(57)【要約】本発明は、細胞または細胞成分に対して特異性を有する、多モード撮像法用の三区画構造ポリマーナノ粒子（コア‐シェル‐コロナ）に関しており、それゆえに生物学的に活性な物質を添加せずに、細胞段階でのさらに進歩した診断方法および標的療法が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性コロナを有し、平均径が２０nm〜９００nmである三区画（コア‐シェル‐コロナ）ポリマー粒子。
【請求項２】
前記コロナが水溶性ポリマーから成り、結果的に生理環境下でコロイドが安定する請求項１に記載のポリマー粒子。
【請求項３】
該コロナの側鎖が化学活性化を介して架橋し得る請求項１〜２に記載のポリマー粒子。
【請求項４】
前記コロナが細胞または細胞成分、特に末梢血液細胞の表面に対して特異的親和性を持つ構造を集合させる請求項１〜３に記載のポリマー粒子。
【請求項５】
前記シェルが、以下に結合する高密度カルボキシル基を持つ毛状構造を有する請求項１〜４記載のポリマー粒子：
（i）  ガドリニウムなどの常磁性金属イオン、
（ii）  ポリヨウ化または臭素化分子またはポリマー鎖などの不透明物質、または硫酸バリウムまたは他の金属などの無機物質および／または
（iii）６８ガリウムまたは１１１インジウムなどの重金属同位体。
【請求項６】
該シェルを形成するモノマーまたは要素がカルボキシル基および／またはヒドロキシル基を含む請求項１〜５に記載のポリマー粒子。
【請求項７】
前記コアが物理的封入または化学結合または染料、蛍光染料両方の使用、または多結晶性磁性酸化鉄を介して標識可能であり、これらのポリマー粒子を光学撮像法、蛍光活性化細胞同定および／または分類、磁気共鳴ならびに／もしくは粒子画像化に適合させる、請求項１〜６に記載のポリマー粒子。
【請求項８】
前記コアが、以下のみから成る群より選択される少なくとも１つの化合物を有するホモポリマーまたはコポリマーから形成されたポリマーを含む請求項１〜７に記載のポリマー粒子：アクリル酸、メタクリル酸、メタクリル酸メチル、２，３‐エポキシプロピルメタクリレート、スチレン、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２‐エチルヘキシル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ‐ブチルアミノエチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピルおよび／または酢酸ビニル。
【請求項９】
前記ホモまたはコポリマーが、以下のみから成る群より選択される化合物を使用して架橋している請求項８のポリマー粒子：メタクリル酸アリル（ＡＬＭＡ）、ジメタクリル酸エチレングリコール（ＥＧＤＭＡ）、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン（ＴＭＰＴＭＡ）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、メタクリル酸グリシジル、２，２‐ジメチルプロパン１，３ジアクリレート、１，３‐ブチレングリコールジアクリレート、１，３‐ブチレングリコールジメタクリレート、１，４‐ブタンジオールジアクリレート、ジアクリル酸ジエチレングリコール、ジメタクリル酸ジエチレングリコール、１，６‐ヘキサンジオールジアクリレート、１，６‐ヘキサンジオールジメタクリレート、ジアクリル酸トリプロピレングリコール、ジメタクリル酸トリエチレングリコール、ジアクリル酸テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール２００ジアクリレート、ジメタクリル酸テトラエチレングリコール、ジメタクリル酸ポリエチレングリコール、エトキシ化ビスフェノールＡジアクリレート、エトキシ化ビスフェノールＡメタクリレート、ポリエチレングリコール６００ジメタクリレート、ジアクリル酸ポリ（ブタンジオール）、トリアクリル酸トリメチロールプロパン、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、トリエトキシトリアクリル酸トリメチロールプロパン、プロポキシトリアクリル酸グリセリル、テトラアクリル酸ペンタエリスリトール、テトラメタクリル酸ペンタエリスリトールおよび／またはモノヒドロキシペンタアクリル酸ジペンタエリスリトール。
【請求項１０】
前記シェル‐コロナがアクリル酸またはメタクリル酸単独、またはそれらの組み合わせのモノマー単位、またはアクリル酸ヒドロキシエチルまたはメタクリル酸ヒドロキシエチルまたはモノメタクリル酸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のモノマーとの組み合わせから優先的に作られる請求項１〜９に記載のポリマー粒子。
【請求項１１】
全直径が９００nm未満、好ましくは２５０nm未満、最も好ましくは１５０nm未満である請求項１〜１０に記載のポリマー粒子。
【請求項１２】
該コロナの厚さが１nm〜１５０nmである請求項１〜１１に記載のポリマー粒子。
【請求項１３】
該コアの割合が全直径に対して０．１〜０．９９５である請求項１〜１２に記載のポリマー粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の画像促進薬を被験体に投与し、前記被験体を画像形成手段に供することを含む画像形成法。
【請求項１５】
前記画像形成手段が、磁気共鳴撮像手段および／または磁性粒子撮像手段、Ｘ線撮像手段、陽電子放出断層撮影手段、ガンマシンチグラフィー手段、光学的撮像手段、蛍光活性化細胞同定および／または分類手段、またはこれらの画像法の組み合わせを使用する手段である請求項１４の方法。
【請求項１６】
心臓、循環器系、脳および脊髄、骨および関節および軟骨、肺；肝臓、脾臓、胃および腸を含む消化管、膵臓、腎臓、尿管、膀胱および生殖器の疾患を同定するための医療診断が目的である請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリマー粒子の使用。
【請求項１７】
神経筋疾患、免疫疾患、腫瘍性疾患、血液病、神経変性疾患および炎症性疾患を同定およびモニターするための医療診断を目的とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリマー粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像向上特性および細胞特異性を有する特別に設計されたポリマーナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子技術は急速に発展している分野であり、この数年、臨床応用で進歩している［１〜３］。より効果的で個別化された療法のための新規な高解像度診断および薬物ナノ担体の開発に大きな期待が寄せられている［４］。分子レベルにおける疾患の理解が深まったことにより、およびナノ構造の生体適合材料の生成を可能にする材料科学の近年の進歩により、科学的根拠が確立された。
【０００３】
ナノ粒子を使用する際の１つの明らかな利点は、送達された物質の局所濃度を比較的高めにする担体系の質量に対する表面比が高くなることである［５］。コロイドも薬物動態およびインビボでの区画化に影響を及ぼす特定の物理化学的特性を有する［６］。一般的に注入部位から散在し、腎臓系により即時に浄化される可溶物質とは異なり、ナノ粒子は通常特定の区画に長期にわたり集中する。また、適用した材料の動向を制御するため、化学的機能付与は生物学的障害を克服し、あるいは特異的輸送および変性プロセスを活用するのに役立つであろう［７、８］。
【０００４】
この数年で、静脈内投与でのナノ粒子毒性および免疫原性、ならびにコロイド安定性および血液半減期に関する研究に多大な尽力が注がれた。他の重要な問題には、ナノ粒子の特定の組織への送達を制御することが挙げられる。近年、動物モデルで、非修飾ナノ粒子との比較に等張無水物修飾ナノ粒子を使用して特異的腫瘍ターゲティングが明らかになった［９］。この試験で特筆すべきは、注入された物質の８０〜９０%が腫瘍に届く以前に肝臓でろ過されたことである。このことから単核食細胞系（ＭＰＳ）による実効的な浄化を回避することが困難であることが示され、同様の結果が他の研究でも示された［１０、１１］。標的組織にナノ粒子を排他的に蓄積させることは現在、多岐にわたる臨床応用を制限する大きな課題であり、細胞毒性または発癌性物質が送達される場合に特に重要である。
【０００５】
