(57)【要約】  本発明は、一般式（Ｉ）に示す新規なジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン及びＤＮＡプローブとしてのその使用、並びに、これを用いたＤＮＡの作製方法に関する。
2009528287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2009528287.tif 000030
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子から選択され；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子であり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子であり；
ｎ＝０若しくは１；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；
Ｙ＝直鎖状アルキル；
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子であり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【化２】
2009528287.tif 000031
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す）
で表される化合物、又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーであるが、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈ、ｍ＝０、ｎ＝１、Ｒ１’＝Ｈ、Ｒ２’＝Ｒ３’＝メチル、Ｒ２、Ｒ８が独立してＨ又はＯ−メチルを表し、Ｒ１２＝Ｈ又はメチルであり、そしてＹ＝−（ＣＨ2）2−又は−（ＣＨ2）3−である化合物を除く。
【請求項２】
式中、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈ；
Ｒ２＝Ｈ又は−Ｏ−アルキル；
Ｒ１’＝Ｈ；
ｎ＝０又は１；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０又は１；
Ｙ＝直鎖状アルキル；
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は１若しくは２つ以上の−ＯＨで置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され、かつ同時にＨではなく；
Ｒ８＝Ｈ、Ｏ−アルキル；
Ｒ１２＝Ｈ、アルキル又は
【化３】
2009528287.tif 000032
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは請求項１と同様に定義され；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル又はＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す請求項１に記載の化合物、又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーであるが、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈ、ｍ＝０、ｎ＝１、Ｒ１’＝Ｈ、Ｒ２’＝Ｒ３’＝メチル、Ｒ２、Ｒ８が独立してＨ又はＯ−メチルを表し、Ｒ１２＝Ｈ又はメチルであり、そしてＹ＝−（ＣＨ2）2−又は−（ＣＨ2）3−である化合物を除く。
【請求項３】
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン、
−２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール、
−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，２−ジアミン、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチルアミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール、
−Ｎ’−（２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノエチル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー。
【請求項４】
一般式（Ｉ）：
【化４】
2009528287.tif 000033
（式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子から選択され；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子であり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子であり；
ｎ＝０若しくは１；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；
Ｙ＝直鎖状アルキル；
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子であり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ３の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【化５】
2009528287.tif 000034
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す）
で表される化合物、又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーのＤＮＡプローブとしての使用。
【請求項５】
請求項４と同様に定義される一般式（Ｉ）：
【化６】
2009528287.tif 000035
で表される化合物、又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーを、適切な標識用溶媒中に含むＤＮＡ標識用溶液。
【請求項６】
ａ）試験サンプルを、請求項４と同様に定義される一般式（Ｉ）：
【化７】
2009528287.tif 000036
で表される誘導体、又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーと接触させること；
ｂ）前記試験サンプルと一般式（Ｉ）に示す誘導体との接触により得られる混合物を、一定の時間、前記一般式（Ｉ）に示す誘導体が、前記試験サンプル中に存在するであろうＤＮＡと複合体を形成するのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｃ）前記混合物を適切な波長で照射し、そして前記照射された混合物から放出される光を観察することによって前記ＤＮＡを検出すること、
から成る工程を含む、試験サンプル中のＤＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するための方法。
【請求項７】
定量的であり、前記照射された混合物から放出される光が、前記試験サンプル中のＤＮＡの量と相関性を示す、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記試験サンプルが、生体サンプルである、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
前記試験サンプルが、尿、血清、血液、血漿、脳脊髄液、唾液、涙液、粘液、随意に固定若しくは固相化されていてもよい組織、随意に固定若しくは固相化されていてもよい真核細胞若しくは原核細胞、細胞溶解物、微生物、電気泳動用マトリックス若しくはポリマーゲル、又は緩衝溶液から成る群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが、合成ＤＮＡである、請求項６ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン、
−２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチルアミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール、
−Ｎ’−（２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−  ジメチルエタン−１，３−ジアミン、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノエチル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン、
又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー
から選択される、請求項６ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標識用溶媒、及び
請求項４と同様に定義される一般式（Ｉ）：
【化８】
2009528287.tif 000037
で表される化合物、又はその許容可能な塩、水和物若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー
を含む、ＤＮＡ標識用キット。
【請求項１３】
前記標識用溶媒が、水性溶媒、緩衝溶液及び有機溶媒から成る群から選択される、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
前記標識用溶媒が、界面活性剤及び／又は安定化剤を更に含む、請求項１２又は１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
核酸結合性蛍光化合物は、ＤＮＡの可視化、精製及び定量化に広く用いられている。最も頻繁に用いられる用途は、ゲル電気泳動、フローサイトメトリー、ＰＣＲにおける生成物のリアルタイム定量化、固定細胞上での間接的なエピ蛍光におけるＤＮＡの顕色（核と有糸分裂時の染色体の染色）及び変異導入である（Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．（編集）２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｎｉｎｔｈ  ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。１９５０年代から、様々なＤＮＡ及びＲＮＡに非共有結合的に結合するプローブが発見されてきた。これらは、その分子構造、結合する核酸のクラス、及びその結合様式に従って分類できる。最も頻繁に用いられる蛍光色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＤＡＰＩ、エチジウムブロマイド）は、ｄｓＤＮＡに強固に優先的に結合し、他の色素（例えば、ＳＹＴＯ色素）は、条件に応じて全ての種類の核酸を染色する（上述のＨａｕｇｈｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）。こういった特性は、これらの試薬の分子構造と高い相関性を有する。例えば、エチジウムブロマイドとヨウ化プロピジウムは、ｄｓＤＮＡ内にインターカレートし（Ｌｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｓ．，１９６１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３，１８−３）、陽イオン性色素のＨｏｅｃｈｓｔとＤＡＰＩは、ｄｓＤＮＡのマイナーグルーブと相互作用を起こし、全体としてｄＡ／ｄＴリッチな配列に優先的に結合する（Ｋｏｐｋａ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，１３７６−１３８０；Ｋｕｂｉｓｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，４５４５−４５５３）。興味深いことに、特定のＤＮＡマーカーは、核酸に対するその濃度に応じて、両方の種類の結合を示す（Ｚｉｐｐｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３２，ｅ１０３）。ＴＯＴＯ色素については、独自の結合様式が提案されており、ｓｓＤＮＡの同一鎖上の塩基間にインターカレートするものと考えられている（Ｒｙｅ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２３，１２１，５−１２２２）。
【０００２】
今日では生細胞を用いた実験が広く興味の対象となっているが、これは主にタンパク質、核酸及び細胞小器官を蛍光低分子又は種々のタイプのＧＦＰで被膜して標識する技術の開発に起因するものである（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３，９０６−９１８；Ｓｈａｖ−Ｔａｌ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５，８５５−８６１；Ｚｉｎｋ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９，４２−５０）。これらの用途は、細胞に比較的長期間に渡って損傷を与えることなく光を照射可能であることによるものである。しかしながら、細胞生物学で用いられる殆どの従来からの細胞透過性ＤＮＡ結合性色素（ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２又は３３２５８）では、スペクトルの紫外線部分（ＵＶ、２００−４００ｎｍ）での光を用いた照射が必要とされる。この波長では、とりわけフリーラジカルの形成とＤＮＡ及び／又はＤＮＡ関連タンパク質内での架橋が原因となって、多くの光損傷が生じてしまう（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ，１９４，８８２−８８３；Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ，５７１，１９−３１）。これらの現象により、ＤＮＡの複製に障害が生じ、そして／又は有糸分裂への進入（Ｐａｌｉｔｔｉ，Ｆ．，２００４，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，１０４，９５−９９）と完了にも障害が起こる。これにより、最終的には細胞はその周期が停止して死滅することになる（Ｋｕｌｍｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｓｋｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１５，３４２−３４７）。エチジウムブロマイドとヨウ化プロピジウムは、両方ともＵＶの波長より長い波長で励起できる。しかしながら、臭化プロピジウムは、細胞内へ透過せず、エチジウムブロマイドは、非常に限られた範囲でしか生きた哺乳動物細胞のＤＮＡにインターカレートしない（Ｔｒａｍｉｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，７８，２６１４−２６２７）。従って、生細胞ビデオ顕微鏡観察と細胞ソーティング用の新たな蛍光ＤＮＡプローブであって：（ｉ）細胞膜透過性で非毒性であり；（ｉｉ）ＵＶ波長よりも長い波長で励起され；そして／又は（ｉｉｉ）長時間の照射に渡り安定性を示す、蛍光ＤＮＡプローブを開発する必要がある。
【０００３】
本発明者らは、ｄｓＤＮＡ結合性の細胞透過性蛍光色素特性を示すジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン誘導体を発見した。これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験でＤＮＡを可視化するために非常に魅力的な試薬である。
【発明の開示】
【０００４】
第一の目的によれば、本発明は、以下の一般式（Ｉ）に示す誘導体に関する：
【０００５】
【化１】
2009528287.tif 000003
【０００６】
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3から選択され；好ましくは、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈであり；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ若しくは−Ｏ−アルキルであり；より好ましくはＯ−アルキルであり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈであり；
ｎ＝０若しくは１；好ましくはｎ＝１であり；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；好ましくはｍ＝０であり；
Ｙ＝直鎖状アルキルであり；好ましくは、３個以上の炭素原子を含む直鎖状アルキルであり；
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同時にＨではなく；より好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に１つ以上のＯＨで置換されていてもよいアルキルから選択され；最も好ましくは、Ｒ２’＝Ｒ３’＝アルキルであり；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ、−Ｏ−アルキルであり；より好ましくは、Ｏ−アルキルであり；最も好ましくは、Ｏ−メチルであり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【０００７】
【化２】
2009528287.tif 000004
【０００８】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；好ましくは、Ｒ１２＝Ｈ、アルキル若しくは
【０００９】
【化３】
2009528287.tif 000005
【００１０】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；より好ましくは、Ｒ１２＝アルキルであり；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表し；好ましくは、Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、Ｈ若しくはアルキルである；
