(57)【要約】  本発明は、一般に、肺疾患の治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達経路阻害剤とインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）シグナル伝達経路阻害剤との組み合わせ投与による気道分泌過多の治療、およびその組成物に関する。
2009511586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤、ＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤、および製薬的に許容される担体を含む、気道分泌過多の治療のための組成物。
【請求項２】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤が、免疫ペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤が、免疫ペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
免疫ペプチドが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体断片である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
免疫ペプチドが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体断片である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
抗ＥＧＦＲシグナル伝達免疫ペプチドが、Ｃ２２５またはＥＭＤ５５９００である、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
抗ＩＬ−１３シグナル伝達免疫ペプチドが、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃである、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤が、ＥＧＦまたはＥＧＦＲの発現を減少させるアンチセンス核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤が、ＩＬ−１３、１Ｌ−１３Ｒ、またはＩＬ−４Ｒの発現を減少させるアンチセンス核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
チロシンキナーゼ阻害剤が、ＰＤ１５３０３５、ＥＫＢ−５６９、４−（３−クロロアニリノ）−６；７−ジメトキシキナゾリン、ＲＧ−１４６２０；チルホスチン２３、チルホスチン２５、チルホスチン４６、チルホスチン４７、またはチルホスチン５１である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤またはＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＩ３Ｋ特異的阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＬＹ２９４００２である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＤ９８０５９またはＬＹ２９４００２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
個体における気道分泌過多の治療方法であって、ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤およびＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤の投与を含む方法。
【請求項１６】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤およびＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤が同時に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤およびＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤が、請求項１に記載の組成物として同時に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの阻害剤が、（ｉ）約０．０５ｍｇから約２．５ｍｇ；（ｉｉ）約０．１ｍｇから約１ｍｇ；または（ｉｉｉ）約０．３ｍｇから約０．５ｍｇの量にて投与される免疫ペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの阻害剤が、（ｉ）約１０μｇ／日から約３ｍｇ／日；（ｉｉ）約３０μｇ／日から約３００μｇ／日；または（ｉｉｉ）約１００μｇ／日の量にて投与されるアンチセンス阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの阻害剤が、１回の投与につき１ｋｇあたり約０．１μｇから約１００ｍｇの量にて投与されるチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
阻害剤が、注入、吸入、経口、リポソーム、またはレトロウイルスベクターにより投与される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＨＬＢＩに授与されたＰＯ１  ＨＬ２９５９４の下、政府の支援により行われた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、一般に、気道疾患を治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
気道分泌過多は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、および喘息を含む、気道疾患の１つの特徴である。分泌過多に罹患している個体では、粘液が気道に貯留し、気道閉塞の原因となる可能性がある。気道上皮を裏打ちしている気道粘膜下腺および杯細胞は、水、炭水化物、タンパク質、および脂質から成る粘着性の粘弾性ゲルである、粘液を分泌する。健康な個体では、粘液は、吸入した外来粒子および感染病原体に対する一次防御となる。粘液は、これらの粒子および病原体を捕捉し、これらの除去を容易にする一方、組織が乾燥するのも防止する。多くの杯細胞および末梢気道を含有し、咳により一掃できない小気道は、粘液貯留および粘液による漸次閉塞に対し特に脆弱である。気道分泌過多は、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、および喘息を含む幾つかの気道疾患のほか、ウイルス性気管支炎および細気管支炎を含む幾つかの呼吸器感染症と関連しているため、相当数の個体が気道分泌過多に罹患している。米国では、約１４２０万人がＣＯＰＤと診断されている。嚢胞性線維症は、３０，０００人のアメリカ人を冒し、喘息は１７００万人のアメリカ人を冒している。
【０００４】
気道分泌過多に罹患した個体に対する従来の治療には、全身性または吸入コルチコステロイド、抗コリン剤、抗生物質療法、気管支拡張剤（例えば、メチルキサンチン）、強力なβ２アドレナリン作動性刺激特性を有する交感神経様作用薬、「粘液溶解」剤（例えば、水、高張食塩水）のエアロゾル輸送、および去痰薬（例えば、グアイフェネシン）の経口投与の使用などが挙げられる。嚢胞性線維症に関して具体的には、より最近のアプローチは、粘液が容易に気道から除去されるように、ＤＮＡに富む粘液または喀痰の粘性を低下させるＤＮＡｓｅを投与することである（Ｓｈａｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、８７：９１８８〜９１９２頁、１９９０年；Ｈｕｂｂａｒｄら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２６：８１２頁、１９９１年）。薬物療法とは別に、軽打法、振動法、および排痰法から成る胸部理学療法も、気道から粘液を除去するのに使用される。最後の手段として、重症肺疾患を有する者には肺移植が１つの選択肢になりえる。上述した薬物療法の多くは、重大な副作用を有する。例えば、吸入コルチコステロイドは、鵞口瘡（口腔のイースト菌感染症）、咳、または嗄声の原因となりえ、全身性コルチコステロイドは、性的発達の遅延、月経周期の変化、体重増加、および血糖値の増加（糖尿病）など、より重度の副作用を有する。メチルキサンチンの副作用には、重度の悪心、振戦、筋攣縮、発作、および不整脈などが挙げられる。
【０００５】
上皮宿主を制御しリモデリングするウイルス誘発性のＥＧＦＲ依存性経路およびＩＬ−１３依存性経路のスキームは、例えば、図２８に示されている。受容体二量化および受容体チロシンキナーゼリン酸化を伴うＥＧＦＲ活性化は、３つの経路の活性化をもたらす：（１）Ｒａｌ動員と、これに続くＳｔａｔ１およびＳｔａｔ３活性化をもたらすｃ−Ｓｒｃ活性化、（２）Ｓｈｃ／Ｇｒｂ２動員と、これに続くＥＲＫ１／２のＭＥＫ１／２活性化をもたらすＳｏｓ、Ｒａｓ、およびｃ−Ｒａｆ活性化、ならびに（３）Ｇａｂ１動員と、これに続くホスファチジルイノシトール−３，４，５−ホスフェート（Ｐｌ−３，４，５−Ｐ３）生成をもたらすＰＩ３Ｋ活性化、ＰＤＫ１／２活性化、次いでプロアポトーシス因子（例えば、Ｂａｄ）を不活化するＡｋｔの活性化。ＩＬ−１３シグナル伝達もまた、繊毛細胞の杯細胞への分化転換を促す遺伝子（ＣＬＣＡおよびＭＵＣ）のアップレギュレーションにそれぞれが寄与する、ＥＲＫ１／２およびＰＩ３ＫならびにＳｔａｔ６を活性化することができる。ＩＬ−１３シグナル伝達は、繊毛細胞の杯細胞への分化転換を促す遺伝子（ＣＬＣＡおよびＭＵＣ）のアップレギュレーションにそれぞれが寄与する、ＥＲＫ１／２およびＳｔａｔ６へのＩＲＳ１／２依存性カスケードを活性化する。生理学的条件下では、これらの経路は、（Ｓｔａｔ１のＩＦＮ依存性活性化と共に）ウイルス感染からの防御をもたらすことができるが、感受性の高い遺伝的バックグラウンドで持続的活性化がある場合、同じ経路が、繊毛細胞過形成および杯細胞化生をもたらしうる。特異的阻害剤、例えば、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３受容体ブロッカーの合理的使用により、正常な上皮構造を十分に回復することができる。
【０００６】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）系のこのリガンドによる活性化は、ラットにおける気道上皮細胞でのムチンの合成および杯細胞化生をもたらすことが示されている（Ｔａｋｅｙａｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９６：３０８１〜３０８６頁、１９９９年）。さらに、ＥＧＦＲ発現は、健康な個体の気道においては希薄であるが、喘息の個体では受容体が発現されることが示されている（ＢｕｒｇｅｌおよびＮａｄｅｌら、Ｔｈｏｒａｘ、５９：９９２〜９９６頁、２００４年）。気道上皮におけるＥＧＦＲ発現を刺激する因子または経路は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）経路である（Ｔａｋｅｙａｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９６：３０８１〜３０８６頁、１９９９年）。Ｎａｄｅｌら、米国特許第６，２７０，７４７号明細書は、ＥＧＦＲアンタゴニストの投与による分泌過多の治療を開示している。
【０００７】
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）シグナル伝達経路は、気道リモデリングおよび分泌過多に関連する。ＩＬ−１３のデコイ受容体（ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）は、マウスにおけるアレルゲン誘発性杯細胞形成を阻害することが見い出された（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：２２５８〜２２６１頁）。ＩＬ−１３は、生理学的条件下で培養された、およびインビボの気道上皮細胞でのムチン遺伝子発現を直接誘導することが示されている（Ｌａｏｕｋｉｌｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：１８１７〜１８２４頁、２００１年；Ｋｏｎｄｏら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７：５３６〜５４１頁、２００２年）。ＩＬ−１３は、ＥＧＦＲに結合して活性化させるＴＧＦαの、ヒト呼吸上皮細胞膜からの放出を刺激することも報告されている（Ｂｏｏｔｈら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５：７３９〜７４３頁、２００１年）。ＩＬ−１３のラット肺への気道内注入は、杯細胞化生を引き起こし、ＩＬ−１３がＩＬ−８産生を誘導する複雑なメカニズムを介してムチン産生を増加させ、好中球動員をもたらす（Ｓｈｉｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８０：Ｌ１３４〜Ｌ１４０、２００１年）。
【発明の開示】
【０００８】
［発明の概要］
本発明の様々な態様の１つは、気道分泌過多治療の改善の提供である。気道分泌過多の病因は、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路を含み、両方とも杯細胞形成に関与する。故に、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路の両方を阻害することで、気道上皮はより完全に元の構造に近づくことができる。
【０００９】
したがって、簡単には、本発明は、個体における気道分泌過多の治療方法であって、ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤およびＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤の投与を含む方法を対象とする。
【００１０】
本発明はまた、ＥＧＦＲシグナル伝達経路阻害剤およびＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤および製薬的に許容される担体を含む、気道分泌過多の治療のための組成物をも対象とする。
【００１１】
他の目的および特徴は、一部は明白であり、一部を以下に指摘する。
【００１２】
［発明の詳細な説明］
免疫シグナルは、検査を受けないでいる場合、慢性気道疾患特有の上皮表現型をもたらしうる。特に、慢性喘息／気管支炎の疾患表現型をもたらす、持続性の杯細胞化生は、繊毛上皮細胞のＥＧＦＲ依存的生存および繊毛細胞の杯細胞へのＩＬ−１３依存的分化転換に依拠する（例えば、実施例１および２参照）。この異常は、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路におけるシグナル伝達段階の標的阻害により補正することができる。ＥＧＦＲ阻害剤による治療は、繊毛細胞が、プログラム細胞死へ進むことを可能にする一方、ＩＬ−１３遮断は、繊毛細胞の杯細胞への移行を妨げる（例えば、実施例２および３参照）。故に、本明細書に記載の通り、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路の両方を遮断することにより、気道上皮を元の構造に回復させることができる（例えば、実施例４参照）。
