(57)【要約】  本発明は、哺乳類の健康状態を促進するための、またはより高齢の成体哺乳類における遺伝子発現プロフィールをより若い成体哺乳類に見られる発現プロフィールとの一致に向けて変化させるためのレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の使用、ならびに対応する栄養補給食品組成物を製造するためのそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の健康状態を促進するための栄養補給食品組成物を製造するためのレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の使用。
【請求項２】
栄養補給食品組成物を通じて、このような化合物の有効量を哺乳類に提供することによって哺乳類の健康状態を促進するためのレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の使用。
【請求項３】
健康状態の促進が、より高齢の成体哺乳類における遺伝子発現プロフィールをより若い成体哺乳類に見られる発現プロフィールとの一致に向けて変化させることによって達成される、請求項１または２に記載のレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の使用。
【請求項４】
遺伝子が、より若年およびより高齢の健康な哺乳類において異なって発現されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
遺伝子が表ＩＩ．１に列挙されるものであり、好ましくはその発現が、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または１００％を超えて変化させられるものであり、最も好ましくはその発現が１００％を超えて変化させられるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
レスベラトロール誘導体、その代謝産物または類似体が合成起源のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体が天然レスベラトロール源からのレスベラトロール含有抽出物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
レスベラトロールが天然レスベラトロール源から単離されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
栄養補給食品組成物が食品添加物、食物または飲料である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
食物または飲料が、一食当たり０．２ｍｇ以上を提供するのに十分な量でレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体を含有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
食物または飲料が、一食当たり２ｍｇ以上を提供するのに十分な量でレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体を含有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
栄養補給食品組成物が投薬単位組成物である、請求項１〜８に記載の使用。
【請求項１３】
投薬単位が０．５ｍｇ以上のレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体を含有する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
投薬単位が５ｍｇ以上のレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体を含有する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
栄養補給食品組成物で使用されることが多い１種以上のその他の活性成分の使用を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の有効量を栄養補給食品組成物を通じて哺乳類に提供するステップを含んでなる、前記哺乳類の健康状態を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生物により若い分子フェノタイプを与える生理学的変化を誘発させることによって、生物の健康状態を促進するための方法に関する。発現「生物」とは、ヒトおよび動物を含んでなる哺乳類を指すものと理解される。本発明の文脈で哺乳類とは、ヒト、その他の霊長類、肉食動物、偶蹄類、齧歯類、奇蹄類、ウサギ目などを含む。好ましい「哺乳類」はヒト、およびネコ、イヌ、およびウマなどのペットである。
【０００２】
健康状態とは、生物がその環境条件下で最適に機能できることを指す。これは最適な肉体および精神の機能を含む。したがって健康状態とは、生物の全機能が最適作動条件にあり、活動制限および慢性障害がない、全体的な良好な肉体機能状態と定義される。したがって運動性、運動動作能力、および熱ストレスに対する耐性が維持される。生物は肉体的故障がなく、傷害を受けておらず、疼痛がない。それは毎日の活動に立ち向かうことができ、生涯の不可避な挑戦に対処する柔軟性を有し、したがって高い生活の質に肉体的に適合している。さらにそれは精神機能の最適性能状態にあって、学習および生産的活動をもたらし、それはその他の個人に対する社会的つながり、および変化に適応して逆境およびストレスに対処する能力を有する。それはまた肉体的変質と、うつ、不安、認知問題などの精神問題と、思考、気分または動態における変質とがない。
【０００３】
生物の健康状態の違いは、若年生物と高齢生物とを比較すれば最も顕著に観察できる。若年および高齢生物間の健康状態における違いは、健康状態の分子シグネチャーとして使用できるそれらの遺伝子発現プロフィールの違いに反映される。健康状態は、米国特許第５，６９２，５０１号明細書で開示されるように、とりわけ例えば血圧、心拍数、体脂肪組成物、肺機能、肝臓機能、脳機能、および体液内の生理学的に重要な構成要素のレベルなどの肉体機能の測定可能パラメーターを評価することによって判定できる。
【０００４】
