(57)【要約】  本発明は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への対象となるタンパク質またはペプチドの提示のための、当該タンパク質またはペプチドのオートファゴソームへの標的化、およびその使用方法に関する。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子への対象となるタンパク質またはペプチドの提示のための、当該タンパク質またはペプチドを標的化するための核酸、当該核酸を含むベクターおよび組成物が開示され、対象者における免疫応答を刺激し、または増強するためのその使用方法も開示される。
2009528819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートファゴソームＬＣ３タンパク質をコードする核酸またはその機能性断片にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸であって、前記対象となるペプチドまたはタンパク質が、ほとんどまたは全く、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子上に効率的に提示されない、核酸。
【請求項２】
配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質が、ウイルスによりコードされている、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質が、インフルエンザウイルスによりコードされている、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質が、マトリックスタンパク質である、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸を含むベクターまたは細胞。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む細胞。
【請求項９】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、対象となるペプチドまたはタンパク質の提示を刺激または増強する方法であって、
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現しうる細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記細胞の表面上に提示される、方法。
【請求項１０】
前記細胞を、前記核酸を含むベクターと接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オートファゴソーム標的化タンパク質がＬＣ３タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が健常であるか、または、前記細胞が疾患に罹患しており前記対象となるペプチドもしくはタンパク質が前記疾患と関連している、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が感染している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がウイルスに感染している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスがインフルエンザまたはＨＩＶである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がウイルスによりコードされている、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１８】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がインフルエンザウイルスによりコードされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がマトリックスタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が、配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が細菌に感染している、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌がマイコバクテリウムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、腫瘍細胞または前癌細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、または上皮細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞をインターフェロンγと接触させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象者における免疫応答を刺激または増強する方法であって、
前記対象者における主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現しうる細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより、前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記細胞の表面上に提示され、これに対する免疫応答が刺激または増強される、方法。
【請求項２７】
前記細胞を、前記核酸を含むベクターと接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記オートファゴソーム標的化タンパク質がＬＣ３タンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸が、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が健常であるか、または、前記細胞が疾患に罹患しており前記対象となるペプチドもしくはタンパク質が前記疾患と関連している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が感染している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がウイルスに感染している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスがインフルエンザまたはＨＩＶである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がウイルスによりコードされている、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３５】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がインフルエンザウイルスによりコードされている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がマトリックスタンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸が、配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が細菌に感染している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌がマイコバクテリウムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、腫瘍細胞または前癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、または上皮細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞をインターフェロンγと接触させる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞を、前記核酸または当該核酸を含むベクターと間接的に接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸または当該核酸を含むベクターを、前記対象者に静脈内投与する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象者に、前記核酸または当該核酸を含むベクターを含む組成物を投与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物を、一定期間にわたって繰り返し投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が、前記対象者から単離された腫瘍細胞を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞を、エクスビボで前記核酸または当該核酸を含むベクターと接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象者が、前癌性または増殖性の細胞または組織を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象者が、新生組織形成の素因を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質を発現しうる細胞；並びに、オートファゴソームＬＣ３タンパク質もしくはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸、または当該核酸を含むベクターを含む組成物。
【請求項５２】
前記核酸が、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がウイルスによりコードされている、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がインフルエンザウイルスによりコードされている、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質がマトリックスタンパク質である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記核酸が、配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記細胞が、過形成細胞、前癌性細胞、または腫瘍細胞である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５８】
前記細胞が健常な細胞であり、前記対象となるペプチドもしくはタンパク質が癌または感染と関連している、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞をさらに含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質を発現する前記細胞について自家のものであるか、同系であるか、または異種同系である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
サイトカインをさらに含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項６２】
前記サイトカインがインターフェロンγである、請求５１に記載の組成物。
【請求項６３】
静脈内投与用に製剤化されている、請求項５１に記載の組成物。
【請求項６４】
対象者における、対象となるペプチドまたはタンパク質に対する免疫応答をダウンモジュレートし、抑制し、または耐性化させる方法であって、
未成熟樹状細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより、前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記未成熟樹状細胞の表面上に提示される、方法。
【請求項６５】
前記細胞を、インビボでまたはエクスビボで、前記核酸を含むベクターと接触させる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記オートファゴソーム標的化タンパク質がＬＣ３タンパク質である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記核酸が、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
免疫応答のダウンモジュレート、抑制、または耐性化は、対象者における移植片拒絶反応または移植片対宿主病を阻害し、または軽減することである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質が、移植片の抗原または宿主の抗原である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
免疫応答のダウンモジュレート、抑制、または耐性化は、対象者における自己免疫疾患を治療することである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象となるペプチドまたはタンパク質が、自己抗原である、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に引用される、２００６年２月２１日に出願された、米国仮特許出願第６０／７７４，６１４号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦委託研究に関する記載
本発明は、米国政府による援助（国立衛生研究所の許可番号ＣＡ１０８６０９）を受けてなされたものである。政府は、本発明について特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
適応的免疫系のＴ細胞は、病原性タンパク質の存在を求めて生体の全ての細胞を監視している。この目的で、プロテアソームで生成したペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示され、ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。これに対し、リソソーム分解の生成物はＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される。典型的にＭＨＣクラスＩＩ上に提示される抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりエンドサイトーシスを受ける外来性タンパク質、または分泌系に存在する内在性タンパク質である。しかしながら、ＭＨＣクラスＩＩ分子から溶出されるペプチドの分析により、天然のＭＨＣクラスＩＩリガンドのかなりの割合（２０％程度）がサイトゾルタンパク質および核タンパク質由来であることが明らかとなっている。さらに、ＣＤ４＋細胞は内因性プロセシング後にサイトゾルの抗原および核の抗原を認識可能であること（例えば、サイトゾルの麻疹ウイルスやインフルエンザＡウイルスの抗原は、ＭＨＣクラスＩＩの提示のために内因性プロセシングを受けるという事実）が示されている。これに続いて、内在性ＭＨＣクラスＩＩによる提示は、腫瘍抗原に加えて、他のウイルス性抗原、自己抗原、モデル抗原について記載されている。従って、トポロジー的にエンドソーム系から隔離された抗原はＭＨＣクラスＩＩ抗原提示経路にアクセス可能であり、ＭＨＣクラスＩＩリガンドのレパートリーを広げている。
【０００４】
異なるプロセシング経路が、内因性ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示に関与しているとされている。近年、オートファジーがサイトゾル抗原および核抗原をＭＨＣクラスＩＩ分子上に輸送していることが示された。そのうち、生理的レベルの第１の病原体由来の抗原であるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の核抗原１（ＥＢＮＡ１）が、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系のＭＨＣクラスＩＩ分子上にマクロオートファジー分解後に提示されることが発見された。
【０００５】
オートファジーは、真核細胞に広くみられる少なくとも３つの細胞内タンパク質分解経路（マクロオートファジー、ミクロオートファジー、およびシャペロン介在性オートファジー）からなる。内因性ＭＨＣクラスＩＩ抗原プロセシングのほとんどの証拠は、マクロオートファジー経路が関係しているとしている。マクロオートファジーによる分解の間、オルガネラ等の細胞質の材料は二重膜で覆われたオートファゴソーム中に取り込まれ、このオートファゴソームは続いて、エンドソームおよびリソソームと融合する。取り込まれたオートファゴソームの内容物は次いで、リソソーム分解酵素によって分解され、分解生成物は細胞によって再利用される。
【０００６】
この経路の操作は、理論上は、免疫応答を促進するための手段として、ＭＨＣクラスＩＩ提示経路にアクセスする手段を提起することになるが、かような手段は依然として知られてはいない。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
一実施形態においては、オートファゴソームＬＣ３タンパク質をコードする核酸またはその機能性断片にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸が提供され、ここで、当該対象となるペプチドまたはタンパク質は、ほとんどまたは全く、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子上に効率的に提示されない。
【０００８】
他の実施形態においては、前記核酸は、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する。さらに他の実施形態においては、前記対象となるペプチドまたはタンパク質はウイルスによりコードされ、さらなる一実施形態では、当該対象となるペプチドまたはタンパク質は、インフルエンザウイルスによりコードされ、他の実施形態ではこれはマトリックスタンパク質であり、さらに他の実施形態では、前記核酸は配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する。
【０００９】
他の実施形態においては、本明細書に記載の核酸を含むベクターまたは細胞が提供される。他の実施形態では、本明細書に記載のベクターを含む細胞が提供される。
【００１０】
一実施形態においては、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、対象となるペプチドまたはタンパク質の提示を刺激または増強する方法が提供され、当該方法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現しうる細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより、前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記細胞の表面上に提示される。
【００１１】
一実施形態においては、前記オートファゴソーム標的化タンパク質はＬＣ３タンパク質である。一実施形態では、前記核酸は、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する。一実施形態では、前記細胞は疾患に罹患している。他の実施形態では、当該細胞は感染しており、さらなる一実施形態では、当該細胞はウイルスに感染しており、一実施形態では、当該ウイルスはインフルエンザであり、あるいは他の実施形態では、ＨＩＶである。当該形態の一実施形態では、前記対象となるペプチドまたはタンパク質はウイルスによりコードされ、一実施形態では、ワクシニアウイルスまたはレンチウイルスによりコードされる。一実施形態では、当該対象となるペプチドまたはタンパク質はマトリックスタンパク質であり、さらなる一実施形態では、当該形態による前記核酸は、配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する。
【００１２】
一実施形態において、前記細胞は細菌に感染しており、一実施形態では、当該細菌はマイコバクテリウムである。他の実施形態では、当該細胞は腫瘍細胞または前癌細胞である。
【００１３】
一実施形態においては、前記細胞をサイトカインと接触させ、一実施形態では、当該サイトカインはインターフェロンγである。
【００１４】
一実施形態においては、対象者における免疫応答を刺激または増強する方法が提供され、当該方法は、前記対象者における主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現しうる細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより、前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記細胞の表面上に提示される。
【００１５】
当該形態の一実施形態では、前記細胞を前記核酸または当該核酸を含むベクターに間接的に接触させる。一実施形態においては、前記核酸または当該核酸を含むベクターを、前記対象者に静脈内投与し、他の実施形態では、前記核酸または当該核酸を含むベクターを含む組成物を当該対象者に投与する。一実施形態では、前記組成物を一定期間にわたって繰り返し投与する。一実施形態では、前記組成物は対象者から単離された腫瘍細胞を含み、一実施形態では、当該細胞をエクスビボで前記核酸または当該核酸を含むベクターと接触させる。一実施形態では、前記対象者は前癌性または増殖性の細胞または組織を有し、あるいは他の実施形態では、当該対象者は新生組織形成の素因を有する。
【００１６】
一実施形態においては、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質を発現しうる細胞；並びに、オートファゴソームＬＣ３タンパク質もしくはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸、または当該核酸を含むベクターを含む組成物が提供される。
【００１７】
他の実施形態においては、対象者における、対象となるペプチドまたはタンパク質に対する免疫応答をダウンモジュレートし、抑制し、または耐性化させる方法が提供され、当該方法は、未成熟樹状細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより、前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記未成熟樹状細胞の表面上に提示される。一実施形態では、前記細胞を、インビボでまたはエクスビボで、前記核酸を含むベクターと接触させる。他の実施形態では、前記オートファゴソーム標的化タンパク質はＬＣ３タンパク質である。さらに他の実施形態では、前記核酸は、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する。
【００１８】
当該形態の一実施形態では、免疫応答のダウンモジュレート、抑制、または耐性化は、対象者における移植片拒絶反応または移植片対宿主病を阻害し、または軽減することである。他の実施形態では、前記対象となるペプチドまたはタンパク質が、移植片の抗原または宿主の抗原である。さらに他の実施形態では、免疫応答のダウンモジュレート、抑制、または耐性化は、対象者における自己免疫疾患を治療することである。他の実施形態では、前記対象となるペプチドまたはタンパク質が自己抗原である。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１Ａ〜図１Ｇは、ヒト上皮細胞系におけるオートファゴソームの形成を示す。（ａ）ヒト上皮細胞系における構成的オートファゴソーム形成。ヒト上皮細胞系であるＨａＣａｔ（ケラチン生成細胞）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡＭＣ（乳癌）および２９３（腎臓）に、ＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトを安定的にトランスフェクションした。エンドソーム／リソソーム区画においてＧＦＰ−ＬＣ３を安定化する目的で、５０μＭクロロキンで１０時間、細胞を処理した（＋ＣＱ、右欄）。細胞を固定し、ＤＡＰIで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバー：２０μｍ。３回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。（ｂ）マクロオートファジーは、抗原提示専門の細胞（樹状細胞など）における構成的なプロセスである。専門ＡＰＣにおけるＧＦＰ−ＬＣ３のリソソーム代謝回転を評価する目的で、ＧＦＰ−ＬＣ３を安定的に発現しているＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球細胞系（Ｂ−ＬＣＬ）、並びに、ＧＦＰ−ＬＣ３を発現している未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣ（ｉＤＣおよびｍＤＣ）を、５０ｍＭクロロキンで１０時間処理し（＋ＣＱ）、または未処理のまま放置した（ＣＱなし）。細胞を固定し、ＤＡＰIで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバーは２０ｍｍを示す。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。（ｃ）ＧＦＰ−ＬＣ３は、樹状細胞のＭＨＣクラスＩＩを取り込む区画で分解される。上図：ＧＦＰ−ＬＣ３を発現する未成熟ＤＣを、５０ｍＭクロロキンで１０時間処理した（＋ＣＱ）。ＭＨＣクラスＩＩ特異抗体およびＤＡＰＩで細胞を染色し、ＧＦＰ−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩとの共局在化を共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバーは１０μｍを示す。３回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。下図：成熟ＤＣを用いて上図と同じ実験を行なった。成熟ＤＣの大部分では、ＭＨＣクラスＩＩは主に細胞表面に局在化していたが、一部の細胞には細胞間ＭＨＣクラスＩＩ区画が存在していた（白矢印）。スケールバーは１０μｍを示す。３回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。（ｄ）ＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画へのＭＰ１−ＬＣ３の輸送にはマクロオートファジーが必要である。ＭＰ１−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞に、コントロールｓｉＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ特異的）またはａｔｇ１２に特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。３６時間後、細胞を２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで処理してＭＨＣクラスＩＩ発現をアップレギュレートし、当該細胞をさらに３６時間培養した。リソソームプロテアーゼによるＭＰ１−ＬＣ３の分解を阻害する目的で、培養の最後の６時間の間、細胞を５０μＭクロロキン（ＣＱ）で処理した（（＋ＣＱ）として示す）。細胞を固定し、ＭＰ１特異抗体およびＭＨＣクラスＩＩ特異抗体並びにＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法で分析した。スケールバー：１０μｍ。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。コントロールｓｉＲＮＡ処理細胞ではＭＰ１−ＬＣ３含有ベヒクルのかなりの割合でＭＨＣクラスＩＩ区画との共局在化が観察できたが、かような共局在化はａｔｇ１２後には完全に見られなくなった。（ｅ〜ｆ）クロロキン処理により、ＧＦＰ−ＬＣ３のオートリソソーム中へのゆっくりとした蓄積が誘導され、これは栄養飢餓とは実質的に異なる。（ｅ）ＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトを安定にトランスフェクトした２９３細胞を未処理のまま放置し（ＣＱなし）、または５０μＭクロロキン（ＣＱ）で２時間もしくは１０時間処理した。細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡法により分析した。ＣＱによってリソソームの酸性化が阻害されることで、ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化オートファゴソームの経時的な緩やかな蓄積が引き起こされる。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。（ｆ）ＭＤＡＭＣ細胞を未処理のまま放置し（−−）、ハンクス平衡塩溶液中で１０時間培養し（飢餓）、５０μＭクロロキンで１０時間処理し（＋ＣＱ）、またはプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４（２８μＭ）、ロイペプチン（４０μＭ）およびペプスタシンＡ（１５μＭ）で１０時間処理した（＋プロテアーゼ阻害剤）。全細胞溶解液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アクチンブロットは等量のタンパク質のロード量を示す。栄養飢餓ではＬＣ３−ＩＩが弱く誘導されるだけであるのに対し、ＣＱまたはプロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４、ロイペプチンおよびペプスタシンＡ）を用いた処理によるリソソームプロテアーゼの阻害によれば、ＬＣ３−ＩＩの著しい蓄積が引き起こされる。２回の実験のうちの１回を示す。（ｇ）ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞をモックトランスフェクションし、またはこれにラミンＡ／Ｃ特異的なもしくはＡＴＧ１２特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖をトランスフェクションした。２日後、細胞を５０ｍＭ  ＣＱで６時間処理し（＋ＣＱ）、または未処理のまま放置し（ＣＱなし）、ＤＡＰＩで染色し、落射蛍光顕微鏡により評価した。２回の実験のうちの１回を示す。
