有しないことを意味する。
【００６２】
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族水酸基側鎖を有する一群のアミノ酸はセリンおよびトレオニンであり、酸性側鎖を有する一群のアミノ酸はグルタミン酸およびアスパラギン酸であり、アミノ含有側鎖を有する一群のアミノ酸はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族の側鎖を有する一群のアミノ酸はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有する一群のアミノ酸はシステインおよびメチオニンである。好適な保存的なアミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、そしてアスパラギン−グルタミンである。
【００６３】
本願明細書で使用される場合の「反応性基」または「反応性化学基」という用語は、共有結合を形成するために他の化学基と反応することができ、すなわち適切な反応条件下で共有結合を形成する反応を起こすことができ、通常他の物質に対する結合位置を表す化学基を意味する。反応性基は、共有結合を形成するために異なる化合物上の官能基と化学的に反応できる本発明の化合物上の部分（例えばカルボン酸またはスクシンイミジルエステル）である。反応性基としては、一般に求核剤、求電子剤および光活性化可能な基が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
「に結合した」は、それに共有結合で結合していることを意味する。他の分子または化学基に結合した分子または化学基は、共有結合で結合している。［分子または化学基を他の分子または化学基に］結合することは、それらが共有結合で結合されたものとなるように、２つの参照された分子または化学基間の化学反応を引き起こすかまたは促すことである。
【００６５】
本願明細書で使用する場合、標識化合物と「反応する」アミノ酸またはアミノ酸の反応性基は、標識化合物に共有結合で結合されたものとなる。
【００６６】
（表１）アミノ酸の反応性基
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【００６７】
本願明細書で使用する場合、「タンパク質」はポリペプチドまたは２つ以上のアミノ酸の配列を意味する。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく合成アミノ酸（修飾アミノ酸または天然では知られていないアミノ酸）であってもよく、それらはペプチド結合により連結されている。「ペプチド」とは、具体的には１０ｋＤａ未満のポリペプチドを指す。本願明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、ペプチドを包含する。
【００６８】
「天然に存在する」とは、同じ組成を有する対象が自然界で見つかるということを指す。例えば、ウイルスを含めた有機体中に存在し、自然界の源から単離することができ、実験室において意図的に修飾されなかったポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００６９】
他の核酸（またはヌクレオチド）配列またはタンパク質（またはアミノ酸）配列「に由来する」核酸（またはヌクレオチド）配列またはタンパク質（またはアミノ酸）配列は、それが由来する配列の少なくとも一部と同一であるか、それが由来する配列の少なくとも一部と非常に相同であり、それが由来するタンパク質の配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。天然に存在するタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列は、「天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列」または単に「由来［アミノ酸］配列」と呼ばれることがある。天然に存在する核酸の配列に由来する核酸配列は、「天然に存在する核酸に由来する核酸配列」または単に「由来［核酸］配列」と呼ばれることがある。
【００７０】
「相同の」とは、タンパク質、ペプチド、またはアミノ酸配列が、参照されたアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性およびより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。他のアミノ酸配列との相同性を有する配列は、参照されるタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも６つのアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸および好ましくは少なくとも２０個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の連続したアミノ酸を有する。
【００７１】
野生型タンパク質またはペプチド配列の「変異体」は、野生型タンパク質の少なくとも２０個の連続したアミノ酸と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。
【００７２】
「組換え方法」は、組換え核酸（天然で見出される類似した核酸分子とは構造的に異なる核酸分子を生成するために組み換えられた核酸）の製造または使用を含む方法である。組換え方法は、キメラ核酸分子を生成するために、ヌクレオチド配列変化を起こすために、または核酸を核酸配列に加えるかまたは削除するために、例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、組換え酵素、メチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼなどを用いることができる。組換え方法は、有機体から直接または間接的に単離された核酸分子を他の源に由来する１つ以上の核酸配列と結合する方法を含む。他の源に由来する配列は、いかなる核酸配列でもよく、例えば遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター配列、転写エンハンサ配列、転写の誘導因子またはプロモーターを結合する配列、転写終結配列、翻訳調節配列、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、スプライス部位、ポリＡ付加配列、ポリＡ配列など）、ベクター、タンパク質コード配列などが挙げられる。有機体から直接または間接的に単離された核酸分子の源以外の源に由来する核酸配列は、異なる有機体のゲノムからの、またはそのゲノム内の核酸配列であってもよい。ゲノムの核酸配列は、染色体性であってもよく染色体外のものであってもよい（例えば、核酸配列はエピソームであってもよく、細胞小器官ゲノムのものであってもよい）。組換え方法は、形質転換、ウイルストランスフェクションなどを含む、細胞に核酸を導入して細胞中に組換え核酸分子を確立する方法をも含む。「組換え方法」は、核酸構築物の産物（例えば組換えＲＮＡ分子および組換えタンパク質）の合成および単離をも含む。「組換え方法」は、「遺伝子工学」および「組換え［ＤＮＡ］技術」と交換可能に使用される。
【００７３】
「組換えタンパク質」は、組換え核酸分子または組換え核酸構築物から作製されるタンパク質である。組換えタンパク質は組換え核酸構築物を収容している細胞において作製されることが可能であり、その細胞は有機体の細胞であってもよく、または培養された原核生物細胞または真核生物細胞であってもよく、例えば生体外の転写および／または翻訳システムを使用して生体外で作製されたものであってもよい。
【００７４】
「実質的には相違しない」または「実質的に同じ」とは、参照された組成物または構成要素が比較された値のより大きいものの１０％未満だけ異なることを意味する。
【００７５】
本願明細書で使用される場合の「精製された」という用語は、例えば、タンパク質または複合体が内在的に見出される細胞混合物または細胞環境（血清タンパク質または細胞溶解物など）において、あるタンパク質と一緒に通常存在するであろうタンパク質の混在が本質的にない、タンパク質の調製物をいう。
【００７６】
「実質的に精製された」とは、存在する支配的な種または活性である種または活性の状態（例えば、モルベースでそれが組成物中の他のいかなる個々の種または活性よりも豊富である状態）を指す。そして好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種または活性が存在する全ての高分子または活性の（モルベース、重量ベースまたは活性ベースで）少なくとも約５０パーセントを構成する組成物である。通常、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種または活性の約８０パーセント超、より好ましくは約８５％超、９０％超または９５％超を構成する。
【００７７】
本願明細書で使用される場合の「試料」という用語は、検出または定量のための生体分子もしくは分析物を含んでいてもよいかなる材料をも指す。生体分子または分析物は、反応性基（例えば、本発明の化合物を分析物に結合することができる基）を含むことができる。試料は希釈剤、緩衝液、界面活性剤を含むこともでき、標的と混ざって見出される混入している種、破片などを含んでいてもよい。例示的な生物学的具体例としては、尿、血清、血漿、全血、唾液、涙液、脳脊髄液、乳頭から分泌液などが挙げられる。液体材料（例えば緩衝液、塩類、アルコール、抽出剤、脂質、溶媒、界面活性剤、還元剤、キレート剤、抗凝固剤、防腐剤、抗菌薬など）に懸濁または溶解している粘液、体組織、細胞などの固体、ゲル、またはゾル物質も挙げられる。試料は、１つ以上の部分的にまたは実質的に精製された生体分子または分析物を含むことができる。試料は、生体細胞、あるいは内在性宿主細胞タンパク質、核酸ポリマー、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチドおよび緩衝液を含む生物流体であってよい。試料は水溶液であってもよく、生存細胞培養物であってもよく、またはポリアクリルアミドゲル、膜ブロットのような固体表面または半固体表面上、またはマイクロアレイ上に固定されていてもよい。
【００７８】
２つ以上の参照されたタンパク質についてゲル（例えばポリアクリルアミドゲル）上のそれらの移動距離によって算出された分子量が１０％以内、好ましくは７％以内、または５％以内にあるとき、その２つ以上のタンパク質は、「実質的に同じである電気泳動分離特性を有する」、または「アクリルアミド電気泳動ゲルでのそれらの移動が実質的には相違しない」。そのタンパク質の算出分子量は、移動距離に分子量の曲線をあてはめることにより、またはポイントツーポイント算出により実行することができる。
【００７９】
第１のアミノ酸上において選択的に標識されたタンパク質を有する前標識されたタンパク質標準セット
本発明は、標識タンパク質の１つ以上が第１のアミノ酸上において選択的に標識される、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを提供する。第１のアミノ酸上において選択的に標識されたタンパク質は、第１のアミノ酸の１つ以上の残基に結合された標識化合物を含み、かつ（ａ）標識化合物に対して反応する第２のアミノ酸の残基を欠失しているか、または（ｂ）天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、その天然に存在するタンパク質の野生型アミノ酸配列よりも少ない数の、標識化合物と反応できる第２のアミノ酸数の残基を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含むタンパク質である。
【００８０】
第２のアミノ酸の残基を欠失したタンパク質は、１０ｋＤａあたり１個未満の第２のアミノ酸残基を有するタンパク質である。第２のアミノ酸の残基を欠失したタンパク質は、第２のアミノ酸の残基を有していなくてもよい。
【００８１】
本発明の文脈において、第１のアミノ酸は、標識が所望され、標識が標識化合物上の反応性基の選択によって標的とされるアミノ酸である。第１のアミノ酸は、本願明細書において、「標的アミノ酸」と称される。
【００８２】
本発明の文脈において、第２または非標的アミノ酸は、標識は所望されないが、第１のアミノ酸上でタンパク質を標識するために用いる条件下で、タンパク質を標識するために用いる標識化合物に対して反応する反応性化学基を有するアミノ酸である。いくつかの態様では、非標的アミノ酸は、標的アミノ酸と同じ反応性基を有する。いくつかの態様では、非標的アミノ酸は、標的アミノ酸とは異なる反応性基を有する。本発明は、前標識されたタンパク質標準として使用するタンパク質におけるそれらの存在を減少させることによって、非標的アミノ酸の標識を減少させようとする。
【００８３】
標識タンパク質標準セットの１つ以上のタンパク質は、例えば、システインのスルフヒドリル基に、Ｎ末端アミノ酸の一級アミンおよび／またはリジンの一級アミンに、ヒスチジンのイミダゾイル（ｉｍｉｄａｚｏｙｌ）基またはトリプトファンのインドール環の二級アミンに、Ｃ末端アミノ酸もしくはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル基に、メチオニンのチオエーテルに、チロシンのフェノレートに、あるいはアスパラギンのアミジノ基に選択的に標識することができる。アミノ酸システイン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、チロシンまたはアスパラギンのいずれもが、標識化合物が結合され得る標的アミノ酸となることができる。アミノ酸システイン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、チロシンまたはアスパラギンのいずれもが、タンパク質が第１のアミノ酸で標識されるときに、標識化合物との相互作用が減少されるかまたは排除されようとする非標的アミノ酸となる可能性がある。
【００８４】
例えば、いくつかの例示的態様において、システインは標的アミノ酸となることができ、リジン、ヒスチジンまたはトリプトファンの１つ以上は非標的アミノ酸となる可能性がある。他の例示的態様において、リジンは標的アミノ酸となることができ、システイン、ヒスチジンまたはトリプトファンの１つ以上は非標的アミノ酸となる可能性がある。
【００８５】
選択的に標識されたタンパク質は、複数の標的アミノ酸を有することができる。例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸は、共に標的アミノ酸となることができる。選択的に標識されたタンパク質は、複数の非標的アミノ酸を有することができる。例えば、リジンは標的アミノ酸となることができ、システイン、アルギニン、ヒスチジンおよびトリプトファンのうちの２つ以上は非標的アミノ酸となる可能性がある。
【００８６】
さらに他の態様において、第１のアミノ酸はヒスチジンであり、第２のアミノ酸はシステイン、リジンまたはトリプトファンのうちの１つ以上である。他の態様において、第１のアミノ酸はトリプトファンであり、第２のアミノ酸はシステイン、リジン、ヒスチジンまたはアスパラギンのうちの１つ以上である。更なる態様において、第１のアミノ酸はアスパラギンであり、第２のアミノ酸はシステイン、リジン、ヒスチジンまたはトリプトファンのうちの１つ以上である。更なる態様において、第１のアミノ酸はチロシンであり、第２のアミノ酸はシステイン、リジン、ヒスチジンまたはトリプトファンのうちの１つ以上である。さらに他の態様において、第１のアミノ酸はメチオニンであってよく、第２のアミノ酸はシステイン、リジン、ヒスチジン、チロシンまたはトリプトファンのうちの１つ以上であってよい。
【００８７】
本発明の選択的に標識されたタンパク質標準は、第１のアミノ酸（標的アミノ酸）上に標識化合物を含みかつ第２のアミノ酸（非標的アミノ酸）を欠失しているか、または第１のアミノ酸（標的アミノ酸）上に標識化合物を含みかつ天然に存在するアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を含む。後者の場合、その派生した配列は、その天然に存在するタンパク質の野生型配列に対してより少ない第２のアミノ酸の残基を有する。アミノ酸を標識のための標的とすることにおいて、標的アミノ酸の反応性基と特異的に反応して共有結合を形成し、これによって標識化合物−タンパク質結合体すなわち標識タンパク質を形成する反応性基を有する標識化合物が選択される。好ましくは、タンパク質標準を標識するために用いる標識化合物は、標的アミノ酸の反応性基に対して高い特異性を有する。標識化合物はそれらの反応性基に基づいて選択されてもよいし、または当該技術分野で公知の方法を用いて、標的アミノ酸のための高い特性を有する反応性基を有するように修飾されてもよい。好ましくは、標識化合物および標的アミノ酸の反応性化学基の反応を最適化する反応条件が、標的アミノ酸に選択された標識を結合するために使用される。
【００８８】
第２のアミノ酸または非標的アミノ酸は、標的アミノ酸に標識化合物を結合するために用いる反応条件下でタンパク質の標的アミノ酸を標識するために用いる標識化合物と反応できるが、標識化合物との結合は所望されないアミノ酸である。非標的アミノ酸は、標的アミノ酸と実質的に同じ効率で、標的アミノ酸と標識との反応よりも低下した効率で、または標的アミノ酸と標識との反応よりも高い効率で、標的アミノ酸を標識するために使用する標識と反応できるものであってよい。特定の具体例において、非標的アミノ酸は、第１のアミノ酸を除いて、タンパク質の他のいかなるアミノ酸よりも効率よく標識と反応できる。
【００８９】
タンパク質標準を標識するために１つ以上の標的アミノ酸を選択して１つ以上の非標的アミノ酸の標識を最少化することにおいて、アミノ酸側鎖に存在する基の反応性が考慮される。例えば、いくつかのアミノ酸の側鎖は、化学結合反応の求核剤として作用できる化学基を含む。アミノ酸のかかる反応性化学基の例としては、システインのスルフヒドリル基、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基、リジンのεアミノ基、ヒスチジンのイミダゾールアミノ基、トリプトファンのインドイルアミノ基、アルギニンのグアニジノ基、タンパク質のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基、グルタミン酸のカルボキシル基、アスパラギン酸のカルボキシル基、チロシンのフェノレート、メチオニンのチオエーテルおよびアルギニンのアミジノ基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。標識の求核剤相互作用基とこれらの基との反応は、要因（標識の反応性基、アミノ酸の求核剤基の強さおよび反応が起こるｐＨが挙げられるが、これらに限定されない）に応じて効率の高低が変わる。例えば、システインのスルフヒドリル基は通常、リジン、タンパク質のＮ末端、ヒスチジンおよびトリプトファンのアミノ基より強い求核剤であり、リジン、タンパク質のＮ末端、ヒスチジンおよびトリプトファンのアミノ基はタンパク質のＣ末端、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基およびチロシンのフェノレートより強い求核剤である。いくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準の標的アミノ酸は、限定的ではないが、システイン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、アルギニン、メチオニン、タンパク質のＮ末端アミノ酸またはタンパク質のＣ末端アミノ酸のようなアミノ酸であり得る。この場合、求核的付加を受けることもできる１つ以上のアミノ酸は、前標識されたタンパク質標準中で欠失していてもよい非標的アミノ酸である。
【００９０】
例えば、中性より高いｐＨで求核剤として作用する化学基を有するアミノ酸（例えばシステイン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジン）は標的アミノ酸となることができ、かつ中性より高いｐＨで求核剤として作用するアミノ酸の同じ基の１つ以上は、標識タンパク質標準中で欠失しているかまたは標識タンパク質標準中で（対応する野生型タンパク質配列よりも）減少した量で存在する非標的アミノ酸となることができる。リジン、ヒスチジンまたはトリプトファンのうちの少なくとも１つが標的アミノ酸である態様において、標識は、標準への結合のためのアミノ反応性基を含むことが好ましい。リジン、ヒスチジン、トリプトファンまたはＮ末端アミノ酸を標識するために用いる化合物に存在することができるアミノ反応性基の例には、限定されるわけではないが、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ハロアセチル化合物、マレイミド誘導体、塩化スルホニル、アルデヒド、ケトン、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミドまたは酸無水物が含まれる。
【００９１】
１つの例において、リジンは標的アミノ酸となることができ、システイン、ヒスチジンまたはトリプトファンの１つ以上は非標的アミノ酸となることができる。いくつかの例示的な態様において、リジンで選択的に標識された選択的に標識されたタンパク質標準は、システイン、ヒスチジンまたはトリプトファンのうちの少なくとも１つの残基を欠失しているかまたは欠く。リジンで選択的に標識されたタンパク質標準は、１つ以上のシステイン、ヒスチジン、またはトリプトファンのコドンは変異または削除によって除去されている、天然に存在するタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸構築物から組換え方法によって任意に作製することができる。いくつかの好ましい態様において、リジンで選択的に標識されたタンパク質標準は、システイン、ヒスチジンもしくはトリプトファンのうちの少なくとも１つ、またはこれらの組み合わせに対するコドンの全てが削除または変異により除去された核酸構築物から作製される。リジンで選択的に標識された本発明の標識タンパク質標準は、１つ以上の非標的アミノ酸の残基を欠いていてもよく、第１のアミノ酸に結合される標識化合物と反応しないように化学的に修飾された１つ以上の更なる非標的アミノ酸を有することができる。
【００９２】
他の例では、システインは標的アミノ酸となることができ、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンのうちの１つ以上は非標的アミノ酸となる可能性がある。リジンの一級アミンの反応性はトリプトファンまたはヒスチジンのインドイルまたはイミダゾールアミンの反応性より大きく、従って、システインに化合物を結合するときには、リジンはより著しく副反応に関与するため、これらの態様では、少なくともリジンは非標的アミノ酸であることが好ましい。例えば、システインは、前標識されたタンパク質標準の標的アミノ酸となることができる。この場合、前標識された標準に付着させる標識化合物は、タンパク質との結合の前に、システインのスルフヒドリル基と反応する反応性化学基を含んでいた標識化合物（例えば、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、マレイミド、ジスルフィド、水銀化合物、ハロアセチル化合物およびヨード酢酸などが挙げられるがこれらに限定されない）である。１つの例において、選択的に標識されたタンパク質標準は、少なくとも１つのシステイン残基に結合される標識化合物を有し、リジン、ヒスチジンまたはトリプトファンのうちの１つ以上の残基を欠く。いくつかの好ましい態様において、システインで選択的に標識されたタンパク質標準は、少なくともリジンを欠失しているか、または対応する野生型アミノ酸配列に比べて減少した数の少なくともリジン残基を有するアミノ酸配列を有する。システインで選択的に標識されたタンパク質標準は、１つ以上のリジン、ヒスチジン、またはトリプトファンのコドンは除去されている、天然に存在するタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸構築物から組換え方法によって任意に作製することができる。いくつかの好ましい態様において、システインで選択的に標識されたタンパク質標準は、リジン、ヒスチジンまたはトリプトファンの少なくとも１つについてのコドンの全てが削除または変異によって除去された核酸構築物から作製される。システインで選択的に標識された本発明の標識タンパク質標準は、１つ以上の非標的アミノ酸を欠いていてもよく、化学的に修飾されている１つ以上の更なる非標的アミノ酸を有することができる。
【００９３】
他の例では、中性より低いｐＨで求核剤として作用する化学基を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）は標的アミノ酸となることができ、中性より低いｐＨで求核剤として作用する１つ以上の他のアミノ酸は、標識タンパク質標準には存在しないか、または標識タンパク質において修飾されている非標的アミノ酸となる可能性がある。１つの例において、アスパラギン酸は標的アミノ酸となることができ、グルタミン酸は非標的アミノ酸となる可能性がある。他の例では、グルタミン酸は標的アミノ酸となることができ、アスパラギン酸は非標的アミノ酸となる可能性がある。グルタミン酸またはアスパラギン酸についての標識化合物は、カルボキシル反応性基（例えば、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾールまたはカルボジイミドが挙げられるがこれらに限定されない）を含むことができる。
【００９４】
チロシンも標的アミノ酸となることができる。この場合、タンパク質標準に結合される標識上の反応性化学基は、例えばスルホニルフルオリドまたはヨードアセトアミドである。他の潜在的標的アミノ酸はメチオニンである。この場合、タンパク質標準を標識するために用いる化合物上の反応性化学基は、例えば、ハロ酢酸、ハロアセチルまたはアリールハライドである。アルギニンは標的アミノ酸となることができる。この場合、タンパク質を標識するために用いる化合物上の化学基はオキサリル基である。
【００９５】
これらの例のいずれにおいても、Ｎ末端アミノ基で標識され得るＮ末端アミノ酸は、標的アミノ酸となることができるし、非標的アミノ酸となることもできる。
【００９６】
