(57)【要約】  本発明は、カロテノイドの誘導体、例えばリコペン、ａ−及びｂ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、ａ−及びｂ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン又は他のカロテノイドの誘導体を含む薬剤組成物を投与することによる癌の化学的予防及び治療の方法に関する。カロテノイドの誘導体は、カロテノイドの酸化生成物、及び好ましくはアルデヒド誘導体、ジアルデヒド誘導体又はケトン誘導体である。カロテノイド誘導体は、天然に存在する任意のカロテノイド、例えばトマト並びに他の果物及び野菜中に見出されるカロテノイドの誘導体であればよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の発病を予防する方法であって、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、前記対象における癌の発病を予防するのに有効な量で前記対象に投与する段階を含む上記方法。
【請求項２】
対象における癌細胞の増殖を抑制する方法であって、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、前記対象における癌細胞の増殖を抑制するのに有効な量で前記対象に投与する段階を含む上記方法。
【請求項３】
対象における癌の進行を遅延させる方法であって、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、前記対象における癌の進行を遅延させるのに有効な量で前記対象に投与する段階を含む上記方法。
【請求項４】
対象における癌を治療する方法であって、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、前記対象における癌を治療するのに有効な量で前記対象に投与する段階を含む上記方法。
【請求項５】
カロテノイドがトマトカロテノイドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
カロテノイドがリコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
カロテノイドの酸化生成物がアルデヒド、ジアルデヒド、ケトン、カルボン酸、エポキシド、フラノキシド、γ−ラクトン、α−ヒドロキシケトン、ジオール、アセタール、ケタール、ハロゲン化誘導体、アセチル化誘導体、１つ又は複数のアルキン結合を含有する誘導体及びこれらの組合せから成る群から選択される誘導体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
カロテノイドがリコペンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
リコペンの酸化生成物がジアポ−８，８’−リコペンジアール（８，８’）、ジアポ−８’，１２−リコペンジアール（８’，１２）、ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール（１０，１０’）、ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール（１２，１２’）、ジアポ−８’，１５−リコペンジアール（８’，１５）、及びこれらの組合せから成る群から選択されるジアルデヒド誘導体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
カロテノイドの酸化生成物が、前記対象において抗酸化剤応答要素（ＡＲＥ）を誘導する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
癌が上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、線腫、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、ユーイング腫瘍、子宮平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛腫、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、末梢神経系癌、中枢神経系癌、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、脊髄リンパ腫、白血病、リンパ腫、リンパ増殖性疾患、急性骨髄性白血病、慢性白血病、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、肝癌及びこれらすべての転移から成る群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
癌が前立腺癌、肝癌及び乳癌から成る群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
カロテノイドの酸化生成物が天然に存在するカロテノイドから得られる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
カロテノイドの酸化生成物が合成化合物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
癌細胞の増殖を抑制する方法であって、癌細胞を、前記癌細胞の増殖を抑制するのに有効な量のカロテノイドの酸化生成物と接触させる段階を含む上記方法。
【請求項１７】
カロテノイドがトマトカロテノイドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カロテノイドがリコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
カロテノイドの酸化生成物がアルデヒド、ジアルデヒド、ケトン、カルボン酸、エポキシド、フラノキシド、γ−ラクトン、α−ヒドロキシケトン、ジオール、アセタール、ケタール、ハロゲン化誘導体、アセチル化誘導体、１つ又は複数のアルキン結合を含有する誘導体及びこれらの組合せから成る群から選択される誘導体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
カロテノイドの酸化生成物がリコペンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
リコペンの酸化生成物がジアポ−８，８’−リコペンジアール（８，８’）、ジアポ−８’，１２−リコペンジアール（８’，１２）、ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール（１０，１０’）、ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール（１２，１２’）、ジアポ−８’，１５−リコペンジアール（８’，１５）、及びこれらの組合せから成る群から選択されるジアルデヒド誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
カロテノイドの酸化生成物が、前記細胞において抗酸化剤応答要素（ＡＲＥ）を誘導する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
癌が上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、線腫、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、ユーイング腫瘍、子宮平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛腫、セミノーマ、胎生期癌、；ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、末梢神経系癌、中枢神経系癌、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、脊髄リンパ腫、白血病、リンパ腫、リンパ増殖性疾患、急性骨髄性白血病、慢性白血病、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、肝癌及びこれらすべての転移から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
癌細胞が前立腺癌細胞、肝癌細胞及び乳癌細胞から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
癌細胞がヒトの癌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
カロテノイドの酸化生成物が天然に存在するカロテノイドから得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
カロテノイドの酸化生成物が合成化合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
カロテノイドの酸化生成物、及び薬剤として許容される担体又は賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項２９】
カロテノイドがトマトのカロテノイドである、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
カロテノイドがリコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
カロテノイドの酸化生成物がアルデヒド、ジアルデヒド、ケトン、カルボン酸、エポキシド、フラノキシド、γ−ラクトン、α−ヒドロキシケトン、ジオール、アセタール、ケタール、ハロゲン化誘導体、アセチル化誘導体、１つ又は複数のアルキン結合を含有する誘導体及びこれらの組合せから成る群から選択される誘導体である、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
カロテノイドがリコペンである、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
リコペンの酸化生成物がジアポ−８，８’−リコペンジアール（８，８’）、ジアポ−８’，１２−リコペンジアール（８’，１２）、ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール（１０，１０’）、ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール（１２，１２’）、ジアポ−８’，１５−リコペンジアール（８’，１５）、及びこれらの組合せから成る群から選択されるジアルデヒド誘導体である、請求項３２に記載の薬剤組成物。
【請求項３４】
カロテノイドの酸化生成物が天然に存在するカロテノイドから得られる、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３５】
カロテノイドの酸化生成物が合成化合物である、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カロテノイドの酸化生成物、例えばリコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン又は他の任意のカロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を投与することによる癌の化学的予防及び治療の方法に関する。カロテノイドの酸化生成物は、天然に存在する任意のカロテノイド、例えばトマト並びに他の果物及び野菜中に見出されるカロテノイドの誘導体であればよい。
【背景技術】
【０００２】
