(57)【要約】  本発明は、特定のリパーゼ変異体および光漂白剤を含む組成物、並びに、このような組成物を生成および使用する方法に関するものである。このような組成物を特定の場所の洗浄および／または処理に使用することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光漂白剤および親リパーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、前記親と比較した場合、少なくとも合わせて３つの置換を含み、前記置換が、
ａ）領域Ｉの少なくとも２つの置換、
ｂ）領域ＩＩの少なくとも１つの置換、
ｃ）領域ＩＩＩの少なくとも１つの置換、および／または
ｄ）領域ＩＶの少なくとも１つの置換という置換の群の１つ以上から選択される、組成物。
【請求項２】
領域Ｉの前記置換が、２３１位および２３３位に相当する位置の置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項３】
２３１位および２３３位の前記置換がＲで置換される、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項４】
前記変異体が、配列番号２の４位に相当する位置の置換を含む、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項５】
前記の配列番号２の４位に相当する位置の置換がＶである、請求項４に記載の洗剤組成物。
【請求項６】
前記変異体が、配列番号２の２２７位に相当する位置の置換を含む、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項７】
前記の配列番号２の２２７位に相当する位置の置換がＧである、請求項６に記載の洗剤組成物。
【請求項８】
前記の領域ＩＩの少なくとも１つの置換が、２０２位、２１１位、２５５位、および２５６位に相当する位置の置換から成る群から選択される置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項９】
前記の領域ＩＩの少なくとも１つの置換が、Ｘ２０２Ｇ、Ｘ２１１Ｌ、Ｘ２５５Ｙ／Ｖ、およびＸ２５６Ｋから成る群から選択される置換を含む、請求項８に記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
前記の領域ＩＩの少なくとも１つの置換が、２１０位に相当する位置の置換を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記の２１０位に相当する位置の置換がＸ２１０Ｋを含む、請求項１０に記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
前記の領域ＩＩＩの少なくとも１つの置換が、８６位および９０位に相当する位置の置換から成る群から選択される置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１３】
前記の領域ＩＩＩの少なくとも１つの置換が、Ｘ８６ＶおよびＸ９０Ａ／Ｒから成る群から選択される置換を含む、請求項１２に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
前記の領域ＩＩＩの少なくとも１つの置換が、８３位に相当する位置の置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
前記の８３位に相当する位置の置換がＸ８３Ｔを含む、請求項１４に記載の洗剤組成物。
【請求項１６】
前記の領域ＩＶの少なくとも１つの置換が、２７位、５８位、および６０位に相当する位置の置換から成る群から選択される置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１７】
前記の領域ＩＶの少なくとも１つの置換が、Ｘ２７Ｒ、Ｘ５８Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｐ／Ｔ、およびＸ６０Ｓ／Ｖ／Ｇ／Ｎ／Ｒ／Ｋ／Ａ／Ｌから成る群から選択される置換を含む、請求項１５に記載の洗剤組成物。
【請求項１８】
２７位、５８位、および６０位に相当する領域ＩＶの少なくとも２つの置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１９】
Ｘ２７Ｒ、Ｘ５８Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｐ／Ｔ、およびＸ６０Ｓ／Ｖ／Ｇ／Ｎ／Ｒ／Ｋ／Ａ／Ｌから成る群から選択される領域ＩＶの少なくとも２つの置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２０】
前記変異体が、規定領域Ｉ〜ＩＶ外の少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２１】
前記の規定領域Ｉ〜ＩＶ外の少なくとも１つの置換が、８１位、１４７位、１５０位、および２４９位に相当する位置の置換から成る群から選択される、請求項２０に記載の洗剤組成物。
【請求項２２】
前記の規定領域Ｉ〜ＩＶ外の少なくとも１つの置換が、Ｘ８１Ｑ／Ｅ、Ｘ１４７Ｍ／Ｙ、Ｘ１５０Ｇ、およびＸ２４９Ｒ／Ｉ／Ｌから成る群から選択される、請求項２０に記載の洗剤組成物。
【請求項２３】
前記親リパーゼの配列番号２に対する同一性が少なくとも９０％である、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項２４】
前記親リパーゼが配列番号２と同一であり、前記変異体が、
ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ｙ、
ｂ）Ｉ２０２Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｃ）Ｉ８６Ｖ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｄ）Ｑ４Ｖ＋Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｅ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ９０Ｒ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｆ）Ｉ９０Ａ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ｖ、
ｇ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｈ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｆ２１１Ｌ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｉ）Ｑ４Ｖ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ｋ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｊ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋの置換の群のうちの１つを含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２５】
前記親リパーゼが配列番号２と同一であり、前記変異体が、
ａ）Ｑ４Ｖ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ｋ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｂ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋの置換の群のうちの１つを含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２６】
前記リパーゼ変異体が、本明細書で定めるとおりに測定した場合のベネフィット・リスク（Benefit Risk）が１を超えることを特徴とする、請求項１に記載の洗浄組成物。
【請求項２７】
光漂白剤、およびリパーゼ活性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドがさらに本明細書に定められる試験条件において、少なくとも０．８の平均相対的パフォーマンス（Average Relative Performance）、および少なくとも１．１のベネフィット・リスク（Benefit Risk）を有する、洗剤組成物。
【請求項２８】
前記組成物が０．１％〜４０％のアニオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が洗浄および／または処理組成物である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物がスルホン化亜鉛フタロシアニンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
スルホン化亜鉛フタロシアニンおよびスルホン化アルミニウムフタロシアニンの混合物を含み、前記混合物のスルホン化亜鉛フタロシアニン対スルホン化アルミニウムフタロシアニンの重量比が１：１を超える、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
スルホン化アルミニウムフタロシアニンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記光漂白剤がキサンテン染料、アントラキノン、またはナフタキノンを含む、請求項１に記載のいずれかの組成物。
【請求項３４】
表面または布地を請求項１の組成物に接触させてから、所望に応じて前記表面または布地を洗浄する、および／またはすすぐ工程を含む、表面または布地を洗浄および／または処理する方法。
【請求項３５】
前記リパーゼ変異体が、突然変異体Ｑ４Ｖ、Ｓ５８Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｐ／Ｔ、１９０Ｒ、またはＱ２４９Ｉ／Ｌの少なくとも１つを含む、配列番号２の変異体である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼおよび光漂白剤を含む組成物、並びに、このような製品を製造および使用するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
洗剤用途に適しているリパーゼ酵素の出現によって、配合者は油脂の除去を向上させる新たなアプローチを得た。このような酵素は、一般的に見られる多くの脂肪質汚れ（皮脂、動物脂（例えばラード、ギー、バター）、植物油（例えばオリーブ油、ひまわり油、ピーナッツ油）など）の主構成要素を形成するトリグリセリドの加水分解を触媒する。しかしながら、これらの酵素は一般に、第１の洗浄サイクルでは性能が弱く、多くの場合、牛乳、クリーム、バター、ヨーグルトなどの乳製品の汚れに存在する脂肪の加水分解に起因すると考えられる悪臭を伴う。理論に束縛されるものではないが、このような汚れは、短鎖（例えばＣ４）脂肪族アシル単位で官能化されているトリグリセリドを含んでおり、脂肪分解後に、前記脂肪族アシル単位が、悪臭を伴う揮発性脂肪酸を放出するため、リパーゼ誘導性の悪臭を発生させる傾向があると考えられる。このような酵素の性能を向上させたとしても、悪臭の問題は残る。従って、この技術の使用は非常に限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
