(57)【要約】  サイモシンベータ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のＮ末端フラグメント、Ｔβ４のＣ末端フラグメント、Ｔβ４スルホキシド、ＬＫＫＴＥＴペプチド、ＬＫＫＴＮＴペプチド、アクチン隔離ペプチド、アクチン結合ペプチド、アクチン動員ペプチド、アクチン重合調節ペプチドまたは組織損傷低減活性を有するそれらの保存的変異体の少なくとも１つを含む、組織損傷を低減または予防するポリペプチドを含む組成物の有効量を投与することによって、組織に通じている血管を通る血流の増加を来たした後に生じる組織の損傷を処置または予防する方法。本組成物は、血流の増加を来たす前、来たしている間および／または来たした後に組織に投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織に通じている血管を通る血流の増加を来たした後に生じる前記組織の損傷を処置または予防する方法であって、サイモシンベータ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のＮ末端フラグメント、Ｔβ４のＣ末端フラグメント、Ｔβ４スルホキシド、ＬＫＫＴＥＴペプチド、ＬＫＫＴＮＴペプチド、アクチン隔離ペプチド、アクチン結合ペプチド、アクチン動員ペプチド、アクチン重合調節ペプチドまたは組織損傷を低減もしくは予防する活性を有するそれらの保存的変異体の少なくとも１つを含む、組織損傷を低減または予防するポリペプチドを含む組成物の有効量を投与すること、あるいは、前記組織損傷を低減または予防するポリペプチドの産生を刺激する刺激薬剤を含む組成物であって、前記血流の増加を来たす前、来たしている間または来たした後の少なくとも１つの間に前記組織に投与される組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４のＣ末端変異体、Ｔβ４のアイソフォームまたは酸化型Ｔβ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、冠状動脈組織に直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、組換えまたは合成ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、サイモシンβ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が、サイモシンβ４の産生を刺激する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血流の増加が、アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼまたはヘパリンの少なくとも１つの投与によって来たされる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血流の増加が、アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼまたはヘパリンの少なくとも１つの投与によって来たされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記血流の増加が、動脈ステント、静脈ステント、心臓カテーテル法、頚動脈ステント、大動脈ステント、肺のステント、血管形成術、バイパス手術または神経外科術の少なくとも１つによって来たされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記血流の増加が、動脈ステント、静脈ステント、心臓カテーテル法、頚動脈ステント、大動脈ステント、肺のステント、血管形成術、バイパス手術または神経外科術の少なくとも１つによって来たされる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織損傷を予防または低減するペプチドが、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、Ｔβ１５、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（Ｄ８Ｐ）プロファイリング、コフィリン、アドセベルチン、プロポミオシン、フィンシリン、デパクチン、ＤｎアーゼＩ、ビリン、フラグミン、セバリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニンまたはアキュメンチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の組織損傷を予防もしくは低減するポリペプチドまたは組織損傷を低減もしくは予防する活性を有する刺激剤を含む薬学的組み合わせであって、その組み合わせは、血流増加に有効な量の血流増加剤をさらに含み、前記ポリペプチドおよび前記薬剤は、別々に投与されてもよいし、共に投与されてもよい、薬学的組み合わせ。
【請求項１４】
前記組織損傷が、神経性の損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記損傷が、外傷、疾患、突発疾患（ｉｄｉｏｐａｔｈ）または脳卒中に起因するものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記損傷が、虚血に起因するものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記損傷が、脳卒中に起因するものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織における血流を増加させる血流増加剤と組み合わせた前記ポリペプチドの投与をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記血流増加剤が、アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼまたはヘパリンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血流増加剤が、ｔＰＡまたはストレプトキナーゼを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、血流を増加させる前記血流増加剤の前、最中または後に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの約０．１〜５０マイクログラムの範囲内の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの約１〜３０マイクログラムの範囲内の用量で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、サイモシンベータ４である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．関連出願の相互参照
本願は、２００６年１月１７日出願の米国仮出願番号６０／７５９，０５１の利益を主張するものである。
【０００２】
２．発明の分野
本発明は、血流の増加によって引き起こされる組織損傷の処置または予防の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
３．背景技術の説明
動脈および他の血管を通る血流の障害を取り除くか、または血流を増加させるために利用される多くの薬物、デバイスおよび医学的手技が存在する。しかしながら、血管の障害を取り除くことによって、時には、酸素、フリーラジカルおよび他の化学物質を含む大量の血液が急速に組織部位に流入し、組織に損傷をもたらす可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当該分野において、血流の増加によって引き起こされる組織損傷を処置または予防するための方法および組成物が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明によれば、組織に通じている血管内の血流の増加を来たした後に生じる前記組織の損傷を処置または予防する方法は、サイモシンベータ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のＮ末端フラグメント、Ｔβ４のＣ末端フラグメント、Ｔβ４スルホキシド、ＬＫＫＴＥＴペプチド、ＬＫＫＴＮＴペプチド、アクチン隔離ペプチド、アクチン結合ペプチド、アクチン動員ペプチド、アクチン重合調節ペプチドまたは組織損傷低減活性を有するそれらの保存的変異体の少なくとも１つを含む、組織損傷を低減または予防するポリペプチドを含む組成物の有効量を投与することを含む。この組成物は、前記血流の増加を来たす前、来たしている間、または来たした後の少なくとも１つの間に前記組織に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、サイモシンβ４（Ｔβ４）などのペプチドおよび他のペプチド、例えば、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴを含み得るアクチン隔離ペプチドまたはアクチン隔離ペプチドフラグメントあるいはそれらの保存的変異体（以下、「組織損傷を予防または低減するペプチド」とも呼ぶ）が、心臓、神経または他の組織の損傷および血流の増加に関連する他の変化の治癒または予防を促進するという発見に基づく。そのような組織損傷予防ペプチドは、サイモシンベータ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のＮ末端フラグメント、Ｔβ４のＣ末端フラグメント、Ｔβ４スルホキシド、ＬＫＫＴＥＴペプチド、ＬＫＫＴＮＴペプチド、アクチン隔離ペプチド、アクチン結合ペプチド、アクチン動員ペプチド、アクチン重合調節ペプチドまたはそれらの保存的変異体の少なくとも１つを含む。Ｎ末端もしくはＣ末端フラグメントまたは変異体（ＫＬＫＫＴＥＴおよびＬＫＫＴＥＴＱを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい）が含まれる。Ｔβ４
