(57)【要約】絶対的鉄欠乏、潜伏性鉄欠乏、機能的鉄欠乏、または潜伏性機能的鉄欠乏を検出するための新しい診断パラメータまたは診断指標が開示されている。パラメータは、ＲＢＣの大きさの係数、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義されるＲＳｆｉ、または（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義されるＲＳｆ２、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）、および（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義される容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）を含む。絶対的鉄欠乏、潜伏性鉄欠乏、機能的鉄欠乏、または潜伏性機能的鉄欠乏を検出するために、これらのパラメータを使用する方法をさらに開示する。ヘモクロマトーシスを検出するために、ＲＳｆを使用する方法もまた開示する。
2009511861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄欠乏の検出の方法であって、
（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析し、該血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、
（ｂ）該ＭＣＶおよび該ＭＲＶの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を取得する工程と、
（ｃ）該ＲＳｆを所定の基準と比較する工程と、
（ｄ）該ＲＳｆが該所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義されるＲＳｆ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義されるＲＳｆ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鉄欠乏は、絶対的鉄欠乏、または機能的鉄欠乏を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
鉄欠乏の検出の方法であって、
（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析し、該血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、
（ｂ）該ＭＣＶおよび該Ｈｇｂの積の関数として定義される容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を取得する工程と、
（ｃ）該ＶＨｆを所定の基準と比較する工程と、
（ｄ）該ＶＨｆが該所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項６】
前記ＶＨｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記鉄欠乏は、絶対的鉄欠乏、潜伏性鉄欠乏、または機能的鉄欠乏を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
鉄欠乏の検出の方法であって、
（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析し、該血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）および総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、
（ｂ）該ＭＣＶ、該Ｈｇｂおよび該ＲＤＷの関数として定義される容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）を取得する工程と、
（ｃ）該ＶＨＤＷｆを所定の基準と比較する工程と、
（ｄ）該ＶＨＤＷｆ係数が該所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
前記ＶＨＤＷｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記鉄欠乏は、絶対的鉄欠乏、機能的鉄欠乏、または潜伏性機能的鉄欠乏を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ヘモクロマトーシスの検出の方法であって、
（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析し、該血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、
（ｂ）該ＭＣＶおよび該ＭＲＶの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を取得する工程と、
（ｃ）該ＲＳｆを所定の基準と比較する工程と、
（ｄ）該ＲＳｆが該所定の基準を満たす場合は、ヘモクロマトーシスの兆候を報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義されるＲＳｆ１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義されるＲＳｆ２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
血液学分析装置にて血液サンプルのＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を生成する方法であって、
（ａ）血液サンプルの第一のアリコートと血液希釈剤を混合して、第一のサンプル混合物を形成して、該血液学分析装置にて該第一のサンプル混合物を分析し、そして赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）を取得する工程と、
（ｂ）該血液サンプルの第二のアリコートを網状赤血球試薬システムに暴露し、第二のサンプル混合物を形成し、該血液学分析装置にて該第二のサンプル混合物を分析し、そして網状赤血球の平均赤血球容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、
（ｃ）工程（ａ）から取得された該ＭＣＶおよび工程（ｂ）から取得された該ＭＲＶを使用して該ＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を取得する工程であって、該ＲＳｆは該ＭＣＶおよび該ＭＲＶの積の関数として定義される、工程と、
（ｄ）血液学分析装置での該血液サンプルの該ＲＳｆを報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義されるＲＳｆ１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＳｆは、（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義されるＲＳｆ２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
血液学分析装置にて血液サンプルの容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を生成する方法であって、
（ａ）血液サンプルの第一のアリコートと血液希釈剤を混合して、第一のサンプル混合物を形成し、該血液学分析装置にて該第一のサンプル混合物を分析し、そして赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）を取得する工程と、
（ｂ）該血液サンプルの第二のアリコートを試薬システムと反応させて、第二のサンプル混合物を形成し、該血液学分析装置にて該第二のサンプル混合物を分析し、そして総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、
（ｃ）工程（ａ）からの該ＭＣＶおよび工程（ｂ）からの該Ｈｇｂを使用して該容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を取得する工程であって、該ＶＨｆは該ＭＣＶおよび該Ｈｇｂの積の関数として定義される工程と、
