(57)【要約】【課題】目的の化合物の免疫原性を改良するための手段及び方法を提供すること。更に、免疫原性再現性を誘導及び／又は強化すること。【解決手段】化合物の免疫原性再現性及び／又は免疫原性を誘導及び／又は強化するための方法。目的の化合物の免疫原性は、前記化合物の立体構造を（更に）拘束することにより、誘導及び／又は改善される。免疫原性化合物の免疫原性再現性は、前記化合物の立体構造が（更に）拘束されることにより、誘導及び／又は強化される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の免疫原性再現性及び／又は免疫原性を誘導及び／又は強化するための方法であって、
少なくとも１つの足場及び／又は担体に結合する前記化合物中の少なくとも２つの異なる部位での結合の形成によって、並びに、
前記化合物中での少なくとも１つの内部結合の形成によって、少なくとも部分的に前記化合物の立体構造が拘束される方法。
【請求項２】
前記免疫原性化合物が、目的のタンパク質性分子の少なくとも一部のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、動物において、目的の前記タンパク質性分子に対して、免疫反応を誘導及び／又は強化できる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記内部結合が、ＳＳ−架橋、Ｓｅ−Ｓｅジセレン結合、末端ＣＣ−二重結合、末端ＣＣ−三重結合、Ｂｒ−ＳＨ結合又はアミド結合を含んでなる、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が少なくとも２つの結合を介して前記足場及び／又は担体に結合する、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記足場が、
−  ハロゲノアルカン、好ましくはジハロアルカン、トリハロアルカン又はテトラハロアルカン、及び／又は、
−  アリル基系、好ましくは２つのアリル基を有するハロゲン原子を含んでなる足場、及び／又は、
−  少なくとも２つのハロメチル基を含んでなる足場、及び／又は、
−  （ヘテロ）芳香族分子、好ましくは少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族分子、
を含んでなる、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記足場がハロメチルアレーンであり、好ましくはビス（ブロモメチル）ベンゼン、（トリス（ブロモメチル）ベンゼン及びテトラ（ブロモメチル）ベンゼン）、並びにその誘導体からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記足場が、オルト−、メタ−及びパラ−ジハロキシレン及び１，２，４，５テトラハロジュレンからなる群から選択され、好ましくはメタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｍ−Ｔ２）、オルト−１，２−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｏ−Ｔ２）、パラ−１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｐ−Ｔ２）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ピリジン（ｍ−Ｐ２）、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（Ｔ３）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）−５−アジドベンゼン（ｍ−Ｔ３−Ｎ３）、及び／又は１，２，４，５テトラブロモジュレン（Ｔ４）である、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
目的の前記タンパク質性分子が、システイン−ｋｎｏｔファミリー、膜貫通タンパク質、ＴＮＦ−α、ＨＧＦ／ＳＦ、ＦＧＦ−β、インターロイキン、ＩＬ−５、ケモカイン、Ｇタンパク質共役受容体、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩＧＦ、ＬＭＦ、エンドセリン−１、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＰＩＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥｒｂＢファミリー、ＨＥＲ１／ＥＧＦ−Ｒ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｐ５３、コルチコトロピンＲＦ、ＡＣＴＨ、副甲状腺ホルモン、ＣＣＫ、Ｐ物質、ＮＰＹ、ＧＲＰ、ニューロトロフィン、アンギオテンシン−２、アンジオゲニン、エリスロポエチン、ニューロテンシン、ＳＬＣＬＣ、ＳＡＲＳ由来タンパク質、ＨＩＶ由来タンパク質、乳頭腫ウイルス由来タンパク質及びＦＭＤＶからなる群から選択される、請求項２から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記システイン−ｋｎｏｔタンパク質ファミリーのメンバーが、糖タンパク質ホルモン−β（ＧＬＨＢ）サブファミリー、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）サブファミリー、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）サブファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）サブファミリー又は糖タンパク質ホルモン−α（ＧＬＨＡ）サブファミリーのメンバーである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
化合物の免疫原性再現性及び／又は免疫原性を誘導及び／又は強化するための方法であって、前記化合物中の少なくとも２つの内部結合の形成によって、少なくとも部分的に前記化合物の立体構造が拘束される方法。
【請求項１２】
前記化合物が、担体に結合する、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
足場及び／又は担体と結合したアミノ酸配列を含んでなり、前記アミノ酸配列が、少なくとも１つの内部結合を含んでなる、免疫原性化合物。
【請求項１４】
前記内部結合が、ＳＳ−架橋、Ｓｅ−Ｓｅジセレン結合、末端ＣＣ−二重結合、末端ＣＣ−三重結合、Ｂｒ−ＳＨ結合又はアミド結合を含んでなる、請求項１３記載の免疫原性化合物。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が少なくとも２つの結合を介して前記足場に結合する、請求項１３又は１４記載の免疫原性化合物。
【請求項１６】
前記足場が（ヘテロ）芳香族分子、好ましくは少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族分子を含んでなる、請求項１３から１５のいずれか１項記載の免疫原性化合物。
【請求項１７】
前記足場がハロメチルアレーンであり、好ましくはビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン及びテトラ（ブロモメチル）ベンゼン、並びにその誘導体からなる群から選択される、請求項１３から１６いずれか１項記載の免疫原性化合物。
【請求項１８】
前記足場が、オルト−、メタ−及びパラ−ジハロキシレン及び１，２，４，５テトラハロジュレン、好ましくはメタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｍ−Ｔ２）、オルト−１，２−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｏ−Ｔ２）、パラ−１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｐ−Ｔ２）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ピリジン（ｍ−Ｐ２）、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（Ｔ３）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）−５−アジドベンゼン（ｍ−Ｔ３−Ｎ３）及び／又は１，２，４，５テトラブロモジュレン（Ｔ４）からなる群から選択される、請求項１３から１７のいずれか１項記載の免疫原性化合物。
【請求項１９】
請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物と、薬理学的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含んでなる免疫原性組成物。
【請求項２０】
薬剤及び／又はワクチン用途への、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物。
【請求項２１】
システイン−ｋｎｏｔファミリー、膜貫通タンパク質、ＴＮＦ−α、ＨＧＦ／ＳＦ、ＦＧＦ−β、インターロイキン、ＩＬ−５、ケモカイン、Ｇタンパク質共役受容体、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩＧＦ、ＬＭＦ、エンドセリン−１、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＰＩＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥｒｂＢファミリー、ＨＥＲ１／ＥＧＦ−Ｒ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｐ５３、コルチコトロピンＲＦ、ＡＣＴＨ、副甲状腺ホルモン、ＣＣＫ、Ｐ物質、ＮＰＹ、ＧＲＰ、ニューロトロフィン、アンギオテンシン−２、アンジオゲニン、エリスロポエチン、ニューロテンシン、ＳＬＣＬＣ、ＳＡＲＳ由来タンパク質、ＨＩＶ由来タンパク質、乳頭腫ウイルス由来タンパク質及び／又はＦＭＤＶのメンバーの存在に関連する障害に対する薬剤及び／又はワクチンの調製への、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物の使用。
【請求項２２】
前記免疫原性化合物が、ＶＥＧＦ、ｈＣＧ、ＰｌＧＦ、ＨＥＲ及び／又はＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、腫瘍関連の疾患に対する薬剤及び／又はワクチンの調製への、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物の使用。
【請求項２３】
前記免疫原性化合物が、ＶＥＧＦのアミノ酸配列の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、血管新生に対する薬剤及び／又はワクチンの調製への、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物の使用。
【請求項２４】
前記免疫原性化合物が、ＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、腫瘍関連の疾患の間の転移形成に対する薬剤の及び／又はワクチンの調製への、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物の使用。
【請求項２５】
請求項１３から１８のいずれか１項記載の化合物の調製方法であって、
−  少なくとも第１及び第２の反応基を含んでなる足場を提供するステップと、
−  前記少なくとも第１及び第２の反応基と反応できる少なくとも１つの分子を準備するステップであって、前記分子がアミノ酸配列を含んでなるステップと、
−  前記足場と前記少なくとも１つの分子とを接触させて、カップリング反応において、前記足場と前記少なくとも１つの分子との少なくとも２つの結合を形成させるステップであって、結合の形成により、連続的な結合の形成が加速され、好ましくは、前記カップリング反応が溶液において、好ましくは水溶液においてなされるステップと、
−  前記分子の内部での内部結合の形成を可能にし、誘導し及び／又は強化するステップと、
を含んでなる方法。
【請求項２６】
前記内部結合が、ＳＳ−架橋、Ｓｅ−Ｓｅジセレン結合、末端ＣＣ−二重結合、末端ＣＣ−三重結合、Ｂｒ−ＳＨ結合又はアミド結合を含んでなる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記足場が、（ヘテロ）芳香族分子、好ましくは少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族分子を含んでなる、請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
前記足場が、ハロメチルアレーンであり、好ましくはビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン及びテトラ（ブロモメチル）ベンゼン、並びにその誘導体からなる群から選択される、請求項２５から２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記足場が、オルト−、メタ−及びパラ−ジハロキシレン及び１，２，４，５テトラハロジュレンからなる群から選択され、好ましくはメタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｍ−Ｔ２）、オルト−１，２−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｏ−Ｔ２）、パラ−１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｐ−Ｔ２）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ピリジン（ｍ−Ｐ２）、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（Ｔ３）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）−５−アジドベンゼン（ｍ−Ｔ３−Ｎ３）又は１，２，４，５テトラブロモジュレン（Ｔ４）である、請求項２５から２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
動物に、腫瘍関連の疾患に対するワクチン投与をする方法であって、前記動物に、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物を適切な投与量で投与するステップを有してなり、前記免疫原性化合物が、ＶＥＧＦ、ｈＣＧ、ＰｌＧＦ、ＨＥＲ及び／又はＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する方法。
【請求項３１】
動物に、血管新生に対するワクチン投与をする方法であって、前記動物に、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物を適切な投与量で投与するステップを有してなり、前記免疫原性化合物が、ＶＥＧＦのアミノ酸配列の少なくとも一部と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する方法。
【請求項３２】
動物に、腫瘍関連の疾患、好ましくは前立腺癌の間の転移形成に対するワクチン投与をする方法であって、前記動物に、請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物を適切な投与量で投与するステップを有してなり、前記免疫原性化合物が、ＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する方法。
【請求項３３】
抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を産生させる方法であって、
−  請求項１３から１８のいずれか１項記載の免疫原性化合物及び／又は請求項１９記載の免疫原性組成物を、ヒト以外の動物にワクチン投与をするステップと、
−  前記動物から前記免疫原性化合物と特異的に結合できる抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を回収するステップと、
を有してなる方法。
【請求項３４】
