(57)【要約】【課題】癌または他の抗原産生性の疾患または病変を治療する免疫療法の組成物および方法を提供する。【解決手段】本発明の一実施形態によると、抗原産生性の疾患または病変を患う患者における少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物であって、好ましくはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ（ガンマ）、およびＴＮＦ−α（アルファ）を含む有効量のサイトカイン混合物を含有する組成物が提供される。該サイトカイン混合物は、抗原産生性の疾患または病変に関連する抗原のアジュバントとして作用して、該抗原に対する患者の免疫応答を増強する。従って、本発明のサイトカイン混合物を用いて、抗原産生性の疾患または病変を患う患者における少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘発するための方法もまた提供される。該組成物および方法は、癌、感染症または持続性病変といった抗原産生性の疾患の治療に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原産生性の疾患または病変を患う患者における少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物であって、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含む有効量のサイトカイン混合物を含有し、該サイトカインは抗原のアジュバントとして作用し、および、患者における該抗原に対する免疫応答を刺激する、組成物。
【請求項２】
前記サイトカインが、天然もしくは組換えサイトカイン、または、天然および組換えサイトカインの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＰＥＧ化したサイトカイン、または天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカインの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記サイトカイン混合物が、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含有し、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦは、天然もしくは組換えサイトカイン、または、天然および組換えサイトカインの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記サイトカイン混合物が、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含有し、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦは、ＰＥＧ化したサイトカイン、または天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカインの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原産生性の疾患が癌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記癌が、頭頸部の扁平上皮細胞癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、リンパ腫、子宮頸癌、および肝臓癌からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原産生性の病変が非癌性の持続性病変である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原が、内因性抗原、外因性抗原、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原が内因性抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原が外因性抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも一つの有効量の外因性抗原をさらに含有し、前記サイトカインと外因性抗原の組み合わせが外因性抗原に対する免疫応答を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍抗原がタンパク質またはペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
腫瘍抗原がタンパク質またはペプチドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
抗原産生性の疾患または病変を患う患者における少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有する有効量のサイトカイン混合物を投与することを含み、該サイトカインは抗原のアジュバントとして作用して、患者における該抗原に対する免疫応答を刺激する、方法。
【請求項１８】
前記サイトカインが、天然もしくは組換えサイトカイン、または天然および組換えサイトカインの混合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サイトカインが、ＰＥＧ化したサイトカイン、または天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカインの混合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記サイトカイン混合物が、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含有し、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦは、天然もしくは組換えサイトカイン、または天然および組換えサイトカインの混合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記サイトカイン混合物が、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦをさらに含有し、該ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦは、ＰＥＧ化したサイトカイン、または天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカインの混合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原産生性の疾患が癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、頭頸部の扁平上皮細胞癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、リンパ腫、子宮頸癌および肝臓癌からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原産生性の病変が非癌性の持続性病変である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原が、内因性抗原、外因性抗原、またはそれらの組み合わせである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原が内因性抗原である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原が外因性抗原である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも一つの有効量の外因性抗原を患者に投与する工程をさらに含み、前記サイトカイン混合物と外因性抗原の組み合わせが外因性抗原に対する免疫応答を刺激する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記腫瘍抗原がタンパク質またはペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍抗原がタンパク質またはペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与工程は、６００から６０，０００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度でＩＬ−２を投与することと定義される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与工程は、３，０００から１２，０００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度でＩＬ−２を投与することと定義される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与工程は、４，０００から８，０００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度でＩＬ−２を投与することと定義される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３６】
前記サイトカイン混合物が外リンパへの注射によって投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
前記サイトカイン混合物が、両側外リンパへの注射によって投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３８】
前記投与工程は、少なくとも１から２０日間、前記サイトカイン混合物を投与することと定義される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与工程は、毎月適宜前記サイトカイン混合物および前記外因性抗原の投与することと定義される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与工程は、外科手術、放射線治療ないし化学治療、または、外科手術、放射線治療ないし化学療法の組み合わせに先立って、前記サイトカイン混合物を投与することと定義される、請求項１７に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与工程は、腫瘍の再発後に、前記サイトカイン混合物を投与することと定義される、請求項１７に記載の方法。
【請求項４２】
有効量のシクロフォスファミド（ＣＹ）を投与する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項４３】
インドメタシン（ＩＮＤＯ）、イブプロフェン、セレコキシブ（セレブレックス（登録商標））、ロフェコキシブ（ビオックス（登録商標））、Ｃｏｘ−ＩＩ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される有効量の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項４４】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有する有効量のサイトカイン混合物を投与する工程を含み、該サイトカイン混合物はアジュバントとして作用し、および、患者における免疫応答を刺激する、癌を治療する免疫療法の方法。
【請求項４５】
少なくとも一つの有効量の外因性癌抗原を患者に投与する工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が、頭頸部の扁平上皮細胞癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、リンパ腫、子宮頸癌および肝臓癌からなる群より選択される、請求項４４または４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン免疫療法に関する。より具体的には、本発明は、癌または他の抗原産生性の疾患状態または病変を患う患者における、内因性または外因性のペプチドまたはタンパク質抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの癌は抗原を有し、該抗原は、宿主の免疫系に作用すると、腫瘍の退縮をもたらしうることが次第に明らかになりつつある。これらの抗原は血清学的および細胞免疫性の両方のアプローチによって定義されており、これらはＢ細胞およびＴ細胞の両エピトープの定義に至った（Ｓａｈｉｎ、１９９７；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｙｎｄｅ、１９９７；Ｗａｎｇ、１９９９）。これらの結果に基づいて、腫瘍の退縮を誘発することが癌免疫療法治療家にとって目標となった。しかしながら、従来、成功した試みは散発的であり、および、頻度および規模において一般に小さなものある。
【０００３】
癌患者を、即ち、腫瘍抗原に対して免疫する試みにおける基本的な問題は、担癌状態が、腫瘍および宿主の免疫系障害の両方に由来する免疫抑制機序と関連していることである（Ｋａｖａｎａｕｇｈ、１９９６）。このため、免疫が困難となり、現在までのところ安定して行うことは不可能であった。免疫の抑制ないし低下は免疫系応答能の低下を伴う。このような抑制は、薬剤誘導性、即ち薬剤治療によって誘導される可能性、例えばＡＩＤＳなどでのウイルス誘導性である可能性、または、癌などの疾患状態によって誘導される可能性がある。この状態では免疫系は事実上停止する。癌などの疾患状態の場合、生体は腫瘍抗原に対して自己防御することはできず、このため、腫瘍の成長を許容し、および転移する可能性もある。
【０００４】
様々な腫瘍免疫戦略が開発されてきた。これらの戦略のすべては複雑であり、感染症に用いられる従来の免疫戦略から大きく逸脱している（例えばＷｅｂｅｒ、２０００を参照）。このような腫瘍免疫戦略の一つは、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役し、かつ、デトックス（登録商標）マイコバクテリア・アジュバント、および低用量のシクロフォスファミド（Ｍａｃｌｅａｎ、１９９６）とともに投与されるセラトープ（登録商標）、即ち、シアリルＴＮ多糖ムチン抗原にかかわる。転移性乳癌および卵巣癌の患者におけるこのワクチンの使用は、患者の低い比率（％）でのみ著名な臨床的反応（即ち、５０％を上回る腫瘍の縮小）をもたらした。
【０００５】
腫瘍抗原を発現する遺伝子の発現ベクターとしてウイルス構築物を用いる遺伝子治療も試みられてきた。例えば、ヒト・パピローマ・ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６およびＥ７タンパク質配列の修飾された形態をコード化する組換えワクチン・ウイルス構築物が、子宮頸癌の患者の免疫に用いられてきた。この構築物による免疫は、疑問のある臨床的反応をもたらした（Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｋｚ、１９９６）。また、組換えワクチンＰＳＡ（前立腺特異抗原）構築物が前立腺癌患者におけるワクチンとして用いられたＳａｎｄａ、１９９９も参照のこと。
【０００６】
別のアプローチは樹状細胞媒介性の治療である。例えば、樹状細胞は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のオリゴペプチド断片を用いてパルスした。次いで、樹状細胞は（ＰＳＭＡ抗原の初回刺激の存在時または非存在時に）転移性前立腺癌の患者に投与された。著名な臨床的反応が患者の低い比率でのみ得られた（Ｍｕｒｐｈｙ、１９９９；Ｔｊｏａ、２０００も参照）。
【０００７】
さらに、悪性黒色腫を患う癌患者に免疫するために、自己腫瘍が、低用量のシクロフォスファミドおよびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）とともに用いられてきた。しかしながら、臨床的反応はほとんど報告されなかった（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ、１９９６）。他の戦略は、ＭＡＧＥ抗原の様々なワクチンアジュバントとの併用を含んだ。この戦略は、悪性黒色腫の患者に反応を起こしたとしても、非常に弱い反応を起こした（私信、Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｂｏｏｎ）。
【０００８】
Ｄｏｙｌｅらのいくつかの特許（米国特許第５，５０３，８４１号；第５，８００，８１０号；第６，０６０，０６８号；第５，６４３，５６５号；および第５，１００，６６４号）は、インターロイキン２（ＩＬ−２）を用いて患者における免疫応答を増強する方法を開示する。この方法は、感染症に応答した使用のために開示され、免疫原性であることが知られている抗原を用いて主に機能する。限定的な適用性が示された。上記に開示されるように、癌の治療には異なるアプローチを必要とすることが知られている。今日まで、ＩＬ−２を用いた治療は、腎細胞癌および悪性黒色腫の二つの癌において軽度の効果を示してきた（２０％未満の奏効率）。該治療は一般に、頭頸部の扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、および前立腺癌には無効と考えられる。従って、この治療はこれらの用途には承認されていない。
【０００９】
複雑な構造および高分子量の既知の「古典的」抗原を用いた健康な患者における予防と、腫瘍抗原またはペプチド（一般的に不成功）を用いた免疫抑制患者（一般的に不成功）における治療（一般的に不成功）とを対比することが重要である。前者は容易であり、われわれが今日用いるウイルス・ワクチンはそれらの有効性を証明する。後者は３０年の真剣な努力にもかかわらず、日常では不可能に近い。
【００１０】
さらに、有効な癌ワクチンは、おそらくは抗体産生よりも優先的に、細胞媒介性の免疫を刺激することを必要とする。記載したように、様々な抗原、アジュバントおよびワクチン構築物を用いた多数の検討にもかかわらず、今日までの臨床試験のデータは失望させるものであった。Ｔ細胞媒介性抗癌免疫応答に対する重要なイベントは、主として、腫瘍または免疫の部位に流入する局所リンパ節中のＴ細胞に対する抗原の提示であり、およびその後の、Ｔ細胞の活性化および末梢部位への移動である。実際には、組織マクロファージ、好中球および／または樹状細胞による抗原の取り込み、および、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原と併用して処理されたペプチドのリンパ節中のＴ細胞への提示は、完全免疫応答にとって不可欠である。Ｔ細胞の免疫活性化の成功への鍵は、免疫部位および流入局所リンパ節の両方でワクチンに対する免疫応答を促進する、適切なサイトカイン環境を生成することである。
【００１１】
免疫応答の動態には二つの段階が含まれる。前者は抗原および可溶性タンパク質のリンパ節への流入であり、リンパ節中で初回の免疫活性化が発生する。その２４〜４８時間後、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、とりわけ樹状細胞は、免疫部位から流入リンパ管を介してリンパ節へと移動し、リンパ節において、抗原の提示および活性化の第二の波が発生する。より具体的にはＡＰＣはリンパ節内で、共刺激受容体とのならびにＴ細胞受容体との結合によって前駆体Ｔヘルパー細胞と相互反応し、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞とＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞のいずれかまたは両方を産する。これらのサブセットの比率によって、その後に発生する細胞媒介性または体液（抗体）性のいずれかの免疫応答の進行が制御される（Ｔｈ１はＤＴＨ／細胞毒性にバイアスするが、一方、Ｔｈ２は抗体の産生にバイアスする）。これらの活性化されたＴ細胞の誘導の後、免疫応答は低下し、主として記憶Ｔ細胞が残る。該記憶Ｔ細胞は、抗原に対する再暴露に応答可能である。
【００１２】
この経路における重大なイベントは、サイトカインによって媒介され、サイトカインは、応答を体液性ないし細胞学的な免疫の方向にバイアスする。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＩＬ−８といった局所的に産生されるサイトカインは、免疫系細胞の動員、抗原の取り込み、樹状細胞の成熟、制御性Ｔ細胞活性の減衰、Ｔ細胞の教育および増殖、およびＴｈ１細胞の発生と関連している（Ｎａｙｌｏｒ、２００３）。応答の相互依存性とは、任意の所定のサイトカインの活性が前駆体イベントの発生に依存していることを意味する。その結果、異なるサイトカインに対する細胞応答の動態に応じて、同時に存在する複数のサイトカインが、注射部位および流入局所リンパ節の両方において、異なる効果をもちうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、出願人に対して発行された米国特許第５，６３２，９８３号および第５，６９８，１９４号に開示された、癌患者もしくは他の抗原産生性の病変ないし疾患状態を患う他の患者といった患者を免疫するための天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）を用いる。より具体的には、過去に米国特許第５，６９８，１９４号において、ＮＣＭ（本明細書中において「ＩＲＸ−２」ともいう）は、老齢の免疫抑制マウスにおけるＴ細胞の発生および機能の促進に有効であることが示されてきた。ＮＣＭは、胸腺中の未成熟Ｔ細胞の比率を低下させるとともに、成熟Ｔ細胞の比率を増加させることが示されてきた。ＮＣＭは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、および微量のＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７を含んだ。
【００１４】
本明細書中に詳細に記載された開示より、本発明のサイトカイン組成物およびそれらを用いる方法は、関心のある任意の抗原、例えば癌または腫瘍抗原、ならびに、他の持続性疾患状態または病変によって産生された抗原に対する免疫応答を刺激するのに適用できることは明らかであろう。本明細書中に詳細に記載されたように、本発明のサイトカイン混合物はアジュバントとして作用して、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞の免疫を刺激する。
【００１５】
さらに本発明は、内因性抗原、即ち、ｉｎ  ｖｉｖｏに存在し、ＡＰＣ（樹状細胞など）によってｉｎ  ｖｉｖｏで処理され、提示されるタンパク質ないしペプチド、または、外因性抗原、即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離ないし生成され、次いで、樹状細胞が存在し、かつ、抗原を例えばＴ細胞に効果的に提示することが可能な環境（例えばリンパ節）にｉｎ  ｖｉｖｏで投与されるタンパク質またはペプチドのいずれかに対する免疫応答を誘発することに関するが、これに限定されない。とりわけ、本発明がペプチド抗原に関する場合、この目標は克服できないと考えられている。ペプチドは有効な免疫原となるには非常に小さすぎると、一般的に考えられている。ペプチドの半減期は短く、および、多くの場合、患者が免疫学的に耐性を有する非突然変異体の自己抗原である。従って、このような抗原に対する免疫応答を得ることは、自己免疫を誘起することと等しい。
【００１６】
本明細書中に記載のとおり、本発明は、ワクチン免疫療法の矛盾のない、かつ、有効な方法を開発するために有用である。該方法において、本発明のサイトカイン組成物を、腫瘍抗原、および、ペプチドをはじめとする内因性および外因性の疾患関連抗原のいずれかまたは両方と併用することにより、癌患者などの患者における免疫応答が誘発される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、癌または他の抗原産生性の疾患ないし病変を治療する免疫療法の組成物および方法に関する。本発明の一実施形態によると、抗原産生性の疾患または病変を患う患者における少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物であって、好ましくはサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ（ガンマ）、およびＴＮＦ−α（アルファ）を含む有効量のサイトカイン混合物を含有する組成物が提供される。好ましい実施形態によると、該サイトカイン混合物は、米国特許第５，６３２，９８３号および第５，６９８，１９４号に開示される、天然サイトカイン混合物、即ちＮＣＭである。該サイトカイン混合物は、抗原産生性の疾患または病変に関連する抗原のアジュバントとして作用して、該抗原に対する患者の免疫応答を増強する。
