(57)【要約】【課題】新規な因子Ｈの精製方法の提供。【解決手段】血漿の寒冷型沈降物の上澄を調製してアニオン交換ゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供し、非保持フラクションをヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含むゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供し、その後非保持フラクションのｐＨを調整し、ヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含むクロマトグラフ担体ゲル／樹脂へＨ因子を結合させ、ゲル／樹脂の平衡化用バッファよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させ、溶出フラクションを希釈し、強酸性のカチオン交換ゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供し、ゲル／樹脂の平衡用バッファのよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させ、溶出フラクションを希釈し、強酸性のアニオン交換ゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供し、ゲル／樹脂を洗浄し、Ｈ因子を溶出させ、Ｈ因子の濃縮物を調製するステップを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の治療用薬剤の調製のための、因子Ｈの使用。
【請求項２】
前記薬剤が、典型的な形のＨＵＳの治療を目的とするものである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記薬剤が、非典型的な形のＨＵＳの治療を目的とするものである、請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記因子Ｈが、凍結された新鮮な血漿から、又は血漿分画から精製される、請求項１から３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
前記因子Ｈが、細菌、酵母、菌類又は哺乳類の細胞からなる群から選択される細胞において、因子Ｈの遺伝子を発現させることによって、遺伝子工学的に調製される、請求項１から３のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が、冷凍乾燥形態で調製される、請求項１から５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、少なくとも１つの感染源を除去又は不活性化する少なくとも１つの工程に供される、請求項１から６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が、ウイルスを不活性化するための少なくとも１つの工程に供される、請求項１から７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
因子Ｈ、並びに薬理学的に許容できる賦形剤及び／又は担体を含んでなる、ウイルスを不活性され、冷凍乾燥させた医薬組成物。
【請求項１０】
以下のステップを含んでなる、因子Ｈの精製方法：
１）血漿の寒冷型沈降物の上澄を調製するステップと、
２）この上澄をアニオン交換体タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
３）非保持フラクションをヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含有するゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
４）ステップ（３）のクロマトグラフィの後、非保持フラクションのｐＨを調整し、ヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含有するクロマトグラフ担体ゲル／樹脂へＨ因子を結合させるステップと、
５）ゲル／樹脂の平衡化用バッファよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させるステップと、
６）溶出フラクションを希釈し、更にそれを強酸性のカチオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
７）ゲル／樹脂の平衡用バッファのよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させるステップと、
８）溶出フラクションを希釈し、更にそれを強酸性のアニオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
９）ゲル／樹脂を洗浄し、Ｈ因子を溶出させるステップと、
１０）Ｈ因子の濃縮物を調製するステップ。
【請求項１１】
ステップ３のヘパリンタイプのグラフト化されたリガンドを含有するクロマトグラフ担体が、ヘパリンセファロースゲル／樹脂である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ステップ４のヘパリンタイプのグラフト化されたリガンドを含有するクロマトグラフ担体が、ヘパリンセファロースゲル／樹脂である、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
