(57)【要約】【課題】【解決手段】ＴＰＰＩＩ（トリペプチジルペプチダーゼＩＩ）阻害剤は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病もしくはハンチントン舞踊病、または虚血性状態、例えば脳卒中および心筋梗塞の処置に役立つ。適当な化合物には、一般式ＲＮ１ＲＮ２Ｎ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−ＣＯ−ＲＣ１のトリペプチド化合物が含まれ、上式で、ＲＮ１、ＲＮ２、Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＲＣ１は本明細書で定義される通りであり、上の例としては、例えばトリペプチド配列ＧＬＡおよびＧＰＧが含まれる。【選択図】図１
2009523157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患または虚血性状態の処置における使用のための、ＴＰＰＩＩ阻害剤である化合物。
【請求項２】
前記化合物が、式（ｉ）から選択されるか、その薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の使用のための化合物
（ｉ）ＲＮ１ＲＮ２Ｎ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−ＣＯ−ＲＣ１
［式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、標準の１文字略語または名称に従う以下の定義を有するアミノ酸残基であり、即ち、
Ａ１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチンまたはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
ＲＮ１およびＲＮ２は、それぞれペプチドのＮ末端に結合し、同じであるかまたは異なり、それぞれ独立して
ＲＮ３、
（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−Ｎ−（（リンカー１）−ＲＮ３）ＲＮ４、または
ＳＯ２−（リンカー１）−ＲＮ３
であり、（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
ＲＮ３およびＲＮ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキル、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
ベンジル、
フェニル、
ナフチル、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル
のいずれかであり、ＲＮ３および／またはＲＮ４には、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
ヒドロキシ−、
チオ−、
アミノ−、
カルボン酸、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルオキシ、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルエステル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキルエステル
フェニル、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル、または
ハロゲン
でよく、ＲＣ１は、トリペプチドのＣ末端に結合し、
Ｏ−ＲＣ２、
Ｏ−（リンカー２）−ＲＣ２、
Ｎ（（リンカー２）ＲＣ２）ＲＣ３、または
Ｎ（リンカー２）ＲＣ２−ＮＲＣ３ＲＣ４、
であり、（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、またはＣ１〜６アルキルもしくはＣ２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
ＲＣ２、ＲＣ３およびＲＣ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキル、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
ベンジル、
フェニル、
ナフチル、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル
のいずれかであり、ＲＣ２および／またはＲＣ３および／またはＲＣ４のそれぞれには、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
ヒドロキシ−、
チオ−、
アミノ−、
カルボン酸、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルオキシ、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルエステル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキルエステル
フェニル、
ハロゲン、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル
の１つまたは複数でよい］。
【請求項３】
式（ｉ）の前記化合物が、
ＲＮ１は水素であり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキルフェニルである、請求項２に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
式（ｉ）の前記化合物が、
Ａ１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
Ａ２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
ＲＮ１はＨであり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキルフェニルである、請求項３に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
式（ｉ）の前記化合物が、
Ａ１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
Ａ２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシンまたは２−アリルグリシンであり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
ＲＮ１はＨであり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニルである、請求項４に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
式（ｉ）の前記化合物が、
Ａ１は、ＧまたはＡであり、
Ａ２は、Ｌ、Ｉまたはノルロイシンであり、
Ａ３は、ＧまたはＡであり、
ＲＮ１は水素であり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニルである、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
ＲＮ１は水素であり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣＨ２ＰｈまたはＣ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−（２−フリル）であり、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキルである、
請求項２から６のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項８】
式（ｉ）の前記化合物が、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＬＡ−ＯＨ、ＦＡ−ＧＬＡ−ＯＨまたはＨ−ＧＬＡ−ＯＨである、請求項７に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
式（ｉ）の前記化合物がＺ−ＧＬＡ−ＯＨである、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
Ａ１が、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸である、請求項２に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
Ａ１がＧまたはＡである、請求項１０に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
Ａ２が、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、Ｋ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンである、請求項２、１０または１１のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
Ａ２が、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、ＰまたはＫである、請求項１２に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
Ａ２がＬ、Ｉ、ノルロイシン、ＰまたはＫである、請求項１３に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
Ａ２がＬまたはＰである、請求項１４に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
Ａ２がＰである、請求項１５に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
Ａ３が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンである、請求項２または１０から１６のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
Ａ３がＧまたはＡである、請求項１７に記載の使用のための化合物。
【請求項１９】
ＲＮ１が水素である、請求項２または１０から１８のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項２０】
ＲＮ２が、
ＲＮ３、
（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−（リンカー１）−ＲＮ３、または
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−ＲＮ３
であり、上式で、
（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
ＲＮ３は、水素または以下の置換されていない基
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜４アルキル、
ベンジル、
フェニル、または
単環式ヘテロアリール
のいずれかである、請求項２または１０から１９のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項２１】
ＲＮ２が、水素、ベンジルオキシカルボニル、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはＦＡである、請求項２０に記載の使用のための化合物。
【請求項２２】
ＲＮ２が、水素、ベンジルオキシカルボニルまたはＦＡである、請求項２１に記載の使用のための化合物。
【請求項２３】
ＲＣ１が、
Ｏ−ＲＣ２、
Ｏ−（リンカー２）−ＲＣ２、または
ＮＨ−（リンカー２）ＲＣ２
であり、上式で、
（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、Ｃ１〜６アルキルもしくはＣ２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
ＲＣ２は、水素または以下の置換されていない基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜５アルキル、
ベンジル、
フェニル、または
単環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール
のいずれかである、請求項２または１０から２２のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項２４】
ＲＣ１が、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ２、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニルである、請求項２３に記載の使用のための化合物。
【請求項２５】
ＲＣ１が、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２またはＮＨ−Ｃ１〜６アルキルである、請求項２４に記載の使用のための化合物。
【請求項２６】
ＲＣ１がＯＨまたはＮＨ２である、請求項２５に記載の使用のための化合物。
【請求項２７】
ＲＣ１がＮＨ２である、請求項２６に記載の使用のための化合物。
【請求項２８】
前記化合物が、ＧＰＧ−ＮＨ２、Ｚ−ＧＰＧ−ＮＨ２、Ｂｎ−ＧＰＧ−ＮＨ２、ＦＡ−ＧＰＧ−ＮＨ２、ＧＰＧ−ＯＨ、Ｚ−ＧＰＧ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＰＧ−ＯＨまたはＦＡ−ＧＰＧ−ＯＨである、請求項２に記載の使用のための化合物。
