(57)【要約】  本発明は、機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することによる、対象における癌の診断、予後および治療のための新規な方法および組成物を提供する。
2009511482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象において癌を治療するための方法。
【請求項２】
癌が肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、および膵臓癌から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌が肺癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
投与が遺伝子治療を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子治療が組換えウイルス遺伝子治療を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組換えウイルス遺伝子治療が組換えアデノウイルス遺伝子治療を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象の少なくとも１つの癌細胞においてＷｗｏｘ発現を誘導することを含む、対象において癌を治療する方法。
【請求項９】
癌細胞株においてＷＷＯＸの発現を誘導することを含む、該細胞株における細胞増殖阻止を誘導する方法。
【請求項１０】
癌細胞株が肺癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドの２つの末端が連結され、その結果環状ポリヌクレオチドを生じる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むＷＷＯＸ遺伝子産物発現カセットを含むベクター。
【請求項１４】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ウイルスベクターが組換えアデノウイルスベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載のウイルスベクターを含む細胞。
【請求項１７】
細胞が肺細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
肺細胞が肺癌細胞である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
ウイルスベクターおよび薬剤的に受容できる賦形剤を含む、対象において癌を治療するための医薬組成物であって、該ベクターはＷＷＯＸ遺伝子産物発現カセットを含み、該カセットは機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドおよび機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
ウイルスベクターが組換えアデノウイルスベクターである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
組成物が吸入のために製剤される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むプラスミド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のプラスミドを含む細胞。
【請求項２４】
ＷＷＯＸ遺伝子を再活性化することが可能な治療用化合物を対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法。
【請求項２５】
対象がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＷＷＯＸ遺伝子の再活性化が結果としてアポトーシスを誘導する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
内因性Ｗｗｏｘの発現を欠如する肺癌細胞におけるＷｗｏｘ発現を回復し、それによって悪性を無効にすることを含む、癌治療の方法。
【請求項２８】
肺癌細胞においてＷＷＯＸ細胞増殖阻止およびアポトーシスを誘導するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府援助
本発明は、ＮＣＩ／ＮＩＨ  Ｇｒａｎｔ／Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＡ７８８９０，ＣＡ７７７３８およびＣＡ５６０３６のグラントによって、すべてまたは一部が援助された。米政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は一般に、癌において、とりわけ肺癌において見いだされた異常な細胞増殖を含むが、それらに限定されないそのような細胞増殖を制御するための組成物および方法に関する。
【０００３】
発明の背景
