(57)【要約】  本発明によって、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色する方法が提供される。この方法は、少なくとも１つの細胞を、フィクス・エラスチカ植物の抽出物、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類からなる群から選択される染色剤と接触させ、それにより、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色することを含む。また、本発明によって、異なる分化段階の細胞を検出する方法および癌および代謝性疾患を診断する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞を、フィクス・エラスチカ植物の抽出物、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類からなる群から選択される染色剤と接触させ、それにより、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色することを含む、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色する方法。
【請求項２】
（ａ）少なくとも１つの細胞を、フィクス・エラスチカ植物の抽出物、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類からなる群から選択される染色剤と接触させ、その結果、予備染色された細胞を得ること、および
（ｂ）前記予備染色された細胞を少なくとも１つの色素と接触させること
を含む、少なくとも１つの細胞を染色する方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの細胞が、細胞の不均一に分化した集団を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの色素が１つの色素である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの色素が、塩基性色素および酸性色素からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、
（ｉｉ）前記少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの色素が前記酸性色素および前記塩基性色素を含むときには、前記酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、前記塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示される、
請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の不均一に分化した集団が固形組織切片を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の不均一に分化した集団が単離細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞の不均一に分化した集団が悪性細胞または前悪性細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞の不均一に分化した集団が胎児細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の不均一に分化した集団が、代謝が損なわれた細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィクス・エラスチカ植物の抽出物が葉の抽出物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィクス・エラスチカ植物の抽出物がエタノール抽出物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記エタノール抽出物が７０％エタノール抽出物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記フィクス・エラスチカ植物の抽出物が粗植物抽出物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記フィクス・エラスチカ植物の抽出物が、精製された植物抽出物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記フィクス・エラスチカ植物の抽出物が、希釈された抽出物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィクス・エラスチカ植物の抽出物が、図４３〜図４４に詳しく示されるようなＮＭＲスペクトルを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記染色剤が蛍光性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記染色剤が、３７５ｎｍで励起されたとき、蛍光を４３０ｎｍにおいて放射する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記染色剤がビオチン化される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４および前記プロアントシアニジン類の少なくとも１つが天然に存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４および前記プロアントシアニジン類の少なくとも１つが合成である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記フィクス・エラスチカ植物のエタノール抽出物が正電荷イオンにより補われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記正電荷イオンが、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの色素が２つの色素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの色素が、塩基性色素、酸性色素、トリアミノトリフェニルメタン誘導体、ジアゾ誘導体、および、これらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
前記２つの色素が、塩基性色素、酸性色素、トリアミノトリフェニルメタン誘導体、ジアゾ誘導体、および、これらの組合せからなる群から選択される色素を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記２つの色素により染色することが、連続して行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記塩基性色素が、ダリアおよびニューフクシンからなる群から選択される、請求項５、２７または２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記酸性色素がライトグリーンである、請求項５または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分化した細胞が正常な健全細胞であり、前記未分化の細胞が悪性細胞または前悪性細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）細胞を請求項２に記載の方法に従って染色すること、および
（ｂ）前記染色を分析すること
を含む、目的とする分化状態の細胞を特定する方法であって、
（ｉ）前記少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、
（ｉｉ）前記少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの色素が前記酸性色素および前記塩基性色素を含むときには、前記酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、前記塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示される、
方法。
【請求項３４】
前記未分化の細胞が悪性細胞または前悪性細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）対象の細胞を請求項２に記載の方法に従って染色し、その結果、細胞の染色された集団を得ること、および
（ｂ）前記細胞の染色された集団の染色を分析すること
を含む、対象におけるガンを診断する方法であって、
（ｉ）前記少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、
（ｉｉ）前記少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの色素が前記酸性色素および前記塩基性色素を含むときには、前記酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、前記塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、
従って、前記未分化細胞の存在またはレベルにより、悪性細胞または前悪性細胞が示され、それにより、対象におけるガンが診断される、方法。
【請求項３６】
（ａ）対象に抗ガン治療を施すこと、
（ｂ）工程（ａ）の後での対象の生検サンプルにおける悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルを請求項３４に記載の方法に従って分析することを含み、それによって、前記悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルにより、治療経過が示される、
抗ガン治療経過をその必要性のある対象において決定する方法。
【請求項３７】
対象のさらなる生検サンプルを工程（ａ）の前および／または工程（ｂ）と同時に得ることをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生検サンプルにおける前記悪性細胞または前悪性細胞の前記レベルを前記さらなる生検サンプルと比較することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）対象の生検サンプルにおける悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルを請求項３４に記載の方法に従って分析すること、
（ｂ）対象に、前記対象の生検サンプルにおける前記悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルに従って抗ガン治療の治療効果的な量を施すこと
を含む、抗ガン治療計画をその必要性のある対象において決定する方法。
【請求項４０】
工程（ａ）を工程（ｂ）の後で繰り返すことをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）細胞を作用因に供すること、
（ｂ）細胞の悪性表現型を、（ａ）の後、および、場合により（ａ）の前に請求項３４に記載の方法に従って分析すること
を含む、細胞の前悪性表現型または悪性表現型を転換させることができる作用因を特定する方法であって、表現型の転換により、細胞の前悪性表現型または悪性表現型を転換させることができる作用因が示される、方法。
【請求項４２】
前記作用因が試験組成物を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記試験組成物が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子化学物質、炭水化物、脂質、および、これらの組合せからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記作用因が試験条件を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記試験条件が、増殖条件および放射線条件からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞が多数の細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
大きい処理量のための手段を使用して行われる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記手段が、自動化されたサンプル採取デバイス、液体取り扱い装置、自動化された染色装置、ディスペンサー、ロボット、または、これらの任意の組合せを含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、細胞の表現型を特定するのに有用な化合物、方法および組成物に関し、より詳細には、悪性の表現型を有する細胞と、前悪性の表現型を有する細胞と、非悪性の表現型を有する細胞とを区別すること、または、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞とを区別すること、または、胎児の細胞に対して母体の細胞を区別することにおいて有用な化合物、方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、生物学的サンプル、細胞学的調製物または組織学的調製物において細胞を示差的に染色することに関する。本発明はさらに、創薬、標的の妥当性確認、診断、薬物治療のモニタリングおよび疾患進行のモニタリングにおける、そのような化合物、方法および組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍学的診断において、腫瘍細胞、悪性細胞または前悪性細胞の存在を検査標本において他の正常な細胞または反応性の細胞の中で決定し、また、可能であるならば、腫瘍のタイプ、および、腫瘍が由来した器官を決定することが必要である。
【０００３】
生細胞における病理学的に関連する形質の評価が、細胞の形態学の解釈によって、または、機能的側面を調べることによって、例えば、運動性［Ａｌｂｅｒｔｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ（１９９４）］、生命力、および、足場非依存的成長［ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＳａｌｍｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７６）、１９７：４６１〜４６３］などを調べることによって一般に行われる。それに反して、固定処理された細胞および組織サンプルは組織学的評価を受ける。例えば、悪性腫瘍またはガンは、表現型の変化を生じさせる形態学的変化を生じさせる。従来、これらの評価は、そのような細胞を人の眼に見えるようにするために、標本を１つの色素または複数の色素の組合せにより染色した後での光学顕微鏡観察によって行われる。その後、腫瘍診断が、Ｂｏｙｄ［Ｂｏｙｄ、“Ａ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ、第８版（１９７０）］（「新生物細胞の重要な特徴は、光学顕微鏡によって明らかにされる場合、核および染色体の異常、細胞質・核の比率低下、粗い不規則なクロマチンネットワーク、および、正常よりも大きい核小体である」）によって示唆されるように、様々な形態学的特徴に基づいて、例えば、組織構成、核および細胞質の構造、および、核対細胞質の比率などに基づいて確立される。加えて、代謝の障害が、代謝が正常な細胞の表現型と比較したとき、変化した（損なわれた）表現型を有する、代謝が損なわれた細胞の存在によって特徴づけられる。
【０００４】
それにもかかわらず、細胞学的評価では、正常な細胞集団の中に存在するガン細胞を所与の調製物において正確に特定することができない。１つの理由が、場合により、非悪性細胞がガン細胞の形態学的特徴をまねることである。例えば、反応性中皮細胞（これは漿液性滲出液に存在する）は、多くの場合、様々な異型特徴、例えば、多核化、核の過染色性、核の偏った位置、および、細胞質の好塩基性など、すなわち、典型的にはガン細胞に特徴的である特徴を呈する［Ｂｒｏｗｎｌｏｗ他、Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔ．Ｊ．（１９８２）、１４（１）：８６〜８８；Ｈａｎｓｅｎ他、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８４）、７７：８８７；Ｐｅｔｒｏｖａ他、Ｌａｂ．Ｄｅｌｏ．（１９８９）、６：９〜１１；Ｂｉｂｂｏ他（１９７６Ａ）、Ｗｉｒｅｄ他、“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ”、Ｃｈｉｃａｇｏ：Ｔｕｔｏｒｉａｌ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、第７版（１９７６）］。例えば、喀痰細胞診において、空胞のある細胞はガン細胞の可能性を示すが、肺炎の患者では特に、反応性腺細胞の可能性もまた示す［Ｂｉｂｂｏ他（１９７６Ｂ）、Ｗｉｒｅｄ他、“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ”、Ｃｈｉｃａｇｏ：Ｔｕｔｏｒｉａｌ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、第７版（１９７６）］。加えて、一部の悪性細胞は、正常な形態学を有する可能性があり、従って、腫瘍細胞学は偽陰性の診断および偽陽性の診断に悩まされる［Ｍｏｒｅｌｌ他、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（１９８２）、６０：４１〜４５］。
【０００５】
従って、非常に数多くの古典的な細胞学的方法にもかかわらず、細胞学的診断の効率は主として、細胞病理学者の技能および経験によって、また、得られたデータを分析する細胞病理学者の能力によって決定される。
【０００６】
古典的な細胞学的技術は多くの場合、免疫組織化学、免疫細胞化学およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションとして知られる、高い親和性および特異性を有する化合物に基づく一群の技術によって補われる。これらの技術が、腫瘍の表現型特徴づけ（例えば、中間径フィラメントに対する抗体が関係することによる表現型特徴づけ）、予後的価値を有する腫瘍マーカーの検出（例えば、ｐ５３抗原の検出）、ならびに、他の発ガン性発現特徴および核酸配列の検出のために使用される。悪性腫瘍を検出するためのこれらの技術の高い特異性にもかかわらず、これらの技術はどれも、腫瘍診断のための汎悪性ツールを提供していない。
【０００７】
現代の診断的細胞診において使用される臨床標本の３つの最も一般的なタイプが、剥離細胞診標本、微細針吸引生検（ＦＮＡＢ）標本および子宮頸膣塗沫標本である。
【０００８】
剥離細胞診は、ガン細胞が、疾患の進行の初期において、その前侵襲性の段階でさえ、腫瘍の表面から剥離する現象を取り扱う［Ｂｏｙｄ、“Ａ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ、第８版（１９７０）］。剥離した細胞が、数多くの体液（例えば、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液、眼液、関節液、胃腸液など）において、呼吸器標本、皮膚サンプルおよび粘膜サンプルならびに尿の場合と同様に見出され得る。これらの剥離細胞は、ブラッシング、洗浄、直接的な穿刺、ドレナージ、接触調製、擦過などによって集めることができる。
【０００９】
微細針吸引（ＦＮＡ）生検は、細胞サンプルを、身体貫通の最小限の侵襲様式を使用して体内から得るために薄い（微細な）針（２２ゲージ以下の細い針）を使用する診断的生検の１つの形態である。微細な針により吸引された細胞サンプルは、その後、様々な疾患プロセスの存在を検出するために顕微鏡で調べられる［ＮＭＬＬＳ、“Ｆｉｎｅ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｐｓｙ（ＦＮＡＢ）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｌｉｎｅ”、ＮＭＬＬＳ文書ＧＰ２０−Ａ（１９９６）］。剥離細胞診とは対照的に、ＦＮＡＢは病変部または細胞塊の分析に向けられており、従って、より直接的な診断的取り組みであると見なされる。ＦＮＡＢでは、典型的には、乳房、甲状腺、頭部、頸部、前立腺、胸部、肺、腹部などから得られる病変部または細胞塊が包含される。
【００１０】
子宮頸膣塗沫標本は、異型性の数多くのタイプ、新生物的性質の一部、前悪性的性質の一部、または、他の病理学的プロセスの診断を可能にすることを目的とする女性生殖管からの擦過標本である。
【００１１】
細胞サンプルのすべてのタイプが、光学顕微鏡観察による可視化を可能にするために、スライドガラスに移され、処理され、染色されなければならない。
【００１２】
現在、診断的細胞診は典型的には、かなり狭い１組の染色方法および組成物に基づいており、そのうちのいくつかは、何年も前に現れたものであるが、現在の臨床的細胞診において依然として広く使用され続けている［ＫｊｅｌｄｓｂｅｒｇおよびＫｎｉｇｅｒ、Ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ（１９８７）；Ｋｏｓｓ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｂａｓｉｓ、第３版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９７９）］。このことは、主に、アルコール固定されたパパニコロウ染色および風乾されたメイ・グリュンワルド・ギムザ染色（ロマノフスキー染色として知られる１つの形式）に当てはまり、一方、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色すること、内分泌細胞診のためのショール染色、および、パッペンハイム方法はそれほどめったには使用されない。
【００１３】
メイ・グリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）染色法は、造血起源の細胞などを診断するために臨床研究室において広く使用される。しかしながら、この方法では、悪性細胞についての染色選択性が示されない。
【００１４】
パパニコロウ染色法は、最初は膣塗沫標本の分析のために開発されたものであり［ＰａｐａｎｉｃｏｌａｏｕおよびＴｒａｕｔ、Ａｎｎ．Ｙ．Ｏｂｓｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．（１９４１）、４２：１９３〜２０６；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ、“Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ”、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ：Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９５４）］、アルコール固定された塗沫標本に存在する層状上皮および単層上皮の細胞タイプを区別することを可能にする。パパニコロウ法（Ｐａｐ塗沫標本）は、核および細胞質の詳細な形態学を正常な細胞および腫瘍細胞において得ることを可能にする。この方法はまた、診療的細胞学の他の分野でも広く使用されている。パパニコロウ染色手法は、すべての他の染色手法と同様に、悪性細胞についての染色選択性を何ら明らかにしないことを強調しなければならない。
【００１５】
従って、これらの先行技術の細胞学的染色プロトコルはどれも、前悪性細胞および悪性細胞、代謝が損なわれた細胞、ならびに、胎児細胞の選択的な多色選択性または染色選択性をもたらさない。従って、表現型の変化を、正常な細胞と比較したときにガン細胞において、また、代謝が正常な細胞と比較したときに、代謝が損なわれた細胞において、また、母体細胞と比較したときに、胎児細胞において検出し、モニターし、また、妥当性確認する確実かつ効率的な細胞学的染色方法が必要であることが広く認識されており、また、そのような方法を有することは非常に好都合であると考えられる。既存の実施は確実である一方で、時間がかかり、また、ほとんどの場合、細胞表現型のハイスループット検査が容易でない。そのうえ、機能が不明である新しい遺伝子の数が増大し続けることの結果として、同様にまた、既知遺伝子の機能を明らかにする必要があることの結果として、ガン遺伝子および腫瘍抑制因子遺伝子を検出するための迅速かつ簡便な方法に対する大きな要求が存在する。化学物質および薬物を、特に、ハイスループットスクリーニングのための自動化に容易に適合化される技術により、変異原性について試験する必要があることが認識されている。さらには、細胞の挙動／表現型を悪性から正常に変化させる新しいタイプ／世代の抗ガン治療が求められている。また、薬物を抗ガン治療において正しく組み合わせることも求められている。これらの要求は、スクリーニングアッセイおよびプラットホームがないために満たされていない。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の１つの態様によれば、少なくとも１つの細胞を、フィクス・エラスチカ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）植物の抽出物、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類からなる群から選択される染色剤と接触させ、それにより、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色することを含む、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色する方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、（ａ）少なくとも１つの細胞を、フィクス・エラスチカ植物の抽出物、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類からなる群から選択される染色剤と接触させ、その結果、予備染色された細胞を得ること、および（ｂ）予備染色された細胞を少なくとも１つの色素と接触させることを含む、少なくとも１つの細胞を染色する方法が提供される。
【００１８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの細胞が、細胞の不均一に分化した集団を含む。
【００１９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの色素が１つの色素である。
【００２０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの色素が、塩基性色素および酸性色素からなる群から選択される。
【００２１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、（ｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、（ｉｉ）少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、（ｉｉｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素および塩基性色素を含むときには、酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示される。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞の不均一に分化した集団が固形組織切片を含む。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞の不均一に分化した集団が単離細胞を含む。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞の不均一に分化した集団が悪性細胞または前悪性細胞を含む。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞の不均一に分化した集団が胎児細胞を含む。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞の不均一に分化した集団が、代謝が損なわれた細胞を含む。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物の抽出物が葉の抽出物を含む。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物の抽出物がエタノール抽出物を含む。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物の抽出物が７０％エタノール抽出物を含む。
【００３０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物の抽出物が粗植物抽出物を含む。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物の抽出物が、精製された植物抽出物を含む。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物の抽出物が、希釈された抽出物を含む。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物の抽出物が、図４３〜図４４に詳しく示されるようなＮＭＲスペクトルを含む。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、染色剤が蛍光性である。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、染色剤が、３７５ｎｍで励起されたとき、蛍光を４３０ｎｍにおいて放射する。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、染色剤がビオチン化される。
【００３７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類の少なくとも１つが天然に存在する。
【００３８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類の少なくとも１つが合成である。
【００３９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、フィクス・エラスチカ植物のエタノール抽出物が正電荷イオンにより補われる。
【００４０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、正電荷イオンが、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選択される。
【００４１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの色素が２つの色素を含む。
【００４２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの色素が、塩基性色素、酸性色素、トリアミノトリフェニルメタン誘導体、ジアゾ誘導体、および、これらの組合せからなる群から選択される。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、２つの色素が、塩基性色素、酸性色素、トリアミノトリフェニルメタン誘導体、ジアゾ誘導体、および、これらの組合せからなる群から選択される色素を含む。
【００４４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、２つの色素により染色することが、連続して行われる。
【００４５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、塩基性色素が、ダリア（Ｄａｈｌｉａ）およびニューフクシンからなる群から選択される。
【００４６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、酸性色素がライトグリーン（Ｌｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ）である。
【００４７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分化した細胞が正常な健全細胞であり、未分化の細胞が悪性細胞または前悪性細胞である。
【００４８】
