(57)【要約】本発明は、式Ｉ（式中、Ｒ１およびＲ２は明細書に記載の通り）の化合物、あるいはその医薬として許容される塩または溶媒和物または立体異性体に関する。本発明はまた、このような化合物を含む医薬組成物および組合せ、このような化合物を調製するための方法および中間体、ならびに例えば慢性閉塞性肺疾患および喘息などの肺障害を治療するためのこのような化合物を使用する方法にも関する。一つの実施形態において、本発明は、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する新規なジアルキルフェニル化合物を提供する。2009541209.tif 000028
2009541209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2009541209.tif 000018
（式中、
Ｒ１は、メチルまたはエチルであり、
Ｒ２は、メチルまたはエチルである）
の化合物、あるいはその医薬として許容される塩または溶媒和物または立体異性体。
【請求項２】
式ＩＩ
【化２】
2009541209.tif 000019
（式中、
Ｒ１は、メチルまたはエチルであり、
Ｒ２は、メチルまたはエチルである）
を有する、請求項１に記載の化合物またはその医薬として許容される塩。
【請求項３】
式ＩＩａ
【化３】
2009541209.tif 000020
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式ＩＩａ
【化４】
2009541209.tif 000021
の化合物の医薬として許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
医薬として許容される担体と、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物とを含む医薬組成物。
【請求項６】
（ａ）請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物と、
（ｂ）ステロイド性抗炎症剤と、
（ｃ）医薬として許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項７】
（ａ）請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物と、
（ｂ）ステロイド性抗炎症剤と
を含む、治療剤の組合せ。
【請求項８】
（ａ）請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物および第１の医薬として許容される担体を含む第１の医薬組成物と、
（ｂ）ステロイド性抗炎症剤および第２の医薬として許容される担体を含む第２の医薬組成物と
を含み、該第１および第２の医薬組成物が別々の医薬組成物である、キット。
【請求項９】
治療を必要としている患者に、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物の治療有効量を投与するステップを含む、肺障害を治療する方法。
【請求項１０】
患者に、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物の治療有効量を投与するステップを含む、慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療する方法。
【請求項１１】
哺乳動物に、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物の気管支拡張を生じさせる量を投与するステップを含む、哺乳動物において気管支拡張を生じさせる方法。
【請求項１２】
哺乳動物に、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物を投与するステップを含む、哺乳動物においてムスカリン受容体をアンタゴナイズし、かつβ２アドレナリン受容体をアゴナイズする方法。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物を使用して生物学的アッセイを行うステップを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物を研究道具として使用する方法。
【請求項１４】
（ａ）試験化合物で生物学的アッセイを行い、第１のアッセイ値を提供するステップと、
（ｂ）請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物で該生物学的アッセイを行い、第２のアッセイ値を提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）からの第１のアッセイ値をステップ（ｂ）からの第２のアッセイ値と比較するステップと
を含み、ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ）の前、後または同時に行われる、生物学的アッセイにおいて試験化合物を評価する方法。
【請求項１５】
前記生物学的アッセイが、ムスカリン受容体結合アッセイまたはβ２アドレナリン受容体結合アッセイである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的アッセイが、哺乳動物における気管支保護アッセイである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
式６
【化５】
2009541209.tif 000022
（式中、Ｐ１はヒドロキシル保護基である）
の化合物を脱保護し、式Ｉの化合物を得るステップを含む、請求項１に記載の化合物を調製する方法。
【請求項１８】
式６ａ
【化６】
2009541209.tif 000023
（式中、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、独立に、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、−Ｃ１〜４アルキル−（フェニル）から選択され、またはＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃのうちの１つは、−Ｏ−（Ｃ１〜４アルキル）である）
の化合物を脱保護し、式Ｉの化合物を得るステップを含む、請求項１に記載の化合物を調製する方法。
【請求項１９】
（ａ）式４
【化７】
2009541209.tif 000024
の化合物を、式５
【化８】
2009541209.tif 000025
（式中、Ｐ１はヒドロキシル保護基である）
の化合物と還元剤の存在下にて反応させ、式６
【化９】
2009541209.tif 000026
の化合物を得るステップと、
（ｂ）式６の化合物を脱保護し、式Ｉの化合物を得るステップと
を含む、請求項１に記載の化合物を調製する方法。
【請求項２０】
遊離塩基の形態の式Ｉの化合物を医薬として許容される酸と接触させるステップを含む、請求項１に記載の化合物の医薬として許容される塩を調製する方法。
【請求項２１】
式ＩＩＩ
【化１０】
2009541209.tif 000027
（式中、
Ｙ１は、−ＣＨＯ、−ＣＮ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＲ３ａ）ＯＲ３ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３ｃ、ブロモおよびヨード（式中、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立に、Ｃ１〜６アルキルから選択され、またはＲ３ａおよびＲ３ｂは連結して、Ｃ２〜６アルキレンを形成し、Ｒ３ｃは、Ｃ１〜６アルキルから選択される）から選択され、
Ｒ１は、メチルまたはエチルであり、
Ｒ２は、メチルまたはエチルである）
の化合物あるいはその塩または立体異性体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物を調製するための中間体。
【請求項２２】
Ｒ１およびＲ２がメチルである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｙ１が−ＣＨＯである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｙ１が−ＣＨＯであり、Ｒ１およびＲ２がメチルである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルＬ−酒石酸塩である、請求項４に記載の化合物。
【請求項２６】
治療に使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
肺障害の治療用の医薬の製造のための、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、β２アドレナリン受容体アゴニストおよびムスカリン受容体アンタゴニスト活性を有する新規なジアルキルフェニル化合物に関する。本発明はまた、このような化合物を含む医薬組成物、このような化合物を調製するための方法および中間体、ならびにこのような化合物を例えば肺障害を治療するために使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（先行技術）
喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの肺障害は、気管支拡張剤で通常治療する。肺障害を治療するために使用される気管支拡張剤の１タイプは、アルブテロール、ホルモテロールおよびサルメテロールなどのβ２アドレナリン受容体（アドレノセプター）アゴニストから構成される。これらの化合物は、一般に吸入によって投与される。気管支拡張剤の他のタイプは、イプラトロピウムおよびチオトロピウムなどのムスカリン受容体アンタゴニスト（抗コリン化合物）から構成される。これらの化合物もまた、典型的には吸入によって投与される。
【０００３】
β２アドレナリン受容体アゴニストとムスカリン受容体アンタゴニストとの組合せを含有する医薬組成物は、肺障害の治療に使用するために当技術分野において公知である。例えば、２００２年８月１３日に発行された特許文献１には、臭化チオトロピウムなどのムスカリン受容体アンタゴニスト、およびフマル酸ホルモテロールなどのβ２アドレナリン受容体アゴニストを含有する医薬組成物が開示されている。
【０００４】
さらに、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する化合物が、当技術分野において公知である。例えば、２００６年１１月２８日に発行された特許文献２には、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有するビフェニル化合物が開示されている。β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する化合物は、このような化合物が単一分子の薬物動態を有する一方、２つの独立した作用機序によって気管支拡張を実現するため非常に望ましい。
【０００５】
肺障害を治療するときに、吸入によって投与する場合、患者が治療剤を１日１回またはそれ未満で投与するのみでよいように、長時間作用性、すなわち少なくとも約２４時間の持続時間を有する治療剤を提供することが特に有用である。当技術分野で以前に開示されているすべての２通りに作用する化合物は、この望ましい特徴を有さない。
【特許文献１】米国特許第６，４３３，０２７号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１４１，６７１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、吸入によって患者に投与する場合長時間作用性を有する、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する新規な化合物への必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する新規なジアルキルフェニル化合物を提供する。本発明の化合物は、吸入によって哺乳動物に投与する場合、他の特徴の中でも長時間作用性、すなわち少なくとも約２４時間の持続時間を有することが見出された。したがって、本発明の化合物は、肺障害を治療するための治療剤として有用および有効であることが見込まれる。
【０００８】
したがって、その組成物の態様の１つでは、本発明は、式Ｉ
【０００９】
【化１１】
2009541209.tif 000003
（式中、Ｒ１はメチルまたはエチルであり、Ｒ２はメチルまたはエチルである）の化合物、あるいはその医薬として許容される塩または溶媒和物または立体異性体に関する。
【００１０】
本発明の特定の態様では、式Ｉの化合物は、式ＩＩ
【００１１】
【化１２】
2009541209.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は、（任意の特定のまたは好ましい実施形態を含めて）本明細書に記載されている通りである）を有する化合物、あるいは医薬として許容されるその塩または溶媒和物である。
【００１２】
その組成物の態様のその他では、本発明は、医薬として許容される担体および式Ｉの化合物を含む医薬組成物に関する。
【００１３】
所望であれば、本発明の化合物は、ステロイド性抗炎症剤などの他の治療剤と組み合わせて投与することができる。したがって、その組成物の態様のその他では、本発明は、（ａ）式Ｉの化合物と、（ｂ）第２の治療剤とを含む医薬組成物に関する。その組成物の態様のその他では、本発明は、（ａ）式Ｉの化合物と、（ｂ）第２の治療剤と、（ｃ）医薬として許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１４】
その組成物の態様のまたその他では、本発明は、治療剤の組合せに関し、その組合せは、（ａ）式Ｉの化合物と、（ｂ）第２の治療剤とを含む。その組成物の態様のその他では、本発明は、医薬組成物の組合せに関し、この組合せは、（ａ）式Ｉの化合物および第１の医薬として許容される担体を含む第１の医薬組成物と、（ｂ）第２の治療剤および第２の医薬として許容される担体を含む第２の医薬組成物とを含む。本発明はまた、このような医薬組成物を含有するキットにも関する。
【００１５】
本発明の化合物は、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する。したがって、式Ｉの化合物は、喘息および慢性閉塞性肺疾患などの肺障害を治療するための治療剤として有用であることが見込まれる。
【００１６】
したがって、その方法の態様の１つでは、本発明は、肺障害を治療するための方法に関し、この方法は、治療を必要としている患者に式Ｉの化合物の治療有効量を投与するステップを含む。本発明はまた、慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療する方法にも関し、この方法は、患者に式Ｉの化合物の治療有効量を投与するステップを含む。さらに、その方法の態様のその他では、本発明は、哺乳動物において気管支拡張を生じさせる方法に関し、この方法は、哺乳動物に式Ｉの化合物の気管支拡張を生じさせる量を投与するステップを含む。本発明はまた、哺乳動物においてムスカリン受容体をアンタゴナイズし、かつβ２アドレナリン受容体をアゴナイズする方法にも関し、この方法は、哺乳動物に式Ｉの化合物を投与するステップを含む。
【００１７】
本発明の化合物は、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有するので、このような化合物は、研究道具としてもまた有用である。したがって、その方法の態様のまたその他では、本発明は、式Ｉの化合物を研究道具として使用する方法に関し、この方法は、式Ｉの化合物を使用した生物学的アッセイを行うステップを含む。
【００１８】
本発明の化合物は、新規な化合物を評価するためにも使用することができる。したがって、その方法の態様のその他では、本発明は、生物学的アッセイにおいて試験化合物を評価する方法に関し、この方法は、（ａ）試験化合物で生物学的アッセイを行い、第１のアッセイ値を提供するステップと、（ｂ）式Ｉの化合物で生物学的アッセイを行い、第２のアッセイ値を提供するステップと（ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）の前、後、または同時に行う）、（ｃ）ステップ（ａ）からの第１のアッセイ値をステップ（ｂ）からの第２のアッセイ値と比較するステップとを含む。
【００１９】
本発明はまた、式Ｉの化合物を調製するのに有用な方法および新規な中間体にも関する。したがって、その方法の態様のその他では、本発明は、式Ｉの化合物の調製方法に関し、この方法は、（本明細書に記載されている）式６の化合物を脱保護し、式Ｉの化合物を得るステップを含む。
【００２０】
その方法の態様のその他では、本発明は、式Ｉの化合物の調製方法に関し、この方法は、（ａ）還元剤の存在下にて式４の化合物を式５の化合物と反応させ、式６の化合物を得るステップと、（ｂ）式６の化合物を脱保護し、式Ｉの化合物を得るステップとを含む（化合物４、５および６は、本明細書に記載されている通りである）。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、式６の化合物を脱保護することによって調製され、式中、ヒドロキシル保護基はシリル基である。したがって、その方法の態様のまたその他では、本発明は、式Ｉの化合物を調製する方法に関し、この方法は、式６ａ
【００２２】
【化１３】
2009541209.tif 000005
（式中、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、独立に、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、−Ｃ１〜４アルキル−（フェニル）から選択され、またはＲ１ａ、Ｒ１ｂおよびＲ１ｃのうちの１つは、−Ｏ−（Ｃ１〜４アルキル）である）の化合物を脱保護し、式Ｉの化合物を得るステップを含む。
【００２３】
他の実施形態では、本明細書に記載する方法は、式Ｉの化合物の医薬として許容される塩を形成するステップをさらに含む。他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する他の方法、および本明細書に記載する方法のいずれかによって調製された生成物に関する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩ
【００２５】
【化１４】
2009541209.tif 000006
（式中、Ｙ１は、−ＣＨＯ、−ＣＮ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＲ３ａ）ＯＲ３ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３ｃ、ブロモおよびヨード（式中、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立に、Ｃ１〜６アルキルから選択され、またはＲ３ａおよびＲ３ｂは結合してＣ２〜６アルキレンを形成し、Ｒ３ｃは、Ｃ１〜６アルキルから選択される）から選択され、Ｒ１およびＲ２は、（任意の特定または好ましい実施形態を含めて）本明細書に記載されている通りである）の化合物あるいはその塩または立体異性体に関し、この化合物は、式Ｉの化合物の調製における中間体として有用である。式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はメチルである。式ＩＩＩの他の特定の実施形態では、Ｙ１は−ＣＨＯである。式ＩＩＩのさらに他の特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はメチルであり、Ｙ１は−ＣＨＯである。
【００２６】
本発明はまた、治療のための式Ｉの化合物の使用にも関する。さらに、本発明は、肺障害の治療用の医薬の製造のための式Ｉの化合物の使用、および研究道具としての式Ｉの化合物の使用に関する。本発明の他の態様および実施形態は、本明細書において開示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
その組成物の態様の１つでは、本発明は、新規な式Ｉの化合物に関する。式Ｉの化合物は、１つまたは複数のキラル中心を含有し、したがって、本発明は、別段の指示がない限りラセミ混合物、純粋な立体異性体（すなわち、エナンチオマーまたはジアステレオマー）、立体異性体が濃縮した混合物などを対象とする。本明細書において特定の立体異性体が示されまたは命名されている場合、別段の指示がない限り、少量の他の立体異性体は、このような他の異性体の存在によって全体として組成物の有用性がなくならない限り本発明の組成物中に存在してもよいことを当業者は理解しよう。
【００２８】
特に、式Ｉの化合物は、下記の部分式において記号＊で示されている炭素原子でキラル中心を含有する。
【００２９】
【化１５】
2009541209.tif 000007
本発明の特定の実施形態では、記号＊で識別されている炭素原子は（Ｒ）配置を有する。この実施形態では、式Ｉの化合物は、記号＊で示されている炭素原子において（Ｒ）配置を有し、またはこの炭素原子において（Ｒ）配置を有する立体異性体の形態で濃縮されている。
【００３０】
式Ｉの化合物はいくつかの塩基性基（例えば、アミノ基）も含有し、したがって、式Ｉの化合物は遊離塩基としてまたは様々な塩の形態で存在できる。すべてのこのような形態は、本発明の範囲内に含められる。さらに、式Ｉの化合物の溶媒和物またはその塩は、本発明の範囲内に含められる。
【００３１】
したがって、別段の指示がない限り、本明細書において化合物への言及、例えば、式Ｉの化合物または化合物６への言及には、その化合物の塩および立体異性体および溶媒和物への言及が含まれることを当業者であれば理解するであろう。
【００３２】
さらに本明細書で使用する場合、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、対応する複数形が含まれる。
【００３３】
本発明の化合物およびその中間体を命名するために本明細書において使用される命名法は一般に、市販のＡｕｔｏＮｏｍソフトウェア（ＭＤＬ社、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して得た。典型的には、式Ｉの化合物は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸のピペリジン−４−イルエステル誘導体と命名した。
【００３４】
代表的な実施形態
下記の置換基および値は、本発明の様々な態様および実施形態の代表的な例を提供することを意図している。これらの代表値は、このような態様および実施形態をさらに規定および例示することを意図し、他の実施形態を除外または本発明の範囲を限定することを意図しない。これに関しては、特定の値または置換基が好ましいという表現は、特別に示されない限り、本発明から他の値または置換基を排除することを決して意図しない。
【００３５】
一実施形態では、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はメチルである。
【００３６】
他の実施形態では、Ｒ１はエチルであり、Ｒ２はエチルである。
【００３７】
他の実施形態では、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はエチルである。
【００３８】
他の実施形態では、Ｒ１はエチルであり、Ｒ２はメチルである。
【００３９】
したがって、その組成物の態様の１つでは、本発明は、
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）；
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジエチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩｂ）；
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２−メチル−５−エチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩｃ）；
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２−エチル−５−メチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩｄ）
から選択された式Ｉの化合物またはその医薬として許容される塩に関する。
【００４０】
定義
本発明の化合物、組成物、方法およびプロセスについて記載する場合、下記の用語は、別段の指示がない限り下記の意味を有する。
【００４１】
「アルキル」という用語は、直鎖状または分枝状でよい一価の飽和炭化水素基を意味する。別段の定義がない限り、このようなアルキル基は典型的には、１〜１０個の炭素原子を含有する。代表的なアルキル基には、例示として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどが挙げられる。
【００４２】
炭素原子の特定の数が、本明細書において使用される特定の用語のために意図されている場合、炭素原子の数は用語の前に示される。例えば、「Ｃ１〜３アルキル」という用語は、１〜３個の炭素原子を有するアルキル基を有し、炭素原子は任意の化学的に許容できる配置にある。
【００４３】
「アルキレン」という用語は、直鎖状または分枝状でよい二価の飽和炭化水素基を意味する。別段の定義がない限り、このようなアルキレン基は典型的には、１〜１０個の炭素原子を含有する。代表的なアルキレン基には、例示として、メチレン、エタン−１，２−ジイル（「エチレン」）、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイルなどが挙げられる。
