(57)【要約】本教示は、親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用した、試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を開発する方法を提供する。種々の態様において、本教示内容は、試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、タンパク質の標準物質を使用せずに開発する方法を提供する。種々の実施形態において、試料は、その試料の由来元となる生理学的流体に少量しか存在しないタンパク質のタンパク質分解断片を含む。本教示内容の方法は、例えば、約１アトモル／マイクロリットル未満の濃度の血中タンパク質に関する質量分析ベースの検定を開発するのに応用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、該タンパク質の標準物質を使用せずに開発するための方法であって、
タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上を、該タンパク質のアミノ酸配列及び該タンパク質の遺伝子配列の翻訳の１つ以上に基づき予想する工程；
該タンパク質分解断片を衝突誘起解離に供する場合に、該タンパク質の該タンパク質分解断片の１つ以上から産生される断片の１つ以上を予想する工程；
タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料を提供する工程；
該試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに充填する工程；
該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、該タンパク質の該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該予想されたタンパク質分解断片の該予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；
該マルチプルリアクションモニタリングを使用して、該予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する該ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程；
該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、予想されたタンパク質分解断片のｍ／ｚ値を包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行う工程；
該実質的に完全な産物イオンスキャンの親娘イオン遷移に伴うイオンシグナルを測定する工程；並びに
試料中の該タンパク質の存在を検定するための親娘イオン遷移として、該実質的に完全な産物イオンスキャンの親娘イオン遷移を選択する工程であって、該検定用の選択された親娘イオン遷移が、該透過された親イオンが該タンパク質のタンパク質分解断片である場合の遷移に対応し、該選択された親娘イオン遷移が、該タンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高のイオンシグナル及びほぼ最高のシグナルノイズ比のうちの１つ以上を有する、工程、
を含む、方法。
【請求項２】
タンパク質のタンパク質分解断片を含む前記試料が、生理学的流体、細胞溶解物、組織溶解物、及びこれらの組み合わせの少なくとも１つに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生理学的流体が、血液、血清、血漿、汗、涙液、尿、脳脊髄液、腹膜液、リンパ、膣分泌物、精液、髄液、腹水液、唾液、痰、胸滲出物、及びこれらの組み合わせの１つ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生理学的流体が血液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質のタンパク質分解断片化の前に、前記血液試料から少なくとも６種類の最も豊富なタンパク質が枯渇されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血液試料が血漿又は血清である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記血液試料が約１０万アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記血液試料が約１万アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記血液試料が約１０００アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液試料が約１００アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液試料が約１０アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液試料が約１アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質のタンパク質分解断片がトリプシンペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質のタンパク質分解断片を含む前記試料が更に、該タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の濃度標準も含み、該濃度標準が、該生体試料中の該タンパク質の存在の検定として選択された親娘イオン遷移に基づいて選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程が、三連四重極イオントラップ質量分析計を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記イオントラップがリニアトラップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マルチプルリアクションモニタリングを使用して、前記予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する前記ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程が、
該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する測定されたイオンシグナルが、前記指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの配列を決定すること；並びに
該配列決定され透過された親イオンの配列が、前記タンパク質のタンパク質分解断片に対応する場合に、該配列決定され透過された親イオンを包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行うこと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの電荷状態を測定する工程も更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定された完全な産物イオンスキャンの少なくとも１つ以上に基づいて、前記タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の質量値、及び前記改善され予想されたタンパク質分解断片の前記予想された衝突誘起解離断片の質量値を改善する工程；
前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、該タンパク質の該改善され予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該予想されたタンパク質分解断片の該改善され予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；並びに
該マルチプルリアクションモニタリングを使用して、前記改善され予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含するｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程、
も更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
血液試料中に少量しかないタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、該タンパク質の標準物質を使用せずに開発するための方法であって、
タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上を、該タンパク質のアミノ酸配列に基づいて予想する工程；
該タンパク質分解断片を衝突誘起解離に供する場合に、該タンパク質の該タンパク質分解断片の１つ以上から産生される断片の１つ以上を予想する工程；
タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料を提供する工程であって、該試料が約１０万アトモル／マイクロリットル未満の濃度の該タンパク質を含む血液試料に由来する、工程；
該試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに充填する工程；
該クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、該タンパク質の該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該予想されたタンパク質分解断片の該予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；
該マルチプルリアクションモニタリングを使用して、該予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する該ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程；
該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する該測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、予想されたタンパク質分解断片のｍ／ｚ値を包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行う工程；
該実質的に完全な産物イオンスキャンの親娘イオン遷移に伴うイオンシグナルを測定する工程；並びに
生体試料中の該タンパク質の存在を検定するための親娘イオン遷移として、該実質的に完全な産物イオンスキャンの親娘イオン遷移を選択する工程であって、該検定用の選択された親娘イオン遷移が、該透過された親イオンが該タンパク質のタンパク質分解断片である場合の遷移に対応し、該選択された親娘イオン遷移が、該タンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高のイオンシグナル及びほぼ最高のシグナルノイズ比のうちの１つ以上を有する、工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記タンパク質のタンパク質分解断片化の前に、前記血液試料から少なくとも６種類の最も豊富なタンパク質が枯渇されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記血液試料が血漿又は血清である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液試料が約１万アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記血液試料が約１０００アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記血液試料が約１００アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液試料が約１０アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記血液試料が約１アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質の前記タンパク質分解断片がトリプシンペプチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質のタンパク質分解断片を含む前記試料が更に、前記タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の濃度標準も含み、該濃度標準が、該生体試料中の該タンパク質の存在の検定として選択された親娘イオン遷移に基づいて選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程が、三連四重極イオントラップ質量分析計を使用することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記イオントラップがリニアトラップを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記マルチプルリアクションモニタリングを使用して、前記予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する前記ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程が、
前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、前記指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの配列を決定すること；並びに
該配列決定され透過された親イオンの配列が、前記タンパク質のタンパク質分解断片に対応する場合に、前記配列決定され透過された親イオンを包含するｍ／ｚ値範囲について前記実質的に完全な産物イオンスキャンを行うこと、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの電荷状態を測定する工程も更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記測定された完全な産物イオンスキャンの少なくとも１つ以上に基づいて、前記タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の質量値、及び前記改善され予想されたタンパク質分解断片の前記予想された衝突誘起解離断片の質量値を改善する工程；
