(57)【要約】これは、血液脳関門（ＢＢＢ）の制御に関わる細胞表面タンパク質（とりわけ、ＮｇＲ２）の発見に関連する。さらに、本発明は、ＢＢＢの透過性をモジュレートする薬剤を同定するための方法に関連する。さらに、本発明は、ＢＢＢの透過性を増大させることによって中枢神経系に治療剤を送達する方法に関連する。本発明は、候補薬剤がＢＢＢの透過性をモジュレートし得るか否かを評価する方法をさらに提供する。ＮｇＲＨ１における遺伝的改変を含む非ヒトトランスジェニック動物もまた、本発明において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に薬剤を投与する工程を包含する血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性をモジュレートする方法であって、該薬剤が、脳に存在するヒトＮｏｇｏレセプター２（ＮｇＲ２）を標的とする、方法。
【請求項２】
被験体の血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性をモジュレートする方法であって、ＮｇＲ２のリガンドを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
前記薬剤が、ＢＢＢの透過性を増大させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が、ＢＢＢの透過性を減少させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記モジュレートする工程は、可逆的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤は、無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、および外部ガイド配列からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
治療剤を被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法であって、ＮｇＲ２の活性および／または発現レベルをモジュレートする結果としてＢＢＢの透過性を増大させることの前、それと同時、またはその後に該治療剤を該ＣＮＳに投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
前記ＮｇＲ２は、ヒトＮｇＲ２である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＮｇＲＨｌ細胞表面タンパク質の活性および／または発現レベルをモジュレートする工程は、ＮｇＲ２を標的とする外因性薬剤によって達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤は、無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、および外部ガイド配列からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＢＢの透過性の増大は、一過性である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤は、ＮｇＲ２のリガンドである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
候補薬剤がＢＢＢの透過性をモジュレートするか否かを評価する方法であって：
ａ．被験体の中枢神経系を該ＢＢＢの透過性のインジケーターに曝露する工程；
ｂ．該被験体にＮｇＲ２を標的とする該候補薬剤を投与する工程であって、ＢＢＢの透過性の増大または減少は、該候補薬剤がＢＢＢの透過性をモジュレートし得ることを示す工程；
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記薬剤は、ＮｇＲ２のアゴニストである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤は、ＮｇＲ２のアンタゴニストである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＮｇＲ２は、ヒトＮｇＲ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、および外部ガイド配列からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体は、ＮｇＲ２欠損であるトランスジェニック動物である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦支援研究）
本願における研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮＩＨ１  ＲＯ１  ＮＳ０４５６２１−０１による１つ以上の助成金によって部分的に資金提供された。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
（相互参照）
本願は、２００６年５月２４日出願の米国仮特許出願第６０／８０８，３２３号（これはその全体が本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
複雑な神経系を有する全ての生物は、血液からＣＮＳを分離する血液脳関門（ＢＢＢ）を有する。この関門は、脳のホメオスタシスを維持するため、ならびに毒性分子、病原生物および身体が有する免疫系の脳への進入を妨げるために重要である。ＢＢＢがいかにして調節されるかを理解することは、広範な種々の神経学的疾患の処置を理解および開発するために意味を有する。
【０００４】
浮腫、脳外傷、卒中および多発性硬化症に罹患する患者は、一次発作の部位に近いＢＢＢの崩壊を示す。崩壊のレベルは、これらの疾患の臨床成績に対して顕著な効果を有し得る。例えば、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患する患者におけるＢＢＢの崩壊の程度は、疾患の重篤度に相関する。人がＭＳの「攻撃」を受ける場合に、血液脳関門が脳または脊髄の切片において破壊され、Ｔリンパ球と称される白血球にミエリンを乗り越え、そしてミエリンを破壊させることが、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を使用して示されている。
【０００５】
ＢＢＢはまた、脳への薬物の送達を阻害することによって全てのＣＮＳ疾患の処置に対する障害となる。多くのＣＮＳ障害またはＣＮＳ状態の処置に対する主要な挑戦は、脳の特定の領域に治療剤を送達する困難性を克服することである。その神経保護的役割において、血液脳関門は、多くの潜在的に重要な診断剤および治療剤の脳への送達を妨げるように機能する。別な方法で診断または治療において有効であり得る治療用分子および治療用遺伝子は、適切な量ではＢＢＢを通らない。例えば、化学療法は、非ＣＮＳの全身的位置におけるこれらの腫瘍の臨床的退縮およびさらに完全な寛解にかかわらず、全身性の癌（乳癌、小細胞肺癌、リンパ腫、および胚細胞性腫瘍）のＣＮＳ転移の処置において比較的無効である。多くの現在利用可能な化学療法剤は、ＢＢＢを透過可能な分子の代表的なカットオフサイズよりも大きい分子量を有するか、あるいはＢＢＢの透過性に不適合性の水溶性または脂溶性を示す。
【０００６】
ＢＢＢは、それが固有に区別する構造的特徴を有するので末梢組織の内皮と区別され得る。大脳毛細血管の内皮細胞は、隣接する内皮細胞間における細胞間の接触を封着させて連続する血管を形成する密着結合を含む。ＢＢＢ内皮細胞間の密着結合は、他の組織における３〜３３Ω・ｃｍ２と比較して１５００〜２０００Ω・ｃｍ２（軟膜脈管）の範囲の高い内皮電気抵抗をもたらす。非軟膜器官のインビボでの大脳微小脈管内皮細胞にわたる電気抵抗は、８０００Ω・ｃｍ２と同程度に高いと推定されている。この高い抵抗の正味の結果は、低い傍細胞透過性である。ＢＢＢのさらなる構造的特徴は、内皮周囲の付属構造（例えば、周皮細胞、星状細胞、および基底膜）を含む。ＢＢＢの内皮細胞は、その脈管に沿って分布し、そして管腔を完全に取り囲む。薄い基底膜（即ち、基底層）は、内皮の管腔から離れた表面を支持する。上記基底層は、内皮細胞および周皮細胞；Ｖｉｒｃｈｏｗ−Ｒｏｂｉｎ間隙として公知である領域を囲む。星状細胞は、代表的に、基底層を共有する星状細胞の末端（ｅｎｄ  ｆｅｅｔ）で内皮細胞に隣接して位置する。
【０００７】
証拠は、毛細血管内皮内におけるＢＢＢの生理学的特徴が遺伝子の特有のセットおよび／またはおそらく周囲の組織からの補因子の発現に関連することを示唆する。重要な移植研究は、これらの特性が内皮細胞に対して内因性とは限らないことを示している。脳内皮細胞によって脈管新生された腸組織は、漏出性の脈管を生成するが、腸内皮細胞によって脈管新生された脳組織は、ＢＢＢの不透過性の脈管を想起させる。この観察は、神経組織がこの重大な関門の形成を調節するという提案をもたらしている。多くの研究は、これらのグリア細胞が脈管を収納するプロセスを発するという事実に起因して、ＢＢＢを調節することにおける星状細胞の役割に集中している。星状細胞の正確な役割は、議論の余地があるが、いくつかの実験は、これらの細胞がＢＢＢを調節する必須の役割を果たすことを示唆する。精製された星状細胞の移植は、ニワトリ絨毛尿膜およびラットの眼の前眼房における脈管の透過性を減少させるために十分であった。さらに、インビトロでの星状細胞と精製された内皮細胞との同時培養は、内皮単層の電気抵抗を上昇させる。しかし、他の研究は、ＢＢＢが損傷後の星状細胞による収納前に再編成することを示唆する。
【０００８】
以前に特徴づけられていないラット脳抗原のうちの１つは、市販の抗体（ＳＭＩ７１）によって認識される内皮脳抗原（ＥＢＡ）である。ＥＢＡは、視神経、網膜、虹彩、および脊髄の脈管、ならびに軟膜の脈管に存在することが示されている。しかし、ＥＢＡは、身体器官（例えば、腸、腎臓、肝臓、甲状腺および膵臓）の関門の特性を欠く内皮細胞にはなく、それらは、血液組織関門を有さないか、またはＥＢＡ抗原を発現しない
さらに、１つの研究は、静脈内に注射された抗ＥＢＡ抗体がＥＣに結合する、組織切片において検出可能であり、そしてＢＢＢの破壊をもたらすことを示し、その破壊は、コントロール抗体を投与された動物において観察されなかった（非特許文献１）。ＥＢＡはＢＢＢの透過性を破壊するために標的とされ得るが、記載されている一方で、特定の標的抗原は、同定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｈａｂｒｉｅｌら  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０００；８７８：１２７−３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この関門の重要性にかかわらず、ＢＢＢの完全性および／または透過性を制御する分子機構については、ほとんど知られていない。基礎をなす分子機構の研究は、モデル系、そしておよび、そのＢＢＢの透過性を外部から操作することができる可逆的モデル系の継続する欠如によって妨げられている。したがって、このような研究を促進する組成物および方法、ならびに診断用途および／または治療用途のための組成物および方法に対する必要性が、存在し続ける。本発明は、これらの必要性に取り組み、そして同様に関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明の１つの局面は、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプター（内皮細胞において優勢に発現される抗原）が血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性を調節することに関与することの発見である。したがって、本発明は、薬剤を被験体に投与する工程を包含する、ＢＢＢの透過性をモジュレートする方法を提供し、該薬剤は、脳に存在するヒトＮｇＲＨ１細胞表面レセプターを標的とする。関連するが、しかし別個の実施形態において、ＢＢＢの透過性のモジュレーション方法は、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプタータンパク質のリガンドを該被験体に投与することを含む。１つの局面において、投与される薬剤は、ＢＢＢの透過性を増大させるその能力によって特徴付けられる。このようなモジュレーションは、好ましくは、ＣＮＳに対する永久的損傷を回避するために可逆的または一過性である。１つの局面において、投与される薬剤は、ＢＢＢの透過性を減少させるその能力によって特徴付けられる。ＮｇＲＨ１を介してＢＢＢの透過性をモジュレートするために有用な薬剤の非限定的な例としては、無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、アンチセンス、アプタマー、および外部ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が挙げられる。
【００１２】
本発明はまた、治療剤を被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法を提供する。その方法は、代表的に、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプターの活性および／または発現レベルをモジュレートする結果としてＢＢＢの透過性の増大させることの前、それと同時、またはその後に上記治療剤をＣＮＳに投与する工程を含む。１つの局面において、上記ＮｇＲＨ１レセプターは、ヒトＮｇＲＨ１である。
【００１３】
本発明は、候補薬剤がＢＢＢの透過性をモジュレートし得るか否かを評価する方法をさらに提供する。この方法は、一般に、（ａ）被験体の中枢神経系に上記ＢＢＢの透過性のインジケーターを曝露する工程；（ｂ）被験体にＮｇＲＨ１細胞表面レセプターを標的とする候補薬剤を投与する工程であって、ＢＢＢの透過性の増大または減少は、その候補薬剤がＢＢＢの透過性をモジュレートし得ることを示す、工程；を包含する。所望される場合、試験される薬剤は、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプター（そのスプライス改変体を含む）のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。このような方法は、トランスジェニック動物を含む動物モデルにおいて行われ得る。
【００１４】
ＮｇＲＨ１における遺伝的改変を含む非ヒトトランスジェニック動物もまた、本発明において提供される。上記改変は、上記動物のＣＮＳにおけるＮｇＲＨ１の発現の減少または増大をもたらし得る。
【００１５】
ＣＮＳ状態、ＣＮＳにおける臨床症状発現を示すＢＢＢに関連する障害および状態を処置するための他の方法も、同様に本明細書中に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、末梢毛細血管  対  脳毛細血管の構造的特徴の図を提供する。
【図２】図２は、血液脳関門の可視化を示す。麻酔した成体ラットは、分子トレーサーであるビオチンを用いて心灌流された。次いで、固定された組織は、切断され、そしてストレプトアビジンａｌｅｘａ−４８８によって染色された。ビオチンストレプトアビジン複合体は、蛍光顕微鏡検査によって可視化された。上記ビオチントレーサーは、脳組織を巡る毛細血管の管腔内にとどまるが、対照的に、筋肉においては、そのトレーサーは、脈管を離れ、そして細胞外空間全体に拡散し得る。
【図３】図３は、ＢＢＢの発達に関与する細胞の相互作用の図を提供する。
【図４】図４は、毛細血管の細胞生物学の図を提供する。
【図５】図５は、視神経の構造的特徴の図を提供する。
【図６】図６は、内皮細胞密着結合の免疫染色を示す。左のパネルにおいて、成体ラットの脳の血管の断面は、オクルディン（赤色）およびＢＳＬ（緑色）によって標識された。隣接する内皮細胞に結合する上記密着結合は、オクルディン染色によって同定され得る。右のパネルは、密着結合の概略図である（Ｇｌｏｏｒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．２００１年１０月；３６（２−３）：２５８−６４）。
【図７】図７は、オクルディンおよびクローディン５のクローディン免疫染色を示す。オクルディンは、血液脳関門に特異的である。ラットの視神経および脾臓組織は、オクルディンに対する抗体およびクローディン５に対する抗体によって染色された。クローディン５（右のパネル）は、両方の組織の内皮細胞によって発現されるが、オクルディン（左のパネル）は、ＣＮＳの内皮細胞に特異的である。
【図８】図８は、密着結合の免疫染色を示す。視神経におけるオクルディン発現およびクローディン５発現の時間経過である。クローディン５（上のパネル）は、１９．５日の胚において産生されると同時に視神経内皮細胞において発現される。一方、オクルディン発現は、誕生後に遅延され、そして観察される。
【図９】図９は、血液脳関門の成熟度が誕生後に進行することを示す。ローダミン結合体化デキストランは、Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙラット中に経心的に灌流された。成熟動物（右のパネル）において、上記トレーサーは、視神経全体を巡る毛細血管の管腔内にとどまり、そのトレーサーは、機能的な血液脳関門の境界を定める。一方、出生後の初期時点（左のパネル）にて、上記トレーサーは、視神経全体に拡散することができ、このことは、血液脳関門が十分に成熟していないことを示唆する。
【図１０】図１０は、ＢＢＢの発達の時間経過を示す。完全な関門は、約Ｐ７〜Ｐ１０で観察される。
【図１１】図１１は、周皮細胞および内皮細胞の免疫染色を示す。視神経由来の血管細胞の精製。ラット視神経は、パパインによって酵素的に解離され、次いでＣ５抗体によるネガティブなイムノパニング（ｉｍｍｕｎｏｐａｎｎｉｎｇ）が行われた。内皮細胞は、ＣＤ３１に対する抗体を使用して選択される一方で、周皮細胞は、ＰＤＧＦＲ  βに対する抗体を使用して選択された
【図１２】図１２は、オクルディン染色を示す。周皮細胞は、視神経内皮細胞におけるオクルディン発現を誘導する。ラット視神経内皮細胞は、単独（上のパネル）か、あるいは視神経周皮細胞（下のパネル）、視神経の星状細胞または網膜神経節細胞（データを示さず）であった。オクルディン発現は、免疫蛍光によってモニタリングされた。周皮細胞によって同時に発現されるが単独で発現されない場合に細胞においてオクルディンを発現した内皮細胞は、星状細胞またはニューロンと接する。
【図１３】図１３は、オクルディン染色を示す。内皮細胞は、増殖培地（上のパネル）において培養されるか、あるいは視神経内皮細胞（下のパネル）の層または視神経星状細胞（データを示さず）の層によって調整された培地と一緒に培養された。オクルディン発現は、周皮細胞の馴化培地を添加した場合にのみ観察された。
【図１４】図１４は、視神経染色を示す。ラット眼球の組織構造。ラット眼球の凍結組織切片は、核色素ＤＡＰＩによって染色された。前眼房は、水晶体と、虹彩毛様体筋（ｉｒｉｓ  ｃｉｌｌｉａｒｙ  ｍｕｓｃｌｅ）と角膜との間に形成される。
【図１５】図１５は、血管化した移植細胞の免疫染色を示す。精製した星状細胞（左のパネル）または視神経周皮細胞を伴う星状細胞（右のパネル）は、ラットの前眼房に移植された。移植片は、ＧＦＡＰによる染色によって可視化（緑色）され、そして虹彩（左のパネル）、毛様体筋（右のパネル）または角膜（データを示さず）において同定することができた。それぞれの場合において、脈管構造は、クローディン５の免疫染色（赤色）によって各移植片に隣接して同定された。
【図１６】図１６．周皮細胞移植片の脈管構造は、オクルディンを発現した。星状細胞の脈管構造（左のパネル）または視神経周皮細胞を伴う星状細胞の脈管構造（右のパネル）は、移植組織を同定するＧＦＡＰ（緑色）およびオクルディン（赤色）によって免疫染色された。オクルディンは、周皮細胞／星状細胞混合物が移植された場合（右のパネル）、隣接する組織において発現されたが、星状細胞のみが移植された場合（左のパネル）に発現されなかった。
【図１７】図１７は、血液脳関門を破壊し得るＳＭＩ７１（抗ＥＢＡ抗体）の全身注射後のＢＢＢ破壊を示す。Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙラットは、４０μｌ／ｋｇのＳＭＩ７１抗体（右のパネル）またはＣＤ３１抗体（左のパネル）を注射され、そして注射後にビオチンによって１５分間灌流された。ビオチントレーサーは、ストレプトアビジン−ａｌｅｘａ−４８８による染色後に蛍光顕微鏡検査によって凍結脳組織切片において検出された（緑色）。ＳＭＩ７１を注射された動物（右のパネル）は、毛細血管から脳実質中へのトレーサーの漏出を示したが、そのトレーサーは、ＣＤ３１注射動物（左のパネル）において毛細血管の管腔内にとどまった。
【図１８】図１８は、ＥＢＡ抗原の発現クローニングおよびポジティブクローンの選択を示す。成体ラット脳発現ライブラリー（ｂｉｏｃｈａｉｎ）は、２０００〜４０００個のクローンのプールへと分けられた。プールは、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトされ、そして免疫蛍光顕微鏡検査を用いてＳＭＩ７１結合によってスクリーニングされた。単一のポジティブプールが、同定された（左上のパネル）。ｓｉｂ選択プロトコルを使用して、プールあたりのクローンの数は、単一のクローンでポジティブプールが同定されるまで減少した（右上、右下）。配列決定した後、これは、Ｎｇｒｈ１として同定された。
【図１９】図１９は、内皮細胞におけるスプライス改変体発現を示す。Ｎｇｒｈ１  ｍＲＮＡは、脳内皮細胞によって発現される。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｎｇｒｈ１に特異的なプライマーを使用して、脳溶解物から単離されたＲＮＡ（左のレーン）、あるいは脾臓由来のＣＤ３１精製内皮細胞（右のレーン）または脳由来のＣＤ３１精製内皮細胞（右のレーンから２番目）において行われた。Ｎｇｒｈ１は、全ての組織において発現される。しかし、特定のスプライス改変体は、脳内皮細胞において発現されるが、脾臓内皮細胞において発現されない。
【図２０】図２０は、ラットＮｏｇｏ−６６レセプターホモログ−１（Ｎｇｒｈ１）ｍＲＮＡの完全なコード配列（配列番号９）を示す。
【図２１】図２１は、マウスＮｏｇｏ−６６レセプターホモログ−１（Ｎｇｒｈ１）ｍＲＮＡの完全なコード配列（配列番号１０）を示す。
【図２２】図２２は、ヒトＮｇＲＨ１をコードする核酸配列（配列番号１１）を提供する。
【図２３】図２３は、脳におけるＥＢＡの空間的かつ時間的な発現を示す；Ａ）成体の脳；Ｂ）Ｐ１の脳；Ｃ）Ｐ８の脳；Ｄ）Ｐ２５の脳；Ｅ）Ｐ６０の脳；Ｆ）およびＧ）はＳＭＩ７１が急性的に解離した皮質培養物中の内皮細胞に対して特異的に結合することを示す；Ｆ）ＶＷＦ；Ｇ）生きたＳＭＩ７１。
【図２４】図２４は、抗ＥＢＡの全身注射後のＢＢＢの崩壊を示す：Ａ）α−ＣＤ３１；Ｂ）α−ＥＢＡ；はまた、ＳＭＩ７１のＮｇｒ２に対する結合特異性を示す：Ｃ）偽トランスフェクト（一次ではない）；Ｂ）Ｎｇｒｈ１＋プールによってトランスフェクトされた（一次ではない）；Ｃ）偽トランスフェクト（ＳＭＩ７１）；Ｄ）Ｎｇｒｈ１＋プールによってトランスフェクトされた（ＳＭＩ７１）；Ｅ）偽トランスフェクト（アイソタイプコントロール：ＧＭ２−５０）；Ｆ）Ｎｇｒｈ１＋プールによってトランスフェクトされた（ＧＭ２−５０）；Ｉ）Ｎｇｒトランスフェクト；Ｊ）Ｎｇｒ２トランスフェクト；およびＫ）Ｎｇｒ３トランスフェクトのＥＢＡ染色。
【図２５】図２５は、を示す。ＥＢＡ抗原の発現クローニング（図１８と同様）：Ａ）およびＢ）ネガティブプール；Ｃ）ポジティブプール：２，５００個のクローン／プール；Ｄ）ポジティブプール：２００個のクローン／プール；Ｅ）ポジティブプール：２０個のクローン／プール；Ｆ）ポジティブプール：１個のクローン。
【図２６】図２６は、脳内皮細胞におけるＮｇｒｈ１発現のスプライス改変体を示す：Ａ）精製された内皮細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ：パネル１は脾臓である；パネル２は脳である；Ｂ）Ｎｇｒｈ１改変体の予想されたドメイン構造：パネル１はＮｇｒｈ１−スプライス改変体である；パネル２は全長Ｎｇｒｈ１である；Ｃ）分画されたラット脳におけるＮｇｒｈ１ウェスタンブロット：パネル１は脳ホモジネートである；パネル２は脳実質画分である；パネル３は脳脈管画分である。
【図２７】図２７は、ＭＡＧの全身注射後のＢＢＢの破壊を示す：Ａ）ＭＡＧ−Ｆｃ注射；Ｂ）コントロールＦｃ注射。
【図２８】図２８は、全長ＮＧＲ２のアミノ酸配列、ラットＮｇＲ２スプライス改変体のアミノ酸配列、およびＮｇＲＨ１の核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（実施形態の詳細な説明）
本開示を通して、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書は、引用を同定することによって参照される。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本明細書によって、本発明が属する技術水準をより十分に記載する本開示に参考として援用される。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴、利点および局面は、以下の記載から以下の記載から当業者に明らかとなる。しかし、以下の記載及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施例を示す一方で、例示目的でのみ与えられることが、理解されるべきである。開示された本発明の精神および範囲内における種々の変更および改変は、以下の記載および本開示の他の部分を読むことから当業者に容易に明らかとなる。
【００１９】
一般的技術：
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術範囲内である免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技術を使用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＭＪ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照のこと。
【００２０】
定義：
明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り複数を含む。例えば、用語「細胞」は、複数の細胞（その混合物を含む）を含む。