インビボでのナノ粒子の挙動に関して理解を深めることによって著しい進歩が可能となり得る。適用した材料の局在化および検出がより正確なものであることが重要な課題である。これは、各特定の方法を活用する多様な撮像技術と検出技術との同時使用によって実現し得る。複数のトレーサーの結合は概して、多機能ナノ粒子の製作を必要とし、１つの障害としては、異なる成分間の明らかな化学的または物理化学的不適合性を克服することである。６８Ｇａは陽電子放出断撮像法（ＰＥＴ）用に広く使用されているトレーサーであるが、標識化を効率的にするため、塩酸溶液および熱供給を必要とする［１２］。このことにより、ナノ粒子の生理的統合性およびコロイド安定性に関して多数の要件が提起される。さらに６４Ｃｕおよび７４Ａｓなどの核種も試験されているが、これまであまり市販されていない［１３、１４］。磁気共鳴撮像法にはＧｄがコントラスト促進物質として広く使用されており、これはキレート剤複合体としてラテックスナノ粒子の表面に付着させることに成功している［１５］。しかし、ナノ分子表面で達成した比較的低いＧｄ負荷量はインビボでの追跡調査を困難なものにする。Ｇｄ標識化したナノ粒子で事前に負荷した移植細胞を使用して、ＭＲＩはインビボで実現されている［１６］。合成樹状ポリマーは生物医学的応用に広く使用されており［４３］、Ｇｄまたはヨウ素を負荷した樹状ナノ粒子はそれぞれ、ＭＲＩ［４４］またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）［４５］に使用されている。
【０００６】
他の種類の合成ポリマー材料を開発中であり、この中ではポリ‐メタクリル酸グリシジル（ポリ‐２，３‐エポキシプロピルメタクリレート＝ＥＰＭＡ）が人工器官または移植分野で周知である［４０］。ＥＰＭＡによる格子の表面修飾は初期の研究で報告されており［４１］、一方、ＥＰＭＡホモポリマー格子はごく最近になって開発された［１７］。カルボキシル化ＥＰＭＡラテックス粒子の生体適合性および低毒性は研究で明らかになり、その研究では、直径２５nm未満のナノ粒子がインビボで神経突起により取り込まれ、次いで逆行輸送後に神経核に留まることが分かった［１７〜１９］。現在、ポリマーコロイド（またはラテックス粒子）は、所与のホモまたはコポリマーを非常に異なる粒子型にする万能の構成要素系と見なされている。サイズや表面電荷密度などの物理化学的特性は容易に制御可能で、さらに例えば生物機能付与の目的で、化学基を重合プロセスに導入することが可能である。いくつかの研究ではＥＰＭＡナノ粒子の製作について記述しており、これは隆起した直鎖ポリメタクリル酸鎖から成る水溶性コロナを有する小型のラテックスコアに存在する［２０］。
【０００７】
驚くべきことに、生体適合性コロナを有し、平均径が２０nm〜９００nmである三区画ポリマー粒子は相乗効果があり、したがって該粒子は前記欠点を特徴とせず、よって磁気共鳴画像法、Ｘ線画像法ならびに陽電子放出断層撮影法またはガンマシンチグラフィーに適している。
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【非特許文献４６】Ishizu K 1998 Progress in Polymer Science, Vol.23, pp. 1383-1408
【非特許文献４７】Reynolds C H etal.2000 J. Am. Chem. Soc. 122, 8940-8945;
【特許文献１】［４７］  EP 1 031 354
【特許文献２】［４８］  1987EP240424
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
単純な球状、またはそれ以上に精巧なコア‐シェルポリマーナノ粒子の合成がポリマー化学において周知である。前記の例としては、単分散で多様なサイズに作成することが可能なラテックスビーズが挙げられる。コア‐シェルポリマー粒子の合成および構造についてはK. Ishizuが記載している［４６］。パラメーターの数は動物およびヒトに使用するポリマーに依存している。最も重要なパラメーターは、ポリマーは生体適合性で、最終コア‐シェル粒子は血液または組織などの生理環境で安定しているコロイド状でなければならないことである。さらに、体内の粒子の半減期は、診断および／または治療目的を満たすのに十分長いが毒物学的負荷を低く維持するのにできるだけ短い必要がある。
【０００９】
重合体コアを有する画像促進剤、例えばそれに結合するガドリニウムなどの画像促進化合物、およびこのコア画像中心を囲む重合体シェルは、Reynoldsらが記載している［４７］。LevergeおよびRollandは、撮像目的の単純な球状の単分散ナノ粒子を調製するために乳化重合を利用しており、ここでは画像促進化合物が粒子の表面に結合する［４８］。両ケースで、記述した粒子は付加的な生体反応性または免疫反応性分子が細胞特異的であることを必要とし、構造機能性能に限りがあることから多モード撮像用に設計することは不可能であった。
【００１０】
生物医学的応用のためのラテックスポリマーおよび進歩的な機能特性を有するコア‐シェルポリマーを記述している科学文献があり、多くの特許が開示している。ナノ粒子を使用した撮像化および標的療法のほとんどの概念は、適切な特異性を生じさせるモノクローナル抗体などの生物学的に活性な物質を利用し、このような目標を達成することである。しかし先行技術は、生物学的に活性な物質を添加せずに細胞または細胞成分に特異的な多モード撮像用のポリマー粒子の合成を伝えることに失敗している。外来抗体などの生物学的活性物質を回避することは難しく、また、生物学的活性物質を患者に使用することは危険を伴うことから、この点では最も重要でもある。また、多様な撮像系（多モード撮像）用のコントラスト促進画像処理を可能にすることは、１つの化合物だけで多様な系の特別な利点：磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）を使用した空間解像度、陽電子放出断層撮像法（ＰＥＴ）を使用した感受性および特異性、Ｘ線を使用した時間解像度およびコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）から利益を得ることとなる。
【００１１】
ここでは、本発明者らはポリマーナノ粒子を使用した多モードインビボ撮像化および検出の実行可能性を説明している。１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、ポリヨウ化分子およびＧｄなどの陽イオン性トレーサーは、キレート接合体を必要とせずに、ポリマーナノ粒子の毛状シェル中間層内に直接結合した。６８Ｇａ‐ＰＥＴは全動物をスキャンする高速で非侵襲的な撮像法として使用し、主に心臓および肝臓、狭い範囲では脾臓におけるトレーサーであることが分かった。血液および抽出した器官の１１１Ｉｎ‐ガンマシンチグラフィーから、この効果が血液区画における局在化に起因していることが明らかになった。Ｇｄラベルを利用したＴ１強調ＭＲＩを確立し、循環系をディスプレイに表示した。最終的に、ローダミンＢなどのフルオロフォアの粒子コアへの組み込み、フローサイトメトリーの使用および共焦点顕微鏡法により、ポリマーナノ粒子と血小板、特定の白血球および単球との急速な会合が明らかになった。よって、新たな三区画ポリマーナノ粒子により、生物学的に活性な物質を添加せずに、細胞段階でのさらに進歩した診断方法および標的療法が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、細胞または細胞成分に対する特異性を有する、多モード画像法のための三区画構造ポリマーナノ粒子（コア‐シェル‐コロナ）に関しており、それゆえに生物学的に活性な物質を添加せずに、細胞段階でのさらに進歩した診断方法および標的療法が可能となる。
本発明は、画像向上特性および細胞特異性を有する特別に設計されたポリマーナノ粒子に関する。ポリマー粒子のこれら２つの基本的な機能的特性は、ポリマー粒子が成長して三区画（コア‐シェル‐コロナ）構造を構築しているときにモノマー付加が制御されることにより、可能となる。粒子の外層であるコロナは例えば、ＣＤ４２ａ陽性細胞（血小板）あるいはＣＤ１４陽性細胞（単球）に結合するように設計されている。中間にある毛状シェルおよび内層の硬質コアは、以下の示差異的局在化を示す適切な画像促進化合物を含み、多モード撮像手段を可能にする：フルオロフォアおよび酸化鉄結晶は硬質コアに位置し；ガドリニウム誘導体、ヨウ素塩および放射性同位体は毛状シェルに位置する。したがって得られたポリマーナノ粒子は、磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）または磁性粒子撮像法、Ｘ線撮像法、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ガンマシンチグラフィー、光学的撮像技術、蛍光活性化細胞同定および／または分類手段などの撮像手段に、もしくは撮像技術の組み合わせを使用する多モード手段に、使用してよい。新たな三区画ポリマーナノ粒子により、生物学的に活性な物質を添加せずに、細胞段階でのさらに進歩した診断方法および標的療法が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の好ましい一実施態様では、前記ポリマー粒子は、水溶性ポリマーのみから成るコロナを特徴とし、結果的に生理環境下でコロイドが安定する。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、側鎖が化学活性化を介して架橋し得るコロナを特徴とする。
