(57)【要約】  アルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）を含むバイオマーカーを用いた診断及び予後診断のための方法及びキット。
2009540335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における疾患又は障害を診断する方法であって、
（ａ）前記対象から得た生体試料における少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定するステップであって、前記バイオマーカーがアルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）を含むステップと、
（ｂ）生体試料において測定されたレベルと、正常な対象集団における対照レベルとを比較し、対照レベルと比較したレベルの上昇又は低下が前記疾患又は障害の指標であるステップと
を含む方法。
【請求項２】
診断方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予後診断又はモニタリングの方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患又は障害が、心筋梗塞、心筋虚血、臓器虚血、不安定狭心症及び安定狭心症、心不全、感染、動脈性高血圧、血液透析又は透析、タンパク尿、急性及び慢性肝不全、ダウン症、炎症性肺塞栓、大動脈の乾燥、敗血症、脳卒中、動脈瘤、癌、腎不全、糖尿病、子癇前症、並びに血管炎からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＡＢＰＰＣが表１に列挙してあるものから選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＡＢＰＰＣが、アファミン、アンチトロンビンIII、セルロプラスミン、クラステリン、ハプトグロビン、βヘモグロビン、ダームシジン、ルミカン、及びトランスサイレチンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
複数のバイオマーカーが測定される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
対象の試料が血液に由来する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
バイオマーカーが質量分析を用いて検出される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
バイオマーカーが、ＳＥＣ、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル法、及び／又は免疫アッセイを用いて検出される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
対象が哺乳動物である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対象がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
特定の疾患又は障害についての、ＡＢＰＰＣを含むバイオマーカーを同定する方法であって、特定の疾患又は障害を有する患者集団において血清ＡＢＰＰＣをスクリーニングするステップと、同定された前記ＡＢＰＰＣと、正常な対象集団におけるＡＢＰＰＣとを比較するステップとを含み、患者集団において異なって発現するＡＢＰＰＣが前記疾患又は障害についてのバイオマーカーである方法。
【請求項１４】
特定の疾患又は障害についてのＡＢＰＰＣバイオマーカーのプロフィールを同定する方法であって、特定の疾患又は障害を有する患者集団における複数の血清ＡＢＰＰＣを測定し、それによりＡＢＰＰＣバイオマーカーのプロフィールを得るステップを含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により得られる、ＡＢＰＰＣバイオマーカーのプロフィール。
【請求項１６】
診断としての、請求項１５に記載のＡＢＰＰＣバイオマーカーのプロフィールの使用。
【請求項１７】
心筋虚血、心筋梗塞、又は血管炎についての、請求項１５に記載のＡＢＰＰＣバイオマーカーのプロフィール。
【請求項１８】
診断又は予後診断用のキットであって、
生体試料中のアルブミンを特異的に捕捉するか又は濃縮する抗体又は化学的部分と、
アルブミンに結合した１つ又は複数の特異的な修飾された又は修飾されていないタンパク質又はペプチドに対する二次抗体又は化学的部分と、
結合した二次抗体の量の検出及び／又は定量のための少なくとも１つの構成要素と
を含むキット。
【請求項１９】
二次抗体が表１から選択されるタンパク質に特異的である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
複数の二次抗体を含む、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府機関ＮＩＨ  Ｎ０１−ＨＶ２８−１８０との契約に基づく基金でなされた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本発明は、アルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ、albumin-bound protein/peptide complex）を含むバイオマーカーを用いた診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清アルブミンは血清中で最も豊富なタンパク質であり、典型的には４５〜５０ｍｇ／ｍｌで存在する。アルブミンは、細胞内の空間におけるタンパク質、脂質、及び小分子を結合する「分子スポンジ（molecular sponge）」として機能し（Millea, K.; Krull, I. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies 2003, 26, 2195-2224、Anderson, N. L.; Anderson, N. G. Mol Cell Proteomics 2002, 1, 845-867、Carter, D. C.; Ho, J. X. Adv Protein Chem 1994, 45, 153-203）、ペプチドホルモン、血清アミロイドＡ、インターフェロン、グルカゴン、ブラジキニン、インスリン、及び連鎖球菌（Streptococcal）プロテインＧと会合体を形成することが見出されているが（Peters, T., Jr. All About Albumin; Academic Press: San Diego, 1996、Baczynskyj, L.; Bronson, G.E.; Kubiak, T. M. Rapid Commun Mass Spectrom 1994, 8, 280-286、Carter, W. A. Methods Enzymol 1981, 78, 576-582、Sjobring, U.; Bjorck, L.; Kastern, W. J Biol Chem 1991, 266, 399-405）、結合パートナーの広範なリスト、及びこれらのパートナーが疾患によって変化するかどうかについては調査されていない。これまでの研究により、変性条件下において高分子量の種が除去されると低分子量の種がより多く回収されることが示されており、このことは、アルブミンのような大きなタンパク質が結合ペプチドであるということをさらに裏付けるものである（Tirumalai, R. S.; Chan, K. C.; Prieto, D. A.; Issaq, H. J.; Conrads, T. P.; Veenstra, T. D. Mol Cell Proteomics 2003, 2, 1096-1103）。さらに、アルブミンは少数の特異的タンパク質、例えばパラオキソナーゼ１（Ortigoza-Ferado, J.; Richter, R. J.; Hornung, S. K.; Motulsky, A. G.; Furlong, C. E. Am J Hum Genet 1984, 36, 295-305）、α−１−酸性糖タンパク質（Krauss, E.; Polnaszek, C. F.; Scheeler, D. A.; Halsall, H. B.; Eckfeldt, J. H.; Holtzman, J. L. J Pharmacol Exp Ther 1986, 239, 754-759）、並びに血清中のクラステリン（Kelso, G. J.; Stuart, W. D.; Richter, R. J.; Furlong, C. E.; Jordan-Starck, T. C.; Harmony, J. A. Biochemistry 1994, 33, 832-839）（パラオキソナーゼ１を介した間接的な相互作用）及びアポリポプロテインＥ（Dergunov, A. D.; Vorotnikova, Y. Y. Int JBiochem 1994, 26, 933-942）に結合することが報告されている。血清中のアルブミン結合ペプチド（３０ｋＤａ未満）は研究されているものの、それらの結合の程度は現在分かっていない（Zhou, M.; Lucas, D. A.; Chan, K. C; Issaq, H. J.; Petricoin, E. F., 3rd; Liotta, L. A.; Veenstra, T. D.; Conrads, T. P. Electrophoresis 2004, 25, 1289-1298）。今までのところ、アルブミンに結合しているタンパク質全体についての包括的な研究は行われていない。加えて、アルブミンに結合しているタンパク質／ペプチドの、タンパク質／ペプチドの組成、比率、又はＰＴＭの状態における何らかの変化についての文献は存在しない。
【０００３】