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーであるが、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈ、ｍ＝０、ｎ＝１、Ｒ１’＝Ｈ、Ｒ２’＝Ｒ３’＝メチル、Ｒ２、Ｒ８が独立してＨ又はＯ−メチルを表し、Ｒ１２＝Ｈ又はメチルであり、そしてＹ＝−（ＣＨ2）2−又は−（ＣＨ2）3−である化合物は除かれる。
【００１１】
より詳細には、本発明の化合物は、以下から選択される：
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物２）、
−２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール（化合物３）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，２−ジアミン（化合物５）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物６）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチルアミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール（化合物７）、
−Ｎ’−（２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物８）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物９）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１０）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１１）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノエチル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１４）、
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー。
【００１２】
以上又は以下の記載で用いる場合：
「アルキル」とは、その鎖内に１ないし２０個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖であってもよい脂肪族炭化水素基である。好ましくは、アルキル基は、その鎖内に１ないし１２個の炭素原子を有する。分枝鎖とは、１個以上の低級アルキル基、例えば、メチル、エチル又はプロピルが直鎖状アルキル鎖に結合していることを意味する。代表的なアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−ペンチル、オクチル、ノニル、デシルが含まれる。
【００１３】
「ハロゲン原子」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を指し；好ましくは、フッ素及び塩素原子である。
【００１４】
「アルキル」は、２つの水素元素を取り除くことで形成する、対応する「アルキレン」、例えば、メチレン等も指す。
【００１５】
本明細書で用いる場合、「許容可能」という用語は、確かな医学的判断の範囲において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の妥当な利点／リスク比に見合う他の問題となる合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織との接触に適した化合物、物質、組成物又は剤形を指す。
【００１６】
本明細書で用いる場合、「許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体であって、親化合物を、その酸塩又は塩基塩を作ることにより改変した誘導体を指す。医薬的に許容可能な塩には、例えば、非毒性の無機酸又は有機酸から形成された親化合物の従来の非毒性の塩又は４級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸から誘導された塩；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸等から誘導される塩が含まれる。更なる添加塩としては、トロメタミン、メグルミン、エポラミン等のアンモニウム塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛又はマグネシウム等の金属塩が含まれる。
【００１７】
本発明の許容可能な塩は、塩基性又は酸性部分を含む親化合物から従来の化学的方法により合成することができる。一般的に、このような塩は、遊離酸型又は遊離塩基型にあるこれらの化合物を、水若しくは有機溶媒中で、又はこれら２つの混合物中で化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることで調製可能である。一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール又はアセトニトリル等の非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５年）の１４１８頁に見出される（この参考文献の開示は、参照により本明細書に援用される）。
【００１８】
幾何異性体及び立体異性体を有する一般式（Ｉ）に示す化合物も、本発明に含まれる。
【００１９】
更なる目的において、本発明は、一般式（Ｉ）に示す化合物の調製方法に関する。
【００２０】
本発明の化合物と方法は、当業者に知られる数多くの方法で調製可能である。例えば、化合物は、当業者に理解されるように、以下に記載する方法、又はその変更を加えた方法を応用又は適用することにより合成できる。適切な変更や置換は、当業者にとって、直ちに明確となってよく理解されるか、又は科学論文から直ちに入手可能となるであろう。
【００２１】
特に、このような方法は、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ著「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」（ＶＣＨ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９年）に見出すことができる。
【００２２】
より詳細には、本発明の化合物は、Ｂｉｓａｇｎｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３，１０４２７−１０４４０に開示される方法を応用又は適用することにより調製可能である。
【００２３】
本発明の化合物は、１又は２つ以上の非対称的に置換された炭素原子を含んでいてもよく、光学活性型又はラセミ型で単離されてもよいことが理解されるであろう。従って、具体的な立体化学又は異性型が特に示されていない場合には、構造物の全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ型及び全ての幾何異性型が意図されている。当該技術分野においては、このような光学活性型の調製及び単離方法はよく知られている。例えば、立体異性体の混合物は、ラセミ型の分割、通常、逆相及びキラルクロマトグラフィー、選択的な塩形成、再結晶等を含む標準的な技術、又はキラル活性を示す出発物質からのキラル合成又は標的キラル中心の慎重な合成により分離できるが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
本発明の化合物は、様々な合成経路により調製可能である。試薬と出発物質は、市販されているか、当業者によく知られる方法により直ちに合成される。他に表示がない限り、全ての置換基は、先行技術に定義される通りである。
【００２５】
以下に記載する反応では、例えば、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオ又はカルボキシ基のような反応性の高い官能基が最終生成物に残っていることを望む場合には、反応におけるこれらの不所望の沈澱を回避するため、これらの官能基を保護することが必要な場合もある。従来からの保護基を標準的な実施に従って用いてもよい（例として、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１；Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３を参照）。
【００２６】
反応によっては、塩基の存在下で行うことができる。この反応に用いる塩基の特性については、その分子の他の部分に悪影響しない限りにおいて、特に制限がなく、このような種類の反応に従来から用いられてきたいずれの塩基も、ここで同様に用いることができる。適切な塩基の例には、以下が含まれる：水酸化ナトリウム，炭酸カリウム，トリエチルアミン，水素化ナトリウム及び水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物；メチルチリウム及びブチルリチウム等のアルカリリチウム化合物；並びにナトリウムメトキシド及びナトリウムエトキシド等のアルカリ金属アルコキシド。
【００２７】
通常は、反応は、適切な溶媒中で行われる。反応又はこれに含まれる試薬に対して悪影響を与えない限り、種々の溶媒を用いることができる。適切な溶媒の例には、以下が含まれる：例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン及びキシレン等の芳香族、脂肪族又は脂環式炭化水素であってもよい炭化水素；ジメチルホルムアミド等のアミド；エタノール及びメタノール等のアルコール並びにジエチルエーテル及びテトラヒドロフラン等のエーテル。
【００２８】
反応は、広範囲な温度で行うことができる。通常においては、本発明者らは、０℃ないし１５０℃の温度で反応を行うことが都合がよいことを見出している（より好ましくは、室温ないし１００℃前後）。反応に必要な時間についても、多くの要因、特に反応温度と試薬の特性に応じて、大きく変化する場合がある。しかしながら、反応が、上で述べた好ましい条件下で行われる場合には、通常は３時間ないし２０時間の時間で十分であろう。
【００２９】
このように調製された化合物は、従来の手法により反応混合物から回収できる。例えば、化合物は、反応混合物から溶媒を蒸留除去することにより回収可能であり、必要とあらば、反応混合物から溶媒を蒸留除去した後に残渣を水に注入し、その後、非水混和性有機溶媒で抽出してその抽出物から溶媒を蒸留により除去することもできる。上記に加え、所望の場合には、生成物は、再結晶、再沈又は種々のクロマトグラフィー技術、特にカラムクロマトグラフィー若しくは調製薄層クロマトグラフィーといったよく知られる種々の技術により、更に精製することができる。
【００３０】
本発明の方法の一局面によれば、一般式（Ｉ）に示す化合物であって、式中、ｍ＝０であり、ｎ＝１である化合物は、一般式（ＩＩ）に示す対応化合物：
【００３１】
【化４】
2009528287.tif 000006
【００３２】
を下記の一般式（ＩＩ’）に示す対応化合物と反応させることにより得ることができる：
ＮＨＲ１’−Ｙ−ＮＲ２’Ｒ３’（ＩＩ’）
式中、Ｒ１〜Ｄ１２、Ｒ１’〜Ｒ３’及びＹは、一般式（Ｉ）と同様に定義され、Ｈａｌは、塩素等のハロゲン原子を表す。
【００３３】
本発明の方法の更なる局面によれば、一般式（Ｉ）に示す化合物であって、式中、ｍ＝１である化合物は、一般式（ＩＩＩ）に示す対応化合物：
【００３４】
【化５】
2009528287.tif 000007
【００３５】
を酸化して、その後、下記の一般式（ＩＩＩ’）に示す対応化合物を用いて還元的にアミノ化することにより得ることができる：
（ＮＨＲ１’）n−Ｙ−ＮＲ２’Ｒ３’（ＩＩＩ’）
式中、Ｒ１〜Ｄ１２、Ｒ１’〜Ｒ３’及びＹは、一般式（Ｉ）と同様に定義され、ＡＬＫは、アルキル基を表す。
【００３６】
一般的に、酸化工程は、ＳｅＯ2又はその同等物を用いて行われる。
還元的アミノ化は、ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）で、又は下記の化合物（ＩＩＩ’’）を中間単離した後に行ってもよい。
【００３７】
【化６】
2009528287.tif 000008
【００３８】
式中、Ｒ１〜Ｄ１２は、一般式（Ｉ）と同様に定義され、ＡＬＫ’は、ＡＬＫに対応する前駆体を表す。
【００３９】
一般式（ＩＩ）及び（ＩＩ’）、（ＩＩＩ）及び（ＩＩＩ’）に示す化合物は、Ｂｉｓａｇｎｉ  ｅｔ  ａｌ．に教示される方法を応用又は適用することにより入手可能であり、そして／又は市販されている可能性もある。
【００４０】
更にまた、本発明の方法には、一般式（Ｉ）に示す化合物を単離する追加の工程が含まれていてもよい。この工程は、当業者であれば、既知の従来の手段、例えば、上記の回収方法等により行うことが可能である。
【００４１】
「核酸分子」は、リン酸エステルポリマー型のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、又はこれらのリン酸エステル類似体、例えば、ホスホロチオエート及びチオエステル等を指し、これらは１本鎖型又は２本鎖若しくは３本以上の鎖から成るへリックスであってもよい。ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡの２本鎖へリックスも可能である。核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子という用語は、これら分子の１次構造及び２次構造のみを指しており、いずれかの特定の３次構造にある分子に限定するものではない。従って、この用語には、２本鎖ＤＮＡに関連する物質、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ（例えば、制限酵素処理断片）又は環状ＤＮＡ分子、プラスミド及び染色体が含まれる。特定の２本鎖ＤＮＡ分子の構造について議論する際には、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（即ち、ｍＲＮＡと相同的な配列を有する鎖）の５’から３’の方向にある配列のみを提示する、通常の慣習に従った記載が認められる。
【００４２】
更なる目的によれば、本発明は、以下の一般式（Ｉ）に示す化合物：
【００４３】
【化７】
2009528287.tif 000009
【００４４】
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3から選択され；好ましくは、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈであり；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ若しくは−Ｏ−アルキルであり；より好ましくはＯ−アルキルであり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈであり；
ｎ＝０若しくは１；好ましくはｎ＝１であり；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；好ましくはｍ＝０であり；
Ｙ＝直鎖状アルキルであり；好ましくは、３個以上の炭素原子を含む直鎖状アルキルであり；
【００４５】
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同時にＨではなく；より好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に１つ以上のＯＨで置換されていてもよいアルキルから選択され；最も好ましくは、Ｒ２’＝Ｒ３’＝アルキルであり；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ、−Ｏ−アルキルであり；より好ましくは、Ｏ−アルキルであり；最も好ましくは、Ｏ−メチルであり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ３の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【００４６】
【化８】
2009528287.tif 000010
【００４７】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；好ましくは、Ｒ１２＝Ｈ、アルキル若しくは
【００４８】
【化９】
2009528287.tif 000011
【００４９】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；より好ましくは、Ｒ１２＝アルキルであり；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す；
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー、のＤＮＡプローブとしての使用に関する。
【００５０】
本発明の前記使用のための化合物は、以下から選択できる：
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物１）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物２）、
−Ｎ’−２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール（化合物３）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物４）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物５）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン（化合物６）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチルアミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール（化合物７）、
−Ｎ’−（２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物８）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物９）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１０）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１１）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−  ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１２）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１３）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノエチル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１４）、
