(57)【要約】  本発明は、インビトロ及びインビボでの核酸送達のためのユニークな非ウイルス性担体及びそれを使用する方法を提供する。
2009523823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオニルアミド単位により化学的に連結されたポリカチオンにより形成されるポリマーであり、核酸送達のための非ウイルス性担体として有用である、前記ポリマー。
【請求項２】
ポリカチオンがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１のポリマー。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡ送達に有用である、請求項１のポリマー。
【請求項４】
遮蔽リガンドをさらに含む、請求項１のポリマー。
【請求項５】
遮蔽リガンドがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項４のポリマー。
【請求項６】
ターゲティングリガンドをさらに含む、請求項５のポリマー。
【請求項７】
ターゲティングリガンドがトランスフェリンである、請求項６のポリマー。
【請求項８】
ポリヌクレオチドと連結することをさらに含む、請求項４のポリマー。
【請求項９】
ポリヌクレオチドと連結することをさらに含む、請求項５のポリマー。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドと連結することをさらに含む、請求項６のポリマー。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドと連結することをさらに含む、請求項７のポリマー。
【請求項１２】
ポリマーのアミンの一部のマイケル付加によって架橋剤のビニル基にポリマーが架橋され、ペンダントエステル基のＮ−アシル化によってさらに修飾される、請求項１のポリマーを作製する方法。
【請求項１３】
ポリマーが、遊離エステル、無水物又はハロゲン化アシルの付加によってさらに修飾される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ポリマー構造の第一及び第二アミンの両方で架橋が生じ得る、請求項１２の方法。
【請求項１５】
架橋剤が、次の物質、アクリレート、メタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、１，６ヘキサンジオールジアクリレート及びポリエチレングリコール６００ジアクリレート、のエステル単量体を含む、請求項１２の方法。
【請求項１６】
架橋剤が１，６ヘキサンジオールジアクリレートである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
請求項１のポリマーを用いてインビボで標的組織に遺伝子を送達する方法。
【請求項１８】
請求項１のポリマーを用いて培養中の細胞にｓｉＲＮＡを送達する方法。
【請求項１９】
請求項１のポリマーを用いてインビボで組織にｓｉＲＮＡを送達する方法。
【請求項２０】
ｓｉＲＮＡの送達が、治療目的のため又は標的確認のためである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ポリマーが、逆の電荷のものに結合し、それらを標的組織に送達することができる目標設定可能な錯化剤を形成する、請求項１のポリマーを用いる方法。
【請求項２２】
ポリマーが、対象の治療物質とイオン結合型錯体又は共有結合を形成する、請求項１のポリマーを用いて対象の治療物質を患者に送達する方法。
【請求項２３】
対象の治療物質が、細胞毒性剤、エンドソーム分解剤及び親水性ポリマーを含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
【化１】
2009523823.tif 000066
からなる式Ｉの化合物（式中、
ポリカチオンはポリエチレンイミン単位であり；
Ｌは非エステルリンカーであり；
ａは約１から約２０の範囲の整数であり；
ｂは約１から約１０の範囲の整数であり；
ｃは約１から約２０の範囲の整数であり；及び
ｄは約１から約１０００の範囲の整数である。）。
【請求項２５】
ポリカチオンがオリオグエチレンイミンである、請求項２４の化合物。
【請求項２６】
Ｌが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分及びスクシンアミジルリンカー部分からなる群から選択される、請求項２４の化合物。
【請求項２７】
Ｌがβ−アミノプロピオニルアミドリンカー部分である、請求項２６に記載の非エステルリンカー。
【請求項２８】
生体分子をさらに含む、請求項２４の化合物。
【請求項２９】
前記生体分子がｓｉＲＮＡである、請求項２８の化合物。
【請求項３０】
約８００ダルトンから約１，０００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項２４の化合物。
【請求項３１】
約２０，０００ダルトンから約２００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項２４の化合物。
【請求項３２】
約２０，０００ダルトンから約３０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項２４の化合物。
【請求項３３】
【化２】
2009523823.tif 000067
からなる式Ｉの化合物（式中、
ポリカチオンはポリエチレンイミンであり；
Ｌは非エステルリンカーであり；
Ｓはスペーサーであるか又は存在せず；
Ａは薬剤であるか又は存在せず；
ａは約１から約２０の範囲の整数であり；
ｂは約１から約１０の範囲の整数であり；
ｃは約１から約２０の範囲の整数であり；及び
ｄは約１から約１０００の範囲の整数である。）。
【請求項３４】
ポリカチオンがオリオグエチレンイミンである、請求項３３の化合物。
【請求項３５】
Ｌが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分及びスクシンアミジルリンカー部分からなる群から選択される、請求項３３の化合物。
【請求項３６】
Ｌがβ−アミノプロピオニルアミドリンカー部分である、請求項３３に記載の非エステルリンカー。
【請求項３７】
生体分子をさらに含む、請求項３３の化合物。
【請求項３８】
前記生体分子がｓｉＲＮＡである、請求項３７の化合物。
【請求項３９】
薬剤及び場合によってはＳをさらに含む、請求項３３の化合物。
【請求項４０】
前記薬剤が、受容体認識、内在化、細胞エンドソームからの生体分子の逃避、核の局在、生体分子放出及び系の安定化を促進する物質からなる群から選択される、請求項３８又は請求項３９の化合物。
【請求項４１】
前記薬剤が、細胞毒性薬、疎水性基、遮蔽剤及びターゲティングリガンドからなる群から選択される、請求項３８又は請求項３９の化合物。
【請求項４２】
前記薬剤がトランスフェリンである、請求項４１の化合物。
【請求項４３】
（ａ）生体分子と；（ｂ）生体分子に連結された化合物と、を含み、化合物−生体分子共役物が、請求項２４又は請求項３３の化合物を含む、非ウイルス性送達系。
【請求項４４】
前記生体分子がｓｉＲＮＡである、請求項４５に記載の非ウイルス性送達系。
【請求項４５】
遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、請求項２８の化合物を哺乳動物に投与することを含み、前記生体分子が、対象の遺伝子の発現を低下させるのに有効なｓｉＲＮＡである、哺乳動物を処置する方法。
【請求項４６】
遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、請求項２８の化合物を哺乳動物に投与することを含み、前記生体分子が、対象の遺伝子の発現を低下させるのに有効なｓｉＲＮＡである、哺乳動物を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒト遺伝子治療の実施が増えていることから、遺伝子のための非ウイルス性送達系に対する注目度が高まっている。リポソームに処方された陽イオン性脂質及び可溶性の陽イオン性ポリマーは、核酸に基づく薬剤と容易に複合体を形成し、それらをインビトロで細胞へと効率的に送達することが分かっている。細胞レベルへの主要な障壁はエンドソーム膜であり、これは、フリップ−フロップ機構を介した陽イオン性脂質（Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．３５（１８）５６１６頁（１９９６））により又はいわゆるプロトン−スポンジ機構を介して陽イオン性ポリマーにより（Ｂｏｕｓｓｉｆ、ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．９２（１６）７２９７頁（１９９５））克服することができる。プロトン−スポンジ仮説は、エンドソームでのｐＨ低下中にポリマーが緩衝液として作用し得ることを述べており、したがって、およそ５の最終ｐＨに到達するためにさらなるプロトンを必要とする。これにより、塩化物対イオンならびに水の流入が増加し、結局は、結果として小胞が破裂し、その内容物が細胞質に放出される。顕著なインビトロならびにインビボ毒性が、陽イオン性ポリマー及び脂質に付随することが多い。細胞レベルにおいて、陽イオン電荷によって、膜が損傷を受け、ベクターが壊死ならびにアポトーシスを引き起こし得る。インビボレベルにおいて、陽イオン電荷によって、赤血球などの細胞性血液成分への結合及び／又は、血清蛋白質ならびに血管内皮との非特異的結合が起こる。ＲＥＳによる非常に速いクリアランスにより、干渉のための意図する解剖学的位置への薬剤の到達が妨げられる。タンパク質及びステルス分子（ＰＥＧなど）による電荷遮蔽、ならびに治療のための意図する細胞への活性ターゲティングリガンドの連結など、これらの好ましくない特性に取り組むためにストラテジーが開発されてきた。
【０００２】