【００１３】
本発明の１局面は、したがって、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路を標的にすることによる上皮過形成および化生の治療、予防薬または治療薬である。本発明の別の局面は、本明細書に記載された上皮過形成および化生の治療に有用な、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路を標的にする組成物である。このような治療は、例えば、慢性喘息および／または気管支炎に対し、全体または一部を防御する予防薬として使用することができる。組成物および治療は、例えば、喘息、気管支炎、細気管支炎、および／または、ＥＧＦＲ活性化、ＩＬ−１３発現、および杯細胞化生の同様のパターンを特徴とする関連する炎症性および感染性障害に伴う、上皮構造の変化を改善するのに治療的に使用することもできる。組成物および治療は、同様に、粘液分泌過多を特徴とする気道疾患または状態を治療するのに使用することができる。
【００１４】
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達の阻害剤による治療の必要性を示す疾患状態、ならびにＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達の阻害剤による治療に適した疾患状態には、例えば、分泌過多状態を誘発するまたは原因となる、慢性閉塞性肺疾患、鼻汁過分泌疾患（例えば、鼻アレルギー）、炎症性疾患（例えば、喘息、気管支拡張症、および肺線維症）、および慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎）、ならびに嚢胞性線維症、呼吸管の家族性非嚢胞性線維症粘液濃縮（familial non-cystic fibrosis mucus inspissation）、カルタジュナー症候群、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症を含む遺伝子疾患、および上気道または下気道感染症（例えば、ウイルス性細気管支炎または鼻炎）などが挙げられる。
【００１５】
治療の必要性の決定は、典型的には、粘液過剰生産と一致する病歴および理学的検査（例えば、粘液を産する咳）、粘液過剰生産を伴う疾患または状態を示す気道の放射線試験もしくは他の撮像試験、または気道の閉塞および／または過敏性のエビデンスを示す肺機能検査により評価されるであろう。
【００１６】
本発明の１局面において、方法は、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤およびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤の投与により、上皮組織のＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達レベルを低下させることを含む。投与量は、少なくとも繊毛細胞の増加を防ぎ、繊毛細胞の杯細胞への分化転換も防ぐのに十分なものである。１つの代表的試験では、ウイルス感染後１２、１４、１７、および２０日目の、ＩＬ−１３を遮断するデコイ受容体による処置は、ウイルス誘発性杯細胞化生を防ぐのに有効であったのに対し、感染後１０〜２１日目からの、ＥＧＦＲシグナル伝達の選択的阻害剤による毎日の処置は、合計上皮細胞の結果的な減少とは不釣り合いな、繊毛細胞の用量依存的消失を引き起こした（例えば、実施例４参照）。これらの結果は、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達の阻害剤による処置が、ＥＧＦＲ活性化、ＩＬ−１３発現、および杯細胞化生を特徴とする炎症性疾患の場合の上皮構造を補正することができることを実証している。
【００１７】
シグナル伝達阻害剤
ＥＧＦＲまたはＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤は、繊毛細胞および杯細胞化生それぞれの増加を結果的に促進する生物学的カスケードに関与するいずれかの因子または成分を、直接または間接的に標的にすることができる。
【００１８】
ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤には、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲリガンド（例えば、アンフィレグリン、ＨＢ−ＢＧＦ、およびＴＧＦ−α）、ＥＧＦＲ発現刺激因子、ＥＧＦＲ成分（例えば、ｈｅｖ−１およびｈｅｖ−２）、およびＥＧＦＲシグナル伝達下流成分を標的にする阻害剤などが挙げられる。例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ活性化（例えば、受容体二量化または受容体チロシンキナーゼリン酸化）を標的にすることができ、または活性化により誘発される以下のような１以上の経路を標的にすることができる：（ｉ）Ｒａｌ動員、ｃ−Ｓｒｃ活性化、ならびにこれに続くＳｔａｔ１およびＳｔａｔ３活性化、（ｉｉ）Ｓｈｃ／Ｇｒｂ２動員、Ｓｏｓ、Ｒａｓ、およびｃ−Ｒａｆ活性化、ならびにこれに続くＥＲＫ１／２のＭＥＫ１／２活性化、または（ｉｉｉ）Ｇａｂ１動員、ＰＩ３Ｋ活性化、これに続くホスファチジルイノシトール−３，４，５−ホスフェート（Ｐｌ−３，４，５−Ｐ３）生成、ＰＤＫ１／２活性化および次いでプロアポトーシス因子を不活化するＡｋｔの活性化（例えば、図８、９、１０、および１１参照）。
【００１９】
別の例として、ＴＮＦα（気道上皮のＥＧＦＲ発現刺激因子）阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の阻害に使用することができる。同様に、該阻害剤は、ＴＮＦαの下流成分を標的にし、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することができる。ＥＧＦＲは、リガンド依存性およびリガンド非依存性メカニズムを介して活性化することができ、それぞれ自己リン酸化またはトランスリン酸化のいずれかをもたらす。ＥＧＦＲシグナル伝達のリガンド非依存性活性化因子には、酸化ストレス（例えば、Ｔａｋｅｙａｍａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８０：Ｌ１６５〜Ｌ１７２、２００１年）、紫外線および浸透ストレス、エンドセリン−１によるＧ−タンパク質結合受容体の刺激、リゾホスファチジン酸およびトロンビン、ｍ１ムスカリン性アセチルコリン受容体、ならびにヒト成長ホルモンなどが挙げられる。
【００２０】
ＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤には、例えば、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−４Ｒαリガンド、ＩＬ−１３Ｒα１リガンド、およびＩＬ−１３下流シグナル伝達成分を標的にする阻害剤などが挙げられる。（例えば、図４参照）。例として、ＩＬ−１３シグナル伝達は、ＩＬ−４／ＩＬ−１３受容体を標的にして阻害することができる。あるいは、ＩＬ−４／ＩＬ−１３受容体発現を刺激する因子または経路（例えば、ＩＬ−１３）は、ＩＬ−１３シグナル伝達経路阻害剤の１つの標的である。ＩＬ−１３経路の他の活性化因子には、ＩＬ−４およびＩＬ−９などが挙げられる。別の例として、ＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤は、（ｉ）ＩＲＳ１／２動員、Ｇｒｂ２／Ｓｏｓ活性化、Ｒａｓ／ｃ−Ｒａｆ活性化、およびこれに続くＥＲＫ１／２およびＰＩ３Ｋ活性化、および／または（ｉｉ）Ｓｔａｔ６活性化を標的にすることができ、これらはそれぞれ、繊毛細胞の杯細胞への分化転換を促す遺伝子（例えば、ＣＬＣＡおよびＭＵＣ）のアップレギュレーションに寄与する（例えば、図４参照）。また、ＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤は、ＩＲＳ１／２動員、ＰＩ３Ｋ活性化、これに続くホスファチジルイノシトール−３，４，５−ホスフェート（Ｐｌ−３，４，５−Ｐ３）生成、ＰＤＫ１／２の活性化および次ぐプロアポトーシス因子を不活化するＡｋｔの活性化を標的にすることができる（例えば、図８、９、１０および１１参照）。
【００２１】
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３アゴニストもまた、それぞれのシグナル伝達経路を阻害するのに使用することができる。ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３アゴニストは、それぞれＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路に関与する受容体との相互作用を模倣する分子である。これらは、シグナル分子の類似体もしくは断片、または受容体のリガンド結合部位エピトープに対する免疫ペプチド、または受容体相互作用部分に結合する特定の免疫ペプチドに対する抗イディオタイプ免疫ペプチドでありうる。アンタゴニストは、受容体結合について競合するが、受容体または結合分子を活性化する能力を欠くタンパク質の形態でありうる（例えば、免疫ペプチド）。抗ＩＬ−１３シグナル伝達アゴニストの１つの例には、ＩＬ−１３作用を特異的に遮断するデコイ受容体として作用する、組換え可溶性ＩＬ−１３受容体α２  Ｆｃ融合タンパク質、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃなどが挙げられる（例えば、実施例４参照）。
【００２２】
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤には、一般に、免疫ペプチド、競合的または不可逆的アンタゴニストとして作用する小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子干渉ＲＮＡなどが挙げられる。
【００２３】
免疫ペプチド阻害剤
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達の免疫ペプチド阻害剤には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体断片などが挙げられる。こうした抗体は、当業者に既知のいずれか適切な方法により作製することができる。市販の抗体もまた、使用することができる。
【００２４】
ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、様々な家禽、ウサギ、マウス、またはラットなどの様々な温血動物から、当業者により容易に生成することができる。簡単には、抗原は、動物を免疫するのに、腹腔内、筋肉内、眼内、または皮下注入を介して、フロインド完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと共に利用する。幾つかの追加免疫後、血清試料を収集し、所望の標的に対する反応性をテストする。特に好ましいポリクローナル抗血清は、これらのアッセイの１つにおいて、バックグラウンドより少なくとも３倍大きいシグナルをもたらすであろう。動物の力価が、反応性の点でいったんプラトーに達すると、より多量の抗血清が、週ごとに動物を出血させる、または失血させることにより、容易に得ることができる。
【００２５】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）技術は、ＥＧＦＲおよび／またはＩＬ−１３シグナル伝達経路を干渉することができるＭＡｂを得るのに使用することができる。ＥＧＦアンタゴニストとして機能するであろう抗体の例には、中和抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｃ２２５（Ｋａｗａｍｏｔｏら（１９８３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：１３３７〜１３４１頁；Ｐｅｔｉｔら（１９９７年）Ｊ．Ｐａｔｈ．１５１：１５２３〜１５３、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．により作製）および抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体ＥＭＤ５５９００（Ｍａｂ  ４２５とも呼ばれる）（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）などが挙げられる。簡単には、ハイブリドーマは、抗原で免疫したマウス由来の脾臓細胞を用いて作製する。免疫した各マウスの脾臓細胞は、例えば、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：３〜４６頁（１９８１年）のポリエチレングリコール融合法を用いて、マウス骨髄腫Ｓｐ  ２／０細胞と融合させる。ハイブリドーマの増殖、ＨＡＴ培地での選択、抗原に対するクローンのクローニングおよびスクリーニングは、標準方法を用いて行う（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：３〜４６頁（１９８１年））。Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：３〜４６頁（１９８１年）により記載の通り、ＨＡＴ選択されたクローンをマウスに注入して腹水で多量のＭＡｂを産生させ、タンパク質Ａカラムクロマトグラフィー（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて精製することができる。ＭＡｂは、その（ａ）特異性、（ｂ）高結合親和性、（ｃ）アイソタイプ、および（ｄ）安定性に基いて選択する。ＭＡｂは、ウェスタンブロッティング法（Ｋｏｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８７６：９１〜１００頁（１９８６年））および酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｋｏｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８７６：９１〜１００頁（１９８６年））を含む、様々な標準方法のいずれかを用いてスクリーニングする、または特異性を試験することができる。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１ｍＭのＫＤ、より一般的には少なくとも約３００μＭのＫＤ、典型的には少なくとも約１０μＭのＫＤ、より典型的には少なくとも約３０μＭのＫＤ、好ましくは少なくとも約１０μＭのＫＤ、およびより好ましくは少なくとも約３μＭのＫＤまたはこれより良いＫＤで結合するであろう。
【００２６】
