(57)【要約】本発明は、ヒトなどの動物へのＳＬＰＩの投与による、神経の生存、成長、および再生を刺激する方法を提供する。これらの方法を使用して、必要とする被験体の種々の神経学的容態（神経障害および変性疾患など）を治療することができる。本発明は、ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、軸索伸長を刺激する工程を含む、ニューロンの軸索伸長を刺激する方法を提供する。本発明はまた、ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、ＮＦ−κＢまたはｃ−ｊｕｎ活性を減少させる工程を含む、ニューロン中のＮＦ−κＢまたはｃ−ｊｕｎ活性を減少させる方法を提供する。
2009532369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、軸索伸長を刺激する工程を含む、ニューロンの軸索伸長を刺激する方法。
【請求項２】
ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、ＮＦ−κＢまたはｃ−ｊｕｎ活性を減少させる工程を含む、ニューロン中のＮＦ−κＢまたはｃ−ｊｕｎ活性を減少させる方法。
【請求項３】
ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、阻害を減少させる工程を含む、ミエリンによってニューロンの軸索伸長の阻害を減少させる方法。
【請求項４】
ＳＬＰＩの投与後に前記ニューロンの成長をモニタリングする工程をさらに含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記接触工程が、前記ニューロンの細胞体を接触させることを含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記接触工程が、前記ニューロンの軸索を接触させることを含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ニューロンが損傷している、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ニューロンが脊髄中または末梢神経系中に存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ニューロンが運動ニューロンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＬＰＩを含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者における神経成長または神経系の再生を刺激する方法。
【請求項１１】
ＳＬＰＩを含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者における障害または神経組織の損傷を治療する方法。
【請求項１２】
前記障害または損傷が、末梢神経の障害またはニューロパシー、頭蓋または脳の外傷、動脈瘤、脊髄損傷、または卒中に起因する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＬＰＩを含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者の疾患、疾病、または容態に関連する神経の変性または損傷を治療または防止する方法。
【請求項１４】
前記患者が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、進行性核上麻痺、視神経炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、または緑内障を罹患している、請求項１０〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ニューロンに投与した場合の軸索成長の刺激に有用な薬物の製造のためのＳＬＰＩを含む組成物の使用。
【請求項１６】
ニューロンに投与した場合のニューロン中のＮＦ−κＢまたはｃ−ｊｕｎ活性の減少に有用な薬物の製造のためのＳＬＰＩを含む組成物の使用。
【請求項１７】
ニューロンに投与した場合のニューロンの軸索伸長の阻害の減少に有用な薬物の製造のためのＳＬＰＩを含む組成物の使用。
【請求項１８】
前記ニューロンの成長をモニタリングする、請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記薬物を、前記ニューロンの細胞体に投与する、請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬物を、前記ニューロンの軸索に投与する、請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ニューロンが損傷している、請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記ニューロンが、末梢神経系の脊髄中に存在する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ニューロンが運動ニューロンである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
患者の神経系における神経の成長または再生の刺激に有用な薬物の製造のためのＳＬＰＩを含む組成物の使用。
【請求項２５】
患者の障害または神経組織の損傷の治療に有用な薬物の製造のためのＳＬＰＩを含む組成物の使用。
【請求項２６】
前記障害または損傷が、末梢神経の障害またはニューロパシー、頭蓋もしくは脳の外傷、動脈瘤、脊髄損傷、または卒中に起因する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
患者の疾患、疾病、または容態に関連する神経の変性または損傷の治療または防止に有用な薬物の製造のためのＳＬＰＩを含む組成物の使用。
【請求項２８】
前記患者が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、進行性核上麻痺、視神経炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、または緑内障を罹患している、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、動物（例えば、ヒト）における神経の生存、成長、および再生を刺激するための分泌性白血球プロテアーゼインヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳動物神経系は、軸索（神経）成長を助長／促進する分子が多数存在するという事実にもかかわらず、障害後に再生されない。この再生の欠如を担う要因には、少なくとも３つの以下の要因が存在する：グリア性瘢痕の形成、ミエリン中の再生インヒビターの存在、および成体軸索の固有の成長能力。障害に関与する状況では、グリア性瘢痕の形成には障害後いくらか時間がかかる。瘢痕形成前のこの「タイミングのいい機会」の間に軸索成長を助長することが有利であろう。例えば、疾病、疾患、または容態に関連する神経の変性または損傷の治療または防止のために、瘢痕化と無関係に軸索成長を助長することができることも望ましいであろう。例えば、もはやインヒビターに応答しないように軸索のインヒビターを中和するか、軸索の成長能力を変化させることによってミエリン中に存在する再生インヒビターの機能を遮断することができる。
【０００３】
今日まで、ミエリン中で以下の３つのインヒビターが同定されている：ミエリン関連糖タンパク質（「ＭＡＧ」）（非特許文献１；非特許文献２；特許文献１，特許文献２，および特許文献３；および特許文献４）、Ｎｏｇｏ（非特許文献３；非特許文献４）；およびオリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｍｙｅｌｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（「Ｏｍｇｐ」）（非特許文献５）。これらの３つの全インヒビターは、Ｎｏｇｏ−６６受容体（「ＮｇＲ」）に結合して、その阻害効果を発揮する（Ｗａｎｇら、上記非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００４】
環状アデノシン一リン酸（「ｃＡＭＰ」）と呼ばれる環状ヌクレオチドレベルの上昇により、ＭＡＧの阻害効果が減少し、神経線維成長を有意に改善することができることが示されている（特許文献５）。
【特許文献１】米国特許第５，９３２，５４２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２０３，７９２号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３９９，５７７号明細書
【特許文献４】国際公開第９７／０１３５２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／８５９８１号パンフレット
【非特許文献１】ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：８０５−１１（１９９４）
【非特許文献２】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：７５７−６７（１９９４）
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３４−４３９（２０００）
【非特許文献４】Ｇｒａｎｄｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３９−４４４（２０００）
【非特許文献５】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４１−９４４（２００２）
【非特許文献６】Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３−２９０（２００２）
【非特許文献７】Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）
【非特許文献８】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明者らは、ｃＡＭＰが分泌性白血球プロテアーゼインヒビター（「ＳＬＰＩ」）産生を大いに増加させ、ＳＬＰＩが神経細胞成長のミエリンインヒビターの阻害的影響を克服してニューロン（例えば、軸索）の再生を促進するという驚くべき発見をした。本発明者らの発見の前に、ＳＬＰＩは神経刺激機能を有することは知られていなかった。
【０００６】
したがって、本発明は、神経の生存、成長、および再生を促進するための以下の段落に記載の方法を提供する。ＳＬＰＩは抗炎症薬でもあるので、炎症に起因する二次ニューロン障害の防御でも有用である。
【０００７】
本発明は、ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、軸索伸長を刺激する工程を含む、ニューロンの軸索伸長を刺激する方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、ＮＦ−κＢまたはｃ−ｊｕｎ活性を減少させる工程を含む、ニューロン中のＮＦ−κＢまたはｃ−ｊｕｎ活性を減少させる方法を提供する。
【０００９】
ニューロンをＳＬＰＩと接触させ、それにより、阻害を減少させる工程を含む、ミエリンによってニューロンの軸索伸長の阻害を減少させる方法も提供する。
【００１０】
上記の各実施形態では、接触工程が、ニューロンの細胞体またはニューロンの軸索をＳＬＰＩと接触させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、ニューロンは損傷している。ニューロンは、中枢神経系（例えば、脊髄）または末梢神経系のニューロンであり得る。いくつかの実施形態では、ニューロンは運動ニューロンであり得る。
【００１１】
本発明はまた、ＳＬＰＩを含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者における神経成長または神経系の再生を刺激する方法を提供する。ＳＬＰＩを含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者における障害または神経組織の損傷を治療する方法も提供する。本発明はまた、ＳＬＰＩを含む組成物を患者に投与する工程を含む、患者の疾患、疾病、または容態に関連する神経の変性または損傷を治療または防止する方法を提供する。本発明の方法のいくつかの実施形態では、患者は、神経の疾患、疾病、または障害（脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、多系統萎縮症、進行性核上麻痺、動脈瘤、非虚血性の頭蓋または脳の外傷、末梢神経障害、ニューロパシー、脱髄疾患、ＡＬＳ、シャルコー・マリー・トゥース病、または脊髄運動萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）が含まれるが、これらに限定されない）を罹患している。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
ＳＬＰＩは、白血球セリンプロテアーゼ（好中球由来のエラスターゼおよびカテプシンＧ、肥満細胞由来のチマーゼおよびトリプターゼ、ならびに膵腺房細胞由来のトリプシンおよびキモトリプシンなど）の強力なインヒビターである（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８：４１７−２６（１９９７）およびその参考文献；Ｇｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：３４５−５１（１９８８））。ＳＬＰＩは、先天性の宿主防御に関する複数の機能（抗炎症性、抗ウイルス性、抗真菌性、および抗細菌性が含まれる）を有する。さらに、マウスにおいて皮膚創傷治癒を促進することが見出されている（Ａｓｈｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６：１１４７−５３（２０００））。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．６４：８３３−４０（２００３）も参照のこと。
【００１４】
免疫系では、ＳＬＰＩは、ＬＰＳ応答を阻害するリポ多糖（ＬＰＳ）誘導性ＩＦＮγ抑制性食細胞産物であることが示されている。ＳＬＰＩは、アネキシンＩＩを介してヒトマクロファージの膜に結合する（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）、およびＭａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１３３７−４６（２００４））。ＳＬＰＩは、単球中のＩＬ−８およびＴＮＦ−α遺伝子のプロモーター領域中のＮＦ−κＢ結合部位に結合し、これらの遺伝子発現を阻害する（Ｔａｇｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：１６５９−６８（２００５）および引用された参考文献）。ＳＬＰＩの抗炎症機能がかかる遺伝子阻害から生じることが示唆された。
