(57)【要約】  本発明は、シトロバクター・ブラキ由来のフィターゼに対して少なくとも74％の同一性を有するフィターゼに関して、そしてこのフィターゼに比較して、少なくとも１つの変更を含んで成る。それらのフィターゼ変異体は、修正された、好ましくは改良された性質、例えば熱安定性、温度プロフィール、pHプロフィール、比活性、動物飼料における性能、低められたプロテアーゼ感受性及び/又は修正されたグリコシル化パターンを有する。本発明はまた、それらのフィターゼをコードするDNA、それらの生成方法、及び例えば動物飼料添加剤へのその使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し配列番号３、配列番号４及び配列番号６ではない、フィターゼ。
【請求項２】
配列番号９及び図１に列挙されるその変異体ではない請求項１記載のフィターゼ。
【請求項３】
次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K、118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つを含んで成る請求項１及び２のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項４】
位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されている請求項３記載のフィターゼ。
【請求項５】
配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1H、K、R、 60P、 105E、 106A、G、 155F、 157F、 173P、 175L、 188P、 205P、 215M、 231P、 254Y、 280P、 330D、 及び/又は371Pの少なくとも１つを含んで成り；但し配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号９及び図１に列挙されるそれらの変異体ではない、フィターゼ。
【請求項６】
下記のもの：52C、 141C、 162C、 31C、 52C、 99C、 59C、 100C、 141 C/199C、 4P、 5P、 111P、 137P、 161P、 52E、 57Y、 76G、 107D、 107G、 109A、 1*、 1*/2*、 1*/2*/3*、 121T、 273L、 285G、 286Q、 299L、362K、 331K/55D、 107E、 46E、 82E、 119R、 119K、 164E、 223E、 276R、 276K、 362R、 379R、 379K、 385D、 410D、 410E、 411R、 411K、 53V、 121 D、 167Q、 196Q、 200K、 202N、 218Q、 241Q、 285N、 314N、 314G、406A、 
179K/180E/181 K/182H/183Q/184*/185*/186*、 
179K/180E/181 K/182Q/183Q/184*/185*/186*、 
179K/180E/181 K/182K/183V/184*/185*/186*、 
179K/180T/181 D/182K/183L/184*/185*/186*、 
111P/241Q、1K、 
114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L、 及び114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L
から選択された変更を含んで成る請求項１〜４のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項７】
配列番号２のフィターゼの変異体である請求項１〜６のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項８】
配列番号３のフィターゼの変異体である請求項１〜６のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項９】
配列番号４のフィターゼの変異体である請求項１〜６のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項１０】
配列番号６のフィターゼの変異体である請求項１〜６のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項１１】
配列番号９のフィターゼの変異体である請求項１〜６のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項１２】
配列番号９に関連し、そして図１に列挙されるフィターゼ変異体のいずれか１つの変異体である請求項１〜６のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項１３】
図１の個々の列に列挙される置換及び置換の組合せから選択された置換又は置換の組合せを、さらに含んで成る請求項１〜12のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項１４】
改良された熱安定性、改良されたpHプロフィール、改良された比活性、修正されたグリコシル化パターン、改良された温度プロフィール、動物飼料における改良された性能を有し、そして/又は可能性あるプロテアーゼ切断部位の変化を組込む請求項１〜13のいずれか１項記載のフィターゼ。
【請求項１５】
請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸配列。
【請求項１６】
適切な発現宿主におけるフィターゼの生成を指図する１又は複数の制御配列に操作可能的に結合される請求項15記載の核酸配列を含んで成る核酸構造体。
【請求項１７】
請求項16記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項１８】
請求項16記載の核酸構造体及び/又は請求項17記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼの生成方法であって、
（ａ）前記フィターゼを含んで成る上清液を生成するために請求項18記載の宿主細胞を栽培し；そして
（ｂ）前記フィターゼを回収することを含んで成る方法。
【請求項２０】
請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼを発現できるトランスジェニック植物又はその一部。
【請求項２１】
請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼを発現できるトランスジェニック非ヒト動物、又はその生成物又は要素。
【請求項２２】
請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼ、及び
（ａ）少なくとも１つの脂溶性ビタミン；
（ｂ）少なくとも１つの水溶性ビタミン；及び/又は
（ｃ）少なくとも１つの微量鉱物を含んで成る組成物。
【請求項２３】
次の酵素群：アミラーゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ及び/又はβ−グルカナーゼから選択された少なくとも１つの酵素をさらに含んで成る請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
動物飼料添加物である請求項22〜23のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２５】
50〜800g/kgの含有率の粗タンパク質を有し、そして請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼ、又は請求項22〜24のいずれか１項記載の組成物を含んで成る動物用飼料組成物。
【請求項２６】
請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼ又は請求項22〜24のいずれか１項記載の組成物を動物飼料に添加する、動物飼料の栄養価値を改良するための方法。
【請求項２７】
有効量の請求項25記載の飼料を動物に供給することを含んで成る、動物飼料におけるフィターゼレベルを低めるための方法。
【請求項２８】
植物性タンパク質の処理方法であって、少なくとも１つの植物性タンパク質又はタンパク質源に、請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼ又は請求項22〜24のいずれか１項記載の組成物を添加する段階を含んで成る方法。
【請求項２９】
動物飼料への；動物飼料の調製への；動物飼料の栄養価値の改良への；動物飼料におけるフィテートレベルを低めるための；植物性タンパク質の処理への；又はフィターゼ基質からのリンの遊離のためへの、請求項１〜14のいずれか１項記載のフィターゼ又は請求項22〜24のいずれか１項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列列挙の参照：
本出願は、コンピューター読み取り形での配列列挙を含む。このコンピューター読み取り形は、引用により本明細書に組込まれる。
発明の分野：
本発明は、シトロバクター・ブラキ（Citrobacter braakii）ATCC51113由来のフィターゼに対して少なくとも74％の同一性を有し、そしてこのフィターゼ（すなわち、その変異体である）に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成るフィターゼに関する。本発明はまた、それらのフィターゼをコードするDNA、それらの生成方法、及び例えば動物飼料及び動物飼料添加剤へのそれらの使用にも関する。シトロバクター・ブラキATCC51113フィターゼの成熟部分は、配列番号２として配列列挙に包含される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
背景技術：
シトロバクター・フレウンジ（Citrobacter freundii）からのphyA遺伝子の配列が、受託番号AY390262として、Zininなど. によりEMBL/GenBank/DDBJデータベースに提供されている。その対応するフィターゼアミノ酸配列は、受託番号Q676V7としてUniProt/TrEMBLデータベースに見出される。Q676V7の予測される成熟部分は、配列番号４として本発明の配列列挙に包含される。
【０００３】
WO2004/085638号は、KCCM10427として寄託された、シトロバクター・ブラキYH-15からのフィターゼのアミノ酸を、配列番号７として開示する。このアミノ酸配列の成熟部分が配列番号３として本明細書に包含される。この配列はまた、受託番号ADU50737としてデータベースGenesequpに見出される。
WO2006/037328号は、シトロバクター・ブラシATCC51113の野生型フィターゼ（すなわち、配列番号２）、及びその変異体（配列番号６として本発明の配列番号に包含される）を開示する。
【０００４】
WO2006/038062号及びWO2006/038128号の両者は、受託番号NCIMB 41247として寄託された、シトロバクター・フレウンジP3-42のフィターゼ遺伝子のアミノ酸配列を開示する。このアミノ酸配列は、配列番号９として本明細書に包含される。
修正された、好ましくは改良された性質のフィターゼを供給することが本発明の目的である。そのような性質の非制限的例は次のことである：熱安定性、温度プロフィール、pHプロフィール、比活性、動物飼料における性能、プロテアーゼ−感受性、及び/又はグリコシル化パターン。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約：
本発明は、配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し配列番号３、配列番号４及び配列番号６ではない、フィターゼに関する。
【０００６】
本発明はまた、配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1H、K、R、 60P、 105E、 106A、G、 155F、 157F、 173P、 175L、 188P、 205P、 215M、 231P、 254Y、 280P、 330D、 及び/又は371Pの少なくとも１つを含んで成り；但し配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号９及び図１に列挙されるそれらの変異体ではない、フィターゼにも関する。
本発明はまた、それらのフィターゼをコードするDNA、それらの生成方法、及び例えば動物飼料及び動物飼料添加剤へのそれらの使用にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
発明の特定の記載：
第１の観点においては、本発明は、配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し配列番号３、配列番号４及び配列番号６ではない、フィターゼに関する。
【０００８】
同一性の％は、セクション“フィターゼポリペプチド、同一性の％”に記載のようにして決定される。
位置番号は、セクション“位置番号付け”に記載のようにして、配列番号２の位置番号付けを言及する。他のフィターゼにおけるそれらの配列番号２の位置番号に対応する位置は、セクション“対応する位置番号の同定”に記載のようにして決定される。
本発明のフィターゼは、配合番号２のフィターゼの変異体であり、すなわちそれは、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成るので、配列番号２とは同一でない。
【０００９】
特定の態様においては、本発明のフィターゼは、下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成る。
【００１０】
もう１つの特定の態様においては、本発明のフィターゼは、配列番号９ではない。
さらなる特定の態様においては、本発明のフィターゼは、図１に列挙される配列番号９の変異体ではない。
【００１１】
好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つを含んで成る。
【００１２】
変更について本明細書に使用される命名法は、セクション“変更、例えば置換、欠失、挿入”に詳細に記載される。
【００１３】
好ましくは、本発明のフィターゼは、次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つを含んで成り；そして/又は位置179, 180, 181 , 182, 183, 184, 185, 及び 186におけるアミノ酸は、KEKHQ, KEKQQ, KEKKV,又はKTDKLにより置換されている。
【００１４】
もう１つの好ましい態様においては、位置179, 180, 181 , 182, 183, 184, 185及び 186におけるアミノ酸が、QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV又はKTDKLにより置換されている。
【００１５】
本発明はまた、配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1H、K、R、 60P、 105E、 106A、G、 155F、 157F、 173P、 175L、 188P、 205P、 215M、 231P、 254Y、 280P、 330D、 及び/又は371Pの少なくとも１つを含んで成り；但し配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号９及び図１に列挙されるそれらの変異体ではない、フィターゼにも関する。好ましい態様においては、フィターゼは変更1Kを含んで成る。さらなる好ましい態様においては、フィターゼは、次の変更の組合せを含んで成る：280P/282P/283P, 155F/254Y及び/又は 155F/157F/254Y。
【００１６】
本発明の好ましいフィターゼは、下記のもの：52C、 141C、 162C、 31C、 52C、 99C、 59C、 100C、 141 C/199C、 4P、 5P、 111P、 137P、 161P、 52E、 57Y、 76G、 107D、 107G、 109A、 1*、 1*/2*、 1*/2*/3*、 121T、 273L、 285G、 286Q、 299L、362K、 331K/55D、 107E、 46E、 82E、 119R、 119K、 164E、 223E、 276R、 276K、 362R、 379R、 379K、 385D、 410D、 410E、 411R、 411K、 53V、 121 D、 167Q、 196Q、 200K、 202N、 218Q、 241Q、 285N、 314N、 314G、406A、 179K/180E/181 K/182H/183Q/184*/185*/186*、 179K/180E/181 K/182Q/183Q/184*/185*/186*、 179K/180E/181 K/182K/183V/184*/1857186*、 179K/180T/181 D/182K/183L/184*/185*/186*、 111P/241Q、1K、114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L、 及び114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L
から選択された変更を含んで成る。
【００１７】
本発明のフィターゼは、いずれかの野生型又は変異フィターゼの変異体であり得る。特定の態様においては、それは、配列番号２，３，４，６，９のフィターゼの変異体、又は配列番号９に関連し、そして図１に列挙されるフィターゼ変異体のいずれか１つの変異体である。
本発明のフィターゼは、図１の個々の列に列挙される変更（置換）及び変更（置換）の組合せから選択された変更（置換）又は変更（置換）の組合せを、さらに含んで成る。
【００１８】
配列番号２のフィターゼの特に好ましい変異体は、次のものである：R339D, N4P, G5P, Q1 1 1 P, E1*, E1*/E2*, E1*/E2*/Q3*, M273L及び N286K；及びそれらのいずれかの組合せ；並びに配列番号３，４及び６のその対応する変異体。
本発明の特に好ましいフィターゼは、次の変更の少なくとも１つを含んで成る：339D, 4P, 5P, 111 P, 1*, 1*/2*, 1*/2*/3*, 273L及び/又は286K。
【００１９】
本発明はまた、配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更の少なくとも１つを含んで成るフィターゼにも関する：
(i) 141 C/199C、 91 C/46C、 52C/99C、 31 C/176C、 31 C/177C、 59C/100C及び/又は 162C/247C; 
(ii) 41P、 91 P、 136P、 137P、 154P、 161 P、 355P、 1 11 P、240P、282P、 283P、 284P、289P、4P1及び/又は 5P; 
(iii) 52E、 551、 57Y、 104A/105F、 107D、G、 109A、G、 76G、 84Y、 121T、362K、 273L、Q、 285G、R、286K、Q、 294T、 299L、 331K/55D及び/又は351 Y;
(iv) 1*、1*/2*又は1*/2*/3*;
(v) K179、 T180、 T181、 E182、 K183、 S184、 T185及び K186 が、QADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV1又はKTDKLにより置換されている;
(vi) 119R、K及び/又は411 R、K;
(vii) 107E及び/又は164E、D;
(viii) 362R、K、276R、K、 379R、K、 409D、E、 223E、 385D、 46D、E、410D、E及び/又は 82E;
【００２０】
(ix) 218Q、 324N、 200R、K、 121D、 196Q、 202N、 406A、 167Q、 53V、Q、 241Q、314N、G、 239Q及び/又は285N;
(x) 114H/115Q/116E/117K/118M/119G/120T/121 M/122D/123P/124T、
114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121 V/122D/123S/124L、
114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120K/121 M/122D/123P/124V、
114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L1、 114H/115Q/116Q/117D/118I/119K/120Q/121A/122D/123P/124L、
114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L又は
114N/115Q/116A/117D/118Lyi 19K/120K/121 T/122D/123P/124L;
(xi) 31T1 74A1 171T1 203T1 281H1 316D及び/又は308A; 及び/又は
(xii) 339D。
【００２１】
変異体を調製するための方法：
C. ブラキATCC51113フィターゼの構造体は、E. コリAppAフィターゼの構造体を、鋳型として用いての相同モデリングにより構築された（Protein Data Bank id.: 1DKO; Lim など, Nat. Struct. Biol. (2000), vol. 2, pp. 108-113）。
構造体は、分子力学（MD）シュミレーション及び静電計算にゆだねられた。推定上のジスルフィド橋及びプロリンについての位置、及び種々の所望する酵素性質に関して、実質的に重要な他の位置がまた同定された。最終的に、推定上のグリコシル化部位（MXT又はNXSの延長）が同定された。
【００２２】
すべてのそれらの提案は、高温端での特定の強調を伴って、熱安定性質に関して、モデル構造体の骨格及びシュミレーション結果内で評価された。
その対応するフィターゼ変異体は、当業界において知られている方法により調製され、そして実験部分に記載されるようにして試験された。
【００２３】
フィターゼポリペプチド、同一性の％：
本発明においては、フィターゼは、フィターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、（１）myo−イノシトール及び/又は（２）その一、二、三、四及び/又は五リン酸、及び（３）の無機リン酸へのフィテート（myo−イノシトール六リン酸）の加水分解を触媒する酵素である。
本明細書においては、用語フィターゼ基質とは、フィチン酸及びフィテート（フィチン酸の塩）、並びに上記（２）下に列挙されるホスフェートを包含する。
【００２４】
インターネット（http://www.expasy.ch/enzyme/）でのENZYMEサイトは、酵素の命名法に関する情報の貯蔵所である。それは主に、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB)の推薦に基づかれており、そしてそれは、EC (Enzyme Commission) 番号が提供されている、個々のタイプの特徴づけられた酵素を記載する（Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28: 304-305）。また、ハンドブック（Enzyme Nomenclature from NC-IUBMB, 1992）も参照のこと。
【００２５】
酵素部位によれば、３種の異なった型のフィターゼが知られている：いわゆる３−フィターゼ（他の名称、１−フィターゼ；myo−イノシトール六リン酸、３−ホスホヒドラーゼ、EC3.1.3.8）、いわゆる４−フィターゼ（他の名称、６−フィターゼ、１L-番号付けシステムに基づかれ、そして１D-番号付けには基づかれない、EC3.1.3.26）及びいわゆる５−フィターゼ（EC3.1.3.72)。本発明に関しては、すべての３種のタイプが、フィターゼの定義に包含される。
【００２６】
特定の態様においては、本発明のフィターゼは、E. コリpH2.5酸性ホスファターゼ（遺伝子appA）及び菌類フィターゼ、例えばアスペルギラス・アワモリフィターゼA及びB（EC: 3. 1. 3. 8）(遺伝子phyA及びphyB)を包含する、酸性ヒスチジンホスファターゼのファミリーに属する。ヒスチジン酸性ホスファターゼは、配列類似性の２つの領域を共有し、それぞれは保存されたヒスチジン残基近くに集中した。それらの２つのヒスチジンは、酵素の触媒機構に関与すると思われる。第１のヒスチジンは、N−末端セクションに位置し、そしてリン−ヒスチジン中間体を形成し、そして２つのヒスチジンはC-末端セクションに位置し、そしてたぶん、プロトン供給体として作用する。
【００２７】
さらなる特定の態様においては、本発明のフィターゼは、保存された活性部位モチーフ、すなわちR-H-G-X-R-X-Pを有し、ここでXはいずれかのアミノ酸を示す（配列番号２，３，４，６のアミノ酸、及び配列番号９のアミノ酸38−44を参照のこと）。好ましい態様においては、保存された活性部位モチーフは、R-H-G-V-R-A-Pであり、すなわちアミノ酸16−22（配列番号２の参照により）はRHGVRAPである。
【００２８】
本発明に関しては、フィターゼ活性は、FYTの単位で決定され、１FYTは次の条件下で、１分当たり１μモルの無機オルトホスフェートを遊離する酵素の量である：pH5.5; 温度37℃；0.0050モル/lの濃度での基質、フィチン酸ナトリウム（C6H6O24P6Na12）。適切なフィターゼアッセイは、WO00/26569号の例１に記載されるFYT及びFTUアッセイである。FTUは飼料及びプレミックスにおけるフィターゼ活性を決定するためである。フィターゼ活性はまた、例１のアッセイ（“ホスファターゼ活性の決定”又は“フィターゼ活性の決定”）を用いて決定され得る。
【００２９】
特定の態様においては、本発明のフィターゼは単離される。用語“単離された”とは、本明細書において使用される場合、SDS−PAGAにより決定される場合、少なくとも20％純粋、好ましくは少なくとも40％純粋、より好ましくは少なくとも60％純粋、さらにより好ましくは少なくとも80％純粋、最も好ましくは少なくとも90％純粋、及びさらに最も好ましくは少なくとも95％純粋であるポリペプチドを言及する。特に、好ましくは、ポリペプチドは、“実質的に純粋な形で”存在し、すなわちポリペプチド調製物は、天然において結合される他のポリペプチドを実質的に有さない。これは、例えば良く知られた組換え方法により、又は従来の精製方法によりポリペプチドを調製することにより達成され得る。
【００３０】
本発明のためには、２種のアミノ酸配列は、EMBOSSパッケージ (http://emboss.org)バージョン2.8.0からのNeedleプログラムを用いることにより決定される。このNeedle−プログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453に記載される世界的一列整列アルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップ開放ペナルティーは10であり、そしてギャップ延長ペナルティーは0.5である。