果物及び野菜の消費量と低い癌の発生率の間の関連を示唆するかなりの疫学的証拠がある。特に、カロテノイド及び他の植物成分が癌予防剤と見なされてきた（１）。β−カロテンは、そのプロビタミンＡ活性及び多くの食物中での幅広い存在のために最も注目されてきた。しかし、β−カロテンを用いた介入研究からの知見は失望させるものであり、それ故にトマトの主要なカロテノイドであるリコペンなどの他のカロテノイドがより集中的な研究の対象となった。トマトの消費と癌予防の関係についての疫学的文献の包括的な解析が、Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉによって出版され（２）、彼は再検討された研究の大部分が、トマト摂取又は血中リコペンレベルとさまざまな種類の癌のリスクとの間の逆相関を報告していることを見出した。Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉは、リコペンがトマト含有食品のこれらの有益な効果に貢献している可能性はあるが、抗癌性はフィトエン、フィトフルエン、及びβ−カロテンなどのトマト中に見られる多成分間の相互作用によっても説明できるのではないかと示唆している。本発明の出願人らは、リコペンが、哺乳動物の子宮内膜、肺及び白血性の癌細胞の増殖を、投与量に依存する仕方で阻害することを示した（ＩＣ５０約２μモル／Ｌ；米国特許第５８２７９００号）。
【０００３】
一般的には果物や野菜及び特にトマトの化学予防効果に関与する生物化学的機序は完全には分かっていない。近年、有益な作用は、少なくとも部分的には、フェーズＩＩの解毒酵素の誘導に起因する（３）ことを示す証拠が蓄積されてきた。この酵素は、多くの有害物質を身体から排出されやすい親水性代謝物質に転化させることによって解毒する。ＮＡＤ（Ｐ）ＨなどのフェーズＩＩ酵素、キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）及びγ−グルタミルシステインシンテターゼ（ＧＣＳ）などのフェーズＩＩ酵素は、動物及びヒトにおいて誘導性であり、これらの組織レベルと化学発癌に対する感受性との間に強い逆相関関係が存在する。
【０００４】
フェーズＩＩ酵素の共誘導は、プロモーター領域又はエンハンサー領域中にあるシス調節ＤＮＡ配列によって媒介され、この配列は抗酸化剤応答要素（ＡＲＥ）として知られている。ＡＲＥ転写系の刺激は、発癌物質及び他の有害化合物に対抗して身体の防御系を動員するための確立された機序である。ＡＲＥを活性化する主要な転写因子Ｎｒｆ２（核因子Ｅ２関連因子２）は、抗酸化遺伝子及び解毒遺伝子の誘導において中心的な役割を果たす。基本条件下では、Ｎｒｆ２は細胞質中にあって阻害タンパク質、Ｋｅａｐ  １に結合されている。誘導剤と出会うとこれはＫｅａｐ  １から解放されて細胞核へ移行する。一時的にトランスフェクトされた癌細胞において、リコペンにはＡＲＥ配列と融合したレポーター遺伝子の発現をトランス活性化する能力があることが、最近本発明の出願人らによって示された（４）。他の２つのトマトのカロテノイド、フィトエン及びフィトフルエンの混合物も、ＡＲＥの活性化に有効であった。この系を活性化することによって、トマトのカロテノイドはフェーズＩＩ解毒酵素の生成を誘導する。
【０００５】
カロテノイド自体が生物学的効果を有すると考えられているが、これらはある種の条件下では酸化されやすく、複数の化合物を生成する。異なる炭素鎖長を有するレチナール及びβ−アポ−カロテナールは、β−カロテンから、溶媒中での自動酸化、パーオキシラジカル、一重項酸素、タバコの煙などの開始剤を用いる酸化などのさまざまな条件下での非酵素的酸化、及びリポキシゲナーゼによる共酸化によって形成されることが知られている。レチノイン酸もベンゼン中のβ−カロテンにより形成されることが示唆された。β−カロテンのパーオキシラジカル酸化生成物も、水性モデル系におけるカロテノイドの分解に及ぼすオゾン及び酸素の影響と同様に知られている。カロテノイド及びそれらの酸化生成物は、ヒト血漿からも抽出されてきた。
【０００６】
生体系におけるリコペンの代謝を調べた研究は少なく、ヒトにおけるリコペンの酸化分解生成物についてはごくわずかしか分かっていない。ヒト血漿中の代謝産物の最初の報告は、リコペンの酸化から得られる５，６−ジヒドロキシ−５’，６’−ジヒドロリコペンのものであった（５）。２，６−シクロリコペン１，５−ジオールＡ及びＢが、ヒトにおけるリコペンのｉｎ  ｖｉｖｏ酸化代謝産物であることも報告されている（６，７）。Ｆｅｒｒｅｉｒａらは、ラット腸粘膜のポストミトコンドリア画分を使用して２種類のリコピン代謝産物を確認した：ａ）開裂生成物（３−ケト−アポ−１３−リコペノン及び３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロ−１５，１５’−アポ−リコペナール）；並びにｂ）酸化生成物（２−アポ−５，８−リコペナール−フラノキシド；リコペン５，６，５’，６’−ジエポキシド、リコペン−５，８−フラノキシド異性体（Ｉ）、リコペン−５，８−フラノキシド異性体（ＩＩ）、及び３−ケト−リコペン−５’，８’−フラノキシド）（８）。Ｋｉｍらは、リコペンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ自動酸化によって形成された、鎖長が可変な一連の同族カルボニル分解産物を報告し、リコペンは生体組織中の酸化条件下で一連のアポリコペナール及び短鎖のカルボニル化合物に解裂される可能性があることを示唆した（９）。Ｃａｒｉｓ−Ｖｅｒｙａｔらは、過マンガン酸カリウム及び金属ポルホリンの触媒作用を受けた大気中酸素を用いるリコペンの酸化によるさまざまなアルデヒド及びジアルデヒド分解生成物の形成を報告した（１０）。
【０００７】
フィトエン及びフィトフルエンなどの他のトマトカロテノイドは、同様に酸化されて類似の酸化生成物を生じることができる。フィトエン及びフィトフルエンは、リコペンの前駆体であり、これらの分子が共役二重結合をほとんど含有しないことを除けば、構造的にリコペンと類似である。これらの化合物の酸化は、リコペンの酸化生成物（例えば中央結合の開裂）の水素化された類似体を生じるはずである。Ａｒａｋｉらは、レチノイン酸の合成非環式類似体を開発し、それらはそれらの構造によればフィトエン及びフィトフルエンの推定されている誘導体である可能性がある（１１）。
【０００８】
数件の研究がリコペンの酸化生成物を癌の化学予防及び治療と結びつけてきた。Ａｕｓｔらは、過酸化水素／四酸化オスミウムを用いるリコペンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酸化によって形成されるジアルデヒド、２，７，１１−トリメチル−テトラデカヘキサエン−１，１４−ジアールが、ラット肝上皮ＷＢ−Ｆ３４４細胞中のギャップ結合による伝達（ＧＪＣ）を刺激することを報告した。細胞間のＧＪＣの刺激は、カロテノイドの癌予防活性に関係づけられる防御機構の１つであると考えられている（１２）。Ｚｈａｎｇらは、リコペンの自動酸化によって形成される開裂生成物（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−４−メチル−８−オキソ−２，４，６−ノナトリエナールが、ヒト前骨髄球白血病ＨＬ−６０細胞におけるアポトーシスを誘導することを報告した（１３）。類似の効果は、同じくトマト中に存在する非環式カロテノイド、フィトエン、フィトフルエン及びζ−カロテンについても、リコペンの酸化混合物についてと同様に観察された（１４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌の化学予防及び治療に有用な化合物を開発するための革新的な手法が、基礎科学段階及び臨床段階の両方において、至急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、カロテノイドの誘導体、例えばリコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン又は任意の他のカロテノイドの誘導体を含む薬剤組成物を投与することによる癌の化学予防及び治療の方法に関する。カロテノイドの誘導体は、カロテノイドの酸化生成物であり、好ましくはアルデヒド誘導体、ジアルデヒド誘導体又はケトン誘導体である。カロテノイドの誘導体は天然に存在するカロテノイド、例えばトマト及び他の果物及び野菜の中で見付けられるカロテノイドの誘導体であればよい。
【００１１】
本明細書で実例によって示すように、本発明の出願人らは、リコペン及び他のカロテノイドの推定されている酸化生成物の構造を有する化合物の抗癌活性を試験した。これらのカロテノイド誘導体は、その抗酸化剤応答要素（ＡＲＥ）を誘導し、癌細胞の増殖を抑制する能力によって実証されるように、抗癌活性を有する。意外にも、これらの誘導体のいくつかは親のカロテノイドよりも活性であることが見出された。
【００１２】
したがって、一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物（例えば、リコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン又は任意の他のカロテノイドの酸化生成物）を含む薬剤組成物を、対象における癌の発病を予防するのに有効な量で含む対象に投与する段階を含む、対象における癌の発病を予防する方法を提供する。
【００１３】
他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌の増殖を抑制するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【００１４】
さらに他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌進行を遅延するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌の進行を遅延する方法を提供する。
【００１５】
さらに他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌を治療するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌を治療する方法を提供する。
【００１６】
現在好ましい一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は、ジアルデヒド誘導体（本明細書ではカロテンジアールと表示する）、アルデヒド誘導体（本明細書ではカロテナールと表示する）及びケトン誘導体（本明細書ではカロテノンと表示する）から成る群から選択される。他の適当な酸化生成物には、これらだけには限定されないが、エポキシド誘導体、フラノキシド誘導体、カルボン酸誘導体、γ−ラクトン誘導体、α−ヒドロキシケトン誘導体、ジオール誘導体、アセタール誘導体、ケタール誘導体、ハロゲン化誘導体、アセチル化誘導体及び１つ又は複数のアルキン結合を含有する誘導体が含まれる。同様に、その中の１つ又は複数の二重結合が還元されているこれらの誘導体の任意の１つ又は複数も企図されている。酸化生成物中でのこれらの官能基の１つ又は複数の組合せも企図されている。
【００１７】