タンパク質を選択的に標識するために複数のアミノ酸を標的とすることができる。例えば、タンパク質のＮ末端アミノ酸およびリジンは標的アミノ酸となることもできる。この場合、選択的に標識されたタンパク質に結合される標識化合物は一級アミンと反応する反応性化学基を含む。他の例では、グルタミン酸、アスパラギン酸およびタンパク質のＣ末端アミノ酸が標的アミノ酸となることができる。この場合、選択的に標識されたタンパク質に結合される色素はカルボン酸と反応する反応性化学基を含む。
【００９７】
タンパク質の特定のアミノ酸（例えば、リジン残基、タンパク質のＮ末端、ヒスチジンおよび／またはトリプトファンのアミノ基；システインのスルフヒドリル基；アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基；ならびにメチオニンのチオエーテルおよびチロシンのフェノレート）に標識を結合するための方法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）；Ｗｏｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３；ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍで利用可能なＨａｕｇｌａｎｄ，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ（２００２）を参照）。一般に、タンパク質のアミノ酸残基に対する標識化合物の結合のための方法は、
（ａ）第１の反応性基を含む第１のアミノ酸を含むタンパク質と、第１の反応性基と反応する第２の反応性基を含む標識化合物とを混合し、タンパク質−標識化合物の混合物を形成する段階；および
（ｂ）この標識化合物が第１のアミノ酸の第１の反応性基と共有結合を形成して標識タンパク質標準が形成されるのに十分な時間、このタンパク質−標識化合物の混合物をインキュベーションする段階
を含む。第１のアミノ酸がシステインであり、システインの反応性基がスルフヒドリル基であるいくつかの好ましい態様においては、上記方法は、
（ｃ）（ａ）に先立って、１つ以上のシステイン残基を含むタンパク質を還元剤と混合する段階；および
（ｄ）システイン−システイン結合が還元されるのに十分な時間、このタンパク質を還元剤と共にインキュベーションする段階
をも含むことが好ましい。
【００９８】
いくつかの局面において、本発明は、リジン残基を欠失したタンパク質の１つ以上のシステイン残基に標識を付着させる段階を含む、タンパク質標準を作製する方法を含む。例えば、いくつかの態様において、上記方法は、リジン残基を欠失したタンパク質にスルフヒドリル反応性基（例えばビニルスルホン、ヨードアセトアミド、マレイミド、ジスルフィド、水銀化合物、ハロアセチル化合物またはヨード酢酸が挙げられるがこれらに限定されない）を含む標識を付着させる段階を含む。いくつかの態様では、リジン残基を欠失したタンパク質は、天然に存在するタンパク質の少なくとも４０個のアミノ酸に対して相同性を有する、例えば天然に存在するタンパク質の少なくとも４０個のアミノ酸に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それが相同性を有する天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列より少ないリジン残基を有する。いくつかの態様では、リジン残基を欠失したタンパク質は、１０ｋＤａあたり１個未満のリジン残基を含む。いくつかの態様では、リジン残基を欠失したタンパク質は、リジン残基を有しない。
【００９９】
いくつかの局面において、本発明は、システイン残基を欠失したタンパク質の１つ以上のリジン残基に標識を付着させる段階を含む、タンパク質標準を作製するための方法を含む。例えば、いくつかの態様において、上記方法は、システイン残基を欠失したタンパク質にアミノ反応性基（例えばイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ハロアセチル化合物、マレイミド誘導体、塩化スルホニル、アルデヒド、ケトン、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミドまたは酸無水物が挙げられるがこれらに限定されない）を含む標識を付着させることを含む。いくつかの態様では、システイン残基を欠失したタンパク質は、天然に存在するタンパク質の少なくとも４０個のアミノ酸に対して相同性を有する、例えば天然に存在するタンパク質の少なくとも４０個のアミノ酸に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それが相同性を有する天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列より少ないシステイン残基を有する。いくつかの態様では、システイン残基を欠失したタンパク質は、１０ｋＤａあたり１個未満のシステイン残基を含む。いくつかの態様では、システイン残基を欠失したタンパク質は、システイン残基を有しない。
【０１００】
好適な方法において、標識化合物は色素である。反応性色素およびそれらの調製は、当該技術分野で周知である（前出のＨａｕｇｌａｎｄ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ（２００２））。
【０１０１】
システイン残基を標識するいくつかの好適な方法において、還元剤は、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ＴＣＥＰまたはＴＢＰである。還元剤は、約０．０１ｍＭ〜約５０ｍＭ、例えば約０．０５μＭ〜約２０ｍＭ、または約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．２ｍＭ〜約５ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約２ｍＭの範囲の濃度で用いることができる。
【０１０２】
好ましくは、共有結合を形成する結合は、本発明の反応性化合物を、その反応性化合物および結合するべき物質が共に可溶性である適切な溶媒中で単に混合することからなる。反応は、適切な温度で試薬の添加なしで自発的に進行することが好ましい。
【０１０３】
結合方法は様々であってよく、当業者の目的に従って最適化することができるため、以下の説明は例示のためだけのものであり本発明を限定するものではない。ペプチドまたはタンパク質結合体の調製は、通常、結合されるタンパク質を室温以下で約．１〜１０ｍｇ／ｍＬで水性緩衝液に最初に溶解することを含む。重炭酸塩緩衝液（ｐＨ約８．３）は、特にスクシンイミジルエステルとの反応に適しており、リン酸緩衝液（ｐＨ約７．２〜８）はチオール反応性官能基との反応に適しており、炭酸塩またはホウ酸緩衝液（ｐＨ約９）はイソチオシアネートおよびジクロロトリアジンとの反応に適している。適切な反応性標識化合物は、結合されるタンパク質の溶液に加えられるときに、適切な結合度を与えるのに十分な量の非プロトン性溶媒（通常ＤＭＳＯまたはＤＭＦ）中に溶解される。任意のタンパク質または他の構成要素に対する化合物の適切な量は、様々な量の化合物がタンパク質に加えられる実験により便宜的に予め決定され、その結合体は（例えば、クロマトグラフィを使用して）精製して未結合の化合物が分離され、このタンパク質−標識化合物の結合体は所望の用途で試験される。十分な結合速度を得るのに実際的である濃度に試薬が保持されることが、通常好ましい。標識反応においては、標的アミノ酸に対して過剰の標識化合物が通常使用される。
【０１０４】
反応性化合物を構成要素溶液へ加えた後、その混合物は、適切な期間の間インキュベーションされる。インキュベーションは、約０℃〜約９０℃の任意の温度で行うことができるが、通常は室温以上（例えば最高６０℃）で約１時間〜氷上で数時間である。インキュベーション後、過剰の標識化合物は、ゲル濾過、透析、ＨＰＬＣ、沈殿、イオン交換性ポリマーまたは疎水性ポリマー上での吸着または他の適切な手段により除去される。色素−タンパク質結合体は、保存することもできるし、溶液中で使用することもできるし、凍結乾燥することもできる。
【０１０５】
標識の選択性は、適切な反応性色素の選択によって最適に得られる。ハロアセトアミド、ビニルスルホンまたはマレイミドのようなチオール選択的試薬でチオールを修飾すること、または活性化されたエステル、アシルアジド、イソチオシアネートまたは３，５−ジクロロ−２，４，６−トリアジンのようなアミン反応性試薬でアミンを修飾することが挙げられる。部分的な選択性は、反応条件の慎重な制御によっても得られる。
【０１０６】
タンパク質標準に結合される標識化合物は、いかなる種類の標識であってもよいが、直接検出可能な標識であることが好ましく、肉眼によって視覚的に検出することができる色素であることがより好ましい。好ましくは、標識化合物は、電気泳動の直後に、好ましくは電気泳動の最中に、ゲルの付加的な処理または画像解析を必要とせずにゲルにおいて標識タンパク質を検出できるような、肉眼によって検出可能な色素である。標識化合物は、未修飾の天然に存在するアミノ酸でないことが好ましい。
【０１０７】
本発明は、分離手順においてその非標識対照物と実質的に同様に挙動するタンパク質標準を提供する。従って、本発明で使用する標識は好ましくは比較的低分子量（例えば約２ｋＤａ未満、好ましくは約１．５ｋＤａ未満、より好ましくは約１ｋＤａ未満の分子量）を有し、分子量は約０．５ｋＤａ未満であってもよい。例えば、標識化合物の分子量は、約０．１ｋＤａ〜約１ｋＤａの間、または約０．２ｋＤａ〜約１．５ｋＤａの間、または約０．３ｋＤａ〜約１ｋＤａの間、または約０．４ｋＤａ〜約０．８ｋＤａの間であってよく、そのため、例えば電気泳動またはクロマトグラフィにおいて、標識化合物はタンパク質の分離速度を実質的には変えない。
【０１０８】
前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識されたタンパク質を標識するために使用する色素は、発色団、フルオロフォアであってもよいし、これらを含んでいてもよく、あるいはフルオロフォアおよび発色団の両方であってもよいしそれら両方を含んでいてもよい。色素は、フルオロフォアでもある発色団を含むことができる。発色団は、いかなる発色団でもよい。いくつかの態様では、発色団は、織物染料（例えばＤｉｒｅｃｔ染料、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ染料、Ｄｉｓｃｈａｒｇｅａｂｌｅな酸性染料、Ｋｅｎａｎｔｈｏｌ染料、Ｋｅｎａｍｉｄｅ染料、Ｄｙａｃｉｄ染料、Ｋｅｍｔｅｘ反応性染料、Ｋｅｍｔｅｘ酸性染料、Ｋｅｍｔｅｘ  Ｅａｓｉｄｙｅ酸性染料、Ｒｅｍａｚｏｌ染料、Ｋｅｍａｚｏｌ染料、Ｃａｌｅｄｏｎ染料、Ｃａｓｓｕｌｆｏｎ染料、Ｉｓｏｌａｎ染料、Ｓｉｒｉｕｓ染料、Ｉｍｐｅｒｏｎ染料、フタロゲン（ｐｈｔａｌｏｇｅｎ）染料、ナフトール（ｎａｐｈｔｏｌ）染料、Ｌｅｖａｆｉｘ染料、プロシオン染料およびイソチオシアネート染料）である。タンパク質標準を標識するために用いることができる織物染料の例としては、例えば、Ｒｅｍａｚｏｌブリリアントブルー、Ｕｎｉｂｌｕｅ  Ａ、マラカイトグリーンイソチオシアネートおよびオレンジ１６（Ｒｅｍａｚｏｌオレンジ）が挙げられる。
【０１０９】
前標識されたタンパク質標準セットの選択的に標識されたタンパク質標準を標識するために用いる色素は、フルオロフォアであってもよい。非限定的な例として、タンパク質標準を標識するために用いるフルオロフォアは、Ａｌｅｘａ蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、フルオレセインもしくはその誘導体、エオシンもしくはその誘導体、テトラメチルローダミン、ローダミンもしくはその誘導体、テキサスレッドもしくはその誘導体、ピリジルオキサゾールもしくはその誘導体、塩化ＮＢＤ、フッ化ＮＢＤ、ＡＢＤ−Ｆ、ルシファーイエローもしくはその誘導体、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ＡＮＳ）もしくはその誘導体、またはオレゴングリーンもしくはその誘導体であってよい。いくつかのアミノ酸は弱い蛍光性でもよいが、それらは視覚的検出が好まれる本発明についてのフルオロフォアと考えない。従って、本発明の目的のためには、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる天然に存在するアミノ酸は、標識または標識化合物とは考えない。
【０１１０】
色素は、例えばシステイン反応性基（例えばマレイミド、ヨード酢酸、ヨードアセトアミドおよびビニルスルホン）またはアミノ反応性基（例えばイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、塩化スルホニル、アルデヒド、ケトン、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミドおよび酸無水物）などの反応性基を具備することができる。例えば、反応性化学基は、有機化学の技術分野で公知の技術を使用して色素に付加することができる。
【０１１１】
色素は、試験される色素を用いて標的アミノ酸上でタンパク質（このタンパク質の少なくとも１つの非標的アミノ酸がそのタンパク質中で欠失している）を標識し、標識タンパク質および非標識型のタンパク質についての分離手順を実行し、分離手順が完結した後に標識タンパク質および非標識タンパク質を検出し、標識されたタンパク質および非標識タンパク質の分離を比較することによって、標準として使用するためのタンパク質を標識する際の適合性について試験することができる。この方法は、非標識タンパク質を検出する前に非標識タンパク質を染色することを含むこともできる。例えば、標識タンパク質および同じタンパク質の非標識型の移動は、本願明細書において開示されるアクリルアミド電気泳動ゲル（例えば４〜１２％、４〜１６％または４〜２０％のアクリルアミド勾配ゲル）上で比較することができ、標識型および非標識型が比較されているその標識タンパク質の分子量は約３．５ｋＤａを超える（例えば少なくとも約５ｋＤａまたは例えば少なくとも約１０ｋＤａである）。タンパク質の選択的標識型および非標識型の移動は、電気泳動の終了時においてローディング色素の先端（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  ｆｒｏｎｔ）が充填部位から少なくとも５ｃｍ移動し、約１０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動と約８０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動が少なくとも３ｃｍ離れている電気泳動条件下で比較される。タンパク質の選択的標識型および非標識型の移動は、電気泳動の終了時においてローディング色素の先端（例えば、充填したクマシー色素の先端）が充填部位から少なくとも６ｃｍ移動し、約１０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動と約８０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動が少なくとも３．５ｃｍ離れている電気泳動条件下で比較されることが好ましい。タンパク質の選択的標識型および非標識型の移動は、ローディング色素の先端が充填部位から少なくとも６．５ｃｍ、例えば６．８ｃｍ移動し、約１０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動と約８０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動が、電気泳動の終了時において少なくとも３．５ｃｍ離れている電気泳動条件下で比較されることが好ましい。
【０１１２】
電気泳動による移動を比較する際は、標識標準および非標識標準の分子量は、タンパク質の移動距離（またはその関数）対分子量（またはその関数、例えば分子量の対数）をプロットすることから生成する曲線を使用して、または好ましくは分析されるタンパク質の分子量を一括する分子量を有する、同じゲルで電気泳動にかけられた既知の分子量の２つのタンパク質の移動距離に基づくポイントツーポイント（ｐｏｉｎｔ−ｔｏ−ｐｏｉｎｔ）算出を使用して、当該技術分野で認識された方法に基づいて算出される。分子量対移動距離のカーブフィットまたはポイントツーポイント算出のいずれかを使用して算出された、タンパク質の標識型および非標識型の分子量の差が所与のパーセンテージの範囲内であるとき、そのタンパク質標準の標識型および非標識型の電気泳動による移動は所与のパーセンテージの範囲内である。
【０１１３】
第２のアミノ酸残基が欠失した選択的に標識されたタンパク質標準
本発明の一局面において、前標識されたタンパク質標準セットは、第１または標的アミノ酸で標識化合物によって選択的に標識され、かつその１つ以上の選択的に標識されたタンパク質は標識化合物と反応できる第２または非標的アミノ酸の残基を欠失している１つ以上のタンパク質を含む。非標的アミノ酸を欠失したタンパク質は、１０ｋＤａあたり１個未満の非標的アミノ酸残基を有する。
【０１１４】
この局面の一態様において、第１のアミノ酸上において選択的に標識された前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、標的アミノ酸に結合される標識化合物と反応できる非標的アミノ酸の残基を欠失している配列の天然に存在するタンパク質またはその断片を含む。例えば、選択的に標識されるタンパク質は、細胞、組織、有機体、生物学的試料（血液または血清などの流体試料を含む）または培地から単離される天然に存在するタンパク質であってよく、このタンパク質の少なくとも一部は天然において非標的アミノ酸の低い存在量を有する。このタンパク質は、タンパク質の１つ以上の部分（例えば１つ以上の非標的アミノ酸残基を含む部分が挙げられるが、これに限定されない）を取り除くために、必要に応じて化学的にまたは酵素でタンパク分解されてもよい。選択的に標識されたタンパク質は、非標的アミノ酸を欠き、かつ細胞、組織、有機体、生物学的試料または培地から単離される天然に存在するタンパク質であってよい。
【０１１５】
第１のアミノ酸を欠失した選択的に標識されたタンパク質は、天然に存在するタンパク質の配列に相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列が細胞中、または生体外合成システムでタンパク質を産生するために用いられる、組換え方法を使用して生成することもできる。天然に存在するタンパク質の配列に対する相同性を有するアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、または少なくとも８０個の連続したアミノ酸に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を備えるのが好ましい。いくつかの態様では、選択的に標識されたタンパク質は、第１のアミノ酸に結合された標識化合物を有し、天然に存在するタンパク質の少なくとも３０個の連続したアミノ酸に少なくとも７０％の相同性を有し、かつ天然に存在するタンパク質の配列と比較して減少した数の第２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。第２のアミノ酸は、好ましくは標識化合物と反応できる非標的アミノ酸である。いくつかの態様では、選択的に標識されたタンパク質は、第１のアミノ酸で標識され、天然に存在するタンパク質の少なくとも４０個の連続したアミノ酸に少なくとも８０％の相同性を有し、かつそれが相同である天然に存在するタンパク質の配列より少ない第２のアミノ酸の残基を有するアミノ酸配列を含む。第２のアミノ酸は、第１のアミノ酸を標識するために用いる標識化合物に対して反応するアミノ酸であることが好ましい。
【０１１６】
選択的に標識されたタンパク質は、例えば、１０ｋＤａあたり１個未満の非標的アミノ酸の残基を有する天然に存在するタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む組換えタンパク質であってもよい。選択的に標識されたタンパク質は、非標的アミノ酸を欠く天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含むことができる。
【０１１７】
いくつかの態様では、上で開示されるように、タンパク質標準の１つ以上の選択的に標識されたタンパク質は、タンパク質が上記天然に存在するタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物から生成され、その天然に存在するタンパク質またはその一部は第２のアミノ酸の残基を欠く、組換え方法を使用して作製される。いくつかの態様では、タンパク質標準の１つ以上の選択的に標識されたタンパク質は、タンパク質が上記天然に存在するタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む核酸構築物から生成され、その核酸配列が第２のアミノ酸の１つ以上のコドンをその配列から除去するように変異されている、組換え方法を使用して作製される。いくつかの例では、第２のアミノ酸の１つ以上のコドンは、標識化合物と反応できる標準タンパク質からアミノ酸残基を削除するために、核酸配列から削除される。いくつかの態様では、非標的アミノ酸の１つ以上のコドンのうちの少なくとも１つは、非標的アミノ酸以外のアミノ酸についてのコドンに変異されている。コドンの変異は、非標的アミノ酸以外のアミノ酸についてのいかなるコドンに対してのものであってもよい。コドンの変異は、いかなる非標的コドンに対してのものであってよく、保存的変異に制限される必要はない。いくつかの態様では、コドンの変異は、タンパク質のアミノ酸配列の保存的アミノ酸変化をもたらす。
【０１１８】
タンパク質標準が組換え方法を使用して作製される態様において、１つ以上の変異を、標準タンパク質をコードする核酸配列に導入することができる。この場合、少なくとも１つの変異は標的アミノ酸の残基の数または標的アミノ酸の位置を変えるためにコドンを変えることができる。標的アミノ酸残基の数を増減することは、タンパク質標準に付着させる標識分子の数を最適化するために行うことができる。標的アミノ酸のコドンは、標準タンパク質内のそれらの位置または間隔を最適化するために変異することもでき、これは標識効率に影響を及ぼすことがある。タンパク質中の標的アミノ酸の位置を変えることは、コドンを変えることによって行うことができ、例えば標識反応の間の立体障害を回避するために標的アミノ酸との間に間隔を提供することによって標識効率を改善するため、または電荷を帯びた基、疎水性領域などからより遠くに標的アミノ酸を配置するために行うことができる。標的アミノ酸のコドンは、例えば１０ｋＤａあたり複数の標的アミノ酸（例えば１０ｋＤａあたり平均２個、３個、４個またはより多くの標的アミノ酸）を含む標識用タンパク質を提供するために、削除されてもよく、挿入されてもよく、または他のアミノ酸のコドンに変異されてもよい。核酸構築物における組換えの機会を減らすために、そのアミノ酸特異性を（「揺らぎ」によって）保持しつつ、標的アミノ酸のコドンをそのコドンの第３のヌクレオチドを変えるように変異することもできる。
【０１１９】
天然に存在するタンパク質は、いかなる天然に存在するタンパク質でもよく、いかなる種の原核生物タンパク質または真核生物タンパク質であってもよい。タンパク質は、特性（例えば、それらが産生される細胞における存在量、単離の容易さ）、または配列特性（例えば、配列における標識の標的とされる標的アミノ酸残基の豊富さおよび接近可能性、配列中に付加的な非標的アミノ酸が大量には存在しないこと、などが挙げられるがこれらに限定されない）に基づいて選択することができる。天然に存在するタンパク質の配列の全てまたは１つ以上の部分を、タンパク質標準において使用することができるし、選択的に標識されたタンパク質標準として使用するためのタンパク質を操作するために配列が変異できるタンパク質として選択することができる。
【０１２０】
例えば、前標識されたタンパク質標準のいくつかの好ましい態様では、標的アミノ酸はリジンであり、非標的アミノ酸はシステインである。この場合、タンパク質配列は、使用するアミノ酸配列におけるリジンの豊富さおよびシステインの少なさに基づき任意に選択することができ、これにより、いくつかの態様では変異するコドンの数を減らすことができる。タンパク質配列をコードするアミノ酸配列は、システインおよび／または他の非標的アミノ酸（例えばヒスチジンおよび／またはトリプトファン）の残基の数をさらに減らすために任意に変異でき、これはリジンを標的とする反応において標識することができる。
【０１２１】
前標識されたタンパク質標準の他の態様において、標的アミノ酸はシステインであり、第２のアミノ酸はリジンである。この場合、タンパク質配列は、使用するアミノ酸配列におけるシステインの豊富さおよびリジンの少なさに基づき任意に選択することができ、これにより、いくつかの態様では変異するコドンの数を減らすことができる。
【０１２２】
別の態様において、非標的アミノ酸を欠失した選択的に標識されたタンパク質は、いくつかの態様において、天然に存在するタンパク質に対して公知の相同性を有しないアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよく、組換え技術によってまたは化学的に、または化学および組換え技術の組み合わせを使用して設計・合成することができる。天然に存在するタンパク質に由来しない配列を含む選択的に標識されたタンパク質は、いくつかの好ましい態様では、非標的アミノ酸の残基を欠く。
【０１２３】
１つの非標的アミノ酸を欠くタンパク質配列は、他の潜在的非標的アミノ酸の頻度の低さに基づいて、さらに選択することもできる。例えば、リジンが色素と結合される標的アミノ酸である場合、リジンおよびシステインより反応性は低いが、それでも標識化合物のアミノ反応性基と反応できるヒスチジンおよびトリプトファンは、必要に応じて、システインに加えて非標的アミノ酸と考えることができる。この例では、システインを欠く配列は、同様に配列中のこれらのアミノ酸の頻度について任意に分析されてもよい。
【０１２４】