本発明のさらに別の態様によれば、目的とする分化状態の細胞を特定する方法が提供され、この場合、方法は、（ａ）細胞を染色すること、および（ｂ）その染色を分析することを含み、（ｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、（ｉｉ）少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、（ｉｉｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素および塩基性色素を含むときには、酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示される。
【００４９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、未分化の細胞が悪性細胞または前悪性細胞である。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、対象におけるガンを診断する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）対象の細胞を染色し、その結果、細胞の染色された集団を得ること、および（ｂ）細胞の染色された集団の染色を分析することを含み、（ｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、（ｉｉ）少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、（ｉｉｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素および塩基性色素を含むときには、酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、従って、未分化細胞の存在またはレベルにより、悪性細胞または前悪性細胞が示され、それにより、対象におけるガンが診断される。
【００５１】
本発明のなおさらなる態様によれば、抗ガン治療経過をその必要性のある対象において決定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）対象に抗ガン治療を施すこと、（ｂ）工程（ａ）の後での対象の生検サンプルにおける悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルを上記方法に従って分析することを含み、それによって、悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルにより、治療経過が示される。
【００５２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法はさらに、対象のさらなる生検サンプルを工程（ａ）の前および／または工程（ｂ）と同時に得ることを含む。
【００５３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法はさらに、生検サンプルにおける悪性細胞または前悪性細胞のレベルをさらなる生検サンプルと比較することを含む。
【００５４】
本発明のさらなる態様によれば、抗ガン治療計画をその必要性のある対象において決定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）対象の生検サンプルにおける悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルを分析すること、（ｂ）対象に、対象の生検サンプルにおける悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルに従って抗ガン治療の治療効果的な量を施すことを含む。
【００５５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法はさらに、工程（ａ）を工程（ｂ）の後で繰り返すことを含む。
【００５６】
本発明のなおさらなる態様によれば、細胞の前悪性表現型または悪性表現型を転換させることができる作用因を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）細胞を作用因に供すること、（ｂ）細胞の悪性表現型を、（ａ）の後、および、場合により（ａ）の前に上記方法に従って分析することを含み、ただし、表現型の転換により、細胞の前悪性表現型または悪性表現型を転換させることができる作用因が示される。
【００５７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、作用因が試験組成物を含む。
【００５８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、試験組成物が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子化学物質、炭水化物、脂質、および、これらの組合せからなる群から選択される。
【００５９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、作用因が試験条件を含む。
【００６０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、試験条件が、増殖条件および放射線条件からなる群から選択される。
【００６１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞が多数の細胞を含む。
【００６２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、方法が、大きい処理量のための手段を使用して行われる。
【００６３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、手段が、自動化されたサンプル採取デバイス、液体取り扱い装置、自動化された染色装置、ディスペンサー、ロボット、または、これらの任意の組合せを含む。
【００６４】
本発明は、異なる分化レベルの細胞を区別するために使用されることができる細胞染色のための方法を提供することによって、現在知られている構成の欠点に首尾良く対処する。
【００６５】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００６６】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００６７】
図１Ａ〜図１Ｂは、起源不明のガン腫と組織病理学によって診断された男性患者に由来する胸水から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。
【００６８】
図２Ａ〜図２Ｂは、胸膜滲出液から調製される塗沫標本を示す。図２Ａは、メイ・グリュンワルド・ギムザプロトコルにより染色される胸膜滲出液を示す。標本が、細胞の可視化を可能にするためにそのようなプロトコルによって染色された。これらの従来技術は差を示さなかった。図２Ｂは、本発明による新規な染色手法により染色される胸膜滲出液を示す。悪性の特性を有する細胞の細胞質が赤色に染色された一方で、正常な上皮細胞、マクロファージおよびすべてのタイプの白血球の細胞質が緑色に染色された。
【００６９】
図３は、乳房のガン腫と組織病理学によって診断された女性患者に由来する胸水から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。
【００７０】
図４は、起源不明のガン腫と組織病理学によって診断された男性患者に由来する胸水から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。挿入写真は染色された単一細胞の拡大を示す。合計で３個の悪性細胞がこの特定のスライドガラスにおいて見出された。
【００７１】
図５Ａ〜図５Ｇは、表５に示されるような６つ（１〜６）の染色状況の７つのパネル（Ａ〜Ｇ）を示す。図５Ａは３ＬＬ肺ガンを示す；図５ＢはＣ６星状膠細胞腫を示す；図５ＣはＡ３７５ヒトメラノーマを示す；図５Ｄはフレンド赤白血病を示す；図５ＥはＮＩＨ３Ｔ３を示す；図５Ｆはラットの腹膜の炎症滲出液を示す；図５Ｇは正常な臨床事例を示す。
【００７２】
図６Ａ〜図６Ｄは、本発明による染色手法を使用して染色される、結腸ガンと診断された患者から得られる組織学的切片を示す。図６Ｄは組織学的切片全体を示し、図６Ａ〜図６Ｃは、示された矢印による図６Ｄのいくつかの視野の拡大を示す。これらの写真は形態学および色の間における明瞭な関連を示すことに留意すること。
【００７３】
図７Ａ〜図７Ｃは、ジメチルヒドラザン誘導の結腸ガン動物モデルから調製され、新規な染色プロトコルにより染色される組織学的切片を示す。図７Ａは、形態学的に正常な表現型に対応する領域を示す；図７Ｂは、形態学的に過形成の組織に対応する領域を示す；図７Ｃは、形態学的に形成異常な組織に対応する領域を示す。
【００７４】
図８は、卵巣肉腫と組織病理学によって診断された女性患者から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。
【００７５】
図９Ａ〜図９Ｄは４対の組織学切片を示す。各対の右側パネルは、本発明による染色手法を使用して染色されるスライドガラスを含有し、左側パネルは、従来のヘマトキシリン・エオシン技術により染色されるスライドガラスを示す。図９Ａは子宮頸ガンを示す；図９Ｂおよび図９Ｄは乳ガンを示す；図９Ｃは皮膚メラノーマを示す。
【００７６】
図１０は、ガン腫病巣を含有する乳房組織から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される腫瘍インプリントを示す。
【００７７】
図１１Ａ〜図１１Ｈは、上皮内高度扁平上皮異型（ＨＧＳＩＬ）と診断された女性から得られるＰａｐ塗沫標本を示す。図１１Ａ〜図１１Ｄは、従来のパパニコロウ染色により染色されるスライドガラスを示し、一方、図１１Ｅ〜図１１Ｈは、本発明による染色手法を使用して染色される同じ患者由来のスライドガラスを示す。
【００７８】
図１２Ａ〜図１２Ｇは、本発明による染色手法を使用して染色される子宮頸部塗沫標本における臨床的に重要な様々な前悪性状態および他の状態を示す。図１２Ａは正常な塗沫標本を示す；図１２Ｂ〜図１２Ｃは、意義不明の異型扁平上皮細胞を示す；図１２Ｄ〜図１２Ｅは上皮内低悪性度扁平上皮異型（ＬＧＳＩＬ）を示す；図１２Ｆ〜図１２Ｇは上皮内高度扁平上皮異型（ＨＧＳＩＬ）を示す。
【００７９】
図１３Ａ〜図１３Ｇは、本発明による染色手法を使用して染色されるＰａｐ塗沫標本を示す。陰性の結果をもたらした従来の診断とは対照的に、本発明による染色手法が陽性の結果をもたらした事例が示される。図１３Ａ〜図１３Ｂは、４１歳の、正常である従来の診断を示す；図１３Ｃ〜図１３Ｄは、５２歳の、炎症である従来の診断を示す；図１３Ｅは、３６歳の、炎症である従来の診断を示す；図１３Ｆは、５２歳の、正常である従来の診断を示す；図１３Ｇは、５４歳の、炎症である従来の診断を示す。
【００８０】
図１４Ａ〜図１４Ｃは、乳ガンと診断された６５歳男性患者の胸水から調製される風乾されたサイトスピン塗沫標本を示す。図１４Ａはメイ・グリュンワルド・ギムザ染色を示し、図１４Ｂ〜図１４Ｃは本発明による染色手法の様々な変法を示す。
【００８１】
図１５Ａ〜図１５Ｃは、ラット動物モデルにおけるジメチルヒドラザン誘導による結腸ガンの組織学切片の染色を示す。図１５Ａは組織学切片全体を示し、悪性の結腸組織および正常な結腸組織を一緒に含む混合組織を示す；図１５Ｂは、示された矢印による図１５Ａの拡大を示す；図１５Ｃは正常な結腸組織を示す。形態学的に正常な組織および悪性の組織に対応する領域が、矢印によって示される緑色／赤色の染色パターンによって区別可能であることに留意すること。
【００８２】
図１６Ａ〜図１６Ｄは、ラット動物モデルにおけるジメチルヒドラザン誘導による結腸ガンの組織学切片の染色を示す。正常な組織および悪性の組織の間での形態学的な違いが色における変化と関連することに留意すること。
【００８３】
図１７Ａ〜図１７Ｂはメラノーマ腫瘍の組織学切片の染色を示す。図１７Ａは、本発明の教示に従った染色を示す；図１７Ｂはヘマトキシリン・エオシンによる染色を示す。
【００８４】
図１８Ａ〜図１８Ｃは、神経膠芽細胞腫を有するラット脳モデルを示す。図１８Ａは、ギムザによる脳染色の切片全体における腫瘍を示す；図１８Ｂは、ヘマトキシリン・エオシンによる脳染色の切片全体における腫瘍を示す；図１８Ｃは、本発明の新規な染色プロトコルによる脳染色の切片全体における腫瘍を示す。本発明の染色プロトコルのみが、腫瘍組織と、正常な組織とを区別したことに留意にすること。
【００８５】
図１９Ａ〜図１９Ｄは、正常な生理学的胚形成の期間中での染色における変化を示す。異なる分化段階に由来するニワトリ胚網膜の垂直切片をニワトリの胚から切開した。パラフィンブロックを調製し、切断し、ガラス製スライドガラスに載せた。網膜切片を各々のプロトコルに従って染色した。図１９Ａは７日目の胚の網膜［Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ＆Ｈａｍｉｌｔｏｎ（ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．（１９５１）、８８：４９〜９２）に従って段階３０〜段階３１］を示す；図１９Ｂは９日目の胚の網膜［分化段階３５］を示す；図１９Ｃは１４日目の胚の網膜［分化段階４０］を示す；図１９Ｄは１８日目の胚の網膜［分化段階４４］を示す。略号：ＧＣＬ＝神経節細胞層、ＩＰＬ＝内網状層、ＯＮＬ＝外顆粒層、ＯＰＬ＝外網状層、ＰＲ＝光受容体、ＰＥ＝色素上皮。
【００８６】
図２０Ａ〜図２０Ｃは正常細胞および腺ガン細胞の示差的な染色を示す。図２０Ａは、チャンバースライドガラスに置床された正常な初代結腸細胞（ＣＣＤ−３０Ｃ０）を示す；図２０Ｂは、正常な結腸細胞（ＣＣＤ−３０Ｃ０）が左側パネルに、結腸ガン細胞（ＨＴ−２９）が右側パネルに置床された（３８４ウエルプレートにおける）４つのウエルの目視画像を示す；図２０Ｃは、チャンバースライドガラスに置床されたヒト結腸直腸腺ガン細胞株ＨＴ−２９を示す。置床期間が終了したとき、風乾された標本を染色した。
【００８７】
図２１は、基準化学化合物による前処理の後でのＨＴ−２９細胞の足場依存的成長を示す。ＨＴ−２９細胞を、軟寒天プロトコルに従って、培地単独（Ｃｏｎｔｒ）、３０マイクロＭのフィチン酸（ＰＡ）、１０マイクロＭの５ＦＵ、１００マイクロＭのゲニステイン、５ｍＭの酪酸塩（Ｂｕｔ）または３０マイクロＭのＮ−メチルホルムアミド（ＮＮＥ）と３日間インキュベーションした。
【００８８】
図２２Ａ〜図２２ＤはＨＴ−２９（ヒト結腸ガン細胞）における表現型薬物スクリーニング結果を示す。図２２Ａは、３８４ウエルプレートに置床されたＨＴ−２９細胞を示す；図２２Ｂは未処理のＨＴ−２９細胞を示す；図２２Ｃは、２．５ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＨＴ−２９細胞を示す；図２２Ｄは、５ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＨＴ−２９細胞を示す。表現型の変化が、赤色（悪性）から青色／緑色（正常）への用量依存的な、徐々に移行する色の変化によって検出された。
【００８９】
図２３Ａ〜図２３ＣはＨＴ−２９（ヒト結腸ガン細胞）における表現型薬物スクリーニング結果を示す。図２３Ａは、顕微鏡で可視化される未処理のＨＴ−２９細胞、２．５ｍＭまたは５ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＨＴ−２９細胞を示す；図２３Ｂ〜図２３Ｃは、分光光度計で測定されるような細胞の光学濃度を示す。６３０ｎｍ（緑色）に対する５６０ｎｍ（赤色）における吸光度の比率が計算された。
【００９０】
図２４Ａ〜図２４ＣはＨＴ−２９細胞の染色に対するゲニステインの影響を示す。ＨＴ−２９細胞を９６ウエルプレートに１日間置床し、０〜１２０マイクロＭのゲニステインにより処理し、風乾により固定し、染色した。図２４Ａは染色の用量依存的変化を示す；図２４Ｂは、ＮＦ／ＬＧの比率（Ｒ）（ＯＤ５６０対ＯＤ６３０）を使用して行われた染色タイプの定量化を示す。この比率はウエルにおける赤色および緑色のバランスに対応する。正常な細胞が、１未満のＲとともに緑色に染色され、悪性の細胞が赤色に染色され、１を越えるＲを示した。図２４Ｃは細胞数に対するゲニステインの影響を示す。
【００９１】
図２５は、ヌードマウスにおけるＨＴ−２９細胞の腫瘍原性に対する細胞処理の影響を示す。実験が、本明細書中下記の材料および実験手法の節において詳しく説明されるヌードマウス実験プロトコルに従って行われた。
【００９２】
図２６Ａ〜図２６ＥはＨＴ−２９細胞の酪酸塩誘導による一時的な表現型変化を示す。ＨＴ−２９細胞を５ｍＭの酪酸塩によって４日間処理した。処理期間が終了したとき、酪酸塩を含む成長培地を、２日間、３日間または４日間、酪酸塩非含有培地により置き換えた。風乾された細胞をプロトコルＩに従って染色した。図２６Ａは非処理のコントロールＨＴ−２９細胞を示す；図２６Ｂは、５ｍＭの酪酸塩によって４日間処理されたＨＴ−２９細胞を示す；図２６Ｃは、処理期間が終了したとき、酪酸塩非含有培地で２日間成長させたＨＴ−２９細胞を示す；図２６Ｄは、処理期間が終了したとき、酪酸塩非含有培地で３日間成長させたＨＴ−２９細胞を示す；図２６Ｅは、処理期間が終了したとき、酪酸塩非含有培地で４日間成長させたＨＴ−２９細胞を示す。軟寒天での結果（図２１）と相関関係にある染色タイプの変化の一時的な性質に留意すること。
【００９３】
図２７Ａ〜図２７Ｂはハイスループットスクリーニング（ＨＳＴ）の結果を示す。図２７Ａは、３８４ウエルプレートに置床され、種々の化合物により処理されたＨＴ−２９細胞を示す。酪酸ナトリウムが陽性コントロールとして使用され、培地単独（処理なし）が陰性コントロールとして役立った。細胞を染色することにより、陽性コントロールと、陰性コントロールとの間における目に見える変化、および、陽性に活性な化合物（Ｈｉｔ）を可視化することが示された。図２７Ｂは、スクリーニングにおいてより以前に検出された活性な化合物の用量依存性を示す。化合物の活性は３０μＭ以下の濃度から測定であった。
【００９４】
図２８は、ハイスループットスクリーニング（ＨＳＴ）の結果を示す。ＨＴ−２９細胞を３８４ウエルプレートに置床し、３０マイクロＭの濃度で薬物様化学ライブラリー（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により処理した。このプロセスが終了したとき、風乾されたプレートを、プロトコルＩＩＩを使用して染色した。このスクリーニングは応答の３つの異なった原型を生じさせた：毒性／静的影響（際立った黒色）、表現型の変化（赤色対緑色の色変化に基づいて、正常な表現型、際立った青緑色）、および、表現型の明白な変化がない（赤色の染色、際立った赤色）。染色の結果を、マルチウエルスキャナーによる各々のウエルにおける光学濃度測定（ＯＤ５６０およびＯＤ６３０）を使用して記録した。染色タイプの定量化を、ＮＦ／ＬＧの比率（Ｒ）（ＯＤ５６０対ＯＤ６３０）を使用して行った。この比率はウエルにおける赤色および緑色のバランスに対応する。目的とする群が緑色に染色され、１未満のＲ、および、０．２よりも大きい細胞数指数を示した。悪性の細胞が、細胞数指数にかかわらず、赤色に染色された。
【００９５】
図２９は、構築物の設計を示す。ＰＣＭＶ−Ｒａｓベクター（野生型Ｈａ−Ｒａｓタンパク質）およびＰＣＭＶ−Ｒａｓ  Ｖ１２ベクター（Ｒａｓの活性形態）をＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。
【００９６】
図３０Ａ〜図３０Ｂは軟寒天における足場依存的成長を示す。安定なＲａｓ発現Ｒａｔ２クローンをプロトコルに従って確立し、特徴づけ、軟寒天に置床した（本明細書中下記の材料および実験手法の節、ならびに、表１３を参照のこと）。３週間のインキュベーション期間が終了したとき、コロニーを計数した。図３０Ａは、小さいコロニーの形成（Ｓ）を誘導した空ベクター（Ｖｅｃ）またはＲａｓの野生型（Ｒａｓ  Ｖｅｃ）を示す；図３０Ｂは、大きいコロニーの形成（Ｌ）を誘導したＲａｓの形質転換性／発ガン性形態の発現を示す。
【００９７】
図３１Ａ〜図３１Ｄは、染色タイプに対する、Ｒａｓ  Ｖ１２誘導による形質転換の影響を示す。図３１Ａ〜図３１Ｂは、顕微鏡カバースリップに置床され、染色されたＲａｔ２細胞を示す（２０倍および６０倍各々拡大される）；図３１Ｃ〜図３１Ｄは、顕微鏡カバースリップに置床され、染色されたＲａｔ２  Ｒａｓ  Ｖ１２細胞を示す（２０倍および６０倍各々拡大される）。置床期間が終了したとき、風乾された標本をプロトコルＶに従って染色した。
【００９８】
図３２Ａ〜図３２Ｄは、染色タイプに対する、Ｒａｓ  Ｖ１２発ガン遺伝子のシグナル伝達阻害の影響を示す。図３２Ａ〜図３２Ｂは、処理を伴うことなくインキュベーションされたＲａｔ２  Ｒａｓ  Ｖ１２細胞を示す（２０倍および６０倍各々拡大される）；図３２Ｃ〜図３２Ｄは、５０マイクロＭのＰＤ９８０５９（ＭＡＰＫＫ阻害剤）と３日間インキュベーションされたＲａｔ２  Ｒａｓ  Ｖ１２細胞を示す（２０倍および６０倍各々拡大される）。表現型の変化が、細胞の染色だけでなく（赤色から緑色への染色）と同様に認められたこと（細胞の拡大および接触阻害の回復）に留意すること。
【００９９】
図３３Ａ〜図３３Ｅは、種々の濃度のシグナル伝達経路阻害剤によって処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞におけるＲａｓ／ＭＡＰＫ経路表現型薬物スクリーニングを示す。図３３Ａは、未処理のＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞、ならびに、ＰＤ９８０５９によって処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞の表現型を示す；図３３Ｂは、ファルネシル化阻害剤（ＨＲ１２）によって処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞を示す；図３３Ｃは、ＭＡＰＫ阻害剤（ＰＤ９８０５９）によって処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞を示す；図３３Ｄは、ゲニステイン（チロシンリン酸化阻害剤）によって処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞を示す；図３３Ｅは、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）によって処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞を示す。
【０１００】
図３４Ａ〜図３４Ｃは、Ｇｌｅｅｖｅｃによって誘導されるＫ５６２赤白血病細胞の分化、ならびに、染色およびヘモグロビン産生に対するその影響を示す。図３４ＡはＫ５６２未処理細胞を示す；図３４Ｂは、（プロトコルに従って）０．２５μＭのＧｌｅｅｖｅｃにより処理されたＫ５６２細胞を示す；図３４Ｃはヘモグロビン産生の検出を示す。Ｋ５６２細胞を（プロトコルに従って）０．２５μＭまたは１．２５μＭのＧｌｅｅｖｅｃにより処理し、ヘモグロビン産生をベンジジンアッセイによって求めた。分化の結果として、赤色から緑色への染色タイプの変化が検出されていることに留意すること。Ｇｌｅｅｖｅｃ誘導による分化がヘモグロビン産生における用量依存的増大によって裏付けられた。
【０１０１】
図３５Ａ〜図３５Ｂは、Ｇｌｅｅｖｅｃの種々の用量によって誘導される分化、ならびに、染色、細胞数およびヘモグロビン産生に対するその影響を示す。図３５Ａは、（プロトコルに従った）０〜１μＭのＧｌｅｅｖｅｃによる処理の後におけるＫ５６２細胞の数およびヘモグロビン産生を示す；図３５Ｂは、０〜１μＭのＧｌｅｅｖｅｃによる処理の後におけるＫ５６２細胞の表現型を示す。染色アッセイが、ヘモグロビン産生または細胞数に対する影響が認められない低いナノモル濃度範囲において感度を示すことに留意すること。
【０１０２】
図３６Ａ〜図３６ＢはＨＬ−６０細胞（ヒト急性骨髄性白血病細胞株）のａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）誘導による分化を示す。図３６Ａは未処理のＨＬ−６０細胞を示す；図３６Ｂは、分化するように１μＭのＡＴＲＡによって３日間誘発されたＨＬ−６０細胞を示す。
【０１０３】
図３７Ａ〜図３７ＣはＵ９３７細胞（単球性白血病／組織球性リンパ腫細胞株）のＩＦＮ−ガンマ誘導による分化を示す。図３７Ａは未処理の悪性Ｕ９３７細胞を示す；図３７Ｂは、２０００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ−ガンマにより４日間処理されたＵ９３７細胞を示す；図３７Ｃは、１００００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ−ガンマにより４日間処理されたＵ９３７細胞を示す。ニトロブルーテトラゾリウム試験（ＮＢＴ）を、Ｕ９３７細胞の分化を検出する生化学的マーカーとして行った。分化の生化学的マーカーにおける用量依存的な増大に留意すること。
【０１０４】
図３８Ａ〜図３８Ｈは、Ｕ９３７細胞の、ＩＦＮ−ガンマまたは酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）により誘導される分化を示す。図３８Ａ〜図３８Ｂは未処理の悪性Ｕ９３７細胞を示す（１０倍および４０倍各々拡大される）；図３８Ｃ〜図３８Ｄは、１ｍＭのＮａＢｕにより４日間処理されたＵ９３７細胞を示す（１０倍および４０倍各々拡大される）；図３８Ｅ〜図３８Ｆは、２０００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ−ガンマにより４日間処理されたＵ９３７細胞を示す（１０倍および４０倍各々拡大される）；図３８Ｇ〜図３８Ｈは、１００００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ−ガンマにより４日間処理されたＵ９３７細胞を示す（１０倍および４０倍各々拡大される）。ＣａｍａＲｘ染色を行った。
【０１０５】
図３９は、表現型薬物スクリーニング方法の可能性を示す。実験が、表に示されるような種々の阻害剤により処理されたＨＰＶ１６不死化ヒトケラチノサイトにおいて行われた。ＡＧ４９４はＡＧ５５５の化学的修飾体であることに留意すること。
【０１０６】
図４０は、抽出物による染色の濃度依存的阻害を示す。Ｒａｔ１  Ｒａｓ  Ｖ１２細胞をＬＧ迅速アッセイ（プロトコルＶＩＩＩ）に従って染色した。抽出物の希釈を７０％ＥｔＯＨで行った。染色強度を、６３０ｎｍのフィルターを有するＥＬＩＳＡリーダーによって定量した。抽出物の阻害能が濃度に依存して徐々に低下することに留意すること。
【０１０７】
図４１は、Ｒａｔ２−ＲａｓＶ１２細胞におけるＬＧ阻害に対する、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０精製された粗抽出物分画物の生物学的影響を示す。染色の変化と、プロアントシアニジン類の量との間における相関関係に留意すること。
【０１０８】
図４２は、酢酸における抽出物活性（ＣＳＴ２００１）の蛍光フィンガープリントを示す。
【０１０９】
図４３は、ＣＳＴ２００１のポリマー分画物およびオリゴマー分画物のＮＭＲフィンガープリントを示す。
【０１１０】
図４４は、ＣＳＴ２００１のＮＭＲフィンガープリントを示す。
【０１１１】
図４５は、ＣＳＴ−２００１のオリゴマー形態の化学構造を示す。
【０１１２】
図４６は、ＣＳＴ−２００１の代わりのオリゴマー形態の化学構造を示す。
【０１１３】
図４７Ａ〜図４７Ｃは、悪性細胞および正常細胞との粗植物抽出物の示差的な相互作用を示す。図４７Ａは、悪性の細胞表現型を表すＨＴ−２９細胞を示す；図４７Ｂは、正常な表現型を呈する、４ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＨＴ−２９細胞を示す；図４７Ｃは、正常な表現型を呈する初代結腸細胞（ＣＣＤ−３３ＣＯ）を示す。細胞をプロトコルＩＸに従って染色し、蛍光検出を、デジタル画像処理ワークステーションを備えるＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して行った。核の染色の強度における違いに留意すること。悪性の核は、正常細胞の核と比較したとき、あまり染色されない傾向を有する。
【０１１４】
図４８Ａ〜図４８Ｆは、ヒト乳ガン（ＭＣＦ−７）細胞とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。図４８Ａは、溶媒コントロールとしての７０％エタノールにおいてインキュベーションされたＭＣＦ−７の未処理細胞を示す；図４８Ｂおよび図４８Ｃは未処理のＭＣＦ−７細胞を示す（２０倍および６０倍各々拡大される）；図４８Ｄは、溶媒コントロールとしての７０％エタノールにおいてインキュベーションされた（酪酸塩による）ＭＣＦ−７の処理細胞を示す；図４８Ｅおよび図４８Ｆは、２．５ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＭＣＦ−７細胞を示す（２０倍および６０倍各々拡大される）。ＭＣＦ−７の未処理細胞は、表現型が悪性の細胞を表し、一方、酪酸塩処理のＭＣＦ−７細胞は、表現型が正常の細胞を表したことに留意すること。表現型が正常の細胞に由来する核は、ＣＳＴ２００１により、各々の悪性対応体よりも強く染色された。
【０１１５】
図４９Ａ〜図４９Ｃは、ヒト結腸細胞とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。図４９Ａは悪性のヒト結腸ガン（ＨＴ−２９）細胞を示す（コントロール、表現型が悪性）；図４９Ｂは、４ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＨＴ−２９細胞を示す（酪酸塩、表現型が正常）；図４９Ｃは正常な初代結腸細胞を示す（正常な初代細胞、表現型が正常）。下に示されるパネルは、矢印によって示されるような拡大を示す。表現型が正常の細胞に由来する核は、ＣＳＴ２００１により、各々の悪性対応体よりも強く染色されたことに留意すること。
【０１１６】
図５０Ａ〜図５０Ｂはヒト白血病Ｋ５６２細胞株とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。図５０Ａは未処理のＫ５６２細胞を示す（表現型が悪性）；図５０Ｂは、１ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＫ５６２細胞を示す（表現型が正常）。下に示されるパネルは、矢印によって示されるような拡大を示す。
【０１１７】
図５１Ａ〜図５１Ｂはヒト白血病ＨＬ−６０細胞株とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。図５１Ａは未処理のＨＬ−６０細胞を示す（表現型が悪性）；図５１Ｂは、１ｍＭの酪酸ナトリウムにより処理されたＨＬ−６０細胞を示す（表現型が正常）。下に示されるパネルは、矢印によって示されるような拡大を示す。
【０１１８】
図５２Ａ〜図５２ＣはＲａｔ１系におけるＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。図５２ＡはＲａｔ１線維芽細胞を示す（表現型が悪性）；図５２Ｂは、Ｒａｓ  Ｖ１２により形質転換されたＲａｔ１（Ｒａｔ１−Ｒａｓ  Ｖ１２）細胞を示す（表現型が悪性）；図５２Ｃは、Ｒａｓ  Ｖ１２により開始される悪性形質転換を阻止するＰＤ９８０５９（ＭＡＰＫＫの特異的阻害剤）により処理されたＲａｔ１−Ｒａｓ細胞を示す（表現型が正常）。下に示されるパネルは、矢印によって示されるような拡大を示す。
【０１１９】
図５３Ａ〜図５３Ｂは、生存しているＵ９３７白血病細胞とのＣＳＴ２００１（天然）の示差的な相互作用を示す。図５３Ａは未処理のＵ９３７細胞を示す（コントロール）；図５３Ｂは、表現型の正常化を誘導するために１．５μＭのＡＴＲＡにより７２時間処理されたＵ９３７細胞を示す。ＣＳＴ２００１から生じる蛍光を、デジタル画像処理ワークステーションを備えるＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡によって検出した。
【０１２０】
図５４は、ＣＳＴ−２００１標識化のための種々の可能性のフローチャート図を示す。細胞は生細胞または固定処理が可能であり、ＣＳＴ２００１は無傷型または修飾型が可能である。限定された数のＣＳＴ２００１修飾の選択肢が図に記載される。
【０１２１】
図５５Ａ〜図５５ＢはＵ９３７白血病細胞におけるビオチン化ＣＳＴ２００１の可視化を示す。図５５Ａは、天然ＣＳＴ２００１により染色されるＵ９３７細胞の一例を示す；図５５Ｂは、ストレプトアビジンＣｙ３により可視化されるビオチン化ＣＳＴ２００１の一例を示す。
【０１２２】