機能的抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を作製および使用することが望ましい場合がある。これらの断片は、一般に、抗原分子のある特定の部位に対する抗体の特異性に関与する、相補性決定領域として知られる一続きのアミノ酸配列を含有する超可変領域を含むであろう。パパインによるタンパク質分解切断は、ジスルフィド結合を介して隣接する重鎖のアミノ末端部分に結合したインタクトな軽鎖を含有するＦａｂ断片と呼ばれる、２つの別個の抗原結合断片を生成する。典型的なＩｇＧ分子の、パパインによるタンパク質分解切断は、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ  １：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．、編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８６年））。また、組換えＤＮＡ法も、ｓｃＦｖ抗体として知られる一本鎖抗原結合ポリペプチドである組換え免疫グロブリンペプチドの生成および選択を可能にする（Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、１０８３２〜１０８３８頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２、６２４〜６２８頁；およびＣｗｉｒｌａら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、６３７８〜６３８２頁）。
【００２７】
免疫ペプチド阻害剤は、例えば、注入あたり約０．０５ｍｇから約２．５ｍｇの量で投与することができる。別の例として、免疫ペプチド阻害剤は、注入あたり約０．１ｍｇから約１ｍｇの濃度で注入することができる。好ましくは、免疫ペプチド阻害剤は、注入あたり約０．３ｍｇから約０．５ｍｇの濃度で注入する。
【００２８】
小分子阻害剤
ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤などが挙げられる。多くのこうしたＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、当技術分野で既知であり、ＰＤ１５３０３５、ＥＫＢ−５６９、およびＡＧ１４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６；７−ジメトキシキナゾリン）；非フェノールチルホスチン類似体ＥＧＦＲ阻害剤ＲＧ−１４６２０；ＥＧＦＲ受容体キナーゼ阻害剤チルホスチン２３（ＲＧ−５０８１０）、チルホスチン２５（ＲＧ−５０８７５）、チルホスチン４６、チルホスチン４７（ＲＧ−５０８６４；ＡＧ−２１３）、チルホスチン５１（ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、プリマスミーティング、ＰＡ；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カマリロ、ＣＡ）；ＢＩＢＸ１５２２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．、インゲルハイム、ドイツ）；ＣＧＰ５９３２６Ｂ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、バーゼル、スイス）；４−アミノキナゾリンＥＧＦＲ阻害剤（米国特許第５，７６０，０４１号に記載）；ニトリルおよびモロノニトリル化合物を含む、ナフタレン、インダンまたはベンゾキサジンであってもよい置換スチレン化合物（米国特許第５，２１７，９９９号に記載）；米国特許第５，７７３，４７６号に記載の阻害剤；３個のジスルフィド架橋を有する３９−アミノ酸プロテアーゼ阻害剤である、ジャガイモ（potato）カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＣＩ）、（Ｂｌａｎｃｏ−Ａｐａｒｉｃｉｏら（１９８８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（２０）：１２３７０〜１２３７７頁）；ボンベシンアンタゴニストＲＣ−３０９５（Ｓｚｅｐｅｓｈａｚｉら（１９９７年）Ｐｒｏｃ  ａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１０９１３〜１０９１８頁）；ＣＧＰ  ５９３２６、ＣＧＰ  ６０２６１およびＣＧＰ  ６２７０６、およびピラゾロピリミジンなどのピリドピリミジン、ピリミドピリミジン、ピロロピリミジン（ＳｔｒａｗｎおよびＳｈａｗｖｅｒ（１９９８年）Ｅｘｐ．−Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）、５５３〜５７３頁）；４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（Ｔｒａｘｉｅｒら（１９９６年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ３９：２２８５〜２２９２頁）；クルクミン（Ｋｏｒｕｔｌａら（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２２４：５９７〜６００頁）；（Ｌａｘｍｉｎ  ａｒａｙａｎａ（１９９５年）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ  １６：１７４１〜１７４５頁）などが挙げられる。
【００２９】
ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤には、Ｇタンパク質脱共役剤スラミンナトリウム（ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、プリマスミーティング、ＰＡ；ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カマリロ、ＣＡ）も含まれる。
【００３０】
ＩＬ−１３シグナル伝達の小分子阻害剤には、ＰＤ９８０５９（ＭＥＫ１／２を→ＥＲＫ１／２に標的化する）およびＬＹ２９４００２（Ｐ１３Ｋを→ＡＫＴに標的化する）などの下流シグナル伝達を標的にするものなどが挙げられる。
【００３１】
小分子阻害剤は、１回の投与につき被験者の体重１ｋｇあたり約０．１μｇから約１００ｍｇの量で投与することができる。当業者は、用量レベルが、以下でより詳しく考察するように、特定化合物、症状の重症度および被験者の副作用に対する感受性の関数として変化しうることを容易に理解するであろう。
【００３２】
アンチセンス阻害剤
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、相補的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質発現を減少させることにより高度に選択的および特異的に遺伝子発現を阻害する。
【００３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤およびこの作製方法には、例えば、Ｋｒｏｎｍｉｌｌｅｒら（１９９１年）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１４７（２）、４８５〜８頁；Ｈｕら（１９９２年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．３６（４）、５０５〜１６頁；ＲｏｙおよびＨａｒｒｉｓ（１９９４年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ８、１１７５〜１１８１頁；Ｃａｓａｍａｓｓｉｍｉら（２０００年）Ａｎｎ−Ｏｎｃｏｌ  １１（３）、３１９〜３２５頁；Ｎｏｒｍａｎｎｏら（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ２０（５）；Ｈｅら（２０００年）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ  ６（５）、７４７〜７４９；Ｒｉｅｄｅｌら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ（２００２年）２１、１１〜１６頁；Ｚｅｎｇら（２００２年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ  ２（３）、１７４〜１８６頁；Ｄｅｎｇら（２００３年）Ｄｉ  Ｙｉ  Ｊｕｎ  Ｙｉ  Ｄａ  Ｘｕｅ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  ２３（９）、８７７〜８１頁；Ｌｉら（２００２年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８、３５７０〜３５７８頁に記載されたものなどが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤には、上記方法に類似した方法で作製されたものも含まれる。ＥＧＦＲアンチセンス遺伝子療法の安全性および有効性は、Ｚｅｎｇら（２００２年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ  ２（３）、１７４〜１８６頁に記載されている。
【００３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤およびこの作製方法には、例えば、Ｍｏｕｓａｖｉら（２００４年）Ｉｒａｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｊ．８（４）１８５〜１９１頁に記載のものなどが挙げられる。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０μｇ／日から約３ｍｇ／日の濃度で静注により投与されうる。例えば、投与用量は、約３０μｇ／日から約３００μｇ／日であってよい。別の例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１００μｇ／日で投与されうる。アンチセンスオリゴの投与は、単回の事象としてまたは治療の時間経過にわたり行ってもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎日、毎週、隔週、または毎月注入することができる。治療の時間経過は、約１週間から約１年またはこれを超えてよい。１つの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１カ月間毎日注入する。別の例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０週間毎週注入する。さらなる例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、４８週間６週ごとに注入する。
【００３６】
ＲＮＡ干渉
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達経路は、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＬ−１３、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα１など、これらの経路の成分に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の治療有効量を患者に投与することでＲＮＡ干渉によりダウンレギュレートすることができる。ｓｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）などの供給元から市販されている。ｓｉＲＮＡは、上皮の過形成および化生および／または分泌過多領域の、またはこの領域付近の組織細胞にｓｉＲＮＡを輸送するのに適した手段により被験者に投与することができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、遺伝子銃、エレクトロポレーション、または静注など他の適切な非経口もしくは経腸投与経路により投与することができる。
【００３７】
ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、その相補的配列を有する遺伝子の発現を特異的に抑制するプロセスである。該遺伝子の抑制は、対応するタンパク質の産生を阻害する。導入の際、長鎖ｄｓＲＮＡは、一般にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路と呼ばれる細胞経路に侵入する。先ず、ｄｓＲＮＡは、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様酵素により２０〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングされる（開始工程）。次いで、ｓｉＲＮＡは集合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex）（ＲＩＳＣ）として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体を構築し、該プロセスにおいて巻き戻される。ｓｉＲＮＡ鎖は、続いてＲＩＳＣを相補的ＲＮＡ分子に導き、相同の（cognate）ＲＮＡを切断および破壊する（エフェクター工程）。相同ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ鎖が結合した領域の中央付近で起こる。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに標的化している、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチド長、好ましくは約１９から約２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡを含むことが好ましい。
【００３８】
一例として、ｓｉＲＮＡの有効量は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を引き起こすのに十分な量、または被験者においてＥＧＦＲもしくはＩＬ−１３シグナル伝達経路を阻害するのに十分な量でありうる。当業者は、その被験者に投与すべき本発明のｓｉＲＮＡ有効量を、被験者のサイズおよび体重；血管新生または疾患浸透の程度；被験者の年齢、健康および性別；投与経路；ならびに投与が局所性かまたは全身性か、などの要素を考慮して容易に決定することができる。一般に、ｓｉＲＮＡ有効量には、上皮過形成および化生部位、またはこの部位付近で、約１ナノモル（ｎＭ）から約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭから約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭから約１０ｎＭの細胞内濃度などがある。より多い、またはより少ない量のｓｉＲＮＡを投与することができると考えられる。
【００３９】
ｓｉＲＮＡは、いずれかのｍＲＮＡ標的配列の、いずれかの約１９〜２５の一続きの隣接ヌクレオチドに標的化することができる。ヒトゲノムデータベース（ＢＬＡＳＴ）の検索を行って、選択ｓｉＲＮＡ配列が、他の遺伝子転写物を標的にしないことを確実にすることができる。ｓｉＲＮＡの標的配列の選択方法は、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１、４９４〜４９８頁）に提供されている。従って、本ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＬ−１３、ＩＬ−４Ｒα、またはＩＬ−１３Ｒα１の標的ｍＲＮＡにおける約１９から約２５ヌクレオチドのいずれかの隣接する一続きと同一のヌクレオチド配列を含む。一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択することができ、好ましくは開始コドンから５０から１００ｎｔ下流（すなわち、３’方向）から始まる。しかし、標的配列は、５’もしくは３’非翻訳領域、または開始コドン付近の領域に位置していてもよい。
【００４０】
処置の用量および時間経過
