(57)【要約】  本発明は、凝固活性をアッセイするための装置を提供する。前記装置では、血流の注入口及びベッセルに２つ以上の物質のパッチが含まれる。前記物質は、血流において凝固経路を開始させることができる。本発明は、凝固経路を開始させることができる物質のある区域及び凝固伝播がモニターされる区域を含む凝固伝播を測定するための装置も提供する。凝固活性のアッセイ方法、血液凝固経路の完全性のアッセイ方法、血液凝固経路の完全性に対する物質の効果のアッセイ方法、凝固伝播のモニター方法、及び１つのベッセルから別のベッセルへの凝固伝播を防ぐ方法も提供される。
2009528509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液流体の注入口、
前記注入口と流体連通しているベッセル、並びに
前記ベッセル内の少なくとも第１及び第２のパッチであって、
（ａ）前記パッチはそれぞれ、被検者の血液流体と接触すると凝固経路を開始させることができる刺激物質を含み、
（ｂ）（ｉ）前記第１のパッチ中の前記刺激物質は前記第２のパッチと異なり、又は
（ｂ）（ii）前記第１のパッチ中の刺激物質の濃度は前記第２のパッチと異なり、又は
（ｂ）（iii）前記第１のパッチは前記第２のパッチと異なる表面積を有し、又は
（ｂ）（iv）前記第１のパッチは前記第２のパッチと異なる形状を有し、又は
（ｂ）（ｖ）前記第１のパッチは前記第２のパッチと異なるサイズを有する、
前記第１及び第２のパッチを含む、
凝固活性のアッセイのための装置。
【請求項２】
複数のパッチを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
第１の組の２個のパッチのメンバー間の距離が、第２の組の２個のパッチのメンバー間の距離と異なる、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
第１の組のパッチが第１の位置にあり、第２の組のパッチが第２の位置にあり、かつ第１の組中のパッチの数が第２の組中のパッチの数と異なる、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
刺激物質が、組織因子、第II因子、第XII因子、第Ｘ因子、ガラス、ガラス様物質、カオリン、デキストラン硫酸、アミロイドβ、エラグ酸、細菌、及び細菌成分の群から選択される少なくとも１つの凝固刺激物を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
パッチがビーズである、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
ビーズをさらに含み、パッチが前記ビーズと結合している、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
パッチが不活性物質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ベッセルが２本の交差するマイクロチャネルを含み、前記チャネルが互いに流体連通している、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
被検者の血液流体を少なくとも第１及び第２のパッチと接触させること、ここで、
（ａ）前記パッチはそれぞれ、被検者の血液流体と接触すると凝固経路を開始させることができる刺激物質を含み、
（ｂ）（ｉ）前記第１のパッチ中の前記刺激物質は前記第２のパッチと異なり、又は
（ｂ）（ii）前記第１のパッチ中の刺激物質の濃度は前記第２のパッチと異なり、又は
（ｂ）（iii）前記第１のパッチは前記第２のパッチと異なる表面積を有し、又は
（ｂ）（iv）前記第１のパッチは前記第２のパッチと異なる形状を有し、又は
（ｂ）（ｖ）前記第１のパッチは前記第２のパッチと異なるサイズを有する、並びに
どのパッチが前記被検者の血液流体の凝固を開始させるかを判定すること
を含む、血液凝固をアッセイする方法。
【請求項１１】
刺激物質が健常者の血液流体の凝固経路を開始させることができる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
接触が、少なくとも最大のパッチが健常者の血液流体の凝固経路を開始させるのに十分な時間の接触である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
パッチ同士が結合している表面をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
被検者の血液流体を表面に結合した第３のパッチに接触させることをさらに含み、第１と第２のパッチ間の距離が、第２と第３のパッチ間の距離と異なる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
表面がマイクロ流体チャネルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
血液流体を、非混和流体により隔てられたプラグ内のパッチと接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血液流体を、連続する流れとしてパッチと接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
パッチがそれぞれ独立したビーズである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
パッチがそれぞれ独立してビーズに結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
各ビーズのサイズ又は形状のどちらかが異なる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
凝固経路が、血小板凝集経路である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
接触が、第１の量の血液流体を第１の濃度のビーズと接触させる第１の接触と、第２の量の血液流体を第２の濃度のビーズと接触させる第２の接触とを含み、各ビーズは刺激物質及び不活性物質を含むパッチと独立して結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
一定分量の血液流体が、サイズを増していくビーズで滴定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
判定が光学的に観測することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
判定が、光の散乱を測定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
血液流体が、全血、血液成分、血漿、血漿タンパク質の溶液、及び血液由来細胞の溶液からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
血液流体をパッチに接触させる前に、まず、過剰量の凝固因子を前記血液流体に添加することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２８】
血液流体をパッチに接触させる前に、被検物質を前記血液流体に添加することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２９】
凝血の伝播速度をモニターすることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項３０】
血液流体をパッチに接触させる前に、異なる被検者の血液流体を前記血液流体に添加することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項３１】
刺激物質を含む第１の区域、及び前記第１の区域に連通し、凝血塊の伝播をモニターするのに適した第２の区域を含み、血液流体が前記第１の区域に置かれると、凝血塊が形成され前記第２の区域に伝播する、凝血塊伝播を測定するための装置。
【請求項３２】
刺激物質を含むパッチをさらに含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
第１及び第２の区域を含むマイクロチャネルを含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３４】
複数のマイクロチャネルを含み、前記マイクロチャネルの各々は分離された第１及び第２の区域を含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３５】
少なくとも１組の交差するマイクロチャネルを含み、第２の区域が第１の組のマイクロチャネルの交差部位にある、請求項３１に記載の装置。
【請求項３６】
複数のマイクロチャネル及び前記マイクロチャネルの少なくとも２つの交差部位を含み、第２の区域が前記交差部位の１つにあり、前記２つの交差部位のサイズが異なる、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
血液流体を装置の第１の区域に接触させる段階であって、前記第１の区域が刺激物質を含んでいる段階と、
前記装置の第２の区域で凝血塊伝播をモニターする段階であって、前記第２の区域が前記第１の区域と連通している段階と
を含む、凝血塊伝播をモニターする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００６年１月３１日出願の米国仮出願第６０／７６３５７４号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
政府の利益
本発明は、ＮＳＦにより授与されたグラント番号ＣＨＥ０３４９０３４、ＯＮＲ  ＰＥＣＡＳＥにより授与されたグラント番号Ｎ０００１４−０３−１−０４８２、及びＹＩＰ（Young Investigators Program）により授与されたグラント番号Ｎ０００１４０６１０６３０の下に米国政府の支援により行われた。米国は本発明に一定の権利を有する可能性がある。
【０００３】
本発明は、血液凝固をアッセイするための方法及びデバイスの分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
止血は、出血が停止される過程のことである。止血は、血液凝固を制御する複雑な生化学的ネットワークの結果である。このネットワークの主機能の１つは、血管損傷の部位で血液凝固を開始し局在化することである。このネットワークが正しく機能できない場合、出血多量を引き起こし大出血をもたらすことがあり、又は逆に、広範囲の凝血塊伝播を起こして血栓症を、その後に心臓麻痺及び脳卒中をもたらすことがある。したがって、正しい位置で血液凝固形成を開始し、局在化した凝固応答を維持することは、このネットワークの機能には不可欠である。しかし、この応答を調節する機序は大部分は特徴付けられないままであり、米国においては、異常な血液凝固に付随する疾患が依然として第１位の死因となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血液凝固の異常を診断するために実施する実験は、インビボで存在する関連する時空間的パラメータを含む方がよい。これらのパラメータには、ｉ）血管表面上及び血管損傷領域に存在する分子を含有する不均一表面、ii）血管の幾何学を再現するチャネル、及びiii）インビボで観察される血流に類似の血流等がある。これらのパラメータを組み入れた臨床実験を行えば、血液凝固に付随する疾患がより正確に診断されると考えられ、これらの疾患に関連する死亡数を減少させる可能性がある。しかし、血液凝固に付随する疾患を診断するために使われる現在の臨床実験には、これらの時空間的パラメータは含まれていない。これらの方法には、ｉ）活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）検査、ii）プロトロンビン時間（ＰＴ）検査、及びiii）血小板凝集測定等がある。時空間的パラメータがなければ、これらの臨床試験をしても誤診を招くか、診断さえ下せない可能性がある。したがって、血液凝固に付随する疾患を診断するための新たな臨床的方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は凝固活性をアッセイするための装置を提供する。一実施形態では、装置には、血液流体の注入口、注入口と流体連通しているベッセル、及びベッセル内の少なくとも２つのパッチが含まれる。パッチにはそれぞれ、被検者の血液流体と接触させると凝固経路を開始させることができる刺激物質が含まれる。１つのパッチの刺激物質は、もう１つのパッチの刺激物質とは異なり、又は前記１つのパッチの刺激物質の濃度は第２のパッチとは異なり、又は１つのパッチはもう１つのパッチとは異なる表面積を有し、又は１つのパッチはもう１つのパッチとは異なる形状を有し、又は１つのパッチはもう１つのパッチとは異なるサイズを有する。
【０００７】
装置は複数のパッチを含んでいてよい。その例では、１組のパッチ間の距離は別の組のパッチ間の距離とは異なっている。
【０００８】
装置は、第１の組のパッチは第１の位置にあり第２の組のパッチは第２の位置にあり、前記第１の組のパッチの数は第２の組のパッチの数とは異なっているベッセルの表面と結合した複数のパッチを含んでいてよい。刺激物質は、組織因子、第II因子、第XII因子、第Ｘ因子、ガラス、ガラス様物質、カオリン、デキストラン硫酸、細菌、及び細菌成分の群から選択される少なくとも１個の凝固刺激物を含んでいてよい。
【０００９】
装置は、ビーズを含んでいてよく、パッチは前記ビーズと結合している。装置は、ビーズであるパッチを含んでいてよい。パッチも不活性物質を含んでいてよい。
【００１０】
装置のベッセルは、互いに流体連通している２本の交差するマイクロチャネルを含んでいてよい。
【００１１】
本発明は、血液凝固をアッセイする方法を提供する。前記方法は、被検者の血液流体を、それぞれが被検者の血液流体と接触すると凝固経路を開始させることができる刺激物質を含んでいる少なくとも２つのパッチに接触させることを含む。１つのパッチの刺激物質は、もう１つのパッチの刺激物質と異なっている、又は前記１つのパッチの刺激物質の濃度が第２のパッチとは異なっている、又は１つのパッチはもう１つのパッチと異なる表面積を有している、又は１つのパッチはもう１つのパッチと異なる形状を有し、又は１つのパッチはもう１つのパッチと異なるサイズを有している。前記方法は、どのパッチが被検者の血液流体の凝固を開始させるかを判定することを含む。
【００１２】
前記方法を実施すると、刺激物質は健常者の血液流体に凝固経路を開始させることができる可能性がある。接触は、少なくとも最大のパッチが健常者の血液流体に凝固経路を開始させるのに十分な時間維持される。前記方法は、サイズが異なる場合もある第１及び第２パッチで実施することができる、又は第１及び第２パッチの刺激物質が異なっていてもよい。同様に、第１及び第２パッチの刺激物質の濃度が異なっていてもよい。
【００１３】
前記方法は、パッチが表面に結合しており、第１と第２のパッチ間の距離が第２と第３のパッチ間の距離とは異なる第３及び第４パッチに被検者の血液流体を接触させることも含んでいてよい。
【００１４】
前記方法は、互いに独立してビーズに結合しているパッチで実施してよい。各ビーズのサイズ又は形状のいずれかは異なっていてよい。さらに、前記方法は、凝固経路が血小板凝集経路である場合に実施してよい。
【００１５】
被検者の血液流体をパッチに接触させることは、まず第１の量の血液流体を第１の濃度のビーズに接触させ、次に第２の量の血液流体を第２の濃度のビーズに接触させることを含んでいてよく、各ビーズは独立して、刺激物質及び不活性物質を含むパッチと結合している。一定分量の血液流体が、サイズを増していくビーズで滴定されてよい。前記血液流体は、連続する流れとしてパッチに接触させてよい。代わりに、血液流体は非混和流体により隔てられたプラグとしてパッチに接触させてよい。同様に、ベッセルはマイクロ流体チャネルであってよい。
【００１６】
どのパッチが凝固を開始させるかの判定は、光学的に観測することを含んでいてよい。この判定は、散乱光の測定を含んでいてよい。
【００１７】
前記方法は、全血及び血漿からなる群から選択される血液流体で実施してよい。
【００１８】
前記方法は、血液流体をパッチに接触させる前に、まず、過剰量の凝固因子を血液流体に添加することを含んでいてよい。前記方法は、血液流体をパッチに接触させる前に、被検物質を血液流体に添加することを含んでいてよい。前記方法は、血液凝固の伝播速度をモニターすることを含んでいてよい。前記方法は、血液流体をパッチに接触させる前に、異なる被検者の血液流体を血液流体に添加することも含んでいてよい。
【００１９】
本発明は、凝血塊伝播を測定するための装置を提供する。前記装置は、刺激物質を含む１つの区域、及び第１の区域と流体連通していて凝血塊の伝播をモニターするのに適した別の区域を含む。血液流体が第１の区域に置かれると、凝血塊が形成され第２の区域に伝播する。
【００２０】
前記装置は、刺激物質を含むパッチを含んでいてよい。前記装置は、第１及び第２の区域を含むマイクロチャネルを含んでいてよい。代わりに、前記装置は、それぞれのマイクロチャネルが第１及び第２の区域を含む、複数の平行なマイクロチャネルを含んでいてよい。
【００２１】
前記装置は、第２の区域が第１の組のマイクロチャネルの交差部位にある、少なくとも１組の交差するマイクロチャネルを含んでいてよい。前記装置は、第２の区域が前記交差部位の１つにあり、前記２つの交差部位のサイズが異なっている、複数のマイクロチャネル及びマイクロチャネルの少なくとも２つの交差部位を含んでいてよい。
【００２２】
本発明は、血液流体を装置の第１の区域に接触させ、前記第１の区域が刺激物質を含む段階と、前記装置の第２の区域で凝血塊伝播をモニターし、前記第２の区域が前記第１の区域と連通している段階を含む、凝血塊伝播をモニターする方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の原理に対する理解を促進するために、ここである好ましいその実施形態に言及し、特定の言語を使ってそれを説明することにする。にもかかわらず、それによって本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。本明細書に記載する本発明の原理のいかなる改変、さらなる修正及び適用も、本発明が関係する分野の当業者には普通に思い浮かぶと考えられるように、企図されている。
【００２４】
血液の凝固は、その間血液が固形の凝血塊を形成する複雑な過程である。血液凝固は、止血（損傷を受けた血管からの失血の休止）の重要な部分であり、それによって損傷を受けた血管壁はフィブリン塊に覆われ、出血を止め損傷を受けた血管の修復を支援する（Davie, 2003, J.Biol. Chem. 278: 50819-50832；Nemerson, 1988, Blood 71:1-8において概説されている）。手短に言えば、血管が損傷すると、血小板が内皮下組織の巨大分子に接着し、次に凝集して一次止血血栓を形成する。前記血小板は血漿凝固因子の局所的活性化を刺激し、血小板凝集体を補強するフィブリン塊が生成される。凝固カスケードでは、「接触活性化」経路（「内因性」経路としても知られる）及び組織因子経路（「外因性」経路としても知られる）によりフィブリンが形成される。創傷治療が生じると、前記血小板は凝集し、フィブリン塊は分解される。血小板凝集体及びフィブリン塊の形成を損傷部位に限定する機序は、血液の流動性を維持するために必要である。
【００２５】
本発明は、表面上の血液流体の凝固時間を測定するために使うことのできる装置（「デバイス」とも呼ばれる）を提供する。前記装置は、ウェット若しくはドライエッチングなどの技術及び/又は従来のリソグラフィー技術又はソフトリソグラフィーなどのマイクロマシニング技術などの技術を使って製作又は製造することができる。本明細書で使用するように、用語「装置」は、微細加工デバイスと呼ばれ、知られ、又は分類される装置を含む。
【００２６】
一例では、本発明に従った装置は、一辺約０．３ｃｍから約１５ｃｍ間の寸法、及び約１μｍから約１ｃｍの厚さを有していてよいが、前記装置の寸法はこれらの範囲外にあってもよい。前記装置は、種々の材料から作製することができるが、典型的には、高分子化合物、金属、ガラス、複合材料、又は他の比較的不活性な材料などの適切な材料で作製される。前記装置の表面は、滑らかでもパターン形成されてもよい。前記装置の側面が異なれば表面が異なっていてよい。
【００２７】
一実施形態では、本発明の装置は、血液流体の注入口、前記注入口と流体連通しているベッセル、及び前記ベッセル中の少なくとも１個のパッチを含む。前記パッチは、被検者の血液流体などの試料に接触させると、凝固経路を開始させることができる凝固刺激物（「刺激物質」とも呼ばれる）を含む。前記パッチは、不活性物質も含んでいてよい。前記不活性物質は、前記刺激物質と混合させてもよい。
【００２８】
装置の表面は、外因性凝固経路の活性化剤及び内因性凝固経路の活性化剤を含む血液凝固刺激物を含有することができる。
【００２９】
例えば、表面は、組織因子（ＴＦ）などの外因性凝固経路を開始させることができる凝固刺激物を含むことができる。表面は、ガラス、ガラス様物質、カオリン、細菌成分、デキストラン硫酸、アミロイドβ、エラグ酸、及びその他の人工表面などの内因性凝固経路を開始させることができる凝固刺激物を含むことができる。
【００３０】
前記凝固刺激物は、凝固を開始させることができるあらゆる表面である。凝固を開始させることがよく知られている表面には、負に帯電した表面（Gailani and Broze, 1991, Science 253: 909）及び結合凝固因子を有する表面（Mann, 1999, Thrombosis and Haemostasis 82: 165）がある。凝固を開始させることが知られている負に帯電した表面には、ガラス、デキストラン硫酸、及び細菌成分がある（Persson et al., 2003, J. Biological Chemistry 278: 31884）。表面に結合すると凝固を開始させることが知られている凝固因子には、組織因子、第XII因子、第Ｘ因子、及び第II因子がある（Kop et al., 1984, J. Biological Chemistry 259: 3993；Mann, 1999, Thrombosis and Haemostasis 82: 165）。さらに、多くの細胞が刺激物として機能することができる表面を提供する（Mann et al., 1990, Blood 76: 1）。
【００３１】
装置は１種類の血液凝固刺激物を含有することができる。代わりに、装置は２種類以上の刺激物を含有することができる。表面上の各刺激物の濃度は変化することができる。例えば、凝固刺激物は、生理学的濃度、薬剤的関連濃度、生理学的濃度以上、又は生理学的濃度以下で使うことができる。２種類以上の刺激物は互いに混合することができる。その刺激物は溶液中にあってもよい。その刺激物はプラグ中にあってもよい。プラグを使う技術は、以下の米国特許及び特許出願、即ち、米国特許第７１２９０９１号Ｂ２、米国特許出願公開第２００６／０００３４３９号Ａ１、米国特許出願公開第２００６／００９４１１９号Ａ１、及び米国特許出願公開第２００５／００８７１２２号Ａ１に記載されており、これらの特許文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【００３２】
１つ又は複数の刺激物は他の物質、不活性物質、担体、薬剤、等と混合することができる。例えば、一好ましい実施形態では、再脂質付加ＴＦは、１ｐｍｏｌ／Ｌ〜１０００ｐｍｏｌ／Ｌ（５〜５０００ｎｍｏｌ／Ｌリン脂質小胞（ＰＣＰＳ）中）の濃度で使うことができる。ＰＣＰＳは、例えば、ウシ脳由来の２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）及び卵黄由来の７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）で構成することができる。ＴＦが小胞溶液中にある場合、小胞溶液中の好ましいＴＦ濃度は、約０．１０ｎＭ〜約１０００ｎＭである。代わりに、ＤＬＰＣ／ＰＳ／テキサスレッド（Texas Red）（登録商標）ＤＨＰＥ（７９．５／２０／０．５モル％）と１×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水／Ｃａ２＋緩衝液中０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ濃度の再形成ＴＦの混合小胞を使うことができる。ＴＦをパッチで使用する場合、好ましいＴＦ濃度は、約０．０００１ｆｍｏｌ／ｃｍ２〜約１．０ｆｍｏｌ／ｃｍ２である。さらに、パッチで使用するＴＦでは、０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭのＴＦ最終濃度が好ましい。
