(57)【要約】本発明は、髄鞘形成、ニューロンの生存および希乏突起膠細胞の分化の促進方法、ならびにＴｒｋＡアンタゴニストの投与により髄鞘脱落および髄鞘発育不全疾患を処置するための方法に関する。本発明はまた、ＴｒｋＡアンタゴニストの使用によりＳｐ３５発現を阻害または低減させる方法に関する。さらに、本発明は、一般的に、Ｓｐ３５とＴｒｋＡの相互作用をブロックするため、およびＳｐ３５アンタゴニストの投与によりＴｒｋＡリン酸化を阻害または低減させるための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＳニューロンと希乏突起膠細胞の混合物を、
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片；
（ｉｖ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｖ）ＴｒｋＡアプタマー；および
（ｖｉ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物と接触させることを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの髄鞘形成を促進するための方法。
【請求項２】
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片；
（ｉｖ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｖ）ＴｒｋＡアプタマー；および
（ｖｉ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物の有効量を、ＣＮＳニューロンの髄鞘形成を必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＣＮＳニューロンの髄鞘形成を促進するための方法。
【請求項３】
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片；
（ｉｖ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｖ）ＴｒｋＡアプタマー；および
（ｖｉ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物の治療有効量を、髄鞘発育不全または髄鞘脱落と関連する疾患、障害または損傷の処置を必要とする哺乳動物に投与することを含む、
哺乳動物における髄鞘発育不全または髄鞘脱落と関連する疾患、障害または損傷を処置するための方法。
【請求項４】
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片；
（ｉｖ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｖ）ＴｒｋＡアプタマー；および
（ｖｉ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物の有効量を、ＣＮＳニューロンの生存の促進を必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＣＮＳニューロンの生存を促進するための方法。
【請求項５】
ＣＮＳニューロンを、
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片；
（ｉｖ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｖ）ＴｒｋＡアプタマー；および
（ｖｉ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物と接触させることを含む、ＣＮＳニューロンにおけるＳｐ３５発現を阻害するための方法。
【請求項６】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストがＴｒｋＡアンタゴニスト化合物である、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物が、Ｋ２５２ａ；Ｋ２５２ａ誘導体；リドカイン；ブピバカイン；プロカイン；１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ［４，３−α］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ）；メチル水銀；エンドカンナビノイドアナンダミド；ＣＥＰ−７０１；ＣＥＰ−７５１；ＰＤ０９８０５９；タモキシフェン；ツニカマイシン；３−モルホリノシドノンイミン（Ｓｉｎ−１）；トリホスチンＡＧ８７９；ハービマイシンＡ；ゲニステイン；５−アザシチジン；およびトリホスチンＲＧ５０８９６４からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物がＫ２５２ａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストがＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドである、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドが、
（ｉ）配列番号：４の３６〜６８；
（ｉｉ）配列番号：４の９０〜１１３；
（ｉｉｉ）配列番号：４の１１５〜１３７；
（ｉｖ）配列番号：４の９０〜１３７；
（ｖ）配列番号：４の６８〜１４０；
（ｖｉ）配列番号：４の１４１〜１９２；
（ｖｉｉ）配列番号：４の２１１〜２６９；
（ｖｉｉｉ）配列番号：４の２１１〜２８３；
（ｉｘ）配列番号：４の１９４〜２６９；
（ｘ）配列番号：４の１９４〜２８３；
（ｘｉ）配列番号：４の２９９〜３６５；
（ｘｉｉ）配列番号：４の３６６〜４０７；
（ｘｉｉｉ）配列番号：４の３６６〜４２４；
（ｘｉｖ）配列番号：４の１〜６８；
（ｘｖ）配列番号：４の１〜１１３；
（ｘｖｉ）配列番号：４の１〜１３７；
（ｘｖｉｉ）配列番号：４の１〜１４０；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：４の１〜１９２；
（ｘｉｘ）配列番号：４の１〜２６９；
（ｘｘ）配列番号：４の１〜２８３；
（ｘｘｉ）配列番号：４の１〜３６５；
（ｘｘｉｉ）配列番号：４の１〜４０７；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号：４の１〜４３９；
（ｘｘｉｖ）配列番号：４の３６〜６８；
（ｘｘｖ）配列番号：４の３６〜１１３；
（ｘｘｖｉ）配列番号：４の３６〜１３７；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号：４の３６〜１４０；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：４の３６〜１９２；
（ｘｘｉｘ）配列番号：４の３６〜２６９；
（ｘｘｘ）配列番号：４の３６〜２８３；
（ｘｘｘｉ）配列番号：４の３６〜３６５；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号：４の３６〜４０７；
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号：４の３６〜４３９；
（ｘｘｘｉｖ）配列番号：４の１９４〜２６９；
（ｘｘｘｖ）配列番号：４の１９４〜２８３；
（ｘｘｘｖｉ）配列番号：４の１９４〜３６５；
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号：４の２１１〜２６９；
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号：４の２１１〜２８３；
（ｘｘｘｉｘ）配列番号：４の２１１〜３６５；
（ｘｌ）配列番号：４の２９９〜３６５；
（ｘｌｉ）配列番号：４の１〜４４１；
（ｘｌｉｉ）配列番号：４の３６〜４４１；
（ｘｌｉｉｉ）配列番号：４のＸ〜Ｙ；
（ｘｌｉｖ）配列番号：４のＸ１〜Ｙ１；
（ｘｌｖ）かかるポリペプチドの断片、変異体または誘導体；および
（ｘｌｖｉ）前記ポリペプチド断片またはその変異体もしくは誘導体のいずれかの少なくとも２つの組合せ
からなる群より選択され、
Ｘは配列番号：４のアミノ酸１〜４０であり、Ｙは配列番号：４のアミノ酸６０〜４５０であり、Ｘ１は配列番号：４のアミノ酸１〜３６であり、Ｙ１はアミノ酸３６０〜４４５である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドが配列番号：４の１〜４４１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドが、さらに非ＴｒｋＡ部分を含む、請求項９〜１１いずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記非ＴｒｋＡ部分が、前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドに融合されたポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ＴｒｋＡ部分が、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製助長部分からなる群より選択される、請求項１２または１３いずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ＴｒｋＡ部分が抗体Ｉｇ部分である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体Ｉｇ部分がヒンジとＦｃ部分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドがポリマーにコンジュゲートされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドが、１、２、３または４つのポリマーにコンジュゲートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリマーの総分子量が５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストがＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片である、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片が、ＴｒｋＡモノクローナル抗体；ＭＣ１９２；ＭＮＡＣ１３モノクローナル抗体；またはＡＢ１５７７抗体のＦａｂ断片からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストがＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドである、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドが、
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
（ｉｖ）低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドが、ＴｒｋＡ  ｍＲＮＡのコード部分に相補的な少なくとも１０塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドがリボザイムである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストがＴｒｋＡアンタゴニストアプタマーである、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＮＳニューロンが哺乳動物中に存在し、前記接触させることが、有効量の前記ＴｒｋＡアンタゴニストを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、請求項１〜２または４〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物が、髄鞘脱落、髄鞘発育不全または神経変性を伴う疾患、障害または損傷を有すると診断されている、請求項２または４いずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患、障害または損傷が、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後損傷、化学療法の神経系の合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン‐コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ‐ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、急性播種性脳炎、ギヤン‐バレー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病およびベル麻痺からなる群より選択される、請求項３または３３いずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患、障害または損傷が多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストがボーラス注射または長時間注入によって投与される、請求項２〜４または３２いずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストが直接、中枢神経系内に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストが直接、ＭＳの慢性病変部内に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストが、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド；ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；およびＴｒｋＡアプタマーからなる群より選択される、請求項１〜３８いずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）ＣＮＳニューロン内に、前記ＴｒｋＡアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを導入すること、および（ｂ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストを発現させることを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドが前記ＣＮＳニューロン内に、
（ａ）トランスフェクション；
（ｂ）エレクトロポレーション；
（ｃ）形質導入；および
（ｄ）直接マイクロインジェクション
からなる群より選択される方法によって導入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＮＳニューロンが哺乳動物中に存在し、前記導入することが、（ａ）前記哺乳動物に、前記ＴｒｋＡアンタゴニストをコードする前記ポリヌクレオチドを投与すること、および（ｂ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストを発現させることを含む、請求項３９〜４１いずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの発現能を有する培養宿主細胞内に投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターとして投与される、請求項３９〜４３いずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドが前記哺乳動物の疾患、障害または損傷の部位またはその付近に導入される、請求項３９〜４５いずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記培養宿主細胞が、（ａ）レシピエント宿主細胞を、請求項４０のポリヌクレオチドまたは請求項４４もしくは請求項４５のベクターで形質転換またはトランスフェクトすること、および（ｂ）前記形質転換またはトランスフェクト宿主細胞を培養することを含む方法によって作製される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記宿主細胞が処置される哺乳動物由来である、請求項４３〜４７いずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パルボウイルスベクターおよびポックスイルスベクターからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヘルペスウイルスベクターが、単純疱疹ウイルスベクターおよびエプスタイン‐バーウイルスベクターからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記レンチウイルスベクターがｐＬＬ３．７である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記パルボウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴｒｋＡアンタゴニストが、局所的投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって投与される、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ＣＮＳニューロンと希乏突起膠細胞の混合物を、
（ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
（ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）Ｓｐ３５アプタマー；および
（ｖ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物と接触させることを含む、Ｓｐ３５とＴｒｋＡの相互作用をブロックするための方法。
【請求項５６】
ＣＮＳニューロンを、
（ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
（ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）Ｓｐ３５アプタマー；および
（ｖ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物と接触させることを含む、ＴｒｋＡリン酸化を阻害するための方法。
【請求項５７】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストが可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを含む、請求項５５または５６いずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、
（ｉ）Ｓｐ３５  Ｉｇドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、
（ｉｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、
（ｉｉｉ）Ｓｐ３５細胞質ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、
（ｉｖ）Ｓｐ３５膜貫通ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、
（ｖ）ＬＲＲドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体のＣ末端のＳｐ３５塩基性領域、および
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の前記Ｓｐ３５ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体の少なくとも２つの組合せ
からなる群より選択されるＳｐ３５領域を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、
（ｉ）Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、
（ｉｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、
（ｉｉｉ）Ｓｐ３５細胞質ドメイン、
（ｉｖ）Ｓｐ３５膜貫通ドメイン、
（ｖ）ＬＲＲドメインのＣ末端のＳｐ３５塩基性領域、および
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の前記Ｓｐ３５ドメインの少なくとも２つの組合せ
からなる群より選択されるＳｐ３５領域を欠いている、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、Ｓｐ３５膜貫通ドメインおよびＳｐ３５細胞質ドメインを欠いている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、
（ｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体、
（ｉｉ）ＬＲＲドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体のＣ末端のＳｐ３５塩基性領域、および
（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体
を含む、請求項５７〜６０いずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインの少なくとも一部分を含むが、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、Ｓｐ３５膜貫通ドメインおよびＳｐ３５細胞質ドメインを欠いている、請求項５９  または請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３３；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３５；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜６４；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜６４；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸６６〜８９；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸９０〜１１３；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１１４〜１３７；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１３８〜１６１；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１６２〜１８５；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸１８６〜２０９；
（ｘｉ）配列番号：２のアミノ酸２１０〜２３３；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２３４〜２５７；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５８〜２８１；
（ｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸２８２〜３０５；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３０６〜３２９；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３３０〜３５３；
（ｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６３〜４１６；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸４１７〜４２４；
（ｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸４１９〜４９３；
（ｘｘ）配列番号：２のアミノ酸４９４〜５５１、
（ｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜６４；
（ｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜８９；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜１１３；
（ｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜１３７；
（ｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜１６１；
（ｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜１８５；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２０９；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２３３；
（ｘｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜２５７；
（ｘｘｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜２８１；
（ｘｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３０５；
（ｘｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３２９；
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３５３；
（ｘｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜４１６；
（ｘｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜４２４；
（ｘｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜４９３；
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５５１；
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５３１
（ｘｘｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜５３２；
（ｘｌ）配列番号：２のアミノ酸３４〜８９；
（ｘｌｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１１３；
（ｘｌｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１３７；
（ｘｌｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１６１；
（ｘｉｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１８５；
（ｘｌｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２０９；
（ｘｌｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２３３；
（ｘｌｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２５７；
（ｘｌｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２８１；
（ｘｌｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜３０５；
（ｌ）配列番号：２のアミノ酸３４〜３２９；
（ｌｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜３５３；
（ｌｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜４１６；
（ｌｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜４２４；
（ｌｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜４９３；
（ｌｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５５１
（ｌｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３０；
（ｌｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３１；
（ｌｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；
（ｌｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３３；
（ｌｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３４；
（ｌｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３５；
（ｌｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３６；
（ｌｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３７；
（ｌｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３８；
（ｌｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３９；
（ｌｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３０〜５３２；
（ｌｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３１〜５３２；
（ｌｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３２〜５３２；
（ｌｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３３〜５３２；
（ｌｘｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；
（ｌｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３５〜５３２；
（ｌｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２；
（ｌｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３０〜５３１；
（ｌｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３１〜５３１；
（ｌｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３２〜５３１；
（ｌｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３３〜５３１；
（ｌｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３１；
（ｌｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３５〜５３１；
（ｌｘｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３１
（ｌｘｘｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜８９；
（ｌｘｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１１３；
（ｌｘｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１３７；
（ｌｘｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１６１；
（ｌｘｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１８５；
（ｌｘｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２０９；
（ｌｘｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２３３；
（ｌｘｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２５７；
（ｌｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２８１；
（ｌｘｘｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜３０５；
（ｘｃ）配列番号：２のアミノ酸３６〜３２９；
（ｘｃｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜３５３；
（ｘｃｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜４１６；
（ｘｃｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜４２４；
（ｘｃｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜４９３；
（ｘｃｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５５１
（ｘｃｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３０；
（ｘｃｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３１；
（ｘｃｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２；
（ｘｃｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３３；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３４；
（ｃｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３５；
（ｃｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３６；
（ｃｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３７；
（ｃｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３８；
（ｃｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３９；
（ｃｖｉ）前記ポリペプチド断片のいずれかの変異体または誘導体、および
（ｃｖｉｉ）前記ポリペプチド断片またはその変異体もしくは誘導体のいずれかの少なくとも２つの組合せ
からなる群より選択されるポリペプチド断片を含む、請求項５７〜６１いずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２または配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、Ｓｐ３５  Ｉｇドメインまたはその断片、変異体もしくは誘導体を含む、請求項５７〜６４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９３を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、さらに非Ｓｐ３５部分を含む、請求項５８〜６７いずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記非Ｓｐ３５部分が、前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに融合されたポリペプチドである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記非Ｓｐ３５部分が、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製助長部分からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記非Ｓｐ３５部分が抗体Ｉｇ部分である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗体Ｉｇ部分がヒンジとＦｃ部分である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドがポリマーにコンジュゲートされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群より選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、１、２、３または４つのポリマーにコンジュゲートされている、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリマーの総分子量が５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストがＳｐ３５抗体またはその断片を含む、請求項５５または５６いずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｓｐ３５抗体またはその断片が、
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸６６〜８９；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸６６〜１１３；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸６６〜１３７；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸９０〜１１３；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸１１４〜１３７；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１３８〜１６１；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１６２〜１８５；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１８６〜２０９；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸２１０〜２３３；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸２３４〜２５７；
（ｘｉ）配列番号：２のアミノ酸２５８〜２８１；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２８２〜３０５；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３０６〜３２９；
（ｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３３０〜３５３；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜６４；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３６３〜４１６；
（ｘｖｉｉ）前記ポリペプチド断片のいずれかの変異体または誘導体；および
（ｘｖｉｉｉ）前記ポリペプチド断片またはその変異体もしくは誘導体のいずれかの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるポリペプチド断片から本質的になるエピトープに特異的に結合する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｓｐ３５抗体が、
【化１６】
2009544703.tif 000019
からなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストがＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドを含む、請求項５５または５６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドが、
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
（ｉｖ）低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
からなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドが、Ｓｐ３５  ｍＲＮＡのコード部分に相補的な少なくとも１０塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドがリボザイムである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記ｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列：
【化１７】
2009544703.tif 000020
を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記Ｓｐ３５アンタゴニストがアプタマーである、請求項５５または５６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
（ａ）前記ＣＮＳニューロン内に、前記Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、発現制御配列への作動可能な連結によって導入すること、および（ｂ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現させることを含む、請求項５５〜８８いずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ポリヌクレオチドが前記ＣＮＳニューロン内に、
（ａ）トランスフェクション；
（ｂ）エレクトロポレーション；
（ｃ）形質導入；および
（ｄ）直接マイクロインジェクション
からなる群より選択される方法によって導入される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターとして投与される、請求項８９または９０いずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パルボウイルスベクターおよびポックスイルスベクターからなる群より選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ヘルペスウイルスベクターが、単純疱疹ウイルスベクターおよびエプスタイン‐バーウイルスベクターからなる群より選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記レンチウイルスベクターがｐＬＬ３．７である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記パルボウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記組成物が、さらに、