（ｄ）該血液学分析装置での該血液サンプルの該ＶＨｆを報告する工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記ＶＨｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）を生成する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法であって、工程（ａ）は前記赤血球の分布幅（ＲＤＷ）を取得する工程をさらに含み、工程（ｃ）は前記ＭＣＶ、前記Ｈｇｂ、および該ＲＤＷを使用して該ＶＨＤＷｆを取得する工程であって、該ＶＨＤＷｆは該ＭＣＶ、該Ｈｇｂ、および該ＲＤＷの関数として定義される工程をさらに含み、また工程（ｄ）は前記血液学分析装置での前記血液サンプルの該ＶＨＤＷｆを報告する工程をさらに含む、方法。
【請求項２０】
前記ＶＨＤＷｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、赤血球および網状赤血球パラメータの特定の関数を使用する、鉄欠乏およびヘモクロマトーシスの検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
鉄欠乏（ＩＤ）は世界的規模で最も一般的な単一欠乏状態である。影響を受けた肉体労働をする個人の能力を低下させ、また子供の成長および学習の双方を減退させるので経済的に重要である。
【０００３】
貧血を伴うまたは貧血を伴わない絶対的鉄欠乏、および機能的鉄欠乏（ＦＩＤ）は高頻度の病態であり、これらの患者は鉄欠乏赤血球生成を有する。絶対的鉄欠乏は体内鉄分総量の減少と定義される。鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）は、鉄欠乏が赤血球生成を減退させ、貧血の発現を引き起こすほど十分に重度である場合に発生する。機能的鉄欠乏は体内鉄分総量が正常である、または増加したとしても、鉄が「閉止」され、赤血球の生成が得られない状態を表す。この状態は、慢性腎不全を有する血液透析中の患者に主に観察される。
【０００４】
鉄状態は、血液学的指標および生化学的指標を使用して測定することができる。鉄状態のそれぞれのパラメータは、身体の異なる鉄区分における変化を反映し、異なるレベルの鉄除去で影響を受ける。特定の鉄測定には、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、平均細胞容積（ＭＣＶ）、ヘマトクリット値（Ｈｃｔ）、赤血球プロトポルフィリン、血漿鉄、トランスフェリン、トランスフェリン飽和率（ＴＳＡＴ）、血清フェリチン（ＳＦ）、ならび近年になって可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）および赤血球分布幅（ＲＤＷ）が含まれる。
【０００５】
正常な鉄状態の標準値は、ＳＦは１００±６０ｎｇ／ｍｌならびにＨｇｂは女性では１２−１７ｇ／ｄｌおよび男性では１４−１９ｇ／ｄｌである。潜伏性鉄欠乏の標準値は、ＳＦは２２ｎｇ／ｍｌ未満およびＨｇｂは正常より若干低い。鉄欠乏性貧血の標準値は、ＳＦは２２ｎｇ／ｍｌ未満、Ｈｇｂは女性では１２ｇ／ｄｌ未満および男性では１３ｇ／ｄｌ未満である。
【０００６】
ヘモグロビン（Ｈｇｂ）は他のどんな鉄状態パラメータより長く使用されてきた。貧血が発現すると、それは鉄欠乏の重症度の定量的尺度を提供する。ヘモグロビン測定は便利で容易なスクリーニング方法であり、妊娠中または幼年期のような、鉄欠乏の有病率が高い場合にとりわけ有用である。鉄状態の尺度としてのヘモグロビンの使用を制限するものは、特異性の欠如であり（Ｂ１２または葉酸欠乏症、遺伝性疾患、および慢性感染症などの因子が赤血球生成を制限するように）、また正常と鉄欠乏母集団との値における著しい重複に起因する相対的無感覚である。鉄欠乏性貧血を特定するために、ヘモグロビンは鉄状態のより選択的な測定とともに測定される。
【０００７】
平均細胞容積（ＭＣＶ）における減少は、貧血の発現開始とほとんど同時に鉄欠乏が重度になる場合に発生する。サラセミアおよび慢性疾患の貧血が解消されると、それは鉄欠乏の極めて特異的な兆候となる。カットオフ値の８０ｆｌは、成人での正常下限値として許容される。
【０００８】
赤血球分布幅（ＲＤＷ）は、貧血の分類のための他のパラメータと組み合わせて近年使用されてきている。それは赤血球の大きさにおけるばらつきを反映し、赤血球不同症の微妙な度合いを検出するために使用することができる。ＲＤＷはＲＢＣヒストグラムから直接算出される。血液学分析装置にて２つの異なる算出値が提供された。ＲＤＷ−ＣＶは、ＭＣＶで除した一標準偏差での分布曲線の幅の比率として測定される。ＲＤＷ−ＳＤは、２０％の頻度レベルでの分布幅の直接測定である。通常、赤血球のための大きさの分布曲線は、１０±１．５％のＲＤＷ−ＣＶ値および４２±５（ｆｌ）のＲＤＷ−ＳＤと非常に対称的である。細胞の大きさにおける比較的大きなばらつきを意味する高ＲＤＷは、大赤血球性か、または小赤血球性細胞の出現によりもたらされる。赤血球分布幅の増加は、鉄欠乏の最も初期の血液学的徴候であると見られる。
【０００９】
現在のところ最も一般に使用される鉄状態パラメータは、トランスフェリン飽和率（ＴＳＡＴ）および血清フェリチン（ＳＦ）である。しかしながら、双方とも鉄状態の間接的尺度である。トランスフェリンは、貯蔵部位から赤血球前駆細胞へ鉄を輸送する、２つの鉄結合部位を含有する輸送タンパクである。ＴＳＡＴ（すなわち、鉄が占める総結合部位のパーセンテージ）は、赤血球生成に使用可能な鉄の尺度である。ＴＳＡＴは血清鉄を総鉄結合能（ＴＩＢＣ）、循環トランスフェリンの量で除し、１００で乗じて計算する。フェリチンは、いくらかの量が血清中で遊離した状態で、細網内皮系（ＲＥＳ）内に主に含有される貯蔵タンパクである。鉄過剰の条件下で、フェリチン産生は血漿鉄における増加を相殺するために増加する。従って、血清中のフェリチン濃度は、貯蔵部での鉄の量を反映する。
【００１０】
慢性腎疾患を有する患者については、ＴＳＡＴが２０％未満およびＳＦが１００ｎｇ／ｍｌ未満の場合に絶対的鉄欠乏が診断される場合がある。鉄状態パラメータが適切な鉄貯蔵を示すので、機能的鉄欠乏は診断がより困難な場合がある。ＦＩＤを定義する際に異なる基準があり、以下の表に示すように、それらのうち１つは、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ−Ｋ／ＤＯＱＩ  （非特許文献１）によって刊行されている。
【００１１】
（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｋ／ＤＯＱＩ（米国）による機能的鉄欠乏（ＦＩＤ）および絶対的鉄欠乏（ＡＩＤ）の定義）
【００１２】
【化１】
2009511861.tif 000003
トランスフェリン飽和率の使用を制限するものは、血清鉄のそれら、すなわち、広域日内変動および低特異性を反映することである。ＴＳＡＴはまた炎症性疾患においても減少する。トランスフェリン飽和率は、鉄状態の他の指標と併用して人口研究において一般に使用される。他方では、フェリチンは急性反応物質であるので、その血中濃度は慢性炎症、感染、悪性腫瘍および肝疾患の存在下で上昇する場合がある。アルコールの消費もまた、血清フェリチンを独立して上昇させることが示唆されてきた。
【００１３】
近年、鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の有用性を有する、いくつかの新しい赤血球および網状赤血球パラメータが報告されてきた。前記パラメータのうち２つは、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ（Ｒ）１２０血液学分析装置（非特許文献２）により報告された低色素性赤血球％（％Ｈｙｐｏと称される）およびＣＨｒ（網状赤血球ヘモグロビン含有量）である。ＣＨｒは式（ＣＨｒ＝ＭＣＶｒ×ＣＨＣＭｒ）によって定義され、式中ＭＣＶｒは平均網状赤血球細胞容積であり、ＣＨＣＭｒは、光学的細胞間ヘモグロビン測定によって取得される、網状赤血球の平均ヘモグロビン濃度である。
【００１４】
網状赤血球は、寿命が１から２日だけの未成熟赤血球である。これらが最初に骨髄から遊離するとき、それらのヘモグロビン含有量の測定は、赤血球生成が直ちに利用できる鉄の量を提供することができる。これらの網状赤血球における正常より少ないヘモグロビン含有量は、需要に対して不十分な鉄供給の兆候である。これらの網状赤血球におけるヘモグロビンの量はまた、成熟赤血球でのヘモグロビンの量に相当する。ＣＨｒは近年、鉄欠乏および機能的鉄欠乏のための試験として多数の研究で評価されてきており、高感度および高度に特異的であることが発見されている。しかしながら、閾値が研究所および使用する機器に応じて異なるので、正確な閾値は設定されていない。
【００１５】
エポエチンは赤血球の刺激的生産において有効であるが、ヘムに結合するための適切な鉄供給がなければ、赤血球は低色素、すなわち、ヘモグロビン含有量が不十分となるであろう。従って、鉄欠乏の状態では、骨髄を離れる赤血球の大幅なパーセンテージが、低いヘモグロビン値となるであろう。ヘモグロビン含有量が２８ｇ／ｄｌ未満の赤血球のパーセンテージを測定することによって、鉄欠乏を検出することができる。パーセンテージが１０％より高い低色素性赤血球は、鉄欠乏と相関関係を有してきた。％Ｈｙｐｏは、光学的細胞間ヘモグロビン測定の基づくＢａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液学分析装置によって報告される。