本発明の文脈で、健康状態の促進とは、肉体的および精神的健康の双方をはじめとする生物の総体的な健康状態における改善を指し、典型的により高齢である成体生物の遺伝子発現プロフィールの、同一生物であるがより若い生物のプロフィールへの変化によって表される、生理学的変化を誘発することによって達成される。本発明による生物の健康状態促進の効果は、より若いフェノタイプをもたらす若返り効果である。この若返り効果は、生物における老化過程を遅らせることを目指して究極的に生理学的機能損失および年齢関連疾患を防止することによってその寿命の延長を試みる、抗老化効果および対応する処置とは異なる。対照的に健康状態促進処置は、より高齢の生物の健康状態を復元することを目指し、したがってそれを同等のより若年生物の健康状態と同じに、またはより似たものにする。
【０００５】
「高齢」または「より高齢」および「若年」または「より若年」という用語は、絶対値を表さないが相対的な個々の用語であり、それらは各生物種に特有である。
【０００６】
生物の健康状態に対する基本要因は、例えば生物が恒常性を維持する能力と、その修復および再生能力である。
【０００７】
恒常性とは、生理学的および心理学的安定性の維持に向けた生物の固有の傾向である。哺乳類における恒常性の機構は、例えば体温調節、身体中の水およびミネラル量調節、代謝廃棄物除去、血液グルコースおよび脂質レベル調節である。細胞レベルでは、温度、塩分、酸性度などの因子、グルコースや脂質などの栄養素、様々なイオン（カルシウム、ナトリウム、カリウムなど）、酸素、そして二酸化炭素や尿素などの廃棄物の濃度もまた許容限界内に保たれなくてはならない。多細胞生物中では、これらの因子はまた、生物がより効果的に機能できるよう、血漿、組織流体、および細胞内流体などの体液中で望ましいレベルに維持されなくてはならない。したがって人体などの複合系は、効率的な恒常性の機構を有して環境の変更に適応し、身体中の安定性と健康状態を維持できなくてはならない。上述の因子の破壊は、生物の健康と生存を保つ、その全ての生化学的過程を構成する代謝に対して悪影響を及ぼすであろう。次にこのような細胞恒常性の調節不全は、器管機能の漸次衰退を誘発する。したがって因子を望ましいレベルに維持する、組み込まれた生理学的機構（恒常性システム）がある。恒常性は、静止状態ではなく平衡状態である。細胞レベルでは、恒常性は、一定の分子の代謝流束の存在下で維持されなくてはならない。例えばタンパク質、脂質膜、糖、および核酸などの細胞構成要素が常に再利用される一方、全体としての生物の完全性は恒常性システムによって維持される。複数の内的および外的刺激によって挑戦される生物では、恒常性機構は頑強で安定しており、その構成細胞、臓器、臓器系、および全身の適切な機能を維持しなくてはならない。したがって恒常性機構は、生物の内部環境を許容限界内に維持して、健康および最適機能を維持するために必須である。これは細胞または生物全体内で起きる一連の化学反応である、多数の代謝経路を通じて生物の代謝を調節することで生じる。生物の代謝は、（１）細胞がエネルギーを使用して複合分子、細胞構造を構築し、生物機能を実施する分子生合成（同化作用）、および（２）分子を分解してエネルギーを生じる過程（異化作用）の２つの主要過程に分けることができる。生物全体はまた、異化作用と同化作用の間の恒常性も維持しなくてはならない。
【０００８】
生物がその正常な恒常性を失った場合、有害症状が発生し、均衡を復元しようとして機構が活性化される。これが成功しなければ、やがて障害が発生する。したがって正常な代謝経路の慢性の不均衡は、多数の障害の発生をもたらす。
【０００９】
恒常性を維持するための代謝および代謝経路の調節は、健康と最適機能またあるいは、障害をもたらす分子事象の中核を成す。細胞代謝は細胞健康と結びついており、生物の健康状態は、その生物中の細胞機能と相関性がある。細胞代謝は、相互に関係している複合代謝経路によって、動的平衡状態（恒常性）の状態において維持される。刺激に対する細胞応答は遺伝子群の協調活動の結果であることが多く、それは恒常性を維持する傾向がある。したがって細胞は、遺伝子発現プロフィールを変化させることで、内的および外的刺激に反応する。
【００１０】
細胞代謝は、直接かつ大いに遺伝子発現に影響を及ぼすことができ、それは次にフィードバック機構によって細胞代謝に影響する。したがって遺伝子発現プロフィールは、その細胞内の代謝経路を調節することで、生物の機能を調整する。したがって遺伝子発現における変化は、細胞代謝に影響を及ぼし、逆もまた然りである。遺伝子発現プロフィールは、細胞、臓器、および生物全体の状態と応答、およびタンパク質とその他の代謝産物の状態変化の結果の包括的マーカーとして使用できる。遺伝子発現プロフィールを使用して、個体で異なる特異的代謝過程および細胞機能もまた同定できる。包括的遺伝子発現プロファイリングは、細胞代謝中に起きる全ゲノムでの応答を画定し、あらゆる遺伝子発現の変化は細胞機能の変化を反映する。
【００１１】
遺伝子発現プロフィールは、生物の生理学的状態および健康状態を反映する、細胞活動および機能の包括的見解を与える。
【００１２】
マイクロアレイ技術は、全ゲノムにおける遺伝子発現分析を可能にし、組織内の包括的遺伝子発現を判定して、生物内の遺伝子制御を評価する。このような技術を使用して同時に数千の遺伝子の発現パターンおよび発現レベルを分析できる。したがって特定ゲノム内の遺伝子の大部分の転写状態が判定される。この技術はまた、異なる生理学的条件下にある生物からの同一組織内における特異的遺伝子の発現レベルの直接の定量的比較も可能にし、分子レベルでその生物の生理学的状態に関する情報を提供する。遺伝子発現の変化を使用して組織の分子フェノタイプを提供し、正常状態と病的状態とを区別して、ならびにこのような生理学的状態に対する特定の介入の効果を判定できる。栄養的介入に応用される場合、マイクロアレイ技術は、食餌性栄養素の機能およびこれらの栄養素に対する生物の包括的応答を理解するための高度に効果的なツールである。
【００１３】
外部刺激または細胞内分子流束に対する細胞応答は一過性であることが多いが、細胞機能に大きな影響を及ぼすことができる。遺伝子発現の調節は、細胞突起の挑戦および変化に対する細胞の初期の迅速な応答である。したがって細胞または生物には、外的または内的刺激にうまく反応し、変化する細胞内環境に適応して恒常性を維持するために、遺伝子発現の協調調節が必須である。
【００１４】