【００３１】
本発明のアミノ酸配列（“発明の配列”）と、請求項に言及されるアミノ酸配列（配列番号２）との間の同一性の程度は、“発明の配列”の長さ、又はいずれにせよ、最も短い配列番号２の長さにより割り算された、２種の配列一列整列での正確な適合の数として計算される。結果は、％同一性で表される。
【００３２】
正確な適合は、“発明の配列”及び配列番号２がオーバーラップの同じ位置において同一のアミノ酸残基を有する場合、発生する（下記一列整列の例においては、これは“|”により表される）。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号２のアミノ酸１−411の長さは411である）。
【００３３】
例13は、配列番号２のフィターゼ及び配列番号９のフィターゼの一列整列の例であり、そしてその例は、それらの２種の主鎖間の％同一性を、いかにして計算するかを示す。
下記純粋に推定的な一列整列の例においては、オーバーラップは、配列１のアミノ酸配列“HTWGER-NL”又は配列番号２のアミノ酸配列“NGWGEDANL”である。この例においては、ギャップは、“−”により示される。
推定的な一列整列の例：
【化１】
2009532043.tif 000002
【００３４】
特定の態様においては、配列番号２に対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の％は、i)２種のアミノ酸を、BLOSUM62置換マトリックス、10のギャップ開放ペナルティー及び0.5のギャップ延長ペナルティーを伴って、Needleプログラムを用いて、一列整列し；ii)前記一列整列における正確な適合の数を計数し；iii)２種のアミノ酸配列の最短の長さにより前記正確な適合の数を割り算し；そしてiv) iii)の割り算の結果を％に転換することにより決定される。
【００３５】
上記仮定的例においては、正確な適合の数は６であり、２種のアミノ酸配列の最短の長さは12であり、従って、同一性の％は50％である。
【００３６】
本発明のフィターゼの特定の態様においては、配列番号２に対する同一性の程度は、少なくとも75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%又は少なくとも99%である。さらなる特定の態様においては、同一性の程度は、少なくとも98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%又は少なくとも99.9%である。他の態様においては、同一性の程度は少なくとも70％、71％、72％又は少なくとも73％である。
【００３７】
さらに特定の態様においては、本発明のフィターゼは、配列番号２に比較して、1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10以下の変更；配列番号２に比較して、11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19又は20以下の変更；配列番号２に比較して、21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29又は30以下の変更；配列番号２に比較して、31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39又は40以下の変更；配列番号２に比較して、41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49又は50以下の変更；配列番号２に比較して、51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60以下の変更；配列番号２に比較して、61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69又は70以下の変更；配列番号２に比較して、71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79又は80以下の変更；配列番号２に比較して、81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89又は90以下の変更；配列番号２に比較して、91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99又は100以下の変更；配列番号２に比較して、101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109又は110以下の変更；配列番号２に比較して、111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119又は120以下の変更；配列番号２に比較して、121 , 122, 123又は124以下の変更を有する。
【００３８】
位置番号付け：
アミノ酸位置を定義するための本明細書において使用される命名法は、シトロバクター・ブラキATCC51113由来のフィターゼのアミノ酸配列に基づかれ、前記成熟配列は、配列番号２として列挙する配列（配列番号２のアミノ酸１−411）で与えられる。従って、本発明においては、位置を番号付けるための基本は、E1で出発し、E411で終結する配列番号２である。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語“成熟”部分（又は配列）とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、その遺伝子装置の一部として含む細胞に分泌されるポリペプチドのその部分を言及する。換言すれば、成熟ポリペプチド部分は、シグナルペプチド部分及び存在する場合、プロペプチド部分が切断された後、残存するポリペプチドのその部分を言及する。シグナルペプチドは、当業界において知られているプログラム（例えば、SignalP）により予測され得る。配列番号２の予測されるシグナルペプチド部分は、配列番号７によりコードされる、配列番号８として列挙する本発明の配列に含まれる。配列番号２は、予測される成熟部分である。一般的に、酵素の成熟部分の最初のアミノ酸は、精製された酵素のN−末端配列決定により測定され得る。シグナルペプチド部分と成熟部分との間の差異は、プロペプチドの存在によるべきである。
【００４０】
変更、例えば置換、欠失、挿入：
フィターゼ変異体は、鋳型（すなわち、対照又は比較アミノ酸配列、例えば配列番号２）に対して種々の型の変更を含んで成ることができる。アミノ酸は他のアミノ酸により置換され得；アミノ酸は欠失され得る；アミノ酸は挿入され得；そしていずれかの数のそのような変更の組合せが存在する。本発明においては、用語“挿入”とはまたN−及び/又はC-末端延長も包含する。
【００４１】
単一の変更のために本明細書において使用される一般的命名法は、次の通りである：XDcY、ここで“X”及び“Y”は独立して1文字アミノ酸コード、又は“＊”（アミノ酸の欠失）を表し、“D”は番号を表し、そして“c”はアルファベット順のカウンター（a, b, c, 等）を表す（単に挿入において存在する）。この命名法を種々の型の変更に適用する純粋に仮定的な例を記載する下記表１を参照のこと。
【００４２】
【表１】
2009532043.tif 000003
【００４３】
上記説明のように、位置番号（“D”）は、配列番号２の最初のアミノ酸残基から計数される。
【００４４】
同じ配列におけるいくつかの変更は“/”（スラッシュ）により分離され、例えば表示“1*/2*/3*”とは、位置番号１，２及び３でのアミノ酸がすべて欠失されていることを意味し、そして表示“104A/105F”とは、位置番号104でのアミノ酸がAにより置換され、そして位置番号105でのアミノ酸がFにより置換されていることを意味する。
他の変異は、“’”（コンマ）により分離され、例えば表示“119R、K”とは、位置119でのアミノ酸がR又はKにより置換されることを意味する。
【００４５】
種々の他の可能性ある列挙において本明細書に使用されるコンマは、それらが通常、文法的に使用されることを意味し、すなわちしばしば及び/又は例えば“53V, Q, 121D, 及び/又は167A”における最初のコンマは二者択一（V又はQ）を表し、そして次の２つのコンマは、及び/又はの選択肢：53V又はQ、及び/又は121D、及び/又は167Qとして解釈されるべきである。
【００４６】
本明細書においては、“少なくとも１つ”（例えば、変更）とは、１又は複数の、例えば１，２，３，４，５，６，７，８，９又は10個の変更；又は12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28又は30個の変更；及び125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190又は200の最大数の変更を意味する。しかしながら、本発明のフィターゼ変異体は、配列番号２に対して少なくとも74％同一であるべきであり、この％は上記のようにして決定される。
置換するか又は延長するかのいずれの表示も伴わないでの置換又は延長は、いずれかの天然の又は非天然のアミノ酸の挿入を言及し、但し鋳型におけるこの位置を市販するアミノ酸を除く。
例13はさらに、この命名法をいかにして適用するかを例示する。
【００４７】
対応する位置番号の同定：
上記に説明されるように、シトロバクター・ブラキATCC51113（配列番号２）の成熟フィターゼは、位置番号付けのために及びそれにより、また命名法のために標準として使用される。
【００４８】
もう１つのフィターゼ、特に本発明のフィターゼ変異体に関して、配列番号２における位置Dに対応する位置は、標記のセクション“フィターゼポリペプチド、同一性の％”に特定されるように、２種の配列を一列整列することにより見出される。この一列整列から、配列番号２の位置Dに対応する本発明の配列における位置が明白且つ明瞭に同定され得る（一列整列におけるお互い上部の２つの位置）。
【００４９】
例13は、配列番号２のフィターゼ及び配列番号９のフィターゼの一列整列の例であり、そしてこの例は、それらの２種の主鎖における対応する位置がいかにして同定されるかを示す。
第３縦列に、２種の配列の多くの一列整列を包含する上記表１に由来する、いくつかの追加の、純粋に仮定的な例が包含される：
【００５０】
表１の第１横列における第３セルを考慮し、上記配列は鋳型であり、下部配列は変異体である。位置番号80は、鋳型におけるアミノ酸残基Gを言及する。アミノ酸Aは、変異体におけるその対応する位置を支配する。従って、置換はG80Aとして表される。
表の第２横列における第３セルを考慮して、上部配列は再び鋳型を表し、そして下部配列は変異体である。位置番号80は再び、鋳型におけるアミノ酸残基Gを言及する。変異体は２つの挿入、すなわち鋳型においてG80の後、及びV81の前にTYを有する。もちろんT及びYは変異体アミノ酸配列においてそれら自体の“真の”位置番号を有するが、本発明のために、本発明者は鋳型位置番号を常に言及し、そして従って、T及びYはそれぞれ位置番号80a及び80bに存在すると言われる。
【００５１】
最終的に、表１の最後の縦列における第３セルを考慮して、位置番号275は、鋳型の最後のアミノ酸を言及する。STのC−末端延長は、再びもちろん、それらは変異体アミノ酸配列にそれら自体の“真の”位置番号を有するが、それぞれ位置番号275a及び275bに存在すると言われる。
【００５２】
修正された性質、参照フィターゼ：
特定の態様においては、本発明にフィターゼは修正された、好ましくは改良された性質を有する。用語“修正された”及び“改良された”とは、もう１つのフィターゼとの比較を包含する。そのような他の、参照の又は比較フィターゼの例は、配列番号３及び/又は４である。参照フィターゼのさらなる例は、配列番号２及び/又は６である。参照フィターゼのさらなる例は、配列番号９及び図１に開示されるその変異体であり得る。
【００５３】
修正され、好ましくは改良される性質の非制限例は次のことである：熱安定性、pHプロフィール、比活性、動物飼料における性能、プロテアーゼ−感受性及び/又はグリコシル化パターン。本発明のフィターゼはまた、修正された、好ましくは改良された温度プロフィールを有し、そして/又はそれは実質的なプロテアーゼ切断部位の変化を組込むことができる。
【００５４】
熱安定性：
熱安定性又は温度安定性は、“温度安定性の決定”のセクション下で例１に記載のようにして決定され得る。従って、好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、対照フィターゼの残留活性よりも高い残留活性を有し、ここで残留活性は次の通りにして決定される：発酵上清液が２つの部分に分けられ、１つの部分は所望する高温で30分間インキュベートされ、そして他の部分は、5℃で30分間インキュベートされ、これに続いて、両者の活性が37℃及びpH5.5でｐ−ニトロフェニルホスフェート上で決定され、そして高温でインキュベートされたサンプルの活性が、5℃でインキュベートされた同じサンプルの活性により割算される。
【００５５】
好ましい高温は50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 8O℃又は 85℃である。所望により、酵素含有サンプルは、0.1MのNaAc（pH5.5）に希釈され得る。本発明のフィターゼの残留活性は好ましくは、対照フィターゼの残留活性の少なくとも105％、又は少なくとも110％、120％、130％、140％、150％である。さらなる態様においては、本発明のフィターゼの残留活性は、対照フィターゼの残留活性の少なくとも200％、又は少なくとも250％、300％、400％又は少なくとも500％である。さらなる態様においては、本発明にフィターゼの残留活性は、対照フィターゼの残留活性の少なくとも2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 10x, 15x, 2Ox又は少なくとも25x倍である。
【００５６】
熱安定性はまた、例５に記載のようにして決定され得る。従って、好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、対照フィターゼの残留活性よりも高い残留活性を有し、ここで残留活性は次の通りにして決定される：発酵上清液が２つの部分に分けられ、１つの部分は所望する50℃で30分間インキュベートされ、そして他の部分は、5℃で30分間インキュベートされ、これに続いて、両者の活性が37℃及びpH5.5でｐ−ニトロフェニルホスフェート上で決定され、そして高温でインキュベートされたサンプルの活性が、5℃でインキュベートされた同じサンプルの活性により割算される。
【００５７】
所望により、酵素含有サンプルは、0.1MのNaAc（pH5.5）に希釈され得る。本発明にフィターゼの残留活性は、配列番号３のフィターゼの残留活性の少なくとも2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 10x, 15x, 2Ox又は少なくとも25x倍である。本発明のフィターゼの残留活性は好ましくは、配列番号３のフィターゼの残留活性の少なくとも105％、又は少なくとも110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%又は少なくとも200%である。次の置換は、それらが、配列番号３のフィターゼ及び配列番号２のフィターゼに比較して、熱安定性を改良するので、特に好ましい（表３を参照のこと）：4P、 5P、 111 P、 1*、1*/2*、1*/2*/3*、273L及び/又は286Q。
【００５８】
熱安定性はまた、例８に記載のようにして決定され得る。従って、好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、対照フィターゼの残留活性よりも高い残留活性を有し、ここで残留活性は次の通りにして決定される：発酵上清液が２つの部分に分けられ、１つの部分は所望する60℃で30分間インキュベートされ、そして他の部分は、5℃で30分間インキュベートされ、これに続いて、両者の活性が37℃及びpH5.5でｐ−ニトロフェニルホスフェート上で決定され、そして高温でインキュベートされたサンプルの活性が、5℃でインキュベートされた同じサンプルの活性により割算される。所望により、酵素含有サンプルは、任意には0.005％のTween-20を含む、0.1MのNaAc（pH5.5）に希釈され得る。本発明にフィターゼ及び対照フィターゼは、バチルス・サブチリス宿主下部において発現され得る。
【００５９】
その宿主下部は、500mlの振盪フラスコにおける100mlのPS1培地（100g/lのスクロース、40g/lの大豆フレーク、10g/lのNa2HPO4・12H2O, 0.1ml/lのDowfax63N10（Dow））において30℃で300rpmで４日間、増殖され得る。本発明のフィターゼの在留活性は好ましくは、配列番号２の対照フィターゼの残留活性の少なくとも32％、又は少なくとも34％、36％、38％、又は少なくとも40％である。より好ましくは、本発明のフィターゼの在留活性は好ましくは、配列番号２の対照フィターゼの残留活性の少なくとも50%、又は少なくとも60%, 70%, 80%, 90%又は少なくとも100%である。さらにより好ましくは、本発明のフィターゼの在留活性は好ましくは、配列番号２の対照フィターゼの残留活性の少なくとも120%, 140%, 160%, 180%又は少なくとも200%である。最も好ましくは、本発明のフィターゼの在留活性は好ましくは、配列番号２の対照フィターゼの残留活性の少なくとも2x、又は少なくとも3x, 4x又は少なくとも5x倍である。次の置換が特に好ましい（表５を参照のこと）：
【００６０】
(i)409E、136P; 
(ii) 411K、 331K/55D、 167Q、 179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*、 107E; 
(iii) 196Q、 276R、 285G、 299L、 200K;
(iv) 119R、121D、 107D、 179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*;
(v) 314N、 161P、 410D、 141 C、179K/180E/181 K/182Q/183Q/184*/185*/186*、285N;
(vi) 164E、 411R、52C、 137P、 314G;
(vii) 1K、1*/2*/3*、121 T、 406A、 82E、 109A; 
【００６１】
(iix) 5P、57Y、 379R、 1*/2*; 
(ix) 410E、 1*、 119K、52E; 
(x) 4P、 362K、 202N、 276K、 385D;
(xi) 111 P/241 Q、 162C、 179K/180E/181 K/182K/183V/184*/185*/186*、 241 Q; 
(xii) 223E、286Q、 107G、 114T/115Q/116A/117D/ 118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L、 379K、 273L;
(xiii) 31 C、 53V、 59C/100C;
(xiv) 46E、111 P、 114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L、76G、 362R;
(xv) 141 C/199C、 52C/99C。
【００６２】
熱安定性はまた、例９に記載のようにして、すなわち精製されたフィターゼタンパク質の変性温度Tdを決定するためのDSC測定を用いても決定され得る。Tdは、タンパク質の熱安定性の表示である：Tdが高いほど、熱安定性が高い。従って、好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、対照フィターゼのTdよりも高いTdを有し、ここで20mMの酢酸ナトリウムpH4.0における透析（好ましくは、２〜３時間の段階、続いて一晩の段階において）、続いての0.45μmの濾過、及び20mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）において20〜90℃で、90℃/時の走査速度での示差走査熱量法を用いて、透析緩衝液による、約２の吸光度単位（A280）に対応するタンパク質濃度への希釈の後、Tdが精製されたフィターゼサンプル（好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、少なくとも95％の純度を有する）に対して決定される。
【００６３】
好ましい態様においては、本発明のフィターゼのTdは、配列番号４のフィターゼのTdよりも高く、少なくとも101％、又は少なくとも102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、又は少なくとも110％である。さらにより好ましくは、本発明のフィターゼのTdは、配列番号４のフィターゼのTdの少なくとも120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%又は少なくとも190%である。次の置換が特に好ましい（表６を参照のこと）：362K、362R、111P及び/又は273L。さらに特定の態様においては、本発明の熱安定性フィターゼは、例２に記載されるように示差走査熱量法（DSC）（すなわち、20mMの酢酸ナトリウム、pH4.0において）を用いて決定される場合、少なくとも50℃の融点Tm（又は変性温度Td）を有する。
【００６４】
さらなる特定の態様においては、Tmは少なくとも51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 62.5. 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99又は少なくとも100℃である。DSC測定はまた、例１（“DSC測定”）又は例２（“DSCによる熱安定性”）に記載のようにして行われ得る。
【００６５】
熱安定性はまた、例12に記載しても決定され得る。従って、好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、70℃及びpH7.0での60分間のインキュベーションの後、同じ手段で処理された対照フィターゼの残留活性に比較して、改良された残留活性を有し、ここで前記残留活性は、インキュベーションの前（ゼロ分で）見出される活性に対して個々のフィターゼについて計算される。残留活性は好ましくは、pH5.5及び37℃でフィチン酸ナトリウムに基づいて測定される。インキュベーションは好ましくは、0.1Mの酢酸ナトリウム（pH4.0）において行われる。
【００６６】
フィターゼは好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、少なくとも95％の純度に精製される。好ましいフィターゼ活性アッセイ緩衝液は、0.25Mの酢酸ナトリウム（pH5.5）である。この方法を用いる場合、本発明のフィターゼの残留活性は好ましくは、対照フィターゼの残留活性の少なくとも105％、より好ましくは少なくとも110%, 115%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%又は少なくとも200%である。他方では、ゼロ分での活性に対する残留活性は好ましくは、少なくとも31％又は少なくとも32％である。改良された熱安定性を提供する次の置換が好ましい（表９を参照のこと）：273L、46E、362R及び/又は53V。
【００６７】
特定の態様においては、本発明のフィターゼ変異体は、対照フィターゼよりも熱安定性であり、ここで熱安定性は、上記４種の試験のいずれかを用いて決定される（約１，５，８，９又は12に基づく）。
特定の態様においては、改良された熱安定性は、配列番号２のフィターゼの次の変異体から予測される（個々のグループ内での優先の順）：
(i) K141C/V199C、Q91C/W46C、G52C/A99C、N31C/E176C、N31C/T177C、G59C/F100C、S162C/S247C;
(ii) D41 P、Q91 P、N136P、T137P、L154P、S161P、T355P、Q111P、K240P、G282P、T283P,T284P、G289P、N4P、G5P;
(iii) G52E、V55I、E57Y、L104A/A105F、K107D,G、Q109A,G、T76G、A84Y、N121T、I362K、M273L、Q、E285G、R、N286Q、V294T、I299L、E331K/55D、F351Y; 
【００６８】
(iv) E1*、E1*/E2*、E1*/E2*/Q3*;
(v) 例えばQADKP、GEDKP、NGISA、IAGKS、KEKHQ、KEKQQ、KEKKV、KTDKLから選択された短いループによるC178 とC187との間に含まれるループの置換;
(vi) E119R、K、E411R、K;
(vii) K107E、R164E、D; 
(iix) I362R、K、T276R、K、I379R、K、V409D、E、Q223E、N385D、W46D、E、T410D、E、Q82E；
(ix) 例えばHQEKMGTMDPT、HQQDIKQVDSL、HQPEIGKMDPV、TQADTSSPDPL、HQQDIKQADPL、TQTDTSSPDPL、NQADLKKTDPL から選択されたループによる、活性部位と直面する残基114 と残基124 との間のループ(YQKDEEKNDPL)の置換;
(x) R339D。
【００６９】
温度プロフィール：
本発明のフィターゼが対照フィターゼに比較して修正された温度プロフィールを有するか、否かにかかわらず、例10に記載のようにして決定され得る。従って、特定の態様においては、本発明のフィターゼは、対照フィターゼに比較して、修正された温度プロフィールを有し、ここで前記温度プロフィールは、20〜90℃の温度範囲（10℃段階）でpH5.5でフィチン酸ナトリウムに基づく温度の関数としてのフィターゼ活性として決定される。好ましい緩衝液は、0.25Mの酢酸ナトリウムpH5.5である。個々の温度での活性は好ましくは、最適温度での値に対して標準化された相対活性（％）として示される。最適温度は、活性が最高である、試験された温度（すなわち、10℃の上昇を有するそれらの温度）内のその温度である。
【００７０】
好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、70℃で少なくとも19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%又は少なくとも25%の相対活性を有する。上記に説明されたように、これは、最適温度での活性に対して相対的である。より好ましくは、本発明のフィターゼは、70℃で少なくとも26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%又は少なくとも32%の相対活性を有する。修正された温度プロフィール（70℃で高い相対活性の形で）を提供する好ましい置換は次のものである（表７を参照のこと）：57Y, 76G, 107G, 273L, 362K, 46E, 362R, 53V及び/又は241 Q。70℃でのそれらの相対活性は、配列番号３及び４の対照フィターゼに比較して、及びいくつかの場合（57Y, 76G, 107G, 273L, 362K, 362R及び/又は53V）、配列番号２の対照フィターゼに比較して、より高い。