前記動物から得られる前記抗体を使用して、単クローン抗体を産生させるステップを更に有してなる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記一部が、目的の前記タンパク質性分子の（ヘアピン）ループに存在するエピトープを含んでなる、請求項２から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも２つの結合を介して足場及び／又は担体と結合したアミノ酸配列を含んでなるタンパク質擬態物であって、前記アミノ酸配列が、少なくとも１つの内部ＳＳ−架橋を含んでなるタンパク質擬態物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学及び免疫学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫原性化合物の検出、同定、単離及び生成技術に対する関心が高まりつつある。免疫原性化合物は、多種多様な用途（例えば例えばワクチン投与プログラム及び目的の抗体、Ｂ細胞及びＴ細胞の産生）で用いられる。ワクチン投与においては、免疫原性化合物を用いて宿主の免疫反応を生じさせる。免疫反応は好ましくは、目的の抗原（例えば病原体又は腫瘍）の存在が関与する疾患に対する防御免疫反応である。かかる免疫原性化合物は、典型的には、目的の前記抗原に完全に、又は部分的に由来するペプチド配列を含んでなる。
【０００３】
免疫原性化合物はまた、目的の抗体、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞を得るために広く用いられている。ヒト以外の動物に対して、免疫原性化合物をワクチン投与し、その後、抗体、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞を動物から回収し、更なる使用に供する。特に、目的の免疫原性化合物を開始物質としてモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の産生は、重要な応用である。ｍＡｂｓの利点としては特に、疾患の原因に関与しうる特定の細胞又は化学伝達物質に対するそれらの標的能力が挙げられる。この特性により、ｍＡｂｓは従来の治療よりも優れた臨床効果を発揮でき、その一方で、一般に副作用を伴うことなく、有効かつ寛容できる治療オプションを患者に提供することにもつながりうる。
【０００４】
当該技術分野で多くの技術開発がなされているもかかわらず、免疫付与により、必ずしも所望の効果が得られていない。例えば、自己抗原に対する免疫付与は、宿主の免疫系は原則として自己抗原を標的としないため、困難である。しかしながら、自己抗原に対する免疫反応は、例えば自己抗原が腫瘍細胞に存在するような様々なケースにおいては要求される。腫瘍に存在する自己抗原に対する免疫反応により、腫瘍が予防できるからである。更に、腫瘍成長は血管新生を必要とする。すなわち新しい血管が形成されることにより、栄養分が腫瘍部位に輸送され、また腫瘍からの老廃物が輸送される。血管新生は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（また脈管透過性要因（ＶＰＦ）とも称される）などの内在性成長ホルモンの作用を伴う。ゆえに、かかる成長因子の作用をアンタゴナイズすることは、血管新生が妨げられるため、腫瘍成長に間接的に逆作用する。
【０００５】
宿主の免疫反応が一般に自己抗原に対して不活性であるという事実から考察すると、免疫反応を誘発できるだけの、自己抗原に対する十分な相違を有する免疫原性化合物がしばしば生じるが、自己抗原との十分な類似性を有するため、それにより誘発された免疫反応はまた、上記自己抗原に対して活性を示す。更に、免疫原性はしばしば、担体（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））及び／又はアジュバント（例えば不完全フロイントアジュバント）で強化される。しかしながら、目的の抗原に対する十分に強い免疫反応を得るには至っていない。
【０００６】
免疫学の分野において遭遇する他の課題は、免疫原性再現性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）が得られないことである。これは、所望の免疫反応が１個体の動物においては得られるが、同じ種の第２の動物においては、それらの動物が同じ種類の免疫原性化合物でワクチン投与を受けた場合であっても、当該免疫反応が得られないか、あるいは著しく小さい程度に留まることを意味する。同じ種の動物間における、この免疫反応の変動性に関しては十分理解されていない。個体間の生物学的多様性は、異なる動物間での免疫系の相違の原因になるものと一般的には考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、目的の化合物の免疫原性を改良するための手段及び方法を提供することである。本発明の更なる目的は、免疫原性再現性を誘導及び／又は強化することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの態様は、化合物の免疫原性再現性及び／又は免疫原性を誘導及び／又は強化するための方法の提供に関し、当該方法では、少なくとも部分的に前記化合物の立体構造が拘束される。
【０００９】
本発明では、目的の化合物の免疫原性は、前記化合物の立体構造を（更に）拘束することにより、誘導及び／又は改善される。免疫原性は更に、例えば担体に対する結合により、前記化合物が既に限られた立体構造しかとれないときに改良される。また、更に立体構造を拘束することにより、免疫原性が大幅に向上する。（更に）拘束された立体構造を有する化合物を動物に投与した場合、目的の特定の抗原に対する免疫反応が誘発され、その誘発は、拘束されていない立体構造を有する同じ種類の化合物を、同じ種類の動物に投与した場合と比較し強い。免疫反応の程度は例えば、ワクチン投与された動物の血液サンプルの抗体価の測定により測定される。
【００１０】
更に、本発明では、免疫原性化合物の免疫原性再現性は、前記化合物の立体構造が（更に）拘束されることにより、誘導及び／又は強化される。本発明の方法により、同じ種の一群の動物に投与したときに、従来公知の免疫原性化合物と比較して、前記同じ種の一群の動物のより大きな割合において免疫反応を誘導できる、免疫原性化合物を調製することが可能になった。ゆえに、立体構造の拘束を有する本発明に係る免疫原性化合物は、立体構造の拘束を有さない同じ種類の化合物と比較し、同じ種の一群の動物のより高いパーセンテージにおいて、顕著な免疫反応を誘発することができる。動物間の多様性は少なくなる。これはすなわち、本発明に係る免疫原性化合物で、同じ種の幾つかの動物をワクチン投与した場合、動物において誘発される免疫反応が、従来公知の免疫原性化合物で免疫された同じ種の動物と比較し、変化が少ないことを意味する。ゆえに伝播も減少する。更に、集団のより大きな割合において免疫反応を誘導することが可能になった。したがって、顕著な免疫反応を得る可能性が、各個人において増加する。これは、例えば一群の動物又はヒトの個体群がワクチン接種を受けるとき（疾患に対する各個体の保護が要求されるため）幾つかのヒト以外の動物にワクチン処理をして、抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を得るとき（最大の収量を得るため）、及び臨床試験のとき（動物個体間の多様性による免疫原性試験の結果の相違が少ないため）、特に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】２つのハロメチル基が、オルト−、メタ−又はパラ−配置で存在する芳香族足場。Ｈａｌは、塩素、臭素又はヨウ素原子を指す。１，２−ビス（ハロメチル）ベンゼン及び他のレギオ異性体、３，４−ビス（ハロメチル）ピリジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、３，４−ビス（ハロメチル）ピリダジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、４，５−ビス（ハロメチル）ピリミジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、４，５−ビス（ハロメチル）ピラジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体４，５−ビス（ハロメチル）−１，２，３−トリアジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、５，６−ビス（ハロメチル）−１，２，４−トリアジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、３，４−ビス（ハロメチル）ピロール（Ｘ＝Ｎ）、−フラン（Ｘ＝Ｏ）、−チオフェン（Ｘ＝Ｓ）及び他のレギオ異性体、４，５−ビス（ハロメチル）イミダゾール（Ｘ＝Ｎ，Ｎ）、−オキサゾール（Ｘ＝Ｎ，Ｏ）、−チアゾール（Ｘ＝Ｓ）及び他のレギオ異性体、４，５−ビス（ハロメチル）−３Ｈ−ピラゾール（Ｘ＝Ｎ，Ｎ）、−イソオキサゾール（Ｘ＝Ｎ、Ｏ）、−イソチアゾール（Ｘ＝Ｓ）及び他のレギオ異性体、１，２−ビス（ブロモメチルカルボニルアミノ）ベンゼン（Ｘ１＝ＮＨ、Ｘ２＝Ｏ）、２，２’−ビス（ハロメチル）ビフェニレン、２，２”−ビス（ハロメチル）ターフェニレン、１，８−ビス（ハロメチル）ナフタレン、１，１０−ビス（ハロメチル）アントラセン、ビス（２−ハロメチルフェニル）メタン。
【図２】３つのハロメチル基が、オルト−、メタ−又はパラ−配置で存在する芳香族足場。１，２，３−トリス（ハロメチル）ベンゼン及び他のレギオ異性体、２，３，４−トリス（ハロメチル）ピリジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、２，３，４−トリス（ハロメチル）ピリダジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、３，４，５−トリス（ハロメチル）ピリミジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、４，５，６−トリス（ハロメチル）−１，２，３−トリアジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、２，３，４−トリス（ハロメチル）ピロール（Ｘ＝Ｎ）、−フラン（Ｘ＝Ｏ）、−チオフェン（Ｘ＝Ｓ）及び他のレギオ異性体、２，４，５−ビス（ハロメチル）イミダゾール（Ｘ＝Ｎ，Ｎ）、−オキサゾール（Ｘ＝Ｎ、Ｏ）、−チアゾール（Ｘ＝Ｓ）及び他のレギオ異性体、３，４，５−ビス（ハロメチル）−１Ｈ−ピラゾール（Ｘ＝Ｎ，Ｎ）、−イソオキサゾール（Ｘ＝Ｎ、Ｏ）、−イソチアゾール（Ｘ＝Ｓ）及び他のレギオ異性体、２，４，２−トリス（ハロメチル）ビフェニレン、２，３’，２”−トリス（ハロメチル）ターフェニレン、１，３，８−トリス（ハロメチル）ナフタレン、１，３，１０−トリス（ハロメチル）アントラセン、ビス（２−ハロメチルフェニル）メタン。
【図３】４つのブロモメチル基が、オルト−、メタ−又はパラ−配置で存在する芳香族足場。１，２，４，５−テトラ（ハロメチル）ベンゼン及び他のレギオ異性体、１，２，４，５−テトラ（ハロメチル）ピリジン（Ｘ＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、２，４，５，６−テトラ（ハロメチル）ピリミジン（Ｘ１＝Ｘ２＝Ｎ）及び他のレギオ異性体、２，３，４，５−テトラ（ハロメチル）ピロール（Ｘ＝ＮＨ）、−フラン（Ｘ＝Ｏ）、−チオフェン（Ｘ＝Ｓ）及び他のレギオ異性体、２，２’，６，６’−テトラ（ハロメチル）ビフェニレン、２，２”，６，６”−テトラ（ハロメチル）ターフェニレン、２，３，５，６−テトラ（ハロメチル）ナフタレン、２，３，７，８−テトラ（ハロメチル）アントラセン、ビス（２，４−ビス（ハロメチル）フェニル）メタン（Ｘ＝ＣＨ２）。
【図４】Ｃｙｓ−ｋｎｏｔ成長因子ファミリーのＢ３−ループ、及びそのペプチド擬態物の概略図。パネルＡは、Ｃｙｓ−ｋｎｏｔタンパク質ファミリーの様々なメンバーの一般的なループ構造を示す。パネルＢは、ＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶ残基を有するＢ３−ループを示す。パネルＣは、２つのシステインが本発明のポリペプチドに導入された、ペプチド擬態物の構造のデザインを示す。これらのシステインを介する足場（Ｔとして示す）への、上記ポリペプチドの共有結合により、野生型タンパク質のＢ３−ループの二次構造的に類似する形態が、当該ペプチドに付与される。
【図５】ＦＳＨ−６３ループｍＴ２／ＳＳ  ＣＬＩＰＳ−ペプチドのワクチン投与試験による抗体応答を示す。
【図６】ＦＳＨ−６３ループに由来する、直鎖状、一重拘束型（Ｔ２又はＳＳ）及び二重拘束型（Ｔ２及びＳＳ）のペプチドを用いた、ワクチン投与試験による抗体応答を示す。
【図７】ＶＥＧＦ−Ａβ５−ループ−β６部分に由来する、直鎖状、一重拘束型（Ｔ２のみ）及び二重拘束型（Ｔ２及びＳＳ）ペプチドを用いた免疫付与実験によって得られた、抗ペプチド抗血清によるＥＬＩＳＡ競合試験を示す。
【図８】ＣＣＲ５コレセプタ（ＧＰＣＲ−ファミリー）中のＥＣＬ２ａ−ループに由来する、直鎖状、一重拘束型（Ｔ２のみ）及び二重拘束型（Ｔ２及びＳＳ）ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ競合試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
免疫原性化合物により免疫反応を誘発できるいかなる動物も、用語「動物」に包含される。好ましくは動物には哺乳類が包含される。１つの好適な態様では、前記動物にはヒト個体が包含される。しかしながら、他の実施形態では、例えば免疫反応を誘導して抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を調製するために場合には、前記動物にはヒト以外の動物が包含される。
【００１３】
化合物の立体構造は、化合物の可能な空間的配置の数として定義される。１つの共有結合のまわりの回転からみて、フリーの化合物はしばしば多くの異なる形態を採る。化合物の立体構造の拘束には、ありうる空間的配置の数を拘束することが必要であり、それによって、化合物に特定の高次構造を、より多くの時間採らせることを強制する。
【００１４】
本願明細書において免疫原性再現性とは、両方の動物が同じ免疫原性化合物によって、ワクチン投与を受けるときに、１匹の動物において得られる同じ種類の免疫反応が、同じ種の第２の動物においても得られる可能性として定義される。免疫原性再現性が強化される場合、一群の動物のより大きいパーセンテージが、同じ種類の免疫反応を示す。同じ種類の免疫反応とは、免疫反応の特異性及び程度がほぼ同等であることを意味する。抗体力価（血清の抗体濃度を意味する）は、しばしば血清の希釈値として用いられる。その濃度においては、結合ＥＬＩＳＡのＯＤは＞３×バックグラウンド−ＯＤとして表される。両方の動物の抗体価の相違が１００倍、好ましくは５０倍未満、最も好ましくは３０倍未満である場合、第１の動物の免疫反応は、第２の動物の免疫反応と同等である。抗体価がＬｏｇ値として表される場合、両方の動物の抗体価の相違が２．０未満、好ましくは１．５未満である場合、第１の動物の免疫反応は第２の動物の免疫反応と同等である。
【００１５】
化合物の免疫原性は、当該化合物が、自身の化合物及び／又は好ましくは目的の分子に対して特異的な免疫反応を誘発する能力であると定義する。好ましくは、前記目的の分子はタンパク質性分子を含んでなる。好ましくは、前記化合物は、前記目的の分子と強く結合し、生物学的活性を中和する抗体を誘発できる。
【００１６】
タンパク質性分子とは、アミノ酸残基を含んでなる分子が、ペプチド結合を経て各々結合している分子であると定義する。前記分子は、１個又は複数個の非アミノ酸部分を含んでなってもよい。
【００１７】