【００２１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。それらは、任意の長さの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはそのアナログのヌクレオチドの重合体形態をいう。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、そして既知または未知の任意の機能を行い得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から規定された遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、重合体の組み立ての前後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、（例えば、標識成分との結合体化によって）重合体化後にさらに改変され得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」ともいう）が次いでペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスをいう。転写物およびコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００２３】
用語「示差的に発現される」とは、被験体においてヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用される場合、コントロールにおいて検出されるものと比較してその配列の多い発現または少ない発現をいう。少ない発現はまた、コントロールと比較して試験被験体において検出可能な発現の欠如によって証明されるような特定の配列の発現の欠如を包含する。
【００２４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の重合体を称するために、交換可能に使用される。上記重合体は、直鎖状または分枝状であり得、それは改変されたアミノ酸を含み得、そしてそれは非アミノ酸によって中断され得る。用語はまた、以下で改変されたアミノ酸重合体を包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作（例えば、標識成分との結合体化）。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸のいずれかあるいは合成アミノ酸（グリシンおよびＤ光学異性体またはＬ光学異性体の両方、およびアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物）をいう。
【００２５】
「被験体」、「個体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトをいう。哺乳類としては、マウス（マウス）、ラット、イヌ、ブタ、類人猿（サル）、家畜、競技用動物、およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。組織、細胞およびインビボで得られた生物学的実体またはインビトロで培養された生物学的実体のそれらの子孫がまた、包含される。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「細胞」は、通常の生物学的な意味において使用され、そして多細胞生物全体をいわない。細胞は、例えば、インビトロ（例えば、細胞培養）、多細胞生物（例えば、鳥、植物およびヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、ネコ、マウスまたはラットなどの哺乳類が挙げられる）であり得る。
【００２７】
用語「薬剤」および「生物学的に活性な薬剤」は、交換可能に使用され、そして記載される文脈における複数の参考文献を包含する。本明細書に記載される動物モデルアッセイまたは細胞培養アッセイにおいて使用される「生物学的に活性な薬剤」は、生物学的化合物または化学的化合物（例えば、単一または複数の有機分子または無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば抗体）、炭水化物含有分子、リン脂質、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）からなる群から選択され得る。さらに、複雑な有機分子または無機分子を含むこのような薬剤は、化合物の不均一な混合物（例えば、粗植物抽出物または精製された植物抽出物）を含み得る。
【００２８】
用語「コントロール」は、比較目的のための実験において使用される代替的な被験体、細胞またはサンプルである。さらに、「コントロール」はまた、異なる時点の比較のための実験における同じ被験体、細胞またはサンプルを示し得る。
【００２９】
用語「関門」は、血液脳関門（ＢＢＢ）の参照において使用される。さらに、用語「関門」はまた、ＢＢＢ機能に関与する細胞表面タンパク質をいうために使用される。
【００３０】
用語「標的」、「標的とする」、「標的とすること」とは、薬剤に適用される場合、使用される特定の文脈において直接的または間接的に機能または効果を及ぼす薬剤をいう。例えば、抗体が抗原を「標的とする」場合、抗体は、その抗原に特異的である。他の場合において、薬剤が抗原（例えば、ＮｇＲＨ１）を「標的とする」場合、例えば、その抗原との直接相互作用または同じかもしくは関連する経路において作用する他の中間体メッセンジャー分子を介する抗原との間接的会合による、抗原の活性（例えば、ＮｇＲＨ１活性またはシグナル伝達経路）および／または発現に対する効果を直接的または間接的に断定し得る。
【００３１】
用語「回復すること」、「回復される」または「回復」は、交換可能に使用され、そして透過性の状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）に現在存在しない状態に復帰させることを意味する。
【００３２】
用語「モジュレートすること」、「モジュレートされる」または「モジュレーション」は、交換可能に使用され、そして所定の状況の直接的または間接的な変化を意味する。例えば、透過性のモジュレーションは、減少または増大し得る。
【００３３】
タンパク質を称するために使用される場合、「ＮｇＲ２」（Ｎｏｇｏレセプター２）としても知られる「ＮｇＲＨ１」（Ｎｏｇｏレセプターホモログ１）は、全長タンパク質のフラグメント、選択的スプライス改変体、対立遺伝子ホモログを包含し、それらは、ＢＢＢの透過性に関わる。
【００３４】
「ＢＢＢ関連障害」は、コントロールまたは参照（同じ被験体における時間的コントロールまたは参照を含む）と比較して閉鎖または開放する（即ち、透過性を減少または増大させる）ＢＢＢをもたらす任意の障害、状態または疾患を含む。
【００３５】
「相補性」とは、伝統的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型または他の非伝統的な型のいずれかによって別のＲＮＡ配列と水素結合を形成する核酸の能力をいう。本発明の核酸分子に対する参照において、核酸分子とその標的または相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連する機能が進行（例えば、酵素的な核酸切断、アンチセンスまたは三重らせん体の阻害）することを可能にするために十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該分野において周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７、ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒら、１９８７、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照のこと）。％相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の隣接する残基の％を示す（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である１０個のうちの５個、６個、７個、８個、９個、１０個）。「完全に相補的」は、核酸配列中の全ての隣接する残基が第２の核酸配列中の同じ数の隣接する残基と水素結合することを意味する。
【００３６】
用語「治療剤」、「治療可能な薬剤」または「治療薬」は、交換可能に使用され、そして被験体に対する投与の際にいくつかの有利な効果を与える分子または化合物をいう。上記有利な効果は、診断的決定の使用可能性、疾患、障害または病理学的状態の寛解、疾患、障害または状態の発症の減少または予防、そして一般に、疾患、障害または病理学的状態の相殺を含む。
【００３７】
（ＢＢＢ透過性のモジュレーション）
１つの局面において、本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性をモジュレートする方法を提供する。その方法は、被験体に薬剤を投与することを包含し、その薬剤は、脳に存在するＮｇＲＨ１細胞表面レセプターを標的とする。
【００３８】
上記方法は、部分的に、ＮｇＲＨ１がＢＢＢを構成する内皮細胞（特に、内皮細胞の管腔の膜）において優勢に発現される関門タンパク質であるという観察を利用する。ＮｇＲＨ１は漏出性の脈管（肝臓、心臓、肺、筋肉、および脳室周囲の器官のものを含む）において低いレベルで発現されるか、または存在さえしないことが、本明細書中で示されている。
【００３９】
本方法の実施において、ＢＢＢの透過性に関与するＮｇＲＨ１標的は、本明細書中に例示されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはその任意のスプライス改変体（例えば、本明細書に添付された図面に例示される配列によってコードされる改変体）であり得る。少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％でさえの配列相同性を示す他のＮｇＲＨ１レセプターもまた、標的とされ得る。当業者は、配列アライメントを行うか、または相同性検索を実施することによって標的の選択を確認することができ、それらは、しばしばコンピューターによる方法の支援によって行われる。一般に、同定する％配列は、２つが最適に整列される場合、問い合わせ配列と既知の配列との間におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の一致の数の割合によって規定される。種々のソフトウェアプログラムが、当該分野において利用可能である。これらのプログラムの非限定的な例は、ＢｌａｓｔおよびＦａｓｔａである。遺伝子またはそのセグメントに対応するＤＮＡ配列を含む任意の配列データベースは、配列分析のために使用され得る。一般的に使用されるデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ、およびＨＴＧＳが挙げられるが、これらに限定されない。配列類似性は、推定上の標的配列を核酸配列データベースまたはタンパク質データベースに対して整列することによって識別され得る。
【００４０】
目的の薬剤は、レセプターに直接結合することによってか、またはレセプターの活性もしくはシグナル伝達経路に対する作用を間接的に会合することによってＮｇＲＨ１レセプターを標的とし得る。特に、上記薬剤は、同じかまたは関連する経路において作用する他の中間体メッセンジャー分子を介するレセプターとの間接的に会合し得る。ＮｇＲＨ１レセプターを標的とするために使用され得る適切な薬剤としては、生物学的化合物または化学的化合物（例えば、単一または複数の有機分子または無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば抗体）、炭水化物含有分子、リン脂質、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスおよび外部ガイド配列、ならびにハンマーヘッド型リボザイム、ＤＮＡザイム、アロザイム、アプタマー、およびデコイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のさらに別の局面において、１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体が、被験体においてＢＢＢの透過性をモジュレートするために投与される。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体が、本明細書に記載される投与のための種々の投薬量および時間的局面を利用して被験体に投与される。
【００４２】
用語「抗体」とは、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（即ち、抗原と特異的に結合（「免疫反応」）する抗原結合部位を含む分子）をいう。構造的に、もっとも単純な天然に存在する抗体（例えば、ＩｇＧ）は、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）を含む。免疫グロブリンは、分子のいくつかの型（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を含む分子の大きなファミリーを示す。用語「免疫グロブリン分子」は、例えば、ハイブリッド抗体、または変化した抗体、およびそれらのフラグメントを含む。抗体の抗原結合機能が天然に存在する抗体のフラグメントによって行われ得ることを示している。
【００４３】
本発明の適切な抗体は、非単鎖抗体および単鎖抗体を含み得る。非単鎖抗体の例としては、（ｉ）米国特許第６，８３３，４４１号に記載されるｃｃＦｖフラグメント；（ｉｉ）本明細書に記載される少なくとも１つのｃｃＦｖフラグメントを含む任意の他の１価分子および多価分子；（ｉｉｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント）；ならびに（ｖｉｉ）ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の抗体は、「１価」または「多価」のいずれかであり得る。前者が、抗原結合ユニットあたり１つの結合部位を有するのに対して、後者は、同じかまたは異なる種類の１つより多くの抗原に結合し得る複数の結合部位を含む。結合部位の数に依存して、本発明の抗体は、２価（２つの抗原結合部位を有する）、３価（３つの抗原結合部位を有する）、４価（４つの抗原結合部位を有する）などであり得る。多価抗体は、それらの結合特異性に基づいてさらに分類され得る。「単一特異性」抗体は、同種の１つ以上の抗原に結合し得る分子である。「多重特異性」抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する分子である。
【００４５】
ＢＢＢの透過性をモジュレートするために、ＮｇＲＨ１レセプターの任意のエピトープに対する１価抗体または多価抗体（そのスプライス改変体を含む）を使用し得る。このようなエピトープは、上記レセプター配列のＮ末端、Ｃ末端、または中央に存在し得る（任意のロイシンが豊富な配列（例えば、図２６を参照のこと））。上記エピトープは、少なくとも３個、好ましくは６個、７個、８個以上アミノ酸を含み得る。全長ＮｇＲＨ１レセプターに対する少なくとも１つの結合部位、およびＮｇＲＨ１レセプターのスプライス改変体に対する別の結合部位を有する多重特異性抗体もまた、使用できる。所望される場合、上記多重特異性抗体は、ＣＮＳ障害に関わる抗原に対する結合部位を含み得、この障害としては、脳腫瘍および別のＢＢＢに関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない。このような構造は、ＢＢＢの透過性に関わる抗原（例えば、ＮｇＲＨ１（そのスプライス改変体を含む））を標的させ、それによってＢＢＢの透過性を増大させ、そして目的の疾患抗原を同時に標的させる。
【００４６】
二重特異性抗原結合ユニットの例としては、ＢＢＢの透過性に関わる抗原に対する一方の腕、および細胞傷害性誘発分子（ＢＢＢを通って送達される）に対する他の腕を有するものが挙げられる（例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２  ／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄｌ（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗全癌腫関連抗原（ｐａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する１つの腕および毒素に結合する１つの腕を有する二重特異性抗体（例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド）；酵素によって活性化されるプロドラッグを変換するためのＢｓＡｂ（例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（リン酸マイトマイシンプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する））；線維素溶解剤として使用され得る二重特異性抗体（例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ））；細胞表面レセプターに対する免疫複合体を標的とするための二重特異性抗原結合ユニット（例えば、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ））；感染症の治療に使用するための二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ）；インビトロまたはインビボでの腫瘍検出のための二重特異性抗体（例えば、抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ（Ｆａｎｇｅｒら、前出を参照のこと）；ならびに診断ツールとしての二重特異性抗体（例えば、抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら、前出を参照のこと））。三重特異性抗体の例としては、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が挙げられる。
【００４７】
適切な抗体は、無脊椎動物および脊椎動物を含む種々の種起源の免疫グロブリン分子である。好ましい抗体としては、ヒト遺伝子によって発現されるヒト抗体またはそのフラグメントが挙げられる。抗体はまた、非ヒト（例えば、げっ歯類または霊長類）抗体に適用されるようにヒト化され得、それは、ハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むそのフラグメントである。ほとんどは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類などの非ヒト種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、上記ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。ヒトの身体に導入される場合、これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練および最適化し、そして免疫原性を最小化するために行われる。一般に、上記ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。上記ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的に、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含み得る。
【００４８】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部がむしろヒト免疫グロブリンに近くするためにその最初の形態から変更されている抗体である。１つのバージョンにおいて、Ｈ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域は、ヒト配列によって置換される。これは、Ｖ領域および異種免疫グロブリンＣ領域を含む融合ポリペプチドである。別のバージョンにおいて、ＣＤＲ領域は、非ヒト抗体配列を含む一方で、Ｖフレームワーク領域はまた、ヒト配列に変換されている。例えば、ＥＰ  ０３２９４００を参照のこと。第３のバージョンにおいて、Ｖ領域は、ヒトＶ領域およびマウスＶ領域のコンセンサス配列を設計し、そしてコンセンサス配列間で異なるＣＤＲの外側の残基を変更することによってヒト化される。
【００４９】
ヒト化抗体の作製において、フレームワーク残基の選択は、高い結合親和性を維持することにおいて重要であり得る。原理において、任意のＨｕＡｂ由来のフレームワーク配列は、ＣＤＲ移植のための鋳型として機能し得る；しかし、このようなフレームワーク中への直鎖状ＣＤＲ置換は、抗原に対する結合親和性の著しい喪失をもたらし得る。Ｇｌａｓｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６０６；Ｔｅｍｐｅｓｔら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６；およびＳｈａｌａｂｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７：２１７。より相同的なＨｕＡｂは、元のｍｕＡｂに対するものであり、ヒトフレームワークが親和性を減少させ得るマウスＣＤＲに歪みを導入することが少なくなるようである。抗体配列データベースに対する配列相同性検索に基づいて、ＨｕＡｂ  ＩＣ４は、ｍｕＭ４ＴＳ．２２に対するフレームワークの良好な相同性を提供するが、他の高度に相同的なＨｕＡｂも、同様に適切である（ヒトサブグループＩ由来のκ  Ｌ鎖またはヒトサブグループＩＩＩ由来のＨ鎖）。Ｋａｂａｔら（１９８７）。種々のコンピュータープログラム（例えば、ＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５）は、Ｖ領域についての理想的な配列を予想するために利用可能である。したがって、本発明は、異なるＶ領域を有するＨｕＡｂを包含する。適切なＶ領域配列を決定することおよびこれらの配列を最適化することは、当業者の技術範囲内である。減少した免疫原性を有する抗体を得るための方法はまた、米国特許第５，２７０，２０２号およびＥＰ  ６９９，７５５に記載される。
【００５０】
所望される場合、上記抗体は、抗原に対する高い親和性の維持および他の好ましい生物学的特性を伴ってヒト化される。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用する親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析プロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、当業者によく知られている。適切な選択された候補免疫グロブリン配列の３次元コンホメーション構造を例示および表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示の検討は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析（即ち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析）を可能にする。この方法において、ＦＲ残基は、所望の抗体の特徴（例えば、標的抗原に対する親和性の増大）が達成されるように、コンセンサス配列および移入配列から選択され、そして組み合わせられ得る。
【００５１】
本発明はまた、化学的に機能的な部分に結合体化される抗体を包含する。代表的に、上記部分は、検出可能なシグナルを生成し得る標識である。これらの結合体化抗体は、例えば、検出システム（例えば、ミエリン病変の定量、腫瘍量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）の定量、ならびに転移病巣の画像化および腫瘍の画像化）において有用である。このような標識は、当該分野において公知であり、そしてその標識としては、放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、基質補因子およびインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、このような標識の使用を教示する特許、米国特許第第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を参照のこと。上記部分は、抗体に共有結合されても、第２の試薬（例えば、第２の抗体、プロテインＡ、またはビオチン−アビジン複合体）によって抗体に組換え的に結合されても、結合体化されてもよい。
【００５２】
他の機能的な部分としては、シグナルペプチド、免疫学的反応性を増強させる薬剤、固体支持体、ワクチンキャリア、生物応答改変因子、常磁性標識および薬物へのカップリングを容易にする薬剤が挙げられる。シグナルペプチドは、細胞膜、通常は、真核生物細胞中の小胞体、および細菌の内膜または内膜および外膜の両方のいずれかを通って新規に合成されたタンパク質を指向する短いアミノ酸配列である。シグナルペプチドは、代表的に、ポリペプチドのＮ末端部分にあり、そして代表的に、生合成および細胞からのポリペプチドの分泌との間において酵素的に除去される。このようなペプチドは、合成された分子の分泌を可能にするために本発明の抗体に組み込まれ得る。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体に特異的でもあり、それによってその１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体がその抗原およびそのＮｇＲＨ１細胞表面レセプターの両方に結合し得る可溶性抗原を投与することに関する。好ましい実施形態において、上記抗原は、標的とされたＮｇＲＨ１細胞表面レセプターおよび１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体と比較して、１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体に対して小さい結合特異性または大きい結合特異性のいずれかを有するか、または有するように改変される。いくつかの実施形態において、上記抗原は、上記１つ以上の抗体が被験体に投与される前、それと同時、またはその後に投与される。
【００５４】
他の局面において、上記可溶性抗原は、上記ＮｇＲＨ１細胞表面レセプターに結合する１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体と比較して、大きい結合特異性または小さい結合特異性で、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプターに結合するように設計される。１つの実施形態において、上記抗原は、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプターに結合する１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体と競合する。別の実施形態において、上記可溶性抗原は、上記１つ以上の抗ＮｇＲＨ１抗体が被験体に投与される前、それと同時、またはその後に投与される。
