(57)【要約】  本発明は、フィラグリン遺伝子における機能喪失変異の同定と、尋常性魚鱗癬の診断並びに／又はアトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬及びアレルギー（食物アレルギーを含む）を含む他の疾患に対する感受性の診断におけるそれらの使用とに関する。
2009523411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィラグリン（ＦＬＧ）遺伝子にコードされるフィラグリン（ＦＬＧ）タンパク質の機能喪失又は部分的機能喪失をもたらす突然変異が、被検体からの核酸試料のＦＬＧ遺伝子内に存在するか否かをｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する工程を含む尋常性魚鱗癬（ＩＶ）に対する遺伝子検査。
【請求項２】
前記検査がＩＶの診断のため及び／又は被検体がＩＶを発症し易いかどうか検査するために使用される請求項１記載の検査。
【請求項３】
前記検査が、被検体がアトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬又は接触性アレルギー及び食物アレルギー（たとえばピーナッツアレルギー）等のアレルギーになりやすい、又はなっている可能性が高いか否かを検出するためにも使用される請求項１又は２記載の検査。
【請求項４】
前記検査がＩＶの軽症又は準臨床的な型の同定に使用される請求項１記載の検査。
【請求項５】
フィラグリン（ＦＬＧ）遺伝子にコードされるフィラグリン（ＦＬＧ）タンパク質の機能喪失又は部分的機能喪失をもたらす突然変異が、被検体からの核酸試料のＦＬＧ遺伝子内に存在するか否かをｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する工程を含む、アトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬及び／又はアレルギーのための遺伝子検査。
【請求項６】
前記核酸がゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ試料である前記請求項１〜５のいずれか１項に記載の検査。
【請求項７】
検査される前記被検体が新生児又は胎児である前記請求項１〜６のいずれか１項に記載の検査。
【請求項８】
前記検査が湿疹及び／又はアレルギー発症をもたらす場合があることが知られる物質に接触し得る特定の職業に対する被検体の適正を検査するために行われる前記請求項１〜７のいずれか１項に記載の検査。
【請求項９】
前記検査が被検体を分類し、疾病発症の‘潜在的危険（ａｔ  ｒｉｓｋ）’状態を予測するために行われる請求項１〜７のいずれか１項に記載の検査。
【請求項１０】
前記突然変異が１−１０ヌクレオチドに影響する前記請求項のいずれかに記載の検査。
【請求項１１】
前記突然変異又は突然変異群が機能フィラグリンペプチドにおける１−５、７−１３又は１５−２０の減少をもたらす前記請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検査。
【請求項１２】
前記突然変異がエクソン３に見出される前記請求項１〜１１のいずれか１項に記載の検査。
【請求項１３】
前記突然変異がエクソン３の固有の、部分リピートの、又は最初のフィラグリンリピートの部位内に見出される請求項１２記載の検査。
【請求項１４】
前記突然変異がＲ５０１Ｘ、２２８２ｄｅｌ４、３７０２ｄｅｌＧ、Ｒ２４４７Ｘ（第７リピート）、Ｓ３２４７Ｘ（第９リピート）、Ｒ１４７４Ｘ（第４リピート）、Ｑ３６８３Ｘ（第１０リピート）、１１０２９ｄｅｌＣＡ（第１０リピート）、Ｅ２４２２Ｘ（第６リピート）、５３６０ｄｅｌＧ（第５リピート）、７２６７ｄｅｌＣＡ（第７リピート）、１１０３３ｄｅｌ４（第１０リピート）、６８６７ｄｅｌＡＧ（第６リピート）、３３２１ｄｅｌＡ（第２リピート）及びＳ２５５４Ｘ（第７リピート）からなる群より選択される請求項１ないし１０のいずれかに記載の検査。
【請求項１５】
前記突然変異がＲ５０１Ｘ、２２８２ｄｅｌ４、３７０２ｄｅｌＧ、Ｒ２４４７Ｘ及びＳ３２４７Ｘからなる群より選択される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検査。
【請求項１６】
前記被検体がアジア起源、特に日本人であり、前記突然変異が３３２３ｄｅｌＡ及び／又はＳ２５５４Ｘである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の検査。
【請求項１７】
前記突然変異がリアルタイムＰＣＲを含む定量ＰＣＲ又は半定量ＰＣＲ、核酸シーケンシング、ハイブリダイゼーション解析及び／又は制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析技術により検出される前記請求項１〜１６のいずれか１項に記載の検査。
【請求項１８】
前記試料からのＦＬＧ遺伝子内におけるフィラグリンリピートの数を同定する工程をさらに含む前記請求項１〜１７のいずれか１項に記載の検査。
【請求項１９】
前記請求項１〜１８のいずれか１項に記載の検査における配列番号１−５４５として同定されるオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２０】
３’部位に配列番号１−５４５のいずれか１つから同定される３’塩基を有し、およそ１２−５０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドの、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の検査における使用。
【請求項２１】
前記プライマーがさらに標識を含む請求項１９又は２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
被検体のフィラグリン遺伝子内の突然変異を検出することに用いられる、配列番号１−５４５として同定される単離されたオリゴヌクレオチド、又は配列番号１−５４５として同定されるオリゴヌクレオチドと同一の３’ヌクレオチドを共有する、少なくとも１２ヌクレオチドのフラグメント若しくは５０ヌクレオチドまでのより大きなオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記突然変異がＩＶ、アトピー性皮膚炎、喘息、乾癬及び／若しくはアレルギーを有する又は発症し易い被検体と関連している請求項２２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド群が配列番号１−８、９−１２、１３−１５等より選択される、又は前記配列番号と同一の３’塩基を含むフラグメント又はより大きなオリゴヌクレオチドである、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２５】
請求項２２〜２４記載の１又は複数種のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２６】
試料中に突然変異ＦＬＧ遺伝子から発現した突然変異ペプチドが存在するか否かを前記突然変異ペプチドに対し特異的な反応性を示す結合物質を使用することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する工程を含む、ＦＬＧ遺伝子の突然変異体から発現した突然変異ペプチドを検出する方法。
【請求項２７】
前記結合物質が抗体である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
フィラグリン配列内に生じた突然変異の結果として生成した突然変異ペプチドに特異的に結合し得る結合物質又は抗体。
【請求項２９】
フィラグリン遺伝子内の２２８２ｄｅｌ４突然変異の結果として生成したペプチドに特異的に結合し得る請求項２８記載の結合物質又は抗体。
【請求項３０】
医薬製造における、１又は複数コピーのＦＬＧタンパク質をコードし得るＦＬＧ遺伝子配列又はその断片の使用。
【請求項３１】
ＦＬＧ遺伝子配列又はその断片が１又は複数コピーのＦＬＧタンパク質を発現し得る、治療又は予防における使用のためのＦＬＧ遺伝子配列又はその断片。
【請求項３２】
１又は複数コピーのＦＬＧタンパク質を発現し得るＦＬＧ遺伝子配列又はその断片を含むＤＮＡコンストラクトを先述の疾病／状態のいずれかを発症した又は発症しやすい患者に投与し、それによって前記１又は複数コピーのＦＬＧタンパク質の発現が前記疾病／状態を治療又は改善する、ＩＶ、アトピー性皮膚炎、喘息、乾癬及び／又はアレルギーに対し予防的又は治療的処置を施す方法。
【請求項３３】
治療で使用するＦＬＧ配列又はその断片を含む組み替え分子。
【請求項３４】
本発明は、
ａ）被検体のＦＬＧ遺伝子が１又は複数個の突然変異を含んでいても１又は複数コピーの前記ＦＬＧポリペプチドの発現が生ずるか決定し；及び
ｂ）少なくとも１又は複数コピーのＦＬＧポリペプチドを発現し得るＦＬＧ対立遺伝子を被検体が有する場合に、ＦＬＧ発現を増加させるためにＵＶ光を使用して被検体を治療する
工程を含む、ＩＶ及び／又は先述の疾病のいずれかを治療、予防及び／又は改善する方法も提供する。
【請求項３５】
ＦＬＧ遺伝子にコードされるＦＬＧタンパク質の機能の喪失又は部分的喪失をもたらす、ＦＬＧ遺伝子の一方又は両方のコピー内の１又は複数個の突然変異を保有するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３６】
試験薬剤をＦＬＧ突然変異トランスジェニック動物に投与し；該薬剤が前記疾病／状態の少なくとも１つの兆候又は症状を軽減又は抑制するかどうかを測定又は決定し、該試験薬剤が前記疾病／状態を治療又は予防し得ることの指標とする工程を含む、突然変異ＦＬＧの発現に関連するＩＶ、アトピー性皮膚炎、喘息、乾癬及び／又はアレルギーを治療又は予防するために有用な薬剤を同定するためのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、フィラグリン遺伝子における機能喪失変異の同定と、尋常性魚鱗癬の診断並びに／又はアトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬及びアレルギー（食物アレルギーを含む）を含む他の疾患に対する感受性の診断におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
尋常性魚鱗癬（ＩＶ；ＯＭＩＭ＃１４６７００）は最も一般的な角化の遺伝性疾患であり、ヒトにおいて最も多い単一遺伝子病の一つである。最も広く引用される発生率は、６０５１個体の健康なイギリス人学童の調査に基づく、２５０人中１人という数字である1。
【０００３】
ＩＶの表現型の特徴としては、手掌部ハイパーリニアリティ（ｈｙｐｅｒｌｉｎｅａｒｉｔｙ）、毛孔性角化症；並びに下腹部、上肢及び下肢にわたって最も顕著に見られる細かい鱗屑などがある2。フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）（フィラメント凝集タンパク質（ｆｉｌａｍｅｎｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ））は、角質層の形成において重要である3-5。毛包間表皮の顆粒層におけるケラトヒアリン顆粒は主に４００ｋＤａのタンパク質であるプロフィラグリンからなる。短い固有のＮ末端ドメインに続き、プロフィラグリン分子の多くは、３２４アミノ酸のフィラグリン配列の１０−１２回リピートからなる6。顆粒細胞の最終分化の際、プロフィラグリンはタンパク質分解により〜３７ｋＤａのフィラグリンペプチドとＳ１００様カルシウム結合ドメインを含むＮ末端ドメインとに開裂する。フィラグリンは急速にケラチン細胞骨格を凝集させ、顆粒細胞を崩壊させて平らな無核扁平細胞にする。この凝縮した細胞骨格は周辺帯（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  （ＣＣＥ））の形成中にトランスグルタミナーゼによって架橋される。ＣＣＥは皮膚の最外障壁層であり、水分の喪失を防ぐだけでなく、アレルゲンや病原菌の侵入をも妨げる7。従ってフィラグリンは表皮分化を促進し、障壁機能を維持することにおいて重要なタンパク質である。