本明細書に記載の治療に使用する場合、治療有効量の本発明の化合物は、化合物のみの形態で、または、そのような形態が存在する場合は、製薬的に許容される塩の形態で、および製薬的に許容される賦形剤と共にもしくは製薬的に許容される賦形剤なしで用いることができる。例えば、本発明の化合物は、いずれかの薬物療法に適用できる妥当なベネフィット／リスク比で、ＥＧＦＲシグナル伝達およびＩＬ−１３シグナル伝達を阻害する、またはＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達カスケードから生じる産物の形成を減少させるのに十分な量で投与することができる。各種阻害剤に特有の用量は、上記により十分に記載している。しかし、本発明の化合物および組成物の合計１日用量は、担当医師により健全な医学的判断の範囲内で決定されることは理解されるであろう。
【００４１】
任意の特定患者に特有の治療的に有効な投与レベルは、治療している障害および障害の重症度；使用する特定化合物の活性；使用する特定組成物；患者の年齢、体重、一般的健康、性別および食習慣；投与時間；投与経路；使用する特定化合物の排泄率；処置期間；使用する特定化合物と組み合わせてまたは同時に使用する薬剤など医術ではよく知られる要素を含む、様々な要素に依拠するであろう。例えば、化合物の投与を、所望の治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加することは、当技術分野の技術の十分に範囲内である。所望であれば、有効１日用量は、投与目的のため複数回投与に分割することができる。したがって、単回投与組成物は、１日用量を構成するような量またはこの約数を含有してよい。
【００４２】
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤の投与は、単回投与としてまたは治療の時間経過にわたり行ってもよい。例えば、阻害剤は、毎日、毎週、隔週、または毎月投与することができる。急性状態の治療では、治療の時間経過は、通常、少なくとも数日となろう。特定の状態においては、治療を数日から数週間延長することもありうる。例えば、治療は、１週間、２週間、または３週間にわたり延長することができよう。より慢性状態では、治療は、数週間から数カ月または１年もしくはこれを超えて延長することができよう。
【００４３】
本明細書に示した方法により、ＥＧＦＲ活性化、ＩＬ−１３発現、および杯細胞化生を特徴とする炎症性疾患の予防的および治療的処置は、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達の、これらの経路の阻害剤の投与を介した遮断、減少、またはダウンレギュレーションを通じて達成することができる。
【００４４】
治療的投与
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤は、外因性物質としてまたは内因性物質として治療的に使用することができる。外因性薬剤は、生体外で生成されるまたは製造され、生体に投与されるものである。内因性薬剤は、生体内へまたは生体内の他の器官へ輸送するための一種の装置（生物学的または他の）により、生体内で生成されるまたは製造されるものである。
【００４５】
外因性治療
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤の安定なおよび有効な量は、例えば、望ましくない副作用を最少化しつつ、患者において所望の治療効果をもたらすような量である。用法は、治療している状態の正確な性質、状態の重症度、患者の年齢および一般的身体状態などといった要素に基づき、熟練医師により決定されるであろう。
【００４６】
本発明の組成物は、１以上のＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤、ならびに前記化合物のための製薬的に許容されるビヒクルを含むであろう。様々な種類のビヒクルが使用できる。ビヒクルは、本来、水性であってよい。化合物は、懸濁液、粘性もしくは半粘性ゲルまたは他の種類の固形もしくは半固形組成物など、他の種類の組成物に容易に組み込むこともできる。懸濁液は、水に比較的不溶である薬剤が好ましい可能性がある。本発明の組成物は、緩衝液、防腐剤、共溶媒および増粘剤（viscosity building agent）など、様々な他の成分も含んでもよい。
【００４７】
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤は、当業者に既知の処方方法により、様々な種類の医薬組成物に含有させることができる。選択する特定の種類の処方は、使用するＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤、投与頻度、および治療する部位など、様々な要因に依拠するであろう。例えば、薬剤は、溶液、懸濁液、および、組織洗浄液など関係組織への局所適用、または関係組織への注入に適した他の投与形態に含めることができる。保存条件下でのｐＨ変動を防止するために、適切な緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはホウ酸ナトリウム）を添加することができる。
【００４８】
このように、使用中の微生物汚染を防止するのに、防腐剤が一般に必要とされる。適切な防腐剤の例には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、または当業者に既知の他の薬剤などが挙げられる。このような防腐剤は、典型的には組成物の総重量（ｗｔ．％）に対して、約０．００１から約１．０重量パーセントのレベルで使用する。
【００４９】
ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤の幾つかは、水への溶解度が限られる場合があるため、組成物中に界面活性剤または他の適切な共溶媒を必要とする場合がある。このような共溶媒には、ポリエトキシレート化ヒマシ油、ポリソルベート２０、６０および８０；プルロニック（登録商標）Ｆ−６８、Ｆ−８４およびＰ−１０３（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．、パーシッパニー、Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ）；シクロデキストリン；または当業者に既知の他の薬剤などが挙げられる。このような共溶媒は、典型的には約０．０１から約２ｗｔ．％のレベルで用いられる。
【００５０】
生理学的にバランスの取れた灌注液（irrigating solution）は、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤の医薬ビヒクルとして使用することができる。本明細書において用いられる、「生理学的にバランスの取れた灌注液」という用語は、侵襲的または非侵襲的医療処置の間、組織の物理的構造および機能を維持するのに適した溶液を意味する。この種の溶液は、典型的には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、および／または塩化物などの電解質；デキストロースなどのエネルギー源；ならびに生理学的レベルでまたはこれに近いレベルで溶液のｐＨを維持する緩衝液を含有するであろう。この種の様々な溶液が知られている（例えば、乳酸化リンゲル液）。ＢＳＳ（登録商標）滅菌灌注液およびＢＳＳ Ｐｌｕｓ（登録商標）滅菌眼内灌注液（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ、Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）は、生理学的にバランスの取れた眼内灌注液の例である。
【００５１】
単純な水溶液の粘性を超える粘性は、活性化合物の組織吸収を増加させ、製剤の調剤の変動を減少させ、製剤の懸濁液または乳剤の成分の物理的分離を減少させ、および／またはその他眼科用製剤を改善するために望ましい場合がある。このような増粘剤には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたは当業者に既知の他の増粘剤などが挙げられる。こうした薬剤は、典型的には約０．０１から約２ｗｔ．％のレベルで使用される。
【００５２】
本発明の組成物は、複数回投与の形態で封入することができる。
【００５３】
内因性治療
治療産物を産生についての遺伝子治療の原則を、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害の輸送に適用することができる。臨床の場合は、治療用のＥＧＦＲおよびＩＬ−１３シグナル伝達阻害剤のための遺伝子輸送系は、当分野にて既知の幾つかの方法のいずれかにより患者（またはヒト以外の動物）へ導入することができる。例えば、ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３アンチセンス核酸シグナル伝達阻害剤は、非病原性ウイルス変異体（例えば、複製欠損マウスレトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター）、脂質小胞（例えば、リポソーム、リポフェクチン、およびサイトフェクチン）、炭水化物および／または治療タンパク質もしくは物質をコードするヌクレオチド配列のその他の化学コンジュゲートでありうる輸送ビヒクル（ベクターと呼ばれる）を介して導入することができる。別の例として、ベクターは、物理的取り込み（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および空気式「遺伝子銃」）、化学的取り込み、または細胞受容体（例えば、受容体ベースのエンドサイトーシス）媒介取り込みにより生体細胞へ導入することができる。核酸配列は、細胞内へ一度取り込まれると、細胞（エピソーム）環境または核（細胞核）環境内で治療物質を産生できるようになる。エピソームは、通常、限られた期間に所望の産物を産生するのに対し、細胞核に組み込まれた核酸配列は、永久も含め長期間治療産物を産生することができる。
【００５４】
遺伝子治療コンストラクトの医薬製剤は、本質的に、許容可能な希釈剤中の遺伝子輸送系から構成することができ、または遺伝子輸送ビヒクルが組み込まれた持続放出マトリックスを含んでもよい。あるいは、例えば、レトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子輸送系が、組換え細胞からインタクトに生成され得る場合、医薬製剤は、遺伝子輸送系を生成する１以上の細胞を含み得る。
【００５５】
遺伝子治療法は、輸送部位ごとに記載することもできる。遺伝子を輸送する基本的方法には、エクスビボ遺伝子導入、インビボ遺伝子導入、およびインビトロ遺伝子導入などが挙げられる。エクスビボ遺伝子導入では、細胞を患者から採取し、細胞培養で増殖させる。ＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクト細胞の数を増やし、次いで患者に再移植する。インビトロ遺伝子導入では、形質転換細胞は、組織培養細胞などの培養増殖細胞であり、特定の患者由来の特定の細胞ではない。これらの「実験室細胞」をトランスフェクトし、トランスフェクト細胞は、患者へ移植するためまたは他の使用のために選択し増殖させる。インビボでは、遺伝子導入は、細胞が患者内にある場合、患者の細胞へのＤＮＡの導入を含む。インビボでは、遺伝子導入は、内皮特異的プロモーターを含有する遺伝子治療ベクターを用いて、患者の眼の内皮細胞へＤＮＡを特異的に導入することも含む。上述の３つの幅広いカテゴリーは全て、インビボ、エクスビボ、およびインビトロで遺伝子導入を実現するのに使用することができる。
【００５６】
遺伝子治療はまた、タンパク質をコードする天然遺伝子を遮断する遺伝子配列により細胞が形質転換されている場合に、そのタンパク質またはポリペプチドを産生すること、すなわち、内因性遺伝子活性化技術も考えられる。
【００５７】
本発明を詳細に記載したことにより、添付の特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を逸脱することなく、修正および改変が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示の実施例は全て、非限定的な例として提供することと理解されたい。
【実施例】
【００５８】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供する。続く実施例で開示する方法は、本発明の実践において十分に機能すると本発明者が見出したアプローチを代表すること、従って本発明の実践様式の例を成すと見なすことができることを、当業者には理解されたい。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更を成すことができ、なおも同様の、もしくは類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
【００５９】
以下の実施例で使用される方法
以下に記載の実施例で使用する特定の方法は、実施例自体の中に含まれるが、さらなる技術も用いられ、すぐ下に記載している。
【００６０】
増殖マーカー。ＢｒｄＵ免疫染色では、マウスに、安楽死の４８時間前、２４時間前および４時間前にＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。ＢｒｄＵは、抗ＢｒｄＵ染色キット（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、サンフランシスコ、ＣＡ）により、メーカーのプロトコルに従って検出した。Ｋｉ６７免疫染色は、抗原アンマスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた熱誘導抗原回復（heat-induced antigen retrieval）の前処置以外は、ＥＧＦＲ免疫染色と同じプロトコルを用いて抗Ｋｉ６７  Ａｂ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ、ニューキャッスル、ＵＫ）により行った。ＰＣＮＡ染色は、ＡＢＣ法（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いたビオチニル化抗マウスＰＣＮＡ  Ａｂ（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カーピンテリア、ＣＡ）により行った。
【００６１】