肺癌は米国における主要な癌死亡の原因であり（１）、米国では年間約１７０，０００例の新規な症例が発生し（１）、死亡率は非常に高い。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は肺癌の約８０％を占める。外科手術が依然として主要なＮＳＣＬＣの治療であるが、患者の大部分は治癒切除を受けることができない。新規な薬物および治療計画にもかかわらず、肺癌患者の予後はここ１０年間、顕著に変化していない。組換えウイルス遺伝子治療が肺癌患者において研究されてきた；野生型ｐ５３をコードするアデノウイルス（Ａｄ）およびレトロウイルスが肺癌治験において腫瘍内に注入されてきた（２〜６）。肺癌第Ｉ相研究における組換えＡｄ注入（７）は安全性および実行可能性を証明していて、組換えＡｄによる遺伝子治療の毒性および有効性を評価するために、第Ｉ／ＩＩ相治験が現在患者を動員している。
【０００４】
肺癌は脆弱部位（ｆｒａｇｉｌｅ  ｓｉｔｅ）ＦＲＡ３Ｂ（９）でのＦＨＩＴ（ｆｒａｇｉｌｅ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉａｄ）遺伝子（８）の初期の発現損失に関連している。脆弱領域はとりわけ環境発癌性物質への暴露により損傷を受けやすく、それが肺癌における病因である。最近、Ｙｅｎｄａｍｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１０）は、ＷＷＯＸ（オキシドレダクターゼを含むＷＷドメイン）遺伝子も非小細胞肺癌の一部において変化していることを証明している。ＷＷＯＸは脆弱部位ＦＲＡ１６Ｄ（１１）に位置し、２つのＷＷドメインと短鎖デヒドロゲナーゼドメインを持つ４１４‐ａａタンパク質をコードする。ＷＷドメインはタンパク質‐タンパク質相互作用ドメインであり、通常の上皮細胞において重要なシグナリングの役割を果たすＷｗｏｘ相互作用子が確認されている。Ｗｗｏｘはｐ７３と相互作用し、細胞質への核ｐ７３の再分布を引き起こし、その転写活性を抑制することができる（１２）。Ｗｗｏｘは、細胞増殖における役割を持つＡｐ２‐γ転写因子とも相互作用する（１３）。きわめて最近、Ｗｗｏｘは転写活性化因子である細胞内ＥｒｂＢ４ドメインへの結合に関してＹａｐタンパク質と競合することが報告されている（１４）。したがって、Ｗｗｏｘ経路は、癌治療標的としても使える可能性があるいくつかの下流シグナリングタンパク質を含む。
【０００５】
ＷＷＯＸ遺伝子は、乳房、卵巣、前立腺、膀胱、食道、および膵臓を含む多くの型の癌において変化している（１５〜１９）。非小細胞肺癌において、ＷＷＯＸエキソンを持たない転写物が腫瘍の２６％、そして８個のうち５個の細胞株で検出された（１０）。ＷＷＯＸ対立遺伝子の損失は腫瘍の３７％で発生し、プロモーターは偏平細胞肺癌の６２．５％において高度にメチル化されている（１０、１９）。肺癌における腫瘍抑制を研究するために、我々はＷＷＯＸ遺伝子を運ぶＡｄによる感染により、Ｗｗｏｘ‐ネガティブ（Ａ５４９、Ｈ４６０、およびＨ１２９９）および‐ポジティブ肺癌細胞（Ｕ２０２０）におけるＷｗｏｘタンパク質発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を検討した；Ｈ１２９９細胞も誘導性Ｗｗｏｘ発現ベクターにより安定にトランスフェクションされ、それが生理的レベルに近いレベルのタンパク質の誘導を可能にする。Ｗｗｏｘ回復はＷｗｏｘタンパク質を構成的に発現する肺癌細胞に対して効果を示さずに、効果的にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアポトーシスを誘導し、ヌードマウスにおける肺癌腫瘍形成性を抑制した。
【０００６】
発明の概要
本発明は、機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象において癌を治療するための方法を提供する。ある態様では、癌は肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、および膵臓癌から選択される。ある態様では、投与は遺伝子治療を含み、そしてある態様では組換えアデノウイルス遺伝子治療のような、組換えウイルス遺伝子治療を含む。
【０００７】
本発明はさらに、対象の少なくとも１つの癌細胞においてＷｗｏｘ発現を誘導することを含む、対象において癌を治療する方法を提供する。本発明はまた、癌細胞株においてＷｗｏｘの発現を誘導することを含む、該細胞株において細胞増殖阻止を誘導する方法を提供する。ある態様では、癌細胞または癌細胞株は肺癌である。
【０００８】
本発明はまた、機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む、ポリヌクレオチドを提供する。ある態様では、ポリヌクレオチドの２つの末端が連結され、その結果環状ポリヌクレオチドになる。
【０００９】
本発明はまた、ＷＷＯＸ遺伝子産物発現カセットを含むベクターを提供し、該カセットは機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む。ある態様では、ベクターはウイルスベクターであり、そしてある態様ではウイルスベクターは組換えアデノウイルスベクターである。本発明はまた、本発明に記載のウイルスベクターを含む細胞を提供する。細胞は肺細胞、とりわけ、肺癌細胞であってもよい。