【０００４】
イムノブロッティング分析において、フィラグリンタンパク質はＩＶ患者の皮膚及び／又はケラチノサイト中に存在しないか又は著しく減少していることが示されている8-10。また、フィラグリンｍＲＮＡの減少がＩＶの個体の一部において示されている11。マウス劣性突然変異体であるｆｌａｋｙ  ｔａｉｌ（ｆｔ）はヒトＩＶに見られる組織学的及び超微細構造的な特徴を有しており12、齧歯類フィラグリン遺伝子座（ＦＬＧ）に対し強い遺伝的連鎖が得られている13,14。生化学的分析においてｆｔ／ｆｔホモ接合体におけるプロフィラグリンの不完全なプロセシングが示されてはいるが12、ＦＬＧ遺伝子におけるゲノム突然変異はこれまでに全く同定されていない。
【０００５】
尋常性魚鱗癬及びアトピー性疾患又はそれらに対する素因を診断する方法を提供することが本発明の目的に含まれる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明はヒトフィラグリン（ＦＬＧ）遺伝子における、タンパク質機能の喪失又は部分的喪失をもたらす突然変異の最初の同定に基づく。
【０００７】
従って、第１の局面において、本発明は
ａ）検査される被検体からの核酸試料を提供し；
ｂ）該核酸のＦＬＧ遺伝子内にフィラグリン（ＦＬＧ）遺伝子にコードされるフィラグリン（ＦＬＧ）タンパク質の機能の喪失又は機能の部分的喪失をもたらす突然変異が存在するか否かを検出する
工程を含む、尋常性魚鱗癬（ＩＶ）の遺伝子検査を提供する。
【０００８】
該検査はＩＶの診断のため及び／又は被検体がＩＶを発症し易いかどうか検査するために使用し得ることが好ましい。さらに、重症型又は軽症型ＩＶが他の疾病と関連性を示すことから、該検査は被検体がアトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬又は接触性アレルギー及び食物アレルギー（たとえばピーナッツアレルギー）等のアレルギーになりやすい、又はなっている可能性が高いか否かを検出するためにも使用され得る。皮膚の状態に関しては、フィラグリン発現が低水準であることによって軽症の及び／又は準臨床的な疾病の発症がもたらされることがある。このように、本発明は前記の軽症の及び／又は準臨床的な形態の疾病の同定及び／又は治療にも関する。実際、多くの皮膚状態が診断未確定となり、治療がむしろ美容上の処置として考えられることがある。
【０００９】
従って、さらなる局面において、本発明は
ａ）検査される被検体からの核酸試料を提供し；
ｂ）該核酸のＦＬＧ遺伝子内にＦＬＧ遺伝子にコードされるＦＬＧタンパク質の機能の喪失又は機能の部分的喪失をもたらす突然変異が存在するか否かを検出する
工程を含む、アトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬及び／又はアレルギーに対する遺伝子検査を提供する
【００１０】
検査する試料は核酸を得られるどのような適当な試料であってもよい。典型的には該核酸はゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡの試料である。簡便には、試料は唾液、口腔擦過又は血液試料であってよい。試料は皮膚生研のような組織試料であってもよい。
【００１１】
被検体は検査を必要とするどのような被検体でもよく、新生児、又は胎児さえも適当であり得る。被検体はしかしどのような世代であってもよく、従って新生児、小児及び成人を含む。上記のように、前記検査は被検体が疾病を発症し易いか否かを確認するために行うことが出来る。従って検査は、例えば湿疹及び／又はアレルギー発症をもたらす場合があることが知られる物質に接触し得る特定の職業に対する被検体の適正を検査するために行うことが出来る。あるいは、該検査は被検体を分類し、例えばアトピー性疾患に対する‘潜在的危険（ａｔ  ｒｉｓｋ）’状態を予測するために行うことが出来る。このように、治療的介入用に被検体を分類又は層別化するために、また適当である場合には得られた任意の結果に基づきアトピー性疾患を予防及び／又は治療するために、被検体を検査することが出来る。
【００１２】
さらに、被検体のＦＬＧ状態、従ってＦＬＧタンパク質の発現の度合い又は発現の欠如を確認することは、ＩＶ及び／又は先に述べた他のいずれかの疾病に罹っているまたは罹り易い被検体のための適した治療法を決定するために利用し得る。例えば、重症度に応じて、又は予測される重症度に応じて当業者が適切な治療的及び／又は美容的療法を決定することが出来、オーダーメード治療を被検体のＦＬＧ状態に基づき行うことができる。
【００１３】
本発明は、一態様において、プロフィラグリン及び結果的にフィラグリンタンパク質の機能喪失をもたらすＦＬＧ遺伝子のこれまでに同定されていなかった突然変異を同定することを基盤とする。本発明はしかしプロフィラグリン及び／又はフィラグリンタンパク質の機能の喪失又は部分的喪失をもたらすＦＬＧ遺伝子のどのような突然変異にも及ぶ。
【００１４】
前記突然変異は付加、欠失、置換又は逆位であり得る。典型的には、該突然変異は１塩基置換、又は２−１０、例えば４塩基欠失のように１−１０ヌクレオチドに対して影響する。該突然変異は転座によるものでもあり得る。プロフィラグリンの又はフィラグリンタンパク質の部分的または完全な機能喪失が意味するのは、突然変異又は突然変異群がＦＬＧ遺伝子の不正確なプロセシング及び／又は発現を引き起こし、通常発現している１又は複数種のフィラグリンペプチドが機能的に発現されていないということであると理解される。典型的には、１０−１２コピーのフィラグリンペプチドが非変異ＦＬＧ遺伝子から発現している6。従って、本発明の変異ＦＬＧ遺伝子は、ゲノム中に存在するＦＬＧ遺伝子の一方又は両方のコピー由来の、１０−１２コピーよりも少ない、典型的には７、５、３又は１コピーのフィラグリンペプチドの機能的発現を生ずると理解される。
【００１５】
突然変異又は突然変異群の部位及び／又は種類によって、機能的フィラグリンの発現の任意の減少は軽度、例えば機能的フィラグリンペプチド１−５コピーの減少；大幅な、例えば機能的フィラグリンペプチド７−１３コピーの減少；又は深刻な、例えば機能的フィラグリンペプチド１５−２０コピーの減少であり得る。
【００１６】
突然変異又は突然変異群はＦＬＧ遺伝子のエクソン１、２、及び／又は３のいずれにも存在し得、典型的にはエクソン３に存在し得る。突然変異又は突然変異群がエクソン３に位置する場合、機能的フィラグリンの発現に関わる有害突然変異の多くは、第３エクソンの最初の２０００塩基以内といったような５’（Ｎ末端）部位内に存在し、例えば第３エクソンの固有、部分的反復、又は第１フィラグリンリピート部位に存在する（図２ａ参照）。
【００１７】
前記ＦＬＧコピー群のうち１コピーの機能低下、また一部のケースでは完全な機能的喪失をもたらす、多数の突然変異が本願発明者らによって同定された。このような突然変異の１つは本明細書のＦＬＧ遺伝子のポジション１５０１における１塩基置換である（図５及び配列番号１８８に示される通り）。１５０１Ｃ＞Ｔ（開始ＡＴＧからの番号付け）ではシチジンがチミジンで置換され、ポジション５０１における対応するアミノ酸がアルギニンから停止コドンへ変わる。この突然変異は第１フィラグリンリピート（図２参照）内に生じ、停止コドンを生成するため、フィラグリンペプチドの機能的なコピーが生成されない。
【００１８】
同定された第２の突然変異はポジション２２８２から始まる４塩基欠失である（図５及び配列番号１８６参照）。この突然変異は２２８２ｄｅｌ４と命名され、１０７塩基下流側に新たな停止コドンをもたらすフレームシフトを生ずる。この突然変異も第１フィラグリンリピート内に生じ、フィラグリンペプチドの機能的コピーは発現しないが、固有のＣ末端部位を保有する短い突然変異型ペプチドが発現し得る（図４及び配列番号１８７参照）。
【００１９】
第３の突然変異は第３フィラグリンリピート内のＧの欠失である。この欠失はポジション３７０２に位置し、図５に示されている。この突然変異は第３リピートにおいてフレームシフトを引き起こし、第１及び第２リピートからの２つのフィラグリンの機能的コピーしか生成しない。
【００２０】
同定されたさらなる突然変異としては、Ｒ２４７７Ｘ（第７リピート）、Ｓ３２４７Ｘ（第９リピート）、Ｒ１４７４Ｘ（第４リピート）、Ｑ１７４５Ｘ（第４リピート）、Ｑ３６８３Ｘ（第１０リピート）、１１０２９ｄｅｌＣＡ（第１０リピート）、Ｅ２４２２Ｘ（第６リピート）、５３６９ｄｅｌＧ（第５リピート）、７３６７ｄｅｌＣＡ（第７リピート）、１１０３３ｄｅｌ４（第１００リピート）、６８６７ｄｅｌＡＧ（第６リピート）、３３２１ｄｅｌＡ（第２リピート）及びＳ２５５４Ｘ（第７リピート）などがある。ヨーロッパ人集団で最も頻繁に及び／又は時折見られる突然変異はＲ５１０Ｘ、２２８２ｄｅｌ４、３７０２ｄｅｌＧ、Ｒ２４４７Ｘ及びＳ３２４７Ｘである。
【００２１】
上で使用されている命名は次の通り理解されるべきである：例えばＳ３２４７はコドンポジション３２４７に突然変異が存在し、セリンをコードするコドンから停止コドンへとコドンが変化する。５３６０ｄｅｌＧはＤＮＡ塩基対ポジション５３６０（開始ＡＴＧ＝１とした番号付け）におけるＧの欠失であり、フレームシフトを引き起こす。
【００２２】
ＦＬＧ遺伝子における突然変異の検出は、リアルタイムＰＣＲを含む定量ＰＣＲ又は半定量ＰＣＲ、核酸シーケンシング、ハイブリダイゼーション解析及び／又は制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析技術を含む種々の方法により行われてもよく、これらは当業者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌ，２０００参照）。
【００２３】
突然変異又は突然変異群がどこに位置するかにより、１若しくは複数個のエクソン又はその一部分を増幅することが適切であり得る。該突然変異（群）がエクソン３に位置している場合、適切なプライマーを用いてエクソン３の全体又は一部分のみを増幅してもよい。該突然変異（群）が第１リピート中に位置している場合、第１リピート、又は該突然変異（群）を含んだその一部分だけを増幅することが必要であり得る。プライマー及び任意の標識を適切に使用することにより、産物を増幅し、その産物が突然変異を含んでいるか否かを確認することが出来る。例えばプライマーは、ネイティブ又は変異配列のみが増幅され検出されるように、３’末端（又はその極めて近傍）にネイティブ又は変異塩基／配列に結合し得る塩基が組み込まれるよう設計されてもよい。エクソン３全体、又はリピート配列の一部の特異的領域を増幅するために用いるのに適したプライマーの選択は、本明細書において配列番号１−１８２として識別される。
【００２４】
配列番号１−８にフィラグリンリピートのロングレンジＰＣＲ及びシーケンシングに適したプライマーを示す。
【００２５】
配列番号９−１２にＲ５０１Ｘ突然変異の検出のための短いＰＣＲ断片を生成するのに適したプライマーを示す。
