(57)【要約】  マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドの１又はそれ以上の生物学的活性を阻害する方法がＭＩＦ阻害化合物を用いて提供される。当該方法は、癌及び炎症性疾患の治療のための治療方法を含む。【選択図】なし
2009541214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドの生物学的活性を阻害する方法であって、前記ＭＩＦポリペプチドを式（Ｉ）
【化１】
2009541214.tif 000022
（ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、アミノ又はカルボキシルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル又はアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール又はアミノであり；及び
ｎは０〜５の整数である）
の構造を有する化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
化合物が少なくともＭＩＦポリペプチドのＮ末端残基の第２番目のメチオニンＭｅｔ−２と安定した相互作用を形成する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＭＩＦポリペプチドがモノマーＡ、Ｂ及びＣのホモトリマー並びにＭｅｔ−２を含むモノマーＡ（Ｍｅｔ−Ａ２）を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
化合物がさらに、ＭＩＦポリペプチドのＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、ｌｌｅ−６４、Ｌｙｓ−６６、Ｔｙｒ−９５、Ｍｅｔ−１０１、Ｖａｌ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の１又はそれ以上と安定した相互作用を形成する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＭＩＦポリペプチドが哺乳動物のＭＩＦポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＭＩＦポリペプチドが配列番号１を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１がヨウ素である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
化合物が４−ヨード−６−フェニルピリミジン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１α）ポリペプチドの生物学的活性を阻害する方法であって、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドを式（Ｉ）
【化２】
2009541214.tif 000023
（ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、アミノ又はカルボキシルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル又はアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール又はアミノであり；及び
ｎは０〜５の整数である）
の構造を有する化合物と接触させることを含み、ＭＩＦポリペプチドをＭＩＦポリペプチドの生物学的活性を阻害する化合物と接触させると、ＨＩＦ１αの生物学的活性が阻害される；前記方法。
【請求項１０】
化合物が少なくともＭＩＦポリペプチドのＮ末端残基の第２番目のメチオニンＭｅｔ−２と安定した相互作用を形成する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＭＩＦポリペプチドがモノマーＡ、Ｂ及びＣのホモトリマー並びにＭｅｔ−２を含むモノマーＡ（Ｍｅｔ−Ａ２）を含む、請求項１０記載の方法。 
【請求項１２】
化合物がさらに、ＭＩＦポリペプチドのＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、ｌｌｅ−６４、Ｌｙｓ−６６、Ｔｙｒ−９５、Ｍｅｔ−１０１、Ｖａｌ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の１又はそれ以上と安定した相互作用を形成する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ＭＩＦポリペプチドが哺乳動物のＭＩＦポリペプチドである、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
ＭＩＦポリペプチドが配列番号１を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１がヨウ素である、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
化合物が４−ヨード−６−フェニルピリミジン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＨＩＦ１αポリペプチドの活性を阻害するとＨＩＦ１αポリペプチドの転写活性が阻害される、請求項９記載の方法。
【請求項１８】
ＨＩＦ１αポリペプチド活性を阻害すると、ＨＩＦ１αを発現する細胞中の血管新生、放射線耐性又はそれらが共に阻害される、請求項９記載の方法。
【請求項１９】
細胞が低酸素癌細胞である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＭＩＦポリペプチドを、放射線、化学療法剤又はその両方での細胞の治療と併用される化合物と接触させる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞の発癌活性を阻害又は予防する方法であって、細胞を式（Ｉ）
【化３】
2009541214.tif 000024
（ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、アミノ又はカルボキシルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル又はアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール又はアミノであり；及び
ｎは０〜５の整数である）
の構造を有する化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２２】
Ｒ１がヨウ素である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
化合物が４−ヨード−６−フェニルピリミジン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
化合物が少なくともマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドのＮ末端残基の第２番目のメチオニンＭｅｔ−２と安定した相互作用を形成する、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
ＭＩＦポリペプチドがモノマーＡ、Ｂ及びＣのホモトリマー並びにＭｅｔ−２を含むモノマーＡ（Ｍｅｔ−Ａ２）を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
化合物がさらに、ＭＩＦポリペプチドのＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、ｌｌｅ−６４、Ｌｙｓ−６６、Ｔｙｒ−９５、Ｍｅｔ−１０１、Ｖａｌ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の１又はそれ以上と安定した相互作用を形成する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＭＩＦポリペプチドが哺乳動物のＭＩＦポリペプチドである、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
ＭＩＦポリペプチドが配列番号１を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
発癌活性を阻害又は予防することが、細胞の遊走、浸潤、細胞生存、足場非依存性増殖、血管新生又はそれらの組み合わせを阻害することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
発癌活性を阻害又は予防することが、前記化合物によるＭＩＦポリペプチド阻害を介したＲｈｏＧＴＰアーゼファミリーメンバーの活性を阻害することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
ＲｈｏＧＴＰアーゼファミリーメンバーがＲａｃ１又はＲｈｏＡである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
細胞が、肺癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、グリア芽腫及び乳腺腺癌からなる群から選択される癌細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項３３】
対象の癌の治療又はその再発を軽減する方法であって、対象に有効量の式（Ｉ）
【化４】
2009541214.tif 000025
（ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、アミノ又はカルボキシルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル又はアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール又はアミノであり；及び
ｎは０〜５の整数である）
の構造を有する化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
Ｒ１がヨウ素である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
化合物が４−ヨード−６−フェニルピリミジン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
化合物が少なくともマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドのＮ末端残基の第２番目のメチオニンＭｅｔ−２と安定した相互作用を形成する、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
ＭＩＦポリペプチドがモノマーＡ、Ｂ及びＣのホモトリマー並びにＭｅｔ−２を含むモノマーＡ（Ｍｅｔ−Ａ２）を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
化合物がさらに、ＭＩＦポリペプチドのＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、ｌｌｅ−６４、Ｌｙｓ−６６、Ｔｙｒ−９５、Ｍｅｔ−１０１、Ｖａｌ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の１又はそれ以上と安定した相互作用を形成する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
癌の治療が、細胞の遊走、浸潤、細胞生存、足場非依存性増殖、血管新生又はそれらの組み合わせを阻害することを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
化合物が、対象に、放射線、化学療法剤又はその両方での癌治療と併用して投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
化学療法剤が低酸素活性化合物を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
低酸素活性化合物がチラパザミン（tirapazamine）を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
細胞が、肺癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、グリア芽腫及び乳腺腺癌からなる群から選択される癌細胞である、請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
対象がヒトである、請求項３３記載の方法。
【請求項４５】
対象の炎症性疾患を治療する方法であって、対象に有効量の式（Ｉ）
【化５】
2009541214.tif 000026
（ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、アミノ又はカルボキシルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル又はアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール又はアミノであり；及び
ｎは０〜５の整数である）
の構造を有する化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４６】
Ｒ１がヨウ素である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
化合物が４−ヨード−６−フェニルピリミジン又はその類似体若しくは誘導体である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
化合物が少なくともマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドのＮ末端残基の第２番目のメチオニンＭｅｔ−２と安定した相互作用を形成する、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
ＭＩＦポリペプチドがモノマーＡ、Ｂ及びＣのホモトリマー並びにＭｅｔ−２を含むモノマーＡ（Ｍｅｔ−Ａ２）を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
化合物がさらに、ＭＩＦポリペプチドのＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、ｌｌｅ−６４、Ｌｙｓ−６６、Ｔｙｒ−９５、Ｍｅｔ−１０１、Ｖａｌ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の１又はそれ以上と安定した相互作用を形成する、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
炎症性疾患が、アトピー性皮膚炎、関節炎、増殖性血管障害、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、サイトカイン介在毒性、敗血症、敗血症ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ介在状態、自己免疫疾患、腫瘍増殖及び血管新生からなる群から選択される、請求項４５記載の方法。
【請求項５２】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主拒絶反応及びループス症候群からなる群から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
対象がヒトである、請求項４５記載の方法。
【請求項５４】
配列番号２に結合特異性があるヌクレオチド配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項５５】
アンチセンスポリヌクレオチドが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項５４記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項５６】
アンチセンスヌクレオチド配列が配列番号３を含む、請求項５４記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項５７】
アンチセンスヌクレオチド配列が配列番号４を含む、請求項５４記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項５８】
細胞又は組織中のマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドの発現を阻害する方法であって、細胞又は組織に請求項５４記載のアンチセンスポリヌクレオチドを接触させることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願で開示された法定主題は、本明細書にその全体を参照して援用する２００６年５月２６日に出願された米国仮出願第６０／８０８６７９号の利益を請求する。
政府の所有権
本願で開示された法定主題は、アメリカ国立衛生研究所生物医学研究総合拠点により授与された補助金第５Ｐ２０ＲＲ０１８７３３−０２号の下で米国政府の援助を受けた。それゆえ、米国政府は本願で開示された法定主題におけるある権利を有する。
技術分野
本願で開示された法定主題は、癌及び炎症性疾患の治療のための治療方法を含む、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の生物学的活性を阻害するための化合物を用いる化合物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞による遊走及び浸潤特性の獲得は、新生組織形成疾患の進行の中心及びしばしば致命的な段階である。正常な非形質転換細胞には厳密な成長因子があり、運動性に対する付着要求性があるものの、悪性細胞は、機能性癌遺伝子変異の獲得、成長因子受容体の過発現及び／又は酵素を分解する細胞外基質の本質的な（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）脱制御を含む複数のメカニズムにより当該要求性を克服してきた。偶然の一致ではなく、多くの固形癌はまた、極めて低酸素状態である。（Ｋｏｏｎｇら２０００ｂ；Ｂｕｃｈｌｅｒら２００４）。
【０００３】
低酸素はマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）発現を誘発しうる。ＭＩＦ発現は前悪性、悪性及び転移性腫瘍中で高まることが示されてきた。乳房、前立腺、結腸、脳、皮膚及び肺に由来する腫瘍は全て対応する非癌細胞よりもＭＩＦの伝達及びタンパク質のレベルが極めて高く含まれることが示されてきた。ＭＩＦは疾患の重篤度に著しく寄与しうることが示唆されうるため、ＭＩＦ発現は、腫瘍の悪性度及び転移の潜在性と密接に相関する。ＭＩＦは、新血管形成等の腫瘍依存性ストローマプロセスを刺激することにより間接的に腫瘍増殖及び進行を暗示してきた。同様に、ＭＩＦはマクロファージ及びリンパ球の活性化並びに生存を示唆しており、炎症性疾患の進行に関与しているかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、ある悪性腫瘍には、最適な増殖と進行を維持するためにＭＩＦを重要かつ機能的に要求するようだ。さらに、ＭＩＦは炎症性疾患の進行にも重要かもしれない。ＭＩＦはそれゆえ、癌の治療のための治療薬の開発の望ましい標的でありうる。従って、現在、特異的にＭＩＦを標的として、癌及び炎症性疾患の治療のためのＭＩＦの１又はそれ以上の生物学的活性を調節する治療的分子という未だ満たされていない要望がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本概要は、本願で開示された法定主題のいくつかの態様、そのうちの多くは当該態様が変化したもの及び置換されたものを列挙する。本概要は、単に多くの変化した態様を例示するにすぎない。さもなければ、特定の態様の１又はそれ以上の代表的な特性への言及は例示である。当該態様は、典型的には、特性がある場合とない場合がありさらに、当該特性は、本概要に列挙されているといないとに関らず、本願で開示された法定主題の他の態様に適用されうる。過度の繰り返しを避けるために、本概要は当該特性の有力な組み合わせを全て列挙したり示唆したりするものではない。
【０００６】
本願で開示された法定主題は、ＭＩＦを化合物と接触させることによりマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドの生物学的活性を阻害することに用いる前記化合物を提供する。ある態様では、当該化合物は、式（Ｉ）
【０００７】
【化１】
2009541214.tif 000003
【０００８】
（ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、アミノ又はカルボキシルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル又はアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール又はアミノであり；及び
ｎは０〜５の整数である）
の構造を有する。
【０００９】
ある態様では、Ｒ１はヨウ素である。特定の態様では、当該化合物は、４−ヨード−６−フェニルピリミジン又はその類似体若しくは誘導体である。
ある態様では、当該化合物は、少なくともＭＩＦポリペプチドのＮ末端残基の第２番目のメチオニンＭｅｔ−２と安定した相互作用を形成する。さらに、ある態様では、当該化合物は、少なくともＭＩＦポリペプチドのＮ末端残基の第１番目のプロリン（Ｐｒｏ−１）と安定した相互作用（例えば、共有結合）を形成する。ＭＩＦ（例えば、配列番号１）はモノマーＡ、Ｂ及びＣのホモトリマーを含み、モノマーＡは、当該化合物と安定して相互作用するＭｅｔ−２（Ｍｅｔ−Ａ２）を含んでもよい。ある態様では、当該化合物はさらに、ＭＩＦポリペプチドのＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、ｌｌｅ−６４、Ｌｙｓ−６６、Ｔｙｒ−９５、Ｍｅｔ−１０１、Ｖａｌ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の１又はそれ以上と安定した相互作用を形成する。
【００１０】
本明細書で開示するように、ＭＩＦの生物学的活性の阻害により、ＨＩＦ１α安定性における影響による低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）の生物学的活性の間接的阻害がもたらされる。すなわち、本願で開示された法定主題のある態様では、ＨＩＦ１αポリペプチド生物学的活性を阻害する方法が提供される。当該方法は、ある態様では、ＭＩＦポリペプチドを式（Ｉ）の構造を有する本明細書で開示された化合物と接触することを含み、それにより、１又はそれ以上のＨＩＦ１αの生物学的活性が阻害される。ある態様では、ＨＩＦ１αポリペプチドの活性を阻害すると、ＨＩＦ１αポリペプチドの転写活性が阻害される。さらに、当該方法のある態様では、ＨＩＦ１αポリペプチドの活性を阻害すると、例えば、低酸素癌細胞等のＨＩＦ１αを発現する細胞中の血管新生、放射線耐性又はそれらを共に阻害する。ある態様では、ＭＩＦポリペプチドは、本明細書で開示された、放射線、化学療法剤又はその両方での細胞の治療と併用される化合物と接触させる。