（ｉ）ＮＧＦアンタゴニスト；
（ｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニスト；
（ｉｉｉ）ＴＡＪアンタゴニスト；および
（ｉｖ）ＯＭｇｐアンタゴニスト
からなる群より選択されるさらなるアンタゴニスト
を含む、請求項１〜５または５５〜５６いずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
希乏突起膠細胞または希乏突起膠細胞の前駆細胞を、
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＴｒｋＡアプタマー；および
（ｖ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストと接触させることを含む、希乏突起膠細胞の分化を促進するための方法。
【請求項１００】
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片；
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＴｒｋＡアプタマー；および
（ｖ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せ
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物の有効量を、希乏突起膠細胞の分化の促進を必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における、希乏突起膠細胞の分化を促進するための方法。
【請求項１０１】
（ａ）希乏突起膠細胞または希乏突起膠細胞の前駆細胞内に、
（ｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド；
（ｉｉ）ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＴｒｋＡアプタマー
からなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを導入すること、および
（ｂ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストを発現させること
を含む、希乏突起膠細胞の分化を促進するための方法。
【請求項１０２】
前記ポリヌクレオチドが、前記希乏突起膠細胞または希乏突起膠細胞の前駆細胞内に、
（ａ）トランスフェクション；
（ｂ）エレクトロポレーション；
（ｃ）形質導入；および
（ｄ）直接マイクロインジェクション
からなる群より選択される方法によって導入される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記希乏突起膠細胞または希乏突起膠細胞の前駆細胞が哺乳動物中に存在し、前記導入することが、（ａ）前記哺乳動物に、前記ＴｒｋＡアンタゴニストをコードする前記ポリヌクレオチドを投与すること、および（ｂ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストを発現させることを含む、請求項１０１または１０２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの発現能を有する培養宿主細胞内に投与される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターとして投与される、請求項１０１〜１０４いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、神経学、神経生物学および分子生物学に関する。より詳しくは、本発明は、髄鞘形成およびニューロンの生存の増進を促進させるため、ならびにＴｒｋＡアンタゴニストの投与により髄鞘脱落および髄鞘発育不全疾患を処置するための方法に関する。本発明はまた、ＴｒｋＡアンタゴニストの使用によりＳｐ３５発現を阻害または低減させる方法に関する。さらに、本発明は、一般的に、Ｓｐ３５およびＴｒｋＡをブロックするため、ならびにＳｐ３５アンタゴニストの投与によりＴｒｋＡリン酸化を阻害または低減させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
神経細胞の機能は、ニューロンとその隣接する環境内の他の細胞との接触に影響される（非特許文献１）。このような細胞としては、特殊（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）グリア細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）の希乏突起膠細胞、および末梢神経系（ＰＮＳ）のシュワン細胞（これは、ニューロンの軸索をミエリン鞘で覆っている）が挙げられる（非特許文献２）。
【０００３】
ミエリン鞘の形成は、ミエリン形成細胞とニューロンの軸索が関与する緻密で動的な細胞細胞相互作用の一例である。一般的に、発達中、軸索は、このプロセスの促進または阻害のいずれかを行なう適切なシグナルの発現によって有髄状態となるか否かが制御されると考えられている（非特許文献３）。
【０００４】
ＣＮＳニューロンは、損傷後に再生するという生来の潜在性を有するが、ミエリン中に存在する阻害タンパク質によってその実行が抑止されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００５】
希乏突起膠細胞上に見られるいくつかのミエリン阻害タンパク質が特性評価されている。既知のミエリン阻害タンパク質の例としては、ＮｏｇｏＡ（非特許文献７；非特許文献８）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）（非特許文献９；非特許文献１０）および希乏突起膠細胞糖タンパク質（ＯＭ−ｇｐ）、非特許文献１１）が挙げられる。これらの各タンパク質は個々に、ニューロンのＮｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）のリガンドであることが示されている（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉら，Ｎｅｕｒｏｎ  ２００２，２００２年６月２８日、オンライン公開）。
【０００６】
最近の神経成長因子（ＮＧＦ）およびその受容体ＴｒｋＡの研究により、軸索での種々のシグナルにより中枢および抹消での髄鞘形成が制御されていることが示唆されている。実際、既報のように、ＮＧＦは、シュワン細胞（ＳＣ）と希乏突起膠細胞の髄鞘形成に対して反対の効果を有する（非特許文献１５）。
【０００７】
神経系の疾患の多くは、髄鞘脱落および髄鞘発育不全と関連したもの、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｎｔｉｎｅ  ｍｙｅｌｏｌｙｓｉｓ）（ＣＰＭ）、ウォーラー変性、ならびにいくつかの遺伝性疾患、例えば、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病およびペリツェーウス‐メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）などである。このような疾患の中でも、ＭＳは、最も広範囲に見られ、世界中でほぼ２５０万人が罹患している。
【０００８】
ＭＳは、一般的に、神経系障害の再発／軽減パターンで始まり、次いで、神経系の損傷の増大とともに慢性期に進行する。ＭＳは、慢性病変部に局在しているミエリン、希乏突起膠細胞および軸索の破壊と関連している。ＭＳで観察される髄鞘脱落は、必ずしも永続的ではなく、該疾患の初期段階では、再髄鞘形成が記録されている。ニューロンの再髄鞘形成には、希乏突起膠細胞が必要である。
【０００９】
ＭＳに対して種々の疾患緩和処置、例えば、コルチコステロイド類および免疫調節（インターフェロンβなど）の使用が利用可能である。また、希乏突起膠細胞と髄鞘形成がＭＳにおいて中心的な役割を果たしているため、希乏突起膠細胞の数を増大させる、または髄鞘形成を増強させるための治療剤を開発する取り組みがなされている。例えば、Ｃｏｈｅｎら，特許文献１；非特許文献１６を参照のこと。
【００１０】
髄鞘形成ならびに希乏突起膠細胞およびニューロンの生存を促進させるためのＳｐ３５アンタゴニストの使用は、例えば、特許文献２および非特許文献１７（これらはともに、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。しかしながら、依然として、ＭＳに対するさらなる治療剤を考案することが急務である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，５７４，００９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０００９３８８号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒら，１９８８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：８１９
【非特許文献２】Ｌｅｍｋｅ，１９９２，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｚ．Ｈａｌｌ編，ｐ．２８１，Ｓｉｎａｕｅｒ
【非特許文献３】ＣｏｌｅｌｌｏおよびＰｏｔｔ，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１５：８３−１００（１９９７）
【非特許文献４】Ｂｒｉｔｔｉｓら，２００１、Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：１１−１４
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓら，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：２７９２−２８０３
【非特許文献６】Ｇｒｉｍｐｅら，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．：２２：３１４４−３１６０
【非特許文献７】Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９
【非特許文献８】Ｇｒａｎｄｐｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４
【非特許文献９】ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：８０５−８１１
【非特許文献１０】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ  １３：７５７−７６７
【非特許文献１１】Ｍｉｋｏｌら，１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１２７３−１２７９
【非特許文献１２】Ｗａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１７，９４１−９４４
【非特許文献１３】Ｇｒａｎｄｐｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，４３９−４４４
【非特許文献１４】Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９
【非特許文献１５】Ｃｈａｎら，Ｎｅｕｒｏｎ  ４３：１８３−９１（２００４）
【非特許文献１６】Ｃｈａｎｇら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３（２００２）
【非特許文献１７】Ｍｉら，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の簡単な概要）
本発明は、Ｓｐ３５が、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンにおいてＴｒｋＡとともに共発現され、これと相互作用するという知見に基づく。具体的には、ＮＧＦは、その対応する受容体ＴｒｋＡを介して、Ｓｐ３５発現ならびにＳｐ３５機能による軸索の髄鞘形成および希乏突起膠細胞の分化の阻害を誘導する。希乏突起膠細胞によって発現されるＳｐ３５は、以前、分化インヒビターと同定されたが（Ｍｉら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−５１（２００５））、軸索でのＳｐ３５の発現により、同等に有効に希乏突起膠細胞の分化が阻害される。分化および髄鞘形成を促進させるには、いずれかの細胞型でのＳｐ３５の阻害で充分である。
【００１４】
このような知見に基づき、本発明は、一般的に、ＴｒｋＡアンタゴニストの投与による髄鞘形成の促進および髄鞘発育不全または髄鞘脱落に関連する疾患、障害または損傷の処置に関する。また、本発明は、一般的に、ＴｒｋＡアンタゴニストの投与によるＣＮＳニューロンの生存の促進方法に関する。さらに、本発明は、一般的に、ＴｒｋＡアンタゴニストの投与によりＳｐ３５発現を阻害または低減させる方法に関する。また、本発明は、一般的に、Ｓｐ３５アンタゴニストの投与により、Ｓｐ３５−ＴｒｋＡ相互作用をブロックする方法およびＴｒｋＡリン酸化を阻害または低減させる方法に関する。
【００１５】
特定のある実施形態において、本発明は、ＣＮＳニューロンと希乏突起膠細胞の混合物を、ＴｒｋＡアンタゴニスト含有組成物と接触させることを含む、哺乳動物における中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの髄鞘形成の促進方法を包含する。他の実施形態において、該方法は、髄鞘形成を促進させるためのものであり、有効量のＴｒｋＡアンタゴニスト含有組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
【００１６】
特定のある実施形態において、本発明は、希乏突起膠細胞または希乏突起膠細胞前駆細胞をＴｒｋＡアンタゴニストと接触させることを含む、希乏突起膠細胞の分化の促進方法を包含する。本発明のさらなる方法は、有効量のＴｒｋＡアンタゴニスト含有組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、希乏突起膠細胞の分化の促進方法を包含する。
【００１７】
特定のある実施形態において、本発明は、ＣＮＳニューロンをＴｒｋＡアンタゴニスト含有組成物と接触させることを含む、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンにおいてＳｐ３５発現を阻害または低減させるための方法を包含する。
【００１８】
さらなる実施形態において、哺乳動物は、髄鞘脱落または髄鞘発育不全と関連する疾患、障害、損傷を有すると診断された動物である。一部のある実施形態において、該疾患、障害または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後損傷、化学療法の神経系の合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン‐コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ‐ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、急性播種性（ｄｉｓｓｍｅｍｉｎａｔｅｄ）脳炎、ギヤン‐バレー症候群、マリー・シャルコー・トゥース病およびベル麻痺からなる群より選択される。
【００１９】
上記の方法の種々の実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストは、ＴｒｋＡがＣＮＳ髄鞘形成および／またはニューロンの生存を負に調節する能力、および／またはＳｐ３５発現を阻害または低減させる能力に干渉する任意の分子であり得る。特定のある実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストは、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ干渉）、ＴｒｋＡアプタマー、または２種類以上のＴｒｋＡアンタゴニストの組合せからなる群より選択される。
【００２０】
特定のある実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストはＴｒｋＡアンタゴニスト化合物である。本発明の特定の一部のＴｒｋＡアンタゴニスト化合物としては、限定されないが、Ｋ２５２ａおよびその誘導体（米国特許第５，４６８，８７号（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようなもの）；リドカイン；ブピバカイン；プロカイン；１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ［４，３−□］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ）；メチル水銀；エンドカンナビノイド（ｅｎｄｏｃａｎｎａｂａｎｏｉｄ）アナンダミド；ＣＥＰ−７０１；ＣＥＰ−７５１；ＰＤ０９８０５９；タモキシフェン；ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）；３−モルホリノシドノンイミン（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓｙｎｄｎｏｍｉｎｅ）（Ｓｉｎ−１）；トリホスチン（Ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ８７９；ハービマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ）Ａ；ゲニステイン；５−アザシチジン；およびトリホスチンＲＧ５０８９６４が挙げられる。
【００２１】
特定のある実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドである。本発明の特定のあるＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドとしては、限定されないが、ＰＴＥＮ；ＳＨＰ−１；妊娠期（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｚｏｎｅ）タンパク質；ヒトアルファ（２）−マクログロブリン（アルファ２Ｍ）；メチルアミン活性化型アルファ２Ｍ（ＭＡ−アルファ２Ｍ）；セロトニン（ｓｅｒａｔｏｎｉｎ）活性化型アルファ２Ｍ（５ＨＴ−アルファ２Ｍ）；百日咳毒素；ｍｙｃ骨髄球腫症（ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｅｓｉｓ）ウイルス関連癌遺伝子（ＭＹＣＮ）によりもたらされるタンパク質；およびカベオリンが挙げられる。特定のある実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４の可溶性ペプチドである。他の実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４のアミノ（ａｍｉｏ）酸１〜４４１を含む。一部のある実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストは、非ＴｒｋＡ部分を含む融合ポリペプチドである。一部のある実施形態において、非ＴｒｋＡ部分は、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製助長部分からなる群より選択される。一部のある実施形態において、抗体Ｉｇ部分はヒンジとＦｃ部分である。
【００２２】
択一的な実施形態では、ＴｒｋＡアンタゴニストは、ＴｒｋＡポリペプチドに結合する抗体またはその断片である。本発明の方法における使用のためのＴｒｋＡアンタゴニスト抗体としては、限定されないが、ＭＣ１９２、ＭＮＡＣ１３モノクローナル抗体およびＡＢ１５７７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）のＦａｂ断片が挙げられる。
【００２３】
他の実施形態では、ＴｒｋＡアンタゴニストは、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などである。
【００２４】
さらなる実施形態では、ＴｒｋＡアンタゴニストはＴｒｋＡアプタマーである。ＴｒｋＡアプタマーは、ＴｒｋＡに結合し、ＴｒｋＡがＣＮＳ髄鞘形成および／またはニューロンの生存を負に調節する能力、および／またはＳｐ３５発現を阻害または低減させる能力に干渉する低分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【００２５】
上記の方法の他の実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストは、（ａ）ＣＮＳニューロン内に、ＴｒｋＡアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、発現制御配列への作動可能な連結によって導入すること；および（ｂ）前記ＴｒｋＡアンタゴニストを発現させることを含む方法によって投与される。一部のある実施形態において、ＣＮＳニューロンは哺乳動物のものであり、前記導入することは、（ａ）前記哺乳動物に、ＴｒｋＡアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、発現制御配列への作動可能な連結によって投与することを含む。一部のある実施形態において、培養宿主細胞は処置対象の哺乳動物由来のものである。特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドは宿主細胞またはＣＮＳニューロン内に、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルスによる形質導入または直接マイクロインジェクションによって導入される。
【００２６】
さらなる実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物の該疾患、障害または損傷の部位またはその付近に投与される。一部のある実施形態において、該ポリヌクレオチドは発現ベクターとして投与される。特定のある実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン‐バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、パルボウイルスおよび単純疱疹ウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである。一部のある実施形態において、ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および皮下投与からなる群より選択される経路によって投与される。
【００２７】
本発明のさらなる方法には、ＣＮＳニューロンと希乏突起膠細胞の混合物をＳｐ３５アンタゴニスト含有組成物と接触させることを含む、Ｓｐ３５とＴｒｋＡ間の相互作用のブロック方法が含まれる。本発明の他の実施形態は、ＣＮＳニューロンをＳｐ３５アンタゴニスト含有組成物と接触させることを含む、ＴｒｋＡリン酸化を阻害または低減させるための方法を包含する。
【００２８】
上記の方法の種々の実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、Ｓｐ３５が髄鞘形成および／またはニューロンの生存を負に調節する能力、および／またはＳｐ３５とＴｒｋＡの相互作用をブロックする能力および／またはＴｒｋＡリン酸化を阻害または低減させる能力に干渉する任意の分子であり得る。特定のある実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体もしくはその断片、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ干渉）、Ｓｐ３５アプタマーまたは２種類以上のＳｐ３５アンタゴニストの組合せからなる群より選択される。
【００２９】
特定のある実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドである。本発明の特定の一部の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、以下のドメイン：（ｉ）Ｓｐ３５ロイシンに富む反復配列（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）ＬＲＲドメインのＣ末端のＳｐ３５塩基性領域、および（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインの１つ以上を含む、または欠いている可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが挙げられる。一部のある実施形態において、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを欠いている。本発明のさらなるＳｐ３５可溶性ポリペプチドとしては、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いているポリペプチドが挙げられる。一部のある実施形態において、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５  ＬＲＲドメインを含むが、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いている。一部のある実施形態において、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸残基３４〜５３２または配列番号：２の３６〜５３２を含む。
【００３０】
一部のある実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、非Ｓｐ３５部分を含む融合ポリペプチドである。一部のある実施形態において、非Ｓｐ３５部分は、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、標的化部分、レポーター部分および精製助長部分からなる群より選択される。一部のある実施形態において、抗体Ｉｇ部分はヒンジとＦｃ部分である。
【００３１】
択一的な実施形態では、Ｓｐ３５アンタゴニストは、以下のＳｐ３５ドメイン：（ｉ）Ｓｐ３５ロイシンに富む反復配列（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）ＬＲＲドメインのＣ末端のＳｐ３５塩基性領域、および（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインの１つ以上を含むＳｐ３５ポリペプチドに結合する抗体またはその断片である。さらに、Ｓｐ３５抗体またはその断片は、本明細書に記載のＳｐ３５ポリペプチド断片を含むポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。さらなる実施形態において、Ｓｐ３５抗体またはその断片は、
【００３２】
【化１】
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からなる群より選択される。
【００３３】
他の実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などである。
【００３４】
さらなる実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストはＳｐ３５アプタマーである。Ｓｐ３５アプタマーは、Ｓｐ３５に結合し、Ｓｐ３５とＴｒｋＡの相互作用に干渉する、および／またはＴｒｋＡリン酸化を阻害または低減させる低分子ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【００３５】
上記の方法の他の実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、（ａ）ＣＮＳニューロン内に、Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、発現制御配列への作動可能な連結によって導入すること；および（ｂ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現させることを含む方法によって投与される。一部のある実施形態において、ＣＮＳニューロンは哺乳動物のものであり、前記導入することは、（ａ）前記哺乳動物に、Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、発現制御配列への作動可能な連結によって投与することを含む。一部のある実施形態において、培養宿主細胞は処置対象の哺乳動物由来のものである。特定のある実施形態において、該ポリヌクレオチドは宿主細胞またはＣＮＳニューロン内に、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルスによる形質導入または直接マイクロインジェクションによって導入される。
【００３６】
一部のある実施形態において、該ポリヌクレオチドは発現ベクターとして投与される。特定のある実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン‐バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、パルボウイルスおよび単純疱疹ウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、脳および脊髄の組織由来のニューロンの種々の型におけるＴｒｋＡおよびＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）の免疫蛍光検査である。
【図２】図２は、培養ＤＲＧニューロンにおけるＴｒｋＡおよびＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）の免疫蛍光検査である。
【図３】図３は、Ｓｐ３５とＴｒｋＡ、ＴｒｋＡ単独、Ｓｐ３５とｐ７５、Ｓｐ３５とｐ７５とＴｒｋＡまたはＴｒｋＡとｐ７５でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）およびＴｒｋＡの免疫沈降である。
【図４】図４は、ＧＦＰ（対照）、ドミナントネガティブＳｐ３５（ＤＮ）または完全長Ｓｐ３５（ＦＬ）のいずれかでトランスフェクトされたＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養細胞ライセートのウエスタンブロットである。抗体を用いて、リン酸化ＴｒｋＡ（ｐ−ＴｒｋＡ）または非リン酸化ＴｒｋＡ（ＴｒｋＡ）を検出した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、Ｓｐ３５−Ｆｃ（図５Ａ）または対照Ｆｃ（図５Ｂ）および神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下でのＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物の免疫蛍光検査である。ミエリンタンパク質ＭＢＰに対する抗体を免疫蛍光検査に使用した（図５Ａおよび５Ｂ）。図５Ｃは、種々の濃度の対照−ＦｃまたはＳｐ３５−Ｆｃポリペプチドで処理したＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物のＭＢＰ＋細胞／ウェルの数を示すグラフである。
【図６】図６は、完全長（ＦＬ）またはドミナントネガティブ（ＤＮ）Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）、Ｎｏｇｏ受容体（ＮｇＲ）、Ｔａｊ、ｐ７５およびＴｒｋＡをコードするウイルスに感染させたＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物のウエスタンブロットである。ＭＡＧおよびＭＢＰに対する抗体を用いてミエリンタンパク質を検出した。
【図７】図７は、ＴｒｋＡインヒビターＫ５２５ａもしくはＳｐ３５−Ｆｃまたは対照−Ｆｃで処理したＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物のウエスタンブロットである。ＭＢＰに対する抗体を用いてミエリンタンパク質を検出した。
【図８】図８は、種々の量のＮＧＦで処理したＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物におけるリン酸化ＴｒｋＡ（ｐ−ＴｒｋＡ）およびＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）のウエスタンブロットである。
【図９】図９ＡおよびＢは、ＮＧＦまたは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の存在下または非存在下での、希乏突起膠細胞の前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣ）および脊髄後根神経節細胞（ＤＲＧ）におけるＴｒｋＡ、Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）およびＧＡＰＤＨ発現のＲＴ−ＰＣＲである（図９Ａ）。種々の量のＮＧＦの存在下での、ＤＲＧニューロンおよび希乏突起膠細胞におけるＳｐ３５のウエスタンブロット（図９Ｂ）。
【図１０】図１０は、ＮＧＦの存在下または非存在下での、ＤＲＧニューロンにおけるＳｐ３５発現の免疫蛍光検査である。
【図１１】図１１は、完全長（ＦＬ）またはドミナントネガティブ（ＤＮ）Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）およびまたは完全長（ＦＬ）またはドミナントネガティブ（ＤＮ）ＴｒｋＡをコードするウイルスに感染させたＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物のウエスタンブロットである。タンパク質ＭＡＧおよびＭＢＰに対する抗体を用いてミエリンタンパク質を検出した。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、ラット坐骨神経（図１２Ａ）および脊髄（図１２Ｂ）における、生後、種々の日数での、Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）、ＴｒｋＡ、ＭＢＰ、ＭＡＧおよびβ−アクチン発現のウエスタンブロットである。アスコルビン（ａｂｓｏｒｂｉｃ）酸の添加による髄鞘形成（ｍｙｅｌｉａｔｉｏｎ）の誘導後、種々の日数での、ＤＲＧ／ＳＣ共培養物におけるＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）、ＴｒｋＡ、ＰＯ、ＭＡＧおよびβ−アクチン発現のウエスタンブロット（図１２Ｃ）。完全長Ｓｐ３５（ＦＬ−ＬＩＮＧＯ）およびドミナントネガティブＳｐ３５（ＤＮ−ＬＩＮＧＯ）を発現するレンチウイルスでトランスフェクトされたＤＲＧ／ＳＣ共培養物におけるＭＡＧ、ＰＯおよびβ−アクチン発現のウエスタンブロット（図１２Ｄ）。
【図１３】図１３は、ＮＧＦの非存在下での、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦおよびＩｇＧ（Ｆｃ−対照）または１Ａ７  Ｓｐ３５抗体またはＴｒｋＡ−Ｆｃの存在下での、希乏突起膠細胞とＤＲＧの共培養物におけるＭＢＰ発現の免疫蛍光検査である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
（定義）
特に規定のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、その定義を記載する本出願書類に支配される。また、文脈上、必要とされない限り、単数形の用語は複数形のものを含むものとし、複数形の用語は単数形のものを含むものとする。本明細書に挙げたすべての刊行物、特許および他の参考文献は、引用によって、引用により組み込まれる個々の各刊行物または特許出願が、あたかも具体的に個々に示されているかのように、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下に記載するものである。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００４０】
本発明をさらに規定するため、以下に用語および定義を示す。
【００４１】
「ａ」または「ａｎ」を伴う存在体（ｅｎｔｉｔｙ）の用語は、１つ以上の該存在体をいうことに留意されたい。例えば、「免疫グロブリン分子」（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すと理解されたい。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ（種類）以上の」および「少なくとも１つ（種類）の」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００４２】
本明細書全体および特許請求の範囲において、語句「〜を含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”または“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”もしくは“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”などの語尾変化形」）は、記載の任意の整数または整数群を含み、任意の他の整数または整数群を排除しないことを示す。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包含的またはオープンエンドであり、記載していないさらなる要素または方法工程を排除しない。語句「本質的に、〜からなる」は、指定の材料または工程の他、特許請求の範囲に記載の発明に基本的かつ新規な特徴に実質的な影響を及ぼさないものを含むことを示す。本明細書で用いる場合、用語「〜からなる」は、表示した材料または方法工程のみを示す。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の治療成果が達成されるのに有効な量をいう。治療成果は、例えば、症状の軽減、生存の延長、運動性の改善などであり得る。治療成果は「治癒」である必要はない。
【００４４】
本明細書で用いる場合、用語「処置」または「処置すること」は、疾患の症状を改善または軽減するための動物への薬剤の投与をいう。さらに、用語「処置」または「処置すること」は、疾患の進行を妨げるための動物への薬剤の投与をいう。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「予防有効量」は、投薬量において必要な期間、所望の予防成果が達成されるのに有効な量をいう。典型的には、予防用量は、被検体において疾患前または疾患病期の早期に使用されるため、予防有効量は治療有効量より少ない。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「希乏突起膠細胞の前駆細胞」は、成熟髄鞘形成性の希乏突起膠細胞となり得る任意の細胞を包含する。非限定的な例としては、Ａ２Ｂ５前駆細胞（これは、Ａ２Ｂ５タンパク質を発現する）、ミエリン形成前希乏突起膠細胞（これは、Ｏ１およびＯ４タンパク質を発現する）が挙げられる。希乏突起膠細胞生物学の一般的な概説については、例えば、ＢａｕｍａｎｎおよびＰｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」には、完全長ｃＤＮＡ配列、例えば、非翻訳５’および３’配列、コード配列、ならびに核酸配列の断片、エピトープ、ドメインおよび変異体のヌクレオチド配列が包含され得る。ポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されたものであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、単鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに単鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、単鎖またはより典型的には二本鎖もしくは単鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成されたものであり得る。また、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成されたものであり得る。また、ポリヌクレオチドは、安定性のため、または他の理由で、１つ以上の修飾塩基または修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ主鎖を含むものであり得る。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非通常塩基（例えば、イノシンなど）が挙げられる。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行なわれ得る。したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態を包含する。
【００４８】
本発明において、「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結されたアミノ酸で構成されたものであり得、遺伝子にコードされた２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸）を含有するものであってもよい。本発明のポリペプチドは、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセッシングなど）または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法のいずれかによって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、ポリペプチド内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端で行なわれ得る。所与のポリペプチドにおいて、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のポリペプチドは多くの型の修飾を含むものであり得る。ポリペプチドは、分枝状のもの（例えばユビキチン化の結果として）であってもよく、また、分枝を伴う、または伴わない環状のものであってもよい。環状で分枝状の、および分枝状で環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌイノシトール）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００４９】