他の現在好ましい一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は、リコペンの酸化生成物である。現在好ましいリコペンの酸化生成物は、リコペンのジアルデヒド誘導体（本明細書ではジアポ−カロテンジアール又はジアポ−リコペンジアールと表示する）である。かかるジアルデヒドリコペンの酸化生成物には、これらだけには限定されないが、ジアポ−８，８’−リコペンジアール（本明細書では８，８’と表示する）、ジアポ−８’，１２−リコペンジアール（本明細書では８’，１２と表示する）、ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール（本明細書では１０，１０’と表示する）、ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール（本明細書では１２，１２’と表示する）、ジアポ−８’，１５−リコペンジアール（本明細書では８’，１５と表示する）、及びこれらの任意の組合せが含まれる。一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は、２，７，１１−トリメチル−テトラデカヘキサエン−１，１４−ジアール（本明細書ではジアポ−６，１２’−リコペンジアールとも表示する）以外のものである。
【００１８】
本発明において使用されるカロテノイドの酸化生成物は、当技術分野で知られている任意の合成方法によって調製された合成誘導体であればよい。さらに本発明では、天然に存在するカロテノイドから、例えば天然に存在するカロテノイドの酸化によって、得られる酸化生成物の使用も企図されている。天然のカロテノイドは、本明細書に記載されている任意の１つ又は複数のカロテノイド、又は任意の他の推定されているカロテノイドであればよい。天然に存在するカロテノイドは、例えばトマト製品（例えば、トマト、トマトソース、ケチャップなど）、発酵物、スイカ、グアバ、グレープフルーツなどの中で見出されるカロテノイドでよい。一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は、天然源からカロテノイドを抽出し、続いて酸化することによって得られる。
【００１９】
他の一態様において、本発明は、本発明のカロテノイドの酸化生成物、及び薬剤として許容される担体又は賦形剤を含む薬剤組成物を提供する。
【００２０】
いかなる機序又は理論にも拘束されたくはないが、カロテノイド誘導体は酸化防止剤応答要素（ＡＲＥ）のレベル及び／又は活性を誘導し、それが次に、有害な発癌性化合物をより毒性が低く身体によって排出されやすい化合物に転化させる役割を果たす、フェーズＩＩ酵素の生成を誘導する。本明細書で実例によって示す通り、カロテノイドの酸化生成物には、細胞内で酸化防止剤応答要素（ＡＲＥ）を誘導する能力がある。一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物はＡＲＥの活性を増大させる。ＡＲＥの誘導は、次いでフェーズＩＩ解毒酵素を誘導し、これが有害な発癌性化合物をより毒性が低く身体によって排出されやすい化合物に転化させる。
【００２１】
非限定的な一実施形態では、カロテノイドの誘導体は、カロテノイドの誘導体とのｋｅａｐ  １付加物を形成することによってＡＲＥの活性を増大させる。これは次にそれのＮｒｆ２からの解離及び後者の活性化を引き起こし得る。
【００２２】
本発明の方法の例となる実施形態のいくつかでは、カロテノイドの酸化生成物が、対象において酸化防止剤応答要素（ＡＲＥ）を誘導し、それによって対象の癌の発病を予防し、癌細胞の増殖を抑制し、癌の進行を遅延し、及び／又は癌を治療するのに有効な量で投与される。
【００２３】
本発明のカロテノイドの酸化生成物は、いくつかの癌細胞系の増殖を抑制することが示されてきた。したがって、本発明はまた、癌細胞を癌細胞の増殖を抑制するのに有効な量のカロテノイドの酸化生成物と接触させることによって、癌細胞の増殖を抑制する方法にも関する。本発明の方法は、細胞又は組織の培養物中で、又は生体中、例えばヒトで実施することができる。これらのカロテノイドの誘導体は、幅広い種類の癌細胞系に対して強力であり、癌の非限定的な例には前立腺癌、肝臓癌及び乳癌が含まれる。
【００２４】
一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は親カロテノイドと比較してさらに活性である。例えば、カロテノイドの酸化生成物は、親カロテノイドと比較して、１０％高い活性、少なくとも５０％高い活性、少なくとも２倍の活性等であり得る。さらに、経口生体利用効率及び貧水溶性化合物の溶解などの因子並びに生物活性に影響する他の因子のために、酸化生成物のｉｎ−ｖｉｖｏ活性はそれらのｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性とは異なり得る。したがって、酸化生成物は、対応する親分子と比較して、より強力な化学療法剤となり得る。
【００２５】
本発明のカロテノイドの酸化生成物は、幅広い種類の癌細胞において癌細胞の増殖を抑制する能力がある強力な化学療法剤である。したがって、本発明はこれまでに記載されていない癌の化学予防及び治療の有力な方法を提供する。
【００２６】
本発明の他の実施形態及び適用性の全容は、本明細書の以後の詳細な記載から明白となるであろう。しかし、詳細な記載及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、本発明の趣旨及び範囲の中でのさまざまな変更及び修正がこの詳細な記載から当業者には明白となるので、例示の目的でのみ提示されていることを理解するべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、カロテノイドの誘導体例えば、リコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン又はトマト抽出物中に存在する任意の他のカロテノイドの誘導体を使用する癌の化学予防及び治療の有力な方法を提供する。これらの誘導体はカロテノイド、例えばトマトのカロテノイドの推定されている酸化生成物である。
【００２８】
カロテノイドの誘導体
本発明のカロテノイドの誘導体は、リコペン、α−及びβ−カロテン、フィトエン、フィトフルエン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン又は任意の他のカロテノイドの推定酸化生成物である。本発明において使用されるカロテノイドの酸化生成物は、当技術分野で知られている任意の合成方法によって調製された合成誘導体であればよい。さらに本発明では、天然に存在するカロテノイドから、例えば天然に存在するカロテノイドの酸化によって得られる酸化生成物の使用も企図されている。天然のカロテノイドは、本明細書に記載されている任意の１つ又は複数のカロテノイド、又は任意の他の推定されているカロテノイドであればよい。天然に存在するカロテノイドは、例えばトマト製品（例えば、トマト、トマトソース、ケチャップなど）、発酵物、スイカ、グアバ、グレープフルーツなどの中で見出されるカロテノイドでよい。一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は、天然源からカロテノイドを抽出し、続いて酸化することによって得られる。カロテノイドは天然源から当業者に知られている抽出技法を使用して抽出することができる。
【００２９】
炭素骨格がカロテノイドの一方又は両方の末端からの断片のホルマール除去によって短縮されたカロテノイドの誘導体は、本明細書では、当技術分野で知られている通り、それぞれ「アポ−カロテノイド」及び「ジアポ−カロテノイド」と呼ぶ。
【００３０】
Ａ．リコペン誘導体
現在好ましい一実施形態では、本発明の方法で使用するカロテノイドの誘導体は、カロテノイドリコペンの推定酸化生成物である。リコペンの任意の酸化生成物が、合成物でも天然物でも、本発明の組成物及び方法で使用することができる。
【００３１】
一実施形態では、リコペン誘導体は、リコペンを当業者に知られている任意の酸化方法で酸化することによって合成で調製される。例えば、リコペンの酸化生成物はＫｉｍらの（９）及びＺｈａｎｇらの（１３）に記載されている通りにリコペンの自動酸化によって、Ａｕｓｔらの（１２）に記載されている通りに過酸化水素／四酸化オスミウムを使用して、Ｋｉｍらの（９）及びＮａｒａらの（１４）に記載されている通りにリコペンのオゾン分解によって、Ｃａｒｉｓ−Ｖｅｙｒａｔらの（１０）に記載されている通りに過マンガン酸カリウムを使用することによって、Ｙｏｋｏｔａらの（１５）に記載されている通りに過酸化水素と硫酸を使用することによって、Ｕｋａｉらの（１６）に記載されている通りに酸素を増感剤（メチレンブルー）の存在下で使用することによって、又は当業者に知られている任意の他の合成的酸化方法によって形成させることができる。リコペン誘導体は、Ｆｅｒｒｅｉｒａらの（８）に記載されている通りにリコペンの酵素酸化によって得ることもできる。リコペン誘導体は、例えばＹｏｋｏｔａらの（１５，１７）に記載されている通りに、例えばトマト及びトマト製品からの単離によって調製することもできる。リコペン及び他のカロテノイドの酸化生成物は、米国特許出願２００３／０１５８４２７に記載されている通りに調製することもできる。
【００３２】
前述の参考文献の内容は、参照によりそれらの全体を、本明細書で完全に記載したかのように組み入れる。
【００３３】
加えて、アルケンのアルデヒド、ケトン及び他の酸化生成物への酸化の別の方法が知られており、リコペン及び他のカロテノイドの酸化に適用することができる可能性がある。例えば、アルケンは、塩化パラジウム、水及び空気の存在下で、通常、塩化銅のような共酸化剤を用いて、アルデヒド又はケトンに酸化することができる。アルデヒドを生成させるもう１つの方法は、一酸化炭素及び水素を金属触媒の存在下で用いるアルケンのヒドロホルミル化である。
【００３４】
リコペンから得ることに加えて、本発明のリコペン誘導体は、何らかの出発原料から、当技術分野で知られているいずれかの従来法を使用して、合成的に調製することができることも当業者には明白であろう。
【００３５】
本発明のリコペンの酸化生成物は合成的に調製することができるが、本発明ではｉｎ  ｖｉｖｏ、例えばヒトの体内で形成される天然のリコペンの酸化生成物の使用も企図されている。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されているリコペンの酸化生成物の任意の１つ又は複数は、生体系で形成されるリコペンの推定酸化生成物である。実際に、変化していないカロテノイドよりも、むしろリコペン及び他のカロテノイドの酸化生成物がカロテノイドの生物活性の一部、例えば癌の予防に関与していることが示唆されてきた（９、１４）。事実、本発明の出願人らがリコペン調製物をエタノールで抽出してこのカロテノイドの親水性酸化誘導体を親分子から分離したとき、このエタノール抽出物は、投与量に依存した形で、元のリコペンの効力と等価な効力で、ＡＲＥレポーター遺伝子を転写活性化した。この誘導体の濃度は明らかにリコペンの濃度よりも低かったので、これらのリコペンの酸化誘導体の１つ又はいくつかは親のリコペンよりも活性であることが示唆された。
【００３６】