【００１６】
％ＨｙｐｏおよびＣＨｒと相関関係を有すると最近報告された２つの他のパラメータは、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００血液学分析装置（Ｍａｃｈｉｎ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００，ＩＳＬＨ２００１Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ，ＩＳＬＨ  ＸＩＶｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．２００１）によって報告されたＲＢＣ−ＹおよびＲＥＴ−Ｙである。ＲＢＣ−Ｙは、成熟赤血球集団内の前方光散乱ヒストグラムの平均値であり、ＲＥＴ−Ｙは、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００血液学分析装置での網状赤血球測定にて取得した網状赤血球集団内の前方光散乱ヒストグラムの平均値である。
【００１７】
鉄欠乏の検出のために今までに使用されてきたその他のパラメータは、ＭＲＶ／ＭＣＶの、または（ＭＲＶ／ＭＣＶ）における比率（ｄＲと称する）であり、ここでＭＲＶは平均網状赤血球細胞容積であり、ＭＣＶは平均赤血球容積である。通常、１．３５より高いＭＲＶ／ＭＣＶの比率は、鉄欠乏の兆候であると見なされる。
【００１８】
さらに、疾患の診断および治療を支援する点からの異なる側面では、疾患が発生する前に特定の血液学的状態を検出することが望ましい。潜伏性鉄欠乏（ＬＩＤ）は、月経に起因して、また時折貧弱な食生活に起因して、排卵期の女性において高頻度を有することがよく知られている。潜伏性鉄欠乏とは、鉄欠乏が存在するがまだ貧血ではないものを指す。一般集団における潜伏性機能的鉄欠乏（ＬＦＩＤ）およびヘモクロマトーシス（ＨＥＭ）が比較的に高頻度であることもまた、よく知られている。潜伏性機能的鉄欠乏とは、機能的鉄欠乏の貧血の前段階を指す。他方では、ヘモクロマトーシス、鉄過負荷による疾病の最も一般的な型は、身体に過度の量の鉄を吸収および貯蔵させる遺伝性疾患である。余分の鉄を臓器に蓄積し、臓器に損傷を引き起こす。治療をしなければ、疾病はこれらの臓器を不全にさせる可能性がある。臨床的に、予防的な処置を施すために、早期にこれらの状態を検出することが重要である。
【００１９】
追加費用を伴わず、病態の早期検出を支援することができる、機器にて定期的に実行される血液分析の間に、自動血液学分析装置にて報告される既存の血液学的パラメータを使用して、絶対的鉄欠乏、潜伏性鉄欠乏、機能的鉄欠乏、および潜伏性機能的鉄欠乏などの、鉄欠乏を検出することができることは望ましい。
【非特許文献１】Ｅｋｎｏｙａｎ  Ｇら、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ：ＤＯＱＩ  ｂｅｃｏｍｅｓ  Ｋ／ＤＯＱＩ  ａｎｄ  ｉｓ  ｕｐｄａｔｅｄ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ’ｓ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２００１年１月；３７（１）：１７９−１９４
【非特許文献２】Ｔｈｏｍａｓ  Ｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｄｉｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４８：７、１０６６−１０７６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
一側面では、本発明は、赤血球および網状赤血球の関数を使用して、絶対的鉄欠乏、潜伏性鉄欠乏、機能的鉄欠乏、または潜伏性機能的鉄欠乏の検出の方法を提供する。
【００２１】
一実施態様では、前記方法は、血液学分析装置にて前記患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに前記血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、前記ＭＣＶおよび前記ＭＲＶの積の関数として定義されるＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を取得する工程と、前記ＲＳｆを所定の基準と比較する工程と、前記ＲＳｆが前記所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程とを含む。本明細書では、ＲＳｆは（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義されるＲＳｆ１か、または（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義されるＲＳｆ２である。
【００２２】
その他の実施態様では、前記方法は、血液学分析装置にて前記患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに前記血液サンプルのＭＣＶおよび総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、ＭＣＶおよびＨｇｂの積の関数として定義される容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を取得する工程と、前記ＶＨｆを所定の基準と比較する工程と、前記ＶＨｆが前記所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程とを含む。本明細書では、ＶＨｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される。
【００２３】
さらなる実施態様では、前記方法は、血液学分析装置にて前記患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに前記血液サンプルのＭＣＶ、Ｈｇｂ、および前記赤血球分布幅（ＲＤＷ）を取得する工程と、ＭＣＶ、ＨｇｂおよびＲＤＷの関数として定義される容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）を取得する工程と、前記ＶＨＤＷｆを所定の基準と比較する工程と、前記ＶＨＤＷｆ係数が前記所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程とを含む。本明細書では、ＶＨＤＷｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義される。
【００２４】
その他の側面では、本発明は、ＲＳｆを使用するヘモクロマトーシスの検出の方法を提供する。前記方法は、血液学分析装置にて前記患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに前記血液サンプルの前記ＭＣＶおよび前記ＭＲＶからＲＳｆを取得する工程と、前記ＲＳｆを所定の基準と比較する工程と、前記ＲＳｆが前記所定の基準を満たす場合は、ヘモクロマトーシスの兆候を報告する工程とを含む。
【００２５】
さらなる側面では、本発明は、上方で定義した血液学分析装置での関数または指標を生成する方法を提供する。
【００２６】
一実施態様では、血液学分析装置での血液サンプルのＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を生成する方法は、第一のサンプル混合物を形成するために血液サンプルの第一のアリコートと血液希釈剤を混合する工程、前記血液学分析装置にて前記第一のサンプル混合物を分析する工程、および赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）を取得する工程と、第二のサンプル混合物を形成するために前記血液サンプルの第二のアリコートを網状赤血球試薬システムに暴露する工程、前記血液学分析装置にて前記第二のサンプル混合物を分析する工程、および網状赤血球の平均赤血球容積（ＭＲＶ）を取得する工程と、取得したＭＣＶおよびＭＲＶを使用してＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ１またはＲＳｆ２）を取得する工程と、前記血液学分析装置での前記血液サンプルの前記ＲＳｆを報告する工程とを含む。
【００２７】