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー。
【００５１】
更なる目的によれば、本発明は、以下の一般式（Ｉ）に示す化合物：
【００５２】
【化１０】
2009528287.tif 000012
【００５３】
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3から選択され；好ましくは、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈであり；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ若しくは−Ｏ−アルキルであり；より好ましくはＯ−アルキルであり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈであり；
ｎ＝０若しくは１；好ましくはｎ＝１であり；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；好ましくはｍ＝０であり；
Ｙ＝直鎖状アルキルであり；好ましくは、３個以上の炭素原子を含む直鎖状アルキルであり；
【００５４】
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同時にＨではなく；より好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に１つ以上のＯＨで置換されていてもよいアルキルから選択され；最も好ましくは、Ｒ２’＝Ｒ３’＝アルキルであり；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ、−Ｏ−アルキルであり；より好ましくは、Ｏ−アルキルであり；最も好ましくは、Ｏ−メチルであり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ３の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【００５５】
【化１１】
2009528287.tif 000013
【００５６】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；好ましくは、Ｒ１２＝Ｈ、アルキル若しくは
【化１２】
2009528287.tif 000014
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；より好ましくは、Ｒ１２＝アルキルであり；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す；
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー、のＤＮＡプローブの調製のための使用にも関する。
【００５７】
本発明の前記使用のための化合物は、以下から選択できる：
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物１）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物２）、
−Ｎ’−２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール（化合物３）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物４）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物５）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン（化合物６）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチルアミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール（化合物７）、
−Ｎ’−（２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物８）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物９）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１０）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１１）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−  ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１２）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１３）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノエチル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１４）、
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー。
【００５８】
好ましい局面では、一般式（Ｉ）に示す化合物は、選択的なＤＮＡプローブである。
更なる局面では、一般式（Ｉ）に示す化合物は、ＤＮＡ蛍光染色プローブであり、より好ましくは、光活性化性（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｂｌｅ）プローブである。
【００５９】
本発明は、更に、以下の一般式（Ｉ）に示す化合物：
【００６０】
【化１３】
2009528287.tif 000015
【００６１】
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3から選択され；好ましくは、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈであり；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ若しくは−Ｏ−アルキルであり；より好ましくはＯ−アルキルであり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈであり；
ｎ＝０若しくは１；好ましくはｎ＝１であり；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；好ましくはｍ＝０であり；
Ｙ＝直鎖状アルキルであり；好ましくは、３個以上の炭素原子を含む直鎖状アルキルであり；
【００６２】
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同時にＨではなく；より好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に１つ以上のＯＨで置換されていてもよいアルキルから選択され；最も好ましくは、Ｒ２’＝Ｒ３’＝アルキルであり；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ、−Ｏ−アルキルであり；より好ましくは、Ｏ−アルキルであり；最も好ましくは、Ｏ−メチルであり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ３の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【００６３】
【化１４】
2009528287.tif 000016
【００６４】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；好ましくは、Ｒ１２＝Ｈ、アルキル若しくは
【００６５】
【化１５】
2009528287.tif 000017
【００６６】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；より好ましくは、Ｒ１２＝アルキルであり；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す；
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー、の試験サンプル中のＤＮＡを検出するための使用にも関する。
【００６７】
実際に、本発明の誘導体は選択的なＤＮＡ色素である。詳細には、これらは、ＲＮＡ又はその他の細胞構成物、例えば、ミトコンドリアやタンパク質等よりもＤＮＡに対する選択性を示す。
【００６８】
これらのＤＮＡ色素はＤＮＡと非共有結合により複合体を形成することが可能であり、ＤＮＡ−色素複合体の形成の後に蛍光シグナルの増加を示す。
【００６９】
従って、本発明は、一般式（Ｉ）に示す誘導体の少なくとも１つがＤＮＡ分子と非共有結合的に結合した複合体にも関する。
【００７０】
前記ＤＮＡ分子は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）若しくはより多くの鎖から成るＤＮＡへリックス、又はＤＮＡ−ＲＮＡ混合へリックスであってもよい。好ましくは、前記ＤＮＡ分子はｄｓＤＮＡである。
【００７１】
本発明の化合物は、膜透過性である。従って、これらの化合物を用いることで、例えば、組織、細胞、細胞小器官内のＤＮＡをプローブするため等、細胞内でＤＮＡを探査したり、又は、例えば、細胞溶解物中若しくは増幅混合物中のＤＮＡを探査するため等、細胞外でＤＮＡを探査することができる。従って、ＤＮＡ分子は、例えば、染色体、プラスミド、環状ＤＮＡ分子、オリゴヌクレオチドの形態にある核内ゲノムＤＮＡであってもよく、又はこれらの断片、例えば、制限酵素処理断片等であってもよい。
【００７２】
ある態様では、前記試験サンプルは、生物サンプルであり、即ち、前記ＤＮＡは、生物由来のものである。
【００７３】
「サンプル」という用語は、本明細書で用いる場合、核酸、特にＤＮＡを含む可能性のある、あらゆる生物由来の物質を包含する、あらゆる物質を指す。サンプルには、希釈剤、緩衝剤、界面活性剤、及び混入種（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、標的ＤＮＡ分子と混合した状態で見い出されるであろうタンパク質又は細胞又は組織のデブリが含まれる場合もある。サンプルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡを単離するための当該技術分野でよく知られる方法及び半固体若しくは溶液系検出アッセイ、又は生細胞若しくは固定細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は細胞内でのＤＮＡ検出により調製可能である。
【００７４】
生体サンプルの例には、尿、血清、血液、血漿、脳脊髄液、唾液、涙液、バイオプシー等により入手可能な組織、粘液又は細胞若しくは微生物が含まれる。詳細には、サンプルは、随意に、バッファー、抽出溶液、溶媒等の液体物質中で培養、分解又は懸濁された細胞であってもよい。細胞は、これらに限定されるものではないが、細菌、酵母、菌類等の原核細胞、そして初代細胞培養系と不死化セルラインを含む植物細胞及び動物細胞等の真核細胞を含む。
【００７５】
サンプルは、例えば、固体又は半固体の支持体上に固相化された組織又は細胞であってもよい。詳細には、一般式（Ｉ）に示す化合物は、従来の組織化学的又は細胞化学的手法により固定及び処理された細胞内でＤＮＡ色素として用いることができる。代表的な固体支持体には、アレイ（特にマイクロアレイ）、マイクロタイタープレート、ニトロセルロースメンブレン等のブロッティングメンブレン、ビーズ又はスライドが含まれる。半固体支持体は、例えば、ポリマーゲル、又は細胞の培養又は懸濁に使用可能なアガー、アガロース、メチルセルロースであってもよい。
【００７６】
更に、サンプルは、随意に細胞デブリから分離されていてもよい細胞溶解物であってもよく、この細胞溶解物は、バッファー、抽出溶液、溶媒等の液体物質中に溶解又は懸濁されたものであってもよい。
また、前記ＤＮＡは合成ＤＮＡであってもよい。合成ＤＮＡは、既に、例えば、ＲＮＡマトリックスの逆転写（ＲＴ）、ＲＴ−ＰＣＲ、若しくはＤＮＡマトリックスのＰＣＲ、又は当該技術分野で知られる他のいずれかの核酸増幅方法によって人工的に調製されている。従って、試験サンプルには、例えば、ＰＣＲ反応混合物のようなＤＮＡが添加された材料、電気泳動用マトリックスとして典型的に使用される（ポリ）アクリルアミドゲル又はアガロースゲル等のゲル、又はＤＮＡを含有する緩衝溶液が含まれる場合がある。従って、検出すべきＤＮＡ分子、即ち、誘導体／ＤＮＡ複合体は、電気泳動用マトリックス又はポリマーゲル中に存在する場合がある。
【００７７】
従って、試験サンプルは、尿、血清、血液、血漿、脳脊髄液、唾液、涙液、粘液、随意に固定若しくは固相化されていてもよい組織、随意に固定若しくは固相化されていてもよい真核細胞若しくは原核細胞、細胞溶解物、微生物、電気泳動用マトリックス若しくはポリマーゲル、又はＰＣＲ反応混合物等の緩衝溶液から成る群から選択することができる。
【００７８】
本発明は、
ａ）試験サンプルを一般式（Ｉ）に示す誘導体：
【００７９】
【化１６】
2009528287.tif 000018
【００８０】
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3から選択され；好ましくは、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈであり；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ若しくは−Ｏ−アルキルであり；より好ましくはＯ−アルキルであり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈであり；
ｎ＝０若しくは１；好ましくはｎ＝１であり；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；好ましくはｍ＝０であり；
Ｙ＝直鎖状アルキルであり；好ましくは、３個以上の炭素原子を含む直鎖状アルキルであり；
【００８１】
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同時にＨではなく；より好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に１つ以上のＯＨで置換されていてもよいアルキルから選択され；最も好ましくは、Ｒ２’＝Ｒ３’＝アルキルであり；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ、−Ｏ−アルキルであり；より好ましくは、Ｏ−アルキルであり；最も好ましくは、Ｏ−メチルであり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ３の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【００８２】
【化１７】
2009528287.tif 000019
【００８３】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；好ましくは、Ｒ１２＝Ｈ、アルキル若しくは
【００８４】
【化１８】
2009528287.tif 000020
【００８５】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；より好ましくは、Ｒ１２＝アルキルであり；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す；
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー、
と接触させること；
【００８６】
ｂ）前記試験サンプルと前記一般式（Ｉ）に示す誘導体との接触により得られる混合物を、一定の時間、前記一般式（Ｉ）に示す誘導体が、前記試験サンプル中に存在するであろうＤＮＡと複合体を形成するのに十分な条件下でインキュベートすること；
【００８７】
ｃ）前記混合物を適切な波長で照射し、そして前記照射された混合物から放出される光を観察することによって前記ＤＮＡを検出すること
から成る工程を含む、試験サンプル中のＤＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するための方法、にも関する。
【００８８】
一般式（Ｉ）に示す誘導体は、「標識用溶液」の形態にある試験サンプルと接触させてもよい。このような標識用溶液には、典型的には、水等の水性溶媒、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝溶液、又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、エタノール若しくはアセトニトリル等の有機溶媒であってもよい適切な「標識溶媒」に溶解した一般式（Ｉ）に示す誘導体が含まれており、随意に界面活性剤及び／又は安定化剤が存在していてもよい。適切な界面活性剤の例には、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＣＨＡＰＳ又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘが含まれる。界面活性剤は、典型的には、約０．１％ないし約０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で水溶液中に存在する。
【００８９】
更なる目的によれば、本発明は、一般式（Ｉ）に示す化合物：
【００９０】
【化１９】
2009528287.tif 000021
【００９１】
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3から選択され；好ましくは、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈであり；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ若しくは−Ｏ−アルキルであり；より好ましくはＯ−アルキルであり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈであり；
ｎ＝０若しくは１；好ましくはｎ＝１であり；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；好ましくはｍ＝０であり；
Ｙ＝直鎖状アルキルであり；好ましくは、３個以上の炭素原子を含む直鎖状アルキルであり；
【００９２】