【００７１】
pHプロフィール：
本発明のフィターゼが、対照フィターゼに比較して、修正されたpHプロフィールを有するか、否かにかかわらず、例11に記載のようにして決定され得る。従って、特定の態様においては、本発明のフィターゼは、対照プロフィールに比較して、修正されたpHプロフィールを有し、ここでpHプロフィールは、2.0〜7.5のpHのpH範囲（0.5のpH単位段階）で37℃でフィチン酸ナトリウムに基づくpHの関数としてのフィターゼ活性として決定される。好ましい緩衝液は、50mMのグリシン、50mMの酢酸及び50mMのビス−トリスのカクテルである。もう１つの好ましい緩衝液は、0.25Mの酢酸ナトリウムである。個々のpHでの活性は好ましくは、最適pHで野値に対して標準化された相対活性（％）として示される。
【００７２】
pH曲線（pHの関数としての相対活性）がより高いか又はより低いpHに移行される修正されたpHプロフィールのもう１つの例が存在する。配列番号２，３又は４の対照フィターゼに比較して、より高いpHの方への0.5pHの単位の移行を提供する好ましい置換は次のものである（表８を参照のこと）；46E、及び/又は218Q。
【００７３】
最適pHが上方又は下方の方向に変えられる、修正されたpHプロフィールのもう１つの例が存在する。配列番号２，３及び４に比較して、低い最適pHを提供する好ましい置換は次のものである（表８を参照のこと）：46E、121D及び/又は200K。配列番号２，３及び４に比較して、より高い最適pHを提供する好ましい置換は次のものである（表８を参照のこと）：218Q及び/又は241Q。
【００７４】
修正されたpHプロフィールはまた、例１に記載のようにして（“修正されたpHプロフィール：pH3.5/5.5活性比の決定”）、すなわちpH3.5及び5.5でホスファターゼ活性を比較することにより決定され得る。他方では、ph3.5での活性は、pH4.0, 4.5又は5.0での活性に比較され得る。さらなる他の態様においては、フィターゼ活性が、ホスファターゼ活性の代わりに、比較される。
【００７５】
特定の態様においては、本発明のフィターゼは、対照フィターゼに比較して、修正されたpHプロフィールを有する。より特定には、pHプロフィールは、3.5〜5.5のpH範囲で修正される。さらにより特定には、pH4.0, 4.5, 5.0及び/又は5.5での活性は、pH−最適（pH3.5）での活性の少なくとも50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は少なくとも 95%のレベルで存在する。
【００７６】
ポリペプチドのpHプロフィール及びpH−最適性は、予定された濃度及び固定されたインキュベーション温度での基質を用いて、それを種々のpH値でインキュベートすることにより決定され得る。pHプロフィールは、フィターゼ活性対pHのグラフ表示である。特定の態様においては、例１のホスファターゼ又はフィターゼアッセイが使用され、例えば基質は5mMのフィチン酸ナトリウムであり、反応温度は37℃であり、そして活性は、種々のpH値、例えばpH2−12で決定され、ここでpH5.5の酢酸緩衝液が適切な緩衝液により置換される。
【００７７】
適切な緩衝液の例は、0.1Mのグリシン/HCl（pH2.0−3.5）、0.1MのNaAc/Ac（pH4.0−5.0）、0.1Mのビス−トリス/HCl（pH5.5−6.5）、0.1Mのトリス/HCl（pH7.0）である。緩衝液の他の例は、100mMの琥珀酸、100mMのHEPES、100mMのCHES、100mMのCABS（HCl又はNaOHによりpH値2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0及び 12.0に調節されている）である。
【００７８】
特定の態様においては、修正されたpHプロフィールは、配列番号２のフィターゼの次の変異体から予測される（個々のグループ内での選択肢の順）：
（i）E218Q、 D324N、 T200R、K、 N121D、 E196Q、 D202N、 E406A、 E167Q、 E53V、Q、 E241Q、 D314N、G、 E239Q、 E285N；
（ii）活性部位と直面する残基114と124との間のループ（YQKDEEKNDPL）の、例えばHQEKMGTMDPT、 HQQDIKQVDSL、 HQPEIGKMDPV、 TQADTSSPDPL、 HQQDIKQADPL、 TQTDTSSPDPL、 NQADLKKTDPLから選択されたループによる置換。
【００７９】
比活性：
特定の態様においては、本発明にフィターゼは、対照フィターゼに対して改良された比活性を有する。より特定には、本発明のフィターゼの比活性は、同じ方法により決定される対照フィターゼの比活性に対して少なくとも105％である。さらなる特定の態様においは、相対的比活性は、同じ方法により決定される場合、対照フィターゼの比活性に対して、少なくとも110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240,260, 280, 300, 350又はさらに400%である。
【００８０】
他においては、用語、高い比活性とは、少なくとも200FYT/mg酵素タンパク質（EP）の比活性を言及する。特定の態様においては、比活性は少なくとも300,400, 500,600, 700,800, 900,1000, 1100,1200, 1300,1400, 1500,1600, 1700,1800, 1900,2000, 2100,2200, 2300,2400, 2500,2600, 2700,2800, 2900又は3000FYT/mgEPである。
【００８１】
比活性は、高く精製されたサンプルに対して測定される（SDSポリアクリルアミドゲルはわずか１種の成分の存在を示す）。酵素タンパク質濃度は、例１に記載のようにして、アミノ酸分析及びFYT単位でのフィターゼ活性により決定され得る。比活性は問題の特定のフィターゼ変異体の特徴であり、そしてそれは、mgフィターゼ変異体酵素タンパク質当たりFYT単位で測定されるフィターゼ活性として計算される。さらなる詳細については例７を参照のこと。
【００８２】
特定の態様においては、修正された比活性は、配列番号２のフィターゼの次の変異体から予測され、ここで活性部位と直面する残基114と124との間のループ（YQKDEEKNDPL）が、例えばHQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTSSPDPL,HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPLから選択されたループにより置換されている。
【００８３】
動物飼料における性能：
特定の態様においては、本発明のフィターゼは、対照フィターゼに比較して、動物飼料における改良された性能を有する。動物飼料における性能は、例６のインビトロモデルにより決定され得る。従って、好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、動物飼料において改良された性能を有し、ここで前記性能は、30％大豆ミール及び70％トウモロコシ、飼料1kg当たり5gのカルシウムの濃度まで添加されたCaCl2から構成される飼料を調製し；40℃及びpH3.0で30分間、それらをプレインキュベートし、続いて前記サンプルを、40℃及びpH3.0で60分間、続いてpH4.0で30分間インキュベートし；反応を停止し；0.5Mの最終濃度へのHClの添加、及び40℃で２時間のインキュベーション、続く１サイクルの凍結−融解及び40℃での１時間のインキュベーションによりフィチン酸及びイノシトール−リン酸を抽出し；フィチン酸及びイノシトールリン酸を、高性能イオンクロマトグラフィーにより分離し；残留フィチン酸リン酸（IP6-P）の量を測定し；フィターゼ処理されたブランクサンプルをフィターゼ処理されていないブランクサンプルとの間の残留IP6−Pの差異を計算し（この差異は分解されたIP6-Pである）；そして対照フィターゼ（配列番号３及び４有するフィターゼ）の分解されたIP6-Pに対する本発明のフィターゼの分解されたIP6-Pを表すことにより、インビトロモデルにおいて決定される。
【００８４】
本発明のフィターゼ及び対照フィターゼはもちろん、好ましくはフィターゼ活性単位（FYT）に基づいて、同じ量で調合される。好ましい投与量は、125FYT/kg飼料である。もう１つの好ましい投与量は、250FYT/kg飼料である。フィターゼは、精製されたフィターゼの形で、又は発酵上清液の形で調合され得る。精製されたフィターゼは好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、少なくとも95％の純度を有する。
【００８５】
好ましい態様においては、対照フィターゼの分解されたIP6-Pの値に対する、本発明の精製されたフィターゼの分解されたIP6-P値は、少なくとも101％、又は少なくとも102%, 103%, 104%, 105%, 110%, 115%又は少なくとも120%である。さらなる好ましい態様においては、対照フィターゼの分解されたIP6-Pの値に対する、本発明の精製されたフィターゼの分解されたIP6-P値は、少なくとも125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%又は少なくとも200%である。好ましくは、配列番号２の分解されたIP6-Pの値に対する、本発明の精製されたフィターゼの分解されたIP6-P値は、少なくとも105%, 110%, 113%, 115%, 120%, 125%又は少なくとも130%である。
【００８６】
次の置換は、配列番号３のフィターゼに比較される場合、動物飼料においてインビトロで改良された又は少なくとも良好の性能を提供する（表４Aを参照のこと）：4P、 5P、 111 P、 1*、1*/2*、1*/2*/3*、273L、286Q。
次の置換はまた、配列番号３のフィターゼに比較される場合、動物飼料において改良された又は少なくとも良好な性能を提供する（図４Bを参照のこと）：57Y、76G、107G、362K、362R、121D、196Q、200K、202N、314N、406A、及び114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L。
【００８７】
さらにより好ましい置換は、動物飼料に添加される場合、次のものである：57Y、76G、362K、362R、121D、196Q、200K、202N及び406A。
本発明のフィターゼの相対的性能はまた、対照フィターゼにより放されるリンの％としても計算され得る。
さらに特定の態様においては、本発明にフィターゼの相対的性能は、対照フィターゼにより放されるリンの量に対する、本発明にフィターゼにより放されるリンの％として計算され得る。
さらに特定の態様においては、本発明のフィターゼの相対的性能は、少なくとも105％、好ましくは少なくとも110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190又は少なくとも200%である。
【００８８】
低められたプロテーゼ感受性：
特定の態様においては、本発明のフィターゼは、低められたプロテアーゼ感受性を有する。より特定には、Kex2プロテアーゼに対する感受性を有し、すなわちこのプロテアーゼにより切断されるようになる低められた傾向を意味する。
【００８９】
グリコシル化パターン：
グリコシル化は、真核生物、例えば菌類及びトランスジェニックの植物において発現する場合（但し、原核生物、例えば菌類において発現しない）、単に観察される現象である。種々のタイプのグリコシル化が存在するが、しかし本発明においては、ほとんどの関連物はN−グリコシル化、すなわちアスパラギンに結合されるN−アセチルグルコサミン分子から出発して、糖がタンパク質に結合されうるアスパラギン−結合されたグリコシル化である。N−グリコシル化は、配列において、次のトリペプチドの一部であるアスパラギンに対してのみ生じることが見出されている：N−X−T又はN−X−５（ここでXはいずれかのアミノ酸を示す）。
【００９０】
驚くべきことには、低い熱安定性が、配列番号２のフィターゼがバチルス・サブチリスにおいて発現される場合に比較して、菌類（酵母）ピチア・ペストリス（Pichina pastoris）において発現される場合、観察された（例２を参照のこと）。
この観察は、熱安定性が、可能性あるグリコシル化部位を変更することにより菌類において発現されるフィターゼに関して改良され得る本発明の提案を導く。
【００９１】
従って、本発明はまた、修正されたグリコシル化パターン、好ましくは修正されたN−グリコシル化部位を有するフィターゼ変異体にも関する。修正されたグリコシル化は、菌類において発現される場合、フィターゼ変異体に対して改良された熱安定性を付与することが予測される。
【００９２】
フィターゼの例は、菌類フィターゼ、例えばグラム陰性フィターゼ、例えばE. コリ及びシトロバクターフィターゼ及びそれらの変異体、例えば本発明のフィターゼ、及び配列番号２，３，４，６及び９のフィターゼである。菌類発現宿主の例は、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Seccharomyces）及びアスペルギラス（Aspergillus）種である。
特定の態様においては、修正されたグリコシル化パターンが、本発明の次のフィターゼ（例えば配列番号２の変異体）から予測される：N31T、N74A、N171T、 N203T、N281H、N316D、 N308A。次のものは、N−X−Tタイプのパターンを置換する：N31T、N74A、N281H。次のものは、N−X−Sタイプのパターンを置換する：N171T、N203T、N308A、N316D。
【００９３】
低アレルギー性変異体：
特定の態様においては、本発明のフィターゼ変異体は、動物、たとえばヒトに暴露される場合、低い免疫原応答をもたらすよう企画された低アレルギー性変異体である。免疫学的応答は、フィターゼ変異体に暴露される動物の免疫系によるいずれかの応答として理解されるべきである。１つのタイプの免疫学的応答は、暴露された動物における高められたレベルのIgEを導くアレルギー応答である。低アレルギー性変異体は、当業界において知られている技法を用いて調製され得る。例えば、フィターゼ変異体は、免疫学的応答に関与するフィターゼ変異体の一部又はエピトープを保護するポリマー成分により接合され得る。
【００９４】
ポリマーによる接合は、WO96/17929号、WO98/30682gou、WO98/35026号及び/又はWO99/00489号に記載のように、フィターゼ変異体へのポリマーのインビトロ化学的カップリングを包含する。接合は、さらに又は他方では、フィターゼ変異体へのポリマーのインビボカップリングを包含する。そのような接合は、フィターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を遺伝的に構築し、フィターゼ変異体における追加のグリコシル化部位をコードするコンセンサス配列を挿入し、そしてフィターゼ変異体をグリコシル化できる宿主においてフィターゼ変異体を発現することによって達成され得る。例えば、WO00/26354号を参照のこと。低アレルギー性変異体を供給するもう１つの手段は、フィターゼ変異体モノマーが他のフィターゼ変異体モノマーのエピトープを保護し、そしてそれにより、オリゴマーの抗原性を低める、フィターゼ変異体の自己オリゴマー化を引き起こすために、フィターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列の遺伝的構築である。
【００９５】
そのような生成物及びそれらの調製法は、例えばWO96/16177号に記載されている。免疫学的応答に関与するエピトープは、種々の方法、例えばWO00/26230号に記載されるファージ表示法、又はEP561907号に記載されるランダムアプローチにより同定され得る。エピトープが同定されると、そのアミノ酸配列は、既知の遺伝子操作技法、例えば特定部位の突然変異誘発によりフィターゼ変異体の変更された免疫学的性質を生成するために変更され得（例えば、WO00/26230号、WO00/26354号及び/又はWO00/22103号を参照のこと）、そして/又はポリマーの接合がエピトープを保護するために、ポリマーのためのエピトープに十分に接近して行われ得る。
【００９６】
核酸配列及び構造体：
本発明はまた、本発明のフィターゼ変異体をコードする核酸配列を含んで成る核酸配列にも関する。
用語“単離された核酸配列”とは、他の核酸配列を実質的に有さない、例えばアガロース電気泳動により決定される場合、少なくとも約20％純粋、好ましくは少なくとも約40％純粋、より好ましくは少なくとも約60％純粋、さらにより好ましくは少なくとも約80％純粋、及び最も好ましくは少なくとも約90％純粋である核酸配列を言及する。
【００９７】
例えば、単離された核酸配列は、核酸配列を、その天然の位置から、それが再生されるであろう異なった部位に移転するために遺伝的構築に使用される標準のクローニング方法により得られる。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望する核酸フラグメントの切除及び単離、ベクター分子中への前記フラグメントの挿入、及び核酸配列の複数コピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への前記組換えベクターの組込みを包含する。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成、合成起源、又はそれらのいずれかの組合せのものであり得る。
【００９８】
本発明の核酸配列は、親フィターゼコード配列又はその副配列中に少なくとも１つの突然変異を導入することによって調製され得、ここで変異体核酸配列は変異体フィターゼをコードする。１つのヌクレオチドをもう１つのヌクレオチドにより交換するために核酸配列中への突然変異の導入は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、又はドーピングされた、スパイキングされた又は位置決定されたランダム突然変異誘発により達成され得る。
【００９９】
ランダム突然変異誘発は適切には、問題の示されるアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも３種の部位において、又は完全な遺伝子内での位置決定された又は領域特異的ランダム突然変異誘発として行われる。突然変異がオリゴヌクレオチドの使用により行われる場合、そのオリゴヌクレオチドは、変更される位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、３種の非親ヌクレオチドによりドーピングされるか又はスパイキングされ得る。このドーピング又はスパイキングは、所望しないアミノ酸のためのコドンが回避されるよう行われ得る。ドーピングされた又はスパイキングされたオリゴヌクレオチドは、例えばPCR、LCR又はいずれかのDNAポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、いずれかの技法により、フィターゼ酵素をコードするDNA中に組込まれ得る。
【０１００】
好ましくは、ドーピングは、個々の位置における野生型及び突然変異の％が前もって定義されている“一定ランダムドーピング”を用いて行われる。さらに、ドーピングは、一定のヌクレオチドの導入のための選択に、及びそれにより、１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入のための選択に指図され得る。ドーピングは、例えば個々の位置における90％の野生型及び10％の突然変異の導入を可能にするために行われ得る。ドーピングスキームの選択における追加の考慮は、遺伝的及びタンパク質−構造的強制に基づかれている。
【０１０１】
ランダム突然変異誘発は好都合には、問題の親フィターゼの一部に局在され得る。これは、例えば酵素の一定領域が酵素の所定の特性のために特に重要であることが同定されている場合、好都合であり得る。
本発明の変異体を供給するための他の方法は、WO95/22625号又はWO96/00343号に記載されるような遺伝子シャフリング、及びEP897985号に記載されるようなコンセンサス誘導方法を包含する。
【０１０２】
核酸構造体：
核酸構造体は、制御配列と適合できる条件下で適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指図する１又は複数の制御配列に操作可能的に連結される本発明の核酸配列を含んで成る。発現は、転写、後翻訳修飾、翻訳、後転写修飾及び分泌（但し、それらだけには限定されない）を包含するポリペプチドの生成に関与するいずれかの段階を包含することが理解されるであろう。
【０１０３】
用語“核酸構造体”とは、本明細書において使用される場合、天然に存在する遺伝子から単離され、又は他方では、天然に存在しない態様で核酸のセグメントを含むように修飾されている、一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義される。用語“核酸構造体”とは、核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味である。
【０１０４】
用語“制御配列”とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して生来であっても又は外来性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。
【０１０５】
用語“操作可能的に連結される”とは、本明細書においては、制御配列が、それがポリペプチドのコード配列の発現を方向づけるよう、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対する適切な位置に配置される形状として定義される。
本明細書において使用される場合、用語“コード配列”（CDS）とは、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は一般的に、ATG開始コドン又は他の開始コドン、例えばGTG及びTTGにより通常開始する読み取り枠により決定される。コード配列は、DNA、cDNA又は組換えヌクレオチド配列であり得る。
【０１０６】
発現ベクター：
用語“発現”とは、転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌（但し、それらだけには限定されない）を包含するポリペプチドの生成に関与するいずれかの段階を包含する。
【０１０７】
用語“発現ベクター”とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成り、そしてその発現を提供する追加のヌクレオチドに操作可能的に結合される、線状又は環状DNA分子として、本明細書において定義される。
本発明のフィターゼ変異体をコードする核酸配列は、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意には、レプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を典型的には含む発現ベクターを用いて発現され得る。
【０１０８】
本発明のフィターゼ変異体をコードするDNA配列を担持する組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利には、ゆだねられ得るいずれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される宿主細胞に依存するであろう。ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノムン中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と共に複製されるベクターであり得る。
【０１０９】
フィターゼ変異体はまた、興味ある動物飼料の少なくとも１つの他の酵素、例えばガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ、アミラーゼ及び/又はβ−グルカナーゼと共に同時発現され得る。酵素は、異なったベクターから、１つのベクターから、又は両技法の混合物を用いて、同時発現され得る。異なったベクターを用いる場合、ベクターは、異なった選択マーカー、及び複数の異なった起点を有することができる。わずか１つのベクターを用いる場合、遺伝子は、1又は複数のプロモーターから発現され得る。１つのプロモーター（二又は多−シストロン性）の調節下でクローン化される場合、遺伝子がクローン化される順序はタンパク質の発現レベルに影響を及ぼすことができる。フィターゼ変異体はまた、フィターゼ変異体をコードする遺伝子がもう１つのタンパク質をコードする遺伝子に整合して融合されている融合タンパク質として発現され得る。このタンパク質は、もう１つの酵素、又はもう１つの酵素からの機能的ドメインであり得る。
【０１１０】
宿主細胞：
用語“宿主細胞”とは、本明細書において使用される場合、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体を有する、形質転換、トランスフェクション、形質導入及び同様のものに対して敏感であるいずれかの細胞型を包含する。
【０１１１】
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
【０１１２】
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
有用な単細胞微生物は、細菌細胞、例えば次のグラム陽性細菌バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシ（Bacillus clausii）、バチルス・コアギランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、又はストレプトミセス細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）、又は次のグラム陰性細菌：E.コリ及びプソイドモナスsp.（但し、それらだけには限定されない）である。好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・サブチリス細胞である。もう１つの好ましい態様においては、バチルス細胞は、好アルカリ性バチルスである。
【０１１３】
細菌宿主細胞中へのベクターの導入は例えば、コンピテント細胞（たとえば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 を参照のこと）を用いてプロトプラスト形質転換（たとえば、Changand Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115）、エレクトロポレーション（たとえば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のこと）又は接合（たとえば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照のこと）によりもたらされ得る。
宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類、昆虫、植物、又は菌類細胞であり得る。
【０１１４】
１つの好ましい観点においては、宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及びオーミコタ（Oomycota）（Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。
【０１１５】
より好ましい観点においては、菌類宿主細胞は酵母細胞である“酵母”とは、本明細書において使用される場合、子嚢胞子酵母（Endomycetals）、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。酵母の分類は未来において変化し得るので、本発明のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds. Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) に記載のようにして定義されるであろう。
【０１１６】
さらにより好ましい観点においては、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hunsenula）、クレベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowia）である。
【０１１７】
最も好ましい観点においては、酵母宿主細胞は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・メサノリカ（Pichia methanolica）、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyses cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイビリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensisi）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、クルベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）である。もう１つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
【０１１８】
もう１つのより好ましい観点においては、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”とは、ユーミコタ（Eumycota）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）。糸状菌は一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴づけられる。成長増殖は、菌子拡張によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシアエによる成長増殖は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素代謝は発酵性である。
【０１１９】
さらにより好ましい観点においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジュウム（Aureobasidium）、ベルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポルセ（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicilium）、ファネロカエト（Phanerochaete）、フェビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）又はトリコダーマ（Trichoderma）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１２０】
最も好ましい観点においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ、アスペルギラス・フミガタス、アスペルギラス・ホエチダス、アスペルギラス・ジャポニカ、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエ細胞である。もう1つの最も好ましい観点においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・クロックウェレンズ 、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチキュラタム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サムブシウム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・ソラニ、フサリウム・スポロトリキオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコセシオイデス又はフサリウム・ベネナタム細胞である。
【０１２１】
さらに最も好ましい観点においては、糸状菌親宿主細胞は、ベルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）又はセリポリオプシス・スベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、ヒューミコラ・インソレンス、ヒューミコラ・ラヌギノサ、ムコル・ミエヘイ、ミセリオプソラ・サーモフィリア、ネウロスポラ・クラサ、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエト・キソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フェビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコダーマ・ハルジアナム、トリコダーマ・コニンギ、トリコダーマ・ロンジブラキアタム、トリコダーマ・レセイ又はトリコダーマ・ビリデ細胞である。
【０１２２】
菌類細胞は、プロトプラスト形質転換、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る。アスペルギラス及びトリコダーマ宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023号及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81; 1474-1874に記載される。フラリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene78: 147-156, 及びWO96/00787号により記載される。
【０１２３】
酵母は、Becker and Guarente. In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito など, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnen など, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75; 1920により記載される方法を用いて形質転換され得る。
【０１２４】
生成方法：
本発明はまた、（ａ）フィターゼの生成の助けとなる条件下で宿主細胞を培養し；そして（ｂ）前記フィターゼを回収することを含んで成る、本発明のフィターゼの生成方法にも関する。
【０１２５】
本発明の生成方法においては、細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする適切な培地において、及び条件下で行われる実験用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ又は固体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当業界において知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、市販の供給者から入手でき、又は公開された組成（例えば、American Type Culture Collectionのカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、それは培地から直接的に回収され得る。それが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。
【０１２６】
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、それは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、栄養培地から回収され得る。
本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）。
【０１２７】
トランスジェニック植物：
本発明はまた、ポリペプチドを、回収できる量で発現し、そして生成するために、本発明のフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により形質転換されているトランスジェニック植物、その植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、食物又は飼料の品質を改良し、例えば栄養価値、嗜好性及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。
【０１２８】
特定の態様においては、ポリペプチドは、種子の内生精子貯蔵液胞にも標的化される。これは、適切なシグナルペプチドにより前駆体としてそれを合成することによって行われる。Horvath など ．、 PNAS, Feb. 15,2000, vol. 97, no. 4, p. 1914-1919を参照のこと。
【０１２９】
トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物又は構築されたその変異体であり得る。単子葉植物の例は、草、例えば湿潤地の草本（ブルーグラス、イチゴツナギ属）、飼草、例えばウシノケグサ、ドクムギ、温帯性草本、例えばヌカボ、及び穀類、例えば小麦、オート麦、ライ麦、イネ、モロコシ、ライコムギ（小麦（Triticum）及びライ麦（Secale）の安定化されたハイブリッド）及びトウモロコシ（サトウモロコシ）である。双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、例えばヒマワリ（Helianthus）、綿（Gossypium）、ルピナス、ジャガイモ、砂糖大根、エンドウ、インゲン豆及び大豆、及びアブラナ科植物（ブラシカセアエ科（Brassicaceae））、例えばカリフラワー、ナタネ種子及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）である。例えば、アメリカ特許第5,689,054号及び第6,111,168号に記載されるような低−フィテート植物は、構築された植物の例である。
【０１３０】
植物部分の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子及び塊茎、並びにそれらの部分を含んで成る個々の組織、例えば表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織である。また特定の植物細胞区画、例えばクロロプラスト、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシゾーム及び細胞質が、植物部分であると思われる。さらに、組織起源が何であろうと、いずれの植物細胞でも、植物部分であると思われる。同様に、植物部分、例えば本発明の利用を促進するために単離された特定の組織及び細胞はまた、植物部分、例えば胚、内生精子、アリューロン及び被膜であると思われる。
【０１３１】
そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫はまた、本発明の範囲内に包含される。
本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする、１又は複数の発現構造体を、植物宿主ゲノム中に導入し、そして得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞中に成長せしめることによって構成される。
【０１３２】
便利には、発現構造体は、選択の植物又は植物における核酸配列の発現のために必要とされる適切な調節配列により操作可能的に連結される本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体である。さらに、発現構造体は、発現構造体が組み込まれている宿主細胞を同定するために有用な選択マーカー、及び問題の植物中への構造体の導入のために必要なDNA配列を含んで成る（後者は、使用されるDBA導入方法に依存する）。
【０１３３】
調節配列、例えばプロモーター及びターミネーター配列、及び任意には、シグナル又はトランスジット配列の選択は、例えばポリペプチドがいつ、どこで及びいかにして発現されることを所望するかに基づかれる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、構成的又は誘発的であり、又は進行的、段階又は組織特異的であり、そして遺伝子生成物は、特定組織又は植物部分、例えば種子又は葉に標的化され得る。調節配列は、Taqueなど., 1988, Plant Physiology 86: 506により記載される。
【０１３４】
構成的発現のために、次のプロモーターが使用され得る：35S−CaMVプロモーター（Franck など., 1980, Cell 21: 285-294）、トウモロコシユビキチン１（Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation）、又はイネアクチン１プロモーター（Plant Mo. Biol. 18,675-689. ; Zhang W, McElroy D. and Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5'region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3,1155-1165）。
【０１３５】
器官特異的プロモーターは例えば、貯蔵吸込み組織、例えば種子、ジャガイモ塊茎及び果物（Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303）、又は代謝吸込み組織、例えば分裂組織（Ito など., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878）からのプロモーター、種子特異的プロモーター、例えばイネからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Wu など., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885- 889）、Vicia fabaからのレグニンB4及び未知の種子タンパク質遺伝子からのVicia fabaプロモーター（Conrad など., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711）、種子油体タンパク質からのプロモーター（Chen など., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941）、ブラシカ・ナパス（Brassica napus）からの貯蔵タンパク質napAプロモーター又は当業界において知られている、例えばWO91/14772号に記載されるようないずれか他の種子特異的プロモーターであり得る。
【０１３６】
さらに、プロモーターは、葉特異的プロモーター、例えばイネ又はトマトからのrbcsプロモーター（Kyozuka など., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000）、クロレラウィルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93）、又はイネからのaldP遺伝子プロモーター（Kagaya など., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674）、又は創傷誘発性プロモーター、例えばジャガイモpin2プロモーター（Xu など., 1993, Plant Molecular Biology 22 : 573-588）であり得る。同様に、プロモーターは、非生物学的処理、例えば温度、渇水又は塩分の変更により誘発できるか、又はプロモータを活性化する外部的に適用される物質、例えばエタノール、エストロゲン、植物ホルモン様エチレン、アブシジン酸、ジベレリン酸及び/又は重金属により誘発できる。
【０１３７】
プロモーターエンハンサー要素がまた、植物におけるポリペプチドのより高い発現を達成するために使用され得る。例えば、プロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロンであり得る。例えば、Xuなど., 1993（前記）は、発現を増強するためへのイネアクチン１遺伝子の最初のイントロンの使用を開示する。
【０１３８】
さらに、コドン使用法は、発現を改良するために、問題の植物種のために最適化され得る（上記に言及されるHorvathなどを参照のこと）。
発現構造体の選択マーカー遺伝子及びいずれか他の部分は、当業界において入手できるそれらから選択され得る。
【０１３９】
核酸構造体は、当業界において知られている従来の技法、例えばアグロバクテリウム介在性形質転換、ウィルス介在性形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、バイオリステック形質転換及びエレクトロポレーションに従って、植物ゲノム中に組込まれる（Gasserなど., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, BiolTechnology 8 : 535; Shimamoto など., 1989, Nature 338: 274）。
【０１４０】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子トランスファーは、トランスジェニック双子葉類を生成するための選択方法であり（再考のためには、Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38を参照のこと）、そして、それはまた、単子葉類を形質転換するためにも使用され得るが、しかし他の形質転換方法が一般的にそれらの植物のために好ましい。現在、アグロバクテリウムアプローチを補足する、トランスジェニック単子葉類を生成するための選択方法は、胚細胞又は成長胚の粒子衝撃である（形質転換DNAにより被覆された微小金又はタングステン粒子）（Christou, 1992, Plant Journal 2 : 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil など., 1992, BiolTechnology 10: 667-674）。単子葉類の形質転換のための他の方法は、Omirullehなど., 1993, Plant Molecular Biology21: 415-428により記載されるようにプロトプラスト形質転換に基づかれる。
【０１４１】
形質転換に続いて、そこに組込まれた発現構造体を有する形質転換体が選択され、そして当業界において良く知られていた方法に従って、完全な植物に再生される。しばすば、形質転換方法は、２種の別々のT-DNA構造体による同時形質転換を用いることによる、再生の間又は次の生成において、選択遺伝子の選択的排除、又は特異的組換え酵素による選択遺伝子の部位特異的排除のために企画される。
【０１４２】
本発明はまた、（ａ）本発明のプロテアーゼ活性有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で栽培し、そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０１４３】
トランスジェニック動物：
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト動物及びその生成物又は要素にも関し、その例は体液、例えば乳汁及び血液、器官、肉及び動物細胞である。例えば、哺乳類細胞においてタンパク質を発現するための技法は当業界において知られている。例えば、ハンドブック Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999), 及びGene Transcription, RNA processing, and Post-translational Processingに関するこのシリーズの他の３種のハンドブックを参照のこと。
【０１４４】
一般的には、トランスジェニック動物を調製するために、選択された動物の選択された細胞が、本発明のプロテアーゼ活性有するポリペプチドをコードする核酸配列により形質転換され、ポリペプチドが発現され、そして生成される。ポリペプチドが、動物から、例えば雌動物の乳汁から回収され、又はそれは動物自体の有益性のために、例えば動物の消化を助けるために発現され得る。動物の例は、下記の動物飼料及び動物飼料添加物のセクションに言及されている。
【０１４５】
動物の乳汁からプロテアーゼを回収する観点から、トランスジェニック動物を生成するためには、プロテアーゼをコードする遺伝子が問題の動物の受精卵中に、例えば適切な乳汁タンパク質プロモーター及びプロテアーゼをコードする遺伝子を含んで成るトランスジーン発現ベクターの使用により挿入され得る。トランスジーン発現ベクターは、受精卵中にマイクロインジェクションされ、そして好ましくは、染色体中に永久的に組込まれる。卵が成長し、そして分裂し始めると、可能性ある胚が代理母中に移植され、そしてトランスジーンを担持する動物が同定される。次に、その得られる動物は、従来の飼育により繁殖される。フィターゼ変異体が動物の乳汁から精製される。例えば、Meade, H. M. など(1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. J. M. Fernandez and J. P. Hoeffler (eds. ), Academic Pressを参照のこと。
【０１４６】
他方では、その体細胞及び/又は生殖細胞のゲノムに、プロテアーゼをコードするトランスジーンを含む異種トランスジーン構造体を包含する核酸配列を担持するトランスジェニック非ヒト動物を生成するために、トランスジーンが、WO2000064247号に開示されるように、フィターゼ変異体の唾液腺特異的発現のための第１の調節配列に操作可能的に連結され得る。
【０１４７】
組成物及び使用：
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含んで成る組成物、及びそれらの使用方法に関する。
ポリペプチド組成物は、当業者において知られている方法に従って調製され得、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、粒子又は微粒子の形で存在することができる。組成物に含まれるポリペプチドは、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
【０１４８】
本発明のフィターゼは、いずれかの産業的状況においては、フィテート、フィチン酸、及び/又はmyo−イノシトールの一、二、三、四及び/又は五−リン酸の分解のために使用され得る。それらの化合物中のリン酸成分が二価及び三価のカチオン、例えば金属イオン、すなわちカルシウム、鉄、亜鉛及びマグネシウム、並びに微量鉱物、マンガン、銅及びモリブデンの栄養的に必須のイオンをキレート化することは良く知られている。さらに、フィチン酸はまた、静電相互作用によりタンパク質を、一定の程度まで結合する。
従って、本発明のポリペプチドの好ましい使用は、動物飼料調製物（ヒト食品を包含する）又はそのような調製物の添加剤においてである。
【０１４９】
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、動物飼料の栄養価値を改良するために使用され得る。動物飼料（ヒト食品を包含する）の栄養価値の改良の非制限的例は、次のものである：飼料消化能力の改良；動物の成長の促進；飼料利用性の改良；タンパク質の生物利用能の改良；消化できるホスフェートのレベルの増強；フィターゼの開放及び/又は分解の改良；微量鉱物の生物利用能の改良；マクロ鉱物の生物利用能の改良；補足ホスフェート、微量鉱物及び/又はマクロ鉱物の添加の必要性の排除；及び/又は卵殻品質の改良。従って、飼料の栄養価値は高められ、そして動物の成長速度及び/又は体重増加及び/又は飼料転換率（すなわち、体重増加に対する消化された飼料の重量）が改良され得る。
さらに、本発明のポリペプチドは、肥料のフィターゼレベルを低めるためにも使用され得る。
【０１５０】
動物、動物飼料及び動物飼料添加物：
用語、動物とは、ヒトを包含するすべての動物を包含する。動物の例は、非反芻動物、及び反芻動物である。反芻動物は例えば、動物、例えば羊、ヤギ、馬及び蓄牛、例えば肉ウシ、乳牛及び子牛を包含する。特定の態様においては、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単一の胃を有する動物、例えばブタ又はイノシシ（子ブタ、成長しているブタ及び雌ブタを包含するが、但しそれらだけには限定されない）；家禽類、例えば七面鳥、鴨及び鶏（ブロイラー鶏、産卵鶏を包含するが、但しそれらだけには限定されない）；及び魚（サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及び鯉を包含するが、但しそれだけには限定されない）；及び甲殻類（小エビ及び車えびを包含するが、但しそれだけには限定されない）を包含する。
【０１５１】
用語、飼料又は飼料組成物とは、動物のために適切な、又は動物による摂取のために意図された、いずれかの化合物、調製物、混合物又は組成物を意味する。
本発明従っての使用においては、ポリペプチドは、食事の前、後又は同時に動物に供給され得る。後者が好ましい。
【０１５２】