化合物が目的の（タンパク質性の）分子に対する特異的な免疫反応を誘発する能力は、交差反応性と呼ばれている。本発明に係る方法は好ましくは、化合物の交差反応性を誘導及び／又は強化するために用いられる。したがって、好ましい実施形態では、化合物の交差反応性を誘導及び／又は強化する方法の提供に関し、詳細には当該方法は、少なくとも部分的に前記化合物の立体構造が拘束されるステップを有してなる。免疫原性化合物は、好ましくは目的のタンパク質性分子に由来し、それはすなわち、前記免疫原性化合物が、目的の前記タンパク質性分子と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなることを意味する。目的のタンパク質性分子と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなる免疫原性化合物は、好ましくは目的の前記タンパク質性分子に特異的な免疫反応を誘導できる。本発明に係る免疫原性化合物はゆえに、好ましくは目的のタンパク質性分子のアミノ酸配列の少なくとも一部と少なくとも５０％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。好ましい実施形態では、前記アミノ酸配列は、目的のタンパク質性分子のアミノ酸配列の少なくとも一部と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の相同性を有する配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。かかる免疫原性化合物は目的のタンパク質性分子に対して免疫反応の誘発に特に適している。好ましい一実施形態では、前記免疫原性化合物は、動物が前記タンパク質性分子自体によってワクチン投与を受ける場合と比較し、目的の前記タンパク質性分子に対するより強い免疫反応を誘発できる。これは例えば、自己抗原に由来するアミノ酸配列を修飾することによって可能となる。個体の免疫系が原則として自己抗原に対する活性を有さないため、修飾された配列は天然型の配列と比較し、免疫反応の誘発が好適に行える。例えばアミノ酸配列の免疫原性を改良する方法はＴＤＫ−Ａｌａｓｃａｎ法及び／又は置換ネットマッピング（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｎｅｔ  ｍａｐｐｉｎｇ）法などが挙げられ、公知技術である。ＴＤＫ−Ａｌａｓｃａｎでは、アラニンによる元のアミノ酸残基の置換を行う。置換ネットマッピング法では、元のアミノ酸残基を、他の任意のアミノ酸残基で置換する。好ましくは、複数の分子を生じさせ、それぞれの鎖のアミノ酸残基は、アラニンによって、又は他のあらゆるアミノ酸残基によって置換される。その後、例えば目的の抗原と特異的に結合できる抗体に対する結合アフィニティを測定することによって、得られる分子の免疫原性（好ましくは交差反応性を含んでなる）を試験する。所望の特徴を有する分子をその後、同定及び／又は分離する。前記分子を、免疫付与のために用いてもよく、又は他のラウンドにおいて、置換及び選抜を行い、更に最適化してもよい。当然ながら他の最適化手順も同様に適用できる。
【００１８】
一実施形態では、目的のタンパク質性分子の非免疫優性部位に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０、８０、９０又は９５％の相同性を有するアミノ酸配列が用いられる。免疫優性部位とは、目的のタンパク質性分子による免疫付与の後、免疫反応が主に標的とする部位のことを指す。かかる免疫優性部位は、例えば容易にアクセスできる。しかしながら、例えば受容体結合部位などの、免疫優性でない他の特定の部位に対する抗体を誘発することが通常望ましい。その場合、前記特定の非免疫優性部位に由来するペプチドの使用が好ましい。この実施態様は例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）（例えば例えばケモカインレセプタＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４）の受容体結合部位に対して特異的に免疫反応を誘導及び／又は強化することに適している。
【００１９】
本発明の一態様はすなわち、立体構造の拘束を有する免疫原性化合物の使用により、目的のタンパク質性分子に対する動物の免疫反応を誘導及び／又は強化する方法の提供に関する。好ましくは、少なくとも部分的な防御的及び／又は治癒的免疫反応が誘発される。防御免疫反応は、ワクチン投与を受けた動物における、目的の前記タンパク質性分子の存在に関連する疾患が、軽減される（あるいはなくなる）ことを意味する。例えば、前記タンパク質性分子が病原体に存在する場合、動物を免疫した後では、前記動物における前記病原体による感染症が緩和され、好ましくは完全に治癒する。他の例として、前記タンパク質性分子が腫瘍に存在する場合、あるいは、腫瘍の成長に関係する場合、前記ワクチン投与をされた動物では、前記腫瘍（の成長）を予防及び／又は抑止されうる。その結果、かかる動物では、腫瘍関連の疾患が緩和されるか、又は完全に治癒する。
【００２０】
治癒的免疫反応とは、目的のタンパク質性分子の存在に関連する疾患に既に罹患する動物において、前記疾患（の兆候）が良好に防止されうることを意味する。
【００２１】
化合物の立体構造は、様々な方法で拘束される。好ましくは、上記立体構造は、前記化合物中の少なくとも２つの異なる部位での結合の形成により拘束される。前記化合物中の前記少なくとも２つの異なる部位の各々は、他の化合物（例えば足場）に、又は前記化合物中の他の部位に結合し、それにより内部結合が形成される。上記結合は、好ましくはエピトープの外側の部位で形成される。これは、動物の免疫系によって生じる抗体及び／又はＴ細胞受容体により認識されるべき目的のエピトープの一部であるアミノ酸残基が、好ましくは結合を形成するために用いられないことを意味する。なぜなら、これにより動物の免疫系による前記エピトープの認識が通常妨げられるからである。典型的には、目的のかかるエピトープは、目的のタンパク質性分子に対して免疫反応を誘発できるエピトープを含んでなる。目的のかかるエピトープのアミノ酸が結合の形成に用いられる場合、得られる化合物は、その後の目的のタンパク質性分子の認識による免疫反応の誘発が弱まるか、あるいは完全に消失する。
【００２２】
結合がエピトープ内部に存在するとき、好ましくは、重要でないか又は抗体結合にほとんど関係しないアミノ酸位との間で結合が形成されなければならない。ゆえに、最も好ましくは、エピトープ中の重要なアミノ酸が、結合を形成するために用いられない。エピトープの重要なアミノ酸とは、その存在により、目的のタンパク質性分子を認識できる免疫反応を誘発するために必要とされるアミノ酸である。当業者であれば、エピトープ認識を維持しながら、どのアミノ酸残基が結合の形成に適するか、またどのアミノ酸残基を用いるべきではないかを、実験的に容易に決定できる。
【００２３】
好ましい実施形態では、化合物の立体構造は、前記化合物中における少なくとも１つの内部結合の形成により拘束される。本発明の一実施形態は、２つの内部結合を含んでなる免疫原性化合物の提供に関する。他の好ましい実施形態では、本発明に係る化合物は、足場及び／又は担体に結合する。最も好ましくは、足場及び／又は担体に結合し、内部結合を含んでなる免疫原性化合物を提供する。本発明では、かかる免疫原性化合物は、化合物の免疫原性再現性及び／又は免疫原性を特異的に誘導及び／又は強化することに適している。鋭意研究の結果、例えば２つの内部結合形成などの他のタイプの結合を有する化合物と比較し、かかる化合物では、免疫原性再現性及び／又は免疫原性を誘導及び／又は強化することが可能となることを見出した。したがって、足場及び／又は担体に結合し、内部結合を含んでなる免疫原性化合物が特に好適である。前記化合物は、前記化合物の立体構造が特殊な態様で拘束されるため、少なくとも２つの結合を介して足場及び／又は担体に結合するのが好ましい。したがって、免疫原性化合物は好ましくは、少なくとも２つの結合を介して足場及び／又は担体に結合し、更に少なくとも１つの内部結合を含んでなる態様で提供される。本発明を考察すると、フリーの化合物と比較し、担体又は足場と結合した本発明の免疫原性化合物の形態が既により拘束されているにもかかわらず、前記足場に結合する化合物の形態が（好ましくは第２の結合の形成によって）更に拘束される場合においても、免疫原性の顕著な改良及び免疫原性再現性がまだ得られることが示唆される。前記第２の結合は好ましくは内部結合である。なぜなら、足場と結合した化合物内部での結合の形成が、前記化合物の免疫原性及び免疫原性再現性を強化するからである。化合物が担体又は足場と結合しているとき、化合物の立体構造は既に拘束されているため、更なる結合（内部結合又は他の化合物に対する結合）により重要な効果がもたらされるとは予想できない。しかしながら、本発明では、第２の結合の形成により顕著な改良がもたらされる。
【００２４】
本発明に係る方法は特に、目的のタンパク質性分子に対して免疫反応を誘導できる免疫原性化合物の三次元構造を最適化することに適用できる。本発明に係る方法を用いてかかる免疫原性化合物の立体構造を拘束することにより、当該化合物をより多くの時間、前記タンパク質性分子の対応するエピトープの三次元構造に密接に類似する高次構造の状態に維持させる。ゆえに、エピトープの天然の三次元構造が巧妙に擬態される。したがって、本発明に係る方法は特に、タンパク質性分子中において特定の三次元構造を有するエピトープに由来する免疫原性化合物の最適化に適している。かかるエピトープの例としては、非線形エピトープ及び／又はタンパク質に存在する特定の三次元構造に存在するエピトープ（例えばループ構造など）である。かかるループ構造の好適な例は、２つの逆平行β鎖との間に通常形成されるβ−ヘアピン構造である。β−ヘアピン構造は通常、比較的容易に利用できる。その結果、免疫反応では、β−ヘアピン配列に存在するエピトープが通常標的となる。ループ構造は、シスチン−ｋｎｏｔスーパーファミリーのメンバーにも存在する。これらのメンバーは「シスチン−ｋｎｏｔ」形態を形成するために結合した、６つのシステインによる特有の配列を有する（図４Ａに示す）。シスチン−ｋｎｏｔ構造は、ｋｎｏｔより上の２つの歪められたβ−ヘアピンループとｋｎｏｔの下の単一のβ−ヘアピンループとを含んでなる。免疫優性エピトープは、これらのループ中に通常存在する。かかるループ構造に存在するエピトープの三次元構造が、本発明に係る方法において模倣されるのが好ましい。ヘアピンループに由来するペプチド配列の立体構造は、好ましくは少なくとも２つの結合を介して拘束され、それにより、前記ペプチド配列の立体構造は、ヘアピンループの天然の三次元構造に酷似する。したがって、本発明は更に、化合物の免疫原性再現性及び／又は免疫原性（好ましくは交差反応性）を誘導及び／又は強化するための方法の提供に関する。前記免疫原性化合物は、目的のタンパク質性分子のアミノ酸配列の一部と、少なくとも５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０、７５、８０、８５、９０及び／又は９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部は少なくとも８つのアミノ酸残基長を有し、前記一部は前記タンパク質性分子の非線形エピトープを含んでなり、及び／又は、前記一部は、前記タンパク質性分子のループ（好ましくはヘアピンループ）に存在する、少なくとも６つのアミノ酸残基、好ましくは少なくとも８つのアミノ酸残基の配列を含んでなる。
【００２５】
天然型のエピトープの三次元構造は、少なくとも部分的に前記エピトープに由来する配列を有する免疫原性化合物の立体構造を、本発明に係る方法によって拘束することにより擬態される。好ましくは、少なくとも２つの結合部位を選択し、それにより、免疫原性化合物中に得られる形態が、目的の前記タンパク質性分子中の前記エピトープの天然型形態に類似する。内部結合の位置は、例えば、化合物中に得られる立体構造が密接に目的の前記タンパク質性分子のエピトープの天然型形態に類似するように選択される。更に、又はその代わりに、前記免疫原性化合物と足場との結合部位は、化合物中に得られる立体構造が密接に目的の前記タンパク質性分子のエピトープの天然型形態に類似するように選択される。本発明に係る免疫原性化合物の立体構造はまた、用いられる足場のタイプにより影響される。なぜなら、用いられる足場のサイズ及び形状が、免疫原性化合物の全体構造に影響しうるからである。当業者であれば、本発明に係る免疫原性化合物を、目的のタンパク質性分子のエピトープの天然型形態に酷似する形態となるように、容易に設計することができる。好ましくは、少なくとも２つの結合の位置を適宜選択し、目的の前記タンパク質性分子のエピトープの天然型形態に酷似する形態を得る。これは、例えば図４Ｂ及び４Ｃに図式的に示すように行う。当然ながら、当該結合は好ましくは目的のエピトープ中に位置しない。なぜなら、かかる結合により、エピトープの形態及び／又はアクセスし易さが損なわれるからである。足場を用いる場合、足場の種類、及び免疫原性化合物のアミノ酸配列に結合する足場中の部位を適宜選択することにより、目的の前記タンパク質性分子のエピトープの天然型形態に酷似する形態が得られる。例えば、異なる結合部位を有する幾つかの化合物を作製して、得られる化合物の免疫原性及び／又は免疫原性再現性を実験により測定することも可能である。それにより、最適な免疫原性特性を有する化合物を選択するのが好ましい。これは、例えば実施例１に例示するように行われる。実施例１においては、内部結合の位置を変化させることによる、最適な立体構造の決定方法が教示される。当然ながら、この実施例で概説される方法により、本発明が限定されるものではない。また、異なる種類の足場（アミノ酸配列中の同一若しくは異なる位置で結合する）を有する幾つかの化合物を作製し、得られる化合物の免疫原性及び／又は免疫原性再現性を実験により決定することも可能である。
【００２６】
本発明では、用語「免疫原性化合物」には、宿主の免疫反応を誘発できるあらゆる種類の化合物が包含される。必須でないが、好ましくは本発明に係る免疫原性化合物はアミノ酸配列を含んでなる。本願明細書では、更に、好ましい実施例として、アミノ酸配列を含んでなる免疫原性化合物が用いた例を記載している。
【００２７】
アミノ酸配列を含んでなる免疫原性化合物の立体構造は好ましくは、上記アミノ酸配列を、直接又は間接的に、例えばリンカーを介して担体又は足場に結合させ、前記アミノ酸配列中に少なくとも１つの内部結合を形成させることによって拘束される。好ましくは、前記内部結合はジスルフィド結合（またＳＳ−架橋とも呼ばれる）を含んでなる。なぜなら、他のアミノ酸側鎖を保護する必要なく、フリーのシステイン残基間でジスルフィド結合を選択的に形成するからである。更にジスルフィド結合は、塩基性条件でインキュベートすることによって、容易に形成される。好ましくは、ジスルフィド結合は２つのシステイン残基間で形成される。なぜなら、それらのスルフヒドリル基は容易に結合に利用できるからである。アミノ酸配列の中のＳＳ−架橋の位置は、遊離システイン残基の位置を調整することによって容易に調整される。特に好適な実施形態では、アミノ酸配列の立体構造を最適に拘束するため、前記システインは、アミノ酸配列の最初及び最後のアミノ酸の周辺に存在する。
【００２８】
当然ながら他の種類の内部結合も、本発明の免疫原性化合物の立体構造の拘束に適する。例えば、Ｓｅ−Ｓｅジセレン結合を用いる。ジセレン結合の効果は、これらの結合が還元に対して非感受性であることである。ゆえに、ジセレン結合を含んでなる免疫原性化合物は、例えば動物の体内に存在する還元条件下で、それらの形態を良好に維持することができる。更に、フリーのＳＨ−基が免疫原性化合物中に存在する（例えばＳＨ−基が担体に対する次のカップリング反応のために使用される）とき、ジセレン結合の存在が好適である。かかるフリーのＳＨ−基は、ジセレン結合と反応できない。別法として、又はそれに追加して、メタテーゼ（ｍｅｔａｔｈｅｓｅ）反応が、内部結合の形成に用いられる。メタテーゼ反応において、２つの末端ＣＣ−二重結合又は三重結合は、Ｒｕの触媒作用による転移反応により形成される。かかる末端ＣＣ−二重又はＣＣ−三重結合は、例えばペプチドＮＨ−基のアルキル化を経て、例えば臭化アリル又は臭化プロパルギルを用いて、又はアルケニル基−又はアルキニル基含有側鎖を有する非天然アミノ酸をペプチドに導入する反応を経て、ペプチドに導入される。メタテーゼ反応は、自発的には行われず、グラブス触媒の使用により行われる。
【００２９】
一実施形態では、内部結合はＢｒ−ＳＨ環化反応により形成される。例えば、遊離システインのＳＨ部分を、好ましくはペプチドのＮ末端、又はリジン（ＲＮＨ２）側鎖に存在するＢｒＡｃ−部分と結合させる。
【００３０】
更なる実施形態では、アスパラギン酸又はグルタミン酸残基のＣＯ２Ｈ−側鎖と、リジン残基のＮＨ２側鎖とを結合させる。すなわち、アミド結合を形成される。ペプチド中のフリーのＣＯ２Ｈ末端を、ペプチド中のフリーのＮＨ２末端に結合させることにより内部結合を形成させ、アミド結合を形成させることも可能である。アミノ酸配列の中で内部結合を形成するための、公知の代替的な方法を利用してもよい。
【００３１】
原則として、内部結合は、少なくとも１つの目的のエピトープの、一次、二次及び三次配列が基本的に維持される限り、免疫原性アミノ酸配列中でどの部分でも形成されうる。１つの好ましい実施形態では、結合は、Ｎ末端の１０アミノ酸配列のうちの任意の１つと、Ｃ末端アミノ酸配列のうちの１０のアミノ酸残基のうちの任意の１つとの間で形成される。好ましくは、結合は、Ｎ末端の６アミノ酸配列のうちの任意の１つと、Ｃ末端アミノ酸配列のうちの６のアミノ酸残基のうちの任意の１つとの間で、より好ましくはＮ末端の４アミノ酸配列のうちの任意の１つと、Ｃ末端アミノ酸配列のうちの４のアミノ酸残基のうちの任意の１つとの間で、形成される。当然ながら内部結合の形成に適する部位は、目的の１つ以上のエピトープの位置に依存する。１つの好ましい実施形態では、結合は、免疫原性アミノ酸配列の最初と最後のアミノ酸残基間で形成される。
【００３２】