【００１０】
本発明はまた、対象において癌を治療するための医薬組成物を提供し、該医薬組成物はウイルスベクターおよび薬剤的に受容できる賦形剤を含み、該ベクターはＷＷＯＸ遺伝子産物発現カセットを含み、該カセットは機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドおよび機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む。ウイルスベクターは、たとえば、組換えアデノウイルスベクターであってもよい。ある態様では、組成物は吸入のために製剤される。
【００１１】
本発明はさらにその上、機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド；および機能性ＷＷＯＸ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むプラスミドを提供する。本発明はまた、本発明に記載のプラスミドを含む細胞を提供する。
【００１２】
本発明はまた、ＷＷＯＸ遺伝子を再活性化することが可能な治療用化合物を対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法を含む。ある態様では、対象はヒトである。ある態様では、ＷＷＯＸ遺伝子の再活性化が結果としてアポトーシスを誘導する。
【００１３】
本発明の付加的な特徴および利点は、一部は後に続く説明において示され、そして一部は説明から明らかであり、あるいは本発明の実施によって知ってもよい。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲においてとりわけ指摘される要素および組み合わせによって実現され、獲得されることになる。
【００１４】
請求されたように、先の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも代表的で、解説的なものでしかなく、本発明を制限するものではないことを理解すべきである。
本発明の種々の目的および利点は、添付の図面の観点から解釈される場合、以下の好ましい態様の詳細な説明から当業者には明白になる。
【００１５】
好ましい態様の詳細な説明
細胞培養。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得たＷｗｏｘ‐ネガティブＡ５４９、Ｈ４６０、およびＨ１２９９ならびにＷｗｏｘ‐ポジティブＵ２０２０肺癌細胞株は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地１６４０中で維持した。Ｑｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得たＨＥＫ‐２９３ＣｙｍＲ細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。Ｈ１２９９細胞はｐ５３を発現しないが、Ａ５４９およびＨ４６０は野生型ｐ５３を発現する（２０）。
【００１６】
組換えＡｄおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入。正常ヒト肝臓ＲＮＡ由来のＷＷＯＸｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写された。２本鎖ｃＤＮＡは以下の条件を使用して、ＰＣＲ増幅により作製された：９５℃を３分間、９４℃３０秒間および６５℃６０秒間および７２℃３０秒間を３０サイクル、ならびに７２℃を７分間；ＷＷＯＸフォワード５′‐ＧＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣ‐３′およびＷＷＯＸリバース５′‐ＴＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＧＣＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣ‐３′プライマーが使用された。ｃＤＮＡはＡｄｅｎｏｖａｔｏｒ−ＣＭＶ５（ＣｕＯ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰトランスファーベクター（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）にクローニングされた（１１）。このベクターはクメート（ｃｕｍａｔｅ）‐誘導性ＣＭＶ５（ＣｕＯ）プロモーターにより駆動されるトランスジーン発現を可能にする。内部リボソームエントリー部位配列はＧＦＰの同時発現を確実にする。組換えプラスミドＡｄ−ＷＷＯＸは、構成的にＣｙｍＲタンパク質を発現する、改変されたヒト胎児腎臓ＨＥＫ−２９３  ＣｙｍＲ細胞（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）にトランスフェクトされ、それはＷＷＯＸ  Ａｄのパッケージングおよび増殖中に、ＣＭＶ５（ＣｕＯ）プロモーターおよびＷｗｏｘ発現を抑制する。