(57)【要約】  ハロヒドリンデハロゲナーゼの存在下で式(1)のエポキシドをシアン酸と反応させることによる、式(2a)または(2b)の光学的に富化されたオキサゾリジノンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハロヒドリンデハロゲナーゼの存在下で式(1)のエポキシドをシアン酸と反応させること：
【化１】
2009528039.tif 000003
［式中、R1およびR2は、互いに独立して、水素、置換されていてもよいアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基から選択される（ただしR1 ≠ R2）。]
および光学的に富化されたオキサゾリジノンを回収すること
による、式(2a)または(2b)の光学的に富化されたオキサゾリジノンの製造方法。
【請求項２】
R1およびR2が-H、-(CH2)n -CH3（n=0〜n=8）の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハロヒドリンデハロゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは少なくとも90％の配列同一性を有するその相同体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
温度が0〜60℃である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的に富化されたオキサゾリジノンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Nakamuraらによる、Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, Vol 180, No.1, 124-130には、β-ヒドロキシニトリルの合成のためのハロヒドリンハロゲン化水素リアーゼの新しい触媒機能が記載されている。
【０００３】
Spelbergらによる、Tetrahedron Asymmetry 2002, 13, 1083-1089では、アグロバクテリウムラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）からのハロヒドリンデハロゲナーゼの生体触媒の潜在性が分析されている。
【０００４】
WO 2005/017141には、改良されたハロヒドリンデハロゲナーゼおよび関連するポリヌクレオチドが開示されている。
【０００５】
US 2003/0124693A1には、エポキシドの酵素的変換が開示されている。
【０００６】
WO 01/90397には、種々の求核試薬を用いた、エポキシドの対応するアルコールへの酵素的変換が開示されている。
【特許文献１】WO 2005/017141
【特許文献２】US 2003/0124693A1
【特許文献３】WO 01/90397
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, Vol 180, No.1, 124-130
【非特許文献２】Tetrahedron Asymmetry 2002, 13, 1083-1089
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ハロヒドリンデハロゲナーゼの存在下で式(1)のエポキシドをシアン酸と反応させること：
【化１】
2009528039.tif 000002
【０００８】
［式中、R1およびR2は、互いに独立して、水素、置換されていてもよいアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基から選択される（ただし、R1 ≠ R2）。]
および光学的に富化されたオキサゾリジノンを回収すること
による、式(2a)または(2b)の光学的に富化されたオキサゾリジノンの製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
使用する酵素はハロヒドリンデハロゲナーゼである。非常に好適なハロヒドリンデハロゲナーゼは、配列表(配列番号１)に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドあるいはその相同体または機能的誘導体である。本発明において、用語「相同体」は、少なくとも90％相同性がある配列、および相同体の配列と好ましくは少なくとも90％同一である配列を意味する。機能的誘導体は、ポリペプチドの酵素活性および触媒活性を実質的に損なうことなく誘導体化または修飾したポリペプチドである。使用することができる酵素の好適な例は、アグロバクテリウムラジオバクター(CBS 750.97)、マイコバクテリウム属の種（Mycobacterium sp.）菌株GP1(Poelarends et al J. Bacteriol., 1999, 181, 2050)またはアルスロバクター属の種（Arthrobacter sp.）菌株AD2(van den Wijngaard et al., J. Bacteriol., 1991, 124)のハロヒドリンデハロゲナーゼである。
【００１０】
特に良好な結果は、1997年5月7日に寄託番号CBS 750.97でCentraal Bureau voor de Schimmelculturesに寄託されたアグロバクテリウムラジオバクター菌株AD1由来のハロヒドリンデハロゲナーゼ(HheC)を用いることにより得られる。この微生物から得られる別の酵素は、そのエポキシドヒドロラーゼ活性について、国際特許出願WO 98/53081に広範に記載されている。
【００１１】