現在好ましいリコペンの酸化生成物は、ジアルデヒド誘導体（本明細書において以後相互交換可能にジアポ−カロテンジアール又はジアポ−リコペンジアールと呼ぶ）。こうしたジアルデヒド誘導体は、例えば、Ｃａｒｉｓ−Ｖｅｙｒａｔらの（１０）によって記載されており、この文献の内容は、参照によりその全体を、本明細書で完全に記載したかのように組み入れる。ジアルデヒド誘導体は、リコペンの表示された炭素原子でのさまざまな結合の開裂によって形成される。これらのジアルデヒド誘導体の例には、これらだけには限定されないが、ジアポ−２，２’−リコペンジアール（２，２’）、ジアポ−４，４’−リコペンジアール（４，４’）、ジアポ−６，６’−リコペンジアール（６，６’）、ジアポ−８，８’−リコペンジアール（８，８’）、ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール（１０，１０’）、ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール（１２，１２’）、ジアポ−６，８’−リコペンジアール（６，８’）（ジアポ−６’，８−リコペンジアール（６’，８）とも表示される）、ジアポ−６，１０’−リコペンジアール（６，１０’）（ジアポ−６’，１０−リコペンジアール（６’，１０）とも表示される）、ジアポ−６，１２’−リコペンジアール（６，１２’）（ジアポ−６’，１２−リコペンジアール（６’，１２）とも表示される）、ジアポ−８，１０’−リコペンジアール（８，１０’）（ジアポ−８’，１０−リコペンジアール（８’，１０）とも表示される）、ジアポ−８，１２’−リコペンジアール（８，１２’）（ジアポ−８’，１２−リコペンジアール（８’，１２）とも表示される）、ジアポ−８’，１５−リコペンジアール（８’，１５）（ジアポ−８，１５’−リコペンジアール（８，１５’）とも表示される）、２，４，６−オクタトリエンジアール，２−（ヒドロキシメチル）−７−メチル−（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−（９ＣＩ）、５−シス−４，４’−７，７’８，８’１１，１１’，１２，１２’，１５，１５’−デカヒドロ−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号１２２４４０−４５−３）、７，７’８，８’１１，１１’，１２，１２’，１５，１５’−デカヒドロ−４，４’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号１２２３３３−８５−１）、７，７’８，８’１１，１１’，１２，１２’，１５，１５’−デカヒドロ−６，６’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号２６９０６−７３−０）などが含まれる。かかるジアルデヒド誘導体の現在好ましい例には、ジアポ−８，８’−リコペンジアール（８，８’）、ジアポ−８’，１２−リコペンジアール（８’，１２）、ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール（１０，１０’）、ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール（１２，１２’）、ジアポ−８’，１５−リコペンジアール（８’，１５）が含まれる。これらの誘導体の構造を下の表１に示す。
【００３７】
表１：ジアポ−リコペンジアールの化学構造
【表１−１】
2009511570.tif 000002
【表１−２】
2009511570.tif 000003
【表１−３】
2009511570.tif 000004
【００３８】
一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は、２，７，１１−トリメチル−テトラデカヘキサン−１，１４−ジアール（本明細書ではジアポ−６，１２’−リコペンジアールとも表示する）以外のものである。
【００３９】
本発明によって包含される他の好ましいリコペンの酸化生成物には、アルデヒド誘導体（本明細書では相互交換可能にアポ−リコペナール又はアポ−カロテナールとも呼ばれる）が含まれる。かかるジアルデヒド誘導体は、例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａら（８）、Ｋｉｍら（９）及びＣａｒｉｓ−Ｖｅｙｒａｔら（１０）によって記載されている。これらのアルデヒド誘導体の例には、これらだけには限定されないが、アポ−６’−リコペナール、アポ−８’−リコペナール、アポ−１０’−リコペナール、アポ−１２’−リコペナール、アポ−１４’−リコペナール、アポ−１５−リコペナール（アシクロレチナール）、アポ−１１−リコペナール（３，７，１１−トリメチル−２，４，６，１０−ドデカテトラエン−１−アール）、アポ−７−リコペナール（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−アール）、３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロ−１５，１５’−アポ−リコペナールなどが含まれる。これらの誘導体の構造を下の表２に示す。
【００４０】
表２：アポ−リコペナールの化学構造
【表２】
2009511570.tif 000005
【００４１】
本発明の方法及び組成物において使用することができるリコペンの酸化生成物のさらなる好ましい例には、ケトン誘導体（本明細書では相互交換可能にアポ−リコペノン又はアポ−カロテノンと呼ぶ）が含まれる。これらのケトン誘導体の例には、これらだけには限定されないが、アポ−１３−リコペノン（６，１０，１４−トリメチル−３，５，７，９，１３−ペンタデカペンタエン−２−オン）、３−ケト−アポ−１３−リコペノン、アポ−９−リコペノン（６，１０−ジメチル−３，５，９−ウンデカトリエン−２−オン）、アポ−５−リコペノン（２−メチル−２−ヘプテン−６−オン）（１６）などが含まれる。これらの誘導体の構造を下の表３に示す。
【００４２】
表３：アポ−リコペノン
【表３】
2009511570.tif 000006
【００４３】
本発明の方法及び組成物において使用することができるリコペンの酸化生成物のさらなる例には、エポキシド誘導体が含まれる。かかるエポキシド酸化生成物の例には、これらだけには限定されないが、リコペン−５，６−５’，６’−ジエポキシド、リコペン５，６−エポキシド（２，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，３０−ドトリアコンタドデカエン，６，７−エポキシ，２，６，１０，１４，１９，２３，２７，３１−オクタメチル−（６ＣＩ）−ＣＡＳ番号５１５９９−１０−１）、リコペン１，２−１’，２’−ジエポキシド（ＣＡＳ番号７６６８２−２１−８）、リコペン１，２−エポキシド（ＣＡＳ番号５１５９９−０９−８）などが含まれる。これらの誘導体の構造を下の表４に示す。
【００４４】
表４：エポキシド酸化生成物の化学構造
【表４】
2009511570.tif 000007
【００４５】
本発明の方法及び組成物において使用することができるリコペンの酸化生成物のさらなる例には、フラノキシド（ｆｕｒａｎｏｘｉｄｅ）誘導体が含まれる。かかるフラノキシド酸化生成物の例には、これらだけには限定されないが、３−ケト−リコペン−５’８’−フランオキシド、リコペン−５，８−フランオキシド異性体（Ｉ）、リコペン−５，８−フラノキシド異性体（ＩＩ）、Ｆｅｒｒｅｉｒａらの（８）に記載の２−アポ−５，８−リコペナール−フランオキシド、１，５−エポキシイリダニル（ｅｐｏｘｙｉｒｉｄａｎｙｌ）−リコペン（２−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン，７−（３，７，１２，１６，２０，２４−ヘキサメチル−１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２３−ペンタコサウンデカエニル）−１，３，３−トリメチル−［１Ｒ［１α，４α，７Ｓ＊（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｅ，１３Ｅ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ）］］−）（ＣＡＳ番号１８９６２０−８２−４）（５）などが含まれる。これらの誘導体の構造を下の表５に示す。
表５：フランオキシド酸化生成物の化学構造
【００４６】
【表５】
2009511570.tif 000008
【００４７】
本発明の方法及び組成物において使用することができる他の適切なリコペンの酸化生成物は、カルボン酸誘導体であり、これらだけには限定されないが、非環式レチノイン酸（９）及び６’−アポリコペノン酸（ａｐｏｌｙｃｏｐｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＡＳ番号２２２５５−３８−５）が含まれる。これらの化合物の構造を下の表６に示す。
【００４８】
表６：カルボン酸酸化生成物の化学構造
【表６】
2009511570.tif 000009
【００４９】
本発明の方法及び組成物において使用することができるリコペンの酸化生成物には、さらに上記の酸化生成物のいずれかの誘導体が含まれてもよい。例えば、上記のリコペン誘導体のいずれかのアセタール、ケタール、アセチル化、水酸化及びハロゲン化誘導体も、本発明の広い範囲の中に含まれる。また、アルキン結合又は水素化された二重結合を含有するリコペン誘導体も含まれる。かかる化合物には、これらだけには限定されないが、１５，１５’−ジデヒドロ−（１１−シス，１１’−シス）−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号９７０５８−１３−４）、１５，１５’−ジデヒドロ−１１−シス−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号９６９９６−９８−４）、１５，１５’−ジデヒドロ−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号９６９４８−３１−１）、２０，２０’−ジヒドロキシ−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号５６２１８−２６−９）、２０−ヒドロキシ−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号５４７９５−８７−８）、２０−ヒドロキシ−１３−シス−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号６４４７４−１３−１）、２０，２０’−ビス（アセチルオキシ）−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号５６２１８−２２−５）、２０−（アセチルオキシ）−１３−シス−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号６４４７４−１２−０）、２０−（アセチルオキシ）−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号５６２１８−２１−４）、２０，２０’−ジブロモ−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号５６２１８−２０−３）、２０−ブロモ−８，８’−ジアポ−Ψ，Ψ−カロテンジアール（ＣＡＳ番号５６２１８−１９−０）、６’−アポリコペナール，ジメチルアセタール（ＣＡＳ番号２２２５５−３７−４）が含まれる。これらの化合物の構造を下の表７に示す。
【００５０】
表７：
【表７−１】
2009511570.tif 000010
【表７−２】
2009511570.tif 000011
【表７−３】
2009511570.tif 000012
【００５１】
本発明ではさらに、前述の分類の１つには含まれない他のどのリコペンの酸化生成物の使用も企図されている。さらなる酸化生成物の非限定的な例には、これらだけには限定されないが、（Ｅ，Ｅ，Ｅ）−４−メチル−８−オキソ−２，４，６−ノナトリエナール（３４）、（２Ｓ＊，５Ｓ＊，６Ｒ＊）−２，６−シクロリコペン−１−メトキシ−５−オール（４１）、（２Ｓ＊，５Ｓ＊，６Ｒ＊），１−１６−ジデヒドロ−２，６−シクロリコペン−５−オール（４１）、２，６−シクロリコペン−１，５−ジオール（１，５−ジヒドロキシイリダニル−リコペンとも呼ばれる）（２７、３９）、リコペン−１，２−ジヒドロ−１−ヒドロキシ−（７ＣＩ）（ＣＡＳ番号１０５−９２−０）、１，１’，２，２’，−テトラヒドロ−１，１’−ジヒドロキシリコペン（ＣＡＳ番号４２１２−５７−１）、５，６−ジヒドロ５，６−ジヒドロキシリコペン（ＣＡＳ番号６６８０３−１７−６）などが含まれる。これらの化合物の構造を下の表８に示す。
【００５２】
表８：
【表８】
2009511570.tif 000013