【００１５】
最近の研究で、白血球（例えば、好中球およびマクロファージ）によって媒介される活性化プロテアーゼの急速な阻害および炎症反応のその抑制（虚血性脳障害に寄与する）により、ＳＬＰＩが局所性卒中（ｆｏｃａｌ  ｓｔｒｏｋｅ）で神経保護的役割を果たし得ることが示唆されている（Ｔａｇｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）；Ｉｌｚｅｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １３：３８−４２（２００２））。血清ＳＬＰＩレベルの上昇は、ヒト卒中患者でも認められる（Ｉｌｚｅｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（上記））。しかし、存在するとすれば、ＳＬＰＩが虚血部位でニューロン自体にどのような影響を及ぼすのか知られていない（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（上記））。
【００１６】
ヒトＳＬＰＩは、耳下腺唾液、精漿、子宮頚管粘液、鼻粘液、および気管支粘膜中に見出される１１．７ｋＤａタンパク質である。ヒト上皮細胞では、ＳＬＰＩは構成性に発現し、その発現は、超生理学的濃度（ｓｕｐｒａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のホルボールエステル、ＴＮＦ−α、およびＬＰＳならびにエラスターゼとコルチコステロイドとの相乗的組み合わせによって増加する（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（上記））。ＳＬＰＩは、カルボキシ末端ドメイン中のロイシン７２（ヒト型）に存在するプロテアーゼ阻害部位を有する２つのシステインリッチドメインから構成される。
【００１７】
本発明者らは、ＳＬＰＩがインビトロでの神経突起（軸索が含まれる）の成長を促進し、インビボで投与した場合にニューロンの成長能力を増大させることを発見した。この発見は、ＳＬＰＩが中枢神経系障害および末梢神経系障害（脊髄損傷など）ならびに軸索変性によって特徴づけられる疾患の治療で有用であることを示す。ＳＬＰＩは、神経再生または神経変性の進行の治療または遅延にも有用であり得る。本発明者らは、ＳＬＰＩがニューロン中の遺伝子転写の調節によってその刺激効果を達成することができることも見出した。
本発明で有用なＳＬＰＩ
本発明の方法で使用されるＳＬＰＩは、ヒト、ラット、およびマウスなどの哺乳動物由来の野生型ＳＬＰＩタンパク質またはその種々のホモログ、対立遺伝子変異型、およびイソ型であり得る。ヒトＳＬＰＩ、ラットＳＬＰＩ、およびマウスＳＬＰＩのアミノ酸配列は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）に記載されている。全長ヒトＳＬＰＩ配列およびそのＸ線結晶構造については、Ｇｒｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）も参照のこと。
【００１８】
アミノ酸配列の変動が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％またはそれを超えた配列同一性を保持し、分子が生物活性（例えば、公知の任意の方法（例えば、第３５段落および以下の実施例２に記載の神経突起伸長アッセイ）によってアッセイした場合の神経の成長および再生の調節）を保持する場合、ＳＬＰＩのアミノ酸配列の軽微な変動物（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）も本発明の一部と見なされる。特に、保存的アミノ酸置換が意図される。保存的置換は、その側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝学的に、コードされたアミノ酸は、一般に、以下のファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン．ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無荷電性極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは、以下である：セリンおよびトレオニンは脂肪族ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは脂肪族ファミリーであり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族ファミリーである。
【００１９】
例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単離置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単離置換、トレオニンのセリンとの単離置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の置換は、得られた分子の性質に大きな影響を及ぼさないであろうと予想することが妥当である。アミノ酸の変化によって機能的なペプチドまたはタンパク質が得られるかどうかを、例えば、本明細書中に詳述したアッセイを使用したペプチドまたはタンパク質誘導体の比活性のアッセイによって容易に決定することができる。
【００２０】
しかし、本発明のＳＬＰＩは、野生型配列と高い相同性または配列同一性を示す必要はない。実際、ラット、マウス、およびヒトＳＬＰＩの相同性は高くない。ラットＳＬＰＩは、そのマウスおよびヒト対応物とそれぞれ約８０％および６０％のアミノ酸配列しか同一でない（Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，（上記））。しかし、これらのＳＬＰＩは、構造が非常に類似している（例えば、Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（上記）を参照のこと）。したがって、本発明で使用可能なＳＬＰＩタンパク質が公知の野生型配列と配列同一性が比較的低い（例えば、５０％、６０％、または７０％）場合、これらのタンパク質は全体的なタンパク質の構造および機能（例えば、神経刺激機能、セリンプロテアーゼ阻害機能、およびＮＦ−κＢ阻害機能）に極めて重要な位置でアミノ酸残基を保存していることが好ましい。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌの図２は、ラット、マウス、およびヒトＳＬＰＩにおける高度に保存されたシステイン残基およびプロリン残基を示す。Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈ．１５６：１０３３−３９（２０００））は、本発明で有用なＳＬＰＩ改変体の例をさらに示す。
【００２１】
本発明で使用可能なＳＬＰＩには、所望のＳＬＰＩ機能を保存した全長ＳＬＰＩのフラグメントも含まれる。例えば、Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ．１１５：８８３−８８８（１９９５））は、全長ＳＬＰＩのＣ末端ドメインを含み、有意なレベルの全長分子のセリンプロテアーゼおよびＮＦ−κＢ阻害活性を有するＳＬＰＩタンパク質を記載している。
【００２２】
本発明のＳＬＰＩには、機能的部分に連結したＳＬＰＩを含む融合タンパク質も含まれる。機能的部分を使用して、ＳＬＰＩを所望のニューロン部位に仕向け、ＳＬＰＩの機能（インビボ半減期が含まれる）を増強するか、ＳＬＰＩの産生および精製を容易にすることができる。例えば、この部分は、遺伝子マーカー、酵素マーカー、化学的マーカー、免疫学的マーカー（エピトープタグ、ｍｙｃ、血球凝集素（ＨＡ）、ＧＳＴ、免疫グロブリン、β−ガラクトシダーゼ、ビオチンｔｒｐＥ、タンパク質Ａ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、マルトース結合タンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ、ポリヒスチジン（例えば、ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端での６つのヒスチジン）、ｌａｃＺ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、酵母α接合因子、ＧＡＬ４転写活性化またはＤＮＡ結合ドメイン、ルシフェラーゼ、および血清タンパク質（オボアルブミン、アルブミン、およびＩｇＧの定常ドメイン（例えば、Ｆｃ）など）など）であり得る。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９８８およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，（上記）を参照のこと。免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン分子が成熟形質細胞から高レベルで分泌されるので、分泌融合タンパク質の作製に特に有用な融合パートナーであり、そしてＦｃ領域は、他のタンパク質由来のドメインを許容し、小胞体および分泌経路を介してこれらを有効に指向させる「代理母」として十分に適応するようである。
【００２３】
融合タンパク質はまた、特定の酵素切断部位（第ＸＩＩＩ因子、トリプシン、ペプシン、または当該分野で公知の任意の他の酵素などの酵素によって認識される部位など）も含むことができる。融合タンパク質を、典型的には、上記のいずれかの組換え核酸法によって作製するか、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３（本明細書中で参考として援用される）に記載の技術などの技術を使用して化学合成するか、化学的架橋によって産生する。タグ化融合タンパク質は、エピトープまたは酵素タグを介して容易に局在化、スクリーニング、および特異的結合することが可能である。いくつかのタグにより、目的のタンパク質をファージミド（所望のタンパク質標的に結合することができるパニング剤に有用なＭ１３など）の表面に提示することが可能である。融合タンパク質の別の利点は、エピトープまたは酵素タグが精製を簡潔にすることができることである。これらの融合タンパク質を、しばしば単一工程で、アフィニティクロマトグラフィによって精製することができる。例えば、Ｈｉｓ６タグ化タンパク質を、Ｎｉアフィニティカラムで精製することができ、ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンアフィニティカラムで精製することができる。同様に、ＩｇＧのＦｃドメインを含む融合タンパク質を、プロテインＡまたはプロテインＧカラムで精製することができ、ｍｙｃなどのエピトープタグを含む融合タンパク質を、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を含む免疫親和性カラムを使用して精製することができる。エピトープタグは、必須の遺伝子によりコードされるタンパク質から、精製後に切断することができる酵素切断部位によって、分離されることが好ましい。融合タンパク質の第２の利点は、エピトープタグを使用して、スクリーニング標的の親和性結合によって融合タンパク質をプレートまたはカラムに結合させることができることである。
【００２４】
本発明のＳＬＰＩタンパク質を、誘導体化、例えば、ペグ化、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、またはユビキチン化することができる。いくつかの実施形態では、誘導体を、例えば、放射性同位体（１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなど）で標識した。他の実施形態では、誘導体を、標識したリガンドの特定の結合対メンバーとして役立ち得るフルオロフォア、化学発光剤、酵素、および抗リガンドで標識した。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＳＬＰＩタンパク質の代わりにＳＬＰＩタンパク質の三次元構造を模倣するペプチドのアナログおよび模倣物を使用する。かかるペプチド模倣物は、ＮＦ−κＢおよびセリンプロテアーゼ阻害機能をＳＬＰＩと競合することができる。ペプチド模倣物は、種々の理由（化学的安定性がより高いこと、生物活性および薬理学的性質（半減期、吸収、効力、有効性など）が増強されること、特異性が変化する可能性があること（例えば、広範な生物活性）、抗原性の減少、および産生に関連する経済上の考慮が含まれる）で、天然に存在するペプチドより優れ得る。
【００２６】
一般に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、所望の生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造が類似しているが、当該分野で周知の方法によって−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、およびＢＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合と随意に置換された１つまたは複数のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の同系のＤアミノ酸との系統的置換（例えば、Ｌ−リジンのＤ−リジンでの置換）を使用して、より安定なペプチドを生成することもできる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変化を含む制限されたペプチドを、当該分野で公知の方法（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））（例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基の付加）によって生成することができる。
【００２７】
１つの実施形態では、本発明の模倣物は、化学構造モチーフを天然分子に類似の所望の分子相互作用を容易にするようにすることによってタンパク質二次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ，ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌを参照のこと）。
【００２８】