前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、該タンパク質の該改善され予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該予想されたタンパク質分解断片の該改善され予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；並びに
該マルチプルリアクションモニタリングを使用して、該改善され予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する該ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程、
も更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、該タンパク質の標準物質を使用せずに開発するための方法であって、
タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上を、該タンパク質のアミノ酸配列に基づいて予想する工程；
該タンパク質分解断片を衝突誘起解離に供する場合に、該タンパク質の該タンパク質分解断片の１つ以上から産生される断片の１つ以上を予想する工程；
タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料を提供する工程；
該試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに充填する工程；
該クロマトグラフィーカラムからの該溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、該タンパク質の該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該予想されたタンパク質分解断片の該予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；
該マルチプルリアクションモニタリングを使用して、該予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する該ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程；
該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する該測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、該透過された親イオンの電荷状態を測定する工程；
該予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する該測定されたイオンシグナルが、該指定されたシグナル閾値を超える場合に、該透過された親イオンの配列を決定する工程；
該配列決定され透過された親イオンの配列が、該タンパク質のタンパク質分解断片に対応する場合に、該配列決定され透過された親イオンを包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行う工程；
該実質的に完全な産物イオンスキャンの親娘イオン遷移に伴うイオンシグナルを測定する工程；並びに
生体試料中の該タンパク質の存在を検定するための親娘イオン遷移として、該親娘イオン遷移を選択する工程であって、該親娘イオン遷移が、該タンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高のイオンシグナル及びほぼ最高のシグナルノイズ比のうちの１つ以上を有する、工程、
を含む、方法。
【請求項３６】
タンパク質のタンパク質分解断片を含む前記試料が、生理学的流体、細胞溶解物、組織溶解物、及びこれらの組み合わせの少なくとも１つに由来する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生理学的流体が、血液、血清、血漿、汗、涙液、尿、脳脊髄液、腹膜液、リンパ、膣分泌物、精液、髄液、腹水液、唾液、痰、胸滲出物、及びこれらの組み合わせの１つ以上を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生理学的流体が血液を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質のタンパク質分解断片化の前に、前記血液試料から少なくとも６種類の最も豊富なタンパク質が枯渇されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記血液試料が血漿又は血清である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記血液試料が約１０万アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記血液試料が約１万アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記血液試料が約１０００アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記血液試料が約１００アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記血液試料が約１０アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記血液試料が約１アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質の前記タンパク質分解断片がトリプシンペプチドを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質のタンパク質分解断片を含む前記試料が更に、該タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の濃度標準も含み、該濃度標準が、前記生体試料中の該タンパク質の存在の検定として選択された親娘イオン遷移に基づいて選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記クロマトグラフィーカラムからの前記溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程が、三連四重極イオントラップ質量分析計を使用することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
前記イオントラップがリニアトラップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
前記測定された完全な産物イオンスキャンの少なくとも１つ以上に基づいて、前記タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の質量値、及び前記改善され予想されたタンパク質分解断片の前記予想された衝突誘起解離断片の質量値を改善する工程；
前記クロマトグラフィーカラムからの溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、該タンパク質の該改善され予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、該予想されたタンパク質分解断片の該改善され予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；並びに
該マルチプルリアクションモニタリングを使用して、該改善され予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する該ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程、
も更に含む、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００５年１０月１３日に出願された仮特許出願第６０／７２７，１８７号（この内容は、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料の分析の多くの用途では、試料中に低濃度でしか存在しない一連のタンパク質の絶対的又は相対的な定量データを得ることが強く望まれている。これは特にバイオマーカーの発見及びバリデーションに当てはまることであり、幾つかの理由から重要なこととされている。例えば、適切な検出限界を達成するには極めて高い感度が必要になる場合があり、又、試料が複雑である（例えば、数桁にわたる濃度で多数のタンパク質が存在する）ために、干渉が生じ、検出限界が損なわれる場合があることが理由として挙げられる。更に、対象タンパク質又はこれに対応するＤＮＡ配列が知られていても、対象タンパク質の標準試料がなく、従って、試料中のタンパク質を定量化することができる検定又は方法の開発が極めて困難な場合もある。
【０００３】
従来、殆どの臨床的に関連するマーカーは、疾患の進行又は治療に関連する血清タンパクレベルを正確に測定できる免疫学的検定によって検出される。しかし、プロテオミクス及び転写プロファイリング法により発見される候補タンパク質マーカーの数が増えてきている中、ヒトの臨床用試料において正確な定量化を行うために使用できる抗体試薬がない場合が多い。更に、殆どの臨床的に関連するバイオマーカーは生体試料中に低濃度でしか存在しない。従って、これらのタンパク質が信頼性の高い疾患の予想因子であり、最終的には臨床診断に使用できることを確認するには、体液、組織、又はその他の生体基質に由来する多くの試料の中からバイオマーカーを定量分析する実用的な手法を開発することが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本発明は、親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用した、試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を開発する方法を提供する。種々の態様において、本教示内容は、試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、タンパク質の標準物質を使用せずに開発する方法を提供する。種々の実施形態において、試料は、その試料の由来元となる生理学的流体（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）に少量しか存在しないタンパク質のタンパク質分解断片を含む。
【０００５】
本教示内容の方法は、生理学的流体、細胞溶解物、組織溶解物を含むがこれらに限定されない幾つかの生体試料の内の何れかに存在するタンパク質に関する質量分析ベースの検定を開発するのに応用することができる。生体試料は種々の供給源、条件、又はこれらの両方に由来してよく、例えばこれらには、対照群対実験群、種々の時点で採取した試料（例えば、配列を形成するため）、疾患群対健常群、実験群対疾患群、汚染群対非汚染群等がある。生理学的流体の例には、血液、血清、血漿、汗、涙液、尿、脳脊髄液、腹膜液、リンパ、膣分泌物、精液、髄液、腹水液、唾液、痰、胸滲出物、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０００６】
種々の実施形態において、本教示内容の方法は、約１０万アトモル／マイクロリットル未満、約１万アトモル／マイクロリットル未満、約１０００アトモル／マイクロリットル未満、約１００アトモル／マイクロリットル未満、約１０アトモル／マイクロリットル未満、及び／又は約１アトモル／マイクロリットル未満の濃度の血中タンパク質に関する質量分析ベースの検定を開発するのに応用することができる。このような方法は例えば、種々の実施形態でタンパク質バイオマーカー検定を開発するのに使用することができる。
【０００７】
質量分析ベースのタンパク質検定を開発するに当たり、本教示内容では、親娘遷移モニタリングの質量分析法を使用する。「親娘イオン遷移モニタリング」即ち「ＰＤＩＴＭ」という用語は、例えば、質量分析を使用した測定であって、第１の質量分離器（しばしば質量分析の第１のディメンションと呼ばれる）の透過される質量電荷比（ｍ／ｚ）の範囲が、分子イオン（しばしば「親イオン」又は「前駆イオン」と呼ばれる）をイオン断片化装置（例えばコリジョンセル、光解離領域等）に透過して、断片イオン（しばしば「娘イオン」と呼ばれる）を生成するように選択され、第２の質量分離器（しばしば質量分析の第２のディメンションと呼ばれる）の透過されるｍ／ｚ範囲が、１つ以上の娘イオンを、娘イオンシグナルを測定する検出器に透過するように選択される、測定を指す。モニタリングされる親イオンと娘イオン質量の組み合わせは、モニタリングされる「親娘イオン遷移」と呼ばれる。任意のモニタリングされる親イオンと娘イオンの組み合わせの、検出器における娘イオンシグナルは、「親娘イオン遷移シグナル」と呼ばれる。本教示内容では、タンパク質のタンパク質分解断片の親イオンを生成し、娘イオンのイオンシグナルを測定するが、任意のモニタリグされるタンパク質分解断片イオンと娘イオンの組み合わせの、検出器における娘イオンシグナルは、「親娘イオンシグナル」と呼ばれる。
【０００８】
親娘イオンシグナル及び本明細書に記述するその他のイオンシグナルは、例えば娘イオンピークの強度（平均、中央値、最大等）、娘イオンピークの面積、又はこれらの組み合わせに基づいていてもよい。
【０００９】
種々の実施形態において、親娘イオン遷移モニタリングは、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）（選択反応モニタリングとも呼ばれる）を含む。ＭＲＭの種々の実施形態において、任意の親娘イオン遷移のモニタリングは、対象親イオンのｍ／ｚ上に配置した第１の四極子を対象親イオンを透過する第１の質量分離器として使用すること、並びに対象娘イオンのｍ／ｚ上に配置した第２の四極子を対象娘イオンを透過する第２の質量分離器として使用することを含む。種々の実施形態においては、例えば、第１の質量分離器を対象親イオンのｍ／ｚ上に配置して親イオンを透過し、対象娘イオンのｍ／ｚ値を含むｍ／ｚ範囲にわたって第２の質量分離器でスキャンを行い、更に例えばスペクトルからイオン強度プロファイルを抽出することによって、ＰＤＩＴＭを行ってよい。例えばＭＲＭ等のＰＤＩＴＭを行うのに、タンデム質量分離器（ＭＳ／ＭＳ）、又はより一般的には多次元質量分離器（ＭＳｎ）を使用してもよい。種々の実施形態において、質量分離器は、三連四重極リニアイオントラップ質量分離器である。
【００１０】