【００１５】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、細胞または細胞成分、特に末梢血液細胞の表面に対して特異的親和性を持つ構造を集合させる前記コロナを特徴とする。
【００１６】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、磁気共鳴画像法に適したガドリニウムなどの常磁性金属イオンに、ポリヨウ化または臭素化分子またはポリマー鎖などの不透明物質に、またはＸ線撮像法に適した硫酸バリウムまたは他の物質などの無機物質に、あるいは陽電子放出断層撮像法またはガンマシンチグラフィーに適した６８ガリウム（６８Ｇａ）または１１１インジウム（１１１Ｉｎ）などの重金属同位体に、結合する高イオン交換能を有するシェルを特徴とする。
【００１７】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、シェルを形成する要素のモノマーがカルボキシル基および／またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする。
【００１８】
別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、高密度カルボキシル基が以下に結合する毛状構造を有するシェルを特徴とする：
（i）  ガドリニウムなどの常磁性金属イオン、
（ii）  ポリヨウ化または臭素化分子またはポリマー鎖などの不透明物質、または硫酸バリウムまたは他の金属などの無機物質および／または
（iii）６８ガリウムまたは１１１インジウムなどの重金属同位体。
【００１９】
本発明のさらにより好ましい実施態様では、前記シェルは、ガドリニウムなどの常磁性金属イオンに、ポリヨウ化または臭素化分子またはポリマー鎖などの不透明物質、または硫酸バリウムまたは他の金属などの無機物質に、および６８ガリウムまたは１１１インジウムなどの重金属同位体に、結合する高密度カルボキシル基を有する毛状構造を持つ。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、以下のみから成る群より選択される少なくとも１つの化合物を有するホモポリマーまたはコポリマーから形成されたポリマーを含むコアを特徴とする：アクリル酸、メタクリル酸、メタクリル酸メチル、２，３‐エポキシプロピルメタクリレート、スチレン、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２‐エチルヘキシル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ‐ブチルアミノエチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピルおよび酢酸ビニル。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施態様では、前記ポリマー粒子は、以下のみから成る群より選択される化合物を使用して架橋している、前記ホモまたはコポリマーを特徴としている：メタクリル酸アリル（ＡＬＭＡ）、ジメタクリル酸エチレングリコール（ＥＧＤＭＡ）、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン（ＴＭＰＴＭＡ）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、メタクリル酸グリシジル、２，２‐ジメチルプロパン１，３ジアクリレート、１，３‐ブチレングリコールジアクリレート、１，３‐ブチレングリコールジメタクリレート、１，４‐ブタンジオールジアクリレート、ジアクリル酸ジエチレングリコール、ジメタクリル酸ジエチレングリコール、１，６‐ヘキサンジオールジアクリレート、１，６‐ヘキサンジオールジメタクリレート、ジアクリル酸トリプロピレングリコール、ジメタクリル酸トリエチレングリコール、ジアクリル酸テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール２００ジアクリレート、ジメタクリル酸テトラエチレングリコール、ジメタクリル酸ポリエチレングリコール、エトキシ化ビスフェノールＡジアクリレート、エトキシ化ビスフェノールＡメタクリレート、ポリエチレングリコール６００ジメタクリレート、ジアクリル酸ポリ（ブタンジオール）、トリアクリル酸トリメチロールプロパン、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、トリエトキシトリアクリル酸トリメチロールプロパン、プロポキシトリアクリル酸グリセリル、テトラアクリル酸ペンタエリスリトール、テトラメタクリル酸ペンタエリスリトールおよびモノヒドロキシペンタアクリル酸ジペンタエリスリトール。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、アクリル酸またはメタクリル酸単独、またはそれらの組み合わせのモノマー単位、またはアクリル酸ヒドロキシエチルまたはメタクリル酸ヒドロキシエチルまたはモノメタクリル酸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のモノマーとの組み合わせから優先的に作られるシェル‐コロナを特徴とする。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、全直径が９００nm未満、好ましくは２５０nm未満、最も好ましくは１５０nm未満であることを特徴とする。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、コロナの厚さが１nm〜１５０nmであることを特徴とする。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は、コアの割合が全直径に対して０．１〜０．９９５であることを特徴とする。
【００２６】
本発明はまた、本発明に記載の画像促進薬を被験体に投与し、前記被験体を画像形成手段に供することを含む画像形成法に関する。
【００２７】
本発明の好ましい一実施態様では、前記画像形成手段は、磁気共鳴撮像手段および／または磁性粒子撮像手段、Ｘ線撮像手段、陽電子放出断層撮影手段、ガンマシンチグラフィー手段、光学的撮像手段、蛍光活性化細胞同定および／または分類手段、またはこれらの撮像法の組み合わせを使用する手段である。
【００２８】
本発明はまた、心臓、循環器系、脳および脊髄、骨および関節および軟骨、肺；肝臓、脾臓、胃および腸を含む消化管、膵臓、腎臓、尿管、膀胱および生殖器の疾患を同定するための医療診断が目的である本発明に記載のポリマー粒子の使用に関する。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、本発明に記載のポリマー粒子は神経筋疾患、免疫疾患、腫瘍性疾患、血液病、神経変性疾患および炎症性疾患を同定およびモニターするための医療診断を目的として使用される。
【００３０】
本発明は以下の観点を特徴として教示する：
‐一般的考えからの脱却
‐問題の新たな認知
‐長年にわたる必要性および要求に対する満足感
‐これまで専門家の努力すべてが無駄になっていること
‐特に、より複雑な学説と置き換わることから発明の作用を証明する解決策の簡易性
‐科学的技術の開発が別の指示に従ったこと
‐成果は開発を進歩させること
‐一致した問題（損害）の解決に関する専門家らの誤認
‐改善、高性能化、価格の低減、得がたい時間、材料、工程、費用または資源の節約、信頼性の回復、欠陥の修正、品質の改善、整備の不要、高効率化、収率の改善、技術的可能性の拡大、他の生成物の提供、予備策の開設、新たな分野の開設、作業の第一解決策、予備生成物、代替物、合理化の可能性、自動化あるいは小型化、または医療基金の充実などの技術的向上
‐特定の選択；多数の可能性の中から、結果が予測不能なある可能性が選択されたことから、その選択は特許性としては幸運な選択であること
‐引用文献の誤り
‐技術分野の未熟さ
‐複合的発明；多数の既知の要素と驚くべき効果との組み合わせ
‐ライセンス供与
‐専門家の賛同
‐商業的成功、および
‐相乗効果。
【００３１】
前記利点の少なくとも１つは、特に本発明の優先的実施態様に示している。
【００３２】