気道上皮細胞の培養および処置。マウス気管上皮細胞（ｍＴＥＣ）の初代気液界面培養を、先に報告されているようにに樹立した（Ｙｏｕら（２００２年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８３：Ｌ１３１５〜１３２１頁）。ヒト気道上皮細胞培養は、移植を受けているＣＯＰＤ患者の肺外植片から、および肺疾患を伴わない肺移植ドナーから収集した気管気管支標本から同じ培養条件を用いて樹立した。全ての場合において、上下コンパートメントにおいて１０μｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．１μｇ／ｍｌコレラ毒素、２５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｂｅｃｔｉｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ベッドフォード、ＭＡ）、３０μｇ／ｍｌウシ下垂体エキス、および５％  ＦＢＳを補充した基礎培地（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３．５ｍＭ  ＮＨＣＯ３、０．０１％ファンギゾン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを伴うＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２）にて細胞を増殖させた。細胞の膜貫通電気抵抗が＞１０００オーム・ｃｍ２になった後、膜をＰＢＳで洗浄し、下部コンパートメントの培地を２％  ＮｕＳｅｒｕｍ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）を補足した基礎培地に変更して、気液界面状態を樹立した。ＥＧＦＲ刺激では、細胞を基礎培地で２４時間インキュベートし、次いで、上部および／または下部コンパートメントに添加したＥＧＦ含有基礎培地（１〜１００ｎｇ／ｍｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、レイクプラシド、ＮＹ）において、１０分間３７℃でインキュベートした。ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤またはビヒクル対照（０．１％  ＤＭＳＯ）は、長期実験では下部コンパートメントに毎日、または短期実験では上下コンパートメントに１．５から６時間添加した。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５、ＭＥＫ１／２阻害剤ＰＤ９８０５９、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８、およびＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ラホーヤ、ＣＡ）製、ならびにｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐフルオロメチルケトン（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（リバーモア、ＣＡ）製であった。Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ（ロッキーヒル、ＮＪ）製の組換えヒトまたはマウスＩＬ−１３を、気液界面状態の２４時間前に、上下コンパートメントに添加し、下部コンパートメントにおいては実験の間中維持した。
【００６２】
免疫組織化学法。培養細胞を４℃でＰＢＳにより２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにおいて１０分間、２５℃で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＴＵＮＥＬ反応については、エタノール：酢酸（２：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）で５分間、−２０℃で透過処理し、または免疫染色については、０．２％トリトン−Ｘで５分間、２５℃で透過処理した。次いで透過処理細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＴＵＮＥＬ反応（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、パーチェス、ＮＹ）にかけるか、または２％魚ゲルにより１時間、２５℃にて遮断し、ウサギ抗活性カスパーゼ  ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）、ウサギ抗−ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルス、ＣＡ）、ウサギ抗−ｐ−ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ビバリー、ＭＡ）、マウス抗−β−チューブリン−ＩＶもしくはウサギ抗−β−チューブリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）抗体と共に一晩、４℃でインキュベートした。一次抗体結合は、ヤギ抗マウスまたはロバ抗ウサギＦＩＴＣまたはＣＹ３二次抗体により検出した。細胞を、４μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ）で対比染色して核形態をチェックし、次いで上述の通り撮像した。
【００６３】
フローサイトメトリー法。マウス気管上皮細胞を上述の通りに培養し、０．２５％トリプシンおよび０．１％  ＥＤＴＡを含有する細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を用いてトランスウェル培養から除去した。細胞を、０．２％  ＢＳＡ含有ＨＢＳＳで洗浄し、５μｇ／ｍｌ  ＪＣ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ）と共に１５分間、２５℃でインキュベートした。ミトコンドリア膜脱分極を有する細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マウンテンビュー、ＣＡ）を用いて、緑色蛍光（ＦＬ１）の低発光から高発光へのシフトにより検出した。
【００６４】
電子顕微鏡法。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）のために、膜上の細胞を、先に報告されているようにに調製した（Ｙｏｕら（２００４年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８６：Ｌ６５０〜６５７頁）。簡単には、試料を、２．５％グルタルアルデヒドで固定し、１．２５％四酸化オスミウムで染色した。細胞を、２．０％タンニン酸で対比染色し、切片作成のためブロックし、ツァイス９０２モデル顕微鏡で撮像した。
【００６５】
統計分析。マウス組織の組織化学についての値を、要因実験デザインのため一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。一元配置分析で有意性が得られた場合、シェッフェのＦ検定を用いてＡＮＯＶＡ後平均比較を行った。
【００６６】
実施例１：繊毛上皮細胞でのＥＧＦＲ持続活性化
通常のヒトパラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルスまたはメタ肺炎ウイルス）は、一般にマウスでの複製が不十分であるため、マウス気道上皮におけるＥＧＦＲ挙動は、マウスパラインフルエンザウイルス（センダイウイルス；ＳｅＶ）を接種したマウスで評価した。このモデル系において、接種により、細気管支粘膜において高効率で複製が起こり、結果的に免疫応答遺伝子発現、免疫細胞浸潤、および上皮損傷が誘導される（Ｗａｌｔｅｒら（２００１年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３、３３９〜３５２頁）。この宿主反応により、接種後１０〜１２日までにＳｅＶは完全に除去される（Ｗａｌｔｅｒら（２００２年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１６５〜１７５頁；Ｔｙｎｅｒら（２００５年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１１８０〜１１８７頁）。幾つかのマウス株では、損傷の後に、上皮修復および正常な気道構造の回復が起こるが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、接種後約２１日目に出現する長期的な（恐らく永久の）杯細胞化生が続いて起こりうる（Ｗａｌｔｅｒら（２００２年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０、１６５〜１７５頁）。
【００６７】
Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢａｌｂ／ｃＪマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から入手し、先に報告されているように、７週齢で、研究用の無菌条件下で維持しモニターした（Ｗａｌｔｅｒら（２００１年）；Ｗａｌｔｅｒら（２００２年）；Ｔｙｎｅｒら（２００６年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：３０９〜３２１頁）。ＳｅＶ（フシミ株（Fushimi Strain）５２）を、孵化鶏卵で増殖させ、回収してウイルス原液とし、５０００  ＥＩＤ５０（５０％発育鶏卵感染用量）（50％ egg infectious dose）は２×１０５  ＰＦＵ（プラーク形成単位）に相当した。この接種材料または同量のＵＶ不活化ＳｅＶを、ケタミン／キシラジン麻酔下で３０μｌ  ＰＢＳにて鼻腔内輸送した。これらの条件下でウイルス組織レベルは、感染後３〜５日目で最大となり、ウイルス除去は１２日目までに完了する（Ｗａｌｔｅｒら（２００１年）；Ｗａｌｔｅｒら（２００２年）；Ｔｙｎｅｒら（２００６年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：３０９〜３２１頁）。センチネルマウス（sentinel mice）および実験対照マウスは、接種マウスと同様に処理し、１１種の齧歯類病原菌（ＳｅＶを含む）への曝露の血清学的または組織学的証拠は示されなかった。ＥＧＦＲ遮断については、マウスを、ＥＫＢ−５６９（Ｌｅｅ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｗｙｅｔｈ  Ａｙｅｒｓｔ  Ｐｈａｒｍａｓｅｕｔｉｃａｌｓ、パールリバー、ＮＹから入手；ｐＨ２．０の水中２０ｍｇ／ｋｇを経管栄養により投与）またはビヒクル対照を感染後１０〜２１日目から毎日投与して処置した。ＩＬ−１３遮断については、マウスに、感染後１２、１４、１７、および２０日目に、Ｆｃに融合した可溶性マウスＩＬ−１３Ｒα２（ｓＩＬ  実施例２：ＥＧＦＲ阻害は、上皮をリモデリングする１３Ｒα２−Ｆｃの側面を低下させる；Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ、Ｗｙｅｔｈ  Ａｙｅｒｓｔから入手；ＰＢＳ中２００μｇ／マウス）または対照Ｆｃを皮下注射した（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、２３１７頁）。
【００６８】
全肺分析については、マウス肺の左葉を、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）含有ＲＩＰＡ緩衝液Ｐａｇｅ  １６（ＰＢＳ中１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ）においてホモジナイズした。気管組織およびｍＴＥＣを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％トリトン−Ｘ  １００、１．０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、０．１ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、および１ｍＭ  β-グリセロリン酸を含有する細胞溶解緩衝液中で収集した。細胞溶解物を遠心分離で除去し、上清タンパク質を４〜１５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、ＭＡ）に移した。膜を、ＥＧＦＲ、ホスホ−ＥＧＦＲ、ホスホ−ＥＲＫ１／２、活性化カスパーゼ３、ホスホ−Ｓｔａｔ６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ）、ホスホ−Ａｋｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、カスパーゼ９（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）、およびβ−アクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、テメキュラ、ＣＡ）に対する抗体に対しブロットした。一次抗体結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした化学発光を強化した二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バッキンガムシャー、ＵＫ）により検出した。
【００６９】
マウス肺を、２５ｃｍ  Ｈ２Ｏ圧における４％パラホルムアルデヒドの気管内注入により固定した。４℃で一晩固定した後、組織をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン／エオシンまたは免疫染色のため３μｍ厚の切片に切断した。
【００７０】
ヒト組織については、喘息被験者（グルココルチコイド治療有りおよび無し）および健康な対照被験者を募集し、特徴付け、先に報告されているように気管支内生検を行った（Ｗａｌｔｅｒ（２００１年）；Ｓａｍｐａｔｈら（１９９９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１３５３〜１３６１頁；Ｔａｇｕｃｈｉ（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７、１９２７〜１９４０頁）。簡単には、喘息被験者については、被験者を吸入プロピオン酸フルチカゾン（１７６０μｇ／ｄ）により３０日間処置した後、次いで６週間または最大呼気流量が２５％減少し１秒の努力呼気肺活量が１５％減少するまでフルチカゾンを中止した後、気管支内生検を行った。全被験者において、過去３カ月間の呼吸器感染症の既往歴はなかった。気管支内生検をＰＢＳで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンと共に１８時間、２５℃でインキュベートした後、上述のように組織化学試験を行った。さらに、肺切除または移植を受けているＣＯＰＤ患者由来の肺組織試料を入手し、上述のように処理した。
【００７１】