【００３３】
１個又は複数個の刺激物を含むパッチを、デバイスの表面に組み込むことができ、典型的にはその表面は不活性である、又は大部分が不活性である。パッチ内の凝固刺激物の濃度は変化させることができる。したがって、装置の表面は、形状、サイズ、刺激物の種類、及び刺激物の濃度が可変である複数のパッチを有することができる。一例では、表面は、同一又は異なるパッチ面積を有する、多様な形状の刺激物のパッチでパターン形成されている。
【００３４】
パッチの形状及びサイズは変化することができる。パッチの形状及びサイズについて三次元の考慮すべき点には、パッチの幾何学と寸法両方について考慮すべき点が含まれる。一例では、パッチは、対称的な又は規則的な形状（例えば、円、正方形、長方形、三角形、星形、等）を有することができる。代わりに、パッチはサイズ及び形状が不規則であることができる。表面上のパッチの数及び密度は変化することができる。好ましくは、表面の約１％がパッチで覆われている。パッチは、マイクロ流体チャネルの壁に位置していてもよい。
【００３５】
ある実施形態では、装置はチャネルの形で製造することができる。好ましくは、装置がチャネルの形で製造される場合、装置はマイクロチャネルである。他の実施形態では、装置は、パッチがすでに組み込まれている製造されたチャネル（ベッセル）を有することができる。一実施形態では、装置は、流体連通を提供する２つ以上の相互接続したチャネルを含むことができる。チャネルは、長さ、幅、厚み、深さなどの異なる寸法及び配置を有することができ、正方形、長方形、三角形、円形の横断面、等を含む異なる形の横断面も有することができる。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、１つ又は複数のチャネルを含む装置を提供する。例えば、そのような装置は、チャネルが微細設計されたマイクロ流体デバイスの形で製造することができる。装置が少なくとも１つ又は複数のチャネルを有する場合、チャネルの横断面は、均等でもよいし不均等でもよい。チャネルは同一の又は異なる流速を提供してよい。チャネルは角度が並行でもよいし、チャネルが交差していてもよい。チャネルは接合点があってよく、その接合点は凝血塊伝播を評価するために使ってよい。好ましくは、接合点は、Ｙ字路又はＴ字路などの三方向接合点（接合点が３つのアームを有する）である。前記アームは均等な流速を提供することができる。代わりに、前記アームは異なる流速を提供することができ、その場合アームの１つは一般に直径が異なる。刺激物は、好ましくは接合点で、チャネル内に添加することができる。
【００３７】
さらに別の実施形態では、本発明は、チャネルに沿って１つ又は複数のパッチを含む装置を提供する。装置は、少なくとも２つのチャネルも含んでよい。この例では、パッチは１つ又は複数のチャネルに沿って位置していてよい。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、少なくとも２つのチャネルのある装置の中を試料が連続して流れる装置を提供する。この実施形態では、液体は１つのチャネル中を流すことができ、試料はもう１つのチャネルを介して導入することができる。例えば、前記液体は添加物、凝固刺激物、薬剤を含むことができ、又は前記液体は坦体液体でよい。
【００３９】
一実施形態では、パッチはビーズ上に存在することができる。代わりに、ビーズそれ自体がパッチになることができる。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの接合点を備えたチャネル中を流れるビーズ上にパッチがある装置を提供する。
【００４０】
一実施形態では、試料を導入した後には流れはない。これは、例えば、疎水性ガラス毛細管を使って実行することができる。試料は、液体をポンプで装置内に送ることなく導入することができるであろう。代わりに、試料は接合点を介して導入することができる。
【００４１】
試験物質を装置内に導入することができる。血液凝固及び／又は血液伝播に対する試験物質の効果は、モニターすることができる。試験物質は、候補調合薬、小分子、有機又は無機分子、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、化合物ライブラリーのメンバー、ペプチド模倣薬、等であってよい。試験物質は、血液をパッチに接触させる前及び／又は血液をパッチに接触させた後に添加することができる。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、種々の刺激物を含有するプラグを含有する１つ又は複数のチャネル、及び試料をプラグに導入するための入口ポートを備えた装置を提供する。装置は、凝固を促進するための少なくとも１つの接合点を含んでいてよい。
【００４３】
パッチを備えた装置は、例えば、Zheng et al., 2004, Advanced Materials 16: 1365-1368；Delamarche et al., 2005, Advanced Materials 17: 2911-2933；Sia and Whitesides, 2003, Electrophoresis 24: 3565-3576；Unger et al., 2000, Science 288: 113-116に記載されているように、当技術分野で公知の方法を使って製造することができる。これらの出版物は、事実上その全体を参照により本明細書に組み込まれているものとする。一例では、装置は、少なくとも一部分はエラストマー材料から構築し、並びに単層及び多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）技術及び／又は犠牲層カプセル化法により構築してよい。基本的ＭＳＬ法は、一連のエラストマー層をミクロ機械加工された鋳型に流し込み、前記鋳型から前記層を取り除き、次に前記層同士を融合させる。犠牲層カプセル化法では、チャネルが必要な場所ではどこでもフォトレジスト模様を沈着させる。
【００４４】
所望の形状をしたパッチは、１）パッチは、支持された脂質膜での微小パターン形成により作製することができる（Groves and Boxer, 2002, Accounts Chem. Res. 35: 149-157）；２）パッチは、フォトリソグラフィーを使って作製することができる。フォトリソグラフィーを使って、不活性脂質の背板に再形成ＴＦを有する脂質でパッチを作製することができる（Yee et al., 2004, J. Am. Chem. Soc. 126: 13962-13972；Yu et al., 2005, Advanced Materials 17: 1477-1480）。フォトリソグラフィーを使って、不活性疎水性ガラスの背板に疎水性ガラスでパッチを作製することもできる（Howland et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127: 6752-6765）；３）スキャニングプローブリソグラフィーを使ってパッチを作製することができる（Jackson and Groves, 2004, J. Am. Chem. Soc. 126: 13878-13879）；４）インクジェット印刷又は表面に小液滴を飛ばす類似の技術などの技術を使って表面にパッチを印刷することができる（Steinbock et al., 1995, Science 269: 1857-1860）；５）ミクロ接触プリンティングを使ってパッチを作製することができる（Xia and Whitesides, 1998, Annual Review of Materials Science, 28: 153-184）；６）パッチはビーズと結合させ、上の若しくは他の方法を使ってパターン形成することができる、又は均一表面組成物にしてパターン形成はしないでもよいを含むがこれらに限定されることはない、いくつかの方法により作製することができる。
【００４５】
１つ又は複数の凝固刺激物を含有する表面で凝固が起きるためには、表面のサイズは一定の閾値サイズよりも大きくなければならない。本発明によれば、血液凝固に関する「閾値パッチサイズ」とは、血液凝固を開始させるパッチサイズの下限値のことである。パッチの形状が異なれば（例えば、正方形対星形）、閾値、即ち凝固ポテンシャルも異なる。同様に、パッチの寸法を変えれば（例えば、長方形パッチの長さ対幅の比）、凝固ポテンシャルも異なってくる。したがって、パッチの形状により、凝固が起こりうるかどうかがわかる。パッチの厚み又は深さは、通常、約１ｎｍ〜約１μｍの範囲である。パッチは、約１ｎｍ〜約１ｍｍの幅のビーズであってもよい。
【００４６】
本発明をさらによく説明するために、パッチサイズは、互いにもっとも離れているパッチの２点間の最大距離で表すことができる。例えば、円形のパッチのパッチサイズは、その円の直径に等しい。正方形のパッチのパッチサイズは、その正方形の対角に等しい。通常、本発明を実施するのに有用なパッチは、約０．０１μｍ〜約５００μｍの閾値サイズを有する。好ましくは、閾値パッチサイズは約１００μｍ未満である。パッチサイズをパッチの面積として表すのも有用である。これは、形状が異なるパッチを比較するのに特に有用である。好ましくは、パッチ面積は約１μｍ２〜約１ｍｍ２である。
【００４７】
本発明を実施するのに有用なパッチには、閾値パッチサイズよりも小さなパッチがあり、これらのパッチは、「閾値以下」パッチと呼ぶこともできる。閾値パッチサイズは、刺激物濃度、薬剤濃度、及び供血者に依存している。好ましくは、凝固は約１μｍ〜１ｃｍより大きいサイズのパッチを使って測定される。ナノパターン形成技術を使えば、ナノメーター目盛りで凝固の開始を測定することができる。
【００４８】
互いに近づけられた閾値以下パッチのクラスターは凝固を開始させるであろう。凝固が起きる閾値以下パッチ間の距離は、ほぼ閾値パッチサイズである。
【００４９】
例えば、特定の血液試料及び刺激物濃度では、閾値パッチサイズは７５μｍでよい。その場合、７５μｍより大きなパッチは急速に凝固を開始し、７５μｍ未満のパッチは凝固を開始しないであろう。５０μｍのパッチは、２５０μｍ間隔をあけられると凝固を開始させないが、２５μｍ間隔をあけられると凝固を開始させるであろう。
【００５０】
パッチは、１つ又は複数の標識、レポーター分子、蛍光分子、色素（例えば、ｐＨ感受性、トロンビン感受性）、微生物（例えば、細菌、ウイルス）、薬剤、タンパク質、代謝物、金属イオン、凝固因子、凝血原因子若しくは薬剤、抗凝固因子若しくは薬剤、線維素溶解性因子若しくは薬剤、又は他の化合物などの、種々の添加物を含むことができる。これらの化合物は、パッチに埋め込む、凍結乾燥する、コンジュゲートする、又は他のあらゆる方法で付着させることができる。これらの化合物は、本発明のある好ましい実施形態、例えば、ある種のアッセイで、アッセイの視覚化のために、外部的に添加された物質の血液凝固に対する影響を試験するために、等で使うことができる。所与のパッチにおけるこれらの化合物はいずれでも濃度は変化することができる。そのような化合物は２種類以上パッチに添加することができる。これらの化合物はどれでも１つを、１つ又は複数のパッチに組み込むことができる。溶液中の凝固をモニターする場合も、添加物を使うことができる。
【００５１】
パッチでの所与の凝固刺激物の濃度を変えると、閾値パッチサイズは予測可能な形で変わる。さらに、凝固阻害薬の濃度を変えると、閾値パッチサイズが特定の形で生じる。異なる供血者（血液が不健康な供血者を含む）の血液流体を使えば、異なる閾値パッチサイズが予測可能な形で得られる。さらに、閾値パッチサイズは、刺激物濃度及び添加される薬剤によって変化する。
【００５２】
小パッチは、そのグループが互いに近づけられる場合、凝固を開始させることができる。パッチ間の距離は、約０．０１μｍ〜約５００μｍの範囲で変化することができる。好ましくは、パッチ間の距離は約１００μｍ未満である。第１の組の少なくとも２つのパッチのもっとも接近したメンバー間の距離は、第２の組の少なくとも２つのパッチのもっとも接近したメンバー間の距離と異なっていてよい。
【００５３】
一部の実施形態では、パッチは個々に使うことができるが、他の実施形態では、一部のパッチは、それと類似しているパッチでも類似していないパッチでも、他のパッチと協調して使うことができる。したがって、この装置の一実施形態では、類似する又は類似していない刺激物のパッチを、不活性な背板に組み込むことができる。
【００５４】
パッチを備えた表面は溶液中に浮遊させることができる。同様に、表面は粒子又はビーズとして形成することができる。したがって、本発明を実施するのに有用なパッチは、粒子又はビーズと結合させることができる。代わりに、パッチは三次元であり、粒子又はビーズの形を取ることができる。粒子又はビーズのサイズ及び形状は変えることができる。
【００５５】
本発明の装置は、（ｉ）血液凝固のアッセイ、（ii）凝血塊伝播のアッセイ、（iii）血液凝固経路の完全性のアッセイ、（iv）血液凝固経路の完全性に対する物質の効果のアッセイ、及び（ｖ）１つのベッセルから別のベッセルへの凝血塊伝播防止のためのアッセイを含む種々のアッセイのために使うことができる。
【００５６】
通常、本発明の方法は、試料を本発明に従って記載されたパッチに接触させることを含む。アッセイする試料は、好ましくは全血又は血液流体（血液含有流体、例えば、血漿）であるが、血液成分、血漿タンパク質溶液、及び血液由来細胞の溶液を含むこともできる。試料は、ヒト並びにラット、マウス、及びゼブラフィッシュなどの非ヒト動物を含む、様々な被検体から入手することができる。好ましくは、試料はヒトから入手される。
【００５７】
試料は単一検体から入手することができる。代わりに、試料は複数の検体から入手することができる。複数の検体又は複数の被検体由来の試料は、パッチに接触させるのに先立って混合することができる。代わりに、複数の検体又は複数の被検体由来の試料は、順次パッチに接触させることができる。試料は、健康なヒト又は非ヒト被検体から入手することができる。代わりに、試料は、不健康なヒト又は非ヒト被検体から入手することができる。健康な及び不健康な被検体から入手される試料を混合し、その混合物をアッセイに使うことも可能である。同様に、健康な及び不健康な被検体由来の試料を、いかなる順序でも順次パッチに添加することが可能である。
【００５８】
試料は、１つ又は複数の標識、レポーター分子、蛍光分子、色素（例えば、ｐＨ感受性、トロンビン感受性）、微生物（例えば、細菌、ウイルス）、薬剤、タンパク質、代謝物、金属イオン、凝固因子、凝血原因子若しくは薬剤、抗凝固因子若しくは薬剤、線維素溶解性因子若しくは薬剤、又は他の化合物などの、種々の添加物を含むことができる。これらの化合物は、本発明のいくつかの好ましい実施形態、例えば、ある種のアッセイで、反応又は血液凝固伝播の視覚化のために、血液凝固に対する外部的に添加された物質の影響を試験するために、等で使うことができる。試料中のこれらの化合物のいずれでも濃度は変化することができる。これらの化合物はいずれでも１つを、１つ又は複数のパッチに接触させる１つ又は複数の試料に組み込むことができる。パッチと試料両方への同一の又は異なる添加物を含むことも可能である。
【００５９】
試料はパッチに接触させる。試料はパッチ上に置くことができる。例えば、試料は、パッチ上にピペットで取る又は毛細管を使ってパッチに送達することができる。試料を表面上に連続して流し、それによって１つ又は複数のパッチに接触させることができる。代わりに、試料は、パッチと接触することになる表面上に置くことができる。同様に、試料がパッチと接触するように、パッチを試料内に置くことができる。
【００６０】
パッチに接触する試料の量は変化することができる。典型的には、１×１０６μｍ２のパッチ面積当たり、約２０μｌ〜約１００μｌの試料を使う。好ましくは、１×１０６μｍ２のパッチ面積当たり、約５０μｌの試料を使う。
【００６１】
本発明の装置の一実施形態は、ヒトの血液が凝固するポテンシャルを測定するための方法で、使うことができる。そのポテンシャルは、凝固の時間又は尤度に基づいて判定することができ、以下のパラメータ、即ち刺激物濃度；パッチのサイズ；パッチの濃度；パッチ間の距離；パッチの形状；粒子のサイズ；粒子の形状；粒子の濃度；刺激物の種類；血液の流速；薬剤、金属イオン、凝固因子などの添加物の濃度；及び正常な血液流体の添加のうちの１つ又は複数を変化させることができる。これらの例は以下に示す。
【００６２】
一例では、本発明は、凝固時間を測定するための方法を提供する。凝固時間は、すでにパッチに接触させた試料で測定される。血液又は血液流体の凝固は、試料の、パッチの、又は両方の光学特性の変化として光学的に観測してもよい。一態様では、光学特性は、色、吸光度、蛍光、反射率、又は化学発光の変化でよい。光学特性は、アッセイ中１回又は複数回測定してもよい。凝固時間は、試料、パッチ、又は両方からの光の散乱を測定することにより検出してもよい。凝固時間は、試料間で比較することができる、又はまったくパッチのない表面上の凝固時間と比較することができる。
【００６３】
凝固が開始された後の凝血塊が成長する能力は、異なるパッチ及び表面上での、並びに異なるチャネル（ベッセル）における凝血塊伝播速度により判定することができる。例えば、凝血塊前面の伝播速度は、時間に対する距離として判定し表すことができる。
【００６４】
凝血塊伝播は、流動状態の下で測定することができる。代わりに、凝血塊伝播は、流動がない状態の下でも測定することができる。
【００６５】
図２１〜２６は、接合点を通る凝血塊伝播の調節を図示する。凝血塊伝播は、血液が流れているベッセル（流動ベッセル）の接合点での剪断速度
2009528509.tif 000003
［秒］によって停止し又は継続する。さらに、接合点を通る凝血塊伝播は、接合点での剪断速度
2009528509.tif 000004
［秒］により調節される。
【００６６】
血液凝固のアッセイは、（ｉ）被検体の血液凝固ポテンシャルを判定する；（ii）凝固刺激物の効果をスクリーニングする；（iii）凝血塊開始、形成、及び伝播に影響を与える薬剤候補をスクリーニングする；並びに（iv）凝血塊開始、形成、及び伝播に影響を与える可能性のある薬剤濃度をスクリーニングするを含む種々の理由で使うことができる。
【００６７】
血液凝固の開始は、本発明の方法を使ってアッセイすることができる。血液凝固の開始は、パッチサイズに対する閾値応答を示す。一例では、本発明は、表面刺激のパッチ上での凝固開始を説明するダムケラー数に基づくスケーリング則を提供する（Kastrup et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 15747-15752）。したがって、凝固開始はパッチ上の活性化因子の生成を表す反応時間スケールｔｒと、パッチからの活性化因子の拡散輸送を表す拡散時間スケールｔＤ間の競合に依存している（図１）。ダムケラー数、Ｄａ＝ｔＤ／ｔｒの大きさは、パッチの直径ｐにより示される。パッチからの活性化因子の拡散が急速に起こる時の小ｐは、小ｔＤ及び小Ｄａに相当し、活性化因子が、パッチの中心から縁に向かって長時間かけて拡散する時の大ｐは大ｔｒ及び大Ｄａに相当する。ｔｒが速くｔｄが遅い場合は、凝固開始は大Ｄａで起こるであろう。スケーリング方程式ｔ＝x２／Ｄ、関連時間ｔ、距離x、及び特定分子の拡散係数Ｄは十分に確立しており、血液凝固を開始させるのに必要とされる閾値パッチサイズｐｔｒを予測するのに利用することができる。定数ｔｒをもつ特定の表面では、反応が起きる前に活性化因子の分子が拡散する距離は、ｐｔｒの直径とほぼ同じ距離になるはずである。即ち、反応が起きるのにある程度の時間（ｔｒ）がかかり、ある決定的に重要なパッチ直径（ｐｔｒ）では、分子は反応が起きることができる前にパッチから拡散することができる。したがって、
ｐｔｒ＝（Ｄ×ｔｒ）１／２
に従って、ｐｔｒはｔｒ１／２.を用いて概算すべきである。
【００６８】
前式で、ｐはパッチの直径であり、ｔｒは反応時間スケールである。
【００６９】
図１は、活性化因子の拡散（Ｄ矢印）と反応（Ｒ矢印）間の競合が、所与のパッチ（ｐ）上で凝固開始が起きるかどうかを決定する様子を図示する。この試料のパッチは、正方形表面上での斜視図で示される円として提示されている。拡散の時間スケールは、パッチサイズに依存しており、反応の時間スケールはパッチサイズとは無関係である。パッチｐの直径が大きい場合、反応が拡散に勝り、凝固が開始されるであろう。パッチｐの直径が小さい場合、拡散が反応に勝ってパッチから活性化因子を迅速に移動させ、凝固は開始しないであろう。
【００７０】
本発明に従った装置及び方法を伴う様々な適用には、診断道具の開発のため及び創薬における、伝播波及び前線を含む閾値応答の観測及び測定がある。閾値応答の観測及び測定は、パッチ、パターン形成表面、若しくはプラグを使って、又は１つ若しくは複数のパッチ、パターン形成表面、及びプラグを組み合わせることにより実施することができるであろう。
【００７１】
パッチ上での血液凝固の開始に対する閾値を測定する場合、この測定は、表面の化学的性質が異なり、全血若しくは血漿を含有するパッチのサイズが異なるビーズ又は粒子で滴定し、ビーズ／粒子組成に対する凝固開始の依存度をモニターすることにより実施することができるであろう。例えば、パッチは血液流体中に浮遊するビーズ上に位置していてもよい。一定分量の血液流体を、ビーズの数を増やしながら滴定してもよい。一定分量の血液流体を、サイズが増えていくビーズで滴定してもよい。血液流体は、連続する流れとしてパッチまで輸送してもよい。血液流体は、非混合流体により隔てられたプラグとしてパッチまで輸送してもよい。
【００７２】
本発明は、１つのベッセルから別のベッセルへの凝血塊伝播を、剪断速度に基づいてアッセイするための方法を提供する。剪断速度は、表面からの距離の増加に従った、局所的流速Ｖ［ｍ／秒］の変化を表す。剪断速度は、表面近傍のあらゆる方向への輸送を判定する。圧力駆動流では、表面での局所的流速［ｍ／秒］はゼロである。
【００７３】
本発明は、凝血塊が伝播する速度並びに、凝血塊形成及び伝播に関係する疾患がこの血液凝固伝播速度をどのように変化させるかを測定するための方法も提供する。そのような血液凝固障害又は疾患には、血友病、遺伝性出血性疾患、活性型プロテインＣ抵抗性、フォンウィルブランド病、及び凝固性亢進がある。凝血塊伝播の速度を緩めることが知られている凝血因子欠損症の例は、第VIII因子（ｆVIII）、第Ｘ因子（ｆＸ）、及び第XI因子（ｆXI）である（Ovanesov et al., 2005, J. Thromb. Haemost. 3: 321-331）。これらの因子欠損症は、以下の出血疾患と関連があり、即ち、ｆVIIIの欠損により血友病Ａに、ｆＸの欠損によりスチュワートプラウアー病に、及びｆXIの欠損により血友病Ｃになる。本発明の方法を使って、血液凝固に影響を及ぼす可能性がある薬物療法を受けている被検者の試料を検査してもよい。
【００７４】
本発明を使って、凝血塊伝播に影響を及ぼす薬剤を求めてスクリーニングすることができる。例えば、トロンビン阻害剤、トロンボモジュリン、他の凝固阻害剤、又はその混合物を、試料に、パッチに、又は試料とパッチ両方に添加することが可能である。同様に、前記方法は、血液流体をパッチに曝露する前に、試料にトロンボモジュリン又は他の凝固阻害剤を添加することを含んでよい。凝固阻害剤は、凝血塊伝播を減少させると予想され、本発明に従ったアッセイは、これらの化合物の効果をより特徴付けるように行うことができる。代わりに、パッチへの又は試料への添加剤は、１つ又は複数の血液凝固因子を含むことができる。同様に、前記方法は、血液流体をパッチに曝露する前に、被検者の血液流体に過剰量の凝固因子を添加することを含んでよい。凝固因子は、凝血塊伝播を増加させると予想され、本発明に従ったアッセイは、これらの化合物の効果をより特徴付けるように行うことができる。
【００７５】
本発明は、血液凝固経路の完全性をアッセイする方法を提供する。血液凝固経路は、血小板凝集経路であってよい。本発明は、血液凝固経路の完全性に対する物質の効果をアッセイする方法も提供する。
【００７６】
本発明は、異なった血液試料由来の凝血塊がどのように伝播するかを判定するための方法も提供する。さらに、本発明は、血流の存在がどのように血液凝固伝播をもたらすのかを判定するための方法を提供する。一例では、本発明は、異なったチャネル配置が血液凝固伝播をどのように変えるかを判定するための方法を提供する。サイズが異なる接合点を通って伝播する被検者の血液の血液凝固感受性の測定を利用すれば、特定の薬剤濃度の効果を評価する、又は凝固過程に関与する特定の酵素及びタンパク質の異常を検出することができると考えられる。特定の血液試料がサイズが異なる接合点を通って伝播する能力は、その血液中の薬剤濃度及び特定酵素の活性に依存するであろう。
【００７７】