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類縁体」は、本発明のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストに言及する場合、Ｓｐ３５活性またはＴｒｋＡ活性を阻害する能力を少なくとも一部保持している任意のアンタゴニスト分子を包含する。本明細書に記載のＳｐ３５およびＴｒｋＡアンタゴニストには、限定されないが、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストが依然としてその機能を発揮する限り、該アンタゴニストの断片、変異体または誘導体分子が包含され得る。本発明の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドには、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡのタンパク質分解断片、欠失断片および特に、動物に送達する場合、より容易に作用部位に達する断片が包含され得る。ポリペプチド断片には、さらに、天然のポリペプチドの抗原性または免疫原性のエピトープ、例えば、線形ならびに３次元のエピトープを含むポリペプチドの任意の部分が包含される。本発明の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ変異体領域を含むもの、例えば、上記の断片、また、アミノ酸の置換、欠失または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。変異体は、天然に存在するもの、例えば、対立遺伝子変異体などであり得る。「対立遺伝子変異体」により、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占有する遺伝子の択一的形態が意図される。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ  Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない変異体は、当該技術分野で知られた変異誘発手法を用いて作製され得る。可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドは、同類または非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含むものであり得る。また、本発明のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストには誘導体分子が包含され得る。例えば、本発明の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドは、天然のポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すように改変されたＳｐ３５またはＴｒｋＡ領域を含むものであり得る。例としては、融合タンパク質およびタンパク質コンジュゲートが挙げられる。
【００５０】
本発明において、「ポリペプチド断片」は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドの短いアミノ酸配列をいう。タンパク質断片は、「独立したもの（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」または該断片が領域の一部を構成するより大きなポリペプチド内に含まれたものであり得る。本発明のポリペプチド断片の代表例としては、例えば、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、および約１００アミノ酸長、またはそれ以上の長さを含む断片が挙げられる。
【００５１】
特定のある実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、「抗体」もしくは「免疫グロブリン」分子、またはその免疫特異的断片、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子または操作された抗体分子または抗体分子と同様の様式で抗原に結合する断片である。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に用いる。さらに、本発明の方法において使用される免疫グロブリン分子は、「免疫特異的」または「抗原特異的」または「抗原結合」分子とも記載し、互換的に用いて抗体分子およびその断片を示す。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的充分理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５２】
以下により詳細に論考するように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別され得る５種類に大別される類型のポリペプチドを包含する。５つの類型はすべて、明白に本発明の範囲に含まれ、以下の論考は、一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がほぼ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。これらの４つの鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって一緒になり「Ｙ」字型構成となっており、軽鎖は、重鎖を囲み（ｂｒａｃｋｅｔ）、「Ｙ」字型の開口部分から始まり可変領域に延びる。
【００５３】
軽鎖および重鎖はともに、構造的および機能的に相同な領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。これに関して、軽（ＶＬ）鎖部分と重（ＶＨ）鎖部分両方の可変ドメインによって抗原認識および特異性が決定されることが認識されよう。逆に、軽鎖（ＣＬ）と重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインによって、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などが付与される。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるほど、大きくなる。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００５４】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダいずれかの軽鎖と結合されたものであり得る。一般に、軽鎖および重鎖は互いに共有結合されており、２つの重鎖の「テイル」部分は、互いにジスルフィド共有結合または非共有結合によって結合されている（免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって作製されたものである場合）。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字型構成のフォーク型末端のＮ末端から各鎖の底部Ｃ末端までに及ぶ。当業者には、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）（これらは、いくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を有する）に分類されることが認識されよう。抗体の「クラス」がそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧまたはＩｇＥに決定されることは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、充分にキャラクタライズされており、機能的特殊性を付与することがわかっている。これらの各類型およびアイソタイプの修飾異型は、本発明の開示に鑑みると当業者に容易に認識可能であり、したがって、本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
上記のように、可変領域によって、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することが可能になる。すなわち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインは、一緒になって可変領域を形成し、３次元の抗原結合部位を規定している。この４元抗体構造は、Ｙ字型の各アーム部分の末端に存在する抗原結合部位を形成している。より詳しくは、抗原結合部位は、各ＶＨ鎖とＶＬ鎖上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定される。場合によっては、例えば、ラクダ科動物種由来のある種の免疫グロブリン分子、またはラクダ科動物の免疫グロブリンに対して操作されたある種の免疫グロブリン分子では、完全体の免疫グロブリン分子は重鎖のみからなり、軽鎖を含まないものであり得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照のこと。
【００５６】
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境において３次元の立体構成を呈すると抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されたアミノ酸の短い非隣接配列である。抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残部は、「フレームワーク」領域と称され、示される分子間ばらつきは小さい。フレームワーク領域は、主としてβ−シート立体配座を示し、ＣＤＲはループを形成しており、場合によっては、これらが連結してβ−シート構造の一部を構成している。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によるＣＤＲの正しい向きでの配置を提供する骨格を形成する機能を果たす。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補性表面によって、抗体のその対応するエピトープへの非共有結合が促進される。それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、正確に規定されているため、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について、当業者により容易に同定され得る（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ、Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００５７】
しかしながら、ラクダ科動物種では、ＶＨＨと称される重鎖可変領域はＣＤＲ全体を構成する。ラクダ科動物のＶＨＨ可変領域と慣用的な抗体由来のもの（ＶＨ）との主な違いとしては、（ａ）ＶＨＨの対応する領域と比べてＶＨの軽鎖接触表面に疎水性アミノ酸が多いこと、（ｂ）ＶＨＨのＣＤＲ３の方が長いこと、および（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１とＣＤＲ３の間に高頻度にジスルフィド結合が存在することが挙げられる。
【００５８】
一実施形態において、本発明の方法における使用のための抗原結合分子は、１つの抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の方法における使用のための抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の方法における使用のための抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の方法における使用のための抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の方法における使用のための抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の方法における使用のための抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題の抗原結合分子に包含され得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は当該技術分野で知られており、例示的な分子は本明細書に記載している。
【００５９】
本発明の方法における使用のための抗体またはその免疫特異的断片としては、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨいずれかのドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示した結合性分子に対する抗Ｉｄ抗体など）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
【００６０】
抗体断片（単鎖抗体を含む）には、可変領域（１つまたは複数）が、単独または以下のもの：重鎖のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインもしくは軽鎖のＣＬの全体もしくは一部分との組合せで含まれ得る。また、本発明には、可変領域（１つまたは複数）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＬドメインの任意の組合せも同時に含む抗原結合断片も包含される。本明細書に開示した方法における使用のための抗体またはその免疫特異的断片は、任意の動物起源、例えば、鳥類および哺乳動物に由来するものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマまたはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源が軟骨系（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えば、サメ由来）であり得る。本明細書で用いる場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が包含され、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１種類以上のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子組み換えされた動物から単離され、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体（後述、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載のもの）が包含される。
【００６１】
本明細書で用いる場合、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上側、中央および／または下側ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異体もしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、重鎖部分には、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が含まれ得る。また、重鎖部分には、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むポリペプチドが含まれ得る。さらに、本発明における使用のための結合性ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠いたものであり得る。上記のように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）が、天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることは、当業者に理解されよう。
【００６２】
本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片のある種のものでは、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、該多量体の第２のポリペプチド鎖のものと同一である。あるいはまた、本発明の方法における使用のための重鎖部分含有単量体は同一ではない。例えば、各単量体は異なる標的結合部位を含むものであり得、例えば、二重特異性抗体が形成され得る。
【００６３】
本明細書に開示した方法における使用のための結合性ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域とを含むものであり得る。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むものであり得る。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むものであり得る。
【００６４】
本明細書で用いる場合、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬの少なくとも一方のドメインを含むものである。
【００６５】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然変異体をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列内に導入することにより作製され得、その結果、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードタンパク質内に導入される。変異は、標準的な手法、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発などによって導入され得る。好ましくは、同類アミノ酸置換が１つ以上の非必須アミノ酸残基においてなされる。
【００６６】
本明細書に開示した方法における使用のための抗体またはその免疫特異的断片はまた、本発明のポリペプチドに対する結合親和性に関して記載または特定され得る。好ましい結合特異性としては、
【００６７】
【化２】
2009544703.tif 000003
未満の解離定数すなわちＫｄのものが挙げられる。
【００６８】
本明細書に開示した方法における使用のための抗体またはその免疫特異的断片は、本明細書に記載のＳｐ３５またはＴｒｋＡのアンタゴニストとしての機能を果たす。例えば、本発明の方法における使用のための抗体は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドの抑制活性をブロックまたは阻害するアンタゴニストとしての機能を果たすものであり得る。
【００６９】
本明細書で用いる場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性の領域または部位が第１の種から採取または誘導されたものであり、定常領域（これは、完全体、一部または本発明に従って修飾されたものであり得る）が第２の種から採取されたものである任意の抗体を意味することが想定される。特定のある実施形態では、標的結合領域または部位が非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）由来であり、定常領域がヒトのものである。
【００７０】
本明細書で用いる場合、用語「操作された抗体」は、重鎖および軽鎖いずれかまたは両方の可変ドメインが、特異性が既知の抗体由来の１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分の交換によって改変され、必要であれば、フレームワーク領域の一部交換および配列変更によって改変された抗体をいう。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスの抗体、またはさらに同じサブクラスの抗体に由来するものであってもよいが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種の抗体に由来するものであることが想定される。特異性が既知の非ヒト抗体由来の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖のフレームワーク領域にグラフティングされた操作された抗体を、本明細書において「ヒト化抗体」という。すべてのＣＤＲをドナー可変領域由来の完全体のＣＤＲで置き換え、１つの可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに転移させることは必要でない場合もあり得る。それどころか、必要なことは、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を転移させるだけであり得る。その説明は、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に示されており、常套的な実験手法の実施または試行錯誤試験のいずれかによって機能的な操作された抗体またはヒト化抗体を得ることは、充分当業者の技能の範囲内である。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は互換的に用いる。これらの用語は、どのような手段であれ（例えば、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段）、２つ以上の要素または成分が互いに接合されていることを示す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームが維持される様式で接合されて、より長い連続的なＯＲＦが形成されることをいう。したがって、得られる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦにコードされたポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（該セグメントは、通常、自然状態ではこのように接合されていない）を含む単一のタンパク質である。したがって、リーディングフレームは融合セグメント全体において連続的となるが、該セグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に分断されていてもよい。
【００７２】
ポリペプチドとの関連において、「線形配列」または「配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向のポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、ここで、該配列内で互いに隣接する残基は、そのポリペプチドの一次構造において連続している。
【００７３】
用語「発現」は、本明細書で用いる場合、遺伝子により生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドが生成されるプロセスをいう。該プロセスとしては、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕現、例えば、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定な発現の両方が挙げられる。これには、限定されないが、遺伝子が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物に転写されること、およびかかるｍＲＮＡがポリペプチド（１種類または複数種）に翻訳されることが含まれる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現には、該生化学物質および任意の前駆物質の生成が含まれる。
【００７４】
「被検体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」により、診断、予後または治療が所望される任意の被検体、特に哺乳動物被検体が意図される。哺乳動物被検体としては、限定されないが、ヒト、家畜、飼養動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシなど）；霊長類（例えば、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジーなど）；イヌ科（例えば、イヌおよびオオカミなど）；ネコ科（例えば、ネコ、ライオンおよびトラなど）；ウマ科（例えば、ウマ、ロバおよびシマウマなど）；食用動物（例えば、ウシ、ブタおよびヒツジなど）；有蹄動物（例えば、シカおよびキリンなど）；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなど）；などが挙げられる。特定のある実施形態において、哺乳動物はヒト被検体である。
【００７５】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少をいう。これは、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子の配列に相同な二本鎖領域のｓｉＲＮＡによって開始される。該遺伝子は、その生物体に対して内因性および外因性であり得、染色体内に組み込まれた状態で存在しているもの、またはゲノム内に組み込まれていないトランスフェクションベクター内に存在しているものであり得る。遺伝子の発現は、完全に阻害されるか、または一部阻害されるかのいずれかである。また、ＲＮＡｉは標的ＲＮＡの機能を阻害すると考えられ得、阻害される標的ＲＮＡの機能は完全または一部であり得る。
【００７６】
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１／ＬＲＲＮ６）
天然に存在するヒトＳｐ３５は、６１４個のアミノ酸からなるグリコシル化された神経系特異的タンパク質（配列番号：２）である。ヒトＳｐ３５ポリペプチドは、１４個のロイシンに富む反復配列（Ｎ−およびＣ−末端キャップを含む）、Ｉｇドメイン、膜貫通領域、および細胞質ドメインからなるＬＲＲドメインを含む。該細胞質ドメインは、カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）チロシンリン酸化部位を含む。また、天然に存在するＳｐ３５タンパク質は、シグナル配列、ＬＲＲＣＴとＩｇドメインの間に短い塩基性領域、およびＩｇドメインと細胞質ドメインの間に膜貫通領域を含む。ヒトＳｐ３５遺伝子は選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）翻訳開始コドンを含み、その結果、Ｓｐ３５シグナル配列のＮ末端に６つのさらなるアミノ酸（ＭＱＶＳＫＲ；配列番号：７）が存在する場合もあり、存在しない場合もある。表１に、配列番号：２の配列に基づき、アミノ酸残基の数に従ってＳｐ３５ドメインおよび他の領域の一覧を示す。Ｓｐ３５ポリペプチドは、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２００４／０８５６４８および米国特許公開公報第２００６／０００９３８８  Ａ１号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳細に特性評価されている。
【００７７】
【表１】
2009544703.tif 000004
Ｓｐ３５の組織分布および発達に伴う発現は、ヒトおよびラットにおいて研究されている。Ｓｐ３５生物学は、実験動物（ラット）モデルにおいて研究されている。ラットＳｐ３５の発現は、神経系のニューロンおよび脳の希乏突起膠細胞に局在している（ノーザンブロットおよび免疫組織化学的染色によって測定）。ラットＳｐ３５のｍＲＮＡ発現レベルは、発育により調節され、出生直後、すなわち、ほぼ生後１日目にピークとなる。ラット脊髄離断損傷モデルでは、Ｓｐ３５は該損傷部位において上方調節される（ＲＴ−ＰＣＲによって測定）。また、Ｓｐ３５は、Ｎｏｇｏ６６受容体（Ｎｏｇｏ受容体）と相互作用することが示されている。例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２００４／０８５６４を参照のこと。
【００７８】
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）は、Ｎｏｇｏ受容体−１−ｐ７５−Ｔａｊニューロトロフィン受容体複合体のさらなる成分である。Ｍｉら，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。Ｎｏｇｏ受容体１とは異なり、Ｓｐ３５遺伝子発現は、脊髄の成体神経細胞が外傷性損傷に曝露されると増大し、これは、Ｓｐ３５がＣＮＳの神経機能に重要な生物学的役割を有することを示す（同文献）。
【００７９】
完全長ヒトＳｐ３５分子のヌクレオチド配列は、以下のとおりである。
【００８０】
【化３】
2009544703.tif 000005
完全長ヒトＳｐ３５ポリペプチドのポリペプチド配列は、以下のとおりである。
【００８１】
【化４】
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ＴｒｋＡまたはｇｐｌ４０ｔｒｋ
ニューロトロフィンは、ニューロンの分化、生存および機能を担う高度に相同な成長因子の小ファミリーである。哺乳動物では、既知のニューロトロフィンは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）（ＮＴ−４／５またはＮＴ−５としても知られる）、およびニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）である。Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５：１３８６−１４０３（１９９４）。ニューロトロフィンは、２つの受容体型、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）およびチロシンキナーゼのＴｒｋ受容体ファミリーの３つの構成員（哺乳動物のもの）（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）に結合する。ニューロトロフィンがＴｒｋ受容体細胞外ドメインに結合すると、シグナル伝達経路が開始される。ニューロトロフィンが結合すると該受容体の自己リン酸化がもたらされ、それによりホモ二量体化が誘導される。ＴｒｋＡの自己リン酸化により、該シグナル伝達経路は、ホスファチジルイノシトールおよびｐ２１ＲＡＳ経路へのカップリングに至る。
【００８２】
チロシンタンパク質キナーゼアイソフォームには、ＴｒｋＡの７９０アミノ酸残基のものおよび７９６アミノ酸残基のものの２種類がある。Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５：１３８６−１４０３（１９９４）。この２つのアイソフォームは、細胞外ドメインに位置する６アミノ酸残基（ＶＳＦＳＰＶ（配列番号：＿）の存在において異なる。７９６アミノ酸のＴｒｋＡ分子は、主にニューロン細胞において発現されるが、７９０アミノ酸形態は、非ニューロン細胞で見出されている。Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５：１３８６−１４０３（１９９４）。ＴｒｋＡ受容体の細胞外ドメインは、システイン−クラスター（ＣＣＩ）、３つの２４アミノ酸のタンデムなロイシンに富むモチーフ（ＬＲＭ）で構成されたロイシンに富むモチーフ、および第２のシステイン−クラスター（ＣＣＩＩ）、その後ろの２つの免疫グロブリン様ドメイン（ニューロン細胞接着Ｎ−ＣＡＭ分子と同様のＣ２型のＩｇＩおよびＩｇＩＩ）で構成されている。Ｕｒｆｅｒら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５８２９−５８４０（１９９８）およびＢａｒｂａｃｉｄ，Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５：１３８６−１４０３（１９９４）を参照のこと。細胞外ドメインは、３９１アミノ酸長であり、配列番号：４の約アミノ酸３３〜約アミノ酸４２３にわたって存在する。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ  Ｐ０４６２９を参照のこと。
【００８３】
以下のヌクレオチド配列は、ヒトＴｒｋＡ受容体のｍＲＮＡとして報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＮＭ＿００２５２９である。
【００８４】
【化５】
2009544703.tif 000007
【００８５】
【化６】
2009544703.tif 000008
以下のポリペプチド配列は、ヒトＴｒｋＡポリペプチド配列（７９６アミノ酸形態）として報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＮＰ＿００２５２０を有する
【００８６】
【化７】
2009544703.tif 000009
以下のヌクレオチド配列は、ラットＴｒｋＡ受容体のｍＲＮＡとして報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号Ｍ８５２１４である。
【００８７】
【化８】
2009544703.tif 000010
【００８８】
【化９】
2009544703.tif 000011
以下のポリペプチド配列は、ラットＴｒｋＡポリペプチド配列（７９９アミノ酸）として報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号Ｐ３５７３９を有する。
【００８９】
【化１０】
2009544703.tif 000012
表２に、配列番号：４の配列に基づき、アミノ酸残基の数に従ってＴｒｋＡドメインおよび他の領域の一覧を示す。当業者には認識されるように、以下に示すドメインの開始残基および末端残基は、ドメインの測定に使用されるコンピュータモデル設計プログラムまたは使用される方法に応じて異なり得る。
【００９０】
【表２】
2009544703.tif 000013
ＴｒｋＡまたはＳｐ３５のアンタゴニストを使用する方法
本発明の一実施形態は、ＣＮＳニューロンと希乏突起膠細胞の混合物を有効量のＴｒｋＡアンタゴニストと接触させることを含む、ＣＮＳニューロンの髄鞘形成の促進方法を提供する。本発明の方法の目的のためのＴｒｋＡアンタゴニストは、ＣＮＳ髄鞘形成の阻害を軽減する、および／またはＣＮＳニューロン細胞生存を促進させる、および／またはＳｐ３５発現を低減または阻害する任意の分子であり得る。本発明の方法における使用のためのＴｒｋＡアンタゴニストは、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＡアプタマーおよび前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択される。
【００９１】
本発明のさらなる実施形態は、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＡアプタマーおよび前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物の有効量を、それを必要とする哺乳動物に、投与することを含む、哺乳動物におけるＣＮＳニューロンの髄鞘形成の促進方法を包含する。
【００９２】
本発明の他の実施形態は、希乏突起膠細胞または希乏突起膠細胞の前駆細胞を、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＡアプタマーおよび前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストの有効量と接触させることによる希乏突起膠細胞の分化の促進方法を包含する。特定のある実施形態において、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、ＴｒｋＡの細胞外ドメイン全体を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まない。さらに、特定のある実施形態では、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１〜Ｘ２（ここで、Ｘ２は４０５〜４２３であり得る）、または配列番号：６のアミノ酸１〜４０５を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まない。さらに、特定のある実施形態では、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１〜Ｘ２（ここで、Ｘ２は４０５〜４２３であり得る）、または配列番号：６のアミノ酸１〜４０５を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まず、前記可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドはＦｃ部分に融合されている。
【００９３】
本発明のさらなる一実施形態は、髄鞘発育不全または髄鞘脱落と関連する疾患、障害または損傷（例えば、多発性硬化症）を、かかる疾患を患う動物（例えば、哺乳動物）において処置する方法であって、それを必要とする哺乳動物への、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＡアプタマーおよび前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストの治療有効量の投与を含む、本質的に該投与からなる、または該投与からなる方法を提供する。
【００９４】
本発明の他の実施形態は、ＣＮＳニューロンの生存をそれを必要とする哺乳動物において促進する方法であって、ＴｒｋＡアンタゴニストがＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＡアプタマーおよび前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニスト含有組成物の有効量を投与することを含む方法を包含する。
【００９５】
本発明のさらなる実施形態は、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＡアプタマーおよび前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニストを含む組成物の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における希乏突起膠細胞の分化の促進方法を包含する。特定のある実施形態において、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、ＴｒｋＡの細胞外ドメイン全体を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まない。さらに、特定のある実施形態において、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１〜Ｘ２（ここで、Ｘ２は４０５〜４２３であり得る）、または配列番号：６のアミノ酸１〜４０５を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まない。さらに、特定のある実施形態において、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１〜Ｘ２（ここで、Ｘ２は４０５〜４２３であり得る）、または配列番号：６のアミノ酸１〜４０５を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まず、前記可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドはＦｃ部分に融合されている。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＮＳニューロンを、ＴｒｋＡアンタゴニストがＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＡアプタマーおよび前記ＴｒｋＡアンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＴｒｋＡアンタゴニスト含有組成物と接触させることを含む、ＴｒｋＡインヒビターの非存在下でのＳｐ３５発現と比べてＳｐ３５発現を低減または阻害させるための方法を包含する。
【００９７】
本発明のさらなる実施形態は、ニューロンと希乏突起膠細胞の混合物を、Ｓｐ３５アンタゴニストが可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、Ｓｐ３５アプタマーおよび前記Ｓｐ３５アンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニスト含有組成物と接触させることを含む、Ｓｐ３５とＴｒｋＡの相互作用のブロック方法を包含する。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態は、ＣＮＳニューロンを、Ｓｐ３５アンタゴニストが可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド、Ｓｐ３５アプタマーおよび前記Ｓｐ３５アンタゴニストの２種類以上の組合せからなる群より選択されるＳｐ３５アンタゴニスト含有組成物と接触させることを含む、ＴｒｋＡインヒビターの非存在下でのＴｒｋＡリン酸化と比べてＴｒｋＡリン酸化を阻害または低減させるための方法を包含する。
【００９９】
本発明の方法において、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、可溶性Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡ抗体、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチド、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアプタマー、またはその組合せの患者への直接投与によって投与され得る。あるいはまた、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、特異的Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストを産生させる発現ベクターによって投与され得る。
【０１００】
本発明の特定のある実施形態において、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、（１）移植可能な宿主細胞を、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストを発現する核酸（例えば、ベクター）で形質転換またはトランスフェクトすること；および（２）形質転換された宿主細胞を哺乳動物の疾患、障害または損傷の部位に移植することを含む方法で投与される。例えば、形質転換された宿主細胞は、特定の罹患部位に移植され得る（例えば、形質転換された宿主細胞はＭＳの慢性病変部位移植され得る）。本発明の一部のある実施形態では、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストをコードする単離核酸で形質転換またはトランスフェクトし、取り出された同じ哺乳動物に移植し戻す。該細胞は、移植される部位と同じ部位から取り出されるのがよいが、そうである必要はない。かかる実施形態は、場合によってはエキソビボ遺伝子療法として知られるものであり、限定的な期間、作用部位に限局的にＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの連続供給をもたらし得る。
【０１０１】
本発明の方法によって処置または改善され得る疾患または障害としては、ＣＮＳニューロンの髄鞘発育不全または髄鞘脱落に関連する疾患、障害または損傷が挙げられる。かかる疾患としては、限定されないが、ニューロンを囲むミエリンが存在しない、不完全、適正に形成されていない、または衰退性のいずれかである疾患および障害が挙げられる。かかる疾患としては、限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィ、アレグザンダー病、ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性（ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線療法後損傷、化学療法の神経系の合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン‐コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ‐ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、急性播種性脳炎、ギヤン‐バレー症候群、マリー・シャルコー・トゥース病およびベル麻痺が挙げられる。
【０１０２】
