(57)【要約】本発明は核酸中の変異を検出する方法に関する。本発明の方法は、疾患を示すか、または疾患に罹りやすい体質であることを示す変異を検出し、識別するのに有効である。本発明には、一塩基伸長プライマーが単位複製配列に対して正しくハイブリダイズし、問題の変異のみを調べると仮定して、一般に各遺伝子座の増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）に依存する普通の伸長アッセイを超えた重要な利点がある。本発明は、一塩基伸長プライマー単独を単にハイブリダイズすることにより得られるより、もっと大きい選択性を可能にする変異（例えば、ＳＮＰ）を含む疑いのある部位の側面にあるいくつかのヌクレオチドの配列情報を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の変異を検出する方法であって、前記方法が
（ａ）変異を含む疑いのある、個別に光学的に検出可能な標的核酸鋳型を、標的／プライマーの二本鎖を形成するために前記変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができるプライマーにさらすステップと、
（ｂ）ポリメラーゼの存在下で１つ以上の標識付きヌクレオチドに前記二本鎖をさらすステップと、
（ｃ）前記標的に対して相補的な１つ以上の標識付きヌクレオチドを前記二本鎖の下流の前記プライマー内に組み込むステップと、
（ｄ）前記組み込まれた標識付きヌクレオチドを識別するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）−（ｄ）を反復し、それにより前記変異が前記標的中に存在するかどうか判断するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記プライマーが、前記変異の上流にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的が、支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体が、ガラスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ガラスが、その上にエポキシド・コーティングを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的が、アミン結合によって直接取り付けられている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的が、リンカーペアによって取り付けられている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーペアが、ビオチン／アビジン、抗原／抗体、および受容体／リガンドから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、さらに、
（ｆ）ステップ（ａ）の前に前記標的を断片化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、さらに、
（ｇ）前記標的を温浸するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ハイブリダイズされたプライマーの５’末端が、変異を含む疑いのある部位から約１塩基と約２０塩基との間にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複数の標的の各々が、支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｎｉｎｅ  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｎｏｒｔｈ、Ｖｅｎｔ、Ｔａｑ、Ｔｇｏ、ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチドが、さらに、３’ヒドロキシルに結合している取り外し可能な保護基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的が、各々が検出可能な異なる標識を含む、複数の異なるヌクレオチド種にさらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識付きヌクレオチドが、光学的に検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記光学的に検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記識別ステップが、前記組み込まれた標識付きヌクレオチドを前記蛍光標識を励起する光にさらすことを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み込まれた標識付きヌクレオチドが、個別に光学的に分解できる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸中の変異を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）変異を含む疑いのある標的核酸鋳型を、前記変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができるプライマーにさらすステップと、
（ｂ）少なくとも１つのヌクレオチドの存在下で、前記変異を含む疑いのある部位を介して、ポリメラーゼの存在下で、前記プライマーを伸長させるステップと、
（ｃ）前記プライマーを前記標的から取り外すステップと、
（ｄ）前記取り外されたプライマーの相補体をハイブリダイズして個別に光学的に検出可能である二本鎖を形成するステップと、
（ｅ）前記相補体を少なくとも１つの標識付きヌクレオチドにさらすステップと、
（ｆ）前記組み込まれた標識付きヌクレオチドを識別するステップと、
（ｇ）ステップ（ｅ）−（ｆ）を反復し、それにより前記変異が前記標的中に存在するかどうか検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記プライマーが、前記変異の上流にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのヌクレオチドの各々が、標識付きでない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的が、支持体に結合されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記支持体が、ガラスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ガラスが、その上にエポキシド・コーティングを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的が、アミン結合によって直接取り付けられている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的が、リンカーペアによって取り付けられている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記リンカーペアが、ビオチン／アビジン、抗原／抗体、および受容体／リガンドから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
複数の標的の各々が、支持体に結合されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
ハイブリダイズされたプライマーの５’末端が、変異を含む疑いのある部位から約１塩基と約２０塩基との間にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２０に記載の方法であって、前記方法が、さらに、
（ｈ）前記相補体を複数の鎖末端ヌクレオチドにさらすステップを含む、
方法。
【請求項３２】
前記ポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｎｉｎｅ  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｎｏｒｔｈ、Ｖｅｎｔ、Ｔａｑ、Ｔｇｏ、ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヌクレオチドが、さらに、３’ヒドロキシルに結合している取り外し可能な保護基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的が、複数の異なるヌクレオチド種にさらされ、各々が、検出可能な異なる標識を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記組み込まれた標識付きヌクレオチドが、光学的に検出可能な標識を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記光学的に検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記識別ステップが、前記組み込まれた標識付きヌクレオチドを蛍光標識を励起する光にさらすことを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組み込まれた標識付きヌクレオチドが、個別に光学的に分解できる、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００６年２月２２日に出願された、米国特許出願第１１／３６０，８５９号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、標的核酸中の変異を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの疾患は、ゲノムの不安定性と関連している。そこで、不安定性マーカーが、診断ツールとして提案されている。例えば、変異は、いろいろな疾患の貴重なマーカーと考えられ、スクリーニング・アッセイの基礎になった。特異的な変異の検出は、特定の型の癌の初期段階の分子スクリーニング・アッセイの基礎になりうる。例えば、ＢＲＣＡ遺伝子の変異は、乳癌のマーカーとして提案されており、ｐ５３細胞周期調節遺伝子の変異は、多数の型の癌の発生と関連している。
