(57)【要約】本発明は、非ヒト種およびヒトにおける、交差種特異性（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価するための該抗体の使用に関する。本発明はさらに、交差種特異性を示す前記二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価するための方法に関する。本発明はまた、交差種特異性を示すこうした二重特異性抗体の生物学的活性および／または有効性を測定する方法にも関する。さらに、本発明は、交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体を含む薬学的組成物に、そして疾患の治療のための、交差種特異性を示す前記二重特異性一本鎖抗体を含む薬学的組成物の調製法に関する。【選択図】図１
2009511521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の治療のための薬学的組成物であって、
（ｉ）非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合する第一の結合ドメイン、および
（ｉｉ）細胞表面抗原に結合する第二の結合ドメイン
を含む二重特異性一本鎖抗体を含み、前記の第一の結合ドメインが、ヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合する、前記薬学的組成物。
【請求項２】
前記の第一の結合ドメインが、アミノ酸配列「ＦＳＥＸＥ」（配列番号２０４）（式中、「Ｘ」はＬ（ロイシン）またはＭ（メチオニン）を示す）を含むヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３のエピトープに結合する、請求項１の薬学的組成物。
【請求項３】
前記の第一の結合ドメインが、第二の結合ドメインのＣ末端またはＮ末端に位置する、請求項１または２の薬学的組成物。
【請求項４】
第二の結合ドメインが、ヒト細胞表面抗原に、そして前記細胞表面抗原の非チンパンジー霊長類相同体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項５】
細胞表面抗原が腫瘍抗原である、請求項１または４の薬学的組成物。
【請求項６】
第一の結合ドメインが、配列番号２、１１０または６のいずれかに示すようなアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む、先行する請求項のいずれかの薬学的組成物。
【請求項７】
第一の結合ドメインが、配列番号４、１４８、１６８または８のいずれかに示すようなアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む、先行する請求項のいずれかの薬学的組成物。
【請求項８】
第一の結合ドメインのＶＨ領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域が、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１〜７のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項９】
第一の結合ドメインのＶＨ領域が、配列番号１１０に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域が、配列番号１４８または配列番号１６８に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１〜７のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１０】
第一の結合ドメインのＶＨ領域が、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域が、配列番号８に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１〜７のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはカルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）である、請求項５の薬学的組成物。
【請求項１２】
非チンパンジー霊長類が、ヒヒ（ｂａｂｏｏｎ）、マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）または旧世界ザルである、先行する請求項のいずれかの薬学的組成物。
【請求項１３】
旧世界ザルがマカク（ｍａｃａｑｕｅ）属のサルである、請求項１２の薬学的組成物。
【請求項１４】
マカク属のサルが、アッサムモンキー（Ａｓｓａｍｅｓｅ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・アッサメンシス（Ｍａｃａｃａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ））、バーバリマカク（Ｂａｒｂａｒｙ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シルバヌス（Ｍａｃａｃａ  ｓｙｌｖａｎｕｓ））、ボンネットモンキー（Ｂｏｎｎｅｔ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ラディアタ（Ｍａｃａｃａ  ｒａｄｉａｔａ）、ウスイロマカク（ＢｏｏｔｅｄまたはＳｕｌａｗｅｓｉ−Ｂｏｏｔｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）、（マカカ・オクレアタ（Ｍａｃａｃａ  ｏｃｈｒｅａｔａ））、スラウェシ−クレステッドマカク（Ｓｕｌａｗｅｓｉ−ｃｒｅｓｔｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ニグラ（Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒａ））、タイワンザル（Ｆｏｒｍｏｓａｎ  ｒｏｃｋ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シクロプシス（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｓｉｓ））、ニホンザル（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｓｎｏｗ  ｍａｃａｑｕｅまたはＪａｐａｎｅｓｅ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ファスカタ（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ））、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙまたはｃｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ  ｍａｃａｑｕｅまたはｌｏｎｇ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅまたはＪａｖａ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））、シシオザル（Ｌｉｏｎ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シレヌス（Ｍａｃａｃａ  ｓｉｌｅｎｕｓ））、ブタオザル（Ｐｉｇｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ネメストリナ（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））、チベットマカク（Ｔｉｂｅｔａｎ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・チベタナ（Ｍａｃａｃａ  ｔｈｉｂｅｔａｎａ）、トンキアンマカク（Ｔｏｎｋｅａｎ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・トンキアナ（Ｍａｃａｃａ  ｔｏｎｋｅａｎａ））、トクモンキー（Ｔｏｑｕｅ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シニカ（Ｍａｃａｃａ  ｓｉｎｉｃａ））、ベニガオザル（Ｓｔｕｍｐ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅまたはＲｅｄ−ｆａｃｅｄ  ｍａｃａｑｕｅまたはＢｅａｒ  ｍｏｎｋｅｙ（マカカ・アークトイデス（Ｍａｃａｃａ  ａｒｃｔｏｉｄｅｓ））、またはムーアモンキー（Ｍｏｏｒ  ｍａｃａｑｕｅ（マカカ・マウルス（Ｍａｃａｃａ  ｍａｕｒｕｓ））である、請求項１３の薬学的組成物。
【請求項１５】
非チンパンジー霊長類ＣＤ３が、配列番号１３５、１３６、１４４または１４５に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１〜１４のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記二重特異性一本鎖抗体が：
（ａ）配列番号３８、４０、１２４、４２または４４のいずれかに示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３７、３９、１２５、４１または４３に示すような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）（ｂ）の相補的核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）遺伝暗号の結果として、（ｂ）のヌクレオチド配列に対して縮重している核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；および
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に、少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記二重特異性一本鎖抗体が：
（ａ）配列番号６６，６８、７４、７６、１２２、７０、７２、７８、８０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、または１９２のいずれかに示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６５、６７、７３、７５、１２３、６９、７１、７７、７９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、または１９１に示すような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）（ｂ）の相補的核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）遺伝暗号の結果として、（ｂ）のヌクレオチド配列に対して縮重している核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；および
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に、少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記の第一または第二の結合ドメインの少なくとも１つが、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植および／または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ドメインである、先行する請求項のいずれかの薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体をコードする核酸配列を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１９に定義するような核酸配列を含むベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
前記ベクターが、請求項１９に定義する前記核酸配列に作動可能であるように連結された制御配列をさらに含む、請求項２０の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項２０または２１の薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれかに定義するベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主を含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供可能なタンパク質性化合物をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか記載の薬学的組成物の産生法であって、請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体の発現を可能にする条件下で、請求項２３に定義する宿主を培養し、そして産生された二重特異性一本鎖抗体を培養から回収することを含む、前記方法。
【請求項２６】
キャリアー、安定化剤および／または賦形剤の適切な配合をさらに含む、先行する請求項のいずれかの薬学的組成物。
【請求項２７】
疾患の予防、治療または改善のための薬学的組成物の調製のための、請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体、請求項１９に定義するような核酸分子、請求項２０〜２２のいずれかに定義するようなベクター、または請求項２３に定義するような宿主の使用。
【請求項２８】
前記疾患が、増殖性疾患、腫瘍性疾患、または免疫学的障害である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記腫瘍性疾患が、悪性疾患、好ましくは癌である、請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
前記薬学的組成物が、さらなる薬剤と組み合わせた投与に適している、請求項２７〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
疾患の予防、治療または改善が必要な被験体における、疾患の予防、治療または改善のための方法であって、請求項１〜２４または２６のいずれかの薬学的組成物、あるいは請求項２５の方法にしたがって産生されるような薬学的組成物の有効量を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３２】
前記疾患が、増殖性疾患、腫瘍性疾患、または免疫学的障害である、請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍性疾患が、悪性疾患、好ましくは癌である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記二重特異性一本鎖抗体を、さらなる薬剤と組み合わせて投与する、請求項３１〜３３のいずれかの方法。
【請求項３５】
前記薬剤が、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供可能なタンパク質性化合物の投与を含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物を、請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体、請求項１９に定義するような核酸分子、請求項２０〜２２のいずれかに定義するようなベクター、または請求項２３に定義するような宿主と同時にまたは同時でなく投与する、請求項３５または３６の方法。
【請求項３８】
前記被験体がヒトである、請求項３１〜３７のいずれか１項の方法。
【請求項３９】
請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体、請求項１９に定義するような核酸分子、請求項２０〜２２のいずれかに定義するようなベクター、または請求項２３に定義するような宿主を含む、キット。
【請求項４０】
請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体の生物学的活性および／または有効性を決定する方法であって、前記二重特異性一本鎖抗体を、非チンパンジー霊長類に投与し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏ活性を測定する、前記方法。
【請求項４１】
ヒトにおける、請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価するための、前記二重特異性一本鎖抗体の使用であって、（ｉ）非チンパンジー霊長類に前記二重特異性一本鎖抗体を投与し、（ｉｉ）前記非ヒト霊長類において、前記二重特異性一本鎖抗体の前記ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを測定し、そして（ｉｉｉ）ヒトにおいて、前記二重特異性一本鎖抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価する工程を含む、前記使用。
【請求項４２】
請求項１〜１８のいずれかに定義するような二重特異性一本鎖抗体の生物学的活性／安全性／毒性を評価するための方法であって
（ｉ）非チンパンジー霊長類に前記二重特異性一本鎖抗体を投与し、
（ｉｉ）前記非ヒト霊長類における、前記二重特異性一本鎖抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを測定し、
（ｉｉｉ）該非ヒト霊長類における、前記二重特異性一本鎖抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価し、そして
（ｉｖ）前記二重特異性一本鎖抗体の有効でそして非毒性である用量を決定し、そしてヒトに前記用量を投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項４３】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ活性が、Ｔ細胞活性化、腫瘍ターゲット細胞枯渇、細胞傷害性、毒性、不都合な副作用の発生、および／またはサイトカイン放出である、請求項４０〜４２のいずれかの方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト種およびヒトにおける、交差種特異性（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価するための該抗体の使用に関する。本発明はさらに、交差種特異性を示す前記二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価するための方法に関する。本発明はまた、交差種特異性を示すこうした二重特異性抗体の生物学的活性および／または有効性を測定する方法にも関する。さらに、本発明は、交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体を含む薬学的組成物に、そして疾患の治療のための、交差種特異性を示す前記二重特異性一本鎖抗体を含む薬学的組成物の調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
市販されるためには、いかなる新規候補薬剤も厳密な試験を通過しなければならない。大まかには、この試験を前臨床期および臨床期に細分することも可能である：後者は、一般的に知られる臨床期、第Ｉ期、第ＩＩ期、および第ＩＩＩ期にさらに細分され、ヒト患者で行われる一方、前者は動物で行われる。一般的に、前臨床試験の目的は、薬剤候補が働き、そして有効でありそして安全であることを立証することである。具体的には、これらの動物研究の目的は、薬剤が発癌性でなく、突然変異誘発性でなく、または催奇形性でないことを立証するとともに、薬剤の薬物動態学を理解することである。動物における安全性および薬剤候補のありうる有効性が前臨床試験において確立されている場合のみ、この薬剤候補は、ヒトにおける臨床試験に関して認可されるであろう。
【０００３】
動物における、小分子薬剤候補、例えば新規のアントラサイクリンに基づく抗新生物剤の振舞いは、多くの場合で、ヒトに対する投与に際するこの薬剤候補の予期される振舞いの指標となるであろう。したがって、その結果、こうした前臨床試験から得られるデータは、一般的に、ヒトの場合で、高い予測力を有するであろう。しかし、こうした適合性は、薬剤候補のあらゆる種類で予期されるものではない；特定の分子形式は、動物において１つの方式で振舞い、そしてヒトにおいて別の方式で振舞うと予期されるであろう。こうした場合、前臨床試験の予測力、およびしたがって臨床試験に関して薬剤候補が認可される可能性は、非常に減少する。
【０００４】
動物においてヒトにおけるのとしばしば異なって作用する薬剤候補の１つの形式は、抗体である。一般的に、抗体は、通常はタンパク質性であるターゲット分子を、非常に特異的に認識することによって、機能する。大部分の抗体薬剤候補はモノクローナル抗体であり；これらは、ターゲット分子上の単一部位、または単一エピトープのみを認識する。しかし、モノクローナル抗体およびその断片に生得的なこの識別能から、これらの化合物は、薬剤開発のための非常に興味深い候補となっているが、また、この識別能のため、前臨床試験が困難になる。これは、こうした抗体が結合するターゲット分子の配列に、種依存性の変異があるためである。ヒトにおいて、例えば、エピトープＸを介して分子Ｙを特異的に認識し、そして該分子に結合するモノクローナル抗体またはその断片は、対応するエピトープＸ’が、ヒト対応物Ｘと異なる可能性もあるため、しばしば、非ヒト種において、対応する分子Ｙ’を特異的に認識し、そして該分子に結合することができない。したがって、モノクローナル抗体（例えばヒト抗原に対する）は、抗原が非常に保存されている非常に稀な場合を除いて、げっ歯類などの系統発生的に遠い種に対して、設計によって、限定された反応性しか持たない傾向がある。ヒトおよび霊長類抗原に対する反応性を持つモノクローナル抗体群間であってさえ、ヒトおよびチンパンジー抗原相同体としか反応しない抗体の例が多くある。これは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体に関してもまた、観察されてきている。最も広く用いられそして最もよく性質決定されている、ＣＤ３複合体に特異的なモノクローナル抗体の１つはＯＫＴ−３であるが、これはチンパンジーＣＤ３と反応するが、他の霊長類、例えばマカクのＣＤ３相同体、あるいはイヌＣＤ３と反応しない（Ｓａｎｄｕｓｋｙら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  １５（１９８６），  ４４１−４５１）。抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＵＣＨＴ−１もまた、チンパンジー由来のＣＤ３と反応性であるが、マカク由来のＣＤ３とは反応性でない（本発明者ら自身のデータ；以下の実施例を参照されたい）。他方、マカク抗原を認識するが、そのヒト対応物を認識しない、モノクローナル抗体の例もある。このグループの一例が、マカク由来のＣＤ３に対して向けられるモノクローナル抗体ＦＮ−１８である（Ｕｄａら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  ３０（２００１），  １４１−１４７）。興味深いことに、マカクにおけるＣＤ３抗原の多型のため、カニクイザルの約１２％に由来する末梢リンパ球が、抗アカゲザルＣＤ３モノクローナル抗体（ＦＮ−１８）との反応性を欠くことが見出されている。Ｕｄａらは、ＦＮ−１８抗体と反応性である動物に由来するＣＤ３に比較した際の、ＦＮ−１８抗体と反応性でないカニクイザルのＣＤ３配列における、２つのアミノ酸の置換を記載した（Ｕｄａら，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  ３２（２００３），  １０５−１０；  Ｕｄａら，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  ３３（２００４），  ３４−７）。
【０００５】
前臨床動物試験におけるモノクローナル抗体の高い特異性と類似の困難が、二重特異性抗体、例えば米国特許第５，２６０，２０３号に開示される一般的な種類の組換え二重特異性一本鎖抗体で観察される。このように困難が増すのは、二重特異性抗体、例えば二重特異性一本鎖抗体が、２つの別個の結合ドメインを含み、このうちどちらか１つ、または両方が、ヒト・ターゲット分子の非ヒト対応物を認識できない可能性もあるという事実のためである。事実上、例えば二重特異性一本鎖抗体が、動物において、意図するそれぞれのターゲット分子を認識できないリスクは、単一特異性抗体またはその断片の場合より２倍高い。
【０００６】
こうした問題に対抗するため、いくつかの既知の戦略が存在する。
１つの既知のアプローチは、チンパンジー・モデルにおいて、（二重特異性）抗体薬剤候補またはその断片の前臨床試験を行うことである。チンパンジーは、ヒトに最も近い遺伝的類縁であり、ゲノムの９９％に渡ってヒトと同一であり、したがって、（二重特異性）抗体薬剤候補またはその断片が特異的に結合する分子のチンパンジー変異体は、この分子のヒト変異体と同一である可能性が非常に高い。したがって、チンパンジーにおいて、（二重特異性）抗体薬剤候補またはその断片によってこの分子が認識されない危険は最小限である。しかし、チンパンジーにおける試験は非常に高価であり、そして倫理的問題が伴う。さらに、チンパンジーは、絶滅危険動物であり、したがって実験に使用可能な動物の数は非常に限定されている。したがって、（二重特異性）抗体療法の大部分の開発者にとって、チンパンジーにおけるこうした前臨床試験は、排除される。
【０００７】
上記アプローチは、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０（２００５），  １−１２）に記載される。この研究では、臨床薬剤候補、二重特異性一本鎖抗体ＣＤ１９ｘＣＤ３の生物学的活性が、チンパンジーにおいて試験された。ヒトにおける療法投与のため、ＷＯ  ９９／５４４４０に先に記載されたＣＤ１９ｘＣＤ３抗体は、ヒトＢ細胞抗原ＣＤ１９およびヒトＴ細胞抗原ＣＤ３に特異的に結合する二重特異性一本鎖抗体である。この論文の著者らは、この二重特異性一本鎖抗体が、ＣＤ３およびＣＤ１９分子のヒトおよびチンパンジー変異体の両方に結合することを見出した。しかし、他の種、すなわちマウス、ビーグル犬、および非チンパンジー霊長類（カニクイ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）、アカゲ（ｒｈｅｓｕｓ）およびヒヒ（ｂａｂｏｏｎ））由来のＢおよびＴ細胞に対する前記二重特異性一本鎖抗体の反応性はまったく見られず、再び、モノクローナル抗体の種感受性が極端であることが確認された。
【０００８】
別のアプローチは、前臨床試験で用いる分子を、この試験に用いる動物に適応させる。このアプローチにしたがって、試験動物への投与のため、いわゆる「代理」抗体を構築することによって、前臨床研究において、必須の安全性情報が得られる。一般的に、こうした代理抗体は、非代理抗体、すなわちヒトにおける実際の薬剤候補が結合するターゲット分子の試験動物対応物を特異的に認識し、そして該対応物に結合するように修飾されている抗体である。したがって、こうした「代理」抗体を用いたアプローチでは、２つの異なる分子：臨床薬剤候補、および臨床候補のターゲット特異性に対応する、動物種における前臨床試験のための候補を別個に開発し、そして調べなければならない。こうした代理アプローチの大きな欠点は、前臨床試験のための代理抗体が、実際の薬剤候補抗体に比較して、修飾されていることである。したがって、代理抗体を用いた前臨床試験で得られるデータは、しばしば、ヒトの場合には直接は適用不能である。上記に説明するように、この減少した適応可能性は、最終的に、これらのアプローチを用いたいかなる前臨床研究の予測力も減少させる。
【０００９】
上記アプローチが、試験のために用いた動物にマッチするように薬剤候補を適応させる一方、他の既知のアプローチは、正確にその逆を行う；これらの他方の既知のアプローチにしたがって、試験に用いる動物を、ヒトへの投与のために意図される薬剤候補に適応させる。
【００１０】
ヒトへの投与が意図される薬剤候補に試験動物を適応させる１つの例は、それ自身の種に内因性である非ヒト分子の代わりに、（二重特異性）抗体またはその断片が特異的に結合するヒト分子を発現するトランスジェニック動物を生成することである。この方式では、前臨床試験において投与される（二重特異性）抗体またはその断片は、トランスジェニック試験動物において、ヒト抗原に出会い、そして該抗原に結合するであろう。例えば、Ｂｕｇｅｌｓｋｉら（Ｂｕｇｅｌｓｋｉら，  Ｈｕｍ  Ｅｘｐ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １９（２０００），  ２３０−２４３）によって設計された研究では、ヒト患者における関節リウマチの長期治療を援助するため、ヒトＣＤ４トランスジェニックマウスにおいて、モノクローナル抗体ケリキシマブの前臨床安全性評価が行われた。ケリキシマブは、ヒトおよびチンパンジーＣＤ４に対する特異性を持つモノクローナル抗体である。著者らは、ヒトタンパク質を発現するトランスジェニックマウスの使用が、限定された交差種特異性を有する生物薬剤学的剤を用いたチンパンジーにおける研究の有用な代替法を提供すると結論付けている（Ｂｕｇｅｌｓｋｉら，  Ｈｕｍ  Ｅｘｐ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １９（２０００），  ２３０−２４３）。しかし、試験目的のためのトランスジェニック動物の生成は、非常に労働集約的、そしてしたがってコスト集約的である。
【００１１】
同じ方向で、しばしば使用される別のアプローチは、試験中の（二重特異性）抗体またはその断片が特異的に結合するはずの分子を発現しているヒト細胞を非トランスジェニック試験動物に注入することである。しかし、トランスジェニック動物種の構築に関連するコストおよび時間を回避する一方、このアプローチは他の問題を提示する。一例として、例えば免疫適格マウスを用いたアプローチでは、動物内に導入された外来細胞は、しばしば、試験動物の免疫系に認識され、そして体系的に排除される。免疫不全マウスは、例えば異種移植腫瘍モデルにおいて、非同系細胞の注入および増殖を許すが、こうした研究において、げっ歯類およびヒト間の系統発生上の距離のため、薬剤候補に関して得られるデータの適用可能性が限定される。さらに、多数回の血液抽出は、より低次の動物、例えばマウスでは、問題が多い。しかし、こうした多数回の血液抽出は、前臨床動物試験における薬剤候補の生物学的効果を評価するための、薬物動態学的パラメータの決定および血液パラメータの連続試験には必須である。
【００１２】
要約すると、ヒトにおける投与に関する薬剤候補の安全性および毒性に関する前臨床データを得るには、２つの主なアプローチがある。１つの方法は、トランスジェニック動物モデル（大部分はマウスモデル）に、臨床薬剤候補を適用することである。しかし、げっ歯類が、霊長類に比較して、ヒトにより関連しないという事実のため、前臨床データには、限定された説明能力しかない。別の方法は、適切な動物種において、代理分子を試験することである。これらの代理分子は、用いる動物に特異的であり、そしてしたがってヒトにおける投与のために開発された臨床薬剤候補とは異なる。問題は、ヒトに非常に関連し、そして前臨床試験で用いた際に高い予測力を有するチンパンジー以外の動物においては、臨床薬剤候補を直接適用することが不可能であることである。意味がある前臨床データを得るための現存する方法として薬剤候補として試験中の（二重特異性）抗体またはその断片に関するものは、試験動物にこの抗体をマッチさせる、この場合は、しばしば、得られるデータが薬剤候補に関して限定された適用性しかないか、または逆に抗体に試験動物をマッチさせる、この場合は、倫理的および／またはコスト上の困難が生じ、そして最悪の場合、薬剤候補に関して得られるデータの適用性がなお限定されることもありうる、のいずれかである。
【発明の開示】
【００１３】
したがって、上に概説した問題に対する解決策を提供することが本発明の目的である。
これらの問題に対する解決策は、二重特異性一本鎖抗体であって、ヒトおよび非チンパンジー霊長類ターゲット分子に結合する交差種（cross-species）特異性を示し、そしてしたがって霊長類において、前記二重特異性抗体の安全性、活性および／または薬物動態学的プロフィールの前臨床評価に、そしてかつ同一の形体で、ヒトにおける薬剤として、使用可能である、前記二重特異性抗体を提供することである。
【００１４】
したがって、本発明の１つの側面は、二重特異性一本鎖抗体の使用であって、該抗体は、非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合する第一の結合ドメイン、および細胞表面抗原抗原に結合する第二の結合ドメインを含み、前記の第一の結合ドメインがヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合するものである、ヒトにおける（ｉｎ  ｖｉｖｏ）前記二重特異性一本鎖抗体の安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価するための前記使用であって、（ｉ）非チンパンジー霊長類に前記二重特異性一本鎖抗体を投与し、（ｉｉ）前記非チンパンジー霊長類において、前記二重特異性一本鎖抗体の前記（ｉｎ  ｖｉｖｏ）安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを測定し、そして（ｉｉｉ）ヒトにおける、前記二重特異性一本鎖抗体の（ｉｎ  ｖｉｖｏ）安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価する工程を含む、前記使用に関する。
【００１５】
別の側面において、本発明は、上に定義するような二重特異性一本鎖抗体の生物学的活性／安全性／毒性を評価するための方法であって
（ｉ）非チンパンジー霊長類に前記二重特異性一本鎖抗体を投与し、
（ｉｉ）前記非チンパンジー霊長類における、前記二重特異性一本鎖抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを測定し、
（ｉｉｉ）該非チンパンジー霊長類における、前記二重特異性一本鎖抗体の該ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールを評価し、そして
（ｉｖ）前記二重特異性一本鎖抗体の有効でそして非毒性である用量を決定し、そしてヒトに前記用量を投与する
工程を含む、前記方法に関する。
【００１６】
特に、ヒトに対する薬剤候補の投与のため、前臨床動物試験で得られるデータの予測価値を改善する手段および方法を提供することが、本発明の目的である。
本明細書において、「二重特異性一本鎖抗体」は、２つの結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を意味する。以下により詳細に定義するように、各結合ドメインは、抗体重鎖由来の１つの可変領域（「ＶＨ領域」）を含み、第一の結合ドメインのＶＨ領域は前記の第一の分子、すなわちＣＤ３分子に特異的に結合し、そして第二の結合ドメインのＶＨ領域は、細胞表面抗原に特異的に結合する。２つの結合ドメインは、場合によって、一般的に約５アミノ酸を含む短いポリペプチド・スペーサーによって、互いに連結されている。各結合ドメインは、抗体軽鎖由来の１つの可変領域（「ＶＬ領域」）をさらに含んでもよく、第一および第二の結合ドメインの各々の内部の、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、ポリペプチド・リンカー（例えばＥＰ  ６２３６７９  Ｂ１に開示され、そして請求される種類のもの）を介して互いに連結されているが、いかなる場合も、第一の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域、ならびに第二の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域が、同時に、それぞれの第一および第二の分子に特異的に結合可能であるように、これらが互いに対形成するのを可能にするのに十分に長い。
【００１７】