【００２６】
配列番号１３−１５に２８２８ｄｅｌ４突然変異の検出のための短いＰＣＲ断片を生成するのに適したプライマーを示す。
【００２７】
配列番号１５−１８に３７０２ｄｅｌＧ突然変異の検出のための短いＰＣＲ断片を生成するのに適したプライマーを示す。
【００２８】
配列番号１９−４０にリピート０に対して特異的なプライマーを示す。
【００２９】
配列番号４１−６７にリピート１に対して特異的なプライマーを示す。
【００３０】
配列番号６８−９３にリピート２に対して特異的なプライマーを示す。
【００３１】
配列番号９４−１３６にリピート３に対して特異的なプライマーを示す。
【００３２】
配列番号１３７−２０１にリピート４に対して特異的なプライマーを示す。
【００３３】
配列番号２０２−２６４にリピート５に対して特異的なプライマーを示す。
【００３４】
配列番号２６５−３２９にリピート６に対して特異的なプライマーを示す。
【００３５】
配列番号３３０−３７７にリピート７に対して特異的なプライマーを示す。
【００３６】
配列番号３７８−４１４にリピート８に対して特異的なプライマーを示す。
【００３７】
配列番号４１５−４６１にリピート９に対して特異的なプライマーを示す。
【００３８】
配列番号４６２−４９３にリピート１０に対して特異的なプライマーを示す。
【００３９】
配列番号４９４−４９７にリピート８．１に対して特異的なプライマーを示す。
【００４０】
配列番号４９８−５０１にリピート８．２に対して特異的なプライマーを示す。
【００４１】
配列番号５０２−５１８にリピート１０．１に対して特異的なプライマーを示す。
【００４２】
配列番号５１９−５３９にリピート１０．２に対して特異的なプライマーを示す。
【００４３】
配列番号５４０−５４４にリピート１１に対して特異的なプライマーを示す。
【００４４】
配列番号５４５にフィラグリン末尾部に対して特異的なプライマーを示す。
【００４５】
全てのケースにおいて、プライマー配列終端のＦは、プライマーがフォワードプライマーであることを示し、Ｒはそれがリバースプライマーであることを示す。
【００４６】
同定されたプライマー配列の短い型又は長い型を使用し得ることが好ましい；例えば、プライマーは１２−５０塩基長であってもよい。しかし、３’末端の塩基は正確なプライマー伸長に重要であり、どのプライマーの３’末端も本明細書で同定された配列と同一であるべきである。
【００４７】
蛍光、化学発光、生物発光又は放射標識等の標識を、ネイティブ又は変異配列の検出を可能にするようにＰＣＲプライマーに組み込んでもよい。ネイティブ又は変異配列のいずれか及び産物中に存在する特定の標識に基づいて検出された（ネイティブ又は変異）配列を含む産物の増幅を促進するように設計された２種の別々に標識されたプライマーをＰＣＲ反応において使用し得ることが、当業者にとって好ましい。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州）のＴａｑＭａｎ（登録商標）システム等の他の標識法を用いてもよい。
【００４８】
もちろん、突然変異を含み得るＤＮＡ部位を含んだＤＮＡ断片はＦＬＧ遺伝子が突然変異を含んでいるか否か決定するために単純に増幅され、シーケンシングされてもよい。また、このような断片を増幅し、適当なオリゴヌクレオチドを用いて、並びに正確に合致するオリゴヌクレオチドだけが突然変異（群）を含んだ領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｇｉｏｎｓ）中の増幅された断片に結合するような極めてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか，２０００15を参照）を用いて、ハイブリダイゼーション解析を行ってもよい。
【００４９】
突然変異を含む又は含まない配列を含んだＤＮＡの断片を最初に増幅させ、後でその断片がネイティブまたは変異配列を含むか否かを該増幅断片内部のプライマーを用いたさらなるＰＣＲ反応を行うことによって検出し、突然変異を検出し（又はしなく）てもよい。このような手法は一般的にネスティッドＰＣＲとして知られる。
【００５０】
さらに、任意の個々の突然変異はＲＦＬＰ分析によって検出され得る新たな制限サイトを生成し得る。最初に適当なプライマーを用いて増幅することが（存在していた場合に）出来る突然変異を含むであろう断片はその後、突然変異又はネイティブ配列が対応するネイティブ又は変異配列中に存在しない制限サイトを有する場合、ＲＦＬＰ分析にかけられる。本発明に従うと、本明細書に同定される典型的な突然変異は新たな制限サイトを生成し、これは最初に突然変異を含む断片を増幅し、その後得られた断片を適当な制限酵素を用いて切断することで容易に検出出来る  −  変異配列を含む断片のみが切断される（さらなる記載については実施例セクションを参照のこと）。
【００５１】
本発明は１種又は複数種の前述のオリゴヌクレオチド／プライマーを含むキットにも及ぶ。該キットは例えばシーケンシング、ＰＣＲの実行及び／又はＲＦＬＰ分析を促進するための他の試薬をも含み得る。このようなキットはまた、フィラグリン遺伝子の１又は複数個の突然変異を検出するためのそれらの使用に関する；及び任意に、突然変異がＩＶ及び／又は他の前述の疾病／状態のいずれかの発症または発症のし易さをもたらすか否かを解釈する方法に関する使用説明書を含んでいてもよい。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチド／プライマーは、当業者に周知のマルチプレックスＰＣＲ法においてフィラグリン配列内の突然変異を同定するように使用してもよい。例えば、Ｋｕｐｅｒｓｔｅｉｎ  Ｇ，  Ｊａｃｋ  Ｅ及びＮａｒｏｄ  ＳＡ；Ｇｅｎｅｔ  Ｔｅｓｔ．１０（１）：１−７（２００６）を参照のこと。
【００５３】
プロフィラグリン／フィラグリンタンパク質の機能低下又は機能の部分的喪失をもたらす突然変異に加えて、本願発明者らは今回、‘通常の’１０回リピートとは対照的に、１１又は１２コピーの完全なフィラグリンリピートからなるフィラグリン遺伝子エクソン３をもたらし得る特異的な反復配列を同定した。本願発明者らは、１１又は１２個のフィラグリンリピートを生成するために、ある個体において第８及び／又は第１０リピートが基本的に重複し得ることを同定した。そのため、望ましくは本発明は１又は複数個の突然変異を検出することとともに被検体におけるフィラグリンリピートの数を同定することにも及ぶ。フィラグリン発現が欠如するか又は少量となる結果を生ずる１個の突然変異対立遺伝子を保有するが１１又は１２個のフィラグリンリピートをコードするもう一方の野生型対立遺伝子を有するヘテロ接合体突然変異被検体は、疾病を発症しないために、又は軽症の疾病しか発症しないために十分なフィラグリンを発現し得る。例えば、１２回リピート対立遺伝子のキャリアは１０回リピートのキャリアよりも２０％多くのフィラグリンを発現し、この発現量の差は疾病の発症に関して有意であり得る。
【００５４】
前述の４塩基欠失（２２８２ｄｅｌ４）はフィラグリンペプチドのＮ末端部位に相当するＮ末端領域とフレームシフト突然変異によって発現した固有のＣ末端領域とを含む固有のペプチドの発現を生ずることが観察された。４塩基欠失を含む突然変異配列から産生したこの固有のペプチドに関しては、特異的な抗体等の適当な結合剤を使用して固有のペプチドを検出することが可能である。このような結合剤／抗体はどれも固有のペプチドに特異的であり、従ってネイティブなフィラグリンペプチドに結合し得ないことが好ましい。
【００５５】
例えば、突然変異配列でコードされる固有のペプチドを組み替えによって又は合成化学を用いて調整し、それに対する抗体を産生することによりモノクローナル抗体等の適した抗体を得る方法は当業者に周知である。このように産生された抗体はその後、それらの特異性を確認するため、前記の固有のペプチドに対して特異的である抗体だけが選択され得るようにスクリーニングされ得る。
【００５６】
このような固有のペプチドに対して特異的に反応性である抗体は任意に標識され、試料中の固有のペプチドの存在を検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る。また、この特異的に反応性である抗体は、検査試料中の任意の前記固有ペプチドを検出するため、ＥＬＩＳＡ等のアッセイにおいて使用され得る。
【００５７】
従って、さらなる局面においては、ＦＬＧ遺伝子突然変異体から発現される突然変異ペプチドを検出する、以下の工程を含む方法が提供される：
ａ）検査される被検体から試料を提供し；そして
ｂ）前記突然変異ペプチドに対し特異的に反応性である結合剤を使用することによって、突然変異ＦＬＧ遺伝子から発現されている突然変異ペプチドの試料中における有無を検出する。
【００５８】
この局面において、試料は好ましくは皮膚組織試料であり得る。典型的には、前記結合剤は抗体、モノクローナル抗体、又はＦａｂフラグメントなどのその断片である。検出は、前記結合剤／抗体／断片に結合した、蛍光、化学発光、生物発光又は放射標識等の標識を検出することによって行われ得る。または、前記結合剤、抗体又は抗体断片は非標識であって、該結合剤、抗体又は抗体断片に対して特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡアッセイ等により検出される。
【００５９】
本明細書に記載される核酸及び変異ペプチド検査は個々に又は同時に行ってよいことを理解されたい。
【００６０】
ＦＬＧタンパク質の機能低下又は部分的喪失をもたらすＦＬＧ遺伝子内の突然変異の同定は、ＩＶ及び／又は他の任意の前述の疾病を遺伝子治療によって予防的に又は治療的に処置する可能性を広げるものである。ＦＬＧ遺伝子の正確な非突然変異コピー（ｃｏｐｙ  ｏｒ  ｃｏｐｉｅｓ）は、患者に存在する変異型のＦＬＧ遺伝子を補完するために用いることが出来る。
【００６１】
このように、さらなる局面においては、医薬製造において、１又は複数コピーのＦＬＧタンパク質をコードし得るＦＬＧ遺伝子配列又はその断片の使用が提供される。該医薬はＩＶ及び／又はアトピー性皮膚炎（湿疹）、喘息、乾癬及びアレルギーを含む疾患の予防的又は治療的処置のために用いることが出来るということが理解される。
【００６２】
本発明は、従って、１又は複数コピーのフィラグリンタンパク質を発現し得る、治療又は予防における使用のためのＦＬＧ遺伝子又はその断片をも提供する。
【００６３】
本研究は、１又は複数コピーのＦＬＧタンパク質を発現し得るＦＬＧ遺伝子配列又はその断片を含んだＤＮＡコンストラクトを前述の疾病を発症した又はし易い患者に投与し、該１又は複数コピーのＦＬＧタンパク質の発現によって該疾病／状態を治療又は改善する、任意の前述の疾病／状態を予防的又は治療的に処置する方法にも及ぶことが好ましい。
【００６４】
典型的には、前記ＦＬＧ配列又はその断片は、患者に投与された際に前記フィラグリンタンパク質を発現させる適当な転写／翻訳調節下の該ＦＬＧ配列又は断片を含んだ組み替え分子の形態で患者に投与される。ＦＬＧ配列又は断片は構成的及び／又は調節可能プロモーター等の適したプロモーターの調節下にあり得ることが好ましい。好都合なプロモーターとしてはネイティブフィラグリンプロモーター、又は適当な後期分化特異的ケラチンプロモーター等が挙げられる。
【００６５】
