(57)【要約】  本発明は、ガンの処置に対する対象の感受性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法に関するものであり、この方法は、対象からの試料における突然変異Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性の存在を検出することを含み、前記突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４の発現もしくは活性の存在は、前記処置に対する抵抗性を示す。本発明は、さらに突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの試料中の突然変異Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性の存在を検出することを含む、ガンの化学療法的処置に対する該対象の感受性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、該突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４の発現もしくは活性の存在が、該処置に対する抵抗性を示す、方法。
【請求項２】
化学療法が、アントラサイクリンの投与を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化学療法が、オキサリプラチンまたはシスプラチンの投与を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
処置が、Ｘ線（ＸＲ）をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ガンが、乳ガン、胃ガン、肉腫、卵巣ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、子宮頸ガン、前立腺ガン、直腸ガン、大腸ガン、肺ガン、ＯＲＬガン、小児腫瘍（神経芽腫、多形神経膠芽腫）、リンパ腫、白血病、骨髄腫、精上皮腫、ホジキン病および悪性血液疾患からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
突然変異ＴＬＲ４核酸の存在が、制限消化、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅を使用することにより検出される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
突然変異ＴＬＲ４核酸の存在が、ヌクレオチドアレイ上に存在する核酸プローブとの選択的ハイブリダイゼーションを使用することにより検出される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
突然変異ＴＬＲ４核酸が、点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換および／または位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）を含む野生型ＴＬＲ４核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
正常なＴＬＲ４をコードするｍＲＮＡの細胞レベルを測定することにより異常なＴＬＲ４タンパク質の発現を測定することを含む方法であって、対照または基準レベルに比べて減少したレベルが、異常なＴＬＲ４タンパク質の発現と相関される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
異常なＴＬＲ４タンパク質に特異的に結合すると確認されたリガンドと試料を接触させることにより、該異常なＴＬＲ４タンパク質の存在を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
リガンドが、異常なＴＬＲ４に特異的な抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２またはＩＬ−１２ｐ４０の細胞レベルを測定することによりＴＬＲ４活性を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
樹状細胞（ＤＣ）が対象の自己ＤＣである、該ＤＣおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む共培養物中のＩＦＮγの細胞レベルを測定することによりＴＬＲ４活性を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
５よりも低いｐＨが異常なＴＬＲ４活性と相関される、食細胞のエンドソームｐＨを測ることによりＴＬＲ４の発現を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
対象の自己樹状細胞（ＤＣ）による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンへの同種ガン細胞、特に黒色腫細胞の異常な交差提示を検出することにより異常なＴＬＲ４活性を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
後期エンドソームとリソソームとの間の融合を検出することにより異常なＴＬＲ４活性を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）対象からＤＮＡの被験試料を得ること、（ｂ）少なくとも一つの核酸プローブと該被験試料を接触させること（ここで、該核酸は、点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換および／または位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）を含む突然変異ＴＬＲ４配列と相補的であり、該配列と特異的にハイブリダイゼーションしてハイブリダイゼーション試料を形成する）、（ｃ）該核酸プローブと該ＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションが起こるために十分な条件で該ハイブリダイゼーション試料を維持すること、ならびに（ｄ）該核酸プローブと該突然変異ＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションがあるかどうかを検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
対象が、正常なＴＬＲ４タンパク質の発現または活性を有するドナー対象の骨髄を使用して同種骨髄移植を受ける、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療するために有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、被験化合物がＴＬＲ４の該発現または活性をモデュレーションする能力を測定することを含む方法。
【請求項２０】
突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療するために有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、被験化合物がＴＬＲ４のリガンドの発現または活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで誘導または増加させる能力を測定することを含む方法。
【請求項２１】
被験化合物が、突然変異または異常なＴＬＲ４タンパク質の機能的発現を回復することができる、請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するための、機能的ＴＬＲ４発現を回復することができる化合物の使用。
【請求項２３】
化合物が、ＨＭＧＢ１、ＧＭＰ、ＬＰＳ、ヒアルロナン、ｈｓｐ７０、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、および正常なＴＬＲ４タンパク質の発現または活性を有する対象の骨髄から選択される、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するためのＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ９リガンドの使用。
【請求項２５】
ＴＬＲ３リガンドが、ポリＡ：ＵおよびポリＩ：Ｃから選択される二本鎖ＲＮＡである、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
ＴＬＲ９リガンドが、低メチル化されたＣおよびＧ富化オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）から選択される、請求項２４記載の使用。
【請求項２７】
突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するためのアルカリ化リソソーム指向性化合物の使用。
【請求項２８】
アルカリ化リソソーム指向性化合物が、液胞型ＡＴＰアーゼを妨害する化合物である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
液胞型ＡＴＰアーゼを妨害する化合物がバフィロマイシンである、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
アルカリ化リソソーム指向性化合物が、クロロキン、キニンおよびその任意の組み合わせから選択される、請求項２７記載の使用。
【請求項３１】
薬学的組成物が、ガンの予防または治療に同時に、別々にまたは連続的に使用するための組み合わせ調製物として、アントラサイクリン、オキサリプラチンおよび／またはシスプラチンをさらに含む、請求項２２〜３０のいずれか一項記載の使用。
【請求項３２】
対象が、正常なＴＬＲ４タンパク質の発現または活性を有するドナー対象の骨髄を使用した同種骨髄移植を受ける、請求項２２〜３０のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、全般に遺伝学、免疫学および医学の分野に関するものである。本発明者らは、さらに特定すればガンの処置に対する対象の感受性を予測または評価するために使用することのできるヒト遺伝子の同定を開示する。このヒト遺伝子は、本明細書においてさらに、ガンの予防および治療に、ならびに治療活性薬物のスクリーニングに使用することのできるガン感受性遺伝子と同定された。
【０００２】
本開示は、さらに具体的には突然変異Ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）タンパク質をコードする異常ＴＬＲ４遺伝子に関するものであり、前記突然変異遺伝子およびタンパク質は、治療的介入のための新規なターゲットとなる。特定のＴＬＲ４突然変異体は、好ましくは位置２９９にアスパラギンの単一突然変異を含む。
【０００３】
本開示は、さらに異常なＴＬＲ４タンパク質の発現または活性に関するものである。
【０００４】
本発明は、対象におけるガンの素因を判定する方法に、および／またはガンの予防もしくは治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００５】
背景技術
病原体に対する自然免疫応答は、主として単球、マクロファージ、顆粒球および樹状細胞により編成され、これらの細胞は、侵入微生物に対する第一線防御として作用する［１］。自己と非自己の識別は、外来生物に存在する分子パターンを認識する能力を備えるホストタンパク質に頼っている［２］［３］。一つの主要なファミリーまたはタンパク質は、パターン認識レセプター（ＰＲＰ）とも呼ばれるＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）である。
【０００６】
ＴＬＲ４は、ロイシンリッチリピートを特徴とする細胞外ドメインを介してグラム陰性細菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）を認識する［４］、［５］、［６］。ＬＰＳがＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）に結合した後で、ＬＰＳはＣＤ１４、ＴＬＲ４およびアダプター分子ＭＤ２を伴うレセプター複合体に輸送される。シグナル伝達は、ＴＬＲ４のＴＩＲ（Toll/IL-1 receptor）ドメインとＭｙＤ８８（myeloid differentiation primary response protein 88）との相互作用により開始する［７］。ＴＬＲ４について、ＴＲＩＦ（Toll-IL1R domain-containing adaptor protein inducing IFN beta）、ＴＲＩＦ関連アダプター分子、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＡＮＫ：TNF receptor associated NFκB kinase）およびＩκＢキナーゼεなどのタンパク質を伴うＭｙＤ８８非依存的経路が解明されており、次に、この経路は、インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）による１型ＩＦＮの誘導に導く［８］、［９］、［１０］、［１１］。
【０００７】
遺伝的多型性、（大部分は一塩基多型（ＳＮＰ））は、１%を超える頻度で見い出される、個体群によくみられる変異体である。これらは、アミノ酸配列を変化させる（非同義ＳＮＰ）ことがあるし、プロモーターに影響することがあるし、サイレントなこともある。二つのＳＮＰがＣＤ１４のプロモーター領域内に同定されたが、その一つであるＣｙｓ１５９Ｔｈｒは、敗血症ショックの発生率および死亡率に関係する［１２］。
【０００８】
さらに重要には、ＴＬＲ４の細胞外ドメイン中のＳＮＰが大いに研究されてきた。２%を超えるアレル頻度を示す、ＴＬＲ４をコードする遺伝子内の二つの同時分離するＳＮＰは、Ａｓｐ２９９ＧｌｙおよびＴｈｒ３９９Ｉｌｅである［１３］。これらの突然変異は、大部分の研究で対照白人個体の約１０%（０〜１９%）に見い出された。吸入されたＬＰＳおよびアレルギー性喘息に対する反応性低下におけるＡｓｐ２９９ＧｌｙというＳＮＰの機能的関連性が、敗血症ショックおよび様々な感染症の発生率および経過またはアテローム性動脈硬化症の病因に関して研究されてきた［１３］。蓄積し続けるが議論の余地のあるデータは、このようなＴＬＲ４のＳＮＰがこれらの炎症性疾患または感染症（同種移植片反応、糖尿病、冠動脈狭窄を含む）の感受性変化または経過に果たす役割の証拠となる（総説は［１４］）。一つの突然変異アレルは、機能障害に必要である［１３］。グラム陰性細菌感染時に敗血症ショックを有した９１人の中で４人がＡｓｐ２９９ＧｌｙというＳＮＰ（Ｔｈｒ３９９Ｉｌｅではなく）を示したが、対照群では０個のＳＮＰが検出された［１５］。妊婦へのガードネレラ種（Gardnerella spp）および他のグラム陰性共生菌の定着は、ＴＬＲ４の突然変異Ｔｈｒ３９９Ｉｌｅアレルを保持する女性では１０倍増加した［１６］。幼児における重症呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）細気管支炎とＴＬＲ４の両ＳＮＰとの間に明らかな相関が見い出されたが、ＣＤ１４のＳＮＰとの相関は見い出されなかった［１７］。
【０００９】
ＴＬＲ４の遮断は、マウスにおけるアテローム性動脈硬化症に有益効果を有し、二つの研究が急性冠動脈イベントに及ぼすＴＬＲ４変異体の予防効果を見出した［１８］、［１９］、［２０］。ＴＬＲ４の希少ＳＮＰもまた、Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ／Ｔｈｒ３９９Ｉｌｅが重大ではなかった髄膜炎菌血症などのいくつかの症例に関連するおそれがある（細胞外領域およびＴＩＲ領域のＣ末端ドメイン、［２１］、［２２］）。
【００１０】
機能障害性ＴＬＲ４を検出する目的で全ＰＢＭＣまたは単球を使用した機能的アッセイは、関連性がないことがある［２３］、［２４］、［２５］。したがって、ＳＮＰと感染症感受性との関連は、単に予備的とみなすことができ、それは、正の相関を報告している研究が少人数で行われたからである。ＳＮＰの存在がそのリガンドによる単球または全血の活性化に影響しないという発見は、感染症感受性にこれらのＳＮＰが果たす潜在的役割の仮説に対するさらなる証拠である。
【００１１】
慢性炎症が腫瘍形成の高いリスクにさらすおそれがあることから、ＴＬＲ４の多型およびガンについての役割が最近取り組まれてきた。スウェーデンでは前立腺ガンを有する者の中で位置１１３８１のＴＬＲ４のＳＮＰがより高頻度であることが見い出された（２４．１%対１９．７%、ｐ＝０．０２）［２６］。さらに最近の研究により、遺伝により受け継がれた自然免疫遺伝子ＴＬＲ４の多型が前立腺ガンのリスクと関連するともまた結論された［２７］。８個のＳＮＰの変異型アレルについてのホモ接合性は、前立腺ガンの統計的に有意に低いリスクと関連した（ＴＬＲ４＿１８９３、ＴＬＲ４＿２０３２、ＴＬＲ４＿２４３７、ＴＬＲ４＿７７６４、ＴＬＲ４＿１１９１２、ＴＬＲ４＿１６６４９、ＴＬＲ４＿１７０５０、およびＴＬＲ４＿１７９２３）が、１１３８１Ｇ／Ｃに対応するＴＬＲ４＿１５８４４多型は、前立腺ガンと関連しなかった（ＧＧ対ＣＧ／ＣＣ：ＯＲ、１．０１；９５%信頼区間、０．７９〜１．２９）。６個のよくみられるハプロタイプ（累積頻度８１%）が観察され、ハプロタイプと前立腺ガンとの間の関連についての包括的検定は、統計的に有意であった［自由度６でχ（２）＝１４．８；Ｐ＝０．０２］。二つのよくみられるハプロタイプは、前立腺ガンのリスク変化と統計的に有意に関連した。
【００１２】
ＴＬＲ４が慢性肺炎および腫瘍形成に果たすモデュレーションの役割の最初の実証は、Bauer AKら［２８］によって提起された。慢性肺炎に果たすＴＬＲ４の役割を判定するために、彼らは、機能的ＴＬＲ４をもつ近交系マウス（ＯｕＪおよびＢＡＬＢ）および突然変異ＴＬＲ４をもつ近交系マウス［ＨｅＪおよびＢＡＬＢ（Ｌｐｓ−ｄ）］をブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）処置したものにおける肺透過性、白血球浸潤、ならびにＮＦκＢ（nuclear factor kappa B）およびＡＰ−１（activator protein 1）のＤＮＡ結合を比較した。彼らは、単一発ガン物質（３−メチルコラントレン）の注射に続くＢＨＴ処置後のこれらのマウスにおける原発性腫瘍形成もまた測った。機能的ＴＬＲ４を有するマウスは、突然変異ＴＬＲ４を有するマウスに比べて肺透過性、白血球炎症、および原発性腫瘍形成が減少した（ＢＡＬＢ（Ｌｐｓ−ｄ）では平均＝２２．３腫瘍／マウスに対し、ＢＡＬＢでは平均＝１３．９腫瘍／マウス、差＝８．４腫瘍／マウス、９５%信頼区間＝４．６〜１２．１腫瘍／マウス；Ｐ＝０．０２５）。ＮＦκＢのＤＮＡ結合活性は、ＨｅＪマウスよりもＯｕＪの方が高かったが、ＡＰ−１活性はＨｅＪマウスで上昇した。
【００１３】
最近になって、Okamotoら［２９］は、頭頚部ガンを有する患者におけるＴＬＲ−４発現の不在と、場合によりＵＦＴ（テガフール：ウラシル＝１：４）を併用し、場合により放射線療法を併用したＯＫ−ＰＳＡまたはＯＫ−４３２の投与を含む特定の治療処置に対する応答減少との間の相関を記載した。しかし、この文書は、ガン処置に対する対象の感受性を評価する、ガンの化学療法的処置にある本発明による方法を記載も示唆もしていない。
【００１４】
ガンとの闘いは、腫瘍細胞を直接ターゲティングするか、または前記細胞に対するホスト防御をブーストする薬学的化合物に有効に依存している。化学療法［ドキシサイクリン（ＤＯＸ）などのアントラサイクリン、オキサリプラチン（本明細書ではＰＬＡＴと呼ぶ）およびシスプラチン（本明細書ではＰＬＡＴと呼ぶ）は、腫瘍学者の装備の中で最も有効な細胞傷害剤としてみなされている］および放射線療法［Ｘ線（ＸＲ）］を特徴とするいくつかの抗ガン療法が提案されているが、前記処置の有益性はまだ不十分な傾向にある。アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチンおよびＸ線は、抗ガン療法の最大７０%ベースに相当するが、前記処置に対する応答減少の原因となる機能障害の検出は、患者の管理に重大と思われる。