【請求項２９】
前記化合物がＧＰＧ−ＮＨ２である、請求項２８に記載の使用のための化合物。
【請求項３０】
前記化合物が、ＡＬＧ−ＮＨ２、Ｚ−ＡＬＧ−ＮＨ２、Ｂｎ−ＡＬＧ−ＮＨ２、ＦＡ−ＡＬＧ−ＮＨ２、ＡＬＧ−ＯＨ、Ｚ−ＡＬＧ−ＯＨ、Ｂｎ−ＡＬＧ−ＯＨまたはＦＡ−ＡＬＧ−ＯＨである、請求項２に記載の使用のための化合物。
【請求項３１】
前記化合物がＡＬＧ−ＮＨ２である、請求項３０に記載の使用のための化合物。
【請求項３２】
Ａ３が、Ｆ、Ｗ、Ｄ、ＥまたはＹではない、請求項２から３１のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項３３】
Ａ３がＰではない、請求項２から３２のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項３４】
Ａ３がＥではない、請求項２から３３のいずれかに記載の使用のための化合物。
【請求項３５】
神経変性疾患の処置で使用するための、前記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項３６】
アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン舞踊病から選択される神経変性疾患の処置で使用するための、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
虚血性状態の処置で使用するための、請求項１から３４のいずれかに記載の化合物。
【請求項３８】
脳卒中および心筋梗塞から選択される虚血性状態の処置で使用するための、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
神経変性疾患または虚血性状態の処置方法であって、それを必要とする患者に請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４０】
神経変性疾患の処置方法であって、それを必要とする患者に請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４１】
アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン舞踊病から選択される神経変性疾患の処置方法であって、それを必要とする患者に請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４２】
虚血性状態の処置方法であって、それを必要とする患者に請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４３】
脳卒中および心筋梗塞から選択される虚血性状態の処置方法であって、それを必要とする患者に請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４４】
神経変性疾患または虚血性状態の処置のための医薬品の製造における、請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４５】
神経変性疾患の処置のための医薬品の製造における、請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４６】
アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン舞踊病から選択される神経変性疾患の処置のための医薬品の製造における、請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４７】
虚血性状態の処置のための医薬品の製造における、請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４８】
脳卒中および心筋梗塞から選択される虚血性状態の処置のための医薬品の製造における、請求項１から３４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４９】
神経変性疾患または虚血性状態の処置に適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む、方法。
【請求項５０】
神経変性疾患の処置に適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む方法。
【請求項５１】
アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン舞踊病から選択される神経変性疾患の処置に適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む方法。
【請求項５２】
虚血性状態の処置に適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む方法。
【請求項５３】
脳卒中および心筋梗塞から選択される虚血性状態の処置に適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む方法。
【請求項５４】
請求項２から３４のいずれかに記載の式（ｉ）の構造を有する化合物、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項５５】
請求項２から３４のいずれかに記載の構造を有する化合物、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物であって、前記化合物が、シンナモイル−ＩＦＰ−エチルアミド、ＧＰＥ−ＯＨ、ＧＧＦ−ＯＨ、ＧＶＦ−ＯＨ、ＡＡＡ−ＯＨまたはＩＰＩ−ＯＨではない、医薬組成物。
【請求項５６】
Ａ３がプロリンではない、請求項５４または５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
化合物がＧＰＥ−ＯＨではない、請求項５４から５６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ＲＣ１がＮＨ２ではない、請求項５４から５７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５９】
医薬として使用するための、請求項５４から５８のいずれかに記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血および神経変性の処置における化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踊病などの神経変性疾患は、数年かけて徐々に進行し、最後に、入院および２４時間の世話が必要になり莫大な医療費を伴う。それらは分解されないタンパク質集合体の沈着によって起こる可能性があり、それは究極的に、脳のある領域における細胞死に至る。これらの疾患を効果的に治療する薬剤の必要性がある。
【０００３】
虚血を治療する効果的な方法のさらなる必要性がある。詳細には、脳卒中および心筋梗塞の急性相の間、脳および心筋の患部に大量の細胞死がある。多くの研究者が、虚血組織の細胞を保護する方法を発明し、この目的のために有効な薬剤を発見しようと努力している。
【０００４】
２６Ｓプロテアソームは、それらのユビキチンとのコンジュゲーションに基づいて基質を認識し、サイトゾルタンパク質分解の大半を担う。この過程は、細胞分割、シグナル伝達、アポトーシスおよび多細胞生物に不可欠な他の多くの過程を制御する制御因子の分解で重要である。これらの制御因子をプロテアソーム分解の標的にすることは、それらのユビキチンコンジュガーゼとの相互作用で決定される。プロテアソームβサブユニットの薬理学的抑制は、以降のアポトーシスを伴う細胞周期の進行を阻止し、さらに、プロテアソームの新合成を増加させる。しかし、プロテアソーム活性のレベルは、通常、基質分解におけるおよび細胞経路の制御のための律速段階ではない。プロテアソーム生合成のいくつかの内因性モジュレーター、例えばＰＩ３１およびＰＡ２８は、プロテアソーム性切断の特異性に影響を及ぼすが、それらはプロテアソーム性タンパク質分解の速度を変化させないようである。プロテアソーム２６Ｓ複合体はサイトゾル内で合成されて組まれ、１９Ｓおよび２０Ｓサブ複合体は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）誘発輸送によって核孔を通して核コンパートメントに移入される。プロテアソーム複合体は核およびサイトゾル全体に分散されるが、プロテアソームの核内蓄積はストレスにさらされた細胞で起こることができ、ストレスは基質のプロテアソーム性分解を変化させる可能性がある。プロテアソーム複合体の細胞内分布のそのような変化を引き起こすものが何かは、わかっていない。
【０００５】
細胞のストレス応答経路の始動は、ホスホイノシチド−３−ＯＨ−キナーゼ関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）による活性化を必要とし、これらの中には、ＤＮＡ損傷へのストレス応答に必須のＡＴＭ／ＡＴＲキナーゼがある。さらに、ＡＴＭキナーゼは、栄養飢餓に応じるＡＲＫ５シグナル伝達を通しても活性化される。障害のあるプロテアソーム活性および細胞ストレスは、ＴＰＰＩＩ（トリペプチジルペプチダーゼＩＩ）およびイソペプチダーゼなどの相補性のサイトゾルペプチダーゼの誘導と関連する。
【０００６】
いくつかの形態のストレスはユビキチン−プロテアソーム経路を妨害し、これには、γ線照射、ＥＲストレス（ＥＲ＝小胞体）および飢餓が含まれる。抑制のレベルは部分的であり、生理作用を引き起こすことができるが、これらの現象の多くの機構は未知である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
今では、虚血および神経変性は、下でさらに説明されるように、ＰＩＫＫの下流側の経路へのそれらの依存という点で関連し、共通の機構を標的にすることによって治療することができると考えている。本発明者らは、有効な治療剤である、一群のペプチドおよびペプチド関連化合物を発見した。本発明は、ＴＰＰＩＩ（トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ）の役割に関する本発明者らの研究に由来する。ＴＰＰＩＩは、ショウジョウバエからヒトまでの多細胞生物で発現される、独特の１３８ｋＤａサブユニットで構築される。ショウジョウバエからのデータは、ＴＰＰＩＩ複合体が、約６ＭＤａの本来の構造物と２つのねじれた鎖を形成する、反復サブユニットからなることを示唆する。ＴＰＰＩＩは、唯一の既知のサイトゾルサブチリシン様セリンペプチダーゼである。細菌のサブチリシンは完全に研究された酵素であり、結晶構造および酵素機能に関する多数の報告がある（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．、Ｂｅｇ，Ｑ．Ｋ．およびＬｏｒｅｎｚ，Ｐ．、２００２、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１５〜３２）。
【０００８】
ゆえに、第１の態様から、本発明は神経変性疾患または虚血性状態の処置での使用のための化合物を提供し、前記化合物はＴＰＰＩＩ阻害剤である。
【０００９】
本明細書で用いるように、用語処置は、確定された神経変性疾患または虚血性状態の治療、ならびに予防療法および前神経変性または前虚血性状態の治療を含む。
【００１０】
さらなる態様から、本発明は、神経変性疾患または虚血性状態の処置における使用のための化合物を提供し、前記化合物は下記式（ｉ）
（ｉ）ＲＮ１ＲＮ２Ｎ−Ａ１−Ａ２−Ａ３−ＣＯ−ＲＣ１
から選択されるか、その薬学的に許容される塩であり、上式で、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、標準の１文字略語または名称に従う以下の定義を有するアミノ酸残基であり、即ち
Ａ１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチンまたはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
ＲＮ１およびＲＮ２は、それぞれペプチドのＮ末端に結合し、同じであるかまたは異なり、それぞれ独立して
ＲＮ３、
（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−Ｎ−（（リンカー１）−ＲＮ３）ＲＮ４、または
ＳＯ２−（リンカー１）−ＲＮ３
であり、
（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
ＲＮ３およびＲＮ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキル、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
ベンジル、
フェニル、
ナフチル、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル
のいずれかであり、ＲＮ３および／またはＲＮ４には、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
ヒドロキシ−、
チオ−、
アミノ−、
カルボン酸、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルオキシ、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルエステル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキルエステル
フェニル、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル、または
ハロゲン
でよく、ＲＣ１はトリペプチドのＣ末端に結合され、
Ｏ−ＲＣ２、