１４〜２１日後に、相同組換えが細胞で起こり、プラーク形成を導いた。プラークは単離され、ウイルスはＨＥＫ−２９３ＣｙｍＲ細胞中で増幅され、ＣｓＣｌグラジエント遠心分離によって精製された。力価は吸光度測定（１ｍｌ毎のウイルス粒子の数）およびプラークアッセイ（プラーク‐形成ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）により測定され、トランスジーン発現はＷｗｏｘモノクローナル抗体を使用したイムノブロットにより評価された（２１）。細胞は次第に感染多重度（ｍｏｉｓ）（細胞毎のウイルス粒子の数）を増加させて組換えＡｄにより形質導入され、形質導入効率はＧＦＰ‐発現細胞の可視化により測定された。
【００１７】
誘導性ＷＷＯＸトランスフェクタント。ヒトＷＷＯＸｃＤＮＡはｐＩＮＤベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた。Ｈ１２９９細胞はエクジソン核受容体サブユニットを含む１０μｇのｐＶｇＲＸＲベクターによりトランスフェクトされ、クローンが選抜され、レポータープラスミドによる一過性トランスフェクションによるポナステロンＡ（ｐｏｎＡ）‐誘導性発現に関して試験された。最も高い発現を示すクローンは１０μｇのｐＩＮＤ−ＷＷＯＸベクターによりトランスフェクトされ、ゼオシン（１５０μｇ／ｍｌ）およびＧ４１８（１，２００μｇ／ｍｌ）中で培養された。Ｈ１２９９／Ｉクローンは選抜され、ｐｏｎＡ（５〜１０μＭ）処理後に誘導性ＷＷＯＸ発現に関して試験された。
【００１８】
ウェスタンブロット解析。タンパク質抽出およびイムノブロット解析は参考文献１３に記載のように行った。以下の一次抗血清が使用された：マウスモノクローナル抗‐Ｗｗｏｘ、１：５００；ウサギポリクローナル抗‐カスパーゼ３、１：１，０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；ウサギポリクローナル抗‐カスパーゼ９、１：２００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；マウスモノクローナル抗‐カスパーゼ８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ウサギポリクローナル抗‐ＰＡＲＰ［ポリ（ＡＤＰ‐リボース）ポリメラーゼ］、１：１，０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；およびウサギポリクローナル抗‐β‐アクチン、１：１，０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【００１９】
細胞増殖および細胞周期速度論。細胞（２ｘ１０５）はｍｏｉｓ１０、２５、５０、７５、および１００で感染され、２４時間間隔で採取され、トリパンブルーで染色され、計数された（ＶｉＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。フローサイトメトリーの場合、細胞は感染後５日目に採取され、冷メタノールで固定され、ＲＮアーゼ処理され、プロピジウムヨージド（５０μｇ／ｍｌ）で染色された。細胞はダブレットディスクリミネーティングゲーティング（ｄｏｕｂｌｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｇａｔｉｎｇ）を使用することによるＥＰＩＣＳ−ＸＬスキャン（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってＤＮＡ内容物が分析された。すべての分析はデュプリケートで行われた。
【００２０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究。動物研究は研究所のガイドラインに従って行われた。Ｈ４６０、Ａ５４９、およびＵ２０２０細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｄ−ＷＷＯＸ（ｍｏｉ＝１００）もしくはＡｄ−ＧＦＰに感染されるか、または偽感染された。感染２４時間後、感染または対照細胞株ごとに５匹の、６週齢の雌ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の左脇腹に、５ｘ１０６の生存細胞がｓ．ｃ．注射された。Ｈ１２９９細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ｍｏｉ１００でＡｄ‐ＧＦＰまたはＡｄ‐ＷＷＯＸに感染された。Ｈ１２９９／Ｉ細胞は１０μＭｐｏｎＡで処理され（Ｈ１２９９／Ｉ＋細胞）、Ｗｗｏｘ発現を誘導した。腫瘍形成性対照は非誘導細胞（Ｈ１２９９／Ｉ−）であった。誘導（Ｈ１２９９／Ｉ、ｐｏｎＡ処理後２４時間）および非誘導（１０７）細胞は５匹のヌードマウスに注射され；５匹のマウスはまた、Ａｄ−ＷＷＯＸ、Ａｄ−ＧＦＰ、および偽感染Ｈ１２９９細胞を注射された。腫瘍直径は５日ごとに測定され、腫瘍は剖検後に重量を測定された。腫瘍容積は方程式Ｖ（ｍｍ３）＝ａｘｂ２／２を使用することにより計算され、式中ａは最大直径であり、ｂは直角に交わる直径である。