本発明に係る免疫原性化合物は好ましくは、足場及び／又は担体が免疫原性を強化するため、足場及び／又は担体に結合するアミノ酸配列を含んでなる。１つの好ましい実施形態では、前記アミノ酸配列は内部結合を含んでなる。したがって、足場及び／又は担体に結合するアミノ酸配列を含んでなる免疫原性化合物（前記アミノ酸配列が少なくとも１つの内部結合を含んでなる）は、もまた提供される。免疫原性化合物は更に、アミノ酸配列の柔軟性を制限するため、好ましくは少なくとも２つの結合を介して足場及び／又は担体に結合する。最も好ましくは、少なくとも１つの内部結合を含んでなるアミノ酸配列が、少なくとも２つの結合を介して足場又は担体に結合する。この方法により、免疫原性及び／又は免疫原性再現性が特に強化される。特に好適な実施形態では、前記足場は、国際公開第２００４／０７７０６２号にて開示されるような、少なくとも第１及び第２の反応基を有する（ヘテロ）芳香族分子（好ましくは少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族分子）を含んでなる。２つのベンジルハロゲン置換基は好ましくは、アミノ酸配列を連結するための第１及び第２の反応基として用いられる。アミノ酸配列は、好ましくは国際公開第２００４／０７７０６２号に記載の方法を使用して足場に結合する。簡潔には、少なくとも第１及び第２の反応基を有する足場が提供される。前記少なくとも第１及び第２の反応基と反応できるアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列が、前記少なくとも第１及び第２の反応基と反応して、前記足場と前記アミノ酸配列との間の少なくとも２つの結合を形成できる条件下で、前記足場と接触し、その際、第１の結合の形成が、連続的な結合の形成を加速する。それにより、高次構造が拘束されたループ構造が形成される。国際公開第２００４／０７７０６２号に従う方法及び足場を利用する利点としては、アミノ酸配列が迅速な、単純な、及び直接的な態様でこれらの足場に結合しうることである。国際公開第２００４／０７７０６２号にて開示される方法を用いることにより、非保護ペプチドの使用が可能になった。ゆえに、面倒な保護及び脱保護ステップが必要ない。更に、足場を選択的に官能化する必要がない。更に、国際公開第２００４／０７７０６２号にて開示される足場を使用したカップリング反応は、溶液における反応にも適している。アミノ酸配列は好ましくは、水溶液中で、国際公開第２００４／０７７０６２号に記載の方法を使用して足場に結合させ、それにより、（有毒な）有機溶剤の使用が制限されるか、更には回避されうる。水は環境に対する負担が小さく、また凍結乾燥にすることによって容易に除去できる。更に、多くの非保護ペプチドは（大部分の塩類と同様に）水溶解性が高く、重炭酸アンモニウム（少ない揮発性の塩の１つ）の使用も可能となるため、水溶液のｐＨを７．８〜８．０（わずかに塩基性のｐＨ）に設定することができる。
【００３３】
第１の結合の形成が、第２の結合の形成を加速するため、国際公開第２００４／０７７０６２号に従う、足場に対するアミノ酸配列の結合は、反応カスケードなどの迅速な協奏的プロセスとして生じる。第１の反応基を経た第１の結合（また（化学的）結合又は連結と呼ばれる）の形成は、第２の反応基及びその他の反応基の反応性を強化し、それにより、その活性化効果は１つの反応基から次の反応基まで「引き継がれ」ることとなる。前記化学反応は、足場の分子骨格を基本的に変化させることなく、官能基の変化をもたらす。例えば、国際公開第２００４／０７７０６２号において用いられる、少なくとも２つの反応性基を含んでなる足場分子は、足場の反応性基がアミノ酸配列との新規な結合に関与しつつ、コア構造又は足場の骨格が直接カップリングには関与しない態様で、アミノ酸配列と反応できる。
【００３４】
実施形態では、少なくとも２つの同一の反応性基を含んでなる合成足場は、１つ以上の免疫原性ペプチドに結合する。前記１つ以上免疫原性ペプチドは、足場への１つ以上のペプチドの結合の前若しくは後に、第２の結合（好ましくは内部結合）を更に形成する。適切なペプチドは、足場上の少なくとも２つの反応性基と反応して、１つ以上の前記ペプチドと前記足場との間の少なくとも２つの結合を形成できる全てのペプチドを含んでなり、それにより、典型的には足場上にループ状若しくは環状のペプチドが形成される。有機化学的にいえば、かかる結合形成の本質は、電荷の吸引及び電子運動である。好ましい実施形態では、アミノ酸配列及び足場間のカップリング反応は、フリーの求核性を有するアミノ酸配列が足場と反応する求核置換反応である。求核原子は典型的には、結合形成の際、親物質との間で電子対を共有する。換言すれば、求核原子は、反応性の電子欠乏中心（原子）を探している。求核原子は負に荷電してもよく、又は荷電しなくてもよく、例えば炭素以外の孤立電子対を有するヘテロ原子を含んでもよく、アルケン又はアルキンの場合はπ電子を有してもよい。求電子物質（「求電子種」）は電気的に中性若しくは正に荷電し、電子が運動するための幾つかの場を有する（空の電子軌道（ＢＨ３など）又は潜在的に空の電子軌道であってもよい）。好ましい実施形態では、前記求核基としてはチオール又はスルフヒドリル基などが挙げられる。チオール基は、飽和炭素原子を置換するための有効な求核基である。求核基を有するアミノ酸配列を提供することは通常困難でない。例えば、システイン残基をアミノ酸配列に導入することによって、アミノ酸配列は、そのチオール部分によって容易に官能化される。
【００３５】
飽和炭素原子において生じる求核反応に共通の特徴としては、当該炭素原子がヘテロ原子（炭素原子又は水素原子以外の原子と本願明細書では定義される）と結合することである。更にヘテロ原子は通常、炭素原子より負に帯電し、置換反応におけるいわゆる脱離基（Ｌ）としても機能する。脱離基は、最初に炭素原子に結合していた電子対と共に脱離する。好ましい実施形態では、少なくとも２つの脱離基を含む足場を用い、少なくとも１つのアミノ酸配列との少なくとも２つの結合の形成を容易にする。脱離基の脱離しやすさは、その基の塩基性と関連がある。弱塩基は一般に、それらが効果的に電子対をできるため、良好な脱離基である。反応基の反応性は主に、脱離基の脱離能により規定される。反応基の反応性とのなんらかの関係がある他の要因は、脱離基と炭素原子との間の結合の強さである。なぜなら、置換が生じる場合には、この結合を破壊する必要があるからである。
【００３６】
すなわち、好ましい実施形態では、各々良好な脱離基を含んでなる少なくとも２つの反応性基を含んでなる足場を、本発明に係る方法で用いる。良好な脱離基は通常、強酸の共役塩基である。重要な脱離基は、５以下のｐＫａ値を有する酸の共役塩基である。特に興味深い脱離基としては、ハロゲン化物イオン（例えばＩ−、Ｂｒ−及びＣｌ−）が挙げられる。ハロゲン化アルキルの炭素−ハロゲン（Ｃ−Ｘ）結合は、炭素上の部分的な正電荷及びハロゲン上の部分的な負電荷を有するため、極性を有する。すなわち、炭素原子は求核物質（一対の電子を供与する物質）による攻撃に影響されやすく、またハロゲンはハロゲン化物イオン（Ｘ−）として（Ｃ−Ｘ結合から２つの電子を有した状態で）脱離する。したがって、一実施形態では、アミノ酸配列は足場上の反応基と結合し、上記反応基は求核物質による攻撃に影響されやすい炭素原子を含んでなり、前記反応基は炭素−ハロゲン結合を含んでなる。好ましい実施形態では、かかる反応性基のうちの少なくとも２つを含んでなる足場を用いて、求核物質として、２つのＳＨで官能化されたペプチドと反応させる。本発明は、少なくとも１つのループ状ペプチド構造を有する足場を含んでなる免疫原性化合物を得る方法の提供に関し、前記方法は、少なくとも１つのペプチドと前記足場を接触させるステップを有してなり、前記足場はハロゲノアルカンを含んでなり、その後で、結合されたペプチドが、第２の結合（好ましくは内部結合）を形成する。あるいは上記ペプチドは、第２の結合（好ましくは内部結合）を形成した後で、ハロゲノアルカンに結合してもよい。ハロゲノアルカン（別名ハロアルカン又はハロゲン化アルキル）とは、鎖中の１つ以上の炭素原子に結合するハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）を含んでなる化合物である。２つのハロゲン原子を含んでなるジハロ足場、及びトリ−及びテトラハロ足場が、高次構造が拘束された化合物の合成（例えば、１つ以上のループ状ペプチド部分からなるペプチド構造を、前記足場に結合させる反応）において特に好適であり、その際、ループ状のペプチド部分は、第２の結合（好ましくは内部結合）を更に形成する。
【００３７】
一般に、良好な脱離基は負電荷を有し、炭素原子を極性化させ、脱離した後も、それは１対の余分の電子対の存在により安定であり、極性化されて遷移状態を安定化させることができる。ヨウ素を除き、全てのハロゲンは炭素原子より負に荷電している。塩素及び臭素はほぼ同様の電気陰性度を有し、炭素を有する結合を同様に極性化させる。イオン化したとき、両方とも非常に弱い塩基性を示し、２つのうちで臭素がより弱い。臭化物イオンは、サイズが大きいため、極性化しやすい。従って、免疫原性ペプチドは好ましくは、少なくとも２つのＣｌ原子を含んでなる足場に結合し、より好ましくは、少なくとも１つのＣｌ原子及び少なくとも１つのＢｒ原子を含んでなる足場と結合し、更に好ましくは、少なくとも２つのＢｒ原子を含んでなる足場と結合する。
【００３８】
好ましい実施形態では、高次構造的に拘束されたアミノ酸配列は、アリル基系を含んでなる足場と結合する。アリル基系中には、少なくとも３つの炭素原子が存在し、そのうちの２つは炭素−炭素二重結合により結合する。好ましい実施形態では、足場と免疫原性ペプチドとの間の結合の形成は、アリル基置換反応を介してなされる。アリル基置換反応とは、アリル基系の１位、すなわち２位と３位との間に存在する二重結合において起こる置換反応のことを指す。攻撃する基は脱離基としての原子１に結合するか、又は、攻撃する基は相対的に３位の位置で結合し、二重結合を２／３から１／２へ変化させる。アリル基置換の反応速度は非常に高い。なぜなら、アリルカチオン反応中間体（正電荷を有する炭素原子が二重結合炭素原子に結合した状態）は非常に安定だからである。これは、アリルカチオンが、２つの等価な構造の共鳴混成体を形成するからである。存在するいずれの構造においても、空のｐ電子軌道と、π電子雲とを有する、電子が不足した炭素原子が存在する。二重結合のπ電子雲によるこの空のｐ電子軌道の重なりにより、π電子の正規の場所からの移動を生じさせ、それにより電子が不足している炭素に電子を供与し、カチオンを安定化させる。
【００３９】
少なくとも２つのアリルハロゲン原子を含んでなる足場は、更に好適である。電子の脱分極のため、ハロゲン化アリルは非常に迅速にイオン化する傾向を有し、カルボカチオン及びハロゲン化物イオンを生じさせ、それにより、炭素−ハロゲン化物の結合の切断が急速に行われる。本発明の別の実施形態では、炭素−酸素二重結合（すなわちカルボニル基）が、足場に存在する。それにより、同様にアリル基系内に、カルボカチオンを安定化させる共鳴構造が形成される。例えば、足場は、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ハロゲンの構造を有する２つ以上の反応性基を含んでなる。
【００４０】
更に、求核置換反応では、基質の構造は、脱離基の性質としての、非常に重要な役割を演ずる。例えば、求核物質が炭素の後方を攻撃する場合、脱離基がメチルに結合している場合、反応は妨害されずに進行する。その際、水素原子は炭素を攻撃するのに十分な表面を生じさせる。その炭素が更に置換されている場合、基のサイズが大きくなるため、求核原子が脱離基を置換するために通る経路が妨害される。これらの理由により、足場が少なくとも２つのハロメチル基を含んでなることは有利である。
【００４１】
一実施形態では、足場は共役型ポリエン（別名芳香族化合物又はアレーン）を含んでなる。それは少なくとも２つの反応性基により形成される。芳香族化合物は平坦であり、分子平面の上下に、非局所化されたπ電子の環状の雲が形成されている。好ましくは、少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基（例えばハロメチル基など）を含んでなる分子足場を用いる。適切な例としては、限定されないが、ジ（ハロメチル）ベンゼン、トリ（ハロメチル）ベンゼン又はテトラ（ハロメチル）ベンゼン、並びにそれらの誘導体が挙げられる。ベンジルハロゲン置換基の利点としては、主に芳香族化合物として公知の共役型ポリエンの共鳴に関連する特殊な安定性が得られることが挙げられ、特にベンジルハロゲン原子には、求核置換反応を生じさせる炭素原子を残すという更に有用な傾向を有する。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、アミノ酸配列が、少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族分子を含んでなる足場に、少なくとも２つの結合を介して結合し、前記アミノ酸配列の立体構造が、好ましくは内部結合を介して更に拘束されることを特徴とする方法の提供に関する。好ましくは前記内部結合は、内部ジスルフィド結合を含んでなる。前記アミノ酸配列は好ましくは、アミノ酸配列中の２つの遊離システインチオールを使用して、上記（ヘテロ）芳香族分子に結合する。好ましくは、前記足場は、ハロメチルアレーンであり、好ましくはビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン及びテトラ（ブロモメチル）ベンゼンからなる群、並びにそれらの誘導体から選択される。好ましくは前記足場は、オルト−、メタ−及びパラ−ジハロキシレン及び１，２，４，５テトラハロジュレンからなる群から選択される。前記足場は、最も好ましくはメタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｍ−Ｔ２）、オルト−１，２−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｏ−Ｔ２）、パラ−１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｐ−Ｔ２）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ピリジン（ｍ−Ｐ２）、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（Ｔ３）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）−５−アジドベンゼン（ｍ−Ｔ３−Ｎ３）、及び／又は１，２，４，５テトラブロモジュレン（Ｔ４）を含んでなる。
【００４３】
本発明はすなわち、結合前記アミノ酸配列（そのアミノ酸配列は好ましくは２つの遊離システインチオールを含んでなる）と、少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族分子、好ましくはハロメチルアレーン、より好ましくはビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン及び／若しくはテトラ（ブロモメチル）ベンゼン、又はそれらの誘導体と、を結合させるステップと、前記アミノ酸配列中に少なくとも１つの内部結合を形成させるステップを有してなる、アミノ酸配列の免疫原性及び／又は免疫原性再現性を誘導及び／又は強化する方法の提供に関する。前記内部結合は、上記アミノ酸配列の足場への結合の前若しくは後に形成される。好ましくは、カップリング反応をさせた後に、前記内部結合を形成させる。前記アミノ酸配列は好ましくは、少なくとも２つの結合を介して（ヘテロ）芳香族分子に結合し、前記アミノ酸配列の立体構造を具体的に拘束する。最も好ましくは、１つのアミノ酸配列を内部結合の形成に用い、ｍ−Ｔ２、ｏ−Ｔ２、ｐ−Ｔ２、ｍ−Ｐ２、Ｔ３、ｍ−Ｔ３−Ｎ３及び／又はＴ４に結合させる。
【００４４】
好適な分子足場にはまた、より小さい若しくは大きな環状構造を有する多環式芳香族化合物が包含される。しかしながら、適切な足場は炭化水素に限定されない。むしろ、複素環式芳香族の足場（環状構造中に炭素以外の少なくとも１つの原子（最も一般的には窒素、酸素又は硫黄）を有する環状分子）も好適である。それらの例としては、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、３−ピロリン、ピリジン、ピリミジン及びそれらの誘導体などが挙げられる。好適な複素環式芳香族の足場としては、少なくとも２つのハロメチル基を含んでなるそれらが挙げられるが、これらに限られない。好適な足場は、メタ−ジブロモ−ピリジンである。他の実施形態では、１つのアミノ酸配列を、複数の芳香族環状構造（例えば融合環を有する芳香族化合物）をベースとするか、又はそれを含んでなる足場に結合させる。炭素−炭素結合を共有する２つの芳香環は、融合していると称される。それらが少なくとも２つの反応性基を含むと仮定した場合、適切な融合芳香環足場としては、例えばナフタレン、アントラセン又はフェナントレン、並びにそれらの誘導体が挙げられる。好ましい実施形態では、融合芳香環足場は、少なくとも２つの反応性基を含んでなり、各基は非常に反応性の高いベンジルハロゲン原子（例えばハロメチル基）を含んでなる。複数の芳香族若しくは共役系分子を含んでなり、その系が一対の炭素原子を共有しない分子であっても、足場分子として有用である。例えば、足場は多環系又は融合環構造を含んでなり、例えば芳香族（ベンゼン）環が炭素−炭素結合を介して直接結合した足場が使用される。あるいは、前記環は、少なくとも１つの原子を含んでなるリンカーを介して結合する。適切な足場の例を、図１から３に列挙する。商業的な観点から、本発明に係る足場は、比較的低コストで市販されているものを多量に入手して使用するのが好ましい。例えば、ジブロモ足場である１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンは、１ｇあたり約５ユーロで現在市販されている。