Ｏ−（リンカー２）−ＲＣ２、
Ｎ（（リンカー２）ＲＣ２）ＲＣ３、または
Ｎ（リンカー２）ＲＣ２−ＮＲＣ３ＲＣ４
であり、（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、またはＣ１〜６アルキルもしくはＣ２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
ＲＣ２、ＲＣ３およびＲＣ４は、同じであるかまたは異なり、水素または以下の必要に応じて置換された基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキル、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
ベンジル、
フェニル、
ナフチル、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル
のいずれかであり、ＲＣ２および／またはＲＣ３および／またはＲＣ４には、０、１または２個（同じかまたは異なる）の必要に応じた置換基があり得、該置換基は、
ヒドロキシ−、
チオ−、
アミノ−、
カルボン酸、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルオキシ、
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキル、
Ｎ−、Ｏ−またはＳ−アセチル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜６アルキルエステル、
カルボン酸の飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ３〜１２シクロアルキルエステル
フェニル、
ハロゲン、
単環式または二環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール、または
非芳香族Ｃ１〜１０ヘテロシクリル
の１つまたは複数でよい。
【００１１】
式（ｉ）の一般式で示されるＮおよびＣＯは、それぞれアミノ酸残基Ａ１の窒素原子およびアミノ酸残基Ａ３のカルボニル基である。
【００１２】
さらなる態様から、本発明は、神経変性疾患または虚血性状態の処置方法であって、それを必要とする患者にＴＰＰＩＩ阻害剤または式（ｉ）から選択される化合物もしくはその薬学的に許容される塩の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
同様に、さらなる態様から、本発明は、神経変性疾患または虚血性状態の処置のための医薬品の製造における、ＴＰＰＩＩ阻害剤または式（ｉ）から選択される化合物もしくはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１４】
理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明は、神経変性疾患または虚血性状態の処置においてＴＰＰＩＩ阻害剤が有用であることを認識するものと考えることができる。
【００１５】
さらなる態様から、本発明は、式（ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
さらなる態様から、本発明は、医薬品として使用するための式（ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１７】
さらなる態様から、本発明は、神経変性疾患または虚血性状態の処置に適当な化合物を同定する方法であって、ＴＰＰＩＩをスクリーニングする化合物と接触させ、その化合物がＴＰＰＩＩの活性を阻害するか否かを同定することを含む方法を提供する。
【００１８】
本出願は、発明者Ｒｉｃｋａｒｄ  ＧｌａｓおよびＨｏｎｇ  Ｘｕによる「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」という名称の２００６年１月１３日に出願の米国特許仮出願６０／７５９０８８の優先権を主張し、その内容は、その出願が虚血および神経変性の処置に関する限り、本明細書に完全に組み込まれる。
【００１９】
本発明は、ストレスに応じたプロテアソーム基質分解の下方制御における、ＴＰＰＩＩの必須の役割を認識する。以下に詳述されるように、プロテアソーム複合体は、ＴＰＰＩＩ依存性の機構を通して核に移行したが、ＰＩＫＫファミリーキナーゼの活性も必要とした。ＰＩＫＫファミリーキナーゼの遮断は、サイトゾルへのプロテアソーム複合体の再分配をもたらした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系で発現される、さもなければ分解耐性のポリグルタミン基質の分解を増加させるために、ＴＰＰＩＩ阻害剤を応用した。さらに、ｐ５３の飢餓依存性蓄積および細胞周期停止が、ＴＰＰＩＩの発現および活性に依存することを示した。
【００２０】
本発明者らのデータは、神経変性および虚血性の疾患の処置での、ＴＰＰＩＩ阻害剤の使用を支持する。
【００２１】
ＴＰＰＩＩは基質のタンパク質ターンオーバーに寄与し、１５個のアミノ酸より長いサイトゾルポリペプチドを分解する主なペプチダーゼであることが最近わかった（Ｒｅｉｔｓ，Ｅ．ら．２００４．Ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＴＰＰＩＩ  ｉｎ  ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：４９５〜５０６）。さらに、ＴＰＰＩＩはプロテアソーム活性が抑制されたリンパ腫細胞の生存を可能にすることができ、それは細胞タンパク質ターンオーバーへのかなりの寄与を示唆した。プロテアソーム基質分解がＴＰＰＩＩによって抑制されたので、ＰＩＫＫファミリーキナーゼ活性の伝達におけるＴＰＰＩＩの関与は、サイトゾルタンパク質分解の特異性の変化ももたらすことを本発明者らの研究は示す。したがって、正常なプロテアソーム活性を有する細胞において、ＴＰＰＩＩは、見かけ上、ユビキチン−プロテアソーム経路による基質分解を制約する働きをする。プロテアソーム活性の細胞レベルがどのように制御されるかは現在明らかではなく、いくつかの報告は、１９Ｓプロテアソームのサブユニットの修飾がこの役割を果たすことができるであろうことを示唆する。ユビキチン結合タンパク質をプロテアソームへ運ぶことが示唆されるＲａｄ２３は、そのユビキチン様（Ｕｂｌ）ドメインを通してＳ２（Ｒｐｎ１）と相互作用する（Ｅｌｓａｓｓｅｒ  Ｓら．２００２．Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｒｐｎ１  ｂｉｎｄｓ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：７２５〜３０）（Ｚｈａｎｇ  Ｘら．２００４．Ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｓ２  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ａ  ｃａｕｓｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐ５３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９：２５１２２〜３３）。さらに、最近のデータは、各触媒回路の間の１９Ｓおよび２０Ｓの複合体のＡＴＰ誘発解離を示唆し、１９Ｓ−２０Ｓ再結合も調節されることを示す（Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｓ．Ｅ．ら．２００５．ＡＴＰ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６Ｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｓ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｙｃｌｅ．Ｃｅｌｌ  １２１：５５３〜６５）。
【００２２】
低下したプロテアソーム基質分解速度は、プロテアソーム複合体の再局在化と相関したが、本発明者らのデータは他の機構を排除しない。他の可能性のある機構は、プロテアソームサブユニット、例えばＲｐｎ１０／Ｓ５ａまたはユビキチン結合基質と直接接触する調節複合体の他のサブユニットのＰＩＫＫファミリーメンバーによる直接調節である。核プロテアソームサブ複合体はそれらの活性に関与するので、ここで研究する機構は、ＤＮＡ転写およびＤＮＡ修復でも役割を果たす可能性がある。ＴＰＰＩＩのサブセットは核に存在するので、ＰＩＫＫファミリーキナーゼ−ＴＰＰＩＩ依存機構によって、プロテアソーム複合体がこのコンパートメントで保持される可能性がある。細胞のＡＭＰ／ＡＴＰレベルを感知するｍＴＯＲまたはＡＲＫ５、即ちＡＭＰＫファミリーの新規Ａｋｔ活性化メンバーなどの下流エフェクターが、これらの事象を調節することも排除することができない。
【００２３】
神経変性疾患の療法を考慮すると、プロテアソーム活性のレベルが重要であるが、ｐ５３もニューロンのアポトーシスを引き起こす際に重要である。それにより、ＰＩＫＫ活性化の他の結果もこの状況の間重要であり、これらは、例えば虚血の間など、ｐ５３が患部組織でのアポトーシスのために重要となる可能性のある場合にも重要である。したがって、ＴＰＰＩＩ阻害剤は、プロテアソーム分解の増加が有益な場合、例えば神経変性疾患において、疾患の療法を改善するために用いることができる。さらに、アポトーシスに導くストレスシグナルの伝達を一時的に妨げるためにｐ５３の発現を抑制することは、虚血の処置を可能にする。
【００２４】
ＴＰＰＩＩは、比較的広い範囲の基質を受け入れる。式（ｉ）に該当するすべての化合物は、ペプチドまたはペプチド類似体である。式（ｉ）の化合物は、当技術分野で公知の方法によって、容易に合成することができる（例えばＧａｎｅｌｌｉｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００、４３、６６４〜６７４を参照）か、市販品を容易に得ることができる（例えばＢａｃｈｅｍ  ＡＧから）。好ましい態様では、化合物は式（ｉ）から選択することができる。そのようなトリペプチドおよび誘導体は、特に有効な治療剤である。
【００２５】
本発明に従い、神経変性疾患または虚血性状態の処置で使用するための化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＰＰＩＩ阻害剤であることが知られている化合物でよい。
【００２６】
例えば、化合物は、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ２００５、２３、４０９〜４１８においてＴＰＰＩＩ阻害剤として特定された化合物から選択することができる。それらの化合物は特にＴＰＰＩＩファルマコフォアに適しているので、化合物は以下の式（ｉｉ）：
【００２７】
【化１】
2009523157.tif 000003
【００２８】
から選択することができ、上式で、Ｒ’はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）２であり、
Ｒ”は、Ｈ、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３またはＣ（ＣＨ３）３であり、
Ｒ”’は、Ｈ、ＣＨ３、ＯＣＨ３、Ｆ、ＣｌまたはＢｒである。
【００２９】
式（ｉｉ）の化合物は、公知の方法によって合成可能である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ２００５、２３、４０９〜４１８およびＢｒｅｓｌｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３、１３、４４６７〜４４７１を参照）。
【００３０】
また、例として、化合物は、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第６３３５３６０号でＴＰＰＩＩ阻害剤として特定された化合物から選択することができる。そのような化合物は、以下の式（ｉｉｉ）のものを含む。
【００３１】
【化２】
2009523157.tif 000004
【００３２】
上式で、
各Ｒ１は同じであるか、異なることができ、ハロゲン、ＯＨ；ハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル；ハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル；ハロゲンおよびＯＨ、Ｘ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル（ＸがＳ、ＯまたはＯＣＯであり、アルキルがハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基で必要に応じて置換される）；少なくとも１つのハロゲンで必要に応じて置換されたＳＯ２（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ＹＳＯ３Ｈ、ＹＳＯ２（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであって、ＹがＯまたはＮＨであり、アルキルが少なくとも１つのハロゲン、ジラジカル−Ｘ１−（Ｃ１〜Ｃ２）アルキレン−Ｘ１−で必要に応じて置換されており、Ｘ１がＯまたはＳであり；インドリン環と縮合したベンゼン環；
からなる群から選択され、ｎは、０〜４であり、
Ｒ２は、Ｒ４がハロゲンおよびＯＨからなる群から選択される１つまたは複数の基によって置換されたＣ１〜Ｃ６アルキルであるＣＨ２Ｒ４；ＺがＯもしくはＳであり、ｐが０〜５であり、ｑが０〜５であり、ただしｐ＋ｑが０〜５である（ＣＨ２）ｐＺ（ＣＨ２）ｑＣＨ３；（Ｃ２〜Ｃ６）不飽和アルキル；または（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルであり、