ステップ６の強酸性のカチオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィが、ＳＰセファロースタイプのクロマトグラフィである、請求項１０から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ステップ８の強酸性のアニオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィが、ＱセファロースＦＦタイプ、又はそれと同等のゲル／樹脂を用いたクロマトグラフィである、請求項１０から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ステップ４の非保持フラクションのｐＨが、ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲、好ましくはｐＨ６．０に調整される、請求項１０から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
ステップ８で希釈されたフラクションのｐＨが、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の範囲に調整される、請求項１０から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
請求項１０から１６のいずれか１項記載の方法によって得られる因子Ｈ濃縮物。
【請求項１８】
補体の活性化の不十分な制御に起因する疾患の治療に用いられる、請求項１０から１６のいずれか１項記載の方法によって得られる因子Ｈ濃縮物。
【請求項１９】
溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の治療に用いられる、請求項１０から１６のいずれか１項記載の方法によって得られる因子Ｈ濃縮物。
【請求項２０】
非典型的な形の溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の治療に用いられる、請求項１０から１６のいずれか１項記載の方法によって得られる因子Ｈ濃縮物。
【請求項２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおける補体の活性制御のための、請求項１０から１６のいずれか１項の方法によって得られる因子Ｈ濃縮物の使用。
【請求項２２】
補体の活性化の不十分な制御に起因する疾患の治療用若しくは予防的治療用の薬剤の調製への、請求項１０から１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた因子Ｈ濃縮物の使用。
【請求項２３】
溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の治療用若しくは予防的治療用の薬剤の調製への、請求項１０から１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた因子Ｈ濃縮物の使用。
【請求項２４】
非典型的な形の溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の治療用若しくは予防的治療用の薬剤の調製への、請求項１０から１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた因子Ｈ濃縮物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結された新鮮な血漿から、溶血性尿毒症症候群（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  Ｕｒｅｍｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＨＵＳ））の治療用の薬剤を調製するための因子Ｈの使用、因子Ｈの精製方法、並びに当該方法によって得られた因子Ｈの提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）は、微小血管症性溶血性貧血、血小板減少症及び腎性疾患に関連する症状として知られている。またそれは３歳未満の児童の急性腎不全の主要な原因でもある。
【０００３】
ＨＵＳには、２つの形式が存在する。ＨＵＳの典型的な形式としては、夏期における、血痕下痢の発症後に生じるＨＵＳが挙げられる。典型的にはＨＵＳは感染症の後に発症し、ほとんどのケースでは、腸管病原性大腸菌（特にＯ−１５７：Ｈ７、ベロ毒素の産生株）による感染症の後に発症する。
【０００４】
一方、ある特定の患者では、典型的な形式とは異なる症状を示す場合もある。ＨＵＳの非典型的な形式では、発症前の前駆症状が見られず、慢性的に病状が進行し、しばしば慢性腎不全に至る。典型的なＨＵＳはあらゆる年齢層においても発症しうる。その場合、児童におけるＨＵＳの発症率は５％に留まる。その症候群の臨床徴候は、小血管内における血小板立地な微小血塊の形成に起因する。これは特に急性腎疾患を発症させている腎臓の糸球体に影響を及ぼす。ＨＵＳは典型的には散発的に発症するが、しばしば家族性である場合もある。これらの両方の症状においても、当該疾患は通常、増悪によって再発するおそれがある。その予後は不良である。更に、腎移移植後においては当該疾患が再発するリスクが高く、ほとんどの場合移植の拒絶反応に至る。
【０００５】