特定の態様においては、ポリペプチドは、それが飼料に添加される形において、又は飼料添加物に含まれる場合、実質的に純粋である。特定の態様においては、それは十分に定義されている。“十分に定義された”とは、フィターゼ調製物がサイズ排除クロマトグラフィーにより決定される場合、少なくとも50％の純度であることを意味する（WO01/58275号の例12を参照のこと）。他の特定の態様においては、フィターゼ調製物は、この方法により決定される場合、少なくとも60、70、80、85、88、90、92、94又は少なくとも95％の純度である。
【０１５３】
実質的に純粋な、及び/又は十分に定義されたポリペプチド調製物が好都合である。例えば、干渉性又は汚染性の他のポリペプチドを実質に有さないポリペプチドを、飼料に正しく適量に分けることがより容易である。用語“適量に分ける”とは、一貫した及び一定した結果を得ることの目的、及び所望する効果に基づいて用量を最適化する能力を正しくは言及する。
しかしながら、動物飼料への使用に関しては、純粋であるフィターゼは必要ではなく；それは他のポリペプチドを含むことができ、この場合、それはフィターゼ調製物と呼ばれる。
【０１５４】
フィターゼ調製物は、（ａ）飼料に直接的に添加され得（又はタンパク質の処理工程に直接的に使用され得る）、又は（ｂ）１又は複数の中間体組成物、例えば続いて飼料に添加される（又は処理工程に使用される）飼料添加物又はプレミックスの生成に使用され得る。上記純度の程度は、上記（ａ）又は（ｂ）のいずれに従って使用されても、元のポリペプチド調製物の純度を言及する。
【０１５５】
この高さの程度の純度を有するポリペプチド調製物は特に、組換え生成方法を用いて得ることができ、ところがそれらは、ポリペプチドが従来の発酵方法により生成される場合、得るにはそんなに容易ではなく、そしてより高いバッチからバッチへの変動を受けやすい。
そのようなポリペプチド調製物はもちろん、他のポリペプチドと共に混合され得る。
ポリペプチドは、それが比較的純粋なポリペプチドとして存在する場合、いずれかの形で、又は動物飼料への添加のために意図された他の成分との混合物の形で、すなわち動物飼料添加物、例えばいわゆる動物飼料のためのプレミックスの形で、飼料に添加され得る。
【０１５６】
さらなる観点においては、本発明は、動物の飼料への使用のための組成物、例えば動物飼料及び動物飼料添加物、例えばプレミックスに関する。
本発明のポリペプチドとは別に、本発明の動物飼料添加物は、少なくとも１つの脂溶性ビタミン、及び/又は少なくとも１つの水溶性ビタミン、及び/又は少なくとも１つの微量鉱物、及び/又は少なくとも１つのマクロ鉱物を含む。前記飼料添加物はまた、少なくとも１つのマクロ鉱物を含むことができる。
【０１５７】
さらに、任意の飼料添加物成分は、着色剤、例えばカロテノイド、例えばβ−カロテノイド、アスタキサンチン、及びルテイン；芳香化合物；安定剤；抗菌ペプチド；多不飽和脂肪酸；反応性酵素生成種；及び/又は中でも、フィターゼ（EC3.1.3.8又は3.1.3.26）；キシラーゼ（EC3.2.1.8）、ガラクタナーゼ（EC3.2.1.89）；α−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.22）；プロテアーゼ（EC3.4._._）；ホスホリパーゼA1（EC3.1.1.32）；ホスホリパーゼA2（EC3.1.1.4）；リソホスホリパーゼ（EC3.1.1.5）；ホスホリパーゼC（EC3.1.4.3）；ホスホリパーゼD（EC3.1.4.4）；及び/又はβグルカナーゼ（EC3.2.1.4又はEC3.2.1.6）から選択された少なくとも１つの他のポリペプチドである。
【０１５８】
特定の態様においては、それらの他のポリペプチドは、十分に定義されている（フィターゼ調製物について上記に定義されるように）。
本発明のフィターゼはまた、他のフィターゼ、例えば子嚢菌フィターゼ、例えばアスペルギラス・フィカム、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリ由来のアスペルギラスフィターゼ；又は担子菌フィターゼ、例えばペニオフォラ・リシ（Peniophora lycii）、アグロシベ・ペジアデス（Agrocybe pediades）、トラメテス・プベスセンス（Trametes pubescens）又はパキシラス・インボルタス（Paxillus involutus）由来の担子菌フィターゼ；又はフィターゼ活性を有する、それらの誘導体、フラグメント又は変異体と共に組合され得る。
【０１５９】
従って、本発明の動物飼料への使用の好ましい態様においては、及び本発明の動物飼料添加量及び動物飼料の好ましい態様においては、本発明のフィターゼは、そのようなフィターゼと組み合わされ得る。
【０１６０】
抗菌ペプチド（AMP）の例は、CAP18, Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Thanatin, Defensin, Lactoferrin, Lactoferricin,及び Ovispirin 、例えば Novispirin (Robert Lehrer, 2000)、Plectasins, 及び Statins,例えばWO 03/044049号 及び WO 03/048148号に開示される化合物及びポリペプチド、及び抗菌活性を保持するそれらの変異体又はフラグメントである。
【０１６１】
抗真菌ポリペプチド（AFP）の例は、WO94/01459号及びWO02/090384号に開示されるように、アスペルギラス・ギガンテウス（Aspergillus giganteus）、及びアスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）ペプチド、並びに抗真菌活性を保持するそれらの変異体及びフラグメントである。
多不飽和脂肪酸の例は、C18, C20及びC22多不飽和脂肪酸、例えばアラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸及びγ−リノール酸である。
【０１６２】
反応性酵素生成種の例は、化学物質、例えば過硼酸塩、過硫酸塩又は過炭酸塩；及び酵素、例えばオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、又はシンターゼである。
通常、脂−及び水−溶性ビタミン、及び微量鉱物は、飼料への添加のために意図された、いわゆるプレミックスの一部を形成し、そしてマクロ鉱物は通常、別々に飼料に添加される。本発明のプロテアーゼにより富化される場合、それらの組成物のいずれかは、本発明の動物飼料添加物の例である。
【０１６３】
特定の態様においては、本発明の動物飼料添加物は、0.01〜10.0％、より特定には0.05〜5.0％；又は0.2〜1.0％（％は、100gの飼料当たりの添加物g数を意味する）のレベルで、動物規定食又は飼料への包含を意図される（又は包含すべきより意図される）。これは、特に、プレミックスのためである。
次のものは、それらの成分の例の非制限的列挙である：
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE及びビタミンK、例えばビタミンK3である。
【０１６４】
水溶性ビタミンの例は、ビタミンB12、ビオチン及びコリン、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ナイアシン、葉酸及びパントテネート、例えばCa−D−パントテネートである。
微量鉱物の例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン及びコバルトである。
マクロ鉱物の例は、カルシウム、リン及びナトリウムである。
【０１６５】
それらの成分（家禽、及び子豚/豚により例示される）の栄養必要条件は、WO01/58275号の表Aに列挙される。栄養必要条件とは、それらの成分が示される濃度で規定食に供給されるべきであることを意味する。
【０１６６】
他方では、本発明の動物飼料添加は、WO01/58275号の表Aに特定される、少なくとも１つの個々の成分を含んで成る。少なくとも１つとは、１、又は２、又は３、又は４及び等〜すべての13個、又はすべての15個の個々の成分の１又は複数の成分のいずれかを意味する。より特定には、この少なくとも１つの個々の成分は、表Aの縦列４、又は５又は６に示される範囲内の飼料中濃度を提供するような量で本発明の添加物に包含される。
【０１６７】
本発明はまた、動物飼料組成物にも関する。動物飼料組成物又は規定食は、比較的に高いタンパク質含有率を有する。家禽及び豚規定食は、WO01/58275号の表B、縦列２−３に示されるように特徴づけられ得る。さらに、そのような魚規定食は通常、200−310g/kgの粗脂肪含有率を有する。
WO01/58275号は、引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許09/77334号に対応する。
【０１６８】
本発明の動物飼料組成物は、50−800g/kgの粗タンパク質含有率を有し、そしてさらに、本明細書に請求されるように、少なくとも１つのポリペプチドを含んで成る。
さらに、又は他方では（上記に示される粗タンパク質含有率）、本発明の動物飼料組成物は、10＋30MJ/kgの代謝可能エネルギー含有率；及び/又は0.1−200g/kgのカルシウム含有率；及び/又は0.1−200g/kgの利用できるリン含有率；及び/又は0.1−100g/kgのメチオニン含有率：及び/又は0.1−150g/kgのメチオニン及びシステイン含有率；及び/又は0.5−50g/kgのリシン含有率を有する。
【０１６９】
特定の態様においては、前記代謝エネルギー、粗タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニン＋システイン、及び/又はリシン含有率は、WO01/58275号（R. 2−5）の表Bにおける範囲２，３，４又は５のいずれか１つの範囲内である。
粗タンパク質は、係数6.25により掛け算される窒素（N）、すなわち粗タンパク質（g/kg）＝N（g/kg）×6.25として計算される。窒素含有率は、Kjeldahl方法 (A. O. A. C. , 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)により決定され得る。
【０１７０】
代謝可能エネルギーは、NRC publication Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D. C. , pp. 2-6、及びthe European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5に基づいて計算され得る。
【０１７１】
完全な動物規定食におけるカルシウム、利用できるリン及びアミノ酸の含有率は、飼料表、例えばVeevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6,8219 pk Lelystad. ISBN 90- 72839-13-7に基づいて計算される。
【０１７２】
特定の態様においては、本発明の動物飼料組成物は、少なくとも１つのタンパク質を含む。前記タンパク質は、動物タンパク質、例えば肉及び骨ミール、及び/又は魚ミールであり得るが；又はそれは植物性タンパク質であり得る。用語、植物性タンパク質とは、本明細書において使用される場合、植物性、例えば修飾されたタンパク質及びタンパク質−誘導体由来の又はそれに起因する少なくとも１つのタンパク質を含む、いずれかの顔愚物、組成物、調製物又は混合物を言及する。特定の態様においては、植物性タンパク質中のタンパク質含有率は、少なくとも10, 20, 30, 40, 50, 又は60％（w/w）である。
【０１７３】
植物タンパク質は、植物タンパク質源、例えばマメ科植物及び穀物、例えばマメ科（Leguminosae）、アブラナ科、アカザ科及びイネ科、例えば大豆粉、ルピナス粉及びナタネ種子粉由来のものである。
特定の態様においては、植物タンパク質源は、１又は複数のマメ科植物、例えば大豆、ルピナス、エンドウ又はインゲン豆からの材料である。
【０１７４】
もう１つの特定の態様においては、植物タンパク質源は、１又は複数のアカザ科植物、例えばビート、砂糖大根、ホウレンソウ又はキノアからの材料である。
植物タンパク質源の他の例は、ナタネ種子、ヒマワリ種子、綿種子及びキャベツである。
大豆は、好ましい植物タンパク質源である。
植物タンパク質源の他の例は、穀物、例えば大麦、小麦ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、ライコムギ及びモロコシである。
【０１７５】
特定の態様においては、本発明の動物飼料組成物は、上記に定義されるような少なくとも１つのタンパク質の又はタンパク質源を含む。それはまた、動物タンパク質、例えば肉及び骨粉、及び/又は魚粉を、典型的には0−25％の量で含むことができる。
さらなる特定の態様においては、本発明の動物用飼料組成物は、0-80％のトウモロコシ；及び/又は0-80％のモロコシ；及び/又は0−70％の小麦；及び/又は0-70％の大麦；及び/又は0-30％のオート麦；及び/及び0-40％の大豆ミール；及び/又は0-25％の魚ミール；0-25％の肉及び骨負ン及び/又は0-20％ホエーを含む。
【０１７６】
動物用規定食は、マッシュ飼料（ペレット化されていない）又はペレット化された飼料として製造され得る。典型的には、微粉砕された飼料材料が混合され、そして十分な量の必須ビタミン及び鉱物が、問題の種についての規定に従って添加される。ポリペプチドは、固体又は液体酵素配合として添加され得る。例えば、固体ポリペプチド配合物は典型的には、混合段階の前又はその間に添加され；そして液体ポリペプチド調製物は典型的には、ペレット化段階の後に添加される。ポリペプチドはまた、飼料添加物又はプレミックスにも組込まれ得る。
【０１７７】
規定食における最終ポリペプチド濃度は、0.01−200mgのポリペプチドタンパク質/kg規定食、例えば0.5−25mgのポリペプチドタンパク質/kg動物規定食の範囲内である。
フィターゼはもちろん、有効量で、すなわち飼料の溶解性及び/又は栄養価値を改良するための適切な量で適用され得る。ポリペプチドは次の量（用量範囲）で投与されることが現在企画される：0.01-200 ; 0.01-100 ; 0.5-100 ; 1-50; 5-100; 10-100; 0.05-50 ;又は0.10-10−すべてのそれらの範囲はmgフィターゼポリペプチドタンパク質/kg飼料（ppm）である。
【０１７８】
kg飼料当たりmgフィターゼポリペプチドタンパク質を決定するために、フィターゼは飼料組成物から精製され、そして精製されたフィターゼの非活性が適切なアッセイを用いて決定される。飼料組成物のフィターゼ活性はまた、同じアッセイを用いて決定され、そしてそれらの２種の決定に基づいて、mgフィターゼタンパク質/kg飼料での用量が計算される。
【０１７９】
同じ原理が、飼料添加物におけるmgフィターゼポリペプチドタンパク質を決定するために適用される。もちろん、サンプルが飼料添加物又は飼料を調製するために使用されるフィターゼのために利用できる場合、比活性はこのサンプルから決定される（飼料組成物又は添加物からフィターゼを精製するために必要でない）。
【０１８０】
特定の実施態様：
本発明はまた、次の特定の実施態様にも関する：
I. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、好ましくは下記のもの：
【０１８１】
1、 2、 3、 4、 5、 31、46、 52、 53、 55、 57、 59、 76、 82、 99、 100、 107、 109、 111、114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、122、123、 124、 137、 141、161、162、 164、 167、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 196、 199、200、 202、 218、 223、 241、 273、 276、 285、 286、 299、 314、 331、339、 362、 379、 385、 406、 410、及び411から選択された少なくとも１つの位置において、
配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し配列番号３、配列番号４及び配列番号６ではない、フィターゼ。
【０１８２】
II.配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、好ましくは下記のもの：
【０１８３】
1、 2、 3、 4、 5、 46、 52、 53、55、 57、 59、 76、 82、 99、 100、 107、 109、 111、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 122、 123、 124、 137、 141、161、162、 164、 167、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 196、 199、 200、 202、218、 223、 241、273、 276、 285、 286、 299、 314、 339、 362、 379、 385、 406、 410、 及び411から選択された少なくとも１つの位置において、
配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成るフィターゼ。
【０１８４】
III. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1、 2、 3、 4、 5、 31、 41、 46、 52、 53、 55、 57、 59、 74、 76、 82、 84、 91、 99、 100、 104、 105、 107、 109、 111、114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 136、 137、 141、 154、 161、162、 164、 167、 171、176、 177、 179、 180、 181、182、 183、 184、 185、 186、 196、 199、 200、 202、 203、 218、 223、 239、 240、 241、247、 273、 276、 281、 282、 283、 284、 285、 286、 289、 294、 299、 308、 314、 316、 324、 331、339、 351、355、 362、 379、 385、 406、 409、 410、及び411から選択された少なくとも１つの位置において、好ましくは下記のもの：
【０１８５】
1、 2、 3、 4、 5、 31、46、 52、 53、 55、 57、 59、 76、 82、 99、 100、 107、 109、 111、114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 137、 141、161、 162、 164、 167、 179、 180、 181、182、 183、 184、 185、 186、 196、 199、 200、 202、 218、 223、 241、273、 276、 285、 286、 299、 314、 331、 339、 362、 379、 385、 406、 410、 及び411から選択された少なくとも１つの位置において、
配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し配列番号３、配列番号４、配列番号６及び配列番号9、並びに図１に列挙されるそれらの変異体ではない、フィターゼ。
【０１８６】
IV. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1、2、 3、 4、 5、 41、 46、 52、 53、 55、 57、 59、 74、 76、 82、 84、 91、 99、 100、 104、 105、 107、 109、 111、114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 122、 123、 124、 136、 137、 141、154、 161、162、 164、 167、 171、 176、 177、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 185、 186、 196、 199、 200、 202、 203、 218、 223、 239、 240、 241、247、 273、 276、 281、282、 283、 284、 285、 286、 289、 294、 299、 308、 314、 324、 339、 351、 355、 362、 379、 385、 406、 409、 410、 及び 411から選択された少なくとも１つの位置において、好ましくは下記のもの：
【０１８７】
1、2、 3、 4、 5、 46、 52、 53、 55、 57、 59、 76、 82、 99、 100、 107、 109、 111、114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 122、 123、 124、 137、 141、161、 162、 164、 167、 179、 180、 181、182、 183、 184、 185、 186、 196、 199、 200、 202、 218、 223、 241、273、 276、 285、 286、 299、 314、 339、 362、 379、 385、 406、 410、 及び 411から選択された少なくとも１つの位置において、
配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し配列番号9、及び図１に列挙されるそれらの変異体ではない、フィターゼ。
【０１８８】
V. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
4、 5、 41、46、 59、 82、 84、 91、99、 105、 107、 109、 111、115、 116、 117、 119、 122、 123、 124、 136、 137、 141、161、 162、 164、 167、 171、 176、 179、 180、 186、 196、 199、 200、 218、 223、 239、 240、 241、247、 273、 276、 281、 282、 283、 284、 289、 294、 299、 308、 314、 324、 339、 351、355、 379、 385、 406、 409、 410、 及び 411から選択された少なくとも１つの位置において、好ましくは下記のもの：
【０１８９】
4、 5、 46、 59、 82、 99、 107、 109、 111、115、 116、 117、 119、 122、 123、 124、 137、 141、161、162、 164、 167、 179、 180、 186、 196、 199、 200、 218、 223、 241、273、 276、 299、 314、 339、 379、 385、 406、 410、 及び 411から選択された少なくとも１つの位置において、
配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成るフィターゼ。
【０１９０】
VI.配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されており；
【０１９１】
好ましくは、次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31 C、 46E、 52C、E、 53V、 55D、 57Y、 59C、 76G、 82E、 99C、 100C、 107D、E、G、 109A、 111 P、 114T、 115Q、 116AT、 117D、 118T、 119K、R、S、 120S、 121D、P、T、122D、 123P、 124L、 137P、 141C、 161 P、 162C、 164E、 167Q、 179K、 180E、T、 181D、K、 182H、K、Q、 183L、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、 200K、 202N、 218Q、 223E、 241 Q、 273L、 276K、R、 285G、R、 286Q、 299L、 314G、N、 331 K、 339D、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 410D、E、 及び/又は 411 R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、KEKHQ、KEKQQ、 KEKKV又はKTDKLにより置換されている、を含んで成るが；
但し、配列番号３，４及び６ではない、フィターゼ。
【０１９２】
VII. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されており；
【０１９３】
好ましくは、次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31 C、 46E、 52C、E、 53V、 55D、 57Y、 59C、 76G、 82E、 99C、 100C、 107D、E、G、 109A、 111 P、 114T、 115Q、 116AT、 117D、 118T、 119K、R、S、 120S、 121D、P、T、122D、 123P、 124L、 137P、 141C、 161 P、 162C、 164E、 167Q、 179K、 180E、T、 181D、K、 182H、K、Q、 183L、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、 200K、 202N、 218Q、 223E、 241 Q、 273L、 276K、R、 285G、R、 286Q、 299L、 314G、N、 331 K、 339D、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 410D、E、 及び/又は 411 R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、KEKHQ、KEKQQ、 KEKKV又はKTDKLにより置換されている、を含んで成るフィターゼ。
【０１９４】
IIX. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されており；
【０１９５】
好ましくは、次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31 C、 46E、 52C、E、 53V、 55D、 57Y、 59C、 76G、 82E、 99C、 100C、 107D、E、G、 109A、 111 P、 114T、 115Q、 116AT、 117D、 118T、 119K、R、S、 120S、 121D、P、T、122D、 123P、 124L、 137P、 141C、 161 P、 162C、 164E、 167Q、 179K、 180E、T、 181D、K、 182H、K、Q、 183L、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、 200K、 202N、 218Q、 223E、 241 Q、 273L、 276K、R、 285G、R、 286Q、 299L、 314G、N、 331 K、 339D、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 410D、E、 及び/又は 411 R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、KEKHQ、KEKQQ、 KEKKV又はKTDKLにより置換されている、を含んで成るが；