別の実施形態では、本発明のペプチドアナログは、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物」とも呼ばれるテンプレートペプチドの性質に類似の性質を有する非ペプチド化合物であり、記載のように、コンピュータ化分子モデリングを用いて創り出すことができる（例えば、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５，２９−６９；Ｖｅｂｅｒ  ＆  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，３９２−３９６；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，１２２９−１２３９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＳＬＰＩタンパク質の代わりにＳＬＰＩタンパク質のアゴニストおよびＳＬＰＩタンパク質または遺伝子の正のレギュレーター（哺乳動物においてＳＬＰＩ転写をアップレギュレートすることができるレギュレーターが含まれる）を使用する。
ＳＬＰＩの使用方法
本発明は、神経系に影響を及ぼすことができる様式で本発明のＳＬＰＩ分子を投与する工程を含む、神経組織またはニューロンに対する損傷を治療または防止する方法を提供する。神経系に影響を及ぼすことができる様式で本発明のＳＬＰＩ分子を投与する工程を含む、神経組織またはニューロンへの神経の再生を促進する方法も提供する。好ましい実施形態では、その損傷は、末梢神経の障害またはニューロパシー、頭蓋または脳の外傷、動脈瘤、脊髄損傷、または卒中に起因する。
【００３０】
本発明はまた、神経系に影響を及ぼすことができる様式でＳＬＰＩ分子を投与する工程を含む、疾病、疾患、または病態に関連する神経の変性または損傷を治療または防止する方法を提供する。神経系に影響を及ぼすことができる様式で本発明のＳＬＰＩ分子を投与する工程を含む、疾病、疾患、または病態に関連する神経組織またはニューロンへの神経の再生を促進する方法も提供する。好ましい実施形態では、疾病、疾患、または病態は、アポトーシスに関連する。別の好ましい実施形態では、疾病、疾患、または病態は、脱髄疾患に起因する。治療することができる疾患には、以下が含まれるが、これらに限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、進行性核上麻痺、および脱髄疾患（多発性硬化症、単相性脱髄、脳脊髄炎、多病巣性白質脳症、汎脳炎、マルキァファーヴァ−ビニャーミ病、脳橋ミエリン溶解（ｐｏｎｔｉｎｅ  ｍｙｅｌｉｎｏｌｙｓｉｓ）、副腎脳白質ジストロフィ、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病（Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍａｅｒｚｂａｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、海綿状変性、アレキサンダー病、キャナヴァン病、異染性白質ジストロフィ、クラッベ病、脊髄運動萎縮症（ｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、シャルコー−マリー−トゥース病が含まれる）、および眼疾患（視神経炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性、および緑内障など）。
【００３１】
本発明はまた、神経系に影響を及ぼすことができる様式でＳＬＰＩ分子に曝露したニューロンを投与する工程を含む、疾病、疾患、または病態に関連する神経の変性または損傷を治療または防止する方法を提供する。神経系に影響を及ぼすことができる様式でＳＬＰＩ分子に曝露したニューロンを投与する工程を含む、疾病、疾患、または病態に関連する神経組織またはニューロンへの神経の再生を促進する方法も提供する。１つの実施形態では、ニューロンを、本発明のＳＬＰＩ分子にエキソビボで（例えば、培養物中で）曝露する。
ＳＬＰＩによって調節される標的化タンパク質によってニューロン再生を刺激する方法
本発明はまた、ＳＬＰＩによってダウンレギュレートされるニューロン中のタンパク質の発現または活性を減少させ、それにより、ＳＬＰＩの供給によりなされると等価なニューロン刺激を達成する方法を提供する。例えば、処置を必要とするニューロン部位へのＳＬＰＩの供給の代わりに、（１）炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；（２）スーパーオキシドジムスターゼ（Ｃｕ／ＺｎおよびＭｎ）などのストレス応答遺伝子；および（３）プロアポトーシス因子（Ｂａｘ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−１１）、ならびにＴＲＡＦ−１および２など）などのアポトーシス関連タンパク質の発現または活性を減少させることができる。他の実施形態では、（１）成長因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ）；（２）一定の酵素（ＢＡＣＥ（β部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素（阻害に必要な事象であるｐ７５受容体の切断に関与することが最近示された酵素ファミリーのメンバー）など）；（３）タンパク質キナーゼＣδ；および（４）ミエリンタンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質）などの軸索成長のミエリン阻害に関連するタンパク質の発現または活性を減少させることができる。さらに他の実施形態では、β−アミロイドおよびアポリポタンパク質Ｅなどのアルツハイマー病に関連するタンパク質の発現または活性を減少させることができる。
有用なＳＬＰＩの同定
本発明で有用なＳＬＰＩを、神経突起伸長アッセイによって同定することができる。神経突起伸長アッセイを、例えば、精製ミエリンの存在下で培養ニューロンを使用して行うことができる。例えば、ＧｒａｎｄＰｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２）、ミエリン調製物については、Ｎｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｄｕｓｌｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２１：７４９−７５７（１９８３）も参照のこと。あるいは、神経突起伸長アッセイを、成長許容基質（例えば、細胞表面神経阻害分子（ＭＡＧ（例えば、Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３−２９０（２００２）；国際公開第９７／０１３５２号パンフレットを参照のこと）；ＯＭｇｐ（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４１−９４４（２００２）など）を発現するように操作されたトランスフェクトした細胞（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）の単層またはＮｇＲまたはＮｇＲ誘導体を発現する細胞（例えば、Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３−２９０（２００２）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４１−９４４（２００２）；ＧｒａｎｄＰｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２）を参照のこと））に対して行うことができる。当該分野で公知のさらなる方法を使用して、神経突起伸長をアッセイすることもできる。
ＳＬＰＩポリペプチドの産生方法
本発明は、ＳＬＰＩコード配列が発現調節配列に作動可能に連結された、ＳＬＰＩポリペプチドをコードする発現ベクターを提供する。広範な種々の宿主／発現ベクターの組み合わせを使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体配列、非染色体配列、および合成核酸配列のセグメントを含むことができる。細菌および真核生物の宿主細胞（酵母細胞または哺乳動物細胞など）に有用な発現ベクターを使用することができる。例えば、種々のプラスミド、溶解性ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウイルス）、およびレトロウイルスベクター（例えば、マウスレトロウイルス）を使用して、哺乳動物細胞中で発現させることができる。昆虫細胞に有用なベクターには、バキュロウイルスベクターおよびｐＶＬ９４１が含まれる。（ウイルスベクターを使用した遺伝子送達についてのより詳細な考察については、以下を参照のこと）。
【００３２】
さらに、広範な種々の発現調節配列のいずれかを、これらのベクター中で使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現することができる。転写を調節する発現調節配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写終結部位が含まれる。転写後事象を調節する真核細胞中の発現調節配列には、スプライス供与部位およびスプライス受容部位ならびに転写されたＲＮＡの半減期を変化させる配列（例えば、ポリ（Ａ）付加を指示する配列またはＲＮＡ結合タンパク質の結合部位）が含まれる。翻訳を調節する発現調節配列には、リボゾーム結合部位、特定の細胞区画に対してか特定の細胞区画内にポリペプチドの発現を標的化させる配列、ならびに翻訳および／またはｍＲＮＡ分解の速度または効率を変化させる５’および３’非翻訳領域中の配列が含まれる。
【００３３】
原核細胞または真核細胞およびそのウイルスの遺伝子発現を調節する有用な発現調節配列の多くの例（構成性プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーター、ならびに／またはエンハンサー配列が含まれる）が、公知である。原核生物宿主と共に使用するのに適切なプロモーターには、制御されたβ−ラクタマーゼ、ラクトース、トリプトファン（ｔｒｐ）、およびλファージプロモーター系、アルカリホスファターゼ、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。細菌系で用いるプロモーターは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含むことが好ましい。酵母宿主での使用に適切なプロモーターの例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーターが含まれる。増殖条件によって調節される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。
【００３４】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２または５など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉種ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノム、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、または免疫グロブリンプロモーター）、および熱ショックプロモーターから得たプロモーターによって調節することができる（かかるプロモーターが宿主細胞系と適合する場合）。他の有用な発現調節配列には、例えば、ウイルスＬＴＲ（モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって管理されるＴ７プロモーター、ファージ１の主なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母ａ接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調節することが公知の他の配列、およびそれらの種々の組み合わせが含まれる。
【００３５】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加させることができる。エンハンサーは、プロモーター上で作動して転写を増加させるＤＮＡのシス作動性エレメントであり、通常、約１０〜３００ｂｐである。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例には、複製起点の終わりに近い部位上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサー、複製起点の終わりに近い部位上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーを、目的のコード配列の５’側または３’側の位置でベクターにスプライシングすることができるが、プロモーターから５’側の部位に配置することが好ましい。
【００３６】
好ましい実施形態では、プロモーターおよび／または調節配列を、特に神経系細胞（例えば、神経細胞または膠細胞）中で発現（好ましくは、調節された発現）するように特異的にデザインする。より好ましい実施形態では、プロモーターは、神経特異的プロモーター（例えば、神経特異的エノラーゼプロモーター）である。他の神経特異的プロモーターが、当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，０６６，７２６号および同第５，７５３，５０２号を参照のこと）。したがって、好ましい実施形態では、本発明の核酸は、軸索成長の見込みの減少によって特徴づけられる患者の障害、病態、または疾患の治療または防止に有用な少なくとも１つの転写調節配列に作動可能に連結する。
【００３７】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトの細胞、または他の多
細胞生物由来の有核細胞）中で使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も好ましくは含む。かかる配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’（時折、３’）非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。
【００３８】
好ましい核酸ベクターには、選択マーカー遺伝子、および任意選択的に増幅可能なマーカー遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）ならびに目的の遺伝子のコピー数を増幅させるための手段も含まれる。かかるマーカー遺伝子は、当該分野で周知である。核酸ベクターは、安定化配列（例えば、ｏｒｉまたはＡＲＳ様配列およびテロメア様配列）を含むこともできるか、あるいは、宿主細胞ゲノムへの好ましい定方向または非定方向の組み込みにデザインすることができる。
【００３９】