【０００４】
早期の変異検出により早期の診断が可能になり、患者が容易に回復しない場合に転移後しばしば起きる病徴を示す前に診療の道が開ける。しかし、遺伝子変異または他の変質の検出は困難であり、特定の試料型では不可能である。例えば、複雑な不均一試料から核酸を単離するのは困難であり、初期段階の変異の識別は困難である。さらに、普通の塩基配列決定法には、コスト、速度、および感度の制約がある。例えば、現在の塩基配列決定法は、通常、インビトロまたはｉｎ  ｓｉｔｕでの増幅ステップを含んでおり、このステップは、標的核酸が必要な信号を得るためには十分なコピー数の中に存在することが必要である。
【０００５】
単一分子技法では、クローニングおよびＰＣＲ増幅などのコストがかかり、しばしば問題を起こす手順は不必要になる。より詳細に説明すると、単一分子塩基配列決定法は、コストを低減し、不十分に増幅する配列などのバルク技法から生じる潜在的な偏りを回避する。さらに、単一分子技法は、普通の塩基配列決定法よりも出発物質の量が少なくてよい。しかし、現在の単一分子塩基配列決定法は不正確で、読み取り長さが限定されており、これが標的核酸中の変異の有無を検出する能力を低下させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当該技術分野では、標的核酸中の特定の遺伝子変異または他の変質の有無を決定する効率的な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明には、一塩基伸長プライマーが単位複製配列に対して正しくハイブリダイズし、問題の変異のみを調べると仮定して、一般に各遺伝子座の増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）に依存する普通の伸長アッセイを超えた重要な利点がある。本発明の高度な多重化特性により、従来の一塩基伸長変異による遺伝子型の特徴を超えた利点が得られる。本発明は、一塩基伸長プライマー単独を単にハイブリダイズすることにより得られるより、もっと大きい選択性を可能にする変異（例えば、ＳＮＰ）を含む疑いのある部位の側面にあるいくつかのヌクレオチドの配列情報を含む。一塩基伸長反応の組み込みを単に記録することにより作ることができる高速偽陽性は、組み込まれたプライマーの側面にある短いストレッチの配列情報を組み込むことにより回避される。
【０００８】
多重化単一分子塩基配列決定法の読み取りは、１つの反応管において行い、次いで、同時に表面上で解読すべき全体変異（例えば、ＳＮＰ）調査反応を可能にした。単一分子塩基配列決定の表面読み取りの密度は、高度多重化ＳＮＰ調査が比較的小さな部位をハイブリダイズすることができることを意味している。したがって、小さな表面積は、本明細書で説明した、高いマグニチュードの個別の変異調査を可能にすることができる。
【０００９】
本発明は、ゲノムの不安定性を示す標的核酸中の変異を検出する方法を提供する。例えば、変異を検出する方法は、癌および他の病理学的遺伝子疾患、障害または症候群などの疾患に付随する変異または他の変質を検出および／または識別するのに有効である。この種の変異には、ヌクレオチドの挿入、欠失、再配列、転移、翻訳、トランバージョン、多型、および置換がある。すなわち、変異は一塩基ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むことができる。本発明は、変異の有無の識別に使うことができる。一般に、変異は、異型接合性の喪失またはゲノム不安定性の他の兆候などの標的核酸の何らかの変化を含むことができる。一般に、標的核酸の変異を検出する方法は、変異を含む疑いのある標的核酸鋳型を、疑わしい変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができるプライマーへさらすことを含む。このプライマーは伸長し、１つ以上の相補性ヌクレオチド類は、変異を含む疑いのある部位によってハイブリダイズされる。変異の有無は、このプライマーに組み込まれているヌクレオチドを分析することにより判断される。
【００１０】
１つの態様では、標的核酸中の変異を検出する方法は、第１のさらすステップ、すなわち、変異を含む疑いのある標的核酸鋳型をプライマーにさらすステップを含む。このプライマーは、この変異に近接する標的核酸の既知領域にハイブリダイズし、標的／プライマーの二本鎖を形成することができる。第２のさらすステップは、既知領域の下流の標的核酸をポリメラーゼの存在下で１つ以上の標識付きヌクレオチドにさらし、この標的に対して相補的な１つ以上の標識付きヌクレオチドを組み込み、次いで、組み込まれた標識付きヌクレオチドを識別することを含む。識別ステップは、組み込まれた標識付きヌクレオチドを、蛍光で標識されたヌクレオチドを励起する光にさらすすることを含む。第２のさらすステップ、組み込みステップ、および識別ステップは、１回以上反復される。この標的核酸の配列は、検出されたヌクレオチドを蓄積し、それによりこの標的核酸の相補性配列を決めることにより決定される。第２のさらすステップ、組み込みステップ、および識別ステップを反復すると、この標識付きヌクレオチドの組み込みの順番に基づいてこの標的核酸の配列を決めることができる。この核酸配列は、標的核酸中に疑わしい変異の有無を検出する。この標的の決定配列が、野生型に対して相補的である場合は、変異の不在が確認される。この標的核酸の決定配列が野生型に対応しない場合は、変異が検出される。この変異は、この核酸配列を予期された野生型配列と比較することにより判断することができる。したがって、野生型と異なる決定配列は、この標的核酸の変異アッセイが陽性である。
【００１１】
これらの方法は、標的を切断する任意のステップを含むことができる。任意に、この標的核酸は、変異を含む疑いのある標的核酸鋳型を、この変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができるプライマーにさらす前に断片化される。１つの実施態様では、この標的核酸はまず断片化され、次いで切断される。例えば、この標的核酸は約２ｋｂ〜約１ｋｂの範囲、好ましくは１．５ｋｂのサイズに断片化される。この標的核酸は、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉにさらすことにより約２５０ｂｐ〜約５０ｂｐの範囲、好ましくは約１５０ｂｐのサイズまで切断することができる。この標的核酸は、個別に光学的に検出することができる。１つの実施形態では、組み込まれた標識付きヌクレオチドは、個別に光学的に分解することができる。
【００１２】
別の態様では、標的核酸中の変異検出方法は、変異を含む疑いのある標的核酸鋳型をプライマーにさらすことを含む。このプライマーは、この変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができる。ポリメラーゼおよび少なくとも１つのヌクレオチドの存在下で、この変異を含む疑いのある部位を介してこのプライマーを伸長させる。任意に、少なくとも１つのヌクレオチド類の各々は標識されていない。伸長プライマーは、この標的から取り外され、相補体は取り外された伸長プライマーにハイブリダイズされ、個別に光学的に検出できる二本鎖を形成する。この相補体は、少なくとも１つの標識付きヌクレオチドにさらされ、組み込まれた標識付きヌクレオチドが識別される。これらの方法は、この相補体を複数の鎖末端ヌクレオチドにさらす任意のステップを含むことができる。１つの実施形態では、この識別ステップは、組み込まれた標識付きヌクレオチドは、蛍光で標識されたヌクレオチドを励起する光にさらすすることを含む。
【００１３】
本明細書で説明したように、この標的核酸は個別に光学的に検出することができる。１つの実施形態では、組み込まれた標識付きヌクレオチドは個別に光学的に分解することができる。さらすステップおよび識別ステップは１回以上反復される。さらすステップおよび識別ステップは、相補的な標識付きヌクレオチドの組み込みの順番に基づいてこの標的核酸の配列を決めることができる。この標的核酸の配列を決めることにより、変異の有無を決めることができる。例えば、決定核酸配列が野生型に対して相補的である場合は、この標的核酸中に変異がないことが確認される。決定核酸配列が、野生型変異に対応しないことが検出された場合は、決定核酸配列を野生型と比較することによりこの変異を識別することができる。したがって、野生型とは異なる決定核酸配列は、標的の変異アッセイにおいて陽性である。本発明により、このプライマーは、変異の上流、例えば、１つの実施形態では、ハイブリダイズされたプライマーの５’末端は、変異を含む疑いのある部位から約１塩基〜約２０塩基の間にある。
【００１４】