アルブミンは、金属へのアルブミンの結合を変化させる疾患によって変化するということが見出されており、現在のところ、虚血のバイオマーカーとして機能している。心筋虚血のバイオマーカーであるとこれまでに同定されているアルブミンの修飾は、アルブミンのＮ末端のＮ−アセチル化であり、これはコバルト及びニッケルへのアルブミンの結合親和性を低下させる（Bar-Or, D.; Curtis, G.; Rao, N.; Bampos, N.; Lau, E. Eur J Biochem 2001, 268, 42-47、Takahashi, N.; Takahashi, Y.; Putnam, F. W. Proc Natl Acad Sci USA1987, 84, 7403-7407、Chan, B.; Dodsworth, N.; Woodrow, J.; Tucker, A.; Harris, R. Eur J Biochem 1995, 227, 524-528）。最新の特許（Crosby, P. A. M., Deborah L In PCT Int. Appl.: USA, 2002、Bar-or, D. L., Edward; Winkler, James V In PCT Int: US, 2004）は、虚血へのアルブミンのこのＮ末端の修飾の使用を対象としており、アルブミンとコバルトとの結合に対する臨床的アッセイ（ＡＣＢ（albumin cobalt binding）アッセイ）をもたらしている。Ｎ末端の修飾に加え、アルブミンの酸化が、酸化ストレスに対するマーカーとして提案されている（Mera, K.; Anraku, M.; Kitamura, K.; Nakajou, K.; Maruyama, T.; Tomita, K.; Otagiri, M. Hypertens Res 2005, 28, 973-980）。腎臓障害及び末期の腎疾患を有する患者におけるアルブミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型、Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight）分析では、疾患によるアルブミンの分子量の増加が示される（Thornalley, P. J.; Argirova, M.; Ahmed, N.; Mann, V. M.; Argirov, O.; Dawnay, A. Kidney Int 2000, 58, 2228-2234）。最後に、アルブミンの脂肪酸運搬機能が、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病において修飾される（Muravskaya, E. V.; Lapko, A. G.; Muravskii, V. A. Bull Exp Biol Med 2003, 135, 433-435）。糖尿病を有する患者において、脂肪酸に対するアルブミンの結合能力は上昇し、アテローム性動脈硬化症を有する患者において、その能力は低下する。結論として、アルブミンが疾患によって変化することの証拠は明らかである。血清中のアルブミンに対するタンパク質及び／又はペプチドの結合の変化は、これまでに調査も記載もされていない。本研究は、いかなる質量の範囲も排除することなく、完全なタンパク質、分解したタンパク質、及びペプチドの分析を含むという理由から、特有のものである。さらに、本研究は、これまでのいかなる文献でも取り扱われていない特徴である、アルブミンに結合するタンパク質及びペプチドにおける変化に焦点を当てたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】Crosby, P. A. M., Deborah L In PCT Int. Appl.: USA, 2002
【特許文献２】Bar-or, D. L., Edward; Winkler, James V In PCT Int: US, 2004
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Millea, K.; Krull, I. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies 2003, 26, 2195-2224
【非特許文献２】Anderson, N. L.; Anderson, N. G. Mol Cell Proteomics 2002, 1, 845-867
【非特許文献３】Carter, D. C.; Ho, J. X. Adv Protein Chem 1994, 45, 153-203
【非特許文献４】Peters, T., Jr. All About Albumin; Academic Press: San Diego, 1996
【非特許文献５】Baczynskyj, L.; Bronson, G.E.; Kubiak, T. M. Rapid Commun Mass Spectrom 1994, 8, 280-286
【非特許文献６】Carter, W. A. Methods Enzymol 1981, 78, 576-582
【非特許文献７】Sjobring, U.; Bjorck, L.; Kastern, W. J Biol Chem 1991, 266, 399-405
【非特許文献８】Tirumalai, R. S.; Chan, K. C.; Prieto, D. A.; Issaq, H. J.; Conrads, T. P.; Veenstra, T. D. Mol Cell Proteomics 2003, 2, 1096-1103
【非特許文献９】Ortigoza-Ferado, J.; Richter, R. J.; Hornung, S. K.; Motulsky, A. G.; Furlong, C. E. Am J Hum Genet 1984, 36, 295-305
【非特許文献１０】Krauss, E.; Polnaszek, C. F.; Scheeler, D. A.; Halsall, H. B.; Eckfeldt, J. H.; Holtzman, J. L. J Pharmacol Exp Ther 1986, 239, 754-759
【非特許文献１１】Kelso, G. J.; Stuart, W. D.; Richter, R. J.; Furlong, C. E.; Jordan-Starck, T. C.; Harmony, J. A. Biochemistry 1994, 33, 832-839
【非特許文献１２】Dergunov, A. D.; Vorotnikova, Y. Y. Int JBiochem 1994, 26, 933-942
【非特許文献１３】Zhou, M.; Lucas, D. A.; Chan, K. C; Issaq, H. J.; Petricoin, E. F., 3rd; Liotta, L. A.; Veenstra, T. D.; Conrads, T. P. Electrophoresis 2004, 25, 1289-1298
【非特許文献１４】Bar-Or, D.; Curtis, G.; Rao, N.; Bampos, N.; Lau, E. Eur J Biochem 2001, 268, 42-47
【非特許文献１５】Takahashi, N.; Takahashi, Y.; Putnam, F. W. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84, 7403-7407
【非特許文献１６】Chan, B.; Dodsworth, N.; Woodrow, J.; Tucker, A.; Harris, R. Eur J Biochem 1995, 227, 524-528
【非特許文献１７】Mera, K.; Anraku, M.; Kitamura, K.; Nakajou, K.; Maruyama, T.; Tomita, K.; Otagiri, M. Hypertens Res 2005, 28, 973-980
【非特許文献１８】Thornalley, P. J.; Argirova, M.; Ahmed, N.; Mann, V. M.; Argirov, O.; Dawnay, A. Kidney Int 2000, 58, 2228-2234
【非特許文献１９】Muravskaya, E. V.; Lapko, A. G.; Muravskii, V. A. Bull Exp Biol Med 2003, 135, 433-435
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、ヒト血清の、アルブミンを濃縮した画分を試験して、健康な個体におけるあらゆるアルブミン結合タンパク質を決定し、さらに、アルブミンに結合するタンパク質が疾患によって変化するかどうかを決定した。研究には、アルブミン並びにあらゆる（修飾された、及び修飾されていない）結合性タンパク質／ペプチド（アルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体、ＡＢＰＰＣ）の単離のための、複数の独立した方法が含まれる（図１）。結果は、ＡＢＰＰＣが疾患に対する有用なバイオマーカーであることを示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、対象における特定の（１又は複数の）アルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）のレベルを測定するステップと、そのレベルを、正常な対象集団の対照レベルとを比較するステップとを含む、疾患又は障害を診断する方法が提供される。特定のＡＢＰＰＣのレベルの変動及びＡＢＰＰＣのプロフィールの変動は、特定の疾患及び障害の指標であることが見出されている。
【０００８】