障害は、通常、様々な生物マーカーを測定することで診断される。しかし代謝における長期不均衡に起因する障害は、障害が確立する前に損傷の測定可能生物マーカーを有さない場合がある。したがって医師が診断を下すときには、疾患は既に存在していることが多い。さらに単に代謝の特定の側面の正常な均衡を修復することで、慢性障害を逆転させるのは可能でないことが多い。遺伝子発現の変化は、細胞突起の挑戦または変化に対する反応の初期事象であり、分子レベルにおける、およびあらゆる損傷が起きる前の非常に初期段階における、あらゆる望まれない構造的変化の検出および補正を可能にし、したがって生物を最適の生理学的状態または健康状態に保つ。
【００１５】
損傷されていない健康な若年成体生物を高齢生物よりも体調良好にして、より良い健康状態に保つことが知られている重要因子は、恒常性を維持するより良い能力、より効率的な修復系、およびより高い再生能力である。例えば若年生物は、肝臓、筋肉、骨、および動脈壁などの組織を修復して再生する能力が、高齢生物よりも高い。若年成体生物は、高齢生物と比較して、困難な条件下で、細胞恒常性をより良く維持するそれらの能力のために、ストレスに対してより抵抗性である。若年生物は、より高齢の生物と比較して敏感な恒常性機構を有し、細胞代謝中の不均衡に対してより迅速に反応でき、損傷をより早く修復でき、ひいては挑戦後の回復期間もまた短縮される。若年成体生物はまた、その中でそれらが適切に機能できる、それらのより幅広い動的条件範囲のために、恒常性をより良く維持でき、例えばそれらは、対応するより高齢の生物よりもより良い温度調節を有し、熱ショック（熱ストレス）に対してより抵抗性である。若年生物はまた、損傷した細胞および分子をより迅速に除去することで恒常性を維持するより高い能力も有し、より速い修復および修復性能力を有することで、身体をより健康な状態に保つ。
【００１６】
肉体組織は若年個体において良好に再生し、より高齢の個体では減退する。最近、コンボイ（Ｃｏｎｂｏｙ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  ２００５年、第４３３巻：７６０〜７６４頁）は、この減退が不可逆的かどうか、またはそれが血行中の因子によって調整できるかどうかを調査した。彼らは「並体癒合」対として若年マウスと高齢マウスの循環系をつなげると、高齢の筋肉および肝臓の修復性能力が、より若年動物の血清存在下で回復したことを実証した。彼らはまた同時に、より若い分子シグナル伝達プロフィールの修復があったことを観察した。研究は、組織修復能力が全身性要因の調節を通じて逆転できることを示し、全身性要因が、組織修復性能力の活性化に重要な分子シグナル伝達経路を調整できることを提案した。したがって高齢細胞は、より若い分子細胞シグナル伝達プロフィールがある若年細胞環境に曝露すると、より若いフェノタイプを取り戻すかもしれない。
【００１７】
包括的遺伝子発現プロフィールと臓器の生理学的機能との関連性は、最近ロッドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）ら（ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年）、２（１２）２１９１〜２２０１頁）によって、ヒトにおいて示されている。この研究では、遺伝子発現プロフィールは、ヒトにおいて腎臓の形態学的および生理学的状態と良く相関した。さらに著者らは、常態ではより若い人々と関連付けられている遺伝子発現プロフィールがあるより高齢のヒトでは、より若い人々のそれとより良く似た、形態学的外観および生理学的状態がある、年齢の割により良い状態の腎臓を有する傾向があることを実証した。対照的に、常態ではより高齢と関連付けられている遺伝子発現プロフィールがあるより若い対象は、より高齢の人々のそれとより良く似た、形態学的外観および生理学的状態がある、年齢の割により劣悪な状態の腎臓を有した。
【００１８】
結果は、組織遺伝子発現プロフィールを使用して、ヒトがそれぞれの暦年齢の割に、健康状態が普通でない状態、またあるいは、異常な退化を示す腎臓を有するかどうかを予測できたことを示した。最後に、高齢および若年のヒト対象からの２つの異なるタイプのヒト腎臓組織において、同一遺伝子は変動し、高齢および若年細胞間の同一の分子の違いが全ての臓器で生じ、全ての組織において一般的な老化機構があることが示唆される。
【００１９】
血液コレステロール（脂質）、血液トリグリセリド脂質、血液低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）およびＬＤＬ対ＨＤＬ比、血液グルコース、肝臓機能、心拍数、タンパク質、ビタミンおよびミネラル代謝、免疫系ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）活性、免疫系活力およびＮＫ細胞比、免疫細胞（ＮＫ、Ｂ、およびＴ細胞数）、および免疫Ｔ細胞ヘルパー／抑制因子比の正常な生理学的値の維持に関与する遺伝子、アポトーシス、細胞接着、細胞生育および維持、細胞骨格組織化、胎芽発育、電子伝達、内外貪食作用、炎症／免疫応答、炭水化物と脂肪酸と脂質と核酸の代謝、ＴＣＡ回路、タンパク質折りたたみ、タンパク質合成、タンパク質ユビキチン化、タンパク質分解、ストレスへの反応、シグナル伝達、転写、または輸送に関与する遺伝子は、特に健康状態を維持して促進するのに貢献すると見なされてもよい。
【００２０】
遺伝子発現産物の観点から、ＩｇＦ１ｒ、Ｂｃｌ２拮抗薬、シクロオキシゲナーゼの発現に関与する遺伝子、特にｅｌＦ４Ａ、４Ｅ、４γ１，ｅｌＦ３サブユニット１０、真核生物翻訳延長因子２、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ４３、Ｌ２７、ＡＲＦ結合タンパク質３、ｆ−ボックスｏｎｌｙタンパク質９、ＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０相同体、Ｈｓｐ１βなど）などのタンパク質合成、代謝回転および修飾に関与する遺伝子は、健康良好さの維持および促進にとって極めて重要である。
【００２１】