【００１１】
本願で開示された法定主題のある態様では、細胞の発癌活性を阻害又は予防する方法が提供される。ある態様では、当該方法は、細胞を本明細書で開示された式（Ｉ）の構造を有する化合物と接触させることを含む。ある態様では、発癌活性を阻害又は予防することは、細胞の遊走、浸潤、細胞生存、足場非依存性増殖、血管新生又はそれらの組み合わせを阻害することを含む。ある態様では、発癌活性を阻害又は予防することは、前記化合物によるＭＩＦポリペプチド阻害により、ＲｈｏＧＴＰアーゼファミリーメンバー（例えば、Ｒａｃ１及び／又はＲｈｏＡ）の活性を阻害することを含む。ある態様では、当該細胞は、肺癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、グリア芽腫及び乳腺腺癌からなる群から選択される癌細胞である。
【００１２】
本願で開示された法定主題のある態様では、対象の癌の治療又はその再発を軽減する方法が提供される。ある態様では、当該方法は、対象に有効量の本明細書で開示された式（Ｉ）の構造を有する化合物を投与することを含む。ある態様では、癌の治療は、細胞の遊走、浸潤、細胞生存、足場非依存性増殖、血管新生又はそれらの組み合わせを阻害することを含む。さらに、ある態様では、当該化合物は、対象に、放射線、化学療法剤又はその両方での癌治療と併用して投与される。ある態様では、化学療法剤は、例えばチラパザミン等の低酸素活性化合物を含む。ある態様では、当該癌は、肺癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、グリア芽腫及び乳腺腺癌からなる群から選択される癌細胞である。
【００１３】
本願で開示された法定主題のある態様では、対象の炎症性疾患を治療する方法が提供される。ある態様では、当該方法は、対象に有効量の本明細書で開示された式（Ｉ）の構造を有する化合物を投与することを含む。ある態様では、炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎、関節炎、増殖性血管障害、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、サイトカイン介在毒性、敗血症、敗血症ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ介在状態、自己免疫疾患、腫瘍増殖及び血管新生からなる群から選択される。さらに、ある態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主拒絶反応及びループス症候群からなる群から選択される。
【００１４】
本願で開示された法定主題は、さらに、ある態様では、配列番号２に結合特異性があるヌクレオチド配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチドを提供する。ある態様では、当該アンチセンスポリヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。さらに、ある態様では、当該アンチセンスヌクレオチド配列は、配列番号３を含む。さらに、ある態様では、当該アンチセンスヌクレオチド配列は、配列番号４を含む。よりさらに、ある態様では、本願で開示された法定主題は、細胞又は組織中のマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）ポリペプチドの発現を阻害する方法を提供し、当該方法は、当該細胞又は組織に、ＭＩＦ内の標的配列（例えば、配列番号２）に結合特異性がある当該アンチセンスポリヌクレオチドを接触させることを含む。
【発明の効果】
【００１５】
従って、本願で開示された法定主題の目的は、ＭＩＦアンタゴニスト及びそれを用いた方法を提供することである。本目的は、本願で開示された法定主題の全体又は部分で獲得される。
【００１６】
本願明細書に記載され、本願で開示された法定主題の全体又は部分で獲得される本願で開示された法定主題の目的、他の目的及び利点は、以下の、本願で開示された法定主題、図面及び制限されない実施例を研究した後の通常の当業者には明らかになるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｘ線結晶学的に決定されたホモトリマーとして存在するヒトＭＩＦの３次元構造を示す図である。
【図２】図２は細胞の増殖、遊走／浸潤及びＨＩＦの安定化に対するＭＩＦ依存性シグナリングを提案するスキームを示す概略図である。ＭＩＦ発現／分泌は成長因子／細胞外基質（ＥＣＭ）により誘導される。細胞外ＭＩＦはその受容体であり、ＣＤ４４と相互作用するＣＤ７４と結合する（３５）。活性なＣＤ４４はその後、ＲｈｏＡ及び／又はＲａｃ１ＧＴＰアーゼの活性化を促進する。ＲｈｏＡ経路では、Ｒｈｏキナーゼ−依存性持続ＭＡＰキナーゼの活性化によりサイクリンＤ１の転写及び網膜芽細胞腫の不活性化がおこる（３６）。ＭＩＦに刺激されたＲａｃ１活性化により、指向された遊走及び浸潤をおこす葉状仮足の形成及びＭＭＰ産生がおこりうる（２２）。最終的には、ＭＩＦの内部化及びその後におこるＣＳＮ５への結合により、低酸素−誘導性ＨＩＦ１αの安定化が促進される。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、低酸素によりＭＩＦの転写及び分泌が促進され、かつ、膵臓腺癌の対象の血漿のＭＩＦレベルが上昇することを表すデータを示す。図３Ａは、ＭＩＡ−Ｐａｃａ−２細胞をＮＳ又はＭＩＦｓｉＲＮＡで形質転換し、４８時間インキュベートした後、細胞を正常酸素又は低酸素状態に放置し、かつ、２４時間後に上清を収集したことを示すイムノブロットの写真である。図３Ｂは、形質転換したＭＩＡ−Ｐａｃａ−２細胞を低酸素又は正常酸素で１６時間インキュベートした後、細胞性ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲを用いてＭＩＦの転写レベルを測定した結果を示す棒グラフである。図３Ｃは、１％低酸素及びＭＩＦで負荷をかけたＨＩＦ１α＋／＋及びＨＩＦ−Ｉα−／−のマウス胎児繊維芽細胞中のｍＲＮＡ発現を示すノザンブロットの写真である。図３Ｄは、化学療法を行う前に収集した健常な供与体及び膵臓腺癌患者由来のＥＬＩＳＡによる血漿のＭＩＦレベルを評価したことを示すグラフである。＊、スチューデントｔ検定（両側）によるＰ＜０．０５。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、ＭＩＦが欠如すると低酸素−誘導性ＨＩＦ−１αの不安定化がおこることを表すデータを示す。ＭＩＦ−欠失細胞からの核及び細胞質抽出物を正常酸素、無酸素（図４Ａ）又は低酸素（図４Ｂ）に曝し、ＨＩＦ１αでイムノブロットした。図４Ｃは、異なる時間で低酸素にさらしたコントロール及びＭＩＦ−欠失細胞からのＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲの分析を示すグラフである。
【図５】図５Ａ−５Ｃは、ＭＩＦはＣＳＮ５と相互作用して、ＣＳＮ５／ＨＩＦ１α相互作用を促進することを表すデータを示す。図５Ａ：ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞をＣｏＣｌ２で４時間インキュベートし、抽出物をＭＩＦ、ＣＳＮ５及びβ−アクチンについてウェスタンブロッティングで分析するか、又は、ＣＳＮ５抗体で免疫沈降して、免疫沈降物をＭＩＦのイムノブロットでＭＩＦ相互作用を評価した。図５Ｂ：ｓｉＲＮＡを形質転換したＭＩＡ−ＰａＣａ−２を１５０μＭのＣｏＣｌ２の有無により４時間インキュベートした。全細胞抽出物及び核抽出物を同時に得た。全細胞抽出物を抗−ＣＳＮ５を用いて免疫沈降した。核抽出物及び共免疫沈降物をイムノブロットによりＨＩＦ１αについて分析した。図５Ｃ：ｓｉＲＮＡを形質転換したＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞を１０μＭのＭＧ−１３２の有無で６時間インキュベートした。全細胞抽出物及び核抽出物を共に得た。全細胞抽出物を抗−ＣＳＮ５で免疫沈降した。核抽出物及び共免疫沈降物をイムノブロットでＨＩＦ１αを分析し、全細胞溶解物の小分画を全ＣＳＮ５について評価した。
【図６】図６は本願で開示された法定主題のＭＩＦ阻害化合物の例示である４−ヨード−６−フェニルピリミジンの図である。
【図７】図７はＭＩＦ阻害剤の例示である４−ヨード−６−フェニルピリミジン及びＭＩＦ間の分子相互作用を示すコンピュータモデルである。ヨード基はＭｅｔＡ２で疎水性結合ポケットの塩基に位置することに留意すること。
【図８】図８は、ＭＩＦ阻害剤４−ヨード−６−フェニルピリミジンが３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボンより有力なＭＩＦ酵素阻害剤であることを示すグラフである。５００ｎＭ組換えＭＩＦ（ｒＭＩＦ）を（密閉）５分間又は（開放）１０分間、指示された阻害剤濃度で前混合し、終濃度２ｍＭのＬ−ドーパクロムメチルエステル基質を加える。５分後、無色基質とする互変異性化でＯＤ４７５を分光光度的に測定した。
【図９】図９Ａ−９Ｃは、ＭＩＦトートメラーゼ阻害剤がＭＩＦ−特異的様相でＨＩＦ−１安定化を阻害することを示すイムノブロットの写真である。細胞をＣｏＣｌ２で負荷をかける前に１時間、ＤＭＳＯ又は指示濃度のＭＩＦアンタゴニストである４−ヨード−６−フェニルピリミジン（＃１６）若しくはオリタ（Ｏｒｉｔａ）化合物である３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボン（Ｔｌ）の有無で前処理した。５時間後、核溶解物を単離し、ＨＩＦ−１についてイムノブロットを行った。図９Ａ及び９Ｂでは、ＭＩＡ−ＰａＣａ膵臓腺癌細胞を用いた。図９Ｃでは、ＭＩＦ＋／＋及びＭＩＦ−／−マウス胎児繊維芽細胞を評価した。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＭＩＦ阻害剤４−ヨード−６−フェニルピリミジンがＩＳＯ−１よりも有力であることを示すグラフである。図１０Ａで、５００ｎＭのｒＭＩＦを所定の阻害剤濃度で３０秒間前混合した後、終濃度２ｍＭのＬ−ドーパクロムメチルエステル基質を加えた。５分後、分光光度的にＯＤ４７５を測定し（互変異性化により無色基質となる）、得られたデータをグラフにした。図１０Ｂでは、２×１０５個の所定の阻害剤又はＤＭＳＯで形質転換又はプレインキュベートしたＡ５４９細胞を、トランスウェルチェンバーをコーティングした上部チェンバーに加えた。１６時間後、上部チェンバー内の細胞を拭き取って捨て、膜の底をクリスタルバイオレットで染色して、可溶化し、ＯＤ５７０を読み、得られたデータをグラフにした。
【図１１】図１１は、ＭＩＦ阻害剤が足場−非依存性増殖を妨げることを示すグラフである。１０５個のＡ５４９ヒト肺腺癌細胞を、ベヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）又は１０、５０若しくは１００μＭのＩＳＯ−１又は４−ヨード−６−フェニルピリミジン（ＣＭＰＤ１６）を含有する軟寒天に捲種した。２０日後、結腸を染色して個数を計測した。データは２つの非依存性実験を代表したものである。
【図１２】図１２は、ＭＩＦ阻害剤４−ヨード−６−フェニルピリミジンによるＮＳＣＬＣ腫瘍増殖の阻害示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに１×１０６個のＡ５４９ヒト肺腺癌細胞を皮下に注射した（４マウス／群）。ベヒクル又は４−ヨード−６−フェニルピリミジン（Ｃｍｐｄ１６；２ｍｇ）を試験中腹腔内に毎日注射した。示したように４日毎に腫瘍増殖を触診でモニターした。結果は腫瘍がないマウス／群の比率で表した。
【図１３】図１３は、ＭＩＦ阻害剤である４−ヨード−６−フェニルピリミジンがインビボでＭＩＦを阻害することを示すグラフである。Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、肝臓を除去する６時間前にトウモロコシ油又はトウモロコシ油に懸濁した１ｍｇの４−ヨード−６−フェニルピリミジン（＃１６）で注射した。組織をホモジナイズした後、１００ｍｇの総肝臓タンパク質をＬ−ドーパクロムメチルエステルトートメラーゼ活性について評価した。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｃは、ＭＩＦ／ＭＩＦ受容体捕捉アッセイの概略図（図１４Ｃ）及び突然変異タンパク質及び候補阻害剤の構造−機能研究手段をもたらすアッセイから収集したデータのグラフである（図１４Ａ及び１４Ｂ）。図１４Ｃ（パネル上）は、ＭＩＦ／ＭＩＦ受容体小分子結合阻害剤及びＭＩＦ部位特異的変異体／受容体結合を評価するのに用いられる捕捉アッセイの概略図を示す。図１４Ａは、ＣＤ７４コーティングプレートを指示濃度の天然ＭＩＦ（ＭＩＦ）、変性ＭＩＦ又はＰ１Ｇ ＭＩＦでプレインキュベートして、０．２μＭビオチン−ｈｒＭＩＦを加えたアッセイのデータのグラフである。図１４Ｂは、１．０μＭの変性ＭＩＦ（ｄＭＩＦ）、天然ＭＩＦ（ＭＩＦ）又は抗−ＣＤ７４を０．２μＭビオチン−ｈｒＭＩＦを加える前に可溶性ＣＤ７４で３０分プレインキュベートしたアッセイのデータのグラフである。阻害剤としては、０．１μＭ ＩＳＯ−１又は４−ヨード−６−フェニルピリミジン（Ｃｍｐ１６）を、ＣＤ７４コーティングプレートの混合物を加える前に、０．２μＭビオチン−ｈｒＭＩＦで３０分プレインキュベートした。図１４Ａ及び１４Ｂは共に、プレートをストレプトアビジン−ＡＰによりインキュベートして２時間後に展開しＰｎＰＰ後、ＯＤ４０５を測定したものである。
【図１５】図１５は、ＭＩＦ阻害剤である４−ヨード−６−フェニルピリミジン及びＭＩＦの間の相互作用を示す概略図である。
【図１６】図１６は、４−ヨード−６−フェニルピリミジン由来のＭＩＦ阻害剤候補化合物の概略図である。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＨＩＦ発現が不完全であることを示す、安定性発現するＭＩＦｓｉＲＮＡ細胞系を示すブロットの写真である。スクランブルｓｉＲＮＡ（ＮＳ）又はｐＳｕｐｅｒ（ｐｕｒｏ）プラスミドを含有するＭＩＦ−特異的オリゴをＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞に安定に形質転換し、ピューロマイシンで選択した。４の代表的なＭＩＦｓｉＲＮＡクローンを、ＮＳオリゴを発現する安定細胞株と比較し、ＭＩＦでイムノブロッティング（図１７Ａ）した。ＮＳ、クローン７及びクローン２を１５０μＭのＣｏＣｌ２の有無で６時間処理して、ウェスタンブロットでＨＩＦ−１ａを評価した（図１７Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願で開示された法定主題の１又はそれ以上の態様の詳細は、以下の添付の記載に示される。法定主題の目的、他の目的及び利点は、明細書、図面及びクレームから明らかであろう。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許及び他の文献はその全体を援用して本明細書に組み込まれる。本明細書で開示されたポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のあるものはＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）のアクセッション番号と相互参照される。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースで相互参照された配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）又は他の公共のデータベースに存在する配列と同等でありかつ関連するように、参照して明示的に組み込まれる。また、本明細書で開示された配列と関連するＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースに存在する注釈は全て参照して本明細書に明示的に組み込まれる。一致しない場合は、定義を含む本願明細書による。
【００１９】
癌の多くは、悪性度が高く、浸潤性悪性腫瘍を産生する。膵臓癌は、予後の平均が３−５％で、全生存率が５年である悪性及び浸潤性の癌の１の型の例示である。（Ｇａｒｃｅａら、２００５）。偶然ではなく、この悪性の癌は、報告されているように、非常に低酸素状態である（Ｋｏｏｎｇら、２０００ｂ；Ｂｕｃｈｌｅｒら、２００４）。低酸素は癌細胞中でマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ；図１参照）の発現を誘導し、ＭＩＦの血漿レベルは癌患者で上昇する。ＭＩＦ発現はまた、正常細胞及び形質転換細胞中で成長因子、細胞外基質及び発癌性刺激により正に調節される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９９９；Ｌｉａｏら、２００３；Ｐｅｔｒｅｎｋｏら、２００３）。
【００２０】
ＭＩＦはヒトの非常に多様な新生組織形成中で過発現される。膵臓、乳房、前立腺、結腸、脳、皮膚及び肺に由来する腫瘍は、全て対応する非癌性細胞よりもＭＩＦの伝達及びタンパク質のレベルが極めて高いことが示されてきた（Ｗｉｎｎｅｒら、２００７；Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、１９９８；Ｂａｎｄｏら、２００２；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９８；Ｍａｒｋｅｒｔら、２００１；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９９；Ｋａｍｉｍｕｒａら、２０００）。当該研究のいくつかはまた、ＭＩＦは疾患の重篤度に重要に寄与しうると示唆され、ＭＩＦ発現は、腫瘍の悪性度及び転移の可能性と密接に相関することを報告する（ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏら、２０００；Ｋａｍｉｍｕｒａら、２０００；Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００２）。
【００２１】
すなわち、ＭＩＦを標的とする分子、特に、ＭＩＦ触媒活性部位で、このＭＩＦ−介在性腫瘍の表現型を阻害する試みが望まれうる。例えば、最近の報告では、抗−ＭＩＦ小分子が、前立腺癌細胞の遊走及び同種のＭＩＦの細胞表面受容体を発現する細胞中のみで異種移植腫瘍の増殖及び血管分布を阻害することを見出した（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）。
【００２２】
本願で開示された法定主題は、新たに同定された抵抗-ＭＩＦアンタゴニストであり、ＭＩＦ生物学的活性を調節し、かつ、以前に試験した化合物よりもその可能性が５〜１０倍高い、触媒活性及び生物学的阻害活性を共に呈する化合物を提供する。それゆえ、本願で開示された法定主題は、化合物、及び、癌及び炎症性疾患の治療ための治療方法を含む、ＭＩＦの生物学的活性を阻害するために当該化合物を用いる方法を提供する。
【００２３】
Ｉ．マクロファージ遊走阻止因子
ＭＩＦは、最も早期に報告されたサイトカインのひとつで、生物学的活性が広範囲に及ぶ免疫調節タンパク質である（検討のため以下を参照のこと：Ｓｗｏｐｅら、１９９９；Ｍｅｔｚら、１９９７；及びＢｕｃａｌａ、１９９６）。ＭＩＦは、本来的には，活性化したリンパ系細胞で分泌され、マクロファージのランダム遊走を阻害し、遅延型過敏反応に関連することが見いだされた（Ｇｅｏｒｇｅら、１９６２；Ｗｅｉｓｅｒら、１９８１；Ｂｌｏｏｍら、１９６６；Ｄａｖｉｄ、１９６６）。ＭＩＦはまた、マクロファージの接着、食作用及び殺腫瘍活性を促進することが示された（Ｎａｔｈａｎら、１９７３；Ｎａｔｈａｎら、１９７１；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌら、１９７５）。残念なことには、初期のＭＩＦの研究の多くは、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４等の他のサイトカインを含み、マクロファージ遊走阻害活性もあることが後に示された混合培養上清が用いられていた（Ｍｃｌｎｎｅｓら、１９８８；Ｔｈｕｒｍａｎら、１９８５）。組換えＭＩＦの有用性により、当該生物学的活性が確認され、他の活性が同定されてきた。
【００２４】
組換えヒトＭＩＦは、本来的にはヒトＴ細胞ライブラリからクローニングされ（Ｗｅｉｓｅｒら、１９８９）、血液由来のマクロファージが細胞内寄生物及び腫瘍細胞をインビトロで殺傷するように活性化されること、ＩＬ−１β及びＴＮＦα発現を刺激すること及び酸化窒素合成を誘導することが示された（Ｗｅｉｓｅｒら、１９９１；Ｐｏｚｚｉら、１９９２；Ｗｅｉｓｅｒら、１９９２；Ｃｕｎｈａら、１９９３）。当該初期の報告のあるものから得られた結論は、用いた組換えＭＩＦの調製物中に生物学的に活性なマイトジェン汚染があることにより混乱したが、ＭＩＦの炎症後活性の可能性がこの複雑な因子に患っていない他の研究により確率された（Ｂｕｃａｌａ、１９９６に掲載）。
【００２５】
より最近のＭＩＦの研究は、精製体における組換えＭＩＦの産生並びに様々な正常なホメオスタシス及び病態生理学的環境におけるＭＩＦの生物学的機能を解明するために、ＭＩＦ−特異的ポリクローナル及びモノクローナル抗体の開発に投資してきた（Ｒｉｃｅら、１９９８参照）。これら最近の報告の洞察では、ＭＩＦは、免疫系のサイトカイン産物であるだけでなく、特に、下垂体である、内分泌系ホルモン様産物でもあることを認識するものであった。本研究は、炎症性反応の重篤度を制限及び抑制するためのグルココルチコイドの正常な活性がＭＩＦにより阻害されるという効果があることから、ＭＩＦの、グルココルチコイドの抗−炎症性効果の対抗調節剤（内分泌的に放出されかつ治療的に投与される）としての有力な活性を強調してきた。それゆえ、内因性のＭＩＦ反応は、様々な炎症性疾患及び状態の病因又は悪化因子として見られる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７参照）。
【００２６】