は、げっ歯類モデルにおいて血管新生における因子であると示唆されている。しかしながら、今までに、そのような特性が、血流の増加によって引き起こされる組織損傷の処置に有用であり得るという示唆は知られていない。いかなる特定の理論にも拘束するわけではないが、これらのペプチドは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（非鋳型指向性ＤＮＡポリメラーゼ）を誘導する能力、１つ以上の炎症性サイトカインまたはケモカインのレベルを低下および調節する能力、ならびに、細胞に対して走化性因子および／または血管新生因子として作用して、血流の増加によって引き起こされる組織損傷を治癒および予防する能力を有することによって、修復、治癒および予防を促進する能力を有し得る。
【０００７】
本発明は、動脈および他の血管を通る血流の障害を取り除くか、または血流を増加させるために利用される薬剤（例えば、薬物、デバイスまたは手技）の使用と組み合わせることによって特に有用である。組織と通じている血管を通る血流の増加を来たした後に生じる組織の損傷を処置または予防するために、組織損傷を予防または低減するペプチドを、血流の増加を来たす前、来たしている間、および／または来たした後に投与することができる。
【０００８】
血管を通る血流の増加を起こすために利用され得る薬剤としては、アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼおよび／またはヘパリンが挙げられるが、これらに限定されない。それらと組み合わせて血流が増加する前、増加している間および／または増加した後に、組織損傷を予防または低減するペプチドを投与することができる。血管を通る血流の増加に有効なそのような薬剤の量は、０．００１〜１，０００ｍｇの範囲内に入っている。本発明はまた、そのような血流増加剤および組織損傷を予防または低減するペプチドを含む組成物にも適用可能である。
【０００９】
血管を通る血流の増加を起こすために利用され得るデバイスおよび手技としては、動脈ステント、静脈ステント、心臓カテーテル法、頚動脈ステント、大動脈ステント、肺のステント、血管形成術、バイパス手術および／または神経外科術が挙げられるが、これらに限定されない。それらと組み合わせて血流が増加する前、増加している間および／または増加した後に、組織損傷を予防または低減するペプチドを投与することができる。
【００１０】
本発明が適用可能であり得る適応症としては、外傷誘発性虚血（神経または心臓）、疾患誘発性虚血、特発性虚血および／または脳卒中が挙げられるが、これらに限定されない。それらと組み合わせて血流が増加する前、増加している間および／または増加した後に、組織損傷を予防または低減するペプチドを投与することができる。
【００１１】
本明細書中に記載する組織損傷を予防または低減するペプチドは、代謝性およびシグナル伝達性の酵素（例えば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐ１３−Ｋ）／Ａｋｔ（タンパク質キナーゼβ））の経路をアップレギュレートすることによって虚血性、感染性、病理学的、毒性または外傷性の損傷後の脳ならびに他の神経血管細胞および組織のアポトーシス死を予防および／または制限することができる。Ｐ１３−Ｋ／Ａｋｔならびに下流のリン酸化ＢａｄおよびプロリンリッチＡｋｔ生存キナーゼをアップレギュレートすることにより、低酸素傷害の間に神経細胞が保護される。さらに、本明細書中に記載する組織損傷を予防または低減するペプチドは、ＩＬ−１８などの炎症性サイトカインおよびＩＬ−８などのケモカインならびにカスパーゼ２、３、８および９などの酵素をダウンレギュレートする能力を有しているために、神経細胞を保護し、神経組織の治癒を促進する。
【００１２】
本明細書中に記載する血栓溶解剤の投与の直前、投与中および／または投与の直後に本
明細書中に記載する組織損傷を予防または低減するペプチドが投与されるとき、それらのペプチドは、神経組織が、Ｐ１３−Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の調節、神経のアポトーシスの減少、ならびに、炎症性ケモカイン、サイトカインおよびカスパーゼの活性の低下を特徴とする冬眠の状態を起こすことを神経組織に誘導することによって低酸素傷害に起因する神経の損傷を制限する。
【００１３】
本明細書中に記載する組織損傷を予防または低減するペプチドは、グルタミン酸誘導性神経毒性を防ぐことによって虚血性または外傷性の損傷後の脳および脊髄における神経毒性を防ぐ。損傷した脳および神経組織からの興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の制御されない放出は、いくつかの炎症性反応、機械的ストレスによって変更された栄養性シグナルならびに損傷を受けた神経細胞および神経組織の死をもたらす、細胞におけるミトコンドリア機能不全およびエネルギーメカニズムの主要なメディエータである。
【００１４】
上述したように、組織と通じている血管を通る血流の増加を来たす前、来たしている間、および／または来たした後に、組織損傷を予防もしくは低減するペプチドが、投与され得る。送達経路としては、非経口、経口、経鼻、肺、心臓内、静脈内、経皮的および／またはリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
サイモシンβ４は、当初は、インビトロにおいて内皮細胞の遊走および分化の間にアップレギュレートされるタンパク質として同定された。サイモシンβ４は、初め、胸腺から単離され、種々の組織において同定される４３アミノ酸、４．９ｋＤａの遍在性ポリペプチドである。このタンパク質には、内皮細胞の分化および遊走、Ｔ細胞の分化、アクチンの隔離ならびに血管新生における役割をはじめとしたいくつかの役割があるとみなされている。
【００１６】
１つの実施形態によれば、本発明は、血流の増加によって引き起こされる組織損傷に関連する損傷および炎症の治癒および予防を促進するための処置の方法であり、この方法は、そのような処置を必要とする被験体に、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴを含む組織損傷低減ペプチドまたは組織損傷低減活性を有するそれらの保存的変異体、好ましくはサイモシンβ４、サイモシンβ４のアイソフォームもしくはサイモシンＴβ４のアンタゴニストを含む組成物の有効量を投与することを含む。本発明はまた、酸化型Ｔβ４も利用し得る。
【００１７】
本発明に従って使用され得る組成物としては、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４アイソフォーム、酸化型Ｔβ４、アクチン結合ドメインを有するポリペプチドまたは他の任意のアクチン隔離タンパク質もしくはアクチン結束タンパク質、あるいは、ペプチドフラグメント（アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくはＬＫＫＴＮＴまたは組織損傷低減活性を有するそれらの保存的変異体を含んでいても含んでいなくてもよいか、またはそれらから本質的になるものであってもそうでなくてもよい）が挙げられる。本明細書中に参照により組み込まれる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２は、本発明において有用であり得るＴβ４のアイソフォームならびに本発明とともに利用され得るアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴおよびそれらの保存的変異体を開示している。本明細書中に参照により組み込まれる国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／００８３３（ＷＯ９９／４９８８３）は、本発明に従って利用され得る酸化型サイモシンβ４を開示している。以下、本発明を主にＴβ４およびＴβ４アイソフォームに関して説明するが、以下の説明は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、ＬＫＫＴＥＴＱまたはＫＬＫＫＴＥＴペプチドおよびＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴまたはＬＫＫＴＥＴＱまたはＫＬＫＫＴＥＴを含んでいるか、またはそれらから本質的になるフラグメント、組織損傷低減活性を有するそれらの保存的変異体、ならびに酸化型サイモシンβ４および本明細書中に記載する他の組織損傷を予防もしくは低減するペプチドに等しく適用可能であると意図されていることが理解されるべきである。