【発明の概要】
【００１５】
概要
ガンの処置、特に化学療法的処置に対する対象の感受性を評価する方法を、本明細書に開示する。この方法は、対象からの試料中の突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性の存在を検出することを含み、前記突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４の発現もしくは活性の存在は、前記処置に対する抵抗性を示す。
【００１６】
ＴＬＲ４遺伝子および発現産物における特定の突然変異をさらに記載する。これらの突然変異は、ガンの処置に対する対象の感受性を評価するための方法に利用することができる。ＴＬＲ４遺伝子のある種のアレルもまた、ガンに対する感受性に関係し、治療的介入のためのターゲットとなる。
【００１７】
対象におけるガンの素因またはガンを有する見込みの増加を測定する方法もまた、本明細書に記載され、この方法は、対象からの試料中の突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性の存在を検出することを含む。特定の方法は、対象からの試料中における点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる、または位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）を含む突然変異ＴＬＲ４配列の存在の検出を含む。
【００１８】
特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するために有用な化合物をスクリーニングするための方法もまた記載する。前記方法は、被験化合物がＴＬＲ４の発現もしくは活性または腫瘍細胞細胞膜へのＨＭＧＢ１（高分子量ボックス１（ＨＭＧＢ１）／アンフォテリン（amphoterin））などのＴＬＲ４リガンドの再局在化をモデュレーションする能力を測定することを含む。
【００１９】
本出願は、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するために、機能的ＴＬＲ４の発現を回復することのできる化合物を使用することをさらに記載する。
【００２０】
本出願は、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するために、機能的ＴＬＲ４の発現を回復することのできる化合物およびそのような化合物を含む薬学的組成物もまた記載する。
【００２１】
本出願人らは、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するためのＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ９リガンドの使用をさらに記載する。このようなリガンドは、ＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスさせ、ＮＦ−κＢ活性化に導く。
【００２２】
本発明は、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するために、機能的ＴＬＲ４の発現を回復することのできるＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ９リガンド、ならびにこのようなＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ９リガンドを含む薬学的組成物もまた包含する。
【００２３】
本出願人らは、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するための、アルカリ化リソソーム指向性化合物の使用をさらに記載する。
【００２４】
本発明は、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するためのアルカリ化リソソーム指向性化合物、およびこのような化合物を含む薬学的組成物もまた包含する。
【００２５】
本発明は、ＴＬＲ４の発現または活性の活性化により、対象におけるガンを治療または予防する方法にもまたある。
【００２６】
さらに特定すれば、ＴＬＲ４遺伝子の突然変異アレルを保持する対象を処置する方法が本明細書に提供され、この方法は、併用療法を採用することを含む。したがって、対象は、例えば遺伝子療法、タンパク質置換療法により、またはＴＬＲ４タンパク質模倣体および／もしくはＨＭＧＢ１などの活性化剤の投与により処置することができる。前記方法の少なくとも一つは、化学療法および／または放射線療法とさらに組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】アポトーシスの免疫原性を示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシス細胞死を誘導する薬物。ＣＴ２６腫瘍細胞上で様々な（ＦＤＡ承認または非承認）薬物をインキュベーションした。ＤＡＰＩおよびアネキシンＶでラベルした２４hr後のＣＴ２６にフローサイトメトリー分析を行った。二重陽性細胞の率を黒棒線で、アネキシンＶ＋／ＤＡＰＩ−の率を白棒線で表す。
【図１Ｂ】アポトーシスの免疫原性を示す図である。野生型マウスにおける薬物誘導性アポトーシス細胞から構成される予防ワクチン。３×１０6個のＣＴ２６細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な薬物で２４hr処理したものを、０日目にＢＡＬＢ／ｃ  ＷＴの左側腹部に接種した。対照をＰＢＳで処置した。７日目に、５×１０5個の生ＣＴ２６細胞を右側腹部に注射し、ノギスを使用して１週間に２回腫瘍の成長をモニターした。無腫瘍マウスの率を示す。各実験は、１群あたりマウス５〜１０匹を含み、少なくとも２回行い、同様の結果を得た。統計解析は、Ｆｉｓｈｅｒの正確法およびＡＮＯＶＡを使用して行った。＊は、ｐ＜０．０５での有意な結果を示す。
【図２Ａ】ＴＬＲ４はＤＯＸに基づく予防ワクチンの免疫原性に重大であることを示す図である。ＴＬＲ４＋／＋マウスに比べたＴＬＲ４−／−マウスにおけるＣＴ２６（大腸）腫瘍の自然成長動態。
【図２Ｂ】ＴＬＲ４はＤＯＸに基づく予防ワクチンの免疫原性に重大であることを示す図である。ＣＴ２６のＤＯＸ誘導性アポトーシスは、ＣＴ２６の攻撃誘発からＴＬＲ４−／−マウスを防御できなかった。１Ｂと同じ実験設定であるが、ＢＡＬＢ／ｃ  ＷＴマウスではなくＴＬＲ４−／−マウスで実施した。
【図２Ｃ】ＴＬＲ４はＤＯＸに基づく予防ワクチンの免疫原性に重大であることを示す図である。ＤＯＸをＷＴまたはＴＬＲ４−／−マウスにおける樹立腫瘍に直接接種する。２週間に１回腫瘍の大きさを測定することにより直接抗腫瘍効果をモニターする。各実験は、１群あたりマウス５〜１０匹を含み、少なくとも２回行われ、同様の結果を得た。統計解析は、Ｆｉｓｈｅｒの正確法およびＡＮＯＶＡを使用して行った。＊は、ｐ＜０．０５での有意な結果を示す。
【図３】ＴＬＲ４はオキサリプラチン誘導性腫瘍退縮に関与することを示す図である。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ａ）またはヌードＳｗｉｓｓマウス（Ｂ）またはＣ５７ＢＬ１０ＳｃＮＪ（Ｃ）マウスに０日目にＧｌａｓｇｏｗ骨肉腫（ＧＯＳ）を接種した。オキサリプラチン（またはＰＢＳ）を５日目に全身投与し、腫瘍の成長をモニターした。各実験は、１群あたりマウス５匹を含み、少なくとも２回行われ、同様の結果を得た。統計解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して行った。＊はｐ＜０．０５での有意な結果を示す。
【図４】Ｘ線は少なくとも部分的にＴＬＲ４により腫瘍の進行をコントロールすることを示す図である。ＩＣ  ＢＡＬＢ／ｃマウス、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＴＬＲ４−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスにＴＳ／Ａ乳腺腫瘍を接種し（Ａ）、３０〜５０mm2の大きさ（およそ９〜１２日目）に達したときに１０Gyをワンショット照射した（Ｂ）。（Ｃ）放射線療法の前後に、ＯＤＮベースのＴＬＲ７／９阻害剤をｉ．ｐ．接種した。腫瘍の大きさを週に２回モニターした。各実験は、１群あたりマウス５匹を含み、少なくとも３回行われ、同様の結果を得た。統計解析は、Ｆｉｓｈｅｒの正確法を使用して行った。＊はｐ＜０．０５での有意な結果を示す。
【図５】ＭｙＤ８８はオキサリプラチン介在性免疫原性に関与することを示す図である。図３Ａと同じ設定であるが、ＧＯＳをＴＲＩＦ−／−（Ａ）またはＭｙＤ８８−／−  ＢＬ／６（Ｂ）マウスに埋め込んだ。腫瘍の大きさを週に２回モニターした。各実験は、１群あたりマウス５匹を含み、少なくとも３回行われ、同様の結果を得た。統計解析は、Ｆｉｓｈｅｒの正確法を使用して行った。＊はｐ＜０．０５での有意な結果を示す。
【図６】ＴＬＲ４-/-マウスはＴＬＲ３リガンドの存在下でＸ線に対する完全な感受性を取り戻すことを示す図である。担ＴＳ／Ａ動物（Ａ）に同様の放射線療法行い（Ｂ）、放射線療法後の＋１、＋４および＋７日目に、５０μgのポリＩ：Ｃを用いた併用療法をｉ．ｐ．で施与した以外は図４と同様。腫瘍の大きさを週に２回モニターした。各実験は、１群あたりマウス５匹を含み、少なくとも３回行われ、同様の結果を得た。統計解析はＦｉｓｈｅｒの正確法を使用して行った。＊はｐ＜０．０５での有意な結果を示す。
【図７】ＴＬＲ４-/-マウスはＴＬＲ９リガンドの存在下でＸ線に対する完全な感受性を取り戻すことを示す図である。ポリＩ：Ｃの変わりに５０μgの
【表１】
2009543570.tif 000002
を動物に投与した以外は図６と同様。
【図８Ａ】ＴＬＲ４-/-ＤＣにおいて食作用および成熟は妨害されないことを示す図である。１μMのCytoTracker Red-（ＣＭＴＭＲ；Invitrogen）でラベルされたアポトーシスＥＬ４ＯＶＡを、未熟段階のＢＭ−ＤＣ（ＴＬＲ４+/+またはＴＬＲ４-/-マウス由来）と１：１の比で３７℃または４℃で４hrインキュベーションした。ＣＤ１１ｃ＋細胞にゲートを通過させるフローサイトメトリー分析は、ＰＥ陽性樹状細胞の率（%）を測定させた。代表的な一実験を示す。
【図８Ｂ】ＴＬＲ４-/-ＤＣにおいて食作用および成熟は妨害されないことを示す図である。Ａと同じであるが、ＥＬ４ＯＶＡをＣＭＴＭＲでラベルせず、Ｉ−ＡBおよびＣＤ８６の表面発現についてＣＤ１１ｃ＋細胞を調べた。上欄（ＴＬＲ４+/+）および下欄（ＴＬＲ４-/-）に代表的な一実験を示す。
【図９Ａ】ＴＬＲ４−／−ＤＣがＢ３Ｚクローン活性化し、細胞関連腫瘍抗原を交差提示する能力の障害を表すことを示す図である。ＥＬ４−ＯＶＡ（照射または非照射）またはトランスフェクションされていないＥＬ４をパルスされた、Ｃ５７ＢＬ／１０マウスまたはＣ５７ＢＬ１０ＳｃＮＪマウスについてのＨ２ｂ同系骨髄ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）と共に、ＯＶＡ特異的ＣＴＬであるＢ３Ｚクローンをインキュベーションした。Ｂ３ＺはＩＬ−２を分泌し、ＩＬ−２は、上清中からＥＬＩＳＡにより測定することができる。ＢＭＤＣと照射されたＥＬ４ＯＶＡ細胞との間の比が異なる実験でＩＬ−２の定量（dosage）を行った。
【図９Ｂ】ＴＬＲ４−／−ＤＣがＢ３Ｚクローン活性化し、細胞関連腫瘍抗原を交差提示する能力の障害を表すことを示す図である。照射または非照射のＥＬ４−ＯＶＡをＢａｌｂ／ｃ  ＴＬＲ４-/-ホストまたはＴＬＲ４+/+ホストの足底に０日目に注射した。神経節細胞を採集し、４日間ＯＶＡタンパク質で攻撃誘発し、ＩＦＮγの測定のために３日目に上清を収集した。３日目にトリチウム化チミジンをこれらのウェルに加え、増殖をcpm単位でモニターした。
【図１０Ａ】ＨＭＧＢ１は、アントラサイクリンおよびＸ線によるストレス誘導時のＴＬＲ４トリガーに重大なリガンドであることを示す図である。ＥＬ４−ＯＶＡ（照射または非照射）またはトランスフェクションされていないＥＬ４をパルスされたＨ２ｂ同系骨髄ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）と共に、ＯＶＡ特異的ＣＴＬであるＢ３Ｚクローンをインキュベーションした。Ｂ３ＺはＩＬ−２を分泌し、ＩＬ−２は、上清中からＥＬＩＳＡにより測定することができる。ブロッキングＴＬＲ４Ｆｃ分子またはアイソタイプ対照Ａｂの存在下で、ＢＭＤＣと照射されたＥＬ４ＯＶＡ細胞との間の比が異なる実験でＩＬ−２の定量を行った。
【図１０Ｂ】ＨＭＧＢ１は、アントラサイクリンおよびＸ線によるストレス誘導時のＴＬＲ４トリガーに重大なリガンドであることを示す図である。抗ＨＭＧＢ１抗体（Ａｂ）またはアイソタイプ対照Ａｂの存在下である以外は同上。
【図１１Ａ】Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ  ＴＬＲ４についての乳ガン女性の遺伝子型決定を示す図である。乳ガンに対する遺伝的感受性。患者を救急室に２年間入院させ、併存症（例えばガン）についてモニターした。現在または過去の病歴にガンを有する患者６４０例をこの研究に登録した。患者の組織学的サブタイプにより患者を分類した。二重ラベルしたアレル特異的オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ分解に基づく単一チューブＰＣＲを患者の血液由来ゲノムＤＮＡに行った。ヘテロ接合性の率（ＴＬＲ４のＡｓｐ２９９Ｇｌｙ一突然変異アレル）を個体数ｎの各コホートについて示す。Ａｓｐ２９９Ｇｌｙの頻度は散発性乳ガンを有して来診した患者で有意に高い。
【図１１Ｂ】Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ  ＴＬＲ４についての乳ガン女性の遺伝子型決定を示す図である。乳ガン（ＢＣ）女性におけるアントラサイクリンおよびＸ線に対する一次抵抗性。ＴＬＲ４  Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ  ＴＬＲ４遺伝子型を有するＢＣ女性１２人を、ｗｔ遺伝子型のＢＣ女性２４人と年齢、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ予後指標およびアジュバント療法（アントラサイクリンおよびＸ線に基づく）についてマッチさせた。無進行生存（５年以内）を示すが、これは、ｗｔ遺伝子型を有する女性の方が有意に長い（ログランク）。
【図１２】ＴＬＲ４はｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシス小体を貪食するＤＣによる抗原提示をコントロールすることを示す図である。  ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８は、ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２b）拘束性Ｔ細胞に対する、照射腫瘍細胞をロードされたＤＣによる抗原提示に必要である。表示した遺伝子型（バックグラウンドＣ５７ＢＩ／６、Ｈ−２bＩ−Ａb）からのＤＣにＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、生存ＥＧ７細胞または照射ＥＧ７細胞（ＥＧ７とＤＣの比は１：１）をパルスし、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｂ３Ｚハイブリドーマと共に４８hインキュベーションし、続いて上清中のＩＬ−２を定量した（実験の部の§１２参照）。
【図１３Ａ】ＴＬＲ４欠損ＤＣによる正常な食作用およびＴＬＲ４欠損ＤＣの正常な成熟を示す図である。死滅中の腫瘍細胞の食作用はＴＬＲ４に依存しない。同系ＷＴまたはＴＬＲ４-/-またはＴｒｉｆ−／−またはＭｙＤ８８−／−ＤＣによる、ＤＸＲで処理されたＣＴ２６（左欄）および照射されたＥＬ４細胞（右欄）の食作用指標。１２ウェルプレート中で腫瘍細胞をCelltracker Green（Calbiochem）でラベルし、ＤＣと共に１：１の比で２hr培養した。インキュベーションの終わりに接着細胞をバーゼン液で採集し、非接着細胞と共にプールし、洗浄し、ＣＤ１１  ｃ−ＡＰＣ抗体で染色した。二重陽性細胞のＦＡＣＳ分析により食作用を評価した。食作用指標は、ＤＣと腫瘍細胞の同時インキュベーションを４℃で行って得られた値と３７℃で行って得られた値の間の比を表す。
【図１３Ｂ】ＴＬＲ４欠損ＤＣによる正常な食作用およびＴＬＲ４欠損ＤＣの正常な成熟を示す図である。死滅中の腫瘍細胞により誘導されたマウス樹状細胞の成熟は、ＴＬＲ４非依存的である。マウスＣ５７ＢＬ／６  ＢＭ−ＤＣを、生きた照射されたＥＧ７細胞（１：１の比）またはＬＰＳと共に２４時間培養した。２４時間後に同時培養上清を収集し、マウスＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−６の検出をＥＬＩＳＡにより行った。ＴＬＲ−４のリガンドであるＬＰＳを陽性対照として使用する。
【図１４Ａ】樹状細胞におけるＴＬＲ４欠損が腫瘍細胞由来抗原のプロセシングに影響することを示す図である。（上欄）ＷＴまたはＴＬＲ４-/-マウスのＢＭ−ＤＣに、照射されたＴＳ／Ａ−ＯＶＡ細胞をロードした。表示した時点で抗ＣＤ１１ｃ抗体および抗Ｋb−ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗体を使用して、Ｋb−ＳＩＩＮＦＥＫＬを発現しているＣＤ１１ｃ＋細胞を検出した。Ｋb−ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗体についての陽性閾値を設定するために、パルスされていないＤＣを使用した。両方の種類のＤＣでのＫb発現は、抗Ｋb抗体でラベルされたＤＣのＭＦＩを評価することにより立証した。（下欄）０．５μMクロロキンまたは１０μg/ml抗ＨＭＧＢ１抗体のいずれかを用いた、上欄と同じ設定。＊  ｐ＜０．０１。ＣＯ＝対照。
【図１４Ｂ】樹状細胞におけるＴＬＲ４欠損が腫瘍細胞由来抗原のプロセシングに影響することを示す図である。表示した濃度のクロロキンまたはバフィロマイシンＡ１の不在下または存在下で、ＷＴたはＴＬＲ４-/-マウスのＢＭ−ＤＣに１mg/mlのＯＶＡタンパク質（可溶性抗原に同化されていることがある）または照射されたＥＧ７細胞（アポトーシス小体に同化されていることがある）をロードした。６時間後に、ＢＭ−ＤＣを洗浄し、Ｂ３Ｚハイブリドーマと共に４８hインキュベーションし（図１２と同様）、前記ハイブリドーマは、ＤＣによる抗原提示に作用した。２回の実験で同様の結果（３回繰り返しの平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）が得られた。＊  ｐ＜０．０１。
【図１４Ｃ】樹状細胞におけるＴＬＲ４欠損が腫瘍細胞由来抗原のプロセシングに影響することを示す図である。ＷＴまたはＴＬＲ４-/-マウスのＢＭ−ＤＣをｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ｒｅｄで染色し、照射されＣＦＳＥラベルされたＥＧ７細胞をロードした。ＣＦＳＥラベルされたターゲット細胞を含有する未融合のファゴソームは緑色に見え、エンドソーム／リソソームと融合したファゴソームは、二つの蛍光色素の共存が原因で黄色に見えた。次に、異なる時点での蛍光顕微鏡法により、ターゲットを貪食したＤＣ中で融合したファゴソームの率の測定結果を評価した。エンドソーム／リソソームの融合はＴＬＲ−４-/-マウスのＢＭ−ＤＣで加速する。
【図１５Ａ】ＴＬＲ４およびそのリガンドＨＭＧＢ１は、共に腫瘍細胞に対するワクチン接種の成功に必要であることを示す図である。死滅中の腫瘍細胞を用いたワクチン接種に及ぼすＴＬＲ４の影響。ＰＢＳまたはオキサリプラチン−ドキソルビシンもしくはＸ線照射で処理した死滅中の腫瘍細胞（ＣＴ２６、ＥＬ４もしくはＭＣＡ２０５）をマウスに免疫処置した。７日後に、マウス（１群１０匹）に生きた同系腫瘍細胞を接種し、腫瘍の成長をモニターした。