前標識されたタンパク質標準セットは、非標的アミノ酸を欠失したアミノ酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多いコピーを含む選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。例示的な態様において、配列は、非標的アミノ酸の残基を欠く。非標的アミノ酸を欠失しているかまたは欠損しているアミノ酸配列は、公知の天然に存在するタンパク質に対する相同性を欠く設計された配列であってもよく、または天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対する相同性（例えば天然に存在するタンパク質の少なくとも３０個の連続したアミノ酸に対する少なくとも７０％の相同性、天然に存在するタンパク質の少なくとも４０個の連続したアミノ酸に対する少なくとも８０％の相同性、天然に存在するタンパク質の少なくとも５０個の連続したアミノ酸に対する少なくとも８０％の相同性）を有する配列であり得る。いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、第１のアミノ酸に結合される標識化合物を含有し、第２のアミノ酸を欠失しているかまたは第２のアミノ酸を欠損しているアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。第２のアミノ酸は、選択的に標識されたタンパク質を標識するために用いる標識化合物に対して反応する非標的アミノ酸であることが好ましい。
【０１２５】
１つの局面では、本発明は、標識化合物により第１のアミノ酸上において選択的に標識され、標識化合物と反応できる第２のアミノ酸を欠失しており、天然に存在するタンパク質の配列の少なくとも３０個の連続したアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む、２つ以上のタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを包含する。前標識されたタンパク質標準セットは、第２のアミノ酸の残基を欠失したアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多い選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。
【０１２６】
一態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、リジンで標識され、システイン残基を欠失した異なる分子量の２つ以上のタンパク質を含む。本発明は、いくつかの態様では、リジンで標識され、システイン残基を欠く異なる分子量の少なくとも２つのタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準のセットを包含する。リジンで選択的に標識されたタンパク質は、細胞、組織、有機体、生物学的試料または培地から単離することができ、または組換え方法を使用して作製することもできる。組換え方法を使用して、システインを欠失しているかまたはシステインを欠く配列の１つ以上のコピーを含むタンパク質は、選択的に標識された標準としての用途のために合成することができる。例えば、選択的に標識されたタンパク質は、１つ以上のＡＤＰリボシル化因子のＣ末端からの配列（Ｓｃｈｕｒｍａｎｎら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：１５６８３（１９９４））またはシステイン残基を欠く１つ以上の巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）胞子タンパク質の配列（Ｓｅｔｌｏｗ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５０：８１６８（１９７５））の１つ以上のコピーを含むことができる。かかる配列は、タンパク質標準を提供するために、それら自身または他の配列と任意の組み合わせで融合できる。システインを欠く他のアミノ酸配列は、遺伝子データベースまたはタンパク質データベースを検索することによって見つけることができる。システインを欠く配列は、標的アミノ酸（例えばリジン）の残基の頻度に基づいて、さらに選択することができる。
【０１２７】
いくつかの態様では、本発明は、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質がシステインを欠失したアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む、リジンで選択的に標識され、システインを欠く複数のタンパク質を有する前標識されたタンパク質標準セットを提供する。前標識されたタンパク質標準セットは、２以上、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多い、リジンで選択的に標識されかつシステインを欠失したタンパク質であって、システインを欠失したアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含むタンパク質を含むことができる。リジンで選択的に標識されたタンパク質標準は、アミノ反応性基（例えばイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、塩化スルホニル、アルデヒド、ケトン、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、または酸無水物が挙げられるがこれらに限定されない）を含む標識化合物を用いて標識される。リジンで選択的に標識されたタンパク質標準は、アミノ反応性基を含む色素を用いて標識されることが好ましい。
【０１２８】
他の態様では、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、システインで標識され、リジン残基を欠失した異なる分子量の２つ以上のタンパク質を含む。本発明は、いくつかの態様では、システインで標識され、リジン残基を欠く異なる分子量の少なくとも２つのタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準のセットを含む。選択的に標識されたタンパク質は、細胞、組織、有機体、生物学的試料または培地から単離された天然に存在するタンパク質であってよく、または組換え方法を使用して作製することもできる。例えば組換え方法を用いて、１０ｋＤａのタンパク質あたり１個未満のリジンを有するタンパク質の少なくとも一部分を有するタンパク質の配列（例えば穀物の種子貯蔵タンパク質（例えばトウモロコシのゼインタンパク質、小麦のグリアジン）、ＨＩＶウイルスまたはエボラウイルスのＬドメイン、またはＷＮＫ−１およびＷＮＫ−４タンパク質をコードする配列（Ｃｏｌｅｍａｎら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９４：７０９９９４−９７（１９９７）；Ｓｈｉｍｏｎｉら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：１８８６９−１８８７４（１９９６）；Ｙａｎｇら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５：１３７９−１３８７（２００５）））は、タンパク質標準を提供するために、任意の組み合わせで融合できる。リジンを欠くかまたは欠失した他のアミノ酸配列は、遺伝子データベースまたはタンパク質データベースを検索することによって見つけられる。非標的アミノ酸を欠失した配列は、標的アミノ酸（例えばシステイン）の頻度に基づいて、さらに選択することができる。リジンを欠失した配列は、他の潜在的非標的アミノ酸（例えばヒスチジンまたはトリプトファンが挙げられるがこれらに限定されない）の頻度の低さに基づいて、さらに選択することができる。
【０１２９】
他の態様において、本発明は、２つ以上の選択的に標識されたタンパク質がリジンを欠失したアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む、システインで選択的に標識され、リジンを欠く複数のタンパク質を有する前標識されたタンパク質標準セットを提供する。前標識されたタンパク質標準セットは、２以上、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多い、システインで選択的に標識されかつリジンを欠失したタンパク質であって、この選択的に標識されたタンパク質がリジンを欠失したアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含むタンパク質を含むことができる。システインで選択的に標識されたタンパク質標準は、スルフヒドリル反応性基（例えばビニルスルホン、ヨードアセトアミド、マレイミドまたはヨード酢酸が挙げられるがこれらに限定されない）を含む標識化合物を用いて標識される。リジンで選択的に標識されたタンパク質標準は、スルフヒドリル反応性基を含む色素を用いて標識されることが好ましい。
【０１３０】
天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列を含む選択的に標識されたタンパク質標準
１つの局面では、本発明は、選択的に標識されたタンパク質が第１のアミノ酸に結合された標識化合物を含み、かつ天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含み、この天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列が天然に存在するタンパク質の野生型アミノ酸配列よりも少ない数の標識化合物と相互作用できる第２のアミノ酸の残基を有する、１つ以上の選択的に標識されたタンパク質を有する前標識されたタンパク質標準セットを包含する。
【０１３１】
天然に存在するタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個または少なくとも８０個の連続したアミノ酸に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有することが好ましい。
【０１３２】
特定の例示的態様において、第１のアミノ酸上において選択的に標識されたタンパク質は、核酸構築物から作製された組換えタンパク質であり、１つ以上の非標的アミノ酸についての１つ以上のコドンは天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列をコードする構築物の核酸配列から変異しているかまたは削除されている。例えば、前標識されたタンパク質標準を作製するために使用される設計されたタンパク質は、リジンがタンパク質をコードする核酸配列のリジンコドンの削除または変異によって配列から除去されているチオレドキシン配列の少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、または少なくとも５０個の連続したアミノ酸に対して少なくとも７０％または少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを有することができる。リジンコドンは、いかなる非リジンコドンにも変異できる。いくつかの例では、１つ以上のリジンコドンは、特性（例えば標識タンパク質の溶解性または精製）を最適化するために非リジンアミノ酸の親水性、電荷または反応性に基づいて非リジンコドンに変異される。
【０１３３】
本発明は、異なる分子量の２つ以上の選択的に標識されたタンパク質が天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列の異なる数のコピーを含む、分子量標準セットを提供する。例えば、標準セットは、野生型タンパク質配列に存在する非標的アミノ酸の残基を欠く天然に存在するタンパク質の少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個または少なくとも５０個の連続したアミノ酸と少なくとも７０％または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多くのコピーを有する、標的アミノ酸上において選択的に標識されたタンパク質を有することができる。
【０１３４】
天然に存在するタンパク質は、いかなる天然に存在するタンパク質でもよい。ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素は、豊富なシステイン残基を有する非常に溶解性の高いタンパク質（標識のための残基の接近可能性について利点）である。ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素の例としては、リポアミドデヒドロゲナーゼ、グルタチオン還元酵素またはチオレドキシンが挙げられる。リポアミドデヒドロゲナーゼ、グルタチオン還元酵素またはチオレドキシンのアミノ酸配列の全てまたはその一部は、システインで選択的に標識された前標識されたタンパク質標準として使用するためのタンパク質に組み込むことができる。配列が前標識されたタンパク質標準を設計するために用いられるリポアミドデヒドロゲナーゼ、グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシンは、原核生物源または真核生物源に由来するものであってよい。ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素は、非限定的な例として、配列番号１（大腸菌のチオレドキシン）、配列番号２（ヒトのチオレドキシン）、配列番号３（大腸菌のグルタレドキシン１）、配列番号３（大腸菌のグルタレドキシン２）、配列番号５（大腸菌のグルタチオン酸化還元酵素）、配列番号６（ヒトのグルタチオン酸化還元酵素）、配列番号７（大腸菌のリポアミドデヒドロゲナーゼ）、配列番号８（ヒトのリポアミドデヒドロゲナーゼ）、それらの変異体、他の種のそれらのアナログおよびかかるアナログの変異体であってよい。
【０１３５】
いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識された分子量標準として使用するタンパク質は、リポアミドデヒドロゲナーゼ、グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシンの配列に由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識された分子量標準として使用するタンパク質は、チオレドキシン配列に由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識された分子量標準として使用するタンパク質は、細菌チオレドキシン配列（例えば大腸菌のチオレドキシン配列）に由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含み、低分子量のチオレドキシン（例えばＴｒｘＡによってコードされる配列）であってもよい。
【０１３６】
チオレドキシン配列の全てまたは一部は、１つ以上の前標識されたタンパク質標準を作製する際に使用することができる。例えば、タンパク質標準において使用するチオレドキシン配列は、カルボキシ末端から１〜５０個（例えば１〜１０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜４０個、または４０〜５０個）のアミノ酸の短縮を有することができ、アミノ酸はカルボキシ末端から短縮されていてもよい。いくつかの好ましい態様において、２２個のアミノ酸が、チオレドキシン配列（例えばタンパク質標準の配列として使用する細菌チオレドキシン配列）の末端から短縮される。いくつかの好ましい態様において、３９〜４１個のアミノ酸は、チオレドキシン配列（例えばタンパク質標準の配列として使用する細菌チオレドキシン配列）の末端から短縮される。
【０１３７】
いくつかの態様では、システインで選択的に標識された前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、ヌクレオチド−ジスルフィド酸化還元酵素（例えばリポアミドデヒドロゲナーゼ、グルタチオン還元酵素またはチオレドキシン）に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい態様において、アミノ酸配列は、チオレドキシン配列に由来し、チオレドキシン（例えば短縮されたチオレドキシン）の少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個または少なくとも５０個のアミノ酸のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％または少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの好ましい態様において、チオレドキシン配列に由来するアミノ酸配列は、リジン残基を欠くことだけが天然に存在するチオレドキシン配列と異なる。いくつかの好ましい態様において、選択的に標識された前標識されたタンパク質標準は、リジン残基を欠いており、１つ以上のシステイン残基で標識され、チオレドキシンに由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。好ましい態様では、タンパク質は天然に存在するチオレドキシン配列に由来するアミノ酸配列の１つ以上のコピーをコードしかつ１つ以上のリジンコドンを削除するかまたは１つ以上のリジンコドンを非リジンコドンに変更するために変異した核酸配列を含む核酸構築物から作製される。
【０１３８】
本発明のいくつかの局面において、前標識されたタンパク質標準セットは、天然に存在する少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、または少なくとも５０個の連続したアミノ酸に対して少なくとも７０％または少なくとも８０％の同一性を有し、標識用に標的とされる第１のアミノ酸の数または間隔を変える１つ以上のアミノ酸変更を含むアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含むことができる。
【０１３９】
更なる標的アミノ酸コドンを、本発明のタンパク質標準をコードする核酸配列に加えてもよい。好ましい態様では、１つ以上の更なるシステインコドンが短縮されたチオレドキシンをコードする核酸配列に加えられる。短縮されたチオレドキシンをコードする核酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多くのコピーが、短縮されたチオレドキシン配列の複数のコピーを有する組換えタンパク質を作製するために、一緒に集められてもよい。いくつかの態様では、タンパク質標準を生成するために用いる組換え核酸構築物は、遺伝子組換えの危険率を低下させるために、コピーごとに同じアミノ酸について別のコドン使用ができるように、さらに変異される。
【０１４０】
分子量に対する第１のアミノ酸の一定の比を有する前標識されたタンパク質
いくつかの本発明の好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、選択的に標識されたタンパク質のうちの２つ以上において、分子量に対する標的アミノ酸の残基の数の比が互いに５％以内、いくつかの態様では互いに２．５％内にある、標的アミノ酸で標識された異なる分子量の２つ以上のタンパク質を含む。例えば、分子量に対する標的アミノ酸の残基の数の比は、１０ｋＤａあたり４残基であってもよく、標準セットの第１のタンパク質について１ｋＤａあたり０．４残基であってもよく、例えば、標準セットの第２のタンパク質について１ｋＤａあたり０．３８〜０．４２残基の標的アミノ酸であってもよいが、この第１および第２のタンパク質は、互いに５％以内の、分子量に対する標的アミノ酸残基の数の比を有する。
【０１４１】
いくつかの好ましい態様では、タンパク質の分子量に対する第１または標的アミノ酸の残基の数の一定の比を有する２つ以上の標識タンパク質が、第１のアミノ酸上において選択的に標識される。いくつかの好ましい態様において、２つ以上の標識タンパク質は、第１のアミノ酸上において選択的に標識され、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列、または天然に存在するタンパク質の少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個または少なくとも５０個の連続したアミノ酸と少なくとも７０％または少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの好ましい態様において、２つ以上の標識タンパク質は、第１のアミノ酸に結合された標識化合物を含み、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列、または天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含み、そしてこの標識タンパク質のアミノ酸配列は標識化合物と反応できる第２のアミノ酸の残基を欠く。本発明は、標識タンパク質のうちの２つ以上が標識化合物を用いて第１のアミノ酸上において選択的に標識されかつ標識化合物と反応できる第２のアミノ酸の残基を欠き、その２つ以上の選択的に標識されたタンパク質において、分子量に対する第１のアミノ酸の残基の数の比が互いに５％、２．５％または１％以内にある、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを提供する。
【０１４２】
前標識されたタンパク質標準セットのいくつかの局面において、このセットは複数の標識タンパク質を含み、そのセットの少なくとも２つのタンパク質は、標的アミノ酸で標識され、かつ１０ｋＤａあたり平均１〜１０個の標的アミノ酸残基（例えば１０ｋＤａあたり平均２〜７個の標的アミノ酸残基、例えば平均３〜５個の標的アミノ酸、例えば平均３．５〜４．５個の標的アミノ酸残基）を有する。これらの態様では、標的アミノ酸で標識される２つ以上のタンパク質は、標的アミノ酸上で選択的に標識化合物により標識されていることが好ましい。例示的態様において、選択的に標識されたタンパク質は、色素と反応できる非標的アミノ酸の残基を欠く。いくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、少なくとも５つの標識タンパク質を含む。このタンパク質のうちの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多くが標的（第１の）アミノ酸上において選択的に標識され、１０ｋＤａあたり平均１〜１０個の標的アミノ酸残基（例えば１０ｋＤａあたり平均２〜７個の標的アミノ酸残基、例えば平均３〜５個の標的アミノ酸残基、例えば平均３．５〜４．５個の標的アミノ酸残基）を有する。
【０１４３】
いくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、そのタンパク質のうちの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多くがシステイン上で標識されており、１０ｋＤａあたり平均３〜５個のシステイン残基、例えば平均３．５〜４．５個のシステイン残基を有する、少なくとも５つの標識タンパク質を含む。いくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、そのタンパク質のうちの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多くがリジンを欠きかつシステイン上で標識されており、１０ｋＤａあたり平均３〜５個のシステイン残基、例えば平均３．５〜４．５個のシステイン残基を有する、少なくとも５つの標識タンパク質を含む。
【０１４４】
標的アミノ酸上で標識化合物によって標識され、かつ互いに５％以内の、分子量に対する標的アミノ酸の残基の数の比を有する、前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１１０ｋＤａまたは少なくとも１５０ｋＤａ（ここで、所与の分子量は±１ｋＤａである）だけ互いと異なる分子量を有することができる。標的アミノ酸上で色素によって標識され、互いに５％以内の、分子量に対する標的アミノ酸の残基の数の比を有する、前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、同じ色素で標識されてもよく、異なる色素で標識されてもよい。
【０１４５】
更なる局面において、本発明は、複数の標識タンパク質の２つ、３つ、４つ、５つまたはこれより多くが第１のアミノ酸上で色素によって選択的に標識され、互いに５％以内の、分子量に対する第１のアミノ酸の比を有し、変性条件下のアクリルアミドゲル電気泳動におけるその５つ以上の前標識されたタンパク質標準の移動が非標識型のタンパク質の同一セットの移動と実質的には相違しない、１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたる複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを提供する。好ましい態様では、１０ｋＤａ以上の分子量を有する５つ以上の標識タンパク質標準の各々は、同じアクリルアミドゲル上での非標識型の５つ以上のタンパク質の各々から起算して５％以内に移動する。
【０１４６】
本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはこれより多い標識タンパク質を含むことができる。例えば、前標識されたタンパク質標準セットは、１０〜１５個、１５〜２０個、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、または１００個以上の標識タンパク質を有することができる。前標識されたタンパク質標準セットの標識タンパク質の全てまたはサブセットは、選択的に標識することができる。前標識されたタンパク質標準セットの標識タンパク質のうちの２つ以上は、標的アミノ酸上に標識化合物を含むことができ、互いに５％以内の、分子量に対する標的アミノ酸の残基の数の比を有することができる。本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはこれより多くの、標的アミノ酸上において選択的に標識されたタンパク質を含むことができる。
【０１４７】
いくつかの好ましい態様において、前標識標準セットは、タンパク質のうちの少なくとも２つが標的アミノ酸上において選択的に標識され、かつ標的アミノ酸上において選択的に標識されたその少なくとも２つのタンパク質が、互いに５％以内の、分子量に対する標的アミノ酸残基の数の比を有する、複数の標識タンパク質を含む。
【０１４８】