【００４４】
「アミノ保護基」という用語は、アミノ基での望ましくない反応を防止するのに適切な保護基を意味する。代表的なアミノ保護基には、それだけに限らないが、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、トリチル（Ｔｒ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジル、ホルミル、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）などが挙げられる。
【００４５】
「カルボキシ保護基」という用語は、カルボキシ基での望ましくない反応を防止するのに適切な保護基を意味する。代表的なカルボキシ保護基には、それだけに限らないが、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、ジフェニルメチル（ベンズヒドリル、ＤＰＭ）などのエステルが挙げられる。
【００４６】
「本発明の化合物」または「式Ｉの化合物」または「式ＩＩの化合物」という用語は、本明細書で使用する場合、別段の指示がない限り、特定の化合物、あるいはその医薬として許容される塩または溶媒和物または立体異性体を意味する。
【００４７】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
【００４８】
「ヒドロキシル保護基」という用語は、ヒドロキシル基での望ましくない反応を防止するのに適切な保護基を意味する。代表的なヒドロキシル保護基には、それだけに限らないが、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）などのトリ（Ｃ１〜６アルキル）シリル基を含めたシリル基；ホルミル、アセチルなどのＣ１〜６アルカノイル基を含めたエステル（アシル基）；ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ジフェニルメチル（ベンズヒドリル、ＤＰＭ）などのアリールメチル基が挙げられる。さらに、２個のヒドロキシル基はまた、例えば、アセトンなどのケトンとの反応によって形成されるプロパ−２−イリジンなどのアルキリデン基として保護されることもできる。
【００４９】
「脱離基」という用語は、求核置換反応などの置換反応において他の官能基または原子によって置換することのできる官能基または原子を意味する。例示として、代表的な脱離基には、それだけに限らないが、クロロ、ブロモおよびヨード基；メシラート、トシラート、ブロシラート、ノシラートなどのスルホン酸エステル基；およびアセトキシ、トリフルオロアセトキシなどのアシルオキシ基が挙げられる。
【００５０】
「質量中央径」または「ＭＭＤ」という用語は、粒子を言及するために使用される場合、粒子の塊の半分がそれより大きい直径の粒子に含まれ、半分がそれより小さい直径の粒子に含まれるような直径を意味する。
【００５１】
「微粉化された」または「微粉化された形態の」という用語は、別段の指示がない限り、粒子の少なくとも約９０パーセントが約１０μｍ未満の直径を有する粒子を意味する。
【００５２】
「あるいは医薬として許容されるその塩または溶媒和物または立体異性体」という用語は、本明細書で使用する場合、式Ｉの化合物の立体異性体の医薬として許容される塩の溶媒和物などの、塩、溶媒和物および立体異性体のすべての置換を含むことが意図されている。
【００５３】
「医薬として許容される塩」という用語は、哺乳動物などの患者に投与するために許容できる塩を意味する（例えば、所与の投与計画において哺乳動物への許容できる安全性を有する塩）。代表的な医薬として許容される塩には、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンホスルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、エジシル酸、フマル酸、ゲンチシン酸、グルコン酸、グルコロン酸、グルタミン酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩化水素酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタリンスルホン酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、ナフタレン−２，６−二スルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オロチン酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびキシナホ酸などの塩が含まれる。
【００５４】
「その保護された誘導体」という用語は、化合物の１つまたは複数の官能基が、保護基または封鎖基との望ましくない反応を受けることから保護または遮断される、特定の化合物の誘導体を意味する。保護することができる官能基には、例示として、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、カルボニル基などが挙げられる。このような官能基のための適切な保護基は、T. W. GreeneおよびG. M. Wuts、Protecting Groups in Organic Synthesis、第３版、Wiley、New York、１９９９年およびそこで引用されている参考文献における教示に例示されるように、当業者には周知である。
【００５５】
「その塩」という用語は、酸の水素が、金属カチオンまたは有機カチオンなどのカチオンで置換される場合に形成される化合物を意味する。本発明では、カチオンは典型的には、式Ｉの化合物のプロトン化した形態を含む、すなわち１つまたは複数のアミノ基が酸によってプロトン化されている。好ましくは、塩は、医薬として許容される塩であるが、患者への投与を意図していない中間化合物の塩については、これは必要でない。
【００５６】
「溶媒和物」という用語は、溶質、すなわち式Ｉの化合物またはその医薬として許容される塩の１個または複数の分子と、溶媒の１個または複数の分子とで形成される複合体または凝集物を意味する。このような溶媒和物は典型的には、溶質および溶媒のモル比が実質的に固定した結晶性固体である。代表的な溶媒には、例示として、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが挙げられる。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。
【００５７】
「治療有効量」という用語は、治療を必要としている患者に投与した場合、治療を行うのに十分な量を意味する。
【００５８】
「治療する」または「治療」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳動物（特に、ヒト）などの患者において疾患または病状（ＣＯＰＤまたは喘息など）を治療することまたは治療を意味し、
（ａ）疾患または病状が起こることを予防すること、すなわち患者の予防的治療、
（ｂ）疾患または病状を回復させること、すなわち患者の疾患または病状を解消または退行させること、
（ｃ）疾患または病状を抑えること、すなわち患者の疾患または病状の進行を遅らせ、または阻止すること、あるいは
（ｄ）患者の疾患または病状の症状を軽減すること
が含まれる。
【００５９】
本明細書において使用されるすべての他の用語は、当業者であれば理解するように、それらの通常の意味を有することが意図されている。
【００６０】
一般の合成手順
本発明の化合物は、下記の一般方法および手順を使用して、あるいは当業者が容易に利用可能なまたは公知の他の情報を使用することによって、容易に利用可能な出発物質から調製することができる。下記の手順は本発明の特定の実施形態または態様を例示する場合があるが、同一または同様の方法を使用して、あるいは当業者には公知の他の方法、試薬および出発物質を使用することによって、本発明の他の実施形態または態様を調製することができることを当業者であれば理解するであろう。典型的または好ましい作業条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が所与である場合、特に明記しない限り、他の作業条件もまた使用することができることはまた理解されよう。最適な反応条件は典型的には、反応物、溶媒および使用する量などの様々な反応パラメーターによって変化するが、当業者であれば、常套の最適化手順を使用して適切な反応条件を容易に決定することができる。
【００６１】
さらに、当業者であれば明らかであろうように、特定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防止するため、従来の保護基が必要または所望である場合がある。特定の官能基のための適切な保護基の選択、ならびにこのような官能基の保護および脱保護のための適切な条件および試薬は、当技術分野で周知である。本明細書に記載する手順において例示した以外の保護基を所望であれば使用してもよい。
【００６２】
一実施形態では、式Ｉ
【００６３】
【化１６】
2009541209.tif 000008
（式中、Ｐ１はヒドロキシル保護基であり、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立に、Ｃ１〜６アルキルから選択され、またはＲ３ａおよびＲ３ｂは結合してＣ２〜６アルキレンを形成する）の化合物は、スキームＩに例示されるように合成される。
【００６４】
スキームＩに示されるように、化合物１は、約０．９５〜約１．０５モル当量の化合物２と反応し、化合物３を提供することができる。このマイケル反応は典型的には、約０℃〜約７５℃、典型的には約４０℃〜約４５℃の範囲の温度で、約８〜約２４時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、ジクロロメタンまたはジクロロメタンとメタノールとの混合物またはエタノールなどの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、生成物を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。あるいは、化合物３を含有する反応混合物を、合成の次のステップにおいて直接使用することができる。
【００６５】
次いで、化合物３は酸性水溶液と反応して、アセタール基が加水分解され、アルデヒド化合物４が提供される。例示として、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などを含めた任意の適切な酸をこの反応において用いることができる。加水分解反応は典型的には、約０℃〜約３０℃、典型的には約２０℃〜約２５℃の範囲の温度で、約１〜約６時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン／エタノール、アセトニトリルなどの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、生成物を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００６６】
次いで、化合物４は還元剤の存在下にて約０．９５〜約１．５モル当量の化合物５と反応して、化合物６が生じる。例示として、水酸化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウムなどの金属水素化物試薬、または水素およびパラジウム炭素などの金属触媒を含めて、任意の適切な還元剤をこの反応において使用してもよい。この還元的アルキル化反応は典型的には、約−２０℃〜約３０℃、典型的には約０℃〜約５℃の範囲の温度で、約１〜約６時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、適切な希釈剤、ならびにジクロロエタンおよびメタノールなどのプロトン性溶媒中で行われる。反応が完了すると、生成物を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００６７】
次いで、化合物６を脱保護し、式Ｉの化合物を得る。化合物６を脱保護するために使用する特定の条件は、用いる保護基によるであろう。例えば、Ｐ１が、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブトキシジフェニルシリルなどのシリル保護基（すなわち、本明細書に記載されているような式６ａの化合物）である場合、この脱保護反応は典型的には、化合物６ａをフッ化物イオンの源と反応させることによって行われる。特定の実施形態では、フッ化物イオンの源は、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩である。フッ化物イオンの他の適切な源には、フッ化テトラブチルアンモニウム、１８−クラウン−６を有するフッ化カリウム、フッ化水素、ピリジンフッ化水素酸塩などが挙げられる。この反応は典型的には、約０℃〜約５０℃、典型的には約１０℃〜約２５℃の範囲の温度で、約２４〜約７２時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、ジクロロエタンなどの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、生成物を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００６８】
化合物１は当技術分野において公知であり、または公知の手順を使用して市販の出発物質および試薬から調製することができる。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１６７１６７（Ａ１）号およびR. Naitoら、Chem. Pharm. Bull.、４６（８）号、１２８６〜１２９４頁（１９９８年）を参照されたい。例示として、化合物１はスキームＩＩに例示されているように調製することができる。
【００６９】
【化１７】
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スキームＩＩに示されるように、ビフェニル−２−イソシアネート（７）をＮ−保護４−ヒドロキシピペリジン８（式中、Ｐ２はベンジルなどのアミノ保護基である）と反応させ、カルバメート中間体９を提供する。この反応は典型的には、約２０℃〜約１００℃、典型的には約６０℃〜約８０℃の範囲の温度で、約６〜約２４時間または反応が実質的に完了するまで行われる。所望であれば、この反応は、ジクロロメタン、トルエンなどの適切な希釈剤中で行うことができる。あるいは、この反応は希釈剤の非存在下にて行うことができる。反応が完了すると、生成物９を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。あるいは、化合物９を含有する反応混合物を合成の次のステップにおいて直接使用する。
【００７０】
次いで、アミノ保護基Ｐ２を、従来の手順を使用して化合物９から除去し、化合物１を得る。例えば、Ｐ２がベンジル基である場合、パラジウム触媒などの触媒の存在下にて、水素またはギ酸アンモニウムを使用して化合物９を脱保護することができる。代表的な触媒には、例示として、パラジウム炭素、水酸化パラジウムオンカーボンなどが挙げられる。この反応は典型的には、約２０℃〜約５０℃、典型的には約４０℃の範囲の温度で、約６〜約２４時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、化合物１を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００７１】
式２の化合物は、当技術分野において公知であり、または公知の手順を使用して市販の出発物質および試薬から調製することができる。例示として、式２の化合物は、スキームＩＩＩに示されるように調製することができる。
【００７２】
【化１８】
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スキームＩＩＩに示されるように、式１０（式中、Ｘ１はブロモまたはヨードである）のアニリン化合物を、最初にアミノ基で保護し、式１１（式中、Ｐ３ａはアミノ保護基であり、Ｐ３ｂは水素またはアミノ保護基である）の化合物を得る。ベンジル、４−メトキシベンジル、トリフルオロアセチルなどの任意の適切なアミノ保護基を使用することができる。例えば、式１０の化合物は、塩化ベンジル、臭化ベンジルまたはヨウ化ベンジルなどの約２またはそれ以上のモル当量、好ましくは約２．５〜約３．０モル当量のハロゲン化ベンジルと反応させ、化合物１１（式中、Ｐ３ａおよびＰ３ｂは両方ともベンジルである）を得ることができる。この反応は典型的には、約０℃〜約５０℃、典型的には約３０℃の範囲の温度で、約１８〜約２４時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの適切な希釈剤中で行われる。典型的には、この反応はまた、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムなどの適切な塩基の存在下でも行われる。反応が完了すると、化合物１１を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００７３】
この反応において用いることができる代表的な式１０の化合物には、２，５−ジメチル−４−ヨードアニリン、２，５−ジエチル−４−ヨードアニリン、２−エチル−４−ヨード−５−メチルアニリン、５−エチル−４−ヨード−２−メチルアニリン、４−ブロモ−２，５−ジメチルアニリン、４−ブロモ−２，５−ジエチルアニリン、４−ブロモ−２−エチル−５−メチルアニリン、４−ブロモ−５−エチル−２−メチルアニリンなどが挙げられる。このような化合物は、（例えば、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｇｒｏｕｐ社、Ｍｉｌｌｂｕｒｙ、ＯＨから）市販されており、または従来の手順を使用して市販の出発物質および試薬から調製することができる。
【００７４】
次いで、化合物１１を、約１〜約２モル当量のｎ−ブチルリチウムまたはｔｅｒｔ−ブチルリチウムなどのアルキルリチウム試薬と接触させ、Ｘ１基がリチウムと置換されている対応するアニオンを形成する。この反応は典型的には、約−７０℃〜約０℃、典型的には約−２０℃の範囲の温度で、約０．２５〜約１時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、トルエン、キシレン、テトラヒドロフランなどの適切な希釈剤中で行われる。
【００７５】
このようにして得られたリチウムアニオンは単離されないが、ｉｎ  ｓｉｔｕで過剰なモル濃度のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと反応し、化合物１２が提供される。一般に、約２〜約４モル当量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが使用される。この反応は典型的には、約−７０℃〜約０℃、典型的には約−２０℃〜約０℃の範囲の温度で、約０．５〜約２時間または反応が実質的に完了するまで行われる。反応が完了すると、化合物１２を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００７６】
次いで、酸触媒の存在下にて化合物１２をアルコールまたはジオールと反応させることによって、化合物１２のアルデヒド基をアセタールとして保護する。任意の適切なアルコールまたはジオールを、この反応において使用することができる。例えば、代表的なアルコールおよびジオールには、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどが挙げられる。一般に、過剰なモル濃度のアルコールまたはジオール、好ましくは約２〜約４モル当量をこの反応において用いる。
【００７７】
任意の適切な酸触媒をこの反応において使用して、アセタールの形成を容易にしてもよい。代表的な酸触媒作用には、例示として、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、塩酸などが挙げられる。
【００７８】
反応は典型的には、約５０℃〜約１００℃、典型的には約６０℃〜約８０℃の範囲の温度で、約１２〜約２４時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、トルエン、キシレンなどの適切な希釈剤中で行われる。典型的には、共沸蒸留による、または分子ふるいの使用によるなどの生成した水が除去されるのを可能とするような方法で反応が行われる。反応が完了すると、化合物１３を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。あるいは、化合物１３を含有する反応混合物を、合成の次のステップにおいて直接使用することができる。
【００７９】
アセタールの形成後に、化合物１３のアミノ基を、標準的試薬および条件を使用して脱保護し、化合物１４を形成させる。例えば、Ｐ３ａおよびＰ３ｂがベンジル基である場合、水素およびパラジウム触媒などの触媒を使用して、化合物１３を脱保護できる。代表的な触媒には、例示として、パラジウム炭素、水酸化パラジウムオンカーボンなどが挙げられる。この反応は典型的には、約２０℃〜約５０℃、典型的には約２５℃〜約３０℃の範囲の温度で、約４〜約１２時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、メタノール、エタノール、エタノール／酢酸エチル混合物などの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、化合物１４を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００８０】
次いで、化合物１４をハロゲン化アクリロイル１５（式中、Ｘ２はクロロ、ブロモまたはヨードである）と反応させて、化合物２を形成する。この反応は典型的には、約−２０℃〜約２５℃、典型的には約０℃〜約５℃の範囲の温度で、約０．５〜約６時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンなどの適切な塩基の存在下にて、ジクロロメタンなどの適切な希釈剤中で行われる。一般に、約１〜１．２モル当量のハロゲン化アクリロイルおよび約１〜約２モル当量の塩基を、この反応において使用する。反応が完了すると、化合物２を典型的には、抽出、再結晶、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。
【００８１】
式５の化合物は、当技術分野において公知であり、または公知の手順を使用して市販の出発物質および試薬から調製することができる。例示として、式５の化合物は、スキームＩＶに示されるように調製することができる。
【００８２】
【化１９】
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スキームＩＶに例示したように、式５の化合物は、式１６（式中、Ｐ４はベンジルなどのヒドロキシル保護基であり、Ｘ３はクロロ、ブロモまたはヨードなどの脱離基である）の化合物から調製することができる。式１６の化合物は、当技術分野において公知である。例えば、２００１年７月３１日に発行された米国特許第６，２６８，５３３（Ｂ１）号およびR. Hettら、Organic Process Research & Development、１９９８年、２号、９６〜９９頁は、２−ブロモ−４’−ベンジルオキシ−３’−ニトロアセトフェノンから出発するＮ−［２−ベンジルオキシ−５−（（Ｒ）−２−ブロモ−１−ヒドロキシエチル）フェニル］ホルムアミド（すなわち、化合物１６の（Ｒ）エナンチオマー（式中、Ｐ４はベンジルであり、Ｘ３はブロモである）である）の調製を記載している。その合成は、K.Muraseら、Chem. Pharm. Bull.、２５（６）号、１３６８〜１３７７頁（１９７７年）に記載されている。所望であれば、ボランジメチルスルフィド錯体などの非キラル還元剤を使用して、２−ブロモ−４’−ベンジルオキシ−３’−ニトロアセトフェノンを還元することによって化合物１６のラセミ体を調製することができる。
【００８３】
化合物１６のヒドロキシル基を、従来の手順および試薬を使用して保護し、化合物１７（式中、Ｐ１はヒドロキシル保護基である）を提供する。特定の実施形態では、ヒドロキシル保護基は、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ジフェニルメチルシリルなどのシリル保護基である。例えば、化合物１６は、約１．１〜約１．３モル当量のイミダゾールの存在下にて、約０．９５〜約１．２モル当量の塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルと反応して、化合物１７（式中、Ｐ１はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである）を提供することができる。この反応は典型的には、約０℃〜約５０℃の範囲の温度、典型的には室温で、約２４〜約４８時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、化合物１７は典型的には、抽出、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。さらに例示するために、Ｎ−｛２−ベンジルオキシ−５−［（Ｒ）−２−ブロモ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］フェニル｝ホルムアミドの合成は、２００４年１２月９日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０２４８９８５（Ａ１）号の実施例２に記載されている。
【００８４】