【図１５Ｂ】ＴＬＲ４およびそのリガンドＨＭＧＢ１は、共に腫瘍細胞に対するワクチン接種の成功に必要であることを示す図である。ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害は死滅中の腫瘍細胞を用いたワクチン接種の効力を妨げる。ＴＬＲ４阻害ペプチド１００μg（対照ペプチド＝ＣＯ）を以前（−７日目および−３日目）に注射されたマウスを使用した、Ａと同じ設定。
【図１５Ｃ】ＴＬＲ４およびそのリガンドＨＭＧＢ１は、共に腫瘍細胞に対するワクチン接種の成功に必要であることを示す図である。死滅中の腫瘍細胞のワクチン接種に及ぼすＨＭＧＢ１の影響。ＣＴ２６、ＥＬ４およびＭＣＡ２０５を用いてＡおよびＢにおけるような実験を行った。抗腫瘍ワクチン接種のために、化学療法的または放射線療法的処置前に対照またはＨＭＧＢ１枯渇性ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションした。＊ｐ＜０．０５。
【図１６Ａ−Ｄ】ＴＬＲ４がマウスにおける抗腫瘍化学療法および放射線療法の効力を指示することを示す図である。従来の抗腫瘍療法の効力に及ぼすＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦおよびＴ細胞の影響。表示した遺伝子型を有するマウスにＥＬ４胸腺腫、ＣＴ２６大腸ガン、ＴＳ／Ａ乳ガン、およびＧＯＳ骨肉腫を樹立させた。表示した腫瘍の大きさで、マウスを未処置のままにするか、または全身化学療法もしくは局所放射線療法により処置するかのいずれかとした。ＥＬ４腫瘍を保持する野生型マウスまたはＴＬＲ４-/-マウスをオキサリプラチンおよび／またはクロロキン（５０μg ｉ．ｐ．１日１回）で処置した。図１６Ｄでは、ＴＬＲ４-/-マウスの化学療法応答障害の修正は、クロロキンを使用して得られる。Ａ〜Ｄで得られた結果（３回繰り返しの平均±ＳＥＭ、１群マウス５匹）は、３回の独立した実験を代表するものである。＊  ｐ＜０．０５。
【図１７Ａ】ＴＬＲ４がヒトにおける抗腫瘍化学療法の有効性を指示することを示す図である。ＴＬＲ４  Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ突然変異により付与されたＨＭＧＢ１結合障害。ＨｅＬａ細胞に空のベクター、野生型または突然変異体ＴＬＲ４をトランスフェクションした。次に、ｒＨＭＧＢ１の存在下で細胞を１時間インキュベーションし、免疫沈降させた。
【図１７Ｂ】ＴＬＲ４がヒトにおける抗腫瘍化学療法の有効性を指示することを示す図である。ＴＬＲ４  Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ突然変異により付与されたＬＰＳ応答障害。正常なＡｓｐ２９９Ａｓｐまたは突然変異Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ  ＴＬＲ４アレルを保持するヒト単球由来ＤＣ（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＦＮα中、３日間で発生）を、表示した用量のｒＨＭＧＢＩまたはＬＰＳの不在下または存在下で、同種Ｔ細胞２×１０5個と共に表示した比で培養した。４日後に3Ｈの取込みによりＴ細胞増殖を評価した。
【図１７Ｃ】ＴＬＲ４がヒトにおける抗腫瘍化学療法の有効性を指示することを示す図である。ＴＬＲ４  Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ突然変異を有するヒトＤＣが腫瘍抗原を交差提示する能力の障害。Ｍｅｌ９６  ＨＬＡ−Ａ２陰性ＭＡＲＴ１陽性黒色腫腫瘍細胞をオキサリプラチンで２４時間処理し、次に、共培養中に０．５μMクロロキンで処理したか、または処理していないヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）にロードした。対照抗体または抗ＨＭＧＢ１抗体（１０μg/ml）いずれかの添加後に、ＥＬＩＳＰＯＴを用いてＩＦＮγ産生細胞のＬＴ１２クローン（ＭＡＲＴペプチド特異的）検出を行った。ＩＦＮγの存在は、ＬＴ−１２クローンの活性化と相関させることができ、ＬＴ−１２クローンの活性化自体は、ＤＣの抗原提示と相関させることができる。
【００２８】
詳細な説明
本発明は、ガン患者の処置に使用される細胞傷害剤が免疫系、さらに具体的にはＴＬＲ４シグナル伝達経路に影響を与えるという観察に基づく。したがって、先天的な、または獲得されたＴＬＲ４機能障害の検出は、ガンを患う対象に使用される最も適切な処置、すなわち治療法に対する前記対象の応答性を回復または促進させる処置を確定するに足る方法として本明細書に開示される。代替（surrogate）ＴＬＲ経路が、このような処置に関与するおそれがある（下にさらに説明する）。
【００２９】
本明細書に記載する前臨床モデルにおいて、本発明者らのデータは、特に大腸ガンにおいて、ＴＬＲ４-/-マウスでの腫瘍の自然進行が、ＴＬＲ４+/+マウスよりも速い成長動態を示す傾向にあることを示している（例えば図２Ａを参照されたい）。
【００３０】
本発明者らは、本明細書において機能障害ＴＬＲ４により仲介される腫瘍進行が、実験条件に固有の外因性炎症促進過程に依存しないことを実証する。実際に、発ガン促進性化合物も炎症促進性化合物も全く加えずにマウスにＣＴ２６細胞を注射する場合に、ＴＬＲ４欠損ホストにおける腫瘍細胞の成長動態は、免疫適格同腹仔よりも有意に増加した（図２Ａ）。
【００３１】
細胞傷害性化合物が細胞自律的効果によってのみ作用するという現在の見解に異議を申し立て、本発明者らは、免疫適格同腹仔および免疫無防備状態の同腹仔［Ｔ細胞またはＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）を欠如している］において、アントラサイクリン、シスプラチン、オキサリプラチンまたはＸ線（ＸＲ）、および他のアポトーシス促進剤（タキサン、マイトマイシンＣ）により仲介される抗腫瘍効果を比較した。本発明者らは、担腫瘍マウスへのドキシサイクリン（ＤＯＸ）、ＰＬＡＴまたはＸＲの投与が、（ＴＬＲ−７、９ではなく）ＴＬＲ−４によりＴ細胞依存的に長期生存を選択的に促進したことを発見した。対照的に、タキサンまたはマイトマイシンＣは、免疫細胞またはレセプターとは無関係に腫瘍の成長を妨げた（実験の部を参照されたい）。本発明者らは、細胞傷害剤が腫瘍細胞によるＨＭＧＢ１などのＴＬＲ４リガンドの発現を誘導または増加させていて、ストレスを受けた腫瘍細胞がＤＣなどの食細胞に到達できるようにしたことを示した。本発明者らは、ＴＬＲ４−／−樹状細胞（ＤＣ）が成熟プログラムを受ける能力またはアポトーシス細胞死との相互作用に続いて炎症性サイトカインを分泌する能力に変化がなかったことを示すことができた。しかし、ＴＬＲ４は、炎症促進カスケードのトリガーよりもむしろ抗原プロセシングおよび抗原提示に重大であった。
【００３２】
定義
様々な態様の概説を容易にするために、以下に用語の説明を提供する。
【００３３】
本明細書に使用する用語「ガン」は、任意の種類の悪性腫瘍（原発または転移）を表す。
【００３４】
典型的なガンは、Ｘ線、アントラサイクリン、シスプラチンおよび／またはオキサリプラチン感受性のガン、例えば乳ガン、胃ガン、肉腫、卵巣ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、子宮頸ガン、直腸ガン、大腸ガン、肺ガン、ＯＲＬガン、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫）、リンパ腫、白血病、骨髄腫、精上皮腫、ホジキン病および悪性血液疾患である。
【００３５】
用語「処置に対する感受性」は、非限定的に、個体における治療化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性薬物に変換する能力、薬物動態（吸収、分布、排出）および薬物の薬力学（レセプター関連）を含む、処置に対する対象の応答レベルを表す。処置は、例えばドキシサイクリン（ＤＯＸ）などのアントラサイクリン、オキサリプラチンもしくはシスプラチンの投与を含む化学療法であってもよいし、および／または処置は、例えばγ線もしくはＸ線（ＸＲ）を使用する放射線療法であってもよい。
【００３６】
本明細書に使用する用語「ガンの素因」、「ガン発生に対する感受性」、「ガンを発生するリスクがある」または「ガンを有する見込みが増大した」は、対象が平均的な集団に比べてガンを発生するリスクが増大していることを意味する。
【００３７】
被験試料は、核酸および／またはポリペプチドを含有する。このような試料の例には、液体、組織、細胞試料、器官、生検などが挙げられる。
【００３８】
収集された試料の性質は、必ずしも特定の種類のガンと相関しない。収集された組織は、実際にガン組織（好ましくはパラフィン包埋したものよりもむしろ凍結したもの）または健常組織（例えば血液、皮膚、間質）であってもよい。
【００３９】
組織は、選択されたガン組織から収集してもよい。
【００４０】
試料は、場合による前記組織の異常状態または疾患状態とは無関係に、例えば血液、血漿および骨髄から選択された組織からもまた得てもよい。
【００４１】
好ましくは、試料は、ＴＬＲ４を発現することが公知の細胞、好ましくは自己単球、樹状細胞および単核細胞から選択される細胞を含む。
【００４２】
特定の例では、対象が乳ガンまたは大腸ガンの発生に対して感受性であるかどうかを判定するためにアッセイが行われるならば、血液、間質もしくは皮膚または腫瘍組織の試料を提供してもよい。
【００４３】
本発明は、様々な対象に、例えば動物、特に哺乳動物、好ましくは成人、小児および出生前段階のヒトを含むヒトに、いっそうさらに好ましくは突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象に使用してもよい。
【００４４】
用語「対象」は、ガンに悩む患者またはガンを発生するおそれのある対象を表す。患者、特にガン患者は、さらに同種骨髄移植を受ける患者でありうる。
【００４５】
用語「異常」は、本明細書において正常な特徴からの逸脱に関連する。正常な特徴は、対照、集団についての基準などに見い出すことができる。例えば、異常な状態がガンなどの疾患状態である場合に、正常な特徴の２、３の適切な源には、ガンを患っていない個体、ガンを患っていないと考えられる個体の集団的基準などが含まれうる。
【００４６】
同様に「異常」は、疾患に関連する状態を表すことがある。用語「関連する」には、疾患を発生するリスクの増大およびその疾患自体が含まれる。例えば、ある種の異常（ＴＬＲ４核酸またはＴＬＲ４タンパク質の発現における異常など）は、ガンを発生する傾向に関連すると記載することができる。
【００４７】
異常ＴＬＲ４核酸などの異常核酸は、正常（野生型）核酸とはある方法で異なる核酸である。このような異常には、対照または基準に比べた、核酸の突然変異［例えば点突然変異（ＳＮＰとも名付けられる一塩基多型）またはヌクレオチド２、３個〜数個の短い欠失もしくは重複］が含まれるが、必ずしもそれに限定されない。これらの種類の異常が、同じ核酸または同じ細胞もしくは試料に共存しうることが了解されよう。加えて、核酸の異常は、対応するタンパク質の発現に異常を引き起こすおそれがあることが了解されている。対応するタンパク質の発現の不在は、このような異常の特定の例である。
【００４８】
したがって、異常なＴＬＲ４タンパク質は、配列、立体配置、または成熟が通常の野生型タンパク質と異なるタンパク質である。好ましくは、異常なタンパク質は、機能的でないか、単に部分機能的である。
【００４９】
異常なＴＬＲ４タンパク質の発現などの異常なタンパク質の発現または活性は、下にさらに説明するように、対照または基準と比べた場合に、通常の（野生型）状態におけるタンパク質の発現または活性と幾分異なるタンパク質の発現または活性を表す。この用語は、好ましくは異常なＴＬＲ４タンパク質の発現を含むが、例えば正常なＴＬＲ４タンパク質をコードするｍＲＮＡの異常転写（このような異常転写は、対照または基準のレベルまたは量に比べて、例えばガンの処置またはガン自体により誘導された転写減少でありうる）が原因の、正常なＴＬＲ４タンパク質の異常発現もまた包含する。
【００５０】
同様に、ＴＬＲ４タンパク質のレベル活性は、正常なＴＬＲ４タンパク質の異常発現または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現を反映しうる。
【００５１】
異常の判定のための試料と比較するために適する対照または基準には、たとえ任意に設定された可能性があろうと、正常と考えられる試料および実験値が含まれるが、このような値は、研究室毎に異なるおそれがあることに留意する。実験室基準および実験値は、公知の、または測定された集団値に基づき設定してもよく、測った、実験的に測定された値を容易に比較できるグラフまたは表の形式で与えてもよい。
【００５２】
異常なＴＬＲ４タンパク質という用語には、対照または基準にそれぞれ比べて、（１）一つまたは複数のアミノ酸残基が異なるような、タンパク質における突然変異；（２）タンパク質の配列への短い欠失または一つもしくは少数のアミノ酸残基の付加；（３）タンパク質ドメイン全体またはサブドメインが除去または付加されるような、アミノ酸残基のより長い欠失または付加；（４）対照または基準量に比べた機能的タンパク質の発現量減少；（５）タンパク質の細胞局在またはターゲティングの変化；（６）時間的にレギュレーションされたタンパク質発現の変化（タンパク質が通常は発現しない場合にそれが発現する、またはタンパク質が通常は発現する場合にそれが発現しないような変化）；および（７）タンパク質の局在した（例えば器官または組織特異的な）発現の変化（タンパク質が通常は発現する場合にそれが発現しない、またはタンパク質が通常は発現しない場合にそれが発現するような変化）が挙げられるが、必ずしもそれに限定されない。
【００５３】
「ＴＬＲ４タンパク質の活性」という用語は、ＴＬＲ４の天然リガンドの一つに対するＴＬＲ４の任意の直接結合、ＴＬＲ４により仲介されるか、またはＴＬＲ４に有利な任意の間接的結合、および特にＴＬＲ４経路の下流のエフェクター（例えばＭｙＤ８８）に及ぼす前記の直接または間接的結合の効果を包含する。
【００５４】
本出願に使用する「ＴＬＲ４遺伝子」という用語は、ヒト染色体９ｑ３２−ｑ３３上のＴｏｌｌ様レセプター４遺伝子ならびにガンに対する感受性に関係するそのアレル（例えば生殖細胞系突然変異）を含めたその変異体、アナログおよびフラグメントを意味する。ＴＬＲ４遺伝子は、ＣＤ２８４、ＴＯＬＬ、ｈＴｏｌｌ（他の名称：homolog of Drosophila toll）ともまた呼ばれることがある。
【００５５】
リコンビナント核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素的技法、またはその組み合わせを含めた通例の技法により調製してもよい。適切なＴＬＲ４遺伝子配列は、ＮＣＢＩなどの遺伝子バンクに見い出すことができる［配列番号１（ＮＭ１３８５５４１；ＧｅｎｅＩＤ：７０９９）参照］。対応するポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ遺伝子バンクの参照番号ＮＰ６１２５６４に見い出される。
【００５６】
用語「ＴＬＲ４遺伝子」には、配列番号１の、または上に確認される任意のコード配列の任意の変異体、フラグメントまたはアナログが含まれる。
【００５７】
ＴＬＲ４ポリペプチドの特定の例は、配列番号２の全てまたは部分を含む（ＮＣＢＩ：ＮＰ６１２５６４参照；ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｏ００２０６参照）。
【００５８】
多型は、例えば変異（例えば８９６Ａ／Ｇ）が存在するヌクレオチド位置により、ヌクレオチド変異（例えばＤ２９９Ｇ）により起こるアミノ酸配列の変更により、または変異に連結する核酸分子の何か他の特徴における変更（例えばステム−ループなどの二次構造の変化またはポリメラーゼ、ＲＮａｓｅなどの関連分子に対する核酸の結合親和性の変化）により表すことができる。例として、ＴＬＲ４遺伝子領域における本明細書に開示される多型は、ＴＬＲ４ポリペプチドにおける変異体アミノ酸Ｄ２９９Ｇの数的位置に基づく、ＴＬＲ４遺伝子におけるその位置［例えば、変異体残基Ｄ２９９ＧもしくはＡｓｐ２９９Ｇｌｙ（Reference SNP Cluster Report: rs4986790）またはＴ３９９Ｉ（Reference SNP Cluster Report: rs4986791）の数的位置に基づく］により、ＴＬＲ４のｍＲＮＡの二次構造にそれが及ぼす効果により、またはＴＬＲ４ポリペプチドの三次構造にそれが及ぼす効果（例えばＨＭＧＢ１またはｈｓｐなどのリガンドに対するポリペプチドの結合親和性の変化）により表すことができる。
【００５９】
診断法
上に言及した観察を用いて、本発明者らは、今回本明細書において対象のＴＬＲ４遺伝子ローカスの分析に基づく診断法を提供する。本発明の内容の範囲内の用語「診断」には、上に定義された対象における初期段階、発症前段階、および後期段階を含む様々な段階での検出、投薬、比較などが含まれる。診断には、典型的には予後、最も適切な処置を確定するための発病の素因またはリスクの判定、対象の特徴付けなどが含まれる。
【００６０】
本明細書に開示される特定の診断法は、ガンの処置に対する対象の感受性を評価する方法であり、この方法は、対象からの試料中の突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性の存在を検出することを含む。前記突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性の存在は、実際に抵抗性、すなわち前記処置に対する対象の負の応答または応答不良を示す。負の応答は、有効な応答の不在として定義することができる。これは、その処置がガンの予防または治療に有効ではないと思われることを意味する。言い換えると、ガン自体は前記処置に抵抗性と思われる。応答不良は、野生型ＴＬＲ４を保持するか、または正常なＴＬＲ４タンパク質を発現する患者において観察される応答に顕著に劣る応答である。
【００６１】
所望により、前記方法は、前に定義したような試料を対象から提供する前工程を含む。
【００６２】
本発明によると、対象の感受性を評価することができる処置は、例えばＤＯＸなどのアントラサイクリン（ドキソルビシン、イダルビシン、４エピルブシン（4 Epirubucine）、ミトキサントロン）、オキサリプラチン、シスプラチン（ＰＬＡＴ）の投与を含めた化学療法、およびＸ線（ＸＲ）の少なくとも一つから好ましくは選択される。
【００６３】
上に言及した処置に対する感受性を分析および予測する診断法は、対象が特定の治療薬を用いて処置されるべきかどうかを判定するために使用することができる。例えば、対象がアントラサイクリン、ＰＬＡＴおよび／またはＸＲに正の応答をする見込みをこの方法が示すならば、前記処置をその個体に施与することができる。逆に、個体が前記処置に負の応答をする見込みがあることをこの方法が示すならば、代わりの処置クールを指示することができる。
【００６４】
本発明者らは、本明細書において対象におけるガンの素因またはガンを有する見込みの増大を判定する診断法を提供し、この方法は、対象からの試料における突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性の存在を検出することを含む。
【００６５】
ＴＬＲ４突然変異は、ＴＬＲ４のゲノム配列またはＲＮＡにおいて判定することができる。
【００６６】
検出された突然変異は、先天的な、または獲得された突然変異であってもよい。
【００６７】