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同時にＨではなく；より好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に１つ以上のＯＨで置換されていてもよいアルキルから選択され；最も好ましくは、Ｒ２’＝Ｒ３’＝アルキルであり；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ、−Ｏ−アルキルであり；より好ましくは、Ｏ−アルキルであり；最も好ましくは、Ｏ−メチルであり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ３の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【００９３】
【化２０】
2009528287.tif 000022
【００９４】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；好ましくは、Ｒ１２＝Ｈ、アルキル若しくは
【００９５】
【化２１】
2009528287.tif 000023
【００９６】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；より好ましくは、Ｒ１２＝アルキルであり；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す；
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー、を適切な標識溶媒中に含むＤＮＡ標識用溶液に関する。
【００９７】
当業者であれば、ＤＮＡ検出を容易化するために、直ちに照射と混合物からの放出光の観察に適切な励起波長又は放出波長を決定できる。これらの波長は、複合体の蛍光特性に依存する。典型的には、励起は、色素／核酸複合体の極大吸光波長又はその前後の光を生じる光源を用いて行われる。好ましくは、照射は、サンプルを４００ないし４５０ｎｍからなる波長、好ましくは４３５ｎｍの波長で照射することにより行う。
【００９８】
更なる好ましい局面では、放出光は、５秒間ないし１分間、好ましくは１０ないし２０秒間からなる反応潜伏時間の後に観察することができるが、正確な時間は、種々の要因、例えば、以下に限定される訳ではないが、細胞の種類、培地中の本発明の化合物の濃度、照射／観察前の本発明の化合物への細胞の曝露時間、顕微鏡の電球の強さ、蛍光フィルターの特性、使用する対物レンズの特性等に依存するであろう。好ましくは、放出光は、４７０ないし４９０  ｎｍ、好ましくは４８４  ｎｍからなる波長を有するが、正確な極大値は、種々の要因、例えば、以下に限定される訳ではないが、励起波長等に依存するであろう。
【００９９】
好ましくは、励起波長は、４００ないし４５０ｎｍ、より好ましくは４３５ｎｍからなり、放出波長は、４７０ないし４９０ｎｍ、より好ましくは４８４ｎｍからなる。
【０１００】
放出光は、ＣＣＤカメラ、蛍光光度計、プレートリーダー、蛍光顕微鏡を含む、いずれかの適切な手段により検出できる。放出光は、更に、サンプルの一部をその蛍光反応性によってソーティング可能なフローサイトメーターを用いて検出することもできる。
【０１０１】
更なる局面では、ＤＮＡの検出方法は、定量的であり、ＤＮＡの定量化を可能にするものであり、即ち、放出光が、試験サンプル中のＤＮＡと相関性を有する。放出光とＤＮＡ量とを相関させることは、既知のＤＮＡ含有量を有するコントロールサンプル（又はコントロールサンプルの希釈物）から放出される光の比較を行うことで可能である。このことは、例えば、リアルタイムＰＣＲ等のリアルタイム増幅方法に有用であろう。
【０１０２】
更なる目的によれば、本発明は、本発明によりＤＮＡを標識する定量的方法によりＤＮＡ量を定量することを含む、試験細胞の細胞周期段階を決定する方法に関する。
【０１０３】
本発明の前記使用のための化合物は、以下から選択できる：
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物１）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物２）、
−Ｎ’−２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール（化合物３）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物４）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物５）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン（化合物６）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチルアミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール（化合物７）、
−Ｎ’−（２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物８）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物９）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１０）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１１）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−  ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１２）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１３）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノエチル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１４）、
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー。
【０１０４】
更なる目的では、本発明は、
−上記に定義される標識用溶媒、及び
−下記の一般式（Ｉ）に示す化合物：
【０１０５】
【化２２】
2009528287.tif 000024
【０１０６】
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3から選択され；好ましくは、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ７＝Ｒ９＝Ｒ１０＝Ｈであり；
Ｒ２＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ若しくは−Ｏ−アルキルであり；より好ましくはＯ−アルキルであり；
Ｒ１’＝Ｈ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈであり；
ｎ＝０若しくは１；好ましくはｎ＝１であり；
Ｘ＝直鎖状アルキル；
ｍ＝０若しくは１；好ましくはｍ＝０であり；
Ｙ＝直鎖状アルキルであり；好ましくは、３個以上の炭素原子を含む直鎖状アルキルであり；
【０１０７】
Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；アルキル又は（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＯＨ、−ＮＲＲ’、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換された（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルから選択され；好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同時にＨではなく；より好ましくは、Ｒ２’とＲ３’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ；随意に１つ以上のＯＨで置換されていてもよいアルキルから選択され；最も好ましくは、Ｒ２’＝Ｒ３’＝アルキルであり；
Ｒ８＝Ｈ；Ｏ−アルキル；（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルが、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されたＯ（Ｃ２−Ｃ１０）アルキル；ハロゲン原子；−ＮＲＲ’；−ＯＨ；Ｏ−アルキル；ＣＦ3であり；好ましくは、Ｈ、−Ｏ−アルキルであり；より好ましくは、Ｏ−アルキルであり；最も好ましくは、Ｏ−メチルであり；
Ｒ１２＝Ｈ；随意に、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ３の１若しくは２つ以上で置換されていてもよいアルキル；
【０１０８】
【化２３】
2009528287.tif 000025
【０１０９】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；好ましくは、Ｒ１２＝Ｈ、アルキル若しくは
【０１１０】
【化２４】
2009528287.tif 000026
【０１１１】
であり、ここで、Ｘ、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｙ、ｍ、ｎは上記と同様に定義され；より好ましくは、Ｒ１２＝アルキルであり；
Ｒ、Ｒ’は、同一であるか若しくは異なっており、独立してＨ、アルキル、又は−ＮＲＲ’、−ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＦ3の１若しくは２つ以上で置換されている（Ｃ２−Ｃ１０）アルキルを表す；
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー、を含むＤＮＡの標識用キットに関する。
【０１１２】
当業者であれば、前記キットには、適切な使用説明書と、前記キットが使用されるアッセイプロトコルに応じた試薬が含まれるであろうことを直ちに理解するであろう。しかしながら、前記キットには、随意にサンプル調製用試薬、緩衝剤又はＤＮＡスタンダードが更に含まれていてもよい。
【０１１３】
本発明の前記使用のための化合物は、以下から選択できる：
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物１）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物２）、
−Ｎ’−２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール（化合物３）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物４）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物５）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，２−ジアミン（化合物６）、
−Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチルアミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール（化合物７）、
−Ｎ’−（２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物８）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（２−ジメチルアミノエチル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物９）、
−Ｎ６，Ｎ１２−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１０）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１１）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−  ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１２）、
−Ｎ’−（２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１，３−ジアミン（化合物１３）、
−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−ジメチルアミノエチル）−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６，１２−ジアミン（化合物１４）、
又はその許容可能な塩、水和物、若しくは水和塩、又はこれらの化合物の多形結晶構造物、又はその光学異性体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマー。
【０１１４】
本発明の化合物は、細胞生物学においてＤＮＡプローブとして使用されることが報告されるものとしては、初めての、長い波長で、毒性を示すことなく光活性化される蛍光ＤＮＡ色素である。
【０１１５】
本発明の化合物の蛍光特性
本発明の化合物が示す吸光／放出特性により、これらの化合物は、ＤＮＡの蛍光染色用試薬として非常に魅力的なものとなる。アクリジンホモ２量体（励起／放出  ４３１／４９８ｎｍ）及び特定の低親和性のＤＮＡ結合性ＳＹＴＯ色素も、同一の領域において吸光／放出極大を有する。しかしながら、本発明の化合物とは異なり、アクリジン色素は、細胞膜を透過できず（Ｈａｕｇｈｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．；Ｌｅ  Ｐｅｃｑ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，１９７５，ＰＮＡＳ，７２，２９１，５−２９１９）、そしてＳＹＴＯ色素は、非選択的なＤＮＡ染色試薬として知られており、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡ及びミトコンドリアを含む他の構造物も染色する（上述のＨａｕｇｈｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）。実際には、全てのＤＮＡ色素は、ＲＮＡ及び／又は１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にも一定の範囲で結合することから、上記のことは驚くべきことではない。例えば、チアゾールオレンジホモ２量体（ＴＯＴＯ）及びエチジウムブロマイドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、同程度の親和性をもってｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡと相互作用を起こす（Ｒｙｅ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０１１６】
本発明者らが得たｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの結果は、本発明の化合物が、ＲＮＡよりも２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合した際に、選択的に蛍光を発することを示している。本発明の化合物を用いたｄｓＤＮＡとＲＮＡの滴定により、低い色素／塩基（ｂ）比又は色素／塩基対（ｂｐ）比では、差異が最も著しく、本発明の化合物／ＤＮＡの蛍光は、本発明の化合物／ＲＮＡ複合体の蛍光よりも、少なくとも６倍高いものであったことが示された。本発明の化合物の量を一定にして、異なる量のｄｓＤＮＡ及びＲＮＡで中和を行った反対の実験では、本発明の化合物／ｄｓＤＮＡの蛍光が、本発明の化合物／ＲＮＡの化合物の蛍光よりも一層強いことも見出された。更にまた、本発明者らが、５  μＭの本発明の化合物を、ＤＮＡ及びＲＮＡを用いて、これらの量を増加させながら滴定すると、ＤＮＡは、色素と〜３０  ｂｐ／色素で飽和したが、ＲＮＡは、２５０  ｂ／色素の比率であっても飽和できなかったことが判明した。一方で、色素／ｂ（ｂｐ）比を増加した場合に、ＤＮＡ又はＲＮＡと結合した本発明の化合物の蛍光の差が、より小さくなったという事実（図２Ａ）は、本発明の化合物が、インターカレーション以外の機構を通じて核酸と相互作用できることを意味する可能性がある。
【０１１７】
特に、インターカレート性ＤＮＡプローブであるエチジウムブロマイドと比較した場合、本発明の化合物は、驚くべきことに、ＲＮＡとの比較においてＤＮＡに対して同程度の選択性を示す。ＤＮＡと結合した場合の本発明の化合物の量子収量（１３．８％）は、エチジウムブロマイドについて報告された量子収量に非常に近似するものであった（１５％）（Ｌｅ  Ｐｅｃｑ，Ｊ．Ｂ．，１９７１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｎａｌ，２０，４１−８６）。まとめると、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は、低い色素／ｂ（ｂｐ）比においては、本発明の化合物が、ＲＮＡと比べてＤＮＡに対して良好な選択性を示すことを意味している。本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び固定細胞上で、核のみを染色し、大量のＲＮＡが局在する細胞質は染色しない。これにより、染色に用いられる本発明の化合物の濃度と条件が、ｄｓＤＮＡとＲＮＡとを効果的に区別するのに最適であることが示される。
【０１１８】
興味深いことに、ＤＮＡを滴定すると、本発明の化合物の蛍光は０．２の色素／ｂｐ比まで増加して、その後に減少したが（図３Ｂ）、ＤＮＡ分子の長さは、色素／ｂｐ比が１になるまで増加し続けた。この蛍光の低下は、静的消光による可能性が最も高い（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．，（１９９１年）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第２版、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ編集、ニューヨーク市、ニューヨーク州）。
【０１１９】