【００４５】
典型的には、本発明に係る方法に用いられるペプチド分子は、合成ペプチド（例えば標準的なペプチド合成手順を用いて調製）である。合成ペプチドは、当技術分野で公知の様々な手順を使用して得られる。これらとしては、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）及び液相有機合成（ＳＰＯＳ）などが挙げられる。ＳＰＰＳは、小さいペプチド及びタンパク質を合成する迅速且つ簡便な方法である。Ｃ末端アミノ酸を、例えばリンカー分子による酸性変化しやすい結合を介して、架橋ポリスチレン樹脂に結合させる。この樹脂は合成に使用する溶媒に不溶性であり、操作が比較的単純であり、過剰な試薬及び副産物を迅速に洗浄除去することができる。適切なペプチドとしては、様々な長さのペプチドが存在する。本願明細書に例示されるように、３アミノ酸残基のオリゴペプチドから、２７残基長のポリペプチドまで、方法、のセクションで使用されている。適切なペプチドの最大限の長さ又はサイズは基本的に、ペプチド合成を使用して得ることができる長さ又はサイズに依存する。一般に、大きな問題なく、最高３０のアミノ酸残基のペプチドを合成することができる。
【００４６】
国際公開第２００４／０７７０６２号に記載の足場へのアミノ酸配列の結合では、非保護アミノ酸配列の使用も可能である。非保護アミノ酸配列に存在してはならない唯一の官能基はシステインＳＨである。なぜなら、それはカップリング反応に関与するからである。本発明の一実施形態では、足場に対する結合に用いられる２つの遊離システイン残基の他に少なくとも２つの更なるシステイン（Ｃｙｓ）残基を含んでなる、アミノ酸配列を用いる。カップリング反応における、これらの更なるＣｙｓチオール基の不必要な関与を防止するための単純な方法としては、例えば、ペプチド合成中にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）（Ｆｍｏｃ−アセトアミドメチル−Ｌ−システイン）を使用し、被保護Ｃｙｓ残基を導入することである。あるいは、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、及び／又は対応するＢｏｃアミノ酸を用いることである。Ａｃｍ又はＳｔＢｕ基は、通常のＴＦＡ脱保護−切断反応中に除去されないが、Ａｃｍ基の場合には酸化的処理（Ｉ２／ＶｉｔＣ）、又はＳｔＢｕ基の場合には還元的処理（ＢＭＥ（過剰）、又は１，４−ＤＴＴ（過剰））を行い、ペプチドを還元型スルフヒドリル形態とする必要がある。それらは直接使用してもよく、又はその後酸化させて対応するシスチニルペプチドとしてもよい。一実施形態では、少なくとも１つのＣｙｓ誘導体、例えばＣｙｓ（Ａｃｍ）又はＣｙｓ（ＳｔＢｕ）などのペプチドを用い、Ｃｙｓ−チオール基の選択的マスキングを実施してもよい。選択的なＣｙｓ−チオール基のアンマスキングにより、所望の時点において、例えば足場とペプチドとの間のカップリング反応の完了後などにおいて、反応に利用できるＣｙｓ−チオール基を作製することができる。これは例えば、ペプチドを足場に結合させた後で、ペプチド内に内部結合を形成させる場合において、非常に魅力的である。例えば、好ましい実施形態では、２つの被保護Ｃｙｓ誘導体、及び他の位置に存在する２つの非保護Ｃｙｓ残基を含んでなる、直鎖状ペプチドを合成する。その後で、２つのＳＨで官能化されたペプチドを、少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族足場に結合させ、足場上にループ状のペプチド構造が確立される。その後、２つのＣｙｓ誘導体をアンマスキングし、内部ジスルフィド架橋を形成させる。
【００４７】
本発明は更に、少なくとも２つの結合を経て足場及び／又は担体と結合するアミノ酸配列を含んでなり、前記アミノ酸配列が少なくとも１つの内部結合を含んでなる化合物の提供に関する。一実施形態では、前記内部結合としてはＳＳ−架橋が挙げられ、好ましくは前記アミノ酸配列中の２つのシステイン残基間の架橋である。なぜなら、それらのスルフヒドリル基が結合に容易に利用できるからである。前記システインは好ましくは、アミノ酸配列中の最初及び最後の位置のアミノ酸の周辺に位置し、それにより、少なくとも部分的に、自由に回転できるペプチド端の形成が回避される。好ましくは前記化合物は、免疫原性化合物及び／又はタンパク質擬態物を含んでなる。本発明に係るタンパク質擬態物の非限定的な例としては、タンパク質の結合特性を模倣（例えばレセプタの活性化、又はレセプタの阻害）するペプチドである。説明したように、結合が形成される部位は、前記アミノ酸配列中の、少なくとも１つの目的のエピトープの位置に依存する。一般に、結合はエピトープ配列中の部位で形成されない。なぜなら、免疫原性が減弱されるからである。
【００４８】
本発明に係る免疫原性化合物は好ましくは、少なくとも２つの結合を経て足場と結合するアミノ酸配列を含んでなる。なぜなら、前記化合物の立体構造が好適に拘束されるからである。説明したように、前記足場は好ましくは少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基（好ましくはハロメチルアレーン）を有する（ヘテロ）芳香族分子を含んでなる。好適な足場は、ビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン及びテトラ（ブロモメチル）ベンゼン、又はそれらの誘導体である。本発明に係る免疫原性化合物は好ましくは、以下からなる群から選択される足場を含んでなる：オルト−、メタ−及びパラ−ジハロキシレン及び１，２，４，５テトラハロジュレン。好ましくはそれらは、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｍ−Ｔ２）、オルト−１，２−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｏ−Ｔ２）、パラ−１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｐ−Ｔ２）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ピリジン（ｍ−Ｐ２）、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（Ｔ３）、メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）−５−アジドベンゼン（ｍ−Ｔ３−Ｎ３）、及び１，２，４，５テトラブロモジュレン（Ｔ４）からなる群から選択される。
【００４９】
本発明に係る免疫原性化合物は、所望の免疫反応を誘導及び／又は強化することに特に適している。一実施形態では、本発明に係る免疫原性化合物は、薬理学的に許容できる担体、アジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤と組み合わされることにより、抗体産生又は体液性免疫反応が強化される。適切な担体の例としては、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えばＢＳＡ又はＲＳＡ）及びオバルブミンなどが挙げられる。多くの適切なアジュバント（油ベース及び水ベース）が当業者に公知である。一実施形態では、前記アジュバントはＳｐｅｃｏｌを含んでなる。他の実施形態では、前記適切な担体は、例えば生理食塩水などの溶液であってもよい。
【００５０】
本発明に係る免疫原性化合物と、薬理学的に許容できる担体、アジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤と、を含んでなる免疫原性組成物もまた提供される。前記免疫原性組成物は好ましくは、防御免疫反応を誘導できるワクチンを含んでなる。あるいは、又はそれに加えて、本発明に係る免疫原性化合物を使用することにより、治癒的免疫反応を誘導及び／又は強化し、疾患に罹患する患者を治療する。薬剤及び／又はワクチン用の、本発明に係る免疫原性化合物も提供される。本願明細書に記載のような予防的及び／又は治療的用途で使用される、本発明の化合物の投与量範囲は、厳密なプロトコル要件が存在する臨床試験における投与量試験を基礎として設計される。典型的には、投与量は、０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、具体的には約０．１〜１００μｇ／ｋｇ体重で変化させることができる。
【００５１】
本発明に係る免疫原性化合物は好ましくは、目的のタンパク質性分子に由来するアミノ酸配列を含んでなり、それにより、前記目的のタンパク質性分子に対する免疫反応が誘発される。一実施形態では、前記目的のタンパク質性分子は、以下からなる群から選択される：シスチン−ｋｎｏｔファミリー、膜貫通タンパク質、ＴＮＦ−α、ＨＧＦ／ＳＦ、ＦＧＦ−β、インターロイキン、ＩＬ−５、ケモカイン、Ｇタンパク質共役受容体、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩＧＦ、ＬＭＦ、エンドセリン−１、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＰＩＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥｒｂＢファミリー、ＨＥＲ１／ＥＧＦ−Ｒ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｐ５３、コルチコトロピンＲＦ、ＡＣＴＨ、副甲状腺ホルモン、ＣＣＫ、Ｐ物質、ＮＰＹ、ＧＲＰ、ニューロトロフィン、アンギオテンシン−２、アンジオゲニン、エリスロポエチン、ニューロテンシン、ＳＬＣＬＣ、ＳＡＥＳ由来タンパク質、ＨＩＶ由来タンパク質、乳頭腫ウイルス由来タンパク質及びＦＭＤＶ。好ましくは、これらのいずれかの目的のタンパク質性分子に対する免疫反応を誘発及び／又は強化することにより、前記目的のタンパク質性分子の存在に関連する障害を予防及び／又は抑止できる。更には、以下のメンバーの存在に関連する障害に対する薬剤及び／又はワクチンの調製への、本発明に係る免疫原性化合物の使用が提供される：システイン−ｋｎｏｔファミリー、膜貫通タンパク質、ＴＮＦ−α、ＨＧＦ／ＳＦ、ＦＧＦ−β、インターロイキン、ＩＬ−５、ケモカイン、Ｇタンパク質共役受容体、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＩＧＦ、ＬＭＦ、エンドセリン−１、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＰＩＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥｒｂＢファミリー、ＨＥＲ１／ＥＧＦ−Ｒ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｐ５３、コルチコトロピンＲＦ、ＡＣＴＨ、副甲状腺ホルモン、ＣＣＫ、Ｐ物質、ＮＰＹ、ＧＲＰ、ニューロトロフィン、アンギオテンシン−２、アンジオゲニン、エリスロポエチン、ニューロテンシン、ＳＬＣＬＣ、ＳＡＲＳ由来タンパク質、ＨＩＶ由来タンパク質、乳頭腫ウイルス由来タンパク質及び／又はＦＭＤＶ。
【００５２】
特に好適な実施形態では、本発明に係る免疫原性組成物のアミノ酸配列は、シスチン−ｋｎｏｔファミリーのメンバーに由来する。シスチン−ｋｎｏｔ（Ｃｙｓ−ｋｎｏｔ）ファミリーのメンバーは、６つのシステインが特殊な配置で結合して形成された、「シスチン−ｋｎｏｔ」形態を有する。これらの活性型のタンパク質は、二量体（ホモ又はヘテロ二量体）である。それらの形状ゆえに、二量体として形成されるための、シスチン−ｋｎｏｔ成長因子の存在が、固有の要件であると考えられる。組織中のこの濃度が過剰になることにより、この単純な構造モティーフの周辺で構築される構造バラエティが豊富になる。Ｃｙｓ−ｋｎｏｔファミリーの多くのメンバーは成長因子である。
【００５３】
トランスフォーミング成長因子β２（ＴＧＦ−β２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の結晶構造中において、６つの保存されたシステイン残基（配列順序のＣｙｓＶＩに対するＣｙｓＩ）が、ｋｎｏｔ様のトポロジーでの配置で３つのジスルフィド結合を形成する。２つのジスルフィド結合（ＣｙｓＩＩとＣｙｓＶとの間（［ＣｙｓＩＩ−Ｖ］）、及びＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＶＩとの間（［ＣｙｓＩＩＩ−ＶＩ］））は、８つのアミノ酸からなるリング様構造を形成し、それを介して、残りのジスルフィド結合（ＣｙｓＩ及びＣｙｓＩＶとの間）が貫通する形をとる（図４Ａを参照）。ジスルフィド結合に関与する保存されたシステインＩからＶＩの硫黄（Ｓ）原子は、典型的にはＳ１からＳ６と称される。６つ以上のシステイン残基を有するシスチンｋｎｏｔ領域も存在する。通常、二量体化の間に、「余分の」システイン残基を用いて、シスチンｋｎｏｔドメイン内のジスルフィド結合、又は鎖間のジスルフィド結合が更に生じる。しかしながら、相同性及びトポロジに基づいて、どのシステインがＣｙｓＩからＣｙｓＶＩの６つの保存された残基であるかを示すことは通常可能である（下記参照）。
【００５４】
ジスルフィド結合の同様のｋｎｏｔ配列が、電位型Ｃａ２＋チャネルと結合する幾つかの酵素阻害剤及び神経毒の構造中で発見されている（ＭｃＤｏｎａｌｄら、１９９３，Ｃｅｌｌ  ７３  ４２１−４２４）。しかしながら、それらの配列では、シスチントのトポロジが異なる（Ｃｙｓ［ＩＩＩ−ＶＩ］が、Ｃｙｓ［Ｉ−ＩＶ］とＣｙｓ［ＩＩ−Ｖ］とにより形成される大環状構造を通過している）。すなわち、シスチン−ｋｎｏｔタンパク質は、その構造から２種類に分類できる（成長因子タイプ、及び阻害剤様のシスチンｋｎｏｔ）。
【００５５】
シスチン−ｋｎｏｔ成長因子スーパーファミリーは、以下のサブファミリーに分類される：糖タンパク質ホルモン（例えば小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ））、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）タンパク質（例えば骨形成タンパク質４）、血小板由来成長因子様（ＰＤＧＦ様）タンパク質（例えば血小板由来成長因子Ａ）、神経成長因子（ＮＧＦ）（例えば脳由来向神経因子）（また表１及び２を参照）など。
【００５６】
表１：Ｃｖｓ−ｋｎｏｔタンパク質サブファミリーの概要
糖タンパク質ホルモン−αファミリー、
糖タンパク質ホルモン（又は性腺刺激ホルモン）−α１，２（ＧＬＨＡ−１，２）、
糖タンパク質ホルモン−βファミリー、
絨毛膜性腺刺激ホルモン−β（β−ＣＧ）、
性腺刺激ホルモン−β１，２（ＧＴＨ−Ｉ，ＩＩ）、
小胞刺激ホルモン（又はフォロトロピン）−β（ＦＳＨ−β）、
黄体ホルモン−β（又はルトロピン）−β（β−ＬＨ）、
甲状腺刺激ホルモン（又はチロトロピン）−β（ＴＳＨ）、
コンタクチン−関連タンパク質様２前駆体（ＣＴＡ−２）、
糖タンパク質ホルモンβ−５前駆体（ＧＰＢ−５）、
神経成長因子ファミリー、
神経成長因子（ＮＧＦ）、
ニューロトロフィン−３，４，５，７（ＮＴ−３，４，５，７；ＨＤＮＦ）、
脳由来向神経性因子（ＢＤＮＦ）、
ＰＤＧＦ−ファミリー、
血小板由来成長因子Ａ，Ｂ−１，２（ＰＤＧＦ−Ａ，Ｂ−１，２）、
ＰＤＧＦ関連トランスフォーミングタンパク質ｓｉｓ（ＴＳＩＳ、ＳＭＳＡＶ、Ｐ２８ＳＩＳ）、
胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、
血管内皮成長因子Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｈ（ＶＧＥＦ−Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｈ）、
血管内皮成長因子トキシン（ＴＸＶＥ、ＳＷＥＧＦ、ＩＣＰＰ）、
トランスフォーミング成長因子スーパーファミリー、
トランスフォーミング成長因子β１−５（ＴＧＦβ１−５）、
アクチビン−β（インヒビン−β）、
ＡＴＰ依存性ＣＬＰ−プロテアーゼＡＴＰ−結合サブユニットＣＬＰＸ（ＣＬＰＸ）、
骨形成タンパク質２−８，１０，１５（ＢＭＰ２−８，１０，１５）、
６０Ａタンパク質前駆体（グラスボートタンパク質、６０Ａ）、
ＣＥＴ−１  線虫、