【００１８】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有する本発明のサイトカイン混合物は、天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカイン、または、天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカインの混合物を含みうる。本発明の別の実施形態によると、該サイトカイン混合物は、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦなどの他の天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカインをさらに含有しうる。
【００１９】
本発明はまた、抗原産生性の疾患または病変を患う患者における少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有する有効量のサイトカイン混合物を投与することを含み、該サイトカインは抗原のアジュバントとして作用して、患者における該抗原に対する免疫応答を刺激する、方法にも関する。
【００２０】
さらに本発明によると、該抗原は内因性抗原および外因性抗原の両方またはそのいずれかでありうる。該抗原が内因性抗原である、即ち、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在する本発明の実施形態では、該サイトカイン混合物は患者に投与され、および、該サイトカインは、内因性抗原のアジュバントとして作用して、患者の免疫応答を刺激する。該抗原が外因性抗原である、即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離ないし生成され、および、患者にｉｎ  ｖｉｖｏで投与される実施形態では、該サイトカイン混合物は外因性抗原と併用して投与される（同一製剤でまたは個別の製剤のいずれかで、同時または異なる時間のいずれかで）。該サイトカイン混合物は、外因性抗原のアジュバントとして作用して、該抗原に対する免疫応答を刺激する。
【００２１】
本発明の組成物および方法の好ましい実施形態によると、該抗原は腫瘍抗原であり、および、該抗原産生性の疾患は、頭頸部の扁平上皮細胞癌（Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ）、前立腺癌、黒色腫、乳癌、リンパ腫、子宮頸癌、または肝臓癌などの癌である。代替的には、該抗原は、肝炎、結核、ないしＨＩＶなどの感染症、または、皮膚ないし全身性カンジダ症、パピローマ・ウイルスと関連する性病いぼ、ないし子宮頸部形成異常などの持続性病変と関連しうる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明については、添付図面に照らして下記の詳細な説明を参照することによって一層理解されるので、本発明の他の利点は容易に理解される。
【図１】正常対照、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ癌患者の対照群、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ癌患者のＮＣＭ治療群におけるリンパ節の大きさを示す棒グラフである。
【図２】図２Ａは、Ｔ細胞領域を示す棒グラフであり、図２Ｂは、正常対照、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ対照、およびＮＣＭで治療したＨ＆Ｎ  ＳＣＣ患者における密度を示す。
【図３】図３Ａは上記３つの治療群におけるＢ細胞領域を比較する棒グラフであり、図３Ｂは、同群における濾胞を比較する棒グラフである。
【図４】図４Ａは上記３つの治療群における他の細胞の比較であり、図４Ｂは、同群における洞組織球症（ＳＨ）の比較を示す。
【図５】節のＢ＆Ｔ（Ｂ細胞およびＴ細胞）および腫瘍のＢ＆Ｔの適合プロットを示すグラフである。
【図６】４８ヶ月時点での治療患者の生存率を示すグラフである。
【図７】わずかな奏効者および無奏効者と比較した、完全奏効者および部分奏効者の生存率を示すグラフである。
【図８】生存率に対する病理指標の関係を示すグラフである。
【図９】生存率に対するリンパ球浸潤の関係を示すグラフである。
【図１０】２４ヶ月時点での治療患者の生存率％（用量反応）を示すグラフであり、「ｘ」は約１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２に等しい。
【図１１】図１１Ａは、ＳＨ＋癌患者のリンパ節中に、部分的に成熟したＣＤ８３＋樹状細胞（ＤＣ）の蓄積を示す棒グラフである。図１１ＢはＮＣＭ（ＩＲＸ−２）による治療直後のＣＤ８６＋活性化ＤＣの数の増加を示す棒グラフである。
【図１２】ＤＣ上のＣＤ８３の発現の増加によって検出されるＤＣの成熟を、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が誘起することを示すグラフである。
【図１３】サイトプシン製剤中の単球由来のＤＣの形態学に対してＮＣＭが及ぼす効果を示す。ＮＣＭで処理した細胞（図１３Ｂ）は、細胞学的な突起および大きな不規則形状の核など、成熟したＤＣの形態学的特徴を示した。
【図１４】ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）でインキュベートした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の発現による、ＣＤ１ａ抗原のダウン・レギュレーション、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）抗原のアップ・レギュレーションを示すヒストグラムを含む。これらの変化はＮＣＭがＤＣの成熟を刺激することを示す。
【図１５】ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が未熟なＤＣの細胞内活性を低下させることを示すグラフであり、この活性の低下はＤＣの成熟を示唆する。
【図１６】ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）がＤＣのＴ細胞刺激能を増強することを示すグラフであり、この増強はＤＣの成熟および活性化を示す。
【図１７】図１７Ａは、ＩＬ−１２を細胞内に産生するＤＣの数を、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が増加させることを示す棒グラフである。ＩＬ−１２は、活性化された成熟ＤＣによって産生されたサイトカインである。図１７Ｂは、ＤＣによって分泌される生物活性ＩＬ−１２の全数を、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が増加させることを示す棒グラフである。
【図１８】ＤＣ中のＶＥＧＦ媒介性アポトーシスを、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）が減少させることを示す棒グラフであり、ＤＣの生存に対するＮＣＭの防御効果を示している。
【図１９】図１９Ａは、付着ＰＢＭＣをＮＣＭで処理した後の、活性化マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の組み合わせに対して陽性の染色を示した単球／マクロファージの、フロー・サイトメトリーで求めたパーセント比率の増加を示す、二つの棒グラフを含む。図１９Ｂは、付着ＰＢＭＣをＮＣＭで処理した後の、活性化マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０に対するフロー・サイトメトリーで求めた平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加を示す、一連の棒グラフである。
【図２０】本発明のＮＣＭが単球／マクロファージを活性化すること、即ち、活性化マーカー、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ４０の発現を、ＴＮＦ−αを上回る程度まで誘起することを示す棒グラフを含む。
【図２１】本発明のＮＣＭが単球／マクロファージを活性化すること、即ち、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の存在時であっても、活性化マーカー、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ４０を誘起することを示す棒グラフを含む。ＩＬ−１０の存在時および非存在時の両方において、ＮＣＭはＬＰＳよりも単球／マクロファージの活性化にすぐれている。
【図２２】本発明のＮＣＭが、活性化された単球／マクロファージからのＴＮＦ−αの産生を刺激し、および、ＩＬ−１０の免疫抑制効果を克服することを示す棒グラフである。ＮＣＭは、ＬＰＳを上回る程度でＴＮＦ−αの産生を刺激した。
【図２３】本発明のＮＣＭ（ＩＲＸ）をはじめとする、様々な共役体およびアジュバントで免疫したマウスの、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチド特異的ＤＴＨ応答を示す図である。該応答は各マウスのｍｍ単位の腫脹（点）および平均（棒）として示され、アジュバントはｘ軸上に記載し、未感作とは免疫されていないマウスを示す。他のすべてのマウスは、（ＫＬＨと）指示しない限り、オブアルブミンＰＳＭＡペプチド共役体で免疫される。
【図２４】図２４Ａは、ＯＶＡ−ＰＳＭＡまたはＫＬＨ−ＰＳＭＡ共役体のいずれかと併用して本発明のＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で免疫し、および次いで（共役体を生成するのに用いられた）ＰＳＭＡペプチドで惹起したマウスにおける、ＤＴＨ検定におけるペプチド特異的ＤＴＨ免疫応答の増強を示す。各マウスの腫脹の増加はデータポイントで表し、腫脹の増加の平均は影付の四角形で表す。図２４Ｂは、共役体の免疫において用いられる担体のみでの惹起に対するＤＴＨ応答を示す。
【図２５】ＯＶＡ−ＰＳＭＡ共役体およびＮＣＭで免疫されたマウスにおける、ペプチド特異的ＤＴＨ応答に及ぼすシクロフォスファミド処理の影響を示す。シクロフォスファミド処理はＤＴＨ応答に効果を及ぼさなかった。
【図２６】本発明のＮＣＭ（ＩＲＸ）をはじめとする、様々なアジュバントがペプチド特異的ＤＴＨ応答に及ぼす効果を、各アジュバントと併用してＰＳＭＡ共役体で免疫したマウスにおいて比較して示す。ＮＣＭのアジュバント効果は、試験を実施した他のアジュバントよりも大きかった。未感作のマウス、即ち、非免疫マウスは陰性対照を表す。
【図２７】図２７Ａは、アジュバントとしてＮＣＭ（ＩＲＸ）またはミョウバン（ａｌｕｍ）のいずれかと併用してＯＶＡ−ＰＳＭＡ共役体で免疫した、老齢マウス対若齢マウスのペプチド特異的ＤＴＨ応答を示す。本発明のＮＣＭは、老齢マウスおよび若齢マウスの両方において、ミョウバンと比較してより大きなペプチド特異的ＤＴＨ応答を刺激した。図２７Ｂは、アジュバントとしてＮＣＭ（ＩＲＸ）またはミョウバンのいずれかと併用してＰＳＭＡ共役体で免疫した、老齢マウス対若齢マウスの担体特異的ＤＴＨ応答を示す。本発明のＮＣＭは、老齢マウスにおける担体特異的ＤＴＨ応答を、若齢マウスでみとめられた応答へと回復させた。
【図２８】Ｔ細胞応答ＫＬＨ−ＰＳＭＡ共役体および本発明のＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で免疫した、マウス由来の脾臓細胞によって分泌されるＩＦＮ−γの形態でのＴ細胞応答の増強を示す。結果は、各マウス（データポイントマーカー）ならびに応答の平均（影付の棒）について表される。分泌されたＩＦＮ−γのすべての増加は、未感作対照と比較して統計的に有意であった。
【図２９】本発明のＮＣＭと併用してＰＳＭＡ共役体で免疫したマウスにみとめられた血清抗体応答を示す。図２９Ａは、ＯＶＡ−ＰＳＭＡ共役体およびＮＣＭ（ＩＲＸ）、ミョウバンまたはＣｐＧで免疫されたマウスにおける、ＯＶＡ担体への血清抗体応答を、他のアジュバント、即ち、ミョウバンおよびＣｐＧと比較して示す。データは、１群あたりマウス５〜１０匹の平均および標準誤差として提示される。図２９Ｂは、ＯＶＡ−ＰＳＭＡ共役体、およびＮＣＭ（ＩＲＸ）、ミョウバンまたはＣｐＧで免疫したマウスにおける、ＰＳＭＡペプチドに対する血清抗体応答を示す。図２９Ｃは、ＮＣＭ（ＩＲＸ）、ミョウバンまたはＰＢＳと併用して、ＫＬＨ−ＰＳＭＡ共役体で免疫したマウスにおけるＰＳＭＡペプチドに対する血清抗体応答を示す。結果はＥＬＩＳＡ検定によって求められ、および、光学密度として提示される。
【図３０】ＰＳＭＡペプチド抗原と併用して本発明のＮＣＭで治療した前立腺癌患者３例における６ヶ月間のＰＳＡ濃度の安定化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、癌または他の抗原産生性の持続性病変ないし疾患状態を治療する免疫療法の組成物および方法に関する。本発明はより具体的には、癌または他の抗原産生性の疾患ないし病変に関連する抗原に対する免疫応答を誘発するための組成物および方法であって、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有するサイトカイン混合物が、患者における該抗原に対する免疫応答を刺激するのに有効な量だけ、患者に投与される組成物および方法に関する。本発明によると、抗原は内因性抗原および外因性抗原のいずれかまたは両方であってもよく、および、サイトカイン混合物は抗原のアジュバントとして作用して、患者における該抗原に対する免疫応答を刺激する。
【００２４】
本明細書中に使用される用語「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を増強する能力をもつ組成物を意味する。このような能力は、免疫媒介性の防御の有意な増加によって現れる。アジュバントが有効であるためには、抗原部位にまたはその近傍に送達されなければならない。免疫の増強は、典型的には、抗原に対して生じる抗体の力価の有意な増加（通常１０倍を上回る）、および、細胞学的な免疫の増強、のいずれかまたは両方によって明示され、後者は、陽性皮膚試験、細胞障害性Ｔ細胞検定、ＩＦＮ−γないしＩＬ−２のＥＬＩＳＰＯＴ検定またはＴ細胞の腫瘍内浸潤により、測定できる。本発明のサイトカイン組成物は、Ｔ細胞媒介性の免疫応答を増強するのに特に適している。本発明のサイトカイン組成物のアジュバント効果には、未感作Ｔ細胞の生成、樹状細胞の分化および成熟の促進、単球およびマクロファージの刺激、および、癌患者の場合は腫瘍へのリンパ球浸潤の増加、腫瘍の断片化、腫瘍の退縮、ならびにリンパ節内における洞組織球症の縮小を含む。
【００２５】
本明細書中に使用される用語「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍に対する免疫応答を誘起する能力があるタンパク質、またはペプチド、または他の分子を意味する。これは、ＰＳＭＡペプチド、ＭＡＧＥペプチド（Ｓａｈｉｎ、１９９７；Ｗａｎｇ、１９９９）、パピローマ・ウイルス・ペプチド（Ｅ６およびＥ７）、ＭＡＧＥ断片、ＮＹ  ＥＳＯ−１、または他の類似の抗原を含みうるが、これらに限定されない。かつて、これらの抗原は、その大きさ、即ち、これらの抗原が小さすぎるとみなされていたこと、または、免疫原性がないとかつて考えられていた（即ち、自己抗原であるとみなされていた）ことのいずれかを根拠に、患者を治療するのに有効とはみなされていなかった。
【００２６】
本明細書中に使用される「ＮＣＭ」とは、米国特許第５，６３２，９８３号および第５，６９８，１９４号に定義および記載される、天然サイトカイン混合物を意味する。簡潔には、ＮＣＭは、４−アミノキノロン抗生物質の常在下で、および、分裂促進因子の常在またはパルス存在下で調製され、該分裂促進因子は好ましい実施形態ではＰＨＡである。ＮＣＭは、天然発生型サイトカインのほかに、組換えサイトカインとＰＥＧ化したサイトカインのいずれかまたは両方を含むことができ、その産生は当業において周知である（例えば米国特許第４，７３８，９２７号、第４，９９２，３６７号、米国特許出願第２００４／０１３６９５２  Ａ１号、およびＭｅｈｖａｒ、２０００を参照）。
【００２７】
本明細書中に使用される用語「内因性抗原」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、即ち、患者などの生体の内部で産生され、および内部に存在し、その結果、本発明のサイトカイン組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与後、該サイトカインが患者の内部の抗原のアジュバントとして作用して、抗原に対する免疫応答を刺激する抗原を意味する。
【００２８】
本明細書中に使用される用語「外因性抗原」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、即ち、治療対象の生体の外部で産生、即ち、単離または生成され、および、ｉｎ  ｖｉｖｏで生体（即ち、患者）に投与され、その結果、本発明のサイトカイン組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与後、該サイトカインが患者の内部の抗原のアジュバントとして作用して、抗原に対する免疫応答を刺激する抗原を意味する。外因性抗原は、化学合成ないし遺伝子工学による化合物ないし分子であってもよく、または、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境から抽出され、および、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離された内因性抗原であってもよい。抽出された抗原は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの再導入のために処理または別の方法で修飾されてもよい。外因性抗原は、本発明のサイトカイン組成物とは別の薬理学的製剤でもまたは同一の製剤のいずれでも投与できる。
【００２９】
上記に定義されるように、本発明のサイトカイン混合物はアジュバントとして作用する、即ち、特定の抗原への患者の免疫応答を刺激または増強する。さらに、本発明のサイトカイン組成物および方法は、Ｔ細胞媒介性の免疫応答を刺激するのに特に適している。本発明の組成物および方法によって促進される免疫応答は、未感作Ｔ細胞の誘導または生成、抗原のＴ細胞への適切な提示（例えばリンパ節内で）を提供する樹状細胞の分化および成熟、および単球ならびにマクロファージの活性化を含む。具体的には、癌患者において本発明の組成物および方法によって促進される免疫応答は、リンパ球による腫瘍浸潤、腫瘍の断片化ならびに退縮、および洞組織球症の（存在する場合は）縮小を含む。
【００３０】
より具体的には、本発明の組成物および方法は、未感作Ｔ細胞の産生を誘起することによって、患者における免疫の低下／抑制を克服するのに役立つ。本明細書中に定義される用語「未感作」Ｔ細胞は、新たに産生されたＴ細胞を意味し、該Ｔ細胞は抗原に暴露されていない。このようなＴ細胞は非特異的であるが、腫瘍ペプチドなど、Ｔ細胞に暴露した抗原をもつ成熟樹状細胞によって抗原が提示された直後に、特異的になることができる。従って、本発明の組成物および方法は、新しいＴ細胞を補充または生成する（以下の実施例２および８を参照）。
【００３１】
さらに、とりわけ腫瘍を有する癌患者では、本組成物および方法は、顕著な腫瘍の断片化および退縮を伴う、腫瘍へのリンパ球浸潤を提供する。例えば、以下の実施例２〜７を参照されたい。このような浸潤は、臨床的反応を最大にし、および、生存率を最大にするために重要である。例えば、リンパ球：顆粒球ないしマクロファージの９０：１０の比率での浸潤が最適であり、好ましくは、Ｔ細胞とＢ細胞のいずれかまたは両方の浸潤は、広範性で集中的であり末梢性でない。組織学的標本における腫瘍の縮小および断片化は良好な免疫応答を反映し、および、本発明の組成物によるアジュバント効果を示す。
【００３２】
さらに、特異的なリンパ節の変化は、リンパ節の腫脹などの有効な免疫応答を示す。即ち、大きさの腫瘍に起因する縮小の逆転だけでなく、正常な節の大きさと比べた大きさの全体的な増加、ならびに、Ｔ細胞およびＢ細胞領域の増加も示す。さらに、癌患者のリンパ節は、多くの場合、洞組織球症（ＳＨ）とも呼ばれる大型の組織球の類洞内蓄積を含有する。ＳＨは未熟な樹状細胞の蓄積であると信じられており、該細胞は腫瘍抗原を取り込み、処理するが、成熟できず、および、これらの腫瘍ペプチドを未感作Ｔ細胞に提示できない。Ｔ細胞への抗原の適切な提示がなければ、これらのＴ細胞はＴｈ１およびＴｈ２のエフェクター細胞を刺激することができない。通常は、該刺激は、体内において細胞媒介性および抗体媒介性の免疫をそれぞれきたす。下記の実施例２〜７に示すように、本発明のサイトカイン組成物および方法は、癌患者のリンパ節内でＳＨを減少させ、および、上記に記載の様々なリンパ変化を産生し、ここでもまた、本発明の組成物によるアジュバント効果を示した。
【００３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な免疫応答の産生時の抗原提示において、樹状細胞がこのように重要な役割を果たすことが知られているので、抗原への良好な免疫応答を誘発する際には、樹状細胞の成熟に対する刺激効果を有する薬剤がアジュバントとして作用する。下記の実施例９に示されるように、本発明のサイトカイン組成物は樹状細胞の成熟を促進する。さらに、実施例２のデータは、本発明のサイトカイン組成物が、ＳＨを引き起こす樹状細胞欠損を、即ちＤＣの成熟を促進することによって取り除くこと、および従って、具体的には癌患者において、本発明の組成物は複数のアジュバント効果を提供する、即ち、リンパ節内でＳＨ中のＤＣを取り除き、ＤＣの成熟を全般的に促進することを示している。
【００３４】
本発明のサイトカイン組成物はまた、単球／マクロファージの強力な活性化因子として作用することによって、さらなるアジュバント効果を提供する。単球は体内のＤＣおよびマクロファージの両方に対する前駆体であり、このため、単球／マクロファージの活性化を促進する薬剤はｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫応答に対するアジュバント効果をもつ。下記の実施例１０を参照のこと。
【００３５】
上記に鑑みて、本発明の組成物および方法は、樹状細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの成熟による有効なペプチド抗原の提示、ならびに単球とマクロファージの活性化、および、未感作していないＴ細胞（ｎａｉｖｅ  ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）の産生、をはじめとする複数の効果により、免疫系を刺激する。抗原の適切な提示は、Ｔ細胞およびＢ細胞のクローン性増殖を導き、患者における免疫を作成する。癌患者の場合、上記に記載された効果によって、腫瘍への例えばリンパ球の（例えば血行性転移による）浸潤、および、腫瘍の縮小と崩壊のいずれかまたは両方が生じる。下記のデータによって示される結果は、免疫記憶に起因する生存率の増加である（例えば下記の実施例３を参照）。
【００３６】
より具体的には次いで、本発明は、サイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有するサイトカイン混合物を含有する組成物を提供する。好ましい実施形態によると、サイトカイン混合物は、６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌの、より好ましくは１５０〜１，２００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度のＩＬ−１；６００〜６０，０００ｐｃｇ／ｍｌの、より好ましくは１，０００〜１２，０００ｐｃｇ／ｍｌの、およびより好ましくは４，０００〜８，０００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度のＩＬ−２；６０〜６，０００ｐｃｇ／ｍｌの、より好ましくは３００〜２，０００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度のＩＬ−６；６，０００〜６００，０００ｐｃｇ／ｍｌの、より好ましくは２０，０００〜１８０，０００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度のＩＬ−８；および、それぞれ、２００〜２０，０００ｐｃｇ／ｍｌ、より好ましくは１，０００〜４，０００ｐｃｇ／ｍｌの範囲の濃度のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含有する。
【００３７】
本発明の別の実施形態によると、サイトカイン混合物は、サイトカインＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＧ−ＣＳＦをさらに含む。さらに別の実施形態によると、該サイトカイン混合物のサイトカインは、天然、組換え、ＰＥＧ化した混合物、または、天然、組換えないしＰＥＧ化したサイトカインの混合物でありうる。サイトカインは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカインの半減期を増加するために、および／または、ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカインタンパク質の免疫原性または毒性を減少させるためにＰＥＧ化してもよい（例えば、米国特許出願第ＵＳ２００４／０１３６９５２  Ａ１号を参照）。サイトカインをはじめとするタンパク質をＰＥＧ化する方法は当業において周知であり（例えばＭｅｈｖａｒ、２０００を参照）、患者の治療用途のために、多数のＰＥＧ化したサイトカインがこれまでＦＤＡによって承認されてきた（例えばＩＦＮ−αおよびＧ−ＣＳＦ）。