本発明者らは、本発明の化合物が、ｄＧ／ｄＣ領域よりもｄＡ／ｄＴ領域に結合した場合に、選択的に蛍光を発することを見出した。このことは、ＤＮＡと複合体形成した際に反対にふるまい、ｄＡ／ｄＴホモポリマーよりもｄＧ／ｄＣホモポリマーと複合体形成した場合に量子収量の全体的な増加を示すＹＯとは異なっている（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３６，１５３−１６７）。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｚｉｐｐｅｒ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）やシプロフロキサシン（Ｖｉｌｆａｎ，Ｉ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１６２８，１１１−１２２）のような他のインターカレーターは、本発明の化合物と同様の選択性を示す。しかしながら、ｄＡ／ｄＴホモポリマーとｄＧ／ｄＣホモポリマーに結合したこれら色素の蛍光の差異は、本発明の化合物の場合と比べて随分と小さなものである。この差異の程度は、遊離した本発明の化合物の蛍光のピークも実際に消滅してしまうことから、ｄＧ／ｄＣ領域への結合力の不足として説明することができない。また、吸光実験では、本発明の化合物が、ｄＧ／ｄＣ領域とｄＡ／ｄＴ領域に同程度に良好に結合することが示されている。上記は、全て、本発明の化合物が、ヌクレオチドのｄＡ／ｄＴペア及びｄＧ／ｄＣペアに結合可能であるが、異なる相互作用を起こすことを示している。観察されたｄＧ／ｄＣ領域による消光作用は、グアニンについて報告される低い酸化電位、又は他の蛍光インターカレーター分子について報告されたような、本発明の化合物とグアニン残基間での電子伝達に起因する可能性がある。（上述のＶｉｌｆａｎ，Ｉ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．；上述のＬａｒｓｓｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｉｈｍｅｌｓ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ，１，２９９９−３００１）。
【０１２０】
構造と機能の相関性
その構造にもよるが、融合ポリ（ヘテロ）芳香族分子は、インターカレーション（Ｌｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）又はマイナー／メジャーグルーブへの結合（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．による総説（１９９６年）、Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（編集）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，７３−１７６頁）を通じてＤＮＡに結合できる。本発明の化合物は、アルカロイドフガロニン（ａｌｋａｌｏｉｄ  ｆａｇａｒｏｎｉｎｅ）の天然のアザ類似体であり（上述のＢｉｓａｇｎｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．）、ＤＮＡ内にインターカレートすることが知られているが、蛍光ＤＮＡマーカーであることは報告されていない。本発明の化合物のＤＮＡへの結合は、恐らく、生理学的ｐＨにおいて正に帯電する側鎖を有するジアルキルアミンの存在に助けられている。他の陽イオン性色素について示されたように（Ｚｉｐｐｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３２９−３７０；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３１，６２３５−６２４２）、塩はｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の化合物／ＤＮＡの蛍光に著しく悪影響を及ぼした。このデータにより、陽イオン性側鎖が、２本鎖へリックスへの色素の結合に寄与するという考えが支持される。仮説としては、前記側鎖は、バックボーンのリン酸残基上の負の電荷と相互作用する可能性がある。
【０１２１】
色素のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのＤＮＡへのドッキングは、殆どの既存のドッキング用プログラムでは、フレキシブルなリガンドの剛性分子（ＤＮＡ）へのドッキングしかできないという事実により、複雑なものとなる。このようなモデリングの明らかな制限は、ドッキング前に、ＤＮＡから既にドッキングした分子（今回はアクチノマイシンＤ）を抽出する必要があることである。この方法では、固いＤＮＡ構造内の塩基対の間に空間が残り、これが、恐らく後の別の分子のドッキングに適したものとなる。ＤＮＡに挿入されたアクチノマイシンＤの部分は、平坦なコンフォメーションを有しており、本発明の化合物のコンフォメーションに近似していることから、本研究者らは、ＤＮＡ／アクチノマイシンＤの原子座標をモデリングすることを選択した。提案されたモデルは、実験データと一致するものであり、低い色素／ｂｐ比においては、本発明の化合物は、塩基対の間にインターカレートできることが示唆された。しかしながら、より高濃度の本発明の化合物の存在下で、該色素が、他のＤＮＡプローブにも見られるように（Ｚｉｐｐｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．）、外側において結合を示す場合が排除されたわけではない。実際、（本発明の化合物がインターカレート可能な）塩基対間の空間を持たないＤＮＡ構造を用いたモデリングでは、本発明の化合物は、容易にマイナーグルーブにフィットできることが示されている。
【０１２２】
光活性化
生物学においては、２種対の光活性化蛍光トレーサーが一般的に用いられる：照射後に「活性化」される「ケージド（ｃａｇｅｄ）」低分子化合物及び蛍光タンパク質である。光活性化蛍光タンパク質は、しばしば、造影波長（ｉｍａｇｉｎｇ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）で励起した場合には、全く又は殆ど蛍光を示さないが、異なる（通常はより短い）波長で照射して活性化した後では、その蛍光を劇的に増加させる（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８７３−１８７７）。多くの場合、このような活性化は、蛍光放出の波長の変化を生じる。
【０１２３】
ケージド蛍光化合物は、該化合物を非蛍光性にする官能基の付加により共有結合的に修飾された非ペプチド型蛍光分子である。光暴露によりこの「保護」基との結合が切断され、本来のフルオロフォアが遊離する。ケージド化合物に伴う問題は、この反応を起こさせるのに紫外線が必要となることである。ＵＶによる細胞へのダメージを最小化するため、光への曝露時間は必要最小限に留めなければならない。このような種類の化合物に対する本発明の化合物の優位性は、より長い波長の光で活性化されることである。従って、照射時間とＤＮＡへのダメージは、問題とならない。
【０１２４】
本発明の化合物の光活性化の本質はどのようなものであろうか。本発明者らが示したように、光活性化は固定細胞内で起こり、本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで何らの構造変化も起こさないことが示されている。更にまた、本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び細胞内でのスペクトル放出は、事実上同一のものである。一方で、光活性化は、純粋なプラスミドＤＮＡでは観察されない。従って、この現象は、タンパク質と結合したＤＮＡ（クロマチン）に依存しているものと考えられる。実際に、ＤＡＰＩ等のマイナーグルーブ結合性プローブ又はエチジウムブロマイド若しくはクロモマイシンＡ３等のインターカレート性分子は、ヌクレオソームを破壊し、そして／又はそのアセンブリー形成を妨害することが示されている。上記の作用については、少なくとも、２種類の異なるメカニズムが関与している可能性がある。外部に結合する色素は、ヒストン又は他のクロマチンタンパク質と、ｄＡ／ｄＴリッチな結合部位に対して競合するか、又はＤＮＡの動き／柔軟性を阻害し、その結果、マイナーグルーブ内でのヒストン−ＤＮＡ接触を低下させる場合がある（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４，２７１２８−２７１３８）。インターカレーターは、ＤＮＡへリックスをほどき、ＤＮＡの長さを伸ばして硬化させることが可能である（ＭｃＭｕｒｒａｙ，ＣＴ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３，８４７２−８４７６）及びこの文献内の参考文献）。本発明者らが、本発明の化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ依存的蛍光発光は、Ｄ１により阻害されることを証明したことは重要である。このことにより、観察された本発明の化合物の細胞内での光活性化が、実際にＤＮＡと結合したヒストン及び／又は他のクロマチンタンパク質のＤＮＡと置き換わりながらゆっくりとＤＮＡと結合することを反映している可能性があることが示唆される。この仮説は、本発明の化合物が、生細胞の場合とは異なり、固定化された細胞上では、直ちに蛍光を発し、その強度が時間と共に更に増加するという事実により裏付けられる。このことは、固定により、クロマチンタンパク質が部分的に変性し、生細胞内の場合よりも本発明の化合物がＤＮＡに接近しやすくなるという事実により説明できる。最後に、何故、本発明の化合物のＤＮＡへの結合により、発光が促進されるのかを示す必要がある。
【０１２５】
本発明は、以下の実施例の記載により更に例示されるが、これに制限されるものではない。
【実施例】
【０１２６】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＣｕｒｉｅのＰｈａｒｍａｃｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＵＭＲ  １７６  ＣＮＲＳ−ＩＣ）により合成された分子に相当する、４０８０種類の化合物からなる非常に広範囲の特許ライブラリーをスクリーニングアッセイにおける一連の化合物として用いた。この集団には、広範囲の異なる複素環式化合物が含まれるが、これらの大部分は、元々はその抗ガン活性の測定用に調製されたものである。ライブラリーの構成成分は、９６ウェルマイクロプレートにて、１０  ｍＭの無水ＤＭＳＯ中にフォーマットされ、暗室で＋４℃にて保存された。全ての操作は、過剰量の光から化合物を保護するように注意して行った。
【０１２７】
化合物Ｉは、視覚的表現型スクリーニング（ｖｉｓｕａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｃｒｅｅｎ）において蛍光核染色色素として同定された。上記の結果に基づき、化合物ライブラリー内に存在する１４種類の密接に関連した化合物Ｉ型分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏテストでより詳細に試験して、構造−機能関連性を立証した（表１）。化合物Ｉ並びに関連する６個のアミノ酸残基が置換されたジベンゾナフチリジン４、１２、１３の剛性は、既に、上述のＢｉｓａｇｎｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．に記載されている。しかしながら、化合物Ｉの完全なキャラクタリゼーションは完了している。他の新たな化合物の全ては、以下に記載するように得られた。
【０１２８】
化合物Ｉ（遊離塩基、淡黄色の結晶）収率８８％、融点１６２℃（軟化）ないし２１０℃（分解）（Ｅｔ2Ｏ）：１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．９５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−β），２．３２（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２），２．５０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−γ），２．９７（ｓ，３Ｈ，１２−ＣＨ３），３．７６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−α），３．９９＆３．９６（２*ｓ，２*３Ｈ，２*ＯＣＨ３），７．４５−７．６０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３＋Ｈ−９＋Ｈ−１０），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．８５（ｔ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ），８．９３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４＋Ｈ−７），９．０９．分析．（Ｃ２４Ｈ２８Ｎ４Ｏ２．０．５Ｈ２Ｏ）計算値：Ｃ，６９．７１；Ｈ，７．０７；Ｎ，１３．５５；測定値：Ｃ，７０．０１；Ｈ，７．０９；Ｎ，１３．７３。
【０１２９】
化合物Ｉ
（６−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン）
ＤＭＦ（１００ｍｌ）中の６−クロロ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン（１．１０ｇ、３．９ｍｍｏｌ）の混合物を、１００℃で、１気圧のＨ2圧力下において、１０％Ｐｄ−Ｃ（３００ｍｇ）を触媒として用いて水素化した。水素の取り込みが完了すると、混合物が熱いうちに触媒をろ過により除去し、熱いＤＭＦで洗浄した。ろ液を蒸発乾固した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2）とエタノールからの再結晶（融点、１５３℃）を行うと、黄色い結晶性固体の化合物Ｉ（２５０ｍｇ，２８％）が得られた：
【０１３０】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），７．７２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２＋Ｈ−３），７．８８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８＋Ｈ−９），８．０７（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７，Ｊ＝８．３Ｈｚ），９．２４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４＋Ｈ−１０），９．３９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１２）．分析．（Ｃ17Ｈ12Ｎ2）計算値：Ｃ，８３．５８；Ｈ，４．９５；Ｎ，１１．４７；測定値：Ｃ，８３，０９；Ｈ，４，８６；Ｎ，１１，４０。
【０１３１】
化合物２、５、６及び７
（６−アミノメチルで置換されたジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン誘導体）
工程１：ＳｅＯ2酸化：化合物１（６６７ｍｇ；３ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液（９０ｍｌ）にＳｅＯ2（３８０ｍｇ）をゆっくりと添加した。反応混合物を３時間還流し、次いで、熱い溶液をろ過して、熱いジオキサンで洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をトルエン中で再結晶させると、ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−カルバルデヒド（４５０ｍｇ，５７％）が得られた：
【０１３２】
分析．（Ｃ17Ｈ12Ｎ2Ｏ）計算値：Ｃ，７９．０６；Ｈ，３．９０；Ｎ，１０．８５；測定値：Ｃ，７８，６１；Ｈ，３，７７；Ｎ，１０，４１。
【０１３３】
工程２：還元的アミノ化：
Ｎ’−ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルメチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（化合物２）：共通する方法の例。
【０１３４】
上記アルデヒド中間体（５００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル−１，３−ジアミン（６２０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）の還流ＭｅＯＨ溶液（１０ｍｌ）に、ＮａＢＨ4（２９３ｍｇ、７．８ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。混合物を１時間還流した。次いで冷水を添加し、得られた混合物は、ＣＨ2Ｃｌ2を用いて抽出した。混合有機溶媒をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、そして残渣を中性アルミナ（水７％）カラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／Ｅｔ０Ｈ：１００／０ないし９５／５の勾配）に付した。黄色の油として得られた化合物２の遊離塩基を、ＨＣｌ／ＭｅＯＨに溶解し、濃縮乾燥させた。エーテルを添加し、化合物２・ＨＣｌの黄色沈殿物を回収した（６１０ｍｇ，３０％），融点１４５℃（軟化）
【０１３５】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．２９（ｔ，６Ｈ，２*ＣＨ3），２．４３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−β），３．１９（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2ＣＨ3），３．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−γ），３．４３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−α），５．２９（ｂｒｓ，２Ｈ，ＣＨ2−６），８．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２＋Ｈ−３），８．１６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８＋Ｈ−９），８．４７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１＋Ｈ−７），９．３５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ＝８．２Ｈｚ），９．５４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１０，Ｊ＝８．２Ｈｚ），９．７５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１２），１０．００（ｂｒｓ，２Ｈ，Ｈ−塩酸塩），１０．９２（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｈ−塩酸塩）．分析（Ｃ24Ｈ29Ｎ4・３ＨＣｌ・１．５Ｈ2Ｏ）計算値：Ｃ１，５６．６４；Ｈ，６．７３；Ｎ，１１．０１；測定値：Ｃ，５６．４３；Ｈ，６．３８；Ｎ，１０．７８。