ＨＵＳは、低補体血症を伴う場合もある。補体は、生物体を感染源から防御する際、また炎症プロセスにおいて不可欠な役割を果たす。それは、多種類の細胞表面マーカー（それらのうちの幾つかは炎症細胞に存在し、その他のものは免疫系細胞に存在する）、並びに宿主細胞を自己免疫から保護する膜における制御タンパク質の両方の血漿タンパク質を含む。補体の血漿タンパク質は合計で約２０存在し、酵素として、結合タンパク質として、又はレギュレータ（阻害物質又は活性化物質）として機能する。補体は２つの異なるルート（すなわち従来のルート及び代替のルート、図１参照）により活性化されうる。
【０００６】
図１中、酵素的なステップを太い矢印で示す。調節タンパクを枠で示す。膜タンパク質を太字で示し、循環タンパク質をイタリックで示す（そこには因子Ｈ（ＦＨ）が含まれる）。
【０００７】
従来のルートは、外来の粒子と結合する抗体によって活性化される。ゆえにそれは抗体依存性といえる。
【０００８】
代替のルートは、微生物の侵入によって活性化される、ゆえにそれは抗体非依存性であり、宿主を細菌感染症から防御する際に極めて重要である。
【０００９】
因子Ｈは、１１０〜６１５μｇ／ｍＬの濃縮で血漿中に存在する１５５ｋＤａのタンパクである。因子Ｈは肝臓、マクロファージ、繊維芽細胞、内皮細胞及び血小板において合成される。分泌型のタンパク質は、２０の繰り返し単位からなる６０アミノ酸からなる。因子Ｈは補体の代替のルートにおいて中心となるレギュレータである。それは血液中における免疫複合体の形成又は解離速度を制御し、それにより、かかるプロセスにおける平衡状態が調節される。
【００１０】
因子Ｉと共に、因子Ｈは、遊離型若しくは細胞表面結合型のＣ３ｂ分子を不活性化する。それにより、抗原抗体複合体からなる免疫複合体（Ｃ３ｂ補体の構成成分と複合体を形成する）はもはや、それに続く補体（構成成分Ｃ５からＣ９）のカスケードを活性化することができなくなる。
【００１１】
因子Ｈの機能は、主に以下の３つに分類することができる。
１）第一に、Ｈ因子は因子Ｉの補因子として挙動する。それにより、因子Ｈ及び因子ＩはタンパクＣ３ｂの切断を生じさせることにより、補体のＣ３ｂタンパクをＣ３ｂｉ（非活性分子）に変化させる。生じる不活性タンパクＣ３ｂは補体においてもはやその機能を発揮できなくなり、Ｃ３コンベルターゼの形成にもはや関与しなくなる。
２）第二に、Ｈ因子は内皮細胞及び血小板への結合機構に関与する。
３）第三に、Ｈ因子は補体活性化の代替のルートにおいて、予備成形されたＣ３コンベルターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）の解離に関与する。この最後の活性は、因子Ｈの分子的整合性に直接依存し、特に因子Ｈにおける無傷のａｓｎ３２３−ａｓｎ３２４結合の存在に依存することを示すものである。
【００１２】
すなわち、因子Ｈの欠損症又は欠如（非典型的なＨＵＳの多くの症例に起因する）によって、補体の活性過剰が生じる（腎生検の間のＣ３タンパクの堆積、及び血流中に存在するＣ３タンパク質レベルの減少により、特定の患者において観察される症状）。
【００１３】
非典型的なＨＵＳに罹患する特定の患者における低いＣ３レベルは、疾患の急性期においてのみ観察される。特定の非典型的なＨＵＳの病態における、しばしば低いＣ３レベルと関連する質的及び量的な因子Ｈの欠如の果たす役割に関しては、これまで活発な議論なされている（非特許文献１）。
【００１４】
Ｈ因子欠損症は、低レベルのＣ３の原因となる代替的な補体ルートを半永久的に活性化させる原因ともなる。
【００１５】
非典型的なＨＵＳと、補体（特に因子Ｈ）の調節タンパクのコーディング部位との関連を示す証拠が、１番染色体上で発見されている（非特許文献２から４）。
【００１６】
また、因子Ｈ遺伝子の突然変異が、劣性若しくは優性の常染色体遺伝による、家族性ＨＵＳとして同定されている（非特許文献５から８）。
【００１７】
非典型的なＨＵＳに罹患する患者の、移植後における再発率は約２５％と言われている。再発する場合の予後は悪く、再発に関連して移植片に対する拒絶が通常生じる。
【００１８】
（従来技術）ＨＵＳにおける補体の役割が公知となる以前から既に、血漿交換の有無を問わない、凍結させた新鮮な血漿を用いた灌流処理が、１９７０年代から行われている。今日、血漿交換の有無を問わない、凍結させた新鮮な血漿を用いた灌流処理が、ＨＵＳ治療において一般的に行われている。しかしながら、凍結させた新鮮な血漿の灌流量及び灌流頻度は、未だ経験則に頼っているのが実情である。
【００１９】
これらの灌流の適用は、２週間〜１ヵ月に２回、定期的に反復させ、各灌流の適用の際は２〜３時間実施する必要がある。
【００２０】
ゆえに、この処理は患者にとって長時間の、反復的な処理を強いるものとなる。
【００２１】
また、使用される凍結された新鮮な血漿量は多量であるため、凍結された新鮮な血漿を灌流に適用する際の標準リスクを増加させる。
【００２２】
第１に、凍結された新鮮な血漿（ＦＦＰ）は抗Ａ又は抗Ｂヘモリシンを含有し、それは同じＡＢＯ型の患者、あるいは少なくともヘモリシンに対応する抗原Ａ又はＢを欠損する患者において保持されなければならない（赤血球の血液適合性とは反対）。これらの要因を考慮に入れなければ、輸血後、受容者側において、ＡＢＯ式適合性における不適合による赤血球の溶血を生じさせることもありうる。
【００２３】
更に、Ｒｈｅｓｕｓシステムの抗原Ｄに対する同種免疫のいかなるリスクをも回避する目的で、特にリスクの大きい患者（少女、出産期の年齢の女性、多くの輸血を受けている患者）において灌流適用を実施する必要があり、その際、患者及びドナーはこの抗原のレベルで同じ特性を有する必要がある。
【００２４】