【００３８】
本明細書中に開示されたサイトカインに関連した誘導体、断片およびペプチドもまた本発明によって包含されており、このような誘導体、断片およびペプチドはそれらそれぞれのサイトカイン生物活性を保持している。好ましい実施形態によると、サイトカイン混合物は、米国特許第５，６３２，９８３号および第５，６９８，１９４号に開示される天然サイトカイン混合物であるＮＣＭである。
【００３９】
本発明のサイトカイン混合物は、疾患または病変に関連した抗原のアジュバントとして作用して、患者における該抗原に対する免疫応答を刺激する。さらに、該抗原は、内因性抗原またはペプチド（例えば癌の場合、抗原またはペプチドは、局所リンパ節内または腫瘍部位に存在しうる）、または、外因性抗原またはペプチド製剤、即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離または生成され、および次いで、本発明のサイトカイン混合物と併用して、患者の所定部位に（例えば癌の場合、腫瘍に所属するリンパ節領域の近傍または内部に）ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されるもののいずれであってもよい。
【００４０】
抗原が内因性である本発明の実施形態によると、本発明の組成物および方法は、本発明のサイトカイン混合物を含有するが、任意の外部の抗原を添加することはない。抗原が外因性である本発明の実施形態によると、本発明の組成物および方法は、本発明のサイトカイン混合物を外因性抗原とともに含有する。後者の実施形態によると、サイトカイン混合物および外因性抗原は、単一の薬理学的製剤でまたは別々の製剤のいずれでも同時に投与でき、または、別々の製剤で異なる時間に投与することもできる。
【００４１】
好ましい実施形態によると、該内因性または外因性の抗原は腫瘍抗原であり、および、腫瘍抗原は全長抗原であっても、または、腫瘍抗原の免疫原性ペプチドまたは断片であってもよい。さらに本発明は、抗原の処理全般に影響を及ぼすことを目的としているので、任意の抗原に対する免疫応答を刺激するのに有用である。さらに、本発明は、ペプチド、脂質および／または糖質をはじめとする抗原およびハプテンのすべての形態に適用可能である。
【００４２】
本発明はまた、抗原産生性の疾患または病変を患う患者において、少なくとも一つの内因性または外因性の抗原に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。より具体的には本発明の方法は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有する有効量のサイトカイン混合物を投与する工程を含み、該サイトカイン混合物は抗原のアジュバントとして作用して、患者における該抗原に対する免疫応答を刺激する。一実施形態によると、患者が患う抗原産生性の疾患は癌である。このような癌は、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ、前立腺癌、黒色腫、乳癌、リンパ腫、子宮頸癌、または肝臓癌を含みうる。
【００４３】
代替的には、抗原産生性の疾患は、抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで産生する任意の感染症、例えば、肝炎、結核またはＨＩＶを含みうる。したがって、本発明は、適用領域を、たとえば、ＨＩＶ＋患者におけるＡＩＤＳウイルス・ワクチン療法との併用による本発明のサイトカイン組成物および方法の使用、または、アジュバント療法が適切な他の状況、即ち、高齢者における腎移植など免疫系を高めるための状況への用途へと、拡大することができる。
【００４４】
さらに、本発明の組成物および方法は、抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで産生する感染性の病変、例えば、皮膚または全身性カンジダ症、パピローマ・ウイルスと関連する性病いぼ、または、子宮頸部形成異常など、非癌性の持続性病変を治療するのに用いることができる。
【００４５】
本発明の方法の一実施形態によると、少なくとも一つの外因性抗原がサイトカイン混合物と併用して患者に投与され、該サイトカイン混合物は、外因性抗原とともに作用して、患者における免疫応答を刺激する。この実施形態によると、本発明の方法は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有する有効量のサイトカイン混合物を、少なくとも一つの有効量の外因性抗原と併用して投与することを含む。好ましい実施形態によると、抗原は腫瘍抗原である。該外因性抗原は、サイトカイン混合物と同じ薬理学的製剤で、従って、サイトカイン混合物と同時に投与でき、または、該抗原は、別々の薬理学的製剤で、サイトカイン混合物が投与されるのと同時にあるいはサイトカイン混合物の投与の前ないし後のある時間に投与できる。下記の実施例１１のデータによって示されるように、本発明のＮＣＭ組成物は、外因性の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と併用すると、マウスおよびヒトの両方における免疫応答を促進するのに有効である。
【００４６】
本発明の方法の代替的な実施形態は、本発明のサイトカイン組成物を患者に投与することを包含し、該サイトカインは、アジュバントとして作用する抗原が一つ以上の内因性抗原、即ち、ｉｎ  ｖｉｖｏですでに配置された抗原である。従って、いずれの外部の抗原も患者に投与する必要はない。この実施形態によると、外因性の抗原製剤を投与する必要はないが、本発明のサイトカイン組成物のみが患者に投与される。
【００４７】
本発明はまた、内因性抗原および外因性抗原の両方を使用することを包含する、即ち、本発明のサイトカイン組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで内因性抗原を有する患者に、外因性抗原と併用して投与され、および、該サイトカインは両方の抗原のアジュバントとして作用して、患者における免疫応答を刺激する。
【００４８】
本発明の方法はまた、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ、前立腺癌、黒色腫、乳癌、リンパ腫、子宮頸癌、および肝臓癌などの癌を治療する免疫療法の方法も含み、該方法において、本発明のサイトカイン混合物は患者に投与されて、免疫応答を刺激する。記載したように、サイトカイン混合物は腫瘍抗原（内因性と外因性のいずれかまたは両方）のアジュバントとして作用して、患者における抗原に対する免疫応答を刺激する。
【００４９】
上記の実施形態のいずれにおいても、下記の治療用投与明細とプロトコールのいずれかまたは両方が用いられる。
【００５０】
好ましくは、本発明のサイトカイン組成物は、治療中の腫瘍または他の持続性病変など病変に所属するリンパ節へと流入するリンパ管の周囲に注射される。より具体的には、局所外リンパ注射または当業者に公知の他の注射が投与されて、免疫療法製剤の十分な局在化を与える。頭頸部癌の場合、頸部に注射を投与するが、治療対象の疾患の必要に応じて他の場所に適用することができる。このような治療は、頭頸部癌患者の高い割合に臨床的退縮を誘起し、このような患者は無再発生存率の向上も示した（Ｈａｄｄｅｎ、１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ、１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ、２０００；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ、１９９３）。対照的に、頭頸部癌の患者における組換えインターロイキン−２の腫瘍内注射（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：５６５４〜５６６２、１９９３））は、Ｔ細胞リンパ球の浸潤を産生したが、有意な臨床的反応はなかった。同様に、外リンパ注射と併用したＭｕｌｔｉｋｉｎｅの腫瘍周辺の注射（Ｃｅｌｓｃｉ  Ｗｅｂｓｉｔｅ）は、１１例の患者にのみ有意な腫瘍応答（即ち、５０％を上回る腫瘍の縮小）を引き起こし、これらの応答割合は１０％未満であった。さらに、サイトカイン・プロトコールに対して最初に陽性応答した患者においても、腫瘍周辺および腫瘍内の注射は、疾患の進行と関連する可能性があり、利点を帳消ししてしまう。従って腫瘍周辺または腫瘍内の注射は禁忌である。
【００５１】
本発明の組成物の投与には１０日間の注射計画が好ましいが、２０日間の注射プロトコールも用いることができる。両側注射が有効である。根治的頸部廓清が発生した場合、対側注射が有効である。
【００５２】
外因性抗原が用いられる実施形態では、外因的に供給される腫瘍抗原およびペプチドなどの合成または抽出された抗原（Ｂｅｌｌｏｎｅ、１９９８を参照）を、異なる製剤で、または、本発明のサイトカイン組成物の一部として、前感作または共感作された局所または遠位リンパ節へと投与できる。
【００５３】
本発明の一実施形態によると、Ｔ細胞の内因的抑制が、例えば癌または他の免疫抑制疾患によって起こりうるが、該抑制は、低用量のシクロフォスファミド（ＣＹ）および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の共投与によって（即ち、本発明のサイトカイン組成物と併用して）阻害することができる。ＮＳＡＩＤは好ましくはインドメタシン（ＩＮＤＯ）であるが、イブプロフェンまたはセレコキシブ（セレブレックス（登録商標））またはロフェコキシブ（ビオックス（登録商標））などのＣｏｘ−ＩＩ阻害剤、またはそれらの組み合わせを用いてもよい。ＮＳＡＩＤＳの副作用はプロトン阻害剤およびプロスタグランジンＥ類似体で積極的に治療できる。亜鉛および総合ビタミン類、可能ならセレンの添加を含むものもまた、Ｔ細胞の免疫回復の助けとなる製剤として添加することができる。好ましくは、亜鉛の用量は１５〜７５ｍｇである。標準的な総合ビタミンを投与できる。亜鉛は市販のグルコン酸塩でありうる。
【００５４】
本発明のサイトカイン組成物は、外科手術、放射線治療、化学治療またはそれらの組み合わせの、前または後に投与できる。本発明の組成物は、腫瘍の再発期、即ち、腫瘍が消失または寛解したと考えられた後の腫瘍成長の再発期間に投与できる。
【００５５】
本発明のサイトカイン組成物は、外因性抗原または内因性抗原のいずれかに対する最適な免疫を促進するために、各患者の臨床状態、投与部位および投与方法、投与の日程計画、患者の年齢、性別、および体重を考慮して、投与および投薬される。従って、本明細書の目的では薬学的な「有効量」とは、当分野で知られるような検討事項によって決定される。該量は、免疫を促進し、その結果、例えば、腫瘍の縮小、腫瘍の断片化およびリンパ球浸潤、再発の遅延または生存率の改善、または、Ｔ細胞数の増加をはじめとする症状の改善もしくは解消を含む。
【００５６】
本発明の方法では、本発明の組成物は様々な方法で投与できる。本発明の組成物に用いられるサイトカインまたは外因性抗原は、その標準的な形態でないし薬学的に許容しうる誘導体として投与でき、および、単独で、または、活性成分として薬学的に許容しうる担体、希釈剤、アジュバントおよび賦形剤と併用して投与できることに留意するべきである。さらに、本発明の組成物は、皮内もしくは皮下、または、外リンパもしくはリンパ内に、節内または脾臓内または筋肉内に、腹腔内に、および胸内に投与できる。治療される患者は、温血動物、とりわけヒトをはじめとする哺乳動物である。薬学的に許容しうる担体、希釈剤、アジュバントおよび賦形剤、ならびに移植担体とは、本発明の活性成分と反応しない、不活性かつ非毒性の固体もしくは液体の増量剤、希釈剤、または、封入材料のことを一般に指す。
【００５７】
投与量は、単回用量または数日間にわたる複数回用量であってもよい。本発明の組成物を投与する場合、該組成物は一般に単位用量の注射剤型（例えば溶液、懸濁液、または乳濁液）で処方される。注射に適した薬剤処方は、滅菌水溶液または分散液、および、滅菌注射溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレン・グリコール、液体ポリエチレン・グリコールなど）、これらの適切な混合物、または植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。
【００５８】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用により、分散液の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、または落花生油、および、ミリスチン酸イソプロピルなどエステル類などの非水性賦形剤もまた、本発明の組成物のための溶媒系として用いることができる。その上、該組成物の安定性、滅菌性、および等張性を増強するための、抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤をはじめとする様々な添加剤も添加できる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい。注射用剤型の持続的な吸収は吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により実施できる。しかしながら本発明によると、用いられる任意の賦形剤、希釈剤または添加剤は、本発明のサイトカインまたは外因性抗原と相溶性でなければならない。
【００５９】
滅菌注射溶液は、本発明を実施するのに用いられるサイトカインまたは外因性抗原を、所望に応じていくつかの他の成分とともに、必要量の適切な溶媒中に加えることによって調製できる。
【００６０】
本発明の薬理学的剤型は、様々な賦形剤、添加剤、および希釈剤など、相溶性のある任意の担体を含有する注射製剤で患者に投与できる。あるいは、本発明で用いられるサイトカインと外因性抗原のいずれかまたは両方は、徐放性皮下移植、または、モノクローナル抗体、ベクター伝達、イオン導入、ポリマー・マトリクス、リポソーム、およびマイクロスフェアなど標的送達系の形態で患者に非経口で投与できる。本発明において有用な送達系の例は、米国特許第５，２２５，１８２号；第５，１６９，３８３号；第５，１６７，６１６号；第４，９５９，２１７号；第４，９２５，６７８号；第４，４８７，６０３号；第４，４８６，１９４号；第４，４４７，２３３号；第４，４４７，２２４号；第４，４３９，１９６号；および第４，４７５，１９６号に開示される送達系を含む。他の多くのこのような移植、送達系、およびモジュールは当業者に周知である。
【００６１】
本発明の組成物および方法が、上記で論じた癌、感染症または持続性病変などの抗原産生性の疾患の治療に有用なことは明らかであろう。該組成物および方法は、患者におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫応答を刺激することによって、これらの疾患によって産生された抗原に対する免疫を促進し、該免疫応答は、患者における疾患の症状および影響を緩和または解消する助けになる。
【００６２】
上記の議論は、本発明の使用に対する事実に基づく論拠を提供する。本明細書中に開示された用途での使用のための本発明の組成物および方法は、下記の非限定的な実施例および添付の図面によって示すことができる。
【００６３】
下記に記載される実施例は、本発明によるサイトカイン混合物であるＮＣＭの調製、癌患者の免疫応答を刺激するための内因性の腫瘍抗原のアジュバントとしてのＮＣＭの使用を示す臨床試験のデータ、ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答を刺激するための本発明のサイトカイン混合物の外因性抗原との併用を示すマウスおよびヒトの実験を記載する。
【００６４】
より具体的には下記の実施例１は、本発明によるサイトカイン組成物ＮＣＭの産生について記載する。ＮＣＭの産生は米国特許第５，６３２，９８３号および第５，６９８，１９４号に完全に開示され、これら特許は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
下記の実施例２は、ＮＣＭ（低用量のシクロフォスファミド（ＣＹ）、インドメタシン（ＩＮＤＯ）および亜鉛と併用）で処理したＨ＆Ｎ  ＳＣＣ患者が、免疫を示す節の変化（例えば節の大きさの増加およびを洞組織球症の減少）、リンパ球による腫瘍浸潤、ならびに、腫瘍の縮小および断片化をはじめとする、有意な臨床的および病理学的応答を示した臨床試験データを開示する。実施例４〜７は、さらに別の癌患者、即ち、リンパ腫、子宮頸癌、肝臓癌、および（ヒト・パピローマ・ウイルスと関連する）陰茎の扁平上皮細胞癌を患う癌患者に関し、これらの患者は全例、本発明のＮＣＭによって治療され、および、治療に対して有意な臨床的反応を示した。実施例３は、これら試験の癌患者の生存率の増加（２年以内）に関するデータを提供する。
【００６６】
実施例２において示されるように、ＮＣＭによる治療は、Ｔリンパ球減少症患者における顕著なＴリンパ球数の増加、および、それに対応する未感作Ｔ細胞（抗原に暴露されない新たに産生されるＴ細胞）の増加もきたした。さらに、下記の実施例８のデータによって示されるように、これらの試験において観察されたＴ細胞の増加は、本発明のサイトカイン組成物による治療に特に起因する。より具体的には、実施例８は、リンパ球減少症Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ癌患者に対する、ＮＣＭのみ（ＣＹとＩＮＤＯのいずれかまたは両方の併用投与を伴わない）による治療のデータを提供する。このデータでは、全リンパ球数、ならびに、特異的なＣＤ３＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット個体群に有意な増加が得られた。
【００６７】
同様に、実施例９のデータは、形態学、表現型および機能的基準によって測定された、樹状細胞の分化および成熟を、ＮＣＭが促進することを示している。上述したように、樹状細胞（ＤＣ）が、患者の抗原に対する免疫において、即ち、適切なＴ細胞に抗原を提示することによって重要な役割を果たすことが知られている。より具体的には実施例９は、成熟を示唆するＤＣ中の形態学的変化を、ＮＣＭが促進することを示す。またＮＣＭは、ＤＣ細胞表面上のＣＤ１ａ抗原の発現をダウン・レギュレートし、ＤＣ細胞表面上のＣＤ８３およびＭＨＣ  ＩＩ抗原の発現をアップ・レギュレートし、および、ＤＣ細胞表面上のＴ細胞共刺激および接着分子、例えば、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）の発現を増加することも示された。さらにＮＣＭは、ＤＣの細胞内活性をダウン・レギュレートし（これはＤＣの成熟と一貫している）、ＤＣのＴ細胞刺激活性を増強し（ＭＬＲ活性の増加によって示される）、および、ＤＣからのＩＬ−１２の産生を増加することも示された。ここでＩＬ−１２自体は、未感作ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の（Ｔｈ１細胞への）分化、ならびに、免疫系の細胞学的および食作用成分の活性化および増殖における不可欠の因子である。最後に、ＮＣＭはＤＣのＶＥＧＦ誘導性アポトーシスを減少させることが示された。ＮＣＭのこの抗アポトーシス効果は、腫瘍環境内の成熟したＤＣの生存を維持するのに非常に重要な役割を果たしうる。これによって、持続した抗原の提示および腫瘍抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化が可能になる。
【００６８】
下記の実施例１０のデータは、ＮＣＭが単球およびマクロファージの強力な活性化因子であることをさらに示す。例えば、ＮＣＭは、単球／マクロファージの活性化マーカー、即ち、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０を有意に増加させる。さらにＮＣＭは、ＴＮＦ−αまたはＬＰＳよりも強力な、単球／マクロファージの活性化因子であることが示され、および、ＮＣＭは免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の存在下であっても細胞の活性化を継続することができた。
【００６９】
下記の実施例１１は、マウスにおいて、サイトカイン組成物を外因性の前立腺特異的膜（ＰＳＭＡ）ペプチド抗原共役体と併用して投与した後に、免疫応答を、即ち、ＤＴＨ応答ならびに抗体応答の形で誘発する、ＮＣＭの能力を示す。ＮＣＭは、進行性前立腺癌を患うヒトにおける非共役ＰＳＭＡペプチドに対するＤＴＨ応答を刺激するのにも有効であった。
【実施例】
【００７０】
細胞培養に関するすべての工程は滅菌状態のもとで実施される。本明細書中に記載されない細胞免疫学の一般的な方法は、ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉなど（細胞免疫学において選択される方法、１９８１）の細胞免疫学的な技法についての一般的な参照文献に記載されるように実施され、および、当業者に周知である。
【００７１】
実施例１
天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）の調製
ＮＣＭ（本明細書中においてＩＲＸ−２ともいう）は、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）およびシプロフロキサシンによってヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激した後、ＧＭＰ条件のもとで２４時間かけて産生される規定のサイトカイン混合物である。ＰＢＭＣの提供者をスクリーニングし、および試験済みの軟膜はＦＤＡに認可された血液銀行から購入される。ＰＨＡの刺激の後、分裂促進因子を遠心分離および洗浄によって除去する。すべての細胞学的要素を遠心分離によって除去し、およびＤＮＡを、陰イオン交換クロマトグラフィーによって除去する。細胞の存在しない上清を、フィルターを通して滅菌しナノフィルターで濾過してウイルスの除去を可能にし、および、これをＩＲＸ−２と指名する。生物学的試験およびサイトカイン濃度のＥＬＩＳＡによる決定の両方を含む厳格なＱＣ試験によって、ＩＲＸ−２の一貫性が保証される。滅菌性、ＤＮＡ、マイコプラズマ、エンドトキシンに関する安全性試験、および、ＣＭＶおよびＥＢＶに対するウイルス試験もまたＧＭＰ工程の一部である。ＩＲＸ−２はこれまで様々な臨床試験において１５０例を上回る患者に安全に投与されてきており、および、ＦＤＡによって承認されたＩＮＤのもと現在第Ｉ／ＩＩ相試験にある。
【００７２】
より具体的には、ＮＣＭは下記のように調製できる。
【００７３】
複数のＨＩＶ陰性肝炎ウイルス陰性提供者からのヒトの血液の軟膜白血球が回収される。代替的な実施形態では、動物が獣医学用途の細胞供給源でありうる。提供者からの細胞はプールされおよびフィコール・ハイパック勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に積層して、好中球および赤血球を含まないリンパ球を得た。当業で知られるものと同じ出発リンパ球集団を生じうる代替的な方法を使用することができる。
【００７４】
リンパ球は洗浄し、および細胞サブセットの選別用の表面活性化細胞培養フラスコ中のＸ−ＶＩＶＯ１０培地（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に分配した。フラスコ（ＭＩＣＲＯＣＥＬＬＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｔ−２５細胞培養フラスコ）は、固定化した刺激剤、即ち、ＰＨＡなどの分裂促進因子を含有する。刺激剤の固定化工程は、パニング手法、即ち、フラスコ中で細胞を単離するための、様々な物質を固定化するための製造業者による記載のとおりである。代替的には、リンパ球は、ＰＨＡなど刺激剤に２〜４時間暴露され、およびその後３回洗浄される。
【００７５】
細胞は、ＣＯ２／空気インキュベーター中で、８０μｇ／ｍｌのシプロフロキサシン（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１０培地中で、３７℃で２４〜４８時間インキュベートする。代替的には、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いることができる（Ｗｅｂｂら、１９７３）。ＨＳＡを含まない培地が生成に用いられる場合、インターロイキン類をさらに安定させるために、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を添加してもよい。一般に、ＨＳＡは０．１〜０．５％（質量／体積）で用いられる。インキュベーションの後、上清を注ぎ出して回収する。上清は４℃から−７０℃で保存される。
【００７６】
実施例２
頸部におけるＮＣＭの局所外リンパ注射を、低用量のＣＹ（３００ｍｇ／ｍ２）、ＩＮＤＯ（２５ｍｇを経口で１日３回）、および亜鉛（元素亜鉛６５ｍｇを硫酸塩として、１日１回経口）による治療に加えることによって、頭頸部の扁平上皮細胞癌（Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ）の患者の高い比率に臨床的退縮を誘起し（Ｈａｄｄｅｎ、１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ、１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ、２０００；Ｈａｄｄｅｎ、２００３；Ｍｅｎｅｓｉｓ、２００３）、無再発生存率の向上の徴候も伴った。全体としては、わずかな奏効（２５％〜５０％）、腫瘍の縮小、および病理組織標本中の腫瘍の縮小を含めると、９０％を上回る患者に効果があり、およびその大半に５０％を上回る腫瘍の縮小があった。