【００２０】
図２Ａ〜図２Ｃは、ヒト上皮細胞系および、一次単球（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）／樹状細胞などの専門ＡＰＣにおける構成的オートファジーを示す。（ａ）ヒト上皮細胞系［ＨａＣａｔ（ケラチン生成細胞）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡＭＣ（乳癌）および２９３（腎臓）］およびＢ細胞系［ＭＳ−ＬＣＬ（ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞系）、ＲＰＭＩ６６６６およびＬ５９１（ホジキンリンパ腫細胞系）］、並びに（ｂ）一次ＣＤ１４＋単球および、未成熟またはＬＰＳ成熟の単球由来樹状細胞を、５０μＭクロロキンで１０時間処理し（＋）、または未処理のまま放置した（−−）。全細胞溶解液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アクチンブロットはＣＱ処理が通常のタンパク質レベルに影響しなかったことを示す。３回の実験のうちの１回を示す。（ｃ）ＨａＣａｔケラチン生成細胞系を５０μＭクロロキンで０、１、２、１０、または２４時間処理し、ＬＣ３−ＩＩの蓄積を抗ＬＣ３ウエスタンブロットにより分析した。アクチンブロットはサンプルのロード量についてのコントロールである。２回の実験のうちの１回を示す。
【００２１】
図３Ａ〜図３Ｄは、オートファゴソームのマーカーであるＧＦＰ−ＬＣ３がＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画のマーカーとともに局在化していることを示す。（ａ）ヒト上皮細胞系を２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで４８時間処理した後の表面ＭＨＣクラスＩＩのアップレギュレーション。抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。２回の実験のうちの１回を示す。（ｂ）ＭＤＡＭＣ乳癌細胞系を２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで処理し、ｐＥＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトで一時的にトランスフェクションし、３６時間後にＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＬＡＭＰ−２に対する抗体およびＤＮＡ含量についてＤＡＰＩで染色した。ＭＩＩＣマーカーとのＧＦＰ−ＬＣ３の共局在化を共焦点顕微鏡法により分析した。（ｃ）培養の最後の１０時間の間、５０μＭクロロキンを存在させたこと以外は（ｂ）と同様である。スケールバー：１０μｍ。３回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。（ｄ）組換えＩＦＮはヒト上皮細胞におけるマクロオートファジーに影響しない。ヒト上皮細胞系（２９３Ｔ、ＨａＣａｔおよびＭＤＡＭＣ）を１０００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＦＮ−αもしくはＩＦＮ−γで２４時間処理し、または未処理のまま放置した（−−）。全細胞溶解液を調製し、等量のタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アステリスク（＊）を付した高分子量バンドはＬＣ３抗血清と交差反応するタンパク質であり、等量のタンパク質のロード量を示す。ＬＣ３−ＩＩレベル（すなわち、マクロオートファジー）は、ＩＦＮ処理の影響を受けない。
【００２２】
図４Ａ〜図４Ｃは、オートファゴソームのマーカーであるＧＦＰ−ＬＣ３が初期／再利用エンドソームまたはＭＨＣクラスＩ取り込み区画のマーカーとは共局在化しないことを示す。ＭＤＡＭＣ乳癌細胞系に、ｐＥＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトを一時的にトランスフェクションし、２４時間後に５０μＭ  ＣＱで１０時間処理した。（ａ）初期エンドソーム抗原（ＥＥＡ１）またはトランスフェリン受容体（ＴＲ）および（ｂ）ＭＨＣクラスＩに対する抗体で細胞を染色した。また、ＤＮＡ含量について細胞をＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法で分析した。スケールバー：１０μｍ。２回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。（ｃ）未処理またはＣＱ処理ＭＤＡＭＣ細胞における、ＧＦＰ−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＭおよびＥＥＡ１との共局在化の定量分析。データは、２回のうちの１回の代表的な実験の１０〜１５個の細胞の平均を示す。エラーバーは標準偏差を示す。等分散のスチューデントのｔ検定（片側）によるｐ値を示す。
【００２３】
図５Ａ〜図５Ｆは、高電子密度の多小胞区画におけるＧＦＰ−ＬＣ３およびＭＨＣクラスＩＩ分子の共局在化を示す。（ａ〜ｄ）ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現し、ＩＦＮγ誘導によりＭＨＣクラスＩＩ陽性である、未処理（ａ、ｂ）またはＣＱ処理（ｃ、ｄ）したＭＤＡＭＣ上皮細胞を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、８０ｎｍ厚さの低温切開片に切り出した。ＨＬＡ−ＤＲ特異抗血清および１０ｎｍプロテインＡ−ゴールド（ＰＡＧ１０）で切片をラベル化し、グルタールアルデヒドで抗体−ＰＡＧ複合体を不可逆的に固定した。続いて、ＧＦＰ特異抗体および１５ｎｍプロテインＡ−ゴールド（ＰＡＧ１５）で切片をラベル化し、電子顕微鏡法により分析した。コントロールとして、ＰＡＧ１０およびＰＡＧ１５を入れ替え、これらも同様のラベル化パターンを示した（ａ・ｂ対ｃ・ｄ）。パネルａ・ｃからの挿入図を拡大してそれぞれパネルｂ・ｄに示す。３回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。（ｅ〜ｆ）ＭＨＣクラスＩＩ／ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化低温切開片の免疫電子顕微鏡法。（ｅ）ＰＦＡ固定ＭＤＡＭＣ−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞の極薄低温切開片を、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗血清／１５ｎｍ金粒子および抗ＧＦＰ抗血清／１０ｎｍ金粒子で二重にラベル化し、電子顕微鏡法により分析した。ＭＨＣクラスＩＩのラベル化はＧＦＰ−ＬＣ３陽性高電子密度多小胞区画および細胞膜上の双方で見られる。３回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。スケールバー：１μｍ。（ｆ）ＭＤＡＭＣ−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞を５０μＭ  ＣＱで１０時間処理し、極薄低温切開片をＭＨＣクラスＩＩ（１０ｎｍ金）およびＧＦＰ（１５ｎｍ金）について二重にラベル化し、電子顕微鏡法により分析した。二重ラベル化した多小胞区画の多くは拡張し、膨潤して１μｍを超える直径を有しており、隙間もいくらか有しているように見える。３回の実験のうちの１回の代表的な３つの領域を示す。スケールバー：１μｍ。
【００２４】
図６Ａ〜図６Ｄは、インフルエンザＡマトリックスタンパク質１のＡｔｇ８／ＬＣ３への融合によるオートファゴソームへの標的化を示す。インフルエンザＡマトリックスタンパク質１（ＭＰ１）のコーディング配列をＬＣ３配列のＮ末端に融合した。この際、ＭＰ１の３’末端にストップコドンを設け、または設けなかった。（ａ）それぞれＭＰ１およびＭＰ１−ＬＣ３をコードする２つのコンストラクトの概略図。（ｂ）ＭＰ１およびＭＰ１−ＬＣ３のレンチウイルスコンストラクトでＨａＣａｔ細胞系およびＭＤＡＭＣ細胞系を安定的にトランスフェクションし、抗ＭＰ１抗血清を用いたウエスタンブロットによりタンパク質の発現を分析した。アクチンブロットは等量のタンパク質ロード量を示す。（ｃ）未処理またはクロロキン処理した（＋ＣＱ）、ＭＰ１またはＭＰ１−ＬＣ３を安定発現するＨａＣａｔ細胞を、抗ＭＰ１抗血清およびＤＮＡ含量についてＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバー：１０μｍ。１回の実験の代表的な領域を示す。（ｄ）ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞を、ＭＰ１またはＭＰ１−ＬＣ３をコードするレンチウイルスに感染させた。リソソームにおけるＧＦＰ−ＬＣ３タンパク質およびＭＰ１タンパク質の分解を阻害する目的で、細胞を５０μＭ  ＣＱで１０時間処理し、次いで抗ＭＰ１抗血清で染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバー：１０μｍ。１回の実験の代表的な領域を示す。
【００２５】
図７Ａ〜図７Ｃは、インフルエンザＭＰ１に特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのキャラクタリゼーションを示す。（ａ）クローンのＣＤ４およびＣＤ８の発現を、フローサイトメトリーにより分析した。クローン９．２６、１１．４６および１０．９はホモ接合性でＣＤ４＋ＣＤ８−であり、クローン９．２はホモ接合性でＣＤ８＋ＣＤ４−であった。（ｂ）これらによるインフルエンザＭＰ１ペプチドの認識を、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた。ＭＰ１ペプチドライブラリーを、ＭＰ１のアミノ酸位置１〜５１（プールＩ）、４１〜８８（プールＩＩ）、７８〜１２８（プールＩＩＩ）、１１８〜１６３（プールＩＶ）、１５２〜２０３（プールＶ）および１９３〜２５２（プールＶＩ）をカバーする６つのサブプールに分けた。クローン９．２、９．２６および１０．９はプールＩＩに、クローン１１．４６はプールＩＩＩに、特異的に反応した。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンではなくＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン９．２が、ＨＬＡＡ２制限ＭＰ１エピトープ５８〜６６を認識した。エラーバーは標準偏差を示す。（ｃ）ＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンについて、ＭＰ１のプールＩＩおよびプールＩＩＩの全てのペプチドを含む、ＭＰ１のアミノ酸配列２９〜１２８をカバーする個々のペプチドに対する認識を調べた。クローン９．２６および１０．９は、ペプチドエピトープＭＰ１６２〜７２を特異的に認識し、クローン１１．４６はエピトープ１１０３〜１１３に特異的であった。エラーバーは標準偏差を示す。
【００２６】
図８Ａ〜図８Ｃは、ＬＣ３へのＭＰ１の融合によりＣＤ４＋Ｔ細胞の認識が増強されるのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の認識は影響を受けないことを示す。（ａ）ＩＦＮγ処理標的細胞（同族ペプチドでパルスしたＨａＣａｔ、ＨａＣａｔ、またはＧＦＰ−ＬＣ３、ＭＰ１もしくはＭＰ１−ＬＣ３を発現するＨａＣａｔ）または未処理のコントロール細胞を、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を２、５および１２．５としてＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン９．２６（上パネル）、１０．９（中パネル）と、または、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を１０、２０および４０としてクローン１１．４６（下パネル）と、共培養した。ＭＰ１の外因性プロセシングを排除する目的で、ＩＦＮγ処理ＨａＣａｔ細胞を、ＨＬＡミスマッチのＭＰ１発現ＭＤＡＭＣ細胞またはＭＰ−ＬＣ３発現ＭＤＡＭＣ細胞の存在下でＴ細胞クローンとともにインキュベートした。共培養の２４時間後、１：２に希釈した培養上清中のＩＦＮγをＥＬＩＳＡにより測定した。エラーバーは標準偏差を示し、全てのＥ：Ｔ比にわたって対応のあるスチューデントのｔ検定のＰ値を示す。それぞれ２回の実験のうちの１回を示す。（ｂ）（ａ）においてＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイに用いた標的細胞の表面ＭＨＣクラスＩＩ染色。２回の実験のうちの１回を示す。（ｃ）ＩＦＮγ処理した、または未処理の標的細胞（同族ペプチドでパルスしたＭＤＡＭＣ、ＭＤＡＭＣ、またはＧＦＰ−ＬＣ３、ＭＰ１もしくはＭＰ１−ＬＣ３を発現するＭＤＡＭＣ）を、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を２、５および１２．５としてＭＰ１−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン９．２（上パネル）と、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を２、５および１０としてクローン１０．９（中パネル）と、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を５、１０および２０としてクローン１１．４６（下パネル）と、共培養した。１：２０に希釈した培養上清中のＩＦＮγをＥＬＩＳＡにより測定した。エラーバーは標準偏差を示す。それぞれ２回の実験のうちの１回を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の詳細な説明
以下の詳細な説明では、本発明の完全な理解のために多くの具体的な詳細を記載する。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細なしに実施されうることは当業者に理解されるであろう。他の例では、本発明を不明瞭としないように、周知の方法、手技および構成成分については詳細に記載していない。
【００２８】
オートファジー経路は内因性ＭＨＣクラスＩＩ抗原プロセシングに関与していると示唆されているが、オートファジーがＭＨＣクラスＩＩ陽性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）においてどの程度構成的に活性であるかについてはこれまでのところ知られていなかったし、また、ＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画への抗原輸送についてこれらの経路がどの程度有効であるかも知られておらず、ＭＨＣクラスＩＩ上の提示のための、オートファゴソーム区画への特異抗原輸送にかような経路が利用されうることも知られていなかった。
【００２９】
本明細書で説明するように、オートファゴソームは、上皮細胞においてＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画と構成的に融合することが発見され、また、インフルエンザＭＰ１融合コンストラクトを例に挙げて本明細書で説明するように、例えば、オートファゴソームマーカーであるＬＣ３への対象となるタンパク質またはペプチドの融合を介した当該経路の標的化により、ＭＨＣクラスＩＩ提示およびＣＤ４＋細胞の認識が著しく増強されることとなった。
【００３０】
かような融合タンパク質は、当該融合タンパク質をコードする核酸または当該核酸を含むベクターの導入により調製されうる。
【００３１】
一実施形態においては、オートファゴソーム標的化タンパク質をコードする核酸またはその機能性断片にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸が提供され、ここで、当該対象となるペプチドまたはタンパク質は、ほとんどまたは全く、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子上に効率的に提示されない。
【００３２】
核酸：
一実施形態において、「核酸」分子との語は、以下に制限されないが、原核配列、真核ｍＲＮＡ、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核（例えば哺乳動物の）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列さえも含みうる。この語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基類似体を含む配列をも意味する。
【００３３】
当業者には理解されるように、ある核酸配列の断片や誘導体、またはあるタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子は、全長の野生型の遺伝子または配列と同様に機能しうる。同様に、核酸配列の形式も野生型の配列と比較して多様でありうるが、とは言え、かような多様性にもかかわらず、タンパク質またはペプチドをコードし、またはその断片であり、野生型の機能を保持して同一の生物学的作用を発現する。これらのそれぞれは本明細書中の実施形態を示す。
【００３４】
本明細書に記載の核酸は、本技術分野において周知のもののような、合成プロセスまたは組換えプロセスにより製造されうる。本明細書の教示による核酸はさらに、本技術分野において公知の技術を用いて、生物物理学的特性または生物学的特性を変化させる目的で修飾されてもよい。例えば、核酸は、ヌクレアーゼに対するその安定性を上昇させる目的で、またはその脂溶性、溶解性もしくは相補配列に対する結合親和性を変化させる目的で修飾されうる。
【００３５】
本明細書の教示によるＤＮＡはまた、本技術分野において公知の方法によって化学的に合成されうる。例えば、ＤＮＡは、全体的にまたは部分的に、本技術分野において公知の方法によって４つのヌクレオチドから科学的に合成されうる。かような方法としては、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８５）に記載のものが挙げられる。ＤＮＡはまた、重複した二本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、ギャップを埋め、末端を一緒にライゲーションすることによっても合成されうる（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｄら（１９８９）やＧｌｏｖｅｒら（１９９５）を参照）。タンパク質のＤＮＡ発現機能ホモログは、部位特異的突然変異誘発法により野生型ＤＮＡから調製されうる（例えば、Ｚｏｌｌｅｒら（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ（１９８３）；およびＺｏｌｌｅｒ（１９８４）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９１）を参照）。得られたＤＮＡは本技術分野において公知の方法によって増幅されうる。適当な方法の１つは、Ｓａｉｋｉら（１９８８）、Ｍｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，１９５号）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である。
【００３６】
本明細書に記載の核酸分子は、オートファゴソーム標的化タンパク質をコードする核酸またはその機能性断片にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質を含む。
【００３７】
一実施形態では、オートファゴソーム標的化タンパク質はＬＣ３タンパク質である。
【００３８】
一実施形態では、ＬＣ３タンパク質は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースに開示され、ＮＭ＿０２５７３５、ＮＭ＿１４２３９２、ＮＭ＿１６７２４５、ＢＣ０１８６３４、ＡＹ６１９７２０、ＢＣ０８６３８９、ＢＣ０４５７５９、ＢＣ０６７７９７、ＢＣ０１０５９６、ＢＣ０１８６３４、ＢＣ０８３５５６、ＡＦ３０３８８８、ＡＦ１８３４１７のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同な配列を有する核酸によりコードされる。
【００３９】
他の実施形態では、ＬＣ３タンパク質は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベースに開示され、Ｑ９ＧＺＱ８、Ｑ６２６２５、ＡＡＵ０４４３７、ＮＰ＿８５２６１０、ＮＰ＿０７３７２９、ＮＰ＿９５５７９４、ＡＡＭ１０４９９、ＮＰ＿０８００１１、ＡＡＨ１８６３４、ＡＡＨ８６３８９、ＡＡＨ８３５５６、ＡＡＨ５８１４４、ＡＡＰ３６１２０、ＡＡＯ３９０７８のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同なアミノ酸配列を有する。
【００４０】
哺乳動物の微小管結合タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）およびそのホモログ（酵母Ａｔｇ８など）は、オートファジーに不可欠の成分である。ラットでは、合成後に、ＬＣ３のＣ末端はシステインプロテアーゼ−Ａｔｇ４により切断されてＬＣ３−Ｉが生成し、これがサイトゾル画分に位置することが判明している。ＬＣ３−Ｉは、Ａｔｇ７（Ｅ１様酵素）およびＡｔｇ３（Ｅ２様酵素）によるプロセシングを介してＬＣ３−ＩＩへと変換されうる。ＬＣ３−ＩＩは、ホスファチジルエタノールアミンによってそのＣ末端が修飾され、オートファゴソーム膜に強固に結合する。例えば、ラットＬＣ３のスプライス変異体も同様に発見されており（それぞれＬＣ３ＡおよびＬＣ３Ｂ）、細胞内局在化の研究によりＬＣ３ＡおよびＬＣ３Ｂの双方がＬＣ３とともに共局在化しており、オートファゴソーム膜に結合していることが判明した。かようなスプライス変異体、すなわち結合タンパク質は、本明細書に記載の方法、核酸、コンストラクト、細胞および組成物において、本明細書に記載のように、オートファゴソーム標的化タンパク質として、関連するタンパク質をクラスＩＩプロセシングおよび提示機構へと標的化する目的で、用いられうる。オートファゴソームに結合することが判明しており、対象となるタンパク質もしくはペプチドとの融合コンストラクトとして調製されると、ＭＨＣクラスＩＩを介して当該コンストラクトをオートファゴソームへと標的化し、および／または当該対象となるタンパク質もしくはペプチドもしくはその機能性断片の提示を促進するように作用する、同定されたいかなるタンパク質も、本明細書の実施形態である。かようなタンパク質は、過去に同定されたオートファゴソーム結合タンパク質であってもよい。
【００４１】
ある実施形態では、「ホモログ」または「相同性」との語は、対応する天然配列の残基と同一の、候補配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの残基の百分率を示す。一実施形態では、これは、必要であれば、相同性の百分率を最大化する目的で配列をアライニングし、ギャップを導入した後のものであってもよいし、ある実施形態では、配列の同一性の一部としての同類置換を考慮しなくてもよい。ある実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端の伸長や挿入は同一性または相同性を減少させるものとして解されない。アライメントのための方法やコンピュータプログラムは本技術分野において周知である。
【００４２】
ある実施形態では、相同性は、本技術分野において周知の方法によって、配列アライメントのためのコンピュータプログラムによって決定されうる。例えば、核酸配列の相同性のコンピュータアルゴリズム分析としては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）、  ＧＥＮＰＥＰＴおよびＴＲＥＭＢＬのパッケージなどの数多く存在する入手可能なソフトウェアパッケージを利用することが挙げられる。
【００４３】