第２に、ＦＦＰのリン酸濃度（特にｉｎ  ｖｉｒｏで弱毒化された血漿（ＶＡＰ）における）が非常に高い（９〜１２ｍｍｏｌ／ｌ）ため、ＦＦＰによりＨＵＳ患者におけるリン酸過剰血症が生じ、また当該ＨＵＳ患者は腎機能不全に罹患することとなる。ＶＡＰ中の高いリン酸濃度（高リン酸血症）は、ＶＡＰの輸血を受ける患者において生じると考えられ、その原因して主なものとしては、−輸血されるＶＡＰの体積が多量であること、−毎日反復輸血されること、−患者が既に腎機能不全に罹患していること、−患者が既に高リン酸血症に罹患していること、が挙げられる。
【００２５】
次に、灌流適用されたＦＦＰの量によっては、タンパクの過剰及び／又はクエン酸の過剰が生じ、それにより循環カルシウムの濃度が減少する。
【００２６】
最後に、ＦＦＰによってアレルギー、及び感染源の侵入のリスクが生じる。実際、現在行われている検出及び不働化方法は、潜在的に凍結された新鮮な血漿に存在する感染源の検出及び除去を可能にするための充分な感度及び能力を必ずしも有しているわけではない。
【００２７】
灌流適用された体積が、利尿によって排出され、通常の動脈圧が維持されるにはあまりに大きい場合、凍結された新鮮な血漿灌流適用と血漿交換との組み合わせは重要である。しかしながらこの組み合わせは、主に血管への介入（中枢ルートが必要）、ロード量の過多、アナフィラキシー反応、凝血塊の問題及びウイルス性疾患の感染などの新たなリスクを生じさせるものである。
【００２８】
更に、血漿交換法は幼児に適用するのが困難である。
【００２９】
他の治療方法としては、腎臓移植が挙げられる。しかしながら、移植後の再発リスクが非常に高い。
【００３０】
更に、ａＨＵＳ患者（非典型的なＨＵＳ）の腎移植後の診断は困難なことが多い。すなわち、再発であるのか、あるいは急性の血管拒絶反応又は移植片のバイオプシーにおける慢性拒絶反応であるのかを識別するのが困難であることが多い。
【００３１】
再発の治療方法としては、凍結された新鮮な血漿の灌流適用や、血漿灌流適用の有無にかかわらない血漿交換法などが挙げられるが、その結果を予測することは不可能に近い。これらの予測不可能な結果の原因としては、ＦＦＰ灌流適用の回数及び量が挙げられ、すなわち、各灌流適用が同種のバッチ由来ではなく、幾つかのドナー由来の血漿の集積物由来であることが主な原因である。
【００３２】
因子Ｈは肝臓で合成されるため、肝臓移植又は肝臓−腎臓の複合移植が提唱されることは一見合理的であるようにも思える。しかしながらかかる移植は、常に内科医及び両親による困難な選択を必要とし、また操作上のリスク及び肝臓移植による拒絶反応のリスクを伴うものである。
【非特許文献１】Ｒｏｕｇｉｅｒ  Ｎ，Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅ  ＭＤ，ら、Ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９８、９：２３１８−２３２６
【非特許文献２】Ｎｏｒｉｓら、Ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉａ  ｄｉｓｃｌｏｓｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９９，１０：２８１−２９３
【非特許文献３】Ｗａｒｗｉｃｋｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎｔｏ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，１９９８、５３：８３６−８４４
【非特許文献４】Ｗａｒｗｉｃｋｅｒら、Ｆａｍｉｌｉａｌ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９９９、１４：１２２９−１２３３
【非特許文献５】Ｂｕｄｄｌｅｓら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００、６６：１７２１−１７２２
【非特許文献６】Ｃａｐｒｉｏｌｉら、Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ  ｇｅｎｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｈｏｔ  ｓｐｏｔ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔ  ２０，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００１、１２：２９７−３０７
【非特許文献７】Ｏｈａｌｉら、Ｈｙｐｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｍｉｃ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｗｉｔｈ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９８、１２：６１９−６２４
【非特許文献８】Ｙｉｎｇら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９９、６５：１５３８−１５４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