本明細書において、用語「結合する」または関連する表現、例えば「結合すること」または「との／に対する反応性」などは、潜在的な結合パートナーとしての多数の異なる分子のプールから、それぞれの第一および／または第二の分子のみが結合するか、またはこうした分子が有意に結合するような度合いまで、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の第一および／または第二の結合ドメインが、それぞれの第一および／または第二の分子の間を区別する能力を指す。こうした結合測定は、例えばＢｉａｃｏｒｅ装置上で、ルーチンに実行可能である。
【００１８】
より具体的には、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の第一の結合ドメインは、ヒトＣＤ３および非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合する。用語「非チンパンジー霊長類」を、以下により詳細に説明する。当業者に明らかであるように、本明細書に定義するような交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体の第一の結合ドメインが、例えばチンパンジーＣＤ３にもまた結合しうることは、本発明の範囲から排除されない。一方、ヒトＣＤ３のみに結合し、非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合しない、結合ドメインは、本発明の範囲から排除されることが明らかである。これは、例えばモノクローナル抗体ＦＮ−１８のものなどの、非チンパンジー霊長類ＣＤ３にのみ結合し、ヒトＣＤ３に結合しない結合ドメインに準用される。
【００１９】
本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の第二の結合ドメインは、以下に示すように、細胞表面抗原、好ましくは腫瘍抗原に結合する。好ましくは、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の結合分子はどちらも、それぞれ、ヒトおよび非チンパンジー霊長類ターゲット分子に結合する。したがって、第二の結合ドメインは、ヒト細胞表面抗原、および非チンパンジー霊長類における該細胞表面抗原の対応する相同体に結合する。非チンパンジー霊長類におけるヒト細胞表面抗原の相同体の同定および決定は、当業者に周知であり、そして例えば配列並列によって実行可能である。
【００２０】
用語「交差種特異性」または「種間特異性」は、本明細書において、ヒトおよび非チンパンジー霊長類における、同じターゲット分子への、本明細書記載の二重特異性一本鎖抗体の２つの結合ドメインの少なくとも１つ、好ましくは両方の結合ドメインの結合を意味する。したがって、「交差種特異性」または「種間特異性」は、同じ分子Ｘに対する種間反応性であり、Ｘ以外の分子に対する反応性でないと理解されるものとする。例えばヒトＣＤ３を認識するモノクローナル抗体の、非チンパンジー霊長類ＣＤ３、例えばマカクＣＤ３に対する交差種特異性は、例えば、ＦＡＣＳ分析によって決定可能である。ＦＡＣＳ分析は、それぞれ、前記のヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３抗原を発現する、ヒトおよび非チンパンジー霊長類細胞、例えばマカク細胞に対する結合に関して、それぞれのモノクローナル抗体を試験する方式で行われる。以下の実施例において、適切なアッセイを示す。本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の第一の結合ドメインを生成するため、例えば、ヒトおよび非チンパンジーＣＤ３（例えばマカクＣＤ３）両方に対するモノクローナル抗体結合を用いてもよい。同様に、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の第二の結合ドメインを生成するため、それぞれ、ヒトおよび非チンパンジー霊長類細胞表面抗原両方に対するモノクローナル抗体結合を利用してもよい。本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体に関する適切な結合ドメインは、当該技術分野に記載される組換え法によって、交差種特異的モノクローナル抗体に由来してもよい。ヒト細胞表面抗原、および非チンパンジー霊長類における前記細胞表面抗原の相同体に対するモノクローナル抗体の結合は、上に示すように、ＦＡＣＳアッセイによって試験可能である。当業者には、文献に記載されるハイブリドーマ技術（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｅｈｌｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），  ４９５−７）によってもまた、交差種特異的モノクローナル抗体を生成可能であることが明らかである。例えば、ヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３で、マウスを代わりに免疫してもよい。ハイブリドーマ技術を介して、これらのマウスから、交差種特異的抗体産生ハイブリドーマ細胞を単離し、そして上に示すようなＦＡＣＳによって分析する。本明細書に記載するような交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体の生成および分析を以下の実施例に示す。交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体の利点には、以下に列挙する点が含まれる。
【００２１】
本明細書において、「ヒト」および「人間」は、種、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を指す。したがって、「ヒト」分子は、ホモ・サピエンスで天然に発現されるような、その分子の変異体である。本明細書記載の構築物の医学的使用に関する限り、ヒト患者は、該構築物で治療されるものとする。
【００２２】
本明細書において、「非チンパンジー霊長類」または「非チンプ霊長類」またはその文法的変形は、チンパンジー以外の任意の霊長類、すなわちチンパンジー属（Ｐａｎ）に属すし、そしてアンスロポピテクス・トログロディテス（Ａｎｔｈｒｏｐｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）またはシミア・サティルス（Ｓｉｍｉａ  ｓａｔｙｒｕｓ）としてもまた知られる、ボノボ（Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ）種およびナミチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）種を含む動物以外である。「（単数の）霊長類」、「霊長類種」、「複数の霊長類」またはその文法的変形は、原猿（ｐｒｏｓｉｍｉａｎｓ）および類人猿（ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）の２つの亜目に分けられ、そしてヒト、類人猿（ａｐｅｓ）、サル（ｍｏｎｋｅｙ）およびキツネザル（ｌｅｍｕｒｓ）を含む、真獣類哺乳動物の目を意味する。具体的には「霊長類」は、本明細書において、原猿亜目（Ｓｔｒｅｐｓｉｒｒｈｉｎｉ）（非メガネザル（ｎｏｎ−ｔａｒｓｉｅｒ）原猿）を含み、該亜目は、キツネザル下目（Ｌｅｍｕｒｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、コビトキツネザル上科（Ｃｈｅｉｒｏｇａｌｅｏｉｄｅａ）およびキツネザル上科（Ｌｅｍｕｒｏｉｄｅａ）を含む）、アイアイ下目（Ｃｈｉｒｏｍｙｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、アイアイ科（Ｄａｕｂｅｎｔｏｎｉｉｄａｅ）を含む）およびロリス下目（Ｌｏｒｉｓｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、ロリス科（Ｌｏｒｉｓｉｄａｅ）およびガラゴ科（Ｇａｌａｇｉｄａｅ）を含む）を含む。「霊長類」は、本明細書において、真猿亜目（Ｈａｐｌｏｒｒｈｉｎｉ）もまた含み、該亜目は、メガネザル下目（Ｔａｒｓｉｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、メガネザル科（Ｔａｒｓｉｉｄａｅ）を含む）、真猿下目（Ｓｉｍｉｉｆｏｒｍｅｓ）（それ自体、広鼻小目（Ｐｌａｔｙｒｒｈｉｎｉ）または新世界ザル、およびオナガザル科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｄｅａ）を含む狭鼻小目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）または新世界ザルを含む）を含む。
【００２３】
非チンパンジー霊長類種は、本発明の意味内において、キツネザル、メガネザル、テナガザル（ｇｉｂｂｏｎ）、マーモセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）（マーモセット科（Ｃｅｂｉｄａｅ）の新世界ザルに属する）または旧世界ザル（オナガザル上科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａ）に属する）であると理解してもよい。
【００２４】
本明細書において、「旧世界ザル」は、オナガザル上科に属するあらゆる猿を含み、該上科はそれ自体：主にアフリカ系であるが、アジアおよび北アフリカのマカクの広い属を含む、オナガザル亜科（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎａｅ）；ならびに、アジアの属の大部分を含むが、アフリカのコロブスザルもまた含む、コロブス亜科（Ｃｏｌｏｂｉｎａｅ）に細分される。
【００２５】
具体的には、オナガザル亜科内で、好適な非チンパンジー霊長類は、アレンモンキー属（Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（アレン沼地ザル（Ａｌｌｅｎ’ｓ  Ｓｗａｍｐ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ａｌｌｅｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ））；コビトグエノン属（Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（コビトグエノン（Ａｎｇｏｌａｎ  Ｔａｌａｐｏｉｎ、Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｔａｌａｐｏｉｎ）；ガボン・タラポアン（Ｇａｂｏｎ  Ｔａｌａｐｏｉｎ、Ｍｉｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｏｇｏｕｅｎｓｉｓ））；パタスモンキー属（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ）内（パタスモンキー（Ｐａｔａｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ  ｐａｔａｓ））；クロロセブス属（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ）内（ミドリザル（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｃｅｕｓ）；グリベットモンキー（Ｇｒｉｖｅｔ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）；ベールマウンテン・ベルベットモンキー（Ｂａｌｅ  Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ  Ｖｅｒｖｅｔ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｄｊａｍｄｊａｍｅｎｓｉｓ）；タンタロスモンキー（Ｔａｎｔａｌｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｔａｎｔａｌｕｓ）；ベルベットモンキー（Ｖｅｒｖｅｔ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｐｙｇｅｒｙｔｈｒｕｓ）；マルブルック（Ｍａｌｂｒｏｕｃｋ、Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｃｙｎｏｓｕｒｏｓ））；またはオナガザル属（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ドリアスグエノン（Ｄｒｙａｓ  ＭｏｎｋｅｙまたはＳａｌｏｎｇｏ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｒｙａｓ）；ダイアナモンキー（Ｄｉａｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｉａｎａ）；ロロウェイモンキー（Ｒｏｌｏｗａｙ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｒｏｌｏｗａｙ）；オオハナジログエノン（Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｓｐｏｔ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｎｉｃｔｉｔａｎｓ）；ブルーモンキー（Ｂｌｕｅ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）；シルバーモンキー（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｏｇｇｅｔｔｉ）；ゴールデンモンキー（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｋａｎｄｔｉ）；サイクスモンキー（Ｓｙｋｅｓ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｌｂｏｇｕｌａｒｉｓ）；モナモンキー（Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｍｏｎａ）；キャンベル・モナモンキー（Ｃａｍｐｂｅｌｌ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｃａｍｐｂｅｌｌｉ）；ロウ・モナモンキー（Ｌｏｗｅ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｌｏｗｅｉ）；クラウングエノン（Ｃｒｅｓｔｅｄ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｏｇｏｎｉａｓ）；ウォルフグエノン（Ｗｏｌｆ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｗｏｌｆｉ）；デント・モナモンキー（Ｄｅｎｔ’ｓ  Ｍｏｎａ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｅｎｔｉ）；ショウハナグエノン（Ｌｅｓｓｅｒ  Ｓｐｏｔ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｅｔａｕｒｉｓｔａ）；アカバラグエノン（Ｗｈｉｔｅ−ｔｈｒｏａｔｅｄ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｇａｓｔｅｒ）；スクラターグエノン（Ｓｃｌａｔｅｒ’ｓ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｃｌａｔｅｒｉ）；アカミミグエノン（Ｒｅｄ−ｅａｒｅｄ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｔｉｓ）；クチヒゲグエノン（Ｍｏｕｓｔａｃｈｅｄ  Ｇｕｅｎｏｎ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｃｅｐｈｕｓ）；アカオザル（Ｒｅｄ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｓｃａｎｉｕｓ）；ロエストグエノン（Ｌ’Ｈｏｅｓｔ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｌｈｏｅｓｔｉ）；プレウスモンキー（Ｐｒｅｕｓｓ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、  Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｒｅｕｓｓｉ）；サンテールモンキー（Ｓｕｎ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｏｌａｔｕｓ）；フクロウグエノン（Ｈａｍｌｙｎ’ｓ  ＭｏｎｋｅｙまたはＯｗｌ−ｆａｃｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈａｍｌｙｎｉ）；ブラッザモンキー（Ｄｅ  Ｂｒａｚｚａ’ｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｎｅｇｌｅｃｔｕｓ））のオナガザル族（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｉ）由来であってもよい。
【００２６】
あるいは、やはりオナガザル亜科内であるが、ヒヒ族（Ｐａｐｉｏｎｉｎｉ）内の好適な非チンパンジー霊長類は、マカク属（Ｍａｃａｃａ）内（バーバリマカク（Ｂａｒｂａｒｙ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｙｌｖａｎｕｓ）；シシオザル（Ｌｉｏｎ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｉｌｅｎｕｓ）；ブタオザル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＢｅｒｕｋ、Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）；キタブタオザル（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｌｅｏｎｉｎａ）；パガイ島マカク（Ｐａｇａｉ  Ｉｓｌａｎｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＢｏｋｋｏｉ、Ｍａｃａｃａ  ｐａｇｅｎｓｉｓ）；シブルー島マカク（Ｓｉｂｅｒｕｔ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｉｂｅｒｕ）；ムーアモンキー（Ｍｏｏｒ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｍａｕｒａ）；ウスイロマカク（Ｂｏｏｔｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｏｃｈｒｅａｔａ）；トンキアンマカク（Ｔｏｎｋｅａｎ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｔｏｎｋｅａｎａ）；ヘックモンキー（Ｈｅｃｋ’ｓ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｈｅｃｋｉ）；ゴロンタロモンキー（Ｇｏｒｏｎｔａｌｏ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒｉｓｃｅｎｓ）；クロザル（Ｃｅｌｅｂｅｓ  Ｃｒｅｓｔｅｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＢｌａｃｋ  “Ａｐｅ”、Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒａ；カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙまたはＣｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ  ＭａｃａｑｕｅまたはＬｏｎｇ−ｔａｉｌｅｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＫｅｒａ、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；ベニガオザル（Ｓｔｕｍｐ−ｔａｉｌｅｄ  ＭａｃａｑｕｅまたはＢｅａｒ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ａｒｃｔｏｉｄｅｓ）；アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）；タイワンザル（Ｆｏｒｍｏｓａｎ  Ｒｏｃｋ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｉｓ）；ニホンザル（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ）；トクモンキー（Ｔｏｑｕｅ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｉｎｉｃａ）；ボンネットモンキー（Ｂｏｎｎｅｔ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｒａｄｉａｔａ）；バーバリマカク（Ｂａｒｂａｒｙ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｓｙｌｖａｎｍｕｓ）；アッサムモンキー（Ａｓｓａｍ  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）；チベットマカク（Ｔｉｂｅｔａｎ  ＭａｃａｑｕｅまたはＭｉｌｎｅ−Ｅｄｗａｒｄｓ’  Ｍａｃａｑｕｅ、Ｍａｃａｃａ  ｔｈｉｂｅｔａｎａ）；アルナーチャルモンキー（Ａｒｕｎａｃｈａｌ  ＭａｃａｑｕｅまたはＭｕｎｚａｌａ、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｎｚａｌａ））；ロフォセブス属（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ）内（ホホジロマンガベイ（Ｇｒａｙ−ｃｈｅｅｋｅｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ａｌｂｉｇｅｎａ）；ロフォセブス・アルビゲナ・アルビゲナ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ａｌｂｉｇｅｎａ  ａｌｂｉｇｅｎａ）；ロフォセブス・アルビゲナ・オスマニ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ａｌｂｉｇｅｎａ  ｏｓｍａｎｉ）；ロフォセブス・アルビゲナ・ジョンストニ（Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ａｌｂｉｇｅｎａ  ｊｏｈｎｓｔｏｎｉ）；ブラック・クレステッド・マンガベイ（Ｂｌａｃｋ  Ｃｒｅｓｔｅｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ａｔｅｒｒｉｍｕｓ）；オプデンボッシュ・マンガベイ（Ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈ’ｓ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ｏｐｄｅｎｂｏｓｃｈｉ）；ハイランド・マンガベイ（Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｌｏｐｈｏｃｅｂｕｓ  ｋｉｐｕｎｊｉ））；ヒヒ属（Ｐａｐｉｏ）内（マントヒヒ（Ｈａｍａｄｒｙａｓ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）；ギニアヒヒ（Ｇｕｉｎｅａ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｐａｐｉｏ）；アヌビスヒヒ（Ｏｌｉｖｅ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）；キイロヒヒ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｃｙｎｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；チャクマヒヒ（Ｃｈａｃｍａ  Ｂａｂｏｏｎ、Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ））内；ゲラダヒヒ属（Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ゲラダヒヒ（Ｇｅｌａｄａ，  Ｔｈｅｒｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｇｅｌａｄａ））；マンガベイ属（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ）内（スーティ・マンガベイ（Ｓｏｏｔｙ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓ）；セルコセブス・アティス・アティス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓ  ａｔｙｓ）；セルコセブス・アティス・ルヌラトゥス（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓ  ｌｕｎｕｌａｔｕｓ）；シロエリマンガベイ（Ｃｏｌｌａｒｅｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｔｏｒｑｕａｔｕｓ）；アギルマンガベイ（Ａｇｉｌｅ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）；ゴールデンベリードマンガベイ（Ｇｏｌｄｅｎ−ｂｅｌｌｉｅｄ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｃｈｒｙｓｏｇａｓｔｅｒ）；タナ川マンガベイ（Ｔａｎａ  Ｒｉｖｅｒ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｇａｌｅｒｉｔｕｓ）；サンジェマンガベイ（Ｓａｎｊｅ  Ｍａｎｇａｂｅｙ、Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｓａｎｊｅｉ）；またはマンドリル属内（Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ（マンドリル（Ｍａｎｄｒｉｌｌ、Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ  ｓｐｈｉｎｘ）；ドリル（Ｄｒｉｌｌ、Ｍａｎｄｒｉｌｌｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｈａｅｕｓ））由来であってもよい。
【００２７】
最も好ましいのは、マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザルとしても知られ、そしてしたがって実施例では「カニクイ」と称される）およびマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（アカゲザル、「アカゲ」と称される）である。
【００２８】
コロブス亜科内で、好適な非チンパンジー霊長類は、コロブス属（Ｃｏｌｏｂｕｓ）内（クロコロブス（Ｂｌａｃｋ  Ｃｏｌｏｂｕｓ，  Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｓａｔａｎａｓ）；アンゴラコロブス（Ａｎｇｏｌａ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ）；キングコロブス（Ｋｉｎｇ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｏｌｙｋｏｍｏｓ）；クマコロブス（Ｕｒｓｉｎｅ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｖｅｌｌｅｒｏｓｕｓ）；アビシニアコロブス（Ｍａｎｔｌｅｄ  Ｇｕｅｒｅｚａ、Ｃｏｌｏｂｕｓ  ｇｕｅｒｅｚａ））；ピリオコロブス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ）属内（ウェスタン・アカコロブス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｂａｄｉｕｓ）；ピリオコロブス・バディウス・バディウス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｂａｄｉｕｓ  ｂａｄｉｕｓ）；ピリオコロブス・バディウス・テミンキー（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｂａｄｉｕｓ  ｔｅｍｍｉｎｃｋｉｉ）；ピリオコロブス・バディウス・ワルドロネ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｂａｄｉｕｓ  ｗａｌｄｒｏｎａｅ）；ペナントコロブス（Ｐｅｎｎａｎｔ’ｓ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｅｎｎａｎｔｉｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・ペナンティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｅｎｎａｎｔｉｉ  ｐｅｎｎａｎｔｉｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・エピエニ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｅｎｎａｎｔｉｉ  ｅｐｉｅｎｉ）；ピリオコロブス・ペナンティ・ボウビエリ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｅｎｎａｎｔｉｉ  ｂｏｕｖｉｅｒｉ）；プレウス・アカコロブス（Ｐｒｅｕｓｓ’ｓ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｐｒｅｕｓｓｉ）；トロン・アカコロブス（Ｔｈｏｌｌｏｎ’ｓ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｔｈｏｌｌｏｎｉ）；中央アフリカ・アカコロブス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｆｏａｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・フォアイ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｆｏａｉ  ｆｏａｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・エリオッティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｆｏａｉ  ｅｌｌｉｏｔｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・オウスタレティ（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｆｏａｉ  ｏｕｓｔａｌｅｔｉ）；ピリオコロブス・フォアイ・セムリキエンシス（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｆｏａｉ  ｓｅｍｌｉｋｉｅｎｓｉｓ）；ピリオコロブス・フォアイ・パルメンティエロルム（Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｆｏａｉ  ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒｏｒｕｍ）；ウガンダ・アカコロブス（Ｕｇａｎｄａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｔｅｐｈｒｏｓｃｅｌｅｓ）；ウジングワ・アカコロブス（Ｕｚｙｎｇｗａ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｏｒｕｍ）；ザンジバル・アカコロブス（Ｚａｎｚｉｂａｒ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｋｉｒｋｉｉ）；タナ川アカコロブス（Ｔａｎａ  Ｒｉｖｅｒ  Ｒｅｄ  Ｃｏｌｏｂｕｓ、Ｐｉｌｉｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｒｕｆｏｍｉｔｒａｔｕｓ））；またはプロコロブス属（Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ）内（オリーブコロブス（Ｏｌｉｖｅ  Ｃｏｌｏ��ｕｓ、Ｐｒｏｃｏｌｏｂｕｓ  ｖｅｒｕｓ））のアフリカの群に由来してもよい。
【００２９】