次いで、化合物１７をベンジルアミン（すなわち、Ｂｎ１−ＮＨ２）と反応させて、化合物１８（式中、Ｂｎ１は、Ｃ１〜４アルキルまたはＣ１〜４アルコキシから独立に選択される、ベンジル基のフェニル環上に１〜３個の置換基を有する非置換ベンジル基または置換ベンジル基である）を得る。代表的なベンジルアミンには、ベンジルアミン、３，４−ジメトキシベンジルアミン、４−メトキシベンジルアミン、４−メチルベンジルアミンなどが挙げられる。この反応は典型的には、化合物１７を約２〜約４モル当量のベンジルアミンと、約４０℃〜約１００℃、典型的には約８０℃〜約９０℃の範囲の温度で、約５〜約２４時間または反応が実質的に完了するまで接触させることによって行われる。一般に、この反応は、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）などの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、化合物１８は典型的には、抽出、クロマトグラフィー、再結晶などの従来の手順を使用して単離される。
【００８５】
次いで、従来の手順および試薬を使用したベンジル基Ｂｎ１、次いでＰ４の除去によって、化合物５を得る。一実施形態では、Ｂｎ１およびＰ４の両方は、同一の反応混合物中で除去されるベンジル基である。典型的には、この反応は、パラジウム触媒などの触媒の存在下にて化合物５を水素と反応させることによって行われる。代表的な触媒には、水酸化パラジウムオンカーボン、パラジウム炭素などが挙げられる。一般に、この脱ベンジル化反応は、酢酸、ギ酸などの酸の存在下にて行われる。この反応は典型的には、約１０℃〜約５０℃の範囲の温度、典型的には室温で、約６〜約２４時間または反応が実質的に完了するまで行われる。一般に、この反応は、メタノール、エタノールなどの適切な希釈剤中で行われる。反応が完了すると、化合物５を典型的には、抽出、クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して単離する。特定の実施形態では、化合物５は、酢酸塩として単離される。
【００８６】
式Ｉの化合物はまた他の合成手順によっても調製することができることを当業者であれば理解するであろう。例えば、合成ステップを行う特定の順番は変更することができ、または様々な中間体を用いることができる。例示として、式ＩＩＩ
【００８７】
【化２０】
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（式中、Ｙ１は−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３ｃである）の化合物は、従来の手順および試薬を使用して還元して、アルデヒド４（すなわち、式中、Ｙ１は−ＣＨＯである）を提供することができる。さらに、このような化合物は、アルコール（すなわち、Ｙ１は−ＣＨ２ＯＨである）に還元することができ、次いで標準的手順および試薬を使用してアルコールを酸化し、アルデヒド４（すなわち、式中、Ｙ１は−ＣＨＯである）を提供することができる。
【００８８】
所望であれば、式Ｉの化合物の遊離塩基の形態を医薬として許容される酸と接触させることによって、式Ｉの化合物の医薬として許容される塩を調製することができる。
【００８９】
本発明の代表的な化合物またはその中間体を調製するための特定の反応条件および他の手順に関するさらなる詳細は、下記の実施例に記載されている。
【００９０】
医薬組成物、組合せおよび製剤
本発明の化合物は典型的には、医薬組成物または製剤の形態で患者に投与される。このような医薬組成物は、それだけに限らないが、吸入、経口、経鼻、（経皮を含めた）局所および非経口投与方法が挙げられる任意の許容できる投与経路によって患者に投与することができる。特定の投与方法に適した本発明の化合物の任意の形態（すなわち、遊離塩基、医薬として許容される塩、溶媒和物など）は、本明細書において議論されている医薬組成物に使用することができることが理解されよう。
【００９１】
したがって、その組成物の態様の１つでは、本発明は、医薬として許容される担体または賦形剤と式Ｉの化合物とを含む医薬組成物に関する。任意選択で、このような医薬組成物は、所望であれば他の治療剤および／または配合剤を含有してもよい。
【００９２】
本発明の医薬組成物は典型的には、式Ｉの化合物の治療有効量を含有する。しかし、当業者であれば、医薬組成物は、治療有効量を超える量（すなわち、バルク組成物）、または治療有効量未満の量（すなわち、治療有効量を達成するための多回投与のために設計されている個々の単位用量）を含有することができることを理解するであろう。
【００９３】
典型的には、医薬組成物は、約０．０１〜約１０重量％などの約０．０１〜約３０重量％の治療剤を含めて、約０．０１〜約９５重量％の治療剤を含有する。
【００９４】
任意の従来の担体または賦形剤を、本発明の医薬組成物において使用することができる。特定の担体または賦形剤、あるいは担体または賦形剤の組合せの選択は、特定の患者を治療するために使用される投与方法、あるいは病状または病態のタイプによるであろう。これに関しては、特定の投与方法のための適切な医薬組成物の調製は、十分に製薬技術の当業者の範囲内である。
【００９５】
本発明の医薬組成物に使用される担体または賦形剤は、市販である。例えば、このような材料は、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。さらに例示するために、従来の製剤技術は、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、Lippincott Williams & White、Baltimore、Maryland（２０００年）；およびH. C. Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第７版、Lippincott Williams & White、Baltimore、Maryland（１９９９年）における教示によって例示されるように当業者には周知である。
【００９６】
医薬として許容される担体としての機能を果たす材料の代表的な例には、それだけに限らないが、下記が挙げられる。（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロース、ならびにその誘導体、（４）トラガカント粉末、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤、（９）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質なしの水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液溶液、（２１）クロロフルオロカーボンおよびハイドロフルオロカーボンなどの圧縮噴射ガス、ならびに（２２）医薬組成物に用いられる他の無毒適合性の物質。
【００９７】
本発明の医薬組成物は典型的には、本発明の化合物を、医薬として許容される担体および任意選択の成分と完全および密接に混合またはブレンドすることによって調製される。必要に応じてまたは所望により、このようにして得られた均一にブレンドされた混合物は、次いで従来の手順および装置を使用して、錠剤、カプセル剤、丸剤、缶、カートリッジ、ディスペンサーなどに成形または充填することができる。
【００９８】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、吸入投与に適切である。吸入投与のために適切な医薬組成物は典型的には、エアロゾルまたは粉末の形態であろう。このような組成物は一般に、ネブライザー吸入器、定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）または同様の送達装置などの周知の送達装置を使用して投与される。
【００９９】
本発明の特定の実施形態では、治療剤を含む医薬組成物は、ネブライザー吸入器を使用して吸入によって投与される。このようなネブライザー装置は典型的には、治療剤を含む医薬組成物を患者の気道に運ぶ霧として噴霧する高速空気流を生じる。したがって、噴霧吸入器での使用のために製剤される場合、治療剤を典型的には、適切な担体に溶解し、溶液を形成する。あるいは、治療剤を微粉化し、適切な担体と混合し、微粉化粒子の懸濁液を形成することができる。吸入によって治療剤を投与するのに適切なネブライザー装置は、当業者には周知であり、またはこのような装置は市販である。例えば、代表的なネブライザー装置または製品には、Ｒｅｓｐｉｍａｔ  Ｓｏｆｔｍｉｓｔ  Ｉｎｈａｌａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）、ＡＥＲｘ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｒａｄｉｇｍ社）、ＰＡＲＩ  ＬＣ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅｕｓａｂｌｅ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ｐａｒｉ  ＧｍｂＨ社）などが挙げられる。
【０１００】
噴霧吸入器に使用するための代表的な医薬組成物は、約０．０５μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの式Ｉの化合物を含む等張水溶液を含む。一実施形態では、このような溶液は、約４〜約６のｐＨを有する。
【０１０１】
本発明の他の特定の実施形態では、治療剤を含む医薬組成物は、ドライパウダー吸入器を使用して吸入によって投与される。このようなドライパウダー吸入器は典型的には、吸気の間に患者の呼吸流に分散する易流動性粉末として治療剤を投与する。易流動性粉末を実現するために、治療剤は典型的には、ラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）またはこれらの組合せなどの適切な賦形剤で製剤される。治療剤は典型的には、微粉化され、適切な担体と混合され、吸入に適切なブレンドを形成する。したがって、本発明の一実施形態では、式Ｉの化合物は、微粉化された形態である。
【０１０２】
ドライパウダー吸入器で使用するための代表的な医薬組成物は、乾燥粉砕ラクトースおよび式Ｉの化合物の微粉化粒子を含む。
【０１０３】
このような乾燥粉末製剤は、例えば、ラクトースを治療剤と混合し、次いで成分を乾燥ブレンドすることによって作製することができる。あるいは、所望であれば、治療剤は、賦形剤なしで製剤することができる。次いで、医薬組成物は典型的には、乾燥粉末送達装置で使用するために、乾燥粉末ディスペンサー、あるいは吸入カートリッジまたはカプセルに充填される。
【０１０４】
吸入によって治療剤を投与するのに適切なドライパウダー吸入用送達装置は、当業者には周知であり、またはこのような装置は市販である。例えば、代表的なドライパウダー吸入用送達装置または製品には、Ａｅｏｌｉｚｅｒ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）、Ａｉｒｍａｘ（ＩＶＡＸ社）、ＣｌｉｃｋＨａｌｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔａ  Ｂｉｏｍｅｄ社）、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、Ｄｉｓｋｕｓ／Ａｃｃｕｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、Ｅａｓｙｈａｌｅｒ（Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ社）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（Ａｖｅｎｔｉｓ社）、ＦｌｏｗＣａｐｓ（Ｈｏｖｉｏｎｅ社）、Ｈａｎｄｉｈａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）、Ｐｕｌｖｉｎａｌ（Ｃｈｉｅｓｉ社）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、ＳｋｙｅＨａｌｅｒ／Ｃｅｒｔｉｈａｌｅｒ（ＳｋｙｅＰｈａｒｍａ社）、Ｔｗｉｓｔｈａｌｅｒ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社）、Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社）、Ｕｌｔｒａｈａｌｅｒ（Ａｖｅｎｔｉｓ社）などが挙げられる。
【０１０５】
本発明のまた他の特定の実施形態では、治療剤を含む医薬組成物は、定量吸入器を使用して吸入によって投与される。このような定量吸入器は典型的には、圧縮噴射ガスを使用して一定量の治療剤を放出する。したがって、定量吸入器を使用して投与される医薬組成物は典型的には、液化噴射剤中に治療剤の溶液または懸濁液を含む。ＣＣｌ３Ｆなどのクロロフルオロカーボン、ならびに１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ａ）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ２２７）などのヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）を含めた任意の適切な液化噴射剤を用いることができる。クロロフルオロカーボンがオゾン層に影響を与えることについての懸念から、ＨＦＡを含有する製剤が、一般に好ましい。ＨＦＡ製剤のさらなる任意選択の成分には、エタノールまたはペンタンなどの共溶媒、ならびにトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、レシチン、およびグリセリンなどの界面活性剤が挙げられる。
【０１０６】
定量吸入器に使用するための代表的な医薬組成物は、約０．０１重量％〜約５重量％の式Ｉの化合物、約０重量％〜約２０重量％のエタノールおよび約０重量％〜約５重量％の界面活性剤を含み、残りはＨＦＡ噴射剤である。
【０１０７】
このような組成物は典型的には、冷却または加圧ヒドロフルオロアルカンを、治療剤、（存在する場合は）エタノールおよび（存在する場合は）界面活性剤を含有する適切な容器に加えることによって調製する。懸濁液を調製するために、治療剤を微粉化し、次いで噴射剤と混合する。次いで製剤を、定量吸入装置の一部を形成するエアロゾル缶に充填する。
【０１０８】
吸入によって治療剤を投与するのに適切な定量吸入装置は、当業者には周知であり、またはこのような装置は市販である。例えば、代表的な定量吸入装置または製品には、ＡｅｒｏＢｉｄ  Ｉｎｈａｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、Ａｔｒｏｖｅｎｔ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）、Ｆｌｏｖｅｎｔ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、Ｍａｘａｉｒ  Ｉｎｈａｌｅｒ（３Ｍ社）、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ  Ｉｎｈａｌｅｒ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社）、Ｓｅｒｅｖｅｎｔ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）などが挙げられる。
【０１０９】
他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、経口投与に適切である。経口投与に適切な医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カシェ剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤の形態；あるいは水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として；あるいは水中油型または油中水型液体エマルジョンとして；あるいはエリキシル剤またシロップ剤としてなどでよく、各々が活性成分として所定の量の本発明の化合物を含有する。
【０１１０】
固体剤形の経口投与用である場合（すなわち、カプセル剤、錠剤、丸剤などとして）、本発明の医薬組成物は典型的には、活性成分として本発明の化合物、およびクエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなどの１種または複数の医薬として許容される担体を含む。任意選択でまたは代わりとして、このような固体剤形はまた、（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤あるいは増量剤、（２）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤、（３）グリセロールなどの湿潤剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および／または炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（５）パラフィンなどの溶液遅延剤、（６）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（７）セチルアルコールおよび／またはモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、（８）カオリンおよび／またはベントナイト粘土などの吸収剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよび／またはその混合物などの滑沢剤、（１０）着色剤、ならびに（１１）緩衝剤も含む。
【０１１１】
離型剤、湿潤剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および香料剤、保存料および抗酸化剤もまた、本発明の医薬組成物中に存在することができる。医薬として許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。錠剤、カプセル剤、丸剤などのためのコーティング剤には、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸フタル酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸、メタクリル酸エステルコポリマー、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）などの腸溶性コーティングに使用されるコーティング剤が挙げられる。
【０１１２】
所望であれば、本発明の医薬組成物はまた、例示として、様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、または他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフィアを使用して活性成分の徐放または制御放出を実現するために製剤することもできる。
【０１１３】
さらに、本発明の医薬組成物は、任意選択で乳白剤を含有してもよく、任意選択で遅延するような方法で、消化管の特定の部分のみに、または優先的に活性成分を放出するように製剤してもよい。使用することのできる包埋組成物の例には、高分子物質およびワックスが挙げられる。活性成分はまた、適切であれば１種または複数の上記の賦形剤と共にマイクロカプセル化形態でもよい。
【０１１４】
経口投与用の適切な液体剤形には、例示として、医薬として許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。このような液体剤形は典型的には、活性成分；ならびに例えば水または他の溶媒などの不活性希釈剤；エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤を含む。懸濁剤は、活性成分に加えて、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物などの懸濁化剤を含有してもよい。
【０１１５】
経口投与用の場合、本発明の医薬組成物は、単位剤形に包装することができる。「単位剤形」という用語は、患者への投与に適切な物理的個別単位を意味し、すなわち、各ユニットが、単独または１種もしくは複数のさらなるユニットと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性剤を含有する。例えば、このような単位剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤などでよい。
【０１１６】
本発明の化合物はまた、公知の経皮的送達系および賦形剤を使用して経皮的にも投与することができる。例えば、本発明の化合物は、プロピレングリコール、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、アザシクロアルカン−２−オンなどの浸透エンハンサーと混合し、パッチまたは同様の送達系に組み入れることができる。ゲル化剤、乳化剤および緩衝液を含めたさらなる賦形剤を、所望であればこのような経皮的組成物に使用することができる。
【０１１７】
さらに、本発明の化合物は、非経口的、すなわち、静脈内、皮下または筋肉内に投与することができる。非経口投与のために、式Ｉの化合物は典型的には、滅菌水、生理食塩水、植物油などの非経口投与のために許容される担体に溶解する。例示として、静脈内用組成物は典型的には、式Ｉの化合物の滅菌水溶液を含み、溶液は約４〜約７の範囲のｐＨを有する。
【０１１８】
所望であれば、本発明の化合物は、１種または複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。この実施形態では、本発明の化合物は、他の治療剤と物理的に混合して両方の薬剤を含有する組成物を形成するか、または各薬剤が別々の異なる組成物中に存在し、それを患者に同時または順次に投与するかのいずれかである。
【０１１９】
例えば、式Ｉの化合物は、従来の手順および装置を使用して第２の治療剤と混合して、式Ｉの化合物と第２の治療剤とを含む組成物を形成することができる。さらに、治療剤は、医薬として許容される担体と混合して、式Ｉの化合物、第２の治療剤および医薬として許容される担体を含む医薬組成物を形成することができる。この実施形態では、組成物の成分を典型的には、混合またはブレンドし、物理的混合物を生じさせる。次いで、物理的混合物を、本明細書に記載する経路のいずれかを使用して治療有効量で投与する。
【０１２０】
あるいは治療剤は、患者へ投与する前は、別々の異なったままでよい。この実施形態では、治療剤は投与前に物理的に混合していないが、別々の組成物として同時または順次に投与される。例えば、式Ｉの化合物は、各治療剤のために別々の区画（例えば、ブリスターパック）を用いる吸入送達装置を使用して、他の治療剤と同時または順次に吸入によって投与することができる。あるいは、別々の送達装置、すなわち各治療剤に１つの送達装置を使用して、組合せを投与することができる。さらに、治療剤は、異なる投与経路、すなわち１つは吸入で、他方は経口投与によって送達することができる。
【０１２１】
本発明の化合物と相容性のある任意の治療剤を、このような化合物と組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、第２の治療剤は、吸入によって効果的に投与される。例示として、本発明の化合物と共に使用してもよい治療剤の代表的なタイプには、それだけに限らないが、ステロイド性抗炎症剤（副腎皮質ステロイドおよびグルココルチコイドを含めた）、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、およびＰＤＥ４阻害剤；ＰＤＥ３阻害剤、アデノシン２ｂモジュレーターおよびβ２アドレナリン受容体アゴニストなどの気管支拡張剤；グラム陽性の抗生物質、グラム陰性の抗生物質、および抗ウイルス剤などの抗感染症薬；抗ヒスタミン剤；プロテアーゼ阻害剤；Ｄ２アゴニストおよびニューロキニンモジュレーターなどの求心性遮断剤；およびムスカリン受容体アンタゴニスト（抗コリン剤）などの抗炎症剤が挙げられる。このような治療剤の多くの例は、当技術分野で周知である。本発明の化合物と組み合わせて投与される他の治療剤の適切な用量は典型的には、約０．０５μｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲である。
【０１２２】
本発明の特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明の化合物と組み合わせて使用することができるステロイド性抗炎症剤の代表的な例には、それだけに限らないが、ジプロピオン酸ベクロメタゾン；ブデソニド；プロピオン酸ブチキソコルト；２０Ｒ−１６α，１７α−［ブチリデンビス（オキシ）］−６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１７β−（メチルチオ）アンドロスタ−４−エン−３−オン（ＲＰＲ−１０６５４１）；シクレソニド；デキサメタゾン；６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル；６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル；６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸（Ｓ）−（２−オキソテトラヒドロフラン−３Ｓ−イル）エステル；フルニソリド；プロピオン酸フルチカソン；メチルプレドニゾロン；フランカルボン酸モメタゾン；プレドニゾロン；プレドニゾン；ロフレポニド；ＳＴ−１２６；トリアムシノロンアセトニドなど、または医薬として許容されるその塩が挙げられる。このようなステロイド性抗炎症剤は市販であり、または従来の手順および試薬を使用して調製することができる。例えば、ステロイド性抗炎症剤の調製および使用は、２００４年６月１５日に発行された米国特許第６，７５０，２１０（Ｂ２）号；２００４年７月６日に発行された米国特許第６，７５９，３９８（Ｂ２）号；２００３年３月２５日に発行された米国特許第６，５３７，９８３号；２００２年２月１４日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００１９３７８（Ａ１）号；およびそこに引用されている参考文献に記載されている。