現在、ＭＩＦは、周知の遅延型過敏反応の関連以外にもいくつかの他の生物学的機能があることが知られている。例えば、上記のようなＭＩＦは、マクロファージにより放出されて、Ｔ細胞はグルココルチコイドの生理学的濃度に対する反応における下垂体メディエーターとして機能する（Ｂｕｃａｌａ、１９９６）。これにより、ＴＮＦ−αＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ−８レベルの変化を介して、グルココルチコイドの免疫抑制活性の主要な効果が導かれる。ＭＩＦの他の生物学的活性としては、刺激されたＴ細胞の調節（Ｂａｃｈｅｒら、１９９６）、ＩｇＥ合成のコントロール（Ｍｉｋａｙａｍａら、１９９３）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の機能的不活性化（Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９）、グルコース及び炭水化物の代謝調節（Ｓａｋａｕｅら、１９９９）並びに腫瘍細胞増殖及び腫瘍血管新生の減衰（Ｃｈｅｓｎｅｙら、１９９９）；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９９）があげられる。
【００２７】
本願発明の発明者は、さらに、本明細書で詳細に開示するように、ＭＩＦが低酸素で誘導される低酸素−誘導因子（ＨＩＦ）の安定化に必須であることを決定した。いかなる特定の理論に拘束されることを望むことなく、細胞分裂及び発癌経路によるＭＩＦ発現は、低酸素−誘導性ＨＩＦ安定化及びその後の低酸素適応設定値をもたらしうる（図２）。一度安定化すると、ＨＩＦ及びＭＩＦからなる増幅ループを開始して、ＨＩＦはその後潜在的に新生物が発達する低酸素領域でのＭＩＦの過発現を指令しうる。
【００２８】
低酸素適応におけるＭＩＦ要求と一致して、ＭＩＦは、腫瘍−関連血管新生でもまた機能しうる。具体的には、ＭＩＦの腫瘍内発現は、血管新生成長因子発現、腫瘍血管密度密度及び切除後の再発のリスクと強く相関する（Ｒｅｎら、２００５；Ｗｉｌｓｏｎら、２００５；Ｓｈｕｎら、２００５；Ｈｉｒａら、２００５；Ｃｈｅｓｎｅｙら、１９９９；Ｗｈｉｔｅら、２００１）。これらの知見は、腺種性結腸ポリポーシス（ＡｐｃＭｍｌ／＋）と交配したＭＩＦ−欠失マウス「オンコマウス」の、腫瘍微血管密度が減少することに対応する腺腫の数及び大きさが共に有意に減少したことを示すことを表す研究と一致する（Ｗｉｌｓｏｎら、２００５）。
【００２９】
ＭＩＦはＤ−ドーパクロムトートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）と重要な配列相同性（同一性３６％）を共有する。これにより、ＭＩＦには酵素活性があり、非生理学的基質Ｄ−ドーパクロム（Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎら、１９９６）及びＬ−ドーパクロムメチルエステル（Ｂｅｎｄｒａｔら、１９９７）の互変異性化を触媒するという発見に至った。他に、フェニルピルビン酸及びｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎら、１９９７）並びに３，４−ジヒドロキシフェニルアミンクロム及びノルピンフィリンクロム（Ｍａｔｓｕｎａｇａら１９９９）はＭＩＦ基質であるが、いかなる当該試薬の互変異性化もＭＩＦの天然機能を含むかどうかは不明である。
【００３０】
ヒトＭＩＦの３次元結晶構造により、当該タンパク質がホモトリマーとして存在し（図１参照；Ｌｏｌｉｓら、１９９６）、４−オキサロクロトナートトートメラーゼ、５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコナート、クロリスマートムターゼ及びＤ−ドーパクロムトートメラーゼと構造的に関連することを示す（Ｓｗｏｐｅら、１９９８；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９９）。結晶構造によりヒトＭＩＦ及びｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸との間で形成された複合体が報告されてきた（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、１９９９）。基質がアミノ末端で疎水性空洞と結合し、サブユニット中の少なくともＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２及びＩｌｅ−６４並びに近接するサブユニット中のＴｙｒ−９５及びＡｓｎ−９７と相互作用することを見出した。マウスＭＩＦ及び（Ｅ）−２−フルオロ−ｐ−ヒドロキシケイ皮酸間の類似の相互作用が報告された（Ｔａｙｌｏｒら、１９９９）。このプロリンをセリンに置換する（Ｐ１Ｓ）部位−指向性突然変異はＤ−ドーパクロムトートメラーゼ活性を欠くため、ＭＩＦのＮ末端のプロリン（Ｐｒｏ−１）が酵素活性に重要な残基であるらしい（Ｂｅｎｄｒａｔら、１９９７）。類似することに、プロリンがグリシンに置換された（Ｐ１Ｇ）ＭＩＦ変異体もまた、Ｄ−ドーパクロム及びＨＰＰトートメラーゼ活性が触媒的に欠如している（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、１９９９；Ｓｗｏｐｅら、１９９８）。
【００３１】
当該活性は３０年以上前に最初に報告されたにかかわらず、ＭＩＦの古典的な膜結合受容体は最近になって報告されている（Ｌｅｎｇら、２００３）。発現クローニング及び機能的解析によりＣＤ７４が細胞外ＭＩＦと高親和性で結合するタンパク質であることが示された（Ｌｅｎｇら、２００３）。ＭＩＦはＩＩ型膜貫通タンパク質ＣＤ７４の当該細胞外ドメインと結合し、ＥＲＫＭＡＰキナーゼへのＭＩＦ−依存性シグナリング、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生及び細胞複製を開始することが示された。ＣＤ７４の細胞質部分は小さく、古典的シグナリングも足場ドメインも含まないため、ＣＤ７４／ＭＩＦ複合体は他の細胞表面を介した分子活性化シグナルを伝えると考えられる。当該分子の一つは、コンドロイチン硫酸ＣＤ７４の異型結合により活性化した、腫瘍関連抗原ＣＤ４４である（Ｎａｕｊｏｋａｓら、１９９３）。Ｓｈｉｈらの最近の報告では現在、ＣＤ４４はＭＩＦ−ＣＤ７４シグナル伝達に必須であることが報告されている（Ｓｈｉら２００６）（図２参照）。
【００３２】
最近の研究は、ＲｈｏＧＴＰアーゼファミリーメンバーの定常状態での活性化で細胞増殖及び移動表現型をおこす細胞外ＭＩＦの機能を示した（Ｓｗａｎｔら、２００５；Ｒｅｎｄｏｎら、２００６）。当該ＭＩＦ介在効果は、ＣＤ７４／ＣＤ４４主導シグナリングに関係すると考えられる（図２中で要約）。さらに、本実施例に示すように、本明細書で開示したＭＩＦ阻害化合物は、ＭＩＦのＣＤ７４への結合を阻害することができ、それにより、細胞外ＭＩＦで初期化される近接のシグナル伝達を阻害する。
【００３３】
ＭＩＦと相互作用する酵母２ハイブリッドスクリーニングによりいくつかの他のタンパク質もまた同定された（Ｊｕｎｇら、２００１；Ｗａｄｇａｏｎｋａｒら、２００５；Ｐｏｔｏｌｉｃｃｈｉｏら、２００３；Ｋｌｅｅｍａｎｎら、２０００）。当該タンパク質の１つであるＪａｂ１／ＣＳＮ５もまた、ＨＩＦ１α及びｐＶＨＬと直接物理的に相互作用することが示された（Ｂｅｍｉｓら、２００４）。以前、ＭＩＦがＣＳＮ５機能及びその後のｐ２７分解、ＪＮＫ活性化及びＡＰ−１介在性転写におけるＣＳＮ５−依存性効果を調節することが示された（Ｋｌｅｅｍａｎｎら、２０００）。興味深いことに、この報告では、細胞外ＭＩＦが細胞内ＣＳＮ５の活性を調節することが見出された。著者らは、細胞外ＭＩＦの細胞内ＣＳＮ５への結合を報告し、受容体介在性エンドサイトーシス内部化の後に、ＭＩＦがＣＳＮ５依存性機能と結合して阻害することを示唆した（Ｋｌｅｅｍａｎｎら２０００）。
【００３４】
本発明者と共同研究者の研究（Ｗｉｎｎｅｒら、２００７）及び他者の研究（Ｌｅｎｇら、２００３）は、細胞外ＭＩＦが細胞内Ｊａｂ１／ＣＳＮ５機能を機能的に制御しうるという示唆を強く支持する。さらに、本実施例及び他の研究で示されたデータは、外因性ＭＩＦがＭＩＦｓｉＲＮＡにより誘導されたＨＩＦの不安定化を救済することができるが、小分子阻害剤は細胞外ＭＩＦの効果を阻害しうることを示す（Ｗｉｎｎｅｒら、２００７）。理論に拘束されることなく、ＭＩＦ活性部位阻害剤及び中和ＭＩＦモノクローナル抗体は共に、ＭＩＦ−依存性ＨＩＦ安定化を阻害するため、ＭＩＦ／ＭＩＦ受容体結合も阻害するものの、本内部化工程は本明細書中に開示されたＭＩＦ阻害化合物の少なくともいくつかの阻害活性と関連する可能性がある。
【００３５】
ＩＩ．定義
以下の用語は当業者には十分理解されると信じるが、以下の定義は本願で開示された法定主題の説明を容易にするためのものである。
【００３６】
他に定義されなければ、本明細書中で用いられた全ての技術的及び科学的用語は、本願で開示された法定主題が属する当業者の一人が通常理解するのと同じ意味である。本明細書に記載されたものと同様又は同等のいかなる方法、装置及び材料も本願で開示された法定主題の実施又は試験に用いられうるが、代表的な方法、装置及び材料をここに記載した。
【００３７】
以下の長年の特許法の慣習で、用語「１の（ａ）（ａｎ）及び（ｔｈｅ）」は、請求の範囲を含む本明細書中で用いられる場合は「１又はそれ以上の」をいう。
すなわち、例えば、「１の細胞」としては、複数の当該細胞その他があげられる。他に指示されないかぎり、本明細書及び請求の範囲で用いられる原料、反応状態その他の量を表現する全ての数は、用語「約」はにより全ての場合に改変されるように理解されるべきである。すなわち、反対に指示されないかぎり、本明細書及び添付の請求の範囲で示される数値パラメータは、本願で開示された法定主題で得られるように求められた所望の特性に依存するように多様でありうる概算値である。
【００３８】
本明細書で用いられるように、用語「約」を値又は質量、重量、時間、容量、濃度又は百分率の量でいう場合は、開示の方法に適するように、特定量から、ある態様では±２０％、ある態様では±１０％、ある態様では±５％、ある態様では±１％、ある態様では、±０．５％及びある態様では±０．１％の変動を含むことを意味する。
【００３９】
ポリペプチド（例えば、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）又は低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−Ｉａ））等の具体的な生物学的に活性な分子に関して本明細書で用いられる用語「生物学的活性」とは、他の分子又は基質の分子によるいかなる生物学的又は酵素活性をも含む。例えば、ＭＩＦに関して、「生物学的活性」としては、Ｔｈ１リンパ球反応阻害（Abe et al., 2001 J Immunol 166:747-53）、転写制御（例えば、サイクリンＤ１発現の転写制御（Liao et al., 2003 J Biol Chem 278:76-81; Swant et al., 2005 J Biol Chem 280:23066-72)）、細胞遊走促進、細胞浸潤促進、足場−非依存性増殖促進、血管新生促進（Chesneyet al., 1999 Mol Med 5:181-91; Shimizu et al., 1999 Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 751-8; Ogawa et al., 2000 cytokine 12:309-14; White et al., 2001 J. Immunol. 166: 7549-55; White et al., 2003 Clin. cancer Res. 9:853-60）、ＨＩＦ１α発現、アラキドン酸代謝、Ｅ２Ｆ転写因子制御の促進（Petrenko & Moll 2005 Mol. Cell 17:225-36）、Ｒｂ不活性化（Liao et al., 2003 J Biol Chem 278:76-81; Swant et al., 2005 J Biol Chem 280:23066-72）及びｐ５３阻害（Hudson et al., 1999 J. Exp. Med. 190: 1375- 82; Mitchell et al., 2002 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 99:345-50）があげられるが、これらに限定されない。ＭＩＦに関して「生物学的活性」はまた、例えばトートメラーゼ活性等の酵素活性があげられる。用語「癌」及び「癌細胞」は、本明細書では相互変換的に用いられ、かつ、一般的に、細胞の制御不能で異常な増殖により特定される疾患群をいう。あるタイプの癌では、癌細胞は、局所的又は血流及びリンパ系を介して他の体内の部分に広がりうる（「転移性癌」）。ある難治性タイプの癌は、極めて低酸素で、かつ、例えば放射線療法等の具体的な療法に耐性であることが観察された。本明細書で開示するように、ＭＩＦは、癌細胞の生存、増殖及び転移をもたらす、遊走、浸潤、細胞生存、足場−非依存性増殖、低酸素適応及び血管新生を含むいくつかの発癌活性の促進するように直接又は間接的に機能する。それゆえ、本願で開示された法定主題は感受性癌の治療のためのＭＩＦ−阻害化合物を提供する。例えば、本明細書で開示された治療的化合物は、頭頸部癌及び膵臓癌がＨＩＦ−１α活性のために極めて低酸素であるため、当該癌の治療に用いられうる。ＭＩＦはＨＩＦ−Ｉαの発現及び活性に機能し、それゆえ、当該治療的化合物のＭＩＦ−阻害活性は当該癌の発癌活性を阻害しうる。腎細胞癌及び前立腺癌もまた、腫瘍形成のためのＨＩＦ１α活性に依存し、すなわち、ＭＩＦ−阻害化合物は、ＭＩＦ阻害を介して当該活性を阻害しうる。さらに、肺癌（例えば、肺腺癌）及びグリア芽腫は、共に著しく転移性であり、転移動態にＭＩＦ活性を要する（例えば、細胞浸潤及び遊走）。すなわち、ＭＩＦ−阻害化合物は、当該癌における発癌及び転移活性を阻害する。さらに、哺乳動物の癌腫は発癌活性にサイクリンＤ１発現を要し、ＭＩＦはサイクリンＤ１の十分な発現に必須である（Ａｐｐｅｎｄｉｘ参照）。すなわち、ＭＩＦ−阻害化合物は、当該癌において同様に発癌及び転移活性を阻害しうる。
【００４０】
本明細書で用いられるように、用語「有効量」は、治療される状態又は疾患の治療に提供する程度に十分な用量を意味する。これは、対象、疾患及び効果のある治療に依存して変動しうる。「低酸素−誘導性因子１」又は「ＨＩＦ−１」は転写因子であり、かつ、癌細胞を含む、低酸素状態での細胞の生存に重要である。ＨＩＦ−１は、共に基本的なへリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）−ＰＡＳ（ＰＥＲ、ＡＲＮＴ、ＳＩＭ）タンパク質ファミリーに属する、Ｏ２及び成長因子−制御サブユニットＨＩＦ−１α及び構造的に発現したＨＩＦ−１βサブユニット（アリール炭化水素受容体核転位因子、ＡＲＮＴ）で構成される。最近、ヒトゲノムでは、転写因子ＨＩＦのサブユニットの、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２（ＥＰＡＳ−１、ＭＯＰ２、ＨＬＦ及びＨＲＦともいう）及びＨＩＦ−３の３つのアイソタイプが同定された。正常酸素状態では、ＨＩＦ１αはユビキチン化されて、プロテアソームで迅速に分解される。しかしながら、低酸素状態では、ＭＩＦ及び／又はＭＩＦ−制御ＣＳＮ５の相互作用のある部分ではＨＩＦ１αは安定化されており、ＨＩＦ−１βでヘテロ二量体化する核に転位する。結果として活性化したＨＩＦ−１は、低酸素下での細胞適応及び生存に重要なＭＩＦを含む６０以上の遺伝子の転写を制御する。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「炎症性疾患」は、炎症により特徴付けられる障害を含む免疫系に関する障害をいう。例示的な炎症性疾患としては、アトピー性皮膚炎、関節炎、増殖性血管障害、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、サイトカイン介在毒性、敗血症、敗血症ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ介在状態、自己免疫疾患、腫瘍増殖又は血管新生があげられるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「炎症性疾患」は自己免疫疾患を含む。例示的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、インシュリン−依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主拒絶反応及びループス症候群があげられるが、これらに限定されない。用語「阻害剤」及び「アンタゴニスト」は、例えばＭＩＦポリペプチド等のポリペプチドの生物学的活性を阻害する、すなわち、不活性化するか又は軽減する化学物質をいう。
【００４２】
用語「作動的に結合した」及び「作動可能に結合した」は、物理的又は機能的に関連する２の核酸配列をいう。例えば、プロモーター又は調節ＤＮＡ配列は、２の配列が作動可能に結合した場合又は調節ＤＮＡ配列が、コーディング又は構造的ＤＮＡ配列の発現レベルに影響するような状態である場合、ＲＮＡ又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列「と関連する」といわれている。用語「ポリヌクレオチド」は、２又はそれ以上の核酸のポリマーをいう。用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらの１本鎖又は２本鎖タイプのポリマーをいう。具体的に限定されなければ、当該用語は、言及された核酸と同様の結合特性があり、かつ、天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。他に指示されないかぎり、具体的な核酸配列はまた、明確に示された配列同様保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列も暗示的に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１又はそれ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成されうる(Batzer et al.,(1991 ) Nucleic acid Res 19:5081 ; Ohtsukaら、(1985) J Biol Chem 260:2605-2608;Rossolini et al., (1994) Mol Cell Probes 8:91-98)。用語「核酸」又は「核酸配列」は、遺伝子によってコードされる、遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡで互換的に用いられうる。
【００４３】
用語「ポリペプチド」「タンパク質」及び「ペプチド」は、その大きさや機能に関係なく２０のタンパク質アミノ酸又はアミノ酸類似体のポリマーをいい、本明細書では互換的に用いられる。「タンパク質」は比較的大きいポリペプチドに用いられることが多いが、「ペプチド」は低分子のポリペプチドに用いられることが多く、当業界で当該用語の使用は重複し多様である。本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、他に注釈がなければ、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をいう。用語「タンパク質」「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、遺伝子産物についていう場合は本明細書では互換的に用いられる。すなわち、例示的なポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然タンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及びそれらの他の同等物、変異体及び類似体があげられる。
【００４４】
本明細書で用いられるように、ＭＩＦの１又はそれ以上のアミノ酸残基及び本明細書で開示された化合物の相互作用に関する用語「安定な相互作用」とは、共有結合及びヴァンデルワールス相互作用等の非共有結合、静電力、水素結合又はそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない部分間の化学的相互作用をいう。具体的には、阻害化合物（例えば、４−ヨード−６−フェニルピリミジン及びそのいかなる類似体及び誘導体を含む式（Ｉ）の化合物）とＭＩＦのＭｅｔ−２等のＭＩＦのアミノ酸との相互作用が本明細書で開示される。「Ｍｅｔ−２」はＭＩＦポリペプチドのＮ−末端から数えてＭＩＦポリペプチドの第２番目のアミノ酸残基をいい、本発明ではメチオニンである（例えば、ヒトＭＩＦ（本明細書にその全体が参照して組み込まれる配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿００２４０６））。同様に、本明細書で開示されたＭＩＦのある阻害化合物は、各々ヒトＭＩＦのＭＩＦポリペプチドのＮ−末端から数えて、第１番目のアミノ酸（プロリン）、第３２番目のアミノ酸（リジン）、第３３番目のアミノ酸（プロリン）及び第３６番目のアミノ酸（チロシン）をいう、「Ｐｒｏ−１」（例えば、共有相互作用）、「Ｌｙｓ−３２」、「Ｐｒｏ−３３」及び「Ｔｙｒ−３６」等であってこれらに限定されない、１又はそれ以上の他のＭＩＦ残基と安定して相互作用しうる。
【００４５】
ＩＩＩ．ＭＩＦ阻害化合物
ヒトＭＩＦ／ＨＰＰ及びＭＩＦ／阻害剤の共結晶構造により、機能的ＭＩＦのホモトリマーの近接する２つのサブユニット間に位置する基質−結合性疎水性空洞が同定された（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、１９９９；Ｔａｙｌｏｒら、１９９９）。この基質結合部位に基づくＭＩＦ生物学的活性の小さい化合物阻害剤を合理的に設計する初期の試みはいくつか成功したが、当該化合物は所望の臨床効果が得られる程度までにはＭＩＦの生物学的活性を阻害しない（Ｓｅｎｔｅｒら、２００２；Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２；Ｄｉｏｓら、２００２）。いかなる具体的な理論に拘束されることなく、本発明者は、構造に基づく阻害剤によるこの基質結合部位の崩壊が細胞表面受容体へのＭＩＦ結合を効果的に中和することができ、それにより、受容体開始シグナル伝達を阻害することを理論だてた（図２）。他の研究では、疎水性ポケットの側で見いだされたＰｒｏＡ１残基が標的とされた。しかしながら、本明細書で開示された結果は、この基質−結合性疎水性空洞の底部に存在するＭｅｔＡ２残基を標的とすると、優れたＭＩＦ触媒及び生物学的阻害剤が産生されることを示唆する。
【００４６】
すなわち、報告されたＭＩＦの生物学的アンタゴニストのうち、ｆａｒ（Ｓｅｎｔｅｒら、２００２；Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２；Ｄｉｏｓら、２００２），ＩＳＯ−１（Ｓ，Ｒ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソザゾール酢酸メチルエステル）は、最も有力であるようである（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２；Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、２００５；ＡｌＡｂｅｄら、２００５；Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）。本化合物は高濃度でＭＩＦ−依存性悪性表現型を阻害しうることが研究で明らかである（実施例及びＲｅｎｄｏｎら、２００６；Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６参照）。ＩＳＯ−１が前立腺癌細胞浸潤、腫瘍用量及び血管新生の阻害をするには、同種のもののＭＩＦ受容体ＣＤ７４が存在しなければならない。