但し、配列番号３、４、６及び９、並びに図１に列挙されるそれらの異性体ではない、フィターゼ。
【０１９６】
IX. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されており；
【０１９７】
好ましくは、次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31 C、 46E、 52C、E、 53V、 55D、 57Y、 59C、 76G、 82E、 99C、 100C、 107D、E、G、 109A、 111 P、 114T、 115Q、 116AT、 117D、 118T、 119K、R、S、 120S、 121D、P、T、122D、 123P、 124L、 137P、 141C、 161 P、 162C、 164E、 167Q、 179K、 180E、T、 181D、K、 182H、K、Q、 183L、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、 200K、 202N、 218Q、 223E、 241 Q、 273L、 276K、R、 285G、R、 286Q、 299L、 314G、N、 331 K、 339D、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 410D、E、 及び/又は 411 R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、KEKHQ、KEKQQ、 KEKKV又はKTDKLにより置換されている、を含んで成るが；
但し、配列番号９、及びに図１に列挙されるそれらの異性体ではない、フィターゼ。
【０１９８】
X. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されており；
【０１９９】
好ましくは、次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31 C、 46E、 52C、E、 53V、 55D、 57Y、 59C、 76G、 82E、 99C、 100C、 107D、E、G、 109A、 111 P、 114T、 115Q、 116AT、 117D、 118T、 119K、R、S、 120S、 121D、P、T、122D、 123P、 124L、 137P、 141C、 161 P、 162C、 164E、 167Q、 179K、 180E、T、 181D、K、 182H、K、Q、 183L、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、 200K、 202N、 218Q、 223E、 241 Q、 273L、 276K、R、 285G、R、 286Q、 299L、 314G、N、 331 K、 339D、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 410D、E、 及び/又は 411 R、Kの少なくとも１つ；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、KEKHQ、KEKQQ、 KEKKV又はKTDKLにより置換されている、を含んで成る、フィターゼ。
【０２００】
XI. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：1H、K、R、 60P、 105E、 106A、G、 155F、 157F、 173P、 175L、 188P、 205P、 215M、 231P、 254Y、 280P、 330D、 及び/又は371Pの少なくとも１つ；
好ましくは  １K、
を含んで成り；但し配列番号３、配列番号４、配列番号６、及び配列番号９及び図１に列挙されるそれらの変異体ではない、フィターゼ。
【０２０１】
XIII. 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして次の変更：52C、 141C、 162C、 31C、 52C、 99C、 59C、 100C、 141 C/199C、 4P、 5P、 111P、 137P、 161P、 52E、 57Y、 76G、 107D、 107G、 109A、 1*、 1*/2*、 1*/2*/3*、 121T、 273L、 285G、 286Q、 299L、362K、 331K/55D、 107E、 46E、 82E、 119R、 119K、 164E、 223E、 276R、 276K、 362R、 379R、 379K、 385D、 410D、 410E、 411R、 411K、 53V、 121 D、 167Q、 196Q、 200K、 202N、 218Q、 241Q、 285N、 314N、 314G、406A、
179K/180E/181 K/182H/183Q/184*/185*/186*、 
179K/180E/181 K/182Q/183Q/184*/185*/186*、 
179K/180E/181 K/182K/183V/184*/1857186*、 
179K/180T/181 D/182K/183L/184*/185*/186*、 
111P/241Q、1K、 
114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L、 及び114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124Lの少なくとも１つ、
を含んで成るフィターゼ。
【０２０２】
XIV.配列番号２のフィターゼの変異体である実施態様１〜13のいずれか１つのフィターゼ。
XV.配列番号３のフィターゼの変異体である実施態様１〜13のいずれか１つのフィターゼ。
XVI.配列番号４のフィターゼの変異体である実施態様１〜13のいずれか１つのフィターゼ。
XVII.配列番号６のフィターゼの変異体である実施態様１〜13のいずれか１つのフィターゼ。
IIXX.配列番号９のフィターゼの変異体である実施態様１〜13のいずれか１つのフィターゼ。
【０２０３】
IXX．配列番号９に関連し、そして図１に列挙されるフィターゼ変異体のいずれか１つの変異体である実施態様１〜13のいずれか１つのフィターゼ。
XX. 図１の個々の列に列挙される置換及び置換の組合せから選択された置換又は置換の組合せを、さらに含んで成る実施態様１〜19のいずれか１つのフィターゼ。
XXI. 改良された熱安定性、改良されたpHプロフィール、改良された比活性、修正されたグリコシル化パターン、改良された温度プロフィール、動物飼料における改良された性能を有し、そして/又は可能性あるプロテアーゼ切断部位の変化を組込む実施態様１〜19のいずれか１つのフィターゼ。
【０２０４】
XXII. 実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸配列。
XXIII. 適切な発現宿主におけるフィターゼの生成を指図する１又は複数の制御配列に操作可能的に結合される実施態様XXIIの核酸配列を含んで成る核酸構造体。
XXIV. 実施態様XXIIIの核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
XXV. 実施態様XXIIIの核酸構造体及び/又は実施態様XXIVの発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
【０２０５】
XXVI. （ａ）フィターゼを含んで成る上清液を生成するために実施態様XXVの宿主細胞を栽培し；そして（ｂ）前記フィターゼを回収することを含んで成る、実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼの生成方法。
XXVII. 実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼを発現できるトランスジェニック植物又はその一部。
IIXXX. 実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼを発現できるトランスジェニック非ヒト動物、又はその生成物又は要素。
【０２０６】
IXXX. 実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼ、及び（ａ）少なくとも１つの脂溶性ビタミン；（ｂ）少なくとも１つの水溶性ビタミン；及び/又は（ｃ）少なくとも１つの微量鉱物を含んで成る組成物。
XXX. 次の酵素群：アミラーゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ及び/又はβ−グルカナーゼから選択された少なくとも１つの酵素をさらに含んで成る実施態様IXXの組成物。
XXXI. 動物飼料添加物である実施態様IXX〜XXXのいずれか１つの組成物。
XXXII. 50〜800g/kgの含有率の粗タンパク質を有し、そして実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼ、又は実施態様IXXX〜XXXIのいずれか１つの組成物を含んで成る動物用飼料組成物。
【０２０７】
XXXIII. 実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼ又は実施態様IXXX〜XXXIのいずれか１つの組成物を動物飼料に添加する、動物飼料の栄養価値を改良するための方法。
XXXIV. 有効量の実施態様XXXIIの飼料を動物に供給することを含んで成る、動物飼料におけるフィターゼレベルを低めるための方法。
XXXV. 植物性タンパク質の処理方法であって、少なくとも１つの植物性タンパク質又はタンパク質源に、実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼ又は実施態様IXXX〜XXXIのいずれか１つの組成物を添加する段階を含んで成る方法。
【０２０８】
XXXVI. 動物飼料への；動物飼料の調製への；動物飼料の栄養価値の改良への；動物飼料におけるフィテートレベルを低めるための；植物性タンパク質の処理への；又はフィターゼ基質からのリンの遊離のためへの、実施態様I〜XXIのいずれか１つのフィターゼ又は実施態様IXXX〜XXXIのいずれか１つの組成物の使用。
【０２０９】
a) 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し配列番号３、配列番号４及び配列番号６ではない、フィターゼ。
【０２１０】
a1) 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成り、但し(i) 31D/121T/316N/331E、 及び (ii) 31D/121N/316K/331E、 及び (iii) 31N/121N/316N/331Kを包含しない、フィターゼ。
【０２１１】
a2) 配列番号２に対して少なくとも74％の同一性を有し、そして下記のもの：
1 、2、3、4、5、31 、41 、46、52、53、55、57、59、74、76、82、84、91、99、100、104、105、107、109、111 、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、136、137、141、154、161、162、164、167、171、176、177、179、180、181、182、183、184、185、186、196、199、200、202、203、218、223、239、240、241、247、273、276、281、282、283、284、285、286、289、294、299、308、314、316、324、331 、339、351 、355、362、379、385、406、409、410及び411から選択された少なくとも１つの位置において、配列番号２に比較して、少なくとも１つの変更を含んで成る、フィターゼ。
【０２１２】
a3)  次の変更：1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つを含んで成り；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されている実施態様a2)のフィターゼ。
【０２１３】
a4) 次の変更：
(i) 31C、 46C1 52C、 59C、 91C、 99C、100C、141C、162C、176C、177C、199C、 及び/又は 247C; 
(ii) 4P、 5P、 41 P、 91 P、 111P、 136P、 137P、 154P、 161 P、 240P、 282P、283P、 284P、 289P、 及び/又は 355P;
(iii) 52E、 55D、I、 57Y、 76G、84Y、104A、105F、107D、G、 109A、G、 273L、Q、 285G、R、 286Q、 294T、 299L、 351Y、 及び/又は 362K; 
(iv) 1*、 1*/2*、 又は 1*/2*/3*; 
【０２１４】
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 が QADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ1 KEKKV、 又は KTDKLにより置換されている; 
(vi) 119K、R、 及び/又は 411K、R; 
(vii) 107E、 及び/又は 164D、E; 
(viii) 46D、E、 82E、 223E、 276K、R、 362K、R、379K、R、 385D、 409D、E、 及び/又は 410D、E; 
【０２１５】
(ix) 53V.Q、 121D、 167Q、 196Q、 200K、R、 202N、 218Q、 239Q、 241Q、 285N、 314G1N、 324N、 及び/又は 406A; 
(x) 114H、N、T 、115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K、 118I、L、M、T、 119G、K、S、 120K、S、T、Q、 121A、M、P、V、 122D、 123P、S、 及び/又は 124L、T、V；
(xi) 31T、 74A、 171T、 203T、 281H、 308A、 及び/又は 316D; 及び/又は
(xii) 339Dの少なくとも１つを含んで成る実施態様a2)〜a3)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２１６】
a5) 次の変更：
(i) 141C/199C、 91C/46C、 52C/99C、 31C/176C、 31C/177C、 59C/100C、 及び/又は 162C/247C;
(ii) 41P、 91 P、 136P、137P、154P、 161P、 355P、1 111P、 240P、 282P、 283P、 284P、 289P、 4P、 及び/又は 5P;
(iii) 52E、 551、 57Y、 104A/105F、 107D、G、109A、G、 76G、 84Y、 362K、 273L、Q、 285G、R、 286Q、 294T、 299L、 331K/55D、 及び/又は 351Y;
(iv) 1*、 1*/2*、 又は 1*/2*/3*;
【０２１７】
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 は
QADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV 又は KTDKLにより置換されている;
(vi) 119R、K、 及び/又は 411R、K; 
(vii) 107E、 及び/又は 164E、D;
(viii) 362R、K、 276R、K、 379R、K、 409D、E、 223E、 385D、 46D、E、 410D、E 及び/又は 82E;
(ix) 218Q、 324N、 200R、K、 121 D、 196Q、 202N、 406A、 167Q、 53V、Q、 241 Q、 314N、G、 239Q、 及び/又は 285N;  
【０２１８】
(x) 114H/115Q/116E/117K/118M/119G/120T/121M/122D/123P/124T、 114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121V/122D/123S/124L、
114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120K/121M/122D/123P/124V、
114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L、
114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121 A/122D/123P/124L、
114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L1 又は 114N/115Q/116A/117D/118L/119K/120K/121T/122D/123P/124L;
(xi) 31T、 74A、 171T、 203T、 281H、 308A、 及び/又は 316D; 及び/又は
(xii) 339Dの少なくとも１つを含んで成る実施態様a2)〜a4)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２１９】
ｂ) 次の変更：
1*、 2*、 3*、 4P、 5P、 31C、T、 41 P、 46C、D、E、 52C、E、 53V、Q、55D、I、 57Y、 59C、 74A、 76G、 82E、 84Y、 91C、P、 99C、 100C、 104A、 105F、 107D、E、G、 109A、G、 111P、 114H、N、T、 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K 118I、L、M、T、 119G、K、R、S、 12OK、S、T、Q、 121 A、D、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 124L、T、V、 136P、 137P、 141C、 154P、 161P、 162C、 164D、E、 167Q、 171T、 176C、177C、 179G、I、K、N、Q、 18OA、E、G、T、 181D、G、I、K、 182H、K、S、Q、 183A、L、P、S、V、Q、 184*、 185*、 186*、 196Q、 199C、200K、R、 202N、 203T、 218Q、 223E、 239Q、 240P、 241Q、 247C、 273L、Q、 276K、R、 281 H、 282P、 283P、 284P、 285G、N、R、 286K、Q、 289P、 294T、 299L、 308A、 314G、N、 316D、 324N、 331K、 339D、 351Y、 355P、 362K、R、 379K、R、 385D、 406A、 409D、E、41OD、E、及び/又は 411R、Kの少なくとも１つを含んで成り；そして/又は位置179、180、181 、182、183、184、185及び186におけるアミノ酸が、QADKP、GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又はKTDKLにより置換されている、の少なくとも１つを含んで成る実施態様a)〜a1)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２２０】
ｃ) 次の変更：
(i) 31 C、46C、52C、59C、 91 C、99C、10OC、141 C、162C、176C、177C、199C、及び/又は 247C; 
(ii) 4P、5P、41 P、91 P、111P、136P、137P、154P、161 P、240P、282P、283P、284P、289P 及び/又は 355P;
(iii) 52E、 55D、I、 57Y、 76G、 84Y、 104A、 105F、 107D、G、 109A、G、 121T、 273L、Q、285G.R、286Q、294T、299L、331 K、351Y、及び/又は 362K;
(iv) 1*、 1*72*. 又は 1*/2*/3*; 
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186はQADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又は KTDKLにより置換されている;
【０２２１】
(vi) 119K、R、 及び/又は 411 K、R;
(vii) 107E、及び/又は 164D、E;
(viii) 46D、E、 82E、 223E、 276K、R、 362K、R、 379K、R、 385D、 409D、E、 及び/又は 41OD、E; 
(ix) 53V、Q、 121D、 167Q、 196Q、 200K、R、 202N、 218Q、 239Q、 241Q、 285N、 314G、N、 324N、 及び/又は 406A;
(x) 114H、N、T 115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K、 118I、L、M、T、119G、K、S、 120K、S、T、Q112、A、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 及び/又は 124L、T、V;
(xi) 31T、 74A、 171T、 203T、 281H、 308A、 及び/又は 316D; 及び/又は 
(xii) 339Dの少なくとも１つを含んで成る上記実施態様のいずれか１つのフィターゼ。
【０２２２】
ｃ1) 次の変更：
(i) 31 C、 46C、 52C、 59C、 91C1 99C、 100C、 141 C、 162C、 176C、 177C、 199C、 及び/又は 247C、 好ましくは52C、99C、141C、 及び/又は 199C; 
(ii) 4P、 5P、41P、91P、111P、136P、137P、154P、161P、240P、282P、283P、284P、289P、及び/又は 355P、好ましくは4P、5P、111P;
(iii) 52E、 55D、I、57Y、76G、 84Y、104A、105F、107D、G、 109A、G、 121T、 273L、Q、 285G、R、286Q、 294T、 299L、331 K、351Y、 及び/又は 362K、 好ましくは 57Y、76G、107G、273L、286Q 及び/又は362K; 
(iv) 1*、 1<*>/2*、 又は 1*/2*/3*;
【０２２３】
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 は、QADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又は KTDKL、好ましくはKEKKVにより置換されている;
(vi) 119K、R、及び/又は 411 K、R、好ましくは119K;
(vii) 107E、及び/又は 164D、E; 
(viii) 46D、E、 82E、 223E、 276K、R、 362K、R、 379K、R、 385D、 409D1、E、 及び/又は 410D、E 好ましくは46E、、223E、 362K、R、 及び/又は 379K、R;
(ix) 53V、Q、 121D、 167Q、 196Q、200K、R、 202N、 218Q、 239Q、 241Q、285N、 314G、N、 324N、 及び/又は 406A、 好ましくは 53V、 121D、 196Q、 200K、 202N、 218Q、 241Q、 314N、 及び/又は 406A;
【０２２４】
(x) 114H、N、T 、115Q、 116A、E、P、T、Q、 117D、E、K、 118I、L、M、T 、119G、K、S、 120K、S、T、Q、121A、M、P、T、V、 122D、 123P、S、 及び/又は 124L、T、V 好ましくは 114T、 115Q、 116A、T、 117D、 118T、19K、S、 120S、 121 P、 122D、 123P、 及び/又は 124L; 
(xi) 31T、 74A、 171T、 203T、 281H、 308A、 及び/又は 316D; 及び/又は
(xii) 339Dの少なくとも１つを含んで成る上記実施態様のいずれか１つのフィターゼ。
【０２２５】
d) 改良された性質を有する上記実施態様のいずれか１つのフィターゼ。
e) 実施態様３の特徴(i)、 (ii)、 (iii)、 (iv)、 (v)、 (vi)、 (vii)、 (viii)、 (x)、 (xi) 及び/又は (xii)の１又は複数の変更を含んで成り、そして改良された熱安定性を有する実施態様c) 又は c1)のフィターゼ。
f) 実施態様c)の特徴(ix) 及び/又は (x) の１又は複数の変更を含んで成り、そして改良されたpHプロフィールを有する実施態様c) 又は c1)のフィターゼ。
g) 実施態様c)の特徴(x)の１又は複数の変更を含んで成り、そして改良された比活性を有する実施態様c) 又は c1)のフィターゼ。
【０２２６】
h) 実施態様c)の特徴(xi)の１又は複数の変更を含んで成り、そして修復されたグリコシル化パターンを有する実施態様c) 又は c1)のフィターゼ。
i) 実施態様c)の特徴(xii)の１又は複数の変更を含んで成り、そして可能性ある切断部位を有する実施態様c) 又は c1)のフィターゼ。
【０２２７】
j)次の変更：
(i) 141C/199C、91C/46C、52C/99C、31C/176C、31C/177C、59C/100C、 及び/又は 162C/247C;
(ii) 41P、91P、136P、137P、154P、161P、355P、111P、240P、282P、283P、284P、289P、4P、 及び/又は 5P;
(iii) 52E、 551、57Y、104A/105F、107D、G、109A、G、76G、84Y、121T、362K、273L、Q、285G、R、286Q、294T、299L、331K/55D、及び/又は 351Y;
(iv) 1*、1*/2*、 又は 1*/2*/3*;
【０２２８】
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 は、QADKP、 GEDKP、 NGlSA、IAGKS、KEKHQ、KEKQQ、KEKKV1 又は KTDKLにより置換されている;
(vi) 119R、K、及び/又は 411R、K; 
(vii) 107E、 及び/又は 164E、D;