最も許容可能であり広く使用されている遺伝子送達ポリマーの１つはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。遺伝子送達に対する多くの所望の特性を有する分解性ＰＥＩ誘導体が記載されており（Ｄ．Ｗ．Ｐａｃｋ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．１４、９３４頁（２００３））、これは非分解性の２５，０００分子量ＰＥＩよりも遺伝子送達活性が１６倍大きく、毒性が低い。分枝ＰＥＩ８００を用い、マイケル方式で１，６ヘキサンジオールジアクリレートと１：１のモル比で反応させることにより、これが合成された。得られた分子量は約３０，０００であり、プロトンＮＭＲによると、この構造は多数の生体分解性エステル連結を有する。ｐＨ５において、分解に対する半減期は３０時間であった。関連する研究において、無水酢酸によるポリエチレンイミンの部分的アセチル化の結果、ポリマーの細胞毒性を変化させることなく遺伝子送達活性が最大で２１倍上昇した（Ｄ．Ｗ．Ｐａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２１、３６５頁（２００４））。ＤＮＡなどのポリヌクレオチドに基づく薬物の治療的送達のための分解性ポリマーのその他の形態が、様々なジアクリレートへの様々なアミンのマイケル付加を用いて得られてきた（Ｌａｎｇｅｒら、ＪＡＣＳ  Ｖｏｌ．１２３、８１５５−８１５６頁（２００１）；ＪＡＣＳ  Ｖｏｌ．１２２、１０７６１−１０７６８頁（２０００））。この場合、最終担体産物はエステル結合を有し、Ｎ−アシル化反応に関与し得る第一又は第二アミンはなかった；ポリマー骨格にエステル結合が存在することにより生体分解性が向上する。
【０００３】
Ｋｉｌｂａｎｏｖら（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２２、３７３−３８０頁（２００５））による研究では、ＤＮＡに対するより分子量の大きい担体に４２３−Ｄａ及び２ｋＤａのＰＥＩの両方を連結するために、２種類の異なる架橋剤、即ち、ジスクシンイミジル基質（ＤＳＳ）及びエチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート（ＥＧＳ）が使用された。架橋剤ＤＳＳは、ＰＥＩのアミンとの反応後、アミド結合を生じさせ、脂肪族骨格を保持するが、これは、元々、担体の構造の一部として２個のアミン反応基（活性エステル）を連結していた。これは、アミド結合を生じさせ、構造の一部として脂肪族骨格を保持した。ＰＥＩとのＥＧＳの使用でもアミド結合が生じるが、その構造ゆえに、担体はエステル結合も有した。Ｋｉｌｂａｎｏｖらは、ＥＧＳにより作製された物質がＤＳＳを用いて作製されたものよりも遺伝子送達の効率が３０倍大きかったと主張した。Ｋｉｌｂａｎｏｖらは、「ＥＧＳに基づく共役物の分解性がより高いことによってＤＮＡの放出が促進され（ベクターを開く。）、従ってＤＮＡの転写での利用可能性が促進される」ことを示唆した。
【０００４】
理想的には、最適の非ウイルス性担体は、低毒性で遺伝子送達効率が高い、強力なポリマーであるべきである。本発明のポリマーの主要な長所は、多岐にわたる核酸を送達する能力である。ＰＥＩ  ２５ｋＤａなどの標準的ポリマーがプラスミドＤＮＡ送達において効率的である一方、これらはｓｉＲＮＡの送達では効率的でなく、より高いポリマー用量でも実質的な遺伝子発現ノックダウンが観察できなかった（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１７、２４１−２４４頁、２００６）。線状ＰＥＩの場合、文献は幾分矛盾している（Ｈａｓｓａｎｉら、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．７、１９８−２０７頁、２００５；Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ．１２、２００５）が、しかし、文献ならびに出願者らにより行われた実験からのデータから、線状ＰＥＩ  ２２ｋＤａが一過性に形質移入された遺伝子のノックダウンに適切であることが示されるが、しかし、安定的に形質移入された細胞株でのロブストなノックダウンを生じさせるのには適していない。これらの標準的試薬とは異なり、本発明のポリマーは、一過性ならびに安定的に形質移入された細胞株でノックダウンを達成することができ、プラスミド送達において高い効率を示す。
【０００５】
まとめると、市販製品として安定性が向上しており、毒性が低く、形質移入効率が高く、分子量が低いままの場合に腎臓による排出に対する潜在能力があり、アミド結合を通じた生体分解性があり、ターゲティング及びステルスリガンドが化学的に連結され得る多数の第一及び第二アミンという長所を有する、非ウイルス性核酸担体系が必要とされている。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の概要）
本発明のある態様によると、一般式Ｉを有する化合物が提供される。
【０００７】
【化３】
2009523823.tif 000003
（式中、ポリカチオンはポリエチレンイミンであり；
Ｌは非エステルリンカー部分であり；
ａは約１から約２０の範囲の整数であり；
ｂは約１から約１０の範囲の整数であり；
ｃは約１から約２０の範囲の整数であり；
ｄは約１から約１０００の範囲の整数である。）。
【０００８】
好ましくは、ＰＥＩはオリオグエチレンイミン（ＯＥＩ）である。式Ｉのポリカチオンは、場合によっては、同じポリカチオンの繰り返しを有し得るか又は様々なポリカチオンの繰り返しの組み合わせも有し得る。
【０００９】
「Ｌ」又は式Ｉのリンカーは非エステル含有リンカー部分である。適切な非エステル含有リンカーには、以下に限定されないが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分及びそれらの組み合わせが含まれる。リンカー部分は、ポリカチオン内に含有されるアミン基に結合される。好ましい実施形態において、非エステル含有リンカー部分は、−ＣＨ２−ＣＨＲ’−ＣＯ−Ｎ−（式中、Ｒ’はＨ又はアルキル基である。）により表される化学基として定義されるプロピオニル単位である。より好ましい実施形態において、非エステルリンカーはβ−アミノプロピオニルアミドリンカー部分である。
【００１０】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物と複合体を形成する生体分子をさらに含む。生体分子は、１以上の陰イオン性基を有し得、式Ｉ又はＩａの化合物とイオン結合を形成し得る。１以上の陰イオン性基を有する生体分子の例には、核酸（例えば、ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ−ＲＮＡバイブリダイザー（ｂｙｂｒｉｄｉｚｅｒ）、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスオリゴ）、タンパク質、ペプチド、脂質及び炭水化物が含まれる。
【００１１】
またさらなる実施形態は、このような式Ｉの化合物及び生体分子と細胞を接触させ、それにより細胞に生体分子を送達することを含む、真核細胞に形質移入する方法を提供する。本方法は、遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、その哺乳動物にこのような化合物を投与することを含む、哺乳動物を治療することを含み得る。好ましい実施形態において、生体分子はｓｉＲＮＡであり、このｓｉＲＮＡは対象の遺伝子の発現を低下させるのに有効である。
【００１２】
別の実施形態は、式Ｉの化合物と生体分子とを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
別の実施形態は、一般式Ｉａを有する化合物をさらに提供する。
【００１４】
【化４】
2009523823.tif 000004
（式中、ポリカチオンはポリエチレンイミンであり；
Ｌは非エステルリンカー部分であり；
Ｓはスペーサーであるか又は存在せず；
Ａは薬剤であるか又は存在せず；
ａは約１から約２０の範囲の整数であり；
ｂは約１から約１０の範囲の整数であり；
ｃは約１から約２０の範囲の整数であり；
ｄは約１から約１０００の範囲の整数である。）。
【００１５】
Ｌ又は式Ｉのリンカーは非エステル含有リンカー部分である。適切な非エステル含有リンカーには、以下に限定されないが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分及びそれらの組み合わせが含まれる。リンカー部分は、ポリカチオン内に含有されるアミン基に結合される。好ましい実施形態において、非エステル含有リンカー部分は、−ＣＨ２−ＣＨＲ’−ＣＯ−Ｎ−（式中、Ｒ’はＨ又はアルキル基である。）により表される化学基として定義されるプロピオニル単位である。より好ましい実施形態において、非エステルリンカーはβ−アミノプロピオニルアミドリンカー部分である。
【００１６】
Ｓはスペーサーであるか又は存在しない。スペーサーは、例えば、置換されているか又は非置換の飽和又は不飽和炭化水素鎖及び、酸素、窒素及び硫黄などの少なくとも１個のヘテロ原子が割り込んだ、置換されているか又は非置換の飽和又は不飽和炭化水素鎖である。好ましくは、炭化水素鎖は、２−２０個の炭素原子、より好ましくは、２−１０個の炭素原子、最も好ましくは、２−６個の炭素原子を含む。適切なスペーサーには、以下に限定されないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も含まれ得る。
【００１７】
Ａは、例えば、受容体認識、内在化、細胞エンドソームからの生体分子の逃避、核の局在、生体分子放出及び系の安定化など、真核細胞において１以上の機能を促進し得る薬剤である。治療剤には、以下に限定されないが、細胞毒性薬（パクリタキセルなど）、エンドソーム分解剤、疎水性ポリマー（以下に限定されないが、ベンゾイル及びラウリル基を含む。）、ターゲティング部分及び遮蔽剤が含まれ得る。遮蔽剤には、以下に限定されないが、親水性のもの（以下に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラクトース、糖及びポリアクリルアミドを含む。）が含まれ得る。ターゲティングリガンドには、以下に限定されないが、トランスフェリン、上皮増殖因子、葉酸、ペプチド、抗体又はその断片、糖及びインテグリン結合物（ＲＧＤペプチドなど）が含まれる。
【００１８】
別の実施形態において、式Ｉａの化合物は、式Ｉａの化合物と複合体を形成する生体分子をさらに含む。この生体分子は、１以上の陰イオン性基を有し得、式Ｉａの化合物とイオン結合を形成し得る。１以上の陰イオン性基を有する生体分子の例には、核酸（例えば、ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ−ＲＮＡバイブリダイザー（ｂｙｂｒｉｄｉｚｅｒ）、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスオリゴ）、タンパク質、ペプチド、脂質及び炭水化物が含まれる。