種々の態様において、本教示内容は、試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、タンパク質の標準物質を使用せずに開発する方法であって、（ａ）タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上を、前記タンパク質のアミノ酸配列及び前記タンパク質の遺伝子配列の翻訳の１つ以上に基づき予想する工程；（ｂ）前記タンパク質の前記タンパク質分解断片を衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に供する場合に前記タンパク質分解断片の１つ以上から産生される断片の１つ以上を予想する工程；（ｃ）タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料を提供する工程；（ｄ）前記試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに充填する工程；（ｅ）前記クロマトグラフィーカラムからの前記溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、前記タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ範囲を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、前記予想されたタンパク質分解断片の前記予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；（ｆ）前記マルチプルリアクションモニタリングを使用して、前記予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する前記ｍ／ｚ値範囲の前記イオンシグナルを測定する工程；（ｇ）前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、予想されたタンパク質分解断片のｍ／ｚ値を包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行う工程；（ｈ）前記実質的に完全な産物イオンスキャンの前記親娘イオン遷移に伴う前記イオンシグナルを測定する工程；並びに（ｉ）生体試料中の前記タンパク質の存在を検定するための親娘イオン遷移として、前記実質的に完全な産物イオンスキャンの親娘イオン遷移を選択する工程であって、前記検定用の選択された親娘イオン遷移が、前記透過された親イオンが、前記タンパク質のタンパク質分解断片である場合の遷移に対応し、前記選択された親娘イオン遷移が、前記タンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う前記測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高の親娘イオンシグナル及びほぼ最高のシグナルノイズ比の１つ以上を有する、工程を含む、方法を提供する。種々の実施形態において、前記予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する前記ｍ／ｚ値範囲の前記イオンシグナルを測定する工程は、（１）前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、前記指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの配列を決定すること；並びに（２）前記配列決定され透過された親イオンの配列が、前記タンパク質のタンパク質分解断片に対応する場合に、前記配列決定され透過された親イオンを包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行うことを含む。種々の実施形態において、このイオンシグナル測定��程は更に、前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの電荷状態を測定する工程も含む。
【００１１】
種々の態様において、本教示内容は、血液試料中に少量しかないタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、前記タンパク質の標準物質を使用せずに開発する方法であって、（ａ）タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上を、前記タンパク質のアミノ酸配列及び前記タンパク質の遺伝子配列の翻訳の１つ以上に基づいて予想する工程；（ｂ）前記タンパク質分解断片を衝突誘起解離に供する場合に、前記タンパク質の前記タンパク質分解断片の１つ以上から産生される断片の１つ以上を予想する工程；（ｃ）タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料を提供する工程であって、前記試料が約１０万アトモル／マイクロリットル未満の濃度の前記タンパク質を含む血液試料に由来する、工程；（ｄ）前記試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに充填する工程；（ｅ）前記クロマトグラフィーカラムからの前記溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、前記タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ範囲を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、前記予想されたタンパク質分解断片の前記予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；（ｆ）前記マルチプルリアクションモニタリングを使用して、前記予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する前記ｍ／ｚ値範囲の前記イオンシグナルを測定する工程；（ｇ）前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、予想されたタンパク質分解断片のｍ／ｚ値を包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行う工程；（ｈ）前記実質的に完全な産物イオンスキャンの前記親娘イオン遷移に伴う前記イオンシグナルを測定する工程；並びに（ｉ）生体試料中の前記タンパク質の存在を検定するための親娘イオン遷移として、前記実質的に完全な産物イオンスキャンの親娘イオン遷移を選択する工程であって、前記検定用の選択された親娘イオン遷移が、前記透過された親イオンが前記タンパク質のタンパク質分解断片である場合の遷移に対応し、前記選択された親娘イオン遷移が、前記タンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う前記測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高の親娘イオンシグナル及びほぼ最高のシグナルノイズ比の１つ以上を有する、工程を含む、方法を提供する。種々の実施形態において、前記予想された衝突誘起解離断片の前記ｍ／ｚ値の１つ以上を包含する前記ｍ／ｚ値範囲のイオンシグナルを測定する工程は、（１）前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、前記指定された強度閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの配列を決定すること；並びに（２）前記配列決定され透過された親イオンの配列が、前記タンパク質のタンパク質分解断片に対応する場合、前記配列決定され透過された親イオンを包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行うことを含む。種々の実施形態において、このイオンシグナル測定工程は更に、前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの電荷状態を測定する工程も含む。
【００１２】
種々の態様において、本教示内容は、試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、前記タンパク質の標準物質を使用せずに開発する方法であって、（ａ）タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上を、前記タンパク質のアミノ酸配列及び前記タンパク質の遺伝子配列の翻訳の１つ以上に基づき予想する工程；（ｂ）前記タンパク質のタンパク質分解断片を衝突誘起解離に供する場合に前記タンパク質分解断片の１つ以上から産生される断片の１つ以上を予想する工程；（ｃ）タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料を提供する工程；（ｄ）前記試料の少なくとも一部をクロマトグラフィーカラムに充填する工程；（ｅ）前記クロマトグラフィーカラムからの前記溶離液の少なくとも一部をマルチプルリアクションモニタリングに供する工程であって、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された親イオンのｍ／ｚ範囲が、前記タンパク質の前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上のｍ／ｚ範囲を含み、各マルチプルリアクションモニタリングスキャンの前記透過された娘イオンのｍ／ｚ範囲が、前記予想されたタンパク質分解断片の前記予想された衝突誘起解離断片の１つ以上のｍ／ｚ値を含む、工程；（ｆ）前記マルチプルリアクションモニタリングを使用して、前記予想された衝突誘起解離断片のｍ／ｚ値の１つ以上を包含する前記ｍ／ｚ値範囲の前記イオンシグナルを測定する工程；（ｇ）前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの電荷状態を測定する工程；（ｈ）前記予想されたタンパク質分解断片の１つ以上の衝突誘起解離断片に対応する前記測定されたイオンシグナルが、前記指定されたシグナル閾値を超える場合に、前記透過された親イオンの配列を決定する工程；（ｉ）前記配列決定され透過された親イオンの配列が、前記タンパク質のタンパク質分解断片に対応する場合に、前記配列決定され透過された親イオンを包含するｍ／ｚ値範囲について実質的に完全な産物イオンスキャンを行う工程；（ｊ）前記実質的に完全な産物イオンスキャンの前記親娘イオン遷移に伴う前記イオンシグナルを測定する工程；並びに（ｋ）生体試料中の前記タンパク質の存在を検定するための親娘イオン遷移として、前記親娘イオン遷移を選択する工程であって、前記親娘イオン遷移が、前記タンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う前記測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高の親娘イオンシグナル及びほぼ最高のシグナルノイズ比の１つ以上を有する、工程を含む、方法を提供する。
【００１３】
当業者であれば理解する通り、「完全な産物イオンスキャン」という用語は、断片化に供した親イオンのプロダクトイオンに対応するｍ／ｚ値にわたる質量分析スキャンを指す。本明細書で使用される「完全な産物イオンスキャン」では、０からプロダクトイオンで可能な最大ｍ／ｚ値までの全てのｍ／ｚ値を包含するスキャンは必要とされない。当業者であれば理解する通り、質量分析計は、効果的に達成できるｍ／ｚ値の下限に限定されてよく、例えば遊離水素イオン断片（Ｈ＋）等の所定の質量以下のプロダクトイオンは対象とならない場合がある。例えば、質量が約３０ａｍｕ未満のイオンをスキャン又は検出しなくても、約３０ａｍｕから、可能な最も高いプロダクトイオン質量に対応するｍ／ｚ値までのプロダクトイオンを質量分析スキャンすれば、「完全な産物イオンスキャン」であると考えられる。
【００１４】
本教示内容の種々の態様の種々の実施形態において、生体試料中の１つ以上の特定のタンパク質（例えば、バイオマーカータンパク質）の存在の検定は、タンパク質が例えば血液試料等の試料中に少量しか存在しない場合に開発される。種々の実施形態において、前記試料は、約１０万アトモル／マイクロリットル未満、約１万アトモル／マイクロリットル未満、約１０００アトモル／マイクロリットル未満、約１００アトモル／マイクロリットル未満、約１０アトモル／マイクロリットル未満、及び／又は約１アトモル／マイクロリットル未満の濃度のタンパク質を含む。種々の実施形態において、本教示内容による試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定は、例えば試料中のタンパク質濃度のダイナミックレンジを下げることにより、より低濃度のタンパク質にも拡張することができる。例えば、より高濃度のタンパク質の除去、試料中の対象タンパク質の濃縮、又はこれらを組み合わせて行い、クロマトグラフィーカラムに充填する試料中の対象タンパク質の相対的な量を増加させることによって、複雑な混合物中のより低濃度の対象タンパク質を検出することができる。
【００１５】
種々の実施形態において、試料は細胞、組織、及び生理学的流体の抽出物から調製される。生理学的流体の例には、血液、血清、血漿、汗、涙液、脳脊髄液、尿、腹膜液、リンパ、膣分泌物、精液、髄液、腹水液、唾液、痰、胸滲出物、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。試料は種々の供給源、条件、又はこれらの両方に由来してよく、例えばこれらには、対照群対実験群、種々の時点で採取した試料（例えば、配列を形成するため）、疾患群対健常群、実験群対疾患群、汚染群対非汚染群等がある。
【００１６】
対象タンパク質のタンパク質分解断片を生成するには、幅広い種法を使用することができる。タンパク質からタンパク質分解断片を生成するのに好適な技法には、何れかの配列特異的開裂プロセスが含まれる。好適な酵素配列特異的開裂技法の例には、例えばセリンプロテアーゼ、及びチオールプロテアーゼ等のプロテアーゼを使用した開裂が含まれる。例えば、タンパク質分解断片（例えば、ペプチド）は、トリプシンによるペプチド結合の酵素加水分解で複数のペプチドタンパク質分解断片を生成することにより、タンパク質から生成することができる。
【００１７】
種々の実施形態において、タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料は更に、本教示内容に基づき前記タンパク質の検定として使用するようにタンパク質分解断片を選択したことにより作成される、タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上の濃度標準も含む。例えば、濃度標準は、対象タンパク質から生成されるタンパク質分解ペプチドの１つに対応する安定同位元素標識ペプチドであってよい。
【００１８】
種々の態様においては、１つ以上の試料中の対象タンパク質の存在を測定するように設計された検定が提供される。この検定は例えば、新薬発見又は診断検定のための種々の生化学経路の発見に使用するバイオマーカーバリデーション検定であってよい。この検定は例えば、疾患又は病態の診断、疾患又は病態の予後診断、又はこれらの両方であってよい。
【００１９】