一実施形態において、相同性の決定は、本技術分野において周知の方法である、候補配列のハイブリダイゼーションを介して行なわれる（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  Ｅｄｓ．  （１９８５）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−３）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙを参照）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、オートファゴソーム標的化タンパク質をコードするＤＮＡの相補体に対して、穏やかな条件からストリンジェントな条件下で行なわれうる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、１０〜２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、１０％デキストラン溶液、および２０μｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「相同性」、「ホモログ」または「相同の」との語は、いかなる場合でも、アミノ酸配列であるか核酸配列であるかにかかわらず、当該配列が、相手方の配列に対して、一実施形態では少なくとも７０％の一致を示すことを意味する。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも７２％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも７５％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも８０％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも８２％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも８５％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも８７％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも９０％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも９２％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも９５％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも９７％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも９９％の一致を示す。他の実施形態では、当該アミノ酸配列または核酸配列は、相手方の配列に対して、少なくとも９５％〜１００％の一致を示す。同様に、本明細書で用いられる場合、特定の配列に対する一致への言及は、直接の一致と、本明細書で定義される当該配列への相同性との双方を包含する。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、相同性は、配列の同一性を意味しうるし、または、構造の同一性もしくは機能の同一性を意味しうる。「相同性」および他の類似の形態の語を用いることにより、核酸またはペプチドにかかわりなく、同様に機能し、および／または配列の同一性を有し、および／または構造が保存されており参照配列と近似しているいかなる分子も、本明細書の実施形態となる。
【００４６】
このようにして、一実施形態では、オートファゴソーム標的化タンパク質をコードする核酸は、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する。
【００４７】
他の実施形態において、オートファゴソーム標的化タンパク質は、γ−アミノ酪酸型Ａ受容体結合タンパク質（ＧＡＢＡＲＡＰ）、１６ｋＤａのゴルジ結合ＡＴＰａｓｅエンハンサー（ＧＡＴＥ１６）、またはこれらの類似体である。
【００４８】
一実施形態において、上記γ−アミノ酪酸型Ａ受容体結合タンパク質（ＧＡＢＡＲＡＰ）は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースに開示され、ＮＭ＿１７４８７４、ＮＭ＿００７２７８、ＢＣ１０６７４８、ＮＭ＿１７２０３６、ＮＭ＿０１９７４９、ＢＣ０５８４４１、ＢＣ００２１２６、ＡＦ１６１５８８、ＡＦ１６１５８７、ＮＭ＿１７７４０８のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同な配列を有する核酸によりコードされる。
【００４９】
他の実施形態では、上記γ−アミノ酪酸型Ａ受容体結合タンパク質（ＧＡＢＡＲＡＰ）タンパク質は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベースに開示され、ＣＡＧ４７０３１、ＣＡＧ３３３２４、ＮＰ＿０６２７２３、ＡＡＤ４７６４３、Ｑ９ＧＪＷ７、ＡＡＩ０６７４９、ＣＡＩ３５１６２、ＡＡＨ３０３５０のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同なアミノ酸配列を有する。
【００５０】
一実施形態において、上記１６ｋＤａのゴルジ結合ＡＴＰａｓｅエンハンサー（ＧＡＴＥ１６）タンパク質は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースに開示され、ＡＹ１１７１４７、ＮＭ＿０２６６９３、ＮＭ＿０３１４１２、ＢＣ０８１４３６のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同な配列を有する核酸によりコードされる。
【００５１】
他の実施形態では、上記１６ｋＤａのゴルジ結合ＡＴＰａｓｅエンハンサー（ＧＡＴＥ１６）タンパク質は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベースに開示され、ＡＡＭ７７０３６、Ｐ６０５１９、ＢＡＢ２１５４９、ＢＡＢ２１５４８、Ｐ６０５２０、ＮＰ＿０８０９６９、ＮＰ＿４９５２７７のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同なアミノ酸配列を有する。
【００５２】
他の実施形態において、オートファゴソーム標的化タンパク質は、シャペロン介在性オートファジーのためのＲＮＡａｓｅＡ由来のＫＦＥＲＱシグナル配列であり、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースに開示され、ＮＭ＿Ｄ２６１２９のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同な５’ａａａｔｔｃｇａｇｃｇｇｃａｇ３’の核酸配列を有する。
【００５３】
他の実施形態では、上記ＫＦＥＲＱシグナル配列は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベースに開示され、ＮＰ＿Ｄ２６１２９のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同なＫＦＥＲＱのアミノ酸配列を有する。
【００５４】
他の実施形態では、オートファゴソーム標的化タンパク質は、エプスタイン−バーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ１）配列（ａａ２６８〜９８４）由来のＧＡ繰り返しドメインであり、ＥＭＢＬヌクレオチドデータベースに開示され、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ＿ＣＡＡ２４８１６のアクセッションナンバーを有するもの、またはその類似体に対応する、またはこれに相同な核酸配列を有する。
【００５５】
本明細書に記載の核酸は、対象となるタンパク質またはペプチドをコードする核酸にインフレームで融合した、オートファゴソーム標的化タンパク質をコードする配列を有し、ここで、当該対象となるタンパク質またはペプチドは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質を介した提示が減少しているか、ほとんど提示されないか、または全く提示されない。
【００５６】
抗原：
一実施形態において、対象となるタンパク質もしくはペプチドまたはその機能性断片は、ＭＨＣクラスＩＩ上への特異的な提示が望まれるエピトープを含む。一実施形態において、「エピトープ」との語は、免疫原性のアミノ酸配列を意味する。エピトープは、６〜８アミノ酸の最小アミノ酸配列（すなわち、ペプチド）であってもよく、当該最小の配列は、自身の天然の状態から外されると免疫原性である。エピトープはまた、他の実施形態では、免疫原性である天然のポリペプチドの一部であってもよく、ここで、当該エピトープを含む当該天然のポリペプチドを抗原と称する。ある実施形態では、あるポリペプチドすなわち抗原は、１または２以上の異なるエピトープを有していてもよい。ある実施形態では、エピトープは、多鎖ポリペプチド（すなわち、異なるオープンリーディングフレームによりコードされるもの）の免疫原性の一部であってもよい。エピトープ、ペプチド、およびポリペプチドとの語はいずれも、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とα−カルボキシ基との間でのペプチド結合により互いに結合した一連のアミノ酸を意味し、グリコシル化、側鎖の酸化またはリン酸化などの修飾を含んでも含まなくてもよい。ただし、かような修飾の存在や不存在が免疫原性を失わせてはならない。本明細書で用いられる場合、「ペプチド」との語は、ペプチドおよびポリペプチドすなわちタンパク質の双方を意味するものとする。
【００５７】
ある実施形態では、エピトープ（ペプチド、ポリペプチド、抗原）は可能な限り小さいものの、依然として免疫原性を維持している。本明細書に記載のように、免疫原性は、免疫応答を誘導する能力、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合してＴ細胞応答を誘導する能力によって、例えばＴ細胞サイトカイン産生を測定することによって、示される。
【００５８】
ある実施形態では、「抗原」または「免疫原」との語は、免疫原性であり、哺乳動物における免疫応答を誘導でき、よって少なくとも１つ（複数含んでもよい）のエピトープを含む、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドを意味する。本明細書に記載のように、「病原体」、有機体、または「作用体」は、本明細書に記載の方法、細胞、核酸、ベクターおよび／または組成物がそのために用いられる、疾患または障害を引き起こしうるものである。ある実施形態では、病原体または有機体への言及は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物を意味する。「作用体」との語はまた、腫瘍抗原または自己免疫もしくは移植に関連した抗原（例えば、自己（宿主）抗原もしくは移植片抗原）などの抗原を意味しうる。
【００５９】
一実施形態において、対象となるペプチドまたはタンパク質は、ウイルスによりコードされ、一実施形態において、対象となるペプチドまたはタンパク質は、インフルエンザウイルスによりコードされ、これは他の実施形態ではマトリックスタンパク質であり、他の実施形態では、インフルエンザマトリックスタンパク質にインフレームで融合したオートファゴソーム標的化タンパク質をコードする核酸は、配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する。
【００６０】
一実施形態では、対象となるペプチドまたはタンパク質はウイルス由来であり、これは以下のウイルスファミリーの１つである：レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１ヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）またはＨＩＶ−ＩＩＩ；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離体）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス科、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラ出血熱ウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オービウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１・２、水疱瘡ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；肝炎Ｘ、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；並びに、未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の作用体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体と考えられている）、非Ａ型非Ｂ型肝炎の作用体（クラス１＝内部感染；クラス２＝非経口感染（すなわち、Ｃ型肝炎））；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、並びにアストロウイルス）。
【００６１】
一実施形態では、対象となるペプチドまたはタンパク質は細菌由来であり、当該細菌は細胞内細菌であり、特に以下のものが挙げられる：赤痢菌種、サルモネラ菌種、フランシセラ種、ヘリコバクター・ピロリなどのヘリコバクター種、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィラなどのレジオネラ菌種、マイコバクテリウム種（例えば、ヒト結核菌、トリ結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・ゴルドネ）、黄色ブドウ球菌などのスタフィロコッカス種、淋菌、髄膜炎菌などのナイセリア種、リステリア・モノサイトゲネスなどのリステリア種、特に化膿連鎖球菌（Ａ群溶血性連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群溶血性連鎖球菌）、ストレプトコッカス・ビリダンス群、ストレプトコッカス・フェーカリス、ストレプトコッカス・ボビス、嫌気性連鎖球菌種、肺炎連鎖球菌などの連鎖球菌種、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、クラミジア種、インフルエンザ菌、炭疽菌、コリネバクテリウム種、ジフテリア菌、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルコシダ、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバシラス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、熱帯苺腫トレポネーマ、レプトスピラ、アクチノマイセス・イスラエリ、野兎病菌、または本技術分野において公知の他のもの（Ｇ．  Ｌ．  Ｍａｎｄｅｌｌ，  “Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ”  ｉｎ  Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  （Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，  １９９６）  １５５６−７を参照）。
【００６２】
一実施形態では、対象となるペプチドまたはタンパク質は原虫由来であり、当該原虫としては特に以下のものが挙げられる：マラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫）、トリパノソーマ、トキソプラズマ、リーシュマニア、クリプトスポリジウム、および本技術分野において公知の他のもの。
【００６３】
一実施形態において、対象となるペプチドまたはタンパク質は、真菌由来であり、当該真菌としては特に以下のものが挙げられる：クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス。
【００６４】
癌抗原
一実施形態において、対象となるペプチドまたはタンパク質は、腫瘍のまたは癌性の細胞または組織であるか、あるいは前癌性の細胞または組織である。一実施形態において、癌性細胞は悪性であってもよいし、または、他の実施形態では、悪性ではない癌であってもよい。癌または腫瘍としては、以下に制限されないが、胆道癌；脳腫瘍；乳癌；子宮頸癌；絨毛腫；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞癌および非小細胞癌）；黒色腫；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌、並びに他の癌腫および肉腫が挙げられる。一実施形態において、上記癌は、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌または結腸癌である。
【００６５】
他の実施形態において、上記抗原は、副腎；膀胱；骨；乳房；頸部；内分泌腺（甲状腺、下垂体、および膵臓など）；結腸；直腸；心臓；造血組織；腎臓；肝臓；肺；筋肉；神経系；脳；眼；口腔；咽頭；喉頭；卵巣；陰茎；前立腺；皮膚（黒色腫など）；精巣；胸腺；および子宮において生じた癌性細胞由来である。かような腫瘍の例としては、アプドーマ、分離種、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン−ピアース、導管腺、エーリッヒ腫瘍、インサイチュ、Ｋｒｅｂｓ２、メルケル細胞、粘液腺、非小細胞肺、燕麦細胞、乳頭腺、スキルス、細気管支、気管支、扁平上皮細胞および移行細胞）、形質細胞腫、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維種、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑液腫瘍、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、性索間質性腫瘍、肝臓癌、汗腺腫、島細胞腫、ライディック細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上皮腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、角化血管腫、木村氏病、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング実験肉腫、カポジ肉腫および肥満細胞肉腫）、新生物、並びに他のかような細胞のものが挙げられる。
【００６６】
一実施形態において、癌に関連した抗原は、腫瘍抗原とも称され、これは一実施形態では、腫瘍細胞または癌細胞の表面に結合したペプチドまたはタンパク質である。癌抗原は、腫瘍または癌の免疫原性の部分を表しうる。
【００６７】
癌抗原としては、ある実施形態では、正常細胞では通常サイレントな（すなわち、発現していない）抗原が挙げられ、あるいは他の実施形態では、分化のある段階にのみ発現するものが挙げられ、あるいか他の実施形態では、胚抗原や胎児性抗原のように一時的に発現しているものが挙げられる。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、変異ｐ５３）、内部挿入や染色体転座の結果生じた融合タンパク質などの、変異細胞の遺伝子によってコードされるものである。さらに他の癌抗原は、例えばＲＮＡ腫瘍ウイルスやＤＮＡ腫瘍ウイルスによって輸送されるもののようなウイルス遺伝子によってコードされうる。腫瘍抗原の例としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸結合抗原（ＣＲＣ）-Ｃ０１７-１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）並びにその免疫原性エピトープであるＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）  並びにその免疫原性エピトープであるＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ  ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００、Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫様ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、並びにｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。
【００６８】
本明細書に記載のいかなる細胞癌抗原も、本明細書に記載の方法および／または組成物に用いられることができ、これらの実施形態を示すものと解されるべきである。
【００６９】
本明細書に記載の核酸、方法、および組成物に用いられる癌抗原としては、特に、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６；ａｍｌ１；シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇイディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸結合抗原（ＣＲＣ）-Ｃ０１７-１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛腫（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（Ｉｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ球様細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー；ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽腔癌（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープであるＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵臓癌（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部および食堂の扁平上皮癌（ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産物）、精巣癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）、並びに黒色腫（メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２１ｒａｓ；ｇｐ１００；Ｐｍｅｌ１１７）が挙げられる。これらの腫瘍抗原を発現する、過形成細胞、前癌性細胞、または腫瘍細胞は、本明細書に記載の方法および／または組成物に用いられうる。上述した任意の癌は従って、本明細書に記載の核酸、ベクター、組成物および方法を用いて治療されることができ、これらの実施形態を示すものと解されるべきである。
【００７０】
本明細書に記載の核酸およびベクターによってコードされる抗原は内因的に合成され、オートファゴソーム標的化タンパク質に融合した当該抗原のエピトープはＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画へと標的化され、最終的に、当該抗原はクラスＩＩＭＨＣ分子を介して提示される。
【００７１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は普通、１２〜２０アミノ酸長のペプチドに結合する。これらのリガンドのペプチド隣接残基（ＰＲＦ）は９つのアミノ酸からなる中心結合コアから伸びている。ＰＦＲはＴ細胞エピトープの免疫原性を変化させうる。増強されたＭＨＣクラスＩＩの結合には特定のモチーフ（例えば、ＭＨＣクラスＩＩリガンドにおけるＣ末端の塩基性残基およびＮ末端のプロリンの存在）が関与している。かようなモチーフは、本明細書のある実施形態では、オートファゴソームへと標的化されるペプチドおよび／またはタンパク質の種類を調整すべく、本明細書に記載の方法、分子および組成物に従って、本明細書に記載のコンストラクトおよび核酸の設計や調製において考慮される。
【００７２】
ある実施形態において、抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ提示のためのペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＩｉタンパク質のＩｉキーセグメントのＣ末端領域をコードすることにより作製され、これにより、ＭＨＣクラスＩＩエピトープの提示能力が増強されうる。
【００７３】
ある実施形態では、オートファゴソームへと標的化された後に良好にＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されるように、当該分子に良好に結合するであろうエピトープをコードするコンストラクトおよび／または核酸を構築する目的で、本明細書に記載の核酸の設計において、コンピュータエピトープ予測プログラムが用いられる。かような予測アルゴリズムは本技術分野において公知であり、例えば以下のウェブサイトに見られるものが挙げられる：
（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）
他の実施形態において、抗原は、対象者の免疫系によって外来物として認識される任意の分子でありうる。他の実施形態では、当該抗原は、哺乳細胞、感染性ウイルス、細菌、真菌または他の有機体（例えば、原虫）由来である。これらの感染性の有機体は、一実施形態では活性であり、あるいは他の実施形態では不活性であり、後者の実施形態は、熱への曝露または当該有機体の複製に必要な少なくとも１つのタンパク質もしくは遺伝子の除去によって達成されうる。一実施形態では、抗原性タンパク質またはペプチドをコードする核酸は単離され、他の実施形態では合成される。
【００７４】
他の実施形態においては、抗原性タンパク質を補うペプチドをコードする核酸のライブラリーが本明細書で用いられる。一実施形態において、核酸は約１５アミノ酸長のペプチドをコードし、他の実施形態では、抗原性タンパク質の長さに沿って４アミノ酸ごとにずらしたペプチドをコードするように構築されうる。他の実施形態では、抗原は、例えば病原体由来のような抗原、または他の疾患もしくは症状に関与している抗原のポリペプチドをコードする２以上の形態の核酸を組み換えることによって得られる。一実施形態においては「ＤＮＡシャッフル」と称されるこれらの組換えの方法は、２以上のヌクレオチドにおいて基質として互いに異なる形態の核酸を用い、その結果、組換え核酸のライブラリーが得られる。当該ライブラリーは次いで、病原体または他の症状に対する免疫応答の誘導能が改善された最適組換え抗原をコードする少なくとも１つの組換え核酸を同定する目的でスクリーニングされる。得られた組換え抗原は、複数の病原株に対して反応する抗体（Ａｂ）によって認識されるという点でキメラであることが多く、通常は広スペクトルの免疫応答を誘導することもできる。
【００７５】
他の実施形態では、関連する作用体（例えば、病原体）のファミリーのメンバーから抗原性ポリペプチドをコードする異なる形態の核酸が得られる。「ファミリーシャッフル」として知られる、関連する有機体からの核酸を用いてＤＮＡシャッフルを行なう当該スキームは、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：  ２８８−２９１）に記載されている。病原体の異なる株および血清型のポリペプチドは通常、６０〜９８％の間で変動し、これによって効率的なファミリーＤＮＡシャッフルが可能となる。従って、ファミリーＤＮＡシャッフルによれば、多価の交差防御抗原を得るための効果的なアプローチが提供される。次に、本明細書および特許請求の範囲に記載の組換え融合タンパク質は、当業者に周知の方法によって製造され、さらには本明細書に記載の組成物および方法において用いられる。
【００７６】
ベクター：
一実施形態においては、本明細書に記載の核酸を含むベクターが提供される。