従来技術のこれらの欠点を克服するべく、発明者らによる鋭意研究の結果、驚くべきことに、ＨＵＳの治療薬の製造に因子Ｈが利用できることを見出した。因子Ｈ、例えば凍結させた新鮮な血漿に由来する因子Ｈ濃縮物を用いることにより、注入体積及び注入時間を減少させつつ、ＨＵＳに罹患する患者の因子Ｈの欠損症を、安全かつ安定的に治療することが可能となる。特に、肝臓移植の直後の期間に因子Ｈを投与することによって、移植された肝臓における低い因子Ｈ産生を補填し、それにより移植片における症状の再発及び拒絶反応を防止することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明はまた、以下のステップを含んでなる因子Ｈの精製方法の提供に関する。
１）血漿の寒冷型沈降物の上澄を調製するステップと、
２）この上澄をアニオン交換体タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
３）非保持フラクションをヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含有するゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
４）ステップ（３）のクロマトグラフィの後、非保持フラクションのｐＨを調整し、ヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含有するクロマトグラフ担体ゲル／樹脂へＨ因子を結合させるステップと、
５）ゲル／樹脂の平衡化用バッファよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させるステップと、
６）溶出フラクションを希釈し、更にそれを強酸性のカチオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
７）ゲル／樹脂の平衡用バッファのよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させるステップと、
８）溶出フラクションを希釈し、更にそれを強酸性のアニオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
９）ゲル／樹脂を洗浄し、Ｈ因子を溶出させるステップと、
１０）Ｈ因子の濃縮物を調製するステップ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の主要な目的は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）（特に典型的な形式のＨＵＳ又は非典型的な形式のＨＵＳ）の治療用薬剤の製造への因子Ｈの使用方法の提供である。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態は、溶血性尿毒症症候群の治療用薬剤を調製するための因子Ｈの使用であり、当該因子Ｈは、新鮮なヒト血漿から精製されたものであるか、又は当業者に公知の標準的な方法による精製物に由来する血漿のフラクションである。この精製方法は当業者に公知である。例えば、リシン−セファロース、ＱＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−トヨパール、セファクリルＳ−３００及びヒドロキシアパタイトのカラムを用いたクロマトグラフィなどが挙げられる。その詳細は、以下の文献に記載されている：Ｆｅａｒｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９，１２４８−１２５２（１９７７）、Ｃｒｏｓｓｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９１，１７３−１８２（１９８０）、Ｎａｇａｓａｗａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２５，５７８−５８２（１９８０）、Ｗｅｉｌｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７３，３２６８−３２７２，（１９７６）及びＷｈａｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４４，１１４７−１１６３（１９７６）。凍結された新鮮な血漿からの精製により得た因子Ｈは例えば、因子Ｈ濃縮物の形で得られる。
【００３７】
本発明の他の実施形態は、溶血性尿毒症症候群の治療用薬剤を調製するための因子Ｈの使用であり、当該因子Ｈは、細菌、酵母、菌類又は哺乳類細胞からなる群から選択される細胞内でその遺伝子を発現させる、遺伝子工学的方法によって得られる。
【００３８】
本発明の具体的実施形態は、溶血性尿毒症症候群の治療用薬剤を調製するための因子Ｈの使用であり、上記のように得られた薬剤は、冷凍乾燥させた形態である。
【００３９】
本発明の更なる実施形態は、溶血性尿毒症症候群の治療用薬剤を調製するための因子Ｈの使用であり、上記のように得られた薬剤を、少なくとも１つの感染源を除去するか又は不活性化するための少なくとも１つのプロセスに供することを特徴とする。感染源としては、ウイルス及び特殊伝達病因（ＮＣＴＡ）（例えばプリオンタンパク）などが挙げられる。
【００４０】
特に、当該薬剤を、ウイルス的に不活性化させるのが好ましい。「ウイルスを不活性化する」とは、当該薬剤を、化学物質（例えば溶剤／洗浄剤）、及び／又は熱（例えば乾熱滅菌又は殺菌処理）、及び／又はナノ濾過などの、当業者に公知の少なくとも１つのウイルス不活性化方法に供することを意味する。これらのいずれかの方法で不活性化できるウイルスとしては、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｂ１９パルボウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ブタパルボウイルス、ポリオウイルス、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）などが挙げられる。