光漂白剤とある種のリパーゼ変異体を組み合わせると、清浄性能効果が向上する一方で、許容不能な悪臭が最小限に収まることを我々は発見した。理論に束縛されるものではないが、リパーゼと光漂白剤の相乗作用によりカロチノイド、アントシアニン、ポルフィリン、タンニン、およびフラビン物質、例えばカレー、唐辛子ソース、トマト系パスタソース、コーヒー、紅茶などを含む染みの除去が向上し、更に洗濯後、例えば洗浄または処理部分の乾燥時などに光漂白剤によりリパーゼ酵素が酸化されて悪臭が減少するというメカニズムによって、このような効果が生じると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、光漂白剤と、Ｃ末端伸張の付着がなく悪臭生成の可能性が軽減されているとともに優れた相対性能を備えるリパーゼ変異体を含む組成物に関する。このようなリパーゼ変異体は、親リパーゼ内で同定される１つ以上の領域内に突然変異体を組み入れることによって得られる。従って、得られた変異体はリパーゼ活性を備えるはずであり、相対性能として表した場合に親リパーゼの活性の８０％以上である。
【０００５】
配列リスト
配列番号１は、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）由来のリパーゼをエンコードするＤＮＡ配列を示している。
【０００６】
配列番号２は、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【０００７】
配列番号３は、アブシディアレフレクサ（reflexa）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【０００８】
配列番号４は、アブシディアコリンビフェラ由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【０００９】
配列番号５は、リゾムコールミエヘイ（Rhizomucor miehei）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１０】
配列番号６は、リゾプスオリゼー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１１】
配列番号７は、アスペルギルスニガー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１２】
配列番号８は、アスペルギルスツビンゲンシス（tubingensis）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１３】
配列番号９は、フザリウムオキシスポラム（oxysporrum）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１４】
配列番号１０は、フザリウムヘテロスポラム（heterosporum）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１５】
配列番号１１は、アスペルギルスオリゼー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１６】
配列番号１２は、ペニシリウムカマンベルティ由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１７】
配列番号１３は、アスペルギルスフォエティダス由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１８】
配列番号１４は、アスペルギルスニガー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１９】
配列番号１５は、アスペルギルスオリゼー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００２０】
配列番号１６は、ランデリナペニサポラ（Landerina penisapora）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
定義
本明細書で使用する時、「洗浄組成物」という用語は、他に指示がない限り、顆粒または粉末形態の万能または「重質」洗浄剤、特に洗濯洗剤、液体、ゲルまたはペースト形態の万能洗浄剤、特にいわゆる重質液体型、液体の高級布地用洗剤、手洗い食器洗浄剤、または軽質食器洗浄剤、特に高起泡型のもの、種々の錠剤、顆粒、液体および家庭および企業での使用のためのリンス補助型を含む機械食器洗浄剤、抗菌ハンドウォッシュ型、洗濯バー、うがい薬、義歯クリーナー、車またはカーペット用シャンプー、浴室クリーナーを含む液体洗浄剤および消毒剤、ヘアシャンプーおよびヘアリンス、シャワージェルおよび泡バスおよび金属クリーナー、並びに、漂白添加物質および「染み用スティック」、または前処理型のような洗浄補助剤を含む。
【００２２】
本明細書で使用する時、「独立して、〜から成る群から選択される」という言い回しは、引用されるマルクーシュ群から選択される部分または要素が同じか、異なるか、または任意の要素の混合物であってもよいことを意味する。
【００２３】
本出願の試験方法の項で開示する試験方法を用いて、本出願人らの発明のパラメータの各値を求めなければならない。
【００２４】
特に記載のない限り、構成成分または組成物の濃度はすべて、前記構成成分または組成物の活性濃度に関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば残留溶媒または副生成物は除外されている。
【００２５】
百分率および比率はすべて、特に指示がない限り、重量で計算されている。百分率および比率はすべて、特に指示がない限り、組成物全体を基準にして計算されている。
【００２６】
本明細書を通じての所与のあらゆる最大数値限定には、あたかもこうしたより小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように、より小さいすべての数値限定が含まれると理解すべきである。本明細書全体を通じて記載されているあらゆる最小数値限定には、それよりも大きいあらゆる数値限定が、あたかもこうしたそれよりも大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含まれる。本明細書全体を通じて記載されているあらゆる数値範囲には、こうしたより広い数値範囲内に入る、それよりも狭いあらゆる数値範囲が、あたかもこうしたそれよりも狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように含まれる。
【００２７】
引用するすべての文書は、関連部分において本明細書に参考として組み込まれるが、いかなる文書の引用も、それが本発明に関して先行技術であるということの承認として解釈すべきではない。
【００２８】
組成物
本発明の組成物は典型的に、約０．０００１％〜約１％、約０．０００２％〜約０．５％、または約０．０００５％〜約０．３％の光漂白剤、および約０．００１％〜約０．０５％、または約０．００２％〜約０．０３％のリパーゼを含んでいる。
【００２９】
このような組成物は、いずれの形状、例えば洗浄組成物および／または処理組成物の形状などをとってよい。
【００３０】
前述の洗浄組成物のいずれかの態様のバランスは、１つ以上の補助剤で保たれている。
【００３１】
適切なリパーゼ変異体
本発明の組成物のリパーゼは、Ｃ末端伸張はないが、親リパーゼの特定領域内に突然変異体を持つことによって、悪臭生成の傾向が軽減されるリパーゼ変異体である。
【００３２】
親リパーゼ
親リパーゼは、「相同性とアラインメント」の項の定義に従った場合、配列番号２に示されているＴ．ラノギノサス（lanuginosus）の配列に対する相同性が少なくとも５０％であるアミノ酸配列を有する真菌性リパーゼであってよい。
【００３３】
親リパーゼは、カンジダ、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、またはヤロウィア（Yarrowia）ポリペプチドなどの酵母ポリペプチド、またはより好ましくは、アクレモニウム、アスペルギルス、オーレオバシディウム、クリプトコッカス、フィロバシディウム、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、マイセリオフソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロミセス、ペニシリウム、ピロミセス、シゾフィラム、タラロミセス、サーモアスカス（Thermoascus）、ティラビア（Thielavia）、トリポクラディウム（Tolypocladium）、またはトリコデルマポリペプチドなどの糸状菌ポリペプチドであってよい。
【００３４】
好ましい態様では、親リパーゼは、リパーゼ活性を有する、サッカロミセスカールスベルゲンシス、サッカロミセスセレヴィシエ、サッカロミセスジアスタティカス（diastaticus）、サッカロミセスダグラシー（douglasii）、サッカロミセスクルイベリ（kluyveri）、サッカロミセスノルベンシス（norbensis）、またはサッカロミセスオビフォーミス（oviformis）ポリペプチドである。
【００３５】
別の好ましい態様では、親リパーゼは、アスペルギルスアクレアタス（aculeatus）、アスペルギルスアワモリ、アスペルギルスフミガタス、アスペルギルスフォエティダス、アスペルギルスジャポニカス、アスペルギルスニダランス、アスペルギルスニガー、アスペルギスルオリゼー、アスペルギスルタービゲンシス（turbigensis）、フザリウムバクトリジオイデス（bactridioides）、フザリウムセレアリス（cerealis）、フザリウムクルークウェレンス（crookwellense）、フザリウムセルモラム、フザリウムグラミネアラム、フザリウムグラミナム（graminum）、フザリウムヘテロスポラム（heterosporum）、フザリウムネグンジ（negundi）、フザリウムオキシスポラム、フザリウムレティキュラタム（reticulatum）、フザリウムロゼウム、フザリウムサンブシウム（sambucinum）、フザリウムサルコクロウム（sarcochroum）、フザリウムスポロトリキオイデス、フザリウムサルフレウム（sulphureum）、フザリウムトルローサム（torulosum）、フザリウムトリコセシオイデス（trichothecioides）、フザリウムベネナタム（venenatum）、フミコラインソレンス、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）（別名：フミコララヌギノーズ（lanuginose））、ムコールミエヘイ（miehei）、マイセリオフソラサーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラクラッサ、ペニシリウムパルロゼラム、トリコデルマハルジアナム、トリコデルマコニンギ、トリコデルマロンギブラキアタム（longibrachiatum）、トリコデルマリーセイ（reesei）、またはトリコデルマビリデポリペプチドである。