【００４７】
本願で開示された法定主題は、以下に詳細に開示する、ＭＩＦ−依存性酵素活性、受容体結合、ＨＩＦ１α安定化、細胞遊走及び足場依存性の阻害に関して、ＩＳＯ−１及び関連化合物よりも実質的により有力である、構造的な固有のＭＩＦ阻害化合物をもたらす（実施例参照）。本明細書で開示された化合物の１の固有の側面は、ピリミジン環が活性部位の基底部ＭｅｔＡ２に位置するヨード基に活性部位があることに関連する（実施例参照）。ここで本明細書で開示された化合物は、低酸素−誘導性ＨＩＦ１α蓄積及びその結果生じた表現型を阻害することに、ＭＩＦのｓｉＲＮＡ−介在性ノックダウンと同様に有効であり、かつ、他のＭＩＦアンタゴニスト化合物よりも３〜５倍有効である。
【００４８】
すなわち、本願で開示された法定主題はＭＩＦと安定な相互作用を形成する化合物をもたらし、かつ、ＭＩＦの生物学的活性を阻害しうる。ある態様では、当該化合物は少なくともＭＩＦポリペプチドのＮ末端残基の第２番目のメチオニン（Ｍｅｔ−２）と安定な相互作用を形成しうる。具体的な態様では、当該化合物は、ＭＩＦモノトリマーのモノマーＡのＭｅｔ−２と安定な相互作用を形成する。ある態様では、当該化合物はさらに、ＭＩＦポリペプチドのＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、ｌｌｅ−６４、Ｌｙｓ−６６、Ｔｙｒ−９５、Ｍｅｔ−１０１、Ｖａｌ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の１又はそれ以上と安定な相互作用を形成しうる。具体的な態様では、当該化合物はＭＩＦのＰｒｏ−１と共有結合を形成する。
【００４９】
ある態様では、ＭＩＦ阻害化合物は式（Ｉ）の構造：
【００５０】
【化２】
2009541214.tif 000004
【００５１】
（ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、アミノ又はカルボキシルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル又はアリールであり；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アリール又はアミノであり；及び
ｎは０〜５の整数である）
を有する。
【００５２】
命名された「Ｒ」（例えば、Ｒ、Ｒ１及びＲ２）基は、本明細書で特定されない限り、一般的にその名前がある基と対応するような当業界で認識される構造があるはずである。例示のため、本明細書で示すある代表的な「Ｒ」基を以下に定義する。当該定義は補填及び例示を目的とし、除外を目的とするものではなく、その定義は、当業者であれば本明細書の開示から明らかであろう。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「アルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、メチルプロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル及びアレニル基を含む、Ｃ１−２０の包括的な、線状（すなわち、「直鎖」）、分岐又は環状、飽和又は少なくとも部分的及び場合によっては完全に不飽和（すなわち、アルケニル及びアルキニル）な炭化水素鎖をいう。「分岐」は、メチル、エチル又はプロピル等の低級アルキル基が線状アルキル鎖に結合するアルキル基をいう。「低級アルキル」は、炭素原子が１〜約８である、例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８炭素原子である（すなわち、Ｃ１−８アルキル）アルキル基をいう。「高級アルキル」は、炭素原子が１０〜約２０である、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０炭素原子であるアルキル基をいう。ある態様では、「アルキル」は、具体的にＣ１−８直鎖アルキルをいう。他の態様では、「アルキル」は具体的にＣ１−８分岐鎖アルキルをいう。
【００５４】
アルキル基は、場合によっては、同一又は異なる１又はそれ以上のアルキル基置換基で置換されうる（「置換アルキル」）。用語「アルキル基置換基」としては、アルキル、置換アルキル、アリール、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシル、アリールオキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシル、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、オキソ及びシクロアルキルがあげられるが、これらに限定されない。場合によっては、アルキル鎖に１又はそれ以上の酸素原子、硫黄原子又は窒素原子置換基が水素（本明細書では「アルキルアミノアルキル」ともいう）又はアリールである置換若しくは非置換の窒素原子が挿入されることができる。
【００５５】
すなわち、本明細書で用いられるように、用語「置換アルキル」としては、本明細書で定義するように、アルキル基の１又はそれ以上の原子又は官能基が、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル（ヒドロキシアルキル、例えば、ｎが１〜２０である（ＣＨ２）ｎ−ＯＨを形成する）、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート及びメルカプトを含む、他の原子又は官能基で置換されたアルキル基があげられる。
【００５６】
さらに、本明細書で用いられるように、用語「アルキル」及び／又は「置換アルキル」としては、「アリル」又は「アリル基」があげられる。用語「アリル基」又は「アリル」は、基−ＣＨ２ＨＣ＝ＣＨ２及び置換により形成されたそれらの誘導体をいう。すなわち、用語「アルキル」及び／又は「置換アルキル」としては、アリル、メチルアリル、ジ−メチルアリル等のアリル基があげられるが、これらに限定されない。用語「アリル位」又は「アリル部位」はアリル基の飽和炭素原子をいう。すなわち、アリル部位で結合するヒドロキシル基又は他の置換基等の基は、「アリル」といわれうる。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「アリール」は、単一の芳香族環又は互いに融合するか、共有結合又はメチレン若しくはエチレン部分等であってこれらに限定されない共通の基に結合した、複数の芳香族環である芳香族置換基をいう。共通の結合基はまた、ベンゾフェノンの場合はカルボニル又はジフェニルエーテルの場合は酸素原子又はジフェニルアミンの場合はニトロゲンでありうる。具体的には、用語「アリール」はヘテロ環状芳香族化合物を包含する。芳香族環は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン及びベンゾフェノンその他を含む。具体的な態様では用語「アリール」は、約５〜約１０の炭素原子、例えば、５、６、７、８、９又は１０の炭素原子を含み、かつ、５−及び６−員環炭化水素及びヘテロ環状芳香族環を含む、環状芳香族を意味する。
【００５８】
アリール基は、場合によっては、同一又は異なりうる１又はそれ以上のアリール基置換基で置換された（「置換アリール」）であることができ、ここで「アリール置換基」としては、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン及び−ＮＲ’Ｒ’’があげられ、ここで、Ｒ’及びＲ’’は各々非依存的に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール及びアラルキルでありうる。
【００５９】
すなわち、本明細書で用いられるように、用語「置換アリール」としてはアリール基があげられ、本明細書で定義するように、アリール基の１又はそれ以上の原子又は官能基は、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート及びメルカプトを含む、他の原子又は官能基で置換されうる。
【００６０】
アリール基の具体例としては、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾール等があげられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書で用いられる一般的に示される構造は、式:
【００６２】
【化３】
2009541214.tif 000005
【００６３】
等の、例えば、置換基Ｒ基を含む、３−炭素、４−炭素、５−炭素、６−炭素等、脂肪族及び／又は芳香族環状化合物であってこれらに限定されない環構造をいい、ここでＲ基は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１又はそれ以上のＲ基が、環構造の１又はそれ以上の用いられる炭素原子で各々置換されうる。Ｒ基の存在又は不存在及びＲ基の数は、整数ｎの値で決定する。ｎが０の場合、当該構造は置換されず、環の各原子は環及び水素原子上のみで近隣の原子と結合する。例えば、当該構造がフェニルでｎがゼロの場合、フェニル環の炭素原子は各々１の水素に結合し、有機化学界での作図慣習の構造に従っても、水素原子は示さない。各Ｒ基は、１以上の場合、他のＲ基よりも環構造の用いられる炭素で置換される。例えば、構造:
【００６４】
【化４】
2009541214.tif 000006
【００６５】
ここで、ｎは０から２の整数であり、以下の限定されない
【００６６】
【化５】
2009541214.tif 000007
【００６７】
等を含む化合物基を含む。
環状環構造中の結合を示す破線は、結合が環中に存在しうることも存在しないことがありうることをも示す。すなわち、環状環構造中の結合を示す破線は、環構造が、飽和環構造、部分的飽和環構造及び不飽和環構造からなる群から選択されることを示す。ある態様では、本願で開示された法定主題により記載される当該化合物は結合基を包含する。本明細書で用いられるように、用語「結合基」は、安定構造を形成するために、２又はそれ以上の他の化学的部分、特にアリール基に結合した、フラニル、フェニレン、チエニル及びピロリル基等の化学的部分を含む。
【００６８】
芳香族環又はヘテロ環状芳香族環の命名された原子が「不在（ない）」と定義された場合、命名された原子は直接結合で置き換えられる。結合基又はスペーサー基が不在であると定義された場合、結合基又はスペーサー基は直接結合で置き換えられる。
【００６９】
「アルキレン」は、１〜約２０炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０炭素原子がある、直鎖又は分岐の二価の脂肪族炭化水素基をいう。アルキレン基は、直鎖、分岐又は環状でありうる。アルキレン基はまた、場合によっては、１又はそれ以上の「アルキル基置換基」で不飽和及び／又は置換される。場合によっては、アルキレン基に１又はそれ以上の酸素原子、硫黄原子又は置換された若しくは非置換された、上記のように窒素原子置換基がアルキルである窒素原子原子（本明細書では「アルキルアミノアルキル」ともいう）が挿入されうる。例示的なアルキレン基としては、メチレン（−ＣＨ２−）；エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）；プロピレン（−（ＣＨ２）Ｈ；シクロヘキシレン（−Ｃ６Ｈ１０−）；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−；−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ２）−であって、ここで、ｑ及びｒは各々依存することなく、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の０〜約２０の整数であって、かつ、Ｒは水素又は低級アルキル；メチレンジオキシル（−０−ＣＨ２−Ｏ−）；及びエチレンジオキシル（−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−）である。アルキレン基は約２〜約３炭素原子があってもよく、さらに、６−２０の炭素があってもよい。
【００７０】
本明細書で用いられるように、用語「アシル」は、カルボキシル基の−ＯＨが他の置換基（すなわち、本明細書で定義されたように、ＲＣＯ-で示されるようなＲがアルキル又はアリール基）で置換された有機酸基をいう。すなわち、用語「アシル」としては、具体的には、アセチルフラン及びフェナシル等のアリールアシル基があげられる。アシル基の具体的な例としては、アセチル及びベンゾイルがあげられる。
【００７１】
「環状」は及び「シクロアルキル」は、非芳香族、モノ又は、約３〜約１０炭素原子、例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０炭素原子の複環状環系をいう。シクロアルキル基は、場合によっては、部分的に不飽和であってよい。シクロアルキル基はまた、場合によっては、本明細書で定義するように、オキソ及び／又はアルキレンのアルキル基置換基で置換されてもよい。場合によっては、環状アルキル鎖に１又はそれ以上の酸素原子、硫黄原子又は窒素原子置換基が水素、アルキル、置換アルキル、アリール、又は置換アリールであり、つまりヘテロ環状基がもたらされる置換された又は非置換の窒素原子原子が挿入されてもよい。代表的なモノ環状シクロアルキル環としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルその他があげられるが、これらに限定されない。さらに、シクロアルキル基は、場合によっては、本明細書の上記で定義されたように、例えば、メチレン、エチレン、プロピレンその他のアルキレン基等の結合基で置換されてもよい。その場合、シクロアルキル基は、例えば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチルその他として記載されうる。その他、複環状シクロアルキル環としては、アダマンチル、オクタヒドロナフチル、デカリン、樟脳、カンファン及びノラダマンチル（ｎｏｒａｄａｍａｎｔｙｌ）があげられる。
【００７２】
「アルコキシル」は又は「アルコキシアルキル」はアルキルが上記のようなアルキル−Ｏ−基をいう。本明細書で用いられる用語「アルコキシル」は、例えば、メトキシル、エトキシル、プロポキシル、イソプロポキシル、ブトキシル、ｔ−ブトキシル及びペントキシルを含む、Ｃ１−２０の包括的に、線状、分岐又は環状、飽和若しくは不飽和オキソ−炭化水素鎖をいう。
【００７３】
「アリールオキシル」は、置換アリールを含む、アリール基が上記のようなアリールＯ−基をいう。本明細書で用いられる用語「アリールオキシル」は、フェニルオキシル又はヘキシルオキシル、及びアルキル、ハロ若しくはフェニルオキシル又はヘキシルオキシルで置換されたアルコキシルで置換されたアルキルをいうこともできる。
【００７４】
「アラルキル」はアリール及びアルキルが上記のようなアリールアルキル基をいい、置換アリール及び置換アルキルがあげられる。例示的なアラルキル基としてはベンジル、フェニルエチル及びナフチルメチルがあげられる。
【００７５】
「アラルキルオキシル」はアラルキル基が上記のようなアラルキル−Ｏ−基をいう。例示的なアラルキルオキシル基はベンジルオキシルである。
「ジアルキルアミノ」は、Ｒ及びＲ’が各々依存せずに上記のようなアルキル基及び／又は置換アルキル基である−ＮＲＲ’基をいう。例示的なアルキルアミノ基としては、エチルメチルアミノ、ジメチルアミノ及びジエチルアミノがあげられる。
【００７６】
「アルコキシカルボニル」はアルキル−Ｏ−ＣＯ−基をいう。例示的なアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ブチルオキシカルボニル及びｔ−ブチルオキシカルボニルがあげられる。
【００７７】
「アリールオキシカルボニル」はアリール−Ｏ−ＣＯ−基をいう。例示的なアリールオキシカルボニル基としては、フェノキシ−及びナフトキシ−カルボニルがあげられる。「アラルコキシカルボニル」はアラルキル−Ｏ−ＣＯ−基をいう。例示的なアラルコキシカルボニル基はベンジルオキシカルボニルである。
【００７８】
「カルバモイル」はＨ２Ｎ−ＣＯ−基をいう。
「アルキルカルバモイル」は、Ｒ及びＲ’の一つが水素であり、他のＲ及びＲ’が上記のようなアルキル及び／又は置換アルキルであるＲ’ＲＮ−ＣＯ−基をいう。
【００７９】
「ジアルキルカルバモイル」は、Ｒ及びＲ’が各々依存せずに上記のようなアルキル及び／又は置換アルキルであるＲ’ＲＮ−ＣＯ−基をいう。
「アシルオキシル」はアシルが上記のようなアシル−Ｏ−基をいう。
【００８０】
「アシルアミノ」はアシルが上記のようなアシル−ＮＨ−基をいう。
「アロリルアミノ」はアロリルが上記のようなアロリル−ＮＨ−基をいう。
用語「アミノ」は−ＮＨ２基をいう。
【００８１】
用語「カルボニル」は−（Ｃ＝Ｏ）−基をいう。
用語「カルボキシル」は−ＣＯＯＨ基をいう。
本明細書で用いられる用語「ハロ」、「ハロゲン化物」又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨード基をいう。
【００８２】
用語「ヒドロキシル」は−ＯＨ基をいう。
用語「ヒドロキシアルキル」は−ＯＨ基で置換されたアルキル基をいう。
用語「メルカプト」は−ＳＨ基をいう。
【００８３】
用語「オキソ」は、本明細書で上記した、炭素原子が酸素原子で置換された化合物をいう。
用語「ニトロ」は−ＮＯ２基をいう。
【００８４】
用語「チオ」は本明細書で上記した、炭素原子又は酸素原子が硫黄原子で置換された化合物をいう。
用語「サルフェート」は-ＳＯ４基をいう。
【００８５】
用語「依存せずに（非依存的に）選択された」が用いられる場合、対象となる置換基（例えば、Ｒ１基及びＲ２基又はＸ基及びＹ基等のＲ基）は、同一であっても異なってもよい。例えば、Ｒ１及びＲ２は共に置換アルキルでもよく、又はＲ１は水素でもよく、かつ、Ｒ２は置換アルキルその他でもよい。
【００８６】
ある具体的な態様では、安定してＭＩＦと相互作用し、ＭＩＦ生物学的活性を阻害する当該化合物は、４−ヨード−６−フェニルピリミジン（図６参照）又はその類似体若しくは誘導体である。構造ベース創薬（ＳＢＤＤ）は、例えば、式Ｉの構造がある他のＭＩＦ阻害化合物を同定するのに用いられうる。有効な化合物開発のためのＳＢＤＤの成功例は十分報告されている。それにより、５０の化合物が臨床試験に導入され、かつ、莫大な数の薬剤認可がもたらされた（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、２００４）。仮想スクリーニングは、ＳＢＤＤの１の側面であり、選択された部位に適合するか、ドッキングする、３次元構造に対する小分子構造の広範なデータベースをプレスクリーニングしうるコンピュータ技術である。これにより、現実の物質の所望の化合物の桁違いのスクリーニングの数を減らすことができる。適用できる方法は多様であり、固定及びフレキシブルドッキング（ＤＯＣＫ（Ｅｗｉｎｇら、２００１）、Ａｕｔｏｄｏｃｋ（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９８）、ＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓら、１９９７）、Ｌｉｇａｎｄｆｉｔ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）、Ｌｕｄｉ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ），ＦｌｅｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ）、ＦｌｅｘＸ−ｐｈａｒｍ（Ｔｒｉｐｏｓ）、ＦｌｅｘＥ（Ｔｒｉｐｏｓ）及びＧｌｉｄｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）があり、ＦｌｅｘＸ（Ｒａｒｅｙら、１９９６）、ＳＣＯＲＥ（Ｅｗｉｎｇら、２００１）、Ｃｈｅｍｓｃｏｒｅ（Ｅｌｄｒｉｄｇｅら１９９７）、Ｌｕｄｉ（Ｂｏｈｍ、１９９２）及びＰＬＰ（Ｇｅｈｌｈａａｒら、１９９５）、ＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓら、１９９７）及びＬｉｇａｎｄｆｉｔ（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍら、２００３）等の用いられる採点法又は順位付け及び方法がある。
【００８７】
有力なＭＩＦ阻害剤スクリーニングの過去の試みでは、阻害に中央標的残基としてＮ末端プロリンが用いられた。その一方で、本願で開示された法定主題は、ある態様では、ＭＥＴ Ａ２の位置のメチオニンを標的とする化合物を同定することに焦点をあてた仮想スクリーニング戦略を用いる（すなわち、触媒活性なトリマーを形成するＡ、Ｂ及びＣモノマーで構成されるヒトＭＩＦの結晶構造に関してＭＩＦモノマーＡ位置２）。これは、以前に同定されたＭＩＦ阻害化合物よりも、〜５倍有力である本明細書で開示されるＭＩＦ阻害化合物によって示されるように、先行する試行よりも価値ある特質である。本発明者は、ある程度この活性部位残基に焦点を当てたが、それは、１）それは、実際はポケットの側に位置するＮ末端プロリンに近接する疎水性結合ポケット基底部にあるからであり（Ｓｕｎら、１９９６）；及び２）先行する研究は、ＭｅｔＡ２に近接する単一のアミノ酸残基を挿入することによるこの疎水性基質−結合ポケットの崩壊が、酵素的及び生物学的活性の完全な損失を導くことを示したからである（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２）。すなわち、本願で開示された法定主題に包含され、かつ、ＭＩＦ阻害特性がある他の式Ｉの構造がある例示的な化合物は、本明細書で開示された新規なスクリーニング及び試験方法を用いて、過度の実験をせずに同定されうる。
【００８８】
ＩＶ．使用方法
本願で開示された法定主題は、本明細書の上記で詳細に開示するように、以前報告されたＭＩＦ阻害剤よりも複数倍有効なＭＩＦ生物学的機能の阻害活性がありうる、標的ＭＩＦの触媒活性部位を標的とすることができ、ＭＩＦ生物学的アンタゴニストとして作用しうるＭＩＦ阻害化合物をもたらす。例えば、ある態様では、本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物は、他のＭＩＦ阻害化合物で必要とされる濃度よりも５倍低い濃度で低酸素−誘導性ＨＩＦ１α安定化を阻害しうる。いかなる具体的な作用の理論に拘束されることを望むわけではないが、本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物は、その細胞表面受容体のＭＩＦ結合阻害能と緊密に相関する可能性を示すようである。すなわち、そして、再度、理論に拘束されることなく、本明細書で開示されたＭＩＦアンタゴニストの生物学的阻害活性は、少なくともある部分、細胞表面受容体ＣＤ７４のＭＩＦ結合を妨げる能力に依存するようである。