あるいは、Ｒ２は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたはＯ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、それぞれは少なくとも１つのハロゲンで必要に応じて置換されており、
Ｒ３はＨ；少なくとも１つのハロゲンで必要に応じて置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；（ＣＨ２）ｐＺＲ５（式中、ｐが１〜３であり、ＺがＯまたはＳであり、Ｒ５がＨまたは（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルである）；ベンジルである。
【００３３】
式（ｉｉｉ）の化合物は、公知の方法によって容易に合成が可能である（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第６３３５３６０号を参照）。
【００３４】
しかし、化合物は、式（ｉ）および（ｉｉ）、より好ましくは式（ｉ）から選択することが好ましい。
【００３５】
化合物が、ＲＮ１、ＲＮ２およびＲＣ１が上でまたは下の好ましい実施形態のいずれかで定義された通りであり、
Ａ１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンまたは２−アリルグリシンであり、
Ａ２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｋ、Ｒ、ヒスチジン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチン、α，γ−ジアミノ酪酸または４，５−デヒドロ−リジンであり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンまたは２−アリルグリシンである、
式（ｉ）の化合物であることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
式（ｉ）の好ましい化合物
式（ｉ）の化合物の様々なグループおよび特定の例が好ましい。
【００３７】
一般に、特にＡ２位置が天然（Ｌ）立体配置のアミノ酸が好ましい。
【００３８】
一般に、ＲＮ１が水素であり、
ＲＮ２が、
ＲＮ３、
（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−（リンカー１）−ＲＮ３、または
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−ＲＮ３
であり、上式で、
（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
ＲＮ３は、水素または以下の置換されていない基：
飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキル、
ベンジル、
フェニル、または
単環式ヘテロアリール
のいずれかであることが好ましい。
【００３９】
一般に、ＲＣ１は、
Ｏ−ＲＣ２、
Ｏ−（リンカー２）−ＲＣ２、または
ＮＨ−（リンカー２）ＲＣ２
であり、上式で、
（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、Ｃ１〜６アルキルもしくはＣ２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
ＲＣ２は水素または以下の置換されていない基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜５アルキル、
ベンジル、
フェニル、または
単環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール
のいずれかであることが好ましい。
【００４０】
一般には、Ｎ末端の置換基に関して、
ＲＮ１は水素であり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（リンカー１）−ＲＮ３またはＣ（＝Ｏ）−（リンカー１）−ＲＮ３であり、
（リンカー１）は、ＣＨ２またはＣＨ＝ＣＨであり、
ＲＮ３は、フェニルまたは２−フリルであることがさらに好ましい。
【００４１】
さらに、
ＲＮ１は水素であり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣＨ２ＰｈまたはＣ（＝Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ−（２−フリル）であることが好ましい。
【００４２】
Ｎ末端置換基のための他の好ましいグループは、
ＲＮ１が水素であり、
ＲＮ２が、ベンジルオキシカルボニル、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはＦＡであり、より好ましくはベンジルオキシカルボニルまたはＦＡであるものである。
【００４３】
一般には、Ｃ末端の置換基に関して、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、より好ましくはＯＨであることが好ましい。
【００４４】
いくつかの好ましいグループは、以下の通りである。
【００４５】
グループ（ｉ）（ａ）：
Ａ１は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アリルグリシン、オルニチンまたはα，γ−ジアミノ酪酸であり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
ＲＮ１はＨであり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキルフェニルである。
【００４６】
グループ（ｉ）（ｂ）：
Ａ１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
Ａ２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシンであり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
ＲＮ１はＨであり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニルである。
【００４７】
グループ（ｉ）（ｃ）：
Ａ１は、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸であり、
Ａ２は、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシンまたは２−アリルグリシンであり、
Ａ３は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリンであり、
ＲＮ１はＨであり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキルフェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニルである。
【００４８】
グループ（ｉ）（ｄ）：
Ａ１は、ＧまたはＡであり、
Ａ２は、Ｌ、Ｉまたはノルロイシンであり、
Ａ３は、ＧまたはＡであり、
ＲＮ１はＨであり、
ＲＮ２は、水素、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、またはＣ（＝Ｏ）−飽和もしくは不飽和で分枝もしくは非分枝Ｃ１〜４アルキルであり、フェニルもしくは２−フリルで必要に応じて置換されており、
ＲＣ１は、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニルである。
【００４９】
特定の好ましい化合物の第１セットは、
Ａ１がＧであり、
Ａ２がＬであり、
Ａ３が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリン、より好ましくはＧまたはＡであり、
ＲＮ１が水素であり、
ＲＮ２がベンジルオキシカルボニルであり、
ＲＣ１がＯＨである化合物である。
【００５０】
特定の好ましい化合物の第２セットは、
Ａ１がＧであり、
Ａ２がＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｓ、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、α−メチルロイシン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、α−メチルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルグリシンまたは２−アリルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシンまたは２−アリルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉまたはノルロイシンであり、
Ａ３がＡであり、
ＲＮ１が水素であり、
ＲＮ２がベンジルオキシカルボニルであり、
ＲＣ１がＯＨである化合物である。
【００５１】
特定の好ましい化合物の第３セットは、
Ａ１が、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、２−アミノ酪酸、ノルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくはＧ、Ａまたは２−アミノ酪酸、より好ましくはＧまたはＡであり、
Ａ２がＬであり、
Ａ３がＡであり、
ＲＮ１が水素であり、
ＲＮ２がベンジルオキシカルボニルであり、
ＲＣ１がＯＨである化合物である。
【００５２】
好ましくは、配列Ａ１−Ａ２−Ａ３は、ＧＬＡ、ＧＬＦ、ＧＶＡ、ＧＩＡ、ＧＰＡまたはＡＬＡ、最も好ましくはＧＬＡであり、
ＲＮ１は水素であり、
ＲＮ２はベンジルオキシカルボニルであり、
ＲＣ１はＯＨである。
【００５３】
アルキル基が飽和または不飽和と記載される場合、これはアルキル、アルケニルおよびアルキニル炭化水素部分を包含する。
【００５４】
Ｃ１〜６アルキルは、好ましくはＣ１〜４アルキル、より好ましくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはブチル（分枝または非分枝）、最も好ましくはメチルである。
【００５５】
Ｃ３〜１２シクロアルキルは、好ましくはＣ５〜１０シクロアルキル、より好ましくはＣ５〜７シクロアルキルである。
【００５６】
「アリール」は、芳香族基、好ましくはフェニルまたはナフチルである。
【００５７】
語の一部としての「ヘテロ」は、１つまたは複数の、好ましくはＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子を含むことを意味する。
【００５８】
「ヘテロアリール」は、好ましくはピリジル、ピロリル、キノリニル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、インドリル、ピラジニル、インダゾリル、ピリミジニル、チオフェネチル、ピラニル、カルバゾリル、アクリジニル、キノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、シノリニルまたはプテリジニルである。
【００５９】
「非芳香族のヘテロシクリル」は、好ましくはピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニルまたは単糖である。
【００６０】
「ハロゲン」は、好ましくはＣｌまたはＦ、より好ましくはＣｌである。
【００６１】
さらなる好ましい式（ｉ）の化合物
一般に、Ａ１は、好ましくは、Ｇ、Ａまたは２−アミノ酪酸、より好ましくはＧまたはＡから選択することができる。
【００６２】
一般に、Ａ２は、好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、Ｐ、Ｋ、２−アミノ酪酸、α−メチルロイシン、α−メチルバリンまたはｔｅｒｔ−ブチルグリシン、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、Ｖ、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、４，５−デヒドロ−ロイシン、アロ−イソロイシン、２−アリルグリシン、ＰまたはＫ、より好ましくは、Ｌ、Ｉ、ノルロイシン、ＰまたはＫ、より好ましくはＬまたはＰから選択することができる。
【００６３】
一般に、Ａ３は、好ましくは、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、２−アミノ酪酸またはノルバリン、より好ましくはＧまたはＡから選択することができる。
【００６４】
一般に、ＲＮ１は水素であることが好ましい。
【００６５】
一般に、ＲＮ２は、好ましくは、
ＲＮ３、
（リンカー１）−ＲＮ３、
ＣＯ−（リンカー１）−ＲＮ３、または
ＣＯ−Ｏ−（リンカー１）−ＲＮ３
であり、上式で、
（リンカー１）は存在しなくてもよく、即ち単結合でもよく、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであることができ、
ＲＮ３は、水素または以下の置換されていない基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜４アルキル、
ベンジル、
フェニル、もしくは
単環式ヘテロアリール
のいずれかである。
【００６６】
一般に、ＲＮ２は、より好ましくは、水素、ベンジルオキシカルボニル、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはＦＡであり、より好ましくは、水素、ベンジルオキシカルボニルまたはＦＡである。