【０１２３】
ステロイド性抗炎症剤が用いられる場合、典型的には、本発明の化合物と同時投与したときに治療的に有益な効果を生じる量で投与される。典型的には、ステロイド性抗炎症剤は、用量当たり約０．０５μｇ〜約５００μｇを実現するのに十分な量で投与されるであろう。
【０１２４】
下記の例では、代表的な本発明の医薬組成物を例示する。
【０１２５】
（実施例Ａ）
乾燥粉末組成物
微粉化された本発明の化合物（１００ｍｇ）を、粉砕ラクトース（２５ｇ）とブレンドする（例えば、粒子の約８５％以下が約６０μｍ〜約９０μｍのＭＭＤを有し、１５％以上の粒子が１５μｍ未満のＭＭＤを有するラクトース）。次いで、このブレンドされた混合物を、用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の化合物を実現するのに十分な量で可剥性のブリスターパックの個々のブリスターに充填する。ブリスターの内容物を、ドライパウダー吸入器を使用して投与する。
【０１２６】
（実施例Ｂ）
乾燥粉末組成物
微粉化された本発明の化合物（１ｇ）を、粉砕ラクトース（２００ｇ）とブレンドし、化合物と粉砕ラクトースとの重量比が１：２００のバルク組成物を形成する。ブレンドされた組成物を、用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の化合物を送達することができる乾燥粉末吸入装置に詰める。
【０１２７】
（実施例Ｃ）
乾燥粉末組成物
微粉化された本発明の化合物（１００ｍｇ）および微粉化されたステロイド性抗炎症剤（５００ｍｇ）を、粉砕ラクトース（３０ｇ）とブレンドする。次いで、このブレンドされた混合物を、用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の化合物を得るのに十分な量で、可剥性のブリスターパックの個々のブリスターに充填する。ブリスターの内容物を、ドライパウダー吸入器を使用して投与する。
【０１２８】
（実施例Ｄ）
定量吸入器用組成物
微粉化された本発明の化合物（１０ｇ）を、レシチン（０．２ｇ）を脱塩水（２００ｍＬ）に溶解することによって調製した溶液に分散させる。このようにして得られた懸濁液を噴霧乾燥し、次いで微粉化し、約１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子を含む微粉化された組成物を形成する。次いで、微粉化された組成物を、定量吸入器によって投与される場合用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の化合物を実現するのに十分な量の加圧した１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含有する定量吸入カートリッジに充填する。
【０１２９】
（実施例Ｅ）
ネブライザー用組成物
本発明の化合物（２５ｍｇ）を、クエン酸緩衝（ｐＨ５）等張食塩水（１２５ｍＬ）に溶解する。化合物が溶解するまで混合物を攪拌し、超音波処理する。溶液のｐＨを調べ、必要に応じて１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液をゆっくり加えることによってｐＨ５に調節する。用量当たり約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の化合物を実現するネブライザー装置を使用して溶液を投与する。
【０１３０】
（実施例Ｆ）
硬質ゼラチンカプセル
本発明の化合物（５０ｇ）、噴霧乾燥ラクトース（４４０ｇ）およびステアリン酸マグネシウム（１０ｇ）を完全にブレンドする。このようにして得られた組成物を、経口投与される硬質ゼラチンカプセル（カプセル当たり５００ｍｇの組成物）に充填する。
【０１３１】
（実施例Ｇ）
経口懸濁液
下記の成分を完全に混合し、経口投与用懸濁液を形成する。
【０１３２】
【化２１】
2009541209.tif 000013
このようにして得られた懸濁液は、懸濁液１０ｍＬ当たり１００ｍｇの活性成分を含有する。懸濁液を経口投与する。
【０１３３】
（実施例Ｈ）
注射用組成物
本発明の化合物（０．２ｇ）を、０．４Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（２．０ｍＬ）とブレンドする。このようにして得られた溶液のｐＨを、必要に応じて０．５Ｎの塩酸水溶液または０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を使用してｐＨ４に調節し、次いで注射用に十分な水を加え、２０ｍＬの総容量とする。次いで、混合物を無菌フィルター（０．２２ミクロン）で濾過し、注射による投与に適した滅菌溶液を提供する。
【０１３４】
有用性
本発明の化合物は、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する、したがって、このような化合物は、β２アドレナリン受容体またはムスカリン受容体によって媒介される病状、すなわち、β２アドレナリン受容体アゴニストまたはムスカリン受容体アンタゴニストで治療することによって回復する病状を治療するために治療剤として有用であることが見込まれる。このような病状は、Eglenら、Muscarinic Receptor Subtypes：Pharmacology and Therapuetic Potential、DN&P、１０（８）号、４６２〜４６９頁（１９９７年）；Emilienら、Current Therapeutic Uses and Potential of beta-Adrenoceptor Agonists and Antagonists、European J. Clinical Pharm.、５３（６）号、３８９〜４０４頁（１９９８年）およびそこで引用されている参考文献の教示によって例示されているように当業者には周知である。このような病状には、例示として、慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎および喘息様気管支炎および気腫）、喘息、肺線維症などの可逆性気道閉塞と関連がある肺障害または疾患が挙げられる。他の状態には、早期分娩、うつ病、うっ血性心不全、皮膚疾患（例えば、炎症性、アレルギー性、乾癬性および増殖性皮膚疾患）、消化性酸を低下させることが望ましい状態（例えば、消化性潰瘍および胃潰瘍）および筋肉疲労疾患が挙げられる。
【０１３５】
したがって、一実施形態では、本発明は、肺障害を治療するための方法に関し、この方法は治療を必要としている患者に式Ｉの化合物の治療有効量を投与するステップを含む。肺障害を治療するために使用する場合、本発明の化合物は典型的には、１日当たりの多回用量、１日当たりの単回用量または１週間当たりの単回用量で吸入によって投与されるであろう。一般に、肺障害を治療するための用量は、約１０μｇ／日〜約５００μｇ／日の範囲であろう。
【０１３６】
その方法の態様の１つでは、本発明は、慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療する方法に関し、この方法は患者に式Ｉの化合物の治療有効量を投与するステップを含む。一般に、ＣＯＰＤまたは喘息を治療するための用量は、約１０μｇ／日〜約５００μｇ／日の範囲であろう。「ＣＯＰＤ」という用語は、Barnes、Chronic Obstructive Pulmonary Disease、N. Engl. J. Med.、２０００年：３４３号：２６９〜７８頁、およびそこで引用されている参考文献の教示によって例示されているような、慢性閉塞性気管支炎および気腫を含めた種々の呼吸状態を含むことを当業者は理解している。
【０１３７】
吸入によって投与する場合、本発明の化合物は典型的には、気管支拡張を生じる効果を有する。したがって、その方法の態様のその他では、本発明は、哺乳動物において気管支拡張を生じさせる方法に関し、この方法は、哺乳動物に、式Ｉの化合物の気管支拡張を生じさせる量を投与するステップを含む。一般に、気管支拡張を生じさせる用量は、約１０μｇ／日〜約５００μｇ／日の範囲であろう。
【０１３８】
治療剤として使用する場合、本発明の化合物は、任意選択で他の治療剤または薬剤と組み合わせて投与される。特に、ステロイド性抗炎症剤と共に本発明の化合物を投与することによって、三重の治療（すなわち、β２アドレナリン受容体アゴニスト活性、ムスカリン受容体アンタゴニスト活性および抗炎症活性）を、２種の治療剤のみを使用して達成することができる。２種の治療剤を含有する医薬組成物（および組合せ）は典型的には、３種の治療剤を含有する組成物と比較して、製剤および／または投与がより容易であるため、このような２種の成分の組成物は、３種の治療剤を含有する組成物よりも有意な利点を提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明の医薬組成物、組合せおよび方法は、ステロイド性抗炎症剤をさらに含む。
【０１３９】
本発明の化合物は、β２アドレナリンアゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有するため、このような化合物は、β２アドレナリン受容体またはムスカリン受容体を有する生体系または生体試料を調査または研究するための研究道具としても有用である。さらに、このような化合物は、例えば、β２アドレナリンアゴニスト活性およびムスカリン受容体アンタゴニスト活性の両方を有する新規な化合物を発見するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。このような生体系または生体試料は、β２アドレナリン受容体および／またはムスカリン受容体を含み得る。β２アドレナリンおよび／またはムスカリン受容体を有する任意の適切な生体系または生体試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで行うことのできるこのような研究において用いることができる。このような研究に適切である代表的な生体系または生体試料には、それだけに限らないが、細胞、細胞抽出物、形質膜、組織試料、哺乳動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタなど）などが挙げられる。
【０１４０】
研究道具として使用される場合、β２アドレナリン受容体および／またはムスカリン受容体を含む生体系または生体試料を典型的には、本発明の化合物のβ２アドレナリン受容体をアゴナイズする量またはムスカリン受容体をアンタゴナイズする量と接触させる。次いで、化合物によってもたらされる生体系または生体試料への作用を、放射性リガンド結合アッセイにおける結合、または機能アッセイにおけるリガンドによって媒介される変化を測定することによる、あるいは哺乳動物における気管支保護アッセイにおいて化合物によって実現する気管支保護の量を決定することによるなどの従来の手順および装置を使用して決定または測定する。代表的な機能アッセイにおけるリガンドによって媒介される変化には、細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）におけるリガンドによって媒介される変化；（ｃＡＭＰを合成する）酵素アデニル酸シクラーゼの活性におけるリガンドによって媒介される変化；受容体によって触媒される［３５Ｓ］ＧＴＰＳのＧＤＰへの交換を介した、グアノシン５’−Ｏ−（チオ）三リン酸（［３５Ｓ］ＧＴＰＳ）の単離された膜への取込みにおけるリガンドによって媒介される変化；細胞内遊離カルシウムイオンのリガンドによって媒介される変化（例えば、蛍光イメージングプレートリーダーまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＦＬＩＰＲ（登録商標）によって測定される）などが挙げられる。本発明の化合物は、本明細書において挙げた機能アッセイにおいて、または同様の性質のアッセイにおいて、β２アドレナリン受容体のアゴナイズ、または活性化をもたらし、ムスカリン受容体のアンタゴナイズ、または活性化の減少をもたらすことが予想される。本発明の化合物は典型的には、約０．１ナノモル〜約１００ナノモルの範囲の濃度でこれらの研究において使用されるであろう。
【０１４１】
さらに、本発明の化合物は、他の化合物を評価するための研究道具として使用することができる。本発明のこの態様では、式Ｉの化合物は、アッセイにおいて試験化合物および式Ｉの化合物によって得られる結果の比較を可能にする標準物質として使用される。例えば、試験化合物または試験化合物の群についてのβ２アドレナリン受容体および／またはムスカリン受容体の結合データ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの放射性リガンド置換アッセイによって決定される）を、式Ｉの化合物のβ２アドレナリン受容体および／またはムスカリン受容体結合データと比較して、望ましい結合を有する試験化合物、すなわち式Ｉの化合物とほぼ同じまたはより優れた結合を有する試験化合物があれば同定する。あるいは例えば、気管支保護効果を、哺乳動物における気管支保護アッセイにおいて試験化合物および式Ｉの化合物について決定することができ、このデータをほぼ同じまたはより優れた気管支保護効果を提供する試験化合物を同定するために比較する。本発明のこの態様には、別々の実施形態として、（ｉ）（適切なアッセイを使用した）比較データの作製、および（ｉｉ）対象となる試験化合物を同定するための試験データの分析の両方が挙げられる。
【０１４２】
本発明の化合物の特性および有用性は、当業者には周知である様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して示すことができる。例えば、代表的なアッセイを、下記の実施例においてさらに詳細に記載する。
【実施例】
【０１４３】
下記の調製および実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を例示するために提示する。しかし、特定の実施形態および態様の例示は、別段の指示がない限り本発明の範囲を何ら限定することを意図しない。
【０１４４】
下記の実施例において使用するすべての試薬、出発物質および溶媒は、民間の供給業者（Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｆｌｕｋａ社、Ｓｉｇｍａ社など）から購入し、別段の指示がない限りさらに精製せずに使用した。
【０１４５】
下記の実施例において、ＨＰＬＣ分析は典型的には、Ａｇｉｌｅｎｔ社から供給されるＺｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ  ＲＰ２．１×５０ｍｍカラム（Ｃ１４カラム）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ社（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）Ｓｅｒｉｅｓ１１００機器（３．５ミクロン粒径を有する）を使用して行った。２１４ｎｍのＵＶ吸光度で検出を行った。移動相「Ａ」は、２％アセトニトリル、９７．９％水、および０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ／ｖ）であり、移動相「Ｂ」は、８９．９％アセトニトリル、１０％水、および０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ／ｖ）であった。ＨＰＬＣ（１０〜７０）データは、６分間にわたり０．５ｍＬ／分の流量の１０％〜７０％の移動相Ｂのグラジエントで得た。ＨＰＬＣ（５〜３５）データは、５分間にわたり０．５ｍＬ／分の流量の５％〜３５％の移動相Ｂのグラジエントで得た。ＨＰＬＣ（１０〜９０）データは、５分間にわたり０．５ｍＬ／分の流量の１０％〜９０％の移動相Ｂのグラジエントで得た。
【０１４６】
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）データを典型的には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）モデルＡＰＩ−１５０ＥＸ機器で得た。ＬＣＭＳ１０〜９０データは、５分間にわたり１０％〜９０％の移動相Ｂのグラジエントで得た。
【０１４７】
小規模の精製を、典型的には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡＰＩ１５０ＥＸ  Ｐｒｅｐ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎシステムを使用して行った。移動相「Ａ」は、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する水（ｖ／ｖ）であり、移動相「Ｂ」は、０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル（ｖ／ｖ）であった。少量の試料（約３〜５０ｍｇの回収試料サイズ）のために、下記の条件を典型的には使用した。２０ｍＬ／分の流量；１５分グラジエントおよび５ミクロン粒子を有する２０ｍｍ×５０ｍｍのＰｒｉｓｍ  ＲＰカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）。より大量の試料（すなわち、粗試料約１００ｍｇ超）のためには、下記の条件を典型的には使用した。６０ｍＬ／分の流量；３０分グラジエントおよび１０ミクロン粒子を有する４１．４ｍｍ×２５０ｍｍのＭｉｃｒｏｓｏｒｂ  ＢＤＳカラム（Ｖａｒｉａｎ社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）。
【０１４８】
（実施例１）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イソシアナート（９７．５ｇ、５２１ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシ−１−ベンジルピペリジン（１０５ｇ、５４９ｍｍｏｌ）（両方ともＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩから市販されている）を、共に７０℃で１２時間加熱し、その間にビフェニル−２−イルカルバミン酸１−ベンジルピペリジン−４−イルエステルの形成をＬＣＭＳによってモニターした。次いで、反応混合物を５０℃に冷却し、エタノール（１Ｌ）を加え、次いで６Ｍの塩酸（１９１ｍＬ）をゆっくりと加えた。次いで反応混合物を周囲温度に冷却し、ギ酸アンモニウム（９８．５ｇ、１．５６ｍｏｌ）を加え、溶液を窒素ガスで２０分間激しく泡立てた。次いで、パラジウム（活性炭上で１０重量％（乾量基準））（２０ｇ）を加えた。反応混合物を４０℃で１２時間加熱し、次いでセライトパッドで濾過した。次いで溶媒を減圧下で除去し、１Ｍの塩酸（４０ｍＬ）を粗残渣に加えた。次いで、水酸化ナトリウム（１０Ｎ）を加え、ｐＨを１２に調節した。水層を酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出し、乾燥し（硫酸マグネシウム）、次いで溶媒を減圧下で除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（１５５ｇ、１００％）を得た。HPLC (10〜70) Rt = 2.52; MS m/z: [M+H+] C18H20N2O2計算値297.15;実測値297.3。
【０１４９】
（実施例２）
３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸
ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（５０ｇ、６７．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５００ｍＬ）溶液に、アクリル酸（１５．０５ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を、還流させながら５０℃で１８時間加熱し、次いで溶媒を除去した。メタノール（６００ｍＬ）を加え、この混合物を７５℃で２時間加熱し、次いで室温に冷却し、濃厚なスラリーを形成させた。固体を濾過によって回収し、メタノール（５０ｍＬ）で洗浄し、空気乾燥し、３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸（６１ｇ、９６％純度）を白色粉末として得た。
【０１５０】
（実施例３）
Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝−ホルムアミド酢酸塩
ステップＡ  Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−ベンジルアミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ベンジルオキシフェニル｝ホルムアミド
５００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、Ｎ−｛２−ベンジルオキシ−５−［（Ｒ）−２−ブロモ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］フェニル｝ホルムアミド（１００ｇ、２１５ｍｍｏｌ）およびＮ−メチル−２−ピロリドン（３００ｍＬ）を加えた。ベンジルアミン（６９．４ｍＬ、６４８ｍｏｌ）を加え、反応混合物を窒素でフラッシュした。次いで反応混合物を９０℃に加熱し、約８時間攪拌した。次いで反応混合物を室温に冷却し、水（１．５Ｌ）および酢酸エチル（１．５Ｌ）を加えた。層を分離し、有機層を水（５００ｍＬ）、水と飽和ブラインとの１：１混合物（計５００ｍＬ）で洗浄し、次いで再び水（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、粗Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−ベンジルアミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ベンジルオキシフェニル｝ホルムアミド（１００ｇ、９０％収率、７５〜８０％純度）をオレンジ色から茶色の濃厚な油として得た。
【０１５１】
ステップＢ  Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝−ホルムアミド酢酸塩
粗Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−ベンジルアミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ベンジルオキシフェニル｝ホルムアミド（１００ｇ、１９４ｍｍｏｌ）を、メタノール（１Ｌ）および酢酸（２５ｍＬ、２９１ｍｍｏｌ）に溶解した。このようにして得られた混合物を、乾燥窒素でパージし、次いで水酸化パラジウムオンカーボン（２０ｇ、２０重量％、約５０％水）を加えた。反応混合物に、室温にて攪拌しながら約１０時間水素を泡立たせた。次いで、混合物を乾燥窒素でパージし、混合物をセライトで濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、酢酸エチル（６００ｍＬ）を残渣に加えた。この混合物を約２時間攪拌し、その時点で濃厚な黄色のスラリーが生じた。スラリーが濾過し、沈殿物を空気乾燥し、Ｎ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド酢酸塩（４８ｇ、９８％純度）を黄色から白色の固体として得た。
LCMS (10〜70) Rt = 3.62; [M+H+]実測値311.3。
【０１５２】
（実施例４）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ  メチル２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート
攪拌した２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート（４８０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の乾燥メタノール（８．２ｍＬ）溶液に、０℃で乾燥窒素下にて塩化チオニル（０．５３８ｍＬ、７．３８ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を放置して室温まで温め、約７時間攪拌した。さらなる塩化チオニル（０．３００ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌を続けた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液を、飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮し、メチル２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート（５７８ｍｇ）を淡黄色の固体として得た。HPLC (10〜70) Rt = 4.61; 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 2.57 (3H, s), 2.61 (3H, s), 3.94 (3H, s), 7.82 (1H, s), 7.87 (1H, s)。
【０１５３】