【００５５】
このような変化したＮｇＲＨ１を有する可溶性抗原または抗ＮｇＲＨ１抗体は、当該分野において利用可能なプロテオミクスの計算的分析方法を利用して選択または設計され得る。特に、このような分析は、天然に存在する結合対と比較して異なる結合動態を有するタンパク質（即ち、可溶性抗原）を選択または設計するために使用される。ＫｏｒｔｅｍｍｅおよびＢａｋｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００４；８：９１−９７；米国特許第第６，９５１，７１５号を参照のこと。
【００５６】
本発明に従う有用な他の生理活性ペプチド（または抗原）は、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３（３）：４１２−４２１（１９９２）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４−８６（１９９１）によって開示されるもの）の使用またはファージディスプレイ手順（例えば、Ｈａｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８（１９９４）に記載されるもの）の使用によって同定され得る。Ｈａｒｔらは、哺乳動物細胞レセプターに対する新規ペプチドリガンドを同定するための線維状ファージディスプレイライブラリーを報告する。一般に、例えば、Ｍ１３またはｆｄファージを使用するファージディスプレイライブラリーは、従来の手順（例えば、上述の参考文献に記載されるもの）を使用して調製される。上記ライブラリーは、４個〜８０個のアミノ酸残基を含む挿入物を示す。上記挿入物は、必要に応じて、ペプチドの完全に変性した配列または偏った配列を示す．特定の分子（例えば、細胞表面レセプター）に選択的に結合するリガンドは、特定の分子を結合するリガンドをそれらの表面上に発現するファージを選択することによって得られる。所望の生物学的活性を有するリガンドは、公知の生物学的活性においてスクリーニングされ得、そしてその根拠に基づいて選択され得る。次いで、これらのファージは、もっとも有用な特徴を有するペプチド発現ファージを同定するためにいくつかのサイクルの再選択に供される。代表的に、結合特性（例えば、最も高い結合親和性または細胞刺激活性）を示すファージは、ファージ表面上に発現されるペプチドの特定のアミノ酸配列および最適な生物学的活性を達成する発現されるペプチドの最適な長さを同定するために核酸分析によってさらに特徴付けられる。
【００５７】
あるいは、このようなペプチドは、１個以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーから選択され得る。非ペプチド合成部分を含むこのようなライブラリーが、さらに合成され得、その非ペプチドの合成部分は、それらの天然に存在する対応物と比較してあまり酵素的分解に供されない。米国特許第５，５９１，６４６号は、生理活性ペプチドをスクリーニングおよび同定するために有用である生体分子ライブラリーに関する方法および装置を開示する。ペプチドライブラリーをスクリーニングするための方法はまた、米国特許第５，５６５，３２５号に開示される。コンビナトリアルライブラリーまたは他の供給源から得られるペプチドは、当該分野において公知である方法によって機能活性についてスクリーニングされ得る。したがって、当業者は、ＮｇＲＨ１に対してある程度のレベルの特異性を有するペプチドを同定することができ、そしてこのようなペプチドは、ＢＢＢ透過性をモジュレートするために利用され得る。
【００５８】
ＮｇＲＨ１を標的とするアプタマーは、特に有用なクラスの薬剤を示す。アプタマーは、特定の分子に対する特異的結合特性に基づいて選択されるＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドを含む。例えば、アプタマーは、当該分野において公知である方法を使用してＮｇＲＨ１の結合のために選択され得る。次いで、上記アプタマーは、ＢＢＢの透過性をモジュレートするために被験体に投与され得る。特定のタンパク質、ＤＮＡ、アミノ酸およびヌクレオチドに対して親和性を有するいくつかのアプタマーが、記載されている（例えば、Ｋ．Ｙ．Ｗａｎｇら、「Ａ  ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｗｈｉｃｈ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｍｏｔｉｆ  ｆｏｒ  ＤＮＡ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１８９９−１９０４（１９９３）；Ｐｉｔｎｅｒら、米国特許第５，６９１，１４５号；Ｇｏｌｄら、「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３−９７（１９９５）；Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許第５，６３１，１４６号）。高い親和性結合アプタマーおよび高い特異性結合アプタマーは、コンビナトリアルライブラリー（前出、Ｇｏｌｄら）に由来している。アプタマーは、高い親和性を有し得、その親和性は、使用される選択に依存してマイクロモル〜ナノモル以下の範囲の平衡解離定数である。アプタマーはまた、例えば、７−メチルＧとＧとの間（Ｈａｌｌｅｒ，Ａ．Ａ．、およびＳａｒｎｏｗ，Ｐ．、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ７−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＲＮＡ  Ｔｈａｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｐｅｄ  ｍＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：８５２１−８５２６（１９９７））、またはＤ−トリプトファンとＬ−トリプトファンとの間（前出、Ｇｏｌｄら）で１０００倍の識別を示す高い選択性を示し得る。
【００５９】
ランダム化されたオリゴヌクレオチドをアプタマー活性についてスクリーニングするための一般的方法は、記載されている。例えば、Ｇｏｌｄら（米国特許第５，２７０，１６３号）は、「ＳＥＬＥＸ」（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を記載する。Ｇｏｌｄらにおいて、ランダム化された配列の領域を有する一本鎖核酸の候補混合物は、標的分子と接触される。上記標的に対する増大した親和性を有する核酸は、候補混合物の残部から分割される。分割された核酸は、リガンドが豊富な混合物を産生するために増幅される。Ｓｚｏｓｔａｋら（米国特許第５，６３１，１４６号）は、アデノシンまたはアデノシン−５’−リン酸に結合する一本鎖ＤＮＡ分子を生成するための方法を記載する。
【００６０】
本発明に従うアプタマーは、そのアプタマーがその標的モノマーに結合し、そしてそれを認識するその能力の一部を維持する限り、結合特異性または安定性を改善するために改変され得る。例えば、ヌクレオチドの塩基および糖を改変するための方法は、当該分野において公知である。代表的に、ホスホジエステル結合は、ＲＮＡまたはＤＮＡのヌクレオチド間に存在する。本発明に従うアプタマーは、その安定性を増大させるために、そのヌクレオチド間にホスホジエステル、ホスホラミダイト、ホスホロチオエートまたは他の公知の結合を有し得るが、但しその結合は、アプタマーとその標的モノマーとの相互作用を実質的に妨害しない。
【００６１】
本発明の方法において使用するために適したアプタマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）、化学反応または当該分野において公知である標準的な方法による機械によって合成され得る。例えば、アプタマーは、標準的な化学を使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）からの自動化ＤＮＡ合成機によって合成され得る。
【００６２】
さらに、ＮｇＲＨ１に結合するアプタマーは、選択後に最適化され得る。例えば、１つの改変が、タンパク質標的に対する親和性および特異性を増強する、チオリン酸ＯＤＮ剤およびジチオリン酸ＯＤＮ剤の「粘着性」である。既存の技術を上回る顕著な改善において、選択の方法は、同時に、非標的タンパク質に対する非特異的結合を減少させ、そして標的との特定の好ましい相互作用のみを増強するためにチオール化したリン酸の総数を制御および最適化する。したがって、本発明の方法において使用される選択されたアプタマーは、親和性、特異性およびヌクレアーゼ抵抗性の組み合わせた特性を有するアプタマーの選択的開発を可能にするために改変され得る。このような最適化方法は、当該分野において公知である（例えば、米国特許第６，８６７，２８９号の開示）。
【００６３】
上記薬剤はまた、デコイの形態をとり得る。「デコイ」によって、所定のリガンドまたは未知のリガンドに優勢に結合するように設計されている核酸分子（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）、またはアプタマーが意味される。このような結合は、標的分子の阻害または活性化をもたらし得る。デコイまたはアプタマーは、特定のリガンドの結合に関して、天然に存在する結合標的と競合し得る。例えば、ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は「デコイ」として機能し得、そしてＨＩＶ  ｔａｔタンパク質に効率的に結合し、それによってＨＩＶ  ｔａｔタンパク質がＨＩＶ  ＲＮＡにコードされるＴＡＲ配列に対して結合することを妨げることが、示されている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ、６３、６０１−６０８）。しかし、これは、具体例であり、そして当業者は、他の実施形態が一般に当該分野において公知である技術を使用して容易にもたらされ得ることを認識する（例えば、Ｇｏｌｄら、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４、７６３；ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７４、５；Ｓｕｎ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２、１００；Ｋｕｓｓｅｒ、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４、２７；ＨｅｒｍａｎｎおよびＰａｔｅｌ、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７、８２０；ならびにＪａｙａｓｅｎａ、１９９９、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、１６２８を参照のこと）。同様に、デコイは、ＮｇＲＨ１またはＮｇＲＨ２に結合し、そしてそれらの結合をブロックするように設計され得るか、またはデコイは、ＮｇＲＨ１に結合し、そして別のリガンドタンパク質との相互作用を妨げるように設計され得る。
【００６４】
所望される場合、本発明の薬剤は、ｓｉＲＮＡの形態である。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、代表的に、二本鎖ＲＮＡを含み、そのＲＮＡの一方の鎖は、ＮｇＲＨ１遺伝子またはＮｇＲＨ２遺伝子のＲＮＡに相補的である。別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡを含み、そのＲＮＡの一方の鎖は、ＮｇＲＨ１遺伝子配列またはＮｇＲＨ２遺伝子配列を有するＲＮＡの配列の一部を含む。さらに別の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡを含み、ＲＮＡの両方の鎖は、非ヌクレオチドリンカーによって連結される。あるいは、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡを含み、ＲＮＡの両方の鎖は、ヌクレオチドリンカー（例えば、ループ構造またはステムループ構造）によって連結される。
【００６５】
ｓｉＲＮＡの設計における標準的な方法は、当該分野において公知である（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３（２００２））。一般に、適切なｓｉＲＮＡは、約１０〜５０ヌクレオチドの間、または約２０〜２５ヌクレオチドの間、または約２０〜２２ヌクレオチドの間である。標的部位は、代表的に、配列の３’末端にＡＡジヌクレオチドを有する。なぜならば、ＵＵオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシングにおいてより有効であり得るからである。残りのヌクレオチドは、一般に、ＡＡジヌクレオチドのヌクレオチド３’に対する相同性を示す。一般に、上記ｓｉＲＮＡは、代表的に、標的配列（例えば、ＮｇＲＨ１レセプター配列）に対する少なくとも約５０％の相同性（好ましくは少なくとも約７０％、約８０％、９０％または９５％でさえの相同性）を示す。所望される場合、潜在的な標的部位はまた、適切なゲノムデータベースと比較されて、標的配列は、他の遺伝子に対する７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満でさえの相同性を有するべきである。ＮＣＢＩサーバー、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ上の容易に利用可能な公のデータベースは、配列相同性を決定するために使用される簡便なツールである。公のｓｉＲＮＡ設計ツールはまた、ＭＩＴのＷｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｕｂｉｎｔ／ｈｔｔｐ：／／ｉｏｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／から容易に利用可能である。
【００６６】
適切なｓｉＲＮＡはまた、ヘアピンｓｉＲＮＡの形態をとり得る。適切なヘアピンｓｉＲＮＡの設計において多くの公知である因子を変化させ得る。このような変数は、推定上のヘアピンのステムをコードする逆方向反復の長さ、逆方向反復の順序、ヘアピンのループをコードするスペーサー配列の長さおよび組成、ならびに標的および予想された逆方向領域に依存して変動し得る５’−オーバーハングの存在または非存在を含む；その全ては、当該分野における標準的な手順によって変化またはカスタマイズされ得る。上記ステムは、１９〜２０ヌクレオチド長、好ましくは  約１９、２１、２５、または２９ヌクレオチド長であり得る。上記ループは、３ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの範囲であり得、好ましくは、約３、４、５、６、７および９ヌクレオチドのループのサイズであり得る。ヘアピンｓｉＲＮＡの選択および設計を支援する公に利用可能なデータベースもまた、利用可能であり（例えば、ｗｗｗ．ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．ｏｒｇ）、そしてヘアピンｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方についてのオンラインの設計ツールは、商業サイト（例えば、ＰｒｏｍｅｇａおよびＡｍｂｉｏｎ）から利用可能である。
【００６７】
本発明の方法を実施するために有用な薬剤の別のクラスは、外部ガイド配列（ＥＧＳ）である。ＥＧＳは、遺伝子サイレンシング剤として使用することができ、ＮｇＲＨ１の機能をダウンレギュレートするか、ＮｇＲＨ１のネガティブな調節因子を阻害することによってＮｇＲＨ１の機能をアップレギュレートするために適用可能であり得る。ＥＧＳは、標的ｍＲＮＡと水素結合機構によって塩基対形成してトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の分子構造と同様の分子構造を形成するように設計される。次いで、ＥＧＳ／ｍＲＮＡ標的は、ＲＮａｓｅ  Ｐによって切断および不活化される。ＲＮａｓｅ  Ｐは、全ての生存可能な真核生物細胞中に大量に存在し、それは、プロセス前駆体転写物の切断によってトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセシングするために機能する。一般に、ＥＧＳは、それが細胞メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）内に含まれる別のＲＮＡ配列と生体分子複合体を形成する場合、ｔＲＮＡ分子の特定の構造的特徴を模倣するように設計される。したがって、任意のｍＲＮＡは、原則として、共触媒として関与するＥＧＳおよびＲＮａｓｅ  Ｐの両方に関してＲＮａｓｅ  Ｐの基質として認識され得る。真核生物ＲＮＡａｓｅ  Ｐのための好ましいＥＧＳは、標的ＲＮＡ分子との複合体において、クローバー型ｔＲＮＡまたはその部分に似ている二次構造を形成する配列からなる。所望の二次構造は、ｔＲＮＡに似ている構造を形成するために、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成スキームを使用して決定される。ＲＮａｓｅ  Ｐは、配列とは対照的に構造を認識するので、水素結合した領域の特定の配列は、形成される所望の構造よりも重要ではない。ＥＧＳおよび標的ＲＮＡ基質は、ＲＮＡａｓｅ  Ｐによる標的ＲＮＡの切断をもたらすために、ｔＲＮＡの二次構造および三次構造の十分な部分に似ているべきである。ＥＧＳの配列は、任意のｔＲＮＡから送達され得る。
【００６８】
ＮｇＲＨ１（そのスプライス改変体を含む）のｍＲＮＡ一次配列を含むＥＧＳは、特に興味深い。ＥＧＳを設計する種々の方法は、例えば、Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，６２４，８２４号、Ｔａｋｌｅらに対する米国特許第６，６１０，４７８号、ＷＯ  ９３／２２４３４、ＷＯ  ９５／２４４８９、およびＷＯ  ９６／２１７３１に記載される。
【００６９】
薬剤のさらに別のクラスは、ＮｇＲＨ１を標的とするアンチセンス分子である。例示的なアンチセンス核酸またはアンチセンス分子は、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５、５６６）の相互作用によって標的ＲＮＡに結合し、そして標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子である（概説については、ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１、１００４およびＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照のこと）。代表的に、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の隣接する配列に沿って標的配列と相補的である。しかし、特定の実施形態において、アンチセンス分子は、基質分子がループを形成するように基質に結合し得、そして／またはアンチセンス分子は、アンチセンス分子がループを形成するように結合し得る。したがって、上記アンチセンス分子は、２つ（またはそれ以上）の隣接しない基質配列に相補的であっても、アンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の隣接しない配列部分は、標的配列に相補的であっても、その両方であってもよい。現在のアンチセンスストラテジーの概説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、２１７８３−２１７８９、Ｄｅｌｉｈａｓら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ、１５、７５１−７５３、Ｓｔｅｉｎら、１９９７、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎ．Ａ．ＤｒｕｇＤｅｖ．、７、１５１、Ｃｒｏｏｋｅ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、３１３、３−４５；Ｃｒｏｏｋｅ、１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１５、１２１−１５７、Ｃｒｏｏｋｅ、１９９７、Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４０、１−４９を参照のこと。さらに、アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によってＲＮＡを標的とし、それによってで標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅ  Ｈを活性化するために使用され得る。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈ切断を活性化し得る１つ以上のＲＮＡｓｅ  Ｈ活性化領域を含み得る。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成され得るか、あるいは一本鎖ＤＮＡ発現ベクターまたはその等価物の使用によって発現され得る。これは、非限定的な例であり、そして当業者は、他の実施形態が一般に当該分野において公知である技術（例えば、Ｇｏｌｄら、米国特許第５，４７５，０９６号および同第５，２７０，１６３号；Ｇｏｌｄら、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４、７６３；ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉ、７４、５；Ｓｕｎ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２、１００；Ｋｕｓｓｅｒ、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｉ．、７４、２７；ＨｅｒｍａｎｎおよびＰａｔｅｌ、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７、８２０；ならびにＪａｙａｓｅｎａ、１９９９、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、１６２８を参照のこと）を使用して容易にもたらされ得ることを認識する。
【００７０】
所望される場合、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性化領域は、核酸薬剤中に設計され得る。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性化領域は、細胞性ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって認識される非共有結合性の複合体を形成するために、標的ＲＮＡに結合し得る核酸分子の領域（一般に、４〜２５ヌクレオチド長以上、好ましくは５〜１１ヌクレオチド長）である（例えば、Ａｒｒｏｗら、米国特許第５，８４９，９０２号；Ａｒｒｏｗら、米国特許第５，９８９，９１２号を参照のこと）。ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は、核酸分子−標的ＲＮＡ複合体に結合し、そして標的ＲＮＡ配列を切断する。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性化領域は、例えば、ホスホジエステル骨格化学、ホスホロチオエート骨格化学（好ましくは、ヌクレオチドのうちの少なくとも４個は、ホスホロチオエート置換である；より具体的には、ヌクレオチドのうちの４〜１１個は、ホスホロチオエート置換である）；ホスホロジチオエート骨格化学、５−チオホスフェート骨格化学、またはメチルホスホネート骨格化学あるいはその組合せを含む。上に記載される１つ以上の骨格化学に加えて、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性化領域はまた、種々の糖化学を含み得る。例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性化領域は、デオキシリボース、アラビノ、フルオロアラビノまたはその組合せ、ヌクレオチド糖化学を含み得る。当業者は、前記のものが非限定的な例であること、ならびにＲＮａｓｅ  Ｈ酵素の活性を支持する核酸のリン酸化学、糖化学、および塩基化学の任意の組合せがＲＮａｓｅ  Ｈ活性化領域の定義および本発明の範囲内であることを認識する。
【００７１】
所望される場合、ＮｇＲＨ１を標的とする酵素的核酸分子、アンチセンス核酸分子、デコイＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＥＧＳ、またはアプタマー分子は、少なくとも１つの２’−糖改変を含む。別の実施形態において、その分子は、少なくとも１つの核酸改変を含む。別の実施形態において、その分子は、少なくとも１つの骨格改変を含む。
【００７２】
別の実施形態において、ＮｇＲＨ１を標的とする酵素的核酸またはアンチセンス核酸分子または本発明の他の核酸分子は、キャップ構造を含み、そのキャップ構造は、５’末端、または３’末端、または５末端および３末端の両方（例えば、３’、３’−連結または５’、５’−連結の脱デオキシ塩基（ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃ）誘導体）にある。