【００２１】
ｅｘ  ｖｉｖｏ研究。Ｈ１２９９、Ｈ１２９９／Ｉ−、およびＨ１２９９／Ｉ＋を注射されたマウスの腫瘍由来のタンパク質溶解産物は、イムノブロット解析によりＷｗｏｘ発現を評価された。Ｈ１２９９／Ｉ＋腫瘍由来のフラグメントは培養され、２日間１０μＭのｐｏｎＡで処理され、イムノブロットにより誘導性Ｗｗｏｘ発現を検出された。
【００２２】
統計解析。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果は平均値±ＳＤとして表わされた。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して試験および対照試料の値を比較した。Ｐ＜０．０５は有意な差を示した。
【００２３】
親の、およびＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染肺癌細胞におけるＷｗｏｘ発現。肺癌細胞株のタンパク質のイムノブロット解析は、Ａ５４９、Ｈ４６０およびＨ１２９９細胞は内因性Ｗｗｏｘを発現しないが、ＷｗｏｘはＵ２０２０細胞において検出されることを示した。乳癌ＭＣＦ‐７細胞は豊富な内因性Ｗｗｏｘを発現し（１８）、陽性対象として使用された（図１Ａ）。
【００２４】
肺癌細胞はｍｏｉ１００でＡｄ‐ＷＷＯＸまたはＡｄ‐ＧＦＰに感染され；アデノウイルストランスジーンは、ＧＦＰ蛍光の共焦点顕微鏡観察による評価のように、それぞれの細胞株の細胞のほぼ１００％で発現された（データは示さない）。感染後７２時間でのイムノブロット解析はすべてのＡｄ‐ＷＷＯＸ‐形質導入細胞におけるＷｗｏｘ過剰発現を示した（図１Ｂ）。
【００２５】
感染細胞の細胞周期速度論。Ｗｗｏｘ過剰発現により誘導された細胞周期変更は、いくつかのｍｏｉでのＡｄ‐ＷＷＯＸまたはＡｄ‐ＧＦＰによる感染後に評価された。内因性Ｗｗｏｘを発現しないＡ５４９、Ｈ４６０およびＨ１２９９細胞では、Ａｄ‐ＷＷＯＸ感染後にサブ‐Ｇ１集団が観察されたが、内因性Ｗｗｏｘ‐陽性Ｕ２０２０細胞では観察されなかった。Ａｄ‐ＧＦＰ感染は細胞周期特性を改変しなかった。Ａｄ‐ＷＷＯＸ感染（ｍｏｉ＝１００）後９６時間で、５８％のＡ５４９、９４％のＨ４６０、および１７％のＨ１２９９細胞がサブ‐Ｇ１部分にあり；７％のＵ２０２０細胞はサブ‐Ｇ１部分にあった（図２）。細胞死のＷｗｏｘ誘導はｍｏｉ‐および時間‐依存的であった（データは示さない）。
【００２６】
Ｗｗｏｘ‐再発現細胞におけるアポトーシス経路。Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、およびＵ２０２０肺癌細胞株は次第にｍｏｉを増加させて感染され、形質導入された細胞の割合は共焦点顕微鏡観察および細胞周期速度論解析によりモニターされた。内因性Ｗｗｏｘを欠如する肺癌細胞株（Ａ５４９、Ｈ４６０、およびＨ１２９９）では、ある範囲のｍｏｉで、Ａｄ‐ＷＷＯＸおよびＡｄ‐ＧＦＰ感染に対する細胞増殖に有意な差が観察された（図３Ａ）。Ｕ２０２０細胞は内因性Ｗｗｏｘ発現によって影響を受けなかった。
【００２７】
Ｗｗｏｘ‐誘導アポトーシス経路を研究するために、下流のアポトーシスエフェクターの発現がｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価された。感染後９６時間で、プロ‐カスパーゼ３および全長ＰＡＲＰ‐１レベルが、Ａｄ‐ＧＦＰ対照細胞に比較して、Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ａ５４９およびＨ４６０細胞において低下した。Ｈ１２９９細胞では、全長ＰＡＲＰ‐１の減少が観察された。前駆体の切断は感染したＵ２０２０細胞では観察されなかった（図３Ｂ）。
【００２８】
Ｈ１２９９細胞における条件的Ｗｗｏｘ発現の影響。Ｈ１２９９／Ｉクローン７はｐｏｎＡにより誘導された時だけＷＷＯＸトランスジーンを発現し（図４Ａ）、その後の実験で使用された。Ｗｗｏｘ発現はｐｏｎＡ処理後用量‐依存的様式で（図４Ｂ）、２４から２７時間まで増加した（図４Ｃ）。
【００２９】
クローン７Ｈ１２９９／Ｉ−（非誘導）細胞は平板培養され、２４時間後（１日目）にＷｗｏｘ発現が１０μＭｐｏｎＡにより誘導された。最大発現は４日目に観察され、５日目までには細胞増殖は有意に影響を受け（図４Ｄ）、細胞数の低下を引き起こし、ＷｗｏｘがＨ１２９９細胞の増殖を阻止することを暗示した。
【００３０】
Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染肺癌細胞株の腫瘍形成性。ヌードマウスはｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍｏｉ１００のＡｄ‐ＧＦＰまたはＡｄ‐ＷＷＯＸに感染し、２４時間培養された、５ｘ１０６のＡ５４９、Ｈ４６０、およびＵ２０２０細胞を接種された。非感染細胞は腫瘍形成性対照として使用された。注射後２８日目に、腫瘍増殖はＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ｈ４６０細胞を接種されたマウスにおいて完全に抑制された（図５Ａ）。２８日目における対照（Ａｄ‐ＧＦＰおよび非処理Ｈ４６０細胞）の平均腫瘍重量はそれぞれ０．６１±０．１５および０．６４±０．１１ｇであった。２８日目において、Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ａ５４９細胞を接種されたマウス５匹のうち２匹は全く腫瘍を示さず、平均腫瘍重量は０．０８±０．０３ｇであり、Ａｄ‐ＧＦＰ‐感染Ａ５４９（０．８１±０．１６ｇ）および偽感染Ａ５４９（０．８６±０．１５ｇ）細胞の腫瘍より有意（Ｐ＜０．００１）に低かった（表１）。感染したＵ２０２０細胞を注射されたマウスでは、腫瘍増殖抑制は全く観察されなかった（図５Ａ）。
【００３１】
腫瘍形成性に関する誘導されたＷｗｏｘ発現の効果。我々は次にＡｄ‐ＷＷＯＸに感染した、またはｐｏｎＡによりＷｗｏｘを発現するように誘導されたＨ１２９９細胞の腫瘍形成性を比較した。ヌードマウスはＡｄ‐ＷＷＯＸまたはＡｄ‐ＧＦＰによる感染後２４時間目に１ｘ１０７細胞を接種された。５匹のマウスもｐｏｎＡ処理後２４時間目に、１ｘ１０７の非誘導Ｈ１２９９／Ｉ（Ｈ１２９９／Ｉ−）および１０７のＨ１２９９／Ｉ＋細胞を接種された。注射後２８日目に、Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ｈ１２９９細胞およびＨ１２９９／Ｉ＋細胞を接種された５匹のうち３匹および５匹のうち４匹のマウスは腫瘍を全く提示しなかった（図５Ｂ）。Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染（０．１０±０．２６ｇ）およびＨ１２９９／Ｉ＋（０．２１±０．３１ｇ）細胞由来の腫瘍の平均重量はＡｄ‐ＧＦＰ（１．６６±０．２８ｇ）、Ｈ１２９９／Ｉ−（１．９８±０．４１ｇ）、および親Ｈ１２９９（１．８７±１．３３ｇ）細胞由来の腫瘍と比較して有意に低下した（図７‐表１）。したがってウイルス感染によって送達された（Ａｄ‐ＷＷＯＸ）または不活性な“内因性”ＷＷＯＸ遺伝子の発現の誘導によるＷｗｏｘ発現（Ｈ１２９９／Ｉ＋）は、ヌードマウスにおける肺癌細胞増殖を抑制することにおいて効果的であった。
【００３２】
Ｈ１２９９／Ｉ＋を外植された腫瘍におけるＷｗｏｘ発現。ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＷｗｏｘ発現を評価するために、我々は親Ｈ１２９９、Ｈ１２９９／Ｉ−、およびＨ１２９９／Ｉ＋腫瘍に由来するフラグメントから抽出されたタンパク質のイムノブロット解析を行った；Ｗｗｏｘ発現はいずれの腫瘍からも見いだされなかった（図６Ａ）。外植され、培養されたＨ１２９９／Ｉ＋腫瘍のフラグメントはｐｏｎＡで処理し、イムノブロット解析によりＷｗｏｘ発現を試験することにより、誘導性ＷＷＯＸプラスミドの保持を検討された。Ｈ１２９９／Ｉ＋外植片におけるＷｗｏｘ誘導の検出は、ＷＷＯＸプラスミドが存在し、誘導性であることを明らかにし（図６Ｂ）、小型腫瘍が、ｉｎ  ｖｉｖｏでインデューサー欠如のためにＷｗｏｘ発現を損失している接種された細胞から得られたことを暗示した。
【００３３】
考察
革新的な治療的方策が肺癌治療にとって緊急に必要である。一般的な脆弱部位における遺伝子は新生物形成過程の初期に、とりわけ環境発現物質への暴露により、しばしば不活性化されるため、我々は癌の発生における脆弱遺伝子発現損失の効果、およびそれらの回復の治療的効果に関心をもってきた（２２）。いくつかの研究は、脆弱ＷＷＯＸ遺伝子発現は肺癌の顕著な割合において（１０、１６）、とりわけプロモーターの高度メチル化によって（１６）不活性化されることを暗示している。高度メチル化は可逆的であり、癌治療にとって有望な方策である。したがって、我々は内因性Ｗｗｏｘの発現を欠く肺癌細胞におけるＷｗｏｘ発現の回復が、肺癌細胞株に蓄積されている非常に多くの癌に関連した遺伝的変更にもかかわらず、悪性を無効にすることになるかどうかを確認してきた。我々はＡｄ‐ＷＷＯＸによる感染によって４種の肺癌細胞株におけるＷｗｏｘ発現を回復させ、内因性Ｗｗｏｘを欠く肺癌細胞の、非常に劇的な腫瘍形成性損失を観察している。
【００３４】
３種のＷｗｏｘ‐ネガティブ細胞株におけるＷＷＯＸ遺伝子の導入は、サブ‐Ｇ１ＤＮＡ内容物を持つ細胞の割合によって、および培養における細胞増殖の抑制によって示されるように、結果としてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアポトーシスを誘導した。サブ‐Ｇ１ＤＮＡ内容物を持つＷＷＯＸ‐感染Ｈ１２９９細胞の割合は、おそらくＨ１２９９細胞におけるＷｗｏｘ発現の回復後しばらくしてアポトーシスが起こる可能性があるため、他の２種のＷＷＯＸ‐ネガティブ細胞株より低かった；別の可能性は、腫瘍抑制効果は３種の肺癌細胞株において同様であるが、Ａ５４９およびＨ４６０細胞におけるｐ５３の発現が、Ｗｗｏｘタンパク質の発現とともに付加的な効果を示したということである。内因性Ｗｗｏｘを発現するＵ２０２０肺癌細胞はＷｗｏｘの過剰発現によって影響を受けず、正常なＷｗｏｘ‐発現肺細胞はＷＷＯＸ遺伝子治療後のＷｗｏｘ過剰発現によって影響を受けないことを暗示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける３種すべての肺癌細胞の増殖は、Ｗｗｏｘ過剰発現の数日後の細胞数の下降によって示されるように、ウイルス感染またはｐｏｎＡ誘導後のＷｗｏｘ過剰発現によって不都合に影響を受けた。