目的は、疾患を有する患者及び健康な患者においてアルブミンに特異的に結合しているタンパク質を、現在の採血手順に適合する、経済的で、迅速で、且つ精度の高い方法で特徴付けることである。本発明者はいかなる特定の仮説にもとらわれないが、これは、アルブミンが疾患によって変化し、ひいてはアルブミンとアルブミン結合性のタンパク質及びペプチドとの複合体が変化するという仮説に基づいている。ＡＢＰＰＣアッセイはアルブミンの修飾、又はＡＢＰＰＣの組成における変化（即ち、１つ又は複数のタンパク質の有無、１つ又は複数のタンパク質の変化した濃度（又は化学量論又はモル濃度の比率）、タンパク質のＰＴＭにおける変化（例えば、タンパク質分解断片対アルブミンを含む完全なタンパク質））を測定し得る。
【０００９】
本方法は単独で、又は、診断の精度及び特異性を向上させるために他の診断試験と共に用いることができる。本方法はまた、この手段又は他の手段によってさらに試験するための、「危険性がある」と思われる個体を同定するためのスクリーニングの目的でも用い得る。
【００１０】
したがって、一態様において、本方法は、（ａ）前記対象から得た生体試料における少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定するステップであって、前記バイオマーカーがアルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）を含むステップと、（ｂ）生体試料において測定されたレベルを、正常な対象集団における対照レベルと比較するステップであって、対照レベルと比較したレベルの上昇又は低下が前記疾患又は障害の指標であるステップとを含む。
【００１１】
別の態様において、本方法は、アルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）を含む少なくとも１つのバイオマーカーの存在について、対象の試料をアッセイするステップを含み、ここで、前記（１又は複数の）バイオマーカーの検出は疾患又は障害の診断と相関するものであり、この相関は、正常な対象と比較した、対象の試料における（１又は複数の）バイオマーカーの存在及びレベルを考慮するものである。
【００１２】
バイオマーカーは、例えばタンパク質アッセイ、結合アッセイ、又は免疫アッセイを用いて、当業者に知られているあらゆる適切な手段によって検出することができる。バイオマーカーはまた、場合によっては試料の適切な最初の処理の後に、質量分析を用いてピークとして同定し得るか、又は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、size exclusion chromatography）を用いてゲルのバンドとして同定し得る。典型的なアッセイは以下の実施例に詳細に記載する。陽性診断では、バイオマーカーは、正常な健康な対照における値と比較して、上昇するか又は低下する。
【００１３】
対象の試料は、例えば、血液、血漿、血清からなる群から選択してもよい。好ましくは、試料はアルブミンを濃縮した血清である。
【００１４】
診断アッセイは、例えば、緊急治療室を受診している患者を評価するために、又は病院内若しくは医師の診療室において進行中の処置のために用いることができる。アルブミンは血清中に非常に富んでいるため（４０〜５０ｍｇ／ｍｌ）、このアッセイは、個体から容易に且つ再現可能に得られ得るという利点を有する。アルブミンに対する特異的抗体が利用可能であり、複雑なアッセイを行うことなく容易にＡＢＰＰＣを捕捉することができる。また、液体クロマトグラフィー及びゲルベースの方法を含む、他の生化学的方法も用いることができる。ＡＢＰＰＣの捕捉はアルブミンを標的とすることに基づいているため、特定の疾患において変化するタンパク質（又はＰＴＭ若しくは他の修飾）を事前に知る必要はないが、それは、ＡＢＰＰＣの捕捉の手順がすべての疾患に共通しているためである。このように、ＡＢＰＰＣは、様々な潜在的な標的を広く網羅する単純な標的アッセイであり、したがって、非常に経済的である。例えば、少量のタンパク質を検出するための複数の特異的抗体を開発する必要はない。さらに、この天然のサブプロテオームの捕捉により、試料の複雑さが軽減し、低濃度のタンパク質でのアッセイの感度に関連する問題が回避される。ＡＢＰＰＣにおけるいくつかのタンパク質が、アルブミンが枯渇した血清において観察されていないため、いくつかのバイオマーカーがＡＢＰＰＣに特有であると思われる。
【００１５】
目的のタンパク質を同定した後、以降の臨床的アッセイで、アルブミンに対する１つの捕捉抗体を、目的のタンパク質に対する異なる検出抗体に容易に結びつけることができる。
【００１６】
本明細書に記載される方法を実施するためのキットもまた提供される。一実施形態において、キットは、例えば、内因性アルブミンを特異的に捕捉し又は濃縮する抗体（又は化学的部分）と、アルブミンに結合した１つ又は複数の特異的タンパク質（又はペプチド又は修飾タンパク質）に対する二次抗体（又は化学的部分）と、結合した二次抗体の量の検出及び／又は定量のための構成要素のいずれかを含み得る。一実施形態において、二次抗体は、特異的なタンパク質によって変化する（１又は複数の）タンパク質に対するものであり、それにより、ＡＢＰＰＣのタンパク質含有量における変化を定量する。
【００１７】
代替の形態は、完全なタンパク質又は酵素分解したタンパク質の質量分析を用いた、目的の（１又は複数の）タンパク質の直接的な検出での内因性ＡＢＰＰＣの（抗体又は化学的部分での）捕捉である。この実施形態において、キットは、（例えば、小さなカラム内の、又はピペットの先端の末端に詰められた）マトリックスと結合した抗アルブミン抗体を含み得、前記マトリックスにおいて、ＡＢＰＰＣは、完全な質量についてのＭＳへの溶出後に濃縮され、又は（（１又は複数の）分析物のすべてのペプチド若しくは特定のシグネチャーペプチドの）消化及びそれに続くＭＳ分析のために溶出される。本発明のキットは複数の抗体を含み得、それによりＡＢＰＰＣの２つ以上の構成要素を同時に評価することができる。
【００１８】
遊離（循環）ＡＢＰＰＣに対する結合性ＡＢＰＰＣの比率が重要であり得るとも考えられている。方法及びキットは、特定のタンパク質を血清アルブミンに結合した形又は遊離した形として測定するために変更し得る。例えば、現在の研究では、多くのタンパク質がアルブミンに結合することが観察されているが、それらはアルブミンが枯渇した血清画分においても観察されており、このことは、前記タンパク質が遊離形態で存在し得ることを示している。これらのタンパク質の例には、例えば、アンチトロンビンIII、アポリポプロテインＡII、ＡIV、ＣII、クラステリン、トランスサイレチン、及びビタミンＤ結合タンパク質が含まれる。専門家は通常の実験を通して、比率が特定の疾患状態においていかに変化するかを決定することができよう。
【００１９】
疾患又は障害を有する患者集団を血清ＡＢＰＰＣについてスクリーニングし、こうして得られたＡＢＰＰＣを正常な対象集団のＡＢＰＰＣと比較することにより、特定の疾患及び障害についての、ＡＢＰＰＣを含むバイオマーカーを同定する方法を提供することもさらなる目的である。そのようなスクリーニングは、本明細書において上述した診断アッセイで行ったものと同様の方法で実施することができる。例えば、ＡＢＰＰＣのプロフィールを決定するために質量分析又はＳＥＣといった方法を用いることができ、差異が見られれば、バイオマーカーとして有用である特定のＡＢＰＰＣが、例えばタンパク質アッセイ、結合アッセイ、又は免疫アッセイを用いて同定される。さらに、タンパク質の消化を実施することができ、１つ又は複数の得られたペプチドがモニターされる。そのようにして同定されたバイオマーカーは、本明細書に記載する診断方法において使用し得る。
【００２０】
本発明の方法及び組成物が有用であると期待される疾患又は障害には、血管炎、心筋梗塞、心不全、敗血症、癌、及び糖尿病が含まれる。本明細書に詳述する方法を用いて、当業者は、ＡＢＰＰＣが変化している他の疾患及び障害を、必要以上の実験を行うことなく決定することができよう。
【００２１】
本願は、２００７年６月１４日に出願された米国仮出願第６０／８１３７６１号、及び２００７年６月１５日に出願された米国仮出願第６０／８１３８２５号に対する優先権を主張するものであり、これらは参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用する参考文献及び特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】アルブミンを濃縮した画分を分離しＡＢＰＰＣを特徴付けるために用いる方法及び対応する対象を示す図である。
【図２】正常なプール血清のアルブミンを濃縮した画分の、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＡＩ、ＢＩ）及びアルブミンについての対応するウェスタンブロット（ＡII、ＢII）を示す図である。
【図３】ＳＥＣクロマトグラムである。（Ａ）分子量標準物質（Ａ）分子量標準物質上に重ね合わせた、アルブミンを濃縮した画分。
【図４】健康な個体からアルブミンを濃縮した画分の８回の連続注入のＳＥＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）である。
【図５】加熱及び非加熱ＳＥＣ画分、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、human serum albumin）残留物、並びに正常なプール血清からアルブミンを濃縮した画分の全体の、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図６】正常なプール血清からアルブミンを濃縮した画分のＳＥＣクロマトグラムの３つの画分（Ａ〜Ｃ）のＲＰ−ＨＰＬＣを示す図である。
【図７】正常なプール血清からアルブミンを濃縮した画分の抗ＨＳＡ残留物  のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】２０人の健康な対照及び５人の疾患を有する患者のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。差異は黄色で示している。
【図９】バルーン血管形成を受けた５人の患者（３人のＭＩ、２人のＳＡ）から得た、３つの時点のアルブミンを濃縮した画分のＳＥＣクロマトグラムである。