本明細書に開示した方法において使用されるＴｒｋＡアンタゴニスト、例えば、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、アンタゴニストＴｒｋＡポリペプチド、ＴｒｋＡ抗体、ＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドまたはＴｒｋＡアプタマーは、ＴｒｋＡが髄鞘形成および／またはニューロンの生存を負に調節する能力および／またはＳｐ３５発現を増大させる能力を停止、低減、抑制もしくは阻害する治療用薬剤として調製および使用され得る。
【０１０３】
本明細書に開示した方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニスト、例えば、可溶性Ｓｐ３５、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドまたはＳｐ３５アプタマーは、Ｓｐ３５がＴｒｋＡと相互作用する能力を停止、低減、抑制もしくは阻害する治療用薬剤として、および／またはＴｒｋＡリン酸化を停止、低減、抑制もしくは阻害する治療用薬剤として調製および使用され得る。
【０１０４】
ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物
本発明の方法におけるＴｒｋＡアンタゴニストとしては、アンタゴニスト化合物の非存在下でのＴｒｋＡの状態と比べた場合、ＴｒｋＡの活性を阻害もしくは低下させる、またはＴｒｋＡのリン酸化を阻害もしくは低減させる任意の化学薬品または合成の化合物を含むＴｒｋＡ化合物アンタゴニストが挙げられる。
【０１０５】
ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物としては、限定されないが、米国特許第５，４６８，８７号（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のＫ２５２ａおよびその誘導体；リドカイン［１３７−５８−６］；ブピバカイン  ２１８０−９２−９］；プロカイン［５９−４６−１］；１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾロ［４，３−□］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ）［４１４４３−２８−１］；メチル水銀［２２９６７−９２−６］；エンドカンナビノイドアナンダミド；ＣＥＰ−７０１［１１１３５８−８８−４］；ＣＥＰ−７５１（ＫＴ−６５８７）；ＰＤ０９８０５９［１６７８６９−２１−８］；タモキシフェン［１０５４０−２９−１］；ツニカマイシン［１１０８９−６５−９］；３−モルホリノシンドノミン（Ｓｉｎ−１）［１６１４２−２７−１］；トリホスチンＡＧ８７９［１４８７４１−３０−４］；ハービマイシンＡ［７０５６３−５８−５］；ゲニステイン［４４６−７２−０］；５−アザシチジン［３２０−６７−１］；およびトリホスチンＲＧ５０８９６４またはトリホスチンＲＧ５０８７２［１０５３７−４７−０］が挙げられる。
【０１０６】
当業者には、本発明の方法において有用であり得る他のＴｒｋＡ化合物を、どのようにしてスクリーニングし、試験するかがわかるであろう。
【０１０７】
可溶性Ｓｐ３５およびアンタゴニストＴｒｋＡポリペプチド
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド
本発明の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストとしては、天然に存在するＳｐ３５の生物学的機能を阻止、阻害または干渉するポリペプチドが挙げられる。具体的には、本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの断片、変異体、またはその誘導体が挙げられる。上記の表１に、Ｓｐ３５ポリペプチドの種々のドメインを示している。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠いており、典型的にはＳｐ３５ポリペプチドの細胞内ドメインを欠いている。例えば、ある種の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５の膜貫通ドメインを含むアミノ酸５５２〜５７６および／またはＳｐ３５の細胞内ドメインを含むアミノ酸５７７〜６１４を欠いている。さらに、ある種の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５ポリペプチドのＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、塩基性領域および／または細胞外ドメイン全体（配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２に相当）を含むものである。当業者には認識され得るように、Ｓｐ３５の細胞外ドメイン全体は、細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに含まれるアミノ酸が、さらに多いか、またはより少ないものであり得る。
【０１０８】
したがって、本発明の方法における使用のための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸４１〜５２５、配列番号２のアミノ酸４０〜５２６、配列番号２のアミノ酸３９〜５２７、配列番号２のアミノ酸３８〜５２８、配列番号２のアミノ酸３７〜５２９、配列番号２のアミノ酸３６〜５３０、配列番号２のアミノ酸３５〜５３１、配列番号２のアミノ酸３４〜５３１、配列番号２のアミノ酸４６〜５２０、配列番号２のアミノ酸４５〜５２１、配列番号２のアミノ酸４４〜５２２、配列番号２のアミノ酸４３〜５２３、および配列番号２のアミノ酸４２〜５２４のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。Ｓｐ３５ポリペプチドアンタゴニストには、表１に記載のドメインの任意の組合せが含まれ得る。
【０１０９】
本発明の方法における使用のためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸１〜３３、配列番号２のアミノ酸１〜３５、配列番号２のアミノ酸３４〜６４、配列番号２のアミノ酸３６〜６４、配列番号２のアミノ酸６６〜８９、配列番号２のアミノ酸９０〜１１３、配列番号２のアミノ酸１１４〜１３７、配列番号２のアミノ酸１３８〜１６１、配列番号２のアミノ酸１６２〜１８５、配列番号２のアミノ酸１８６〜２０９、配列番号２のアミノ酸２１０〜２３３、配列番号２のアミノ酸２３４〜２５７、配列番号２のアミノ酸２５８〜２８１、配列番号２のアミノ酸２８２〜３０５、配列番号２のアミノ酸３０６〜３２９、配列番号２のアミノ酸３３０〜３５３、配列番号２のアミノ酸３６３〜４１６、配列番号２のアミノ酸４１７〜４２４、配列番号２のアミノ酸４１９〜４９３、および配列番号２のアミノ酸４９４〜５５１のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。
【０１１０】
本発明の方法における使用のためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸１〜３３、配列番号２のアミノ酸１〜３５、配列番号２のアミノ酸１〜６４、配列番号２のアミノ酸１〜８９、配列番号２のアミノ酸１〜１１３、配列番号２のアミノ酸１〜１３７、配列番号２のアミノ酸１〜１６１、配列番号２のアミノ酸１〜１８５、配列番号２のアミノ酸１〜２０９、配列番号２のアミノ酸１〜２３３、配列番号２のアミノ酸１〜２５７、配列番号２のアミノ酸１〜２８１、配列番号２のアミノ酸１〜３０５、配列番号２のアミノ酸１〜３２９、配列番号２のアミノ酸１〜３５３、配列番号２のアミノ酸１〜４１６、配列番号２のアミノ酸１〜４２４、配列番号２のアミノ酸１〜４９３、配列番号２のアミノ酸１〜５５１、配列番号２のアミノ酸１〜５３１、および配列番号２のアミノ酸１〜５３２のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。
【０１１１】
本発明の方法における使用のためのなおさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸３４〜６４、配列番号２のアミノ酸３４〜８９、配列番号２のアミノ酸３４〜１１３、配列番号２のアミノ酸３４〜１３７、配列番号２のアミノ酸３４〜１６１、配列番号２のアミノ酸３４〜１８５、配列番号２のアミノ酸３４〜２０９、配列番号２のアミノ酸３４〜２３３、配列番号２のアミノ酸３４〜２５７、配列番号２のアミノ酸３４〜２８１、配列番号２のアミノ酸３４〜３０５、配列番号２のアミノ酸３４〜３２９、配列番号２のアミノ酸３４〜３５３、配列番号２のアミノ酸３４〜４１６、配列番号２のアミノ酸３４〜４２４、配列番号２のアミノ酸３４〜４９３、および配列番号２のアミノ酸３４〜５５１のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。
【０１１２】
本発明の方法における使用のためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸３４〜５３０、配列番号２のアミノ酸３４〜５３１、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２、配列番号２のアミノ酸３４〜５３３、配列番号２のアミノ酸３４〜５３４、配列番号２のアミノ酸３４〜５３５、配列番号２のアミノ酸３４〜５３６、配列番号２のアミノ酸３４〜５３７、配列番号２のアミノ酸３４〜５３８、配列番号２のアミノ酸３４〜５３９、配列番号２のアミノ酸３０〜５３２、配列番号２のアミノ酸３１〜５３２、配列番号２のアミノ酸３２〜５３２、配列番号２のアミノ酸３３〜５３２、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２、配列番号２のアミノ酸３５〜５３２、配列番号２のアミノ酸３６〜５３２、配列番号２のアミノ酸３０〜５３１、配列番号２のアミノ酸３１〜５３１、配列番号２のアミノ酸３２〜５３１、配列番号２のアミノ酸３３〜５３１、配列番号２のアミノ酸３４〜５３１、配列番号２のアミノ酸３５〜５３１、および配列番号２のアミノ酸３６〜５３１のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。
【０１１３】
本発明の方法における使用のためのなおさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸３６〜６４、配列番号２のアミノ酸３６〜８９、配列番号２のアミノ酸３６〜１１３、配列番号２のアミノ酸３６〜１３７、配列番号２のアミノ酸３６〜１６１、配列番号２のアミノ酸３６〜１８５、配列番号２のアミノ酸３６〜２０９、配列番号２のアミノ酸３６〜２３３、配列番号２のアミノ酸３６〜２５７、配列番号２のアミノ酸３６〜２８１、配列番号２のアミノ酸３６〜３０５、配列番号２のアミノ酸３６〜３２９、配列番号２のアミノ酸３６〜３５３、配列番号２のアミノ酸３６〜４１６、配列番号２のアミノ酸３６〜４２４、配列番号２のアミノ酸３６〜４９３、および配列番号２のアミノ酸３６〜５５１のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。
【０１１４】
本発明の方法における使用のためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号２のアミノ酸３６〜５３０、配列番号２のアミノ酸３６〜５３１、配列番号２のアミノ酸３６〜５３２、配列番号２のアミノ酸３６〜５３３、配列番号２のアミノ酸３６〜５３４、配列番号２のアミノ酸３６〜５３５、配列番号２のアミノ酸３６〜５３６、配列番号２のアミノ酸３６〜５３７、配列番号２のアミノ酸３６〜５３８、および配列番号２のアミノ酸３６〜５３９のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。
【０１１５】
さらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、その断片、変異体または誘導体としては、Ｓｐ３５のＩｇドメインを含むポリペプチドが挙げられる。例えば、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９５、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９６、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９７、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９８、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９９、配列番号２のアミノ酸４１７〜５００、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９２、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９１、配列番号２のアミノ酸４１２〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１３〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１４〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１５〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１６〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１１〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１０〜４９３、配列番号２のアミノ酸４１０〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１１〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１２〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１３〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１４〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１５〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１６〜４９４、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９４、および配列番号２のアミノ酸４１８〜４９４のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体。
【０１１６】
また、本発明の方法における使用のための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、本明細書に開示した可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを２種類以上含むものである。本発明の方法における使用のための該２種類以上の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、一緒に融合されて本明細書に開示したＳｐ３５可溶性ポリペプチドを多数含む単一のポリペプチドを形成したものであってもよく、本発明の方法における使用のための組成物を構成する個々の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドであってもよい。
【０１１７】
本発明を実施するための種々の例示的な可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドならびにこのような分子を得るための方法および材料は、後述のものである、および／または例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２３、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ２００４／０８５６４８や米国特許公開公報第２００６／０１７６７３号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を見るとよい。
【０１１８】
ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド
本発明の方法における使用のためのＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドとしては、ＴｒｋＡの活性をブロック、阻害、干渉または低減し得る任意のポリペプチドが挙げられる。かかるタンパク質としては、限定されないが、ＰＴＥＮ；ＳＨＰ−１；妊娠期タンパク質；ヒトアルファ（２）−マクログロブリン（アルファ２ｍ）；メチルアミン活性化型アルファ２Ｍ（ＭＡ−アルファ２Ｍ）；セロトニン活性化型アルファ２Ｍ（５ＨＴ−アルファ２Ｍ）；百日咳毒素；ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連癌遺伝子（ＭＹＣＮ）によりもたらされるタンパク質；およびカベオリンが挙げられる。さらに、本発明の方法における使用のためのＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドとしては、限定されないが、ＴｒｋＡポリペプチド（可溶性ポリペプチドを含む）が挙げられる。
【０１１９】
具体的には、本発明の方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡポリペプチドとしては、可溶性ＴｒｋＡポリペプチドの断片、変異体または誘導体が挙げられる。上記の表２に、ＴｒｋＡポリペプチドの種々のドメインを示している。可溶性ＴｒｋＡポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠いており、典型的にはＴｒｋＡポリペプチドの細胞内ドメインを欠いている。例えば、ある種の可溶性ＴｒｋＡポリペプチドは、ＴｒｋＡの膜貫通ドメインを含む配列番号：４のアミノ酸４０８〜４３３、４０８〜４３９、４２４〜４３３もしくは４２４〜４３９および／またはＴｒｋＡの細胞内ドメインを含む配列番号：４のアミノ酸４３４〜７９６もしくは４４０〜７９６を欠いている。さらに、ある種の可溶性ＴｒｋＡポリペプチドは、ＴｒｋＡポリペプチドのシステインクラスター（ＣＣＩおよび／またはＣＣＩＩ）、ロイシンに富むモチーフおよび／または１つ以上のロイシンに富む反復配列、Ｉｇドメイン（ＩｇＩおよび／またはＩｇＩＩ）および／または細胞外ドメイン全体もしくはその一部分（配列番号：４のアミノ酸３６〜４２３もしくは３６〜４０７に相当）を含む。当業者には認識され得るように、ＴｒｋＡの細胞外ドメインは、細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに含まれるアミノ酸が、さらに多いか、またはより少ないものであり得る。
【０１２０】
特定のある実施形態において、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、ＴｒｋＡの細胞外ドメイン全体を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まない。さらに、特定のある実施形態において、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１〜Ｘ２（ここで、Ｘ２は４０５〜４２３であり得る）、または配列番号：６のアミノ酸１〜４０５を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まない。さらに、特定のある実施形態において、希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１〜Ｘ２（ここで、Ｘ２は４０５〜４２３であり得る）、または配列番号：６のアミノ酸１〜４０５を含む可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを含まず、前記可溶性ＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドはＦｃ部分に融合されている。
【０１２１】
本発明の方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号：４のアミノ酸Ｘ〜Ｙ（ここで、Ｘは配列番号：４のアミノ酸１〜４０であり、Ｙは配列番号：４のアミノ酸６０〜４５０である）のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＴｒｋＡポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。本発明の特定のある実施形態において、配列番号：４ののアミノ酸Ｘ〜Ｙ（ここで、Ｘは配列番号：４のアミノ酸１〜４０であり、Ｙは配列番号：４のアミノ酸６０〜４５０である）のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなる希乏突起膠細胞の分化の促進方法における使用のためのＴｒｋＡポリペプチドは、配列番号：４のアミノ酸１〜４０５を含まない。
【０１２２】
本発明の方法における使用のための可溶性ＴｒｋＡポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号４の３６〜６８；配列番号４の９０〜１１３；配列番号４の１１５〜１３７；配列番号４の９０〜１３７；配列番号４の１４１〜１９２；配列番号４の２１１〜２６９；配列番号４の２１１〜２８３；配列番号４の１９４〜２６９；配列番号４の１９４〜２８３；配列番号４の２９９〜３６５；配列番号４の３６６〜４０７；配列番号４の３６６〜４２４のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＴｒｋＡポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。ＴｒｋＡポリペプチドアンタゴニストには、表２に記載のドメインの任意の組合せが含まれ得る。
【０１２３】
本発明の方法における使用のためのさらなる可溶性ＴｒｋＡポリペプチド、その断片、変異体または誘導体としては、限定されないが、配列番号４の１〜６８；配列番号４の１〜１１３；配列番号４の１〜１３７；配列番号４の１〜１４０；配列番号４の１〜１９２；配列番号４の１〜２６９；配列番号４の１〜２８３；配列番号４の１〜３６５；配列番号４の１〜４０７；配列番号４の１〜４４１；配列番号４の１〜４３９；配列番号４の３６〜６８；配列番号４の３６〜１１３；配列番号４の３６〜１３７；配列番号４の３６〜１４０；配列番号４の３６〜１９２；配列番号４の３６〜２６９；配列番号４の３６〜２８３；配列番号４の３６〜３６５；配列番号４の３６〜４０７；配列番号４の３６〜４３９；のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＴｒｋＡポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体挙げられる。
【０１２４】
さらなる可溶性ＴｒｋＡポリペプチド、その断片、変異体または誘導体としては、ＴｒｋＡの１つ以上のＩｇドメインを含むポリペプチドが挙げられる。例えば、配列番号４の１９４〜２６９；配列番号４の１９４〜２８３；配列番号４の２１１〜２６９；配列番号４の２１１〜２８３；配列番号４の２９９〜３６５；配列番号４の１９４〜３６５；または配列番号４の２１１〜３６５のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＴｒｋＡポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。
【０１２５】
本発明の方法における使用のためのさらなるＴｒｋＡポリペプチド、その断片、変異体または誘導体としては、限定されないが、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン全体またはその一部分を含む、本質的に該ドメインからなる、もしくは該ドメインからなるＴｒｋＡポリペプチドが挙げられる。例えば、配列番号：４のアミノ酸Ｘ１〜Ｙ１（ここで、Ｘ１は配列番号：４のアミノ酸１〜３６であり、Ｙ１はアミノ酸３６０〜４４５である）のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＴｒｋＡポリペプチド、またはかかるポリペプチドの断片、変異体もしくは誘導体（例えば、配列番号：４のアミノ酸１〜４４１もしくは配列番号：４の３６〜４４１）。
【０１２６】
本発明の方法における使用のためのさらなるＴｒｋＡポリペプチド、その断片、変異体または誘導体としては、限定されないが、免疫グロブリンドメインに融合された完全長ＴｒｋＡタンパク質（配列番号：４の７９０アミノ酸形態または７９６アミノ酸形態のいずれか）を含む、本質的に該タンパク質からなる、もしくは該タンパク質からなるＴｒｋＡポリペプチドが挙げられる。例えば、ＩｇＧドメインに融合された配列番号：４の１〜７９６；配列番号：４の３６〜７９６のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＴｒｋＡポリペプチド。本明細書に記載のさらなるＴｒｋＡポリペプチド、その断片、変異体または誘導体もまた、免疫グロブリンドメインに融合されたものであり得る。
【０１２７】
また、本発明の方法における使用のためのさらなるＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、本明細書に開示したＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを２種類以上含むものである。本発明の方法における使用のための該２種類以上のＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドは、一緒に融合されて本明細書に開示したＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを多数含む単一のポリペプチドを形成したものであってもよく、本発明の方法における使用のための組成物を構成する個々のＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドであってもよい。
【０１２８】
本明細書に記載の本発明の方法における使用のための可溶性Ｓｐ３５およびＴｒｋＡポリペプチドは環状であってもよい。可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドの環化により、線状ペプチド立体配座の自由度が低減され、より構造的に拘束された分子がもたらされる。多くのペプチド環化方法、例えば、ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸残基間のアミド結合の形成による「主鎖を主鎖への」環化が当該技術分野で知られている。「主鎖を主鎖への」環化方法としては、２つの□−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）間のジスルフィド結合の形成が挙げられる。本発明における特定の一部の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡペプチドは、そのペプチドのＮ−およびＣ−末端上に環状Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドを形成するための修飾を含むものである。かかる修飾としては、限定されないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分とビオチンを有するシステイン残基が挙げられる。他のペプチド環化方法は、Ｌｉ＆Ｒｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１２９】
本明細書に記載の可溶性Ｓｐ３５またはアンタゴニストＴｒｋＡポリペプチドは、置換、挿入または欠失などの種々の改変を有するものであってもよい。例えば、置換としては、限定されないが、以下：配列番号：２のＳｐ３５ポリペプチドの６位のバリンをメチオニンへ；配列番号：２のＳｐ３５ポリペプチドの２９４位のセリンをグリシンへ；配列番号：２のＳｐ３５ポリペプチドの３４８位のバリンをアラニンへ；Ｓｐ３５ポリペプチドの４１９位のアルギニンをヒスチジンへ；４５６位のアルギニンをグルタミン酸へ；および配列番号：２の４５８位のヒスチジンをバリンへの置換が挙げられる。
【０１３０】
本明細書に記載の配列番号：２または配列番号：４のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一の可溶性Ｓｐ３５またはアンタゴニストＴｒｋＡポリペプチドの対応する断片もまた想定される。
【０１３１】
当該技術分野で知られているように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本明細書において論考する場合、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるか否かは、当該技術分野で知られた方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア、例えば、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）のバージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）などを用いて決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴでは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて２つの配列間の相同性が最良のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列が、参照配列と例えば９５％同一であるか否かを本発明に従って決定する場合、パラメータは、もちろん、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の完全長において計算されるように、および参照配列のアミノ酸総数の５％までの相同性ギャップが許容されるように設定される。
【０１３２】
本発明の方法における使用のための可溶性Ｓｐ３５またはアンタゴニストＴｒｋＡポリペプチドは、２種類以上の可溶性Ｓｐ３５またはアンタゴニストＴｒｋＡポリペプチドの任意の組合せを含むものであり得る。
【０１３３】
抗体またはその抗原結合断片
一実施形態において、本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、抗体分子またはその免疫特異的断片である。特に記載のない限り、本明細書で用いる場合、抗体に関する「その断片」は、免疫特異的断片、すなわち、抗原特異的断片をいう。一実施形態において、本発明の方法における使用のための抗体は、二重特異性結合分子、結合性ポリペプチド、または抗体（例えば、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン欠失抗体）、または１つより多くのエピトープ（例えば、１つより多くの抗原もしくは同じ抗原上の１つより多くのエピトープ）に対する結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施形態において、二重特異性抗体は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡのエピトープに特異的な２つの標的結合ドメインおよび第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有する４価抗体であり得る。したがって、４価の二重特異性抗体は、各特異性に対して２価のものであり得る。
【０１３４】
また、本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストには、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ活性のアンタゴニストであるＳｐ３５またはＴｒｋＡ特異的抗体もしくは抗原結合断片、変異体または誘導体が包含される。例えば、特定のあるＳｐ３５またはＴｒｋＡ抗体が、ＣＮＳニューロン上に発現されたＳｐ３５またはＴｒｋＡに結合すると、髄鞘形成の阻害がブロックされる。
【０１３５】
本明細書に記載の方法における使用のための特定の一部のアンタゴニスト抗体は、特定のＳｐ３５ポリペプチド断片またはドメインに特異的または優先的に結合する。かかるＳｐ３５ポリペプチド断片としては、限定されないが、配列番号：２の３４〜５３２；３４〜４１７、３４〜４２５、３４〜４９３、６６〜５３２、６６〜４１７（ＬＲＲドメイン）、６６〜４２６、６６〜４９３、６６〜５３２、４１７〜５３２、４１７〜４２５  （Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７〜４２４（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７〜４９３、４１７〜５３２、４１９〜４９３  （Ｓｐ３５  Ｉｇ領域）、もしくは４２５〜５３２のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなるＳｐ３５ポリペプチド、または配列番号：２の３４〜５３２；３４〜４１７、３４〜４２５、３４〜４９３、６６〜５３２、６６〜４１７、６６〜４２６、６６〜４９３、６６〜５３２、４１７〜５３２、４１７〜４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７〜４９３、４１７〜５３２、４１９〜４９３（Ｓｐ３５  Ｉｇ領域）、もしくは４２５〜５３２のアミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＳｐ３５変異体ポリペプチドが挙げられる。
【０１３６】
本発明の方法における使用のための、特定のあるＳｐ３５特異的抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片としては、限定されないが、Ｓｐ３５の１つ以上のロイシンに富む反復配列（ＬＲＲ）を含む、本質的に該反復配列からなる、もしくは該反復配列からなる断片が挙げられる。かかる断片としては、例えば、配列番号：２の６６〜８９、６６〜１１３、６６〜１３７、９０〜１１３、１１４〜１３７、１３８〜１６１、１６２〜１８５、１８６〜２０９、２１０〜２３３、２３４〜２５７、２５８〜２８１、２８２〜３０５、３０６〜３２９、または３３０〜３５３のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなる断片が挙げられる。配列番号：２の６６〜８９、６６〜１１３、９０〜１１３、１１４〜１３７、１３８〜１６１、１６２〜１８５、１８６〜２０９、２１０〜２３３、２３４〜２５７、２５８〜２８１、２８２〜３０５、３０６〜３２９、または３３０〜３５３のアミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応する断片もまた想定される。
【０１３７】
本発明の特定のある抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片としては、限定されないが、Ｓｐ３５のＬＲＲに隣接する１つ以上のシステインに富む領域を含む、本質的に該領域からなる、もしくは該領域からなる断片が挙げられる。かかる断片としては、例えば、配列番号：２の３４〜６４（Ｎ末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＮＴ））のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなる断片、または配列番号：２の３６３〜４１６（Ｃ末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＣＴ））のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなる断片が挙げられる。配列番号：２のアミノ酸３４〜６４および３６３〜４１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応する断片もまた想定される。
【０１３８】
他の実施形態において、本明細書に記載の方法において使用されるＳｐ３５アンタゴニストとしては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が挙げられ、ここで、該エピトープは、配列番号：２の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号：２の少なくとも７個、少なくとも９個または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなる。記載の配列番号：２の所与のエピトープのアミノ酸は、隣接または線状のものであり得るが、そうである必要はない。特定のある実施形態において、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面上に、または可溶性断片として（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合された）発現されるＳｐ３５の細胞外ドメインによって形成される非線形エピトープを含む、本質的に該エピトープからなる、もしくは該エピトープからなる。したがって、特定のある実施形態において、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは、配列番号：２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００個の隣接または非隣接アミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなり、ここで、非隣接アミノ酸は、タンパク質のフォールディングによってエピトープを形成する。
【０１３９】
本明細書に記載の方法における使用のための特定の一部のアンタゴニスト抗体は、特定のＴｒｋＡポリペプチド断片またはドメインに特異的または優先的に結合する。ＴｒｋＡアンタゴニスト抗体の特定の一部の非限定的な例としては、限定されないが、ＴｒｋＡ受容体（例えば、ＭＮＡＣ１３；ＡＢ１５７７（ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；およびＭＣ１９２）へのＮＧＦの結合を妨げる、または弱めるモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１４０】
本発明の方法における使用のための例示的な抗体またはその断片としては、限定されないが、Ｍｉらの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／２６２７１（発明の名称「Ｓｐ３５抗体およびその使用」、２００６年７月７日に出願、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の
【０１４１】
【化１１】
2009544703.tif 000014
からなる群より選択される参照モノクローナル抗体と同じＳｐ３５エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
【０１４２】
他の実施形態において、本発明の方法において使用されるＳｐ３５およびＴｒｋＡアンタゴニストとしては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープまたはＴｒｋＡに特異的または優先的に結合するＳｐ３５またはＴｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が挙げられ、ここで、該エピトープは、それぞれ、上記の配列番号：２のまたは配列番号：４の１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の隣接または非隣接アミノ酸を含む、本質的に該アミノ酸からなる、もしくは該アミノ酸からなることに加えて、そのタンパク質を修飾するさらなる部分（例えば、糖鎖部分）が、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ抗体が修飾標的タンパク質に、そのタンパク質の非修飾型よりも高い親和性で結合するように含まれたものであり得る。あるいはまた、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ抗体は、標的タンパク質の非修飾型に全く結合しないものである。
【０１４３】
特定のある実施形態において、本発明の方法において使用されるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストとしては、上記のＳｐ３５またはＴｒｋＡまたは断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、非関連またはランダムなエピトープに結合するよりも容易に結合する、上記のＳｐ３５またはＴｒｋＡまたは断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、かかるエピトープに対して、関連、類似、相同または類縁のエピトープに結合するよりも容易に結合する；それ自体が上記のＳｐ３５またはＴｒｋＡまたは断片もしくは変異体のある特定のエピトープに特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害する；あるいは、上記のＳｐ３５またはＴｒｋＡまたは断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍまたは約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性で結合する本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。特別な一態様において、該抗体またはその断片は、マウスのＳｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドまたはその断片と比べ、ヒトのＳｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。
【０１４４】
抗体結合解離定数との関連で用いる場合、用語「約」は、抗体親和性を測定するために使用される方法に固有のばらつきの程度を許容する。例えば、使用する器具類の精度レベル、測定対象の試料数に基づく標準誤差および丸め誤差に応じて、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを包含し得る。
【０１４５】
具体的なある実施形態において、本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストとしては、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１または１０−３秒−１以下のオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｆｆ））で結合する本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１または１０−５秒−１  ５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。
【０１４６】
他の実施形態において、本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストとしては、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｏｎ  ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｎ））で結合する本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体が挙げられる。あるいはまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合する。