【００６７】
一般に、ＲＣ１が
Ｏ−ＲＣ２、
Ｏ−（リンカー２）−ＲＣ２、または
ＮＨ−（リンカー２）ＲＣ２
であり、上式で、
（リンカー２）は存在しない、即ち単結合、Ｃ１〜６アルキルもしくはＣ２〜４アルケニル、好ましくは単結合、またはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２もしくはＣＨ＝ＣＨであってもよく、
ＲＣ２は水素または以下の置換されていない基：
飽和または不飽和で分枝または非分枝Ｃ１〜５アルキル、
ベンジル、
フェニル、もしくは
単環式Ｃ１〜１０ヘテロアリール
のいずれかであることが好ましい。
【００６８】
一般に、ＲＣ１は、より好ましくは、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、ＮＨ２、ＮＨ−Ｃ１〜６アルキルまたはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル−フェニル、より好ましくは、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ２またはＮＨ−Ｃ１〜６アルキル、より好ましくは、ＯＨまたはＮＨ２である。
【００６９】
特に興味がある化合物には、Ａ２がＰであるものが含まれる。
【００７０】
特に興味がある化合物には、ＲＣ１がＮＨ２であるものが含まれる。
【００７１】
一般に、以下のアミノ酸、Ｆ、Ｗ、Ｄ、ＥおよびＹは、Ａ３により不適当である。同様に、一般に、Ａ３は、Ｐおよび／またはＥでないものが選択されることがあるが、それは、これらを含む化合物はより低い活性を示すからである。
【００７２】
好ましい式（ｉｉ）の化合物
式（ｉｉ）の化合物は、好ましくは、
Ｒ’が、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３であり、
Ｒ”が、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）２であり、
Ｒ”’が、ＨまたはＣｌである化合物である。
【００７３】
好ましい式（ｉｉｉ）の化合物
式（ｉｉｉ）の化合物の様々な好ましいグループおよび特定の例は、別にとられたＳｃｈｗａｒｔｚらのＵＳ６，３３５，３６０Ｂ１の請求項のいずれかに規定される通りである。
【００７４】
式（ｉ）の治療化合物の一例は、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、即ち、Ｎ末端がＺ基で誘導体化され、Ｃ末端が誘導体化されないトリペプチドＧＬＡである。Ｚは、ベンジルオキシカルボニルを表す。これは、ＲＮ１がＨ、ＲＮ２がＺ、Ａ１がＧ、Ａ２がＬ、Ａ３がＡ、ＲＣ１がＯＨである、式（ｉ）の化合物である。この化合物はＢａｃｈｅｍ  ＡＧから市販され、真核生物ＴＰＰＩＩの細菌同族体、サブチリシンを抑制することが発見された。Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨは低コストであり、実験的にはよく働く。
【００７５】
好ましい化合物には、ＧＬＡを含むもの、例えば、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＬＡ−ＯＨ、ＦＡ−ＧＬＡ−ＯＨおよびＨ−ＧＬＡ−ＯＨ、例えばＺ−ＧＬＡ−ＯＨが含まれるが、本発明に従い、本明細書での任意の化合物または化合物群のいかなる開示も、配列Ａ１Ａ２Ａ３はＧＬＡではないとのただし書き、または化合物はＺ−ＧＬＡ−ＯＨ、Ｂｎ−ＧＬＡ−ＯＨ、ＦＡ−ＧＬＡ−ＯＨまたはＨ−ＧＬＡ−ＯＨからなる群から選択されないとのただし書き、または化合物はＺ−ＧＬＡ−ＯＨではないとのただし書きに必要に応じて従うことができる。
【００７６】
神経変性疾患または虚血性状態の処置では、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨまたは本明細書で記載される他の化合物を投与することができる。
【００７７】
他の好ましい化合物には、Ａ１Ａ２Ａ３がＧＰＧであるもの、例えばＧＰＧ−ＮＨ２またはＺ−ＧＰＧ−ＮＨ２が含まれる。
【００７８】
当業者は、本明細書で記載される化合物は、任意の適当な方法で投与することができることがわかろう。例えば、投与は、非経口的、例えば静脈内もしくは皮下、経口、経皮、鼻腔内、吸入、または経直腸であることができる。好ましい一実施形態では、化合物は注射によって投与される。
【００７９】
本発明の医薬組成物に用いる薬学的に許容される付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの無機酸、ならびに、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸およびアリールスルホン酸などの有機酸に由来するものが含まれる。本明細書で記載される薬学的に許容される賦形剤、例えば、媒体、アジュバント、担体または希釈剤は、当技術分野の技術者に周知であり、容易に入手できる。薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用および毒性を及ぼさないものでよい。医薬製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、１９ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）で見られる。
【００８０】
組成物は任意の投与経路、例えば経口、静脈内、経皮または皮下、経鼻、筋肉内または腹腔内投与のために調製することができる。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路によって決まる。非経口投与のためには、非経口的に許容される水溶液を使用し、それは発熱物質を含まず、必要なｐＨ、等張性および安定性を有する。当業者は適当な溶液を調製する能力が十分あり、多数の方法が文献で記載されている。薬剤送達方法の簡単な総説は、例えば、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）でも見られる。
【００８１】
本発明との関連で、哺乳動物、特にヒトに投与する用量は、相応な時間枠の間哺乳動物で治療反応を実現するのに十分であるべきである。当業者は、投薬量が、患者の年齢、状態および体重、ならびに、疾患の段階／重症度を含めて、様々な因子によって決まることを理解するであろう。用量は、投与の経路（投与形態）、タイミングおよび頻度によっても決まる。経口投与の場合、投薬量は、例えば約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、より好ましくは約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ／日の化合物、またはその薬学的に許容される塩の対応量でよい。
【００８２】
治療薬は、単一用量で、または治療クールとして定期的に使用することができる。
【００８３】
ＴＰＰＩＩ活性の抑制についてどのように化合物をスクリーニングするべきかは、当業者に明白である。ＴＰＰＩＩタンパク質は第１段階で精製することができ、ＴＰＰＩＩに好ましい蛍光原基質を第２の段階で用いることができる。これは、ＴＰＰＩＩ活性を測定する効果的な方法になる。
【００８４】
特に高レベルの精製を達成する必要はなく、スクリーニング法で用いるのに十分な品質のＴＰＰＩＩを得るために、従来の単純な技術を用いることができる。ＴＰＰＩＩの精製の一つの非限定的な例では、１００×１０６個の細胞（例えばＥＬ−４細胞）を沈殿させ、ガラスビーズおよびホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でボルテックスすることによって溶解した。細胞溶解物を分画遠心分離にかけた。最初に、細胞のホモジネートを１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次に、上清を超遠心管へ移した。次に、試料を１００，０００×ｇで１時間超遠心分離し、上清（ほとんどの生化学文献ではサイトゾルと表される）を１００，０００×ｇで５時間遠心分離すると、高分子量サイトゾルタンパク質／タンパク質複合体が沈殿した。生じたペレットを５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、３０％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴに溶解し、１μｇの高分子量タンパク質をペプチダーゼアッセイの酵素として用いた。
【００８５】
ＴＰＰＩＩの活性は、例えば基質ＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて試験することが可能である。これは、例えば、５０ｍＭトリ塩基ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴで構成される１００μｌの試験緩衝液中で、１００μｍの濃度で用いることができる。９００μｌの１％ＳＤＳ溶液による希釈を用いて、反応を停止することが可能である。切断活性は、例えば、ＬＳ５０Ｂ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）における、４６０ｎｍでの発光で測定することができる。
【００８６】
本発明で有用な化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで虚血または神経変性の部分的または好ましくは完全な治療をもたらすものと定義することができる。
【００８７】
本発明で用いる化合物は、十分に血清安定性であり、即ちｉｎ  ｖｉｖｏで、それらは所望の治療効果を発揮するのに十分長い期間、それらの同一性を保持する。
【００８８】
いくつかの形態のストレスのシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ様キナーゼファミリーの酵素（ＰＩＫＫ）に依存する。これらには、核酵素ＡＴＭ、ＡＴＲおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓ、さらにはサイトゾル内のｍＴＯＲが含まれる。本発明者らのデータは、ＰＩＫＫがサイトゾル内の高分子量ペプチダーゼであるトリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＴＰＰＩＩ）の安定化に寄与することを裏付けた。さらに、ＴＰＰＩＩは、ＰＩＫＫの下流側経路のいくつか、例えばｐ５３安定化およびｉｎ  ｖｉｖｏでのγ線照射耐性に必要のようである。いくつかの形態のストレスはユビキチン−プロテアソーム経路（ＵＰＰ）の活性を抑制し、本発明者らの結果は、細胞のストレスの間、トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＴＰＰＩＩ、大きなサイトゾルペプチダーゼ）がＵＰＰの抑制を引き起こしたことを示す。ＵＰＰ活性の低下は核内へのプロテアソーム複合体の移行と同時に起こり、プロテアソームの核移行は、ＰＩ３Ｋ様キナーゼ（ＰＩＫＫ）の活性に依存した。プロテアソーム分解からＴＰＰＩＩを保護するためにＰＩＫＫ活性が必要とされ、ＴＰＰＩＩの発現または活性の抑制は、プロテアソームのストレス誘発性核局在化を阻止した。ＴＰＰＩＩ阻害剤は、さもなければ分解耐性のポリグルタミン基質のプロテアソーム性分解を促進した。本発明者らのデータは、ＴＰＰＩＩがプロテアソーム基質分解の抑制を媒介したこと、および、プロテアソーム複合体の再局在化は、細胞のストレスに応じてのＰＩＫＫ活性化の結果であることを示唆する。このことから、神経変性疾患の処置におけるＴＰＰＩＩ阻害剤の使用が導かれる。
【００８９】
さらに、本発明者らの結果は、ＴＰＰＩＩが、ＰＩＫＫの活性に同じく依存する事象である飢餓に応じて、強く上方制御されることを示す。γ線照射への応答で見られるように、ＴＰＰＩＩは、飢餓に応じるｐ５３の蓄積にとっても重要であった。ｐ５３はある虚血性疾患の病理の強い決定因子であり、それにより、虚血性疾患を処置するために、ＴＰＰＩＩの抑制を用いることができる。
【００９０】
本発明は、これから要約する添付図面に関して、下記のそれには限定されない実施例でさらに詳細に記載される。
[実施例]
【００９１】
用いた材料および方法は、以下の通りであった。
【００９２】