好ましい実施形態では、本発明の核酸配列を、目的のコードされた核酸配列を含む、タンパク質をコードするＲＮＡを高レベルで発現可能な発現ベクターにインフレームで挿入する。核酸のクローニングおよび配列決定法は当業者に周知であり、種々の実験マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（上記））に記載されている。生物学的、化学的、および免疫学的試薬の製造者からの製品情報からも有用な情報が得られる。
【００４０】
勿論、全てのベクターおよび発現調節配列が本発明の核酸配列を発現するように等しく十分に機能するわけではない。全ての宿主が同一の発現系を使用して等しく十分に機能するわけではない。しかし、当業者は、過度の実験を行うことなく、且つ本発明の範囲を逸脱することなく、これらのベクター、発現調節配列、および宿主を選択することができる。発現調節配列の選択では、種々の要因も考慮すべきである。これらには、例えば、配列の相対強度、その調節能力（例えば、調節可能な誘導性発現など）、および特に潜在的な二次構造に関する本発明の核酸配列との適合性が含まれる。発現ベクターのデザインは、形質転換すべき宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質の型などの要因にも依存し得る。さらに、ベクターのコピー数およびベクターのコピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（マーカーなど）の発現も考慮すべきである。
【００４１】
単細胞宿主（例えば、細菌、酵母、および培養した動物細胞または植物細胞）を、選択されたベクターとの適合性、本発明の核酸細胞によってコードされる産物の毒性、その分泌特性、ポリペプチドを正確に折り畳む能力、その発酵または培養の要件、および本発明の核酸細胞によってコードされる産物の精製しやすさを考慮することによって選択すべきである。
【００４２】
本発明のポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞ならびに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が含まれるが、これらに限定されない。他の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または懸濁培養での増殖のために選択された２９３細胞）；機能的ＤＨＦＲ遺伝子を欠くＣＨＯ細胞（例えば、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（例えば、ＨｅｐＧ２、ＢＢ８０６５）；およびマウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が含まれる。ヒト幹細胞（例えば、米国特許第６，２４５，５６６号および同第６，０９０，６２２号を参照のこと）、特に神経幹細胞および関連する送達系（例えば、米国出願公開第２００２０１６４３０９号および同第２００２００６４８７３号）を、本発明にしたがって使用することもできる。適切な宿主細胞の選択では、本発明の核酸を保有するベクターを考慮し、これは、当業者によってなされる範囲内である。
【００４３】
宿主細胞への核酸の形質転換および他の導入方法（例えば、抱合、プロトプラスト形質転換または融合、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合）を、当該分野で周知の種々の方法によって行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，（上記）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）を参照のこと）。使用する宿主細胞、ベクター、および形質転換法に応じて、ポリペプチドの一過性および安定な発現は構成性または誘導性であろう。当業者は、ポリペプチドが一過性または安定な様式で発現するかどうか、およびタンパク質が構成性または誘導性に発現するかどうかを決定することができる。
【００４４】
組換えタンパク質のトランスフェクション、発現、および精製の詳細は十分に報告されており、当業者に理解されている。細菌細胞発現系中での外来遺伝子の組換え産生で使用される各工程の種々の技術的態様に関するさらなる詳細を、当該分野の多数のテキストおよび実験マニュアルで見出すことができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（上記），およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記），およびＫｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
薬学的組成物および治療
本発明のＳＬＰＩを、薬学的組成物に処方し、取り組むべき特定の臨床的病態を処置するための治療有効用量にてインビボで投与する。１つまたは複数の本発明の薬学的組成物の投与は、神経系における神経の成長または再生の調節および促進、神経組織またはニューロンの障害または損傷の治療、および神経系の外傷、疾病、病態、または疾患に関連する神経変性の治療に有用である。かかる外傷、病態、疾患、疾病、または障害には、以下が含まれるが、これらに限定されない：頭蓋または脳の外傷、動脈瘤、卒中、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、ハンチントン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、進行性核上麻痺、および脱髄疾患（多発性硬化症、単相性脱髄、脳脊髄炎、多病巣性白質脳症、汎脳炎、マルキァファーヴァー−ビニャーミ病、脳橋ミエリン溶解、副腎白質ジストロフィ、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、海綿状変性、アレキサンダー病、キャナヴァン病、異染性白質ジストロフィ、クラッベ病、脊髄運動萎縮症、およびシャルコー−マリー−トゥース病が含まれる。）。
【００４５】
本発明の組成物を、単独または１つまたは複数の治療薬または診断薬と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の組成物を、例えば、抗炎症薬、抗凝固薬、抗血栓剤、または組織プラスミノゲンアクチベーター（これらに限定されない）と共に投与することができる。
【００４６】
治療すべき患者は、ヒトまたは脊椎動物であり得る。所与の適用のための好ましい薬学的処方物および治療に有効な投与計画の決定は、例えば、患者の病態および体重、所望の治療範囲、および患者の治療許容度を考慮して、当業者によってなされる範囲内である。
【００４７】
本発明のＳＬＰＩ（単離型および精製型、その塩または薬学的に許容可能な誘導体が含まれる）を、ニューロンの障害または疾病の治療に使用される薬剤の従来より許容されている任意の投与様式を使用して投与することができる。１つの実施形態では、１つまたは複数の本発明のＳＬＰＩ分子を発現するように操作された自己細胞、同種（ａｌｌｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、または異種細胞を、治療計画で使用することができる。かかる操作された細胞を使用して治療薬を合成し、独立して宿主に投与することができる。あるいは、操作された細胞から分泌または放出される本発明のＳＬＰＩ分子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡなどの外因性核酸で形質転換したか、トランスフェクトしたか、感染させた細胞を、例えば、かかる操作された細胞を治療を必要とする標的化された組織または細胞と連携した宿主の領域に移植することによって治療薬として直接使用することができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドが常に分泌タンパク質というわけではない場合、宿主細胞からのタンパク質の分泌に必要なシグナルペプチドを有するように操作することができる。かかるシグナルペプチドは、その長さ（約１６〜３０アミノ酸）および疎水性によって特徴づけられ、そしてそれらは、アミノ酸配列レベルでは高度には保存されていない（例えば、Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６を参照のこと）。真核細胞中での分泌のためのシグナル配列として機能するアミノ酸残基を、当業者に周知の多数の日常的な遺伝子操作方法のいずれかによって異種タンパク質のＮ末端に付けることができる。例えば、Ｆａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，４１  ，ｐｐ．１４４−５３（２０００）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ／２００１／ｐｅｘも参照のこと）；Ｂｏｒｎｇｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１４，ｐｐ．２３７−４６（１９９８）；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，ｐｐ．９８２−９８７（１９９５）；米国特許第５，７４７，６６２号明細書；国際公開第００／５０６１６号パンフレット；国際公開第９９／５３０５９号パンフレット；および国際公開第９６／２７０１６号パンフレット（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本発明のポリペプチドの分泌形態を発現する宿主細胞は、神経系を浸す脳脊髄液（ＣＳＦ）中のポリペプチドレベルを上昇させると予想される。あるいは、例えば、ＣＳＦへの直接注射によって本発明の分子を供給することが可能である。本発明の分子の他の形態を分泌するトランスフェクトした細胞を、類似の様式で、ニューロンの障害または変性部位に投与することができる。
【００４９】
その後に本発明のＳＬＰＩ分子を過剰発現する細胞へのウイルスまたは非ウイルス遺伝子送達を、当業者に周知の多数の技術のいずれかによってｅｘ  ｖｉｔｒｏまたはインビボで行うことができる。多数のかかる送達方法は、ニューロンで作用することが示されている。例えば、米国出願公開第２００２０１６８７６０号（ニューロン細胞への遺伝子移入のためのレトロウイルスベクター）；米国出願公開第２００２０１６８３３８号（中枢神経系へのＤＮＡ送達）；Ｃｈｅｒｋｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，２１０，６６４号（組換えレトロウイルス発現ベクターを含む中枢神経系への遺伝子移入方法）；Ｋａｐｌｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，１８０，６１３号（神経系細胞へのＤＮＡのＡＡＶ媒介性送達）；Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，０９６，７１６号（中枢神経系細胞のリポソーム媒介性トランスフェクション）；Ｋｏｃｈａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，９８１，２２５号（遺伝子移入ベクター、これを含む組換えアデノウイルス粒子、その産生方法、およびその使用方法）；Ｇａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，７６２，９２６号（中枢神経系の欠損、疾患、または損傷を治療するための遺伝子操作された細胞の移植方法）；国際公開第００８１９２号（遺伝子送達のためのヘルペスウイルスベクター）；およびＣＡ２２４７９１２号（中枢神経系中の移植媒介性遺伝子送達のための遺伝子操作した初代乏突起膠細胞）（その全開示が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００５０】
例えば、ニューロン細胞に、感染宿主細胞が高レベルで本発明の分子（例えば、ポリペプチド）を発現するウイルスベクターを感染させることができる。有用なウイルスベクターには、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１、または損傷した軸索によって取り込まれ得る他の弱毒化ウイルス、組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、細胞を直接トランスフェクトすることができる。プラスミドＤＮＡを、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体（例えば、抗体抱合体）、ポリリジン抱合体、グラマシジンＳ（ｇｒａｍａｃｉｄｉｎ  Ｓ）、人工ウイルスエンベロープまたは他のかかる細胞内キャリア、ならびに遺伝子構築物の直接注射、またはインビボで行ったリン酸カルシウム沈殿を用いて送達させることができる。特定の核酸送達系の選択は、意図する標的および投与経路（例えば、局所または全身）などの要因に依存するであろう。好ましい実施形態では、ベクター構築物を、発現産物が血液脳関門を通過することができるような方法で使用する。さらに、発現をインビボ調節することができるベクターは、細胞中での発現のインビトロ調整（本明細書などに記載のエキソビボアッセイ系での使用など）にも有用であると認識される。
【００５１】
本発明で有用な１つの好ましいウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムを、目的の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常な溶解ウイルスの生活環を複製する能力に関して不活化されるように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）を参照のこと。アデノウイルスＡｄ株５ｄｌ３２４型またはアデノウイルスの他の型（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、これらが非分裂細胞に感染することができず、これらを使用して広範な細胞型に感染させることができるという点で、一定の状況で有利であり得る（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（上記））。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮が可能であり、上記のように、感染範囲に影響を及ぼすように改変することができる。さらに、移入したアデノウイルスＤＮＡ（およびこれに含まれる外来ＤＮＡ）を宿主細胞のゲノムに組み込まないがエピソームに保持されることにより、移入したＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれるようになる（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）状況における挿入変異誘発の結果として起こり得る潜在的に問題が回避される。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡを保有する能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照された）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７（１９８６））。現在使用されており、それにより、本発明で好ましい最も複製欠損のアデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部を欠失しているが、８０％ものアデノウイルス遺伝子材料を保持する（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １６：６８３（１９７９）；Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）；およびＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ．，１９９１）ｖｏｌ．７．ｐｐ．１０９−１２７を参照のこと）。挿入した核酸配列の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＭＬＰ）および随伴するリーダー配列、Ｅ３プロモーター、または外因的に付加されたプロモーター配列の調節下にあり得る。