【００７７】
Ｂリンパ球およびＴリンパ球の両方の腫瘍への浸潤が観察されたので、これらの反応は免疫の退化によって媒介されたと推測される。この療法は有意な毒性を伴わなかった。リンパ球減少症癌患者のＮＣＭとの併用による治療は、顕著なリンパ球の動員をきたし、分析によって、これらの患者は、ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞（即ち、未感作Ｔ細胞（下記の表Ｉを参照））の増加を示した。さらに、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣの患者において、腫瘍内または腫瘍周辺へのＮＣＭの注射の結果、免疫療法に起因する腫瘍の退縮の逆行、または、腫瘍の進行のいずれかが生じた。従って、腫瘍は免疫の部位ではない。むしろ、局所リンパ節の分析によって、局所リンパ節が、想定した腫瘍抗原に対する免疫の部位であることを明らかにした（Ｍｅｎｅｓｅｓ、２００３；図１〜５を参照）。臨床的には１５％および病理学的には５０％の患者に転移が予測されていたが、ＮＣＭによって治療したこれらの患者のいずれも転移を発症しなかった。これらの結果は、単なる局所免疫ではなくむしろ全身性免疫が誘起されたことを示す。患者は治療前に、皮膚試験において０．１ｍｌのＮＣＭに対して事前検査を行っており、皮膚試験で陽性（２４時間時点で＞０．３ｍｍ）であった患者のうち９０％を上回る患者に、強い臨床的および病理学的応答があった。皮膚試験が陰性であった患者は弱い応答または無応答があった。このように、皮膚試験では応答の良好な者を選別する。
【００７８】
これらのＴリンパ球減少症患者には、Ｔリンパ球数（ＣＤ３）の顕著な増加が観察された７５２→１０２０（Ｔ細胞数：７５２対１６００（正常））。重要なことに、これに対応して「未感作の」ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞も増加した（５３２→７８２）。先述したように、一般には、これらの増加は、成人、とりわけＮＣＭのような薬理療法を受けた患者には、発生しないと考えられている。これらの細胞はおそらくは最近胸腺から遊出したものであり、および、腫瘍抗原のような新しい抗原に応答する大きな新たな能力となると考えられうる。先に存在するＣＤ４５ＲＡ陽性細胞は腫瘍抗原に応答していなかった。これは、腫瘍による免疫抑制（アネルギー）を理由に、応答できなかったと思われる。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
文献（Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１／１２：６２９−６４４、１９９７；Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２１：７９〜１０１、１９９９）は、局所リンパ節が、二つの主要な癌の型であるＳＣＣおよび腺癌の両方に対して、腫瘍と関連した異常を反映することを示す。該異常は、洞組織球症、リンパの枯渇、および、多くの場合、腫瘍細胞と（ＩＬ−２とともに）反応できる腫瘍と関連したリンパ球の存在を含む。転移によって、リンパの枯渇および機能の低下が発生する。併発のない頸部リンパ節のＨ＆Ｎ  ＳＣＣ患者１０例に対する未発表の分析では、リンパ節の平均の大きさの減少およびＨ＆Ｎ  ＳＣＣに関連する洞組織球症の増加を示した（本出願の図１〜４Ａおよび４Ｂの対照を参照）。
【００８１】
一周期のＮＣＭプロトコールを用いた治療の後（Ｈａｄｄｅｎ、１９９４；Ｍｅｎｅｓｅｓ、１９９８；Ｂａｒｒｅｒａ、２０００）、併発のない頸部リンパ節は図１〜４に示す変化を示した。ＮＣＭで治療しないＨ＆Ｎ  ＳＣＣ患者の局所リンパ節と比べると、これらの節は、大きさ、Ｔ細胞領域および密度の有意な増加、および、洞組織球症およびうっ血の減少を示した。治療患者のリンパ節はすべて刺激され、および、対照の節よりも大きく、Ｔ細胞領域および密度も増加していた。従ってこれらの節は、正常に回復しただけでなく、Ｔ細胞の優勢、すなわち既知であるＨ＆Ｎ  ＳＣＣにおける生存率との正の相関の証拠を示した（Ｈａｄｄｅｎ、１９９７）。
【００８２】
重要なことに、Ｂ細胞およびＴ細胞領域に関連するリンパ節の変化が、Ｔ細胞およびＢ細胞の浸潤を反映する腫瘍の変化と相関した場合、高い相関関係がＴ細胞（ｐ．＜０．０１）およびＢ細胞（＜０．０１）および全リンパの存在（ｐ．＜０．００１）（図５）に対して得られた。同様に、これらの変化は病理学的および臨床的基準による腫瘍の縮小と相関した。これらの知見は、腫瘍反応がリンパ節の変化と、直接的なかつ正の相関をすること、および、従属変数としてのリンパ節の変化を腫瘍の反応が反映することを示す。免疫系が機能する機序一般（Ｒｏｉｔｔ、１９８９）、および、その後のサイトカイン遺伝子による腫瘍トランスフェクション（Ｍａａｓｓ、１９９５）に関する知識とあわせて鑑みると、これらの知見は、ＮＣＭプロトコールが、これらの患者に対して、リンパ節のレベルで内因性の腫瘍抗原に対して免疫することを示す。これまでは誰も、自己腫瘍抗原による免疫を反映するリンパ節変化の証拠を提示してこなかった。このことは、本発明が、遠隔転移の縮小を生じる目的で、かつては無効であるかまたは効果に乏しかった、腫瘍抗原による免疫を誘起しうることを確認するものである。
【００８３】
実施例３
前述した臨床試験の臨床学的、病理学的および生存率のデータのさらなる分析によって、より多くの洞察が本発明の性質に提供される。その理由は、本発明は、自らの自己腫瘍抗原に対する患者の免疫、および、結果として生じる腫瘍の免疫の退化に関するからである。図６は、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）プロトコールによる治療が４８ヶ月時点での生存率の増加に関連する（ｐ＜０．０１）ことを示す。図７は、正の臨床反応が生存率と相関する、即ち、完全奏効（ＣＲ）または部分奏効（ＰＲ）の患者（５０％を上回る腫瘍縮小）が、わずかな奏効（ＭＲ）（５０％未満であるが２５％を上回る腫瘍縮小）または無反応（ＮＲ）（２５％未満）の患者よりも生存率が良好であった（ｐ＜０．０１）ことを示す。図８は、病理反応がより強い患者（指標６〜９）のほうが、病理反応がより弱い患者よりも（６未満）、生存率が良好であった（ｐ＜０．０２）ことを示す。図９は、腫瘍へのリンパ浸潤が単一の変数として生存率を予測する（ｐ＜０．０１）ことを示す。臨床反応の病理反応との関係のカイ二乗分析は有意性の高い関係（ｐ＜０．０１）を示し、このことは、この両者が生存率と相関するだけでなく、互いに相関し、従って、臨床反応、免疫の退化パラメータ、および生存率の間で相互に関連する、統計的なデータの三角関係を提供することを示している。このような関係は、ヒトの癌の免疫療法に対してこれまで全く示されてこなかった。
【００８４】
最後に図１０は、本発明のＮＣＭに関して、用量と２４ヶ月時点での全体の生存率を関連付ける用量反応曲線を提示する。ＮＣＭ治療は、約１００〜２３３国際単位のＩＬ−２当量で生存率に最適な影響を及ぼす。
【００８５】
実施例４
頭頸部のリンパ腫の患者２例を、上記に記載されたプロトコールに従って治療した。下記のスキームに従った。
【００８６】
治療前に患者には、０．１ｍｌのＮＣＭを前腕の皮下に注射して皮膚試験を行い、領域に印を付け、および２４時間後に、試験結果を読み取った。誘起および紅斑が３ｍｍ以上であった場合、該試験は陽性とみなされた。
【００８７】
症例１
患者は、左顎下腺領域の腫瘍の存在を示し、他に症状のない病歴３ヶ月の２３歳の男性であった。緊急治療室にて患者は、左顎下腺領域に深いレベルに部分的に固定された堅い直径約６．５ｃｍのリンパ節腫脹がみとめられた。残りの健康診断は正常であった。切開生検はホジキン・リンパ腫を示した。病変はＥＣＩＩＡ期であった。ＮＣＭの一周期治療が施され、リンパ節腫脹の大きさが直径１ｃｍだけ減少するわずかな奏効を得た。ＮＣＭ治療の後に得られた生検報告は、病変の６０％が正常なリンパ浸潤を示し、および、新生物の残り（４０％）は壊死を示した。生存率する腫瘍細胞が見出されなかった。
【００８８】
この後、患者は頸部に３６００ラドの放射線治療を受けた。患者は２年間無病であった。
【００８９】
症例２
患者は、有痛性の中頸部腫瘤ならびに１０ｋｇの体重減少を提示した病歴２ヶ月の８２歳の男性である。健康診断で、患者は、右口蓋扁桃に腫瘍を提示し、該腫瘍は約４×３ｃｍまで肥大し、扁桃の中心に潰瘍があった。頸部では、右顎下リンパ節の測定値は約２×２ｃｍであり、および、リンパ節腫瘤はレベルＩＩおよびＩＩＩ、約５×５ｃｍであった。健康診断の残りは正常であった。扁桃および一方の頸部リンパ節の切開生検は中等度の明確な非ホジキン・リンパ腫の混合物を示した。
【００９０】
患者は２周期のＮＣＭを受け、その終了時に、扁桃および頸部リンパ節腫脹の直径１ｃｍの縮小が観察された。ＮＣＭ治療後の病理報告は、２０％が生存腫瘍、３０％が腫瘍の断片化および壊死、および、５０％が正常なリンパ球浸潤を示した。
【００９１】
患者には、６周期の化学治療（ＣＨＯＰ）、次いで、合計用量４６００ラドの外部放射線治療（ＲＴ）が施された。患者はＲＴの８ヶ月後に後頭部レベルで副腎過形成が再発した。患者は、頸部疾患の徴候から３ヶ月後に死亡した。
【００９２】
実施例５
臨床的にＩＢ１期、ＩＢ２期およびＩＩＡ期の未治療の早期子宮頸癌の患者１０例を、ＮＣＭの局所外リンパ注射（１０日の連日注射）、その後、２１日目の広範子宮全摘術によって治療した。ＮＣＭ治療を開始する１日前に、患者は、３００ｍｇ／ｍのＣＹの単回のＩＶ投与を受けた。ＩＮＤＯないしイブプロフェン、および硫酸亜鉛が１日目から２１日目まで経口で投与された。臨床反応ならびに病理反応、毒性ならびに無病生存率を評価した。
【００９３】
すべての患者がＮＣＭ治療を完了し、および、反応および毒性を評価した。臨床反応は、患者の５０％（３例が部分奏効（ＰＲ）、２例がわずかな奏効（ＭＲ）（２５％を上回り５０％未満の縮小））に見られた。７例の患者は外科手術を受けた。病理学的には、腫瘍の断片化と関連する腫瘍の縮小が５例にみとめられた。リンパ球、形質細胞、好中球、マクロファージおよび好酸球を含む、腫瘍に浸潤する細胞型には不均一なパターンがあった。治療は、注射中の軽度の疼痛ならびに少量の出血およびＩＮＤＯへの胃の不耐性を除いて、耐性が高かった。２４ヶ月のフォロー・アップ時に、９例の患者は無病であった。
【００９４】
本試験は、早期の未治療の子宮頸癌において、ＮＣＭ治療が免疫媒介性腫瘍への応答を誘起することを示す。
【００９５】
実施例６
原発性肝細胞癌から肝転移した２例の患者を、脾臓内ＮＣＭ（１回または３回の注射）によって治療した。プロトコールは、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ、子宮頸部、またはリンパ腫の症例について前述したとおりであった。進行性肝細胞癌の患者１例は部分奏効を示し、断層撮影によって確認された。残りの１例は、部分奏効を示し、外科手術によって確認された。組織学的試験は腫瘍の縮小、断片化、およびリンパ浸潤を示した。
【００９６】
実施例７
（ヒト・パピローマ・ウイルスが関連する）陰茎の扁平上皮細胞癌の患者４例を、上記に記載したようなＮＣＭプロトコールで治療した。４例はすべて臨床的に部分奏効し、および、外科標本はＨ＆Ｎ  ＳＣＣ癌患者に特徴的にみられる腫瘍の縮小および断片化、およびリンパ浸潤を示した。
【００９７】
実施例８
ＮＣＭによるＴリンパ球減少症の改善
下記の実験の目的は、リンパ球減少症患者のリンパ球数（ＬＣ）に対する１０日の連日注射（１１５単位ＩＬ−２当量／日）での、６つのサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有するＮＣＭによる治療の効果を評価することであった。これらの患者は、過去の頭頸部癌への外科手術および放射線治療から回復し、および、平均細胞数４４１個／ｍｍ３の持続性リンパ球減少症を患っていた。ＬＣの正常レベルは２０００個／ｍｍ３である。患者は治療時に癌はなかった。０日目および１３日目にＬＣを得た。Ｔリンパ球（ＣＤ３＋）およびＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）を細胞蛍光測定法によって評価した。表ＩＩは、応答した患者５例のデータを提示する。有意な増加がＬＣ、ＣＤ３＋、およびＣＤ４＋Ｔ細胞に観察された。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
これらの変化は、リンパ球減少症のＡＩＤＳ患者において、はるかに高い用量のＰＥＧ化したインターロイキン２（３×１０６単位の組換えＩＬ−２）によって達成した変化と匹敵している（Ｔ．Ｍｅｒｉｇａｎ、私信）が、毒性は少なかった。これらの変化は、ＡＩＤＳ患者において１０×１０６単位／日を上回るＩＬ−２の８日間の注入によって達成される変化よりも少ない。しかしながら後者は、多大な費用、不都合を要し、顕著な毒性があった（Ｋｏｖａｋｓ、１９９７）。ＮＣＭによるこれらの結果は、ＩＮＤＯおよびＣＹの非存在下で得られた。従って、この治療法のＬＣに対する効果は、本発明のＮＣＭ組成物による効果であることを示す。
【０１００】
実施例９
ＮＣＭは樹状細胞の成熟および活性化を刺激する
過去の実験において、ＮＣＭで治療したＨ＆Ｎ  ＳＣＣ患者５例、および未治療Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ対照患者５例からリンパ節を単離し、および、樹状細胞の細胞表面マーカー（即ち、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、およびＣＤ６８＋）のパネルを用いて、フロー・サイトメトリーによって、細胞組成を分析した。上述したように、洞組織球症は、一部の癌患者に見られるリンパ節の病変であり、未熟な樹状細胞を代表する大きな組織球のリンパ節内で蓄積することを特徴とする。図１１Ａに示すように、ＳＨを患う患者（ＳＨ＋）はリンパ節内にＣＤ６８＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６ＤＣの蓄積を有するが、一方、顕著なＳＨのない患者はＣＤ８３＋細胞がほとんどなかった。しかしながら、ＮＣＭ治療によって、未治療の癌対照と比べると、ＣＤ８６＋（ＣＤ６８＋、ＣＤ８３＋と共存する）ＤＣの数が５倍増加し、このことは「活性化された」ＤＣ表現型への変換を示している。対照は、ＮＣＭで治療した癌患者と比較するための、未治療のＨ＆Ｎ  ＳＣＣ患者である（図１１Ｂを参照）。
【０１０１】
洞組織球症は、内因性の腫瘍ペプチドを有すると推測される部分的に成熟したＤＣの蓄積を表しているので、共刺激受容体ＣＤ８６の発現による完全な成熟および活性化によって、成熟後ただちにこの欠損を修正し、Ｔ細胞に対する有効な抗原の提示をできるように、本発明のＮＣＭを使用したことを反映する。従って本発明のＮＣＭは、洞組織球症を逆行させ、未感作Ｔ細胞の有効な免疫化を導く。
【０１０２】
上記に記載のデータおよびその後のＭｅｎｅｓｅｓら（２００３）の文献に含まれるデータは、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ患者の治療への外リンパＮＣＭ、低用量のＣＹ、およびＩＮＤＯを用いた治療によって、該癌および他の癌のリンパ節内に高頻度にみられる洞組織球症を逆行させたことを示した。しかしながら、上記の薬剤ＮＣＭ、ＣＹおよび／またはＩＮＤＯのうち何がこの欠損を修正したかは、このデータからは明らかでなかった。
【０１０３】
下記のデータは、６つのサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを含有するＮＣＭが、ＣＹとＩＮＤＯのいずれかまたは両方の非存在下で、ＤＣの成熟および活性化を誘起する証拠を提示する。これらの実験に用いられるＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は、上記に記載した６つのサイトカイン、または下記の表ＩＩＩに示されるようなサイトカインを含有する。これらの実験の目的のため、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の濃度は、ＩＲＸ−２に含有されるＴＮＦ−αの濃度として表される。ＩＲＸ−２中のＴＮＦ−αを始めとするサイトカインの濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定され、および組換えＴＮＦ−αの純度は９５％を上回る。滴定を除くすべての実験では、ＮＣＭは濃度１ｎｇ／ｍｌで用いた。
【０１０４】
【表３】
2009544724.tif 000005
【０１０５】
用いた培地は、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、および、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０であった。（すべての試薬はＣｅｌｌｇｒｏ（ハーンドン、バージニア州）から購入した。）ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、およびＶＥＧＦ１６５はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（ロッキーヒル、ニュージャージー州）から購入した。Ｘ−ＶＩＶＯ  １０はＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（ウォーカーズビル、メリーランド州）から購入した。ＬＰＳはＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。すべての試薬について、高感度のリムルス血球抽出液検定（ＬＡＬ検定；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で、製造業者の指示に従ってエンドトキシンの混入を試験し、陰性であることがわかった。すべての溶液の含有量は、検出下限である０．０６ＥＵ／ｍｌ未満であった。さらに、すべてのプラスチック品は発熱性ではなかった。
【０１０６】
これらの実験に用いられたＰＢＭＣは、健常な提供者の白血球に富む軟膜３０ｍｌから、フィコール・ハイパック遠心分離（Ｃｅｌｌｇｒｏ、ハーンドン、バージニア州）を用いた遠心分離によって取得し、および、４２．５〜５０％のインタフェースから軽い比重の画分が回収された。細胞は培養培地中に再懸濁され、および、６ウェル・プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に付着させた。３７℃で２時間後に、付着していない細胞を洗浄によって除去し、および付着細胞（９０％までがＣＤ１４＋細胞、即ち単球）は、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を添加した培地３ｍｌ中で培養した。
【０１０７】
表面マーカーの分析のため、下記の蛍光色素共役ｍＡｂｓ：ＣＤ８６−ＰＥ、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ５４−ＡＰＣ、ＣＤ８３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１ａ−ＡＰＣ、ＣＤ４０−ＦＩＴＣ（すべてはＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州から購入）、および適切なアイソタイプ対照を用いた。免疫表現型分析をＦＡＣＳを用いて実施した。細胞（０．２５ｘ１０６）を、２％のＦＢＳおよび０．１％のＮａＮ３（ＦＡＣＳ洗浄緩衝剤）を添加したＰＢＳ中で洗浄し、および、ＡＰＣ共役ｍＡｂｓ、ＰＥ共役ｍＡｂｓないしＦＩＴＣ共役ｍＡｂｓ、または、対応するアイソタイプに合致したｍＡｂで、室温で３０分間インキュベートした。過剰なｍＡｂを、ＦＡＣＳ洗浄緩衝剤中で洗浄することによって除去した。結果は、平均蛍光強度または特定の抗原を発現する細胞のパーセント比率のいずれかとして表した。１０，０００イベントの取得後に、蛍光分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロー・サイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ロックビル、メリーランド州）で実施し、および、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ロックビル、メリーランド州）で解析した。
【０１０８】
図１２に示すように、本発明のＮＣＭ組成物は、ＤＣ成熟の主要なマーカーであるＣＤ８３抗原を持つＤＣの数を増加させた。より具体的には、付着ＰＢＭＣを、上記に記載したようにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で７日間培養し、および次いで、組換えＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）またはＮＣＭ（ＩＲＸ−２）のいずれかでその量を増加させながら刺激した。４８時間後、細胞を洗浄し、およびＣＤ８３の発現をフロー・サイトメトリーで分析した。ＣＤ８３＋細胞の増加から明らかなように、図１２は、ＤＣの成熟を誘起するのにＮＣＭが活発であることを示す。さらにＮＣＭは、当量用量の単独のＴＮＦ−αよりもより活発に、ＤＣの成熟を誘起した。図１２に示すデータは、５回の個々の実験の平均±ＳＥＭ（ｐ＜０．０００１、分散分析による）として表す。
【０１０９】
これらのデータは、ＮＣＭがＤＣの成熟を促進すること、および、ＮＣＭ混合物中に含有されるＤＣの成熟に作用することが知られたいずれの単一のサイトカインによっても説明ができない方法で成熟を促進することを示す。例えば、ＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの正常な分化には、１００〜５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）および５００〜１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在が必要である。これによって、ＤＣ系統に分化したが比較的未熟な状態（低／中等度のＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲの発現、ＣＤ８３には無効）にある細胞群を生成する。未希釈のＮＣＭは、検出不能な量のＩＬ−４を有し、および、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＤＣの分化に必要な量よりも、１０〜５０倍低い濃度のＧＭ−ＣＳＦ（約１．１ｎｇ／ｍｌ）を含有する。従って、図１２の培養において産生されたＣＤ８３＋細胞は、ＮＣＭ中の個別のサイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦでは説明がつけられない。
【０１１０】
ＴＮＦ−αはこのような細胞を誘導できるが、その濃度は、本発明のＮＣＭ中の濃度を大きく上回る（図１２を参照）。例えば、樹状細胞系統への初回の分化の後（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４より数日後）に、病原体に由来するシグナル（例えばＬＰＳ）など「ｄａｎｇｅｒ  ｓｉｇｎａｌ」を加えることによって、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲの高／強発現およびＣＤ８３の存在をはじめとする、完全に成熟した樹状細胞の表現型が誘起される。２０〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲にあるＴＮＦ−αは、このような病原体由来の危険シグナルを概ね模倣することができ、同マーカーのアップ・レギュレーションをきたす。しかしながら、未希釈のＮＣＭ混合物は、平均してわずか２．８ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを有し、これは、ＤＣの完全な成熟に必要なＴＮＦ−α濃度よりもはるかに低い。このため、図１２に示される結果は、この実験に用いられたＴＮＦ−α当量濃度においては、ＮＣＭによるＣＤ８３マーカーの誘起は、ＮＣＭ混合物中のＴＮＦ−αの存在のみが原因でないであろうことを、明らかに示している。
【０１１１】
ＤＣは、未熟な細胞から成熟細胞へと進化するにつれ、明確な形態学的変化を遂げることが知られている。従って、未熟なＤＣをＮＣＭで処理して、ＮＣＭ処理が細胞の形態を変化させたか否かを決定した。より具体的には、上述したように、付着ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）の存在下で４日間成長させ（該処理は未熟なＤＣを産することが知られている）、および次いで、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で処理するか、または、対照として未処理のまま放置するかのいずれかとした。３日後に、細胞をライト染色および顕微鏡検査によって可視化した。図１３に示すように、ＮＣＭで処理した細胞（図１３Ｂ）は成熟したＤＣに特徴的な細胞学的突起および運動性を示し、細胞学的プロセスおよびベールを連続的に伸縮させた。これらの細胞は、大きな不規則形状の核、多数の小胞、比較的少数の細胞質顆粒、および、未処理の対照（図１３Ａ）と比べて、顕著なかつ豊富な細胞学的突起を有していた。従って、ＮＣＭ処理の結果、典型的な成熟ＤＣの形態を所有するＤＣを生じた。