その他の実施態様では、血液学分析装置での血液サンプルの容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を生成する方法は、第一のサンプル混合物を形成するために血液サンプルの第一のアリコートと血液希釈剤を混合する工程、前記血液学分析装置にて前記第一のサンプル混合物を分析する工程、および赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）を取得する工程と、第二のサンプル混合物を形成するために前記血液サンプルの第二のアリコートを試薬システムと反応させる工程、前記血液学分析装置にて前記第二のサンプル混合物を分析する工程、および総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）を取得する工程と、取得したＭＣＶおよびＨｇｂを使用して容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）を取得する工程と、前記血液学分析装置での前記血液サンプルの前記ＶＨｆを報告する工程とを含む。
【００２８】
この方法は、容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）を生成する工程をさらに含むことができ、ここで前記方法は、前記第一のサンプル混合物の分析から前記赤血球の分布幅（ＲＤＷ）を取得する工程と、取得したＭＣＶ、Ｈｇｂ、およびＲＤＷを使用してＶＨＤＷｆを取得する工程と、前記血液学分析装置での前記血液サンプルの前記ＶＨＤＷｆを報告する工程とを含む。
【００２９】
本発明の利点は、本発明の例となる実施態様を示す添付図面と併せて、以下の説明から明白となるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
一側面では、本発明は、赤血球および網状赤血球パラメータの特定の関数を使用する、鉄欠乏を検出するための方法を提供する。本明細書で使用する鉄欠乏の用語は、絶対的鉄欠乏（ＩＤ）、潜伏性鉄欠乏（ＬＩＤ）、機能的鉄欠乏（ＦＩＤ）および潜伏性機能的鉄欠乏（ＬＦＩＤ）を含む。
【００３１】
文献でしばしば鉄欠乏と称される、絶対的鉄欠乏は、体内鉄分総量の減少と定義される。鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）は、鉄欠乏が赤血球生成を減退させ、貧血の発現を引き起こすほど十分に重度である場合に発生する。潜伏性鉄欠乏とは、鉄欠乏が存在するがまだ貧血ではないものを指す。他方では、機能的鉄欠乏は、体内鉄分総量が正常または増加しているが、鉄が赤血球の生成を得られない状態を定義する。この状態は、慢性腎不全を有する血液透析中の患者に主に観察される。潜伏性機能的鉄欠乏とは、機能的鉄欠乏の貧血の前段階を指す。上記のように、鉄欠乏の異なる型を有する個人は、鉄欠乏性赤血球生成の異なる程度を有する。
【００３２】
一実施態様では、前記方法は、血液サンプルの赤血球の平均細胞容積（ＭＣＶ）および網状赤血球の平均細胞容積（ＭＲＶ）の積の関数を使用し、本明細書ではそれは、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を含む鉄欠乏を検出するための、ＲＢＣの大きさの係数（ＲＳｆ）を指す。より具体的には、方法は以下の工程、（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに血液サンプルのＭＣＶおよびＭＲＶを取得する工程と、（ｂ）血液サンプルのＲＳｆを取得する工程と、（ｃ）ＲＳｆを所定の基準と比較する工程と、（ｄ）ＲＳｆが所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程とを含む。
【００３３】
好ましい一実施態様では、ＲＳｆは（ＭＣＶ×ＭＲＶ）１／２の式によって定義され、本明細書ではＲＳｆ１と称する。代替の実施態様では、ＲＳｆは（ＭＣＶ×ＭＲＶ）／１００の式によって定義され、本明細書ではＲＳｆ２と称する。所定の基準は通常、本発明の様々な実施態様にて以下に詳細に記載するように、特定の診断パラメータのカットオフ値である。頻繁に使用される一基準は、特定のパラメータまたは指標の受信者動作特性（ＲＯＣ）分析のカットオフ値である。
【００３４】
赤血球を測定するためには、血液サンプルは通常、サンプルチャンバまたは槽の中で希釈剤により実質上希釈する。非集中フロー開口を有するインピーダンス測定を使用して、血液サンプルは約６２５０：１の希釈比で希釈することができる。測定に集中フロー用フローセルを使用する場合は、希釈比は２９０：１など、大幅に低くてもよい。血液学分析装置にて測定する間に赤血球細胞容積および形態を維持するために、等張希釈剤を血液サンプルを希釈するのに使用する。通常、希釈剤は１つ以上のアルカリ性金属塩を含有する。様々な市販の等張血液希釈剤が、血液サンプルを希釈するために使用することができる。適切な例には、米国特許第４，５２１，５１８号、第４，５２８，２７４号、第５，９３５，８５７号および第６，７０６，５２６号に記載の希釈剤が含まれるが、それらに限定されない。
【００３５】
伝導液中で懸濁される粒子または血球がフローセルまたは開口に浸透する場合は、電気信号またはパルスは、インピーダンスの増加に起因して測定することができる。電気パルスは、血液サンプルの血球の数を計数するために使用されてきた。他方では、パルス波形、パルス高およびパルス幅は、粒子の容積または大きさに直接関連し、測定された細胞の容積に換算することができる。異なる容積を有する２つ以上の異なる血球を含有するサンプルを測定する場合は、測定から取得したヒストグラムは、これらの血球の容積分布を表すことができる。ＤＣインピーダンス測定装置を装備した血液分析装置による、血球の計数およびサイジングのために使用される検出方法および装置は、米国特許第２，６５６，５０８号、第３，８１０，０１１号および第５，１２５，７３７号に概して記載されており、それらの全体は参照することによって本明細書に組み込まれる。本明細書では、句「血球のサイジング」とは、細胞容積の測定を指す。
【００３６】
別法として、低角光散乱測定もまた、血球の計数およびサイジングのために使用することができる。本明細書では、用語「低角光散乱測定」とは、入射光線から１０度未満の範囲で測定される光散乱信号を指す。
【００３７】
細胞容積測定では、細胞容積分布ヒストグラムを取得する。赤血球測定については、取得したヒストグラムは、赤血球分布ヒストグラムと称する。正常な血液サンプルについては、幅が狭い明確な赤血球分布、通常ガウス分布が取得される。臨床的に異常な血液サンプルについては、高容積側か、または低容積側への分布のずれ、非対称分布、高容積側か、低容積側、または両側への人口拡張など、分布の様々なひずみが観察されてきた。平均細胞容積（ＭＣＶ）および赤血球分布幅（ＲＤＷ）は、赤血球分布ヒストグラムから計算する。
【００３８】
血液サンプルの総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）は通常、血液サンプルのアリコートを細胞融解試薬と混合することによって、自動血液学分析装置にて測定される。細胞融解試薬に暴露した時点で赤血球は完全に融解し、またヘモグロビンはサンプル混合物へと遊離し、細胞融解試薬中のリガンドと接触した時点で色原体を形成する。ヘモグロビン色原体は次いで、所定の波長でＵＶ−ＶＩＳ分光学によって測定され、Ｈｇｂは前記測定から計算される。
【００３９】
Ｈｇｂを測定するために適切な一融解試薬には、米国特許第４，５２１，５１８号、第４，５２８，２７４号、第５，９３５，８５７号および第６，７０６，５２６号に記載の希釈剤などの等張血液希釈剤、および米国特許第５，７６３，２８０号、第５，８３４，３１５号および第６，５７３，１０２号に記載の融解試薬などの融解試薬が含まれ、これらはその全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。別法として、試薬システムはまた、米国特許第５，８８２，９３４号に記載の単一融解試薬であってもよく、その全体は参照することによって本明細書に組み込まれる。さらに、ヘモグロビンを測定するために当技術分野で知られている様々な細胞融解試薬は、本発明の目的のために使用することができる。
【００４０】
血液サンプル中の網状赤血球は、光散乱、吸収、インピーダンスおよび／またはそれらの組み合わせを使用する、ルーチンサンプル分析におけるいくつかの高性能血液学分析装置にて測定および報告される。最も一般に報告されるパラメータには、網状赤血球パーセント（ＲＥＴ％）および絶対数（ＲＥＴ＃）、網状赤血球容積（ＭＲＶ）、ならびに未成熟網状赤血球比（ＩＲＦ）が含まれる。具体的な測定方法にもよるが、他の網状赤血球パラメータもまた、血液学分析装置によって提供される。