図５６Ａ〜図５６Ｃは、Ｕ９３７細胞においてＮａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬（ＮＲ）を使用する金属との複合体におけるＣＳＴ２００１の蛍光シグナルを示す。図５６Ａは、ＰＢＳから生じるＵ９３７細胞の蛍光シグナルを示す。図５６Ｂは、ＣＳＴ２００１から生じるＵ９３７細胞の蛍光シグナルを示す。図５６Ｃは、ＮＲとの複合体におけるＣＳＴ２００１から生じるＵ９３７細胞の蛍光シグナルを示す。結果がＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取装置）によって検出された。主ピークの平均蛍光強度がグラフにおいて各々の図の下に示される。
【０１２３】
図５７は、沈殿形成によって可視化される、ＣＳＴ２００１と、ＢＳＡとの間で形成される複合体の放射拡散アッセイを示す。
【０１２４】
図５８Ａ〜図５８Ｃは、Ｃｙ３結合アビジンを使用するビオチン化ＣＳＴによる細胞の染色を示す。ＢＳＡ−天然ＢＳＡを表す（コントロール）。ＢＳＡ−Ｂｉｏはビオチン化ＢＳＡを表す。下段のパネルはサンプルにおける細胞を示す。
【０１２５】
図５９Ａ〜図５９Ｂは、生存ＭＣＦ−７腺ガン細胞の、ＣＳＴ２００１＋Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬（ＮＲ）による示差的な蛍光染色を示す。図５９Ａは未処理のＭＣＦ−７細胞（悪性、コントロール）を示す；図５９Ｂは、酪酸塩により処理されたＭＣＦ−７細胞（正常化された）を示す。
【０１２６】
図６０Ａ〜図６０Ｂは、生存Ｒａｔ２細胞の、ＣＳＴ２００１＋Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬（ＮＲ）による示差的な蛍光染色を示す。図６０Ａは未処理の（正常な）Ｒａｔ２細胞を示す；図６０Ｂは、Ｒａｔ２  Ｒａｓ  Ｖ１２により形質転換された細胞（悪性）を示す。
【０１２７】
図６１Ａ〜図６１ＣはＣＳＴ２００１による示差的な蛍光染色を示す。図６１ＡはＵ９３７細胞（白血病細胞）のＣＳＴ２００１染色を示す；図６１ＢはＪａｒ（ヒト絨毛ガン細胞）のＣＳＴ２００１染色を示す；図６１Ｃは、ＣＳＴ２００１−Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬の複合体によって染色される、Ｕ９３７細胞およびＪａｒ細胞の混合物を示す。矢印は、ＣＳＴ２００１＋ＮＲ試薬によって染色されるＵ９３７細胞を示す。
【０１２８】
図６２Ａ〜図６２Ｄは、ＩＩ型糖尿病が誘導された動物モデルから調製される組織学切片の染色を示す。図６２Ａおよび図６２Ｃは、正常なスナネズミに由来する腎臓の切片を示す；図６２Ｂおよび図６２Ｄは、糖尿病スナネズミに由来する腎臓の切片を示す。すべての切片がプロトコルＸに従ってＣＡＭＡ染色された。高倍率像（下段パネル）は糸球体構造に注目しており、このプロトコルによって可視化される糖尿病組織に関連する緑色の染色を強調する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２９】
本発明は、細胞分化の検出のために使用されることができる細胞の表現型を分析する組成物および方法の発明である。特に、本発明は、癌を診断するため、治療を監視するため、治療計画を決定するため、および疾患に対する新規な治療形態を開発するために使用されることができる。
【０１３０】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記載を参照してより良く理解することができる。
【０１３１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載において示されるか、または、図面において例示される構築の細部および構成成分の配置に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定するものとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
【０１３２】
何十年間にわたって、腫瘍学研究は、検査される生物学的標本における様々な生殖系細胞のガン性細胞の存在または非存在を確認するために使用することができる検出可能なガン特異的マーカーについての探索に集中している。数多くのガン特異的マーカー（これらには、タンパク質、炭水化物および核酸が含まれる）が見出され、特徴づけられた。しかしながら、これらはどれも、汎悪性的であること、または、すべてのガン細胞タイプもしくは大部分までものガン細胞タイプによって発現されること、または、すべてのガン細胞タイプもしくは大部分までものガン細胞タイプから分泌されることは示されなかった。従って、探求が、効果的な腫瘍検出を可能にする普遍的マーカーについて続けられている。
【０１３３】
正常な細胞および悪性の細胞は著しく異なる表現型を有する。違いには、腫瘍を動物モデルにおいて形成する能力、軟寒天におけるコロニー形成、接触阻害の喪失および伝播性変化、より速い代謝速度、ならびに、腫瘍特異的マーカーの発現が含まれる。正常な表現型と、悪性の表現型とを、何らかの特定の細胞タイプに限定されない簡便な方法によって識別することが最も重要である。
【０１３４】
悪性の細胞と正常な細胞を区別するための１つの考えられる取り組み方法は、それらの代謝状態における違いに基づく［「ワールブルグ効果」としても知られている；Ｗａｒｂｕｒｇ  Ｏ．  Ｍａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｒｎｏｌｄ  Ｃｏｎｓｔａｂｌｅ、１９３０；Ｓｅｍｅｎｚａ  Ｇ．Ｌ．、Ａｒｔｅｍｏｖ  Ｄ．、Ｂｅｄｉ  Ａ．、Ｂｈｕｊｗａｌｌａ  Ｚ．、Ｃｈｉｌｅｓ  Ｋ．、Ｆｅｌｄｓｅｒ  Ｄ．、Ｌａｕｇｈｎｅｒ  Ｅ．、Ｒａｖｉ  Ｒ．、Ｓｉｍｏｎｓ  Ｊ．、Ｔａｇｈａｖｉ  Ｐ．、Ｚｈｏｎｇ  Ｈ．、２００１、‘腫瘍の代謝’：７０年後、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．、２４０：２５１〜６０、考察２６０−４；Ｋａｎｎａｇｉ  Ｒ．、２００４、シアリルルイスＸおよびシアリルルイスＡの発現のガンに伴う誘導についての分子機構−再検討されるワールブルグ効果、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．、２０（５）：３５３〜６４］。
【０１３５】
ワールブルグ効果は、急速に成長しているガン細胞を特徴づける嫌気性解糖の高い速度を表す。酸化的リン酸化から解糖へのエネルギー産生の変化がガン細胞の基本的な特性である。Ｗａｒｂｕｒｇは、ガンがミトコンドリアでの酸化的リン酸化における欠陥によって引き起こされると考えたが、この変化は酸素の存在下でさえ生じることが今では知られている［Ｌｕ  Ｈ．、Ｆｏｒｂｅｓ  Ｒ．Ａ．およびＶｅｒｍａ  Ａ．、２００２、好気的解糖による低酸素症誘導因子１の活性化がガン発性におけるワールブルグ効果に関係する、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７（２６）、２３１１１〜２３１１５］。しかしながら、急速に成長しているガンにおける過度な解糖現象の妥当性が依然として残っている［Ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ  Ｓ．、Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ、１９７２、実験的ヘパトーマにおける呼吸および異常な遺伝子発現、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２：２００７〜２０１６］。
【０１３６】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、異なる代謝表現型または分化細胞表現型を、形態学的評価を損なうことなく、示差的な染色によって区別することができる新規な検出アッセイを発見している。理論によって拘束されることはないが、異なる分化状態または代謝状態（増殖能力）を区別することができることは、上記で記載されたワールブルグ効果に基づくことが示唆される。この方法は、示差的な代謝状態を有する細胞、または、分化の異なる段階にある細胞における明瞭な染色的区別をもたらすことができ、従って、早期のガン細胞検出における有用なツールとなり得る。
【０１３７】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明の方法論は、示差的な細胞染色を酸性色素（例えば、緑色）および／または塩基性色素（例えば、赤色）によって強調するための植物抽出物（Ｚｅｔｉｑ（商標）溶液）の使用に基づく。正常に分化した細胞は、あまり分化していない細胞（例えば、代謝が損なわれた細胞または悪性の細胞）よりも大きい親和性を酸性色素に対して有すると考えられる。同様に、そのようなあまり分化していない細胞は、正常に分化した細胞よりも大きい親和性を塩基性色素に対して示す。本発明の染色技術は染色におけるこれらの違い（すなわち、示差的な染色）を強調する。
【０１３８】
結果は二元的な発色応答であり、迅速に代謝している細胞（例えば、悪性細胞または未分化細胞など）は赤色／紫色に染まり、より遅い代謝を有する正常な細胞または高度に分化した細胞は緑色または青緑色に染まる。最も重要なことに、この示差的な染色が、従来の染色方法を使用して顕微鏡で検出可能な細胞の部分構造の形態学的な違いの可視化の鋭敏さを損なうことなく達成され、従って、染色された細胞の形態学に基づいた従来の分析をも可能にする。
【０１３９】
本発明の方法は、齧歯類およびヒトの両方の生物学的サンプルにおけるガン腫および肉腫などを含めて広範囲の様々な悪性腫瘍の腫瘍検出について首尾よく妥当性が確認された。この方法の新生物感度が、細胞学的サンプル、組織学的サンプル、および、動物における発ガン物質誘導ガンモデルのサンプルに対して確認された。そのうえ、この方法は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、正常な細胞を悪性の細胞から明瞭に区別し、同様にまた、分化した細胞を未分化の細胞から明瞭に区別する。
【０１４０】
具体的には、本発明の方法論を使用して、本発明者ら、ガン細胞を、腹腔吸引物、胸腔吸引物および心嚢吸引物から首尾よく検出しており、また、悪性細胞と、非悪性細胞とを明確に区別している。２段階の乾燥手法を使用したとき、正常細胞の細胞質が緑色に染まったか、または、染色されないままであり、一方、ガン細胞の細胞質が色において赤色に染まった（図１Ａ、図１Ｂから図４および図８）。このことは、特に、メイ・グリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）染色手法により、悪性細胞と、正常細胞とを区別することができなかった困難な場合において明白であった。
【０１４１】
本発明者らはまた、子宮頸部塗沫標本の示差的な染色を示している。これらの結果は、赤色の色調でのガン細胞の染色とは際立って対照的に、緑色の色調での正常な細胞の示差的な染色を明らかにする（図１１Ａ〜図１１Ｈから図１３Ａ〜図１３Ｇ）。
【０１４２】
本発明者らはまた、本発明の染色手法が、体液から調製される細胞学的塗沫標本に限定されるのではなく、接触調製物（図１０）および他のタイプの細胞調製物または組織調製物（組織学的）、例えば、パラフィン包埋組織（図６Ａ〜図６Ｄおよび図９Ａ〜図９Ｄ）などに対しても適用され得ることを示している。本発明では、正常な細胞と、悪性の細胞とが、同じ組織において、例えば、結腸ガン（図６Ａ〜図６Ｄ、図７Ａ〜図７Ｃ、図１５Ａ〜図１５Ｃおよび図１６Ａ〜図１６Ｃ）およびメラノーマ（図１７Ａ〜図１７Ｂ）などにおいて明瞭に区別される。
【０１４３】
本発明の方法および組成物は、手術切除後の悪性組織の境界域検出という挑戦的課題を可能にし（図１８Ａ〜図１８Ｃ）、同様にまた、分化の様々な段階を、例えば、胚形成などにおいて識別することを可能にする（図１９Ａ〜図１９Ｄ）。
【０１４４】
従って、本発明の１つの態様によれば、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色する方法が提供され、この場合、この方法は、少なくとも１つの細胞を、フィクス・エラスチカ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）植物の抽出物、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４およびプロアントシアニジン類からなる群から選択される染色剤と接触させ、それにより、少なくとも１つの細胞を染色または予備染色することを含む。
【０１４５】
本明細書中で使用される用語「染色する」は、細胞またはその細胞内構造を視覚的に際立たせることを示す。本発明の染色剤は、適切な手段によって検出することができる自己蛍光によって特徴づけられる。従って、本発明の染色剤は、３７５ｎｍで励起されたとき、４３０ｎｍにおける蛍光を放射する。基本的には、本発明の染色剤は、（本明細書中下記においてさらに記載されるように）正常な代謝状態または分化状態の細胞を染色するが、損なわれた代謝状態または分化状態の細胞をそれほど染色しない（または、全く染色しない）。そのような示差的な染色を、蛍光検出のために設計された手段（例えば、蛍光顕微鏡）によって検出することができる。
【０１４６】
本明細書中で使用される用語「予備染色する」は、染色を強調するという目的のための染色のために細胞を調製または状態調整することを示す。典型的には、予備染色手法は、色素にさらされると、染色された構造物のより良好な可視化を達成することを容易にする。本発明によれば、予備染色手法は、異なる代謝状態または分化状態の染色された細胞の分類を、酸性色素および塩基性色素に対するそれらの示差的な親和性を強調することによって容易にする。
【０１４７】
本明細書中で使用される用語「細胞」は、多細胞生物（好ましくは、ヒト）の真核生物細胞を示す。１個１個の細胞を、多数の細胞と同様に、本発明の教示に従って使用することができる。従って、細胞の均一集団または不均一集団（例えば、種々の分化状態の集団）を染色することができる。典型的には、生物学的サンプル（例えば、生検物）は細胞の不均一な集団を含む。
【０１４８】
そのような不均一集団は、不均一に分化した細胞（例えば、固形組織（例えば、腫瘍）サンプルまたは切片の不均一に分化した細胞、あるいは、例えば、懸濁状態（例えば、血液）における単離された細胞など）を含むことができる。例えば、細胞の集団は、悪性細胞または前悪性細胞、ならびに、正常な健康細胞を含むことができる。代替として、細胞のそのような集団は、代謝が正常な細胞、および、代謝が損なわれた細胞を含むことができる。加えて、または、代替として、集団は、胎児および／または胚の細胞、ならびに、母体の細胞を含むことができる。
【０１４９】
本発明の細胞は、細胞株、初代培養物、および、例えば、生検物（手術生検物および微細針吸引物など）など由来する細胞サンプルであり得る。生検物回収の様々な方法が当該技術分野では広く知られており、検出されるガンの種類または検出される任意の他の医学的状態に非常に依存する。
【０１５０】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の染色剤は植物から単離され、その活性分画物は天然に存在し得るか、または、合成であり得る。
【０１５１】
抽出物を単離するための好ましい植物には、フィクス（Ｆｉｃｕｓ）属、アロエ（Ａｌｏｅ）属およびランタナ（Ｌａｎｔａｎａ）属の植物、好ましくは、フィクス・エラスチカ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、ランタナ・カマラ（Ｌａｎｔａｎａ  Ｃａｍａｒａ）およびアロエ・アルボレセンス（Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）の植物が含まれるが、これらに限定されない。現時点で知られている最も好ましい実施形態によれば、抽出物はフィクス・エラスチカに由来する。
【０１５２】
抽出物を植物の様々な部分から調製することができ、例えば、葉から調製することができる。葉からの抽出物調製のための指針が下記の実施例の節の実施例１の実験詳細部に示される。
【０１５３】
本発明のエタノール抽出物の様々な調製プロトコルが下記の実施例の節の実験詳細部に記載される。抽出物は、活性な成分を本質的に含み、混入物を有しない精製された植物抽出物である得るか、または、その特徴的な染色能が維持される限り、粗植物抽出物であり得る。実際、本明細書中下記の実施例１５に示されるように、活性な抽出物分画物のＣＳＴ２００１が、悪性細胞を染色するとき、シグナルのコントラストおよび強度の向上を示した。図４３および図４４は、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４またはプロアントシアニジン類を含む活性な分画物の特徴づけを表す。後者（フラビノイドの特定のクラスとしても知られている）は、典型的には、オリゴマー形態（２ｍｅｒ体〜１０ｍｅｒ体（Ｃ２６Ｈ３２Ｏ１５）を含むことができる；図４５および図４６を参照のこと）またはポリマー形態である。
【０１５４】
本発明のエタノール抽出物は、５０％エタノール抽出物、６０％エタノール抽出物、７０％エタノール抽出物、８０％エタノール抽出物、９０％エタノール抽出物または１００％エタノール抽出物を含む。好ましくは、希釈された抽出物または非希釈の抽出が使用される。しかしながら、抽出物を希釈しすぎないようにする対策を講じなければならない。これは、このことがその後の染色に影響を及ぼすことがあるからである（下記の表１４を参照のこと）。
【０１５５】
本発明の染色剤（例えば、抽出物）は、正荷電イオン（これには、マグネシウムおよびカルシウムが含まれるが、これらに限定されない）が補われることがある（本明細書中下記の実施例１５を参照のこと）。
【０１５６】
本発明の染色剤は、蛍光染色または同じ予備染色もしくは満足すべき予備染色を可能にする条件のもとで細胞と接触させられる。そのような条件の例には、固定処理条件、すすぎ洗浄、風乾およびパラフィン包埋化などが含まれるが、これらに限定されない（本明細書中下記の実施例の節を参照のこと）。
【０１５７】
本発明の染色された細胞は、当該技術分野では広く知られ、また、本明細書中下記においてさらに記載される蛍光検出方法を使用して検出することができる。
【０１５８】
代謝状態または分化状態が異なる細胞の間における違いを強調するために、細胞は少なくとも１つの色素と接触させられる。
【０１５９】
そのような色素の例が表１ａに示され、また、本明細書中下記においてさらに示される。好ましい実施形態によれば、酸性色素はライトグリーン（Ｌｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ）であり、塩基性色素はニューフクシン（Ｎｅｗ  Ｆｕｃｈｓｉｎ）またはダリア（Ｄａｈｌｉａ）である。
2009528835.tif 000002
2009528835.tif 000003
2009528835.tif 000004
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2009528835.tif 000011
2009528835.tif 000012
示されたカタログ番号は、ＳｔａｉｎｓＦｉｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｉｎｓｆｉｌｅ．ｉｎｆｏ／ＳｔａｉｎｓＦｉｌｅ／ｊｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）からのものである。
【０１６０】
好ましい実施形態によれば、色素は塩基性色素または酸性色素であり、その結果、
（ｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示される；
（ｉｉ）少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示される；
（ｉｉｉ）少なくとも１つの色素が酸性色素および塩基性色素を含むときには、酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示される。
【０１６１】
本明細書中で使用される表現「所定の閾値を超える染色」は、基準の細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、１００％（すなわち、２倍）、３倍、５倍、１０倍以上の染色強度を示す。基準の細胞は、正常に分化した細胞が可能であり、好ましくは、未分化の表現型が疑われる試験細胞と同じ組織および標本の正常に分化した細胞が可能である。代わりとして、試験細胞が、（好ましくは、同じ組織および標本の）正常な最終分化した表現型であるときには、基準の細胞は、（損なわれた代謝状態または悪性／前悪性表現型の）未分化の細胞である。
【０１６２】
異なる分化状態または代謝状態の細胞の間における視覚的違いをより良好に改善するために、２つの異なる色素が連続して使用される（例えば、酸性色素および塩基性色素）。従って、例えば、細胞を最初に酸性色素により（例えば、緑色に）染色し、続いて、塩基性色素により（例えば、赤色に）染色することができる。上記の例示と一致して、正常に分化した細胞が緑色に染色され（または、全く染色されず）、一方、それほど分化していない細胞が赤色に染色される。他の色素が本明細書中下記においてさらに記載される。
【０１６３】
様々な染色検出様式が本明細書中下記においてさらに記載される。さらなる染色様式または形態学的分析を並行して行うことができる。これは、本明細書中上記で述べられたように、本発明の教示は細胞の形態学を損なわないからである。
【０１６４】
従って、本発明の教示は、細胞サンプルにおける異なる分化状態（または目的とする分化状態）の細胞を特定するために使用することができる。
【０１６５】
従って、本発明のさらなる態様によれば、目的とする分化状態の細胞を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、細胞を上記で記載されるように染色すること、および、その染色を分析することを含み、ただし、少なくとも１つの色素が酸性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、少なくとも１つの色素が塩基性色素であるときには、所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示され、少なくとも１つの色素が酸性色素および塩基性色素を含むときには、酸性色素による所定の閾値を超える染色強度により、分化した細胞が示され、塩基性色素による所定の閾値を超える染色強度により、未分化の細胞が示される。
【０１６６】
上記の方法論は、（本明細書中下記においてさらに記載されるように、この用語の非常に広い意味で）、損なわれた分化状態の細胞に関連する様々な医学的状態を診断するために臨床において使用することができる（すなわち、そのような細胞が医学的状態の開始の一因であるか、または、医学的状態の結果である）。下記では、ほとんどの場合、悪性疾患が扱われるが、本発明は、本明細書中下記においてさらに詳述されるように、数多くの医学的状態を診断するために、または、数多くの医学的状態の治療をモニターするために使用することができる。
【０１６７】
従って、本発明の別の態様によれば、ガンをその必要性のある対象において診断する方法が提供される。
【０１６８】
本明細書中で使用される用語「診断する」は、病理学的異常（例えば、ガンまたは前悪性病変）または症状を分類すること、病理学的異常の重篤度（悪性度または段階）を決定すること、病理学的異常の進行をモニターすること、病理学的異常の結果および／または回復の見込みを予測することを示す。
【０１６９】
本明細書中で使用される表現「その必要性のある対象」は、ガンを有する危険性がある動物対象もしくはヒト対象［例えば、遺伝的素因を有する対象、ガンの病歴および／または家族歴を有する対象、発ガン因子、職業的危険、環境的危険にさらされている対象］、および／または、ガンの疑われる臨床的徴候［便における血液またはメレナ、原因不明の痛み、発汗、原因不明の発熱、食欲不振に至るまでの原因不明の体重減少、排便習慣における変化（便秘および／または下痢）、テネスムス（不完全な排便感覚、具体的には直腸ガンの場合）、貧血および／または全身衰弱］を示す対象を示す。加えて、または、代替として、その必要性のある対象は、定期的な健康診断を受けている健康なヒト対象が可能である。
【０１７０】
悪性細胞または前悪性細胞の存在を分析することは、生物学的サンプル（例えば、生検物）がそれにより回収されるインビボまたはエクスビボで行うことができる。そのような生検サンプルは様々な細胞を含み、また、切開生検物または切除生検物であり得る。代替として、細胞を完全な切除物から回収することができる。
【０１７１】
生検標本はまた、疾患の原因が確実でないか、または、その範囲もしくは正確な特徴が疑わしいときには、病変部の一部から採取することができる。生検標本の周縁部または境界部はまた、疾患が生検の領域を越えて広がっているかもしれないかどうかを見るために慎重に調べられる。「異常のない境界部」または「陰性の境界部」は、疾患が生検標本の周辺部に全く見出されなかったことを意味する。「陽性の境界部」は、疾患が見出されたことを意味し、さらなる治療が必要とされる場合がある。本発明者らは、本発明の教示により、ラットの脳の腫瘍の境界部を検出することができることを明らかにすることができた（実施例４を参照のこと）。
【０１７２】
本発明の教示を用いる一方で、さらなる情報を、治療計画、治療経過を決定すること、および／または、疾患の重篤度を測定することに関して集めることができる。
【０１７３】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、抗ガン治療計画をその必要性のある対象において決定する方法が提供される。従って、この方法は、ガンと診断される対象によく適するか、または、診断と同時に適用することができる。この方法は、悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルを本発明の教示に従って対象の生検サンプルにおいて分析すること、および、治療的有効量の抗ガン治療を対象の生検サンプルにおける悪性細胞の存在またはレベルに従って対象に施すことによって行われる。
【０１７４】
本明細書中で使用される表現「治療計画」は、その必要性のある対象（例えば、病理学的異常と診断された対象）に施される治療のタイプ、治療の適用量、スケジュールおよび／または継続期間を指定する治療計画を示す。選択された治療計画は、最良の臨床的結果（例えば、病理学的異常の完全な治癒）をもたらすことが期待される攻撃的療法、または、病理学的異常の症状を緩和することができ、それにもかかわらず、病理学的異常の不完全な治癒をもたらすより穏やかな療法が可能である。特定の場合には、治療計画には、対象への何らかの不快、または、有害な副作用（例えば、健康な細胞または組織に対する損傷）が伴い得ることが理解される。治療のタイプには、外科的介入（例えば、病変、疾患細胞、疾患組織または疾患器官の切除）、細胞置換治療、局所的様式または全身的様式での治療薬物（例えば、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、化学療法剤）の投与、体外線源（例えば、体外ビーム）および／または体内線源（例えば、近接照射療法）を使用する放射線治療にさらすこと、ならびに／あるいは、これらの任意の組合せが含まれ得る。治療の適用量、スケジュールおよび継続期間は、病理学的異常の重篤度および選択された治療のタイプに依存して変化し得る。当業者は、治療のタイプを、治療の適用量、スケジュールおよび継続期間とともに調節することができる。
【０１７５】
日常的に使用されるガン治療の例には、放射線治療、化学療法（例えば、ＣＨＯＰ、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ビンカアルカロイド、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカンアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシドおよびダクチノマイシン）、抗体治療［例えば、トラツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）およびリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）］、または、上記のいずれかの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
述べられたように、本明細書中に記載される同じ教示を、抗ガン治療経過をその必要性のある対象において決定するために効果的に使用することができ、この場合、この方法は、対象に抗ガン治療（例えば、上記で記載された治療など）を施すこと、および、施術後の対象の生検サンプルにおける悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルを上記で記載された方法に従って分析することを含み、それによって、悪性細胞または前悪性細胞の存在またはレベルにより、治療経過が示される。
【０１７７】
好ましくは、いくつかの生検サンプルが、例えば、治療前および治療後などに得られ（定期的に、例えば、任意の治療サイクルなどで繰り返すことができる）。この場合、悪性細胞または前悪性細胞のレベルが種々の生検物において比較され、治療後におけるレベルの低下により、治療（緩和および最終的には治癒）が示される。
【０１７８】
本発明の教示は、細胞の表現型を容易に特定することを可能にする。このことは、治療リード化合物として使用することができる抗ガン性薬剤を特定するために利用することができる。実際、本発明者らは、本発明の教示を、薬物スクリーニング（図２２Ａ〜図２２Ｄ、図２３Ａ〜図２３Ｃ、図２４Ａ〜図２４Ｃ、図２７Ａ〜図２７Ｂおよび図２８）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系の確立（図２０Ａ〜図２０Ｃ）、および、標的の有効性評価（図３０Ａ〜図３０Ｂ、図３１Ａ〜図３１Ｄおよび図３２Ａ〜図３２Ｄ）のために用いている。実施例の節において本明細書中下記に例示されるように、薬物の影響性を、本発明の染色方法を使用して、モデル系において、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などについて試験することができる（図３４Ａ〜図３４Ｃおよび図３５Ａ〜図３５Ｂ）。
【０１７９】
従って、本発明のさらに別の態様によれば、細胞の前悪性表現型または悪性表現型を転換させることができる作用因を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、細胞を作用因に供すること、および、その後での細胞の悪性表現型を本発明の教示に従って分析することを含み、ただし、表現型の少なくとも部分的な転換により、細胞の前悪性表現型または悪性表現型を転換させることができる作用因が示される。
【０１８０】
本明細書中で使用される表現「悪性（の）」は、「ガン性（の）」としてもまた知られており、侵入（これは転移とも呼ばれる）の能力を有する腫瘍の形成を引き起こす制御されない細胞増殖を示す。
【０１８１】
本明細書中で使用される表現「前悪性（の）」は、常にではないが、悪性、ガン性になり得る細胞形質転換を示す。前ガン性とも呼ばれる（例えば、前悪性病変）。
【０１８２】
本明細書中で使用される表現「前悪性表現型または悪性表現型を転換させる」は、前悪性細胞または悪性細胞の増殖特性および／または侵入特性を少なくとも部分的に転換することを示す。
【０１８３】
本明細書中で使用される用語「作用因」は、前悪性または悪性の細胞表現型を逆戻りさせることができるか、あるいは、少なくとも部分的に逆戻りさせることができる分子または条件を示す。
【０１８４】
本発明による作用因として利用することができる分子の例には、核酸、例えば、ポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス分子（これらには、限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ペプチド核酸、ならびに、変化した骨格構造および／または塩基構造または化学的修飾を有するポリヌクレオチドアナログが含まれる）；タンパク質、ポリペプチド（例えば、ペプチド、例えば、ＩＦＮ−ガンマ、図３７Ａ〜図３７Ｃおよび図３８Ａ〜図３８Ｈを参照のこと）、炭水化物、脂質および「小分子」薬物候補物が含まれるが、これらに限定されない。「小分子」は、例えば、天然に存在する化合物（例えば、植物抽出物および微生物培養液などに由来する化合物）、または、分子量が約１００００ダルトン未満（好ましくは約５０００ダルトン未満、最も好ましくは約１５００ダルトン未満）である合成された有機化合物もしくは有機金属化合物が可能である。
【０１８５】