【００８９】
すなわち、本願で開示された法定主題は、ＭＩＦポリペプチドを本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物と接触させることを含む、ＭＩＦポリペプチドの生物学的活性を阻害する方法を提供する。本明細書で開示された化合物により阻害されうる例示的なＭＩＦの生物学的活性としては、Ｔｈ１リンパ球の阻害、（例えば、サイクリンＤ１発現の）転写制御、細胞遊走促進、細胞浸潤促進、足場−非依存性増殖促進、血管新生促進、ＨＩＦ１α安定化の促進、アラキドン酸代謝、Ｅ２Ｆ転写因子制御、Ｒｂ不活性化及びｐ５３阻害があげられる。
【００９０】
さらに、本明細書で開示するように、ＭＩＦ生物学的活性阻害により低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１α）の生物学的活性が間接的に阻害される。すなわち、本願で開示された法定主題のある態様では、ＨＩＦ１αポリペプチドの生物学的活性を阻害する方法が提供される。当該方法には、ある態様では、ＭＩＦポリペプチドを、本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物に接触させて、その結果、１又はそれ以上のＨＩＦ１αの生物学的活性を阻害することが含まれる。ある態様では、ＨＩＦ１αポリペプチドの活性を阻害すると、ＨＩＦ１αポリペプチドの転写活性が阻害される。さらに、ある態様では、当該方法では、ＨＩＦ１αポリペプチドの活性を阻害すると、例えば低酸素癌細胞等のＨＩＦ−１αを発現する細胞で血管新生、放射線耐性又はそれらが共に阻害される。ある態様では、ＭＩＦポリペプチドを、当該細胞を放射線、化学療法剤又はその両方での治療と併用して本明細書で開示された化合物と接触させる。
【００９１】
ＩＶ．Ａ．  治療方法
例えばＭＩＦ受容体結合のような、ＭＩＦを標的とするさらに生物学的に活性な薬剤の同定は、少なくともある部分低酸素適応を阻害することにより作用する、癌細胞の発癌活性の阻害及び癌の治療についての新規な治療的アプローチを示すかもしれない。これに関連して、当該治療方法は、本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物を適用する本願で開示された法定主題により提供される。本明細書で開示された治療方法としては、細胞の発癌活性を阻害又は予防する方法、癌の治療及び癌の再発のリスクを軽減する方法があげられる。さらに、本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物は、免疫系機能及び炎症性機能に関するＭＩＦ生物学的活性を阻害しうる。それゆえ、本発明のＭＩＦ阻害化合物は、さらに、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療に適用される。
【００９２】
ある態様では、当該治療方法としては、細胞の発癌活性を阻害又は予防する方法があげられる。当該方法には、細胞を本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）と接触させることが含まれる。ある態様では、当該細胞は、肺癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、グリア芽腫及び乳腺腺癌からなる群から選択される癌細胞である。
【００９３】
発癌活性を阻害又は予防することには、当該細胞の遊走、浸潤、細胞生存、足場非依存性増殖、血管新生又はそれらの組み合わせを阻害するが含まれうる。変異した癌遺伝子の下流のエフェクター又は構造的に活性な成長因子受容体に重要な基は、ＲｈｏＧＴＰアーゼ酵素ファミリーである。図２に示すように、ＭＩＦは、Ｒｈｏファミリーの発癌活性の一因となる。主要な３のファミリーメンバーである、Ｒａｃ、Ｒｈｏ及びＣｄｃ４２のうち、Ｒａｃはおそらく浸潤性表現型の促進及び維持に最も重要である。例えば、アクチン細胞骨格再形成の促進に加えて、Ｒａｃはまた、非小細胞肺癌基質メタロプロテアーゼの発現及びその結果生じた浸潤性態様に必須である。すなわち、ある態様では、発癌活性を阻害又は予防することには、前記化合物によるＭＩＦポリペプチド阻害を介した、ＲｈｏＧＴＰアーゼファミリーメンバー（例えば、Ｒａｃ１及び／又はＲｈｏＡ）の活性を阻害することが含まれる。
【００９４】
本願で開示された法定主題のある態様では、対象における癌を治療する方法又は再発のリスクを軽減する方法が提供される。ある態様では、当該方法には、本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物の有効量を対象に投与することが含まれる。ある態様では、当該癌の治療には、当該癌の遊走、浸潤、細胞生存、足場非依存性増殖、血管新生又はそれらの組み合わせを阻害することが含まれる。ある態様では、当該癌は、肺癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、グリア芽腫及び乳腺腺癌からなる群から選択される癌である。
【００９５】
ある態様では、当該癌の治療方法のうち、当該化合物は、放射線、化学療法又はその両方による当該癌の治療と併用して対象に投与される。例えば、ある態様では、本明細書で開示されたＭＩＦアンタゴニストの投与と併用して適用される化学療法剤には低酸素−活性化化学療法的化合物が含まれうる。「低酸素−活性化」化合物は、低酸素下状態でのみ毒性基体に活性化される小分子化合物である。本明細書で上記したように、そのような低酸素原子レベルは固形腫瘍に共通する。すなわち、低酸素活性化合物は、固形腫瘍の低酸素領域で優先的にその毒性体に活性化される。本明細書で開示したＭＩＦアンタゴニストと組み合わせて投与されうる低酸素−活性化化学療法的化合物の１の非限定的例は、チラパザミン（３−アミノ−１，２，４−ベンゾタジン−１，４ジオキシド）である。例えば、さらに、一般的な癌治療剤としてのチラパザミン及び低酸素活性化合物の記載として、Zeman et al. (1986) lnt J Radiat Oncol Biol Phys 12(7):1239-42及びGandara et al. (2002) Semin Oncol 29 (1 Suppl 4): 102-9を参照されたい。
【００９６】
上記のように、ＭＩＦ生物学的活性としてはまた免疫機能制御があげられ、ＭＩＦは多くの炎症性疾患の一因となる。すなわち、本願で開示された法定主題のある態様では、対象の炎症性疾患を治療することが提供される。ある態様では、当該方法は、本明細書で開示されたＭＩＦ阻害化合物の有効量を対象に投与することを含む。ある態様では、当該炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎、関節炎、増殖性血管障害、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、サイトカイン介在毒性、敗血症、敗血症ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ介在状態、自己免疫疾患、腫瘍増殖又は血管新生からなる群から選択される。さらに、ある態様では、自己免疫障害は、関節リウマチ、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主拒絶反応及びループス症候群からなる群から選択される。しかしながら、治療されうる炎症性疾患は、これらの具体的に本明細書で開示されたものに限定されない。
【００９７】
ＩＶ．Ｂ．  対象
本願で開示された法定主題の治療方法に関して、本明細書で用いられる用語としての「対象」は、ある態様では、脊椎動物である対象をいう。好ましい脊椎動物は、温血であり、好ましい温血脊椎動物は、哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書で用いられるように、用語「対象」としては、ヒト及び動物の対象があげられる。すなわち、獣医学的治療的使用が本願で開示された法定主題に従って提供される。
【００９８】
すなわち、本願で開示された法定主題は、ヒト等の哺乳動物及びシベリアトラ等の絶滅のために重要である哺乳動物；ヒトが消費するために農場で飼育される動物等の毛財的な重要性がある動物；及び／又はペット又は動物園で飼育される動物等の社会的に重要な動物のための治療を提供する。当該動物の例としては：ネコ及び犬等の肉食動物；ブタ（ｐｉｇｓ）、ブタ（ｈｏｇｓ）及び野生のイノシシを含むブタ（ｓｗｉｎｅ）；ウシ、オス牛（ｏｘｅｎ）、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダ等の反芻動物及び／又は有蹄動物；及びウマがあげられるが、これらに限定されない。また、トリの治療も提供される。絶滅及び／又は動物園で飼育されるような種類のトリ及びニワトリ、より具体的には家畜化されたトリすなわちシチメンチョウ、ニワトリ、カモ、ガチョウ、ホロホロ鳥等でヒトに対して経済的に重要である家禽類のトリの治療も提供される。すなわち、また、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄類、ウマ（競走馬を含む）、家禽類他を含むがこれら限定されない家畜に対する治療も提供される。
【００９９】
ＩＶ．Ｃ．  処方
本発明の法定主題の当該方法に従って治療的化合物を対象へ投与するのに最適な方法としては、全身投与、非経口投与（血管内、筋肉内、動脈内投与）、経口送達、口内送達、皮下投与、吸引、気管内吸入、外科的移植、経皮送達、局所注入及び超速度注入／照射があげられるが、これらに限定されない。適用可能で継続的な注入ができる部位では標的部位での化合物蓄積を促進しうる（例えば、米国特許第６，１８０，０８２号参照）。
【０１００】
本発明の法定主題の当該方法に従って用いられる投与の具体的な態様は、当該化合物及び／又は用いられる担体、治療される症状の重篤度及び投与後の当該化合物の代謝又は除去のメカニズムを含むがこれらに限定されない様々な因子に依存する。
【０１０１】
本明細書に記載した治療的組成物は、好ましくは、医薬的に許容される担体を含む組成物を含む。適当な処方としては、酸化防止剤、緩衝液、精菌剤、殺菌性抗生物質を含みうる水性及び非水性無菌注入液及び意図されるレシピエントの体液と等張に処方された液体;及び懸濁試薬及び濃化試薬を含みうる水性及び非水性無菌懸濁液があげられる。
【０１０２】
当該方法で用いられる組成物は、懸濁液、溶液若しくは油中乳化液等のタイプ又は水性ベヒクルの形をとってもよく、かつ、懸濁液、安定剤、分散剤等の製剤試薬を含有しうる。もしくは、活性成分は、使用前に、無菌発熱物質非含有水等の無菌安定ベヒクルで構成された粉末体でありうる。
【０１０３】
当該処方は、単位用量又は例えば密閉アンプル及びバイアルのような複数用量容器中に存在してもよく、使用直前に無菌液体担体を添加することのみが必要な、冷凍及びフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。
【０１０４】
経口投与のため、当該組成物は、結合試薬（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ポテトデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の、医薬的に許容される賦形剤で従来技術により調製された、例えば、錠剤又はカプセルの剤型をとりうる。当該錠剤は、当業界で公知の方法でコーティングされうる。例えば、本明細書で開示されたＭＩＦアンタゴニストは、それを胃腸管中の所望の場所に達するまで保護する、腸溶性又は遅延放出コーティングであるｐＨ安定性コアとして処方されうる。
【０１０５】
経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁液の剤型をとりうるか、又は使用前に水か又は他の適当なベヒクルと構成させるための乾燥製品として存在してもよい。当該液体調製物は、医薬的に許容される、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ベヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分留植物性油脂）；及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）等の添加剤で従来技術により調製できる。当該調製物はまた、適当な緩衝塩、人工甘味料、着色料及び甘味剤を含有しうる。経口投与のための調製物は、当該活性化合物を制御放出するように適当に処方されうる。口内投与のため、当該組成物は、従来の態様で処方された錠剤又はトローチ剤の剤型をとりうる。
【０１０６】
当該化合物はまた、移植又は注入のための調製物として処方される。すなわち、例えば、当該化合物は、適当なポリマー性又は疎水性材料（例えば、許容される油中での乳化物として）若しくはイオン交換樹脂、又は、やや不溶性の可溶性誘導体（例えば、やや不溶性の可溶性塩）として処方されうる。
【０１０７】
当該化合物はまた、直腸組成物（例えば、座薬又は、ココアバター又は他のグリセリド等の従来の座薬基剤を含有する貯留浣腸剤）、クリーム若しくはローション又は経皮パッチとして処方されうる。
【０１０８】
Ｖ．  ＲＮＡ干渉
本願で開示された法定主題は、ＭＩＦコーディング配列の部分に結合特異性があるアンチセンスポリヌクレオチドを提供し、かつ、当該細胞又は組織を当該アンチセンスポリヌクレオチドに接触させることにより細胞又は組織中のＭＩＦポリヌクレオチドの発現を調節する（例えば、阻害する）ことに用いられうる。ある態様では、当該アンチセンスポリヌクレオチドは、ＭＩＦのポリヌクレオチド配列ＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＴ（配列番号２）に結合特異性があるヌクレオチド配列を含む。
【０１０９】
ある態様では、当該ｓｉＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列ＣＣＵＵＣＵＧＧＵＧＧＧＧＡＧＡＡＡＵｄＴｄＴ（配列番号３）を含むセンス鎖を含む。さらに、ある態様では、当該ｓｉＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列ＡＵＵＵＣＵＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＧｄＴｄＴ（配列番号４）を含むアンチセンス鎖を含む。
【０１１０】
本明細書で用いられる用語「調節する」とは、遺伝子の発現レベル又はＲＮＡ分子若しくは１又はそれ以上のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードしている同等のＲＮＡ分子のレベルの変化をいうか、又は、１又はそれ以上のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性がアップレレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ、発現、レベル又は活性が、当該モジュレーターが存在しない場合に観察されるよりも高いか又は低くなるようなことをいう。例えば、用語「調節する」は、「阻害する」又は「抑制する」ことを意味することができるが、用語「調節する」の使用は本定義に限定されない。
【０１１１】
用語「ＲＮＡ」は、少なくとも１のリボヌクレオチド残基を含む分子をいう。「リボヌクレオチド」により、β−Ｄ−リボフラノーズ部分の２’位にヒドロキシル基があるヌクレオチドが意味される。当該用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖及び一本鎖領域が共にあるＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ等の単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えＲＮＡ及び改変ＲＮＡ、又は、１又はそれ以上のヌクレオチドが付加、削除、置換及び／又は改変された天然ＲＮＡとは異なる類似体ＲＮＡを包含する。当該改変には、例えば当該ＲＮＡの１又はそれ以上のヌクレオチドのような、ｓｉＲＮＡの末端又は内部等に非ヌクレオチド材料が添加されることも含まれうる。本願で開示された法定主題の当該ＲＮＡ分子のヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチド又は化学的合成ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド等の非標準ヌクレオチドを含みうる。当該改変ＲＮＡは、類似体又は天然ＲＮＡの類似体という場合もある。
【０１１２】
用語「アンチセンスポリヌクレオチド」は、「低分子（small）干渉ＲＮＡ」、「低分子(short)干渉ＲＮＡ」、「小ヘアピンＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」及び「ｓｈＲＮＡ」ということができ、これらは互換的に用いられ、かつ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は遺伝子サイレンシングをおこすことができるいかなる核酸分子をもいう。例えば、Ｂａｓｓら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａ；及び国際出願公開公報ＷＯ００／４４８９５号、ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ００／０１８４６、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ９９／０７４０９及びＷＯ００／４４９１４を参照のこと。
【０１１３】
１の態様では、当該アンチセンスポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡであり、かつ、当該標的核酸分子とハイブリダイズできる場合は、当該ｓｉＲＮＡは当該標的核酸分子に特異的に結合するように、相補的センス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、当該アンチセンス領域は、標的核酸分子（例えば、ＭＩＦをコードする核酸分子）のある領域に相補的な配列を含む。他の態様では、当該ｓｉＲＮＡは自己相補的センス及びアンチセンス領域がある一本鎖ポリヌクレオチドを含み、当該アンチセンス領域は、標的核酸分子のある領域に相補的な配列を含む。他の態様では、当該ｓｉＲＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を含む、１又はそれ以上のループ構造及びステムがある一本鎖ポリヌクレオチドを含み、当該アンチセンス領域は、標的核酸分子のある領域に相補的な配列を含み、かつ、当該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉをおこすことができる活性なｓｉＲＮＡをインビボ又はインビトロで生成するために処理されうる。本明細書で用いられるｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有するこれらの分子に限定される必要はなく、さらに、化学的に改変されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをも包含する。
【０１１４】
本願で開示された法定主題は、低分子二本鎖ＲＮＡ分子が細胞質遺伝子のダウンレギュレート、すなわち、ＲＮＡ干渉といわれるプロセスをすることができるという利点がある。本明細書で用いられる「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）とは、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に介在される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスをいう。共に本明細書にその全体が組み込まれるＦｉｒｅら、１９９８及び米国特許第６，５０６，５５９号を参照のこと。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外部遺伝子の発現を妨げるために進化してきた進化的保存細胞防御メカニズムと考えられる（Ｆｉｒｅ、１９９９）。
【０１１５】
ＲＮＡｉは、細胞及び生物を、あるウイルス（具体的には、当該二本鎖ＲＮＡウイルス又は二本鎖ＲＮＡ中間体を含む生活環があるこれらのウイルス）による感染が原因である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子産生、又は、一本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ種に対するウイルスゲノムＲＮＡホモログを分解するメカニズムを介した宿主ゲノムへのトランスポゾン因子のランダム組込みから保護するために進化してきたようだ。
【０１１６】
細胞中の長いｄｓＲＮＡが存在すると、酵素ダイサー、リボヌクレアーゼＩＩＩの活性が刺激される。ダイサーは、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）といわれる短断片ｄｓＲＮＡへの分解を触媒する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、２００１）。ダイサー介在性分解による当該低分子干渉ＲＮＡは一般的には、約２１−２３ヌクレオチドの長さで、約１９塩基対の二重体を含有する。分解後、当該ｓｉＲＮＡはＲＮＡ−誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）といわれるエンドヌクレアーゼ複合体に組み込まれる。当該ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二重体のアンチセンス鎖に相補的である、当該細胞に存在する一本鎖ＲＮＡの切断を介在できる。Ｅｌｂａｓｈｉｒらによれば、当該標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重体のアンチセンス鎖に相補的である一本鎖ＲＮＡの領域の中央付近でおこる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ｂ）。
【０１１７】
ＲＮＡｉは、いくつかの細胞系及び生物で報告されてきた。Ｆｉｒｅら、１９９８は、シノラブディス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＲＮＡｉを報告した。Ｗｉａｎｎｙ＆Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ、１９９９は、マウス胚のｄｓＲＮＡが介在したＲＮＡｉを開示する。Ｈａｍｍｏｎｄら、２０００は、ショウジョウバエ細胞中のＲＮＡｉを当該細胞にｄｓＲＮＡを形質転換することにより誘導することができた。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１ａは、ヒト胎生腎臓細胞及びを含む培養哺乳動物細胞中で２１ヌクレオチド合成ＲＮＡの二重体を導入することによりＲＮＡｉの存在を示した。