本発明は従って、治療における使用のためのＦＬＧ配列又はその断片を含む組み替え分子をも提供する。組み替え分子はプラスミド、ファージミド又はウイルスベクターの形態であってもよい。さらに、組み替え的に発現された若しくは化学的に合成されたフィラグリン若しくはプロフィラグリンタンパク質、又はその機能的に重要な断片は、尋常性魚鱗癬及び／又はアトピー性疾患の治療又は予防対策として、生産され、適した軟膏又は他の医薬賦形剤の媒介により皮膚に適用することが出来る。このような処置は皮膚の障壁機能及び／又は保湿性を高め得ることから、美容的にも有用であり得る。フィラグリンは発生初期から毛髪において顕著に発現していることから16、このような処置は、正常な又は低下したフィラグリン発現を示す個体において保湿性等の毛髪の美容的特性をも改善し得る。
【００６６】
遺伝子治療での使用においてはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、リポソーム、ＤＮＡワクチン等を含む多数の様々なウイルス又は非ウイルスベクター及びそれらの送達法が知られている17。
【００６７】
本発明は、
ａ）１又は複数コピーのＦＬＧポリペプチドの発現が、被検体のＦＬＧ遺伝子が１又は複数個の突然変異を含んでいても生じているかどうか決定し；また
ｂ）少なくとも１又は複数コピーのＦＬＧポリペプチドを発現し得るＦＬＧ対立遺伝子を有する被検体の場合、ＦＬＧ発現を増加させようとするためにＵＶ光を用いて被検体を処置する
工程を含む、ＩＶ及び／又は任意の前述の疾病を治療、予防及び／又は改善する方法をも提供する。
【００６８】
目的は皮膚におけるＦＬＧポリペプチドの発現を増加させることである。これはヘテロ接合体被検体、即ちＦＬＧ遺伝子の突然変異コピー１個とネイティブコピー１個とを有する被検体において最も容易に達成され得る。
【００６９】
ＦＬＧ遺伝子の発現はＵＶ光によって誘導されることが知られている18。従って、フィラグリンの機能喪失突然変異のヘテロ接合のコピーを有する個体の皮膚をＵＶ処理すれば正常な対立遺伝子の発現が増加し、それによって有益な効果が生じ得る。
【００７０】
本発明は、ＦＬＧ遺伝子にコードされるＦＬＧタンパク質の機能の喪失又は部分的喪失をもたらすＦＬＧ遺伝子の一方又は両方のコピー内の１又は２個以上の突然変異を有するトランスジェニック非ヒト動物にも関する。望ましくは、該非ヒト動物のＦＬＧ遺伝子は、ＦＬＧ遺伝子に関して非ヒト動物を‘ヒト化’するために、ヒト突然変異型遺伝子と置き換えられてもよい。
【００７１】
本発明のトランスジェニック動物はＩＶ及び／又は本明細書で述べた他の疾病に対する様々な治療法の開発のために使用することが出来、そこには他のタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子薬、化学薬品及び核酸系薬剤を含むがそれらに限定されない、治療効果のある様々な薬剤の同定が含まれる。
【００７２】
非ヒト動物という用語は本明細書においてヒトをのぞく全ての脊椎動物を含むものとして使用される。これはまた、胚や胎児の段階を含めた発生のあらゆる段階にある個々の動物も含む。トランスジェニック動物は、標的組み替え又は組み替えウイルスのマイクロインジェクション若しくは感染等の細胞下レベルの計画的な遺伝子操作により直接又は間接に改変された又は受け入れられた遺伝的情報を有する１又は複数個の細胞を含む、どのような動物でもよい。トランスジェニック動物という用語は古典的な交雑育種又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を含むことを目的としているのではなく、１又は複数個の細胞が組み替えＤＮＡ分子によって改変されている、又は該細胞が該分子を受け入れた動物を指すことを意図している。
【００７３】
ＦＬＧ遺伝子の突然変異型を発現しているトランスジェニック非ヒト動物を作成するために、突然変異ＦＬＧ核酸配列を卵母細胞マイクロインジェクション又は幹細胞へのトランスフェクション若しくはマイクロインジェクションの標準的な手法により該動物の生殖細胞系列に挿入した。好ましくは、内在遺伝子を除いて胚性幹細胞又は胎児線維芽細胞を用いた相同組み替えを適用し得ることが望ましい。
【００７４】
マウスは飼育が容易で比較的安価であり、繁殖が容易なため、トランスジェニック動物モデルによく用いられる。しかし、サル、ヒツジ、ウサギ、イヌ、及びラット等を含むがそれらに限定されない他の非ヒトトランスジェニック哺乳動物も本発明に従って作成され得る。トランスジェニック動物は導入遺伝子；即ち導入され、安定的に組み込まれ、継続的世代にわたって伝わるクローン化遺伝子を有するものである。
【００７５】
例えばマウスにおける卵母細胞インジェクションでは、ＦＬＧをコードする１又は複数コピーの核酸配列が受精直後のマウス卵母細胞の前核に挿入され得る。この卵母細胞は続いて偽妊娠した仮親に再移植される。その後、生きて生まれたマウスは、例えば突然変異ＦＬＧ配列の存在に関する尾部ＤＮＡの分析を用いて組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）のスクリーニングにかけてもよい。
【００７６】
トランスジェニック哺乳動物の作成法は周知であり、例えばＷａｌｌほか（１９９２）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４９（２）：１１３−２０19；  ＭｃＣｒｅａｔｈほか（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：１０６６−１０６９20；Ｌａｉほか（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１０８９−９２21；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにおけるＨｏｇａｎほか（１９８６）22；ＷＯ  ９１／０８２１６又は米国特許第４，７３６，８６６号に記載されている。本明細書に開示されるマウスは無毛又はヌードマウスバックグラウンドと交配させ、皮膚の異常が視認され、疾病の進行及び／又は潜在的な治療のモニタリングが促進されるようすることが出来る。
【００７７】
試験薬剤をＦＬＧ変異トランスジェニック動物に投与し；該薬剤がＩＶ及び／又は前述の任意の他の疾病の少なくとも１つの兆候又は症状を軽減又は抑制するかどうかを測定又は決定し、該試験薬剤がＩＶ及び／又は前述の任意の他の疾病を治療又は予防し得ることの指標とする工程を含む、変異ＦＬＧの発現と関連したＩＶ及び／又は前述の任意の他の疾病を治療又は予防するのに有用な薬剤を同定するためのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ。スクリーニングアッセイの結果はコントロール、即ち試験薬剤を投与されていない動物又は前記疾病の兆候又は症状を減ずることが知られる薬剤を投与した動物と比較することが出来る。該試験薬剤の投与経路は様々であり得る。投与経路としては、経口、経鼻、経直腸、経粘膜、経腸、非経口、静脈、腹腔内、局所等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
実施例セクション
以下、本発明を実施例に基づき、次を示す図を参照しながらより具体的に説明する。
【００７９】
図１に解析したＩＶの家族の家系図を示す。
ここで解析した家族歴が入手可能なＩＶの家族。家族１−３はアイルランド起源、家族４−６はスコットランド起源、及び家族７は米国起源である。加えて、家族歴が入手不可能な８つの独立したＩＶの事例が分析された（図示せず）。後者に関して、１つの事例はアイルランド起源、４つの事例はスコットランド起源、及び３つの事例は米国起源であった。分析した全ての患者は白人（Ｗｈｉｔｅ  Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ）であった。黒塗りの記号は顕著なＩＶ症状を表す；斜行平行線の記号は非常に軽症のＩＶ症状を表す；白抜きの記号はＩＶ表現型が検出されないことを表す。Ｒ５０１Ｘ及び２２８２ｄｅｌ４の２種の突然変異の遺伝子型を示す。ｗｔ／ｗｔはスクリーニングした領域のみを参照したものであり、エクソン３の中央領域における他の配列変化を除外するものではないことに注意されたい。ＩＶ表現型を有しない２人だけがフィラグリン突然変異を有していることが見出された：家族５の、Ｒ５０１Ｘを有する個体ＩＩ−５；家族７の、Ｒ５０１Ｘの絶対保因者である個体ＩＩ−１。これに基づき、ヘテロ接合体における浸透度は〜９０％と見積もられたが、これはおそらく確認バイアスによる過大評価であろう。これらの家族の、どちらか一方のフィラグリン変異をヘテロ接合体又はホモ接合体で保有する多くの個体は、尋常性魚鱗癬に加えアトピー性皮膚炎（湿疹）及び／又は喘息及び／又はアレルギーを示す（図４も参照）。このように、フィラグリン突然変異は個体をこれらの他の疾患に罹りやすくする。
【００８０】
図２にＦＬＧ突然変異の検出及び確認を示す。
（ａ）対応するタンパク質構造を示す注釈を付けたフィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）の概略図。エクソン１は短い５’ＵＴＲ配列からなる。エクソン２、及びエクソン３の５’端は、フィラグリンＮ末端ドメインをコードする。エクソン３の残りは、およそ１ｋｂの１０−１２回リピートからなり、それぞれリンカー配列によって隔てられたフィラグリンペプチドをコードしており、次に短い固有のコード配列及び３’ＵＴＲが続く。表皮の最終分化の際、各プロフィラグリン分子はタンパク質分解により１０−１２コピーのフィラグリンを放出し、これらはケラチン細胞骨格を凝集させ、顆粒細胞を物理的に崩壊させて扁平上皮細胞を形成させる。ここで用いられるＰＣＲ断片、及びエクソン３の第１リピート内の２つのヌル突然変異Ｒ５０１Ｘ及び２２８２ｄｅｌ４の位置を示す。
（ｂ）エクソン３、従って全フィラグリンリピートにわたるゲノムＤＮＡからのロングレンジＰＣＲ産物。
（ｃ）エクソン３のフィラグリン第１リピートからのコドン４９９−５０３に対応する正常な配列。
（ｄ）（ｃ）におけるものと同一のＦＬＧの領域であって、ナンセンス突然変異Ｒ５０１Ｘを生ずるヘテロ接合体の対変異１５０２Ｃ＞Ｔを示すもの。
（ｅ）（ｃ）に見られるものと同一のＦＬＧの領域であって、ナンセンスコドンＲ５０１Ｘを生ずるホモ接合体の突然変異を示すもの。
（ｆ）家族３の複数のメンバーからの突然変異Ｒ５０１ＸのＮｌａＩＩＩ制限消化による確認及び２２８２ｄｅｌ４のＤｒａＩＩＩ制限消化による確認。
（ｇ）エクソン３のフィラグリン第１リピートからの正常な配列で、コドン７１３−７１７に該当するもの。
（ｈ）（ｆ）におけるものと同一のＦＬＧの領域であって、２２８２ｄｅｌ４のヘテロ接合体欠失突然変異による重複ピークを示すもの。
（ｉ）（ｆ）におけるものと同一のＦＬＧの領域であって、突然変異２２８２ｄｅｌ４を確認する突然変異クローンから得られたもの。この突然変異は１０７ｂｐ下流に中途終止コドンをもたらし、翻訳をフィラグリン第１リピート内で終止させる。
【００８１】
図３にフィラグリンヌル尋常性魚鱗癬の形態学的特徴を示す。
（ａ）正常（非魚鱗癬）コントロールからの皮膚生検。ホルムアルデヒド固定・パラフィン包埋組織のヘマトキシリン・エオジン染色は表皮表面の顆粒細胞層における顕著なケラトヒアリン顆粒を示す（矢印）。
（ｂ）ＦＬＧ遺伝子がナンセンス突然変異Ｒ５０１Ｘのホモ接合である家族４における発端者からの皮膚生検。（ａ）に見られる正常コントロールとは対照的に、表皮上面のケラトヒアリン顆粒が完全に欠如している。最上部の生存層に見られる変成核（矢印）によって、これが通常ケラトヒアリン顆粒の見られる領域であることが分かる。
（ｃ）正常個体からの顆粒層と角質層との境界上のケラチノサイトの透過型電子顕微鏡写真は顕著なケラトヒアリン顆粒（アローヘッド）を示す。Ｎ＝核；Ｋ＝角質層の角化物質。元の倍率＝〜５，６００×。