非限定的な例として、前標識されたタンパク質標準セットは、５〜２０個の標識タンパク質を含むことができ、そのうちの１〜２０個がシステインで標識され、かつリジン残基を欠く。非限定的な例として、前標識されたタンパク質標準セットは５〜２０個の標識タンパク質を含むことができ、そのうちの２〜２０個はシステイン残基上に標識を含みかつリジン残基を欠き、かつ互いに５％以内の、分子量に対するシステイン残基数の比を有する。
【０１４９】
前標識されたタンパク質標準の高い分解能の電気泳動分離
標識化合物が非標的アミノ酸と反応するのを防止することで、タンパク質の標識の不整合を減らすことができる。例えば、第１のアミノ酸に対して高い特異性を有し第２のアミノ酸に対して低い特異性を有する色素を用いて特定のタンパク質を標識すると、第１のアミノ酸で主に標識されているが、タンパク質に存在する第２のアミノ酸上での標識の程度が異なる標識タンパク質変異体の集団をもたらすことがある。タンパク質に付着させた色素分子の量の範囲に応じて、標識タンパク質の集団のかかるばらつきは、特定の標識タンパク質についての質量範囲を生じさせることになる。これは、タンパク質１μｇにつき異なる標識強度を有するタンパク質標準につながり、そして質量に依存する分離技術（例えば電気泳動およびクロマトグラフィが挙げられるがこれらに限定されない）におけるタンパク質標準の分解能の低さにつながる。
【０１５０】
本発明は、サイズ、電荷またはサイズおよび電荷の組み合わせに基づいて、明確にかつ整合して分離する前標識されたタンパク質標準を提供する。前標識された標準は、分離または実験的な手順の前に標識され、分離または実験的な手順の最中またはその終結時にタンパク質を染色するために必要とされる付加的な工程を実行することなく、分離手順の最中またはその後に観察することができる。前標識されたタンパク質標準は、半固体（例えばゲル）または液体培地での等電点電気泳動；サイズ、電荷またはそれらの組み合わせに基づいたクロマトグラフィ分離（ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣを含む）；ならびに、電気泳動（キャピラリー電気泳動、フリーフロー電気泳動、非変性（未変性）ゲル電気泳動および変性ゲル電気泳動、質量分析ならびにクロマトフォーカシングが含まれるがこれらに限定されない）などのタンパク質分離技術で使うことができる。いくつかの好適な局面において、本発明は、標識のための標的とされないアミノ酸（非標的アミノ酸）に対する色素の結合が制限されるように選択的に標識されたタンパク質分子量標準を提供する。本発明は加えて、セットの少なくとも１つの標識タンパク質が第１のアミノ酸上において選択的に標識されている、生化学的分離の分子量マーカーとして使用することができる前標識されたタンパク質標準のセットを提供する。
【０１５１】
本発明の前標識されたタンパク質標準は、１つ以上の試料タンパク質と一緒に動く前標識された標準を使用して分子量が測定できるゲル電気泳動に特に有用である。例えば、本願明細書において提供される前標識された標準は、非変性タンパク質がサイズに基づいて分離されるＢｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅゲル電気泳動（Ｓｃｈａｇｇｅｒ  Ｈおよびｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ  Ｇ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：２２３−２３１；Ｓｃｈａｇｇｅｒ  Ｈ，Ｃｒａｍｅｒ  ＷＡおよびｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ  Ｇ（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：２２０−２３０；およびＳｃｈａｇｇｅｒ  Ｈ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：２３１−２４４に記載されている）のマーカーとして使うことができ、またはタンパク質が尿素、ホルムアミドまたは１つ以上の変性界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）が挙げられるがこれらに限定されない）を使用して変性される、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような変性ゲル電気泳動において用いることができる。いくつかの好ましい態様において、タンパク質標準は、タンパク質が界面活性剤（例えばＳＤＳまたはＬＤＳが挙げられるがこれらに限定されない）を使用して変性される変性アクリルアミドゲル電気泳動において使用される。多くの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動システムは、当該技術分野において公知である（例えばビストリスゲル、トリストリシンゲル、トリスアセテートゲルまたはトリスグリシンゲル）。タンパク質の電気泳動分離のためのゲルは市販されており、例えば、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッドから入手可能であるＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリスアセテートゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビストリスゲル、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリシンゲルおよびＮｏｖｅｘ（登録商標）トリスグリシンゲルがある。本発明は、分子量マーカーとして使用することができる前標識されたタンパク質標準を提供する。この前標識されたタンパク質標準は、電気泳動ゲル上（変性条件下で動く電気泳動ゲルなど）で鮮明なバンドを生成し、この前標識されたタンパク質標準の移動は、それらの非標識対照物の移動と実質的に同様である。
【０１５２】
タンパク質の標識型および非標識型の移動は、電気泳動の終了時においてローディング色素の先端が充填部位から少なくとも５ｃｍ移動し、約１０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動と約８０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動が、少なくとも３．５ｃｍ離れている電気泳動条件下で、ＭＯＰＳまたはＭＥＳ緩衝液を使用して例えばビストリスアクリルアミドゲル上で、またはトリスアセテート、トリシンまたはトリスグリシンアクリルアミドゲル上で比較できる。ゲルは、１０ｃｍ以下の長さ、例えば長さ８ｃｍを有する「ミニゲル」であってよく、または長さ１０ｃｍ超の長さ、例えば長さ１２ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍまたはこれ以上であってもよく、電気泳動期間の終わりに色素先端が、ゲルの長さの少なくとも８０％を移動するようにする。色素の先端は、クマシー色素の先端（例えばクマシーＧ２５０色素先端）であってよい。
【０１５３】
例えば、標識タンパク質標準とその非標識対照物との間の移動の整合性を試験するために、電気泳動は、電気泳動終了後ゲルの色素の先端が充填部位から少なくとも５ｃｍ（例えば少なくとも６ｃｍ、例えば少なくとも６．５ｃｍ、例えば約６．８ｃｍ）移動するようにして８ｃｍの長さを有するポリアクリルアミドゲル上で実行することができる。色素の先端は、クマシー色素の先端（例えばクマシーＧ２５０色素の先端）であってよい。
【０１５４】
例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、カールズバッド）から入手可能なＭＯＰＳまたはＭＥＳ緩衝液を使用する４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ビストリスアクリルアミド８ｃｍ×８ｃｍゲル、または４〜２０％トリスグリシン８ｃｍ×８ｃｍアクリルアミドゲルは、タンパク質を分離するための製造業者の取扱説明書に提供される電気泳動条件を使用して標識タンパク質標準および非標識タンパク質標準の移動特性を測定するために用いることができる。タンパク質の選択的標識型および非標識型の移動は、電気泳動の終了時においてローディング色素の先端が充填部位から少なくとも５ｃｍ移動し、約１０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動と約８０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動が少なくとも３ｃｍ離れている電気泳動条件下で比較される。タンパク質の選択的標識型および非標識型の移動は、電気泳動の終了時においてローディング色素の先端が充填部位から少なくとも６ｃｍ移動し、約１０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動と約８０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動が少なくとも３．５ｃｍ離れている電気泳動条件下で比較されることが好ましい。タンパク質の選択的標識型および非標識型の移動は、電気泳動の終了時においてローディング色素の先端が充填部位から少なくとも６．５ｃｍ移動し、約１０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動と約８０ｋＤａと算出されるタンパク質の移動が少なくとも３．５ｃｍ離れている電気泳動条件下で比較されることが好ましい。色素の先端は、クマシー色素の先端（例えばクマシーＧ２５０色素の先端）であってよい。
【０１５５】
好ましくは、参照された変性アクリルアミドゲルのうちの１つ上で５ｋＤａより大きい分子量を有する前標識されたタンパク質標準およびその対照物について算出された分子量は、互いに１０％、７％または５％以内にある。
【０１５６】
本発明は、３．５ｋＤａを超える分子量を有する（例えば、５ｋＤａを超える分子量を有する、例えば１０ｋＤａ以上の分子量を有する）前標識されたタンパク質の全てが電気泳動ゲル上でそれらの非標識対照物と実質的に同じ移動がある、異なる分子量の５つ以上の標識タンパク質を有する前標識されたタンパク質標準セットを提供する。
【０１５７】
本発明は、３．５ｋＤａを超える分子量、５ｋＤａを超える分子量または１０ｋＤａ以上の分子量を有する前標識されたタンパク質の全てが、電気泳動ゲル（例えば当該技術分野で公知のビストリスゲルおよびトリスグリシンゲル）上で非標識対照物から起算して１０％、７％または５％以内に移動する、異なる分子量の少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個または少なくとも１５個の前標識されたタンパク質を有する前標識されたタンパク質標準のセットを提供する。
【０１５８】
本発明は、標識されていない同じタンパク質の移動距離の１０％以内に、７％以内に、５％以内に、４％以内に、２．５％以内に、２％以内に、１．５％以内にまたは１％以内に移動する個々の前標識されたタンパク質を提供する。
【０１５９】
本発明は、３．５ｋＤａ以上の分子量を有するセットの全てのタンパク質が、標識されていない同じタンパク質の移動距離から起算して５％以内に移動する、前標識されたタンパク質分子量標準セットを提供する。本発明は、５ｋＤａ以上の分子量を有するセットの全てのタンパク質が、標識されていない同じタンパク質の移動距離から起算して５％以内に移動する、タンパク質分子量標準セットを提供する。本発明は、１０ｋＤａ以上の分子量を有するセットの全てのタンパク質が、標識されていない同じタンパク質の移動距離から起算して５％以内に移動する、タンパク質分子量標準セットを提供する。
【０１６０】
本発明は、３．５ｋＤａ以上の分子量を有するセットの全てのタンパク質が、４〜１２％のビストリスゲルまたは４〜２０％のトリスグリシンゲル上での標準的なタンパク質ゲル電気泳動条件下で標識されていない同じタンパク質の移動距離から起算して４％以内に、２．５％以内に、２％以内に、１．５％以内に、または１％以内に移動する、前標識されたタンパク質分子量標準セットを提供する。本発明は、５ｋＤａ以上の分子量を有するセットの全てのタンパク質が、標識されていない同じタンパク質の移動距離から起算して４％以内に、２．５％以内に、２％以内に、１．５％以内に、または１％以内に移動する、前標識されたタンパク質分子量標準セットを提供する。本発明は、１０ｋＤａ以上の分子量を有するセットの全てのタンパク質が、標識されていない同じタンパク質の移動距離から起算して４％以内に、２．５％以内に、２％以内に、１．５％以内に、または１％以内に移動する、前標識されたタンパク質分子量標準セットを提供する。
【０１６１】
本発明はさらに、３．５ｋＤａを超える分子量、５ｋＤａを超える分子量または１０ｋＤａ以上の分子量を有するセットの全てのタンパク質が、標識されていない同じタンパク質の移動距離から起算して４％以内に、２．５％以内に、２％以内に、１．５％以内に、または１％以内に移動する、前標識されたタンパク質分子量標準セットを提供する。
【０１６２】
本発明のいくつかの局面において、前標識されたタンパク質標準セットは、前標識されたタンパク質標準セットが変性アクリルアミドゲル（ＭＥＳ電気泳動緩衝液によって動く長さ８ｃｍのビストリスゲル（例えば４〜１２％のビストリス８×８ｃｍゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド））上で電気泳動にかけたとき、１０ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質からのバンドの幅が２倍未満の相違であるようにタンパク質のうちの２つ以上が選択的に標識された２〜２０個のタンパク質を含む。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上にわたるサイズの標識タンパク質を含み、少なくとも１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質に由来する肉眼に見える可視バンドの幅は、幅が５０％未満、４０％未満または３０％未満の幅の相違である。少なくとも２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質に由来する肉眼に見えるバンドの幅は、１５％以下だけ幅が異なっていてもよい。本発明の前標識された標準セットは、少なくとも２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ未満の分子量を有し異なる色を有する少なくとも４つの異なる色素を含み、電気泳動にかけられたタンパク質の肉眼に見えるバンドの幅は１５％未満だけ異なる、少なくとも６つのタンパク質を含むことができる。前標識された標準セットは、電気泳動にかけられたタンパク質の肉眼に見えるバンドの幅が３％以下だけ異なる５つのタンパク質を含む。前標識された標準セットは、電気泳動にかけられたタンパク質の肉眼に見えるバンドの幅が３％以下だけ異なる、異なる色の少なくとも４つの異なる色素を用いて標識された５つのタンパク質を含む。
【０１６３】
一態様において、前標識されたタンパク質標準セットは、タンパク質が少なくとも２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ未満の分子量を有し、電気泳動にかけられたタンパク質のバンドの幅が１５％未満だけ異なる、区別可能に異なる色を有する４つの異なる色素で染色された６つのタンパク質を含む。別の態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、タンパク質が約２０ｋＤａから約８０ｋＤａまでの分子量を有し、５つのタンパク質の分子量は等しい増分だけ異なり、電気泳動にかけられたタンパク質のバンドの幅が３％以下だけ異なる、区別可能に異なる色を有する４つの異なる色素で染色された５つのタンパク質を含む。
【０１６４】
前標識されたタンパク質標準セット
更なる局面において、本発明は、変性アクリルアミドゲル電気泳動における５つ以上の標識タンパク質標準の移動が非標識型のタンパク質の同一セットの移動と実質的には相違しない、１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上の分子量範囲にわたる５つ以上の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを提供する。好ましい態様では、同じアクリルアミドゲルから算出されるとき、１０ｋＤａ以上の分子量を有する５つ以上の標識タンパク質標準の各々の電気泳動による移動は、５つ以上の標識タンパク質標準の各々の電気泳動による移動の５％以内にある。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、標識タンパク質が１０ｋＤａ以下から少なくとも１００ｋＤａまでの分子量範囲にわたり、１０ｋＤａ以上の分子量を有する５つ以上の標識タンパク質標準の各々のアクリルアミドゲル上の電気泳動による移動が、同じアクリルアミドゲル上の非標識型のその５つ以上のタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の５％以内にある、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはこれより多い標識タンパク質を含む。
【０１６５】
いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、１０ｋＤａ以上の分子量を有する標識タンパク質標準の各々の電気泳動による移動が、非標識型のそのタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の５％以内にある、１０ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたる少なくとも１０個の標識タンパク質を含む。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、１０ｋＤａ以上の分子量を有する標識タンパク質標準の９０％の電気泳動による移動が、非標識型のそのタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の４％以内にある、１０ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたる少なくとも１０個の標識タンパク質を含む。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、１０ｋＤａ以上の分子量を有する標識タンパク質標準の７０％の電気泳動による移動が、非標識型のそのタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の３％以内にある、１０ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたる少なくとも１０個の標識タンパク質を含む。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、１０ｋＤａ以上の分子量を有する標識タンパク質標準の７０％の電気泳動による移動が、非標識型のそのタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の２．５％以内にある、１０ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたる少なくとも１０個の標識タンパク質を含む。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットは、１０ｋＤａ以上の分子量を有する標識タンパク質標準の７０％の電気泳動による移動が、非標識型のそのタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の２％以内にある、１０ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたる少なくとも１０個の標識タンパク質を含む。
【０１６６】
前標識されたタンパク質分子量標準セットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはこれより多い標識タンパク質を含むことができる。例えば、前標識されたタンパク質標準セットは、１０〜１５個、１５〜２０個、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上または１００個以上の標識タンパク質を有することができる。前標識されたタンパク質分子量標準セットのタンパク質のいずれかまたは全ては、選択的に標識することができる。例えば、前標識されたタンパク質分子量標準セットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはこれより多い標識タンパク質を含むことができ、そのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはこれより多くは標的アミノ酸上において選択的に標識されている。前標識されたタンパク質分子量標準セットは、１０〜１５個、１５〜２０個、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、または１００個以上の標識タンパク質を含むことができ、このうちの１０〜１５個、１５〜２０個、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、または１００個以上が標的アミノ酸上において選択的に標識されている。
【０１６７】
これらの局面のいくつかの態様において、１０ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質標準セットの１、２、３、４、５個またはこれより多い標識タンパク質は、標的アミノ酸上において選択的に標識され、それらの非標識対照物と実質的に同様に移動する。いくつかの態様では、タンパク質標準セットの１、２、３、４、５個またはこれより多い標識タンパク質は、リジンで選択的に標識され、システイン残基を欠く。この局面のいくつかの態様において、タンパク質標準セットの１、２、３、４、５個またはこれより多い標識タンパク質は、システインで選択的に標識され、リジン残基を欠く。
【０１６８】
他の例において、前標識されたタンパク質標準セットは、２〜２０個の標識タンパク質を含むことができ、そのうちの１〜２０個はリジンで標識されかつシステイン残基を欠き、かつ必要に応じて、さらに１つ以上のヒスチジン残基、１つ以上のトリプトファン残基または１つ以上のチロシン残基のうちの１つ以上を欠く。他の例では、前標識されたタンパク質標準セットは、５〜２０個の標識タンパク質を含むことができ、そのうちの２〜２０個はリジンで標識されかつシステイン残基を欠き、かつ必要に応じて、さらにヒスチジン残基、１つ以上のトリプトファン残基または１つ以上のチロシン残基のうちの１つ以上を欠き、かつ互いに５％以内の、分子量に対するリジン残基数の比を有する。
【０１６９】
前標識されたタンパク質標準セットの異なるタンパク質は、異なるアミノ酸で標識することができる。前標識されたタンパク質標準セットの異なるタンパク質は、標準セットのタンパク質が例えばゲル上で分離されるときに、２つ以上のタンパク質バンドを色によって特徴づけることができるように、異なる色を有する異なる色素を用いて標識することができる。標識タンパク質の１つ以上が第１の色素を用いて標識され、標識タンパク質の１つ以上が第２の色素を用いて標識されるように、または標識タンパク質の１つ以上が第１の色素を用いて標識され、標識タンパク質の１つ以上が第２の色素を用いて標識され、標識タンパク質の１つ以上が第３の色素を用いて標識されるように、または標識タンパク質の１つ以上が第１の色素を用いて標識され、標識タンパク質の１つ以上が第２の色素を用いて標識され、標識タンパク質の１つ以上が第３の色素を用いて標識され、標識タンパク質の１つ以上が第４の色素を用いて標識されるようになど、例えば、２、３、４個またはこれより多くの異なる色素を用いることができる。前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質を標識するために複数の色素が用いられる場合、このセットの１、２、３、４個またはこれより多い前標識されたタンパク質は同じ色素を用いて標識されてもよい。
【０１７０】
いくつかの態様では、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、いかなる分子量範囲にもわたることができるが、好ましい態様において、１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上まで、または１０ｋＤａ以下から１５０ｋＤａ以上まで、または５ｋＤａ以下から１５０ｋＤａ以上まで、または１０ｋＤａ以下から２００ｋＤａ以上まで、または５ｋＤａ以下から２００ｋＤａ以上まで、または１０ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上まで、または５ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたる。
【０１７１】
本発明のいくつかの局面において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、３つ以上の標識タンパク質の第１および第２のタンパク質がそのセットの第２のおよび第３のタンパク質と同じ分子量増分だけ互いと異なる、３つ以上の標識タンパク質を含む。いくつかの態様では、分子量増分（±１ｋＤａ）は、５ｋＤａの間の値の倍数、１０ｋＤａ間の値の倍数、２０ｋＤａ間の値の倍数または５０ｋＤａの倍数である。いくつかの好ましい態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、４つ以上の標識タンパク質のうちの少なくとも４つが１０ｋＤａ（±１．０ｋＤａ）の倍数だけ互いと異なる、４つ以上の標識タンパク質を含む。いくつかの好ましい態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、５つ以上の標識タンパク質のうちの少なくとも５つが１０ｋＤａの倍数だけ互いと異なる、５つ以上の標識タンパク質を含む。いくつかの好ましい態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、５つ以上の標識タンパク質の少なくとも４０％が１０ｋＤａの倍数だけ互いと異なる、５つ以上の標識タンパク質を含む。