本発明で使用する酵素、ハロヒドリンデハロゲナーゼは、エポキシドヒドロラーゼとは異なることに注目されたい。後者は、Archer, Tetrahedron, 53 (1997), pp. 15617-15662に広範に記載されている。両方のタイプの酵素が共通に有する唯一の特徴は、それらがアグロバクテリウムラジオバクター菌株AD1から単離することができることである。同様に、Lutje Spelberg et al., Tetrahedron: Asymmetry, 9 (1998), pp. 459-466および欧州特許出願EP 0 879 890は、エポキシドヒドロラーゼの応用に関する。
【００１２】
ハロヒドリンデハロゲナーゼの方法条件下での活性、安定性、およびエナンチオ選択性は、当技術分野で公知の方法、例えば不安定な基を除去し、エナンチオ選択性を改変するための部位特異的突然変異誘発、遺伝子シャフリングを用いた指向性進化、部位飽和突然変異誘発、またはstructure-inspiredランダム突然変異誘発、または変異性PCRにより改良することができる。これらの方法は、当技術分野で公知である(Powell et al., 2001, ACIE 40, 3948; Otten and Quax, 2005, Biomol. Eng. 22, 1; Williams et al., 2004, Cell MolLife Sci 61:3034)。増大した活性およびエナンチオ選択性を有する変異体(Tang et al., 2005, Biochemistry 44, 6609; Tang et al., 2003, Biochemistry 42, 14057)および改良された安定性を有する変異体(Tang et al., 2002, Enz Microb Techn. 30, 251)の構築により近年示されたように、このような突然変異誘発法は、ハロヒドリンデハロゲナーゼの性能を改良するために適用することができる。
【００１３】
改良されたハロヒドリンデハロゲナーゼは、例えばWO 2005/018579 A2およびWO 2005/017141 A1に開示されている。導入された変異にはSerによるCysの置換が含まれる。さらに改良されたハロヒドリンデハロゲナーゼは、配列番号1の位置134(Thr)への変異の導入、特にAlaによるThrの置換のような置き換えにより生産することができる。
【００１４】
酵素は、全細胞として加えることができ、粗抽出物または精製酵素として凍結乾燥された形態で加えることができる。酵素は、セルロース、セファデックスまたはデキストランのような巨視的な担体上に固定することができる。酵素は、架橋された酵素結晶(CLEC)として適用することも、または逆ミセル中に取り込むこともできる。通常の実験において、酵素溶液は、求核試薬およびエポキシドを含む緩衝液と混合する。場合により、酵素を安定化させるために、反応混合物にメルカプトエタノールまたはグリセロールのような添加剤を加えることができる。
【００１５】
式(1)のエポキシドは、スルホニウムイリドを用いて対応するケトンから(Mosset, P.; Gree, R. Syn. Comm. 1985, 15, 749-757)、またはm-CPBA(メタ-クロロ過安息香酸)のようなペルオキシカルボン酸を用いたアルケンの酸化により(Schwartz, N. N.; Blumbergs, J. H. J. Org. Chem. 1964, 29, 1976-1979)調製することができる。
【００１６】
R1およびR2基は、互いに独立して、水素、置換されていてもよい芳香族基または脂肪族基であり、好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個の炭素原子を含む。好ましくは、R1およびR2は、水素、置換されていてもよいアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、シクロアルキル、およびアルコキシ基の群から選択される。式(2a)または(2b)の光学的に富化した第３級オキサゾリジノンは、R1がR2と化学的に異なる場合に限り、本発明の方法により製造することができる。
【００１７】
R1またはR2により表されるアルキル基の好ましい例には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基またはドデシル基のような1〜15個の炭素原子を有する直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が含まれる。
【００１８】
さらに好ましい残基は、R1およびR2が、H、-(CH2)n -CH3（n=0〜n=8）、-C6H5(フェニル)、-(CH2)n-(C6H5) (アリールアルキル)、-C6H11(シクロヘキシル)、CH2CO2R3の群から選択され、R3は-CH3(メチル)、-C2H5(-エチル)、-C(CH3)3(tert-ブチル)から選択される残基である。
【００１９】
アルキル基はハロゲン原子のような置換基を有していてもよく、アルキル基はヒドロキシル基のような置換基を有していてもよく、例えばグリシドールであることができる。アルキル基は、アミノ、メチルアミノまたはジメチルアミノのような非置換または置換のアミノ基を有していてもよい。R1またはR2により表されるアリール基の例には、フェニル基およびナフチル基が含まれる。芳香環上に１つまたは複数の置換基を有するスチレンオキシド誘導体は、フェニル基の例である。エポキシドの代表的な例は、スチレンオキシド、4-ニトロスチレンオキシド、2-ニトロスチレンオキシド、3-ニトロスチレンオキシド、3-クロロスチレンオキシド、4-クロロスチレンオキシドまたは2,3-ジクロロスチレンオキシドである。R1またはR2により表されるアラルキル基の例には、ベンジル基、2-フェニルエチル基および1-ナフチルメチル基が含まれる。R1またはR2により表されるアルケニル基の例には、ビニル基、アリル基および5-ヘキセニル基が含まれる。R1またはR2により表されるシクロアルキル基の例には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が含まれる。R1またはR2により表されるアルコキシ基の例には、フェノキシ基、4-ニトロフェノキシ基、ナフチルオキシ基、メトキシ基、ヘキシルオキシ基およびビニルオキシ基が含まれる。