【００１９】
別の実施形態において、式Ｉａの化合物は、式Ｉａの化合物と複合体を形成する生体分子及び薬剤（即ち、遮蔽、ターゲティング及び／又は送達促進剤）（場合によってはスペーサーを含む。）をさらに含む。
【００２０】
またさらなる実施形態は、このような式Ｉａの化合物及び生体分子（場合によってはそれにより細胞に生体分子を送達するための薬剤をさらに含む。）と細胞を接触させることを含む、真核細胞に形質移入する方法を提供する。本方法は、遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、その哺乳動物にこのような化合物を投与することを含む、哺乳動物を治療することを含み得る。好ましい実施形態において、生体分子はｓｉＲＮＡであり、このｓｉＲＮＡは対象の遺伝子の発現を低下させるのに有効である。
【００２１】
別の実施形態は、式Ｉａの化合物と生体分子とを含む医薬組成物を提供し、本ポリマーと複合体を形成する薬剤をさらに含み得る。
【００２２】
またさらなる実施形態は、遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、哺乳動物に生体分子との式Ｉの化合物の複合体を投与することを含む（前記生体分子は、対象の遺伝子の発現を低下させるのに有効なｓｉＲＮＡである。）、哺乳動物を治療する方法を提供する。
【００２３】
またさらなる実施形態は、遺伝子治療を必要とする哺乳動物を同定し、生体分子との式Ｉａの化合物の複合体を哺乳動物に投与することを含む（前記生体分子は、対象の遺伝子の発現を低下させるのに有効なｓｉＲＮＡである。）、哺乳動物を治療する方法を提供する。
【００２４】
（発明の詳細）
本発明は、生体分子送達のためのユニークな非ウイルス性担体に関し、この担体は、プロピオニルアミド単位により化学的に連結されたポリカチオンを有するポリマーである。本発明は、さらに、下記の式Ｉ及びＩａの化合物、該化合物を調製する方法、ならびに式Ｉ及びＩａの化合物を使用する方法に関する。
【００２５】
Ｉ．式Ｉの化合物
実施形態は、式Ｉで述べられるようなプロピオニルアミド単位により化学的に連結されたポリカチオンを提供する。
【００２６】
【化５】
2009523823.tif 000005
【００２７】
式Ｉにおいて、ポリカチオンは、水溶液中に置かれた場合、２個を超える陽イオン電荷を得ることができる分子として定義される。例えば、ある実施形態において、式Ｉのポリカチオンは、以下に限定されないが、ポリエチレンイミン  ４００Ｄａ−７５０ｋＤａ、デンドリマー構造（例えば異なる構造及び分子量の、ポリプロピレンイミンデンドリマー又はＰＡＭＡＭデンドリマー）、スペルミン、スペルミジン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン及びペンタエチレンヘキサアミンを含む。好ましくは、式Ｉのポリカチオンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、最も好ましくは、式Ｉのポリカチオンはオリオグエチレンイミン（ＯＥＩ）である。式Ｉのポリカチオンは、場合によっては同じポリカチオンの繰り返しを有し得るか又は様々なポリカチオンの繰り返しの組み合わせも有し得る。
【００２８】
「Ｌ」又は式Ｉのリンカーは非エステル含有リンカー部分である。適切な非エステル含有リンカーには、以下に限定されないが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分及びそれらの組み合わせが含まれる。リンカー部分は、ポリカチオン内に含有されるアミン基に結合される。好ましい実施形態において、非エステル含有リンカー部分は、−ＣＨ２−ＣＨＲ’−ＣＯ−Ｎ−（式中、Ｒ’はＨ又はアルキル基である。）により表される化学基として定義されるプロピオニル単位である。より好ましい実施形態において、非エステルリンカーはβ−アミノプロピオニルアミドリンカー部分である。
【００２９】
ポリカチオンは、同じポリカチオンの繰り返し単位又は様々なポリカチオンの組み合わせを含有し得、ここで、ａ及びｃは約１から約２０の範囲の整数である。さらに、Ｌは、同じリンカー部分又は様々なリンカー部分の組み合わせの何れかでも繰り返し得、従ってｂは約１から約１０の範囲の整数である。式Ｉの化合物全体も繰り返し得、ｄは約１から約１００の範囲の整数であり、好ましくは約３０の範囲である。
【００３０】
ＩＩ．式Ｉａの化合物
さらなる実施形態は、式Ｉａで述べられるようなプロピオニルアミド単位により化学的に連結されたポリカチオンを提供する。
【００３１】
【化６】
2009523823.tif 000006
（式中、「Ｓ」はスペーサーであるか又は存在しない。）。スペーサーは、例えば、置換されているか又は非置換の飽和又は不飽和炭化水素鎖及び、酸素、窒素及び硫黄などの少なくとも１個のヘテロ原子が割り込んだ、置換されているか又は非置換の飽和又は不飽和炭化水素鎖である。好ましくは、炭化水素鎖は、２−２０個の炭素原子、より好ましくは２−１０個の炭素原子、最も好ましくは２−６個の炭素原子を含む。適切なスペーサーには、限定されないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も含まれ得る。
【００３２】
式Ｉａの化合物のさらなる実施形態において、これは、また、薬剤（「Ａ」）も含み得る。「Ａ」は、薬剤であるか又は存在しない。好ましくは、「Ａ」は、例えば、受容体認識、内在化、細胞エンドソームからの生体分子の逃避、核の局在、生体分子放出及び系の安定化など、真核細胞において１以上の機能を促進し得る薬剤である。治療剤には、以下に限定されないが、細胞毒性薬（パクリタキセルなど）、エンドソーム分解剤、疎水性ポリマー（以下に限定されないが、ベンゾイル及びラウリル基を含む。）、ターゲティング部分及び遮蔽剤が含まれ得る。遮蔽剤には、以下に限定されないが、親水性のもの（以下に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラクトース、糖及びポリアクリルアミドを含む。）が含まれ得る。ターゲティングリガンドには、以下に限定されないが、トランスフェリン、上皮増殖因子、葉酸、抗体又はその断片、ペプチド、糖及びインテグリン結合物（ＲＧＤペプチドなど）が含まれる。
【００３３】
Ｓ及びＡの少なくとも１つが式Ｉａ中に存在しなければならないことを理解されたい。
【００３４】
ポリカチオンは、同じポリカチオンの繰り返し単位又は様々なポリカチオンの組み合わせを含有し得、ここで、ａ及びｃは約１から約２０の範囲の整数である。さらに、Ｌは、同じリンカー部分又は様々なリンカー部分の組み合わせの何れかでも繰り返し得、従ってｂは約１から約１０の範囲の整数である。式Ｉａの化合物全体も繰り返し得、ｄは約１から約１００の範囲の整数であり、好ましくは約３０の範囲である。
【００３５】
式Ｉの化合物の分子量は、約８００ダルトンから約１，０００，０００ダルトンの範囲、好ましくは約２０，０００ダルトンから約２００，０００ダルトンの範囲、最も好ましくは約２０，０００ダルトンから約３０，０００の範囲であり得る。
【００３６】
式Ｉａの化合物の分子量は、約８００ダルトンから約１，０００，０００ダルトンの範囲、好ましくは約２０，０００ダルトンから約２００，０００ダルトンの範囲、最も好ましくは約２０，０００ダルトンから約３０，０００の範囲であり得る。
【００３７】
Ｌに対するポリカチオンのモル比は２０−５０である。薬剤に対するポリカチオンにおける遊離アミンのモル比が薬剤によって変化し得るが、約１０００から２であり得る。
【００３８】
ＩＩＩ．生体分子との複合体中の式Ｉ又はＩａの化合物
式Ｉの化合物は、生体分子と複合体を形成し得、従って、生体分子を細胞に送達するための担体として有用である。式Ｉの化合物と複合体を形成する生体分子の例には、核酸、タンパク質、ペプチド、脂質及び炭水化物が含まれる。核酸の例には、ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイザー（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｒ）及びアンチセンスＤＮＡ（例えばアンチセンスオリゴ）が含まれる。好ましい核酸はｓｉＲＮＡである。ポリマーと複合体を形成する生体分子を含む陽イオン性リポポリマーは、陽イオン性リポポリマー及び生体分子を共溶媒（ｍｕｔｕａｌ  ｓｏｌｖｅｎｔ）中で混合することにより、より好ましくは下記実施例に記載の方法により、形成され得る。
【００３９】
ＩＶ．生体分子及び場合によっては薬剤との複合体中の式Ｉ又はＩａの化合物
本発明のポリマーは、特定の治療剤（以下に限定されないが、細胞毒性薬（パクリタキセルなど）、エンドソーム分解剤、疎水性ポリマー及びその他のターゲティング部分を含む。）とイオン結合型錯体又は共有結合を形成することもできる。
【００４０】
ＯＥＩ−ＨＤ担体を遮蔽リガンドで修飾することができるが、この遮蔽リガンドは、インビボ投与後に不要な非特異的相互作用が起こるのを減少させ、従って、投与後の循環寿命を向上させる。遮蔽リガンドには、親水性であるものが含まれ、これには、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ラクトース、糖及びポリアクリルアミドが含まれる。さらに、対象の組織への取り込みを向上させるために、ＯＥＩ−ＨＤ又は遮蔽されたＯＥＩ−ＨＤであり得る担体が、これらに共役されたターゲティングリガンドを有し得る。ターゲティングリガンドの例には、以下に限定されないが、トランスフェリン、上皮増殖因子、葉酸、抗体又はその断片、糖及びインテグリン結合物（ＲＧＤペプチドなど）が含まれる。
【００４１】
Ｖ．式Ｉ及びＩａの化合物の調製
ポリカチオン、好ましくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の架橋は、架橋基のビニル基に対するポリマーのアミンの断片のマイケル付加により、及びペンダントエステル基のＮ−アシル化から起こる。架橋基は、アクリレート又はメタクリレートエステル単量体であり得る。アクリレート及びメタクリレートエステル単量体には、以下に限定されないがジアクリレート、ジアルキルアクリレート、ジメタクリレート、ジアクリレートエステル単量体を含むいくつかの基が含まれることを理解されたい。アシル化は、ヒドロキシル（Ｏ−アシル化）又はアミノ（Ｎ−アシル化）基を有する有機化合物の分子へのアシル基の導入として定義される。酢酸エチル及び無水物などのエステルの、ポリマーとの反応により、ポリマーのさらなるＮ−アシル化を行うことができる。化学的修飾は、ポリマー構造の第一及び第二アミンの両方で起こり得、従って、イオン化可能な基の総数が減少する。多官能性反応物を修飾に使用する場合、ポリマーの平均分子量が上昇する。これらの機構及び導入される化学単位を図１で示す。