【０１４７】
本発明の特定の一部の方法は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的断片（これは、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一画分が、所望の生化学的特性、例えば、ほぼ同じ免疫原性の完全体の非改変抗体と比べた場合、エフェクター機能の低下、非共有結合により二量体化する能力、腫瘍部位に局在する能力の増大、血清半減期の短縮、または血清半減期の増大などがもたらされるように欠失あるいは改変されている）の投与を含む。例えば、本明細書に記載の方法における使用のための特定のある抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似したポリペプチド鎖を含むが、該重鎖ドメインの１つ以上の少なくとも一部分を欠いているドメイン欠失抗体である。例えば、特定のある抗体では、修飾抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失している（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠失している）。
【０１４８】
本明細書に記載の方法における使用のための特定のあるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片では、Ｆｃ部分が、当該技術分野で知られた手法を用いて、エフェクター機能が低下するように変異され得る。例えば、定常領域ドメインの（点変異もしくは他の手段による）欠失または不活化によって循環修飾抗体のＦｃ受容体結合が低減され、それにより、腫瘍局在が増大され得る。他の場合では、本発明と整合する該定常領域の修飾によって補体結合がモジュレートされ、したがって、コンジュゲートされた細胞毒素の血清半減期および非特異的会合が低減されることがあり得る。また他の定常領域の修飾を使用し、抗原特異性または抗体柔軟性の増大によって局在の増強を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分が修飾され得る。該修飾で得られる生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティおよび他の生化学的効果、例えば、腫瘍局在、生体分布および血清半減期などは、必要以上の実験を行なうことなく、よく知られた免疫学的手法を用いて容易に測定および定量され得る。
【０１４９】
本明細書に開示した方法における使用のための抗体またはその免疫特異的断片の修飾形態は、完全体の前駆体または親抗体から当該技術分野で知られた手法を用いて作製され得る。例示的な手法を、本明細書においてより詳細に論考する。
【０１５０】
特定のある実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片の可変領域と定常領域の両方が、完全にヒトのものである。完全ヒト抗体は、当該技術分野で知られた本明細書に記載の手法を用いて作製され得る。例えば、ある特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、該抗原を、抗原刺激に応答してかかる抗体を産生するように改変されているが、その内在遺伝子座は不能にしたトランスジェニック動物に投与することによって産生され得る。かかる抗体を作製するために使用され得る例示的な手法は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の手法が当該技術分野で知られている。完全ヒト抗体は、種々のディスプレイ手法、例えば、ファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイ系（本明細書の他の箇所に、より詳細に記載している）によって同様に作製され得る。
【０１５１】
本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該技術分野で知られた手法を用いて作製または製造され得る。特定のある実施形態において、抗体分子またはその断片は、「組換えにより作製」されたもの、すなわち、組換えＤＮＡ手法を用いて作製される。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な手法は、本明細書の他の箇所でより詳細に論考している。
【０１５２】
本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片には、該抗体への任意の型の分子の共有結合によって修飾された誘導体が含まれ、該共有結合は、例えば、該抗体がその対応するエピトープに特異的に結合するのを妨げないようなものである。例えば、なんら限定されないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体が挙げられる。任意の数多くの化学的修飾が既知の手法によって、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであってもよい。
【０１５３】
好ましい実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、処置対象の動物、例えばヒトにおいて有害な免疫応答を惹起しない。一実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片は、当該技術分野で認められた手法を用いて、その免疫原性が低減されるように修飾され得る。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ）されたものであり得るか、またはキメラ抗体が作製され得る。このような型の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体から誘導される。これは、種々の方法によって、例えば、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域にグラフティングしてキメラ抗体を作製すること；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部を、必須フレームワーク残基を保持している、もしくは保持していないヒトフレームワークおよび定常領域内にグラフティングすること；または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってこれをヒト様部分で「覆う（ｃｌｏａｋ）」ことによって得られ得る。かかる方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号，同第５，６９３，７６１号，同第５，６９３，７６２号および同第６，１９０，３７０号（これらはすべて，引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１５４】
また、脱免疫化を用いて抗体の免疫原性を減少させ得る。本明細書で用いる場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を包含する（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照のこと）。例えば、出発抗体由来のＶＨおよびＶＬ配列を解析し、ヒトＴ細胞エピトープを各Ｖ領域から「マッピング」すると、該配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の重要な残基と関連してエピトープの位置が示される。最終の抗体の活性を改変するリスクの少ない選択的アミノ酸置換を同定するため、Ｔ細胞エピトープマップの個々のＴ細胞エピトープを解析する。アミノ酸置換の組合せを含む一連の選択的ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、続いて、このような配列を、一連の結合性ポリペプチド、例えば、本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的断片内に組み込み、次いで、機能について試験する。典型的には、１２〜２４種の変異体抗体を作製して試験する。次いで、修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を、発現ベクター内にクローニングし、続いて、プラスミドを細胞株内に導入すると、完全体の抗体が産生される。次いで、該抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイにおいて比較し、最適な変異体を同定する。
【０１５５】
本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片は、当該技術分野で知られた任意の適当な方法によって作製され得る。ポリクローナル抗体は、当該技術分野でよく知られた種々の手順によって作製され得る。例えば、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ  免疫特異的断片を種々の宿主動物、例えば、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどに投与すると、該抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生成が誘導され得る。免疫学的応答を増大させるため、宿主の種に応じて種々のアジュバントが使用され得、限定されないが、フロイント（完全および不完全）、無機質ゲル（水酸化アルミニウムなど）、表面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなど）、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒト用アジュバント、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどが挙げられる。かかるアジュバントもまた、当該技術分野でよく知られている。
【０１５６】
モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた多種多様な手法を用いて、例えば、ハイブリドーマ、組換え手法およびファージディスプレイ手法、またはその組合せの使用によって作製され得る。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマ手法を用いて作製され得，該手法としては，当該技術分野で知られた，例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）（前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されたものなどが挙げられる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、ハイブリドーマ手法によって作製される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、単一のクローン（例えば、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローン）に由来する抗体をいい、その作製方法をいうのではない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ手法によって作製される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた多種多様な手法を用いて、例えば、ハイブリドーマおよび組換え手法およびファージディスプレイ手法の使用によって作製され得る。
【０１５７】
当該技術分野で認められたプロトコルを使用し、一例において、抗体は哺乳動物において、関連する抗原（例えば、精製Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ抗原またはかかる抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの多数回の皮下注射または腹腔内注射によって生成させる。この免疫処置により、典型的には、活性化された脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答が惹起される。得られた抗体を動物の血清から回収してポリクローナル調製物を得てもよいが、多くの場合、個々のリンパ球を脾臓、リンパ節または末梢血から単離してモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均一な調製物を得ることが望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から採取したものである。
【０１５８】
このよく知られた方法（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注射した哺乳動物由来の比較的短い寿命または致死性のリンパ球を、不死化腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合させると、不死化され、かつ遺伝子にコードされた抗体の産生能を有するＢ細胞のハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」が得られる。単一の抗体を形成するため、得られたハイブリッドを選択、希釈および再培養（ｒｅｇｒｏｗｔｈ）によって、個々の各系統が特定の遺伝子を含む単一の遺伝子系統に分離する。これは、所望の抗原に対して均一な抗体を産生し、親遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｒｅｎｔａｇｅ）が純粋であることに関連して「モノクローナル」と呼ばれる。
【０１５９】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合骨髄腫親細胞の増殖または生存を阻害する１種類以上の物質を含有する適当な培養培地に播種し、培養する。当業者には、ハイブリドーマの形成、選択および培養のための試薬、細胞株および培地がいくつかの供給元から市販されており、標準化されたプロトコルが充分確立されていることが認識されよう。一般的に、ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、インビトロアッセイ、例えば、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などによって測定する。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定した後、該クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９−１０３（１９８６））によって培養してもよい。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から慣用的な精製手順によって、例えば、プロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって分離され得ることはさらに認識されよう。
【０１６０】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の手法によって作製され得る。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を使用し、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって作製され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖の定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１６１】
また、当業者には、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡが、抗体ファージライブラリーからも誘導され得ることが認識されよう。特に、かかるファージを利用し、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウスのもの）で発現させた抗原結合ドメインをディスプレイさせ得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。このような方法に使用されるファージは、典型的には、ファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインとともに、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え融合させたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを含む糸状ファージである。例示的な方法は，例えば、ＥＰ３６８  ６８４  Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）；ＮａｇｙらＮａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に示されている。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））には，大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の作製、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換えが記載されている。別の実施形態では、リポソームディスプレイが、ディスプレイ基盤としてバクテリオファージの代わりに使用され得る（例えば、Ｈａｎｅｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）を参照のこと）。また別の実施形態では、細胞表面ライブラリーが抗体についてスクリーニングされ得る（Ｂｏｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。かかる手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ手法の代替法を提供する。
【０１６２】
ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、これをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトもしくはマウスのｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。特定のある実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーによって互いに連結し、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）内にクローニングする。該ベクターを大腸菌内にエレクトロポレーションし、該大腸菌をヘルパーファージに感染させる。このような方法に使用されるファージは、典型的には、ＦｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨまたはＶＬ領域は、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合させる。目的の抗原（すなわち、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。
【０１６３】
抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されたものが挙げられる。
【０１６４】
上記の参考文献に記載のように、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、完全体の抗体（例えば、ヒト抗体）または任意の他の所望の抗原結合断片を作製するために使用し、任意の所望の宿主（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌）内で発現させ得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより作製するための手法もまた、当該技術分野で知られた方法、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら，ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示された方法などを用いて採用され得る。
【０１６５】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を作製するために使用され得る手法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが挙げられる。一部の用途、例えば、ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイでは、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を使用することが好ましいことがあり得る。キメラ抗体は、抗体の種々の部分が異なる動物種に由来している分子、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などである。キメラ抗体の作製方法は、当該技術分野で知られている。例えば，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変（好ましくは改善）するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換される。このようなフレームワーク置換は、当該技術分野でよく知られた方法によって同定される（例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル設計によって抗原結合に重要なフレームワーク残基が同定され、配列比較によって特定の位置の非通常フレームワーク残基が同定される）。（例えば、Ｑｕｅｅｎら，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。抗体は，当該技術分野で知られたさまざまな手法、例えば、ＣＤＲ−グラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面処理（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４）），ならびに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を用いてヒト化され得る。
【０１６６】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、当該技術分野で知られたさまざまな方法によって、例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照のこと。
【０１６７】
ヒト抗体はまた、機能性内因性免疫グロブリンを発現する能力は持たないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製され得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体がマウス胚性幹細胞内に、無作為に、または相同組換えによって導入され得る。あるいはまた、ヒト可変領域、定常領域および多様な領域が、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞内に導入され得る。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは独立して、または同時に非機能性となり得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失により、内因性の抗体産生が抑制される。修飾された胚性幹細胞を拡大培養して胚盤胞内にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製する。次いで、キメラマウスを交配し、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。このトランスジェニックマウスを通常の様式で、選択した抗原（例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部分）を用いて免疫処置する。該抗原に対して指向されるモノクローナル抗体が、免疫処置したトランスジェニックマウスから慣用的なハイブリドーマ手法を用いて得られ得る。トランスジェニックマウスに保有されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再配列され、続いて、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、かかる手法を使用し、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの手法の概説については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの手法ならびにかかる抗体を作製するためのプロトコルの詳細な論考については、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。また、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）などの企業が上記のものと類似した手法を使用し、選択した抗原に対して指向されるヒト抗体の提供に従事することがあり得る。
【０１６８】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「選択ガイド（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる手法を用いて作製され得る。このアプローチでは、選択した非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択が誘導される（Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。米国特許第５，５６５，３３２号もまた参照のこと。
【０１６９】
別の実施形態において、本発明の方法における使用のための所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用的な手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定され得る。単離してサブクローニングしたハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として供される。該ＤＮＡは、単離したら発現ベクター内に配置され得、次いで、これを、他の場合では免疫グロブリンを産生しない原核生物または真核生物宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞など）にトランスフェクトする。より詳しくは、単離したＤＮＡ（これは、本明細書に記載のような合成のものであってもよい）は、Ｎｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（１９９５年１月２５日に出願）（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして、抗体の製造のために定常および可変領域の配列をクローニングするために使用され得る。本質的に、これは必然的に、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を伴う。この目的に好適なプライマーもまた、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下により詳細に論考するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、臨床用および市販用の免疫グロブリン供給物を提供するために比較的大量に培養され得る。
【０１７０】
具体的な一実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、当該技術分野でよく知られた方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列と比較して配列が超多様性の領域を決定することにより調べ、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列が同定され得る。常套的な組換えＤＮＡ手法を用いて１つ以上のＣＤＲをフレームワーク領域（例えば、ヒトフレームワーク領域）内に挿入すると、非ヒト抗体がヒト化され得る。フレームワーク領域は、天然に存在するものであってもコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧はＣｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組合せによって生成されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内において行われ得、好ましくは、該アミノ酸置換によってその抗体の抗原に対する結合が改善される。さらに、かかる方法を使用し、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製すると、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子が作製され得る。ポリヌクレオチドに対する他の改変が本発明に包含され、それは当該技術分野の技能の範囲内である。
【０１７１】
また、「キメラ抗体」の作製のために開発された、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。本明細書で用いる場合、キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの（例えば、ヒト化抗体など）である。
【０１７２】
あるいはまた、単鎖抗体の作製について報告された手法（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を、単鎖抗体を作製に適合させてもよい。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖と軽鎖の断片をアミノ酸橋絡を介して連結させ、単鎖抗体をもたらすことにより形成される。また、大腸菌内での機能性Ｆｖ断片の合成のための手法も使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１７３】
また、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体は、内因性免疫グロブリンを産生する能力を持たないトランスジェニック動物（例えば、マウス）において産生させたヒト抗体または実質的にヒト抗体であり得る（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号および同第５，５８９，３６９号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異型マウスにおける抗体の重鎖連結領域のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが報告されている。かかる生殖細胞系変異型マウスにヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原刺激によりヒト抗体の産生がもたらされる。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作製する別の好ましい手段が、米国特許第５，８１１，５２４号（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。このようなヒト抗体に関連する遺伝物質もまた、本明細書に記載のようにして単離および操作され得ることは認識されよう。
【０１７４】
組換え抗体を作製するためのまた別の非常に効率的な手段が、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。具体的には、この手法により、サル可変ドメインとヒト定常配列を含む霊長類化抗体の生成がもたらされる。この参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、この手法は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号および同第５，７５６，０９６号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。
【０１７５】
別の実施形態では、リンパ球を顕微操作によって選択し、種々の遺伝子が単離され得る。例えば、免疫処置した哺乳動物から末梢血単核細胞を単離し、約７日間インビトロで培養し得る。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングされ得る。陽性ウェルの細胞が単離され得る。個々のＩｇ産生Ｂ細胞がＦＡＣＳによって、または補体媒介型溶血斑形成法において同定することによって単離され得る。Ｉｇ産生Ｂ細胞はチューブ内で顕微操作され得、ＶＨおよびＶＬ遺伝子が、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅され得る。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクター内にクローニングされ、発現のために細胞（例えば、真核生物または原核生物の細胞）内にトランスフェクトされ得る。
【０１７６】
あるいはまた、抗体産生細胞株は、当業者によく知られた手法を用いて選択および培養され得る。かかる手法は、さまざまな実験室用マニュアルおよび主な刊行物に記載されている。これとの関連において、後述する本発明における使用に適した手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）（増補版を含む）に記載されている。
【０１７７】
本明細書に開示した方法における使用のための抗体は、当該技術分野で知られた任意の抗体合成方法によって作製され得、特に、化学合成によって、または好ましくは本明細書に記載の組換え発現手法によって作製され得る。
【０１７８】
さらに、本発明の範囲には、抗原結合ＤＮＡ配列のあらゆる対立遺伝子、変異体および変異が包含されることがさらに認識されよう。
【０１７９】
よく知られているように、ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から標準的な手法によって、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿の後、遠心分離またはクロマトグラフィーを行なうことなどによって単離され得る。所望される場合は、全ＲＮＡからｍＲＮＡが標準的な手法によって、例えば、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィーなどによって単離され得る。好適な手法は当該技術分野で熟知されている。
【０１８０】
一実施形態において、本発明の方法における使用のための抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、よく知られた方法に従い、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて同時または別々のいずれかで作製され得る。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公表された重鎖と軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーによって開始され得る。上記のように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合、そのライブラリーが、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（例えば、マウス定常領域プローブなど）によってスクリーニングされ得る。
【０１８１】
ＤＮＡ（典型的には、プラスミドＤＮＡ）は、細胞から当該技術分野で知られた手法を用いて単離され、標準的なよく知られた手法（例えば、組換えＤＮＡ手法に関する前述の参考文献に詳細に示されたもの）に従って制限マッピングされ、配列決定され得る。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の解析の際の任意の時点で、本発明に従って合成されるものであってもよい。
【０１８２】
抗体、またはその断片、誘導体もしくは類縁体、例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現には、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要である。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはその一部分（好ましくは、該重鎖または軽鎖の可変ドメインが含まれる）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該抗体分子の産生のためのベクターを、組換えＤＮＡ手法によって当該技術分野でよく知られた手法を用いて作製するのがよい。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の調製方法を、本明細書において記載する。当業者によく知られた方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築され得る。このような方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ手法、合成手法およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードし、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。かかるベクターには、該抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列が含まれ得（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、該抗体の可変ドメインをかかるベクター内にクローニングすると、重鎖または軽鎖全体が発現され得る。
【０１８３】
発現ベクターは宿主細胞に、慣用的な手法によって導入され、次いで、トランスフェクト細胞を慣用的な手法によって培養し、本明細書に記載の方法における使用のための抗体を産生させる。したがって、本発明は、本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードし、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態では、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、免疫グロブリン分子全体の発現のために以下に詳述するようにして、宿主細胞において共発現させ得る。
【０１８４】
さまざまな宿主−発現ベクター系が、本明細書に記載の方法における使用のための抗体分子を発現させるために利用され得る。かかる宿主−発現系とは、目的のコード配列が生成され、続いて精製され得る媒体を表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、本発明の抗体分子をインサイチュで発現する細胞も表す。このようなものとしては、限定されないが、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌など（例えば、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核生物細胞（特に、完全体の組換え抗体分子の発現用のもの）が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞を、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せたものは、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１８５】
細菌系では、いくつかの発現ベクターが、発現させる抗体分子の意図される用途に応じて好都合に選択され得る。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のために大量のかかるタンパク質を産生させる場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指令するベクターが所望され得よう。かかるベクターとしては、限定されないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））（これは、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列が個々にベクター内でｌａｃＺコード領域とインフレームにライゲートされたものであり得る）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））；などが挙げられる。また、ｐＧＥＸベクターは、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用され得る。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスであるグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１８６】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして典型的に使用される。該ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。その抗体コード配列は、該ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローニングされ得、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０１８７】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス系の発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合配列（例えば、後期プロモーターと三連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）にライゲートされ得る。次いで、このキメラ遺伝子はアデノウイルスゲノム内に、インビトロまたはインビボ組換えによって挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）内への挿入により、感染宿主内で生存可能であり、抗体分子を発現する能力をもつ組換えウイルスがもたら
される（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳には、特異的開始シグナルも必要とされ得る。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらにまた、開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズ（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）でなければならない。このような外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方のさまざまな起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１８８】