(viii) 362R、K、 276R、K、 379R、K、 409D、E、 223E、 385D、 46D、E、41 OD、E、 及び/又は 82E;
(ix) 218Q、324N、200R、K、121 D196Q、202N、406A、167Q、53V、Q、241Q、314N、G、239Q、及び/又は 285N;
【０２２９】
(x) 114H/115Q/116E/117K/118M/119G/120T/121 M/122D/123P/124T、 114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121V/122D/123S/124L、
114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120K/121M/122D/123P/124V、
114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L、 114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121A/122D/123P/124L、
114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L、 又は
114N/115Q/116A/117D/118L/119K/120K/121T/122D/123P/124L;
(xi) 31T、74A、171T、203T、281H、316D、及び/又は 308A; 及び/又は 
(xii) 339Dの少なくとも１つを含んで成るa1)-a5)を包含する実施態様a)-d)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２３０】
k)次の変更：
(i) K141C/V199C、 Q91C/W46C、 G52C/A99C、 N31C/E176C、 N31C/T177C、 G59C/F100C、 及び/又は S162C/S247C; 
(ii) D41P、 Q91P、 N136P、 T137P、 L154P、 S161P、 T355P、 Q111P、 K240P、 G282P、 T283P、T284P、 G289P、 N4P、 及び/又は G5P;
(iii) G52E、 V55I、 E57Y、 L104A/A105F、 K107D、G、 Q109A、G、 T76G、 A84Y、 N121T、 I362K、M273L、Q、 E285G、R、 N286Q、 V294T、 I299L、 E331K/V55D、 及び/又は F351Y;
【０２３１】
(iv) E1*、 E1*/E2*、 又は E1*/E2*/Q3*; 
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186は、QADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又は KTDKLにより置換されている;
(vi) E119R、K、 及び/又は E411R、K;
(vii) K107E、 及び/又は R164E、D;
(viii) I362R、K、 T276R、K、 I379R.、K、 V409D、E、 Q223E、 N385D、 W46D、E、 T410D、E、 及び/又は Q82E;
【０２３２】
(ix) E218Q、 D324N、 T200R、K、 N121D、 E196Q、 D202N、 E406A、 E167Q、 E53V、Q、 E241Q、D314N、G、 E239Q、 及び/又は E285N;
(x) Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/N121M/L124T、
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S、
Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V、
Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P、 
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A、
Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P、 又は 
Y114N/K116A/E118L/E119K/N121T;
【０２３３】
(xi) N31T、 N74A、 N171T、 N203T、 N281H、 N316D、 及び/又は N308A; 及び/又は
(xii) R339Dの少なくとも１つを含んで成るa1)-a5) 及びc1)を包含する実施態様a)-d)のいずれか１つのフィターゼ。
l)配列番号２の変異体である実施態様k)のフィターゼ。
【０２３４】
m) 次の変更：
(i) T141C/V199C、 Q91C/W46C、 G52C/A99C、 D31C/E176C、 D31C/T177C、 G59C/F100C、 及び/又は S162C/S247C; 
(ii) D41P、 Q91P、 N136P、 T137P、 L154P、 S161P、 T355P、 Q111P、 K240P、 G282P、 T283P、T284P、 G289P、 N4P、 及び/又は G5P;
(iii) G52E、 V55I、 E57Y、 L104A/A105F、 K107D、G、 Q109A、G、 T76G、 A84Y、 I362K、 M273L、Q、 E285G、R、 N286Q、 V294T、 I299L、 E331K/V55D、 及び/又は F351Y;
【０２３５】
(iv) E1*、 E1*/E2*、 又は E1*/E2*/Q3*;
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 は、QADKP、 GEDKP、 NGISA1 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又は KTDKLにより置換されている; 
(vi) E119R、K、 及び/又は E411R、K;
(vii) K107E、 R164E、D;
(viii) I362R、K、 T276R、K、 1379R、K、 V409D、E、 Q223E、 N385D、 W46D、E、 T41 OD、E、Q82E;
(ix) E218Q、 D324N、 T200R、K、 T121D、 E196Q、 D202N、 E406A、 E167Q、 E53V、Q、 E241Q、D314N、G、 E239Q、 及び/又は E285N; 
【０２３６】
(x) Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/T121 M/L124T、
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121V/P123S、
Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/T121M/L124V、
Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/T121P/、 
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121A/、
Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/T121 P、 又は 
Y114N/K116A/E118L/E119K; 
(xi) N74A、 N171T、 N203T、 N281H、 N316D、 及び/又は N308A; 及び/又は
(xii) R339Dの少なくとも１つを含んで成るa1)-a5) 及びc1)を包含する実施態様a)-d)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２３７】
n)配列番号４の変異体である実施態様m)のフィターゼ。
o) 次の変更：
(i) K141 C/V199C、 Q91C/W46C、 G52C/A99C、 D31C/E176C、 D31C/T177C、 G59C/F100C、 及び/又は S162C/S247C;
(ii) D41P、 Q91P、 N136P、 T137P、 L154P、 S161P、 T355P、 Q111P、 K240P、 G282P、 T283P、T284P、 G289P、 N4P、 及び/又は G5P;
(iii) G52E、 V55I、 E57Y、 L104A/A105F、 K107D、G、 Q109A、G、 T76G、 A84Y、 N121T、 I362K、 M273L.Q、 E285G、R、 N286Q、 V294T、 I299L、 E331K/V55D、 及び/又は F351Y;
【０２３８】
(iv) E1*、E1*/E2*、 又は E1*/E2*/Q3*;
(v) K179、 T180、 T181、 E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 は、QADKP、 GEDKP1 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又は KTDKLにより置換されている;
(vi) E119R、K、 及び/又は E411R、K; 
(vii) K107E、 及び/又は R164E、D;
(viii) I362R、K、 T276R、K、 I379R、K、 V409D、E、 Q223E、 N385D、 W46D、E、 T410D、E、 及び又はQ82E;
(ix) E218Q、 D324N、 T200R、K、 N121D、 E196Q、 D202N、 E406A、 E167Q、 E53V、Q、 E241Q、D314N、G、 E239Q、 及び/又は E285N; 
【０２３９】
(x) Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/N121IV1/L124T、
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S、
Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V、 
Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P、 
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A、
Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P、 又は 
Y114N/K116A/E118L/E119K/N121T;
(xi) N74A、 N171T、 N203T、 N281H、 及び/又は N308A; 及び/又は
(xii) R339Dの少なくとも１つを含んで成るa1)-a5) 及びc1)を包含する実施態様a)-d)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２４０】
p)配列番号３の変異体である実施態様o)のフィターゼ。
q) 次の変更：
(i) K141 C/V199C、 Q91 C/W46C、 G52C/A99C、 N31C/E176C、 N31C/T177C、 G59C/F100C、 及び/又は S162C/S247C; 
(ii) D41P、 Q91P、 N136P、 T137P、 L154P、 S161P、 T355P、 Q111P、 K240P、 G282P、 T283P、T284P、 G289P、 N4P、 及び/又は G5P;
(iii) G52E、 V551、 E57Y、 L104A/A105F、 K107D、G、 Q109A、G、 T76G、 A84Y、 N121T、 I362K、M273L、Q, E285G、R、 N286Q、 V294T、 I299L、 V55D、 及び/又は F351Y;
【０２４１】
(iv) E1*、 E1*/E2*、 又は E1*/E2*/Q3*; 
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 は、QADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又は KTDKLにより置換されている;
(vi) E119R、K、 及び/又は E411R、K;
(vii) K107E、 及び/又は R164E、D;
(viii) I362R、K、 T276R、K、 1379R、K、 V409D、E、 Q223E、 N385D、 W46D、E、 T410D、E、 及び/又は Q82E;
(ix) E218Q、 D324N、 T200R、K、 N121 D、 E196Q、 D202N、 E406A、 E167Q、 E53V、Q、 E241Q、D314N、G、 E239Q、 及び/又は E285N;
【０２４２】
(x) Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/N121M/L124T、
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S、
Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V、
Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P、 
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A、
Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P、 又は 
Y114N/K116A/E118L/E119K/N121T;
(xi) N31T、 N74A、 N171T、 N203T、 N281H、 N316D、 及び/又は N308A; 及び/又は
(xii) R339Dの少なくとも１つを含んで成るa1)-a5) 及びc1)を包含する実施態様a)-d)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２４３】
r)配列番号６の変異体である実施態様q)のフィターゼ。
s) 次の変更：
(i) K141C/V199C、 Q91C/W46C、 G52C/A99C、 D31C/E176C、 D31C/T177C、 G59C/F100C、 及び/又は S162C/S247C; 
(ii) D41 P、 Q91P、 N136P、 T137P、 L154P、 S161 P、 T355P、 Q111P、 K240P、 G282P、 T283P、T284P、 G289P、 N4P、 及び/又は G5P;
(iii) G52E、 V55I、 E57Y、 L104A/A105F、 K107D、G、 Q109A、G、 T76G、 A84Y、 I362K、 M273L、Q、 E285G、R、 N286Q、 V294T、 I299L、 E331K/V55D、 及び/又は F351Y;
【０２４４】
(iv) E1*、 E1*/E2*、 又は E1*/E2*/P3*;
(v) K179、 T180、 T181、E182、 K183、 S184、 T185、 及び K186 は、QADKP、 GEDKP、 NGISA、 IAGKS、 KEKHQ、 KEKQQ、 KEKKV、 又は KTDKLにより置換されている; 
(vi) E119R、K、 及び/又は E411R、K;
(vii) K107E、 及び/又は R164E、D;
(viii) I362R、K、 T276R、K、 I379R、K、 V409D、E、 Q223E、 N385D、 W46D、E、T410D、E、及び/又はQ82E;
【０２４５】
(ix) E218Q、 D324N、 T200R、K、 T121 D、 E196Q、 D202N、 E406A、 E167Q、 E53V、Q、 E241Q、 D314N、G、 E239Q、 及び/又は E285N;
(x) Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/T121M/L124T、
Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121V/P123S、
Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/T121M/L124V、
Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/T121 P、 Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121A、
Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/T121 P、 又は
Y114N/K116A/E118L/E119K;
(xi) D31T、 N74A、 N171T、 N203T、 N281 H、 N316D、 及び/又は N308A; 及び/又は
(xii) R339Dの少なくとも１つを含んで成るa1)-a5)及びc1)を包含する実施態様a)-d)のいずれか１つのフィターゼ。
【０２４６】
t) 配列番号９の変異体である実施態様s)のフィターゼ。
u) a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-d)のいずれかのフィターゼをコードする核酸配列を含んで成る単離された核酸配列。
v) 適切な発現宿主におけるフィターゼの生成を方向ずける１又は複数の制御配列に操作可能的に結合される実施態様u)の核酸配列を含んで成る核酸構造体。
w) v)の実施態様の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
x) 実施態様v)の核酸構造体及び/又は実施態様w)の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
y) （ａ）前記フィターゼを含んで成る上清液を生成するために実施態様x)の宿主細胞を栽培し；そして（ｂ）前記フィターゼを回収することを含んで成る、a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-d)のいずれかのフィターゼの生成方法。
z) a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-t )のいずれか１つのフィターゼを発現できるトランスジェニック植物又はその一部。
【０２４７】
ae) a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-t )のいずれか１つのフィターゼを発現できるトランスジェニック非ヒト動物、又はその生成物又は要素。
oe) a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-t )の少なくとも１つのフィターゼ、及び（ａ）少なくとも１つの脂溶性ビタミン；（ｂ）少なくとも１つの水溶性ビタミン；及び/又は（ｃ）少なくとも１つの微量鉱物を含んで成る組成物。
【０２４８】
aa)次の酵素群：アミラーゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ及び/又はβ−グルカナーゼから選択された少なくとも１つの酵素をさらに含んで成る実施態様oe)の組成物。
bb)動物飼料添加物である実施態様oe)−aa)のいずれか１つの組成物。
cc)50〜800g/kgの含有率の粗タンパク質を有し、そしてa1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-t )のいずれか１つのフィターゼ、又は実施態様oe)−aa)のいずれか１つの組成物を含んで成る動物用飼料組成物。
【０２４９】
dd) a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-t )のいずれか１つのフィターゼ又は実施態様oe)−aa)のいずれか１つの組成物を動物飼料に添加する、動物飼料の栄養価値を改良するための方法。
ee)有効量の実施態様cc)の飼料を動物に供給することを含んで成る、動物飼料におけるフィターゼレベルを低めるための方法。
【０２５０】
ff)植物性タンパク質の処理方法であって、少なくとも１つの植物性タンパク質又はタンパク質源に、a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-t )のいずれか１つのフィターゼ又は実施態様oe)−aa)のいずれか１つの組成物を添加する段階を含んで成る方法。
gg)動物飼料への；動物飼料の調製への；動物飼料の栄養価値の改良への；動物飼料におけるフィテートレベルを低めるための；植物性タンパク質の処理への；又はフィターゼ基質からのリンの遊離のためへの、a1)−a5)及びc1)を包含する実施態様a)-t )のいずれか１つのフィターゼ又実施態様oe)−aa)のいずれか１つの組成物の使用。
【０２５１】
本明細書及び請求項に記載される発明は、それらの実施態様は本発明を単に例示するものであるので、本明細書に開示される特定の実施態様によりその範囲を制限されない。いずれかの同等の実施態様は、本発明の範囲内に包含される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの他に、本発明の種々の修飾は、当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は本発明の範囲内にある。
【実施例】
【０２５２】
使用される化学物質は、少なくとも試薬品種の市販の製品である。
例１：変異体の調製、及び熱安定性及びpHプロフィールの試験：
フィターゼ変異体の調製：
配列番号２のアミノ酸配列を有するフィターゼの異変体をコードするDNAを、当業界において知られている方法により生成し、そしてその構造体を、Takami など., Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:1455 (1992)により記載されるシグナルペプチドをコードするDNAに、PCRにより融合し、そして標準技法を用いて、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）宿主細胞（Diderichsenなど (1990), J. Bacteriol., 172, 4315-4321を参照のこと）のゲノム中に、相同組換えにより組込む。前記遺伝子を、三重プロモーターシステムの制御下で発現し（WO99/43835号に記載されるように）、そして得られるフィターゼタンパク質を、従来の方法を用いて精製する。
【０２５３】
温度安定性の決定：
フィターゼ変異体の温度安定性を、次の手段で決定することができる：前記変異体及び1ml当たり約10μgのタンパク質を有する対照タンパク質（配列番号２，３，４及び/又は６）の0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）に溶解されたタンパク質溶液500μlを、２つの部分に分け、１つの部分をプラスチック容器において、所望する高められた温度（例えば、50℃、 55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、又は85℃、）でインキュベートし、他の部分を5℃で貯蔵する。
【０２５４】
高温での30分間のインキュベーションの後、タンパク質溶液を氷浴に移し、そして冷却された、及び加熱されたサンプルの活性を、下記に記載されるホスファターゼアッセイにより測定する（緩衝液ブラインドは控除される）。残留活性は、冷却されたサンプルの活性により割算された、熱処理後の活性（％）として定義される。変異体は、ホスファターゼ、又はフィターゼにおける残留活性が、対照に比較して、高い場合、より温度安定性（熱安定性）であると思われる。
【０２５５】
ホスファターゼ活性の決定：
75μlのフィターゼ含有酵素溶液を、マイクロタイタープレートのウェル、例えばNUNC269620に分散し、そして75μlの基質を添加する（基質の調製のためには、２個の5mgのｐ−ニトロフェニルホスフェート錠剤（Sigma, カタログ番号N−9389）を、10mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）に溶解する）。プレートを密閉し、そして37℃で15分間、750rpmで振盪しながらインキュベートする。インキュベーションの後、75μlの停止試薬を添加し（停止試薬は水中、0.1Mの四硼酸二ナトリウムである）、そして405nmでの吸光度をマイクロタイタープレート分光計により測定する。１ホスファターゼ単位は、所定の反応条件下で１分当たり１μモルのリン酸を放す酵素活性として定義される（緩衝液ブラインドは控除された）。１μモルのp−ニトロフェノールの吸光度は、アッセイ条件下で56AU（AU＝吸光度単位）であることが決定される。
【０２５６】
DSC測定：
示差走査熱量法（DSC）を、Micro CalからのVP-DSCを用いて、種々のpH値で行う。操作を、20〜90℃で1.5℃/分の一定走査速度で行う。DSCの実施の前、フィターゼを、適切な緩衝液（例えば、0.1Mのグリシン−HCl、pH2.5又は3.0；20mMの酢酸ナトリウムpH4.0；0.1Mの酢酸ナトリウムpH5.5；0.1Mのトリス−HCl、pH7.0）により平衡化されたNAP-5カラム（Pharmacia）を用いて脱塩する。データ処理を、MicroCal Originソフトウェアー（バージョン4.10）を用いて実施し、そして変性温度Td（又は、融解温度Tmと呼ばれる）を、サーモグラムにおけるピークの頂点での温度として定義する。
【０２５７】
修正されたpHプロフィール；pH3.5/5.5活性比の決定：
フィターゼ変異体のpHプロフィールの修正を、次の通りにして決定することができる：活性をpH3.5（0.1Mの酢酸緩衝液、pH3.5）及びpH5.5（0.1Mの酢酸緩衝液、pH5.5）で測定し、両者の場合、緩衝液ブラインドは控除される。pH3.5で測定された活性をpH5.5で決定された活性により割算し、すなわち２つの吸光度を分割する（下記の参照のこと）。活性を測定するために、変異体及び対照の上清液を、それぞれの緩衝液において適切に希釈する（例えば、１：5000）。
【０２５８】
75μlのそれぞれの酵素溶液を、マイクロタイタープレートウェル、例えばNUNC269620に分散し、そしてその対応するpHを有する基質75μlを添加する（基質は、２つの5mgのp−ニトロフェニルリン酸錠剤（Sigma, カタログ番号N−9389）を、10mlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5及び10mlの0.1Mの酢酸緩衝液、pH3.5に溶解することにより調製する）。プレートを密封し、そして37℃で15分間、750rpmで振盪しながらインキュベートする。インキュベーションの後、75μlの停止（水中、0.1Mの四硼酸二ナトリウム）試薬を添加し、そして405nmでの吸光度を、マイクロタイタープレート分光計により測定する。
【０２５９】
フィターゼ活性の測定：