（ｄ）ＦＬＧ遺伝子がナンセンス突然変異Ｒ５０１Ｘのホモ接合である家族４における発端者からの顆粒層細胞の透過型電子顕微鏡写真。ケラトヒアリン顆粒が完全に欠如している（*）。コントロール（Ｋ）と比較して角質層が完全には角化しておらず、表皮障壁の異常が示される。Ｎ＝核。元の倍率＝〜５，６００×。
（ｅ）ホルムアルデヒド固定・パラフィン包埋組織の抗フィラグリンリピートモノクローナル抗体１５Ｃ１０（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社）を用いた免疫組織化学的染色であって、免疫ペルオキシダーゼ法で可視化されたもの。正常コントロールからの皮膚生検材料では、ケラトヒアリン顆粒は表皮の上部基底上層において強く染色される（矢印）。
（ｆ）家族４における発端者からの皮膚生検材料の免疫ペルオキシダーゼ染色においては、抗フィラグリンリピートモノクローナル抗体１５Ｃ１０（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社）で上部基底上層に全く染色が見られない（矢印）。これはＲ５０１Ｘがホモ接合である患者においてフィラグリンペプチドが産生されないことを示すものであり、第１フィラグリンリピート内のナンセンス突然変異と矛盾しない。
（ｇ）プロフィラグリンのＮ末端ドメイン内のエピトープに対するポリクローナル抗体Ｂ１を用いた、正常コントロール個体からの皮膚生検材料の免疫ペルオキシダーゼ染色。ケラトヒアリン顆粒の顕著な染色を示す（矢印）。
（ｈ）家族４における発端者からの皮膚生検材料の、プロフィラグリンＮ末端抗体Ｂ１による免疫ペルオキシダーゼ染色。顆粒の染色は見られないが、フィラグリンリピートエピトープ（ｆ）とは異なり、残留染色の拡散像がある。これは通常プロフィラグリンが発現している上部基底上細胞においてより顕著であるが（矢印）、それに加え、表皮全体にわたってパッチ状に拡散した細胞質の染色がある（アローヘッド）。この抗体のエピトープは突然変異の上流にあることから、これはＲ５０１Ｘホモ接合体においてプロフィラグリンの短くなった断片が合成されていることを示す。
【００８２】
図４にフィラグリンリピートの全長配列を示し、発明者らによって同定された突然変異の位置及びここで同定された特異的プライマーが結合する位置を示す。これらの特異的プライミングサイトは、発明者らによって同定された新奇のさらなるリピートを含む個々のフィラグリンリピートのアラインメントの分析によって同定された。
【００８３】
図５にＩＶの家族の家系図及び対応するアトピーの遺伝を示す。
図６はフィラグリン変異型がアトピーの強さに関与することを示すグラフである。
図７はフィラグリン突然変異のキャリアでは陽性アレルゲンの数が増加することを示すグラフである。
図８は年上の喘息患者においてフィラグリン変異型が湿疹のより強いリスク因子となることを示すグラフである。
図９は、ａ）正常コントロール及びＲ５１０Ｘ／Ｒ２４４７Ｘ遺伝子型を有するＩＶ患者からの皮膚生検材料の免疫染色；ｂ）正常コントロール及びＲ５１０Ｘ／Ｒ２４４７Ｘ並びにＲ５１０Ｘ／Ｒ５１０Ｘ遺伝子型を有するＩＶ患者からの皮膚生検タンパク質抽出物のイムノブロッティングを示す。
図１０はＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子にコードされるプロフィラグリンタンパク質の模式図である。
【００８４】
図１１にＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子ＦＬＧ8+のＤＮＡ配列を示す；
図１２にＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子ＦＬＧ10+のＤＮＡ配列を示す；並びに
図１３にＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子ＦＬＧ8+10+からの断片の配列を次の注釈と共に示す：
注釈付き配列−交互式に太字テキストでリピートを示す。
*＝このフィラグリンリピート配列に特異的な固有の塩基対
Ｎ＝ただ１個の他のフィラグリンリピート配列とのみ共有される塩基対。数Ｎ。
Ｎ*＝リピートＮにおける近傍の相違により、基本的に特異的である塩基対。
【実施例】
【００８５】
方法
罹患者及び表現型
血液試料はＩＶを有する１５家族及び民族的に一致する正常コントロールから、ヘルシンキ合意の原則に従うインフォームドコンセントに基づいて得た。
【００８６】
ＦＬＧエクソン３に対するロングレンジＰＣＲ
プライマーＦｉｌＬＲ２Ｆ（＋鎖）５’  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＣ  ３’及びＦｉｌＬＲ１Ｒ（−鎖）５’  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＡＣ  ３’を使用し、フィラグリン遺伝子の約１２ｋｂ（エクソン３、従って全リピートドメインを含む）を、ゲノムＤＮＡから、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、英国イーストサセックス）を用いて増幅した。‘ホットスタート’を、１Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。反応物は次の延長されたＰＣＲプログラムにより増幅した：（９２℃  ５分間×１）；（９２℃  １０秒間、４９℃  ３０秒間、６８℃  ６分間）×１０；（９２℃  １０秒間、４９℃  ３０秒間、６８℃  ６分間プラス１０秒間の増分／サイクル）×２８；及び（６８℃  １０分間）×１。
【００８７】
Ｒ５０１Ｘ突然変異分析
Ｒ５０１Ｘの突然変異分析用に、約１．５ｋｂを増幅する短いＰＣＲ断片が設計された。プライマーＦｉｌＦ３（＋鎖）５’  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  Ｇ  ３’及びＲＰＴ１Ｐ６（−鎖）５’  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＡＴＴ  ３’を、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４％  ＤＭＳＯ及び１Ｕ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  耐熱ＤＮＡポリメラーゼミックス（Ｒｏｃｈｅ社）を含むＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ社）中で用いた。反応物は次の条件下で増幅した：（９４℃  ５分間×１）；（９４℃  ３０秒間、５７℃  １分間、７２℃  ２分間）×３０；及び（７２℃  ５分間）×１。突然変異Ｒ５０１Ｘでは新たなＮｌａＩＩＩ制限酵素サイトが創られる；これを突然変異の確認とコントロール試料のスクリーニングとに用いた。プライマーＦｉｌＨ１Ｆ３（＋鎖）５’  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  Ａ  ３’及びＲＰＴ１Ｐ６（上記）を用い、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４％  ＤＭＳＯ及び１Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含んだＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して３１２ｂｐのゲノムＤＮＡを増幅した。反応物は次の通り増幅した：（９４℃  ５分間×１）；（９４℃  ３０秒間、５８℃  ４５秒間、７２℃  １分間）×３０；及び（７２℃  ５分間）×１。ＰＣＲ産物を５Ｕ  ＮｌａＩＩＩで４時間３７℃にて消化した。消化物は３％アガロースゲル上で分離した。
【００８８】
２２８２ｄｅｌ４突然変異分析
８１１ｂｐのゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲ断片をＲＰＴ１Ｐ７（＋鎖）５’  ＡＡＴ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ３’及びＲＰＴ２Ｐ１（−鎖）５’  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  Ｔ  ３’を用いて、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４％  ＤＭＳＯ及び１Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含んだＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して増幅した。ＰＣＲ増幅条件は：（９４℃  ５分間×１）；（９４℃  ３０秒間、５７℃  ４５秒間、７２℃  １分３０秒間）×３５；及び（７２℃  ５分間）×１であった。突然変異２２８２ｄｅｌ４では新たなＤｒａＩＩＩ制限酵素サイトが創られ、これをこの突然変異について試料をスクリーニングするのに用いた。ＰＣＲ産物を５Ｕ  ＤｒａＩＩＩで４時間３７℃にて消化した。消化物は２％アガロースゲル上で分離した。ヘテロ接合体個体からのＰＣＲ断片をベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。クローンをＤｒａＩＩＩ消化によってスクリーニングし、４ｂｐ欠失を確認するためにシーケンスした。
【００８９】
組織学及び電子顕微鏡検査
ルーチン的なヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を、各試料の形態学的特徴を評価するために行った。凍結及びパラフィン包埋切片の免疫ペルオキシダーゼ染色では、Ｅｎｖｉｓｉｏｎシステム（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社、デンマーク）を用いた。使用した抗体はヒトフィラグリンリピートユニットのＣ末端部位内のエピトープに対するマウスモノクローナル１５Ｃ１０（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社、英国ニューカッスルアポンタイン）及びプロフィラグリンのＮ末端に対するウサギポリクローナル抗血清Ｂ１であった23。透過型電子顕微鏡法では、患者からの皮膚試料を半分の濃度のＫａｒｎｏｖｓｋｙ固定液（２．５％グルタルアルデヒド及び２％ホルムアルデヒド）中で固定し、その後１．３％四酸化オスミウム中で固定し、先の記載24に大部分従って標準的な方法を用い処理した。
【００９０】
ロッドスコアの算出
ロッドスコアは、ヘテロ接合体が９０％の浸透度の軽症の表現型と指定され、ホモ接合体又は複合ヘテロ接合体が１００％の浸透度の重症の表現型と指定された疾病の不完全優性モデルを使用し、ＬＩＮＫＡＧＥバージョン５．１のＭＬＩＮＫアルゴリズムにより、算出した。突然変異対立遺伝子の合計頻度は０．０３７と推定された（表１）。ヘテロ接合体において５０％浸透度で再計算しても、θ＝０で７．０８という高度に有意な最大合計ロッドスコアを示した。
【００９１】