単一分子塩基配列決定法では、この標的核酸分子／プライマーの二本鎖は、固定されたプライマーに添加されたヌクレオチド類が個別に光学的に分解できるように、表面に固定される。プライマー、鋳型および／またはヌクレオチド類似体は、この二本鎖の位置が個別に光学的に分解できるように、検出可能に標識づけることができる。任意に、この二本鎖は、何らかのヌクレオチド類を添加する前に個別に光学的に分解できるように、表面に固定することができる。
【００１５】
このプライマーは固体支持体に取り付けることができ、それによりハイブリダイズされた標的核酸分子を固定するか、またはこの標的核酸を固体支持体に取り付け、それによりこのハイブリダイズされたプライマーを固定することができる。この鋳型またはプライマーのいずれかを固体支持体に結びつける前または後に、このプライマーおよび標的は、互いにハイブリダイズすることができる。例えば、この標的核酸は、ガラスなどの支持体または表面に結びつけることができる。このガラス支持体は、エポキシド・コーティングを有してもよい。さらに、この多重化単一分子塩基配列決定により、この変異調査反応全体を１つの反応管で行い、同時に表面で解読することができる。単一分子塩基配列決定法の表面読み取りの密度は、この高度多重化変異調査が小さな部位をハイブリダイズすることができることを意味している。例えば、この部位は１０ｍｍ２未満にすることができる。したがって、３．５ｃｍ×３．５ｃｍの寸法を有する表面は、本明細書で説明した５００，０００個の変異調査反応を約１００組、表面に塗布し、一分子結像系により同時に読みとれるように改変することができる。
【００１６】
この標的は、アミン結合またはリンカーペアによって支持体に直接取り付けられる。適切なリンカーペアは、ビオチン／アビジン、抗原／抗体、および受容体／リガンドから選択することができる。１つの実施形態では、複数の標的の各々は、支持体に結びつけられている。この標的は、各々が異なる検出可能な標識を有する、複数の異なるヌクレオチド種にさらすことができる。この方法を実行するときには検出可能な何らかの標識を使用することができる。標識付きヌクレオチドは、例えば、蛍光標識などの光学的に検出可能なものであればよい。適切な蛍光標識の例には、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、アレクサ、共役多重染料、またはこれらいずれかの組み合わせがある。本発明の方法に適した、当業者に周知の検出可能な他の標識もある。疑わしい変異に近接する領域に対してハイブリダイズするプライマーに、この標的核酸をさらした後、このプライマー／標的核酸の二本鎖は、鋳型に従ってこのプライマーを伸長させるのに適した条件下でポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドにさらすことにより伸長する。例えば、１つの実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性を低下させたＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて、鋳型に従ってプライマーを伸長させる。一般に、このプライマー／標的核酸二本鎖は、鋳型依存性のヌクレオチドの重合を可能にする。このプライマーは、１つ以上の塩基を伸長する。このポリメラーゼは、例えば、Ｋｉｅｎｏｗ、Ｎｉｎｅ  ｄｅｇｒｅｅｓ  ｎｏｒｔｈ、Ｖｅｎｔ、Ｔａｑ、Ｔｇｏ、ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、またはこれらのいずれかの組み合わせから選択することができる。このヌクレオチドは、３’ヒドロキシルに結合した取り外し可能な保護基を含むことができる。
【００１７】
各プライマーのハイブリダイゼーション溶融温度はほぼ同じにすることができる。１つの実施形態では、これらのプライマーは長さ約１ｂｐ〜約３０ｂｐの間にある。任意に、各プライマーは同じ長さであり、すなわち、同数のヌクレオチド塩基対から構成されている。これらのプライマーは、例えば、光学的に検出可能な標識により標識されている。適切な標識には、蛍光標識がある。多重反応では、プライマーは変異の検出および／または測定を容易にするために標識を付けて区別することができる。
【００１８】
この方法は、本明細書では、蛍光標識の例を挙げているが、この方法は蛍光標識に限定されず、化学発光標識、発光標識、燐光標識、蛍光分極標識、および荷電標識を含むあらゆる検出可能な標識を付けたヌクレオチドを用いて行うことができる。
【００１９】
変異検出の方法には、この標的核酸の遺伝子座における変異の有無の検出がある。疾患に付随する変異は、本発明により検出することができる。疾患に付随するこの種の変異には、例えば、ＣＡＲＤ１５、ＳＥＲＣＡ２ｂ、ＧＳＴＭ−１、ＮＡＴ２、ＮＯＤ２、ＡＢＣＡ３、Ｋ−ＲＡＳ、ｐ５３、ＡＰＣ、ＤＣＣ、またはＢＡＴ２６がある。肺癌、食道癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、またはリンパ腫などの癌に付随する変異がある。アルツハイマー病、パーキンソン病、およびクローン病などの他の疾患または障害に付随する変異もある。変異検出の方法によると、変異の有無は検出することができ、変異の存在を検出すると、変異の型（例えば、Ｋ−ＲＡＳ変異）を決めることができる。
【００２０】
以下、この方法の特定の実施形態について詳細に説明する。本発明の他の実施形態は、後続の図面および詳細な説明を精査すると明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、一般に、標的核酸中の変異の有無を検出する方法に関する。これらの検出方法は、単一分子塩基配列決定に特に適している。この変異検出方法は、単一分子塩基配列決定法によって標的核酸中の変異の有無を検出する能力を限定する単一分子塩基配列決定における読み取り長さおよび精度の制限を回避する。
【００２２】
単一分子塩基配列決定法は、ゲノムＤＮＡから直接作用し、それによりＤＮＡ増幅（ＰＣＲ）の必要性を排除する固有の利点を有する。全体的な試料調製プロセスを大幅に単純化することに加えて、この配列決定法は増幅エラーおよびバイアスの導入を停止し、最終的にはコストを低減する。増幅を排除することにより、核酸分子は基板上にきっちりと充填することができ、それにより既定の表面積から最大量の配列情報が得られる。ヒトゲノム全体は、例えば、単一のコンパクトなガラス基板上に表現することができる。個別に分解可能な単一核酸分子を高密度に詰めた基板を画像化すると、画像あたり、したがって、単位時間あたり最大量の配列情報が得られ、数年とは対照的に１日でゲノム全体の塩基配列決定が可能になる。そこで、これらの利点は、試料調製および塩基配列決定の化学の両方について、直接コスト低減につながる。さらに、試薬の使用量が、増幅をベースにした代替技術よりも、等量のデータについて桁違いに低くなる。具体的に述べると、これらの方法は、標的核酸鋳型において疑わしい変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができるプライマーを用いる。プライマー組み込み後、変異の有無は、疑わしい変異の領域で組み込むヌクレオチド類により検出される。疑わしい変異に近接する既知領域とプライマーをハイブリダイズさせると、配列識別によって変異の検出を可能にする鋳型内へ組み込む必要がある単一分子の数を限定する。したがって、組み込みエラーおよび読み取り長さ限定の影響力が低減される。任意に、これらの変異検出の方法は、高度並行多重化アッセイにおいて使用することができる。変異の有無を検出するのに必要な時間は、単一分子塩基配列決定法が単独で使用される場合に比べて、この方法では短縮される。この標的および／または組み込まれたヌクレオチドは、個別に光学的に分解することができる。
【００２３】
核酸の塩基配列決定法
本発明は、標的核酸中の変異を検出する方法を含む。変異を検出するこれらの方法は、単一分子塩基配列決定法に特に適している。この種の方法は、例えば、２００４年４月に出願された米国特許出願第１０／８３１，２１４号、２００４年５月２４日に出願された第１０／８５２，０２８号、２００５年６月１０日に出願された第１０／８６６，３８８号、２００２年３月１２日に出願された第１０／０９９，４５９号、および２００３年７月２４日に発行された米国特許出願公開第２００３／０１３８８０号に記載されており、これらの開示内容は全体が本明細書に組み込まれている。
【００２４】
一般に、変異を検出する方法は、個別に光学的に分解できる標的核酸鋳型（本明細書では鋳型核酸または鋳型とも呼ばれる）をプライマーにさらすことを含み、このプライマーは、変異に近接するこの標的核酸にこのプライマーをハイブリダイズするのに適した条件下で、標的核酸の少なくとも一部に相補的である。このプライマーは、この変異に近接する既知領域にハイブリダイズし、標的核酸／プライマーの二本鎖を形成することができる。
【００２５】