【００５３】
また、アルケンは当業者には周知の通り化学反応によってγ−ラクトン、ジオール及びα−ヒドロキシケトンに転化させることもできる。これらのどの誘導体の使用もやはり本発明の広い範囲内で企図されている。アセタール及びケタール誘導体も、例えば米国特許２００３／１５８４２７に記載されている通り企図されており、この特許の内容は参照によりその全体を、本明細書で完全に記載したかのように組み入れる。
【００５４】
加えて、本明細書において前記したリコペンの酸化生成物の１つ又は複数の任意の混合物も本発明の方法又は組成物において使用することができる。本明細書において企図されている通り、かかる混合物には、リコペンの合成誘導体の混合物、当技術分野において知られている任意の酵素的及び非酵素的手順を使用するリコペンの酸化によって形成される混合物、及び生体系におけるリコペンの酸化によって得られる混合物（例えば、ヒトなどのｉｎ  ｖｉｖｏで形成されるリコペンの酸化生成物）が含まれる。２つ以上の官能基を含有する酸化生成物、例えばアルデヒド基とヒドロキシ基、アルデヒド基とハロゲン基（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）などを含有する化合物も企図されている。
【００５５】
Ｂ．β−カロテン誘導体
他の一実施形態では、本発明の方法において使用するカロテノイド誘導体は、カロテノイドβ−カロテンの推定酸化生成物である。リコペンの酸化生成物の場合と同様に、これらの誘導体は、当業者に知られている任意の酸化方法によるβ−カロテンの酸化によって合成で調製することができる。或いは、β−カロテン誘導体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば人体中で形成される酸化生成物であってもよい。
【００５６】
β−カロテンの酸化生成物は、当技術分野において記述されているどの方法によって形成されてもよい。例えば、レチナール及びさまざまな炭素鎖長を有するβ−アポ−カロテナールは、溶媒中の自動酸化、ペルオキシラジカル開始剤、一重項酸素、タバコの煙を用いる酸化などのさまざまな条件下での非酵素的酸化、及びリポキシゲナーゼによる共酸化によってβ−カロテンから形成されることが知られてきた。レチノール酸が、ベンゼン中でのβ−カロテンの自動酸化によって形成されることも示唆された。β−カロテンのペルオキシラジカル酸化生成物も知られている。
【００５７】
かかるβ−カロテンの酸化生成物の例としては、これらだけには限定されないが、Ｉ）（Ｅ）−β−イオノン（３−ブテン−２−オン，４−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イルとも命名されている）−，（３Ｅ）−（９ＣＩ）；３−ブテン−２−オン，４−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−、（Ｅ）−（８ＣＩ）；）；２）β−アポ−１４’−カロテナール（２，４，６，８，１０−ウンデカペンタナール，５，９−ジメチル−１１−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イルとも命名されている）−，（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ，１０Ｅ）−（９ＣＩ）；１４’−アポ−β，Ψ−カロテナール；１４’−アポ−β−カロテナール（６ＣＩ，７ＣＩ，８ＣＩ）；２，４，６，８，１０−ウンデカペンタナール，５，９−ジメチル−１１−（２，６，６，−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−，（全Ｅ）−；カルボニル４００）；３）β−アポ−１０’−カロテナール（２，４，６，８，１０，１２，１４−ペンタデカヘプタエナール，４，９，１３−トリメチル−１５−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−，（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−（９ＣＩ）とも命名されている）；１０’−アポ−β，Ψ−カロテナール；１０’−アポ−β−カロテナール（６ＣＩ，７ＣＩ）；１０’−アポ−β−カロテナール、全トランス−（８ＣＩ）；２，４，６，８，１０，１２，１４−ペンタデカヘプタエナール，４，９，１３−トリメチル−１５−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−、（全Ｅ）−）；４）β−アポ−８’カロテナール（２，４，６，８，１０，１２，１４，１６−ヘプタデカオクタエナール，２，６，１１，１５−テトラメチル−１７−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−，（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ，１０Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ，１６Ｅ）−（９ＣＩ）とも命名されている）；８’−アポ−β，Ψ−カロテナール；８’−アポ−β−カロテナール（６ＣＩ）；８’−アポ−β−カロテナール，全トランス−（８ＣＩ）；β−アポ−カロテナール：２，４，６，８，１０，１２，１４，１６−ヘプタデカオクタエナール，２，６，１１，１５−テトラメチル−１７−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−，（全Ｅ）−；８’−アポ−β，Ψ−カロテン−８’−アール；８’−アポ−β−カロテン−８’−アール；８’−アポ−カロテン−８’−アール；８’−アポ−β−カロテン−８’−アール；Ｃ  Ｏｒａｎｇｅ  １６；Ｃ．Ｉ．４０８２０；Ｃ．Ｉ．Ｆｏｏｄ  Ｏｒａｎｇｅ  ６；Ｅ  １６０ｅ；全トランス−β−アポ−８’−アール）；５）４−ヒドロキシ−β−アポ−１３−カロテノン（３，５，７−オクタトリエン−２−オン，８−（３−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−６−メチル−，（３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−（９ＣＩ）とも命名されている）；６）１２’−アポ−β，Ψ−カロテナール，１３’−シス（１３’−シス−β−アポ−１２’−カロテナールとも命名されている）；７）β，β−カロテン−５，６−エポキシド（β，β−カロテン，５，６−エポキシ−５，６−��ヒドロ−（９ＣＩ）とも命名されている）；β−カロテン，５，６−エポキシ−５，６−ジヒドロ−（７ＣＩ）；β−カロテン，５，６−エポキシ−５，６−ジヒドロ−（７ＣＩ），β−カロテン，５，６−エポキシ−５，６−ジヒドロ，全トランス−（８ＣＩ）；７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタン，β−カロテン５，６−エポキシド；β−カロテン５，６−モノエポキシド；β−カロテンモノエポキシド；５，６−ジヒドロ−β，β−カロテン５，６−エポキシド；５，６−エポキシ−β−カロテン；５，６−エポキシ−５，６−ジヒドロ−β，β−カロテン；５，６−モノエポキシ−β−カロテン）；及び８）５，８−エポキシ−５，８−ジヒドロ−β，β−カロテン（β，β−カロテン，５，８−エポキシ−５，８−ジヒドロ−（９ＣＩ）とも命名されている）；β−カロテン，５，８−エポキシ−５，８−ジヒドロ−，全トランス−（８ＣＩ）；β−カロテン５，８−エポキシド；５，８−エポキシ−５，８−ジヒドロ−β，β−カロテンが含まれる。上記の化合物の化学構造を下の表９に挙げる。
【００５８】
表９：β−カロテンの酸化生成物の化学構造
【表９−１】
2009511570.tif 000014
【表９−２】
2009511570.tif 000015
【表９−３】
2009511570.tif 000016
【００５９】
本発明の幅広い範囲の中に包含される他の適当なβ−カロテンの酸化生成物には、これらだけには限定されないが、β−アポ−１３−カロテノン、レチナール、β−アポ−１２’−カロテナール、１５，１５’−エポキシ−β，β−カロテン、及び１１，１５’−シクロ−１２，１５−エポキシ−１１，１２，１５，１５’−テトラヒドロ−β−カロテンが含まれる。
【００６０】
当技術分野の熟練者には、リストが決して網羅的なものではなく、代表例として使用するべきであり、且つ本発明の方法及び組成物において使用することができる他のβ−カロテンの酸化生成物を制限するものではないことは明らかである。したがって、本明細書においてリコペンに関して前記した任意の１つ又は複数の酸化生成物は、β−カロテンにも適用することができる。したがって、本発明では、β−カロテンのジアルデヒド誘導体、アルデヒド誘導体、ケトン誘導体、エポキシド誘導体、フラノキシド誘導体、カルボン酸誘導体γ−ラクトン誘導体、α−ヒドロキシケトン誘導体、ジオール誘導体、アセタール誘導体、ケタール誘導体、ハロゲン化誘導体、アセチル化誘導体、１つ又は複数のアルキン結合を含有する誘導体、二重結合の１つ又は複数が還元されている水素化誘導体などの使用が企図されている。これらの官能基の１つ又は複数の組合せも企図されている。２つ以上の官能基を含有する化合物も企図されている。かかる酸化生成物は、上記の方法任意の１つによって合成で調製することができ、又はこれらの生成物を上記の生体系内でｉｎ  ｖｉｖｏ形成させることもできる。
【００６１】
Ｃ．他のカロテノイド誘導体
本発明が上記のカロテノイド誘導体だけには限定されないことは当業者には明白なはずである。むしろ、本発明では、合成であろうと天然であろうと、どの果物及び野菜に見出されるどのカロテノイドのどの酸化生成物の使用も企図されている。下に示す通り、リコペンとβ−カロテンの間の構造の相違は、対称な分子のそれぞれの側の８位より先にある。したがって８位〜１５位からの誘導体であるすべての化合物は、２つの対称的な８位の間で同じ共役二重結合系を有するどのカロテノイドからでも得ることができる。これにはβ−イオノン環を有するすべてのカロテノイドが含まれ、これらだけには限定されないが、α−及びβ−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチン、フィトエン、フィトフルエン、α−及びβ−クリプトキサンチン、カンタキサンチン及びアスタキサンチンが含まれる。最後の２つ（カンタキサンチン及びアスタキサンチン）は、低い摂取量の故に通常血中には見出されず商業的には重要であり得る。
【００６２】
β−カロテン
【化１】
2009511570.tif 000017
【００６３】
リコペン
【化２】
2009511570.tif 000018
【００６４】
これらの化合物の酸化（脱水素化は含まない）は、上に示したリコペンの酸化生成物の水素化された類似体を生じるはずである（例えば中央の結合の開裂）。したがって、本発明では、これらのカロテノイドの推定酸化生成物である合成又は天然のカロテノイドの誘導体の任意の１つ又は複数の使用も企図されており、これらだけには限定されないが、ジアルデヒド誘導体、アルデヒド誘導体、ケトン誘導体、エポキシド誘導体、フラノキシド誘導体、カルボン酸誘導体、γ−ラクトン誘導体、α−ヒドロキシケトン誘導体、ジオール誘導体、アセタール誘導体、ケタール誘導体、ハロゲン化誘導体、アセチル化誘導体、１つ又は複数のアルキン結合を含有する誘導体、その中の１つ又は複数の二重結合が還元されている水素化誘導体などが含まれる。これらの官能基の１つ又は複数の組合せも企図されている。２つ以上の官能基を含有する化合物も企図されている。これらの誘導体は上記のリコペンの酸化生成物と類似の方法で得ることができる。
【００６５】