【００４２】
得られるポリマーは、逆の電荷を有する様々なもの（以下に限定されないが、核酸及び治療用ペプチドを含む。）に対して、非ウイルス性合成担体として適用がある。本発明のポリマーの主要な長所は、幅広い核酸の送達能である。ＰＥＩ  ２５ｋＤａなどの標準的ポリマーがプラスミドＤＮＡ送達において効率的である一方、これらはｓｉＲＮＡ送達には効率的ではなく、より高いポリマー用量でも実質的な遺伝子発現ノックダウンが観察できなかった（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１７、２４１−２４４頁、２００６）。線状ＰＥＩの場合、文献は幾分矛盾している（Ｈａｓｓａｎｉら、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．７、１９８−２０７頁、２００５；Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ．１２、２００５）が、文献ならびに出願者らにより行われた実験からのデータから、線状ＰＥＩ  ２２ｋＤａが一過性形質移入遺伝子のノックダウンに適切であることが示されるが、しかし、安定的に形質移入された細胞株でのロブストなノックダウンを生じさせるのには適していない。これらの標準的試薬とは異なり、本発明のポリマーは一過性ならびに安定的に形質移入された細胞株でノックダウンを達成することができ、プラスミド送達において高い効率を示す。従って、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの２本鎖ＲＮＡ分子は、本発明のポリマー担体での送達に比類なく適している。ｓｉＲＮＡ送達は、治療目的又は標的確認、即ち、新規治療目的のための潜在的な標的の同定のためであり得る。
【００４３】
以下に限定されないが、デンドリマー構造（例えば、異なる構造及び分子量を有する、ポリプロピレンイミンデンドリマー又はＰＡＭＡＭデンドリマー）、スペルミン、スペルミジン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン及びペンタエチレンヘキサアミンを含む様々なオリゴアミンから、又は４００から２５,０００ＭＷの範囲の分枝型ポリエチレンイミンからなる原料物質から、本発明のポリマー担体を調製することができる。分枝型ポリエチレンイミンは、１−、２−又は多官能性薬剤で化学的に修飾されているか又は架橋されている。ポリエチレンイミンは、過剰の第一、第二及び第三アミンを含有し、これらのアミンはポリマー質量のおよそ３０％を構成する。第一及び第二アミンの両者は、架橋剤との反応に対して利用可能である。架橋剤は、少なくとも２個の反応基を有する分子として定義され、少なくとも２個のポリマー分子を化学的に連結するために使用される。架橋剤として使用できる薬剤には、以下に限定されないが、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、１，６ヘキサンジオールジアクリレート、ポリエチレングリコール６００ジアクリレート及びその他の２−もしくは多アクリレート又は２−もしくは多メタクリレート分子が含まれる。本発明で使用される好ましい薬剤はジアクリレート、即ち１，６ヘキサンジオールジアクリレート（略してＨＤ）である。ＨＤは４個の可能な反応部位、即ち２個のビニル基及び２個のエステル基を有する。ポリエチレンイミンが低分子量なので、発明者らは、これを通例、オリオグエチレンイミン、略してＯＥＩと呼ぶ。ＯＥＩをＨＤと合わせ、数日加熱する場合、反応性アミンはマイケル方式で不飽和の２個の部位を架橋する。
【００４４】
通常、使用されるＯＥＩに対するＨＤの比はモルベースで１：１である。この比が１：１を超える場合、数字表示はモル比を示し、例えば、ＯＥＩ−ＨＤ−１は、ＨＤ：ＯＥＩ比が１：１であることを意味し、ＯＥＩ−ＨＤ−５はＨＤ：ＯＥＩ比が５：１であることを意味する。反応が完了すると、プロトンＮＭＲから、ビニル基全てが消費され、得られた産物が通常水溶性であることが示される。このように、膨潤性のヒドロゲルが形成される程はＯＥＩ鎖の架橋は起こっていない。典型的な試料のサイズ排除クロマトグラフィーから、数及び重量平均分子量が計算できるクロマトグラムが得られ、それによると多分散性であった（数平均分子量で重量平均分子量を割るか又はＭｗ／Ｍｎ）。これらの値はそれぞれ３０００、１６，０００及び５．３であった。１という多分散性値は、単分散分子量を示す。２−３という値は幾分狭く、一方４以上の値はより広い分散を示す。
【００４５】
このポリマーは、より高分子量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５，０００（その毒性レベルは遺伝子導入又はｓｉＲＮＡ送達でのインビボ使用には許容できない。）よりも毒性が低くなるように設計された。本発明において出発物質として使用されるＯＥＩ  ８００のような低分子量ＰＥＩは比較的無毒性であるが、細胞膜を横断して核酸を送達する際にはあまり効率が良くない。上述の反応からの産物は、細胞に対して比較的無毒性であり、尚且つ、細胞膜を横断してｓｉＲＮＡ及びＤＮＡを送達する効率が非常に良好である。この上述の反応からの産物はまた、細胞質にｓｉＲＮＡ及びＤＮＡを放出するので、これらが細胞において生物学的効果を発揮することができる。上記で示した理想的構造のさらなる特性は、構造の一部であり得るエステル結合によって生物分解性であるはずであることである。理論的には、エステル加水分解において副産物としてヘキサンジオールを、ならびに１−アルキルアミノ−プロピオン酸末端基を含有するＯＥＩ  ８００を得ることができるであろう。
【００４６】
合成及び単離後、このような担体において赤外線スペクトルを行ったが、発明者らは、驚くことに、存在するエステルがごく僅かであり強いアミドピークが主要であることを見出した。赤外線スペクトルにおいてカルボン酸もまた示されず、これは、早期のエステル加水分解を妨げると思われる（図２）。蒸留水に対する透析後の産物のプロトンＮＭＲから、ＨＤ結合の一部であるべき脂肪族メチレン基が存在しないことが示された。これらの結果を説明できる反応は、ＯＥＩにおける残存アミンによるエステル結合のアシル化であり、ＯＥＩは、出発物質のモル比に基づき大量であるはずである。このようなアシル化はまた、水溶性であり透析により除去可能な１，６ヘキサンジオールの副産物も与える。ＯＥＩにおけるアミンによるエステルアシル化のさらなる証拠は、ポリマーに対する非溶媒である、酢酸エチルでの産物の洗浄により得られた。この場合、分析から、一定限度の量の酢酸エチルのＮ−アシル化が起こったことが示された。
【００４７】
２段階のプロセスによって類似のポリカチオン担体を得ることができる。この代替的な２段階プロセスにおいて、第一段階は、コアポリカチオンを架橋剤で修飾することにあり、第二段階は類似又は異なるタイプのポリカチオン、例えばスペルミン及びペンタエチレンヘキサアミンの付加によるさらなる修飾にある。
【実施例】
【００４８】
本発明は、次の実施例によりさらに明らかとなろうが、これは本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４９】
（実施例１）
担体、ＯＥＩ−ＨＤ−１の合成
ポリエチレンイミン（重量平均分子量８００）５．０ｇ（０．００６３モル）をＤＭＳＯ  ７．５ｍＬ中で溶解した。別個の容器において、ＤＭＳＯ  ３．３ｍＬ及び１．４ｍＬ＝１．４ｇ（０．００６３モル）１，６ヘキサンジオールジアクリレートを添加した。両溶液を混合した。６０℃にサーモスタット調節した油浴に５０ｍＬ丸底フラスコを浸し、磁気撹拌バーを取り付けた。このフラスコに緩く栓をして、４日間反応させた。次に高速撹拌している酢酸エチルの溶液２００ｍＬに反応溶液を滴下添加し、これにより粘性のある物質がフラスコの底部及び側面に形成された。容器を傾けて溶媒を捨て、新鮮な酢酸エチル２００ｍＬ一定分量を添加し、物質を混合した。再び容器を傾けてこれを捨て、さらに１００ｍＬ一定分量を添加し、混合し、容器を傾けて粘性物質以外のものを捨てた。この物質をアルミホイルで作ったボートに移し、室温にて一晩、真空オーブン中にこれを置いた。表面積が小さく物質の粘度が高かったため、この排出プロセスで酢酸エチル全てを除去できず、さらなる精製を必要とした。
【００５０】
（実施例２）
透析によるＯＥＩ−ＨＤ−１の精製
ＯＥＩ−ＨＤ−１  ０．８０ｇを測り取り、これをシンチレーションバイアルに添加し、次いでダルベッコのＰＢＳ緩衝液１０ｍＬを添加した。短時間振盪した後これが溶解した。蒸留水のビーカー中で約１０分間煮沸することによって、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ３５００カットオフ透析膜（０．４ｍＬ／ｃｍ長の容量）の約１リニアフットを予め調整した。次に、透析チューブの一方の端に結び目を作り、ＯＥＩ−ＨＤ−１溶液を添加し、他端を結んで閉じた。このチューブを蒸留水およそ３ガロン中に置き、この水を穏やかに４日間撹拌した。その後、チューブから物質を取り除き、凍結乾燥して、チューブに添加したポリマー質量の約３０％を回収した。プロトン及び炭素１３ＮＭＲをこの産物に対して行った。
【００５１】
（実施例３）
ジオキサンへのＯＥＩ−ＨＤ−１の沈殿
実施例１を繰り返すが、洗浄に酢酸エチルを用いる代わりにジオキサンを使用した。ジオキサンを使用することにより、酢酸エチルエステルにより遊離アミンがアセチル化する可能性を回避する。
【００５２】
（実施例４）
ＯＥＩ−ＨＤ−５の合成
１２５ｍＬガラスボトルにおいてポリエチレンイミン（重量平均分子量８００）５．０ｇ（０．００６３モル）をＤＭＳＯ  ７．５ｍＬ中で溶解した。別個の容器に、ＤＭＳＯ  １７ｍＬ及び７．０ｍＬ＝７．０ｇ（０．０３１５モル）１，６ヘキサンジオールジアクリレートを添加し、混合した。１２５ｍＬボトル中で両溶液を合わせ、それに緩く栓をして、６０℃にサーモスタット調節したオーブンに入れた。反応に入って約３０分後、ゲルが形成されるのが見られた。この反応を全部で３日間続けた。次に、容器を傾けてＤＭＳＯをゲルから捨て、スパチュラでこのゲルを塊に分けた。水約１０ｍＬが入った２０ｍＬシンチレーションバイアルに小塊を入れたところ、ゲルの殆どが溶解したようだった。