標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。標的核酸分子は、動物、植物、バクテリア、ウイルス、真菌、または他の細胞有機体から得られた、あらゆる細胞物質から得ることができる。標的核酸は、有機体からまたは血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、大便および組織など有機体から得られた生物試料から直接得られる。あらゆる組織または体液試料は、変異検出方法において使用する核酸の源として使用することができる。核酸分子は、一次細胞培養または細胞系などの培養細胞からも単離することができる。標的核酸が得られる細胞は、ウイルスまたは他の細胞内病原体によって感染させることができる。試料は、生物試料、ｃＤＮＡライブラリー、またはゲノムＤＮＡから抽出された全体がＲＮＡでもよい。核酸は、通常、粉砕して分析用の適切なフラグメントを作成する。１つの実施形態では、生物試料からの核酸は、超音波処理により粉砕する。テスト試料は、２００３年１０月９日に発行された、米国特許出願公開第２００２／０１９０６６３号Ａ１で説明されたとおりの試料が得られ、その開示内容は全体が本明細書に組み込まれている。一般に、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）により説明された方法などのいろいろな方法による生物試料から抽出することができる。一般に、標的核酸分子は、約５ｋｂ〜約２０ｋｂの範囲になる可能性がある。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステム構造およびループ構造）であるかもしれない。
【００２６】
この変異検出方法は、プライマーの使用を前提にしている。各プライマーは、一本鎖の核酸である。この方法により、プライマーはこの標的核酸に関するその相補性領域をハイブリダイズする。より詳細に説明すると、この標的核酸上のこのプライマーの相補性領域は、疑わしい変異に近接する既知領域である。
【００２７】
この方法を実行する場合、この標的核酸は１つ以上のプライマーと共に培養される。１つの実施形態では、このプライマーは、固相または半固相マトリックスなどの支持体に結合される。個々のプライマーの長さは、ヌクレオチドの数で、約４個〜約１００個になる。好ましい実施形態では、個々のプライマーの長さは、ヌクレオチドの数で、約８個〜約３０個になる。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプライマーは、この標的核酸をハイブリダイズするために使われる。これらのプライマーは、当該技術分野で標準的な方法である、商業的に入手できる自動化された合成器を用いて化学的に合成される。
【００２８】
１つ以上のプライマーは標識されるのがよい。例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣまたはローダミンなどの）、酵素（アルカリ性ホスファターゼなどの）、ビオチン、また他の周知の標識化合物が、直接的または間接的にプライマーに取り付けられる。あるいは、このプライマーは放射能で標識されたり、または他のよく使われる標識またはレポーター分子に結合される。さらに、これらのプライマーは、各々のプライマーを独自に識別する分子量改変剤（ＭＷＭＥ）を用いてマークしてもよい。
【００２９】
プライマーハイブリダイゼーション反応は、異なる核酸配列を有するプライマーが、同等の強度を有するこれらの相補性ＤＮＡをハイブリダイズする条件下で行うことができる。これは、１）同等の長さを有するプライマーを用い、および２）ハイブリダイゼーション混合物中に、長さは同一であるが、グアノシン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含有量が異なるプライマー間の溶融温度（Ｔｍ）の差異を排除する、適切な濃度の１つ以上の薬剤を含む、ことにより実現される。したがって、これらの条件下で、複数の一本鎖核酸の各メンバーのハイブリダイゼーション溶融温度（Ｔｍ）はほぼ同等である。このために使われる薬剤には、テトラメチルアンモニウム・クロライド（ＴＭＡＣ）などの４級アンモニウム化合物がある。
【００３０】
ＴＭＡＣは、Ｇ−Ｃ対の間の水素結合エネルギーを低減する。同時に、ＴＭＡＣは、Ａ−Ｔ対の間の水素結合の熱安定性を高める。これら相反する影響は、水素結合が３つあるＧＣ塩基対と水素結合が２つあるＡ−Ｔ対との間の普通の結合強度の差を縮める。ＴＭＡＣは、各プライマーの溶融曲線の勾配も大きくする。同時に、これらの作用は、単一塩基の差が解決することができ、非特異的なハイブリダイゼーションを最小限にする点まで増加すべきハイブリダイゼーションの厳しさを許容する。例えば、引用により本明細書に組み込まれた、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１５８５，（１９８５）を参照のこと。これらの特性を示すあらゆる薬剤は、本発明の方法を実行する場合に使用することができる。この種の薬剤は、濃度を上げながら薬剤有無の場合の異なるテストプライマーについて溶融曲線を測定することにより容易に識別される。これは、ナイロンフィルターなどの固体マトリックスに標的核酸を取り付け、長さは同じであるが、このフィルターへのＧ＋Ｃ含有量が異なる放射性標識付きプライマーを個別にハイブリダイズし、温度を上げてフィルターを洗浄し、次いで、各温度でフィルターに結びついた放射性標識付きプライマーの相対量を測定することにより実現することができる。上で説明したハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップにおいて存在する薬剤は、ほぼ重ね合わせられる、急勾配の溶融曲線をもたらし、種々のプライマーについて使用することができる。
【００３１】
変異を検出する本発明の方法を実行すると、特異的なハイブリダイゼーションを最大にし、非特異的なハイブリダイゼーションを最小にする適切な条件下で、この標的核酸およびプライマーは十分な時間培養される。考慮すべき条件には、各プライマーの濃度、ハイブリダイゼーションの温度、塩濃度、および無関係な核酸の有無がある。
【００３２】
１つの実施形態では、これらのプライマーの各々は同数のヌクレオチド類を含む。これらのプライマー配列は、標的核酸において疑わしい変異に隣接した既知領域にハイブリダイズするようにデザインされる。任意に、各プライマーの最適濃度は、各プライマーの信号対ノイズ比（すなわち、特異的結合対非特異的結合）が、標識付きプローブの濃度を上げて測定されるテスト・ハイブリダイゼーションにより決定することができる。
【００３３】
ハイブリダイゼーションの温度は、使われるこれらのプライマーの長さに対して最適化することができる。これは、上で説明した溶融曲線測定手順を用いて経験的に決めることができる。最適時間、温度、プライマー濃度、塩の型、および塩の濃度等のハイブリダイゼーション条件の決定は一致してなされるべきであることは、当業者には理解できるであろう。
【００３４】
この変異検出方法により、プライマーはこの標的核酸のプライマーの相補性領域のみをハイブリダイズする。プライマー相補性領域は、疑わしい変異に近接する既知領域である。プライマーがハイブリダイゼーション後、この標的核酸は変異が疑われる遺伝子座の付近に単一鎖として留まるであろう。典型的な変異には、単一ヌクレオチドの多型がある。ハイブリダイゼーションに続いて、非結合プライマーは、必要であれば、完全に対応した標的核酸：プライマーのハイブリダイゼーション生成物を保持する条件下で洗浄除去される。温度、洗浄時間、塩の型および塩の濃度などの洗浄条件は上で説明したように、経験的に決められる。
【００３５】
これらの変異検出方法は、潜在的な変異として検出される既知の多型を回避することができる。例えば、１つ以上の多型が、この標的核酸、複数のプライマーと関連している場合、多型変異体の１つをハイブリダイズするようにデザインされた各々を提供することができる。この標的上の多型変異体に対して相補的なプライマーはこの多型の領域をハイブリダイズするであろう。したがって、この方法によると、プライマーは、疑わしい変異に近接する既知の多型を含む既知の多型変異体をブロックするようにデザインすることができる。したがって、各多型変異体に対して相補的なプライマーを提供すると、この方法によりこの標的核酸に関連した多型変異体以外の変異の有無を示す、変異を含む疑いのある一本鎖領域およびプライマーによりこの多型領域がブロックされることを保証する。
【００３６】
１つの実施形態では、この標的核酸／プライマーの二本鎖は、一分子区別を容易にするために個別の光学的な分解が可能である。この核酸標的、鋳型、プライマー、および／または標的／プライマーの二本鎖は支持体に結びつけることができる。取り付け用支持体の選択は、用いる検出方法に左右される。この方法で用いるのに好ましい支持体には、エポキシドまたは高分子電解質多重層を含む支持体がある。この種の層またはコーティングは、表面化学の光学的検出に対して敏感に反応する、ガラスまたはシリカなどの表面上に堆積されるのが好ましい。しかし、この変異検出方法で使われる支持体自身は、本明細書で説明した方法の機能にとって重要ではない。１つの実施形態では、支持体に結びつけられた核酸二本鎖は、例えば、エポキシド・コーティングを有するガラスに結びつけられる。この二本鎖は、例えば、アミン結合またはリンカーペアによって支持体に直接取り付けることができる。適切なリンカーペアは、例えば、ビオチン／アビジン、抗原／抗体、および受容体／リガンドから選択される。１つの実施形態では、複数の標的の各々は、支持体に結びつけられ、複数の標的は、例えば、各標的核酸を単一ビードにつなぐ各標的核酸の末端においてアミン結合により単一被覆ビードに結びつけられる。
【００３７】
１つ以上のヌクレオチド類および１つのポリメラーゼは、鋳型に従っててプライマーを伸長するのに適した条件下で標的核酸／プライマーの二本鎖に添加される。このプライマーは１つ以上のヌクレオチド類により伸長させることができる。
【００３８】