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、Ｔβ４もしくはＴβ４アイソフォームまたは本明細書中に記載する他の組織損傷を予防もしくは低減するペプチドを含む組織損傷低減組成物の有効量を組織部位と接触させることによって、被験体における炎症および損傷を治癒および予防するための方法を提供する。この接触は、直接的であってもよいし、全身的であってもよい。損傷した部位の接触の例としては、組織損傷を予防もしくは低減するペプチドを単独で含む組成物、あるいは、浸透を増強するか、または、組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの処置されるべき領域への放出を遅延もしくは減速させる少なくとも１つの薬剤とそのペプチドとを組み合わせて含む組成物と、その部位との接触が挙げられる。この投与は、直接的であってもよいし、全身的であってもよい。投与の例としては、例えば、本明細書中に記載する組織損傷を予防または低減するペプチドを含む溶液、ローション、膏薬、ゲルクリーム、ペーストスプレー、懸濁液、分散液、ヒドロゲル、軟膏、泡沫、オイルまたは固体による、直接適用、注射または点滴が挙げられる。投与としては、例えば、組織損傷を予防または低減するペプチドなどを含む組成物の静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下への注射または吸入、経皮投与または経口投与が挙げられ得る。被験体は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【００１９】
組織損傷を予防または低減するペプチドは、任意の適切な組織損傷を低減または予防する量で投与され得る。例えば、組織損傷を予防もしくは低減するペプチドは、約０．０００１〜１，０００，０００マイクログラム、より好ましくは約０．０１〜５，０００マイクログラム、さらにより好ましくは約０．１〜５０マイクログラムの範囲内の用量、最も好ましくは約１〜３０マイクログラムの範囲内の量で投与され得る。
【００２０】
本発明の組成物は、１日に１回の投与または複数回の投与（例えば、投与日１日につき２、３、４回またはそれ以上の適用の投与）で毎日、１日おきなどで投与され得る。
【００２１】
Ｔβ４アイソフォームが同定され、Ｔβ４の既知アミノ酸配列に対して約７０％または約７５％または約８０％またはそれ以上相同性を有している。そのようなアイソフォームとしては、例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５が挙げられる。Ｔβ４と同様に、Ｔβ１０およびＴβ１５アイソフォームは、アクチンを隔離することが示されている。Ｔβ４、Ｔβ１０およびＴβ１５ならびにこれらの他のアイソフォームは、アクチンの隔離または結合の媒介に関与しているとみられるアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴを共有している。いかなる特定の理論にも拘束するわけではないが、Ｔβ４アイソフォームの活性は、一つにはアクチンの重合を制御する能力に起因し得る。β−サイモシンは、遊離Ｇ−アクチンを隔離することによってＦ−アクチンを脱重合するとみられる。従って、Ｔβ４がアクチン重合を調節する能力は、ＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴ配列を介してアクチンに結合するかまたはアクチンを隔離する能力に全面的または部分的に起因し得る。よって、Ｔβ４と同様に、アミノ酸配列のＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴを有するＴβ４アイソフォームをはじめとした、アクチンと結合し得るか、またはアクチンを隔離し得るか、またはアクチン重合を調節し得る他の組織損傷を予防または低減するタンパク質も、単独で有効であるか、または本明細書中に示すようにＴβ４と組み合わせて有効である可能性がある。
【００２２】
従って、既知のＴβ４アイソフォーム（例えば、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５）ならびにまだ同定されていないＴβ４アイソフォームが、本発明の方法において有用であると明確に考えられる。そのようなＴβ４アイソフォームは、被験体において実施される方法をはじめとした本発明の方法において有用である。ゆえに、本発明は、Ｔβ４ならびにＴβ４アイソフォームのＴβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５ならびに薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００２３】
さらに、適切な隔離アッセイ、結合アッセイ、動員アッセイまたは重合アッセイにおいて証明されるか、またはアクチン結合を媒介するアミノ酸配列（例えば、ＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴ）が存在することによって同定されるような、アクチン隔離能力もしくはアクチン結合能力を有するか、またはアクチンを動員することができるかもしくはアクチン重合を調節することができる他のタンパク質も、本発明の方法において同様に使用され得る。そのようなタンパク質としては、例えば、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、アドセベルチン、プロポミオシン（ｐｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ）、フィンシリン（ｆｉｎｃｉｌｉｎ）、デパクチン、ＤｎアーゼＩ、ビリン（ｖｉｌｉｎ）、フラグミン、セバリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニンおよびアキュメンチンが挙げられる。そのような方法としては、被験体において実施される方法が挙げられ、本発明は、本明細書中に示されるようなゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎアーゼＩ、ビリン、フラグミン、セバリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニンおよびアキュメンチンを含む薬学的組成物をさらに提供する。従って、本発明は、アミノ酸配列のＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＮＴ（その１次アミノ酸配列内であり得る）およびそれらの保存的変異体を含み得る組織損傷低減ポリペプチドの使用を含む。
【００２４】
本明細書中で使用するとき、用語「保存的変異体」またはその文法上の変化形は、生物学的に類似する別の残基によるアミノ酸残基の置換のことを示す。保存的変異の例としては、疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）の別の疎水性残基との置換、極性残基の別の極性残基との置換（例えば、リシンへのアルギニンの置換、アスパラギン酸へのグルタミン酸の置換またはアスパラギンへのグルタミンの置換）などが挙げられる。
【００２５】
Ｔβ４は、多くの組織および細胞型に局在しているので、Ｔβ４の産生を刺激する薬剤または別の組織損傷を予防もしくは低減するペプチドは、組織および／または細胞からの組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの産生に影響を及ぼす組成物に加えられ得るか、またはその組成物を含み得る。そのような薬剤としては、成長因子のファミリーのメンバー（例えば、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、サイモシンα１（Ｔα１）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））が挙げられる。より好ましくは、上記薬剤は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーである。本発明の組成物は、細胞外マトリックス沈着、細胞遊走および血管新生を介した結合組織の成長をもたらすことによって、血流の増加によって引き起こされる組織損傷を低減し得る。
【００２６】
１つの実施形態によれば、被験体は、被験体において、本明細書中に定義されるような組織損傷を予防または低減するペプチドの産生を刺激する薬剤で処置される。
【００２７】
さらに、血流の増加事象によって引き起こされる組織損傷の治癒を助けるか、または刺激する薬剤が、組織損傷を予防または低減するペプチドとともに組成物に加えられ得る。そのような薬剤としては、血管形成剤、成長因子、細胞の分化を指示する薬剤が挙げられる。例えば、限定するわけではないが、単独または組み合わせでの組織損傷を予防または低減するペプチドを、以下の１つ以上の任意の薬剤：ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＬ−１、プロサイモシンαおよびサイモシンα１の有効量と組み合わせて加えることができる。
【００２８】
本発明はまた、薬学的に許容可能な担体中に、組織損傷を予防もしくは低減するペプチ
ドの治療有効量を含む薬学的組成物を含む。そのような担体としては、とりわけ、本明細書中に列挙するものが挙げられる。
【００２９】