したがって遺伝子発現プロフィールを生物の健康状態、または若返り効果の指標として使用してもよい。対応するより高齢の対象と比較して、代謝過程を平衡がとれた状態に維持して恒常性を維持する若年成体におけるより高い能力は、その遺伝子発現プロフィールに反映されてもよい。したがって若年成体生物の平均遺伝子発現プロフィールは、健康良好さの最適生理学的状態の基準として使用できる。さらに細胞シグナル伝達をより若いプロフィールに変化させることで、その細胞のためにより若い環境を作り出し、したがって恒常性および修復効率を維持する能力を復元し、ひいてはまた生物を若返らせることで、生物の健康状態を促進できる。遺伝子発現プロフィールの全ゲノムでの分析は、細胞、組織または生物の健康状態の包括的アセスメントを可能にする。生物の遺伝子発現プロフィールと、健康なより若い成体生物の遺伝子発現プロフィールとの比較は、生物の包括的健康状態の尺度として使用できる。より若い遺伝子発現プロフィールは、細胞または生物のより若い代謝およびシグナル伝達プロフィールを反映し、それは内部または外部刺激に対してより抵抗性になり、したがって生物をより良い健康状態に保つ。
【００２２】
本発明により、哺乳類の健康状態促進、または若返り効果は、レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の有効量を前記哺乳類に投与することによって達成できることが発見された。
【００２３】
「レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体」という用語は、
本明細書での用法では一般式Ｉ、
【化１】
2009528028.tif 000002
（式中、Ａは炭素−炭素単一または二重結合を指し、後者はトランスまたはシスであってもよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、互いに独立して水素、ヒドロキシ、エーテル化ヒドロキシまたはエステル化ヒドロキシ基を示す）によって包含される化合物を含んでなる。好ましいのは、Ａが二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）である化合物Ｉである。
【００２４】
シンボルＡによって示される炭素−炭素二重結合はトランスまたはシスであってもよいが、上の式Ｉはシス／トランス混合物もまた含むものと理解される。しかしＡがトランス炭素−炭素結合である式Ｉの化合物が好ましい。
【００２５】
エーテル化またはエステル化ヒドロキシ基は、非置換のまたは置換された１〜２６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基、または非置換のまたは置換された１〜２６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖脂肪族、芳香脂肪族または芳香族カルボン酸に由来してもよい。エーテル化ヒドロキシ基はさらにグリコシド基であってもよく、エステル化ヒドロキシ基はさらにグルクロニドまたは硫酸基であってもよい。Ａが−ＣＨ＝ＣＨ−である式Ｉの化合物の例は、レスベラトロール（Ｒ１、Ｒ３、およびＲ５＝水素、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６＝ヒドロキシ）、ピセタノール（Ｒ３およびＲ５＝水素、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ６＝ヒドロキシ）、およびラポンチゲニン（Ｒ５＝水素、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ６＝ヒドロキシ、およびＲ２＝メトキシ）である。Ａが−ＣＨ２−ＣＨ２−である式Ｉの化合物の例は、ジヒドロレスベラトロール（Ｒ１、Ｒ３およびＲ５＝水素、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６＝ヒドロキシ）、ジヒドロピセタノール（Ｒ３およびＲ５＝水素、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６＝ヒドロキシ）、およびトリスチン（Ｒ３およびＲ５＝水素、Ｒ２、Ｒ４およびＲ６＝ヒドロキシおよびＲ１＝メトキシ）である。これらの化合物は全て周知であり市販され、または当該技術分野で周知の方法に従って得ることができる。
【００２６】
本発明の目的で、レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体は、合成または天然起源であってもよい。好ましい本発明の一実施態様では、レスベラトロール、特に合成起源の（トランス）−レスベラトロールが本発明の目的で使用される。本発明の別の実施態様では、天然起源、すなわち天然レスベラトロール源から単離されたレスベラトロールが、またはブドウ種子抽出物またはオオイタドリ抽出物などの天然レスベラトロール源からのレスベラトロール含有抽出物として使用される。さらにレスベラトロールは、単独で、すなわち単一活性構成要素として、または補給食剤中で使用されることが多い１種以上のその他の活性成分と組み合わせて、本発明の目的で使用されてもよい。このようなその他の成分としては、特にそれらのエステル形態の、天然の、抽出物および濃縮物または合成物の形態の、およびほぼ純粋な形態の、ミネラル塩と、ビタミン（例えばビタミンＥおよびＣ）と、β−カロテン、リコペン、ルテインまたはゼアキサンチンなどのカロテノイドと、エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）などの緑茶カテキンと、ヒドロキシチロソールおよびオレウロペインなどのオーリブフェノール類と、補酵素Ｑ１０と、ゲニステインと、あらゆる種類のＰＵＦＡとが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明により、その食餌にレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体を添加された哺乳類の遺伝子発現プロフィールが、同一暦年齢を有してその食餌がレスベラトロールを欠く哺乳類に見られるプロフィールよりも、健康な若年成体哺乳類に見られるプロフィールにより近いことが発見された。換言すると、本発明により、レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体成体の有効量を哺乳類に投与することで、成体哺乳類中の遺伝子発現プロフィールが、より若い成体哺乳類の発現プロフィールとの一致に向けて変化できることが発見された。
【００２８】