デカペンタプレジックタンパク質前駆体（ＤＥＣＡ）、
ＤＶＲ１−タンパク質前駆体（植物極ＶＧ１タンパク質）、
ドルサリン−１前駆体（ＤＳＬ１）、
ＸＮＲ−１，２，４（ツメガエル属）、
ＺＮＲ−１（ゼブラフィッシュ）、
ＶＧ１（ニワトリ）、
胎盤骨形成タンパク質結節状前駆体（ＮＯＤＡ）、
ノウム病タンパク質（ＮＤＰ）、
前立腺分化因子（ＰＤＦ）、
（胚性）成長分化要因１−９（ＧＤＦ−１−９）、
グリア細胞株由来向神経因子前駆体（ＧＤＮＦ）、
左右決定因子−ｂ前駆体（左利き−ｂタンパク質、ＬＦＴＢ）、
巨大核細胞刺激因子（ＭＳＦ）、
ムチン−２前駆体（腸ムチン−２）、
ミューラー管抑制因子（ＭＩＳ）、
ニュールツリン前駆体（ＮＲＴＮ）、
ペルセフィン前駆体（ＰＳＰＮ）、
スクレオスチン（ＳＯＳＴ）、
スクリュータンパク質前駆体（ＳＣＷ）、
ユニヴィン前駆体（ＵＮＩＶ）。
【００５７】
表２：Ｃｙｓ−ｋｎｏｔタンパク質ファミリーの様々なメンバーのアラインメント
【表１】
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【００５８】
全ての成長因子のシスチンｋｎｏｔ構造は同様のトポロジを有し、ｋｎｏｔより上の２つの歪められたβヘアピン（β−１及びβ−３）ループと、ｋｎｏｔの下の１つの（β−２）ループを有する。β−１ループはＣｙｓＩ及びＣｙｓＩＩとの間のアミノ酸の伸展により形成され、β−２ループはＣｙｓＩＩＩ及びＣｙｓＩＶとの間のアミノ酸により形成され、β−３ループはＣｙｓＩＶ及びＣｙｓＶ（図４Ａを参照）との間のアミノ酸により形成される。ヘアピンループのサイズ（すなわち示されたシステイン間のアミノ酸の数）は、ファミリーの間で著しく異なりうる。
【００５９】
特に好適な実施形態では、本発明に係る免疫原性化合物は、動物において、糖タンパク質ホルモン−β（ＧＬＨＢ）サブファミリー、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）サブファミリー、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）サブファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）サブファミリー又は糖タンパク質ホルモン−α（ＧＬＨＡ）サブファミリーのメンバーに対して免疫反応を誘導及び／又は強化できるアミノ酸配列を含んでなる好ましくは、前記アミノ酸配列は、前記シスチン−ｋｎｏｔタンパク質ファミリーの少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。相同性が高いほど、前記シスチン−ｋｎｏｔタンパク質ファミリーに対する免疫反応の誘発が、特異的になる。これらのサブファミリーは、多くの異なる種類の癌の形成及び増殖において重要な役割を果たす。したがって、これらのサブファミリーの少なくとも１つのメンバーに特異的な免疫反応の誘発は、この種の疾患の予防及び／又は抑止にとり有用である。更に、これらのサブファミリーの幾つかのメンバーは、生殖力の調節に関与している（ｈＣＧ、ＦＳＨ）。
【００６０】
特に好適な実施形態では、ＶＥＧＦに対する免疫反応を誘導できる免疫原性化合物の、免疫原性及び／又は免疫原性再現性が強化される。ＶＥＧＦ（特定のＶＥＧＦ−Ａ／Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及び／又はＶＥＧＦ−Ｄにおいて、）に対する免疫反応を誘発及び／又は強化することは、（リンパ）血管新生とは反対に作用する。これは例えば、個体が腫瘍関連の疾患に罹患する、あるいは罹患する危険性を有する場合に望ましい。腫瘍成長は、（リンパ）血管新生を必要とし、その際、新しい血管（又はリンパ管）の形成がなされ、それにより、栄養分が腫瘍部位へ輸送され、また腫瘍からの老廃物が輸送され、また拡散する。したがって、（リンパ）血管新生に反対に作用させることにより、腫瘍の成長及び拡散を防ぐことができる。（リンパ）血管新生では、内因性成長ホルモン（例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ−Ａ／Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及び／又はＶＥＧＦ−Ｄ））の作用が伴う。ゆえに、かかる成長因子の作用に間接的に反対に作用させることにより、腫瘍成長に反対に作用する（血管新生が少なくとも部分的に防止されるため）。
【００６１】
同様に、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）も血管新生に関与する。従って、ＰｌＧＦに対する免疫反応の誘発により、血管新生とは反対の作用が生じ、間接的に腫瘍成長と反対の作用が生じる。ＰｌＧＦは主に腫瘍組織中での血管新生に関与するが、通常の組織の血管新生にはほとんど関与しないか全く関与しないため、ＰｌＧＦに対する免疫反応を誘発及び／又は強化する治療は、好ましくない副作用が回避できるため、好ましい。
【００６２】
更なる好ましい実施形態では、ｈＣＧに対する免疫反応を誘導できる、免疫原性化合物の免疫原性及び／又は免疫原性再現性が強化される。ｈＣＧは通常、腫瘍組織において過剰発現する。したがって、ｈＣＧに対する免疫反応の誘発により、腫瘍組織が攻撃される。ｈＣＧは通常、妊娠中にのみ発現されるため、非妊娠個体においては、好ましくない副作用は少なくとも部分的に回避されうる。
【００６３】
更に、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＨＥＲ）、及び肝細胞成長因子／刺激因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は通常、腫瘍組織において過剰発現する。したがって、これらのタンパク質に対する免疫反応によっても、腫瘍組織が攻撃される。ＶＥＧＦ、ｈＣＧ、ＰｌＧＦ、ＨＥＲ及び／又はＨＧＦ／ＳＦに対する免疫反応は好ましくは、前記タンパク質に少なくとも部分的に由来するアミノ酸配列の使用によって誘発される。説明したように、上記アミノ酸配列は例えば、好ましくはＴＤＫ−Ａｌａｓｃａｎ法及び／又は置換ネットマッピング法を使用して最適化されるが、必須というわけではない。この方法により、免疫原性が強化される。したがって、更に提供される本発明に係る免疫原性化合物は、ＶＥＧＦ、ｈＣＧ、ＰｌＧＦ、ＨＥＲ及び／又はＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。また、腫瘍関連の疾患に対する薬剤及び／又はワクチンの調製への、前記免疫原性化合物の使用、並びに腫瘍関連の疾患に対するワクチンを動物に投与する方法であって、前記動物に本発明に係る免疫原性化合物を適切な投与量で投与するステップを有してなる方法の提供に関する。前記免疫原性化合物は、ＶＥＧＦ、ｈＣＧ、ＰｌＧＦ、ＨＥＲ及び／又はＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。また、本発明に係る免疫原性化合物の使用であって、前記免疫原性化合物が、ｈＣＧのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、生殖力調節のための薬剤及び／又はワクチンの調製への使用もまた提供される。
【００６４】
ＰｌＧＦは主に腫瘍組織の血管新生に関与するが、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ／Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ）もまた、別の（非腫瘍）組織の血管新生において重要な役割を果たす。また、非腫瘍関連の症状の場合においても、血管新生に反対の作用を生じさせることが望ましい（例えば眼内の網膜症（望ましくない眼内の血管新生であり、失明をもたらしうる））。したがって、更に提供される本発明に係る免疫原性化合物の使用は、前記免疫原性化合物が、ＶＥＧＦのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、血管新生に対する薬剤及び／又はワクチンの調製のための使用である。他の実施形態は、血管新生に対するワクチンを動物に投与する方法の提供に関し、当該方法は、前記動物に本発明に係る免疫原性化合物を適切な投与量で投与することを含んでなり、前記免疫原性化合物は、ＶＥＧＦのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。眼内の網膜症の場合には、本発明に係る前記免疫原性化合物を個体に投与することにより、例えばＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｂに対する免疫反応が誘発及び／又は強化される。それに加えて、又はその代わりに、本発明に係る前記免疫原性化合物による免疫付与の後、目に対して、当該個体又はヒト以外の動物に由来する抗ＶＥＧＦ−Ａ又は抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体、又はＴ細胞を投与する。前記免疫原性化合物がヒト以外の動物に投与された場合、回収された抗体又はＴ細胞は更に、ヒトへの使用に適応させるため、当該技術分野で公知の方法を用いて処理するのが好ましい。例えば、ヒト以外の抗体の重鎖及び軽鎖由来の６つの超可変領域を、ヒトフレームワーク配列中に組み込み、ヒト定常部と結合させてもよい。
【００６５】
肝細胞増殖因子受容体／刺激因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は、腫瘍の発生の後の、主に転移形成に関与する。特に前立腺癌の場合に、ＨＧＦ／ＳＦは重要な役割を演ずる。したがって、転移形成と反対の作用を生じさせるため、ＨＧＦ／ＳＦの作用と反対の作用を生じさせるのが特に好ましい。したがって、更に提供される本発明に係る免疫原性化合物の使用は、前記免疫原性化合物が、ＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、腫瘍関連の疾患の間の（好ましくは前立腺癌の間の）転移形成に対する薬剤及び／又はワクチンの調製への使用である。更に、腫瘍関連の疾患（好ましくは前立腺癌）の間に、動物に、転移形成に対するワクチン投与をする方法の提供に関する。当該方法は、本発明に係る免疫原性化合物を、前記動物に、適切な投与量で投与することを含んでなり、前記免疫原性化合物は、ＨＧＦ／ＳＦのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。
【００６６】
ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＨＥＲ又はＥｒｂＢ（又はＨＥＲ−１の場合にはＥＧＦ−Ｒ、又はＨＥＲ−２の場合にはｎｅｕ））は、多種多様な腫瘍（例えば胸部腫瘍など）において過剰発現する。ＨＥＲは多くの腫瘍において過剰発現するため、ＨＥＲに対する免疫付与により、広範囲の腫瘍関連の疾患に対する、一般的な治療方法が提供される。したがって、更に提供される本発明に係る免疫原性化合物の使用は、前記免疫原性化合物が、ＨＥＲのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部が、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する、腫瘍関連の疾患（好ましくは乳癌）に対する薬剤及び／又はワクチンの調製への使用である。更に、動物に、腫瘍関連の疾患（好ましくは乳癌）に対するワクチンを投与する方法の提供に関する。当該方法は、前記動物に、本発明に係る免疫原性化合物を適切な投与量で投与することを含んでなり、前記免疫原性化合物は、ＨＥＲのアミノ酸配列中の少なくとも一部と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する配列を有するアミノ酸配列を含んでなり、前記一部は、少なくとも８つのアミノ酸残基長を有する。
【００６７】
更に、本発明に係る免疫原性化合物を調製するための手段及び方法の提供に関する。一実施形態は、本発明に係る化合物の調製方法の提供に関する。当該方法は、
−  少なくとも第１及び第２の反応基を含んでなる足場を準備するステップと、
−  前記少なくとも第１及び第２の反応基と反応できる、少なくとも１つの分子を準備するステップであって、前記分子がアミノ酸配列を含んでなるステップと、
−  前記足場と、前記少なくとも１つの分子とを接触させ、カップリング反応において、前記足場と前記少なくとも１つの分子との間で少なくとも２つの結合を形成させるステップであって、結合の形成により連続的な結合の形成が加速され、前記カップリング反応が好ましくは溶液において、より好ましくは水溶液において実施されるステップと、
−  前記分子内部における内部結合の形成、及び／又は、前記分子と他の部分との第３の結合の形成を可能にし、誘導し及び／又は強化するステップと、
を有してなる。前記分子は好ましくはアミノ酸配列を含んでなる。前記内部結合は好ましくはＳＳ−架橋を含んでなる。上記したように、前記ＳＳ−架橋は、好ましくは２つのシステイン残基間の結合であり、システイン残基は好ましくはアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端端周辺に位置する。
【００６８】
前記分子は好ましくは、上記の足場のうちの少なくとも１つに結合する。ゆえに、本発明に係る化合物の調製方法の提供にも関し、当該方法では、前記足場が、（ヘテロ）芳香族分子、好ましくは少なくとも２つのベンジルハロゲン置換基を有する（ヘテロ）芳香族分子、より好ましくはハロメチルアレーンを含んでなり、前記ハロメチルアレーンが、好ましくはビス（ブロモメチル）ベンゼン、トリス（ブロモメチル）ベンゼン及びテトラ（ブロモメチル）ベンゼン、並びにそれらの誘導体からなる群から選択される。一実施形態では、前記足場は、オルト−、メタ−及びパラ−ジハロキシレン及び１，２，４，５テトラハロジュレングループから選択され、好ましくはメタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｍ−Ｔ２）オルト−１，２−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｏ−Ｔ２）パラ−１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（ｐ−Ｔ２）メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）ピリジン（ｍ−Ｐ２）２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（Ｔ３）メタ−１，３−ビス（ブロモメチル）−５−アジドベンゼン（ｍ−Ｔ３−Ｎ３）又は１，２，４，５テトラブロモジュレン（Ｔ４）である。
【００６９】
本発明に係る免疫原性化合物は特に、ヒト以外の動物を使用した抗体、Ｔ細胞及びＢ細胞の生成に適している。したがって、抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を産生させる方法が更に提供され、当該方法は、
−  本発明に係る免疫原性化合物及び／又は本発明に係る免疫原性組成物を、ヒト以外の動物にワクチン投与するステップと、
−  前記動物から、前記免疫原性化合物に特異的に結合できる抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を回収するステップと、
を有してなる。更なる好ましい実施形態では、前記動物から得られる前記抗体を使用して、モノクローナル抗体を産生するステップを有してなる。ヒト以外の動物にワクチン投与をして、抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞を回収し、目的の抗体を分離し、モノクローナル抗体を産生する方法及びプロトコルは公知であり、更なる説明の必要はない。
【００７０】
好ましい実施形態では、誘発された抗体、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞は更に、ヒトへの利用に用いられる。例えば、Ｉｇの重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子を、回収したＢ細胞から単離し、第２の細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系など）で発現させる。前記第２の細胞（また本願明細書においてプロデューサー細胞と称する）は、産業規模での抗体の生産にとり好適である。前記プロデューサー細胞の増殖により、目的の抗体を生産できるプロデューサー細胞株が確立される。好ましくは、前記プロデューサー細胞株はヒト用の化合物の調製に適している。ゆえに前記プロデューサー細胞株は好ましくは、病原体（例えば病原性微生物）を含まない。その代わりに、又はそれに加えて、Ｔ細胞受容体をコードする核酸を、回収した目的のＴ細胞から分離し、天然型の（好ましくはヒト）Ｔ細胞に導入する。好ましくはＴ細胞を培養し、Ｔ細胞株を得る。