【０１７２】
本発明の標準セットの前標識されたタンパク質は、組換え方法によって作製することができる。タンパク質標準は、細胞培養で生産することができ、１つ以上の標的核酸上での選択的な標識のために精製することができる。いくつかの態様では、タンパク質標準は、アミノ酸タグ配列（例えばタンパク質を精製するために用いることができるアミノ酸タグ）を有する。例示的なアミノ酸タグはＨｉｓタグである。組換え方法によって作製されるタンパク質は、天然に存在するタンパク質の配列に基づいていてもよく、または合成的に設計された配列を有していてもよい。
【０１７３】
いくつかの局面において、前標識されたタンパク質標準セットは、組換え方法によって作製されない１つ以上のタンパク質を含むことができる。天然源（例えば有機体、細胞または培地）から単離される前標識されたタンパク質標準セットの標識タンパク質は、例えば化学保護基の付加または化学的もしくは酵素による切断による断片化によって、酵素によりまたは化学的に改変することができるし、または改変されていなくてもよい。いくつかの局面において、前標識されたタンパク質標準セットは、少なくとも部分的には合成方法（例えば化学合成）によって作製される１つ以上のタンパク質を含むことができる。
【０１７４】
前標識されたタンパク質標準セットは、選択的に標識されていない１つ以上のタンパク質を含むことができる。選択的に標識されていない本発明の前標識されたタンパク質標準の標識タンパク質は、組換えタンパク質であってもよく、細胞、組織、有機体、生物学的試料または培地から単離されるタンパク質であってよい。タンパク質は、化学合成を使用して、完全にまたは部分的に作製することもできる。
【０１７５】
本発明は、標識タンパク質の１つ以上が第１のアミノ酸上において選択的に標識され、複数の標識タンパク質が１つ以上の溶液として提供されている、複数の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットをも包含する。好ましい態様では、溶液形態で提供されている前標識されたタンパク質標準セットは、標識タンパク質のうちの２、３、４、または５つがシステインで標識されかつリジンを欠く、少なくとも５つの標識タンパク質を含む。本発明は、標識タンパク質が１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたり、同じアクリルアミドゲルから算出されるとき５ｋＤａ以上の分子量を有する前標識されたタンパク質標準の各々の電気泳動による移動が、非標識型の同じ５つ以上のタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の５％以内にある、少なくとも１２個の標識タンパク質を含む溶液形態で提供されている前標識されたタンパク質標準セットを包含する。溶液は、１つ以上の緩衝液、還元剤、キレート剤、アルコール、界面活性剤または色素を含むことができる。
【０１７６】
天然に存在するタンパク質に由来する配列の１つ以上のコピーを含む少なくとも２つのタンパク質を含み、これらのタンパク質が第１のアミノ酸の残基を欠く、非標識タンパク質標準のセットもまた本願明細書において提供される。いくつかの好ましい態様において、非標識タンパク質標準のセットは、天然に存在するタンパク質に由来する配列の２つ以上のコピーを含む２つ以上のタンパク質を含み、この２つ以上の標識タンパク質はリジン残基を欠く。いくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準のセットは、３つ以上、４つ以上または５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、１１以上または１２以上の標識タンパク質標準を含み、そのタンパク質の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上がリジンを欠きかつ天然に存在するタンパク質に由来する配列の２つ以上のコピーを含む。この標準は、２つ、３つ、４つまたはこれより多い視覚的に識別可能な色素を用いて標識されていてもよい。この標準は、１０ｋＤａ未満から１００ｋＤａを超えるまで、または５ｋＤａ未満から２５０ｋＤａを超えるまでの分子量範囲にわたることができる。この標準は、１０ｋＤａ（±１ｋＤａ）の倍数である増分だけ異なる２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のタンパク質標準を有することができる。いくつかの態様では、リジンを欠く２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上のタンパク質において、分子量に対するシステイン残基の比には、５％を超える変化はない。いくつかの態様では、リジンを欠く２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上のタンパク質の各々は、１０ｋＤａあたり１〜１０個、２〜７個、または３〜５個のシステイン残基を有する。
【０１７７】
タンパク質の分子量を測定するための前標識された標準セットの使用方法
本発明はまた、第１のアミノ酸上において選択的に標識され、第２のアミノ酸の残基を欠失した少なくとも１つのタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準のセットの２つ以上のタンパク質標準を分離する方法をも包含する。方法のいくつかの態様において、１つ以上の選択的に標識されたタンパク質標準、この方法は、電気泳動ゲルに前標識されたタンパク質標準セットを適用する段階と、ゲル全体に電界を印加する段階と、前標識されたタンパク質標準セットの２つ以上のタンパク質標準を分離する段階とを含む。それらのバンドが重複しないように、この２つ以上のタンパク質標準は分離される。好ましい態様では、バンドが重複しないように、そして１０ｋＤａ以上の分子量を有するセットの電気泳動にかけられたタンパク質の各々のゲル上のバンドの幅に２倍を超える変化がないように、前標識された標準セットのタンパク質標準の全ては分離される。好ましい態様では、バンドが重複しないように、そして１０ｋＤａ以上の分子量を有するセットの電気泳動にかけられたタンパク質の各々のゲル上のバンドの幅に２倍を超える変化がないように、かつ１０ｋＤａ以上の分子量を有する標準セットのタンパク質のバンド強度に２．５倍を超える変化がないように、前標識された標準セットのタンパク質標準の全ては分離される。好ましい態様において、１０ｋＤａ以上の分子量を有する前標識された標準セットのタンパク質標準は、非標識型の同じタンパク質標準が移動する距離から起算して５％以内に移動する。
【０１７８】
更なる局面において、本願明細書において提供される前標識されたタンパク質標準セットを使用して１つ以上の試料タンパク質を特性解析する方法が提供される。この方法は、ゲル中で１つ以上のタンパク質および本願明細書において記載されている少なくとも１つの前標識されたタンパク質標準を電気泳動にかけることと、その１つ以上のタンパク質の移動を前標識された標準セットの少なくとも１つのタンパク質標準の移動と比較することとを含む。いくつかの好ましい態様において、この方法は、１つ以上の試料タンパク質の分子量を測定することをさらに含む。
【０１７９】
例えば、上記方法は、１つ以上のタンパク質を含む試料をゲルの第１のレーンで電気泳動にかけることと、第１のアミノ酸上において選択的に標識された少なくとも２つの標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットをゲルの第２のレーンで電気泳動にかけることと、標準の２つ以上の標識タンパク質のうちの少なくとも２つの移動距離を測定することと、１つ以上の試料タンパク質のうちの少なくとも１つの移動距離を測定することと、標準の少なくとも２つの標識タンパク質の移動距離および分子量に基づいて少なくとも１つの試料タンパク質の分子量を算出することを含む。この方法では、ポイントツーポイント較正を使用してもよく、または例えば最少二乗法を使用して移動距離対分子量（または分子量の対数）に基づいて曲線を生成することによって、移動距離を比較してもよい。
【０１８０】
好ましい態様では、バンドが重複しないように、そして１０ｋＤａ以上の分子量を有するそのセットの電気泳動にかけられたタンパク質の各々のゲル上のバンドの幅に２倍を超える変化がないように、前標識された標準セットのタンパク質標準の全ては互いから分離される。好ましい態様では、バンドが重複しないように、そして１０ｋＤａ以上の分子量を有するそのセットの電気泳動にかけられたタンパク質の各々のゲル上のバンドの幅に２倍を超える変化がないように、そして１０ｋＤａ以上の分子量を有する前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質のバンド強度に２．５倍を超える変化がないように、前標識された標準セットのタンパク質標準の全ては分離される。好ましい態様において、１０ｋＤａ以上の分子量を有する前標識された標準セットのタンパク質標準は、非標識型の同じタンパク質標準が移動する距離から起算して５％以内に移動する。
【０１８１】
前標識されたタンパク質標準キット
本発明は、記載されている前標識されたタンパク質標準セットを含み、かつ１つ以上の緩衝液、ローディング色素、還元剤、非標識タンパク質標準、ブロット膜、ゲルカセット、プレキャストゲルまたは電気泳動緩衝液の１つ以上をさらに含むキットをも包含する。キットの構成要素は、１つ以上の容器中に収容されていてもよく、キットの構成要素のうちの２つ以上は共通のパッケージ（例えば箱、ラックまたはジャー）で提供されてもよい。キットは、取扱説明書またはインターネットでキットまたはその構成要素の使用のための手順にアクセスするための説明書を含むこともできる。
【０１８２】
キットの前標識されたタンパク質標準のセットは、凍結乾燥された固体として、または液体中の溶液としてまたは冷凍された形の溶液として提供することができる。セットの１つ以上の標識されたタンパク質標準を含む溶液は、１つ以上の緩衝液、還元剤、キレート剤、アルコール、界面活性剤または色素を含むことができる。キットの前標識されたタンパク質標準のセットは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはこれより多い、２つ以上の標識された標準の１つ以上の混合物として提供される標準タンパク質を含むことができる。いくつかの態様では、前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質の全ては、キットの単一の混合物（それは、１つ以上のアリコートで提供されていてもよい）として提供される。キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットのタンパク質は、１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたることが好ましく、５ｋＤａ以下から２５０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたることができる。
【０１８３】
キットの一態様において、キットで提供される前標識された標準セットは、標識タンパク質の１つ以上が第１のアミノ酸上において選択的に標識され、タンパク質を標識するために用いる色素と反応できる第２のアミノ酸を欠く複数の標識タンパク質を含む。
【０１８４】
いくつかの好ましい態様において、キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットは少なくとも５つの標識タンパク質を含み、その標識タンパク質のうちの２つ、３つ、４つまたは５つはシステインに標識されかつリジンを欠く。本発明は、標識タンパク質が１０ｋＤａ以下から１００ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたり、同じアクリルアミドゲルから算出されるとき５ｋＤａ以上の分子量を有する前標識されたタンパク質標準の各々の電気泳動による移動が、非標識型の同じタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の５％以内にある、少なくとも１０個の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを含むキットをも包含する。本発明は、標識タンパク質が５ｋＤａ以下から２６０ｋＤａ以上までの分子量範囲にわたり、同じアクリルアミドゲルから算出されるとき５ｋＤａ以上の分子量を有する前標識されたタンパク質標準の各々の電気泳動による移動が、非標識型の同じタンパク質標準の各々の電気泳動による移動の５％以内にある、少なくとも１２個の標識タンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットを含むキットをも包含する。
【０１８５】
いくつかの態様では、キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットは、２つ以上の標識タンパク質のうちの少なくとも２つの分子量に対する第１のアミノ酸の残基の数の比が互いに５％以内、いくつかの態様では互いに２．５％以内にある、第１のアミノ酸で標識される２つ以上のタンパク質を含む。キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットのいくつかの好ましい態様において、第１のアミノ酸上において選択的に標識された少なくとも２つのタンパク質は、１０ｋＤａあたり２〜７個、または３〜５個の第１のアミノ酸の残基（例えば３．５〜４．５個の第１のアミノ酸の残基）を有する。キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットのいくつかの好ましい態様において、第１のアミノ酸上において選択的に標識されたセットの少なくとも５つのタンパク質は、１０ｋＤａあたり３〜５個の第１のアミノ酸の残基（例えば３．５〜４．５個の第１のアミノ酸の残基）を有する。いくつかの好ましい態様において、キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットは、標識タンパク質のうちの２つ、３つ、４つまたは５つがシステインで標識されかつリジンを欠き、かつその２つ、３つ、４つ、または５つの標識タンパク質が、互いに５％以内の、分子量に対するシステイン残基の比を有する、少なくとも５つの標識タンパク質を含む。これらの態様では、２つ、３つ、４つまたは５つの標識タンパク質は、１０ｋＤａあたり２〜７個または２〜５個のシステイン残基を有することができる。
【０１８６】
天然に存在するタンパク質に由来する配列の２つ以上のコピーを含む少なくとも１つの標識タンパク質を含み、この少なくとも１つの標識タンパク質がリジン残基を欠き、かつ少なくとも１つのシステイン残基で標識されている、前標識されたタンパク質標準のセットを含むキットもまた本願明細書において提供されるいくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準のセットは、天然に存在するタンパク質に由来する配列の２つ以上のコピーを含む２つ以上の標識タンパク質を含み、この２つ以上の標識タンパク質はリジン残基を欠き、かつ少なくとも１つのシステイン残基で標識されている。いくつかの好ましい態様において、前標識されたタンパク質標準のセットは、３つ以上、４つ以上または５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０個以上、１１個以上、または１２個以上の標識タンパク質標準を含み、この２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のリジンを欠くシステインで標識されたタンパク質が天然に存在するタンパク質に由来する配列の２つ以上のコピーを含む。この標準は、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの視覚的に識別可能な色素によって標識され得る。この標準は、１０ｋＤａ未満から１００ｋＤａを超えるまで、または５ｋＤａ未満から２５０ｋＤａを超えるまでの分子量範囲にわたることができる。この標準は、１０ｋＤａ（±１ｋＤａ）の倍数である増分だけ異なる２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のタンパク質標準を有することができる。好ましい態様では、このセットの前標識されたタンパク質標準の全ては、非標識型の同じタンパク質の移動から起算して５％以内に移動できる。好ましい態様において、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上のリジンを欠くｃｙｓで標識されたタンパク質において、分子量に対するシステイン残基の比には、５％を超える変化はない。好ましい態様では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上のリジンを欠くｃｙｓで標識されたタンパク質の各々は、１０ｋＤａあたり１〜１０個、２〜７個、または３〜５個のシステイン残基を有する。
【０１８７】
関連した態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは、３つ以上の標識タンパク質を含み、この３つ以上の標識タンパク質の第１および第２のタンパク質はそのセットの第２および第３のタンパク質と同じ分子量増分だけ互いと異なる。いくつかの態様では、分子量増分は、１ｋＤａまでの概数にした場合、５ｋＤａの倍数、１０ｋＤａの倍数、２０ｋＤａの倍数または５０ｋＤａの倍数である。いくつかの好ましい態様において、本発明の前標識されたタンパク質標準セットは５つ以上の標識タンパク質を含み、この５つ以上の標識タンパク質のうちの少なくとも５つは１０ｋＤａの倍数だけ互いと異なる。いくつかの好ましい態様において、キットで提供される前標識されたタンパク質標準セットは、少なくとも５つの標識タンパク質を含み、この標識タンパク質のうちの２つ、３つ、４つまたは５つはシステインで標識されかつリジンを欠き、このセットの標識タンパク質のうちの少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つは１０ｋＤａ（±１ｋＤａ）の倍数だけ分子量増分が異なる。
【０１８８】
別の局面においては、本発明は、本願明細書において開示される前標識された標準セットおよびキットのいずれかを含む前標識されたタンパク質標準のセットを顧客に提供する方法を提供する。一態様において、この方法は、標準セットの標識タンパク質の少なくとも１つが第１のアミノ酸上において選択的に標識されている前標識されたタンパク質標準セットを収入と引きかえに顧客に提供することを含む。他の態様では、この方法は、５〜１２個の標識タンパク質を含み、かつその標識タンパク質のうちの少なくとも５つがシステインで標識されかつリジン残基を欠く前標識されたタンパク質標準セットを顧客に提供することを含む。他の態様では、この方法は、標準セットの標識タンパク質のうちの２つ以上が第１のアミノ酸上において選択的に標識されており、この２つ以上の選択的に標識されたタンパク質のうちの少なくとも２つが分子量に対する第１のアミノ酸の一定の比を有する前標識されたタンパク質標準セットを、収入と引きかえに顧客に提供することを含む。他の態様では、この方法は、前標識されたタンパク質セットが５〜１２個の標識タンパク質を含み、この標識タンパク質のうちの少なくとも５つがシステインで標識されかつリジン残基を欠き、かつこの少なくとも５つの標識タンパク質が、分子量に対するシステイン残基について同じ比を有する、前標識されたタンパク質標準を顧客に提供することを含む。他の態様では、この方法は、１２以上の標識タンパク質を含み、５ｋＤａ以上の分子量を有する標識タンパク質標準の各々の移動が、同じアクリルアミドゲル上の非標識型のその５つ以上のタンパク質標準の各々の移動の５％以内にある、前標識されたタンパク質標準セットを、収入と引きかえに顧客に提供することを含む。他の態様では、この方法は、１２個の標識タンパク質を含み、その１２個の標識タンパク質のうちの少なくとも５つがシステインで標識されかつリジン残基を欠き、かつこの１２個の標識タンパク質標準の各々の電気泳動による移動が同じアクリルアミドゲル上の非標識型の同じタンパク質標準の電気泳動による移動と同じである、前標識されたタンパク質標準セットを顧客に提供することを含む。
【０１８９】
以下の実施例は、本発明を実証することを意図しており、本発明を限定することは意図していない。
【０１９０】
実施例１：鮮明な分子量マーカーの発現プラスミド：３０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび５０ｋＤａのタンパク質
３０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび５０ｋＤａのタンパク質についての発現プラスミドを、６つの直列型の大腸菌のチオレドキシン（Ｔｈｉｏ）セグメントからなる合成的に誘導したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｐＴｒｃＢＨ  ６０ｋｄ構築物を使用して作製した。ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、米国、ワシントン州）と、最適タンパク質−色素標識を可能にするであろう仕様に従って１５９５ｂｐ  ＯＲＦを合成するように契約した。
【０１９１】
図１Ａは、１）カルボキシ末端から２３アミノ酸が除去されている、２）最後のＴｈｉｏ（８６番目）コドン位置でｖａｌの代わりにｇｌｕで置換している、そして３）６つのＣ末端ヒスチジンをＣ末端に加えた、という特徴を有するクローンｐＴｒｘｆｕｓｐｒｌ１０Ａ（参照によりその全体が本願明細書に組み入れられる米国特許第６，７０３，４８４号を参照）の短縮されたチオレドキシンＯＲＦを、４つのシステイン（Ｃ）アミノ酸を含みリジン（Ｋ）アミノ酸を含まないように改変したＴｈｉｏ  ＯＲＦ（図１Ｂの最上列）と共に並べる。２つの更なるシステインを、位置２および１２のセリン残基（Ｓ）のコドン改変によってＯＲＦに加えた。リジンよりもシステインに色素分子が結合しやすいように、全７つのリジン（Ｋ）アミノ酸を、位置４、１９、５２、７０、８３のアルギニン（Ｒ）および位置３６のメチオニン（Ｍ）に変更した。位置３５および３７のシステインおよびメチオニンをアルギニンおよびシステインで置き換え、システイン残基間の距離を大きくし、位置３４および３７のシステイン残基と結合する２つの色素分子により生成される潜在的立体障害を最小化した。位置２３および４５のイソロイシンを、タンパク質の予測される疎水性を減少させるためにアルギニンに変更した。
【０１９２】
２７９ｂｐのＴｈｉｏ  ＯＲＦを、最終産物の分子量必要条件を満たすように短縮した。６つのＴｈｉｏ反復構築物（ｒｅｐｅａｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を作製する上で、ｐＴｒｃＢＨ  ６０ｋｄの６つのＴｈｉｏ反復のうちの１番目のものを２０８ｂｐに設定し（７．７ｋｄの翻訳産物を提供する）、残りの５つの同一の反復を２５８ｂｐに設定した（各々、９．８ｋｄの翻訳産物を提供する）。構築物が完全に集められたときに、ほぼ１８番目のアミノ酸ごとの第３の塩基コドンは反復を最小化するために揺らぎを許容した。
【０１９３】
図２Ａの略図で示すように、６つの集められたＴｈｉｏ反復を、５つのユニークな制限部位によって分離した。６つのＴｈｉｏ反復ＯＲＦの５’末端はＢｇｌＩＩ部位を含み、３’末端は５つのユニークな制限部位を含み、１０個のＨＩＳ配列が続き、ＰｍｅＩ部位でキャップされている。この設計は、ＢａｍＨＩおよびＰｍｅＩ制限部位を使用してこのＯＲＦ（ＢＨ６量体  ＯＲＦ（配列番号１３、図２Ｂ）と呼ばれる）をｐＴｒｃ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）へとサブクローニングし、ほぼ６０ｋｄの翻訳産物を作製することができる発現プラスミドを作製することを可能にし、加えてこれはより短い構築物を作製するためにそれを再クローン化する前に５つのユニークな制限部位酵素のうちのどれを用いてプラスミドを消化するかに応じて、同じベクターからほぼ１０ｋｄ、２０ｋｄ、３０ｋｄ、４０ｋｄ、または５０ｋｄの翻訳産物を合成するための発現プラスミドを生成できるという柔軟性をも備えていた。
【０１９４】
図３Ａは、より低分子量のｐＴｒｃ  ＢＨ  ３０ｋＤａ構築物（図４Ａに示す）、ｐＴｒｃ  ＢＨ  ４０ｋＤａ構築物（図５Ａに示す）、およびｐＴｒｃ  ＢＨ  ５０ｋＤａ構築物（図６Ａに示す）を生成するために使用したｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋＤａクローニング構築物のマップを示す。
【０１９５】
ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの配列検査されたＴｈｉｏ反復ＯＲＦ挿入断片（ＢＨ６量体  ＯＲＦ）（図２Ｂ、配列番号１３）を、ＰｍｅＩ、続いてＢｇｌＩＩを使用した逐次的な消化によって、それらのｐＵＣ−マイナスクローニングベクターから切り取った。６つのＴｈｉｏ挿入断片（１５９５ｂｐ）をゲル精製し、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ（商標）樹脂ミニカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて溶出し、室温で１０分間の１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、改変したｐＴｒｃ  ＬａｃＺ−Ｆｌａｓｈベクターにライゲーションした。
【０１９６】
ｐＴｒｃ  ＬａｃＺ−Ｆｌａｓｈ発現ベクターは、Ｃ末端ｌｕｍｉｏ配列および１０個のｈｉｓタグを有するＬａｃＺ  ＯＲＦ、ｔｒｐ／ｌａｃ誘導プロモーターおよび大腸菌で真核生物遺伝子の発現を強化するための配列を含む。それを、ＢＨ６量体  ＯＲＦのインフレーム翻訳を可能にするために、１つのＮｃｏＩ部位を削除するように制限消化およびライゲーションによって、変異させた。改変したｐＴｒｃ発現ベクターを、ＢａｍＨＩおよびＰｍｅＩで消化し、４２８５ｂｐベクター断片をゲル精製した。
【０１９７】