この方法で有用なヌクレオチド類には、あらゆるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体があり、天然に存在するものでも、合成されたものでもよい。例えば、好ましいヌクレオチド類には、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン、およびウリジンのリン酸エステル類がある。組み込まれたヌクレオチドは、例えば、組み込まれたヌクレオチドに存在する標識により識別される。このヌクレオチドは、ヌクレオチド３’ヒドロキシルに結合された取り外し可能な保護基を有することができる。１つの実施形態では、この標的核酸は、各々が検出可能な異なる標識を有する複数の異なるヌクレオチド種にさらされる。この標識は、例えば、蛍光標識などの光学的に検出可能な標識でよい。標識付き各ヌクレオチド種は、種々の標識を含んでもよいし、同じ標識を含んでもよい。組み込まれた標識付きヌクレオチドは、個別の光学的な分解が可能である。識別ステップには、組み込まれた標識付きヌクレオチドの蛍光標識を励起する光へさらすことが含まれる。
【００３９】
いずれかのポリメラーゼおよび／または重合酵素を使用してよい。好ましいポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性の低いＫｌｅｎｏｗである。この方法で一般に有用な核酸ポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および前述のいずれかの変異体型または変質型がある。ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの特性は、参考文献、例えば、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｏｍｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）で詳細に説明されている。この方法で有用な従来から知られているＤＮＡポリメラーゼには、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１，Ｓｔｒａｇｅｎｅ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０：１８６−８，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ  １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ  ａｎｄ  ＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる，Ｃａｒｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ，１９：４１９３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、９゜Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｓａｂｉｎｏ，１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ．，１２７：１５５０）、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３．特許出願  ＷＯ  ０１３２８８７から）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる，Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ  Ｔｈｅ��ｍｏｔａｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ；Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｓａｂｉｎｏ，１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．３１：１２３９；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｅｃｏｍｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、および古細菌のＤＰＩＩ／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９５：１４２５０→５）があるが、これらに限定されない。
【００４０】
他のＤＮＡポリメラーゼには、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標），９゜Ｎｍ（商標），Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標），Ｔａｑ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｐｆｕ，Ｔｆｌ，Ｔｔｈ，Ｔｌｉ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント，Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ，ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔｇｏ，ＪＤＦ−３，変異体および変異形およびこれらの誘導体があるが、これらに限定されない。この方法で有用な逆転写酵素には、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶおよび他のレトロウイルス（Ｌｅｖｉｎ，Ｃｅｌｌ  ８８：５−８（１９９７）；Ｖｅｒｍａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，４７３：１−３８（１９７７）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：２８９−３４７（１９７５）を参照のこと）からの逆転写酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
ここで図１を参照すると、変異検出の方法の１つの実施形態では、変異（Ｘ）を含む疑いのある標的核酸が提供される。この標的核酸は、疑わしい変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができるプライマーにさらされる。このプライマーは、特異的なハイブリダイゼーションを助長する条件下でこの標的にさらされるのが好ましい。１つの実施形態では、複数のプライマーが提供されるが、ただ１つのプライマーのみが、疑わしい変異に近接する既知領域にハイブリダイズする。標的核酸／プライマーの二本鎖が生成し、任意に、結合していないプライマーが洗浄除去される。この標的核酸／プライマーの二本鎖は、ポリメラーゼの存在下で一種の標識付きヌクレオチドにさらされる。この標識付きヌクレオチドは、ワトソン−クリックの塩基対形成の法則にならい鋳型に従って組み込まれる。言い換えると、このヌクレオチドは、その相補体が鋳型に存在する遺伝子座においてプライマーに組み込まれる。二本鎖のアレイでは、適切な組み込みとなるよう鋳型に従って合成反応が生じるとともに、誤って組み込まれた塩基からの信号が低下する。変異検出方法には、第１のヌクレオチド種に対応する少なくとも１つの標識付きｄＮＴＰおよびポリメラーゼを含む反応混合物の存在下で、塩基配列決定反応の実行が含まれる。この方法により、利用可能な鋳型ヌクレオチドに対して相補的である標識付きｄＮＴＰは、読み取り長に加えられることになるであろう。組み込まれた標識付きヌクレオチド（Ｚ）は、例えば、その標識により識別される。標識付きヌクレオチド類が組み込まれる場合は、その後合成が行われる前に、この標識は任意に漂白および／または切り離しをすることができる。この標的／プライマーの二本鎖をポリメラーゼの存在下で１つ以上の標識付きヌクレオチドに繰り返しさらすと、組み込まれたヌクレオチド類（ＺＺＺＸｃＺＺＺ）は識別され、疑わしい変異（Ｘ）の有無が検出される。１つの実施形態では、この変異（Ｘ）はその相補体、Ｘｃの組み込みにより検出される。任意に、この変異Ｘは、この測定配列ＺＺＺＸｃＺＺＺを野生型の配列と比較することにより決められる。
【００４２】
この方法は、合成による単一分子塩基配列決定を含むことができる。プライマー／標的核酸の二本鎖は、１つ以上の二本鎖が個別に光学的に分解できるように表面に結びつけられる。この方法によると、プライマー／標的核酸（鋳型）の二本鎖は、ポリメラーゼおよび第１ヌクレオチド種の標識付きヌクレオチドにさらされる。任意に、組み込まれていない標識付きヌクレオチド類および／または組み込まれていない連鎖伸長阻害剤は洗浄除去される。この組み込まれた標識付きヌクレオチドは識別され、任意に、光学的に検出可能な標識は組み込まれたヌクレオチドから除去される。このようにして、このプライマーがハイブリダイズされている疑わしい変異に近接する既知領域に隣接した標的核塩基配列決定に相補的なヌクレオチドのアイデンティティは識別される（例えば、既知領域にハイブリダイズされたプライマーの下流の標的核酸の塩基）。この重合反応は、組み込まれたヌクレオチド類の配列が蓄積され、この蓄積された配列から変異を含む疑いのある部位にわたる標的核酸の配列を決めることができるまで、ワトソン−クリックの４つの核酸種の各々に対応する標識付きヌクレオチドの存在下で連続的に反復される。適切な（すなわち、相補的な）ヌクレオチドをプライマーに加えつつ、上記方法を実施すると相補的なデオキシヌクレオチドが加えられた二本鎖の大部分が得られる。
【００４３】