実に驚くべきことに、三区画ポリマー粒子（コア‐シェル‐コロナ）は当技術分野の現況で述べられている欠点を有さず、医薬品としても、多様な撮像法に対しても使用可能である。本発明に記載のポリマー粒子をそれ自体で医薬品として使用しなければ、本発明の好ましい実施態様では、医薬品を本発明に記載のポリマー粒子に結合させることが可能である。
【００３３】
ポリマーナノ粒子合成：全化学物質を入手形態のまま使用した。例えば、Millipore unit製のultra-pure waterを全調製工程で使用した。ポリマーナノ粒子を、２５０mLの二重壁ガラス反応器（HWS Mainz、ドイツ）中、セミバッチ乳化共重合により合成した。この反応器にはガラス製アンカースターラー、窒素注入口、還流冷却器および滴下漏斗が備えられていた。０．２gのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Serva）を１５６mLの水に溶解した。０．１０８gのペルオキソ二硫酸カリウム（Sigma Aldrich, Seelze、ドイツ）を２０mLの水に溶解した。１．６gのメタクリル酸（Fluka/Sigma Aldrich, Seelze、ドイツ）を最小限量の水に溶解し、その後体積を最終的に２０mLにし、注入ポンプ（型610 B.S., Medipan Warszawa、ポーランド）に接続されたプラスチックシリンジ（B.Braun）に入れた。ＳＤＳ溶液［３．５４mmol/L］を直接に単独で、あるいは、ナノ粒子（ＣＬ２と称する）の蛍光標識の場合は２０mgのローダミンＢ（Sigma Aldrich, Seelze、ドイツ）を補ってガラス製反応器に入れた。その後１８gの２，３‐エポキシプロピルメタクリレート（Fluka/Sigma Aldrich, Seelze、ドイツ）［０．６５mol/L］を添加した。エマルジョンを、外気温度で２０分間、連続攪拌（３５０／分）して窒素浄化し、その後、窒素浄化しながら加熱して６０℃の重合温度にし、攪拌を継続した。１０分後６０℃で、滴下漏斗を介してペルオキソ二硫酸カリウム溶液を反応器［２．０４mmol/L］内のモノマーエマルジョンへ素早く添加して重合を開始した。同時に注入ポンプを始動し、一定の流速０．１５mL*分−１で、メタクリル酸溶液を一定に重合ラテックスに添加しながら、２．２時間、カルボキシル化を行った［０．０９５mol/L］。６時間後に重合を終了し、窒素気流を停止し、格子を外気温まで冷却した。ポリマー分散度は固体内容物の約１０%であった。さらに精製を以下のとおりに行った：ナノ粒子は最初に、VISKING（登録商標）チューブ（排除限界は１４，０００ダルトン）内で３日間、脱イオン水（５Lに対してラテックス１００mL）に対して透析し、水は１日に２回交換した。次いで、超純粋（Millipore）を使用して、照射‐エッチング膜（Nuclepore/Whatman；孔径は粒子径；２５nm、５０nm、１００nmに調整）を備えたBERGHOFF（登録商標）細胞４００mL中で、ろ液の電気伝導率が１μS/cm未満になるまで限外ろ過を行った。所与のモル濃度に関するデータはすべて、反応器内での最終的な総体積１９６mLに関連している。
【００３４】
小型のローダミンＢ標識ポリマーナノ粒子（５２nm、ＣＬ６と称する）を、０．７gのＳＤＳおよび５mgのローダミンＢを添加し、２０mLシリンジ（２０mLのモノマー水溶液を充填した）中の１．２gのメタクリル酸を使用して合成した。また、小型のナノ粒子ならびに、等モノマーモル濃度のメタクリル酸およびポリエチレングリコールの両方を含有するコロナも、ＣＬ６のものと同様のプロトコールにしたがって生成した（ＣＬ１３と称する）が、例外として、シリンジには０．６gのメタクリル酸および１．９９gのＰＥＧ２００‐モノ‐メタクリレートの混合物を含有していた。
【００３５】
ポリマーナノ粒子標識化および物理化学的特徴評価：ポリマーナノ粒子を、例えば１．５mLの脱イオン水中、６．５MBqの１１１ＩｎＣｌ３（Tyco Healthcare、ドイツ）を有するナノ粒子２８mgをインキュベートすることによって、１１１Ｉｎで標識化した。３０分後、標識ナノ粒子をディスポーサブルのＰＤ１０脱塩カラム（Sigma Aldrich, Seelze、ドイツ）を使用してゲルろ過で精製した。カラム平衡および溶出にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Biochrom, Berlin、ドイツ）を使用した。溶出したナノ粒子を含む画分にのみ、検出可能放射活性が見られ、このことは１１１Ｉｎが完全にナノ粒子で吸収されたことを示唆している。溶出後、負荷したナノ粒子が１．５mL中に９５%回収され、結果として希釈効果は最小限であった。
【００３６】
ＴｉＯ２をベースにした２０mCiの６８Ｇｅｒ／６８Ｇａ発生装置（Cyclotron Co. Obninsk、ロシア）から６８Ｇａを得た。発生した６８Ｇａを、Bio-Rad AG 50W-X8カラム（Bio-Rad, Munich、ドイツ）で陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、事前に濃縮した。結合後、カラムを、０．１５MのＨＣｌを含有する８０%アセトンで３回洗浄し、６８Ｇａを０．０５MのＨＣｌを含有する９７．５６%アセトン４００μLを使用して溶出した。発生装置は一定量の０．３ＧＢｑの６８Ｇａを産生した。溶出の直後、Ｎ２気流により５分間、アセトンを蒸発させた。標識化反応では、１mLの脱イオン水中で２５mgのポリマーナノ粒子を事前に加熱して８２℃にし、６８Ｇａ溶液と混合した。インキュベーションを１５分まで延長し、その間、温度は６０℃まで下げた。その後、ＰＤ１０カラムを使用して標識化ナノ粒子を上記のとおりに精製した。それらには、１mgの格子当たり一定量の０．２MBqの６８Ｇａが含有されていた。
【００３７】
Ｇｄ標識化のために、０．２mMの原液として調製した指定量のＧｄＣｌ３を、３７mgのポリマーナノ粒子に添加し、最終的に体積を１．５mLにし、室温で３０分間インキュベートした。ナノ粒子に結合したＧｄの量を、非結合画分から計算し：ナノ粒子を２０，０００gで５分間かけて沈降させ、上清中、arsenazo III（Sigma Aldrich, Seelze、ドイツ）に基づいた比色アッセイによりＧｄを定量した［２２］。ＭＲＩ研究では、ナノ粒子に
対する量が１%（w/w）未満であるＧｄを使用し、これに対して遊離Ｇｄを検出しなかった。よって標識化反応にしたがって精製工程を省略した。
【００３８】
ナノ粒子のサイズを動的光散乱（ＤＬＳ）により判定し、ζ電位をNano-ZS Zetaziser（Malvern Instruments, Herrenberg、ドイツ）を使用し、メーカー説明書にしたがって、電気泳動移動度により測定した。各試料で測定を３回行い、平均を求めた。示した結果は３つの個々の標本の平均を表す。コロイド安定性は、水、１mMのＭｇＣｌ２、１mMのＣａＣｌ２および１g/lのグルコースを含有するｐＨ７．４のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ならびに４%のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補われたＨＢＳＳなどの多様な条件におけるナノ粒子の凝集傾向と定義した。即時に、１mgのナノ粒子を１mLの指定の培地に希釈し、室温で３０分間インキュベートし、ＤＬＳで測定した。ζ電位を１mMのＮａＣｌ中で測定した。顕微鏡（Axiovert 200, Zeiss Jena、ドイツ）を備えたNanoWizard  ＡＦＭ装置（JPK Instruments AG, Berlin、ドイツ）を使用して原子間力顕微法（ＡＦＭ）を行った。即時に、希釈したナノ粒子を新しい滅菌済雲母シート上でインキュベートし、脱イオン水ですすぎ、５分間風乾した。力定数７．５N/mのカンチレバーチップを使用して、間欠接触モードで画像を得た。
【００３９】
インビボ研究：動物実験に際して、雄ウィスターラット（体重３２０〜３５０g）をイソフルラン吸引で麻酔し、その後動物実験処理に関する国立機関（LaGetSi, Berlin、ドイツ）の標準動物処置ガイドラインにしたがって、９０mg/体重kgの塩酸ケタミン（Serumwerk, Bemburg、ドイツ）および１０mg/体重kgの塩酸キシラジン２%（Bayer, Brunsbuttel、ドイツ）を腹腔内注射した。別段の指示がなければ、５００μLのＰＢＳ中標識化ナノ粒子を、尾静脈に静脈内注射した。
【００４０】
陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）：ＰＥＴを、画像取得および再構成用のSUN Microsystemsコンピューターワークステーション（Philips Medical Systems, Hamburg、ドイツ）を２つ備えたMOSAIC Animal PET Imagingシステムを使用して行った。１mmの解像度を有する１２８ｘ１２８ピクセルの断面２３０枚を作成する放射限定捕捉モードでステップアンドシュート法全身スキャンを介してデータを得た。減衰補正をせずに３Ｄ‐ＲＡＭＬＡアルゴリズムを使用して生データを反復的に再構成した。得られたＰＥＴ画像をＤＩＣＯＭ（Digital Imaging and Communications in Medicine）フォーマットに輸送し、Amira（商標）ソフトウエアパッケージ（Mercury Computer Systems, Dusseldorf、ドイツ）を使用しさらに処理した。このソフトウエアはＰＥＴ画像の３Ｄ視覚化ならびに異なる実験から得られたデータセットの重層および整列を可能にした。
【００４１】
６８Ｇａ‐ＰＥＴでは、２．２MBqの６８Gaを含むポリマーナノ粒子を注入し、１５分後に動物をスキャンした。スキャンの時間は５分であり、その間、７．４メガ数（Mcts）を記録した。１８フッ素‐フッ化物（１８F‐フッ化物）および[１８F]フルオロ‐２‐デオキシグルコース（１８ＦＤＧ）をClinic for Nuclear Medicine at the Berlin University Medical School(Charite, Berlin、ドイツ)から厚意で譲渡された。骨格を画像化するため、ラットの尾静脈に２５３MBqの１８Ｆ‐フッ化物溶液を注射し、５時間後に、１０６Mctsを集積する５分間のスキャンにてＰＥＴ画像を得た。眼、心臓および腎臓を可視化するために１８ＦＤＧを代謝トレーサーとして使用した。６２MBqの１８ＦＤＧを尾静脈に注射し、２５分後に動物をスキャンした。３分間に５５Mctsが集積された。
【００４２】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）：４０mT/mの勾配システムおよび四肢コイルを供えた３Ｔ‐ＭＲスキャナー（Signa Excite 3.0T, General Electric Healthcare, Milwaukee、ＵＳＡ）を使用してＭＲＩを行った。ファントム撮像法のため、指定量のＧｄ標識ポリマーナノ粒子または対照の造影剤としてのMagnevist（商標）（Schering, Berlin、ドイツ）を１mLのＰＢＳに希釈し、Nunc 24マイクロウェルプレート（Sigma Aldrich, Seelze、ドイツ）に懸濁した。Ｔ１強調スピンエコー（ＳＥ）パルス系列（ＴＲ／ＴＥ＝５４０ms／１８ms、空間解像度０．３７ｘ０．４３ｘ１．０mm、ＮＥＸ＝４）でＭＲスキャンを行った。インビボ撮像法では、２１．５μgのＧｄを持つナノ粒子２５mgを含む１mLをラットに静脈注射した。注入の直後から、コントラスト動態の時間分解画像分析法（ＴＲＩＣＫＳ）［２３］を利用して、３０秒以内の脂肪抑制腹部ＭＲスキャンを６回連続した。
【００４３】
ガンマシンチグラフィー：ガンマシンチグラフィーを利用して、１１１Ｉｎ標識ポリマーナノ粒子の生体内分布を定量的に研究した。ナノ粒子投与の１５分後または１時間後に、２００mg/体重kgの塩酸ケタミンを静脈注射して動物を屠殺した。即時に１mLの血液試料を心臓穿刺により採取し、次いで器官を取り出し、ＰＢＳ中ですすいだ。1480 Wallac WIZARD（商標）Gamma Counter（PerkinElmer, Rodgau-Jugesheim、ドイツ）で放射活性を測定した。体重kg当たりラット血液量を６０mLと仮定し、血液内総活性を算出した。示された値は、４つの個々の実験から得た平均データである。
【００４４】
フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡：ローダミンＢ標識ポリマーナノ粒子と血液成分との相関を分析するため、健常ヒトドナーから得た２００μLの全血を５μLのナノ粒子（１２０μg）と混合した。このナノ粒子対血液比は、動物実験における平均的ナノ粒子希釈比と一致していた。混合物を３７℃でインキュベートし、試料を指定の時点でＰＢＳ中に１００倍希釈した。いくつかの実験では、事前冷却血液を使用して室温（ＲＴ）または４℃でインキュベーションを行った。競合実験では、全血を第一のナノ粒子型とともに、指定の温度およびインキュベーション時間でインキュベートした。その後、結合競合体として第二のナノ粒子型を添加し、さらに混合物を指示どおりにインキュベートした。即時に、希釈細胞を、４８８nmのアルゴンレーザー（Becton-Dickinson, Heidelberg、ドイツ）を備えたＦＡＣスキャンフローサイトメトリーに９０秒供し、CellQuest Softwareを使用しデータを分析した。対数散布図を設定し、２つの集団に区分けした。一方は血小板および細胞残屑、他方は赤血球および白血球を含有する集団である。両集団をゲート制御し、ＦＬ‐２チャネルで蛍光測定を行った。ラット血液が１mL当たり５ｘ１０９の赤血球を含むこと、および稼動中に５１０，０００個の赤血球が計数されたことを考慮し、総分析血液量は０．１μLと見積もった。さらに細胞残屑から血小板を区分けするために、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４２ａ抗体（BD PharMingen, Heidelberg、ドイツ）を使用して直接免疫蛍光染色法を行った。上記と同様の実験プロトコールを使用したが、例外として、ナノ粒子添加から５分後に４μLの抗体を混合物に添加し、遮光して室温で１０分間インキュベートした。ＰＢＳで希釈した後、血小板／細胞残屑集団を上述のようにゲート制御し、ローダミンＢ蛍光およびＦＩＴＣ蛍光をそれぞれＦＬ‐２およびＦＬ‐１チャネルで測定した。
【００４５】
同様に、ローダミンＢ標識ナノ粒子と白血球との相互作用を、白血球共通抗原ＣＤ４５または単球表面抗原ＣＤ１４の免疫染色により分析した。これらの実験において、２．５μLのナノ粒子を１００μLの全血とともに室温で５分間インキュベートし、２μLのＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５（BD PharMingen, Heidelberg、ドイツ）またはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４抗体（Beckman Coulter, Krefeld、ドイツ）を添加した。１０分後、５００μLのOptiLyseC溶液（Beckman Coulter, Krefeld、ドイツ）を添加し、混合物をさらに１０分間インキュベートし、赤血球を溶解し、白血球を固定させた。最後に５００μLのＰＢＳを試料に添加し、５分経過直後にフローサイトメトリーを行った。記述どおりに蛍光を測定した。白血球と血小板との会合を測定する場合、上記のように全血をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４２ａ抗体とともにインキュベートし、細胞をゲート制御し、血小板を区別し、白血球のみを選択した。
【００４６】
細胞培養実験では、Ｊ７７４‐Ａ１細胞（マウス単球マクロファージＡＣＣ１７０；German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）およびヒト単球ＴＨＰ‐１細胞を、１０%ウシ胎仔アルブミン（Boehringer、ドイツ）含有Dulbecco's MEM培地中、３７℃、５%ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞取り込み試験では、２ｘ１０５個の細胞を、５００μLの培地中、３００μgナノ粒子とともに、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳバッファーで２回洗浄し、Axiovision 3.1ソフトウエアを備えた倒立蛍光顕微鏡（Axiovert 200M, Zeiss、ドイツ）を使用して観察した。血小板の顕微鏡観察では、全血をナノ粒子とともにインキュベートし、その後血小板を抗ＣＤ４２ａ‐抗体を使用して染色し、上述した白血球フローサイトメトリー実験では血液を溶解した。実験すべてで、３つの個々の実験から代表的データを示した。
【００４７】
ポリマーナノ粒子の合成および放射性標識化：ポリマーナノ粒子を乳化共重合により容易に合成し、サイズ、ポリマー親水性および官能基での表面被覆率が異なる様々な型が生成された。蛍光分子および／または酸化鉄結晶は包接重合により添加可能であり、得られた格子のコロイド特性は、適切なポリマーを使用して表面を拡張することで多様である。また、それらの生体適合性はいくつかの動物実験で明らかになった［１７〜２１］。
【００４８】