血流の増加によって引き起こされる組織損傷に関連する炎症、損傷および変性を治癒または予防する実際の用量、処方または組成物は、被験体のサイズおよび健康状態をはじめとした多くの因子に依存し得る。しかしながら、当業者は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（前出）およびその明細書中に引用されている参考文献に開示されているような臨床上の用量を決定するための方法および技術を説明している教示を使用して適切な使用用量を決定し得る。
【００３０】
適切な処方は、組織損傷を予防または低減するペプチドを約０．００１〜５０重量％の範囲内、より好ましくは約０．０１〜０．１重量％の範囲内、最も好ましくは約０．０５重量％の濃度で含む。
【００３１】
本明細書中に記載する治療的なアプローチは、被験体への任意の従来の投与技術を含めて、本発明の組織損傷を予防または低減する化合物を含む試薬または組成物の様々な投与経路または送達経路を伴う。本発明の組織損傷を予防または低減する化合物を使用するかまたはそれらを含む方法および組成物は、薬学的に許容可能な無毒性の賦形剤または担体と混合することによって薬学的組成物に製剤化され得る。
【００３２】
本発明は、組織損傷を予防もしくは低減するペプチドまたはその機能的フラグメントと相互作用する抗体の使用を含む。様々なエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体ならびに異なるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（前出）に開示されているような当業者に周知の方法によって、タンパク質のフラグメントを含む抗原から作製される。本発明において使用するとき、抗体という用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことが意図される。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本発明は、組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの遺伝子の発現を調節する薬剤の有効量を投与することによって、被験体を処置する方法を提供する。用語「調節する」とは、組織損傷を予防または低減するペプチドが過剰発現されているときの組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの発現の阻害または抑制、および、組織損傷を予防もしくは低減するペプチドが過小発現されているときの発現の誘導のことをいう。用語「有効量」とは、有効な処置をもたらす組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの遺伝子の発現の調節に有効な調節剤の量のことを意味する。Ｔβ４または組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの遺伝子の発現を調節する薬剤は、例えば、ポリヌクレオチドであり得る。このポリヌクレオチドは、アンチセンスであってもよいし、トリプレックス薬剤（ｔｒｉｐｌｅｘ  ａｇｅｎｔ）であってもよいし、リボザイムであってもよい。例えば、Ｔβ４の構造遺伝子領域またはプロモーター領域に特異的なアンチセンスが利用され得る。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、Ｔβ４または組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの活性を調節する化合物を利用するための方法を提供する。Ｔβ４または組織損傷を予防もしくは低減するペプチドの活性に作用する化合物（例えば、アンタゴニストおよびアゴニスト）としては、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチド、化合物、亜鉛などの鉱物および生物学的薬剤が挙げられる。
【００３５】
いかなる特定の理論にも拘束するわけではないが、本発明は、１つ以上の炎症性サイトカインまたはケモカインのレベルを低下させ、また、内皮細胞に対する走化性因子として作用するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（非鋳型指向性ＤＮＡポ
リメラーゼ）を誘導することによって、治癒を促進するか、あるいは血流の増加または他の変性的もしくは環境的な因子によって引き起こされる組織損傷を予防することによって、血流の増加によって引き起こされる組織損傷に関連する炎症または損傷の治癒または予防を促進し得る。
【実施例】
【００３６】
実施例１
合成Ｔβ４およびＴβ４に対する抗体は、ＲｅｇｅｎｅＲｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（３  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｅｔｒｏ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｕｉｔｅ  ７００，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８１４）によって提供されたものであり、それを、心臓内皮細胞の間葉細胞への変換に対する作用を測定するためにコラーゲンゲルアッセイにおいて検定した。心臓弁および他の心臓組織の発生は、上皮間葉系の変換によって形成されること、および、このプロセスにおける欠陥は、発生中および生存している間において、重大な心血管の奇形および損傷を引き起こし得ることが十分に証明されている。生理学的濃度のＴβ４は、コラーゲンゲルアッセイにおいて、心内膜細胞の間葉細胞への変換を著しく増強する。さらに、Ｔβ４に対する抗体は、この変換を阻害し、阻止した。房室心内膜の侵襲性間葉への変換は、正常な心臓組織の形成および維持ならびに心臓弁の形成の１態様である。
【００３７】
実施例２
心臓の発生に関与する制御経路は、心臓の修復を助ける心筋細胞の再プログラムにおいて有用性を有し得る。心臓の形態形成の間に発現する遺伝子の研究によって、４３アミノ酸ペプチドのサイモシンβ４が、発生中の心臓において発現することが見出された。サイモシンβ４は、数多くの機能を有し、最も顕著な機能は、Ｇアクチンモノマーの隔離、ならびに、それに続く細胞の運動性、器官形成および細胞の他の生物学的事象に必要なアクチン細胞骨格形成に対する作用に関与する。近年のドメイン解析により、β４−サイモシンは、アクチンに対するそれらのカルボキシ末端の親和性に基づいてアクチンの構築に作用し得ることが示唆されている。サイモシンβ４は、細胞の運動性に加えてＲｈｏ依存性の遺伝子発現または核のアクチンによって制御されるクロマチンリモデリング事象に影響を及ぼすことによって、転写事象に作用し得る。
【００３８】
現在、サイモシンβ４が心筋細胞および内皮細胞の遊走を刺激し得、心筋細胞の生存を促進し得ることが示されている。ＬＩＭドメインタンパク質ＰＩＮＣＨおよびインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）（この両方が、細胞の遊走および生存に必要である）は、生存キナーゼＡｋｔ／ＰＫＢのリン酸化をもたらすサイモシンβ４と複合体を形成した。Ａｋｔリン酸化の阻害により、心臓細胞に対するサイモシンβ４の作用が逆転した。冠状動脈結紮後にサイモシンβ４で成体マウスを処置することにより、心臓でのＡｋｔのリン酸化が増加し、２４時間以内の早期の筋細胞の生存が増大し、心機能が改善した。これらの結果から、心臓発生の間に発現する内因性タンパク質が、再配置されて、急性の冠状動脈事象の発生において心筋層が保護され得ることが示唆される。
【００３９】
結果
発生中のサイモシンβ４の発現
発生中の脳でのサイモシンβ４の発現は、詳細にではないが、心臓脈管系における発現と同様に以前に報告されていた。胎生（Ｅ）１０．５日のマウス胚のホールマウントＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションにより、左心室、右心室の外側の弯曲部および心臓流出管におけるサイモシンβ４の発現が明らかになった。放射性のインサイチュハイブリダイゼーションから、サイモシンβ４転写物が、心内膜床として知られる心臓弁前駆体の領域に豊富に存在していることが示唆された。この領域の細胞は、間葉系変換を経て、心内膜から遊走し、心筋層と心内膜を分断している細胞外マトリックスの隆起を浸潤する
内皮細胞由来である。心内膜細胞に加えて、一部の心筋細胞は、遊走してその床領域を構成し、このプロセスは、心室の中隔形成および再モデリングに必要である。免疫組織化学を使用して、その床におけるサイモシンβ４を発現している細胞もまた、心筋アクチンを発現していることが見出されたことから、サイモシンβ４が、心内膜床を浸潤する遊走性の心筋細胞に存在していることが示唆された。最終的に、サイモシンβ４の転写物およびタンパク質もまた、Ｅ９．５〜Ｅ１１．５に心室中隔、および、細胞が成熟するにつれて小柱領域に移動する、緻密層として知られる心筋層の分化が少なく増殖性の高い領域において発現する。腹側の心臓の領域から遊走する流出路心筋層（Ｏｕｔｆｌｏｗ  ｔｒａｃｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）もまた、サイモシンβ４タンパク質を高レベルで発現した。
【００４０】
分泌されたサイモシンβ４は心臓細胞の遊走および生存を刺激した