任意に、組み込まれていないヌクレオチド類は、検出ステップの前または後に除去される。組み込まれていないヌクレオチド類は、洗浄により除去することができる。この標的核酸／プライマーの二本鎖は、組み込まれたヌクレオチドの標識が除去され、一部除去され、分解されおよび／またはこの標識をヌクレオチドに取り付けたリンカーが切り離され、それにより標識を除去するように任意に処理される。標的核酸／プライマーの二本鎖を１つ以上の標識付きヌクレオチドおよびポリメラーゼにさらし、組み込まれたヌクレオチド類を検出するステップは、さらに、（１）標識を除去および／または分解し、（２）標識および少なくとも一部のリンカーを除去および／または分解し、または（３）リンカーを切り離す処置を反復することができ、それによりこの鋳型核酸中の追加塩基類を識別し、識別された塩基類を蓄積し、それにより標的核酸の配列を決める。一部の実施形態では、標識または残りのリンカーおよび標識は、例えば、プライマー伸長の最終回では除去されない。
【００４４】
１つの実施形態では、第２のさらすステップでは、この標的核酸／プライマーの二本鎖は、１つ以上の標識付きヌクレオチド類にさらされる。このプライマーがハイブリダイズする既知領域の下流のこの標的領域は、一本鎖である。この既知領域の下流のこの標的領域は、この標識付きヌクレオチド類にさらされる。この標的核酸に対して相補的な１つ以上の標識付きヌクレオチド類は、標識付きヌクレオチドが標的核酸のその一本鎖相補体をハイブリダイズするように、このプライマー内に組み込まれる。この組み込まれたヌクレオチドは、このヌクレオチド標識、例えば、標識の蛍光により識別される。第２さらすステップ、組み込みステップ、および識別ステップは反復され、それによりこの標的核酸中に疑わしい変異が存在するならば検出する。この標的核酸の少なくとも一部の配列は決められる。この測定核酸配列と野生型配列とを比較すると、この標的核酸中の変異の検出および／または測定が可能になる。
【００４５】
この方法の１つの実施形態では、変異を含む疑いのある標的核酸が提供される。この標的核酸は、個別に光学的に検出することができ、サイズは、約５ｂｐ〜約２５０ｂｐ、好ましくは約１５０ｂｐまでの範囲である。この標的核酸は、疑わしい変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができるプライマーにさらされる。第２のさらすステップでは、この標的核酸は、ポリメラーゼの存在下で既知領域から下流の１つ以上の標識付きヌクレオチドにさらされる。１つ以上の標識付きヌクレオチドはこのプライマー内に組み込まれ、組み込まれたこの標識付きヌクレオチドは識別される。
【００４６】
第２のさらすステップ、この組み込みステップ、およびこの識別ステップは、１回以上反復され、変異がこの標的核酸中に存在すれば検出する。
【００４７】
１つの実施形態では、この標的核酸は、例えば、Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ装置を用いてゲノムＤＮＡを約２．０ｋｂ〜約１．０ｋｂ、より詳細に述べると約１．５ｋｂ以下に断片化洗浄することにより調製される。次いで、断片化されたＤＮＡは、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉにさらされて約５ｂｐから約２５０ｂｐ、好ましくは約１５０ｂｐまでの範囲のサイズに切断される。ＤＮａｓｅ  Ｉを不活性化した後、この切断されたＤＮＡはサイズが約５ｂｐから約２５０ｂｐまでの範囲にあり、これを本変異検出方法にかける。
【００４８】
１つの実施形態では、この標的核酸が含むと疑われている変異は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。調製したＤＮＡは、９５〜９８℃で５分間変性され、次いで、予め０℃に冷却された金属ブロック中で急冷する。一旦ＤＮＡを変性すると、二本鎖ＤＮＡは個別の一本鎖に分離する。このＤＮＡ二本鎖の分離したいずれかの単一鎖から疑わしいＳＮＰの配列を決めることはできるが、１方向がもう１つの方向よりも有効かもしれない。
【００４９】
１つの実施形態では、この切断・変性されたＤＮＡは、ＳＮＰ特異性プライマー・スライドに結合する用意ができている。予め識別・テストされたＳＮＰ特異性プライマーは、単一分子塩基配列決定法（ＳＭＳ）のＳＮＰ検出に使える。あるいはさらに、プライマーは、この検出方法において使用するために特異的にデザインすることができる。各プライマーは、類似した溶融温度を有するのが好ましい。一部の実施形態では、各プライマーはほぼ同じＧＣ含有量を有する。適切なプライマーは、各々が、単一ＳＮＰに対して非常に特異的である。ＳＭＳ  ＳＮＰプライマーをデザインする場合、ＳＮＰ配列を考えることも重要である。何故ならば、例えば、約８ｂｐ〜約３０ｂｐ配列タグからなるこれらのプライマーは、その中で検出された何らかのＳＮＰ配列に近接する興味深い領域を識別するためには十分ユニークな存在であらねばならないからである。疑わしいＳＮＰ（例えば、疑わしいＳＮＰに近接する数百〜数千の領域）に近接する既定数の既知領域にハイブリダイズする疑わしいＳＮＰ特異的プライマーは、販売業者による合成により調製される。任意に、各プライマーは、エポキシド処理した固体表面に連結するために５’アミンを含む。スライドは、必要なときに使用するために予め調製し、貯蔵してもよい。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、一般に、高温（通常、５０６０℃）における３×ＳＳＣにて行われるが、最適結合を実現するためにはより特異的なハイブリダイゼーション条件を発現させる必要があるかもしれない。適切で特異的なハイブリダイゼーション条件は、異なるＧＣ含有量を有するプライマーの最適結合を実現するためにハイブリダイゼーション緩衝液においてＤＴＡＢおよび／またはホルムアミドを用いる。
【００５１】
本変異検出方法の１つの実施形態では、ＳＮＰを有する疑いのある断片化された標的ゲノムＤＮＡフラグメントを捕獲するためにＳＮＰ特異性プライマーが使われる。実際のゲノムＤＮＡは、検出されたＳＮＰ配列の逆相補体である。ＳＮＰを含む疑いのある標的核酸は、疑わしいＳＮＰに近接する標的の既知領域にハイブリダイズしうるプライマーにさらされる。１つの実施形態では、ＳＮＰ特異性プライマーは、検出されるＳＮＰの上流（５’）約１ｂｐから約２０ｂｐ、好ましくは約５ｂｐまでをハイブリダイズする。
【００５２】
プライマーのハイブリダイゼーション／捕獲に続いて、これらのハイブリダイズされたプライマーはｇＤＮＡ鋳型からのＤＮＡ合成を刺激するために使われる。このようにして、この標的／プライマーの二本鎖は、ポリメラーゼの存在下で、疑わしい変異に近接する既知領域の下流の１つ以上の標識付きヌクレオチドにさらされる。１つ以上の標識付きヌクレオチドはプライマーに組み込まれ、組み込まれた標識付きヌクレオチドが識別される。標的／プライマーの二本鎖の、ポリメラーゼ存在下において標識付きヌクレオチドへさらし、標識付きヌクレオチドの組み込み、および組み込まれた標識付きヌクレオチドの識別の各ステップは、反復され、それにより標的核酸中に存在すれば変異を検出する。このようにして、ｇＤＮＡ配列内の唯一のタグの位置を明確に識別するのに十分な塩基対がプライマーに添加され、例えば、ほぼ１５ｂｐ〜２０ｂｐがこのプライマーに添加される。配列決定されたタグは、ゲノム全体の配列決定に使われるタグよりも短いものとすることができる。これは、調査スペースが、ＳＮＰ特異性プライマーが結合するｇＤＮＡの領域の近くの領域に限定されているからである。この方法は、調査領域の複雑さを効果的に低減し、調査部位を、疑わしい変異に近接する領域をプライマーがハイブリダイズする部位の周りに限定する。すなわち、この調査スペースは、ＳＮＰプライマー結合部位に近接する。このプライマーおよび／またはこのポリメラーゼは、ヌクレオチド付加が起きる方向（例えば、３’および／または５’）を決めるために選択される。
【００５３】
この方法の別の実施形態では、標的核酸内の変異を検出する方法は、変異を含む疑いのある標的核酸鋳型をプライマーにさらすことを含む。このプライマーは、この変異に近接する既知領域にハイブリダイズすることができる。このプライマーは、ポリメラーゼおよび少なくとも１つのヌクレオチドの存在下で変異を含む疑いのある部位で伸長する。この伸長プライマーは、この標的から切り離され、相補体は切り離された伸長プライマーをハイブリダイズして、個別に光学的に検出可能な二本鎖を形成する。この相補体を少なくとも１つの標識付きヌクレオチドにさらし、組み込まれた標識付きヌクレオチドを識別する。この方法は、この相補体を複数の鎖末端ヌクレオチド類にさらす任意のステップを含むことができる。
【００５４】
この方法によると、非常に多重化された変異の検出は、検出器として単一分子塩基配列決定装置を用いて行うことができる。図２Ａ−２Ｂを参照すると、この方法は、この標的核酸中の疑わしい変異（Ｘ）に近接する既知領域にハイブリダイズすることができる１つ以上のプライマー（Ｐ）を用いる。これらのプライマーは、例えば、この変異検出方法により調査されるＳＮＰなどの変異に近接する標的核酸の領域に対して選択性を有するべくデザインされる。適切なプライマーには、例えば、部位特異性態様にて標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）をハイブリダイズする遺伝子座特異性オリゴヌクレオチド・プライマー（ＬＳＯＰ）がある。１つの実施形態では、プライマーは、変異を含む疑いのある部位に近接する標的核酸の領域をハイブリダイズするべくデザインされる。例えば、このプライマーは、変異を含む疑いのある部位から１塩基以上の既知領域にハイブリダイズする（例えば、このプライマーは疑わしいＳＮＰの約１ｂｐ〜約２０ｂｐ上流（５’）である）。適切なプライマーは、調査対象の標的核酸および／または標的核酸種ゲノム（例えば、これらのプライマーはヒトゲノムに存在する特異的な塩基配列を有する）において特異的な塩基配列を有するのに十分な長さ（例えば、十分な塩基対の長さ）のものである。この標的核酸は、任意の数のプライマー、例えば、約１〜約５００，０００種類のプライマーにさらすことができる。