ＦＬＧは３つのエクソンからなる25,26。エクソン１（１５ｂｐ）は５’ＵＴＲ配列のみからなり、エクソン２（１５９ｂｐ）は開始コドンを含む。エクソン３は著しく長く（１２，７５３ｂｐ）、Ｎ末端ドメインの大部分と全フィラグリンリピートとをコードする（図２ａ）。フィラグリンリピートの数は１０から１２と集団内で変異する6。リピート間のＤＮＡレベルでのホモロジーはおよそ１００％であるため、このエクソンの内部領域の通常のＰＣＲを基盤としたシーケンシングはほとんど不可能である。エクソン１又は２には５つのＩＶの家族において配列変化が見られなかった。本願発明者らはエクソン３、従って全リピートドメインをカバーする１２ｋｂのゲノム断片を増幅するロングレンジＰＣＲの条件を開発した（図２ｂ）。この断片の全長シーケンシングは進行中であるが、初期のシーケンシングにより、ホモ接合体ナンセンス突然変異Ｒ５０１Ｘがリピート１の最初の部分の近傍にあることが家族１からの３人の罹患個体において示された（図２ｃ−ｅ）。より短いＰＣＲ断片を用いてＲ５０１Ｘの分離が家族１において確認され、さらにこの突然変異は解析された他の１４個体のＩＶの親族において同定された。この突然変異は新たなＮｌａＩＩＩ制限酵素サイトを生成する；これを用いて突然変異を確認し、集団をスクリーニングした（図２ｆ）。この方法により、該突然変異はアイルランド人、スコットランド人及び北米白人（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｕｃａｓｉａｎ）集団中に比較的高頻度で存在することが見出された（合計頻度０．０２７；表１参照）。
【００９２】
３つの家族においては、極めて顕著な表現型を示すＩＶ患者はＲ５０１Ｘのホモ接合体であった（図１）。他の家族や独立した事例では、顕著なＩＶ表現型はＲ５０１Ｘのヘテロ接合体であることが見出された。これらの事例のさらなるシーケンシングにより、第２の突然変異、２２８２ｄｅｌ４がエクソン３内に明らかになった（図２ｇ−ｉ）。これは１０７ｂｐ下流に中途終始コドンをもたらし、Ｒ５０１Ｘと同様にタンパク質翻訳を第１フィラグリンリピート内で終止させる（図２ａ）。突然変異２２８２ｄｅｌ４はＤｒａＩＩＩ制限酵素サイトを生成し、これがＩＶの家族及びコントロール試料のスクリーニングに用いられた（図２ｆ；表１）。該突然変異は解析したＩＶの家族の１０個体において分離された。家族歴が入手不可能であった８つの‘散発性の’臨床的に有意なＩＶの事例のうち、４例がＲ５０１Ｘにおいてホモ接合であり、残る４例がＲ５０１Ｘ／２２８２ｄｅｌ４複合ヘテロ接合体であった。興味深いことに、先にＦＬＧ遺伝子座と有意に関連していると報告されている27米国の家族の一部が、エクソン３の分析に必要な新たに得た高品質ＤＮＡを用いて分析された。家族７における重症の罹患個体はＲ５０１Ｘ／２２８２ｄｅｌ４の複合ヘテロ接合体であり（図１）、先の報告にある連鎖データ27と矛盾しない。遺伝の不完全優性様式は、非常に軽い症状と同時にＲ５０１Ｘホモ接合体及びＲ５０１Ｘ／２２８２ｄｅｌ４複合ヘテロ接合体の完全なＩＶ表現型の例もあるＩＶ患者の複数の例が見られる家族１において最も典型的に例示される。一連の分析された家族において、２個体だけがヌル突然変異（ともにＲ５０１Ｘ）のヘテロ接合であり、明確な表現型を有しなかった（家族５及び７；図１）。これらの少ない数からすると、ヘテロ接合体における浸透度は約９０％のように思われるが、これは確認バイアスによる過大評価であろう。米国、アイルランド及びスコットランドの白人における２２８２ｄｅｌ４の対立遺伝子頻度は〜０．０１と見られた（表１）。決定した対立遺伝子頻度を用い、軽症罹患ヘテロ接合体及び重症罹患ホモ接合体を想定すると、家族１−７に対する最大合計２ポイントロッドスコア（図１）はθ＝０で８．１１であった。
【００９３】
Ｒ５０１ホモ接合体からの皮膚生検材料（発端者、家族４）を、組織学的及び超微細構造的分析にかけた。従来の組織学により顆粒層が無い（図３ａ＆ｂ）ことが、及び電子顕微鏡法によりケラトヒアリンが完全に欠如していること（図３ｃ＆ｄ）が示された。免疫組織化学では、全フィラグリンリピートペプチドに保存されているエピトープが完全にＲ５０１ホモ接合体において欠如していることが示された（図３ｅ＆ｆ）。対照的に、フィラグリン第１リピート上流の配列にコードされるプロフィラグリンＮ末端ドメイン内のエピトープは、異常な拡散的な分布ではあるが、まだ存在していた（図３ｇ＆ｈ）。Ｒ５０１Ｘ／２２８２ｄｅｌ４複合ヘテロ接合体の免疫組織化学的分析では同様な結果が生じた（図示せず）。このことで、Ｒ５０１Ｘ又は２２８２ｄｅｌ４のどちらもがフィラグリンペプチド産生の完全な喪失を示し、従って機能的にこれらはヌル対立遺伝子であることが確認される。
【００９４】
プロフィラグリンはケラトヒアリン顆粒の主要な成分であるため、これはＩＶのより重症な事例と関連する顆粒層の欠如を説明する27（図３）。ＩＶの表皮において短くなったプロフィラグリンペプチドが存在する（図３ｂ）ことは、固有のＮ末端ドメイン及び少量のフィラグリン配列を含んだペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定であることを示した先の研究と矛盾しない23。正常な表皮においては、Ｎ末端のＣａ2+結合ドメインは前駆タンパク質転換酵素によってプロフィラグリンから開裂し、続けて核を含む様々な細胞内区画に局在化する28,29。短くなったペプチドに対しＩＶの表皮において同様な過程が生じていると考えられる。
【００９５】
本明細書において、発明者らは、３つの白人集団でＩＶがＦＬＧにおける主に２つの高頻度のヌル突然変異によって引き起こされ、フィラグリン産生の喪失と欠陥的表皮障壁形成をもたらすことを示した。分析されたＩＶの家族においては、ほとんどのＲ５０１Ｘ突然変異はＦＬＧのイントロン２内にある同一の１５６ｂｐのマイクロサテライトの対立遺伝子と連鎖不平衡を示し（不掲載データ）、ヒトの進化期間においてこれらが古くからの突然変異であることが示唆される。ＦＬＧ近傍の多型のさらなる分析により突然変異のおよその古さが決定されるであろう。遺伝的浮動はなぜこれらの突然変異がそれほど一般的になったのかを説明するであろう。あるいは、ヘテロ接合体優位がこれらの対立遺伝子の高い頻度を説明するかもしれない。一つの明白な仮説は、欠陥的障壁形成によってバクテリア又は他の抗原への暴露が増加し、より大きな先天性免疫をもたらすということである。この‘自然皮膚予防接種’により、汎流行性伝染病又は他の病原体による攻撃を受けた際にヘテロ接合体の方がより生き残り易いのかもしれない。これはｆｔマウス12又は人工フィラグリンヌルマウスを用いて検証可能である。
【００９６】
ＩＶの遺伝様式及び発症に関して；本明細書内のケースのように、非常に微妙なヘテロ接合体表現型は、おそらく特に探さない限りは臨床的に注目されることはあまりないであろう。〜０．０３７の合計ヌル対立遺伝子頻度（表１）及び顕著なヘテロ接合体表現型を仮定すると、１４人中１人がＩＶを有することになり、これは事実と明らかに異なる。この対立遺伝子頻度では、７３０人に１人がホモ接合又は複合ヘテロ接合であり、顕著なＩＶを有することになる。ヘテロ接合体表現型が微妙であることは、不完全な浸透度及び季節変化2と相まって、おそらく２５０人に１人という発生率1を説明するであろう。これらの高い突然変異対立遺伝子頻度からすると、ＩＶの家族もまた頻繁に優性の又は偽優性の遺伝を低い浸透度とともに有するようである（図１）。サザン分析によって、フィラグリンリピートの数における多型がヒト（１０−１２リピート）6及びマウス（１２−２０リピート）30で示されている。発明者らもロングレンジＰＣＲを用いてこのサイズ変異を観察し、より長い変異対立遺伝子の配列を決定した（下記）。ヌル突然変異のヘテロ接合体はもう一方の対立遺伝子上に伸長したエクソン３を有し、突然変異の全体的な影響を減少させるかもしれない。これは、家族５及び７に見られる表現型的に正常なヘテロ接合体を説明するかもしれない（図１）。比較的高い集団内頻度により、フィラグリンヌル突然変異はそれ自体が先天性魚鱗癬、ネザートン症候群又は基底上ケラチンの異常による疾病等の、家族内及び家族間の表現型変異がよく記載されている他の魚鱗癬様皮膚状態における修飾因子であり得る31-34。ＩＶのアトピー体質への関与はよく立証されている；ＩＶの人々のうち３７−５０％がアトピー性疾患を有し1,36、また逆に約８％のアトピー性皮膚炎患者がＩＶの古典的特徴を有する1,35。このように、フィラグリンは主要な遺伝要素を有することが知られる非常に一般的な皮膚疾患における要因であり得る。
【００９７】
調査したＩＶの家族のうち、多くのフィラグリンヌル又はヘテロ接合個体もアトピー性皮膚炎（ＡＤ；‘湿疹’）及び／又は喘息を有していた。図５に、３／６のフィラグリンヌルヘテロ接合体及び５／５のホモ接合体がアトピー性疾患を有していた例を示す。発明者らは、従って、喘息と関連する一般的なアトピーにおけるこれらの変異体の役割を試験しようと試みた。疾病状態不明な８００人の学童のコホート（集団コホート）及び医師により診断されたＤｕｎｄｅｅ  ＢＲＥＡＴＨＥ研究からの喘息の５５０人の学童並びに青年において遺伝子型を同定した。学童において、Ｒ５０１Ｘのキャリアの頻度は５．２％、２２８２ｄｅｌ４の変異型は３．６％で存在し、合計キャリア頻度は８．８％であった。両者のフィラグリン変異型は喘息コホートにおいて大きな比率を占め、どちらの対立遺伝子のキャリアも優性のリスクを示した（表２；合計遺伝子型ＯＲ＝１．９４  ９５％ＣＩ＝１．３５−２．８０、ｐ＝０．０００５）。両者の変異型のホモ接合体が喘息コホートにおいて観察され、２つの複合ヘテロ接合体も観察された。ＡＤは喘息と相互に関連することが知られており1,36、またフィラグリンは主要な表皮構造タンパク質であるため、ＡＤ／喘息とフィラグリン異常との強い相関が期待される。これに一致して、フィラグリンヌル対立遺伝子を保有する喘息コホートの全児童の７５％がＡＤを有しており、これはこれらのフィラグリン変異型を有しない児童の４６．７％のみに対し対照的である（表３；ＯＲ＝２．８１  ９５％ＣＩ＝１．６４−４．８１、ｐ＝０．０００１）。リスクは動物に日常的にさらされる個体に主に見られることから、この観察はアレルゲンへの暴露と相関があるようである（ＯＲ  ５．２  ９５％ＣＩ＝２．３６−１１．５０、ｐ＝０．０００００６）。
【００９８】
これらのデータは、障壁機能の異常がアレルギーに対しより大きなリスクをもたらし得るということを示唆した。この仮説は、喘息を有する、有意に大きな数の児童が、もし彼らがフィラグリンヌル変異型を保有していた場合、アレルギー検査についてアレルギークリニックへ問い合わせをしたことがあるという観察によって指示された（ＯＲ＝１．７８  ９５％ＣＩ＝１．０８−２．９５、ｐ＝０．０３４）。さらに重要なことには、検査したヌル変異型を有する全個体（ｎ＝２０）が少なくとも１つのアレルゲンに体して陽性であったのに対し、検査した５６個体の非キャリア個体のうち２６個体がアレルゲンに対し陰性であった（ｐ＝０．００００６）。この特筆すべきアトピー表現型は、コホートのアトピーの度合いの定義を増やすと共にヌル変異型のキャリアの頻度が系統的に増加するという結果をもたらし（図６）、喘息、ＡＤ及び免疫学的に確認されたアレルギーを有する全個体の４６．７％がフィラグリンヌル変異型（Ｎ＝７５）を有した。この群において、該変異型はさらに陽性アレルゲンの数の増加とも関係しており、ヌル変異型キャリアのアレルゲンの平均数は野生型個体ものよりも大幅に大きい（図７）。これは、一般的な複合アトピー性疾患のかなりの部分がフィラグリン遺伝子の変異型の単一のペアによって説明できることを示している。それら両者の変異型の集団キャリア頻度（〜９％）を考えると、これらの観察はアトピーの理解に対して非常に大きな影響があり、喘息及びアレルギーに対する新奇な治療法の開発をもたらし得る。喘息及びアレルギーは青年期には弱まることがあり、小児期のアトピーの一時性の特徴は‘アトピーマーチ（ａｔｏｐｉｃ  ｍａｒｃｈ）’として知られている。ここに発明者らは、フィラグリンリピートがハプロ不全である個体は持続性のアトピーの集団を代表し、ここで観察された湿疹のリスクは喘息コホートにおいて年齢と一致して増加し、アトピーマーチと矛盾がないことを示す（図８）。