細胞および培養条件。ＥＬ−４は、Ｃ５７ＢＩ／６マウス系統に由来する、ベンツピレンによって誘導されたリンパ腫細胞系統である。ＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉは、ｐＳＵＰＥＲベクターでトランスフェクトされたＥＬ−４細胞であり（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ、Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ、Ａｇａｍｉ，Ｒ．Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２；２９６：５５０〜３）、空に対してＴＰＰＩＩに対するｓｉＲＮＡを含有する。ＨｅＬａ細胞は、ヒト子宮頸癌細胞である。ストレスを誘導するために、細胞を５０％〜７５％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で増殖させて飢えさせるか、２５０〜２０００ラドでγ線照射し、３７℃および５．３％ＣＯ２でインキュベートした。本発明者らのフローサイトメトリーデータは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるフローサイトメトリーゲーティングで判定した、生細胞を表す。安定したトランスフェクタントの生成のために、５×１０６個の細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサー内の５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、１０μｇのＤＮＡと９６０μＦで２５０Ｖでパルスし、Ｇ４１８に対する耐性によって選択した。ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰは、フローサイトメトリーを通して生細胞で２６Ｓプロテアソーム活性を監視するための迅速に分解するＧＦＰ分子を形成する、ユビキチン融合構築物である（Ｄａｎｔｕｍａ，Ｎ．Ｐ、Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｋ．、Ｇｌａｓ，Ｒ．、Ｊｅｌｌｎｅ，Ｍ．およびＭａｓｕｃｃｉ，Ｍ．Ｇ．２０００．Ｓｈｏｒｔ−ｌｉｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ／ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３８〜４３）。Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰは、ユビキチン−プロテアソーム経路を通して分解される非常に不安定なＧＦＰ分子もコードする、類似したベクターである。Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２は同じ基質であるが、１１２個のグルタミンを有する拡張Ｃ末端を有する（Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｌ．Ｇ．、Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｋ．、Ｍａｓｕｃｃｉ，Ｍ．Ｇ．およびＤａｎｔｕｍａ，Ｎ．Ｐ．２００２．Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１１：２６８９〜７００）。
【００９３】
酵素阻害剤。ＮＬＶＳはキモトリプシンのペプチダーゼ活性を優先的に標的とするプロテアソーム阻害剤であって、生細胞でのプロテアソーム分解を効率的に抑制する。ブタビンダイドは文献で記載される（Ｒｏｓｅ，Ｃ、Ｖａｒｇａｓ，Ｆ、Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｐ、Ｂｏｕｒｇｅａｔ，Ｐ、Ｂａｍｂａｌ，ＲＢ、Ｂｉｓｈｏｐ，ＰＢら．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９６；３８０：４０３〜９）。Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ）は、ＴＰＰＩＩのそれと相同である活性部位を有する細菌酵素、サブチリシン（Ｂａｃｈｅｍ、Ｗｅｉｌ  ａｍ  Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の阻害剤である。ワートマニン(Wortmannin)は、ＰＩＫＫ（ＰＩ３−キナーゼ関連）−ファミリーキナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の阻害剤である。すべての阻害剤はＤＭＳＯで溶解し、使用時まで−２０℃で保存した。
【００９４】
タンパク質精製、ペプチダーゼアッセイおよびＤＮＡ断片の分析。１００×１０６個の細胞を沈殿させ、ガラスビーズおよびホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でボルテックスすることによって溶解した。細胞溶解物を分画遠心分離にかけ、そこでは、１００，０００×ｇで１時間の遠心分離からの上清（サイトゾル）を１００，０００×ｇの遠心分離に３〜５時間かけ、高分子量サイトゾルタンパク質／タンパク質複合体を沈殿させた。生じたペレットを５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、３０％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴに溶解し、１μｇの高分子量タンパク質を、ＴＰＰＩＩ発現のためのペプチダーゼアッセイまたはウェスタンブロットの酵素として用いた。ＴＰＰＩＩの活性を試験するために、５０ｍＭトリ塩基ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴで構成される１００μｌの試験緩衝液中で、基質ＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１００μＭの濃度で用いた。切断活性は、ＬＳ５０Ｂ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）における、４６０ｎｍでの発光により測定した。ＤＮＡ断片の分析のために、細胞を１２穴プレートに１０６細胞数／ｍｌで播種し、アポトーシス誘導剤として通常用いられるＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である、２５μＭのエトポシドに、飢餓（５０％ＰＢＳ）まで曝露させた。細胞を１２穴プレートに１０６細胞／ｍｌで播種し、示した時間、通常１８〜２４時間インキュベートした。ＥＬ−４対照および適応細胞からのＤＮＡを標準のクロロホルム抽出によって精製し、アポトーシス細胞からＤＮＡを検出するために、２．５μｇのＤＮＡを１．８％アガロースゲルにロードした。
【００９５】
抗体および抗血清。以下の分子を、指定した抗体によって検出した。ＧＦＰをウサギ抗ＧＦＰ血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｂｒｅｄａ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により；１９Ｓプロテアソーム複合体を抗Ｒｐｔ６（１９Ｓ塩基ＡＴＰアーゼサブユニット）により、２０Ｓプロテアソーム複合体を（Ａｆｆｉｎｉｔｙ、Ｅｘｅｔｅｒ、ＵＫ）により；ＴＰＰＩＩの検出のために、ニワトリ抗ＴＰＰＩＩ血清（Ｉｍｍｕｎｓｙｓｔｅｍ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。ＴＰＰＩＩのウェスタンブロット法のために完全細胞溶解物を用いた実験では、即ち分画をＴＰＰＩＩについて濃縮しなかった場合、ストレスに曝露させなかった細胞で、ＴＰＰＩＩは検出限界未満であった。ウェスタンブロット法は、標準の技術によって実施した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質検定用試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で測定した。特記されていない場合は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分離のために、レーンにつき５μｇのタンパク質をロードした。
【００９６】
免疫組織化学。細胞を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）を通してガラスカバースリップに付着させ、アセトン：メタノール（１：１）で１時間固定させ、次に、スライドをＢＳＳ緩衝液中で１時間再水和させた。第１の抗体を加え、ＢＳＳで短時間洗浄するまで１時間そのままにし、その後、二次コンジュゲート体（抗ウサギＦＩＴＣ）を加えて１時間インキュベートした。次に、スライドを洗浄し、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３３２５８で３０分間染色した。最後に、スライドにＤＡＢＣＯマウント緩衝液をマウントし、分析まで４℃に保った。
【００９７】
フローサイトメトリー。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒによって定量化した。生細胞のフローサイトメトリー細胞選別は、細胞と２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）との５分間のインキュベーション、ならびに、以降のＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅによるＰＩ＋およびＰＩ−集団への選別によって実施した。ＰＩは、飢餓またはγ線照射によって細胞のストレスを誘導した実験で、死細胞を排除するためにも用いた。
【００９８】
略語リスト。ＡＴＭ、突然変異毛細血管拡張性運動失調；ＢＲＣＴ、ＢＲＣＡのＣ末端リピート；ＮＬＶＳ、４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニルアセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ビニルスルホン；ＰＩ、ヨウ化プロピジウム；ＰＩＫＫ、ホスホイノシチド−３−ＯＨ−キナーゼ関連キナーゼ；ＴＰＰＩＩ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ；ＦＡ、３−（２−フリル）アクリロイル。
【００９９】
本明細書では、化学物質およびアミノ酸のために標準の略語を用いる。
【０１００】
略語                              代替略語
Ａ        アラニン                Ａｌａ
Ｒ        アルギニン              Ａｒｇ
Ｎ        アスパラギン            Ａｓｎ
Ｄ        アスパラギン酸          Ａｓｐ
Ｃ        システイン              Ｃｙｓ
Ｅ        グルタミン酸            Ｇｌｕ
Ｑ        グルタミン              Ｇｌｎ
Ｇ        グリシン                Ｇｌｙ
Ｈ        ヒスチジン              Ｈｉｓ
Ｉ        イソロイシン            Ｉｌｅ
Ｌ        ロイシン                Ｌｅｕ
Ｋ        リジン                  Ｌｙｓ
Ｍ        メチオニン              Ｍｅｔ
Ｆ        フェニルアラニン        Ｐｈｅ
Ｐ        プロリン                Ｐｒｏ
Ｓ        セリン                  Ｓｅｒ
Ｔ        スレオニン              Ｔｈｒ
Ｗ        トリプトファン          Ｔｒｐ
Ｙ        チロシン                Ｔｙｒ
Ｖ        バリン                  Ｖａｌ
本発明は、いくつかの非天然αアミノ酸も利用する。
【０１０１】
略語                                    側鎖
Ａｂｕ    ２−アミノ酪酸                ＣＨ２ＣＨ３
Ｎｖａ    ノルバリン                    ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
Ｎｌｅ    ノルロイシン                  ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
ｔｅｒｔ−ブチルアラニン      ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３
α−メチルロイシン            （ＣＨ３）（ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ３）
４，５−デヒドロ−ロイシン    ＣＨ２Ｃ（＝ＣＨ２）ＣＨ３
アロ−イソロイシン            ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３
α−メチルバリン              （ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ３）
ｔｅｒｔ−ブチルグリシン      Ｃ（ＣＨ３）３
２−アリルグリシン            ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２
Ｏｒｎ    オルニチン                    ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２
Ｄａｂ    α，γ−ジアミノ酪酸          ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２
４，５−デヒドロ−リジン      ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＮＨ２
【実施例１】
【０１０２】
ＴＰＰＩＩは、プロテアソーム基質分解のストレス誘発性抑制を媒介する。