【００５３】
（実施例５）
ＯＥＩ−ＨＤ-１０の合成
１２５ｍＬガラスボトルにおいてポリエチレンイミン（重量平均分子量８００）５．０ｇ（０．００６３モル）をＤＭＳＯ  ７．５ｍＬ中で溶解した。別個の容器に、ＤＭＳＯ  ３４ｍＬ及び１４ｍＬ＝１４ｇ（０．０６３０モル）１，６ヘキサンジオールジアクリレートを添加し、混合した。１２５ｍＬボトル中で両溶液を合わせ、それに緩く栓をして、６０℃にサーモスタット調節したオーブンに入れた。反応に入って約３０分後、ゲルが形成されるのが見られた。この反応を全部で３日間続けた。次に、容器を傾けてＤＭＳＯをゲルから捨て、スパチュラでこのゲルを塊に分けた。水約１０ｍＬが入った２０ｍＬシンチレーションバイアルに小塊を入れ、２日間振盪した。物質は溶解しなかった。
【００５４】
（実施例６）
ＯＥＩ−Ｓｕｂ−１の合成
ＰＥＩ-８００（０．００１３モル）１．０ｇを測り取り、塩化マグネシウム上で静置することにより乾燥させたＤＭＳＯ  ５ｍＬを添加した。ＰＥＩは完全に溶解しなかったが、濁った懸濁液が形成された。スベロイルクロリド０．２２ｍＬ（０．２６ｇ、密度１．１７２、０．００１３モル）を乾燥ＤＭＳＯ  ５ｍＬにピペットで添加した。全てのガラス容器を炎であぶり、水分を除去した。室温にて手で振盪しながら、スベロイル溶液をＰＥＩ溶液／懸濁液に滴下添加した。不溶性ゲル様物質がすぐに形成された。このゲルを過剰な新鮮乾燥ＤＭＳＯで１回洗浄し、次いで過剰なジオキサンで２回洗浄した。容器を傾けて残存溶媒を捨て、室温にて１９時間、ハウスバキューム下にゲルを置いた。この物質は、真空乾燥後でも著しく臭いが強かった。ＩＲ（顕微鏡）及びＤ２ＯでのプロトンＮＭＲに試料を供した。プロトンＮＭＲから、予想される水に加えて、残存ＤＭＳＯ及びジオキサンの存在が示された。５０ｍｇをファイル試料用に取り、試料の残りを蒸留水約１０ｍＬ中で完全に溶解した。試料を透析チューブ（３５００分子量カットオフ）に入れ、磁気撹拌バーで穏やかに撹拌しながら５日間、蒸留水約１２Ｌに対して透析した。試料を２本のバイアルに分け、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試料およそ１００ｍｇを回収した。不純なファイル試料として得られた５０ｍｇに対して補正したところ、物質の約９０％が失われており、これはおそらく透析膜を通過したことによる。ＰＥＩ−８００−Ｓｕｂ−１の構造案を図３ａで示し、産物のＩＲを図３ｂで図式により示す。
【００５５】
（実施例７）
ＯＥＩ−ＨＤ−１によるＳｉＲＮＡノックダウン
ＯＥＩ−ＨＤ−１を用いたＨＵＨ７／ＥＧＦＰＬｕｃ細胞におけるｓｉＲＮＡ送達の結果を図４でまとめる。血清不含培地（ＯｐｔｉＭＥＭ）中ウェルあたり５，０００個の細胞を用いて、９６ウェルプレートで形質移入を行った。２０μＬ  ＨＢＳ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中でＯＥＩ−ＨＤ−１／ｓｉＲＮＡ処方物を調製し、血清不含培地８０μＬに添加した（総体積１００μＬ）。送達から４時間後、形質移入培地を増殖培地に交換し、２日後、ルシフェラーゼ活性を測定した。０．１０μｇ  ｓｉＲＮＡ（４０ｎＭ）及びＣ／Ｐ比８／１（ＯＥＩ−ＨＤ−１／ｓｉＲＮＡ：ｗ／ｗ）を用い、非特異的Ｍｕｔ  ｓｉＲＮＡを用いた形質移入と比較して、最大で５０％のルシフェラーゼ活性のノックダウンを達成した。明確にするために、Ｃ／Ｐ比は、担体：プラスミド重量比を意味し、これは、本発明の目的の場合、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡであり得る。Ｍｕｔ  ｓｉＲＮＡを対照として使用したが、これは担体の毒性のよい尺度である。よって、Ｍｕｔ  ｓｉＲＮＡを用いてシグナル低下が見られる場合（生物学的活性はないはずである。）、同じ濃度の特異的なｓｉＲＮＡを用いて見られるノックダウンを細胞における担体の毒性的影響に対して補正すべきである。
【００５６】
０．２５μｇ  ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）及びＣ／Ｐ比４／１を用いて、非特異的Ｍｕｔ  ｓｉＲＮＡを用いた形質移入と比較して、最大で６０％のルシフェラーゼ活性のノックダウンを達成した。０．５０μｇ  ｓｉＲＮＡ（２００ｎＭ）の場合、最大で８０％のノックダウンが観察された。ｓｉＲＮＡのより高濃度（最高１．００μｇ  ｓｉＲＮＡ（４００ｎＭ）を使用した場合、ルシフェラーゼ活性はさらに低下しなかった。従って、ＯＥＩ−ＨＤ−１（ＨＢＳ中の複合体、血清不含培地中の形質移入）を用いたＨＵＨ７／ＥＧＦＰＬｕｃにおける送達の場合、ルシフェラーゼ発現の最大ノックダウンは、２００ｎＭ（５，０００個の細胞あたり０．５０μｇ  ｓｉＲＮＡ）及びＣ／Ｐ比２／１により達成され得る。
【００５７】
（実施例８）
様々な緩衝培地中でのＯＥＩ−ＨＤ−１を用いたｓｉＲＮＡノックダウン
様々な血清不含の複合体形成培地（ＨＢＳ：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ＨＢＧ：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％グルコース；ＯｐｔｉＭＥＭ：低塩濃度血清不含培地、Ｇｉｂｃｏ）中でＯＥＩ−ＨＤ−１がルシフェラーゼ発現をノックダウンする能力を試験した。使用した複合体形成培地とは独立して、ＯＥＩ−ＨＤ−１／ｓｉＲＮＡ処方物は、複合体形成培地間で顕著な差はなく、ルシフェラーゼ活性を最大で８０％ノックダウンすることができた。ＯｐｔｉＭＥＭ中の処方物は、１００ｎＭ（Ｃ／Ｐ：２／１）で高効率であった。これは、ＯＥＩ−ＨＤ−１／ｓｉＲＮＡ粒子がより速く凝集することにより起こり得る。結果を図５で示す。
【００５８】
（実施例９）
血清含有培地中でのＯＥＩ−ＨＤ−１によるｓｉＲＮＡノックダウン
血清存在下（１０％ＦＣＳ）でＯＥＩ−ＨＤ−１を用いてＨＵＨ７／ＥＧＦＰＬｕｃでのｓｉＲＮＡ送達を行った。ＨＢＳ（２０μＬ）中でＯＥＩ−ＨＤ−１／ｓｉＲＮＡ処方物を調製し、細胞において血清含有培地８０μＬに複合体を添加した。２種類の異なるアプローチを行った；第一に、通常どおりｓｉＲＮＡ送達から４時間後に培地を交換し、第二の培地を２日間交換しなかった。培地交換後、２００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ及びＣ／Ｐ比６／１を用いて、ルシフェラーゼ発現の最大ノックダウンを達成した（これは、血清不含培地で達成した最適移入条件：２００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ、Ｃ／Ｐ比２／１とは異なっていた。）。
【００５９】
培地交換なしでの、ＯＥＩ−ＨＤ−１／ｓｉＲＮＡ送達に対する最適移入条件は、血清なしの場合と同じであった（２００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ、Ｃ／Ｐ比２／１）。さらに、培地交換なしで、ＯＥＩ−ＨＤ−１は非常に毒性が高く、Ｃ／Ｐ比６／１及び２００ｎＭで細胞は死んだ。興味深いことに、培地交換なしで、１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ及びＣ／Ｐ比４／１が既にルシフェラーゼ遺伝子の発現ノックダウンに非常に有効であった。
【００６０】
まとめると、ＯＥＩ−ＨＤ−１ビヒクルは血清存在下でもｓｉＲＮＡ送達に対して有効であった。血清不含培地での結果と同様に、１０％ＦＣＳ存在下でもルシフェラーゼ発現の最大で８０％のノックダウンが観察された。さらに培地交換なしでは、最大効果を達成するには、より低いｓｉＲＮＡ濃度で既に十分であった。結果を図６ａ及び６ｂでまとめる。
【００６１】
（実施例１０）
ＯＥＩ−Ｓｕｂ−１によるＳｉＲＮＡノックダウンの失敗
様々なポリマー／ｓｉＲＮＡ比を用いて、ＨＵＨ７／ＥＧＦＰＬｕｃ細胞でのｓｉＲＮＡ送達について、架橋剤としてＯＥＩ（８００Ｄａ）及びスベロイル酸（ｓｕｂｅｒｏｙｌ  ａｃｉｄ）（Ｃ６Ｈ１２Ｏ２Ｃｌ２）を用いて合成したＯＥ−Ｓｕｂ−１（実施例６に記載のように）を試験した。Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（ＧＬ３）及びＭｕｔ  ｓｉＲＮＡ（ＩＸ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて、トリプリケートで、９６ウェルプレート及びウェルあたり５，０００個の細胞で、形質移入を行った。ＨＢＳ中でＯＥＩ−複合体を調製し、血清不含培地中でｓｉＲＮＡ送達を４時間行った。次に、形質移入培地を増殖培地に交換し、ｓｉＲＮＡ送達から２日後にルシフェラーゼ発現を測定した。ｓｉＲＮＡの量を細胞５，０００個あたり０．１から０．５０μｇまで変動させ、ＯＥＩ−Ｓｕｂ−１／ｓｉＲＮＡ比を同様に変動させたが；図７で示されるようにルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制は観察されなかった。
【００６２】
（実施例１１）
ＯＥＩ−ＨＰ−１へのＫ５ペプチド模倣物のカップリング
１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び２０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．５を含有する反応緩衝液１ｍＬ中でＯＥＩ−ＨＤ（２．８ｍｇ）を溶解する。撹拌しながら、１００％エタノール８０μＬ中でこの溶液にＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（８０μｇ）を添加する。９０分間反応を続ける。次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いてゲルろ過によってＳＰＤＰ−活性化ＯＥＩ−ＨＤを精製する。第二段階において、Ｎ末端にシステインを有するＫ５ペプチドの３倍モル過剰量を同じ緩衝液中で添加する。室温にて１２時間反応を進行させ、次いでＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いてゲルろ過により精製する。
【００６３】
（実施例１２）
ＯＥＩ−ＨＤ−１へのＲＧＤＣ（システイン末端）ペプチドのカップリング