【００７７】
本明細書に記載の核酸配列は、特定のベクター中にサブクローニングされうるが、当該ベクターの選択は、ある実施形態では、細胞内での当該配列の導入、発現、制御等の所望の方法に依存しうる。本明細書に記載の核酸コンストラクトを作製するには、対象となる配列をコードするポリヌクレオチド断片を、哺乳動物へ形質導入／形質転換するのに適し、かつ、形質導入／形質転換された細胞中での組換え産物の発現を指示するのに適した市販の発現ベクター系中にライゲーションすればよい。当然のことながら、かような市販のベクター系は、存在するプロモーター配列またはエンハンサー配列を置換し、複製し、もしくは変異させる目的で、および／または、例えば追加の選択マーカーをコードする配列もしくはレポーターポリペプチドをコードする配列などの任意の追加のポリヌクレオチド配列を導入する目的で、汎用の組換え技術によって容易に修飾されうる。
【００７８】
一実施形態において、「ベクター」との語は、ベクター中にサブクローニングされた対象となる配列を含む核酸コンストラクトを意味し、この場合、当該核酸配列は本明細書に記載の融合産物をコードする。
【００７９】
本明細書に記載のベクターは、選択可能な適当なマーカーを含みうる。当該ベクターはさらに複製開始点を含んでもよく、またシャトルベクターであってもよく、このシャトルベクターは、例えば大腸菌のような細菌において増殖可能であり（ここで、当該ベクターは選択可能な適当なマーカーおよび複製開始点を含む）、かつ、脊椎動物細胞での増殖、または選択した有機体のゲノムへの一体化にも適合しうる。本明細書に記載のこの実施形態によるベクターは、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体でありうる。
【００８０】
ある実施形態では、本明細書に記載のベクターは、制御可能なプロモーターを有している。遺伝子産物の発現を制御するヌクレオチド配列（本明細書では「制御エレメント」と称し、例えば、プロモーター配列やエンハンサー配列である）は、一実施形態では、遺伝子産物が発現するであろう細胞の種類に応じて、他の実施形態では遺伝子産物の所望の発現レベルに応じて、選択されうる。
【００８１】
例えば、関連する遺伝子の細胞タイプ特異的な発現を可能とするプロモーターが用いられうる。筋芽細胞の遺伝子発現に特異的なプロモーターは、その遺伝子産物の筋特異的な発現を可能とする、対象となる遺伝子と連鎖しうる。本技術分野において公知の筋特異的制御エレメントとしては、ジストロフィン遺伝子からの上流領域（Ｋｌａｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２３９６）、クレアチンキナーゼ遺伝子（Ｂｕｓｋｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｕｓｃｈｋａ，  （１９８９）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ９：２６２７）およびトロポニン遺伝子（Ｍａｒ  ａｎｄ  Ｏｒｄａｈｌ，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８５：６４０４）が挙げられる。
【００８２】
他の細胞タイプに特異的な制御エレメントも、本技術分野において公知である（例えば、肝特異的発現のためのアルブミンエンハンサー；膵臓島細胞特異的発現のためのインスリン制御エレメント；神経ジストロフィン、神経エノラーゼおよびＡ４アミロイドプロモーターなどの種々の神経細胞特異的制御エレメント）。他の実施形態では、多様な異なる細胞タイプにおいて遺伝子の構成的な発現を指示しうる制御エレメント（例えば、ウイルス制御エレメント）が用いられうる。遺伝子発現を促進する目的で汎用されるウイルスプロモーターの例としては、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス並びにレトロウイルスＬＴＲ由来のものが挙げられる。
【００８３】
他の実施形態では、自身に連鎖した遺伝子の誘導可能な発現をもたらす制御エレメントが用いられうる。誘導可能な制御エレメント（例えば、誘導可能なプロモーター）を用いることで、細胞中での遺伝子産物の製造を調節することが可能となる。真核細胞に用いるための潜在的に有用な誘導可能な制御システムの例としては、ホルモン制御エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｊ．Ｈ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７を参照）、合成リガンド制御エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ  １９９３を参照）、およびイオン化放射線制御エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，  Ｙ．  Ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７−１０６１３；  Ｄａｔｔａ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８９：１０１４−１０１５３を参照）が挙げられる。他の組織特異的な、または誘導可能な制御エレメントが、本明細書の実施形態に従って用いるために開発されてもよい。
【００８４】
ある実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび核酸は細胞中に導入され、他の実施形態では、当該細胞は本明細書に記載の細胞を含む。本明細書に記載の細胞中に上記組換えベクターを導入するには、本技術分野において公知の多くの技術が存在する。例えば、以下に制限されないが、ＤＮＡ直接取り込み技術、ウイルス、プラスミド、直鎖ＤＮＡもしくはリポソーム介在性形質導入、リン酸カルシウム介在性およびＤＥＡＥ−デキストラン介在性形質導入法を用いた受容体介在性取り込み法およびマグネトポレーション法、エレクトロポレーション法、リポソーム介在性トランスフェクション、直接注入法、並びに受容体介在性取り込み法（詳細については、例えば、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ”  Ｖｏｌ．  １−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  （１９８９）  ａｎｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）または他の標準的なラボマニュアルを参照）が挙げられる。核酸コート粒子を用いた衝撃もまた想定される。
【００８５】
特定の発現ベクター系および細胞への核酸の導入法の有効性は、本技術分野において一般的に用いられている標準的なアプローチにより評価されうる。例えば、細胞中に導入されたＤＮＡをフィルタＤＮＡハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）によって検出してもよいし、導入されたＤＮＡの転写により産生されたＲＮＡを、例えばノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出してもよい。遺伝子産物は、適当なアッセイによって、例えば、特異抗体を用いるもののような産生タンパク質の免疫学的検出によって、または酵素アッセイのような遺伝子産物の機能活性を検出する機能アッセイによって、検出されうる。細胞により発現されるべき対象となる遺伝子産物が容易にアッセイ可能でない場合には、用いられる制御エレメントおよびベクターに連鎖したレポーター遺伝子を用いて、まず発現系を最適化してもよい。当該レポーター遺伝子は遺伝子産物をコードし、当該遺伝子産物は容易に検出可能となり、よって系の有効性の評価に用いられうる。本技術分野において用いられる標準的なレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびヒト成長ホルモンまたは本明細書に列挙した任意のマーカータンパク質が挙げられる。
【００８６】
ある実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態では、オートファゴソーム標的化タンパク質および対象となるタンパク質またはペプチドをコードするｃＤＮＡを含むパッケージ系が構築される。
【００８７】
パッケージ系とは、核酸をカプシドで包み、当該核酸をビリオン産生細胞から輸送し、当該核酸を標的細胞へと伝達し、標的細胞においては導入遺伝子の発現を促進しうる、ビリオンを産生するのに必要な全ての遺伝子情報を発現可能な形態でまとめて提供可能な、単位のベクターまたは複数のベクター群である。ある実施形態では、当該パッケージ系は、自身をパッケージすることが実質的に不能であり、よって、標的細胞中への導入後のビリオン産生が阻害されることから、減衰が生じることとなる。
【００８８】
他の実施形態では、本明細書に記載の組換えベクターは、マーカーポリペプチドをコードする異種の核酸配列をさらに含む。当該マーカーポリペプチドとしては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤＳ−レッド（赤色蛍光タンパク質）、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または多数存在する当業者に公知の他のレポータータンパク質が挙げられうる。
【００８９】
他の実施形態では、本明細書に記載の組換えベクターおよび核酸は、免疫修飾タンパク質をさらにコードしうる。
【００９０】
有用な免疫修飾タンパク質としては、サイトカインまたはケモカインが挙げられる。有用な例としては、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−２，ＩＬ−１２，ＩＬ−４，ＩＦＮ−γまたはこれらの組み合わせが挙げられる。他の有用な例としては、例えばインターロイキン１〜１５などのインターロイキン、インターフェロンα、β、またはγ、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）などのケモカイン、マクロファージ走化活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性ペプチドであるＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９１】
他の実施形態では、当該免疫修飾タンパク質は、ヒト特異性またはヒト以外の動物への特異性を有してもよく、天然のタンパク質への同程度の結合活性を有する細胞外ドメインおよび／または他の断片を含んでもよい。他の実施形態では、当業者にとっては当然であるが、免疫修飾タンパク質は上述したタンパク質の変異体または類似体であってもよく、融合タンパク質を含むように、または独立して発現してもよい。ある実施形態では、当該免疫修飾タンパク質は、本明細書に記載の核酸またはベクターの発現と同時に発現してもよいし、他の実施形態では本明細書に記載の核酸またはベクターの発現の前に、他の実施形態ではこれよりも後に、発現してもよい。複数の免疫修飾タンパク質が単一のコンストラクト中に組み込まれてもよく、これ自体もまた、本明細書の他の実施形態である。
【００９２】
他の実施形態では、本明細書に記載の核酸を含む細胞が提供される。他の実施形態では、本明細書に記載のベクターを含む細胞が提供される。
【００９３】
一実施形態では、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、対象となるペプチドまたはタンパク質の提示を刺激または増強する方法が提供され、当該方法は、  主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現しうる細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記細胞の表面上に提示される。
【００９４】
一実施形態では、「主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現しうる」との句は、当該分子を内因的に発現する細胞を意味し、あるいは他の実施形態では、当該分子を発現するように誘導された細胞を意味し、あるいは他の実施形態では、当該分子を発現するように設計された細胞を意味する。ある実施形態では、当該細胞は専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と称され、単球、マクロファージまたは骨髄細胞系列の任意の細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｍ細胞またはこれらの任意の組み合わせを含みうる。ある実施形態では、当該細胞は上皮細胞であり、ある実施形態では、当該細胞はサイトカインに曝露され、すると当該細胞は、例えばインターフェロンγの投与後に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子の発現をアップレギュレートする。
【００９５】
細胞および標的化療法
ある実施形態では、細胞は、健常な対象者中のものであり、または他の実施形態では、健常な対象者から単離される。本明細書に記載の方法／細胞は、ある実施形態ではワクチン接種、または他の実施形態では疾患の予防、または他の実施形態では疾患の治療の手段である。
【００９６】
ある実施形態では、細胞は、罹患しているか、および／または異常である。本願の罹患したまたは異常な細胞としては、特に、感染した細胞、腫瘍細胞、前癌性細胞、炎症巣、良性の腫瘍またはポリープ、カフェオレスポット、白板症および他のほくろが挙げられる。
【００９７】
本明細書に例として挙げたように、インフルエンザＭＰ１をオートファゴソーム結合Ａｔｇ８／ＬＣ３タンパク質に融合させることにより、ＭＨＣクラスＩＩ提示を増強させるためにこれを標的化した。抗原の源が細胞間の経路によって輸送される場合にはＭＰ１のＭＨＣクラスＩＩ提示へのアクセスは示されたが（図７）、Ａｔｇ８／ＬＣ３に融合するとＭＰ１のＭＨＣクラスＩＩ提示は有意に（１７倍）増加した。かような増加は、ＭＰ１／ＬＣ３融合タンパク質が発現してもＭＰ１または表面ＭＨＣクラスＩＩの合計発現量は増加しなかったという事実にもかかわらず起こったものである。
【００９８】
従って、ここでは、例えばウイルスベクターを介した細胞間輸送後にＭＨＣクラスＩＩ提示およびＣＤ４＋Ｔ細胞刺激を増強するためにオートファジーによる標的化が抑制されることが示された。
【００９９】
当該研究において用いられたＭＰ１のＡｔｇ８／ＬＣ３との融合タンパク質はまた、ＭＨＣクラスＩ上にも効率的にプロセシングされた。上で概説した直接の抗ウイルス作用に加えてＣＤ４＋Ｔ細胞も保護ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクターの作用および記憶の維持に不可欠であることが示されていることから、ある実施形態では、ヘルパーＴ細胞の刺激の改善は免疫応答の一要素として働き、かような免疫応答の誘発が望まれている。ある実施形態では、かような利用は広範なワクチン開発戦略の一部（例えば、組換えウイルスワクチンの開発を介したもの）である。
【０１００】
一実施形態において、本明細書に記載の細胞、または本明細書に記載の任意の方法に用いるための細胞は、感染しており、一実施形態では、当該細胞はウイルスに感染しており、当該ウイルスは、一実施形態ではインフルエンザであり、または他の実施形態ではＨＩＶであり、あるいは他の実施形態では本明細書に記載の任意の病原体であり、あるいは当業者に知られることとなるであろうものである。
【０１０１】
一実施形態では、対象となるペプチドまたはタンパク質はウイルスによりコードされており、一実施形態ではインフルエンザウイルスによりコードされている。一実施形態では、当該対象となるペプチドまたはタンパク質はマトリックスタンパク質であり、一実施形態では、本形態による核酸は、配列番号２に相同な、またはこれに対応する配列を有する。
【０１０２】
一実施形態において、細胞は細菌に感染しており、一実施形態では当該細菌はマイコバクテリウムであり、ある実施形態では、当該マイコバクテリウムは、不活性化しなくともＭＨＣクラスＩＩ提示をほとんど誘発しないことが示されているものである。ある実施形態では、当該細胞は、本明細書に記載の、または当業者に知られることとなるであろう任意の細菌または病原体に感染している。
【０１０３】
他の実施形態において、当該細胞は、腫瘍細胞または前癌性細胞である。
【０１０４】
ある実施形態では、当該細胞は健常であり、予防用ワクチン戦略としての抗原の提示を促進する。他の実施形態では、当該細胞は健常であり、当該細胞の抗原への曝露部位よりも遠位の疾患または症状のための予防的治療として、ＭＨＣクラスＩＩ上への抗原の提示を促進する。
【０１０５】
一実施形態においては、対象者における免疫応答を刺激または増強する方法が提供され、当該方法は、前記対象者における主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現しうる細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含み、これにより、前記オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片が、前記対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記細胞の表面上に提示される。
【０１０６】
本形態の一実施形態によれば、細胞は、核酸または当該核酸を含むベクターと間接的に接触する。一実施形態では、当該核酸または当該核酸を含むベクターは、対象者に静脈内投与され、他の実施形態では、当該核酸または当該核酸を含むベクターもしくは細胞を含む組成物が対象者に投与される。一実施形態では、当該組成物は、一定期間にわたって繰り返し投与される。一実施形態では、当該組成物は、対象者から単離された腫瘍細胞を含み、当該細胞は、一実施形態ではエクスビボで前記核酸または当該核酸を含むベクターと接触する。一実施形態では、対象者は前癌性細胞または過形成細胞を有し、他の実施形態では、対象者は新生組織形成の素因を有する。
【０１０７】
ある実施形態では、本明細書に記載の実施形態に用いるための細胞は、対象者に投与されるときに、当該細胞が投与される対象者について、自家のものであり、または他の実施形態では同系であり、または他の実施形態では異種同系である。一実施形態では、当該細胞は、新生組織形成またはその素因を有する対象者から単離される。
【０１０８】
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の細胞にサイトカインまたは増殖因子を添加することをさらに含んでもよく、または他の実施形態では、本明細書に記載の組成物を含んでもよい。一実施形態では、当該サイトカインおよび／または増殖因子は、本明細書に記載の組成物または細胞の投与によって、対象者において刺激された進行しつつある免疫応答を増強し、活性化し、または方向づけるように作用しうる。一実施形態では、当該サイトカインおよび／または増殖因子は、さらに細胞の成熟を促進し、これにより、他の実施形態では、対象者におけるより強固な提示がもたらされる。ある実施形態では、当該サイトカインは、Ｔｈ−１対Ｔｈ−２（またはその逆）のタイプの応答に関して、かような応答を付勢する。
【０１０９】
ある実施形態では、上記細胞はインビボの源（例えば、生体におけるほとんどの固形の組織、末梢血、リンパ節、消化管関連リンパ系組織、脾臓、胸腺、皮膚、免疫学的損傷部位（例えば、滑液）、膵臓、脳脊髄液、腫瘍サンプル、肉芽腫組織、またはかような細胞が得られる他の任意の源など）から得られる。一実施形態では、上記細胞は、ヒトの源から、他の実施形態ではヒトの胎児、新生児、子供または成人の源から得られる。他の実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物において用いられる細胞は、動物の源（例えば、ブタまたはサルまたは他の任意の対象となる動物）から得られてもよい。他の実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物に用いられる細胞は、正常な対象者から、または他の実施形態では罹患している対象者から、または他の実施形態では対象となる疾患が疑われる対象者から、または他の実施形態では、特定の遺伝的プロファイルの疾患が疑われる対象者（例えば、特定の遺伝子を過剰発現している、または他の実施形態では特定の遺伝子を過少発現していることが知られている個体）から得られてもよいし、あるいは他の実施形態では、所定の新生組織形成が一般的に疑われている集団由来のものであってもよい。
【０１１０】
本明細書において、一実施形態では、「細胞を接触させる」との語は、所定の物に対して細胞を直接的におよび間接的に曝露することの双方を意味する。一実施形態では、本明細書に記載の核酸またはベクター、および必要であればサイトカイン、増殖因子またはこれらの組み合わせに対する細胞の接触は、直接的であり、または他の実施形態では間接的である。一実施形態では、細胞を接触させることには、本技術分野において周知の任意の手段（例えば、マイクロインジェクション）によって細胞を直接的に注入することが含まれうる。他の実施形態では、細胞への供給が間接的である（例えば、細胞の周囲に存在する培地への添加、または本技術分野において周知であり本明細書に記載したような任意の経路による対象者への投与など）こともまた予想される。
【０１１１】
ある実施形態では、本明細書に記載の核酸、ベクターおよび細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しうる細胞に対して特異的に標的化される。ＡＰＣ、これらの幹細胞または他の前駆体細胞タイプへの標的化された送達は、以下の例のような標的化リガンドを含む送達ベヒクルを用いた受容体介在性遺伝子導入によって達成されうる：（ａ）造血系幹細胞について：抗ＣＤ３４モノクローナル抗体または幹細胞因子（ｃ−ＫｉｔもしくはＣＤ１１７）またはｆｌｋ−２リガンド（ヒトホモログＳＴＫ−１）；（ｂ）単球／マクロファージ／樹状細胞前駆体：抗ＣＤ３３モノクローナル抗体；（ｃ）分化マクロファージ／樹状細胞について：マンノース基を有するグリコシル化ＤＮＡ結合ペプチドが特異的な受容体（例えば、マンノース受容体）への標的化に用いられうる；（ｄ）ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞について：ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の定常領域またはＭＨＣクラスＩＩに結合するリガンド（例えば、可溶性ＣＤ４）に特異的な抗体；例えば、ＭＨＣクラス発現細胞の１サブセットであるＢリンパ球は、可溶性ＣＤ４を用いて、またはＣＤ８０、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２に対する抗体またはこれらに対するリガンドを用いて標的化されうる；内皮細胞については、γ−インターフェロン受容体および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体；（ｅ）ＡＰＣまたはＴ細胞については、それぞれ、Ｂ７−１、Ｂ７−２もしくはＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４などの共刺激分子に対するリガンドまたはこれらに対する抗体。これらの標的化リガンドは、標的化作用に加えて、ＡＰＣに対する共刺激シグナルを増加させ、そしてその活性化を増強するという２つの役割を果たしうる。
【０１１２】
他の実施形態では、ＡＰＣ、これらの幹細胞または他の前駆体細胞を特異的に標的化するための手段として、これらの細胞タイプでの発現をもたらすＤＮＡ制御エレメントが用いられる。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書に記載の細胞、核酸、ベクターおよび／または組成物は、新生組織形成またはその素因を有する対象者に投与される。ある実施形態では、かような使用は対象者における新生組織形成を阻害し、緩和し、治療し、改善し、寛解を伸ばし、再活性化を抑制するなどの目的でなされる。
【０１１４】
一実施形態では、「新生組織形成」との語は、異常増殖の特徴を示す個体の１または２以上の細胞のプロセスを包含する。一実施形態では、かようなプロセスは、個体における増殖細胞の塊の存在に向けた進行を含みうる。他の実施形態では、新生組織形成は、異常な細胞分裂が比較的少ないだけの極めて初期の段階を意味しうる。一実施形態では、腫瘍の発生に対する個体の素因が考慮される。本発明ではいかようにも制限されず、腫瘍の発生を経験したことのない個体におけるバイオマーカーの発現プロファイルのレベルの増加は、新生組織形成の発生に対する個体の素因の指標となりうる。
【０１１５】
一実施形態では、「新生組織形成を有する素因がある」との語は、新生組織形成の発生のリスク因子または確率が高い個体（例えば、新生組織形成の家族歴を有する個体、または他の実施形態では特定の癌に関連した遺伝子（例えば、例えば米国特許出願公開第２００４００１８５２に記載されているようないわゆる乳癌遺伝子）を発現している個体など）を意味する。
【０１１６】
癌は、細胞の制御不能な増殖（すなわち、分裂）を伴う疾患である。癌細胞の制御不能な増殖に関与しているいくつかの公知のメカニズムとしては、増殖因子の独立、ゲノム変異の検出の失敗、および不適切な細胞シグナリングが挙げられる。癌細胞が正常な増殖制御を無視する能力は、増殖速度を増加させることにつながりうる。癌の原因は完全には明らかとはなっていないが、癌に関与しているか、または少なくとも対象者を罹患しやすくする因子のいくつかは知られている。かような因子としては、特定の遺伝子変異（例えば、乳癌についてのＢＲＣＡ遺伝子変異、結腸癌についてのＡＰＣ）、癌の原因となることが疑われている剤（すなわち、発癌物質）（例えば、アスベスト、ＵＶ放射線）への曝露、および乳癌などの特定の癌についての家族性の素因が挙げられる。ある実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物に用いられる腫瘍細胞、過形成細胞または前癌性細胞は、これらの現象を示す個体または細胞系から得られてもよい。
【０１１７】
癌を有する対象者は、一実施形態では、検出可能な癌性細胞を有する対象者である。
【０１１８】
癌の進行のリスクのある対象者とは、癌の進行の可能性が通常よりも高い者をいう。かような対象者としては、例えば、癌の進行についてのより高い確率に関連することが示されている遺伝子異常を有する対象者、癌に対する家族性の素因を有する対象者、タバコ、アスベストまたは他の化学的な毒などの癌誘発剤（すなわち、発癌物質）に曝露された対象者、および以前に癌の治療を受け明らかな寛解にある対象者が挙げられる。
【０１１９】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物に用いられる腫瘍細胞、前癌性細胞または過形成細胞は、癌関連抗原を発現するであろうし、一実施形態では特異的に、または他の実施形態ではより高濃度で、または他の実施形態では特定の形態で発現するであろう。
【０１２０】
本明細書に記載の方法および組成物に用いられる腫瘍細胞は、仮想的には、本明細書に記載のような任意のタイプの腫瘍から調製されうる。
【０１２１】
一実施形態においては、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質を発現しうる細胞、並びに、オートファゴソームＬＣ３タンパク質もしくはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸、または当該核酸を含むベクターを含む組成物が提供される。
【０１２２】