サイモシンβ４は、サイトゾルおよび核に見られ、細胞内で機能するが、本発明者らは、ｍｙｃタグ化サイモシンβ４でトランスフェクトされたＣｏｓ１細胞の条件培地に、ウエスタンブロットによって検出可能なサイモシンβ４が含まれていることを見出し、これは、創傷部の体液（ｗｏｕｎｄ  ｆｌｕｉｄ）中にサイモシンβ４が分泌され、存在するという以前の報告と一致するものである。胚の心臓外植片に細胞外から加えられたファージ粒子の表面上でサイモシンβ４が発現すると、抗ファージ抗体が細胞表面を覆うことが見出され、サイトゾルおよび核において最終的に検出されたのに対し、コントロールのファージは、検出できなかった。ビオチン化サイモシンβ４を用いて、同様の観察結果が得られた。これらのデータから、分泌されたサイモシンβ４は、細胞に内部移行され得ることが示唆されたが、細胞侵入のメカニズムは、未だ判明していない。
【００４１】
心臓細胞の遊走に対する分泌されたサイモシンβ４の効果を検定するために、３次元コラーゲンゲル上で細胞遊走および変換事象をアッセイするために設計された胚の心臓外植片システムを利用した。このアッセイでは、弁形成領域由来の隣接する胚の心筋層および心内膜の外植片を、心内膜がコラーゲンに隣接するようにコラーゲンゲル上に置いた。心筋細胞からのシグナルは、心内膜細胞の遊走を誘導するが、心筋細胞では、かなりの数がコラーゲン上へ正常に遊走しなかった。対照的に、初代外植片にサイモシンβ４を加えると、多数の自発的に拍動している心筋アクチン陽性細胞が、外植片から遊走したことが観察された。コントロール細胞と比べてこれらの細胞において、それぞれＴＵＮＥＬアッセイまたはホスホ−ヒストンＨ３免疫染色に基づいた細胞死または増殖速度の有意差は見られなかった。
【００４２】
出生後の心筋細胞の応答を検定するために、初代ラット新生仔心筋細胞をラミニンコートしたガラス上で培養し、その細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはサイモシンβ４で処理した。胚の心筋細胞と同様に、サイモシンβ４処理された新生仔心筋細胞の遊走距離が、コントロールと比べて有意に増加していたことが見出された（ｐ＜．０５）。心筋細胞遊走に対するサイモシンβ４の効果に加えて、同様の効果が、胚の心臓外植片アッセイにおいて内皮の遊走について観察された。サイモシンβ４にＥ１１．５の外植片を曝露することにより、ＰＢＳへの曝露と比べて多数の内皮細胞が遊走した（ｐ＜．０１）。
【００４３】
新生仔心筋細胞の初代培養物は、典型的には約１〜２週間生存し、いくつかの細胞は、本発明者らの研究室内のラミニンコートされたスライド上で生育したとき、最大２週間、拍動した。驚いたことに、新生仔心筋細胞は、サイモシンβ４に曝露されたとき有意に長く生存し、律動的に収縮する筋細胞が最大２８日間観察された。さらに、拍動の速度は、サイモシンβ４で処理された新生仔心筋細胞において一貫して速かった（９５対５０の拍動数／分，ｐ＜．０２）ことから、細胞−細胞連絡の変化またはより活発な心筋細胞が示唆される。
【００４４】
サイモシンβ４は、ＩＬＫおよびＡｋ／タンパク質キナーゼＢを活性化する
サイモシンβ４が細胞の遊走および生存事象に影響を及ぼし得る潜在的なメカニズムを調べるために、サイモシンβ４と相互作用するタンパク質を探索した。サイモシンβ４のアミノ末端をａｆｆｉゲルビーズに融合することによって、これまで未知であった相互作用タンパク質の同定を可能にするがアクチンとの関連を妨げるカルボキシ末端を露出させた。Ｅ９．５〜１２．５のマウス心臓Ｔ７ファージｃＤＮＡライブラリーを合成し、ファージディスプレイによってスクリーニングし、サイモシンβ４と相互作用するクローンを濃縮し、ＥＬＩＳＡによって確認した。ＬＩＭドメインタンパク質であるＰＩＮＣＨを、このスクリーニングにおいて最も一貫して単離した。ＰＩＮＣＨは、アクチンの非存在下でサイモシンβ４と相互作用した（ＥＬＩＳＡ）。ＰＩＮＣＨおよびインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）は、互いに直接相互作用し、また、限局性接着複合体として知られる細胞−細胞外マトリックス相互作用に関連する大きな複合体の一部としてアクチン細胞骨格と間接的に相互作用する。ＰＩＮＣＨおよびＩＬＫは、一つには、生存および成長のシグナル伝達経路における中心的なキナーゼである、セリン−トレオニンキナーゼＡｋｔ／タンパク質キナーゼＢのリン酸化を促進することによって、細胞の運動性および細胞の生存に必要である。サイモシンβ４をコードするプラスミドを、培養細胞においてＰＩＮＣＨまたはＩＬＫとともに、またはそれら無しでトランスフェクトし、サイモシンβ４が、独立してＰＩＮＣＨまたはＩＬＫと共沈降することが見出された。さらに、ＰＩＮＣＨ、ＩＬＫおよびサイモシンβ４は、一貫して共通複合体として免疫沈降したが、ＩＬＫのサイモシンβ４との相互作用は、ＰＩＮＣＨとの相互作用よりも弱かった。サイモシンβ４とのＰＩＮＣＨ相互作用は、ＰＩＮＣＨの第４および第５のＬＩＭドメインにマッピングされたが、ＩＬＫのアミノ末端のアンキリンドメインは、サイモシンβ４相互作用に対して十分であった。
【００４５】
限局性接着複合体へのＩＬＫの補充が、その活性化にとって重要であるので、ＩＬＫの局在化および発現に対するサイモシンβ４の効果をアッセイした。合成サイモシンβ４タンパク質（１０ｎｇ／１００μｌ）またはサイモシンβ４を発現するプラスミドによる、胚の心臓外植片またはＣ２Ｃ１２筋芽細胞の処理の後の、免疫細胞化学によるＩＬＫの検出は、細胞縁周辺で顕著に増強した。ウエスタン解析により、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＩＬＫタンパク質レベルのわずかな増加が示唆されたことから、免疫蛍光の増強は、一つにはサイモシンβ４による局在性の変更に起因し得ると示唆される。Ｃ２Ｃ１２細胞をサイモシンβ４で処理すると、ＩＬＫが機能的に活性化されることが、Ａｋｔのセリン４７３に対するホスホ特異的抗体を使用して、ＩＬＫの公知の基質であるＡｋｔのリン酸化が増加したことによって証明されたが、Ａｋｔタンパク質全体は、変化しなかったことが見出された。細胞外から投与されたサイモシンβ４およびトランスフェクトされたサイモシンβ４の同様の効果が、このペプチドの内部移行に関する以前の観察結果と一致し、このことは、サイモシンβ４に対するシグナル伝達の細胞外での役割ではなく、細胞内での役割を示唆した。サイモシンβ４が、Ｇ−アクチンモノマーのプールを隔離するので、ＩＬＫ活性化に対する効果が、重合したＦ−アクチンとモノマーのＧ−アクチンとの均衡を制御するサイモシンβ４の役割に依存していることを試験した。Ｆ−アクチン重合を、Ｃ３トランスフェラーゼを用いて阻害し、また、Ｆ−アクチン形成を活性化Ｒｈｏで促進したが、いずれの介入によっても、ＣＯＳ１細胞またはＣ２Ｃ１２細胞をサイモシンβ４で処理した後に観察されるＩＬＫ活性化は影響を受けなかった。
【００４６】
ＩＬＫの活性化が、観察されたサイモシンβ４の効果に必要であるか否かを判定するために、十分に説明されているＩＬＫ阻害剤であるワートマニン（ＩＬＫの上流のキナーゼであるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）を阻害する）を使用した。サイモシンβ４活性についてのアッセイとして心筋細胞の遊走および拍動頻度を用いて、ワートマニン有りまたは無しのサイモシンβ４の存在下で、上記のように胚の心臓外植片を培養した。サイモシンβ４の効果を媒介するＩＬＫと一致して、心筋細胞の遊走および拍動頻度の有意な低下が、ＩＬＫの阻害時に観察された（ｐ＜．０５）。これらの
結果を併せると、細胞内でのサイモシンβ４−ＰＩＮＣＨ−ＩＬＫの生理的に重要な相互作用が支持され、この複合体が、アクチン重合とは比較的無関係にサイモシンβ４の観察された効果の一部を媒介し得ることが示唆された。
【００４７】
サイモシンβ４は、心筋梗塞後の細胞生存を促進し、心機能を改善する
インビトロで培養された心筋細胞の生存および遊走ならびにＡｋｔのリン酸化に対するサイモシンβ４の効果から、サイモシンβ４が、心筋損傷後にインビボにおいて心臓の修復を助け得るか否かを検定した。５８匹の成体のマウスにおいて心筋梗塞を冠状動脈結紮によって創り出し、その半分のマウスについて結紮の直後に、全身、心臓内または全身＋心臓内をサイモシンβ４で処置し、残りの半分のマウスをＰＢＳで処置した。コラーゲン（コントロール）またはサイモシンβ４と混合したコラーゲンによる心臓内注射を行った。２週間後に生存していた４５匹のマウスすべてを、梗塞の２週間後および４週間後に、無作為盲検化の超音波検査で心臓の収縮を複数回測定することによって心機能について調べた。梗塞の４週間後、コントロールマウスの左心室は、２３．２＋／−１．２％という平均収縮率を有し（ｎ＝２２，９５％信頼区間）；対照的に、サイモシンβ４で処置されたマウスは、３７．２＋／−１．８％という平均収縮率を有した（ｎ＝２３，９５％信頼区間；ｐ＜．０００１）。心室機能の第２の基準としての２次元心エコー測定から、サイモシンβ４で処置されたマウスにおける左心室から駆出された血液の平均率（駆出率）が、５７．７＋／−３．２％であり（ｎ＝２３，９５％信頼区間；ｐ＜．０００１）、冠状動脈結紮後のコントロールマウスでは２８．２＋／−２．５％という平均値であった（ｎ＝２２，９５％信頼区間）ことが明らかになった。心臓の収縮率または駆出率のそれぞれ６０％超または１００％の改善から、サイモシンβ４への曝露による有意な改善が示唆されるが、偽手術された動物と比較して、心機能は、未だ低いままである（約６０％の収縮率；約７５％の駆出率）。結局のところ、拡張末期径（ＥＤＤ）および収縮末期径（ＥＳＤ）が、コントロール群よりも有意に高かったことから、サイモシンβ４処置により、機能の改善と一致する、梗塞後の心臓拡張の減少がもたらされることが示唆された。注目すべきことには、サイモシンβ４が、腹腔内注射によって全身に投与されるか、または心臓の梗塞内のみに局所的に投与されたとき、改善の程度は、統計的に差はなかったことから、サイモシンβ４の有益な効果が、心外性の起源からの効果ではなく心臓細胞に対する直接的な効果を介して生じ得ることが示唆される。コントロールの心臓注射は、注射に対する内因性の反応が心臓の回復に寄与する可能性を低くしている同じコラーゲンビヒクルによる注射で行った。