【００５２】
本発明の核酸分子の送達に有用な別の好ましいウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および産生生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする天然に存在する欠陥ウイルスである。（概説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９（１９９２）を参照のこと）。アデノ随伴ウイルスは、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込み、高い頻度の安定な組み込みを示すことができる数少ないウイルスのうちの１つでもある（例えば、  Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６（１９９２）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３（１９８９）を参照のこと）。ＡＡＶベクターを使用して、種々の核酸が異なる細胞型に移入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８５）；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２３９（１９８８）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９（１９８４）；およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０（１９９３）を参照のこと）。
【００５３】
本発明の核酸分子の送達に有用なさらに別の好ましいウイルスベクター系は、神経系において効率的な異種遺伝子の形質導入および発現を達成することを示した複製欠損単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）ベクターである（Ｄｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．５：３５３（１９９０）；Ｆｅｄｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１６３６（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：４８７（１９９２）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１１５：３０３（１９９２）；Ｆｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１１（１９９２）；Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇｐｐ  ４５−４８（１９９２）；およびＨｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３６５５（１９９３））。ＨＳＶ−２ベクターも記載されている（Ｌｉｎｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｏｋｅ．２６：１６７０（１９９５）；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１６：４８６（１９９６）を参照のこと）。
【００５４】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ヒトの遺伝子療法のための本発明の好ましいベクターである。これらのベクターは、遺伝子を細胞に効率的に送達し、導入された核酸を宿主の染色体ＤＮＡに安定に組み込む。複製欠損レトロウイルスを産生する特殊化した細胞株（「パッケージング細胞」）の開発は、遺伝子療法への適用に特に好ましい（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１（１９９０）を参照のこと）。レトロウイルスコード配列の一部（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を、対象受容体の１つをコードする核酸に置換し、それにより、レトロウイルスを複製欠損にした組換えレトロウイルスを構築することができる。次いで、複製欠損レトロウイルスを、ビリオンにパッケージングし、これを使用して、標準的な技術によるヘルパーウイルスの使用によって標的細胞に感染することができる。組換えレトロウイルスの産生およびかかるウイルスでのインビトロまたはインビボでの細胞感染のプロトコールを、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。レトロウイルスの代表例には、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが含まれ、これらは、当業者に周知である。狭宿主性および広宿主性レトロウイルス系の調製のためのパッケージングウイルス株の代表例には、ｐｓｉ．Ｃｒｉｐ、ｐｓｉ．Ｃｒｅ、ｐｓｉ２、およびｐｓｉ．Ａｍが含まれる。レトロウイルスは、種々の遺伝子を多数の異なる細胞型にインビトロおよび／またはインビボで導入するために広範に使用されている。さらに、ウイルス粒子表面上のウイルスパッケージングタンパク質の改変によってレトロウイルスおよびレトロウイルスに基づくベクターの感染範囲を制限するのに有用である。（例えば、国際公開第９３／２５２３４号パンフレットおよび同第９４／０６９２０号パンフレット；Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８６：９０７９−９０８３（１９８９）；Ｊｕｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：３２５１−３２５５（１９９２）；およびＧｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：２５１−２５４（１９８３））；Ｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１４１４３−１４１４６（１９９１）を参照のこと）。
【００５５】
ＳＬＰＩを、操作した細胞または本発明のかかる分子を放出または分泌するように操作した他の生体適合性材料の（例えば、脳脊髄液への）脊髄移植によって送達させることができる。随意に、本発明の１つまたは複数の分子を放出または分泌するトランスフェクトした細胞を、免疫隔離（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｏｒｙ）カプセルまたはチャンバーにカプセル化し、当業者に公知の利用可能な方法を使用して脳または脊髄領域に移植する。例えば、米国特許第６，１７９，８２６号、同第６，０８３，５２３号；同第５，６７６，９４３号；同第５，６５３，９７５号；同第５，４８７，７３９号；同第４，２９８，００２号；同第４，６７０，０１４；および同第５，４８７，７３９号；国際公開第８９／０４６５５号パンフレット；国際公開第９２／１９１９５号パンフレット；国際公開第９３／００１２７号パンフレット；および引用文献（その全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。あるいは、ポンプおよびチャンバー様デバイスを使用することができる。皮下投与のためにデザインされたポンプなどのポンプおよび／またはカテーテル様デバイスを、障害部位に皮下または髄腔内で移植または挿入して、ＳＬＰＩを適時および所望の濃度で投与することができる。例えば、米国特許第４，５７８，０５７号およびその引用文献を参照のこと。埋め込みポンプについては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍを参照のこと。それらは、それぞれ本明細書中で参考として援用される。
【００５６】
本発明の分子が血液脳関門を通過することができる場合、障害部位から離れた位置に移植または挿入した、当業者によって選択され経験的に修正することができるポンプおよびカテーテル様デバイスを使用して、適時および所望の濃度で本発明の分子を投与することができる。本発明の分子が血液脳関門を通過しない場合、病変部位付近または病変部位から離れた位置にポンプおよびカテーテル様デバイスを使用して、本発明の分子を髄腔内に送達することができる。
【００５７】
本発明のＳＬＰＩを、単独で投与するか、種々の手段によって軸索成長を好む環境を提供する１つまたは複数の薬剤と組み合わせて投与することができる。１つの実施形態では、ＳＬＰＩを、本発明のベクターに組み込むか同時に投与することができる。別の実施形態では、ＳＬＰＩを、局所または全身に注射することができ、本発明の分子または組成物と同時投与することが好ましい。さらに別の実施形態では、かかる薬剤を、米国特許第５，０９２，８７１号および同第４，９５５，８９２号に記載の神経ガイダンスチャネル（ｎｅｒｖｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）と共に供給することができる。かかる薬剤クラスの例には、栄養因子（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、受容体、細胞外基質タンパク質、内性因子が含まれる。例示的栄養因子には、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＩＧＦＩ、ＩＧＦＩＩ、ＧＤＮＦ、ＧＰＡ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｂ、およびアポリポタンパク質Ｅが含まれるが、これらに限定されない。例示的受容体には、受容体のＴｒｋファミリーが含まれるが、これに限定されない。例示的細胞外基質タンパク質は、ラミニンである。例示的内性因子には、ＧＡＰ−４３およびアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｅｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰＰ）が含まれるが、これらに限定されない。例示的接着分子には、ＮＣＡＭおよびＬ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は、種々の形態であってよく、好ましい投与様式にしたがって選択することができる。これらには、例えば、固体、半固体、および液体の投薬形態（錠剤、丸薬、粉末、液体の溶液または懸濁液、座剤、ならびに注射液および注入液など）が含まれる。好ましい形態は、意図する投与様式および治療への応用に依存する。投与様式には、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与、または局所投与が含まれ得る。
【００５９】
本発明のＳＬＰＩ分子を、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を含むか含まない滅菌等張処方物に入れることができる。処方物は好ましくは液体であるか、凍結乾燥粉末であり得る。例えば、ＳＬＰＩ分子を、５．０ｍｇ／ｍｌクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌクエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌグリシン、および１ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０を含む処方緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で希釈することができる。この溶液を、凍結乾燥し、冷蔵保存し、投与前に滅菌注射用蒸留水（ＵＳＰ）で再構成することができる。
【００６０】
組成物はまた、好ましくは、当該分野で周知の従来の薬学的に許容可能なキャリアを含む（例えば、  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８０，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。かかる薬学的に許容可能なキャリアには、他の薬剤、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、賦形剤など（ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物など）を含むことができる。組成物は、好ましくは、単位用量形態であり、通常、１日に１回または複数回投与する。
【００６１】
本発明の薬学的組成物を、罹患組織または血流中、これらの付近、またはこれらと連絡してミクロスフィア、リポソーム、ナノ粒子、およびナノ粒子または微粒子の送達系または徐放性処方物を使用して投与することもできる。徐放性キャリアの適切な例には、座剤またはマイクロカプセルなどの成形物の形態の半透性ポリマー材料が含まれる。埋め込み可能であるかマイクロカプセルの徐放性材料には、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはエチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））が含まれる。
【００６２】
本発明のＳＬＰＩを含むリポソームを、周知の方法によって調製することができる（例えば、ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４０３０−３４（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと）。通常、リポソームは、脂質含有率が約３０ｍｏｌ．％コレステロールよりも高い小さな（約２００〜８００Å）の単層型のリポソームである。コレステロールの比率は、最適なＳＬＰＩ分子放出速度を調節するように選択される。