【００３５】
我々は、３種のＷＷＯＸ‐ネガティブ肺癌細胞株におけるＡｄ‐ＷＷＯＸ形質導入による、および安定にトランスフェクションされたＨ１２９９肺癌細胞におけるＷｗｏｘ発現の誘導による、肺癌細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成性の効率的な抑制を観察した。攻撃的なＨ４６０細胞株の腫瘍形成性はＡｄ‐ＷＷＯＸ処理により、注射後２８日目に完全に抑制された。腫瘍の発生およびサイズにおける有意な低下が、ＷＷＯＸ‐形質導入Ａ５４９およびＨ１２９９細胞を注射された動物において観察された。結果は、Ｗｗｏｘの損失が肺癌の病因に重要な役割を果たす可能性があることを暗示する。おそらく、ｉｎ  ｖｉｖｏ微小環境がともかくもＷｗｏｘアポトーシス経路を活性化するため、Ｈ１２９９細胞における両方のＷｗｏｘ回復の方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏよりｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、結果としていっそう劇的な効果になるように見えることは興味深い。
【００３６】
この研究は、ＷＷＯＸが細胞増殖阻止およびアポトーシスを肺癌細胞に誘導することを証明する。Ａ５４９およびＨ４６０細胞株において、我々は固有の経路によるカスパーゼ‐依存的なアポトーシスの誘導を観察した。Ｈ１２９９細胞では、我々は全長ＰＡＲＰ‐１の切断を観察したが、おそらくこれらの細胞においてアポトーシスが後になって起こるためにプロカスパーゼ３、９、および８は切断されなかった。ＷｗｏｘおよびＦｈｉｔタンパク質発現は、プロモーター高度メチル化に関連して肺、乳房、および膀胱癌においてしばしば低下する（１６）。エピジェネティックな変更は特定の薬剤または阻害剤によって無効にすることができ、治療薬のような阻害剤を暗示する（２３〜２６）。ＷｗｏｘのｐｏｎＡ‐誘導性発現は、エピジェネティックな機序によるサイレンシング後のＷＷＯＸ再活性化の効果のモデルと見なされうる。誘導性Ｗｗｏｘ発現を回復後の腫瘍形成性損失の程度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方におけるＡｄ‐ＷＷＯＸ発現後に観察される腫瘍抑制に匹敵し、Ｗｗｏｘの甚だしい過剰発現は腫瘍抑制をもたらすために必ずしも必要でないことを暗示した。この発見は、エピジェネティックにサイレンシングされたＷＷＯＸ遺伝子を再活性化可能な薬物が肺癌の治療に効果的でありうることを暗示する。
【００３７】
肺癌細胞におけるＷｗｏｘタンパク質発現の回復後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアポトーシスの誘導およびｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成性の抑制が起こり、Ｗｗｏｘシグナル経路の再活性化が肺癌予防および治療の潜在的な標的であることを暗示する。
【００３８】
特許法の条項に従って、本発明の原則および実施様式は好ましい態様において説明され、例示されている。しかし、本発明はその意図および範囲から逸脱せずに、明確に説明され、例示されたものと異なって実行されてもよいことは理解されるべきである。
【００３９】
参考文献
先に論じた参考文献および以下の参考文献は、それらが本明細書に述べたものに対する代表的な手続き上の、または他の補足的な細目を提供する程度に、明確に参照として本明細書に援用される。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ｗｗｏｘタンパク質の発現。（Ａ）内因性Ｗｗｏｘの発現はＵ２０２０およびＭＣＦ７細胞において検出されるが、Ｈ１２９９、Ｈ４６０、またはＡ５４９細胞では検出されない（５０μｇのタンパク質を負荷）。レーン１，Ｈ１２９９；レーン２、Ｈ４６０；レーン３、Ａ５４９；レーン４、Ｕ２０２０；レーン５、ＭＣＦ‐７。（Ｂ）Ａｄ‐ＷＷＯＸによる感染後のＷｗｏｘの発現（２５μｇ負荷）。レーン１，Ｈ１２９９、Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染；レーン２、Ｈ１２９９、Ａｄ‐ＧＦＰ‐感染；レーン３、Ｈ１２９９；レーン４、Ｈ４６０、Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染；レーン５、Ｈ４６０、Ａｄ‐ＧＦＰ‐感染；レーン６、Ｈ４６０；レーン７，Ａ５４９、Ａｄ‐ＷＷＯＸ‐感染；レーン８，Ａ５４９、Ａｄ‐ＧＦＰ‐感染；レーン９，Ａ５４９。