本発明は、異なる薬剤及び他の分子、並びに／又は天然のタンパク質の濃度の変動が血液凝固伝播速度に対して有する効果をモニターするために利用することができる方法も提供する。特定の薬剤の存在の下での及び不在の下での血液凝固成長速度の測定を利用すれば、凝血塊がどれほどよく成長するかを判定することができると考えられる。例えば、本発明の方法を使えば、トロンビン阻害剤が、閾値剪断速度以下でチャネルの接合点を通る凝血塊伝播を予防できることを実証することが可能である。代わりに、様々な刺激物及び濃度を含有するパッチを使ってこれを試験することができる。
【００７８】
本発明は、１つのベッセルから別のベッセルへの凝血塊伝播防止のためのアッセイ法を提供する。パッチがチャネルの形の、又はパッチが、互いに流体連通している流体チャネルの表面に組み込まれた本発明の装置を製造することができる。前記チャネルの配置は、凝固活性の範囲が測定できるように製造することができる。次に、血液流体などの試料をパッチに接触させる。次に、閾値剪断速度以下でチャネルの接合点を通る凝血塊伝播速度をモニターする。必要であれば、様々な物質も添加して、チャネル接合点を通る凝固伝播に対する添加した物質の効果をさらに観測することができる。
【００７９】
本発明は、血液凝固をアッセイするための既知の方法に対する以下の利点、即ち、さらに少量の試料を使うことができること；自動化された試薬混合による最少試料調製；最初の血小板凝集、したがって凝固時間のリアルタイム観測の可能性；混合速度が制御可能であること、のうちの１つ又は複数を有する。
【００８０】
本発明の方法及びデバイスを使って、血液凝固以外に他の生物学的経路の活性を検出できることが企図されている。例えば、ヒトの体液がパッチ上で免疫応答を開始するポテンシャルを試験することができる。この例では、体液試料を１つ又は複数の抗原（例えば、微生物、細菌、ウイルス、等）を含有するパッチに接触させる。開始に対する閾値パッチサイズをモニターすることを利用して、細菌表面のクラスターの存在の下で免疫応答の開始などの事象を検出することができる。
【００８１】
本発明の方法及びデバイスを使って、血液又は血漿以外の液体を含む試料で生物学的経路の活性を検出できることが企図されている。例えば、クオラムセンシングを開始するのに必要とされるホモセリンラクトンの量を、細菌を含有する溶液で試験することができる。血液以外の溶液で、開始させる閾値パッチサイズをモニターすることを利用して、アルツハイマー病経路を開始させるのに必要なアミロイドβタンパク質の量、てんかん性発作を開始させるのに必要な神経細胞損傷の量などの事柄を検出することができ、少量の細菌の検出のために利用することができる。
【００８２】
本発明は、記載された特定の方法、プロトコル、被検体、又は試薬に限定されるものではなく、したがって変化があってよいことは理解されるべきである。本明細書で使用の用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけであり、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、本発明の範囲は特許請求の範囲のみに限定されることも理解されるべきである。以下の実施例は、特許請求の範囲に記載されている発明を限定するためではなく、例証するために提供されるものである。
［実施例］
【００８３】
数値シミュレーションを使った自己触媒システムのスケーリング予測は、実験的に試験し、ヒト血漿を使って検証した。スケーリング予測が、既知の血液凝固成分と同じ規模の速度及び拡散定数をもつ刺激パッチ上で活性化される単純自己触媒システムに妥当であることを、三次元数値シミュレーションを使って検証した。この単純自己触媒システムは、本発明者らにより提唱された止血のモジュラー機序の基づいている（Runyon et al., 2004, Angew. Chem. Int Edit. 43:1531）。単純自己触媒システムは本明細書では、活性化因子の高次自己触媒的生成と活性化因子の低次消費間の競合に基づいて閾値応答を示すシステムと呼ばれる。この生成と消費間の競合が、１つは安定した１つは不安定な少なくとも２つの定常状態を作り出す。不安定な定常状態は閾値濃度で起こり、それ以上では活性化因子の生成は消費よりも速くなる。
【００８４】
前記機序は、３つの相互作用するモジュール、即ち活性化因子の自己触媒的生成、活性化因子の直線的消費、及び高濃度の活性化因子での沈殿（又は、凝固）からなる。生成と消費の相互作用は、システムに２つの定常状態、即ち低濃度の活性化因子での安定な定常状態、及び比較的高濃度の活性化因子での不安定な定常状態を作り出す。通常、活性化因子の濃度は安定な定常状態近くにとどまるが、活性化因子濃度の大きな摂動が起これば、活性化因子が増幅され沈殿の開始が起こる不安定な定常状態よりも上にシステムを押し上げることになる。本明細書では、シミュレーションにおいては、この溶液相は、刺激パッチ並びに活性化因子の反応及びパッチから溶液への拡散を含有する表面上の自己触媒システムと見なされた。シミュレーションは、市販のソフトウェア（FEMLAB, COMSOL社製、スウェーデン）を使って実施された。
【００８５】
図２は、流れのないマイクロ流体チャネルを通る連続する及び一定の凝血塊成長（伝播）を図示する。図２Ａは、損傷した血管を再現するマイクロ流体チャネルの蛍光顕微鏡写真の画像である。この画像では、ＰＣ：オレゴングリーン（不活性な脂質）の脂質単層により、緑色蛍光が観測された。表面（凝血塊活性化表面）上のＤＭＰＣ：ＰＳ：テキサスレッドの単層とＴＦ：VIIａ複合体により赤色蛍光が観測された。図２Ｂは、流れのない６０×６０μｍ２のマイクロ流体チャネルにおける連続凝血塊成長のコマ撮り蛍光顕微鏡写真を図示する。凝固は、α−トロンビンに特異的な蛍光発生基質でモニターした。図２Ｃは、３つの異なるチャネルサイズにおける類似の凝血塊成長速度（Ｖｆ）を図示するグラフである。あらゆる場合に、Ｖｆは３０と４０μｍ／分の間であった。
【００８６】
図３は、ベッセル間接合点を使って、血液凝固伝播の閾値を評価することができる様子を図示する顕微鏡写真を示す。図３Ａは、小（２０μｍ×２０μｍ）ベッセル接合点に向かう凝血塊成長の時系列を示す。このマイクロ流体設計では、接合点での小チャネルの幅は閾値接合点サイズ未満であり、凝血塊成長は停止する。図３Ｂは、大きなベッセル接合点（１００×１００μｍ×μｍ）に向かう凝血塊成長の時系列を示す。このマイクロ流体設計では、接合点での小チャネルの幅は閾値接合点サイズより大であり、凝血塊成長はより大きなベッセルへと続いていく。図３Ｃは、被検者の血漿の閾値接合点サイズの数量化を図示する。この血漿では、閾値接合点サイズは、４０μｍと７５μｍの間であった。
【００８７】
図４は、単純な化学的機序に基づく凝固の開始を表す数値シミュレーションを示す。図４ａは、開始時間対パッチサイズ曲線を描いている。各曲線は、凡例に表示される特定のｔｒに対応している。図４ｂは、ｐｔｒ対ｔｒのプロットが１／２パワースケーリング関係を示し、スケーリング予測を実証している様子を図示する。
【００８８】
刺激物の均質な表面からいくつかの生成速度を表すｔｒの値を判定した。ｐがｔｒごとに異なる場合、図４ａに示されるように、閾値パッチサイズが存在することがわかった。ｔｒごとに、ｐｔｒの特定の値が観測された。ｐ＞ｐｔｒの場合、血液凝固が開始され、ｐ＜ｐｔｒの場合、血液凝固の開始はなかった。
【００８９】
別の組の実験では、単純非線形化学的システムでこの予測の正確さが試験された。モデルは、３つの反応で構成された単純な興奮性（全か無か）システムであった。活性化因子はＨ＋であった。このシステムの開始は、表面からの酸の著しい生成による塩基性から酸性状態への変換に対応している。酸は、表面上のフォト酸分子の層を照射することにより生成された。酸性パッチは、フォトマスクを通じた表面の部分を選択的に照射することにより作製された。照射強度を、したがって表面からの酸の生成を調整することにより、ｔｒに対する異なる値が得られた。
【００９０】
図５は、血液凝固の開始に対するスケーリング関係を図示する。図５ａには、化学モデルのｐｔｒ対ｔｒのグラフを示す。図５ｂは、血液試料のｐｔｒ対ｔｒのグラフを示す。ｔｒの値ごとに、ｐｔｒの特定の値が観測された。ｐｔｒ対ｔｒのプロットは、１／２パワースケーリング関係（図５ａ）を示しており、スケーリング予測を実験的に実証した。
【００９１】
血液凝固は興奮性システムと見なしてもよい。そのようなシステムの開始により、トロンビンなどの高濃度の活性化因子が形成され、それに続いて固体の凝血塊が形成される可能性がある。インビボでの活性化因子の生成のための刺激物は組織因子（ＴＦ）である。スケーリング予測が血液凝固に適用されるかどうかを判定するために、本発明者らは、ＴＦを含有するリン脂質二重層の表面に曝露したヒト血漿の凝固時間を測定した。これらの実験でｔｒを変化させるために、表面上のＴＦ濃度及びアルガトロバン、即ち溶液中のトロンビンの阻害剤の濃度を変化させた。特定のサイズのＴＦパッチは、フォトリソグラフィー工程を通じて得られた。ｔｒの値ごとに、ｐｔｒの特定の値が観測された。ｐｔｒ対ｔｒのプロットは、１／２パワースケーリング関係（図５ｂ）を示しており、複合及び生物システムへのスケーリング予測の適用性を実証した。
【００９２】
本発明のインビトロ実験は、凝固を開始させるのに必要な血管損傷のサイズはダムケラー数により記載される反応の時間スケールと関係があることを予想している。この関係を理解すれば、凝固障害を診断し治療するためのさらによい道具を設計するのに寄与するであろう。薬物の濃度がｐｔｒにどのように影響を及ぼすかを理解すれば、これらの薬物の投与に有用である可能性がある。
【００９３】
本発明を使うことにより得られる正確な身体的特徴は、被検者がインビボでの血液凝固に対してどれほど感受性があるかを予測するのに寄与する可能性がある。被検者の血液の凝固に対するポテンシャルは、通常、非常に高濃度の活性化因子が集中して添加されるインビトロ実験での凝固時間を測定することにより判定される。これらの診断法は、インビボでの凝固開始の時空間的特徴を密接に再現しないし、よりよい身体的特徴により、より優れた方法の開発が可能になるであろう。
【００９４】
本発明は、全か無かシステムの活性化（複雑なネットワーク中での反応）が表面上でどのようにして起きるのかを理解するのに寄与する可能性がある。本発明は、複雑なネットワークの挙動を予測するのに寄与する可能性がある。
【００９５】
形状への応答
本発明者らは、形状への応答は生化学的ネットワークのレベルで出現できることを実証した。本発明者らは、自分たちが開発した機序（Runyon et al., 2004, Angew. Chem. Int. Edit. 43:1531）及び実験システム（Kastrup et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103; 15747）に頼って、インビトロでのヒト血漿の凝固開始を調べた。この生化学的ネットワークは、形状に応答すること、つまり、刺激パッチの形状が凝固が開始されるかどうかを制御することがわかった。
【００９６】
凝固の刺激物を提示するパッチの形状に対する血液凝固カスケード（開始）の開始の応答を特徴付けるために、刺激物の表面パッチ上でのトロンビンによるフィブリンの形成及び青色蛍光色素の形成（Lo and Diamond, 2004, Thromb. Haemost. 92: 874）を、それぞれ明視野及び蛍光顕微鏡を使ってモニターした。フィブリンとトロンビン両方の形成は、凝固が起きたことを示す。開始を刺激する組込み型膜タンパク質である組織因子（ＴＦ）の表面パッチは、フォトリソグラフを使ってパターン形成した。ＴＦは、赤色蛍光色素で標識した０．５ｍｏｌ％の脂質を含有するリン脂質二重層で再形成した。マイクロ流体チャンバーにおいて、様々な形状のＴＦ表面がヒト血漿に提示された。異なった形状のパッチを比較する場合、すべてのパッチの面積（したがって、ＴＦの量）は一定に保たれた（３．１４×１０４μｍ２）。
【００９７】
図６は、ヒト血漿の凝固開始が、同一面積及び凝固刺激物ＴＦの量の表面パッチの形状に応答した様子を示す。図６ａは、ＴＦを含有するリン脂質二重層のパッチ上での凝固を示す側面模式図である。図６ｂは、３通りに測定された変化するアスペクト比の長方形パッチ上でのヒト血漿の開始時間を定量化する図である。図６ｃは、円形及び正方形パッチ上での凝固を、しかし同一面積の細い長方形及び星形パッチ上では凝固していないことを示すコマ撮り蛍光顕微鏡写真を示す。
【００９８】
ＴＦを含有するパッチにヒト血漿を曝露すると、開始は特定の形状のみで起きた。開始は臨界サイズより上の円形パッチ上で起きた。他の形状上の開始は、異なる傾向を示した。正方形（アスペクト比＝１：１）などの幅広の長方形は、４分未満で開始したが、細い長方形（アスペクト比≧１６：１）は４８分以内に開始しなかった（図６ｂ、ｃ）。これらの実験から、開始を引き起こすのに必要な臨界長方形幅（上の実験では約９０μｍ）があるように思われた。興味深いことに、星形パッチは、開始の境界上にあり、実験の半分のみ（１４実験のうち７実験）で開始した。
【００９９】
形状に対するこの応答の背後にある機序を調べるために、発見者は、単純化反応−拡散システムを考慮した３Ｄ数値シミュレーションを開発して、数値シミュレーションにおける形状に対する応答を再現した。前記シミュレーションでは、自己触媒的反応混合物は、同一面積（７８５４μｍ２）の様々な形状の刺激パッチでパターン形成した表面に接触していた。このシミュレーションは、ヒト血漿で見られた実験結果を再現した（図７）。
【０１００】
図７は、単純化反応−拡散系の数値シミュレーションが形状に対する応答を実証したことを図示する。図７ａは、［Ｃ］が細いパッチ上ではより低いことを示すパッチからの拡散及び活性化因子の一次生成のみを考慮した３Ｄシミュレーションからの２Ｄ濃度プロットを示す。活性化因子の拡散的除去は細いパッチ（高アスペクト比、左）上ではより効果的であり、［Ｃ］を閾値より下に維持しているが、幅広のパッチ（低アスペクト比、右）上での最大［Ｃ］は、閾値［Ｃ］より上であった。図７ｂは、二次自己触媒的生成及び一次阻害に対応する溶液相反応も考慮される場合、細いパッチ（左）では消費が優勢になり、［Ｃ］を閾値より下に維持する様子を図示する。幅広のパッチ（右）では生成が優勢になり、［Ｃ］は閾値よりも上に増加し広範囲に拡大し、開始をもたらした。
【０１０１】
異なる形状のパッチ上での活性化因子濃度［Ｃ］に対する拡散の効果を特徴付けるために、パッチからの活性化因子の一次生成のみが考慮され、溶液中の反応は考慮されなかった（図７ａ）。幅広の長方形（より低いアスペクト比）では、パッチの中心からパッチの外への拡散の時間スケールはより長く、細いパッチ（高アスペクト比）よりも幅広のパッチ上の方がより高い最大［Ｃ］を生じた。幅広と細いパッチ間の［Ｃ］のこの差が、自己触媒的媒体の開始にどのような影響を及ぼすのかを調べるために、溶液相反応をシミュレーションに加えた（図７ｂ）。この自己触媒的媒体の開始は、溶液中での２つの競合する反応、即ち１）活性化因子の二次自己触媒的生成、及び２）前記活性化因子の一次消費、又は阻害の結果として、［Ｃ］に対する閾値を有していた。これらの溶液相反応を考慮すると、パッチ間の［Ｃ］の小差は拡大し、開始は全か無か応答を示し、つまり［Ｃ］は規模を数桁増加して、開始するか、又は閾値［Ｃ］より下のままで、開始しないのいずれかである。これらのシミュレーションでは、開始に必要な閾値［Ｃ］は、２×１０−８Ｍであった。所与の組のパラメータでは、アスペクト比≦４：１の長方形は１２秒未満で開始し、アスペクト比≧１６：１の長方形はシミュレーションを止める時点の１０００秒以内では開始しなかった。
【０１０２】
形状に対する応答のこの機序が正しければ、シミュレーションと同じ化学的原理に基づく非生物学的システムはヒト血漿で見られる結果を再現すると考えられる。本発明者らは、ヒト血漿で見られるパッチ面積に対する閾値応答（Kastrup et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 15747）を再現する止血のための実験化学モデルを開発した（Runyon et al., 2004, Angew. Chem. Int. Edit. 43: 1531）。
【０１０３】
本発明のモデルは、活性化因子Ｈ＋の阻害及び自己触媒的生成に基づく自己触媒システムを構成するよく特徴付けられた非生物学的反応からなっていた（Nagipal and Epstein, 1986, J. Phys. Chem. 90:6285）。このモデルでは、紫外線が「凝固」を開始させる刺激物であった。
【０１０４】
図８は、止血を再現するよう構築された単純化化学システムが、同一面積の刺激物を提示する表面パッチの形状にどのように応答するのかを示す。図８ａは、紫外線刺激で照射したフォト酸表面のパッチ上での「凝固」を示す側面模式図である。図８ｂは、３通りに測定した長方形パッチ上での開始時間を定量化するグラフである。図８ｃは、「凝固」は、正方形などの小さいアスペクト比の長方形パッチ上では起きたが、同一表面積でも大きなアスペクト比のパッチ上では起きなかったことを示すコマ撮り蛍光顕微鏡写真を示す。
【０１０５】
紫外線は、フォト酸の２−ニトロベンズアルデヒドを２−ニトロソ安息香酸に転換し、［Ｈ＋］がブロモフェノールブルーからイエローへの変化によって示されるアルギン酸塩からのアルギン酸の沈殿を誘導するのに必要な閾値レベルに達すると「凝固」が起きた（図８ａ）。ヒト血漿において観察されシミュレーションにより予測されるように、同一面積（１．２６×１０４μｍ２）のパッチの形状は、この化学システムの開始が起きるかどうかを決定付けた。さらに、開始は長方形のアスペクト比に依存しており（図８ｂ、ｃ）、幅広の長方形は開始したが、細い長方形は開始しなかった。興味深いことに、ヒト血漿における結果とは対照的に、これらの実験では星形は開始しなかった。この所見は、数値シミュレーションにより説明された。星形は、閾値に近い活性化因子濃度を生成した。パッチからの生成速度及び活性化因子の拡散係数などのパラメータを変化させると、星形を開始から非開始へ転換させることができたが、他の形状は同じ応答を保持した。
【０１０６】
これらの結果は、単純化モデル及びシミュレーションはこのシステムの全体的動態は捉えているが、複雑なネットワークの動態のさらに微妙な詳細を確証するためには実験測定値が必要とされることを強調している。これらの結果は、形状に対する応答は生物のレベルだけではなく、生化学的ネットワークのさらに基本的レベルでも現れることができることをさらに実証している。
【０１０７】
試薬
緩衝液で使用する溶媒及び塩類はすべて、他の形で記載していなければ市販品から購入し、そのまま使用した。Poly(dimethylsiloxane)（ＰＤＭＳ、Sylgard Brand 184 Silicone Elastomer Kit）は、Dow Corning社から購入した。1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine（ＤＬＰＣ）、ブタ脳由来L-α-phosphatidylserine（ＰＳ）、及び1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（ＤＰＰＣ）は、Avanti Polar Lipids社から購入した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）ＤＨＰＥ（Texas Red（登録商標）1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）ＤＨＰＥ（Oregon Green（登録商標）1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）、N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、triethylammonium salt（ＮＢＤ−ＤＨＰＥ）、5-(and-6)-carboxy SNAFL-1（ＳＮＡＦＬ）、rhodamine 110、bis-(p-tosyl-L-glycyl-L-prolyl-L-arginine amide)及びFluoSpheres（sulfate microspheres, 1.0μm、yellow-green fluorescent（505/515）、2% solids）は、Molecular Probes/Invitrogen社より購入した。正常プール血清（ヒト）（ＮＰＰ）は、George King BioMedical社より購入した。t-butyloxycarbonyl-β-benzyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amide（Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）は、Peptides International社より購入した。アルブミン（ＢＳ）（ＢＳＡ）、及び中粘度アルギン酸はSigma社より購入した。ヒト組換え組織因子（ＴＦ）及びコーントリプシン阻害剤（ＣＴＩ）は、Calbiochem社より購入した。アルガトロバンはAbbot Laboratoriesにより製造された。ブロモフェノールブルー及び亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２、純度８０％）はAcros Organics社より購入した。Krytox fluorinated greaseはDupont社製である。シリコン処理したガラス製カバースリップはHampton Research社より購入した。無水ヘキサデカン、２−ニトロベンズアルデヒド、及びn-octadecyltrichlorosilane（ＯＴＳ）は、Aldrich社より購入した。チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、純度９９．９％）及び無水メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、純度９９．７％）はFisher Scientific社より購入した。
【０１０８】
化学モデルの試薬は、溶液相試薬（モデル反応混合物）及び固体相パターン形成基材からなっていた。モデル反応混合物は、ＮａＣｌＯ２、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、アルギン酸、及びブロモフェノールブルーを含有する溶液であった（Runyon et al., 2004, Angew. Chem. Int. Ed. 43: 1531-1536）。ＮａＣｌＯ２及びＮａ２Ｓ２Ｏ３を含有する溶液は、準安定であった。閾値濃度の酸（ヒドロニウムイオン）の添加により、前記酸を始動させて、急速に及び自己触媒的に反応し、より多くの酸を生成することができた（Nagypal and Epstein, 1986, J. Phys. Chem. 90: 6285-6292）。アルギン酸は、塩基性状態の下では、アルギン酸ナトリウムとして存在し、水溶性である。しかし、酸性状態の下では、アルギン酸は不溶性ゲルを生成する。ブロモフェノールブルーは、前記反応混合物が反応し、「凝固」を開始する時間をモニターするために利用されたｐＨ指示薬である。反応混合物は、ブロモフェノールブルーの蛍光（λｅｘ＝５３５〜５８５ｎｍ、λｅｍ＝６００〜６８０）によりモニターされた。「凝固」が開始されると、塩基性反応混合物は酸性になり、赤色蛍光は消光し、目に見える黄色が出現した。固体相パターン形成基材は、ジメチルシロキサンエチレンオキサイドブロック共重合体中に２−ニトロベンズアルデヒドが分散した薄層（２０〜３０μｍ）で被膜されたカバースリップからなっていた。フォトマスクを通した紫外線照射により、２−ニトロベンズアルデヒド（酸性ではない）は２−ニトロソ安息香酸（酸性、ｐＫａ＜４）に光異性化された。
【０１０９】
準安定モデル反応混合物の前駆物質として２種類の安定な溶液を調製する。２種類の安定な溶液を調製した。これらの２種類の溶液を組み合わせると、こうして得られた溶液はモデル反応混合物を構成し、これは準安定であった。溶液１は、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、アルギン酸、及びブロモフェノールブルーの水溶液であった。溶液２は、ＮａＣｌＯ２の水溶液であった。
【０１１０】
溶液１の調製：保存アルギン酸溶液は、ＮａＯＨ溶液（５０ｍＬ、ｐＨ＝１０．８）にアルギン酸（０．２９０ｇ、中粘度）を添加することにより作製し、約９０℃で４５分間加熱して溶解した。保存Ｎａ２Ｓ２Ｏ３／アルギン酸／ブロモフェノールブルー溶液は、５ｍＬの前記保存アルギン酸溶液中で、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３５Ｈ２Ｏ（０．１２２ｇ、０．４９２ｍｍｏｌ）とブロモフェノールブルー（ナトリウム塩）（ＮａＯＨ水溶液中１２．５μｌの０．１７Ｍ溶液、ｐＨ＝１１．６）を組み合わせることにより作製した。この手順により、最終ｐＨ約７のＮａ２Ｓ２Ｏ３／アルギン酸／ブロモフェノールブルー溶液が得られた。