【図１０Ａ】パネルＡは、図９の高分子量のＳＥＣ画分のＲＰ−ＢＰＬＣクロマトグラム（２１０ｎｍ）を示す。黄色のバーは３つの時点の間の差異を示す。
【図１０Ｂ】パネルＢは、同一の画分の一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１０Ｃ】パネルＣは、パネルＢにおけるゲルのアルブミンについてのウェスタンブロットを示す。
【図１１】ＡＢＰＰＣを含むＳＥＣ画分のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図１０Ａ）の一部分の拡大図である。
【図１２】２人の健康な対照及び１人の心筋梗塞を有する患者のＳＥＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）である（Ａ）。パネルＢは、パネルＡの試料から得た高分子量のＳＥＣ画分のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１３】２人の健康な対照、２人のＡＭＩの患者、及び２人の血管炎の患者の、アルブミンを濃縮した画分の一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図１４】アルブミンのピークを示すために拡大した、図１０Ａの高分子量のＳＥＣ画分のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。矢印は、２人のＭＩ患者及び１人のＳＡ患者での時点８におけるアルブミンの保持時間における変化を示す。赤い丸は、同一の試料で時点８においてのみ見られたピークを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
以下の用語は、別段の指示がない限り、本願を通して以下に定義されるように用いられる。
【００２４】
「マーカー」又は「バイオマーカー」は本明細書において同様の意味で用いられ、本発明の下では、特定の疾患又は障害を有する患者から得た試料において、対照の値と比較して異なって存在する（特定の特異的同一性又は明らかな分子量の）ＡＢＰＰＣを言い、前記対照の値は、例えば、対照の対象（例えば、陰性診断の人、正常な又は健康な対象）から得た同等の試料における平均値からなる。バイオマーカーは、アルブミンに結合しているか若しくはアルブミンから切断されている特異的なペプチド若しくはタンパク質として、或いは質量分析、ＳＥＣ、又は他の分離プロセス若しくは抗体検出における特定のピーク、バンド、画分などとして同定され得る。いくつかの応用において、例えば、質量分析、又は他のプロフィール若しくは複数の抗体を複数のバイオマーカーの同定に用いることができ、且つ個々のバイオマーカー及び／又は部分的な若しくは完全なプロフィールの間の差異を診断に用いることができる。
【００２５】
「異なって存在する（differentially present）」という表現は、特定の疾患又は障害を有する患者から得た試料に存在するマーカーの量及び／又は頻度における、対照の対象と比較した差異を言う。例えば、マーカーは、疾患又は障害を有する患者の試料において、（例えば対照の対象の試料から決定する）対照の値と比較して高いレベル又は低いレベルで存在するＡＢＰＰＣであり得る。或いは、マーカーは、患者の試料において、対照の対象の試料と比較して高い頻度又は低い頻度で検出されるＡＢＰＰＣであり得る。マーカーは、量、頻度、又はその両方に関して異なって存在し得る。それはまた、存在量／検出量の単なる増加又は減少ではなく、マーカーであるタンパク質の物理的変化／修飾でもあり得る。例えば、変化しているものは、タンパク質の翻訳後修飾、切断、又はアイソフォームであり得、この変化がアッセイにより検出される。これは疾患を有する人と対照との対比における、異なる量の測定とは別のものである。
【００２６】
ある試料におけるマーカー、化合物、組成物、若しくは物質の量が、別の試料におけるマーカー、化合物、組成物、若しくは物質の量と、又は対照の値と統計上有意に異なる場合、マーカー、化合物、組成物、若しくは物質は試料において異なって存在する。例えば、化合物が他の試料（例えば対照）におけるよりも少なくともおよそ１２０％、少なくともおよそ１３０％、少なくともおよそ１５０％、少なくともおよそ１８０％、少なくともおよそ２００％、少なくともおよそ３００％、少なくともおよそ５００％、少なくともおよそ７００％、少なくともおよそ９００％、若しくは少なくともおよそ１０００％多く若しくは少なく存在する場合、又は化合物が１つの試料において検出可能であり他の試料においては検出されない場合、化合物は異なって存在する。
【００２７】
或いは、又はそれに加えて、特定の疾患又は障害に罹患している患者の試料におけるマーカー等の検出頻度が、健康な個体から得た対照の試料又は対照の値におけるよりも統計上有意に高いか又は低い場合、マーカー、化合物、組成物、又は物質は、試料間で異なって存在する。例えば、バイオマーカーが１組の試料において他の組の試料よりも少なくともおよそ１２０％、少なくともおよそ１３０％、少なくともおよそ１５０％、少なくともおよそ１８０％、少なくともおよそ２００％、少なくともおよそ３００％、少なくともおよそ５００％、少なくともおよそ７００％、少なくともおよそ９００％、又は少なくともおよそ１０００％高い頻度で又は低い頻度で見られて検出される場合、バイオマーカーは２組の試料の間で異なって存在する。これらの典型的な値はあるものの、熟練した専門家であれば、マーカーが異なって存在するかどうかを決定するための統計上有意な差異を表すカットオフポイント等を決定することができると予想される。
【００２８】
「診断」は、病態の存在又は性質を同定することを意味し、特定の疾患又は障害を発症する危険性がある患者を同定することを含む。診断方法は感度及び特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、陽性反応を示す、疾患を有する個体のパーセンテージである（「真陽性」のパーセント）。アッセイによって検出されない、疾患を有する個体は、「偽陰性」である。疾患を有しておらず且つアッセイにおいて陰性反応を示す対象は「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は１から偽陽性の比率を差し引いたものであり、「偽陽性」の比率は、疾患を有しておらず陽性反応を示す人の割合として定義される。特定の診断方法によっては状態の確定診断が得られない可能性があるが、診断に役立つ陽性の兆候が前記方法により得られる場合には、前記診断は満足なものである。
【００２９】
「検出」、「検出する」等の用語は、バイオマーカーの検出、又は疾患若しくは障害の検出（例えば、アッセイの陽性の結果が得られた場合）との関連で用い得る。後者の場合、「検出」及び「診断」は同義的であると考えられる。
【００３０】
「危険性がある」とは、正常な対象と比較して、又は対照群と比較して、例えば患者集団のリスクが上昇していることを意味するものである。したがって、特定のマーカーを有する対象は特定の疾患又は障害に対する増大したリスクを有し得、さらなる試験が必要であると同定される。「増大したリスク」又は「高いリスク」は、可能性の、例えば対象が障害を有している可能性の、あらゆる統計上有意な増大を意味する。リスクは、比較対象である対照群よりも、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％増大している。
【００３１】
マーカーの「試験量（test amount）」は、試験対象の試料において存在するマーカーの量を言う。試験量は、絶対的な量（例えばμｇ／ｍｌ）又は相対的な量（例えばシグナルの相対強度）のいずれであってもよい。
【００３２】
マーカーの「診断量」は、特定の疾患又は障害の診断と一致する、対象の試料におけるマーカーの量を言う。診断量は、絶対的な量（例えばμｇ／ｍｌ）又は相対的な量（例えばシグナルの相対強度）のいずれであってもよい。
【００３３】
マーカーの「対照量」は、マーカーの試験量と比較されるあらゆる量又は量の範囲であり得る。例えば、マーカーの対照量は、診断しようとする疾患又は障害に罹患していない人におけるマーカーの量であり得る。対照量は、絶対的な量（例えばμｇ／ｍｌ）又は相対的な量（例えばシグナルの相対強度）のいずれであってもよい。
【００３４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は本明細書において同様の意味で用いられ、α−アミノ酸残基の重合体、とりわけ天然のα−アミノ酸の重合体を言う。前記用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の類似体又は模倣物である、アミノ酸の重合体に適用され、また、天然のアミノ酸の重合体にも適用される。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成する炭水化物残基の付加、リンタンパク質を形成するリン酸化、及び多くの化学的修飾（例えば、酸化、脱アミド、アミド化、メチル化、ホルミル化、ヒドロキシメチル化、グアニジン化）によって修飾され得、また、分解、還元、又は架橋され得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語には、タンパク質の、あらゆる修飾されていない形態及び修飾された形態が含まれる。
【００３５】
「検出可能な部分」又は「標識」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、及び化学的手段により検出可能な組成物を言う。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられるような）酵素、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質、又は標的に対して相補的な配列を有する核酸分子が含まれる。検出可能な部分は、試料における結合性の検出可能部分の量を定量するために用い得る、放射性シグナル、発色性シグナル、又は蛍光シグナルなどの測定可能なシグナルを多くの場合生じさせる。シグナルの定量は、例えばシンチレーション計数、濃度測定、フローサイトメトリー、又は完全なペプチド若しくは続いて消化されたペプチドの質量分析（１つ又は複数のペプチドを評価することができる）による直接的な分析によって行われる。