【００３６】
別の好ましい態様では、親リパーゼはサーモミセス（Thermomyces）リパーゼである。
【００３７】
より好ましい態様では、親リパーゼはサーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）リパーゼである。更に好ましい実施形態では、親リパーゼは、配列番号２のリパーゼである。
【００３８】
領域と置換の同定
以下で領域Ｉ〜領域ＩＶと称されている位置は、配列番号２のアミノ酸残基の位置である。異なるリパーゼの相当（または相同）位を見つけるには、「相同とアラインメント」の部分に記載されている手順を用いる。
【００３９】
領域Ｉの置換
領域Ｉは、Ｎ末端残基Ｅ１を取り囲んでいるアミノ酸残基から構成されている。この領域では、より正に荷電したアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。１〜１１位および２２３〜２３９位に相当するアミノ酸残基が領域Ｉに含まれている。１位、２位、４位、８位、１１位、２２３位、２２７位、２２９位、２３１位、２３３位、２３４位、および２３６位が特に興味深い。とりわけ、Ｘ１Ｎ／＊、Ｘ４Ｖ、Ｘ２２７Ｇ、Ｘ２３１Ｒ、およびＸ２３３Ｒの置換が同定されている。
【００４０】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一性は８５％または９０％など少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４１】
領域ＩＩの置換
領域ＩＩは、アシル鎖の片側とアルコール部分の片側で基質と接しているアミノ酸残基から構成されている。この領域では、より正に荷電したアミノ酸で、またはより疎水性の低いアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。２０２〜２１１位および２４９〜２６９位に相当するアミノ酸残基が領域ＩＩに含まれている。２０２位、２１０位、２１１位、２５３位、２５４位、２５５位、２５６位、２５９位が特に興味深い。とりわけ、Ｘ２０２Ｇ、Ｘ２１０Ｋ／Ｗ／Ａ、Ｘ２５５Ｙ／Ｖ／Ａ、Ｘ２５６Ｋ／Ｒ、およびＸ２５９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｖの置換が同定されている。
【００４２】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一性は８５％または９０％など少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４３】
領域ＩＩＩの置換
領域ＩＩＩは、柔軟な構造を形成するアミノ酸残基から構成されており、このため、基質が活性部位に入り込めるようになっている。この領域では、より塩基性の高いアミノ酸、またはより疎水性の低いアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。８２〜１０２位に相当するアミノ酸残基が領域ＩＩＩに含まれている。８３位、８６位、８７位、９０位、９１位、９５位、９６位、９９位が特に興味深い。とりわけ、Ｘ８３Ｔ、Ｘ８６Ｖ、およびＸ９０Ａ／Ｒの置換が同定されている。
【００４４】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一性は８５％または９０％など少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４５】
領域ＩＶの置換
領域ＩＶは、静電気によって表面に結合しているアミノ酸残基から構成されている。この領域では、より正に荷電したアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。２７位および５４〜６２位に相当するアミノ酸残基が領域ＩＶに含まれている。２７位、５６位、５７位、５８位、６０位が特に興味深い。とりわけ、Ｘ２７Ｒ、Ｘ５８Ｎ／ＡＧ／Ｔ／Ｐ、およびＸ６０Ｖ／Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｒ／Ｋ／Ａ／Ｌの置換が同定されている。
【００４６】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一性は８５％または９０％など少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４７】
その他の位置のアミノ酸
親リパーゼは所望により、その他のアミノ酸の置換、具体的にはその他の置換を１０個未満または５個未満含んでもよい。例は、親リパーゼの２４位、３７位、３８位、４６位、７４位、８１位、８３位、１１５位、１２７位、１３１位、１３７位、１４３位、１４７位、１５０位、１９９位、２００位、２０３位、２０６位、２１１位、２６３位、２６４位、２６５位、２６７位、および２６９位のうちの１つ以上に相当する置換である。ある特定の実施形態では、８１位、１４３位、１４７位、１５０位、および２４９位に相当する位置の少なくとも１つに置換がある。ある好ましい実施形態では、少なくとも１つの置換は、Ｘ８１Ｑ／Ｅ、Ｘ１４３Ｓ／Ｃ／Ｎ／Ｄ／Ａ、Ｘ１４７Ｍ／Ｙ、Ｘ１５０Ｇ／Ｋ、およびＸ２４９Ｒ／Ｉ／Ｌから成る群から選択する。
【００４８】
変異体は、定義済みの領域Ｉ〜ＩＶの外に置換を含んでよく、定義済みの領域Ｉ〜ＩＶの外の置換の数は、６個未満、または５個未満、または４個未満、または３個未満、または２個未満、例えば、５個または４個または３個または２個または１個であるのが好ましい。あるいは、変異体は、定義済みの領域Ｉ〜ＩＶ以外では置換を全く含まない。
【００４９】
更に、置換は例えば、例えば、ＷＯ９２／０５２４９号、ＷＯ９４／２５５７７号、ＷＯ９５／２２６１５号、ＷＯ９７／０４０７９号、およびＷＯ９７／０７２０２号に記載されている置換など、当該技術分野において既知の原則に従って生成させてもよい。
【００５０】
親リパーゼの変異体
１つの態様では、変異体は、親と比較した場合、少なくとも合計で３個の置換を含んでおり、置換は、
ａ）領域Ｉの置換の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ、
ｂ）領域ＩＩの置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ、
ｃ）領域ＩＩＩの置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ、
ｄ）および／または領域ＩＶの置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ、の置換群の１つ以上から選択される。
【００５１】
前記変異体は、その変異体の親に比べて、後掲の表１に列挙される置換に相当する置換を含んでよい。
【表１】
2009523902.tif 000002
【００５２】
さらなる特定の実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一であり、表１の変異体は従って以下のとおりである。
【表２】
2009523902.tif 000003
【００５３】
アミノ酸修飾に関する命名法
本発明によるリパーゼ変異体について説明する際には、参照しやすくするために、元のアミノ酸：位置：置換済みアミノ酸という命名法を用いる。
【００５４】
この命名法に従うと、例えば、１９５位でグルタミン酸をグリシンに置換したものはＧ１９５Ｅと表示する。同じ位置でグリシンが欠失したものはＧ１９５＊と表示し、追加のアミノ酸残基、例えばリジンを挿入したものはＧ１９５ＧＫと表示する。特定のリパーゼが、他のリパーゼと比べて「欠失部分」を含み、そのような位置で挿入を行う場合、３６位にアスパラギン酸を挿入した時には、＊３６Ｄと表示する。複数の突然変異体はプラス記号で区切る。すなわち、Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅは、チロシンをアルギニンに置換した１７０位の突然変異体とグルタミン酸をグリシンに置換した１９５位の突然変異体をそれぞれ表している。
【００５５】
Ｘ２３１は、上記のアラインメント手順を適用した場合、２３１位に当たる親ポリペプチド中のアミノ酸を表す。Ｘ２３１Ｒは、アミノ酸をＲで置換したものを表す。配列番号２では、ＸはＴであり、従ってＸ２３１Ｒは２３１位のＴをＲに置換したものを表す。ある位置（例えば２３１位）のアミノ酸が、アミノ酸の群、例えばＲおよびＰおよびＹから成る群から選択される別のアミノ酸で置換されているような場合、これは、Ｘ２３１Ｒ／Ｐ／Ｙによって表されることになる。
【００５６】
いずれのケースでも、ＩＵＰＡＣによる１文字または３文字の正式なアミノ酸略称を採用する。
【００５７】
アミノ酸のグループ化
本明細書では、アミノ酸は、ｐＨ１０における電荷に応じて、負電荷アミノ酸、正電荷アミノ酸、または電気的に中性のアミノ酸に分類される。従って、負電荷アミノ酸はＥ、Ｄ、Ｃ（システイン）、およびＹ、とりわけＥおよびＤである。正電荷アミノ酸はＲ、Ｋ、およびＨ、とりわけＲおよびＫである。中性のアミノ酸は、ジスルフィド架橋の一部を形成している場合、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、およびＣである。同じグループ（負、正、または中性）の別のアミノ酸との置換は同類置換（conservative substitution）という。
【００５８】
中性のアミノ酸は、疎水性または非極性のもの（ジスルフィド架橋の一部としてのＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、およびＣ）と親水性または極性のもの（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ）に分けてよい。
【００５９】
アミノ酸の同一性
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の相関性は、「同一性」というパラメータによって評される。
【００６０】
本発明の目的上、２つのアミノ酸配列のアラインメントは、エンボス（EMBOSS）パッケージ（http://emboss.org）バージョン２．８．０内のニードル（Needle）というプログラムを用いることによって割り出す。ニードル（Needle）プログラムは、Ｓ．Ｂ．ニードルマン（Needleman）およびＣ．Ｄ．ワンチ（Wunsch）著（１９７０年）、分子生物学会誌（J. Mol. Biol.）４８号、４４３〜４５３ページに記載されているグローバルアラインメントアルゴリズムを実行する。用いる置換マトリクスはＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープニングペナルティは１０、ギャップエクステンションペナルティは０．５である。
【００６１】
本発明のアミノ酸配列（「本配列」、例えば配列番号２のアミノ酸１〜２６９）と、異なるアミノ酸配列（「異質配列」という）の同一性の程度は、２つの配列のアライメントの完全一致数を「本配列」の長さまたは「異質配列」の長さのうち短い方で除した値として算出する。この結果をパーセント同一性として表す。
【００６２】