本発明による作用因としての使用のために好適な条件の例には、培養条件、例えば、温度、湿度、大気圧力、ガス濃度、成長培地、接触表面、放射線暴露（例えば、ガンマ線、ｕｖ線、Ｘ線）、および、培養における他の細胞の存在または非存在が含まれるが、これらに限定されない。本発明による作用因としての使用のために好適な別の条件には、細胞内の侵入微生物による感染が含まれ、そのような微生物は、例えば、（ｉ）細胞内細菌：結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、（ｉｉ）細胞内真菌：ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クリプトコックス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、（ｉｉｉ）細胞内寄生虫：リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ｓｐ．、（ｉｖ）細胞内ウイルス：単純ヘルペスウイルス、天然痘、麻疹ウイルス、レトロウイルスであるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本発明のこの態様によって使用することができる細胞には、細胞株、初代培養物、永続的な細胞培養物、器官型培養物または組織が含まれる。ガン細胞の例が下記の実施例の節において示される。
【０１８７】
本明細書中上記で述べられたように、表現型の転換が本発明の教示に従って検出される。例えば、細胞は、転換作用因にさらされた後では、もはや赤色に染まらない。
【０１８８】
異常な表現型転換のさらなる確認のために、細胞は、特定の変化（例えば、アポトーシス、接合部の喪失、伸長または円形化などを含む様々な生理学的変化など）について顕微鏡検査される。
【０１８９】
本発明は、理論的には、単一細胞を用いて実施することができるが、そのような方法は効率的ではなく、また、望ましくない。好ましくは、本発明の方法は、様々な作用因を同時にスクリーニングするために多数の細胞を使用する作用因のハイスループットスクリーニングのために使用される。
【０１９０】
そのような大規模なスループットスクリーニング法において、作用因はライブラリー（例えば、各々が、（ｉ）異常な表現型を転換させることができることについて試験される、多数のポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド（作用因）、および、（ｉｉ）発現構築物からのポリペプチドの発現を行わせるための少なくとも１つのシス作用調節エレメントを有する多数の発現構築物を含む発現ライブラリーなど）の一部であり得る。
【０１９１】
代替として、例えば、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｌａｘｏ、ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＢｒｙｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂをはじめとする様々な化学企業から入手可能な化学ライブラリーもまた、スクリーニングのために使用することができる。場合により、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリー（これらは、例えば、Ｐａｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＭｙｃｏｓｅａｒｃｈから入手可能であるか、あるいは、当該技術分野で既知の方法によって容易に製造可能である）もまた、本発明によって利用することができる。
【０１９２】
大規模なスクリーニングを行うとき、個々の作用因に供される細胞集団は、異常な表現型の転換の特定を容易にするように区画化することができる。これは、細胞集団を、ウエルあたりちょうど１つまたは２つのクローンの成長を可能にする所定の密度で平らなガラス底マルチウエルプレートに小分けすることによって行うことができる。
【０１９３】
スクリーニングする工程において、手作業を続けることができ、だが、ロボット（例えば、ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ顕微鏡用のマルチウエル付属品、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ自動化顕微鏡など）を使用する自動化されたスクリーニングが好ましい。
【０１９４】
特定されると、異常な細胞表現型を少なくとも部分的に転換させることができる作用因が回収される。そのような作用因がポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド発現産物であるならば、上記で議論されたように、細胞が単離され、増殖させられ、ポリヌクレオチド作用因を、例えば、ＰＣＲ増幅によって単離するために使用される。
【０１９５】
回収された作用因はさらに、様々な生化学的方法および細胞生物学的方法を使用して、その正確な作用機構について分析され、最適な効果のために調節される。最終的には、単離された作用因のどれがリード化合物の可能性を有するかを識別することが、作用因の効果を様々な疾患の薬理学的モデルにおいて試験することによって達成することができる。疾患の進行または開始に影響を及ぼす作用因が薬物開発のためのリード物質となる。
【０１９６】
そのような作用因は、多くの病理学状態（例えば、ガンなど）および代謝性疾患（例えば、糖尿病および肥満など）を治療するために適用することができる。
【０１９７】
下記には、本発明の教示のさらなる説明が示される。
【０１９８】
従って、本発明は、悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって、または、悪性細胞および非悪性細胞における示差的な蛍光を有することによって、悪性細胞と、非悪性細胞とを区別することができる化合物を提供する。本発明の化合物はさらに、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞の示差的な染色を生じさせることによって、または、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞における示差的な蛍光を有することによって、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞とを区別することができる。本発明はさらに、そのような化合物を含む組成物およびキット、ならびに、ａ）悪性細胞、非悪性細胞、代謝が損なわれた細胞、または、代謝が正常な細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定すること、ｂ）非悪性細胞におけるガン遺伝子の発現が細胞の非悪性表現型に影響を及ぼすかどうかを決定すること、ｃ）細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現または機能を変化させることにより、細胞の表現型が影響されるかどうかを決定すること、ｄ）悪性細胞、および／または、代謝性疾患を有する細胞の存在をサンプルにおいて検出すること、ｅ）対象における状態または疾患を診断すること（この場合、状態または疾患は、少なくとも１つの悪性細胞の存在によって特徴づけられる代謝性疾患または状態である）、ｆ）対象における状態または疾患の進行をモニターすること（この場合、状態または疾患は、少なくとも１つの悪性細胞の存在によって特徴づけられる代謝性疾患または状態である）、ｇ）少なくとも１つの悪性細胞の存在によって特徴づけられる代謝性疾患または状態または疾患のための治療を受けている対象について治療計画をモニターおよび／または調節すること、ｈ）少なくとも１つの悪性細胞の存在を対象において検出するためにインビボ造影すること、ｉ）ニューロン細胞または幹細胞の分化（胚幹細胞および成体幹細胞）を誘導する作用因を特定すること、および、ｊ）器官／組織損傷に対する組織保護をもたらす作用因を特定することのためにそのような化合物を使用する方法を提供する。本発明の方法は、大きい処理量のための手段に適合化することができ、また、大きい処理量のための手段を使用して行うことができ、従って、創薬、標的の妥当性確認、診断、薬物治療のモニタリング、および、疾患進行のモニタリングのための効率的かつ信頼できるツールを提供する。
【０１９９】
本明細書中で使用される用語「示差的な染色」は、２つの細胞集団の表現型を区別すること（例えば、悪性細胞の表現型を非悪性細胞の表現型に対して区別すること）ができる染色、または、健康な細胞に対する疾患細胞の表現型を区別すること（例えば、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞の表現型とを区別すること）ができる染色を示す。本明細書中で使用される用語「示差的な蛍光」は、２つの細胞集団の表現型を区別すること（例えば、悪性細胞の表現型を非悪性細胞の表現型に対して区別すること）ができる染色、または、健康な細胞に対する疾患細胞の表現型を区別すること（例えば、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞の表現型とを区別すること）ができる染色を示す。
【０２００】
１つの実施形態において、本発明の化合物を含む組成物は植物抽出物である。別の実施形態において、組成物は粗植物抽出物である。別の実施形態において、組成物は、精製された植物抽出物である。
【０２０１】
別の実施形態において、本発明の化合物は、植物から抽出される。別の実施形態において、植物はフィクス・エラスチカである。さらに別の実施形態において、化合物は合成化合物であり、この場合、合成化合物は全合成または部分合成によって合成することができる。別の実施形態において、化合物は、図４３〜図４４に詳しく示されるようなＮＭＲスペクトルによって特徴づけられる。別の実施形態において、化合物は蛍光性である。別の実施形態において、化合物は、４３０ｎｍにおける蛍光を、３７５ｎｍで励起されたときに放射する。別の実施形態において、化合物は悪性細胞または非悪性細胞の染色を阻害する。
【０２０２】
１つの実施形態において、作用因は物理的作用因である。別の実施形態において、作用因は化学的作用因である。別の実施形態において、作用因は生物学的作用因である。別の実施形態において、作用因は遺伝子である。別の実施形態において、作用因は腫瘍抑制因子遺伝子である。別の実施形態において、作用因はガン遺伝子である。別の実施形態において、作用因は、物理的作用因、化学的作用因、生物学的作用因、遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子またはガン遺伝子の任意の組合せである。
【０２０３】
加えて、１つの実施形態において、本発明は、細胞の染色を阻害することができる化合物を含む組成物を特定するための方法を提供し、この場合、この方法は、少なくとも１つの細胞を含むサンプルを得る工程、サンプルを色素の存在下で組成物と接触させる工程、および、色素による細胞の染色の阻害を組成物の濃度の関数として分析する工程を含み、それにより、組成物を特定する。１つの実施形態において、この方法はさらに、化合物を得るために組成物を精製する工程を含む。
【０２０４】
本明細書中で定義されるように、「接触させる」は、細胞の表現型に影響を及ぼす化合物、組成物、色素または作用因が、試験チューブ、フラスコ、組織培養、チップ、アレイ、プレート、マイクロプレートまたは毛細管などにおいて少なくとも１つの細胞を含むサンプルの中に導入され、所望の影響（例えば、細胞を染色すること、色素による細胞の染色を阻害すること、悪性表現型から非悪性表現型への転換、および、非悪性表現型から悪性表現型への転換など）を可能にするために十分な温度および時間でインキュベーションされることを示す。サンプルを、そのような化合物、組成物、色素または作用因と接触させるための様々な方法が当業者には知られており、そのような方法は、操作されるアッセイプロトコルのタイプに依存して選択することができる。インキュベーション方法もまた標準的であり、当業者に知られている。
【０２０５】
本明細書中で使用される用語「得る」は、それに含有される生物学的サンプルを本発明の染色方法の実施形態の１つ以上に供するという目的のためにサンプルまたは標本を提供すること、得ること、入手すること、または、供給することを交換可能に示す。
【０２０６】
本明細書中で使用される用語「検出する」は、細胞を検出するという行為、細胞を感知するという行為、細胞を発見するという行為、細胞をあらわにするという行為、細胞を可視化するという行為、または、細胞を特定するという行為を示す。
【０２０７】
本明細書中で使用される用語「サンプル」は、生物、および、細胞染色のために好適な標本を形成するためのプロセスから生じる生物学的サンプル、または、生物、および、細胞染色のために好適な標本を形成するためのプロセスに由来する生物学的サンプル、例えば、任意の組織、細胞含有組織、細胞株、細胞培養物、初代細胞培養物などを包含するが、これらに限定されない。
【０２０８】
本明細書中で使用される用語「色素」は、色を生物学的組織、動物、植物に与える任意の物質、あるいは、そうでない場合には、組織、細胞、または、それらを含む身体部分の細胞学的または組織学的な可視化のために有用である任意の物質を示す。本発明を実行するという目的のために直ちに有用であることが見出されている色素が本明細書中に開示されているが、本明細書中に記載されない他の色素がこの目的のために同様に有用であり得る。従って、本発明の記載は、スペクトルの可視範囲において色が現れる色素を提供するが、検出のための適切なフィルター、照明、形態または手段の使用により、直接の観察に対して見ることができない色素が、本発明を実行するために本明細書中に記載される可視性色素と同等であると判明し得ることが容易に想像され得る。
【０２０９】
１つの実施形態において、色素は酸性色素である。別の実施形態において、色素は塩基性色素である。別の実施形態において、色素はトリアミノトリフェニルメタン誘導体である。別の実施形態において、色素はジアゾ誘導体である。別の実施形態において、色素は、酸性色素、塩基性色素、トリアミノトリフェニルメタン誘導体、ジアゾ誘導体の任意の組合せである。
【０２１０】
別の実施形態において、色素は、ヘマトキシリンギル、アズールＡ、エオシンイエロー、フロキシン、ライトグリーン、ニューフクシン、ダリア、塩基性フクシン、メチルバイオレット、ゲンチアンバイオレット、メチルバイオレット６ｂ、クリスタルバイオレット、パラローザニリン、ローザニリン、マゼンタＩ、イソルビン、フクシンＮＢ、ＦＩＡＴ−７６４、スピラーズパープル、ビスマルクブラウンＲ、ビスマルクブラウンＹ、ビスマルクブラウンエオシンコンジュゲート、ビスマルクブラウンフロキシンコンジュゲート、フェニックスブラウンＡ、または、これらの任意の組合せである。
【０２１１】
１つの実施形態において、色素は赤色色素である。本明細書中で使用される用語「赤色」は、赤色の色だけでなく、関連した色合いおよび色調（例えば、スミレ色、ピンク色もしくはピンクがかった色、紫色もしくは紫がかった色、または、マゼンタなど）をも示す。１つの実施形態において、赤色色素はニューフクシンである。
【０２１２】
１つの実施形態において、色素は緑色色素である。本明細書中で使用される用語「緑色」は、緑色の色だけでなく、関連した色合いおよび色調（例えば、薄緑色、暗緑色、エメラルド色、オリーブ色およびライム色など）をも示す。１つの実施形態において、緑色色素はライトグリーン色素である。
【０２１３】
色素の濃度は、アッセイの必要性に基づいて経験的に決定される。色素の好適な濃度は、色素による細胞の染色の検出を、本明細書中に記載されるような検出方法のいずれかを使用して可能にする濃度である。
【０２１４】
１つの実施形態において、細胞の染色を阻害することができる化合物を含む組成物は植物抽出物である。別の実施形態において、組成物は粗植物抽出物である。別の実施形態において、組成物は、精製された植物抽出物である。別の実施形態において、細胞の染色を阻害することができる化合物が、植物から抽出される。別の実施形態において、植物はフィクス・エラスチカである。さらに別の実施形態において、化合物は合成化合物である。別の実施形態において、化合物は、図４３〜図４４に詳しく示されるようなＮＭＲスペクトルによって特徴づけられる。別の実施形態において、化合物は蛍光性である。別の実施形態において、化合物は、４３０ｎｍにおける蛍光を、３７５ｎｍで励起されたときに放射する。別の実施形態において、化合物はＣ２３Ｈ４４Ｏ４の分子式を有する。
【０２１５】
加えて、１つの実施形態において、本発明は、悪性細胞または非悪性細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定するための細胞組織学的染色方法が提供され、この場合、この方法は、２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を試験作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、悪性細胞と、非悪性細胞とを、本明細書中上記で記載されるような悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を少なくとも第１の色素および第２の色素と接触させる工程、第１の色素および第２の色素による第１の分画物の染色を検出する工程、第１の色素および第２の色素による第２の分画物の染色を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の染色を比較し、それにより、悪性細胞または非悪性細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定する工程を含む。別の実施形態において、この方法は、悪性細胞または非悪性細胞の表現型に影響を及ぼす作用因の組合せを特定するために適合化される。
【０２１６】
１つの実施形態において、悪性の表現型を有する細胞が１つの色素により実質的に染まり、非悪性の表現型を有する細胞が、第１の色素とは異なる第２の色素により実質的に染まる。本明細書中で使用される用語「実質的に染まる」は、細胞が、１つの特定の色素により、それ以外の色素による染色よりも大きな程度に染まることを意味する。１つの実施形態において、悪性の表現型を有する細胞が赤色色素により実質的に染まる。別の実施形態において、非悪性の表現型を有する細胞が緑色色素により実質的に染まる。
【０２１７】
別の実施形態において、悪性の表現型を有する細胞が１つの色素により実質的に染まり、非悪性の表現型を有する細胞が同じ色素により示差的に染まる。例えば、悪性の表現型を有する細胞が１つの色素により実質的に染まり、非悪性の表現型を有する細胞が、それほど強くなく、同じ色素により染まる。
【０２１８】
加えて、別の実施形態において、本発明は、悪性細胞および非悪性細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定するための方法が提供され、この場合、この方法は、２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、悪性細胞および非悪性細胞を、悪性細胞および非悪性細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を比較し、それにより、悪性細胞または非悪性細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定する工程を含む。１つの実施形態において、この方法は、作用因の異なる濃度を使用して繰り返される。１つの実施形態において、蛍光性化合物は合成化合物または植物から抽出された化合物であり、これらは、本明細書中上記で記載されるように、図４３〜図４４に詳しく示されるようなＮＭＲスペクトルによって特徴づけられるか、または、Ｃ２３Ｈ４４Ｏ４の分子式を有する。別の実施形態において、化合物は、４３０ｎｍにおける蛍光を、３７５ｎｍで励起されたときに放射する。別の実施形態において、この方法は、悪性細胞または非悪性細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定するために使用される。
【０２１９】
別の実施形態において、本発明は、代謝が損なわれた細胞の表現型、または、代謝が正常な細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定するための細胞組織学的染色方法が提供され、この場合、この方法は、２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞とを、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を少なくとも１つの色素と接触させる工程、この色素による第１の分画物の染色を検出する工程、この色素による第２の分画物の染色を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の染色を比較し、それにより、代謝が損なわれた細胞の表現型、または、代謝が正常な細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定する工程を含む。
【０２２０】
別の実施形態において、本発明は、代謝が損なわれた細胞の表現型、または、代謝が正常な細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定するための方法が提供され、この場合、この方法は２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞とを、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を比較し、それにより、代謝が損なわれた細胞の表現型、または、代謝が正常な細胞の表現型に影響を及ぼす作用因を特定する工程を含む。
【０２２１】
加えて、別の実施形態において、本発明は、非悪性細胞におけるガン遺伝子の発現が細胞の非悪性表現型に影響を及ぼすかどうかを決定するための細胞組織学的染色方法を提供し、この場合、この方法は、２つ以上の非悪性細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、ガン遺伝子を第２の分画物において発現させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、悪性細胞と、非悪性細胞とを、本明細書中上記で記載されるような悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を少なくとも第１の色素および第２の色素と接触させる工程、第１の色素および第２の色素による第１の分画物の染色を検出する工程、第１の色素および第２の色素による第２の分画物の染色を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の染色を比較し、それにより、非悪性細胞におけるガン遺伝子の発現が細胞の非悪性表現型に影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む。
【０２２２】
加えて、別の実施形態において、本発明は、非悪性細胞におけるガン遺伝子の発現が細胞の非悪性表現型に影響を及ぼすかどうかを決定するための方法を提供し、この場合、この方法は、２つ以上の非悪性細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、ガン遺伝子を第２の分画物において発現させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、悪性細胞と、非悪性細胞とを、悪性細胞および非悪性細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を比較し、それにより、非悪性細胞におけるガン遺伝子の発現が細胞の非悪性表現型に影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む。
【０２２３】
本明細書中で使用される用語「ガン遺伝子」は、本明細書中では「腫瘍促進」遺伝子と交換可能に使用され、当該技術分野におけるその一般に理解されている意味を有しており、すなわち、その発現が腫瘍の発達と相関する遺伝子である。
【０２２４】
１つの実施形態において、ガン遺伝子は、非悪性細胞から、悪性の表現型を有する細胞への転換を促進する。別の実施形態において、ガン遺伝子は、ガン遺伝子を化学的に、生物学的に、ウイルスにより、または、細菌により細胞にトランスフェクションすることによって細胞において発現させられる。
【０２２５】
加えて、別の実施形態において、本発明は、細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現または機能が細胞の表現型に影響を及ぼすかどうかを決定するための細胞組織学的染色を提供し、この場合、この方法は、２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、腫瘍抑制因子遺伝子の発現または機能を第２の分画物において変化させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、悪性細胞と、非悪性細胞とを、本明細書中上記で記載されるような悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を少なくとも第１の色素および第２の色素と接触させる工程、第１の色素および第２の色素による第１の分画物の染色を検出する工程、第１の色素および第２の色素による第２の分画物の染色を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の染色を比較し、それにより、細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現が細胞の表現型に影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む。
【０２２６】
加えて、別の実施形態において、本発明は、細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現または機能が細胞の表現型に影響を及ぼすかどうかを決定するための方法を提供し、この場合、この方法は、２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、腫瘍抑制因子遺伝子の発現または機能を第２の分画物において変化させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、悪性細胞と、非悪性細胞とを、悪性細胞および非悪性細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を比較し、それにより、細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現が細胞の表現型に影響を及ぼすかどうかを決定する工程を含む。
【０２２７】
本明細書中で使用される用語「腫瘍抑制因子遺伝子」は、当該技術分野におけるその一般に理解されている意味を有しており、すなわち、その発現および正常な機能が腫瘍抑制因子活性と相関する遺伝子である。
【０２２８】
１つの実施形態において、細胞は悪性細胞である。別の実施形態において、腫瘍抑制因子遺伝子の発現を変化させること、または、腫瘍抑制因子遺伝子の異常な機能もしくは正常でない機能を改変することは、悪性細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の発現／機能を高めることを含む。別の実施形態において、腫瘍抑制因子遺伝子の発現を高めることは、腫瘍抑制因子遺伝子を化学的に、生物学的に、ウイルスにより、または、細菌により細胞にトランスフェクションすることを含む。別の実施形態において、腫瘍抑制因子遺伝子の機能を正常化することは、腫瘍抑制因子遺伝子の正常な機能を化学的に、生物学的に、ウイルスにより、または、細菌により細胞において発現させることを含む。別の実施形態において、腫瘍抑制因子遺伝子の発現を高めること、または、腫瘍抑制因子遺伝子の機能を正常化することは、悪性細胞から、非悪性の表現型を有する細胞への転換を促進させる。本明細書中で使用される用語「異常な」は、正常でないか、非通常的であるか、正常から逸脱しているか、不規則であるか、または、異型である機能を示す。
【０２２９】
１つの実施形態において、細胞は非悪性細胞である。別の実施形態において、腫瘍抑制因子遺伝子の発現／機能を変化させることは、非悪性細胞における腫瘍抑制因子遺伝子の機能的なサイレンシングを含む。別の実施形態において、腫瘍抑制因子遺伝子の機能的なサイレンシングは、非悪性細胞から、悪性の表現型を有する細胞への転換を促進させる。
【０２３０】
加えて、別の実施形態において、本発明は、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するための細胞組織学的染色方法を提供し、この場合、この方法は、少なくとも１つの細胞を含むサンプルを得る工程、サンプルを、悪性細胞と、非悪性細胞とを、本明細書中上記で記載されるような悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物と接触させる工程、サンプルを少なくとも第１の色素および第２の色素と接触させる工程、および、第１の色素および第２の色素によるサンプルの染色を検出し、それにより、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出する工程を含む。
【０２３１】
加えて、別の実施形態において、本発明は、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するための方法を提供し、この場合、この方法は、少なくとも１つの細胞を含むサンプルを得る工程、サンプルを、悪性細胞と、非悪性細胞とを、悪性細胞および非悪性細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と接触させる工程、および、サンプルの染色を検出し、それにより、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出する工程を含む。
【０２３２】
さらには、別の実施形態において、本発明は、代謝が損なわれた細胞の存在をサンプルにおいて検出するための方法であって、少なくとも１つの細胞を含むサンプルを得る工程、サンプルを、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞とを、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物と接触させる工程、サンプルを少なくとも１つの色素と接触させる工程、および、色素によるサンプルの染色を検出し、それにより、代謝が損なわれた細胞の存在をサンプルにおいて検出する工程を含む方法を提供する。
【０２３３】
さらには、別の実施形態において、本発明は、代謝が損なわれた細胞の存在をサンプルにおいて検出するための方法であって、少なくとも１つの細胞を含むサンプルを得る工程、サンプルを、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞とを、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞における示差的な染色を有することによって区別することができる化合物と接触させる工程、および、サンプルの蛍光を検出し、それにより、代謝が損なわれた細胞の存在をサンプルにおいて検出する工程を含む方法を提供する。
【０２３４】
加えて、別の実施形態において、本発明は、状態または疾患を対象において診断するための方法を提供し、この場合、状態または疾患は少なくとも１つの悪性細胞の存在によって特徴づけられ、この方法は、対象から得られたサンプルにおける少なくとも１つの悪性細胞を、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して検出する工程を含み、ただし、サンプルにおける少なくとも１つの細胞の存在により、対象がそのような状態または疾患を有することが示される。１つの実施形態において、状態または疾患はガンまたは前悪性の状態もしくは疾患である。
【０２３５】
さらには、１つの実施形態において、本発明は、代謝性疾患を対象において診断するための方法を提供し、この場合、この方法は、対象から得られたサンプルにおける、代謝性疾患を有する少なくとも１つの細胞を、代謝性疾患を有する細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して検出する工程を含み、ただし、サンプルにおける、代謝性疾患を有する少なくとも１個の細胞の存在により、対象が代謝性疾患を有することが示される。
【０２３６】
加えて、別の実施形態において、本発明は、状態または疾患の進行を対象においてモニターするための方法を提供し、この場合、状態または疾患は少なくとも１つの悪性細胞の存在によって特徴づけられ、この方法は、第１のサンプルを対象から得る工程、第１のサンプルにおける悪性細胞の存在および／または数を、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して決定する工程、第２のサンプルを一定の期間の後で対象から得る工程、第２のサンプルにおける悪性細胞の存在および／または数を、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して決定する工程、および、第１のサンプルおよび第２のサンプルにおける悪性細胞の存在および／または数を比較し、それにより、状態または疾患の進行を対象においてモニターする工程を含む。１つの実施形態において、状態または疾患はガンまたは前悪性の状態もしくは疾患である。