【００５５】
１つの実施形態では、これらのプライマーは、単一の管内での反応において調査対象のこの標的核酸にハイブリダイズされる。別の実施形態では、これらのプライマーは、ハイブリダイゼーションを最適化するのに適している多重反応によってこの標的核酸にさらされる。この多重反応は、ＳＭＳ読み出しステップのためにためることができる。
【００５６】
さらに図２Ａ−２Ｂを参照すると、このプライマー（Ｐ）は疑わしい変異（Ｘ）に近接する標的核酸の既知領域にハイブリダイズされ、それによりプライマー／標的の二本鎖を形成する。ハイブリダイゼーション後、このプライマー／標的の二本鎖は、ポリメラーゼの存在下で少なくとも１つのヌクレオチドにさらされる。
【００５７】
１つの実施形態では、この二本鎖は多重態様においてこのプライマーの伸長を可能にする限定量の４個のデオキシヌクレオチド３リン酸とＤＮＡポリメラーゼとの混合物にさらされる。別の実施形態では、このプライマーは、プライマー内に組み込む限られた数のヌクレオチド類の多重反応によって伸長され、例えば、この反応動力学がこのプライマーの少なくとも５０塩基の伸長を可能にする。任意に、１つ以上のヌクレオチド類は、３’ヒドロキシルに取り付けられた取り外し可能な保護基を有し、これが伸長反応のブロックを可能にする。伸長反応を停止するもう１つの方法は、４個未満（例えば、１〜３）のデオキシヌクレオチド３リン酸を含む方法である。これによれば存在しないデオキシヌクレオチド３リン酸を必要とする塩基のところで当該塩基を読みとることができず、その相補体が欠けてしまうため、ポリメラーゼの伸長が自然停止する。
【００５８】
二本鎖伸長後、この混合物は支持体１００にハイブリダイズされる。この支持体１００は、捕獲プライマー（ＰＣ１，ＰＣ２，ＰＣ３）を用いて改変することができる。これらの捕獲プライマー（例えば、ＰＣ１，ＰＣ２，ＰＣ３）は、この伸長プライマー（Ｐｅｘｔｅｎｄｅｄ）の少なくとも一部に対して相補的であるようにデザインされる。より詳細に説明すると、これらの捕獲プライマーは、調査対象の変異の下流の標的核酸の配列に対して相補的であるようにデザインされる（例えば、捕獲プライマーＰＣ１は、この伸長プライマー、Ｐｅｘｔｅｎｄｅｄにおける変異Ｘの３’である配列ＭＭＭに対して相補的であるようにデザインされる）。変異Ｘは疑わしいＳＮＰでよい。適切な捕獲プライマーは、単一分子塩基配列決定法を何度でも生き残れるように、十分に高い溶融温度（Ｔ）を有するようにデザインされる。伸長反応で用いた各プライマーには少なくとも１つの捕獲プライマーがある。したがって、多重塩基伸長反応において５００，０００個のプライマーがある場合は、支持体に取り付けられた少なくとも５００，０００個のプライマーが必要になる。各プライマーには少なくとも１０個の捕獲プライマーが存在するのが好ましい。これらの捕獲プライマーは、３’末端が単一分子塩基配列決定反応において使用できるように、５’末端が支持体に取り付けられるような方向にあり、３’末端が支持体から外れた方向にある。捕獲プライマーの３’末端は、この変異の下流の標的核酸の配列に対して相補的である。図２Ｂを参照すると、ＰＣ１の３’末端は、下流の標的核酸相補体の配列、すなわち、変異Ｘの３’の配列に対して相補的であり、すなわち、配列ＭＭＭに対して相補的である。この捕獲プライマーの少なくとも一部は、この変異の下流の標的核酸の配列、すなわち、伸長プライマー、Ｐｅｘｔｅｎｄｅｄの部分であるこの変異の相補体Ｘｅの３’に対して相補的である。この捕獲プライマーは、単一分子塩基配列決定（例えば、安定し、且つ蛍光標識付きヌクレオチド類の低い非特異的な結合を有する）に用いるのに適合しているのが好ましい。
【００５９】
伸長プライマーＰｅｘｔｅｎｄｅｄをこの捕獲プライマーＰＣ１にハイブリダイゼーション後、多重塩基配列決定伸長プライマーは、１）調査対象の変異の配列（例えば、ＳＮＰ）、２）５’変異が調査された直後の１つ以上のヌクレオチド、３）３’の変異が調査された直後の５個以上のヌクレオチド類をコード化し、これらコード化プライマーは、複数回の単一分子塩基配列決定（ＳＭＳ）を受ける。ＳＭＳは、この変異の両側に関する情報を提供し、この変異（Ｘ）自身の配列を含む。この変異がＳＮＰならば、ＳＭＳはＳＮＰの遺伝子型を生じる。１より多いＳＮＰの複対立遺伝子があるならば、配列は、存在するＳＮＰ対立遺伝子の識別を可能にするＳＭＳプロセスにより作られるであろう。このようにして、変異（Ｘ）の有無は検出され、変異がこの標識中に存在することが検出されると、変異の型は、例えば、ＳＭＳにより塩基配列決定がなされた核酸により決めることができる。
【００６０】
さらに別の実施形態では、ユニバーサルプライマーが使われる。この方法は、支持体に共有結合により固定された複数の種々の型のプライマーを回避し、代わりに、ユニバーサル・ハイブリダイゼーション支持体がこの支持体に固定される。特に、説明した方法により決められた配列は野生型と比較され、この標的核酸中に存在する変異を決める。この変異検出方法のこの実施形態により、プライマーは、標的核酸中の疑わしい変異に近接する既知領域にハイブリダイズされる。このプライマーは、例えば、ＳＮＰなどの疑わしい変異の上流（例えば、５’）で少なくとも１つのヌクレオチドをハイブリダイズするのが好ましい。このプライマーは、この標的／プライマーの二本鎖を、ヌクレオチドの存在下で、ポリメラーゼにさらすことにより伸長される。このプライマーは、この変異の下流（例えば、３’）方向に少なくとも１つのヌクレオチド伸長するのが好ましい。プライマー伸長の方向は、例えば、この混合物を適切な動力学的調節により調節される。この伸長は、調査対象の変異（例えば、ＳＮＰ）の下流（例えば、３’）方向にこのプライマーをヌクレオチド数個分伸長できるように限定するのが好ましい。この反応は、迅速に停止され、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）とｄＡＴＰのアリコートとがこの反応混合物に導入される。このＴｄＴは動力学的に調節され、適切な数の単一型のヌクレオチドの組み込みが可能になる。１つの実施形態では、少なくとも５個のｄＡヌクレオチドがこの伸長プライマーに組み込まれる。好ましい実施形態では、少なくとも５０個のｄＡのヌクレオチドがこの伸長プライマーに組み込まれる。所望の数のｄＡヌクレオチドの組み込み後、この反応は、大過剰のジデオキシＡ３リン酸を添加して停止される。
【００６１】
ポリメラーゼ伸長反応停止後、この多重混合物は、組み込まれた多重単一型のヌクレオチド、例えば、ポリＡテール伸長プライマーに対して相補的であるプライマーを捕獲するために改変される支持体にハイブリダイズされる。この方法により、これらの捕獲プローブは、自由末端（例えば、非捕獲末端）において組み込まれた単一型のヌクレオチドに対して相補的な多重ヌクレオチド類を特徴づける。例えば、ポリＡテール伸長プライマーに対して相補的な捕獲プローブ各々がポリＴ配列を特徴づける。
【００６２】
標的核酸に関連した変異（例えば、ＳＮＰ）の上流および下流両方の配列情報の小部分のＳＭＳは、標的ゲノムＤＮＡとプライマーのクロス・ハイブリダイゼーションを是正する。
【００６３】
核酸鋳型の塩基配列決定法は標識を用いてもよく、この標識は検出可能であることが好ましい。１つの実施形態では、この標識は蛍光標識などの光学的に検出可能な標識である。この標識は、シアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、アレクサ、共役多重染料、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む検出可能な標識から選択することができる。しかし、適切に検出可能な標識は、本発明で使用することができ、当業者には周知のことである。
【００６４】
検出