完全一致は、「本配列」と「異質配列」に、同一のアミノ酸残基が重複部分の同じ位置に備わっている場合に発生する。配列の長さは、配列内のアミノ酸残基の数である（例えば配列番号２の長さは２６９である）。
【００６３】
親リパーゼとＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）のアミノ酸同一性は少なくとも５０％であり、特には、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％超、または９８％を超える。特定の実施形態では、親リパーゼはＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）と同一である。
【００６４】
上記の手順は、同一性の計算に加えて相同性の計算とアラインメントでも用いてもよい。本発明の文脈においては、相同性とアラインメントは、以下に記載されているとおりに計算されている。
【００６５】
相同性とアラインメント
本発明の目的上、相同性の程度は、当該技術分野において既知のコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージに搭載されているＧＡＰ（ウィスコンシンパッケージ（Wisconsin Package）プログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年８月、ジェネティックスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）、５３７１１米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５）（Ｓ．Ｂ．ニードルスマン（Needleman）およびＣ．Ｄ．ワンチ（Wunsch）（１９７０年）、分子生物学会誌（Journal of Molecular Biology）、４８号、４４３〜４５ページ）によって適切に割り出されてもよい（ＧＡＰは、ギャップ生成ペナルティが３．０、ギャップ伸長ペナルティが０．１というギャップポリペプチド配列比較用の設定で用いる）。
【００６６】
本発明では、アブシディアレフレクサ（reflexa）、アブシディアコリムビフェラ、リズムコアミエヘイ（Rhizmucor miehei）、リゾープスデレマ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス（tubigensis）、フザリウムオキシスポラム、フザリウムヘテロスポラム（heterosporum）、アスペルギルスオリゼー、ペニシリウムカマンベルディ、アスペルギルスフォエティダス、アスペルギルスニガー、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）（別名：フミコララヌギノーサ（Humicola lanuginosa））、およびランデリナペニサポラ（Landerina penisapora）のリパーゼ配列内の相当（または相同）位は、図１に示されているアラインメントによって定義されている。
【００６７】
アラインメントに示されていないリパーゼ配列の相同位を確認するには、当該配列を、図１に示されている配列に揃える。ＧＡＰプログラムによって見出された最も相同性の高い配列に対するＧＡＰアラインメントを用いて、その新たな配列を、図１中の本アラインメントに揃える。ＧＡＰはＧＣＧプログラムパッケージに搭載されている（ウィスコンシンパッケージ（Wisconsin Package）プログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年８月、ジェネティックスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）、５３７１１米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５）（Ｓ．Ｂ．ニードルスマン（Needleman）およびＣ．Ｄ．ワンチ（Wunsch）（１９７０年）、分子生物学会誌（Journal of Molecular Biology）４８号、４４３〜４５ページ）。ギャップ生成ペナルティが３．０、ギャップ伸長ペナルティが０．１というポリペプチド配列比較用の設定を用いる。
【００６８】
親リパーゼとＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）の相同性は少なくとも５０％であり、特には、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％超、または９８％を超える。特定の実施形態では、親リパーゼはＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）と同一である。
【００６９】
ハイブリダイゼーション
本発明は更に、リパーゼ活性を持つ分離ポリペプチドであって、厳密性が非常に低い条件、好ましくは厳密性が低い条件、より好ましくは厳密性が中度である条件、更に好ましくは厳密性が中の上である条件、更に好ましくは厳密性が高い条件、最も好ましくは厳密性が非常に高い条件の下で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０に含まれているｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の部分配列、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の相補鎖とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドによってエンコードされている分離ポリペプチドに関するものである（Ｊ．サンブルック（Sambrook）、Ｅ．Ｆ．フリッチェ（Fritsch）、およびＴ．マニアタス（Maniatus）、１９８９年、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」第２版、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク）。配列番号１の部分配列は、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド、または好ましくは少なくとも２００個の連続したヌクレオチドを含んでいる。更には、前記部分配列は、リパーゼ活性を持つポリペプチド断片をエンコードすることがある。
【００７０】
鎖長が少なくとも１００個のヌクレオチドの長いプローブでは、厳密性が非常に低い条件から非常に高い条件は、５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの断片化変性サケ精子ＤＮＡ、および厳密性が非常に低い場合と低い場合には２５％のホルムアミド、厳密性が中度である場合と中の上である場合には３５％のホルムアミド、厳密性が高い場合と非常に高い場合には５０％のホルムアミド中、４２℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行った後に、標準的なサザンブロッティング手順を最適に行うものとして定義する。
【００７１】
鎖長が少なくとも１００個のヌクレオチドの長いプローブでは、担体物質は最後に、２Ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃で（厳密性が非常に低い場合）、より好ましくは少なくとも５０℃で（厳密性が低い場合）、更に好ましくは少なくとも５５℃で（厳密性が中度である場合）、更に好ましくは少なくとも６０℃で（厳密性が中の上である場合）、更に好ましくは少なくとも６５℃で（厳密性が高い場合）、最も好ましくは少なくとも７０℃で（厳密性が非常に高い場合）、３回、それぞれにつき１５分間洗浄する。
【００７２】
ＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、リパーゼの生成
本発明は、本発明のリパーゼをエンコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を組み入れる発現ベクター、およびＤＮＡ配列または発現ベクターを含む形質転換宿主細胞を提供する。これらは、当該技術分野において既知の方法によって得られてもよい。
【００７３】
本発明は、リパーゼの生成を促す条件下で前記形質転換宿主細胞を培養し、得られた培養液からリパーゼを回収することによって、リパーゼを生成させる方法も提供する。この方法は、当該技術分野において既知の原理に従って実施してよい。
【００７４】
リパーゼ活性
―中性のｐＨにおけるトリブチリンのリパーゼ活性（ＬＵ）
乳化剤としてアラビアゴムを用いてトリブチリン（グリセリントリブチレート）を乳化させることによって、リパーゼの基質を用意する。続いて、ｐＨスタット滴定実験装置内で、トリブチリンを３０℃、ｐＨ７または９で加水分解する。リパーゼ活性の１単位（１ＬＵ）は、ｐＨ７において毎分１マイクロモルの酪酸を放出できる酵素の量に匹敵する。
【００７５】
―ベネフィット・リスク（Benefit Risk）
悪臭リスクの低下との比較による性能を表すベネフィット・リスク係数は、ＢＲ＝ＲＰａｖｇ／Ｒとして定義する。本明細書に記載のリパーゼ変異体のＢＲは、１超、１．１超、または更には１超〜約１０００であってよい。
【００７６】
―平均相対的パフォーマンス（Average Relative Performance）
平均相対的パフォーマンス（ＲＰａｖｇ）を算出する手順は、本明細書の実施例５に記載されている。本明細書に記載されているリパーゼ変異体の（ＲＰａｖｇ）は、少なくとも０．８、少なくとも１．１、少なくとも１．５、又、更には少なくとも２〜約１０００であってよい。
【００７７】
適切な光漂白剤
適切な光漂白剤としては、触媒光漂白剤および光開始剤が挙げられる。適切な触媒光漂白剤としては、以下の式の水溶性フタロシアニンから成る群から選択される触媒光漂白剤が挙げられる。
【数１】
2009523902.tif 000004
式中、
ＰＣはフタロシアニン環構造であり、
ＭｅはＺｎ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｃａ、Ｍｇ、Ｎａ、Ｋ、Ａｌ−Ｚ１、Ｓｉ（ＩＶ）、Ｐ（Ｖ）、Ｔｉ（ＩＶ）、Ｇｅ（ＩＶ）、Ｃｒ（ＶＩ）、Ｇａ（ＩＩＩ）、Ｚｒ（ＩＶ）、Ｉｎ（ＩＩＩ）、Ｓｎ（ＩＶ）、またはＨｆ（ＶＩ）であり、
Ｚ１はハロゲン化物、サルフェート、ニトレート、カルボキシレート、アルカノレート、またはヒドロキシルイオンであり、
ｑは０、１、または２であり、
ｒは１〜４であり、
Ｑ１はスルホ若しくはカルボキシル基、または以下の式のラジカルであり、
ＳＯ２Ｘ２−Ｒ１−Ｘ３＋、−Ｏ−Ｒ１−Ｘ３＋、または−（ＣＨ２），−Ｙ１＋、
式中、
Ｒ１は分枝状または非分枝状Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、または１，３−若しくは１，４−フェニレンであり、
Ｘ２は−ＮＨ−、または−Ｎ−Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり、
Ｘ３＋は、以下の式の基であり、
【化１】
2009523902.tif 000005
あるいは、Ｒ１がＣ１〜Ｃ８アルキレンの場合、以下の式の基である。
【化２】
2009523902.tif 000006