また、挿入配列の発現をモジュレートするか、またはその遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾およびプロセッシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質生成物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、該タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾に関して特徴的および特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングが確実となるように、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のため、一次転写物の適正なプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。かかる哺乳動物宿主細胞としては、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正常乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げられる。
【０１８９】
長期間で抗収率の組換えタンパク質の産生には、安定な発現が使用され得る。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株は、操作されたものであり得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御され得るＤＮＡで形質転換させ得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を１〜２日間、富化培地中で培養し得、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択可能なマーカーは、選択物に対して耐性を付与し、細胞がその染色体内にプラスミドを安定に組み込むこと、および培養されて増殖巣を形成することを可能にし、次に、該増殖巣をクローニングおよび拡大培養して細胞株とし得る。この方法は、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作するのに好都合に使用され得る。
【０１９０】
いくつかの選択系、例えば限定されないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））が使用され得、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）遺伝子は、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子：ｄｈｆｒ（これは、メトトレキサートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）；ならびにｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４）の選択の基準として使用され得る。当該技術分野で一般的に知られた使用され得る組換えＤＮＡ手法である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の第１２章および第１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９１】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（概説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害因子のレベルの増大により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅される領域は抗体遺伝子と関連しているため、該抗体の産生もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０１９２】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターと軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターでコトランスフェクトされ得る。該２つのベクターは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含むものであり得る。あるいはまた、重鎖ポリペプチドとおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用してもよい。かかる状況では、過剰の毒性遊離重鎖を回避するため、好都合には軽鎖は重鎖の前に配置される（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを構成するものであってもよい。
【０１９３】
本発明の抗体分子は、組換えにより発現させたら、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性（特に、プロテインＡの後の特異的抗原に対する親和性により）およびサイズ排除（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）可溶性、または任意の他の標準的なタンパク質精製手法によって精製され得る。あるいはまた、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法は、ＵＳ２００２  ０１２３０５７  Ａ１（これは、引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１９４】
一実施形態において、本発明の方法における使用のための結合分子または抗原結合分子は、１つ以上のドメインが一部または完全に欠失した合成の定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定のある実施形態において、適合性の修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されたドメイン欠失構築物または変異体を含む（ΔＣＨ２構築物）。他の実施形態では、短い連結ペプチドを欠失ドメインの代わりに使用し、可変領域に対して動きの柔軟性と自由度をもたらし得る。当業者には、かかる構築物が、抗体の異化作用速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性のため、特に好ましいことが認識されよう。
【０１９５】
特定のある実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のための修飾抗体はミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で報告された方法を用いて作製され得る（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照のこと）。
【０１９６】
別の実施形態では、本明細書に開示した方法における使用のための修飾抗体は、当該技術分野で知られたＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２（これらは、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）を用いて誘導され得る。この例示的なベクターを操作してＣＨ２ドメインを欠失させ、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターが得られるようにした。
【０１９７】
一実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体またはその断片は、単量体サブユニット間の会合が許容される限り、アミノ酸の欠失もしくは置換が数個または１個ですらある免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域における単一のアミノ酸の変異で、充分にＦｃ結合が実質的に低減され得、それにより腫瘍局在を増大させ得る。同様に、モジュレートされるエフェクター機能（例えば、相補鎖結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの当該部分を単に欠失させることが望ましい場合があり得る。定常領域のかかる部分の欠失により、抗体の選択した特性（血清半減期）が改善され得るが、主題の定常領域ドメインと関連する他の望ましい機能はそのままである。さらに、上記において示唆したように、開示した抗体の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを向上させる１つ以上のアミノ酸の変異または置換によって合成されたものであってもよい。これに関して、修飾抗体の立体配置および免疫原性プロフィールを実質的に維持したまま、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によってもたらされる活性を破壊することが可能であり得る。また他の実施形態は、望ましい特性（例えば、エフェクター機能など）を増強するため、またはより多くの細胞毒素もしくは糖鎖結合をもたらすための、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。かかる実施形態では、選択した定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製させることが望ましい場合があり得る。
【０１９８】
本発明はまた、Ｓｐ３５ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはその断片である本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、本質的に該変異体からなる、または該変異体からなる抗体の使用を提供する。当業者にはわかる標準的なアミノ酸置換生成手法、例えば、限定されないが、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発を使用し、結合分子をコードするヌクレオチド配列に変異が導入され得る。好ましくは、該変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３に対して、５０アミノ酸未満の置換、４０アミノ酸未満の置換、３０アミノ酸未満の置換、２５アミノ酸未満の置換、２０アミノ酸未満の置換、１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸未満の置換、または２アミノ酸未満の置換をコードするものである。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいはまた、変異は、コード配列の全部または一部に沿って無作為に、例えば飽和突然変異誘発などによって導入され得、得られた変異型を生物学的活性についてスクリーニングし、活性を保持している変異型が同定され得る。
【０１９９】
例えば、フレームワーク領域内のみ、または抗体分子のＣＤＲ領域内のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレントまたは中性のミスセンス変異であり得る、すなわち、抗体の抗原結合能力に対して効果を全くまたはほとんど有しない。このような型の変異は、コドン使用頻度を最適化するため、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいはまた、非中性のミスセンス変異により、抗体の抗原結合能力が改変されることがあり得る。最もサイレントで中性のミスセンス変異の位置は、おそらくフレームワーク領域内であり、一方、最も非中性のミスセンス変異の位置は、おそらくＣＤＲ内であるが、これは絶対要件ではない。当業者であれば、所望の特性を有する（例えば、抗原結合活性の改変または結合活性の改変（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変更）がないなど）変異体分子を設計し、試験することができよう。変異誘発後、コードタンパク質を常套的に発現させ得、該コードタンパク質の機能的および／または生物学的活性を、本明細書に記載の手法を用いて、または当該技術分野で知られた手法を常套的に変形することにより測定することができる。
【０２００】
本発明の方法における使用のためのさらなるアンタゴニストおよびアンタゴニストの組合せ
前述のアンタゴニスト（ａｎｔｇｏｎｉｓｔ）に加え、本発明の方法における使用のためのさらなるＴｒｋＡアンタゴニストとしては、ＴｒｋＡの活性をブロック、阻害、干渉または低減し得る任意のポリペプチド、抗体、化合物またはヌクレオチドが挙げられる。かかるアンタゴニストとしては、ＴｒｋＡリガンドである神経成長因子（ＮＧＦ）のＴｒｋＡ受容体への結合に干渉するポリペプチド、抗体、化合物またはヌクレオチドが挙げられ、それ自体もＮＧＦアンタゴニストとみなされる。かかる分子としては、限定されないが、ＮＧＦとＴｒｋＡの相互作用を破壊する抗体、ＴｒｋＡのペプチド模倣（ｐｅｐｔｏｍｉｍｅｔｉｃ）アンタゴニスト、およびＴｒｋＡ受容体を活性化しないＮＧＦ類縁体が挙げられる。このような型の分子の例は、例えば、米国特許第６，８８１，７１９号、同第６，９１９，４２６号、同第６，０３４，１１９号、および国際出願公開公報番号ＷＯ９５／２１１９３（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を見るとよい。
【０２０１】
本発明の方法における使用のための本明細書に記載のアンタゴニストは、種々の組合せの組成物として投与され得る。例えば、種々のＴｒｋＡアンタゴニストは、Ｓｐ３５アンタゴニストとの組合せで使用され得る。また、本発明の方法における使用のための組成物は、多種類のＴｒｋＡアンタゴニストとＳｐ３５アンタゴニストを含むものであってもよい。
【０２０２】
さらに、本発明における使用のための組成物は、ＣＮＳにおいて発現されるタンパク質（例えば、Ｎｏｇｏ受容体１（ＮｇＲ１）、Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）、ＴＡＪまたは希乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）など）に対する他のアンタゴニストを含むものであってもよい。ＮｇＲ１のアンタゴニストは、米国特許出願公開公報第２００２／００７７２９５および同第２００５／０２７１６５５  Ａ１号ならびに国際特許公開公報番号ＷＯ０１／５１５２０、ＷＯ０３／０３１４６２、ＷＯ２００４／０１４３１１およびＷＯ２００５／０１６９５５（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）のアンタゴニストは、米国特許公開公報第２００６／０００９３８８  Ａ１号および国際出願公開公報番号ＷＯ２００４／０８５６４８（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を見るとよい。ＴＡＪアンタゴニストの例は、米国特許出願公開公報第２００６／００５８２２３  Ａ１号（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＯＭｇｐアンタゴニストは、米国特許仮出願第６０／７３０，３５７号および同第６０／７３５，１７０号（これらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、本発明の方法における使用のための組成物は、任意の数および組合せのＴｒｋＡ、Ｓｐ３５、ＮｇＲ１、ＴＡＪおよびＯＭｇｐアンタゴニストを含むものであり得る。
【０２０３】
アプタマー
別の実施形態において、本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、非反復配列を有し、所望の標的（例えば、ポリペプチド）に対して特異的結合特性を有し、所与の標的の特異的リガンドであるヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。本発明のヌクレオチドアプタマーとしては、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡに結合する二本鎖ＤＮＡおよび単鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。
【０２０４】
核酸アプタマーは、当該技術分野で知られた方法を用いて、例えば、試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法によって選択される。ＳＥＬＥＸは、標的分子に対して高度に特異的な結合性を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第５，２７０，１６３号（これも引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、核酸がさまざまな２次元および３次元構造を形成する能力、ならびに事実上任意の化学物質の化合物（モノマー系またはポリマー系いずれも（他の核酸分子およびポリペプチドを含む））のリガンドとしての機能を果たす（特異的結合対を形成する）ヌクレオチド単量体内で利用可能な化学的多能性に基づくものである。任意の大きさまたは組成の分子が標的として供され得る。
【０２０５】
ＳＥＬＥＸ法は、同じ一般選択スキームを用いる候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択ならびに結合、分割および増幅の段階的反復を伴うものであり、所望の結合親和性と選択性が得られる。核酸（好ましくは、無作為化配列のセグメントを含むもの）の混合物を出発点とし、ＳＥＬＥＸ法は、該混合物を標的と、結合に有利な条件下で接触させる工程；非結合核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分割する工程；核酸−標的複合体を解離させる工程；核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅させてリガンド富化核酸混合物を得る工程を含む。結合、分割、解離および増幅工程は、標的分子に対して高度に特異的な高親和性核酸リガンドが得られるように、所望されるだけ多数サイクル反復される。
【０２０６】
ヌクレオチドアプタマーは、例えば、診断用ツールとして、または細胞内シグナル伝達および輸送経路を詳細に分析するための特異的インヒビターとして使用され得る。
Ｊａｍｅｓ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：５４０−５４６（２００１）を参照のこと。ヌクレオチドアプタマーは、親和性と特異性が高いため、良好な創薬候補となっている。例えば、毒素リシンに対するアプタマーアンタゴニストが単離されており、ナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ  ＪＲら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：４９３７−４９４２（２０００）を参照のこと。また、ヌクレオチドアプタマーは、感染性疾患、悪性疾患に対して、およびウイルス表面タンパク質に対して細胞の感染性を低下させるために使用され得る。
【０２０７】
本発明の方法における使用のためのヌクレオチドアプタマーは、他のポリヌクレオチドに関して本明細書において記載のようにして修飾されたものであってもよい（例えば、主鎖もしくは塩基の修飾またはペプチドへのコンジュゲーションによって）。
【０２０８】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡのタンパク質構造を使用し、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡに対して作用するアプタマーをＳＥＬＥＸを用いてスクリーニングすると、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ媒介性プロセス（例えば、髄鞘形成のＳｐ３５またはＴｒｋＡ媒介型阻害）を阻害するアプタマーの同定が可能となり得る。
【０２０９】
本発明の方法における使用のためのポリペプチドアプタマーは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡに結合し、それによりその作用をブロックする能力に関して選択されたランダムペプチドである。ポリペプチドアプタマーは、両端がタンパク質骨格に結合された短いペプチド可変ドメインを含むものであり得る。この二重構造による拘束によって、ペプチドアプタマーの結合親和性が抗体のものと同等のレベル（ナノモル範囲）まで大きく増大する。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｆら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８（８）：４２６−４３０（２０００）を参照のこと。この短い可変ペプチドの長さは、典型的には約１０〜２０アミノ酸であり、その骨格は、良好な可溶性および小型化特性を有する任意のタンパク質であり得る。骨格タンパク質の非限定的な一例は、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａである。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＢＡら  ＰＮＡＳ  ９５（２４）：１４２７２−１４２７７（１９９８）を参照のこと。本発明の方法における使用のためのポリペプチドアプタマーのさらなる非限定的な例は、リガンド調節ペプチドアプタマー（Ｌｉｇａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒ）（ＬｉＲＰＡ）である。ＬｉＲＰＡ骨格は、３つのタンパク質ドメイン：ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ＦＲＢＰ−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）で構成されたものであり得る。例えば、Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ＢＦら，Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  １２（７）：８４７−８５５（２００５）（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０２１０】
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質機能の主要インヒビターとしての機能を果たすペプチドまたは低分子ポリペプチドである。ペプチドアプタマーは、標的タンパク質に特異的に結合し、その機能的能力をブロックする。Ｋｏｌｏｎｉｎら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４，２６６−１４，２７１（１９９８）。高い親和性および特異性で標的タンパク質に結合するペプチドアプタマーは、当該技術分野で知られたさまざまな手法によって単離され得る。ペプチドアプタマーは、ランダムペプチドライブラリーから酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Ｘｕ，Ｃ．Ｗ．ら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２，４７３−１２，４７８（１９９７））またはリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２（１９９７））によって単離され得る。また、ペプチドアプタマーは、ファージライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０（１９９８））または化学的に作製したペプチドライブラリーから単離され得る。ペプチドアプタマーは、これが合成される手段が困難なため、その使用がポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑となり得るが、無限の化学的多様性を有する。
【０２１１】
本発明の方法における使用のためのペプチドアプタマーは、本明細書の他の箇所に他のポリペプチドに関して記載のように修飾されたものであってもよい（例えば、ポリマーへのコンジュゲーションまたはタンパク質への融合）。
【０２１２】
融合タンパク質およびコンジュゲートされたポリペプチド、アプタマー、化合物および抗体
本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物およびアンタゴニスト抗体は、さらに、異種ポリペプチドにＮ−もしくはＣ−末端で組換え融合させてもよく、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的にコンジュゲートさせてもよい（共有結合性および非共有結合性コンジュゲーションを含む）。例えば、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物および抗体は、検出アッセイにおける標識およびエフェクター分子（異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素など）として有用な分子に組換え融合またはコンジュゲートさせ得る。例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ３９６，３８７を参照のこと。
【０２１３】
本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物および抗体には、修飾された（すなわち、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物または抗体がＳｐ３５またはＴｒｋＡの生物学的機能を阻害するのを妨げない分子の任意の型の共有結合による）誘導体が包含される。例えば、限定を意図しないが、本発明のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物および抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結などによって修飾されたものであり得る。任意の数多くの化学的修飾が既知の手法によって、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などによって行なわれ得る。さらに、該誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含むものであってもよい。
【０２１４】
本明細書に開示した方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結されたアミノ酸で構成されたものであり得、遺伝子にコードされた２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含有するものであってもよい。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体は、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセッシングなど）または当該技術分野でよく知られた化学的修飾手法によって修飾されたものであり得る。かかる修飾は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に充分記載されている。修飾は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドまたは抗体内の任意の場所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端、あるいは糖鎖などの部分に行なわれ得る。所与のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体において、同じ型の修飾が同じまたは異なる程度でいくつかの部位に存在し得ることは認識されよう。また、所与のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体は多くの型の修飾を含むものであり得る。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体は、例えばユビキチン化の結果として分枝状のものであり得、また、分枝のある、またはない環状のものであり得る。環状で分枝状の、および分枝状で環状のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーおよび抗体は、天然の翻訳後プロセスから生成したものであり得るか、または合成方法によって作製されたものであり得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介型付加、例えばアルギニル化など、ならびにユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０２１５】
本発明はまた、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡの機能を阻害または低減させるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体の融合体を含む、本質的に該融合体からなる、もしくは該融合体からなる融合タンパク質を提供する。好ましくは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体が融合される異種ポリペプチドは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドもしくは抗体の機能に有用であるか、またはこれらを標的化するのに有用なものである。本発明の特定のある実施形態では、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、例えば、ＬＲＲドメイン、Ｉｇドメインもしくは細胞外ドメイン全体（配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２に相当）を含むＳｐ３５ポリペプチドを、異種ポリペプチド部分に融合させてＳｐ３５アンタゴニスト融合ポリペプチドを形成するか、または配列番号：４のＴｒｋＡ  Ｉｇドメイン、システインドメインもしくはロイシンに富む反復配列もしくは細胞外ドメイン全体もしくはＴｒｋＡポリペプチドを、異種ポリペプチド部分に融合させてＴｒｋＡアンタゴニスト融合ポリペプチドを形成する。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト融合タンパク質、アプタマーおよび抗体は、種々の目的、例えば、血清半減期の増大、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞の分泌の改善、容易な精製、およびより高いアビディティを達成するために使用され得る。達成されるべき目的（１つまたは複数）に応じて、異種部分は、不活性または生物学的に活性なものであり得る。また、これは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体に安定に融合されるように、またはインビトロもしくはインビボで切断可能なように選択され得る。他のこのような目的を達成するための異種部分は、当該技術分野で知られている。
【０２１６】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマーまたは抗体の発現に対する択一法として、選択した異種部分を予め形成し、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体に化学的にコンジュゲートすることができる。ほとんどの場合、選択した異種部分は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体に融合させても、コンジュゲートさせても同様に機能を果たす。したがって、異種アミノ酸配列の以下の論考において、特に記載のない限り、異種配列はＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体
に、融合タンパク質の形態で、または化学的コンジュゲートとして接合したものであり得ることを理解されたい。
【０２１７】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体などの薬理学的に活性なポリペプチドは、多くの場合、急速なインビボクリアランスを示し、体内で治療有効濃度を達成するためには、大用量が必要とされる。また、約６０ｋＤａより小さなポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、場合よっては腎臓毒性に至る。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体などの比較的低分子ポリペプチドの融合またはコンジュゲーションは、かかる腎臓毒性のリスクを低減または回避するために使用され得る。治療用ポリペプチドのインビボ安定性（すなわち、血清半減期）を増大させるための種々の異種アミノ酸配列、すなわち、ポリペプチド部分または「担体」が知られている。
【０２１８】
その長い半減期、広範なインビボ分布および酵素的もしくは免疫学的機能の欠如のため、本質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ断片が異種部分として一般に使用される。Ｙｅｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄら，Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に教示されたものなどの方法および材料の適用により、ＨＳＡを用いると、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分のおかげで薬理学的活性を示すとともに、有意に増大した（例えば、１０倍〜１００倍高い）インビボ安定性を示すＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト融合ポリペプチド、アプタマー、抗体またはポリペプチド／抗体コンジュゲートが形成され得る。ＨＳＡのＣ末端は、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分のＮ末端に融合され得る。ＨＡＳは天然に分泌されるタンパク質であるため、ＨＳＡのシグナル配列は、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ融合タンパク質を真核生物（例えば、哺乳動物）の発現系において産生させる場合に、細胞培養培地中への該融合タンパク質の分泌を得るために利用され得る。
【０２１９】
特定のある実施形態において、本発明の方法における使用のための特定のある実施形態において、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体およびその抗体断片は、さらに、標的化部分を含む。標的化部分としては、身体のある特定の部分、例えば、脳またはその区画に局在化するように指向されるタンパク質またはペプチドが挙げられる。特定のある実施形態において、本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体またはその抗体断片は、脳標的化部分に結合または融合されている。脳標的化部分は、共有結合により（例えば、翻訳による直接融合、または直接もしくはスペーサー分子（これは、任意選択的に切断可能であり得る）を介してのいずれかによる化学的連結によって）結合されるか、または非共有結合により（例えば、可逆的相互作用、例えば、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧなどによって）結合される。他の実施形態において、本発明の方法における使用のための他の実施形態において、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体またはその抗体断片は、１つ以上の脳標的化部分に結合される。さらなる実施形態において、脳標的化部分は、本発明の方法における使用のための複数のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体またはその抗体断片に結合される。
【０２２０】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体またはその抗体断片に結合された脳標的化部分により、かかるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体またはその抗体断片の脳送達が増強される。タンパク質または治療用薬剤に融合させると血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して該タンパク質または治療用薬剤を送達するいくつかのポリペプチドが報告されている。非限定的な例としては、単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂら（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）；ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体であるｍＡＢ  ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６）；ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６およびＢ８ペプチド（Ｘｉａら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）；および米国特許第６，３０６，３６５号の配列番号：１〜１８が挙げられる。上記の参考文献の内容は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２２１】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ組成物の脳送達の増強は、当該技術分野で充分確立されたいくつかの手段によって測定される。例えば、脳標的化部分に連結され、放射性標識、酵素標識または蛍光標識されたＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体またはその抗体断片の動物への投与；脳局在化の測定；および脳標的化部分に結合されていない対応する放射性標識されたＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物、抗体またはその抗体断片との局在化の比較。標的化の増強の他の測定手段は、上記の参考文献に記載されている。
【０２２２】
シグナル配列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）の構築に有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいはまた、他のシグナル配列が使用され得る。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔内で切断される。これにより、Ｆｃ領域と可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分を含む免疫融合体タンパク質の分泌がもたらされる。
【０２２３】
一部のある実施形態において、該ＤＮＡ配列は、分泌カセットとＳｐ３５またはＴｒｋＡ部分との間のタンパク質分解的切断部位をコードするものであり得る。かかる切断部位により、例えば、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解的切断がもたらされ得、したがってＦｃドメインが標的タンパク質から分離され得る。有用なタンパク質分解的切断部位としては、タンパク質分解性酵素、例えば、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼＫなどによって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２２４】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み込まれ得る。有用なベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、これは、免疫融合体のＤＮＡの転写がヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーとプロモーターの制御下に置かれたものである。例えば、Ｌｏら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）；およびＬｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照のこと。適切な宿主細胞が可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされ得、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドの発現および分泌のために使用され得る。典型的に使用される宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【０２２５】
一実施形態において、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドのヒンジおよびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合される。Ｓｐ３５−ＦｃまたはＴｒｋＡ−Ｆｃ融合体の潜在的な利点としては、可溶性、インビボ安定性および多価性（例えば、二量体化）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧ  Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいはまた、ＩｇＥまたはＩｇＭ  Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧのＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域が一般的に使用される。一実施形態において、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まる配列であって、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に規定する配列（すなわち、残基２１６、カバット（Ｋａｂａｔ）システムにより重鎖定常領域の最初の残基を１１４とする）、または他の免疫グロブリンの類縁部位が該融合体に使用される。融合が行なわれる正確な部位は重要ではない；具体的な部位はよく知られており、該分子の生物学的活性、分泌または結合特性が最適化されるように選択され得る。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築して発現させるための材料および方法は、当該技術分野で知られており、必要以上の実験を行なうことなく、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ融合体を得るために適用され得る。本発明の一部の実施形態では、Ｃａｐｏｎら，米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載のものなどのＳｐ３５またはＴｒｋＡ融合タンパク質が使用される。
【０２２６】
完全にインタクトな野生型Ｆｃ領域は、エフェクター機能を示すが、本発明の方法に使用されるＦｃ融合タンパク質には、通常、不必要であり、所望されない。したがって、典型的には、分泌カセットの構築の際に特定の結合部位をＦｃ領域から欠失させる。例えば、軽鎖との共発現は不必要であるため、重鎖結合タンパク質の結合部位であるＢｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））が、免疫融合体の効率的な分泌を妨げないようにＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させる。膜貫通ドメイン配列（例えば、ＩｇＭ内に存在するものなど）もまた、一般的には欠失させる。