【００４１】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０またはＣｏｕｌｔｅｒ  ＧＥＮ＊ＳＴＭ血液学分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社  カリフォルニア州フラートン）にて、血液サンプルのいくつかのアリコートは、異なる分析形態で同時に分析する。ＣＢＣ形態では、血液サンプルの第一のアリコートは、第一のサンプル混合物を形成するために等張血液希釈剤によって希釈され、赤血球および血小板は第一のサンプル混合物から測定する。同時に、血液サンプルの第二のアリコートは、第二のサンプル混合物から第二のサンプル混合物を形成するために、血液希釈剤および細胞融解試薬と混合し、ヘモグロビンおよび白血球を測定する。様々な赤血球パラメータは、数ある中でも、平均細胞容積（ＭＣＶ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ）、および平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）などの微分パラメータを含む測定から報告される。これらの血液学分析装置で報告されるＲＤＷは、ＭＣＶで除した一標準偏差での分布曲線の幅の比率として測定されるＲＤＷ−ＣＶである。
【００４２】
Ｒｅｔｉｃ形態では、血液サンプルの第３のアリコートを網状赤血球試薬システムに暴露する。より具体的には、血液サンプルの第３のアリコートを、メチレンブルーを含有する網状赤血球染色試薬と混合し、次いで第３のサンプル混合物を形成するために、融解試薬／定着試薬と混合する。メチレンブルー、非蛍光色素染料は、網状赤血球内の残留ＲＮＡを沈殿させることによって、成熟赤血球からの網状赤血球の分化を達成するために使用する。第３のサンプル混合物は次いで、ＶＣＳ検出方法によって測定する。網状赤血球パラメータのうちで、ＭＲＶ、平均球体化細胞容積（ＭＳＣＶ）、未成熟網状赤血球比（ＩＲＦ）、ならびに高光散乱網状赤血球パーセントおよび絶対数（ＨＬＲ％およびナンバー記号）が機器によって報告される。網状赤血球はまた、様々な市販の血液学分析装置にて知られているように、蛍光測定を使用して測定することができる。
【００４３】
本明細書では、ＶＣＳ検出方法または技術とは、集中フローセルに浸透する細胞によって生成される直流（ＤＣ）信号および高周波（ＲＦ）信号および中角光散乱（ＬＳ）信号の多次元測定を指す。これら３つの測定のうちで、ＤＣおよびＲＦ測定の双方は、伝導性媒質内に運ばれる細胞がフローセルに浸透するにつれて増加するインピーダンスを検出する、インピーダンス測定である。この技術は、米国特許第５，１２５，７３７号に十分に記載されており、その全体は参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００４４】
上述したように、Ｂａｙｅｒ血液学分析装置によって報告されたＣＨｒ（網状赤血球ヘモグロビン含有量）は近年、鉄欠乏および機能的鉄欠乏を検出するために使用されてきており、高感度および高度に特異的であることが発見されている。通常、ＣＨｒが２８ｐｇ未満または２９ｐｇ未満のカットオフ値が、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を決定するのに使用される。他方では、低色素性赤血球のパーセンテージもまた、鉄欠乏を決定するのに使用されてきた。％Ｈｙｐｏが５％未満を正常と見なす。２つの異なる基準、より具体的には、５％より高い、および１０％より高い％Ｈｙｐｏが使用されてきた。１０％より高い％Ｈｙｐｏが、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を定義するためにより一般に使用されてきた（Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ、Ｆら、Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎａｅｍｉａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ，  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，第１９巻、２００４年５月（付録２））。
【００４５】
実施例１は、ＣＨｒと比較して鉄欠乏を検出するためにＲＳｆ１を使用する、本発明の方法を例示する。示すように、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０およびＧＥＮ＊Ｓ血液学分析装置にて、９８１の臨床全血サンプルを分析し、血液学分析装置にて報告されたＭＣＶおよびＭＲＶを使用して、それぞれの血液サンプルに対してＲＳｆ１を計算した。同じ血液サンプルはまた、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液学分析装置にて分析した。ＲＳｆ１の受信者動作特性（ＲＯＣ）分析は、異常な、すわなち、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を定義するための基準として２８ｐｇ未満のＣＨｒを使用して実行した。この基準を使用して、９９のサンプルを異常と見なし、８８２を正常と見なした。
【００４６】
図１は、取得したＲＳｆ１のＲＯＣ曲線示す。Ｙ軸上で感度を描き（真陽性の比）、またＸ軸上で１００特異性（偽陽性の比）を描く。完全な差別化のある試験は、真陽性の比が１００％である（完全な感度）である場合、左上角を通過するＲＯＣ曲線を有する。差別化のない試験のための理論曲線は、左下角から上右角まで４５度の対角線である。曲線が上左角に接近するほど、試験の精度は高くなる。さらに、ＲＯＣ曲線の下の領域（ＡＵＣ）はまた、診断試験の臨床精度の公約数である。ＲＳｆ１のためのＲＯＣ分析からのＡＵＣは０．９４８であり、ＲＳｆ１がＣＨｒと高度に相関関係を有することを示す。ＡＵＣおよびＲＯＣ曲線の値は、ＲＳｆ１が絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の際にＣＨｒと同様の診断能力を有することを示す。カットオフが１０２．３以下の状態で、ＲＳｆ１はそれぞれ、感度が９１．９％、特異性が８２．２％であった。
【００４７】
ＲＯＣ分析はまた、ＲＳｆ２のためにも実行した。ＲＳｆ２のＡＵＣは０．９４８である。カットオフが１０４．７３以下の状態で、ＲＳｆ２はそれぞれ、感度が９１．９％、特異性が８２．２％であった。示すように、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２の双方に対するＲＯＣ分析結果は同じであった。この実施例は、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２が鉄欠乏の検出の際に実質上相当することを示す。本明細書では、カットオフとは、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２のＲＯＣ分析のカットオフ値を指し、それぞれ上述したように、ＭＣＶおよびＭＲＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表す。本明細書ではこれらの係数は、鉄欠乏を検出するための指標として使用する。
【００４８】
さらに、カットオフ値は、異なる患者集団で異なってもよいことが理解されるであろう。例えば、血液透析中の腎不全の患者については、これらの患者が異常に高いＭＣＶを有するので、ＲＳｆ１のカットオフは約１０５．１であることが発見されている。実施例１では、研究した患者集団は、サラセミアおよび溶血性貧血など他の状態を含むが、ＲＳｆ１のカットオフは１０２．３であることが分かる。ＣＨｒのための推奨カットオフは、使用する特定の血液学分析装置に応じて異なってもよいことがさらに留意される。比較研究では、比較対象の基準の設定もまた、カットオフ値に影響を与えることができる。しかしながら、既知の臨床的設定では、ＲＳｆ１またはＲＳｆ２のカットオフ値は経験的に決定することができる。
【００４９】
ＭＣＶを測定する場合、測定するものは、血液サンプルを採取する前の１２０日間に生成された赤血球の平均の大きさまたは容積である（赤血球の平均寿命が縮まる場合を除く）ことが理解することができる。他方では、ＭＲＶを測定する場合、測定するものは、血液サンプルを採取する前の３日未満の期間内の、つい最近生成された赤血球の大きさまたは容積である。成熟赤血球および網状赤血球の双方において、９０％を超える細胞内含有量はヘモグロビンであるので、これらの赤血球の大きさは、細胞のヘモグロビン含有量と直接相関関係を有する。従って、ＭＣＶおよびＭＲＶの双方の積の関数として、ＲＳｆは網状赤血球および成熟赤血球の双方の細胞ヘモグロビン含有量を間接的に反映する。
【００５０】