ステップＢ  メチル４−アミノ−２，５−ジメチルベンゾアート
メタノールと水との９：１混合物（計２５ｍＬ）中のメチル２，５−ジメチル−４−ニトロベンゾアート（５２３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に、０℃で塩化アンモニウム（４０１ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）を加えた。亜鉛（１．６３ｇ、２５ｍｍｏｌ）を１部ずつ加え、このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、反応混合物をセライトで濾過し、セライトパッドをメタノールで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、このようにして得られた残渣を酢酸エチルに溶解した。この溶液を飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、メチル４−アミノ−２，５−ジメチルベンゾアート（４５０ｍｇ）を黄色の油として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ2.14 (3H, s), 2.53 (3H, s), 3.83 (3H, s), 3.85 (2H, br s), 6.48 (1H, s), 7.72(1H, s)。
【０１５４】
ステップＣ  メチル４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチルベンゾアート
ジクロロメタン（３．６ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．４１３ｍＬ）中の３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオン酸（６７０ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）およびメチル４−アミノ−２，５−ジメチルベンゾアート（３９０ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（８２９ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、混合物を飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、３％〜５％メタノールを含有するジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、メチル４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチルベンゾアート（５６８ｍｇ、５９％収率）を得た。LCMS (10〜70) Rt = 4.55; [M+H+] 実測値530.4。
【０１５５】
ステップＤ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
攪拌した１Ｍの水素化アルミニウムリチウムのＴＨＦ（１．５２ｍＬ、１．５２ｍｍｏｌ）溶液に、０℃でメチル４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチルベンゾアート（４００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いで１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５ｍＬ）と水（５ｍＬ）との１：１混合物を加え、２時間攪拌を続けた。ジクロロメタンを加え、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。５％メタノールを含有するジクロロメタンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルを得た。LCMS (10〜70) Rt = 3.94; [M+H+] 実測値502.5。
【０１５６】
ステップＥ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液に、０℃でジメチルスルホキシド（１２８μＬ、１．８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１５７μＬ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後に、三酸化硫黄ピリジン錯体（１４３ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、０℃での攪拌を１時間続けた。水を加え反応をクエンチし、層を分離した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５０ｍｇ、１００％収率）を得て、それをさらに精製せずに使用した。[M+H+] 実測値500.4。
【０１５７】
ステップＦ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ジクロロメタンとメタノールとの１：１混合物（計３．０ｍＬ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）およびＮ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド（１１２ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で３０分間攪拌した。トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（１９１ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌した。酢酸を加え反応をクエンチし、混合物を減圧下で濃縮し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステルを得て、それをさらに精製せずに使用した。LCMS (10〜70) Rt = 4.55; [M+H+] 実測値794.6。
【０１５８】
ステップＧ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２３８ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）懸濁液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１４７μＬ、０．９０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で一晩攪拌し、次いで混合物を減圧下で濃縮した。分取−ＲＰ−ＨＰＬＣ（グラジエント：０．０５％ＴＦＡを含む水中で２〜５０％アセトニトリル）によって残渣を精製した。適切な画分を回収し、混合、凍結乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルをジトリフルオロ酢酸塩（５０ｍｇ、９７％純度）として得た。LPLC (2〜90) Rt = 2.76; [M+H+] 実測値680.8。
【０１５９】
（実施例５）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ  ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン
オーバーヘッド攪拌機、温度制御および添加漏斗を備えた２リットルの丸底フラスコに、４−ヨード−２，５−ジメチルアニリン（１００．０ｇ、０．４０５ｍｏｌ）（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｇｒｏｕｐ社、Ｍｉｌｌｂｕｒｙ、ＯＨから）を加えた。エタノール（１Ｌ）および固体炭酸カリウム（１６０ｇ、１．１５９ｍｏｌ）を加え、次いでニートの臭化ベンジル（１４０ｍＬ、１．１７９ｍｏｌ）を一度に加えた。このようにして得られた混合物を３０℃で約１８時間攪拌し、その時点でＨＰＬＣは９８％超の変換を示す。次いで、混合物を室温に冷却し、ヘキサン（１Ｌ）を加えた。この混合物を１５分間攪拌し、次いで濾紙で濾過し、固体を取り出し、濾過ケーキをヘキサン（２００ｍＬ）で洗浄した。回転エバポレーターを使用して、濾液の容量を約５００ｍＬまでに減らし、濃塩酸（３０ｍＬ）を加えた。次いで残りの溶媒を、回転エバポレーターを使用して除去した。このようにして得られた残渣に、ヘキサン（５００ｍＬ）を加え、この混合物を約３０分攪拌し、その時点で易流動性のスラリーが形成された。スラリーを濾過し、濾過ケーキをヘキサン（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン塩酸塩（１１５ｇ、６２％収率、９７．５％純度）を緑がかった色の固体として得た。
【０１６０】
ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン塩酸塩を、３Ｌのフラスコに移し、トルエン（１Ｌ）および１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１Ｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を１時間攪拌し、次いで層を分離した。有機層を希釈したブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、溶媒を回転蒸発によって除去し、ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン（８０ｇ）を半固体の濃厚な油として得た。（あるいはこのステップにおいて、ジクロロメタンをトルエンの代わりに使用することができる）。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ2.05 (3H, s), 2.19 (3H, s), 3.90 (4H, s), 6.91 (1H, s), 7.05-7.20 (10H, m),7.42 (1H, s); MS [M+H+] 実測値428。
【０１６１】
ステップＢ  ４−ジベンジルアミノ−２，５−ジメチルベンズアルデヒド塩酸塩
オーバーヘッド攪拌機、温度制御および添加漏斗を備えた１リットルの三つ口丸底フラスコに、ジベンジル−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アミン（１５ｇ、３５ｍｍｏｌ）を加えた。トルエン（３００ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を約１５分間攪拌した。反応フラスコを乾燥窒素でパージし、約−２０℃に冷却し、ヘキサン中の１．６Ｍのｎ−ブチルリチウム（３３ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）を、添加漏斗によって１滴ずつ加えた。添加の間、反応混合物の内部温度を−１０℃未満に維持した。添加が完了したときに、このようにして得られた混合物を約−１５℃で１５分間攪拌した。次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ、１２９ｍｍｏｌ）を１滴ずつ加え、その間内部反応温度を０℃未満に維持した。次いでこのようにして得られた混合物を−２０℃〜０℃で約１時間攪拌した。次いで１Ｍの塩酸水溶液（２００ｍＬ）を５分間にわたって加え、このようにして得られた混合物を１５分間攪拌した。次いで層を分離し、有機層を希釈したブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去し、４−ジベンジルアミノ−２，５−ジメチルベンズアルデヒド塩酸塩（１１．５ｇ、９０％収率、９５％純度）を濃厚な油として得て、静置すると固化した。生成物は、約３〜５％のデス−ヨード副生成物を含有した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ2.42 (3H, s), 2.50 (3H, s), 4.25 (4H, s), 6.82 (1H, s), 7.10-7.30 (10H, m),7.62 (1H, s), 10.15 (1H, s); MS [M+H+] 実測値330.3。
【０１６２】
ステップＣ  ４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルアミン
５００ｍＬの丸底フラスコに、４−ジベンジルアミノ−２，５−ジメチルベンズアルデヒド塩酸塩（１１．５ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）およびトルエン（１５０ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を、塩が完全に溶解するまで攪拌した。次いで反応フラスコを乾燥窒素で５分間パージした。エチレングリコール（５．２５ｍＬ、９４．２ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（７６０ｍｇ、６．２ｍｍｏｌ）を加え、このようにして得られた混合物を６０℃〜８０℃で約２０時間加熱した。次いで溶媒を、４０℃にてロータリーエバポレーターで（約４０分にわたって）ゆっくりと除去した。トルエン（１００ｍＬ）を残渣に加え、溶媒を再び４０℃にてロータリーエバポレーターゆっくり除去した。別の一定分量のトルエン（１００ｍＬ）を使用してこの処理を繰り返し、混合物を乾燥するまで蒸発させた。酢酸エチル（１５０ｍＬ）および飽和水性炭酸水素ナトリウム（１００ｍＬ）を残渣に加え、層を分離した。有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、粗ジベンジル−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチル−フェニル）アミン（１１．４ｇ）を得た。
【０１６３】
粗ジベンジル−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチル−フェニル）アミンを、エタノールと水との２：１混合物（計１５０ｍＬ）に溶解し、このようにして得られた混合物を乾燥窒素で５分間にわたりパージした。パラジウム炭素（２．３ｇ、１０重量％、約５０％水を含有）および固体炭酸水素ナトリウム（１．０ｇ）を加え、このようにして得られた混合物を、２５℃〜３０℃にて約１ａｔｍの水素で約８時間水素化した。次いで、混合物をセライトで濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、粗４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルアミン（５．６ｇ、９２％収率）を濃厚な油として得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ2.05 (3H, s), 2.22 (3H, s), 3.7-3.9 (4H, m), 3.95 (4H, s), 5.59 (1H, s), 6.72(1H, s), 7.0-7.25 (11H, m)。
【０１６４】
ステップＤ  Ｎ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド
５００ｍＬの丸底フラスコに粗４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルアミン（５．６ｇ、２９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１００ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（７．６ｍＬ、４３．５ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を、成分が溶解するまで室温で攪拌し、次いで混合物を０℃に冷却した。次いで、塩化アクリロイル（２．３５ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）を５分間にわたって１滴ずつ加えた。反応混合物を０℃〜５℃で１時間攪拌し、次いで水（５０ｍＬ）を加え、約３０分間攪拌を続け、その時点で微細固体が形成された。混合物を濾過し、固体を収集した。次いで、濾液の層を分離し、有機層を減圧下で乾燥するまで濃縮した。ジクロロメタン（５０ｍＬ）を残渣に加え、易流動性のスラリーが生じるまでこの混合物を攪拌した。（上記の微細固体を回収するために使用したのと同じ漏斗を使用して）スラリーを濾過し、濾過ケーキをジクロロメタン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、Ｎ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（３．１ｇ、９７％純度）を白色からオフホワイトの固体として得た。
【０１６５】
次いで、上記からの濾液を乾燥するまで蒸発させ、メタノール（１０ｍＬ）を残渣に加えた。この混合物を１５分間攪拌し、次いで沈殿物を濾過によって回収し、メタノール（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、Ｎ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（０．８ｇ、９５％純度）の２回目の収穫を得た。1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ2.10 (3H, s), 2.23 (3H, s), 3.85-4.10 (4H, m), 5.60-6.40 (3H, m), 5.59 (1H, s),7.18 (1H, s), 7.23 (1H, s)。
【０１６６】
ステップＥ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル塩酸塩
５０ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（１．２ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）およびＮ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（１．０ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を加えた。エタノール（１０ｍＬ）およびジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、スラリーを形成させた。反応混合物を４５℃〜５０℃で約１８時間加熱し、次いで室温に冷却した。１Ｍの塩酸水溶液（１０ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を約３時間激しく攪拌した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を約５分間攪拌した。次いで、層を分離し、有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、粗ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル塩酸塩（１．９ｇ）を得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ1.2-1.4 (2H, m), 1.58-1.75 (2H, m), 2.0-2.17 (2H, m), 2.19 (3H, s), 2.38 (3H,s), 2.41-2.50 (4H, m), 2.5-2.75 (2H, m), 4.31-4.42 (1H, m), 7.10-7.35 (9H, m),7.55 (1H, s), 7.75 (1H, s), 8.59 (1H, s), 9.82 (1H, s), 9.98 (1H, s); MS [M+H+] 実測値500.2。
【０１６７】
ステップＦ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
２Ｌの三つ口丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル塩酸塩（３８ｇ、７０ｍｍｏｌ）およびＮ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド酢酸塩（３３．６ｇ、９１ｍｍｏｌ）を加えた。ジクロロメタン（５００ｍＬ）およびメタノール（５００ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を、乾燥窒素下にて室温で約３時間攪拌した。次いで反応混合物を０℃〜５℃に冷却し、固体トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（４４．５ｇ、３８１ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって１部ずつ加えた。反応混合物を、０℃から室温に約２時間にわたってゆっくりと温め、次いで０℃に冷却した。飽和水性炭酸水素ナトリウム（５００ｍＬ）およびジクロロメタン（５００ｍＬ）を加えた。この混合物を完全に攪拌し、次いで層を分離した。有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、粗ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５５ｇ、８６％純度）を黄色の固体として得た。
【０１６８】
粗生成物（３０ｇ）を、２％メタノールを含有するジクロロメタン（計１５０ｍＬ）に溶解し、２％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウムを含有するジクロロメタンを詰めて平衡化したシリカゲルカラム（３００ｇ）に充填した。生成物を、２％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウム（１Ｌ）を含有するジクロロメタン、４％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウム（１Ｌ）を含有するジクロロメタン、ならびに５％メタノールおよび０．５％水酸化アンモニウム（約３Ｌ）を含有するジクロロメタンを使用してカラムから溶出した。画分（２００ｍＬ）を回収し、９０％超の純度を有するそれらの画分を、混合し、減圧下で濃縮し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２１．６ｇ、９６．５％純度）を黄色がかった固体として得た。MS [M+H+] 実測値794.6。
【０１６９】
ステップＧ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルフッ化水素酸塩
１Ｌの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２１．５ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた混合物を、成分が溶解するまで室温で攪拌し、次いでトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（８．８５ｍＬ、５４．２ｍｍｏｌ）を加え、このようにして得られた混合物を２５℃で約４８時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、濃厚なペーストを得た。ジクロロメタン（１００ｍＬ）および酢酸エチル（２００ｍＬ）をペーストに加え、このようにして得られた混合物を３０分間攪拌した。このようにして得られたスラリーを、乾燥窒素下にてゆっくりと濾過し、濾過ケーキをジクロロメタンと酢酸エチルとの１：２混合物（計１００ｍＬ）で洗浄し、窒素下にて２時間乾燥し、次いで真空下にて一晩乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルをフッ化水素酸塩（２５ｇ、９６．９％純度）として得たが、これは硬質クレー様の固体であった。MS [M+H+] 実測値680.8。
【０１７０】
ステップＨ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルフッ化水素酸塩（２５ｇ）を、移動相として１％トリフルオロ酢酸を含有する水中のアセトニトリルの１０％〜５０％混合物を使用した３つの等量のバッチで、６インチ逆相カラム（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ固相）によって精製した。９９％超の純度の画分を混合し、次いで１容の水で希釈した。このようにして得られた混合物を０℃に冷却し、混合物のｐＨが約７．５〜８．０となるまで固体炭酸水素ナトリウムを加えた。約５分以内に、白色スラリーが生じた。スラリーを３０分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケーキを水（５００ｍＬ）で洗浄し、約４時間で空気乾燥し、次いで一晩真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１２ｇ、９９＋％純度）を半結晶質の遊離塩基として得た。
【０１７１】
（実施例６）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