生物の遺伝子発現プロフィールと生理学的機能との相関の点から見てレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体で処置された哺乳類は、その食餌にレスベラトロールが添加されていない同一年齢生物の平均的健康状態よりも、健康なより若い生物により類似した健康状態になる。したがって食餌性レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体は、より若いフェノタイプを生物に与える生理学的変化を誘導することで、生物の包括的健康状態を促進する。本発明による食餌性レスベラトロールによる健康良好さの促進は、精神適応度を改善し、肉体的適応度を増強し、運動性および性能を改善し、肉体強度および精神強度を増強し、長寿命と健康な加齢を提供する。換言すると健康良好さ促進の典型的な結果は、哺乳類に対する若返り、または若返り効果である。
【００２９】
したがって一実施態様では、本発明は、レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の有効量を前記哺乳類に提供するステップを含んでなる、哺乳類の健康状態を促進し、または哺乳類を若返らせる方法に関する。
【００３０】
本発明の活性化合物は、好ましくは栄養補給食品を通じて提供される。
【００３１】
したがってさらに別の実施態様では、本発明は、哺乳類の健康状態を促進し、より高齢の成体哺乳類における遺伝子発現プロフィールを前記哺乳類の若返りを意味するより若い成体哺乳類に見られる発現プロフィールとの一致に向けて変化させるための栄養補給食品組成物を製造するためのレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の使用に関する。
【００３２】
「栄養補給食品」という用語は、本明細書での用法では、栄養および製薬分野用途の双方で使用するための組成物を指す。したがって栄養補給食品組成物は、カプセルまたは錠剤などの固形製剤または溶液または懸濁液などの液体製剤であってもよい、食物および飲料に対する補給剤、または経腸的または非経口用途のための製剤処方であることができる。「食物」という用語は、本明細書での用法ではまた、動物飼料も含む。前述から明らかなように、栄養補給食品組成物という用語はまた、上述の活性成分を含有する食物および飲料、ならびに投薬単位組成物も含んでなる。
【００３３】
本発明のより具体的な実施態様としては、細胞代謝および性能を改善することで恒常性における不均衡を防止し、ひいては肉体性能を改善し、肉体運動性を維持するための、肉体的および精神適応度および強度を改善するための、生物が若年状態を維持する能力を増強することで生物の修復性および修復能力を維持するための、生理学的異常性および／または生化学的不規則−原因障害を避けることで臓器機能を維持するための、および生物が変化する環境に適応する能力を促進するためのレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の使用が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
遺伝子発現プロフィールに対するレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の効果は、例えばより詳細に後述されるように、それ自体が公知の方法によって判定できる。
【００３５】
［動物および食餌操作］
オス−Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス（６〜７週齢）は、ハーラン・スプラーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）から購入した。マウスは個別に飼育し、水を自由に提供した。対照群（ＯＣ、Ｎ＝５）にはニュージャージー州フレンチタウンのバイオサーブ（Ｂｉｏ−ｓｅｒｖ（Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ，ＮＪ））からの改変ＡＩＮ−９３Ｍ半精製食を９８ｋｃａｌ／週間で給餌し、それは平的自由飼料摂取よりもおよそ１５％より少ないカロリーを提供した。処置群（ＲＥＳ、Ｎ＝５）には対照と同一カロリー摂取を給餌したが、１４ヶ月齢から５０ｍｇ／ｋｇ食餌（ｗ／ｗ）のレスベラトロール（シグマ（Ｓｉｇｍａ）からの３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン）を添加した。動物（ＯＣおよびＲＥＳ）を３０ヶ月齢で屠殺した。若年動物は５ヶ月齢で屠殺した（ＹＣ、Ｎ＝５）。上述の全群から心臓を採取して、即座に液体窒素内で凍結し、分析まで−８０℃で保存した。
【００３６】
［標的ＲＮＡ調製および高密度オリゴヌクレオチド配列ハイブリダイゼーション］
ニューヨーク州グランドアイランドのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））からのトリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）試薬を使用して、凍結組織から総ＲＮＡを抽出した。カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのオリゴ−ｄＴ−結合オリゴテックス樹脂を使用して、ポリアデニレート［ポリ（Ａ）＋］ＲＮＡを総ＲＮＡから純化した。ライフ・テクノロジーズからのスーパースクリプト・チョイス・システム（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、カリフォルニア州ラ・ホーヤの（Ｇｅｎｓｅｔ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））からのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ−ｄＴプライマーで、１μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）に変換した。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールによってＤｓ−ｃＤＮＡを抽出し、ウィスコンシン州マジソンのノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ））からのペレットペイント共沈殿剤で沈殿させた。