Ｙ１＋は以下の式の基である。
【化３】
2009523902.tif 000007
ｔは０または１である。
【００７８】
上記の式中、
Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４はＣ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキル、またはＮＲ７Ｒ８であり、
Ｒ５およびＲ６は互いに独立してＣ１〜Ｃ５アルキルであり、
Ｒ７およびＲ８は互いに独立して水素またはＣ１〜Ｃ５アルキルであり、
Ｒ９およびＲ１０は互いに独立して非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであるか、またはヒドロキシル、シアノ、カルボキシル、カルボ−Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アルコキシ、フェニル、ナフチル、若しくは、ピリジルで置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｕは１〜６であり、
Ａ１は芳香族５〜７員窒素複素環を完成させる単位であり、環は、適切な場合、環員として更に１つまたは２つの窒素原子を含んでもよく、
Ｂ１は飽和５〜７員窒素複素環を完成させる単位であり、環には、適切な場合、環員として１〜２つの窒素、酸素、および／または硫黄原子を含んでもよく、
Ｑ２はヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ２２アルキル、分枝Ｃ３〜Ｃ２２アルキル、Ｃ２〜Ｃ２２アルケニル、分枝Ｃ３〜Ｃ２２アルケニル、およびこれらの混合物、Ｃ１〜Ｃ２２アルコキシ、スルホ若しくはカルボキシルラジカル、以下の式のラジカル
【化４】
2009523902.tif 000008
以下の式の分枝アルコキシラジカル
【化５】
2009523902.tif 000009
以下の式のアルキルエチレンオキシ単位、
【化６】
2009523902.tif 000010
または以下の式のエステルである。
【化７】
2009523902.tif 000011
式中、
Ｂ２は水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０アルコキシ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＳＯ３−Ｍ１、−ＯＳＯ３−Ｍ１、−ＰＯ３２−Ｍ１、−ＯＰＯ３２−Ｍ１、およびこれらの混合物であり、
Ｂ３は水素、ヒドロキシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３−Ｍ１、−ＯＳＯ３Ｍ１、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、
Ｍ１は水溶性カチオンであり、
Ｔ１は−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｘ１およびＸ４は互いに独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、または−Ｎ−Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり、
Ｒ１１およびＲ１２は互いに独立して水素、スルホ基およびその塩、カルボキシル基およびその塩、またはヒドロキシル基であり、Ｒ１１およびＲ１２ラジカルの少なくとも１つはスルホ基またはカルボキシル基またはそれらの塩であり、
Ｙ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−Ｎ−Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり、
Ｒ１３およびＲ１４は互いに独立して水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、シアノ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、スルホ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、カルボキシ若しくはハロゲン−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、非置換フェニル、またはハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、若しくは、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシで置換されているフェニル、スルホ若しくはカルボキシルであり、あるいは、Ｒ１３およびＲ１４は、結合している窒素原子と共に飽和５または６員複素環を形成し、環は環員として更に１つの窒素または酸素原子を含んでもよく、
Ｒ１５およびＲ１６は互いに独立してＣ１〜Ｃ６アルキルまたはアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルであり、
Ｒ１７は水素、非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、フェニル、カルボキシル、カルボ−Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、若しくはＣ１〜Ｃ６アルコキシで置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１８はＣ１〜Ｃ２２アルキル、分枝Ｃ３〜Ｃ２２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２２アルケニル、または分枝Ｃ３〜Ｃ２２アルケニル、Ｃ３〜Ｃ２２グリコール、Ｃ１〜Ｃ２２アルコキシ、分枝Ｃ３〜Ｃ２２アルコキシ、およびこれらの混合物であり、
Ｍは水素、またはアルカリ金属イオン若しくはアンモニウムイオンであり、
Ｚ２−は塩素、臭素、アルキルサルフェートまたはアリールサルフェートイオンであり、
ａは０または１であり、
ｂは０〜６であり、
ｃは０〜１００であり、
ｄは０または１であり、
ｅは０〜２２であり、
ｖは２〜１２の整数であり、
ｗは０または１であり、
Ａ−は有機または無機アニオンであり、
ｓは、Ａ−が一価アニオンの場合はｒに等しく、多価アニオンの場合はｒ以下であり、Ａｓ−は正電荷を打ち消す必要があり、ｒが１でない場合、Ｑ１ラジカル同士は同一でも異なっていてもよく、
フタロシアニン環構造には更に可溶化基を含んでもよい。
【００７９】
その他の適切な触媒光漂白剤としては、キサンテン色素およびこれらの混合物が挙げられる。別の態様では、適切な触媒光漂白剤としては、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、エオシンＹ、ホキシン（Phoxine）Ｂ、ローズベンガル、Ｃ．Ｉ．食用赤色１４号、およびこれらの混合物から成る群から選択される触媒光漂白剤が挙げられる。別の態様では、適切な光漂白剤は、スルホン化亜鉛フタロシアニンおよびスルホン化アルミニウムフタロシアニンの混合物にしてよく、混合物のスルホン化亜鉛フタロシアニン対スルホン化アルミニウムフタロシアニンの重量比は１超、１超〜約１００未満、または約１〜約４である。
【００８０】
適切な光開始剤としては、芳香族１，４−キノン（アントラキノンおよびナフタキノンなど）、α−アミノケトン（とりわけベンゾイル部分を含むもの、あるいはα−アミノアセトフェノンと呼ばれているもの）、α−ヒドロキシケトン（とりわけα−ヒドロキシアセトフェノン）、リン含有光開始剤（モノアシル、ビスアシル、およびトリスアシルホスフィンオキシドおよびスルフィドなど）、ジアルコキシアセトフェノン、α−ハロアセトフェノン、トリスアシルホスフィンオキシド、ベンゾインおよびベンゾイン系光開始剤、並びにこれらの混合物から成る群から選択される光開始剤が挙げられる。別の態様では、適切な光開始剤としては、２−エチルアントラキノン、ビタミンＫ３、２−サルフェート−アントラキノン、２−メチル−１−［４−フェニル］−２−モルホリノプロパン−１−オン（イルガキュア（Irgacure）（登録商標）９０７）、（２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルホリノフェニル）−ブタン−１−オン（イルガキュア（Irgacure）（登録商標）３６９）、（１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン）（イルガキュア（Irgacure）（登録商標）２９５９）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン（イルガキュア（Irgacure）（登録商標）１８４）、オリゴ［２−ヒドロキシ−２−メチル−１−［４（１−メチル）−フェニル］プロパノン（イーサキュア（Esacure）（登録商標）ＫＩＰ１５０）、２−４−６−（トリメチルベンゾイル）ジフェニル−ホスフィンオキシド、ビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル）−フェニル−ホスフィンオキシド（イルガキュア（Irgacure）（登録商標）８１９）、（２，４，６−トリメチルベンゾイル）フェニルホスフィン酸エチルエステル（ルシリン（Lucirin）（登録商標）ＴＰＯ−Ｌ）、およびこれらの混合物から成る群から選択した光開始剤が挙げられる。
【００８１】
前記の光漂白剤は組み合わせて使用することができる（いずれかの光漂白剤混合物を使用してもよい）。適切な光漂白剤は、アルドリッチ（Aldrich）（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）、フロンティアサイエンティフィック（Frontier Scientific）（米国ユタ州ローガン）、チバスペシャルティケミカルズ（Ciba Specialty Chemicals）（スイス、バーゼル）、ＢＡＳＦ（ドイツ、ルートウィヒスハーフェン）、ランベルティ（Lamberti S.p.A）（イタリア、ガッララーテ）、ディグローカラーコーポレーション（Dayglo Color Corporation）（インド、ムンバイ）、オーガニックダイスタフス（Organic Dyestuffs Corp.）（米国ロードアイランド州イーストプロビデンス）から購入可能であり、および／または本明細書に記載の実施例に従って生成可能である。
【００８２】
補助剤物質
本発明の目的には必須でないが、以下に例示されている補助剤の非限定的なリストは、当該組成物中で使用するのに適しており、例えば、洗浄性能を補助若しくは向上させるために、洗浄すべき基材の処理のために、または香料、着色剤、色素などを用いる場合のように洗浄組成物の審美性を変化させるために、本発明の特定の実施形態に組み込むのが望ましい。このような追加成分の明確な性質およびそれを組み込む濃度は、組成物の物理的形態および使用すべき洗浄作業の性質に左右される。適切な補助剤物質としては、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素および酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、色素、布地色調剤、香料、構造伸縮性付与剤、柔軟仕上げ剤、キャリア、向水性物質、加工助剤、溶媒、および／または顔料が挙げられるが、これらに限らない。下記の開示に加え、このようなその他の補助剤の適切な例および使用濃度は、米国特許第５，５７６，２８２号、米国特許第６，３０６，８１２Ｂ１号、および米国特許第６，３２６，３４８Ｂ１号に記載されており、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８３】