【００７３】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明の核酸分子は、約１０ヌクレオチド長と１００ヌクレオチド長との間であり得る。例えば、本発明の酵素的核酸分子は、好ましくは約１５ヌクレオチド長と５０ヌクレオチド長との間、より好ましくは約２５ヌクレオチド長と４０ヌクレオチド長との間（例えば、３４ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、または３８ヌクレオチド長）である（例えば、Ｊａｒｖｉｓら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、２９１０７−２９１１２を参照のこと）。本発明の例示的なＤＮＡザイムは、好ましくは約１５ヌクレオチド長と４０ヌクレオチド長との間、より好ましくは約２５ヌクレオチド長と３５ヌクレオチド長との間（例えば、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、または３２ヌクレオチド長である（例えば、Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７、１３３３０−１３３４２；Ｃｈａｒｔｒａｎｄら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３、４０９２−４０９６を参照のこと）。本発明の例示的なアンチセンス分子は、好ましくは約１５ヌクレオチド長と７５ヌクレオチド長との間、より好ましくは約２０ヌクレオチド長と３５ヌクレオチド長との間（例えば、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、または２８ヌクレオチド長）である（例えば、Ｗｏｏｌｆら、１９９２、ＰＮＡＳ．、８９、７３０５−７３０９；Ｍｉｌｎｅｒら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５、５３７−５４１を参照のこと）。本発明の例示的な三重鎖形成オリゴヌクレオチド分子は、好ましくは約１０ヌクレオチド長と４０ヌクレオチド長との間、より好ましくは約１２ヌクレオチド長と２５ヌクレオチド長との間（例えば、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、または２１ヌクレオチド長）である（例えば、Ｍａｈｅｒら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、８８２０−８８２６；ＳｔｒｏｂｅｌおよびＤｅｒｖａｎ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、７３−７５を参照のこと）。当業者は、核酸分子（即ち、ＮｇＲＨ１コードＤＮＡまたはＮｇＲＨ１コードＲＮＡ）がその標的と相互作用し、そして／または本明細書で企図される反応を触媒する上記核酸分子のための十分な長さおよび適切なコンホメーションであることが必要とされることを認識する。本発明の核酸分子の長さは、記載された一般的な境界内に限られるものではない。
【００７４】
好ましくは、ＮｇＲＨ１発現をモジュレート（例えば、ダウンレギュレート）する核酸分子は、ＮｇＲＨ１のＲＮＡ分子に相補的な１２個と１００個との間の塩基を含む。さらにより好ましくは、例えば、ＮｇＲＨ１発現をモジュレートする核酸分子は、ＮｇＲＨ１のＲＮＡ分子に相補的な１４個と２４個との間の塩基を含む。
【００７５】
本発明の核酸薬剤は、発現ベクターによって細胞に送達され得る。したがって、本発明のベクターは、本発明の少なくとも１つの酵素的核酸分子、アンチセンス、または他の核酸分子の核酸配列を、細胞（例えば、内皮細胞）における核酸分子の複製および／または発現を可能にする様式で含む。所望される場合、本発明の発現ベクターは、同じかまたは異なり得る２つ以上の酵素的核酸分子をコードする核酸配列を含む。
【００７６】
発現ベクターを設計する方法は、当該分野において公知である。所望される場合、本発明の特定の核酸分子は、真核生物プロモーターから細胞内で発現され得る（例えば、ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９、３４５；ＭｃＧａｒｒｙおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８３、３９９；Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８、１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、２、３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４３２−４１  ；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９、１０８０２−６；Ｃｈｅｎら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０、４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３、２２５９；Ｇｏｏｄら、１９９７、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４、４５；これらの参考文献の全ては、本明細書にその全体が参考として援用される）。当業者は、任意の核酸が適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真核生物細胞において発現され得ることを理解する。このような核酸の活性は、酵素的核酸による一次転写物からのそれらの放出によって増大し得る（Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ  ＷＯ  ９３／２３５６９、およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ  ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、２７、１５−６；Ｔａｉｒａら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９、５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａら、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１、３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、２５８５６；これらの参考文献の全ては、本明細書にその全体が参考として援用される）。ＣＮＳに特異的な遺伝子治療アプローチは、Ｂｌｅｓｃｈら、２０００、Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．、１３、２６９−２８０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２０００、Ｃｅｎｔ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．Ｄｉｓ．、４８５−５０８；ＰｅｅｌおよびＫｌｅｉｎ、２０００、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、９８、９５−１０４；Ｈａｇｉｈａｒａら、２０００、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７、７５９−７６３；ならびにＨｅｒｒｌｉｎｇｅｒら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、３５、２８７−３１２によって記載される。核酸の神経系の細胞に対するＡＡＶ媒介性送達は、Ｋａｐｌｉｔｔら、米国特許第６，１８０，６１３号によってさらに記載される。
【００７７】
インビボ方法またはインビトロ方法において使用されるベクターは、ＳＶ−４０、アデノウイルス、レトロウイルスに由来するＤＮＡ配列ならびに機能的な哺乳動物ベクターおよび機能的なプラスミドの組合せに由来するシャトルベクターならびにファージＤＮＡの誘導体を含み得る。真核生物発現ベクターは、周知である（例えば、Ｐ  Ｊ  ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ  Ｂｅｒｇ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １：３２７−３４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍｉｎｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４（１９８１）、ＫａｕｆｉｎａｎｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８０：４６５４−４６５９（１９８３）ならびにＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０（１９８０）（これらは、本明細書に参考として援用される）によって記載されるもの）。本発明の方法において使用されるベクターは、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターであり得る。複製欠損アデノウイルスが、好ましい。例えば、末端反復配列に含まれるウイルス調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子が目的の単一遺伝子によって置換されている「単一遺伝子ベクター」が、使用され得る（例えば、ＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６０８−６１４（１９８８）（これらは、本明細書に参考として援用される）によって記載されるような、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＩＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびマウス骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭｕＭＰＳＶ）、ならびにトリレトロウイルス（例えば、細胞内皮症ウイルス（Ｒｅｖ）およびラウス肉腫ウイルス）。
【００７８】
複数遺伝子が導入され得る組換えレトロウイルスベクターがまた、本発明の方法によって使用され得る。独立プロモーターの調節下でｃＤＮＡを含む内部プロモーターを有するベクター（例えば、ヒトアデノシンデアミナーゼ（ｈＡＤＡ）のｃＤＮＡがその独自の調節配列（ＳＶ４０ウイルス（ＳＶ４０）由来の初期プロモーター）と一緒に挿入された選択マーカー（ｎｏｅ．ｓｕｐ．Ｒ）を有するＮ２ベクターに由来するＳＡＸベクター）は、当該分野において公知である本発明の方法によって設計および使用され得る。
【００７９】
哺乳動物宿主細胞細胞において、多くのウイルスベースの発現系が、利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、目的のヌクレオチド配列（例えば、治療可能な薬剤をコードする）は、アデノウイルスの転写制御複合体または翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロ組換えまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能であり、そして感染した宿主においてＡＱＰ１遺伝子産物を発現し得る組換えウイルスを生じる。（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３６５５−３６５９（１９８４）を参照のこと）。
【００８０】
特定の開始シグナルもまた、挿入された治療用ヌクレオチド配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。その独自の開始コドンおよび隣接配列を含む治療用遺伝子または治療用ｃＤＮＡの全体が適切な発現ベクターに挿入される場合において、さらなる翻訳制御シグナルが、必要とされる可能性がない。しかし、治療用コード配列の一部のみが挿入される場合において、外来性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）が、提供されなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするにするために所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことによって増強され得る（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３：５１６−５４４（１９８７）を参照のこと）。細胞は、遺伝子発現の時間的制御のための種々の誘導性プロモーターを含むベクターまたは核酸分子（相同組換え）によってトランスフェクトされ得る。
【００８１】
誘導性発現系は、本発明のモジュレーション方法の実施において特に有用である。誘導性発現系の非限定的な例は、以下に記載される。
【００８２】
（一般的な真核生物の誘導性遺伝子発現系２）
【００８３】
【表１−１】
2009541211.tif 000002
【００８４】
【表１−２】
2009541211.tif 000003
ＮｇＲＨ１を標的とするために設計された本発明の薬剤は、それがＢＢＢの透過性をモジュレートすることにおける効果を媒介する限り、アゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る。例えば、ＮｇＲＨ１が、ＢＢＢの完全性を維持するために必要である場合、上記薬剤（例えば、ＮｇＲＨ１に特異的な抗体）は、アンタゴニストとして機能し得る。ＮｇＲＨ１を介するシグナル伝達が、病理学的状態（例えば、ＭＳ）などにおいてＢＢＢを破壊する場合、上記薬剤は、アゴニストとして作用し得る。
【００８５】
１つの実施形態において、変化したＢＢＢの透過性は、可逆的または一過性である。ＢＢＢ透過性の一過性の増大は、ＢＢＢ内皮に対する永久的な損傷を回避する。これは、ＢＢＢに対して不透過性である診断用物質および／または治療用物質の適用のために特に望ましい。所望される場合、上記薬剤は、ＢＢＢの透過性をある期間にわたって、ＢＢＢを通る薬剤が所望の生物学的効果をもたらすこと可能にするために十分である程度まで一過性に増大させる。例えば、抗ＮｇＲＨ１抗体の注射は、一過性のＢＢＢ透過性をもたらし、ＢＢＢの不透過性は、約２時間未満で回復した。ＢＢＢの透過性が増大する持続期間を制御するために適用される薬剤の量を、変化させ得る。意図される適用に依存して、約５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、または６０分間にわたってＢＢＢの透過性を増大させ得る。あるいは、上記薬剤は、１時間、２時間、３時間、４時間、または５時間より長くＢＢＢの透過性を増大させ得る。透過性の程度はまた、意図される適用に依存して調整され得る。上記薬剤は、短期間（例えば、約３０分間、２０分間、１０分間、または５分間未満）にわたってＢＢＢの透過性をわずかか、または劇的に増大させるように設計され得る。対照的に、薬剤は、ＢＢＢを締めるために適用され得、したがって、所望の期間および程度にわたってその透過性を減少させる。投薬時間／濃度を制御することによって、ＢＢＢの透過性のモジュレーションは、有効に持続性であり得るか、または所望の期間にわたって持続性であり得る。
【００８６】
（ＢＢＢ透過性のモジュレータの同定）
本発明はまた、候補薬剤がＢＢＢの透過性をモジュレートするか否かを評価する方法を提供する。その方法は、（ａ）被験体の中枢神経系をＢＢＢの透過性のインジケーターに曝露する工程；（ｂ）被験体にＮｇＲＨ１細胞表面レセプターを標的とする候補薬剤を投与する工程であって、ＢＢＢの透過性の増大または減少は、候補薬剤がＢＢＢの透過性をモジュレートし得ることを示す、工程を包含する。
【００８７】
ＢＢＢの透過性は、当該分野において公知である種々のインジケーター（例えば、Ｏｌｓｏｎら  １９９４；Ｓａｒｉｓら  １９８８；Ｒａｐｏｐｏｒｔ  ２０００；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  １９８７；Ｇｈａｂｒｉｅｌら  ２０００）を利用することによって試験され得る。例えば、１８０Ｄａよりも大きい分子量の色素、トレーサーまたはマーカー（例えば、フルオレセインナトリウムまたはエバンスブルー）は、インタクトなＢＢＢの通過を妨げられる。アッセイは、実験動物において行われ得、その実験動物としては、マウス、ラット、イヌ、ブタ、またはサルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
適切なインジケーターは、血液脳関門透過性を決定、可視化、測定、同定、または定量するために利用される、当該分野において公知である任意の色素、マーカー、またはトレーサーを含む。非限定的な例としては、エバンスブルーおよびフルオレセインナトリウムが挙げられる。このようなインジケーターの例は、当業者に明らかであり、そしてインタクトなＢＢＢを横切ることはできないが、より透過性であるＢＢＢを横切ることができ、そして同定、測定、または定量し得る任意の化合物を本質的に含む。
【００８９】
インジケーターは、ＢＢＢの透過性の変化を決定するために利用される酵素、トレーサーまたはマーカーであり得、それらの非限定的な例は、以下の通りである：
【００９０】
【表２】
2009541211.tif 000004
色素、トレーサーまたはマーカーのさらなる例は、デキストラン、ビオチン、フィブリノーゲン、アルブミン、Ｃｏｏｎｓ反応を使用する血液グロブリン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ結合体化デキストラン（７０，０００ｄａ  ＭＷ）、Ｎａ（＋）−フルオレセイン（ＭＷ  ３７６）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化デキストラン（ＭＷ  ６２，０００または１４５，０００）、または分子量１０，０００ＤａのＦＩＴＣ標識化デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン−１０Ｋ）を含む。
【００９１】
所望される場合、変化したＢＢＢの透過性は、ＮｇＲＨ１（そのスプライス改変体を含む）の変化した発現および／または活性に相関し得る。ＮｇＲＨ１関連遺伝子またはＮｇＲＨ１関連遺伝子産物は、候補薬剤の投与の前、間または後における対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの違いについてアッセイすることによって決定され得る。あるいは、ＮｇＲＨ１関連遺伝子またはＮｇＲＨ１関連遺伝子産物の示差的発現は、コードされるポリペプチドまたは遺伝子産物のレベルの違いを検出することによって決定される。
【００９２】
広範な種々の定量的核酸分析が、当該分野において利用可能である。それらとしては、定量的ＰＣＲ、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。上で概説された一般原理に基づくタンパク質分析のための多くの技術が、当該分野において利用可能である。それらとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素標識または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
ＮｇＲＨ１（そのスプライス改変体を含む）を特異的に認識または結合する抗体は、上述のタンパク質分析を行うために好ましい。これらの抗体は、従来のハイブリドーマ技術または当該分野において利用可能である他の方法によって産生され得る。
【００９４】
本発明の方法はまた、トランスジェニック動物の使用によって実施され得る。トランスジェニック動物は、以下の２つの型に大まかに分類され得る：「ノックアウト」および「ノックイン」。「ノックアウト」は、好ましくは標的遺伝子発現がわずかであるか、または検出不能であるように標的遺伝子の機能の低下をもたらすトランスジェニック配列の導入によって、標的遺伝子における変化を有する。「ノックイン」は、例えば、標的遺伝子のさらなるコピーの導入によってか、または標的遺伝子の内因性コピーの発現の増強を提供する調節配列を作動可能に挿入することによって標的遺伝子の増大した発現をもたらす宿主細胞ゲノムの変化を有する、トランスジェニック動物である。ノックイントランスジェニック動物またはノックアウトトランスジェニック動物は、標的遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。本発明のトランスジェニック動物は、ＮｇＲＨ１を過剰発現または過小発現し得るノックインとして大まかに分類され得る。
【００９５】
本発明において、トランスジェニック動物は、ＢＢＢの透過性のモジュレーションを決定、同定および／または定量するためのモデル系を提供するように設計される。このような決定は、ＢＢＢの透過性の破壊または改変の前または後を含む動物の寿命の間の任意の時間において起こり得る。トランスジェニックモデル系はまた、ＢＢＢの透過性を促進するか、または増大させる生物学的に活性な薬剤の開発のために使用され得る。さらに、上記モデル系は、試験薬剤が、例えば、外傷または疾患によって生じるＢＢＢの開放などのＢＢＢの「開放」後（即ち、透過性を増大させる）に上記関門を回復するか、または透過性を減少させるか否かをアッセイするために利用され得る。さらに、細胞は、エキソビボ技術を含む細胞ベースまたは細胞培養の設定において行われるさらなる研究またはアッセイのために、本発明のトランスジェニック動物から単離され得る。
【００９６】
本発明の動物モデルは、動物の神経系におけるＢＢＢの透過性状態の改変をもたらす手順に従う任意の非ヒト脊椎動物を包含する。好ましいモデル生物としては、哺乳類、霊長類、およびげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいモデルの非限定的な例は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、チンパンジー、およびサルである。試験動物は、野生型またはトランスジェニックであり得る。
【００９７】
本発明のいくつかの局面において、トランスジェニック動物は、ＮｇＲＨ１欠損である。本発明のなお他の局面において、ＮｇＲＨ１欠損動物は、さらなる遺伝子型／表現型のバックグラウンドを包含するように操作される。１つの実施形態において、さらなるバックグラウンドは、オクルディン、クローディン７、クローディン１０およびクローディン１１から選択される１つ以上の密着結合タンパク質が欠損している。なお他の実施形態において、動物は、クローディン２、クローディン５、クローディン６、クローディン１２、クローディン１５およびクローディン１９から選択されるタンパク質を欠損し得る。
【００９８】
胚の顕微操作のための技術における利点は、ここで、受精した哺乳動物の卵子中への異種ＤＮＡの導入をも可能にする。例えば、全能性幹細胞または多能性幹細胞は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介性沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染または他の手段によって形質転換され得る。次いで、形質転換細胞は、胚に導入され、次いでその胚は、トランスジェニック動物に発生する。好ましい実施形態において、発生する胚を、導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物が感染した胚から産生され得るように所望の導入遺伝子を含むウイルスベクターに感染させる。別の好ましい実施形態において、所望の導入遺伝子は、好ましくは、単一の細胞期において胚の前核または細胞質に同時注射され、その胚は、成熟トランスジェニック動物に発生することが可能になる。トランスジェニック動物を産生するためのこれらおよび他の改変体方法は、当該分野において良好に確立されており、したがって本明細書で詳述されない。例えば、米国特許第５，１７５，３８５号および同第５，１７５，３８４号を参照のこと。
【００９９】
（治療剤のＣＮＳに対する送達）
本発明はまた、被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）に治療剤を送達する方法を特徴とする。その方法は、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプターの活性および／または発現レベルをモジュレートする結果としてＢＢＢの透過性を増大させる前、それと同時、またはその後に治療剤をＣＮＳに投与することを包含する。このような方法は、任意のＣＮＳ疾患、そして特に、ＢＢＢに関連する障害（例えば、関門の完全性が損なわれる場合）の処置において使用され得る。
【０１００】
ＮｇＲＨ１（スプライス改変体を含む）を標的とする本明細書中に記載される任意の薬剤は、本発明の方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、投与される薬剤は、ＢＢＢの透過性をモジュレートする、ＮｇＲＨ１（スプライス改変体を含む）を標的とする抗体である。
【０１０１】
抗体が使用される例として、その抗体は、ＮｇＲＨ１を標的とし、そして被験体においてＢＢＢの透過性を増大させる。例えば、被験体は、ＢＢＢ関連障害に罹患しているか、またはＢＢＢ関連障害に罹患しているようであり、増大した透過性は、治療性能を提供する。このような治療性能は、疾患を寛解させる治療剤のＢＢＢを通る送達を含み得る。ＣＮＳに特異的な多くの状態は、治療剤がＢＢＢを横切ることを妨げられるので、処置することが困難である。したがって、このような場合における抗体の投与は、ＮｇＲＨ１の機能または活性をダウンレギュレートし、透過性の増大を生じ、次いで特定の治療剤がＣＮＳに送達されることを可能にする。
【０１０２】
治療剤の送達は、ＮｇＲＨ１細胞表面レセプターの活性および／または発現レベルをモジュレートする結果としてＢＢＢの透過性を増大させることと同時であり得るか、またはその後であり得る。
【０１０３】
このような方法は、任意のＣＮＳ疾患、そして特に、ＢＢＢに関連する障害（例えば、関門の完全性が損なわれる場合）の処置において使用され得る。別の実施形態において、ＢＢＢ関連障害（例えば、ＢＢＢを「開放する」）に罹患する被験体において、抗体は、上記関門を有効に回復または維持するために投与される。例えば、抗体は、ＢＢＢを横切るアルブミン（またはインタクトなＢＢＢを横切らないいくつかの任意のタンパク質）の有害作用に罹患する被験体に投与され得る。このような被験体において、ＮｇＲＨ１を標的とする抗体は、ＮｇＲＨ１の機能をアップレギュレートし、したがって透過性を減少させる。効果において、ＮｇＲＨ１のダウンレギュレーションは、ＢＢＢの回復と同じである。本発明の１つ以上の方法において使用するための抗体（このような抗体の薬学的に需要可能な形態を含む）を産生する方法は、当業者に公知である。（例えば、米国特許第５，５８５，０９７号；同第５，８４６，５３４号；同第６，７０６，２６５号；同第６，９８２，３２１号；同第６，４９１，９１６号；同第５，８８５，５７３号；またはＷＯ  ０４／０４３３８６；ＥＰ  １０９８９０９；あるいは米国特許出願公開第２００３／０２１６５５１号；同第２００５／００３７０００号；同第２００５／００６４５１４号；または同第２００５／００５４８３２号）。
【０１０４】
ＢＢＢに関連する状態／障害の例は、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、免疫機能不全性の筋中枢神経崩壊（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳虚血、脳性麻痺、皮質基底核神経節変性、クロイツフェルト−ヤコブ症候群、ダンディー−ウォーカー症候群、認知症、血管性脳炎、脳脊髄炎、癲癇、本態性振戦、クールー−ランドウ−クレフナー症候群、レビー小体病、マシャド−ジョセフ病、メージュ症候群、片頭痛、灰白脊髄炎、多系統委縮症、髄膜炎、ドレーガー症候群、トゥレット症候群、ハラーホルデン−スパッツ症候群、水頭症、オリーブ橋小脳委縮症、核上性麻痺、または脊髄空洞症を含む。