種々の態様において、本教示内容は、本発明の方法の機能を、例えばフロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ等があるがこれらに限定されないコンピュータ可読媒体に記録したコンピュータ可読命令として埋め込んだ製造物品を提供する。
【００２０】
本教示内容の前記及びその他の態様、実施形態、目的、特徴及び利点は、付随する図面と共に以下の説明からより詳細に理解することができる。これらの図面において、各図に記載される同じ参照記号は一般的に同じ特徴及び構成要素を指す。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の原理を例示することに力点が置かれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（種々の実施形態の詳細な説明）
質量分析ベースのタンパク質検定を開発するに当たり、本教示内容では、親娘イオン遷移モニタリングの質量分析法を使用する。種々の実施形態において、親娘イオン遷移モニタリングは、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）を含む。図１を参照すると、ＭＲＭスキャンは、例えば、対象タンパク質分解断片（即ち、親イオン１０２）の質量をイオン断片化装置１０３に透過するように第１の質量分離器１０１を設定することによって行うことができる。第１の質量分離器１０１の設定は、例えば、実質的にタンパク質分解断片の質量を中心とした約３質量単位幅の質量ウィンドウ内のイオンを透過するように第１の質量分離器を設定することによって可能である。種々の実施形態において、イオン断片化装置１０３の衝突エネルギーは、イオン断片化装置内のこのペプチド（娘イオン）の選択された荷電断片の生成を促進するように選択することができる（ここで、イオン断片化装置は、ＣＩＤを行う衝突ガス、及びイオン断片１０４の回収と断片イオンの透過を促進する四極子を含む）。第２の質量分離器１０５は、対象娘イオン１０６を検出器１０７に透過して、透過された娘イオンのイオンシグナルを生成するように（例えば、実質的に娘イオンの質量を中心とした約１質量単位幅の質量ウィンドウ内のイオンを移動するように第２の質量分離器を設定することによって）設定される。
【００２２】
種々の実施形態において、親イオンと娘イオンの各組み合わせのＭＲＭパラメータは、親イオン（対象タンパク質のタンパク質分解断片）に関連する選択された娘イオンのシグナルを最適化するように選択することができる。種々の実施形態において、この実験では質量分離器で通常約１０ｍｓ〜約２００ｍｓであるがこれらに限定されない滞留時間を使用することができ、又、ＭＲＭ遷移を急速に変更できる機能により、ＬＣ−ＭＳの一回の実行で混合物に含まれる複数の構成要素をモニタリングすることができる。例えば、ＬＣ−ＭＳの１回の実行で５０〜１００種類の構成要素を一度にモニタリングすることができる。特定の期間を使用することにより、ＬＣ−ＭＳの１回の実行で更に多くのＭＲＭ遷移をモニタリングすることができる。
【００２３】
本教示内容では、ＰＤＩＴＭを実行するのに幅広い質量分析システムを使用することができる。好適な質量分析システムは、２つの質量分離器と、この２つの質量分離器の間のイオン飛行経路に配置されたイオン断片化装置とを備える。好適な質量分離器の例には、四重極型、ＲＦマルチポール、イオントラップ、飛行時間（ＴＯＦ）、タイムドイオンセレクターを伴うＴＯＦが含まれるが、これらに限定されない。好適なイオン断片化装置には、衝突誘起解離（ＣＩＤ、衝突支援解離（ＣＡＤ）とも呼ばれる）、光誘起解離（ＰＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、ポストソース分解、又はこれらの組み合わせの原理で動作するものが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
質量分析器の好適な質量分析システムの例には、三連四重極、四重極リニアイオントラップ、四重極ＴＯＦシステム、及びＴＯＦ−ＴＯＦシステムを含むものが含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
質量分析システムに好適なイオン源には、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザイオン化（ＭＡＬＤＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、及び大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）源が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＥＳＩイオン源は、ＬＣコラムに由来するイオン化試料を質量分離器に導入する手段として機能することができる。ＥＳＩの幾つかの望ましい特徴の１つは、クロマトグラフィーカラムから得た分画が、カラムから直接ＥＳＩイオン源に移動できるという点である。
【００２６】
種々の実施形態において、質量分析システムは、親イオンを選択しその断片娘イオンを検出する三連四重極質量分析計を含む。種々の実施形態において、第１の四極子（本明細書でＱ１と称する）は親イオンを選択する。第２の四極子（本明細書でＱ２と称する）は、十分に高い圧力及び電圧で維持されることから、数多くの低エネルギー衝突が生じ、親イオンの一部が断片化する。第３の四極子Ｑ３は、選択した娘イオンを検出器に透過するように選択される。
【００２７】
種々の実施形態において、三連四重極質量分析計中の四極子の１つ以上は、リニアイオントラップとして構成することができる（例えば、終端電極を追加し、四極子内に実質的に長い円筒状のトラップ容量を提供する）。種々の実施形態において、第１の四極子Ｑｌは親イオンを選択する。第２の四極子Ｑ２は十分に高い衝突ガス圧及び電圧で維持されることから、数多くの低エネルギー衝突が生じ、親イオンの一部が断片化する。第３の四極子Ｑ３は、断片イオンをトラップし、充填時間後に、例えば終端電極にパルスして、選択された娘イオンをイオントラップから出すことによって、選択された娘イオンを検出器に透過するように選択される。所望の充填時間は、例えば断片イオンの数、イオントラップ内の電荷密度、種々のペプチドの溶離間の時間、デューティサイクル、励起状態のイオン種若しくは多重荷電イオンの分解時間、又はこれらの組み合わせに基づいて決定することができる。
【００２８】
図２を参照すると、試料中のタンパク質の存在を検出するための質量分析ベースの検定を開発する本発明の種々の実施形態の概念図が示されている。種々の実施形態において、本教示内容では、対象タンパク質の既知の又は予想された配列に基づき、対象タンパク質の最初の推定ＭＲＭ遷移を決定する。タンパク質配列情報は、アミノ酸配列データベース（例えば、Ｃｅｌｅｒａ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ等）、ＤＮＡデータベース、遺伝子配列の翻訳、直接の実験測定、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない幾つかの供給源から得ることができる。本発明の方法では、タンパク質配列２１０から、タンパク質のタンパク質分解断片（例えば、ペプチド断片）を予想し、イオン断片化装置の断片方法によるタンパク質分解断片の断片化から得たこれらのタンパク質分解断片の断片（娘イオン）を予想する。種々の実施形態において、イオン断片化方法は衝突誘起解離（ＣＩＤ）を含み、予想される娘イオンは対応するタンパク質分解断片のＣＩＤから得たものである。従って、タンパク質の理論的なタンパク質分解から生成されるタンパク質分解断片（例えば、ペプチド）を使用して、対応するタンパク質分解断片の１つ以上の娘イオンを決定し、それによって最初の親娘イオン遷移２２０を決定し、ＭＲＭでモニタリングすることができる。この遷移は、しばしばＭＳ１／ＭＳ２という記述で列挙されることが多く、この場合、ＭＳ１は第１の質量分離器によって透過された公称質量電荷比（従って、公称タンパク質分解断片ｍ／ｚ）を指し、ＭＳ２は、第２の質量分離器によって透過された公称ｍ／ｚ（従って、公称タンパク質分解断片娘イオンのｍ／ｚ）を指す。
【００２９】
次いで、対象タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料をＭＲＭ実験に供する。試料は、ＭＲＭ実験に供する前に、例えば試料を濃縮する、干渉試料を分画して除去する、より高濃度のタンパク質の少なくとも一部を除去する等の処理工程に供してよい。試料の少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムに充填され、溶離液の少なくとも一部が質量分析システムに向けられる。質量分析システムを使用して、最初の親娘イオン遷移の１つ以上によるＭＲＭを行い、親娘イオン遷移シグナルを測定する（２３０）。ＭＲＭで検出されているペプチドの同一性を確認するには、ペプチドの依存ＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを得るために情報依存取得実験を使用することができる（２４０）。種々の実施形態において、例えばイオンシグナルが指定されたシグナル閾値を超える場合には、対応するタンパク質分解断片に実質的に完全な産物イオンスキャンが行われる。種々の実施形態において、イオンシグナルが指定されたシグナル閾値を超える場合には、幾つかのリニアイオントラップスキャンが起動され、例えばペプチドの電荷状態及びモノアイソトピック質量を確認する高解像度スキャン（リニアイオントラップを使用した高解像度スキャン）を行うか、及び／又はペプチドの配列を確認する強化プロダクトイオンスキャン（リニアイオントラップを使用したＭＳ／ＭＳスキャン）を行う。
【００３０】
例えば、透過された親イオン及び配列決定された親イオンに完全な産物イオンスキャンを行うことで、検出された親イオンを所望のタンパク質由来のタンパク質分解断片として同定することができる。好ましくは、親イオンは衝突セル中で一連の断片イオンに断片化され、これらの中ではアミノ酸数の多い方から少ない方に並んだイオンのラダーができる。断片化はペプチドの任意の場所で生じる可能性があることから、観察された質量電荷比のスペクトルが生成される。一般的に、断片化スペクトルでは２組の顕著なイオンが観察される。１組はペプチドのＣ末端からアミノ酸を除去した配列ラダーであり（しばしばｙシリーズと呼ばれる）、もう１組はＮ末端からアミノ酸を除去した配列ラダーである（しばしばｂシリーズと呼ばれる）。親イオンの完全又は部分的なアミノ酸配列情報は、断片化スペクトルを解釈することによって得られる。ペプチド内の異なるアミノ酸はそれぞれ異なる質量を有するため、ペプチドの断片化スペクトルは通常そのペプチド配列に特徴がある。
【００３１】
種々の実施形態においては、実験的に測定されたフルスキャンＭＳ／ＭＳスペクトルを使用して、最初に予想された親娘イオン遷移を改善し、改善したＰＤＩＴの組を生成する。ＭＲＭを実行し親娘イオン遷移シグナルを測定する工程２３０は、改善した親娘イオン遷移の１つ以上を使用して繰り返される。この改善及び測定のプロセスは繰り返してもよい。
【００３２】
本教示内容の方法では次いで、生体試料中のタンパク質の存在の検定として親娘イオン遷移を選択する（２５０）。親娘イオン遷移は、（ｉ）親娘イオン遷移の親イオンがそのタンパク質のタンパク質分解断片であること；並びに以下の少なくとも１つに基づいて選択される：（ｉｉ）選択された親娘イオン遷移は、そのタンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高のイオンシグナル（本実施例ではピーク面積で決定）を有すること；（ｉｉｉ）選択された親娘イオン遷移は、そのタンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高のシグナルノイズ比を有すること；（ｉｖ）選択された親娘イオン遷移は、そのタンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、イオンシグナル内にほぼ最少のエラー量を有するイオンシグナルを有すること；（ｖ）選択された親娘イオン遷移は、指定された閾値値を超える定量下限値（ＬＯＱ）、シグナルノイズ比、及び／又は親娘イオンシグナルの１つ以上を有すること。
【００３３】
種々の実施形態において、選択された親娘イオン遷移の娘イオンは、検出レベル（ＬＯＱ）、定量限界（ＬＯＱ）、シグナルノイズ（Ｓ／Ｎ）比、その他のペプチドのその他の娘イオンとの質量類似性等の１つ以上に基づいて選択することができる。種々の実施形態において、ＬＯＱは、使用したＬＣカラム上の試料のアトモルレベル（１０−１８モル）からフェムトモルレベル（１０−１５モル）の範囲内にあり、ダイナミックレンジはＬＯＱよりも３桁〜４桁高いマグニチュードである。
【００３４】
種々の実施形態において、本教示内容の方法は、検定の感度を高めるために（例えば、低濃度のタンパク質を検出しやすくするために）試料を調製する工程を含む。検定の感度を高めるには、例えば、試料中のタンパク質濃度のダイナミックレンジを下げる、試料中の対象タンパク質の相対濃度を増加させる、及びこれらを組み合わせる方法を含むがこれらに限定されない、幾つかの方法を使用することができる。例えば、対象タンパク質が低濃度である場合は、より高濃度のタンパク質を除去する、試料中の対象タンパク質を濃縮する、又はこれらを組み合わせることにより、例えばクロマトグラフィーカラムに充填される試料中の対象タンパク質の相対量を増加させて、達成することができる。質量分析計は理論的には単一分子を検出することができるが、一般的なクロマトグラフィーカラムには、充填できるタンパク質量に実用的な限界がある。
【００３５】
種々の実施形態において、タンパク質のタンパク質分解断片を含む試料は更に、本教示内容に基づきタンパク質の検定として使用するようにタンパク質分解断片を選択されたことにより作成される、タンパク質のタンパク質分解断片の１つ以上の濃度標準も含む。例えば、濃度標準は、対象タンパク質から生成されるタンパク質分解ペプチドの１つに対応する安定同位元素標識ペプチドであってよい。種々の実施形態において、本教示内容は、試料中のタンパク質に関する質量分析ベースの検定を、タンパク質の標準物質を使用せずに開発する方法を提供することを理解されたい。従って、種々の実施形態において、本教示内容は、試料中のタンパク質に関する質量分析検定で使用する濃度標準を決定する方法を提供する。
【００３６】