適切に希釈された（例えば、0.25Mの酢酸ナトリウム、0.005％（w/v）Tween−20、pH5.5）、フィターゼ含有酵素溶液75μlを、マイクロタイタープレートウェル、例えばNUNC269620に分散し、そして75μlの基質を添加する（10mlの0.25M酢酸ナトリウム（pH5.5）に、米からのフィチン酸ナトリウム（Aldrichカタログ番号274321）100mgを溶解することにより調製する）。プレートを密封し、そして37℃で15分間、750rpmで振盪しながらインキュベートする。インキュベーションの後、75μlの停止試薬を添加し（前記停止試薬は、10mlのモリブデン酸溶液（0.25％（w/v）アンモニア溶液中、10％（w/v）アンモニウムヘプタ−モリブデート）；10mlのバナジン酸アンモニウム（Bie＆Berntsenからの市販の0.24％製品、カタログ番号LAB17650）及び21.7％（w/v）の硝酸）を混合することにより調製される）、405nmでの吸光度をマイクロタイタープレート分光計により測定する。フィターゼ活性をFYTの単位で表し、１FYTとは、上記条件下で、１分当たり1μモルの無機オルト−ホスフェートを放す酵素の量である。測定されるフィターゼ活性についての絶対値を、無機ホスフェートの適切な希釈から調整された標準曲線（既知活性を有するそのような標準酵素調製物は必要に応じ、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerdから入手できる）に対する参照により得る。
【０２６０】
例２：熱安定性に対する発現宿主/グリコシル化の影響：
バチルスにおける発現：
配列番号２のフィターゼを、例１に記載のようにして、バチルス・サブチリスにおいて発現し、そして次の従来の方法を用いて精製した：遠心分離、細菌濾過、硫酸アンモニウム沈殿（80％硫酸アンモニウム溶液）、遠心分離、緩衝液A（50mMの酢酸ナトリウム、1.5Mの硫酸アンモニウム、pH4.5）へのペレットの再懸濁、濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Phenyl Toyopearl, 緩衝液Aによる充填、緩衝液B（50mMの酢酸ナトリウム、pH4.5）による溶出）、及びカチオン交換のクロマトグラフィー（SP−セファロース、10mMのクエン酸ナトリウム、pH4.0による充填、線状塩グラジエント（10mMのクエン酸ナトリウムpH4.0＋１MのNaCl）による溶出）。
【０２６１】
ピチア（Pichia）における発現：
さらに、配列番号２のフィターゼを、のロドリゲスなど、Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 382, no. 1, 2000, pp. 105-112により一般的に記載のようにして、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）において発現した。フィターゼを、次の通りにして、発酵ブイヨンの上清液から精製した：硫酸アンモニウム（80％飽和）による沈殿、10mlの25mM硫酸ナトリウムpH4.5への再溶解、同じ緩衝液に対する透析、及び0.45mmのフィルターを通しての濾過。150mlのこの溶液を、同じ緩衝液pH4.5により平衡化された、40mlのSP Sepharose FFカラム（Pharmacia）に適用し、そしてタンパク質を線状NaClグラジエント（0〜0.5M）により溶出した。カラムからの画分を、フィターゼ活性について分析した。フィターゼ活性を有する画分を、SDS−PAGEにより調べ、そして純粋な画分をプールした。タンパク質濃度を、BCAキット（Pierce）を用いて測定した。
【０２６２】
DSCによる熱安定性：
配列番号２のピチア−及びバチルス−発現されたフィターゼを、示差走査熱量法（DSC）による熱安定性測定にゆだねた。
【０２６３】
サンプル調製：
サンプル（3ml以下の体積）を、500mlの20M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）に対して、最少１時間、冷たい室（約5℃の遠心分離機）において透析した。サンプルを500mlの新鮮な冷緩衝液調製物に移し、そして一晩、透析した。サンプルを、0.45μlの注射器フィルターを用いて濾過し、透析緩衝液を用いて、体積を約1.5mlの調節し、そしてA280（280nmでの吸光度）を記録した。透析緩衝液を、DSC走査において対照として使用した。サンプルを、真空吸引を用い、そして約10分間、撹拌し、ガス抜きした。
【０２６４】
ピチア−発現されたフィターゼのサンプル調製の間（20mM酢酸ナトリウム（NaAc）pH4.0に対する透析）、沈殿物が形成された。上清液を、第１の実験のために使用した。その後、精製された原液の残る部分を、20mMのNaAc（pH4.0）に対して透析し、そしてこれを、バッチに存在するいくらかの低Mw不純物の沈殿を可能にした。このバッチを、最初の実験に非常に類似するTmを表す第２の実験のために使用した（54℃対55℃）。
【０２６５】
DSC実験：
MicroCalTMVP-DSC装置を用いて実験設定：走査速度：90ｋ/時、走査間隔：20〜90℃センチグレード、フィードバックモード：なし、濾過期間：16秒。
サンプルの酵素濃度は、A280及び280nmでの理論的に計算された吸光係数（Vector NTIバージョン9.0.0）により評価される場合、約１〜1.5mg/mlであった。熱により折りたたまない温度（Td）を、MicroCal Originソフトウェア（バージョン4.10）を用いて評価し、そして変性温度をサーモグラムにおける頂点での温度として決定した。
結果が下記表２に要約される。
【０２６６】
【表２】
2009532043.tif 000004
【０２６７】
表２から、ピチア−発現されたフィターゼはバチルス−発現されたフィターゼよりもより低い熱安定性であることが明白である。
ピチア−発現されたフィターゼは、質量分析法（Maldi-TOF）を用いて広範囲の分子質量により可視化される場合、重度にグリコシル化され、ところがバチルス−発現されたフィターゼではグリコシル化されなかった。
【０２６８】
例３：フィターゼ変異体R339D：
置換R339を有する配列番号２のフィターゼのタンパク質−構築された変異体を調製し、そして当業界において知られている方法を用いて、アスペルギラス・オリザエにおいて発現した。その変性温度Tdを、例２に記載のようにしてDSCを用いて、62.5℃（20mMの酢酸ナトリウム、pH4.0）に決定した。
さらに、R339D置換は、アスペルギラスにおける発現のための可能性ある関連物のKex2プロテアーゼ切断部位を除去するよう作用する。
【０２６９】
例４：フィターゼ変異体を含んで成る動物飼料及び動物飼料添加物：
動物飼料添加物：
0.15gのフィターゼ酵素タンパク質を含む、配列番号２のフィターゼ変異体R339Dの配合物を、次のプレミックスに添加する（プレミックスに1kg当たり）：
5000000IE     ビタミンA
1000000IE     ビタミンD3
13333  mg     ビタミンE
1000   mg     ビタミンK3
750    mg     ビタミンB1
2500   mg     ビタミンB2
1500   mg     ビタミンB6
7666   mcg    ビタミンB12
12333  mg     Niacin
【０２７０】
33333  mcg    Biotin
300    mg     葉酸
3000   mg     Ca-D-Panthothenate
1666   mg     Cu
16666  mg     Fe
16666  mg     Zn
23333  mg     Mn
133    mg     Co
66     mg     I
66     mg     Se
5.8    %      カルシウム
25     %      ナトリウム
【０２７１】
動物用飼料：
これは、配列番号２のフィターゼ変異体R339D1.5mg/kg（1.5ppm）を含んで成る動物用飼料（ブロイラー飼料）の例である（フィターゼ酵素タンパク質として計算された）：
62.55％のトウモロコシ
33.8％の大豆ミール（50％粗タンパク質、CP）
1.0％の大豆油
0.2％のDL−メチオニン
0.22％のDCP（リン酸二カルシウム）
0.76％のCaCO3（炭酸カルシウム）
0.32％の砂
0.15％のNaCl（塩化ナトリウム）
１％の上記プレミックス。
【０２７２】
上記成分を混合し、そして飼料を、所望する温度、例えば60, 65, 75, 80, 85, 90又はさらに95℃でペレット化する。
例５：温度安定性の決定：
配列番号２の８種の変異体（配列番号２に比較しての変更が下記表３に示されている）を、例１に記載のようにして調製した。配列番号２及び３を有する２種の対照フィターゼを、同じ態様で調製した。
【０２７３】
温度安定性を次の通りにして決定した：
変異体及び対照タンパク質の個々の上清液200μlを２つの部分に分け、１つの部分をプラスチック容器において50℃でインキュベートし、他の部分を5℃で貯蔵した。50℃での30分インキュベーションの後、そのタンパク質溶液を氷浴に移した。0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）における１：100の希釈の後、冷却された、及び加熱されたサンプルの活性を、例１のホスファターゼアッセイ（“ホスファターゼ活性の決定”）により測定し、ここで緩衝液ブラインドは控除された。結果は、それぞれ5℃及び50℃での30分間のインキュベーションの後、酵素活性（吸収単位（AUでの））として表３に示され、そして残留活性（RA）は、％での冷却されたサンプル（5℃でのインキュベーション）の活性により割算された、加熱処理されたサンプルの活性として計算される。
【０２７４】
【表３】
2009532043.tif 000005
【０２７５】
例６：インビトロモデルでの動物飼料における性能：
フィターゼ変異体の動物飼料における性能を、インビトロモデルにおいて、対照タンパク質、例えば配列番号２，３，４及び/又は６の性能に比較する。インビトロモデルは、単一胃の動物における胃腸条件をシュミレートし、そしてインビボでの動物試験に包含される結果と十分に相互関係する。その比較を次の通りにして行う：
変異体サンプルにおけるフィターゼ活性を、“フィターゼ活性の決定”下で例１に記載のようにして決定する。
【０２７６】
30％の大豆ミール及び70％のトウモロコシミール、並びに1kgの飼料当り5gのカルシウムの濃度にするために添加されるCaCl2から構成される飼料サンプルを調製し、そして40℃及びpH3.0で30分間プレインキュベーションし、続いてペプシン（3000U/g飼料）及び適切な用量、例えばg飼料当り0.25〜0.75フィターゼ単位（FYT）のフィターゼ（同一の投与量が、比較を可能にするために試験されるべきすべてのフィターゼのために使用される）を添加する。フィターゼ活性を有さないブランクがまた、対照として包含される。次に、サンプルを、40℃及びpH3.0で60分間、続いてpH4.0で30分間インキュベートする。
【０２７７】
反応を停止し、そしてフィチン酸及びイノシトール−リン酸を、HClを0.5Mの最終濃度まで添加し、そして40℃で２時間インキュベートすることにより抽出し、続いて１回の凍結−融解サイクル及び40℃での１時間のインキュベーションを行う。
フィチン酸及びイノシトール−リン酸を、Chen など., Journal of Chromatography A (2003) vol. 1018, pp. 41- 52により記載のようにして、高性能イオンクロマトグラフィーにより分離し、そしてSkoglund など., J. Agric. Food Chem. (1997), vol. 45, pp. 431-436により記載のようにして、定量化する。
【０２７８】
次に、放されたリンを、フィターゼ処理されたサンプルと、処理されていないサンプルとの間でのイノシトール−リン酸結合されたリン（IP-P）の差異として計算する。変異体の相対的性能を、対照フィターゼにより放されるリンの％として計算する。
配列番号２の多くのフィターゼ変異体のインビトロ性能を、上記のようにして、kg飼料当たり125FYTの投与量で決定した。
【０２７９】
結果は、それぞれ上清液及び精製されたフィターゼについて、下記表4A及び4Bに示される。残留IP6-Pは、インビトロインキュベーションの後、残留するIP6-P（フィチン酸リン）の量を示し、そしてそれはmg/gDM（乾燥物質）で示される。分解されたIP6-Pは、ブランクの残留IP6-Pと、それぞれのサンプルの残留IP6-Pとの間の差異として決定される。最終的に、最後の欄において、分解されたIP6-Pは、配列番号２を有するフィターゼに対して示される。表4Aにおいて、ブランク及び対照（配列番号２）値は、多くの独立した測定値からの平均であり、そして他の値は単一の測定値に基づかれている。表4Bにおいては、ブランク値は多くの独立した測定値からの平均であり、そして他の値は単一の測定値に基づかれている。
【０２８０】
【表４Ａ】
2009532043.tif 000006
【０２８１】
変異体015, 016, 018, 040, 041 , 042, 044及び050は、配列番号２及び３のフィターゼよりも少なくとも良好であるか又はより良好であるインビトロ性能を有すると思われる。
【０２８２】
【表４Ｂ】
2009532043.tif 000007
【０２８３】
変異体030, 031 , 037, 056, 072, 085, 087, 089, 090, 095, 098及び125は、配列番号３のフィターゼと少なくとも同じようにインビトロで遂行すると思われる。
【０２８４】
例７：比活性：
フィターゼ変異体の比活性を、250mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）に対して透析された、高く精製されたサンプルに対して決定した。純度を、わずか１つの成分の存在を示すSDSポリアクリルアミドゲル上であらかじめ調べた。
【０２８５】
タンパク質濃度を、次の通りにアミノ酸分析により決定した：サンプルのアリコートを、排気されたガラス管において110℃で16時間、6NのHCl、0.1％のフェノールにおいて加水分解した。得られるアミノ酸を、製造業者の説明書に従って作動されるApplied Biosystems 420Aアミノ酸分析システムを用いて定量化した。アミノ酸の量から、合計の質量、及び従ってまた、加水分解されたアリコートにおけるタンパク質の濃度が計算され得る。
【０２８６】
フィターゼ活性を、例１に記載のようにして（“フィターゼ活性の決定”）、FYTの単位で決定し、そしてその比活性を、mgフィターゼ変異体酵素タンパク質当たり、FYT単位で測定されるフィターゼ活性として計算する。
配列番号２のフィターゼ及び変異体072（配列番号２のI362R）の比活性を上記のようにして決定した。変異体072の比活性は、配列番号２のフィターゼの比活性の86％であった。不確定（標準偏差）を約10％に見積もり、これは、主に複雑な基質に基づくフィターゼ活性アッセイのためである。
【０２８７】
例８：温度安定性：
配列番号２の多くの変異体を、例１に記載のようにして調製し、そしてバチルス・サブチリス宿主株を、500mlの振盪フラスコにおける100mlのPS1倍地（100g/lのスクロース、40g/lの大豆フレーク、10g/lのNa2HPO4・12H2O, 0.1ml/lのDowfax 63N10（Dow））において、30℃、300rpmで４日間、増殖した。
【０２８８】
２種の対照フィターゼ、すなわち配列番号３を有するフィターゼ（配列番号２の変異体N31 D/Q139K/L197F/N316Kに対応する）、及び配列番号４を有するフィターゼ（配列番号２の変異体N31D/N121T/K132T/Q139Kに対応する）を、同じ態様で調製した。
また、配列番号９を有するフィターゼ（配列番号２の変異体Q3P/N31 D/N121T/K132T/Q139Kに対応する）も比較のために包含された。
【０２８９】
変異体及び対照フィターゼの温度安定性を次の通りにして決定した：
上清液を、20μlの上清液を、180μlの0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5＋0.005％Tween−20に添加することにより、10倍に希釈した。その希釈された酵素を２つの部分に分け、１つの部分をプラスチック容器において60℃でインキュベートし、そして他の部分を5℃で貯蔵した。60℃での30分間のインキュベーションの後、タンパク質溶液を氷浴に移した。0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5及び0.005％のTween−20において１：10に希釈した後、冷却された及び加熱されたサンプルの活性を、例１のホスファターゼアッセイ（“ホスファターゼ活性の決定”）により測定し、緩衝液ブラインドは控除された。
【０２９０】
表５は、対照フィターゼに比較して、改良された温度安定性を有する変異体の列挙である。個々の変異体のために、表はまた、配列番号２に比較して、変更を特定している。それぞれ5℃及び60℃での30分間のインキュベーションの後、酵素活性（吸収及び単位（AU）での）を決定し、そして熱処理されたサンプル（60℃でのインキュベーション）の活性として計算された残留活性（RA）を、冷却されたサンプル（5℃でのインキュベーション）の活性により割算した。次に、残留活性結果を、同じ態様で発現され、そして処理された、配列番号２のフィターゼの残留活性に対して標準化した。得られる改良因子（IF）が表５に示されている。配列番号２のフィターゼに関しては、IFは1.0であり、ところが配列番号３及び４の２種の対照フィターゼは、配列番号２のフィターゼよりも低い熱安定性であり、このことは、それらの２種のフィターゼに関するIFがそれぞれ、わずか0.1及び0.3であった事実から明らかである。
【０２９１】
【表５Ａ】
2009532043.tif 000008
【０２９２】
【表５Ｂ】
2009532043.tif 000009
【０２９３】
例９：DSCによる熱安定性：
配列番号２の多くの精製された変異体を、一般的に例１に記載のようにして調製した。２種の対照フィターゼ、すなわち配列番号３を有するフィターゼ（配列番号２の変異体N31 D/Q139K/L197F/N316Kに対応する）、及び配列番号４を有するフィターゼ（配列番号２の変異体N31D/N121T/K132T/Q139Kに対応する）を、同じ態様で調製した。また、配列番号９を有するフィターゼ（配列番号２の変異体Q3P/N31 D/N121T/K132T/Q139Kに対応する）も比較のために包含された。
【０２９４】
タンパク質サンプルのアリコートを、２〜３時間の段階で、続いて一晩の段階で、２×500mlの20mM酢酸ナトリウム（pH4.0）に対して4℃で透析した。個々のサンプルを0.45μmのフィルターにより濾過し、そして緩衝液により、約2A280単位に希釈した。測定される正確な吸光度値が結果の表に示される。DSCを、20mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）において、20〜90℃で、90℃/時の走査速度でMicroCal VP-DSC上で行った。
得られる変性温度（Td）が、下記表６に示され、これは３種の異なった実験の結果を要約する。
【０２９５】
【表６】
2009532043.tif 000010
【０２９６】
例10：精製及び温度プロフィール：
本明細書において使用されるフィターゼ変異体、及び対照及び比較フィターゼを次の通りにして精製した：フィターゼを有する発酵上清液を最初に、7200rpm及び5℃で１時間、遠心分離し、そして４種のWhatmanガラスマイクロ繊維フィルター（2.7、1.6、1.2及び0.7μm）のサンドイッチフィルターを通して濾過した。これに続いて、溶液を無菌濾過した（0.22μmのカットオフを有するFast PES Bottleトップフィルターを通して、又は圧力を用いてのSeitz-EKS深さフィルターを通して）。溶液に固体硫酸アンモニウムを添加し、1.5Mの最終濃度にし、そしてpHを6MのHClを用いて6.0に調節した。
【０２９７】
フィターゼ含有溶液を、緩衝液Aとして、25mMのビス−トリス（ビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン））＋1.5Mの硫酸アンモニウムpH6.0を用いて、及び緩衝液Bとして、25mMのビス−トリスpH6.0を用いて、XK26カラムにおける約50mlのブチル−セファロースに適用した。カラムからの画分を、ホスファターゼアッセイ（例１、“ホスファターゼ活性の決定”を参照のこと）を用いて、活性について分析し、そして活性を有する画分をプールした。プールされた画分を、10mMの酢酸ナトリウム（pH4.5）に対して広範囲に透析した。
【０２９８】
これに続いて、フィターゼ含有溶液を、緩衝液Aとして、50mMの酢酸ナトリウムpH4.5を用いて、及び緩衝液Bとして、50mMの酢酸ナトリウム＋1MのNaCl pH4.5を用いて、XK26カラムにおいて約75mlのSセファロース上でのクロマトグラフィーにより精製した。再び、カラムからの画分を活性について分析し、活性を有する画分をプールした。最終的に、精製されたフィターゼを含む溶液を、10kDaのカットオフ膜を備えたAmiconウルトラ−15濾過装置を用いて濃縮した。
【０２９９】
SDS−PAGEから推定されるような分子量は、すべてのフィターゼについて約40kDaであり、そして純度は、すべての場合、95％以上であった。
変異体の温度プロフィール（温度の関数としてのフィターゼ活性）を、例１（“フィターゼ活性の決定”）に実質的に記載されるようにして、20〜90℃の温度範囲で決定したが、しかしながら、酵素反応（100μlのフィターゼ含有酵素溶液＋100μlの基質）を、マイクロタイタープレートの代わりにPCR管において実施した。所望する温度での15分の反応期間の後、管を20℃に20秒間、冷却し、そして150μlの反応混合物をマイクロタイタープレートに移した。75μlの停止試薬を添加し、そして405nmでの吸光度でマイクロタイタープレート分光計において測定した。結果は下記表７に要約される。個々の温度（10℃の段階での20〜90℃）について与えられる数字は、最適下での値に標準化された相対的活性（％）である。
【０３００】
【表７】
2009532043.tif 000011
【０３０１】
変異体030, 031 , 037, 044, 056, 062, 072, 083及び093は、対照フィターゼ026及び102に比較して、70℃でより高い相対的活性を有する。
【０３０２】
例11：pHプロフィール：
多くの変異体、及び前の例に使用されるのと同じ対照及び比較フィターゼのpHプロフィール（pHの関数としてのフィターゼ活性）を、例１（“フィターゼ活性の決定”）に記載のようにして、2.0〜7.5のpH範囲（0.5のpH−単位段階で）で、37℃で決定し、但し緩衝液カクテル（50mMのグリシン、50mMの酢酸及び50mMのビス−トリ）を、0.25Mの酢酸ナトリウム（pH5.5）緩衝液の代わりに使用した。その結果は下記表８に要約される。個々のpH（2.0−7.5）について与えられる数字は、最適下での値に標準化された相対活性（％）である。
【０３０３】
【表８】
2009532043.tif 000012
【０３０４】
YC062及びYC091に関して、pH曲線（pHの関数としての相対活性）は、より高いpHに向かって0.5pH単位、移行すると思われる。
さらに、表８のフィターゼ（対照フィターゼ026及び102を包含する）のほとんどに関して、最適性はpH3.5−pH4.0で存在し、3.5の最適pHが、062、085及び089に関して観察され、そして4.0の最適pHが091及び093について観察される。
【０３０５】
例12：温度安定性：
多くの精製された変異体、及び前記例におけるのと同じ対照及び比較フィターゼの温度安定性を、70℃及びpH4.0（0.1M酢酸ナトリウム）でのインキュベーションの後、残留フィターゼ活性を測定することにより決定した。フィターゼをインキュベートし、そしてサンプルを、０，10, 30及び60分後に採取し、そして氷上で冷却した。pH5.5での残留活性を、例１に記載される方法（“フィターゼ活性の決定”）を用いて決定した。0分で見出される活性に対して標準化された結果が、下記表９に示される。
【０３０６】
【表９】
2009532043.tif 000013
【０３０７】
上記結果は、044, 062, 072及び083がそれらの同じ条件（70℃及びpH4）下で、対照フィターゼよりも、より安定していることを示唆する（但し、この実験においては、大きな変動が000に関して観察された）。
【０３０８】
例13：同一性の百分率の計算及び対応する位置の同定：
配列番号９を、EMBOSSパッケージバージョン2．8.0からのNeedleプログラムを用いて、配列番号２と共に一列整列した。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップ開放ペナルティーは10.0であり、そしてギャップ延長ペナルティーは0.5であった。
得られる一列整列は図２に示される。
【０３０９】
配列番号９と２との間の同一性の程度を次の通りにして計算する：正確な一致の数は406である（垂直のストロークを有するすべてのそれら）。最も短い配列の長さは411である（配列番号２）。同一性の百分率は、406/411×100％＝98.8％である。
図２の一列整列をまた、次の通りに、対応する位置を得るために使用する：この一列整列におけるお互いの上部のアミノ酸は対応する位置に存在する。例えば、配列番号２の位置３でのアミノ酸Qは、配列番号９の位置番号25におけるアミノ酸Pに対応する。本発明のために、本発明者は、配列番号２の位置番号を言及する。従って、配列番号９は、置換Q3Pを含んで成る、配列番号２の変異体として見なされ得る。
【０３１０】
一列整列のオーバーラップ内の置換の形での他の差異、すなわちN31D, N121T, K132T及び Q139Kが、位置31、121、132及び139で見出される。
追加の差異がN−末端で見出され、ここで配列番号９は、配列番号２に比較して、22個のアミノ酸の延長を有する。
全体的に、配列番号9は、配列番号2の次の変異体として見なされ得る：
*0aM/*0bS/*0cT/*0dF/*OeI/*OfI*/*0gR*/*OhL/*OiL/*0jF/*0kF/*0mS/*0nL/
*0oL/*0pC/*0qG/*OrS/*0sF/*0tS/*0uI/*0vH/*0wA/Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K。
【図面の簡単な説明】
【０３１１】
【図１】図１は、WO2006/038062号の表２に対応し、そして配列番号９のアミノ酸配列を有する、シトロバクター・フレウンジNCIMB41247フィターゼの多くの変異体を開示する。
【図２】図２は、配列番号２及び９のフィターゼの一列整列を示す。  図１における位置番号は、配列番号９の番号付けを言及する。その対応する配列番号２の位置は、22の控除により見出され得る（例えば、図１の変異体P229Sは、本発明の番号付けを用いての変異体P207Sを意味する）。
【図１】
2009532043.tif 000014
【図１−２】
2009532043.tif 000015
【図１−３】
2009532043.tif 000016
【図２】
2009532043.tif 000017
【配列表】
2009532043000001.app
【国際調査報告】
2009532043.tif 000018
2009532043.tif 000019
2009532043.tif 000020