【００７１】
本発明を、以下の実施例で更に詳細に説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明を明確化するものに過ぎない。
【実施例】
【００７２】
材料及び方法：ペプチドのバルク合成：
Ｓｙｒｏ−シンセサイザ（ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ社、ドイツ）により、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ（ＲｉｎｋＡｍｉｄｅ）樹脂（ＢＡＣＨＥＭ、ドイツ）を使用して、固相ペプチド合成によりペプチドを合成した。全てのＦｍｏｃ−アミノ酸を、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ（ＫＷ）、Ｏ−ｔ−Ｂｕ（ＤＥＳＴＹ）、Ｎ−Ｔｒｔ（ＨＮＱ）、Ｓ−Ｔｒｔ（Ｃ）、Ｓ（Ａｃｍ）（Ｃ）又はＮ−Ｐｂｆ（Ｒ）基として保護された側鎖官能性を有する状態で、Ｏｒｐｅｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａ社（ハイデルベルク、ドイツ）又はＳｅｎｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｄｉｅｌｓｄｏｒｆ、スイス）から購入した。二重カップリングを使用した、３０分の活性化時間による、ＮＭＰにおけるＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／アミノ酸／ＤＩＰＥＡ（１：１：１：２）の６．５倍の過剰によるカップリングプロトコルを使用した。室温で、樹脂を３０分間ＮＭＰ／Ａｃ２Ｏ／ＤＩＥＡ＝１０：１：０．１（ｖ／ｖ／ｖ）と反応させ、ペプチドのアセチル化を実施した。アシル化されたペプチドを、室温で２〜４時間、１３．３％（ｗ）のフェノール、５％（ｖ）のチオアニソール、２．５％（ｖ）の１，２−エタンジチオール及び５％（ｖ）のｍｉｌｌｉ  Ｑ−Ｈ２Ｏを含有するＴＦＡ（１５ｍｌ／ｇの樹脂）と反応させることによって、樹脂から分離除去した。粗製のペプチドを、「ＤｅｌｔａＰａｃｋ」（２５×１００又は４０×２１０ｍｍの内径、１５μｍの粒径、１００Åのポアサイズ、Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）、又は、「ＸＴＥＲＲＡ」（１９×１００ｍｍの内径、５μｍの粒径（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）、ＲＰ−１８調製用Ｃ１８カラム、１〜２％のＢ／分のリニアＡＢグラジェント、溶媒Ａ：０．０５％のＴＦＡを含有する水、溶媒Ｂ：０．０５％のＴＦＡを含有するＡＣＮ）を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製した。ペプチドの正確な一次イオン分子量を、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、オランダ）による電子−スプレーイオン化質量分析、又はＶＧ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩ（ＶＧ  Ｏｒｇａｎｉｃ、英国）質量分析によって確認した。アミノ酸を、１文字表記で示す。星印（＊）は、Ｎ末端のアセチル化を示し、ナンバー記号（＃）はＣ末端のアミド化を示す。
【００７３】
ｍＴ２−ペプチドの合成：
２つの遊離システイン（ＣＴ）を含有するペプチドを、室温で３時間、２５％のＡＣＮ／７５％の重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）中の１，３−（ビスブロモメチル）ベンゼン１．０５当量と反応させ、ｍＴ２  ＣＬＩＰＳ上へ環化させた。Ｔ２−ペプチド構築物を、ＲＰ−ＨＰＬＣで生成し、更にアニオン交換樹脂で室温で２〜３時間処理した。最後に、ペプチド構築物をＡＣＮ／ｍｉｌｌｉＱ−Ｈ２Ｏ溶液から凍結乾燥し（３×）、ＴＦＡ及び／又は重炭酸アンモニウムを完全に除去した。１，３−（ビスブロモメチル）ベンゼン（ｍＴ２）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、オランダ）から購入した。
【００７４】
Ｔ２／ＳＳ又はＰ２／ＳＳ−ペプチドの合成：
ペプチド（２つの遊離システイン（ＣＴ）及び２つのＡｃｍ保護されたシステイン（ＣＳ）を含む）を、室温で３時間、２５％のＡＣＮ／７５％重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）中の、１．０５当量の対応する（ビスブロモメチル）ベンゼン又はピリジン化合物と反応させ、Ｔ２／Ｐ２  ＣＬＩＰＳ上で環化させた。Ａｃｍ−基の脱保護及び次のＳＳ−酸化のため、Ｔ２／Ｐ２−ペプチド構築物を室温で１５分間、１ｍＭ（最終濃度）となるように、ＭｅＯＨ／ＤＭＳＯ（９：１、ｖ／ｖ）の混合物中で、過剰量（１０当量）のＩ２で処理し、更にｖｉｔＣで過剰のＩ２を除去した。反応混合物を更に、９倍容のＨ２Ｏで希釈し、ＨＰＬＣ−抽出用のＲＰ  Ｃ１８−カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ  ３ｃｃ、Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ、米国）を通じて濾過した。ペプチド構築物を更に、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（６ｍＬ、１：１  ｖ／ｖ）による溶出によって回収し、更に凍結乾燥して溶媒を除去した。ペプチド構築物をＲＰ−ＨＰＬＣで更に精製し、更に室温で２〜３時間、アニオン交換樹脂（ＢＩＯ−ＲＡＤ、ＡＧ  １−Ｘ８樹脂（１００−２００メッシュ）で処理した。最後に、ペプチド構築物をＡＣＮ／ｍｉｌｌｉＱ−Ｈ２Ｏ溶液から凍結乾燥し（３×）、ＴＦＡ及び／又は重炭酸アンモニウムを完全に除去した。１，２−（ｏＴ２）、１，３−（ｍＴ２）、１，４−（ビスブロモメチル）ベンゼン（ｐＴ２）及び１，３−ビス（ブロモメチル）ピリジン（ｍＰ２）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、オランダ）から購入した。
【００７５】
ワクチン投与試験：
オスのウィスターラットを、０日目に、４００μＬのＰＢＳ／ＣＦＡ＝１：１（ｖ／ｖ）中のＣＬＩＰＳ／ＳＳ−ペプチド構築物〜２．５ｍｇ／ｍＬ溶液（ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水、ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント）でワクチン投与し、更に４週目にブースター（同じ量及び濃度）を行った。８−９週後にラットから採血し、抗血清を回収した。
【００７６】
ＥＬＩＳＡによる抗ＦＳＨペプチド抗血清の評価：
抗血清を、２，２’−アジン−ジ（エチルベンズチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴＳ）を使用して、ＦＳＨ−結合ＥＬＩＳＡ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、ＰＳ；１μｇ／ｍＬのタンパク質によるＧＤＡ−コーティング）で分析した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識ヤギ−抗−ラット血清を用いた。市販の抗タンパク質抗体を、ポジティブコントロールとして分析対象に含めた。ＦＳＨは、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ者から購入した。
【００７７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、抗ＦＳＨペプチド抗血清によるＦＳＨ阻害活性：
抗ＦＳＨ抗血清のＦＳＨ阻害活性を、Ｙ１マウス副腎細胞（ｈＦＳＨＲのｃＤＮＡで安定にトランスフェクション）を用いて、ヒトＦＳＨＲ細胞系アッセイにおいて測定した（Ｗｅｓｔｈｏｆｆその他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９７、５６、４６０−４６８）。このアッセイでは、抗ＦＳＨ抗体が、天然のＦＳＨの細胞表面レセプタ（ＦＳＨＲ）上へのホルモン（生物学的）活性を中和する能力を測定した。市販の抗ＦＳＨ  ｍＡｂ  ６６０２を、ポジティブコントロールとして用いた。ＦＳＨは、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ社から購入した。
【００７８】
結果：
実施例１：ＣＴＣ−（６１−７４）及びＣＳＳＣ−拘束（５６−７９）ペプチドの存在による、ｈＦＳＨ−交差反応性抗血清の産生能に対する効果：
【００７９】
以下のｈＦＳＨに由来するペプチドを合成し、ｈＦＳＨ交差反応性抗体の産生能を評価した。
１．一重拘束ペプチド（ＣＴＣ単独）、
２〜５．二重拘束ペプチド（ＣＴＣ：６１−７４で固定、ＣＳＣ：４つの異なる位置で固定）。結果を表３及び図５に示す。
【００８０】
表３：Ｙ１細胞バイオアッセイにおける、ＦＳＨ−β３ループｍＴ２／ＳＳ  ＣＬＩＰＳペプチドによるワクチン処理試験＋それに対応する中和活性による、抗体応答
【表２】
2009544697.tif 000003
ａ．「ＣＴ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基がＴ２−ＣＬＩＰＳを介して連結することを表す。「Ｃｓ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基がシステイン（＝ＳＳ）架橋を介して連結することを表す。
ｂ．Ｆｏｘ他に従うアミノ酸位の付番。（Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．２００１、１５、３７８−３８９）。
ｃ．抗体力価は、ＥＬＩＳＡにより測定し（実施例１のＭａｔｅｒｉａｌｓ及びＭｅｔｈｏｄｓを参照）、血清の希釈度は１０ｌｏｇ値として表した。その際、結合ＥＬＩＳＡにおけるＯＤは＞３×バックグラウンド−ＯＤである（１／１０希釈＝１、１／１００＝２、１／１０００＝３、１／１００００＝４など）。
ｄ．数値をＦＳＨ−刺激アッセイにおいて測定し（実施例１の材料及び方法を参照）、最も高い精製血清（ｐｒｏｔＧ−カラム）の希釈剤を表す。その際、ＦＳＨ誘導された生物活性の完全なブロッキングが依然観察された（６ｎｇ／ｍＬのＦＳＨで細胞刺激）。
【００８１】
この試験により、二重拘束ＦＳＨタンパク質β３−ループ擬態物（位置６１と７４のｍＴ２−ＣＬＩＰＳ、加えて位置５５と８０、又は５７と７８間の内部ジスルフィド（ＳＳ）結合により高次構造的に拘束される）が、高レベルの、かつ再現性のある抗ＦＳＨ抗体（及び中和）抗体力価（ペプチド３及び５における、２×４．６及び４．５／４．４）を生じさせることが示された。内部ジスルフィド（ＳＳ）結合の位置は、この試験において系統的に変化し、５５〜８０及び５７〜７８で最適であるとわかった。ペプチド２における抗ＦＳＨの中和効果の欠如は、正しい抗体を生成するために必要となる結合エピトープ（Ｖ５７及びＶ７８）の部分的な欠失が原因と考えられる。
【００８２】
本発明に係る方法で得られた抗ＦＳＨ抗体の力価は、位置６１と７４で、ｍＴ２−ＣＬＩＰＳのみを介して拘束され、内部ジスルフィド（ＳＳ）結合（化合物１）を欠く、対応する一重拘束ペプチドと比較し、顕著に高く、再生可能であった（２×４．６、ｉ．ｓ．ｏ．３．５／１．５）。上記の結果は、二重拘束（ｍＴ２−ＣＬＩＰＳ＋ＳＳ−結合）ＦＳＨβ３−ループ擬態物が、対応する一重拘束化合物（化合物１：ｍＴ２−ＣＬＩＰＳ単独）より顕著に高い抗ＦＳＨ  Ａｂ−力価を生じさせることを明らかに証明するものである。更に、本発明に係る同じ化合物（化合物２、３、４又は５）でワクチン投与された２匹の個々のラットの抗体価が、コントロール化合物（化合物１）でワクチン投与された２匹の個々のラットの抗体価と比較し、各々に類似することを図５に示す。ゆえに、動物個体間の変動が少なく、免疫原性再現性が強化されていることを意味する。
【００８３】
実施例２：一重拘束ペプチド７〜８及び直鎖状ペプチド６と比較した、二重拘束ペプチド３の、ｈＦＳＨ−交差反応性抗血清の産生能：
【００８４】
ｈＦＳＨに由来する、以下のペプチドのセットを合成し、それらのｈＦＳＨ交差反応性抗体を誘発する能力を評価した。
Ａ：
６．直鎖状ペプチド（拘束なし）、
７．一重拘束ペプチド（ＣＴＣ単独）、
８．一重拘束ペプチド（ＣＳＣ単独）、
３．二重拘束ペプチド（ＣＴＣ及びＣＳＣ）（実施例１を参照）。
Ｂ：
９．直鎖状ペプチド（拘束なし）、
１０．一重拘束ペプチド（ＣＴＣ単独）、
１１．一重拘束ペプチド（ＣＳＣ単独）、
１２．二重拘束ペプチド（ＣＴＣ及びＣＳＣ）。
【００８５】
表４及び図６で、ラット抗血清における、これらの２つのセットのペプチド（ＦＳＨのβ３−ループを模倣する）により誘発されるｈＦＳＨの中和活性（ＮＴ）及びＥＬＩＳＡ−力価（ＥＴ）に関するデータを要約する。
【００８６】
表４：
【表３】
2009544697.tif 000004
ａ．「ＣＴ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基が（１，３−ジメチルベンジル）−ベースのリンカーを介して連結することを表す。「Ｃｓ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基がシステイン（＝ＳＳ）架橋を介して連結することを表す。
ｂ．Ｆｏｘ他に従うアミノ酸位の付番。（Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．２００１、１５、３７８−３８９）。
ｃ．抗体力価は、ＥＬＩＳＡにより測定し（実施例１のＭａｔｅｒｉａｌｓ及びＭｅｔｈｏｄｓを参照）、血清の希釈度は１０ｌｏｇ値として表した。その際、結合ＥＬＩＳＡにおけるＯＤは＞３×バックグラウンド−ＯＤである（１／１０希釈＝１、１／１００＝２、１／１０００＝３、１／１００００＝４など）。「−」はＥＬＩＳＡ力価＜２．０を示す。
ｄ．中和力価（ＮＴ）を、ＦＳＨ刺激アッセイにおいて測定し（材料及び方法を参照）、最も高い精製血清（ｐｒｏｔＧ−カラム）の希釈度を表す（１／１０希釈＝１、１／１００＝２、１／１０００＝３など）。その際、ＦＳＨ誘導された生物活性の完全なブロッキングが依然観察された（６ｎｇ／ｍＬのＦＳＨで細胞刺激）。「−」は中和力価＜１．０を示す。
【００８７】
この２つのセットの試験（Ａ及びＢ）により、二重拘束ＦＳＨタンパク質β３−ループ擬態物３及び１２（位置６１及び７４のｍＴ２−ＣＬＩＰＳ、更に位置５６及び７９間の内部ジスルフィド（ＳＳ）結合により、高次構造が拘束）の能力が、対応する一重拘束ペプチド７−８及び１０−１１では部分的に、又は対応する直鎖状ペプチド６及び９では完全に、喪失していることが示された。ゆえに、これらの試験は、２つの拘束の存在が重要であることを。更に、測定されたＥＴとＮＴとの間に強い相関が存在した。すなわち、高いＥＴにより、高いＮＴが予測される。
【００８８】
結論：
ＣＴＣ−及びＣＳＣ−拘束の両方を有するペプチド（ＦＳＨのβ３−ループに由来）でラットに免疫付与した結果、再現的に抗血清が産生され、ＥＬＩＳＡにおいてｈＦＳＨと強く結合し、ＦＳＨ−刺激アッセイにおいてｈＦＳＨの生物活性を中和した。直鎖状ペプチドでは全く効果がなく、一重拘束ペプチド（ＣＴＣ−又はＣＳＣ−拘束単独）では効果がはるかに弱かった（２つに１つで反応、非常に低いＥＴ／ＮＴ）。
【００８９】
実施例３：ＣＴＣ−拘束のタイプ（オルト／メタ／パラ−キシリル：２，６−ジメチルピリジル）の違いによる、ペプチドのｈＦＳＨ−交差反応性抗血清の産生能に対する効果：
【００９０】
ペプチド形態の拘束に用いるＣＴＣ−拘束タイプがそれぞれ異なる、二重拘束ｈＦＳＨに由来する、以下のペプチドセットを合成し、ｈＦＳＨ交差反応性抗体の産生能を評価した。
３．メタキシリルリンカー、
１３．オルトキシリルリンカー、
１４．パラ−キシリルリンカー、
１５．メタ−（２，６−ジメチルピリジル）リンカー。
【００９１】
表５で、ＦＳＨ  β３−ループを模倣する拘束ペプチドに対するラット抗血清の、ｈＦＳＨに対する中和活性（ＮＴ）及びＥＬＩＳＡ−力価（ＥＴ）に関するデータを要約する。
【００９２】
表５：
【表４】
2009544697.tif 000005
下付文字ａからｄは、実施例１を参照のこと。
【００９３】
これらのデータは、実施例１にて説明したように、良好な抗体産生が、ペプチド形態の拘束に用いるＣＴＣ−拘束のタイプ（オルト／メタ／パラ−キシリル、２，６−ジメチルピリジル）には依存しないことを明らかに示すものである。結果は、メタ配向キシリル又はジメチルピリジルベースのリンカーにおいて最適であることを示すが、オルト／パラ−キシリル−ベースのリンカーもまた、直鎖状若しくは位置６１−７４で拘束されたペプチドと比較し、非常に良好（高いｈＦＳＨ−ＥＴ／ＮＴ）であることを示すものである。