本発明は、本発明のカロテノイドの酸化誘導体の薬剤として許容される塩を含む。薬剤として許容される塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム又は塩酸、クエン酸などの無機／有機の酸を用いる処理によって調製することができる。「薬剤として許容される塩」という用語は、無機又は有機の塩基及び無機又は有機の酸を含む、薬剤として許容される無毒性の塩基又は酸から調製された塩のことを指す。本明細書で使用する本発明のカロテノイドの酸化生成物への言及は、それらの薬剤として許容される塩をも含むことを意味すると解釈するものとする。
【００６６】
本発明は、本発明のカロテノイドの酸化生成物の水和物をも含む。「水和物」という用語は、これらだけには限定されないが、半水化物、一水和物、二水和物、三水和物などを含む。本発明は、本発明のカロテノイドの酸化生成物のすべての結晶多形形態及びすべての無定形形態をも含む。
【００６７】
作用の機序
いかなる特定の機序及び理論にも拘束されたくはないが、カロテノイドの酸化生成物はそれらの強力な効果を抗酸化剤応答要素（ＡＲＥ）を誘導することによって発揮し、次にこれがフェーズＩＩ解毒酵素の発現を誘導すると考えられる。この酵素は多くの有害物質を、身体から排出されやすい親水性代謝産物に転化させることによって解毒する。フェーズＩＩ酵素の例は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）及びｇ−グルタミルシステインシンテターゼ（ＧＣＳ）である。主要なＡＲＥ−転写活性化因子Ｎｒｆ２が、抗酸化遺伝子及び解毒遺伝子の誘導において中心的な役割を果たす。
【００６８】
本明細書に例示の目的で記載されている非限定的な一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は、ｋｅａｐ  １のカロテノイドの酸化生成物との付加物を形成することによってＡＲＥの活性を増大させる。次にこれ（付加物）はＮｒｆ２から解離して後者の活性化を引き起こすことができる。Ｋｅａｐ  １はシステインに富む細胞質タンパク質であり、Ｎｒｆ２の活性化を負に調節する。Ｋｅａｐ  １の中心領域は最もシステインに富む領域であり、細胞質の隔離及びＮｒｆ２の抑制に必須である。Ｎｒｆ２のＫｅａｐ  １からの解離は、Ｎｒｆ２の核への移行を可能にする調節段階に相当し、癌の予防に重要なＡＲＥ依存性の遺伝子の転写を活性化させる。Ｋｅａｐ  １−Ｎｒｆ２からのＮｒｆ２の解離は、これらの特異的システイン残基の酸化還元状態によって調節され得る。精製されたヒトＫｅａｐ  １のＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析において特有のアルデヒドの付加物が観察された。これらの付加物の形成は、Ｎｒｆ２の安定化、Ｎｒｆ２の核への移行及びＡＲＥ依存性遺伝子の活性化と同時に起こった。
【００６９】
本明細書で使用する「誘導する」という用語及びその変化形は、その広く知られている増大させる又は高めるの意味を有する。「抗酸化剤応答要素を誘導する」という用語はＡＲＥのレベル、ＡＲＥの活性、ＡＲＥの発現、又はこれらの任意の組合せを誘導することを指す。例えば、本発明の出願人らは、カロテノイドの酸化生成物がいくつかの癌細胞系においてＡＲＥの活性を増大させることを実証した。
【００７０】
本明細書で使用する「活性」という用語は、酵素活性のことを指す。本明細書で使用する「レベル」という用語は、タンパク質のレベル、遺伝子のレベル（ＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｍ−ＲＮＡ）のレベル、又はこれらの任意の組合せを指す。本明細書で使用する「発現」という用語は、遺伝子の発現又はタンパク質の発現を指す。
【００７１】
したがって、一実施形態で、本発明は、酸化防止剤応答要素をカロテノイドの酸化生成物の有効量と接触させることによって、酸化防止剤応答要素を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を提供する。
【００７２】
他の一態様において、本発明は酸化防止剤応答要素を含有する細胞をカロテノイドの酸化生成物と接触させることによって、細胞内の酸化防止剤応答要素を誘導するｉｎ  ｖｉｖｏの方法を提供する。細胞は非悪性（非癌）細胞、前悪性（前癌）細胞又は悪性（癌）細胞であってよい。
【００７３】
さらに別の実施形態において、本発明は、細胞を、酸化防止剤応答要素を誘導するのに有効な量のカロテノイドの酸化生成物と接触させ、それによってフェーズＩＩ解毒酵素を誘導することにより、フェーズＩＩ解毒酵素を含有する細胞でフェーズＩＩ解毒酵素を誘導するｉｎ  ｖｉｖｏの方法を提供する。この細胞は非悪性（非癌）細胞、前悪性（前癌）細胞、又は悪性（癌）細胞であってよい。
【００７４】
本発明は前述の作用機序には限定されないこと、及び本発明の化合物が他の細胞内標的に作用して本明細書に記載の抗癌効果を達成してもよいことは当業者には明白である。
【００７５】
治療上の使用
本明細書に記載する通り、本発明のカロテノイドの酸化生成物は、幅広い種類の癌細胞において癌細胞の増殖を抑制する能力がある強力な化学予防剤及び化学療法剤である。したがって、本発明はこれまでに記載されたことがない癌の化学予防及び治療の強力な方法を提供する。
【００７６】
したがって、一態様において、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を投与することによる癌の予防及び治療の方法に関する。
【００７７】
他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌の発病を予防するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌の発病を予防する方法を提供する。
【００７８】
他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌細胞の増殖を抑制するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【００７９】
さらに他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌の進行を遅延するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌の進行を遅延する方法を提供する。
【００８０】
さらに他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌の再発を予防するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌の再発を予防する方法を提供する。
【００８１】
本明細書において実証する通り、本発明のカロテノイドの誘導体は癌細胞の増殖を抑制するが、これは癌の進行を遅延するためには重要である。細胞増殖の抑制は、それが癌の進行を緩慢にするので、癌の治療のために重要である。したがって、他の一実施形態では、本発明は、カロテノイドの酸化生成物を含む薬剤組成物を、対象における癌を治療するのに有効な量で対象に投与する段階を含む、対象における癌を治療する方法を提供する。
【００８２】
一実施形態では、カロテノイドの酸化生成物は親のカロテノイドと比較してより活性であり、例えば少なくとも１０％高い活性、好ましくは少なくとも５０％高い活性、より好ましくは少なくとも２倍の活性である。酸化生成物は、親のカロテノイドと比較して１０倍に達する活性さえも示すことがある。「より活性」は、例えば、酸化生成物が親のカロテノイド分子と比較して一般的に抗癌剤としてより有効であることを意味する。例えば、酸化生成物は親のカロテノイド分子と比較して、より低い投与量及びより高い有効性でＡＲＥを誘導し、フェーズＩＩ解毒酵素を誘導し、癌細胞の増殖を抑制し、癌の発病を予防し、癌の進行を遅延する。
【００８３】
さらに、酸化生成物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性とは異なり得る。一般的に、酸化生成物はそれらの対応する親よりも極性であり、それがある種の性質、例えば溶解性、分解及び生体利用効率などに影響することがある。そういうものとして、酸化生成物は対応する親分子と比較してより強力な化学療法剤であり得る。
【００８４】
本明細書で使用する「治療」という用語は障害の寛解処置と同様に予防処置も含む。本明細書で使用する「抑制」という用語は、本明細書において「軽減」又は「抑圧」と相互交換可能に使用され、その広く解釈されている低減又は減少の意味を有する。本明細書で使用する「進行」という用語は範囲又は重大性の増大、前進、成長又はより悪くなることを意味する。本明細書で使用する「再発」という用語は、回復後に病気が戻ることを意味する。
【００８５】
本明細書で使用する「投与」という用語は、本発明のカロテノイドの酸化生成物と接触させることを意味する。投与は細胞又は組織培養物、又は生体、例えばヒトに対して遂行することができる。一実施形態では、本発明は、本発明の化合物をヒトに対して投与することを包含する。
【００８６】
「癌」又は「悪性腫瘍」は、本明細書では本発明に関して相互交換可能に使用され、固形腫瘍の形態であれ非固形腫瘍の形態であれ、すべての原発部位からの新生物を含み、且つ悪性固形腫瘍又は非固形腫瘍の両方及びこれらの転移を含む。この用語は特に、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、線腫、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、ユーイング肉腫、子宮平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛腫、セミノーマ、胎生期癌、；ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、末梢神経系癌、中枢神経系癌、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、脊髄リンパ腫、白血病、リンパ腫、リンパ増殖性疾患、急性骨髄性白血病、慢性白血病、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、肝癌及びこれらすべての転移のことを指す。より好ましくは癌は前立腺癌、肝癌及び乳癌から成る群から選択される。
【００８７】
本発明の他の実施形態では、カロテノイドの酸化生成物を１つ又は複数の従来の化学療法剤又は化学予防剤と共に配合して投与することができる。カロテノイドの誘導体と従来の薬剤との組合せは、従来の薬剤のより少ない量の投与を可能にすることがあり、したがって対象が経験する副作用が顕著に低下する可能性があり、しかも十分な化学療法又は化学予防の効果が達成される。
【００８８】
本発明のカロテノイドの酸化生成物は、いくつかの細胞系の増殖を抑制することが示された。したがって、他の一態様において、本発明は、癌細胞を癌細胞の増殖を抑制するのに有効な量のカロテノイドの酸化生成物と接触させることによって癌細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
【００８９】
本明細書及び付帯の特許請求の範囲を通じて使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって明確にそうではないと指示されない限りは複数を含む。したがって、例えば、「カロテノイドの酸化生成物」と言えばかかる化合物の混合物を含み、「抗酸化剤応答要素」又は「フェーズＩＩ酵素」と言えばかかる分子の個々の混合物への言及を含み、「配合物」又は「方法」と言えば本明細書で記載されている種類の並びに／又は本開示を読めば当業者には明白となる１つ又は複数の配合物、方法及び／若しくは段階を含む。
【００９０】
薬剤組成物