【００４８】
サイモシンβ４が心機能を改善する様式を同定するために、サイモシンβ４有りまたは無しで処置した心臓の複数の連続した組織学的切片を調べた。３つのレベルでの切片のトリクローム染色により、瘢痕の大きさが、サイモシンβ４で処置したすべてのマウスにおいて小さくなっていたが、上記の心エコーのデータと一致して、サイモシンβ４の全身的送達と局所送達に差はなかったことが明らかになった。一部のマウスの左心室の６つのレベルの切片を使用した瘢痕体積の定量化により、サイモシンβ４で処置されたマウスにおける瘢痕体積の有意な減少が証明された（ｐ＜．０５）。本発明者らは、ＰＢＳまたはサイモシンβ４で処置した心臓の冠状動脈結紮の３、６、１１または１４日後に有意な心筋細胞の増殖または死を検出しなかった。しかしながら、本発明者らは、結紮の２４時間後に、筋肉−アクチン抗体（赤色）での二重標識により確認したところ、サイモシンβ４で処置された心筋細胞において、ＴＵＮＥＬアッセイ（緑色）によって細胞死の著しい減少を見出した。筋細胞でもあるＴＵＮＥＬ陽性細胞は、サイモシンβ４群では稀であったが、コントロール心臓においては多く存在した。この観察結果と一致して、梗塞の３日後の左心室の収縮率は、心臓内サイモシンβ４処置では３９．２＋／−２．３４％（ｎ＝４，９５％信頼区間）であったのに対し、コントロールでは２８．８＋／−２．２６％（ｎ＝４，９５％信頼区間）であり（ｐ＜．０２）；駆出率は、それぞれ６４．２＋／−６．６９％または４４．７＋／−８．４％であった（ｐ＜．０２）ことから、サイモシンβ４に
よる早期の保護が示唆される。最終的には、処置した心臓と処置していない心臓との間で、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１またはＡｂｃｇ２陽性心筋細胞の数に差は検出されず、サイモシンβ４で処置された動物における心筋細胞の細胞体積が、成熟筋細胞と同程度であったことから、サイモシンβ４によって誘導される改善が、おそらくは心臓系統への既知の幹細胞の補充によって影響を受けなかったことが示唆される。従って、瘢痕体積の減少およびサイモシンβ４で処置されたマウスの機能の保存は、おそらくは、心筋細胞の生存に対するサイモシンβ４の効果による梗塞後の心筋層の早期の保存が原因とみられる。
【００４９】
サイモシンβ４が、培養細胞においてＩＬＫ活性およびＡｋｔリン酸化をアップレギュレートするので、インビボにおけるこれらのキナーゼに対する効果を検定した。ウエスタンブロットによって、冠状動脈結紮後にサイモシンβ４で処理されたマウスの心臓溶解産物中のＩＬＫタンパク質のレベルが、ＰＢＳ処置マウスと比べて増加していたことが見出された。同様に、サイモシンβ４で処置されたマウスにおいて、Ａｋｔ−５４７３に対するホスホ特異的抗体は、リン酸化Ａｋｔ−５４７３の量の増加を明らかにし、これは、先に記載したＩＬＫに対するサイモシンβ４の効果と一致するものである。Ａｋｔタンパク質全体は、増加しなかった。これらのインビボにおける観察結果は、インビトロにおいて証明された細胞の遊走および生存に対するサイモシンβ４の効果と一致し、ＩＬＫの活性化およびその後のＡｋｔの刺激が、サイモシンβ４によって誘導される心筋細胞の生存の増強を部分的に説明し得ると示唆されるが、単一のメカニズムが、サイモシンβ４の細胞に対する効果の全レパートリーに関与しているわけではないようである。
【００５０】
考察
本明細書中に示した証拠から、心臓の形態形成中の細胞の遊走および生存に関与するタンパク質であるサイモシンβ４が、心臓の梗塞後の心筋細胞の喪失を最小限にするように再配置され得ることが示唆される。ＰＩＮＣＨ、ＩＬＫおよびＡｋｔの役割に鑑みて、上記データは、この複合体が、細胞の運動性、生存および心臓の修復に対するサイモシンβ４の効果の中心的役割を果たしていることに一致する。サイモシンβ４が冠状動脈結紮後の２４時間以内の細胞死を予防する能力によって、マウスにおいて観察された瘢痕体積の減少および心室機能の改善がもたらされると思われる。ＩＬＫのサイモシンβ４活性化は、多くの細胞効果を有する可能性があるが、Ａｋｔの活性化は、サイモシンβ４が細胞生存を増強する最も有力なメカニズムであり得る。このことは、心臓の損傷後に投与されたマウスの骨髄由来の幹細胞において過剰発現されるときの心臓修復に対するＡｋｔの示唆されている効果と一致するが、これは、非細胞の自律的な様式で生じている可能性がある。
【００５１】
細胞死から心臓を保護する際のサイモシンβ４の早期の効果は、「冬眠」によって低酸素傷害を乗り切ることができる筋細胞とよく似ている。心筋層の冬眠の根底にあるメカニズムは不明であるが、代謝およびエネルギー利用の変化が、細胞の生存を増強するとみられる。サイモシンβ４などの誘導薬剤は、内皮細胞遊走および新しい血管形成のための時間を提供し得る心筋層の冬眠と類似の様式で細胞特性を変化させ得る。
【００５２】
本明細書中で、本発明者らは、Ｇ−アクチン隔離ペプチドサイモシンβ４が、胚の心臓において心筋細胞および内皮細胞の遊走を促進し、この特性を出生後の心筋細胞においても保持していることを示す。胚の培養心筋細胞および出生後の培養心筋細胞の生存もまた、サイモシンβ４によって増強された。サイモシンβ４は、ＰＩＮＣＨおよびインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）と機能的複合体を形成し、それによって、心筋細胞に対するサイモシンβ４の効果に必要である生存キナーゼＡｋｔ／ＰＫＢが活性化された。マウスの冠状動脈結紮の後、サイモシンβ４処置によって、心臓におけるＩＬＫおよびＡｋｔの活性のアップレギュレーションがもたらされ、早期の筋細胞の生存が増強され、心機能が改善された。これらの知見は、サイモシンβ４が、心筋細胞の遊走、生存および修復を促進
し、急性の心筋損傷が発生したときの新規治療標的であることを示唆している。
【００５３】
方法
ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション
密接に関連したサイモシンβ１０の転写物との相同性を共有していないマウスサイモシンβ４  ｃＤＮＡの３’ＵＴＲ領域から合成した、ジゴキシゲニン標識またはＳ標識したアンチセンスリボプローブを用いて、Ｅ９．５〜１２．５のマウス胚のホールマウントまたは切片ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを行った。
【００５４】
免疫組織化学
胚または成体の心臓組織をパラフィンに包埋し、切片を免疫組織化学に使用した。胚の心臓切片を、サイモシンβ１０を認識しない抗サイモシンβ４とともにインキュベートした。成体の心臓を、心臓の基部から尖に向かって１０の等価なレベルの切片にした。一連の切片を、トリクローム切片に使用し、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＃Ｓ７１１１）用に筋節のａ−アクチニン、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ａｂｃｇ２およびＢｒｄＵ抗体との反応に使用した。
【００５５】
コラーゲンゲル遊走アッセイ
Ｅ１１．５野生型マウス胚から流出路を切開し、先に記載したようにコラーゲンマトリックス上に置いた。接着の１０時間後に、外植片を、ＰＢＳ中の３０ｎｇ／３００μｌサイモシンβ４、ＰＢＳ単独またはサイモシンβ４と１００ｎＭのワートマニン中でインキュベートした。３〜９日間、３７℃、５％ＣＯ２で培養を行い、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドにて、室温で１０分間固定した。内皮の遊走に対する各条件下では少なくとも３つの別個の外植片を用い、心筋の遊走については８つの別個の外植片を用いて、遊走および距離を定量化するために細胞を数えた。
【００５６】
コラーゲンゲル外植片についての免疫細胞化学
パラホルムアルデヒドで固定した外植片を、透過処理溶液（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．８；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；３００ｍＭスクロース；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を用いて１０分間、室温において透過処理し、室温にてＰＢＳですすいだ（２×５分）。一連のブロッキング工程およびすすぎ工程の後、検出抗体を使用し、外植片をすすぎ、平衡緩衝液（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（抗Ｆａｄｅキット）とともに室温にて１０分間インキュベートした。外植片を顕微鏡用スライドガラスに載せ、カバーし、蛍光顕微鏡によって検鏡した。推奨されるようにＡｐｏｐＴａｇ  Ｐｌｕｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ検出キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＃Ｓ７１１１）を用いてＴＵＮＥＬアッセイを行った。