コロブス亜科内で、好適な非チンパンジー霊長類は、別に、ラングール属（Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（ネパール・グレイラングール（Ｎｅｐａｌ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｃｈｉｓｔａｃｅｕｓ）；カシミール・グレイラングール（Ｋａｓｈｍｉｒ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｊａｘ）；タライ・グレイラングール（Ｔａｒａｉ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈｅｃｔｏｒ）；ハヌマンラングール（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｐｌａｉｎｓ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｎｔｅｌｌｕｓ）；マラバーラングール（Ｂｌａｃｋ−ｆｏｏｔｅｄ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈｙｐｏｌｅｕｃｏｓ）；南部平野グレイラングール（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐｌａｉｎｓ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｕｓｓｕｍｉｅｒｉ）；タフテッド・グレイラングール（Ｔｕｆｔｅｄ  Ｇｒａｙ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｓｅｍｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｒｉａｍ））；Ｔ．ベツルス（Ｔ．  ｖｅｔｕｌｕｓ）群またはトラキピテクス属（Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ）内（カオムラサキラングール（Ｐｕｒｐｌｅ−ｆａｃｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｖｅｔｕｌｕｓ）；ニルギリラングール（Ｎｉｌｇｉｒｉ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｊｏｈｎｉｉ））；トラキピテクス属のＴ．クリスタトゥス（Ｔ．  ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）群内（ジャワ・ルトン（Ｊａｖａｎ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）；シルバー・ルトン（Ｓｉｌｖｅｒｙ  Ｌｅａｆ  ＭｏｎｋｅｙまたはＳｉｌｖｅｒｙ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｃｒｉｓｔａｔｕｓ）；インドシナ・ルトン（Ｉｎｄｏｃｈｉｎｅｓｅ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｇｅｒｍａｉｎｉ）；テナセリム・ルトン（Ｔｅｎａｓｓｅｒｉｍ  Ｌｕｔｕｎｇ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｂａｒｂｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．オブスキュルス（Ｔ．  ｏｂｓｃｕｒｕｓ）群内（ダスキー・リーフモンキー（Ｄｕｓｋｙ  Ｌｅａｆ  ＭｏｎｋｅｙまたはＳｐｅｃｔａｃｌｅｄ  Ｌｅａｆ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｏｂｓｃｕｒｕｓ）；ファイレ・リーフモンキー（Ｐｈａｙｒｅ’ｓ  Ｌｅａｆ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｈａｙｒｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．ピレアトゥス（Ｔ．  ｐｉｌｅａｔｕｓ）群内（キャップ・ラングール（Ｃａｐｐｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｉｌｅａｔｕｓ）；ショートリッジ・ラングール（Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅｉ）；ゴールデンラングール（Ｇｅｅ’ｓ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｇｅｅｉ））；トラキピテクス属のＴ．フランコイシ（Ｔ．  ｆｒａｎｃｏｉｓｉ）群内（フランソワ・ルトン（Ｆｒａｎｃｏｉｓ’  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｆｒａｎｃｏｉｓｉ）；ハティン・ラングール（Ｈａｔｉｎｈ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｈａｔｉｎｈｅｎｓｉｓ）���ハクトウラングール（Ｗｈｉｔｅ−ｈｅａｄｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｐｏｌｉｏｃｅｐｈａｌｕｓ）；ラオス・ラングール（Ｌａｏｔｉａｎ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｌａｏｔｕｍ）；コシジロラングール（Ｄｅｌａｃｏｕｒ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｄｅｌａｃｏｕｒｉ）；インドネシア・クロラングール（Ｉｎｄｏｃｈｉｎｅｓｅ  Ｂｌａｃｋ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｔｒａｃｈｙｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｅｂｅｎｕｓ））；またはリーフモンキー属（Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ）内（クロカンムリリーフモンキー（Ｓｕｍａｔｒａｎ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｍｅｌａｌｏｐｈｏｓ）；シマ・スリリ（Ｂａｎｄｅｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）；サラワク・スリリ（Ｓａｒａｗａｋ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｃｈｒｙｓｏｍｅｌａｓ）；シロモモ・スリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｔｈｉｇｈｅｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）；シロビタイ・スリリ（Ｗｈｉｔｅ−ｆｒｏｎｔｅｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｆｒｏｎｔａｔａ）；ジャワ・スリリ（Ｊａｖａｎ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｃｏｍａｔａ）；トーマス・スリリ（Ｔｈｏｍａｓ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｔｈｏｍａｓｉ）；ホース・スリリ（Ｈｏｓｅ’ｓ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｈｏｓｅｉ）；クリイロ・リーフモンキー（Ｍａｒｏｏｎ  Ｌｅａｆ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｒｕｂｉｃｕｎｄａ）；メンタワイ・ラングール（Ｍｅｎｔａｗａｉ  ＬａｎｇｕｒまたはＪｏｊａ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｐｏｔｅｎｚｉａｎｉ）；ナツナ島スリリ（Ｎａｔｕｎａ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｓｕｒｉｌｉ、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ  ｎａｔｕｎａｅ））のラングール（Ｌａｎｇｕｒ（ｌｅａｆ  ｍｏｎｋｅｙ））群由来であってもよい
コロブス亜科内で、好適な非チンパンジー霊長類は、別に、ドゥクモンキー属（Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ）内（ドゥクモンキー（Ｒｅｄ−ｓｈａｎｋｅｄ  Ｄｏｕｃ、Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ  ｎｅｍａｅｕｓ）；クロアシドゥクモンキー（Ｂｌａｃｋ−ｓｈａｎｋｅｄ  Ｄｏｕｃ、Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ  ｎｉｇｒｉｐｅｓ）；ハイイロアシドゥクモンキー（Ｇｒａｙ−ｓｈａｎｋｅｄ  Ｄｏｕｃ、Ｐｙｇａｔｈｒｉｘ  ｃｉｎｅｒｅａ））；シシバナザル属（Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）（キンシコウ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｒｏｘｅｌｌａｎａ）；クロシシバナザル（Ｂｌａｃｋ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｂｉｅｔｉ）；ハイイロシシバナザル（Ｇｒａｙ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ｂｒｅｌｉｃｈｉ）；トンキンシシバナザル（Ｔｏｎｋｉｎ  Ｓｎｕｂ−ｎｏｓｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ、Ｒｈｉｎｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｖｕｎｃｕｌｕｓ））；テングザル属（Ｎａｓａｌｉｓ）内（テングザル（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｓ  Ｍｏｎｋｅｙ、Ｎａｓａｌｉｓ  ｌａｒｖａｔｕｓ））；またはコバナテングザル属（Ｓｉｍｉａｓ）内（メンタワイコバナテングザル（Ｐｉｇ−ｔａｉｌｅｄ  Ｌａｎｇｕｒ，  Ｓｉｍｉａｓ  ｃｏｎｃｏｌｏｒ））のシシバナ（Ｏｄｄ−Ｎｏｓｅｄ）群由来であってもよい。
【００３０】
本明細書において、用語「マーモセット」は、例えば、マーモセット亜属（原文のまま）の大西洋マーモセットに属する（コモンマーモセット（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）  ｊａｃｃｈｕｓ）；クロミミマーモセット（Ｂｌａｃｋ−ｔｕｆｔｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）  ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔａ）；クールマーモセット（Ｗｉｅｄ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）  ｋｕｈｌｉｉ）；ハクトウマーモセット（Ｗｈｉｔｅ−ｈｅａｄｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）；キガシラコモンマーモセット（Ｂｕｆｆｙ−ｈｅａｄｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）  ｆｌａｖｉｃｅｐｓ）；ミミナガコモンマーモセット（Ｂｕｆｆｙ−ｔｕｆｔｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）  ａｕｒｉｔａ））；ミコ亜属（Ｍｉｃｏ）のアマゾンマーモセットに属する（リオアカリマーモセット（Ｒｉｏ  Ａｃａｒｉ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ａｃａｒｉｅｎｓｉｓ）；マニコアマーモセット（Ｍａｎｉｃｏｒｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｍａｎｉｃｏｒｅｎｓｉｓ）；シルバーマーモセット（Ｓｉｌｖｅｒｙ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ａｒｇｅｎｔａｔａ）；ホワイトマーモセット（Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｌｅｕｃｉｐｐｅ）；エミリアマーモセット（Ｅｍｉｌｉａ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｅｍｉｌｉａｅ）；クロテマーモセット（Ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｎｉｇｒｉｃｅｐｓ）；マルカマーモセット（Ｍａｒｃａ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）ｍａｒｃａｉ）；オグロマーモセット（Ｂｌａｃｋ−ｔａｉｌｅｄ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｍｅｌａｎｕｒａ）；サンタレムマーモセット（Ｓａｎｔａｒｅｍ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｈｕｍｅｒａｌｉｆｅｒａ）；マウエスマーモセット（Ｍａｕｅｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ，Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｍａｕｅｓｉ）；キンシロフサミミマーモセット（Ｇｏｌｄ−ａｎｄ−ｗｈｉｔｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｃｈｒｙｓｏｌｅｕｃａ）；フサミミマーモセット（Ｈｅｒｓｈｋｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）；サテアマーモセット（Ｓａｔｅｒｅ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ、Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｍｉｃｏ）  ｓａｔｅｒｅｉ）、マーモセット属（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）内の任意の新世界ザル；カリベラ亜属（Ｃａｌｌｉｂｅｌｌａ）に属するルースマレン・ドワーフマーモセット（Ｒｏｏｓｍａｌｅｎｓ’  Ｄｗａｒｆ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ）（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃａｌｌｉｂｅｌｌａ）  ｈｕｍｉｌｉｓ）；またはセブエラ亜属（Ｃｅｂｕｅ���ｌａ）に属するピグミーマーモセット（Ｐｙｇｍｙ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ）（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  （Ｃｅｂｕｅｌｌａ）  ｐｙｇｍａｅａ）を意味する。
【００３１】
本明細書において、ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体の一部として発現される分子を指し、そして先行技術において典型的に指すような意味を有する。ヒトにおいて、ＣＤ３は、個々の型または独立に組み合わせた型の、すべての既知のＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３アルファおよびＣＤ３ベータを含む。非チンパンジー霊長類ＣＤ３抗原は、本明細書において、例えばマカカ・ファシキュラリスＣＤ３およびマカカ・ムラッタＣＤ３である。マカカ・ファシキュラリスにおいて、ＣＤ３は、ＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陰性およびＣＤ３イプシロンＦＮ−１８陽性、ＣＤ３ガンマおよびＣＤ３デルタを含む。マカカ・ムラッタにおいて、ＣＤ３は、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマおよびＣＤ３デルタを含む。好ましくは、前記ＣＤ３は、本明細書において、ＣＤ３イプシロンである。ヒトＣＤ３イプシロンは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００７３３に示され、そして配列番号１３４を含む。ヒトＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００００７３に示され、そして配列番号１４２を含む。ヒトＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００７３２に示され、そして配列番号１４３を含む。
【００３２】
マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陰性」（すなわち、上述の多型のため、モノクローナル抗体ＦＮ−１８によって認識されないＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ０７３９９４に示され、そして配列番号１３６を含む。
【００３３】
マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３イプシロン「ＦＮ−１８陽性」（すなわちモノクローナル抗体ＦＮ−１８によって認識されるＣＤ３イプシロン）は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ０７３９９３に示され、そして配列番号１３５を含む。マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３ガンマは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ０７３９９２に示され、そして配列番号１４４を含む。マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３デルタは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ０７３９９１に示され、そして配列番号１４５を含む。
【００３４】
マカカ・ムラッタの各ＣＤ３イプシロン、ガンマおよびデルタ相同体の核酸配列およびアミノ酸配列を、当該技術分野に記載される組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第３版  ２００１）によって同定し、そして単離してもよい。これは、本明細書に定義するような、他の非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン、ガンマおよびデルタ相同体にも準用される。
【００３５】
上に示すように、そして本明細書に開示するように、本発明の薬学的組成物に含まれる二重特異性一本鎖抗体の第一の結合ドメインは、アミノ酸配列「フェニルアラニン（Ｆ）−セリン（Ｓ）−グルタミン酸（Ｅ）」を含む、ヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３のエピトープにつながると予測される。当業者は、当該技術分野に知られる方法によって、一本鎖構築物の所定の抗体／結合分子および／または（本発明におけるような）所定の「結合ドメイン」によって検出されるエピトープを容易に推定する立場にあり、前記方法はまた、付随する実施例にも例示され、そしてウェスタンブロット分析、エピトープ・マッピングまたはｐｅｐｓｐｏｔ分析等を含むことも可能である。
【００３６】
前記の第一の結合ドメインによって検出されるはずのエピトープは、好ましくは、１５アミノ酸±３アミノ酸の範囲内である。想定されるのは（限定されるわけではないが）、「Ｆ−Ｓ−Ｅ」ストレッチ／「Ｆ−Ｓ−Ｅ」コアエピトープを含む、前記エピトープ中の１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３アミノ酸である。
【００３７】
以下の実施例に示すように、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の第一の結合ドメインが結合するヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３の最小コアエピトープは、アミノ酸残基「ＦＳＥ」を含むエピトープである。より具体的には、最小エピトープは、アミノ酸残基「ＦＳＥＸＥ」（配列番号２０２および２０４）を含み、メチオニンのロイシンへの置換は、２つの中性非極性アミノ酸残基間の保存されるアミノ酸置換である。最小エピトープは、不連続エピトープの一部であってもよい。本明細書において、用語「不連続エピトープ」は、所定のポリペプチド鎖、本明細書において、例えば、抗体に同時に結合されるＣＤ３（好ましくはＣＤ３イプシロン）内の少なくとも２つの非隣接アミノ酸配列ストレッチと理解されるものとする。これらのアミノ酸ストレッチは、異なる長さであってもよく、そしてまた、抗体および抗原の相互作用に関与してもよい。したがって、上に定義するような、最小（コア）エピトープに加えて、二重特異性一本鎖抗体は、１つ、２つまたはさらにより多くてもよい非隣接エピトープに同時に結合してもよい。最小（コア）エピトープと組み合わせた、この（これらの）非隣接エピトープ（単数または複数）が、抗原および抗体間の接触部位に相当することも可能である。この定義にしたがって、こうした同時結合は、直鎖型のポリペプチドのものであってもよい。ここで、伸長ループを形成しているポリペプチドであって、１つの領域において、例えば２つの配列が大体平行であり、そして互いに近接している、前記ポリペプチドを想像してもよい。直鎖配列中の非隣接エピトープが三次元構造を形成して、これらのエピトープをごく近接させることも可能である。この状態で、これらは、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体に同時に結合する。この定義にしたがって、上に示すポリペプチドの少なくとも２つの配列ストレッチ（最小（コア）エピトープを含む）の同時結合は、また、コンホメーションエピトープに対する抗体結合の形を取ってもよい。ここで、成熟ポリペプチドは、通常、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するような三次コンホメーションを形成している。この三次コンホメーションにおいて、ポリペプチド鎖は、例えば成熟してフォールディングしたポリペプチドの特定の領域の外部表面上に、上に示すような少なくとも２つの配列ストレッチが、空間的に近接するような方式で、フォールディングしており、ここで、次に、取り巻くポリペプチド配列との関連において、三次コンホメーションによって、認識される。
【００３８】
用語「細胞表面抗原」は、本明細書において、細胞表面上にディスプレイされる分子を意味する。大部分の場合、この分子は、三次型で、この分子の少なくとも部分が、細胞外部からアクセス可能なままであるように、細胞の形質膜中または形質膜上に位置するであろう。形質膜「中」に位置する細胞表面分子の限定されない例は、三次コンホメーションにおいて、親水性および疎水性の領域を含む、膜貫通タンパク質である。ここで、少なくとも１つの疎水性領域によって、細胞表面分子が、細胞の疎水性形質膜中に包埋されるか、または挿入されることが可能になり、一方、親水性領域は、形質膜のどちらかの側へ、それぞれ、細胞質および細胞外空間へと伸長される。形質膜「上」に位置する細胞表面分子の限定されない例は、パルミトイル基を所持するようにシステイン残基が修飾されたタンパク質、ファルネシル基を所持するようにＣ末端システイン残基が修飾されたタンパク質、またはグリコシル・ホスファチジル・イノシトール（「ＧＰＩ」）アンカーを所持するようにＣ末端が修飾されたタンパク質である。これらの基は、形質膜の外部表面へのタンパク質の共有結合を可能にし、ここで、該タンパク質は、抗体などの細胞外分子による認識に対してアクセス可能なままである。
【００３９】
本明細書において、「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞上に提示される抗原と理解することも可能である。これらの抗原は、細胞表面上に提示されていてもよく、分子の膜貫通部分および細胞質部分としばしば組み合わされる、細胞外部分を持つ。これらの抗原は、時々、腫瘍細胞のみによって提示され、そして正常なものによっては決して提示されないことも可能である。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上にのみ発現されることも可能であるし、または正常細胞に比較して、腫瘍特異的突然変異を示してもよい。この場合、これらは腫瘍特異的抗原と呼ばれる。より一般的であるのは、腫瘍細胞および正常細胞によって提示される抗原であり、そしてこれらは腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞に比較して過剰発現されていてもよいし、または正常組織に比較して腫瘍組織の構造がよりコンパクトでないため、腫瘍細胞において、抗原結合に関してアクセス可能である。本明細書における腫瘍抗原の限定されない例は、ＥｐＣＡＭ（Ｎａｕｎｄｏｒｆ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １００／１（２００２），  １０１−１１０）、ＥＧＦＲ（Ｌｉｕ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８２／１２（２０００），  １９９１−１９９９；  Ｂｏｎｎｅｒ，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  １２（２００２），  １１−２０；  Ｋｉｙｏｔａ，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６３／１（２００２），  ９２−９８；  Ｋｕａｎ，  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌ．  １７／２（２０００），  ７１−７８）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｋｕａｎ，  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌ．  １７／２（２０００），  ７１−７８）、またはカルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）（Ｕｅｍｕｒａ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８１／４（１９９９），  ７４１−７４６；  Ｌｏｎｇｃａｓｔｅｒ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１／１７（２００１），  ６３９４−６３９９；  Ｃｈｉａ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９／１６（２００１），  ３６６０−３６６８；  Ｂｅａｓｌｅｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１／１３（２００１），  ５２６２−５２６７）である。
【００４０】
ヒトおよび非チンパンジー霊長類核酸およびアミノ酸配列の対応する配列を、例えばＮＣＢＩデータベース中に見出すことも可能である。
ヒト細胞表面抗原（好ましくは腫瘍抗原）および非チンパンジー霊長類における前記細胞表面抗原の相同体（好ましくは腫瘍抗原）に結合する交差種特異的モノクローナル抗体を、上に示すように、生成してもよい。「相同体」は、本明細書において、異なる種において類似のまたは同一の生物学的機能を持つ遺伝子産物をコードし、そして共通の前駆体遺伝子に起因しうる遺伝子（例えばＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、細胞表面抗原または腫瘍抗原をコードする）を指す。ヒトおよび非チンパンジー霊長類腫瘍抗原に対する前記モノクローナル抗体の交差種特異性を、上に示すようなＦＡＣＳアッセイによって試験してもよい。あるいは、当業者に知られるような免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ、またはＥＬＩＳＡアッセイを用いてもよい。本明細書に記載するような交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体の第二の結合ドメインは、例えば、以下の実施例に記載する組換え技術によって、こうした交差種特異的モノクローナル抗体に由来してもよい。
【００４１】
用語、本明細書における二重特異性一本鎖抗体の「ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および／または活性および／または薬物動態学的プロフィールの評価」は、以下に示すように理解可能である。新規の候補薬剤は市販可能になる前に、厳しい試験を通過しなければならず、これは大まかに、動物における前臨床試験およびヒト患者における臨床期に細分可能である。動物における前臨床試験の目的は、薬剤候補が安全であり、そして有効であることを立証することである（例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；  ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；  ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｊｕｌｙ  １６，  １９９７を参照されたい）。
【００４２】
用語「薬剤」、「薬剤候補」または「薬学的組成物」は、本明細書において、本明細書に定義する二重特異性一本鎖抗体を指す。
以下の実施例に、ＷＯ  ９９／５４４４０に、またはＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０（２００５），  １−１２）によって記載されるように、例えば細胞傷害性アッセイによって、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の生物学的活性を決定してもよい。「有効性」または「ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性」は、本明細書において、例えば標準化ＮＣＩ反応基準を用いた、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体による療法に対する反応を指す。本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体を用いた療法の成功またはｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、意図される目的のための、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の有効性、すなわち二重特異性抗体が望ましい効果、すなわち病的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇を引き起こす能力を指す。限定されるわけではないが、白血球カウント、ディファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引を含む、それぞれの疾患実体に関する確立された標準法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を監視してもよい。さらに、多様な疾患特異的臨床化学パラメータおよび他の確立された標準法を用いてもよい。さらに、コンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国癌研究所基準に基づく反応評価に関して［Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ，  Ｈｏｒｎｉｎｇ  ＳＪ，  Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ，  Ｓｈｉｐｐ  ＭＡ，  Ｆｉｓｈｅｒ  ＲＩ，  Ｃｏｎｎｏｒｓ  ＪＭ，  Ｌｉｓｔｅｒ  ＴＡ，  Ｖｏｓｅ  Ｊ，  Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ，  Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ，  Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ，  Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ，  Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ，  Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ，  Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ，  Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ，  Ｈｏｐｐｅ  Ｒ，  Ｃａｎｅｌｌｏｓ  ＧＰ．  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  １９９９  Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、陽電子放出型断層撮影スキャニング、白血球カウント、ディファレンシャル、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、および多様なリンパ腫特異的臨床化学パラメータ（例えば乳酸デヒドロゲナーゼ）、ならびに他の確立された標準法を用いてもよい。
【００４３】
薬剤開発における別の主な課題は、薬物動態学的特性の予測可能な調節である。この目的に向けて、薬剤候補の薬物動態学的プロフィール、すなわち特定の薬剤が所定の状態を治療する能力を達成する薬物動態学的パラメータのプロフィールを確立する。特定の疾患実体を治療するための薬剤の能力に影響を及ぼす、薬剤の薬物動態学的パラメータには、限定されるわけではないが：半減期、分布体積、肝臓初回通過代謝および血清結合の度合いが含まれる。所定の薬剤の有効性は、上述のパラメータ各々によって影響を受けうる。「半減期」は、投与した薬剤の５０％が、生物学的プロセス、例えば代謝、排泄等を通じて排除される時間を意味する。
【００４４】
「肝臓初回通過代謝」によって、肝臓との最初の接触に際して、すなわち肝臓の最初の通過中に、薬剤が代謝される傾向を意味する。
「分布体積」は、例えば細胞内および細胞外空間、組織および臓器などのような、体の多様な区画全体の薬剤の保持の度合い、ならびにこれらの区画内での薬剤の分布を意味する。
【００４５】
「血清結合の度合い」は、薬剤が、血清タンパク質、例えばアルブミンと相互作用し、そしてこうしたタンパク質に結合して、薬剤の生物学的活性の減少または喪失を導く傾向を意味する。
【００４６】
薬物動態学的パラメータにはまた、投与した薬剤の所定の量に関する、生物学的利用能、遅延時間（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、追加の発症および／またはＣｍａｘも含まれる。
【００４７】
「生物学的利用能」は、血液区画における薬剤の量を意味する。
「遅延時間」は、薬剤投与と、血液または血漿におけるその検出および測定可能性の間の時間的遅延を意味する。
【００４８】
「Ｔｍａｘ」は、薬剤の最大血液濃度に達するまでの時間であり、そして「Ｃｍａｘ」は、所定の薬剤で得られる最大血液濃度である。生物学的効果に必要な、薬剤の血液または組織濃度に達する時間は、すべてのパラメータによって影響を受ける。上に概説するように、非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験で決定可能な交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体の薬物動態学的パラメータもまた、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０（２００５），  １−１２）による刊行物に記載される。
【００４９】
用語「毒性」は、本明細書において、不都合な事象または非常に不都合な事象に現れる、薬剤の毒性効果を指す。これらの副作用は、投与後の全身での薬剤の耐容性の欠如および／または局所耐容性の欠如を指すことも可能である。毒性にはまた、薬剤によって引き起こされる催奇形性または発癌性効果も含まれうる。
【００５０】
用語「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性」または「耐容性」は、本明細書において、投与直後に（局所耐容性）、そして薬剤適用のより長い期間の間に、非常に不都合な事象を誘導しない、薬剤の投与を定義する。例えば、治療中および追跡調査期間中に、定期的な間隔で、「安全性」、「ｉｎ  ｖｉｖｏ安全性」または「耐容性」を評価してもよい。測定には、臨床評価、例えば臓器所見、および実験室異常のスクリーニングが含まれる。臨床的評価を行って、そしてＮＣＩ−ＣＴＣおよび／またはＭｅｄＤＲＡ標準にしたがって、正常知見に対する逸脱を記録し／コード化してもよい。臓器所見には、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｖ３．０  （ＣＴＣＡＥ）に示されるような、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心臓不整脈、凝血等の基準が含まれることも可能である。試験してもよい実験室パラメータには、例えば血液学、臨床化学、凝血プロフィールおよび尿分析、ならびに血清、血漿、リンパまたは脊髄液、液体（ｌｉｑｕｏｒ）等の他の体液の検査が含まれる。したがって、例えば、身体検査、画像化技術（すなわち超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、技術デバイスを用いた他の測定（すなわち心電図）、生命徴候）によって、実験室パラメータを測定し、そして不都合な事象を記録することによって、安全性を評価してもよい。例えば、組織病理学的および／または組織化学的方法によって、本発明にしたがった使用および方法における、非チンパンジー霊長類の不都合な事象を調べてもよい。
【００５１】
用語「有効で、そして非毒性である用量」は、本明細書において、大きな毒性効果を伴わず、または本質的に伴わず、病的細胞の枯渇、腫瘍排除、腫瘍萎縮または疾患の安定化を引き起こすのに十分に高い、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の耐容性用量を指す。当該技術分野に記載される、例えば用量増大研究によって、こうした有効で、そして非毒性である用量を決定してもよく、そしてこうした用量は、非常に不都合な副作用（用量制限毒性、ＤＬＴ）を誘導する用量より低いはずである。
【００５２】
上述の用語はまた、例えば、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６；  ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；  ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｊｕｌｙ  １６，  １９９７にも言及される。
【００５３】