実施例１に例示するように、ＲＳｆは、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を検出するためにＣＨｒと統計的に十分相関関係を有する。これらの結果は、ＲＳｆが絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の際に、ＣＨｒと同様の診断能力を有することを示す。ＲＳｆが鉄欠乏、または鉄欠乏性赤血球生成の条件下で、細胞的特徴を反映することを理解することができる。鉄欠乏では、２つの異常な細胞特性、血色素減少症（赤血球および網状赤血球における低いヘモグロビン値）および小赤血球症（低赤血球および網状赤血球容積）が通常観察される。鉄欠乏を検出する際、ＲＳｆは、網状赤血球および赤血球の双方の細胞の大きさおよびヘモグロビン含有量の減少を知らせる一方で、ＣＨｒは、網状赤血球ヘモグロビン含有量の減少、すなわち、低色素性網状赤血球を知らせる。従って、ＲＳｆおよびＣＨｒの双方が、鉄欠乏、または鉄欠乏性赤血球生成の条件下で細胞的特徴を反映する。
【００５１】
さらに、さらなる実施態様では、ＲＳｆはまた、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を決定するための他の生化学的指標と併せて使用することができる。表１は、ｓＴｆＲ／ｌｏｇフェリチンとともにＲＳｆ１を使用する実施例を例示する。本明細書では、ｓＴｆＲは可溶性トランスフェリン受容体である。ｓＴｆＲ−Ｆ指標と称する、ｓＴｆＲ／ｌｏｇフェリチンは、機能的鉄欠乏の診断において臨床的に使用されてきた。
【００５２】
（表１．血液透析中、慢性腎疾患を有する患者に対する診断基準）
【００５３】
【表１】
2009511861.tif 000004
さらなる実施態様では、本発明の方法は、絶対的鉄欠乏、潜在的鉄欠および機能的鉄欠乏を含む、鉄欠乏を検出するために、本明細書では容積ヘモグロビン係数（ＶＨｆ）と称する、ＭＣＶおよびＨｇｂの積の関数を使用する。小球性貧血は鉄欠乏に起因する典型的な病態であるので、この関数は小球性貧血関数（ＭＡｆ）とも称する。より具体的には、方法は以下の工程、（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに血液サンプルのＭＣＶおよびＨｇｂを取得する工程と、（ｂ）血液サンプルのＶＨｆを取得する工程と、（ｃ）ＶＨｆを所定の基準と比較する工程と、（ｄ）ＶＨｆが所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程とを含む。好ましい実施態様では、ＶＨｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義される。
【００５４】
実施例１は、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液学分析装置によって報告されるＣＨｒと比較して、絶対的鉄欠乏または機能的鉄欠乏を検出するためにＶＨｆを使用する方法を例示する。ＶＨｆは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ−７５０血液学分析装置にて報告されるＭＣＶおよびＨｇｂを使用して、１２３０の臨床全血サンプルのために計算した。ＶＨｆのＲＯＣ分析は、異常な、すわなち、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を定義するための基準として２８ｐｇ未満のＣＨｒを使用して実行した。この基準を使用して、１７７のサンプルを異常と見なし、１０５３を正常と見なした。図２は、取得したＶＨｆのＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ分析からのＡＵＣは０．９２１であり、ＶＨｆがＣＨｒと高度に相関関係を有することを示す。ＡＵＣおよびＲＯＣ曲線の値は、ＶＨｆが絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の際にＣＨｒと同様の診断能力を有することを示す。カットオフが９．０未満の状態で、ＶＨｆはそれぞれ、感度が８８．７％、特異性が８４．８％であった。本明細書では、カットオフとは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／１００の式によって定義されるＶＨｆのＲＯＣ分析のカットオフ値であり、ＭＣＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはデシリットル当たりのグラム（ｇ／ｄｌ）で表す。本明細書ではこの係数は、鉄欠乏を検出するための指標として使用する。カットオフ値は使用する機器および患者集団に応じて異なることができるので、それは既知の臨床的設定において決定できることが留意される。
【００５５】
実施例２は、Ｂａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液学分析装置によって報告される％Ｈｙｐｏと比較して、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を検出するためにＶＨｆを使用する方法をさらに例示する。ＶＨｆのＲＯＣ分析は、異常な、すわなち、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を定義するための基準として１０％より高い％Ｈｙｐｏを使用して、２４７の臨床全血サンプルにて実行した。ＶＨｆのＡＵＣは０．８３４である。カットオフが１０．２未満の状態で、ＶＨｆはそれぞれ、感度が８１％、特異性が７７％であった。これらの結果は、ＶＨｆが絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の際に、％Ｈｙｐｏと同様の診断能力を有することを示す。さらに、患者の血清フェリチン濃度およびＴＳＡＴ値とは無関係に、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を検出するために使用できることが発見された。
【００５６】
さらに、実施例４は、排卵期の、非貧血性女性における潜伏性鉄欠乏を検出するためにＶＨｆを使用する実施例を示す。示すように、２１１の排卵期の、非貧血性女性のグループにおけるＶＨｆ値は、正常と潜伏性鉄欠乏の女性との間で統計的有意差を有する。これらの結果は、ＶＨｆが潜伏性鉄欠乏を検出するために使用できることを示す。
【００５７】
その上さらなる実施態様では、本発明は、本明細書では容積ヘモグロビン／分布係数（ＶＨＤＷｆ）と称する、ＭＣＶ、ＨｇｂおよびＲＤＷの関数を使用して、絶対的鉄欠乏、機能的鉄欠乏、および潜伏性機能的鉄欠乏を含む、鉄欠乏を検出するための方法を提供する。方法は以下の工程、（ａ）血液学分析装置にて患者の血液サンプルを分析する工程、ならびに血液サンプルのＭＣＶ、ＲＤＷおよびＨｇｂを取得する工程と、（ｂ）取得したＭＣＶ、ＲＤＷおよびＨｇｂを使用して血液サンプルのＶＨＤＷｆを取得する工程と、（ｃ）ＶＨＤＷｆを所定の基準と比較する工程と、（ｄ）ＶＨＤＷｆが所定の基準を満たす場合は、鉄欠乏の兆候を報告する工程とを含む。好ましい実施態様では、ＶＨＤＷｆは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義される。
【００５８】
実施例３は、基準として１０％より高い％Ｈｙｐｏを使用して、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏を検出するためにＶＨＤＷｆを使用する方法を例示する。ＶＨＤＷｆのＲＯＣ分析は、異常を定義するための基準として１０％より高い％Ｈｙｐｏを使用して、１６６の臨床全血サンプルにて実行した。この基準を使用して、６４のサンプルを異常と見なし、１０２を正常と見なした。図３Ａは、ＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ分析からのＡＵＣは０．８３２であり、カットオフが５．０以下の状態で、ＶＨＤＷｆはそれぞれ、感度が８５．９％、特異性が６６．７％であった。本明細書では、カットオフとは、（ＭＣＶ×Ｈｇｂ）／（ＲＤＷ×１０）の式によって定義されるＶＨＤＷｆのＲＯＣ分析のカットオフ値であり、ＭＣＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはデシリットル当たりのグラム（ｇ／ｄｌ）で表し、ＲＤＷはパーセンテージで表す。本明細書ではこの係数は、鉄欠乏を検出するための指標として使用する。
【００５９】
ＶＨＤＷｆのさらなるＲＯＣ分析は、異常を定義するための基準として５％より高い％Ｈｙｐｏを使用して実行した。この基準を使用して、８９のサンプルを異常と見なし、７７を正常と見なした。図３Ｂは、取得したＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８５７であった。カットオフが５．８以下の状態で、ＶＨＤＷｆはそれぞれ、感度が９１．０％、特異性が７１．４％であった。これらの結果は、ＶＨＤＷｆが高感度であり、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出において、％Ｈｙｐｏと同様の能力を有していることを示す。