【０１１１】
溶液２の調製：保存ＮａＣｌＯ２溶液は、ＮａＣｌＯ２（０．２７０ｇ、２．９９ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのミリポアフィルターにかけたＨ２Ｏに溶解することにより作製した（最終ｐＨ約１０．７）。この溶液は、１２時間以内に使用した。
【０１１２】
試薬を組み合わせて化学モデルで使用する準安定反応混合物を形成する。モデル反応混合物は、保存Ｎａ２Ｓ２Ｏ３／アルギン酸／ブロモフェノールブルーと保存ＮａＣｌＯ２溶液を容積比１：１で組み合わせることにより調製した。この手順により、最初は目に見える紫色であり、赤色蛍光も発する溶液が得られた。１Ｎ  ＨＣｌを１滴添加すると、「凝固」反応が開始され、前記溶液は目に見える黄色に変わり、赤色蛍光も消光した。酸の添加がなければ、自然開始（通常２０分以内）により、亜塩素酸／チオ硫酸反応の確率的性質によって、同じく紫色から黄色に変化した（Nagypal, I. & Epstein, I. R., 1986, J. Phys. Chem. 90: 6285-6292）。
【０１１３】
フォト酸被膜基材を調製する。フォト酸、２−ニトロベンズアルデヒドは常に暗所で保管した。フォト酸は、攪拌しながら６０℃まで加熱することにより、ジメチルシロキサンエチレンオキサイドブロック共重合体に溶解させた（重量比１：１）。この混合物は、スピンコートされるまで６０℃で維持した。均質なフォト酸／シロキサン混合物は、５０μＬの温かい混合物を室温で、シリコン処理したカバースリップ（直径２２ｍｍ）の中心に置くことによりスピンコートした。基材は直ちに１０秒間５００ｒｐｍで回転させ、次に１５秒間１５００ｒｐｍで回転させた。５分以内に、２−ニトロベンズアルデヒドはシロキサン流体から凝固し、カバースリップ上に薄いゲル様層（厚さ２０〜３０μｍ）を生じた。フォト酸被膜した基材は暗所に保管し、１２時間以内に使用した。
【０１１４】
マイクロ流体チャンバーにおいて化学モデルでの「凝固」開始を測定する
チャンバーを設計し組み立てる。化学モデル実験で使用されるマイクロ流体チャンバーは、ＰＤＭＳガスケットをシリコン処理したカバースリップに封着することにより構築した。使い捨てチャンバーは、内部直径が１０ｍｍ、外部直径が２０ｍｍ、及び深さが１ｍｍであった。３０μＬ滴のモデル反応混合物をチャンバーに入れた。フォト酸基材で被膜したガラスカバースリップを上に置いた。
【０１１５】
図９は、化学モデルを使った実験のための装置の模式図である。ＰＤＭＳガスケット（ＰＤＭＳ）は、シリコン処理したガラススリップに封着した。化学モデル反応混合物（３０μＬ、モデル反応混合物）をチャンバーに入れた。ジメチルシロキサンエチレンオキサイドブロック共重合体中に分散した２−ニトロベンズアルデヒド（５０重量％）のフォト酸層（２０〜３０μｍ）をＰＤＭＳの上に、化学モデル反応混合物に接触させて置いた。フォトマスク（フォトマスク、黒）を上に置き、特定の位置（灰色）にのみ紫外線（３００〜４００ｎｍ、ＵＶ矢印）を通過させた。
【０１１６】
紫外線照射により酸性パッチを作製する。１００Ｗ水銀ランプを使って、上から試料を照射した。光は熱吸収フィルター（５０ｍｍ直径Ｔｅｃｈ  Ｓｐｅｃ（商標）熱吸収ガラス）を通過し、次にショートパスフィルター（Chroma社製 #D350）を通過し、主に３００〜４００ｎｍ波長を試料に到達させた。次に、光はコンデンサーを通過し、この光は分散されて試料上に直径約６ｍｍの均質な照明領域が生じた。紫外線は、フォト酸分散で被膜されたガラスカバースリップの上に直接置かれた「シルバーオンマイラー（silver on Mylar）」フォトマスク（CAD/Art Services社製）を通じて照射された。
【０１１７】
落射蛍光顕微鏡を使ってモデル反応混合物を撮像する。１５０Ｗキセノン光源を使って、試料の下からモデル反応混合物をモニターした。光はフィルターキューブ（λｅｘ＝５３５〜５８５ｎｍ、λｅｍ＝６００〜６８０）及び５×０．１５ＮＡ対物レンズを通過した。１８０ｍｓごとに１０ｍｓの露光時間をとり、カメラはビン（bin）＝２×２、及びゲイン＝２５５で設定した。赤色蛍光の消光は、モデル反応混合物が反応して「凝固」を開始したことを示していた。顕著な光脱色は、ｐＨ感受性色素では見られなかった。「凝固」開始が起こると（大きなパッチで照射の約２２秒後）、蛍光強度の消光が急速に起こり、１秒未満で約１０の因数で減少した。これは、単純な光脱色と一致していない。
【０１１８】
化学モデルシステムにおける酸性パッチの画像（ここでは本発明者らは「凝固」のモニターには言及していない）は、「紫外線照射源」を緑色域フィルター（HOYA社製）でろ過することにより得られた。緑色光はフォトマスク及び実験装置を通過して下の対物レンズに至った。パッチの画像は試料の下から撮った（図９を参照されたい）。下から撮った画像は、光がフォト酸の固体懸濁の薄層を通過する際の光の歪みにより「不明瞭」に見えるパッチを示す。
【０１１９】
化学モデルシステムにおける「凝固」開始の画像を分析する。モデル反応混合物では、最初のグレースケールコマ撮り蛍光画像は、「凝固」が開始されると蛍光の消光（高蛍光から低蛍光への変化）を示した（画像は図１４を参照されたい）。MetaMorph（登録商標）では、これらの画像は均一な着色の黄色であり、黒い物体では閾値化されていた。この手順により、すべての画像で淡黄色と黒い領域が反転していた。最終結果は、「凝固」は開始されると、画像は暗黒から淡黄色へ向かっていた。この手順により、「凝固」と同時に視覚的に観測される黄色が得られる間は、もっと感度の高い蛍光イメージングの使用が可能になった。
【０１２０】
酸性パッチの最初の画像は緑色に着色され、そのレベルはMetaMorph（登録商標）で調整された。処理されたMetaMorph（登録商標）画像は、ＲＧＢモードに設定された新アドビフォトショップ（Adobe Photoshop）ドキュメントで開かれた。２種類の層、即ち上層はパッチの緑色画像及び下層は「凝固中」の溶液の黄色画像からなる重ね撮り画像が作製された。上層のブレンディングオプションは、緑色の場合にのみブレンドするよう設定された。
【０１２１】
5-(and-6)-carboxy-seminaphthofluorescein-1（ＳＮＡＦＬ）を使って化学モデルにおけるパッチからの酸生成を定量化する
酸生成を定量化するための実験装置を作製する。化学モデルのための上記の実験装置に類似の実験装置を使用した（同一照明設定及び画像化設定）。以下の相違点、即ち１）異なるチャンバーを使用する、２）４０×０．８５ＮＡ対物レンズを使用する、及び３）モデル反応混合物はＳＮＡＦＬ溶液で置き換えるを適用した。これらの実験では、チャンバーは、直径約３ｍｍの円形に巻き、シリコン処理したカバースリップ（２２ｍｍ）上に置いた直径１００μｍの銀ワイヤーからなっていた。シリコングリースをワイヤー周りに塗った。１０ｍＭ tris(hydroxymethyl)aminomethane（Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝９．７）中１０μＭ  ＳＮＡＦＬ（赤色蛍光＝塩基性、緑色蛍光＝酸性）の２μＬ滴を銀ワイヤー円に置くが、ワイヤーには接触しなかった。フォト酸基材を銀ワイヤーの上に置きシリコングリースでしっかり閉じた。フォトマスクをフォト酸基材上に置いた。
【０１２２】
ＳＮＡＦＬで酸検量線を作製する。検量線は、ＳＮＡＦＬの蛍光強度対添加した酸濃度として作製した。ＳＮＡＦＬ／Ｔｒｉｓ溶液を、各種量のＨＣｌを添加して調製した。前記溶液の最終ｐＨは６．５〜９．７の範囲であった。チャンバー中のＳＮＡＦＬ／Ｔｒｉｓ＋ＨＣｌ溶液では、緑色及び赤色蛍光強度を測定した。この酸滴定のための検量線（緑色／赤色強度対［Ｈ３Ｏ＋］比）はＳ字形曲線に適合した。
【０１２３】
異なるパッチサイズに対し酸生成を定量化する。アレイ及び単一パッチの酸生成は、ＳＮＡＦＬ溶液で記載した実験装置を使って測定した。試料には紫外パルスを２０秒間照射し、２分間平衡化させ、次に緑色及び赤色蛍光強度を測定した。生成した酸の量は、蛍光強度データ、測定した検量線、及び試料の既知容積を使って判定した（結果は図１３を参照されたい）。
【０１２４】
凝固刺激剤を提示する表面上での凝固開始のモジュラー機序についての数値シミュレーション
数値シミュレーションを使って、提唱されたモジュラー機序には閾値パッチサイズが存在しうることを、各モジュールの反応速度を表す単一速度方程式を使って図示した。この例では、本発明者らは、ｉ）１つは活性化因子を生成し（自己触媒的に）、１つは活性化因子を消費する（直線的に）２つのモジュール間の競合が活性化因子の濃度に対する閾値応答を生じることができるかどうかを試験し、ii）これら２つのモジュールを組み込んでいるシミュレーション、活性化因子を生成する表面パッチ、及び拡散がパッチサイズに対して閾値応答を生じることができるかどうかを試験し、iii）血液凝固の生化学反応に対する妥当なパラメータが、実験的に測定された値と同じ大きさの閾値パッチサイズを生じることができるかどうかを試験した。その目的は閾値パッチの正確なサイズを予測することではなかった。反応の時間スケールｔＲ、即ち単一の実験的に決定されたパラメータは、閾値パッチのサイズに対するより単純でより信頼性のある予測の判断材料である。
【０１２５】
数値シミュレーションで使用するパラメータを選択する。モジュラー機序では、「凝固」刺激物を提示するパッチで起きている拡散及び反応は、市販の有限要素パッケージＦＥＭＬＡＢ３．１版（Comsol社製、ストックホルム、スウェーデン）を使って数値的にシミュレートした。表面は、「凝固」刺激物を提示するパッチ及び前記パッチ周辺の１ｍｍ「不活性」近傍からなっていた。濃度プロファイル及び「凝固時間」に対する種々のパッチサイズの効果を判定した。
【０１２６】
活性化因子の濃度「Ｃ」の変化を数値的にシミュレートするために、溶液中での拡散の他に溶液中及び表面パッチ上で起きている反応も検討した。Ｃは、血液中に存在する一組の凝固促進分子と比較してよい。Ｃの大量輸送は、標準対流拡散方程式でモデル化した。拡散係数５×１０−１１ｍ２／秒を使用した（トロンビンなどの血液凝固における溶液相プロテアーゼの概算値）。シミュレーションでは対流は使用しなかった。１μｍの境界層の厚みを選択した。この境界層の厚みでは、仮定では、層を通じた側方拡散は速く、溶液は側方に均一である。境界層のサイズはかなり任意であり、境界層の厚みを通じた拡散が反応速度及び最小のパッチを横切る拡散速度よりもずっと速い限り一定範囲の厚みを使ってよい。境界層を使って、３Ｄシミュレーションをコンピュータ的にもっと効率のよい疑似２Ｄシミュレーションに簡略化する。絶縁／対称の境界条件は、「不活性」近傍の外縁で使用した。
【０１２７】
３種類の反応速度式、即ちｉ）パッチ表面でのＣの生成、反応速度＝ｋｐａｔｃｈ；ii）溶液中でのＣの自己触媒的生成、反応速度＝ｋｐｒｏｄ［Ｃ］２＋ｂ；及びiii）溶液中でのＣの直線的消費、反応速度＝−ｋｃｏｎｓｕｍ［Ｃ］をシミュレーションに組み込んだ。使用した値は、［Ｃ］ｉｎｉｔｉａｌ＝１×１０−９Ｍ、ｋｐａｔｃｈ＝１×１０−９Ｍ／秒、ｋｐｒｏｄ＝２×１０７Ｍ−１／秒、ｂ＝２×１０−１０Ｍ／秒、及びｋｃｏｍｓｕｍ＝０．２／秒であった。これらの値は、血液凝固における代表的反応の近似値に基づいて選択された（Kuharsky and Fogelson, 2001, Biophys. J. 80: 1050-1074）。これらの値を使うと、２種類の定常状態が存在し、１つは［Ｃ］＝１．１×１０−９Ｍで、１つは８．９×１０−９Ｍであった。これらの定常状態の存在は、反応速度式に対する速度プロットを検討することにより理解されるであろう（図１０）。速度プロットを記載している総説は、Tyson et al., 2003, Curr. Opin. Cell Biol. 15: 221-231を参照されたい。
【０１２８】
図１０は、反応速度式の速度プロットがモジュラー機序の数値シミュレーションに組み込まれている様子を図示する（詳細は上の本文を参照されたい）。図１０Ａは、ｉ）Ｃの自己触媒的生成のモジュール（曲線）、及びii）Ｃの直線的消費のモジュール（直線）を表す２種類の反応速度式を示す。これらの２本の線の交差部位は定常状態を表している。［Ｃ］＝１．１×１０−９Ｍでの定常状態は安定している。しかし、［Ｃ］＝８．９×１０−９Ｍでの定常状態は不安定であり、閾値［Ｃ］であるＣｔｈｒｅｓｈを表している。［Ｃ］＞Ｃｔｈｒｅｓｈの場合、生成速度は消費速度よりも大きく、［Ｃ］の急速な増幅が起こる。図１０Ｂは、ｉ）パッチ表面でＣの生成に関与する反応（水平線）、及びii）高［Ｃ］で起こる沈殿のモジュール（破線）を表す２つの追加の式を図示する。沈殿モジュールは、シミュレーションに組み込まれてはおらず（実験化学モデルには組み込まれていたが）、ここでは明確にするために模式的に含まれている。
【０１２９】
［Ｃ］＝８．９×１０−９Ｍでの定常状態は不安定であり、Ｃの閾値濃度、Ｃｔｈｒｅｓｈを表していた。［Ｃ］＞Ｃｔｈｒｅｓｈの場合、急速な増幅が起こり、それによって沈殿を開始（固体「凝血塊」の形成）するに十分な［Ｃ］が生成された。パッチのないシミュレーション（パッチサイズｐはゼロ）では、［Ｃ］は［Ｃ］＝１．１×１０−９Ｍの安定な定常状態値にとどまった。大きなパッチがシミュレーションに組み込まれた場合、溶液中及びパッチ上でのＣの組合せ生成により、［Ｃ］は１０秒で［Ｃ］ｔｒを超えた。
【０１３０】
シミュレーションの結果。数値シミュレーションで得られた濃度プロファイルは、シミュレーションでの「凝固」はパッチサイズｐに対する閾値応答を見せることを示した（図１１）。上のパラメータを使えば、パッチｐ＝５０μｍでは、［Ｃ］は決してＣｔｈｒｅｓｈまで増加することはなかった。しかし、ｐ＝１００の場合、［Ｃ］は１０秒でＣｔｈｒｅｓｈまで増加した。閾値パッチサイズｐｔｒ（凝固を開始させることになる最小ｐ）は５０μｍと６０μｍの間であった。ｐｔｒの値はｋｐａｔｃｈが減少するのに従って増加し、パッチの表面での生成速度はｐｔｒに影響を及ぼすことになることを示していた。パッチの表面での生成速度の変化のせいによるこのｐｔｒの変化は、ＴＦ濃度が減少すると、ｔＲが増加し、ｐｔｒが増加することを示した予備実験結果と一致している。数値シミュレーションでは、Ｄが増やされるに従ってｐｔｒの値も増加した。
【０１３１】
図１１は、モデルにおける「凝固」を開始させる可能性がパッチサイズに対する閾値応答を示すことを数値シミュレーションが示していた様子を図示する。シミュレーションでは、パッチｐ≦５０μｍは決して「凝固」を開始しなかったが、パッチｐ≧６０μｍは常に「凝固」を開始した。
【０１３２】
実験とシミュレーションの量的一致は、偶然に起きた可能性がある。反応の時間スケールｔＲ、即ち単一の実験的に決定されたパラメータは、異なる血漿試料では、閾値パッチのサイズに対するより単純でより信頼性のある予測の判断材料である。
【０１３３】
閾値以下パッチの緊密なクラスター上での「凝固」に対する数値シミュレーション。Ｃの濃度プロファイルに対する及び「凝固時間」に対する閾値以下パッチ間の距離を変化させることの効果を判定した。閾値以下パッチｐ＝４０μｍのクラスターは、互いに十分接近して置かれたときのみ［Ｃ］＞Ｃｔｈｒｅｓｈを生じた。４０μｍパッチが８０μｍ隔てられた場合は、Ｃｔｈｒｅｓｈには到達しなかったが、パッチが２０μｍだけ隔てられた場合は、Ｃｔｈｒｅｓｈに急速に到達し「凝固」が開始された。
【０１３４】
血漿を使った実験のためにＰＤＭＳマイクロ流体チャンバーを調製する
チャンバーを設計し作製する。血漿及び全血実験において使用されるマイクロ流体チャンバー（図１２）は、主にpoly(dimethylsiloxane)（ＰＤＭＳ）で構築され、マルチレベル機械圧延真ちゅうマスターから作製された。使い捨てＰＤＭＳチャンバーは内径１３ｍｍ、外径２０ｍｍ、深さ１ｍｍであった。
【０１３５】
図１２は、血漿及びパターン形成されたリン脂質二重層基材を使った実験のための実験装置を図示する。図１２Ａは、パターン形成されたリン脂質二重層で被膜されたガラスカバースリップを含有するために使われるＰＤＭＳマイクロ流体チャンバー（灰色）の模式図である。再形成組織因子（ＴＦ）を有する凝固促進負に帯電したリン脂質（濃灰色）は、不活性中性脂質の背板にパターン形成した。チャンバーは血漿を含有し、上をシリコン処理したガラスカバースリップで閉じて密封された。図１２Ｂはチャンバーの断面図である。
【０１３６】
チャンバーでの対流及び背板凝固を除去する。溶液中の対流を減少させるために、ＰＤＭＳチャンバーを４〜８時間ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液に浸漬した。対流をさらに減少させ、ＰＤＭＳ表面上での背板凝固を減少させるために、次に、チャンバーを１〜２時間１％ＢＳＡ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中、ｐＨ＝７．３）に浸漬した。血漿又は全血実験に先立って、チャンバーはＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液で十分にすすいだ。ＰＤＭＳとシリコン処理したガラススリップ間に良好な密着を形成させるために、ＢＳＡの一部をチャンバーの上部外表面から無塵ティシュを使って除去した。
【０１３７】
凝固実験用のチャンバーを構築する。浸漬したチャンバーを３５×１０ｍｍペトリ皿（BD Biosciences社製）に置いた。基材（パンターン形成したカバースリップ）をチャンバー内に置いた。クライトックス（Krytox）フッ素化グリースの薄層をチャンバーの上に適用した。次に、適切な血漿又は全血試料（下記参照）をチャンバー内に置いた。次に、シリコン処理ガラスカバースリップを軽く押しつけ、余分な血漿を押し出し、グリースと接触させチャンバーを密封した。次に、ペトリ皿をＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液で満たし、チャンバーを浸したままにしてＰＤＭＳを通じた蒸発を排除した。チャンバーは、２３〜２４℃又は３７℃のいずれかで維持した。
【０１３８】
チャンバー内部の対流を測定する。対照実験では、正常プール血漿中で蛍光微粒子（フルオスフェア、FluoSpheres）のコマ撮り蛍光顕微鏡写真を撮ることにより、ＰＤＭＳチャンバー内部の流れを測定した。個々のフルオスフェアが進む距離を測定し、その経過時間で割った。フルオスフェア（硫酸微粒子、直径１．０μｍ、黄緑色蛍光（５０５／５１５）、２％固体）の原液は、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液で希釈した（２５μＬから５ｍＬへ）。希釈フルオスフェア溶液は、３０秒間ボルテックスし、１分間超音波処理し、フルオスフェアの凝集体を粉砕した。このフルオスフェア溶液（７０μＬ）をクエン酸正常プール血漿（２１０μＬ）に添加した。フルオスフェア／血漿混合物をチャンバーに添加し、チャンバーを密封した。チャンバー全体の最大１０地点で１分ごとに画像を撮影した。
【０１３９】
組織因子（ＴＦ）経路を介して凝固の開始を空間的に制御するパターン形成された支持リン脂質二重層を調製する
汚染を減少させ、親水性の表面を作り出すためにカバースリップを洗浄する。リン脂質二重層を使った凝固実験において再現性のある結果を得るために、大きなガラス粒子及び塵などの汚染物質を除去することが不可欠であった。カバースリップの洗浄過程は、以下の段階、即ち、１）３Ｍスコッチテープ（＃８１０）を用いて大きなガラス粒子を除去する、２）溶液サイクル（ｉ. ＥｔＯＨ、ii. Ｈ２Ｏ、iii. １０％ＥＳ  ７×洗浄剤、iv. ＥｔＯＨ、ｖ．ミリポアろ過水）を使って超音波処理し、段階と段階の間ではＨ２Ｏ及びＥｔＯＨで洗浄し、遊離したガラス粒子をさらに除去する、３）新たに作った「ピラニア」溶液（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２、容積比３：１；この混合物は有機物質と激しく反応するので、慎重に扱わなければならない）にほぼ２０分間浸漬する、並びに４）ミリポアろ過水で十分に洗浄しＮ２気流中で乾燥させる、からなっていた。洗浄したカバースリップは、乾燥後直ちに使用した。
【０１４０】
脂質小胞の溶液を調製する。単層小胞の調製はすでに他所に記載されている（Yee et al., 2004, J. Am. Chem. Soc. 126: 13962-13972）。手短に言えば、ピラニア洗浄されたガラス小瓶で、脂質の適切なクロロホルム溶液を所望の濃度及びモル比まで混合した。クロロホルムはＮ２気流（気体）で蒸発させ、次に、脂質ケーキを少なくとも３時間真空乾燥（５０ミリトール）させた。乾燥脂質は、ボルテックスによりミリポアろ過水に懸濁し（１０ｍｇ／ｍＬ）、次に４℃で一晩水和させた。水和小胞は５回凍結融解サイクルにかけた。それをドライアイス／アセトン浴で凍結させ、脂質転移温度より高い温度でオーブン装置で解凍した。これらの小胞は、脂質転移温度より高い温度でホワットマンヌクレポアトラックエッチ（Whatman Nuclepore Track-Etch）膜（細孔サイズ１００ｎｍ）を１０回押し出した（Lipex（商標）Extruder、Northern Lipids社製）。押し出した小胞は、ミリポアろ過水を使って保存濃度まで希釈し（５ｍｇ／ｍＬ）、４℃で保存した。すべての小胞溶液は２週間以内に使用した。
【０１４１】
凝固促進小胞を得るために組織因子（ＴＦ）を再形成する。ＴＦは、１×ＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水／Ｃａ２＋緩衝液中１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＤＬＰＣ／ＰＳ／テキサスレッド（登録商標）ＤＨＰＥ（７９．５／２０／０．５モルパーセント）の混合小胞に再形成した。図１７，１８及び１９の実験では、小胞溶液中のＴＦ濃度は、０．４０ｎＭ（ＴＦ対脂質比２．５×１０−７）であった。ＴＦはすべて小胞に組み込まれていると仮定すると、計算される表面濃度は０．０８ｆｍｏｌ／ｃｍ２と考えられる。表１の実験では、ＴＦの最終濃度０．１６ｎＭ（ＴＦ対脂質比１×１０−７）を使用した。ＴＦを小胞溶液に添加した後、溶液は３７℃で３０分間インキュベートし、次に、１２℃で保存した。前記小胞は１８時間以内に使用した。
【０１４２】
不活性二重層を形成する。不活性支持リン脂質二重層は、ＤＰＰＣ（９７％）及び緑色蛍光色素（３％のオレゴングリーン（登録商標）ＤＨＰＥ又はＮＢＤ−ＤＨＰＥのいずれか）からなっていた（Jung et al., 2005, ChemPhysChem 6:423-426）。二重層は２１５μＬのＤＰＰＣ小胞溶液（ＰＢＳ中０．３４ｍｇ／ｍＬ小胞）を親水性ＰＤＭＳチャンバー中の新たに洗浄したカバースリップに５０℃で添加することにより作製した。ＰＤＭＳは、カバースリップを添加する前に、プラズマクリーナ（SPI Plasma Prep）での酸化により親水性にした。小胞溶液を含有するマイクロ流体チャンバーは５０℃で１０分間インキュベートし、次に、室温まで冷却した。過剰な小胞は、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液での洗浄を繰り返すことにより除去した。二重層は室温で暗所に保存し、２４時間以内に使用した。
【０１４３】
露出したガラスのあらゆる部分を除去するために不活性二重層に裏込めする。ＤＰＰＣ二重層の欠陥により引き起こされる露出したガラス基材の部分がないことを確実にするために、すべての二重層は、３０μＬのＤＬＰＣ小胞溶液（ＰＢＳ緩衝液中２．５ｍｇ／ｍＬ小胞）で裏込めし、暗所において４０分間室温でインキュベートさせた。過剰な小胞は、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液で広範囲に洗浄することにより除去した。これらの二重層は、数時間以内にフォトパターン形成した。
【０１４４】
不活性二重層のパッチ領域を選択的に除去するためにフォトパターン形成する。ＤＬＰＣで裏込めしたＤＰＰＣ二重層に、以前公表された方法を使ってフォトパターン形成した（Yee et al., 2004, J. Am. Chem. Soc. 126: 13962-13972；Yu et al., 2005, Adv. Mater. 17: 1477-1480）。手短に言えば、二重層被膜カバースリップを、フォトマスク（石英上にクロム、Photo Sciences社製）の下のアルミニウムアラインメントトレイ上に置いた。この装置は、０℃に設定された冷却プレート（エコーサーム（Echo Therm）（商標）、Torrey Pines Scientific社製）上に置き、照射中試料の温度を２０〜３０℃に維持した。二重層は、遠紫外線（二重壁冷却石英浸漬ウェル中のハノビア（Hanovia）中圧４５０Ｗ  Ｈｇ液浸ランプ）を７分間照射し、次にＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液で十分に洗浄した。パターン形成した二重層は２時間以内に裏込めした。