【０２２７】
ほとんどの場合で、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域が使用される。あるいはまた、免疫グロブリンγのその他のサブクラス（γ−２、γ−３およびγ−４）のＦｃ領域が分泌カセットに使用され得る。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域が分泌カセットに一般的に使用され、これは、ヒンジ領域の少なくとも一部分、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。一部のある実施形態において、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２欠失Ｆｃであり、これは、ヒンジ領域の一部分とＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域は含まない。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９０）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７に記載されている。一部のある実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域が使用される。
【０２２８】
Ｓｐ３５−ＦｃまたはＴｒｋＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる立体配置で構築され得る。立体配置の一例では、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分のＣ末端がＦｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合されている。わずかに異なる立体配置では、短鎖ポリペプチド（例えば２〜１０個のアミノ酸）が、融合体の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間に組み込まれている。かかるリンカーにより立体配座の柔軟性がもたらされ、それにより、状況によっては生物学的活性が改善され得る。ヒンジ領域の充分な部分がＦｃ部分において保持されている場合、Ｓｐ３５−ＦｃまたはＴｒｋＡ−Ｆｃ融合体は二量体化し、したがって２価の分子を形成する。単量体Ｆｃ融合体の均一な集団では、単一特異性の二価二量体がもたらされる。各々が異なる特異性を有する２種類の単量体Ｆｃ融合体の混合物では、二重特異性の二価二量体が得られる。
【０２２９】
対応するアミノ反応性基およびチオール反応性基を含有する任意のいくつかの架橋剤を使用し、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドを血清アルブミンに連結させ得る。適当なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳおよびＧＭＢＳが挙げられる。他の適当なリンカー、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。還元可能な連結を生成させるためのスルフヒドリル基との反応のための保護または非保護チオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡおよびＳＡＴＰが挙げられる。かかる試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０２３０】
コンジュゲーションは、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を伴うものである必要はない。例えば、可溶性Ｓｐ３５−アルブミンまたはＴｒｋＡ−アルブミン融合体は遺伝子操作手法を用いて得られ得、この場合、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分は血清アルブミン遺伝子に、そのＮ末端、Ｃ末端または両方で融合される。
【０２３１】
可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドは、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分の精製または同定が助長されるようにＮ−またはＣ−末端で異種ペプチドに融合され得る。例えば、市販のクロマトグラフィー媒体を使用する精製が助長されるように、ヒスチジンタグが可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドに融合され得る。さらに、エピトープタグにより、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ融合ポリペプチドが、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の型の親和性マトリックスを使用する親和性精製によって容易に精製されることが可能になる。かかる精製タグは、多くの例が当該技術分野で知られており、限定されないが、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザ血球凝集素（ｈｅｍｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９  ２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグならびにこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０  ３６１６（１９８５））；ならびに単純疱疹ウイルス糖プロテインＤ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７  ５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド（Ｈｏｐｐら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４  １２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９２  １９４（１９９２））；α−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３  １５１６６（１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３  ６３９７（１９９０））が挙げられる。タグは、抗体によって認識され、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドの機能に干渉しない任意のペプチドエピトープであり得る。
【０２３２】
本発明の一部のある実施形態において、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ融合構築物は、細菌内での可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分の産生を増強するために使用される。かかる構築物には、高レベルで正常に発現および／または分泌される細菌タンパク質が、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして使用される。例えば、Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）を参照のこと。
【０２３３】
可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分を適当な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端に融合させることにより、２価または４価の形態の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチドが得られ得る。例えば、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分をＩｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合させると、２つの可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分を含む２価の単量体ポリペプチドが生成され得る。Ｉｇ部分のおかげでこのような単量体の２つが二量体化すると、４価形態の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡタンパク質が得られる。かかる多価形態は、標的に対する結合親和性の増大を達成するために使用され得る。また、多価形態の可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡは、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ部分をタンデムに配置してコンカテマーを形成することにより得られ得、これは、単独で、または融合パートナー（例えば、ＩｇもしくはＨＳＡなど）と融合させて使用され得る。
【０２３４】
コンジュゲートされるポリマー（ポリペプチド以外）
本発明の一部のある実施形態では、１つ以上のポリマーを本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチド、化合物、アプタマーまたは抗体にコンジュゲート（共有結合）させた可溶性Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチド、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアプタマー、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物またはＳｐ３５もしくはＴｒｋＡ抗体を伴う。かかるコンジュゲーションに適したポリマーの例としては、ポリペプチド（上記）、アプタマー、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。典型的には、必ずしもそうではないが、ポリマーは、可溶性Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチド、アプタマー、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物またはＳｐ３５もしくはＴｒｋＡ抗体に、以下：可溶性、安定性またはバイオアベイラビリティの１つ以上を改善する目的でコンジュゲートさせる。
【０２３５】
Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、ＴｒｋＡアンタゴニスト化合物、アプタマーまたはＴｒｋＡもしくはＳｐ３５抗体へのコンジュゲーションに一般的に使用されるポリマーの類型は、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も高頻度に使用される。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物または抗体単独と比べて血清半減期を増大させるため、ＰＥＧ部分（例えば、１、２、３、４または５つのＰＥＧポリマー）を、各Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーもしくは抗体またはＴｒｋＡアンタゴニスト化合物にコンジュゲートさせ得る。ＰＥＧ部分は、非抗原性で本質的に生物学的に不活性である。本発明の実施に使用されるＰＥＧ部分は分枝状または非分枝状であり得る。
【０２３６】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマー、化合物または抗体に結合されるＰＥＧ部分の数および個々のＰＥＧ鎖の分子量は種々であり得る。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少ない。通常、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、化合物、アプタマーまたは抗体に結合させるポリマーの総質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１つのポリマー鎖を結合させる場合、その鎖の分子量は通常２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖を結合させる場合、各鎖の分子量が通常１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖を結合させる場合、該分子量が通常７〜１４ｋＤａである。
【０２３７】
該ポリマー、例えばＰＥＧはＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体に、該ポリペプチド上の任意の適当な露出した反応性基を介して連結され得る。露出した反応性基（１つまたは複数）は、例えば、Ｎ末端アミノ基もしくは内部リジン残基のεアミノ基または両方であり得る。活性化ポリマーは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体上の任意の遊離アミノ基と反応し、これに共有結合され得る。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体の遊離カルボン酸基、適当に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化糖鎖部分およびメルカプト基（利用可能な場合）もまた、ポリマー結合のための反応性基として使用され得る。
【０２３８】
コンジュゲーション反応では、典型的には、ポリペプチド濃度に応じてポリペプチド１モルあたり約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが使用される。通常、選択される比率によって、反応の最大化と、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチドまたは抗体の所望の薬理学的活性を障害し得る副反応（多くの場合、非特異的）の最小化との均衡が示される。好ましくは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体の生物学的活性（例えば、任意の本明細書に記載のアッセイまたは当該技術分野で知られたアッセイで示される）の少なくとも５０％が保持され、最も好ましくは、ほぼ１００％が保持される。
【０２３９】
ポリマーはＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体に、慣用的な化学反応を用いてコンジュゲートさせ得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分を、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体のリジンのεアミノ基にカップリングさせ得る。リジン側鎖への連結は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）などにより行なわれ得る。好適なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は市販されている。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーが、スクシンイミジル部分の代わりに使用され得る。このようなものとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカーボネートが挙げられる。条件は、通常、反応の選択性および程度が最大限となるように最適化される。かかる反応条件の最適化は、当該技術分野の通常の技能の範囲内である。
【０２４０】
ＰＥＧ化は、当該技術分野で知られた任意のＰＥＧ化反応によって行なわれ得る。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）、ならびに欧州特許出願ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（もしくは類縁の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行なわれ得る。
【０２４１】
アシル化によるＰＥＧ化は、一般的に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体の反応を伴う。任意の反応性ＰＥＧ分子がＰＥＧ化に使用され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧは、高頻度に使用される活性化ＰＥＧエステルである。本明細書で用いる場合、「アシル化」は、限定されないが、以下の型の結合：治療用タンパク質と水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧ：アミド、カルバメート、ウレタンなどを包含する。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応パラメータは、一般的に、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチド、アプタマーまたは抗体が損傷または不活化され得る温度、溶媒およびｐＨ条件が回避されるように選択される。
【０２４２】
一般的に、連結結合部はアミドであり、典型的には、得られる生成物の少なくとも９５％がモノ−、ジ−またはトリ−ＰＥＧ化されている。しかしながら、より高度にＰＥＧ化された種がいくらか、使用された具体的な反応条件に応じた量で形成され得る。任意選択で、精製ＰＥＧ化種は混合物（特に、未反応種）から慣用的な精製方法によって、例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィーおよび電気泳動などによって分離される。
【０２４３】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般的に、還元剤の存在下での、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体との反応を伴う。また、実質的にＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体のＮ末端アミノ基におけるＰＥＧ化のみに好都合となるように（すなわち、モノＰＥＧ化タンパク質）、反応条件を操作してもよい。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化いずれの場合も、ＰＥＧ基は、典型的には該タンパク質に−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して結合される。特に−ＣＨ２−基に関して、この型の結合は「アルキル」結合として知られている。
【０２４４】
Ｎ末端標的化モノＰＥＧ化生成物を作製するための還元的アルキル化による誘導体化では、誘導体化に利用可能な種々の型の１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の差示的反応性が利用される。該反応は、リジン残基のε−アミノ基と該タンパク質のＮ末端アミノ基とのｐＫａの差を利用することが可能なｐＨで行なわれる。かかる選択的誘導体化によって、アルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性ポリマーの該タンパク質への結合が制御される。すなわち、該ポリマーとのコンジュゲーションが主として該タンパク質のＮ末端で起こり、他の反応性基（リジン側鎖のアミノ基など）の有意な修飾は起こらない。
【０２４５】
アシル化およびアルキル化の両方のアプローチに使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、典型的には、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾されており、そのため、本発明の方法に提供されたときに重合度が制御され得る。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水安定性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓら，米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。該ポリマーは分枝状または非分枝状であり得る。アシル化反応では、選択されるポリマー（１種類または複数種）は、典型的には単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化では、選択されるポリマー（１種類または複数種）は、典型的には単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、該水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。それは、該残基が、通常、哺乳動物組換え発現系によってより簡便に作製されるためである。
【０２４６】
ＰＥＧ化された可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチド、アプタマーまたは抗体の作製方法は、一般的に、（ａ）Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体をポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と、該分子が１つ以上のＰＥＧ基に結合された状態になる条件下で反応させる工程、および（ｂ）反応生成物（１種類または複数種）を得る工程を含む。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知パラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定される。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比率が大きいと、一般的に、より高いパーセンテージでポリＰＥＧ化生成物がもたらされる。
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー／可溶性Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチド、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアプタマーまたはＳｐ３５もしくはＴｒｋＡ抗体を作製するための還元的アルキル化は、一般的に、（ａ）可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡタンパク質またはポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と、還元的アルキル化条件下、該ポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したｐＨで反応させる工程；および（ｂ）反応生成物（１種類または複数種）を得る工程を含む。
【０２４７】
実質的に均一な集団のモノ−ポリマー／可溶性Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチド、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアプタマーまたはＳｐ３５もしくはＴｒｋＡ抗体のためには、還元的アルキル化反応条件は、該ポリペプチドまたは抗体のＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にするものである。かかる反応条件は、一般的に、リジン側鎖アミノ基と該Ｎ末端アミノ基にｐＫａの差をもたらすものである。本発明の目的のためには、ｐＨは、一般的に３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
【０２４８】
可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチド、アプタマーまたは抗体タグ、例えば、後にタンパク質分解によって放出され得る一部分を含むものであり得る。したがって、リジン部分は、まず低分子量リンカー（例えば、トラウト試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）、これは、リジンおよびＮ末端の両方と反応する）で修飾されたＨｉｓ−タグを反応させ、次いで、該Ｈｉｓタグを放出させることにより、選択的に修飾され得る。すると、該ポリペプチドは遊離ＳＨ基を含むことになり、これは、チオール反応性先端（ｈｅａｄ）基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離もしくは保護ＳＨ）を含有するＰＥＧで選択的に修飾され得る。
【０２４９】
トラウト試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を構成する任意のリンカーで置き換えてもよい。例えば、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で置き換えてもよい。同様に、該タンパク質を、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳもしくはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、得られた生成物を遊離ＳＨ含有ＰＥＧと反応させてもよい。
【０２５０】
一部のある実施形態では、ポリアルキレングリコール部分を、本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリペプチド、アプタマーまたは抗体のシステイン基にカップリングさせる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を用いて行なわれ得る。
【０２５１】
任意選択で、可溶性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリペプチド、アプタマーまたは抗体はポリエチレン−グリコール部分に、不安定結合を介してコンジュゲートさせる。不安定結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断にて切断され得る。例えば、該結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断されるものであり得る。
【０２５２】
該反応は、生物学的に活性な物質と不活性ポリマーとの反応に使用される任意の適当な方法により、反応性基がＮ末端のαアミノ基上に存在する場合は、一般的にｐＨ約５〜８（例えば、ｐＨ５、６、７または８のｐＨ）で行なわれ得る。一般的に、該方法は、活性化ポリマーを調製すること、およびその後、該タンパク質をこの活性化ポリマーと反応させて製剤化に適した可溶性タンパク質を作製することを伴う。
【０２５３】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリヌクレオチドアンタゴニスト
本発明の方法におけるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストとしては、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含むＳｐ３５またはＴｒｋＡポリヌクレオチドアンタゴニストが挙げられる。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリヌクレオチドアンタゴニストは、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡの発現を抑制する（ノックダウン）。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、限定されないが、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびＲＮＡｉが挙げられる。典型的には、かかる結合分子を個々に動物に投与する（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）が、かかる結合分子を、宿主細胞に取り込ませてインビボで発現させたポリヌクレオチドからインビボで発現させてもよい。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）もまた参照のこと。
【０２５４】
ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現をいう。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子（ｓｈｏｒｔ）干渉ＲＮＡ）により特異的ｍＲＮＡ（例えば、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ）との相互作用によって標的遺伝子をサイレンシングするものである。次いで、ｄｓ  ＲＮＡ複合体は、細胞による分解の標的となる。さらなるＲＮＡｉ分子としては、短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（低分子干渉ヘアピン型ともいわれる）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって連結された標的遺伝子のセンス配列とアンチセンス配列を含むものである。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質内へと輸送され、該ｍＲＮＡとともに分解される。ＲＮＡｉのためのＲＮＡの発現には、Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモーターが使用され得る。本発明の一部のある実施形態では、ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクター（例えば、ｐＬＬ３．７）で発現させる。
【０２５５】
ＲＮＡｉは、その「標的」ｍＲＮＡに対して配列特異的相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１）。ショウジョウバエの細胞無含有ライセートにおける生化学的研究により、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのメディエイターは、２１〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）であることが示されている。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明の方法に好都合に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲとして知られるＲＮアーゼによるｄｓＲＮＡのプロセッシングにより誘導される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１）。ｓｉＲＮＡ二本鎖生成物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ））と称される多タンパク質ｉＲＮＡ複合体に補充（ｒｅｃｒｕｉｔ）されるようである。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに誘導され、そこでｓｉＲＮＡ二本鎖が配列特異的に相互作用して触媒的に切断を媒介すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａら，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１）。
【０２５６】
ＲＮＡｉは、遺伝子機能を解析するため、および哺乳動物細胞の必須遺伝子を同定するために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３，２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５，２００１）（非限定的な一例として、ニューロンが挙げられる（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９，２００２）。また、ＲＮＡｉは、治療モダリティ、例えば、ウイルス、例えば限定されないが、ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０，２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１，２００２）の感染，複製および／または増殖の抑止または遮断、ならびに癌遺伝子（例えば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒら，Ｂｌｏｏｄ  １０１（４）：１５６６−９，２００２）の発現の低減について評価されている。ＲＮＡｉは、哺乳動物（マウス）および両生類（ツメガエル）の胚における遺伝子発現をモジュレートするため（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４２３６−１４２４０，２００２；およびＺｈｏｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９，２００２）、ならびに生後のマウスにおける遺伝子発現をモジュレートするため（Ｌｅｗｉｓら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２：１０７−１０８，２００２）、ならびに成体トランスジェニックマウスにおいて導入遺伝子発現を低減するため（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９，２００２）に使用されている。細胞培養物中およびインビボでのｓｉＲＮＡの有効性および特異性を測定するための諸方法が報告されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４，２００２；Ｌａｓｓｕｓら，Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３，２００２；およびＬｅｉｒｄａｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８，２００２を参照のこと）。
【０２５７】
ＲＮＡｉを媒介する分子、例えば限定されないがｓｉＲＮＡは、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，２００２；Ｙｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，２００２）、および大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを用いた二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）によってインビトロで作製され得る。
【０２５８】
また、ｓｉＲＮＡ分子は、２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングさせることによっても形成され得、典型的には、二本鎖部分と単鎖部分の両方を含む以下の一般構造を有する。
【０２５９】
【化１２】
2009544703.tif 000015
式中、Ｎ、ＸおよびＹはヌクレオチドである；ＸはＹに水素結合する；「：」は、２つの塩基間の水素結合を意味する；ｘは、１〜約１００の値を有する自然数の整数である；ならびにｍおよびｎは独立して、０〜約１００の値を有する自然数の整数である。一部のある実施形態において、Ｎ、ＸおよびＹは独立して、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵである。特に合成ｓｉＲＮＡ（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング生成物）の場合は、天然に存在しない塩基およびヌクレオチドが存在し得る。二本鎖の中央部分は、「コア」と呼ばれ、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有する。単鎖部分は突出端であり、測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有する。図示した突出端は３’突出端であるが、５’突出端を有する分子もまた本発明の範囲内である。また、突出端のないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、ならびにコアの一方側には突出端を有するが他端にはないもの（例えば、ｍ＝０およびｎ＞１、またはその逆）も本発明の範囲内である。
【０２６０】
最初は、ＲＮＡｉ手法は哺乳動物系に容易に適用可能でないと思われた。これは、哺乳動物では、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、アポトーシスカスケードおよび細胞死をもたらすためである（Ｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３，１９９７）。また、以前から、ｄｓＲＮＡは哺乳動物細胞においてインターフェロンカスケードを活性化し、それにより細胞生理機能の改変もまたもたらされ得ることが知られている（Ｃｏｌｂｙら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３，１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７，１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２，１９６７；Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５，１９７０；およびＹｏｕｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２，１９６６）。しかしながら、ＰＫＲおよびインターフェロンカスケードのｄｓＲＮＡ媒介型活性化には、約３０塩基対より長いｄｓＲＮＡが必要とされる。対照的に、３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを引き起こすことが示されている（Ｃａｐｌｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７、２００１）。したがって、長鎖ｄｓＲＮＡを実質的に含まない短鎖ＲＮＡを作製することにより、長鎖ｄｓＲＮＡ分子に伴う望ましくない非特異的効果が回避され得ることが予測される。
【０２６１】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａら，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２；Ｃａｐｌｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２，１９９９；Ｎａｇａｓｅら，ＤＮＡ  Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９；Ｎａｐｏｌｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９，１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １３：６７−７３，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１０７７−１０８７，２０００；Ｒｏｍａｎｏら，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：３３４３−３３５３，１９９２；Ｔａｂａｒａら，Ｃｅｌｌ  ９９：１２３−１３２，１９９９；およびＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
【０２６２】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，２００２）により、ヘアピン型にフォールディングされた低分子ＲＮＡ分子が、ＲＮＡｉを行なうための手段として使用された。したがって、かかる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本発明の方法に好都合に使用される。機能性ｓｈＲＮＡの幹部およびループの長さは種々である。幹部の長さは、約２５〜約３０ｎｔの任意の範囲であり得、ループの大きさは、サイレンシング活性に影響しない４〜約２５ｎｔの範囲であり得る。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、このようなｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮアーゼのｄｓＲＮＡ生成物と類似し、任意の事象において、特定の遺伝子の発現の阻害に対して同じ能力を有すると考えられる。
【０２６３】
アンチセンス手法は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって、または三重らせんの形成によって遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス手法は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に論考されている。三重らせんの形成は、例えば、Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００（１９９１）に論考されている。該方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づくものである。
【０２６４】
例えば、Ｓｐ３５をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用し、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドが設計され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的であり、それにより標的タンパク質の転写および産生が妨げられるように設計される。該アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡにインビボでハイブリダイズして該ｍＲＮＡ分子が標的ポリペプチドに翻訳されることを阻止する。
【０２６５】
一実施形態では、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡ遺伝子に特異的なアンチセンス核酸を、外来配列からの転写によって細胞内で生成させる。例えば、ベクターまたはその一部分を転写させてアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成させる。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡが生成される限り、エピソームのまま維持されていてもよく、染色体に組み込まれた状態であってもよい。かかるベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ手法の方法によって構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または脊椎動物細胞における複製および発現に使用される当該技術分野で知られたその他のものであり得る。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物（好ましくはヒト）の細胞において機能を果たす当該技術分野で知られた任意のプロモーター（例えば、本明細書の他の箇所に記載のものなど）によるものであり得る。