【０１１８】
他の研究では、ｓｉＲＮＡ二重体の標的−相補鎖上の５’リン酸がｓｉＲＮＡ活性を促進し、ＡＴＰがｓｉＲＮＡ上の５’リン酸部分を維持するのに用いられることが示された（Ｎｙｋａｎｅｎら、２００１）。ｓｉＲＮＡ分子が導入された場合に許容されうる他の改変としては、糖リン酸骨格の改変又は少なくとも１の窒素原子又は硫黄原子ヘテロ原子でのヌクレオシドの置換（国際出願公開公報ＷＯ００／４４９１４号及びＷＯ０１／６８８３６号）及び、二本鎖ＲＮＡ−依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、具体的には、２’−アミノ又は２’−０−メチルのヌクレオチド及び２’−０又は４’−Ｃメチレン架橋を含有するヌクレオチドの活性化を阻害しうるあるヌクレオチドの改変（カナダ特許出願第２，３５９，１８０号）があげられる。
【０１１９】
ｄｓＲＮＡ及びＲＮＡｉの使用を開示する他の文献としては、各々が本明細書にその全体が組み込まれる、国際出願公開公報ＷＯ０１／７５１６４号（ショウジョウバエ由来の細胞を用いたインビトロＲＮＡｉ系及びある機能的なゲノム的適用及びある治療的適用のための特異的ｓｉＲＮＡ分子の使用）；ＷＯ０１／３６６４６号（ｄｓＲＮＡ分子を用いた、哺乳動物細胞中の具体的な遺伝子の発現を阻害する方法）；ＷＯ９９／３２６１９号（遺伝子発現を阻害するために用いる、ｄｓＲＮＡ分子を細胞に導入する方法）；ＷＯ０１／９２５１３号（ＲＮＡｉを促進する因子を用いることによる遺伝子抑制を介在する方法）；ＷＯ０２／４４３２１号（合成ｓｉＲＮＡ構築物）；ＷＯ００／６３３６４号及びＷＯ０１／０４３１３号（ポリヌクレオチド配列の機能を阻害する方法及び組成物）；及びＷＯ０２／０５５６９２号及びＷＯ０２／０５５６９３号（ＲＮＡｉを用いて遺伝子発現を阻害する方法）があげられる。
【０１２０】
ある態様では、本願で開示された法定主題は、ＲＮＡｉをＭＩＦの発現を少なくとも部分的に阻害するために適用する。阻害は好ましくは、正常な発現量の少なくとも約１０％である。ある態様では、当該方法は、標的細胞を、ＭＩＦの発現を阻害するのに十分な量でアンチセンスポリヌクレオチドに接触されることを含む。ある態様では、当該標的細胞は対象中に存在し、当該ＲＮＡは当該対象に導入される。
【０１２１】
当該ＲＮＡは、標的タンパク質（例えば、ＭＩＦ）をコードする遺伝子のコーディング鎖に対応するリボヌクレオチド配列を含む第１鎖及び第１鎖と相補的なリボヌクレオチド配列を含む第２鎖を含む二本鎖領域をもちうる。当該第１鎖及び第２鎖は、互いに二本鎖分子を形成するためにハイブリダイズする。当該二本鎖領域は、少なくとも長さが１５塩基対であってもよく、ある態様では、長さが１５〜５０塩基対で、ある態様では、当該二本鎖領域は長さが１５〜３０塩基対である。
【０１２２】
ある態様では、当該ＲＮＡは、分子内自己ハイブリダイゼーションにより二本鎖領域を形成する１の鎖を含むが、これは、好ましくは。ある態様では、当該ＲＮＡは、分子内ハイブリダイゼーションにより少なくとも１９塩基にわたり相補的である二本鎖領域を形成する２つの別個の鎖を含む。
【０１２３】
当業者であれば、あらゆる適当な共通の技術をＲＮＡを標的細胞に導入することに用いられうることを認識するはずである。ある態様では、当該ＲＮＡをコードするベクターが標的細胞に導入される。例えば、当該ＲＮＡをコードするベクターを標的細胞に形質転換し、その後、当該ＲＮＡを細胞ポリメラーゼで転写することができる。
【０１２４】
ある態様では、当該ＲＮＡをコードする核酸を含む組換えウイルスを産生することができる。ＲＮＡを標的細胞に導入することは、その後、標的細胞を当該組換えウイルスで感染することを含む。細胞ポリメラーゼが当該ＲＮＡを転写すると、標的細胞内でＲＮＡが発現される。組換えウイルス技術は当業者には周知である。当業者であれば、本明細書でこれ以上の詳細な議論の必要なく、直ちに本願で開示された法定主題を用いるために組換えウイルス産生を最適化するために必要な、適当なウイルス及びベクターの要素を選択することに関連する複数の因子を理解するはずである。組換えウイルスの産生及び使用の詳細は、本明細書にその全体が参照して組み込まれる国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０２／２２０１０号に見られる。もしくは、例えば、ｐＳＩＬＥＮＣＥＲ ＡＤＥＮＯ １．０−ＣＭＶ系（登録商標）（Ambion, Austin, Texas, USA）等の組換えウイルスを産生するための市販のキットを用いることができる。
【０１２５】
以下の実施例は、本願で開示された法定主題の態様を例示することを含む。本明細書の開示及び当業界の一般的なレベルの観点から、当業者であれば、以下の実施例が例示的にすぎず、多くの変更、修飾及び改変が本願で開示された法定主題の範囲を逸脱することなく用いられることを理解するはずである。
【実施例１】
【０１２６】
低酸素はＨＩＦ１α−依存性態様でＭＩＦの発現及び分泌を誘導する
癌細胞系で示されるように（Ｂａｃｈｅｒら、２００３；Ｋｏｏｎｇら、２０００ａ）、ＭＩＦ発現は低酸素状態における反応で増加する。膵臓癌は極めて低酸素であることが報告されているため（Ｋｏｏｎｇら、２０００ｂ）、研究は、ヒト膵臓癌細胞系での低酸素によるＭＩＦ制御を調査するために開始した。２のヒト膵臓腺癌細胞系、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２（図３）及びＰＡＮＣ−１がＭＩＦの低酸素−誘導性の転写制御に感受性であるという結果が示された。具体的には、低酸素原子環境におかれた場合、ＭＩＦ分泌（図３Ａ）及び転写（図３Ｂ）が著しく増加したことが示された。添付の図３は、ヒトＭＩＦに対して設計された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴで形質転換した細胞のデータである。その他、ＨＩＦ−１α−不全マウス由来のマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）（Ｒｙａｎら、１９９８；Ｚｕｎｄｅｌら、２０００）は、低酸素−誘導性ＭＩＦの転写に極めて不適応であることが見いだされた（図３Ｃ）。
【０１２７】
腫瘍低酸素は、一般的な新生物疾患（Ｊａｎｓｓｅｎら、２００５；Ｍｅｎｏｎ及びＦｒａｋｅｒ、２００５；Ｓｈａｎｎｏｎら、２００３）及び具体的には、膵臓癌（Ｋｏｏｎｇら、２０００ｂ）の優れた予後の指標として報告された。本明細書で開示されたインビトロの知見（図３Ａ及び３Ｂ）を臨床的な状況と相関させる試みでは、次に、以前に膵臓腺癌と診断された患者のＭＩＦ血漿レベルを測定した。１の研究で、正常なコントロール供与体及びいかなる癌療法をも経験した膵臓癌患者由来の血漿試料中のＭＩＦレベルの評価方法を確立した。図３Ｄに示すように、コントロール血漿に対する中央ＭＩＦレベルは２４．８ｎｇ／ｍｌであるが、膵臓癌腫患者のＭＩＦレベルの平均値は３６．８ｎｇ／ｍｌ（両側スチューデントｔ検定でＰ＝０．０３８２）であった。当該結果は、血漿中のＭＩＦレベルと膵臓腺癌患者の間に陽性の相関関係があることを最初に示す。
【実施例２】
【０１２８】
ＭＩＦは低酸素-誘導性ＨＩＦ１αの安定化及びその後の転写に必須である
ＨＩＦ１αのある転写標的はまた、ＨＩＦ−αの発現及び／又は安定化を制御しうるかもしれない（Ｅｐｓｔｅｉｎら、２００１；Ｈａｇｅｎら、２００３）。実施例１の結果は、ＭＩＦはＨＩＦ１α遺伝子転写の標的であり、低酸素により強力誘導されることを示す。ＨＩＦ１αによる低酸素−誘導性遺伝子発現の調節は十分に報告されているため、低酸素によるＨＩＦ１α安定化がＭＩＦの損失に感受性があるか否かを試験した。
【０１２９】
ＭＩＦ−特異的ｓｉＲＮＡを、０．２％Ｏ２（無酸素）中で１６時間インキュベートする前に、ＭＩＡ−Ｐａｃａ−２細胞で形質転換した。図４Ａに示すように、ｓｉＲＮＡによるＭＩＦの枯渇によって、β−アクチン発現は影響を受けないが、細胞質ＭＩＦ発現の損失が９０％を越えた。ＨＩＦ１αは、モック形質転換細胞又はコントロールｓｉＲＮＡ形質転換細胞中では無酸素処理により核中で有効に安定であったが、ＭＩＦ欠損細胞はＨＩＦ１αの安定化については完全に不全であった（図４Ａ）。低酸素−介在性ＨＩＦ１α安定化におけるＭＩＦ要求性をより完全に試験するため、１％Ｏ２（低酸素）に暴露したＭＩＦ含有対不全膵臓腺癌細胞の経時的評価を実行した。結果は、評価した全ての時点で、低酸素−介在性ＨＩＦ安定化にはＭＩＦが強く要求され（図４Ｂ）て、この要求性はＨＩＦタンパク質が安定なレベルである（Ｗｉｎｎｅｒら、２００７も参照）ことが明らかになった。
【０１３０】
血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の低酸素−誘導性発現は、腫瘍の悪性進行中の決定的な工程であり、複数の抗癌様相の標的である（Ｚｈｏｎｇ及びＢｏｗｅｎ、２００６）。この前血管新生成長因子が潜在的に腫瘍−関連し血管新生を刺激するため、ＶＥＧＦの発現又はシグナリングの崩壊は抗腫瘍形成であることが報告されてきた（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、１９９９；Ｔｓｕｚｕｋｉら、２０００；Ｇｒａｅｖｅｎら、２００１）。低酸素−誘導性ＶＥＧＦ転写がＭＩＦ枯渇により減衰するか否かを測定するため、異なる時間低酸素に暴露したＭＩＦコンピテント又は不全細胞のリアルタイムＰＣＲ分析を実行した。データは、最大低酸素−誘導性ＶＥＧＦ転写はＭＩＦに著しく依存することを示し（図４Ｃ）たが、それは、ＭＩＦがなぜ腫瘍−関連血管新生に絶対に重要であるかの説明になるかもしれない（Ｃｈｅｓｎｅｙら、１９９９；Ｗｉｌｓｏｎら、２００５；Ｗｈｉｔｅら、２００１；Ｓｈｕｎら、２００５）。広義には、当該研究は、膵臓腫瘍形成は潜在的に−低酸素によって開始されるシグナリングにより広く影響を受けることが示唆され（Ｋｏｏｎｇら、２０００ｂ）−ＭＩＦの存在に依存しうることを示す。
【実施例３】
【０１３１】
ＭＩＦは膵臓腺癌細胞でＣＳＮ５と結合し、ＭＩＦ枯渇によりＣＳＮ５結合の喪失及びＨＩＦ−１α安定化がおこる
最近、ＭＩＦはＣＳＮ５の機能を調節し（Ｋｌｅｅｍａｎｎら、２０００）、ＣＳＮ５は低酸素−誘導性ＨＩＦ−１α安定化に必須であることが示された（Ｂｅｍｉｓら、２００４）ため、次に、ＭＩＦとＨＩＦ１α安定化におけるＣＳＮ５との間にどのような機能的関係があるのかを試験することを目的とした。ＭＩＦが膵臓腺癌細胞でＣＳＮ５と相互作用するか否かを試験するために、共免疫沈降反応を、ＣｏＣｌ２の濃度を変化させて暴露された細胞の溶解物で実行した。図５Ａに示すように、ＭＩＦは、ＣｏＣｌ２を極めて緩慢に増加させて観察された試験した全ての状態でＣＳＮ５と有効に共免疫沈降した。ＭＩＦ／ＣＳＮ５相互作用のこの増加は極めて再現性があり、ＭＩＦ／ＣＳＮ５細胞内結合に影響する制御にあるレベルが存在するかもしれないことを示唆する。
【０１３２】
ＣＳＮ５の結合は、ＨＩＦ−１αを機能的に安定化するために機能する（Ｂｅｍｉｓら、２００４）ため、次に、ＭＩＦが損失するとＨＩＦ−１のＣＳＮ５への結合が崩壊するかを試験した。未処理及びＣｏＣｌ２処理ＭＩＦ−コンピテント及び欠失細胞由来のＣＳＮ５／ＨＩＦ１α複合体の共免疫沈降では、ＭＩＦ損失により、ＰＨＤ阻害により誘導されるＣＳＮ５のＨＩＦ１αへの結合が著しく低下したことが明らかになった（図５Ｂ）。細胞溶解物中のＨＩＦ−１α発現（上部パネル）とＣＳＮ５で引かれるＨＩＦ１α量（中央パネル）との間に著しい相違がみられたにもかかわらず、ＭＩＦ−欠失細胞中のＣＳＮ５／ＨＩＦ１α相互作用の観察された損失は、単にＨＩＦ１α安定化の全体的な損失のために過ぎない可能性はぬぐいされなかった。
【０１３３】
このことを確認するため、ＭＩＦ−含有及びＭＩＦ−欠失細胞中のＨＩＦ１αを人工的に安定化させるためにプロテアソーム阻害剤を用いた。重要なことには、プロテアソーム阻害剤で処理したＭＩＦ−欠失膵臓癌腫細胞は、ＭＩＦ含有細胞と同等量の安定化ＨＩＦ−１αを含有していた（図５Ｃ）。この知見は、ＨＩＦ１αタンパク質の分解及び転写でなく又は翻訳を調節するＭＩＦの機能を示唆する。
【０１３４】
その後、細胞溶解物をＭＧ−１３２−介在性ＨＩＦ１α安定化細胞中のＣＳＮ５／ＨＩＦ１α相互作用について評価した。興味深いことに、ＭＧ−１３２−処理ＭＩＦ含有細胞は、著しい量のＨＩＦ１αに結合したＣＳＮ５を含有したが、ＭＩＦ−欠損細胞は、このＣＳＮ５／ＨＩＦ１α複合体の小分画のみを含有した（図５Ｃ）。ＣＳＮ５レベルがＭＩＦ状態によっては不変であったことは注目に値する（図５Ｃ）。当該結果は、ＣＳＮ５−依存性ＨＩＦ１α安定化におけるＭＩＦの直接的な機能を示唆する。
【０１３５】
当該知見を組み合わせると、膵臓腺癌細胞におけるＭＩＦ及びＨＩＦ１αの新規な共制御軸が明らかである。当該データは、ＭＩＦ発現及び分泌は、ＨＩＦ−１α−依存性態様では低酸素により促進されること、さらに重要なことには、定常状態のＭＩＦには低酸素−誘導性ＨＩＦ１α安定化が必須であることを示す。当該結果はさらに、ＭＩＦがＣＳＮ５のＨＩＦ１αへの結合を促進することによりＨＩＦ１α安定化の一因となることを示唆し、ＭＩＦをＣＳＮ５生物作用の機能レギュレーターとして報告した以前のレポート（Ｋｌｅｅｍａｎｎら、２０００）と一致する。
【０１３６】
当該研究ではさらに、ＭＩＦが抗−新生物の薬理学的薬剤を設計する優れた標的に相当することを示唆する。ＭＩＦが低酸素環境中でのＨＩＦ１α安定性を決定するのに必須であるだけでなく、その結果生じたＨＩＦの安定化が、腫瘍細胞運動性を高め、増殖可能性を高めるＭＩＦの発現及び分泌を高めるように機能する。次項の実施例は、本明細書で開示された−ＭＩＦ阻害化合物の同定及び試験を開示し、それらがＨＩＦ１αの低酸素−誘導性安定化及びその結果生じた悪性表現型を遮断する活性があることを示す。
【実施例４】
【０１３７】
小分子ＭＩＦ阻害化合物の仮想スクリーニング及び試験
ＭＩＦに対する唯一の報告された仮想スクリーングは先端化学開発（ＡＣＤ）ライブラリを用いてＤＯＣＫの初期バージョンを用いたもので、ライブラリ中で正常な基質と類似でる化合物及び極めて高い活性（濃縮率−３％）である化合物を見出した（Ｏｒｉｔａら、２００１）。本発明の研究のため、その結果生じた改変しうる新規なＭＩＦ阻害剤テンプレートを考案して試験した。ＭＩＦ基質結合ポケットＭｅｔＡ２の基部を標的として、剛体ドック中の水素−結合供与体及び受容体並びに脂肪族天然物を検討するコンピュータプログラムＬＵＤＩ（Accelrys, San Diego, California, U.S.A.）を用いた（パラメータ：８Ａ半径無結合又は回転可能結合、５０００フィット、保存３００最低フィット、脂肪族芳香族及び静電チェックオプション、ＡＣＤライブラリ使用）。ＧＥＮＦＲＡ（登録商標）（Accelrys）を用いたＡＣＤ由来のｓｄｆファイル（Elsevier MDL(登録商標), San Ramon, California, U.S.A.）を形質転換し、３４３，８０２構造のライブラリを仮想スクリーニングソフトウェアＬＵＤＩのために適当に得た（Ｏｒｉｔａ（Ｏｒｉｔａら、２００１）らで用いられたドックと反対）。最初の３のエネルギー機能を用いて、手動コンセンサススコアをリストにランキングした。上位１００ヒットをランキングして、７６個の化合物が市販されていることを見出し、ＣＨ ＥＭ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ（登録商標）（San Diego, California, U.S.A.; Walters及びMurcko, 2002）を介して得た。最初に得た７６化合物のうち、わずか４１個が１００μＭ濃度で水溶液に可溶性であることが見出された。３５個の水非可溶性化合物をさらに、低濃度での溶解性及び触媒阻害活性について試験した。当初可溶性であった４１個の化合物のうち、９個の化合物は、精製組換えＭＩＦの触媒活性を阻害することが見出された（（Ｏｒｉｔａら、２００１）で報告された＜３％に比較して精製タンパク質に対する成功率（９／４１）２２．０％）。当該化合物を細胞環境における特異性を評価するために全細胞溶解物に含有される触媒活性に対して試験した場合（Ｏｒｉｔａの研究ではなされていない）、３の化合物が阻害することが見出された。１の化合物４−ヨード−６−フェニルピリミジンは、ＭＩＦ触媒及び生物学的活性に共に優れた阻害活性を呈することが見出された（図６及び７参照）。
【０１３８】
Ｏｒｉｔａ及び共同研究者は５２４個の有力な阻害剤を同定し、ＭＩＦトートメラーゼ阻害について試験した。彼らが見出したうち１４個の化合物はＭＩＦ酵素阻害活性があり（ヒット率〜２．６７％−本発明のヒット率〜２０％との比較）、報告されたＫｉ値ランキングは０．０３８〜７．４μＭであった。本発明の新規な仮想スクリーニングアプローチ及びそれを用いて同定された化合物をさらに実証するため、当該同定された化合物を初期のスクリーニングで同定された最も有力な阻害剤に対して試験した。本化合物３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボン（ＴＩ報告されたＫｉ値３８ｎＭ）を２つの関係のない会社から得て、本発明で同定した３個の化合物と比較した。驚くべきことに、ＴＩはＫｉ値が３８ｎＭであることが報告されていたが、本発明者と共同研究が行ったアッセイでは、３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボンは、クレームされた化合物よりも数段階低いか、本明細書で開示された２個の化合物と同程度の阻害活性を呈することが示された。さらに、４−ヨード−６−フェニルピリミジン（化合物＃１６として図及び実施例に記載されている）は、３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボン（ＴＩ）（１６〜５μＭ対ＴＩ〜２５μＭ）（図８）よりも５倍低いＩＣ５０であることが見出された。特筆すべきことは、３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボンの市販品の２つでも同様の結果が得られたことである。この知見から、本発明で同定されたＭＩＦアンタゴニスト、４−ヨード−６−フェニルピリミジンが今までで報告された中で最も有力なＭＩＦ阻害剤であることが示唆される。これら本明細書に記載されたデータを組み合わせると、新規な本発明で開示された仮想スクリーニングアプローチはＭＩＦの新規な小分子阻害剤を同定することが提案されることが信じられる。
【実施例５】
【０１３９】
小分子ＭＩＦ触媒阻害剤はＭＩＦ−特異的態様でＨＩＦ−１α安定化を遮断する
上記のように（図４参照）、ＭＩＦが低酸素及びプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤−誘導性ＨＩＦ１α安定化並びにその結果生じた膵臓腺癌細胞の低酸素適応に必須であることを決定した。次に、ＭＩＦｓｉＲＮＡを用いて観察したＭＩＦ薬理学的阻害剤がＨＩＦ１αの不安定化効果を再現しうることを試験した（図４）。新たに測定されたＭＩＦアンタゴニスト４−ヨード−６−フェニルピリミジン（「化合物＃１６」ともいう）の試験に加えて、Ｏｒｉｔａのスクリーニング（図８）で同定されたＴＩ化合物もまた試験した。化合物＃１６によるＭＩＦの阻害は完全に膵臓癌腫細胞でＣｏＣｌ２（プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤）を極めて高濃度で用いる場合（１００μＭ−図９Ａ）により誘導されるＨＩＦ１α安定化を阻害する。
【０１４０】
次に、当該２個の化合物の観察される触媒阻害活性が、ＭＩＦ阻害のこの生物学的アッセイでも同様に観察されるかを試験した。図９Ｂに示すように、４−ヨード−６−フェニルピリミジンは、用量依存性態様でＨＩＦ−１α安定化を阻害し、１０μＭでコントロールのＨＩＦ１αの５０％近くを抑制した。その一方、３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボンは１０μＭでも阻害活性を示さず、唯一５０μＭでわずかな阻害活性を示しただけであった。注目すべきことは、生物学的阻害活性におけるこの〜５倍の相違は、当該２個の化合物を比較した場合に観察される５倍の酵素阻害活性の相違に密接に相当することである（図８）。ＴＩでＶＥＧＦがおおよそ２０％軽減するのに比較して、＃１６が５０μＭで８０％を越えてＰＨＤ阻害剤誘導性ＶＥＧＦを抑制すると共に、これは同様の阻害効果がＣｏＣｌ２−誘導性ＶＥＧＦ発現及び分泌で観察される（ＥＬＩＳＡで測定）ことに著しく注目する。興味深いことに、ＩＳＯ−１はまた、ＣｏＣｌ２により誘導されるＨＩＦ１α安定化を阻害できるが、その酵素阻害活性と極めて緊密に相関する１００μＭ又はそれより高濃度で緩慢に有効であるに過ぎない（図１０）。
【０１４１】
最近、ＨＩＦ１α阻害における＃１６の効果がＭＩＦにおけるその阻害効果を介したものであることを確認するため、ＭＩＦ−含有細胞及びＭＩＦ−欠損細胞で阻害活性を試験した。図９Ｃに示すように、＃１６は有力にＭＩＦ＋／＋マウス胎児繊維芽細胞でＨＩＦ１α安定化を遮断するが、ＭＩＦ−／−繊維芽細胞はＭＩＦ阻害剤には影響されなかった。理論に拘束されることなく、この知見は、以下の２つの理由：１）化合物＃１６のＭＩＦ特異性を示すものである点；及び２）他の新規に同定された有力な小分子ＭＩＦ阻害剤同様＃１６の同種もののＭＩＦ特異性を評価する他の価値あるスクリーニングツールを提供するものである点で重要でありうる。
【０１４２】
当該データを組み合わせると、新規なクラスの間接的なＨＩＦ−α阻害剤の同定が示唆される。低酸素適応及びその結果の悪性転移性の表現型が付与されることにおける主要な重要性のため、ＨＩＦ−αの小分子阻害剤を同定することは、極めて重要である。本発明の知見は、ＭＩＦの小分子標的には、固有の重要な転写因子を阻害する間接的な意味があることを示す。
【実施例６】
【０１４３】
ＭＩＦアンタゴニストはＭＩＦ−依存性細胞遊走及び足場非依存性増殖を阻害する
上記の実施例では、触媒ＭＩＦ阻害剤の以前報告された代表例（例えば、３’，４’，７−トリヒドロキシシイソフラボン）を示す。図８及び９は以前同定されたＭＩＦ阻害化合物よりも劣るＭＩＦの機能の有効な触媒及び生物学的阻害剤である。以前同定されたＭＩＦ阻害化合物及び具体的には、４−ヨード−６−フェニルピリミジンに対する代表的なＭＩＦ生物学的阻害剤（ＩＳＯ−１）を次に評価した。ＩＳＯ−１は、ＭＩＦのインビトロ及びインビボの生物学的機能が詳細に特定された阻害剤である（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２；Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、２００５；ＡｌＡｂｅｄら、２００５；Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）。本発明者及び共同研究者（Ｒｅｎｄｏｎら、２００６）及び他の研究室（Ｒｅｎら、２００６；Ｓｕｎら、２００５；Ｒｅｎら、２００５；Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）の最近の研究では、ＭＩＦが最大限の腫瘍細胞遊走／浸潤に必須であり、ＩＳＯ−１がＭＩＦ−依存性細胞遊走及び足場−非依存性増殖を阻害することを明らかにする（Ｒｅｎｄｏｎら、２００６；Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）。すなわち、４−ヨード−６−フェニルピリミジン（本明細書では「化合物＃１６」ともいう）をＩＳＯ−１に対して試験し、ＭＩＦの触媒活性及び生物学的活性における相対的な阻害効果を決定した。図１０に示すように、化合物＃１６の酵素阻害及び遊走阻害に対するＩＣ５０はＩＳＯ−１より１０倍低く（１０μＭでのＩＳＯ−１は完全に不活性である）本分子はＩＳＯ−１よりも著しく有力で実現可能なＭＩＦアンタゴニストであることを示す。重要なことは、当該遊走阻害の結果は、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２膵臓腺癌細胞で同様の態様でなされる場合には、ほどんと同一であることである。