ＴＬＲ４遺伝子ローカスにおける突然変異は、そのローカスのコード領域および／または非コード領域における単独または様々な組み合わせの、任意の形の突然変異、欠失、交換および／または挿入であってもよい。さらに具体的には、突然変異には点突然変異が含まれる。欠失は、一残基から最大で遺伝子またはローカス全体までなどの、遺伝子ローカスのコード部分または非コード部分における一つ、二つまたはそれを超える残基の任意の領域を包含してもよい。典型的な欠失は、連続する約２０塩基対未満のドメイン（イントロン）または繰り返し配列またはフラグメントなどのより小さな領域に影響するが、より大きな欠失も同様に起こることがある。挿入は、遺伝子ローカスのコード部分または非コード部分における一つまたは数個の残基の付加を包含することがある。挿入は、典型的には遺伝子ローカスに１から２０塩基対の付加を含むことがある。交換には、配列の逆位が含まれる。ＴＬＲ４遺伝子ローカスの突然変異は、停止コドンの創出、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングまたはプロセシング、産物の不安定性、切断されたポリペプチド産物などを招くことがある。変化は、変化した機能、安定性、ターゲティングまたは構造を有するＴＬＲ４ポリペプチドの産生を招くことがある。変化は、タンパク質の発現減少またはその代わりに前記産生の増加もまた引き起こすことがある。
【００６８】
本発明に記載の方法の特定の態様では、ＴＬＲ４遺伝子の変化は、ＴＬＲ４遺伝子または対応する発現産物における点突然変異、欠失および挿入から、さらに好ましくは点突然変異から、なおいっそう好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）から選択される。
【００６９】
特に今回、本発明は、点突然変異を含む突然変異ＴＬＲ４核酸を開示し、好ましくは点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）を含むＴＬＲ４（好ましくはヒトＴＬＲ４）の野生型配列を開示する。
【００７０】
したがって、本発明に記載の特定の方法は、対象からの試料における点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換または位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）を含む突然変異ＴＬＲ４配列の存在を検出することを含む。
【００７１】
突然変異ＴＬＲ４ヒト核酸配列の特定の例は、Ｄ２９９Ｇ多型を含むＴＬＲ４配列（Reference SNP Cluster Report: rs4986790）またはＴ３９９Ｉ多型を含むＴＬＲ４配列（Reference SNP Cluster Report: rs4986791）を含む。
【００７２】
本明細書に記載する方法は、対象が多型に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるかどうかを判定することを目的とする工程をさらに含んでもよい。
【００７３】
本発明の方法では、ＴＬＲ４遺伝子における任意の突然変異または変化は、任意の他の遺伝子またはタンパク質における他の突然変異または変化などの他のマーカーと組み合わせて評価してもよい。
【００７４】
試料中の突然変異ＴＬＲ４の存在は、試料の遺伝子型決定により検出することができる。検出は、ＴＬＲ４遺伝子の全てまたは部分の選択的ハイブリダイゼーションおよび／または増幅を用いて、ＴＬＲ４遺伝子の全てまたは部分を配列決定することにより行うことができる。さらに好ましくは、ＴＬＲ４遺伝子特異的増幅は、突然変異同定工程の前に実施される。本明細書に記載する特定の態様では、突然変異ＴＬＲ４核酸の存在は、制限消化、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅を使用することにより検出される。具体的な態様は、対象のＴＬＲ４遺伝子配列における少なくとも一つのＳＮＰの存在を検出することを含む。
【００７５】
別の態様では、この方法は、異常なＴＬＲ４  ＲＮＡの発現の存在を検出することを含む。異常なＲＮＡ発現には、突然変異ＲＮＡ配列の存在、異常なＲＮＡスプライシングまたはプロセシングの存在、異常な量のＲＮＡの存在などが含まれる。これらは、例えば制限消化、ＴＬＲ４  ＲＮＡの全てもしくは部分の配列決定または前記ＲＮＡの全てもしくは部分の選択的ハイブリダイゼーションもしくは選択的増幅を含む、当技術分野で公知の様々な技法により検出することができる。
【００７６】
さらなる態様では、この方法は、異常なＴＬＲ４ポリペプチドまたはタンパク質の発現の存在を検出することを含む。異常なＴＬＲ４ポリペプチドまたはタンパク質の発現には、突然変異ポリペプチド配列の存在、異常な量のＴＬＲ４ポリペプチドの存在、異常な組織分布の存在などが含まれる。これらは、例えば配列決定および／または特異的リガンド（抗体など）への結合を含めた、当技術分野で公知の様々な技法により検出することができる。
【００７７】
他の適切な方法は、異常なＴＬＲ４の遺伝子またはＲＮＡの発現または配列を検出または定量するために使用することができる。これらには、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、アレル特異的増幅、サザンブロット（ＤＮＡに関する）、ノーザンブロット（ＲＮＡに関する）、一本鎖コンフォメーション解析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル泳動、クランプ変性剤ゲル電気泳動（clamped denaturing gel electrophoresis）、ヘテロ二本鎖分析、ＲＮａｓｅ保護、化学的ミスマッチ切断、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。
【００７８】
以前に説明したように特定の態様では、この方法は、対象からの試料中の異常なＴＬＲ４核酸の存在を検出または判定することを含む。これは、以前に説明したように、前記試料中に存在する核酸の制限消化、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅を使用することにより達成することができる。
【００７９】
制限消化は、当技術分野で周知の技法および酵素を使用して実施することができる。
【００８０】
配列決定は、自動シーケンサーを使用して、当技術分野で周知の技法を使用して実施することができる。配列決定は、完全なＴＬＲ４遺伝子または好ましくはその特異的ドメインに、典型的には有害な突然変異または他の変化を保持することが公知であるか、または疑われるドメインに行うことができる。
【００８１】
Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ多型（Ａ８９６Ｇ）を含む領域を増幅する特異的プライマーの例を本明細書に提供する：
【００８２】
【表２】
2009543570.tif 000003
【００８３】
これらの配列は、８６bpのフラグメントを増幅するために使用することができる。プライマーセットの別の例(これは１０１bpのフラグメントを増幅するために使用することができる)が、本出願の実験の部に提供される。
【００８４】
リガンドの結合に関与する別の突然変異はＴｈｒ３９９Ｉｌｅである。Ｔｈｒ３９９Ｉｌｅ多型（Ｃ１１９６Ｔ）を含む領域を増幅する特異的プライマーの例を本明細書にさらに提供する：
【００８５】
【表３】
2009543570.tif 000004
【００８６】
これらの配列は、１７８bpのフラグメントを増幅するために使用することができる。
【００８７】
Ｔｈｒ３９９ＩｌｅのＡＳＯは、それぞれ
【００８８】
【表４】
2009543570.tif 000005
【００８９】
である。
【００９０】
増幅は、核酸の複製開始に役立つ相補的核酸配列の間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。
【００９１】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）によるなどの、当技術分野で公知の様々な技法により行ってもよい。
【００９２】
これらの技法は、市販の試薬およびプロトコールを使用して行うことができる。好ましい技法は、アレル特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、反応を開始するために通常は特異的核酸プライマーの使用を必要とする。
【００９３】
ＴＬＲ４遺伝子またはローカスからの配列の増幅に有用な核酸プライマーは、前記ローカスのターゲット領域に隣接するＴＬＲ４遺伝子ローカスの部分と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、前記ターゲット領域は、ガンを有するか、またはガンを発生するリスクのある、ある対象において突然変異している。
【００９４】
ＴＬＲ４ターゲット領域を増幅するために使用することができるプライマーは、ＴＬＲ４のゲノム配列またはＲＮＡ配列に基づき、特に配列番号１の配列（ＮＭ１３８５５４；  ＧｅｎｅＩＤ：７０９９）に基づき設計してもよい。
【００９５】
本発明の別の特定の目的は、周囲の領域を含むＴＬＲ４遺伝子またはローカスからの配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、好ましくはＴＬＲ４遺伝子ローカス中の核酸配列に相補的であるか、または特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、ＴＬＲ４遺伝子ローカスのターゲット領域に隣接する前記ローカスの部分と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、前記ターゲット領域は、ガン、ガンの素因またはガンを有する見込みの増大を有するある対象において変化している。
【００９６】
本発明は、核酸プライマーにもまた関し、前記プライマーは、ガン、ガンの素因またはガンを有する見込みの増大を有するある対象において突然変異しているＴＬＲ４コード配列（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の部分に相補的であり、かつ特異的にハイブリダイゼーションする。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＴＬＲ４遺伝子またはＲＮＡにおける突然変異配列に特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＴＬＲ４遺伝子ローカスに突然変異が存在することを示す。対照的に、増幅産物の不在は、特異的突然変異が試料に存在しないことを示す。
【００９７】
本明細書に開示される方法に使用することができる典型的な核酸プライマーは、点突然変異を含む突然変異ＴＬＲ４配列に、典型的には点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換または位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）を含む野生型ＴＬＲ４配列に特異的に相補的であって、そのＴＬＲ４配列にハイブリダイズするプライマーである。
【００９８】
本明細書に開示される方法におけるＡｓｐ２９９Ｇｌｙ多型に使用することができる特定のプライマーは、例えば
【００９９】
【表５】
2009543570.tif 000006
【０１００】
または
【０１０１】
【表６】
2009543570.tif 000007
【０１０２】
から選択される配列の全てまたは別個の部分を含む。本明細書に開示される方法におけるＴｈｒ３９９Ｉｌｅ多型に使用することができる特定のプライマーは、例えば
【０１０３】
【表７】
2009543570.tif 000008
【０１０４】
から選択される配列の全てまたは別個の部分を含む。ハイブリダイゼーションの検出法は、核酸配列の突然変異の検出に役立つ、相補的核酸配列の間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。
【０１０５】
特定の検出技法は、野生型または突然変異のＴＬＲ４遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用に続いて、ハイブリッドの存在の検出を伴う。このプローブは、懸濁状態でもよいし、（核酸アレイ技法の場合と同様に）基質または支持体に固定化されてもよい。プローブは典型的にはラベルされ、ハイブリッドの検出を容易にする。
【０１０６】
典型的なハイブリダイゼーション検出法は、以下の、突然変異ＴＬＲ４核酸（好ましくは遺伝子ローカス）に特異的な核酸プローブと対象からの試料を接触させる工程およびハイブリッドの形成を評価する工程を含む。特に好ましい態様では、この方法は、野生型ＴＬＲ４遺伝子ローカスおよびその様々な突然変異形にそれぞれ特異的なプローブのセットと試料を同時に接触させることを含む。この態様では、試料中のＴＬＲ４遺伝子ローカスにおける様々な形の突然変異の存在を直接検出することが可能である。また、様々な対象からの様々な試料を並行して処理してもよい。
【０１０７】
本明細書に開示される特定の方法は、ガンの処置、特に化学療法的処置に対する対象の感受性を評価する工程を含み、この方法は、（ａ）ＴＬＲ４配列を含むＤＮＡの被験試料を対象から得ること、（ｂ）少なくとも一つの核酸プローブと被験試料を接触させること（ここで、前記核酸は突然変異ＴＬＲ４配列に相補的であり、かつその配列と特異的にハイブリダイゼーションしてハイブリダイゼーション試料を形成する）、（ｃ）核酸プローブとＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な条件でハイブリダイゼーション試料を維持すること、および（ｄ）核酸プローブとＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションがあるかどうかを検出することを含む。核酸プローブとＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションは、そのガンが対象における前記処置に抵抗性であると実際に確認する。好ましくは、突然変異ＴＬＲ４配列は、処置抵抗性と関連する。前記処置は、好ましくは、例えばＤＯＸなどのアントラサイクリンおよび／またはオキサリプラチンもしくはシスプラチン（ＰＬＡＴ）の投与を含む化学療法、ならびに好ましくはＸ線（ＸＲ）を含む放射線療法から選択される。処置は、さらに放射線療法と組み合わせた化学療法を含むことがある。
【０１０８】
対象におけるガンの素因またはガンを有する見込みの増大を検出または判定する方法もまた本明細書に開示される。前記方法は、以下の工程、すなわち（ａ）ＴＬＲ４配列を含むＤＮＡの被験試料を対象から得る工程、（ｂ）少なくとも一つの核酸プローブと被験試料を接触させる工程（ここで、前記核酸は突然変異ＴＬＲ４配列に相補的であり、かつその配列と特異的にハイブリダイゼーションしてハイブリダイゼーション試料を形成する）、（ｃ）核酸プローブとＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションに十分な条件でハイブリダイゼーション試料を維持する工程、および（ｄ）核酸プローブとＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションがあるかどうかを検出する工程を含む。核酸プローブとＴＬＲ４配列の特異的ハイブリダイゼーションは、実際に対象におけるガンの素因またはガンを有する見込みの増大を示す。
【０１０９】
典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、３０℃を超える、好ましくは３５℃を超える、さらに好ましくは４２℃より高い温度、および／または約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩分が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩分および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度を改変することにより当業者が調整することができる。
【０１１０】
本開示のための「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション分子とターゲット配列との間で２５%未満のミスマッチがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。
【０１１１】
好ましい態様では、突然変異ＴＬＲ４配列は、点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）および位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）から選択される点突然変異を含む。
【０１１２】
本発明の文脈内で、プローブは、ＴＬＲ４の遺伝子またはＲＮＡ（のターゲット部分）と相補的であり、かつそれと特異的にハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチド配列であって、特に位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換または位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に至る多型を有するＴＬＲ４アレルに関連するポリヌクレオチド多型を検出するために適するポリヌクレオチド配列を表し、この多型は、ガンの素因があるか、またはガンと関連する。プローブは、好ましくはＴＬＲ４の遺伝子、ＲＮＡ、またはそのターゲット部分に完全に相補的である。プローブは、典型的には２５〜１００ヌクレオチド長、好ましくは２０〜５０ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。より長いプローブも同様に使用することができることを了解すべきである。本発明の好ましいプローブは、２５〜３０ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子であり、これは、変化を保持するＴＬＲ４核酸（例えば遺伝子またはＲＮＡ）の領域と特異的にハイブリダイゼーションすることができる。
【０１１３】
異常な（例えば突然変異）ＴＬＲ４配列（特に遺伝子またはＲＮＡ）に特異的な核酸プローブ、すなわち前記異常なＴＬＲ４配列と特異的にハイブリダイゼーションし、正常な（参照）ＴＬＲ４配列と本質的にハイブリダイゼーションしない核酸プローブが、本明細書に記載される。特異性は、ターゲット配列へのハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションにより発生するシグナルと区別することができる特異的シグナルを発生することを示す。完全な相補的配列は、本発明によるプローブを設計するために好ましい。しかし、特異的シグナルが非特異的ハイブリダイゼーションと区別することができる限り、ある種のミスマッチを許容してもよいことを了解すべきである。
【０１１４】
プローブの配列は、ガンの処置、ガンの存在、ガンの素因またはガンを有する見込みの増大に対する対象の感受性に連結した突然変異を、特にＳＮＰなどの点突然変異を保持するＴＬＲ４の遺伝子またはＲＮＡの任意の配列に基づき容易に調製することができる。これらの核酸分子のフラグメントまたは部分に基づき、例えばＴＬＲ４配列におけるヌクレオチド８９６（Ａ８９６Ｇ）およびヌクレオチド１１９６（Ｃ１１９６Ｔ）で確認された多型を包含する領域に基づきプローブおよびプライマーを発生させることもまた適切である。
【０１１５】
本明細書に記載する方法に実際に使用することができる典型的な突然変異ＴＬＲ４配列は、ＴＬＲ４の野生型配列および点突然変異、好ましくは位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換または位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。
【０１１６】
本明細書に記載する特定のプローブは、Ｄ２９９Ｇ多型を含むＴＬＲ４配列（Reference SNP Cluster Report: rs4986790）の全てもしくは別個の部分またはＴ３９９Ｉ多型を含むＴＬＲ４配列（Reference SNP Cluster Report: rs4986791）の全てもしくは別個の部分を含む。