５００ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（１７．０ｇ、５８ｍｍｏｌ）およびＮ−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（１３．１ｇ、５２．９ｍｍｏｌ）を加えた。エタノール（１５０ｍＬ）およびジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、スラリーを形成させた。反応混合物を５０℃〜５５℃で約２４時間加熱し、次いで室温に冷却した。溶媒の大部分をロータリーエバポレーターで除去し、濃厚なスラリーとした。エタノール（試薬グレード）を加え、約２００ｍＬの総容量とし、このようにして得られた混合物を８０℃に加熱し、次いでゆっくりと室温に冷却した。このようにして得られた濃厚な白色スラリーを濾過し、エタノール（２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２３．８ｇ、約９８％純度）を白色固体として得た。
【０１７２】
ステップＢ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
５００ｍＬ丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−［１，３］ジオキソラン−２−イル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１５ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（１５０ｍＬ）を加え、スラリーを形成させた。２Ｍの塩酸水溶液（７５ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を３０℃で１時間攪拌した。次いで、混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えた。２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（７５ｍＬ）を加え、ｐＨを調べ、次いで溶液のｐＨが９〜１０の範囲となるまでさらなる２Ｍの水酸化ナトリウムを加えた。層を分離し、有機層を希釈したブライン（７５ｍＬ；１：１ブライン／水）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１２．５ｇ、約９８％純度）を得た。所望であれば、エタノール（３容のエタノール）でスラリーを形成し、スラリーを８０℃に加熱し、次いで室温にゆっくり冷却し、濾過によって単離することによって、この中間体の純度を増すことができる。
【０１７３】
ステップＣ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルイミノ］メチル｝−２，５−ジメチル−フェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
２５０ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（７．１ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）およびＮ−｛５−［（Ｒ）−２−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−２−ヒドロキシフェニル｝ホルムアミド酢酸塩（５．８ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）を加えた。メタノール（１００ｍＬ）を加え、スラリーを形成させ、この混合物を４５℃〜５０℃で窒素下にて１時間攪拌した。次いで、混合物を室温に冷却し、トルエン（５０ｍＬ）を加え、溶媒を３５℃〜４５℃の範囲の温度にてロータリーエバポレーターで除去した。トルエン（５０ｍＬ）を残渣に加え、溶媒を除去し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルイミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１２ｇ）を黄色からオレンジ色の固体として得た。
【０１７４】
ステップＤ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
水素化フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルイミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（４．６ｇ）および２−メチルテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた混合物を、固体が溶解するまで（約５分）攪拌し、次いで混合物を窒素でパージした。白金担持カーボン（９２０ｍｇ、５重量％、担持活性炭）を加え、混合物を５０ｐｓｉで６時間水素化した（Ｐａｒｒ  ｓｈａｋｅｒ）。次いで、混合物をセライトで濾過し、セライトを２−メチルテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）で洗浄した。濾液に、チオプロピル修飾シリカゲル（溶液の２０重量％、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）を加え、この混合物を２５℃〜３０℃で３時間攪拌した。次いで、混合物をセライトで濾過し、濃縮し、溶媒を除去した。残渣をメタノール（残渣１ｇ毎に５ｍＬ）に溶解し、次いでこのようにして得られた溶液を、激しく攪拌した飽和水性炭酸水素ナトリウムと水（残渣１ｇ毎に４０ｍＬ）との１：１混合物にゆっくり加えた。このようにして得られたオフホワイトのスラリーを２０分間攪拌し、次いで濾過した。濾過ケーキを水（２０容）で洗浄し、３時間空気乾燥し、次いで室温で一晩真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（８０％回収、約９６％純度）を得た。
【０１７５】
ステップＥ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルＬ−酒石酸塩
２００ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミノ］−メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（３．８ｇ、４．８ｍｍｏｌ）および２−メチルテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた混合物を、成分が溶解するまで室温で攪拌し（約１５分）、次いでトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．９４ｍＬ、５．７６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を２５℃で約２４時間攪拌した。この混合物に、飽和水性炭酸水素ナトリウムと水との１：１混合物（４０ｍＬ）および２−メチルテトラヒドロフランを加え、このようにして得られた混合物を固体が溶解するまで攪拌した（溶液のｐＨ約８）。層を分離し、有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残渣を２−メチルテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、固形のＬ−酒石酸（６５０ｍｇ）を加えた。このようにして得られた混合物を２５℃〜３０℃で１８時間攪拌し、次いで濾紙で濾過した。濾過ケーキを２−メチルテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）、イソプロパノール（１０ｍＬ）で洗浄し、直ちに真空下に置き、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルＬ−酒石酸塩（３．７ｇ、＞９７％純度）を得た。
【０１７６】
ステップＦ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル
２５０ｍＬの丸底フラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルＬ−酒石酸塩（３．５ｇ）およびメタノール（３５ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を１５分間攪拌した。飽和水性炭酸水素ナトリウムと水（７０ｍＬ）との１：１混合物を、５分にわたり加え、攪拌を２時間続けた。このようにして得られたオフホワイトスラリーを濾過し、濾過ケーキを水（２０ｍＬ）で洗浄し、２時間空気乾燥し、次いで一晩真空乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２．３ｇ）を半結晶質の遊離塩基として得た。
【０１７７】
ＪＥＯＬ  ＥＣＸ−４００ＮＭＲ分光計を使用して周囲温度で、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル（ＤＭＳＯ−ｄ６約０．７５ｍＬ中に２２．２ｍｇ）の試料について、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを得た。
【０１７８】
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6), 主異性体, δ 9.64 (br, 1H), 9.54 (br s, 1H), 9.43 (s,1H), 8.67 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.03 (d, J = 1.9, 1H), 7.25-7.45 (m, 9H), 〜7.3(nd, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 8.2, 1.9, 1H), 6.79 (d, J = 8.2, 1H),5.15 (br, 1H), 4.53 (dd, J = 7.3, 4.7, 1H), 4.47 (m, 1H), 〜3.65 および 〜3.60 (AB対,2H), 2.68 (br m, 2H), 〜2.59 (nd, 4H), 2.44 (br t, J = 6.5, 2H), 2.20 (s, 3H), 〜2.17(br m, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.73 (br, 2H), 1.44 (br q, J = 〜9.0, 2H).
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6), 副異性体, δ 9.64 (br, 1H), 9.43 (s 1H), 9.26 (br d,J = 〜7.0, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.50 (br d, J = 〜7.0, 1H), 7.25-7.45 (m, 9H), 〜7.3(nd, 1H), 7.07 (s, 1H), 〜7.07 (nd, 1H), 6.95 (dd, J = 8.3, 1.8, 1H), 6.83 (d, J=8.3, 1H), 5.15 (br, 1H), 4.47 (m, 1H), 〜3.65 および 〜3.60 (AB対, 2H), 2.68 (br m,2H), 〜2.59 (nd, 2H), 2.44 (br t, J = 6.5, 2H), 2.20 (s, 3H), 〜2.17 (br m, 2H),2.14 (s, 3H), 1.73 (br, 2H), 1.44 (br q, J = 〜9.0, 2H).
13C NMR(100 MHz, DMSO-d6), 主異性体, δ 170.0, 159.9, 153.9, 145.5, 139.3,137.6, 135.2, 135.0, 134.8, 133.4, 133.4, 130.2, 130.2, 128.6, 128.2, 127.8,127.4, 127.2, 127.0, 126.1, 125.7, 125.6, 121.7, 118.6, 114.5, 71.4, 70.0,57.4, 53.9, 50.3, 50.1, 33.7, 30.7, 18.2, 17.5.
13C NMR(100 MHz, DMSO-d6), 副異性体, δ 170.0, 163.4, 153.9, 147.8, 139.3,137,6, 135.7, 135.2, 135.0, 134.8, 133.4, 133.4, 130.2, 130.2, 128.6, 128.2,127.8, 127.4, 127.2, 127.0, 126.1, 125.7, 123.0, 119.6, 115.6, 71.0, 70.0,57.3, 53.9, 50.3, 50.1, 33.7, 30.7, 18.2, 17.5。
【０１７９】
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、主要な異性体（約８２モルパーセント）および少量の異性体（約１８モルパーセント）の存在を示し、これは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｈ結合での回転障害から生じる回転異性体であると思われた。フェニル基は、主要な異性体においてカルボニル酸素に対してｓｙｎであり、少量の異性体においてはａｎｔｉであると考えられる。
【０１８０】
（実施例７）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩの種結晶
半結晶質のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５００ｍｇ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解し、曇点に達するまで水を加えた。このようにして得られた混合物を２５℃で３時間攪拌し、このようにして得られた結晶質を濾過によって単離し、結晶質のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（４２０ｍｇ）を得た。この結晶質の遊離塩基は、約１４２℃〜約１５０℃で吸熱性熱流中にピークを示す示差走査熱量測定（ＤＳＣ）トレース；ならびに約２０．７±０．３、２１．６±０．３、２２．５±０．３および２３．２±０．３の２θ値において他のピークの中で有意な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）図形を有することが決定された。この結晶質の遊離塩基の形態を形態ＩＩと表す。この化合物の形態ＩＩおよび他の結晶質の遊離塩基の形態についてのさらなる情報は、本発明の譲受人に譲渡され本明細書と同日付で出願された米国特許出願第＿＿号（整理番号Ｐ−２２２−ＵＳ１）および２００６年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／７９４，７０９号（これらの開示内容は、全内容が参照により本明細書中に組み込まれている）に開示されている。
【０１８１】
（実施例８）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩの結晶化
オーバーヘッド攪拌機、温度制御および添加漏斗を備えた３Ｌの三つ口丸底フラスコに、半結晶質のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１４ｇ）およびメタノール（１．４Ｌ）を加えた。水（５００ｍＬ）を一度に加え、次いで曇点に達するまでさらなる水（２００ｍＬ）をゆっくりと加えた。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルの形態ＩＩ（５０ｍｇ）の種結晶を加え、このようにして得られた混合物を２５℃で３時間攪拌し、その時点で易流動性のスラリーが生じた。水（３００ｍＬ）を１５分間にわたり加え、このようにして得られた混合物を２５℃で一晩攪拌した。次いで混合物を濾過し、濾過ケーキを水（１００ｍＬ）で洗浄し、約２時間空気乾燥し、次いで真空下にて室温で４８時間乾燥し、結晶質のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（１２．５ｇ、９９．６％純度）を得た。この結晶塩を形態ＩＩであると決定した。
【０１８２】
（実施例９）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］−ピペリジン−４−イルエステル
ステップＡ  ４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルアミン
ジクロロメタンとメタノール（４００ｍＬ）との１：１混合物中の２，５−ジメチルアニリン（２０ｇ、１６５ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸水素ナトリウム（２０．８ｇ、２５０ｍｍｏｌ）およびジクロロヨウ素酸テトラメチルアンモニウム（Ｉ）（４４．７ｇ、１６５ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を室温で１時間攪拌し、次いで水（５００ｍＬ）を加えた。有機層を取り出し、５％水性チオ硫酸ナトリウム（５００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、真空下にて濃縮し、４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルアミン（３９．６ｇ、９８％収率）を得た。生成物をさらに精製せずに使用した。
【０１８３】
ステップＢ  Ｎ−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド
４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルアミン（３７．２ｇ、１５１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５００ｍＬ）溶液に、炭酸水素ナトリウム（２５．４ｇ、３０２ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を０℃に冷却し、塩化アクリオリル（１２．３ｍＬ、１５１ｍｍｏｌ）を２５分にわたってゆっくり加えた。このようにして得られた混合物を室温で一晩攪拌し、次いで濾過した。濾液の容量を約１００ｍＬまでに減らし、沈殿物が形成された。沈殿物を濾過、乾燥し、水（１Ｌ）で洗浄し、次いで再び乾燥し、Ｎ−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（４２．９８ｇ、９５％純度、９０％収率）を得た。生成物をさらに精製せずに使用した。
【０１８４】
ステップＣ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）−エチル］ピペリジン−４−イルエステル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとイソプロパノール（７００ｍＬ）との６：１ｖ／ｖ混合物中のＮ−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニル）アクリルアミド（３２．２ｇ、１０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（３６．３ｇ、１２３ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を５０℃で２４時間、次いで８０℃で２４時間加熱した。次いで反応混合物を室温に冷却し、真空下にて濃縮した。残渣をジクロロメタン（１Ｌ）に溶解し、この溶液を１Ｎの塩酸水溶液（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。エタノール（４００ｍＬ）を加え、このようにして得られた混合物を真空下にて約４００ｍＬの容量まで濃縮し、その時点で沈殿物が形成された。沈殿物を濾過、乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５９．６ｇ、８４％純度、７９％収率）を得た。m/z: [M+H+] C29H32IN3O3計算値598.49; 実測値598.5。
【０１８５】
ステップＤ  ４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチル安息香酸メチルエステル
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとメタノール（６００ｍＬ）との５：１ｖ／ｖ混合物中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヨード−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５６ｇ、９４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（４９ｍＬ、２８１ｍｍｏｌ）、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン（３．９ｇ、９．４ｍｍｏｌ）および酢酸パラジウム（ＩＩ）（２．１ｇ、９．４ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を一酸化炭素でパージし、次いで一酸化炭素雰囲気下にて７０℃〜８０℃で一晩攪拌した（バルーン圧力）。反応混合物を真空下にて濃縮し、残渣をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解した。この混合物を１Ｎの塩酸水溶液（５００ｍＬ）、水（５００ｍＬ）、次いでブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、次いで真空下にて濃縮した。残渣をエタノールと混合し（エタノール対残渣、約５：１ｖ／ｗ）、すべての固形物が溶解するまで混合物を加熱した。この溶液を室温にゆっくりと冷却し、このようにして得られた沈殿物を濾過によって単離し、４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチル安息香酸メチルエステル（４７．３ｇ、９７％純度、９２％収率）を得た。m/z: [M+H+] C31H35N3O5計算値530.63; 実測値530.4。
【０１８６】
ステップＥ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチル−フェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
４−｛３−［４−（ビフェニル−２−イルカルバモイルオキシ）ピペリジン−１−イル］プロピオニルアミノ｝−２，５−ジメチル安息香酸メチルエステル（４９．８ｇ、９３．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、水素化アルミニウムリチウム（１０．７ｇ、２８１．７ｍｍｏｌ）を１部ずつ加えた（１０×１．０７ｇ）。このようにして得られた混合物を３時間攪拌し、次いで水（１０．７ｍＬ）、次いで１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１０．７ｍＬ）およびさらなる水（３２．１ｍＬ）を加えた。この混合物を一晩攪拌し、次いで濾過した。有機層を真空下にて濃縮し、残渣を酢酸エチルと混合した（酢酸エチル対残渣、約５：１ｖ／ｗ）。この混合物をすべての固形物が溶解するまで加熱し、次いで溶液を室温に冷却した。このようにして得られた沈殿物を濾過し、乾燥し、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（２４．６ｇ、９５％純度、４７．５％収率）を得た。この材料をさらに精製せずに使用した。m/z: [M+H+] C30H35N3O4計算値502.62; 実測値502.5。
【０１８７】
ステップＦ  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ヒドロキシメチル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（５．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）およびジメチルスルホキシド（５．６ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を加えた。このようにして得られた混合物を０℃に冷却し、三酸化硫黄ピリジン錯体（８．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で１時間攪拌し、次いで水（３００ｍＬ）を加えた。有機層を取り出し、１Ｎの塩酸水溶液（３００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で洗浄した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−ホルミル−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステルを含有するこのようにして得られた溶液を、さらに精製せずに使用した。m/z: [M+H+] C30H33N3O4計算値500.60; 実測値500.4。
【０１８８】
（実施例１０）
ヒトＭ１、Ｍ２、Ｍ３およびＭ４ムスカリン受容体を発現している細胞からの細胞培養および膜調製