【００６３】
本発明のＳＬＰＩを、リポソームに付着することが可能であり、このリポソームは、随意に所望の治療部位への組成物の標的化または投与に役立てるための他の薬剤を含むことができる。任意の公知の架橋剤（標的送達用の毒素または化学療法薬を抗体にカップリングするために広範に使用されているヘテロ二官能性架橋剤など）によって付着することができる。炭水化物指向性架橋試薬４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）を使用して、リポソームに抱合することもできる（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ  １６Ｅ  ７７（１９９２））。
【００６４】
本発明のＳＬＰＩを、ナノ粒子送達によって送達させることもできる。多数のナノ粒子送達方法が当該分野で公知であり、ナノカプセルが含まれるが、これに限定されない。
【００６５】
以下の用語は、他で示されない限り、以下の意味を有すると理解するものとする。
【００６６】
核酸配列の文脈での用語「配列同一率」または「同一な」は、最大に対応するように整列させた場合に同一な２つの配列中の残基をいう。配列同一性を比較する長さは、少なくとも９ヌクレオチド、通常、少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６またはそれを超えるヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当該分野で公知の異なるアルゴリズムが多数存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  中のプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡにより、クエリー配列と検索配列との間の最良に重複する領域のアラインメントおよび配列同一率が得られる（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０，（本明細書中で参考として援用される））。例えば、核酸配列間の配列同一率を、そのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６およびスコアリング行列のためのＮＯＰＡＭ因子）を使用するＦＡＳＴＡまたはＧＣＧバージョン６．１（本明細書中で参考として援用される）で提供されるデフォルトパラメーターを使用するＧａｐを使用して決定することができる。
【００６７】
核酸またはそのフラグメントをいう場合、用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、別の核酸（またはその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入物または欠失物を最適に整列させた場合、上記で考察した配列同一性の任意の周知のアルゴリズム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐなど）によって測定した場合、少なくとも約５０％、より好ましくは６０％のヌクレオチド塩基、通常少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列が同一である。
【００６８】
あるいは、核酸またはそのフラグメントが、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で別の核酸、別の核酸の鎖、またはその相補鎖とハイブリッド形成する場合に実質的な相同または類似が現れる。核酸ハイブリッド形成実験の文脈での「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。当業者に容易に認識されるように、核酸ハイブリッド形成は、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリッド形成種の塩基組成、相補領域の長さ、およびハイブリッド形成核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチ数などの条件により影響を受ける。当業者は、ハイブリッド形成の特定のストリンジェンシーを達成するためにこれらのパラメーターを変動する方法を承知している。
【００６９】
一般に、「ストリンジェントなハイブリッド形成」を、特定の条件下での特定のＤＮＡハイブリッドの融点（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で行う。「ストリンジェントな洗浄」を、特定の条件下での特定のＤＮＡハイブリッドのＴｍよりも約５℃低い温度で行う。Ｔｍは、５０％の標的配列が完全に適合したプローブとハイブリッド形成する温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記），頁９．５１（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本明細書中に記載の目的のために、「高ストリンジェンシー条件」を、液相ハイブリッド形成について、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍ  クエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳ中での６５℃で８〜１２時間の水性ハイブリッド形成（すなわち、ホルムアミドなし）、その後の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの６５℃で２０分間の２回の洗浄と定義する。６５℃でのハイブリッド形成は、多数の要因（ハイブリッド形成する配列の長さおよび同一率が含まれる）に応じて異なる速度でおこることが当業者に認識される。
【００７０】
用語「融合タンパク質」は、異種アミノ酸配列とカップリングしたポリペプチドまたはフラグメントを含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は、２つまたはそれを超える異なるタンパク質由来の２つまたはそれを超える所望の機能的エレメントを含むように構築することができるので、融合タンパク質は有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチド由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４０、５０、または６０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも７５、１００、または１２５個のアミノ酸を含む。融合タンパク質を、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列をインフレームでもつポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列の構築、およびその後の融合タンパク質の発現によって、組換え的に産生することができる。あるいは、融合タンパク質を、ポリペプチドまたはそのフラグメントの別のタンパク質への架橋によって化学的に産生することができる。
【００７１】
用語「非ペプチドアナログ」は、基準ポリペプチドと類似の性質を有する化合物をいう。非ペプチド化合物を、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ）」ということもできる。例えば、Ｊｏｎｅｓ，（１９９２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｕｎｇ，（１９９７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；"Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ"，Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９９２；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；および上記の各引用文献（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。かかる化合物を、しばしば、コンピュータ化分子モデリングを使用して構築する。本発明の有用なペプチドと構造が類似するペプチド模倣物を使用して、等価な効果を得ることができ、したがって、本発明の一部と想定される。
【００７２】
「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」は、その配列が、未変性または野生型のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸が挿入、重複、欠失、再構成、または置換しているポリペプチドをいう。ムテインは、ある位置の１つのアミノ酸が別のアミノ酸に変化した１つまたは複数のアミノ酸点置換、天然に存在するタンパク質配列中の１つまたは複数のアミノ酸がそれぞれ挿入または欠失された１つまたは複数の挿入および／または欠失、および／またはアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかまたは両方のアミノ酸配列の短縮を有することができる。ムテインは、天然に存在するタンパク質と比較して同一であるが、好ましくは異なる生物活性を有し得る。例えば、ムテインは、セリンプロテアーゼ活性が増加または減少し得る。
【００７３】
ムテインは、その野生型対応物と比較して全体で少なくとも７０％の配列が相同である。野生型タンパク質と全体で８０％、８５％、または９０％の配列が相同なムテインがさらにより好ましい。さらにより好ましい実施形態では、ムテインは、全体で９５％の配列同一性、さらにより好ましくは９７％、さらにより好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％の配列が同一である。配列相同性を、任意の一般的な配列分析アルゴリズム（ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔなど）によって測定することができる。
【００７４】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性が減少したアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性が減少したアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体の形成に対する結合親和性が変化したアミノ酸置換、（４）結合親和性または酵素活性が変化したアミノ酸置換、および（５）かかるアナログの他の物理化学的性質または機能的性質を付与または改変するアミノ酸置換である。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、２０個の従来のアミノ酸およびその略語は、慣例適用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸（α置換アミノ酸、α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の従来にないアミノ酸など）の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドに適切な成分であり得る。従来にないアミノ酸の例には、以下が含まれる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で使用されるポリペプチド表示法では、標準的用法および慣習に従って、左方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシ末端方法である。
【００７６】
タンパク質をコードする核酸配列が第２のタンパク質をコードする核酸配列に類似の配列を有する場合、タンパク質は、第２のタンパク質に対して「相同性」を有するか、「相同性」である。あるいは、２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第２のタンパク質に対して相同性を有す。（したがって、用語「相同タンパク質」は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。好ましい実施形態では、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して６０％配列相同性を示すタンパク質であり、７０％配列相同性がより好ましい。野生型タンパク質に対して８０％、８５％、または９０％配列相同性を示す相同タンパク質がさらにより好ましい。さらにより好ましい実施形態では、相同タンパク質は、９５％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を示す。本明細書中で使用される場合、アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性（特に、予想される構造類似性に関して）は、機能の類似が示唆されると解釈される。
【００７７】
「相同性」をタンパク質またはペプチドに関して使用する場合、同一でない残基の位置がしばしば保存的アミノ酸置換によって異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質が実質的に変化しない。２つまたはそれを超えるアミノ酸配列が保存的置換によって相互に異なる場合、配列同一率または相同性の程度を、置換の保存性が修正されるように上方に調整することができる。この調整手段は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００７８】
以下の６つの群は、それぞれ、相互に保存的置換されるアミノ酸を含む：
１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００７９】
配列同一率とも呼ばれるポリペプチドの配列相同性を、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。例えば、ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の修飾（保存的アミノ酸置換が含まれる）に割り当てた相同性の測定を使用して類似の配列を適合させる。例えば、ＧＣＧは、密接に関連したポリペプチド（異なる動物種由来の相同ポリペプチドなど）の間または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するためのデフォルトパラメーターと共に使用することができる「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。
【００８０】
ＳＬＰＩ配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（本明細書中で参考として援用される））。ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメーターは以下である：