細胞のストレスの間のプロテアソーム分解速度を試験するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）リポーター基質で安定してトランスフェクトされた、ＥＬ−４．Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰおよびＨｅＬａ．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ細胞を用いた（Ｄａｎｔｕｍａ，Ｎ．Ｐ、Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｋ．、Ｇｌａｓ，Ｒ．、Ｊｅｌｌｎｅ，Ｍ．およびＭａｓｕｃｃｉ，Ｍ．Ｇ．２０００．Ｓｈｏｒｔ−ｌｉｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ／ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３８〜４３）。これらのＧＦＰベースの基質は、Ｎ末端が迅速にユビキチン化されてプロテアソームによって分解されるように修飾される。生細胞のフローサイトメトリー分析により、プロテアソーム阻害剤ＮＬＶＳで処理したＥＬ−４．Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰおよびＨｅＬａ．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰにおけるＧＦＰ蛍光の定常レベルの強い増加を観察した（図１）。さらに、本発明者はＥＬ−４．Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰおよびＨｅＬａ．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ細胞の飢餓ならびにγ線照射への曝露は、ＧＦＰ蛍光の蓄積をもたらし、低濃度のＮＬＶＳで処理したときに観察されるレベルに到達することがわかった（図１）。本発明者らのデータは、したがって、細胞のストレスの間、ユビキチン−プロテアソーム経路の活性が低下することを示唆する。
【実施例２】
【０１０３】
大きなサイトゾルペプチダーゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＴＰＰＩＩ）は、ＰＩ３Ｋ様キナーゼ（ＰＩＫＫ）のファミリーの活性化メンバーからのシグナルの伝達にとって重要であると考えられている。ＰＩＫＫは飢餓およびγ線照射への応答にとって重要であるので、ＴＰＰＩＩがユビキチン−プロテアソーム経路の阻害にとって重要か否か試験した。したがって、ＴＰＰＩＩ発現のｓｉＲＮＡ媒介性抑制を得るために前に用いたベクターｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩｉで同時トランスフェクトした、ＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ細胞を作製した。ＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰおよびＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ／ＴＰＰＩＩｉ細胞（ＴＰＰＩＩｉ  ｓｉＲＮＡをコードするプラスミドで同時トランスフェクトした）のγ線照射への曝露によって、ＧＦＰ蛍光の誘導は、少なくとも一部、ＴＰＰＩＩの発現に依存することがわかった（図２ａ）。さらに、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞は、ＥＬ−４．ｗｔ細胞（空のｐＳＵＰＥＲベクターを発現する、図２ｂ）と比較して、より高い濃度のプロテアソーム阻害剤の存在下で増殖する能力がかなり高かった。これは、ＴＰＰＩＩｉ  ｓｉＲＮＡプラスミドで同時トランスフェクトしたＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ細胞における、蛍光リポーター基質ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰを分解する能力の増加と相関し（図２ｃ）、ＴＰＰＩＩがプロテアソーム基質の分解を抑制することをさらに示唆する。
【０１０４】
ＴＰＰＩＩがプロテアソーム基質分解を低減させるということをさらに実証するために、プロテアソームによる分解にしばしば抵抗する基質の分解を研究した。前に用いたものに類似するが、Ｃ末端のポリグルタミンリピートを含有するリポーター基質である、Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２を用いた（Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｌ．Ｇ．、Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｋ．、Ｍａｓｕｃｃｉ，Ｍ．Ｇ．およびＤａｎｔｕｍａ，Ｎ．Ｐ．２００２．Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１１：２６８９〜７００）。そのようなポリグルタミン配列は、プロテアソームタンパク質分解を抑制し、細胞内封入体に集積し、神経変性疾患を引き起こす（Ｚｏｇｈｂｉ，Ｈ．Ｙ．およびＯｒｒ，Ｈ．Ｔ．２０００．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｒｅｐｅａｔｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：２１７〜４７）（Ｂｅｎｃｅ，Ｎ．Ｆ．、Ｓａｍｐａｔ，Ｒ．Ｍ．およびＫｏｐｉｔｏ，Ｒ．Ｒ．２００１．Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１５５２〜５）（Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｐ．、Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．、Ｔａｎａｋａ，Ｍ．、Ｎｕｋｉｎａ，Ｎ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．２００４．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ  ｃａｎｎｏｔ  ｄｉｇｅｓｔ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｔｈｅｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．１４：９５〜１０４）。本発明者らは安定して発現するＥＬ−４細胞がＵｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２を効率的に分解することに失敗したこと、および、ＮＬＶＳによる処理は、ＥＬ−４細胞で分解されない基質の蓄積をさらに増加させることを見出した（図２ｄ）。しかし、ｐＳＵＰＥＲ−ＴＰＰＩＩｉ  ｓｉＲＮＡプラスミドによる同時トランスフェクションは集積したＵｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２基質の完全な除去を可能にし、それは、２０Ｓプロテアソームの触媒活性に依存した（図２ｄ）。さらに、ＴＰＰＩＩの２つの異なる触媒性阻害剤ブタビンダイドおよびＺ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ）を用い、それらが、ＥＬ−４細胞でＲ−ＧＦＰ−Ｑ１１２基質の安定性に影響を及ぼすか否か調べた。Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨは、ＴＰＰＩＩと触媒機構を共有する酵素である、その細菌同族体サブチリシンを標的とするように設計された阻害剤である（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．１９９９．Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ：ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｕｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２４：３５５〜９）（Ｂｒｙａｎ，Ｐ．Ｎ．２０００．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１５４３：２０３〜２２２）。ＥＬ−４．Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２細胞を１００μＭブタビンダイドまたは２５μＭのＺ−ＧＬＡ−ＯＨで処理したとき、ＥＬ−４．Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２基質の段階的減少が観察され、ＴＰＰＩＩの活性がそれらの分解を抑制することが示唆された（図２ｅ）。ペプチダーゼ阻害剤によるこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において、本発明者らの阻害剤の血清誘発不安定化を回避するために、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地を用いた（Ｒｅｉｔｓ，Ｅ．ら．２００４．Ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＴＰＰＩＩ  ｉｎ  ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：４９５〜５０６）。これらの観察から、本発明者らはＴＰＰＩＩがＵＰＰのストレス誘発性抑制を媒介したと結論する。
【実施例３】
【０１０５】
プロテアソーム複合体の飢餓誘発性核局在は、ＴＰＰＩＩの発現および活性を必要とする。ＴＰＰＩＩがプロテアソーム基質分解を制御した機構をさらに特徴付けるために、ＴＰＰＩＩが１９Ｓ調節プロテアソーム複合体の細胞下局在化を調節するか否か試験した。１９Ｓ塩基複合体の成分であるＲｐｔ６  ＡＴＰアーゼサブユニットに対する抗体を用いて、免疫組織化学染色を行った。未処理のＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞で、サイトゾルおよび核で均質の１９Ｓプロテアソーム染色が明白であった（図３ａ、ｂ、上パネル）。さらに、飢餓ＥＬ−４．ｗｔ細胞は細胞量が減少し、特徴的に染色された核を有するＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８対照との比較から明白なように、核においてＲｐｔ６の強い染色が検出可能であった（図３ａ、下方パネル）。対照的に、ＴＰＰＩＩ発現が抑制されたＥＬ−４細胞、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉは、飢餓の間、１９Ｓプロテアソームをそれらの核に局在化することに失敗したことを見出した（図３ｂ、下方パネル）。細胞サイズの減少は、細胞のストレス感知と同時に起こり、類似したデータがγ線照射曝露の間に得られた。飢餓からの解放は、ほとんどのＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞の増殖を可能にし、これらの細胞がアポトーシス性でないことを示した（図３ｃ）。
【０１０６】
さらに、対照のおよびストレス下にあるＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞のサイトゾルを精製し、サイトゾルの高分子量分画を生化学的に分析した。ウェスタンブロット法による検出で、ＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞のサイトゾルでプロテアソームα−３サブユニットの強い発現を本発明者らは見出した（図３ｄ）。しかし、飢餓の後、ＥＬ−４．ｗｔからのサイトゾルではプロテアソームを生化学的に検出することは実質的にまったくできなかったが、サイトゾルα−３サブユニットの類似した検出がＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞で検出された。
【実施例４】
【０１０７】
プロテアソーム分布のＴＰＰＩＩ依存性シフトは、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌、図４ａ）の飢餓の後にも見られた。この過程におけるＴＰＰＩＩの関与は、ＥＬ−４，ＨｅＬａ細胞でプロテアソームの核局在を抑制したＴＰＰＩＩ特異阻害剤ブタビンダイドの使用によって支持された（図４ａ、ｂ）。
【実施例５】
【０１０８】
ストレス誘発性キナーゼは、プロテアソーム分布およびＴＰＰＩＩ発現を制御する。ＤＮＡ損傷に対する応答の間、ＴＰＰＩＩの発現は、ＰＩＫＫファミリーのメンバーによって制御される。ＰＩＫＫシグナル伝達が飢餓に応じるプロテアソームの核局在のためにも必要とされるか否か試験するために、本発明者らの飢餓ＥＬ−４細胞を、ＰＩＫＫファミリーキナーゼの阻害剤ワートマニンの１μＭで処理した。その処理はプロテアソーム複合体をサイトゾルに向け直したことから、ＥＬ−４細胞におけるプロテアソームのストレス誘発性移行は、１μＭワートマニンによって抑制されることがわかった（図５ａ、ｂ）。さらに、１μＭワートマニンとのインキュベーションが６〜９時間後にすべての検出可能なＴＰＰＩＩタンパク質の分解を誘発したのに対して、プロテアソームα−３サブユニットの発現は同期間の間一定に保たれたので、ストレス誘発性ＴＰＰＩＩ発現もＰＩＫＫキナーゼ活性を必要とすることを本発明者らはさらに見出した（図５ｃ）。しかし、ＮＬＶＳでプロテアソームをブロックすることは、ワートマニン処理の間の急速なＴＰＰＩＩ下方制御を阻止したことから、ストレスシグナル伝達が抑制されるときのＴＰＰＩＩのプロテアソーム性分解が示唆された（図５ｃ）。これらのデータは、ＴＰＰＩＩが、細胞の飢餓の間プロテアソームの核局在のために必要とされるストレスシグナルのＰＩＫＫ誘発性媒介物質であることを示唆する。
【０１０９】
本発明者らのデータは、細胞のストレスの間のＰＩＫＫによるシグナル伝達は、プロテアソーム基質分解を抑制することを示した。ＴＰＰＩＩの抑制は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定してトランスフェクトされた細胞での、ポリグルタミン基質の分解を可能にする。したがって、本発明者らは、病原性の、疾患誘発性タンパク質の負荷を除去するために、神経変性疾患患者の、おそらく定期的な、処置を提案する。さらに、本発明者らの実験は、特にトリペプチドＴＰＰＩＩ阻害剤が、この状況で分配すべき化合物であることを明らかにする。
【実施例６】