【０１１７】
プローブのヌクレオチド置換および化学的改変を行ってもよい。このような化学的改変は、ハイブリッドの安定性を増大させるために（例えばインターカレーション基）、またはプローブをラベルするために達成してもよい。ラベルの典型的な例には、放射性同位体、酵素の基質、補因子、リガンド、化学発光剤または蛍光剤、ハプテン、および酵素が含まれるが、それに限定されるわけではない。ラベルのための方法および様々な目的に適したラベルの選択の指針は、例えばSambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989）およびAusubelら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998）に述べられている。
【０１１８】
本発明者らは、本明細書においてガンの処置、特に化学療法的処置に対する対象の感受性を評価する方法に、または対象におけるガンの素因もしくはガンを有する見込みの増大を検出もしくは測定する方法に、上記核酸プローブまたはプライマーを使用することを記載する。
【０１１９】
本明細書に開示される、ガンの処置、特に化学療法的処置に対する対象の感受性を評価する方法または対象におけるガンの素因を判定する方法は、先天的なものまたは獲得されたものであってもよい異常なＴＬＲ４タンパク質またはＴＬＲ４タンパク質の発現を検出することにより、上に示すようにさらに行うことができる。
【０１２０】
本発明による好ましい方法は、ＴＬＲ４タンパク質（正常なＴＬＲ４、すなわち野生型ＴＬＲ４、または異常なＴＬＲ４）への結合について確認されたリガンドと試料を接触させる工程、および例えば対象のＴＬＲ４と前記ＴＬＲ４リガンドとの間の複合体の形成を判定することにより、前記対象のＴＬＲ４と前記ＴＬＲ４リガンドとの間に結合が起こるかどうかを評価する工程を含む。
【０１２１】
リガンドは、所定のターゲットに特異的に結合する薬剤である。用語「特異的に」は、１０%未満、好ましくは５%未満の薬剤が、前記所定のターゲットとは異なるターゲットと結合することを意味する。したがって、ＴＬＲ４タンパク質特異的リガンドは、実質的にＴＬＲ４タンパク質とのみ結合する。実質的にＴＬＲ４タンパク質にのみ結合する特異的抗体および他の薬剤（およびその機能的フラグメント）などの異なる種類のリガンドを使用してもよい。
【０１２２】
本明細書に開示される好ましいリガンドは、異常なＴＬＲ４タンパク質またはポリペプチドに特異的に結合することについて確認されたリガンドである。
【０１２３】
抗ＴＬＲ４タンパク質抗体は、HarlowおよびLane（Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988）を含めたいくつかの出典に記載されている標準的な手順を使用して産生させることができる。特定のリガンドが実質的にＴＬＲ４タンパク質にのみ結合するという判定は、日常的な手順を使用または適応させることにより容易に下すことができる。一つの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ウエスタンブロット手順（Harlow and Lane（Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988）を含めた多数の標準的な出典に記載されている）を利用する。ウエスタンブロットは、抗ＴＬＲ４タンパク質モノクローナル抗体などの所与のＴＬＲ４タンパク質結合剤が実質的にＴＬＲ４タンパク質にのみ結合することを判定するために使用してもよい。
【０１２４】
本発明の文脈内で、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および実質的に同じ抗原特異性を有するそのフラグメントまたは誘導体を意味する。より短い抗体フラグメントもまた、特異的結合剤として役立つことがある。例えば、ＴＬＲ４に結合するＦＡｂ、Ｆｖ、および単鎖Ｆｖ（ＳＣＦｖ）は、ＴＬＲ４特異的結合リガンドであろう。
【０１２５】
これらの抗体フラグメントは、以下のように定義される：（１）ＦＡｂ、すなわち酵素パパインを用いて抗体全体を消化して、１本のインタクトな軽鎖および１本の重鎖の部分を回収することにより産生する抗体分子の一価抗原結合フラグメントを有するフラグメント；（２）ＦＡｂ’、すなわちペプシンで抗体全体を処理し、続いて還元して１本のインタクトな軽鎖および重鎖の部分を回収することにより得られる抗体分子フラグメント（抗体１分子あたり２個のＦＡｂ’フラグメントが得られる；（３）（ＦＡｂ’）２、すなわち酵素ペプシンで抗体全体を処理し、その後の還元を行わないことにより得られる抗体フラグメント；（４）Ｆ（Ａｂ’）２、すなわち二つのＦＡｂ’フラグメントが二つのジスルフィド結合により結合した二量体；（５）Ｆｖ、すなわち２本の鎖として発現された軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する遺伝子操作されたフラグメント；ならびに（６）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、すなわち適切なポリペプチドリンカーにより遺伝的に融合した単鎖分子として連結した軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する遺伝子操作された分子。これらのフラグメントを製造する方法は日常的である。
【０１２６】
本明細書に提示される特定の抗体は、以前に定義したような、そして本明細書に例示されるような異常なＴＬＲ４タンパク質またはポリペプチド、典型的には突然変異ＴＬＲ４ポリペプチドに特異的である。好ましくは、抗体は、ＴＬＲ４の細胞外ドメインから選択される配列の全てまたは別個の部分を含む。ＴＬＲ４の細胞外ドメインを配列番号３に示す。
【０１２７】
本発明に使用することができる別の特定の抗体は、野生型ＴＬＲ４ポリペプチドに特異的である。
【０１２８】
したがって、具体的な態様では、試料は、異常なＴＬＲ４タンパク質またはポリペプチドに特異的な抗体と接触され、免疫複合体の形成が測定される。免疫複合体を検出するために、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）などの様々な方法を使用することができる。
【０１２９】
ＴＬＲ４に対する結合について確認された他のリガンドは、例えば（ｉ）アントラサイクリン、シスプラチン、オキサリプラチンにより、またはＸ線により腫瘍細胞上に誘導されるＴＬＲ４リガンド、（ｉｉ）ＤＯＸまたはＰＬＡＴまたはＸ線−アポトーシス細胞、および（ｉｉｉ）グラム陰性細菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）から選択することができる。
【０１３０】
アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチンまたはＸ線により腫瘍細胞上に誘導されるリガンドは、特にＴＬＲ４Ｆｃ（抗ＴＬＲ４抗体Ｆｃフラグメント）、ＴＬＲ４Ｉｇ（抗ＴＬＲ４免疫グロブリン）および抗ＨＭＧＢ１抗体から選択されるプローブを使用して腫瘍細胞の表面に検出することができる。プローブは、好ましくはタグ付けされている。この試験には、好ましくは前記ＴＬＲ４リガンドの分泌を高める同種樹状細胞が含まれる。
【０１３１】
したがって特定の態様では、本発明は、本明細書においてＴＬＲ４経路による腫瘍細胞の免疫原性の欠如を検出するための方法を開示し、前記方法は、アントラサイクリン、シスプラチン、オキサリプラチンまたはＸ線で処置された自己腫瘍細胞であって、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ４Ｆｃ（抗ＴＬＲ４抗体Ｆｃフラグメント）、またはＴＬＲ４Ｉｇ（抗ＴＬＲ４免疫グロブリン）を発現する自己腫瘍細胞を接触させることを含み、前記ＴＬＲ４ＦｃまたはＴＬＲ４Ｉｇの結合の不在は、腫瘍細胞の免疫原性の欠如と相関する。
【０１３２】
ＥＬＩＳＡ結合アッセイまたはウエスタンブロット（ＷＢ）などの、当業者に周知の技法を上記方法に適用してもよい。
【０１３３】
非特異的結合が起こるおそれがあるものの、ターゲットＴＬＲ４ポリペプチドへの結合は高い親和性で起こり、非特異的結合と確かに識別することができる。
【０１３４】
試料の核酸またはポリペプチドと前述のリガンドまたはプローブとの接触は、プレート、チューブ、ウェル、ガラスなどの任意の適切な装置の中で行うことができる。特定の態様では、接触は、核酸アレイに関して、またはヌクレオチドアレイに存在する核酸プローブなどの特異的プローブもしくはリガンドアレイに関して行われる。
【０１３５】
公知のリガンドの例は、ＨＭＧＢ１、ＧＭＰ、ＬＰＳ、ヒアルロナン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ｈｓｐ６０またはｈｓｐ７０であり、これらは、本発明による薬学的組成物に使用することができる。これらは、正常または非突然変異ＴＬＲ４核酸または正常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有するが、アントラサイクリン、シスプラチン、オキサリプラチンまたはＸ線を用いた処置後にＴＬＲ４リガンドが誘導されていない対象におけるガンを治療または予防するために特に有用である。
【０１３６】
本発明は、対象の自己樹状細胞（ＤＣ）による細胞傷害性Ｔリンパ球クローン（ＣＴＬ）への同種腫瘍細胞、特に黒色腫細胞の異常な交差提示を検出することにより異常なＴＬＲ４活性を測定することを含む方法をさらに開示する。
【０１３７】
同種腫瘍細胞またはガン細胞は、例えばアントラサイクリン、シスプラチン、オキサリプラチンまたはＸ線で処理された腫瘍細胞であってもよい。特定の例では、同種腫瘍細胞はアポトーシス小体である。
【０１３８】
以前に記載したプローブとちょうど同様に、リガンドは、懸濁状態であってもよいし、基質または支持体上に固定化されていてもよい。
【０１３９】
基質は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の支持体などの固形基質または半固形基質であってもよい。基質は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどの様々な形状および大きさであってもよい。
【０１４０】
接触は、複合体が試薬（リガンドまたはプローブ）と試料の核酸またはポリペプチドとの間で形成するために適した任意の条件で行うことができる。
【０１４１】
したがって、試料は、ＴＬＲ４核酸またはポリペプチドの様々な形、例えばその野生型および様々な異常型などに特異的な様々なリガンドまたはプローブと同時にまたは並行してまたは連続的に接触させることができる。
【０１４２】
ＴＬＲ４は、主として骨髄系細胞［例えば単球、樹状細胞（ＤＣ）］にｉｎ  ｖｉｖｏで発現される。ＴＬＲ４シグナル伝達は、炎症促進性サイトカイン（例えばＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２）の分泌をトリガーし、ＤＣの成熟を加速するために重要である。
【０１４３】
したがって本出願では、異常なＴＬＲ４の発現または活性は、例えばＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２またはＩＬ−１２ｐ４０、Ｒａｎｔｅｓ、ＩＰ−１０およびＭＩＰ１ａから選択される化合物の分泌の不在もしくは存在に、またはその細胞レベルの変化にもまた相関しうる。このようなＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２またはＩＬ−１２ｐ４０の細胞レベルは、本発明者らによって開示される本明細書における方法で測ってもよい。このような測定値は、さらに正常レベルと比較することができる。測ったレベルは、好ましくは（ｉ）単球および／または樹状細胞（ＤＣ）ならびに（ｉｉ）ＴＬＲ４リガンド、好ましくはＨＭＧＢ１を含む培養物から測った参照レベルと比較される。
【０１４４】
異常なＴＬＲ４発現または活性は、正常なＴＬＲ４の異常な転写と相関させることもまたできる。異常な転写は、対照または基準の量またはレベルと比べて増加した発現のことがある。これは、例えばガンの処置またはガン自体により誘導される、対照または基準の量またはレベルと比べた発現減少のこともまたある。
【０１４５】
本発明は、正常なＴＬＲ４をコードするｍＲＮＡの細胞レベルを測ることにより異常なＴＬＲ４タンパク質の発現を測定することを含む方法を提供し、ここで、対照または基準のレベルと比べて減少したレベルは、異常なＴＬＲ４タンパク質の発現と相関される。ｍＲＮＡレベルは、患者から単離された単球または樹状細胞に関してｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測ってもよい。
【０１４６】
このような方法には、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖転写）の使用を含む工程が含まれることがある。
【０１４７】
異常なＴＬＲ４発現または活性は、さらに樹状細胞（ＤＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む共培養物中のＩＦＮγ（ＮＫ細胞由来）の細胞レベルを測ることにより検出してもよい。ＤＣは、被験対象由来の自己細胞である。ＮＫ細胞は、自己または同種であってもよい。共培養は、少なくとも一つのＴＬＲ４リガンドの存在下および任意のＴＬＲ４リガンド不在下で並行して行うことができる。測られた対象のＩＦＮγレベルは、さらに参照レベルと比較される。本発明者らは、異常なＩＦＮγレベル（公知の基準に比べて低い値）またはＩＦＮγの不在が異常なＴＬＲ４の発現と相関することを実際に発見した。
【０１４８】
インターロイキンおよびＩＦＮγの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーにおける細胞内サイトカイン染色などの、当技術分野で周知の技法により測定することができる。
【０１４９】
異常なＴＬＲ４の発現または活性は、ＴＬＲ４突然変異を示すかまたは示さない食細胞のエンドソームｐＨを測ることによってもまた検出することができる。前記ｐＨは、さらに正常なｐＨと比較することができる。異常なｐＨは、異常なＴＬＲ４の発現と相関する。７よりも小さい、好ましくは６、５または４よりも小さいｐＨが、異常なＴＬＲ４活性と相関する。
【０１５０】
任意の特定の理論に縛られることを望むわけではないが、本発明者らは、ＴＬＲ４がアントラサイクリン／オキサリプラチン／シスプラチン／ＸＲに対する応答性に影響しうるメカニズムが、骨髄前駆細胞、すなわち樹状細胞（ＤＣ）に関与するであろうと考える。実際に、ＤＯＸに誘導されるアポトーシス腫瘍細胞でパルスしたＴＬＲ４−／−骨髄ＤＣは、ＴＬＲ４−／−マウスにおいてナイーブＴ細胞をプライミングできないが、ＴＬＲ４＋／＋のＤＣ対応物はプライミングできる。しかし、ＴＬＲ４機能障害により促進されるＴ細胞のプライミング障害は、取込みも成熟プロセスを意味するのではなく、むしろＤＣのエンドソーム区画内での抗原輸送（routing）および分解を意味する。したがって、ＴＬＲ４は、担ガンホストにおける化学療法または放射線療法によりトリガーされる免疫原性アポトーシスの効力をコントロールする。
【０１５１】
したがって本発明者らは、本明細書において対象の自己樹状細胞（ＤＣ）による細胞傷害性リンパ球クローン（ＣＴＬ）またはＣＤ４＋Ｔ細胞クローンへの、好ましくはそれぞれＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ依存的な同種腫瘍細胞の異常な交差提示を検出することにより、異常なＴＬＲ４の活性を測定することを含む方法を提供する。
【０１５２】
特定の例では、ＨＬＡ−Ａ＊０２発現ＤＣは、例えばＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ１抗原を有する、Ｘ線で誘導された同種黒色腫腫瘍細胞系（ＨＬＡ−Ａ２陰性）でパルスすることができる。このようなＤＣは、交差提示がｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こらない場合にＩＦＮγを産生するＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｍａｒｔ１特異的ＣＴＬクローンと共にインキュベーションすることができよう。ＴＬＲ４野生型個体では交差提示が起こり、ＩＦＮγがＥＩＡで測定されるが、その一方でＡｓｐ２９９Ｇｌｙ  ＴＬＲ４  ＤＣまたはＴｈｒ３９９Ｉｌｅ  ＴＬＲ４では、ＤＣにパルスされたアポトーシス物質のどの薬用量でも交差提示が失敗するであろう。
【０１５３】
本発明者らは、さらに後期エンドソームとリソソームとの間の融合を検出することにより異常なＴＬＲ４の活性を測定することを含む方法を提供する。
【０１５４】
この方法は、共焦点顕微鏡または電子顕微鏡でエンドソーム区画（食細胞、Ｘ線でアポトーシスを起こした腫瘍細胞、好ましくはラベルされた腫瘍細胞が貪食されたものを含む）とリソソーム（例えばＦＩＴＣ中の抗ＬＡＭＰ  Ａｂでラベルされている）との融合動態を検出することを目的にする。マージは、例えば１５分、３０分、１時間および３時間で細胞内の二重陽性区画を正確に定量させる。ＴＬＲ４−／−ＤＣでは、死滅した小体を含有する区画とリソソームとの共局在は顕著に加速される。
【０１５５】
したがって前に言及したように、本出願に記載する方法は、好ましくは自己の単球、樹状細胞および単核細胞から選択される、正常状態のＴＬＲ４を発現する細胞を含む試料に好ましくは行われる。
【０１５６】
本発明者らは、本明細書において骨髄移植を受ける対象のＴＬＲ４突然変異状態を判定することを含む診断法をさらに記載する。
【０１５７】
以前に定義されたように、ガンの処置、特にガンの化学療法的処置に対する対象の感受性を評価する方法に使用するためのキット、または対象におけるガンの素因を判定する方法に使用するためのキットが、本明細書にさらに提供される。このキットは、前述の異常な、好ましくは突然変異したＴＬＲ４配列と特異的にハイブリダイゼーションする前述の核酸プローブを含み、この配列は、そのガンが対象における前記治療に対して抵抗性であると確認するか、またはガンの素因増大もしくはガンを有する見込みの増大と関連する。
【０１５８】
このキットは、前述のようなプライマーおよび／またはリガンド、例えば抗体をさらに含んでもよい。このキットは、ハイブリダイゼーション、増幅または抗原−抗体免疫反応を行うための試薬および／またはプロトコールもまた含むことがある。
【０１５９】
本明細書に記載する方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行ってもよい。これらは好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【０１６０】
スクリーニング法
本出願は、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するための化合物を、好ましくは薬物候補または先導物をスクリーニングするための新規な方法もまた提供し、この方法は、被験化合物がＴＬＲ４の発現または活性をモデュレーションする能力を測定することを含む。
【０１６１】
上記方法を用いてスクリーニングされる好ましい被験化合物は、突然変異した、または異常なＴＬＲ４の機能的発現を回復または増強することができる。
【０１６２】
本明細書に開示されるスクリーニング法は、好ましくはＴＬＲ４核酸またはポリペプチドと同様にＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしてＮＦ−κＢ活性化に導く分子を新しいターゲットとして使用する。この方法には、結合アッセイおよび／または機能的アッセイが含まれ、この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞系、動物などにおいて行うことができる。
【０１６３】