ニューヨーク州ファーミンデールのエンゾ（Ｅｎｚｏ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ））からのバイオアレイ高収率ＲＮＡ転写物標識キット（ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）を使用して、生体外でビオチン標識ＲＮＡを合成した。次にキアゲンからのＲＮｅａｓｙ親和性カラムを使用して、ビオチン標識アンチセンスｃＲＮＡを純化し無作為に断片化した。１０μｇの断片化ｃＲＮＡを含有するハイブリダイゼーションカクテル（２００μｌ）をカリフォルニア州サンタクララのアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））からのマウスゲノム４３０  ２．０  ＤＮＡマイクロアレイ内に注入した。ハイブリダイゼーション後、抗体を使用して、シグナル増幅プロトコルによって、アフィメトリックスからの流体ステーション（モデル８００１０１）内で、遺伝子チップを洗浄して染色した。アフィメトリックスからのヒューレット・パッカード・ジーンアレー・スキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ）（モデル９００１５４）を使用して、ＤＮＡチップを３μｍの解像度で２回スキャンし、平均した画像をさらなる分析のために使用した。
【００３７】
［データ分析］
４５，１０１個のプローブセットを含有するアフィメトリックス・マウスゲノム４３０  ２．０配列を使用して、遺伝子発現データを得た。以下で詳述するように全てのステップは、最新版のプローブセット（２００５年８月２３日にアフィメトリックスから入手できるマウスゲノム４３０．２．０配列プローブセット・アノテーション）を使用して実施した。シグナル強度はアフィメトリックスの遺伝子チップ操作ソフトウェアバージョン１．３を使用して、判定した。データ分析はジ−ンデータ・エキスプレッショニスト（Ｇｅｎｅｄａｔａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ）（登録商標）プロ（Ｐｒｏ．）バージョン２．０を使用して実施した。
【００３８】
［ステップ１  データ取得および品質管理］
品質管理のために基準モジュール付きダイアグノース（Ｄｉａｇｎｏｓｅ）を使用して、全てのデータをジ−ンデータ・エキスプレッショニスト（Ｇｅｎｅｄａｔａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ）（登録商標）プロ・リファイナー（Ｐｒｏ．Ｒｅｆｉｎｅｒ）にインポートした。その他の同様に処理された生物学的複製から高度の変動性を示したサンプルをデータセットから除去し、さらなる分析から排除した。異常なデータ分布パターンのために、２つのチップ（ＹＣ群の１つ、ＲＥＳ群の１つ）を排除した。１８個のチップをジ−ンデータ・エキスプレッショニスト（Ｇｅｎｅｄａｔａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ）（登録商標）プロ・アナリスト（Ｐｒｏ．Ａｎａｌｙｓｔ）を使用してさらに分析した。
【００３９】
０．０６５のアフィメトリックス品質値（辺縁発現のための閾値）を使用して、さらなる処理のために存在シグナルおよび辺縁シグナルを選択した。全てのデータを各チップの中央値に正規化した。
【００４０】
さらなる分析では、同一処置群に由来するチップを共にグループ化し、各プローブについて群平均を群の中央値として設定した。５個のチップの内少なくとも３個（または４個の内３個）が存在／辺縁であるシグナルのみをさらなる選択のために使用した。
【００４１】
［ステップ２  不明瞭なプローブセットの消去］
アフィメトリックスの「データ分析の基礎（Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ）」マニュアル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｄａｔａ＿ａｎａｌｙｓｉｓ＿ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ＿ｍａｎｕａｌ．ｐｄｆ）によれば、テキスト「＿ｘ＿ａｔ」または「＿ｓ＿ａｔ」を含有するプローブセットは単一遺伝を確信的にクエリーしないので、それらをデータセットから除外した。さらに良好に特徴づけられる遺伝子をクエリーしないプローブセットは、さらなる分析から除外した。例としては、ｃＤＮＡ配列を表すプローブセット、発現した配列タグ（ＥＳＴ）、理研ｃＤＮＡ配列、ＤＮＡセグメントまたは仮説的タンパク質が挙げられる。
【００４２】
［ステップ３  統計学的分析］
［１）加齢に伴う遺伝子変化］
ＹＣとＯＣ群とを比較して、加齢に伴って変化する遺伝子（加齢マーカー）を選択した。レスベラトロールによって遺伝子発現に変化があったかどうかを判定するために、それぞれＯＣとＲＥＳマウスとで比較を行った。有意性がＰ＜０．０１で試験される２標本検定と組み合わさった、変化＞１．２５倍のｎ−倍検定、または一貫して１群に存在するが別の群には不在を使用して、顕著に変化した遺伝子を選択した（統計的有意性を計算するのにｔ−検定およびウエルチ検定の双方を使用した）。
【００４３】
［２）加齢に伴う不変の遺伝子］
最初に分散＜０．０５でフィルターし、次に＜１．２５倍の変化に、有意性がｐ＞０．０１（すなわちＹＣおよびＯＣ群の間で顕著に不変）で試験される２標本検定を加えてさらに選択し、ＹＣおよびＯＣ群を比較して、加齢に伴って不変の遺伝子（非加齢マーカー）を選択した。同様に、＞１．２５倍の変化または一貫して１群に存在するが別の群には不在のどちらかを使用して、顕著に変化した遺伝子を判定した。統計的有意性を計算するのに両側ｔ−検定およびウエルチ検定の双方を使用し、Ｐ＜０．０１は顕著な変化と見なされた。
【００４４】
［ステップ４  教師あり学習を使用した分類］
分類は、教師あり学習および検定相の２相に分割される複合課題である。分類の目的は、個々の入力データを所与として出力変数（この場合、年齢）を予測することである。教師あり学習相は、それによって出力変数を予測できる規則を学習する目的で、訓練データにアルゴリズムを適用することを伴う一方、検定相は、学習相で収集された規則を適用して、新しい個体に対して予測を立てることを構成する。提供される訓練データに基づいて、予測を立てることもまた可能である。
【００４５】