【０２３７】
さらには、別の実施形態において、本発明は、代謝性疾患の進行を対象においてモニターするための方法を提供し、この場合、この方法は、第１のサンプルを対象から得る工程、前記第１のサンプルにおける、代謝性疾患を有する細胞の存在および／または数を、代謝性疾患を有する細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して決定する工程、第２のサンプルを一定の期間の後で対象から得る工程、第２のサンプルにおける、代謝性疾患を有する細胞の存在および／または数を、代謝性疾患を有する細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して検出する工程、および、第１のサンプルおよび第２のサンプルにおける、代謝性疾患を有する細胞の存在および／または数を比較し、それにより、代謝状態または代謝疾患の進行を対象においてモニターする工程を含む。
【０２３８】
加えて、別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの悪性細胞の存在によって特徴づけられる状態または疾患のための治療を受けている対象について治療計画をモニターするための方法を提供し、この場合、この方法は、第１のサンプルを治療計画の開始の前に対象から得る工程、第１のサンプルにおける悪性細胞の存在および／または数を、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して決定する工程、治療計画を開始する工程、第２のサンプルを一定の期間の後で対象から得る工程、第２のサンプルにおける悪性細胞の存在および／または数を、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して決定する工程、および、第１のサンプルおよび第２のサンプルにおける悪性細胞の存在および／または数を比較し、それにより、対象についての治療計画をモニターする工程を含む。１つの実施形態において、状態または疾患はガンまたは前悪性の状態もしくは疾患である。
【０２３９】
さらには、１つの実施形態において、本発明は、代謝性疾患のための治療を受けている対象について治療計画をモニターするための方法を提供し、この場合、この方法は、第１のサンプルを治療計画の開始の前に対象から得る工程、第１のサンプルにおける、代謝性疾患を有する細胞の存在および／または数を、代謝性疾患を有有する細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して決定する工程、治療計画を開始する工程、第２のサンプルを一定の期間の後で対象から得る工程、第２のサンプルにおける、代謝性疾患を有する細胞の存在および／または数を、代謝性疾患を有する細胞の存在をサンプルにおいて検出するための本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して決定し、それにより、対象についての治療計画をモニターする工程を含む。
【０２４０】
１つの実施形態において、治療計画をモニターする方法はさらに、治療計画を、治療計画の投薬量、投薬スケジュールまたはこれらの組合せを調節することによって調節する工程を含む。１つの実施形態において、治療計画は放射線治療を含む。別の実施形態において、治療計画は化学療法を含む。別の実施形態において、治療計画は免疫療法を含む。別の実施形態において、治療計画はウイルス治療を含む。別の実施形態において、治療計画は、放射線治療、化学療法、免疫療法およびウイルス治療の任意の組合せを含む。別の実施形態において、治療計画は、化学化合物、天然化合物、合成化合物、モノマー、ポリマー、タンパク質、糖タンパク質、脂質、炭水化物、脂肪酸、核酸、抗体、ウイルス、プリオン、合成化合物のコンビナトリアルライブラリー、ゲノムライブラリー、核酸、核酸ライブラリー、タンパク質、タンパク質ライブラリー、天然抽出物、植物抽出物、動物抽出物、または、これらの混合物による治療を含む。
【０２４１】
１つの実施形態において、本明細書中上記で記載された方法において使用される染色を検出する工程は、第１の分画物および第２の分画物における、第２の色素に対する第１の色素による染色の比率を求めることを含む。別の実施形態において、本明細書中上記で記載された方法において使用される染色を検出する工程はさらに、第１の色素によるサンプルの染色を検出すること、第２の色素によるサンプルの染色を検出すること、および、第１の色素によるサンプルの染色と、第２の色素によるサンプルの染色との和を求めることによってサンプルによる細胞の総数を求めることを含む。
【０２４２】
別の実施形態において、本明細書中上記で記載された方法のいずれかにおいて使用される染色を検出する工程は、第１の色素または第２の色素の吸収を検出することを含む。別の実施形態において、染色を検出する工程は、第１の色素および第２の色素の色の強度を検出することを含む。別の実施形態において、染色を検出する工程は、第１の色素および第２の色素の色のパターンを検出することを含む。別の実施形態において、染色を検出する工程は、第１の色素および第２の色素の色の分布を検出することを含む。別の実施形態において、染色を検出する工程は、第１の色素および第２の色素の色の濃度を検出することを含む。別の実施形態において、染色を検出する工程は、本明細書中上記で記載された検出方法の任意の組合せを含む。
【０２４３】
１つの実施形態において、本発明の方法はさらに、細胞を固定処理する工程を含む。別の実施形態において、本発明の方法はさらに、細胞を風乾により固定処理する工程を含む。
【０２４４】
１つの実施形態において、本発明の方法は、作用因、ガン遺伝子および腫瘍抑制因子遺伝子などの異なる濃度を使用して繰り返される。
【０２４５】
１つの実施形態において、本発明の方法は、大きい処理量のための手段に適合化され、また、大きい処理量のための手段を使用して行われる。別の実施形態において、そのような手段は、自動化されたサンプリングデバイス、液体取り扱い装置、自動化された染色装置、ディスペンサー、ロボット、または、これらの任意の組合せを含む。
【０２４６】
加えて、別の実施形態において、本発明は、悪性細胞の存在をサンプルにおいて検出するためのキットを提供し、この場合、キットは、悪性細胞と、非悪性細胞とを、本明細書中上記で記載されるように、悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって、または、悪性細胞および非悪性細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と、サンプルを保持するための部材とを含む。
【０２４７】
加えて、別の実施形態において、本発明は、代謝が損なわれた細胞の存在をサンプルにおいて検出するためのキットを提供し、この場合、キットは、代謝が損なわれた細胞と、代謝が正常な細胞とを、本明細書中上記で記載されるように、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞の示差的な染色を生じさせることによって、または、代謝が損なわれた細胞、および、代謝が正常な細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と、サンプルを保持するための部材とを含む。
【０２４８】
１つの実施形態において、そのような部材は、スライドガラス、顕微鏡スライドガラス、ウエルのアレイ、マイクロタイタープレートアッセイトレイ、透明な容器、カバースリップ、フィルター、メンブラン、チューブ、または、これらの組合せからなる群から選択される。
【０２４９】
別の実施形態において、キットはさらに、少なくとも第１の色素および第２の色素を含む。色素は、本明細書中上記で記載された色素のいずれかであり得る（例えば、酸性色素、塩基性色素、トリアミノトリフェニルメタン誘導体、ジアゾ誘導体、または、これらの組合せ）。別の実施形態において、キットはさらに、少なくとも１つの固定剤を含む。別の実施形態において、キットはさらに、緩衝液、キレート化剤、保存剤、または、これらの任意の組合せを含む。
【０２５０】
加えて、別の実施形態において、本発明は、悪性細胞と、非悪性細胞とを、本明細書中上記で記載されるように、悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物を含む組成物の最適な作業用濃度を特定する方法であって、悪性の表現型を有する２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を、悪性の表現型から非悪性の表現型への転換を促進させる作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を組成物の１つ以上の濃度と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を少なくとも第１の色素および第２の色素と接触させる工程、第１の色素および第２の色素による第１の分画物および第２の分画物の染色を検出する工程、組成物の各々の濃度での第１の分画物における第２の色素に対する第１の色素による染色を示す比率Ｒ１を測定する工程、組成物の各々の濃度での第２の分画物における第２の色素に対する第１の色素による染色を示す比率Ｒ２を測定する工程、および、比率Ｒ１／Ｒ２を組成物の各々の濃度について計算する工程を含む方法を提供し、この場合、組成物の最適な作業用濃度は、Ｒ１／Ｒ２が最大である濃度である。１つの実施形態において、悪性細胞が第１の色素により実質的に染まり、非悪性細胞が第２の色素により実質的に染まる。
【０２５１】
別の実施形態において、本発明は、悪性細胞と、非悪性細胞とを、本明細書中上記で記載されるように、悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物を含む組成物の最適な作業用濃度を特定する方法であって、非悪性の表現型を有する２つ以上の細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を、非悪性の表現型から悪性の表現型への転換を促進させる作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を組成物の１つ以上の濃度と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を少なくとも第１の色素および第２の色素と接触させる工程、第１の色素および第２の色素による第１の分画物および第２の分画物の染色を検出する工程、組成物の各々の濃度での第１の分画物における第２の色素に対する第１の色素による染色を示す比率Ｒ１を測定する工程、組成物の各々の濃度での第２の分画物における第２の色素に対する第１の色素による染色を示す比率Ｒ２を測定する工程、および、比率Ｒ１／Ｒ２を組成物の各々の濃度について計算する工程を含む方法を提供し、この場合、組成物の最適な作業用濃度は、Ｒ１／Ｒ２が最大である濃度である。１つの実施形態において、悪性細胞が第１の色素により実質的に染まり、非悪性細胞が第２の色素により実質的に染まる。
【０２５２】
加えて、別の実施形態において、本発明は、対象における少なくとも１つの悪性細胞の存在を検出するためのインビボ画像化方法を提供し、この場合、この方法は、対象に、悪性細胞と、非悪性細胞とを、悪性細胞および非悪性細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物を含む組成物を投与する工程、対象に少なくとも第１の色素および第２の色素を投与する工程、および、対象における第１の色素および第２の色素の存在を検出し、それにより、対象における少なくとも１つの悪性細胞の存在を検出する工程を含む。１つの実施形態において、悪性細胞が第１の色素により実質的に染まり、この場合、対象における第１の色素の存在を検出することにより、対象が悪性細胞を有することが示される。
【０２５３】
悪性疾患：
本明細書中で使用される用語「ガン」は、悪性腫瘍、悪性または新生物の各用語と交換可能に使用され、制御されない様式で増殖する傾向があり、また、場合により、転移する傾向がある細胞の正常でない成長によって特徴づけられる細胞の疾患を示す。
【０２５４】
本明細書中で使用される「ガン細胞」または「悪性（の）細胞」は、正常な細胞分裂制御から解放されている細胞であり、従って、正常でない成長、および、制御されない様式で増殖し、また、場合により、転移する傾向によって特徴づけられる。１つの実施形態において、用語「悪性（の）細胞」は、悪性の表現型を有する細胞を示す。悪性細胞の定義には、新生物細胞、前悪性細胞、転移細胞、悪性細胞、腫瘍細胞、発ガン性細胞、ガンの遺伝子型を有する細胞、悪性の表現型を有する細胞、悪性の遺伝子型を有する細胞、ガン遺伝子によりトランスフェクションされた細胞、ウイルスにより形質転換された細胞、ガン遺伝子についてのマーカーを発現する細胞、ガンについてのマーカーを発現する細胞、または、これらの組合せが含まれる。この定義には、これらの細胞のいずれかに由来する細胞株が含まれる。本発明における使用のために好適である悪性の細胞／細胞株の限定されない例には、ヒト結腸直腸腺ガン（ＨＴ２９）細胞株、ヒト乳ガン（ＭＣＦ−７）細胞株、ヒト白血病Ｋ５６２細胞株、ヒト白血病ＨＬ−６０細胞株、Ｒａｓ  Ｖ１２により形質転換されたＲａｔ１（Ｒａｔ１  Ｒａｓ）細胞株、組織球性リンパ腫（Ｕ９３７）細胞株、または、これらの組合せがある。
【０２５５】
本明細書中で使用される「非悪性（の）細胞」は、正常な細胞、正常な細胞株、非悪性細胞の表現型を発現するように誘導されている悪性細胞、不死化された細胞株、初代細胞培養物、または、これらの任意の組合せを示す。この定義には、これらの細胞のいずれかに由来する細胞株が含まれる。１つの実施形態において、用語「非悪性（の）細胞」は、悪性の表現型を有する細胞を示す。本発明における使用のために好適である非悪性の細胞／細胞株の限定されない例には、ヒト初代結腸細胞（ＣＣＤ−３３Ｃ０）、ラット線維芽細胞、酪酸ナトリウムにより処理されたＭＣＦ−７細胞株、酪酸ナトリウムにより処理されたＨＴ２９細胞株、ＰＤ９８０５８により処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞株、酪酸ナトリウムおよび／もしくはグリーベックにより処理されたＫ５６２細胞株、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）により処理されたＵ９３７細胞株、または、これらの組合せがある。
【０２５６】
本明細書中で使用される「正常（な）細胞」は、悪性の表現型を有しない細胞、および／または、代謝性疾患を有しない細胞を示す。
【０２５７】
本発明の実施形態によれば、悪性細胞またはガン細胞は下記の通りである：腺ガン細胞、副腎腫瘍細胞、エナメル上皮腫細胞、未分化細胞、甲状腺の未分化ガン細胞、血管線維腫細胞、血管腫細胞、血管肉腫細胞、アプドーマ細胞、銀親和性細胞腫細胞、男性胚細胞腫細胞、腹水腫瘍細胞、腹水腫瘍細胞、星状膠芽細胞腫細胞、星状膠細胞腫細胞、毛細血管拡張性運動失調細胞、心房粘液腫細胞、基底細胞ガン細胞、良性腫瘍細胞、骨ガン細胞、骨腫瘍細胞、脳幹神経膠腫細胞、脳腫瘍細胞、乳ガン細胞、バーキットリンパ腫細胞、ガン性細胞、類ガン腫細胞、ガン腫細胞、小脳神経星状膠細胞腫細胞、子宮頸ガン細胞、サクランボ色血管腫細胞、胆管ガン細胞、胆管腫細胞、軟骨芽細胞腫細胞、軟骨腫細胞、軟骨肉腫細胞、コリオブラストーマ細胞、絨毛ガン細胞、結腸ガン細胞、共通急性リンパ芽球性白血病細胞、頭蓋咽頭腫細胞、嚢胞ガン細胞、嚢胞線維腫細胞、嚢腫細胞、細胞腫細胞、非浸潤性乳管ガン細胞、管内乳頭腫細胞、未分化胚細胞腫細胞、脳腫瘤細胞、子宮内膜ガン細胞、内皮腫細胞、脳室上衣細胞腫細胞、上皮腫細胞、赤白血病細胞、ユーイング肉腫細胞、節外性リンパ腫細胞、ネコ肉腫細胞、線維腺腫細胞、線維肉腫細胞、甲状腺の濾胞ガン細胞、神経節膠腫細胞、ガストリノーマ細胞、多形性神経膠芽細胞腫細胞、神経膠腫細胞、性腺芽腫細胞、血管芽細胞腫細胞、血管内皮芽細胞腫細胞、血管内皮腫細胞、血管周皮細胞腫細胞、血管リンパ管腫細胞、血管細胞芽細胞腫細胞、血管細胞腫細胞、毛様細胞性白血病細胞、過誤腫細胞、ヘパトカルシノーマ細胞、肝細胞ガン細胞、ヘパトーマ細胞、組織腫細胞、ホジキン病細胞、副腎腫細胞、浸潤性ガン細胞、浸潤性腺管細胞ガン細胞、インスリノーマ細胞、若年性血管線維腫細胞、カポジ肉腫細胞、腎臓腫瘍細胞、大細胞型リンパ腫細胞、白血病細胞、慢性白血病細胞、急性白血病細胞、脂肪腫細胞、肝臓ガン細胞、肝臓転移細胞、リュッケガン細胞、リンパ節腫細胞、リンパ管腫細胞、リンパ性白血病細胞、リンパ球性リンパ腫細胞、リンパ細胞腫細胞、リンパ水腫細胞、リンパ腫細胞、肺ガン細胞、悪性中皮腫細胞、悪性奇形腫細胞、肥満細胞腫細胞、髄芽細胞腫細胞、メラノーマ細胞、髄膜腫細胞、中皮腫細胞、転移性細胞、転移細胞、転移拡散細胞、モートン神経腫細胞、多発性骨髄腫細胞、骨髄芽球腫細胞、骨髄性白血病細胞、骨髄脂肪腫細胞、骨髄腫細胞、筋芽細胞腫細胞、粘液腫細胞、鼻咽頭ガン細胞、新生物細胞、腎芽細胞腫細胞、神経芽細胞腫細胞、神経線維腫細胞、神経線維腫症細胞、神経膠腫細胞、神経腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、希突起神経膠腫細胞、視神経膠腫細胞、骨軟骨腫細胞、骨原性肉腫細胞、骨肉腫細胞、卵巣ガン細胞、乳頭パジェット病細胞、パンコースト腫瘍細胞、膵臓ガン細胞、クロム親和性細胞腫細胞、クロム親和性細胞腫細胞、プラスマ細胞腫細胞、原発性脳腫瘍細胞、胎児転位腫細胞、プロラクチノーマ細胞、腎細胞ガン細胞、網膜芽細胞腫細胞、横紋筋肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、固形腫瘍細胞、肉腫細胞、二次腫瘍細胞、セミノーマ細胞、皮膚ガン細胞、小細胞ガン細胞、扁平上皮ガン細胞、イチゴ状血管腫細胞、Ｔ細胞リンパ腫細胞、奇形腫細胞、精巣ガン細胞、胸腺腫細胞、栄養膜腫瘍細胞、腫瘍形成性細胞、腫瘍阻害細胞、腫瘍進行細胞、前庭神経鞘腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、または、これらの組合せ。
【０２５８】
ニューロン細胞または幹細胞の分化
さらには、本発明の別の実施形態によれば、ニューロン細胞または幹細胞の分化を誘導する作用因を特定するための細胞組織学的染色方法が提供され、この場合、この方法は、２つ以上の未分化のニューロン細胞または幹細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、未分化のニューロン細胞または幹細胞と、分化したニューロン細胞または幹細胞とを、未分化のニューロン細胞または幹細胞および分化したニューロン細胞または幹細胞の示差的な染色を生じさせることによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を少なくとも第１の色素および第２の色素と接触させる工程、第１の色素および第２の色素による第１の分画物の染色を検出する工程、第１の色素および第２の色素による第２の分画物の染色を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の染色を比較し、それにより、ニューロン細胞または幹細胞の分化を誘導する作用因を特定する工程を含む。別の実施形態において、この方法は、ニューロン細胞または幹細胞の分化を誘導する作用因の組合せを特定するために適合化される。
【０２５９】
さらには、別の実施形態において、本発明は、ニューロン細胞または幹細胞の分化を誘導する作用因を特定するための方法が提供され、この場合、この方法は、２つ以上の未分化のニューロン細胞または幹細胞を含むサンプルを得る工程、少なくとも第１の分画物および第２の分画物をサンプルから小分けする工程、第２の分画物を作用因と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物を、未分化のニューロン細胞または幹細胞と、分化したニューロン細胞または幹細胞とを、未分化のニューロン細胞または幹細胞および分化したニューロン細胞または幹細胞における示差的な蛍光を有することによって区別することができる化合物と接触させる工程、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を検出する工程、および、第１の分画物および第２の分画物の蛍光を比較し、それにより、ニューロン細胞または幹細胞の分化を誘導する作用因を特定する工程を含む。別の実施形態において、この方法は、ニューロン細胞または幹細胞の分化を誘導する作用因の組合せを特定するために適合化される。
【０２６０】
本明細書中で使用される用語、「未分化の」ニューロン細胞または幹細胞および「分化した」ニューロン細胞または幹細胞は、単に、完全に分化し、すなわち、分化のプロセスを完了しているニューロン細胞または幹細胞に対して、完全に分化していないニューロン細胞または幹細胞を示すわけではない。むしろ、これらの用語にはまた、発達および分化における種々の段階にあるニューロン細胞または幹細胞が含まれる。例えば、本発明の化合物は、分化の異なる段階にある２つのニューロン細胞または幹細胞における示差的な染色を生じさせることができる。別の実施形態において、本発明の化合物は、分化の異なる段階にある２つのニューロン細胞または幹細胞における示差的な蛍光を有することができる。
【０２６１】
分化の誘導と、疾患表現型の正常化との間における可能性のある相関関係が、文献では認められる（Ｌｉｎｄｓｅｌｌ  Ｐ．、２００１）。そのうえ、分化を誘発する作用因を組織保護剤として使用する可能性についての科学的基礎が、ニューロン細胞または幹細胞の損傷の場合における神経保護剤によって明らかにされ得るし、また、十分に認められる（Ｃｈｅｕｎｇ他、２０００）。霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）抽出物（漢方）がＰＣ１２細胞のニューロン細胞分化または幹細胞分化を誘導した。ＰＣ１２細胞のニューロン細胞分化または幹細胞分化および神経保護を媒介する神経活性化合物の存在が報告された（Ｃｈｅｕｎｇ他、２０００）。神経成長因子（ＮＧＦ）は、ＰＣ１２細胞において形態学的および神経化学的な分化因子として作用することが示されており、これはまた、ＰＣ１２細胞を血清枯渇および虚血の毒性から保護する（Ｂｏｎｉｅｃｅ他、１９９５）。ＮＧＦの神経保護効果は、分化および神経突起形成を促進させるために、ＮＧＦによって使用される同じシグナル伝達段階のいくつかを必要とする（Ｂｏｎｉｅｃｅ他、１９９５）。さらには、ＰＣ１２細胞をレチノイン酸（これはＰＣ１２細胞の分化を促進させ、ＰＣ１２細胞の成長を阻害する）にさらすことにより、虚血期間中の細胞の生存もまた改善されることが見出された。加えて、ＮＧＦおよびレチノイン酸の組合せは、いずれかの作用因が単独である場合よりも効果的あった。これら２つの作用因が、独立した経路によって保護をもたらすと考えられ（Ｂｏｎｉｅｃｅ他、１９９５）、しかし、これらのシグナルは分化と結びついている。
【０２６２】
本明細書中において意図されるように、本発明は、分化を誘導する作用因を検出するための有用なスクリーニング系を提供する。ＮＧＦの検出（示されず）、レチノイン酸の検出（図３６Ａ〜図３６Ｂ）および酪酸ナトリウムの検出（図２２Ａ〜図２２Ｄおよび図２３Ａ〜図２３Ｃ）を示す本明細書中下記に記載される結果に基づいて、本発明はさらに、ニューロン細胞または幹細胞の損傷に対する神経保護の方法を提供し、この場合、この方法は、ニューロン細胞または幹細胞を、ニューロン細胞または幹細胞の分化を誘導する作用因と接触させる工程を含み、ただし、作用因は、本明細書中上記で記載される方法のいずれかに従って特定される。
【０２６３】
代謝性疾患
【０２６４】
本明細書中で定義されるように、用語「代謝が損なわれた細胞」は、正常でない代謝活性の結果として、異常な、欠損した、または、正常でない代謝欠陥を有する細胞を示す。本明細書中で定義されるように、用語「代謝が正常な細胞」は、正常な代謝機能および／または代謝活性を有する細胞を示す。
【０２６５】
本明細書中において意図されるように、本発明の範囲内である代謝性疾患の限定されない列挙には、炭水化物代謝性疾患、ステロイド代謝の障害、結合組織、筋肉、骨、アミノ酸代謝の障害、プリン／ピリミジン代謝の障害、血液障害、脂質代謝の障害、金属代謝の障害、輸送障害、リソソーム酵素の障害、および、ヘム／ポルフィリン代謝性疾患が含まれる。
【０２６６】
１つの実施形態において、代謝性疾患は、炭水化物代謝性疾患、ステロイド代謝の障害、結合組織障害、筋肉障害、アミノ酸代謝の障害、プリン／ピリミジン代謝の障害、血液障害、脂質代謝の障害、金属代謝の障害、輸送障害、リソソーム酵素の障害、および、ヘム／ポルフィリン代謝性疾患からなる群から選択される。
【０２６７】
別の実施形態において、代謝性疾患は、糖尿病、フルクトース不耐性、グリコーゲン貯蔵疾患、副腎過形成、筋ジストロフィー、エーラーズ・ダンロス症候群、低ホスファターゼ血症、フェニルケトン尿症、白皮症、甲状腺腫、痛風、レッシュ・ナイハン症候群、色素性乾皮症、血友病、β−サラセミア、鎌状赤血球貧血、高コレステロール血症、ウィルソン病（銅排出）、嚢胞性線維症、くる病、ゴーシェ病、テイ・サックス病、ポルフィリン症およびニーマン・ピック病からなる群から選択される。
【０２６８】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０２６９】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０２７０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｍｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９４年、第３版；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃ���ｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２７１】
実施例１
非子宮頸部生検物の悪性細胞および非悪性細胞の示差的染色
材料および実験手法
材料および実験手法の下記の節は、本明細書中下記において詳述される実施例１〜実施例５に関連する。
【０２７２】
染色手順
下記の表１ｂは本発明による一般的な染色についての段階毎の手順を提供する。風乾が、好ましくは、本発明の教示に従って行われ、これにより、プロトコルの示差的な効果が改善されることには留意されたい。マルチウエルプレートを乾燥後に染色することができる：染色後、少なくとも３時間、最適には２４時間。
2009528835.tif 000013
【０２７３】
試薬：
ヘキストＮ３３３４２、Ｓｉｇｍａ、ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ；ダリアミクローム１０５、カラーインデックス（ＣＩ）：４２５３５、Ｅｄｗａｒｄ  Ｇｕｒｒ  ＬＴＤ；ニューフクシン、ＳＩＧＭＡ、ロット：３７Ｈ３４６３、ＣＩ：４２５２０；酢酸パラローザニリン、Ａｌｌｉｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＩ：４２５００；塩酸ローザニリン、ＢＤＨ、Ｐｒｏｄ．３００２４、ＣＩ：４２５１０；メチルバイオレット、Ｆｌｕｋａ、６９７１０、ＣＩ：４２５３５Ｌ；ライトグリーン，ＳＦイエローイッシュ、ロット：０５５Ｈ４４０５、ＣＩ：４２０９５；ファストグリーンＦＣＦ、ＢＤＨ、ＣＩ：４２０５３；エオシンイエローシェイド、ＢＤＨ製品番号３４０２７、ＣＩ：４５３８０；ビスマルクブラウンＲ、ＳＩＧＭＡ、ロット：１１１Ｈ３４７０、ＣＩ：２１０１０；トルイジンブルー、Ｆｌｕｋａ、ＣＩ：５２０４０；メチルグリーン、ＭＥＲＣＫ、ＣＩ：４２５９０；ピクリン酸、ピロニンＹ、Ｆｌｕｋａ、ＣＩ：４５００５；メイ・グリュンワルド染色液、ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ．番号Ｍ６９０１；ハリス・ヘマトキシリン、Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；ヘマトキシリン溶液Ｇｉｌｌ  Ｎｏ．３、Ｓｉｇｍａ  ＧＨＳ−３−３２；ニューフクシン、ＣＩ：４２５２０、Ｓｉｇｍａ  Ｎ−０６３８；フロキシン、Ｃ．Ｉ．：７７８、Ｈａｒｔｍａｎ  Ｌｅｄｄｏｎ  Ｃｏ．；アズールＡ、Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｔ．番号４４２；メチルバイオレット；塩基性フクシン；ＰＢＳ錠剤、ＳＩＧＭＡ、Ｐ４４１７；トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、メタノール、氷酢酸（ＧＡＡ）；ホルムアルデヒド；エーテル；カルボキシメチルセルロース樹脂、ＣＭ５２、Ｗｈａｔｍａｎ。
【０２７４】
組織調節剤化合物を含有する分画物のためのスクリーニングアッセイ：
このスクリーニングアッセイは、精製された分画物を活性についてスクリーニングすることを目的として開発された。このアッセイは、分画物が、粗抽出物または確認された抽出物（ＧＳと標識される）の活性を刺激することができるかどうかを評価するために設計される。分画物は、分画物が悪性細胞の最初の（緑色または赤色の）染色を著しく阻害することができるならば、あるいは、組織調節活性が組織学的染色において確認されたならば、活性であると見なされる。
【０２７５】
植物抽出物：
処理のための最適な葉は１５グラム〜２５グラムであり、それらの長さは、葉の基部から端まで測定されたとき、好ましくは１８センチメートル〜３０センチメートルである。これらの仕様に達しなかった葉は、赤色顔料を有する傾向があり、阻害の観点から活性が大きすぎる傾向があり、一方、これらの基準を超える葉は、非常に強い緑色顔料によって特徴づけられ、ほとんど活性を示さない傾向がある。
【０２７６】
６００グラムの葉を１ｃｍ〜２ｃｍの小片に切断した。切断された葉を１．５リットルの７０％エタノール（ＥｔＯＨ）と混合し、密閉容器において１０日間保った（室温）。その後、液体を固体から分離し、さらなる使用のために室温で保った。最適な精製収率のために、この液体は、室温で少なくとも１０日間、１ヶ月まで、容器において寝かすことができた。
【０２７７】
本発明の染色手法における使用のための植物（フィクス・エラスチカ）抽出物の代替調製：
投入材料：
葉材料を葉の長さおよび重量に関して上記で記載されるように選択した。
【０２７８】
最適な抽出物の代替調製：
葉を１ｃｍ〜２ｃｍの小片に切断した。切断片をオーブンにおいて６５℃で２４時間（ｈｒ）乾燥した。開始時に、水分含有量が８０％であったが、終了時には、水分含有量は４％となっているべきである。
【０２７９】
材料を粉末（７００ミクロン〜１０００ミクロン）に混合した。この粉末を還流系での抽出（１回の抽出あたり１時間（ｈｒ）、溶媒：７０％エタノール、４０℃）において使用した。３回の連続した抽出を行った。毎回、粉末を再抽出した。各々の抽出における７０％エタノールの量：最初−１：５；２回目−１：４；３回目−１：３。３つの得られた抽出物を混合し、真空フィルター（ろ紙Ｎｏ．４０）でろ過した。混合され、ろ過された抽出物を、一定の重量が得られるまで、真空下、６０℃においてロータリーエバポレーターでエバポレーションした。
【０２８０】
得られた粉末（最終的湿度は３％であった）をさらに粉砕機において混合した。粉末抽出物を染色試薬としての使用のために再構成した。粉末を１．３％（ｗ／ｖ）のＴＤＳで７０％エタノールに溶解した（ｐＨ７．４）。粉末化抽出物の貯蔵寿命：１％の湿度、透明ガラスにおいて室温で６ヶ月後−活性は最初のレベルと同等であった。
【０２８１】
染色溶液および固定液：
固定液Ｎｏ．１（Ｆｉｘ−１）：固定液Ｎｏ．１は、０．３％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、２０％のエタノール、２．５％のメタノール、２．５％の氷酢酸（ＧＡＡ）、２．５％のホルムアルデヒド、４３％のエーテルおよび２９．２％の再蒸留水を含有した。エーテルを使用直前に加えた。
【０２８２】
固定液Ｎｏ．２（Ｆｉｘ−２）：固定液Ｎｏ．２は、１．２％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、２０％のエタノール、１．２％のメタノール、２．５％の氷酢酸（ＧＡＡ）、０．５％のホルムアルデヒド、４０％のエーテルおよび３４．６％の再蒸留水を含有した。エーテルを使用直前に加えた。
【０２８３】
固定液Ｎｏ．２Ｂ（Ｆｉｘ−２Ｂ）：固定液Ｎｏ．２Ｂは、６．６％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、６．６％の氷酢酸（ＧＡＡ）、３．３％のメタノール、３．３％のホルマリン、８０．２％のエーテルを含有した。