【００３６】
「抗体」は、エピトープ（例えば抗原）を特異的に結合し認識する、１つ若しくは複数の免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされているポリペプチドリガンド、又はその断片を言う。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ及びλ軽鎖の定常領域の遺伝子、α、γ、δ、ε、及びμ重鎖の定常領域の遺伝子、並びに無数の免疫グロブリンの可変領域の遺伝子が含まれる。抗体は、例えば完全な免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼでの消化により生じる多くのよく特徴付けられた断片として存在する。これには例えばＦａｂ’断片及びＦ（ａｂ）’２断片が含まれる。本明細書で用いる「抗体」という用語にはまた、抗体全体の修飾により生じる抗体断片、又は組換えＤＮＡの手法を用いてデノボ合成された抗体断片が含まれる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体も含まれる。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つ又は複数の重鎖の定常領域のドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むが重鎖の可変領域は含まない、免疫グロブリンの重鎖の部分を言う。
【００３７】
「結合アッセイ」は、抗体などの作用物質への結合によってバイオマーカーが検出される生化学的アッセイであって、それを介して検出プロセスが実施される生化学的アッセイを意味する。検出プロセスは、放射性標識又は蛍光標識などを伴い得る。このアッセイはバイオマーカーの固定を伴い得るか、又は溶液中で実施され得る。
【００３８】
「免疫アッセイ」は、抗原（例えばマーカー）を特異的に結合するための抗体を用いるアッセイである。免疫アッセイは、抗原の単離、標的化、及び／又は定量のために特定の抗体の特異的な結合特性を用いることを特徴とする。
【００３９】
タンパク質又はペプチドに関して言う場合、抗体に「特異的に（若しくは選択的に）結合する」という表現、又は「特異的に（若しくは選択的に）免疫反応性である」という表現は、タンパク質及び他の生体由来物質の不均質な集団におけるタンパク質の存在の決定要因である結合反応を言う。したがって、指定された免疫アッセイ条件の下では、特定の抗体は、特定のタンパク質にバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、試料内に存在する他のタンパク質には実質的には有意な量で結合しない。そのような条件下での抗体への特異的な結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択された抗体が必要であり得る。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々な免疫アッセイフォーマットを用いることができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが通常用いられる（特異的な免疫反応性の決定に用い得る免疫アッセイのフォーマット及び条件の記載については、例えばHarlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照。）
【００４０】
アルブミンは種間で同種であるため、本発明の方法はヒトに限定されたものではなく、他の動物（例えば、鳥、爬虫類、両生類、哺乳類）において、特に哺乳類において有用であるが、「対象」、「患者」、又は「個体」という用語は通常、ヒトを言う。
【００４１】
「試料」は本明細書において、その最も広い意味で用いられる。試料は、血液、血清、血漿、涙、房水、硝子体液、髄液を含む体液と、細胞若しくは組織の調製物の、又は細胞が増殖した培地の可溶性画分と、細胞又は組織から単離又は抽出された細胞小器官又は膜と、溶液内の、又は基質に結合したポリペプチド又はペプチドと、細胞と、組織と、組織プリントと、指紋、皮膚、又は毛髪と、それらの断片及び誘導体とを含み得る。対象の試料は通常、血液、血漿、及び血清を含めた、血液由来物質の誘導体を含む。
【００４２】
「アルブミンを濃縮した血清又は血漿」は、アルブミン並びにアルブミンに結合している会合ペプチド及び会合タンパク質以外の構成要素を減少させるか又は除去するための処理をした血清又は血漿を意味する。
［実施例］
【００４３】
血清又は血漿からアルブミンを単離するために利用可能な２つの主要な方法があり、それらは、親和性に基づく方法（例えば抗体、チバクロンブルー）、及び化学に基づく方法（例えばＮａＣｌ／ＥｔＯＨ［Fu, Q., Garnham, C. P., Elliott, S. T., Bovenkamp, D. E. et al., Proteomics 2005, 5, 2656-2664、Colantonio, D. A., Dunkinson, C., Bovenkamp, D. E., Van Eyk, J. E., Proteomics 2005, 5, 3831-3835］、ＴＣＡ／アセトン［Chen, Y. Y., Lin, S. Y., Yeh, Y. Y., Hsiao, H. H. et al., Electrophoresis 2005, 26, 2117-2127］）である。親和性に基づく方法の多くは、比較され、効果的にアルブミンを除去することが示されている［Zolotarjova, N., Martosella, J., Nicol, G., Bailey, J. et al., Proteomics 2005, 5, 3304-3313、Bjorhall, K., Miliotis, T., Davidsson, P., Proteomics 2005, 5, 307-317、Chromy, B. A., Gonzales, A. D., Perkins, J., Choi, M. W. et al., J. Proteome Res. 2004, 3, 1120-1127］。しかし、これらの方法は、リガンド及びカラム物質、並びにＬＣカラムの場合の実験間でのキャリーオーバーに対する、タンパク質／ペプチドの非特異的な結合に対して脆弱である［Zolotarjova, N., Martosella, J., Nicol, G., Bailey, J. et al., Proteomics 2005, 5, 3304-3313、Colantonio, D. A., Dunkinson, C., Bovenkamp, D. E., Van Eyk, J. E., Proteomics 2005, 5, 3831-3835、Bjorhall, K., Miliotis, T., Davidsson, P., Proteomics 2005, 5, 307-317、Chromy, B. A., Gonzales, A. D., Perkins, J., Choi, M. W. et al., J. Proteome Res. 2004, 3, 1120-1127、Steel, L. F., Trotter, M. G., Nakajima, P. B., Mattu, T. S. et al., Mol. Cell. Proteomics 2003, 2, 262-270、Stanley, B. A., Gundry, R. L., Cotter, R. J., Van Eyk, J. E., Dis. Markers 2004, 20, 167-178］。或いは、アルブミンは、１９４０年代からＮａＣｌ／ＥｔＯＨを用いて精製されており［Cohn, E. J., Strong, L. E., Hughes, W. L., Mulford, D. J. et al., J. Am. Chem. Soc. 1946, 68, 459-475］、この方法は医薬品等級のアルブミンを単離するために通常用いられるものである。近年では、このプロセスはプロテオミクス分野に最適化され、アルブミンの効果的な精製及び除去に必要なステップが最小限となったが［Fu, Q., Garnham, C. P., Elliott, S. T., Bovenkamp, D. E. et al., Proteomics 2005, 5, 2656-2664］、他のタンパク質の同時精製は依然として問題となる可能性がある。
【実施例１】
【００４４】
ヒト血清のアルブミンを濃縮した画分の単離
化学抽出によるアルブミンの枯渇を、Fu et al.により記載されているように実施した［Fu, Q., Garnham, C. P., Elliott, S. T., Bovenkamp, D. E. et al., Proteomics 2005, 5, 2656-2664］。簡潔に説明すると、遠心分離により１００μＬの正常なヒトの血清の脂質を枯渇させ、その後、プロテインＧアフィニティーカラム（Amersham Biosciences社製、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、アメリカ）を用いてＩｇＧを枯渇させた。ＩｇＧを枯渇させた血清を４２％エタノール／１００ｍＭ  ＮａＣｌに入れ、４℃で１時間インキュベートし、その後、１６０００×ｇで４５分間遠心分離した。上清（アルブミンを濃縮した画分）を回収し、以下に記載する研究に用いた。
【実施例２】
【００４５】
ＡＢＰＰＣの単離及び特徴付け
アルブミンを濃縮した画分全体の処理を図１に概略的に示す。この研究は、アルブミン並びにあらゆる（修飾された、及び修飾されていない）結合性タンパク質／ペプチド（アルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体、ＡＢＰＰＣ）の単離のための複数の独立した方法を含むものであった。