分類分析のために、提供される訓練データ「若年（ＹＣ）」および「高齢（ＯＣ）」群に基づいて、サポートベクターマシーン（Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）（ＳＶＭ）を使用した教師あり学習を実施し、出力変数「年齢」を予測する規則を見いだした。清浄にしたプローブセット（上記参照）を用いた。次に出力変数「年齢」を予測するための分類機能を使用して、レスベラトロール群からの結果を分析した。４個のチップは全て若年に分類された。＋１〜−１の分類出力範囲の数値が各チップに割当てられ、＋１は特異的カテゴリーに対する完全一致を示唆し、−１は最高度のミスマッチを示す。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
表Ｉ：この表は各チップからの分類子出力数値を含み、平均（ａｖｅｒａｇｅ）（平均（ｍｅａｎ））および標準偏差は各群について計算される。レスベラトロール群は０．３４８５５の平均分類出力を有し、これは明らかに高齢群よりも若年群について計算される値にはるかに近かった。
【００４８】
マウスアフィメトリックス遺伝子配列を使用して、若年、高齢およびレスベラトロール給餌マウス群における心臓組織中の全ゲノムでの遺伝子発現をモニターした。チップ上で利用できる２６，０００個のプローブセットの中で、１２８５個の遺伝子は、若年マウスおよび高齢マウス群の間で顕著に変化していた（少なくとも１．２５倍、ｐ＜０．０１）。高齢マウス群では、それらの中の５０１個の遺伝子が上方制御され、７２４個の遺伝子が下方制御されていた。レスベラトロール処置群では、１２８５個の遺伝子中、５８５個の遺伝子の発現がより若い成体マウス群の方向に変化しており（４５．５％、表ＩＩ参照）、心臓を健康で若年状態に保つ上での顕著なレスベラトロールの効果が示された。レスベラトロール効果の範囲を要約すると、レスベラトロール処置によって変化した１０２３個の前述の遺伝子中、３４２個は若年群の発現レベルに類似しまたはそれを超えており（５８．１％）、６２個の遺伝子は若年群と比較して８０〜９０％のレベルであり、５３個の遺伝子は７０〜８０％のレベルに達していた。したがって高齢動物群のマウスと同じ生物学的年齢であるにもかかわらず、レスベラトロール補給食を給餌された高齢動物は、意外にも若年動物のそれに近い遺伝子プロフィールを示した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
付録１（表ＩＩ．１）に、表ＩＩの５８５個の全ての遺伝子を具体的に同定した。老化過程は、タンパク質合成およびタンパク質折りたたみの機能低下を伴い、それは特に筋肉内のタンパク質代謝回転の不均衡をもたらすことが文献で十分に立証されている。運動は高齢者において、筋肉タンパク質合成およびミトコンドリア機能を増大させることが示されている。さらに生理学的および病理学的変化の結果として、タンパク質折りたたみおよびタンパク質修飾はまた、老化によっても影響される。アルツハイマー病およびパーキンソン病などの多数の疾患は、異常なタンパク質修飾と関連付けられている。高齢動物群では、タンパク質合成およびタンパク質折りたたみに関係した多数の遺伝子の顕著な減少が観察された（表Ｉ参照）。対照的にレスベラトロール補給食を給餌された高齢動物では、例えば真核生物翻訳開始因子４Ａ１、２、３、４Ｅ、４ｇ１などのタンパク質合成に関与する遺伝子など、これらの遺伝子の多くが若年動物に見られるレベルに、またはその近くに上方制御された。同様に、ｆ−ボックスｏｎｌｙタンパク質９、ホモシステイン誘導性、小胞体ストレス誘導性、ユビキチン様ドメインメンバー１、およびユビキチン特異的プロテアーゼ３などのタンパク質修飾に関与する遺伝子は、高齢動物群において全て顕著に下方制御された一方、レスベラトロール群ではこれらの効果が逆転した（表ＩＩＩ参照）。
【００５１】
結論として、本研究はレスベラトロールで経口的に処置された成体哺乳類の遺伝子発現プロフィールが、同一暦年齢を有する哺乳類よりも健康なより若い成体哺乳類により近いことを示した。レスベラトロール処置動物におけるこのより若い遺伝子発現プロフィールは、動物における健康状態を促進し、動物を若返らせる。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
【表４】
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【００５４】
【表５】
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【００５５】
【表６】
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【００５６】
【表７】
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【００５７】
【表８】
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【００５８】
【表９】
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【００５９】
本発明の目的で、レスベラトロール、誘導体、代謝産物または類似体の投薬量要件は、厳密に重要でない。関与する哺乳類の性質およびその病状と要件次第で、１日あたり約３０ｍｇ／ｋｇ体重までの量、またはなおもより高い量が投与されてもよい。したがってヒト成体（体重約７０ｋｇ）では、投薬量は約２０００ｍｇ／日までであってもよい。特定の本発明の実施態様では、ヒト成体（体重約７０ｋｇ）のための投薬量は、約５００ｍｇ／日まで、特に約５００ｍｇ／日までである。適切には、投薬量は０．５ｍｇ以上である。本発明の特定の実施態様では、ヒト成体（体重約７０ｋｇ）のための投薬量は、２ｍｇ以上、特に５ｍｇ以上である。食物または飲料中で投与される場合、その中に含有されるレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体の量は、適切には一食当たり約０．２ｍｇ以上である。別の本発明の実施態様では、このような量は一食当たり２ｍｇ以上である。他方ではレスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体は、一食当たり１００、２００または５００ｍｇまでの量で、食物または飲料中で投与されてもよい。レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体が製剤処方として投与される場合、このような処方は、例えばカプセルまたは錠剤あたりなどの固体投薬単位あたり、約１００、２００または５００ｍｇまで、または液体製剤一日量あたり約２０００ｍｇまでを含有してもよい。レスベラトロールが天然起源の抽出物として使用される場合、上の投薬量値は、抽出物に含有される純粋なレスベラトロールの量を指す。