ＢＨ６量体  ＯＲＦを消化したｐＴｒｃベクター骨格にＢａｍＨＩ−ＰｍｅＩによってライゲーションし、図２Ａに示す挿入断片を有するｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋｄ発現構築物を生成した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを使用した制限消化スクリーニングによって陽性クローンを同定し、ＢＬ２１  ＤＥ３  ＳＴＡＲのタンパク質発現スクリーニングは制限消化結果を実証した。
【０１９８】
この構築物のＤＮＡ塩基配列決定で決定したｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋｄのタンパク質のアミノ酸組成は、バリン（Ｖ）残基がＣ末端の１０個のＨＩＳ配列をキャップしていることを示した（図３Ｂ、配列番号１４）。バリンでキャップされたＨＩＳ配列は、ＰｍｅＩ部位内のｐＴｒｃ  ＬａｃＺ−Ｆｌａｓｈベクターに由来した。１０個のＨＩＳタグの末端のこのバリンの存在は、合成したタンパク質のＮｉ−ＮＴＡ精製に影響を及ぼさなかった。
【０１９９】
更なるｐＴｒｃ  ＢＨ発現クローンを、図２Ａに示す５つのユニークな部位のうちの１つを使用して制限消化によって得た。ｐＴｒｃ  ＢＨ  ３０ｋｄのマップ、および挿入断片によってコードされる３０ｋＤａ  ＯＲＦの配列（配列番号１５）を図４に示す。ｐＴｒｃ  ＢＨ  ４０ｋｄのマップ、および挿入断片によってコードされる４０ｋＤａ  ＯＲＦの配列（配列番号１６）を図５に示す。ｐＴｒｃ  ＢＨ  ５０ｋｄのマップ、および挿入断片によってコードされる５０ｋＤａ  ＯＲＦの配列（配列番号１７）を図６に示す。クローンをコロニーＰＣＲでスクリーニングし、以下のプライマー
2009544974.tif 000003
および
2009544974.tif 000004
を使用して陽性発現構築物を同定した。ＢＬ２１  ＤＥ３  ＳＴＡＲでのタンパク質発現スクリーニングを行い、ＰＣＲスクリーニングの結果が正しいことを確認した。
【０２００】
実施例２：鮮明な分子量マーカーの発現プラスミド：１１０ｋｄ、１６０ｋｄおよび２６０ｋｄのタンパク質
１０ｋｄあたり４個のｃｙｓ残基および０個のｌｙｓ残基を含むＢＨ６量体  ＯＲＦの多量体を含む１００ｋｄ、１５０ｋｄおよび２５０ｋｄのタンパク質をコードする発現構築物を、ＰＣＲによって生成した実施例１のｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋＤａの発現構築物の挿入断片を使用して作製した。
【０２０１】
５０ｋｄのＰＣＲ挿入断片（１３１４ｂｐ）の合成
実施例１のｐＴｒｃ  ＢＨ  ６０ｋＤａの発現構築物をＰＣＲテンプレートとして使用して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ−Ｄ熱安定性ポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体、６６ｍＭトリス−ＳＯ４（ｐＨ８．９）、１９．８ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２．４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２２０μＭ  ｄＮＴＰ、および安定剤、ならびに以下のプライマーセット
2009544974.tif 000005
を含むＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を使用して、いくつかの５０ｋＤａの挿入断片を生成した。
【０２０２】
１３１４ｂｐ挿入断片（５０ｋＤａ）を、１．２％Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）でゲル精製した。ＰＣＲ挿入断片を、製造業者の指示書を使用してｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）にＴＡクローン化した。プライマー設計により、各５０ｋｄのＴＡクローンが表２に示すようなベクター構築を容易にするユニークな配列末端を有することが可能になった。
【０２０３】
（表２）高分子量マーカー構築物のために使用した５０ｋｄの挿入断片
2009544974.tif 000006
【０２０４】
白色コロニーを、クローニングにおいて使用する特異的なプライマーセットを使用するコロニーＰＣＲスクリーニングのために選択した。クローン５０．２＿Ｂ３の５０．２挿入断片、クローン５０．３＿Ｃ１４の５０．３挿入断片、クローン５０．４−１０ＨＩＳ−ＰｍｅＩ＿Ｃ４の５０．４挿入断片のＴＡ挿入断片、およびＭＭ  ５０ｋｄクローンのＭＭ  ５０ｋｄ挿入断片の配列を、表３のプライマーを使用して確認した。
【０２０５】
（表３）５０ｋｄの挿入断片を確認するために使用した塩基配列決定プライマー
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【０２０６】
配列が決定されたクローンの全ては、配列番号３７（図７）の同一の５０ｋｄをコードする１３１４ｂｐ配列を含んでいた。
【０２０７】
ｐＴｒｃ  ５０ｋＤａ基本ベクター、およびｐＴｒｃ  １１０ｋＤａ発現ベクター、ｐＴｒｃ  １６０ｋＤａ発現ベクターおよびｐＴｒｃ  ２６０ｋＤ発現ベクターのアセンブリ
ｐＴｒｃ  ５０ｋＤａ基本ベクター
ＴＡクローン５０．１＿クローン  ２ＤをＢｇＬＩＩおよびＮｏｔＩ（ｐＣＲ２．１ベクターに由来する部位）により消化し、５０ｋＤａの挿入断片を除去した。その断片をゲル精製した。改変したｐＴｒｃ  ＬａｃＺ−ＦｌａｓｈベクターをＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩで消化し、ゲル精製したベクター（４３７７ｂｐ）をＴＡ  ５０．１＿２Ｄ挿入断片にライゲーションした。
【０２０８】
陽性クローンを、５０．１順方向プライマー（配列番号２０）および５０．１逆方向プライマー（配列番号２１）を使用してコロニーＰＣＲにより同定した。このクローン（標識されたｐＴｒｃ  ５０．１  Ｄ３）は、ｐＴｒｃ  １１０ｋＤａ発現ベクター、ｐＴｒｃ  １６０ｋＤａ発現ベクター、およびｐＴｒｃ  ２６０ｋＤａ発現ベクターの構築のための次のサブクローニングにおいて使用する基本構築物であった。
【０２０９】
ｐＴｒｃ  １１０ｋｄ発現ベクター
ＴＡクローン５０．２−１０ＨＩＳ−ＰｍｅＩクローンＢ６を、ＸｈｏＩおよびＰｍｅＩにより消化した。ゲル精製した挿入断片を、同様にＸｈｏＩおよびＰｍｅＩにより消化しておいたｐＴｒｃ  ５０．１  Ｄ３にサブクローン化した。ＸｈｏＩおよびＰｍｅＩによる制限消化スクリーニングによって、タンパク質発現スクリーニングによって後で確認した陽性クローンを同定した。
【０２１０】
発現されたタンパク質は、予想される１００ｋＤａより１１０ｋＤａに近い分子量を有していた。この断片の調製において、推定５０ｋＤａのサブクローン化断片（第１または第２）の１つが５０ｋＤａ  Ｔｈｉｏ反復断片ではなく６０ｋＤａ  Ｔｈｉｏ反復断片であったと考えられる。発現されたタンパク質の実際の分子量の質量分析で、予想値よりそれが１０ｋＤａ大きいことが明らかとなった（表４）。発現クローンは、標識されたｐＴｒｃ  ５０．１−２  Ｐｍｅ、クローン  Ｂ６−９であり、これをｐＴｒｃ  １１０ｋｄ（図８Ａ）と新たに名付けた。挿入断片の配列は、直接決定しなかった。クローン化した断片に基づいて予測した配列を、図８Ｂに配列番号３８として提供する。
【０２１１】
ｐＴｒｃ  １６０ｋｄ発現ベクター
ＴＡクローン５０．２クローンＢ３をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ（ｐＣＲ２．１に由来する部位）により消化し、５０ｋＤａの挿入断片を除去した。ｐＴｒｃ  ５０．１  Ｄ３ベクターをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩにより消化し、ゲル精製したベクターを５０．２＿Ｂ３のゲル精製した挿入断片にライゲーションした。陽性クローンを、ＸｈｏＩ−ＡｖｒＩＩを使用する制限消化スクリーニングにより同定し、それは標識されたｐＴｒｃ１−２  Ｃ６であった。
【０２１２】
２つの５０ｋｄ挿入断片を含むこのｐＴｒｃ１−２  Ｃ６ベクターを、ＡｖｒＩＩおよびＰｍｅＩにより消化した。ゲル精製したベクターを、ＡｖｒＩＩおよびＰｍｅＩにより消化しておいたＴＡクローン５０．３−ＨＩＳ−ＰｍｅＩ挿入断片にライゲーションし、ゲル精製した。陽性クローンを、ＡｖｒＩＩ−ＰｍｅＩを使用する制限消化スクリーニングにより同定し、後でタンパク質発現スクリーニングによって確認した。この場合、発現されたタンパク質は、予想した１５０ｋＤａよりも１６０ｋＤａに近い分子量を有した。断片調製において、推定５０ｋＤａのサブクローン化断片のうちの１つが５０ｋＤａのＴｈｉｏ反復断片ではなく６０ｋＤａのＴｈｉｏ反復断片であったと考えられる。発現されたタンパク質の実際の分子量の質量分析で、予想値より、それが１０ｋＤａ大きいことが分かった（表４）。この発現クローンは、標識されたｐＴｒｃ１，２，３  Ｐｍｅであり、これをｐＴｒｃ  １６０ｋｄと新たに名付けた（図９Ａ）。挿入断片の配列は、直接決定しなかった。クローン化した断片に基づいて予測した配列を、図９Ｂに配列番号３９として提供する。
【０２１３】
ｐＴｒｃ  ２６０ｋｄ発現ベクター
２６０ｋＤａタンパク質発現ベクター、ｐＴｒｃ  １６０＋ＬａｃＺも構築した。１６０ｋＤａタンパク質構築物（図９）におけるｐＴｒｃ  ５０ｋＤａ  Ｔｈｉｏ反復断片２とＴｈｉｏ反復断片３との間に存在するユニークな制限部位（ＡｖｒＩＩ）を使用して、１００ｋＤａのポリペプチドをコードする短縮されたＬａｃＺ遺伝子（配列番号４０、図１０）をＡｖｒＩＩ部位にクローン化した。
【０２１４】
２６０ｋＤａのタンパク質は、２５３，６２４ダルトンの推定質量を有していた。このタンパク質は、７３個のシステインアミノ酸および１９個のリジンアミノ酸を含んでいた。挿入断片の配列は、直接決定しなかった。クローン化した断片に基づいて予測した配列を、図１１Ｂに配列番号４１として提供する。
【０２１５】
ＬａｃＺ遺伝子を、ＡｖｒＩＩ制限部位でキャップされたプライマーを使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）によって生成した。生成したＰＣＲ産物を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド、米国）を使用して、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド、米国）にＴｏｐｏクローン化した。
【０２１６】
短縮されたＬａｃＺ  ＯＲＦを、ＡｖｒＩＩ消化を用いてクローニングベクターから切除し、断片をゲル精製した。ｐＴｒｃ  １６０ｋＤａ構築物をＡｖｒＩＩを用いて線状化し、ゲル精製した。
【０２１７】
短縮されたＬａｃＺ挿入断片を、非アルカリホスファターゼ処理のｐＴｒｃ  １６０ｋＤａベクターにライゲーションした。ライゲーション反応を、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０コンピテント細菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド、米国）に形質転換し、生成したコロニーをＬａｃＺ遺伝子についてＰＣＲスクリーニングにかけた。ＰＣＲコロニースクリーニングは、ＬａｃＺ挿入断片を含んでいる１１／８０クローンを同定し、発現スクリーニングは正しい配向でＬａｃＺ挿入断片を有する５／１１クローンを同定した。ＢＬ  ２１  ＤＥ３におけるｐＴｒｃ  １６０＋ＬａｃＺクローンＢ１を、１．０ＬのＢＲＭ−Ａｍｐ中で、３０℃で１８時間発現させ（誘導なし）、発現パフォーマンスを検査した。このクローンを、後でｐＴｒｃ  ２６０ｋＤａと名付けた（図１１Ａ）。
【０２１８】
タンパク質の発現について試験するために、発現プラスミドをコンピテントなＢＬ２１−ＤＥ３細胞に形質転換した。この細胞を、３７℃で１００μｇ／ｍｌアンピシリンを有するＬＢ培地で増殖させた。ＯＤ６００が０．４〜０．６に達したとき、ＩＰＴＧを１ｍＭまで加え、細胞を３７℃でさらに４〜６時間インキュベーションした。
【０２１９】
発現期間の後、１ｍｌの細胞培養物を５０００×ｇで５分間遠心分離した。液体画分を棄て、２５μｇ／ｍｌのリゾチームと共に１００μｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国、ウィスコンシン州、マディソン）をこの細胞に加えた。試料をボルテックスにかけて細胞を再懸濁させ、室温で１０分間インキュベーションした。５０μｌの溶解物を別々のチューブに移した。溶解する細菌試料のさらに５０μｌを１０，０００×ｇで５分間遠心分離した。液体画分を棄て、ペレット（不溶性画分）を５０μｌの１×ＬＤＳ試料緩衝液に再懸濁させた。
【０２２０】
５μｌの４×ＬＤＳおよび２μｌのＮｕＰＡＧＥ還元試薬を、１５μｌの溶解物全体、および１５μｌの不溶性画分に加えた。試料を７０℃で１０分間インキュベーションした。各試料の１０μｌを４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上に充填し、３７分間、２００Ｖで、１×ＭＥＳ泳動緩衝液を用いて泳動した。このゲルを、マイクロ波手順を使用してＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎタンパク質染色剤で染色し、発現されたタンパク質を視覚化した。
【０２２１】
実施例３：組換えタンパク質の生成
以下の手順を、分子量標準として使用するための組換えタンパク質の生成のために用いた。
【０２２２】
３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび１１０ｋＤａ（リジンなし（ＮＬ））タンパク質
試薬
・ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国、ウィスコンシン州、マディソン）
・超純水中で新たに調製した２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム
・誘導された５０ｍｌの細胞培養物（リッチ培地［２４ｇ／Ｌの酵母エキス、１２ｇ／Ｌのトリプトン、０．０５％のブドウ糖、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ（ＮＨ４）２−ＳＯ４および１％のグリセロール］を含み、そのＯ．Ｄ．が０．５に到達した後、ラクトースを１ｍＭまで加え、培養物を３２℃または３７℃の温度で、または３０℃という低温で一晩インキュベーションした。）
【０２２３】
大規模な培養物は、空気を吹き込んだ７Ｌの発酵装置（例えばＡｐｐｌｉｋｏｎ発酵装置）で増殖させることができる。ほぼ１リットルのリッチ培地を有する２．８Ｌの非バッフル型の播種フラスコに発現プラスミドを含んでいる新たに形質転換した（１週齢未満）コロニーを接種することによって、タンパク質分子量標準を大量に生産した。（リッチ培地１リットルにつき：１２グラムのトリプトン、最終的に１リットル体積まで蒸留水に溶解した２４グラムの酵母エキスをオートクレーブ処理し、ほぼ３０℃に冷却した後に、１０ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのアンピシリン、５０ｍｌの２０×ＮＰＳ、１０ｍｌの５０５２溶液および１Ｍ硫酸マグネシウム１ｍｌを加える。２０×ＮＰＳを、蒸留水１リットルにつき６６ｇの硫酸アンモニウム、１３６ｇのリン酸カリウム（一塩基）、および１４２ｇのリン酸カリウム（二塩基）を加えることによって作製する。５０５２溶液を、蒸留水１リットルにつき５００グラムのグリセロールおよび５０グラムのブドウ糖を加えることによって作製する。２０×ＮＰＳおよび５０５２溶液は、ミクロンフィルターを使用して濾過滅菌する。）ＯＤが１．０〜３．０の間になるまで（ほぼ７〜９時間）、播種フラスコを３０℃で撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）インキュベーションする。
【０２２４】
次に、１５０ｍｌの播種フラスコ培養物を、種培養に関して作製した５リットルのリッチ培地を含む７リットルの発酵装置へ移す。発酵装置を１．２５ｌｐｍの空気、５００ｒｐｍの撹拌という通気パラメータでインキュベーションし、ＫＯＨまたは５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を用いてｐＨを６．８に制御する。インキュベーションは、３０℃でほぼ１．５〜２時間であるか、またはＯＤが０．５〜１に達するまでである。この時点で、ラクトースを０．０５％〜０．５％の間の最終濃度まで培養物に加える。例えば、５０ｍｌの２０％ラクトースの溶液を、０．２％のラクトースの最終濃度のために５Ｌの培養物に加える。
【０２２５】
２つの連続的な１時間ごとの読み取り値が０．５未満のＯＤ変化を示すときに、細胞を初期の静止期で採取する。これは、通常、接種の１４〜１７時間後に発生する。最終的なＯＤは、通常１０以上である。
【０２２６】
タンパク質の単離
・８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝７．８
・Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂
・８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝６
・８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝４
・１０Ｎ  ＮａＯＨ
【０２２７】
材料および装置
・５０ｍｌの遠心分離管
・１０，０００×ｇの力を得ることができる遠心分離機
【０２２８】
タンパク質の抽出
・５０ｍｌの細胞培養を、１０分間の５０００×ｇで遠心分離する。
・細胞培地を棄て、５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム２５μｌを含んでいる２．５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国、ウィスコンシン州、マディソン）を細胞ペーストに加える。
・室温で３０分間断続的にボルテックスにかけることによって、細胞を溶解試薬に再懸濁させる。
・溶解した試料を、８，０００×ｇで１０分間遠心分離する。
・可溶性画分を棄てる。
・４ｍｌの８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝７．８をペレットに加える。
・試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけ、ペレットを分散させ、その直後にＰｏｌｙｔｒｏｎミキサーを使用して混合する。
・Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いた混合後に試料が透明に見えれば、遠心分離を行う。透明でない場合は、試料を７０℃で５分間加温してタンパク質の可溶化を容易にしたのち、遠心分離を行う。
・試料を室温まで放冷する。
・試料を、５，０００×ｇで５分間遠心分離し細胞片をペレット化する。
【０２２９】
ＮＴＡ精製
可溶化したタンパク質を、８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝７．８中で平衡化させた１０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに充填する。カラムをスタンドに取り付け、液体をカラムから排出させる。このカラムをキャップで栓をし、８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝７．８の４ｍｌをカラムに加える。カラムを、シェーカーで２分間インキュベーションし、その後洗浄液をカラムから排液する。ｐＨ７．８での洗浄プロセスを、さらに１回繰り返す。８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝６の４ｍｌをカラムに加え、カラムをシェーカー上で２分間インキュベーションする。洗浄溶液を廃棄し、ｐＨ６での洗浄プロセスをさらに１回繰り返す。結合したタンパク質を、カラムの頂部から８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝４の５ｍｌを加えて溶出し、１ｍｌの画分を集めた。集めた画分を、電気泳動により分析する。精製したタンパク質を有する画分を一緒に保存し、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．５〜８に調整する。
【０２３０】
タンパク質の濃縮
１４ｍｌの６０％ＴＣＡを、Ｎｉ−ＮＴＡ精製から得た３０ｍｌのタンパク質溶液に加え、よく混合した。ＴＣＡを加えたタンパク質溶液を、４℃で１〜２時間インキュベーションし、次いで４℃で１０分間８，０００×ｇで遠心分離する。液体を棄て、３０ｍｌの超高純度のＨ２Ｏを加え、よく混合する。タンパク質を８０００×ｇで１０分間遠心分離し、タンパク質ペレットを廃棄しないように注意しながら液体を廃棄する。Ｈ２Ｏ洗浄を繰り返し、３００μｌの５０ｍＭトリス、１％ＳＤＳ  ｐＨ＝８をペレットに加える。タンパク質を、必要に応じて７０℃で１０〜１５分間加熱し、ボルテックスにかけてタンパク質を再溶解させる。
【０２３１】
１６０ｋＤａおよび２６０ｋＤａの精製
試薬：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国、インディアナ州、インディアナポリス）、新たに調製した超純水中の２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび１１０ｋＤａ（ＮＬ）のタンパク質に関する誘導された細胞培養物、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＭＢ−１５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ｃｈｅｌａｔｅ  ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本、東京）、ＣＨＡＰＳ界面活性剤、尿素、１Ｍ  Ｎａ−リン酸塩  ｐＨ＝７．８、イミダゾール、５Ｍ  ＨＣｌ、塩化コバルト（ＩＩ）。
【０２３２】
溶液の調製
調整溶液：８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、０．５％ＣＨＡＰＳ  ｐＨ＝７．８（２リットル）
９６０ｇの尿素を水に可溶化させる。１０ｇ／リットルのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ混合床樹脂を用いて２時間以上、脱イオン化する。体積を２リットルに調整する。０．２μｍまたは０．４μｍフィルターで濾過する。４０ｍｌの１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ＝７．８を加える。１０グラムのＣＨＡＰＳを加えて、可溶化されるまで混合する。
【０２３３】
溶出緩衝液：８Ｍ尿素、２００ｍＭイミダゾール、０．５％ＣＨＡＰＳ  ｐＨ＝７．８
９６０ｇの尿素を水に可溶化する。１０ｇ／リットルのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ混合床樹脂を用いて２時間以上、脱イオン化する。体積を２リットルに調整する。０．２μｍまたは０．４μｍフィルターで濾過する。２７グラムのイミダゾールを加える。５Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ７．８〜８まで滴定する。１０グラムのＣＨＡＰＳを加えて、可溶化されるまで混合する。
【０２３４】
タンパク質の抽出は、以下の通りに行う：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国、インディアナ州、インディアナポリス）と共に１０ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国、ウィスコンシン州、マディソン）を、１ｇの細胞ペーストごとに加える。阻害剤１錠剤を、溶液５０ｍｌごとに使用する。２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム４０μｌを、１グラムのペーストごとに加える。ボルテックスにかけることによって、細胞を溶解試薬に再懸濁させる。溶解を、シェーカーまたは回転ミキサー上で室温で１時間行う。溶解した試料を、８，０００×ｇで１０分間遠心分離する。可溶性画分を棄てる。細胞ペースト１グラムごとに５ｍｌのカラム調整溶液（８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、０．５％ＣＨＡＰＳ  ｐＨ＝７．８）を加える。ペレットを破砕するために細胞ペーストを１０〜２０秒間ボルテックスにかけ、ペーストを直ちにＰｏｌｙｔｒｏｎを用いて混合する。試料を８，０００×ｇで１０分間遠心分離し、あらゆる不溶性粒子を除去する。可溶化された画分を、ＨＩＳ精製のために保持する。溶解物を調製するのと同じ日に、精製を実行しなければならない。
【０２３５】
ＨＩＳ精製は以下のように行う：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、日本、東京）に塩化コバルト（ＩＩ）を充填する。樹脂を広範囲にわたって洗浄し、あらゆる未結合のコバルトを除去する。水で洗浄した後は、カラムは淡いピンクの色でなければならない。カラム調整溶液（８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸、０．５％ＣＨＡＰＳ  ｐＨ＝７．８）を用いてカラムを広範囲にわたって洗浄する。試料を、カラムに充填する（約２０ｍｌの試料を、１００ｍｌのカラム床体積に加えることができる）。流量を止め、カラムを室温で１時間インキュベーションする。ＵＶ２８０ｎｍの信号がベースラインに到達するまで、カラム調整溶液を用いてカラムを洗浄する。タンパク質を、溶出緩衝液（８Ｍ尿素、２００ｍＭイミダゾール、０．５％ＣＨＡＰＳ  ｐＨ＝７．８）により溶出する。
【０２３６】