【００６０】
実施例４は、排卵期の、非貧血性女性における潜伏性機能的鉄欠乏を検出するためにＶＨＤＷｆを使用する実施例を示す。示すように、２１１の排卵期の、非貧血性女性のグループにおけるＶＨＤＷｆ値は、潜伏性機能的鉄欠乏の女性と正常な女性との間で統計的有意差を有した。図４は、潜伏性機能的鉄欠乏を検出するためのＶＨＤＷｆのＲＯＣ曲線を示す。潜伏性機能的鉄欠乏の検出については、ＡＵＣは０．８０であり、カットオフが１２．０４以下の状態で、ＶＨＤＷｆはそれぞれ、感度が８６．７％、特異性が７８．７％であった。この結果は、ＶＨＤＷｆが潜伏性機能的鉄欠乏を検出するために使用できることを示し、この理由のため、それはＬＦＩＤ係数（ＬＦＩＤｆ）とも称される。
【００６１】
その他の側面では、本発明は、ヘモクロマトーシス（ＨＥＭ）を検出するためにＲＳｆを使用する方法にさらに方向付けられる。実施例４は、排卵期の、非貧血性女性におけるヘモクロマトーシスを検出するためにＲＳｆを使用する実施例を示す。示すように、２１１の排卵期の、非貧血性女性のグループにおけるＲＳｆ２値は、ヘモクロマトーシスの女性と正常な女性との間で統計的有意差を有した。図５は、ヘモクロマトーシスを検出するためのＲＳｆ２のＲＯＣ曲線を示す。ヘモクロマトーシスの検出については、ＡＵＣは０．７７であり、カットオフが９２．４より高い状態で、ＲＳｆ２はそれぞれ、感度が１００．０％、特異性が４９．４％であった。これらの結果は、ＲＳｆがヘモクロマトーシスを検出するために使用できることを示す。
【００６２】
鉄欠乏、機能的鉄欠乏、潜伏性鉄欠乏、潜伏性機能的鉄欠乏およびヘモクロマトーシスを検出する際に、新しいパラメータＲＳｆ、ＶＨｆおよびＶＨＤＷｆを使用する本発明の方法は、時間節約的および低コスト的手法であることが理解されるであろう。上述のように、これらのパラメータは、追加費用を伴わず、自動網状赤血球測定から取得することができる。患者から血液を採取してから約１５分で血液学的分析結果を得ることができるので、ターンアラウンドタイムは非常に短い。
【００６３】
以下の実施例は、本発明の実例となるものであり、特許請求の範囲で定義する、本発明の範囲を限定するよう解釈されるものでは決してない。手順の開示に従って、様々な他の要素および割合を用いてよいことが理解されるであろう。
【実施例】
【００６４】
実施例１
貧血の共同研究を、ＲｅＣＡＭＨ、Ｃａｔｈｏｌｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｏｍｅ（イタリア）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ロンドン（英国）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ、リュブリャナ（スロベニア）、Ｍａｘｉｍａ  Ｍｅｄｉｓｃｈ  Ｃｅｎｔｒｕｍ、フェルトホーフェン（オランダ）、Ｉｎｓｅｌｓｐｉｔａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｓｐｉｔａｌ、ベルン（スイス）を含み、欧州において５つの異なる参加センターで実行した。合計１２３０の全血サンプルをこれら５つのセンターで収集し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０またはＣｏｕｌｔｅｒ  ＧＥＮ＊Ｓ血液学分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州、フラートン）、およびＢａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０または２１２０血液学分析装置（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ニューヨーク州、タリタウン）にて分析した。血液学分析装置は、製造業者が推奨する標準操作条件下で操作した。病態には、ｒ−ＨｕＥＰＯ／静脈内鉄治療下の慢性腎疾患血液透析患者、鉄欠乏性貧血、潜伏性鉄欠乏、および機能的鉄欠乏を含めた。血清フェリチンデータが入手可能な場合、鉄欠乏性貧血は、Ｈｇｂが１２ｇ／ｄｌ未満およびＳＦが２２ｎｇ／ｍｌ未満と定義し、潜伏性鉄欠乏は、ＳＦが２２ｎｇ／ｍｌ未満およびＨｇｂが１２ｇ／ｄｌより多いと定義した。絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏はまた、２８ｐｇ未満のＣＨｒおよび／または１０％より高い％Ｈｙｐｏを使用して定義した。本研究では、様々な正常な対象および臨床患者は、臨床化学試験を受けなかったことが留意される。
【００６５】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ−７５０またはＣｏｕｌｔｅｒ  ＧＥＮ＊Ｓ血液学分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社  カリフォルニア州フラートン）にて、医師が網状赤血球パラメータを要請した場合は、ＣＢＣ形態、およびＲｅｔｉｃ形態を使用してサンプルを分析した。第一のサンプル混合物を形成するために、血液サンプルの１．６μｌの第一のアリコートを６２５０：１の希釈比でＩｓｏｔｏｎ３Ｅによって希釈し、前記混合物はＤＣインピーダンス測定によって測定し、赤血球パラメータを生成した。血液サンプルの２８μｌの第二のアリコートを６ｍｌのＩｓｏｔｏｎ３Ｅで希釈し、次いで第二のサンプル混合物を形成するために１ｍｌのＬｙｓｅ  Ｓ  ＩＩＩ  ｄｉｆｆと混合した。第二のサンプル混合物の吸収を約５４０ｎｍで測定し、Ｈｇｂを取得した。血液サンプルの３４μｌの第３のアリコートを０．２ｍｌのＲｅｔｉｃ  Ｓｔａｉｎ試薬と混合し、次いで第３のサンプル混合物を形成するために２．０ｍｌのＲｅｔｉｃ  Ｌｙｓｅと混合し、前記混合物はＶＣＳ測定方法によって測定し、網状赤血球パラメータを取得した。上述の試薬はすべてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃの製品であった。
【００６６】
Ｃｏｕｌｔｅｒ血液学分析装置にて報告されるＭＣＶおよびＭＲＶを使用して、９８１のサンプルのためにＲＳｆ１を計算し、ここでＭＣＶおよびＭＲＶは双方ともフェムトリットル（ｆｌ）で表した。医師が血液検査を指示し、網状赤血球パラメータのためにすべてのサンプルを分析したわけではないことが留意される。ＲＳｆ１についての受信者動作特性（ＲＯＣ）分析は、異常な、すわなち、絶対的鉄欠乏または機能的鉄欠乏を定義するための基準として２８ｐｇ未満のＣＨｒを使用して実行した。この基準を使用して、９９のサンプルを異常と見なし、８８２を正常と見なした。図１は、取得したＲＳｆ１のＲＯＣ曲線示す。ＲＳｆ１のためのＲＯＣ曲線の下の領域（ＡＵＣ）は０．９４８である。カットオフが１０２．３以下の状態で、ＲＳｆ１はそれぞれ、感度が９１．９％、特異性が８２．２％であった。
【００６７】
ＲＯＣ分析はまた、ＲＳｆ２のためにも実行した。ＲＳｆ２のためのＲＯＣ分析からのＡＵＣは、０．９４８であった。カットオフが１０４．７３以下の状態で、ＲＳｆ２はそれぞれ、感度が９１．９％、特異性が８２．２％であった。ＲＳｆ１およびＲＳｆ２の双方に対するＲＯＣ分析結果は同じであったことが留意される。この実施例は、ＲＳｆ１およびＲＳｆ２が鉄欠乏の検出の際に実質上相当することを示す。
【００６８】
Ｃｏｕｌｔｅｒ血液学分析装置にて報告されるＭＣＶおよびＨｇｂを使用して、それぞれの血液サンプルのためにＶＨｆを計算し、ここでＭＣＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはデシリットル当たりのグラム（ｇ／ｄｌ）で表した。ＶＨｆのＲＯＣ分析は、異常な、すわなち、絶対的鉄欠乏または機能的鉄欠乏を定義するための基準として２８ｐｇ未満のＣＨｒを使用して実行した。この基準を使用して、１７７のサンプルを異常と見なし、１０５３を正常と見なした。図２は、取得したＶＨｆのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．９２１であった。カットオフが９．０以下の状態で、ＶＨｆはそれぞれ、感度が８８．７％、特異性が８４．８％であった。
【００６９】
実施例２
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ロンドン（英国）で、２４７の全血サンプルを収集し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ−７５０およびＢａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液学分析装置それぞれにて分析した。血液学分析装置は双方とも、標準操作条件下で操作した。