驚くべきことに、同一分子を前臨床動物試験にも使用可能な二重特異性抗体に基づくヒト用の療法剤を生成することが可能であることが見出された。これは、ヒト抗原に対する（および、遺伝的類似性のため、おそらくチンパンジー対応物に対する）結合に加えて、非チンパンジー霊長類、例えばマカクの前記抗原の相同体に結合する、二重特異性一本鎖抗体が予期せず同定されたためである。したがって、（ヒトから）系統発生的に遠い種において試験するための代理二重特異性一本鎖抗体を構築する必要性が消失する。その結果、臨床試験、ならびに続く市販認可において、ヒトに投与することを意図するのとまさに同じ二重特異性一本鎖抗体を動物前臨床試験で使用可能である。ヒトに対する後の投与におけるのと同じ分子を前臨床動物に使用可能であることによって、前臨床動物試験で得たデータが、ヒトの場合に適用不能になる危険性が実質的に排除されるか、または少なくとも非常に減少する。要するに、ヒトに実際投与するのと同じ分子を用いて動物における前臨床安全性データを得ると、ヒトに適したシナリオにデータを適用しうることがはるかに確実になる。対照的に、代理分子を用いる慣用的なアプローチでは、前記代理抗体は、前臨床安全性評価に用いる動物試験系に分子的に適応していなくてはならない。したがって、ヒト療法で用いる代理抗体は、実際に、薬物動態学的パラメータおよび／または生物学的活性における前臨床試験で用いるものとは配列が異なり、そしてまた、構造も異なる可能性もあり、その結果、前臨床動物試験で得たデータは、ヒトの場合に対して、限定された適用可能性／移行可能性しか持たない。代理分子の使用は、完全に新規の抗体構築物の構築、産生、精製および性質決定を必要とする。これによって、その分子を得るために必要なさらなる開発コストおよび時間が生じる。要するに、ヒト療法で用いるはずの実際の薬剤に加えて、代理を別個に開発しなければならず、したがって、２つの二重特異性一本鎖抗体分子の開発を二系統行わなければならない。したがって、本明細書に記載する交差種特異性を示す二重特異性抗体に基づく構築物の主な利点は、同一分子を、ヒトにおける、そして前臨床動物試験における、療法に使用可能であることである。
【００５４】
一方、例えば二重特異性抗体が結合するヒト分子を産生するトランスジェニック動物を生成するなど、ヒトに対する投与が意図される二重特異性抗体薬剤候補に、試験動物を適応させることもまた、もはや不要である。本発明の使用および方法にしたがって、交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体を、動物の遺伝子操作をまったく伴わずに、非チンパンジー霊長類における前臨床試験に直接使用可能である。当業者に周知であるように、試験動物を薬剤候補に適応させるアプローチは、動物を修飾したために、前臨床安全性試験で得た結果が、ヒトに関しては、より典型的でなく、そして予測的でないリスクを常に所持する。例えば、トランスジェニック動物においては、導入遺伝子がコードするタンパク質は、しばしば、非常に過剰発現される。したがって、このタンパク質抗原に対する抗体の生物学的活性に関して得られるデータは、該タンパク質がはるかにより低く、より生理学的なレベルで発現されるヒトに関しては、その予測価値が限定されうる。
【００５５】
本発明の交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体を使用する、さらなる利点は、動物試験のための種としてチンパンジーを使用するのを回避することにある。チンパンジーは、ヒトに最も近縁であり、そして最近、ゲノム配列決定データに基づいて、ヒト科に分類された（Ｗｉｌｄｍａｎら，  ＰＮＡＳ  １００（２００３），  ７１８１）。したがって、チンパンジーで得られるデータは、一般的に、ヒトに関して非常に予測性が高いと見なされる。しかし、絶滅危険種としての立場のため、医学的実験に使用可能なチンパンジーの数は、非常に制限される。したがって、上述のように、動物試験用のチンパンジーの維持は、コストがかかり、そしてかつ倫理的に問題である。本発明の二重特異性一本鎖抗体の使用は、得られる動物試験データの品質、すなわち適用可能性を害することなく、財政的な重荷および倫理的な反発の両方を回避する。この観点から、交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体の使用、および非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験のための本発明にしたがった方法は、チンパンジーにおける研究の妥当な代替物を提供する。
【００５６】
本発明の二重特異性一本鎖抗体のさらなる利点は、動物前臨床試験の一部として、例えば薬物動態学的動物研究の経過において用いた際に、多数回の血液試料を抽出可能であることである。非チンパンジー霊長類を用いると、より低次の動物、例えばマウスを用いるより、多数回の血液抽出が、はるかにより容易に達成可能である。多数の血液試料の抽出によって、本発明の二重特異性一本鎖抗体によって誘導される生物学的効果を決定するため、血液パラメータの連続試験が可能になる。さらに、多数回の血液試料の抽出によって、研究者が、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の薬物動態学的プロフィールを評価することが可能になる。さらに、血液パラメータ中に反映される前記二重特異性一本鎖抗体によって誘導されうる潜在的な副作用を、前記抗体投与の経過中に抽出される異なる血液試料において、測定することも可能である。これによって、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の潜在的な毒性プロフィールの決定が可能になる。
【００５７】
交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体を含む薬学的組成物、前記二重特異性抗体の使用、および本発明にしたがった方法の利点は、以下のように簡単に要約可能である：
第一に、前臨床試験で用いる、交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体は、ヒト療法で用いるものと同じである。したがって、薬物動態学的特性および生物学的活性が異なりうる２つの独立の分子を開発する必要性はもはやない。これは、例えば、慣用的な代理アプローチにおけるより、薬物動態学的結果が、より直接、ヒト設定に移行可能および適用可能である点で、非常に好適である。
【００５８】
第二に、ヒトにおける療法剤を調製するための、本発明にしたがった交差種特異性を示す二重特異性抗体の使用および方法は、代理アプローチよりも、よりコストおよび労働集約型でない。
【００５９】
第三に、動物試験用の種としてのチンパンジーの使用が回避される。
第四に、徹底的な薬物動態学的研究のため、多数回の血液試料を抽出可能である。
本発明のさらなる側面は、上に定義するような二重特異性一本鎖抗体の生物学的活性および／または有効性を決定する方法であって、前記二重特異性一本鎖抗体を、非チンパンジー霊長類に投与し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏ活性を測定する、前記方法に関する。
【００６０】
好ましくは、前記のｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、Ｔ細胞活性化、腫瘍ターゲット細胞枯渇、細胞傷害性、毒性、不都合な副作用の発生、および／またはサイトカイン放出である。前記ｉｎ  ｖｉｖｏ活性の決定法は、例えばＷＯ  ９９／５４４４０に示される。
【００６１】
本発明は、別の側面において、ヒト患者の治療のための薬学的組成物であって、
（ｉ）非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合する第一の結合ドメイン、および
（ｉｉ）細胞表面抗原に結合する第二の結合ドメイン
を含む二重特異性一本鎖抗体を含み、前記の第一の結合ドメインが、ヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３に結合する、前記薬学的組成物もまた提供する。
【００６２】
本発明にしたがって、用語「薬学的組成物」は、患者、好ましくはヒト患者に対する投与のための組成物に関する。好ましくは、薬学的組成物は、キャリアー、安定化剤および／または賦形剤の適切な配合物を含む。好ましい態様において、薬学的組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、クモ膜下腔内および／または鼻内投与のための、あるいは組織内への直接注入による組成物を含む。前記組成物を、注入または注射を介して患者に投与することが特に想定される。異なる方法によって、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所または皮内投与によって、適切な組成物の投与を達成してもよい。本発明の組成物は、薬学的に許容しうるキャリアーをさらに含んでもよい。適切な薬学的キャリアーの例は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、多様な種類の湿潤剤、無菌溶液、リポソーム等が含まれる。周知の慣用的方法によって、こうしたキャリアーを含む組成物を配合してもよい。例えば、非チンパンジー霊長類、例えばマカクに、本明細書記載の交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体を増加する用量で投与することによる用量増大研究によって決定可能な適切な用量で、これらの組成物を被験体に投与してもよい。上に示すように、本明細書記載の交差種特異性を示す二重特異性一本鎖抗体は、非チンパンジー霊長類における前臨床試験において、そしてヒトにおける薬剤として、同一の形で好適に使用可能である。これらの組成物をまた、他のタンパク質性および非タンパク質性薬剤と組み合わせて投与してもよい。これらの薬剤を、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体を含む組成物と同時に、あるいは時間的に定義した間隔および投与回数で、前記二重特異性一本鎖抗体の投与前または投与後に、別個に投与してもよい。投薬措置は、主治医および臨床要因によって決定されるであろう。医学業に周知であるように、いかなる患者のための投薬量も、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の化合物、性別、投与時間および経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与中の他の薬剤を含む、多くの要因に応じる。非経口投与のための調製物には、無菌水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性キャリアーには、水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル溶液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルのデキストロース溶液に基づくものなど）等が含まれる。例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガス等の保存剤および他の添加剤もまた、存在してもよい。さらに、本発明の組成物は、好ましくはヒト起源の、タンパク質性キャリアー、例えば血清アルブミンまたは免疫グロブリンを含んでもよい。本発明の組成物が、組成物の意図される使用に応じて、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体に加えて、さらなる生物学的活性剤を含んでもよいことが想定される。こうした剤は、胃腸系に作用する薬剤、細胞分裂阻害剤として作用する薬剤、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を防止する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えばコルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬剤、循環系に作用する薬剤および／または当該技術分野に知られるサイトカインなどの剤であってもよい。
【００６３】
本発明の薬学的組成物の好ましい態様にしたがって、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の第一の結合ドメインは、アミノ酸配列「ＦＳＥ」を含むヒトおよび非チンパンジー霊長類ＣＤ３のエピトープに結合する。アミノ酸残基「ＦＳＥ」を含む最小コアエピトープ、アミノ酸配列「ＦＳＥＸＥ」（配列番号２０２および２０４；式中、「Ｘ」はロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）に対応する）を含む最小エピトープ、または本明細書に定義するような非隣接エピトープは、好ましくは、長さ１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３アミノ酸残基である。好ましくは、前記エピトープは、長さ１３アミノ酸残基である。さらにより好ましくは、「ＦＳＥＸＥ」（配列番号２０２および２０４；式中、「Ｘ」はロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）に対応する）モチーフを持つエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列「ＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣ」（配列番号１９５）を含む。カニクイＣＤ３イプシロンにおいて、対応するエピトープは、「ＥＦＳＥＭＥＱＳＧＹＹＶＣ」（配列番号２０１）である。メチオニンのロイシンへの置換は、２つの中性非極性アミノ酸残基間の保存されるアミノ酸置換である。好ましいエピトープの対応する配列「ＥＦＳＥＸＥＱＳＧＹＹＶＣ」（式中、ＸはＬ（ロイシン）またはＭ（メチオニン）に対応する）を、配列番号２０７に示す。以下の実施例に示すように、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体は、このエピトープに結合するだけでなく、前記の最小エピトープに隣接しないアミノ酸ストレッチにも結合する。例えば、最小コアエピトープに加えて、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体は、前記ＣＤ３イプシロン鎖中に含有されるヒトＣＤ３イプシロンのエピトープ（単数または複数）に同時に結合可能である。したがって、前記エピトープは、さらに、アミノ酸配列「ＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤ」（配列番号２０３）を含んでもよい。前記鎖に含有されるカニクイＣＤ３イプシロンの追加の（またはさらなる）エピトープもまた、本明細書に定義するような結合分子、または結合ドメインを含む分子によって検出可能である。これらの追加のまたはさらなる配列は、アミノ酸配列「ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴ」（配列番号１９９）および「ＹＹＶＳＹＰＲＧＳＮＰＥＤ」（配列番号２００）を含むことも可能である。したがって、最小エピトープは、不連続エピトープまたはコンホメーションエピトープの一部である可能性が最も高い。当業者には明らかであるように、本発明の範囲には、この最小（コア）エピトープに結合するだけでなく、ＣＤ３（好ましくはＣＤ３イプシロン）内の１つ、２つまたはさらにより多い非隣接アミノ酸配列ストレッチにも結合する二重特異性一本鎖抗体が含まれる。以下の実施例に示す結果に基づいて、交差種特異的抗ＣＤ３抗体は、それぞれカニクイおよびヒトのＣＤ３イプシロンのアミノ酸ストレッチＦＳＥＭＥ（配列番号２０６）およびＦＳＥＬＥ（配列番号２０５）を含む、カニクイおよびヒト両方のＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基５７〜６１の領域で、ＣＤ３イプシロンに接触し、モチーフＦＳＥがエピトープコアを形成すると結論付けられる。アミノ酸ＦＳＥＬＥ（配列番号２０５）またはＦＳＥＭＥ（配列番号２０６）を含むヒトＣＤ３イプシロンのＥ−Ｆループ（アミノ酸５６〜６２）がアクセス可能である（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎら，  ＰＮＡＳ  １０１（２００４），  ｐ．７６７５−８０）ため、もっともらしいことではあるが、これまでのところ、同じかまたは非常に類似のエピトープを持つ単一のファミリーを形成すると考えられる、すべての抗ＣＤ３抗体の代表と見なされてきた、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ−３およびＵＣＨＴ−１のＣＤ３イプシロン鎖上の既知のエピトープと、この新たに定義されたエピトープとの重複がない（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、同書；  Ａｒｎｅｔｔら，  ＰＮＡＳ  １０１（２００４），  ｐ．１６２６８−７３）ために、この結果は驚くべきことである。要約すると、エピトープ「ＦＳＥ」および「ＦＳＥＸＥ」（配列番号２０４）は、ＵＣＨＴ−１またはＯＫＴ−３によって認識されるエピトープとは別個であり（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎら，  ＰＮＡＳ  １０１（２００４），  ｐ．７６７５−８０；  Ａｒｎｅｔｔら，  ＰＮＡＳ  １０１（２００４），  ｐ．１６２６８−７３）、そしてヒトおよびマカクＣＤ３に対する交差種特異的抗ＣＤ３抗体結合に特有である。好ましくは、最小エピトープは、アミノ酸配列「ＦＳＥＸＥ」（配列番号２０４）（式中、ＸはＬ（ロイシン）またはＭ（メチオニン）である）を含み、そして非極性中性アミノ酸残基の置換を表す。
【００６４】
本発明の薬学的組成物において、本発明の薬学的組成物の二重特異性一本鎖抗体の前記の第一の結合ドメインは、第二の結合ドメインのＣ末端に位置する。しかし、本発明のやはり一部は、「非チンパンジー霊長類ＣＤ３に対する第一の結合ドメイン」が、本明細書に定義する「細胞表面抗原に対する第二の結合ドメイン」のＮ末端に位置する、二重特異性構築物である。
【００６５】
以下の実施例に示すように、上述の利点は、第一の結合ドメイン（ＣＤ３に対する結合）が、第二の結合ドメインのＣ末端に位置する、すなわち第二の結合ドメインよりも、二重特異性一本鎖抗体のＣ末端により近い場合だけでなく、第一の結合ドメイン（ＣＤ３に対する結合）が、第二の結合ドメインのＮ末端に位置する、すなわち第二の結合ドメインよりも、二重特異性一本鎖抗体のＮ末端により近い場合にも達成可能である。したがって、本明細書に定義する二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインの配置は、第一の結合ドメインが、第二の結合ドメインのＣ末端に位置するものであってもよい。Ｖ鎖の配置は、ＶＨ（細胞表面抗原）−ＶＬ（細胞表面抗原）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）、ＶＨ（細胞表面抗原）−ＶＬ（細胞表面抗原）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）、ＶＬ（細胞表面抗原）−ＶＨ（細胞表面抗原）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）またはＶＬ（細胞表面抗原）−ＶＨ（細胞表面抗原）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）であってもよい。第一の結合ドメインが、第二の結合ドメインのＮ末端に位置する配置では、以下の順序が可能である：ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＬ（細胞表面抗原）−ＶＨ（細胞表面抗原）、ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（細胞表面抗原）−ＶＬ（細胞表面抗原）、ＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＬ（細胞表面抗原）−ＶＨ（細胞表面抗原）またはＶＬ（ＣＤ３）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＶＨ（細胞表面抗原）−ＶＬ（細胞表面抗原）。本明細書において、「のＮ末端」または「のＣ末端」およびその文法的変形は、二重特異性一本鎖抗体の絶対的なＮまたはＣ末端への配置ではなく、一次アミノ酸配列内での相対的な位置を意味する。したがって、限定されない例として、「第二の結合ドメインのＣ末端に位置する」第一の結合ドメインは、単に、第一の結合ドメインが、二重特異性一本鎖抗体内で、第二の結合ドメインのカルボキシル側に位置することを意味し、そしてさらなる配列、例えばＨｉｓタグ、あるいは別のタンパク質性または放射性同位体などの非タンパク質性化合物が、二重特異性一本鎖抗体の最終的なＣ末端に位置する可能性を排除しない。
【００６６】
薬学的組成物の別の好ましい態様において、第二の結合ドメインは、細胞表面抗原、および前記の細胞表面抗原の非チンパンジー霊長類相同体に結合する。
本発明のこの態様にしたがって、本明細書記載の二重特異性一本鎖抗体の第一および第二の結合ドメインはどちらも、それぞれ、前記の第一および第二の分子のヒトおよび非チンパンジー霊長類変異体の両方に特異的に結合する。上記記述の観点から、二重特異性一本鎖抗体の両側に十分な（交差種）特異性が存在し、したがって、第一および第二の分子両方に関して種間適合性が確実となり、そしてしたがって、前臨床動物研究で得たデータから、ヒトにおける投与の場合を最適に推定可能であるため、これは特に好適である。
【００６７】
好ましくは、前記細胞表面抗原は、腫瘍抗原である。さらにより好ましくは、前記腫瘍抗原は、ＥｐＣＡＭ（Ｎａｕｎｄｏｒｆ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １００／１（２００２），  １０１−１１０）、ＥＧＦＲ（Ｌｉｕ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８２／１２（２０００），  １９９１−１９９９；  Ｂｏｎｎｅｒ，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  １２（２００２），  １１−２０；  Ｋｉｙｏｔａ，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６３／１（２００２），  ９２−９８；  Ｋｕａｎ，  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌ．  １７／２（２０００），  ７１−７８）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｋｕａｎ，  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌ．  １７／２（２０００），  ７１−７８）、またはカルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）（Ｕｅｍｕｒａ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８１／４（１９９９），  ７４１−７４６；  Ｌｏｎｇｃａｓｔｅｒ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１／１７（２００１），  ６３９４−６３９９；  Ｃｈｉａ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９／１６（２００１），  ３６６０−３６６８；  Ｂｅａｓｌｅｙ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１／１３（２００１），  ５２６２−５２６７）である。
【００６８】
細胞表面抗原および／または腫瘍抗原として特に好ましいのはＥｐＣＡＭである。以下の実施例に示すように、本出願は、初めて、それぞれ、配列番号４７および４８に示すカニクイＥｐＣＡＭの細胞外ドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。前記配列は、ヒトおよびカニクイＥｐＣＡＭに対する交差種特異性を示す、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体の生成および性質決定のための必須のツールである。
【００６９】
本発明の薬学的組成物のさらなる好ましい態様において、第一の結合ドメインは、配列番号２、１１０または６のいずれかに示すようなアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。第一の結合ドメインのＶＨ領域が、少なくとも、配列番号１１２に示すようなアミノ酸配列を含む第三のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ３）、または配列番号１１３に示すようなアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３＊を含むことが想定され、そして好ましい。第一の結合ドメインは、配列番号１１４に示すようなアミノ酸配列を含む第二のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ２）をさらに含んでもよい。さらに、第一の結合ドメインは、配列番号１１５に示すようなアミノ酸配列を含む第一のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１）をさらに含んでもよい。したがって、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、言及したＣＤＲの１つ、２つまたは３つすべてを含んでもよい。言及したＣＤＲは、例えば、配列番号２および１１０に示すＶＨ領域に含まれる。
【００７０】
あるいは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号１１９に示すようなアミノ酸配列を含む第三のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ３）を含む。好ましくは、第一の結合ドメインは、配列番号１２０に示すようなアミノ酸配列を含む第二のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ２）をさらに含む。特に好ましくは、第一の結合ドメインは、配列番号１２１に示すようなアミノ酸配列を含む第一のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１）をさらに含む。したがって、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、言及したＣＤＲの１つ、２つまたは３つすべてを含んでもよい。上に示すＣＤＲは、例えば、配列番号６に示すＶＨ領域に含まれる。
【００７１】
薬学的組成物の別の好ましい態様において、第一の結合ドメインは、配列番号４、１４８、１６８または８のいずれかに示すようなアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む。第一の結合ドメインのＶＬ領域が、少なくとも、配列番号１１６に示すようなアミノ酸配列を含む第三のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ３）を含むことが想定され、そして好ましい。ＶＬ領域は、配列番号１１７に示すようなアミノ酸配列を含む第二のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ２）をさらに含んでもよい。ＶＬ領域は、配列番号１１８に示すようなアミノ酸配列を含む第一のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１）をさらに含んでもよい。したがって、第一の結合ドメインのＶＬ領域は、言及したＣＤＲの１つ、２つまたは３つすべてを含んでもよい。上に示すＣＤＲは、例えば、配列番号４、１４８および１６８に示すＶＬ領域に含まれる。
【００７２】
あるいは、第一の結合ドメインのＶＬ領域が、配列番号１６４に示すようなアミノ酸配列を含む第三のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ３）を含むことが想定される。好ましくは、第一の結合ドメインは、配列番号１６５に示すようなアミノ酸配列を含む第二のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ２）をさらに含む。特に好ましくは、第一の結合ドメインは、配列番号１６６に示すようなアミノ酸配列を含む第一のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１）をさらに含む。したがって、第一の結合ドメインのＶＬ領域は、言及したＣＤＲの１つ、２つまたは３つすべてを含んでもよい。上に示すＣＤＲは、例えば、配列番号８に示すＶＬ領域に含まれる。
【００７３】
好ましくは、第一の結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１１８）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１１７）、およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１１６）、ならびにＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１１５）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１１４）およびＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１１２）またはアミノ酸配列「ＶＳＷＦＡＹ」（配列番号１１３）を含むＣＤＲ−Ｈ３＊を含む。
【００７４】
あるいは、第一の結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１６６）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１６５）、およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１６４）、ならびにＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１２１）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１２０）およびＣＤＲ  Ｈ３（配列番号１１９）を含む。
【００７５】
さらにより好ましくは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり；あるいは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号１１０に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域は、配列番号１４８に示すようなアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり；あるいは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号１１０に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域は、配列番号１６８に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、あるいは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域は、配列番号８に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる。あるいは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域は、配列番号１４８に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる。あるいは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号１１０に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる。あるいは、第一の結合ドメインのＶＨ領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなり、そして第一の結合ドメインのＶＬ領域は、配列番号１６８に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる。
【００７６】
上述のように、第一の結合ドメインの可変領域の順序は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨであってもよい。どちらの配置も本発明の範囲内である。配列番号２のＶＨおよび配列番号４のＶＬを含む第一の結合ドメインに関しては、ＶＨ−ＶＬ配置を、配列番号９および１０に示し、一方、ＶＬ−ＶＨ配置を、配列番号１１および１２に示す。
【００７７】
配列番号１１０のＶＨおよび配列番号１４８のＶＬを含む第一の結合ドメインに関しては、ＶＨ−ＶＬ配置を、配列番号１４６および１４７に示す。配列番号１１０のＶＨおよび配列番号１６８のＶＬを含む第一の結合ドメインに関しては、ＶＨ−ＶＬ配置を、配列番号１６９および１７０に示し、一方、ＶＬ−ＶＨ配置を、配列番号１９３および１９４に示す。配列番号６のＶＨおよび配列番号８のＶＬを含む第一の結合ドメインに関しては、ＶＨ−ＶＬ配置を、配列番号１３および１４に示し、一方、ＶＬ−ＶＨ配置を、配列番号１５および１６に示す。
【００７８】
同様に、第二の結合ドメインの可変領域の順序は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨであってもよい。どちらの配置も、本発明の範囲内である。例えば、ヒトおよびカニクイＥｐＣＡＭに対する交差種特異性を示す第二の結合ドメインのＶＨ−ＶＬ配置を、配列番号５３および５４に示し、一方、ＶＬ−ＶＨ配置を、配列番号５５および５６に示す。
【００７９】
本発明の薬学的組成物の特に好ましい態様において、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体は：
（ａ）配列番号３８、４０、１２４、４２または４４のいずれかに示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３７、３９、１２５、４１または４３に示すような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）（ｂ）の相補的核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）遺伝暗号の結果として、（ｂ）のヌクレオチド配列に対して縮重している核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；および
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に、少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
上に示す好ましい態様では、第一の結合ドメイン（ＣＤ３に対する結合）のみが、交差種特異性を示す。
最も好ましくは、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体は：
（ａ）配列番号６６、６８、７４、７６、１２２、７０、７２、７８、８０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、または１９２のいずれかに示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６５、６７、７３、７５、１２３、６９、７１、７７、７９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、または１９１に示すような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）（ｂ）の相補的核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｆ）遺伝暗号の結果として、（ｂ）のヌクレオチド配列に対して縮重している核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；および
（ｇ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に、少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
上述の態様では、第一および第二の結合ドメインが、交差種特異性を示す。
薬学的組成物の別の好ましい態様において、非チンパンジー霊長類は、ヒヒ、マーモセットまたは旧世界ザルである。