免疫染色では、組織切片を脱パラフィン化し、等級付アルコール（graded alcohol）中で再水和し、疎水性フィルム（ＩｍｍＥｄｇｅ  ＰＥＮ、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンガム、ＣＡ）で囲んだ。抗原回収については、切片を、ＰＢＳ中４０μｇ／ｍｌの最終濃度のプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）により５分間消化し、次いで蒸留水中３％過酸化水素中で１０分間処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を消光した。非特異的結合を、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ８）中３％  ＢＳＡおよび２％ヤギ血清により、１時間おいて遮断した。一次抗体を、ブロッキング緩衝液中に、ヒトおよびマウス組織切片について、それぞれ０．０５または０．１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、一晩４℃にてインキュベートした。マウスＥＧＦＲの対応する配列と同一のアミノ酸残基１００５−１０１６に対するウサギ抗ヒトＥＧＦＲ抗体ＳＣ−０３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルス、ＣＡ）製）を用いて、ＥＧＦＲを検出した。リン酸化Ｔｙｒ８４５に対するウサギ抗ホスホ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ８４５）抗体＃２２３１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ビバリー、ＭＡ）製）を用いてリン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）を検出した。この抗体については、最終濃度０．１６および０．３２μｇ／ｍｌを、ヒトおよびマウス組織にそれぞれ使用した。繊毛細胞、クララ細胞、および杯細胞を、マウス抗β−チューブリン−ＩＶ  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）、ヤギ抗クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびマウス抗ヒトＭＵＣ５ＡＣ  ｍＡｂ  ４５Ｍ１（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．、フレモント、ＣＡ）をそれぞれ用いて同定した。特異性を検証するため、１０倍過剰なペプチド抗原または非免疫ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を前吸収させた一次抗体と共に切片をインキュベートした。一次抗体結合後、切片をＴＢＳＴで洗浄し、次いでビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。シグナルを、メーカーのプロトコル（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従って、Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ法および３，３’−ジアミノベンジジンクロモゲンにより増幅した。切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ  ６０（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、リバーデール、ＮＪ）でマウントした。免疫蛍光は、以下のことを除き、光学顕微鏡法の免疫染色と同様にして行った：組織をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、トーランス、ＣＡ）において凍結し、切片を２％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ウェストグローブ、ＰＡ）で遮断し、２５℃で３０分間ＣＹ−３コンジュゲート抗体またはＦＩＴＣコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を用いて一次抗体結合を検出し、切片をＨｏｅｃｈｓｔ色素３３４３２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ）で対比染色したこと。切片を、デジタル顕微鏡写真システム（Ｏｐｔｒ��ｎｉｘ  ＣＣＤ  ＣａｍｅｒａおよびＭＡｇｎａｆｉｒｅ  ｖ２ソフトウェア）にインターフェイスした光学または免疫蛍光顕微鏡（オリンパスモデルＢＸ−５１）で撮像した。先に報告されているように（Ｗａｌｔｅｒら（２００１年）；Ｗａｌｔｅｒら（２００２年）；Ｓａｍｐａｔｈら（１９９９年））、パブリックドメインＮＩＨ画像プログラム（米国立衛生研究所で開発され、インターネット上のｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅで入手可能）を用いマッキントッシュコンピュータで行った分析により、レポーターを、基底膜１ｍｍあたりの肺気道の繊毛細胞を計数して定量化した。共焦点顕微鏡法を、ＬＳＭ−５１０ソフトウェアを備えたツァイスレーザースキャニングシステム（ツァイス、ソーンウッド、ＮＹ）を用いて実施した。
【００７２】
ウェスタンブロット分析結果は、抗ＥＧＦＲおよび抗ホスホ−ＥＧＦＲ抗体が、気道組織試料の受容体を特異的に認識することを示した（データ示さず）。抗ＥＧＦＲ抗体による気道組織の免疫染色結果は、ＥＧＦＲ発現は、主に繊毛上皮細胞の頂端膜に局在化するが、他の細胞種（例えば、基底細胞および気道平滑筋細胞）も弱く免疫染色されることを示した（図１）。ＳｅＶ感染マウス対ＳｅＶ−ＵＶを接種した対照マウス間の、抗ＥＧＦＲ免疫染色のパターンまたはレベルに有意差は観察されなかった。反対に、ホスホ−ＥＧＦＲに対する免疫染色（リン酸化Ｔｙｒ８４５を認識する抗ホスホ−ＥＧＦＲ抗体を用いる）は、活性化したＥＧＦＲのレベルは、未接種またはＳｅＶ−ＵＶ接種対照マウスと比べて、ＳｅＶ接種後約２１日目に持続的に増加したことを示した。ＥＧＦＲ発現パターンと同様に、ホスホ−ＥＧＦＲも、主に繊毛上皮細胞の頂端表面に局在化したが、この場合、頂端細胞染色には、この同じ繊毛細胞集団における対応する核染色が伴った（図１）。他の細胞種（例えば、基底細胞）も、核および細胞質の部位で弱く免疫染色された。これらの所見は、活性化ＥＧＦＲの核転座に関する報告と一致する（Ｌｉｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：８０２〜８０８頁）。免疫染色のこのパターンは、ＥＧＦＲ一次抗体が、主に非リン酸化受容体を認識することを示した。両抗体において、免疫染色は、対応する抗原による前吸収により完全に消失した。さらに、正常なウサギＩｇＧを、アイソタイプ陰性対照として使用し、これはバックグラウンドを超える有意なシグナルを示さなかった。レーザー走査型共焦点顕微鏡により検出された二重標識および免疫蛍光結果から、マウス気道において、ＥＧＦＲが繊毛上皮細胞に対するマーカー（すなわち、β−チューブリン）と共局在化するが、クララ細胞に対するマーカー（すなわち、ＣＣＳＰ）または杯細胞に対するマーカー（すなわち、ＭＵＣＡ５ＡＣ）とでは共局在化しないことが示された（図２）。これは、主に繊毛上皮細胞にＥＧＦＲ発現が局在化したことと一致する。
【００７３】
マウスで見られたＥＧＦＲ免疫染色のパターンは、ヒト被験者のものと類似していた。特に、正常および喘息被験者においても、ＥＧＦＲ発現は繊毛上皮細胞の頂端細胞膜に局在化し、ホスホ−ＥＧＦＲは同様に杯細胞化生を示す喘息被験者において増加した（図２９）。ホスホ−ＥＧＦＲ発現は、同様に繊毛上皮細胞の頂端部分に局在化しており、その発現には同じ繊毛細胞における対応する核染色が伴った。正常および喘息被験者の双方において、基底細胞にも弱くはあるがさらなるホスホ−ＥＧＦＲ免疫染色が現れた。
【００７４】
実施例２：繊毛上皮細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達の機能的役割
繊毛上皮細胞での持続性ＥＧＦＲシグナル伝達の機能的役割を明確にするため、肺切片を、繊毛上皮細胞、クララ細胞、および杯細胞に対するマーカーで免疫染色した。組織の調製および免疫染色は、上述のように行った。
【００７５】
気道上皮で見られる細胞種の定量分析から、Ｓｅｖ−ＵＶを接種した対照マウスと比べて、Ｓｅｖ感染マウスでは、接種後２１日目に繊毛および杯細胞が増加すると同時にクララ細胞が減少した（ただし１２日目まではそうでなかった）ことが示された（図３〜４）。次に、観察された上皮構造のこれらの変化にＥＧＦＲシグナル伝達が関与しているどうかを判定した。マウスに感染後１０日目から２１日目まで毎日、不可逆ＥＧＦＲ阻害剤ＥＫＢ−５６９を経口投与して処置すると、感染後２１日目にマウス肺全体でＡｋｔ活性化の完全阻害が達成され（図３０）、これは、ＥＧＦＲ生存促進（pro-survival）シグナル伝達がこれらの条件下で効果的に遮断されたことを示している。これらの試験では、インビトロで気道上皮細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達を選択的に阻害する新たな不可逆ＥＧＦＲ阻害剤（ＥＫＢ−５６９）を使用した（図３０）。インビボでの遮断を実現するため、（ウイルス除去または上皮修復を妨害しないように）接種後１０日目から２１日目（リモデリング反応が発生）まで、ＥＫＢ−５６９を毎日経口投与した。これらの処置条件下、ＥＫＢ−５６９は、インビボでもＥＧＦＲシグナル伝達を遮断した（図３０）。
【００７６】
ＥＧＦＲ阻害剤による処置は、上皮リモデリングの３つの側面全てを修正するのに役立つことも観察された。具体的には、繊毛細胞増加およびクララ細胞減少の完全な遮断、ならびに杯細胞化生の部分的だが有意な阻害が観察された（図６）。ＥＫＢ−５６９処置は、気道上皮細胞の合計数に影響せず（サイトケラチン染色細胞は、接種後２１日目のビヒクル処置後に基底膜ｍｍあたり１３３±３、薬剤処置後で１３７±５であった）、他の上皮細胞（例えば、基底およびクララ細胞）集団における代償性変化と矛盾しなかった。同じ繊毛細胞集団におけるＥＧＦＲとβ−チューブリン発現の共局在化を示す免疫組織化学データに基づき、ＥＧＦＲ遮断が、繊毛細胞過形成に影響する可能性があることは予想された。しかし、クララ細胞または杯細胞のいずれかにおいて活性化ＥＧＦＲ発現が相対的に欠如することからは、ＥＧＦＲシグナル中断がこれらの細胞種のレベルに与える影響は予想できなかった。
【００７７】
慢性上皮リモデリングにおけるＥＧＦＲの役割の根底にあるメカニズムをより理解するため、さらなる実験をデザインした。上皮過形成は、増殖が増加するか、または細胞死が減少した結果のどちらかでありえた。このため、上皮リモデリングが起こっているマウスにおける増殖の増加の証拠を探した。先に述べた通り、一過性の上皮増殖（ＢｒｄＵ標識によりマークされている）が感染後５〜１２日の間に見られる（図５Ａおよび６；（Ｌｏｏｋら（２００１年）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９、２０５５〜２０６９頁））。Ｋｉ−６７およびＰＣＮＡ増殖マーカーにおいても同じパターンの免疫染色が見られた（データ示さず）。この増殖反応により、ウイルス複製を受けて、直接的な細胞変性作用および免疫媒介細胞死を被った宿主細胞の置換が可能になると考えられる（Ｔｙｎｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら（２００６年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：３０９〜３２１頁）。驚くことではないが、この修復段階には、上皮細胞（一般に基底細胞）および上皮下（恐らく免疫）細胞におけるＥＧＦＲ活性化が伴う（図５Ｂ）。しかし、接種後２１日目までには、細胞増殖は未接種対照マウスと変わりがなかったため、持続的増殖反応の証拠はもはや見られなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。さらに、この置換段階（基底細胞コンパートメントでのＢｒｄＵ取り込みおよびＥＧＦＲ活性化によりマークされる）は、長期上皮リモデリングを発生しないマウス（Ｂａｌｂｃ／Ｊ）株においても同じであった（図５Ａ〜５Ｃ、６、および７）。故に、この一過性の増殖反応は、遺伝的感受性の強い（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ）マウスでのみ見られた、続く長期リモデリングを説明することができなかった。さらに、持続的な上皮増殖反応がないということは、繊毛細胞過形成が、上皮細胞のこのサブ集団における細胞死の抑制に基づく、ＥＧＦＲ依存性の細胞生存の選択的な増加を反映している可能性があることを示唆している。
【００７８】
実施例３：培養下のＥＧＦＲシグナル伝達および繊毛細胞生存
ＥＧＦＲが、必要な生存シグナルを繊毛上皮細胞に提供するのかどうかを判定するために、マクロファージクリアランス（macrophage clearance）がアポトーシス細胞の検出を不明瞭にせず、シグナル伝達事象がより明確になるような条件で、組織培養においてＥＧＦＲ遮断を分析した。初期実験は、インビボで見られるのと同じように、培養下においてＥＧＦＲが繊毛上皮細胞に局在化するかどうかの判定を目的とした。マウス気管から回収した気道上皮細胞の気液界面培養物を用いて上皮系をインビトロで再構成した。この系では、繊毛（β−チューブリン陽性）細胞は、全細胞集団の４５±１％に相当し、これは、正常なマウス気道と類似のレベル（上気道では３６％）であり、また先に報告されているマウス気管標本値と類似のレベルであった（Ｐａｃｋら（１９８０年）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２０８、６５〜８４頁）。インビボでの場合と同様、培養下の繊毛上皮細胞は、頂端細胞膜に沿ってＥＧＦＲおよびホスホ−ＥＧＦＲの構成的発現を示し、ホスホ−ＥＧＦＲは、リガンドによる活性化後、この部位および核部位で見られた（図５、データ示さず）。他の研究者は、ＥＧＦＲが培養気道上皮細胞の側底細胞膜にも局在化しうることを報告している（Ｖｅｒｍｅｅｒら（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ  ４２２、３２２〜３２６頁）が、いずれの違いも、培養条件、異なる抗体による認識に影響する受容体不均一性、または頂端局在と側底局在の比率に関係する受容体の存在比に起因しうる（Ｋｕｗａｄａら（１９９８年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５、Ｃ１４１９〜Ｃ１４２８頁）。
【００７９】
次に、選択的阻害剤による処理により、繊毛上皮細胞の成長および生存におけるＥＧＦＲシグナル伝達の役割を明確にした。阻害剤の特異性を検証する初期実験では、先ず完全培地から取り出し、次いでＥＧＦＲ依存性シグナルを最大にするためＥＧＦで刺激した培養物を使用した。これらの条件下、ＰＤ１５３０３５によるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害は、全ての下流シグナルを遮断し、一方、ＬＹ２９４００２によるＰＩ３Ｋ阻害は、Ａｋｔのリン酸化を遮断し、ＰＤ９８０５９によるＭＥＫ１／２阻害は、ＥＲＫ１／２のリン酸化を遮断することが見出された（図５および６）。次いで、繊毛細胞生存に対するこれらのＥＧＦＲシグナルの効果を判定した。ＰＤ１５３０３５による処理により、繊毛細胞が用量依存的に消失することが確認され、この消失は結果的な全上皮細胞の減少とは不釣り合いであった（図６および７）。同様の結果が、別のＥＧＦＲ特異的阻害剤ＡＧ１４７８で得られた（データ示さず）。次に、ＥＧＦＲ活性化が幾つかの下流シグナル伝達経路を誘発することを認識しつつ、マウス気管上皮細胞（ｍＴＥＣ）培養物をＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＥＫ１／２阻害剤で処理したところ、ＬＹ２９４００２による処理のみが、同様の繊毛上皮細胞の消失をもたらすことが見出された（図１１）。この培養系は、高密度では有意な細胞増殖を示さないことから、繊毛上皮細胞の消失は、細胞生存の減少が原因であった可能性が高いようである。
【００８０】