【００４１】
本発明の別の目的は、冷凍乾燥され、ウイルスを不活性化された、上記の実施形態に係る医薬組成物であり、因子Ｈ、並びに薬理学的に許容できる賦形剤及び／又は担体を含んであることを特徴とする。
【００４２】
本発明の別の目的は、以下のステップを含んでなる、因子Ｈの精製方法に関する：
１）血漿の寒冷型沈降物の上澄を調製するステップと、
２）この上澄をアニオン交換体タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
３）非保持フラクションをヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含有するゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
４）ステップ（３）のクロマトグラフィの後、非保持フラクションのｐＨを調整し、ヘパリンタイプのグラフト化リガンドを含有するクロマトグラフ担体ゲル／樹脂へＨ因子を結合させるステップと、
５）ゲル／樹脂の平衡化用バッファよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させるステップと、
６）溶出フラクションを希釈し、更にそれを強酸性のカチオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
７）ゲル／樹脂の平衡用バッファのよりもイオン強度の強いバッファでＨ因子を溶出させるステップと、
８）溶出フラクションを希釈し、更にそれを強酸性のアニオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィに供するステップと、
９）ゲル／樹脂を洗浄し、Ｈ因子を溶出させるステップと、
１０）Ｈ因子の濃縮物を調製するステップ。
【００４３】
本発明の具体的実施形態では、ステップ３における、ヘパリンリガンドがグラフト化されているクロマトグラフ保持体は、セファロースヘパリンゲル／樹脂である。
【００４４】
本発明の具体的実施形態では、ステップ４における、ヘパリンリガンドがグラフト化されているクロマトグラフ保持体は、セファロースヘパリンゲル／樹脂である。
【００４５】
本発明の具体的実施形態では、ステップ６における、強酸性のカチオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィは、ＳＰセファロースタイプのクロマトグラフィである。
【００４６】
本発明の具体的実施形態では、ステップ８における、強酸性のアニオン交換タイプのゲル／樹脂上のクロマトグラフィは、ＱセファロースＦＦタイプのクロマトグラフィ又はその均等物である。
【００４７】
好適には、ステップ４の非保持フラクションのｐＨを、ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲、好ましくはｐＨ６．０となるように調整する。
【００４８】
好適には、ステップ８の希釈されたフラクションのｐＨを、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の範囲に調整する。
【００４９】
本発明の精製方法は、血漿に由来する因子Ｈを精製するための、工業的実用化の可能な唯一の方法であると考えられ、当該方法により、精製された因子Ｈ濃縮物を、化学物質若しくは合成プロテアーゼに対する阻害剤の非存在下で得ることが可能となり、それにより、これらの阻害剤が最終生産物中に検出されることはなくなる。
【００５０】
実際、現在行われているヒト血漿から因子Ｈを精製する方法は基礎研究において用いられるが、それは沈殿精製技術（例えばＰＥＧ、硫酸アンモニウム沈殿）及びプロテアーゼインヒビターを使用して実施されることが多いため、産業的な実施が困難なことが多い。これらのプロテアーゼインヒビターは、因子Ｈの分子内のアスパラギン３２３及びアスパラギン３２４のアミノ酸間の結合を切断する役割を果たすトリプシンタイプのタンパク質（血清及び血漿に存在）の活性を阻害する。したがって、プロテアーゼインヒビターの添加により、この因子のタンパク質分解の減少、及びその安定性の向上に関与する。しかしながら、プロテアーゼインヒビターは毒性化合物であることが多く、治療用途に用いる因子Ｈの産業的な調製方法へのその使用は不適当である。
【００５１】
更に、本発明の方法は、得られる因子Ｈの濃縮物では、主要な３タイプの活性が保持されるという利点を有し、一方現在行われている技術で得られる因子Ｈは、かかる活性が保持されない。本発明の方法によって得られた因子Ｈは、補体の代替ルートにおける中心的な制御活性（ＨＵＳ、特に非典型的なＨＵＳに罹患する患者に不足すると考えられる活性）を発揮することができる。特に、本発明の方法によって調製される因子Ｈは、補体の代替ルートにおいても、予備成形されたＣ３コンベルターゼを分離させる活性を保持しており、ＨＵＳの治療の際に、その最大限の機能活性で使用することができる。
【００５２】