本発明者らは、特に生物学的活性化合物、さらに特定すればガンの予防または治療に活性な化合物を選択する方法を開示し、前記方法は、ＴＬＲ４核酸（例えば遺伝子またはＲＮＡ）、ＴＬＲ４ポリペプチド、ＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしてＮＦ−κＢ活性化に導く分子、およびそのフラグメントから選択される産物と被験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させること、ならびに前記被験化合物が前記産物と結合する能力を測定することを含む。
【０１６４】
さらなる特定の態様では、この方法は、本発明によるＴＬＲ４ポリペプチドを発現するリコンビナントホスト細胞またはＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしてＮＦ−κＢ活性化に導く分子を被験化合物と接触させること、および前記被験化合物が前記ＴＬＲ４ポリペプチドまたはＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスする前記分子とそれぞれ結合し、その活性をモデュレーションする能力を測定することを含む。特定の態様では、前記ＴＬＲ４ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＴＬＲ４の異常状態の原因であるか、または突然変異を含む異常な、好ましくは突然変異した、ＴＬＲ４ポリペプチドまたはそのフラグメントである。
【０１６５】
前記核酸、ポリペプチドまたは分子への結合は、被験化合物が前記ターゲットの活性をモデュレーションし、したがって対象においてガンに導く経路に影響する能力に関する指標を提供する。
【０１６６】
結合の判定は、当業者に公知の様々な技法により行うことができ、被験化合物のラベルによる、特定のＴＬＲ４タンパク質またはポリペプチド（野生型または異常なＴＬＲ４）への結合について公知または確認された、ラベル化された対照または参照リガンドとの競合によるなどのその一部は、本明細書において前述された。
【０１６７】
本明細書に記載するさらなる目的は、生物学的活性化合物を、さらに特定すれば突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンの予防または治療に活性な化合物を選択する方法にあり、前記方法は、本発明によるＴＬＲ４遺伝子と被験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることおよび前記被験化合物が前記ＴＬＲ４遺伝子の発現をモデュレーションする能力を測定することを含む。
【０１６８】
このような生物学的活性化合物を選択する別の方法がさらに提供され、ここで、前記方法は、ＴＬＲ４ポリペプチドまたはＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしてＮＦ−κＢ活性化に導く分子と被験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程および前記被験化合物が前記ＴＬＲ４ポリペプチドまたはＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスする前記分子の活性をそれぞれモデュレーションする能力を測定する工程を含む。
【０１６９】
目下開示されている方法に使用することができる特定のＴＬＲ４遺伝子、ポリペプチドまたはそのフラグメントは、好ましくはＴＬＲ４ポリペプチドの位置２９９でアスパラギンのグリシンによる置換に導く突然変異および／またはＴＬＲ４ポリペプチドの位置３９９でトレオニンのイソロイシンによる置換に導く突然変異を含む、本出願における前述の突然変異ＴＬＲ４遺伝子、ポリペプチドまたはそのフラグメントである。
【０１７０】
目下開示されている方法に使用することができる、ＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしてＮＦ−κＢ活性化に導く特定の分子は、ＴＬＲ３リガンドおよび／またはＴＬＲ９リガンド、例えば二本鎖ＲＮＡ（例えばポリＡ：ＵおよびポリＩ：Ｃ）および／または低メチル化されたＣおよびＧ富化オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）から選択することができる。
【０１７１】
本発明の別の特定の目的は、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンの予防または治療に活性な化合物を選択する方法にあり、前記方法は、ＴＬＲ４の活性のレギュレーションに関与するポリペプチドと、好ましくはＭｙＤ８８もしくはＴＲＩＦポリペプチドと、いっそうさらに好ましくはＭｙＤ８８ポリペプチドと、またはその結合部位含有フラグメントと被験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させること、および前記被験化合物が前記ポリペプチドまたはそのフラグメントと結合する能力を測定することを含む。
【０１７２】
さらに特定の態様では、この方法は、ＴＬＲ４の活性のレギュレーションに関与するポリペプチド、好ましくはＭｙＤ８８もしくはＴＲＩＦポリペプチド、いっそうさらに好ましくはＭｙＤ８８ポリペプチドを発現しているリコンビナントホスト細胞を被験化合物と接触させる工程、および前記被験化合物が前記ポリペプチドと結合して前記ポリペプチドの活性をモデュレーションする能力を測定することを含む。
【０１７３】
本明細書に開示されるさらなる方法は、生物学的活性化合物を、さらに特定すれば突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンの予防または治療に活性な化合物を選択する工程を含み、前記方法は、ＴＬＲ４の活性のレギュレーションに関与する遺伝子と、好ましくはＭｙＤ８８またはＴＲＩＦをコードする遺伝子と、なおさらに好ましくはＭｙＤ８８をコードする遺伝子と被験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させること、および前記被験化合物が前記遺伝子の発現をモデュレーションする能力を測定することを含む。
【０１７４】
スクリーニング法の特定の態様では、モデュレーションは活性化である。スクリーニング法の他の特定の態様では、モデュレーションは阻害である。
【０１７５】
本発明の方法は、多数の化合物をスクリーニングするために適する。これらの化合物は、様々な起源、性状および組成でありうる。被験化合物は、単離された状態または他の物質と混合された状態の脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などの任意の有機物または無機物であってもよい。この化合物は、例えば産物のコンビナトリアルライブラリーの全てまたは部分であってもよい。
【０１７６】
アントラサイクリン、ＰＬＡＴまたはＸ線により腫瘍細胞上に誘導されるリガンドは、ＴＬＲ４Ｆｃ、ＴＬＲ４Ｉｇおよび抗ＨＭＧＢ１抗体から特に選択されるプローブを使用して、腫瘍細胞培養でスクリーニングしてもよい。プローブは、優先的にタグ付けされている。
【０１７７】
特定の態様では、本発明は、突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを処置するために有用な化合物をスクリーニングするための方法もまた開示し、前記方法は、被験化合物がＴＬＲ４のリガンドの発現または活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで誘導または増加させる能力を測定することを含む。
【０１７８】
ＴＬＲ４リガンドは、ＴＬＲ４の発現をアップレギュレーションしていた。本発明者らは、ＴＬＲ４リガンドが化学療法または放射線療法に、特に化学療法に対する対象の感受性を増大できることをさらに実証した。
【０１７９】
このような化合物は、共焦点顕微鏡を使用して検出することができる。実際に、化学療法または放射線療法の施与後に、内因性ＴＬＲ４リガンドが核から腫瘍細胞の細胞膜に１〜３０分以内に移行することが本発明者らによって示された。
【０１８０】
ＴＬＲ４の発現をアップレギュレーションするために、かつ／または化学療法および／もしくは放射線療法に対する対象の感受性を増大させるために使用することができる、本明細書において確認された好ましいリガンドは、ＨＭＧＢ１およびＬＰＳである。
【０１８１】
上記スクリーニング法は、プレート、例えばマルチウェルプレート、チューブ、皿、フラスコなどの任意の適切な装置中で行ってもよい。いくつかの被験化合物を並行してアッセイすることができる。
【０１８２】
記載するスクリーニング法により得られる物質は、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンの治療または予防のための薬学的組成物を調製するために使用することができる。
【０１８３】
記載するスクリーニング法により得られる物質は、化学療法および／または放射線療法（例えばＸ線を使用したもの）に対する対象の、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象の、特に骨髄移植、さらに特定すれば同種骨髄移植を受ける対象の感受性を高めるための薬学的組成物を調製するためにもまた使用することができる。
【０１８４】
対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するために機能的ＴＬＲ４発現を回復または増強、すなわち増加または有利にすることができる公知の、または前述のスクリーニング法を用いて単離された生物学的活性化合物の使用が、特に本明細書に提供される。対象は、好ましくは前に説明したように突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する者である。
【０１８５】
本発明は、対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するための、機能的ＴＬＲ４の発現を回復することができる任意の公知の化合物および本発明によるスクリーニング法を用いて確認された任意の化合物、ならびにそのような化合物を含む任意の薬学的組成物を包含する。
【０１８６】
本明細書に提供される薬学的組成物は、前記ガンの予防または治療に同時に、別々にまたは連続的に使用するための組み合わせ調製物として、ＤＯＸなどのアントラサイクリン、オキサリプラチンおよび／またはシスプラチン（ＰＬＡＴ）から選択される少なくとも一つの化合物をさらに好都合に含んでもよい。
【０１８７】
好ましい態様では、本明細書に記載する薬学的組成物、特に化学療法産物を含まない薬学的組成物が、ＴＬＲ４が突然変異した個体において化学療法または放射線療法の施与を含む任意の処置前に投与される。薬学的組成物の投与は、任意のその後の処置の前および／または間に、例えば任意のその後の処置の１日前および前記処置の間に、３週間毎に単回投与または繰り返し投与して行ってもよい。
【０１８８】
別の例では、薬学的組成物の投与は、化学療法的処置期間中に毎日、および前記化学療法的処置が終了した数日後に、典型的には前記化学療法的処置が終了した１、２、３、４、５、６、７（１週間）、８、９または１０日後にもまた行うことができる。
【０１８９】
したがって特定の態様では、本発明者らは、本明細書において機能的（例えば野生型）ＴＬＲ４ポリペプチド、機能的ＴＬＲ４ポリペプチドをコードする核酸、機能的ＴＬＲ４ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターまたは機能的ＴＬＲ４ポリペプチドをコードする核酸を含むリコンビナントホスト細胞を含む薬学的組成物を提供する。
【０１９０】
この組成物は、さらにまたはその代わりに、ＴＬＲ４の発現を回復または増強することができる、公知のまたは前に記載された方法を用いて選択される生物学的活性化合物から好ましくは選択される、本発明に開示される少なくとも一つの産物を含んでもよい。
【０１９１】
本明細書に開示される薬学的組成物は、薬学的に許容される担体またはビヒクルをさらに含む。
【０１９２】
対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するための、ＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしＮＦ−κＢ活性化に導く生物学的活性化合物の使用が、本明細書にさらに提供される。
【０１９３】
本発明は、対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するための、ＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしＮＦ−κＢ活性化に導く生物学的活性化合物、およびそのような化合物を含む薬学的組成物もまた包含する。
【０１９４】
ＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしＮＦ−κＢ活性化に導く、好ましい生物学的活性化合物は、ＴＬＲ３リガンドまたはＴＬＲ９リガンドである。ＴＬＲ３リガンドは、例えばポリＡ：ＵおよびポリＩ：Ｃから選択することができる。ＴＬＲ９リガンドは、低メチル化されたＧ富化オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチド−ＣｐＧ  Ａ、ＢまたはＣ）から選択することができる。
【０１９５】
対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを治療または予防するための薬学的組成物を調製するためのアルカリ化リソソーム指向性化合物の使用が、本明細書にさらに提供される。
【０１９６】
本発明は、対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するためのアルカリ化リソソーム指向性化合物およびそのような化合物を含む薬学的組成物もまた包含する。
【０１９７】
アルカリ化リソソーム指向性化合物は、液胞型ＡＴＰアーゼを妨害する化合物、クロロキン、キニンおよびその任意の組み合わせから選択される任意の化合物でありうる。本発明に使用することができる、液胞型ＡＴＰアーゼを妨害する化合物の例は、バフィロマイシン、アピクラレン（apicularen）、アルカゾリド（archazolid）およびコンカナマイシンである。
【０１９８】
正常なＴＬＲ４タンパク質の発現または活性を有する対象の骨髄は、対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象における、特に前に定義された骨髄移植を受ける対象におけるガンを予防または治療するために、さらに使用することができる。
【０１９９】
上に開示された化合物を含む薬学的組成物は、前記ガンの予防または治療に同時に、別々にまたは連続的に使用するための組み合わせ調製物としてアントラサイクリン、オキサリプラチンおよび／またはシスプラチン（ＰＬＡＴ）もさらにまた含んでもよい。
【０２００】
したがって、（ｉ）ＴＬＲ４シグナル伝達経路をバイパスしてＮＦ−κＢ活性化に導く生物学的活性化合物、好ましくは前述のＴＬＲ３リガンドおよび／もしくはＴＬＲ９リガンドならびに／またはアルカリ化リソソーム指向性化合物と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体またはビヒクルとを含む薬学的組成物もまた、本明細書に提供される。前記薬学的組成物は、アントラサイクリン、オキサリプラチンおよびシスプラチンから選択される少なくとも一つの産物をさらに含んでもよい。このような組成物は、対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを予防または治療するために使用することができる。
【０２０１】
上記薬学的組成物は、任意の化学療法または放射線療法の前に、例えば１日前に、および／またはその間に投与することができる。これらは、好ましくは任意の化学療法または放射線療法の間に、および／または後に投与される。
【０２０２】
本明細書に提供される薬学的組成物の投与は、当業者に公知の任意の方法により、好ましくは経口経路または注射により（好ましくは全身経路により）行うことができる。投与される用量は、当業者によって合わせられることがある。
【０２０３】
治療に関して典型的には、投与用量は、例えば：
−  ４−エピルビシン（アントラサイクリン）に関して：３週間毎に１００mg/m2；
−  オキサリプラチンに関して：３週間毎に約６００〜１０００mg/m2；
−  核酸化合物に関して、用量は例えば３５〜５０mg/週の範囲のポリＡ：Ｕ、６週間でありうる。
【０２０４】
予防的処置に関連して、本発明による薬学的組成物は、好ましくは３週間毎に投与される。
【０２０５】
繰り返し処置は、可能性があることには他の活性薬剤、治療法または任意の薬学的に許容されるビヒクル（例えば緩衝剤、等張食塩水、安定化剤の存在下など）と組み合わせて行ってもよいことが了解されている。
【０２０６】
本発明は、対象、特に突然変異ＴＬＲ４核酸または異常なＴＬＲ４タンパク質の発現もしくは活性を有する対象におけるガンを、ＴＬＲ４の発現または活性の活性化により治療または予防する方法にもまたある。対象は、正常なＴＬＲ４タンパク質の発現または活性を有するドナー対象の骨髄を使用した同種骨髄移植を受ける患者でありうる。
【０２０７】
さらに特定すれば、ＴＬＲ４遺伝子の突然変異アレルを保持するか、または異常なＴＬＲ４タンパク質を発現する対象を処置する方法（組み合わせ療法を含む）が本明細書に提供される。したがって対象は、例えば遺伝子療法、タンパク質置換療法またはＴＬＲ４タンパク質模倣体および／もしくは活性化因子の投与により処置してもよい。前記方法の少なくとも一つをさらに化学療法または放射線療法と組み合わせてもよい。
【０２０８】
本発明は、本明細書前記の産物を使用して、ＴＬＲ４の発現または活性の活性化により対象におけるガンを処置する方法にもまたある。
【０２０９】
ガン患者もしくはガンを発生するリスクのある患者における、ガンの処置に対する対象の感受性を評価すること、または先天的な、もしくは獲得されたＴＬＲ４欠損を検出することを目標にする本明細書に記載する診断法は、このような処置について選択することができる対象に、特にガンの処置を、特に化学療法的処置および／または同種骨髄移植を受ける対象に適用してもよい。同種骨髄移植を受ける対象に関しては、適切な骨髄ドナー対象を選択することが好ましい。適切な骨髄ドナー対象は、本明細書に定義される正常なＴＬＲ４タンパク質の発現または活性を有する対象である。
【０２１０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の実験の節（図１〜１７参照）に示されるが、これらは例示的であって、本出願の範囲を限定するものではないとみなすべきである。
【０２１１】
実験の部
本発明者らは、ガンを処置するための腫瘍学者の装備に通例利用される多様なアポトーシス促進剤の効力にＴ細胞免疫が果たす役割について最初に取り組んだ。第１に、本発明者らは、免疫適格マウスにおいて、いくつかの化合物、すなわちＤＯＸ、ＰＬＡＴおよびＸＲが、Ｔ細胞を欠如した無胸腺Ｎｕ／Ｎｕ同腹仔よりも強力な抗腫瘍効力を仲介したことを見出した。
【０２１２】
第２に、自然免疫がコグネイトＴ細胞介在性免疫応答の成り行きを指示することから、本発明者らは、化学療法または放射線療法によって誘導される抗腫瘍効果に関与する自然レセプターをスクリーニングし、ＴＬＲ４が選択的に関係づけられることを見い出した。ＴＬＲ４シグナル伝達の下流で、ＴＲＩＦおよびＭｙＤ８８は、異なる炎症の成り行きに導く重大な経路である。細胞傷害療法は、ＴＲＩＦではなくＭｙＤ８８による免疫原的細胞死を誘導する。
【０２１３】
第３に、本発明者らは、放射線療法（ＸＲ）をＴＬＲ３リガンドまたはＴＬＲ９リガンドと組み合わせた場合に、ＴＬＲ４欠損マウスがＸＲ誘導性細胞死に対する完全な感受性および長期生存を取り戻すことを発見した。
【０２１４】
第４に、本発明者らは、ＴＬＲ４が化学療法および／またはＸ線療法後の長期生存に重大であるメカニズムを強調した：
−  外因性抗原（アポトーシス死小体）の交差提示が適切に起こることができず、抗腫瘍特異的Ｔ細胞を誘発できない；