ポリマーナノ粒子の体内分布を研究するための高感受性かつ非侵襲的検出法として本発明者らは６８Ｇａ‐ＰＥＴの使用を希望し、酸性処理および加熱に耐性であるとされている粒子型を選択した。得られたナノ粒子はポリメタクリル酸コロナを有し、ｐＨ１、８０℃で物理的安定性およびコロイド安定性を示す。ポリマーナノ粒子の特徴評価を表１にまとめる。流体力学直径は１４４nmであり、多分散指数は０．０１２と狭い。乾燥ナノ粒子を原子間力顕微鏡観察し、サイズがおよそ１２０nmの球が単分散した集団となっていることが分かった。ナノ粒子は、カルボキシル基の高い表面密度に起因し得る強い負ζ電位（−４２．１mV、３（ｂ））を有する。二価陽イオン（ＨＢＳＳ）のｐH、イオン強度および含有量に関して、インビボ条件に近い緩衝化食塩水中でコロイド安定性を確認した。さらに、動的光散乱実験で評価されたとおり、血清アルブミンの吸着は検出されなかった（表１）。そのサイズ、ζ電位およびコロイド安定性から、ポリマーナノ粒子は静脈内送達のための基本的な物理化学要件を満たすことが結論づけられた。
【表１】
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【００４９】
ＰＥＴトレーサーである６８Ｇａは、テトラアザシクロドデカン‐四酢酸（ＤＯＴＡ）などのキレート剤と通常キレート化合物をつくる三価金属陽イオンである［２４］。本発明者らは、ナノ粒子表面に存在する高密度のカルボキシル基は金属イオンとの強い配位結合の形成を可能にするという仮説を立てた。したがって、ナノ粒子を、６８Ｇａ‐ＤＯＴＡ複合体形成に一般的に使用される条件下で、６８Ｇａで直接標識化した（実験の項を参照）。非結合６８Ｇａをサイズ排除クロマトグラフィー（図２（ｂ））により分離し、標識化率はナノ粒子１mg当たり０．２Mbq６８Ｇａとなった。
【００５０】
これらの結果は、１１１Ｉｎが、６８Ｇａに類似して金属キレート剤と併用したガンマシンチグラフィーに使用するさらなる放射性トレーサーであるという考えを奨励するものであった。図２（ｂ）のクロマトグラムで分かるとおり、ポリマーナノ粒子との簡単な共インキュベーションでも効果的に標識化できた。
ＰＥＴおよびガンマシンチグラフィーによる体内分布：最初に、静脈内注射したウィスターラットで、６８Ｇａ標識およびＰＥＴ撮像法により標識化ポリマーナノ粒子の体内分布を調査した。解剖学的局在化をより正確にするため、骨格および代謝活性的な器官も、特異性ＰＥＴトレーサーとしてそれぞれ１８Ｆ‐フッ化物および１８ＦＤＧを使用した個々の実験で画像化した。これらの実験では、１８ＦＤＧを使用し、眼、心臓および腎臓を視覚化した。Amira（商標）ソフトウエアを使用して異なるイメージデータの同時視覚化を可能にした。図２（ａ）から分かるように、６８Ｇａは心臓に局在化し、また、肝臓に割り当てられ得る大きい区画にも局在化する。脾臓に代表されるように、小さい構造も確認可能である。興味深いことに、腎臓ではシグナルは検出されず、これはトレーサーの腎排泄を検出できなかったことを示唆する。可溶トレーサーのかなりの部分は、腎臓系を経て即時に血流から排泄されるため［３１、３２］、本発明者らは、腎臓および膀胱におけるシグナル非検出から、１時間という観察時間の間にトレーサーがナノ粒子と強く会合するという仮説を立てた。注射から１時間後に、６８Ｇａの半減期が短いことから（ｔ１／２＝６８分、図示せず）、ＰＥＴでは全体的に弱いシグナルを有する明確な類似の器官分布パターンが見られた。
【００５１】
心臓および肝臓で血液含有量が特に高いことから、ナノ粒子がこれらの器官に取り込まれているのか、あるいは実際にはこれら器官の血液画分に存在しているのかは不明瞭なままであった。おそらく血液区画の希釈効果により、また、この技術の解像度が比較的低いため血管は可視化されなかった。メーカーに指定された手持ちの装置からボクセルのサイズは１mm3と予測する。したがって、大部分の血管などの小構造から発生する強いシグナルがかなり弱まる。血液区画をさらに分析するため、１１１Ｉｎ標識ナノ粒子の静脈注射後にガンマシンチグラフィーを行った。１５分後に、注入による活性の７５%が血液で見られ、２１%が肝臓で見られたことを、図２（ｃ）に示す。総血液量の１０〜１５%は肝臓に含まれていることを考慮し、１５分後、注入物質の１０〜１３．５%が肝臓に蓄積していると結論づけた。１時間後に４５%が血液に残留し、４０%が肝臓に存在し、肝臓によるクリアランスが経時的に増加していることが示唆された。腎臓および膀胱では放射性活性は比較的弱いままであり、６８Ｇａで見られたように１１１Ｉｎはポリマーナノ粒子に強く結合することが示唆された。
【００５２】
Ｇｄ標識およびＭＲＩ：Ｇｄは、Ｔ１強調ＭＲＩ［１５］の際に、物理学的条件では三価陽イオンとして使用される超常磁性の造影剤である。臨床用途はＧｄ‐ＤＴＰＡ（Magnevist（商標））などの安定的Ｇｄ‐キレート剤複合体に限定され、比較的高用量のＧｄを、典型的にはＧｄ４０mg／体重kgの範囲で、静脈内注射することが望まれる［２５、２６］。図３（ａ）から、ポリマーナノ粒子が簡単な共インキュベーション工程を介して１mgの格子当たりおよそ１%のＧｄを完全に吸収していることが分かる。１０分の１のＧｄを使用した場合、コロイド安定性をＨＢＳＳ中で維持した（図３（ｃ））。この場合、ζ電位は変化せず（図３（ｂ））、ポリマーナノ粒子の物理化学的特性およびコロイド特性がわずかにしか変わらないことが示された。また、標識ナノ粒子は、ＭＲのコントラスト促進が強く、この促進はＧｄを１０倍多く含むMagnevist（登録商標）に匹敵していた（図３（ｄ））。ナノ粒子のコントラスト促進のこの明らかな増加は、負に帯電したポリメタクリル酸ネットワーク内のＧｄ３＋イオンの局所濃度が比較的高いためと考えられた。別の理由としてはＧｄ原子周辺の内部水和層が増加してプロトン交換率が高まったためであり得る［２７］。
【００５３】
次に、その後のコントラスト促進スキャンを造影剤の投与前のスキャンから減算する時間分解高速ＴＲＩＣＫＳ系列を使用し、インビボＭＲ血管造影を行った。ラットに、総量２１．５μgのＧｄを含有する０．０８６%Ｇｄを負荷したポリマーナノ粒子を静脈内注射した。注射直後、連続的な３０秒間のスキャンを行い、最初のスキャンでは腹部大動脈の鮮明な描写が得られ、標識ナノ粒子の移行が示された（図３（ｅ、ｆ））。留意すべきは本実験では、Ｇｄは６０μg/kgしか投与されず、これはＭＲ血管造影に使用されたMagnevist（登録商標）に含まれるＧｄの標準量より約３桁分少ないということである。
【００５４】
例えば血液細胞との相互作用：得られた結果から、注射から最初の１５分後以内にポリマーナノ粒子の大部分は血液区画中、効果的に循環することが示された。このことから、循環が可溶性相中で生じるのか、あるいは血液細胞などの特定の血液成分と関連して生じるのかという疑問が提起された。そのため、ローダミンＢ標識ナノ粒子とともにインキュベートした全血を使用したフローサイトメトリーにより、血液細胞との相互作用の可能性を調査した。予備実験では、ローダミンＢ標識化はナノ粒子の物理化学的特性を改変しないことが確認された。図４（ａ）から、５分後に血小板および細胞残屑（Ｇ２、下段）に割り当てられ得る亜集団の約１０パーセントがナノ粒子に標識化されるようになることが分かる。このプロセスは実験条件下で１時間にわたり安定し続けた。また、さらに高用量のナノ粒子を使用した場合、標識画分はさらに増加し、本実験で吸着プロセスが飽和しなかったことが示された。対照的に、赤血球では蛍光は増加することはなかった（Ｇ１、上段）。これらの観察に基づいて、動物実験で約４億４千万個の血小板または残屑構成要素は実際ナノ粒子に標識化されることが予想し得た。さらに、実験は正確な相互作用機序を同定することに役立つとされている。しかしながら、血液、細胞内小体成分との強い会合は、ナノ粒子の動向に影響を及ぼし、１時間後の肝臓に見られるろ過プロセスにおける役割を担うことが予測された。次に、ＣＤ４２ａ発現の分析を介して分析した集団の細胞残屑から、血小板を識別した。図４（ｂ）から、５分後にＣＤ４２ａ陽性細胞がナノ粒子に標識化されるようになることが分かる。対照的に、細胞残屑を含むＣＤ４２ａ陰性集団に、ローダミンＢ蛍光の増加は見られなかった。最終的に、一般的白血球抗原ＣＤ４５および単球表面抗原ＣＤ１４の発現に基づいて、白血球との相互作用の可能性も調査した（図４（ｃ））。フローサイトメトリー分析により、２組のＣＤ４５陽性亜集団の発現レベルが異なることが示された。最低発現レベルのものは、ローダミンＢ標識ナノ粒子で標識化されるようになった。さらに、ＣＤ１４発現細胞はナノ粒子にほぼ完全に標識化された。これらのデータから、細胞への相互作用が選択的プロセスであることが分かる。
【００５５】