【０１４５】
二重層の光除去した領域に凝固促進脂質を裏込めすることによりパッチを作製する。凝固促進パッチを作製するために、パターン形成した二重層を３０μＬのＴＦ再形成小胞溶液（ＰＢＳ緩衝液中１．２５ｍｇ／ｍＬ小胞）で裏込めし、室温で４分間インキュベートさせた。活性ＴＦを含有するリン脂質二重層は、以前にすでに調製している（Contino et al., 1994, Biophys. J. 67: 1113-1116 (1994)）。過剰な小胞は、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液で勢いよく洗浄することにより除去した。パターン形成した二重層は直ちに凝固実験に使用した。
【０１４６】
第XII因子経路を介した凝固開始を空間的に制御するために、シラン処理したガラスカバースリップ上でパターン形成した親水性パッチを調製する
ガラスカバースリップ上に不活性シラン処理した表面を形成する。ガラスカバースリップのシラン処理の詳細な手法は、以前に記載されている（Howland et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127: 6752-6765）。手短に言えば、新たにピラニア洗浄したガラスカバースリップを清潔なガラス皿に入れた。無水ヘキサデカン（１０ｍＬ）及びn-octadecyltrichlorosilane（ＯＴＳ）（４０μＬ）を、Ｎ２（気体）環境でカバースリップに添加した。この溶液は、３０分間インキュベートした。次に、第２の４０μＬ分量のＯＴＳを溶液に添加し、さらに４５分間インキュベートした。過剰なＯＴＳは、無水ヘキサデカンで６回洗浄し、続いてＥｔＯＨで数回洗浄することにより除去した。シラン処理したカバースリップは真空下で保存し、４８時間以内に使用した。
【０１４７】
不活性シラン処理層で親水性ガラスパッチを選択的に作製するためにフォトパターン形成する。親水性パッチは、上に及び文献（Howland et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127: 6752-6765）に記載のフォトパターン形成装置を使って作製した。シラン処理カバースリップは、２時間フォトマスクの下で照射した。照射後、カバースリップはＥｔＯＨ及びミリポアろ過水で洗浄した。パターン形成カバースリップは３０分以内に使用した。
【０１４８】
はんだぬれ性試験を使って親水性パッチを検出する。親水性領域は、グリセロールはんだぬれ性試験を使って検出した（Wu and Whitesides, 2002, J. Micromech. Microeng. 12: 747-758）。パターン形成したカバースリップは、グリセロールで被膜し、過剰なグリセロールは軽度の真空を使って除去した。この過程により、紫外線に曝露されたカバースリップの領域（親水性領域）のみに液滴のグリセロールが残された。画像化後、及び正常プール血漿の添加に先立って、グリセロールは、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液で勢いよく洗浄することにより除去した。
【０１４９】
実験用のヒト血液試料を調製する
供血者の血液から全血及び血小板豊富血漿を調製する。血液試料は、シカゴ大学の機関審査委員会により設けられた指針（プロトコル＃１２５０２Ａ）に従って個々の健常な供血者から得た。全血は、３．２％クエン酸ナトリウムを含有するバキュテナー（登録商標）チューブに採集した（容積比９：１）。血小板豊富血漿（ＰＲＰ）は、３００×ｇで１０分間の遠心分離により得られた。
【０１５０】
正常プール血漿を調製する。クエン酸正常プール血漿（ＮＰＰ）（ヒト）（Butenas et al., Blood 105:2764-2770）は、George King Bio-Medical社より購入し、必要になるまで−８０℃、１ｍＬ分割量で保存した。必要になると、前記血漿は１８℃でインキュベートすることにより解凍した。
【０１５１】
血漿試料をカルシウム再沈着化し、血栓感受性色素を添加する。血漿試料はすべて、血栓感受性蛍光色素のＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡを含有するＣａＣｌ２溶液を添加することによりカルシウム再沈着化した（ＣａＣｌ２、４０ｍＭ；ＮａＣｌ、９０ｍＭ；及びＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、０．４ｍＭ）。各実験の開始時に、血漿とＣａＣｌ２を含有する溶液を容積比３：１で混合した。このカルシウム再沈着化した血漿溶液（４００μＬ）は、図９に示す実験装置に穏やかに混ぜながら添加した。凝固は、明視野顕微鏡を使ってフィブリンの出現、及び4-Methyl-Coumaryl-7-Amine（ＭＣＡ）がトロンビンによりＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡから切断されると生成される蛍光シグナルの出現により検出した。
【０１５２】
全血試料をカルシウム再沈着化し、トロンビン感受性色素を添加する。全血試料は、１）まず全血（３７６μＬ）をトロンビン感受性蛍光色素のrhodamine 110-bis-(p-tosyl-L-glycyl-L-prolyl-L-arginine amide)（２μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）と混合する、２）次に、前記全血はＣａＣｌ２溶液（２３．５μＬ、２００ｍＭ）と混合させることによりカルシウム再沈着化した（Rivard et al., 2005, J. Thrombosis and Heamostasis 3, 2039-2043）。このカルシウム再沈着化全血溶液を図１２に示す実験装置に添加した。凝固は、rhodamine 110がトロンビンによりrhodamine 110-bis-(p-tosyl-L-glycyl-L-prolyl-L-arginine amide)から切断されると生成される蛍光シグナルの出現により検出した。rhodamine 110色素がＭＣＡ色素に代わって全血実験においてトロンビン検出のために使われた。なぜならば、赤血球は、rhodamine 110の最大励起及び発光波長で、ＭＣＡよりも吸光係数が低いからである。
【０１５３】
第XII因子経路をコーントリプシン阻害剤を使って阻害する。ＴＦ経路の凝固時間を測定する実験（リン脂質二重層及び再形成ＴＦを使用する全実験）では、第XII因子（接触）経路はコーントリプシン阻害剤（ＣＴＩ）で阻害した。ＣＴＩ原液（６．２７ｍｇ／ｍＬ）を、血漿を解凍した直後に（ＮＰＰ）又は遠心分離後に（ＰＲＰ）、血漿に最終濃度１００μｇ／ｍＬになるまで添加し、各実験に先立ってほぼ１０時間１８℃でインキュベートした。全血では、採集後ＣＴＩを最終濃度１００μｇ／ｍＬになるまで添加した。第XII因子（接触）経路の凝固時間を測定する実験（親水性ガラスパッチ又はゼラチンを使った全実験）では、ＣＴＩは添加しなかった。代わりに、ＮＰＰは、各実験に先立って、解凍し１８℃で４時間保存した。
【０１５４】
血漿の凝固開始を画像化する
蛍光顕微鏡を使って凝固及び蛍光脂質を検出する。１０×０．４ＮＡ対物レンズを冷却CCDカメラORCA ERG1394（12-bit, 1344×1024解像度）（Hamamatsu Photonics社製）と0.65×カプラーで連結したLeica DMI 6000B落射蛍光顕微鏡を使って画像を得た。照明は７５Ｗ  Ｘｅ光源が提供した。３種類のフィルターキューブ、即ち１）ＭＣＡを検出するためのDAPI/Hoechst/AMCA（λex=320〜400nm、λem=435〜495）（Chroma社製 #31000v2）、２）テキサスレッドＤＨＰＥ脂質色素を検出するためのテキサスレッド（λex=530〜590nm、λem=600〜680）（クロマ#41004）、並びに３）オレゴングリーンＤＨＰＥ脂質色素、ＮＢＤ−ＤＨＰＥ脂質色素、及びrhodamine 110を検出するためのFITC/Bodipy/Fluo3/DiO（λex=455〜505nm、λem=510〜565）（Chroma社製#41001）を使用した。明視野顕微鏡（照明はハロゲンランプから）も使用して、凝固中のフィブリンの形成を検出した（例は図１５を参照されたい）。MetaMorph（登録商標）Imaging System（Universal Imaging Corp社製）を使って画像を収集した。画像は、MetaMorph（登録商標）Imaging System及びAdobe Photoshopを使って処理した。全画像補正を、画像全体に及び全組の得た画像に一律に適用した。
【０１５５】
凝固開始の画像を分析する。凝固の最初のグレースケール蛍光画像及びリン脂質二重層はMetaMorph（登録商標）で着色した。色はフィルターキューブの発光波長により設定した。凝固の全蛍光画像では、そのレベルは同一値に調整した。これらの画像はコピーし、MetaMorph（登録商標）から、ＲＧＢモードに設定した新Adobe Photoshopドキュメントに直接張り付けた。Adobe Photoshopでは、ＭＣＡからの青色蛍光画像及び脂質二重層の代表的赤色蛍光画像を、赤色画像をスクリーニングすることによりオーバーレイした。すべての変換をすべての画像に一律に適用し、画像はすべて同一の形で処理した。
【０１５６】
化学モデルにおける「凝固」の開始はパッチのみでの光誘導性酸生成によるものであることを確証するための追加の対照実験
モデル反応混合物の開始の源としての加熱及び光化学を排除する。フォトマスクの加熱を最小限に抑えるために、ショートパス及びＩＲフィルターを使って、λ＜３００ｎｍ及びλ＞４００ｎｍの光を排除した。開いたパッチのないフォトマスクの照射では反応は開始せず、反応はマスクの加熱によっては始動しないことを示していた。２−ニトロベンズアルデヒドの不在の下での照射では反応は開始せず、化学モデルの光化学それ自体は使用した条件のもとでは開始を誘発しないことを示していた。照射の不在の下では、モデル反応混合物も５００〜１２００秒間安定であった。
【０１５７】
酸生成はパッチ面積に依存していることを確証する。酸性パッチにより生成される酸（Ｈ＋生成）の量を測定するために、モデルシステムは酸感受性蛍光色素の5-(and 6)-carboxy-seminaphthofluorescein-1（ＳＮＡＦＬ）で置き換えた（この溶液の調製は上を参照されたい）。ＳＮＡＦＬの蛍光強度を測定することにより酸性パッチの種々のアレイについてＨ＋生成を測定した（図１３）。Ｈ＋生成は、酸性パッチの同一の総表面積ａを有するが、個々のパッチの異なるサイズｐを有する異なるアレイはほぼ同量の酸を生成することを確証するために、Ｈ＋生成を測定した。各アレイはパッチの同一の総表面積（ａ＝５．０３×１０５μｍ２）を有し、各アレイはほぼ同量の酸を生成した（因数２以内で）。単一の８００μｍパッチ（ａ＝５．０３×１０５μｍ２）は２．９×１０−２ｎｍｏｌ／秒でＨ＋を生成し、４×４００μｍパッチのアレイ（ａ＝５．０３×１０５μｍ２）は３．４×１０−２ｎｍｏｌ／秒で生成し、１６×２００μｍパッチのアレイ（ａ＝５．０３×１０５μｍ２）は２．６×１０−２ｎｍｏｌ／秒で生成し、及び６４×１００μｍパッチのアレイ（ａ＝５．０３×１０５μｍ２）は１．７×１０−２ｎｍｏｌ／秒で生成した。単一４００μｍパッチ（ａ＝１．２６×１０５μｍ２）は７×１０−３ｎｍｏｌ／秒で生成した。
【０１５８】
図１３は、生成された酸の量がパッチの総表面積にどのように依存しているのかを図示する。モデル反応混合物の不在の下で、酸感受性蛍光色素の5-(and 6)-carboxy-seminaphthofluorescein-1（ＳＮＡＦＬ、二重発光、二重励起特性のある色素）を使ってＨ＋生成をモニターした。まず、蛍光強度対Ｈ＋濃度の検量線は、ＨＣｌによる滴定によりＳＮＡＦＬについて決定した（データは示していない）。次に、ＳＮＡＦＬの緑色及び赤色蛍光強度の変化を、フォトマスク及びフォト酸層を通した２０秒パルスの紫外線に続いて２分ごとに測定した。蛍光強度データ、測定した検量線、及び試料の既知の容積を使って、生成したＨ＋の量を判定した。パッチの同一の総表面積ａを有するが、異なるパッチサイズｐを有するパッチの異なるアレイについてＨ＋生成を測定した。Ｈ＋生成は、同一の総表面積を有するアレイでほぼ同じであった（因数２以内で）。Ｈ＋生成は、アレイの４分の１の表面積を有する単一４００μｍパッチについても測定し、生成したＨ＋は２．４〜４．８倍少なかった。
【０１５９】
反応速度は、Ｈ＋生成線の勾配（図１３）を測定することにより判定した。単一４００μｍパッチは、ｐ≦２００アレイの４分の１の面積を有し、ほぼ４分の１の酸を生成したが、化学モデルの「凝固」を開始させることができた。パッチｐ≦２００のアレイは「凝固」を開始させなかった。これらの結果は、閾値は生成される酸の総量によってだけではなく、酸を生成するパッチのサイズによっても決定されるという主張を支持している。
【０１６０】
フォト酸表面上の化学モデルにおけるｐＨ感受性色素の蛍光強度プロファイルを定量化する
化学モデルにおける「凝固」の開始により、塩基性から酸性状態への変化、及び色素のブロモフェノールブルーからの赤色蛍光の消光が引き起こされた。モデル反応混合物では、最初のグレースケールコマ撮り蛍光画像は、「凝固」が開始されると蛍光の消光（高蛍光から低蛍光への変化）を示した。図１７〜１９では、化学モデルの画像は、一律に黄色に着色され、濃い物体では閾値化されていた。この手順により、すべての画像において淡黄色と濃い領域は反転していた。
【０１６１】
図１４は、フォト酸表面上の化学モデルにおけるｐＨ感受性色素の蛍光強度プロファイルの定量化を図示する。最初の（無修正の）画像の蛍光強度は、化学モデルを使った実験すべてにおける「凝固」時間を判定するために定量化した。図１４Ａは、４００μｍパッチ上の化学モデルにおける「凝固」開始のコマ撮り蛍光顕微鏡写真及びラインスキャン（破線）である。ラインスキャンは、２２秒で「凝固」が開始されており、蛍光を消光したことを示す。図１４Ｂは、２００μｍパッチのアレイ上における化学モデルのコマ撮り蛍光顕微鏡写真及びラインスキャンを示す。ラインスキャンは、蛍光強度が著しく減少しているわけではないので、これらのパッチ上では「凝固」が開始しなかったことを示す。画像の修正及び着色はその情報をゆがめることはなく、着色画像の分析により類似の強度プロファイルが得られた。
【０１６２】
「凝固」が開始されると、蛍光強度が劇的に減少した。単一４００μｍパッチは２２秒で「凝固」を開始した（図１４Ａ）。「凝血塊」は反応性フロントとして、パッチから周囲に伝播し、伝播するに従って蛍光を消光した。２００μｍパッチのアレイは、２２０秒以内に「凝固」を開始させることはなかった（図１４Ｂ）。パッチで強度が増加するのは、上の光源からフォトマスクの透明なパッチを通過してくる少量の赤色及び緑色光によるものであった（図９のモデルシステムの模式図を参照されたい）。蛍光強度は、蛍光を測定するために使われる低倍率における通常の不均一照明により、画像の縁では他より低いように思われた。これとは対照的に、試料の上からの紫外線照明は、直径約６ｍｍの均一な照明領域を生じるように焦点をぼかされた。対照実験として、蛍光色素の均一な溶液を撮像し、その画像は同程度の不均一性を示し、縁では強度を減少させていた。
【０１６３】
パターン形成された支持リン脂質二重層上の血漿におけるトロンビン感受性色素の蛍光強度プロファイルを定量化する
血漿の凝固の開始により、トロンビンが突発的に生成し、それに付随してフィブリン形成が開始された。血漿中の凝固開始を検出するために、蛍光顕微鏡を使って、4-methyl-coumaryl-7-amide（ＭＣＡ、青色蛍光）を放出するペプチド修飾クマリン色素のトロンビン誘導切断を検出し（図１５Ｈ）、明視野顕微鏡を使ってフィブリンの形成を検出した（図１５Ｉ）。６１μｍパッチでは（図１５Ａ〜Ｅ）、血小板豊富血漿（ＰＲＰ）の凝固はパッチ上で４５分以内に開始しなかった。
【０１６４】
図１５は、血漿の凝固開始の定量化を図示する。図１５Ａ及びＢには、緑色脂質色素を含有する不活性二重層の背板にパターン形成された赤色脂質色素を含有するＴＦ再形成二重層の６１μｍパッチが示されている。図１５Ｃ及びＤは、ＭＣＡのせいによる蛍光強度の大きな増加は６１μｍパッチ上では２０分以内にはまったく観測されなかったことを示す。架橋フィブリン鎖の形成も血小板凝集も６１μｍパッチ上では観測されなかった。図１５Ｅは、図１５Ｃにおいて蛍光強度を定量化しているラインスキャン（（Ｃ）の破線）を示す。図１５Ｆ及びＧには、緑色脂質色素を含有する不活性二重層の背板にパターン形成された赤色脂質色素を含有するＴＦ再形成二重層の１３７μｍパッチが示されている。図１５Ｈ及びＩには、１３７μｍパッチ上で２分以内に、トロンビンによるＭＣＡの放出により蛍光強度の大幅な増加が見られた様子が示されている。架橋フィブリン鎖の形成及び血小板の凝集（内側が黒い白色矢印）が１３７μｍパッチ上で観測された。内側が白い白色矢印は、カバースリップ下のＰＤＭＳチャンバーにおける不完全点を指摘している。図１５Ｊは、（Ｈ）において蛍光強度を定量化しているラインスキャン（（Ｈ）の破線）を示す。
【０１６５】
トロンビンによるＭＣＡの放出のための蛍光の大幅な増加は観測されず（図１５Ｃ及びＥ）、架橋フィブリン鎖の形成も血小板の凝集も観測されなかった（図１５Ｄ）。この一般的な応答は、凝固を開始しなかったパッチすべてにおいて見られた。１３７μｍパッチでは（図１５Ｆ〜Ｊ）、２分以内にパッチ上でＰＲＰの凝固が開始した。トロンビンによるＭＣＡの放出のための蛍光の大幅な増加が観測された（図１５Ｈ及びＪ）。架橋フィブリン鎖の形成も血小板の凝集も観測された（図１５Ｉ）。この一般的な応答は、凝固を開始したパッチすべてにおいて見られた。
【０１６６】
図１８Ｃ及びＤで提示されたパッチのアレイでは、同一の一般的応答が観測された（図１６）。図１６には、図１８Ｄに提示されたアレイ上での血漿の凝固開始の定量化を示す。図１６Ａ及びＢは、５０μｍパッチのアレイでは凝固が４３分以内にパッチ上で開始しなかったことを示す。トロンビンによるＭＣＡの放出のための蛍光の大幅な増加は観測されず（図１６Ａ及びＢ）、架橋フィブリン鎖の形成も観測されなかった。図１６Ｃ及びＤは、４００μｍパッチのアレイでは３分以内にパッチ上で凝固が開始した様子を示す。トロンビンによるＭＣＡの放出のための蛍光の大幅な増加が観測された（図１６Ｃ及びＤ）。架橋フィブリン鎖の形成も観測された。
【０１６７】
血漿を含有するチャンバーにおける対流を測定し除去する
血漿チャンバー内部の流れ（図１２）は、正常プール血漿中の蛍光微粒子（フルオスフィアー）のコマ撮り蛍光顕微鏡写真を撮ることにより測定した。個々のフルオスフィアーが進む距離を測定し、経過した時間で割った（この溶液の調製は上を参照されたい）。チャンバーが流れを除去するために最適化された後、流速は典型的に基材上１０μｍで３μｍ／分未満であり、基材上１００μｍで１０μｍ／分未満であった。３μｍ／分の流速は、開始された凝固の伝播速度（２５〜３５μｍ／分）の１０分の１である。
【０１６８】
流れを除去するために講じる段階。流れを除去するために講じる段階には、ｉ）密封されたＰＤＭＳチャンバーを使って、空気／血漿界面（マランゴニ流）で生じる対流及び蒸発を除去する、ii）ＰＤＭＳチャンバーを４〜８時間ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液に浸漬し、ＰＤＭＳを通じた蒸発を除去し、一定の浸透圧を維持する、iii）次に、チャンバーを１時間ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ｐＨ＝７．３）に浸漬し、考えうる表面張力の勾配によりＰＤＭＳ／血漿界面で生じるマランゴニ流を除去する、iv）チャンバーは、血漿を内部で密封した後ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）溶液に浸した、ｖ）顕微鏡観察中の照射量は最小限に抑えた、及びvi）顕微鏡の試料台の動きは最小限に抑えた、が挙げられた。
【０１６９】
供血者血小板豊富血漿の閾値を、２４℃及び３７℃で正常プール血漿と比較する
供血者血小板豊富血漿及び正常プール血漿の閾値パッチサイズは２４℃及び３７℃で測定した。凝固時間は、異なるサイズのパッチを含有するアレイで凝固刺激（ＴＦ再形成二重層）を提示するパッチ上で測定した（表１）。単一実験では、７つの異なるパッチサイズ上の凝固時間を測定した。表１中の二重層を調製するために使われる小胞中のＴＦ濃度は０．１６ｎＭ（ＴＦ対脂質比１×１０−７）であった。この値は、本文に記載された実験で使用される値（０．４０ｎＭ）の２．５分の１の濃度である。正常プール血漿（ＮＰＰ）では、［ＴＦ］＝０．１６ｎＭを使うと、［ＴＦ］＝０．４０ｎＭ（ｔＲ＝３０秒）を使うより長い反応時間スケールｔＲ＝２０６秒を生じ、及び対応するより大きな閾値パッチサイズｐｔｒ［ｍ］（［ＴＦ］＝０．１６ｎＭで１６０±３２μｍ対［ＴＦ］＝０．４０ｎＭで７５±２５μｍ）を生じた。供血者由来の血小板豊富血漿（ＰＲＰ）の凝固時間対パッチサイズを測定した。所与の［ＴＦ］では、ＰＲＰはＮＰＰ（２０６秒）より短いｔＲ（供血者Ｘで４０秒、供血者Ｙで４８秒）であり、対応するより小さいｐｔｒ（ＰＲＰで８５±２６及び９０±７μｍ対ＮＰＰで１６０±３２）であった。
【０１７０】
【表１】
2009528509.tif 000005
【０１７１】
モジュラー化学的機序は止血の開始を予測する
本発明者らは、モジュラーアプローチを使って築いた単純化学モデルシステムを使って、止血の複雑なネットワークにおける血液凝固開始の時空間的動態を予測してよいことを実証した。マイクロフルイディクスを使って、複雑なネットワークと凝固刺激を提示するパッチでパターン形成された表面を有するモデルシステムの両方を曝露するインビトロ環境を作り出した。両システムとも閾値応答を示し、凝固は閾値サイズよりも大きな孤立したパッチ上のみで開始した。両システムの閾値パッチサイズの規模は、反応と拡散の競合を測定するダムケラー数により表した。反応はパッチにおいて活性化因子を生成し、拡散はパッチから活性化因子を除去する。化学モデルは、ヒト血漿を使って検証される追加の予測をし、マイクロフルイディクスを使って実行されるそのような化学モデルシステムを使って、複雑な生化学的ネットワークの時空間的動態を予測してよいことを示唆している。
【０１７２】
開始の時空間的動態を形にするために、全体的キネティクスが、ｉ）活性化因子の高次自己触媒的生成、ii）活性化因子の直線的消費、及びiii）高濃度の活性化因子での凝血塊の形成に対応する３種の相互作用モジュールとして、止血のほぼ８０反応を表した。活性化因子の濃度Ｃは制御パラメータとして働いた。これらのモジュール間の相互作用により、これより上の濃度で凝固が開始された閾値濃度Ｃｔｈｒｅｓｈが生じる（これより下の濃度では凝固は開始されなかった）。この表現では、止血は通常、低Ｃで安定な定常状態にある。Ｃのわずかな増加はＣ＜Ｃｔｈｒｅｓｈを保存し、そのような摂動は減衰し、システムは安定な定常状態に戻る。大きな摂動は不安定な定常状態を超えて濃度を増加させ（Ｃ＞Ｃｔｈｒｅｓｈ）、活性化因子を増幅させて、凝固を開始させる。したがって、止血の機能的であるが徹底して単純化した化学モデルは、各モジュールをそのモジュールのキネティクスに匹敵するキネティクスを有する少なくとも１つの化学反応で置き換えることにより作製してもよい。
【０１７３】
図１７は、ヒト血漿と単純化学モデルの両方が、凝固刺激を提示するパッチのサイズに対する閾値応答を有する凝固を開始させる様子を図示する。図１７Ａは、化学モデルにおける「凝固」開始での閾値応答を試験するために使うマイクロ流体デバイスの単純化した模式図である。反応混合物は、２−ニトロベンズアルデヒドを含有するフォト酸表面上に保持していた。フォトマスクを通じた紫外線照射により、２−ニトロベンズアルデヒド（酸性ではない）は２−ニトロソ安息香酸（酸性、ｐＫａ＜４）に光異性化され、「凝固」刺激の酸性パッチ（緑色）を生み出した。「凝固」が開始されると、塩基性反応混合物は酸性になり、黄色になった。
【０１７４】
図１７Ｂは、パッチｐ＝２００μｍ（上、開始なし）及びｐ＝８００μｍ（下、急速な開始）上の化学モデルにおける「凝固」開始のコマ撮り蛍光顕微鏡写真（着色黄色）を示す。図１７Ｃは、凝固開始を調節する際のパッチでの凝固活性化因子の生成とパッチから離れていく活性化因子の拡散の競合を定量的に描写する数値シミュレーションを示す。閾値以下のパッチ（上、５０μｍ）では、拡散が優勢であり、活性化因子の濃度は凝固を開始させるのに必要な閾値濃度Ｃｔｈｒｅｓｈ（破線）には到達しない。閾値以上のパッチ（下、１００μｍ）では、活性化因子の生成が優勢であり、Ｃｔｈｒｅｓｈを超えて、活性化因子が急速に増幅され、凝固が起こる。