次に、ＥＧＦＲシグナル伝達の遮断が、アポトーシスレベルに調和した変化をもたらすかどうかをテストした。繊毛上皮細胞の消失と並行して、カスパーゼ３およびＴＵＮＥＬ陽性細胞の急速な活性化（６時間以内）が、細胞消失と同じパターンで、すなわち、ＭＥＫ１／２ではなくＥＧＦＲまたはＰＩ３Ｋシグナル伝達が遮断された場合と同じパターンで観察された（図８）。この状況において、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、アポトーシスが進行中であった。なぜなら、この過程は、カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる処理で遮断され（図９）、カスパーゼ３およびカスパーゼ９切断／活性化（図１０）ならびにミトコンドリア膜電位の消失（図１１）を伴っていたためである。したがって、これらの結果は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路が、ミトコンドリア機能不全およびその結果のプログラム細胞死を阻害する下流因子への選択的ＰＩ３Ｋシグナル伝達を介して繊毛細胞アポトーシスに対する防御を行うことを明確に表している。これらの所見は、ＥＧＦＲ、および他の環境下で細胞死を阻止するＥＲＫ１／２への他の受容体シグナルに関する報告（Ｔｙｎｅｒら（２００５年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１１８０〜１１８７頁；Ｍｏｎｉｃｋら（２００５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２１４７〜２１５８頁；Ｒｏｕｘら（２００４年）Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：３２０〜３４４頁）とは幾分対照をなしている。
【００８１】
実施例４：インビトロおよびインビボでのＥＧＦＲシグナル伝達および杯細胞化生
上述の通り、繊毛細胞に対するＥＧＦＲシグナル伝達の作用は、インビボでの杯細胞化生に対するＥＧＦＲ遮断の影響を容易に説明するものではなかった。繊毛細胞での選択的ＥＧＦＲ発現およびその結果の生存機能は、繊毛細胞過形成の阻害を説明するものの、杯細胞化生の遮断を直接説明するものではない。こうして、ＥＧＦＲが、杯細胞生存に対する同様の機能効果を依然として有しうるかどうかが問題となった。この可能性をテストするため、ウイルス感染後の杯細胞化生のＩＬ−１３依存性を明確にした付随試験を利用した（未発表所見、ＥＹ  ＫｉｍおよびＭＪ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ）。したがって、このエフェクター経路は、アレルゲン曝露後のムチン産生に関する試験で確立されたものと重複する（Ｇｒｕｎｉｇら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２、２２６１〜２２６３頁；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２、２２５８〜２２６１頁）。さらに、モルモットおよびヒト（Ｌａｏｕｋｉｌｉら（２００１年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１８１７〜１８２４頁；Ｋｏｎｄｏら（２００２年）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：５３６〜５４１頁；Ａｔｈｅｒｔｏｎら（２００３年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５：Ｌ７３０〜Ｌ７３９頁）、ならびにマウス（未発表所見、ＪＤ  ＭｏｒｔｏｎおよびＭＪ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ）から培養した気道上皮細胞において、ＩＬ−１３による処理により、杯細胞形成を刺激できることが認められた。培養マウス気管上皮細胞をＩＬ−１３にて処理し、これに続く杯細胞の発生を、ＭＵＣ５ＡＣ発現によりマークした（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら（２００１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８、５１７５〜５１８０９頁；Ｚｈｏｕら（２００１年）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５、４８６〜４９１頁）。ＴＵＮＥＬ反応の手続きは、ムチン含量を減少させるようなので、カスパーゼ３活性により細胞死を追跡した。繊毛細胞とは対照的に、杯細胞は、ＥＧＦＲ阻害に応じた細胞死亡率の増加を示さないことが分かった（図１２）。ＭＵＣ５ＡＣ陰性集団に対するＭＵＣ５ＡＣ陽性集団における活性カスパーゼ３細胞レベルの定量化において、杯細胞ではＥＧＦＲ遮断の有無にかかわらずアポトーシスレベルが類似していたのに対し、非杯細胞（すなわち、繊毛上皮細胞）ではこれらの処理条件下で有意なカスパーゼ陽性染色を示すことが示された（図５Ｃ）。さらに、非杯細胞死のレベルは、ＩＬ−１３処理の有無にかかわらず類似しており、これは、繊毛細胞における細胞死経路が、杯細胞形成に際しＩＬ−１３依存性の作用に影響されないことを示している。
【００８２】
ＥＧＦＲ遮断が、インビトロでの杯細胞生存に影響しなかったことから、インビボでの杯細胞化生に対するＥＧＦＲ遮断の強力な影響は、繊毛細胞過形成のＥＧＦＲ遮断の下流でありうることが推論された。この可能性は、次に、ＩＬ−１３処置が、繊毛細胞および杯細胞の特性を一時的に共有する細胞の発生をもたらすことが見出された際に、支持されるようになった。このように、ｍＴＥＣ培養物の電子顕微鏡観察により、ＩＬ−１３影響下において繊毛が保存され、粘液顆粒が徐々に発生している繊毛−杯細胞のサブセットの証拠が得られた（図１８）。これらの移行細胞は、ＩＬ−１３処置開始後早期（１〜２日）に最も顕著であったのに対し、繊毛のない成熟杯細胞は、処置後後期（５日）に最も多かった。これらの条件下の繊毛−杯細胞の形態学的特徴は、アレルゲン曝露マウスの気道において電子顕微鏡により見出された粘液顆粒含有繊毛細胞と類似するようである（Ｈａｙａｓｈｉら（２００４年）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４４４：６６〜７３頁）。
【００８３】
気道上皮培養物は、本来であれば繊毛細胞を産生する環境においてＩＬ−１３処理を利用して杯細胞形成を促す条件下で確立されたため、これらの繊毛−杯細胞は、繊毛細胞から杯細胞表現型へ分化転換するようＩＬ−１３により再命令されているように見えた。同様の分化転換がインビボでも発生する可能性は、ＳｅＶ接種後に杯細胞化生を示すマウスから採取した切片において確認された。共焦点顕微鏡法により、繊毛または杯細胞の大半が、それぞれβ−チューブリンまたはＭＵＣ５ＡＣを発現したのに対し、β−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣの両方を発現する上皮細胞のサブ集団があることが示された（図１９）。同様に、共焦点画像はまた、一般に、繊毛細胞はＥＧＦＲを発現するが杯細胞は発現しないこと、しかし、ＥＧＦＲおよびＭＵＣ５ＡＣの両方を発現する細胞のさらなるサブ集団があることを示した（図２０）。いずれの場合にも、ｚ軸に沿った複数の共焦点セクションおよび三次元再構成を用いて単一細胞内の共局在化を確認した。ＭＵＣ５ＡＣおよびβ−チューブリンおよび／またはＭＵＣ５ＡＣおよびＥＧＦＲを発現するサブ集団は、移行中であるようであった。なぜなら、これらサブ集団は、成熟杯細胞に観察されたような、特徴的な形態および粘膜上皮層のルーメン表面の位置に到達しない場合が多かったためである。さらに、完全に分化した杯細胞では局在化がより頂端部位であったのに対し、これらの移行細胞では、粘液顆粒は、細胞のより基底のコンパートメントに局在化する場合が多かった。この形態学的挙動も、これらの繊毛−杯細胞が、杯細胞前駆体に相当することを示唆する。アレルゲン誘導杯細胞化生に関する先の報告通り、ＣＣＳＰおよびＭＵＣ５ＡＣの共発現を伴う上皮細胞のサブ集団も、繊毛−杯細胞の検出（図２３）に匹敵するレベルで検出された（図２１）。
【００８４】
次の目的は、インビトロで観察されたように、ＩＬ−１３が、繊毛細胞の杯細胞への形成をインビボでも促進するかどうかを確証することであった。これらの実験においては、マウスに輸送された場合にＩＬ−１３作用を特異的に遮断するデコイ受容体として作用する、組換え可溶性ＩＬ−１３受容体α２  Ｆｃ融合タンパク質（ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃと命名）を利用した（Ｇｒｕｎｉｇら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２、２２６１〜２２６３頁；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２、２２５８〜２２６１頁）。治療条件は、ＥＧＦＲ遮断に使用したものに類似するように選択したため、処置は、ウイルス接種後１２日から２１日に延長した。このタイムフレームは、杯細胞化生の発生と呼応したＩＬ−１３、ｍＣＬＣＡ３、およびＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現の誘導とも合致する（図２２）。これらの条件下、本発明者は、ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ処置が、ウイルス誘導杯細胞化生の防止にきわめて有効であることを見出した（図２３）。しかし、ＥＧＦＲ遮断とは幾分対照的に、ｓＩＬ−１３Ｒα２処置により、繊毛細胞過形成レベルのさらなる増加（杯細胞への進展の遮断と一致）およびクララ細胞レベルの無変化（杯細胞形成が、少なくとも一部は、クララ細胞集団ではなく繊毛細胞に由来する可能性と一致）も引き起こされた。他の細胞源（例えば、クララ細胞または基底細胞）も、この状況で杯細胞化生に寄与しうる可能性を完全に除外することはできないが、ＩＬ−１３遮断後の繊毛細胞増加が杯細胞減少とほぼ一致することは、繊毛細胞集団の分化転換が、これらの条件下で杯細胞化生の重要な経路であることを示唆する。実際、ムチン遺伝子のクララ細胞発現に関する過去および現在の証拠と合わせると、本結果は、上皮細胞分化のさらなる可塑性の証拠を明瞭に提供する可能性がある。
【００８５】
最後の２組の実験では、所見をマウスからヒト被験者試験へと再び拡大した。最初の組の実験では、気道において著しく増加した杯細胞レベルを示し、肺移植時に分析用に十分な肺組織が得られる、ＣＯＰＤ患者由来の気道組織を分析した。マウスモデルに関する免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法と同じ免疫染色プロトコルを適用すると、ＣＯＰＤ患者由来の肺外植片切片も、気道上皮細胞サブセットにおいてβ−チューブリン−ＭＵＣ５ＡＣ共発現の証拠を示すことが見出された（図２５）。ヒト（またはマウス）気道におけるβ−チューブリンの管腔染色は、検出されなかった。これは、繊毛が、エンドソームの脱落（shedding）ではなく分解(degradation)により加工されうるという提案と一致する。先に報告されているように（Ｂｏｅｒｓら（１９９９年）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５９）、上皮細胞サブセットにおいてＣＣＳＰ−ＭＵＣ５ＡＣ共発現も見出された。２組目の実験では、マウス試験に使用した戦略を再び適用し、ヒト気道上皮細胞の挙動を、ＩＬ−１３を含むまたは含まない気液界面培養条件で分析した。この場合、ＣＯＰＤ患者から培養した気道上皮細胞は、ＩＬ−１３の影響下でβ−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣを共発現する細胞サブセットの発生をもたらした。先に報告されているように、β−チューブリンは、繊毛細胞の基底小体内に局在化するため（Ｙｏｕら（２００４年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８６：Ｌ６５０〜６５７頁）、粘液顆粒に見られるＭＵＣ５ＡＣとのより緊密な共局在化が生じる。本来健康な肺移植ドナーから培養した気道上皮細胞において、ＩＬ−１３処理の初日でさえＩＬ−１３に応答して、同じパターンの繊毛細胞および杯細胞マーカーのＩＬ−１３誘導性共発現が見られた（図２７）。マウスおよびヒト組織試験とも同様に、複数の共焦点画像をｚ軸に沿って調べ、三次元再構成を行うと、単一細胞内での繊毛細胞および杯細胞マーカーの共局在化が証明された。このように、ヒト被験者で経験したＥＧＦＲ活性化と同様に、マウスモデルで見られた杯細胞化生の下流メカニズム、すなわち、ＩＬ−１３に誘導された繊毛細胞から杯細胞への分化転換に対応するものが分泌過多ヒト疾患に存するようであることが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆは、ＳｅＶまたは当量のＵＶ不活化ＳｅＶ（ＳｅＶ−ＵＶ）接種後２１日目に採取し、次いでＥＧＦＲおよびホスホ−ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）ならびに５０倍の抗原過剰による競合について免疫染色した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来気道切片の代表的な顕微鏡写真である。バー＝２０μｍ。方法は、実施例１にさらに記載している。
【００８７】
【図２】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、および２Ｉは、ＳｅＶ接種後２１日目にマウスから採取し、次いでＥＧＦＲ、β−チューブリン、ＣＣＳＰ、およびＭＵＣ５ＡＣ単独および組み合わせについて免疫蛍光染色した、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。一次抗ＥＧＦＲ  Ａｂ結合を抗ＣＹ３  Ａｂ（赤色蛍光）により検出し、他は抗ＦＩＴＣ  Ａｂ（緑色蛍光）により検出した。バー＝２０μｍ。方法は、実施例１にさらに記載している。
【００８８】
【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、ＳｅＶまたはＳｅＶ−ＵＶ接種後２１日目に採取し、次いでβ−チューブリン−ＩＶ（緑色蛍光）およびＣＣＳＰ（赤色蛍光）についてヘマトキシリン／エオシン染色、免疫蛍光染色し、ならびにＭＵＣ５ＡＣについて免疫染色した、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。非免疫ＩｇＧによる免疫染色では、バックグラウンドを超えるシグナルは得られなかった（データ示さず）。バー＝２０μｍ。方法は、実施例２にさらに記載している。
【００８９】
【図４】図４Ａ、および４Ｂは、図３の条件に加えて、Ｓｅｖ接種後未処理条件の１２日目、およびＳｅｖ接種後１０〜２１日目の間ＥＫＢ−５６９により処理した条件の１２日目についての、対応する定量データを示す棒グラフである。値は平均±ＳＥＭを表し、ＳｅＶ−ＵＶ対照との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例２にさらに記載している。
【００９０】
【図５Ａ】図５Ａは、ＳｅＶ接種後示した日にＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＢａｌｂ／ｃＪマウスから採取し、次いでＢｒｄＵ（図５Ａ）について免疫染色した、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。バー＝２０μｍ。方法は、実施例２および３にさらに記載している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＳｅＶ接種後示した日にＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＢａｌｂ／ｃＪマウスから採取し、次いでホスホ−ＥＧＦＲ（図５Ｂ）について免疫染色した、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。バー＝２０μｍ。方法は、実施例２および３にさらに記載している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＳｅＶ接種後示した日にＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＢａｌｂ／ｃＪマウスから採取し、次いでＭＵＣ５ＡＣ（図５Ｃ）について免疫染色した、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。バー＝２０μｍ。方法は、実施例２および３にさらに記載している。