【００５７】
胚のＴ７ファージディスプレイｃＤＮＡライブラリー
Ｓｔｒａｉｇｈｔ  Ａ’ｓ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用することによってＥ９．５〜１２．５のマウス胚心臓から等量のｍＲＮＡを単離し精製した。Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ＯｒｉｅｎｔＥｘｐｒｅｓｓ  ｃＤＮＡ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用することによって、ｃＤＮＡを合成した。ベクターＴ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３を使用して、ランダムプライムされたｃＤＮＡを５〜１５個のファージ１０Ｂコートタンパク質分子のＣ末端に提示させた。第２のコートタンパク質１０Ａの発現を誘導した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、挿入断片をＴ７  ｓｅｌｅｃｔ１０−３ベクター（Ｔ７  ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結した。そのベクターをパッケージングした。そのライブラリーの複雑性は、１０７であった。３７℃で４時間のＢＬＴ５６１５  Ｅ．Ｃｏｌｉ
株の対数期０．５Ｌ培養においてパッケージングされたファージを増幅した。細胞の残骸を遠心分離によって除去し、ファージを８％ポリエチレングリコールと共に沈殿させた。１Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてそのペレットからファージを抽出し、ＣｓＣＩ勾配の超遠心分離で精製した。精製したファージをＰＢＳに対して透析し、１０％グリセロール中で−８０℃にて保存した。
【００５８】
Ｔ７ファージバイオパニング
３００μｌのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造者のマニュアルに従って合成した１２μｇのサイモシンβ４タンパク質（ＲｅｇｅｎｅＲｘ）に、おそらくアミノ末端のリシン残基を介して連結した。ＰＢＳ中の３％ＢＳＡを用いて１時間ブロッキングした後、そのゲルをカラムに移し、１０ｍｌのＰＢＳ、２ｍｌの１％ＳＤＳ／ＰＢＳおよび１ｍｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。５００μｌのＰＢＳＴ中の１０９ｐｆｕのＴ７ファージ胚心臓ライブラリー（１００×の複雑性）をカラムにアプライし、５分間インキュベートして、低ストリンジェンシーバイオパニングを達成した。結合しなかったファージを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。結合しているファージを２．０ｍｌの１％ＳＤＳで溶出した。１０μｌの溶出されたファージの力価を測定し、残りのファージを溶解するまで０．５Ｌの対数期ＢＬＴ５６１５  Ｅ．Ｃｏｌｉ培養物においてすぐに増幅した。細胞の残骸を遠心分離で除去し、溶解産物の力価を測定し、１０９ｐｆｕのファージを次の回のバイオパニングに使用した。バイオパニングを４回行い、配列解析に向けた増幅の前に、２回目、３回目および４回目の後にそれぞれ３０個のシングルコロニーを拾った。１０アミノ酸超を含むシングルコロニーを増幅し、ＥＬＩＳＡ確認アッセイに使用した。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ確認アッセイ
ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を１μｇ／１００μｌの合成サイモシンβ４ペプチドで一晩コーティングし、次いで、ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡでブロッキングした。１０９ｐｆｕの増幅単一ファージコロニーを、各ウェル内のＰＢＳＴ中に別々に加え、室温で１．５時間インキュベートした。Ｔ７野生型ファージをネガティブコントロールとして使用した。ＰＢＳで洗浄する（４回）ことによって結合しなかったファージを除去し、室温で１時間、２００μｌの１％ＳＤＳ／ＰＢＳをウェルに加えることによって結合しているファージを溶出した。
【００６０】
免疫共沈降
Ｃｏｓ細胞および１０Ｔ１／２細胞をサイモシンβ４、ＰＩＮＣＨおよび／またはＩＬＫでトランスフェクトし、溶解産物を先に記載したように各々に対する抗体とともに沈殿させた。抗ＩＬＫポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗サイモシンβ４ポリクローナル抗体およびＰＩＮＣＨのタグバージョンに対する抗ｍｙｃ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
【００６１】
動物および手術手技
１６週齢（２５〜３０ｇ）の５８匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、先に記載したように左前下行枝の結紮によって心筋梗塞を発生させた。結紮されたマウスのうちの２９匹に対して、結紮の直後にサイモシンβ４処置を行い、残りの２９匹にはＰＢＳ注射を行った。処置は、サイモシンβ４（１０μｌのコラーゲン中の２００ｎｇ）もしくは１０μｌのコラーゲンを心臓内に；サイモシンβ４（３００μｌのＰＢＳ中の１５０μｇ）もしくは３０００のＰＢＳを腹腔内に；または心臓内と腹腔内の両方への注射によるものであった。マウスを屠殺するまで腹腔内注射を３日おきに行った。用量は、これまでのサイモシンβ４体内分布の研究に基づくものであった。心臓を取り出し、計量し、組織切片用に固定した。さらなるマウスを結紮の０．５、１、３、６および１１日後に研究のために
同様の様式で手術した。
【００６２】
心エコー検査による心機能の解析
収縮機能を評価する心エコー検査を、先に記載したようにＭモードおよび２次元測定を使用して行った。測定値は、スキャンのレベルの一貫性のための基準点として使用される乳頭筋と共に、無作為盲検化様式で行った少なくとも２つの別個のスキャンから選択された６つの心周期の平均として示した。拡張末期を左心室（ＬＶ）の拡張期の最大径と定義し、収縮末期を後壁運動のピークと定義した。各群における単一のアウトライヤを統計解析のために省いた。収縮機能の代わりである収縮率（ＦＳ）をＬＶ径から以下のとおり計算した：ＦＳ＝ＥＤＤ−ＥＳＤ／ＥＤＤ×１００％。駆出率（ＥＦ）を２次元像から計算した。ＥＤＤ，拡張末期径；ＥＳＤ，収縮末期径。
【００６３】
瘢痕体積の計算
先に記載したのと同様にＯｐｅｎｌａｂ  ３．０３ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）を使用し、各マウスの心臓の６つの切片を用いて瘢痕体積を計算した。各切片におけるコラーゲン沈着の面積のパーセントを盲検様式で測定し、各マウスについて平均した。
【００６４】
統計解析
９５％信頼区間による、変数の標準的なｔ検定を使用して統計的計算を行った。
【００６５】
サイモシンβ４は、胚の心臓において心筋細胞および内皮細胞の遊走を促進し、この特性は出生後の心筋細胞においても保持されている。生存している心筋細胞または胚および出生後の培養心筋細胞もまた、サイモシンβ４によって増強された。サイモシンβ４は、ＰＩＮＣＨおよびインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）と機能的複合体を形成し、それによって、生存キナーゼＡｋｔ（タンパク質キナーゼＢとしても知られる）が活性化された。マウスの冠状動脈結紮の後、サイモシンβ４処置により、心臓においてＩＬＫおよびＡｋｔ活性のアップレギュレーションがもたらされ、早期の筋細胞の生存が増強され、心機能が改善される。これらの知見は、サイモシンβ４が、心筋細胞の遊走、生存および修復を促進し、サイモシンβ４が制御する経路が、急性の心筋損傷の発生時の新規治療標的であることを示唆している。
【００６６】
実施例３
合成Ｔβ４およびＴβ４に対する抗体は、ＲｅｇｅｎｅＲｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（３  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｅｔｒｏ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｕｉｔｅ  ７００，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８１４）によって提供されたものであり、それを、心臓内皮細胞の間葉細胞への変換に対する作用を測定するためにコラーゲンゲルアッセイにおいて検定した。心臓弁および他の心臓組織の発生は、上皮間葉系の変換によって形成されること、および、このプロセスにおける欠陥は、発生中および生存している間において、重大な心血管の奇形および損傷を引き起こし得ることが十分に証明されている。生理学的濃度のＴβ４は、コラーゲンゲルアッセイにおいて、心内膜細胞の間葉細胞への変換を著しく増強する。さらに、Ｔβ４に対する抗体は、この変換を阻害し、阻止した。房室心内膜の侵襲性間葉への変換は、正常な心臓組織の形成および維持ならびに心臓弁の形成において重要である。