【００８２】
薬学的組成物のさらにより好ましい態様において、旧世界ザルはマカク属のサルである。
最も好ましくは、マカク属のサルは、アッサムモンキー（Ａｓｓａｍｅｓｅ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・アッサメンシス（Ｍａｃａｃａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ））、バーバリマカク（Ｂａｒｂａｒｙ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シルバヌス（Ｍａｃａｃａ  ｓｙｌｖａｎｕｓ））、ボンネットモンキー（Ｂｏｎｎｅｔ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ラディアタ（Ｍａｃａｃａ  ｒａｄｉａｔａ）、ウスイロマカク（ＢｏｏｔｅｄまたはＳｕｌａｗｅｓｉ−Ｂｏｏｔｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）、（マカカ・オクレアタ（Ｍａｃａｃａ  ｏｃｈｒｅａｔａ））、スラウェシ−クレステッドマカク（Ｓｕｌａｗｅｓｉ−ｃｒｅｓｔｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ニグラ（Ｍａｃａｃａ  ｎｉｇｒａ））、タイワンザル（Ｆｏｒｍｏｓａｎ  ｒｏｃｋ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シクロプシス（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｃｌｏｐｓｉｓ））、ニホンザル（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｓｎｏｗ  ｍａｃａｑｕｅまたはＪａｐａｎｅｓｅ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ファスカタ（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ））、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙまたはｃｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ  ｍａｃａｑｕｅまたはｌｏｎｇ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅまたはＪａｖａ（登録商標）   ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））、シシオザル（Ｌｉｏｎ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シレヌス（Ｍａｃａｃａ  ｓｉｌｅｎｕｓ））、ブタオザル（Ｐｉｇｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ネメストリナ（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））、チベットマカク（Ｔｉｂｅｔａｎ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・チベタナ（Ｍａｃａｃａ  ｔｈｉｂｅｔａｎａ）、トンキアンマカク（Ｔｏｎｋｅａｎ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・トンキアナ（Ｍａｃａｃａ  ｔｏｎｋｅａｎａ））、トクモンキー（Ｔｏｑｕｅ  ｍａｃａｑｕｅ）（マカカ・シニカ（Ｍａｃａｃａ  ｓｉｎｉｃａ））、ベニガオザル（Ｓｔｕｍｐ−ｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅまたはＲｅｄ−ｆａｃｅｄ  ｍａｃａｑｕｅまたはＢｅａｒ  ｍｏｎｋｅｙ（マカカ・アークトイデス（Ｍａｃａｃａ  ａｒｃｔｏｉｄｅｓ））、またはムーアモンキー（Ｍｏｏｒ  ｍａｃａｑｕｅ（マカカ・マウルス（Ｍａｃａｃａ  ｍａｕｒｕｓ））である。
【００８３】
好ましくは、非チンパンジー霊長類ＣＤ３は、配列番号１３５、１３６、１４４または１４５に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなる。
本発明の薬学的組成物のさらなる態様にしたがって、前記の第一または第二の結合ドメインの少なくとも１つは、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植および／または脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ドメインである。
【００８４】
用語「ヒト」抗体は、本明細書において、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体が、ヒト生殖系列抗体レパートリー中に含有されるアミノ酸配列（単数または複数）を含むことを意味すると理解されるものとする。したがって、本明細書において定義する目的で、前記二重特異性一本鎖抗体は、こうしたヒト生殖系列アミノ酸配列（単数または複数）からなるならば、すなわち問題の二重特異性一本鎖抗体のアミノ酸配列（単数または複数）が、発現されたヒト生殖系列アミノ酸配列（単数または複数）と同一であるならば、ヒトと見なされてもよい。本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体はまた、最も近いヒト生殖系列配列（単数または複数）から、体細胞超変異のインプリントによって予期されるよりも多くは逸脱しない配列からなる場合、ヒトと見なされてもよい。さらに、多くの非ヒト哺乳動物、例えばマウスおよびラットなどのげっ歯類の抗体は、発現されたヒトの抗体レパートリーにおいてもまた存在すると予期されうるＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。発現されたヒトレパートリーに存在すると予期されうるヒトまたは非ヒト起源のこうした任意の配列（単数または複数）もまた、本発明の目的のため、「ヒト」と見なされるであろう。
【００８５】
本明細書において、用語「ヒト化された」、「ヒト化」、「ヒトのような」またはその文法的に関連する変形は、交換可能に用いられ、結合ドメインの少なくとも１つにおいて、非ヒト抗体またはその断片由来の少なくとも１つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む二重特異性一本鎖抗体を指す。ヒト化アプローチは、例えば、ＷＯ  ９１／０９９６８およびＵＳ  ６，４０７，２１３に記載される。限定されない例として、該用語は、少なくとも１つの結合ドメインの可変領域が、別の非ヒト動物、例えばげっ歯類由来の、単一のＣＤＲ領域、例えばＶＨの第三のＣＤＲ領域を含む場合、ならびに１つのまたは両方の可変領域が、それぞれの第一、第二および第三のＣＤＲの各々で、前記非ヒト動物由来のＣＤＲを含む場合を含む。二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインのすべてのＣＤＲが、例えばげっ歯類由来の対応する同等物によって置換されている場合、典型的には、「ＣＤＲ移植」と呼ばれ、そしてこの用語は、本明細書に用いるような用語「ヒト化」またはその文法的に関連する変形に含まれると理解されるものとする。用語「ヒト化」またはその文法的に関連する変形はまた、第一および／または第二の結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ内の１以上のＣＤＲ領域の置換に加えて、ＣＤＲ間のフレームワーク（「ＦＲ」）領域内にあるアミノ酸が、置換に用いたＣＤＲ領域が由来する動物におけるその位（単数または複数）のアミノ酸（単数または複数）に対応するように、こうした領域内の少なくとも１つの単一アミノ酸残基のさらなる突然変異（例えば置換）が達成されている場合も含む。当該技術分野に知られるように、ターゲット分子に対するＣＤＲドナーとして用いる非ヒト抗体の元来の結合親和性を回復するため、ＣＤＲ移植後、しばしば、こうした個々の突然変異がフレームワーク領域中に作製される。用語「ヒト化」は、上述のようなフレームワーク領域中のアミノ酸置換に加えて、非ヒト動物由来のＣＤＲ領域における、ヒト抗体由来の対応するＣＤＲ領域のアミノ酸（単数または複数）へのアミノ酸置換（単数または複数）をさらに含んでもよい。
【００８６】
本明細書において、用語「脱免疫化された」、「脱免疫化」またはその文法的に関連する変形は、前記野生型構築物を、ヒトにおいて非免疫原性にするかまたはより免疫原性でなくすることによる、元来の野生型構築物に対する第一および／または第二の結合ドメインの修飾を意味する。脱免疫化アプローチは、例えば、ＷＯ  ００／３４３１７、ＷＯ  ９８／５２９７６、ＷＯ  ０２／０７９４１５またはＷＯ  ９２／１０７５５に示される。用語「脱免疫化」はまた、Ｔ細胞エピトープを生成する減少した傾向を示す構築物にも関する。本発明にしたがって、用語「Ｔ細胞エピトープを生成する減少した傾向」は、特異的Ｔ細胞活性化につながるＴ細胞エピトープの除去に関する。さらに、「Ｔ細胞エピトープを生成する減少した傾向」は、Ｔ細胞エピトープの形成に寄与するアミノ酸の置換、すなわちＴ細胞エピトープの形成に必須のアミノ酸の置換を意味する。言い換えると、「Ｔ細胞エピトープを生成する減少した傾向」は、減少した免疫原性、または抗原非依存性Ｔ細胞増殖を誘導する能力の減少に関する。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、細胞内で、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され、そして続いて、Ｔ細胞活性化を誘発するため、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示されることが可能な短いペプチド配列に関する；とりわけ、ＷＯ  ０２／０６６５１４を参照されたい。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるペプチドに関しては、次いで、Ｔ細胞のこうした活性化は、Ｔ細胞が前記抗体を産生するように直接刺激することによって、抗体応答を生じさせうる。「Ｔ細胞エピトープを生成する減少した傾向」および／または「脱免疫化」は、当該技術分野に知られる技術によって測定可能である。好ましくは、Ｔ細胞増殖アッセイによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質の脱免疫化を試験してもよい。このアッセイにおいて、野生型または脱免疫化ペプチドのいずれかに対して反応した増殖に関して、世界中のＨＬＡ−ＤＲアレルの＞８０％に相当するドナー由来のＰＢＭＣをスクリーニングする。理想的には、細胞増殖は、抗原提示細胞に野生型ペプチドを装填した際にのみ検出される。あるいは、すべてのハプロタイプに相当するＨＬＡ−ＤＲ四量体を発現させることによって、脱免疫化を試験してもよい。これらの四量体を、ペプチド結合に関して試験するか、または増殖アッセイにおいて、抗原提示細胞の代わりに、ペプチドをこれらの四量体に装填してもよい。脱免疫化ペプチドがＨＬＡ−ＤＲハプロタイプ上に提示されるかどうかを試験するため、ＰＢＭＣに対する、例えば蛍光標識ペプチドの結合を測定してもよい。さらに、患者における投与後、脱免疫化分子に対する抗体が形成されているかどうかを決定することによって、脱免疫化を証明してもよい。好ましくは、ＣＤＲ領域の結合親和性が影響を受けないように、Ｔ細胞エピトープを誘導する減少した傾向を生成するため、抗体由来分子は、フレームワーク領域において脱免疫化されており、そして大部分のＣＤＲ領域は、修飾されない。１つのＴ細胞エピトープの除去さえ、免疫原性の減少を生じる。
【００８７】
本発明はまた、本明細書に定義するような二重特異性一本鎖抗体をコードする核酸配列を含む薬学的組成物も提供する。
本発明はさらに、上に定義するような核酸配列を含むベクターを含む薬学的組成物に関する。好ましくは、前記ベクターは、上に定義する前記核酸配列に作動可能であるように連結された制御配列をさらに含む。より好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターである。
【００８８】
さらなる側面において、本発明は、上に定義するベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主を含む薬学的組成物に関する。
本発明のさらなる側面は、免疫エフェクター細胞に対して活性化シグナルを提供可能なタンパク質性化合物をさらに含む、上に定義するような薬学的組成物に関する。
【００８９】
好ましくは、薬学的組成物は、キャリアー、安定化剤および／または賦形剤の適切な配合をさらに含む。
別の側面において、本発明は、上に定義するような薬学的組成物の産生のための方法であって、上に定義するような二重特異性一本鎖抗体の発現を可能にする条件下で、上に定義するような宿主を培養し、そして産生された二重特異性一本鎖抗体を培養から回収することを含む、前記方法に関する。
【００９０】
本発明のさらなる側面は、疾患の予防、治療または改善のための薬学的組成物の調製のための、上に定義するような、または上に定義するような方法によって産生されるような、二重特異性一本鎖抗体、上に定義するような核酸分子、上に定義するようなベクターまたは上に定義するような宿主の使用に関する。本発明の別の側面は、疾患の予防、治療または改善が必要な被験体における、疾患の予防、治療または改善のための方法であって、本発明の薬学的組成物、あるいは上に示す方法にしたがって産生されるような薬学的組成物の有効量を投与する工程を含む、前記方法に関する。
【００９１】
好ましくは、前記疾患は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、または免疫学的障害である。さらにより好ましくは、前記腫瘍性疾患は、悪性疾患、好ましくは癌である。ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する特異性を持つ、本明細書に定義するような交差種特異的二重特異性一本鎖抗体を、上皮癌および腫瘍の療法に用いてもよい。ＣＡＩＸに対する特異性を持つ、本明細書に定義するような交差種特異的二重特異性一本鎖抗体構築物を、低酸素（ｈｙｐｏｘｉｃａｌ）領域または区域を伴う腫瘍の治療に用いてもよい。さらに、前記ＣＡＩＸ構築物を、腎臓癌または子宮癌の治療に用いてもよい。本発明の使用または方法の別の好ましい態様において、本明細書で上に定義するような前記薬学的組成物は、さらなる薬剤と組み合わせて、すなわち同時療法の一部として投与するのに適している。前記同時療法において、場合によって、二重特異性一本鎖抗体と同じ薬学的組成物中に、活性剤が含まれてもよいし、または別個の薬学的組成物中に含まれてもよい。後者の場合、前記の別個の薬学的組成物は、二重特異性一本鎖抗体を含む前記薬学的組成物の投与前、投与と同時、または投与後の投与に適している。さらなる薬剤または薬学的組成物は、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物であってもよい。さらなる薬剤がタンパク質性化合物である場合、該タンパク質性化合物が、免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供可能であることが好適である。
【００９２】
好ましくは、前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物を、本明細書で上に定義するような二重特異性一本鎖抗体、本明細書で上に定義するような核酸分子、本明細書で上に定義するようなベクター、または本明細書で上に定義するような宿主と、同時にまたは同時でなく、投与してもよい。好ましくは、治療しようとする前記被験体はヒトである。
【００９３】
さらなる側面において、本発明は、本明細書で上に定義するような二重特異性一本鎖抗体、本明細書で上に定義するような核酸分子、本明細書で上に定義するようなベクター、または本明細書で上に定義するような宿主を含むキットに関する。
【００９４】
これらの態様および他の態様を、本発明の説明および実施例に開示し、そして含む。組換え技術および免疫学における方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第３版  ２００１；  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ；  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７；  Ｇｏｌｅｍｉｓ；  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００２に記載される。本発明にしたがって使用される抗体、方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば電子デバイスを用いて、公共の図書館およびデータベースから回収可能である。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．  ｎｃｂｉ．  ｎｌｍ．  ｎｉｈ．ｑｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ下で、インターネットで利用可能な公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用してもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏａｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｑｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｑｒ．ｏｒＱ／．などのさらなるデータベースおよびアドレスが当業者に知られ、そしてまた、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｖｃｏｓ．ｃｏｍを用いても得られうる。
【実施例】
【００９５】
以下の実施例で、本発明を例示する：
実施例１：交差種特異的抗体のフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析によって、マカクＣＤ３（以下で「カニクイ」とも称される、マカカ・ファシキュラリスのＣＤ３）に対する抗ヒトＣＤ３抗体の交差種特異性を試験した。試験した抗体は、ＷＯ  ９９／５４４４０に記載されるような抗ＣＤ３抗体（本出願の配列番号１６２に示すようなもの）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＯＫＴ−３（Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）、ＵＣＨＴ−１−ＰＥ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、それぞれ配列番号２および４に示すＶＨおよびＶＬ鎖を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）、ならびにそれぞれ配列番号６および８に示すＶＨおよびＶＬ鎖を含むＩｇであった。試料あたり２ｘ１０５細胞（Ｈ．  Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ、ドイツ・ハイデルベルグの厚意によって提供された、それぞれ、マカカ・ファシキュラリスおよびマカカ・ムラッタのマカクＴ細胞株）を、モノクローナル抗体の作用希釈（個々に滴定によって決定）を含有する２５μｌのＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．０５％ＮａＮ３で、４℃で３０分間染色した。ＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．０５％ＮａＮ３で細胞を２回洗浄し、そして必要な場合は二次抗体を添加した。二次抗体を添加した後、同じ溶液中で細胞を２回再洗浄し、そして１０，０００の生存細胞を獲得した。Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて、データを収集し、そして分析した。前方および側方分散電子ゲーティングを用いて、非生存細胞を排除した。アイソタイプ対照または二次抗体のみを陰性対照として用いた。図１からわかるように、それぞれ配列番号２および４に示すＶＨおよびＶＬ鎖を含むＩｇ、ならびにそれぞれ配列番号６および８に示すＶＨおよびＶＬ鎖を含むＩｇのみが、非チンパンジー霊長類ＣＤ３、すなわちマカクＣＤ３に対する交差種特異性を示した。
【００９６】
実施例２：ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞およびカニクイＰＢＭＣに対する、配列番号２および４を含むＩｇ、配列番号６および８を含むＩｇ、ならびにｍＡｂ  ＦＮ１８の結合に関するＦＡＣＳアッセイ
ＦＡＣＳアッセイを用いて、カニクイＰＢＭＣ上のカニクイＣＤ３抗原およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ４８３）上のヒトＣＤ３抗原に対する、配列番号２および４を含むＩｇ、配列番号６および８を含むＩｇ、ならびにｍＡｂ  ＦＮ１８の結合を試験した。この目的のため、それぞれ、２％ＦＣＳを含む５０μｌ  ＰＢＳ中で１：２５に希釈した、配列番号６および８を含むＦＩＴＣコンジュゲート化Ｉｇ、ならびに配列番号２および４を含むＦＩＴＣコンジュゲート化Ｉｇと、２．５ｘ１０５細胞をインキュベーションした。未希釈抗体５０μｌ中で、ＦＩＴＣコンジュゲート化ｍＡｂ  ＦＮ１８抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）とのインキュベーションを行った。ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ連邦共和国ハイデルベルグ）上で試料を測定した。アッセイ結果を図２に示す。配列番号２および４を含むＩｇに関しては、ヒト細胞に対して、ならびにカニクイ細胞に対して、強い抗原結合が検出された。配列番号６および８を含むＩｇに関しては、ヒト細胞に強い結合が観察されたが、カニクイ細胞に対してはより弱い結合が観察された。ＦＮ１８に関しては、カニクイ細胞に対する強い結合が観察可能であり、一方、ヒト細胞に対する結合はまったく検出不能であった。
【００９７】
実施例３：非ヒト霊長類に対する種特異性を示す、２つの抗ヒトＣＤ３抗体の可変領域の配列決定
実施例１および２の交差種特異的抗ＣＤ３  Ｉｇの可変領域の配列決定のため、ＰＣＲ（第一周期として、９３℃５分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の伸長；３０周期分の９３℃１分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の伸長；７２℃５分間の最終伸長）を用いて、抗体の可変領域のコード配列を増幅した。可変領域の５’領域の配列は知られていないため、単一のプライマーの代わりに、５’プライマーセットを、それぞれの抗体のアイソタイプにしたがって選択した一定の３’プライマーと組み合わせて用い、そして５’領域用の２つの異なるプライマーセットがあり、一方は軽鎖可変領域用であり、そしてもう一方は重鎖可変領域用であった。ＰＣＲ反応で用いるプライマーの組み合わせを以下に示す。
【００９８】
重鎖可変領域：
５’プライマー：
5'-SAGGTGCAGCTCGAGGAGTCAGGACCT-3' (配列番号81)
5'-GAGGTCCAGCTCGAGCAGTCTGGACCT-3' (配列番号82)
5'-CAGGTCCAACTCGAGCAGCCTGGGGCT-3' (配列番号83)
5'-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGGGCA-3' (配列番号84)
5'-GARGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGAGGA-3' (配列番号85)
5'-GAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGT-3' (配列番号86)
5'-GAAGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA-3' (配列番号87)
5'-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGAGCT-3' (配列番号88)
5'-GGGCTCGAGCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3' (配列番号89)
5'-GGGCTCGAGCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (配列番号90)
5'-GGGCTCGAGCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3' (配列番号91)
３’プライマー：
5’-gaggaattcgaactggacagggatccagagttcc-3’  (配列番号92)
5’-cggaattcgaatgacatggacatctgggtcatcc-3’  (配列番号93)
軽鎖可変領域：
５’プライマー：
5'-CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT-3' (配列番号94)
5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC-3' (配列番号95)
5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3' (配列番号96)
5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3' (配列番号97)
5'-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3' (配列番号98)
5'-CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3' (配列番号99)
5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3' (配列番号100)
5'-GGGGAGCTCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3' (配列番号101)
5'-GGGGAGCTCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3' (配列番号102)
5'-GGGGAGCTCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3' (配列番号103)
5'-GGGGAGCTCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT-3' (配列番号104)
３’プライマー：
5’-gaggaattcgaactgctcactggatggtggg-3’  (配列番号105)
5’-cggaattcgaacaaactcttctccacagtgtgacc-3’  (配列番号106)
標準的プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）（２００１））にしたがって、長さ３５０〜７００塩基対を持つすべてのＰＣＲ産物を単離し、精製し、そしてそれぞれの３’プライマーを用いて、配列決定した。
【００９９】
機能する可変領域コード配列に関して、得た配列を調べ、そして各抗体の重鎖および軽鎖に関して、可変領域をコードする配列を得た。本明細書に含まれる配列表中、交差種特異的抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１〜８に記載する。
【０１００】
実施例４：抗ヒトＥｐＣＡＭおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体のクローニング
前述のＣＤ３交差種特異性を含む二重特異性一本鎖抗体を生成するためには、増幅された可変領域をＰＣＲによって修飾して、対応する一本鎖Ｆｖ抗体断片を得なければならなかった。一本鎖Ｆｖ抗体中の軽鎖および重鎖可変領域の適切な配置を決定するため、各抗体に関して、２つの異なる一本鎖Ｆｖ抗体を生成した。この目的のため、２工程の融合ＰＣＲを用いて、可変領域をコードする配列を増幅した。ＰＣＲに基づくクローニング工程を行うのに適したプライマーセットを設計して、最終的に、ＶＨ−リンカー−ＶＬおよびＶＬ−リンカー−ＶＨの順で、１５アミノ酸リンカー（［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３）が２つの可変ドメインを連結する、一本鎖抗体を生じた。対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、本明細書に含まれる配列表の配列番号９〜１２および配列番号１３〜１６に記載する。
【０１０１】
要約すると、以下のプライマーの組み合わせを用いた：
配列番号１１および１２に示すＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖ抗体に関しては：配列番号１７〜２０。
配列番号９および１０に示すＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ抗体に関しては：配列番号２１〜２４。
配列番号１５および１６に示すＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖ抗体に関しては：配列番号２５〜２８。
配列番号１３および１４に示すＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ抗体に関しては：配列番号２９〜３２。
【０１０２】
一本鎖抗体を生成するため、それぞれのプライマーの組み合わせを用いた２つのＰＣＲを行った。このＰＣＲ中に、続く融合ＰＣＲ中に１５アミノ酸リンカーのコード配列を形成するように組み合わされる、それぞれのリンカープライマーから始まる重複する相補配列をＰＣＲ産物内に導入した。この増幅されたＶＨおよびＶＬドメインを次のＰＣＲで融合させ、このＰＣＲ中には、外部プライマーのみおよび両方のＰＣＲ産物が必要であった。生じたｓｃＦｖ抗体は、５’端で、ＢｓｐＥＩに対する制限酵素認識部位が先行する小さいＳｅｒ（Ｇｌｙ４）Ｓｅｒリンカーが隣接し、そして３’端には、６ヒスチジン・アフィニティタグが隣接し、その後、停止コドンおよびＳａｌＩに対する制限酵素認識部位が続く。第二の一本鎖Ｆｖ抗体は、明細書中に含まれる配列表の配列番号３３および３４に記載される「５−１０」と称される、抗ヒトＥｐＣＡＭ特異性であった。一本鎖Ｆｖ抗体の融合を達成し、そして真核発現を可能にするため、次いで、一本鎖Ｆｖ抗体のコード配列を、ＢｓｐＥＩ（Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４）Ｓｅｒリンカーの５’）およびＳａｌＩを介して、ヒトＥｐＣＡＭ特異的一本鎖Ｆｖ抗体５−１０およびＢｓｐＥＩに対する制限酵素認識部位のコード配列を含有するｐＥＦＤＨＦＲ発現ベクター（ｐＥＦＤＨＦＲは、Ｍａｃｋら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２（１９９５）７０２１−７０２５に記載された）内にクローニングした。ネズミ免疫グロブリン・リーダーペプチドのコード配列は、本明細書に含まれる配列表の配列番号３５および３６に記載され、Ｋｏｚａｋ翻訳開始コンセンサス配列およびＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位が先行する。標準的プロトコルにしたがって、構築物の単一クローンを単離し、そしてベクター中の隣接領域に相補的なプライマーを用いて配列決定した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）（２００１））。さらなる実験のため、各構築物のクローンを選択した。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、５−１０ＬＨｘ配列番号１２に関しては、本明細書に含まれる配列表の配列番号３７および３８に、５−１０ＬＨｘ配列番号１０に関しては、配列番号３９および４０に、５−１０ＬＨｘ配列番号１６に関しては、配列番号４１および４２に、そして５−１０ＬＨｘ配列番号１４に関しては、配列番号４３および４４に記載される。
【０１０３】
実施例５：ＣＨＯ細胞における５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、５−１０ＬＨｘ配列番号１６および５−１０ＬＨｘ配列番号１４二重特異性一本鎖抗体の発現
Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５，  ５３７−５６６に記載されるように、構築物の真核発現のため、二重特異性一本鎖抗体をコードする配列を含むプラスミドを、ＤＨＦＲ不全ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。最大５００ｎＭ  メトトレキセート（ＭＴＸ）の最終濃度まで、ＭＴＸ濃度を増加させることによって、構築物の遺伝子増幅を誘導した。次いで、トランスフェクション細胞を増大させ、そして１リットルの上清を産生した。Ｋｕｆｅｒら  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌ．１，  ｐ．１０（２００１）に記載されるように、培養上清から、構築物を最終的に精製した。
【０１０４】
実施例６：ＫａｔｏＩＩＩ細胞またはヒトＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞に対する、およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、５−１０ＬＨｘ配列番号１６および５−１０ＬＨｘ配列番号１４の結合に関するＦＡＣＳアッセイ
ＦＡＣＳアッセイを用いて、ＥｐＣＡＭを発現しているヒトＫａｔｏＩＩＩ細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１０３）上、またはヒトＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞上のＥｐＣＡＭ抗原に対する、およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のヒトＣＤ３抗原に対する、二官能性構築物の結合を試験した。この目的のため、２．５ｘ１０５細胞を、構築物を含有する細胞培養上清５０μｌとインキュベーションした。２％ＦＣＳを含む５０μｌ  ＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体、ＢＳＡ不含、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国ヒルデンから得た）を用いて、構築物の結合を検出した。第二の工程として、２％ＦＣＳ（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ連邦共和国ハンブルグから得た）を含む５０μｌ  ＰＢＳ中で１：１００に希釈した、試薬、Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲート化アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃガンマ断片特異的抗体を用いた。ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ連邦共和国ハイデルベルグ）上で試料を測定した。抗原結合は、抗ヒトＥｐＣＡＭ特異性に関して、ならびにヒトＣＤ３陽性細胞株に対する抗ＣＤ３特異性に関して、明らかに検出可能であった（図３を参照されたい）。
【０１０５】