本発明のカロテノイドの酸化生成物は単独ででも投与することができるが、これらの化合物を、カロテノイドの酸化生成物を薬剤として許容される担体又は賦形剤と一緒に含有する薬剤組成物中で投与することが企図されている。
【００９１】
本発明の薬剤組成物は、経口、直腸内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、及び鼻腔内を含むさまざまな経路による投与向けに製剤することができる。こうした組成物は製薬技術分野で周知の方法で調製され、有効成分として本明細書で上記したカロテノイドの酸化生成物の少なくとも１つを、薬剤として許容される賦形剤又は担体と一緒に含む。本発明による薬剤組成物の調製の間に、有効成分は普通には賦形剤と混合するか、賦形剤で希釈するか又はカプセル、小袋、紙若しくは他の容器の形態でよい担体の内部に封入する。賦形剤が希釈剤として働く場合は、それは、有効成分の媒体、担体又は媒体として役立つ固体、半固体、又は液体の材料であればよい。したがって、組成物は錠剤、丸薬、粉末、トローチ、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、アエロゾル（固体として又は液体媒体中の）、例えば１０重量％までの有効化合物を含有する軟膏、ソフト又はハードのカプセル、座薬、滅菌注射液、滅菌包装された粉末の形態であればよい。
【００９２】
製剤を調製するときには、他の成分と合わせる前に、有効成分を粉砕して適切な粒子サイズにすることが必要なことがある。有効化合物が実質的に不溶性である場合は、通常は２００メッシュ未満の粒子サイズに粉砕する。有効成分が実質的に水溶性である場合は、製剤中で実質的に均一な分布をもたらすために、普通は粉砕によって粒子サイズを、例えば４０メッシュに調節する。
【００９３】
適当な賦形剤の一部の例には、これらだけには限定されないが、乳糖、デキストロース、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、及びメチルセルロースが含まれる。製剤は、さらに潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油；湿潤剤；乳化剤及び懸濁化剤；保存剤、例えばヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル；甘味料；並びに香味料を含むことができる。本発明の組成物は、当技術分野で知られている手順を使用することによって、患者への投与後に有効成分の迅速、持続又は遅延放出をもたらすように製剤することができる。
【００９４】
本組成物は、好ましくはそれぞれの投与量が約０．１〜約５００ｍｇの有効化合物を含む、単位投与形態（剤形）に製剤することが好ましい。「単位投与形態（剤形）」という用語は、ヒト対象及び哺乳動物に対する１単位ずつの投与として適当な物理的に個別の単位のことを言うものであり、それぞれの単位は所望の治療効果を生じると計算された所定量の有効化合物を、適当な薬剤用賦形剤と合わせて含有する。
【００９５】
錠剤などの固形組成物の調製のためには、主たる有効成分は薬剤用賦形剤と混合して、本発明の化合物の均一な混合物を含有する固形の予備製剤組成物を形成する。これらの予備製剤組成物を均一と言う場合は、組成物を等しく有効な単位投与形態例えば錠剤、丸薬及びカプセルなどに再分割しやすいように、有効成分が組成物全体に均等に分散されていることを意味する。この固形予備製剤は、次いで上記した種類の単位投与形態に再分割される。
【００９６】
本発明の錠剤又は丸薬は、持続性の作用という利点を与える投与形態を提供するように、被覆するか又は他の方法で調合してもよい。例えば、錠剤又は丸薬は内側の投与要素及び外側の投与要素を含んで、後者が前者の周りの外皮となることもできる。これら２つの要素を、胃内での崩壊に抵抗して内側要素をそのまま十二指腸まで通過させるか又は放出を遅延することを可能にする、腸溶性の層によって分離することができる。こうした腸溶性層又は被覆にはさまざまな材料を使用することができ、こうした材料には、いくつかのポリマー酸並びにポリマー酸のシェラック、セチルアルコール、及び酢酸セルロースなどの材料との混合物が含まれる。
【００９７】
経口又は注射によって投与するために本発明の組成物を組み込むことができる液体形態には、水溶液、適当に香味を付けたシロップ、水性又は油性懸濁液、及び綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、又はピーナッツ油などの食用油で香味を付けたエマルジョンが、エリキシル剤並びに類似の薬剤媒体と同様に含まれる。
【００９８】
以下の実施例は本発明の特定の実施形態をより完全に例示するために提示するものである。しかし、これらは決して本発明の幅広い範囲を限定するものと解釈してはならない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書で開示されている原理の多くの変更形態及び変形形態を容易に考案することができる。
【実施例】
【００９９】
実験の詳細の部
材料及び方法
材料
リコペンの推定酸化生成物は、ＢＡＳＦのＤｒ．Ｈａｎｓｇｅｏｒｇ  Ｅｒｎｓｔによって合成された。トマト抽出物から精製された結晶リコペン（調製時純度＞９７％）は、ＬｙｃｏＲｅｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  （Ｂｅｅｒ−Ｓｈｅｖａ、  Ｉｓｒａｅｌ）から無償提供された。抗酸化剤として０．０２５％のブチル化ヒドロキシトルエンを含有するテトラヒドロフランは、Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、ＭＥＭ（基礎培地）−イーグル培地、木炭ストリッピング済みＦＣＳ（ウシ胎児血清）、脱脂ＦＣＳ、及びＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ（リン酸緩衝液）は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）はＳｉｇｍａから購入した。非環式レチノイン酸（ａｃＲＡ）は、ＢＡＳＦのＤｒ．Ｈａｎｓｇｅｏｒｇ  Ｅｒｎｓｔから入手し、全トランス−レチノイン酸（ａｔＲＡ）は、Ｓｉｇｍａから入手した。
【０１００】
リコペン、合成のリコペン誘導体及びｔＢＨＱ溶液
リコペン及び合成のリコペン誘導体（リコペンの推定酸化生成物）をテトラヒドロフラン中に溶解させ、すでに記載されている通りに細胞培養用培地に可溶化させた（８）。ｔＢＨＱをＤＭＳＯ中に溶解させた。細胞培養培地中のテトラヒドロフラン及びＤＭＳＯの最終濃度は、それぞれ０．５％及び０．１％であった。媒体は提示している実験中に測定されたパラメーターには影響を与えなかった。すべての手順は減光下で行った。
【０１０１】
レポーター構築物及び発現ベクター
ＡＲＥレポーター構築物はＤｒ．Ｊ．Ｊ．Ｇｉｐｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；（参考文献１８））によって提供された。ＮＱＯ１ｈＡＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃ及びＧＣＳｈＡＲＥ４−ｔｋ−ｌｕｃは、それぞれヒトＮＱＯ１及びＧＣＳのヘビーサブユニットのプロモーターからの活性な応答要素の配列を含有する。後者の構築物の不活性変異型は該配列の単一塩基変異を含む。
【０１０２】
細胞培養
ＭＣＦ−７、ヒト乳房癌細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、ＭＤ）から購入した。ＭＣＦ−７細胞は、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ナイスタチン（１２．５Ａｇ／ｍＬ）、インスリン０．６μｇ／ｍＬ、及びＦＣＳ１０％を含有するＤＭＥＭ中で培養した。Ｔ４７Ｄ，ヒト乳房癌細胞系は、Ｄｒ．Ｙａｆａ  Ｋｅｉｄａｒ（Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｉｓｒａｅｌ）によって提供され、ＤＭＥＭ培地中で培養した。ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、ＭＤ）から購入し、ＲＰＭＩ培地上で培養した。この培地はペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ナイスタチン（１２．５μｇ／ｍＬ）、及びウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％、及びインスリン６μｇ／ｍＬを含有していた。それぞれの実験の前に、細胞はステロイドホルモンを欠乏させ、ＤＣＣ  ＦＣＳ１０％を補充したフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ中で３〜５日間保持した。
【０１０３】
一過性トランスフェクション及びレポーター遺伝子アッセイ
細胞トランスフェクション及びレポーター遺伝子アッセイは、一般的に以下の通り行った。一部の変異は異なる細胞系に使用することができる。ＴＦｘ−５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、細胞に、レポータープラスミド０．０５μｇ及びＲｅｎｉｌｌａ  ルシフェラーゼ発現ベクター（Ｐ−ＲＬ−ｎｕｌｌ  ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）０．０２μｇを内部標準として含有するＤＮＡ約０．０７μｇをトランスフェクトした。この目的のために、細胞を２４ウエルのプレートに播いた（１ウエル当たり細胞１００，０００個）。１日後、細胞を血清を含まない適切な培養培地で２回リンスし、続いてＤＮＡ及びＴＦｘ−５０試薬を投入比１：３で含有する培地０．２ｍＬを加えた。次いで細胞を、空気９５％／ＣＯ２５％中、３７℃で３０分間インキュベートした。木炭ストリッピング済みの脱脂ＦＣＳ３％を含有する培地４００マイクロリットルを加えてインキュベーションを８時間続けた。次にこれを脱脂ＦＣＳ３％及び試験化合物を補充された培地と交換して細胞をさらに１６時間インキュベートした。ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）のために、細胞抽出物をメーカーの指示書に従って調製した。
【０１０４】
リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法
細胞からすべてのＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出し、ｃＤＮＡをすでに記載されている通りに調製した（１９）。ＮＱＯ１及びＧＣＳ  ｍＲＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定し、結果をグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼｍＲＮＡの対応する値によって正規化した。次のプライマーを使用した。
ＮＱＯ１センス、５Ｖ−ＣＡＡＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＡＴ  Ａ−３Ｖ、
ＮＱＯ１アンチセンス、５Ｖ−ＴＴＣＡＡＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧ−３Ｖ、
ＧＣＳセンス、５ＶＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＧＴＧＴＣＣＧＴＣＴ−３Ｖ、
ＧＣＳアンチセンス、５ＶＴＧＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＣＣＴＣ−３Ｖ、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼセンス、５Ｖ−
ＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣ−３Ｖ、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼアンチセンス、５Ｖ−ＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ−３Ｖ。
【０１０５】
ｃＤＮＡサンプル（７μＬ）を９倍に希釈し、特定のプライマー（０．２ｍｍｏｌ）及びＴｈｅｒｍｏ−Ｓｔａｒｔ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ、Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）と混合した。次いでＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｄｙｅ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）を反応混合物に加えた。反応はＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置（Ｃｏｒｂｅｔｔ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｒｔｈｌａｋｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中で行った。この装置での標準的な繰り返し（サイクリング）条件は、９５℃で１５分間の最初の酵素活性化、次いで９５℃で１０秒間、アニーリング温度（ＮＱＯ１及びＧＣＳプライマーについては６０℃、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプライマーについては５８℃）で１５秒間、及び７２℃で２０秒間を３５サイクルであった。
【０１０６】
ウエスタンブロッティング
細胞を、以前に記載されている方法（２０）を改変して溶解させた。細胞の単層を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで氷冷溶解バッファーＡ［ＨＥＰＥＳ（双極性イオン緩衝剤）（ｐＨ７．５）５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ、グリセリン１０％（ｖ／ｖ）、トリトン  Ｘ−１００  １％（ｖ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  １．５ｍｍｏｌ、ＥＧＴＡ  １ｍｍｏｌ、アプロチン１０μｇ／ｍＬ、ロイペプチン１０μｇ／Ｌ、フェニルメチルスルホニルフロリド１μｍｏｌ／Ｌ、オルトバナジン酸ナトリウム２ｍｍｏｌ／Ｌ、ピロリン酸ナトリウム１０ｍｍｏＬ、ＮａＦ  ５０ｍｍｏｌ、及びＤＴＴ（ジチオトレイトール）０．２ｍｍｏｌ／Ｌ］中に掻き入れた。溶解液を氷上で１０分間インキュベートし、細胞の残骸を遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、１０分間）によって取り除いた。サンプルのタンパク質含有量を、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を使用してブラッドフォード法で測定した。等量のタンパク質（３０μｇ）をＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって分離し、次いでニトロセルロース膜に転写した。タンパク質を以下に記す一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光装置（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して可視化した。一次抗体：ＮＱＯ１（ｃ−１９、ｓｃ−１６４６４）、ＧＣＳ（ＧＳＨ１  Ｎ−２０、ｓｃ−１５０８５）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から入手。タンパク質の存在量は、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ＶＤＳ−ＣＬ画像化装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して濃度測定分析によって定量化した。
【０１０７】
細胞の増殖
ＭＣＦ−７、ＬＮＣａＰ及びＴ４７Ｄ細胞を９６ウエルプレートに播種した。１日後、培地をさまざまな物質を含有しているものと交換した。実験中の毎日、１つのプレートをチミジン取り込みアッセイに使用した。チミジンの取り込みは次の通りに測定した：冷チミジン（１００μＭ）を含有する［３Ｈ］チミジン（比放射能５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）２．５μＣｉ／ウエルを加えてプレートを１時間（ＭＣＦ−７細胞）又は３時間（ＬＮＣａＰ、Ｔ４７Ｄ細胞）インキュベートした（３７℃）。ヌクレオチドの取り込みを、無標識のチミジン（０．５μｍｏｌ）を加えることによって停止させた。次いで細胞をトリプシン処理し、セルハーベスター（Ｉｎｏｔｅｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してグラスファイバーフィルター上に集めた。放射能は、放射線画像解析装置（ＢＡＳ  １０００、富士、日本）によって決定した。
【０１０８】
（実施例１）
リコペン誘導体によるＡＲＥの誘導
リコペン及びいくつかのリコペン誘導体の、抗酸化剤応答要素（ＡＲＥ）の誘導に対する効果を、上述のすべての癌細胞系において試験した。使用したアッセイは、Ｎｒｆ２転写因子によって活性化される抗酸化剤応答要素の転写活性、及びそのカロテノイド及びそれらの誘導体による活性化を測定する。関心のある遺伝子のプロモーターの部分を、材料及び方法において記載したルシフェラーゼレポ−ター遺伝子に融合させた。これらの構築物を細胞中にトランスフェクトした。細胞をカロテノイド又は誘導体と共にインキュベートし、転写の活性化を測定した。
【０１０９】
次の合成リコペン誘導体を使用した：ａ）ジアポ−８，８’−リコペンジアール（８，８’）、ｂ）ジアポ−８’，１２−リコペンジアール（８’，１２）、ｃ）ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール（１０，１０’）、ｄ）ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール（１２，１２’）、ｅ）ジアポ−８’，１５−リコペンジアール（８’，１５）。
【化３】
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【０１１０】
結果は、実験３〜６の平均値として図１に示す。平均値の標準誤差（ＳＥ）（示さず）は平均値の１０％以下であった。実験間の変動を低減するために、結果はそれぞれの特定の誘導体を用いて得られた刺激とｔＢＨＱ（周知のこの系における正の対照）を用いて得られた刺激との比として表した。
【０１１１】
図１に示すように、カロテンジアルデヒドは、ＡＲＥレポーター遺伝子の転写を刺激する。これらの誘導体のいくつか（８’，１５；８’，１２及び１０，１０’）は、親分子リコペンよりも活性であり、すべての誘導体が他の知られているレチノイン酸誘導体、例えば全トランス−レチノイン酸（ａｔＲＡ）、非環式レチノイン酸（ａｃＲＡ）及び非環式レチナール（ａｃＲｅ−ａｌ）などよりも活性であった。
【０１１２】
これらの結果はまた、刺激の効力がジアルデヒド主鎖の炭素原子数に関係することをも示唆している。１０’１０及び８’１２（１２炭素鎖）誘導体が最も活性であり、最も長い誘導体（８’８−１６炭素鎖）及び最も短いもの（１２’１２−８炭素鎖）はずっと活性が低かった。８’１５誘導体（８炭素鎖）も活性であり、炭素鎖の長さに加えて、化合物の他の特徴も重要であることを示唆している。
【０１１３】
（実施例２）
乳房の癌細胞の増殖に対するリコペン誘導体の効果
リコペン、ａｔＲＡ及びいくつかのリコペン誘導体（ａ）ジアポ−８，８’−リコペンジアール、（ｂ）ジアポ−８’，１２−リコペンジアール、（ｃ）ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール、（ｄ）ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール、及び（ｅ）ジアポ−８’，１５−リコペンジアールの、２つのヒト乳癌細胞系（ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ）における細胞増殖及びＡＲＥ誘導に対する効果を調べた。
【０１１４】
図２Ａは、いくつかのリコペン誘導体のＡＲＥ誘導についての効果を示し、図２Ｂは、細胞の増殖についての対応する効果を示す。示されている通り、乳房の癌細胞の増殖は、いくつかの合成ジアルデヒドであるリコペン誘導体によって異なって抑制された。
【０１１５】
これらの結果はさらに、ＡＲＥの活性化（図２Ａ）と細胞増殖の抑制（図２Ｂ）との間には、有意な相関関係があることを示している。例えば、１０’１０誘導体は、ＡＲＥの誘導と細胞増殖の抑制の両方においてリコペンよりも活性であったが、８’８誘導体は両方のアッセイにおいてより活性が低かった。
【０１１６】
（実施例３）
前立腺癌細胞の増殖に対するリコペン誘導体の効果
リコペン、ａｔＲＡ及びいくつかのリコペン誘導体（ａ）ジアポ−８，８’−リコペンジアール、（ｂ）ジアポ−８’，１２−リコペンジアール、（ｃ）ジアポ−１０，１０’−リコペンジアール、（ｄ）ジアポ−１２，１２’−リコペンジアール、及び（ｅ）ジアポ−８’，１５−リコペンジアールの、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系における細胞増殖及びＡＲＥ誘導に対する効果を調べた。図３に示す通り、前立腺癌細胞の増殖もこれらの誘導体によって異なる仕方で抑制され、幅広い範囲の癌細胞の増殖を抑制するこれらの誘導体の能力を実証している。
【０１１７】
本明細書で提示した結果は、リコペンの推定酸化生成物であるリコペンの誘導体が、癌細胞増殖の強力な抑制剤であり、したがって癌の治療及び予防のために有用な薬剤であることを実証している。
【０１１８】
本発明のある種の実施形態が例示され説明されてきたが、本発明が本明細書に記載された実施形態に限定されないことは明らかであろう。多数の改変、変更、変形、置き換え及び等価物が、付帯の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく当業者には明白となるであろう
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】リコペン及びリコペン誘導体によるＡＲＥ誘導を示すグラフである。
【図２】リコペン及びリコペン誘導体によるＡＲＥ誘導及びヒト乳癌細胞系における細胞増殖の抑制を示すグラフである。図２Ａ：ＭＣＦ−７細胞（左）及びＴ４７Ｄ細胞（右）におけるＡＲＥ誘導；図２Ｂ：ＭＣＦ−７細胞（左）及びＴ４７Ｄ細胞（右）における細胞増殖の抑制。
【図３】ヒト前立腺癌細胞系におけるリコペン及びリコペン誘導体による細胞増殖の抑制を示すグラフである。
【０１２０】
参考文献
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2009511570.tif 000021
【図１】
2009511570.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2009511570.tif 000025