ある実施形態では、細胞は、約１０×１０４〜１×１０８個、または他の実施形態では１×１０６〜約２５×１０６個、または他の実施形態では約２．５×１０６〜約７．５×１０６個の範囲の濃度で、対象者に投与される。ある実施形態では、細胞は、製薬上許容されうる担体または希釈剤（例えば、以下に制限されないが、ハンクス溶液（ＨＢＳＳ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および水）中に懸濁化される。他の実施形態では、腫瘍細胞は、約５×１０４〜約５×１０６細胞であり、例えば、５×１０４、５×１０５、または５×１０６腫瘍細胞である。
【０１２３】
他の実施形態では、細胞を含みうる溶液は、無血清の培地であり、当該培地は他の実施形態では市販のもの（例えば、Ｘ−ＶＩＶＯ１０（商標）またはＸ−ＶＩＶＯ１５（商標）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  メリーランド州）、造血幹細胞−ＳＦＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ニューヨーク州）等の動物性タンパク質フリーのベース培地、または細胞の生存能力を促進もしくは保持する任意の製剤など）であってもよい。用いられる無血清培地は、他の実施形態では、以下の特許文献に記載されているものであってもよい：国際公開ＷＯ９５／００６３２、米国特許第５，４０５，７７２、ＰＣＴ  ＵＳ９４／０９６２２。上記無血清ベース培地は、他の実施形態では、臨床グレードのウシ血清アルブミンを含有してもよく、その濃度は、他の実施形態では約０．５〜５％であり、または他の実施形態では約１．０％（ｗ／ｖ）でありうる。他の実施形態では、Ｂｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｙｌａｎｄ，  Ｇｌｅｎｄａｌｅ，カリフォルニア州）などのヒト血清由来の臨床グレードのアルブミンが用いられうる。
【０１２４】
他の実施形態では、細胞は、親和性に基づいた分離法によって分離されうる。親和性による分離技術としては、他の実施形態では、抗体被覆磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィ、モノクローナル抗体に連結されたまたはモノクローナル抗体と一緒に用いられる（例えば、補体と細胞毒）細胞毒性剤、および固体マトリックス（例えば、プレート）に結合した抗体を用いる「パンニング」、または他の任意の簡便な技術が挙げられる。一実施形態では、分離技術は、蛍光活性化細胞分別装置を含んでもよく、これらは精巧さの程度が大きく異なり、例えば、複数の色チャネル、小角および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの任意の技術が、本明細書の細胞またはこれに用いられる細胞の分離を可能とするものであれば、用いられることができると理解されるべきであり、本明細書の実施形態の一部として考慮されるべきである。
【０１２５】
他の実施形態では、分離技術において用いられる親和性試薬は、上述した細胞表面分子に対する特定の受容体またはリガンドであってもよい。
【０１２６】
他の実施形態では、本明細書において用いられる抗体はラベルに共役していてもよく、当該ラベルは、他の実施形態では分離のために用いられうる。他の実施形態では、分離を容易とする目的で、ラベルとしては、磁気ビーズ（これは直接の分離を可能とする）、ビオチン（これは、例えば支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いて除去されうる）、蛍光色素（これは蛍光活性化細胞分別装置に用いられる）などが挙げられ、本技術分野において周知の他のものも挙げられる。蛍光色素としては、一実施形態では、例えばフィコエリスリン、アロフィコシアニン、フルオレセイン、テキサスレッドまたはこれらの組み合わせなどのフィコビリタンパク質が挙げられる。
【０１２７】
一実施形態では、抗体を用いた細胞の分離は、細胞懸濁液に対して、結合可能な細胞表面抗原への結合に十分な時間、抗体を添加することを必要とする。インキュベーション時間は異なる時間であってもよく、例えば一実施形態では５分間であり、または他の実施形態では１５分間であり、または他の実施形態では３０分間である。非特異的結合を最小としつつ、抗体を用いた特定のラベル化をもたらす任意の長さの時間が、本形態について想定されるものとして考慮されるべきである。
【０１２８】
他の実施形態では、細胞の染色強度がフローサイトメトリーによって測定されてもよく、このフローサイトメトリーではレーザーが蛍光色素の定量レベルを検出する（徒当該レベルは抗体が結合した細胞表面抗原の量に比例する）。フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳはまた、他の実施形態では、細胞集団を抗体染色の強度並びに細胞サイズおよび光散乱などの他のパラメータに応じて分離する目的にも用いられうる。
【０１２９】
分離された細胞は、細胞の生存能力を維持する任意の適当な培地中に回収されてもよく、他の実施形態では、当該培地は回収チューブの底に血清のクッションを含んでもよい。
【０１３０】
他の実施形態では、本明細書で用いられる細胞を含有する培地は、当該細胞が応答しうる他のサイトカインまたは増殖因子を含有してもよい。一実施形態では、当該サイトカインまたは増殖因子は、生存、増殖、機能またはこれらの組み合わせを促進する。他の実施形態では、本明細書の細胞または本明細書で用いられる細胞を含有する培地はポリペプチド因子および非ポリペプチド因子を含んでもよい。
【０１３１】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物は、腫瘍細胞、前癌性細胞または過形成細胞を攻撃する免疫系を促進することが知られているもののような公知の癌の治療法を含んでもよい。他の実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物は、血管新生阻害剤などの公知の癌の治療法を含んでもよく、当該剤は、固体腫瘍の血液供給を攻撃することにより作用する。ほとんどの悪性の癌は転移可能である（すなわち、一次腫瘍部位に存在し、遠位の組織に伝播し、これにより二次の腫瘍を形成する）ため、かような転移を妨げる治療法もまた、癌の治療には有用である。血管新生の調節剤としては、塩基性ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＮＦ−α、ＴＮＰ−４７０，トロンボスポンジン−１、血小板因子４、ＣＡＩおよびタンパク質のインテグリンファミリーの特定のメンバーが挙げられ、よって、ある実施形態では、血管新生阻害剤は特異的に標的化されてかような分子の活性または適当な機能を阻害する。一実施形態では、当該阻害剤は、メタロプロテイナーゼ阻害剤を含み、これは癌細胞によって一次腫瘍部位に存在して他の組織へと浸出するのに用いられる酵素を阻害する。
【０１３２】
他の実施形態では、本明細書に記載の方法は、新生組織形成を予防するのに用いられ、または他の実施形態では、対象者における転移を予防するのに用いられる。腫瘍の転移は、第一次的には生体中の離れた部位への血管系を介した腫瘍細胞の伝播を伴う。一実施形態では、「転移」との語は、原発腫瘍とは不連続の部位に位置する腫瘍細胞を意味するものとし、通常は腫瘍細胞のリンパ液および／または血行系を介した伝播を介するものである。一実施形態では、転移との語は、原発腫瘍部位からは離れた腫瘍細胞の侵襲および移行を意味する。転移は、ある実施形態では、原発腫瘍から生体の他の部位への癌細胞の伝播により生じる原発腫瘍の領域とは区別される癌細胞の領域である。原発性の腫瘍塊の診断時には、対象者は転移の存在について診断されうる。転移は、特定の兆候の診断に加えて、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、血液および血小板の計数、肝機能調査、胸部Ｘ線および骨スキャンによって、最も頻繁に検出される。
【０１３３】
本明細書で用いる場合、転移に関して「予防」および「予防する」との語は、癌細胞または腫瘍細胞の転移を完全にまたは部分的に阻害すること、並びに、癌細胞または腫瘍細胞の転移能力のいかなる増加をも阻害することを意味する。
【０１３４】
癌の侵襲および転移は、形質転換細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）により侵襲および移動し、足場非依存性の増殖特性を獲得することを可能とする細胞接着特性における変化を伴う複合的なプロセスである。Ｌｉｏｔｔａ，  Ｌ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６４：３２７−３３６  （１９９１）。これらの変化の中には、接着斑において起こるものもあり、当該接着斑とは、膜結合の、細胞骨格の、細胞間シグナリング分子を含む細胞／ＥＣＭ接触点である。転移性の疾患は、腫瘍細胞の播種性の病巣がその増殖および伝播を支える組織を播種した際に起こり、かような腫瘍細胞の二次的な拡散は大多数の癌に関連した罹患率および死亡率の原因となっている。
【０１３５】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法および／または本明細書に記載の組成物は、具体的には、治療の手段として、または他の実施形態では予防の手段として、または他の実施形態では転移の開始を遅らせる手段として、または他の実施形態では転移の進行を停止させる手段として、転移の開始時にまたはこれの最中に細胞を利用する。
【０１３６】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物は、一定期間にわたる全身性の免疫応答を提供し、従って原発腫瘍に対してだけでなく当該原発腫瘍と腫瘍抗原を共有する転移細胞に対しても有効となりうる。ある実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物は、複数のタイプの腫瘍に対抗するのに有用であり、当該腫瘍は、例えばかような腫瘍において発現しまたはダウンレギュレートされている抗原について多少は関連するかもしれないものであり、本願の実施形態を表わしうる。
【０１３７】
一実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物は、癌の治療のためのものである。一実施形態では、「治療」との語は、治療される個体または細胞の自然な進行を変化させる試みにおける介入を意味し、予防のために、または臨床的な病状の進行中に行われうる。望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の除去、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患の状態の改善または軽減、および寛解または予後の改善が挙げられる。
【０１３８】
ある実施形態では、対象者における、対象となるペプチドまたはタンパク質に対する免疫応答をダウンモジュレートし、抑制し、または耐性化させる方法が提供される。かような方法は、移植片拒絶反応および自己免疫疾患を予防し、軽減するのに有用であるが、これは非制限的な例に過ぎない。移植片拒絶反応（宿主対移植片病）においては、ダウンモジュレートが望まれる免疫応答が対象とする抗原としては、移植片（移植）のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。移植片における免疫細胞が宿主を攻撃する、移植片対宿主病においては、ダウンモジュレートが望まれる免疫応答が対象とする抗原としては、移植のレシピエント（すなわち、宿主）のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。他の実施形態では、本明細書に一般的に記載の方法によって自己免疫が治療可能であり、この際、対象となるペプチドまたはタンパク質は自己の（すなわち、宿主の）抗原である。本形態の実施にあたっては、未成熟樹状細胞を、オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片をコードする核酸にインフレームで融合した、対象となるペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸と接触させることを含む。この接触は、エクスビボでもインビボでもよく、後者は一般的にはベクターを未成熟樹状細胞に標的化することによる。オートファゴソーム標的化タンパク質またはその機能性断片は、対象となるペプチドまたはタンパク質をオートファゴソームへと標的化し、当該ペプチドまたは対象となるタンパク質の断片が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して、前記未成熟樹状細胞の表面上に提示される。これにより、Ｔ細胞の欠失またはアネルギーのプロセスによる対象となるペプチドまたはタンパク質への免疫応答のダウンモジュレーションがもたらされる。定常状態では、樹状細胞は未成熟状態であり、その免疫の誘導剤としての公知の機能を発揮するほどに完全には分化してはいない。それにもかかわらず、未成熟樹状細胞は、自己抗原および無害の環境タンパク質を捕捉しながら、組織を通ってリンパ器官へと連続的に循環する。近年の実験により、抗原を発現している未成熟樹状細胞がＴ細胞を欠失させるか制御性Ｔ細胞を展開させることによってＴ細胞を鎮静化させるという直接の証拠がもたらされている（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，  ２００２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９，  ３５１−３５８によってレビューされている）。
【０１３９】
一実施形態では、オートファゴソーム標的化タンパク質はＬＣ３タンパク質である。他の実施形態では、核酸は、配列番号１に相同な、またはこれに対応する配列を有する。上述したように、上記方法が対象者における移植片拒絶反応または移植片対宿主病を予防または軽減するのに用いられる場合には、対象となるペプチドまたはタンパク質は、移植された組織もしくは器官由来の移植片抗原、または宿主（自己）抗原である。上記方法が対象者における自己免疫を治療するのに用いられる場合には、対象となるペプチドまたはタンパク質は自己抗原である。治療の影響を受けやすい自己免疫疾患の非制限的な例としては、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、および関節リウマチ（ＲＡ）が挙げられる。
【０１４０】
疾患の症状に関連した「病状」は、罹患した個体の健康、正常な生理機能または生活の質を危うくする任意のものをいう。当該病状は、以下に制限されないが、従来未罹患であった領域への罹患組織の有害な侵襲、正常な組織機能の犠牲の下での増殖、不規則なもしくは抑制された生物活性、炎症応答または免疫学的応答の悪化または抑制、他の病原体または作用体に対する感染しやすさの上昇、並びに、痛み、発熱、吐き気、疲労、気分の変化および主治医によって診断されうるかような他の兆候などの望ましくない臨床症状が挙げられうる。
【０１４１】
ある実施形態では、本明細書に記載の核酸、ベクター、細胞、方法および／または組成物は、本明細書に記載の任意の感染の予防、抑制、治療、兆候の緩和などを提供する。ある実施形態では、上記抗原は疾患特異的であり、他の実施形態では、当業者には当然であるが、パンワクチン戦略として、複数の感染／疾患由来の複数の抗原が用いられる。
【０１４２】
ある実施形態では、本明細書に記載の核酸、ベクター、細胞は、有効量で対象者に提供され、一実施形態では、当該有効量は、有利なまたは望ましい臨床的効果、特に免疫応答の発生または臨床症状の認識可能な改善を達成するのに十分な量を意味する。免疫原性の量は、治療される対象者集団（罹患または非罹患）において所望の免疫学的応答を引き起こすのに十分な量である。罹患した対象者に対する臨床応答の点では、有効量は、疾患の進行を緩和し、軽減し、安定化し、逆行させ、または遅らせ、そうでなければ疾患の病理学的結果を緩和するのに十分な量である。有効量は、単一用量または分割用量として与えられうる。本明細書に記載の方法および／または組成物は、免疫原性のまたは治療上の有効量を提供しうるものと理解されるべきであり、これらは双方とも本願の実施形態として考慮されるべきである。
【０１４３】
ある実施形態では、上記治療は、疾患の進行をモニタリングするための標準的なプロトコールによって確認されることができ、例えば腫瘍に罹患した対象者の場合には、例えば磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、適当な造影剤を用いたラジオシンチグラフィ、循環している腫瘍マーカー抗原のモニタリング、対象者の臨床応答、またはこれらの組み合わせを利用したモニタリングが有効でありうる。例えば、一実施形態では、適当な臨床マーカーは、進行性卵巣癌をモニタリングするための血清ＣＡ−１２５である。Ｈｅｍｐｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．  ５４：３８−４４。
【０１４４】
本明細書に記載の方法による組成物および／または細胞の投与は、例えば月ごとに、半月ごとに、または他の実施形態では週ごとに、所望の効果が得られるまで適宜なされうる。その後、特に免疫学的効果または臨床効果が治まったときには、当業者には当然であるが、追加の増強剤の投与または維持投薬が適宜設計されてなされうる。
【０１４５】
細胞ワクチンの複数の用量が同一の患者に投与される際には、ワクチン中の異種リンパ球が抗アロタイプ応答を引き起こす可能性に対して注意を払うべきである。複数のドナーからの異種細胞の混合物を用いることや、各用量において異なる異種細胞集団を用いることは、いずれも抗アロタイプ応答の発生を最低限に抑えるのに有効でありうる戦略である。
【０１４６】
治療中、対象者は注射部位における副作用または発熱反応などの一般的な副作用について定期的に評価される。副作用は、適当な対症的臨床ケアによって管理される。
【０１４７】
ある実施形態では、遺伝子送達システムが提供され、ある実施形態では、当該システムは、ウイルス抗原、細菌抗原または腫瘍抗原に共役したオートファゴソーム標的化タンパク質（一実施形態ではＬＣ３である）を含むウイルスベクターを利用する。これらのシステムを用いたワクチン化は、ある実施形態では、全ての感染細胞または腫瘍細胞において発現すべき融合タンパク質を必要とせずに、標的化抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞免疫を増強する。
【０１４８】
ある実施形態では、本明細書に記載のようなＭＨＣクラスＩＩ提示のための標的化抗原を介した能動免疫化、能動免疫化のための例えば樹状細胞の養子免疫伝達のためのエクスビボ感染、受動免疫化のためのＣＤ４＋Ｔ細胞のエクスビボ刺激、またはこれらの組み合わせを目的として、ウイルス投与を用いる方法が提供される。一実施形態では、本明細書に記載の方法に従って、ＬＣ３−抗原融合タンパク質をエクスビボでトランスフェクションする目的で非罹患の抗原提示細胞が用いられる。ある実施形態では、本明細書に記載のこれらの形態によれば、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞および上皮細胞が用いられる。
【０１４９】
他の実施形態では、上記組成物は、例えば、グラム陰性細菌由来のテクニ酸（ＬＴＡ、ＲＴＡ、ＧＴＡおよびこれらの合成対応物など）、ヘモシアニンおよびヘモエリスリン（ＫＬＨなど）、キチンまたはキトサンなどのアジュバントをさらに含みうる。他の実施形態では、上記アジュバントは、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびトリペプチドペプチドグリカンおよびこれらの誘導体（スレオニル−ＮＤＰ）、脂肪酸誘導体（ＭＴＰＰＥなど）、並びに、参照により本明細書に引用される米国特許第４，９５０，６４５号に記載の誘導体を含みうる。ＢＣＧ、ＢＤＧ細胞壁骨格（ＣＷＳ）並びにトレハロースモノミコレートおよびジミコレート（それぞれ参照により本明細書に引用される、米国特許第４，５７９，９４５号および米国特許第４，５２０，０１９号）もまた、本明細書において、単独でまたは２剤もしくは３剤の組み合わせで、あるいはモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）と組み合わせて（例えばＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０），  Ｇｒａｂａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０），  Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２；  １９９４）；  Ｔａｎａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ａ；ｂ；  １９９５）；  Ｂｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）および米国特許第４，９８７，２３７号に記載のものを参照）、アジュバントとして用いられてもよい。両親媒性および界面活性剤（ＱＳ２１など）、並びに非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤は、好ましいアジュバントのさらに他の群である。これらのアジュバントは、本明細書の全ての形態において有用であるが、細胞間腫瘍抗原などの細胞間抗原に対する免疫応答を引き起こしまたは増強するのに用いる組成物において特に有用性を発揮しうる。
【０１５０】
他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、医薬組成物の製造に有用なバルクの薬剤組成物（例えば、純粋でないかまたは滅菌されていない組成物）、および医薬組成物（すなわち、対象者または患者への投与に適した組成物）を含むことができ、これらは単位用量の製剤の調製に用いられうる。かような組成物は、本明細書に記載の予防剤および／または治療剤の予防上または治療上有効な量、あるいはこれらの剤と製薬上許容されうる担体との組み合わせを含む。
【０１５１】
一実施形態において、「製薬上許容されうる」との語は、連邦政府または州政府の規制当局によって認可されているか、米国薬局方または他の一般に認識されている、動物（特にはヒト）に用いられる薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」との語は、他の実施形態では、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤または治療剤の投与に用いられるベヒクルを意味する。かような製薬上の担体は、水および油（ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油由来、動物由来、植物由来または合成由来のものなど）などの滅菌液体でありうる。他の担体としては水があり、他の実施形態では、これは医薬組成物が静脈内投与される際に用いられる。食塩水溶液およびデキストロース溶液およびグリセロール溶液もまた、液体担体として用いられ、他の実施形態では、当該液体担体は注射可能な溶液を含む。適当な製薬上の賦形剤としては、他の実施形態では、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられうる。上記組成物は、必要であれば少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤をも含有してもよい。これらの組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放製剤などの形態をとりうる。
【０１５２】
本明細書に記載の組成物は、中性の形態または塩の形態で製剤化されうる。製薬上許容されうる塩としては、以下に制限されないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などを由来とするもののようなアニオンを用いて形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどを由来とするもののようなカチオンを用いて形成されるものが挙げられる。
【０１５３】
これらの形態の一実施形態では、本明細書に記載の組成物、および／または本明細書に記載の方法に用いられる組成物は、用量およびスケジュールが決められ、これらは当該組成物が投与される対象者の年齢、健康状態、性別、身長および体重に応じて変動する。当業者には当然のことであるが、これらのパラメータは、第Ｉ相、第２相、および第３相の臨床試験や他の手段などの十分に確立された手法および分析による各システムによって決定されうる。
【０１５４】
投与のためには、本明細書に記載の細胞、核酸および／またはベクターは、適当な液体状のベヒクルまたは賦形剤などの製薬上許容されうる担体および、必要であれば１種または２種以上の補助的な添加剤と組み合わされうる。液体上のベヒクルおよび賦形剤は一般的であり、市販されている。これらの例としては、蒸留水、生理食塩水、デキストロースの水性溶液などが挙げられる。
【０１５５】
非経口の、局所的な、粘膜への、例えば、経口の、経鼻のためなど、または腹腔内投与のための適当な製剤としては、水溶性または水分散性の形態の活性成分の水性溶液が挙げられる。また、注射用の油性懸濁液に適当な活性成分の懸濁液も投与されうる。適当な親油性溶媒またはベヒクルとしては、例えばゴマ油などの脂肪酸またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。注射用の水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランなどの、当該懸濁液の粘度を上昇させる物質を含有してもよく、必要に応じて、当該懸濁液は安定化剤をも含んでもよい。他の実施形態では、細胞は、完全フロイントアジュバント、塩化亜鉛、リン酸カルシウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等の無機塩、サポニン、高分子、脂質または脂質画分（脂質Ａ、モノホスホリル脂質Ａ）、修飾オリゴヌクレオチドなどの本技術分野において周知の免疫アジュバントと混合されてもよい。
【０１５６】
医薬組成物の調製および投与のための一般的な手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９０），  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ＰＡに概説されており、本明細書の実施形態を構成する。
【０１５７】
従来の担体を用いた投与に加えて、細胞、核酸、ベクターおよび／または他の活性成分は、当業者に公知の多種多様な専門的な薬物送達技術によって投与されうる。以下の実施例は例示の目的のためのみに記載され、本発明をいかようにも限定するものではない。
【実施例】
【０１５８】
実施例
材料および方法
細胞系
ＨａＣａｔ（ヒトケラチン生成細胞）は、ブリスベン（オーストラリア）のＲａｊｉｖ  Ｋｈａｎｎａから贈呈されたものである。ＭＤＡＭＣ（ヒト乳癌細胞系）は、パリ（フランス）のＩｒｅｎｅ  Ｊｏａｂから贈呈されたものである。ＨｅＬａおよび２９３はＡＴＣＣから購入した。ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球細胞系であるＭＳ−ＬＣＬは、健常ドナーのＰＢＭＣを、マーモセット細胞系であるＢ９５−８［Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＡＲＣ  Ｓｃｉ  Ｐｕｂｌ  （１１，  ３９５−４０８．  （１９７５）］の上清とともに、ＲＰＭＩ−１６４０＋２０％ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミン＋２μｇ／ｍＬゲンタマイシン＋１μｇ／ｍＬシクロスポリンＡを用いて培養することにより作製した。２つのＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫細胞系であるＲＰＭＩ６６６６およびＬ５９１は、それぞれ、ＡＴＣＣから購入したもの、およびゲッティンゲン（ドイツ）のＭａｒｔｉｎａ  ＶｏｃｋｅｒｏｄｔおよびＤｉｅｔｅｒ  Ｋｕｂｅから贈呈されたものである。マウスハイブリドーマであるＩＶＡ１２（抗ヒトＭＨＣクラスＩＩ）およびｗ６／３２（抗ヒトＭＨＣクラスＩ）は、ＡＴＣＣから購入した。上皮細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１１０μｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウムおよび２μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ中で日常的に培養した。Ｂ細胞系およびハイブリドーマは、１０％ＦＣＳ＋グルタミン＋ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。