本教示内容の別の態様において、上記の方法の機能は、汎用コンピュータにコンピュータ可読命令として実装することができる。コンピュータは質量分析システムとは別個のものである場合もあれば、このシステムから脱着可能なものである場合もあり、このシステムに統合される場合もある。コンピュータ可読命令は、例えばＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、Ｃ、Ｃ＋＋、又はＢＡＳＩＣ等の幾つかの高レベル言語の何れか１つにて書かれる場合がある。更に、コンピュータ可読命令は、スクリプト、マクロ、又はＥＸＣＥＬやＶＩＳＵＡＬ  ＢＡＳＩＣ等の市販のソフトウェアに機能を埋め込まれる機能にて書かれる場合もある。加えて、コンピュータ可読命令はコンピュータ上に常駐するマイクロプロセッサを対象としたアセンブリ言語で実装することもできる。例えば、コンピュータ可読命令をＩＢＭ  ＰＣ又はＰＣクローンで実行するように構成する場合は、Ｉｎｔｅｌ  ８０×８６アセンブリ言語で実装することができる。一実施形態において、コンピュータ可読命令は、例えばフロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、磁気テープ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ可読プログラム媒体を含むがこれらに限定されない製造物品に埋め込むことができる。
【００３７】
以下の実施例は、本教示内容の種々の原理を使用した実験を例示するものである。これらの実施例の教示内容は網羅的なものではなく、本発明の適用範囲を制限することを意図したものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１  枯渇ヒト血漿におけるフィブロネクチンの検出及び確認）
本実施例では、ヒト血漿（ここではアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン、ハプトグロビン及び抗トリプシンという最も高濃度に含まれている一般的な血漿タンパク質を枯渇させた）におけるフィブロネクチンの検出及び確認を示している。これは、例えば、検定の結果の信頼性を高めるため、定量化に使用される特異的な保持時間での各ＭＲＭ遷移に関する配列確認情報（フルスキャンＭＳ／ＭＳ）を得るという、今回の検定の確認における重要な工程である。フィブロネクチンは一般的に約５３９７ａｍｏｌ／μＬの濃度のヒト血漿中に存在する。
【００３９】
試料の調製
本実施例では、試料にはヒト血漿が含まれている。この血漿試料は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（「ＭＡＲＳ」スピンカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、（アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン、ハプトグロビン及び抗トリプシンという）最も高濃度に含まれている一般的な血漿タンパク質が枯渇されており、この試料はクロマトグラフィーカラムに充填する前にろ過によって脱塩した。又、この血漿試料は、カラムに充填する前に変性、還元、アルキル化し、トリプシンによって消化しておいた。
【００４０】
クロマトグラフ
ヒト血漿（０．０１μＬ）をＣ１８カラム（７５μｍ×１５ｃｍ、ＬＣパッキング）に充填し、４０分間勾配を使用した逆相ＨＰＬＣ（０．１％ギ酸中の２〜３５％アセトニトリル）によって成分を分離させた。場合によっては、プレカラム脱塩工程を使用した（Ｃ１８トラップ、３００μｍ×５ｍｍ、ＬＣパッキング）。
【００４１】
質量分析装置
ＭＲＭ分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）システム（Ｑ１：単位解像度、Ｑ３：単位解像度）上のＮａｎｏＳｐｒａｙ（登録商標）システム供給源を使用して実施した。各ペプチドのＭＲＭは、ＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて予想するか、ペプチド配列に基づいて設計した。最終検定における各ＭＲＭ遷移及び保持時間の確認には、例示するＭＩＤＡＳＴＭワークフローを使用したＭＲＭ−Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを使用した。
【００４２】
考察
図３Ａは、クロマトグラフィーカラムに充填した血漿約０．０１μＬ（即ち、約５４ａｍｏｌのタンパク質を含む充填した試料）に関するフィブロネクチン３０２のＤＬＱＦＶＥＶＴＤＶＫペプチドのＭＲＭ遷移（６４７．３／７８９．４）を示している。図３Ａは又、本実施例に関するＭＲＭ遷移シグナル３０４も示している。本実施例において、ＭＲＭによるペプチドの検出は、ＭＳ／ＭＳ実験によってペプチド配列を確認して、検出されたペプチドを同定し、フィブロネクチンのタンパク質分解断片（ペプチド）の娘イオン上の配列情報を得るためのＭＳ／ＭＳデータの収集を促進する。図３Ｂは、このようなＭＳ／ＭＳデータ２０６の一例を示している。消化試料は高度に複雑なペプチド混合物（タンパク質分解断片）であるが、ＭＲＭサーベイスキャンデータ３０４では単一のピークのみが観察されている。図３Ｂに示す完全な産物イオンスキャンＭＳ／ＭＳデータ３０６（星印は図３ＡのＭＲＭで使用したＱ３質量を示す）は、ＭＲＭスキャン３０４で観察された単一のピークが、フィブロネクチン由来の標的タンパク質分解断片（ペプチド）であるＤＬＱＦＶＥＶＴＤＶＫであることを確認するのに使用した。本実施例は、複雑な生体混合物中の対象となる標的タンパク質由来のペプチドが、濃度は低いものの、ＭＲＭによって検出し、ＭＳ／ＭＳによって確認できることを示している。
【００４３】
（実施例２  全ヒト血漿試料及び枯渇ヒト血漿試料での評価）
本実施例は、多重法を使用したヒト血漿中の５３個のタンパク質を示すペプチド（タンパク質分解断片）に適用した通り、本教示内容の種々の実施形態に関するデータ及び評価を示す。このうち４７個は、２〜２２％の変化量の同時係数（ＣＶ）（ｎ＝１０）による定量的データをもたらした（検定の７８％はＣＶ＜１０％）。１３７  ＭＲＭを連続して測定した５回の実験（各１０回の反復実行）では、幾つかのペプチドから２〜７％の範囲のＣＶが得られ、本教示内容を使用して複雑な消化物において達成可能な精度を証明している。（下記に示す通り）免疫サブトラクションによる６つの一般的に最も高濃度に含まれるタンパク質の枯渇は、全血漿と比べてＣＶを改善したが、両試料タイプ（枯渇及び非枯渇）とも検体を検出することが可能である。反復消化及び枯渇／消化実験では、それぞれ＞９９．５％及び＞９８．９％の相関係数（Ｒ２）が得られた。各ペプチドの絶対検体特異性は、ＭＲＭ誘発ＭＳ／ＭＳスキャンを使用して明らかにした。Ｌ−セレクチン（０．６７μｇ／ｍＬで測定）及びタンパク質の信頼できる検出では、μｇ／ｍＬレベル以下のタンパク質は、最小限の試料調製で血漿中で定量化することが可能であり、１回の実験で約４〜５桁のダイナミックレンジが得られた。種々の実施例においては、本教示内容を使用してより濃度の低いタンパク質の検出を容易にするために、追加の先行的試料調製を実施することが可能である。このため、種々の実施例において、本教示内容は、バイオマーカーのバリデーションのための強固なプラットフォームを提供することができる。
【００４４】
図４Ａは、本実施例で分析された試料における５３個のタンパク質（この図ではスペースの都合で１０個のタンパク質のみ標識されている）のペプチドに関するＬＣクロマトグラムデータを示しており、図４Ｂはこれらのタンパク質の高濃度の範囲を示している。図４Ｂのひし形の記号は理論的に予想される値であり、正方形の記号は本実施例の実験結果を表している。
【００４５】
試薬
化学物質の入手先は以下の通りである：トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）、ギ酸（Ｓｉｇｍａ）、トリ−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Ｓｉｇｍａ）、及びアセトニトリル（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ）。
【００４６】
試料のタンパク質枯渇及び消化
全ての実験は、健常志願者に由来する単一のヒト血漿試料のアリコートで実施した。枯渇させた試料調製には、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（「ＭＡＲＳ」スピンカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造業者の推奨するプロトコルに十分に従って、６種類の一般的に最も豊富なタンパク質を血漿から枯渇させた。次に、枯渇させた試料を、ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮機（５０００  ＭＷＣＯ、ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）を使用して、５０ｍＭ重炭酸アンモニウムに交換した。又、非枯渇血漿も消化の前に脱塩した。
【００４７】
枯渇血漿試料及び非枯渇血漿試料の両方を変性させ、６０℃の０．０５％  ＳＤＳ及び５ｍＭトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン中で、培養タンパク質によって１５分間還元した。次に、試料はヨードアセトアミド中で１０ｍＭに調製し、２５℃で１５分間暗室培養した。１つのアリコートにはトリプシンを加え（プロテアーゼ：タンパク質比＝１：２０）、３７℃で５時間培養した。
【００４８】
タンパク質のタンパク質分解断片の予想
本実施例では、以下の３つの基本的手法を採用して、このタンパク質のタンパク質分解断片及びＭＲＭ遷移を予想した：（１）配列データベースからのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ消化、及びＣＩＤペプチド断片イオンの予想、（２）利用可能なＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクスサーベイデータからの予想、及び（３）本教示内容、ＭＩＤＡＳＴＭワークフローを使用したタンパク質の全候補ペプチドの包括的なＭＲＭ試験。更に本教示内容の方法を評価するため、ランダムＭＲＭ遷移も発生させた。
【００４９】
Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ
このＩｎ  ｓｉｌｉｃｏ方法では、心血管疾患の一部の側面の実証された又は可能性ある血漿マーカーである１７７組のタンパク質及びタンパク質形態（例えば、内容全体が参考として本明細書で援用される、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎ．Ｌ．  （２００５）  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｋｅｒｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ５６３．１，  ２３−６０を参照）、並びに正常な血漿濃度の推定値が得られる選択された６２個のタンパク質のサブセットを収集した。これらのそれぞれについて予想されたトリプシンペプチドが、関連するＳｗｉｓｓｐｒｏｔ注釈及び以下の一連のコンピュータ化された物理化学的パラメータと共に生成された：例えば、アミノ酸組成物、ペプチド質量、Ｈｏｏｐ−Ｗｏｏｄｓ親水性（例えば、内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｈｏｐｐ，  Ｔ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  Ｋ．Ｒ．  （１９８１）  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８，  ３８２４−８を参照）、並びに逆相（Ｃ１８）クロマトグラフにおける予想保持時間（例えば、全体が参考として本明細書で援用される、Ｋｒｏｋｈｉｎ，  Ｏ．Ｖ．Ｃｒａｉｇ，  Ｒ．，  Ｓｐｉｃｅｒ，  Ｖ．，  Ｅｎｓ，  Ｗ．，  Ｓｔａｎｄｉｎｇ，  Ｋ．Ｇ．，  Ｂｅａｖｉｓ，  Ｒ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｊ．Ａ．  （２００４）  Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅｓ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｉｏｎ  ｐａｉｒ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｈｐｌｃ：  Ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｏｆｆ−ｌｉｎｅ  ｐｈｌｃ−ｍａｌｄｉ  ｍｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３，９０８−１９を参照）。同じタンパク質から最も多く検出されるペプチドのヒット数によって分けられたデータセットでペプチドの個々の「ヒット数」を計算することで算出した実験的検出の尤度指数は、Ａｄｋｉｎｓによって報告されたデータセットに由来するものであった（例えば、全体が参考として本明細書で援用される、Ａｄｋｉｎｓ，  Ｊ．Ｎ．，  Ｖａｒｎｕｍ，  Ｓ．Ｍ．，  Ａｕｂｅｒｒｙ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｒ．Ｊ．，  Ａｎｇｅｌｌ，  Ｎ．Ｈ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｐｏｕｎｄｓ，  Ｊ．Ｇ．  （２００２）  Ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １，９４７−５５を参照）。ペプチド品質の全体指数は、Ｐ、ＫＰ、ＲＰ及びＤＰの内容物の陽性重量、並びにＣ、Ｗ、Ｍ、キモトリプシン部位の陰性重量、特定のＳｗｉｓｓＰｒｏｔ特徴（炭水化物結合、改質残基、配列競合、��は遺伝的変異）、並びに８００未満又は２０００以上の質量を求める式により得た。６２個のタンパク質マーカー候補について予想された３６１９個のトリプシンペプチド（標的当たり６〜４９２個のペプチド）は、長さが１〜２８５個のアミノ酸の範囲内であった。８〜２４個のアミノ酸の範囲内では、７２１個のペプチドにはｃ−末端Ｌｙｓが、６９０個のペプチドにはｃ−末端Ａｒｇがあった。本実施例では、更に試験をするため、Ｃ末端Ｌｙｓで終わるこれらの標的タンパク質の３０個からのペプチドを選択した。最終的に、単一のＣＩＤ断片化規則に基づき、断片イオンを予想し、ＭＲＭ遷移を生じさせるために使用した（例えば、親ｍ／ｚ値を上回る１つ目及び２つ目のｙイオン）。
【００５０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクスサーベイデータ
又、ペプチドは、直接のプロテオミクスサーベイ実験に基づいて選択した。この場合、フルスキャンＭＳによって観察される主要なイオンを、４０００Ｑ  ＴＲＡＰ装置のイオントラップ機能を使用したＭＳ／ＭＳに供する、血漿消化物の伝統的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ペプチドは、所定の親タンパク質の相対的に最高のシグナル強度及びクロマトグラフのピーク形状を示す同定されたものを選択した。更に、ＢｅａｖｉｓのＧＰＭデータベース（例えば、内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｃｒａｉｇ，  Ｒ．，  Ｃｏｒｔｅｎｓ，  Ｊ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｂｅａｖｉｓ，  Ｒ．Ｃ．  （２００４）  Ｏｐｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｓｙｓｔｅｍｆ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ，  ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ，  ａｎｄ  ｓｔｏｒｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔａ．  Ｊ  Ｐｔｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ３，１２３４−４２を参照）を使用して、検出されることの多い標的タンパク質からペプチドを選択した（多重実験）。フルスキャンＭＳ／ＭＳデータから、観察された最も高濃度のｙイオンをＭＲＭ遷移の断片イオンとして使用した。
【００５１】
ＭＲＭ試験
又、種々の血漿タンパク質から測定可能なトリプシンペプチドを探し出すために、ＭＩＤＡＳＴＭワークフローの適合も使用した（例えば、内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｕｎｗｉｎ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｌｅｖｅｒｅｎｔｚ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｇｒａｌｌｅｒｔ，  Ａ．，  Ｈａｇａｎ，  Ｉ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｗｈｅｔｏｎ，  Ａ．Ｄ．  （２００５）  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４，  １１３４−１１４４を参照）。この手法では、タンパク質配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで消化し、有望なｙイオン断片を予想して、全てのペプチドについて許容されるサイズの枠内で理論的なＭＲＭ値を生成した。次に、これらのＭＲＭ値を、特定のペプチドのピークを検出するデータ依存実験にてサーベイスキャンとして使用し、その結果得られる各ＭＲＭピークをフルスキャンＭＳ／ＭＳによって試験し、仮説を立てたペプチドの配列検証を得た。得られたフルスキャンＭＳ／ＭＳデータから、観察された最も高濃度のｙイオンをＭＲＭ遷移の断片イオンとして使用し、これによって、ここでｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予想した結果の更なる改善を行った。
【００５２】
ランダムＭＲＭ
本実施例の疑似ランダムＭＲＭを得る当たっては、２つの手法を使用した。最初の手法では、（Ｅｘｃｅｌ  ＲＡＮＤ機能により）４０８．５〜１２９０．２の間で無作為に分布した１００  ＭＳ１値（実際のＭＲＭの初期セットの最大及び最小値を試験）を使用し、このＭＳ１と実際のＭＲＭの最大値（１４９５．６）との間で無作為に選択したＭＳ２値を対にし、これによって実際のＭＲＭの特性（一般的には＋２荷電状態のペプチド及び＋１荷電断片）を模倣した。２つ目のセットでは、実際のＭＲＭの大規模な表のＭＳ１値の中から無作為に選択した１３１  ＭＳ１値と、同じ表の実際のＭＳ２値から無作為に選択したＭＳ２値とを対にし、各ＭＳ２が１回目と２回目の間で対をなすＭＳ１質量とならなければならないという制限のみを課した（自験の実際のＭＲＭの選択基準に近づけるため）。
【００５３】
標識ペプチド内部標準：ｐｏｌｙＳＩＳ
選択した実験では、一連の安定同位体標識内部標準（ＳＩＳ）ペプチドを、ポリプロテインのトリプシン消化物に混ぜることにより、試料に加え（「ｐｏｌｙＳＩＳ」）、本教示内容の方法の種々の実施形態の性能を評価し、これらの方法の商業的可能性の評価に関する実演を行った。しかし、安定同位体ペプチドは、同位体標識アミノ酸を使用したペプチドの化学合成、及び／又は標識試薬（例えば、ＩＣＡＴＴＭ、ｉＴＲＡＱＴＭ）による合成ペプチドの化学標識を含むがこれらに限定されない幾つかの供給源の何れからも得られる可能性がある。但し、本実施例における標準ペプチドの使用は、本教示内容の方法を評価することを目的としており、標準ペプチドは本教示内容の方法の使用に必ずしも必要なわけではないことを理解されたい。
【００５４】
手短に言えば、このｐｏｌｙＳＩＳタンパク質は、Ｕ−１３Ｃ６  Ｕ−１５Ｎ２標識リジンの存在下における３０の濃縮トリプシンペプチド配列（３０個の血漿タンパク質由来）の無細胞転写及び合成遺伝子コーディングの翻訳によって生成されたものである（天然ペプチドと比べた総質量増分は８ａｍｕ）。これらのペプチドの１３個を今回の試験で使用した（残りはピーク面積＞１ｅ４で再現可能に検出されなかった）。各ペプチドの極限ｃ末端における標識原子の配置は、ｃ末端を含む全ての断片（即ち、ｙ−イオン）が標識による質量シフトを示すのに対し、ｎ−末端を含む全ての断片（従って、より多くのｃ末端残基の１つを喪失した：即ち、ｂシリーズイオン）は、天然（試料由来）標的タンパク質からの対応する断片と同じ質量であるという効果を持つ。これらの特徴（シフトしたｙ−イオン、正常ｂ−イオン）は、ＳＩＳペプチドの断片化パターンの翻訳を容易にする。ｐｏｌｙＳＩＳタンパク質の絶対濃度を測定するため、アリコートを１Ｍ尿素、０．０５％  ＳＤＳ及び５０ｍＭトリスで希釈してｐＨ８とし、Ｎ末端エドマン配列決定に供し、初回濃度である５±１ピコモル／μＬを得た。ｐｏｌｙＳＩＳタンパク質のトリプシン消化物は、表１に示す最終濃度でヒト全血漿消化物及び枯渇ヒト血漿消化物を急増させた。
【００５５】
データ収集及び処理
ｐｏｌｙＳＩＳ標準物質を加えた場合と加えなかった場合の血漿消化物をＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ（Ｄｉｏｎｅｘの一事業部［米国カリフォルニア州サニーベール］）を使用したエレクトロスプレーＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、又は直径７５ミクロンのＣ１８  ＰｅｐＭａｐ逆相カラム（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇ）を備えたＥｋｓｉｇｅｎｔ  ｎａｎｏｆｌｏｗ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍｓ（表１）によって分析したのち、３〜３０％アセトニトリルに０．１％ギ酸を加えた勾配で溶出させた。カラムオーブン（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）を使用してカラムの温度を３５℃に維持した。４０００Ｑ  ＴＲＡＰハイブリッド三連四重極／リニアイオントラップ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）でＮａｎｏＳｐｒａｙ（登録商標）供給源を使用してエレクトロスプレーＭＳデータを収集し、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェア１．４．１（ＩｎｔｅｌｌｉＱｕａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）の定量化法を使用してピークを組み込んだ。ＭＲＭ遷移は、Ｑ１及びＱ３四重極の両方にて単位解像度で取得し、特異性を最大化させた。
【００５６】
ＭＲＭ遷移
本実施例では、ＭＲＭ検定の代表的なペプチドを選択する初回手法において、計算された特徴のみに基づき、広範囲の血漿濃度（６．６×１０８〜１ｆｍｏｌ／ｍＬ正常濃度）に及ぶ各３０個のタンパク質から、８〜１８個のアミノ酸からなる単一のペプチドを選択した（例えば、内容全体が参考として本明細書で援用される、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎ．Ｌ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎ．Ｇ．，  Ｈａｉｎｅｓ，  Ｌ．Ｒ．，  Ｈａｒｄｉｅ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｏｌａｆｓｏｎ，  Ｒ．Ｗ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｔ．Ｗ．  （２００４）  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ｓｉｓｃａｐａ）．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ３，  ２３５−４４を参照）。ＭＲＭは、二重電荷ペプチドイオンを想定し、２＋親イオンのｍ／ｚ値を超える有望なｙ−イオンとして選択された断片を使用し、衝突エネルギーを一般式（ＣＥ＝０．０５×ｍ／ｚ＋５）によって割り当て、ペプチドをＵ−１３Ｃ６  Ｕ−１５Ｎ２リジンによって標識された各ペプチドの単一コピーを含む鎖状ｐｏｌｙＳＩＳタンパク質と表して、設計した。ｐｏｌｙＳＩＳのトリプシン消化を分析したところ、ＭＲＭによって３０個のペプチドが全て検出された。ヒト全血漿の消化物にｐｏｌｙＳＩＳペプチドを加えた場合、同じＭＲＭ信号によって標識ｐｏｌｙＳＩＳペプチドの１９個が検出されたが、（同位体標識質量について調整した同じＭＲＭによって）検出された血漿消化物由来非標識同種ペプチドは１１個のみであった。
【００５７】
単一のタンパク質と異なるペプチドは、ＥＳＩ−ＭＳによる検出能において広範に変動する可能性があることから、代替のＭＲＭ設計法も又、主に従来のペプチドサーベイスキャン法からの実験データに基づき、立証された検出能を有するペプチドに選択基準を適用して、進められた。３時間のＬＣ勾配を使用して、情報依存性データ収集（ＩＤＡ）を使用した分離における主要な二重又は三重電荷イオンについてＭＳ／ＭＳスキャンを収集し、２回目は、最初の実行で検出されたペプチドイオンの時間フィルタリング排除を使用して実施された。これらの結果では、高濃度のアルブミンからフィブロネクチン（正常な血漿中濃度は約１μｇ／ｍＬ）までの５４個の血漿タンパク質が同定された。この実験ＭＳ／ＭＳデータは、ペプチド選択、電荷状態、及び特定の使用条件（即ち、衝突ペプチド断片化によるエレクトロスプレーイオン化）下の最も高濃度のｙ−イオンのｍ／ｚ値に関する明確な情報をもたらし、ＭＲＭの設計の改善を可能にした。これらのＭＲＭをその後の実行で同じ試料を分析するために使用し、任意のＭＲＭ信号でＭＳ／ＭＳスキャンを起動したところ、ペプチドの大部分がクロマトグラムでピークとして検出され、データベースの検索によって同定された。これらのＭＲＭクロマトグラムの大半では、検出されたピークは１回のみであった。
【００５８】
ＭＲＭを使用したペプチド検出感度はフルスキャンＭＳサーベイ法で達成されたよりも高いことが予想されるため、上述のサーベイ実験では検出されなかったタンパク質のための包括的な新規のＭＲＭ設計法が検討された。新規のソフトウェアツールであるＭＩＤＡＳＴＭワークフロー（前述を参照）の適合を使用して、それぞれの多数の高質量ｙ−イオン断片と共に有用なサイズ範囲で予想したトリプシンペプチドを全て選択することにより、一連の標的タンパク質のそれぞれについて、大量のＭＲＭを生成した。これらのＭＲＭを未分画血漿消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳで試験し、観察された任意のピークでＭＳ／ＭＳスキャンを起動し、一度に１〜２個のタンパク質の予想されたトリプシンペプチド全てを含むパネルでグループ分けした（１回の実行につき５０〜１００個のＭＲＭ）。試験した１２個のタンパク質のうち、９個からは信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が約２０を上回るＭＲＭ信号が少なくとも１回は得られた。得られたフルスキャンＭＳ／ＭＳデータを、最終検定で検出を改善する目的でＭＲＭ遷移を精選するために使用した。
【００５９】
上記の手法からのＭＲＭ結果を保存し、ヒト血漿の５３個のタンパク質を表す合計６０個のペプチドを網羅した最適なＭＲＭの組を収集した（表２を参照：７個のタンパク質は２つのペプチドで表されている）。この組にはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法で選択された１８個のペプチドが含まれている（初回の３０個のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏペプチドの内の８個は、濃度が低すぎて検出できない可能性があることから削除し、その代わりにその他の４つの実験データからより適切なペプチドを選択した）。１つを除く全てのペプチドでは、ペプチドの２個の断片（即ち、１ペプチド当たり２つのＭＲＭを使用）が測定され、１１９個のＭＲＭがもたらされた。最後に、消化物血漿試料中に混入させた標的ペプチドの１８個の安定同位体標識内部標準（「ＳＩＳ」）バージョンのＭＲＭ（即ち、ｐｏｌｙＳＩＳタンパク質のトリプシン消化物）を含めた。本実施例に記載した複製実行全てでは、ＭＲＭにつき１８ｍｓｅｃの滞留時間及び測定間の約３秒間のサイクル時間を使用して、結果として得られた１３７個のＭＲＭを測定した。
【００６０】
最終的なＭＲＭ法を構築したら、各特異的ペプチドを示す各ＭＲＭ遷移及びそれぞれの保持時間を再度検証した。ＭＲＭ信号の出現についてはフルスキャンＭＳ／ＭＳを取得し、結果として得られたスペクトルを手動で検査し、特異的なペプチドに対するマッチングを測定した。
【００６１】
考察
何れの体液でのバイオマーカーの早期及び後期のバリデーションにおいても重要な要素は、高度に再現可能な方法で多くの試料を同時に調製及び分析する能力である。本実施例では、ヒト血漿中の５３個のタンパク質を表すトリプシンペプチドから質量分光ＭＲＭ検定を設計した（タンパク質の一覧については表２を参照）。本実施例では、最小限の試料調製による血漿中の約１μｇ／ｍＬの濃度までのタンパク質が、消化ヒト血漿及び枯渇／消化ヒト血漿中で確実に検出され、例えば図４Ｂに例示する通り、この単一の方法での約５桁のダイナミックレンジをもたらした。このため、種々の実施例において、本教示内容は、バイオマーカーのバリデーションのための強固なプラットフォームを提供することができる。
【００６２】