【０２８４】
固定液Ｎｏ．３（Ｆｉｘ−３）：固定液Ｎｏ．３は、０．４％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、１．２％のメタノール、２．５％のＧＡＡ、２．５％のホルムアルデヒド、９３．４％の再蒸留水を含有した。
【０２８５】
固定液Ｎｏ．４（Ｆｉｘ−４）：固定液Ｎｏ．４は、１．２％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、７％のメタノール、９％のＧＡＡ、７％のホルムアルデヒド、７６．４％の再蒸留水を含有した。
【０２８６】
固定液Ｎｏ．１０２−Ｂ（Ｆｉｘ−１０２−Ｂ）：固定液Ｎｏ．１０２−Ｂは、６．６％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、７．５％の氷酢酸（ＧＡＡ）、５．８％のメタノール、５．８％のホルマリン、蒸留水を含有した。
【０２８７】
さらなる植物抽出物：
アロエ・アルボレセンス・ミラー（Ａｌｏｅ  ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｍｉｌｌｅｒ）抽出物（Ｅｘｔ−１）：６００グラムの切断された葉を１リットルの９６％エタノールと混合し、密閉容器において１０日間保った（室温）。その後、液体を固体から分離し、さらなる使用のために室温で保った。
【０２８８】
フィクス・エラスチカ抽出物（Ｅｘｔ−２）：上記で記載されるが、簡単に記載すると、６００グラムの切断された葉を１．５リットルの７０％エタノールと混合し、密閉容器において１０日間保った（室温）。その後、液体を固体から分離し、さらなる使用のために室温で保った。
【０２８９】
ランタナ・カマラ（Ｌａｎｔａｎａ  Ｃａｍａｒａ）抽出物（Ｅｘｔ−３）：３００グラムの切断された葉を１リットルの７０％エタノールと混合し、密閉容器において１０日間保った（室温）。その後、液体を固体から分離し、さらなる使用のために室温で保った。
【０２９０】
色素：
フロキシン（Ｄｙｅ−Ａ）：アニリン色素のフロキシンを、パラフィン包埋組織を染色するために使用した。色素を、１．５グラムのフロキシンを２００ｍｌの再蒸留水および５０ｍｌのエタノールと混合することによって調製した。
【０２９１】
ＢＢｒ（Ｄｙｅ−Ｂ）：ＢＢｒ色素を、２グラムのビスマルクブラウンＲを５０ｍｌのエタノールおよび２００ｍｌの再蒸留水に溶解することによって調製した。
【０２９２】
エオシン（Ｄｙｅ−Ｃ）：イエローを、０．２６グラムのエオシンイエローシェイドを１５ｍｌの１００％エタノールおよび３５ｍｌの再蒸留水に溶解することによって調製した。
【０２９３】
ハリス・ヘマトキシリン色素（Ｄｙｅ−１）：市販のハリス・ヘマトキシリン色素、これは直ちに使用可能である。
【０２９４】
ライトグリーン（Ｄｙｅ−２）：アニリン色素のライトグリーンが染色手法において全般的な染色液として役立った。このアニリン色素を、４グラムのライトグリーンを５０ｍｌの７０％エタノールおよび５０ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
【０２９５】
ヘマトキシリンギル（Ｄｙｅ−３）：ヘマトキシリンギルＮｏ．３の直ちに使用可能な溶液。
【０２９６】
ビスマルクブラウンフロキシンコンジュゲート（Ｄｙｅ−４）：Ｄｙｅ−ＡおよびＤｙｅ−Ｂを混合し、２０分間煮沸し、室温に冷却した。色素をろ紙でろ過し、２５０ｍｌの無水エタノールを加えた。
【０２９７】
ライトグリーン５０％（Ｄｙｅ−５）：アニリン色素のライトグリーン５０％をプロトコルのいくつかでは全般的な染色液として使用した。このアニリン色素を、４グラムのライトグリーンを５０ｍｌのエタノールおよび５０ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
【０２９８】
ニューフクシン（Ｄｙｅ−６）：０．４％溶液を３３％エタノールにおいて調製した。
【０２９９】
アズール（Ｄｙｅ−７）：アニリン色素のアズールＡを、パラフィン包埋組織を染色するために使用した。このアニリン色素を、０．２５グラムのアズールＡを５０ｍｌの１００％エタノールおよび５０ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
【０３００】
リン酸塩緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を、市販のＰＢＳ錠剤を使用して調製した。２００ｍｌの再蒸留水について１錠を使用して、作業用溶液を達成した。
【０３０１】
ダリア色素（Ｄｙｅ−８）：ダリア色素が非子宮頸部塗沫標本のための染色剤として役立った。ダリア色素を、０．５グラムのダリアを２０ｍｌの７０％エタノールおよび８０ｍｌの再蒸留水において混合することによって調製した。
【０３０２】
ダリア９９ａ（Ｄｙｅ−２３）：ダリア９９Ａは、非子宮頸部塗沫標本のための改訂手法において使用されるアニリン色素であった。ダリア９９Ａを、１．５グラムの塩基性フクシン、１グラムのメチルバイオレット、０．５グラムのニューフクシンを１００ｍｌのエタノールおよび２０  ４００ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
【０３０３】
ライトグリーン２０％（Ｄｙｅ−２４）：アニリン色素のライトグリーン２０％を凍結切片のためのプロトコルにおいて全般的な染色液として使用した。このアニリン色素を、４グラムのライトグリーンを２０ｍｌのエタノールおよび８０ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
【０３０４】
ビスマルクブラウンエオシン：ビスマルクブラウンエオシンを、５ｇのビスマルクブラウン−Ｒを２００ｍｌの蒸留水および２５  ７５ｍｌの１００％エタノールに溶解することによって調製し、５分間傍らに置いた。次いで、２．５ｇのエオシンイエローシェイドを１５０ｍｌの蒸留水および５０ｍｌの１００％エタノールに溶解し、１０分間傍らに置いた。両者を混合し、５分間煮沸し、室温に冷却し、ろ紙でろ過した。ろ紙を乾燥させ、３００ｍｌの無水エタノールで洗浄した。
【０３０５】
メイ・グリュンワルド染色液：メタノールにおける０．２５％メイ・グリュンワルド色素をソレンソン（Ｓｏｒｅｎｓｏｎ）緩衝液（ｐＨ６．８）に希釈した。
【０３０６】
ギムザ染色液：ソレンソン緩衝液（ｐＨ６．８）で希釈されたギムザ染色液の１０％。
【０３０７】
ヘマトキシリン／エオシン染色プロトコル：
スライドガラス上の、厚さ４ミクロンのパラフィン包埋組織を２つのキシレン浴において脱パラフィン処理し（各３分間）、２つの連続するエタノール浴において洗浄し（各３分間）、その後、２つの連続する９５％エタノール浴（各３分間）および蒸留水浴（３分間）において洗浄した。脱パラフィン処理の後、スライドガラスをヘマトキシリン染色液（Ｄｙｅ−１）に１分間浸け、水が透明になるまで（容器において流しながら）水道水で洗浄した。その後、スライドガラスをエオシン染色液（Ｄｙｅ−Ｃ）に１分間〜２分間沈め、上記のように水道水で洗浄した。その後、スライドガラスを、増大するアルコールの溶液（５０％、７０％、８０％、９５％×２、１００％×２）において脱水し、キシレンにより洗浄した（３回〜４回）。脱水後のスライドガラスをＰｅｒｍｏｕｎｔまたは他の好適な有機封入媒体により封入した。
【０３０８】
メイ・グリュンワルド・ギムザ染色プロトコル：
スライドガラスをメタノールにおいて１５分間固定処理し、その後、メイ・グリュンワルド染色液において５分間染色した。スライドガラスを水によりすすぎ、ギムザ染色液において１０分間染色した。染色後、スライドガラスをソレンソン緩衝液（ｐＨ６．８）ですすぎ、５０／５０（ｖ／ｖ）の緩衝液／アセトンで再びすすいだ。すすぎ後、スライドガラスを２回のアセトン洗浄において脱水し、キシレンで洗浄した。最後に、スライドガラスをＰｅｒｍｏｕｎｔまたは他の好適な有機封入媒体により封入した。
【０３０９】
パパニコロウ染色プロトコル：
塗沫標本を乾燥し、下記の染色工程および洗浄工程を採用した：スライドガラスを７０％エタノールにより２分間洗浄し、その後、水道水により２回、各１分間洗浄した。スライドガラスをギルのヘマトキシリンにより４分間染色し、スコット水により２分間、７０％エタノールにより１分間、次いで、９５％エタノールにより１分間すすいだ。その後、スライドガラスを、オレンジＧを使用して２分間染色し、９５％エタノールにより２回、各１分間洗浄した。その後、スライドガラスをエオシンＡ（エオシンアズール）により１０分間染色した。エオシンＡ（エオシンアズール）は対比染色液であり、３つの色素（エオシンＹ、ライトグリーンＳＦイエローイッシュおよびビスマルクブラウンＹ）から構成される。その後、スライドガラスを９５％エタノールにより２回、各１分間洗浄し、キシレンにより２回、各５分間処理した。スライドガラスを封入し、乾燥したら、スライドガラスを顕微鏡下でスクリーニングした。
【０３１０】
細胞株：
細胞株の培養：本明細書中で使用される細胞株が下記の表４に列挙される。細胞株は、１％グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｇ）および１０％熱不活化（５７℃、３０分）ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｂｉｏ−Ｌａｂ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（１リットルあたり４．５ｇのグルコース、ＤＭＥＭ）において培養された。細胞を（毎週）連続して継代し、直径が１０ｃｍのＭｉｎｉｐｌａｔｅ組織培養プレート（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ、イスラエル）で培養した。培養物は、５％ＣＯ２を含有する空気混合物とともに加湿インキュベーターにおいて３７℃で維持された。
【０３１１】
細胞株塗沫標本：すべてのタイプの細胞懸濁物を遠心分離し、ペレットを少量の新鮮なＤＭＥＭ−ＦＣＳ培地に再懸濁した。懸濁物の小さい数滴をガラス製スライドガラスに置き、塗沫標本化し、風乾し、本明細書中下記においてさらに詳述されるような染色実験において使用した。
【０３１２】
初代細胞懸濁物：骨髄細胞をマウスの大腿骨および脛骨の洗浄によって得て、ガラス製スライドガラスに置き、塗沫標本化し、風乾し、本明細書中下記においてさらに詳述されるような染色実験において使用した。
【０３１３】
実験結果
本明細書中に示される染色手法は、細胞学研究室から日常的に受け取り、また、細胞学研究室によって分類される臨床でのガン陽性およびガン陰性の細胞学的塗沫標本を使用して開発された。悪性細胞の存在が、標準的な細胞学的検査によって、また、ほとんどの場合には組織病理学的診断によって確認された。
【０３１４】
約３０００の腹腔吸引物、胸腔吸引物および心嚢吸引物が染色手順の開発努力のために使用された。この染色手法は、日常的なメイ・グリュンワルド・ギムザ染色のために適用可能なタイプの風乾された細胞学的塗沫標本に対して適用可能であった。
【０３１５】
最初の工程は、最も良いその後の染色結果のために最適化された複雑な固定剤試薬（Ｆｉｘ−１およびＦｉｘ−２）の使用を伴う特に設計された固定処理手順であった。これらの複雑な固定処理試薬は、ほとんどの場合において、染色手順の有効性のためには不可欠であった。効果的な染色を可能にすることに加えて、本明細書中に記載される固定処理手順はまた、従来の固定処理手順と比較して、優れた形態学的保存（具体的には、核の特徴および細部の形態学的保存）をもたらした。２番目の工程は、核の細部をより良好に対比するために導入されたハリス・ヘマトキシリンにより対比染色することを含んだ。３番目の工程は、その後の工程で適用される色素について細胞の結合能力を変化させると考えられる植物抽出物（アロエ・アルボレセンス・ミラー、フィクス・エラスチカおよびランタナ・カマラ）による処理を含んだ。４番目の工程は、生物学的色素を使用する逐次的染色、すなわち、最初に、酸性色素（例えば、ライトグリーン）への短い暴露、次いで、塩基性色素（例えば、ニューフクシンまたはダリア）へのより長い暴露を含む。
【０３１６】
上記の染色手法に供される塗沫標本において、正常な細胞（すなわち、中皮細胞および上皮細胞、マクロファージ、顆粒球および様々なリンパ球）の細胞質は緑色色調に変わったか、または、染色されないままであった。際立って対照的に、ガン細胞の細胞質は色が赤色になった（図１Ａ〜図１Ｂおよび図２Ａ〜図２Ｂ）。細胞の核は、ダリア染色液によって強化されたハリス・ヘマトキシリンの結果として青紫色となった（図３）。腫瘍細胞の一部において、細胞質の赤色色調が、核の明確な赤色色調と一緒に出現した（図１Ａ〜図１Ｂおよび図２Ｂ）。顆粒球が、赤色に染まった核を伴って時々出現することがあるが、そのような核はガン細胞の赤色の細胞質から明瞭に区別可能である（図１Ａ〜図１Ｂ）。
【０３１７】
本発明において記載される染色プロトコルは、日常的なメイ・グリュンワルド・ギムザ染色のために適用可能なタイプの風乾された細胞学的塗沫標本に対して適用可能である。
【０３１８】
染色手法についての二重盲検試験において、１２８個のサンプルが、イスラエル国内の病院の細胞学研究室に勤める十分に訓練された３名の病理学者によって試験された。２つのスライドガラスが各々の試料から調製された。一方がメイ・グリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）により従来法で染色され、これに対して、もう一方が、本発明による染色手順を使用して、かつ、本明細書中上記において記載されるように染色された。ＭＧＧ染色されたスライドガラスの各々が２名の病理学者のうちの一方によって評価され、本発明の方法に従って染色されたスライドガラスが第３の病理学者によって評価された。
【０３１９】
結果が本明細書中下記の表２にまとめられており、その結果は驚くべきものであった。試験された４０個の胸水サンプルのうち、３個が、用いられた両方の染色方法によって陽性であることが見出され、１個が悪性細胞を含むことが疑われた。１０個の腹水サンプルのうち、ＭＧＧ染色方法によって、３個が陽性であることが見出され、２個が悪性細胞を含むことが疑われ、これに対して、本発明による染色手法を使用した場合、５個すべてがそのような細胞を含むことが見出された。７５個の気管支肺胞洗浄サンプルおよびブラッシングサンプルのうち、ＭＧＧ染色方法によって、４個が陽性であることが見出され、３個が悪性細胞を含むことが疑われ、これに対して、本発明による染色手法を使用した場合、７個すべてがそのような細胞を含むことが見出された。３個の心嚢液サンプルのうち、ＭＧＧ染色方法によって、１個が悪性細胞を含むことが疑われることが見出され、これに対して、本発明による染色手法を使用した場合、この同じサンプルはそのような細胞を含むことが見出された。
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【０３２０】
これらの結果は、本発明による染色手法が、困難な事例における悪性腫瘍の診断では特に、ＭＧＧ染色手法よりも良好な性能をもたらしたことを明瞭に示した。しかしながら、さらなる努力が、本発明による染色手法の色の差異化、コントラストおよび特異性を高めることに関して性能を改善することに向けられた。
【０３２１】
従って、別の試みにおいて、本発明の染色手法が臨床的予備研究で再確認された。結果が本明細書中下記の表３にまとめられる。この研究は、この手法の操作者のために使用可能にされる唯一のデータが、コード化された基準、および、臨床サンプルのタイプ（例えば、胸膜滲出液、腹膜滲出液など）であったサンプル分割の二重盲検研究として設計された。本発明の染色手法を使用することにより、３例のガン陽性事例、４５例のガン陰性事例および１例の疑わしい事例を特定することがもたらされた。これらの結果は、従来の細胞学的評価によって得られた結果と一致していた。本発明による染色手法は、ほんの数個の散らばったガン細胞がスライドガラス上に存在するときでさえ、強い染色を与えたことを強調しなければならない（図４）。
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【０３２２】
異なる起源の様々な悪性細胞株、良性系統、正常な組織の初代培養物、ならびに、成体組織および胚組織から調製される懸濁物を、その後、本発明の染色手法の差異化の有効性をさらに確認するために使用した（表４）。この取り組みは、臨床での塗沫標本に通常の場合には存在する離れた細胞成分の調査を可能にした。結果が本明細書中下記の表４にまとめられ、図５Ａ〜図５Ｇに示される。
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【０３２３】
試験された悪性細胞のすべてが赤色に染色され、一方、試験されたすべての非悪性細胞株および初代培養物が緑色に染色された。
【０３２４】
本発明の手法の理解を改善するために、プロセスの特定の構成要素が省かれた１組の実験を行った（表５を参照のこと）。この手法を、それらについての結果の細胞病理学的確認が染色前に得られた細胞株および臨床標本の両方を用いて調べた（表６および図５Ａ〜図５Ｇ）。
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【０３２５】
これらの実験からの結果は染色手法の様々な構成要素の役割を示していた。完全な手法は悪性細胞の赤色染色および正常細胞の緑色染色または非染色をもたらした一方で、ダリア工程を省くことにより、著しい違いが、ライトグリーンに対する様々な腫瘍の親和性において存在し得ることが明らかにされ、ヘパトーマでは、低い親和性が明らかにされ（示されず）、一方、星状膠細胞腫（図５Ｂ５〜６）、３ＬＬガン腫（図５Ａ５〜６）およびＣａＣｏ２ガン腫（示されず）では、高い親和性が明らかにされた。他方で、調べられたすべての腫瘍が、ライトグリーン染色工程を省くことによって強調されるように、ダリアに対する強い親和性を呈した（図５Ａ〜図５Ｇ、本明細書中上記に記載される手法２および手法４）。
【０３２６】
多くの正常細胞が緑色に染まる一方で、いくつかの正常細胞は、著しく緑色に染色されることがなかった。このことは、例えば、抽出物およびダリア色素の両方が省かれたときでさえ（示されず）、すべての場合において非常に弱い緑色の染色を示したヘパトーマについては当てはまる。いくつかの白血球が、マクロファージおよび間質細胞と同様に、緑色に染まった。
【０３２７】
ラットの腹膜に存在するマスト細胞の顆粒が、本発明の技術により赤色に染まった（図５Ｆ）。ダリア（すなわち、本明細書中上記の表５に記載される手法番号５および手法番号６）の非存在下では、これらの顆粒が緑色に染まることの証拠が認められない（図５Ｆ）。
【０３２８】
抽出物を本発明の手法から省いたとき、全体的な結果が変化した。ライトグリーンのみより染色したとき、赤血球および破片に対する染色液の非特異的な結合から主に構成されるかなりぼやけて、くすんだ背景が得られた（本明細書中上記の表５に記載される手法番号６、および、図５Ａ６〜図５Ｇ６）。抽出物による処理の後でライトグリーンにより染色したとき、この背景染色は抑制される（本明細書中上記の表５に記載される手法番号５、および、図５Ａ５〜図５Ｇ５）。従って、抽出物はクリーニング効果を有する。
【０３２９】
このクリーニング効果にもかかわらず、ダリア染色が省かれる場合、他の正常な要素が緑色に染まること、または、いくつかの腫瘍集団が緑色に染まることが防止されなかった（すなわち、本明細書中上記の表５に記載される手法番号５において）。
【０３３０】
ダリアのみにより染色するとき（本明細書中上記の表５に記載される手法番号４、および、図５Ａ４〜図５Ｇ４）、ぼやけて、くすんだ背景、および、いくつかの正常な細胞（例えば、肝細胞）が強い赤色に染まることが観測された。植物抽出物による前処理は、背景および非悪性細胞の両方からのこの染色を抑制する（本明細書中上記の表５に記載される手法番号２、および、図５Ａ２〜図５Ｇ２）。
【０３３１】
完全な染色手法は、部分的プロトコルのいずれかを使用することによって得ることができていない結果をもたらした。完全な手法の結果には、正常な細胞と、悪性の細胞と区別する非常に大きい能力が含まれた（図５Ａ１〜図５Ｇ１）。完全な手法での赤色染色の強度はいくらかの変動を異なる腫瘍の間で有しているが、同じ群の中では非常に良好な結果を常にもたらしたことには留意しなければならない。最も強い赤色染色がヘパトーマについて得られ、最も穏やかな赤色染色が神経芽細胞腫について得られた（示されず）。
【０３３２】
臨床標本における本発明による染色手法の有効性を分析するために、８例の代表的な事例を、表７に示されるように選んだ。
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【０３３３】
すべての試験された腫瘍事例において、本発明による染色手法は、スライドガラス上のすべての形態学的に明らかな腫瘍細胞（１個１個の細胞およびクラスター化した細胞）を赤色に標識することをもたらした。Ｚｗｅの場合、多量の反応性中皮がスライドガラス上に存在するが、これらは腫瘍細胞から容易に区別されたことは強調されなければならない。Ｚｉｐの細胞が図８に示される。
【０３３４】
上記の結果は、本発明による染色手法を様々な細胞タイプに対して実行するときに得られる結果に関するいくつかの重要な結論を裏付けるために役立つ。これらの結論が本発明下記の表８にまとめられる。
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【０３３５】
図６Ａ〜図６Ｄ、図９Ｂ〜図９Ｄおよび図１０に示されるように、本発明の染色手法は、体液から調製される細胞学的塗沫標本に限定されるのではなく、接触調製物（図１０）および他のタイプの細胞調製物または組織調製物（例えば、パラフィン包埋組織など）（図６Ａ〜図６Ｄ、図９Ｂ〜図９Ｄ）に対してもまた適用することができる。
【０３３６】
本発明の染色手法の染色効果は、固定剤試薬、染色液、抽出物およびすすぎ洗浄水を含めて、すべての工程の期間中におけるｐＨに対して敏感である。
【０３３７】
固定処理手順は、好ましくは、低いｐＨ環境のもとで行われる。固定液１および固定液２のｐＨは、エーテルを加える前に測定されたとき、各々、１．７および１．４である。植物抽出物のｐＨは、わずかに酸性で、５．５〜６．０の範囲にあることが見出された。本発明の染色手法において、ライトグリーン染色液についての最適なｐＨは３．５〜５．０の範囲内であり、ダリア染色液については３〜４の範囲にある。ライトグリーン工程後のスライドガラスをＰＢＳ（ｐＨ７．４）によりすすぐことにより、最終的な結果が改善されたことが認められた。すすぎのために使用された蒸留水のｐＨは６．０〜６．５の範囲であった。
【０３３８】
本発明の染色手法は、緑色に対する満足すべき対比を有する多くの他の塩基性染料もまた考慮され得るので、ダリアの使用に限定されない。塩基性染料のほとんどの変化は、暴露時間および濃度を最適化することを必要とする。例えば、塩基性フクシンおよびメチルバイオレットの混合物が満足すべき結果をもたらした。２０％エタノールにおける０．６％塩基性フクシンおよび０．３％メチルバイオレットの溶液は、染色手順におけるさらなる変化を伴うことなく、十分に匹敵し得る結果をもたらした。
【０３３９】
Ｇｕｒｒ［Ｇｕｒｒ、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｔａｉｎｓ”、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｈｉｌｌ（Ｂｏｏｋｓ）Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９６０）］によれば、さらなるメチル基（またはエチル基）の付加は塩基性フクシンおよびその成分をすみれ色色素（これには、ダリア、ゲンチアンバイオレット、メチルバイオレット６ｂ、クリスタルバイオレットなどが含まれる）に変換する。結果として、染色手法は、性能におけるわずかな変化を伴うが、塩基性フクシンのすべてのこれらの誘導体を用いて行うことができる。
【０３４０】
同様に、酸性染料のライトグリーンに対する代替物としてのファストグリーンの影響が調べられ、結果は、ライトグリーンが優れているにもかかわらず、類似していた。他の酸性染料もまた考慮され得る。
【０３４１】
本明細書中上記で提供される本発明の染色手法の染色工程の順序（表１ｂ）が、最適な結果をもたらすことが見出された。染色の途中で、非子宮頸部の細胞学的塗沫標本のための染色手順を使用して、塩基性染料および酸性染料による染色の順序を逆にしたならば（例えば、ライトグリーンの前にダリア）、下記の多色影響があまり顕著にならなかった。
【０３４２】
上記で記載された２段階の固定処理プロセスは、１段階の水に基づいた手順によって置き換えることができる。水に基づいた固定液は、１．２グラムのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、４ｍｌの氷酢酸（ＧＡＡ）、３ｍｌのホルマリン、２ｍｌのメタノールの溶液を含み、再蒸留水により１００ｍｌにされた。上記で提案された２段階の手順は、染色結果に関して、この固定液よりも優れていたが、エーテルに基づいたので、臨床での日常的な実施については問題があった。
【０３４３】
時間はこの手順では不可欠であり、不十分な暴露および過度の暴露は逆の効果を引き起こし得る。本明細書中上記で提案される時間（表１ｂ）は、最大の示差的な染色のために最適であるとして選択された。時間に最も敏感な工程は、ライトグリーンにさらすことであった。これは、多くの場合、ライトグリーンが、ライトグリーンへの暴露が長すぎたならば、腫瘍細胞においてさえ、塩基性染料よりも優勢であると考えられるからである。
【０３４４】
実施例２
子宮頸部塗沫標本および乳ガン塗沫標本における悪性細胞および非悪性細胞の示差的染色
子宮頸部塗沫標本のための手順を、非子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルによるアルコール固定された塗沫標本の最適でない染色結果に対する応答において開発した。このような塗沫標本には、婦人科学的な子宮頸部パプ塗沫標本、および、非子宮頸部のアルコール固定された乳ガン塗沫標本の両方が含まれた。
【０３４５】
これらの染色手順は、非子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルにおいて記載される植物抽出物の効果および同じ固定処理プロセスを適用して、ピクリン酸とのビスマルクブラウンのコンジュゲート、および、エオシンとのビスマルクブラウンのコンジュゲートの染色特性を利用していた。子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルは、緑色色調での正常な細胞と、赤色色調（炎のような赤色）でのガン細胞との示差的な染色をもたらした。加えて、これらの染色手順はともに、子宮頸部塗沫標本において優勢である細胞変化（良性、悪性および前悪性）のほとんどを検出することができるようであった。これらの変化には、ベセスダ分類によって指示されるような新形成と同様に、意義不明の異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、上皮内低悪性度扁平上皮異型（ＬＧＳＩＬ）および上皮内高度扁平上皮異型（ＨＧＳＩＬ）が含まれた（図１２Ａ〜図１２Ｇ）。
【０３４６】
本発明による子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルの利点を評価するために、上皮内高度扁平上皮異型（ＨＧＳＩＬ）と診断された女性からのＰａｐ塗沫標本を調製し、従来のパパニコロウ染色液により染色し（図１１Ａ〜図１１Ｄ）、または、本発明による染色手法により染色した（図１１Ｅ〜図１１Ｈ）。図１１Ｂおよび図１１Ｄ（特に図１１Ｄ）に示される細胞は、図１１Ａおよび図１１Ｃに示される異型細胞とちょうど同じように、従来のパパニコロウ染色液によって赤色に染色された異型細胞であり、このことは、異型細胞の特定を、特に、異型細胞が数において少なく、また、赤色に染色された正常な細胞の中に「隠れている」場合には非常に困難にしている。鮮明な区別において、図１１Ｅ〜図１１Ｈから明瞭に明白であるように、異型細胞のみが、本発明による染色手法を使用して赤色に染まった。
【０３４７】
１８３個のＰａｐ塗沫標本を包含する臨床試験では、下記の結果が得られた（表９）：
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【０３４８】
不一致の８事例を再検討した。すべての場合において、従来法で染色されたスライドガラスは、見逃されていた異型性を含有していた。
【０３４９】
本発明による手法では陽性に染色され、一方、パパニコロウ染色液により染色されたスライドガラスの細胞病理学的解釈による従来の診断が陰性の結果をもたらした事例のいくつかが図１３Ａ〜図１３Ｇに示される。
【０３５０】
本発明による染色手法では、スライドガラス上に存在する異型性の程度が段階別に分けられないことを強調しなければならない。むしろ、本発明による染色手法は、スライドガラス上の異型性の存在を強調するために使用される。
【０３５１】
非子宮頸部塗沫標本のための染色プロトコルと、子宮頸部塗沫標本のための染色プロトコルと、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色手法との間おける違いを明らかにするために、乳ガンと診断された６５歳の男性患者の胸水から調製される風乾されたサイトスピン塗沫標本をこれらの手順に従って染色した（図１４Ａ〜図１４Ｃ）。子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルおよび非子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルを使用することによってもたらされた全体的な染色は極めて類似していた一方で、明らかな色の違いは別として、子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルは、１個１個の細胞において優れた特性を有するようであった。
【０３５２】
下記の表１０は、子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルおよび非子宮頸部塗沫標本のためのプロトコルを使用する染色結果を記載する。
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【０３５３】
実施例３
パラフィン包埋組織学切片および凍結切片における悪性細胞および非悪性細胞の示差的染色
組織学的切片により得られる結果は、細胞学的塗沫標本により得られる結果と一致している。しかしながら、細胞学的塗沫標本は通常、非常に少ない様々な細胞および組織タイプを含有する一方で、組織学切片は組織および細胞タイプの完全な範囲を表し、悪性の構造体を正常な構造体から区別することはより困難な課題を生じさせることを強調しなければならない。
【０３５４】
同様に、図６Ａ〜図６Ｄにおいて、正常な組織に隣接する結腸ガン細胞は、正常な細胞を示す明瞭かつ明確な緑色の細胞質の色とは対照的には、明瞭かつ明確な赤色の細胞質の色によって首尾良く区別された。
【０３５５】
組織学的切片のための染色プロトコルは悪性の新生物細胞ならびに一部の新形成の赤色の染色をもたらした。過形成は、異形成と同様に、正常な細胞とは異なって染まった（図７Ａ〜図７Ｃを参照のこと）。図６Ａ〜図６Ｄおよび図７Ａは、正常な形態学を有する結腸腺が緑色に染まり、一方、顕微鏡視野内の結腸腺が赤色およびピンク色に染まったことを明らかにした（図６Ａ〜図６Ｄ）。同様に、図１５Ａ〜図１５Ｃおよび図１６Ａ〜図１６Ｄにおいて、正常な組織に隣接する結腸ガン細胞が、正常な細胞を示す明瞭かつ明確な緑色の細胞質の色とは対照的には、明瞭かつ明確な赤色の細胞質の色によって首尾良く区別された。
【０３５６】
組織学的切片上に存在する赤血球が、アズールＡにおけるエオシン成分のために赤色に染まった。切片の他の要素（例えば、線維芽細胞、内皮細胞、筋肉および細胞外マトリックス成分など）は、新形成を取り囲む正常な内皮組織、扁平組織が緑色に染まるように、緑色に染まった。
【０３５７】
別の一例において、メラノーマ患者から採取された組織切片が、本発明の染色プロトコルに対する比較において、従来のヘマトキシリン・エオシン染色液を使用することによって染色された。図１７Ａ〜図１７Ｂは、両方の方法が、細胞、細胞の構成要素および細胞の形態学の可視化を可能にするが、新規な染色プロトコルのみが、悪性細胞と、正常な細胞とを区別することができ、正常な細胞を青緑色に染色し、悪性細胞を明確な赤色に染色することができたことを明瞭に明らかにする。
【０３５８】
現在、正常な細胞と、悪性細胞との十分な区別が、１つだけの植物抽出物（フィクス・エラスチカ）が使用される非子宮頸部塗沫標本のための改訂プロトコルおよび組織学的切片のためのプロトコルによって得ることができることが明白である。
【０３５９】
実施例４
悪性組織の境界部検出