【００９４】
結論：
ＣＴＣ拘束のタイプは適宜変化させてもよく、良好な抗体産生においてはそれほど重要でなかった。
【００９５】
実施例４Ａ：ｈＦＳＨ−交差反応性抗血清を産生するペプチドの能力に対する、ＣＴＣ−拘束位置の効果：
【００９６】
ＣＴＣ−拘束位置が異なる二重拘束ｈＦＳＨに由来する、以下のペプチドセットを合成し、ｈＦＳＨ交差反応性抗体の産生能を評価した。
６、１６−１９：エピトープ「内部」のＣＴＣ−拘束（５９−７６から６３−７２）、
２０−２２：エピトープの「外側」のＣＴＣ−拘束（５７−７８から５５−８０）。
【００９７】
表６で、ＦＳＨ  β３−ループを模倣するＴ２／ＳＳ−二重拘束ペプチドに対するラット抗血清の、ｈＦＳＨの中和活性（ＮＴ）及びＥＬＩＳＡ−力価（ＥＴ）に関するデータを要約する。
【００９８】
表６：
【表５】
2009544697.tif 000006
下付文字ａからｄは、実施例１を参照のこと。
【００９９】
表６のデータは、「内部」へのＣＴＣ拘束の配置を有するエピトープ（６３−７２から５９−７６）の場合、特定の位置（６１−７４、６３−７２）の場合にのみ高いＥＴであり、一方残りの位置（６２−７３、６０−７５、５９−７６）では、ｈＦＳＨ交差反応性抗体の産生能が全く損なわれることを示すものである。これは、ｈＦＳＨの抗体認識にとり重要なアミノ酸（Ｅ５９、Ｔ６０、Ｒ６２、Ｌ７３）の除去に起因する。その代わり、エピトープの「外側」におけるＣＴＣ−拘束の配置（５７−７８から５５−８０）では、全ての位置において高いＥＴを示した。すなわちこの場合、ＣＴＣ−拘束の存在が、当該ペプチドの、正しいｈＦＳＨ−交差反応性抗体の産生能にとり、それほど阻害要因とはならないことを示すものである。
【０１００】
結論：
重要なアミノ酸を用いて結合を形成してはならない。上記結合はエピトープの外側で形成されるのが好ましい。但しエピトープ内部の非必須アミノ酸であれば用いてもよい。
【０１０１】
実施例４Ｂ：ｈＦＳＨ−交差反応性抗血清を産生するペプチド能力への、ＣＳＳＣ−拘束位置の効果：
【０１０２】
ＣＳＳＣ−拘束位置が異なる二重拘束ｈＦＳＨに由来する、の以下のペプチドセットを合成し、ｈＦＳＨ交差反応性抗体の産生能を評価した。
２３：５７−７８のＣＳＳＣ−拘束、
２４：５５−８０のＣＳＳＣ−拘束、
２５：５４−８１のＣＳＳＣ−拘束、
２６：５１−８４のＣＳＳＣ−拘束、
２７：４８−８７のＣＳＳＣ−拘束、
２８：４５−９０のＣＳＳＣ−拘束。
【０１０３】
これに加えて、位置６１−７４のＣＴＣ−拘束を欠く、以下の一重拘束ペプチドのセットを合成し、比較した。
２６−ＳＳ：５１−８４でのＣＳＳＣ−拘束のみ、
２７−ＳＳ：４８−８７でのＣＳＳＣ−拘束のみ、
２８−ＳＳ：４５−９０でのＣＳＳＣ−拘束のみ。
【０１０４】
表７で、ＦＳＨ  β３−ループを模倣するこの拘束されたペプチドセットに対するラット抗血清の、ｈＦＳＨの中和活性（ＮＴ）及びＥＬＩＳＡ−力価（ＥＴ）に関するデータを要約する。
【０１０５】
表７：
【表６】
2009544697.tif 000007
【０１０６】
結論：
上記のデータは、エピトープ（５８−７９〜４５−９０）の外側でＣＳＳＣ−拘束位置を変化させても、それ程ペプチドの免疫原性性質に影響せず、全ての二重拘束ペプチドにおいて高いＥＴであることを明らかに示すものである。これとは対照的に、ＣＳＳＣ−拘束（２６ＳＳ−２８ＳＳ）のみを有する対応する一重拘束ペプチドはそれ程効果的ではなく、ほぼ完全に、ｈＦＳＨ−交差反応性抗体の顕著な産生能が損なわれていた。
【０１０７】
実施例５Ａ：ｈＶＥＧＦ（ｃｙｓ−ｋｎｏｔの成長因子ファミリーの更にもう１つのメンバー）のβ５−ループ−β６領域に由来する、二重拘束ペプチド（ＣＴＣ及びＣＳＣ）の、ｈＶＥＧＦ−交差反応性抗血清の産生能：
【０１０８】
ｈＶＥＧＦに由来する、以下のペプチドセットを合成し、ｈＶＥＧＦ交差反応性抗体の産生能を評価した。
２９：直鎖状ペプチド（拘束なし）、
３０：一重拘束ペプチド（７８−９４のＣＴＣ単独）、
３１：二重拘束ペプチド（７８−９４のＣＴＣ及び７４−９８のＣＳＳＣ）。
【０１０９】
結果を表８に示す。
【０１１０】
表８：
【表７】
2009544697.tif 000008
ａ．「ＣＴ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基が（１，３−ジメチルベンジル）−ベースのリンカーを介して連結することを表す。「Ｃｓ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基がシステイン（＝ＳＳ）架橋を介して連結することを表す。
ｂ．アミノ酸の付番は、ｄｅ  Ｖｏｓら（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９８，６，１１５３−１１６７）に準拠した。
ｃ．ペプチド及びタンパク質（ｈＶＥＧＦ）抗体価（ＥＴ）は、ＥＬＩＳＡにより測定し（材料及び方法を参照）、血清希釈度のログ値として表した。その際、結合ＥＬＩＳＡにおけるＯＤは＞３×バックグラウンド−ＯＤである（１／１０希釈＝１、１／１００＝２、１／１０００＝３、１／１００００＝４など）。「−」はＥＬＩＳＡ力価＜２．０を示す。
【０１１１】
ＦＳＨ（実施例１−４を参照）で観察されたのと同様に、この試験においもまた、ｈＶＥＧＦのβ５−ループ−β６領域に由来する、高次構造が二重拘束されたペプチド（位置７８−９４のＣＴＣ−拘束、及び位置７４−９８のＣＳＳＣ−拘束の両方による）では、高レベルかつ再現性を有する抗ＶＥＧＦ抗体（及び中和）力価（ペプチド３１においては２×＞４．４）が観察された。
【０１１２】
実施例５Ｂ：ｈＶＥＧＦ（ｃｙｓ−ｋｎｏｔの成長因子ファミリーの更にもう１つのメンバー）のβ５−ループ−β６領域に由来する、二重拘束ペプチド（ＣＴＣ及びＣＳＣ）の、表面に固定したｈＶＥＧＦに対する抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂの結合をブロックする能力
【０１１３】
６つの抗ペプチド抗血清２９．１−３１．２（実施例５Ｂを参照）により、結合競合試験を実施し、ｈＶＥＧＦと結合する血清の能力を評価した。この試験のセットアップ（図７に図式的に示す）は以下の通りである：
ＥＬＩＳＡ−プレートを、ｈＶＥＧＦ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ＰＳ；酢酸バッファ（ｐＨ＝５）中で３時間のＧＤＡ−活性化、更にリン酸バッファ（ｐＨ＝８）中で１μｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦに曝露、一晩）でコーティングした。更にウェルを、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ（４０ｎｇ／ｍＬ）と、６つの抗血清のうちの１つ（１／１０希釈）（／５％のウマ血清中）との１：１混合液１００μＬを用いて、３７℃で１時間インキュベートした。表面に固定された、ＶＥＧＦと結合する抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂの量を、更に、２，２’−アジン−ジ（エチルベンズチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴＳ）と、二次抗体としてのペルオキシダーゼ標識ヤギ−抗ヒト血清との組み合わせを使用して決定し、それを用いて、抗ペプチド血清の、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂとの結合に関する競合能力を測定した。ＶＥＧＦと結合する抗ペプチド血清の結合、及びそれによるｍＡｂの結合をブロックする能力はすなわち、ｍＡｂの低い結合レベルをもたらすものである。
【０１１４】
上記の結果（図７を参照）はまた、二重拘束ペプチド３１に由来する抗ペプチド血清の性能は、対応する直鎖状ペプチド（２９）及び一重拘束ペプチド（３０）よりも非常に強いことを明らかに示すものである。抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂのＶＥＧＦへの結合をブロックする抗ペプチド血清２９．１／２の能力は、測定不能（非特異性ＩｇＧのそれに等しい）であり、一方、一重拘束ペプチド３０に対する血清のうちの１／２のみが活性を示した。
【０１１５】
全体の結論：
実施例１のｈＦＳＨに関して説明した、二重拘束ペプチドによりラットの免疫付与により、ｈＶＥＧＦと非常に類似する結果が得られたが、ｃｙｓ−ｋｎｏｔタンパク質−ファミリーの他のメンバーとは類似しなかった。ＥＬＩＳＡにおいて見られる、二重拘束ペプチド（ＣＴＣ−及びＣＳＣ−拘束の両方）により生じた両抗血清（２−ｏ−２）のｈＶＥＧＦへの結合はいずれも、直鎖状（ＣＴＣ−なし、及びＣＳＣ−拘束）又は一重拘束（ＣＴＣ−拘束のみ）ペプチドによって生じた抗血清よりも優れていた。更に、ＥＬＩＳＡにおける競合試験で、両方の血清が、ｈＶＥＧＦのβ５−ループ−β６一部に由来する直鎖状又は一重拘束ペプチドを含む血清より、非常に能率的に表面固定されたＶＥＧＦと抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂとの結合をブロックすることが明らかに示された。
【０１１６】
実施例６：上皮細胞増殖因子受容体ファミリー（ＥＧＦＲ）に属するＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）タンパク質のドメインＩＩ（ＣＲ１）に存在する二量体化アームに由来する、二重拘束ペプチド（ＣＴＣ及びＣＳＣ）の、ＥＲｂＢ２−交差反応性抗血清を生成する能力：
【０１１７】
ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）に由来する、以下のペプチドセットを合成し、ＥｒｂＢ２に対する交差反応性抗体の産生能を評価した。
３２：直鎖状ペプチド（拘束なし）、
３３：一重拘束ペプチド（２４６−２６６のＣＴＣのみ）、
３４：二重拘束ペプチド（２５１−２６０のＣＴＣ、及び２４６−２６６のＣＳＳＣ）、
３５：二重拘束ペプチド（２５４−２５６のＣＴＣ、及び２４６−２６６のＣＳＳＣ）。
【０１１８】
結論：
表９のデータは、ｈＦＳＨに関して実施例１にて説明したように、二重拘束ペプチドによるラットの免疫付与により、ＥＲｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）受容体タンパク質（受容体蛋白のＥＧＦＲ−ファミリーのメンバー）のドメイン−ＩＩ（ＣＲ１）中の二量体化アームに由来する二重拘束ペプチドにおいて、非常に類似する結果が得られることを明らかに示すものである。
【０１１９】
表９：
【表８】
2009544697.tif 000009
ａ．「ＣＴ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基が（１，３−ジメチルベンジル）−ベースのリンカーを介して連結することを表す。「Ｃｓ」で示すアミノ酸は、Ｃｙｓ残基がシステイン（＝ＳＳ）架橋を介して連結することを表す。
ｂ．Ｎａｇａｔａらによるアミノ酸位の付番（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６，２９０，Ｇ１２４３−Ｇ１２５１）。
ｃ．ペプチド及びタンパク質（ｈＶＥＧＦ）抗体価（ＥＴ）は、ＥＬＩＳＡにより測定し（材料及び方法を参照）、血清希釈度の１０ｌｏｇ値として表した。その際、結合ＥＬＩＳＡにおけるＯＤは＞４×バックグラウンド−ＯＤである（１／１０希釈＝１、１／１００＝２、１／１０００＝３、１／１００００＝４など）。「−」はＥＬＩＳＡ力価＜２．０を示す。
【０１２０】
総合すると、２つの異なる二重拘束ペプチド（ＣＴＣ−及びＣＳＣ−拘束の両方）によって産生される４つの抗血清（２×２）は、ＥＬＩＳＡのＥＲｂＢ２タンパク質と強く結合した。これとは対照的に、対応する直鎖状ペプチドを用いて得られた抗血清は、ＥＲｂＢ２と弱く結合するだけであり（１−ｏ−２；ＥＴ＝２．４；＜２．０）、一報、一重拘束ペプチド（ＣＴＣ−拘束のみ）を用いて得た抗血清の場合、２つの血清のいずれも、ＥＬＩＳＡにおいてＥＲｂＢ２タンパク質と結合しなかった（ＥＴ＝＜２．０）。
【０１２１】
実施例７：Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属する、ＣＣＲ５−受容体タンパク質の細胞外領域ループ−２（ＥＣＬ−２）に由来する、二重拘束ペプチド（ＣＴＣ及びＣＳＣ）の、受容体蛋白を模倣する能力：
【０１２２】
ＣＣＲ５のＥＣＬ−２ループに由来する、以下のペプチドセットを合成し、抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体への結合に関する、受容体タンパク質を模倣する能力に関して試験した。
３６：直鎖状ペプチド（拘束なし）、
３７：一重拘束ペプチド（１６９−１７８のＣＴＣのみ）、
３８：二重拘束ペプチド（１６９−１７８のＣＴＣ、及び１６７−１８０のＣＳＳＣ）、
３９：二重拘束ペプチド（１６９−１７８のＣＴＣ、及び１６６−１８１のＣＳＳＣ）。
【０１２３】
これらの４つのペプチドを用いて結合競合試験を行い、抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体２Ｄ７（また図８を参照）と結合するそれらの能力を評価した。これにより、ＣＣＲ５−受容体タンパク質の表面を機能的に模倣させる手段が提供され、それにより、ＣＣＲ５に対する抗体を産生させるための良好な免疫原ともなりうることが示された（実施例１から４で示すＦＳＨ由来ペプチドの免疫原性は、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ（データ示ず）における、抗ＦＳＨ  ｍＡｂの結合をブロックするこれらのペプチドの改良された能力に、正確に対応していた）。表面に固定された、ＣＣＲ５のＥＣＬ２ａ−ループに由来するペプチドを用いた、ｍＡｂ  ２Ｄ７とペプチドとの結合する能力を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ｍＡｂ  ２Ｄ７はＥＬＩＳＡにおいて、このペプチドと強く結合した。溶液中における２Ｄ７に対するペプチド３６−３９の結合は、本発明において、表面に固定されたペプチドへの結合競合試験として行われ、ｍＡｂ  ２Ｄ７の表面への結合の減少として示されている。
【０１２４】
競合試験のセットアップ（図８に図式的に示す）は、以下の通りである：
ＥＬＩＳＡプレートを、二重拘束ペプチド＊ＣＳＦＴＲＣＴＴＱＫＥＧＬＨＹＴＣＴＴＳＳＨＣＳ＃（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ＰＳ；酢酸バッファ（ｐＨ＝５）中で３時間、ＧＤＡ−活性化、更にリン酸バッファ（ｐＨ＝８）中で、１０μｇ／ｍＬの拘束ペプチドで一晩曝露）でコーティングした。更に、上記のウェルを、５％のウマ血清中の、ｍＡｂ  ２Ｄ７（２２ｎｇ／ｍＬ）と、上記４つのうちの１つのペプチド（開始濃度５００μＭ、１／３希釈系列）との１：１混合液１００μＬで、３７Ｃで１時間インキュベートした。次に、表面に固定された拘束ペプチドと結合するｍＡｂ  ２Ｄ７の量を、２，２’−アジン−ジ（エチルベンズチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴＳ）を使用して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ−抗−マウス血清との組合せにより測定した。
【０１２５】
上記の結果は、二重拘束ペプチド（３８−３９）の性能は、対応する直鎖状（３６）及び一重拘束ペプチド（３７）より非常に強いことを明らかに示すものであった（図８を参照）。２Ｄ７との結合をブロックする直鎖状ペプチド３６の能力は、最高濃度においても検出することができず、一方、一重拘束ペプチド３７では、５００μＭにおいて〜５０％であった。しかしながら、二重拘束ペプチド３８及び３９では、２Ｄ７の結合を１６５μＭの濃度で〜９０％で阻害したため、効果が非常により高いことが示された。これは明らかに、ｍＡｂ結合ペプチドとしての、二重拘束ペプチドの改良された可能性を示すものである。
【０１２６】
結論：
受容体タンパク質ＣＣＲ５のＥＣＬ２−ループに由来する二重拘束ペプチドは、対応する直鎖状又は一重拘束ペプチドより、非常に良好にこのレセプタを擬態することが、競合ＥＬＩＳＡ試験により確認された。すなわち、これらのペプチドで免疫することにより、天然型のＣＣＲ５との交差反応をし得る抗体又は抗血清を産生させる能力が改良されることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009544697.tif 000017
【国際調査報告】
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2009544697.tif 000019
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