６種類の一連の実験（Ａ〜Ｆ）を実施した。各実験では、単一の試料（同じ注入量）の連続複製ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの実行中に１３７個のＭＲＭからなる同じ組を測定し、適切なピークをＡｎａｌｙｓｔＴＭソフトウェアを使用して統合し、各実行で各ＭＲＭの値（ピーク面積）を得た。ＬＣ  ＭＲＭ法の再現性は、同じ試料で１０個のＬＣ−ＭＲＭ複製を測定することによって評価した。実験Ａ〜Ｅ（それぞれ１０個の複製を実行）を表１に要約した。このような実験群には全（未分画）ヒト血漿（Ｂ、Ｃ）及び高濃度タンパク質を枯渇させた血漿（Ａ、Ｄ、Ｅ）；総ペプチド充填量高値（Ｂ、Ｅ）及び充填量低値（Ａ、Ｃ、Ｄ）；及び種々のクロマトグラムの設定が含まれていた。本実施例の実験の目的の１つは、種々の一般的な血漿消化実験におけるＭＲＭの性能を評価することであった。参照ペプチドの充填量（実験Ａ）は、最も豊富なタンパク質（タンパク質質量の約８０％）を枯渇させた後の１０ｎＬの血漿中に含まれるタンパク質のトリプシン消化によって得た。総ペプチド質量の６０〜７０ｎｇを占めると推定されるこの充填量は、ＭＲＭペプチドのナノ流量クロマトグラムに等しい充填量であることを証明した。実験Ｂ及びＥでは更に高い充填量を使用し、ピーク安定性（高充填量による有害な影響を受けたクロマトグラムの品質）と信号対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比との間のトレードオフ（検体量の増大により改善）を検討した。本実施例では、検討した条件の中で６０〜７０ｎｇの充填量が最適であることが示された。クロマトグラム溶出時間は再現可能であり、平均ＣＶが２％（実験Ｄ）及び２．５％（実験Ｅ）であることが示されている。
【００６３】
再現性の考察
血漿調製の枯渇及び消化工程の両方に関する再現性は、別々の日に同じ血漿試料のアリコートで試料調製を実施したほか、１つの試料を選択し、それを２つに分け、並行して枯渇を行った後、更にそれぞれを分割して同じ日に消化を並行して行うことにより、検討した。何れの試料も後で評価し、関連付けた。結果からは、これらの試料調製法は高度に再現可能な様式で実施できることが示唆されている。
【００６４】
異種調製における試料調製の再現性
図１０Ａ及び１０Ｂを参照すると、図１０Ａは１３７個全てのＭＲＭに及ぶ５件の実験（Ａ〜Ｅ）に関するＭＲＭ値（ピーク面積）のＣＶのヒストグラムを示しており、このようなデータを反復再現性の評価に使用した。ＣＶは、各試料で１０回の反復注入を実施し、各ＭＲＭ遷移のピーク面積を測定した後、１０回の反復における各ＭＲＭの平均、標準偏差及び変動係数を計算することにより測定した。図１０Ａは、５回の実験に関する変動の係数（ＣＶ：平均ピーク面積によって分割された標準偏差）のヒストグラムを示している（各ＭＲＭの個々の値については、５回の実験における１０回の複製分析の平均値及びＣＶを記載した表２に示している）。タンパク質枯渇血漿の分析では、ＭＲＭの６０％以上が１０％未満の同時ＣＶを示し、ほぼ半数が５％未満のＣＶを示した。これらのＭＲＭの幾つか（例えば、α−１−抗キモトリプシン、アポリポタンパク質Ｅ、ヘモペキシン、ヘパリン補因子ＩＩ、プラスミノーゲン、プロトロンビン、フィブリノゲンγ鎖、補体Ｃ４及び因子Ｂ）は、３回の実験にわたって３〜４％の平均同時ＣＶを示し、一般的な良好の臨床免疫検定と同等の精度であった。全（非枯渇）血漿消化の分析では、一般的にこれよりも高いＣＶ値が示された（ＭＲＭの２０〜５０％が１０％未満のＣＶを示した）。このような再現性の測定値は、未処理のピーク面積で計算され、内部標準を使用した補正は行わなかった。測定されたタンパク質の内の４種類は、使用したタンパク質免疫枯渇プロセスにより除去されると推測された。消化物の分析で得られた全血漿試料とタンパク質枯渇血漿試料との平均ピーク面積の比較では、アルブミン（１．３ｅ８が約１ｅ４に減少）、トランスフェリン（１．５ｅ５が約５ｅ３に減少）及びハプトグロブリン（４．６ｅ６が約１ｅ５に減少）の大幅な減少が認められた。本実施例において、α−１−抗トリプシンは、データの分析において、今回除去されたことを確認するのに十分な信頼性をもって検出されなかった。
【００６５】
ＭＲＭに関する多くの測定値はＣＶの改善を期待させるものであったことから、実験では、５９個のペプチドに関して別々に測定した２つの断片の合計値が、１０回の複製実行にわたって個々のＭＲＭよりも少ないＣＶを示すかどうかも検討された。表３に示す通り、５９個のペプチドにおける総ＭＲＭの平均ＣＶは、何れの個別のＭＲＭの平均よりも１〜３％低値であった。合計ＣＶを各ＭＲＭの２つの断片のＣＶの低い方と比較すると、実験群Ａ〜ＥにおけるＣＶの平均減少率は＋０．７％〜−０．１％の範囲であった。これらのＣＶの小幅な改善は、測定時間の倍増（又はモニタリングしたペプチド数の半減）という犠牲を払って得られたものである。
【００６６】
実験群Ｄ及びＥのＣＶとピーク面積との間の相関関係は、少なくとも本実施例のデータ及び条件に関して言えば、１ｅ４未満のピーク面積では１０％未満のＣＶを生じる可能性が少ないことを示唆している（図８）。１ｅ４のカットオフ値は約１０の信号対ノイズ比に対応しており、これは、報告された定量下限のＳ／Ｎの定量的目標と一致する。測定された最高のピーク面積（全血漿消化試料のアルブミンペプチド）は１ｅ８を超えており、このカットオフ値を約４桁以上上回る最大使用ダイナミックレンジを示している。
【００６７】
免疫サブトラクションにより再現性を改善
本実施例では一般的に、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭＡＲＳカラムを使用した最も豊富なタンパク質の免疫サブトラクションによって、非サブトラクトタンパク質のＭＲＭの性能が改善された。この効果は、単に検出感度が改善されたことに起因するのではなく、全血漿ではなく枯渇血漿消化物で検出を実施した今回の組ではペプチドが存在するとしても少数であったためであると考えられる。むしろ、枯渇の効果は、約１／４〜１／５倍という総ペプチド充填量の減少によって達成されたクロマトグラムピーク形状の改善のほか、ＭＲＭピークの信号対ノイズ比に現れていると思われ、これらの両方がＣＶの改善に寄与していると考えられる。図９及び９Ｂは、アルブミンペプチドの除去におけるタンパク質枯渇の利益のほか（主要なピークは図９Ａ）、これによって枯渇試料で小規模なピークが惹起されていることを示している（図９Ｂ）。非枯渇血漿消化物の極めて高い充填量では、ピーク保持時間の大幅なシフトが認められたが、定格充填量の領域での充填では、高濃度のペプチドがＭＲＭ保持時間に及ぼす影響が小規模であった。
【００６８】
免疫枯渇及び消化の再現性の評価
６つ目の実験セット（Ｆシリーズ）では、同じ血漿試料の２つのアリコートでＭＡＲＳ枯渇を実施したのち、各枯渇試料の２つのアリコートを別々に消化した（合計４試料；例えば、Ｆ１＿２は最初の枯渇の２回目の消化であることを示す）。配列の影響を回避するため、無作為化した順序で、試料毎に１３７個のＭＲＭに関する４回の複製の実行を実施した。図５Ｂ及び５Ｃでは、単一の枯渇試料の２つの消化（図５Ｃ、Ｆ１＿１対Ｆ１＿２）、２つの並行して実施した枯渇／消化（図５Ｂ、Ｆ１＿１対Ｆ２＿１）の平均ピーク面積を比較している。複製消化物は、優れた比較可能性を示している（Ｆ１＿１対Ｆ１＿２及びＦ２＿１対Ｆ２＿２のＲ２はそれぞれ０．９９５及び０．９９８）。複製枯渇物（必然的に種々の消化物の影響も含む）はわずかに劣っている（例えば、Ｆ２＿１対Ｆ１＿１又はＦ２＿２対Ｆ１＿２のＲ２はそれぞれ０．９８９及び０．９９１）。（！！図５Ｂ及び５Ｃを図５Ａ及び５Ｂに変更する必要あり）
感度の評価
Ｌ−セレクチン及びフィブロネクチンという血漿中で比較的低い正常濃度の２つのタンパク質は、試験したＭＲＭの中でも明確に検出されている。Ｌ−セレクチンの可溶形態は、約０．６７μｇ／ｍＬ（２６）又は２０．３ｐｍｏｌ／ｍＬという正常濃度で血漿中に存在する３３ｋＤａのタンパク質である。フィブロネクチンは約１．４μｇ／ｍＬ（２７、（２８）、又は５．４ｐｍｏｌ／ｍＬという正常濃度で血漿中に存在する２６０ｋＤのタンパク質である。実験Ｄのカラムに血漿０．０１μＬに相当する消化物を充填したと考えると、これらのペプチドはそれぞれ、約２００ａｍｏｌ及び約５０ａｍｏｌでカラムに存在していると推測される。Ｌ−セレクチンの場合は、２．０ｆｍｏｌの強化ＳＩＳ標準を使用して、天然の（試料由来の）ペプチドがＳＩＳ（単一の時点での定量）の０．１倍の量で存在しており、予想通りに２００ａｍｏｌの測定値と、０．６〜０．６７μｇ／ｍＬの推定した血漿中濃度をもたらしたことが明らかにされた。実行Ｄ及びＥでのフィブロネクチンのＣＶはそれぞれ４％及び４％であり、Ｌ−セレクチンのＣＶはそれぞれ２２％及び１１％であったことから、これらの実験における高品質検出では、Ｌ−セレクチンが下限（〜１ｅ４）近くであることを示している。
【００６９】
今回のデータ分析の時間及び段階では、選択された５３個の標的タンパク質の内の６個が確実な観察されなかった。凝固因子Ｖ、ビタミンＫ依存性タンパク質Ｃ又はＣ４ｂ結合タンパク質から選択されたペプチドからは、再現可能な信号が得られなかった。又、より高濃度のタンパク質由来のペプチドでも、今回のデータ分析の時間及び段階では確実に検出されなかった場合もみられた。インターαトリプシン阻害薬軽鎖（このタンパク質の重鎖由来のペプチドは良好な品質のＭＲＭをもたらしたものの）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ及びα１−抗トリプシンは、今回確実に検出されなかった。これらのより高濃度のタンパク質では、別のペプチドを選択することでより確実な検出が可能となる可能性があると考えられる：インターαトリプシン阻害薬軽鎖及びα−１−抗トリプシンの何れについても、別のペプチドが数多く存在しているが、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ等の少ないタンパク質については、より適切な代替ペプチドがないと思われるため、カラムに充填する試料におけるこれらのペプチドの更なる濃縮が必要であると思われる。
【００７０】
ランダムＭＲＭの動作及びＭＲＭ信号の密度
非無作為に設計されたＭＲＭの大半では、枯渇血漿等の複雑な消化物に関するＬＣの実行中に検出されるピークは１回のみであるように思われる：７３％のピーク面積は標的ペプチド検体と一致する約３２，０００を上回り（このデータでは信号対ノイズ比値を１０と試算）、２回目のピークが同じピーク面積基準に達したのはわずかに約８％であった。このため、実験では、同じ枯渇血漿消化物試料で無作為化した２種類を試験することによって、「ＭＲＭ−スペース」でのペプチドのピーク密度が実際に低い（試料の複雑性の割にはＭＳ／ＭＳ検出器の高い特異性と同等）ことを確認することを試みた。最初のセットでは、１３７個の設計したＭＲＭで使用した実際のペプチドの質量範囲にわたって無作為に割り付けた「親」質量によって１００個のＭＲＭを生成した後、設計したＭＲＭ（「ランダムＭＲＭ」）の中で「親」質量と最大断片質量との間に「断片」質量を無作為に割り付けた。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔでＭａｓｃｔｏｔを検索したところ、１００個のランダムＭＲＭの中で、３２，０００を超える面積を有するピークを示したのはわずか６例であり、これらのピークの中でタンパク質の同定につながるＭＳ／ＭＳスペクトルを生じたものは１つもなかった。１３１個のランダムＭＲＭからなる２つ目のセットは、断片質量が親（「ランダム複合ＭＲＭ」）よりも低値であるような場合を除き、親イオンと、血漿中で検出可能な設計したＭＲＭのセットからのＣＩＤ断片イオン質量とを無作為に対にするによって生成した。実際のペプチド質量及び断片質量を使用することで、これらのＭＲＭでは、実際のペプチド質量が積分質量の周囲に群がる傾向から生じる可能性があるバイアス（質量欠陥）が回避された。この２つ目のセットでは、ＭＲＭの約１２％が約３２，０００を超えるピーク面積のピークを示し、これらのピークからは何れもタンパク質同定をもたらすＭＳ／ＭＳスペクトルが得られなかった。ランダムＭＲＭセットで観察された何れのピークも、設計した血漿タンパク質ＭＲＭの大部分の溶出の後にＬＣ勾配（１００分後）を生じた。これらの結果は、これらの実験の今回の感度では、極めて複雑なペプチド試料であり、何れの質量分析計の単位解像度を使用している場合でも、ＭＲＭスペースで定量可能な特徴の密度はわずか６〜１２％であり、この内の少量が標準的なトリプシンペプチドであると思われることを示唆している。非無作為に設計したＭＲＭでは、ランダムＭＲＭで観察されたピーク面積の分布が２つ目（非標的ペプチド）のピークの分布と極めて一致しており、これらの追加のピークが無作為な背景を表していることを示唆している。
【００７１】
血漿消化物の複雑性（特に、少数の過剰ペプチドが除去された枯渇血漿の複雑性）にもかかわらず、殆どのＭＲＭはペプチドＬＣクロマトグラム全体でわずか１回のピークしか示さなかった。この所見は、枯渇血漿消化物で測定した無作為に割り付けたＭＲＭの２組に見られた低密度のピークと一致しており、検出器として使用した２段階のＱｑＱ−ＭＳ選択プロセスの特異性を明らかにしている。ＭＲＭのサブセット（約１０％）における２つ目のピークの存在は（実際のところこれらがトリプシンペプチドであるかにかかわらず）、クロマトグラフ溶出時間がこれらの検定で望まれる絶対検体特異性をもたらす要因になる可能性があることを示している。
【００７２】
予想ＭＲＭ遷移の改善
Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ手段単独で選択し、ＰｏｌｙＳＩＳペプチドの生成に使用した約半数のペプチド（３０個中１３個）は、血漿中で検出され、約１ｅ４を超えるＭＳ信号を発生した。トリプシンペプチドのイオン化特性の予想は、将来大幅に改善されることが期待されるが、本実施例では、実験的ＭＳ／ＭＳデータを使用し、より適切な親娘イオン遷移を選択するための予想を改善した。本実施例では、２つの実験的方法が特に有用であることが証明された。ＭＳ１で認められた高信号ペプチドのサブセットをＭＳ／ＭＳに供した従来のＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータ依存性フルスキャンＭＳ実験では、高濃度の（高濃度に存在する）ペプチドが検出された。低濃度のペプチドは、本教示内容を使用し、標的タンパク質由来の適切なサイズの予想トリプシンペプチド全ての候補ＭＲＭの一覧を作成した後、検出されたＭＲＭピークをＭＳ／ＭＳ（ＡｎａｌｙｓｔＴＭソフトウェア内の専用のスクリプトを使用してＭＲＭ法が設計される、ＭＩＤＡＳワークフロー）によって特徴付けることによって、検出した。ＭＲＭは一般的に極めて低濃度の成分を検出するフルスキャンサーベイＭＳよりも高感度であることから、ＭＩＤＡＳ法によって、更に低濃度のペプチドのＭＲＭ（親娘イオン遷移）の改善がもたらされたほか、本教示内容の種々の実施形態において、この手法は、試料中のタンパク質に関する質量分光ベースの検定を開発する方法で使用されている。このプロセスは、高感度三連四重極ＭＲＭとハイブリッドリニアイオントラップ４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ質量分光計でのイオントラップＭＳ／ＭＳスキャン機能とを組み合わせることによって容易になった。