【０１５９】
単球および樹状細胞の調製
ニューヨーク血液センターまたは研究室の健常ドナーからの血液検体由来の白血球濃縮物（バフィーコート）をＰＢＭＣの源として用い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（アマシャム−ファルマシア  バイオテック）を用いた密度勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ１４陽性の単球／マクロファージの陽性選択は、ミルテニー  バイオテク（ベルギッシュ−グラッドバッハ、ドイツ）からの抗ＣＤ１４マイクロビーズを用いて行なった。樹状細胞（ＤＣ）は、ＲＰＭＩ−１６４０＋１％単一ドナー血清＋グルタミン＋ゲンタマイシンを含む６ウェルプレート中に６．６×１０５個のＣＤ１４＋細胞／ｍＬを播種することにより、ＣＤ１４陽性細胞から作製した。組換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４、５００Ｕ／ｍＬ）およびｒｈＧＭＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）を０、２、および４日目に添加した。５日目に、浮遊している未成熟ＤＣを新しいプレートに３．３×１０５細胞／ｍＬで移し、培地の半分を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、シグマ、セントルイス、ミズーリ州）またはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）を含有する新鮮な培地と交換して、樹状細胞を成熟させた。全てのサイトカインは、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）、ぺプロテック（ロッキーヒル、ニュージャージー州）、バーレックス（リッチモンド、カリフォルニア州）、またはシグマ（セントルイス、ミズーリ州）から得た。
【０１６０】
Ｔ細胞クローン
従来文献に記載されているように（Ｆｏｎｔｅｎｅａｕ，  Ｊ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５８，  １１１−２６．  （２００１））、インフルエンザＡマトリックスタンパク質１（ＭＰ１）特異的Ｔ細胞クローンである９．２、９．２６および１０．９を作製した。簡単に言えば、研究室のドナー（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０５０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０７０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１、ＨＬＡ−ＤＱＢＩ＊０６０２、およびＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１）の全血から単離されたＣＤ１４陰性ＰＢＭＣを、インビトロで転写されたインフルエンザＡ  ＭＰ１−ＲＮＡ（Ｉｒｉｎａ  Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖａ（Ａｒｇｏｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ノースカロライナ州）から贈呈されたもの）をエレクトロポレーションされた自己成熟ＤＣで刺激した（ＰＢＭＣ：ＤＣ比＝３０：１、培地：５％ヒト血清＋グルタミン＋ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０）。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ｐｌｕｓ  Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用い、３００Ｖ・１５０μＦで、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中、１０μｇのＲＮＡでＤＣをエレクトロポレーションした。ＰＢＭＣ／ＤＣの共培養の８日目に、上記刺激を繰り返し、１０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２を添加して、Ｔ細胞の生存を増強した。２１日目に、生存細胞を１０、１または０．３細胞／ウェルで限界希釈することによりクローニングし、ＲＰＭＩ−１６４０＋８％ＰＨＳ＋１５０Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２（カイロン、エメリービル、カリフォルニア州）＋１μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ−Ｌ（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）＋グルタミン＋ゲンタマイシン中に播種した。１０５個／ウェルの放射線処理したＰＢＭＣおよび１０４個／ウェルの放射線処理したＬＣＬを、フィーダー細胞として添加した。４０日目に、スプリットウェルＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、播種した細胞についてＭＰ１ペプチドミックス（１０アミノ酸が重複する６４個の１５マーペプチド）およびＨＬＡ−Ａ２免疫優勢エピトープであるＭＰ１５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）の認識を調べた。ＭＰ１特異的クローンについて、抗ＣＤ４−ＰＥおよび抗ＣＤ８−ＰＥ（ＢＤ  バイオサイエンセズ  ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いた染色とこれに続くフローサイトメトリーを用いた分析によって、ＣＤ４／ＣＤ８の発現を調べた。ＭＰ１特異的なホモ接合性ＣＤ４＋クローンまたはＣＤ８＋クローンを、上述したように播種し、５×１０６細胞／クライオバイアルのアリコート中に凍結した。全てのペプチドは、ロックフェラー大学のプロテオミクスリソースセンターから購入した。
【０１６１】
阻害剤および組換えタンパク質
クロロキン（ＣＱ）は、シグマ（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、５０μＭで用いた。組換えヒトＩＦＮγは、プロスペック−タニー  テクノジーン  リミテッド（イスラエル）から購入し、２００Ｕ／ｍＬで用いた。
【０１６２】
ＬＣ３融合コンストラクトおよび安定トランスフェクタントの作製
遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、ヒトＢ−ＬＣＬからヒトＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ配列のｃＤＮＡ（ＮＭ＿０２２８１８）を哺乳動物発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クローンテック、マウンテンビュー、カリフォルニア州）中にクローニングした。ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＨｅＬａ細胞系および２９３細胞系を作製するために、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて細胞系中にＥＧＦＰ−ＬＣ３コンストラクトを一時的にトランスフェクションし、続いて５００μｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下で細胞を培養した。ｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ−ＭＰ１ベクター（Ｐｅｔｅｒ  Ｐａｌｅｓｅ（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ニューヨーク）から贈呈されたもの）から、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３マトリックスタンパク質１（ＭＰ１）を、３’末端にストップコドンを設け、または設けずに、ＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をＥＧＦＰ配列に代えてｐＥＧＦＰ−ＬＣ３ベクター中にインサートして、ＭＰ１−ＬＣ３融合コンストラクトを得た。レンチウイルスコンストラクトについては、ＥＧＦＰ−ＬＣ３、ＭＰ１−ＬＣ３またはＭＰ１ストップ−ＬＣ３を、レンチウイルスベクターであるｐＨＲ−ＳＩＮ−ＣＳＧＷΔＮｏｔＩ（Ｊｅｒｅｍｙ  Ｌｕｂａｎ（コロンビア大学、ニューヨーク）から贈呈されたもの）中にサブクローニングした。レンチウイルス粒子の作製については、レンチウイルスベクターをヘルパープラスミドであるｐＣＭＶΔＲ８．９１およびｐＭＤＧとともに、リン酸カルシウムトランスフェクションによって２９３Ｔ細胞中に共トランスフェクションした。組換えウイルス粒子を含有する培地の上清を、トランスフェクション後１、２および３日目に回収し、０．４５μｍフィルタで濾過し、−８０℃で凍結させた。ＧＦＰ−ＬＣ３、ＭＰ１−ＬＣ３またはＭＰ１を安定発現するＨａＣａｔ細胞系およびＭＤＡＭＣ細胞系については、１０〜４０のＭＯＩを用いたレンチウイルス感染によって作製した。
【０１６３】
抗血清
ＫＬＨキャリアタンパク質（コカリコ  バイオロジカルズ、リームスタウン、ペンシルベニア州）に共役したＮ末端ペプチドＬＣ３１−１５（ＭＰＳＥＫＴＦＫＱＲＲＴＦＥＱＲ；配列番号４）を用いて２匹のウサギを免疫化することにより、ＬＣ３抗血清を作製した。動物を５回（初回接種後２、３、７、１１および１５週目に）ブーストし、次いで屠殺して、最終ブリードを得た。１匹のウサギから回収した抗血清はＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにより良好なＬＣ３反応性を示し、ウエスタンブロットには１：２０００の希釈で用いた。インフルエンザＭＰ１特異的ウサギ抗血清は、Ａｒｉ  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ（チューリヒ、スイス）から贈呈されたものである。
【０１６４】
ａｔｇ１２のノックダウン
以下の２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡオリゴを用いた：
Ａｔｇ１２センス：５’−ＵＣＡＡＣＵＵＧＣＵＡＣＵＡＣＡＵＧＡＵｄＴ（配列番号５）；
Ａｔｇ１２アンチセンス：５’−ＵＣＡＵＧＵＡＧＵＡＧＣＡＡＧＵＵＧＡＵｄＴ（配列番号６；ＮＭ＿００４７０７の６８７〜７０５番目のヌクレオチド）
コントロールとしては、ＤｈａｒｍａｃｏｎからのラミンＡ／Ｃ特異的ｓｉＲＮＡ（ラミンセンス：５’−ＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡｄＴｄＴ（配列番号７）；ラミンアンチセンス：５’−ＵＧＵＵＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＡＧｄＴｄＴ  （配列番号８））またはホタルルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（ＧＬ２センス：５’−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ；配列番号９；ＧＬ２アンチセンス：５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＵＵＣＣＧＣＧＵＡＣＧｄＴｄＴ；配列番号１０）を用いた。ｓｉＲＮＡ二本鎖の送達は、２４ウェルの型中、２０ｐｍｏｌ  ｓｉＲＮＡ＋１．５ｍＬリポフェクトアミン／ウェルで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いたトランスフェクションにより行ない、ノックダウン効果を２〜３日後に分析した。
【０１６５】
溶解物の調製およびイムノブロッティング
氷上で５分間、氷冷溶解バッファ（コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ、インディアナポリス、インディアナ州）を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０）中で細胞を溶解させた（約１０６／１００μＬ）。低速の遠心分離（４００ｇ、３分間）により全細胞および細胞の破片をペレット化し、除去後の上清を新しいチューブに移した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）によりタンパク質濃度を測定した。４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファ（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６.8，４０％グリセロール、８％ＳＤＳ、０．５７Ｍ  β−メルカプトエタノール、０．１２％ブロモフェノールブルー）中でサンプルを５分間煮沸した。等量のタンパク質を１１％または１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、ＰＶＤＦメンブレン（ハイボンド−Ｐ、アマシャム  バイオサイエンセズ、イギリス）上に転写した。一次抗体についてはＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）およびＥＣＬプラス検出システム（アマシャム  バイオサイエンセズ、イギリス）を用いて可視化した。ローディングコントロールとして、抗β−アクチン抗体（クローンＡＣ−４０、シグマ、セントルイス、ミズーリ州）およびＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いてブロットをリプローブした。
【０１６６】
免疫細胞化学および共焦点顕微鏡法
２４ウェルプレート中の顕微鏡のカバーガラス上に上皮細胞を載置し、３７℃にて一晩培養した。ＰＢＳ中で細胞を１回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドＰＢＳ中で１５分間、室温（ＲＴ）にて固定した。ＰＢＳ中で細胞を１回洗浄し、０．１％トリトンＸ−１００ＰＢＳ中で５分間、室温にて透過化した。ＰＢＳ中でさらに１回洗浄した後、ブロッキングバッファ（パーキンエルマーのＴＳＡキットのもの）＋０．１％サポニン中で３０分間、細胞をブロックした。一次抗体を、室温にて３０〜６０分間、ブロッキングバッファ＋０．１％サポニン＋５％正常血清（二次抗体に応じて、ヤギまたはロバ）中に添加した（一次抗体：抗ＭＨＣクラスＩ抗体および抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体（ＩＶＡ１２ハイブリドーマおよびｗ６／３２ハイブリドーマのハイブリドーマ上清、ＡＴＣＣ）、抗ＨＬＡ−ＤＭ（クローンＭａＰ−ＤＭ１、ＢＤ  バイオサイエンセズ  ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）、抗ＬＡＭＰ−２（クローンＨ４Ｂ４、サザン  バイオテクノロジー  アソシエイツ、バーミンガム、アラバマ州）、抗ＥＥＡ１（サンタ  クルーズ  バイオテック、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、および抗トランスフェリン受容体（クローンＤＦ１５１３、シグマ、セントルイス、ミズーリ州））。ＰＢＳ＋０．１％サポニン中で、細胞を５分間、３回洗浄し、ブロッキングバッファ＋０．１％サポニン＋５％正常血清（ヤギまたはロバ）中で３０分間、暗闇の中でインキュベートした（二次抗体：ローダミン−レッド（商標）−Ｘ（ＲＲＸ）共役ロバ抗マウスＩｇＧおよびＲＲＸ協約ロバ抗ヤギＩｇＧ（ジャクソン  イムノリサーチ、ウエストパイン、ペンシルベニア州）、並びにＡｌｅｘａ５４６共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン−モレキュラー  プローブス、カールスバッド、カリフォルニア州））。次いで、細胞をＤＡＰＩ核酸染色液（０．５μｇ／ｍＬ、モレキュラー  プローブス）とともに１分間インキュベートし、続いてＰＢＳ＋０．１％サポニン中で、細胞を５分間、３回洗浄し、ＰＢＳ中で１回洗浄した。最後に、プロロング  ゴールド  アンチフェード試薬（インビトロジェン−モレキュラー  プローブス、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いてカバーガラスを顕微鏡スライド上に載置し、スライドを暗闇の中で乾燥させた。６３ｘ／１．４Ｎ．Ａ．油浸レンズを備えた倒立ＬＳＭ５１０レーザースキャン共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００）で、４０５ｎｍのダイオードレーザーおよびアルゴンレーザー（４８８ｎｍおよび５４３ｎｍのレーザー線）並びに１エアリーユニットのピンホール直径を用いて、細胞を分析した。ＬＳＭ５１０の共焦点ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、写真を撮影した。このプロファイルおよびＬＳＭ５１０ソフトウェアのヒストグラムツールを用いて、マーカーの共局在化を定量した。このプロファイル分析では、赤色の小胞の合計数と比較した二重陽性の小胞の数を、１０〜１５個の二重陽性細胞／条件で測定した。このヒストグラム分析では、バックグラウンドを超える赤色チャンネルピクセルの合計数と比較した共局在化ピクセルの数を、１０〜１５個の二重陽性細胞／条件で測定した（バックグラウンド閾値はＬＳＭ５１０のアルゴリズムによって各細胞について決定した）。
【０１６７】
低温切開片の電子顕微鏡観察および免疫ラベル化
ＧＦＰ−ＬＣ３で安定にトランスフェクションしたＭＤＡＭＣ細胞を、０．２５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、エレクトロン  マイクロスコピー  サイエンセズ）を用いて室温にて１時間固定し、次いで８％ＰＦＡ／Ｈｅｐｅｓ中、４℃にて一晩固定した。ＰＢＳ中で細胞を１回洗浄し、０．１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ  ＰＢＳで１０分間クエンチし、１％ゼラチンＰＢＳ中にスクラップし、次いで５％ゼラチンＰＢＳ中に埋め込んだ。このゼラチンペレットの小片に２．３ＭスクロースＰＢＳを４℃にて一晩浸潤させ、低温試料ピン上に載置し、液体窒素中で冷凍させた。クリオアタッチメントを備えたライカウルトラカット超ミクロトームを用い、−１０８℃にて極薄切片（８０ｎｍ）を切り出し、２％メチルセルロース（２５センチポアズ；シグマ−アルドリッチ）と２．３ＭスクロースＰＢＳとの１：１混合物を用いてフォームバー被覆・カーボン被覆ニッケルグリッド上に集めた。０．１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ  ＰＢＳを用いて１０分間クエンチした後、グリッドを１％魚皮膚ゼラチン（ＦＳＧ、シグマ−アルドリッチ）ＰＢＳの溶液中で２０分間インキュベートした。次いで、ウサギ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗血清Ｃ６８６１（Ｐｅｔｅｒ  Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ（エール大学、ニューヘブン、コネチカット州）から贈呈されたもの）を用い、ＰＢＳ−ＦＳＨ中で３０分間、室温にてこれをラベル化し、ＰＢＳ中で４回洗浄し、次いで１０ｎｍまたは１５ｎｍのプロテインＡゴールド（ユトレヒト大学（オランダ）の細胞生物学部から購入したもの）とともにインキュベートした。ＰＢＳ中でさらに４回洗浄した後、１％グルタールアルデヒドＰＢＳ中、室温にて５分間グリッドを固定し、ＰＢＳ中で５回洗浄し、０．１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ  ＰＢＳで１０分間、再度クエンチした。ウサギ抗ＧＦＰ抗体（インビトロジェン−モレキュラー  プローブス、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて同様のラベル化操作を繰り返し、１％グルタールアルデヒド中での最後の固定化後に、ＨＰＬＣグレードの水の中で８回洗浄した。１．８％メチルセルロースと０．５％酢酸ウラニル（エレクトロン  マイクロスコピー  サイエンセズ、ハットフィールド、ペンシルベニア州）との混合物を、氷上で１０分間切片に浸潤させ、０．５％酢酸ウラニル／１．８％メチルセルロース中で３回洗浄し、空気乾燥させた。テックナイ１２バイオツイン（ＦＥＩ）顕微鏡にてサンプルを分析し、コダック４４８９フィルムを用いて写真を撮影した。
【０１６８】
Ｔ細胞アッセイ
ＭＰ１発現標的細胞およびＭＰ−ＬＣ３発現標的細胞を、２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで２４時間処理し、ＭＨＣクラスＩＩの発現をアップレギュレートした。細胞をＤＭＥＭ中で３回洗浄してＩＦＮγを除去し、トリプシン−ＥＤＴＡで分離し、５％ＰＨＳ＋グルタミン＋ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０（５％ＰＨＳ培地）中に再懸濁させた。５％ＰＨＳ培地でＴ細胞クローンを１回洗浄し、丸底９６ウェルプレート中に１０５Ｔ細胞／ウェルで播種した。標的細胞は、２、５および１２．５のＥ：Ｔ比で（すなわち、５×１０４、２×１０４、および８×１０３標的／ウェルで）添加した。
【０１６９】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ（マブテック  インコーポレイテッド、マリーモント、オハイオ州）を用いて、培地上清中のＩＦＮγを測定した。簡単に言えば、９６ウェルのヌンク−イムノ（商標）マキシソーププレート（ナルジェ  ヌンク  インターナショナル、ロチェスター、ニューヨーク州）を、抗ＩＦＮγ一次抗体である１−Ｄ１Ｋ（マブテック）で一晩コートし、１％ＢＳＡ  ＰＢＳで１時間ブロックした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン−２０中に、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン由来の培地上清を１：２に希釈し、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンからの上清を１：２０に希釈した。希釈した上清をプレートに２時間添加し、次いでビオチン化抗ＩＦＮγ抗体である７−Ｂ６−１（マブテック）およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（マブテック）を用いてそれぞれ１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ基質であるＴＭＢ（シグマ、セントルイス、ミシガン州）を用いてＩＦＮγを検出した。スタンダードとしては、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン−２０中に希釈した（２０００〜２０ｐｇ／ｍＬ）組換えヒトＩＦＮγ（マブテック）を用いた。
【０１７０】
フローサイトメトリー
ＩＶＡ１２ハイブリドーマ上清およびアレクサフロアー４８８共役ウサギα−マウスＩｇＧ（インビトロジェン−モレキュラー  プローブス、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて細胞を染色することにより、上皮細胞におけるＭＨＣクラスＩＩの表面レベルを測定した。ＦＡＣＳキャリバー装置（ベクトン−ディッキンソン）を用いて細胞を分析した。
【０１７１】
統計
記載がある場合には、対応のあるまたは等分散の片側スチューデントＴ検定による統計を適用した。
【０１７２】
実施例１
ヒト上皮細胞系において、オートファゴソームはリソソームプロテアーゼによって構成的にターンオーバーされている。
【０１７３】
ＭＨＣクラスＩＩ陽性のヒト細胞が構成的オートファジーを発現しているかどうかを調べる目的で、ヒト上皮細胞系におけるオートファジーのレベルを測定した。上皮細胞は、インビトロおよびインビボの双方で、炎症性サイトカインに応答して容易にＭＨＣクラスＩＩ分子をアップレギュレートする。このため、これらの細胞系がＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチドリガンドを生成するのにオートファジーのような内因性分解経路に依存しているかどうかを決定することが試みられたのである。オートファジーの定量には、オートファゴソームの特異的マーカーであるＡｔｇ８／ＬＣ３を用いた。ＬＣ３は、新たに生成するオートファゴソームの内側および外側の膜中のリン脂質にそのＣ末端を介して共有結合し、よってオートファゴソーム中に特異的に取り込まれるユビキチン様のタンパク質である。オートファゴソームの寿命は短く（ｔ１／２＝８分間）、エンドソームまたはリソソームと迅速に融合していわゆるアンフィソームまたはオートリソソームを生成する。これらの融合区画において、管腔内ＬＣ３は、リソソームプロテアーゼによって急速に分解される。より多くのオートファゴソームが生成すると、オートリソソームではより多くのＬＣ３が分解され、従って、ＬＣ３のリソソームにおけるターンオーバーはオートファジー活性についての良好な指標である。
【０１７４】
蛍光顕微鏡法によるヒト上皮細胞におけるＬＣ３のリソソームターンオーバーを可視化する目的で、異なる器官［ＨａＣａｔ（皮膚）、ＨｅＬａ（頸部）、ＭＤＡＭＣ（乳房）、２９３（腎臓）］由来の細胞系をＧＦＰ−ＬＣ３融合コンストラクトでトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトは、トランスジェニックマウスおよび培養細胞におけるオートファゴソームを可視化する目的で従来用いられており、ＧＦＰ−ＬＣ３が過剰発現してもオートファジー活性は変化しないことがわかっている。ＧＦＰ−ＬＣ３でトランスフェクションした細胞系を、リソソーム酸性化阻害剤であるクロロキン（ＣＱ）で処理し、リソソームのタンパク質分解をブロックし、そしてオートリソソームにおけるＧＦＰ−ＬＣ３の蓄積を可視化した。本研究で分析した全ての細胞系において、ＧＦＰ−ＬＣ３はＣＱ処理の１０時間後にサイトゾル小胞中に著しく蓄積し（図１Ａ）、これにより、１０時間の観察期間中に多くのＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化オートファゴソームが生成してリソソームと融合したことが示唆される。ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化小胞の明るい蓄積はＣＱ処理の１〜２時間後から観察された（データは示さず）が、阻害剤中で１０時間後にはより顕著となった。オートファジーは栄養不足と関連しているかもしれないが、ＧＦＰ−ＬＣ３の緩やかな蓄積によれば、オートファゴソームがリソソーム分解のためにＧＦＰ−ＬＣ３を連続的に輸送している、すなわち、栄養リッチな条件下にあるヒト上皮細胞系においてオートファジーが構成的に活性であることが示される。