更なる本発明の方法によって調製される因子Ｈ濃縮物は１付近の比活性（ＡＳ＝０．８〜０．９）を有し、凍結された新鮮な血漿の溶液（ＡＳ＝０．００８）よりも高い効果を有するものの、本願明細書の冒頭で説明したように、治療効果は若干あっても、多くの不利益をもたらすこともある。これらの不利益としては、血漿の投与により、ＨＵＳを治療するための不必要な更なるタンパク質（アルブミン、フィブリノーゲンなど）が生体内に導入され、それは一方では、タンパクの過剰ロードに起因する望ましくない反応の誘導や、又は「血清病」として公知のアレルギー反応の誘導の原因ともなる。
【００５３】
最後に、血漿に存在する感染性のウイルスの不活性化は、血液製剤中に存在するウイルスの不活性化のために通常用いられる方法よりも通常困難であり、実用的でない。しかしながら、本発明の方法によって調製された因子Ｈ濃縮物は、定式化されている試験済みの方法により、ウイルス安全性を担保することができる。
【実施例】
【００５４】
＜実施例１＞：因子Ｈの精製方法：
因子Ｈの精製に適用した方法を、図２に図式的に示す。
【００５５】
ヒトの凍結された新鮮な血漿を１℃〜６℃の温度で融解させ、寒冷型沈降物を遠心沈降に供し、寒冷型沈降物の不溶性画分と血漿上澄画分とを分離させた。
【００５６】
得られた寒冷型沈降物の血漿上澄（因子Ｈ濃縮物、約４００〜約５００ｍｇ／Ｌの濃度で因子Ｈを含有）を、アニオン交換体タイプの樹脂／ゲル（例えばＤＥＡＥセファデックスタイプのゲル／樹脂）を用いたクロマトグラフィに供し、樹脂／ゲル上のこれらの因子を保持させ、血漿上澄からビタミンＫに依存する形で因子を分離させた。
【００５７】
非保持の血漿上清画分（フラクションＡ）（因子Ｈ濃縮物、約４００〜約５００ｍｇ／Ｌで因子Ｈを含有）を更に、ヘパリンセファロースＦＦタイプのゲル／樹脂上のアフィニティークロマトグラフィに供し、樹脂／ゲル中に抗トロンビンＩＩＩを保持させ、抗トロンビンＩＩＩをこのフラクションＡから分離させた。
【００５８】
この非保持フラクションＡ（フラクションＢ）（因子Ｈ濃縮物、約３００〜約４００ｍｇ／Ｌで因子Ｈを含有）のｐＨを、ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲、好ましくはｐＨ６．０に調整した。
【００５９】
フラクションＢ（ｐＨが調整された）を、ヘパリンセファロースＦＦタイプの第２のゲル／樹脂、又は、ヘパリンタイプのリガンドをグラフト化された他の任意のクロマトグラフ保持体を用いたクロマトグラフィに供した。血漿タンパク分画Ｂに含まれる大部分のタンパクを更にクロマトグラフィ濾液によって溶出させた。ゲル／樹脂にわずかに吸着したタンパクを、一連の洗浄及び前溶出工程によって除去した。ゲル／樹脂に保持される因子Ｈは更に、ゲル／樹脂の平衡化に使用するバッファより強いイオン強度を有するバッファを用いて溶出した。
【００６０】
因子Ｈを含有する溶出フラクション（フラクションＣ）を希釈し、更に強酸性のカチオン交換タイプのゲル／樹脂（例えばＳＰセファロースＦＦタイプ又はそれと同様のゲル／樹脂）によるクロマトグラフィに供した。ゲル／樹脂にわずかに吸着したタンパクを、一連の洗浄及び前溶出工程によって除去した。ゲル／樹脂に保持される因子Ｈは更に、ゲル／樹脂の平衡化に使用するバッファより強いイオン強度を有するバッファを用いて溶出した。
【００６１】
因子Ｈを含有する溶出フラクション（フラクションＤ）を更に、溶媒若しくは界面活性剤（例えばポリソルベート８０及びＴｎＢＰ）による処理による、ウイルスの不活性化ステップに供した。かかる処理を行うことにより、ウイルス（特にエンベロープを有するタイプのウイルス）を効率的に不活性化することが可能である。
【００６２】
更にフラクションＤを希釈し、このフラクションのｐＨを、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の範囲となるように調整した。フラクションＤを更に、強酸性のアニオン交換タイプのゲル／樹脂（例えばＱセファロースＦＦタイプ又は当量のゲル／樹脂）を用いたクロマトグラフィに供した。一連の洗浄の後、ゲル／樹脂に保持された因子Ｈを、ゲル／樹脂の平衡化用のバッファより強いイオン強度を有するバッファを用いて溶出した。
【００６３】
上記の界面活性剤タイプの溶剤による処理に用いた、ウイルスの失活のために用いた物質を、クロマトグラフィ工程の間に除去することにより、因子Ｈの純度が向上した。
【００６４】
因子Ｈを含有する溶出フラクション（フラクションＥ）を更に、約１５ｎｍの空隙を有するフィルタを用いたナノ濾過に供し、ウイルスを除去した。このウイルス除去処理により、ウイルス（特に小型のエンベロープを有するウイルス）を効率的に除去することができる。得られる溶液（フラクションＦ）を、最後に濃縮し、限外濾過により調整し、更に０．２２μｍのフィルタで濾過した。
【００６５】
上記の精製方法の収量、及びこの方法により精製された因子Ｈの比活性を、２つの異なるバッチ毎に測定した。それぞれの結果を表１に示す。比活性（Ａ．Ｓ．）を、タンパク質１ｍｇ当たりの因子Ｈタイプの抗原のｍｇとして表す。
【００６６】
【表１】
2009518368.tif 000002
＜実施例２＞：因子Ｈの活性の測定方法：
ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェルタイプ）のウェルを、０．２Ｍの炭酸ナトリウムバッファ中の２．５ｇ／ｍＬ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社：ｒｅｆ．３４１２７４）の濃度の精製Ｃ３ｂタンパク質溶液で被覆した。その際、溶液１００μＬをウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間、及び４℃で一晩静置した。
【００６７】