実施例７：ターゲット細胞としてＫａｔｏＩＩＩ細胞を、そしてエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いた、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、および５−１０ＬＨｘ配列番号１４に関する細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞としてヒトＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を、そしてエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いた、ＦＡＣＳに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイによって、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、および５ＬＨ−１０ｘ配列番号１４の生物活性を分析した。ターゲット細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして製造者の使用説明書にしたがって、ＰＫＨ２６色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）で標識した。標識ターゲット細胞をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２回洗浄し、そして１０：１のＥ：Ｔ比で、新鮮に単離したエフェクター細胞と混合した。９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり、５０μｌ  ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ体積中の２ｘ１０４ターゲットおよび２ｘ１０５エフェクター細胞を添加した。ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で、異なる二重特異性一本鎖構築物の１０倍連続希釈を調製して、最終反応体積中、１０００ｎｇ／ｍｌの出発濃度を得た。５０μｌの異なる溶液を、対応するウェルに３つ組で添加した。個々の細胞傷害性混合物を、３７℃、５％ＣＯ２で、２４〜４８時間インキュベーションした。
【０１０６】
続いて、細胞傷害活性の測定を行った。この目的に向けて、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をウェルあたり１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加して、そしてプレートを室温で１０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳによって、ＰＫＨおよびＰＩ陽性および陰性ターゲット細胞の数を決定した。式：細胞傷害性（％）＝［（ＰＩ陰性細胞／対照中のＰＩ陰性細胞の平均）ｘ１００］にしたがって、構築物をまったく含有しない対照における生存ターゲット細胞の平均（ＰＫＨ陽性およびＰＩ陰性）を超えるＰＫＨ陽性およびＰＩ陰性（生存ターゲット細胞）の比として、細胞傷害性を測定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国サンディエゴ）によって、シグモイド用量反応殺細胞曲線を分析し、そして半最大殺細胞を誘導するＢｉＴＥ濃度（ＥＣ５０値）を計算した。このアッセイの結果を以下の図４に示す。すべての構築物は、細胞傷害活性を示した。５−１０ＬＨｘ配列番号１４、５−１０ＬＨｘ配列番号１２および５−１０ＬＨｘ配列番号１０の生じたＥＣ５０値は、それぞれ１．３ｐｇ／ｍｌ、１．５ｐｇ／ｍｌおよび５．８ｐｇ／ｍｌであった。
【０１０７】
実施例８：ターゲット細胞としてＫａｔｏＩＩＩ細胞を、そしてエフェクター細胞としてカニクイＰＢＭＣを用いた、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、および５−１０ＬＨｘ配列番号１４に関する細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞としてヒトＥｐＣＡＭ陽性ＫａｔｏＩＩＩ細胞を、そしてエフェクター細胞としてカニクイＰＢＭＣを用いた、ＦＡＣＳに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイによって、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、および５−１０ＬＨｘ配列番号１４の生物活性を分析した。
【０１０８】
ターゲット細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして製造者の使用説明書にしたがって、ＰＫＨ２６色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）で標識した。標識ターゲット細胞をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２回洗浄し、そして１０：１のＥ：Ｔ比で、新鮮に単離したエフェクター細胞と混合した。９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり、５０μｌ  ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ体積中の２ｘ１０４ターゲットおよび２ｘ１０５エフェクター細胞を添加した。ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で、異なる二重特異性一本鎖抗体の１０倍連続希釈を調製して、最終反応体積中、１０００ｎｇ／ｍｌの出発濃度を得た。５０μｌの異なる溶液を、対応するウェルに３つ組で添加した。個々の細胞傷害性混合物を、３７℃、５％ＣＯ２で、２４〜４８時間インキュベーションした。
【０１０９】
続いて、細胞傷害活性の測定を行った。この目的に向けて、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をウェルあたり１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加して、そしてプレートを室温で１０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳによって、ＰＫＨおよびＰＩ陽性および陰性ターゲット細胞の数を決定した。式：細胞傷害性（％）＝［（ＰＩ陰性細胞／対照中のＰＩ陰性細胞の平均）ｘ１００］にしたがって、構築物をまったく含有しない対照における生存ターゲット細胞の平均（ＰＫＨ陽性およびＰＩ陰性）を超えるＰＫＨ陽性およびＰＩ陰性（生存ターゲット細胞）の比として、細胞傷害性を測定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国サンディエゴ）によって、シグモイド用量反応殺細胞曲線を分析し、そして半最大殺細胞を誘導する二重特異性一本鎖抗体濃度（ＥＣ５０値）を計算した。このアッセイの結果を以下の図５に示す。５−１０ＬＨｘ配列番号１４、５−１０ＬＨｘ配列番号１２および５−１０ＬＨｘ配列番号１０は、細胞傷害活性を示した。５−１０ＬＨｘ配列番号１４、５−１０ＬＨｘ配列番号１２および５−１０ＬＨｘ配列番号１０の生じたＥＣ５０値は、それぞれ８７ｐｇ／ｍｌ、６９ｐｇ／ｍｌおよび５２ｐｇ／ｍｌであった。５−１０ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３（配列番号１６３に示すような脱免疫化抗ＣＤ３抗体）は活性をまったく示さなかった。これは、ｄｉ抗ＣＤ３抗体が、ヒトＣＤ３のみに結合し、カニクイＣＤ３には結合しないという事実による。
【０１１０】
実施例９：カニクイＥｐＣＡＭ抗原の配列決定およびカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞の生成
抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体の交差種特異性を試験するための、カニクイＥｐＣＡＭ抗原を得るために、まず、カニクイＥｐＣＡＭ抗原のコード配列を決定しなければならなかった。この目的に向けて、３頭の動物の結腸組織試料を、総ＲＮＡの単離およびランダムプライミング逆転写によるｃＤＮＡ合成のため、平行して用い、標準的プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）（２００１））にしたがってこれらを行った。ＰＣＲ（第一周期として、９３℃５分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の伸長；３５周期分の９３℃１分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の伸長；７２℃５分間の最終伸長）を用いて、ＥｐＣＡＭ抗原のコード配列を増幅した。カニクイＥｐＣＡＭ抗原のコード配列は知られていないため、ヒトＥｐＣＡＭ抗原の既知のコード配列（Ｓｚａｌａ  Ｓ．ら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ８７  （１９９０）；  ｐ．  ３５４２−６）にしたがって、ＰＣＲ反応に適したプライマー（配列番号４５に記載する５’プライマー、配列番号４６に記載する３’プライマー）を設計した。また、全抗原のコード配列の発現を可能にするようにも、プライマーを設計した。３つの試料に関しては、９６０塩基対のＰＣＲ産物を単離し、精製し、そしてＸｂａＩおよびＳａｌＩを介して、ｐＥＦＤＨＦＲ内にサブクローニングした。標準的プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）（２００１））にしたがって、ベクター中の隣接配列に相補的な適切な配列決定プライマーを用いて、各試料に関して、多数のクローンを配列決定した。
【０１１１】
カニクイＥｐＣＡＭ抗原の新規ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、本明細書に含まれる配列表中の配列番号４７および４８に記載する。
ヒトＥｐＣＡＭ抗原のコード配列と比較することによって、得た配列を調べた。図６に示すように、ヒトＥｐＣＡＭ抗原のコード配列、および３頭のカニクイザルの結腸試料から得た配列の間には、高い度合いの配列相同性がある。
【０１１２】
カニクイＥｐＣＡＭに関して陽性である細胞株を生成するため、検証されたヌクレオチド配列を持つ、ｐＥＦＤＨＦＲ内にサブクローニングされた、カニクイＥｐＣＡＭ抗原の前述のコード配列のクローンを、Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５，  ５３７−５６６に記載されるように、構築物の真核発現のため、ＤＨＦＲ不全ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。最大５００ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで、ＭＴＸ濃度を増加させることによって、構築物の遺伝子増幅を誘導した。次いで、ＦＡＣＳアッセイを用いて、カニクイＥｐＣＡＭの発現に関して、トランスフェクション細胞を試験した。この目的のため、２．５ｘ１０５個の細胞を、３つの異なるマウス抗ヒトＥｐＣＡＭハイブリドーマの上清５０μｌとインキュベーションした（Ｍ７９−  Ｆｏｇｌｅｒら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８（１９８８）；  ｐ．６３０３−８；  ３Ｂ１０−  Ｐａｓｓｌｉｃｋら  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８７（２０００），  ｐ．５４８−５５２；  ２Ｇ８−  Ｂａｌｚａｒら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７７（１９９９），  ｐ．６９９−７１２）。２％ＦＣＳ（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ連邦共和国ハンブルグから得た）を含む５０μｌ  ＰＢＳ中で１：１００に希釈した、Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲート化アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃガンマ断片特異的抗体を用いて、抗体の結合を検出した。ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ連邦共和国ハイデルベルグ）上で試料を測定した。抗ＥｐＣＡＭ抗体２Ｇ８は、交差種特異的と認識され、そしてカニクイＥｐＣＡＭの発現を確認した（図７を参照されたい）。非トランスフェクション細胞（黒塗りの曲線として示す）に比較した際、トランスフェクタント（白抜きの曲線として示す）は、２Ｇ８ハイブリドーマ上清とのみ結合を示し、これはしたがって、ヒトおよびカニクイＥｐＣＡＭに特異的な抗体種と認識される。
【０１１３】
実施例１０：非ヒト霊長類に交差種特異的である抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体の可変領域の配列決定
抗ＥｐＣＡＭ抗体２Ｇ８の可変領域の配列決定のため、それぞれのハイブリドーマ細胞株を、総ＲＮＡの単離およびランダムプライミング逆転写によるｃＤＮＡ合成に用い、標準的プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）（２００１））にしたがってこれらを行った。ＰＣＲ（第一周期として、９３℃５分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の伸長；３０周期分の９３℃１分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃１分間の伸長；７２℃５分間の最終伸長）を用いて、抗体の可変領域のコード配列を増幅した。可変領域の５’領域の配列は、知られていないため、５’プライマーの前述のセットを、３’プライマーを抗体のアイソタイプにしたがって選択した一定の３’プライマーと組み合わせて用いた。
【０１１４】
重鎖可変領域：
３’プライマー：
5’-TATGCAACTAGTACAACCACAATCCCTGGG-3’ (配列番号107)
軽鎖可変領域：
３’プライマー：
5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’ (配列番号108)
標準的プロトコル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）（２００１））にしたがって、長さ３５０〜７００塩基対を持つすべてのＰＣＲ産物を単離し、精製し、そしてそれぞれの３’プライマーを用いて、配列決定した。
【０１１５】
機能する可変領域コード配列に関して、得た配列を調べ、そして抗体の重鎖および軽鎖に関して、可変領域をコードする配列を単離した。本明細書に含まれる配列表中、可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４９〜５２に記載する。
【０１１６】
実施例１１：ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体のクローニング
前述のＣＤ３交差種特異性および前述のＥｐＣＡＭ交差種特異性を含む二重特異性一本鎖抗体分子を生成するためには、２Ｇ８抗体の増幅された可変領域をＰＣＲによって修飾して、対応する一本鎖Ｆｖ抗体断片を得なければならなかった。軽鎖および重鎖可変領域の異なる配置を持つ、２つの一本鎖Ｆｖ抗体を生成した。この目的のため、２工程の融合ＰＣＲを用いて、可変領域をコードする配列を増幅した。ＰＣＲに基づくクローニング工程を行うのに適したプライマーセットを設計して、最終的に、ＶＨ−リンカー−ＶＬおよびＶＬ−リンカー−ＶＨの順で、１５アミノ酸リンカー（［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３）が２つの可変ドメインを連結する、２Ｇ８一本鎖抗体を生じた。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、本明細書に含まれる配列表の配列番号５３〜５６に記載する。
【０１１７】
要約すると、以下のプライマーの組み合わせを用いた：
２Ｇ８  ＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖ抗体（以後、配列番号５５および５６に示す２Ｇ８ＬＨと称される）に関しては：配列番号５７〜６０。
【０１１８】
２Ｇ８  ＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ抗体（以後、配列番号５３および５４に示す２Ｇ８ＨＬと称される）に関しては：配列番号６１〜６４。
一本鎖抗体を生成するため、それぞれのプライマーの組み合わせを用いた２つのＰＣＲを行った。このＰＣＲ中に、重複する相補配列（それぞれのリンカープライマーから始まり、続く融合ＰＣＲ中に１５アミノ酸リンカーのコード配列を形成するように組み合わされる）をＰＣＲ産物内に導入した。この増幅されたＶＨおよびＶＬドメインをこの融合ＰＣＲで融合させ、このＰＣＲ中には、外部プライマーのみおよび両方のＰＣＲ産物が必要であった。生じたｓｃＦｖ抗体は、５’端で、ＢｓｒＧＩに対する制限酵素認識部位が隣接し、そして３’端には、ＢｓｐＥＩに対する制限酵素認識部位が続く。次いで、５−１０ＬＨ  ｓｃＦｖを置換して、上述のｐＥＦＤＨＦＲ発現ベクター内に、ＢｓｒＧＩおよびＢｓｐＥＩを介して、ＥｐＣＡＭ特異的一本鎖Ｆｖ抗体のコード配列をクローニングした。標準的プロトコルにしたがって、構築物の単一クローンを単離し、そしてベクター中の隣接配列に相補的なプライマーを用いて配列決定した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）（２００１））。さらなる実験のため、各構築物のクローンを選択した。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１２に関しては、本明細書に含まれる配列表の配列番号６５および６６に、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０に関しては、配列番号６７および６８に、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１６に関しては、配列番号６９および７０に、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１４に関しては、配列番号７１および７２に、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２に関しては、配列番号７３および７４に、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１０に関しては、配列番号７５および７６に、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１６に関しては、配列番号７７および７８に、そして２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１４に関しては、配列番号７９および８０に記載される。
【０１１９】
実施例１２：ＣＨＯ細胞における２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１２、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１６、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１４、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１０、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１６および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１４二重特異性一本鎖抗体の発現
Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５，  ５３７−５６６に記載されるように、構築物の真核発現のため、二重特異性一本鎖抗体をコードする配列を含むプラスミドを、ＤＨＦＲ不全ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。最大５００ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度まで、ＭＴＸ濃度を増加させることによって、構築物の遺伝子増幅を誘導した。次いで、トランスフェクション細胞を増大させ、そして１リットルの上清を産生した。Ｋｕｆｅｒら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌ．１，  ｐ．１０（２００１）に記載されるように、培養上清から、構築物を最終的に精製した。
【０１２０】
実施例１３：ＫａｔｏＩＩＩ細胞またはカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞、およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１２、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１６、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１４、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１０、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１６および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１４の結合に関するＦＡＣＳアッセイ
ＦＡＣＳアッセイを用いて、ＫａｔｏＩＩＩ細胞上のヒトＥｐＣＡＭ抗原またはカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞に対する、およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上のヒトＣＤ３抗原に対する、細胞培養上清由来の二官能性構築物の結合または精製二官能性構築物の結合を試験した。この目的のため、２．５ｘ１０５細胞を、５０μｌの上清と、または２％ＦＣＳを含む５０μｌ  ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの精製構築物と、インキュベーションした。２％ＦＣＳを含む５０μｌ  ＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体、ＢＳＡ不含、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国ヒルデンから得た）を用いて、構築物の結合を検出した。第二の工程として、２％ＦＣＳ（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ連邦共和国ハンブルグから得た）を含む５０μｌ  ＰＢＳ中で１：１００に希釈した、試薬、Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲート化アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃガンマ断片特異的抗体を用いた。ＦＡＣＳｓｃａｎ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ連邦共和国ハイデルベルグ）上で試料を測定した。抗原結合は、抗ＥｐＣＡＭ特異性に関して、ならびに抗ＣＤ３特異性に関して、明らかに検出可能であった（図８を参照されたい）。カニクイＥｐＣＡＭに対する結合に関する陰性対照として、ヒトＣＤ３（ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞）に対する結合を示すが、カニクイＥｐＣＡＭ（カニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞）に対する結合を示さない、５−１０ＬＨｘ配列番号１０構築物を含めた。５−１０ＬＨ部分は、ヒトＥｐＣＡＭにのみ結合する。
【０１２１】
実施例１４：ターゲット細胞としてカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞を、そしてエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いた、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２に関する細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞としてカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞を、そしてエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いた、ＦＡＣＳに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイによって、選択した二重特異性一本鎖抗体の生物活性を分析した。
【０１２２】
ターゲット細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして製造者の使用説明書にしたがって、ＰＫＨ２６色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）で標識した。標識ターゲット細胞をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２回洗浄し、そして１０：１のＥ：Ｔ比で、新鮮に単離したエフェクター細胞と混合した。９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり、５０μｌ  ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ体積中の２ｘ１０４ターゲットおよび２ｘ１０５エフェクター細胞を添加した。ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で、異なる二重特異性一本鎖抗体の１０倍連続希釈を調製して、最終反応体積中、５０００ｎｇ／ｍｌの出発濃度を得た。５０μｌの異なる溶液を、対応するウェルに３つ組で添加し、そして３７℃、５％ＣＯ２で、２４〜４８時間インキュベーションした。
【０１２３】
続いて、細胞傷害活性の測定を行った。この目的に向けて、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をウェルあたり１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加して、そしてプレートを室温で１０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳによって、ＰＫＨおよびＰＩ陽性ターゲット細胞の数を決定した。式：細胞傷害性（％）＝［（ＰＩ陽性細胞／ＰＫＩ陽性細胞）ｘ１００］にしたがって、ターゲット細胞総数（ＰＫＨ陽性）を超えるＰＩ陽性（死亡細胞）の比として、細胞傷害性を測定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国サンディエゴ）によって、シグモイド用量反応殺細胞曲線を分析し、そして半最大殺細胞を誘導する二重特異性一本鎖抗体濃度（ＥＣ５０値）を計算した。このアッセイの結果を以下の図９に示す。２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２の生じたＥＣ５０値は、それぞれ１１０３ｐｇ／ｍｌおよび３６３８ｐｇ／ｍｌであった。５−１０ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３（ヒトＣＤ３には結合するが、カニクイＣＤ３には結合しない、配列番号１６３に示すような抗ＣＤ３抗体の脱免疫化型）は、陰性対照として含まれ、そして活性をまったく示さなかった。これは、５−１０ＬＨが、ヒトＥｐＣＡＭのみに結合し、カニクイＥｐＣＡＭに対する交差種特異性を欠くという事実による。
【０１２４】
実施例１５：ターゲット細胞としてカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞を、そしてエフェクター細胞としてカニクイＰＢＭＣを用いた、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２に関する細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞としてカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞を、そしてエフェクター細胞としてカニクイＰＢＭＣを用いた、ＦＡＣＳに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイによって、選択した二重特異性一本鎖抗体の生物活性を分析した。
【０１２５】
ターゲット細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして製造者の使用説明書にしたがって、ＰＫＨ２６色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）で標識した。標識ターゲット細胞をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２回洗浄し、そして１０：１のＥ：Ｔ比で、新鮮に単離したエフェクター細胞と混合した。９６ウェル丸底プレート中、ウェルあたり、５０μｌ  ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ体積中の２ｘ１０４ターゲットおよび２ｘ１０５エフェクター細胞を添加した。ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で、異なる二重特異性一本鎖抗体の１０倍連続希釈を調製して、最終反応体積中、５０００ｎｇ／ｍｌの出発濃度を得た。５０μｌの異なる溶液を、対応するウェルに３つ組で添加した。個々の細胞傷害性混合物を、３７℃、５％ＣＯ２で、２４〜４８時間インキュベーションした。
【０１２６】
続いて、実施例１４に記載するように、細胞傷害活性の測定を行った。２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２の生じたＥＣ５０値は、それぞれ３９８１０ｐｇ／ｍｌおよび６０３５０ｐｇ／ｍｌであった。５−１０ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３（配列番号１６３に示すような抗ＣＤ３抗体の脱免疫化型）は陰性対照として含まれ、そして活性をまったく示さなかった。ｄｉ抗ＣＤ３は、ヒトＣＤ３のみに結合し、マカク／カニクイＣＤ３には結合できない。５−１０ＬＨは、ヒトＥｐＣＡＭにのみ結合し、カニクイＥｐＣＡＭに対する交差種特異性を欠く。
【０１２７】
実施例１６：ヒトおよびカニクイＣＤ３に結合するヒト様ＣＤ３抗体断片の生成
１．相関するヒトＶＨの決定
Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＤＮＡ分析ソフトウェアを用いて、配列番号２に示すネズミＶＨ鎖のアミノ酸配列を、ヒトＶＨ生殖系列配列のレパートリーに並列させた（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）。この分析に基づいて、ヒトＶＨセグメント３−７３をテンプレート配列として選択した（図１１を参照されたい）。ＣＤＲおよびフレームワークの定義は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームにしたがった。
【０１２８】
フレームワーク領域内の配列番号２に示すＶＨ鎖およびヒトＶＨセグメント３−７３の間で異なる、対応するアミノ酸残基を、ＤＮＡレベルで、ヒト残基に向けて突然変異させた。しかし、構築物は、元来のネズミＶＨ配列の潜在的に決定的なフレームワーク残基（Ｋａｂａｔ番号付けスキームにしたがう）：Ｈ−３０、Ｈ−４１、Ｈ４９、Ｈ８２ｂ、Ｈ−９３を保持した（図１２を参照されたい）。この方式で、ＣＤＲ内で、配列番号２配列に示すネズミＶＨ鎖と同一のアミノ酸配列を設計した。対応するアミノ酸配列を配列番号１１０に示し、一方、対応する核酸配列を配列番号１１１に示す；図１２もまた参照されたい。Ｎ末端ＶＨ配列を「ＥＶＱＬＬＥ」に変化させて、適切なＮ末端クローニング部位を生成した（図１２を参照されたい）。
【０１２９】
２．ヒト様ＶＨ領域の遺伝子合成およびクローニング
前述のヒト様ＶＨ領域の遺伝子を合成し（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ、ドイツ）、そして制限部位ＸｈｏＩおよびＢｓｔＥＩＩを介して、適切な細菌発現ベクター内にサブクローニングした。このベクターはすでに、ヒト様ＶＨ領域と対を形成するＶＬ鎖をコードする配列（配列番号１４８に示すアミノ酸配列；クローニングのため、配列番号４に示す元来のＶＬに比較して、Ｎ末端がわずかに変化した）を含有し、その後、ＦｌａｇおよびＨｉｓ−６タグが続き、そして機能するｓｃＦｖを大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の周辺質内に導くリーダー配列が先行した。クローニング後の機能するドメイン配置は、リーダー配列−ＶＨ−（Ｇ４Ｓ）３−ＶＬ−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ６であった。
【０１３０】
３．配列番号１１０に示すヒト様ＶＨ／配列番号１４８に示すＶＬに比較した、配列番号２に示す元来のネズミＶＨ／配列番号４に示すＶＬを有するｓｃＦｖ構築物の機能分析
ａ）元来のネズミＶＨ（配列番号２）およびＶＬ（配列番号４）、ならびにｂ）ＶＬ（配列番号１４８）と組み合わせたヒト様ＶＨ（配列番号１１０）をコードするプラスミドＤＮＡを、各々、標準的プロトコルにしたがって、大腸菌ＴＧ１に形質転換した。元来のネズミＶＨ（配列番号２）およびＶＬ（配列番号４）を含むＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９および１０に示す。ヒト様ＶＨ（配列番号１１０）およびＶＬ（配列番号１４８）を含むＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１４７および１４６に示す。
【０１３１】
９６ウェル形式で、大腸菌ＴＧ−１において、異なるクローンの発現を行った。１００μｌのＬＢ／０．１％グルコースに単一クローンの一晩培養物１０μｌを接種し、そして３７℃で４時間増殖させた。最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを添加した後、培養物を３０℃でさらに１８〜２０時間増殖させた。ウェルあたり、４０μｌのＢＥＬ緩衝液（４００ｍＭホウ酸、３２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０＋２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）を添加し、そして室温で１時間振盪した。遠心分離によって細胞破片を除去し、そしてフローサイトメトリー実験において上清を試験した。
【０１３２】
ヒトＴ細胞株ＨＰＢ−Ａｌｌおよびカニクイ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＴ細胞を、それぞれ、ヒトＣＤ３およびカニクイＣＤ３陽性細胞として用いた。典型的には、１００，０００の細胞を５０μｌのｓｃＦｖ含有細菌上清とインキュベーションし、そして氷上で３０分間インキュベーションした。
【０１３３】
細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、続いて５０μｌの抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａｈｉｓ、Ｒｏｃｈｅ）含有ＰＢＳに再懸濁し、そして氷上でさらに３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そしてＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体と、氷上でさらに３０分間インキュベーションした（この工程において、カニクイＰＢＭＣを抗ＣＤ２  ＦＩＴＣと同時インキュベーションして、ＰＢＭＣ混合物中のＴ細胞を同定した）。細胞を１回洗浄した後、適切な緩衝液中に細胞を再懸濁し、そしてフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）中で、抗体構築物に結合した細胞の陽性度を決定し、そして分析した。
【０１３４】
配列番号１０の対照ｓｃＦｖは、ヒトＣＤ３陽性細胞に対して、ならびにカニクイＣＤ３陽性細胞に対して、明らかなシフトを示し、これはヒトおよびカニクイＣＤ３両方への結合の指標である。ヒト様ＶＨを含有する配列番号１４６に示すｓｃＦｖもまた、ＣＤ３陽性ヒト（図１３を参照されたい）およびカニクイ細胞（図１４を参照されたい）に対する明らかな結合を示す。