組み込まれたヌクレオチドを識別するために、用いた標識のタイプに適しているあらゆる検出方法が使われる。したがって、代表的な検出方法には、放射性検出、光学的吸収度による検出、例えば、ＵＶ−可視部吸光度の検出、光学的放射検出、例えば、蛍光または化学発光がある。単一分子蛍光は、総内部反射（ＴＩＲ）照明を備えた普通の顕微鏡を用いて行うことができる。これらの伸長プライマーに関連した検出可能部分は、用いた走査方法により、各基板のすべてまたは一部を同時にまたは連続的に走査することにより基板上で検出することができる。蛍光標識の場合は、基板上の選択領域は、Ｆｏｄｏｒ（米国特許第５，４４５，９３４号）およびＭａｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，０９１，６５２号）に記載されているものなどの蛍光顕微鏡装置を用いて１つずつまたは１列ずつ連続的に走査することができる。単一分子からの蛍光を感知することができる装置には、走査トンネル顕微鏡（ｓｉＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）がある。ハイブリダイゼーション・パターンは、Ｙｅｒｓｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．９３：４９１３（１９９６）に記載されているものなどの適切な光学装置（Ｐｌｏｅｍ，ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｓｏｎ，Ｔ．Ｇ．Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌａｎｄｏｎ，ｐｐ．１−１１（１９９３）を備えたＣＣＤカメラ（例えば、ニュージャージー州Ｔｒｅｎｔｏｎ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｏｄｅｌ  ＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ）を用いて走査することもでき、あるいはＴＶモニターにより画像化してもよい。放射性信号の場合は、蛍光撮像装置を使用することができる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３：５６６，１９９０；Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３：５６６，１９９２；１９９３）。画像化装置の商業的供給者には、他に、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，（マサチューセッツ州Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ワールドワイドウェブ上ではｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍ），Ｇｅｎｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カナダ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｗａｔｅｒｌｏｏ；ワールドワイドウェブ上ではｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．がある。この種の検出方法は、取り付けられた複数の標的核酸を同時に走査する場合に特に有用である。
【００６５】
この方法は、標的核酸における変異検出、例えば、標的核酸内の単一ヌクレオチド中の変異の検出を提供する。例えば、変異を検出するこれらの方法には、例えば、標的核酸分子中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）がある。このためには、多数の方法が利用できる。挿入染料で標識された核酸内の単一分子を視覚化する方法には、例えば、蛍光顕微鏡法がある。例えば、蛍光スペクトルおよび単一分子励起状態の寿命を測定することができる。光電子増倍管またはアバランシェ光ダイオードなどの標準検出器を使用することができる。２段画像強化ＣＯＤカメラを用いた全領域画像化も使用することができる。さらに、低ノイズ冷却ＣＣＤも、単一蛍光分子の検出に使用することができる。
【００６６】
信号の検出システムは、用いた標識部分に左右され、この部分は利用できる化学技術により定義することができる。光学的信号では、光ファイバーまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）の組み合わせが、検出ステップで使用することができる。基板自身が用いた放射線に対して透明である場合は、この標的核酸から基板の反対側に配置された検出器を有する基板を通過する入射光ビームを有することができる。電磁的な標識付け部分では、種々の形態の分光システムを使用することができる。この検出システムでは種々の物理的配向性が利用され、重要なデザイン・パラメータに関する説明がこの技術分野で提供される。
【００６７】
単一核酸分子に組み込まれた蛍光標識付きヌクレオチド類の検出には、多数の方法を使用することができる。光学装置には、近接場走査顕微鏡、遠距離共焦点顕微鏡、広視野落射照明、光散乱、暗視野顕微鏡、光変換、単一および／または多光子励起、スペクトル波長識別、蛍光体識別、エバネセント波照明、および総内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡がある。一般に、特定の方法は、カメラを備えた顕微鏡を用いたレーザー活性化蛍光の検出を含む。適切な光子検出システムには、光ダイオードおよび増強ＣＣＤカメラがあるが、これらに限定されない。例えば、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラを使用することができる。表面近くの液体中の個々の蛍光染料分子を画像化するためにＩＣＣＤカメラを使用すると多数の利点がある。例えば、ＩＣＣＤ光学装置を用いると、蛍光体の連続画像（映画）を得ることができる。
【００６８】
本発明の方法の一部の実施形態では、二次元画像化の場合ＴＩＲＦ顕微鏡を用いる。ＴＩＲＦ顕微鏡は、全内部反射励起光を用い、当該技術分野において周知のものである。例えば、ワールドワイドウェブ上ではｎｉｋｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｊｐ／ｅｎｇ／ｐａｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｉｒｆ．ａｓｐｘを参照のこと。特定の実施形態では、検出は、エバセント波照明および全内部反射蛍光顕微鏡を用いて行う。エバセント光場は、例えば、蛍光標識付き核酸分子を画像化するために表面にセットアップすることができる。レーザービームが液体と固体基板（例えば、ガラス）との間の界面で全反射される場合は、励起光ビームは液体中では短距離しか浸透できない。光場は、反射界面で突然終わることはないが、その強度は距離と共に指数関数的に低下する。「エバセント波」と呼ばれるこの表面電磁場は、界面に近い液体中で蛍光分子を選択的に励起することができる。界面における薄いエバセント光場は、バックグラウンドが低く、可視波長における高い信号対ノイズ比を用いて単一分子の検出を容易にする。
【００６９】
このエバセント場は、取り付けられた標的核酸標的分子／プライマーの錯体中に蛍光標識付きヌクレオチド類をポリメラーゼの存在下で組み込んだ時にこれらのヌクレオチド類を画像化することもできる。次いで、全内部反射蛍光顕微鏡を用いて、取り付けられた標的核酸標的分子／プライマーの錯体および／またはこれらの組み込まれたヌクレオチド類を、単一分子解像度により可視化する。
【００７０】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、検出スキームとして用いることができる。塩基配列決定法の文脈におけるＦＲＥＴは、Ｂｒａｓｌａｖａｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：３９６０−３９６４（２００３）において一般的に説明されている。この文献は引用により本明細書に組み込まれている。本質的には、１つの実施形態では、ドナー蛍光プローブは、プライマー、ポリメラーゼ、または鋳型に取り付けられる。このプライマーに組み込むために添加されたヌクレオチド類は、これらの２つが最も近くにあるときにドナーにより活性化される受容体蛍光プローブを含む。
【００７１】
測定された信号は手作業で分析するか、または結果を一覧表にするために適切なコンピュータ方法により分析することができる。これらの基板および反応条件は、ハイブリダイゼーションおよび伸長の条件の完全性を証明し、望ましいならば、数量化のための標準曲線を得るために適切な対照を含む。例えば、対照核酸は試料に添加することができる。予期された伸長生成物の不在は、試料またはアッセイに欠陥があり、補正が必要であることを示している。
【００７２】
１つの実施形態では、検出可能な部分は、ピロリン酸基に取り付けられ、このピロリン酸基は、プライマー伸長の間に、ヌクレオチド類似体から取り外される。検出可能な部分を含み、蛍光を検出しているピロリン酸は、この鋳型／プライマー二本鎖から検出ａｌｌ内に取り外すことができ、そこで検出可能な標識の存在および／または量は、例えば、適切な波長における励起および蛍光の検出により測定され蛍光を検出している。
【００７３】
本発明は、本発明の意図または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特異的な形に具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書で説明した発明を限定するよりむしろすべての点が例示であると考えるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によるより、むしろ添付した特許請求の範囲により示され、これらの特許請求の範囲の等価な範囲および意味の中にあるすべての変化は、したがって、これらの請求の範囲に包含されることを目的としている。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】疑わしい変異に近接する既知領域のプライマーをハイブリダイズし、標識付きヌクレオチド類を組み込むことを含む、変異検出方法の概略図である。
【図２Ａ】疑わしい変異に近接する既知領域のプライマーをハイブリダイズし、この疑わしい変異によってプライマー／標的核酸を伸長することを含む、変異検出方法の概略図である。
【図２Ｂ】疑わしい変異に近接する既知領域のプライマーをハイブリダイズし、この疑わしい変異によってプライマー／標的核酸を伸長することを含む、変異検出方法の概略図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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