緩衝液交換のために、試料体積に対して１０倍のカラム体積を有するＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６カラムを調製する。このカラムを、５０ｍＭトリス、１％ＳＤＳ  ｐＨ＝８で平衡化させる。２０％ＳＤＳを、１％の最終濃度まで試料に混合する。試料をカラムに通し、画分を２８０ｎｍでの検出を使用してモニタリングする。第１のピークを、タンパク質ピークとして集める。このタンパク質を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、２〜３ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。
【０２３７】
タンパク質の定量
溶液の全タンパク質濃度を測定する場合、混在するバンドはタンパク質濃度の正確な評価を妨げる可能性がある。従って、ゲルベースのタンパク質定量方法が、分子量標準タンパク質にとって好ましい。
【０２３８】
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国、イリノイ州、ロックフォード）から入手した２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準液を、電気泳動ゲル上のバンド強度を比較するために用いる。２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液の１μｌを、２５μｌの４×ＬＤＳ試料緩衝液、６４μｌの水および１０μｌのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）に加える。濃縮した分子量標準タンパク質１μｌを含む試料を同じ方法で調製し、両方の試料を７０℃で１０分間インキュベーションする。ＢＳＡ標準および分子量標準タンパク質（各々５μｌ）を、電気泳動ゲルに並べて泳動する。各標識タンパク質試料の５μｌをＢＳＡ標準のレーンの間に充填して、複数の標準を同じゲルで比較することが好ましい。試料濃度を視覚的に測定するか、または定量ソフトウェアを備えたＡｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒ  ３０００（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、米国、カリフォルニア州、サンリアンドロ）を使用して測定する。
【０２３９】
実施例５：インスリンｂ鎖の精製
ウシインスリンは、２つのポリペプチド鎖からなる：ペプチドインスリンＢ鎖：理論的なｐＩ：６．９０／Ｍｗ（平均質量）：３３９９．９３；およびペプチドインスリン  Ａ鎖：理論的なｐＩ：３．７９／Ｍｗ（平均質量）：２３３９．６５。変性条件でのウシ膵臓インスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、ミズーリ州、セントルイス）の還元、次いでイオン交換カラム上でのｂ鎖の分離により、ウシインスリンｂ鎖を精製した。
【０２４０】
精製のために使用した方法は以下の通りであった：インスリンを８Ｍ尿素、５０ｍＭトリスｐＨ＝８に５ｍｇ／ｍｌで可溶化した。溶液１ｍｌごとに４００ｍＭトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）を１０μｌ（４ｍＭの最終濃度まで）加えた。溶液を、時々ボルテックスにかけながら７０℃で５分間加熱した。溶液は透明になり、室温に冷却した。試料を、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ＝５．３中の８Ｍ尿素で平衡化させたＤＥＡＥイオン交換カラムに充填した。カラムを、１０分間、５０ｍＭの酢酸ナトリウム  ｐＨ＝５．３中の８Ｍ尿素で洗浄した。ｂ鎖を洗浄緩衝液で溶出した。画分を集めた（ＵＶ検出器を使用して、２８０ｎｍでモニタリングした）。結合したａ鎖を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝５．３中の８Ｍ尿素を用いて溶出した。
【０２４１】
精製したｂ鎖を、２０％の最終濃度へ６０％のＴＣＡを加えることによって沈殿させた。−２０℃で３０分間インキュベーションした後、ｂ鎖調製物を１０，０００×ｇで遠心分離し、タンパク質を集めた。ＴＣＡ上清を取り除き、沈殿物を２０００×ｇで１０秒間再び回転させ、管壁からのＴＣＡ液滴を集めた。残留する液体を除去し、タンパク質ペレットを５０ｍＭトリス、１％ＳＤＳ  ｐＨ＝８に高濃度（例えば、４ｍｇ／ｍｌ以上）で再溶解化させた。ｐＨが７．５〜８未満である場合、ＮａＯＨによりｐＨを調整した。
【０２４２】
インスリンの定量
５０ｍＭトリス、１％ＳＤＳ  ｐＨ＝８の溶液を用いてゼロ点調整した後、２８０ｎｍで吸光度を測定することによりインスリンの濃度を測定した。インスリンｂ鎖は、（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓツールによれば）１ｍｇ／ｍｌの濃度で０．９１３の理論的吸光度を有する。希釈率を考慮して、タンパク質溶液の実際の吸光度を１ｍｇ／ｍｌの溶液の吸光度で除算することによって、濃度を測定することができる。Ｃ＝ＡｘＤ／０．９１３（式中、Ｃは濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、Ａは２８０ｎｍの吸光度であり、Ｄは希釈率である）。
【０２４３】
実施例６：未染色マーカーのタンパク質アルキル化
インスリンｂ鎖
アルキル化は、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で行う。１０ｍｇ／ｍｌのインスリンｂ鎖１００μｌを、５０ｍＭトリスｐＨ＝８、０．５％ＳＤＳの最終濃度を有する溶液中で１ｍｌの体積に希釈する。イソプロパノール中の４００ｍＭトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）１０μｌをタンパク質試料に加え、この混合物を１０〜１５秒間ボルテックスにかけた。試料を、７０℃で１０分間インキュベーションし、次いで室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却した。超純水中の１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、この試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、次いで暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２４４】
１０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準
１０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質マーカーは、大腸菌のチオレドキシンからのアミノ酸１〜８５を含み、８６番目のアミノ酸位置のアミノ酸のバリンおよび位置８７〜９２のヒスチジン残基をグルタミン酸で置換した、組換え技術によって発現された短縮された大腸菌チオレドキシンタンパク質である（Ｔｒｘｆｕｓｐｒｌ１０Ａ、参照によって全体が本願明細書に組み入れられる米国特許第６，７０３，４８４号の図３を参照）。１０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）原液（ＯＤ＝８．３）１００μｌを、５０ｍＭトリスｐＨ＝８および０．５％のＳＤＳの最終濃度を有する１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけ、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。試料を室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却し、１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２４５】
リゾチーム
リゾチームを、１５ｋＤａ分子量マーカーとして使用した。水中の１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）溶液１００μｌを、５０ｍＭトリスｐＨ＝８および０．５％ＳＤＳの最終濃度を有する１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけ、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。試料を室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却し、５．５μｌの（蒸留した）４−ビニルピリジンを加え、この試料をボルテックスにかけて４−ビニルピリジンを可溶化し、次いで暗所で室温で１時間インキュベーションした。
【０２４６】
２０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準
２０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準は、（参照によりその全体が本願明細書に組み入れられる米国特許第６，７０３，４８４号に開示されたように）大腸菌ＤＥＡＤボックスタンパク質の５ｋＤａの断片の２つのコピーに融合する短縮されたチオレドキシン断片を含む。２０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）原液（ＯＤ＝８．２）１００μｌを、５０ｍＭトリスｐＨ＝８および０．５％ＳＤＳの最終濃度を有する１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけ、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。試料を室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却し、１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２４７】
３０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
リジンを有しない３０ｋＤａタンパク質（３０ｋＤａ  ＮＬ）を、実施例１および実施例３において提供した発現構築物から生成した。アルキル化は、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で行った。２ｍｇ／ｍｌ  ３０ｋＤａ（ＮＬ）の原液２５０μｌを、５０ｍＭトリス、０．５％ＳＤＳ  ｐＨ＝８の最終濃度に１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭ  ＴＢＰ（トリブチルホスフィン）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけた。次いで試料を、７０℃で１０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却した。１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、それから暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２４８】
４０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
リジンを有しない４０ｋＤａのタンパク質（４０ｋＤａ  ＮＬ）を、実施例１および実施例３において提供した発現構築物から生成した。アルキル化は、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で行った。２ｍｇ／ｍｌ  ３０ｋＤａ（ＮＬ）の原液２５０μｌを、５０ｍＭトリス、０．５％ＳＤＳ  ｐＨ＝８の最終濃度に１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭ  ＴＢＰ（トリブチルホスフィン）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけた。次いで試料を、７０℃で１０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却した。１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、この試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、それから暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２４９】
５０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
リジンを有しない５０ｋＤａのタンパク質（５０ｋＤａ  ＮＬ）を、実施例１および実施例３において提供した発現構築物から生成した。アルキル化は、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で行った。２ｍｇ／ｍｌ  ３０ｋＤａ（ＮＬ）の原液２５０μｌを、５０ｍＭトリス、０．５％ＳＤＳ  ｐＨ＝８の最終濃度に１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭ  ＴＢＰ（トリブチルホスフィン）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけた。次いで試料を、７０℃で１０分間インキュベーションした。次いでこの試料を、室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却した。１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、この試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、それから暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２５０】
６０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準
６０ｋＤａのＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）分子量マーカータンパク質は、短縮された大腸菌チオレドキシンタンパク質の６つの融合されたコピーを含む（参照によりその全体が本願明細書に組み入れられる米国特許第６，７０３，４８４号を参照）。６０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）原液（ＯＤ＝３．４９）１００μｌを、５０ｍＭトリスｐＨ＝８および０．５％のＳＤＳの最終濃度を有する１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけ、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。試料を室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却し、５．５μｌの（蒸留した）４−ビニルピリジンを加え、この試料をボルテックスにかけて４−ビニルピリジンを可溶化し、次いで暗所で室温で１時間インキュベーションした。
【０２５１】
８０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準
８０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）分子量標識タンパク質は、短縮された大腸菌チオレドキシンタンパク質（参照によりその全体が本願明細書に組み入れられる米国特許第６，７０３，４８４号を参照）の８つの融合されたコピーを含む。６０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）原液（ＯＤ＝６．３６）１００μｌを、５０ｍＭトリスｐＨ＝８および０．５％のＳＤＳの最終濃度を有する１ｍｌの体積に希釈した。イソプロパノール中の４００ｍＭトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけ、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。この試料を室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却し、５．５μｌの（蒸留した）４−ビニルピリジンを加え、この試料をボルテックスにかけて４−ビニルピリジンを可溶化し、次いで暗所で室温で１時間インキュベーションした。
【０２５２】
１１０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
リジンを有しない１１０ｋＤａタンパク質（１１０ｋＤａ  ＮＬ）を、実施例２および実施例３において提供した発現構築物から生成した。アルキル化は、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で行った。１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび水６７５μｌを、１１０ｋＤａ（ＮＬ）タンパク質の２ｍｇ／ｍｌの原液２５０μｌに加えた。イソプロパノール中の４００ｍＭ  ＴＢＰ（トリブチルホスフィン）１０μｌを加え、タンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけた。次いで試料を、７０℃で１０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却した。１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、この試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、それから暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２５３】
１６０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
リジンを有しない１６０ｋＤａのタンパク質（１６０ｋＤａ  ＮＬ）を、実施例２および実施例３において提供した発現構築物から生成した。アルキル化は、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で行った。１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび水６７５μｌを、１６０ｋＤａ（ＮＬ）タンパク質の２ｍｇ／ｍｌの原液２５０μｌに加えた。イソプロパノール中の４００ｍＭ  ＴＢＰ（トリブチルホスフィン）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけた。次いで試料を、７０℃で１０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却した。１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、この試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、それから暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２５４】
２６０ｋＤａ  タンパク質標準
２６０ｋＤａ  タンパク質標準（２６０ｋＤａ）を、実施例２および実施例３で提供した発現構築物から生成した。アルキル化は、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で行った。１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび水６７５μｌを、２６０ｋＤａ（ＮＬ）のタンパク質の２ｍｇ／ｍｌの原液２５０μｌに加えた。イソプロパノール中の４００ｍＭ  ＴＢＰ（トリブチルホスフィン）１０μｌを加え、このタンパク質試料を１０〜１５秒間ボルテックスにかけた。次いでこの試料を、７０℃で１０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間（または温度が３０℃に下がるまで）冷却した。１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、試料を３〜５秒間ボルテックスにかけ、それから暗所で室温で４０〜６０分間インキュベーションした。
【０２５５】
アルキル化したタンパク質の精製
全てのアルキル化されたタンパク質を、５０ｍＭトリスｐＨ＝８中の０．１％ＳＤＳで平衡化させたＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６ゲル濾過カラムで精製した。タンパク質溶出は、ＵＶ検出器を用いて２８０ｎｍでモニタリングした。試料体積は、カラム体積の１０％以下であった。
【０２５６】
実施例７：赤色色素＃１（８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸−アミノフェニルビニルスルホン、８−ＡＮＳ−ＡＰＶＳ）の合成
８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸−アミノフェニルビニルスルホン（８−ＡＮＳ−ＡＰＶＳ）の合成は、急速な分解の傾向があり、危険であり得るジアゾニウム塩の使用を必要とする。ジアゾニウム塩を、乾燥させてはならない。合成スキームを、図１２に示す。
【０２５７】
４−アミノフェニル−２−スルホナトエチルスルホン（２．８１ｇ）を、撹拌棒を備えた２００ｍＬの丸底フラスコに入れた。５０ｍＬの水をフラスコに加え、次いで１０ｍＬの濃ＨＣｌを加えた。この混合物を激しく撹拌し、氷水浴で０℃に冷却した。別の５０ｍＬのフラスコにおいて、０．６９ｇの亜硝酸ナトリウムを２０ｍＬの水に加え、それが完全に溶解するまで混合した。この混合物を滴下漏斗に加え、４−アミノフェニル−２−スルホナトエチルスルホンが入っているフラスコの上に配置した。亜硝酸ナトリウム溶液をこの混合物に滴下すると、フラスコの固体は溶液中で黄色がかった／緑色を発色しながら溶解し始めた。亜硝酸ナトリウムの添加終了後、氷浴を取り除き、温度を約２０℃まで上げた。ジアゾニウム塩が生成につれて、溶液は透明になった。溶液を再度０℃へ冷却し、ジアゾニウム塩を沈殿させた。
【０２５８】
８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ＡＮＳ）を、撹拌棒を備えた２５０ｍＬの丸底フラスコにその固体を配置することにより調製した。３０ｍＬの水を加え、次いで５ｍＬの１．０Ｍ炭酸ナトリウムを加えた。８−ＡＮＳが溶けるまで、混合物を激しく撹拌した。ジアゾニウム塩を滴下漏斗へ移し、撹拌しながらジアゾニウム塩溶液を８−ＡＮＳの溶液に滴下した。直ちに暗色を呈した。添加が終了すると、この混合物を少なくとも２時間〜一晩撹拌した。
【０２５９】
この色素を、溶離剤としてメタノールまたはアセトニトリルを使用して逆相クロマトグラフィにより精製した。この色素を、５０ｍＭリン酸ｐＨ３．０中でＣ−１８樹脂に充填した（シリカベースのＣ−１８吸着剤のシラン結合の切断を回避するために、カラム上へ充填する前に色素水溶液のｐＨを上げた）。樹脂に結合した色素を洗浄し、連結工程からの酸の大部分を除去した。低ｐＨで色素は紫色であり、集めた画分は純度を評価するために場合によってはＨＰＬＣによって点検した。合わせた画分を減圧でロータリーエバポレーションによって真空中で濃縮した。収率は、標準的方法により算出した。乾燥色素ビニルスルホン前駆体を５０ｍＬの水に溶かし、撹拌棒を備えた１００〜２００ｍＬの丸底フラスコへ移した。溶液をかきまぜながら、１．０Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍＬを加えた。ｐＨは、調整したｐＨ計を用いて１０．０±０．２に維持した。この溶液を１時間混合し、次いで１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ７に調整した。この色素を逆相カラムを使用して精製した。この反応性色素を、ｐＨを７に合わせた後に、直接カラムに充填した。この色素を充填した後、カラムを水で徹底的に洗浄した。この色素をアセトニトリル中で溶出し、着色した画分を集めた。色素画分を合わせ、ロータリーエバポレータを使用して真空内で溶媒を除去した。固体色素を秤量し、収率を算出した。陰イオンモード質量スペクトルを得て、親ピークが４９２の質量対電荷比に観察されたことを確認した。
【０２６０】
実施例８：オレンジ１６色素の活性化
出発物質の反応性オレンジ１６（またＲｅｍａｚｏｌブリリアントオレンジ３Ｒとも呼ばれる）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手した。染色したマーカータンパク質を生成するためのタンパク質のスルフヒドリルと反応させるために、この色素をビニルスルホンに変換した。この色素のビニルスルホン体を生成するための反応スキームを、図１３に示す。
【０２６１】
１００ｍＬの丸底フラスコに、適切な大きさの卵子形の撹拌棒を取り付けた。このフラスコに、必要な水量により溶解した反応性オレンジ１６を入れた。この溶液を撹拌しながら、ｐＨが１０．０±０．１になるまで、水酸化ナトリウムをこの撹拌した溶液に滴下した。ｐＨをモニタリングしながら、この反応液を２時間撹拌した。１Ｍ炭酸ナトリウム１００μｌを、ｐＨを１０．０に保つために加えた。２時間後に、ｐＨを、１Ｍ  ＨＣｌを使用して再度中性に調整した。
【０２６２】
これをＣ１８カラムクロマトグラフィによって精製した。５０ｍＭリン酸  ｐＨ４中でＷａｔｅｒｓ  ｂｏｎｄａｐａｋ樹脂カラムに生成物を充填した。製品をカラムに充填すると、カラムをカラムの３倍の体積の水で洗浄し、５０％ＨＰＬＣ用メタノールを含む水を使用して生成物を溶出した。画分を合わせ、暗色の画分をロータリーエバポレータで真空中で濃縮した。生成物をフラスコからこすり落とし、生成物の重量を得るために、風袋を計った琥珀の瓶／バイアルに入れた。瓶にアルゴンをパージし、それと出発物質を区別するために、以下の名前で標識した：「反応性オレンジ１６ビニルスルホン」。
【０２６３】
実施例９：色素を用いた標準タンパク質の標識