クローン化されたヒトｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３およびｈＭ４ムスカリン受容体サブタイプを各々安定的に発現しているＣＨＯ細胞株を、１０％ＦＢＳおよびジェネテシン２５０μｇ／ｍＬを添加したＨａｍｓ  Ｆ−１２培地中でほぼ集密的にまで増殖させた。細胞を５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター中で増殖させ、ｄＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡによって浮遊させた。細胞を５分の６５０×ｇでの遠心分離によって回収し、細胞ペレットを−８０℃で凍結保存するか、または使用するために膜を直ちに調製した。膜調製のために、細胞ペレットを溶解緩衝液中で再懸濁させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−２１００組織破壊器（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ社；２０秒×２破裂）でホモジナイズした。粗膜を、４０，０００×ｇで４℃にて１５分間遠心分離した。次いで、膜ペレットを再懸濁緩衝液で再懸濁させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破壊器で再びホモジナイズした。Lowryら、１９５１年、Journal of Biochemistry、１９３号、２６５頁に記載されている方法によって膜懸濁液のタンパク質濃度を決定した。すべての膜を−８０℃にて一定分量で凍結保存するか、または直ちに使用した。一定分量の調製したｈＭ５受容体膜を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）から直接購入し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１８９】
（実施例１１）
ムスカリン受容体についての放射性リガンド結合アッセイ
クローン化されたムスカリン受容体についての放射性リガンド結合アッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて１００μＬの総アッセイ容量で行った。ｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、ｈＭ４またはｈＭ５ムスカリン性サブタイプのいずれかを安定的に発現しているＣＨＯ細胞膜を、下記の特定の標的タンパク質濃度（μｇ／ウェル）にアッセイ緩衝液で希釈した。同様のシグナル（ｃｐｍ）を得るために、ｈＭ１では１０μｇ、ｈＭ２では１０〜１５μｇ、ｈＭ３では１０〜２０μｇ、ｈＭ４では１０〜２０μｇ、およびｈＭ５では１０〜１２μｇであった。アッセイプレートへの添加の前に、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破壊器を使用して膜を短時間ホモジナイズした（１０秒）。Ｌ−［Ｎ−メチル−３Ｈ］スコポラミンメチルクロリド（［３Ｈ］−ＮＭＳ）（ＴＲＫ６６６、８４．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を０．００１ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の濃度で使用して、放射性リガンドのＫＤ値を決定するための飽和結合研究を行った。１ｎＭおよび１１の異なる試験化合物濃度の［３Ｈ］−ＮＭＳを用いて、試験化合物のＫｉ値を決定するための置換アッセイを行った。最初に試験化合物を、希釈用緩衝液中で４００μＭの濃度まで溶解し、次いで希釈用緩衝液（５×）で１０ｐＭ〜１００μＭの範囲の最終濃度まで段階希釈した。添加順序およびアッセイプレートの容量は、下記の通りであった。放射性リガンド２５μＬ、希釈した試験化合物２５μＬ、および膜５０μＬ。アッセイプレートを３７℃で６０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ中で前処理したＧＦ／Ｂガラス繊維フィルタプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で急速に濾過することによって結合反応を終了させた。フィルタプレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で３度すすぎ、結合していない放射能を除去した。次いで、プレートを空気乾燥し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション流体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）５０μＬを各ウェルに加えた。次いで、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で計数した。結合データを、１サイト競合モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で非線形回帰分析によって分析した。試験化合物についてのＫｉ値を、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng Y；Prusoff WH.（１９７３年）Biochemical Pharmacology、２２（２３）号：３０９９〜１０８頁）を使用して、放射性リガンドの観察されたＩＣ５０値およびＫＤ値から計算した。Ｋｉ値をｐＫｉ値に変換し、相乗平均および９５％信頼区間を決定した。次いで、これらの要約統計量をデータ報告のためにＫｉ値に戻した。
【０１９０】
このアッセイにおいて、より低いＫｉ値は、試験化合物が試験した受容体に対して高い結合親和性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５ムスカリン受容体サブタイプについて１０ｎＭ未満のＫｉ値を有することが見出された。
【０１９１】
（実施例１２）
ヒトβ１、β２またはβ３アドレナリン受容体を発現している細胞からの細胞培養および膜調製
クローン化されたヒトβ１およびβ２アドレナリン受容体を安定的に発現しているヒト胎児腎（ＨＥＫ−２９３）細胞株、またはクローン化されたヒトβ３アドレナリン受容体を安定的に発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、ジェネテシン５００μｇ／ｍＬの存在下にてＤＭＥＭまたは１０％ＦＢＳを含むＨａｍｓ  Ｆ−１２培地中で、ほぼ集密的にまで増殖させた。細胞単層を、ＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡで浮遊させた。細胞を、１，０００ｒｐｍの遠心分離によってペレットにし、細胞ペレットを−８０℃で凍結保存するか、または使用するために膜を直ちに調製した。β１およびβ２受容体を発現している膜の調製のために、細胞ペレットを、溶解緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、４℃）で再懸濁し、氷上のタイトフィット型のＤｏｕｎｃｅガラスホモジナイザー（３０ストローク）を使用してホモジナイズした。よりプロテアーゼ感受性であるβ３受容体を発現している膜については、細胞ペレットを、５０ｍＬ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）当たり１錠の「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ」を添加した溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。ホモジネートを２０，０００×ｇで遠心分離し、このようにして得られたペレットを、上記のように再懸濁および遠心分離によって溶解緩衝液で一度洗浄した。次いで、最終的なペレットを、氷冷の結合アッセイ緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁した。Lowryら、１９５１年、Journal of Biological Chemistry、１９３号、２６５頁；およびBradford、Analytical Biochemistry、１９７６年、７２号、２４８〜５４頁に記載されている方法によって、膜懸濁液のタンパク質濃度を決定した。すべての膜を一定分量で−８０℃にて凍結保存するか、または直ちに使用した。
【０１９２】
（実施例１３）
ヒトβ１、β２およびβ３アドレナリン受容体についての放射性リガンド結合アッセイ
アッセイ緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４、２５℃）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ＢＳＡ）中にヒトβ１、β２またはβ３アドレナリン受容体を含有する膜タンパク質１０〜１５μｇを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート中で１００μＬの総アッセイ容量で結合アッセイを行った。β１およびβ２受容体について［３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（ＮＥＴ−７２０、１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、および０．０１ｎＭ〜２０ｎＭの範囲の１０または１１の異なる濃度での［１２５Ｉ］−（−）−ヨードシアノピンドロール（ＮＥＸ−１８９、２２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、放射性リガンドのＫｄ値を決定するための飽和結合研究を行った。１０ｐＭ〜１０μＭの範囲の１０または１１の異なる濃度の試験化合物について、１ｎＭの［３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール、および０．５ｎＭの［１２５Ｉ］−（−）−ヨードシアノピンドロールを用いて、試験化合物のＫｉ値を決定するための置換アッセイを行った。非特異的結合を、１０μＭのプロプラノロールの存在下にて決定した。アッセイを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、０．３％ポリエチレンイミンで予浸した、β１およびβ２受容体のためのＧＦ／Ｂ、またはβ３受容体のためのＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタプレート（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で急激に濾過することによって結合反応を終了させた。フィルタプレートを濾過緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４、４℃）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ）で３度洗浄し、結合していない放射能を除去した。次いで、プレートを乾燥し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体シンチレーション流体（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）５０μＬを加え、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）でプレートを計数した。結合データを、１サイト競合のための３パラメーターモデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて非線形回帰分析によって分析した。１０μＭのプロプラノロールの存在下にて決定するように、曲線最小を非特異的結合についての値に固定した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng Y、およびPrusoff WH.、Biochemical Pharmacology、１９７３年、２２号、２３号、３０９９〜１０８頁）を使用して、放射性リガンドの観察されたＩＣ５０値およびＫｄ値から、試験化合物についてのＫｉ値を計算した。
【０１９３】
このアッセイにおいて、より低いＫｉ値は、試験化合物が、試験した受容体に対して高い結合親和性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）は、β２アドレナリン受容体については１０ｎＭ未満のＫｉ値、ならびにβ１およびβ３アドレナリン受容体については１０００ｎＭ超のＫｉ値を有することが見出された。
【０１９４】
（実施例１４）
ムスカリン受容体サブタイプに対する拮抗作用の機能アッセイ
アッセイＡ  ｃＡＭＰ蓄積のアゴニスト媒介性阻害の遮断
このアッセイにおいて、ｈＭ２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞における、試験化合物がフォルスコリン媒介性ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害を遮断する能力を測定することによって、ｈＭ２受容体に対するアンタゴニストとしての試験化合物の機能的有効性を決定した。メーカーの指示に従って、１２５Ｉ−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４Ｂ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いたＦｌａｓｈｐｌａｔｅ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ラジオイムノアッセイフォーマットでｃＡＭＰアッセイを行った。上記の細胞培養および膜調製の節で記載したように、細胞をｄＰＢＳで一度すすぎ、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）で浮遊させた。離れた細胞を、ｄＰＢＳ５０ｍＬ中で６５０×ｇの遠心分離によって５分間２度洗浄した。次いで、細胞ペレットをｄＰＢＳ１０ｍＬ中で再懸濁させ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１  Ｄｕａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で細胞を計数した。細胞を６５０×ｇで再び５分間遠心分離し、１．６×１０６〜２．８×１０６細胞／ｍＬのアッセイ濃度まで刺激緩衝液中で再懸濁した。
【０１９５】
試験化合物を最初に、希釈用緩衝液（ＢＳＡ（０．１％）１ｍｇ／ｍＬを添加したｄＰＢＳ）で４００μＭの濃度まで溶解し、次いで希釈用緩衝液で１００μＭ〜０．１ｎＭの範囲の最終的なモル濃度まで段階希釈した。オキソトレモリンを同様に希釈した。
【０１９６】
アデニル酸シクラーゼ活性のオキソトレモリン阻害を測定するために、フォルスコリン２５μＬ（ｄＰＢＳに希釈して２５μＭの最終濃度）、希釈したオキソトレモリン２５μＬ、および細胞５０μＬを、アゴニストアッセイウェルに加えた。オキソトレモリン阻害性アデニル酸シクラーゼ活性を遮断する試験化合物の能力を測定するために、フォルスコリンおよびオキソトレモリン２５μＬ（各々２５μＭおよび５μＭの最終濃度、ｄＰＢＳ中に希釈）、希釈した試験化合物２５μＬ、および細胞５０μＬを、残りのアッセイウェルに加えた。
【０１９７】
反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、氷冷の検出緩衝液１００μＬを加えることによって反応を停止した。プレートを密封し、室温で一晩インキュベートし、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）で翌朝計数した。メーカーの利用者マニュアルに記載されているように、試料およびｃＡＭＰ標準物質について観察した計数に基づいて、生成したｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌ／ウェル）を計算した。非線形回帰（１サイト競合式）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた非線形回帰分析によってデータを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を使用して、各々、ＫＤおよび［Ｌ］として、オキソトレモリン濃度反応曲線のＥＣ５０とオキソトレモリンアッセイ濃度とを使用して、Ｋｏｂｓを計算した。
【０１９８】
このアッセイにおいて、より低いＫｏｂｓ値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）は、ｈＭ２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞における、フォルスコリン媒介性ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害の遮断について、約１０ｎＭ未満のＫｏｂｓ値を有することが見出された。
【０１９９】
アッセイＢ  アゴニスト媒介性［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の遮断
この機能アッセイにおいて、ｈＭ２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞において、オキソトレモリンによって刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を遮断する試験化合物の能力を測定することによって、試験化合物のｈＭ２受容体のアンタゴニストとしての機能的有効性を決定した。
【０２００】
使用時に、凍結した膜を解凍し、次いでウェル毎にタンパク質５〜１０μｇの最終的標的組織濃度でアッセイ緩衝液中に希釈した。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−２１００組織破壊器を使用して膜を短時間ホモジナイズして、次いでアッセイプレートに加えた。
【０２０１】
各実験において、アゴニストであるオキソトレモリンによる［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の刺激に対するＥＣ９０値（９０％最大反応のための有効濃度）を決定した。
【０２０２】
オキソトレモリンによって刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を阻害する試験化合物の能力を決定するために、下記を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．４ｎＭ）を含むアッセイ緩衝液２５μＬ、オキソトレモリン（ＥＣ９０）２５μＬおよびＧＤＰ（３ｕＭ）、希釈した試験化合物２５μＬおよびｈＭ２受容体を発現しているＣＨＯ細胞膜２５μＬ。次いで、アッセイプレートを３７℃で６０分間インキュベートした。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９６ウェルハーベスターを使用して、アッセイプレートを、１％ＢＳＡで前処理したＧＦ／Ｂフィルターで濾過した。プレートを氷冷の洗浄緩衝液で３秒間３度洗浄し、次いで空気乾燥または真空乾燥した。Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０シンチレーション液体（５０μＬ）を各ウェルに加え、各プレートを密封し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で放射能を計数した。非線形回帰（１サイト競合式）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた非線形回帰分析によって、データを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を使用して、各々、ＫＤおよび［Ｌ］、リガンド濃度として、試験化合物の濃度反応曲線のＩＣ５０値とアッセイにおけるオキソトレモリン濃度とを使用してＫｏｂｓを計算した。
【０２０３】
このアッセイにおいてより低いＫｏｂｓ値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）は、ｈＭ２受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるオキソトレモリンによって刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の遮断について、約１０ｎＭ未満のＫｏｂｓ値を有することが見出された。
【０２０４】
アッセイＣ  ＦＬＩＰＲアッセイを介したアゴニスト媒介性カルシウム放出の遮断
この機能アッセイにおいて、試験化合物が細胞内カルシウムのアゴニスト媒介性増加を阻害する能力を測定することによって、ｈＭ１、ｈＭ３およびｃＭ５受容体のアンタゴニストとしての試験化合物の機能的有効性を決定した。
【０２０５】
アッセイを行う前夜に、受容体を安定的に発現しているＣＨＯ細胞を、９６ウェルＦＬＩＰＲプレートに播いた。Ｃｅｌｌｗａｓｈ（ＭＴＸ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、ＦＬＩＰＲ緩衝液（カルシウムおよびマグネシウムを含有しないハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭの塩化カルシウム、２．５ｍＭのプロベネシド）で、播いた細胞を２度洗浄し、増殖培地を除去した。洗浄後、各ウェルはＦＬＩＰＲ緩衝液５０μＬを含有した。次いで細胞を、５０μＬ／ウェルの４μＭのＦＬＵＯ−４ＡＭ（２×溶液を作製した）と共に、５％二酸化炭素下にて３７℃で４０分間インキュベートした。色素インキュベーション期間に続いて、細胞をＦＬＩＰＲ緩衝液で２度洗浄し、各ウェル中に５０μＬの最終容量とした。
【０２０６】
オキソトレモリンについての細胞内Ｃａ２＋放出の用量依存的な刺激を決定し、それによって試験化合物をＥＣ９０濃度でのオキソトレモリン刺激に対して測定できた。細胞を最初に化合物希釈用緩衝液と共に２０分間インキュベートし、次いでオキソトレモリンを加えた。式ＥＣＦ＝（（Ｆ／１００−Ｆ）＾１／Ｈ）＊ＥＣ５０と関連した下記のＦＬＩＰＲ測定およびデータ整理の節において詳しく述べる方法に従って、オキソトレモリンについてのＥＣ９０値を作成した。ＥＣ９０濃度のオキソトレモリンを試験アッセイプレートの各ウェルに加えて、３×ＥＣＦのオキソトレモリン濃度を、刺激プレートにおいて調製した。
【０２０７】
ＦＬＩＰＲのために使用したパラメーターは、０．４秒の曝露長さ、０．５ワットのレーザー強度、４８８ｎｍの励起波長、および５５０ｎｍの放射波長であった。オキソトレモリンを加える前の１０秒間の蛍光の変化を測定することによってベースラインを決定した。オキソトレモリン刺激に続いて、ＦＬＩＰＲによって１．５分間０．５〜１秒毎に蛍光の変化を連続的に測定して、最大蛍光変化を得た。
【０２０８】
蛍光変化を、各ウェルについて最大蛍光マイナスベースライン蛍光として表した。シグモイド用量反応についてのビルトインモデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、非線形回帰による試験化合物濃度の対数に対して生データを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng & Prusoff、１９７３年）に従って、ＫＤとしてオキソトレモリンＥＣ５０値およびリガンド濃度についてのオキソトレモリンＥＣ９０を使用して、ＰｒｉｓｍによってアンタゴニストＫｏｂｓ値を決定した。
【０２０９】
このアッセイにおいて、より低いＫｏｂｓ値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）は、ｈＭ１、ｈＭ３およびｃＭ５受容体を安定的に発現しているＣＨＯ細胞におけるアゴニスト媒介性カルシウム放出の遮断について、約１０ｎＭ未満のＫｏｂｓ値を有することが見出された。
【０２１０】
（実施例１５）
ヒトβ１、β２またはβ３アドレナリン受容体を非相同的に発現しているＨＥＫ−２９３およびＣＨＯ細胞株における細胞全体ｃＡＭＰフラッシュプレートアッセイ
メーカーの指示に従って、［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いたＦｌａｓｈｐｌａｔｅ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ラジオイムノアッセイフォーマットでｃＡＭＰアッセイを行った。β１およびβ２受容体アゴニストの有効性（ＥＣ５０）の決定のために、クローン化されたヒトβ１およびβ２受容体を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３細胞株を、１０％ＦＢＳおよびジェネテシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ中でほぼ集密的にまで増殖させた。β３受容体アゴニストの有効性（ＥＣ５０）の決定のために、クローン化されたヒトまたはβ３アドレナリン受容体を安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞株を、１０％ＦＢＳおよびジェネテシン（２５０μｇ／ｍＬ）を添加したＨａｍｓ  Ｆ−１２培地中でほぼ集密的にまで増殖させた。細胞をＰＢＳですすぎ、２ｍＭのＥＤＴＡまたはトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）を含有するｄＰＢＳ（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含有しないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で細胞を引き剥がした。Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンターで細胞を計数した後、細胞を１，０００ｒｐｍの遠心分離によってペレットにし、室温まで予熱したＩＢＭＸ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｋｉｔ）を含有する刺激緩衝液中に１．６×１０６〜２．８×１０６細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁した。このアッセイにおいて１ウェル毎に約４０，０００〜８０，０００細胞を使用した。試験化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ−２０００中に０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈し、１００μＭ〜１ｐＭの範囲の１１の異なる濃度で試験した。反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を含有する冷たい検出緩衝液１００μＬを加えることによって反応を停止させた。生成したｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌ／ウェル）を、メーカーの利用者マニュアルに記載されるように、試料およびｃＡＭＰ標準物質について観察された計数に基づいて計算した。シグモイド式によるＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いた非線形回帰分析によって、データを分析した。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Cheng YおよびPrusoff WH.、Biochemical Pharmacology、１９７３年、２２号、２３号、３０９９〜１０８頁）を使用して、ＥＣ５０値を計算した。