【００７３】
この改善法の例については、タンパク質凝固因子ＸＩＩａ軽鎖に関する図７で図示されている。このタンパク質にＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース由来のタンパク質配列を使用することで、２４個のタンパク質分解ペプチドの４８個の理論ＭＲＭの一覧が得られ、サーベイスキャンとして使用した。一例として、これらのＭＲＭの１つが示されており、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予想された親娘イオン遷移を使用して、スキャン７０２及びその後の高解像度スキャン７０４を実施した。予想されたペプチドに起因する信号はスキャン７０６で観察された。完全な産物イオンスキャン７０８からは、予想された娘イオン７１０が別の断片７１２よりも大幅に信号強度が低いことが明らかになった。このスキャン７０８の情報を使用して、予想されたＭＲＭ（親娘イオン）の遷移を改善し、元のＭＲＭ  ７０２よりも信号対ノイズ比の高い新しいＭＲＭ７１４を得た。この改善プロセスは、このタンパク質由来の２つのタンパク質分解ペプチドについて実施したが、優れた信号強度及びＳ／Ｎに基づいて最終検定のために選択したのは、わずか１個のペプチドだけであった。
【００７４】
タンパク質検定のための親娘イオン遷移（ＭＲＭ）の選択
試験した１１９個のＭＲＭから親娘イオン遷移（ＭＲＭ）を同定した。それぞれのタンパク質の検定に望ましい特性を有することは、表２のカラム「最適ＭＲＭ」に×印を付けて示されている。５９例では、試験した２つの断片イオンから断片（娘）イオンを選択し、７例では、タンパク質ごとに２つのペプチドを試験した例からペプチド（タンパク質分解断片）を選択した。（４７回のＭＲＭ検定の）４７個のペプチド配列は何れも、（集合ペプチドを表す）ヒトプロテオームに固有であることが検証されており、標的タンパク質中で１回のみ発生した。ペプチドの内の３種類（抗トロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、及びビタミンＫ依存性タンパク質Ｃ）は、マウスでも同じように発生し、７種類（アポリポタンパク質Ｅ、ビタミンＫ依存性タンパク質Ｃ、補体Ｃ４β及びγ、フィブロネクチン、ハプトグロブリンβ、及びインターαトリプシン阻害薬重鎖）はラットでも発生した（他のヒト配列は何れも、他の種の集合ペプチドでは発生しない）。
【００７５】
最終の４７のＭＲＭ検定の中で、１２検定はｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏ法より行われて３０個のｐｏｌｙＳＩＳペプチドがもたらされており、１検定は以前のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法により行った（例えば、内容全体が参考として本明細書で援用される、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎ．Ｌ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎ．Ｇ．，Ｈａｉｎｅｓ，  Ｌ．Ｒ．，  Ｈａｒｄｉｅ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｏｌａｆｓｏｎ，  Ｒ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｔ．Ｗ．  （２００４）  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ｓｉｓｃａｐａ）．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ３，  ２３４−４４を参照）。実験的試験の結果、合計８個のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ選択ペプチドが同じ標的タンパク質に由来するペプチドによって置換され（１３７個のＭＲＭの選択の前に４個、後に４個）、２個はその後失敗して、未だに置換されておらず、８個は濃度が不十分であることが予想されるために試験前に除外した。このため、１３個のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ選択ペプチドが残り、このうち１０個は試験中に置換された。５回の実験（Ａ〜Ｅ）における４７回の最適ＭＲＭのＣＶ分布については、図１０Ｂに示している。例えば、実験Ｄでは、これらの内の４０個でＣＶが１０％を下回り、１９個が５％を下回っており、この再現可能な定量化法の可能性が示されている。
【００７６】
生体試料（ヒト血漿）中のタンパク質の存在を検定するための親娘イオン遷移として選択可能な１つ以上のＭＲＭ遷移は、以下の条件に基づいて選択した：（ｉ）親娘イオン遷移の親イオンは、ペプチドのフルプロダクトスキャン及び以下の特性の少なくとも１つに基づいて、そのタンパク質のタンパク質分解断片であることが確認される（ｉｉ）選択された親娘イオン遷移は、そのタンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高のイオンシグナル（本実施例ではピーク面積で決定）を有すること；（ｉｉｉ）選択された親娘イオン遷移は、そのタンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、ほぼ最高のシグナルノイズ比を有すること；並びに／或いは（ｉｖ）選択された親娘イオン遷移は、そのタンパク質のその他の親娘イオン遷移に伴う測定されたイオンシグナルに比べて、イオンシグナル内にほぼ最少のエラー量を有するイオンシグナルを有すること（例えば、他のピークから分離しているか又は低バックグラウンドで現れるＭＲＭクロマトグラムのピークは一般的に、ピーク面積によって測定された場合、高バックグラウンドの領域のピーク及び／又は他のピークとのオーバーラップのみられる領域のピークに比べて、イオン信号値のエラーが少ない）。
【００７７】
多重機能及び処理能力の考察
複雑な消化物におけるペプチドを測定するためのＬＣ−ＱｑＱ−ＭＳプラットフォームの多重機能は重要な機能であり、各実行中に数多くのタンパク質を正確に測定することを可能にする。何れも全ＬＣ勾配を通して１８ｍｓｅｃの連続測定で連続してモニタリングした、今回の１３７個のＭＲＭのセットの性能を考えれば、１００〜２００個のＭＲＭをＬＣ長勾配でペプチドを日常的に測定するのに利用できると思われる。再現可能なクロマトグラフの溶出時間を考えれば、ピークの発生が予想される時間枠（例えば、静的、動的又はこれらの組み合わせ）の中で既存のシステムによって各ＭＲＭを測定することが可能である（例えば、自験のＤ及びＥで測定したピーク溶出時間では平均２〜２．５％ＣＶとすれば、総実行時間の１０％の時間枠）。溶出時間及びカラムの再現可能性のほか、溶出時間内ではさほど密集しないというＭＲＭ信号の選択に関する知識に基づくと、１０倍のＭＲＭ（１，０００〜２，０００）が１回のＬＣ  ＭＲＭ実験で使用できると考えられる。
【００７８】
ＭＲＭ測定の処理能力に関する更なる考察としては、クロマトグラフの実行時間が挙げられる。反復実験Ｄ及びＥでは、３０分間の勾配を使用し、この勾配は（試料間の洗浄を含めて）７５分間の総サイクル時間をもたらした。ＭＲＭスペースでの低密度のピークにより示される検体特異性は、種々の実施形態において、クロマトグラフ分離による利益が少ない、タンパク質検定に好適なＭＲＭを開発できることを示している。個々の時間枠においてＭＲＭ測定に焦点を当てることができることから、各ピークにわたって必要とされる多重測定を犠牲にすることなく、使用した溶出時間でより多くのＭＲＭを得ることができる。種々の実施形態において、より高流量（例えば、キャピラリー流量）のシステムへのシフトと併せて、実行時間の改善が得られ、日常的な操作におけるロバスト性の向上等が容易になる。
【００７９】
（実施例３  内部標準ペプチドを使用した定量化の評価）
本教示内容に関する方法においては、必須ではないものの、最終検定でのタンパク質絶対量の定量化に関する内部標準を得るために、安定同位体標識ペプチドを含めることができる。最初の検定では、既知の量のペプチドを加え、血漿中の当該タンパク質の量を測定するための対照として使用した。単極の濃度曲線が生成されたが、より正確な定量化からは多重極の濃度曲線が得られる可能性がある。一例として、図６Ａ及び６ＢにはＬ−セレクチン由来のタンパク質分解ペプチド断片ＡＥＩＥＹＬＥＫに関する比較ＭＲＭデータを示しており、図６Ａは標準の同位体標識断片ＡＥＩＥＹＬＥＫ＊に関するデータである。標識ペプチドのピーク面積（図６Ｂ）と非標識ペプチドのピーク面積（図６Ａ）との比のほか、既知の標識Ｌ−セレクチンペプチド濃度（２ｆｍｏｌ／カラム）を使用することで、Ｌ−セレクチンの血漿中濃度が約０．７μｇ／ｍＬであることが確定され、このタンパク質に関する文献データ値である０．６７μｇ／ｍＬと十分に一致していた。
【００８０】
特許、特許出願、記事、書籍、学術論文、論文、ウェブページを含む、本出願中に引用した文献及び同様な資料は、その文献及び同様な資料の形式にかかわらず、全体が参考として本明細書で援用される。援用された文献及び同様な資料の１つ以上が、用語、用語の使用法、技術等を含めて本出願と矛盾する場合は、本出願が優先される。
【００８１】
本明細書で使用される各項の見出しは構成上の目的であり、本明細書の主題を限定するものであると解釈すべきではない。
【００８２】
以上において本発明を種々の実施形態及び実施例と共に説明してきたが、本教示内容をこのような実施形態又は実施例に限定することを目的としたものではない。逆に、当業者であれば理解する通り、本発明は種々の代替例、改変及び等価物を包含する。
【００８３】
以上において本教示内容を特定の例示的な実施形態を参照して具体的に示し、記述してきたが、本発明の趣旨及び適用範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に種々の変更が加えられる場合があることを理解されたい。従って、本教示内容の適用範囲及び趣旨に含まれる実施形態及びその等価物が全て特許請求の対象である。本教示内容の検定の説明及び図は、特に記載のない限り、記載した要素の順序に限定して読むべきではない。
【００８４】
請求項は、特に記載のない限り、記載した要素の順序に限定して読むべきではない。付随する請求項の適用範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に種々の変更が加えられる場合があることを理解されたい。従って、以下の請求項及び等価物の適用範囲及び趣旨に含まれる実施形態及びその等価物が全て特許請求の対象である。
【００８５】
【表１】
2009511915.tif 000002
実験間に３０分間の洗浄時間を設けて反復実行を実施した。充填は試料から得た血漿の等価量として示している。
【００８６】
【表２−１】
2009511915.tif 000003
【００８７】
【表２−２】
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【００８８】
【表２−３】
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【００８９】
【表２−４】
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【００９０】
【表２−５】
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【００９１】
【表２−６】
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【００９２】
【表２−７】
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【００９３】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、実施例で使用する質量分析計システムの簡略化した概略図である。
【図２】図２は、バイオマーカーのバリデーションのためのＭＲＭ検定を開発する方法の種々の実施形態を概略的に示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、実施例１で考察するフィブロネクチンペプチドに関するＭＲＭ及びＭＳ／ＭＳ実験データを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例２の５３個のタンパク質のペプチドのデータを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは実施例２で分析した試料中に存在するこれらのタンパク質の量の範囲を示す。
【図５Ａ】図５Ａはそれぞれ、同じ血漿試料に関する実施例２の平行枯渇／消化実験及び平行消化実験それぞれの間の、ＭＲＭ遷移のピーク面積の相関グラフを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂはそれぞれ、同じ血漿試料に関する実施例２の平行枯渇／消化実験及び平行消化実験それぞれの間の、ＭＲＭ遷移のピーク面積の相関グラフを示す。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、試料のＬ−セレクチンのペプチド断片に関する実施例３のＭＲＭデータ（図６Ａ）と、同位体標識した合成ペプチドのＭＲＭデータ（図６Ｂ）を比較した図である。
【図７】図７は、測定された親娘イオンシグナルに基づき予想されたＭＲＭ遷移を改善したものを概略的に示す。
【図８】図８は、実施例２の２つの実験（消化血漿及び枯渇血漿）のピークＣＶ対ピーク面積のグラフである。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、実施例２の血漿から最も高濃度の６種類のタンパク質を枯渇させた効果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例２の５つの実験セットに関するＣＶ値の分布を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例２の５つの実験セットに関するＣＶ値の分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月11日(2008.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009511915000001.app
【国際調査報告】
2009511915.tif 000024
2009511915.tif 000025