１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び２０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．５を含有する反応緩衝液１ｍＬ中でＯＥＩ−ＨＤ（２．８ｍｇ）を溶解する。撹拌しながら、１００％エタノール８０μＬ中でこの溶液にＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（８０μｇ）を添加する。９０分間反応を続ける。次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いてゲルろ過によってＳＰＤＰ−活性化ＯＥＩを精製する。第二段階において、ＲＧＤＣペプチドの３倍モル過剰量を同じ緩衝液中で添加する。室温にて１２時間反応を進行させ、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いてゲルろ過により精製する。
【００６４】
（実施例１３）
抗体断片（Ｆａｂ’）のカップリング
Ｍｅｒｄａｎら、Ｂｉｏｃｏｍｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１４、９８９頁（２００３）からの手順を用いて、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び２０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．５を含有する反応緩衝液１ｍＬ中でＯＥＩ−ＨＤ（２．８ｍｇ）を溶解する。撹拌しながら、１００％エタノール８０μＬ中でこの溶液にＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（８０μｇ）を添加する。９０分間反応を続ける。次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いてゲルろ過によってＳＰＤＰ−活性化ＯＥＩを精製する。
【００６５】
第二段階において、直前に還元したＦａｂ’の１．４倍モル過剰量を同じ緩衝液中で添加する。室温にて１２時間反応を進行させ、緩衝液Ａとして０．９％ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４及び緩衝液Ｂとして３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４及びＭａｃｒｏＰｒｅｐ  ＨｉｇｈＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａより）を用いて勾配イオン交換クロマトグラフィーによって精製を行う。
【００６６】
（実施例１４）
ＨＭＤＩ活性化を介したＯＥＩ−ＨＤへのポリエチレングリコールのカップリング
ＰＥＧモノメチルエーテル（０．５−２０ｋＤａ）をクロロホルム無水物（２００ｇ／Ｌ）中で溶解し、６０℃で２４時間、ヘキサメチレンジイソシアネート、ＨＭＤＩの１０倍過剰量で活性化する。軽ガソリンで繰り返し抽出することにより未反応ＨＭＤＩを慎重に除去する。続いて、イソシアネートが末端にあるＰＥＧとＯＥＩ−ＨＤのアミノ基との反応を６０℃にて２４時間、クロロホルム無水物中で行う。ＯＥＩ−ＨＤに対する活性化ＰＥＧの比を変化させることによりＰＥＧ化の度合いを調整することができる。反応溶液をジエチルエーテル又はその他の適切な非溶媒中で沈殿させ、産物を真空中で乾燥させる。
【００６７】
（実施例１５）
ＰＥＧ−ＮＨＳを介したＯＥＩ−ＨＤへのポリエチレングリコールのカップリング
所望の分子量のＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルをＤＭＳＯ中で溶解し、ＯＥＩ−ＨＤ−１の水溶液に添加する。反応物を２４時間撹拌し、ＰＥＧ化ポリマーを例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより単離する。
【００６８】
（実施例１６）
ＰＥＧ−遮蔽された目的設定可能な担体を形成するための、ＰＥＧ−スペーサーを介した環状ＲＧＤペプチドのカップリング
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．３２、１４９頁、２００４において公表された手順に従い、ＲＧＤをポリエチレングリコールに連結する。ＲＧＤとのポリエチレングリコールの化学共役物（Ｈ−ＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ−ＯＨ）を最初に合成する。ジスルフィド架橋により環状の１０マーＲＧＤペプチドを形成する２個のシステイン残基を酸化することにより、これを行う。次に、環状ペプチド６０ｍｇを６００μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で溶解する。テトラヒドロフラン２０μＬ中で予め溶解させたトリエチルアミン（ＴＥＡ）８．５４μＬを窒素下でペプチドに添加する。１分間撹拌した後、活性化ＰＥＧ、即ちＮＨＳ−ＰＥＧ-ＶＳ（ＴＨＦ：ＤＭＳＯ；３００μＬ：１００μＬ中２１２ｍｇ）の溶液を一度に添加し、ペプチドのアミノ末端とＰＥＧのｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を反応させる。反応混合物を室温で４時間撹拌し、ＴＥＡに対して当量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により反応を停止させる。蒸留水に対する透析によってＲＧＤ−ＰＥＧ−ＶＳを精製し、次いで乾燥凍結する。第二段階において、精製したＲＧＤ−ＰＥＧ−ＶＳ中間体１００ｍｇ（２１．７μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ  １ｍＬ中で溶解する。この溶液に、０．５ｍＬ  ＴＨＦ中で溶解したＴＥＡの６当量を添加し、混合する。ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中で溶解したＯＥＩ−ＨＤの９．４ｍｇ（アミンに関して２１８μｍｏｌ）一定分量をこの溶液に添加し、室温で１２時間撹拌して、ＰＥＧのビニルスルホン（ＶＳ）との、ＯＥＩのアミンのマイケル付加を引き起こす。ＴＦＡ塩としてＨＰＬＣにより産物を精製する。
【００６９】
（実施例１７）
ＯＥＩ−ＨＤ産物
記載のように（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ．９、１３−１４頁、２００５）、パクリタキセルをポリエチレングリコール分子の一方の末端に連結する。ＰＥＧ鎖の他方のヒドロキシル末端をトリクロロ−ｓ−トリアジンと反応させ、活性化ＰＥＧ末端基を生成させる。ｐＨ９．０にて水中で活性化ＰＥＧをＯＥＩ−ＨＤと組み合わせ、ＯＥＩ−ＨＤ担体にＰＥＧ−パクリタキセルを連結する。ターゲティングリガンドならびに対象の細胞に対する特異的ｓｉＲＮＡを有する他のＯＥＩ−ＨＤポリマーと、このＯＥＩ−ＨＤ-ＰＥＧ−パクリタキセル部分を組み合わせ、ポリプレックスを形成させる。このポリプレックスは、細胞での転写を干渉する薬剤を送達する特性（ｓｉＲＮＡ）ならびに低分子の細胞毒性薬、即ちパクリタキセルを送達する特性を有する。
【００７０】
（実施例１８）
ＲＡＮ−ｓｉＲＮＡ送達のための化学的修飾ポリカチオンのインビボでの使用
ＲＡＮ  ｓｉＲＮＡは、ＲＡＮ  ＧＴＰａｓｅに対する低分子干渉ＲＮＡである。この酵素は殆どの細胞に必須であり、発現のノックダウンによって毒性のある影響が出る。１５匹のマウスの背中に１００万個のＮｕｅｒｏ２Ａ腫瘍細胞を皮下注射し、その結果、局所的腫瘍が生じ、皮膚を通してカリパスでこれを測定した際に直径３ｍｍの大きさになるまで成長させた。各群５匹で３群、即ち治療群、対照群及びビヒクル群にマウスを分けた。治療群には、０．６：１の重量比でＯＥＩ−ＨＤ担体にポリプレックス化されたＲＡＮ−ｓｉＲＮＡを投与し、この担体は、ＯＥＩ−ＨＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ  １０重量％を含有していた。対象の腫瘍がトランスフェリン（Ｔｆ）に対する受容体を発現することが知られているので、ＰＥＧスペーサーを介してＯＥＩ−ＨＤにトランスフェリン（Ｔｆ）を共有結合させたが、これはターゲティング剤としての役割を果たした。対照群には、０．６：１の重量比でＯＥＩ−ＨＤにポリプレックス化されたｓｉＣＯＮＴＲＯＬ（生物学的に不活性の対照ｓｉＲＮＡ）を投与し、この担体は、ＯＥＩ−ＨＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ  １０重量％を含有していた。最後の群には、緩衝液ビヒクル、ＨＥＰＥＳ緩衝グルコースを投与した。各マウスに対して、尾静脈を通じて３日間あけて、３回、２００μＬの注射を行った。各治療注射はｓｉＲＮＡ  ３５μｇを含有し、各対照注射はｓｉＣＯＮＴＲＯＬ  ４０μｇを含有していた。ビヒクル群には、緩衝液のみ２００μＬを投与した。全動物に対して、腫瘍サイズ及び動物体重を毎日測定した。
【００７１】
最初の注射を行ってから８日間マウスを生存させた。この試験に関与する体重減少は何れの実験群でも見られなかった。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及び緩衝液群に対する腫瘍成長曲線は基本的に同じであったが；第３日に、ＲＡＮ  ｓｉＲＮＡ処置群に対する成長曲線がよい方向に変化し、図８で示されるように速度が遅くなった。
【００７２】
（実施例１９）
ＲＡＦ−１−ｓｉＲＮＡ送達のための化学的修飾ポリカチオンのインビボでの使用
実施例２０に記載の実験プロトコールを繰り返すが、腫瘍を生成させるために、ＳＣＩＤ−マウス、５百万個のＨＵＨ７肝臓腫瘍細胞及び治療群においてＲＡＦ−１−ｓｉＲＮＡに変更する。ＲＡＦ−１−ｓｉＲＮＡ−低分子干渉ＲＮＡは、多くの癌細胞に対して重要な生体分子であるＲＡＦ−１に対するものである。
【００７３】
（実施例２０）
ＰＬＫ−１−ＳｉＲＮＡ送達のための化学的修飾ポリカチオンのインビボでの使用
実施例１９に記載の実験プロトコールを繰り返すが、ＰＬＫ−１を発現することが知られており、細胞培養においてＰＬＫ−１  ｓｉＲＮＡでの形質移入後に細胞死が起こることが分かっている腫瘍細胞に変更する。ＰＬＫ−１−ｓｉＲＮＡ−低分子干渉ＲＮＡは、細胞周期の進行の重要な制御因子であるｐｏｌｏ−様キナーゼ１に対するものである。発現のノックダウンにより毒性的な影響が生じる。