【０１７５】
ヒトのＢ細胞および樹状細胞におけるマクロオートファジーを定量する目的で、ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）並びに単球由来の未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣにおいて、レンチウイルスにより輸送されるＧＦＰ−ＬＣ３のターンオーバーを可視化した。専門ＡＰＣにおけるＧＦＰ−ＬＣ３のリソソームターンオーバーを評価する目的で、ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球細胞系（Ｂ−ＬＣＬ）およびＧＦＰ−ＬＣ３を発現する未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）および成熟ＤＣ（ｍＤＣ）を、５０ｍＭクロロキンで１０時間処理するか（＋ＣＱ）、または未処理のまま放置した（ＣＱなし）。細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバーは２０ｍｍを表す。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。３つの全ての細胞タイプにおいて、ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化オートファゴソームは、１０時間のＣＱ処理後に著しく蓄積しており（図１Ｂ）、これにより、構成的なオートファゴソームのターンオーバーが示される。
【０１７６】
次いで、専門ＡＰＣ（なかでも、樹状細胞）における、オートファゴソームのＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画とのオーバーラップを調べた。レンチウイルスＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトでＣＤ１４＋単球をトランスフェクトし、未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣを生成させ、これらをＭＨＣクラスＩＩ特異抗体を用いて染色した。ＤＣは構成的にＭＨＣクラスＩＩ陽性であることから、これらの実験においてＩＦＮγ処理は不要であった。
【０１７７】
１０時間のＣＱ処理後、未成熟ＤＣのＭＨＣクラスＩＩ区画は、その多くがオートファゴソームマーカーであるＧＦＰ−ＬＣ３を含有していた（図１Ｃ、上図）。共局在化分析によれば、４１％（±７％）のＭＨＣクラスＩＩラベル化区画がＧＦＰ−ＬＣ３陽性であった。成熟ＤＣの大部分では、ＭＨＣクラスＩＩ分子は主として細胞表面に局在化しており（図１Ｃ、下図）、よってオートファゴソームとのオーバーラップは最小限であった。しかしながら、小胞内ＭＨＣクラスＩＩ染色を依然として示す細胞のサブセットでは、ＣＱ処理後にＧＦＰ−ＬＣ３の多くがこれらのＭＩＩＣ内に局在化していた（図１Ｃ、下図、白矢印）。リソソーム酸性化阻害剤であるＣＱの非存在下では、ＧＦＰ−ＬＣ３は主としてサイトゾル中に存在し、未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣの双方において観察できたＧＦＰ−ＬＣ３＋の小胞はごくわずかのみであった（図１Ｂを参照）。従って、未処理のＤＣに対しては共局在化分析を行なうことができなかった。しかしながら、ＣＱ処理された未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣのＭＩＩＣにおけるＧＦＰ−ＬＣ３の蓄積によれば、上皮細胞系だけではなく専門ＡＰＣ（すなわち、樹状細胞）においてもオートファゴソームはＭＨＣクラスＩＩ経路に関与することが示された。
【０１７８】
ＭＰ１−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画への輸送にはマクロオートファジーが必要とされることを示す目的で、ＭＰ１−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞を、コントロールｓｉＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ特異的）またはａｔｇ１２に特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。３６時間後、２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで細胞を処理してＭＨＣクラスＩＩの発現をアップレギュレートし、さらに３６時間培養した。リソソームプロテアーゼによるＭＰ１−ＬＣ３の分解を阻害する目的で、培養の最後の６時間の間、細胞を５０μＭクロロキンで処理した（図１Ｄ；ＣＱ）（（＋ＣＱ）と示す）。細胞を固定し、ＭＰ１特異抗体およびＭＨＣクラスＩＩ特異抗体並びにＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバー：１０μｍ。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞では、ＭＰＡ１−ＬＣ３含有小胞のかなりの割合がＭＨＣクラスＩＩ区画と共局在化していることが観察されたのに対し、ａｔｇ１２処理後にはかような共局在化は完全に阻害された。
【０１７９】
クロロキン処理によりオートリソソームにおけるＧＦＰ−ＬＣ３の緩やかな蓄積が誘導され、当該処理は栄養飢餓とは実質的に異なることを示す目的で、ＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトで安定にトランスフェクトされた２９３細胞を、未処理のまま放置し（図１Ｅ、ＣＱなし）、または５０μＭクロロキン（ＣＱ）で２時間もしくは１０時間処理した。細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡法により分析した。ＣＱを用いたリソソーム酸性化の阻害により、ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化オートファゴソームの緩やかな蓄積が経時的に引き起こされた。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。図１Ｆでは、ＭＤＡＭＣ細胞を未処理のまま放置し（−−）、ハンクス平衡塩溶液中で１０時間培養し（飢餓）、５０μＭクロロキンで１０時間処理し（＋ＣＱ）、またはプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４（２８μＭ）、ロイペプチン（４０μＭ）およびペプスタシンＡ（１５μＭ）で１０時間処理した（＋プロテアーゼ阻害剤）。全細胞溶解液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アクチンブロットは等量のタンパク質のロード量を示す。栄養飢餓ではＬＣ３−ＩＩが弱く誘導されるだけであるのに対し、ＣＱまたはプロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４、ロイペプチンおよびペプスタシンＡ）を用いた処理によるリソソームプロテアーゼの阻害によれば、ＬＣ３−ＩＩの著しい蓄積が引き起こされる。２回の実験のうちの１回を示す。図１Ｇでは、ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞をモックトランスフェクションし、またはこれにラミンＡ／Ｃ特異的なもしくはＡＴＧ１２特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖をトランスフェクションした。２日後、細胞を５０ｍＭ  ＣＱで６時間処理し（＋ＣＱ）、または未処理のまま放置し（ＣＱなし）、ＤＡＰＩで染色し、落射蛍光顕微鏡により評価した。２回の実験のうちの１回を示す。その結果、ＧＦＰ−ＬＣ３で明るくラベル化された小胞の蓄積はＣＱ処理の２時間後に既に観察され（図１Ｅ）、このことは、これらの小胞の急速な分解の速度論とも良好に整合する。ＣＱ処理によるＧＦＰ−ＬＣ３＋小胞の蓄積はマクロオートファジーに依存していた。なぜなら、オートファゴソーム形成に不可欠な遺伝子であるＡＴＧ１２のｓｉＲＮＡ介在性のノックダウンにより、これらの小胞の蓄積が完全に阻害されたためである（図１Ｇ）。
【０１８０】
実施例２
オートファジーはヒト上皮細胞系および専門ＡＰＣにおいて構成的に活性なプロセスである。
【０１８１】
トランスフェクトしたＧＦＰ−ＬＣ３で得られた結果を内因性オートファゴソームへと拡張する目的で、内因性ＬＣ３のターンオーバーを定量した。これはまた、上皮細胞系による分析を、トランスフェクトするのがより困難であるＭＨＣクラスＩＩ陽性の細胞系（Ｂ細胞系および一次単球／樹状細胞など）へと拡張することも可能とする。抗ＬＣ３ウエスタンブロットにおいて別々に定量されうることから、オートファゴソーム結合ＬＣ３（ＬＣ３−ＩＩと称する）および遊離サイトゾルＬＣ３（ＬＣ３−Ｉと称する）はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動におけるその明らかな分子量（それぞれ１６ｋＤおよび１８ｋＤ）によって区別可能であるという事実を利用した。
【０１８２】
リソソームプロテアーゼ阻害剤であるＣＱの存在下または非存在下で、異なる上皮細胞系およびＢ細胞系、一次ＣＤ１４＋単球および単球由来の樹状細胞を１０時間培養し、次いでＬＣ３−ＩＩの蓄積をイムノブロッティングによって定量した。分析した全ての細胞タイプにおいて、ＣＱ処理によってオートファゴソーム結合ＬＣ３−ＩＩは著しく蓄積し（図２ａおよび図２ｂ）、これにより、ＬＣ３−ＩＩラベル化オートファゴソームは、エンドソーム／リソソームにおいて１０時間の間に構成的に分解されたことが示される。ＧａＣａｔ細胞系について図２ｃに示すように、細胞のＬＣ３−ＩＩレベルはＣＱ処理の１時間後には既に上昇しており、より長い処理時間後に緩やかに蓄積していることから、オートファゴソームは連続的に生成されていることが確認される。ウエスタンブロットの密度の定量によれば、ＬＣ３−ＩＩはＣＱ処理の１０時間後には５倍（ＨａＣａｔ細胞およびＭＤＡＭＣ細胞）並びに３０倍（２９３細胞）蓄積することが明らかとなった（データは示さず）。これらを総合すると、これらの実験によれば、分析した全ての細胞タイプにおいてオートファジーは構成的に活性なプロセスであることが確認される。さらに、構成的なオートファジーは形質転換細胞系だけではなく、一次単球および樹状細胞について示されたように一次細胞の特徴でもある。
【０１８３】
実施例３
ＩＦＮγ処理されたヒト上皮細胞系において、ＧＦＰ−ＬＣ３はＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画のマーカーと共局在化する。
【０１８４】
オートファゴソームがＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画（ＭＩＩＣ）と融合するかどうかを調べる目的で、共焦点顕微鏡法を用い、オートファゴソームマーカーであるＧＦＰ−ＬＣ３がＭＩＩＣのマーカーと共局在化するかどうかを調べた。ＭＩＩＣは、後期のエンドソーム／リソソームマーカー（ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２）に加えてＭＨＣクラスＩＩ取り込みのための区画（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩおよびペプチド発現シャペロンであるＨＬＡ−ＤＭ１）をも含む一般的な後期のエンドソーム区画として特徴づけられている。
【０１８５】
上皮細胞はその制限された細胞内電位のために内因性のＭＨＣクラスＩＩ抗原提示に強く依存しうることから、この上皮細胞を用いて分析を行なった。用いたヒト上皮細胞系のほとんど（２９３細胞以外）は、ＩＦＮγ処理後にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現した（図３ａ）。共局在化分析については、ＩＦＮγを用いて細胞を処理し、ＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトで一時的にトランスフェクトし、ＭＤＡＭＣ細胞（図３ｂ）およびＨａＣａｔ細胞（データは示さず）において、ＭＩＩＣマーカーＭＨＣクラスＩＩに特異的な抗体（ＨＬＡ−ＤＭおよびＬＡＭＰ−２）を用いて染色した。本研究で用いたヒト細胞をＩＦＮγ処理してもオートファジーの誘導またはオートファゴソームパターンの変化は観察されなかった（データは示さず）が、ＩＦＮγ処理によってＭＨＣクラスＩＩ陽性区画の形成が誘導された。図３ｂに示すように、これらのＭＨＣクラスＩＩ陽性区画の多くはＧＦＰ−ＬＣ３と共局在化していた。ＭＨＣクラスＩＩおよびＨＬＡ−ＤＭのＧＦＰ−ＬＣ３との共局在化をＬＳＭ５１０ソフトウェアのツール（これは細胞の断面に沿って強度プロファイルをオーバーレイする）を用いて定量したところ、二重陽性細胞のうち、ＭＨＣクラスＩＩ＋区画の５８％およびＨＬＡ−ＤＭ＋区画の５２％がＧＦＰ−ＬＣ３陽性であった。同様に、ＬＳＭ５１０ソフトウェアのヒストグラムツール（これは特定の強度閾値を超えるピクセルについて、共局在化ピクセルの数を定量する）を用いたところ、ＧＦＰ−ＬＣ３との共局在化はＭＨＣクラスＩＩ＋区画については４０％、ＨＬＡ−ＤＭ＋区画については３８％であることが判明した。ＭＩＩＣ（これはオートファゴソームのマーカータンパク質の分解によって、ＧＦＰ−ＬＣ３との共局在化を示さなかった）の割合を調べる目的で、クロロキン処理したＭＤＡＭＣ細胞およびＨａＣａｔ細胞に対して同様の実験を行なった。ＧＦＰ−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＭおよびＬＡＭＰ−２との共局在化は、これらの条件下においてより顕著であった（図３ｃ、ＨａＣａｔ細胞についてはデータを示さず）。ＬＳＭ５１０のヒストグラムツールを用いた共局在化分析によれば、ある程度の増加（ＭＨＣクラスＩＩについては４０％から４４％、ＨＬＡ−ＤＭについては３８％から４５％）のみが明らかとなったが、ＬＳＭ５１０のプロファイルツールを用いた分析では、クロロキン処理後に、ＭＨＣクラスＩＩ＋小胞については共局在化が５８％から８６％に増加し、ＨＬＡ−ＤＭ＋小胞では５２％から７１％に増加することが示された。これらの結果から、ヒト上皮細胞系において、ＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画の大部分はオートファゴソームからの入力を獲得することが示される。
【０１８６】
本研究で用いたヒト細胞系では、イムノブロットによって測定したところ、ＩＦＮγ処理によってマクロオートファジーの検出可能なアップレギュレーションは引き起こされなかった（図３Ｄ）。ヒト上皮細胞系（２９３Ｔ，ＨａＣａｔおよびＭＤＡＭＣ）を、１０００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＦＮαもしくはＩＦＮγで２４時間処理し、または未処理のまま放置した（−−）。全細胞溶解液を調製し、等量のタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによってＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アステリスク（＊）を付した高分子量のバンドはＬＣ３抗血清と交差反応するタンパク質であり、等量のタンパク質のロード量を示す。ＬＣ３−ＩＩレベル（よって、マクロオートファジーのレベル）は、ＩＦＮ処理の影響を受けなかったが、ＩＦＮｇ処理は、ＭＨＣクラスＩＩ陽性区画の誘導に加えて、マクロオートファジーの活性にわずかに影響した可能性がある。
【０１８７】
実施例４
初期のエンドソームまたはＭＨＣクラスＩ取り込み区画は、ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化小胞とほとんど融合しない。
【０１８８】
オートファゴソームがＭＩＩＣと選択的に融合するかどうかを判定する目的で、ＧＦＰ−ＬＣ３の他の細胞内区画のマーカーとのオーバーラップを分析した（具体的には、初期のエンドソーム（初期のエンドソーム抗原であるＥＥＡ１が陽性のもの）および再利用エンドソーム（トランスフェリン受容体（ＴＲ）が陽性のもの））。ＭＤＡＭＣ細胞系について図４ａに示すように、ＧＦＰ−ＬＣ３は、クロロキンの存在下でさえも、ＥＥＡ１またはトランスフェリン受容体のいずれとも有意に共局在化しなかった。ＥＥＡ１のＧＦＰ−ＬＣ３との共局在化をＬＳＭ５１０ソフトウェアを用いて定量したところ、ＭＤＡＭＣ細胞において共局在化は低かったが（プロファイル分析によって９％、ヒストグラム分析によって７％）、クロロキン処理後はわずかに増加した（それぞれ、２６％および２１％）。ＭＨＣクラスＩＩおよびＨＬＡ−ＤＭとＥＥＡ１との間でのＧＦＰ−ＬＣ３の共局在化の差異は、ＣＱの存在下および不存在下で統計的に有意であった（等分散のスチューデントのＴ検定による統計：ｐ＜０．００１）。ＨａＣａｔ細胞では、ＧＦＰ−ＬＣ３のＥＥＡ１またはトランスフェリン受容体とのオーバーラップもまた最小限であった（データは示さず）。さらに、ＩＦＮγ処理した細胞では、ＧＦＰ−ＬＣ３は、初期エンドソームまたは再利用エンドソーム中にほとんど導入されなかった（データは示さず）。未処理のまたはＣＱ処理したＭＤＡＭＣ細胞におけるＧＦＰ−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＭおよびＥＥＡ１との共局在化についての定量分析を図４Ｃに示す。データは、２回のうちの１回の代表的な実験由来の１０〜１５個の細胞の平均を表す。エラーバーは標準偏差を示す。等分散のスチューデントのｔ検定（片側）によるｐ値を示す。
【０１８９】
細胞間の抗原のＭＨＣクラスＩＩ上への提示では、オートファジーが示唆されているが、ＭＨＣクラスＩ提示には影響していないようである。この点をさらに確かめるため、ＧＦＰ−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩ分子とのオーバーラップを分析した。予想通り、ＭＨＣクラスＩは主として核周囲のＥＲ／ゴルジ領域に、および細胞膜上に見られ、より末梢にまで分布するＧＦＰ−ＬＣ３陽性の小胞とは共局在化しなかった（図４ｂ）。同時に、このデータは、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞においてオートファゴソームは主としてＭＩＩＣと融合するが、初期／再利用エンドソームまたはＭＨＣクラスＩ取り込み区画とはほとんど融合しないことを示唆している。
【０１９０】
実施例５
高電子密度の多小胞区画において、ＧＦＰ−ＬＣ３およびＭＨＣクラスＩＩは共局在化する。
【０１９１】
ＧＦＰ−ＬＣ３／ＭＨＣクラスＩＩ二重陽性区画を電子顕微鏡法によって同定する目的で、未処理のまたはＣＱ処理した、ＧＦＰ−ＬＣ３で安定にトランスフェクトしたＭＤＡＭＣ細胞の極薄低温切開片を調製し、これらをＨＬＡ−ＤＲおよびＧＦＰに特異的な抗体で染色し、当該抗体を１０ｎｍおよび１５ｎｍのプロテインＡゴールド粒子でラベル化した。未処理細胞およびＣＱ処理細胞の双方において、上記２つの抗体は、大きい（１〜２μｍ）、高電子密度の多小胞区画を強くラベル化したのに対し、他のオルガネラ（核やミトコンドリアなど）はほとんど金について陰性であった（図５ａおよび図５ｃ）。ＣＱ処理した細胞では、未処理の細胞と比べて、二重ラベル化した多小胞区画がより多く見られた（データは示さず）。この二重ラベル化区画の形態は、高電子密度の物質、多くの小さい（時には大きい）内部小胞の存在によって特徴づけられた（図５ｂおよび図５ｄ）。
【０１９２】
ＰＦＡ固定したＭＤＡＭＣ−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞の極薄低温切開片を、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗血清／１５ｎｍ金粒子および抗ＧＦＰ抗血清／１０ｎｍ金粒子を用いて二重にラベル化し、電子顕微鏡法により分析した（図５Ｅ）。ＭＨＣクラスＩＩのラベル化は、ＧＦＰ−ＬＣ３陽性の高電子密度の多小胞区画、および細胞膜の双方において見られる。３回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。スケールバー：１μｍ。ＭＤＡＭＣ−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞を５０μＭ  ＣＱで１０時間処理し、極薄低温切開片をＭＨＣクラスＩＩ（１０ｎｍ金）およびＧＦＰ（１５ｎｍ金）について二重にラベル化し、電子顕微鏡法により分析した（図５Ｆ）。二重ラベル化した多小胞区画の多くは拡張し、膨潤して１μｍを超える直径を有しており、隙間もいくらか有しているように見える。３回の実験のうちの１回の代表的な３つの領域を示す。スケールバー：１μｍ。
【０１９３】
他のオルガネラ（核やミトコンドリアなど）はほとんど金について陰性であった；しかしながら、ＧＦＰ−ＬＣ３染色のいくらかはサイトゾルにおいて観察され、ＭＨＣクラスＩＩ染色はＥＲ、ゴルジ、および細胞膜において見られた（図５Ｅ）。二重ラベル化区画の形態は、未処理の細胞およびＣＱ処理した細胞において非常に類似していたが、ＣＱ処理した細胞においてずっと多く見られ（データは示さず）、これらのうちのいくらかはクロロキン処理下でリソソーム区画に特徴的な膨潤表現型を示した（図５Ｆ）。このように、ＧＦＰ−ＬＣ３およびＭＨＣクラスＩＩ分子は、腔内脂質膜上に互いに極めて接近して観察されることが多かった。このことから、オートファゴソームの多くは、内部膜上でＭＨＣクラスＩＩ区画と融合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＬＣ３の双方を含有する多小胞区画を生成することが示唆される。
【０１９４】
実施例６
サイトゾル抗原および核抗原は、Ａｔｇ８／ＬＣ３との融合によってオートファジー分解に標的化される。
【０１９５】
オートファゴソームは連続的にＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画と融合するという知見によって、サイトゾルの物質がＭＨＣクラスＩＩ発現（よってＣＤ４＋Ｔ細胞への抗原提示）のためのペプチドを提供する手段が提供される。この仮説を検証する目的で、サイトゾル抗原のオートファジーへの標的化によってＣＤ４＋Ｔ細胞の認識が増強されるかどうかを判定することが試みられた。この目的で、インフルエンザマトリックスタンパク質１のオートファゴソームマーカータンパク質Ａｔｇ８／ＬＣ３との融合コンストラクトを作製し（図６ａ）、当該融合タンパク質のＬＣ３部位が抗原をオートファジー膜およびこれに続くＭＩＩＣでの分解へと標的化していると結論づけた。
【０１９６】
ヒトＬＣ３タンパク質をコードする核酸を用いた。ヒト微小管結合タンパク質１Ａ／１Ｂの軽鎖３Ｂ（Ｅｘｐａｓｙアクセッションナンバー：ＭＬＰ３Ｂ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ９ＧＺＱ８））を用いた。その配列は以下の通りである：
【０１９７】
【表１】
2009528819.tif 000003
【０１９８】
この核酸は、ＥＭＢＬデータベースに記載の（アクセッションナンバー：ＡＡＧ２３１８２）アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【０１９９】
上述したように、ＭＰ１−ＬＣ３融合タンパク質が発現した。ＭＰ１−ＬＣ３融合タンパク質をコードする上記核酸配列は下記の配列を有する：
【０２００】
【表２】
2009528819.tif 000004
【０２０１】
普通の文字は、ＭＩ＿ＩＡＷＩＬ類似のインフルエンザ株Ａ／ＷＳＮ／３３由来のＭＰ１配列に対応し、イタリック文字はリンカー配列を表し、太字のヌクレオチドはＬＣ３配列を表す。
【０２０２】
上述したように、上記核酸は下記のアミノ酸配列を有するＭＰ１−ＬＣ３融合タンパク質をコードした：
【０２０３】
【表３】
2009528819.tif 000005
【０２０４】
次いで、このＭＰ１−ＬＣ３融合タンパク質またはＭＰ１コントロールタンパク質を、ヒト上皮細胞系であるＨａＣａｔおよびＭＤＡＭＣに安定発現させた（図６ａ）。ウエスタンブロット分析により、双方の細胞系において抗原が発現し、当該抗原が予想される分子量（ＭＰ１：２８ｋＤ；ＭＰ１−ＬＣ３：４３ｋＤ）を有することが示された（図６ｂ）。特に、双方の細胞系において、ＭＰ１−ＬＣ３融合タンパク質はＭＰ１よりもわずかに低いレベルで存在していた。この融合タンパク質の標的化の挙動を評価する目的で、免疫細胞化学によるこれらの局在化を調べた。予想通り、野生型のＭＰ１は、いくらかのサイトゾルスペックルおよび核スペックルとともにサイトゾルおよび核に局在化し、このパターンはＣＱ処理後にも劇的には変化しなかった（ＨａＣａｔ：図６ｃ；ＭＤＡＭＣ：データは示さず）。これに対し、ＭＰ１−ＬＣ３融合タンパク質は斑点状のサイトゾルの染色を示し、これはＣＱによるリソソームタンパク質分解の阻害によってさらに増強された（図６ｃ）。ＭＰ１−ＬＣ３陽性のサイトゾルの斑点がオートファゴソームであるかどうかを調べる目的で、ＨａＣａｔ細胞系およびＭＤＡＭＣ細胞系においてＧＦＰ−ＬＣ３およびＭＰ１−ＬＣ３を共発現させ、これらの共局在化を共焦点顕微鏡法により分析した。双方の細胞系において、ＧＦＰ−ＬＣ３およびＭＰ１−ＬＣ３融合タンパク質は、ＣＱ処理後に同一のサイトゾル小胞に蓄積したのに対し、天然のＭＰ１は、ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化区画とは有意に共局在化しなかった（ＭＤＡＭＣ：図６ｄ；ＨａＣａｔ：データは示さず）。これにより、ＬＣ３タグが実際にサイトゾル抗原を、オートファゴソームへ、そしてこれに続くリソソームプロテアーゼによる分解へと標的化ししていることが示される。
【０２０５】
実施例７
オートファジー分解への抗原の標的化により、ＣＤ４＋Ｔ細胞の認識が増強される。
【０２０６】
サイトゾル抗原／核抗原のＬＣ３融合を介したオートファジー分解への標的化により、ＭＨＣクラスＩＩ提示が増強されるという仮説を確認する目的で、ＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＭＰ１発現標的細胞とＭＰ１−ＬＣ３発現標的細胞との認識を分析した。この目的で、ＨａＣａｔ細胞系にＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱがマッチしたドナーから、ＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを作製し（図７）、これによりＩＦＮγ処理ＨａＣａｔ細胞を標的細胞として用いることが可能となった。このＣＤ４＋Ｔ細胞クローンはホモ接合性でＣＤ４陽性であり、ＭＰ１ペプチドライブラリー中のオーバーラップペプチドのＭＰ１６２−７２ペプチド配列を認識した。ＬＣ３融合のＭＨＣクラスＩに対する効果を分析する目的で、同一のドナーからＭＰ１５８−６６特異的なＨＬＡ−Ａ２制限ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンをも作製し（図７）、これについてＨＬＡ−Ａ２陽性のＭＤＡＭＣ標的細胞の認識を調べることができた。
【０２０７】