【００４６】
最初の分析は、加熱した、及び加熱していない試料の一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びにアルブミンについてのウェスタンブロットを含むものであった（図２）。一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、アルブミンを含む１１６ｋＤａのバンドの消失、及び重度の変性（即ち、加熱及び８Ｍの尿素での処理）の後にのみ生じるいくつかのバンドの出現により、アルブミンを濃縮した画分におけるタンパク質／ペプチドの多くが、アルブミン又は他のタンパク質と会合していたということが示される（図２ＡＩ、ＢＩ）。重要なことには、これらの結果は、ゲルへの添加量が過剰であった場合（６〜１２μｇ／レーン）にのみ見られた。低分子量のバンドの存在は、加熱していない試料の添加量が少ない場合は視覚化されなかった。ウェスタンブロットでは、アルブミンは、加熱していない試料において１１６ｋＤａのバンドに存在し、予想された分子量である６６ｋＤａよりも遠くへ泳動した（図２ＡII）。しかし加熱すると、このバンドは消失し、いくつかがアルブミンを含む小さな分子量のバンドが出現する（図２ＢII）。したがって、アルブミンは、二量体を形成しているか、又は、１つ若しくは複数の他のタンパク質／ペプチドに結合しているため、高分子量で出現することが可能であり、重度の変性条件下においてのみ、これらのタンパク質／ペプチドは放出される。このことと一致するものとして、セルロプラスミン、ハプトグロビン、及びα−１Ｂ−糖タンパク質を含む、アルブミン以外のタンパク質のペプチドが、この１１６ｋＤａのバンドにおいて同定されたという事実がある。非加熱条件においては、アルブミンが低分子量で泳動するということが認められる。これは、ジスルフィドの不完全な還元によるものであり得、それにより、アルブミンがＳＤＳで十分に飽和されず移動に影響するか、又はアルブミンに結合している別のタンパク質若しくはペプチドが、ゲルにおけるアルブミンの移動を変化させる。さらに、加熱後に複数のアルブミン断片が存在することは（図２ＢII）、アルブミンの広範なタンパク質分解が生じたことを示す。結論として、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果はアルブミンへのタンパク質の結合の確実な証拠ではないが、これらの予備的な結果により、ＳＥＣ及び免疫アフィニティークロマトグラフィーによる、より精密な分析が促される。
【００４７】
従来のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、アルブミンを濃縮した画分をサイズによって分離し、自然条件において存在するあらゆるタンパク質複合体を単離した。ＳＥＣの選択は、それが、自然条件下において、非特異的な結合が最小であり、且つサイズによってタンパク質複合体を区別する能力を有するためである。抗ＨＳＡスピンカラムによる免疫親和性をヒトアルブミンに対する特異性について選択したが、マトリックスによる非特異的結合が欠点として認められた。抗アルブミン抗体アフィニティーカラム（抗ＨＳＡ）を用いて、アルブミン及びあらゆる結合性タンパク質／ペプチドを結合した。その後、カラムに結合したタンパク質をカラムから溶出し（抗ＨＳＡ残留物）、さらなる分析に付した。抗ＨＳＡ残留物及び高分子量のＳＥＣ画分を一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ、reversed phase high performance liquid chromatography）により分離して、それによりさらにアルブミンから結合性タンパク質／ペプチドを分離し、その後、トリプシン消化及びタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行ってタンパク質／ペプチドを同定した。
【００４８】
大きなタンパク質は小さなタンパク質及びペプチドよりもカラム上にある時間が短く、より早く溶出されるため、従来のＳＥＣを用いて、アルブミンを濃縮した画分をサイズによって分離した。自然条件下において、アルブミンに結合したタンパク質及びペプチドが、アルブミンを含む（１又は複数の）画分内に溶出する一方で、結合していないタンパク質及びペプチドは、それらの自然の分子量と一致して、アルブミンとは別に溶出することが予想される。図３Ａにおいて良好に分離したピークにより示されているように、ＳＥＣでは、広範なタンパク質（２９〜２０５ｋＤａ）を良好な分離能で分離することができた。アルブミンを濃縮した画分はＳＥＣによって４つの領域（Ａ〜Ｄ）に分離し、その時点で溶出する主なピークは、６６ｋＤａの標準的なタンパク質よりもわずかに大きな質量と一致していた（図３Ｂ）。ＳＥＣの利点は、図４において見られるように、再現性が高いことである。
【００４９】
ＳＥＣ−Ａは１１６ｋＤａ付近で溶出する画分を含み、ＳＥＣ−ＢはＳＥＣ−Ａのすそ及びＳＥＣ−Ｃの勾配部分の画分を含み、ＳＥＣ−Ｃは、６６ｋＤａよりもわずかに上を溶出する画分を含み、そしてＳＥＣ−Ｄは低分子量領域の試料を含む。次に、各画分（Ａ〜Ｄ）をさらに分離及び脱塩し、その後、質量分析によって分析した。ＳＥＣ画分を、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（図６）の２つの方法により分離し、その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳに付した。
【実施例３】
【００５０】
ＡＢＰＰＣにおいて同定されたタンパク質
一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＲＰ−ＨＰＬＣによるＳＥＣ画分の分析により、画分Ａ、Ｂ、及びＣに溶出しているアルブミンに加え、複数の種の存在が明らかになる。興味深いことに、高分子量のＳＥＣ画分におけるこれらのタンパク質の多くは６６ｋＤａよりかなり低い分子量を有し、それらのタンパク質を表１に列挙する。
【００５１】
【表１】
2009540335.tif 000003
2009540335.tif 000004
2009540335.tif 000005
2009540335.tif 000006
【００５２】
１１６ｋＤａ付近を溶出すると、ＳＥＣ−Ａは、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１１６ｋＤａで視覚化されたバンドと分子量が同様であった。予想された通り、この画分は分子量が１００ｋＤａより大きいタンパク質を含む（ｎ＝６）。加えて、この画分はまた、分子量が１００ｋＤａをはるかに下回る２６個のタンパク質も含み、このことは、それらがいくつかの他の（１又は複数の）タンパク質と会合し、それにより自然条件下において高分子量で溶出するということを示している。ゲルによって明らかに分かるように（図５）、ＳＥＣ−Ａにおけるいくつかのバンドは９０℃で１０分間の加熱の後に存在するのみであり、レチノール結合タンパク質、クラステリン、及びパラオキソナーゼ１を含む。１００ｋＤａ付近で溶出する画分を含むＳＥＣ−Ｂは、ＳＥＣ−Ａ及びＳＥＣ−Ｃで見られるタンパク質の混合物であると予想されるが、それはこれらのピークのすその末端がＳＥＣ−Ｂと重複しているからであり、この重複しているバンドは図５で明らかである。ＳＥＣ−Ｃは６６ｋＤａ付近で溶出する画分を含む。ＳＥＣ−Ａの場合のように、多くのバンドはこの試料の加熱の後にのみ存在し、画分は、α−１−酸性糖タンパク質１、α−２ＨＳ−糖タンパク質、及び亜鉛α２糖タンパク質を含む、分子量が６６ｋＤａよりはるかに低い多くのタンパク質を含む。要約すると、ＳＥＣの結果は、自然条件下において予想される分子量よりもはるかに大きい分子量で溶出する多くのタンパク質を示し、このことは、それらが、潜在的にはアルブミンである他のタンパク質と会合して、高分子量の複合体を形成していることを示唆している。アルブミンは各ＳＥＣ画分において見られ、このことは、異なるタンパク質を含む様々な複合体においてアルブミンが存在している可能性があることを示唆している。換言すれば、アルブミン複合体は不均質であり得る。したがって、ＳＥＣの結果は、自然条件下においてアルブミン−タンパク質／ペプチド複合体が存在するという結論を支持するものである。
【００５３】
抗ＨＳＡ免疫アフィニティーカラムを用いて、ＳＥＣの結果を裏付け、且つアルブミンとのタンパク質の相互作用をさらに特異的に調べた。抗ＨＳＡキットを、他の血清タンパク質に対する交差反応を有することなくヒト血清からアルブミンの９５％超を特異的に除去するように設計する。したがって、アルブミンを濃縮した画分を抗ＨＳＡカラムに通すと、アルブミンに結合していないタンパク質及びペプチドは通過し、アルブミンに結合しているものはアルブミンに結合したままカラムに結合すると予測される。抗ＨＳＡカラムに結合しているタンパク質及びペプチド（即ち残留物）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより直接的に分析し（図５）、ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに分離し（図７）、その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳに付した。これらの各技術により、残留物に存在するアルブミンに加えて多くの他のタンパク質が明らかになった（表１）。抗ＨＳＡ残留物において同定された４９個のタンパク質のうち３４個はまた、ＳＥＣ画分Ａ〜Ｃにおいても見られ、このことは、これらが実際に直接的又は間接的にアルブミンと会合しているということを裏付けるものである。
【００５４】