【００９９】
ナッツ及び食物アレルギー
喘息コホートをピーナッツ及び／又は他のナッツ類に対しアレルギーが記録されている人々について分析した。２３個体がナッツアレルギーを有することが判明しており、これらのうち８個体がフィラグリンヌル突然変異（２２８２ｄｅｌ４又はＲ５０１Ｘのどちらか）を保有しており、すなわち３５％がキャリアであった。集団コントロールコホートにおいては、６２１個体のうち６０個体、すなわち９．７％がフィラグリンヌル突然変異を保有していた。従って、フィラグリン突然変異キャリア頻度は喘息及びナッツアレルギーを示す人々で著しく増加している。フィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）では０．０００８の両側Ｐ値が示され、これは極めて有意であると考えられる（オッズ比＝５．５２０  ９５％ＣＩ  ２．２４８−１３．５５４）。このように、フィラグリン突然変異はナッツアレルギー及び喘息に対し高度に有意なリスク因子である。加えて、アトピーは食物アレルギー、特に牛乳、鶏卵、バナナ、キウイ、ホワイトフィッシュ、小麦、プローン／シュリンプ及びイチゴ類のものと強い相関を示す37-39。ナッツアレルギーは食物アレルギーの最も信頼できるマーカーと見なされるため、フィラグリン突然変異が一般的に食物アレルギーと相関していることがこれによって強く推定される。
【０１００】
ＦＬＧの包括的な突然変異検出法
任意のフィラグリンリピートに完全に特異的であることが詳細な配列アラインメントによって決定されていた塩基上で終わるプライマーを用いて、または一部のケースにおいては２つのフィラグリンリピートのみによって共有されている塩基上で終わるプライマーを用いて、ＦＬＧ遺伝子のエクソン３に全体にわたって広がる、一連の重なり合ったＰＣＲ断片が生成された。これらの断片を前記増幅プライマー及び／又は同様に固有の塩基上で終わる内部プライマーを用いて完全にシーケンシングした。一部の個体においては、１塩基多型の同定により、重なり合うＰＣＲ断片が両者の対立遺伝子を増幅したことが明らかになり、このシーケンシング方法の特異性及び有用性が示された。この方法を用いて、ホモ接合又は複合ヘテロ接合の突然変異を予測させる重症のＩＶ表現型を示す個体をシーケンシングした。これらの患者は主にアイルランド人及びスコットランド人、さらに少数のオランダ人及びオーストリア人の個体を含んだヨーロッパ集団からであった。多数の機能喪失変異が同定され、これらは全てナンセンス突然変異又はフレームシフト突然変異のいずれかとして中途終止コドンをもたらすものであった。多くのケースでは、これらはより一般的な突然変異Ｒ５０１Ｘ又は２２８２ｄｅｌ４とトランス（ｔｒａｎｓ）に遺伝した。具体的には、これらのさらなる突然変異は、アイルランド人及びスコットランド人患者における３７０２ｄｅｌＧ（第３リピート）、Ｒ２４４７Ｘ（第７リピート）、Ｓ３２４７Ｘ（第９リピート）、Ｒ１４７４Ｘ（第４リピート）、Ｑ１７４５Ｘ（第４リピート）、Ｑ３６８３Ｘ（第１０リピート）、１１０２９ｄｅｌＣＡ（第１０リピート）；オランダ人患者におけるＥ２４２２Ｘ（第６リピート）、５３６０ｄｅｌＧ（第５リピート）、７２６７ｄｅｌＣＡ（第７リピート）並びに１１０３３ｄｅｌ４（第１０リピート）；及びオーストリア人患者における６８６７ｄｅｌＡＧ（第６リピート）であった。これらのさらなる３’突然変異を保有する患者のＩＶ表現型は第１リピートにＲ５０１Ｘ又は２２８２ｄｅｌ４突然変異を保有する患者のものと基本的に区別できなかった。従って、基本的にプロフィラグリン分子のどこにある中途終止コドン突然変異も類似又は同等の病原性を有するようである。次の突然変異はヨーロッパ集団において時折及び／又は頻繁に見られた：Ｒ５０１Ｘ、２２８２ｄｅｌ４、３７０２ｄｅｌＧ、Ｒ２４４７Ｘ及びＳ３２４７Ｘ。オランダ人及びオーストリア人の突然変異は１８８個体のアイルランド人ＡＤ患者には検出されず、集団特異的又は非常に稀であると考えられる。残りの変異型は罹患率について調査を行わなかった。
【０１０１】
ＦＬＧエクソン３の３’側半分における突然変異は基本的に機能ヌル対立遺伝子（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｕｌｌ  ａｌｌｅｌｅｓ）である。
このさらなる３’突然変異の生化学的な影響を決定するため、生検材料を複合ヘテロ接合体遺伝子型Ｒ５０１Ｘ／Ｒ２４４７Ｘの２個体の患者から得た。フィラグリンリピートドメインに対するＮｏｖｏｃａｓｔｒａ  １５Ｃ１０抗体による皮膚切片の免疫染色においては、この患者は表皮上面に識別可能であるが非常に限局的な顆粒細胞層を有することが示された（図９Ａ）。この生検からのタンパク質抽出物を用いた、イムノブロッティングのより定量的な技法によると、非常に少量の短くなったプロフィラグリン分子しか発現しておらず、また重要なことに、これは成熟したフィラグリンへとプロセッシングされていなかった（図９Ｂ）。基本的に同一の結果がＲ５０１Ｘ／１１０３３ｄｅｌ４複合ヘテロ接合体について得られた（図示せず）。このように、さらなる３’ＦＬＧ突然変異は短くなったプロフィラグリンの著しく減少した発現をもたらし、成熟したフィラグリンの完全な喪失をもたらす。従ってこれらは基本的にフィラグリンの機能ヌル対立遺伝子（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｕｌｌ  ａｌｌｅｌｅｓ）である。
【０１０２】
ＦＬＧ遺伝子のさらなる３’リピート及び第１リピートにおける突然変異はＡＤに対する素因となる
中程度−重症のＡＤを示す１８８個体のアイルランド人の小児科事例のコホートを、この集団で頻繁に及び／又は時折見られる５つの突然変異Ｒ５０１Ｘ、２２８２ｄｅｌ４、３７０２ｄｅｌＧ、Ｒ２４４７Ｘ及びＳ３２４７Ｘについて遺伝子型を同定した。対立遺伝子頻度の比較を、同じ５つのＦＬＧ変異型について遺伝子型を同定した任意抽出の７３６個体のアイルランド人コントロール集団に対して行った。ピアソンカイ二乗分析により、５つの突然変異全てが独立にＡＤ表現型と相関していることが示され、個々に統計的に有意な＜０．０５のＰ値を示した（表４）。全５遺伝子型のデータをまとめると、２．１２×１０-51という極めて有意なＰ値が得られた。ＡＤコホートにおける約４８％の患者が前記５個のフィラグリン変異型のうち１又は複数個を保有していた。従って、広範なＦＬＧ突然変異がアトピーに対する遺伝的素因の原因となっており、これが早発性の中程度−重症ＡＤにおける主要な遺伝子である。
【０１０３】
非ヨーロッパ人集団においては異なる範囲のＦＬＧ突然変異がアトピーに対する素因となる
ヨーロッパ人特異的な突然変異Ｒ５０１Ｘ及び２２８２ｄｅｌ４は２５３人の日本人個体では見られなかった。従って、ＦＬＧ遺伝子を、ＩＶを示す４つの日本人家族においてシーケンシングし、２つの新奇突然変異３３２１ｄｅｌＡ及びＳ２５５４Ｘを同定した。
【０１０４】
これらのヌルＦＬＧ突然変異について１４３個体の日本人ＡＤ患者をスクリーニングしたところ、６患者（４．２％）におけるＳ２５５４Ｘ、及び２患者（１．４％）における３３２１ｄｅｌＡを含む、８人（５．６％）のＡＤ患者においてそれらが同定された。両者のヌル変異型は１５６個体の日本人の非アトピー及び非魚鱗癬コントロールにおいて存在せず、ＦＬＧ突然変異とＡＤとの間に統計的に有意な相関を示した（カイ二乗Ｐ値  ０．００１５）。
【０１０５】
このように、非ヨーロッパ集団（このケースでは日本人）においては、異なるセットの頻繁に及び／又は時折見られるＦＬＧ突然変異が存在し、アトピーに対する遺伝的素因の原因となっているようである。他のヒト集団はそれらに特有のＦＬＧ突然変異の範囲を有しているように思われる。
【０１０６】
フィラグリン遺伝子（ＦＬＧ）のサイズ変異型
ヒト集団においてはＦＬＧ遺伝子のエクソン３にサイズ変異が見られることがこれまでに報告されており、これらの変異型対立遺伝子はそれらのサイズを基に、２つの部分リピートに加えて１０、１１又は１２個の全長フィラグリンリピートからなると予測されていた（Ｇａｎほか、１９９０）40。しかし、ＦＬＧ遺伝子エクソン３内のこれらの挿入位置、及びこれらのさらなるフィラグリンリピートをコードする正確なＤＮＡ配列は未知のままであった。
【０１０７】
第７リピート及び第１１リピートに位置する特異的ＰＣＲプライマーを用い、ＤＮＡ断片を親族ではない個体から生成した。この断片はＦＬＧ遺伝子の公開配列（ヒトゲノム、２００６年３月のアセンブリ、ｈｇ１８）から、〜４．２ｋｂのサイズであると予測された。便宜上、この対立遺伝子をＦＬＧNと呼ぶ。一部の個体において、〜５．２及び／又は〜６．２ｋｂのさらなるバンドが観察された。これらの長い対立遺伝子をプラスミドベクターｐＣＲ３．１にクローニングし、これら変異型対立遺伝子の全長シーケンシングを行った。これにより、一部の個々の対立遺伝子が第８リピートの重複を含んでいることが分かり、ＦＬＧ8+と命名された。一方の対立遺伝子は基本的に第１０リピートの重複を含むものからなっており、ＦＬＧ10+と命名された。この対立遺伝子上の両者の第１０リピート配列のコピーは、公開されたゲノム配列から多少の配列分化が見られた。同様に、ＦＬＧ8+対立遺伝子上の２つの第８リピートのコピー間でも、より少ない数の配列の相違があった。一部の個体においては、重複した第８リピートと重複した第１０リピートとを含むより長い対立遺伝子が存在しており、ＦＬＧ8+10+と命名された。サイズ変異型を、ＦＬＧNと表示されたｈｇ１８ゲノムデータベース配列と比較して、図１０に図式的に示す。これらの対立遺伝子の重複領域の未加工の配列を図１１−１３に示す。ここで生成した全新奇配列データを代表する完全に注釈を付けたＦＬＧ8+10+の配列を、これまでに知られている、及び新奇のフィラグリンリピート配列の位置と共に図１３に示す。
【０１０８】
これらのさらなるリピート配列を、全ての存在するフィラグリンリピートとアラインメントすることにより、特異的増幅、シーケンシング及び突然変異の検出をこれらの新奇対立遺伝子内において可能にする多数のプライマーサイトが同定された。これらの特異的塩基上で終わるフォワード及びリバースプライマーを配列番号４９４−５３９として配列表に列挙する。これらのプライマーの長さは変わり得るが、それでもプライマーの３’末端がこれらの特異的塩基上で終わっているか又はそれらに非常に近接している場合、特異的ＰＣＲ増幅、シーケンシング及び突然変異分析を可能にするものであることが分かる。重複したリピート領域内の特異的塩基は図１３においても注釈されている。
【０１０９】
尋常性魚鱗癬及び／又はアトピー性疾患を示す一部の個体は、これらの新たなサイズ変異型対立遺伝子を構成する新たに識別された配列内に機能喪失変異を保有している場合があることが分かる。また、サイズ変異は機能喪失又は他の突然変異をＦＬＧ遺伝子内に保有しているヘテロ接合キャリアの表現型を調節し得る：すなわち、Ｒ５０１Ｘ突然変異のヘテロ接合キャリアは第１０、第１１又は第１２フィラグリンリピートのいずれかをコードする第２の野生型対立遺伝子を保有し得ることも分かる。ヘテロ接合の野生型対立遺伝子のサイズは観察される表現型に影響を与えうる：例えば、１２回反復（ＦＬＧ8+10+）対立遺伝子のキャリアは１０回反復の野生型対立遺伝子をトランス（ｔｒａｎｓ）に保有するＲ５０１Ｘのキャリアよりも２０％多いフィラグリンを発現するであろうことが分かる。従って、これらのサイズ変異型の検出は尋常性魚鱗癬及びアトピー性疾患において予後判定に有用であり得る。
【０１１０】
参考文献
1.Wells, R.S. and Kerr CB, Br Med J., 1:947-949 (1966).