上述の如く、前記補助成分は、本出願人らの組成物に必須ではない。従って、本出願人らの組成物の特定の実施形態には、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素および酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、色素、香料、構造弾性化剤、柔軟仕上げ剤、キャリア、向水性物質、加工助剤、溶媒、および／または顔料という補助剤物質のうちの１つ以上を含んでいない。しかしながら、１つ以上の補助剤が存在する場合、その１つ以上の補助剤は、以下に詳細に記載されているように存在してよい。
【００８４】
漂白剤−本発明の洗浄組成物は、１つ以上の漂白剤を含んでよい。漂白触媒以外の適切な漂白剤としては、光漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成過酸、およびこれらの混合物が挙げられる。一般的に、漂白剤を用いる場合、本発明の組成物は漂白剤を、標記洗浄組成物の約０．１重量％〜約５０重量％または更に約０．１重量％〜約２５重量％含んでよい。好適な漂白剤の例としては、以下のものが挙げられる。
【００８５】
（１）予備形成済み過酸：適切な予備形成済み過酸としては、過カルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシモノスルホン酸および塩（例えばオクシゾン（Oxzone）（登録商標）など）、並びに、これらの混合物から成る群から選択した化合物が挙げられるが、これらに限らない。適切な過カルボン酸としては、化学式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｏ−Ｍを有する疎水性および親水性過酸が挙げられる（前記式中、Ｒはアルキル基であり、所望に応じて分岐しており、前記過酸が疎水性の場合には、６〜１４個の炭素原子、または８〜１２個の炭素原子を有し、前記過酸が親水性の場合には、６つ未満の炭素原子、または更には４つ未満の炭素原子を有し、Ｍは、対イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、または水素）である。）。
【００８６】
（２）アルカリ金属塩、例えばペルボレート（通常はモノまたはテトラハイドレート）、ペルカーボネート、ペルサルフェート、ペルホスフェート、ペルシリケート塩、およびこれらの混合物のナトリウム塩などの過酸化水素源（例えば無機ペルハイドレート塩）。本発明のある１つの態様では、前記無機ペルハイドレート塩は、ペルボレート、ペルカーボネート、およびこれらの混合物のナトリウム塩から成る群から選択する。無機ペルハイドレート塩（用いた場合）は、典型的には、全組成物の０．０５〜４０重量％、または１〜３０重量％の量で存在し、典型的には、当該組成物中へ結晶固形物（コーティングされていてもよい）として組み込まれる。適切なコーティングとしては、無機塩（アルカリ金属シリケート、カーボネート若しくはボレート塩、またはこれらの混合物など）、または有機物質（水溶性若しくは分散性ポリマー、ワックス、油、または脂肪石鹸など）が挙げられる。
【００８７】
（３）Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌを有する漂白活性化剤（前記式中、Ｒはアルキル基であり、所望に応じて分岐しており、前記漂白活性化剤が疎水性の場合には、６〜１４個の炭素原子、または８〜１２個の炭素原子を有し、前記漂白活性化剤が親水性の場合には、６つ未満の炭素原子、または更には４つ未満の炭素原子を有し、Ｌは脱離基である。適切な脱離基の例は、安息香酸およびその誘導体（特に、ベンゼンスルホネート）である。適切な漂白活性化剤としては、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸またはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、およびノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）が挙げられる。適切な漂白活性剤はＷＯ９８／１７７６７号にも開示されている。いずれかの適切な漂白活性化剤も使用してもよいが、本発明のある１つの態様では、標記洗浄組成物は、ＮＯＢＳ、ＴＡＥＤ、またはこれらの混合物を含んでよい。
【００８８】
過酸および／または漂白活性化剤（存在する場合）は一般に、組成物に対して約０．１〜約６０重量％、約０．５〜約４０重量％または更には約０．６〜約１０重量％の量で、組成物中に存在する。１つ以上の疎水性過酸またはその前駆体は、１つ以上の親水性過酸またはその前駆体と組み合わせて使用してよい。
【００８９】
過酸化水素供給源および過酸または漂白活性化剤の量は、有効酸素（過酸化物供給源より供給される）対過酸のモル比が、１：１〜３５：１、または更に２：１〜１０：１となるように選択してよい。
【００９０】
界面活性剤−本発明による洗浄組成物は、界面活性剤または界面活性剤系を含んでよく、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双極性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、およびこれらの混合物から選択してよい。界面活性剤（存在する場合）は典型的に、標記組成物の約０．１重量％〜約６０重量％、約１重量％〜約５０重量％または更には約５重量％〜約４０重量％の濃度で存在する。
【００９１】
ビルダー−本発明の洗剤組成物は、１つ以上の洗剤ビルダーまたはビルダー系を含んでよい。ビルダーを使用する場合、標記組成物には典型的に、ビルダーを標記組成物の少なくとも約１重量％、約５重量％〜約６０重量％、または更に約１０重量％〜約４０重量％含有させる。ビルダーとしては、ポリホスフェートのアルカリ金属塩、アンモニウム塩およびアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属シリケート、アルカリ土類およびアルカリ金属カーボネート、アルミノシリケートビルダーおよびポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレンまたはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸およびカルボキシメチルオキシコハク酸、エチレンジアミン４酢酸およびニトリロ３酢酸のようなポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム塩、並びに、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸などのポリカルボキシレート、並びに、これらの可溶性塩が挙げられるが、これらに限らない。
【００９２】
キレート剤−本明細書の洗浄組成物には、キレート剤を含有させてよい。適切なキレート剤としては、銅、鉄、および／またはマンガンキレート剤、並びに、これらの混合物が挙げられる。キレート剤を使用する場合、標記組成物はキレート剤を、標記組成物の約０．００５重量％〜約１５重量％、または更には約３．０重量％〜約１０重量％含んでよい。
【００９３】
移染防止剤−本発明の洗浄組成物には１つ以上の移染防止剤も含有させてもよい。適切なポリマー移染防止剤としては、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。移染防止剤は、標記組成物中に存在する場合、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、または更には約０．１重量％〜約３重量％の濃度で存在してよい。
【００９４】
増白剤−本発明の洗浄組成物は、洗浄する物品に色合いを付けることのできる追加成分（蛍光増白剤など）も含むことができる。適切な蛍光増白剤の濃度としては、約０．０１重量％、約０．０５重量％、約０．１重量％、更には約０．２重量％という低い濃度から、０．５重量％、または更には０．７５重量％という高い濃度までが挙げられる。
【００９５】
分散剤−本発明の組成物は分散剤も含むことができる。適切な水溶性有機物質としては、ホモポリマーまたはコポリマーの酸またはそれらの塩が挙げられ、それらのうちのポリカルボン酸は、互いに炭素原子２つを超えない程度に離れている少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含んでいる。
【００９６】
追加の酵素−洗浄組成物は、洗浄性能および／または布地ケア効果を提供する１つ以上の酵素を含むことができる。適切な酵素の例としては、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクテートリアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼおよびアミラーゼ、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。典型的な組み合わせは、例えば、プロテアーゼおよびリパーゼをアミラーゼとともに含んでよい酵素反応混液である。上述の追加酵素は、洗浄組成物に存在する場合、組成物の約０．００００１重量％〜約２重量％、約０．０００１重量％〜約１重量％、又、更には約０．００１重量％〜約０．５重量％の酵素タンパク質の濃度で存在してよい。
【００９７】
酵素安定剤−種々の技法によって、洗剤で使用する酵素を安定化させることができる。本発明で用いる酵素は、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンを酵素に供給する最終組成物中カルシウムおよび／またはマグネシウムイオンの水溶性供給源の存在によって安定化させることができる。プロテアーゼを含む水性組成物の場合、更に安定性を向上させるために、可逆性蛋白質分解酵素抑制剤（ホウ素化合物など）を添加することができる。
【００９８】
触媒金属錯体−本出願人らの洗浄組成物は、触媒金属錯体を含むことができる。金属含有漂白触媒の１つの種類は、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、またはマンガンの陽イオンのような、限定された漂白触媒活性の遷移金属陽イオン、亜鉛またはアルミニウムの陽イオンのような、漂白触媒活性をほとんどまたは全く持たない補助金属陽イオン、並びに触媒金属および補助金属の陽イオンに対して限定された安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）およびそれらの水溶性の塩類を含む触媒系である。このような触媒は、米国特許第４，４３０，２４３号に開示されている。
【００９９】
所望する場合、本明細書の組成物はマンガン化合物を用いて触媒作用され得る。このような化合物および使用濃度は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第５，５７６，２８２号に開示されているマンガン系触媒が挙げられる。