−  外因性抗原の細胞内輸送は、野生型（ＷＴ）ＤＣおよびＴＬＲ４−／−  ＤＣで異なる。ＴＬＲ４−／−  ＤＣでは、リソソームの外因性抗原分解の加速が観察される。
【０２１５】
第５に、本発明者らは、ＨＭＧＢ１がＴＬＲ４+ＤＣによるＣＴＬへのアポトーシス小体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ交差提示に関与することを発見した。
【０２１６】
本発明者らは、さらに、突然変異Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ  ＴＬＲ４アレルを有する雌よりもｗｔ遺伝子型を有する雌の方が無進行生存（５年以内）が有意に長いことを実証する（図１１参照、ログランク解析）。
【０２１７】
最後に、本発明者らは、散発性乳ガン患者または大腸ガン患者もまた、対照（＜１０%）よりも高い頻度（＞２５%）の突然変異Ａｓｐ２９９Ｇｌｙアレルを示すことを発見した。
【０２１８】
１．材料と方法
マウス系統
Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２d）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）およびヌードＢａｌｂ／ｃマウスは、Centre d'elevage Janvier（Le Genest St Isle, France）およびCharles River Laboratories（L'Arbresle, France）から得た。ヌードＣ５７ＢＬ／６マウスは、Taconic Animal Laboratory（Ejby, Denmark）から得た。ヌードｓｗｉｓｓマウス（ｎｕ／ｎｕ）は、発明者自身の動物施設（Villejuif, France）で繁殖させた。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＢａｌｂ／ｃ  ＴＬＲ４−／−マウス（Gregoire Lauvau提供）ならびにＭｙＤ８８−／−およびＴｒｉｆ−／−マウス（Bernhard Ryffel提供）は、発明者の無病原体動物施設で飼育した。最終的に、Ｃ５７ＢＬ／１０およびＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＮＪマウスは、Jackson Laboratoryから購入した。動物は、６〜２０週齢の間に使用した。全ての動物は、動物実験倫理委員会ガイドライン（Val de Marne, France）通りに維持した。
【０２１９】
腫瘍細胞系
ＣＴ２６およびＴＳ／Ａは、それぞれＢＡＬＢ／ｃマウスと同系の大腸ガンおよび乳ガン細胞系である。Ｂ１６Ｆ１０は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同系の黒色腫ガン細胞系である。細胞は、１０%ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、１mMピルビン酸塩および１０mM  Ｈｅｐｅｓを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で５%ＣＯ２下で３７℃で培養した。
【０２２０】
処理されたＣＴ２６細胞３×１０6個を２００μlのＰＢＳに入れて６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories）の下側腹部に皮下接種し、一方で未処理対照細胞５×１０5個を対側の側腹部に接種した。同様に、ＴＳ／Ａ細胞１×１０5個をマウスの右側腹部に接種した。
【０２２１】
細胞死アッセイ
細胞をトリプシン処理し、細胞生存率の測定のために２．５μMのＤＡＰＩ（Invitrogen）で１０分間染色後にFACSVantageを用いた細胞蛍光測定分析に供し、ホスファチジルセリン曝露を評価するためにアネキシンＶをフルオレセインイソチオシアネート（Bender Medsystems）とコンジュゲーションさせた［３０］。
【０２２２】
腫瘍同種移植片
Ｇｌａｓｇｏｗ骨肉腫（ＧＯＳ）および膵臓腺ガン（Ｐ０３）腫瘍は、F. Levi（Paul Brousse Hospital, Villejuif）により親切に提供を受けた。腫瘍は、６週齢を超えるｎｕ／ｎｕマウス中で維持し、Grandaらにより以前に記載されたような皮下（ｓ．ｃ．）移植片（implant）としてそれぞれ２週間または４週間毎に継代した［３１］。
【０２２３】
試薬
高純度リポ多糖（ＬＰＳ）はInvivogenから購入し、終濃度１μg/mlで培養に使用した。ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））はAmpligenから得た。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、ポリ（Ｉ：Ｃ）を食塩水に希釈し、放射線療法後の＋１日目、＋４日目および＋７日目に、ＸＲ処置に供されたマウスに５０μgをｉ．ｐ．注射した。同様に、A. Carpentier博士（Department of Neurology, Groupe Hospitalier Pitie Salpetriere, Paris, France）から頂いた
【０２２４】
【表８】
2009543570.tif 000009
【０２２５】
を放射線療法の１日後に投与した。
【０２２６】
阻害性ＴＬＲ４ペプチド
ＮＨ２末端Ｔａｔ配列を有するＴＬＲ４  ６６３−６８６ペプチドは以下の通りであった：
【０２２７】
【表９】
2009543570.tif 000010
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、ＣＴ２６アポトーシス細胞を免疫処置後の０日目、＋３日目および＋６日目にマウスにペプチド１００μgをｉ．ｐ．注射した。
【０２２９】
ＴＬＲ７／９を妨害するＯＤＮ
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に基づくＴＬＲ７／９シグナル伝達阻害剤および対照ＯＤＮは、F. Barrat（Dynavax, Berkeley, CA, USA）により親切に提供を受けた。ＴＬＲ７／９阻害性ＯＤＮ（ＩＲＳ９５４）および対照ＯＤＮ（ＯＤＮ５３２）の配列は、それぞれ
【０２３０】
【表１０】
2009543570.tif 000011
【０２３１】
である。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために、ＯＤＮを食塩水に希釈した。ＴＬＲ７／９シグナル伝達の有効な阻害を達成するために、ＸＲ処置に供されたマウスに−４日目、−１日目および＋２日目に５０μgのＯＤＮを与えた。対照マウスには同様にＯＤＮを同じスケジュールで投与した。阻害性ＯＤＮの効力を評価するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスに食塩水または２５μgの免疫刺激性ＣｐＧのいずれかをｓ．ｃ．注射した。注射の２時間後にマウスから採血し、マウス血清中のＴＮＦａおよびＩＬ−１２ｐ４０濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２３２】
アポトーシス腫瘍細胞ワクチンの調製（ＤＯＸまたはＸＲ）
２０μＭドキソルビシンを補充した培地中でＣＴ２６細胞を４〜２４h培養した。または、Ｂ１６ＯＶＡ細胞を１μMイダルビシン（Aventis）で２４h処理して細胞死を誘導した。
【０２３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮を促進するための化学療法または放射線療法プロトコール
Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部にＴＳ／Ａ細胞１０5個を注射した。次に、マウスをそれぞれ３〜６匹の処置群にランダムに割り付けた。腫瘍の成長は、ノギスを使用してモニターした。腫瘍の大きさが３０〜５０mm2に達したときに処置を開始した。イソフルランを使用してマウスを短時間麻酔し、確実に固定するためにプラスチック拘束器に注意深く入れた。照射する腫瘍領域以外の全身は、鉛シールドにより保護した。全Ｘ線量１０Gyをシングルショットで送達した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮膚にＧＯＳまたはＰ０３いずれかの腫瘍移植片を移植した。腫瘍が触知可能になったときに処置を開始した（［３１］により記載されている通り）。５日目に、触知可能なＧＯＳ腫瘍を有するマウスをオキサリプラチン（５mg/kg  ｉ．ｐ．）で処置した。同様に、（普通は９日目から１３日目の間に）触知可能なＰ０３腫瘍を有するマウスにドセタキセル（６０mg/kg）をｉ．ｐ．注射した。
【０２３４】
マウス樹状細胞、食作用、成熟、サイトカイン分泌、Ｔ細胞活性化についての機能的アッセイ
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、以前に記載されたようにＦＬＴ３Ｉを使用して発生させた［３０］。成熟および食作用の実験は、以前に記載されたように行った［３０］。簡潔には、樹状細胞をCytoTracker Red（ＣＭＴＭＲ；Invitrogen）で予備染色したアポトーシスまたはネクローシスＣＴ２６細胞と１：１または５：１の比で食作用実験のために２〜４h、または成熟実験のために２４h同時インキュベーションした。次に、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６分子に特異的なＦＩＴＣコンジュゲーション抗体（Becton Dickinson）を用いたＦＡＣＳにより細胞を分析した。免疫磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用して精製し、生存またはアポトーシス性ＣＴ２６またはＴＳ／Ａ細胞と共に１：１および５：１の比で２４時間同時インキュベーションした新鮮単離されたＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞について樹状細胞の成熟およびサイトカイン分泌もまた評価した。次に、上清を採集し、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮｇの分泌をＥＬＩＳＡ（OptEIA ELISA Kit；BD Biosciences）により測定した。
【０２３５】
プライミング実験のために、Lutzらのプロトコール［３２］を幾分改変したものにしたがって骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を調製した。ペニシリン（１００U/ml Gibco）、ストレプトマイシン（１００μg/ml Gibco）、Ｌ−グルタミン（Gibco）、２−メルカプトエタノール（５０μM, Sigma）、１０%熱不活性化濾過ＦＣＳ（Gibco）、および３０%のＪ５５８上清を補充したIscoves培地（Sigma）中でＢＭＤＣを培養した。ＢＭＤＣは、培養物中の樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋およびクラスＩＩ＋の両方）の率が８０%を超えた１０日目から１２日目の間に使用した。ＢＭＤＣを静かに回収し、アポトーシス腫瘍細胞（ＣＴ２６  ＤＸまたはＢ１６ＯＶＡ  Ｉｄａ）共に１０：１の比で同時培養した。４時間インキュベーション後に、アポトーシス小体をロードされたＢＭＤＣをリン酸食塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの足底に、ロードされた樹状細胞３・１０5個を注射した。または、負のプライミング実験のために、腫瘍細胞３・１０5個を樹状細胞なしで注射した。
【０２３６】
５日目に、流入領域リンパ節の神経節細胞を採集し、細胞１０5個／ウェルで９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（Nunc）プレートに蒔き、抗ＣＤ３ｅ  ｍＡｂ（１０μg/ml）および低用量のＩＬ−２（１００U/ml）を用いたＴＣＲ交差結合に供した。上清を２４時間後に採集し、サイトカインの分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。
【０２３７】
ＤＮＡ試料
１９９０年から２００６年の間にGustave Roussy Instituteに入った、乳ガンを有する女性１５３人のコホートからゲノム材料を得た。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は市販のキット（Qiagen）を使用して血中白血球から単離した。または、ＤＮＡはパラフィン包埋組織から単離した。非腫瘍組織の２０μm切片はキシレンで脱パラフィンし、エタノールで再水和した。次に、試料を９５℃で５分間煮沸してＤＮＡを回収し、このＤＮＡを最終的に４℃で保存してから増幅させた。
【０２３８】
プライマーおよびアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
ＴＬＲ４  Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ突然変異部位を有する１０１bpフラグメントを増幅するためにＰＣＲプライマーを構築した（Applied Biosystems）。Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ多型のために以下のプライマーを使用した：
【０２３９】
【表１１】
2009543570.tif 000012
【０２４０】
それぞれ野生型Ａｓｐ２９９アレルおよび２９９Ｇｌｙアレル変異体のためにセンス配列：
【０２４１】
【表１２】
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【０２４２】
を有する二重ラベルＡＳＯ（Applied Biosystems）を設計した（イタリック体の塩基は各ＡＳＯについての多型部位を示す）。
【０２４３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の条件およびデータ解析
５μlの２×Universal Taqman Master Mix（Applied Biosystems）、０．２５μlの４０×ＰＣＲプライマーおよびTaqman MGBプローブならびに２．７５μlのｄＨ2Ｏを添加することによって反応１回あたり基準容量２μlのｇＤＮＡ（５ng）を増幅させた。９６ウェル蛍光プレート（ABgene）中でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃で１０minの初回変性、９２℃で１５sの変性および６０℃で６０sのアニーリングを４５サイクル。ABIPrism 7700配列検出器（Applied Biosystems）で蛍光シグナルを自動測定した。ＦＡＭシグナルをそれに対応するＶＩＣ（商標）シグナルと比較し、Van Rijnらにより以前に記載されたように各データポイントについて−ｌｏｇ（ＦＡＭ／ＶＩＣ）比を計算することによって遺伝子型を各対象に割り付けた［３３］。
【０２４４】
２．抗腫瘍免疫応答を誘導する細胞傷害性化合物
アントラサイクリンに誘導されるアポトーシスがカスパーゼ依存的に腫瘍細胞の免疫原性を促進したことが、最近報告された［３０］。したがって、本発明者らは、ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する（図１Ａ）およびｉｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏで生存腫瘍細胞に対する防御Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる化学療法（Ｘ線を含む）の現行のプロトコールに通例使用される数個のＦＤＡ承認化合物のスクリーニングを実施した。実験の設定は以下の通りであった。ＣＴ２６大腸ガン腫瘍細胞を細胞傷害性化合物と共に４〜１８hrのインキュベーションに供し、洗浄し、ＢＡＬＣ／ｃ同系マウスの側腹部にｓｃ接種した。１５日後に、最小腫瘍原性用量の１０倍の生きたＣＴ２６腫瘍細胞を用いてマウスの対側の側腹部を１０回攻撃誘発し、腫瘍の成長動態をモニターした。本発明者らは、オキサリプラチン（ＰＬＡＴ）（図示せず）、ドキソルビシン（またはイダルビシン、ＤＯＸ、図１Ｂ）および照射（図示せず）により誘導される細胞死が、免疫適格であるがヌードでない同腹仔の腫瘍の成長（outgrowth）を予防することができたことを見出した。対照的に、タキサン、マイトマイシンＣは、アポトーシス細胞死を仲介するが、ヌードマウスと同様に免疫適格マウスに有効であった（図示せず）。細胞死を誘導する様々な薬物の大規模リストにおいて、アントラサイクリン、照射およびオキサリプラチン（図示せず）だけが免疫原性を仲介することができた（図１Ｂ）。
【０２４５】
３．アントラサイクリン誘導性アポトーシスはＴＬＲ４依存的に免疫原性である
Janewayおよび共同研究者により推論されたように、コグネイト免疫応答は自然免疫により指示される。ＴＬＲ４、ＴＬＲ７〜８およびＴＬＲ９は外来抗原に対する自然免疫の重要構成要素であることから、本発明者らは、アポトーシス細胞により誘導される抗腫瘍免疫にこれらのレセプターが果たす役割を評価した。ＴＬＲ４機能喪失型マウス（ＴＬＲ４-/-）において、上に言及したワクチン接種（アントラサイクリン処理ＣＴ２６）は、生存ＣＴ２６の攻撃誘発に対してホストを防御できなかった（図２Ｂ）。同様の結果が、ＴＬＲ４に結合する（が、突然変異対照ペプチドではない）競合ペプチドを注射された野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスで得られた（図示せず）。非免疫原性ワクチン（マイトマイシンＣ誘導性アポトーシス腫瘍細胞など）と共に同時投与されたＤＯＸはＴ細胞免疫を誘導せず、ＤＯＸ調製物中にＴＬＲ４リガンドが存在することは排除されたことは注目すべきである（図示せず）。図２Ｃにおいて、本発明者らは、樹立腫瘍へのＤＯＸの直接接種がＴＬＲ４−／−同腹仔でなくＴＬＲ４＋／＋ホストに腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【０２４６】
４．プラチナ系化合物はＴＬＲ４により腫瘍を抑制する
担腫瘍ホストにおける化学療法に対する応答性に免疫系が果たす役割をさらに概要するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６免疫適格マウス（図３Ａ）、Ｎｕ／Ｎｕ  ｓｗｉｓｓマウス（無胸腺、図３Ｂ）およびＣ５７ＢＬ１０ＳｃＮＪマウス（突然変異ＴＬＲ４を保持する、図３Ｃ）におけるＧｌａｓｇｏｗ骨肉腫の樹立移植片に対して全身オキサリプラチン（ＰＬＡＴ）により誘導される抗腫瘍効果を調べた。ＰＬＡＴは、Ｎｕ／Ｎｕマウスでも、Ｃ５７ＢＬ／６ヌード黒色マウス（図示せず）でも、ＴＬＲ４突然変異マウスでもなく、免疫適格マウスにおける腫瘍進行を有意にコントロールすることができた。この実験は、移植された腫瘍片を扱っているため、接種する腫瘍に混入するＬＰＳの潜在的役割を除外している。
【０２４７】
５．Ｘ線はＴＬＲ４依存的に腫瘍の成長をコントロールする
Ｘ線誘導性アポトーシスは、予防の設定で腫瘍の攻撃誘発からマウスを防御することができる（図１Ａ）。本発明者らは、Ｘ線がヌードＢＡＬＢ／ｃ対応マウスに比べて免疫適格マウス（ＩＣ）において成長中の３０〜５０mm2のＴＳ／Ａ乳房腫瘍を抑制することができるかどうかを評価した。第１に、ＴＳ／Ａの自然成長は、ｗｔ、ヌードおよびＴＬＲ４−／−のＢＡＬＢ／ｃマウスの間で有意差はなかった（図４Ａ）。しかし再度、ＩＣにおいてＸ線により促進される抗腫瘍活性は、ヌードマウスおよびＴＬＲ４欠損同腹仔よりも強力であった（図４Ｂ）。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９がＸ線介在性抗腫瘍免疫応答に関与しないと強調することが重要である（図４Ｃ）。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９両方のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）系阻害剤が、Dynavax Technologies Corporation（Berkeley）により開発された［３４］。これらの阻害剤の特異性は、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに応答したＰＤＣによるＩＦＮα産生阻害により確認された［３４］。本発明者の管理では、このようなＯＤＮは、ＣｐＧのｉｎ  ｖｉｖｏ接種に続いてＴＮＦαおよびＩＬ−１２ｐ４０の血清レベルを有意に減少させることができた（図示せず）。