外科的切除後における悪性組織の境界部検出という難題は、腫瘍の完全な除去を確認するために最も重要なことである。そのような診断を、外科的手法の期間中に、特に、前立腺ガンおよび結腸ガンをはじめとする様々な固形腫瘍ならびに転移物の場合において行うことが好ましい。凍結切片の顕微鏡による可視化によって通常的には行われるので、境界部検出プロセスの効率を改善することが大きく求められている。本発明の染色プロトコルは、得られる結果を、専門家の病理学者を必要とすることなく分析することができるので、境界部検出を簡略化することができ、また、加速することができる。図１８Ａ〜図１８Ｃは、ラットの脳における神経膠芽細胞腫腫瘍の検出が、ギムザ染色液（図１８Ａ）またはヘマトキシリン・エオシン（図１８Ｂ）の従来による両方でのその可視化と比較して、本発明の方法を使用する場合には容易であること（図１８Ｃ）を明らかにする。
【０３６０】
実施例５
分化の様々な段階の識別
胚の細胞を、未分化の表現型段階から、最終分化した表現型段階への正常な発達進行に関連する迅速な増殖能を有する組織の一例として選択した。図１９Ａ〜図１９Ｄは、分化の様々な異なる段階にあるニワトリ胚の網膜切片を示し、新規なプロトコルを使用する染色が細胞の全体的な代謝状態に関連することを明らかにする。代謝状態は、未分化の細胞において、はるかにより大きく、明確に赤色に染まり、これに対して、最終分化した細胞は明確に緑色に染まる。未分化であり続ける細胞が赤色の染色パターンを呈し、また、細胞が分化を経て進行し、増殖性がなくなるにつれ、細胞が緑色に染まることが明瞭に示される。
【０３６１】
実施例６
細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系において区別するための本発明の教示の使用
材料および実験手法
材料および実験手法の下記の節は、本明細書中下記において詳述される実施例６〜実施例１２に関連する。
【０３６２】
染色手順：
下記の表１１は本発明による全般的な染色のための手順を示す：
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【０３６３】
軟寒天プロトコル：
２０％血清培地を４８℃の浴で加温した。５％の寒天を電子レンジで２分間融解し、ＲＴで１０分間冷却し、４８℃のＨ２Ｏ浴に入れた。１：５の寒天希釈物を、１％寒天の最終濃度のために、事前に加温された培地で調製した。１．５ｍｌの寒天を３５×１０ｍｍのプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログＮｏ．６２７１０２）に注ぎ、プレートをＲＴで１０分間固化させた。プレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて、適正なｐＨに調節した。寒天希釈物を、０．３％最終濃度のために、事前に加温された培地で調製した。処理された細胞をトリプシン処理し、１００００細胞／５０μｌ〜１００μｌ／プレートの濃度に再懸濁した。細胞の生存能をトリパンブルーにより確認した。細胞懸濁物を寒天に素早く加え、（細胞を均一に懸濁するために）２回〜３回穏やかにひっくり返し、その後、各々の事前に注がれた１％寒天プレートの上に注いだ（１．５ｍｌの寒天＋細胞懸濁物）。プレートを、およそ１０分間、ＲＴに冷却し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に入れた。２００μｌの２０％血清培地を細胞に３日毎に加えた。
【０３６４】
ヌードマウス実験プロトコル：
Ｈ２９細胞を１００マイクロＭのゲニステイン、１０マイクロＭの５ＦＵ、５ｎＭの酪酸塩、３０マイクロＭのＮ−メチルホルムアミド（ＮＭＦ）、３０マイクロＭのフィチン酸または培地単独と３日間インキュベーションした。４日目に、細胞を集め、０．２ｍｌのＰＢＳにおける５×１０６細胞の最終濃度に希釈した。希釈後直ちに、各々の試験群からのＨＴ２９細胞を１０匹のヌードマウスの背側に皮下注入した（マウスあたり５×１０６細胞の０．５ｍｌ）。アッセイ期間中、腫瘍のタイズおよびマウスの体重を１週間に２回記録した。腫瘍体積（ｍｍ３）を下記の式に従って推定した：長さ（ｍｍ）×［幅（ｍｍ）］２×０．５。
【０３６５】
ＨＴＳスクリーニング手順：
１日目−細胞を置床した：培地を調製し、細胞をトリプシン処理し、計数し、培地に希釈した。細胞置床濃度はウエルあたり５０００細胞であった。
２日目−ライブラリーの添加。化合物を、ＤＭＳＯストック液から、成長培地での３０マイクロモル濃度の処理濃度に最終的な作業用濃度に希釈した（「２日目の培地」）。
３日目−細胞培地の補給。培地を「２日目の培地」によって置き換えた。
４日目−細胞培地の補給。培地を「２日目の培地」によって置き換えた。
５日目−細胞を培地により洗浄し、風乾した。
【０３６６】
Ｒａｔ１／Ｒａｔ２細胞株の安定的なトランスフェクション：
Ｒａｔ１細胞またはＲａｔ２細胞（同じ系統の異なるクローン）をトランスフェクションの前日に２５００００細胞／ウエル（６ウエルプレート）で置床した。トランスフェクションの当日、培養物の密度は８０％〜９０％のコンフルエンシーであった。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションを行った。ＰＥＩストック溶液を水で調製した（１０ｍＭ（４．５ｍｇ／１０ｍｌ）、ｐＨ７．４）。溶液Ｉ−５０マイクロＬの１５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける  マイクロＬのＰＥＩを混合し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベーションした。溶液ＩＩ−５０マイクロＬの１５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける２マイクロｇのＤＮＡを調製し、混合し、ＲＴで５分間インキュベーションした。溶液Ｉおよび溶液ＩＩを混合し、ＲＴで２０分間インキュベーションした（トランスフェクション混合物）。混合物の体積をトランスフェクション培地（抗生物質および血清を含まない培地）により１ｍｌに調節した。Ｒａｔ細胞をトランスフェクション培地により洗浄し、トランスフェクション混合物を細胞に４時間加えた。インキュベーション期間が終了したとき、培地を完全成長培地により取り替えた。
【０３６７】
Ｋ５６２系の調製：
Ｋ５６２細胞を、インキュベーターにおいて４日間、５００００細胞／ｍｌの濃度で２０ｍｌの完全ＲＭＰＩ培地とともに７５ｍｌのフラスコに播種した。細胞培地を４８時間後に取り替えた。９６時間のインキュベーションの後、Ｋ５６２細胞を遠心分離し、血清非含有培地に１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。１００マイクロリットルの細胞を９６ウエルプレート（これは０．０１％のポリ−Ｌ−リシンにより事前に被覆された）に置床し、細胞がウエルの底に接着するまで２時間インキュベーションした。培養培地を吸引し、プレートを少なくとも１２時間開けて風乾した。ヘモグロビンアッセイを、ＰＢＳで洗浄され、凍結および解凍を３回行うことによって水において溶解された１０５個の細胞を用いて達成した。１００マイクロＬの細胞溶解物をベンジジンアッセイに付した。
【０３６８】
ニトロブルーテトラゾリウム試験（ＮＢＴ）：
１ｍｌの細胞成長培地における１×１０６個の細胞を、０．１％のニトロブルーテトラゾリウムクロリド（Ｍｅｒｃｋ）および１００ｎｇのホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）の存在下、３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をサイトスピン処理し、スライドガラスをメイ・グリュンワルド・ギムザ染色液（Ｓｉｇｍａ）により染色した。細胞を濃い藍色のホルマザン顆粒の存在についてスコア化した。
【０３６９】
試薬：
ゲニステイン、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ−６６４９；フィチン酸、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−３１６８；ＳＦＵ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ−６６２７；酪酸、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ−５８８７；ＮＭＦ、Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４７３９３６；ＰＤ９８０５９、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５１３０００；
ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ．ｃｏｍ；
ＤＮＡ構築物−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号Ｋ６０１３−１（Ｒａｓ優性ネガティブベクターセット）；
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４０８７２−７；
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン遊離塩基、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ２８８５；
Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）イマチニブメシラート、Ｎｏｖａｒｔｉｓ；
ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ２６２５；
組換えヒトＩＦＮ−ガンマ、Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ。１００マイクロｇ／ｍｌのストック溶液を蒸留水で調製した。ＩＦＮ−ガンマの比活性は２×１０７ＮＩＨ  Ｇｇ２３−９０１−５３０ユニット／ｍｇである。
ヘマトキシリン溶液ギルＮｏ．３、Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ、カタログ番号０１５４０；
アズールＡ、ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ａ−６２７０；
ビスマルクブラウンＲ、ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｂ−７７５８；
エオシンイエロー（認定）、ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｅ４３８７；
フィオキシン、フロキシン−Ｂ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ４０３０；
ライトグリーン，ＳＦイエローイッシュ、Ｍｅｒｃｋ、Ｉ．１５９４１；
ニューフクシン（ＣＩ：４２５２０；ベーシックバイオレット２）、Ｓｉｇｍａ、Ｎ−０６３８；
Ｌａｂ−Ｔｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒスライドシステム−Ｌａｂ−Ｔｅｋ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１７７４０２
【０３７０】
細胞株：
すべての細胞株をＡＴＣＣから購入し、ＡＴＣＣの説明書に従って処理した。
ＣＣＤ−３３ＣＯ、正常な初代結腸細胞、ＭＥＭイーグル培地：４５０ｍｌのＭＥＭイーグル培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（ＢＩカタログ番号０１−０４０−１Ａ））、５ｍｌのＰＳＡ／ＰＳ、５ｍｌのＬ−グルタミン、５ｍｌのピルビン酸Ｎａ、５０ｍｌのＦＣＳ。
ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺ガン、Ｍｍｌｏｙ培地、１．５ｍＭのグルタミン、４５０ｍｌのＭｍｌｏｙ５ａ培地、５ｍｌのＰＳＡ／ＰＳ、５０ｍｌのＦＣＳ。
Ｒａｔ２、ＤＭＥＭ培地、４５０ｍｌのＤＭＥＭ  ＨＧ培地（ＢＩカタログ番号０１−０５５１−１Ａ）、５ｍｌの２０ＰＳＡ／ＰＳ、５ｍｌのＬ−グルタミン、５０ｍｌのＦＣＳ。
Ｋ５６２、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ＲＰＭＩ１６４０培地：４５０ｍｌのＲＰＭＩ１６０培地（ＢＩカタログ番号０１−１０４−１Ａ）、５ｍｌのＰＳＡ／ＰＳ、５ｍｌのＬ−グルタミン、５０ｍｌのＦＣＳ。
ＨＬ−６０、急性前骨髄球性白血病細胞をイスコブ改変ダルベッコ培地において維持した（４００ｍｌのイソコブ改変ダルベッコ培地（ＢＩカタログ番号０１−０５８−１Ａ）、５ｍｌのＰＳＡ／ＰＳ、４ｍＭのグルタミン、１００ｍｌのＦＣＳ（２０％））。
Ｕ９３７、組織球性リンパ腫を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌのグルコースおよび１０％のウシ胎児血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０において維持した。
ＭＣＦ−７、腺ガン；乳腺。細胞をＤＭＥＭ培地において維持した。
【０３７１】
染色溶液および固定液：
ＦＩＸ２Ｂ−８％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、８％氷酢酸（ＧＡＡ）、４％ホルムアルデヒド、４％メタノール、３０％エタノールおよび４６％エーテル。
ＦＩＸ１０２Ｂ−８％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、７％メタノール、９％ＧＡＡ、７％ホルムアルデヒドおよび６９％再蒸留水。
【０３７２】
色素：
ヘマトキシリンギル（Ｄｙｅ−１）−ヘマトキシリンギルＮｏ．３の直ちに使用可能な溶液。
アズール（Ｄｙｅ−２）−アニリン色素のアズール−Ａを、０．２５グラムのアズールを５０ｍｌのエタノールおよび５０ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
ビスマルクブラウンエオシンコンジュゲート（Ｄｙｅ−３）−これを、Ｄｙｅ−ＢおよびＤｙｅ−Ｃを混合することによって調製した。混合物を３分間煮沸し、室温に冷却した。混合物をろ紙でろ過した。フィルターを乾燥させ、２５０ｍｌの無水エタノールにより洗浄した。フィルターを除き、調製物を使用した。
ビスマルクブラウンフロキシンコンジュゲート（Ｄｙｅ−４）−これを、Ｄｙｅ−ＡおよびＤｙｅ−Ｂを混合することによって調製した。混合物を２０分間煮沸し、室温に冷却した。混合物をろ紙でろ過した。フィルターを乾燥させ、２５０ｍｌの無水エタノールにより洗浄した。フィルターを除き、調製物を使用した。
ライトグリーン４％（Ｄｙｅ−５）−アニリン色素のライトグリーン４％を組織学的切片のためのプロトコルにおける全般的な染色液として使用した。このアニリン色素を、４グラムのライトグリーンを７０ｍｌのエタノールおよび３０ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
フロキシン（Ｄｙｅ−Ａ）：アニリン色素のフロキシンを、パラフィン包埋組織を染色するために使用した。このアニリン色素を、１．５グラムのフロキシンを２００ｍｌの再蒸留水および５０ｍｌのエタノールと混合することによって調製した。
ＢＢｒ（Ｄｙｅ−Ｂ）：ＢＢｒ色素を、２グラムのビスマルクブラウンＲを５０ｍｌのエタノールおよび２００ｍｌの再蒸留水に溶解することによって調製した。
エオシンイエロー（Ｄｙｅ−Ｃ）−０．２６グラムのエオシンイエローシェイドを１５ｍｌの１００％エタノールおよび３５ｍｌの再蒸留水と混合した。
ニューフクシン（Ｄｙｅ−６）−０．４％溶液を３３％エタノールにおいて調製した。
ライトグリーン４％（Ｄｙｅ−７）−４％溶液を２０％エタノールにおいて調製した。
ニューフクシン（Ｄｙｅ−８）−０．４％溶液を３３％エタノールにおいて調製した。
ニューフクシン（Ｄｙｅ−９）−０．５％溶液を２０％エタノールにおいて調製した。ｐＨを５．７に調節した。
ライトグリーン４％（Ｄｙｅ−１０）：アニリン色素のライトグリーン４％を組織学的切片のためのプロトコルにおける全般的な染色液として使用した。このアニリン色素を、４グラムのライトグリーンを１００ｍｌの再蒸留水と混合することによって調製した。
【０３７３】
実験結果
この研究方法は、組織サンプルではなく、むしろ、固定処理された単一細胞が関与したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を裏付けるために修正されている。正常対悪性の組織を表すモデル系を、初代の正常結腸細胞（ＣＣＤ−３３Ｃ０）およびヒト結腸直腸腺ガン（ＨＴ−２９）を使用して構築した。このモデル系における示差的な染色を得るために、組織学的サンプルのために使用される染色プロトコルのいくつかの修正が必要であった（プロトコルＩＩ）。得られた結果（図２０Ａ〜図２０Ｃ）は、正常な細胞表現型（緑色、図２０Ａ）と、悪性の細胞表現型（赤色、図２０Ｃ）とを明瞭に識別した。いくつかの表現型関連試験が、これらの細胞の正常な表現型および異常な表現型を確認するために行われている。正常細胞の飽和密度は、おそらくは接触阻害のために、悪性細胞よりもはるかに低く（図２０Ａ〜図２０Ｂ、示されず）、正常細胞の広がりが、悪性の対応体と比較して目立っており（図２０Ａ〜図２０Ｂ）、また、これに加えて、ＨＴ−２９は軟寒天における顕著な増殖巣形成能を有していた（図２１）。
【０３７４】
実施例７
創薬のための本発明によって記載される方法および化合物の使用
正常な表現型および形質転換された表現型を示差的に染色することができる染色プロトコルを開発したことにより、本発明者らは、悪性細胞の表現型変化を検出するためにこの染色方法を使用することができることを本明細書中において明らかにした。多数の化学化合物が、細胞の表現型の正常化を引き起こすことが文献では報告され、代表的な異なる細胞活性／機構が選ばれた。これらの化学物質の例には、酪酸ナトリウム［Ｎｅｗｍａｒｋ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ（１９９４）、７８：１〜５］およびゲニステイン［Ｂａｒｎｅｓ、Ｊ．Ｎｕｔｒ（１９９５）、１２５（３  Ｓｕｐｐｌ）：７７Ｓ〜７８３Ｓ１ｓ］。
【０３７５】
酪酸ナトリウムは、分化と、細胞表現型の正常化とを、ヒストンデアセチラーゼの活性を阻害することによって誘導し［Ｐａｒｋｅｒ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８６）、２６１：２７８６〜２７９０］、一方、ゲニステインは強力なチロシンキナーゼ阻害剤である［Ｂａｒｎｅｓ、Ｊ  Ｎｕｔｒ（１９９５）、１２５（３Ｓｕｐｐｌ）：７７Ｓ〜７８３Ｓ１ｓ］。本明細書中において明らかにされるように、生来的なＨＴ−２９細胞は赤色に染まり、一方、これらの化合物により効果的に処理された細胞は緑色／青色に染まるが、実験中を通して生存したままであった（プロトコルＩＩを使用したとき）。
【０３７６】
色変化の程度の定量化を容易にするために、また、細胞が赤色色素および緑色色素の混合物を含有することは明白であるので、赤色色素のスペクトルで測定される光学濃度（ＯＤ赤色）と、緑色のスペクトルで測定される光学濃度（ＯＤ緑色）との比率を表す測定量を開発した。この比率（これはＲと示される）は、簡便で、有用なツールであることが判明した：悪性細胞は１以上のＲ値を呈し、一方、正常な細胞は１未満のＲ値を呈する。
【０３７７】
図２２Ａ〜図２２Ｄおよび図２３Ａ〜図２３Ｃは、悪性細胞の分化を誘導するために増大する濃度の酪酸ナトリウムにより処理されたＨＴ２９（ヒト結腸ガン細胞）における表現型薬物スクリーニングの結果を示す。酪酸塩による処理は、分化および表現型変化に関連した細胞数における減少および形態学的変化をもたらした。表現型の変化が、赤色（悪性）から青色／緑色（正常）への、徐々にではあるが、濃度および時間に依存した色の変化によって検出された。類似した色変化が、ゲニステインによる処理の後で得られた（図２４Ａ）。３つのタイプの結果が図２４Ａ〜図２４Ｃに示された：染色タイプ（図２４Ａ）、染色結果の定量化（図２４Ｂ）、および、細胞数に対する処理の影響（図２４Ｃ）。図２４Ａ〜図２４Ｃにおいて明らかにされるように、ゲニステイン処理の結果として、細胞数の減少によって説明することができない、細胞の染色タイプにおける明白な用量依存的変化（赤色に染まることから緑色／青色に染まることへの変化）が認められた（図２４Ｃ）。
【０３７８】
実施例８
機能的アッセイを使用する妥当性確認
細胞表現型の生化学的な妥当性確認は、異なる細胞系における幅および異なる分化系における幅がないことを多くの場合には欠点として有するにもかかわらず、非常に有益なツールである。アルカリホルファターゼは結腸細胞の刷子縁分化についての妥当なマーカー［Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９９０）、９８（５Ｐｔ１）：１１９９〜２０７］である一方で、アルカリホルファターゼは、他の分化経路の場合と同様に、他の細胞系ではほとんど価値を有していない。同様に、ヘモグロビン産生は、正常な造血細胞の明瞭な特徴［Ｃｌａｒｋｅ他、Ｂｌｏｏｄ（１９８２）、６０：３４６〜３５１；ＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕおよびＨｕｂｅｒｍａｎ、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（１９９５）、２０８（１）：１０９〜１５］であるが、悪性形質転換された造血細胞では非常に阻害される。このマーカーが造血系において有益であるとしても、このマーカーはほとんどの他の細胞系ではマーカーとしての価値を何ら有していない。従って、広範囲の生化学的マーカーがない一方で、形質転換された表現型の機能的な評価を可能にする古典的な取り組み方法が数多く存在する。最も一般的に使用される古典的な取り組み方法には、悪性細胞の足場依存的な成長を確認する軟寒天、および、免疫抑制マウスにおける悪性細胞の腫瘍形成能をアッセイする動物モデルが含まれる［Ａｌｂｅｒｔｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ、ｃ（１９９４）］。本発明者らは、上記で報告された結果を確認するためにこれらの古典的な取り組み方法を使用した。軟寒天における挙動（図２１）およびヌードマウスにおける挙動（図２５）が、異なる化合物により前処理された細胞の機能を研究することによって明らかにされた。そのような化合物は、上記で示された染色アッセイにおいて異なる応答を生じさせるそれらの能力に従って分類された。一方の群が、赤色から緑色への色変化に影響を及ぼす能力を有しており、一方、他方の群は、赤色から緑色への染色のタイプを変化させるこの能力を有していなかった。いくつかの化合物は、表現型の安定的な変化ではなく、むしろ、表現型の一時的な変化に影響を及ぼし得ること、また、このことが、軟寒天実験およびヌードマウス実験で得られた結果に影響することが推測された。本発明者らは、これらの化合物が表現型の安定的な持続し得る変化に影響を及ぼし得ることを、細胞を処理し、酪酸ナトリウム処理を止めた後における細胞を観察することによって調べた（図２６Ａ〜図２６Ｅ）。ゲニステインの場合、正常な染色タイプが、細胞から化合物を取り去った後の長い期間にわたって存在し、この挙動は明らかに、軟寒天において観測される正常な表現型（図２１）、および、ヌードマウスにおける最小限の腫瘍形成性に寄与し、また、３０日まででさえ、腫瘍がこれらの動物において全く検出されなかった（図２５）。それに反して、酪酸ナトリウムは一時的な色変化の取り消しを引き起こし、赤色に染まることの転換を４日以内に引き起こした（図２６Ａ〜図２６Ｅ）。予想されるように、酪酸ナトリウムにより処理された細胞は、軟寒天および動物モデルの両方において、形質転換された表現型と一致する様式で挙動した（各々、図２１および図２５）。これらの結果の間における相関関係が下記の表１２にまとめられる。
2009528835.tif 000027
【０３７９】
まとめると、本明細書中において明らかにされるように、染色結果は、表現型が影響されていることを示す一方で、この変化は一時的または最終的のいずれかであり得る。変化が一時的であるならば、軟寒天またはヌードマウスにおける細胞の機能性が幾分か阻止される場合があるが、最終的には、その挙動は、形質転換された表現型の機能性を刺激する。
【０３８０】
実施例９
ハイスループットスクリーニングにおける本発明によって記載される方法および化合物の使用
以前の報告に基づいて、本発明者らは、この取り組み方法を創薬のための構成として使用するための概念的可能性、すなわち、非常に多数の化合物を所望の生物学的活性について工業的に試験することを考えた。上記で提案された染色方法は、ガン調節剤としてもまた一般に知られている非細胞毒性化合物の検出を可能にする。これらのタイプの化合物は、悪性／形質転換された細胞の表現型の改善を引き起こす。
【０３８１】
この概念の実用的な実行を、３８４ウエルプレートおよび液体取り扱いシステムを大きい化学物質コレクションのスクリーニングにおいて使用して完成させた。これらの化合物のいくつかが細胞毒性であり、従って、比率（Ｒ）の測定を信頼できないものにし得る可能性を取り扱うために、本発明者らは化合物の細胞毒性の程度の測定を開発した。
【０３８２】
染色プロトコルにおける２つの色素の使用により、２つの異なる波長で読み取り、両方の出力結果を評価のために使用することを実行可能にする明確な吸光度プロフィルがもたらされた。赤色色素のニューフクシン（ＮＦ）の吸光度が５６０ｎｍで読み取られ、緑色色素のライトグリーン（ＬＧ）の吸光度が６３０ｎｍで読み取られた。両者が分光光度計プレートリーダーにおいて同時に読み取られた。生データの出力が自動的に変換および分析された。
【０３８３】
緑色色素および赤色色素の両方が表現型の色の区別に寄与したので、悪性度の指標が、ＮＦ／ＬＧの比率を使用して作られた。１の商を、悪性の表現型と、正常な表現型とを区別するためのカットオフとして使用した。悪性細胞が赤色に染まり、従って、１よりも大きい悪性度の指標を有した。正常な細胞または未分化の細胞が緑色に染まり、従って、１未満の悪性度指標を有した（図２３Ｃを参照のこと）。
【０３８４】
各々のウエルにおける細胞の数もまた、結果の評価において意味を有した。誤った解釈を排除するために、非常に少ない数の細胞は背景読み取り値を与え、この背景読み取り値が、悪性度指標として計算されたときに誤って解釈され得るときには、細胞数の推定が必要であった。従って、ＮＦ＋ＬＧの和（すなわち、ＯＤ赤色＋ＯＤ緑色）をウエルにおける細胞数についての推定値として使用し、非処理のコントロールを使用してこれを正規化した。このことは、細胞が赤色または緑色のいずれかに染まり、両者の和がウエルにおける細胞の全体的な存在を反映したという事実に基づいた。異なる密度での細胞が置床された実験では、関連した範囲でのこれらの色素の和の直線性が示された（データは示されず）。
【０３８５】
簡単に記載すると、小分子の化学ライブラリー（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を化合物の３０マイクロモル濃度の初期濃度でスクリーニングした。ＨＴ−２９細胞を置床し、異なる化合物により４日間処理し、その後、プロセスが終了したとき、プロトコル（ＩＩ）を使用して染色した。
【０３８６】
自動での、形式設定されたＥｘｃｅｌに基づく分析ツールにより、結果が分析される。表現型変化のヒットが、化合物が１未満のＮＧ／ＬＧの比率を与えるが、０．２よりも大きい、ＮＦ＋ＬＧの和の値を有したときに宣告された。細胞毒性のヒットが、ＮＦ＋ＬＧの和が０．２未満であったときに宣告された。これらヒットは、肉眼による場合でさえ視覚化され得る（図２７Ａ）。
【０３８７】
５５１２０個の小さい薬物様分子からなるＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリーのスクリーニングは、一次スクリーニングでの２４８個（０．４５％）のヒットをもたらし、それらからの３２個のヒット（０．０６％）がＨＴ−２９細胞株に対してナノモル濃度において活性であった（図２８）。そのような化合物のうちの６個を選んで、さらに妥当性確認した。このライブラリーは以前に何回もスクリーニングされているが、これらの化合物は、他のアッセイでは抗ガン性リード物質として検出されたことは一度もなかった。ヒット物の活性を反復したアッセイによって確認した。すべてのヒット物が２回目について陽性であった。活性の範囲が、同じ比色アッセイを使用する用量応答曲線を使用して調べられた（図２７Ｂ）。
【０３８８】
このスクリーニングの結果が図２８にプロットされる。結果が示すように、このスクリーニングは、与えられたレベルの化合物濃度についての応答の３つの明確な典型を引き起こした：毒性／静的効果、表現型の変化（これは赤色から緑色への色変化に基づく）、および、表現型の明白な変化がないこと（赤色に染まること）。ウエルにおける細胞数によって測定されるような非常に毒性の応答を誘導することなく、細胞の色の変化に影響を及ぼすことができる化合物の部分集団は、緑色に染まることが細胞の腫瘍形成性と相関すると示されているので、可能性ある薬物候補として大きく注目される。大きい静的／毒性効果を示す化合物は、表現型が変化するより低い濃度が細胞毒性のより低いレベルにおいて存在するかどうかを決定するために、より低い濃度で再試験しなければならない。
【０３８９】
実施例１０
標的の妥当性確認のための本発明の方法および化合物の使用
上記の結果は、この染色方法が、悪性細胞において生じている表現型の変化を判定することができることを明らかにする。加えて、結果はまた、この方法が、正常な細胞における表現型の変化を判定することにおいて有用性を有することを示している。このことは、標的の妥当性確認の分野における非常に望ましい特徴である。この系はＲａｔ１細胞またはＲａｔ２細胞に基づいて構築された。空の発現ベクター（Ｖｅｃ）を安定的に発現するクローン、Ｒａｔの野生型（Ｒａｓ−ｖｅｃ）を安定的に発現するクローン、および、Ｒａｓの発ガン性形態（Ｒａｓ−Ｖ１２）を安定的に発現するクローン（図２９）を誘導し、ウエスタンブロッティング（示されず）、細胞骨格組織化（示されず）、および、軟寒天における挙動（表１３および図３０Ａ〜図３０Ｂに従う）によって特徴づけた。ＳＶＴ２細胞を足場依存的成長についての陽性コントロールとして使用した［Ｓｉｍｃｈａ他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９６）、１３３（１）：１９９〜２０９］。従って、細胞を形質転換し、軟寒天におけるコロニー形成を誘導するＲａｓ−Ｖ１２の以前に報告された能力［Ｅｇｏｚｉ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）、８０：９１１〜９１８］が確認された。
2009528835.tif 000028
【０３９０】
Ｒａｔ１  Ｒａｓ細胞を染色する粗抽出物の能力が表１４にまとめられた。表１４において、染色能力が抽出物の濃度と直接に相関する。
2009528835.tif 000029
【０３９１】
実施例１１
全経路創薬系の開発における本発明によって記載される方法および化合物の使用
本発明者らは、プロトコル（ＩＶ）を使用して染色の妥当性を確認するために作製された１組のクローンを使用した。予想通り、表現型が正常な細胞は緑色であるようであり（図３１Ａ〜図３１Ｂ、Ｒａｔ２）、表現型が悪性の細胞／形質転換された細胞は赤色であるようであった（図３１Ｃ〜図３１Ｄ、Ｒａｔ２  Ｒａｓ−Ｖ１２）。
【０３９２】
最も良く解明されているシグナル伝達経路の１つが、Ｒａｓによって開始され、ＭＡＰＫＫが限局的な役割を果たす経路である。Ｒａｓにより誘導される形質転換を、ＭＡＰＫＫ活性を妨げることによって停止させることが可能であることが報告されている［Ｄｕｅｓｂｅｒｙ他、ＰＮＡＳ（２００１）、９８（７）：４０８９〜４０９４］。ＰＤ９８０５９は、この活性を有する強力な化学的阻害剤である。Ｒａｓ−Ｖ１２細胞のＰＤ９８０５９とのインキュベーションは悪性表現型を正常細胞の表現型に変化させることが、以前の報告［Ｄｕｅｓｂｅｒｙ他、ＰＮＡＳ（２００１）、９８（７）：４０８９〜４０９４］に基づいて予想された。図３２Ａ〜図３２Ｄに示されるように、悪性細胞／形質転換細胞の赤色染色（図３２Ａ〜図３２Ｂ）が、正常化された細胞における緑色染色（図３２Ｃ〜図３２Ｄ）によって置き換えられた。
【０３９３】
他のシグナル伝達経路がＲａｓを伴う場合があり、従って、表現型薬物スクリーニングのシグナル伝達経路感受性がＲａｔ１−Ｒａｓ系において評価された。ファルネシル化阻害剤（ＨＲ１２、図３３Ｂ）またはＭＡＰＫ阻害剤（ＰＤ９８０５９、図３３Ａおよび図３３Ｃ）によるシグナル伝達経路への化学的介入は、悪性から正常への表現型の緩やかな用量依存的な変化をもたらした。本発明の特異な特徴は、標準的な実施とは対照的に、発ガン性標的のシグナル伝達に関する事前の知識が薬物スクリーニングのために何ら要求されないことである。ゲニステイン（チロシンリン酸化阻害剤、図３３Ｄ）またはＬＹ２９４００２（ＰＩ３キナーゼ阻害剤、図３３Ｅ）が染色タイプを変化させることができないことは、このことを明瞭に裏付けている。
【０３９４】