【０１１２】
さらに、未熟なＤＣから成熟したＤＣへの原型的変化の結果、所定の細胞表面抗原の特徴のはっきりした増加および減少をきたすことが知られている。例えば、未熟なＤＣは高レベルのＣＤ１ａを発現し、および、サイトカインまたは細菌産物などの刺激との遭遇後ただちに、このマーカーはダウン・レギュレートされる。従って、（上記に記載したように）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で処理した付着ＰＢＭＣ（単球）を７日間成長させ、および次いで、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の存在下非存在下で、４８時間インキュベートして、ＤＣの活性化および成熟と関連した細胞の表面マーカーの獲得または損失が、ＮＣＭ処理に起因するか否かを決定した。ＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ５４の発現をフロー・サイトメトリーで試験し、および、平均蛍光強度で表した。
【０１１３】
図１４のヒストグラムによって示されるように、未熟なＤＣをＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で処理した（ヒストグラム中実線で示される）の結果、ＣＤ１ａ発現のダウン・レギュレーション（１４７対６２）、ならびに、ＭＨＣＩＩ  発現のアップレギュレーション（４５５対６６２）をきたした。さらに、ＮＣＭ処理は、細胞の大きさの増加および粒度の減少（データ表示なし）をきたした。未処理の対照は各ヒストグラム中の破線によって示される。未治療のＤＣの平均値はパネルの左上の角に示され、ＮＣＭで処理したＤＣのそれぞれの値は右上の角に示されている。示したヒストグラムは代表的な実験からのものであり、および、各値は、少なくとも１０回の個々の実験からの平均結果を表す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００２、＊＊＊＝ｐ＜０．００００５、２群スチューデントｔ検定）。さらに図１４によって示すように、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）処理は、共刺激表面分子ＣＤ８６（Ｂ７−２としても知られる）（１９３対３９０）、ＣＤ４０（４６対７５）、およびＣＤ５４（細胞間接着分子１、ＩＣＡＭ−１としても知られる）（１８４０対３７７９）の発現を増強した。表面マーカー発現におけるこれらの変化のすべては、本発明のＮＣＭがＤＣの活性化の強力なエフェクターであることを示す。
【０１１４】
抗原提示細胞としての役割と整合して、未熟なＤＣは高いエンドサイトーシス活性を持ち、活発に抗原を取り込む。成熟後ただちに、この活性はダウン・レギュレートされ、その直後に、ＤＣは抗原処理および提示に携わる。生理学的条件のもとでは、ＡＰＣのエンドサイトーシスのダウン・レギュレーションは、表面上のペプチド／ＭＨＣ錯体の増加と関連し、Ｔ細胞の刺激の増強をきたす。エンドサイトーシスに及ぼすＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の影響を試験するために、ＤＣをＮＣＭ（ＩＲＸ−２）でその量を増加させながらインキュベートし、ＦＩＴＣ−デキストランを取り込む能力を決定した。より具体的には、（上述したように）付着ＰＢＭＣ（単球）をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で４日間処理し、および次いで、ＴＮＦ−α（１μｇ／ｍｌ）で、または、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α当量となるまで濃度を増加させながら刺激した。１８時間後、細胞をＦＩＴＣ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）でインキュベートし、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるまで添加した。細胞を３７℃で３０分間培養した。インキュベーションの後、細胞を氷温のＰＢＳで４回洗浄し、および、上述したようにフロー・サイトメトリーによって分析した。
【０１１５】
図１５に示すように、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）でインキュベートした（黒色円）未熟なＤＣは、用量依存的にエンドサイトーシスをダウン・レギュレートした。ＮＣＭ中にみとめられた対応する用量のＴＮＦ−αによる処理（白色円）は、最小の効果をもたらした。未熟なＤＣをより大量のＴＮＦ−α（１０〜２５ｎｇ／ｍｌ）で処理した結果、期待されたようなエンドサイトーシスの活性のダウン・レギュレーションをきたした（データ表示なし）。図１５のデータは、未刺激のＤＣの平均蛍光強度に対する刺激したＤＣの平均蛍光強度のパーセント比率として示され、および、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭである（ｐ＜０．００００１、分散分析による）。これらの実験は、本発明のＮＣＭが、ＤＣの細胞内活性をダウン・レギュレートすることを示し、このダウン・レギュレーションはＤＣ成熟の指標である。
【０１１６】
次に、ＮＣＭがＤＣのＴ細胞刺激能を増強する能力を評価した。活性化され、成熟したＤＣは未感作Ｔ細胞の強力な刺激剤である。ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）による処理が、機能的効果、ならびに、上記に記載された表現型および形態学的変化へと変換されたことを示すために、ＤＣのＴ細胞刺激能に及ぼすＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の影響をリンパ球混合反応（ＭＬＲ）増殖検定にて評価した。
【０１１７】
より具体的には、（上記に記載したように）付着ＰＢＭＣ（単球）をまずＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で７日間処理し、および次いで、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の存在下または非存在下で刺激した。４８時間後、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で処理または未処理のＤＣを回収し、および、下記のようにＭＬＲで検定した。精製したＤＣを無関係の提供者からの１×１０５個のＴ細胞とともに、ＤＣ：Ｔ比率１：５、１：１０、１：３０、および１：１００で共培養した。軟膜から精製したＰＢＭＣを、ナイロンとウールのカラムにかけてフィコール・ハイパック勾配遠心分離することにより、同種Ｔ細胞を調製した。丸底９６ウェル・プレート中で検定を３回を実施した。ＭＬＲ検定中はＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は提示されなかった。ＤＣとＴ細胞の共培養から５日後、ウェルをＢｒＤＵで１８時間パルシングした。ＢｒＤＵの取り込みを測色ＢｒＤＵ取り込み検定（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて測定した。
【０１１８】
図１６に示すように、共培養の２日前にＮＣＭ（ＩＲＸ−２）に暴露されたＤＣ（黒色正方形）は、Ｔ細胞増殖応答の誘起において、未治療のＤＣ（白色円）よりもより強力であり、これは、ＮＣＭで処理したＤＣが機能的に能力が高いことを確認するものである。図１６のデータは、（（ＤＣ刺激Ｔ細胞の光学濃度−ＤＣ単独の光学濃度）／静止Ｔ細胞の光学濃度）±ＳＥＭとして定義される刺激指数として表され、４回の個々の実験の平均結果である（ｐ＜０．０５、分散分析による）。
【０１１９】
共培養中にＮＣＭがなかったこと、および、観察されたＴ細胞刺激の増加は、Ｔ細胞に対するＮＣＭの直接的な効果よりも、むしろＤＣに対するＮＣＭの刺激効果に起因することに留意することが重要である。従って、同種ＭＬＲ反応における増殖の増強によって示されるように、本発明のＮＣＭは、ＤＣのＴ細胞刺激活性を増強する。さらに上記において、ＮＣＭは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の発現を増加させることが示された。この細胞表面の補助リガンドは、ＬＦＡ−１を介したシグナル伝達に関与しており、その結果として、Ｔｈ１表現型へのバイアスを生じる（Ｒｏｇｅｒｓ、２０００）。これらの効果の癌における機能的な結果は、ＮＣＭで処理したＤＣが、Ｔ細胞応答をＴｈ１表現型に向けて極性化させ、および、腫瘍に特異的なＣＴＬ活性の活性化に有利に働き、従って、腫瘍拒絶を促進する。
【０１２０】
本発明者らのデータはまた、ＮＣＭがＤＣからのＩＬ−１２の産生を刺激することも示している。ＩＬ−１２は、感染中に病原体に応答して、ＤＣによって分泌されるサイトカインを極性化させる強力なＴｈ１である。しかしながら、ＤＣが腫瘍拒絶を媒介する際の最も重要な役割の一つは、Ｔｈ１へとバイアスした抗腫瘍Ｔ細胞応答を効果的に、かつ、効率的に刺激することであり、および、この応答を指示する際にきわめて重要なサイトカインの一つがＩＬ−１２である。ＩＬ−１２は活性化されたＤＣによって産生され、および、未感作ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化に関与する必須因子である。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌し、および、これらのサイトカインは、ＩＬ−１２とあいまって、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）など、免疫系の細胞学的および食作用の成分の活性化および増殖を仲介する。
【０１２１】
ＮＣＭがＤＣ中のＩＬ−１２産生を誘起しうるか否かを決定するため、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４培養単球をＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で１８時間刺激し、および、細胞内のＩＬ−１２  ｐ７０産生について試験した。より具体的には、（上述したように）付着ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で４日間成長させ、および次いで、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の存在下または非存在下で、または、ＬＰＳで１８時間処理した。最後の４時間にブレフェルディンＡ（ＢＦＡ；１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を添加して、サイトカインの大部分をゴルジ体に蓄積させた。フィックス・アンド・パーム（Ｃａｌｔａｇ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を用いて、製造業者の指示に従って、細胞を固定および透過し、および次いで、ＦＩＴＣ標識抗ＩＬ−１２  ｐ７０ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）または適切なアイソタイプの対照（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）で標識した。細胞をフロー・サイトメトリーによって分析した。
【０１２２】
図１７Ａに示すように、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は、ＩＬ−１２を産生するＤＣの比率を平均して４．５％（陽性）から２２．５％まで増加させた。ＤＣ中におけるＩＬ−１２産生の刺激剤であるＬＰＳを陽性対照として用いて、および、ＮＣＭと相対して同等のレベル（２７％±１１）の誘起を提供した。図１７Ａのデータは、４回の独立した実験の平均であり、および、ＩＬ−１２に対して陽性の染色を示した細胞のパーセント比率±ＳＥＭとして表される（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ＩＬ−１２の細胞内産生の増加が生物活性ＩＬ−１２の分泌の増加と対応していることを確認するために、ＮＣＭで処理した（上述したように最初にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で４日間培養し、および、ＮＣＭで４８時間インキュベートした）ＤＣの上清中の生物活性ＩＬ−１２の濃度を、生物活性ｐ７０ヘテロ二量体を検出する市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて測定した。従って、図１７Ｂに示すように、ＮＣＭへの暴露の４８時間後、ＤＣ上清は対照で処理したＤＣよりも有意に多くの生物活性ＩＬ−１２を含有した。図１７Ｂのデータは、６回の独立した実験の平均（±ＳＥＭ）である（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
【０１２３】
最後に、発明者らのデータは、ＮＣＭがＤＣ中のＶＥＧＦ誘導性アポトーシスを低下させることを示した。ＶＥＧＦはＤＣ成熟の阻害剤であり、およびこれまで、成熟中のＤＣにおけるアポトーシスレベルを増加させることが示されてきた。ＮＣＭがＶＥＧＦの効果を軽減できるか否かを決定するために、ＤＣを、ＩＲＸ−２の存在下または非存在下でＶＥＧＦで処理し、および、アポトーシスのレベルをアネキシン−ＦＩＴＣ  Ｖ結合により決定した。より具体的には、付着ＰＢＭＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で７日間処理し、および次いで、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在時または非存在時に、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の存在下または非存在下で（１：３）、さらに２日間インキュベートした。細胞を採取し、および氷温のＰＢＳ中で２回洗浄し、および、アネキシン結合緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）中で再懸濁した。アネキシン−Ｖ  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）およびヨウ化プロピジウムを添加し、および細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をフロー・サイトメトリーによって分析した。
【０１２４】
図１８に示すように、対照と比べると、ＶＥＧＦで処理した細胞中でのアポトーシスレベルが増加した。しかしながら、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）はＶＥＧＦで処理した細胞中のアポトーシスのレベルを減少させた。図１８のデータは４回の独立した実験の結果であり、および、アネキシンＶ−ＦＩＴＣに対して陽性の染色を示した細胞のパーセント比率（±ＳＥＭ）として表した。このデータは、ＮＣＭが、刺激能に加えて、成熟したＤＣに対する防御効果も有することを示唆している。さらに、欠陥のあるＤＣの機能および数は、腫瘍による異常なＶＥＧＦの発現によって一部調節されうる（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、１９９６ｂ；Ｓａｉｔｏ、１９９９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ、２００４）。腫瘍によるＶＥＧＦ産生は、Ｈ＆Ｎ  ＳＣＣ、肺癌、胃癌、および骨肉種を含むいくつかの癌において、予後不良の予測因子であることが示された（Ｇａｌｌｏ、２００１；Ｋａｙａ、２０００；Ｍｉｙａｋｅ、１９９２；Ｓａｉｔｏ、１９９８；Ｓｍｉｔｈ、２０００）。本明細書中に含まれたデータは、ＮＣＭが、ＤＣのＶＥＧＦ媒介性アポトーシスを逆行させることができ、ひいては、腫瘍環境内での成熟したＤＣの生存を促進し、および、持続した抗原の提示および腫瘍抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化を許容する。
【０１２５】
ＤＣによる過去の試験は、単球培養培地（ＭＣＭ）など天然サイトカイン混合物、または、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＰＧＥ２を含有する組換え炎症性サイトカインの混合物を採用して、ＤＣを成熟させて、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成されたＤＣ系の癌ワクチンに用いてきた（Ｒｏｍａｎｉ、１９９６；Ｂｅｎｄｅｒ、１９９６；Ｓｏｒｇ、２００３）。ＮＣＭと、他の試験に用いられるサイトカイン混合物との非常に重要な違いは、本試験に用いられたサイトカインの濃度が１０〜１００倍低かったことであり、このことは、ＮＣＭの固有サイトカイン成分間の相乗効果を示唆している。さらに、これらの他の混合物によって成熟したＤＣの使用には重大な問題が伴う。例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２の存在下で成熟したＤＣは、ＩＬ−１２の産生が低いかまたは全くなく、仮に不適切に活性化されると、寛容原性をもちうる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、２００２；Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ、２０００）。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成されて完全に成熟したＤＣは「消耗」し、効率的に有効なＴ細胞応答を一次刺激できない可能性があるとの懸念がある（Ｋａｌｉｎｓｋｉ、２００１）。ｅｘ  ｖｉｖｏ法で成熟させ、ＤＣで治療した患者に見られる低いレベルの臨床反応は、これらの懸念を裏付けている（Ｈｏｌｔｌ、２００２；Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒ、２００２；Ｔｈｕｒｎｅｒ、１９９９）。
【０１２６】
本明細書中に提示される証拠は、ＮＣＭが樹状細胞の強力な活性化因子であることを確認するものである。このデータは、Ｔ細胞に対するＮＣＭの既知の効果（Ｈａｄｄｅｎ、１９９５ｂ）とあいまって、ＮＣＭが、癌患者にみとめられるＡＰＣおよびＴ細胞の欠損を克服できることを示唆しており、および、出願人による臨床試験に見られる良好な臨床結果に対する機序の説明を提供している。現在では、ＤＣが癌を対象とした免疫療法において中心的な役割を果たすと認識されているが、一方で、例えば、腫瘍に特異的なＴ細胞免疫の戦略、または、腫瘍−抗原でパルシングしたＤＣ単独の再導入など、免疫系の単一の要素を個々に操作しても、患者に対して有意な臨床的改善を産み出しえない（Ｒｉｄｇｗａｙ、２００３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、２００４）ことが明らかになりつつある。より有益な治療計画は、併用するいくつかの調整的な細胞型、例えばＴ細胞とＤＣ、の活性を増強する治療計画であってもよい。この治療計画によって、相互反応を増強できるとともに、機能的なカスケードが、腫瘍の様々な免疫抑制戦略によって阻害されずに、むしろ永続化する可能性が高い。この場合には、本発明のＮＣＭは、腫瘍抗原を添加した内因性のＤＣ、および、腫瘍抗原に特異的な細胞毒性Ｔ細胞の両方を刺激するよう作用してもよく、その結果、有効な免疫応答および腫瘍拒絶をもたらす。これらを一緒に考慮すると、これらの結果は、本発明のサイトカイン組成物が、内因性の腫瘍抗原に対する免疫応答を誘起するための強力な臨床ツールとなりうること、または、癌ワクチンの場合において、外因的に添加された腫瘍抗原とともに用いられうることを示す。
【０１２７】
実施例１０
ＮＣＭによる単球／マクロファージの活性化の刺激
サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含有する本発明のＮＣＭは、単球／マクロファージの強力な活性化因子でもある。より具体的には、付着ＰＢＭＣ（９０％まで単球）をＸ−ＶＩＶＯ１０培地中（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）で一晩成長させ、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で２４時間刺激し（最終濃度１：３で）、および、活性化されたマクロファージ上に典型的にみとめられる様々な活性化マーカーの発現について、フロー・サイトメトリーによって試験した。対照として、細胞をＮＣＭのない培地中で２４時間インキュベートした。図１９に示すように、サイトカインを添加しないものと比べて、ＮＣＭによる細胞の処理によって、陽性の染色を示した細胞のパーセント比率が統計学的に増加し（図１９Ａ）、および、ＨＬＡ−ＣＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０（すべて単球／マクロファージの活性化マーカーである）に対する平均蛍光指数（ＭＦＩ）が増加した（ｐ＜．０３）（図１９Ｂ）。図１９に示すデータは、３回の独立した実験／提供者からの平均値±ＳＥＭを表す。
【０１２８】
さらに、本発明のＮＣＭが、ＴＮＦ−αを上回る程度まで単球を活性化することがみとめられた。より具体的には、付着ＰＢＭＣを、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（最終濃度１：３で；約１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α）またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激し、および、活性化マーカーの発現についてフロー・サイトメトリーによって試験した。図２０に示すように、ＮＣＭは、ＴＮＦ−αよりも統計的に大きな、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ８０の発現を誘起した（ｐ＜．０３）。図２０に示すデータは、３回の独立した実験／提供者からの平均値±ＳＥＭを表す。
【０１２９】
同様に、適度の（活性化はするが最大ではない）用量のＬＰＳを用いて実施した試験でも、ＮＣＭが比較的に強い活性化シグナルであったことを示した。より具体的には、付着ＰＢＭＣを、ＩＬ−１０（５ｎｇ／ｍｌ）の存在時または非存在時に、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（最終濃度１：３で）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激し、および、活性化マーカーの発現についてフロー・サイトメトリーによって試験した。図２１に示すように、ＮＣＭは、単球／マクロファージ成熟マーカーであるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、およびＣＤ４０の発現において、ＬＰＳよりも大きな増加をきたした。さらに、免疫抑制サイトカインＩＬ−１０の存在下で、ＮＣＭは依然として単球を刺激することができたが、一方、ＬＰＳはできなかった（ｐ＜．０２）。図２１に示すデータは、３回の独立した実験／提供者からの平均値±ＳＥＭを表す。
【０１３０】
最後に、単球が活性化シグナルに応答してＴＮＦ−αを分泌し、この分泌が単球／マクロファージの非特異的な殺活性と関連していることが知られている。図２２に示すデータは、本発明のＮＣＭが単球からのＴＮＦ−αの産生を刺激し、およびＩＬ−１０の免疫抑制効果を克服することを示している。より具体的には、付着ＰＢＭＣを、ＩＬ−１０（５ｎｇ／ｍｌ）の存在時または非存在時に、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（最終濃度１：３で）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激し、および、細胞内染色およびフロー・サイトメトリーによって、ＴＮＦ−α産生について試験した。図２２に示すように、ＮＣＭは、ＬＰＳまたは対照よりもＴＮＦ−αの産生の増加が大きかった。ＩＬ−１０の存在時であっても、ＮＣＭは依然として単球を刺激してＴＮＦ−αを産生することができたが、一方、ＬＰＳは産生できなかった（ｐ＜．０５）。図２２に示すデータは、５回のそれぞれの実験／提供者からの平均値±ＳＥＭを表す。
【０１３１】
実施例１１
下記に詳説する各実験は、本発明のＮＣＭ組成物が、外因性抗原と併用して作用して、マウス中の抗原に対する免疫応答の向上（細胞学的なおよび抗体の両方）を誘発する能力を示す。
【０１３２】
外因性腫瘍抗原の投与
マウス