【０１４４】
肺腺癌足場−非依存性増殖を阻害するＩＳＯ−１及び＃１６の相対的な可能性を次に試験し比較した。図１１に示すように、ＩＳＯ−１及び化合物＃１６は共にＡ５４９軟寒天増殖を阻害するが、＃１６はＩＳＯ−１よりも５〜１０倍有力であることが見出された（図１０のＩＣ５０データと類似）。本知見は悪性疾患干渉におけるＭＩＦの小分子標的の使用確認するためだけでなく、いかなる他の報告された化合物よりも新規かつより有力なＭＩＦ阻害剤を同定するために重要である。
【０１４５】
抗−ＭＩＦ化合物のインビボ効能を評価するために設計された研究では、４−ヨード−６−フェニルピリミジン（化合物＃１６）をヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）副産物の異種移植モデルで試験した。化合物＃１６は、Ａ５４９の足場−依存性を阻害することが見いだされた（図１１）ため、腫瘍副産物も同様に阻害されるはずであると仮定した。図１２で示したように、ベヒクルで処した理マウスは１６日目に始まった皮下腫瘍病巣が進行したが、化合物１６で処理したマウスは無腫瘍のままであった。当該データは、化合物＃１６及び本明細書で開示された式Ｉに関連する化合物は送達でき、実際に腫瘍副産物を阻害しうることを示唆する。
【０１４６】
化合物＃１６のＭＴＤ及びインビボ阻害活性を測定する研究もまた完遂した。各群２匹のマウスを用いて、４−ヨード−６−フェニルピリミジンの０．５、１、２及び４ｍｇ用量（各２５、５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇ）を毎日注入（７日間）しても、明らかな毒性は見られなかったことが見出された。次に、化合物＃１６のインビボ酵素阻害を分析した。５０ｍｇ／ｋｇの４−ヨード−６−フェニルピリミジンの単一のボーラス注入では、注入後６時間で５０％を越える内因性肝臓ＭＩＦ酵素トートメラーゼ活性が阻害されたことが見出された（図１３）。当該データを組み合わせると、４−ヨード−６−フェニルピリミジンで例示される本発明で開示されたＭＩＦアンタゴニストはインビボ実験では安全かつ活性であり、代表的なＭＩＦ小化合物阻害剤ＩＳＯ−１よりも１０倍以上有効であることが示された。さらに、本発明の新規で実現可能なスクリーニング及びシステマチック試験方法により発見された、本明細書で開示された式Ｉの本発明のＭＩＦ阻害化合物は、ＭＩＦ小分子阻害剤をさらに同定するための本発明のアプローチ及び実験的設計を確認する。
【実施例７】
【０１４７】
ＭＩＦ阻害剤はＭＩＦ／ＭＩＦ受容体相互作用を遮断する
上記のように、小分子アンタゴニストがＭＩＦの生物学的機能を遮断するためには、ＭＩＦがその細胞表面受容体と結合することを遮断しなければならない（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）。ＭＩＦのその細胞表面受容体との結合阻害剤を調査するためのハイスループットアッセイが設計された（Ｌｅｎｇら、２００３）。捕捉アッセイは、ＣＤ７４の当該細胞外ＭＩＦ結合ドメインと結合するビオチン化したヒト組換えＭＩＦ（ｈｒＭＩＦ）リガンドの結合に基づく（図１４Ｃ参照）。
【０１４８】
ＭＩＦ／ＭＩＦ受容体相互作用の有力な阻害剤を評価するために、ビオチン化ＭＩＦをＭＩＦ特異的阻害剤又は非標識ＭＩＦで共インキュベートした。非標識ＭＩＦの場合は、構造−機能研究のために構築された相対的な部位特異的変異体のＭＩＦ受容体結合能を測定する単一の実験アプローチを提供した。
【０１４９】
実施例として、図１４Ａ及び１４Ｂは、１）酵素的機能及び生物学的機能を要することが知られているＰｒｏ−１で変異したＭＩＦタンパク質による部分的に不全なＣＤ７４結合（Ｓｗｏｐｅら、１９９８）（図１４Ａ）；及び２）化合物１６及びＩＳＯ−１によるＭＩＦ／ｓＣＤ７４の極めて有効な遮断（図１４Ｂ）；を示す２の捕捉アッセイ実験を示す。図１４Ｂに記載の実験では、用いられた０．２μＭビオチン化ＭＩＦに対してわずか０．１μＭのＭＩＦアンタゴニストしか用いなかったために，本アッセイの最大阻害可能性は５０％であったことを注記する。すなわち、化合物＃１６は最高可能パーセンテージ（すなわち５０％）でＭＩＦ受容体結合を阻害する。ＭＩＦ／ＭＩＦ受容体相互作用を遮断する場合はＩＳＯ−１よりも化合物＃１６の効能は高いこともまた注記する。本捕捉アッセイは明らかに酵素及び生物学的活性間の構造−機能関係の研究の極めて価値あるツールである。さらに、変異体ＭＩＦタンパク質を試験する結合研究は、小分子ＭＩＦ標的スクリーニングのために改変するアミノ酸残基を明らかにしうる。これは、受容体結合データを、ＭＩＦの活性部位内のアミノ酸残基標的を改変及び拡張することができる各点突然変異タンパク質由来のものと結合して試験する候補化合物から収集できることを期待できる。
【０１５０】
実施例１〜７の議論
全ての固形腫瘍は腫瘍形成を通して微環境で適応する必要がある。１の本適応反応の顕著な特徴は、前腫瘍形成／血管新生遺伝子のＨＩＦ指向発現を刺激する腫瘍内低酸素の進行である。本発明の知見は、当該遺伝子産物の一つＭＩＦが膵臓癌患者で上昇し、当該細胞外サイトカイン／成長因子ＭＩＦと転写因子ＨＩＦ１αの固有の機能的相互関係の１の因子を示すことを立証する。これは、ＭＩＦ欠損細胞又は小分子ＭＩＦアンタゴニストで処理された細胞が、低酸素及びＰＨＤ阻害剤−誘導性ＨＩＦ１α安定化並びにその結果生じた代謝及び血管新生遺伝子産物の転写に不適応であることを示す本発明のデータにより示される。ＨＩＦ発現は腫瘍悪性の直接の一因となり、膵臓癌は非常に低酸素であることが報告される（Ｋｏｏｎｇら、２０００ｂ）ため、ＭＩＦは腫瘍維持、環境適応及び最終的な予後の機能的な一因となるようだ。すなわち、本明細書で開示されたＭＩＦアンタゴニストは、間接的なＨＩＦ１αアンタゴニスト及び抗癌剤の新規なクラスを示す。
【実施例８】
【０１５１】
ＭＩＦに対するコンピュータ仮想スクリーニングの精度をあげるためのＭＩＦ受容体結合／触媒活性に必須の他のアミノ酸の同定
ＭＩＦの生物学的作用（インビトロ受容体結合）対触媒作用の相対的な構造−機能関係を評価するために、個々の点変異を含有するいくつかのＭＩＦ組換えタンパク質発現プラスミドを構築する。ＭＩＦの新規でより有力な阻害剤を同定するために、受容体結合作用及び／又は触媒機能に必須であることが見出されたアミノ酸に焦点をあてた仮想スクリーニングを実行しうる。１８，０００，０００以上の化合物からなるいくつかの仮想ライブラリをコンピュータ的にスクリーニングした。
【０１５２】
ヒトＭＩＦでの部位−特異的変異の生成
ＭＩＦの３次元構造の再調査により、ＭＩＦ／基質相互作用に直接影響を及しうるか又は結合ポケット特性を改変することが考えられるＭＩＦの基質結合ポケット周辺かその内部にいくつかのよく保存されたアミノ酸残基があることが明らかである。ＭＩＦの基質結合に重要と報告された残基としては：１のＭＩＦモノマー由来のＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２、ｌｌｅ−６４及び近接するもの由来のＴｙｒ−９５、Ａｓｎ−９７があげられる（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、１９９９）。本発明者及び共同研究者は、基質／受容体のドッキング又は結合に潜在的に重要なＭＩＦ／基質結合ポケットの結晶構造から多くの他の残基を同定してきた。これには、Ｍｅｔ−２、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｈｉｓ−６２、Ｓｅｒ−６３、Ｌｙｓ−６６、Ｍｅｔ−１０１、ＶａＩ−１０６、Ｔｒｐ−１０８及びＰｈｅ−１１３の残基があげられる。興味深いことに、Ｍｅｔ−１０１以外の当該残基は、多くの種、ある場合では遠縁のＭＩＦ関連Ｄ−ドーパクロムトートメラーゼとの間で極めてよく保存されている（Ｓｗｏｐｅら、１９９８）。
【０１５３】
全ての部位特異的変異はQUICKCHANGE（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, California, U.S.A.)を用いて作製することができる。簡潔には、ＰＣＲプライマー対は所望の変異を含有するように作製することができ、製造業者により記載されたように、ｐＥＴ１１ｂ／ＭＩＦ原核生物発現プラスミド（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら、１９９４）のＰＣＲ増幅が実行される。変異のために標的とされた全ての残基は、所望の当該アミノ酸をアラニンに置換でき、全ての変異体はシークエンスで確認されうる。
【０１５４】
ＭＩＦ酵素は、報告されたように、変異体ごとに発現し、精製し、折り畳みしうる（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら、１９９４）。相対的な酵素活性は、以下に記載するように評価することができ、ＣＤ７４結合研究は本明細書に記載したように測定できる。当該変異データは、リード抗−ＭＩＦ小分子アンタゴニスト中で標的とされるはずであるＭＩＦの重要残基の同定に用いられうる。本情報はさらに、仮想スクリーニングの精度を向上すること及び当該残基との相互作用を含む存在する化合物を作製することにより化学的合成を標的とする他の部位を示すことができる。
【０１５５】
ドーパクロムトートメラーゼアッセイ
ＭＩＦ特異的生物学的アッセイにおける候補化合物の試験の前に、全ての同定されたアンタゴニストは、ドーパクロムトートメラーゼアッセイでＭＩＦ−依存性触媒活性阻害能についてスクリーニングしうる。ＭＩＦ触媒及び阻害の研究は報告されたように（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２）実行しうる。簡潔には、Ｌ−ドーパクロムメチルエステルを、過ヨウ素酸塩ナトリウムで、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステル（Sigma, St. Louis, MO）の酸化により２．４ｍＭに調製することができる（Ｄｉｏｓら、２００２）。活性は、ドーパクロムメチルエステル（０．３ｍｌ）を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６、０．５ｍＭ ＥＤＴＡに５００ｎＭｒＭＩＦ（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら、１９９４）を含有するキュベット中に加えて調製し、５分後に分光光度計で４７５ｎｍでの吸光度の軽減を室温で測定することにより決定することができる。上記のように精製された全ての変異体ＭＩＦ酵素は、本方法を用いて野生型ＭＩＦ酵素の相対活性に対して試験することができる。加えて、本実施例の最終章で同定された候補阻害剤は、様々な濃度でＤＭＳＯに溶解でき、ドーパクロム基質を加える１分前にＭＩＦと共にキュベットに添加できる（ＤＭＳＯの終濃度は０．１％より低いはずである）。
【０１５６】
ＣＤ７４捕捉アッセイ
可溶性ＣＤ７４タンパク質（ｓＣＤ７４７３−２３２）を以前の報告（Ｌｅｎｇら、２００３）のとおりに発現し、精製することができる。簡潔には、アミノ酸第７３−２３２番目のコーディング領域を含むｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ｐＣＲＴ７／ＣＴＴＯＰＯＦ大腸菌発現ベクター（Invitrogen, Carlsbad, California, U.S.A.）に結合することができる。組換えｓＣＤ７４をＩＰＴＧ導入下で大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に発現させることができる。ｓＣＤ７４タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーにより微生物溶解物から精製することができる。ｈｒＭＩＦのビオチン化を製造業者の指示に従って実行することができる（Biotin Labeling Kit; Roche Molecullar Biochmicals, Indianapolis, Indiana, U.S.A.）。
【０１５７】
９６穴プレートに６０μｌ／穴の精製可溶性ＣＤ７４（ＣＤ７４７３−２３２）を０．１ｍｇ／ｍｌでコーティングし、一晩４℃でインキュベートすることができる。プレートをＴ−ＴＢＳで洗浄し、その後、一晩４℃でＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（登録商標）（Pierce, Rockford, Illinois, U.S.A.）中でインキュベートすることができる。ブロッキング緩衝液を除去後、抗−ＣＤ７４、変性ＭＩＦ、ＭＩＦ又は変異体ＭＩＦを様々な濃度で室温３０分間インキュベートすることができる。その後０．２μＭのビオチン−ＭＩＦをプレートに直接加え、一晩４℃でインキュベートする。阻害アッセイのため、様々な濃度の当該化合物を０．２μＭビオチン−ＭＩＦで暗所で室温３０分間プレインキュベートした後、プレートに加えて一晩インキュベートすることができる。プレートをＴ−ＴＢＳで４回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＡＰ（R & D systems, Minneapolis, Minnesota, U.S.A.）をウェルに加えて暗所でさらに１時間室温でインキュベートする。洗浄後、６０μｌ／穴のＰＮＰＰ（Sigma）を加えて暗所で４０５ｎｍで読み込むことができるまで発展させることができる。
【０１５８】
ＭＩＦ触媒活性部位に対する仮想スクリーニング
コンピュータ的方法を、ＭＩＦの有力な小分子阻害剤を１８００万個までスクリーニングするのに用いうる。当該戦略は、本明細書で開示するように、標的結合部位がＭＩＦ結合ポケットの基底部メチオニン（Ａ２）であることを指示して始める。本標的残基は以前報告された仮想スクリーニング（Ｏｒｉｔａら、２００１）とは異なり、本明細書のデータは、本アプローチを用いて他の化合物を見出すことができることを示す。ＭｅｔＡ２を標的とするのに加え、変異データの結果は、ＭＩＦ／ＭＩＦ受容体相互作用に必須であることが見出された領域及び／又は触媒機能に必須であることが見出された領域を含むことを組み込むことができる。異なるスコアリングアルゴリズムがある様々な仮想スクリーニングソフトウェアを、ＭＩＦの触媒活性及び生物学的活性に対して試験するためのリード化合物を同定するためのコンセンサススコアに到達するために運用できる。最新版のＤＯＣＫ（Ｅｗｉｎｇら、２００１）、ＦｌｅｘＸ（Ｒａｒｅｙら、１９９６）及びＣＳＣＯＲＥ（登録商標）（Tripos, St. Louis, Missouri, U.S.A.）を、ＤＯＣＫ６．１（フレキシブル受容体を許容する）、Ａｕｔｏｄｏｃｋ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、１９９６）、Ｓｕｒｆｌｅｘ（Ｊａｉｎ、２００３）及びＭｏｌｅｇｒｏ（Ｔｈｏｍｓｅｎ＆Ｃｈｈｓｔｅｎｓｅｎ、２００６）があるよりフレキシブルなプロトコールを用いて検討することができるより小規模の結合データベースを得るためにより大規模なデータベースを前スクリーニングするために用いることができる。１以上の方法及びスコアリング技術を用いる利点は、いかなる系にも適用可能な普遍的な方法がないことである。これらを組み合わせた場合、「ヒット」率が高まり、誤差陽性率が軽減する。
【０１５９】
商業的に入手可能な化合物を調査でき、含有することができる小分子データベースは；サイバル（Ｓｙｂｙｌ）生成ガステイジャー（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ）チャージ１９９０個の小分子を含有するＮＣＩ多様性セット、現在４，６００，０００以上の小分子を含有し、ＡＭＳＯＬ算出部分チャージがより正確であるＺＩＮＣライブラリ（これは、ＡＣＤライブラリが変化したもので、緩慢なリピンスキの法則に従った大きさ、ｌｏｇＰ、Ｈ−結合受容体及び供与体の数でフィルタリングされた多数の分子を有する（Ｗａｌｔｅｒｓら、１９９９；Ｗａｌｔｅｒｓ及びＭｕｒｃｋｏ、２００２；Ｌｉｐｉｎｓｋｉ、２０００））及び１４，０００，０００以上のの固有かつ商業的に入手可能な構造を有するケムナビゲーター（Ｃｈｅｍｎａｖｉｇａｔｏｒ）（Ｗａｌｔｅｒｓ及びＭｕｒｃｋｏ、２００２）アイリサーチ（ｉＲｅｓｅａｒｃｈ）ライブラリである。アイリサーチライブラリはＺＩＮＣライブラリとの重複を確認することができ、固有の構造は新規のライブラリを形成することができる。アイリサーチのため、２Ｄデータベースコンコード（ＣＯＮＣＯＲＤ）は、３Ｄ構造を生成するのに用いることができる。
【０１６０】
図７に示したデータは、Ｌｕｄｉ（Accelrys）ソフトウェア及びＡＣＤライブラリ（Ｃｏｒｉｎａ及びＧｅｎｆｒａを用いて変換された）を用いて固定のドッキング手順を用いて生成したものである。しかしながら、Ｌｕｄｉは上記のドッキングソフトウェア同様実行しない場合があり、自由度及び部分チャージが制限される。開始ＤＯＣＫスクリーニングは、グリッドスペーシング０．３Ａ、コンタクトカットオフ４．５Ａ及びエネルギーカットオフ１０Aを用いることができる。ＡＭＢＥＲ（Ｃｏｒｎｅｌｌら、１９９５）チャージはＭＩＦ標的結合ポケットのグリッド生成に用いられうる。固定リガンドドッキングは、上位１０，０００分子の接触スコア、化学的スコア及びエネルギースコアを組み合わせて実行することができる。これらは、その結果、完全自由度ドッキングに用いることができる。同様のアプローチは他の仮想スクリーニングソフトウェアに用いることができる。プロトコールは結果に応じて適応することができる。
【実施例９】
【０１６１】
仮想コンビナトリアルライブラリスクリーニングを介した化合物の最適化及び受容体結合データ解析
本実施例は、ＭＩＦの同定し試験した阻害剤及び実施例９で概要した標的仮想スクリーニングの当該方法論を用いて同定された固有の鋳型に基づく。点変異体の受容体結合／触媒活性由来の仮想コンビナトリアルライブラリスクリーニング及びデータ分析を、化合物最適化を推定するために用いうる。
【０１６２】
仮想コンビナトリアルライブラリ生成及びスクリーニング
サイバルソフトウェアＬＥＧＩＯＮ（登録商標）（Ｔｈｏｒｐｅら、１９９９）により、公知の化学的合成反応を合成的に獲得しうる化合物のライブラリを生成することができるコンビナトリアルライブラリの生成に基づく反応をさせることができる。これにより、試薬及び反応のリストが各新規な化合物のために生成されるため、現実に作製されうる分子の設計の可能性が高まる。もしくは、ＬＥＧＩＯＮ（登録商標）は、ユーザに対するシステム変更をコア分子の特定部位にさせることができる製品に基づく態様で用いられうる。当該ライブラリはその後、ＭＩＦ結合ポケット中のリガンド及び受容体の構造的自由度を可能にするフレキシブルドケッティングソフトウェアを用いてより全体的に評価することができる。本プロセスは、実施例８で見出されたいかなる新規な生物学的に活性な化合物にもまた用いられうる。当該手順はより活性で新規な類似体の結果ではなく、ユーザが特定した部位で添付の側鎖のライブラリを用いる、改変インシリココンビナトリアル生成プログラムＣＯＭＢＩＬＩＢＭＡＫＥＲ（登録商標）（Ｃｒａｍｅｒら、１９９８；Ｐｅａｒｌｍａｎ及びＳｍｉｔｈ、１９９９）を用いることができる。実施例８で得られたＭＩＦ変異データは、ＭＩＦ／ＭＩＦ受容体相互作用及び／又は触媒活性に重要な残基側鎖をカバーする分子を「成長させる」鋳型領域に指向するために用いることができる。
【０１６３】
化合物最適化及び合成スキーム
理論に拘束されることなく、ＭｅｔＡ２位で結合するＭＩＦの基底部の足場となっているのがヨード基であるため、４−ヨード−６−フェニルピリミジン及び関連化合物はＭＩＦの他のリガンドから固有である（図１５）。ピリミジン環はＮ３とＮｅＡ６４（骨格相互作用）及びＮ１とＬｙｓＡ３２側鎖との２の水素結合を形成する。フェニル基をＴｙｒＡ３６に重ねることによりさらに安定化する。化学的最適化には以下の幾つかの可能性がある（図１６）：１）ヨード基を改変して水素結合をＭｅｔＡ２に形成する（ＩをＣＨ２ＯＨで置換する）；２）フェニル環の第２位のヒドロキシル基を導入すると、ピリミジンのＮ１位へ水素結合させるはずであり、ＬｙｓＡ３２側鎖との静電気的相互作用（Ｏ−ＮＨ３）が高まるはずである；３）フェニル基の第３位のＣＨ２ＣＨ２ＯＨによる置換により、ＬｙｓＡ６６側鎖と相互作用できるはずである；４）Ｈ−結合受容体又は供与体によるフェニル基の第４位の置換によりＴｙｒＡ３６のＯＨとの相互作用が高まる；５）Ｈ−結合受容体又は供与体によるフェニル基の第５位の置換によりＴｒｐＡ１０８（ＮＨ）との相互作用を高めることができる；６）Ｈ−結合受容体又は供与体によるフェニル基の第５位及び第６位の置換によりＴｙｒＣ９５（ＯＨ）との相互作用を高めることができる；７）Ｈ−結合受容体又は供与体によるピリミジン環の開環での置換によりＳｅｒＡ６３との相互作用を高めることができる（図１５）。実施例８で得られた変異データは、どの残基を標的とすべきかという重要な糸口を提供することができ、それゆえ、調製し試験することが望まれる誘導体を決定するために重要な役割を担うことができる。
【０１６４】
合成スキームをＭＩＦ 阻害剤化合物４−ヨード−６−フェニルピリミジンの誘導化のために記載する(スキーム1)。
【０１６５】
【表１】
2009541214.tif 000008
【０１６６】
本スキームは、実施例８で記載された仮想スクリーニング戦略から同定された他の化合物の合成研究の生成された鋳型としての役目を果たすことを意味する。立体電子空間は最初にリード化合物付近にマッピングされる。その結果、すぐに利用可能な商業的な開始材料及び試薬から、合成配列は最小限の工程を適用して設計される。本合成プランの利点に加え、置換基を環の１つに組み込む場合の順序を改変することができる。加えて、必要であれば、置換基に機能を付与することができる（例えば、アルコールの酸化又は新たな置換反応）。それ自体試験に有望な候補物質である商業的に利用可能な開始材料６から１の合成を単一の工程ですることができる（Ｓａｋａｍｏｔｏら、１９８０）（ｅｑ１）。
【０１６７】
【表２】
2009541214.tif 000009
【０１６８】