2.Judge, M.R., McLean, W.H.I. & Munro, C.S. Disorders of keratinization. in Rook's Textbook of Dermatology, Vol. 2 (eds. Burns, T., Breathnach, S., Cox, C. & Griffiths, C.) 34.54-34.56 (Blackwell Scientific Publishing, Oxford, 2004).
3.Steinert, P.M., Cantieri, J.S., Teller, D.C., Lonsdale-Eccles, J.D. & Dale, B.A. Characterization of a class of cationic proteins that specifically interact with intermediate filaments. Proc Natl Acad Sci 78, 4097-4101 (1981).
4.Dale, B.A., Resing, K.A. & Lonsdale-Ecccles, J.D. Filaggrin : a keratin filament associated protein. Ann. NY Acad. Sci. 455, 330-342 (1985).
5.Listwan, P. & Rothnagel, J.A. Keratin bundling proteins. Methods Cell Biol 78, 817-27 (2004).
6.Gan, S.Q., McBride, O.W., Idler, W.W., Markova, N. & Steinert, P.M. Organization, structure, and polymorphisms of the human profilaggrin gene. Biochemistry 29, 9432-40 (1990).
7.Candi, E., Schmidt, R. & Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol 6, 328-40 (2005).
8.Fleckman, P., Holbrook, K.A., Dale, B.A. & Sybert, V.P. Keratinocytes cultured from subjects with ichthyosis vulgaris are phenotypically abnormal. J Invest Dermatol 88, 640-5 (1987).
9.Pena Penabad, C. et al. Differential patterns of filaggrin expression in lamellar ichthyosis. Br J Dermatol 139, 958-64 (1998).
10.Sybert, V.P., Dale, B.A. & Holbrook, K.A. Ichthyosis vulgaris: identification of a defect in synthesis of filaggrin correlated with an absence of keratohyaline granules. J Invest Dermatol 84, 191-4 (1985).
11.Nirunsuksiri, W., Zhang, S.H. & Fleckman, P. Reduced stability and bi-allelic, coequal expression of profilaggrin mRNA in keratinocytes cultured from subjects with ichthyosis vulgaris. J Invest Dermatol 110, 854-61 (1998).
12.Presland, R.B. et al. Loss of normal profilaggrin and filaggrin in flaky tail (ft/ft) mice: an animal model for the filaggrin-deficient skin disease ichthyosis vulgaris. J Invest Dermatol 115, 1072-81 (2000).
13.Lane, P.W. Two new mutations in linkage group XVI of the house mouse. Flaky tail and varitint-waddler-J. J Hered 63, 135-40 (1972).
14.Rothnagel, J.A. et al. Characterization of the mouse loricrin gene: linkage with profilaggrin and the flaky tail and soft coat mutant loci on chromosome 3. Genomics 23, 450-6 (1994).
15.Sambrook & Russel; "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", (2000); Cold Spring Harbor Laboratory Press.
16.Dale BA, Holbrook KA, Kimball JR, Hoff M, Sun TT., Expression of epidermal keratins and filaggrin during human fetal skin development., J Cell Biol. 1985 Oct; 101(4):1257-60.
17.Gene Therapy (2004) 11, S57  63.
18.Lee DS, Quan G, Choi JY, Kim SY, Lee SC.Chronic ultraviolet radiation modulates epidermal differentiation as it up-regulates transglutaminase 1 and its substrates. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2005 Feb;21(1):45-52.
19.Wall, et al. (1992) J. Cell Biochem. 49(2): 113-20.
20.McCreath, et al. (2000) Nature 405: 1066-1069.
21.Lai, et al. (2002) Science 295: 1089-92.
22. Hogan, et al. (1986) In: Manipulating the mouse embryo.  A Laboratory Manual.  Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
23.Pearton, D.J., Dale, B.A. & Presland, R.B. Functional analysis of the profilaggrin N-terminal peptide: identification of domains that regulate nuclear and cytoplasmic distribution. J Invest Dermatol 119, 661-9 (2002).
24.Eady, R.A.J. Transmission electron microscopy. in Methods in Skin Research (eds. Skerrow, D. & Skerrow, C.J.) 1-36 (John Wiley & Sons, Chichester, 1985).
25.Presland, R.B., Haydock, P.V., Fleckman, P., Nirunsuksiri, W. & Dale, B.A. Characterization of the human epidermal profilaggrin gene. Genomic organization and identification of an S-100-like calcium binding domain at the amino terminus. J Biol Chem 267, 23772-81 (1992).
26.Markova, N.G. et al. Profilaggrin is a major epidermal calcium-binding protein. Mol Cell Biol 13, 613-25 (1993).
27.Compton, J.G., DiGiovanna, J.J., Johnston, K.A., Fleckman, P. & Bale, S.J. Mapping of the associated phenotype of an absent granular layer in ichthyosis vulgaris to the epidermal differentiation complex on chromosome 1. Exp Dermatol 11, 518-26 (2002).
28.Presland, R.B. et al. Evidence for specific proteolytic cleavage of the N-terminal domain of human profilaggrin during epidermal differentiation. J Invest Dermatol 108, 170-8 (1997).
29.Ishida-Yamamoto, A., Takahashi, H., Presland, R.B., Dale, B.A. & Iizuka, H. Translocation of profilaggrin N-terminal domain into keratinocyte nuclei with fragmented DNA in normal human skin and loricrin keratoderma. Lab Invest 78, 1245-53 (1998).
30.Rothnagel, J.A. & Steinert, P.M. The structure of the gene for mouse filaggrin and a comparison of the repeating units. J. Biol. Chem. 265, 1862-1865 (1990).
31.Bale, S.J., Compton, J.G., Russell, L.J. & DiGiovanna, J.J. Genetic heterogeneity in lamellar ichthyosis. J Invest Dermatol 107, 140-1 (1996).
32.Bitoun, E. et al. Netherton syndrome: disease expression and spectrum of SPINK5 mutations in 21 families. J Invest Dermatol 118, 352-61 (2002).
33.Smith, F.J.D. et al. Genomic organization and fine mapping of the keratin 2e gene (KRT2E): K2e V1 domain polymorphism and novel mutations in ichthyosis bullosa of Siemens. J. Invest. Dermatol. 111, 817-821 (1998).
34.McLean, W.H.I. et al. Mutations in the rod 1A domain of keratins 1 and 10 in bullous congenital ichthyosiform erythroderma (BCIE). J. Invest. Dermatol. 102, 24-30 (1994).
35.Tay, Y.K., Khoo, B.P. & Goh, C.L. The epidemiology of atopic dermatitis at a tertiary referral skin center in Singapore. Asian Pac J Allergy Immunol 17, 137-41 (1999).
36.Koukkanen K., Ichthyosis vulgaris.  A clinical and histopathological study of patients and their close relatives in the autosomal dominant and sex-linked forms of the disease.  Acta Derm Venereol Suppl (Stockh).  1969;62:1-72.
37.Werfel T, Breuer K., Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2004 Oct; 4(5): 379-85.  Role of food allergy in atopic dermatitis.
38.Sicherer S.H., Sampson H.A., J. Allergy Clin Immunol. 1999 Sep; 104 (3 Pt 2): S114-22.  Food hypersensitivity and atopic dermatitis: pathophysiology, epidemiology, diagnosis and management.
39.Ellman L.K., Chatchatee P., Sicherer S.H. & Sampson H.A.  Pediatr Allergy Immunol. 2002 Aug; 13(4): 205-8.  Food hypersensitivity in two groups of children and young adults with atopic dermatitis evaluated a decade apart.
40.Gan S.Q., McBride O.W., Idler W.W., Markova N., Steinert P.M.  Organization, structure, and polymorphisms of the human profilaggrin gene.  Biochemistry 1990; 29: 9432-40.
【０１１１】
【表１】
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ＦＬＧ突然変異Ｒ５０１Ｘ及び２２８２ｄｅｌ４の対立遺伝子頻度
【０１１２】
【表２】
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小児喘息コホートにおいてはＲ５０１Ｘ及び２２８２ｄｅｌ４の両者が大きな比率を占める。
【０１１３】
【表３】
2009523411.tif 000005
フィラグリン変異型を有する及び有しない喘息小児の特徴
【０１１４】
【表４】
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５種のＦＬＧ突然変異に関するケースコントロール相関研究（ｃａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）（１８８個体のアイルランド人ＡＤ患者対７３６個体のアイルランド人集団コントロール）
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】解析したＩＶの家族の家系図を示す。
【図２】ＦＬＧ突然変異の検出及び確認を示す。
【図３】フィラグリンヌル尋常性魚鱗癬の形態学的特徴を示す。
【図４】フィラグリンリピートの全長配列を示し、発明者らによって同定された突然変異の位置及びここで同定された特異的プライマーが結合する位置を示す。
【図５】ＩＶの家族の家系図及び対応するアトピーの遺伝を示す。
【図６】フィラグリン変異型がアトピーの強さに関与することを示すグラフである。
【図７】フィラグリン突然変異のキャリアでは陽性アレルゲンの数が増加することを示すグラフである。
【図８】年上の喘息患者においてフィラグリン変異型が湿疹のより強いリスク因子となることを示すグラフである。
【図９】ａ）正常コントロール及びＲ５１０Ｘ／Ｒ２４４７Ｘ遺伝子型を有するＩＶ患者からの皮膚生検材料の免疫染色；ｂ）正常コントロール及びＲ５１０Ｘ／Ｒ２４４７Ｘ並びにＲ５１０Ｘ／Ｒ５１０Ｘ遺伝子型を有するＩＶ患者からの皮膚生検タンパク質抽出物のイムノブロッティングを示す。
【図１０】ＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子にコードされるプロフィラグリンタンパク質の模式図である。
【図１１】ＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子ＦＬＧ８＋のＤＮＡ配列を示す。
【図１２】ＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子ＦＬＧ１０＋のＤＮＡ配列を示す。
【図１３】ＦＬＧのサイズ変異型対立遺伝子ＦＬＧ８＋１０＋からの断片の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図４−１４】
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【図４−１５】
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【図４−１６】
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【図４−１７】
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【図４−１８】
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【図４−１９】
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【図４−２０】
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【図４−２１】
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【図４−２２】
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【図４−２３】
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【図４−２４】
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【図４−２５】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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