【０１００】
本明細書で有用なコバルト漂白剤触媒は既知であり、例えば、米国特許第５，５９７，９３６号、米国特許第５，５９５，９６７号に記載されている。このようなコバルト触媒は、例えば米国特許第５，５９７，９３６号および米国特許第５，５９５，９６７号に教示されているような既知の手順によって容易に調製される。
【０１０１】
本明細書の組成物は、又、配位子の遷移金属錯体（例えば、ビスピドン（bispidone）（ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０５／０４２５３２Ａ１）および／または大多環状剛性配位子（「ＭＲＬ」と略される）を適切に含んでもよい。実際問題として、限定するためではないが、本発明の組成物および工程は、水性洗浄媒体において、少なくとも約１億分の１の活性ＭＲＬ種を提供するように調整することができ、典型的には、約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、または更には約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄溶液中に提供する。
【０１０２】
本遷移金属漂白触媒における好適な遷移金属としては、例えばマンガン、鉄およびクロムが挙げられる。適切なＭＲＬとしては、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンが挙げられる。
【０１０３】
適した遷移金属ＭＲＬは、既知の手順、例えば、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／３２６０１および米国特許第６，２２５，４６４号で教示されている手順によって容易に調製される。
【０１０４】
溶媒−好適な溶媒としては、水および他の溶媒（例えば、親油性流体）が挙げられる。好適な親油性流体の例としては、シロキサン類、その他のシリコーン類、炭化水素類、グリコールエーテル類、例えばグリセリンエーテル類などのグリセリン誘導体類、ペルフルオロ化アミン類、ペルフルオロ化およびハイドロフルオロエーテル溶媒類、低揮発性の非フッ素化有機溶媒類、ジオール溶媒類、環境に優しいその他の溶媒類、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０１０５】
組成物の生成方法
本発明の組成物は、いずれかの適切な形状で配合可能であり、配合者が選択したいずれかのプロセスによって調製可能であり、それらの非限定例は、本出願者の実施例、および米国特許第４，９９０，２８０号、米国特許第２００３００８７７９１Ａ１号、米国特許第２００３００８７７９０Ａ１号、米国特許第２００５０００３９８３Ａ１号、米国特許第２００４００４８７６４Ａ１号、米国特許第４，７６２，６３６号、米国特許第６，２９１，４１２号、米国特許第２００５０２２７８９１Ａ１号、欧州特許第１０７０１１５Ａ２号、米国特許第５，８７９，５８４号、米国特許第５，６９１，２９７号、米国特許第５，５７４，００５号、米国特許第５，５６９，６４５号、米国特許第５，５６５，４２２号、米国特許第５，５１６，４４８号、米国特許第５，４８９，３９２号、米国特許第５，４８６，３０３号に記載されており、これらはすべて参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
使用方法
本発明は、ある場所、とりわけ表面または布地を洗浄および／または処理する方法を含む。これらの方法は、本出願人の洗浄組成物の実施形態を、希釈していない形状で、または洗浄溶液中で希釈して、表面または布地の少なくとも一部に接触させてから、所望に応じて表面または布地をすすぐ工程を含む。表面または布地は前述のすすぎ工程の前に洗浄工程にさらされてもよい。本発明の目的上、洗浄は、擦ることおよび機械的攪拌を含むが、これらに限定されない。当業者に理解されるように、本発明の洗浄組成物は理想的には洗濯用途に用いるのに適している。それ故に、本発明は布地を洗濯するための方法を含む。この方法は、洗濯されるべき布地を本出願の洗浄組成物の少なくとも１つの実施形態、洗浄添加物、またはこれらの混合物を含む前記洗浄洗濯溶液と接触させる工程を含む。布地は、標準的な消費者の使用条件で洗濯され得る大部分の任意の布地を含んでもよい。溶液は、好ましくは、約８〜約１０．５のｐＨを有する。５．組成物は、溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用してよい。水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。水対布地の比率は、典型的には約１：１〜約３０：１である。
【実施例】
【０１０７】
リパーゼ変異体の実施例
緩衝剤および基質として使用する化学薬品は、少なくとも試薬等級の市販品である。
―媒質および溶液：ＬＡＳ（サーファック（Surfac）ＰＳ（商標））およびゼオライトＡ（ウェサリス（Wessalith）Ｐ（商標））。用いるその他の成分は、標準的な実験用試薬である。
―材料：ＥＭＰＡ  Ｓｔ．ガレン（スイス、Ｓｔ．ガレン、ＣＨ−９０１４レールヒェンフェルトシュトラーセ５）製のＥＭＰＡ２２１
【０１０８】
（実施例１）：酵素の生成
遺伝子エンコード型リパーゼを含むプラスミドを構築させ、当業界の標準的な方法を用いて適切な宿主細胞に移動させる。
【０１０９】
３４℃という一定の媒質温度と１．２リットルという開始容量を用いて、フェッドバッチ発酵として発酵を行う。媒質の初期ｐＨは６．５に設定する。ｐＨが７．０まで上昇したら、１０％Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、この値を維持させる。媒質中の溶存酸素の濃度は、攪拌速度を変えるとともに、毎分１リットルの媒質あたり１．０リットルの空気という一定の通気速度を用いることによって制御する。フィード添加速度は、フェッドバッチ局面全体にわたって一定濃度に維持する。バッチ媒質には、炭素源としてのマルトースシロップ、窒素源としての尿素と酵母エキス、および微量金属と塩の混合物を含有させた。フェッドバッチ局面中に連続的に添加させるフィード物には炭素源としてのマルトースシロップを含む、その一方で、窒素の十分な供給を確保する目的で、酵母エキスと尿素を添加させる。
【０１１０】
リパーゼの精製は、当該技術分野において既知の標準的な方法を用いることによって、例えば、発酵上澄みをろ過してから疎水性クロマトグラフィーとアニオン交換を、例えば欧州特許０  ８５１  ９１３号に記載されているとおりに実施することによって、行ってよい。
【０１１１】
（実施例２）：相対性能（ＲＰ）を算出するためのＡＭＳＡ（機械的応力自動測定装置）
本出願の酵素変異体は、機械的応力自動測定装置（ＡＭＳＡ）を用いて試験する。ＡＭＳＡによる試験によって、大量の少容量酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡのプレートには、試験溶液用の数多くのスロットと、洗浄する布地見本をすべてのスロット開口部にしっかり押し込む蓋が備わっている。洗浄時間中、前記プレート、試験溶液、布地、および蓋を力強く振り動かし、試験溶液を布地と接触させるとともに、機械的応力を加えるようにする。さらなる説明は、ＷＯ０２／４２７４０号、特に２３〜２４ページの「特殊な方法の実施形態（Special method embodiments）」の項を参照されたい。洗剤試験溶液が入っている容器には、金属プレート内に円筒形の穴（直径６ｍｍ、奥行き１０ｍｍ）が備わっている。汚れの付いた布地（試験材）は、前記金属プレートの上に置き、蓋として用いて、前記容器の上を密封させる。各容器からのあらゆる流出を防ぐために、別の金属プレートを、汚れの付いた前記布地の上に置く。汚れの付いた前記布地とともに前記２つの金属プレートを、３０Ｈｚの周波数と２ｍｍの振幅で上下に揺り動かす。
【０１１２】
この測定は、以下に定めた実験条件の下で行う。
【表３】
2009523902.tif 000012
【０１１３】
クリームウコン見本は、ウコン（デンマークのサンタマリア（Santa Maria））５ｇをクリーム（脂肪３８％、デンマークのアルラ（Arla））１００ｇと５０℃で混合させ、その混合物を前記温度で約２０分間置き、（５０℃で）ろ過して非溶解粒子をすべて除去することによって、調製する。前記混合物を２０℃まで冷却し、綿布地見本のＥＭＰＡ２２１をクリーム−ウコン混合物に浸し、その後、一晩かけて室温で乾燥させ、使用時まで冷凍する。クリーム−ウコン見本の調製については、特許出願ＰＡ２００５  ００７７５号（２００５年５月２７日申請）に開示されている。
【０１１４】
酵素変異体の性能は、規定の酵素変異体を用いて洗浄した布地サンプルの色の輝度として測定する。輝度は、白色光を照射した時に布地サンプルから反射される光の強度として表すこともできる。布地が汚れている場合、反射光の強度は、汚れていない布地の強度よりも低い。従って、反射光の強度を用いて、酵素変異体の洗浄性能を測定することができる。
【０１１５】
色測定は、専門的なフラットベットスキャナー（ＰＦＵ  ＤＬ２４００ｐｒｏ）によって行う。前記スキャナーを用いて、洗浄済み布地サンプルの画像をキャプチャする。スキャンは、解像度２００ｄｐｉ、出力色深度２４ビットで行う。正確な結果を得るために、スキャナーは、反射ターゲットのコダック（Kodak）ＩＴ８によって頻繁に較正する。
【０１１６】
スキャン済み画像から光強度の値を抽出するために、特別設計のソフトウェアアプリケーション（ノボザイムズカラーベクターアナライザー（Novozymes Color Vector Analyzer）を用いる。このプログラムは、画像から２４ビットピクセルの値を読み出し、その値を赤・緑・青（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ベクトルとしてＲＧＢの値を合計してから、得られたベクトルの長さを以下に従って計算することによって割り出す。
【数２】
2009523902.tif 000013
【０１１７】
酵素変異体の洗浄性能（Ｐ）は、以下の式に従って算出する。Ｐ＝Ｉｎｔ（ｖ）−Ｉｎｔ（ｒ）、
式中、Ｉｎｔ（ｖ）は、試験酵素で洗浄した布地の表面の光強度の値であり、Ｉｎｔ（ｒ）は、試験酵素なしで洗浄した布地の表面の光強度の値である。
【０１１８】
相対性能スコアは、「相対性能スコア（ＲＰ）は、基準酵素に対する試験酵素変異体の性能（Ｐ）の合計、つまり、ＲＰ＝Ｐ（試験酵素）／Ｐ（基準酵素）である」という定義によるＡＭＳＡ洗浄の結果として得られる。
【０１１９】
ＲＰａｖｇは、基準酵素と比較した場合の、４つのすべての酵素濃度（０．１２５、０．２５、０．５、１．０ｍｇ  ｅｐ／ｌ）の平均相対的パフォーマンスを表す。
ＲＰａｖｇ＝ａｖｇ（ＲＰ（０．１２５），ＲＰ（０．２５），ＲＰ（０．５），ＲＰ（１．０））
【０１２０】
変酵素変異体は、基準酵素よりも優れた性能を発揮する場合、洗浄性能の向上をもたらすと考えられる。本発明の文脈においては、基準酵素は置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のリパーゼである。
【０１２１】
（実施例３）：リスク係数を割り出すためのＧＣ（ガスクロマトグラフ）