【００６７】
実施例４
０．１μｇ〜１μｇ／ｋｇ体重のサイモシンＢ４（ＴＢ４）を、血管形成術の直後に心臓カテーテル法によって投与し、次いで、最大７日間、患者に６００μｇ〜６ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）のＴＢ４を静脈内に１日に２〜４回投与する。処置の量および期間は、心電図検査および血管造影法のときの核イメージングによって測定したときおよび患者の最初
の入院の間の急性心筋梗塞後の心室の損傷の程度に依存する。
【００６８】
実施例５
０．１μｇ〜１μｇ／ｋｇ／ＢＷのＴＢ４を、血管形成術および／またはステント術の直後に心臓カテーテル法によって投与する。次いで、ＭＩ後の最大７日間、６００μｇ〜６ｍｇ／ｋｇＢＷを１日に２〜４回、患者に対してＩＶ投与を行った。心筋の維持状態および再狭窄の減少を心電図検査によって測定し、核イメージングまたは他の診断方法によってモニターする。
【００６９】
実施例６
ＴＢ４を１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇＢＷ／日の用量で、最大３０日間ＩＶ投与することにより、プラーク形成に起因する冠状動脈の閉塞を低減する。
【００７０】
実施例７
サイモシンベータ４および本明細書中に記載する他の組織損傷を予防または低減するペプチドを、動脈および他の血管を通る血流の障害を取り除くか、または血流を増加させるために利用される薬物、デバイスおよび手技（アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ヘパリン、動脈ステント、静脈ステント、心臓カテーテル法、頚動脈ステント、大動脈ステント、肺のステント、血管形成術、バイパス手術および／または神経外科術を含む）を用いて投与する。上記薬物、デバイスおよび手技によってもたらされた血流の増加の前、増加中および／または増加後に、組織損傷低減ポリペプチドを投与する。組織損傷低減ポリペプチドは、血流の増加に関連する組織損傷を低減および／または予防する。
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月17日(2008.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織に通じている血管を通る血流の増加を来たした後に生じる前記組織の損傷を処置または予防するための薬物の調製における組成物の使用であって、その組成物は、サイモシンベータ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のアイソフォーム、Ｔβ４のＮ末端フラグメント、Ｔβ４のＣ末端フラグメント、Ｔβ４スルホキシド、ＬＫＫＴＥＴペプチド、ＬＫＫＴＮＴペプチド、アクチン隔離ペプチド、アクチン結合ペプチド、アクチン動員ペプチド、アクチン重合調節ペプチドまたは組織損傷を低減もしくは予防する活性を有するそれらの保存的変異体の少なくとも１つを含む、組織損傷を低減または予防するポリペプチドを含むか、あるいは、前記組織損傷を低減または予防するポリペプチドの産生を刺激する刺激薬剤を含む組成物であって、その組成物は、前記血流の増加を来たす前、来たしている間または来たした後の少なくとも１つの間に前記組織に投与されるものである、使用。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＬＫＫＴＥＴまたはＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４のＣ末端変異体、Ｔβ４のアイソフォームまたは酸化型Ｔβ４を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組成物が、全身投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物が、冠状動脈組織への直接投与のためのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、組換えまたは合成ポリペプチドである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、サイモシンβ４である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、サイモシンβ４の産生を刺激するためのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記血流の増加が、アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼまたはヘパリンの少なくとも１つの投与によって来たされる、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記血流の増加が、アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼまたはヘパリンの少なくとも１つの投与によって来たされる、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記血流の増加が、動脈ステント、静脈ステント、心臓カテーテル法、頚動脈ステント、大動脈ステント、肺のステント、血管形成術、バイパス手術または神経外科術の少なくとも１つによって来たされる、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記血流の増加が、動脈ステント、静脈ステント、心臓カテーテル法、頚動脈ステント、大動脈ステント、肺のステント、血管形成術、バイパス手術または神経外科術の少なくとも１つによって来たされる、請求項７に記載の使用。
【請求項１２】
前記組織損傷を予防または低減するペプチドが、Ｔβ４、Ｔβ４ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、Ｔβ１５、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（Ｄ８Ｐ）プロファイリング、コフィリン、アドセベルチン、プロポミオシン、フィンシリン、デパクチン、ＤｎアーゼＩ、ビリン、フラグミン、セバリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニンまたはアキュメンチンを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１に記載の組織損傷を予防もしくは低減するポリペプチドまたは組織損傷を低減もしくは予防する活性を有する刺激剤を含む薬学的組み合わせであって、その組み合わせは、血流増加に有効な量の血流増加剤をさらに含み、前記ポリペプチドおよび前記薬剤は、別々に投与されてもよいし、共に投与されてもよい、薬学的組み合わせ。
【請求項１４】
前記組織損傷が、神経性の損傷である、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記損傷が、外傷、疾患、突発疾患または脳卒中に起因するものである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記損傷が、虚血に起因するものである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記損傷が、脳卒中に起因するものである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
前記組成物および前記組織における血流を増加させる血流増加剤を含む薬学的組み合わせをさらに含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
前記血流増加剤が、アスピリン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、プラスミノゲン、抗凝固剤、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼまたはヘパリンを含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記血流増加剤が、ｔＰＡまたはストレプトキナーゼを含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドが、血流を増加させる前記血流増加剤の前、最中または後に投与するためのものである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの約０．１〜５０マイクログラムの範囲内の用量で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの約１〜３０マイクログラムの範囲内の用量で投与される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、サイモシンベータ４である、請求項２３に記載の使用。
【国際調査報告】
2009523804.tif 000002
2009523804.tif 000003