【００７４】
（実施例２１）
実施例１９からのポリプレックスの形成及び特性解析
Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを用いて、ポリプレックスサイズの特性解析を行う。この機器は、従来の手法によりゼータ電位を測定することができ、準弾性レーザ光散乱技術により粒子サイズを測定することができる。ＯＥＩ−ＨＤ、１．１μｇ及びＯＥＩ−ＰＥＧ−トランスフェリン、０．１２μｇをＨＢＧ（ＨＥＰＥＳ緩衝グルコース、ｐＨ７．３の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有する５％グルコース溶液（重量／体積））２５μＬ総体積中で混合する。ＨＢＧを用いてｓｉＲＮＡ（２．０μｇ）の個々の量を別のバイアル中で２５μＬになるように希釈した。続いて、ｓｉＲＮＡ溶液にポリマー溶液を添加し、容器を１０回転倒撹拌することによって混合した。得られたポリプレックス懸濁液の粒子サイズは２００−３００ｎｍであり、ゼータ電位は−１．３ミリボルトであった。ゼータ電位は、粒子の固定イオン層と可動イオン拡散層との間の滑り面での電場において運動しているコロイド粒子に関与する電位である。
【００７５】
（実施例２２）
核酸担体ＯＥＩ−ＨＤ−１への活性化二官能性ＰＥＧのカップリングとそれに続く、ペンダント活性化ＰＥＧ末端基へのトランスフェリンのカップリング
ＯＥＩ（３４Ｋ）、３００ｍｇ（〜９ｘ１０−６モル）を１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．６  ５ｍＬ中で溶解した。別個のバイアル中で、７５ｍｇ（ＮＭＲにより純度６６％、−１ｘ１０−５モル）ＯＰＳＳ−ＰＥＧ（５Ｋ）−ＳＰＡ（オルト−ピリジルジスルフィド−ポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピオネート）をエタノール４ｍＬ中で溶解した。両溶液を合わせ、室温で２時間撹拌した。次に、反応溶液をイオン交換クロマトグラフィーに供し、ＯＰＳＳ−ＰＥＧ-ＯＥＩを含有する分画を回収した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置を用いて精製産物の体積を１ｍＬに減少させた。ＰＤ１０カラム（ＯＥＩで予め飽和）を用いて産物を脱塩した。試料溶液１ｍＬをカラムに添加し、次いで水１．５ｍＬを添加することによってこれを行った。最初のフロースルーを捨て、水２ｍＬ中で試料を溶出させた。この溶液を凍結乾燥し、プロトンＮＭＲにより分析し、その結果、７１４のＯＥＩ繰り返し単位あたり１個のピリジルジチオ基が示された。この中間体をＯＥＩ−ＨＤ−１−ポリエチレングリコール−２−ピリジルジチオ−プロピオンアミド又は略して「ＯＥＩ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ」と名づけた。
【００７６】
ＯＥＩ−ＰＥＧ−ＳＨへのＯＥＩ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳの還元
凍結乾燥ＯＥＩ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ  ２５ｍｇを１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液１．５中で溶解した。続いて、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）４０ｍｇ（〜２．６ｘ１０−４モル）を試料溶液に添加し、これを３０分間撹拌した。反応の進行を監視するために、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で試料溶液１０μＬを５００μＬに希釈し、ＵＶ／ＶＩＳ光度計を用いて吸収スキャンを行った。３４３ｎｍでの極大値を観察することにより、この反応の進行を確認した。ＰＤ１０カラムを用いて、反応溶液を精製した。このカラム（ＯＥＩで予め飽和させ、ＨＢＳ緩衝液で平衡化）に反応溶液１．５ｍＬを添加し、次いでＨＢＳ緩衝液１ｍＬを添加することにより（ＨＢＳ緩衝液は使用前にアルゴンで泡立て通気した。）、これを行った。最初のフロースルーを捨て、ＨＢＳ  ２ｍＬ中で試料を溶出させた。ＯＥＩ−ＰＥＧ−ＳＨ試料溶液の濃度は、銅錯化アッセイにより測定した場合、５ｍｇ／ｍＬであった。保存のため、封入前に試料溶液にアルゴンを５分間泡立て通気した。
【００７７】
Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）によるトランスフェリンの修飾
トランスフェリン（６０ｍｇ）をＨＢＳ緩衝液３ｍＬ中で溶解した。続いて、ＳＰＤＰ  ３．５ｍｇをエタノール７ｍＬ中で溶解した（完全に溶解するために慎重に溶液を加温）。すぐに、ＳＰＤＰ溶液０．５ｍＬをピペットでトランスフェリン溶液に移し、１時間穏やかに撹拌した。
【００７８】
反応溶液をＹＭ−１０  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置に移し、体積を１ｍＬまで減少させた。さらに４回の１ｍＬ緩衝液交換をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置で行った。精製トランスフェリン−ＳＰＤＰ溶液にアルゴンガスを５分間泡立て通気した。
【００７９】
トランスフェリン−ＳＰＤＰとのＯＥＩ−ＰＥＧ−ＳＨのカップリング
ＯＥＩ−ＰＥＧ−ＳＨ  １０ｍｇをＨＢＳ緩衝液２ｍＬ中で溶解し、精製した活性化トランスフェリン溶液２．７ｍＬを新しいシンチレーションバイアルに入れ、室温で一晩穏やかに撹拌した。次に、５ｍｇ（４ｘ１０−５モル）Ｎ−エチル−マレイミドで未反応スルフィドリル基を不活性化し、３０分間撹拌した。
【００８０】
イオン交換クロマトグラフィーによりＯＥＩ−ＰＥＧ−トランスフェリンを精製した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置を用いて体積を減少させ、前述のように産物を脱塩した。
【００８１】
生物学的共役物（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）中のポリアミン（ＯＥＩ）の濃度は、銅錯化アッセイにより測定した場合、１．３ｍｇ／ｍＬであり、ＵＶ分光法により測定した場合トランスフェリンは２．９ｍｇ／ｍＬであった。
【００８２】
トランスフェリンへの鉄の取り込み
Ｋｕｒｓａ  Ｍ、Ｗａｌｋｅｒ  ＧＦ、Ｒｏｅｓｓｌｅｒ  Ｖ、Ｏｇｒｉｓ  Ｍ、Ｒｏｅｄｌ  Ｗ、Ｋｉｒｃｈｅｉｓ  Ｒ、Ｗａｇｎｅｒ  Ｅ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００３に記載のように、トランスフェリン含量１ｍｇあたり鉄負荷緩衝液１．２５μＬを試料に添加することにより、トランスフェリンへの鉄負荷を行う。
【００８３】
ＯＥＩ−ＰＥＧ  ５Ｋ−トランスフェリンへのｓｉＲＮＡの結合親和性を調べるためのシフトアッセイの使用
非特異的ｓｉＲＮＡ保存溶液から０．０１ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。ｓｉＲＮＡ溶液２０μＬをいくつかの小さなプラスチックバイアルに移し、続いて、各バイアル中の総体積を４０μＬに一定に維持しながら、ＨＢＧ緩衝溶液中のＯＥＩ−ＰＥＧ  ５Ｋ−トランスフェリンの量を増加させた。ＯＥＩ−ＰＥＧ  ５Ｋ−トランスフェリン−対−ｓｉＲＮＡの重量比は０から１０の範囲であった。ピペッティング後、バイアルの内容物をよく混合し、１０分間静置した。次いで、各バイアルから２０μＬ一定分量をアガロースゲルプレートのそれらの対応するウェルに移した。７５ボルトに設定した電気泳動装置にアガロースゲルプレートを置いた。１５分後、プレートを取り出し、写真撮影した。発明者らは、重量比１.５以上のウェルではｓｉＲＮＡの移動バンドが観察されなかったことを見出した。このことから、全ｓｉＲＮＡが１．５以上の重量比でＯＥＩ（３４Ｋ）−ＰＥＧ（５Ｋ）−トランスフェリンと複合体を形成したことが示された。
【００８４】
（実施例２３）
式Ｉ又はＩａの化合物とのベンゾイル安息香酸のカップリング
【００８５】
【化７】
2009523823.tif 000007
【００８６】
（ＲＬＵ＝相対的発光単位；Ｃ：Ｐ＋担体対プラスミド又はｓｉＲＮＡ比ｗ／ｗ；ｌｕｃ＝抗−ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ；ｓｃｒ＝スクランブラー（ｓｃｒａｍｂｌｅｒ）ｓｉＲＮＡ対照；及びｌｉｐ＝リポフェクタミン形質移入剤）
ベンゾイル安息香酸−スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１５７７）を使用し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で反応を行った。２０ｍｇ  ポリマー（下記）を２ｍＬ  ＨＢＳ中で溶解し、ｐＨを７．３に調整した。続いて、ベンゾイル安息香酸−ＮＨＳエステルの様々な量を１ｍＬ  無水ＤＭＳＯ中で添加した。
【００８７】
全ての反応を１２時間行い、その後、脱イオン水を用いておよそ６ｍＬに希釈した。続いて透析を行い、その後、共役物を凍結乾燥した。
【００８８】
【表１】
2009523823.tif 000008
【００８９】
【表２】
2009523823.tif 000009
【００９０】
再び試料を凍結乾燥し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で溶解した。これらの溶液から、銅アッセイを用いて、非修飾ポリマーに対して濃度を決定した。
【００９１】
ダイナミックレーザー光散乱によるサイズ決定
ｓｉＲＮＡ  ０．５μｇを５０μＬの総体積でＯＥＩの個々の量と複合体形成させた。
【００９２】
【表３】
2009523823.tif 000010
【００９３】
【表４】
2009523823.tif 000011
【００９４】
【表５】
2009523823.tif 000012
【００９５】
【表６】
2009523823.tif 000013
【００９６】
【表７】
2009523823.tif 000014
【００９７】
【表８】
2009523823.tif 000015
【００９８】
【表９】
2009523823.tif 000016
【００９９】
【表１０】