期待値：１０（デフォルト）
フィルタ：ｓｅｇ（デフォルト）
ギャップオープンコスト（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ）：１１（デフォルト）
ギャップ伸長コスト（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ａ  ｇａｐ）：１（デフォルト）
最大アラインメント：１００（デフォルト）
ワードサイズ：１１（デフォルト）
表示数：１００（デフォルト）
ペナルティ行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２
相同性のために比較したポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基長であろう。多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用したデータベース検索は、当該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列を、ＦＡＳＴＡ（ＧＣＧバージョン６．１中のプログラム）を使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡにより、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複領域のアラインメントおよび配列同一率が得られる（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０（本明細書中で参考として援用される））。例えば、アミノ酸配列間の配列同一率を、ＧＣＧバージョン６．１（本明細書中で参考として援用される）で提供されているＦＡＳＴＡをデフォルトパラメーター（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリング行列）で使用して決定することができる。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、句「治療有効量」は、選択された投与計画（例えば、選択された投薬レベルおよび治療期間）での治療後に被験体がニューロンの生存、成長、または再生において検出可能な改善を示すような本発明の分子の量を意味する。
【００８２】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記載しているが、本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な方法および材料も本発明の実施で使用することができ、これらは当業者に明らかである。本明細書中で言及した全ての刊行物および他の引用文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義が含まれる）に従う。材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【００８３】
当業者に公知の組換えＤＮＡテクノロジーの一般的原理を記載する標準的な参考資料には、以下が含まれる：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）。当業者に公知の免疫学の一般的原理を記載する標準的な参考資料には、以下が含まれる：Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）；およびＲｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３ｄ  Ｅｄ．，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９３）。当業者に公知の医科生理学および薬理学の一般的原理を記載する標準的な参考資料には、以下が含まれる：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，１４ｔｈ  Ｅｄ．，（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓ．Ｆａｕｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．，１９９８。
【００８４】
本明細書および段落を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載の整数または整数群を含むが、任意の他の整数または整数群を排除しないことを意味すると理解される。
【００８５】
以下は、本発明の組成物および方法を説明する実施例である。これらの実施例は、本発明を制限すると解釈されるべきではない。実施例は、例示のみを目的とする。
【実施例】
【００８６】
（実施例１）
小脳ニューロンを、本質的に、Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４３，ｐｐ．４６４−６６（１９９０）；Ｎｅｕｒｏｎ，５，ｐｐ．２０９−１９（１９９０）；およびＫｌｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ，ｐｐ．３３７−７８，ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ／Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｇ．Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｇｏｓｌｉｎ，Ｅｄｓ．）（１９９１）に記載のように単離した。簡潔に述べれば、９日齢までの動物について、２匹の動物から小脳を取り出し、５ｍｌの０．０２５％トリプシンを含むＰＢＳに入れ、すり砕き、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む５ｍｌ  ＤＭＥＭの添加によってトリプシン処理を停止させ、細胞を、８００ｒｐｍで６分間遠心分離した。細胞を、２％ＦＣＳを含む２ｍｌのＳＡＴＯ中で単一細胞浮遊液（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）に再懸濁した。
（実施例２）
本発明者らは、以前に、ニューロン中の環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルとミエリンによる再生の阻害との間に正相関が存在することを確証していた（例えば、国際公開第０１／８５９８１号パンフレットを参照のこと）。内因性ｃＡＭＰレベルは新生ニューロン中で高く、ＭＡＧおよびミエリンに対する外延的成長が認められたが、生後４日間でニューロンｃＡＭＰは急落し、これは、ミエリン阻害の開始と関係があった。より古いニューロンにおけるｃＡＭＰレベルがジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）での処置によって上昇した場合、阻害は逆転し、ＭＡＧおよびミエリンに対する神経線維成長が増強された。インビボでは、ｃＡＭＰレベルを、末梢神経の傷害またはｄｂｃＡＭＰ注射によって上昇させることができ、これにより、脊髄中の切離神経線維が再生した。
【００８７】
ｃＡＭＰの影響は、遺伝子転写を誘導する能力の結果であった。アップレギュレートされた遺伝子を同定するために、本発明者らは、ｄｂｃＡＭＰまたは条件傷害（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｌｅｓｉｏｎ）のいずれかを受けたＤＲＧニューロンに対してマイクロアレイ分析を行った。本発明者らは、両方の場合でＳＬＰＩの発現が非常に増加することを見出した。本発明者らは、培養において、ニューロンをＳＬＰＩで処置した場合にＭＡＧおよびミエリンに対する神経線維の成長が有意に増加することおよびこの影響がｄｂｃＡＭＰを用いて認められた影響と等価であったことを示した。
【００８８】
さらに、本発明者らは、成体動物に投与した場合にＳＬＰＩがニューロンの成長能力を増加したことを見出した。ポンプによってＳＬＰＩを脊髄に送達させた。ニューロンを取り出してＭＡＧを発現する細胞上に培養した場合、成長が有意に増加した。これらのデータは、ＳＬＰＩがＣＮＳ損傷後および軸索変性によって特徴づけられる疾患において再生を促進する可能性を有することを示した。
【００８９】
図１Ａおよび１Ｂは、ＳＬＰＩがＤＲＧニューロンのＭＡＧによる阻害を逆転したことを示した。非処置ＤＲＧニューロンをＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞上に培養した場合、神経突起伸長が強く阻害された。しかし、ニューロンをＳＬＰＩで処置した場合、ＭＡＧに対する神経突起伸長は有意に増加し、５および１０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩが最も広範に成長させた。
【００９０】
図２Ａおよび２Ｂは、ＳＬＰＩがミエリンに対する皮質ニューロンの神経突起伸長を増強させたことを示す。ＤＲＧニューロンと異なり、皮質ニューロンは、生後１日で、ＭＡＧおよびミエリンによって阻害された。ミエリンに対する神経突起伸長は、５および１０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩで有意に増加し、この影響は、ジブチリルＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）を用いて認められた影響に等価であった。
【００９１】
図３Ａおよび３Ｂは、ＳＬＰＩのインビボ送達によって成体ＤＲＧニューロンのＭＡＧ阻害が克服されたことを示す。２および５μｇ／ｋｇ／時間の速度でのＳＬＰＩの髄腔内送達は、ＤＲＧニューロンのＭＡＧ阻害を遮断し、神経突起伸長を有意に増加する。これは、ＳＬＰＩが生きた動物に投与した場合に有効であることを示した。
【００９２】
要約すると、上記結果は、ＳＬＰＩがＭＡＧおよびミエリンの阻害効果を克服することができ、軸索成長を促進することを最初に示している。これらのニューロンの軸索が脊髄の運動機能を調節する神経路を形成するので、皮質神経突起成長がＳＬＰＩによって増強されることを示すデータは特に重要である。最も重要には、神経突起伸長は、成体ラットへのＳＬＰＩの髄腔内送達後に増加する。これらの実験により、インビボで投与した場合にＳＬＰＩが成熟ニューロン再生能力を増強することができ、それにより、ＳＬＰＩが脊髄損傷および他のＣＮＳ外傷の治療のための実行可能な治療選択肢となるという証拠が得られた。
（実施例３）
上記のように、ＳＬＰＩは、生きた動物に投与した場合に成長を促進し、且つ非毒性である。ＣＮＳニューロン中のＳＬＰＩの細胞内分布を調査するために、小脳顆粒ニューロン（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｎｅｕｒｏｎ）（ＣＧＮ）を、組換えＳＬＰＩで１時間処置し、核内のタンパク質を、細胞質中のタンパク質から分離した。ウェスタンブロッティングを行って、核および細胞質画分中のＳＬＰＩを検出した。内因性ＳＬＰＩが検出されないことを確実にするために、本発明者らは、これらの実験において、組換えＳＬＰＩに対して惹起した抗体を使用した。本発明者らは、ＳＬＰＩが核に迅速に局在化することを見出した。ＳＬＰＩは、ＳＬＰＩ処置ＣＧＮから単離した核画分中のみに存在し、リン−ＣＲＥＢの存在により、ＳＬＰＩが核に局在化することを確認した。
【００９３】
要約すると、本発明者らは、ＳＬＰＩがＣＧＮの核に局在化することを最初に示した。したがって、理論に拘束されないが、ＳＬＰＩは、ニューロン中で転写調節因子として作用し、細胞死（例えば、アポトーシス）およびミエリン阻害に関与する遺伝子発現のダウンレギュレーションによって軸索再生およびニューロン生存を促進する可能性が高い。これらの影響は、脊髄損傷、卒中、および他のＣＮＳ外傷だけでなく、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、および多発性硬化症などの神経変性障害にも適用可能であろう。
（実施例４）
上記の実施例２に示すように、ＳＬＰＩは、インビボで投与した場合に有効である。ＳＬＰＩが障害後のミエリン阻害を克服し、軸索再生を助長することができることをさらに確認するために、成体ラットの脊柱の切離を実行することができる。次いで、ＳＬＰＩを、成体ラットの脊柱切離後に髄腔内送達させる。適切な術後時点で、脊髄を、脊柱再生を証明するために組織学的に試験する。さらに、ＳＬＰＩを、成体ラットの前根または坐骨神経の切離後に髄腔内送達させて、運動性軸索の再生を評価することができる。運動機能の回復を測定するために挙動分析を行った。
【００９４】
坐骨神経および前根の障害後の運動性軸索再生の促進によって、本アプローチをＡＬＳに適用することができる。胚幹細胞由来運動ニューロンの移植と併せてＳＬＰＩを髄腔内投与して、前根流出部（ｅｘｉｔ  ｚｏｎｅ）を介した運動性軸索の成長を助長する。胚または前成体ラットに対して類似の実験を行って、異なる発達段階でのＳＬＰＩ処置の影響を決定することができる。
（実施例５）
ＴＮＦ−α発現およびｐ３８分裂活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のＴＮＦ−α媒介活性化は、Ｇ９３Ａ変異スーパーオキシドジムスターゼ−１を発現するトランスジェニックマウス（広く使用されているＡＬＳモデル）における運動ニューロン欠損の発生および進行に関連した事象である（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．９５：１７２−７８（２００１）；Ｔｏｒｔａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：１８０−９２（２００３）；Ｙｕａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２６８１−９２（１９９８）。ＳＬＰＩがニューロンにおけるＴＮＦ−αレベルおよびｐ３８ＭＡＰＫ活性化を減少させるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡを使用して、ＳＬＰＩにてインビトロで１時間処置したＤＲＧニューロンおよびＣＧＮ中のＴＮＦ−αレベルを測定することができる。ＳＬＰＩを成体ラットに髄腔内送達させ、脊髄組織サンプルに対してＥＬＩＳＡ分析を行って、ＴＮＦ−αレベルがインビトロで減少するかを決定することができる。ＳＬＰＩがｐ３８ＭＡＰＫ活性を遮断する能力を、ニューロンのＳＬＰＩとのプレインキュベーションおよびその後のＴＮＦ−αでの処置によって試験することができる。ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を、ウェスタンブロッティングによって分析することができる。
（実施例６）