【０１１０】
飢餓誘発性のｐ５３蓄積および増殖停止におけるＴＰＰＩＩの必要条件。ＴＰＰＩＩが飢餓に対する応答で重要であるか否か試験したが、その訳は、この種のストレスがＰＩＫＫによって制御され、虚血性疾患などの疾患発生病理に非常に重要であるからである。本発明者らはＥＬ−４細胞の増殖培養物中のＴＰＰＩＩの発現を試験し、４〜５日間の増殖の後に高密度に到達した細胞培養は、細胞密度のピークに到達する間に、徐々に高いＴＰＰＩＩ発現を獲得したことを観察した（図６ａおよびｂ）。これらの細胞培養物へ新しい培地を添加すると、ＴＰＰＩＩ発現の急速な下方制御が起きた（矢印で示す、図６ａ）。これらのデータは、ＴＰＰＩＩの発現が飢餓によって上方制御されることをさらに支持する。
【０１１１】
飢餓に対する応答における、ＴＰＰＩＩの機能的役割を調査した。最大細胞密度に接近するＥＬ−４．ｗｔ対照細胞の培養物で、３Ｈトリチウムの取り込みによって検出されたＤＮＡ合成の下方制御を観察したが、これは、ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞では観察されなかった（図６ｃ）。これらのデータと同調して、本発明者らは飢餓ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞で、ＥＬ−４．ｗｔ細胞と比較して減少したｐ５３の蓄積を認める（図６ｄ）。飢餓に瀕するＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞での増殖停止の存在をさらに試験するために、２〜５日間飢餓を生き延びた生細胞（即ちＰＩｎｅｇ細胞）のフローサイトメトリー選別を実施し、新鮮培地でのそれらの増殖を測定した。２日後、これらの細胞の約５０％はＰＩｎｅｇであったが、飢餓の５日後には３〜５％だけがＰＩｎｅｇであった。飢餓させたＰＩｎｅｇ  ＥＬ−４．ｗｔ細胞の培養は、増殖が再開するまでにかなりの遅れがあることがわかり、このことは、飢餓を５日間生き延びたＥＬ−４．ｗｔ細胞のマイナー分画の間で特に明らかであった（図６ｅ）。対照的に、５日間の飢餓を生き延びたＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞は、ほとんど直後に急速な増殖を再開した。それにより、ＰＩＫＫによって制御される数種類のストレスへの応答は、ＴＰＰＩＩを必要とする。飢餓細胞で観察されたＴＰＰＩＩの強い発現は、明らかに細胞周期停止およびｐ５３の蓄積に寄与した。
【０１１２】
脳卒中の動物マウスモデルは、ｐ５３−／−動物でニューロン死の大きな低下を示す（Ｙｏｎｅｋｕｒａ  Ｉ、Ｔａｋａｉ  Ｋ、Ａｓａｉ  Ａ、Ｋａｗａｈａｒａ  Ｎ、Ｋｉｒｉｎｏ  Ｔ．ｐ５３  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｇｌｏｂａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２００６、２６：１３３２〜４０）。本発明者らのデータは、ＴＰＰＩＩの抑制は、いくつかの形態のストレス、例えば飢餓に応じる、ｐ５３の蓄積を減少させることを示す。したがって、本発明者らは、虚血性疾患の処置のための標的として、ＴＰＰＩＩを提案する。例えば、トリペプチドＴＰＰＩＩ阻害剤は、例えば急性の全身病の患者へ注射により投与し、虚血組織でのｐ５３の蓄積を減少させ、それによって組織生存を延長させることができる。十分な時間が提供される場合、血流の副行路が形成され、ｐ５３蓄積の抑制は、したがって、例えば脳卒中の間の、梗塞のサイズを低減させることができる。
【実施例７】
【０１１３】
重要なことに、本発明者らは、ｐ５３の蓄積がＴＰＰＩＩ活性に依存することを示した（図７ａ）。さらに、Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨ処理がＴＰＰＩＩ発現の大きな減少をもたらすことを発見し（図７ｂ）、どのように活性部位のブロッキングが、ほとんどの場合、分子の発現を妨げるためにｓｉＲＮＡを用いたときに観察されるものに類似した結果を与えるのかについての理論的根拠を提供する。
【実施例８】
【０１１４】
ジ−ペプチド、トリ−ペプチドおよび誘導体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験。
【０１１５】
表１は、任意であるが相対的である蛍光定量的ユニットにおける、ＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−７−アミド−４−メチルクマリン）のいくつかの濃度の化合物による切断の抑制に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏデータを含む。試験した大部分の化合物で、多少の有益効果が見られる。
【０１１６】
ＴＰＰＩＩタンパク質を濃縮し、次に、ＴＰＰＩＩに好ましい蛍光原基質ＡＡＦ−ＡＭＣを用いた。１００×１０６個の細胞を沈殿させ、ガラスビーズおよびホモジナイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、２５０ｍＭショ糖、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でボルテックスすることによって溶解した。細胞溶解物を、分画遠心分離にかけた。最初に、細胞のホモジネートを１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次に、上清を超遠心管へ移した。次に、試料を１００，０００×ｇで１時間超遠心分離し、上清（ほとんどの生化学文献ではサイトゾルと表される）を１００，０００×ｇで５時間遠心分離すると、高分子量サイトゾルタンパク質／タンパク質複合体が沈殿した。生じたペレットを５０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、３０％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴに溶解し、１μｇの高分子量タンパク質をペプチダーゼアッセイの酵素として用いた。
【０１１７】
ＴＰＰＩＩの活性を試験するために、本発明者らは５０ｍＭトリ塩基ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴで構成される１００μｌの試験緩衝液中で、基質およびＡＡＦ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１００μＭの濃度で用いた。反応を停止するために、９００μｌの１％ＳＤＳ溶液で希釈した。切断活性は、ＬＳ５０Ｂ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）における、４６０ｎｍでの発光により測定した。
【０１１８】
ＦＡ＝３−（２−フリル）アクリロイル；ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水。各化合物名の最初のテキスト（Ｚ、ＦＡ、Ｈ、その他）は、Ｎ末端の置換基である；Ｈは、Ｎ末端が遊離のＮＨ２であることを示す。各化合物名の終わりのテキスト（ＯＨ、ＮＢｕ、その他）は、Ｃ末端の置換基である；ＯＨは、Ｃ末端が遊離のＣＯ２Ｈであることを示す。
【０１１９】
【表１−１】
2009523157.tif 000005
【０１２０】
【表１−２】
2009523157.tif 000006
【０１２１】
ＧＰＧ−ＮＨ２およびＺ−ＧＰＧ−ＮＨ２を含めて、他の化合物も上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で高い能力を発揮した。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】細胞のストレスの間のプロテアソーム基質分解の抑制。（ａ〜ｈ）示すように、γ線照射、飢餓またはプロテアソーム阻害剤による処理に曝露させたＥＬ−４．Ｕｂ−Ｒ−ＧＦＰ細胞（ａ〜ｄ）およびＨｅＬａ．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ細胞（ｅ〜ｈ）の、フローサイトメトリーによって定量化されたＧＦＰ蛍光。γ線照射した細胞は１０００ラドに曝露させ、３〜４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした。飢餓細胞は、５〜７日間培地を補充することなく、高密度の標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で増殖させた。死細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるゲーティングで排除した。
【図２】ユビキチン−プロテアソーム経路のストレス誘発性抑制は、ＴＰＰＩＩに依存する。（ａ）γ線照射への曝露から１〜４日後のＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ（左）およびＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ／ＴＰＰＩＩｉ細胞の平均蛍光強度。（ｂ）０、５または２５μＭのＮＬＶＳの存在下でのＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖。（ｃ）０、２、４、６、８または１０μＭのＮＬＶＳで一晩処理したＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ（空の円）およびＥＬ−４．ＵｂＧＶ７６−ＧＦＰ／ＴＰＰＩＩｉ細胞（塗りつぶされた円）の、フローサイトメトリーによって定量化した平均蛍光強度（ＭＦＩ）。（ｄ）未処理のまたはＮＬＶＳの示した濃度で処理した、安定してトランスフェクトしたＥＬ−４対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞におけるＵｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２の発現。（ｅ）最高７２時間、ブタビンダイドまたはＴＰＰＩＩ阻害剤Ｚ−ＧＬＡ−ＯＨで処理した、安定してトランスフェクトしたＥＬ−４細胞におけるＵｂ−Ｒ−ＧＦＰ−Ｑ１１２の発現。
【図３】細胞のストレスの間のプロテアソームの核局在は、ＴＰＰＩＩに依存する。（ａ、ｂ）抗Ｒｐｔ６（１９Ｓ塩基サブユニット）による染色で検出した、ＥＬ−４．ｗｔ（ａ）対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ（ｂ）における１９Ｓプロテアソームの局在を示し、未処理（上パネル）対飢餓（下パネル）細胞を比較した。スケールバー＝５μｍ。（ｃ）示した時間飢餓にさらした、ＥＬ−４．ｗｔ（上）対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞（下）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖。（ｄ）飢餓にさらしたか、未処理のＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞からのサイトゾル分画の、抗ＴＰＰＩＩおよび抗プロテアソームα−３によるウェスタンブロット法。
【図４】ＴＰＰＩＩの抑制は、ストレスの間のプロテアソームの核局在を阻止する。（ａ）未処理（上）、飢餓にさらした（中央）または飢餓および１００μＭブタビンダイド(Butabindide)にさらした（下）ＨｅＬａ細胞内の１９Ｓプロテアソームの局在。スケールバー＝５μｍ。（ｂ）Ｒｐｔ６染色で検出した、１００μＭブタビンダイドの存在下での、飢餓ＥＬ−４細胞内の１９Ｓプロテアソームの局在。
【図５】ＰＩＫＫファミリーキナーゼ活性は、ＴＰＰＩＩ発現およびプロテアソームの核局在を制御する。（ａ、ｂ）１μＭワートマニン（ＰＩＫＫファミリーキナーゼの阻害剤）の存在下または非存在下で飢餓にさらし、抗Ｒｐｔ６（１９Ｓプロテアソーム、ａ）または抗α−３（２０Ｓプロテアソーム、ｂ）について染色したＥＬ−４細胞の、免疫組織化学的分析。スケールバー＝５μｍ。（ｃ）１μＭワートマニンで０、３、６、９および１６時間処理した飢餓ＥＬ−４細胞における、抗ＴＰＰＩＩおよび抗プロテアソームα−３についてのウェスタンブロット法。
【図６】飢餓誘発性細胞周期停止は、ＴＰＰＩＩの発現を必要とする。（ａ）１日目に１０５細胞／ｍｌで播種し、細胞培養培地を交換せずに８日間培養したＥＬ−４．ｗｔ対照細胞に由来する細胞溶解物の、抗ＴＰＰＩＩによるウェスタンブロット法。矢印は、新しい細胞培養培地の添加を示す。（ｂ、ｃ）ＥＬ−４．ｗｔおよびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の間の生細胞（ｂ）およびＤＮＡ合成（ｃ）。（ｄ）６０％ＰＢＳ中で０、１または３０時間飢餓にさらしたＥＬ−４．ｗｔ対照対ＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞におけるｐ５３の発現。（ｅ）２日間または５日間の飢餓培地での培養後に正常な組織培養培地で生育中の、生きているＥＬ−４．ｗｔ（空のバー）およびＥＬ−４．ＴＰＰＩＩｉ細胞（塗りつぶしたバー）。
【図７】ＴＰＰＩＩ阻害剤は、ＴＰＰＩＩタンパク質の発現およびｐ５３の安定化を阻止する。（ａ）実験開始の２時間前から１００μＭブタビンダイドで処理した、または未処理のγ線照射（５００ラド）ＥＬ−４．ｗｔ細胞での、ｐ５３のウェスタンブロット分析。（ｂ）２５μＭのＺ−ＧＬＡ−ＯＨで処理した、または未処理のγ線照射（５００ラド）ＥＬ−４．ｗｔ対照細胞での、ＴＰＰＩＩのウェスタンブロット分析。
【図１】
2009523157.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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