１５個のタンパク質が抗ＨＳＡ残留物において見られたが、それらはＳＥＣ画分のいずれにおいても見られず、結合していることを確認することができなかったが、結合している可能性のあるものとして表１に記載する。同様に、７個のタンパク質がＳＥＣ−Ａにおいて見られたが、それらは抗ＨＳＡにおいては見られず、したがって、アルブミンに結合していることを確認することができなかった。しかし、ＳＥＣ画分におけるこれらの７個のタンパク質のうち４個（アトラクチン、α２マクログロブリン、プレグナンシーゾーンタンパク質、及び補体成分４Ａ）は１００ｋＤａを超える分子量を有し、したがって、他のタンパク質と会合していなくてもＳＥＣ−Ａにおいて溶出すると予想される。アクチン及び単球分化抗原ＣＤ１４は１００ｋＤａより小さい分子量を有するが、アルブミンを濃縮した画分において見られる他のタンパク質と会合することが知られており、したがって、これらのタンパク質は複合体を形成し得、その結果、高分子量で溶出する。１つのタンパク質、即ちレチノール結合タンパク質のみがＳＥＣ−Ａにおいて見られ、前記タンパク質はアルブミンに結合することが知られているため抗ＨＳＡ残留物において見られると予想されたが、抗ＨＳＡ残留物においては見られなかった。要約すると、３４個のタンパク質がアルブミンに結合していることが確認され、１６個のさらなるタンパク質が結合している可能性がある。正常な血清において、最も少量のアルブミン結合タンパク質は１．０Ｅ＋１〜１．０Ｅ＋３ｐｇ／ｍｌの範囲であった（炭酸脱水素酵素Ｉ、フィブリノゲンα鎖、βトロンボグロブリン）。したがって、結合したタンパク質の範囲が広いこと（即ち、豊富なタンパク質のみではない）、アルブミン−タンパク質／ペプチド複合体が堅固な結合を示すという事実（即ち、ＳＤＳの存在下で見られ、したがって非特異的な複合体）、及び、ペプチドだけではなくタンパク質全体が結合しているという事実は、総合すると、アルブミンが特異的にタンパク質を結合していることを示す。最後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって見られる分子量、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの位置、及び観察された配列の範囲を組み合わせることで、本発明者は、結合した、及び結合している可能性のある５０個のタンパク質のうち２７個で、完全な又はほぼ完全な形（ペプチドだけではない）が存在し、分子量が８．７〜１１９ｋＤａの範囲であることを確認することができる。
【００５５】
本明細書において同定されるタンパク質の一覧を、Anderson, et al（Anderson, L. J Physiol 2005, 563, 23-60）及びBerhane, et al（Berhane, B. T.; Zong, C; Liem, D. A.; Huang, A.; Le, S.; Edmondson, R. D.; Jones, R. C.; Qiao, X.; Whitelegge, J. P.; Ping, P.; Vondriska, T. M. Proteomics 2005, 5, 3520-3530）がまとめた心血管のバイオマーカーの総合的な一覧と比較した。さらに、他のタイプのバイオマーカーについての文献調査も実施した（Anderson, L. J Physiol 2005, 563, 23-60、Berhane, B. T.; Zong, C; Liem, D. A.; Huang, A.; Le, S.; Edmondson, R. D.; Jones, R. C.; Qiao, X.; Whitelegge, J. P.; Ping, P.; Vondriska, T. M. Proteomics 2005, 5, 3520-3530、Gonzalez-Conejero, R.; Lozano, M. L.; Rivera, J.; Corral, J.; Iniesta, J. A.; Moraleda, J. M.; Vicente, V. Blood 1998, 92, 2771-2776、Fujita, Y.; Ezura, Y.; Emi, M.; Sato, K.; Takada, D.; Eno, Y.; Katayama, Y.; Takahashi, K.; Kamimura, K.; Bujo, H.; Saito, Y. J Hum Gen 2004, 49, 24-28、Rampazzo, A.; Nava, A.; Malacrida, S.; Beffagna, G.; Bauce, B.; Rossi, V.; Zimbello, R.; Simionati, B.; Basso, C.; Thiene, G.; Tobwin, J.; Danieli, G. Am J Hum Genet 2002, 71, 1200-1206、Shigeldyo, T.; Yoshida, H.; Matsumoto, K.; Azuma, H.; Wakabayashi, S.; Saito, S.; Fujikawa, K.; Koide, T. Blood 1998, 91, 128-133、Rosales, F.; Ritter, S.; Zolfaghari, R.; Smith, J.; Ross, A. J. Lipid Res. 1996, 37, 962-971）。これらの調査の結果の要約を表１に示す。興味深いことに、ＡＢＰＰＣにおける３９個のタンパク質は潜在的なバイオマーカーであることがこれまでに報告されており、これらのほとんどは心血管疾患に関連するものであった。恐らく、ＡＢＰＰＣにおける最も興味深い潜在的なバイオマーカーは、アルブミンが枯渇した画分では見られなかったタンパク質である。このカテゴリーのタンパク質は、α−２ＨＳ−糖タンパク質、アポリポプロテインＡＩ、セルロプラスミン、インターαトリプシンインヒビターＨ４、キニノゲン、アポリポプロテインＣIII、カルボキシペプチドＢ２、フィブノリゲン、プロトロンビン、血清アミロイドＡ４、及びβトロンボグロブリンである。興味深いことに、βトロンボグロブリン以外のこれらのタンパク質のすべては、心血管の潜在的なバイオマーカーであることが報告されている。βトロンボグロブリンは、血清中に低レベルで通常存在するケモカインであり、免疫応答に関与する。さらに興味深いことに、α−２ＨＳ−糖タンパク質、アポリポプロテインＡＩ、アポリポプロテインＣIII、及びセルロプラスミンは完全な形態で見られた。
【実施例４】
【００５６】
心筋梗塞におけるＡＢＰＰＣのバイオマーカーの同定
健康な個体及び疾患を有する個体のアルブミンを濃縮した画分を、いくつかの方法によって比較し、疾患に典型的な、又は疾患に相関する、何らかの変化が検出され得るかどうかを決定した。２０人の健康な対照の、アルブミンを濃縮した画分の全体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを、５人の疾患を有する患者（２人の血管炎、３人の急性心筋梗塞（ＡＭＩ、acute myocardial infarction））と比較すると、５つの興味深い差異が明らかになった（図８）。これらのピークは疾患を有する試料においてのみ存在し、それは、重篤なＡＭＩにおいて、他の疾患を有する患者よりも強度の高いものであった。
【００５７】
アルブミンを濃縮した画分の全体に加え、ＥＲを受診し、バルーン血管形成としても知られる経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ、percutaneous transluminal coronary angioplasty）を受けた、心筋梗塞（ＭＩ、myocardial infarction）及び安定狭心症（ＳＡ、stable angina）と診断された患者の間でＡＢＰＰＣを比較した。３つの時点（＃１＝基準、＃７＝手順の１時間後（虚血）、及び＃８＝手順の２４時間後（壊死））をＳＥＣにより分析し、その後、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。各試料のＳＥＣクロマトグラム（図９）は、すべての試料で同様のパターンを示し、アルブミンを濃縮した画分及びＳＥＣの再現性を示している。しかし、個体における、時間の間での明らかな差異が確認できる。４つの試料の時点１及び７において、また１つの試料においてのみ時点７で、大きなピーク（黄色の矢印）を６６ｋＤａより下で見ることができる。このピークはすべての試料において時点８で著しく減少する。高分子量の範囲（６６ｋＤａより大きい）の３つのピークも、ＳＥＣクロマトグラムにおいて確認される。ＳＡを有する患者において、３つのピークはすべての時点間で同様であると思われる。しかし、ＭＩの患者においては、中央のピークは、時点１及び７で、時点８よりも低い強度で現れる。同様に、１つの試料において（ＭＩ、男性、５１歳）、４つ目のピークは、時点８で高分子量の領域に現れる（緑色の矢印）。ＳＥＣの分解能は限界があるため、より詳細を知るためには、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＡＢＰＰＣのさらなる分離が必要であった。
【００５８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ及び一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方によってさらに分離すると、ＡＢＰＰＣのさらなる詳細が現れる。ここでも同様に、ＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィールはすべての試料間で同様のパターンを有し、再現性を示す。しかし、差異は明らかである（図１０Ａで示され、図１１で拡大されている）。すべての試料で、時点１と時点７及び８との対比で複数の差異が存在する。時点７及び８と比較して、時点１においては、ＡＢＰＰＣに含まれているタンパク質はより少ないと思われる。一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、さらに、各試料内での時点間の差異、及び試料間での差異も明らかになる。興味深いことに、ＭＩの患者は、高分子量のＳＥＣにおいて、ＳＡの試料が有していない複数の低分子量のバンド（３１ｋＤａ未満）を含む。これらの特定の試料についてタンパク質のＩＤは得られていないが、同様のバンドパターンを有するゲルの低分子量のバンドに含まれるタンパク質は、アポリポプロテインＡＩ、ハプトグロビン、レチノール結合タンパク質、及びトランスサイレチンである。また、１１６ｋＤａよりわずかに大きいバンドは、ＭＩの試料（５１歳、６５歳）においてより暗く現れる。先のゲルにおいて、このバンドはセルロプラスミンと同定された。高分子量のＳＥＣ画分のゲルのウェスタンブロット分析（図１０Ｃ）により、断片のバンドであると推定される複数の低分子量のバンドに加え、１１６ｋＤａ付近のバンドに存在するアルブミンが示された。完全な形態（６６ｋＤａ）で存在するアルブミンと、ウェスタンブロットで得られた低分子量の断片で存在するアルブミンとの対比における定量分析により、興味深い傾向が明らかになった。ＭＩの試料における、アルブミン全体対アルブミン断片の比率は平均で１．４７であったが、ＳＡの試料における比率は４．５７であり、そのｔ検定スコアは０．０１であった。したがって、ＭＩとＳＡとの対比における、アルブミンの選択的及び特異的なタンパク質分解、又はアルブミンにおける、アルブミンを熱分解しやすくする変化は、有用なバイオマーカーである。