該手順は、オブアルブミン（ＯＶＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のいずれかに共役させたＰＳＭＡの予測されたＴ細胞エピトープ（ＬＬＨ＆ＡＬＦ）（各１００μｇ）に基づいて、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ペプチドでマウスに免疫することであった。単離された非共役ペプチドを用いたこれまでの試みはマウスで成功しなかった。低用量のＣＹ（４００μｇ／マウス）の後に、ＮＣＭ（０．１ｍｌ）を両方の共役抗原と併用して単回免疫として提供した後、ＮＣＭ（０．１ｍｌ）を抗原を伴わずに９日間連続注射した。一方、ＣｐＧ、ミョウバン、またはＲＩＢＩ−Ｃｏｒｉｘａアジュバントは、ＯＶＡ共役体と併用した単回一次免疫であった。追加免疫（上記の共役体およびアジュバント）を各群のマウスに２１日目及び２８日目に与えた。Ｔ細胞ペプチドに対するＤＴＨ応答は最後の追加免疫の９日後に測定し、および、１５〜２１日目の屠殺時に血清を採取した。
【０１３３】
図２３は、抗原惹起として個々のＡＬＦおよびＬＬＨペプチド（各１０μｇ）を用いた、即ち、共役体を用いない、マウスの皮膚試験に対するＤＴＨの結果を示す。該図に示すように、両共役体による免疫化の後、および、ＯＶＡ共役体にミョウバンを与えた後に、ＮＣＭは抗原に対する有意なＤＴＨ応答を誘起する。ミョウバン、ＲＩＢＩ−Ｃｏｒｉｘａ、およびＣｐＧの活性はごく僅かであった。
【０１３４】
血清抗体の結果
血清を指示どおりに希釈し、および、ペプチド（ＡＬＦもしくはＬＬＨ）またはオブアルブミンのいずれかで被覆したマイクロプレートのウェルに添加した。結果は、５つのマウス群に対して４０５での平均ＯＤとして表される。データは下記の表ＩＶに提示される。
【０１３５】
より具体的には、ＮＣＭと併用したＫＬＨ共役体によって免疫されたマウスは、オブアルブミン抗体に対して陰性であったが、ペプチドに対して陽性であった。ＯＶＡ共役体およびＮＣＭで免疫されたマウスは、ＯＶＡおよびペプチドの両方の抗体に対して陽性であった。一方、ＯＶＡ共役体＋ＣｐＧで免疫されたマウスは、ＯＶＡに対してのみ陽性であった。これらの結果は、ＮＣＭがアジュバントとして作用して、共役ＰＳＭＡペプチドが該ペプチドに特異的なＤＴＨおよびＩｇＧ応答の両方を刺激する能力を増強するが、一方、ミョウバン、ＲＩＢＩ−Ｃｏｒｉｘａ、およびＣｐＧなど他のアジュバントは不活性または活性に乏しかったことを示す。
【０１３６】
【表４Ａ】
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【表４Ｂ】
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【表４Ｃ】
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【０１３７】
追加的な実験を実施して、上記の結果を確認し、および、本発明のＮＣＭ組成物が若齢マウスおよび老齢マウスの両方においてＴ細胞に特異的な免疫応答を増強することを示した。下記に記載する実験では、下記の方法および材料を用いた。
【０１３８】
試薬
前立腺特異的膜抗原ペプチド（ペプチド１：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ；ペプチド２：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ）は、ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（ルイスヴィル、テキサス州）によって合成された。オブアルブミンおよびシクロフォスファミドはＳｉｇｍａから、およびＫＬＨはＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。ＲＡＳとも呼ばれるＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒ−７００）はＣｏｒｉｘａから購入し、およびミョウバン（各４０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウム）はＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＲＡＳは、モノホスホリル脂質Ａ（０．５ｍｇ）および合成トレハロース・ジコリミコレート（０．５ｍｇ）、および４４μｌのスクアレンおよびツイン−８０から成る。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（マウスに特異的な配列）はＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓによって合成された。ＣｐＧ配列はＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴであり、および、チオフォスフォネート誘導体であった。マウス中のＣｐＧの生物活性は、マウス脾臓細胞の増殖およびマウス付着細胞によるＴＮＦ−αの産生（データ表示なし）を測定することによって確認される。
【０１３９】
（本明細書中においてＩＲＸ−２ともいう）ＮＣＭは、ＰＨＡおよびシプロフロキサシンによってヒト末梢血単核細胞を刺激した後２４時間かけて産生される規定されたサイトカイン混合物である。ＰＨＡは、サイトカインを含有する上清を回収する前に除去される。２つのウイルス除去工程が、その後の処理（イオン交換および２段階のナノ濾過）に含まれている。生物学的試験およびサイトカイン濃度のＥＬＩＳＡ判定の両方を含む厳格なＱＣ試験によってＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の一貫性を保証する。滅菌性、ＤＮＡ、マイコプラズマ、エンドトキシンに関する安全性試験、および、ＣＭＶおよびＥＢＶに対するウイルス試験もまた、該工程の一部である。これら試験の全期間にわたって数ロットのＩＲＸ−２を用いた。ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）のロットに含有される多数のサイトカインの濃度が下記の表Ｖに記載されている。該表では、＊は、これら試験に用いられた５ロットのＩＲＸ−２の平均サイトカイン濃度を表し、および＊＊は、すべてのロットでは測定されていないが直近のロットのみに対して測定されたレベルを表す。ｐｇ／ｍｌの範囲で提示された追加的なサイトカインは、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−ｌ２、およびＩＬ−１０を含む。ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７およびＩＦＮ−αなどの典型的なＴｈ２にバイアスするサイトカインは、提示されなかった。同じ実験で二つのロットが試験された場合は、該２ロットは常に活性が類似していた（データ表示なし）。
【０１４０】
【表５】
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【０１４１】
抗原ペプチドの共役体
上記に記載のペプチド１および２を、上記に記載したようなオブアルブミンまたはＫＬＨ担体などの担体分子に共役させた。両方のペプチドは各担体に、即ち、単一の製剤として共役させた。例えば、これらの試験に用いられたＯＶＡ−ＰＳＭＡ共役体またはＫＬＨ−ＰＳＭＡ共役体は、担体分子に結合した両方のペプチドを含有した。ペプチドは、カルボジイミド法を用いてそれぞれの担体に共役させた（ＯＤＣ；ピアスＥＤＣキット７７５０２、ロックフォード、イリノイ州）。早期の試験では、グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を使用したが、この２方法の間に免疫原性の差（データ表示なし）はなかったので、その後の試験にはより管理された方法としてカルボジイミド結合が選択された。共役体は、セファデックス精製カラムからの画分中のＯＤ２８０および２１５を測定することによって特徴付けた。カラムからの２８０ＯＤピークはオブアルブミンまたはＫＬＨ共役体を表し、および、共役体として回収された。用量決定はカラムから回収した担体の濃度に基づいた。２１５を観測すると、遊離ペプチドを表すテーリングピークを示し、このことは、共役手順の間に過剰なペプチドが存在したことを確認した。
【０１４２】
免疫
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒまたはＨａｒｌａｎのいずれかから購入し、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＣＳＨＬ）によって飼育した。すべての手順はＣＳＨＬのＡＬＡＣ委員会によって承認された。いくつかの実験では、シクロフォスファミド（４００または２０００μｇ／１００μｌ、腹腔内）をＩＲＸ−２による処理の３日前に注射した。その後の試験は、シクロフォスファミドが、マウスにおけるＮＣＭ（ＩＲＸ−２）による応答の増強に対して、統計学的に有意な効果を及ぼさなかったことを示した（データ表示なし）。免疫を下記のように実施した。ＰＳＭＡ共役体１００μｌ、および、１００μｇのＮＣＭないしミョウバンなどアジュバント、または、ＰＢＳを含有する２００μｌ／マウスを、尾の付け根の皮下に注射して、局所リンパ節への急速な流入を与えた。一次免疫の後に、常に９回の（２、３、４、５、８、９、１０、１１および１２日目に）追加的なＮＣＭの注射（１００μｌ＝６〜８ＩＵのＩＬ−２当量）を行った。ミョウバンまたはＲＩＢＩとは異なり、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を反復して同一部位に注射しても、該部位に顕著な炎症をきたさなかった（未公開の所見）。ＤＴＨ活性を評価する前に、共役体およびアジュバントによる（１４日目および２８日目の）追加免疫を２回実施した。追加免疫では、追加のＮＣＭは与えなかった。
【０１４３】
若齢マウスにおけるアジュバント比較試験では、ＲＡＳ（Ｒ−７００＝スクアレン／ツイン８０中のＭＰＬ＋ＴＤＭ）を１ｍｌのＰＢＳで再構成し（推奨されたプロトコールによる）、および次いで、共役体１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）と混合した。ミョウバンを抗原と１：１で混合した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、マウス用に公開されたプロトコールにしたがって、共役体と混合した（マウス１匹あたり共役体１００μｇおよびＣｐＧ２０μｇ）。
【０１４４】
ＤＴＨ検定
ＤＴＨ検定のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原惹起は、該２個のＰＳＭＡペプチドの混合物（担体を含まない）（２０μｌ中１００μｇ）または担体単独（オブアルブミンまたはＫＬＨ）（２０μｌ中５０〜１００μｇ）のいずれかによって行った。マウスには、追加免疫の９日後に、惹起抗原を左肢足蹠におよびＰＢＳを右肢足蹠に皮下に注射した。２４時間後、右肢および左肢足蹠の厚さをデジタル読み取りノギス（Ｐｒｅｉｓｓｅｒ  ＤＩＧＩ−ＭＥＴモデル１８３１４、Ｓｔｏｆｉｔｉｎｇ  Ｃｏ．、ウッド  デール  、イリノイ州）を用いて測定した。腫脹応答を左肢足蹠の厚さ（実験的応答）から右肢足蹠の厚さ（ベースライン）を減算することによって計算した。データは、各マウスの腫脹ならびに平均±平均の標準誤差として表した。統計学的解析はスチューデントｔ検定または分散分析により行った。
【０１４５】
抗原／分裂促進因子誘導性サイトカインの産生および測定
これら試験のために、追加免疫の１４〜２１日後に脾臓を採取し、および、金網を通して分散させて単離した。脾臓細胞を採取しおよびプラスチックに９０分間付着させることによって付着細胞を得た。単離した付着細胞はプールされ、その後培養に添加されて、追加的な抗原提示細胞を提供した。２×１０４個の付着細胞を１ウェルあたり約６×１０５個のリンパ球に添加した。
【０１４６】
抗原からのサイトカイン放出、またはリンパ球の分裂促進因子誘導性の活性化を、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）のデュオセッツＥＬＩＳＡ試薬を用いて上清中で測定した。抗原に刺激された細胞からの上清を採取するための最適日は６日目（ＩＦＮ−γの場合）であり、一方、ＰＨＡに刺激されたＩＬ−２の産生は３日目に最適であった（データ表示なし）。
【０１４７】
オブアルブミンおよびペプチドに対する血清抗体
屠殺時の血清は、ＥＬＩＳＡ検定で後に使用するために凍結させた。ＥＬＩＳＡプレート（イムノロン−４、Ｎｕｎｃ、デンマーク）を興味のある抗原（オブアルブミン、ＫＬＨ、共役体または個々のペプチド）で一晩被覆した。血清の希釈液をブロックされおよび洗浄されたウェルに添加して、一晩インキュベートした。抗マウス・ビオチンおよびビオチン−アルカリ・フォスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＢｉｏＴｅｃｈ、バーミングハム、アラバマ州）を順次添加し、およびｐＮＰＰ基質の添加の後、ＯＤを測定しおよび血清の希釈に対してプロットした。
【０１４８】
下記に詳説するこれら試験の結果は、若齢マウスおよび老齢マウスの両方において、本発明のＮＣＭが、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍抗原に特異的な免疫応答を刺激することを示している。より具体的には下記に記載する実験では、Ｔ細胞活性化の指標としてｉｎ  ｖｉｖｏのＤＴＨ（遅延型過敏症）検定を使用した。癌抗原に対するＤＴＨ応答は、動物モデルおよび臨床試験における腫瘍の除去と良好に相関し、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞免疫応答との有用な相関を提供する（例えば、Ｓｔｕａｒｔ、１９８７；Ｓｗｅａｔ、１９９８を参照）。この実験によって示されるように、若齢マウスにおいて本発明のＮＣＭ組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞免疫応答を刺激する際に、前立腺特異腫瘍抗原のアジュバントとして作用する。さらに本実験は、ＮＣＭが、若齢マウスにおいてＴ細胞ペプチドに対する免疫応答を増加させるだけでなく、Ｔ細胞に障害のある老齢マウスにおいてＴ細胞免疫応答も回復させることを示している。従って、下記に詳説する実験では、老齢マウスおよびヒトの両方に発生する、加齢を原因とする免疫機能の低下である免疫機能不全のモデルとして、老齢マウスを用いた。さらに、この免疫機能不全は、ヒトにおいて加齢に伴う癌の発生率の増加の主な理由であると信じられている。
【０１４９】
若齢マウスにおけるペプチド特異的ＤＴＨ応答のＮＣＭによる増強
若齢マウスに、ＯＶＡ−ＰＳＭＡまたはＫＬＨ−ＰＳＭＡ共役体と併用した、ＮＣＭ（または陰性対照としてのＰＢＳのいずれか）で、上述したように（例えば、共役体１００μｇ、およびＮＣＭまたはＰＢＳ１００μｌを含む２００μｌ／マウスを）免疫した。免疫は、尾の付け根に皮下注射として投与され、局所リンパ節への急速な流入を提供した。マウスは後に、上記に記載したようなＤＴＨ検定において、惹起抗原として、ＰＳＭＡペプチド（図２４Ａ）、または、共役体の免疫にそれぞれ用いられる担体（図２４Ｂ）のいずれかを用いて惹起した。
【０１５０】
図２４Ａに示すように、ＯＶＡ−ＰＳＭＡまたはＫＬＨ−ＰＳＭＡ共役体と併用した、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）による若齢マウス（６〜８週齢）の免疫は、担体にかかわらずペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強した。ペプチドをＮＣＭと共投与したが共役を伴わない場合、ペプチド特異的ＤＴＨ応答は測定されなかった（データ表示なし）。担体（オブアルブミンまたはＫＬＨのいずれも）に対するＤＴＨ応答はペプチドに対するよりも強く、および、ＮＣＭの投与によってＤＴＨ活性を増強しなかった（図２４Ｂ）。ＮＣＭペプチド共役体による免疫へのミョウバンの添加は、陽性のペプチド特異的ＤＴＨ応答（データ表示なし）を変更しなかった。
【０１５１】
初期の試験では、免疫の３日前に、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を、シクロフォスファミドによる１回の前処理と併用して用いた。より具体的には、一次免疫の３日前に、マウスを、シクロフォスファミドの投与（４００μｇ／マウスまたは２ｍｇ／マウスのいずれか）の存在下または非存在下で、ＯＶＡ−ＰＳＭＡ共役体およびＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で免疫した。２回の追加免疫の後（１４日目および２８日目）、上述したようにＤＴＨ検定を実施した。
【０１５２】
図２５に示すように、シクロフォスファミドによる前処理はペプチド特異的応答には必要なく、その後の実験には用いられなかった。さらにこの実験は、ペプチド共役体と併用したＮＣＭ処理は、マウスをシクロフォスファミドで前処理したか否かにかかわらず、ミョウバンまたはＰＢＳの使用よりも有意に大きな程度（ｐ＜０．０５）、ペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強したことを確認した。この検定の結果を、平均の腫脹（図２５中の棒）および各マウスの腫脹（図２５中の菱形のデータポイント）で表した。さらに、これらのマウス試験のすべての結果は、一次免疫後に９日間の追加的なＮＣＭ（ＩＲＸ−２）注射を用いたが、４日間の追加的な処理は９日間の処理とは統計的な差はなかった（データ表示なし）。
【０１５３】
さらに、ＰＳＭＡ共役体に対するペプチド特異的免疫応答をＮＣＭが刺激する能力を、３つの他のアジュバント、ミョウバン、ＲＩＢＩアジュバントシステム（またはＲＡＳ）、およびＣｐＧの能力と比較した。より具体的には、これらの異なるアジュバントと併用したＯＶＡ−ペプチド共役体で免疫した。２回の追加免疫（１４日目および２８日目に）の後、上記に記載したようなＤＴＨ検定を（追加免疫後９日目に）実施した。本試験の結果を図２６に示し、および平均の腫脹（棒）および各マウスの腫脹（菱形のデータポイント）として表される。
【０１５４】
図２６に示すように、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）のアジュバント効果は、試験を実施した他のアジュバントの効果よりも大きかった（ｐ＜０．００１）。すべてのアジュバントが、未感作マウスよりも担体タンパク質への応答を増強したが（データ表示なし）、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）のみが腫瘍ペプチド特異的免疫応答を増強した。
【０１５５】
加齢マウスにおけるペプチド特異的免疫応答のＮＣＭによる増強
出願人らは最初に、分裂促進因子（ＰＨＡ）で刺激した老齢マウスの脾臓細胞が、若齢マウスの応答と比べて、二つの主要なＴ細胞サイトカイン、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌において劣っていた（ＩＬ−２：２８５対７５ｐｇ／ｍｌ、およびＩＦＮ−γ：１５３５対１２８ｐｇ／ｍｌ）ことを示すことによって、老齢マウス（＞１８月齢）におけるＴ細胞免疫応答が若齢マウス（８〜１６週齢）における応答と比べて不完全であることを確認した。
【０１５６】
出願人らは次いで、ＰＳＭＡ共役体、および、アジュバントとしてＮＣＭまたはミョウバンのいずれかで免疫し、その後抗原惹起した老齢マウス対若齢マウスにおいて、上記に記載のＤＴＨ検定を用いてＤＴＨ応答を試験した。より具体的には、老齢マウス（試験の開始時に１８〜２０月齢）および若齢マウス（試験の開始時に６〜８週齢）を、上述したように、アジュバントとしてＮＣＭまたはミョウバンと併用して、ＰＳＭＡ共役体であるＯＶＡ−ＰＳＭＡで免疫した。マウスを次いで、上記に記載のＤＴＨ検定に従って抗原で惹起した。
【０１５７】
図２７Ａに示すように、ペプチド特異的ＤＴＨ応答に関して、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は老齢マウスの免疫活性を若齢マウスの免疫活性までに回復させた。結果は、１群あたりマウス９〜１５匹の平均に対する、ＰＢＳを注射した足と抗原を注射した足との腫脹の差として表される。ＮＣＭで処理した老齢群および若齢群の腫脹の平均は、ペプチド特異的応答に関して統計的に差はなかった。しかしながら、ＮＣＭ若齢群およびＮＣＭ老齢群の両方のＤＴＨ応答は、ミョウバンで処理したマウスにみとめられたものよりも有意に大きかった（＊ｐ＜０．００５、スチューデントｔ検定）。
【０１５８】
ＯＶＡ担体に特異的なＤＴＨ応答について、図２７Ｂは、老齢マウスは若齢マウスと比べてこの応答が不十分であった（＊ｐ＜０．０５）が、ＮＣＭ処理によって、老齢マウス中のオブアルブミンに特異的なＤＴＨ応答が回復した（図２７Ｂ）ことを示す。オブアルブミンに対する若齢マウスの応答はミョウバンにおいて最適であり、従って、ＮＣＭによって向上しなかった。
【０１５９】
これらの実験は、老齢マウスおよび若齢マウスの両方において、特定の抗腫瘍抗原のＴ細胞免疫応答を刺激する際の、本発明のＮＣＭ組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでのアジュバント効果を示した。実際には本発明のＮＣＭは、試験を実施した他のアジュバントと比べて、より大きな腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を提供した。
【０１６０】
下記に記載するような別の実験を実施して、免疫刺激の別の指標である、Ｔ細胞サイトカインおよびＩＦＮ−γの産生に対するＮＣＭ処理の効果を測定した。
【０１６１】
脾臓Ｔ細胞のＥｘ  ｖｉｖｏでの応答に対してＮＣＭが及ぼす効果
従って、ＮＣＭおよびＰＳＭＡ共役体で免疫したマウスに対するＮＣＭ処理のアジュバント効果を、免疫したマウス由来の脾臓細胞によるＩＦＮ−γの分泌を測定することによって決定した。より具体的には、ＫＬＨ−ＰＳＭＡ共役体（上記に記載したような）およびＮＣＭ（ＩＲＸ−２）で免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、共役体（ＫＬＨ−ＰＳＭＡ）、担体（ＫＬＨ）、またはペプチド（ＰＳＭＡ）でｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートした。培養の６日後に脾臓細胞からの上清を回収し、および、上記方法および材料の節に記載されているようにＩＦＮ−γの分泌を測定した。図２８に示すように、共役体およびＮＣＭで免疫したマウスにおけるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ中）の産生形態でのＴ細胞応答は、３抗原すべてについて、未感作マウスよりも大きかった。
【０１６２】
血清抗体力価に対するアジュバントの効果
さらに、ＮＣＭ処理がｉｎ  ｖｉｖｏで抗体産生に対するアジュバント効果を有したか否かを決定するために実験を実施した。より具体的には、マウスを、上記に記載したようなＰＳＭＡ−共役体、および、アジュバントであるＮＣＭ、ミョウバンまたはＣｐＧで免疫した。アジュバントに対する陰性対照としてＰＢＳを用いた。マウスからの血清を、３回目の免疫から１５日後（図２９ＡおよびＢに示すデータ）、または、３回目の追加免疫から８および１５日後（図２９Ｃのデータ）のいずれかの日の屠殺時に得た。血清をＥＬＩＳＡによって抗体について検定し、結果を希釈率対光学密度として（図２９ＡおよびＢ）、または、最適希釈率１／４００での光学密度として（図２９Ｃ）表した。
【０１６３】
担体（オブアルブミンまたはＫＬＨのいずれか）に対する血清抗体力価を測定し、および、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）、ミョウバンおよびＣｐＧがオブアルブミンに対して類似の力価を誘起し、応答はＣｐＧ＞ミョウバン＞ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）であったことを示した（図２９Ａおよびデータ表示なし）。予測されたように、ＫＬＨ共役体で免疫したマウスは、オブアルブミンに対して力価を生成せず、このことは、ＥＬＩＳＡ検定の特異度を確認するものであった（例えば、図２９Ａを参照）。しかしながら、図２９Ｂに示されるようなペプチドに特異的な抗体応答に関しては、ミョウバンおよびＣｐＧとは対照的に、ＯＶＡ−ＰＳＭＡペプチド共役体と併用してＮＣＭは、両方のペプチドに対する血清抗体を誘起した。図２９Ｂ中のデータは、ＮＣＭをミョウバンならびにＣｐＧと比較したＡＬＦペプチドに対するデータであり、分散分析により、ｐ＜０．０５である。同様の応答をＬＬＨペプチドに対して測定した（データ表示なし）。図２９Ｃに示すように、ペプチドに対する担体としてＫＬＨが共役体中で用いられる場合、ＮＣＭ（ＩＲＸ−２）は、アジュバントなし（ＰＢＳ）またはミョウバンよりも高いペプチド抗体応答を誘起した（ＮＣＭ対ミョウバンおよびＰＢＳ、ｐ＜０．００１）。図２９Ｃのマーカーは個々のマウスを示す。上記に記載したような検定方法で、両方のペプチドで被覆したＥＬＩＳＡプレートに対する抗体応答を測定した。
【０１６４】