【０１３６】
必要なアミンを用いることで、化合物５、６及び７も、還元的アミノ化により調製した。
【０１３７】
化合物５（黄色の粉末、収率５６％）融点１６０℃（軟化）
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．２２（Ｓ，６Ｈ，２*ＣＨ3），２．５４（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2−β，Ｊ＝２．９Ｈｚ），２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−α），４．５８（Ｓ，２Ｈ１ＣＨ2−６），７．６９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２＋Ｈ−３），７．８６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８＋Ｈ−９），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７，Ｊ＝８．１Ｈｚ），９．２３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４＋Ｈ−１０），９．３７（Ｓ，１Ｈ，Ｈ−１２）．分析．（Ｃ21Ｈ22Ｎ4・３Ｈ2Ｏ）計算値：Ｃ，６５．６０；Ｈ，７．３４；Ｎ，１４．５７；測定値：Ｃ，６５．８４；Ｈ，６．９５；Ｎ，１４．６０。
【０１３８】
化合物６（黄色の粉末、収率５０％）：融点４５℃（軟化）；
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．７２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−β），２．１５（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ3）2），２．３２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2−γ），２．８２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−α），４．５８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2−６），７．９３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２＋Ｈ−３），８．０９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８＋Ｈ−９），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝８．０Ｈｚ），８．５９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７，Ｊ＝８．３Ｈｚ），９．２７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４＋Ｈ−１０），９．６５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１２）．分析．（Ｃ22Ｈ24Ｎ4・３Ｈ2Ｏ）計算値：Ｃ，６６．３１；Ｈ，７．５９；Ｎ，１４．０６；測定値：Ｃ，６６．６２；Ｈ，７．５７；Ｎ，１４．１２。
【０１３９】
化合物７（淡い桃色の粉末、収率５７％）：融点１５６℃；
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．１５（Ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），３．４０−３．６５（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−ＯＨ），４．６７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2−６），７．７２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２＋Ｈ−３），７．９２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８＋Ｈ−９），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７，Ｊ＝７．９Ｈｚ），９．１０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ＝８．４Ｈｚ），９．２８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１０，Ｊ＝８．４Ｈｚ），９．４１（Ｓ，１Ｈ，Ｈ−１２）．分析．（Ｃ21Ｈ23Ｎ3Ｏ3・Ｈ2Ｏ）計算値：Ｃ，６９．０２；Ｈ，６．３４；Ｎ，１１，５０；測定値：Ｃ，６９．１，５；Ｈ，６．３２；Ｎ，１１．３３。
【０１４０】
化合物３：
（２−［２−（ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン−６−イルアミノ）エチルアミノ］エタノール）
６−クロロジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン（５００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール（１０ｍｌ）中で還流と共に３時間加熱した。過剰量のジアミンは、減圧下で蒸発乾固し、残渣を抽出した（ＣＨ2Ｃｌ2／Ｈ2Ｏ）。混合有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、そして残渣を中性アルミナ（水７％）カラムクロマトグラフィー（Ｅｔ０Ｈ−ＣＨ2Ｃｌ2，０ないし１０％の勾配；次いでＣＨ2Ｃｌ2／Ｅｔ０Ｈ／ＮＥｔ3９０／１０／０．５）に付した。化合物３はベージュ色の粉末として得られた（６５ｍｇ，１０％），融点１００℃（軟化）：
【０１４１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．８６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），３．１２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＡｒ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2ＮＨＡｒ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．９８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2ＯＨ），７．６２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２＋Ｈ−３），７．７８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８＋Ｈ−９），７．８８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７，Ｊ＝８．１Ｈｚ），９．０２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ＝８．０Ｈｚ），９．１２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１０＋Ｈ−１２）．分析（Ｃ20Ｈ20Ｎ4Ｏ・０．３３Ｈ2Ｏ）計算値：Ｃ，７１．００；Ｈ，６．１１；測定値：Ｃ，７１．３４；Ｈ，６．３３。
【０１４２】
化合物８、９、１０、１１及び１４
（６−ジメチルアミノアルキルアミノ−及び６，１２−ビス［ジメチルアミノアルキルアミノ］ジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン）。共通する方法：
【０１４３】
必要な塩化中間体（ｃｈｌｏｒｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）［６−クロロ−２−メトキシ−１２−メチルジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン（化合物８用）；６，１２−ジクロロ−２−メトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン（化合物９及び１０用）；６，１２−ジクロロ−２，８−ジメトキシジベンゾ［ｃ，ｈ］［１，５］ナフチリジン（２６）（化合物１１及び１４用）］を、大量の過剰量のＮ，Ｎ−ジメチルエタン−１，２−ジアミン又はＮ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミンの存在下で、出発物質の塩化化合物が消失するまで（１２−４８時間）、還流しながら加熱した。次いで、この混合物を減圧下で濃縮し、水に溶解し、そしてＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。混合有機溶媒をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、そして残渣を中性アルミナ（水７％）カラムクロマトグラフィー（Ｅｔ０Ｈ−ＣＨ2Ｃｌ2，０ないし１％の勾配）に付したところ、６，１２−ジアミノで置換されたジベンゾナフチリジンが得られた。
【０１４４】
化合物８（黄色の粉末、収率３３％）：融点１３９℃；
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．９４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−β），２．３６（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ3）2），２．５７（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2−γ），３．００（ｓ，３Ｈ，１２−ＣＨ3），３．８８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2−α），３．９５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），７．３６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−１＋Ｈ−３），７．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８），７．７４（ｍ，３Ｈ，Ｈ−７＋Ｈ−９＋Ｎ−Ｈ），９．００（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ＝８．９Ｈｚ），９．０９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１０，Ｊ＝８．２Ｈｚ）．分析．（Ｃ23Ｈ26Ｎ4Ｏ）計算値：Ｃ，７３．７７；Ｈ，７．００；Ｎ，１４．９６；測定値：Ｃ，７３．２８；Ｈ，６．９２；Ｎ，１４．５６。
【０１４５】
化合物９（黄色の粉末、収率１８％）：融点１６９℃；
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ２．２９（２*ｓ，２*６Ｈ，２*Ｎ（ＣＨ3）2），２．６７（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−β），３．７８（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−α），３．９６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），７．２２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−８＋Ｈ−９），７．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３，Ｊ＝２．０＆８．９Ｈｚ），７．６０（ｔ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．７８（ｔ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．８２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ＝８．９Ｈｚ），８．８８（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１０，Ｊ＝８．２Ｈｚ）．分析．（Ｃ25Ｈ32Ｎ6Ｏ・Ｏ．５Ｈ2Ｏ）計算値：Ｃ，６８．００；Ｈ，７．５３；測定値：Ｃ，６８．３９；Ｈ，７．３７。
【０１４６】
化合物１０（黄色の粉末、収率５０％）：融点１５５℃；
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１．９６（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−β），２．２４（２*ｓ，２*６Ｈ，２*Ｎ（ＣＨ3）2），２．４６（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−γ），３．７４（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−α），３．９９（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），７．４４（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３＋Ｈ−８＋Ｈ−９），７．６３（ｔ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．８１（ｔ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ），８．２９（ｄ，１Ｈ，Ｈ−７，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．８６（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ＝８．９Ｈｚ），８．９５（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１０，Ｊ＝８．０Ｈｚ）．分析．（Ｃ27Ｈ36Ｎ6Ｏ）計算値：Ｃ，７０．４０；Ｈ，７．８８；測定値：Ｃ，７０．０３；Ｈ，７．６６。
【０１４７】
化合物１１（黄色の粉末、収率７０％）：融点２１６℃；
1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ−6）δ１．９７（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−β），２．２５（ｓ，１２Ｈ，２*Ｎ（ＣＨ3）2），２．４５（ｔ，４Ｈ，２*ＣＨ2−γ），３．７３（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−α），３．９８（ｓ，６Ｈ，２*ＯＣＨ3），７．３７（ｔ，２Ｈ，２*Ｎ−Ｈ），７．４５（ｄｄ，２Ｈ，Ｈ−３＋Ｈ−９，Ｊ＝９．０＆２．２Ｈｚ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｈ−１＋Ｈ−７，Ｊ＝２．２Ｈｚ），８．８３（ｄ，２Ｈ，Ｈ−４＋Ｈ−１０，Ｊ＝９．０Ｈｚ）．分析．（Ｃ28Ｈ38Ｎ6Ｏ2）計算値：Ｃ，６８．５４；Ｈ，７．８１；Ｎ，１７．１３；測定値：Ｃ，６８．３５；Ｈ，７．６７；Ｎ，１７．０７。
【０１４８】
化合物１４（黄色の粉末、収率１６％）：  融点２０９℃；  
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．３１（ｓ，１２Ｈ，２*Ｎ（ＣＨ3）2，２．７３（ｔ，４Ｈ，２*ＣＨ2−β），３．８４（ｍ，４Ｈ，２*ＣＨ2−α），３．９３（ｓ，６Ｈ，２*ＯＣＨ3），５．８１（ｂｒｓ，２Ｈ，２*Ｎ−Ｈ），７．２０（ｄ，２Ｈ，Ｈ−１＋Ｈ−７，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．３３（ｄｄ，２Ｈ，Ｈ−３＋Ｈ−９，Ｊ＝９．０＆２．３Ｈｚ），８．９０（ｄ，２Ｈ，Ｈ−４＋Ｈ−１０，Ｊ＝９．０Ｈｚ）．分析．（Ｃ26Ｈ34Ｎ6Ｏ2・Ｈ2Ｏ）計算値：Ｃ，６４．９８；Ｈ，７．５５；測定値：Ｃ，６４．４３；Ｈ，７．４１。
【０１４９】
化合物Ｉの安定性：暗室で、無水ＤＭＳＯ中に−２５℃で保存した場合、化合物Ｉは、最長で３年間安定である（ＬＣ−ＭＳ）。暗室でＤＭＳＯ中に４℃で保存した場合、化合物Ｉは少なくとも１年間安定である。周囲温度では、化合物Ｉは、暗室で保存した場合には、ＤＭＳＯ溶液中で少なくとも４８時間安定であることが判明した。
【０１５０】
化合物Ｉの溶解性：ＤＭＳＯ中では、化合物Ｉ（遊離塩基）は、〜７ｍＭで飽和するまで溶解できる。７  ｍＭを１当量とした場合、７当量のＨ2Ｏと混合されたＤＭＳＯ中の化合物Ｉ（〜１２％  ＤＭＳＯ中に０．８７５ｍＭの化合物Ｉ）は、混濁液を形成する。１分間超音波処理を行うと、この溶液は、透明になり、更に水溶液中に溶解できるようになる。
【０１５１】
化合物Ｉの汚染除去：７５ｍＭの化合物Ｉの水溶液２ｍｌを１００ｍｇの活性炭と共に室温で５分間インキュベートした。ろ過した後には、化合物Ｉはスペクトロメトリーでは検出できなくなる。
【０１５２】
細胞培養とスクリーニング
本試験では、異なる３種類の細胞を用いた：ＹＦＰ−α−チューブリン発現コンストラクト（ｐＥＹＦＰ−Ｔｕｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で安定に形質転換されたアフリカツメガエル上皮セルラインＸＬ１７７（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１３，５５７−５６３）、マウス線維芽細胞及びヒト初代線維芽細胞。ＸＬ１７７細胞は、抗生物質、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳが補充され（ｐＨ７．２）、更に０．７ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が添加された６０％Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ−１５培地中で、２０℃で増殖させた。細胞は、底部がガラス製の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、独国）内に播種し、２４時間増殖させた後に、Ｃｕｒｉｅ−ＣＮＲＳ低分子ライブラリーの試験化合物の存在下（２５又は５０μＭの終濃度）で更に２０〜２４時間インキュベートした。マウス及びヒトの線維芽細胞は、抗生物質と１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で５％のＣＯ2の存在下で３７℃で増殖させた。細胞は、４０ｘ油浸対物レンズと標準的なＡｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣフィルター（Ｏｍｅｇａ、ＸＦ１００−２；Ｅｘ４７５ＡＦ４０／Ｅｍ５３５ＡＦ４５／Ｄｉｃｈｒｏｉｃ５０５）を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡を用いて観察した。その後の実験は、より低濃度の化合物Ｉと本明細書と図の説明文に記載されるインキュベーション時間を用いて行った。化合物Ｉ様化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ試験においては、前記分子を細胞培養培地に終濃度１０μＭで添加し、細胞と共に１０〜６０分間（最長で２４時間）インキュベートした後にスコア付けした。