【００７０】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ−７５０血液学分析装置にて報告されるＭＣＶおよびＨｇｂを使用して、それぞれの血液サンプルのためにＶＨｆを計算し、ここでＭＣＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはｇ／ｄｌで表した。ＶＨｆのＲＯＣ分析は、異常な、すわなち、絶対的鉄欠乏または機能的鉄欠乏を定義するための基準として１０％より高い％Ｈｙｐｏを使用して実行した。ＡＵＣは０．８３４であった。カットオフが１０．２以下の状態で、ＶＨｆはそれぞれ、感度が８１％、特異性が７７％であった。
【００７１】
実施例３
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ロンドン（英国）で、１６６の全血サンプルを収集し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液学分析装置にて分析し、さらにＢａｙｅｒ  ＡＤＶＩＡ１２０血液学分析装置にて分析した。血液学分析装置は、標準操作条件下で操作した。対象には、鉄の静脈内投与を伴うｒ−ＨｕＥＰＯの治療下の慢性腎疾患血液透析患者、鉄欠乏性貧血、および潜伏性鉄欠乏の患者を含めた。こられの状態の定義は、実施例１に記載したものと同じであった。
【００７２】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ−７５０血液学分析装置にて報告されるＭＣＶ、ＨｇｂおよびＲＤＷを使用して、それぞれの血液サンプルのためにＶＨＤＷｆを計算し、ここでＭＣＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはｇ／ｄｌで表し、ＲＤＷはパーセンテージで表した。ＶＨＤＷｆのＲＯＣ分析は、異常な、すわなち、絶対的鉄欠乏または機能的鉄欠乏を定義するための基準として１０％より高い％Ｈｙｐｏを使用して実行した。この基準を使用して、６４のサンプルを異常と見なし、１０２を正常と見なした。図３Ａは、ＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ分析からのＡＵＣは、０．８３２であった。カットオフが５．０以下の状態で、ＶＨＤＷｆはそれぞれ、感度が８５．９％、特異性が６６．７％であった。
【００７３】
ＶＨＤＷｆのさらなるＲＯＣ分析は、異常を定義するための基準として５％より高い％Ｈｙｐｏを使用して実行した。この基準を使用して、８９のサンプルを異常と見なし、７７を正常と見なした。図３Ｂは、取得したＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８５７であった。カットオフが５．８以下の状態で、ＶＨＤＷｆはそれぞれ、感度が９１．０％、特異性が７１．４％であった。この実施例が示すように、ＶＨＤＷｆは、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の際に高感度を有した。
【００７４】
実施例４
１２ｇ／ｄｌと１３ｇ／ｄｌとの間のヘモグロビンを有する、年齢１２から４５歳の２１１人の連続無作為の女性から全血サンプルを収集した。標準操作条件下でＣｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液学分析装置にて血液サンプルを分析し、完全血球算定（ＣＢＣ）および網状赤血球パラメータを取得した。血清鉄（Ｆｅ）、トランスフェリン（Ｔｆ）、血清フェリチン（ＳＦ）、トランスフェリン飽和率（ＴＳＡＴ）を含む鉄の分析結果を化学分析装置にて取得した。さらに、ＳＦが１００ｎｇ／ｍｌより高い、正常または鉄の多いすべての女性については、遺伝性ヘモクロマトーシスの存在もまた分析した。
【００７５】
本研究から、３１の潜伏性鉄欠乏、７の潜伏性機能的鉄欠乏、９のヘモクロマトーシス、および１６４の正常な鉄の分析結果を識別した。本明細書では、潜伏性鉄欠乏はＳＦが２２ｎｇ／ｍｌ未満であることにより定義され、潜伏性機能的鉄欠乏はＴＳＡＴが２０％未満およびＳＦが１００ｎｇ／ｍより多いことにより定義され、ヘモクロマトーシスはＳＦが１００ｎｇ／ｍｌより多く、またＴＳＡＴが５０％より多いことにより定義される。さらに、先述のように、本研究に関与するすべての女性は、１２と１３ｇ／ｄｌとの間のＨｇｂを有した。これら９人のヘモクロマトーシス患者の遺伝学研究は、Ｈ６３Ｄに対して３つのヘテロ接合体変異および２つのホモ接合体変異、ならびにｇｅｎ  Ｃ２８２Ｔに対して１つのヘテロ接合体変異を示した。
【００７６】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０血液学分析装置から報告されるＭＣＶ、ＭＲＶ、ＲＤＷおよびＨｇｂからのそれぞれのサンプルのためにＲＳｆ１、ＲＳｆ２、ＶＨｆおよびＶＨＤＷｆを計算し、ここでＭＣＶおよびＭＲＶはフェムトリットル（ｆｌ）で表し、Ｈｇｂはｇ／ｄｌで表し、ＲＤＷはパーセンテージで表した。Ｔ−スチューデント検定およびＲＯＣ分析をこれらのパラメータにて実行した。表２に示すように、正常な女性と潜伏性鉄欠乏の女性との間でＶＨｆに統計的有意差が存在した。表３に示すように、正常な女性と潜伏性機能的鉄欠乏の女性との間でＶＨＤＷｆに統計的有意差が存在した。表中のカットオフ値は、ＲＯＣ分析から得ていることが留意される。
【００７７】
図４は、潜伏性機能的鉄欠乏を検出するためのＶＨＤＷｆのＲＯＣ曲線を示す。潜伏性機能的鉄欠乏の検出については、ＲＯＣ分析からのＡＵＣは０．８０であり、カットオフが１２．０４以下の状態で、ＶＨＤＷｆはそれぞれ、感度が８６．７％、特異性が７８．７％であった。
【００７８】
【表２】
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表４に示すように、ＲＳｆ２は正常な女性とヘモクロマトーシスを有する女性との間で統計的有意差を有した。ＲＳｆ１のＲＯＣ分析を実行した。図５は、ヘモクロマトーシスを検出するためのＲＳｆ２のＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．７７であった。ヘモクロマトーシスの検出については、カットオフが９２．４より高い状態で、ＲＳｆ２はそれぞれ、感度が１００．０％、特異性が４９．４％であった。ＲＳｆ１のＲＯＣ分析もまた実行した。ＲＳｆ１のＡＵＣは０．７７であり、カットオフが９６．１以上状態で、ＲＳｆ１はそれぞれ、感度が１００．０％、特異性が４９．４％であった。ＲＳｆ１およびＲＳｆ２の双方に対するＲＯＣ分析結果は実質上同じであったことが留意される。
【００７９】
とりわけ好ましい実施態様を参照して本発明を説明してきた。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく様々な変更を行うことができ、添付の特許請求の範囲内にかかる変更を含むことを意図していることが理解されるであろう。本発明を詳細に説明し、添付図面に絵画的に示してきたとはいえ、これらは本発明の範囲に関し限定するものとして解釈されるべきではなく、むしろその好ましい実施態様の適例であると解釈されるべきである。しかしながら、上記の明細書に記載し、添付の特許請求の範囲および法的同等物に定義した本発明の精神および範囲内で、様々な修正および変更を行うことができることが理解されるであろう。本明細書に引用した特許および他の刊行物のすべては、参照することにより明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、実施例１に記載するように、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の基準としてＣＨｒを使用した、ＲＳｆ１のＲＯＣ曲線である。
【図２】図２は、実施例１に記載するように、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の基準としてＣＨｒを使用した、ＶＨｆのＲＯＣ曲線である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、実施例３に記載するように、絶対的鉄欠乏および機能的鉄欠乏の検出の基準として、それぞれ１０％より高い、および５％より高い％Ｈｙｐｏを使用した、ＶＨＤＷｆのＲＯＣ曲線である。
【図４】図４は、潜伏性機能的鉄欠乏を検出するためのＶＨＤＷｆのＲＯＣ曲線である。
【図５】図５は、ヘモクロマトーシスを検出するためのＲＳｆ２のＲＯＣ曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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