【０１７５】
図１７Ｄは、血漿を含有しそれを凝固刺激を提示するパッチに曝露するために使われるインビトロマイクロ流体システムの模式図である。再形成組織因子を有する負に帯電したリン脂質二重層のパッチ（脂質／ＴＦ）（赤色蛍光）は、不活性脂質の背板にパターン形成した。青色は凝固を表す。図１７Ｅは、赤色パッチｐ＝５０μｍ（上、開始なし）及びｐ＝１００μｍ（下、急速な開始）上の血漿の「凝固」開始のコマ撮り蛍光顕微鏡写真（青色蛍光）を示す（ｐ［ｍ］はパッチの直径である）。
【０１７６】
化学モデルにおける「凝固」開始はパッチサイズに対して閾値応答を示した
この化学モデルシステムの量的動態を観測するために、本発明者らは、酸性パッチ上の「凝固」開始が堅牢（大きなパッチでは開始するが小さなパッチでは開始しない）であるかどうかを試験した（図１８Ａ）。「凝固」開始のために刺激物として紫外線を利用した。酸の光化学的生成は、フォトマスクを使って空間的にパッチに限定した。酸は表面パッチから溶液中に拡散し、「凝固」反応は、酸の局所濃度が閾値Ｃｔｈｒｅｓｈを超えた場合のみ開始された。
【０１７７】
図１８は、ヒト血漿におけるインビトロ凝固開始が、凝固活性化因子である組織因子（ＴＦ）を提示する脂質表面の総評面積ではなく空間的分布に依存していることを、化学モデルが正しく予測している様子を図示する。図１８Ａは、パッチｐ＝５０、２００、４００及び８００μｍのアレイ（上から下、緑色）上の化学モデルにおける「凝固」開始のコマ撮り蛍光顕微鏡写真（黄色）である。アレイはすべてパッチの同一総面積を有していた（５×１０５μｍ２）。パッチｐ＝５０〜２００μｍのアレイ上では「凝固」は開始しなかったが、パッチｐ＝４００〜８００μｍ上では急速に開始した。図１８Ｂは、Ａに示されるデータを使って、化学モデルにおける「凝固」開始に対する閾値応答を定量化するグラフである。図１８Ｃは、ｐ＝１００μｍ及びｐ＝４００μｍパッチのアレイ（赤色）上の血漿の「凝固」開始（青色）を示すが、ｐ＝２５μｍ及びｐ＝５０μｍパッチのアレイ上（赤色）では開始がないことを示すコマ撮り蛍光顕微鏡写真である。すべてのアレイにおけるパッチの総評面積は同一であった（３．５×１０６μｍ２）。図１８Ｄは、Ｃに示されるデータを使って、血漿の「凝固」開始に対する閾値応答を定量化するグラフである。凝固時間はフィブリンの出現をモニターすることにより判定した。
【０１７８】
化学モデルにおける「凝固」開始は、円形パッチの直径であるパッチサイズｐ［ｍ］に対する閾値応答を示した（図１８Ｂ、１７実験）。単一パッチｐ≧４００≧ｐｔｒμｍは、約２２秒で確かに「凝固」を開始し、単一パッチｐ≦２００＜ｐｔｒμｍは、５００秒以内に開始を引き起こすことはなかった。対照実験は、開始は表面での酸の生成によるものであって、試料の加熱によるものでも溶液の光化学によるものでもないことを立証した。
【０１７９】
化学モデルにおける「凝固」開始はダムケラー数により表してよい
このシステムにおける動態の半定量的記述を得るために、本発明者らは、反応と拡散の競合を考慮することにより、閾値パッチサイズｐｔｒ［ｍ］（凝固を開始させる最小パッチのサイズｐ）を評価した。反応は時間スケールｔＲ［秒］でパッチにおいて活性化因子を生成し、拡散輸送は時間スケールｔＤ［秒］でパッチから前記活性化因子を除去する。パッチｐ＜ｐｔｒでは、拡散が優勢であり（ｔＤ＜ｔＲ）、活性化因子の濃度は決して閾値Ｃｔｈｒｅｓｈに到達しない。パッチｐ＞ｐｔｒでは、反応が優勢であり（ｔＤ＞ｔＲ）、活性化因子の局所濃度は閾値Ｃｔｈｒｅｓｈを超え、「凝固」を開始させる。この競合はダムケラー数により表され（Bird et al., 2002, Transport Phenomena, John Wiley & Sons, New York, 2nd ed.）、ｐｔｒはｔＲ≒ｔＤであるｐに一致する（図１８Ｃ）。ｔＤ≒ｐ２／Ｄなので、ｐｔｒはｐｔｒ≒（Ｄ×ｔＲ）１／２として対応するはずである（Ｄ［ｍ２／秒］は活性化因子の拡散係数である）。このスケーリング予測は妥当であり、凝固中の膜上でタンパク質分解フィードバックループを調節する膜パッチサイズに対して元来提唱されたスケーリング予測と一致している（Beltrami and Jesty, 2001, Math. Biosci. 172: 1-13）。化学モデルシステムでは、実験値２００＜ｐｔｒ＜４００μｍは、Ｄ（Ｈ＋）約１０−８ｍ２／秒、及びｔＲ約２２秒を使って計算した予測されたｐｔｒ約４７０μｍと一致している。
【０１８０】
化学モデルは、凝固開始に対する時空間的動態を正しく予測する
この化学モデルは血液凝固の開始に対し４つの予測をする。まず、このモデルは閾値パッチサイズｐｔｒの存在及び値を予測する。この予測を試験し、止血ネットワーク開始の動態を調べるために、本発明者らは、空間及び時間において凝固開始を制御するインビトロマイクロ流体システムを開発した（図１８Ｄ）。パターン形成され支持リン脂質二重層を使って凝固刺激、即ち二重層に組み込まれる再形成されたヒト組織因子（ＴＦ）と共にホスファチジルセリンを含有する脂質表面のパッチを提示した。ＴＦは、血管損傷及び動脈硬化プラーク破裂の部位で曝露される膜内在性タンパク質である。これらの凝固誘導パッチは、不活性脂質二重層（ホスファチジルコリン）の背板領域に取り囲まれていた。パターン形成された脂質表面上に新たにカルシウム再沈着化された血漿を含有し、対流を除去するためにマイクロ流体チャンバーを使った。
【０１８１】
止血ネットワークの開始は、２種類の経路、即ちＴＦ経路及び第XII因子経路を通じて起きてよい。ＴＦによる開始を試験する実験では、コーントリプシン阻害剤を使って第XII因子経路を阻害した。このネットワークの「開始」とは、トロンビンの急増及びフィブリン形成の開始で最高潮に達する凝固過程のことである。明視野顕微鏡を使ってフィブリンの形成を検出し、蛍光顕微鏡を使ってペプチド修飾クマリン色素のトロンビン誘導切断を検出した。本明細書に報告する凝固時間は、フィブリンが出現する時間を示し、すべての実験で、フィブリンの出現は蛍光の増加と相関していた。凝固の蛍光画像は、色素のバックグラウンド蛍光を減少させるように一律に閾値化されていた。
【０１８２】
このマイクロ流体システムにおける血漿の凝固開始は、パッチサイズに対して閾値応答を示した。パッチｐ≧１００μｍは、３分未満で凝固を開始し（４４実験のうち４０実験）、パッチｐ≦５０μｍは凝固を開始しなかった（２８実験のうち２８実験、実験当たり少なくとも３０パッチ）（図１８Ｅ）。パッチｐ≦５０の実験において、背板凝固が３２〜７５分で観測され（一般に開始はパッチ上ではなかった）、まったくパッチのない表面上での開始の４５〜７０分範囲と一致しており、他の研究者が報告している背板凝固時間と一致していた。開始された凝固は反応性フロントとして２５〜３５μｍ／分で伝播した。ｐｔｒの値を予測するために、Ｄ約５×１０−１１ｍ２／秒を使い（凝固カスケードの増幅に関与する代表的活性化タンパク質としてのトロンビンに対する近似値）、ｔＲ約３０±５秒を使った（パターン形成していない凝固誘導二重層上の凝固開始時間を測定することにより得られた）。予測されたｐｔｒ約４０μｍは、測定値５０＜ｐｔｒ＜１００μｍと一致している。膜内での活性化因子の拡散を考慮することにより、かなり小さな閾値パッチサイズ（数μｍ）が以前提唱されていた。結果は、ｐｔｒが溶液中のタンパク質の拡散により決定されることを示す。
【０１８３】
第２に、モデルは、パッチの総表面積ではなく、個々のパッチのサイズ（孤立していて、相互作用がない）が凝固の開始を決定することを予測している。この効果を実証するために、化学モデルをパッチのアレイに曝露した（図１９Ａ及びＢ）。
【０１８４】
図１９は、ヒト血漿の凝固開始が、拡散により連通している閾値以下パッチの緊密なクラスター上で起こりうることを化学モデルが正しく予測している様子を図示する。図１９Ａは、化学モデルシステムにおける閾値以下パッチｐ＝２００μｍのクラスターの固定時間（５４秒）蛍光顕微鏡写真を示す。これらのパッチは、２００μｍ（右）離すと「凝固」を開始したが、８００μｍ（左）離すと凝固を開始しなかった。図１９Ｂは、血漿に曝露された閾値以下パッチｐ＝５０μｍ（赤色）のクラスターの固定時間（９分）蛍光顕微鏡写真を示す。これらのパッチは、５０μｍ（右）離すと凝固を開始したが、２００μｍ（左）離すと凝固を開始しなかった。
【０１８５】
各アレイは、パッチの同一総表面積（５×１０５μｍ２）を有しており、同量の酸を生成したが、パッチｐ≧４００μｍのアレイのみが「凝固」を開始した。総面積は無関係であった、つまり単一閾値以上パッチは、閾値以下パッチのアレイの４分の１の面積であり、約４分の１の酸しか生成しないにもかかわらず、「凝固」を急速に開始した。血漿の凝固（図１９Ｃ及びＤ）もこの動態を示し、即ち同一総表面積のパッチのアレイ中、パッチｐ≧１００μｍのアレイのみが凝固を開始した（パッチサイズ当たり６測定値）。凝固開始は、試料中のＴＦの空間的分布に精緻に感受性であった。試料中のＴＦの量がわかるだけでは、開始が起こるかどうかを予測するには十分ではなかった。なぜならば、一定容積の血漿を使う実験では、閾値以上パッチは凝固を誘導し、それより２０倍の総表面積があり、２０倍のＴＦを有する閾値以下パッチのアレイは開始を誘導しなかったからである。
【０１８６】
第３に、モデルは、閾値以下パッチの十分に緊密なクラスターは凝固を開始させるはずであることを予測している（図２０）。図２０の画像は、化学モデルが第２（第XII因子）の経路を介した凝固開始を正しく予測している様子を図示しており、モデルがインビトロでの止血の複雑なネットワーク全体の開始の動態を描写していることを示唆している。ガラス上のヒト血漿における第XII因子経路を介した凝固開始の試験が示されている。１３分（図２０Ａ）及び２１分（図２０Ｂ）の２枚のコマ撮り蛍光顕微鏡写真は、不活性シラン処理ガラスの背板にパターン形成された凝固誘導親水性ガラスパッチｐ＝４００、２００、１００，５０、及び２５μｍ（左から右へ、白色）のアレイ上での凝固開始を示す。本明細書に示す血漿試料では、閾値パッチサイズは１００μｍと２００μｍの間であった。
【０１８７】
クラスター周辺のパッチ上での活性化因子の生成は、中心パッチから離れた活性化因子の拡散流量を減らしている。所与のｔＲでは、ｐｔｒに等しい拡散長スケールよりも間隔を狭めた閾値以下パッチでは凝固開始が起こるはずである。この効果を実証するために、本発明者らは、化学モデル（２００＜ｐｔｒ＜４００）を閾値以下パッチの２つのクラスターに曝露した（図２０Ａ）。２００μｍ離された２００μｍパッチのクラスターは、「凝固」を急速に開始し、８００μｍ離されたクラスターは開始しなかった。数値シミュレーションはこれらの実験と一致している。これらの予測は、血漿を使って立証され（５０＜ｐｔｒ＜１００）、５０μｍ離された５０μｍパッチのクラスターは、凝固を急速に開始し、２００μｍ離されたパッチのクラスターは開始しなかった（９実験、図２０Ｂ）。活性化因子の増幅は膜の、特に血小板の表面でははるかに急速に起こりうることは公知であり、これらの結果は、ｐｔｒを設定する際の溶液中の輸送の重要性をさらに裏付けている。
【０１８８】
第４に、この化学モデルが、ＴＦ経路における反応の一部ではなくネットワークの開始の全体的動態を表しているとすれば、第XII因子経路を介した血液凝固の開始も閾値応答を示すと考えられることが示唆される。この経路を開始させるために、本発明者らは血漿を負に帯電したガラスに曝露し、開始はｔＲ約９分で起きた。本発明者らは、トロンビンの拡散係数を使って、閾値パッチサイズｐｔｒを約（Ｄ×ｔＲ）１／２、即ち約１６０μｍと予測した。この予測を試験するために、親水性ガラスのパッチを、不活性疎水性シラン処理ガラスの背板に作製した。ｐｔｒ約１００μｍは、血漿を異なるサイズのパッチの単一アレイ上に置くことによりすぐに決定された（図９）。１４実験すべてにおいて、パッチｐ≧２００μｍは凝固を誘導したが、パッチｐ≦５０μｍは凝固を誘導しなかった。パッチｐ＝１００μｍは閾値サイズに近く、１４実験のうち４実験のみで凝固を開始し（１２〜１９分）、パッチごとの表面化学のわずかな変動と一致しているか、又は第XII因子経路を介した凝固開始の確率的性質と一致している。したがって、被検者の血液がＴＦ又は第XII因子経路のいずれかにより凝固を開始する能力は、異なるサイズのパッチのアレイを有する単一スライド上で閾値応答を測定することによりすぐに評価することができる。
【０１８９】
止血ネットワークにおける凝血塊伝播を描写する機序
止血の調節機序の理解に向けた１つのアプローチは、あらゆる複雑な生化学的ネットワークに関して、そのネットワークのモデルを開発することである。図２１は、単純な調節機序に基づく止血の動態、即ち活性化因子の生成と除去間の競合により引き起こされる閾値応答を再現する単純な化学モデルを図示する。この閾値応答は、活性化因子の濃度Ｃａｃｔが臨界濃度Ｃｃｒｉｔを超える場合にのみ凝固が起こることにより明らかにされる。この機序は、１）ＣａｃｔがＣｃｒｉｔより上にとどまる場合、凝血塊は一定速度Ｆｖ［ｍ／秒］で反応性フロントとして伝播する、及び２）ベッセルの所与の幾何学では、妨害ベッセルから血流のある非妨害ベッセルへの凝血塊伝播は、血流のあるベッセルにおける剪断速度
2009528509.tif 000006
［／秒］に依存している。
【０１９０】
図２１は、高（ａ）及び低（ｂ）剪断速度での２つのベッセルの接合点を通過する凝血塊伝播の調節のための提案された機序の模式図である。凝固（青色）は活性化因子（・）の濃度Ｃａｃｔが臨界濃度Ｃｃｒｉｔを超えると開始する。ＣａｃｔがＣｃｒｉｔより上にとどまる場合、この凝血塊は速度Ｆｖ［ｍ／秒］で反応性フロントとして妨害ベッセル中を伝播する。伝播している凝血塊が２つのベッセル（接合点）間の接合点に到達すると、接合点での血流のあるベッセル（流動ベッセル）における剪断速度
2009528509.tif 000007
［／秒］によって伝播は停止するか、又は続行する。図２１ａは、流動ベッセル中の活性化因子が、生成されるよりも速く成長する凝血塊から除去され、流動ベッセル中のＣａｃｔをＣｃｒｉｔよりも下に維持するために、流動ベッセルの
2009528509.tif 000008
が閾値剪断速度
2009528509.tif 000009
よりも上の場合、凝血塊伝播は接合点で停止する様子を図示する。図２１ｂは、流動ベッセル中の活性化因子が成長する凝血塊から除去されるのが生成されるよりも遅く、流動ベッセル中のＣａｃｔにＣｃｒｉｔを超えさせるために、流動ベッセルの
2009528509.tif 000010
が
2009528509.tif 000011
よりも下の場合、凝血塊伝播は接合点を通過して続行する様子を図示する。
【０１９１】
本発明は、インビボと単純インビトロ実験間の妥協案を提示するマイクロ流体システムを提供する。本発明は、流動、幾何学、及び表面の正確な制御を可能にする。このシステムをヒト血漿で使って、提唱された機序の予測を試験し、この単純な機序が、凝血塊伝播の時空間的動態の調節に対する洞察を提供することを実証した。
【０１９２】
凝血塊は、流動が不在の下で一定速度で反応性フロントとして伝播する
凝血塊は、一定速度で反応性フロントとして伝播するという予測を試験するために、本発明者らは、マイクロ流体システムを使って、ヒト血漿の凝固を調節し観察した。このシステムはpoly(dimethylsiloxane)（ＰＤＭＳ）に作製した。
【０１９３】
図２２は、流動の不在の下でのマイクロ流体チャネルを通じた血液凝固伝播の測定を図示する。凝血塊は、チャネル壁上を凝固の膜結合阻害因子であるトロンボモジュリン（ＴＭ）の不在及び存在の下で、類似の速度Ｆｖで伝播する。図２２ａは、マイクロ流体デバイスにおける凝血塊伝播を開始させモニターするための手順の模式図である。凝固は、脂質−ＴＦ被膜チャネル壁上のみで開始し、不活性脂質上では開始せず、デバイスのうち不活性脂質がチャネル壁を被膜する部分へと伝播した。図２２ｂは、再形成ＴＦを有する脂質（脂質−ＴＦ）を、不活性脂質の背板におけるチャネルの特定部分に局在化できることを示すマイクロ流体デバイスの蛍光顕微鏡写真である。図２２Ｃは、血漿をチャネル内に導入した後の０、４０、及び８０分での凝血塊の位置を示すコマ撮り蛍光顕微鏡写真である。図２２ｄは、ＴＭの不在の下での（Ｆｖ≒２０μｍ／分）、及びＴＭの存在の下での（脂質対ＴＭ＝７．６×１０４、Ｆｖ≒２５μｍ／分、及び脂質対ＴＭ＝７．６×１０３、Ｆｖ≒２４μｍ／分）凝血塊伝播速度を定量化する実験を示す。
【０１９４】
凝固開始及び伝播は、同一チャネルの壁を異なるリン脂質でパターン形成することにより空間的に隔てられていた（図２２ａ）。このパターン形成は、リン脂質小胞を含有する２つの層流を、チャネルの反対端からデバイスに流し込むことにより実施した。１本のストリームは、凝固を開始させる脂質、即ちホスホコリン、ホスファチジルセリン、及びテキサスレッド（登録商標）ホスホエタノールアミンの混合物を再形成組織因子と共に含有しており（脂質−ＴＦ、図２２ａ）、もう一方のストリームは、凝固を開始しない脂質、即ちホスファチジルコリンを含有していた（不活性脂質、図２２ａ）。次に、チャネルはＮａＣｌ水溶液で洗浄して、過剰な脂質小胞を除去し、チャネル壁上に脂質−ＴＦ又は不活性脂質の被膜を残した（図２２ａ、ｂ）。次に、血漿をデバイスに流し込み、脂質−ＴＦに接触させ、流動を停止した。明視野顕微鏡を使ってフィブリン形成を検出し、蛍光顕微鏡を使ってペプチド修飾クマリン色素のトロンビン誘導切断を検出して、凝固をモニターした。
【０１９５】
凝固は、チャネル壁が脂質−ＴＦで被膜されている場所のみで開始した。この凝血塊は、デバイスのうち不活性脂質で被膜された部分に伝播した（図２２ａ）。この凝血塊は、一定速度Ｆｖ≒２０μｍ／分で反応性フロントとしてチャネルの中を伝播した（図２２ｃ、ｄ）。
【０１９６】
チャネル壁上のトロンボモジュリンは凝血塊伝播に影響を与えない
凝血塊伝播はトロンボモジュリン（ＴＭ）、即ち血管損傷部位近傍の血管壁上に位置する凝固阻害因子によって調節されると提唱されてきた。ＴＭが血漿に均一に混合されている場合には、凝血塊伝播は減少することが明らかにされている。血管壁上のＴＭの局在化を再現するために、ＴＭをチャネル壁に組み込ませ、このＴＭが凝血塊伝播を停止させるのに十分かどうかを試験した。本発明者らは、再形成ＴＭで不活性脂質小胞を形成することにより（脂質対ＴＭ）、及び上記の手順を使ってチャネル壁を被膜することにより、不活性リン脂質表面にＴＭを組み込んだ。
【０１９７】
対照実験は、チャネル壁上のＴＭ活性が、血管内皮細胞の単層に対して以前測定されたのと同一桁であることを立証した。測定されたＴＭ活性は表２に示されており、この表は、再形成トロンボモジュリン（ＴＭ）を有する卵ＰＣ脂質被膜表面からの活性化タンパク質Ｃ（ａＰＣ）生成の定量化を図示する。凝血塊伝播の対応する速度を示す。
【０１９８】
【表２】
2009528509.tif 000012
【０１９９】
脂質対ＴＭのモル比が７．６×１０４の場合、凝血塊は、ＴＭがない場合とほぼ同一速度で伝播した（Ｆｖ≒２５μｍ／分、緑色三角形、図２２ｃ）。チャネル壁に位置するＴＭが凝血塊伝播を停止させないことをさらに明らかにするために、ＴＭ密度を１０の因数で増加させても、Ｆｖの感知できるほどの変化はまったく観測されなかった（図２２ｃ）。追加の対照実験では（表２を参照されたい）、本明細書で使用する両方の濃度では、高ＴＭ濃度で以前観測された飽和効果と一致する類似のＴＭ活性が示された。このデバイスにおけるＴＭの存在の下での凝血塊伝播（表面対容積比約０．０２μｍ２μｍ−３）は、これらの条件の下で凝血塊伝播を調節することを追加の機序が司っている可能性があることを示唆している。
【０２００】
剪断速度は、１つのチャネルから別のチャネルへの凝血塊伝播を調節している
血流の
2009528509.tif 000013
が凝血塊伝播を調節するという予測を試験するために、本発明者らは、凝血塊の先端を、流れるカルシウム再沈着化血漿に曝露するマイクロ流体デバイスを考案した。
【０２０１】
図２２は、
2009528509.tif 000014
に対する閾値が接合点を通る凝血塊伝播を調節する様子を図示する。図２２ａは、接合点を通る凝血塊伝播の
2009528509.tif 000015
に対する依存性を試験するために使うマイクロ流体デバイスの模式図である。接合点を通る凝血塊伝播は、流動チャネル（黒色）の３区域（破線）をモニターすることにより判定した。黒色矢印は、流動の方向を示す。図２２ｂ、ｃは、凝血塊が接合点に到達した２７分後の流動チャネルの３区域の蛍光顕微鏡写真である。図２２ｂは、
2009528509.tif 000016
では、凝血塊が「弁」の中まで伝播しなかった様子を示す。図２２ｃは、
2009528509.tif 000017
では、凝血塊が「弁」の中まで伝播し、次に「弁」から下流の流動チャネルの残りの部分で凝固した様子を示す。図２２ｄは、凝血塊伝播の
2009528509.tif 000018
に対する依存性の定量化である。破線は短い凝固時間と長い凝固時間の間の分割を表している。中黒円は凝固が「弁」において観測された実験を表している。中白円は「弁」における凝固に先立って停止した実験を表している。
【０２０２】
このデバイスは、血漿が流れている非妨害連結チャネルにおいて開始を引き起こすことなく、１つのチャネル（開始チャネル、図２２ａ）において流動の不在の下で凝固開始を可能にした。さらに、このデバイスは、弁において観測される循環流体を再現するために、静脈弁に類似する流動チャネルにあるデバイスを組み込んだ。図２２ａは、この「弁」が流動チャネルにおける血漿の滞留時間を増加させ、開始チャネルと流動チャネル間の接合点（その後に接合点と呼ばれる）からの凝血塊伝播のモニターを可能にしたことを図示する。対照実験は、「弁」内での循環流体を裏付けた。このシステムは、平均流速Ｖａｖ［ｍ／秒］及び
2009528509.tif 000019
の制御も可能にした。本発明者らは、流動の存在の下での凝血塊形成を研究する際に広く使われているパラメータである
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の点から、接合点を通る凝血塊伝播を分析した。圧力駆動流では、表面での局所流速Ｖ［ｍ／秒］はゼロである。剪断速度は、表面からの距離が増していくのに合わせたＶの変化を描写し、表面近傍のあらゆる方向への輸送を決定する。本発明者らは、長方形断面を有するチャネルの垂直壁の中間地点の
2009528509.tif 000021
を計算した。凝固時間は、凝血塊が接合点から「弁」まで伝播する時間が３０分よりも大きい場合は「長い」と見なした。図２２ｄは、自然凝固が流動チャネルにおいて６０〜８０分で起きた様子を示す。
【０２０３】
流動チャネルの開始チャネルから「弁」までの伝播は
2009528509.tif 000022
に対する閾値応答を示し、閾値剪断速度
2009528509.tif 000023
はこれらの条件の下では約９０／秒であった（図２２ｄ）。開始チャネルでは凝固は流動の不在の下で開始され、接合点へと伝播した。開始チャネルにおいて、接合点への伝播は常に流動の不在の下で起きた。流動チャネルの
2009528509.tif 000024
が
2009528509.tif 000025
よりも上の場合、凝血塊伝播は接合点で停止し、長い凝固時間をもたらした（図２２ｂ）。しかし、流動チャネルの
2009528509.tif 000026
が
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よりも下の場合、開始チャネルの凝血塊は接合点を通過して、まず流動チャネルの「弁」まで、次に「弁」の下流の流動チャネルの残りの部分まで伝播し、短い凝固時間をもたらした（図２２ｃ）。
2009528509.tif 000028
に非常に近い
2009528509.tif 000029
では、本発明者らは
2009528509.tif 000030
が同一の２つの実験において短い凝固時間と長い凝固時間の両方を観測し（図２３ｄ）、これにより接合点を通過する伝播の
2009528509.tif 000031
に対する感受性が実証された。
【０２０４】
「弁」における剪断速度ではなく接合点における剪断速度が凝血塊伝播を調節する
接合点における
2009528509.tif 000032
が凝血塊伝播を調節することをさらに実証するために、本発明者らは、接合点での
2009528509.tif 000033
を「弁」での
2009528509.tif 000034
から切り離すデバイスを考案した。図２２に示すデバイスでは、接合点での
2009528509.tif 000035
の変化により、「弁」での
2009528509.tif 000036
が変化し、したがって、「弁」での再循環速度が変化した。
【０２０５】
図２３は、接合点を通過する凝血塊伝播は、「弁」での
2009528509.tif 000037