図７Ａ〜図７Ｃは、インフルエンザＭＰ１に特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのキャラクタリゼーションを示す。図７ａでは、クローンのＣＤ４およびＣＤ８の発現を、フローサイトメトリーにより分析した。クローン９．２６、１１．４６および１０．９はホモ接合性でＣＤ４＋ＣＤ８−であり、クローン９．２はホモ接合性でＣＤ８＋ＣＤ４−であった。図７ｂでは、これらによるインフルエンザＭＰ１ペプチドの認識を、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた。ＭＰ１ペプチドライブラリーを、ＭＰ１のアミノ酸位置１〜５１（プールＩ）、４１〜８８（プールＩＩ）、７８〜１２８（プールＩＩＩ）、１１８〜１６３（プールＩＶ）、１５２〜２０３（プールＶ）および１９３〜２５２（プールＶＩ）をカバーする６つのサブプールに分けた。クローン９．２、９．２６および１０．９はプールＩＩに、クローン１１．４６はプールＩＩＩに、特異的に反応した。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンではなくＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン９．２が、ＨＬＡＡ２制限ＭＰ１エピトープ５８〜６６を認識した。エラーバーは標準偏差を示す。図７ｃでは、ＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンについて、ＭＰ１のプールＩＩおよびプールＩＩＩの全てのペプチドを含む、ＭＰ１のアミノ酸配列２９〜１２８をカバーする個々のペプチドに対する認識を調べた。クローン９．２６および１０．９は、ペプチドエピトープＭＰ１６２〜７２を特異的に認識し、クローン１１．４６はエピトープ１１０３〜１１３に特異的であった。エラーバーは標準偏差を示す。
【０２０８】
２つの異なる形態のＭＰ１がどの程度ＭＨＣクラスＩＩ上に提示されるのかを調べる目的で、ＭＰ１発現ＨａＣａｔ標的細胞またはＭＰ１−ＬＣ３発現ＨａＣａｔ標的細胞に応答した２つのＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンのＩＦＮγ分泌を測定した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡアッセイにより、双方のＣＤ４＋Ｔ細胞クローン（クローン９．２６および１０．９、図８ａ、それぞれ上の２つの図）の応答がＬＣ３融合によって非常に増加することが示された。細胞系標的に対するＴ細胞クローンの比が最低（エフェクター対標的、すなわちＥ：Ｔ比が２）のとき、ＭＰ１−ＬＣ３は３〜４倍のＩＦＮγ産生を誘導したのみである（等分散のスチューデントのＴ検定の統計：ｐ＜０．００１）のに対し、標的細胞が（よってＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体）が制限的となる、より高いＥ：Ｔ比（５および１２．５）の場合にはＩＦＮγ分泌における差異は特に顕著であった。これらのＥ：Ｔ比の場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンによるＩＦＮγ分泌は、ＭＰ１−ＬＣ３に対する応答ではＭＰ１と比較して９〜１７倍（等分散のスチューデントのＴ検定の統計：ｐ＜０．００３）の間で増加した（全てのＥ：Ｔ比にわたって、対応のあるスチューデントのＴ検定の統計：ｐ＜０．００７）。トランスフェクトされていないＨａＣａｔ細胞およびＧＦＰ−ＬＣ３をトランスフェクトしたＨａＣａｔ細胞は、バックグラウンドを超えては認識されなかった（図８ａ、カラム２およびカラム３）。ＭＰ１に対するＩＦＮγ応答は、ペプチドパルスされたＨａＣａｔ陽性コントロールの認識により分泌された量の３０％を超えることはなかったのに対し、ＭＰ１−ＬＣ３は、ペプチドパルスされた標的によって達成されるＣＤ４＋Ｔ細胞認識の最大値を９５％まで刺激することが可能であった（図８ａ、上の２つの図、カラム１、カラム４およびカラム５）。混合した実験により、ＭＰ１およびＭＰ１−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩ提示が実際には内因性プロセシングによるものであることが示された。これは、ＨＬＡがマッチしたＨａＣａｔ細胞をミスマッチのＭＰ１発現ＭＤＡＭＣ細胞またはＭＰ１−ＬＣ３発現細胞と混合すると、いかなるＴ細胞応答も刺激されなかったためである（図８ａ、カラム６およびカラム７）。さらに、ＩＦＮγによってＭＨＣクラスＩＩが誘導されないと、ＭＰ１発現ＨａＣａｔ細胞およびＭＰ１−ＬＣ３発現ＨａＣａｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を刺激することができなかった（図８ａ、上の２つの図、カラム８およびカラム９）ことから、この提示はＭＨＣクラスＩＩによって制限を受けていることが確認された。図８ａの下の図は、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比が１０、２０および４０のときの未成熟ＤＣ／成熟ＤＣについてのクローン１１．４６の結果を示す。また、ＭＨＣクラスＩＩの表面染色により、ＭＰ１発現標的細胞およびＭＰ１−ＬＣ３発現標的細胞において、ＩＦＮγに応答して同様にＭＨＣクラスＩＩがアップレギュレートされたことが示され（図８ｂ）、これにより、ＭＰ１−ＬＣ３の認識の増強はＭＨＣクラスＩＩの発現レベルの増加によるものではなかったことが示される。
【０２０９】
ＬＣ３融合のＭＨＣクラスＩ提示に対する効果を調べる目的で、ＭＰ１発現ＭＤＡＭＣ標的細胞およびＭＰ１−ＬＣ３発現ＭＤＡＭＣ標的細胞に対するＭＰ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのＩＦＮγ応答を分析した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡにより、３つの全てのＥ：Ｔ比について、ＭＰ１発現標的およびＭＰ１−ＬＣ３発現標的に応答してＣＤ８＋Ｔ細胞により同程度の量のＩＦＮγが分泌され（図７ｃ）、これにより、ＬＣ３融合はＭＨＣクラスＩ提示に悪影響を及ぼさず、そして双方のコンストラクトはおそらく同程度の量のリボソーム分解産物（ＤＲｉＰ）を生成し、当該産物は次いでＣＤ８＋Ｔ細胞認識のために効率的にプロセシングを受けるということが示唆される。これは、ＩＦＮγ処理した標的細胞（図８ｃ、上図、カラム１〜５）および未処理の標的細胞（図８ｃ、上図、カラム７〜１１）の双方について観察されたが、ＭＨＣクラスＩ提示はＩＦＮγ処理によってわずかに増強されたようであり、このことはＭＨＣクラスＩのプロセシング機構の増強と整合している。これらを総合すると、上記のデータにより、ＬＣ３融合を介したサイトゾル抗原のオートファジー分解への標的化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞認識に悪影響を及ぼすことなくＣＤ４＋Ｔ細胞認識を非常に増加させることが示唆される。図８ｃの中図および下図は、それぞれＣＭ−ＬＣＬおよび未成熟／成熟ＤＣについての対応する結果を示す。
【０２１０】
本明細書では本発明の特定の特徴を例示し、記載したが、多くの修飾、置換、変更、および等価物を当業者であれば思い当たるであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の思想に含まれるかような修飾および変更の全てを包含するものと解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１Ａ】ヒト上皮細胞系における構成的オートファゴソーム形成。ヒト上皮細胞系であるＨａＣａｔ（ケラチン生成細胞）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡＭＣ（乳癌）および２９３（腎臓）に、ＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトを安定的にトランスフェクションした。エンドソーム／リソソーム区画においてＧＦＰ−ＬＣ３を安定化する目的で、５０μＭクロロキンで１０時間、細胞を処理した（＋ＣＱ、右欄）。細胞を固定し、ＤＡＰIで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバー：２０μｍ。３回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。
【図１Ｂ】マクロオートファジーは、抗原提示専門の細胞（樹状細胞など）における構成的なプロセスである。専門ＡＰＣにおけるＧＦＰ−ＬＣ３のリソソーム代謝回転を評価する目的で、ＧＦＰ−ＬＣ３を安定的に発現しているＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球細胞系（Ｂ−ＬＣＬ）、並びに、ＧＦＰ−ＬＣ３を発現している未成熟ＤＣおよび成熟ＤＣ（ｉＤＣおよびｍＤＣ）を、５０ｍＭクロロキンで１０時間処理し（＋ＣＱ）、または未処理のまま放置した（ＣＱなし）。細胞を固定し、ＤＡＰIで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバーは２０ｍｍを示す。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。
【図１Ｃ】ＧＦＰ−ＬＣ３は、樹状細胞のＭＨＣクラスＩＩを取り込む区画で分解される。上図：ＧＦＰ−ＬＣ３を発現する未成熟ＤＣを、５０ｍＭクロロキンで１０時間処理した（＋ＣＱ）。ＭＨＣクラスＩＩ特異抗体およびＤＡＰＩで細胞を染色し、ＧＦＰ−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩとの共局在化を共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバーは１０μｍを示す。３回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。下図：成熟ＤＣを用いて上図と同じ実験を行なった。成熟ＤＣの大部分では、ＭＨＣクラスＩＩは主に細胞表面に局在化していたが、一部の細胞には細胞間ＭＨＣクラスＩＩ区画が存在していた（白矢印）。スケールバーは１０μｍを示す。３回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。
【図１Ｄ】ＭＨＣクラスＩＩ取り込み区画へのＭＰ１−ＬＣ３の輸送にはマクロオートファジーが必要である。ＭＰ１−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞に、コントロールｓｉＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ特異的）またはａｔｇ１２に特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。３６時間後、細胞を２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで処理してＭＨＣクラスＩＩ発現をアップレギュレートし、当該細胞をさらに３６時間培養した。リソソームプロテアーゼによるＭＰ１−ＬＣ３の分解を阻害する目的で、培養の最後の６時間の間、細胞を５０μＭクロロキン（ＣＱ）で処理した（（＋ＣＱ）として示す）。細胞を固定し、ＭＰ１特異抗体およびＭＨＣクラスＩＩ特異抗体並びにＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法で分析した。スケールバー：１０μｍ。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。コントロールｓｉＲＮＡ処理細胞ではＭＰ１−ＬＣ３含有ベヒクルのかなりの割合でＭＨＣクラスＩＩ区画との共局在化が観察できたが、かような共局在化はａｔｇ１２後には完全に見られなくなった。
【図１Ｅ】クロロキン処理により、ＧＦＰ−ＬＣ３のオートリソソーム中へのゆっくりとした蓄積が誘導され、これは栄養飢餓とは実質的に異なる。ＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトを安定にトランスフェクトした２９３細胞を未処理のまま放置し（ＣＱなし）、または５０μＭクロロキン（ＣＱ）で２時間もしくは１０時間処理した。細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡法により分析した。ＣＱによってリソソームの酸性化が阻害されることで、ＧＦＰ−ＬＣ３ラベル化オートファゴソームの経時的な緩やかな蓄積が引き起こされる。２回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。
【図１Ｆ】クロロキン処理により、ＧＦＰ−ＬＣ３のオートリソソーム中へのゆっくりとした蓄積が誘導され、これは栄養飢餓とは実質的に異なる。ＭＤＡＭＣ細胞を未処理のまま放置し（−−）、ハンクス平衡塩溶液中で１０時間培養し（飢餓）、５０μＭクロロキンで１０時間処理し（＋ＣＱ）、またはプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４（２８μＭ）、ロイペプチン（４０μＭ）およびペプスタシンＡ（１５μＭ）で１０時間処理した（＋プロテアーゼ阻害剤）。全細胞溶解液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アクチンブロットは等量のタンパク質のロード量を示す。栄養飢餓ではＬＣ３−ＩＩが弱く誘導されるだけであるのに対し、ＣＱまたはプロテアーゼ阻害剤（Ｅ６４、ロイペプチンおよびペプスタシンＡ）を用いた処理によるリソソームプロテアーゼの阻害によれば、ＬＣ３−ＩＩの著しい蓄積が引き起こされる。２回の実験のうちの１回を示す。
【図１Ｇ】ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞をモックトランスフェクションし、またはこれにラミンＡ／Ｃ特異的なもしくはＡＴＧ１２特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖をトランスフェクションした。２日後、細胞を５０ｍＭ  ＣＱで６時間処理し（＋ＣＱ）、または未処理のまま放置し（ＣＱなし）、ＤＡＰＩで染色し、落射蛍光顕微鏡により評価した。２回の実験のうちの１回を示す。
【図２】ヒト上皮細胞系および、一次単球（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）／樹状細胞などの専門ＡＰＣにおける構成的オートファジーを示す。（ａ）ヒト上皮細胞系［ＨａＣａｔ（ケラチン生成細胞）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＭＤＡＭＣ（乳癌）および２９３（腎臓）］およびＢ細胞系［ＭＳ−ＬＣＬ（ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞系）、ＲＰＭＩ６６６６およびＬ５９１（ホジキンリンパ腫細胞系）］、並びに（ｂ）一次ＣＤ１４＋単球および、未成熟またはＬＰＳ成熟の単球由来樹状細胞を、５０μＭクロロキンで１０時間処理し（＋）、または未処理のまま放置した（−−）。全細胞溶解液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アクチンブロットはＣＱ処理が通常のタンパク質レベルに影響しなかったことを示す。３回の実験のうちの１回を示す。（ｃ）ＨａＣａｔケラチン生成細胞系を５０μＭクロロキンで０、１、２、１０、または２４時間処理し、ＬＣ３−ＩＩの蓄積を抗ＬＣ３ウエスタンブロットにより分析した。アクチンブロットはサンプルのロード量についてのコントロールである。２回の実験のうちの１回を示す。
【図３Ａ】ヒト上皮細胞系を２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで４８時間処理した後の表面ＭＨＣクラスＩＩのアップレギュレーション。抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。２回の実験のうちの１回を示す。
【図３Ｂ】ＭＤＡＭＣ乳癌細胞系を２００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮγで処理し、ｐＥＧＦＰ−ＬＣ３レポーターコンストラクトで一時的にトランスフェクションし、３６時間後にＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＬＡＭＰ−２に対する抗体およびＤＮＡ含量についてＤＡＰＩで染色した。ＭＩＩＣマーカーとのＧＦＰ−ＬＣ３の共局在化を共焦点顕微鏡法により分析した。
【図３Ｃ】培養の最後の１０時間の間、５０μＭクロロキンを存在させたこと以外は（ｂ）と同様である。スケールバー：１０μｍ。３回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。
【図３Ｄ】組換えＩＦＮはヒト上皮細胞におけるマクロオートファジーに影響しない。ヒト上皮細胞系（２９３Ｔ、ＨａＣａｔおよびＭＤＡＭＣ）を１０００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＦＮ−αもしくはＩＦＮ−γで２４時間処理し、または未処理のまま放置した（−−）。全細胞溶解液を調製し、等量のタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。抗ＬＣ３ウエスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩを可視化した。アステリスク（＊）を付した高分子量バンドはＬＣ３抗血清と交差反応するタンパク質であり、等量のタンパク質のロード量を示す。ＬＣ３−ＩＩレベル（すなわち、マクロオートファジー）は、ＩＦＮ処理の影響を受けない。
【図４Ａ】初期エンドソーム抗原（ＥＥＡ１）またはトランスフェリン受容体（ＴＲ）に対する抗体で細胞を染色した。また、ＤＮＡ含量について細胞をＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法で分析した。スケールバー：１０μｍ。２回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。
【図４Ｂ】ＭＨＣクラスＩに対する抗体で細胞を染色した。また、ＤＮＡ含量について細胞をＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法で分析した。スケールバー：１０μｍ。２回の実験のうちの１回の代表的な細胞を示す。
【図４Ｃ】未処理またはＣＱ処理ＭＤＡＭＣ細胞における、ＧＦＰ−ＬＣ３のＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＭおよびＥＥＡ１との共局在化の定量分析。データは、２回のうちの１回の代表的な実験の１０〜１５個の細胞の平均を示す。エラーバーは標準偏差を示す。等分散のスチューデントのｔ検定（片側）によるｐ値を示す。
【図５Ａ−Ｄ】ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現し、ＩＦＮγ誘導によりＭＨＣクラスＩＩ陽性である、未処理（ａ、ｂ）またはＣＱ処理（ｃ、ｄ）したＭＤＡＭＣ上皮細胞を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、８０ｎｍ厚さの低温切開片に切り出した。ＨＬＡ−ＤＲ特異抗血清および１０ｎｍプロテインＡ−ゴールド（ＰＡＧ１０）で切片をラベル化し、グルタールアルデヒドで抗体−ＰＡＧ複合体を不可逆的に固定した。続いて、ＧＦＰ特異抗体および１５ｎｍプロテインＡ−ゴールド（ＰＡＧ１５）で切片をラベル化し、電子顕微鏡法により分析した。コントロールとして、ＰＡＧ１０およびＰＡＧ１５を入れ替え、これらも同様のラベル化パターンを示した（ａ・ｂ対ｃ・ｄ）。パネルａ・ｃからの挿入図を拡大してそれぞれパネルｂ・ｄに示す。３回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。
【図５Ｅ】ＰＦＡ固定ＭＤＡＭＣ−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞の極薄低温切開片を、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗血清／１５ｎｍ金粒子および抗ＧＦＰ抗血清／１０ｎｍ金粒子で二重にラベル化し、電子顕微鏡法により分析した。ＭＨＣクラスＩＩのラベル化はＧＦＰ−ＬＣ３陽性高電子密度多小胞区画および細胞膜上の双方で見られる。３回の実験のうちの１回の代表的な領域を示す。スケールバー：１μｍ。
【図５Ｆ】ＭＤＡＭＣ−ＧＦＰ−ＬＣ３細胞を５０μＭ  ＣＱで１０時間処理し、極薄低温切開片をＭＨＣクラスＩＩ（１０ｎｍ金）およびＧＦＰ（１５ｎｍ金）について二重にラベル化し、電子顕微鏡法により分析した。二重ラベル化した多小胞区画の多くは拡張し、膨潤して１μｍを超える直径を有しており、隙間もいくらか有しているように見える。３回の実験のうちの１回の代表的な３つの領域を示す。スケールバー：１μｍ。
【図６Ａ】それぞれＭＰ１およびＭＰ１−ＬＣ３をコードする２つのコンストラクトの概略図。
【図６Ｂ】ＭＰ１およびＭＰ１−ＬＣ３のレンチウイルスコンストラクトでＨａＣａｔ細胞系およびＭＤＡＭＣ細胞系を安定的にトランスフェクションし、抗ＭＰ１抗血清を用いたウエスタンブロットによりタンパク質の発現を分析した。アクチンブロットは等量のタンパク質ロード量を示す。
【図６Ｃ】未処理またはクロロキン処理した（＋ＣＱ）、ＭＰ１またはＭＰ１−ＬＣ３を安定発現するＨａＣａｔ細胞を、抗ＭＰ１抗血清およびＤＮＡ含量についてＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバー：１０μｍ。１回の実験の代表的な領域を示す。
【図６Ｄ】ＧＦＰ−ＬＣ３を安定発現するＭＤＡＭＣ細胞を、ＭＰ１またはＭＰ１−ＬＣ３をコードするレンチウイルスに感染させた。リソソームにおけるＧＦＰ−ＬＣ３タンパク質およびＭＰ１タンパク質の分解を阻害する目的で、細胞を５０μＭ  ＣＱで１０時間処理し、次いで抗ＭＰ１抗血清で染色し、共焦点顕微鏡法により分析した。スケールバー：１０μｍ。１回の実験の代表的な領域を示す。
【図７Ａ】クローンのＣＤ４およびＣＤ８の発現を、フローサイトメトリーにより分析した。クローン９．２６、１１．４６および１０．９はホモ接合性でＣＤ４＋ＣＤ８−であり、クローン９．２はホモ接合性でＣＤ８＋ＣＤ４−であった。
【図７Ｂ】これらによるインフルエンザＭＰ１ペプチドの認識を、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより調べた。ＭＰ１ペプチドライブラリーを、ＭＰ１のアミノ酸位置１〜５１（プールＩ）、４１〜８８（プールＩＩ）、７８〜１２８（プールＩＩＩ）、１１８〜１６３（プールＩＶ）、１５２〜２０３（プールＶ）および１９３〜２５２（プールＶＩ）をカバーする６つのサブプールに分けた。クローン９．２、９．２６および１０．９はプールＩＩに、クローン１１．４６はプールＩＩＩに、特異的に反応した。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンではなくＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン９．２が、ＨＬＡＡ２制限ＭＰ１エピトープ５８〜６６を認識した。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７Ｃ】ＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンについて、ＭＰ１のプールＩＩおよびプールＩＩＩの全てのペプチドを含む、ＭＰ１のアミノ酸配列２９〜１２８をカバーする個々のペプチドに対する認識を調べた。クローン９．２６および１０．９は、ペプチドエピトープＭＰ１６２〜７２を特異的に認識し、クローン１１．４６はエピトープ１１０３〜１１３に特異的であった。エラーバーは標準偏差を示す。
【図８Ａ】ＩＦＮγ処理標的細胞（同族ペプチドでパルスしたＨａＣａｔ、ＨａＣａｔ、またはＧＦＰ−ＬＣ３、ＭＰ１もしくはＭＰ１−ＬＣ３を発現するＨａＣａｔ）または未処理のコントロール細胞を、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を２、５および１２．５としてＭＰ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン９．２６（上パネル）、１０．９（中パネル）と、または、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を１０、２０および４０としてクローン１１．４６（下パネル）と、共培養した。ＭＰ１の外因性プロセシングを排除する目的で、ＩＦＮγ処理ＨａＣａｔ細胞を、ＨＬＡミスマッチのＭＰ１発現ＭＤＡＭＣ細胞またはＭＰ−ＬＣ３発現ＭＤＡＭＣ細胞の存在下でＴ細胞クローンとともにインキュベートした。共培養の２４時間後、１：２に希釈した培養上清中のＩＦＮγをＥＬＩＳＡにより測定した。エラーバーは標準偏差を示し、全てのＥ：Ｔ比にわたって対応のあるスチューデントのｔ検定のＰ値を示す。それぞれ２回の実験のうちの１回を示す。
【図８Ｂ】図８ＡにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイに用いた標的細胞の表面ＭＨＣクラスＩＩ染色。２回の実験のうちの１回を示す。
【図８Ｃ】ＩＦＮγ処理した、または未処理の標的細胞（同族ペプチドでパルスしたＭＤＡＭＣ、ＭＤＡＭＣ、またはＧＦＰ−ＬＣ３、ＭＰ１もしくはＭＰ１−ＬＣ３を発現するＭＤＡＭＣ）を、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を２、５および１２．５としてＭＰ１−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン９．２（上パネル）と、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を２、５および１０としてクローン１０．９（中パネル）と、標的に対するエフェクターの比（Ｅ：Ｔ）を５、１０および２０としてクローン１１．４６（下パネル）と、共培養した。１：２０に希釈した培養上清中のＩＦＮγをＥＬＩＳＡにより測定した。エラーバーは標準偏差を示す。それぞれ２回の実験のうちの１回を示す。
【図１Ａ】
2009528819.tif 000006
【図１Ｂ】
2009528819.tif 000007
【図１Ｃ】
2009528819.tif 000008
【図１Ｄ】
2009528819.tif 000009
【図１Ｅ】
2009528819.tif 000010
【図１Ｆ】
2009528819.tif 000011
【図１Ｇ】
2009528819.tif 000012
【図２】
2009528819.tif 000013
【図３Ａ】
2009528819.tif 000014
【図３Ｂ】
2009528819.tif 000015
【図３Ｃ】
2009528819.tif 000016
【図３Ｄ】
2009528819.tif 000017
【図４Ａ】
2009528819.tif 000018
【図４Ｂ】
2009528819.tif 000019
【図４Ｃ】
2009528819.tif 000020
【図５Ａ−Ｄ】
2009528819.tif 000021
【図５Ｅ】
2009528819.tif 000022
【図５Ｆ】
2009528819.tif 000023
【図６Ａ】
2009528819.tif 000024
【図６Ｃ】
2009528819.tif 000025
【図６Ｄ】
2009528819.tif 000026
【図７Ａ】
2009528819.tif 000027
【図８Ｂ】
2009528819.tif 000028
【図６Ｂ】
2009528819.tif 000029
【図７Ｂ】
2009528819.tif 000030
【図７Ｃ】
2009528819.tif 000031
【図８Ａ】
2009528819.tif 000032
【図８Ｃ】
2009528819.tif 000033
【配列表】
2009528819000001.xml
【国際調査報告】
2009528819.tif 000038
2009528819.tif 000039
2009528819.tif 000040