【０２１１】
このアッセイにおいて、より低いＥＣ５０値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）は、β２アドレナリン受容体については約１０ｎＭ未満のＥＣ５０値、β１アドレナリン受容体については約３０ｎＭのＥＣ５０値、およびβ３アドレナリン受容体については７００ｎＭ超のＥＣ５０値を有することが見出された。
【０２１２】
（実施例１６）
ヒトβ２アドレナリン受容体を内因性発現する肺上皮細胞株の細胞全体のｃＡＭＰフラッシュプレートアッセイ
このアッセイにおいて、内因性レベルのβ２アドレナリン受容体を発現している細胞株を使用して、試験化合物のアゴニストの有効性および固有活性を決定した。ヒト肺上皮細胞株（ＢＥＡＳ−２Ｂ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６０９、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（January Bら、British Journal of Pharmacology、１９９８年、１２３、４、７０１〜１１頁）からの細胞を、完全無血清培地（エピネフリンおよびレチノイン酸を含有するＬＨＣ−９培地、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）中で７５〜９０％密集度まで増殖した。アッセイの前日に、培地を、ＬＨＣ−８（エピネフリンまたはレチノイン酸を含有せず、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）に切り換えた。メーカーの指示に従って［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰ（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いたＦｌａｓｈｐｌａｔｅ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ラジオイムノアッセイフォーマットでｃＡＭＰアッセイを行った。
【０２１３】
アッセイの日に、細胞をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の５ｍＭのＥＤＴＡでかき落とすことによって浮遊させ、計数した。１，０００ｒｐｍの遠心分離によって細胞をペレットにし、６００，０００細胞／ｍＬの最終濃度で事前に３７℃に温めた刺激緩衝液中で再懸濁した。このアッセイにおいて、細胞を１００，０００〜１２０，０００細胞／ウェルの最終濃度で使用した。試験化合物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ−２０００中のアッセイ緩衝液（７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４、２５℃）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ＢＳＡ）中に段階希釈した。試験化合物を、アッセイにおいて１０μＭ〜１０ｐＭの範囲の１１の異なる濃度で試験した。反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、氷冷の検出緩衝液１００μＬを加えることによって反応を停止した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートし、Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で翌朝計数した。メーカーの利用者マニュアルに記載されるように、試料およびｃＡＭＰ標準物質について観察した計数に基づいて、反応物ｍＬ当たりの生成したｃＡＭＰの量を計算した。データを、シグモイド用量反応についての４−パラメーターモデルを使用したＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で非線形回帰分析によって分析した。
【０２１４】
このアッセイにおいて、より低いＥＣ５０値は、試験化合物が、試験した受容体においてより高い機能活性を有することを示す。ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニル−カルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（化合物ＩＩａ）は、完全β２アゴニストであるイソプロテレノール（１．０）と比較して０．３超の固有活性値と共に、１０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有することが見出された。
【０２１５】
（実施例１７）
気管支保護の有効性および持続時間を決定するためのアイントホーフェンアッセイ
このアッセイにおいて、モルモットを使用して試験化合物の気管支保護の有効性および持続時間を決定した。このアッセイは、Einthoven（１８９２年）Pfugers Arch. ５１号：３６７〜４４５頁；およびMohammedら（２０００年）Pulm Pharmacol Ther. １３（６）号：２８７〜９２頁に記載されている手順から派生した。このアッセイにおいて、通気圧の変化は気道抵抗の代替的測定値としての役割を果たす。試験化合物による前処理に続いて、プロプラノロールの存在下にて静脈内メタコリンに対する気管支収縮の用量反応曲線を使用してムスカリンアンタゴニストの有効性を決定した。同様に、ヒスタミンを使用してβ２アゴニストの気管支保護の有効性を決定した。プロプラノロールの非存在下にてメタコリンを使用して、併せた気管支保護の有効性を決定した。
【０２１６】
２５０〜４００ｇの体重の雄Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（Ｈａｒｌａｎ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してアッセイを行った。投与溶液５ｍＬを使用して全身曝露投与チャンバー（Ｒ＋Ｓ  Ｍｏｌｄｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）において、試験化合物またはビヒクル（すなわち、滅菌水）を、１０分にわたって吸入（ＩＨ）により投与した。２２ｐｓｉの圧力のＢｉｏｂｌｅｎｄ（５％ＣＯ２；２１％Ｏ２；および７４％Ｎ２の混合物）によって推進されるＬＣ  Ｓｔａｒ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｓｅｔ（モデル２２Ｆ５１、ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社、Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ、ＶＡ）から生じるエアロゾルに、動物を曝露させた。吸入による投与後様々な時点で肺機能を評価した。
【０２１７】
アッセイの開始前７５分に、モルモットをケタミン（４３．７ｍｇ／ｋｇ）キシラジン（３．５ｍｇ／ｋｇ）／アセプロマジン（１．０５ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋内（ＩＭ）注射で麻酔した。この混合物の追加用量（開始用量の５０％）を必要に応じて投与した。頸静脈および頸動脈を分離し、生理食塩水を充填したポリエチレンカテーテル（各々ｍｉｃｒｏ−ｒｅｎａｔｈａｎｅおよびＰＥ−５０、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）でカニューレ処置した。頸動脈を圧力トランスデューサーに接続し、血圧測定を可能とし、メタコリンまたはヒスタミンの静脈注射のために頸静脈カニューレを使用した。次いで、気管を切開して取り除き、１４Ｇ針（＃ＮＥ−０１４、Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ社、Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ、ＦＬ）でカニューレ処置した。カニューレ挿入が完了すると、２．５ｍＬの体積を超えない１ｍＬ／１００ｇ体重のストローク体積、毎分１００ストロークの速度で設定した人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、ＭＡ）を使用して、モルモットに人工呼吸を施した。Ｂｉｏｐａｃ（ＴＳＤ１３７Ｃ）前置増幅器に接続したＢｉｏｐａｃトランスデューサーを使用して、気管カニューレ内の通気圧（ＶＰ）を測定した。加温パッドを使用して体温を３７℃に維持した。データ収集の開始前に、ペントバルビタール（２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）投与し、自発呼吸を抑制し、安定的なベースラインを得た。Ｂｉｏｐａｃ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）データ収集インターフェースでＶＰの変化を記録した。ベースライン値を少なくとも５分間収集し、その後モルモットを２倍増の用量の気管支収縮剤（メタコリンまたはヒスタミン）によってＩＶで非累積的に攻撃誘発した。メタコリンを気管支収縮剤として使用した場合、動物をプロプラノロール（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）で前処理し、試験化合物の抗ムスカリン作用を分離させた。メタコリンまたはヒスタミンに対する用量反応曲線の構築の３０分前にプロプラノロールを投与した。Ａｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅデータ収集ソフトウェア（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、ＶＰの変化を記録した。研究の完了後、動物を安楽死させた。
【０２１８】
ＶＰの変化を水のｃｍで測定した。ＶＰの変化（ｃｍ  Ｈ２Ｏ）＝ピーク圧力（気管支収縮性攻撃誘発後）−ピークベースライン圧力である。メタコリンまたはヒスタミンに対する用量反応曲線を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン３．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、４つのパラメーターロジスティック式に当てはめた。下記の式を使用した。
【０２１９】
【化２２−１】
2009541209.tif 000014
式中、Ｘは用量の対数であり、Ｙは反応である。ＹはＭｉｎで開始し、Ｓ字形で漸近的にＭａｘに達する。
【０２２０】
準最大用量のメタコリンまたはヒスタミンに対する気管支収縮性反応の阻害率を、下記の式を使用して試験化合物の各用量で計算した。反応の阻害％＝１００−（（ピーク圧力（気管支収縮性攻撃誘発後、処理）−ピークベースライン圧力（処理）＊１００％／（ピーク圧力（気管支収縮性攻撃誘発後、水）−ピークベースライン圧力（水）×１００）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅからの４つのパラメーターロジスティック式を使用して阻害曲線を当てはめた。ＩＤ５０（気管支収縮性反応の５０％阻害を生じるために必要な用量）およびＥｍａｘ（最大阻害）もまた、必要に応じて推定した。
【０２２１】
試験化合物の吸入後の異なる時点での気管支保護の程度を使用して、薬力学的半減期（ＰＤ  Ｔ１／２）を推定した。１相指数関数的減衰式（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン４．００）を使用した非線形回帰当てはめを使用してＰＤ  Ｔ１／２を決定した。Ｙ＝スパン＊ｅｘｐ（−Ｋ＊Ｘ）＋プラトー；スパン＋プラトーで開始し、速度定数Ｋでのプラトーへ減衰する。ＰＤ  Ｔ１／２＝０．６９／Ｋ。プラトーを０に制限した。
【０２２２】
投与後１．５時間で、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（４−｛［（Ｒ）−２−（３−ホルミルアミノ−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシエチルアミノ］メチル｝−２，５−ジメチルフェニルカルバモイル）エチル］ピペリジン−４−イルエステル（ＩＩａ）は、メタコリンによって誘発される気管支収縮およびヒスタミンによって誘発される気管支収縮の両方について約５０μｇ／ｍＬ未満のＩＤ５０を有することが見出された。
【０２２３】
さらに、この化合物は、単一の準最大用量（１００μｇ／ｍＬ）として投与された場合、約７２時間までの有意な気管支保護を生じた。このアッセイにおいて、サルメテロール（３μｇ／ｍＬ）（β２アドレナリン受容体アゴニスト）は、６〜１４時間有意な気管支保護を示し、チオトロピウム（１０μｇ／ｍＬ）（ムスカリン受容体アンタゴニスト）は、７２時間を超えて有意な気管支保護を示した。
【０２２４】
（実施例１８）
気管支保護の有効性および持続時間を決定するためのプレチスモグラフモルモットアッセイ
このアッセイにおいて、モルモットアッセイを使用して試験化合物の気管支保護の有効性および持続時間を決定した。
【０２２５】
２５０〜３５０ｇの体重の６匹の雄モルモット（Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ（ＨｓｄＰｏｃ：ＤＨ）Ｈａｒｌａｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の群を、ケージカードで個々に識別した。研究の間、動物に食物および水を自由に取らせた。試験化合物を、全身曝露投与チャンバー（Ｒ＆Ｓ  Ｍｏｌｄｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）中で吸入によって１０分にわたって投与した。エアロゾルが中央の多岐管から６つの個々のチャンバーに同時に送達されるように投与チャンバーを配置した。モルモットを、試験化合物またはビヒクル（ＷＦＩ）のエアロゾルに曝露した。ＬＣ  Ｓｔａｒ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｓｅｔ（モデル２２Ｆ５１、ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社、Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ、ＶＡ）を使用して、２２ｐｓｉの圧力で気体混合物（ＣＯ２＝５％、Ｏ２＝２１％およびＮ２＝７４％）によって推進されるエアロゾルを水溶液から発生させた。この作業圧力でネブライザーを通る気体流は、毎分約３Ｌであった。発生したエアロゾルを陽圧によってチャンバーに送った。エアロゾル化溶液の送達の間に非希釈空気を使用した。１０分の噴霧の間に、約１．８ｍＬの溶液を噴霧した。充填したネブライザーの噴霧前および噴霧後の重量を比較することによって、この値を重量測定法で測定した。
【０２２６】
吸入によって投与した試験化合物の気管支保護効果を、投与後１．５時間、２４時間、４８時間および７２時間で全身プレチスモグラフィーを使用して評価した。肺の評価の開始の４５分前に、各モルモットを、ケタミン（４３．７５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（３．５０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（１．０５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔した。手術部位を剪毛し、７０％アルコールで清浄にし、首の腹側面の２〜３ｃｍ正中線切開を行った。頸静脈を分離し、生理食塩水を充填したポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）でカニューレ処置し、生理食塩水中のアセチルコリンまたはヒスタミンの静脈内注入を可能とした。次いで、気管を切開して取り除き、１４ＧのＴｅｆｌｏｎチューブ（＃ＮＥ−０１４、Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ社、Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ、ＦＬ）でカニューレ処置した。必要であれば、麻酔混合物のさらなる筋肉内注射によって麻酔を維持した。麻酔の深さをモニターし、動物が足をつまむことに反応する場合、または呼吸数が毎分１００呼吸を超える場合は調節した。
【０２２７】
カニューレ挿入を完了すると、動物をプレチスモグラフ（＃ＰＬＹ３１１４、Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、Ｓｈａｒｏｎ、ＣＴ）に入れ、食道圧カニューレ（ＰＥ−１６０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）を挿入して、肺駆動圧を測定した。Ｔｅｆｌｏｎ気管チューブをプレチスモグラフの開口に取り付け、モルモットがチャンバーの外側からの大気を吸うことを可能にした。次いで、チャンバーを密封した。加熱灯を使用して体温を維持し、１０ｍＬのキャリブレーションシリンジ（＃５５２０シリーズ、Ｈａｎｓ  Ｒｕｄｏｌｐｈ社、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）を使用して、モルモットの肺を４ｍＬの空気で３回膨張させ、下気道が崩壊しないこと、および動物が過換気にならないことを確認した。
【０２２８】
ベースラインがコンプライアンスについて０．３〜０．９ｍＬ／ｃｍ  Ｈ２Ｏの範囲であり、抵抗性について０．１〜０．１９９ｃｍ  Ｈ２Ｏ／ｍＬ／秒の範囲であることを決定した後、肺の評価を開始した。肺の値の収集および誘導のために、Ｂｕｘｃｏ肺測定コンピュータプログラムを使用した。このプログラムを開始させることにより、実験プロトコルおよびデータ収集が開始された。各呼吸でプレチスモグラフ内に生じる経時的な体積の変化を、Ｂｕｘｃｏ圧力トランスデューサーによって測定した。ある期間にわたるこのシグナルを統合することによって、流れの測定を各呼吸について計算した。Ｓｅｎｓｙｍ圧力トランスデューサー（ＴＲＤ４１００）を使用して収集したこのシグナルおよび肺駆動圧の変化を、Ｂｕｘｃｏ（ＭＡＸ２２７０）前置増幅器を介してデータ収集インターフェース（ＳＦＴ３４００およびＳＦＴ３８１３）に接続した。すべての他の肺のパラメーターを、これらの２種の入力から導いた。
【０２２９】
ベースライン値を５分間収集し、その後モルモットをアセチルコリンまたはヒスタミンで攻撃誘発した。試験化合物のムスカリンアンタゴニスト効果を評価する場合、アセチルコリンによる攻撃誘発の１５分前に、プロパノロール（５ｍｇ／Ｋｇ、ｉｖ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を投与した。アセチルコリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、下記の用量および実験の開始からの所定の時間でシリンジポンプ（ｓｐ２１０ｉｗ、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）から静脈内に１分間注入した。５分で１．９μｇ／分、１０分で３．８μｇ／分、１５分で７．５μｇ／分、２０分で１５．０μｇ／分、２５分で３０μｇ／分および３０分で６０μｇ／分。あるいは、プロパノロールで前処理せずにアセチルコリン攻撃誘発モデルで試験化合物の気管支保護効果を評価した。
【０２３０】
試験化合物のβ２アドレナリン受容体アゴニスト効果を評価する場合、下記の用量および実験の開始からの所定の時間でシリンジポンプからヒスタミン（２５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、静脈内に１分間注入した。５分で０．５μｇ／分、１０分で０．９μｇ／分、１５分で１．９μｇ／分、２０分で３．８μｇ／分、２５分で７．５μｇ／分および３０分で１５μｇ／分。各アセチルコリンまたはヒスタミン投与の後３分で、抵抗性またはコンプライアンスがベースライン値に回復しない場合は、モルモットの肺を、１０ｍＬのキャリブレーションシリンジからの４ｍＬの空気で３回膨張させた。記録した肺のパラメーターには、呼吸数（呼吸／分）、コンプライアンス（ｍＬ／ｃｍ  Ｈ２Ｏ）および肺抵抗（ｃｍ  Ｈ２Ｏ／ｍＬ／秒）が含まれた。このプロトコルの３５分で肺機能測定が完了すると、モルモットをプレチスモグラフから取り出し、二酸化炭素窒息で安楽死させた。
【０２３１】
データを２種の方法の１つで評価した。
【０２３２】
（ａ）肺抵抗（ＲＬ）（ｃｍ  Ｈ２Ｏ／ｍＬ／秒）を、圧力変化と流量変化の比から計算した。アセチルコリン（６０μｇ／分、ＩＨ）に対するＲＬ反応を、ビヒクルおよび試験化合物について計算した。各前処理時間でのビヒクル処置動物における平均アセチルコリン反応を計算し、対応する前処理時間における各試験化合物用量での、アセチルコリン反応の阻害率を計算するために使用した。「ＲＬ」についての阻害用量反応曲線を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン３．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して４つのパラメーターロジスティック式に当てはめ、気管支保護ＩＤ５０（アセチルコリン（６０μｇ／分）気管支収縮反応を５０％阻害するのに必要な用量）を評価した。下記の式を使用した。
【０２３３】
【化２２−２】
2009541209.tif 000015
式中、Ｘは用量の対数であり、Ｙは反応である（ＲＬにおけるアセチルコリン誘導性増加の阻害率）。ＹはＭｉｎで開始し、Ｓ字形で漸近的にＭａｘに達する。
【０２３４】
（ｂ）下記の式（American Thoracic Society、Guidelines for methacholine and exercise challenge testing、１９９９年、Am J Respir Crit CareMed. ２０００年；１６１号：３０９〜３２９頁に記載されているＰＣ２０値を計算するために使用される式から誘導した）を使用して、一連のアセチルコリンまたはヒスタミン攻撃誘発に対する流量および圧力から誘導された肺抵抗値を使用して、ベースライン肺抵抗の倍増をもたらすのに必要なアセチルコリンまたはヒスタミンの量として定義されるＰＤ２量を計算した。
【０２３５】
【化２３】
2009541209.tif 000016
式中、
Ｃ１＝Ｃ２前のアセチルコリンまたはヒスタミンの濃度
Ｃ２＝肺抵抗（ＲＬ）に少なくとも２倍の増加をもたらすアセチルコリンまたはヒスタミンの濃度
Ｒ０＝ベースラインＲＬ値
Ｒ１＝Ｃ１後のＲＬ値
Ｒ２＝Ｃ２後のＲＬ値
である。
【０２３６】
スチューデント両側ｔ検定を使用してデータの統計解析を行った。Ｐ−値＜０．０５は、有意であるとみなした。
【０２３７】
２００４年８月２４日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１６７１６７（Ａ１）号に記載されている化合物５０を、このアッセイにおいて試験した。化合物５０の化学構造は下記の通りである。
【０２３８】
【化２４】
2009541209.tif 000017
この化合物は、本発明の化合物のフェニル環上に存在するアルキル基を欠いている。このアッセイにおいて、化合物５０は、３μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの範囲の用量では投与後２４時間で有意な気管支保護を示した。化合物５０についての２４時間でのＰＤ２×バルブは、ビヒクル（水）群と同様であった。
【０２３９】
このアッセイにおいて、サルメテロール（１００μｇ／ｍＬ）（β２アドレナリン受容体アゴニスト）は、少なくとも２４時間有意な気管支保護を示し、チオトロピウム（１０μｇ／ｍＬ）（ムスカリン受容体アンタゴニスト）は、少なくとも２４時間有意な気管支保護を示した。
【０２４０】
本発明を特定の態様またはその実施形態を参照して説明してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、または等価物で代用することができることは、当業者であれば理解されよう。さらに、引用される特許法および特許に関する規則で認められている限りは、本明細書において引用したすべての公開資料、特許および特許出願は、各書類が個別に本明細書において本明細書中に組み込まれているのと同一程度に参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【国際調査報告】
2009541209.tif 000029
2009541209.tif 000030
2009541209.tif 000031
2009541209.tif 000032
2009541209.tif 000033