１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０の溶液で、３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。
【００６８】
非特異的な部位を更に、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、１％のウシ血清アルブミンを含有する溶液３００μＬ／ウェルで、３７℃で１時間静置して飽和させた。次に、上記の洗浄溶液でウェルの洗浄を実施した。
【００６９】
以下の成分（２０ｍＭのＮｉＣｌ2のストック溶液（１．５ｍＭ最終濃度）  ７５μＬ、１ｍｇ／ｍｌのＢ因子（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｒｅｆ．３４１２６２）  ４μＬ、１ｍｇ／ｍｌのＤ因子（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｒｅｆ．３４１２７３）  ３μＬ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２、２５ｍＭのＮａＣｌ、４％のウシ血清アルブミンを含有する）  ９１８μＬ）を含有する溶液１００μＬを、各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
【００７０】
１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０の溶液で、３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。
【００７１】
因子Ｈ溶液を、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．０６２５μｇ／ｍＬ、０．０１５６２５μｇ／ｍＬ、０．００３９０６２５μｇ／ｍＬ及び０．００１μｇ／ｍＬの因子Ｈ濃度となるように調製した。各ウェルに１００μＬの溶液を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００７２】
更に１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有する緩衝溶液（ｐＨ７．２）で、３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。
【００７３】
ヤギ抗ヒトＢ因子抗体溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｒｅｆ．：３４１２７２）を、０．１％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳバッファ（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ−３８１３）（ｐＨ７．４）で１／２，０００に希釈し、更に希釈液１００μＬをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００７４】
ＰＢＳ（ｐＨ７．２、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有）で、３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。次に、０．１％のウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで１／１０，０００に希釈した、ペルオキシダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ｒｅｆ．４０１５１５、１ｍｇ／ｍＬ）標識し抗ヤギウサギ抗体を含有する溶液１００μＬをウェルに添加し、室温２０〜２５分間インキュベートした。
【００７５】
ＰＢＳ（ｐＨ７．２、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有）で、３００μＬ／ウェルで３回洗浄した。
【００７６】
クエン酸ナトリウム溶液中の５ｍｇ／１０ｍＬのＯＰＤペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）基質を最後に１００μＬ／ウェルの量で、更にＨ2Ｏ2を１０μＬでウェルに添加した。反応混合液を約１０分間ウェルと接触させ、更にウェルあたり５０μＬの４Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を添加し、反応を停止させた。
【００７７】
次に、ウェル中の溶液の吸光度を４９２ｎｍの波長で測定した。その結果を図３に示す。図３に、因子Ｈの濃度又はタンパク濃度（ＳＡＨ）に対する吸光度測定値の関係を示すグラフを示す。
【００７８】
因子Ｈの活性を測定するための同様の方法は、ＭｃＲａｅら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００５、１７４：６２５０−６２５６に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】補体活性化の２つのルートを示す図。
【図２】因子Ｈの精製方法のダイアグラム。
【図３】因子ＨによるＣ３コンベルターゼの解離。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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