ではなく、接合点での
2009528509.tif 000038
による調節される様子を図示する。剪断速度、凝固時間、及びデバイスの一部の模式図が示されている。凝固時間は２つの実験の平均として報告されている。デバイスの大きさは図２６を、図２３ａ〜ｄにおける実験の流速は表３を参照されたい。
【０２０６】
接合点と「弁」の両方での高
2009528509.tif 000039
（１９０／秒）は、長い凝固時間をもたらし（図２３ａ）、接合点と「弁」の両方での低
2009528509.tif 000040
（３０／秒）は、短い凝固時間をもたらした（図２３ｂ）。接合点での流動チャネルの幅を狭めて、接合点での高
2009528509.tif 000041
及び「弁」での低
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を生み出した場合、長い凝固時間が観測され（図２３ｃ）、「弁」での低
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は接合点を通過する凝血塊伝播を促進するのに十分ではないことを示唆している。接合点での流動チャネルの幅を拡大して、接合点での低
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及び「弁」での高
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を生み出した場合、短い凝固時間が観測され（図２３ｄ）、「弁」での
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ではなく、接合点での
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が凝血塊伝播を調節することを示唆している。
【０２０７】
【表３】
2009528509.tif 000048
【０２０８】
短時間にトロンビンを阻害すると、閾値以下剪断速度では凝血塊伝播を停止する
提唱された調節機序（図２１）は、活性化因子の除去速度が活性化因子の生成速度に勝り、流動チャネルにおいてＣａｃｔ＜Ｃｃｒｉｔを維持する場合、凝血塊伝播は接合点で停止することを示唆している。したがって、活性化因子の生成速度を減少させると、Ｃａｃｔ＜Ｃｃｒｉｔを維持するのに必要な
2009528509.tif 000049
は減少するはずである。この仮説を試験するために、本発明者らは、接合点の凝血塊を不可逆直接トロンビン阻害剤のD-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl-chloromethyl ketone（ＰＰＡＣＫ、図２４ａ）に短時間曝露した。
【０２０９】
図２４は、接合点の凝血塊を不可逆直接トロンビン阻害剤（ＰＰＡＣＫ）に短時間曝露することにより、流動チャネルの
2009528509.tif 000050
の場合の、接合点を通過する凝血塊伝播を減少させることができることを図示する。図２４ａは、接合点の凝血塊の縁がＰＰＡＣＫに曝露されている実験の模式図である。図２４ｂは、流動チャネルの
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の場合の、接合点を通過する凝血塊伝播への７分間ＰＰＡＣＫ曝露の効果の定量化を図示する。凝血塊伝播は、７分間ＰＰＡＣＫ曝露後著しく減少した。ＰＰＡＣＫを使った凝固時間は、ＰＰＡＣＫ流動が停止された後の時間として報告される。エラーバーは最小値と最大値間の範囲として報告されており、平均が示されている。
【０２１０】
トロンビンは、凝血塊伝播中に高濃度で生成される凝固の強力な活性化因子であり、正のフィードバックに関与しているため、阻害の標的として選択された。カルシウム再沈着化血漿を、
2009528509.tif 000052
でデバイスに流し込むと、図２１におけるように凝固が開始された。凝血塊が接合点に到達すると、ＰＰＡＣＫ（最終濃度＝０．７５μＭ）が血漿に取り込まれ、
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で７分間流し込まれた。次に、ＰＰＡＣＫの流動は停止され、カルシウム再沈着化血漿が
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で流し込まれ、図２２におけるように凝固がモニターされた。この７分間ＰＰＡＣＫ曝露は、ＰＰＡＣＫ曝露なしの１１分からＰＰＡＣＫ曝露での４６分に凝血塊伝播を著しく遅くした（図２４ｂ）。ＰＰＡＣＫの不在の下での対照実験により、接合点での凝血塊が、
2009528509.tif 000055
への１０分曝露後活性なままであることが立証された。
【０２１１】
これらのインビトロの結果は、血管損傷部位へのＰＰＡＣＫの局所的投与は、同一の抗血栓性効果を実現するためには全身投与よりも数桁低い濃度でよいことを実証した以前のインビボ研究を補完している。総合すると、これらの結果は、不可逆直接トロンビン阻害剤又はヒルジン（Ｋｄ＝２０ｆＭ）などの高結合親和性を有する可逆直接トロンビン阻害剤は、凝血塊に位置するトロンビンの延長した阻害を通じて血栓症を効果的に予防できると考えられることを示唆している。
【０２１２】
流動の存在の下での接合点における凝血塊伝播をモニターした実験で使用したデバイスの幾何学及び寸法
図２５は、流動の存在の下で接合点を通る凝血塊伝播をモニターするための実験手順の模式図である。図２５ａには、２種類のリン脂質小胞（脂質−ＴＦと不活性脂質）をＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）に浸漬したＰＤＭＳデバイスに流し込んだ様子を示す。各脂質−ＴＦ流は０．５μＬ／分で流し、各不活性脂質流は２．０μＬ／分で１５分間流した。確実に脂質−ＴＦが接合点を通って流れないようにするために、脂質小胞は次々に停止させた。まず、脂質−ＴＦを停止され、不活性脂質はほぼ１分間流れ続けた。不活性脂質を停止するためには、栓をした注入口（クロス）から栓を抜き、ＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）を１．０μＬ／分でこの注入口に流し込んだ。次に、不活性脂質（ｉ）の流動を停止させ、ＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）を１．０μＬ／分でこの注入口に流し込んだ。最後に、不活性脂質（ii）の流動を停止させた。図２５ｂは、過剰な脂質小胞は、ＮａＣｌ溶液をそれぞれ２０分間１．０μＬ／分で流すことにより除去した様子を図示する。この手順により、チャネル壁上に脂質の被膜が残った。ＮａＣｌ溶液を停止させた後、デバイスをＮａＣｌ溶液からはずし、アウト（ｉ）及びアウト（iii）を密封した（上と下のクロス）。出口を密封するために、少量（２５〜５０μＬ）のNorland Optical Adhesive 81をＰＤＭＳに適用し、１５〜２０秒間紫外線（λ＝３２０〜４００ｎｍ）に曝露した。次に、血漿及びＣａＣｌ２溶液（ＣａＣｌ２、４０ｍＭ；ＮａＣｌ、９０ｍＭ；及びＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、０．４ｍＭ）を３：１容積流量比（血漿対ＣａＣｌ２溶液）で流し込むことにより、チップ上に血漿をカルシウム再沈着化した。これらの溶液は、ほぼ１分間流し、次にアウト（ii）を上のように密封した（中位クロス）。最後に、デバイスをＥＤＴＡ溶液（５０ｍＭ）に浸した。図２５ｃは、チャネル壁が脂質−ＴＦで被膜された場所で凝固が開始した様子を図示する。この凝血塊は、接合点まで伝播し、凝固は「弁」でモニターした。
【０２１３】
図２６は、流動の存在の下で接合点を通る凝血塊伝播のために使うデバイスの実際の幾何学と寸法を示す模式図である。図２６ａは、図２３、２４、及び２５で使われるデバイスの基本設計を示す。このセクションでのデバイスでは、区域１、３、及び４の高さ（ｈ）、幅（ｗ）、及び長さ（ｌ）は同一であった。図２６ｂ、ｃ、ｄは、同一実験の接合点及び「弁」での異なる剪断速度を得るために、区域２で作製したチャネル幾何学の異形を示す。区域２の４チャネルすべてにおいて同一異形を作製した。ＰＰＡＣＫ実験では（図２４）、デバイス幾何学は、このデバイスが溶液を切り替えさせる１つの余分な注入口を有すること以外、ａ及びｂに示されるのと同じであった。
【０２１４】
プラグベースマイクロ流体システムを使った全血又は血漿内での抗凝固薬アルガトロバンのオンチップ滴定及び凝固時間の判定
プラグベースマイクロ流体システムを開発して、抗凝固薬（アルガトロバン）を血液試料中に滴定し、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験を使って凝固時間を測定した。これらの実験を実施するために、以下の技術、即ち、ｉ）マイクロチャネル壁上にテフロン（登録商標）ＡＦコーティングを使って、血液を含有するプラグの形成及びプラグ内での固形フィブリン塊の輸送を可能にする、ii）親水性ガラス毛細管を使って、水流からプラグ内への試薬の確実な合流を可能にする、iii）明視野顕微鏡を使ってプラグ内のフィブリン塊の形成を検出し、蛍光顕微鏡を使い、蛍光発生基質を使ってトロンビンの生成を検出する、並びにiv）アルガトロバン（０〜１．５μｇ／ｍＬ）のプラグ内への滴定及びこうして得られたＡＰＴＴの室温（２３℃）と生理的温度（３７℃）での測定をプラグベースシステムのために開発した。ＡＰＴＴ測定は正常プール血漿（血小板欠乏血漿、ＰＰＰ）を使って、及び供血者血液試料（全血と血小板豊富血漿の両方、ＰＲＰ）を使って行った。プラグベースマイクロ流体デバイスにより測定したＡＰＴＴ値及びＡＰＴＴ比は、３７℃で臨床検査室で得られた結果と比較した。オンチップアッセイから得られたＡＰＴＴデータは、臨床検査室で得られた結果の約倍であったが、これら２つの方法から得られたＡＰＴＴ比は互いによく一致していた。
【０２１５】
試薬及び溶液。水溶液はすべて１８−ＭΩ脱イオン水（Millipore社製、ビルリカ、マサチューセッツ州）で調製した。試薬はすべて、他に明記していなければ、Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズリー州）より購入した。ヒトα−トロンビンの蛍光発生基質であるt-butyloxycarbonyl-β-benzyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amide（λｅｘ＝３６５ｎｍ、λｅｍ＝４４０ｎｍ）は、Peptide Institute社（大阪、日本）より購入した。この基質では、３７℃の速度パラメータは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを有するｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中でｋｃａｔ＝１６０／秒、ＫＭ＝１１μＭであった。ＡＰＴＴ試薬のSigma Diagnostics Alexinは、Trinity Biotech社（ウィックロー、アイルランド）より入手した。アルガトロバン（保存濃度１００ｍｇ／ｍＬ）はGlaxoSmithKline社（フィラデルフィア、ペンシルベニア州）より入手した。この保存液は、実験に先立って１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８で希釈した。1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol（ＰＦＯ、９８％）はAlfa Aesar社より入手した。
【０２１６】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイのプロトコル。血液試料は、シカゴ大学病院放射線学科の機関審査委員会（プロトコル＃１２５０２Ａ）の承認を得て健常な供血者から入手した。全血は、脱灰全血を得るために、１部３．２％クエン酸ナトリウム対９部血液の比でバキュテナーチューブに採集した。チューブは穏やかに振って内容物を混合した。供血者の全血（細胞も血漿も含有している）を使う実験用に、試料はさらに処理することなくバキュテナーチューブから使用した。供血者の血小板豊富血漿（ＰＲＰ）を使う実験用に、血漿は、バキュテナーチューブからの試料を１６００ｒｐｍで１０分間２度遠心分離した後に得た。正常プール血漿（血小板不足血漿、ＰＰＰ）は、George King Biomedical社（オーバーランドパーク、カンザス州）から入手し、−８０℃で保存した。これらのプール血漿試料は、少なくとも３０人の健常な供血者の血漿で構成されていた。正常プール血漿（ＰＰＰ）を使う実験用に、試料は解凍し、次に１５００ｒｃｆで１５分間遠心分離して、長い貯蔵から生じた沈着デブリを除去した。
【０２１７】
血液凝固のネットワーク中の反応は、通常２種類の経路、即ち、内因性経路と外因性経路に分類される。ＡＰＴＴアッセイは、内因性経路により開始された場合の凝固に必要な時間を測定する。ＡＰＴＴ試薬は、２つの成分、即ち、ｉ）第XII因子に結合して内因性経路を開始させる負に帯電した粒子、及びii）因子複合体に必要な結合部位を提供するリン脂質を含有している。この研究に使用するＡＰＴＴ試薬であるAlexinでは、活性化因子はエラグ酸であり、リン脂質はウサギ脳セファリンであった。まず、一部の脱灰血液試料を一部のAlexinと混合し、３分間インキュベートして、凝固の内因性経路を十分に活性化した。次に、血漿とAlexinのこの混合物は、一部の２０〜２５ｍＭ  ＣａＣｌ２でカルシウム再沈着化した。ＣａＣｌ２の最終濃度は約７〜８ｍＭである。過剰なＣａＣｌ２を使ってクエン酸の効果を克服する。最後に、ＣａＣｌ２の添加と試料内でのフィブリン塊の検出の間に経過する時間はＡＰＴＴとして記録する。この手順は、ＡＰＴＴを測定するためにプラグベースマイクロ流体デバイスを適合させるための指針として使われた。ＡＰＴＴの臨床結果は、シカゴ大学病院の凝固研究所によりSTA Coagulation Analyzer（Diagnostica Stago社製、パルシパニー、ニュージャジー州）を使って測定した。
【０２１８】
マイクロ流体装置。マイクロ流体デバイスは、ＰＤＭＳ、poly(dimethylsiloxane)にラピッドプロトタイピングを使って作製した。マイクロチャネルは、tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane蒸気を１時間ではなく１．５時間デバイスに流し込む以外は、以前記載されたシラン処理プロトコルを使って、疎水性及び蛍光親和性にした。シラン処理プロトコルに加えて、マイクロチャネルは無定形Teflon（Teflon AF 1600, poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethy)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]）で被膜した。まず、マイクロチャネルは、ＦＣ−７０とＦＣ−３２８３の１：４（ｖ／ｖ）混合物中１％（ｗ／ｖ）Teflon AF 1600溶液で満たした。３７℃で行う実験では、マイクロチャネルは、ＦＣ−７０とＦＣ−３２８３の１：１（ｖ／ｖ）混合物中２．５％（ｗ／ｖ）Teflon AF 1600溶液で満たした。次に、デバイスは、溶液が蒸発するまで一晩７０℃で乾燥させた。複合ガラス／ＰＤＭＳ毛細管デバイスは、ガラス毛細管をＰＤＭＳデバイスに結合させる前にPlasma Prep II血漿洗浄剤を使って親水性にする以外、以前記載された（Zheng et al., 2004, Angew. Chem. Int. Edit. 43: 2508-2511）通りに作製した。
【０２１９】
マイクロ流体実験。マイクロ流体実験は、以下の変更をして以前記載された通りに行った。プラグは、１０：１（ｖ／ｖ）のＦＣ−７０対ＰＦＯの混合物であるフッ素化分散媒を使って形成し、２３℃でγ＝１０ｍＮｍ−１及びμ＝２４ｍＰａ  ｓであった。フッ素化分散媒の流量は３μＬ／分に維持した。プラグを形成するために使用した水溶液はAlexin及び血液試料（全血血小板豊富血漿又は血小板不足血漿のいずれか、さらに詳しい情報は次の段落参照）であった。Alexinでは、流量は、２３℃で行う実験では０．３μＬ／分、３７℃で行う実験では１．２μＬ／分であった。２つの血流では、全体流量は、２３℃では０．３μＬ／分、３７℃では１．２μＬ／分であった。１００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液（３００ｍＯｓ）を一滴、合流接合点でそれぞれのプラグに注入した。ＣａＣｌ２溶液の流量は、２３℃では０．２μＬ／分、３７℃では０．４μＬ／分であった。Alexin、２つの血流、及びＣａＣｌ２溶液の流量から評価すると、ＣａＣｌ２の濃度は、２３℃及び３７℃の実験でそれぞれ２５ｍＭ及び１４ｍＭであった。過剰なＣａＣｌ２を使って、クエン酸の効果を克服した。３７℃の実験では、顕微鏡加熱試料台（Brook Industries社製、レークヴィラ、イリノイ州）を使ってデバイスを３７℃に保った。
【０２２０】
このセクションのすべての図（図２８は除く）では、マイクロ流体デバイスの主ＰＤＭＳチャネルは、３００μｍ×２７０μｍ（幅×高さ）、小チャネルは１００μｍ×１００μｍであった。図２８ａでは、主ＰＤＭＳチャネル及びサイドチャネルの両方が２００μｍ×２５０μｍであった。図２８ｂでは、主ＰＤＭＳチャネルは２００μｍ×２５０μｍ、小サイドチャネルは５０μｍ×５０μｍであった。図２８ｃでは、主ＰＤＭＳチャネルは２００μｍ×２６０μｍ、サイドアーム及びコーナーボリュームの高さは８０μｍであった。
【０２２１】
全血試料を使ったＡＰＴＴの測定。全血を使ったマイクロ流体実験では、水性シリンジ中の原液は、ｉ）Alexin、ii）全血及びiii）３．０μｇ／ｍＬアルガトロバンを含む全血であった。実験は、Leica DM IRB又はDMI6000顕微鏡のいずれかを使って行った。全血で形成されたプラグ内のフィブリン塊は、Spot Insightカラーデジタルカメラ（Diagnostics Instruments社製）を使って光学的に検出した。
【０２２２】
血漿試料を使ったＡＰＴＴの測定。血漿（血小板豊富又は血小板不足のいずれか）を使ったマイクロ流体実験では、３種類の水性シリンジ中の原液は、ｉ）Alexin、ii）３．５μＬ基質溶液を２４６．５μＬ血漿に添加することにより調製した１５０μＭ蛍光発生基質を含む血漿、及びiii）３．５μＬ基質溶液及び０．７５μＬのアルガトロバン（１ｍｇ／ｍＬ）を２４５．５μＬ血漿に添加することにより調製した１５０μＭ蛍光発生基質及び３．０μｇ／ｍＬアルガトロバンを含む血漿であった。実験は、Leica DMI6000顕微鏡を使って行った。α−トロンビンに対する蛍光発生基質の切断は、DAPIフィルター（λｅｘ＝３５０±２５ｎｍ、λｅｍ＝４６０±２５ｎｍ）及び冷却CCD ORCA ERG 1394（１２−ｂｉｔ、１３４４×１０２４解像度）（Hamamatsu Photonics社製、浜松市、日本）を使って蛍光により顕微鏡上でモニターした。血漿試料内のフィブリン塊は、明視野顕微鏡により顕微鏡上でモニターした。
【０２２３】
ＡＰＴＴ試験を実施するためのマイクロ流体チップの全体設計
マイクロ流体デバイスは、５つの異なる区域、即ちプラグ形成区域、混合区域、インキュベーション区域、合流接合点及び検出区域からなっていた（図２７）。図２７に示すのは、ＡＰＴＴを判定するための及びアルガトロバンを滴定するためのプラグベースマイクロ流体デバイスの模式図である。Alexin（ＡＰＴＴ試薬）及び血液（血漿又は全血のいずれか）を含有するプラグは、プラグ形成区域で形成され、次にインキュベーション区域に輸送される（マイクロ写真、上左）。３分間流れた後、ＣａＣｌ２溶液を合流接合点で各プラグに注入した（マイクロ写真、上右）。ＣａＣｌ２液滴はマイクロ写真中の破線で跡をつけた。検出区域では、プラグ内で形成された凝血塊は、時間の関数として観測した（マイクロ写真、下右）。
【０２２４】
３種類の水性試薬、即ちｉ）Alexin、ii）脱灰血液、及びiii）アルガトロバンと混合した脱灰血液、のプラグを形成した。血液試料は、供血者の全血、供血者の血漿（ＰＲＰ）又は正常プール血漿（ＰＰＰ）のいずれかであった。Alexinの流速及び血流の組合せ流速は、ＡＰＴＴアッセイにより要求される通りに、１：１比で維持した。２つの血流の相対的流速を変化させることにより、プラグ内のアルガトロバンの濃度を変化させた。プラグ内での試薬の混合を促進するために、マイクロ流体ネットワークの設計に曲がりくねったチャネルを組み込んだ。インキュベーション区域のマイクロチャネルの長さは、特に水性及びフッ素化分散媒流の全体流速で、プラグのインキュベーション時間が、ＡＰＴＴアッセイにより特定化された３分になるように設計した（図２７、マイクロチャネルネットワークの上部区域）。
【０２２５】
合流接合点は、インキュベーション後にプラグにＣａＣｌ２を注入するのに必要であった（図２７、マイクロチャネルネットワークの右側）。この接合点に関するこれ以上の情報は下に与えている。プラグ内でのＣａＣｌ２の混合を加速するために、別の曲がりくねったチャネルをマイクロチャネルネットワークに設計した。ＡＰＴＴの開始時間（ｔ＝０）は、合流接合点で血液のプラグをＣａＣｌ２溶液と合流させた時点に定めた。これは、ＡＰＴＴアッセイの開始時間がＣａＣｌ２を血液試料に添加する時間に等しい臨床検査室で使用される方法に一致する。しかし、予備マイクロ流体実験では、凝固時間は混合速度に依存しているように思われた。混合速度は、広範囲の自己触媒システムに影響を与えることが知られている。
【０２２６】
ＰＤＭＳマイクロチャネル壁に接着することなくプラグ内部でフィブリン塊をもっと確実に輸送するために、マイクロチャネルの表面をまずフッ素化シランで処理し、次に無定形テフロンで被膜した。プラグ内でフィブリン塊が形成される時間を判定するために、検出区域で明視野及び蛍光顕微鏡により画像を撮り分析した（図２７、マイクロチャネルネットワークの下部区域）。
【０２２７】
流れを流動プラグに合流させる２つの新しい方法
プラグベースマイクロ流体システム上での多段階アッセイを実施するためには、試薬のプラグへの注入が必要である。３種類の合流方法：即ちｉ）試薬を含有するチャネルを通過する際に試薬を直接プラグに注入する；ii）液滴の及びプラグ３５の形成間の頻度が一致すると、小液滴を主チャネルの近接する比較的大きなプラグに合流させる；iii）１０の比較的小さな液滴を単一の比較的大きなプラグに合流させる、がプラグベースマイクロフルイディクスのために以前開発されていた。しかし、これら３種類の方法は、このアッセイにおいて実行するのは困難であった。これらの遅い流速（ＣａＣｌ２流で０．１〜０．２ｍｍ／秒）では、ＣａＣｌ２が通過して行くプラグに直接注入される場合、サイドチャネルにおいてＣａＣｌ２流の汚染が起きた（図２８ａ）。サイド接合点がさらに小さい幅及び高さで使われる場合、小液滴のＣａＣｌ２が形成され、接合点で通過するプラグと合流しなかった（図２８ｂ）。
【０２２８】
図２８は、疎水性サイドチャネルを使ったマイクロ流体デバイス内での合流を図示する。図２８ａには、サイドチャネルが疎水性（シラン処理ＰＤＭＳ）の場合、サイドチャネルが大きい（幅２００μｍ及び高さ２５０μｍ）と汚染が起きた（５実験中５実験）様子が示されている。図２８ｂは、サイドチャネルが小さすぎる場合（幅及び高さが２０μｍ）は、合流が起きなかった（４実験中４実験）ことを図示する。合流のための別のアプローチは、ＣａＣｌ２の液滴を通過するプラグと同じ頻度で形成することであった。図２８ｃは、接合点で、通過して行くプラグ同士間の分散媒がサイドアームに流れ込んで、ＣａＣｌ２流からの液滴を中断する様子を示す。図２８ｄには、様々な水分画ｗｆでＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓ＝０．１２５に対して一貫して合流が得られたことが示されている（△）。一定のｗｆ＝０．４では、ＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓ＝０．１２５に対してのみ高い割合の合流（９５％）が測定された（■）。各記号は１００プラグからの測定値を表している。スケールバーはすべて１００μｍであった。
【０２２９】