上記に記載の試験は、本発明のＮＣＭが、原型前立腺ペプチドのワクチンモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞ペプチド特異的ＤＴＨ応答、およびｅｘ  ｖｉｖｏでの脾臓細胞のＴ細胞応答を増強することを示す。サイトカイン混合物の（２、３のみのサイトカインのいくつかの活性とは異なる）このきわめて重要な性質は、単球がないため単球由来のサイトカインが不十分な細胞培養から作られた製剤が、脾臓細胞のペプチド特異的ＤＴＨ応答またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞応答を増強できなかったことが観察されることによって、確認される。ＮＣＭのこの新しい性質は、様々な作用機序を代表するよう選択された他のアジュバントとＮＣＭを比較することによっても示された。例えば、ＣｐＧはＡＰＣに対するＴＬＲ作動アジュバントであり、およびＴＬＲ活性化アジュバント代表する。一方、ＲＡＳシステムは、油および細菌成分を有するアジュバントを代表し、マウスモデル中のフロインド・アジュバントのより安全な代替物である。ミョウバンは、ＦＤＡに承認されたワクチンの大半に用いられるアジュバントである。本試験では、ＮＣＭはペプチド特異的ＤＴＨ応答を増強したが、ミョウバン、ＣｐＧおよびＲＡＳは増強しなかった。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞ペプチド特異的ＤＴＨ応答のＮＣＭによる増強は、ＩＦＮ−γの抗原特異的分泌によって定義される脾臓細胞によるｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞応答の増加と相関した。最後に、すべてのアジュバントが（ＰＢＳと比べて）担体に対する抗体応答を増強したが、担体に共役させたペプチドに対する抗体応答を増強したのはＮＣＭのみであった。
【０１６５】
ＮＣＭ中のサイトカインが、ＤＴＨ検定によって定義されるペプチド特異的免疫応答を増強するべく作用する機序は、大概複雑である。その理由は、ＡＰＣの動員、呑食、増殖、活性化、成熟および移動、および、Ｔ細胞の動員、増殖、分化および成熟が、すべてサイトカインの影響を受けるからである。しかしながら、これらの試験においてみとめられたＤＴＨ応答のこのペプチド特異性は、抗原の提示、ならびに、その後のＴ細胞の増殖および末梢への移動に及ぼすＮＣＭの影響の結果であると信じられている。ＮＣＭのサイトカインは、ＤＣ耐性またはＴ調整バランスをＴ細胞エピトープに対する応答の活性化へと移行させることもまた信じられている。ＮＣＭは、担体中のＴ細胞ヘルパー・エピトープを増強し、有効なＴ細胞免疫応答の発生に追加的な刺激を提供している可能性がある。本明細書中に示されるように（実施例９および１０を参照）、本発明のＮＣＭは、樹状細胞の成熟および活性化を刺激し、これによって、抗原の提示およびＩＬ−１２の分泌（樹状細胞による）を促進する。ここで、ＩＬ−１２は強力なＴｈ１極性化サイトカインである。ＮＣＭは、単球およびマクロファージの強力な活性化因子でもある。
【０１６６】
ＮＣＭは、ＮＣＭ中に存在するサイトカインの既知の影響にもとづき、Ｔ細胞に別の影響を及ぼす。上記の実施例２および８に示すように、本発明のＮＣＭは、リンパ球減少症患者において、未感作T細胞の産生をはじとする、Ｔリンパ球数を増加させる。さらに、ＩＬ−１（ＮＣＭ中に存在する）が、リンパ球の走化性因子、ならびに、他のサイトカイン産生の刺激剤であることが知られている。既知の活性には、ＩＬ−２分泌の誘起による静止Ｔ細胞の増殖およびの活性化の増加、および、ＮＣＭの活性にとってより重要な、ＩＬ−２受容体のアップ・レギュレーションが含まれる。さらに、ＴＮＦ−α（これもＮＣＭ中に存在する）は、Ｌ−８およびＣＳＦなど他のサイトカインが行うように、ＩＬ−１の活性を増強する。ＩＬ−８もまた、Ｔ細胞、好塩基球および好中球をはじめとする複数の細胞に対する走化性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）として作用する。ＩＬ−２は、受容体を介して刺激することによってだけでなく、追加的なＩＬ−２受容体ならびに追加的なサイトカインの受容体をアップ・レギュレートすることによっても、活性化された細胞の増殖を増強するべく作用する。従って、本発明のＮＣＭ組成物のサイトカインは多面発現的であり、単球、樹状細胞およびＴ細胞に影響を及ぼす。
【０１６７】
本発明のＮＣＭ中に生理的濃度で存在するサイトカインの活性部位は局所性であり、注射部位ならびに注射部位と関連するリンパ節の両方を含む。ＮＣＭは毎日投与できるので、すべてのサイトカインの局所濃度の上昇を維持することができる。本発明のＮＣＭをアジュバントとして用いるＤＴＨ応答のこのペプチド特異性は、将来のＴ細胞ワクチンにおけるＮＣＭの使用を支持するものである。
【０１６８】
さらに本試験は、本発明のＮＣＭが、加齢マウスにおけるＴ細胞サイトカイン欠損を修正することを示している。癌は免疫系の低下が知られている老齢の個体により高頻度に発生することに留意することが重要である。さらに、腫瘍に対する現在の治療（放射線治療および化学治療）の多くは、それ自体が免疫抑制性でありうるため、患者の免疫能力をさらに低下させる。従って、多くの患者のための癌ワクチンは、加齢、癌治療および癌防御機構と関連する免疫不全を回復する潜在力のある薬剤が有用でありうる。高齢者におけるワクチンの使用に対するこの潜在的な障害を考慮し、本試験では、老齢マウスならびに免疫能力の高い若齢マウスにおいて、ＮＣＭの有効性を評価した。まず、老齢マウスからの脾臓細胞は、若齢マウスと比べた場合、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの両方のサイトカインの産生が不十分であることが判明した。オブアルブミンに関しては、ＤＴＨ応答も損なわれた。本発明のＮＣＭ組成物は担体に対する弱い応答を回復させることができただけでなく、ペプチド特異的応答を若齢マウスの応答と類似のレベルまで回復させるにも有効であった。
【０１６９】
ワクチンモデルにおけるＮＣＭの使用のプロトコールは、頭頸部癌の患者におけるＮＣＭ（ＩＲＸ−２）を用いた第Ｉ／ＩＩ相臨床試験、および、免疫応答の既知の動態（例えば、Ｍｅｎｅｓｅｓ、２００３；Ｈｉｌｌｍａｎ、１９９５を参照）にもとづいている。臨床試験では、低用量のシクロフォスファミドの事前の注射および１０日間のＮＣＭ（ＩＲＸ−２）投与と併用して腫瘍流入局所リンパ節を標的化した結果、腫瘍のリンパ球浸潤の増強、腫瘍構造の断片化、および腫瘍の大きさの縮小をきたす（上記の実施例２〜７を参照）。上述したように、マウスにおけるワクチンモデルでは、初回の試験はシクロフォスファミドの事前の注射を用いたが、しかし、その後の試験は健常な非担癌マウスには必要なかったことを確認した（図２５）。さらに、一次免疫後のＮＣＭの連日投与（４〜９日間）によって、注射部位、およびそれに続く流入リンパ節が、活性化から記憶移行までの期間に、Ｔ細胞免疫応答の最適な刺激のために十分なサイトカイン濃度を有することが保証されるので、重要であると思われる。サイトカイン濃度は低いので、注射部位では顕著な炎症性応答はない。これは、注射部位で腫脹および炎症がみとめられたミョウバンおよびＲＩＢＩアジュバントシステムの両方（未公開の所見）とは対照的である。
【０１７０】
担体への共役のないＰＳＭＡペプチドを用いた第Ｉ／ＩＩ相試験について報告されたデータを基にすると、本明細書中に記載の提案されたペプチド担体ワクチンは、治療ワクチンとして臨床的に大いに有望である（Ｔｏｊａ、２０００；Ｏ’Ｈａｇａｎ、２００１；Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ、２０００；およびＮａｙｌｏｒ、１９９１）。この二つのペプチドは、両方のコンピュータモデル化、および、前立腺癌患者のリンパ球の応答にもとづくＴ細胞エピトープである。患者を、ペプチド単独でまたはペプチドでパルシングした樹状細胞で治療した場合、第Ｉ／ＩＩ相試験において臨床およびＴ細胞の応答に改善が見られた。しかしながら、第Ｉ相試験では、アジュバントのないペプチドはペプチドでパルシングした樹状細胞よりも有効性が低かった。ＮＣＭをペプチド共役体とともに投与した場合にみとめられたペプチド特異的応答の増強、および、幅広い臨床試験でのＫＬＨ共役体の安全性を考慮すると、ペプチドおよびＮＣＭ（ＩＲＸ−２）での臨床試験は正当化される。
【０１７１】
本明細書中に提示された癌ペプチド・ワクチン・マウス・モデルを用いた諸試験、および、本発明のＮＣＭを用いた内因性抗原に対して活発な抗腫瘍応答を示したヒトの臨床データは、本発明のＮＣＭ組成物を、腫瘍特異的な崩壊を仲介するに十分な免疫応答を生成するために、腫瘍ワクチン中で使用することを裏付けている。さらに、ＮＣＭは若齢マウスおよび老齢マウスの両方におけるＴ細胞特異応答を増強するべく作用するので、ＮＣＭは、Ｔ細胞免疫応答の増強を狙った任意の癌ワクチン、とりわけ高齢の癌患者に対する癌ワクチンに封入される候補となる。
【０１７２】
ヒト
進行性前立腺癌の患者３例は、事前の低用量のＣＹ（３００ｍｇ／ｍ２）、および、ＮＣＭ（１ｍｌ−１００単位、ＩＬ−２当量）と併用した非共役のＡＬＦ＆ＬＬＨペプチド（各１００μｇ）、および、連日のＩＮＤＯ（２５ｍｇ、１日３回）、および、９回の追加的なＮＣＭの注射（１ｍｌ）を受けた。１５日目に、ＮＣＭの追加免疫およびペプチドが与えられた。別の患者（＃４）は、この投薬計画においてＯＶＡ共役ペプチドを受けた。ＮＣＭ（０．１ｍｌ）、ＡＬＦもしくはＬＬＨ（１０μｇ）による遅延型過敏性反応（ＤＴＨ）を、ｃｍ単位の紅斑および継続時間について２４時間後に読み取った、皮内皮膚試験によって測定した。結果は表ＶＩに提示される。
【０１７３】
【表６】
2009544724.tif 000010
【０１７４】
これらのデータは、ＮＣＭ投薬計画が進行性前立腺癌のヒトにおいて、非共役および共役ＰＳＭＡペプチドに対するＤＴＨ応答を誘導するのに有効であることを示す。この結果は、単離ペプチドでは成功しなかった大部分の過去の試みの結果とは異なる。
【０１７５】
別の実験は、本発明のＮＣＭが、ＰＳＭＡペプチド抗原のアジュバントとして作用して疾患の安定化をもたらす能力を示した。より具体的には、進行性前立腺癌のＨＬＡ−Ａ２陽性の男性３例をＮＣＭ（ＩＲＸ−２）（１１５単位、ＩＬ−２当量）および上記に記載の２つのＰＳＭＡペプチド（各１００μｇ）で治療した。初回の免疫は頸部への注射により、その後、９回のＮＣＭ（ＩＲＸ−２）の注射（上記の実施例２のプロトコールに記載のように、低用量のシクロフォスファミド、インドメタシン、および亜鉛とともに）、および次いで、ＮＣＭおよび二つのペプチドに月１度の追加免疫を５回行った。
【０１７６】
表ＶＩＩは病歴（Ｈｘ）および療法への応答（Ｒｘ）を簡単にまとめている。３例の患者はすべて、４から１０年前に（他の薬剤に加えて）前立腺切除術および精巣摘出術を受けており、再発をきたした。全例が４から推定６ヶ月にわたるＰＳＡの上昇の倍増段階にあった。２例に骨痛の症状があった。ＮＣＭおよびペプチドによる免疫およびフォロー・アップである追加免疫注射は症状を誘導しなかった。
【０１７７】
骨痛を伴う２例の患者には疼痛の消失があった。３例の患者はすべて臨床的に安定していた（患者＃２が一過性の増悪により大腿骨の骨折があったことを除く）。３例すべてが単離ＰＳＭＡペプチドでの皮膚試験に対する一過性の皮膚反応性を発症した（ＡおよびＢ；各１０μｇ）。３例すべてがＮＣＭまたはＰＨＡでの皮膚試験に対する反応性の増加を示した。これらの結果は、本発明のＮＣＭが、ＰＳＭＡペプチドに対する免疫をこれらの患者に付与し、および免疫および追加免疫期間中に疾患を安定させたことを示している。図３０も参照されたい。図３０はこれら３例の患者における６ヶ月間のＰＳＡ抗原レベルの安定化を示す。上記に記載した追加の患者＃４は、一過性のＰＳＡおよび臨床的な安定を示したが、臨床的な情報はまだ完全ではない。早期再発したＰＳＡレベル（７）である別の追加の患者は、正常レベルへの復帰を示し、この状態は２年間のフォロー・アップ期間中、追加的な療法なしに（完全奏効）持続した。
【０１７８】
【表７】
2009544724.tif 000011
【０１７９】
本出願書全体にわたって、米国特許を初めとする様々な刊行物は、著者、年、および特許番号によって参照される。刊行物の完全な引用を下記に記載する。本発明が関係する最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物および特許の開示のその全体が、本出願書に参照によって組み込まれる。
【０１８０】
本発明は例示的に記載されており、および用いられた術語は本質的に限定のための語というよりも説明のための語となるよう意図されていることが理解されるべきである。
【０１８１】
明らかに、上記の教示の観点から本発明の多くの変形および変更が可能である。従って、記載された発明の範囲内で、本発明は具体的に記載された以外にも実施することができることを理解するべきである。
【０１８２】
参照
米国特許番号
４，４３９，１９６
４，４４７，２３３
４，４４７，２２４
４，４７５，１９６
４，４８６，１９４
４，４８７，６０３
４，７３８，９２７
４，９２５，６７８
４，９５９，２１７
４，９９２，３６７
５，１００，６６４
５，１６７，６１６
５，１６９，３８３
５，５０３，８４１  
５，２２５，１８２
５，６３２，９８３
５，６４３，５６５
５，６９８，１９４
５，８００，８１０
６，０６０，０６８  
米国特許出願公開
ＵＳ  ２００４／０１３６９５２  Ａ１
刊行物
Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，  Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  Ｊ，  Ｚｉｎｓｅｒ  Ｊ  ＆  Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．    Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＩＲＸ−２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．    Ｉｎ  Ｆｉｒｓｔ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．      ＪＪ  Ａｌｖａｒｅｚ  Ｖｉｃｅｎｔ，  Ｅｄ．  Ｍｏｎｄｕｚｚｉ，  Ｂｏｌｏｇｎａ，  Ｉｔａｌｙ；  １９９８；  ｐｐ  １０１７−１０１９．
Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，  Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，  Ｚｉｎｓｅｒ  Ｊ，  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  Ｊ，  Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：  Ａ  ｐｈａｓｅ  １１  ｔｒｉａｌ．  Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １２６：３４５−３５１  （２０００）．
Ｂｅｌｌｏｎｅ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ２０  （Ｎｏ．  １０），  ｐ  ４５７−４６２  （１９９８）．
Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｋｚ  Ｌ  Ｋ，  Ｆｉａｎｄｅｒ  Ａ．  Ｎｉｍａｋｏ  Ｍ．  Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ａｎｄ  １８，  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３４７：１５２４−１５２７  （１９９６）．
Ｂｅｎｄｅｒ  Ａ，  Ｓａｐｐ  Ｍ，  Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｇ，  Ｓｔｅｉｎａｍｎ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｎ．    Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９６：１２１−１３５  （１９９６）．
Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ，  Ｃｈｅｎ  Ｈ，  Ｇｉｒｇｉｓ  Ｋ，  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｔ，  Ｍｅｎｙ  Ｇ，  Ｎａｄａｆ  Ｓ，  Ｋａｖａｎａｕｇｈ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｅ  ＤＰ．    Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．    Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２：１０９６−１１０３  （１９９６ｂ）．
Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ，  Ｃｏｒａｋ  Ｊ，  Ｃｉｅｒｎｉｋ  ＩＦ，  Ｋａｖａｎａｕｇｈ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｅ  ＤＰ．    Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３：４８３  （１９９７）．
Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ，  Ｉｓｈｉｄａ  Ｔ，  Ｏｙａｍａ  Ｔ，  Ｒａｎ  Ｓ，  Ｋｒａｖｔｓｏｖ  Ｖ，  Ｎａｄａｆ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｅ  ＤＰ．    Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．    Ｂｌｏｏｄ，  ９２：４１５０−４１５６  （１９９８）．
Ｇａｌｌｏ  Ｏ，  Ｆｒａｎｃｈｉ  Ａ，  Ｍａｇｎｅｌｌｉ  Ｌ，  Ｓａｒｄｉ  Ｉ，  Ｖａｎｎａｃｃｉ  Ａ，  Ｂｏｄｄｉ  Ｖ，  Ｃｈｉａｒｕｇｉ  Ｖ，  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｉ  Ｅ．    Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＶＥＧＦ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ．    Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．    Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，  ３：５３−６１  （２００１）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，  Ｅｎｄｉｃｏｔｔ  Ｊ，  Ｂａｅｋｅｙ  Ｐ，  Ｓｋｉｐｐｅｒ  Ｐ，  Ｈａｄｄｅｎ  Ｅ  Ｍ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．    Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．  １２０：３９５−４０３  （１９９４）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，  Ｓａｈａ  Ａ  Ｒ，  Ｓｏｓａ  Ｍ，  Ｈａｄｄｅｎ  Ｅ  Ｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  α１  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ａｇｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １７：８２１−８２８  （１９９５）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，  Ｂａｒｒｅｒａ  ＪＬ，  Ｋｕｒｍａｎ  Ｍ，  Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，  Ｚｉｎｓｅｒ  ＪＷ，  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｈａｄｄｅｎ  Ｅ．    Ａ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＩＲＸ−２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ．    Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ３：１０７３−１０８１  （２００３）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，  Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊ，  Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，  ａｎｄ  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  Ｊ．    Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＩＲＸ−２  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．    Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃２９４  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ２００４  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｍｅｅｔｉｎｇｓ  （ＣＯＳＭ），  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．  （２００４）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．    Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ３：３６２−３８５  （１９９５ａ）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ：  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２１：７９−１０１  （１９９９）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：  Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１／１２：６２９−６４４  （１９９７）．
Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．  Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｚｉｎｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １７：６９６−７０１  （１９９５）．
Ｈａｄｄｅｎ  Ｊ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，  Ｂａｒｒｅｒａ  ＪＬ，  Ｋｕｒｍａｎ  Ｍ，  Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，  Ｚｉｎｓｅｒ  ＪＷ，  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｈａｄｄｅｎ  Ｅ，  “Ａ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＩＲＸ−２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ，”  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３；  １０７３−１０８１  （２００３）．
Ｈｉｌｌｍａｎ  ＧＧ，  Ｈａｓｓ  ＧＰ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ａｇｇａｒｗａｌ  ＢＢ，  Ｐｕｒｉ  ＲＫ，  ｅｄｓ．    ＩＮ：  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．；  ｐ  ３７−５４  （１９９５）．
Ｈｏｌｔｌ  Ｌ，  Ｚｅｌｌｅ−Ｒｉｅｓｅｒ  Ｃ，  Ｇａｎｄｅｒ  Ｈ，  Ｐａｐｅｓｈ  Ｃ，  Ｒａｍｏｎｅｒ  Ｒ，  Ｂａｒｔｓｃｈ  Ｇ，  Ｒｏｇａｔｓｃｈ  Ｈ，  Ｂａｒｓｏｕｍ  ＡＬ，  Ｃｏｇｇｉｎ  ＪＨ  Ｊｒ．，  ａｎｄ  Ｔｈｕｒｎｈｅｒ  Ｍ．    Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  Ｔｕｍｏｒ  Ｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ８：３３６９−３３７６  （２００２）．