培養したマウスマクロファージおよびヒト単球を使用し、細胞相互作用を蛍光顕微鏡でさらに分析した。図５（ａ）には、３７℃のインキュベーション後、ローダミンＢ標識ナノ粒子（ここではＣＬ２と称する）がマクロファージおよび単球に取り込まれたことが示されている（上の２段）。しかし、４℃で細胞周辺に環状分布が見られ、細胞膜で局在していることが示唆された。このことは、エンドサイトーシスのように、活性プロセスを経た物理条件下で細胞がポリマーナノ粒子を取り込んだことを明らかにしている。ナノ粒子と血小板との相互作用を、全血中でナノ粒子をインキュベートしてさらに分析した。本実験では、次に血小板を固定し、赤血球を溶解バッファーで溶解した。図５（ｂ）（ＣＬ２、下段）では、２つの血小板がフローサイトメトリー（ＦＩＴＣ）に用いられる抗ＣＤ４２ａ抗体により免疫細胞化学を経て同定されたことが示されている（明視野）。両血小板のうち１つをローダミンＢ標識ナノ粒子で明確に標識化した。さらに、顆粒染色パターンから、二酸化ナトリウムまたはラテックスナノ粒子を使用する他の試験に見られるように、顆粒中にナノ粒子が局在化することが分かる［４２］。
【００５６】
ナノ粒子のサイズおよびそのコロナの化学的性質は生細胞との相互作用に影響を及ぼす重要な特性である。本発明の系においてこれらのパラメーターの効果を調査するため、流体力学直径が小さく（５２nm）、高度にカルボキシル化されたコロナが類似しているローダミンＢ標識ポリマーナノ粒子（ＣＬ６と称する）を合成し、また、流体力学直径が６２nmであり、ポリメタクリル酸およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の両方を等モルで含むコロナを有する類似のナノ粒子（ＣＬ１３と称する）も同様に合成した。両型のナノ粒子をマクロファージおよび単球に取り込ませた（図５（ａ））。対照的に、血小板はＣＬ６のみ取り込み（図５（ｂ））、これらの細胞による細胞摂取がＰＥＧの存在により妨げられたことを明らかにした。
【００５７】
ナノ粒子‐血小板相互作用の特徴評価：この相互作用の性質をさらに明らかにするため、全血液およびフローサイトメトリー分析を使用した実験を追加した。量を増加して非標識ナノ粒子（ＥＰＳ４、２〜５倍過剰量）をプレインキュベートすると、ローダミンＢ標識ナノ粒子（ＣＬ２）の血小板への会合は阻害され（図６（ａ））、相互作用は飽和性プロセスであることを示した。対照的に、非標識ナノ粒子をポストインキュベートしても標識ナノ粒子は細胞から転移することはなく、細胞会合が不可逆的であることが明らかとなった（図６（ｂ））。さらに、４℃でインキュベーションすると、明らかに細胞会合は阻止された（図６（ｃ））。このことから、インキュベーションを４℃で行えば、フローサイトメトリー分析に先立つ希釈工程によりナノ粒子は細胞から離れることが明らかである。対照実験では、インキュベーションを最初に４℃で行い、その後室温で継続した。室温だけでのインキュベーションと比較して同じ細胞会合が見られ（図６（ｄ））、４℃での阻害は可逆的であることが分かった。次に、４℃でインキュベートした場合、血小板およびナノ粒子で競合結合実験が実行可能であるかを確認する必要があった。フローサイトメトリーのヒストグラムを図６（ｅ、ｆ）に示す。表２には３つの個々の実験に基づく定量分析がまとめてある。最初に全血をローダミンＢ標識ナノ粒子（ＣＬ２）とともにインキュベートし、非標識ナノ粒子（ＥＰＳ４）とともに、その量を増加してポストインキュベートした。競合実験を４℃で行った場合、ローダミンＢ陽性細胞は、非標識ナノ粒子の非存在下での３９．６０%から、２および５倍の過剰重量の非標識ナノ粒子を使用したポストインキュベーション後にはそれぞれ２７．６０%および１７．５３%へと減少した。対照的に、室温で実験を行ったところ、ポストインキュベーション工程は標識細胞の数に影響を及ぼさないことが分かった。これは図６（ｂ）に示す前述の置換実験と一致している。本発明者らは、ナノ粒子は適切な競合体を使用して４℃で血小板表面から転移させることが可能であると結論付ける。このことは内部移行に関与する的確な相互作用パートナーを決定するのを促進するものとなろう。
【００５８】
顕微鏡観察とともにこれらのデータは、ナノ粒子と血小板との２段階の会合、すなわちポリメタクリル酸コロナと血小板表面との受動的かつ可逆的相互作用、およびその後の細胞内部顆粒局在化を生じさせる活性プロセスを介する内部移行を示唆している。
【００５９】
最終的に、本出願者らは、ナノ粒子で標識化した血小板が血液中の白血球により、ますます認識されるかどうか知りたいと考えた。このことにより、血液区画からのこれら血小板を高速に除去することになり得る。全血をローダミンＢ標識ナノ粒子とともにインキュベートし、その後ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４２ａ抗体で染色し、血小板を検出した。その後溶解血液でフローサイトメトリー分析を行い、血小板を区別するために血球計数器を白血球に対してゲート制御した。これらの条件下で、ＣＤ４２ａ陽性白血球は、白血球‐血小板共凝集体あるいは貪食された血小板を含有する白血球に選別することが可能である。ナノ粒子を使用しない対照実験を図７（ａ）に示す。この場合、細胞の９．６９%がＣＤ４２ａ陽性であり、血小板と会合した白血球に一致していた。ローダミンＢ標識ナノ粒子をインキュベートしたところ、この数はあまり変化しなかった（計８．９９%、図７（ｂ））。さらに、細胞の１．１８%がローダミンＢ陽性かつＣＤ４２ａ陽性であった。これは全ＣＤ４２ａ陽性細胞の１５．１１%であり、本実験条件下での血小板負荷率にほぼ相当している。したがって本発明者らは、ナノ粒子は血小板の血液内白血球への会合を増加させることはないと結論づける。
【００６０】
インビボ送達でのナノ粒子の挙動を理解することは、診断および治療応用のための多機能ナノ担体の開発において重要な課題であり、適切かつ高感度の検出法を必要とする［２８］。本研究では、ＰＥＴ、ガンマシンチグラフィー、ＭＲＩおよび蛍光検出を活用し、静脈内投与後のポリマーナノ粒子の動向を調査する可能性を明らかにしている。あるモデルが誘導可能である場合、ナノ粒子の画分は即時に特定の細胞と会合し、それにより血液区画内で循環する。次いで肝臓内への転移が起こり、このことは単核食細胞系によるコロイド担体の効果的な排除を示す他の研究と一致する［１０、２９、３０］。このプロセスは一般的に、可溶血液因子が粒子表面へ吸着し、マクロファージまたは他の食作用細胞による除去を誘発するためと考えられる［３０］。対照的に、本結果から、この報告の三区画ポリマーナノ粒子のクリアランスは可溶性相中のみでは起こらないが、血液細胞と会合していれば起こることが示唆される。細胞残屑と赤血球との会合は検出されなかった。しかしながら、血小板ならびにＣＤ４５陽性白血球亜集団およびＣＤ１４陽性単球への強い会合が見られた（図７および８）。ポリマー粒子とのこれらの血液細胞の相互作用は選択的であることが分かった。本発明者らの知る限りでは、この現象は以前他の報告に記述されており、したがって標的薬物送達および細胞療法に対して新しい機会を広げるものである。
【００６１】
三区画ポリマーナノ粒子の特徴は、撮像法および検出の異なる様式に使用し得る異なるトレーサーに結合する可能性である。知る限りでは、標識ナノ粒子を使用するＰＥＴは、供給源が依然として制限されている６４Ｃｕを使用する場合のみ報告されている［６、１３］。対照的に、ポリマーナノ粒子は、臨床的に良好に確立された放射性トレーサー６８ＧａによりＰＥＴを可能にする。ＰＥＴは高速の全身スキャンを可能にする高感度で非侵襲的な方法である。他方、ＭＲＩの利点は時空間解像度が高く、より的確な解剖学的情報を得られることである［３３］。
【００６２】
ナノ粒子の体内分布は、コントラスト促進用の酸化鉄コアを有するナノ粒子のためのＴ１強調ＭＲＩを使用して多数の研究で調査されてきた［３４〜３６］。他のナノ粒子型には、例えばポリマーをベースにした系、Ｇｄ標識化が試験されておりＴ１強調ＭＲＩを可能にしている。効果的な標識化が報告されてはいるが、この本方法の感受性が低いために、インビボ画像処理の研究ではほんのわずかしか成果を得られていなかった［１５、２７、３７］。この報告に記述された三区画ポリマーナノ粒子は〜０．１% Gd/mgの格子を、それらの物理化学的特性の改変を検出することなく吸着し得ることが示された。インビボ撮像法が実現し、注射直後に血液区画における注入後ボーラスの可視化が可能になった（図３（ｅ））。
【００６３】
異なる陽イオン性トレーサーへの結合能は、所与のポリマーナノ粒子の濃縮されたポリメタクリル酸シェル‐コロナ構造のカルボキシル基によりもたらされる。したがって、他の類似した金属イオンおよび特に多様な半減期を有する同位体を使用し、よって現在利用可能な主要な生化学撮像技術に対してポリマーナノ粒子が適応可能になることが期待される。これらには単一光子コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）またはＰＥＴ用の６０、６１、６４Ｃｕに使用される９９ｍＴｃ、６７Ｇａおよび１２３Ｉが挙げられる。