本発明者らは、合流のための２つのアプローチを実行した。最初のアプローチでは、合流接合点は、プラグ同士間のフッ素化分散媒がサイドアームに流れ込んで、コーナーボリューム内のＣａＣｌ２の液滴を中断させるように設計した（図２８ｃ）。この設計をするために、水性プラグ及びプラグ同士の間隔をあける分散媒のサイズは、種々の水分画ｗｆに対して特徴付けた。この設計を使って、その接合点を通過するプラグとコーナーボリュームで形成される液滴間で頻度を一致させた。成功した合流はＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓの比に依存していたが、水分画ｗｆには依存していなかった。水分画ｗｆ＝Ｕａｑｕｅｏｕｓ／Ｕｔｏｔａｌであり、Ｕａｑｕｅｏｕｓ［μＬ／分］は血液及びAlexinの水流の全容積流量、Ｕｔｏｔａｌ［μＬ／分］は血液、Alexin及び分散媒流の全容積流量、並びにＵＣａＣｌ２［μＬ／分］はＣａＣｌ２流の流量である。プラグ及びプラグ同士の間隔をあける分散媒の長さには、wf及びＵｔｏｔａｌ［μＬ／分］の関数としての依存性が存在した。ｗｆ＝０．４では、成功した合流事象の最高の割合（９５％）は、ＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓ＝０．１２５で、ＵＣａＣｌ２が０．１μＬ／分に維持された時に観測された（図２ｄ、中黒記号）。ＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓを０．１２５に維持した場合、０．３６〜０．４５までの種々のｗｆで成功した合流（９２％〜９９％）が観測された（図２ｄ、中白記号）。このアプローチの利点は、大きな作製努力を必要としないことであった。しかし、合流は、広範囲のＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓにわたり一貫して起きたわけではなかった。
【０２３０】
図２９ａは、サイドチャネルに挿入された親水性ガラス毛細管を使った一貫した合流を図示する。図２９ｂは、プラグへのＣａＣｌ２の注入量、Ｖｉｎｊｅｃｔｅｄ  ＣａＣｌ２［ｎＬ］が流量［μＬ／分］により制御されていた様子を示しており、ＵＣａＣｌ２はＣａＣｌ２流の流量、ＵａｑｕｅｏｕｓはAlexin及び血液の流に対する全水流量であった。表では、各記号は１０プラグの測定値を表している。ＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓの値ごとに少なくとも２つの記号が示されており、一部の記号は一致している。
【０２３１】
図２９ａに示されているアプローチは、サイドチャネルの界面化学の制御に依存していた。小サイドチャネルを使って、逆汚染を回避した（図２８ｂ）が、サイドチャネルは親水性になった。合流接合点は、親水性毛細管をこのサイドチャネルに挿入することにより作製した。ＣａＣｌ２溶液は、湿潤のために毛細管に付着したままであり、図２８ｂに見られる望ましくない液滴は形成されなかった。この例では：（ｉ）この方法が機能するように主チャネルの縁に合わせて毛細管フラッシュを挿入すること、及び（ii）血液プラグのサイズをＣａＣｌ２液滴のサイズより大きくすること（ＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓ＜１、典型的には本明細書の実験では０．１７〜０．３３）が重要である。これらの２つの必要条件が満たされると、本発明者らがＡＰＴＴアッセイのために使用した水流（０．６〜２．４μＬ／分）及びＣａＣｌ２流（０．２〜０．４μＬ／分）の流量で一貫した合流（１００％、＞異なるデバイスでの４０実験）が観測された。プラグに注入されているＣａＣｌ２の体積Ｖｉｎｊｅｃｔｅｄ  ＣａＣｌ２［ｎＬ］は、ＵＣａＣｌ２／Ｕａｑｕｅｏｕｓと共に直線的に増加した（図２９ｂ）。流量を制御することにより、注入試薬の正確な量は容易に制御することができた。ＡＰＴＴ測定のためのＣａＣｌ２溶液の直接注入にこの合流アプローチを使った。
【０２３２】
プラグ内の凝血塊を検出し画像を分析して、ＡＰＴＴ及びトロンビン生成を測定する
ＡＰＴＴは、ＣａＣｌ２の添加から血液試料内のフィブリン塊の検出までの経過時間である。試験センターで使用する大半のポイントオブケアデバイス及び市販の機械では、フィブリン塊の形成は、光学的透過率の変化又は磁性粒子の運動の変化を検出することにより検出する。本明細書では、プラグ内のフィブリン塊は、明視野顕微鏡によって検出され、プラグ内のトロンビン生成は蛍光顕微鏡によって検出された。マイクロチャネルを進んでいくプラグを撮影した画像の分析により、本発明者らはプラグ内のＡＰＴＴを判定する標準法を確立した。
【０２３３】
供血者の全血のプラグ中でフィブリン塊を検出する。全血で形成されたプラグでは、明視野顕微鏡を使って、フィブリン塊内の赤血球（ＲＢＣ）の捕獲を検出した。図３０は、明視野顕微鏡を使った全血プラグ内の凝血塊の観測を図示する。図３０ａは、全血の単一プラグがマイクロチャネルを通過しながら追跡される様子を図示する。時間ｔ［秒］は、ＣａＣｌ２と合流した後にプラグが進んだ時間であった。赤血球がもはやプラグ内部で動かなくなり、濃密な凝血塊がプラグの後半部内で観測された時、プラグ内の全血は完全に凝固したと見なした（ａ、一番下の画像）。図３０ｂは、プラグの画像（ａのような）を分析することにより、フィブリン塊を含有するプラグの割合が、検出区域において時点ごとに判定された様子を図示する。総数で少なくとも２０プラグが、時点ごとに使われた。実験は２３℃で実施した。
【０２３４】
ＡＰＴＴは、プラグ内のＲＢＣが（マイクロチャネルを流れるプラグの動きに対して）もはや動いていない時間であると判定された。単一プラグの一連の画像は、２フレーム／秒で得られた。単一プラグを追跡するため、顕微鏡試料台は、マイクロチャネル内を移動するプラグの速度に対して同一速度で動かした。凝固する前、ＲＢＣは均一に分散しており、プラグ内の内部循環により動かされていた。しばらくたった後、ＲＢＣの小さな塊がプラグ内に現れたが、内部循環によりまだ動いているＲＢＣもあった（図３０ａ、一番上の画像、ｔ＝１２１秒）。動いているプラグ内の剪断（約２／秒）は、血小板を活性化することにより凝固を誘導するのに必要な剪断（約７５０／秒）よりはるかに低かった。しばらくたって、フィブリン塊に捕われたＲＢＣのより大きくより濃厚な塊がプラグの後半部に移動し、残りのＲＢＣは、フィブリンネットワーク内に捕われているために動かなかった（図３０ａ、一番下の画像、ｔ＝１３６秒）。図３０ａに示されるプラグでは、プラグのＡＰＴＴは２３℃でｔ＝１３６秒であった。ｔｔｒａｎｓ［秒］は、凝固の最初の兆候（図３０ａ、一番上の画像）からＲＢＣがプラグに対してもはや動かなくなる時（図３０ａ、一番下の画像）までに経過した時間と定義した。図３０ａに示されるこのプラグでは、ｔｔｒａｎｓは１５秒であった。
【０２３５】
ＡＰＴＴは多くのプラグからも統計的に判定された。各時点で、少なくとも２０プラグに対して画像が得られた。各時点での一組の画像から、フィブリン塊を含有するプラグの数を計測した。この数をプラグの総数で割って、各時点での「凝固したプラグの割合」を得た（図３０ｂ）。ＡＰＴＴは、全血のプラグの５０％が凝固する時間であった。ＡＰＴＴは２３℃で１２２秒であり（図３０ｂ）、以前測定されたＡＰＴＴの２３℃で１７５±５８秒、２５℃で１０４±２０秒と一致していた。平均ｔｔｒａｎｓは、全血の９プラグに対し１５．４±２．８秒であった。
【０２３６】
供血者の血漿（血小板豊富）で形成されたプラグ内の凝血塊を検出する。臨床研究所は、全血ではなく血漿を使ってＡＰＴＴを測定することが多い。本発明者らは、２つの方法、即ち明視野顕微鏡を使って濃厚なフィブリン塊の形成を観測すること、及び蛍光顕微鏡を使ってトロンビンによる蛍光発生基質の切断を検出することを使って血漿のＡＰＴＴを判定した。
【０２３７】
図３１は、明視野及び蛍光顕微鏡を使った、血小板豊富血漿（ＰＲＰ）のプラグ内でのフィブリン塊形成の観測を図示する。図３１ａは、血漿の単一プラグをマイクロチャネルを通過する際に追跡した様子を示す（ａ、左パネル）。明視野画像は、凝血塊がもっと容易に見えるようにデジタルゾーベル（Sobel）フィルターで処理した（ａ、右パネル）。血漿は、フィブリン塊がプラグの後半部に凝縮し、プラグの連続画像が同じに見える時に完全に凝固したと見なした（ｔ＝１１２．５秒の画像をｔ＝１１５．５秒の画像と比較されたい）。図３１ｂは、血漿内でトロンビンに対する蛍光発生基質を含有するプラグが形成された様子を図示する。この基質の蛍光強度は増加する。グラフでは、黒い破線はそれぞれ、個々のプラグから生じた蛍光強度を表しており、ここで単一プラグはマイクロチャネルを通過する際に追跡された（全部で４プラグを示す）。蛍光顕微鏡で収集した画像から得られた積分強度は、（赤色正方形）明視野顕微鏡を使った画像から観測される凝固したプラグの割合と比較した。蛍光強度が最大蛍光シグナルの約３０％の時には、プラグの約５０％が凝固していた。各記号は、検出区域において各時点での少なくとも１０プラグの測定値を表している。実験は２３℃で実施した。
【０２３８】
明視野顕微鏡を使って血漿内のフィブリン塊を観測するために、マイクロチャネルの中を進んでいく単一プラグの時系列の画像を得た（図３１ａ、左パネル）。デジタル畳み込みフィルターゾーベル（Metamorphソフトウェアによる）を使って、凝血塊の視覚的検出を支援した（図３１ａ、右パネル）。図３１ａに示すプラグでは、ＡＰＴＴは約１１３秒であり、ｔｔｒａｎｓは１４秒であった。ｔｔｒａｎｓ［秒］は、凝固の最初の兆候（図３１ａ、最初の画像）からプラグに対してフィブリン塊がもはや動かなくなる時（図３１ａ、第５画像）までに経過した時間と定義した。
【０２３９】
蛍光顕微鏡を使って、血漿のプラグに対してトロンビン生成のさらに定量的な判定を行うことができる。本発明者らは、トロンビンに対する蛍光発生基質を使った。トロンビンで切断されると、この基質の蛍光強度は約１０倍増加する。トロンビンは凝固ネットワークで生成される最終酵素であり、フィブリノーゲンを切断することによりフィブリン塊の形成を推進する。フィブリン塊は低濃度のトロンビン（２〜１０ｎＭ）で形成され、大多数のトロンビン（約１μＭ）は凝血塊が完全に形成された後に生成される。トロンビンは、基質と比較するとフィブリノーゲンを切断する方を好む。
【０２４０】
血漿の単一プラグをマイクロチャネルを通過する際に追跡し、その蛍光強度を時間の関数として測定した（４プラグに対して示される、各プラグは１つの黒色破線により表される、図３１ｂ）。個々のプラグそれぞれの実際のＡＰＴＴは異なるが、相対的蛍光強度が０から１に増加するのに要する時間は同じであった。多くのプラグに対する平均ＡＰＴＴを判定するために、本発明者らは、明視野顕微鏡によるフィブリン塊の検出を蛍光顕微鏡によるトロンビン生成の検出と関連付けた。同一実験から明視野及び蛍光顕微鏡により各時点での画像を得た。明視野画像を分析して、凝固したプラグの割合を時間の関数として判定した。ＡＰＴＴ（約１００秒）はプラグの５０％がフィブリン塊を含有する時間であると判定された。このＡＰＴＴは、最大蛍光シグナルの約３０％の蛍光強度と相関があった（図３１ｂ）。
【０２４１】
アルガトロバンの滴定並びにＡＰＴＴ及びトロンビン生成の測定
ＡＰＴＴに対する抗凝固薬の効果を判定するために、正常プール血漿、供血者の血漿、又は供血者の全血の試料にアルガトロバンを滴定しながらＡＰＴＴを測定した。正常プール血漿のＡＰＴＴを測定することは、中央臨床検査室の凝固計器の標準較正法である。したがって、本発明者らは、正常プール血漿からもＡＰＴＴを得た。オンチップ滴定では、血液の２つの注入流のうちの１つが３μｇ／ｍＬのアルガトロバンを含有していた。これらの２つの血流の相対的流量を変化させることにより、プラグ内のアルガトロバンの濃度を変化させた。実験は、２３℃及び３７℃で行った。
【０２４２】
図３２は、アルガトロバンを血液試料に滴定しながらの２３℃でのトロンビン生成及びＡＰＴＴの測定を図示する。図３２ａ、ｂは、血漿におけるトロンビン生成の検出を図示する。図３２ｃは、全血におけるＡＰＴＴの測定を示す。図３２ｄは、（ｃ）に対するこうして得られたＡＰＴＴ比を示す。プラグ内のアルガトロバンの濃度は、０μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ、及び１．０μｇ／ｍＬであった。各記号は少なくとも２０プラグの測定値を表している。図３２ｃに示す全血試料では、ＡＰＴＴは、凝固したプラグの割合が５０％である時間であった。図３２ｄは、ＡＰＴＴ比がアルガトロバンの各濃度で全血試料に対して判定された様子を図示する。ＡＰＴＴ比は、アルガトロバンを含まない基準ＡＰＴＴに対するアルガトロバンを含むＡＰＴＴの比であった。
【０２４３】
２３℃で行った実験では、供血者の血漿試料におけるトロンビン生成に対するアルガトロバンの効果は、正常プール血漿から得られた結果と十分一致していた（図３２ａ、ｂ）。ＡＰＴＴ比は、アルガトロバンを含まない基準ＡＰＴＴに対する血漿中にアルガトロバンを含むＡＰＴＴの比である。供血者の全血試料では、２３℃でのＡＰＴＴ比は、アルガトロバンの濃度への依存性を示していた（図３２ｄ）。通常、０．２と２．０μｇ／ｍＬ間のアルガトロバンの用量は、１．５と３．０間のＡＰＴＴ比を達成するのに必要である。このオンチップＡＰＴＴアッセイを使って、２３℃で、アルガトロバン用量０．５μｇ／ｍＬでは２．３のＡＰＴＴ比、及びアルガトロバン用量１．０μｇ／ｍＬでは２．８のＡＰＴＴ比が達成された（図３２ｄ）。この供血者では、アルガトロバンの濃度に対するＡＰＴＴ比の非線形依存性が観測された。この依存性は、血漿を使った実験から全血を使った実験まで再現性があった。
【０２４４】
３７℃の生理的温度での実験を行うためには、プロトコルからの２つの修正が必要であった。まず、さらに濃縮したテフロンＡＦ溶液（２３℃での測定のため１％ｗ／ｖに代わって２．５％ｗ／ｖ）を使ってマイクロチャネルを被膜し、フィブリン塊のマイクロチャネル壁への固着を防いだ。フィブリン塊は温度が高くなるほどチャネル壁に付着する可能性が高くなった。第２に、Alexin及び血液試料のさらに高い注入流量を使ってさらに大きなプラグを形成した（プラグの幅対長さ比は約１：３であった）。
【０２４５】
図３３は、（ａ）正常プール血漿、（ｂ）供血者の血漿へアルガトロバンを滴定しながらの３７℃でのＡＰＴＴ測定値、並びに（ｃ）ＡＰＴＴの、及び（ｄ）ＡＰＴＴ比の対応する値を図示する。両血漿試料では、ＡＰＴＴは、プラグの５０％がフィブリン塊を含有する時間であった。プラグ内のアルガトロバンの濃度は０μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、及び１．５μｇ／ｍＬであった。各記号は、少なくとも２０プラグの測定値を表している。図３３ｃは、正常プール血漿を使った臨床ＡＰＴＴの値が、正常プール血漿及び供血者の血漿を使ったプラグベースマイクロ流体実験で測定したＡＰＴＴの約２分の１であった様子を図示する。図３３ｄは、ＡＰＴＴ比が、正常プール血漿を使った臨床ＡＰＴＴと、正常プール血漿及び供血者の血漿を使ったプラグベースマイクロ流体実験の間でよく一致していた様子を示す。
【０２４６】
アルガトロバンを２３℃の実験と同じ方法で滴定しながら、正常プール血漿（図３３ａ）及び供血者の血漿（図３３ｂ）についてＡＰＴＴを３７℃で測定した。３７℃で得られたＡＰＴＴも、２３℃で得られたＡＰＴＴの約４分の１の短かさであった。ＡＰＴＴ比は、これら２つの温度で類似していた。アルガトロバン０．５μｇ／ｍＬでは、２３℃でＡＰＴＴ比２．３が（図６ｄ）、３７℃でＡＰＴＴ比約２．１が（図３３ｂ）得られた。アルガトロバン１．０μｇ／ｍＬでは、２３℃でＡＰＴＴ比２．８が（図３２ｄ）、３７℃でＡＰＴＴ比２．７が（図３３ｂ）得られた。３７℃でのオンチップアッセイにより測定されたＡＰＴＴ値及びＡＰＴＴ比を、３７℃での臨床検査室から得られた結果と比較した。プール血漿試料をアルガトロバン（０〜１．５μｇ／ｍＬ）と混合し、ＡＰＴＴ測定のためにシカゴ大学の凝固検査室に提出した。凝固検査室から得られたＡＰＴＴは一貫して、本発明者らがオンチップアッセイから得たＡＰＴＴの約半分であった（図３３ｃ）。しかし、これらの２つの方法から得た対応するＡＰＴＴ比は互いによく一致していた（図３３ｄ）。
【０２４７】
２つの技術的発展により、この例で提示される作業が可能になった。まず、テフロンＡＦコーティングの使用は、マイクロチャネル壁へのフィブリン塊の固着を最小限に抑えることに寄与した。第２に、水流からプラグへの試薬の確実な添加は、試薬流を親水性の狭いガラス毛細管を通して注入することにより実現された。この合流方法は、特に相互汚染を最小限に抑えなければならず、試薬の比を変化させなければならない場合には、多段階アッセイ及びプラグ内の反応の実施には重要であると考えられる。本発明の方法は、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイを含む、血液を使う他のアッセイ及び血液試料内の他の分析物の検出に有用であると考えられる。前処理試薬カートリッジを使った単一血液試料に関する複合試験及び滴定を迅速に実施すること（Zheng et al., 2005, Angew. Chem. Int. Edit. 44: 2520-2523）は、このプラグベースマイクロ流体システムを使って実現することができる心躍る好機である。
【０２４８】
図３６は、総表面積ではなく、個々のパッチのサイズｐが重要であるという仮説を試験するための実験の模式図である。図３６ａは、活性化表面の小パッチ（ｐｓ）のアレイは凝固を開始しないという仮説を図示する。図３６ｂは、単一大パッチ（ｐｌ）が凝固を開始させる様子を図示する。（ａ）の９パッチの総活性化表面積は（ｂ）の大パッチの表面積に等しい。活性化表面は、化学モデル実験では酸性層であり、血漿実験では組織因子を含有する負に帯電した脂質である。
【０２４９】
図３７は、閾値以下パッチのクラスターは、パッチが拡散により連通するくらい互いに近くに置かれた場合には凝固を開始させるという仮説を試験するための実験の模式図である。図３７ａは、活性化表面の閾値以下パッチのクラスターが拡散長スケールｐｔｒよりも大きな距離ｄで隔てられた場合は凝固を開始しないという仮説を図示する。図３７ｂは、閾値以下パッチはｐｔｒよりも短い距離で隔てられた場合には凝固を開始させるはずである様子を示す。活性化表面は、化学モデル実験では酸性層であり、血漿実験では組織因子を含有する負に帯電した脂質である。
【０２５０】
図３８は、ヒトの凝固ポテンシャルを迅速に特徴付けることができるシステムの模式図を図示する。図３８ａは、特定の血液試料の閾値パッチサイズを迅速に測定するのに使うことができる異なるサイズのパッチの単一アレイを図示する。２種類の活性化表面、即ち再形成ＴＦを有する負に帯電した脂質（外因性経路用）及び親水性ガラス（内因性経路用）を使うことができる。図３８ｂは、パッチのアレイをマイクロチャネル内部に作製することができる様子を図示する。各チャネルは、一連の組織因子パッチ及び一連の親水性ガラスパッチを含有することができる。チャネル間では、パッチサイズ、ＴＦ濃度、及び薬物用量の範囲などのパラメータを変えることができる。凝固因子異常のある市販の血漿試料、並びにアルガトロバン及びヘパリンなどの薬物が添加された血液試料を含む、多数及び多種類の試料にはハイスループット測定を行うことができる。
【０２５１】
本発明は、記載の特定のデバイス、方法、プロトコル、被検体、又は試薬に限定されるものではなく、したがって変化してよいことを理解すべきである。本明細書で使用の用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲のみにより限定されることも理解すべきである。普通に遭遇し、当業者には明白な種々の条件及びパラメータの適切な修正及び改作は、本発明の範囲内である。本明細書に引用する出版物、特許、及び特許出願はすべて、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込まれているものとする。オンラインで入手できる、及び上で参照した出版物に付随する補助的資料（情報、原文、グラフ、画像、表、及び映画を含む）も、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】拡散と反応間の競合の略図であり、この競合が所与のパッチ上で凝固の開始が起こるかどうかを決定する。
【図２】流動の不在の下でのマイクロ流体チャネル中の血液凝固伝播の測定を図示する画像及びグラフを示す。
【図３】ベッセル同士の接合点を使って血液凝固伝播の閾値を評価することができる様子を図示するマイクロ写真及びグラフを示す。
【図４】単純化学的機序の基づく凝固開始の数値シミュレーションを描くグラフを示す。
【図５】化学モデル及び血漿における開始の相似関係を図示し、開始が凝固刺激、即ち組織因子（ＴＦ）の量に応答する様子を示す。
【図６】ヒト血漿の凝固開始が同一面積の表面パッチの形状に応答する様子を図示する画像及びグラフを示す。
【図７】単純化反応−拡散システムの数値シミュレーションが形状への応答を実証する様子を図示する画像を示す。
【図８】止血を再現するように構築された単純化化学システムが同一面積の刺激を提示する表面パッチの形状に応答する様子を図示する画像とグラフを示す。
【図９】化学モデルを使う実験用の装置の模式図である。
【図１０】反応速度式の速度プロットがモジュール機序の数値シミュレーションに組み込まれている様子を図示するグラフを示す。
【図１１】数値シミュレーションが、モデルにおける「凝固」開始の可能性がパッチサイズに対する閾値応答を示すことを示唆している様子を示すグラフである。
【図１２】血漿及び全血実験において使われるマイクロ流体チャンバーを模式的に図示する。
【図１３】生成する酸の量がパッチの総表面積に依存している様子を図示する。
【図１４】フォト酸表面上の化学モデルにおけるｐＨ感受性色素の蛍光強度プロファイルの定量化を図示する。
【図１５】血漿の凝固開始の定量化を図示する。
【図１６】アレイ上の血漿の凝固開始の定量化を図示する。
【図１７】ヒト血漿及び単純化学モデルの両方が、凝固刺激を提示するパッチのサイズに対する閾値応答を有する凝固を開始させる様子を図示する画像及びグラフを示す。
【図１８】ヒト血漿におけるインビトロ凝固開始が、凝固活性化因子である組織因子（ＴＦ）を提示する脂質表面の総表面積ではなく、空間分布に依存していることを、化学モデルが正しく予測している様子を図示する画像及びグラフを示す。
【図１９】ヒト血漿の凝固開始が、拡散により連通する閾値以下パッチの緊密なクラスター上で起こりうることを、化学モデルが正しく予測している様子を図示する画像を示す。
【図２０】第２（第XII因子）の経路を介した凝固開始を化学モデルが正しく予測している様子を図示する画像を示す。
【図２１】高（ａ）及び低（ｂ）剪断速度で２本のベッセルの接合点を通る凝固伝播の調節に対して提唱された機序の模式図である。
【図２２】▲ガンマ▼に対する閾値が接合点を通る凝固伝播を調節する様子の図解である。
【図２３】接合点を通る凝固伝播が、接合点での▲ガンマ▼により調節され、「弁」では調節されない様子の図解である。
【図２４】接合点を通る凝固伝播は、阻害剤を添加することにより変えられる様子を図示する。
【図２５】流動の存在の下で接合点を通る凝固伝播をモニターするための実験手順の模式図である。
【図２６】流動の存在の下で接合点を通る凝固伝播のために使われるデバイスの実際の幾何学及び寸法を示す模式図である。
【図２７】ＡＰＴＴの判定用及びアルガトロバンの滴定用のプラグベースマイクロ流体デバイスの模式図である。
【図２８】疎水性サイドチャネルを使ったマイクロ流体デバイス内での合流を図示する。
【図２９】親水性ガラス毛細管をサイドチャネルに挿入する様子、及びプラグ内への注入量が流量に制御されている様子を示す図表を図示する。
【図３０】明視野顕微鏡の使用、及び全血のプラグ内での観測された凝血塊の図表を図示する。
【図３１】明視野及び蛍光顕微鏡画像、並びに血小板豊富血漿（ＰＲＰ）のプラグ内でのフィブリン塊の形成の図表を図示する。
【図３２】血液試料中へアルガトロバンを滴定しながらの２３℃でのトロンビン生成及びＡＰＴＴの測定を図示するグラフを示す。
【図３３】（ａ）正常プール血漿、（ｂ）供血者の血漿へアルガトロバンを滴定しながらの３７℃でのＡＰＴＴ測定値、並びに（ｃ）ＡＰＴＴ及び（ｄ）ＡＰＴＴ比の対応する値を図示するグラフを示す。
【図３４】流動の不在の下での複数の血液試料の凝固伝播を同時にモニターするのに使うことができるデバイスの例を図示する。
【図３５】凝固の３局面、即ち、ｉ）開始、ii）流動の不在の下での伝播、及びiii）流れている血液試料への伝播をモニターするために使うことができるデバイスの例を図示する。
【図３６】総表面積ではなく、個々のパッチのサイズｐが重要であるという仮説を試験するための実験の模式図である。
【図３７】閾値以下パッチのクラスターは、パッチが拡散により連通するくらい互いに近くに置かれた場合には凝固を開始させるという仮説を試験するための実験の模式図である。
【図３８】ヒトの凝固ポテンシャルを迅速に特徴付けることができるシステムの模式図を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月2日(2008.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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