【０１０５】
１つの実施形態において、化合物（抗体に結合し得るペプチドまたは他の分子であり得る）は、ヒトに投与される抗体の抗体結合部位に可逆的に結合される。上記化合物は、抗原に対する抗体の結合部位を占有し、それによって抗原に対する抗体の結合を阻害する。上記化合物は、抗体結合部位に可逆的に結合され、そして抗体結合の制限された低下を有するように選択されるので、抗体は、抗体が指向する抗原に結合し得る。そのようなものとして、上記抗体および化合物の組合せおよび濃度は、ＮｇＲＨ１の機能、したがってＢＢＢの透過性をモジュレートするための１つの高感度な機構を提供する。
【０１０６】
このような薬剤の投薬レベルは、ＢＢＢに関連する状態の処置に有用な、１キログラムの体重あたり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ、１キログラムの体重あたり０．０１〜１００ｍｇのオーダーであり得る（患者または被験体につき１日あたり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。上記量の薬剤は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変動する単一投薬形態を産生するためにキャリア材料と合わせられ得る。投薬単位形態は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。任意の特定の患者または被験体に対する特定の用量レベルは種々の因子（使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身的健康状態（ｇｅｎｅｒａｌ  ｈｅａｌｔｈ）、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄速度、薬物の組合せおよび治療を受ける特定の疾患の重篤度を含む）に依存することが、理解される。本明細書に記載される投薬レジメンは、ＮｇＲＨ１を標的とする核酸、抗体、リガンド、ペプチまたはタンパク質分子に等しく適用可能である。
【０１０７】
１つの局面において、本発明は、ＢＢＢの透過性をモジュレートするための方法に関し、その方法は、被験体に少なくとも１つのＮｇＲＨ１特異的な生物学的に活性な薬剤またはその結合フラグメントを投与することを包含し、それらは、１つ以上の別個の用量で約２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの用量にて投与される。いくつかの実施形態において、上記生物学的に活性な薬剤は、抗体および／またはリガンドである。１つの実施形態において、抗体は、ＳＭＩ７１である。１つの実施形態において、リガンドは、ＭＡＧである。
【０１０８】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＮｇＲＨ１特異的抗体および／またはＮｇＲＨ１特異的リガンドは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。さらに、上記抗体は、１つ以上の用量で投与される。所望される場合、ＮｇＲＨ１抗体は、処置の間において抗ＮｇＲＨ１抗体の血清濃度を約２０μｇ／ｍｌのレベルに維持するために十分な用量で投与される。
【０１０９】
本発明の１つ以上の方法に適用できるような１つの好ましい実施形態において、ＮｇＲＨ１を標的とする少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤は、別個の機会において投与され、投与される用量の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０用量であり、そして／または用量が投与される機会の数は、週、月、年（必要とされる場合）、被験体の寿命にわたって少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０の異なる時点である。このような実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、抗体またはリガンド（例えば、ＳＭＩ７１またはＭＡＧ）である。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、ＮｇＲＨ１の少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤が処置の間に被験体において血管内皮細胞上のＮｇＲＨ１部位の約８５％の飽和を達成するために十分な用量で投与される、本発明の１つ以上の方法に関する。いくつかの実施形態において、約少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のレベルから選択される。
【０１１１】
治療剤は、治療薬または予防薬（例えば、神経変性疾患の発症を阻害または予防する）として送達され得る。治療的利益によって、処置される基礎をなす障害の根絶または寛解が意味される。予防的利益のために、診断が依然として行われていないとしても、上記薬剤は、疾患を発症する危険性がある患者またはこのような疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する患者に投与され得る。あるいは、予防的投与は、特に、症状が周期的に発現する場合、基礎をなす障害の生理学的症状の発症を回避するために適用され得る。この後者の実施形態において、治療は、基礎をなす徴候の代わりの関連する生理学的症状に関して予防的である。特定の適用に有効である実際の量は、とりわけ、処置される状態および投与経路に依存する。
【０１１２】
本発明の１つの局面において、治療可能な薬剤は、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗遊走剤、抗線維症剤（ａｎｔｉ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、アポトーシス促進剤、カルシウムチャンネル遮断剤、抗悪性腫瘍剤、抗体、抗血栓剤、抗血小板剤、ＩＩｂＩＩＩＩａ因子、抗ウイルス剤、およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。治療可能な薬剤の特定の例としては、以下が挙げられる：ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、ミゾリビン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、サーティカン、ラパマイシン、トリプトライド、メトトレキサート、ベニジピン、アスコマイシン、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、カンプトテシン、トポテカン、ヒドロキシ尿素、タクロリムス（ＦＫ  ５０６）、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダクリズマブ、アザチオプリン、プレドニゾン、ゲムシタビン、それらの誘導体、薬学的な塩および組合せ。
【０１１３】
治療可能な薬剤のさらなる例は、抗癌剤；化学療法剤；血栓溶解剤；血管拡張剤；抗微生物剤または抗生物質；有糸分裂阻害剤；増殖因子アンタゴニスト；フリーラジカルスカベンジャー；生物製剤；放射線治療剤；放射線不透過剤；放射標識された薬剤；抗凝固剤（例えば、へパリンおよびその誘導体）；血管新生抑制薬（例えば、サリドマイド；血管新生薬；ＰＤＧＦ−Ｂおよび／またはＥＧＦインヒビター；乾癬剤を含む抗炎症剤；リボフラビン；チアゾフリン；ザフリン（ｚａｆｕｒｉｎ）；シクロオキシゲナーゼインヒビター（例えば、アセチルサリチル酸、ＡＤＰインヒビター（例えば、クロピドグレル（例えば、プラビックス）およびチクロピジン（例えば、チクリド（ｔｉｃｌｉｄ））、ホスホジエステラーゼＩ１１インヒビター（例えば、シロスタゾール（例えば、プレタール）、糖タンパク質ＩＩ／ＩＩＩＩａ因子（例えば、アブシキシマブ（例えば、ＲｈｅｏｐｒｏＴＭ）；エプチフィバチド（例えば、Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）、およびアデノシン再取り込みインヒビター（例えば、ジピリダモール）を含む抗血小板剤；抗酸化剤、窒素酸化物ドナーを含む治癒剤および／または促進剤；制吐剤；鎮吐剤；トリプディオライド（ｔｒｉｐｄｉｏｌｉｄｅ）、ジテルペン、トリテルペン、ジテルペンエポキシド、ジテルペノイドエポキシド、トリテルペノイド、またはｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｆｏｒｄｉｉ  ｈｏｏｋ  Ｆ（ＴＷＨＦ）、ＳＤＺ−ＲＡＤ、ＲＡＤ、ＲＡＤ６６６、または４０−０−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、それらの誘導体、薬学的な塩および組合せからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む。
【０１１４】
抗腫瘍剤または抗癌剤はまた、本発明の１つ以上の方法を利用して送達され得る。治療可能な抗腫瘍剤または治療可能な抗癌剤は、腫瘍の増殖のさらなる増大を減少または予防する分子であり、そしてそれらとしては、以下のような抗癌剤が挙げられる：アシビシン（Ａｃｉｖｉｃｉｎ）；アクラルビシン；塩酸アコダゾール（Ａｃｏｄａｚｏｌｅ）；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレスチン（Ａｄｏｚｅｌｅｓｔｉｎ）；アルデスロイキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）；アルトレタミン（Ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）；アンボマイシン（Ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン（Ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ）；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール（Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（Ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチジン；アゼテパ（Ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン（Ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）；バチマスタト（Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）；ベンゾデパ（Ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド（Ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）；塩酸ビスアントレン（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；ビスナフィドジメシラート（Ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  Ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン（Ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；硫酸ブレオマイシン；ブレキナル（Ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）ナトリウム；ブロピリミン（Ｂｒｏｐｉｒｉｍｉｎｅ）；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド（Ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）；カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレスチン（Ｃａｒｚｅｌｅｓｔｉｎ）；セデフィンゴール（Ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）；クロラムブシル；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）；クリスナトール（Ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）メシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎ  ）；デキソルマプラチン（Ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン（Ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；デザグアニンメシラート；ジアジクオン（Ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；デセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン（Ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（Ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキセート（Ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（Ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（Ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロメート（Ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（Ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（Ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；塩酸エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール（Ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（Ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；塩酸ファドロゾール（Ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）；ファザラビン（Ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド（Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）；フルオロウ��シル；フルロシタビン（Ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ホスキドン（Ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）；ホストリエシン（Ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）ナトリウム；ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イバルビシン（Ｉｂａｒｕｂｉｃｉｎ）；イホスファミド；イルモホスフィン（Ｉｌｍｏｆｏｓｆｉｎｅ）；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−１ａ；インターフェロンγ−１ｂ；イプロプラチン（Ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）；塩酸イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）；酢酸ランレオチド（Ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）；レトロゾール（Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール（Ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）；ロメトレキソル（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）ナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン（Ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；マソプロコル（Ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル（Ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ（Ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）；ミチンドミド（Ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトジリン（Ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（Ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；ミトスペル（Ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン（Ｍｉｔｏｔａｎｅ）；塩酸ミトザントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）；ノガラマイシン（Ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）；オルマプラチン（Ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン（Ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；ペガスパルガーゼ（Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）；ペリオマイシン（Ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン（Ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）；プロメスタン（Ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポルフィマー（Ｐｏｒｆｉｍｅｒ）ナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；塩酸プロマイシン；ピラゾフリン（Ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン；ログレチミド（Ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴル（Ｓａｆｉｎｇｏｌ）；塩酸サフィンゴル；セムスチン；シムトラゼン（Ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン（Ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ）；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン（Ｓｔｒｅｐｔｎｉｇｒｉｎ）；ストレプトゾシン；スロフェヌル（Ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン（Ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；テコガラン（Ｔｅｃｏｇａｌａｎ）ナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン（Ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）；テニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン（Ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）；塩酸トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）；クエン酸トレミフェン��Ｔｏｒｅｍｉｆｅｎ）；酢酸トレストロン（Ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ）；リン酸トリシリビン（Ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）；塩酸ツブロゾール（Ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ）；ウラシルマスタード；ウレデパ（Ｕｒｅｄｅｐａ）；バプレオチド（Ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；ベルテポルフィン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン（Ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ）；硫酸ビングリシネート（Ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）；硫酸ビンレウロシン（Ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）；酒石酸ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；硫酸ビンロシジン（Ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）；硫酸ビンゾリジン（Ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）；ボロゾール（Ｖｏｒｏｚｏｌｅ）；ゼニプラチン（Ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン；およびタキソール。
【０１１５】
本発明の別の局面において、治療可能な薬剤は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドである。このような生理活性タンパク質または生理活性ペプチドの例としては、以下が挙げられる：細胞をモジュレートするペプチド、走化性ペプチド、抗凝固ペプチド、抗血栓ペプチド、抗腫瘍ペプチド、抗感染ペプチド、増殖増強ペプチド、および抗炎症ペプチド。タンパク質の例としては、抗体、酵素、ステロイド、増殖ホルモンおよび増殖ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、およびそのアゴニストアナログおよびアンタゴニストアナログ、ソマトスタチンおよびそのアナログ、ゴナドトロピン（例えば、黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモン、ペプチドＴ、チロカルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルカゴン、バソプレシン、オキシトシン、アンギオテンシンＩおよびアンギオテンシンＩＩ、ブラジキニン、カリジン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、グルカゴンならびに上記分子の多数のアナログおよび同類物が挙げられる。上記治療剤は、インスリン、ＭＭＲ（ムンプス、麻疹および風疹）ワクチン、腸チフスワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、単純ヘルペスウイルス、細菌トキソイド、これら毒素Ｂ−サブユニット、インフルエンザワクチンウイルス、ｂｏｒｄｅｔｅｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、カナリアポックス、ポリオワクチンウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質およびサイトカインからなる群から選択される抗原、ならびにウシ成長ホルモン（時として、ＢＳＴと称される）、エストロゲン、アンドロゲン、インスリン増殖因子（時として、ＩＧＦと称される）、インターロイキンＩ、インターロイキンＩＩおよびサイトカインからなる群から選択される他の薬剤から選択され得る。３つのこのようなサイトカインは、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびタフトシンである。
【０１１６】