【図２】非処理、Ａｄ‐ＧＦＰ‐、およびＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染細胞のフローサイトメトリー解析。Ｗｗｏｘ‐ネガティブＡ５４９、Ｈ４６０、およびＨ１２９９細胞はＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染によるＷｗｏｘ発現の回復後５日目にアポトーシスに至るが、Ｕ２０２０細胞は影響を受けない。Ａｄ‐ＧＦＰ感染はアポトーシスを誘導しなかった。
【図３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖に対するＷｗｏｘ発現の影響。（Ａ）非感染、Ｗｗｏｘ‐ネガティブＡ５４９、Ｈ４６０、およびＨ１２９９細胞、ならびにＡｄ‐ＧＦＰおよびＡｄ‐ＷＷＯＸによる感染後の細胞の増殖。（Ｂ）ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３のイムノブロット検出。レーン１，Ａ５４９；レーン２、Ａ５４９／Ａｄ‐ＧＦＰ；レーン３、Ａ５４９／Ａｄ‐ＷＷＯＸ；レーン４、Ｈ４６０；レーン５、Ｈ４６０／Ａｄ‐ＧＦＰ；レーン６、Ｈ４６０／Ａｄ‐Ｗｗｏｘ；レーン７、Ｈ１２９９；レーン８、Ｈ１２９９／Ａｄ‐ＧＦＰ；レーン９、Ｈ１２９９／Ａｄ‐ＷＷＯＸ；レーン１０、Ｕ２０２０；レーン１１、Ｕ２０２０／Ａｄ‐ＧＦＰ；レーン１２、Ｕ２０２０／Ａｄ‐ＷＷＯＸ。ＰＡＲＰはＷｗｏｘがＡｄ‐Ｗｗｏｘ‐感染により回復する場合、Ｗｗｏｘ‐ネガティブ細胞株において切断される（レーン３、６および９）。カスパーゼ３はＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染後、Ａ５４９およびＨ４６０（レーン３および６）において切断されるが、Ｈ１２９９細胞では切断されない。Ｕ２０２０細胞では、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３のいずれもＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染後に切断されない（レーン１２）。
【図４】Ｈ１２９９／Ｉ細胞におけるＷｗｏｘの誘導性発現。（Ａ）細胞は１０μＭｐｏｎＡの存在下（＋）または非存在下（−）において４８時間培養され、Ｗｗｏｘ発現に関して試験された。ｐｏｎＡによる誘導後にだけトランスジーンを発現するクローン７および２がその後の実験に使用された。ＧＡＰＤＨ発現は負荷対照として使用された。（Ｂ）Ｈ１２９９／Ｉクローン７細胞は次第に濃度を増加させたｐｏｎＡの非存在下および存在下で４８時間インキュベートした。Ｗｗｏｘレベルは用量‐依存的様式で増し、比重測定により定量し、ＧＡＰＤＨ発現レベルに標準化した。（Ｃ）１０μＭｐｏｎＡによる処理後のＨ１２９９／Ｉクローン７細胞におけるＷｗｏｘ誘導の時間経過。（Ｄ）Ｈ１２９９／Ｉクローン７細胞の増殖に対する１０μＭｐｏｎＡの効果。１日目に、ｐｏｎＡが添加され、最大Ｗｗｏｘ発現は４日目に見いだされた。５日目から、誘導された細胞（Ｈ１２９９／Ｉ＋）は非誘導細胞（Ｈ１２９９／Ｉ−）より有意に遅く増殖する（Ｐ＜０．００１）。実験はトリプリケートで行われた。
【図５】肺癌細胞の腫瘍形成性に対するＷｗｏｘ発現の効果。（Ａ）非処理、Ａｄ‐ＧＦＰ‐、およびＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ａ５４９、Ｈ４６０、およびＵ２０２０肺癌細胞の腫瘍容積。Ａ５４９およびＨ４６０細胞におけるＷｗｏｘ発現の回復はＡｄ‐ＧＦＰ感染細胞と比較して有意に（Ｐ＜０．００１）腫瘍増殖を抑制した。（Ｂ）非処理、Ａｄ‐ＧＦＰ‐、およびＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ｈ１２９９細胞ならびにＨ１２９９／Ｉ−およびＨ１２９９／Ｉ＋細胞の腫瘍容積。腫瘍はＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ｈ１２９９細胞において、およびＨ１２９９／Ｉ＋細胞において抑制された。（Ｃ）非感染、Ａｄ‐ＧＦＰ‐、およびＡｄ‐ＷＷＯＸ‐感染Ａ５４９ならびにＨ１２９９／Ｉ−およびＨ１２９９／Ｉ＋細胞による腫瘍形成の例。
【図６】Ｈ１２９９／Ｉ−およびＨ１２９９／Ｉ＋細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ解析。（Ａ）イムノブロット解析によるＷｗｏｘ発現に関して試験された、Ｈ１２９９（レーン１）、非誘導Ｈ１２９９／Ｉ−（レーン２、３および４）、および誘導されたＨ１２９９／Ｉ＋（レーン５）腫瘍由来のタンパク質溶解産物。ＷｗｏｘはＨ１２９９／Ｉ−またはＨ１２９９／Ｉ＋腫瘍において発現されなかった。（Ｂ）Ｈ１２９９／Ｉ＋腫瘍の一部は平板培養され、細胞はｐｏｎＡで処理された。Ｗｗｏｘは１０μＭｐｏｎＡによる処理後４８時間目に再発現され、誘導性ＷＷＯＸプラスミドの存在を示唆した。
【図７】表１‐ヌードマウスにおける腫瘍重量（グラム）±ＳＤ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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