アルコール誘導体２−４の合成は、この２工程配列中の第１及び第２工程でスズキカップリングを用いた共通の配列（スキーム１）を用いて達成できる（Ｇｏｎｇ及びＰａｕｌｓ、２０００；Ｗａｎｇら、２００５；Ｓａｙｇｉｌｉら、２００４）。本合成の他の利点は、商業的なボロン酸が商業的に利用可能な開始材料７であることであり、ヒドロキシ基に何か困難なことがあれば、スキーム中に示したように様々な保護試薬で簡易に保護することができる。合成５は公開された手順に基づき（Ｓａｗａｙａｍａら、１９７７）、ｅｑ２に示す。
【０１６９】
【表３】
2009541214.tif 000010
【０１７０】
コア構造として当該化合物４−ヨード−６−フェニルピリミジンを最初に用いて、上記の示した代表的な合成スキーム（スキーム１）により、本ＭＩＦアンタゴニストの他の有力な類似体を同定することができる。さらに、実施例８に記載した仮想スクリーニング研究により、サイバルソフトウェア生成コンビナトリアルライブラリを用いた分析に利用可能な所望の他の分子を産生することができ、その後、リード誘導体の合成をすることができる。ＭＩＦ−依存性受容体結合／触媒研究の拡張変異分析で、新規な置換基群又は本明細書で開示されたコア構造の拡張を用いて、より適切に標的とされるいくつかのアミノ酸残基を明らかにすることができる。
【実施例１０】
【０１７１】
同定されたＭＩＦアンタゴニストの触媒及び生物学的阻害活性のスクリーニング及び評価
実施例８に記載されたＭＩＦ−依存性触媒及び受容体結合の阻害試験に加えて、全ての候補ＭＩＦ阻害化合物を、２の非依存性インビトロＭＩＦ生物学的アッセイで試験することができる。全てのリード誘導体抗−ＭＩＦ化合物及び新規に同定された分子を触媒及び受容体結合阻害活性について最初に試験することができる（実施例８参照）。ＨＩＦ安定化及び細胞遊走における当該化合物の触媒／受容体結合遮断活性、阻害効果を試験した後、酵素又は受容体結合阻害に関して全ての化合物を評価することができる。
【０１７２】
ＣＤ７４に結合するＭＩＦの要求性をＨＩＦ１α安定化アッセイで試験することができる。実際、以前の研究では、ＣＤ７４は前立腺癌細胞浸潤及び足場依存性を要求されることが示されており、当該効果を遮断するためにＩＳＯ−１の能力が必要であるようだ（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）。図９に示すように、ＭＩＦ−／−細胞は、ＰＨＤ−阻害剤誘導性ＨＩＦ１α安定化を著しく低下させることを示すＭＩＦ欠損細胞系でＭＩＦｓｉＲＮＡ形質転換細胞に対する表現型と類似する。ＣＤ７４−／−繊維芽細胞について、低酸素又はＰＨＤ阻害剤によるＨＩＦ−１α誘導性を安定化する機能を同様に試験することができる。加えて、生物学的アッセイで阻害することが見出された候補化合物を、ＭＩＦ−／−及びＣＤ７４−／−マウス胎児繊維芽細胞中の特異性を試験することができる。
【０１７３】
候補ＭＩＦ阻害剤によるＨＩＦ−Ｉα不安定化スクリーニング
ＭＩＦがＨＩＦ安定性に中心的な役割を果たすという本明細書で開示された知見は、膵臓腺癌細胞系でなされた研究に由来する。当該研究はさらに、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２膵臓腺癌細胞は極めてＭＩＦ阻害剤−介在性ＨＩＦ不安定化に感受性であることを示す（図９Ａ及び９Ｂ）。本細胞系は候補ＭＩＦアンタゴニストの大規模試験に用いることができる。本インビトロスクリーニングをスケールアップするために、ヒト細胞溶解物中の全ＨＩＦ１αを検出するためのＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡベースアッセイを用いることができる（R&D systems)。初期の研究では、ＭＩＦｓｉＲＮＡ及びＭＩＦアンタゴニスト化合物＃１６（５０μＭ）は共にＣｏＣｌ２−誘導性ＨＩＦ安定化を、本ＨＩＦ１αＥＬＩＳＡで評価したコントロールの〜７５−９０％阻害することを示す。ＭＩＡ−Ｐａｃａ−２細胞を２４穴プレートに５×１０５細胞／穴で１６時間プレーティングすることができる。培地は、全て二重ウェルで、０．１％ＤＭＳＯ（−コントロール）、５０μＭ＃１６（＋コントロール）及び５、５０μＭ濃度の試験阻害剤を含有する新鮮な培地に取り替えることができる。１時間後、細胞をさらに６時間、１５０μＭＣｏＣｌ２で負荷をかけることができる。当該細胞を２回ＰＢＳでリンスした後、キットに含まれる溶解緩衝液を、製造業者の指示に従って当該細胞を溶解するために用いることができる。指示に従って、ＨＩＦ１α捕捉抗体を予めコーティング及び遮断をすることができ、希釈細胞溶解物をＨＩＦ１αＥＬＩＳＡプレート上でアッセイすることができる。
【０１７４】
ＨＩＦ１α蓄積に対する活性を示す当該化合物は、さらに拡張して、濃度限界範囲を広げて試験することができる。具体的には、１０倍区分用量を５ｎＭ〜５０μＭの範囲で試験することができる。リードＭＩＦ阻害化合物は、低酸素−誘導性（ＰＨＤ−阻害剤誘導性に反し）ＨＩＦ−１αに対する阻害活性を評価することによりさらに確認することができる。さらに、化合物は、ＥＬＩＳＡによる低酸素−誘導性ＶＥＧＦ発現及びウェスタンブロットによるＧＬＵＴ−１発現レベルで試験することができる。
【０１７５】
ヒト膵臓腺癌細胞遊走
ＭＩＦ−受容体結合が、ＭＩＦ阻害剤の全ての阻害効果に要求されるかを決定することは望ましいかもしれない。Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒらは、腫瘍細胞遊走及び足場依存性にはＣＤ７４が必要である（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００６）ことを教唆するが、ＭＩＦ−依存性ＨＩＦ安定化にＣＤ７４が必要であることはそれほど明確に教唆していない。すなわち、全ての候補抗−ＭＩＦ化合物は、両アッセイで相関する阻害活性がみられるか及びこれはＭＩＦ受容体結合及び／又は触媒活性に相関するのかを決定するためにヒト膵臓腺癌細胞系でのＨＩＦ安定化及び細胞遊走の阻害を試験することができる。
【０１７６】
簡潔には、２×１０５ＭＩＡ−ＰａＣａ−２ヒト膵臓腺癌細胞を０．３ｍｌの遊走培地（ＤＭＥＭ、０．５％ＢＳＡ）に再懸濁して、ベヒクル（０．１％Ｍｅ２ＳＯ）、５μＭ又は５０μＭの候補阻害剤の存在で３０分間インキュベートすることができる。コラーゲンコーティングした（ＰＢＳ-中に１０μｇ／ｍｌで一晩）トランスウェルチャンバーを０．４ｍｌｓ遊走培地におき、細胞を上部チェンバー中におくことができる。１６時間後、上部チェンバーから細胞を拭き取り、膜底をクリスタルバイオレットで染色し、イソプロパノール／酢酸で可溶化して、ＯＤ５７０で分光光度をよみとることができる。細胞遊走について阻害効果を呈する当該化合物は、さらに、濃度範囲を広げて試験することができ（例えば、５ｎＭ〜５０μＭ）、ＩＣ５０濃度を測定することができる。
【０１７７】
リードＭＩＦ阻害剤のＨＩＦ−１α安定化及び特異性のＭＩＦ受容体（ＣＤ７４）要求性
ＣＤ７４がＭＩＦ−依存性ＨＩＦ安定化に必須か否かを決定するために、野生型（Ｃ５７ＢＩ／６）及びＣＤ７４−／−（Ｃ５７ＢＩ／６）ＭＥＦを、二重に２４穴プレートに１６時間ほとんど密集状態でプレーティングすることができる。同時に、ＭＩＦ−／−マウス線維芽細胞（Ｃ５７ＢＩ／６）を等密度で二重にプレーティングすることができる。１６時間後、細胞をさらに６時間低酸素（１％Ｏ２）又はＰＨＤ阻害剤で負荷をかけ、本明細書の実施例に記載した全ＨＩＦ−１αＥＬＩＳＡによって、細胞溶解物の相対的なＨＩＦ−１α安定化を検討することができる。（内部ＥＬＩＳＡ標準カーブから推定した）ＨＩＦ濃度は、低酸素又はＣｏＣｌ２により誘導されるＨＩＦ安定化がＭＩＦ−欠損細胞で観察される不全と同様にＣＤ７４−欠損細胞でも不全であるか否かを決定するために評価することができる（図９）。
【０１７８】
リード抗−ＭＩＦ化合物、野生型、ＭＩＦ−／−及びＣＤ７４−／−線維芽細胞（全てＣ５７ＢＩ／６）の特異性を試験するために、上記のようにプレーティングした細胞を、有効であることを予め決定したＨＩＦ阻害用量で１時間処理し、ＣｏＣｌ２で６時間惹起することができる。その後、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルをＥＬＩＳＡで決定し、野生型ＭＥＦの相対的低下をＭＩＦ−／−及びＣＤ７４−／−細胞でみられた低下と比較することができる。
【０１７９】
最後に、インビトロ細胞毒性研究は、毒性の証拠があることが疑われる場合は、当該実験と並行して実行することができる。簡潔には、細胞は、２４時間１μＭ〜１００μＭの範囲の濃度でベヒクル（ＤＭＳＯ）又は候補化合物で処理することができる。当該研究では、ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）（Serotec Limited, Oxford, United Kingdom）として知られるテトラゾリウム還元の方法を用いることができる。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（登録商標）試薬は、４時間細胞に対して１０％溶液で添加することができ、波長励起５３０ｎｍ及び放出５９０ｎｍで蛍光プレートリーダーで読込むことができる。毒性は、各薬剤で処理したウェルとベヒクルで処理したウェルを割り算して評価することができる。
【実施例１１】
【０１８０】
ＨＩＦ−ｌα依存性態様における膵臓腫瘍増殖及び病理学の改変許容能力を決定するための同定したＭＩＦアンタゴニストの試験
リード抗−ＭＩＦ化合物処理したマウスの移植膵臓癌腫異種移植の腫瘍増殖及び関連する低酸素適応を評価することができ、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１α標的遺伝子（ＣＡ９、ＧＬＵＴ−１）の免疫組織化学的分析を、血管新生、低酸素、アポトーシス及びネクローシス等の様々な組織学的バイオマーカーと共に評価することができる。重要なＨＩＦ１αｓｉＲＮＡ又はドミナント干渉変異体を発現するコントロール膵臓癌腫細胞系をＭＩＦ及びＨＩＦ特異性を決定するために阻害剤処理の有無で試験することができる。
【０１８１】
リードＭＩＦアンタゴニスト処理したマウスのヒト膵臓異種移植の腫瘍増殖特性決定
抗−ＭＩＦ阻害剤４−ヨード−６−フェニルピリミジン；２）４−ヨード−６−フェニルピリミジンの同種のもの；及び３）実施例８〜１０で同定されたリード化合物及び最適リード候補化合物；の存在下でＣＤ７４陽性ヒト膵臓腺癌細胞系の固形腫瘍への進行の可能性を試験することができる。ヌードＢａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）雌マウスの脇腹に２×１０６ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞を皮下注射した。マウスごとに１のインプラントを行い、各試験は１０マウス／群（合計２０マウス／群で繰り返される）からなることができる。コントロールマウスはトウモロコシ油のみを注射することができ、試験マウスは問題となっている抗−ＭＩＦ化合物を注射することができる（開始化合物濃度＝５０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内２４時間毎；トウモロコシ油で希釈）。腫瘍増殖曲線を得るために、腫瘍の３の相互に直交する直径をノギスを用いて毎日測定でき、質量は、以下の式（Ｔａｅｔｌｅら、１９８７）：質量（ｍｇ）＝（幅、ｍｍ）２×（長さ、ｍｍ）／２を用いて測定できる。測定した質量を相対平均処置群腫瘍体積±ＳＥＭとしてプロットすることができる。コントロール腫瘍が総体重の１０％（〜２ｇｍ）に達した後、当該マウスを安楽死させることができ、各群からの小サブセットを、以下の項に記載するように、低酸素及び低酸素マーカー決定並びにＩＨＣ及び血管分布指標のため、頸部脱臼で屠殺することもできる。
【０１８２】
膵臓腫瘍異種移植モデル中の腫瘍増殖に対してＭＩＦに特異的であること同様最も阻害することが見出された化合物をその後、定着した腫瘍のモデルで試験することができる。簡潔には、マウスの皮下に２×１０６のＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞をインプラントすることができ、本明細書で記載されるように、質量の測定にノギスを用いることができる。腫瘍が２００ｍｇになったら、各群に同程度の腫瘍サイズである１０の群にマウスを分ける。コントロールマウスはトウモロコシ油のみで注射することができ、試験マウスは試験化合物（５０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内２４時間毎；トウモロコシ油で希釈）を注射することができる。上記のように、インプラント開始から腫瘍増殖曲線を作成することができる。コントロール腫瘍が総体重の１０％（〜２ｇｍ）に達した後、当該マウスを安楽死させることができ、各群からの小サブセットを、以下の項に記載するように、低酸素及び低酸素マーカー決定並びにＩＨＣ及び血管分布指標のため、頸部脱臼で屠殺することもできる。当該アッセイで（ＭＩＦ−欠損ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞と比較して）最大活性があることが見出された化合物を、腫瘍増殖阻害のための用量反応決定及び最大耐量試験に用いることができる。
【０１８３】
ＭＩＦアンタゴニストで処置されたマウス中のヒト膵臓異種移植の低酸素特性、マーカー及び血管分布の決定
４−ヨード−６−フェニルピリミジン並びに他のリード及び／又は同種の化合物を用いた初期試験のため、腫瘍低酸素マーカー及び腫瘍−関連血管新生を評価することができる。簡潔には、腫瘍負荷をかけて、低酸素の麻酔の交絡効果のため、マウスを頚部脱臼により屠殺することができる。マウスの屠殺直前に、ＨＹＰＯＸＹＰＲＯＢＥ−１（商標）（６０ｍｇ／ｋｇ； Southcot Corporation, Research triangle Park, North Carolina, U.S.A.）をマウスのサブグループに静脈内投与することができる。コントロール及び抗ＭＩＦアンタゴニスト処置マウス由来の代表的な腫瘍の小切片を液体ニトロゲンで急速冷凍することができる。重量測定後、ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（商標）（Sakura Finetechnical Co., Ltd., Tokyo, Japan）に異種移植を行い、解析まで−７０℃に保存することができる。連続した切片を各移植標本から切断することができる。各標本の１切片をＨ＆Ｅで染色することができる。他に、他の連続切片を、製造業者のプロトコールに従い、アポトーシスｉｎ  ｓｉｔｕ検出キット（和光純薬化学工業株式会社、大阪、日本）を用いてｉｎ  ｓｉｔｕ  ＴＵＮＥＬアッセイを用いて行うことができる。連続切片で、各々、抗因子ＶＩＩＩ（抗マウス）及び抗ピモニダゾール染色により血管内容物及び低酸素を分析することもできる。他の連続切片で、ＩＨＣによりＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＣＡ９及びＧＬＵＴ−１（ＨＩＦ−標的遺伝子）について分析することができる。低酸素領域間、血管分布及びアポトーシスの相関関係で、コントロールマウスから当該腫瘍の関係について評価することができる。
【０１８４】
抗-ＭＩＦ化合物に対する膵臓腺癌腫瘍増殖及び感受性を発現するＭＩＦ-欠損及び優勢阻害ＨＩＦ１αの試験
理論に拘束されることなく、ＭＩＦアンタゴニストによる膵臓腫瘍増殖で観察される減衰効果は、ＭＩＦ−依存性ＨＩＦ１α安定化阻害並びにその結果の低酸素適応軽減及び血管新生のため、有力となりうる。この可能性をさらに試験するために、有力なアンタゴニストの相対的な効果を、ＭＩＦ発現欠損ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞系又は優勢阻害変異体ＨＩＦ−１αを発現するＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞系で試験することができる。さらに、コントロール対ＭＩＦ又はＨＩＦ不全細胞系の固形腫瘍への進行能の非負荷比較により、主としてＭＩＦがＨＩＦ−１αの調節を介して腫瘍増殖に影響を与えるのではないかという重要な洞察をもたらすことができる。
【０１８５】
優勢阻害ＨＩＦ−１α（ｄ／ｎＨＩＦ−１α）変異体は、ＤＮＡ−結合ドメイン及び二量体ドメインを含むが、いかなるトランス活性化ドメイン０２−制御ドメインも欠損している（Ｆｏｒｓｙｔｈｅら、１９９６）。優勢阻害ＨＩＦ−１α−発現細胞系は、ｐＬＸＳＮ−ＨＡ−ｄｎＨＩＦ−１αでフェニックスパッケージング細胞系を一過性トランスフェクトとすることにより作製されるレトロウイルス上清でＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞をレトロウイルス感染させて生成することができる。ＭＩＦ−欠損細胞系は、最近、ＭＩＦ特異的ＭＩＦｓｉＲＮＡで安定性トランスフェクトすることにより開発された（図１７Ａ及び１７Ｂ）。簡潔には、２×１０６のコントロール細胞、ＭＩＦ−欠損細胞（クローン７−図１７Ａ及び１７Ｂ）又はｄ／ｎＨＩＦ１α発現する細胞を、１０のヌードＢａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（２０ｇｍｓ）群に皮下注射することができる。初期試験のため、各群の腫瘍増殖曲線は、上記のように質量測定により評価することができる。リード化合物の研究のため、２０マウス群に、コントロール細胞、ＭＩＦ−欠損細胞（クローン７-図１７）又はｄ／ｎＨＩＦ１α発現細胞で注射することができる。各群の１／２（１０マウス）をトウモロコシ油のみで注射することができ、他の１／２を問題のリード化合物で注射することができる（５０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内に各２４時間；トウモロコシ油で希釈）。腫瘍の質量は上記の項目で記載されたようにノギスで２４時間毎に測定することができる。コントロール腫瘍が総体重の１０％（〜２ｇｍ）に達した後、当該マウスを安楽死させることができ、各群からの小サブセットを、以下の項に記載するように、低酸素及び低酸素マーカー決定並びにＩＨＣ及び血管分布指標のため、頸部脱臼で屠殺することもできる。
【０１８６】
インビボでのＭＩＦアンタゴニストの最大耐量
個体間の薬剤感受性の多様性のため、最大耐量という概念を有することが望ましく、治療的手段が見込みのある臨床医薬のためにある。最大耐量（ＭＴＤ）研究を実行することによりその相対的毒性を測定するために有望な抗−ＭＩＦリード化合物に関する試験を実行することができる。５０ｍｇ／ｋｇが耐性であることが決定された場合、次に、用量を増加させていくと同様に耐性であるか否かを、マウスの小群（例えば、５マウス／群）で、最初は１００ｍｇ／ｋｇから、それから２００、３００、４００及び最終的に５００ｍｇ／ｋｇの用量に随時増量する手順で決定することができる。７日間にわたり化合物を毎日腹腔内に注射する間、最終注射後４日間まで、マウスの疼痛又は不快症状を厳密にモニターすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
要すれば、可溶性サイトカイン／成長因子、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、構造ベース創薬のための固有の強力な標的を表す。ＭＩＦは、腫瘍の増殖、運動性及び低酸素適応をもたらし、ＭＩＦ阻害小分子は全ての当該前主要原性効果を阻害する。ＭＩＦの正常な進行及び生育が不全であるマウスの事実に基づく当該知見は、本明細書で開示された有力なＭＩＦアンタゴニストは、現在使用されているものよりも毒性が少なく、より有力な抗癌疾患治療の新創出を表すことが強く示唆される。
【０１８８】
本願で開示された法定主題の様々な詳細は、本願で開示された法定主題の範囲から逸脱することなく変更されうること及び、よりさらに、上記記載は例示の目的のみであり、制限のためではないことは理解されるはずである。
【０１８９】
【表４】
2009541214.tif 000011
【０１９０】
【表５】
2009541214.tif 000012
【０１９１】
【表６】
2009541214.tif 000013
【０１９２】
【表７】
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【０１９３】
【表８】
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【０１９４】
【表９】
2009541214.tif 000016
【０１９５】
国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０２／２２０１０号
国際出願公開番号第ＷＯ９９／０７４０９号
国際出願公開番号第ＷＯ９９／３２６１９号
国際出願公開番号第ＷＯ００／０１８４６号
国際出願公開番号第ＷＯ００／４４８９５号
国際出願公開番号第ＷＯ００／４４９１４号
国際出願公開番号第ＷＯ００／６３３６４号
国際出願公開番号第ＷＯ０１／３６６４６号
国際出願公開番号第ＷＯ０１／０４３１３号
国際出願公開番号第ＷＯ０１／２９０５８号
国際出願公開番号第ＷＯ０１／３６６４６号
国際出願公開番号第ＷＯ０１／６８８３６号
国際出願公開番号第ＷＯ０１／７５１６４号
国際出願公開番号第ＷＯ０１／９２５１３号
国際出願公開番号第ＷＯ０２／０５５６９２号
国際出願公開番号第ＷＯ０２／０５５６９３号
国際出願公開番号第ＷＯ０２／４４３２１号
【０１９６】
【表１０】
2009541214.tif 000017
【０１９７】
【表１１】
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【０１９８】
【表１２】
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【０１９９】
【表１３】
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【０２００】
【表１４】
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【配列表フリーテキスト】
【０２０１】
配列番号１はヒトＭＩＦポリペプチド配列である。
配列番号２はＭＩＦからのｓｉＲＮＡ標的配列である。
配列番号３はＭＩＦ−標的ｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖である。
配列番号４はＭＩＦ−標的ｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖である。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2009541214.tif 000033
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2009541214.tif 000036
【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009541214.tif 000042
【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009541214.tif 000044