上記のように、ＳＬＰＩはＣＧＮの核に局在する。ＳＬＰＩでの処置がニューロンにおける転写に影響を及ぼすことを確認するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験を行って、ＳＬＰＩによって調節される他の遺伝子を同定することができる。このアプローチにより、ＡＬＳモデルにおける運動ニューロン喪失を防止するための新規の分子標的を得ることができる。さらに、ＳＬＰＩと相互作用するプロモーターを、ＳＬＰＩ処置ニューロンのＣｈＩＰ分析およびＤＮＡ配列決定によって同定することができる。細胞死およびミエリン阻害における役割に基づいて候補遺伝子を同定し、ＣｈＩＰ分析およびＰＣＲをさらに行って、ＳＬＰＩがそれらの発現をダウンレギュレートする能力を評価することができる。
（実施例７）
ＳＬＰＩのインビボ投薬量および毒性を決定するために、ＳＬＰＩを、後柱切離を行った成体ラットに髄腔内または皮下投与することができる。麻痺するが膀胱機能を保持し、動物の術後ケアが非常に容易である比較的簡潔な脊髄損傷モデルであるので、後柱傷害を選択する。後柱で認められた軸索再生は、ＳＬＰＩの治療薬としての可能性の証明を提供する。
【００９５】
ＳＬＰＩの最適濃度を決定するための用量−応答実験を、以下のように行うことができる。Ｐ６  ＤＲＧおよび小脳ニューロンを、０、１、２、５、１０、２０、または５０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩで処置する。ＣＨＯ細胞の単層およびＣＮＳミエリン基質を、８ウェルチャンバースライドに調製する。ニューロンを、約１０，０００ニューロン／ウェルの密度で培養し、１６〜１８時間インキュベートし、βＩＩＩチューブリンで免疫染色した。神経突起伸長を、以前に記載のように定量する（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：７５７−６７（１９９４））。
【００９６】
ＳＬＰＩを、皮下注射または髄腔内ポンプによって成体ラットに投与する。同一手段によってコントロール群に生理食塩水を投与する。ＤＲＧニューロンを切り出し、コントロールおよびＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞の単層に移し、一晩培養する。神経突起伸長を上記のように定量する。
【００９７】
後柱傷害を作製するために、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３４：８９５−９０３（２００２）に記載のように、８週齢雌ラットのＴ６−Ｔ７で後柱切離を行う。至適濃度のＳＬＰＩを、障害時に挿入した皮下注射または髄腔内ポンプによって送達させ、適切な期間で除去する。コントロールとして生理食塩水を投与する。術後２４日に、軸索を、４ｍｌの１％ビオチン化コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）の左坐骨神経への注射によって経神経節的に追跡する。４日後に動物を経噴門潅流によって屠殺し、胸髄を取り出し、後固定し、凍結防止を行う。脊髄を、長手方向に２０μｍ切開し、βＩＩＩチューブリンについて免疫染色する。ＣＴＢを、フルオレセイン抱合ストレプトアビジンとのインキュベーションによって視覚化し、軸索再生を、βＩＩＩチューブリンおよびＣＴＢの同時局在化によって示す。
（実施例８）
好中球は、脊髄損傷の初期段階で起こる二次ニューロン障害で主な役割を果たす（Ｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７９：１１７７−８２（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５１：７７−８８（１９９８））。多数の好中球が障害部位に浸潤し、エラスターゼ（内皮細胞を特異的に標的化するＳＬＰＩ基質）を放出する（Ｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（上記））。ＳＬＰＩが脊髄損傷後に好中球浸潤、出血、およびニューロンの壊死を防止することを確認するために、上記のように、ラットにおける後柱傷害を実施し、ＳＬＰＩを動物に送達させることができる。同様に障害の挫傷モデルも使用することができる。障害後１、２、または５日目に動物を屠殺し、障害部位を含む脊髄領域を切開する。これらの切片を、ヘマトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）およびエオシンで染色し、出血および壊死の証拠について試験する（Ｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７９９：２６４−６９（１９９８））。好中球浸潤およびエラスターゼ発現の範囲を、ミエロペルオキシダーゼおよびエラスターゼの免疫染色によってそれぞれ決定する。最後に、βＩＩＩチューブリンについての免疫染色と併せたＴＵＮＥＬ染色を行い、ニューロン生存に及ぼすＳＬＰＩの影響を確認する。ニューロンの壊死数の減少により、ＳＬＰＩが急性精髄損傷後の神経学的結果を非常に改善する可能性のある有効な神経防御薬であることを確認する。
（実施例９）
本発明のＳＬＰＩを動物（ヒトが含まれる）に送達させるために、当業者に明らかな種々の方法（例えば、分子の神経系への標準的な送達技術および遺伝子移入技術）を使用することができる。神経系のニューロンおよび膠細胞へのウイルスまたは非ウイルス媒介遺伝子移入法は、当該分野で公知である（例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ，Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｒａｎｃａ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ：Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照のこと）。ＳＬＰＩ分子を、所望の標的細胞に移入し、神経系細胞が浸漬した流動物（例えば、ＣＳＦ）中に発現産物が出現し、次いで、これらの流動物を介して細胞に輸送することができる。異種遺伝子の調節のための公知且つ利用可能な転写調節配列および発現系を使用した本発明のポリヌクレオチドの誘導性発現および他の調節された発現は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００９８】
本発明の発現プラスミド（例えば、発現形態および分泌形態のＳＬＰＩをコードするもの）でトランスフェクトした哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）を培養し、培養物を分泌速度についてアッセイした。細胞を、修復を必要とする神経障害付近が罹患または障害した被験体の脊髄周囲の脳脊髄液に外科的に移植することができる。
【００９９】
随意に、反復投与が実行された。細胞は、ＳＬＰＩを分泌し、神経再生を刺激する。
（実施例１０）
ＳＬＰＩがインビボで視神経中の軸索再生を促進する能力を調査した。成体雄Ｆｉｓｃｈｅｒラット（２００〜３００ｇ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、イソフルレン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔し、定位固定フレームに配置した。以下のように視神経を破壊した。右視神経を露呈し、髄膜を除去した。次いで、眼から２ｍｍの距離の神経を精細な鉗子で１０秒間破壊した。特別なケアを行って眼動脈障害を回避した。切開部を閉じた後、動物の右眼に５μｌの滅菌生理食塩水または１０μｇの組換えヒトＳＬＰＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；２μｇ／μｌを含む５μｌの滅菌生理食塩水）のいずれかを単回硝子体内注射によって右眼に投与した。２週間の術後生存後、動物を、４％パラホルムアルデヒドの経噴門潅流によって屠殺し、視神経を解剖した。神経を２０ミクロン切開し、ゼラチンコーティングスライド上に解凍マウントした（ｔｈａｗ−ｍｏｕｎｔｅｄ）。切片を、５％ウサギ血清、２％ＢＳＡ、および０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）で１０００倍希釈したポリクローナルヒツジ抗ＧＡＰ−４３抗体を使用して、ＧＡＰ−４３について免疫染色した。一晩のインキュベーション後、切片をＴＢＳでリンスし、ＦＩＴＣ抱合ウサギ抗ヒツジ二次抗体（ウサギ血清、ＢＳＡ、およびＴｗｅｅｎを含むＴＢＳで５００倍希釈）中にて室温で２時間インキュベートした。スライドにＰｅｒｍａｆｌｕｏｒマウティング培地（Ｔｈｅｒｍｏ）と共にカバーガラスをかけ、蛍光下で観察した。
【０１００】
結果を、図５に示す。上のパネルは、視神経破壊後に生理食塩水を注射した動物の視神経を示す一方で、下のパネルは、ＳＬＰＩを注射した動物由来の視神経を示す。ＧＡＰ−４３は、活動的に成長している軸索のみに存在するので、ＧＡＰ−４３陽性軸索の存在は、軸索の成長および再生を示す。生理食塩水処置神経ではＧＡＰ−４３陽性軸索は認められないが（図５、上のパネル）、しかしＳＬＰＩで処置した神経中にはＧＡＰ−４３陽性軸索が多数存在する（図５、下のパネル）。障害部位に多数の軸索が存在し、そのうちのいくつかは傷害部位を超えて伸長し（図５の下のパネルの左から右）、軸索の再生を示す。したがって、これらのデータは、ＳＬＰＩを用いた障害を受けた視神経の治療が軸索の成長および再生を導くことを示し、さらに、ＳＬＰＩがＣＮＳおよび視神経における軸索再生の有効な促進手段であることを良好に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、ＳＬＰＩがＭＡＧによる脊髄後根神経節（「ＤＲＧ」）ニューロンの阻害を逆転することを示す４つの写真および棒グラフのパネルである。生後６日のラット由来のＤＲＧニューロンを、２、５、または１０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩで処置し、コントロールまたはＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞の単層に培養し、１６時間インキュベートした。ニューロンを、βＩＩＩチューブリンで染色し、ＭＥＴＡＭＯＲＰＨ画像分析ソフトウェアを使用して神経突起の長さを定量した。データを、±ＳＥＭで示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、ＳＬＰＩがＭＡＧによる脊髄後根神経節（「ＤＲＧ」）ニューロンの阻害を逆転することを示す４つの写真および棒グラフのパネルである。生後６日のラット由来のＤＲＧニューロンを、２、５、または１０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩで処置し、コントロールまたはＭＡＧ発現チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞の単層に培養し、１６時間インキュベートした。ニューロンを、βＩＩＩチューブリンで染色し、ＭＥＴＡＭＯＲＰＨ画像分析ソフトウェアを使用して神経突起の長さを定量した。データを、±ＳＥＭで示す。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、ＳＬＰＩがミエリンによる皮質ニューロンの神経突起伸長を増強することを示す４つの写真および棒グラフのパネルである。生後１日のラット由来の皮質ニューロンを、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）および５または１０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩで処置し、中枢神経系ミエリン（１μｇ／ウェル）でコーティングした８ウェルチャンバースライドに培養した。ニューロンを２４時間インキュベートし、βＩＩＩチューブリンで免疫染色した。棒グラフは、平均神経突起の長さ±ＳＥＭを示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、ＳＬＰＩがミエリンによる皮質ニューロンの神経突起伸長を増強することを示す４つの写真および棒グラフのパネルである。生後１日のラット由来の皮質ニューロンを、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）および５または１０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩで処置し、中枢神経系ミエリン（１μｇ／ウェル）でコーティングした８ウェルチャンバースライドに培養した。ニューロンを２４時間インキュベートし、βＩＩＩチューブリンで免疫染色した。棒グラフは、平均神経突起の長さ±ＳＥＭを示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、それぞれＳＬＰＩのインビボ送達によって成体ＤＲＧニューロンのＭＡＧ阻害が克服されることを示す４つの写真および棒グラフのパネルである。１、２、または５μｇ／ｋｇ／時間のＳＬＰＩを脊髄に２４時間注入した成体ラット由来のＤＲＧニューロンを、コントロールまたはＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞上に培養した。ニューロンを１６時間インキュベートし、βＩＩＩチューブリンで染色した。棒グラフは、平均神経突起の長さ±ＳＥＭを示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、それぞれＳＬＰＩのインビボ送達によって成体ＤＲＧニューロンのＭＡＧ阻害が克服されることを示す４つの写真および棒グラフのパネルである。１、２、または５μｇ／ｋｇ／時間のＳＬＰＩを脊髄に２４時間注入した成体ラット由来のＤＲＧニューロンを、コントロールまたはＭＡＧ発現ＣＨＯ細胞上に培養した。ニューロンを１６時間インキュベートし、βＩＩＩチューブリンで染色した。棒グラフは、平均神経突起の長さ±ＳＥＭを示す。
【図４】図４は、ＳＬＰＩが小脳顆粒ニューロン（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｎｅｕｒｏｎ）（「ＣＧＮ」）の核に局在することを示すウェスタンブロット画像である。生後５日のラット由来のＣＧＮを、１０μｇ／ｍｌ  ＳＬＰＩと１時間インキュベートした。細胞質画分および核画分を、未処置（−）およびＳＬＰＩ処置（+）ニューロンから単離し、ＳＬＰＩについてのウェスタンブロッティングによって分析した。膜も剥ぎ取り、リン−ＣＲＥＢ（核内に見出される活性転写因子）について探索して核画分の純度を検証した。ポジティブコントロールとして組換えＳＬＰＩを使用した。
【図５】図５は、視神経破壊後に生理食塩水を注射した動物（上のパネル）またはＳＬＰＩを注射した動物（下のパネル）由来の視神経のＧＡＰ−４３染色を示す写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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