本発明のいくつかの局面において、ＢＢＢの透過性は、抗生物質、または治療可能な抗感染剤を送達するために、上で本明細書に記載される１つ以上の方法によってモジュレートされる。このような抗感染剤は、微生物の活性を減少させるか、または微生物を殺し、そしてそれらとしては、以下が挙げられる：アズトレオナム；  グルコン酸クロルヘキシジン；イミド尿素（Ｉｍｉｄｕｒｅａ）；リセタミン（Ｌｙｃｅｔａｍｉｎｅ）；ニブロキサン（Ｎｉｂｒｏｘａｎｅ）；ピラズモナム（Ｐｉｒａｚｍｏｎａｍ）ナトリウム；プロピオン酸；ピリチオンナトリウム；塩化サンギナリウム；チゲモナムジコリン（Ｔｉｇｅｍｏｎａｍ  Ｄｉｃｈｏｌｉｎｅ）；アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン（Ａｌａｍｅｃｉｎ）；アレキシジン；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル；アミサイクリン；アミフロキサシン（Ａｍｉｆｌｏｘａｃｉｎ）；アミフロキサシンメシラート；アミカシンサルフェート；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンホマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；硫酸アストロミシン；アビラマイシン（Ａｖｉｌａｍｙｃｉｎ）；アボパルシン（Ａｖｏｐａｒｃｉｎ）；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；塩酸バカンピシリン；バシトラシン；バシトラシンメチレンジサリチル酸塩；バシトラシン亜鉛；バンベルマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイシン（Ｂｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）；硫酸ベタマイシン；ビアペネム（Ｂｉａｐｅｎｅｍ）；ビニラマイシン（Ｂｉｎｉｒａｍｙｃｉｎ）；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグスルフェクス（Ｂｉｓｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ  Ｍａｇｓｕｌｆｅｘ）；ブチカシン（Ｂｕｔｉｋａｃｉｎ）；硫酸ブチロシン；硫酸カプレオマイシン；カルバドックス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナム（Ｃａｒｕｍｏｎａｍ）ナトリウム；セファクロル；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナファート；セファマンドールナトリウム；セファパロール（Ｃｅｆａｐａｒｏｌｅ）；セファトリジン；セファザフルール（Ｃｅｆａｚａｆｌｕｒ）ナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン（Ｃｅｆｂｕｐｅｒａｚｏｎｅ）；セフジニル（Ｃｅｆｄｉｎｉｒ）；セフェピメ（Ｃｅｆｅｐｉｍｅ）；塩酸セフェピメ；セフェテコール（Ｃｅｆｅｔｅｃｏｌ）；セフィキシム（Ｃｅｆｉｘｉｍｅ）；塩酸セフメノキシム；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシド一ナトリウム；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；塩酸セフォチアム；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール（Ｃｅｆｐｉｍｉｚｏｌｅ）；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド（Ｃｅｆｐｉｒａｍｉｄｅ）；セフピラミドナトリウム；硫酸セフピローム（Ｃｅｆｐｉｒｏｍｅ）；セフポドキシムプロキセチル（Ｃｅｆｐｏｄｏｘｉｍｅ  Ｐｒｏｘｅｔｉｌ）；セフプロジル（Ｃｅｆｐｒｏｚｉｌ）；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン（Ｃｅｆｔｉｂｕｔｅｎ）；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアクセチル（Ａｘｅｔｉｌ）；セフロキシムピボキセチル（Ｐｉｖｏｘｅｔｉｌ）；セフロキシムナトリウム；セファセトリル（Ｃｅｐｈａｃｅｔｒｉｌｅ）ナトリウム；セファレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；塩酸セトサイクリン；セトフェニコール；クロラムフェニコール；パルミチン酸クロラムフェニコール；パントテン酸クロラムフェニコール錯体；コハク酸クロラムフェニコールナトリウム；クロルヘキシジンホスファニラート；クロロキシレノール；二硫酸クロルテトラサイクリン；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン（Ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；クラリスロマイシン（Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）；塩酸クリナフロキサシン（Ｃｌｉｎａｆｌｏｘａｃｉｎ）；クリンダマイシン；塩酸クリンダマイシン；バルミチン酸クリンダマイシン塩酸塩；リン酸クリンダマイシン；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン（Ｃｌｏｘｙｑｕｉｎ）；コリスチメサートナトリウム；硫酸コリスチン；クメルマイシン（Ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎ）；クメルマイシンナトリウム；シクラシリン；シクロセリン；ダルフォプリスチン（Ｄａｌｆｏｐｒｉｓｔｉｎ）；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；塩酸デメクロサイクリン；デメサイクリン；デノフンギン（Ｄｅｎｏｆｕｎｇｉｎ）；ジアベリジン（Ｄｉａｖｅｒｉｄｉｎｅ）；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；硫酸ジヒドロストレプトマイシン；ジピリチオン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンホスファテックス（Ｆｏｓｆａｔｅｘ）；ドキシサイクリンヒクラート；ドロキサシン（Ｄｒｏｘａｃｉｎ）ナトリウム；エノキサシン（Ｅｎｏｘａｃｉｎ）；エピシリン；塩酸エピテトラサイクリン；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストレート（Ａｃｉｓｔｒａｔｅ）；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンエチルスクシネート；エリスロマイシングルセプテート（Ｇｌｕｃｅｐｔａｔｅ）；ラクトビオン酸エリスロマイシン；プロピオン酸エリスロマイシン；ステアリン酸エリスロマイシン；塩酸エタンブトール；エチオナミド；フレロキサシン（Ｆｌｅｒｏｘａｃｉｎ）；フロキサシリン；フルダラニン（Ｆｌｕｄａｌａｎｉｎｅ）；フルメキン（Ｆｌｕｍｅｑｕｉｎｅ）；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキシシリン（Ｆｕｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）；塩化フラゾリウム；酒石酸フラゾリウム；フシジン酸ナトリウム；フシジン酸；硫酸ゲンタマイシン；グロキシモナム（Ｇｌｏｘｉｍｏｎａｍ）；グラミシジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン（Ｈｅｘｅｄｉｎｅ）；イバフロキサシン（Ｉｂａｆｌｏｘａｃｉｎ）；イミペ���ム；イソコナゾール；イセパミシン（Ｉｓｅｐａｍｉｃｉｎ）；イソニアジド；ジョサマイシン；硫酸カナマイシン；キタサマイシン；レボフラルタドン（Ｌｅｖｏｆｕｒａｌｔａｄｏｎｅ）；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン；リノマイシン；塩酸リノマイシン；ロメフロキサシン（Ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ）；塩酸ロメフロキサシン；ロメフロキサシンメシラート；ロラカルベフ（Ｌｏｒａｃａｒｂｅｆ）；マフェナイド；メクロサイクリン（Ｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ）；スルホサリチル酸メクロサイクリン；リン酸メガロミシン（Ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）カリウム；メキドクス（Ｍｅｑｕｉｄｏｘ）；メロペネム（Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；馬尿酸メテナミン；マンデル酸メテナミン；メチシリンナトリウム；メチオプリム（Ｍｅｔｉｏｐｒｉｍ）；塩酸メトロニダゾール；リン酸メトロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；塩酸ミノサイクリン；塩酸ミリンカマイシン（Ｍｉｒｉｎｃａｍｙｃｉｎ）；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジクス酸ナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；パルミチン酸ネオマイシン；硫酸ネオマイシン；ウンデシレン酸ネオマイシン；硫酸ネチルマイシン；ニュートラマイシン；ニフラデン（Ｎｉｆｕｒａｄｅｎｅ）；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン（Ｎｉｆｕｒａｔｒｏｎｅ）；ニフルダジル；ニフリミド；ニフルピリノール；ニフルキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド（Ｎｉｔｒｏｍｉｄｅ）；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オルメトプリム（Ｏｒｍｅｔｏｐｒｉｍ）；オキサシリンナトリウム；オキシモナム（Ｏｘｉｍｏｎａｍ）；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；塩酸オキシテトラサイクリン；パルジマイシン（Ｐａｌｄｉｍｙｃｉｎ）；パラクロロフェノール；パウロマイシン（Ｐａｕｌｏｍｙｃｉｎ）；ペフロキサシン（Ｐｅｆｌｏｘａｃｉｎ）；ペフロキサシンメシラート；ペナメシリン（Ｐｅｎａｍｅｃｉｌｌｉｎ）；ベンザチンペニシリンＧ；ペニシリンＧカリウム；プロカインペニシリンＧ；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリンＶ；ベンザチンペニシリンＶ；ヒドラバミンペニシリンＶ；ペニシリンＶカリウム；ペンチジドン（Ｐｅｎｔｉｚｉｄｏｎｅ）ナトリウム；アミノサリチル酸フェニル；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリン（Ｐｉｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）ナトリウム；ピリジシリンナトリウム；塩酸ピルリマイシン（Ｐｉｒｌｉｍｙｃｉｎ）；塩酸ピバンピシリン；ピバンピシリンパモエート；ピバンピシリンプロベネート；硫酸ポリミキシンＢ；ポルフィロマイシン；プロピカシン（Ｐｒｏｐｉｋａｃｉｎ）；ピラジンアミド；ピリチオン亜鉛；酢酸キンデカミン（Ｑｕｉｎｄｅｃａｍｉｎｅ）；キヌプリスチン（Ｑｕｉｎｕｐｒｉｓｔｉｎ）；ラセフェニコール；ラモプラニン（Ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）；ラニマイシン（Ｒａｎｉｍｙｃｉｎ）；レロマイシン（Ｒｅｌｏｍｙｃｉｎ）；レプロマイシン（Ｒｅｐ���ｏｍｉｃｉｎ）；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファンピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロサラマイシン（Ｒｏｓａｒａｍｉｃｉｎ）；酪酸ロサラマイシン；プロピオン酸ロサラマイシン；リン酸ロサラマイシンナトリウム；ステアリン酸ロサラマイシン；ロソキサシン（Ｒｏｓｏｘａｃｉｎ）；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン（Ｓａｎｃｙｃｌｉｎｅ）；サンフェトリネン（Ｓａｎｆｅｔｒｉｎｅｍ）ナトリウム；サルモキシシリン（Ｓａｒｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）；サルピシリン（Ｓａｒｐｉｃｉｌｌｉｎ）；スコパフンギン（Ｓｃｏｐａｆｕｎｇｉｎ）；シソマイシン；硫酸シソマイシン；スパルフロキサシン（Ｓｐａｒｆｌｏｘａｃｉｎ）；塩酸スペクチノマイシン；スピラマイシン；塩酸スタリマイシン（Ｓｔａｌｌｉｍｙｃｉｎ）；ステフィマイシン（Ｓｔｅｆｆｉｍｙｃｉｎ）；硫酸ストレプトマイシン；ストレプトニコジド；スルファベンズ；スルファベンザミド；スルファセトアミド；スルファセトアミドナトリウム；スルファシチン；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメータ；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニル酸亜鉛；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト（Ｓｕｌｆａｚａｍｅｔ）；スルフィソキサゾール；スルフィソキサゾールアセチル；スルフィソキサゾールジオラミン；スルホミキシン；スロペネム（Ｓｕｌｏｐｅｎｅｍ）；スルタミシリン（Ｓｕｌｔａｍｉｃｉｌｌｉｎ）；サンシリン（Ｓｕｎｃｉｌｌｉｎ）ナトリウム；塩酸タランピシリン；テイコプラニン；塩酸テマフロキサシン（Ｔｅｍａｆｌｏｘａｃｉｎ）；テモシリン；テトラサイクリン；塩酸テトラサイクリン；リン酸テトラサイクリン錯体；テトロキソプリム（Ｔｅｔｒｏｘｏｐｒｉｍ）；チアンフェニコール；チフェンシリン（Ｔｈｉｐｈｅｎｃｉｌｌｉｎ）カリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン（Ｔｉｃｌａｔｏｎｅ）；塩化チドニウム（Ｔｉｄｏｎｉｕｍ）；トブラマイシン；硫酸トブラマイシン；トスフロキサシン（Ｔｏｓｕｆ
ｌｏｘａｃｉｎ）；トリメトプリム；硫酸トリメトプリム；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；硫酸トロスペクトマイシン（Ｔｒｏｓｐｅｃｔｏｍｙｃｉｎ）；チロスリシン；バンコマイシン；塩酸バンコマイシン；バージニアマイシン；ゾルバマイシン；塩酸ジフロキサシン（Ｄｉｆｌｏｘａｃｉｎ）；ラウリルイソキノリニウムブロミド；モキサラクタム二ナトリウム；オルニダゾール；ペンチソマイシン（Ｐｅｎｔｉｓｏｍｉｃｉｎ）；および塩酸サラフロキサシン（Ｓａｒａｆｌｏｘａｃｉｎ）、ならびにそれらの誘導体、および組合せ。
【０１１７】
本発明のいくつかの局面において、ＢＢＢの透過性は、治療可能な抗炎症剤を送達するためにモジュレートされる。このような抗炎症剤は、炎症応答を減少させ、そしてそれらとしては、以下のステロイド系化合物および非ステロイド系化合物が挙げられる：アルクロフェナック；ジプロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド；αアミラーゼ；アンシナファル（Ａｍｃｉｎａｆａｌ）；アンシナフィド（Ａｍｃｉｎａｆｉｄｅ）；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリロース（Ａｍｉｐｒｉｌｏｓｅ）；アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）；アニロラク（Ａｎｉｒｏｌａｃ）；アニトラザフェン（Ａｎｉｔｒａｚａｆｅｎ）；アパゾン；バルサラジド（Ｂａｌｓａｌａｚｉｄｅ）二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモル（Ｂｒｏｐｅｒａｍｏｌｅ）；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン（Ｃｉｃｌｏｐｒｏｆｅｎ）；シンタゾン（Ｃｉｎｔａｚｏｎｅ）；クリプロフェン（Ｃｌｉｐｒｏｆｅｎ）；プロピオン酸クロベタゾール；クロベタゾンブチラート；クロピラク（Ｃｌｏｐｉｒａｃ）；プロピオン酸クロチカゾン（Ｃｌｏｔｉｃａｓｏｎｅ）；酢酸コルメタゾン（Ｃｏｒｍｅｔｈａｓｏｎｅ）；コルトドキソン（Ｃｏｒｔｏｄｏｘｏｎｅ）；デフラザコート（Ｄｅｆｌａｚａｃｏｒｔ）；デソニド；デスオキシメタゾン；デキサメタゾン；ジプロピオネート；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；二酢酸ジフロラゾン；ジフルミドン（Ｄｉｆｌｕｍｉｄｏｎｅ）ナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドネート（Ｄｉｆｌｕｐｒｅｄｎａｔｅ）；ジフタロン（Ｄｉｆｔａｌｏｎｅ）；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド（Ｄｒｏｃｉｎｏｎｉｄｅ）；エンドリソン；エンリモマブ（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）；エノリカム（Ｅｎｏｌｉｃａｍ）ナトリウム；エピリゾール；エトドラク（Ｅｔｏｄｏｌａｃ）；エトフェナメート（Ｅｔｏｆｅｎａｍａｔｅ）；フェルビナク（Ｆｅｌｂｉｎａｃ）；フェナモル（Ｆｅｎａｍｏｌｅ）；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク（Ｆｅｎｃｌｏｒａｃ）；フェンドサール（Ｆｅｎｄｏｓａｌ）；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン（Ｆｌａｚａｌｏｎｅ）；フルアザコート（Ｆｌｕａｚａｃｏｒｔ）；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；酢酸フルオロメトロン；フルカゾン（Ｆｌｕｑｕａｚｏｎｅ）；フルルビプロフェン；フルレトフェン（Ｆｌｕｒｅｔｏｆｅｎ）；プロピオン酸フルチカゾン（Ｆｌｕｔｉｃａｚｏｎｅ）；フラプロフェン（Ｆｒａｐｒｏｆｅｎ）；フロブフェン（Ｆｕｒｏｂｕｆｅｎ）；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタゾール；酢酸ハロプレドン；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダプ（Ｉｌｏｎｉｄａｐ）；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール（Ｉｎｔｒａｚｏｌｅ）；酢酸イソフルプレドン；イソキセパク（Ｉｓｏｘｅｐａｃ）；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール（Ｌｏｆｅｍｉｚｏｌｅ���；ロルノキシカム（Ｌｏｒｎｏｘｉｃａｍ）；ロテプレドノールエタボネート（Ｌｏｔｅｐｒｅｄｎｏｌ  Ｅｔａｂｏｎａｔｅ）；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリソン（Ｍｅｃｌｏｒｉｓｏｎｅ）ジブチラート；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン（Ｍｅｓｅｃｌａｚｏｎｅ）；メチルプレドニゾロンスレプタネート；モルニフルメート（Ｍｏｒｎｉｆｌｕｍａｔｅ）；ナブメトン（Ｎａｂｕｍｅｔｏｎｅ）；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン（Ｎｉｍａｚｏｎｅ）；オルサラジン（Ｏｌｓａｌａｚｉｎｅ）ナトリウム；オルゴテイン（Ｏｒｇｏｔｅｉｎ）；オルパノキシン（Ｏｒｐａｎｏｘｉｎ）；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン（Ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；グリセリン酸フェンブタゾンナトリウム；ピルフェニドン（Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）；ピロキシカム；ケイ皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナザート（Ｐｒｅｄｎａｚａｔｅ）；プリフェロン（Ｐｒｉｆｅｌｏｎｅ）；プロドール酸；プロカゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン（Ｒｉｍｅｘｏｌｏｎｅ）；ロマザリト（Ｒｏｍａｚａｒｉｔ）；サルコレクス（Ｓａｌｃｏｌｅｘ）；サルナセジン（Ｓａｌｎａｃｅｄｉｎ）；サルサラート；塩化サンギナリウム；セクラゾン（Ｓｅｃｌａｚｏｎｅ）；セルメタシン（Ｓｅｒｍｅｔａｃｉｎ）；スドキシカム（Ｓｕｄｏｘｉｃａｍ）；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン（Ｔａｌｍｅｔａｃｉｎ）；タルニフルメート（Ｔａｌｎｉｆｌｕｍａｔｅ）；タロサラート；テブフェロン（Ｔｅｂｕｆｅｌｏｎｅ）；テニダプ（Ｔｅｎｉｄａｐ）；テニダプナトリウム；テノキシカム；テシカム（Ｔｅｓｉｃａｍ）；テシミド；テトリダミン；チオピナク（Ｔｉｏｐｉｎａｃ）；ピバル酸チキソコルトル（Ｔｉｘｏｃｏｒｔｏｌ）；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド（Ｔｒｉｃｌｏｎｉｄｅ）；トリフルミデート（Ｔｒｉｆｌｕｍｉｄａｔｅ）；ジドメタシン（Ｚｉｄｏｍｅｔａｃｉｎ）；ゾメピラックナトリウム。
【０１１８】
使用され得るさらなる非ステロイド系抗炎症剤としては、アスピリン、ジクロフェナク、フルビプロフェン、イブプロフェン、ケトロラク、ナプロキセン、およびスプロフェンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなるバリエーションにおいて、上記抗炎症剤は、ステロイド系抗炎症剤である。
【０１１９】
本発明のいくつかの局面において、ＢＢＢの透過性は、抗凝固性である治療可能な薬剤を送達するためにモジュレートされる。このような抗凝固剤は、血液の凝固を妨げる分子であり、そしてそれらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アンクロッド；抗凝固性クエン酸デキストロース溶液；抗凝固性クエン酸リン酸デキストロースアデノシン溶液；抗凝固性クエン酸リン酸デキストロース溶液；抗凝固性へパリン溶液；抗凝固性クエン酸ナトリウム溶液；アルデパリンナトリウム；ビバリルジン；ブロミンジオン；ダルテパリンナトリウム；デシルジン；ジクマロール；へパリンカルシウム；へパリンナトリウム；アポラート（Ｌｙａｐｏｌａｔｅ）ナトリウム；メシル酸ナファモスタット；フェンプロクモン；チンザパリンナトリウム；ワルファリンナトリウム。
【０１２０】
本発明のいくつかの局面において、ＢＢＢの透過性は、抗血栓性である治療可能な薬剤を送達するためにモジュレートされる。抗血栓分子は、本明細書中で使用される場合、血栓の形成を妨げる分子であり、そしてそれらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：塩酸アナグレリド；ビバリルジン；ダルテパリンナトリウム；ダナパロイドナトリウム；塩酸ダゾキシベン；硫酸エフェガトラン；エノキサパリンナトリウム；イフェトロバン；イフェトロバンナトリウム；チンザパリンナトリウム；トリフェナグレル。
【０１２１】
本発明のいくつかの局面において、造影剤（例えば、放射性同位体および蛍光性薬剤）は、変化したＢＢＢを通って送達される。これらの薬剤は、ＣＮＳまたはＣＮＳの特定の領域を画像化するために特に有用である。さらに、放射性同位体は、例えば、Ｈａｒｂｅｒｔ、「Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９８７、ｐｐ．１−３４０に記載されるように、癌および他の病理学的状態の処置のために使用され得る。いくつかの実施形態においては、放射性同位体としては、短い半減期を有する同位体および同位体の塩が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、Ｙ−９０、Ｐ−３２、１−１３１、Ａｕ  １９８。
【０１２２】
放射性同位体、薬物、および毒素が特定の細胞によって産生されるか、または特定の細胞に関連するマーカーに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントに結合体化され得ること、およびこのような抗体結合体が、放射性同位体、薬物または毒素を腫瘍部位に対して標的化して、それらの治療効力を増強し、そして副作用を最小化するために使用され得ることもまた、周知である。これらの薬剤および方法の例は、ＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋおよびＴｈｏｒｐｅ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒに対する導入、Ｌ．Ｍ．ＦｒａｎｋｓおよびＮ．Ｍ．Ｔｅｉｃｈ編、第１８章、ｐｐ．３７８−４１０、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８６）、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．−Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、３−３００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）、Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｒ．Ｏ．（ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １：３５７、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８４）、Ｐａｓｔａｎら（Ｃｅｌｌ  ４７：６４１、１９８６）、Ｖｉｔｅｔｔａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８−１１０４、１９８７）およびＢｒａｄｙら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１３：１５３５−１５４４、１９８７）において概説される。癌のための免疫結合体の使用および他の形態の治療の他の例は、とりわけ、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，４６０，４５９号、同第４，４６０，５６１号および同第４，６２４，８４６号、ならびにＲｏｗｌａｎｄ、米国特許第４，０４６，７２２号、Ｒｏｄｗｅｌｌら、米国特許第４，６７１，９５８号、ならびにＳｈｉｈら、米国特許第４，６９９，７８４号（これらの全ての開示は、本明細書にその全体が参考として援用される）に開示されている。
【０１２３】
血管新生因子または抗血管新生因子はまた、必要とされる場合、脳の状態を処置するために送達され得る。血管新生（組織における新規の血管の増殖）は、最近増加した研究の目的となっている。組織の領域に対する酸素負荷された血液の新規供給を提供するこのような血管増殖は、種々の組織および筋肉の病気、特に、虚血を治療する可能性を有する。主に、研究は、血管新生因子（例えば、遺伝子工学技術から産生されるヒト増殖因子）を完成させることに集中している。心筋組織へのこのような増殖因子の注入は新規の高密度な組織内の毛細血管網によって示されるその部位での血管新生を開始するが、報告されている。Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｏ−Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９８；９７：６４５−６５０。血管新生因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＥＧＦ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＨＯ−１、ＳＯＤ、ＮＯＳＩＩ、ＮＯＳＩＩＩ、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、ＴＧＦ−β、アンギオポエチン−１、ｂＦＧＦ、およびマクロファージ走化活性化タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、およびそれらの機能的誘導体または組合せ。