【００２０】
エポキシド(1)は、反応媒質中に、1〜300 mMの濃度で溶解した形態で、または最高300 mMまでの濃度で第２の固相もしくは液相として存在することができる。エポキシド自体が第２の相であってもよいし、エポキシドを第２の有機相中に溶解させることもできる。これは、ヘキサンまたはオクタンのような水と混合しない有機溶媒中にエポキシドを溶解させることにより行うことができる。次に、得られた溶液を酵素を含む水相に接触させ、２つの相を激しく混合する。このような第２の相の使用には、反応後のエポキシドとアルコールの分離を簡単にすることができるという利点がある。一般に、アルコールは水相中に溶解して残存すると予想され、エポキシドは通常有機相から回収することができる。エポキシドを変換する前に、好ましくはエポキシドが水性媒質とエポキシドを合わせた重量に基づいて0.01〜20重量％の量で存在する水性媒質中に、エポキシドを加えることが好ましい。
【００２１】
反応は、エポキシド(1)を溶解させる、または第２の固相もしくは液相として加える緩衝水性媒質中で行われることが好ましい。好適な緩衝液は、例えばトリス-緩衝液(H2SO4を用いて所望のpHに調整した2アミノ-2-(ヒドロキシルメチル)-1,3プロパンジオール)、グリシン-緩衝液(NaOHを用いて所望のpHに調整したグリシン)、リン酸緩衝液またはMOPS緩衝液(NaOHを用いて所望のpHに調整した4-モルホリンプロパンスルホン酸)である。これらは、好ましくは50〜250 mMの濃度で使用される。
【００２２】
場合により、エポキシド(1)の溶解度を増加させるために、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルのような共溶媒を加えてもよい。共溶媒は5体積％〜最高50体積％までの量で加えることができる。共溶媒の割合の増加は、エポキシド(1)の溶解性に有利に働き得る。しかし、高めの共溶媒濃度においては、不都合な酵素の不活性化が観察され得る。
【００２３】
媒質のpHは、好ましくは3〜12、さらに好ましくは6.5〜8である。反応を行う温度は、好ましくは0〜60℃、さらに好ましくは20〜30℃である。
【００２４】
本発明の方法において反応するシアン酸(cyanate)は、好ましくはシアン酸ナトリウムまたはシアン酸カリウムのようなシアン酸アルカリとして加えられる。
【００２５】
反応後、反応混合物全体は、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはトルエンのような有機溶媒を用いて抽出することができる。反応しないまたは非常にゆっくりとしか反応しないエポキシドエナンチオマーと式(2a)または(2b)の光学的に富化されたオキサゾリジノンはその後、結晶化(固体物質の場合)、分留または例えば溶離液としてヘプタン/酢酸エチル(比7:3)を用いたシリカ60H上でのフラッシュクロマトグラフィーのような技術あるいは当技術分野で周知の他の分離技術により分離することができる。
【００２６】
エポキシドとオキサゾリジノン(2a)または(2b)とのエナンチオマー組成は、キラルガスクロマトグラフィーまたはキラルHPLCを用いて決定することができる。
【００２７】
分離した光学的に富化されたエポキシドは、さらなる合成工程、特に求核剤を用いた開環に使用することができ、これにより光学的に純粋な形態の置換第３級アルコールを製造することが可能となる。
【００２８】
本発明を、以下の非制限的な実施例により、さらに説明する。
【実施例１】
【００２９】
250 mMolのラセミ体の2-エチルオキシラン(式1、R1=H; R2 = Et)を500mMolトリス-SO4緩衝液(pH 7.5)に溶解し、次に精製酵素(トリス緩衝液中の1 wt％のハロヒドリンデハロゲナーゼHheC)および125 mMol NaOCNを加えた。反応混合物を室温(24℃)で攪拌し、ガスクロマトグラフィー(GC)によりモニターした。反応を24時間後に停止し、酢酸エチルを加えることにより３回抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、蒸発濃縮した。粗生成物を、溶離液としてペンタン/CH2Cl2(4:6)を用いたシリカゲル60 H上でのクロマトグラフィーにより精製した。これにより、5R-5-エチルオキサゾリジン-2-オン(収率35％、e.e.82％)を得た。Chiraldex G-TA カラム(30 m x 0.25 mm x 0.25 mm)を用いたGCにより光学純度を測定した。NMRデータは合成されたラセミ体の基準化合物のものと同一であった。
【実施例２】
【００３０】
250 mMolのラセミ体の2-エチル-2-メチルオキシラン(式1、R1= Me; R2 = Et)を500mMolトリス-SO4緩衝液(pH 7.5)に溶解し、次に精製酵素(トリス緩衝液中の1 wt％のハロヒドリンデハロゲナーゼ HheC)および125 mMolNaOCNを加えた。反応混合物を室温(24℃)で攪拌し、ガスクロマトグラフィー(GC)によりモニターした。反応を7時間後に停止し、酢酸エチルを加えることにより３回抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、蒸発濃縮した。粗生成物を、溶離液としてペンタン/CH2Cl2(4:6)を用いたシリカゲル60 H上でのクロマトグラフィーにより精製した。これにより、5R-5-エチル-5-メチルオキサゾリジン-2-オン(収率40％、e.e.97％)を得た。Chiraldex G-TA カラム(30 m x 0.25 mm x 0.25 mm)を用いたGCにより光学純度を測定した。NMRデータは合成されたラセミ体の基準化合物のものと同一であった。
【配列表】
2009528039000001.app
【国際調査報告】
2009528039.tif 000004
2009528039.tif 000005
2009528039.tif 000006