【００６０】
「一食分」という用語は、本明細書での用法では常態では１回の食事でヒト成体によって摂取される食物または飲料の量を指し、例えば約１００ｇ〜約５００ｇの範囲であってもよい。
【００６１】
本発明の目的で、レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体は、例えば正常な代謝機能の維持に必須であるビタミンおよびミネラルを含んでなるマルチビタミン製剤への添加剤として、補給食剤として投与してもよい。レスベラトロール、その誘導体、代謝産物または類似体はまた、好ましくは経腸用途のための医薬組成物として投与されてもよく、それは固体または液体ガレヌス製剤であってもよい。固体ガレヌス製剤の例は、従来のガレヌス製剤キャリアと一緒に活性成分を含有する、錠剤、カプセル（例えば硬質または軟質シェルゼラチンカプセル）、丸薬、小袋、粉末、顆粒などである。あらゆる従来のキャリア材料を利用できる。キャリア材料は、投与に適した有機または無機不活性キャリア材料であることができる。適切なキャリアとしては、水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、滑石、植物油などが挙げられる。さらに医薬調剤の慣例に従って、着香剤、保存料、安定剤、乳化剤、緩衝液などの添加剤が添加されてもよい。個々の活性成分が単一組成物中で適切に投与される一方、それらはまた、個々の投薬単位中で投与されてもよい。
【００６２】
以下の実施例で本発明をさらに詳しく例示する。
【００６３】
医薬組成物は、従来の製剤手順によって調製されてもよい。
【００６４】
［実施例１］
［軟質ゼラチンカプセル］
カプセルあたり３０ｍｇの活性成分レスベラトロールを含有する軟質ゼラチンカプセルを従来の手順によって調製する。
【００６５】
［実施例２］
［硬質ゼラチンカプセル］
カプセルあたり２０ｍｇの活性成分レスベラトロールを含有する硬質ゼラチンカプセルを従来の手順によって調製する。
【００６６】
［実施例３］
［錠剤］
活性成分として錠剤あたり１０ｍｇのレスベラトロール、および賦形剤として微晶質セルロース、二酸化シリコーン（ＳｉＯ２）、ステアリン酸マグネシウム、クロスポビドンＮＦ（崩壊剤）を２００ｍｇになるまで含有する錠剤を従来の手順によって調製する。
【００６７】
［実施例４］
一食当たり０．２ｍｇ〜２００ｍｇの量のレスベラトロールを含有する食品は、従来の製剤手順によって調製されてもよい。このような食品の例は、清涼飲料、パン、クッキー、ヨーグルト、アイスクリーム、および甘味菓子類である。
【００６８】
例えば１０％ジュースおよびレスベラトロールを含有するオレンジ−レモンジュース飲料を以下の成分から調製する。
【００６９】
【表１０】
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【００７０】
［調製］
・安息香酸ナトリウムを撹拌しながら水に溶解する。
・撹拌を継続して、糖シロップ、アスコルビン酸、クエン酸、ペクチン溶液、ジュース配合物を相次いで添加する。高速ミキサーは使用しないこと。
・瓶詰めシロップを（炭酸）水で希釈して１Ｌの飲料にする。
【００７１】
【表１１】
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【００７２】
［ジュース配合物の調製］
・脱イオン水を果汁濃縮物に添加して穏やかに撹拌し、果汁濃縮物を水和させる。
・油性香料およびβ−カロテン１０％ＣＷＳ原液を添加して、ロータステータ−ホモジナイザー内で予備乳化する。
・２００バールの高圧ホモジナイザー内で均質化する。
【００７３】
［β−カロテン１０％ＣＷＳの添加］
β−カロテン１０％ＣＷＳはジュース化合物に、脱イオン水中の１〜１０％原液として添加すべきである。
【００７４】
［実施例５］
回復期の体重５５ｋｇの７０歳のヒトに、レスベラトロールを１日あたり２０ｍｇの２ヶ月間にわたる投与計画で投与する。
【００７５】
［実施例６］
スポーツイベントへの参加を意図する体重７０ｋｇの５５歳のヒトに、１日あたり３０ｍｇのレスベラトロールを前記イベント前に３ヶ月にわたって投与する。
【００７６】
［実施例７］
倦怠感および一般的意欲欠如の頻繁な発症を訴える体重７５ｋｇの６０歳のヒトに、１日あたり５０ｍｇのレスベラトロールを３ヶ月にわたって投与する。
【００７７】
【表１２】
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【００７８】
【表１３】
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【００７９】
【表１４】
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【００８０】
【表１５】
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【００８１】
【表１６】
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【００８２】
【表１７】
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【００８３】
【表１８】
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【００８４】
【表１９】
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【００８５】
【表２０】
2009528028.tif 000022
【００８６】
【表２１】
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【００８７】
【表２２】
2009528028.tif 000024
【００８８】
【表２３】
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【国際調査報告】
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