【０１３５】
４．相関するヒトＶＬの決定
Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ＤＮＡ分析ソフトウェアを用いて、配列番号２に示すネズミＶＨ鎖のアミノ酸配列を、ヒトＶＬ生殖系列配列のレパートリーに並列させた（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）。この分析に基づいて、ヒトＶラムダ・セグメント７ａをテンプレート配列として選択した（図２１を参照されたい）。ＣＤＲおよびフレームワークの定義は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームにしたがう。
【０１３６】
フレームワーク領域内の配列番号４に示すネズミＶＬ鎖およびヒトＶラムダ・セグメント７ａの間で異なる、対応するアミノ酸残基を、ＤＮＡレベルで、ヒト残基に向けて突然変異させた。しかし、構築物は、元来のネズミＶラムダ配列の潜在的に決定的なフレームワーク残基（Ｋａｂａｔ番号付けスキームにしたがう）：Ｌ３６、Ｌ４６、Ｌ４９、Ｌ５７を保持した（図２１を参照されたい）。この方式で、ＣＤＲ内で、配列番号４配列に示すネズミＶＬ鎖と同一のアミノ酸配列を設計した。生成したヒト様ＶＬの対応するアミノ酸配列を配列番号１６８に示し、一方、対応する核酸配列を配列番号１６７に示す。Ｎ末端ＶＬ配列を「ＥＬ」に変化させて、適切なＮ末端クローニング部位を生成した。
【０１３７】
５．ヒト様ＶＬ領域の遺伝子合成およびクローニング
上述のヒト様ＶＬ領域の遺伝子を合成し（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ、ドイツ）、そして制限部位ＳａｃＩおよびＢｓｉＷＩを介して、適切な細菌発現ベクター内にサブクローニングした。このベクターはすでに、ヒト様ＶＬ領域（配列番号１６８に示すアミノ酸配列）と対を形成する上述のヒト様ＶＨ鎖をコードする配列（配列番号１１０に示すアミノ酸配列）を含有し、その後、ＦｌａｇおよびＨｉｓ−６タグが続き、そして機能するｓｃＦｖを大腸菌の周辺質内に導くリーダー配列が先行した。クローニング後の機能するドメイン配置は、リーダー配列−ＶＨ−（Ｇ４Ｓ）３リンカー−ＶＬ−Ｆｌａｇタグ−Ｈｉｓ６タグであった。
【０１３８】
６．配列番号１６８に示すヒト様ＶＬと組み合わせて配列番号１１０に示すヒト様ＶＨを有するｓｃＦｖ構築物の機能分析
ａ）元来のネズミＶＨ（配列番号２）およびＶＬ（配列番号４）、ならびにｂ）ヒト様ＶＬ（配列番号１６８）と組み合わせたヒト様ＶＨ（配列番号１１０）をコードするプラスミドＤＮＡを、各々、標準的プロトコルにしたがって、大腸菌ＴＧ１に形質転換した。元来のネズミＶＨ（配列番号２）およびＶＬ（配列番号４）を含むＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９および１０に示す。ヒト様ＶＨ（配列番号１１０）およびヒト様ＶＬ（配列番号１６８）を含むＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１６９および１７０に示す。ヒト様ＶＬ（配列番号１６８）およびヒト様ＶＨ（配列番号１１０）を含むＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１９３および１９４に示す。クローニング戦略が異なるため、配列番号１９４のＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号１７０のＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖの１つに比較して、３つのアミノ酸交換を示すが、前記ｓｃＦｖの結合能および特異性には影響がない。
【０１３９】
９６ウェル形式で、大腸菌ＴＧ−１において、異なるクローンの発現を行った。１００μｌのＬＢ／０．１％グルコースに単一クローンの一晩培養物１０μｌを接種し、そして３７℃で４時間増殖させた。最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを添加した後、培養物を３０℃でさらに１８〜２０時間増殖させた。ウェルあたり、４０μｌのＢＥＬ緩衝液（４００ｍＭホウ酸、３２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０＋２．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム）を添加し、そして室温で１時間振盪した。遠心分離によって細胞破片を除去し、そしてフローサイトメトリー実験において上清を試験した。
【０１４０】
ヒトＴ細胞株ＨＰＢ−Ａｌｌ、ならびに末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のヒトおよびカニクイＴ細胞を、それぞれ、ヒトＣＤ３およびカニクイＣＤ３陽性細胞として用いた。
典型的には、１００，０００の細胞を５０μｌのｓｃＦｖ含有細菌上清とインキュベーションし、そして氷上で３０分間インキュベーションした。
【０１４１】
ａ）ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして続いて５０μｌの抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａｈｉｓ、Ｒｏｃｈｅ）含有ＰＢＳに再懸濁し、そして氷上でさらに３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そしてＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体と、氷上でさらに３０分間インキュベーションした。細胞を１回洗浄した後、適切な緩衝液中に細胞を再懸濁し、そしてフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）中で、抗体構築物に結合した細胞の陽性度を決定し、そして分析した。
【０１４２】
ｂ）ヒトおよびカニクイＰＢＭＣ（Ｔ細胞を含有する）をＰＢＳで３回洗浄し、そして続いて５０μｌのビオチン化抗Ｈｉｓ抗体（ビオチン化Ｐｅｎｔａｈｉｓ、Ｒｏｃｈｅ）含有ＰＢＳに再懸濁し、そして氷上でさらに３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そしてＰＥ標識ストレプトアビジンと、氷上でさらに３０分間インキュベーションした。この工程において、ＰＢＭＣを抗ＣＤ２  ＦＩＴＣと同時インキュベーションして、ＰＢＭＣ混合物中のＴ細胞を同定した。
【０１４３】
ａ）またはｂ）由来の細胞を１回洗浄した後、適切な緩衝液中に細胞を再懸濁し、そしてフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）中で、抗体構築物に結合した細胞の陽性度を決定し、そして分析した。
【０１４４】
配列番号１０の対照ｓｃＦｖ（配列番号４のネズミＶＨ−配列番号２のネズミＶＬ）は、図２２に示すように、ヒトＣＤ３陽性細胞に対して、明らかなシフトを示す。ヒトおよびカニクイＴ細胞に対するシフトは、より明らかでなく、これは検出系の感度がより低いためである可能性が最も高い（図２３）。
【０１４５】
配列番号１７０のヒト様ｓｃＦｖ（配列番号１１０のヒト様ＶＨ−配列番号１６８のヒト様ＶＬ）は、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対して、陽性シフトを示し（図２２）、そしてヒトならびにカニクイＴ細胞に対する明らかなシフトを示す（図２３、上部パネル）。
【０１４６】
ｓｃＦｖと同じ特異性（すなわちＣＤ３イプシロンに対する特異性）を有する、実施例１に記載するネズミＩｇＧ抗体ｍＡｂ  Ｉ  １０μｇ／ｍｌとプレインキュベーションすると、上述のネズミｓｃＦｖまたはヒト様ｓｃＦｖで染色された細胞のシフトは、有意に減少し、ｓｃＦｖおよび元来のネズミ抗体の結合領域が類似であることが強調される；図２３、下部パネルを参照されたい。
【０１４７】
実施例１７：ヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロン両方に結合する交差種特異的抗ＣＤ３抗体に関するエピトープの決定
交差種特異的抗ＣＤ３抗体が結合するヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロンのエピトープを決定するため、どちらもヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロンに結合する、抗体Ｉ（配列番号２に示すＶＨ鎖および配列番号４に示すＶＬ鎖を含むＩｇ）および抗体ＩＩ（配列番号６に示すＶＨ鎖および配列番号８に示すＶＬ鎖を含むＩｇ）を用いて、エピトープ・マッピングを行った；図１もまた参照されたい。ペプチド・スポッティング（「ｐｅｐｓｐｏｔ」）分析のため、ヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列由来の重複する１３量体ペプチド（図１５を参照されたい）を、Ｃ末端を介して、Ｗｈａｔｍａｎ  ５０セルロース−β−アラニン膜に共有結合させ、一方、アセチル化Ｎ末端は未結合のままにした。該ペプチド中、アミノ酸システインは、対応するＣＤ３イプシロン配列に存在する場合はいずれも、アミノ酸セリンに交換された。生成した個々の１３量体ペプチド（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨによる）を、図１６および１７に示す。カニクイＣＤ３イプシロンに関しては、４３スポットを試験し、一方、ヒトＣＤ３イプシロンに関しては、４７スポットを試験した。２つの隣接するペプチドの重複配列の長さが１１アミノ酸になるように設定した。
【０１４８】
ｐｅｐｓｐｏｔ実験を以下のように行った。製造者のプロトコルにしたがって、膜をメタノールで１分間リンスし、１ｘＴＢＳで洗浄し、そして１ｘＴＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨのＢＭ化学発光ブロッティング基質（ＰＯＤ））で３時間ブロッキングした。一次抗体の一晩インキュベーション以外、室温で、オービタルシェーカー上、すべてのインキュベーションおよび洗浄工程を行った。ブロッキング溶液を廃棄した直後に、１ｘＴＢＳ／０．５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬中、上述の交差種特異的抗ＣＤ３抗体５または３μｇ／ｍｌと膜を、オービタルシェーカー上、４℃で一晩インキュベーションした。１ｘＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで１５分間４回洗浄した後、商業的に入手可能な西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化抗ＩｇＧ（Ｆ（ａｂ）２特異的）抗体またはアルカリホスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体（それぞれ、１ｘＴＢＳ／０．５％ブロッキング試薬中で、製造者の推奨にしたがって希釈）と２時間インキュベーションすることによって、結合した抗ＣＤ３抗体の検出を達成した。続いて、１ｘＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで膜を１５分間６回洗浄した。増進化学発光（１００：１に混合した、発光基質溶液Ａおよび出発溶液Ｂ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨのＢＭ化学発光ブロッティング基質（ＰＯＤ））およびＢｉｏＭａｘ  Ｆｉｌｍ（Ｋｏｄａｋ）によって、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを視覚化した。５−ブロモ−４−クロロ−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム液体基質系（Ｓｉｇｍａ）を用いて、アルカリホスファターゼを視覚化した。
【０１４９】
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化二次抗体の非特異的な結合を排除するため、二次抗体のみと膜をインキュベーションした。上述の実験におけるように、すべての他の工程を行った。
【０１５０】
対照ｐｅｐｓｐｏｔアッセイ（図１８（Ａ）を参照されたい）は、カニクイＣＤ３イプシロンのスポット３３および４２、ならびにヒトＣＤ３イプシロンのスポット３７、３９および４６上にシグナルを示した。これらのシグナルは、非特異的と見なされ、そしてさらには言及しない。
【０１５１】
１．抗ＣＤ３抗体Ｉ（配列番号２に示すＶＨ鎖および配列番号４に示すＶＬ鎖を含むＩｇ）
（ｉ）カニクイＣＤ３イプシロンに対する結合
カニクイＣＤ３イプシロン由来のペプチドに対する、交差種特異的抗ＣＤ３抗体Ｉ（配列番号２に示すＶＨ鎖および配列番号４に示すＶＬ鎖を含むＩｇ）の強い結合シグナルが、スポット１上、ならびにペプチド・スポット２４〜２９のストレッチ上に検出された（図１８（Ｂ））。後者は、カニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基４７〜６９に対応する（図１５を参照されたい）。この領域を含む１３量体ペプチドはすべて、１つの最小アミノ酸モチーフ５６〜５９（ＥＦＳＥ）を含有する。スポット１は、カニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基１〜１３（ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴ）に対応する。
【０１５２】
（ｉｉ）ヒトＣＤ３イプシロンに対する結合
交差種特異的抗ＣＤ３抗体Ｉは、ヒトＣＤ３イプシロン由来のペプチド・スポット１５、２８、３２、３３および４０に結合した（図１８（Ｂ）を参照されたい）。ペプチド・スポット２８〜３３のストレッチはヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基４７〜６９に対応し、そして最小アミノ酸モチーフ５７〜５９（ＦＳＥ）を含む。スポット１５および４０は、それぞれ、アミノ酸残基３０〜４２（ＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤ）および７１〜８３（ＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹ）に対応する。
【０１５３】
２．抗ＣＤ３抗体ＩＩ（配列番号６に示すＶＨ鎖および配列番号８に示すＶＬ鎖を含むＩｇ）
（ｉ）カニクイＣＤ３イプシロンに対する結合
交差種特異的抗ＣＤ３抗体ＩＩ（配列番号６に示すＶＨ鎖および配列番号８に示すＶＬ鎖を含むＩｇ）を用いたｐｅｐｓｐｏｔ分析は、ペプチド・スポット２７〜２９のストレッチ上、ならびにスポット３３上に強いシグナルを示した（図１９を参照されたい）。スポット２７〜２９に渡るストレッチは、カニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基５３〜６９に対応し（図１５を参照されたい）、１３量体ペプチドは、共通して、アミノ酸５７〜６１の最小ストレッチ（ＦＳＥＭＥ）を有する。スポット３３は、アミノ酸残基６５〜７７（ＹＹＶＳＹＰＲＧＳＮＰＥＤ）に相関する。
【０１５４】
（ｉｉ）ヒトＣＤ３イプシロンに対する結合
交差反応性抗ＣＤ３抗体ＩＩは、ヒトＣＤ３イプシロン由来のペプチド・スポット１５、１９、３２および３３、３７、３９および４０に結合した（図１９を参照されたい）。スポット１９は、ヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基３８〜４６ｄ（ＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤ）に対応する（図１５を参照されたい）。スポット３２〜３３の小さいストレッチは、最小ペプチドＦＳＥＬＥ（アミノ酸５７〜６１）を含有するアミノ酸残基５５〜６９に対応する。スポット３７および３９は、それぞれ、ヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基６５〜７７（ＹＹＶＳＹＰＲＧＳＫＰＥＤ）および６９〜８１（ＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹ）にマッチする。スポット１５および４０の相関は、すでに上述した。
【０１５５】
要約すると、どちらの交差種特異的抗ＣＤ３抗体も、ヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロン上の不連続エピトープを認識する。カニクイＣＤ３イプシロンに関しては、どちらの交差種特異的抗ＣＤ３抗体も、ペプチド・スポット２７〜２９の明らかな重複範囲を認識した（図１６を参照されたい）。この領域を含む１３量体ペプチドはすべて、１つの最小ペプチドＦＳＥＭＥ（カニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基５７〜６１）を含有する。スポット３２および３３に関して、両抗体が結合するヒトＣＤ３イプシロン上のペプチド交差点を決定可能である（図１７を参照されたい）。このセクションは、ヒトＣＤ３イプシロンの残基５７〜６１に対応する最小ペプチドＦＳＥＬＥを含有する。
【０１５６】
これらの結果に基づいて、交差種特異的ＣＤ３抗体断片が、それぞれ、カニクイおよびヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸ストレッチＦＳＥＭＥおよびＦＳＥＬＥを含む、カニクイおよびヒトＣＤ３イプシロン両方のアミノ酸残基５７〜６１の領域中で、ＣＤ３イプシロンに接触し、モチーフＦＳＥがエピトープコアを形成すると結論付けられる。この結果は、アミノ酸ＦＳＥＬＥまたはＦＳＥＭＥを含むヒトＣＤ３イプシロンのＥ−Ｆループ（アミノ酸５６〜６２；図１５を参照されたい）がアクセス可能である（Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎら，  ＰＮＡＳ  １０１（２００４），  ｐ．７６７５−８０）ため、もっともらしいことではあるが、しかしながら、これまでのところ、同じかまたは非常に類似のエピトープを持つ単一のファミリーを形成すると考えられる、すべての抗ＣＤ３抗体の代表と見なされてきた、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３およびＵＣＨＴ１のＣＤ３イプシロン鎖上の既知のエピトープと、この新たに定義されたエピトープとの重複がない（図１７を参照されたい；Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、同書；  Ａｒｎｅｔｔら，  ＰＮＡＳ  １０１（２００４），  ｐ．１６２６８−７３を参照されたい）ために、驚くべきことである。
【０１５７】
実施例１８：ヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロン両方に結合するヒト様交差種特異的抗ＣＤ３抗体に関するエピトープの決定
実施例１７に記載するようなペプチド・スポッティング（「ｐｅｐｓｐｏｔ」）分析によって、実施例１６で記載するヒト様交差種特異的抗ＣＤ３抗体断片（配列番号１７０）のエピトープマッピングを行った。この目的のため、配列番号１７０に示す前記一本鎖Ｆｖ断片を、配列番号１１０に示すようなＶＨ領域を含むネズミ・ガンマ１重鎖および配列番号１６８に示すようなＶＬ領域を含むカッパ軽鎖を持つ、全長ＩｇＧ抗体に変換した。ｐｅｐｓｐｏｔ実験の手順は、実施例１７で用いるプロトコルと同一であった。
【０１５８】
ｐｅｐｓｐｏｔ膜を、４μｇ／ｍｌの言及したＩｇＧ１抗体、および結合したＣＤ３抗体を検出するアルカリホスファターゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベーションした。第二の膜を、アルカリホスファターゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体のみとインキュベーションして、検出抗体の非特異的結合を明らかにした。
【０１５９】
対照ｐｅｐｓｐｏｔアッセイ（図２４（Ａ）を参照されたい）で検出された以下のシグナルは、非特異的と見なされ、そしてさらには言及しない：カニクイＣＤ３イプシロンの染色されたスポット・ストレッチ１０〜１３、１５〜１９、３０〜３２、３５〜４１、ならびにヒトＣＤ３イプシロンの２〜６、１４〜１９、２６、３４〜３９および４６。
【０１６０】
（ｉ）カニクイＣＤ３イプシロンに対する結合
交差種特異的抗ＣＤ３抗体（配列番号１１０に示すＶＨ鎖および配列番号１６８に示すＶＬ鎖を含むネズミＩｇＧ１）は、カニクイＣＤ３イプシロン由来のペプチド・スポット１および３３、ならびにペプチド・スポット２４〜２９のアミノ酸ストレッチに結合した（図２４（Ｂ））。スポット２４〜２９に渡るストレッチは、カニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基４７〜６９に対応し（図１５および１６を参照されたい）、一方、１３量体ペプチドは、共通して、アミノ酸５６〜５９の最小ストレッチ（ＥＦＳＥ）を有する。スポット１およびスポット３３は、それぞれ、カニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基１〜１３（「ＱＤＧＮＥＥＭＧＳＩＴＱＴ」；配列番号１９９）および６５〜７７（「ＹＹＶＳＹＰＲＧＳＮＰＥＤ」；配列番号２００）に対応する。
【０１６１】
（ｉｉ）ヒトＣＤ３イプシロンに対する結合
ヒトＣＤ３イプシロン由来のペプチドに対する、言及した交差種特異的抗ＣＤ３  ＩｇＧ１抗体の結合シグナル（図２４（Ｂ）を参照されたい）は、スポット２８および３３上に見られ、これは、それぞれ、ヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸残基４７〜５９および５７〜６９に対応する（図１７を参照されたい）。２つの染色されたスポットは、最小アミノ酸モチーフ５７〜５９（ＦＳＥ）を含む。
【０１６２】
ヒト様交差種特異的抗ＣＤ３抗体は、実施例１および１７に記載する抗体ＩおよびＩＩと同じ、ヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロン上の不連続エピトープを認識する。ペプチド膜上の前記ヒト様抗体の結合シグナルによって、コア領域としての、カニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列「ＦＳＥＭＥ」（アミノ酸残基５７〜６１）に対応するペプチド交差点、およびヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列「ＦＳＥＬＥ」（アミノ酸残基５７〜６１）に対応するペプチド交差点が明らかになる。これは、カニクイおよびヒトＣＤ３イプシロン両方の上の、交差種特異的抗ＣＤ３抗体ＩおよびＩＩに関して決定されたエピトープと一致する（実施例１７を参照されたい）。
【０１６３】
実施例１９：ヒト様交差種特異的抗ＣＤ３抗体に関する、ヒトＣＤ３イプシロン上の同定したエピトープの検証
ヒトＣＤ３イプシロン上の、実施例１６で記載したヒト様交差種特異的抗ＣＤ３抗体断片のエピトープを検証するため、ヒトＣＤ３イプシロン上のアミノ酸残基「ＦＳＥＬＥ」の定義した結合領域を含む１３量体ペプチドを用いたドットブロットアッセイによって、実施例１８で決定したような同定した結合領域をさらに分析した。このペプチドは、ヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列「ＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣ」（配列番号１９５）を含む。ペプチドは、２つの型で存在し、そしてＮまたはＣ末端のいずれかでビオチン化されている。Ｎ末端標識の場合、短いリンカーがペプチドとビオチンを連結する。実施例１８に記載するように、抗体断片を、配列番号１１０に示すようなＶＨ領域を含むネズミ・ガンマ１重鎖および配列番号１６８に示すようなＶＬ領域を含むカッパ軽鎖を持つ、ネズミＩｇＧ形式に変換した。
【０１６４】
ドットブロットを以下のように行った。ニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ  ＢＡ  ８５、０．４５μｍ）上にペプチドを固定するため、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  ＳｃｈｕｅｌｌのＭｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉスポットブロット系を用いた。真空を用いて、１００μｌ  ＴＢＳ中の各７５μｇのペプチドを、膜を通じて、ろ過した。ろ過工程後、膜を１ｘＴＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨのＢＭ化学発光ブロッティング基質（ＰＯＤ））で２時間ブロッキングした。一次抗体の一晩インキュベーション以外、室温で、オービタルシェーカー上、すべてのインキュベーションおよび洗浄工程を行った。ブロッキング溶液を廃棄した直後に、１ｘＴＢＳ／０．５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬中、上述の抗ＣＤ３抗体３μｇ／ｍｌと膜を、オービタルシェーカー上、４℃で一晩インキュベーションした。対照として、ヒトＣＤ３イプシロンに結合する抗ＣＤ３ネズミＩｇＧ１抗体ＵＣＨＴ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、同量の２つのペプチドでブロッティングした第二の膜に適用した。１ｘＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで１０分間３回洗浄した後、商業的に入手可能なアルカリホスファターゼ・コンジュゲート化抗ＩｇＧ抗体（１ｘＴＢＳ／０．５％ブロッキング試薬中で、製造者の推奨にしたがって希釈）と２時間インキュベーションすることによって、結合した抗ＣＤ３抗体の検出を達成した。続いて、１ｘＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで膜を１０分間３回洗浄した。５−ブロモ−４−クロロ−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム液体基質系（Ｓｉｇｍａ）を用いて、アルカリホスファターゼを視覚化した。
【０１６５】
配列番号１１０に示すＶＨ領域および配列番号１６８に示すＶＬ領域を含む、言及したＣＤ３特異的抗体は、膜にブロッティングした、どちらの型のペプチド「ＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣ」（配列番号１９５）にも結合した（図２５（Ａ）（１）および（２）を参照されたい）が、抗ＣＤ３ネズミＩｇＧ抗体ＵＣＨＴ１に関しては、結合はまったく得られなかった（図２５（Ｂ）（１）および（２）を参照されたい）。抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１によって認識されるエピトープは、例えば、Ｋｊｅｒ−Ｎｉｅｌｓｅｎら、同書；  Ａｒｎｅｔｔら，  ＰＮＡＳ（２００４），  ｐ．１６２６８−７３に記載される。
【０１６６】
これらの結果は、本明細書に記載する抗ＣＤ３抗体（配列番号１１０に示すＶＨ領域および配列番号１６８に示すＶＬ領域を含む）の新たに定義されたエピトープの同定を支持する。前記エピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン鎖上のアミノ酸残基「ＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣ」（配列番号１９５）に対応し、そしてアミノ酸ストレッチ「ＦＳＥＬＥ」を含む。
【０１６７】
実施例２０：カニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の生成
ＥＧＦＲ陽性カニクイ結腸のショック凍結片を用いて、キット・マニュアル（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙミニキット）の使用説明書にしたがって単離した総ＲＮＡを得た。得たＲＮＡを、ランダムプライミング逆転写によるｃＤＮＡ合成に用いた。ＥＧＦＲ抗原の全長配列のクローニングのため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
5’ EGFR AG XbaI 5’-ggtctagagcatgcgaccctccgggacggccggg-3’ (配列番号197)
3’ EGFR AG SalI 5’-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3’ (配列番号198)
ＰＣＲ（第一周期として、９３℃５分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃２分間の伸長；３０周期分の９３℃１分間の変性、５８℃１分間のアニーリング、７２℃２分間の伸長；７２℃５分間の最終伸長）を用いて、コード配列を増幅した。続いて、ＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、適切に消化した発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ内に連結し、そして大腸菌に形質転換した。標準的プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））にしたがって、前述の方法を行った。構築物の真核発現のため、ＤＨＦＲ不全ＣＨＯ細胞内に、配列が検証されたヌクレオチド配列を持つクローンをトランスフェクションした。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５，  ５３７−５６６に記載されるように、ＤＨＦＲ不全ＣＨＯ細胞における真核タンパク質発現を行った。ＭＴＸ濃度を、最大２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度に増加させることによって、構築物の遺伝子増幅を行った。
【０１６８】
実施例２１：ＥＧＦＲおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体の生成
一般的に、各々、ヒトおよびカニクイＣＤ３抗原に対する結合特異性を持つドメイン、ならびにヒトおよびカニクイＥＧＦＲ抗原に対する結合特異性を持つドメインを含む、二重特異性一本鎖抗体分子を、以下の表１に示すように名付ける：
【０１６９】
【表１】
2009511521.tif 000003
【０１７０】
遺伝子を合成し、そして続いて、ヒトおよびカニクイＣＤ３と反応性であるＣＤ３特異的ＶＨおよびＶＬの組み合わせを含む発現ベクター内にクローニングすることによって、ネズミ・ハイブリドーマ由来のヒトおよびカニクイＥＧＦＲと反応性である可変軽鎖（Ｌ）および可変重鎖（Ｈ）ドメインを含有する前述の構築物を得た。本明細書において、配列番号１７０は、ヒト様ＶＨ（配列番号１１０）およびヒト様ＶＬ（配列番号１６８）を含む抗ＣＤ３  ＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列に対応する。配列番号１９４は、ヒト様ＶＬ（配列番号１６８）およびヒト様ＶＨ（配列番号１１０）を含む抗ＣＤ３  ＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列に対応する。次いで、エレクトロポレーションによって、構築物をＤＨＦＲ不全ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。
【０１７１】
実施例２２：ＥＧＦＲおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体の発現および精製
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において、二重特異性一本鎖抗体を発現させた。Ｋａｕｆｍａｎｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５，  ５３７−５６６に記載されるように、ＤＨＦＲ不全ＣＨＯ細胞における真核タンパク質発現を行った。ＭＴＸ濃度を、最大２０ｎＭ  ＭＴＸの最終濃度に増加させることによって、構築物の遺伝子増幅を誘導した。静置培養２継代後、採取前に７日間、ＣＨＯ修飾ＭＥＭ培地を含むローラーボトル中、細胞を増殖させた。遠心分離によって細胞を取り除き、そして発現したタンパク質を含有する上清を−２０℃で保存した。
【０１７２】
Ａｅｋｔａ（登録商標）ＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアをクロマトグラフィーに用いた。すべての化学薬品は研究等級であり、そしてＳｉｇｍａ（ダイゼンホッフェン）またはＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット）より購入された。製造者によって提供されるプロトコルにしたがって、ＺｎＣｌ２が装填されたＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）カラム（Ｍｅｒｃｋ）を用いて、固定金属アフィニティークロマトグラフィー（「ＩＭＡＣ」）を行った。緩衝液Ａ２（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ  ７．５、０．４Ｍ  ＮａＣｌ）でカラムを平衡化し、そして３ｍｌ／分の流速で、細胞培養上清（５００ｍｌ）をカラム（１０ｍｌ）に適用した。緩衝液Ａ２でカラムを洗浄して、未結合試料を取り除いた。以下にしたがって、緩衝液Ｂ２（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール）の２工程勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出した：
工程１：６カラム体積の２０％緩衝液Ｂ２；
工程２：６カラム体積の１００％緩衝液Ｂ２。
【０１７３】
工程２から溶出したタンパク質分画を、さらなる精製のためにプールした。
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００  ＨｉＰｒｅｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出したタンパク質試料（流速１ｍｌ／分）を、検出のため、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに供した。精製前に、分子量測定のため、カラムを較正した（分子量マーカーキット、Ｓｉｇｍａ  ＭＷ  ＧＦ−２００）。タンパク質アッセイ色素（ＭｉｃｒｏＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ）および標準タンパク質としてのＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、タンパク質濃度を決定した。
【０１７４】
ＩＭＡＣおよびゲルろ過の２工程精製プロセスで、二重特異性一本鎖抗体を単離した。主な産物は、ＰＢＳ中のゲルろ過によって決定した際、未変性条件下で、約５２ｋＤａの分子量を有した。この分子量は、二重特異性一本鎖抗体に対応する。この方法にしたがって、すべての構築物を精製した。
【０１７５】
プレキャスト４−１２％  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った、還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥで、精製二重特異性一本鎖抗体タンパク質を分析した。製造者によって提供されるプロトコルにしたがって、試料調製および適用を行った。ＭｕｌｔｉＭａｒｋタンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、分子量を決定した。コロイド性クーマシーで、ゲルを染色した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコル）。単離タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定すると、＞９５％であった。
【０１７６】