このモデル系を使用して、本発明者らは、ガン遺伝子とのトランスフェクションによる正常細胞の悪性形質転換によって作製される操作された細胞株が、創薬のためのプラットホームとして使用され得ることを示している。これは、この形質転換が化学化合物によって可逆的であるからである。
【０３９５】
実施例１２
さらなる系の開発における本発明によって記載される方法および化合物の使用
上記で報告された創薬法の有用性を評価するために、ガン調節応答に影響を及ぼし得ることが知られている既存の薬物および化合物を調べた。妥当性確認の目的のために、生化学的マーカーまたは分化が利用できる細胞系を使用した。
【０３９６】
本発明者らは、Ｋ５６２赤白血病細胞に基づいた、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）についてのモデル系を確立した。この系の利点は、赤血球系細胞の分化が、ヘモグロビン合成のレベルを測定すること（ベンジジン染色方法）によって比較的容易に確認できることである。以前に報告されたように［Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ他、Ｊ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ（１９８６）、５、２５０〜２６２］、Ｋ５６２細胞の赤血球系分化が、酪酸ナトリウム（示されず）、ＤＭＳＯ（示されず）およびＧｌｅｅｖｅｃ（商標）（図３４Ａ〜図３４Ｃおよび図３５Ａ〜図３５Ｂ）によって誘導された。これらの分化誘導剤のすべてが、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（図３４Ａ〜図３４Ｃおよび図３５Ａ〜図３５Ｂ）によって示されたような赤色から青色／緑色への染色表現型の明白な変化を引き起こした。
【０３９７】
ＳＴＩ５７１（Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）、イマチニブメシラート）は、ＣＭＬの治療のために適応される成功した薬物の一例である。ＣＭＬの場合、疾患の進行が、白血病クローンの最終分化についての能力の進行性喪失を生じさせる分子的異常の蓄積によって引き起こされる。Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）はＢｅｒ−Ａｂｌのキナーゼ活性を標的とし、従って、ＣＭＬにおける最終分化を誘引し、臨床における強い血液学的応答および細胞遺伝学的応答を誘導する［Ｄｒｕｃｋｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２）、第８巻、第４号（Ｓｕｐｐｌ．）、Ｓ１４〜Ｓ１８］。
【０３９８】
細胞数およびヘモグロビン産生に対するＧｌｅｅｖｅｃ（商標）の影響に関する相関研究を行った（図３４Ｃおよび図３５Ａ）。Ｋ５６２細胞染色の検出レベルは非常に高感度であることが見出され、所望されるＧｌｅｅｖｅｃ活性を３０ｎＭの濃度で検出することができた（図３５Ｂ）。この濃度において、細胞数またはヘモグロビン産生のいずれも、影響をまだ受けていない（図３５Ａ）。
【０３９９】
２つのさらなる白血病系を確立した：ＨＬ−６０（ヒト急性骨髄性白血病細胞株）およびＵ９３７（単球性白血病／組織球性リンパ腫細胞株）。ＨＬ−６０細胞は、ＡＴＲＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸）により誘導される分化［Ａｌｉｓｏｎ他、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ（２００２）、第８９章、“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ”］の結果として、赤色から緑色への強い色変化を示した（図３６Ａ〜図３６Ｂ）。Ｕ９３７細胞を、分化を誘導するために、酪酸ナトリウム（図３８Ｃ〜図３８Ｄ）またはＩＦＮ−ガンマ（図３７Ｂ〜図３７Ｃおよび図３８Ｅ〜図３８Ｈ）により処理した。ニトロブルーテトラゾリウム還元（ＮＢＴ）試験を、これらの細胞の分化の状態を示す生化学的マーカーとして使用した（図３７Ａ〜図３７Ｃ）。増大する濃度のＩＦＮ−ガンマによる処理は、悪性の赤色から、正常の緑色への細胞の色における変化と非常に相関する生化学的に陽性の細胞の増大した数をもたらした（図３８Ａ〜図３８Ｂおよび図３８Ｅ〜図３８Ｈ）。類似した結果が酪酸ナトリウムにより得られた（図３８Ａ〜図３８Ｄ）。
【０４００】
別の系を確立した。この系では、ＨＰＶ１６不死化ヒトケラチノサイトが、（Ａ．Ｌｅｖｉｔｚｌｉ博士（ヘブライ大学、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）の研究に由来する）種々の阻害剤によって処理された。図３９は表現型薬物スクリーニング法のリード物質最適化能を示す。この実験は、本発明の染色手法によって視覚化された細胞の表現型に対する種々の化学的足場変化の影響を示す。ＡＧ５５５は機能しないことに留意すること；しかしながら、ＡＧ５５５モチーフの化学的修飾はＡＧ４９４において部分的活性をもたらした。
【０４０１】
本発明者らは、細胞の表現型を測定する非常に信頼でき、かつ、効果的な様式のための基礎を築いている。この方法は、創薬、標的妥当性確認および診断学などの様々な適用に向けて実施に移されている。ガン腫および他の腫瘍の両方を取り扱う様々な系が開発されており、それらの結果が、様々な受け入れられる方法およびマーカーを使用して妥当性確認されている。この創薬プラットホームは、化学化合物に関してだけでなく、タンパク質リガンドに関しても機能するので、一般的な特性を有する。本発明者らは、この系がガン遺伝子の標的妥当性確認のために容易に使用されることを示しており、本発明者らはまた、センス構築物およびアンチセンス構築物のスクリーニングのためにこの系を使用することが可能となっている（示されず）。腫瘍抑制因子遺伝子を試験することはこれまでありふれたことである。これは、単に、この系を悪性細胞とともに開始し、悪性細胞を腫瘍抑制因子遺伝子によりトランスフェクションすることであるからである（示されず）。提案された方法は、最適な結果を得るためにこの系の特定の特徴を考慮に入れて、異なる細胞系への迅速な調節を必要とする。この方法の一般性は部分的には、染色が処理後に行われるという事実と関連があり、そのために、細胞に施された処置の性質ではなく、その効率が重要である。
【０４０２】
実施例１３
悪性細胞と、非悪性細胞とを区別することができる、植物粗抽出物からの新規な染色性化合物（ＣＳＴ２００１）の精製
材料および実験手法
実施例１３〜実施例１７のための手順、プロトコル、細胞株、試薬、アッセイ、染色溶液および固定液のすべてが、本明細書中上記の実施例６〜実施例１２のための材料および実験手法の節において記載される通りである。
【０４０３】
ＣＳＴ−２００１の精製
１．粗エタノール抽出物（５０ｍｌ）を１ＮのＮａＯＨにより強塩基性（ｐＨ１２．０）に調製し、混合し、４℃で１時間保った。
２．４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
３．１０ｍｌの７０％エタノール（ｐＨ１２）により１回洗浄した。
４．ペレットを４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
５．ペレットを２０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。
６．ペレットを４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
７．ペレットを１０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。
８．１ＮのＨＣｌを、ｐＨが２．０に達するまで加え、懸濁物を４℃で１時間保った。
９．ペレットを４０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によって集めた。
１０．ペレットを１０ｍｌの７０％エタノールに溶解した。
１１．ｐＨを１ＮのＮａＯＨにより６．２に調節した。
１２．高濃縮抽出物を褐色びんにおいて室温で貯蔵した。
１３．１０ｍｌの高濃縮抽出物を５ｍｌのＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加え、混合した。
１４．Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルを５００×ｇでの１０分間の遠心分離によって沈降させた。
１５．上清を注意深くデカンテーションした（活性物を含有した）。
１６．工程１〜工程３をさらに２回繰り返した。
１７．上清（これがＣＳＴ２００１として示される）を分析（例えば、蛍光スペクトル、ＮＭＲおよびＭＳ）のために使用した。
【０４０４】
実験結果
植物抽出物：
上記で示された染色方法は、非悪性細胞に対する悪性細胞の表現型特異的な色識別のために重要であることが経験的に示されている植物抽出物の使用を伴う。本発明者らは、粗抽出物と同じ活性を可能にする組成物を首尾よく特定している。
【０４０５】
このプロセスにおける出発点は粗抽出物の調製である。
【０４０６】
１．粗抽出物：
プロセスのために最適である葉（フィクス・エラスチカ）は１５グラム〜２５グラムの重さを有していなければならず、それらの長さは、葉の基部から端まで測定されたとき、１８センチメートル〜３０センチメートルでなければならない。６００グラムの葉を１ｃｍ〜２ｃｍの小片に切断した。切断された葉を１．５リットルの７０％ＥｔＯＨと混合し、密閉容器において１０日間保った（室温）。その後、液体を固体から分離し、さらなる使用のために室温で保った。各々のバッチ処理物は、最適な作業用濃度を決定するためにバッチ最適化を必要とした。バッチ最適化手順では、様々な細胞対（正常細胞対悪性細胞、非処理細胞対処理細胞、正常細胞対ガン遺伝子トランスフェクション細胞、悪性細胞対腫瘍抑制因子遺伝子トランスフェクション細胞など）が使用された。この手順の目的は、７０％ＥｔＯＨを粗抽出物に加えることによって作業用溶液の濃度を変化させる希釈曲線を使用して、Ｒ悪性／Ｒ正常の比率を最大にすることであった。
【０４０７】
代替として、粗抽出物が下記のプロトコルによって調製されている：葉（１００ｇ）を２００ｍｌの９０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルにより室温で６日間抽出した。その後、アセトニトリルをロータリーエバポレーションによって除いた。ろ過後（０．４ｍｍＳ＆Ｓ）、水性画分を３５℃で減圧下においてロータリーエバポレーターで濃縮した。残留する水性画分（約１０ｍｌ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スェーデン）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより分画化した。
【０４０８】
ＩＩ  活性画分ＣＳＴ−２００１の精製および性質：
多段階精製プロトコルを、粗抽出物の活性と類似する活性を示す活性画分を得るために設計した。アッセイするプロセスをより容易にするために、１色素迅速アッセイ（ＬＧ迅速アッセイ、材料および実験手法の節において記載されるようなプロトコルＶＩＩＩ）を開発した。この迅速アッセイでは、抽出物が、ＬＧによる染色（図４０）および多くの他の色素による染色（示されず）を減少させることができるかが調べられる。阻害活性の程度が、ＬＧのＯＤ６３０ｎｍを使用して測定された（図４０）。
【０４０９】
ＣＳＴ−２００１を、材料および実験手法の節において詳述されるような精製スキームに従って粗抽出物から精製した。２．５マイクロｍｏｌのＭｇ２＋および／またはＣａ２＋の存在は、１色素迅速アッセイ（プロトコルＶＩＩＩ）におけるＣＳＴ−２００１の機能的活性のために非常に重要であることが見出された。
【０４１０】
ＣＳＴ−２００１は、蛍光フィンガープリント、元素分析を含めて、集中した化学的確認および機能的確認に付され、化学構造の情報が構造解明の過程で集められた。
【０４１１】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー：
粗抽出物（水において２ｍｌ）を、水により事前に平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０の１．５×８ｃｍのカラムに加えた。その後、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％および８０％（ｖ／ｖ）のメタノール：水の２回の４ｍｌずつによる連続した溶出、次いで、２０％、４０％、６０％および８０％（ｖ／ｖ）のアセトン：水の２回の４ｍｌずつによる連続した溶出を行った。得られた分画物を、ＬＧを阻害するそれらの能力について、また、プロアントシアニジン類の含有量に関して調べた（図４１）。これらの目的のために、２００ｍｌの各分画物をエバポレーションし、１００ｍｌの７０％エタノールに再溶解した。
【０４１２】
プロアントシアニジン類についての酸ブタノールアッセイ：
５０μｌのサンプル（７０％エタノールでのクロマトグラフィー分画物）、３００μｌの酸ブタノール（９５：５（ｖ／ｖ）のブタノール：濃ＨＣｌ）および１０μｌの鉄試薬（２ＮのＨＣｌにおける０．０４ＭのＦｅＮＨ４（ＳＯ４）２）を混合し、９５℃で５０分間インキュベーションし、冷却後、５４０ｎｍでの吸光度を求めた（図４１）。
【０４１３】
オリゴマー状およびポリマー状のプロアントシアニジン類：
オリゴマー状およびポリマー状のプロアントシアニジン類（図４１）をプールし、溶媒をロータリーエバポレーターでエバポレーションし、水溶液を凍結乾燥した。プロアントシアニジン類の収量は１００ｇのフィクス葉について１３０ｍｇの「オリゴマー」および８３ｍｇの「ポリマー」であった。
【０４１４】
ＣＳＴ２００１の蛍光スペクトル：
ＣＳＴ２００１の蛍光スペクトル研究をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ  ＬＳ５０ｂで行った。スペクトルは、酢酸中で、１つのピーク（３７５ｎｍで励起されたとき、４３０ｎｍにおける放射）を示した（図４２）。試験したとき、この蛍光フィンガープリントがＣＳＴ２００１精製の種々の段階で存在した。
【０４１５】
オリゴマー状プロアントシアニジン類のＨＰＬＣ：
オリゴマー状プロアントシアニジン類をＨＰＬＣ方法によって分離した。吸光度スペクトルをすべてのピークについて記録した。Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  Ｓｉ−６０の２５０−４（Ｍｅｒｃｋ）カラムを使用した。
【０４１６】
溶媒系：
Ａ−ジクロロメタン＋４％の５０％酢酸水溶液、
Ｂ−メタノール＋４％の５０％酢酸水溶液、
すべての溶媒はＨＰＬＣ規格であった。
グラジエント：
０分        流速：０．８ｍｌ／分    Ａ％：１００    Ｂ％：０、
１０分      流速：０．８ｍｌ／分    Ａ％：７０      Ｂ％：３０、
２０分      流速：０．８ｍｌ／分    Ａ％：５０      Ｂ％：５０、
２５分      流速：０．８ｍｌ／分    Ａ％：１４      Ｂ％：８６、
３０分      流速：０．８ｍｌ／分    Ａ％：７０      Ｂ％：０、
３４．８分  流速：０．８ｍｌ／分    Ａ％：７０      Ｂ％：０、
３４．９分  流速：０．１ｍｌ／分    Ａ％：７０      Ｂ％：０、
検出：
ダイオードアレイ、２２０〜６００ｎｍ；８００ｍｓ；６ｎｍ。
【０４１７】
ＮＭＲおよびＣＳＴ−２００１構造解明
ＣＳＴ２００１の化学的性質およびフィンガープリントを表すさらなる情報をＮＭＲ（図４３）およびＮＭＲ−１Ｈ（図４４）によって得た。精製されたプロアントシアニジン類をＵＶスペクトル（ｌｍａｘ＝２８０ｎｍ）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルによって特徴づけた。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより、オリゴマー状およびポリマー状の化合物がプロアントシアニジン類（縮合タンニン）から構成されることが確認された。２つのオリゴマー形態が示される（図４５および図４６）。ＮＭＲスペクトル分析によれば、ＣＳＴ２００１はステアリン酸の誘導体（ＭＷ＝３８４）であった。ＮＭＲスペクトル分析の結果は、ＣＨ３−０．９１ｐｐｍ；α−ＣＨ２−２．３９ｐｐｍ；β−ＣＨ２−１．６５ｐｐｍ；（ＣＨ２）１４−１．３２ｐｐｍ；ＣＨ２−ｄｑ、３．７５ｐｐｍ；ＣＨ−ｍ、４．０６ｐｐｍ；およびＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ−４．２ｐｐｍを示した。ＣＳＴ２００１についての提案される化学式はＣ２３Ｈ４４Ｏ４であった。
【０４１８】
実施例１４
悪性細胞および正常化細胞との粗植物抽出物の示差的相互作用
粗抽出物の場合と同様に、ＣＳＴ−２００１における蛍光シグナルの存在は、示差的な細胞内分布の特徴のために抽出物またはＣＳＴ−２００１により処理されている細胞におけるこのシグナルの検出を可能にした。インキュベーション後の蛍光を観測したとき、本発明者らは、粗植物抽出物が、表現型が正常な細胞または悪性の細胞と異なって相互作用する傾向があることを見出した。検出されたシグナルが実際に抽出物において生じ、実験の何らかの他の関与した成分から生じていなかったことを確実にするために、実験に使用されていない非処理細胞の背景蛍光のレベルを調べた。粗抽出物から生じた蛍光シグナルの一例が図４７Ａ〜図４７Ｃに示される（プロトコルＩＸに従う）。この実験では、ヒト結腸直腸腺ガン細胞（ＨＴ−２９、図４７Ａ）が、分化および表現型正常化を誘導するために酪酸ナトリウムにより処理された（図４７Ｂ）。加えて、初代結腸細胞（ＣＣＤ−３３Ｃ０）が正常のコントロールとして調べられた（図４７Ｃ）。核染色の強度における顕著な違いが認められた（矢印）。
【０４１９】
実施例１５
悪性細胞および正常化細胞との濃縮ＣＳＴ−２００１の示差的相互作用
核区画における蛍光の表現型特異的な分布が、Ｍｇ＋２またはＣａ＋２を用いて濃縮されたＣＳＴ−２００１（濃縮ＣＳＴ−２００１）について、また、粗抽出物について同じであった一方、シグナルのコントラスおよび強度、ならびに、シグナル対背景の比率が、粗抽出物ではなく、むしろ、濃縮ＣＳＴ−２００１を使用して、劇的に改善された。以前に記載されたプロトコル（ＩＸ）を使用したとき、本発明者らは、形質転換された細胞または悪性細胞の核がそれらの各々の正常な対応体または処理された対応体よりもかなり小さい蛍光を有したことを再び観測した。
【０４２０】
この現象の範囲を検討するために、悪性細胞、正常細胞、および、酪酸ナトリウムまたはＡＴＲＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸）を使用して正常化されている細胞の様々な組を使用する非常に多数の細胞モデルを確立した。これらのモデルには、ヒト乳ガンＭＣＦ−７（図４８Ａ〜図４８Ｆ）、ヒト結腸ガンＨＴ−２９（図４９Ａ〜図４９Ｂ）、正常なヒト結腸細胞（図４７Ｃおよび図４９Ｃ）、ヒト白血病Ｋ５６２（図５０Ａ〜図５０Ｂ）、ヒト白血病ＨＬ−６０細胞株（図５１Ａ〜図５１Ｂ）、ヒト白血病Ｕ９３７細胞株（示されず）、ならびに、Ｒａｔ１線維芽細胞およびＨａ−Ｒａｓ  Ｖ１２形質転換Ｒａｔ１（Ｒａｔ１−Ｒａｓ）細胞に基づくガン遺伝子標的由来の実験系（図５２Ａ〜図５２Ｂ）が含まれた。後者の系において、本発明者らはまた、Ｒａｔ１−Ｒａｓ細胞を、Ｒａｓ  Ｖ１２によって開始される悪性形質転換を阻止するＰＤ９８０５９（ＭＡＰＫＫ特異的阻害剤）により処理することの影響を調べた（図５２Ｃ）。すべての場合において、風乾により固定処理された細胞が、濃縮ＣＳＴ−２００１、または、溶媒コントロールとしての７０％エタノールのいずれかとインキュベーションされた（プロトコルＩＸ）。
【０４２１】
濃縮ＣＳＴ−２００１による処理の後、ＣＳＴ−２００１から生じる蛍光が細胞の細胞質および核の内部において異なる様式で分配されている。悪性細胞における蛍光シグナルの局在化は、正常な細胞または転換剤処理の細胞とは本質的に異なった。研究された、表現型が悪性の細胞のすべてにおいて、蛍光は、核の強い蛍光（＋）が観測された、表現型が正常な細胞との比較では、核において非常に弱かった（−）。結果が下記の表１５にまとめられる。
2009528835.tif 000030
【０４２２】
実施例１６
生細胞とのＣＳＴ−２００１の示差的相互作用
ＣＳＴ２００１が２つの表現型を識別することができることを明らかにするために、Ｕ９３７白血病細胞を、表現型の正常化を誘導するために１．５μＭのＡＴＲＡと７２時間インキュベーションした。処理が終了したとき、ＣＳＴ２００１を培地に加え、ＡＴＲＡ処理のＵ９３７細胞および溶媒処理のＵ９３７細胞と２時間インキュベーションした。ＣＳＴ２００１から生じる蛍光を検出し、強度レベルがこれら２つの表現型の間で区別された（２倍、図５３Ａ〜図５３Ｂ）。
【０４２３】
天然ＣＳＴ２００１の自己蛍光は非常に弱かった。従って、いくつかの試みを、図５４におけるフロ−チャートに記載されるような異なる調節によって蛍光を増大させるために行った：ビオチン化［Ｗｉｌｃｈｅｋ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９８６）、１３８：８７２〜８７９によって記載される通りに］、および、複合体形成［Ｋａｒａｂｏｕｒｎｉｏｔｉｓ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ（１９９８）、８５（７）：１００７によって記載される通りに］。ビオチン化は、ストレプトアビジン−Ｃｙ３によって検出される特異的なシグナルにおける１０倍の増大をもたらした。図５５Ａ〜図５５Ｂは、天然ＣＳＴ２００１と、ビオチン化ＣＳＴ２００１との間でのシグナル強度における違いを例示する。
【０４２４】
ジフェニルホウ酸−エタノールアミン（Ｋａｒａｂｏｕｒｎｉｏｔｉｓ［Ｋａｒａｂｏｕｒｎｉｏｔｉｓ他、Ａｍｅｒ  Ｊ  ｏｆ  Ｂｏｔ（１９９８）、８５（７）：１００７〜１０１２］の研究に基づくＮａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬）との複合体形成は、ＦＡＣＳによって測定されたような強い蛍光増大（２６倍）をもたらした（図５６Ａ〜図５６Ｃ）。
【０４２５】
ＣＳＴ２００１はタンパク質との複合体を形成することができた。そのような複合体化は、放射拡散アッセイによって検出されたタンパク質沈殿化を誘導した。簡単に記載すると、ＢＳＡ含有アガロースゲルに、低下する濃度の抽出物を負荷した。ＢＳＡの沈殿リングが視認された（図５７）。このことは用量依存的な沈殿化プロセスを示している。このＣＳＴ２００１の能力は、ビオチン化ＢＳＡによるＵ９３７細胞可視化のために首尾よく利用された（図５８Ａ〜図５８Ｃ）。
【０４２６】
ＣＳＴ２００１に基づいて生細胞を染色することの３つの限定されない例が示された：ＭＣＦ−７の非処理細胞および処理細胞（図５９Ａ〜図５９Ｂ）、Ｒａｔ２正常細胞対Ｒａｔ２  Ｒａｓ  Ｖ１２悪性細胞（図６０Ａ〜図６０Ｂ）、および、胎盤起源の細胞（絨毛ガン、図６１Ａ〜図６１Ｃ）。
【０４２７】
実施例１７
正常なスナネズミの腎臓に対する糖尿病スナネズミの腎臓とのＣＳＴ−２００１の示差的相互作用
この糖尿病モデルは、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔ、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）において確立された（Ｋａｌｍａｎ他）。
【０４２８】
図６２Ａ〜図６２Ｄは、ＩＩ型糖尿病が誘導された動物モデルから調製される組織学切片の染色を示す。正常なスナネズミに由来する腎臓のＣＡＭＡ染色後の切片（図６２Ａおよび図６２Ｃ）、および、糖尿病スナネズミに由来する腎臓のＣＡＭＡ染色後の切片（図６２Ｂおよび図６２Ｄ）が示される。高倍率像（下段パネル）は糸球体構造に注目しており、このプロトコルによって可視化される糖尿病組織に関連する緑色の染色を強調する。この実験は、ＣＳＴ−２００１による正常組織および糖尿病組織の示差的な染色を示す。
【０４２９】
本明細書において具体的に示されたことおよび記述されたことによって本発明が限定されないことは、当業熟練者によって理解されるであろう。むしろ、本発明の範囲は、特許請求の範囲により限定される。
【０４３０】
本発明はその具体的な実施形態とともに記載されているが、多くの代替および改変および変化が当業者には明かであることはいうまでもないことである。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替および改変および変化を包含するものとする。
【０４３１】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０４３２】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０４３３】
【図１】起源不明のガン腫と組織病理学によって診断された男性患者に由来する胸水から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。
【図２】胸膜滲出液から調製される塗沫標本を示す。
【図３】乳房のガン腫と組織病理学によって診断された女性患者に由来する胸水から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。
【図４】起源不明のガン腫と組織病理学によって診断された男性患者に由来する胸水から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。
【図５ａ−ｄ】表５に示されるような６つ（１〜６）の染色状況の４つのパネル（Ａ〜Ｄ）を示す。
【図５ｅ−ｇ】表５に示されるような６つ（１〜６）の染色状況の３つのパネル（Ｅ〜Ｇ）を示す。
【図６】本発明による染色手法を使用して染色される、結腸ガンと診断された患者から得られる組織学的切片を示す。
【図７】ジメチルヒドラザン誘導の結腸ガン動物モデルから調製され、新規な染色プロトコルにより染色される組織学的切片を示す。
【図８】卵巣肉腫と組織病理学によって診断された女性患者から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される塗沫標本を示す。
【図９】４対の組織学切片を示す。
【図１０】ガン腫病巣を含有する乳房組織から調製され、本発明による染色手法を使用して染色される腫瘍インプリントを示す。
【図１１】上皮内高度扁平上皮異型（ＨＧＳＩＬ）と診断された女性から得られるＰａｐ塗沫標本を示す。
【図１２】本発明による染色手法を使用して染色される子宮頸部塗沫標本における臨床的に重要な様々な前悪性状態および他の状態を示す。
【図１３】本発明による染色手法を使用して染色されるＰａｐ塗沫標本を示す。
【図１４】乳ガンと診断された６５歳男性患者の胸水から調製される風乾されたサイトスピン塗沫標本を示す。
【図１５】ラット動物モデルにおけるジメチルヒドラザン誘導による結腸ガンの組織学切片の染色を示す。
【図１６】ラット動物モデルにおけるジメチルヒドラザン誘導による結腸ガンの組織学切片の染色を示す。
【図１７】メラノーマ腫瘍の組織学切片の染色を示す。
【図１８】神経膠芽細胞腫を有するラット脳モデルを示す。
【図１９】正常な生理学的胚形成の期間中での染色における変化を示す。
【図２０】正常細胞および腺ガン細胞の示差的な染色を示す。
【図２１】基準化学化合物による前処理の後でのＨＴ−２９細胞の足場依存的成長を示す。
【図２２】ＨＴ−２９（ヒト結腸ガン細胞）における表現型薬物スクリーニング結果を示す。
【図２３】ＨＴ−２９（ヒト結腸ガン細胞）における表現型薬物スクリーニング結果を示す。
【図２４】ＨＴ−２９細胞の染色に対するゲニステインの影響を示す。
【図２５】ヌードマウスにおけるＨＴ−２９細胞の腫瘍原性に対する細胞処理の影響を示す。
【図２６】ＨＴ−２９細胞の酪酸塩誘導による一時的な表現型変化を示す。
【図２７】ハイスループットスクリーニング（ＨＳＴ）の結果を示す。
【図２８】ハイスループットスクリーニング（ＨＳＴ）の結果を示す。
【図２９】構築物の設計を示す。
【図３０】軟寒天における足場依存的成長を示す。
【図３１】染色タイプに対する、Ｒａｓ  Ｖ１２誘導による形質転換の影響を示す。
【図３２】染色タイプに対する、Ｒａｓ  Ｖ１２発ガン遺伝子のシグナル伝達阻害の影響を示す。
【図３３】種々の濃度のシグナル伝達経路阻害剤によって処理されたＲａｔ１  Ｒａｓ細胞およびＲａｔ１細胞におけるＲａｓ／ＭＡＰＫ経路表現型薬物スクリーニングを示す。
【図３４】Ｇｌｅｅｖｅｃによって誘導されるＫ５６２赤白血病細胞の分化、ならびに、染色およびヘモグロビン産生に対するその影響を示す。
【図３５】Ｇｌｅｅｖｅｃの種々の用量によって誘導される分化、ならびに、染色、細胞数およびヘモグロビン産生に対するその影響を示す。
【図３６】ＨＬ−６０細胞（ヒト急性骨髄性白血病細胞株）のａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）誘導による分化を示す。
【図３７】Ｕ９３７細胞（単球性白血病／組織球性リンパ腫細胞株）のＩＦＮ−ガンマ誘導による分化を示す。
【図３８】Ｕ９３７細胞の、ＩＦＮ−ガンマまたは酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）により誘導される分化を示す。
【図３９】表現型薬物スクリーニング方法の可能性を示す。
【図４０】抽出物による染色の濃度依存的阻害を示す。
【図４１】Ｒａｔ２−ＲａｓＶ１２細胞におけるＬＧ阻害に対する、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０精製された粗抽出物分画物の生物学的影響を示す。
【図４２】酢酸における抽出物活性（ＣＳＴ２００１）の蛍光フィンガープリントを示す。
【図４３】ＣＳＴ２００１のポリマー分画物およびオリゴマー分画物のＮＭＲフィンガープリントを示す。
【図４４】ＣＳＴ２００１のＮＭＲフィンガープリントを示す。
【図４５】ＣＳＴ−２００１のオリゴマー形態の化学構造を示す。
【図４６】ＣＳＴ−２００１の代わりのオリゴマー形態の化学構造を示す。
【図４７】悪性細胞および正常細胞との粗植物抽出物の示差的な相互作用を示す。
【図４８】ヒト乳ガン（ＭＣＦ−７）細胞とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。
【図４９】ヒト結腸細胞とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。
【図５０】ヒト白血病Ｋ５６２細胞株とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。
【図５１】ヒト白血病ＨＬ−６０細胞株とのＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。
【図５２】Ｒａｔ１系におけるＣＳＴ２００１の示差的な相互作用を示す。
【図５３】生存しているＵ９３７白血病細胞とのＣＳＴ２００１（天然）の示差的な相互作用を示す。
【図５４】ＣＳＴ−２００１標識化のための種々の可能性のフローチャート図を示す。
【図５５】Ｕ９３７白血病細胞におけるビオチン化ＣＳＴ２００１の可視化を示す。
【図５６】Ｕ９３７細胞においてＮａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬（ＮＲ）を使用する金属との複合体におけるＣＳＴ２００１の蛍光シグナルを示す。
【図５７】沈殿形成によって可視化される、ＣＳＴ２００１と、ＢＳＡとの間で形成される複合体の放射拡散アッセイを示す。
【図５８】Ｃｙ３結合アビジンを使用するビオチン化ＣＳＴによる細胞の染色を示す。
【図５９】生存ＭＣＦ−７腺ガン細胞の、ＣＳＴ２００１＋Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬（ＮＲ）による示差的な蛍光染色を示す。
【図６０】生存Ｒａｔ２細胞の、ＣＳＴ２００１＋Ｎａｔｕｒｓｔｏｆｆ試薬（ＮＲ）による示差的な蛍光染色を示す。
【図６１】ＣＳＴ２００１による示差的な蛍光染色を示す。
【図６２】ＩＩ型糖尿病が誘導された動物モデルから調製される組織学切片の染色を示す。
【図２１】
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【図２５】
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【図２９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図５４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ−ｄ】
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【図５ｅ−ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【国際調査報告】
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