【０１２４】
処置の持続期間およびレジメンは、処置される特定の状態および被験体に依存して変動し得る。例えば、治療剤は、少なくとも１、７、１４、３０、６０、９０日、または数カ月、数年にわたってか、あるいは被験体の寿命を通して本発明の方法によって投与され得る。
【０１２５】
（本発明の薬学的組成物）
本明細書に開示される本発明の１つ以上の方法は、生物学的に活性な薬剤を選択するために利用され得、その生物学的に活性な薬剤は、次いで脱髄の処置に関与し得る。再ミエリン化をモジュレートするために有効な選択された生物学的に活性な薬剤は、ニューロンの脱髄障害を処置するための医薬の調製のために使用され得る。１つの局面において、本発明の同定／選択された生物学的に活性な薬剤は、病原体（例えば、細菌およびウイルス）によって与えられたニューロンの脱髄を処置するために投与され得る。別の局面において、上記選択された薬剤は、毒性物質によって引き起こされるニューロンの脱髄、または例えば、橋中央ミエリン溶解およびビタミン欠乏症などでの身体における毒性代謝産物の蓄積を処置するために使用され得る。なお他の局面において、上記薬剤は、身体的な傷害（例えば、脊髄傷害）によって引き起こされる脱髄を処置するために使用され得る。さらになお別の局面において、上記薬剤は、遺伝的特性を有する障害、遺伝的障害（白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、変性性多系統委縮症、ビンスワンガー脳症、中枢神経系における腫瘍、および多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない）において発現される脱髄を処置するために投与され得る。
【０１２６】
種々の送達系が、公知であり、そして本発明の生物学的に活性な薬剤を投与するために使用され得る（例えば、リポソーム中の封入、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、（１９８７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの部分としての治療用核酸の構築など）。送達の方法としては、動脈内経路、筋肉内経路、静脈内経路、鼻腔内経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物を処置が必要な領域に対して局所的に投与することが、望まれ得る；これは、例えば、限定のためではなく、外科手術の間の局所注入、注射、またはカテーテルによって達成され得る。特定の実施形態において、上記薬剤は、被験体の神経系、好ましくは中枢神経系に送達される。別の実施形態において、上記薬剤は、再ミエリン化を受けるニューロン組織に投与される。
【０１２７】
選択された薬剤の投与は、処置の過程全体を通して連続的または間欠的に１つの用量で達成され得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、そして治療のために使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される被験体に伴って変化する。単回投与または複数回投与は、処置する医師によって選択される用量のレベルおよび様式によって行われ得る。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物の調製は、薬学的調製物の調製のための一般に受容される手順に従って行われる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１８版（１９９０）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ＰＡを参照のこと。投与の意図される用途および様式に依存して、薬学的組成物の調製において活性成分をさらに処理することが、望まれ得る。適切な処理は、適切な非毒性成分および非干渉成分と混合すること、滅菌すること、用量単位に分割すること、および送達デバイスに封入することを含み得る。
【０１２９】
経口投与、鼻腔内投与、または局所投与のための薬学的組成物は、固体形態、半固体形態または液体形態（錠剤、カプセル、粉末、液体、および懸濁物が挙げられる）で供給され得る。注射のための組成物は、液体溶液または懸濁物、エマルション、あるいは注射前の液体における溶解または懸濁に適した固体形態として供給され得る。気道を介する投与に関して、好ましい組成物は、適切なエアロゾル噴霧器（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｒ）デバイスと一緒に使用される場合に固体、粉末、またはエアロゾルを提供するものである。
【０１３０】
薬学的に受容可能な液体組成物は、例えば、液体賦形剤（例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、またはエタノール）に本明細書中で例示されるポリペプチドを溶解または分散することによって調製され得る。上記組成物はまた、他の薬剤、医薬品、アジュバント、キャリア、または補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝化剤）を含み得る。
【実施例】
【０１３１】
（実施例１）
トレーサー透過性研究：ラットを、ケタミン／キシラジンカクテルによって麻酔した。胸腔を、切開し、そして右心房を、小さい解剖用剪刀によって切開した。ビオチン（ＤＰＢＳ中にｌ〜２ｍｇ／ｍｌ）を、ｄｙｎａｍａｘ蠕動ポンプを１０分間にわたって使用して左心室に１５分間にわたって灌流し、次いで、１０〜１５分間の４％パラホルムアルデヒドを灌流した。次いで、固定したラット脳／組織を、３０％スクロース中に沈める前に４％パラホルムアルデヒド中で４度にて一晩インキュベートした。次いで、その脳および組織を、２：１  ３０％スクロース対ＯＣＴ混合物中で凍結し、そして１２〜１６μｍの凍結切片を、クリオスタットを使用して作製した。切片を、ＰＢＳにおいて再水和し、次いで、１：５００ストレプトアビジンａｌｅｘａ−４８８と一緒にインキュベートする前に５０％ヤギ血清によってブロックした。次いで、アビジン−ビオチン複合体を、蛍光顕微鏡検査によって可視化した。透過性をまた、ビオチンの代わりに１０ｋＤローダミン−デキストラン（ＤＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍｌ）を使用して評価した。この場合において、デキストランを、切片した後に直接的に可視化した。
【０１３２】
免疫組織化学を使用し、それは、ＥＢＡ免疫反応性は成体ラット中枢神経系全体にわたる血管において特異的に可視化され得るが、末梢組織（例えば、肝臓、肺または筋肉）においては特異的に可視化されないことを示した（図２３）。ＥＢＡ反応性は、初期の出生後発達の間に可視化されないが、ｐ１７でＣＮＳ脈管のサブセットにおいて最初に観察され、次いでｐ２０で全てのＣＮＳ脈管全体にわたって観察される（図２３；Ｃ〜Ｄ）。このことは、胚形成においてＣＮＳ内皮細胞によって発現され始め、そして出生後の生活全体を通して持続するオクルディン、ｐ−糖タンパク質、ｇｌｕｔ−１およびトランスフェリンレセプターを含む他の公知のＢＢＢマーカーとは対照的である。
【０１３３】
ＢＢＢの透過性は、分子トレーサーによってラットを灌流し、そしてこれらのトレーサーが脳実質中に拡散し得るか否かを可視化することによって決定される。ＢＢＢは、誕生後および出生後の発達および成人期を通して、ビオチン（ＭＷ−２５０ダルトン  １ｍｇ／ｍｌ）またはテトラメチル−ローダミンデキストラン（約１０ｋＤ、２ｍｇ／ｍｌ）に対して不透過性であることが示され、このことは、ＢＢＢ出生後の発達前に形成することを示す（図２３；Ｂ〜Ｅ）。しかし、増大したビオチン濃度（例えば、２ｍｇ／ｍｌ）によって、ＢＢＢは、ｐ１８までこの高いレベルのトレーサーに感受性であった（図２４；Ｉ〜Ｋ）。興味深いことに、これは、ＥＢＡ発現の時期と一致する。
【０１３４】
（実施例２）
ＳＭＩ７１（抗ＥＢＡ抗体）による染色：成体ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）を、ケタミン／キシラジンカクテルの腹腔内注射によって麻酔した。そのラットの胸腔を、切開して心臓を露出させた。その心臓の右心房を、鋭利な剪刀によって切り、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水を、その心臓の左心室に１０分間にわたって灌流し、次いで４％パラホルムアルデヒドによる灌流を行った。固定した脳を、解剖し、そしてさらに、４％  ＰＦＡ中で一晩にわたって水浸固定し、次いで３０％スクロースにおいてさらに一晩にわたって平衡化した。次いで、その脳および末梢組織を、３０％スクロース：ＯＣＴの２：１混合物中で凍結し、そして１０〜２０ミクロンの切片を、クリオスタットを使用して切断した。脳および組織切片を、メタノール／０．３％過酸化水素混合物によって３０分間にわたってブロックし、次いで５０％ヤギ血清によってさらに３０分間にわたってブロックした。次いで、ＳＭＩ７１抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を、４度にて一晩インキュベートした。
【０１３５】
ＳＭＩ７１の可視化を、ベクタステインマウスＩｇＧ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ  ＰＫ６１０２）を使用し、次いで、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質反応（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ  ＳＫ−４１００）を使用して行った。解離培養物のために、成体ラットを、二酸化炭素によって安楽死させた。脳の皮質領域を、解剖し、そしてＬ−システイン（０．４ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮＡｓｅ（１２５Ｕ／ｍｌ）を含む１６５ユニットのパパインによって３０分間にわたって３５度で酵素的に消化した。５ｍｌピペットで粉砕することによる機械的分離の後、細胞を、１０００ｇでの遠心分離によって回収し、そして２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）においてポリＤ−リジンによってコーティングしたカバーガラスにプレートした。細胞を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ  ＨＲＰキットを使用して１：１０００  ＳＭＩ７１抗体によって４度にて一晩染色し、次いで４％  ＰＦＡによる固定を行い、５０％ヤギ血清によってブロックし、その後ヤギ抗マウスａｌｅｘａ  ４８８結合体化二次抗体と一緒にインキュベートした。同時標識実験のために、内皮細胞をまた、１：５００抗ＶＷＦ（ＤＡＫＯ）一次抗体およびヤギ抗ウサギａｌｅｘａ  ５９４によって標識した。切片を、エタノールによって再水和し、キシレンによって洗浄し、そして光学顕微鏡下で見た。
【０１３６】
（実施例３）
発現クローニング：Ｂｉｏｃｈａｉｎから購入した成体ラット脳ｃＤＮＡライブラリーを、Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換し、そして１プレートあたり２０００個のコロニーであるようにＬＢ−アンピシリンプレートに拡散した。各プレートからのコロニーを、一緒に擦過して、コロニーのプールを形成した。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを使用して単離し、そしてリポフェクチン２０００を使用してＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。カバーガラス上で増殖させた細胞を、次いで、ＤＰＢＳ中の１：１０００  ＳＭＩ７１抗体と一緒に４℃にて一晩インキュベートし、その後、４％の冷ＰＦＡ中で１０分間にわたって固定し、５０％ヤギ血清によって３０分間にわたってブロックし、その後、ヤギ抗マウスａｌｅｘａ  ４８８抗体と一緒に１．５時間にわたって室温でインキュベートした。カバースリップを、次いで、ＤＡＰＩを伴うｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを使用してスライドガラス上にのせ、そして蛍光顕微鏡によって可視化した。ポジティブプール由来のＤＮＡを、次いで、Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換し、そして２００個のコロニー／ディッシュでプレートした。
【０１３７】
ＣＯＳ−１細胞の染色を、上記のように免疫蛍光を使用して行った。ポジティブプールを、ｓｉｂ選択技術を使用して２００個のプールへと分離した。簡単にいうと、ポジティブプールを、Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換し、次いで、１プレートあたり２００個のコロニーによってＬＢ−Ａｍｐにプレートした。個々のプレートを、擦過して、２００個のプールを産生した。ＤＮＡを、単離し、そして上記のようにＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。ポジティブサブプールの同定後、次いで、これらを、２０個のプールへと狭め、次いで個々のクローンへと狭めた。個々のポジティブクローンを、Ｔ７順方向プライマーおよびＴ７逆方向プライマーならびにＭ１３順方向プライマーおよびＭ１３逆方向プライマーを使用してＳｔａｎｆｏｒｄ  ＰＡＮ施設によって配列決定した。
【０１３８】
発現クローニングがＥＢＡの同定のために有用な技術であるか否かを試験するために、ＳＭＩ７１抗体の特異性を、決定した。これを達成するために、生（ｌｉｖｅ）の免疫蛍光染色を、急性に解離した成体ラット皮質細胞において行った。これらの培養物において、ＳＭＩ７１抗体は、内皮細胞マーカーＶＷＦによって二重標識した細胞の小さい円形の集塊を染色した（図２４；Ｆ〜Ｇ）。上記抗体は、この懸濁物において他の細胞を染色せず、このことは、その抗体が内皮抗原に高度に特異的であることを示唆した。ＳＭＩ７１抗体の高い程度の特異性に起因して、成体ラット脳ｃＤＮＡライブラリーからもたらされた任意の抗原はＥＢＡ抗原であることが、証明された。成体ラット脳ｃＤＮＡ発現ライブラリーを１５００〜３０００個のプールへと分離する工程を包含する分子クローニングアプローチを、利用した。ＣＯＳ−１細胞へのこれらのプールのトランスフェクション後、ポジティブクローンを含むプールを、ＳＭＩ７１抗体を用いた生の染色によって同定した。
【０１３９】
３００，０００個のクローンに対するスクリーニング後、単一のポジティブプールを、同定した（図２５）。ｓｉｂ選択技術を使用して、上記プール中のクローンの数を、単一のポジティブクローンが得られるまで減少させた（図２５Ｆ）。配列決定後、このクローンがＮｇｒ２（ニューロンにおいて発現されると考えられるＧＰＩ連結分子）であることを、検証した。
【０１４０】
いくつかのアプローチを、正しいクローンが同定されたことを確認するために使用した。Ｎｇｒ２トランスフェクトＣＯＳ−１細胞は、種々の非特異的ＩｇＭコントロール抗体、または利用したヤギ抗マウス二次抗体に結合せず（図２４）、このことは、その結合がＳＭＩ７１に特異的であることを示す。次に、Ｎｇｒ２のｓｉＲＮＡノックダウンは、Ｎｇｒ２トランスフェクトＣＯＳ−１細胞に対するＳＭＩ７１の結合を阻害し、そして標的分子のｓｉＲＮＡノックダウンは、Ｎｇｒ２トランスフェクトＣＯＳ−１細胞に対するＳＭＩ７１の結合を阻害しなかった（図２４；Ｂ、Ｄ、Ｆ）。さらに、ＰＩ−ＰＬＣの酵素作用によるＧＰＩ連結の除去もまた、Ｎｇｒ２トランスフェクトＣＯＳ−１細胞に対するＳＭＩ７１結合を妨害した（図２４；Ｅ〜Ｆ）。さらに、ＳＭＩ７１抗体は、２つの相同的なタンパク質（ＮｇｒおよびＮｇｒ３）によってトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を染色しなかった（図２４Ｉおよび図２４Ｋ）。これらの実験は、ＳＭＩ７１がＣＯＳ−１細胞においてＮｇｒ２に結合することを示し、このことは、観察された染色がＳＭＩ７１抗体とＮｇｒ２タンパク質との間の特異的相互作用を示すことを実証する。
【０１４１】
（実施例４）
精製された内皮細胞に対するＲＴ−ＰＣＲ。成体ラットを、二酸化炭素によって安楽死させた。脳および脾臓を、切り出し、上記のように酵素的に解離させた。内皮細胞を、Ｃ５抗体によるネガティブパニング後に抗ＣＤ３１抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてイムノパニングを行うことによって単離した。結合しなかった細胞を洗い流した後、残った内皮細胞を、ＲＬＴ緩衝液によって溶解し、そしてＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎからのＲＮＡｅａｓｙキットを使用して単離した。３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲを、ラットＮｇｒｈ１配列から得られ、ｍｅｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓウェブサイト（ｗｗｗ２．ｅｕｒ．ｎｌ／ｆｇｇ／ｃｈｌ／ｍｅｎｕ／ｍｅｎｕ２．ｈｔｍｌ）において同定された多くのプライマー（アクセッション番号ＡＦ５３２８６０；順方向プライマー：ｃａｃａｇｃｇａｃｔｃｔｔｃｔｔｇｃａｇ（配列番号１）、ａｃｔｇｇａｃｃｔｃｇｇｔｇａｃａａｔｃ（配列番号２）、ｔｔｇｃａｇａａｃａａｃｃｔｃａｔｔｃｇ（配列番号３）、ｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｇｇｃｔｃｔｔｃｔｃ（配列番号４）．逆方向プライマー：ｇａｔｔｇｔｃａｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔ（配列番号５）、ａｇｇａａａａｇｇｔｇｇｃｔｃａｇｇｔｔ（配列番号６）、ｇａｔｔｇｔｃａｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔ（配列番号７）、ｔａｇｔｇａｃｔｇｃａｇｃｃｔｃｔｃｃａ（配列番号８））を利用して行った。ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムを含む１％アガロースゲル上で分離し、そしてＵＶ光によって可視化した。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｎｇｒ２  ｃＤＮＡの異なる領域に対するプライマーを利用して、精製された脳内皮細胞および脾臓内皮細胞から単離されたｍＲＮＡに対して行った。興味深いことに、Ｎｇｒ２は、脳内皮細胞および脾臓内皮細胞の両方において発現されたが、しかし、脳内皮細胞に特異的であるスプライス改変体は、存在しなかった（図２６Ａ）。この改変体の配列決定後、それは、オープンリーディングフレームシフトおよび早発の終止コドンをもたらす２３塩基対の挿入を有する転写物を示した（図２６Ｂ）。興味深いことに、このタンパク質は、細胞表面に分泌されるが、ＧＰＩ連結されないと予想される。このことに一致して、ＰＩ−ＰＬＣの酵素的切断は、解離ラット皮質培養物中の内皮細胞に対するＳＭＩ７１結合を妨害しなかった。
【０１４２】
脳ホモジネートおよび脈管画分を、スプライス改変体の存在を確認するためにウェスタンブロットイムノアッセイによって分析した。市販のＮｇｒ２抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ウェスタンブロットアッセイのために利用した。なぜならば、それは、Ｎｇｒ２トランスフェクトＣＯＳ−１細胞のバンドと反応するが、偽トランスフェクト細胞のバンドとは反応しないからである（図２６Ｃ）。ラット脳脈管を、単離し、そしてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて、氷上のＤＰＢＳ中でホモジナイズし、そして２００Ｏｇで１０分間にわたって４℃にてスピンした。ペレットを、ＰＢＳに再懸濁し、そして１５％デキストラン溶液（ＭＷ  ３５ｋＤ〜４５ｋＤ）の上に積層し、そして３５００ｇで５５分間にわたって遠心分離した。次いで、ペレット中の脈管画分を、収集し、ＰＢＳによって洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁し、そして−８０℃で保存した。脈管および脳ホモジネートを、１：５００ヤギ抗Ｎｇｒ２抗体を使用し、次いで、ロバ抗ヤギＨＲＰ結合体化二次抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１４３】
興味深いことに、脳ホモジネートは、予想される全長Ｎｇｒ２を含んだが、脈管画分は、より小さいダブレットを含んだ（図２６Ｃ）。このダブレットは、予想される切断されたＮｇｒ２よりも大きく移動したが、翻訳後のグリコシル化を含み得る。
【０１４４】
ＳＭＩ７１が内皮細胞に特異的であり、ＣＯＳ−１細胞によって発現される外来Ｎｇｒ２に特異的であるという事実、およびＮｇｒ２がＣＮＳ内皮細胞において発現されるという事実は、Ｎｇｒ２がＥＢＡであることを示唆する。
【０１４５】
（実施例５）
脈管画分の単離：成体ラットを、二酸化炭素によって安楽死させた。脳を、切り出し、そして冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。１５００ｇでの遠心分離によって回収した後、ペレットを、０．５Ｍスクロースに再懸濁し、そして１．０〜１．５Ｍスクロース勾配に対して積層した。遠心分離後、脈管画分ペレットを、脳実質界面と同様に回収した。これらのサンプルを、遠心分離し、そしてＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁して、ウェスタンブロットによって分析した。
【０１４６】
ウェスタンブロット：サンプルを、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そしてＰＶＤＦ膜に転写した。５％ミルクにおいて１時間にわたって室温でブロックした後、膜を、１：１００抗Ｎｇｒｈ１抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、次いで二次のロバ抗ヤギＨＲＰ結合体化二次抗体と一緒に、４度にて一晩インキュベートした。シグナルを、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して現像し、そしてＸ線フィルム上に露出した。
【０１４７】
ＲＴ−ＰＣＲを、Ｎｇｒｈ１が脳内皮細胞において発現されることだけでなく、脳内皮細胞に特異的であり、そして他の内皮細胞においては発現されないスプライス形態が存在することをも実証するために、精製された内皮細胞に対して使用する。さらに、分画されたラット脳に対する市販のＮｇｒｈ１抗体を使用したウェスタンブロットによって、脳の残部からなくなる脈管画分に存在するＮｇｒｈ１抗体によって認識される特異的な二重鎖バンドが存在することを示した。ＳＭＩ７１抗体の顕著な特異性および脳内皮細胞におけるＮｇｒｈ１の存在に起因して、正しい標的が同定されたことが、検証された。
【０１４８】
本発明者らは、脳切片において、ＳＭＩ７１抗体染色が血管に限定されるが、解離培養物においては、ＳＭＩ７１抗体染色が内皮細胞を特異的に染色することを、観察した。
【０１４９】
したがって、ＳＭＩ７１に結合されるラット脳ｃＤＮＡライブラリーから発現される任意のタンパク質産物が所望の抗原であることが、分かる。成体ラット脳ｃＤＮＡ発現ライブラリー（ｂｉｏｃｈａｉｎ）を、２０００〜４０００個のクローンのプールへと分離し、そして各プールによってＣＯＳ−１細胞をトランスフェクトするために利用した。免疫蛍光顕微鏡検査を使用して、どの細胞がＳＭＩ７１に結合するかを、決定した。３００，０００個を上回るクローンを含む８４個のプールを分析した後、１個のポジティブプールを同定した。ｓｉｂ選択技術を使用して、上記プールのサイズを、単一のポジティブクローンが同定されるまで狭めた。このクローンは、多くのアイソタイプ特異的コントロールによって認識されず、このことは、結合がＳＭＩ７１抗体に特異的であることを示唆する。配列決定後、分子標的を、Ｎｇｒｈ１として同定した。
【０１５０】
精製された内皮細胞に対するＲＴ−ＰＣＲを、Ｎｇｒｈ１が脳内皮細胞において発現されることだけでなく、脳内皮細胞に特異的であり、そして他の内皮細胞において発現されないスプライス改変体形態が存在することをも実証するために利用した。さらに、分画されたラット脳に対する市販のＮｇｒｈ１抗体を使用したウェスタンブロットによって、脳の残部からなくなる脈管画分に存在するＮｇｒｈ１抗体によって認識される特異的なダブレットバンドが存在することを示した。ＳＭＩ７１抗体の顕著な特異性および脳内皮細胞におけるＮｇｒｈ１の存在に起因して、正しい標的が同定されたことは、明白である。
【０１５１】
（実施例６）
ＮｇＲＨ１欠損マウスのＢＢＢ。興味深いことに、ＥＢＡは、ＢＢＢの成熟において遅くに発現され、その発現は、脳切片において約ｐ１５またはｐ１７にて始まり、次いでｐ２０で全ＣＮＳレベルにわたって始まるようである。
【０１５２】
Ｎｇｒｈ１欠損マウスのＢＢＢを、トレーサーの全身送達によって機能を調べ、かつ電子顕微鏡検査によって超微細構造を調べる。Ｎｇｒｈ１欠損マウスは、生存可能であり、そしてこのことは、Ｎｇｒｈ１欠損マウスがＢＢＢにおいて致命的（例えば、致死的出血）であるような大きな欠損を有さないことを示す。したがって、このようなマウスは、より高い濃度のトレーサーまたは超微細構造分析によって検出され得るより僅かな欠損を有し得る。このような場合は、トレーサーに対する正常な透過性を有するオクルディン欠損マウスにおいて観察されるが、脳のカルシウム沈着は、カルシウムに対するＢＢＢの透過性の僅かな変化を示唆する。
【０１５３】
Ｎｇｒｈ１欠損マウスがＢＢＢにおいて機能的欠損を有するか否かを決定するために、ヘテロ接合体マウスを、Ｎｇｒｈ１欠損マウスならびに野生型同腹仔およびヘテロ接合体同腹仔を産生するために繁殖させる。成体マウスを、ビオチン（５００Ｄ）ならびに１０ｋＤテトラメチルローダミンデキストランおよび７０ｋＤテトラメチルローダミンデキストランを含む種々の分子量のトレーサーによって灌流する。これらのマウスの脳を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、３０％スクロースに沈め、そしてＯＣＴ中に包理する。マウスの脳、脊髄および視神経の１０ミクロンの凍結切片を作製した後、上記トレーサーを、蛍光顕微鏡検査によって可視化する。デキストラントレーサーは、直接的に可視化され得るが、ビオチントレーサーは、ａｌｅｘａ−４８８に結合体化したストレプトアビジンによって染色後に可視化される。本発明者らはまた、トレーサーの濃度を変動させる。ビオチンを、１．０〜２．０ｍｇ／ｍｌにて使用し、一方でデキストランを、０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌにて使用する。