全てのリジンなし（ＮＬ）タンパク質（３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび１６０ｋＤａ  ＮＬタンパク質）および２６０ｋＤａタンパク質の標識は、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で行った。反応に加えるタンパク質および水の量は、出発のタンパク質濃度に応じて調整した。インスリンおよびリゾチームは、対応する指示書に記載されている濃度で標識した。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準は、参照によりその全体が本願明細書に組み入れられる米国特許第６，７０４，４８４号に記載されている。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準の原液は一定濃度（指示書で指定されたＯＤ）で標識した。
【０２６４】
インスリン
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８７５μｌを、２０ｍｇ／ｍｌのインスリンｂ鎖タンパク質５０μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いでこの試料を室温で５分間、または温度が５０℃より低くなるまで冷却した。次いで水中の１０ｍｇ／ｍｌのＵｎｉｂｌｕｅ  Ａ  １００μｌをペプチド試料に加え、この試料を５０℃で３時間インキュベーションした。
【０２６５】
１０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）標準
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）１０ｋＤａタンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド、米国特許第６，７０３，４８４号）を、前標識されたマーカーセットの１０ｋＤａ標準として使用するために標識した。１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８２５μｌを、１０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準原液の８．３ＯＤ溶液の１００μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌの８−ＡＮＳ−ＡＰＶＳの５０μｌをタンパク質試料に加え、試料を室温で３時間インキュベーションした。
【０２６６】
リゾチーム
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８２５μｌを、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム水溶液１００μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌのＵｎｉｂｌｕｅの５０μｌをこのタンパク質試料に加え、この試料を室温で一晩インキュベーションした。
【０２６７】
２０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）２０ｋＤａタンパク質標準（短縮されたチオレドキシンがＤｅａｄボックスタンパク質の５ｋＤａの断片の２つのコピーに連結された１９．８９１ｋＤａのタンパク質）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド、米国特許第６，７０３，４８４号）を、前標識されたマーカーセットの２０ｋＤａ標準として使用するために標識した。１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％のＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８２５μｌを、２０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準原液の８．２ＯＤ溶液１００μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。ＤＭＦ中の２０ｍｇ／ｍｌのＢｏｄｉｐｙ５３０／５５０ヨードアセトアミドの１２．５μｌをこのタンパク質試料に加え、この試料を室温で３時間インキュベーションした。
【０２６８】
３０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８００μｌを、３０ｋＤａ  ＮＬ標準タンパク質の５ｍｇ／ｍｌの溶液の１２５μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。水中の１０ｍｇ／ｍｌのＵｎｉｂｌｕｅ  Ａの１００μｌをタンパク質試料に加え、この試料を室温で一晩（１４〜１８時間）インキュベーションした。
【０２６９】
４０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水７２５μｌを、４０ｋＤａ（ＮＬ）標準タンパク質の２．５ｍｇ／ｍｌの溶液の２００μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。水中の４０ｍｇ／ｍｌの活性化したオレンジ１６の５０μｌをタンパク質試料に加え、この試料を室温で３時間インキュベーションした。
【０２７０】
５０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８００μｌを、５０ｋＤａ（ＮＬ）標準タンパク質の５ｍｇ／ｍｌの溶液の１２５μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。水中の１０ｍｇ／ｍｌのＵｎｉｂｌｕｅ  Ａの１００μｌをタンパク質試料に加え、この試料を室温で一晩（１４〜１８時間）インキュベーションした。
【０２７１】
６０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）６０ｋＤａ  タンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド、米国特許第６，７０３，４８４号）を、前標識されたマーカーセットの６０ｋＤａの標準として使用するために標識した。１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水６６５μｌを、６０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）標準タンパク質原液の３．４９ＯＤ溶液の２６０μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。ＤＭＦ中の１０ｍｇ／ｍｌの８−ＡＮＳ−ＡＰＶＳの５０μｌをタンパク質試料に加え、この試料を室温で６時間インキュベーションした。
【０２７２】
８０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）８０ｋＤａタンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド、米国特許第６，７０３，４８４号）を、前標識されたマーカーセットの８０ｋＤａの標準として使用するために標識した。１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８２５μｌを、８０ｋＤａのＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準原液の６．３６ＯＤ溶液の１００μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。ＤＭＦ中の２０ｍｇ／ｍｌのＢｏｄｉｐｙ５３０／５５０ヨードアセトアミドの１２．５をタンパク質試料に加え、この試料を室温で２．５時間インキュベーションした。
【０２７３】
１１０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８００μｌを、１１０ｋＤａ（ＮＬ）標準タンパク質の４ｍｇ／ｍｌの溶液１２５μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。水中の１０ｍｇ／ｍｌのＵｎｉｂｌｕｅ  Ａの１００μｌをタンパク質試料に加え、この試料を室温で一晩（１４〜１８時間）インキュベーションした。
【０２７４】
１６０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水８００μｌは、１６０ｋＤａ（ＮＬ）の標準タンパク質の４ｍｇ／ｍｌの溶液の１２５μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。ＤＭＦ中の２０ｍｇ／ｍｌのオレンジ１６の１００μｌをタンパク質試料に加え、この試料を５０℃で３時間インキュベーションした。
【０２７５】
２６０ｋＤａ  タンパク質標準
１ＭトリスｐＨ＝８  ５０μｌ、２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび超純水７２５μｌを、２６０ｋＤａの標準タンパク質の２．５ｍｇ／ｍｌの溶液２００μｌに加えた。４００ｍＭ  ＴＢＰ  ２．５μｌを加え、このタンパク質試料を７０℃で２０分間インキュベーションした。次いで試料を、室温で５分間または温度が３０℃より低くなるまで冷却した。ＤＭＦ中の２０ｍｇ／ｍｌのＢｏｄｉｐｙ５３０／５５０  ヨードアセトアミドの２５をタンパク質試料に加え、この試料を室温で５〜６時間インキュベーションした。
【０２７６】
標識タンパク質の精製
リゾチーム以外の標準タンパク質の全てを、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０ｃ樹脂を詰めたゲル濾過ＬＣカラムで精製した。カラムの体積は、Ｕｎｉｂｌｕｅ  Ａ、オレンジ１６およびＢｏｄｉｐｙ５３０／５５０色素で標識したタンパク質については試料の体積の少なくとも１５倍であった。カラムの体積は、赤色（８−ＡＮＳ−ＡＰＶＳ）色素で標識したタンパク質については試料の体積の少なくとも２０倍であった。
【０２７７】
Ｕｎｉｂｌｕｅ−Ａで標識したリゾチームの精製のために、８Ｍ尿素によって平衡化させたＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６カラムを使用した。このカラムは、試料体積の少なくとも２０倍量を有した。試料をカラムに充填し、この色素をタンパク質結合体から分離した。２つの色素ピークを観察した。試料を集めた後、５０ｍＭトリス、０．５％ＳＤＳで平衡化させたＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６カラムに試料を充填することによって、尿素をトリス／ＳＤＳに交換した。（カラム体積は、試料体積の少なくとも１０倍であった。）
【０２７８】
標識タンパク質のキャッピング
電気泳動による移動の変化につながりかつゲル上のバンドの鮮明さを低下させる可能性がある分子内ジスルフィド架橋および分子間ジスルフィド架橋をタンパク質が形成するのを防止するために、標準タンパク質上のあらゆる未反応のシステイン残基を中和するために、キャッピング工程を実施した。タンパク質結合体１ｍｌにつき２０％ＳＤＳ  ２５μｌおよび４００ｍＭ  ＴＢＰ  １０μｌを加え、室温で３０分間インキュベーションすることによって、標識タンパク質を変性し還元した。次いで、タンパク質結合体１ｍｌにつき５０μｌの１Ｍヨードアセトアミドを加え、試料を室温で１時間インキュベーションした。リゾチームの場合、リゾチーム標準液のＳＤＳ濃度が既に０．５％であったため、ＳＤＳは反応の前に加えなかった。タンパク質結合体１ｍｌにつき４００ｍＭ  ＴＢＰ  １０μｌを加え、この試料を室温で３０分間インキュベーションした。次いで、タンパク質結合体１ｍｌにつき１Ｍヨードアセトアミド５０μｌを加え、この試料を室温で１時間インキュベーションした。
【０２７９】
未反応の還元剤およびアルキル化試薬を、５０ｍＭトリスｐＨ＝８中の０．１％ＳＤＳによって平衡化させたＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６カラム上のゲル濾過によって、標識されアルキル化されたタンパク質から除去した。
【０２８０】
標識タンパク質のＳｅｐｈａｃｒｙｌ精製
場合によっては、標準タンパク質の第２の精製を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラムで行った。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ２００−ＨＲを１０ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質に対して使用し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ４００−ＨＲを４０ｋＤａ〜２６０ｋＤａの分子量を有するタンパク質に対して使用した。カラムを、５０ｍＭトリス、０．１％ＳＤＳで洗浄し、次いで試料を充填した。
【０２８１】
カラムは試料体積の少なくとも３０倍の体積および少なくとも２０の長さ対内径比を有していた（例えば、１００ｃｍ×内径５ｃｍのＩＤカラムを、１００ｍｌの試料を精製するために使うことができる）。１０ｍｌの画分を集め、アリコートをゲル上で泳動し、精製されたタンパク質画分を一緒に保存した。
【０２８２】
濃縮
標準タンパク質は、適切なポアサイズを有するＶｉｖａｓｐｉｎ  ＭＷＣＯフィルターで濃縮した：２６０ｋＤａ  １６０ｋＤａ、および１１０ｋＤａの標準タンパク質に対しては１００ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター、８０ｋＤａ、６０ｋＤａおよび５０ｋＤａの標準タンパク質に対しては５０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａの標準タンパク質に対しては３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター、２０ｋＤａ、リゾチームおよび１０ｋＤａの標準タンパク質に対しては１０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター、インスリンｂ鎖に対しては３ｋＤａのＭＷＣＯフィルター。
【０２８３】
実施例１０：電気泳動による移動
前染色されたタンパク質の各々を、対応する非標識タンパク質マーカーと並べてゲル上に充填した。試料を、８ｃｍ×８ｃｍの４〜１２％ビストリス／ＭＥＳゲル、４〜１２％ビストリス／ＭＯＰＳゲルおよび４〜２０％のトリスグリシンゲル上での移動について分析した。色素の先端がゲルの底（試料ウェルの底から６．８ｃｍ）に到達するまで、ゲルを２００Ｖで泳動した。電気泳動後、ゲルを、マイクロ波手順に従ってＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ  ＳｔａｉｎクマシーＧ−２５０（登録商標））タンパク質染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）で染色した。ゲルを、脱イオン水で数時間から一晩、脱染色した。標識タンパク質の移動は、Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒ  ３０００画像処理システムで測定した。ゲルの画像はＡｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒで撮影し、標識タンパク質の移動を非標識型の同じタンパク質標準に対して解析した。分子量を算出しているタンパク質の最も近くに移動している２つのタンパク質マーカー（一方は、分子量を算出しているタンパク質標準よりも短い距離を移動したもの、および他方は分子量を算出しているタンパク質標準より長い距離を移動したもの）についての移動距離に対して分子量の対数をプロットすることによって標準曲線を生成して、ポイントツーポイント較正を使用して、タンパク質の移動距離に基づいてタンパク質の分子量を算出する際の測定値の精度を高めた。ポイントツーポイント較正から算出された分子量が１０％以内にあるとき、前標識されたタンパク質標準はそれらの非標識対照物と実質的に同様に移動することを観察した。１０ｋＤａ以上の分子量を有する標識された分子量マーカータンパク質の全てが、それらの非標識対照物の移動から起算して４．５％以内に移動した。
【０２８４】
実施例１１：鮮明な前染色標準タンパク質混合調製物
１２個の標識タンパク質（インスリンｂ鎖、１０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準、２０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準、３０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準、４０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準、５０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準、６０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準、８０ｋＤａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質標準、１１０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準、１６０ｋＤａ  ＮＬタンパク質標準および２６０ｋＤａ  タンパク質標準）を混合し、タンパク質標準の分子量が３．５ｋＤａ未満から２５０ｋＤａ超にわたる分子量標準セットを作製した。この分子量標準セットは、４つの異なる視覚的に識別可能な色素で標識されたタンパク質を含んでいた。バッチごとのバンド強度が２０％以下しかばらつかない標準を提供するために、標識された標準の各新規な調製物からのバンドの強度を以前のバッチの標準と比較することにより、バッチごとに強度が整合するようにタンパク質を混合した。適切な量の各タンパク質標準を混合物に加え、目標の最終体積の５０％まで超純水を加えた。それから、目標の最終量の５０％分量の２×試料緩衝液（１３０ｍＭトリスｐＨ＝６．５、４％ＳＤＳ、６０％グリセロール、０．０１％のクマシーＧ２５０）をマーカー混合調製物に加えた。
【０２８５】
前標識されたセットと同じタンパク質を含む非標識標準セットも処方した。電気泳動ゲルで見られるときに２０ｋＤａおよび８０ｋＤａの標準タンパク質バンドが他のタンパク質バンドより強度であるように、非標識標準セットを処方した。このため、ユーザが強い２０ｋＤａおよび８０ｋＤのバンドの観察によって直ちにタンパク質を正しい位置に置くことができる。
【０２８６】
（表４）鮮明な前染色標準タンパク質
2009544974.tif 000008
【０２８７】
実施例１２：前標識されたタンパク質標準セットの電気泳動
１×ＭＥＳ緩衝液を用いて泳動する４〜１２％ビストリス（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標））アクリルアミドゲル中で、実施例１１の前標識された標識セット（１０μｌ）を非標識型のタンパク質の同一セット（５μｌ）と一緒に電気泳動にかけた。図１４は、システインで標識されリジンを欠く５つのタンパク質を含む前標識されたタンパク質標準セットが、それらの非標識対照物と実質的に同様に移動する鮮明なバンドを生成する１２個のバンドを備えていることを示す。実施例１１の前標識されたマーカーセットを、他の市販のマーカー（１、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；２、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｕａｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；３、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；４、鮮明な前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；５−Ｒａｉｎｂｏｗ（ＧＥ）；６−ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）前染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；７−ＭｕｌｔｉＭａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；８−ＳｅｅＢｌｕｅ＋２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に、１×ＭＥＳ緩衝液を用いて泳動する４〜１２％のビストリス（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標））アクリルアミドゲル、１×ＭＯＰＳ緩衝液を用いて泳動する４〜１２％のビストリス（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標））アクリルアミドゲル、および４〜２０％のトリスグリシン（Ｎｏｖｅｘ（登録商標））ゲルでも電気泳動にかけた（図１５）。全てのゲルはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッドから入手した８×８ｃｍの「ミニ」ゲルであり、電気泳動条件は製造業者によって提供されたものであった。
【０２８８】
（表５）ビストリスゲル上での前標識された標準セットの移動
2009544974.tif 000009
【０２８９】
（表６）４〜２０％のトリスグリシンゲル上での前標識された標準セットの移動
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【０２９０】
実施例１３：前標識されたタンパク質標準セットの電気泳動にかけたタンパク質のバンド幅の算出
実施例１１の１０μｌの鮮明な前染色タンパク質標準処方物を、１×ＭＥＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて泳動する４〜１２％のアクリルアミド勾配ビストリスＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上で泳動した。電気泳動の後、ゲルを測定尺のコピーを有するスライド（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ）上に置いた（図１６Ａ）。次いでゲルを３００／３００ｄｐｉでスキャンし、グレースケールの「．ＢＭＰ」画像として保存した。
【０２９１】
ゲルの解像度を、（それをＧｅｌｏ．ｅｘｅと互換性を持つようにするために）後に幅全体にわたって低下させた。生成したゲル画像はＧｅｌｏ．ｅｘｅ（画像の寸法を測定するように設計されたソフトウェアプログラム）に充填し、トレースをゲルの長さに沿って画像強度から抽出した。
【０２９２】
抽出したトレースをＰｅａｋｍａｎ．ｅｘｅにロードした。ベースラインを調整し、ピークを選択した。画像の強度が最大強度ピーク高さの５０％以上であった所で、Ｐｅａｋｍａｎ．ｅｘｅプログラムはバンドの幅を測定した（図１６Ｂ）。データを、Ｅｘｃｅｌにロードし、１ｍｍあたりの画像ユニットの数を、この長さに対する画像ユニットの総数によってゲルの長さを除算することにより算出した：ゲルの泳動長さ＝６８ｍｍ、画像ユニットの長さ＝８５０−４４＝８０６、１ｍｍあたりの画像ユニットの数＝８０６／６８＝１１．８５。従って、ｍｍ単位で幅を得るために、各ピークの半値幅を１１．８５で除算した。
【０２９３】
電気泳動タンパク質標準（ピーク２〜１３、ゲル上の前染色タンパク質バンドに対応する）が生成したバンドの幅を表７に提供する。３．５ｋＤａを超える分子量を有するタンパク質からの肉眼に見えるバンド幅は、０．５９ｍｍ〜１．１６ｍｍの幅の範囲（ちょうど２倍未満の違い）にわたる。少なくとも１０ｋＤａ〜１１０ｋＤａ以下の分子量を有するタンパク質からの肉眼に見えるバンドの幅は、０．７３ｍｍ〜１．１６ｍｍの幅の範囲（１．５倍未満の違い）にわたる。少なくとも２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質からの肉眼に見えるバンドの幅は、０．９９ｍｍ〜１．１６ｍｍの幅の範囲（２０％未満の違い）にわたる。このマーカーは、電気泳動にかけられたタンパク質の肉眼に見えるバンドの幅が２０％未満だけ異なる、少なくとも２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ未満の分子量を有する６つのタンパク質を含む。
【０２９４】
（表７）鮮明な前染色標準タンパク質のバンド幅
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【０２９５】
ピーク高さの列により分かるように、バンドの強度はこのセットのタンパク質の中で２．５倍以下だけ変化する。
【０２９６】
本発明の各種態様を上記実施例において記載し提供してきたが、改変および変更が本発明の趣旨と範囲の中に包含されることは理解されると考えられる。特に、本願明細書において記載した態様の要素および特徴は、本発明の範囲内の更なる態様を生み出すために、本願明細書に記載のまたは当該分野で公知の他の態様の要素および特徴と組み合わせてもよい。見出しは、単に本願明細書を読む当業者の便宜だけのために提供したものであり、本発明の範囲を限定しない。
【０２９７】
この明細書で言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関係する当業者の技術水準を表しており、それらは、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられると明記されているのと同じ程度に参照により本願明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2009544974.tif 000020
【図８Ｂ】
2009544974.tif 000021
【図９Ａ】
2009544974.tif 000022
【図９Ｂ】
2009544974.tif 000023
【図１０】
2009544974.tif 000024
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2009544974.tif 000034
【配列表】
2009544974000001.app
【国際調査報告】
2009544974.tif 000035
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2009544974.tif 000037