【００５９】
異なる組の試料、即ち２人の健康な対照及び１人のＭＩを有する患者で、より詳細な分析を行った。ＡＢＰＰＣをＳＥＣにより単離し、ＳＥＣＡ＊及びＳＥＣＢ＊の２つの画分に分けた（図１２Ａ）。疾患を有する人と対照との間の差異は、２つの高分子量のピークの高さが減少することで明らかに確認することができる。次に、ＳＥＣＡ＊をＲＰ−ＨＰＬＣで分離した（図１２Ｂ）。ＭＩの試料は、５０〜６４分の保持時間でピーク強度が有意に低下した。画分を５８〜６１分間トリプシン消化した後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりさらに分析したところ、健康な対照には存在しＭＩの試料には存在しない、７個のタンパク質が明らかになった。このことは、健康な人よりも、疾患を有する人においてＡＢＰＰＣが含むタンパク質が少ないことを示す。この試料の組は、ＳＥＣによる分析の前に、タンパク質濃度ではなく全容量により標準化したことが認められる。
【実施例５】
【００６０】
血管炎におけるバイオマーカーの同定
ＭＩを有する患者に加え、血管炎を有する患者からアルブミンを濃縮した画分も試験した。一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭＩを有する患者及び血管炎を有する患者からアルブミンを濃縮した画分の比較は興味深いものである（図１３）。疾患を有する人において複数の高分子量のバンドが現れたが、それは対照では存在しなかった。
【実施例６】
【００６１】
今までのところ、データは、ＡＢＰＰＣが存在し、この複合体が疾患において変化することの証拠を提供する。ＡＢＰＰＣのこの変化は、疾患を有する人と健康な人との対比において、血清における特定のタンパク質の利用可能性が変化することによる可能性がある。一方、いくつかの証拠により、アルブミン自体における変化が指摘される（図１４）。高分子量のＳＥＣ画分のＲＰ−ＨＰＬＣにおけるアルブミンの保持時間は、ＭＩを有する２人の患者及びＳＡを有する高齢の患者において、時点８で変化する（図１４、黒の矢印）。また興味深いことに、同じ試料で、時点８においてクロマトグラムの初期に小さなピークが現れる（図１４における赤い丸）。
【００６２】
考察
ＡＢＰＰＣ及びアルブミン自体が疾患によって変化するというこれらの所見は、アルブミンの生物学的役割に関する重要な生物学的な懸念をもたらす。変化の原因及び性質は不明であるが、本明細書において示される結果は、検出し得る以上にＡＢＰＰＣにおいて変化が存在するということの十分な証拠を提供する。ＡＢＰＰＣが特に様々な疾患の診断指標として役立つ機会は、ＡＢＰＰＣを再現可能に得ることが容易であり、ＡＢＰＰＣが完全なタンパク質及びペプチドに結合し、且つタンパク質を特異的に結合するという事実により高められる。１つの捕捉試薬のみが必要であることから、ＡＢＰＰＣアッセイはハイスループットの分析に適している。したがって、１回のアッセイが複数の疾患の潜在的なバイオマーカーを広く網羅し得るため、ＡＢＰＰＣアッセイは安価であり、且つ効果的なものである。さらに、アルブミンはヒト血清において最も豊富なタンパク質であるため、ＡＢＰＰＣアッセイに必要な血液の全容量は少ない。これは侵襲が最小であるということであり、それは、新生児医学、小児医学において、及び失血が重篤である患者にとって重要である。診断指標としてのＡＢＰＰＣの応用には複数の場合が含まれる。同一の捕捉試薬を用いることができるため、ＡＢＰＰＣは、単一の疾患については単一の診断指標として用いることができ、又は複数の疾患については多重診断指標として用いることができる。この特徴により容易性が増し、それにより臨床アッセイを展開し得る。これに加えて、血清におけるＡＢＰＰＣの利用可能性があり、したがってこれは市販の製品の頑健性に役立つ。単純なイエス／ノーの診断に加え、ＡＢＰＰＣは、疾患のステージ、進行、又は治療計画の識別といった、より高度な分析にも拡張し得る。疾患の特異的マーカーは、アルブミンにおける変化、アルブミンの変化したタンパク質分解、熱分解に対するアルブミンの脆弱性に影響するアルブミンにおける変化、アルブミンに結合したタンパク質における変化、ＡＢＰＰＣの化学量論における変化、ＡＢＰＰＣにおける結合性タンパク質に対する遊離タンパク質の比率、ＡＢＰＰＣにおける完全なタンパク質対タンパク質断片の対比の比率、又は上述したあらゆるものの組合せであり得る。商業的応用には、ＡＢＰＰＣを捕捉する方法、目的の特異的なタンパク質／ペプチドを検出する方法、目的のタンパク質の修飾を検出する方法、遊離タンパク質対結合性タンパク質の比率を測定する方法、完全対ペプチド断片の比率を測定する方法、又はＡＢＰＰＣにおける化学量論の変化を測定する方法が含まれ得る。検出方法には、質量分析又は抗体系が含まれ得る。
【００６３】
本発明者は、以上に、疾患の進行の間にＡＢＰＰＣがどのように修飾されるかについていくつかの実施例を示した。したがって、アルブミン及びＡＢＰＰＣの修飾は、疾患の状態（１つの状態若しくは２つの状態の間）又は疾患の一連の経過を診断するために用い得る。１つの実施例において、患者は、血管形成の際のバルーン拡張によって、誘発性の心筋虚血及び心筋梗塞を有していた。この実験条件は、胸の痛みを訴えて救急科を受診している心臓病の患者における病気の推移を模倣するものである。心筋虚血（心筋スタニングの潜在的な形態）は、心臓の領域への血流が減少するか又はなくなると生じる。心臓はこの制限された血流を補うが、虚血が（程度及び／又は期間の両方で）かなり重篤である場合、最終的には筋細胞はアポトーシス及び／又は壊死する（心筋梗塞）。したがって、心筋虚血の検出により、ＡＭＩを発症する恐れのある患者の初期の診断が可能になる。その結果、これらの患者は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ、tissue-type plasminogen activator）、血管形成術、若しくは他の血栓減少剤及び保護剤を用いた治療を初期に受け得るか、又は処置及びモニタリングを増やすべく状態を高め得る。初期の再潅流療法が心筋を助けるということはよく記載されている。したがって、弱い心筋の初期の検出は有利である。現在では、初期の検出のための診断には２つのアプローチがあり、それらは、ｉ）初期の検出のための、より感度の高い心筋壊死のマーカーの開発、又はii）虚血特異的マーカーの開発である。提供されている虚血のマーカーはわずかであり、ＦＤＡの認可を受けているものは１つしかない。これは、ＡＭＩを阻止するために不在壊死マーカーと共に用いられる、修飾されたアルブミン（修飾された金属結合）である。本願では、本発明者は、アルブミン及びその結合複合体（ＡＢＰＰＣ）が虚血によって変化し、そしてさらにＡＭＩ（細胞壊死）によって変化するという、特有のプロフィールを概説する。したがって、ＡＢＰＰＣにより、基準となる健康な個体（及び安定狭心症を有する個体）と、虚血及びＡＭＩによる侵害とを区別することができる。第２のケースにおいて、本発明者は、血管炎であると既に診断されている患者によるＡＢＰＰＣにおける変化を示す。血管炎を有する患者の大部分は治療の後に寛解へ向かうが、ほとんどが再燃し、続いて治療の再開を必要とする。したがって、血管炎についての有益な診断は、個体がいつ再燃を生じるかを予測する能力を有するものである。寛解期にある血管炎の患者と、その後の再燃を生じている患者との間の比較において、アルブミン及びＡＢＰＰＣの特有のプロフィールが得られた。したがって、ＡＢＰＰＣは、基準となる健康な個体と、寛解期にある血管炎を有する個体と、再燃している血管炎を有する個体とを区別するために用い得る。
【００６４】
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【図１】
2009540335.tif 000007
【図２】
2009540335.tif 000008
【図３】
2009540335.tif 000009
【図４】
2009540335.tif 000010
【図５】
2009540335.tif 000011
【図６】
2009540335.tif 000012
【図７】
2009540335.tif 000013
【図８】
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【図９】
2009540335.tif 000015
【図１０Ａ】
2009540335.tif 000016
【図１０Ｂ】
2009540335.tif 000017
【図１０Ｃ】
2009540335.tif 000018
【図１１】
2009540335.tif 000019
【図１２】
2009540335.tif 000020
【図１３】
2009540335.tif 000021
【図１４】
2009540335.tif 000022
【国際調査報告】
2009540335.tif 000023
2009540335.tif 000024