【０２４８】
６．ＴＲＩＦではなくＭｙＤ８８がＰＬＡＴ介在性免疫原性に関与する
ＴＬＲ４はＴＲＩＦまたはＭｙＤ８８を介してシグナル伝達できることから、本発明者らは、これらの経路のどれが、樹立骨肉腫移植片を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＬＡＴ誘導性細胞死の免疫原性に重大であるかを評価した。ＰＬＡＴはＴＲＩＦ−／−動物においてその抗腫瘍効力を維持したが（図５Ａ）、ＰＬＡＴは、ＭｙＤ８８−／−対応動物においては有意な腫瘍抑止を誘導できなかった（図５Ｂ）．
【０２４９】
７．ＴＬＲ３リガンドまたはＴＬＲ９リガンドはＴＬＲ４欠損をバイパスし、Ｘ線に対する応答性を回復する
ＴＬＲ３は、本発明者らの設定でＴＬＲ４トランスダクションに関与しないＴＲＩＦを介してシグナル伝達することから、本発明者らは、ＴＬＲ３を介した刺激が、ＴＬＲ４欠損ホストにおいて独立したメカニズムでＸ線誘導性抗腫瘍効果を増強することができるという仮説を立てた。本発明者らは、局所放射線療法の間に全身投与された二本鎖ＲＮＡであるポリＩ：Ｃが、担ＴＳ／Ａ動物におけるＴＬＲ４欠損を回避したことを実際に観察した。このことから、ポリＩ：Ｃは、ＴＬＲ４+/+マウスに比べてＴＬＲ４-/-マウスにおける自然の腫瘍進行を有意に妨害しなかった（図６Ａ）が、ＴＬＲ４-/-マウスは、ポリＩ：Ｃの存在下でのみ、Ｘ線からＴＬＲ４+/+マウスと同様の利益を得た（図６Ｂ）。ＴＬＲ４はＭｙＤ８８を介して（ＮＦ−ｋＢ活性化に導く）シグナルを伝達することから、任意のＴＬＲ４欠損は、炎症促進性サイトカインの誘導に導くシグナル伝達カスケードに不可欠な、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８とＴＩＲドメインとの相互作用を防止するであろう。ＴＬＲ９はＭｙＤ８８の集合もまた促進できることから、本発明者らは、ＴＬＲ９リガンドがＸ線に応答してＴＬＲ４欠損をバイパスできるかどうかに取り組んだ。ＴＬＲ３の連結について上に記載したものと同様に、ＴＬＲ９の連結は、マウスに腫瘍が進行する間にいくらかの抗腫瘍活性を発揮したばかりでなく（図７Ａ）、ＴＬＲ４-/-マウスにおけるＸ線の効力もまた回復させた（図７Ｂ）。
【０２５０】
８．ＴＬＲ４の機能に関与する細胞メカニズム：洞察
ＴＬＲ４は、主としてｉｎ  ｖｉｖｏ骨髄系細胞（単球、ＤＣ）に発現する。ＴＬＲ４シグナル伝達は炎症促進性サイトカイン（ＭｙＤ８８が関与する場合はＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２）の分泌をトリガーするために、そしてＤＣの成熟を加速するために重大である。ＤＣの分化および活性化の両方は、ナイーブＴ細胞のプライミングおよび極性化を可能にする。本発明者らは、照射によりアポトーシス細胞死プログラムを（Ｘ線刺激の２４hr後に）トリガーされたＥＬ４ＯＶＡ腫瘍細胞と共にインキュベーションし、それに続いて骨髄由来ＤＣ（またはリンパ節から新鮮単離されたＤＣ）が取り込みおよび成熟するディファレンシャルな能力を評価した。アポトーシスＥＬ４ＯＶＡの取り込みは、ＴＬＲ４-/-マウスおよびＴＬＲ４+/+マウスで同様であった（図８Ａ）。ＤＣ活性化の徴候であるＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８６のアップレギュレーションは、ＴＬＲ４-/-マウスおよびＴＬＲ４+/+マウスの両方で類似であった（図８Ｂ、上欄および下欄）。顕著な場合、ＩＬ−６およびＴＮＦαの分泌はＴＬＲ４に非依存的であった（図示せず）。ＩＬ−２の分泌もＩＬ−１２の分泌も検出することができなかった。ＤＣにより示される成熟の外面的な徴候にかかわらず、ＴＬＲ４-/-マウスにおけるＤＣ介在性Ｔ細胞プライミングは影響を受けた。ＴＬＲ４-/-マウスから発生したＢＭ−ＤＣにパルスした照射ＥＬ４０ＶＡアポトーシス細胞がＢ３Ｚクローンをプライミングできないことから、ＤＣは照射されたアポトーシス腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでプロセシングすることができる抗原提示細胞である見込みがある（図９Ａ）。ＴＬＲ４-/-マウスでは、照射されたＥＬ４ＯＶＡをＢａｌｂ／ｃマウスに注射した後の交差プライミングが欠損していた（図９Ｂ）。さらに、Ｘ線により誘導されたアポトーシス細胞をパルスされ、抗原特異的ＣＴＬクローンと共にインキュベーションされたマウスＢＭ−ＤＣを使用した交差提示のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、ＴＬＲ４Ｆｃまたは抗ＨＭＧＢ１抗体を共培養物に加えない限り、ＴＬＲ４−／−ＤＣは特異的ＣＴＬを活性化できないが、ＴＬＲ４＋／＋細胞は実際に活性化することが明らかにされた（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０２５１】
９．化学療法または照射に対する抵抗性におけるＴＬＲ４の一塩基多型の分析（局所再発）
本発明者らは、１９８０年から２０００年の間にＩＧＲでの診断または治療に加入した乳ガン女性におけるＴＬＲ４  Ａｓｐ２９９Ｇｌｙの遺伝子型決定を実施した。ＤＮＡは、ＰＢＬまたはＥＢＶでトランスフォーメーションされたＢ細胞またはパラフィン包埋腫瘍組織から得た。遺伝子型決定は、二重ラベルしたアレル特異的オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ分解に基づく単一チューブポリメラーゼ連鎖反応により実施した（以前に従来の制限フラグメント長多型分析と比較され、直接配列決定により確認された方法［３３］）。本発明者らは、乳ガンの患者５００人超を評価した。前記患者の約１０%がＴＬＲ４の単一突然変異体アレルを有した（文献の過去の対照（historical control）に匹敵する率、［１４］に総説）。
【０２５２】
次に、本発明者らは、家族性乳ガンを有し、年齢がマッチするコーカサス人種女性の二つのコホートにおける無進行生存（ＰＦＳ）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ予後指標およびアジュバント療法（アントラサイクリンならびに腫瘍および同側の胸部に及ぼすＸ線に基づく）を検討したが、これらのコホートは、Ａｓｐ２９９ＧｌｙまたはＧｌｙ２９９Ｇｌｙ突然変異（ｎ＝１２）を示す者、およびＴＬＲ４についてＷＴ表現型を示す者（Ａｓｐ２９９Ａｓｐ）（ｎ＝２４）であった。ログランク解析（図１１Ａ）では、ＰＦＳは、ＷＴ個体の方が５年時点で有意に優れていた（ｐ＜０．０５）。進行は、同側の再発または転移を意味した。
【０２５３】
１０．乳ガンの感受性におけるＴＬＲ４の一塩基多型の分析
重症敗血症の重症度および転帰に関する、ＴＬＲ多型に関連する罹患率を測定する目的で、Hopital COCHIN（Pr Dhainaut）の医療集中治療室（ＩＣＵ）において２００２年から２００６年の間に末梢ＤＮＡの前向きサンプリングを行った。患者３０００人のうち担ガン患者６００人超がＩＣＵに入り、自動ＲＴ−ＰＣＲでの高処理量スクリーニング（Taqman, Applied biosystem 7900）を用いてＴＬＲ４のＡｓｐ２９９ＧｌｙのＳＮＰについて評価した。各種類の悪性腫瘍（造血ガン対固形腫瘍、具体的には大腸ガン、前立腺ガン、乳ガン、白血病、リンパ腫、骨髄腫、ＮＳＣＬＣなど）について症例頻度を比較した。これらの「症例」は、ＩＣＵに入院した患者である「対照」とマッチさせ、年齢、性別、人種についてマッチさせた。ＴＬＲ４のＳＮＰの頻度は、異なる群および亜群で比較し、敗血症ショック発生の独立した基準として、および予後マーカーとして分析した。本発明者らのデータは、ＴＬＲ４についての突然変異状態が、散発性乳ガンの発生のための独立した予後因子である事実を指し示している（図１１Ｂ）。
【０２５４】
１１．ガンの予防および治療におけるＴＬＲ４欠損を代償するためならびに抗原提示および細胞傷害剤に対する応答を回復するための、クロロキンもしくはキニン（アルカリ化リソソーム指向性薬）または液胞型ＡＴＰアーゼを妨害する任意の化合物（リソソームのアルカリ化を促進する）の使用
本発明者らは、ＨＭＧＢ１の結合を減少させるＴＬＲ４突然変異体が、アントラサイクリンにより処置された乳ガン患者の予後に影響することを示した。ＴＬＲ４の細胞外ドメインに影響する、ＴＬＲ４における配列多型（８９６Ａ／Ｇ、Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ、ｒｓ４９８６７９０）は、ヒトにおけるエンドトキシン応答減少および心血管疾患に対する感受性減少と関連する［１３、１８］。ＴＬＲ４のＡｓｐ２９９Ｇｌｙ突然変異がＬＰＳシグナル伝達欠損を招くかどうかは、議論を要する問題であるものの［１３、２３、３５］、本発明者らは、ＴＬＲ４のＡｓｐ２９９Ｇｌｙ多型がＨＭＧＢ１に対する応答に影響しうる可能性に取り組んだ。ＴＬＲ４のＷＴまたは突然変異体アレルのいずれかを用いたＨｅｌａ細胞（ＷＴ  ＴＬＲ４を有する）のトランスフェクションにより、突然変異体ＴＬＲ４レセプターの発現がＨＭＧＢ１に対するＮＦ−κＢ活性化を鈍らせることが実証された（図示せず）。正常および突然変異ヒトＴＬＲ４をトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞にＨＭＧＢ１を添加した後に、免疫沈降実験を行った。突然変異体（Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ）ＴＬＲ４へのＨＭＧＢ１の結合は、正常（Ａｓｐ２９９Ａｓｐ）ＴＬＲ４に比べて減少した（図１７ａ）が、両方のトランスフェクタントは、類似量のＴＬＲ４分子を含んでいた。突然変異ＴＬＲ４に対するＨＭＧＢ１のこの結合障害は、単球由来ＤＣ（ＭＤ−ＤＣ）がＣＴＬにメラノーマ抗原を交差提示する能力が大きく障害されることの説明となるおそれがある。正常（Ａｓｐ２９９Ａｓｐ）ＴＬＲ４を有する個体由来のＭＤ−ＤＣおよび突然変異体（Ａｓｐ２９９Ｇｌｙ）ＴＬＲ４を有する個体由来のＭＤ−ＤＣは、反応においてこれらが同種反応性Ｔ細胞を刺激する能力に区別がつかなかったが、この反応は、ＨＭＧＢ１ではなくＬＰＳにより（しかし、ＤＣが正常なＴＬＲ４アレルを含む場合にのみ）刺激することができた（追補の図１７ｂ）。正常な（Ａｓｐ２９９Ａｓｐ）個体からのＭＤ−ＤＣは、ＨＭＧＢ１依存的にＣＴＬクローンに死滅中のメラノーマ細胞由来のＭＡＲＴ１を交差提示した（図１７ｃ）。対照的に、ＴＬＲ４のＡｓｐ２９９Ｇｌｙアレルを有する個体由来のＭＤ−ＤＣは、障害のある交差提示細胞であった（図１７ｃ）。本発明者らは、この障害がクロロキンの添加により回復することを本明細書において実証する（図１７ｃ）。したがって、クロロキンは、患者の樹状細胞が彼らのＴ細胞に腫瘍抗原を提示する能力の障害を代償することができる。
【０２５５】
これは、マウス樹状細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた他のデータを確証するものである。ＴＬＲ４は、死滅中の腫瘍細胞由来抗原のプロセシング／提示をコントロールする。ＴＬＲ４欠損は、抗原の取り込み、プロセシング／提示および／または共刺激シグナルの提供に影響することによって、ＤＣのレベルで抗腫瘍免疫応答を代償することができた。ＷＴおよびＴＬＲ４-/-ＤＣは、照射ＥＧ７胸腺腫またはドキソルビシン処理ＣＴ２６大腸ガン細胞の貪食に等しく有効であった（図１３ａ）。ＴＬＲ４-/-ＤＣによる成熟マーカー（ＭＨＣクラスＩＩおよび共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６を含む）の獲得および炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α）の産生は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ、公知のＴＬＲ４リガンド）に対する応答が欠損していたが、死滅中の腫瘍細胞に対する応答はインタクトであった（図示せず、および図１３ｂ）。しかし、ＴＬＲ４は、ＯＶＡをトランスフェクションされた死滅中のＴＳ／Ａ（Ｈ−２d）細胞をＤＣにロード後に、ＤＣがＫb／ＳＩＩＮＦＥＫＬというＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を細胞膜表面に発現する動態に影響した。ＷＴおよびＴＬＲ４-/-ＤＣは、ベースラインで匹敵するレベルのＫb分子を発現し、飽和量の遊離ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをパルス後に類似の動態でＫb／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体を獲得した（図示せず）。しかし、死滅中のＯＶＡ発現ＴＳ／Ａ細胞をロード後に、ＷＴ対照よりもＴＬＲ４-/-ＤＣで顕著に減少したＫb／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の露出が検出された（図１４ａ）。
【０２５６】
本発明者らは、これらの発見に基づいて、ＴＬＲ４が抗原のプロセシング／提示に影響する見込みがあることを本明細書において実証する。
【０２５７】
ＴＬＲ４は、ファゴソームのリソソーム依存性分解を阻害すると報告された［３６］。ＴＬＲ４-/-ＤＣは、死滅中の細胞の抗原を提示する代わりに、リソソーム区画内でその細胞を分解する［３７］。本発明では、本発明者らは、クロロキン（リソソーム指向性アルカリ産物）またはバフィロマイシンＡ１（リソソームの酸性化を担う液胞型ＡＴＰアーゼの特異的阻害剤）のいずれかを用いてリソソーム活性を阻害することにより、ＴＬＲ４-/-ＤＣによる抗原提示を回復しようと努めた。実際に、好ましくは準毒性濃度で使用された（マウスにおけるクロロキンの準毒性濃度は１０〜２０μM、バフィロマイシンＡ１は２０〜３０μM）いずれかの薬剤によるリソソームのアルカリ化は、ＴＬＲ４-/-ＤＣが死滅中の細胞由来の抗原を提示する能力を高めたが、ＷＴのＤＣによる抗原提示を改善しなかった（図１４ｂ）。したがって、クロロキンを用いたＴＬＲ４-/-ＤＣの処理により、ＤＣがＫb／ＳＩＩＮＫＥＫＬ複合体を提示する能力は正常レベルまで回復した（図１４ａ、下欄）。次に、本発明者らは、死滅中の腫瘍細胞をロードされたＷＴ対ＴＬＲ４-/-ＤＣにおいてファゴソームとリソソームの間の融合動態を直接測定した。ＷＴ  ＤＣに比べてＴＬＲ４-/-ＤＣにおける食細胞の積荷とリソソームとの共局在の有意な加速が観察された（図１４ｃ）。
【０２５８】
これらのデータは、ＴＬＲ４が、おそらくリソソームの抗原分解を阻害することにより、ＤＣによる腫瘍細胞抗原のプロセシング／提示をレギュレーションすることを確認するものである。
【０２５９】
１２．クロロキンおよびキニンはＴＬＲ４分子を欠如した動物における化学療法に対する応答性を回復する
ドキソルビシン処理されたＣＴ２６大腸ガン細胞の注射は、１週間後に接種された生きたＣＴ２６細胞の成長を阻止する免疫応答の誘導に高度に有効である［３０］。ドキソルビシン処理ＭＣＡ２０５肉腫細胞はＭＣＡ２０５から守って、類似の結果が得られた。これはＷＴマウスにあてはまったが、ＴＬＲ４-/-マウスではアントラサイクリン処理細胞でもオキサリプラチン処理細胞でも腫瘍ワクチン作用（vaccination）は実現できなかった（図１５ａ）。これらのデータは、オキサリプラチンまたは照射ＥＬ４胸腺腫細胞について確認することができ、これらは、腫瘍の攻撃誘発からＴＬＲ４-/-ホストを防御できなかった（図１５ａ）。死滅中の腫瘍細胞と共に同時注射した細胞透過性ブロッキングペプチド［３８］を用いたＴＬＲ４の薬理学的阻害もまた、抗腫瘍免疫を阻止した（図１５ｂ）。さらに、中和抗体（図１５ｂ）またはＨＭＧＢ１特異的ｓｉＲＮＡ（図１５ｃ）を用いた、アントラサイクリンまたはオキサリプラチン処理ＣＴ２６細胞からのＴＬＲ４リガンドＨＭＧＢ１の枯渇は、抗腫瘍ワクチン接種の効力を損なった。
【０２６０】
臨床的にさらに関連する設定、すなわち全身化学療法または局所放射線療法を用いた樹立腫瘍の処置において、本発明者らは、ＴＬＲ４の存在が治療の成り行きを指示したことを見い出した。ＣＴ２６大腸ガン（図１６ａ）、ＴＳ／Ａ乳ガン（図１６ｂ）、異種移植されたＧＯＳ骨肉腫（図１６ｃ）、およびＥＬ４胸腺腫（図１６ｄ）は、免疫適格なＷＴマウス、ＴＬＲ４-/-マウスおよびｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスにおいて類似の動態で進行した。適切な細胞傷害剤を用いた化学療法または局所放射線療法は、免疫適格ＷＴマウスにおける腫瘍の成長を低下させ、担腫瘍マウスの生存を延長したが、ＴＬＲ４-/-マウス（図１６ａ〜ｄ）およびｎｕ／ｎｕマウス（図１６ｂおよび図示せず）ではあまり有効ではなかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータによると（図１２）、Ｔｒｉｆ-/-マウスは、ＷＴマウスに類似した化学療法応答を備えたが、ＭｙＤ８８-/-動物は、免疫不全マウスのように挙動した（図１６ｃ）。同様に、ＴＬＲ７リガンドおよびＴＬＲ９リガンドに応答した形質細胞様ＤＣからのＩＦＮα産生を抑制する方式を使用した、全身オリゴヌクレオチドを用いたＴＬＲ７およびＴＬＲ９の阻害［３４］は、ｉｎ  ｖｉｖｏで放射線療法の効力に影響できなかった（図示せず）。さらに、クロロキンの全身投与は、図１４に提示したデータによると、ＷＴマウスではなくＴＬＲ４-/-マウスにおける化学療法の効力を高めた（図１６ｄ）。これらの結果は、腫瘍細胞内因性細胞傷害効果により専ら作用すると考えられた化学療法方式に、ＴＬＲ４／ＭｙＤ８８依存性免疫がこれまでに認識されていない貢献を果たすことを示す。化学療法の転帰に及ぼすこのような免疫の効果は、アントラサイクリンおよびオキサリプラチンなどの限られた薬物のセットについてのみ検出され、一方でパクリタキセル、カンプトテシンおよびアルキル化剤は、免疫適格マウスおよび免疫不全マウスにおいて等しく有効であったことに留意することが重要である（図示せず）。
【０２６１】
症例報告
ＴＬＲ４のＡｓｐ２９９Ｇｌｙ突然変異を保持し、独特の肺転移を有して来診した乳ガン患者は、NavelbineおよびXelodaの３ヶ月間併用療法が進行中であった。肺結節は３ヶ月以内に１０mmから２２mmの大きさに成長した。同じ化学療法方式を３ヶ月、経口クロロキン２００mg/日、１４日間（そして１週間で同治療再開を３サイクル行う）と組み合わせた行った後に結節は安定なままであった（ＲＥＣＩＳＴ基準）。
【０２６２】
クロロキンを使用したプロトコール
樹立腫瘍の治療法（アジュバント療法）：
細胞傷害性化合物の投与（化学療法）に対応する期間およびその後５日間、クロロキン（１００〜３００mg/日）を投与した。
【０２６３】
キニンを使用したプロトコール
ＴＬＲ４突然変異患者において、キニンは、好ましくは化学療法または放射線療法の翌日に開始して、８mg/kgで８時間毎に（×３回／日）３日間静脈内投与することができる。
【０２６４】
【表１３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ−Ｄ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１４Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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