2009523823.tif 000017
【０１００】
（実施例２４）
式Ｉ又はＩａの化合物に対するラウリン酸のカップリング
ラウリン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｈｉｃｈ番号ＯＬ３９００−５ｇ、ロット番号０８７Ｈ５１７４）を使用し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で反応を行った。２０ｍｇポリマーを２ｍＬ  ＨＢＳ中で溶解し、ｐＨを７．３に調整した。続いて、ラウリン酸ＮＨＳエステルの様々な量を１ｍＬ無水ＤＭＳＯ中で添加した。
【０１０１】
【表１１】
2009523823.tif 000018
【０１０２】
【表１２】
2009523823.tif 000019
【０１０３】
全ての反応を１２時間行い、その後、脱イオン水を用いておよそ６ｍＬに希釈した。続いて透析を行い、その後、共役物を凍結乾燥した。
【０１０４】
【表１３】
2009523823.tif 000020
【０１０５】
続いて、共役物をＤ２Ｏ中で溶解し、１Ｈ−ＮＭＲに供した。次の実際のカップリング度をＮＭＲにより決定した。
【０１０６】
ＮＭＲ計算に基づくカップリング度：
【０１０７】
【表１４】
2009523823.tif 000021
【０１０８】
再び試料を凍結乾燥し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で溶解した。これらの溶液から、銅アッセイを用いて、非修飾ポリマーに対して濃度を決定した。
【０１０９】
ダイナミックレーザー光散乱によるサイズ決定
ｓｉＲＮＡ  ０．５μｇを５０μＬの総体積でＯＥＩの個々の量と複合体形成させた。ＨＢＳ中で実験を行った。
【０１１０】
【表１５】
2009523823.tif 000022
【０１１１】
【表１６】
2009523823.tif 000023
【０１１２】
【表１７】
2009523823.tif 000024
【０１１３】
【表１８】
2009523823.tif 000025
【０１１４】
ノックダウン効率、Ｈ１２９９細胞、ウェルあたり０．５μｇ  ｓｉＲＮＡ
ＰＥＩ  ８００及びＰＥＩ  ２ｋ及びその誘導体
【０１１５】
【表１９】
2009523823.tif 000026
【０１１６】
【表２０】
2009523823.tif 000027
【０１１７】
【表２１】
2009523823.tif 000028
【０１１８】
ＯＥＩ  ５ｋ及びその誘導体
【０１１９】
【表２２】
2009523823.tif 000029
【０１２０】
【表２３】
2009523823.tif 000030
【０１２１】
【表２４】
2009523823.tif 000031
【０１２２】
ＯＥＩ  ９ｋ誘導体
【０１２３】
【表２５】
2009523823.tif 000032
【０１２４】
【表２６】
2009523823.tif 000033
【０１２５】
ＯＥＩ  ３０ｋ誘導体
【０１２６】
【表２７】
2009523823.tif 000034
【０１２７】
【表２８】
2009523823.tif 000035
【０１２８】
（実施例２３）
ＰＥＩ／ＯＥＩへのラウリン酸のカップリング及び共役物の物理化学的ならびに生物学的評価
ラウリン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ番号ＯＬ３９００−５ｇ、ロット番号０８７Ｈ５１７４）を使用し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で反応を行った。２０ｍｇポリマーを２ｍＬ  ＨＢＳ中で溶解し、ｐＨを７．３に調整した。続いて、ラウリン酸ＮＨＳエステルの様々な量を１ｍＬ無水ＤＭＳＯ中で添加した。
【０１２９】
ＰＥＩ  ８００Ｄａ及びＰＥＩ  ２ｋＤａ
【０１３０】
【表２９】
2009523823.tif 000036
【０１３１】
ＯＥＩ  ５ｋＤａ、９ｋＤａ及び３０ｋＤａ
【０１３２】
【表３０】
2009523823.tif 000037
【０１３３】
全ての反応を１２時間行い、その後、脱イオン水を用いておよそ６ｍＬに希釈した。続いて透析を行い、その後、共役物を凍結乾燥した。
【０１３４】
【表３１】
2009523823.tif 000038
【０１３５】
続いて、共役物をＤ２Ｏ中で溶解し、１Ｈ−ＮＭＲに供した。次の実際のカップリング度をＮＭＲにより決定した。
【０１３６】
ＮＭＲ計算に基づくカップリング度：
【０１３７】
【表３２】
2009523823.tif 000039
【０１３８】
再び試料を凍結乾燥し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で溶解した。
【０１３９】
これらの溶液から、銅アッセイを用いて、非修飾ポリマーに対して濃度を決定した。
【０１４０】
ダイナミックレーザー光散乱によるサイズ決定
ｓｉＲＮＡ  ０．５μｇを５０μＬの総体積でＯＥＩの個々の量と複合体形成させた。ＨＢＳ中で実験を行った。
【０１４１】
【表３３】
2009523823.tif 000040
【０１４２】
【表３４】
2009523823.tif 000041
【０１４３】
【表３５】
2009523823.tif 000042
【０１４４】
【表３６】
2009523823.tif 000043
ノックダウン効率  Ｈ１２９９細胞、０．５μｇ  ｓｉＲＮＡ／。
【０１４５】
ＰＥＩ  ８００及びＰＥＩ２ｋ及びその誘導体
【０１４６】
【表３７】
2009523823.tif 000044
【０１４７】
【表３８】
2009523823.tif 000045
【０１４８】
【表３９】
2009523823.tif 000046
【０１４９】
ＯＥＩ  ５ｋ及びその誘導体
【０１５０】
【表４０】
2009523823.tif 000047
【０１５１】
【表４１】
2009523823.tif 000048
【０１５２】
【表４２】
2009523823.tif 000049
【０１５３】
ＯＥＩ  ９ｋ誘導体
【０１５４】
【表４３】
2009523823.tif 000050
【０１５５】
【表４４】
2009523823.tif 000051
【０１５６】
ＯＥＩ  ３０ｋ誘導体
【０１５７】
【表４５】
2009523823.tif 000052
【０１５８】
【表４６】
2009523823.tif 000053
【０１５９】
（実施例２４）
ＰＥＩ／ＯＥＩへのベンゾイル安息香酸のカップリング及び共役物の物理化学的ならびに生物学的評価
【０１６０】
【化８】
2009523823.tif 000054
【０１６１】
ベンゾイル安息香酸−スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１５７７）を使用し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で反応を行った。２０ｍｇポリマーを２ｍＬ  ＨＢＳ中で溶解し、ｐＨを７．３に調整した。続いて、ベンゾイル安息香酸−ＮＨＳエステルの様々な量を１ｍＬ無水ＤＭＳＯ中で添加した。全ての反応を１２時間行い、その後、脱イオン水を用いておよそ６ｍＬに希釈した。続いて透析を行い、その後、共役物を凍結乾燥した。
【０１６２】
【表４７】
2009523823.tif 000055
【０１６３】
使用した透析膜：
【０１６４】
【表４８】
2009523823.tif 000056
【０１６５】
合成した共役物に対する実際のカップリング度
【０１６６】
【表４９】
2009523823.tif 000057
【０１６７】
再び試料を凍結乾燥し、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中で溶解した。これらの溶液から、銅アッセイを用いて、非修飾ポリマーに対して濃度を決定した。
【０１６８】
ダイナミックレーザー光散乱によるサイズ決定
ｓｉＲＮＡ  ０．５μｇを５０μＬの総体積でＯＥＩの個々の量と複合体形成させた。
【０１６９】
【表５０】
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【０１７０】
【表５１】
2009523823.tif 000059
【０１７１】
【表５２】
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【０１７２】
ノックダウン効率  Ｈ１２９９細胞、ウェルあたり０．５μｇ  ｓｉＲＮＡ。
【０１７３】
【表５３】
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【０１７４】
【表５４】
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【０１７５】
【表５５】
2009523823.tif 000063
【０１７６】
【表５６】
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【０１７７】
【表５７】
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【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１ａ−１ｂ：ポリカチオン修飾の機構の案。
【図２】ＯＥＩ−ＨＤ産物に対する赤外線スペクトル。
【図３ａ】図３ａ−３ｂ：スベリン酸クロリドで修飾したＰＥＩ−８００に対する構造要素及びＩＲ。
【図３ｂ】図３ａ−３ｂ：スベリン酸クロリドで修飾したＰＥＩ−８００に対する構造要素及びＩＲ。
【図４】ＯＥＩ−ＨＤ−１を用いたｓｉＲＮＡ送達  ＨＵＨ７／ＥＧＰＬｕｃ細胞。
【図５】様々な培地中でのＯＥＩ−ＨＤ−１によるｓｉＲＮＡノックダウン。
【図６ａ】図６ａ−６ｂ。血清含有培地中でのＯＥＩ−ＨＤ−１によるｓｉＲＮＡノックダウン。
【図６ｂ】図６ａ−６ｂ。血清含有培地中でのＯＥＩ−ＨＤ−１によるｓｉＲＮＡノックダウン。
【図７】ＯＥＩ−ＳＵＢ−１でのｓｉＲＮＡノックダウンの失敗。
【図８】ＲＡＮ−ｓｉＲＮＡに対する化学的修飾ポリカチオンのインビボでの使用の結果。
【図９】図９ａ−９ｂ。β−アミノプロピオニルアミドリンカーの例。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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