【００９１】
【図６】図６は、図５Ａの条件に対応する定量データを示す棒グラフである。値は平均±ＳＥＭを表し、０日目との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例２および３にさらに記載している。
【００９２】
【図７】図７は、ＳｅＶまたはＳｅＶ−ＵＶ接種後２１日目にＢａｌｂ／ｃＪマウスから採取し、次いでβ−チューブリン、ＣＣＳＰ、およびＭＵＣ５ＡＣについて免疫染色した、気道切片についての対応する定量的形態計測を示す棒グラフである。値は平均±ＳＥＭを表し、ＳｅＶ−ＵＶ対照との有意差は（＊）で示されている。バー＝２０μｍ。方法は、実施例２および３にさらに記載している。
【００９３】
【図８】図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、気液界面条件下に１０日間置いた後、ＥＧＦＲについて免疫染色した（上）、または二重免疫蛍光した後β−チューブリンおよびＥＧＦＲまたはｐ−ＥＧＦＲについて共焦点顕微鏡法を行った気道上皮細胞（ｍＴＥＣ）培養物の代表的な顕微鏡写真である。方法は、実施例２にさらに記載している。
【００９４】
【図９】図９は、基礎培地に１日間置き、次いで阻害剤を併用してまたは併用せずにＥＧＦ（１または１０ｎｇ／ｍｌ）により１０分間処理したｍＴＥＣ培養物のウェスタンブロット分析の画像である。各阻害剤は最大有効濃度にて下部チャンバーおよび上部チャンバーに添加してそれぞれ６時間および２．５時間おき、その後両チャンバーにＥＧＦを添加した。各条件については、抗ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲ、ホスホ−Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）、またはホスホ−ＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）Ａｂを含む細胞溶解物、および増強化学発光による検出とした。方法は、実施例２にさらに記載している。
【００９５】
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、および１０Ｄは、ビヒクルまたはＰＤ１５３０３５（０．３μＭ）で７日間、３７℃にて処理し、次いでβ−チューブリンおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３４３２について免疫蛍光染色したｍＴＥＣ培養物の代表的な顕微鏡写真である。バー＝２０μｍ。方法は、実施例２にさらに記載している。
【００９６】
【図１１】図１１は、示した用量で７日間、ＰＤ１５３０３５、ＬＹ２９４００２、およびＰＤ９８０５９による処理を行ったおよび行わなかった、β−チューブリン染色細胞の定量分析（全Ｈｏｅｃｈｓｔ染色細胞に対する割合（％）として表示）を示す一連の棒グラフである。有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例２にさらに記載している。
【００９７】
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅ、１２Ｆ、１２Ｇ、および１２Ｈは、ビヒクル、ＰＤ１５３０３５（０．３μＭ）、ＬＹ２９４００２（５０μＭ）、およびＰＤ９８０５９（５０μＭ）で３日間、３７℃にて処理し、次いで活性カスパーゼ３（Ａｃｔ−Ｃ−３）の切断断片またはＴＵＮＥＬ反応について免疫蛍光染色したｍＴＥＣ培養物の代表的な顕微鏡写真である。バー＝２０μｍ。方法は、実施例３にさらに記載している。
【００９８】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、図１２の処理条件に加え、ＰＤ１５３０５プラスｚＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）を用いた、活性カスパーゼ３染色細胞についての図１２の定量分析（全Ｈｏｅｃｈｓｔ染色細胞の割合（％）として表示）を示す棒グラフである。値は平均±ＳＥＭを表し、ビヒクル単独との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例３にさらに記載している。
【００９９】
【図１４】図１４は、図１２の処理条件を用いた、ｍＴＥＣ培養物からの細胞溶解物における活性カスパーゼ３（Ａｃｔ−Ｃ−３）および活性カスパーゼ９（Ａｃｔ−Ｃ−９）の免疫ブロット分析の画像である。抗カスパーゼ９抗体は、活性カスパーゼ９（Ａｃｔ−Ｃ−９）の前駆細胞（Ｃ−９）および切断断片を認識する。方法は、実施例３にさらに記載している。
【０１００】
【図１５】図１５は、図１２の処理条件を用いた、ｍＴＥＣ培養物のＪＣ−１染色のフローサイトメトリー分析を示す棒グラフである。値は、ＦＬ２からＦＬ１へのシフトにより検出された、減少したミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を有する細胞の割合（％）を表す。値は平均±ＳＥＭを表し、ビヒクル単独との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例３にさらに記載している。
【０１０１】
【図１６】図１６は、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ、５日間）により処理し、または処理せず、およびその後ＰＤ１５３０３５（０．３μＭ、３日間）により処理し、または処理せず、ＭＵＣ５ＡＣ（赤）および活性カスパーゼ３（緑）について免疫蛍光染色し、ならびにＨｏｅｃｈｓｔ色素（青）で対比染色した、ｍＴＥＣ培養物の代表的な顕微鏡写真である。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０２】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、図１６に対応する定量データを示す棒グラフである。値は、活性カスパーゼ３陽性杯細胞（ＭＵＣ５ＡＣ＋活性カスパーゼ３＋／ＭＵＣ５ＡＣ＋細胞）および杯細胞以外の陽性細胞（全ＴＵＮＥＬ染色細胞／全Ｈｏｅｃｈｓｔ染色細胞）の割合（％）についての平均±ＳＥＭを表す。ビヒクル対照との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０３】
【図１８Ａ】図１８Ａは、未処理の（図１８Ａ）培養ｍＴＥＣの代表的な透過電子顕微鏡写真である。方法は、実施例４にさらに記載している。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ、３７℃で２日間）による処理後の（図１８Ｂ〜１８Ｄ）培養ｍＴＥＣの代表的な透過電子顕微鏡写真である。初期繊毛−杯細胞は、少量の粘液顆粒も含有する細胞表面に見られる繊毛により同定した（図１８Ｂ）。方法は、実施例４にさらに記載している。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ、３７℃で２日間）による処理後の（図１８Ｂ〜１８Ｄ）培養ｍＴＥＣの代表的な透過電子顕微鏡写真である。後期繊毛−杯細胞は、細胞質中に多数の粘液顆粒を示す（図１８Ｃ）。方法は、実施例４にさらに記載している。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ、３７℃で２日間）による処理後の（図１８Ｂ〜１８Ｄ）培養ｍＴＥＣの代表的な透過電子顕微鏡写真である。成熟杯細胞は、繊毛がなく特徴的な粘液顆粒を含有する（図１８Ｄ）。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０４】
【図１９】図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃは、ＳｅＶ接種後２１日目にマウスから採取し、β−チューブリン（緑）およびＭＵＣ５ＡＣ（赤）について共焦点免疫顕微鏡法を行った、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。矢印は、β−チューブリンが染色された繊毛細胞（ｃ）、ＭＵＣ５ＡＣが染色された杯細胞（ｇ）、ならびにβ−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣ両方が染色された細胞（ｃｇ）を示す。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０５】
【図２０】図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃは、図１９の通りに採取したが、ｐ−ＥＧＦＲ（赤）およびＭＵＣ５ＡＣ（緑）について免疫染色した、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。矢印は、ｐ−ＥＧＦＲが染色された繊毛細胞（ｃ）、ＭＵＣ５ＡＣが染色された杯細胞（ｇ）、ならびにｐ−ＥＧＦＲおよびＭＵＣ５ＡＣ両方（ｃｇ）が染色された細胞を示す。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０６】
【図２１】図２１Ａ、２１Ｂ、および２１Ｃは、図１９の通りに採取したが、ＣＣＳＰ（緑）およびＭＵＣ５ＡＣ（赤）について免疫染色した、気道切片の代表的な顕微鏡写真である。矢印は、ＣＣＳＰ（ｃｃ）またはＣＣＳＰおよびＭＵＣ５ＡＣ両方（ｃｃｇ）が染色された細胞を示す。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０７】
【図２２】図２２は、ＣＣＳＰまたはβ−チューブリンについても免疫染色したＭＵＣ５ＡＣ発現細胞の定量分析を示す棒グラフである。値は平均±ＳＥＭを表し、対応するＳｅＶ−ＵＶ対照との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０８】
【図２３】図２３Ａ、２３Ｂ、および２３Ｃは、ＳｅＶ接種後の示した期間における、ＧＡＰＤＨ対照レベルに対して補正した、肺ＩＬ−１３（図２３Ａ）、ｍＣＬＣＡ３（図２３Ｂ）、およびＭＵＣ５ＡＣ（図２３Ｃ）ｍＲＮＡレベルについてのリアルタイムＰＣＲ結果を示す棒グラフである。値は平均±ＳＥＭを表し、対応するＳｅＶ−ＵＶ対照との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１０９】
【図２４】図２４は、ＳｅＶに感染させ、接種後１２、１４、１７、および２０日目からｓＩＬ−１３受容体アンタゴニスト（ｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ）または対照ＩｇＧにより処置したマウスの気道における、β−チューブリン（繊毛細胞）、ＣＣＳＰ（クララ細胞）、およびＭＵＣ５ＡＣ（杯細胞）免疫染色の定量分析を示す棒グラフである。バー＝２０μｍ。対応するＩｇＧ処置との有意差は（＊）で示されている。方法は、実施例４にさらに記載している。
【０１１０】
【図２５】図２５Ａ、２５Ｂ、および２５Ｃは、ＣＯＰＤ患者から採取し、β−チューブリン、ＭＵＣ５ＡＣ、もしくはＣＣＳＰについて免疫染色して免疫蛍光顕微鏡で観察した（図２５Ａ）、またはβ−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣ、もしくはＣＣＳＰおよびＭＵＣ５ＡＣについて免疫染色してレーザー共焦点走査型顕微鏡で観察した（それぞれ、図２５Ｂおよび２５Ｃ）肺切片からの代表的な顕微鏡写真である。矢印および囲みは、ＭＵＣ５ＡＣを発現する杯細胞（ｇ）、ＣＣＳＰを発現するクララ細胞（ｃｃ）、β−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣを共発現する繊毛−杯細胞（ｃｉｇ）、またはＣＣＳＰを共発現する杯細胞（ｃｃｇ）を示す。
【０１１１】
【図２６】図２６Ａ、２６Ｂ、および２６Ｃは、ＣＯＰＤ患者から培養し、ＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）で５日間インキュベートし、次いでγ−チューブリン（赤）（図２６Ａ）、ＭＵＣ５ＡＣ（緑）（図２６Ｂ）、ならびにγ−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣ両方（図２６Ｃ）について免疫染色した、ヒト上気道上皮細胞（ｈＬＡＥＣ）の代表的な顕微鏡写真である。矢印は、γ−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣについて免疫染色された細胞を示す。
【０１１２】
【図２７】図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、および２７Ｄは、対照（非ＣＯＰＤ）被験者から培養し、ＩＬ−１３で１日間インキュベートし、図２６の通りに免疫染色し、次いでレーザー共焦点走査型顕微鏡でｘ−ｙ軸（図２７Ａ）およびｚ軸（図２７Ｂ〜２７Ｄ）において観察した、ｈＬＡＥＣの代表的な顕微鏡写真である。矢印は、γ−チューブリンおよびＭＵＣ５ＡＣ両方について免疫染色された細胞を示す。
【０１１３】
【図２８】図２８は、上皮宿主反応およびリモデリングを制御する、ウイルス誘導性ＥＧＦＲおよびＩＬ−１３依存性経路の仕組みを示す概略図である。
【図２９】図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ、および２９Ｄは、健康な対照および喘息被験者から採取した気管支内生検切片からの代表的な顕微鏡写真である。切片は、図１および図２と同じ方法を用いて、ＥＧＦＲおよびホスホ−ＥＧＦＲについて免疫染色した。バー＝２０μｍ。方法は、実施例２にさらに記載している。
【図３０】図３０Ａおよび３０Ｂは、インビトロ（図３０Ａ）およびインビボ（図３０Ｂ）でのＥＫＢ−５６９処置の効果を示すウェスタンブロット分析の画像である。図３０Ａは、気液界面条件下で培養し、ＥＫＢ−５６９（１μＭ、３７℃で１０分間）の存在下または非存在下、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）と共にもしくは無しで、またはＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ）と共にもしくは無しでインキュベートし、示した抗体でブロットしたヒト気管気管支上皮細胞（ｈＴＥＣ）の細胞溶解物のウェスタンブロット画像である。図３０Ｂは、ＳｅＶまたはＳｅＶ−ＵＶを接種し、接種後１０〜２１日目にＥＫＢ−５６９で処置したまたは処置しなかった、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの肺溶解物のウェスタンブロット画像である。ブロッティングは示した抗体を用いて行った。方法は、実施例１および２にさらに記載している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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