Ｋａｌｉｎｓｋｉ  Ｐ，  Ｓｃｈｕｉｔｅｍａｋｅｒ  Ｊ，  ｄｅ  Ｊｏｎｇ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｋａｐｓｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．    Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ（２）  ｉｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｐ４０  （ＩＬ−１２ｐ４０）  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ＩＬ−１２ｐ７０  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ．    Ｂｌｏｏｄ，  ９７：３４６６−３４６９  （２００１）．
Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ  Ｋ，  Ｎｉｓｈｉｓａｋａ  Ｎ，  Ｊｏｎｅｓ  ＲＦ，  Ｗａｎｇ  ＣＹ，  Ｈａｓｓ  ＧＰ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５：  ２６５−２７３  （２０００）．
Ｋａｖａｎａｕｇｈ  Ｄ  Ｙ，  Ｃａｒｂｏｎｅ  Ｄ  Ｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｈｅｍａｔｏｌ−Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ  １０（４）：９２７−９５１  （１９９６）．
Ｋａｙａ  Ｍ，  Ｗａｄａ  Ｔ，  Ａｋａｔｓｕｋａ  Ｔ，  Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｓ，  Ｎａｇｏｙａ  Ｓ，  Ｓｈｉｎｄｏｈ  Ｍ，  Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ  Ｆ，  Ｍｅｚａｗａ  Ｆ，  Ｏｋａｄａ  Ｆ，  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｉ  Ｓ．    Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｃａｒｃｏｍａ  ｉｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６：５７２−５７８  （２０００）．
Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ  Ａ，  Ｍｅｓｓｉ  Ｍ，  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ，  ａｎｄ  Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ．    Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ＴＨ１，  ＴＨ２  ａｎｄ  ｎｏｎｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．    Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １：３１１−３１６  （２０００）．
Ｍａｃｌｅａｎ  Ｇ  Ｄ，  Ｍｉｌｅｓ  Ｄ  Ｗ，  Ｒｕｂｅｎｓ  Ｒ  Ｄ，  Ｒｅｄｄｉｓｈ  Ｍ  Ａ，  Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ  ＳＴｎ−ＫＬＨ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９（４）：３０９−３１６  （１９９６）．
Ｍａａｓｓ  Ｇ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｗ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｔｈｒｅｅ  ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ｓｔａｇｅｓ  ｍａｙ  ｂｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９２：５５４０−５５４２  （１９９５）．
Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３（６）：  ７７３−７８１  （１９９６）．  
Ｍｅｈｖａｒ，  Ｒ．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ  Ｓｃｉ  ３  （１）：  １２５−１３６  （２０００）．  
Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，  Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊ  Ｌ，  Ｚｉｎｓｅｒ  Ｊ，  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  Ｊ，  Ｈａｄｄｅｎ  Ｊ  Ｗ．  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｐｅｒｉｌｙｍｐａｔｉｃ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｓｕｒｇｅｒｙ．  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２２：４４７−４５４  （１９９８）．
Ｍｅｎｅｓｅｓ  Ａ，  Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ  Ｅ，  Ｂａｒｒｅｒａ  Ｊ  Ｌ，  ｄｅ  ｌａ  Ｇａｒｚａ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｈａｄｄｅｎ  Ｊ  Ｗ，  Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：    ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＩＲＸ−２．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ３；  １０８３−１０９１  （２００３）．
Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ．    Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９８１）．
Ｍｉｙａｋｅ  Ｍ，  Ｔａｋｉ  Ｔ，  Ｈｉｔｏｍｉ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｈａｋｏｍｏｒｉ  Ｓ．    Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ／Ｌｅ（ｙ）／Ｌｅ（ｂ）  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．    Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３２７：１４−１９  （１９９２）．
Ｍｕｒｐｈｙ  Ｇ  Ｐ，  Ｔｊｏａ  Ｂ  Ａ，  Ｓｉｍｍｏｎｓ  Ｓ  Ｊ．  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｕｌｓｅｄ  Ｗｉｔｈ  ＨＬＡ−Ａ２−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．  ３８：４３−７８  （１９９９）．
Ｎａｙｌｏｒ  ＰＨ，  ｅｔ  ａｌ．    Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  ｐ１７−Ｂａｓｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＡＩＤＳ  Ｖａｃｃｉｎｅ  −  ＨＧＰ−３０  −  ＫＬＨ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．  １３  （Ｓｕｐｐｌ．  １）：  １１７−１２７  （１９９１）．
Ｎａｙｌｏｒ  ＰＨ，  Ｈａｄｄｅｎ  ＪＷ．  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｙｉｅｌｄｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３：  １２０５−１２１５  （２００３）．  
Ｏ’Ｈａｇａｎ  ＤＴ，  ＭａｃＫｉｃｈａｎ  ＭＬ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｍ．  Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １８：  ６９−８５  （２００１）．
Ｒｉｄｇｗａｙ  Ｄ．    Ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  １０００  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．    Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  ２１：８７３−８８６  （２００３）．
Ｒｏｇｅｒｓ  Ｐ，  ａｎｄ  Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．    ＣＤ２８，  Ｏｘ−４０，  ＬＦＡ−１  ａｎｄ  ＣＤ−４  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．    Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １６４：２９５５−２９６３  （２０００）．
Ｒｏｉｔｔ  Ｉ，  Ｂｒｏｓｔｏｆｆ  Ｊ，  Ｍａｌｅ  Ｄ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ，  Ｐｈｉｌａ，  Ｐａ．，  （１９８９）．
Ｒｏｍａｎｉ  Ｎ，  Ｒｅｉｄｅｒ  Ｄ，  Ｈｅｕｅｒ  Ｍ，  Ｅｂｎｅｒ  Ｓ，  Ｋａｍｐｇｅｎ  Ｅ，  Ｅｉｂｌ  Ｂ，  Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓｅｒ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｇ．    Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ．    Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇａｒｄ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９６：１３７−１５１  （１９９６）．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，  Ｙａｎｇ  ＪＣ，  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ  ＮＰ．    Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｍｏｖｉｎｇ  ｂｅｙｏｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．    Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １０：９０９−９１５  （２００４）．
Ｓａｈｉｎ  Ｕ，  Ｔｕｒｅｃｉ  ０，  Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈ．  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：７０９−７１５  （１９９７）．
Ｓａｉｔｏ  Ｈ，  Ｔｓｕｊｉｔａｎｉ  Ｓ，Ｉｋｅｇｕｃｈｉ  Ｍ，  Ｍａｅｔａ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｋａｉｂａｒａ  Ｎ．    Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅ．    Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ７８：１５７３−１５７９  （１９９８）．
Ｓａｉｔｏ  Ｔ，  Ｋｕｓｓ  Ｉ，  Ｄｗｏｒａｃｋｉ  Ｇ，  Ｇｏｏｄｉｎｇ  Ｗ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ  Ｔ．    Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｅｘ  Ｖｉｖｉ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５：１２６３−１２７３  （１９９９）．
Ｓａｎｄａ  Ｍ  Ｇ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｄ  Ｃ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｌ  Ｇ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ−ＰＳＡ  （Ｐｒｏｓｔｖａｃ）  ｃａｎ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５３：  ２６０−２６６  （１９９９）．
Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒ  Ｂ，  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＥＳ，  Ｂｅｒｇｅｒ  ＴＧ，  Ｗｅｉｎｌｉｃｈ  Ｇ，  Ｅｂｎｅｒ  Ｓ，  Ｗｏｅｒｌ  Ｐ，  Ｂｅｎｄｅｒ  Ａ，  Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ  Ｂ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＰＯ，  Ｒｏｍａｎｉ  Ｎ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｇ．    Ｒａｐｉｄ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｙｐｅ  １  Ｔ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍａｔｕｒｅ，  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｏａｄｅｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．    Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９５：１２７９−１２８８  （２００２）．
Ｓｍｉｔｈ  Ｂ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｇ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｄ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｃ，  ａｎｄ  Ｈａｆｆｔｙ  Ｂ．    Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  １８：２０４８−２０５２  （２０００）．
Ｓｏｒｇ  Ｒ，  Ｏｚｃａｎ  Ｚ，  Ｂｒｅｆｏｒｔ  Ｔ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｊ，  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  Ｒ，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｔ  Ｐ．    Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｓｃａｌｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｃｌｏｓｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２６：３７４−３８４  （２００３）．
Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ．    Ｔｈｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．    Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ９：２７１−２９６  （１９９１）．
Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ  Ｍ．    Ａｖｏｉｄｉｎｇ  ｈｏｒｒｏ  ａｕｔｏｔｏｘｉｃｕｓ：  Ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ，  ９９：３５１−３５８  （２００２）．
Ｓｔｕａｒｔ  ＰＭ，  Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ  ＰＭ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＤ，  Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＭＫ，  ｄｅｌ  Ｍｕｒｏ  ＦＡ，  Ｍｅｌｖｏｌｄ  ＲＷ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ７８：  １１５９−１１６８  （１９８７）．
Ｓｗｅａｔ  ＳＣ，  Ｐａｃｅｌｌｉ  Ａ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＰ，  Ｂｏｓｔｗｉｃｋ  ＤＧ．  Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＳＭＡ）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５２：  ６３７−６４０  （１９９８）．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ａ，  Ｋｏｎｏ  Ｋ，  Ｉｃｈｉｈａｒａ  Ｆ，  Ｓｕｇａｉ  Ｈ，  Ｆｕｊｉｉ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｙ．    Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｙ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．    Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ５３：５４３−５５０  （２００４）．
Ｔｈｕｒｎｈｅｒ  Ｍ，  Ｒａｄｍａｙｒ  Ｃ，  Ｒａｍｏｎｅｒ  Ｒ，  Ｅｂｎｅｒ  Ｓ，  Ｂｏｃｋ  Ｇ，  Ｋｌｏｃｋｅｒ  Ｈ，  Ｒｏｍａｎｉ  Ｎ，  ａｎｄ  Ｂａｒｔｓｃｈ  Ｇ．    Ｈｕｍａｎ  ｒｅｎａｌ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．    Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ６８：１−７  （１９９６）．
Ｔｈｕｒｎｈｅｒ  Ｂ，  Ｈａｅｎｄｌｅ  Ｉ，  Ｒｏｄｅｒ  Ｃ，  Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ  Ｄ，  Ｋｅｉｋａｖｏｕｓｓｉ  Ｐ，  Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  Ｈ，  Ｂｅｎｄｅｒ  Ａ，  Ｍａｃｚｅｋ  Ｃ，  Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ  Ｄ，  ｖｏｎ  ｄｅｎ  Ｄｒｉｅｓｃｈ  Ｐ，  Ｂｒｏｃｋｅｒ  ＥＢ，  Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ，  Ｅｎｋ  Ａ，  Ｋａｍｐｇｅｎ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｇ．    Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍａｇｅ−３Ａ１  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  Ｍａｔｕｒｅ，  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐａｎｄｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍｅ  Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｔａｇｅ  ＩＶ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １９０：１６６９−１６７８  （１９９９）．
Ｔｊｏａ  ＢＡ，  Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＳＪ，  Ｂｏｗｅ  ＶＡ，  Ｒａｇｄｅ  Ｈ，  Ｒｏｇｅｒｓ  Ｍ，  Ｅｌｇａｍａｌ  Ａ，  Ｋｅｎｎｙ  ＧＭ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＰＳＭＡ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．    Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：  ３９−４４  （１９９８）．
Ｔｊｏａ，  ＢＡ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＰ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｉｍｍｕｎｏ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７４：  ８７−９３  （２０００）．
Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｙｎｄｅ  Ｂ，  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：６８４−６９３  （１９９７）．
Ｗａｎｇ  Ｒ  Ｆ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ  Ａ．  Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７０：８５−１００  （１９９９）．
Ｗｅｂｅｒ  Ｊ．  Ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｍｅｄｓｃａｐｅ  Ａｎｔｈｏｌｏｇｙ  ３：２  （２０００）．
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Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ  Ｔ，  Ｓｔａｎｓｏｎ  Ｊ，  Ｓｈｕｒｉｎ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｏｎｅ  Ｓ．    Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ．    Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １７３：１５２６−１５３４  （２００４）．
Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ  Ｔ．    Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔ，  ２００１：３４６−３５５  （２００１）．
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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