製造者によって提供されるプロトコルにしたがって、Ｏｐｔｉｔｒａｎ（登録商標）ＢＡ−Ｓ８３膜およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎブロット・モジュールを用いて、ウェスタンブロットを行った。用いた抗体は、Ｈｉｓタグ（Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ）に対して向けられ、そしてヤギ抗マウスＩｇは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）で標識され、そして基質としてはＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。二重特異性一本鎖抗体は、ウェスタンブロットによって特異的に検出可能であった。精製二重特異性分子に対応する５２ｋＤで、単一バンドが検出された。
【０１７７】
実施例２３：ＥＧＦＲおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性抗体のフローサイトメトリー結合分析
それぞれ、ヒトおよびカニクイＥＧＦＲおよびＣＤ３に結合する能力に関して、交差種特異的二重特異性抗体構築物の機能性を試験するため、ＦＡＣＳ分析を行った。この目的のため、ＥＧＦＲ陽性扁平上皮癌Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５５５）およびＣＤ３陽性ヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ（ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ＡＣＣ４８３）を用いて、ヒト抗原に対する結合をチェックした。実施例２０に記載する、生成したカニクイＥＧＦＲトランスフェクタント、およびＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって得たカニクイＰＢＭＣを用いることによって、カニクイ抗原に対する結合反応性を試験した。それぞれの細胞集団の２００，０００細胞を、交差種特異的二重特異性抗体構築物（１μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質５０μｌと、氷上で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、そして構築物の結合を未標識ネズミＰｅｎｔａ  Ｈｉｓ抗体（２％ＦＣＳを含む５０μｌ  ＰＢＳ中、１：２０で希釈；Ｑｉａｇｅｎ；注文番号３４６６０）で検出した。洗浄後、２％ＦＣＳを含む５０μｌ  ＰＢＳ中、１：１００に希釈した、フィコエリトリンにコンジュゲート化したＦｃガンマ特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて、結合した抗Ｈｉｓ抗体を検出した。新鮮な培地を陰性対照として用いた。
【０１７８】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ハイデルベルグ）上のフローサイトメトリーによって、細胞を分析した。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  ＳｈｅｖａｃｈおよびＳｔｒｏｂｅｒ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００２）に記載されるように、蛍光強度のＦＡＣＳ染色および測定を行った。
【０１７９】
いくつかのドメイン配置の結合能は、図２９〜３６に示すように、明らかに検出可能であった。ＦＡＣＳ分析において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３に特異的なＶＨおよびＶＬドメインの異なる配置を持つすべての構築物は、培地、ならびに、１．および２．検出抗体を用いた陰性対照に比較した際、ＣＤ３およびＥＧＦＲに対する結合を示した。要約すると、ヒトおよびカニクイＣＤ３およびＥＧＦＲ抗原に対する二重特異性抗体の交差種特異性は、明らかに立証可能であった。
【０１８０】
実施例２４：ＥＧＦＲおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体の生物活性
実施例２３に記載するＥＧＦＲ陽性細胞株を用いた、クロム５１放出ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイによって、生成した二重特異性一本鎖抗体の生物活性を分析した；図３９および４０もまた参照されたい。エフェクター細胞として、それぞれ、刺激したヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞または刺激したカニクイＰＢＭＣを用いた。
【０１８１】
刺激したＣＤ８＋  Ｔ細胞の生成を以下のように行った：
ペトリ皿（８５ｍｍ直径、Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度の、商業的に入手可能な抗ＣＤ３特異的抗体で、３７℃で１時間、あらかじめコーティングした。ＰＢＳでの１回の洗浄工程によって、未結合タンパク質を取り除いた。標準的プロトコルにしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって、末梢血（３０〜５０ｍｌヒト血液または１０ｍｌカニクイ血液）から、新鮮なＰＢＭＣを単離した。あらかじめコーティングしたペトリ皿に、５０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＣＳ／ＩＬ−２  ２０Ｕ／ｍｌ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ）中、３〜５ｘ１０７  ＰＢＭＣを添加し、そして２日間刺激した。第三日、細胞を収集し、ＲＰＭＩ  １６４０で１回洗浄した。ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、そして再び、１日培養した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ５６＋  ＮＫ細胞を枯渇させることによって、ＣＤ８＋  ＣＴＬを単離した。
【０１８２】
ターゲット細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして５０％ＦＣＳを含む１００μｌ  ＲＰＭＩの最終体積中、１１，１ＭＢｑ  ５１Ｃｒで、３７℃で４５分間標識した。続いて、標識ターゲット細胞を５ｍｌ  ＲＰＭＩで３回洗浄し、そして次いで、細胞傷害性アッセイに用いた。ウェルあたり１０００のターゲット細胞および１００００のエフェクター細胞に対応する、１０：１のＥ：Ｔ比で、総体積２５０μｌの補充ＲＰＭＩ（上述のとおり）中、９６ウェルプレート中でアッセイを行った。１μｇ／ｍｌの交差種特異的二重特異性一本鎖抗体分子および２０のその３倍希釈を適用した。アッセイ時間は１８時間であり、そして最大溶解（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ添加）および自発的溶解（エフェクター細胞なし）の差に関連する、上清中の放出クロムの相対値として、細胞傷害性を測定した。すべての測定を４つ組で行った。上清中のクロム活性の測定をＷｉｚａｒｄ  ３ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ケルン）で行った。実験データの分析を、Ｐｒｉｓｍ  ４  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） （バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）で行った。シグモイド用量反応曲線は、該ソフトウェアによって決定すると、典型的には、Ｒ２値＞０．９０を有した。分析プログラムによって計算したＥＣ５０値を生物活性の比較に用いた。
【０１８３】
図３９および４０に示すように、生成した交差種特異的二重特異性一本鎖抗体構築物はすべて、ヒトＣＤ８＋細胞によって誘発されたヒトＥＧＦＲ陽性ターゲット細胞、およびカニクイＣＤ８＋細胞によって誘発されたカニクイＥＧＦＲ陽性ターゲット細胞に対して、細胞傷害活性を示した。図３９では、ＥＧＦＲと反応性である可変ドメインおよび脱免疫化ヒトＣＤ３特異的可変ドメインを持つ、二重特異性一本鎖抗体（ＥＧＦＲ  ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３）を、陰性対照として用いた。図４０では、同じ構築物（ＥＧＦＲ  ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３）を、陽性対照として用いた。陰性対照として、不適切な二重特異性一本鎖抗体を用いた。
【０１８４】
実施例２５：カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）およびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体の生成および性質決定
【０１８５】
【表２】
2009511521.tif 000004
【０１８６】
上述の実施例と同様、ヒトおよびカニクイＣＡＩＸ抗原と反応性である、可変軽鎖（Ｌ）および可変重鎖（Ｈ）ドメインを含有する、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ／ＭＮ）およびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体を生成し、そして続いて、ヒトおよびカニクイＣＤ３と反応性である、ＣＤ３特異的ＶＨおよびＶＬの組み合わせを含む発現ベクター内にクローニングした。以下を例外として、本質的に実施例２０〜２４に記載するように実験を行った：
ヒトＣＡＩＸ抗原に対する結合能を評価するため、ＣＡＩＸ陽性ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）を用いて、ＦＡＣＳ結合実験を行った。カニクイ皮膚細胞株ＣＹＮＯＭ−Ｋ１（イタリア・ジェノバの国立癌研究所（ＩＳＴ）、ＥＣＡＣＣ９００７１８０９）またはアカゲザル上皮細胞株４ＭＢｒ−５（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２０８）を配置することによって、カニクイ組織に対する交差種特異性を試験した。ＣＡＩＸおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体を用いて行う細胞傷害性アッセイにも、細胞株の同じ変化を適用する。
【０１８７】
図２６〜２８に示すように、生成したＣＡＩＸおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体は、ヒトおよびカニクイ抗原両方に対して結合を示し、そして完全に交差種特異的であることが立証された。分析した構築物の細胞溶解性生物活性を、図３７および３８に示す。図３７の左パネルにおいて、ＣＡＩＸと反応性である可変ドメインおよび脱免疫化ヒトＣＤ３特異的可変ドメインを持つ二重特異性一本鎖抗体を、陽性対照として用いた。右パネルにおいて、同じ構築物を陰性対照として用いた。
【０１８８】
【表３−１】
2009511521.tif 000005
【０１８９】
【表３−２】
2009511521.tif 000006
【０１９０】
【表３−３】
2009511521.tif 000007
【０１９１】
【表３−４】
2009511521.tif 000008
【０１９２】
【表３−５】
2009511521.tif 000009
【０１９３】
【表３−６】
2009511521.tif 000010
【０１９４】
【表３−７】
2009511521.tif 000011
【０１９５】
【表３−８】
2009511521.tif 000012
【０１９６】
【表３−９】
2009511521.tif 000013
【０１９７】
【表３−１０】
2009511521.tif 000014
【０１９８】
【表３−１１】
2009511521.tif 000015
【０１９９】
【表３−１２】
2009511521.tif 000016
【０２００】
【表３−１３】
2009511521.tif 000017
【０２０１】
【表３−１４】
2009511521.tif 000018
【０２０２】
【表３−１５】
2009511521.tif 000019
【０２０３】
【表３−１６】
2009511521.tif 000020
【０２０４】
【表３−１７】
2009511521.tif 000021
【０２０５】
【表３−１８】
2009511521.tif 000022
【０２０６】
【表３−１９】
2009511521.tif 000023
【０２０７】
【表３−２０】
2009511521.tif 000024
【０２０８】
【表３−２１】
2009511521.tif 000025
【０２０９】
【表３−２２】
2009511521.tif 000026
【０２１０】
【表３−２３】
2009511521.tif 000027
【０２１１】
【表３−２４】
2009511521.tif 000028
【０２１２】
【表３−２５】
2009511521.tif 000029
【０２１３】
【表３−２６】
2009511521.tif 000030
【０２１４】
【表３−２７】
2009511521.tif 000031
【０２１５】
【表３−２８】
2009511521.tif 000032
【０２１６】
【表３−２９】
2009511521.tif 000033
【０２１７】
【表３−３０】
2009511521.tif 000034
【０２１８】
【表３−３１】
2009511521.tif 000035
【０２１９】
【表３−３２】
2009511521.tif 000036
【０２２０】
【表３−３３】
2009511521.tif 000037
【０２２１】
【表３−３４】
2009511521.tif 000038
【０２２２】
【表３−３５】
2009511521.tif 000039
【０２２３】
【表３−３６】
2009511521.tif 000040
【０２２４】
【表３−３７】
2009511521.tif 000041
【０２２５】
【表３−３８】
2009511521.tif 000042
【０２２６】
【表３−３９】
2009511521.tif 000043
【０２２７】
【表３−４０】
2009511521.tif 000044
【０２２８】
【表３−４１】
2009511521.tif 000045
【０２２９】
【表３−４２】
2009511521.tif 000046
【０２３０】
【表３−４３】
2009511521.tif 000047
【０２３１】
【表３−４４】
2009511521.tif 000048
【０２３２】
【表３−４５】
2009511521.tif 000049
【０２３３】
【表３−４６】
2009511521.tif 000050
【０２３４】
【表３−４７】
2009511521.tif 000051
【０２３５】
略語：
ｓｃＦｖ＝一本鎖Ｆｖ
ＡＡ＝アミノ酸配列
ＮＡ＝核酸配列
Ｌ＝ＶＬ領域
Ｈ＝ＶＨ領域
配列表に用いる一文字コード：
Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ
Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ
Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ
Ｋ＝ＧまたはＴ
Ｍ＝ＡまたはＣ
Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ
Ｒ＝ＡまたはＧ
Ｓ＝ＣまたはＧ
Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ
Ｗ＝ＡまたはＴ
Ｙ＝ＣまたはＴ
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】マカクＣＤ３に対する交差種特異的抗体の同定：マカク（カニクイ）ＣＤ３に対する、ＷＯ  ９９／５４４４０に記載され、配列番号１６２に示す抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ−３、配列番号６および８を含むＩｇ、配列番号２および４を含むＩｇ、ならびにＵＣＨＴ−１の交差種特異性を、実施例１に記載するようなフローサイトメトリーを用いて試験した。配列番号６および８を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）、ならびに配列番号２および４を含むＩｇは、マカクＣＤ３に対して交差種特異性を示す。対照的に、配列番号１６２に示す抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ−３およびＵＣＨＴ−１は、マカクＣＤ３に結合できない。
【図２】ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞およびマカカ・ファシキュラリス（カニクイ）のＰＢＭＣに対する、配列番号２および４を含むＩｇ、配列番号６および８を含むＩｇ、ならびにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＦＮ−１８の結合に関するＦＡＣＳアッセイ。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞は、ヒトＣＤ３複合体を発現する。非染色細胞と比較して、それぞれの抗体で染色した細胞を示す。配列番号２および４を含むＩｇに関して、ヒトならびにカニクイ細胞に対する強い抗原結合が検出された。配列番号６および８を含むＩｇに関して、ヒト細胞に対する強い結合が観察されたが、カニクイ細胞に対してはより弱い結合が観察された。ＦＮ−１８に関して、カニクイ細胞に対する強い結合が観察されたが、ヒト細胞に対する結合はまったく検出不能であった。
【図３】ＥｐＣＡＭを発現するヒトＫａｔｏＩＩＩ細胞またはヒトＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞、およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、５−１０ＬＨｘ配列番号１６および５−１０ＬＨｘ配列番号１４の結合に関するＦＡＣＳアッセイ。それぞれの構築物が結合した細胞（白抜きの曲線として示す）を、検出抗体のみとインキュベーションした細胞（黒塗りの曲線として示す）と比較して示す。すべての二重特異性構築物の抗原結合は、抗ヒトＥｐＣＡＭ特異性に関して、ならびにヒトＣＤ３陽性ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞株上の抗ＣＤ３特異性に関して、明らかに検出可能であった。
【図４】ターゲット細胞としてヒトＫａｔｏＩＩＩ細胞を、そしてエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いた、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０および５−１０ＬＨｘ配列番号１４に関する細胞傷害性アッセイ。すべての構築物が、細胞傷害活性を示した。
【図５】ターゲット細胞としてヒトＫａｔｏＩＩＩ細胞を、そしてエフェクター細胞としてカニクイＰＢＭＣを用いた、５−１０ＬＨｘ配列番号１２、５−１０ＬＨｘ配列番号１０、および５−１０ＬＨｘ配列番号１４に関する細胞傷害性アッセイ。５−１０ＬＨｘ配列番号１４、５−１０ＬＨｘ配列番号１２および５−１０ＬＨｘ配列番号１０が、細胞傷害活性を示した。カニクイＣＤ３に結合できない５−１０ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３（配列番号１６３に示す脱免疫化抗ＣＤ３抗体）を、陰性対照として用いた。
【図６】カニクイＥｐＣＡＭ抗原（配列番号４８にも示す）およびヒトＥｐＣＡＭ抗原の細胞外部分のアミノ酸配列並列。
【図７】トランスフェクションＣＨＯ細胞上のカニクイＥｐＣＡＭ抗原の検出のためのＦＡＣＳアッセイ。３つの異なる抗ヒトＥｐＣＡＭハイブリドーマ（Ｍ７９、３Ｂ１０、２Ｇ８）の上清を結合に関して試験した。非トランスフェクション細胞（黒塗りの曲線として示す）に比較した際、トランスフェクタント（白抜きの曲線として示す）は、２Ｇ８ハイブリドーマの上清とのみ、結合を示し、したがって、これは、ヒトおよびカニクイＥｐＣＡＭに対する交差種特異的抗体と認識される。
【図８−Ａ】ＫａｔｏＩＩＩ（図８Ａ）細胞またはカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞（図８Ｂ）およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１２、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１６、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１４、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１０、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１６および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１４の結合に関するＦＡＣＳアッセイ。抗原結合は、抗ＥｐＣＡＭ特異性に関して、ならびに抗ＣＤ３特異性に関して、明らかに検出可能であった。カニクイＥｐＣＡＭに対する結合に関する陰性対照として、ヒトＣＤ３（ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上）に対する結合を示すが、カニクイＥｐＣＡＭ（カニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞）には結合を示さない、５−１０ＬＨｘ配列番号１０構築物を含めた。
【図８−Ｂ】ＫａｔｏＩＩＩ（図８Ａ）細胞またはカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞（図８Ｂ）およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１２、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１６、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１４、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１０、２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１６および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１４の結合に関するＦＡＣＳアッセイ。抗原結合は、抗ＥｐＣＡＭ特異性に関して、ならびに抗ＣＤ３特異性に関して、明らかに検出可能であった。カニクイＥｐＣＡＭに対する結合に関する陰性対照として、ヒトＣＤ３（ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上）に対する結合を示すが、カニクイＥｐＣＡＭ（カニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞）には結合を示さない、５−１０ＬＨｘ配列番号１０構築物を含めた。
【図９】ターゲット細胞としてカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞を、そしてエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを用いた、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２に関する細胞傷害性アッセイ。２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２が、細胞傷害活性を示した。陰性対照として、５−１０ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３（配列番号１６３に示す脱免疫化抗ＣＤ３抗体）を含めた。５−１０ＬＨはカニクイＥｐＣＡＭに結合できない。
【図１０】ターゲット細胞としてカニクイＥｐＣＡＭトランスフェクションＣＨＯ細胞を、そしてエフェクター細胞としてカニクイＰＢＭＣを用いた、２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２に関する細胞傷害性アッセイ。２Ｇ８ＬＨｘ配列番号１０および２Ｇ８ＨＬｘ配列番号１２が、細胞傷害活性を示した。陰性対照として、５−１０ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３（配列番号１６３に示す脱免疫化抗ＣＤ３抗体）を含めた。この構築物はカニクイＣＤ３およびカニクイＥｐＣＡＭに結合できない。
【図１１】配列番号２およびヒトＶＨセグメント（ｈｕ）３−７３のアミノ酸比較。
【図１２】交差種特異的ヒト様ＶＨ領域（それぞれ、配列番号１１０および１１１としても示される）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。
【図１３】配列番号１１０に示すヒト様ＶＨ鎖および配列番号１４８に示すＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖのＦＡＣＳ分析。完全ｓｃＦｖアミノ酸配列を配列番号１４６に示す。配列番号１０の対照ｓｃＦｖは、ヒトＣＤ３陽性ＨＰＢ−Ａｌｌ細胞に対して明らかなシフトを示し、そしてしたがって、ヒトＣＤ３に結合する。配列番号１４６に示すｓｃＦｖもまた、前記ＣＤ３陽性ヒト細胞に対して明らかな結合を示す。
【図１４】配列番号１４６のｓｃＦｖの結合分析。配列番号１０の対照ｓｃＦｖは、カニクイＣＤ３陽性Ｔ細胞に対して明らかなシフトを示し、そしてしたがって、カニクイＣＤ３陽性細胞に結合する。配列番号１４６のｓｃＦｖもまた、カニクイＣＤ３陽性細胞に対して明らかな結合を示す。
【図１５】ヒトおよびカニクイＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列の並列。
【図１６】カニクイＣＤ３イプシロン由来の１３量体ペプチドのアミノ酸配列（４３ペプチド・スポット）。
【図１７】ヒトＣＤ３イプシロン由来の１３量体ペプチドのアミノ酸配列（４７ペプチド・スポット）。
【図１８】増進化学発光によって現像したＰｅｐｓｐｏｔ、（Ａ）西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧを用いた対照ｐｅｐｓｐｏｔ、（Ｂ）配列番号２に示すＶＨ鎖および配列番号４に示すＶＬ鎖を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）に対応する交差種特異的抗ＣＤ３抗体Ｉを用いたｐｅｐｓｐｏｔ。
【図１９】配列番号６に示すＶＨ鎖および配列番号８に示すＶＬ鎖を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）に対応する交差種特異的抗ＣＤ３抗体ＩＩを用いたＰｅｐｓｐｏｔ。
【図２０】カニクイおよびヒトＣＤ３イプシロンに対する、ＯＫＴ−３およびＵＣＨＴ−１、ならびにそれぞれ、図１８および１９で言及する、交差種特異的抗ＣＤ３抗体ＩおよびＩＩのＥ−Ｆループ・エピトープの接触残基。
【図２１】ヒト生殖系列ラムダ７ａセグメントに対する、配列番号４に示すネズミＶＬのアミノ酸配列比較。
【図２２】ヒトＣＤ３陽性ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞に対する、配列番号１０に示すネズミｓｃＦｖおよび配列番号１７０に示すヒト様ｓｃＦｖの結合。
【図２３】上部パネル：ＰＢＭＣ中のヒトおよびカニクイＴ細胞に対する、配列番号１０に示すネズミｓｃＦｖおよび配列番号１７０に示すヒト様ｓｃＦｖの同等の結合。下部パネル：ｓｃＦｖと同じ（すなわちＣＤ３イプシロンに対する）結合特異性を有する、実施例１に記載するネズミＩｇＧ抗体ｍＡｂＩ  １０μｇ／ｍｌとプレインキュベーションした際、上述のネズミｓｃＦｖまたはヒト様ｓｃＦｖで染色した細胞のシフトが有意に減少し、ｓｃＦｖおよび元来のネズミ抗体ｍＡｂ  Ｉの結合領域が類似であることが強調される。
【図２４】アルカリホスファターゼ検出系によって現像したＰｅｐｓｐｏｔ、（Ａ）アルカリホスファターゼ・コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧを用いた対照ｐｅｐｓｐｏｔ、（Ｂ）実施例１８に記載するように、配列番号１１０に示すヒト様ＶＨ鎖および配列番号１６８に示すヒト様ＶＬ鎖を含む交差種特異的抗ＣＤ３抗体を用いたｐｅｐｓｐｏｔ。
【図２５】ブロットしたペプチド、ヒトＣＤ３イプシロン由来の「ビオチン−リンカー−ＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣ」（１）および「ＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣ−ビオチン」（２）に結合する、実施例１９に記載するような、配列番号１１０のヒト様ＶＨおよび配列番号１６８のヒト様ＶＬを含む、交差種特異的抗ＣＤ３抗体（Ａ）、ならびに抗ＣＤ３ネズミＩｇＧ１抗体ＵＣＨＴ１（Ｂ）を用いたドットブロットアッセイ。
【図２６】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ５４９（ヒトＣＡＩＸ＋）およびＣＹＮＯＭ−Ｋ１（カニクイＣＡＩＸ＋）細胞に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、ＣＡＩＸ  ＨＬｘ配列番号１９４のＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図２７】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ５４９（ヒトＣＡＩＸ＋）および４ＭＢｒ−５（マカクＣＡＩＸ＋）細胞に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、ＣＡＩＸ  ＨＬｘ配列番号１７０のＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図２８】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ５４９（ヒトＣＡＩＸ＋）および４ＭＢｒ−５（マカクＣＡＩＸ＋）細胞に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、ＣＡＩＸ  ＬＨｘ配列番号１７０のＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図２９】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、ＥＧＦＲ  ＨＬｘ配列番号１７０のＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３０】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、ＥＧＦＲ  ＬＨｘ配列番号１７０のＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３１】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、ＥＧＦＲ  ＨＬｘ配列番号１９４のＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３２】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、ＥＧＦＲ  ＬＨｘ配列番号１９４のＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３３】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、配列番号１７０ｘＥＧＦＲ  ＨＬのＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３４】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、配列番号１７０ｘＥＧＦＲ  ＬＨのＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３５】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、配列番号１９４ｘＥＧＦＲ  ＨＬのＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３６】それぞれ、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＣＤ３＋）、カニクイＰＢＭＣ（カニクイＣＤ３＋）、Ａ４３１（ヒトＥＧＦＲ＋）およびカニクイＥＧＦＲでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞（カニクイＥＧＦＲ＋）に対する、交差種特異的二重特異性一本鎖構築物、配列番号１９４ｘＥＧＦＲ  ＬＨのＦＡＣＳ結合分析。実施例２３に記載するように、ＦＡＣＳ染色を行った。太線は、１μｇ／ｍｌの精製単量体タンパク質とインキュベーションし、続いて、抗ｈｉｓ抗体およびＰＥ標識検出抗体とインキュベーションした細胞を示す。細いヒストグラムの線は、陰性対照：抗ｈｉｓ抗体および検出抗体とのみインキュベーションした細胞を反映する。
【図３７】示すターゲット細胞株に向け直された、ＣＡＩＸおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体構築物によって誘導される細胞傷害活性。ヒトおよびカニクイ起源の刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞を、それぞれ、エフェクター細胞として用いた。実施例２４および２５に記載するように、アッセイを行った。図３７の左のパネルにおいて、ＣＡＩＸと反応性である可変ドメインおよび脱免疫化ヒトＣＤ３特異的可変ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体を陽性対照として用いた。右のパネルにおいて、同じ構築物を陰性対照として用いた。
【図３８】ターゲット細胞株、Ａ５４９に向け直された、ＣＡＩＸおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体構築物、ＣＡＩＸ  ＨＬｘ配列番号１９４によって誘導される細胞傷害活性。ヒトおよびカニクイ起源の刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞を、それぞれ、エフェクター細胞として用いた。実施例２４および２５に記載するように、アッセイを行った。
【図３９】ターゲット細胞株としての、カニクイＥＧＦＲでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞に向け直された、ＥＧＦＲおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体構築物によって誘導される細胞傷害活性。カニクイ起源の刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞を、エフェクター細胞として用いた。この図に示す測定は、単一アッセイで行われた。実施例２４に記載するように、アッセイを行った。ＥＧＦＲと反応性である可変ドメインおよび脱免疫化ヒトＣＤ３特異的可変ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体（ＥＧＦＲ  ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３）を陰性対照として用いた。
【図４０】ターゲット細胞株としての、ヒトＡ４３１に向け直された、ＥＧＦＲおよびＣＤ３交差種特異的二重特異性一本鎖抗体構築物によって誘導される細胞傷害活性。ヒト起源の刺激したＣＤ８陽性Ｔ細胞を、エフェクター細胞として用いた。この図に示す測定は、単一アッセイで行われた。実施例２４に記載するように、アッセイを行った。ＥＧＦＲと反応性である可変ドメインおよび脱免疫化ヒトＣＤ３特異的可変ドメインを含む二重特異性一本鎖抗体（ＥＧＦＲ  ＬＨｘｄｉ抗ＣＤ３）を陽性対照として用いた。陰性対照として、不適切な二重特異性一本鎖抗体を用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−Ａ】
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【図８−Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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