【０１５３】
試薬
Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いてプラスミドｄｓＤＮＡを精製し、スーパーコイルド（ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）の形態で吸光度及び蛍光試験に用いた。Ｅ．ｃｏｌｉのトータルＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎから購入し、ｄＡ／ｄＴ及びｄＧ／ｄＣホモポリマーは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ウシ胸腺（ＣＴ）高分子量ＤＮＡとＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。エチジウムブロマイドは、Ａｍｒｅｓｃｏから購入した。
【０１５４】
分光測定及び蛍光測定
分光測定及び蛍光測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  ＬＳ５０Ｂ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。ＤＮＡ及びＲＮＡと複合体形成した化合物Ｉの蛍光放出は、５０  ｍＭのＮａリン酸バッファー（ｐＨ  ７．２）中で、室温にて測定した。使用する前に、Ｅ．ｃｏｌｉのトータルＲＮＡを１００℃で１分間加熱して直ちに氷上に移して５分間静置し、その後、化合物Ｉの溶液と混合した。全ての測定は、室温（２０〜３０℃）にて、光から保護され、希釈した後に１０〜１５分間インキュベートした溶液中で行った。ｂ／色素及びｂｐ／色素という単位は、色素１モル当たりのＲＮＡの塩基又はＤＮＡの塩基対のモル数として定義される。量子収量は、ＦＬＵＯＲＯＭＡＸ−３  Ｓｐｅｘ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＨＯＲＩＢＡ）とＵＶＩＫＯＮ  ＸＬ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＳＥＣＯＭＡＭ）を用いて、「ｌｕｐａｃ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＥＰＡ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９８６，２１−２９」の記載に従って、硫酸キニーネをスタンダードとして用いて測定した。
【０１５５】
粘度測定
図３Ａ及びＢの説明文に記載されるように、ウシ胸腺（ＣＴ）ＤＮＡを、その塩基対数で０．１又は０．５ｍＭの濃度になるように５０ｍＭのＮａリン酸バッファー（ｐＨ７．２）に溶解させた。特注のキャピラリー粘度測定器にＤＮＡ溶液を通過させ、メニスカスが一定の距離を通過するのに要する時間をストップウォッチを用いて測定した。全ての実験は、２３℃で行った。粘性度は、以下の等式を用いて計算した：
η＝（ｔ−ｔ0）／ｔ0
ここで、ｔはＤＮＡ溶液（色素含有又は不含）の流動時間であり、ｔ0はＮａリン酸バッファー単独での流動時間である。各コントロールと色素含有ＤＮＡ溶液につき、流動時間は、３回ないし５回測定した。色素含有ＤＮＡ溶液の粘度は、（η／η0）1/3として計算され、ここで、η0及びηは、それぞれ、色素の不存在下及び存在下でのＣＴ  ＤＮＡ溶液の相対粘度である。この計算は、相対溶液粘度と相対輪郭長の間に存在する以下の関係に基づく：
（Ｌ／Ｌ0）：Ｌ／Ｌ0＝（η／η0）1/3
ここで、Ｌは、見かけの分子長を表す（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９６８，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３５，２５１−２９０）。平均粘度と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）は、各時間流動測定について計算した（η／η0）1/3を用いて決定した。
【０１５６】
化合物Ｉで染色した生細胞内での核蛍光測定
１００Ｗの水銀ランプを備えた倒立顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍで観察を行う１０分前に、５  μＭの化合物Ｉを直接細胞用培地に添加した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）で駆動されるＣｏｏｌＳｎａｐ  ＨＱ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）白黒カメラを用いてコマ撮り画像を入手した。全ての実験は４Ｏ倍又は６３倍の（図１Ｃ及びＤ）油浸Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  Ｚｅｉｓｓ対物レンズを用いて行った。蛍光強度を測定するため、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いてそれぞれの核の内側に楕円形の領域を描き、積分した強度（平均ピクセル値で乗じた核表面積）を、各画像について記録した。
【０１５７】
化合物Ｉで染色した固定細胞内での核蛍光測定
ヒト初代皮膚線維芽細胞を、ポリ−Ｄ−リジンコーティングガラスカバースリップ上で増殖させ、冷却（−２０℃）無水メタノール中で１５分間かけて固定した。サンプルをＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．２）中で再水和させ、１０％ＰＢＳ（水で希釈）でリンスし、１０％ＰＢＳ中に１２０μＭの化合物Ｉで、暗室内で室温で１５分間かけて染色した。サンプルは、洗浄することなく、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（商標）マウント用媒体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）又はＭｏｗｉｏｌを用いてマウントし、３時間以内に分析した。画像入手のため（図５Ｂ、Ｄ）、ＯｍｅｇａフィルターセットＸＦ１００−２（上記参照）を用いて、細胞を連続して（開放シャッター）３０分間照射した。画像は、１０秒間の間隔を空けて入手し、１６ビットのフォーマットでスタックとして保存した。核蛍光を積分した強度を、上記のように測定し、１８０枚の画像毎に記録した。各領域の最終時点での蛍光を１００％と定め、同一の領域の先の時点における蛍光強度（フレーム）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて計算した。
【０１５８】
生細胞内での化合物Ｉの蛍光のスペクトル分析
Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２レーザー走査性共焦点顕微鏡を用いて観察を行う直前に、化合物Ｉを、終濃度５μＭでＤＭＥＭ培地中の３Ｔ３マウス生細胞に添加した。「λ走査」モードを用いて、連続して４０５又は４５８ｎｍで励起しながら、２０分間かけて細胞蛍光量を観察し、化合物Ｉの放出スペクトルを記録した。
【０１５９】
分子モデリング
ウェブから入手可能なソフトウェアＣＯＲＩＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｃｈｅｍｉｅ．ｕｎｉ−ｅｒｌａｎｇｅｎ．ｄｅ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｃｏｒｉｎａ／ｃｏｒｉｎａ．ｈｔｍｌ）（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｊ．，２００４，Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，Ｊ．（編集），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ−Ｆｒｏｍ  Ｄａｔａ  ｔｏ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２３１−２６１頁）を用いて、ｐｄｂフォーマットで化合物Ｉの３次元原子配置を入手した。コンピューターに基づくモデリングには、本発明者らは、低エネルギー結合様式を見つけだすＡＳｃｏｒｅ又はＬａｍａｒｃｋｉａｎ遺伝的アルゴリズム（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９，１６３９−１６６２）によるスコアリング機能を用いたＡｒｇｕｓＬａｂソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（２００４）ＡｒｇｕｓＬａｂ  ４．０．１．Ｐｌａｎａｒｉａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＬＬＣ，シアトル、ワシントン州）を採用した。ｄｓＤＮＡ内への化合物Ｉのドッキングには、本発明者らは、Ａａ／Ｔｔ塩基ステップ（Ｂａｓｅ  Ｓｔｅｐ）にインターカレートしたアクリジン−ペプチド薬物と共に結晶化されたＤＮＡ１２量体５’−Ｄ（ＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＣｐＧ）−３’（配列番号１）の３次元配置を用いた（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａ  ｂａｎｋ  ＰＤＢ  ＩＤ−１Ｇ３Ｘ（Ｍａｌｉｎｉｎａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，９３４１−９３４８））。化合物Ｉのドッキングに先立ち、Ｎ（α）−（９−アクリジノイル）テトラアルギニンアミドをＤＮＡとの複合体から取り除き、化合物ＩとＤＮＡの両方に水素を付加した。カリフォルニア大学サンフランシスコ校のＲｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓが作製したＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａパッケージ（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ，２５，１６０５−１６１２）を用いて分子グラフィック画像を作製した。
【０１６０】
結果
化合物Ｉは生細胞内で分裂間期にある核を染色する
アフリカツノガエルＸＬ１７７生細胞上でのＣｕｒｉｅ−ＣＮＲＳ化合物ライブラリーの視覚的表現型スクリーニング（Ａｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣフィルターを使用）において、化合物Ｉは、明るい緑色の核シグナルを生み出すことが判明した（図１Ｃ）。このシグナルは１０〜２０秒間の照射の後に現れ、その後、何分間にも渡って安定であった（下記を参照）。培養細胞内で観察された核染色は、以下のことを示している：（１）薬物が細胞膜透過性であること；（２）標準的な細胞培養条件下で非毒性である（培養系で最大６日間）；（３）ＤＮＡ若しくはクロマチンタンパク質を染色するか、又は単に核内に蓄積する。
【０１６１】
化合物Ｉのスペクトル特性はＤＮＡへの結合により変化する
色素は単に核内に蓄積する可能性もあることから、核染色自体は、色素がＤＮＡに結合することを証明するものではない。また、化合物Ｉは、有糸分裂期の染色体も染色するが（図１Ｄ）、理論上は、化合物Ｉが、核酸ではなく、ＤＮＡ関連タンパク質（例えばヒストン）に特異的に結合している可能性も考えられた。この問題を明らかにするため、ｄｓＤＮＡを添加する前後において、遊離した化合物Ｉの吸光及び放出スペクトルを記録した。遊離した化合物Ｉは、２２４、２４５、２８３、３２６、３７３及び３９１ｎｍに極大を有する複雑な吸光プロファイルを示す（図１Ｅは、３００ないし５５０ｎｍのスペクトル部分を示す）。３９１ｎｍにおける遊離した化合物Ｉのモル吸光係数を測定すると１０，８００ｃｍ-1Ｍ-1であった。２本鎖プラスミドＤＮＡの存在下では、３７３と３９１ｎｍでの化合物Ｉの吸光ピークが減少し、４３５  ｎｍに新たなピークが現れた（図１Ｅ）。色素に対して異なるｂｐ比にあるｄｓＤＮＡとの複合体の吸光スペクトルをオーバーレイすると、３９８ｎｍに単一の等吸収点が得られる。遊離した化合物Ｉは、４３８ｎｍ前後で蛍光を発する（正確なピークの位置は、励起波長に依存する）。ＤＮＡに結合すると、４３８ｎｍの放出ピークは減少し、４２６ｎｍへの浅色シフトが起こる。同時に、４８４ｎｍ前後の極大に新たなピークが発達する（図１Ｆ）。化合物Ｉ／ＤＮＡ複合体の蛍光の正確な極大は、色素／ｂｐ比及び／又は核酸の塩基対の組成の関数として、僅かに変化する。例えば、図１Ｆに示すように、ｂｐ／色素比４０のプラスミドＤＮＡは４７２ｎｍで極大を示すが、同一のｂｐ／色素比にある化合物Ｉは、ｄＡ／ｄＴホモポリマーの存在下では、４８４ｎｍで極大を示す（以下も参照）。化合物Ｉ／ｄｓＤＮＡ溶液を３００ｎｍないし５００ｎｍの範囲の異なる波長で励起した際に、本発明者らは、蛍光強度は（４３５ｎｍで励起した際に認められる極大と共に）大きく変化するが、放出では、常に４８４ｎｍ前後に主な蛍光ピークが示され、そして（より短い励起波長３２３、３４８、３７３、３９１では）４２０ｎｍに別の肩が示されることを発見した。５０ｍＭのＮａ−リン酸（ｐＨ７．２）における５μＭの化合物Ｉ（４３５ｎｍで励起）の量子収率は、遊離色素が２．７％であり、５０μＭのＣＴＤＮＡとの混合状態のものが１３．８％であった。これらの結果は、化合物Ｉが、可視光スペクトルの青色／緑色領域で励起されて放出する、新たなＤＮＡ結合性蛍光プローブであることを示している。
【０１６２】
化合物ＩはＲＮＡと比べてｄｓＤＮＡに優先的に結合する
数多くの既知の蛍光色素が、ｄｓＤＮＡに優先的に結合し、ＳＹＴＯ色素等の他の色素は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ及びＲＮＡに同程度によく結合する（上述のＨａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．）。このような特性を知ることは、１種類又は別の種類（又は複数種類）の核酸が存在する可能性のある実験の設計において重要である。化合物Ｉの選択性を調べるため、本発明者らは、２本鎖プラスミドＤＮＡ又は熱変性させたＥ．  ｃｏｌｉのＲＮＡとインキュベートした色素の４８４ｎｍでの蛍光強度を比較した。この比較のため、５０μＭ（塩基又は塩基対に対して）のＤＮＡ又はＲＮＡを異なる量の化合物Ｉで滴定した。図２Ａに示すように、低い色素／ｂｐ比及び色素／ｂ比では、化合物Ｉの放出強度は、ＲＮＡよりもＤＮＡと混合した場合に有意に強くなった（６倍）。高い色素／ｂｐ比及び色素／ｂ比では、その差は小さくなり（色素／ｂ（ｂｐ）比が０．２において１．８倍）、このことは、大量の色素により、両方の種類の核酸が飽和される場合があることを意味している。次いで、本発明者らは、反対方向の実験を行った。即ち、１μＭに固定された量の化合物Ｉを、ＤＮＡ及びＲＮＡを用いて、これらの量を増加させながら滴定した。図２Ｂに示すように、ｄｓＤＮＡと混合した化合物Ｉの蛍光は、同一のｂ（ｂｐ）／色素比のＲＮＡと比較して、今回も同様に、有意に強いものであった（２．５〜３．６）。更にまた、固定量の化合物Ｉは、ｄｓＤＮＡ量を〜３０ｂｐ／色素比に増加することで飽和できたが、ＲＮＡ量を増加させても（最大で２５０ｂ／色素比まで）飽和できなかった。以上をまとめると、これらの結果は、化合物Ｉが、ＲＮＡと比べてｄｓＤＮＡに対して高い選択性を有することを示しており、細胞内に観察された核染色（図１Ｃ）を殆ど完全に説明している。
【０１６３】
化合物Ｉの流体力学試験では、化合物ＩがＤＮＡ鎖間にインターカレート可能なことが示される。
ＤＮＡ結合性色素は、インターカレーション若しくは外部結合、又はその両方によってｄｓＤＮＡと相互作用する。外部結合には、殆どの場合、ＤＮＡのマイナーグルーブが関与している（Ｋｏｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｊｕｒａ，Ｐ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９７，２５７−２７１）。インターカレーションは、リガンドが、逆行するＤＮＡ鎖の間に挿入された場合に起こる。化合物ＩがｄｓＤＮＡに結合するメカニズムを決定するため、本発明者らは流体力学試験を行った。このアプローチは、インターカレートする分子は、ＤＮＡ断片の長さを増加させ、その結果、ＤＮＡ溶液の粘性が増加するという知見に基づくものである（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．；Ｓｕｈ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，３，７２３−７２８）。この実験では、化合物Ｉを既知のＤＮＡインターカレーターであるエチジウムブロマイド及び外部マイナーグルーブ結合剤のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８と比較した。０．５  ｍＭのＣＴ  ＤＮＡを０．１ｍＭの濃度の薬物と混合し（０．２の色素／ｂｐ比）、粘度測定に用いた。図３Ａに示すように、化合物Ｉはエチジウムブロマイドと同様の挙動を示し、ＤＮＡ溶液の粘性を増加させる。対称的に、先に記載されるように（上述のＺｉｐｐｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８の場合には、粘性が僅かに低下することが判明した。
【０１６４】