【０１５４】
ＢＢＢの機能を評価するために、トレーサーを、それらが毛細血管の管腔内に存在するか、または脳実質全体に拡散する（即ち、透過性／関門崩壊の増大）かを決定するためにアッセイした。得られたデータは、ＢＢＢが高濃度のトレーサー（２．０ｍｇ／ｍｌ  ビオチン）に対して損なわれるが、低濃度のトレーサー（１．０ｍｇ／ｍｌ  ビオチン）に対しては損なわれないか否かを提供する。この高感度アッセイは、これらの動物のＢＢＢが完全に成熟するか、または初期発育段階にとどまるかを決定する。これが上記の例である場合、そのことは、Ｎｇｒｈ１が成体における低い透過性をもたらすＢＢＢ成熟の最終段階に必要とされることを示唆する。このことは、いくつかの研究がＢＢＢにおける小さな混乱が脳の発達および機能に対して大きな帰結をもたらし得ることを示唆するので、非常に興味深い。例えば、クローディン５における多形性が、ヒトの統合失調症に関連している一方で、Ｍｏｏｄｙ（ハエのＢＢＢに必要とされるタンパク質）における変異は、一般的に乱用される薬物に対する変化した感受性をもたらす。
【０１５５】
（実施例７）
ＮｇＲＨ１欠損マウスのＢＢＢ構造。成体げっ歯類の脳内皮細胞は、関門特性を欠く内皮細胞とは形態学的に異なる。脳内皮細胞は、密着結合によって一緒に保持され、細胞内小胞をほとんど含まず、そしてそれらの細胞膜において開口部を欠く。興味深いことに、ＳＭＩ７１抗体の全身注射は、これらの構造の各々に影響を及ぼすようである。電子顕微鏡検査は、この抗体を注射されたマウスのＢＢＢが、より弱い密着結合、より多くの細胞内小胞を有し、そして開口部を形成するようであることを示した。実際に、ＳＭＩ７１の全身注射は、ＢＢＢを破壊する。
【０１５６】
ラットに、生きた内皮細胞に結合する抗ＥＢＡ抗体または抗ＣＤ３１抗体コントロールのいずれかを注射した。２０分後、そのラットを、ビオチントレーサーによって灌流し、そのビオチントレーサーは、次いで、パラホルムアルデヒド固定後に凍結切片において可視化された。上記抗ＥＢＡ抗体は、ＢＢＢを破壊することができ、トレーサーが脳実質に漏出することを可能にした（図２４Ａ〜Ｂ）。このことは、皮質、小脳および視神経を含む脳の全ての領域において生じた。一方で、上記ＣＤ３１抗体は、ＣＮＳ脈管の透過性に対して作用を有さなかった。興味深いことに、灌流固定がトレーサーの灌流後に直接行われるので、セグメントが破壊される脈管の特定のセグメントが、可視化された（図２４）。興味深いことに、４０μｌ  ＳＭＩ７１抗体／ｋｇの用量において、脈管構造の少数の割合のみが、トレーサーに対して透過性であった
さらに、密着結合の存在、開口部の存在および細胞内小胞の数を、変異体と同腹仔との間で比較する。任意の超微細構造的欠損が成体Ｎｇｒｈ１変異体において観察される場合、比較を、出生後の発達初期（ｐ２およびｐ８）（ＥＢＡ発現前の時期）の変異体動物および野生型動物から行う。違いが成体において存在し、そして発達の間に存在しない場合、代替機構が、ＢＢＢの維持に関与する。成体Ｎｇｒｈ１変異体の実質における表現型の変化（脳の鉱化作用および神経細胞の変性を含む）は、特定のイオンまたは分子に対する関門の欠損を示す。
【０１５７】
Ｎｇｒｈ１欠損マウスの密着結合を、フリーズフラクチャー電子顕微鏡検査によって調べる。フリーズフラクチャー法は、膜間の結合を大きい分解能で可視化するために使用される技術である。デキストラン密度遠心分離によって単離した毛細血管標本を、グルタルアルデヒド中で固定し、液体窒素中で急速凍結し、ダブルレプリカデバイスにおいて割り、および透過型電子顕微鏡検査によって分析する。この技術は、膜の細胞外側（Ｅ−面）および原形質側（Ｐ−面）の間の密着結合の可視化を可能にする。密着結合数は、鎖の数の計数によって定量され得、そして複雑性は、結合の長さに対する分岐点の比を使用して算出され得る。脳内皮細胞は、フリーズフラクチャー法によって分析される場合、特徴的な密着結合形態学を有する。それらは、Ｐ−面およびＥ−面の膜の両方において５５：４５の比で粒子を含む。このことは、粒子がＥ−面上に多い非脳内皮細胞とは対照的である。フリーズフラクチャー法を、Ｎｇｒｈ１欠損マウスと同腹仔コントロールとのＰ−面：Ｅ−面の粒子の比を比較して、これらのマウスの密着結合において小さい混乱が存在するか否かを解明するために利用する。
【０１５８】
ＢＢＢ密着結合の密着結合タンパク質含量がまた、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光顕微鏡検査の両方によって評価され得る。脳内皮細胞は、密着結合においてＺＯ−１、オクルディン、クローディン５およびクローディン１２（これらの各々について、市販の抗体が入手可能である）を発現する。Ｎｇｒｈ１欠損マウスおよび同腹仔コントロール由来の脳毛細血管は、密度遠心分離によって単離され得、そして各密着結合タンパク質のタンパク質レベルは、ウェスタンブロットによって測定される。さらに、変異体および同腹仔の各々の脳を、固定し、そして免疫蛍光顕微鏡検査によって分析して、任意のこれらのタンパク質の誤った局在が存在するか否か決定し得る。これらのデータは、密着結合（ＴＪ）鎖が構造的にインタクトであるか否か、ＴＪの発現／タンパク質レベルが正常であるか否か、およびこのようなタンパク質がＴＪに局在するか否かを決定する。
【０１５９】
（実施例８）
ＮｇＲＨ１シグナル伝達およびＢＢＢの透過性。ＥＡＥ、卒中および神経の挫滅を含む一連の神経の発作後に、ＮｇＲＨ１のアゴニストおよびアンタゴニストをＮｇｒｈ１欠損マウス、野生型同腹仔およびヘテロ接合体同腹仔に投与することによって、ＢＢＢの透過性の違いが、アッセイされ得る。ＳＭＩ７１抗体がＢＢＢを一過性に破壊し得るという事実に起因して、Ｎｇｒｈ１モジュレートすることは、種々のＣＮＳ疾患についての治療薬および／または診断薬を投与するための方法を提供し得る。
【０１６０】
したがって、上で本明細書に提供される通り、本発明の１つ以上の生物学的に活性な薬剤（治療薬）は、被験体に投与される。例えば、ＮｇＲＨ１を標的とする抗体（またはペプチド、核酸分子もしくはアプタマー）は、動物被験体および投薬量について当該分野において公知である測定学（米国特許第４９３８９４９号においても開示されるように、例えば、動物の重量、送達経路、選択される生物学的に活性な薬剤または年齢）に基づいて決定された有効用量で投与される。したがって、一旦動物が、ＢＢＢ漏出を引き起こす神経の発作に供されると、選択された治療薬は、Ｎｇｒ２シグナル伝達をブロックすることによってＢＢＢを回復させ（即ち、関門の完全性）、したがって疾患または状態を寛解するために投与される。
【０１６１】
さらに、同じ動物は、ことなるＮｇＲＨ１特異的候補化合物（またはＮｇＲＨ１特異的薬剤）をスクリーニングして、このような化合物ＮｇＲＨ１アゴニストまたはＮｇＲＨ１アンタゴニストであるか否かを決定するために利用され得る。換言すれば、候補薬剤がＢＢＢを回復させる場合、その化合物はアゴニストであると決定され、一方でＢＢＢの透過性がさらに増大する場合、その候補薬剤はアンタゴニストであると考えられる。透過性は、当該分野において公知である１つ以上の酵素、色素、トレーサーまたはマーカー（まとめて、「トレーサー」）の全身投与によって測定され得る。
【０１６２】
（実施例９）
Ｎｇｒ２リガンドの全身注射は、ＢＢＢを破壊する。Ｎｇｒは、共レセプターｐ７５、ｌｉｎｇｏおよびｔｒｏｙを介してシグナル伝達する一方で、リガンドＮｏｇｏ、ＯＭｇｐおよびＭＡＧの結合後の成長円錐の崩壊（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｅ  ｃｏｌｌａｐｓｅ）に関与することが公知である。リガンドに対するＮｇｒ２の結合がＢＢＢを崩壊させるために十分であったか否かを試験するために、ＣＮＳ脈管の透過性を、ＭＡＧの全身注射後に分析した。興味深いことに、ＭＡＧの注射後において（コントロールタンパク質の注射後には存在しない）、ＢＢＢは、ビオチンに対して漏出性であり（図２７）、したがってこのことは、Ｎｇｒ２の活性化がＢＢＢの崩壊をもたらし得ることを示す。ＭＡＧを、１００μｌ食塩水に希釈した０．６２５ｍｇ／ｋｇで、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの尾静脈に注射した。トレーサー研究を、注射の１５分後に行った。
【０１６３】
（実施例１０）
ＢＢＢ、ＮｇＲＨ１および多発性硬化症。実験的アレルギー性脳骨髄炎（ＥＡＥ）は、げっ歯類が特定のミエリン成分によって免疫される、多発性硬化症についてのマウスモデルである。ヒト疾患に関する通り、自己免疫応答を伴うＢＢＢの崩壊が存在する。この崩壊は、それが脳および脊髄の実質への免疫分子および免疫細胞の接近を可能にするので、重要であり、その免疫分子および免疫細胞は白質を損傷し得る。
【０１６４】
ＥＡＥは、当該分野において公知である方法を利用して、誘導され得る。ＢＢＢの透過性を比較するために、トレーサーを、試験動物、参照動物および／またはコントロール動物に投与する。Ｎｇｒｈ１マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいて発達している。この系統において、ＭＯＧエピトープ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓから入手可能）を、ＩＦＡ中のＭ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ａと混合し、そしてそれを、百日咳毒素のｉ．ｐ．注射と組み合わせてマウスにｓ．ｃ．注射する。この接種は、重篤度が尾および肢の強度によって１〜５の尺度でモニタリングできる慢性自己免疫疾患をもたらす。この実験において、本発明者らは、種々の時点（例えば、接種後の選択された日数）においてＮｇｒｈ１欠損マウスと同腹仔コントロールとのＢＢＢ崩壊を比較する。
【０１６５】
ＢＢＢ漏出を、ビオチンの心灌流を行い、次いでＰＢＳによって脈管を洗うことによって定量できる。解剖した脳、脊髄および視神経におけるビオチン含量を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用するウェスタンブロットによって定量する。ＢＢＢの崩壊をまた、エバンスブルー色素の尾静脈注射によって定性的に分析できる。ＰＢＳの心灌流を行って脈管から色素を除去した後、次いで脳、脊髄および視神経を、解剖し、実質におけるエバンスブルー漏出の程度を、視覚的に比較する。したがって、上記で本明細書に記載される生物学的に活性な薬剤から選択したＮｇＲＨ１のアゴニストまたはアンタゴニストを、ＭＳ動物に投与する。動物の尾および肢の強度を反映する得られたデータは、疾患の重篤度を決定する。したがって、アゴニストを投与する場合、ＢＢＢの透過性が、回復し、したがって誘導したＭＳモデルを寛解する。対照的に、アンタゴニストを投与する場合、尾および肢の強度は、さらに低下する（疾患状態が悪化する）。
【０１６６】
（実施例１１）
ＮｇＲＨ１および卒中。卒中の間において、虚血は、ＢＢＢの病巣崩壊をもたらす。この破壊は、患者において観察される神経の損傷および長期の症状に寄与すると考えられる。この実験において、本発明者らは、Ｎｇｒｈ１が虚血後におけるＢＢＢの崩壊に必要であるか否かを決定する。これを達成するために、Ｎｇｒｈ１欠損マウスおよび同腹仔コントロールマウスを、１時間にわたる中大脳動脈閉鎖に供し、その中大脳動脈閉鎖は、この脈管の縫合によって行われる。ＢＢＢの崩壊を、閉鎖した半球およびコントロールの半球において、虚血後の１日目、２日目、および４日目にてビオチンの心灌流によって定量する。これらの時点において、ＢＢＢの破壊をまた、エバンスブルー色素の尾静脈注射によって定性的に分析する。
【０１６７】
Ｎｇｒｈ１変異体マウスが卒中にＢＢＢの破壊をあまり示さない場合、変異体および野生型の両方のこの傷害からの回復が、決定される。虚血後における運動の良好な回復を判定するいくつかの標準的な方法が、存在する。回転ロッド試験において、上記マウスを、速度が周期的に上昇する回転する円柱状のロッド上におく。ロッド上にいる時間の長さは、上記マウスの運動機能がどの程度かを判定する。オープンフィールド活動試験（ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔ）において、上記マウスを、赤外線検出光電池を有する自動化されたケージにおく。経路の長さならびに後ろ足立ちの回数および持続時間を含む動物の動きを、運動活動をモニタリングするために記録する。これらの実験は、卒中の病理に対するＢＢＢの寄与の大きさの測定を提供する。
【０１６８】
（実施例１２）
ＢＢＢおよび神経傷害。末梢神経に対する挫滅傷害後に、血液神経関門（ＢＮＢ）は、（例えば、ＰＮＳ傷害の後の）挫滅部位に対して遠位の神経の全長にそって崩壊するが、ＢＢＢは、傷害の部位においてのみ崩壊する。この崩壊は、ミエリン破片を除去するために血清成分および細胞をその神経に供給し、そして迅速な再生を容易にする。ＥＢＡは、末梢神経の内皮細胞によって発現され、そして発現は、このような崩壊の間に喪失する。したがって、Ｎｇｒｈ１シグナル伝達は、坐骨神経挫滅後の血液神経関門の崩壊に必要とされる。ＣＮＳおよびＰＮＳにおける関門崩壊の違いは、ミエリン破片の除去における違いから生じ得る。さらに、ｉｆ全てのＮｇｒファミリーレセプターによるシグナル伝達がＢＢＢの崩壊のために十分である場合、ＯＭｇｐおよびＮｏｇｏもまた、同じ観点で使用され得る。
【０１６９】
例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを、Ｎｇｒｈ１欠損マウスおよび同腹仔の血液神経関門（ＢＮＢ）に投与し、そして透過性を、挫滅傷害に対して遠位の坐骨神経において評価する。挫滅傷害を、坐骨神経に対して行い、そしてＢＮＢの透過性を、挫滅後の２〜６日目に、ビオチントレーサーおよびデキストラントレーサーの灌流によってモニタリングする。実験室における他の研究において、本発明者らは、血清成分がミエリンの迅速な除去および速い再生に必要とされることを示した。Ｎｇｒｈ１マウスのＢＮＢが挫滅傷害に対して遠位で崩壊しない場合、そのようなマウスは、ウォーラー変性（ＷＤ）を完了も再生もしない。これらのマウスにおけるＷＤを、Ｐ０およびＭＢＰについての坐骨神経の遠位セグメントのウェスタンブロットによって測定する一方で、再生を、電気生理学によってモニタリングする。興味深いことに、Ｎｇｒおよびそのホモログは、ミエリンタンパク質ＮｏｇｏおよびＭＡＧの結合によって、再生のインヒビターとして関係している。したがって、ＮｇＲＨ１変異体は、ＣＮＳにおけるさらなる再生を示す。しかし、Ｎｇｒｈ１アゴニストは、ＢＮＢの開放によって、ＰＮＳにおける再生を支援することができ、したがってＮｇＲＨ１アンタゴニストは、より少ない再生を与える。
【０１７０】
（実施例１３）
内皮細胞培養アッセイ。ヒト脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）は、２０％熱非働化ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｔａｒｚａｎａ、Ｃａｌｉｆ．）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ）、および１×ＭＥＭビタミン溶液（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地において成長させることができる。血液脳関門の内皮の顕著な特徴を示すことが示されているこれらの細胞は、細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、単球、ウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）、および真菌（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）がいかにして脳に進入するのかを調べるために広範に使用されている。Ａ５４９細胞とヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との融合体として得られるＥＡ．ｈｙ９２６細胞は、全身性内皮細胞のモデルとして頻繁に使用される。このような細胞は、１０％熱非働化ＦＢＳおよび１（×）ヒポキサンチン−チミンサプリメント（ＧＩＢＣＯ）を補充した高濃度グルコース（４．５ｇ／リットル）のダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ）において増殖させることができる。両方の内皮細胞培養物を、プレートし、そして２５−ｃｍ２フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｎ．Ｃ．）において成長させることができる。
【０１７１】
コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して上記フラスコから取り出され、そして１０５／ｍｌに調整され得る。ヒトＢＭＥＣおよびＥＡ．ｈｙ９２６細胞を、コラーゲンでコーティングした半透性Ｔｒａｎｓｗｅｌｌポリカーボネート組織培養挿入物（直径６．５ｍｍ  ０．３３ｃｍ、孔径３．０μｍ；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ．）の上に接種した（２００μｌ）。このインビトロモデルは、上の区画（血液側）および下の区画（脳側または組織側）への分離した接近を可能にする。上記細胞を、５〜７日間にわたって適切な培地において培養することができる。上のチャンバーおよび下のチャンバーの両方の培地は、通常、毎日交換される。実験の前日、培養培地を、２０％  ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌグルタミン（実験培地）を補充した培地Ｍ１９９によって１：１に希釈したＨａｍ  Ｆ−１２栄養培地からなる実験培地に交換し、そして一晩インキュベートする。ＥＶＯＭ電圧計（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、Ｆｌａ．）を備えるＥｎｄｏｈｍチャンバーを使用する電気抵抗測定を、単層の完全性を決定するために使用することができ、そして膜自体の抵抗についての調整後に、製造業者の推奨に従って、オーム  時間  センチメートル２として表す。
【０１７２】
したがって、本明細書に記載される１つ以上の方法によって得られた候補のＮｇＲＨ１特異的薬剤（例えば、アプタマー、アンチセンス、タンパク質、ペプチドまたは抗体）は、その候補薬剤が電気抵抗によって測定した場合に透過性を増大または減少させるか否かを決定するために、細胞培養物に投与され得る。そのようなものとして、電気抵抗の上昇は、アゴニストを同定し、一方で電気抵抗の低下は、アゴニストを同定する。
【０１７３】
（実施例１４）
３−Ｄ培養。別の例において、単離された内皮細胞、周皮細胞および星状細胞（内皮−周皮細胞−星状細胞、またはＥＰＡ）は、本明細書に記載される１つ以上の方法を利用して単離され得、次いで神経親和性の増殖因子血管性の増殖因子を補充した適切な培地において培養され得る。そのようなものとして、ＥＰＡ培養は、ＢＢＢモデルを提供し、そのＢＢＢモデルは、次いで、ＢＢＢトレーサーアッセイにおいて利用され得、そして本発明の１つ以上の方法では、関門透過性のアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングにおいて利用され得る。
【０１７４】
本質的に、上記培養は、ＥＰＡ  ３−次元細胞培養系を提供する。これらの培養物は、１：１の比で混合された細胞からなり、および室温にて固化するコラーゲンマトリックスに懸濁され、次いで培地によって覆われる。２４時間後、３−次元培養物中で、上記内皮細胞は、再配列し、そして星状細胞の末端が接触する管様構造を形成する。
【０１７５】
当該分野において公知であるさらなるマトリックス（例えば、マトリゲル、ペプチド骨格またはフィブロネクチン）は、３−Ｄ培養物の産生において利用され得る。マトリゲルの使用は、それが費用においてより有効なので好ましい。細胞および関門の表現型の区別はまた、蛍光顕微鏡検査および／またはウェスタンブロッティングによって確認され、このことは、形態学的分析を可能にし、そして培養物内での細胞の位置確認を正確にする。
【０１７６】
さらに、１つ以上の細胞型は、トランスフェクトされて所望の遺伝子を発現し得る（例えば、ＮｇＲＨ１の変化した発現レベルを提供する内皮細胞）。これに関して、所望の遺伝子の発現は、当該分野において公知である誘導性プロモーター（例えば、ｔｅｔ−応答性）によってか、または上で本明細書に記載される通りに調節され得る。前出、表１。さらに、他の細胞型との接触の結果としての遺伝子発現およびタンパク質発現の変化は、分子生物学技術、公知の細胞特異的マーカーにおけるＦＡＣＳ分析分類、ならびに培養培地中への異なるサイトカインおよび増殖因子（例えば、ＶＥＧＦおよびＥｐｏ）の放出を測定するためのＥＬＩＳＡ技術およびＲＩＡ技術を使用して、同定およびモニタリングされ得る。これらの方法は、通常の生理学的条件下でＢＢＢにおいて発現されたタンパク質の同定を可能にする。
【０１７７】
さらに、上記細胞培養アッセイは、特定の遺伝子産物がＢＢＢの透過性に与える影響を決定するために、構成的または時間的に調節される状況における種々の遺伝子発現プロフィールからの作用をアッセイし、分析するための効率的な手段を提供し得る。透過性は、上で本明細書に記載される蛍光染色技術を利用して評価されても、関連分野において公知である蛍光検出技術において行われる通りに評価されてもよい。
【０１７８】
１つ以上の細胞型をトランスフェクトすることの代わりか、またはそれに加えて、ＥＰＡ培養は、種々の生物学的に活性な薬剤をスクリーニングしてＢＢＢの透過性に対するそれらの薬剤の効果を決定するために利用され得る。例えば、種々の細胞表面レセプター（ＮｇＲＨ１を含む）を標的とする化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡは、いかなる追加的な因子がＢＢＢの透過性を調節するＮｇＲＨ１シグナル伝達機構に関与するのかを決定するために、ＥＰＡ培養においてスクリーニングされ得る。
【０１７９】
（実施例１５）
内皮細胞の精製：視神経を、胚または出生後のＳｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙラットの１〜２匹の同腹仔から解剖した。単一細胞懸濁物を、４０ユニットのパパインを用いた２０分間にわたる酵素的解離を行い、次いで２１ゲージおよび２３ゲージの針を用いて粉砕することによる機械的分離を行うことで作製した。その細胞を、星状細胞系統の細胞、希乏突起神経膠細胞系統の細胞および小神経膠細胞を枯渇させるためにＣ５抗体によってコーティングしたディッシュ上でインキュベートした。次いで、これらのディッシュ由来の上清を、内皮細胞を結合するために、ＣＤ３１に対する抗体によってコーティングしたペトリ皿上でインキュベートした。その上清由来の細胞を、洗い流し、そして内皮細胞を、トリプシン処理によって回収した。内皮細胞を、コラーゲンＩＶによってコーティングしたカバーガラス上でｂＦＧＦを含むＮＢ−ＳＡＴＯにおいて培養した。
【０１８０】
周皮細胞の精製：視神経を、出生後７日目のｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙラットの１〜２匹の同腹仔から解剖した。単一細胞懸濁物を、８５ユニットのパパインを用いた４５分間にわたる酵素的解離を行い、次いで２１ゲージおよび２３ゲージの針を用いて粉砕することによる機械的分離を行うことで作製した。その細胞を、３０分間にわたって３７度に放置して失われたエピトープを回復させ、次いで星状細胞系統の細胞、希乏突起神経膠細胞系統の細胞および小神経膠細胞を枯渇させるためにＣ５抗体によってコーティングしたディッシュ上でインキュベートした。次いで、これらのディッシュ由来の上清を、周皮細胞を結合するために、ＰＤＧＦＲβに対する抗体によってコーティングしたペトリ皿上でインキュベートした。その上清由来の細胞を、洗い流し、そして周皮細胞を、トリプシン処理によって回収した。次いで、その周皮細胞を、１０％  ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、インスリンおよびピルビン酸塩を含むＤＭＥＭにおいて培養した。
【０１８１】
（実施例１６）
精製した細胞の移植：精製した細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、１００，０００個の細胞／μｌでＤＰＢＳに再懸濁した。成体Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙラットを、ケタミン／キシラジンカクテルを使用して安楽死させた。３０ゲージの針を用いて、小さい穴を、眼球の前眼房に作製した。より小さい穴を、後眼房に作製して、圧力を同じにした。ワイヤツールマイクロピペット（ｗｉｒｅｔｏｏｌ  ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ）を利用して、５〜１０μｌの細胞を、前眼房に注射した。ラットを、回復のために、分析前に２週間にわたって放置した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−Ｅ】
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【図２３Ｆ−Ｇ】
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【図２４Ａ−Ｄ】
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【図２４Ｅ−Ｆ】
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【図２４Ｇ−Ｊ】
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【図２４Ｋ】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２５Ｃ−Ｆ】
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【図２６】
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【図２７Ａ−Ｂ】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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