以下の方法を用いて、固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフ（ＳＰＭＥ−ＧＣ）によって、リパーゼによって洗浄した見本から放出される酪酸を測定する。リパーゼを１ｍｇ／Ｌ含んでいる表３の規定溶液中で洗浄した４つの布地断片（直径５ｍｍ）をガスクロマトグラフ（ＧＣ）用バイアル瓶に移す。スタビルワックス（Stabilwax）−ＤＡ  ｗ／インテグラ−ガード（Integra-Guard）というカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）とカーボクセン（Carboxen）ＰＤＭＳ  ＳＰＭＥというファイバーが備わっているバリアン（Varian）３８００ＧＣ上で前記サンプルを分析する。各サンプルは予め、１０分間、４０℃でインキュベートしてから、ＳＰＭＥファイバーによって、布地断片の上のヘッドスペース内で２０分サンプリングした。続いて、このサンプルをカラムに注入した（注入温度＝２５０℃）。カラム流量は２ｍｌ  ヘリウム／分にした。カラムのオーブン温度勾配は、０分＝４０℃、２分＝４０℃、２２分＝２４０℃、３２分＝２４０℃にした。酪酸をＦＩＤ検出によって検出し、酪酸の検量線に基づき酪酸の量を算出した。
【０１２２】
リパーゼ変異体のリスク性能悪臭Ｒは、リパーゼ変異体によって洗浄した見本から放出される酪酸の量と、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のリパーゼ（基準酵素）で洗浄した見本から放出される酪酸の量（いずれの値も、リパーゼなしで洗浄した見本から放出される酪酸の量に対して補正した後のもの）の比率である。変異体のリスク（Ｒ）は、以下の式に従って計算する。
悪臭＝１ｍｇの酵素タンパク質で発現した酪酸（μｇ単位で測定）／Ｌ（空試験値に対して補正済み）
α試験酵素＝悪臭試験酵素−空試験値
α基準酵素＝悪臭基準酵素−空試験値
Ｒ＝α試験酵素／α基準酵素
Ｒ係数が１未満である場合、変異体では基準酵素よりも悪臭が少ないと考えられる。
【０１２３】
（実施例４）：２８０ｎｍの吸光度に対する活性（ＬＵ）
２８０ｎｍの吸光度に対するリパーゼの活性は、以下の測定ＬＵ／Ａ２８０によって割り出す。
【０１２４】
リパーゼの活性は、上記のリパーゼ活性の項に記載されているとおりに割り出す。２８０ｎｍにおけるリパーゼの吸光度（Ａ２８０）を測定し、ＬＵ／Ａ２８０の比率を計算する。相対ＬＵ／Ａ２８０は、変異体のＬＵ／Ａ２８０を基準酵素のＬＵ／Ａ２８０で除した値として計算する。本発明の文脈においては、基準酵素は置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のリパーゼである。
【０１２５】
（実施例５）：ＢＲ（ベネフィット・リスク）
悪臭リスクの低下との比較における性能を表すベネフィット・リスク係数は、つまりＢＲ＝ＲＰａｖｇ／Ｒとして定義する。
【０１２６】
ＢＲ係数が１を超える場合、変異体は、洗浄性能の向上と悪臭の減少を呈すると考えられる。
【０１２７】
上記の方法を適用すると、以下の結果を得られる。
【表４】
2009523902.tif 000014
【０１２８】
基準リパーゼと表４の７および８の変異体は、ＷＯ２０００／０６００６３号に記載されている。
【０１２９】
（実施例６）
ＢＲ（ベネフィット・リスク）
ベネフィット・リスクは、表５に列挙されている変異体について測定した。ベネフィット・リスク係数は、実施例５に記載されているものと同じ方法で測定し、列挙されているすべての変異体で、ベネフィット・リスク係数が１を超えることが分かった。
【表５−１】
2009523902.tif 000015
【表５−２】
2009523902.tif 000016
【表５−３】
2009523902.tif 000017
【０１３０】
基準リパーゼはＷＯ２０００／０６００６３号に記載されている。
【０１３１】
組成物の実施例
別段の指示がない限り、材料はアルドリッチ（Aldrich）（米国５３２０１ウィスコンシン州ミルウォーキー私書箱２０６０）から入手することができる。
【０１３２】
（実施例１〜６）
手洗い用またはトップローディング式洗濯機用に設計されている顆粒状洗濯洗剤組成物    
【表６】
2009523902.tif 000018
上記の組成物のいずれかを用いて、水中濃度６００〜１００００ｐｐｍ（典型的な中央条件は２５００ｐｐｍである）、２５℃、および水：布の比率２５：１によって、布地を洗濯する。
【０１３３】
（実施例７〜１０）
フロントローディング式自動洗濯機用に設計されている顆粒状洗濯洗剤組成物
【表７】
2009523902.tif 000019
【０１３４】
上記の組成物のいずれかを用いて、水中濃度１０，０００ｐｐｍ、２０〜９０℃、水：布の比率５：１で布地を洗濯する。典型的なｐＨは約１０である。
【０１３５】
（実施例１１〜１６）
【表８】
2009523902.tif 000020
【０１３６】
組成物の実施例１〜１６の原料および注記
平均脂肪族炭素鎖長がＣ１１〜Ｃ１２である直鎖アルキルベンゼンスルホネートは、ステパン（Stepan）（米国イリノイ州ノースフィールド）から供給されている。
【０１３７】
Ｃ１２〜１４ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリドは、クラリアント（Clariant GmbH）（ドイツ、シュルツバッハ）から供給されている。
【０１３８】
ＡＥ３Ｓは、ステパン（Stepan）（米国イリノイ州ノースフィールド）から供給されているＣ１２〜１５アルキルエトキシ（３）サルフェートである。
【０１３９】
ＡＥ７は、ハンツマン（Huntsman）（米国ユタ州ソルトレークシティ）から供給されている、平均エトキシル化度が７のＣ１２〜１５アルコールエトキシレートである。
【０１４０】
ナトリウムトリポリホスフェートは、ローディア（Rhodia）（フランス、パリ）から供給されている。
【０１４１】
ゼオライトＡは、インダストリアルゼオライト（ＵＫ）（Industrial Zeolite （UK） Ltd）（英国エセックス州グレイズ）から供給されたものである。
【０１４２】
１．６Ｒシリケートは、コマ（Koma）（チェコ共和国ネステミカ（Nestemica））から供給されたものである。
【０１４３】
ナトリウムカーボネートは、ソルベー（Solvay）（米国テキサス州ヒューストン）から供給されたものである。
【０１４４】
ポリアクリレートＭＷ４５００は、ＢＡＳＦ（ドイツ、ルートウィヒスハーフェン）から供給されている。
【０１４５】
カルボキシメチルセルロースは、ＣＰＫｅｌｃｏ（オランダ、アルンヘム）から供給されているフィンフィックス（Finnfix）（登録商標）ＢＤＡである。
【０１４６】
サビナーゼ（Savinase）（登録商標）、ナタラーゼ（Natalase）（登録商標）、ターマミル（Termamyl）（登録商標）、マンナウェイ（Mannaway）（登録商標）は、ノボザイムズ（Novozymes）（デンマーク、バグスバード（Bagsvaerd））から供給されている。
【０１４７】
リパーゼ変異体１〜５は、実施例５の表４に記載されているもの、およびこれらの混合物である。
【０１４８】
蛍光増白剤１はチノパル（Tinopal）（登録商標）ＡＭＳ、蛍光増白剤２はチノパル（Tinopal）（登録商標）ＣＢＳ−Ｘであり、これらはスルホン化亜鉛フタロシアニンと共にチバスペシャルティケミカルズ（Ciba Specialty Chemicals）（スイス、バーゼル）から供給されている。
【０１４９】
ジエチレントリアミンペンタ酢酸は、ダウケミカル（Dow Chemical）（米国ミシガン州ミッドランド）から供給されたものである。
【０１５０】
ナトリウムペルカーボネートは、ソルベー（Solvay）（米国テキサス州ヒューストン）から供給されている。
【０１５１】
ナトリウムペルボレートは、デガッサ（Degussa）（ドイツ、ハーナウ）から供給されたものである。
【０１５２】
ＮＯＢＳは、イーストマン（Eastman）（米国アーカンソー州ベーツビル）から供給されているナトリウムノナノイルオキシベンゼンスルホネートである。
【０１５３】
ＴＡＥＤは、クラリアント（Clariant GmbH）（ドイツ、シュルツバッハ）からパーアクティブ（Peractive）（登録商標）のブランド名で供給されているテトラアセチルエチレンジアミンである。
【０１５４】
汚れ放出剤は、ローディア（Rhodia）（フランス、パリ）から供給されているリペロテックス（Repel-o-tex）（登録商標）ＰＦである。
【０１５５】
アクリル酸／マレイン酸コポリマーは、分子量が７０，０００、アクリレート：マリエートの比率が７０：３０であり、ＢＡＳＦ（ドイツ、ルートウィヒスハーフェン）から供給されている。
【０１５６】
プロテアーゼは、ジェネンコアインターナショナル（Genencor International）（米国カリフォルニア州パロアルト）から供給されているＦＮ３であった。
【０１５７】
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二コハク酸、（Ｓ，Ｓ）異性体（ＥＤＤＳ）のＮａ塩は、オクテル（Octel）（英国エルズミアポート）から供給されたものである。
【０１５８】
ヒドロキシエタンジホスホネート（ＨＥＤＰ）は、ダウケミカル（Dow Chemical）（米国ミシガン州ミッドランド）から供給されたものである。
【０１５９】
泡抑制剤疑集体は、ダウコーニング（Dow Corning）（米国ミシガン州ミッドランド）から供給されたものである。
【０１６０】
ＨＳＡＳは、米国特許第６，０２０，３０３号および米国特許第６，０６０，４４３号で開示されているような中鎖分枝状アルキルサルフェートである。
【０１６１】
Ｃ１２〜１４ジメチルアミンオキシドは、プロクター＆ギャンブルケミカルズ（Procter & Gamble Chemicals）（米国オハイオ州シンシナティ）から供給されたものである。
【０１６２】
非イオン性物質は、好ましくは平均エトキシル化度が９のＣ１２〜Ｃ１３エトキシレートであるのが好ましい。
【０１６３】
プロテアーゼは、ジェネンコアインターナショナル（Genencor International）（米国カリフォルニア州パロアルト）から供給されたものである。
＊引用数字は１００ｇあたりの酵素量（ｍｇ）
１米国特許第４，５９７，８９８号に記載されているようなもの
２ＢＡＳＦから商標名ルテンシット（LUTENSIT）（登録商標）およびＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０１／０５８７４に記載されているものが利用可能である
†本明細書に記載されているリパーゼ
【０１６４】
本発明の特定の実施形態を例示し記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の様々な変更および修正を実施できることが、当業者には明白であろう。従って、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】リパーゼのアラインメントを示している。
【図１】
2009523902.tif 000021
【配列表】
2009523902000001.xml
【国際調査報告】
2009523902.tif 000041
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