【００６４】
また、記述した標識化の概念を他の型のナノ粒子にも移入可能であり、十分に高密度のポリメタクリル酸層を組み入れることを可能にした。ナノ粒子の体内分布に影響を及ぼす重要なパラメーターは、そのサイズ、表面電荷密度、親水性、ならびにコアおよび外表層の化学組成である［６、３８］。ポリマーナノ粒子は重合プロセス中に容易に修飾できる。通常の物理化学的特性は広範囲内で多様であり、本研究で使用のローダミンＢで例示されるように、付加的な化学物質を含ませることが可能である。他の成分を導入して生分解を容易にし、あるいは医薬物質を組み込むことができた［３９］。外層を適切なモノマーの連続付加によりさらに拡大し、標的送達および療法のための血液成分または特異性細胞に対する相互作用を調節することが可能である。
【００６５】
表２：非標識粒子（ＥＰＳ４）とのインキュベーション後のローダミンＢ標識ポリマーナノ粒子（ＣＬ２）の血小板からの解離
【表２】
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【００６６】
これらのデータには図６（ｅ、ｆ）に示されている実験がまとめられている（ｎ＝３）。上段の３つの実験では、最初に全血をＣＬ２とともに４℃で５分間インキュベートし、細胞表面と相互作用することを可能にした。次いで、ＥＰＳ４を添加しない（Ｏｘ）か、あるいは２または５倍の過剰重量で混合物に添加して、さらに４℃で１５分間インキュベートした。室温でのさらなる３０分間のインキュベーション後に、混合物をフローサイトメトリー分析用に処理した。陽性細胞は、ローダミンＢ標識ナノ粒子に標識化された血小板である。下段の３つの実験は、室温（ＲＴ）で行った対照である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ポリマーナノ粒子のサイズの測定とコロイド安定性を示す。風乾したナノ粒子の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）およびナノ粒子水溶液の光子相関分光法（ＰＣＳ）を利用し、それぞれナノ粒子の形態および流体力学直径を測定した（ｎ＝３）。ＰＣＳによりコロイド安定性を評価し、生理食塩条件下、およびｐＨ（ハンクスバッファー食塩水、ＨＢＳＳ）下、ならびに血中アルブミン量に対応する４%ＢＳＡを加えたＨＢＳＳ存在下でナノ粒子の凝集傾向としてそのコロイド安定性を定義した。
【００６８】
【図２】ポリマーナノ粒子の放射性標識および静脈注射後のインビボ体内分布である。（ａ）ウィスターラットに６８Ｇａ標識ナノ粒子を静脈内注射し、１５分後に動物ＰＥＴ装置を使用してスキャンした（黄色および赤色シグナル）。おおまかに解剖学的選別を行うために、ラットを個々の実験において、骨格および軟骨撮像には１８Ｆ‐フッ化物で（灰色シグナル）、また眼、心臓および腎臓の可視化には１８Ｆ‐デオキシグルコースで（青色シグナル）処置した。得られたデータセットを３Ｄ再構築し、重層し、Amira（商標）を使用して整列させた。異なる角度から得た２つの像を示す。（ｂ）６８Ｇａまたは１１１Ｉｎによる直接的な標識化後のナノ粒子溶液の溶出プロファイルである。負荷したナノ粒子の９５%が画分６〜８に集中した（網掛け部）。（ｃ）１１１Ｉｎ標識ナノ粒子を用い、抽出した器官および血液試料中、規定の時点で放射活性を測定した。
【００６９】
【図３】Ｇｄによるポリマーナノ粒子の標識化およびＴ１強調ＭＲＩを使用したインビボ撮像である。（ａ）ナノ粒子をＧｄＣｌ３とともにインキュベートし、Ｇｄで直接標識化した。Ｇｄ結合能を、３７mgのナノ粒子を使用して評価した。Ｇｄ添加量が３６０μgになるまで、遊離のＧｄは検出され得なかった。（ｂ）ナノ粒子のζ電位をＧｄ含有量で測定し、ＨＢＳＳでは有意な凝集は見られなかった。（ｃ）表１と同様に、Ｇｄ標識ナノ粒子のコロイド安定性を、水およびＨＢＳＳ中でＤＬＳ測定することで評価した。（ｄ）異なるＧｄ量を使用した「ｂ」におけるものと同じＧｄ標識ナノ粒子を含むファントムのＴ１強調ＭＲＩである。Magnevist（登録商標）を比較に使用した。（ｅ）および（ｆ）インビボＭＲＩでは、図２と同様に０・０８６%Ｇｄを含むＧｄ標識ナノ粒子を添加し、ラットを即時に、コントラスト動態（ＴＲＩＣＫＳ）の時間分解画像分析法を使用して、３０秒間（ｅ）ならびにその後１分間（ｆ）、スキャンした。
【００７０】
【図４】フローサイトメトリーを利用した、ローダミンＢ標識ポリマーナノ粒子と血液成分との相互作用である。ローダミンＢ標識ナノ粒子を前記インビボ実験に対応する全血とともにインキュベートした。３つの個々の実験から得た代表的なデータを示す。最初に、希釈した全血を散布図により分析し、赤血球（Ｇ１）と細胞残屑を加えた血小板（Ｇ２）とを区別した。その後ローダミンＢ標識ナノ粒子の、ゲート制御した細胞成分への会合を規定の時点で評価した。ｔ＝０（ヒストグラムの網掛け部）を対照とする（ａ）。モノクローナルＦＩＴＣ標識抗体を使用したＣＤ４２ａ発現分析によりＧ２において細胞残屑から血小板をさらに区別した。ｔ＝０を対照とする（ｂ）。同様に、ＣＤ４５またはＣＤ１４の表面発現により白血球との相互作用を分析した（ｃ）。これらの実験では、フローサイトメトリーに先だって赤血球を溶解した。非処理細胞を対照とする。
【００７１】
【図５】培養細胞（ａ）および全血由来血小板（ｂ）による細胞取り込みに対する、ローダミンＢ標識ポリマーナノ粒子のサイズおよびコロナの影響である。ナノ粒子のサイズは１４４nm（ＣＬ２）、５２nm（ＣＬ６）および６２nm（ＣＬ１３）であった。ＣＬ２およびＣＬ６のコロナはメタクリル酸から構成されていた。ＣＬ１３のコロナはメタクリル酸とポリエチレングリコールとの混合物から構成されていた。マクロファージおよび単球との２０分間のインキュベーション後に明視野および蛍光像を得た。指示がなければインキュベーション温度は３７℃とした。全血をナノ粒子とともに室温で１０分間インキュベートし、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４２ａ抗体を添加し、さらに１０分間かけて、血小板を染色した。ＣＬ１３の場合は染色を省略した。溶解血液で顕微鏡観察を行い、赤血球を除去し、血小板を固定した。スケールバーは、上のパネルでは２０μmに相当し（ａ）、下のパネルでは５μmに相当する（ｂ）。
【００７２】
【図６】血小板とのポリマーナノ粒子の相互作用を特徴評価するためのフローサイトメトリー分析である。全血をナノ粒子とともに指示どおりにインキュベートし、ゲート制御した血小板でサイトメトリー分析を行った。指示があれば、競合実験でローダミンＢ標識化したナノ粒子（ＣＬ２）および非標識ナノ粒子（ＥＰＳＡ４）とともに連続的にインキュベートした。インキュベーション温度の細胞会合への影響を、図の説明にあるとおり室温（ＲＴ）または４℃で連続的にインキュベートして評価した。４℃で行った競合実験、ならびに対応する室温での対照実験（ｅ、ｆ）の定量分析を表２にまとめる。
【００７３】
【図７】血小板と血液白血球との会合に対するローダミンＢ標識ポリマーナノ粒子の影響である。ローダミンＢ標識ナノ粒子との全血のインキュベーション後に、血小板をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４２ａ抗体で染色し、溶解バッファーで赤血球を除去した後、ゲート制御した白血球でフローサイトメトリーを行った。よってＣＤ４２ａ陽性細胞は、血小板と会合した白血球である。これらから、白血球は対照実験では９．６９%で（ａ）、ナノ粒子とのインキュベーション後には８．９９%（ｂ）になることが分かる。
【００７４】
【図８】末梢血単球と相互作用するポリマーナノ粒子の共焦点顕微鏡写真である。ローダミン標識ポリマーナノ粒子は末梢血単球の外膜に即時に結合する（上パネル）。末梢血単球はカルセインＡＭで標識することができた（中央パネル）。カルセインＡＭは広く使用されている緑色蛍光細胞マーカーである。カルセインＡＭは膜透過性であり、よってインキュベーションにより細胞に導入され得るが蛍光性は生体細胞機構に依存している。左側：正常な透過光下の体内細胞；中央：蛍光下の細胞；右側：単細胞における色分布‐緑色（内側）および赤色（外側）ローダミン標識ポリマーナノ粒子を有する単一の単球である（下パネル）。左：三次元的視界；右：断面図
【００７５】
【図９】ポリマーナノ粒子はＣＤ１４受容体を介して末梢血単球に結合する。末梢血単球はＣＤ１４ＦＩＴＣ（緑色シグナル）およびローダミン標識化ポリマー粒子（赤色シグナル）で同時に標識化した。外部細胞膜で両方のフルオロフォアが現れ、部分的に共局在化する（黄色シグナル）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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