次に、本発明者らは、粘性の増加が、蛍光強度の増加と同じように一致するかということに疑問を抱いた。この問題に対する回答を得るため、０．１ｍＭ（ｂｐ）のＣＴ  ＤＮＡを化合物Ｉと化合物Ｉの量を増加させながら混合し、上記と同様に粘度測定を行った。ＤＮＡ／化合物Ｉの粘性は、色素／ｂｐ比１まで増加した（図３Ｂ）。粘性の増加を蛍光と相関させるため、本発明者らは、粘度測定に用いた化合物Ｉ／ＤＮＡ溶液の４８４  ｎｍにおける蛍光強度を測定した。色素ｂｐ比０．２において極大蛍光強度に達し、その後、急速に減退した（図３Ｂ）。ＤＮＡ／化合物Ｉの粘性が色素／ｂｐ比１まで増加することから、後者の結果は「クエンチング」効果（上述のＬａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）を示唆するものである。結論として、流体力学試験により、化合物ＩがｄｓＤＮＡ内にインターカレートできることが示された。
【０１６５】
化合物Ｉは、ｄＧ／ｄＣ  ＤＮＡ領域よりもｄＡ／ｄＴ  ＤＮＡ領域に結合した際に、選択的に蛍光を発する
【０１６６】
多くのインターカレート性色素及びマイナーグルーブ結合性ＤＮＡ色素は、ｄＡ／ｄＴ又はｄＧ／ｄＣ  ＤＮＡ領域と異なる態様で相互作用を起こす場合がある。更に興味深いことに、ｄＡ／ｄＴ配列及びｄＧ／ｄＣ配列と同程度に良好に結合する色素であっても、そのヌクレオチドの特性により、蛍光強度が影響を受ける（上述のＬａｒｓｓｏｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．）。異なるＤＮＡ領域に結合した場合の化合物Ｉの特性を調べるため、本発明者らは、過剰量のプラスミドＤＮＡと、ｄＡ／ｄＴ又はｄＧ／ｄＣのいずれかのホモポリマーと混合された状態での化合物Ｉの蛍光を調べた。図３Ｃには、プラスミドＤＮＡとの結合に伴い、化合物Ｉが４８４ｎｍにピークを生じさせ、同時に４３８ｎｍのピークが有意に減少することを示している。４８４ｎｍのピークは、プラスミドＤＮＡをｄＡ／ｄＴホモポリマーと置き換えた場合により一層顕著なものとなった（図１Ｆも参照）。驚くべきことに、ｄＧ／ｄＣホモポリマーと混合された状態では、４８４ｎｍでの化合物Ｉの蛍光強度は、化合物Ｉ−ｄＡ／ｄＴの場合と比べて９．５倍低いものであった。この効果については、４３８ｎｍでの蛍光ピークが急激に減少していることから（１２，７分の１への減少：ピークも４２６ｎｍにシフトしている）、ＤＮＡへの結合力不足によって説明することができない。図３Ｃにおいて、グラフは、３７１ｎｍでの励起による放出スペクトルを示しており、遊離した化合物Ｉの放出がプロットされている。また、ＤＮＡ／化合物Ｉ複合体を３９１及び４３５ｎｍで励起した場合にも、類似する結果が得られた。本発明者らは、１塩基対に対して異なる色素の比率で、ｄＡ／ｄＴ及びｄＧ／ｄＣホモポリマーに結合した場合の化合物Ｉの蛍光量の差異を定量し、その差異が、色素／ｂｐ比８において２３倍であったことを見出した（図３Ｄ）。興味深いことに、ｄＡ／ｄＴ及びｄＧ／ｄＣホモポリマーに結合した化合物Ｉの吸光スペクトルは、色素／ｂｐ比１までは非常に近似していた。しかしながら、より高い色素／ｂｐ比では、４３５ｎｍでの化合物Ｉ−ｄＧ／ｄＣ吸光度は、化合物Ｉ−ｄＡ／ｄＴよりも〜３０％優れており、このことは、化合物Ｉが、両方のＤＮＡに同程度に良好に結合し、蛍光強度の差異はｄＧ／ｄＣ領域への結合力不足を反映するものではないことを示唆している。
【０１６７】
以上をまとめると、これらの結果は、化合物Ｉは、ｄＡ／ｄＴとｄＧ／ｄＣの両方の領域に同程度に良好に結合するが、ｄＡ／ｄＴ配列と複合体形成した場合に選択的に蛍光を発することを示している。
【０１６８】
化合物Ｉ系列の構造−活性関連性
化合物Ｉの構造特性がどのようにしてそのＤＮＡへの結合に寄与しているのかということに対して更なる洞察を得るため、本発明者らは、化合物ライブラリーに存在する１４種類の構造類似体を分析した。これらの化合物のいくつかは、ｉｎ  ｖｉｖｏで蛍光を発するが、この特性は、最初のスクリーニングでは検知されず、このことは恐らく、シグナルが現れる前の反応潜伏時間に起因するものと考えられる（下記参照）。化合物Ｉ様分子の活性を評価するため、３種類の試験を用いた：（１）本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記分子の存在下でヒト線維芽細胞をインキュベートし、顕微鏡において核蛍光のスコアリングを行った；（２及び３）本発明者らはｉｎ  ｖｉｔｒｏでプラスミドＤＮＡの添加の前後で遊離分子の吸光と蛍光を観察した。表１に結果をまとめる。細胞は、油浸対物レンズとＡｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣフィルターを用いた倒立エピ蛍光顕微鏡で観察した。遊離分子の放出ピークは、ＤＮＡに結合した色素の放出ピークとあまりにも近似していたため、化合物Ｉと類似体８及び１２を除き、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの正確な蛍光強度測定は不可能であった。これにより、色素／ＤＮＡピークの高さが影響を受けた。
【０１６９】
表１：１４種類の化合物Ｉ関連分子の特性のまとめ
*−染色は、核シグナル／バックグラウンド比に基づき、「弱い」、「中程度」又は「強い」として定義した。§−これらの分子の存在下では、Ａｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣフィルターで可視化した場合であっても核は最初は蛍光を発しなかったが、ＵＶ光による短時間（１０秒間）の事前照射の後に視認可能になった（ＤＡＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔフィルター、Ｏｍｅｇａ）ＸＦ０３。ＮＤ−未測定（測定不可能）。
【０１７０】
【表１Ａ】
2009528287.tif 000027
【０１７１】
【表１Ｂ】
2009528287.tif 000028
【０１７２】
【表１Ｃ】
2009528287.tif 000029
【０１７３】
化合物ＩのＤＮＡへの結合の分子モデリング
化合物Ｉの構造のモデリングにより、フレキシブルな正に帯電した側鎖を有する平坦で強固な複素環コアが予測される（図１Ｂ）。流体力学試験により化合物ＩがＤＮＡ鎖の間にインターカレートすることが示されたことから、本発明者らは、ＤＮＡ構造に挿入された化合物Ｉの推定上のモデルを提唱した。このため、本発明者らはＡｒｇｕｓＬａｂ  ４．０．１ソフトウェア並びにアクリジン−ペプチド薬物と複合体形成したｄｓＤＮＡ１２量体５’−Ｄ（ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ）−３’（配列番号２）の原子配置を用いた。ドッキングについては、本発明者らは、ＡｒｇｕｓＬａｂスコアリング機能ＡＳｃｏｒｅと前記１２量体全体を包み込むグリッドを用いた。図４に示す最もエネルギーの低いコンフォメーション（−４．００ｋｃａｌ／ｍｏｌ）では、２組のヌクレオチド（ＡＴ／ＡＴ）の間にスタックした化合物Ｉが表されている。遺伝的アルゴリズムによるスコアリング機能又は２組のＧＣヌクレオチドを用いて同様の結果を得た。
【０１７４】
化合物Ｉは光により活性化される
化合物Ｉで処理した細胞の最初のｉｎ  ｖｉｖｏの観察では、１０〜２０秒間の反応潜伏時間（濃度に依存する）の後に緑色の核染色が現れたことが示され、光活性化現象が示唆された。この効果を定量化するため、マウスの生線維芽細胞を５μＭの化合物Ｉの存在下でインキュベートし、コマ抜きビデオ顕微鏡を用いて細胞を撮影した。核蛍光は、化合物Ｉで処理し、標準的なＡｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣフィルターセット（４７５ＡＦ４０、５３５ＡＦ４５）（図５Ａ）を用いて連続照射した細胞の核内でゆっくりと発生した。蛍光は照射の８分後にピークに達し、その後に消え始め（図５Ｃ）、最も恐らくは、化合物Ｉの「退色」を反映していたものと考えられる。照射領域の直ぐ外側にある細胞の核は認知不可能（非蛍光）な状態で残っており、光活性化は、照射領域内にある細胞のみに関するものであった。理論上は、光活性が、生細胞により触媒される化合物Ｉの構造の化学修飾に起因するという可能性もあった。この可能性を試験するため、本発明者らは、固定した細胞の核を化合物Ｉで染色し、３０分間の連続照射の間に核蛍光を測定した。図５Ｂ及びＤは、固定細胞内で化合物Ｉ／ＤＮＡの蛍光が長時間に渡って直線的に増加することを示している。照射領域の直ぐ外側に位置する細胞の核は殆ど視認できなかった。化合物Ｉを異なる色素／ｂｐ比で混合し、上記のように顕微鏡内で照射した場合には、光活性化は起こらなかった。理論上は、バンドパスＡｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣフィルターで観察される蛍光の増加が、時間に伴う放出波長のシフトを表していたという可能性もあった。これが起こったのかどうかを決定するため、本発明者らは、共焦点顕微鏡を用いて生細胞の核内の化合物Ｉの放出スペクトルを記録した。図５Ｅは、ＤＮＡに結合した化合物Ｉの放出スペクトルが、４０５  ｎｍで励起した場合には、時間と共に大きく変化しないことを示している。４５８  ｎｍでの励起によっても同様の結果が得られ、このことは、蛍光強度の変化が、放出波長の大きな変化の結果として生じるものではないことを意味している。
【０１７５】
ヒストンやＨＧＭ１等のクロマチンタンパク質との競合が、外部結合剤（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｍｂｏ  Ｊ，８，４１８９−４１９５；Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６５，８５７３−８５８２）及びインターカレート性低分子（ＭｃＭｕｒｒａｙ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，５６４４−５６５２；Ｍｉｒ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１１，５７８−１１，５８５；Ｍｉｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ，１０９，１２１−１３５）の両方の結合に影響することが示されていることから、本発明者らは、化合物Ｉ／ＤＮＡの蛍光が、ヒストンの存在により影響を受けるかどうかという疑問を抱いた。１μＭのヒトヒストン１（Ｈ１）の不存在下又は存在下で化合物Ｉにより１  μＭのプラスミドＤＮＡを滴定したところ、Ｈ１が化合物Ｉの蛍光に有意に影響を及ぼすことが示された（図５Ｆ）。同時に、遊離した化合物Ｉの蛍光（３９１ｎｍで励起）は、Ｈ１によってはクエンチングされなかった。
【０１７６】
従って、本発明者らは、細胞内の化合物Ｉの蛍光は、光によって活性化され、最も恐らくは、この光活性は、メタノール固定による影響を受けないタンパク質と複合体形成したＤＮＡに依存すると結論付けた。
【０１７７】
化合物Ｉにより、細胞内での容易なＤＮＡ定量が可能になる
化合物Ｉで染色した核のいくつかは、他のものよりも明るく見えており（図１Ｃ及び図５Ａ、Ｂ）、例えば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎやＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の他のＤＮＡプローブが示したように、蛍光強度がそのＤＮＡ含有量に正比例しており、従って、その細胞周期の状態を反映している可能性が示唆される。既に化合物Ｉで染色された生細胞内のＤＮＡ内容物を直接プローブするためには、別のｄｓＤＮＡ結合色素を用いる必要がある。このような２重染色では、結合部位に対する潜在的な競合及び／又は蛍光に対する予想不可能な効果というリスクが伴う。従って、本発明者らは、固定細胞内の化合物Ｉで染色された核の積分された全蛍光量を、既知の細胞周期タンパク質マーカーと比較することに決定した。本発明者らは、ヒト初代線維芽細胞をメタノールで固定し、抗サイクリンＡ抗体を用い、その後、Ａｌｅｘａ  ５６８標識された２次抗体を用いて間接免疫蛍光法を行い、化合物Ｉを用いて核を対比染色した。サイクリンＡはＳ期の開始時とＧ２細胞周期を通して細胞内に蓄積し、サイクリンＢとは異なり、事実上全てが核内に存在する（総説：Ｐｉｎｅｓ，  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ，１７０，１８７−１９６；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １９６−２０４．）。この事実により、化合物Ｉ／ＤＮＡの蛍光とサイクリンＡの蛍光の相関が容易化される。実際に、本発明者らは、サイクリンＡ陰性の細胞が、その核内に顕著に低い化合物Ｉの蛍光を示すことを見出している（図６Ａ）。更にまた、本発明者らは、サイクリンＡ陽性細胞において、化合物Ｉの蛍光とサイクリンＡの蛍光との正の相関関係を観察している（図６Ｂ）。サイクリンＡ陽性度が強い核（図６Ｂ、楕円により示される右上隅の点）には、サイクリンＡ陰性核の約２倍の量の化合物Ｉの蛍光が含まれることは注目に値する。このことは、Ｇ１及びＧ２期の細胞に見出されることが予想される、それぞれ２Ｎ及び４ＮのＤＮＡ含有量と十分に一致する。これらの結果は、化合物Ｉが、細胞周期段階を反映する核内ＤＮＡ含有量の簡便な定量を可能にすることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】化合物Ｉは新規な蛍光ＤＮＡ色素である。Ａ．化合物Ｉの分子構造及び名称。Ｂ．平坦な構造を示す化合物Ｉの３次元モデルの透視正射図。Ｃ．ｉｎ  ｖｉｖｏにて化合物Ｉで染色された分裂間期細胞の核。アフリカツメガエルＸＬ  １７７細胞を、５μＭの化合物Ｉの存在下でインキュベートし、標準的なＡｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣフィルターセットを用いて照射した。Ｄ．ｉｎ  ｖｉｖｏにて化合物Ｉで染色された有糸分裂時の染色体（分裂後期）。Ｅ．プラスミドＤＮＡとｂｐ／色素比８で混合された２５μＭの遊離及びＤＮＡに結合した化合物Ｉの吸収スペクトル。Ｆ．１μＭの遊離状態及びＤＮＡに結合した状態の化合物Ｉの放出スペクトル。４３８ｎｍにおける遊離した化合物Ｉのピークは、ＤＮＡへの結合によって低下し、４２６ｎｍにシフトし、新たなピークが、４７２−４８４ｎｍ前後に発達することに留意すべきである。プラスミドＤＮＡ及びｄＡ／ｄＴホモポリマーをｂｐ／色素比２０で用いた。両方の場合で、化合物Ｉは、３７３ｎｍで励起し、遊離した化合物Ｉの蛍光が可視化された。  （Ｃ）及び（Ｄ）のサイズバーは、１０μｍである。
【図２】化合物Ｉは、ＲＮＡよりもｄｓＤＮＡに選択的に結合する。Ａ．５０μＭのｄｓＤＮＡ又はＲＮＡと混合された異なる量の化合物Ｉの蛍光放出値。Ｂ．ｄｓＤＮＡ及びＲＮＡで滴定した１μＭの化合物Ｉの蛍光放出値。
【図３】化合物ＩはＤＮＡ溶液の粘度を増加させ、ＤＮＡのｄＧ／ｄＣ領域よりもｄＡ／ｄＴ領域に結合した際に選択的に蛍光を発する。Ａ．０．１ｍＭの濃度での以下の種々の色素の不存在下（コントロール）又は存在下における０．５ｍＭ  ＣＴ  ＤＮＡの相対粘度（（η／ηo）1/3）：エチジウムブロマイド（ＥＢ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｈｏ）及び化合物Ｉ。Ｂ．種々の量の化合物Ｉの存在下でのＣＴ  ＤＮＡ溶液の相対粘度（赤色曲線：右側のＹ軸）。青色曲線は、粘度測定に用いた同一のＤＮＡ／化合物Ｉ溶液の蛍光強度を示す（左側のＹ軸）。Ｃ．１μＭの化合物Ｉ並びに、４０μＭのプラスミドＤＮＡ、ｄＡ／ｄＴ及びｄＧ／ｄＣホモポリマーと混合された１μＭの化合物Ｉの蛍光スペクトル。３７３ｎｍで励起され、遊離した化合物Ｉのピークが示された。Ｄ．ｄＡ／ｄＴ及びｄＧ／ｄＣホモポリマーで滴定した５  μＭの化合物Ｉの蛍光放出値。グラフには、４３５ｎｍで励起した後の４８４ｎｍでの放出値が示されている。（Ａ）及び（Ｂ）のエラーバーは、標準誤差を示す。
【図４】ｄＡ／ｄＴの２組の塩基対間にインターカレートした化合物Ｉの推定モデル。Ａ．マイナーグルーブ側から見た図。Ｂ．側面図（左側にマイナーグルーブ）。Ｃ．２組のｄＡ／ｄＴ塩基対間にスタックした化合物Ｉ。黄色の線は、水素結合を示す。
【図５】生細胞及び固定細胞内での化合物Ｉの光活性化。Ａ．生細胞内でのＤＮＡに結合した化合物Ｉの光活性化を示す画像のパネル。５μＭの化合物Ｉとインキュベートし、Ａｌｅｘａ４８８／ＦＩＴＣを用いて照射した線維芽細胞は、明るい核シグナルを発生させ、このシグナルは８分後にプラトーに達する。数値は各時点（秒）に対応する。Ｂ．固定細胞内での化合物Ｉの活性化を示す画像のパネル。メタノールで固定したヒト初代線維芽細胞を、材料及び方法に記載するように化合物Ｉで染色し、１００Ｗの水銀ランプを用いた連続的な３０分間の照射の間、１０秒間の間隔を設けて画像を撮影した。数値は各時点に対応する。代表的な核では、平均ピクセル値は、平面（１）で５１２であり、平面（１８００）では１４３４であった。Ｃ．（Ａ）に示す蛍光の定量化。グラフは２６分間を超える平均的な核の蛍光を示す。Ｄ．（Ｂ）に示す蛍光の定量化。グラフは３０分間を超える平均的な核の蛍光を示す。（Ｂ）に示す全ての核を定量化に用いた。Ｅ．５μＭの化合物Ｉの存在下でインキュベートし、４０５ｎｍで励起した、３Ｔ３生細胞内の核の代表的な放出スペクトル。曲線は、提示する時点で行ったスキャンに対応する。右上隅の挿入図は、実験過程において核内で測定された化合物Ｉの活性化を示す（図５Ｃと同様）。Ｆ．１μＭのヒストン１の不存在下又は存在下で１μＭのプラスミドＤＮＡと種々の量で混合された化合物Ｉの蛍光値。４３５ｎｍで励起した後の４８４ｎｍでの放出。目で追いやすいように各点を通る曲線が示されているが、何らかの等式への適合を表すものではない。（Ｃ）と（Ｄ）のエラーバーは、標準偏差に対応する。
【図６】化合物Ｉの核内蛍光は細胞周期段階を反映する。Ａ．画像は、抗サイクリンＡ抗体で染色され、化合物Ｉで対比染色されたメタノール固定化線維芽細胞の同一の代表的な顕微鏡視野を示す。画像は、２０倍対物レンズを用いて得られた。Ｂ．化合物Ｉと抗サイクリンＡ抗体で染色された（Ａに示す実験）細胞内での核蛍光の定量化（Ａに示す実験）。ドットは、無作為選択された６つの異なる顕微鏡視野内で測定された８１個の核を表す。右上隅の領域は、強いサイクリンＡ陽性反応を示す細胞を囲んでいる。
【図７】ｉｎ  ｖｉｖｏでの核染色の画像。ａ：化合物Ｉを用いて得られた核染色。ｂ：化合物９を用いて得られた核染色。ｃ：化合物１０を用いて得られた核染色。ｄ：化合物１１を用いて得られた核染色。ｅ：化合物１２を用いて得られた核染色。ｆ：化合物１３を用いて得られた核染色。ｇ：化合物１４を用いて得られた核染色。
【図１】
2009528287.tif 000038
【図２】
2009528287.tif 000039
【図３】
2009528287.tif 000040
【図４】
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【図５】
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【図６】
2009528287.tif 000043
【図７】
2009528287.tif 000044
【国際調査報告】
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