【０２６６】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は、好ましいが必要ではない。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡをコードするＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な配列は、該ＲＮＡとハイブリダイズするのに充分な相補性を有する配列を意味し、安定な二本鎖の形成、または三重らせんの形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、内包され得る塩基ミスマッチが多くなるが、依然として安定な二本鎖（または場合によっては三重らせん）が形成され得る。当業者には、ハイブリダイズ複合体の融解点を測定するための標準的な手順の使用によって、許容されるミスマッチの程度を確認することができよう。
【０２６７】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドン（該コドンを含む）までの５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害時に最も効率的に機能を果たすはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳の阻害時に有効ことが示されている。概要は、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照のこと。したがって、５’または３’いずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドが、Ｓｐ３５の翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補配列を含むものであるのがよい。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、低効率性の翻訳阻害因子であるが、本発明に従って使用され得る。アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるのがよく、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的なある態様において、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２６８】
また別の実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは相補ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成するが、通常の状況とは逆に、鎖は互いに平行である（Ｇａｕｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。該オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Ｉｎｏｕｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
【０２６９】
本明細書に開示した方法における使用のためのポリヌクレオチド組成物は、さらに、触媒性ＲＮＡまたはリボザイムを含む（例えば、ＰＣＴ国際特許公開公報ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４日公開）；Ｓａｒｖｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムはｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって決定される位置で切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の二塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は当該技術分野でよく知られており、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）により充分に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率が増大し、非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積が最小限となるように操作される。
【０２７０】
アンチセンスアプローチの場合ように、本明細書に開示した方法における使用のためのリボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化の改善のためなど）で構成されたものであり得、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡをインビボで発現する細胞に送達され得る。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセンスコードＤＮＡの導入について上記と同じ様式で細胞内に導入され得る。好ましい送達方法は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターなど）の制御下でのリボザイム「コード」ＤＮＡ構築物の使用を伴い、その結果、トランスフェクトされた細胞は、充分な量のリボザイムが産生され、内因性Ｓｐ３５またはＴｒｋＡメッセージが破壊され、翻訳が阻害される。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるため、効率性に必要とされる細胞内濃度はより低い。
【０２７１】
本明細書に開示した方法における使用のためのポリヌクレオチド、例えば、上記のアプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾異形、単鎖または二本鎖であり得る。該ポリヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖鎖部分またはリン酸主鎖が修飾されていてもよい。該ポリヌクレオチドは、他の懸垂基、例えば、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体のインビボ標的化のため）、または細胞膜を通貨する輸送を助長する薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照のこと）もしくは血液脳関門を通過する輸送を助長する薬剤（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）またはインターカレート剤などを含むものであり得る（例えば，Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）。この目的のため、該ポリヌクレオチドを、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などにコンジュゲートさせ得る。
【０２７２】
本明細書に開示した方法における使用のためのポリヌクレオチド（アプタマーなど）は、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むものであり得、該修飾塩基部分は、限定されないが、５フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２、２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される。
【０２７３】
また、本明細書に開示した方法における使用のためのポリヌクレオチド（アプタマーなど）は、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖鎖部分を含むものであり得る。
【０２７４】
また別の実施形態において、本明細書に開示した方法における使用のための  ポリヌクレオチド（アプタマーなど）は、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類縁体を含む群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸主鎖を含むものである。
【０２７５】
本発明の方法における使用のためのポリヌクレオチド（アプタマーなど）は、当該技術分野で知られた標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されたものなど）の使用によって合成され得る。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールド・ポア・ガラスポリマー支持体の使用によって作製され得る（Ｓａｒｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などである。
【０２７６】
ベクター
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストをコードする核酸を含むベクターを使用することによっても、本発明の方法における使用のためのアンタゴニストが作製され得る。かかる核酸を作動可能に連結させるベクターおよび発現制御配列の選択は、所望の機能的特性（例えば、タンパク質発現）および形質転換させる宿主細胞に依存する。
【０２７７】
作動可能に連結されたコード配列の発現の調節に有用な発現制御配列は、当該技術分野で知られている。例としては、限定されないが、誘導型プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナルおよび他の調節エレメントが挙げられる。誘導型プロモーターを使用する場合、これは、例えば、宿主細胞媒体内での栄養状態の変化または温度の変化によって制御され得る。
【０２７８】
ベクターに、原核生物のレプリコン、すなわち、細菌宿主細胞内の染色体外で組換えＤＮＡ分子の自律複製および維持を指令する能力を有するＤＮＡ配列を含めてもよい。かかるレプリコンは、当該技術分野でよく知られている。さらに、原核生物のレプリコンを含むベクターにはまた、その発現によって検出可能なマーカー（例えば、薬物耐性）が付与される遺伝子を含めてもよい。細菌系薬物耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０２７９】
また、原核生物のレプリコンを含むベクターに、細菌宿主細胞内でのコード遺伝子配列の発現を指令するための原核生物系またはバクテリオファージプロモーターを含めてもよい。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には、発現させるＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有するプラスミドベクター内に提供される。かかるプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬならびにｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の好適な原核生物宿主が、本発明の方法において使用されるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子の発現に使用され得る。
【０２８０】
本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系が使用され得る。例えば、一類型のベクターには、動物系ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスに由来するＤＮＡエレメントが利用される。他では、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を伴う。さらに、ＤＮＡがその染色体内に組み込まれた細胞は、トランスフェクト宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカー導入することにより選択され得る。マーカーにより、栄養素要求株宿主に対する原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または重金属（銅など）に対する抵抗性がもたらされ得る。選択可能マーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接連結されているか、または共形質転換によって同じ細胞内に導入されているかのいずれかであり得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。また、さらなるエレメントがｍＲＮＡの最適な合成に必要なことがあり得る。このようなエレメントとしては、シグナル配列またはスプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナルが挙げられ得る。
【０２８１】
一実施形態において、ＮＥＯＳＰＬＡと称される発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号、引用により本明細書に組み込まれる）が使用され得る。このベクターには、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウス主要成体（ｍａｊｏｒ）β−グロビンプロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子ならびにリーダー配列が含まれている。このベクターは、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションさせると、非常に高いレベルの発現をもたらすことがわかり、その後、Ｇ４１８含有培地中での選択およびメトトレキサート増幅を行なう。もちろん、真核生物細胞内で発現を誘発し得る任意の発現ベクターが本発明において使用され得る。好適なベクターの例としては、限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ＰＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＴから入手可能）が挙げられる。さらなる真核生物細胞系発現ベクターが当該技術分野で知られており、市販されている。典型的には、かかるベクターには、所望のＤＮＡセグメントの挿入のための簡便な制限部位が含まれている。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０２８２】
一般に、多数の形質転換細胞を、好適に高レベルのアンタゴニストを発現するものに関してスクリーニングすることは、常套的な実験手法であり、これは、例えば、ロボットシステムによって行なわれ得る。
【０２８３】
哺乳動物宿主細胞発現に高頻度に使用される調節配列としては、哺乳動物細胞での高レベルのタンパク質発現を指令するウイルス系エレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルスメジャー後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマならびに強力な哺乳動物系プロモーター（天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなど）などが挙げられる。ウイルス系調節エレメントおよびその配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ，米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｈｅｒ，米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【０２８４】
組換え発現ベクターは、宿主細胞内でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子を有するものであり得る。選択可能マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が容易になる（例えば、Ａｘｅｌ，米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞においてＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性が付与される。高頻度に使用される選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
【０２８５】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストをコードするベクターは、適当な宿主細胞の形質転換のために使用され得る。形質転換は、任意の適当な方法によるものであり得る。哺乳動物細胞内への外来ＤＮＡの導入方法は、当該技術分野でよく知られており、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内への封入ポリヌクレオチド（１種または複数種）によるトランスフェクション、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。また、核酸分子は哺乳動物細胞内に、ウイルスベクターによって導入され得る。また、哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞内に導入される外来ＤＮＡを含む組換えウイルスによって形質導入され得る。
【０２８６】
宿主細胞の形質転換は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適した慣用的な方法によってなされ得る。原核生物宿主細胞の形質転換には、エレクトロポレーションおよび塩処理法が使用され得る（Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換には、エレクトロポレーション、カチオン系脂質または塩処理法が使用され得る。例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１３７３−７６（１９７９）を参照のこと。
【０２８７】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳動物起源のものである。当業者は、発現させる所望の遺伝子産物に最良に適した具体的な宿主細胞株を優先的に決定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株としては、限定されないが、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＤＨＦＲ−）、ＨＥＬＡ（ヒト頚部癌）、ＣＶＩ（サル腎臓細胞株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原でのＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓細胞株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス機関Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは出版された文献から利用可能である。
【０２８８】
産生細胞株からのポリペプチドの発現は、既知の手法を用いて増強され得る。例えば、特定のある条件下での発現の増強には、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）系が一般に使用される。例えば、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号および同第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照のこと。
【０２８９】
宿主細胞
本発明の方法における使用のためのＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの発現のための宿主細胞は、原核生物系または真核生物系であり得る。例示的な真核生物宿主細胞としては、限定されないが、酵母ならびに哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５８）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が挙げられる。他の有用な真核生物宿主細胞としては、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセス属である。
【０２９０】
遺伝子療法
Ｓｐ３５およびある種のＴｒｋＡアンタゴニスト（例えば、アンタゴニストポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体およびアプタマー）は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）において、ＤＡニューロンの変性、死もしくは欠落または再生に関連する疾患、障害または損傷の処置に対する遺伝子療法アプローチを用いてインビボで生成させ得る。これは、適当な発現制御配列に作動可能に連結させた適当なＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストコード核酸の投与を伴う。一般的に、このような配列はウイルスベクター内に組み込まれる。かかる遺伝子療法のための好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン‐バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠陥ウイルスベクターであり得る。典型的には、そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子内に欠失を有するアデノウイルスベクターが使用される。アデノウイルスベクターが使用される場合、該ベクターには、通常、選択可能マーカー遺伝子を含めない。
【０２９１】
医薬組成物および投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ）方法
本発明の方法において使用されるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、哺乳動物、例えば、ヒトへの投与のための医薬組成物に製剤化され得る。本発明の方法において使用される医薬組成物には、薬学的に許容され得る担体、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（リン酸塩など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂などが含まれる。
【０２９２】
本発明の方法に使用される組成物は、任意の適当な方法によって、例えば、非経口投与、脳室内投与、経口投与、スプレー剤吸入、局所投与、経腸投与、経鼻投与、口腔内投与、経膣投与または埋入レザーバ（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）によって投与され得る。用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変部内および頭蓋内注射または注入手法を包含する。前述のように、本発明の方法において使用されるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、神経系においてニューロンの生存および髄鞘形成を促進させる機能を果たす。したがって、本発明の方法において、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、これが血液脳関門を通過するような様式で投与される。この通過は、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアンタゴニスト分子自体に固有の物理化学的特性、医薬製剤中の他の成分、または血液脳関門を破る機械装置（針、カニューレもしくは外科用器具など）の使用によってもたらされ得る。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストが本質的に血液脳関門を通過しない分子（例えば、該通過を容易にする部分との融合体）である場合、適当な投与経路は、例えば、髄腔内または頭蓋内（例えば、ＭＳの慢性病変部内に直接）である。Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストが本質的に血液脳関門を通過する分子である場合、投与経路は、後述する種々の経路の１つ以上によるものであり得る。
【０２９３】
本発明の方法において使用される組成物の滅菌注射用形態は、水性または油性の懸濁液であり得る。このような懸濁液は、当該技術分野で知られた手法に従って、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化され得る。また、滅菌注射用調製物は、無毒性の非経口に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射用液剤または懸濁剤（例えば、１，３−ブタンジオール中の懸濁液など）であり得る。使用され得るビヒクルおよび溶媒のうち許容され得るものは、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用される。この目的のため、任意の無刺激性固定油、（例えば、合成のモノ−またはジ−グリセリド）が使用され得る。脂肪酸、例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などは、注射用剤の調製に有用であり、天然の薬学的に許容され得る油類、例えば、オリーブ油またはヒマシ油（特に、そのポリオキシエチル化形態）も有用である。このような油状液剤または懸濁剤には、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースもしくは薬学的に許容され得る投薬形態の製剤（例えば、乳剤および懸濁剤）に一般に使用される同様の分散剤もまた含まれることがあり得る。また、他の一般に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓおよび薬学的に許容され得る固形、液状もしくは他の投薬形態の製造に一般に使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ向上剤なども製剤化の目的で使用されることがあり得る。
【０２９４】
非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入またはボーラス用量の後、維持用量の負荷であり得る。このような組成物は、特定の一定間隔または種々の間隔で（例えば、１日１回または「必要なとき」に）投与され得る。
【０２９５】
本発明の方法に使用される特定の一部の医薬組成物は、許容され得る投薬形態で、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤などで経口投与され得る。また、特定の一部の医薬組成物は、経鼻エーロゾル剤または吸入によって投与され得る。かかる組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進剤および／または他の慣用的な可溶化剤もしくは分散剤使用し、生理食塩水中の液剤として調製され得る。
【０２９６】
単回投薬形態を作製するために担体材料と合わされ得るＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの量は、処置対象の宿主、使用されるアンタゴニストの型および具体的な投与様式に応じて異なる。該組成物は、単回用量、反復用量として、または設定したある期間にわたる注入で投与され得る。また、投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）がもたらされるように調整され得る。
【０２９７】
本発明の方法では、「治療有効量」または「予防有効量」のＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストが使用される。かかる治療有効量または予防有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの要素に応じて種々であり得る。また、治療有効量または予防有効量は、任意の毒性または有害な影響よりも治療上有益な効果が勝るものである。
【０２９８】
任意の具体的な患者に対する具体的な投薬および処置レジメンは、さまざまな要素、例えば、使用される具体的なＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、ならびに投与期間、排出速度、併用薬物、ならびに処置対象の具体的な疾患の重症度に依存する。医療介護者によるかかる要素の判断は、当該技術分野の通常の技能の範囲内である。また、該量は、処置対象の個々の患者、投与経路、製剤の型、使用される化合物の特性、疾患の重症度、および所望の効果に依存する。使用量は、当該技術分野でよく知られた薬理学的および薬物動態学的原則によって決定され得る。
【０２９９】
本発明の方法において、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、一般的に、神経系に直接脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）に、または髄腔内（例えば、ＭＳの慢性病変部）内に投与される。本発明の方法による投与のための組成物は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドが投与されるように製剤化され得る。本発明の一部のある実施形態において、投薬量は０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。一部のある実施形態では、投薬量は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【０３００】
Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニスト抗体での処置のためには、投薬量は、例えば宿主の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常では０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の中間の用量もまた本発明の範囲内であることが意図される。被検体には、かかる用量が、毎日、１日毎、毎週または実証的分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って投与され得る。例示的な処置は、長期間（例えば、少なくとも６ヶ月間）にわたる反復投与での投与を伴うものである。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間に１回、または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を伴うものである。例示的な投薬スケジュールとしては、１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇを連日、３０ｍｇ／ｋｇを１日毎または６０ｍｇ／ｋｇを毎週が挙げられる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２種類以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投薬量は、表示した範囲内である。
【０３０１】
特定のある実施形態において、被検体は、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子で処置され得る。核酸の用量は、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇ  ＤＮＡ／患者の範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、１０〜１００ビリオン／用量またはそれ以上で種々である。
【０３０２】
特定のある実施形態において、ＴｒｋＡアンタゴニストは、ミエリンタンパク質（例えば、ＭＢＰおよびＭＡＧ）の量を、未処置のＣＮＳニューロンまたは哺乳動物とミエリンタンパク質のレベルと比べて少なくとも
【０３０３】
【化１３】
2009544703.tif 000016
増大させることによりＣＮＳニューロンの髄鞘形成を促進させるのに有効な量で投与され得る。
【０３０４】
特定のある実施形態では、ＴｒｋＡアンタゴニストは、生存ニューロンの数を、未処置のＣＮＳニューロンまたは哺乳動物の生存ニューロンの数と比べて少なくとも
【０３０５】
【化１４】
2009544703.tif 000017
増加させることによりＣＮＳニューロンの生存を促進させるのに有効な量で投与され得る。
【０３０６】
特定のある実施形態では、ＴｒｋＡアンタゴニストは、Ｓｐ３５発現を、未処置のＣＮＳニューロン、希乏突起膠細胞または哺乳動物におけるＳｐ３５発現と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％阻害または低減させるのに有効な量で投与され得る。
【０３０７】
特定のある実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、Ｓｐ３５とＴｒｋＡの相互作用を、Ｓｐ３５アンタゴニストの非存在下でのＳｐ３５とＴｒｋＡの相互作用と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％ブロックする（競合アッセイまたは免疫沈降アッセイによる測定時）のに有効な量で投与され得る。
【０３０８】
特定のある実施形態では、Ｓｐ３５アンタゴニストは、ＴｒｋＡのリン酸化を、未処置のＣＮＳニューロン、希乏突起膠細胞または哺乳動物におけるリン酸化ＴｒｋＡの量と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％阻害するのに有効な量で投与され得る。
【０３０９】
また、補助活性化合物を本発明の方法において使用される組成物に組み込んでもよい。例えば、可溶性Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡポリペプチドまたは融合タンパク質は、１種類以上のさらなる治療用薬剤とともに共製剤化および／または共投与され得る。
【０３１０】
本発明には、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストを選択した標的組織に送達するための任意の適当な方法、例えば、水性液剤のボーラス注射または制御放出系の埋入が包含される。制御放出埋入物の使用により、反復注射の必要性が低減される。
【０３１１】
本発明の方法において使用されるＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは、脳内に直接注入してもよい。化合物を脳に直接注入するための種々の埋入物が知られており、神経障害を患っているヒト患者への治療用化合物の送達に有効である。このようなものとしては、ポンプを使用する脳内への長時間注入、定位固定埋入物、一時的介在的カテーテル、永続的頭蓋内カテーテル埋入、および外科的に埋入される生分解性埋入物が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌら（上掲）；Ｓｃｈａｒｆｅｎら，「Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒら，「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；第６６章，第５７７〜５８０頁，Ｂｅｌｌｅｚｚａら，「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」，Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇら，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍら，「Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
【０３１２】
また、該組成物は、化合物の適当な送達系または支持系としての機能を果たす生体適合性の担体物質中に分散されたＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストを含むものであり得る。徐放用担体の好適な例としては、坐剤またはカプセル剤などの成形体の形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋入可能な、またはマイクロカプセル型徐放用マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０３１３】
本発明の一部のある実施形態において、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストは患者に、脳の適切な領域への直接注入によって投与される。例えば、Ｇｉｌｌら，「Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。択一的な手法が利用可能であり、本発明によるＳｐ３５アンタゴニストの投与に適用され得る。例えば、カテーテルまたは埋入物の定位固定配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局在化ユニットを用いて行われ得る。コントラスト増強コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）スキャン（１２０ｍｌのオムニペイク（ｏｍｎｉｐａｑｕｅ）の注入、３５０ｍｇのヨウ素／ｍｌ、２ｍｍ切片厚）により、３次元多面的処置計画（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が可能となり得る。この装置によって磁気共鳴画像法による試験に基づく計画が可能となり、ＣＴおよびＭＲＩの標的情報が併合されて明白に標的が確認される。
【０３１４】
ＧＥ  ＣＴスキャン装置（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）での使用のために改良されたＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）が、この目的に使用され得る。したがって、埋入物をモニタリングする際、ＢＲＷ定位固定フレームの環状のベースリングは患者の頭蓋に装着され得る。ベースプレートに挟持されたグラファイトロッドローカライザーフレームにより、（標的組織）領域全体の連続ＣＴ切片が３ｍｍ間隔で得られ得る。コンピュータにより作製された処置計画プログラムは、ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間のマッピングのためにグラファイトロッド画像のＣＴ座標を使用し、ＶＡＸ  １１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）において実行され得る。
【０３１５】
本明細書に記載の障害の処置方法は、所望の治療活性または予防活性に関して、ヒトにおける使用の前に、典型的には、インビトロで、次いで、許容され得る動物モデルにおいてインビボで試験される。
好適な動物モデル（例えば、トランスジェニック動物）は、当業者によく知られたものである。例えば、Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの分化および生存効果を示すためのインビトロアッセイを本明細書に記載している。軸索の髄鞘形成に対するＳｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの効果は、実施例に記載のようにしてインビトロで試験され得る。最後に、インビボ試験は、Ｓｐ３５もしくはＴｒｋＡアンタゴニストを発現するトランスジェニックマウスを創出すること、またはＳｐ３５もしくはＴｒｋＡアンタゴニストを本明細書に記載のようなマウスもしくはラットモデルに投与することにより行なわれ得る。
【０３１６】
本発明の実施の際には、特に記載のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的な手法が使用され、それは、当該技術分野の技能の範囲内である。かかる手法は、文献に充分説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３巻セット），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（２０００）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら  米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈシリーズ），Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９８８）；専門書Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻，Ｗｕら（編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻，Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（編）（１９８６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４巻セット），第１版，Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照のこと。
【０３１７】
抗体操作の一般原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｂ．Ｌ．Ｌｏ（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ．Ｄｕｂｅｌ（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に示されている。タンパク質操作の一般原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ら（編），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に示されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；ならびにＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に示されている。さらに、当該技術分野で知られており具体的に記載していない免疫学の標準的な方法は、一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），第２版，Ｊ．Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８），Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）ならびにＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に従う。
【０３１８】
免疫学の一般原理を示した標準的な参考文献書物としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．；Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版，Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙら，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．（２０００）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｐｅａｋｍａｎら，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（１９９７）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｉ．Ｒｏｉｔｔら，Ｍｏｓｂｙ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００１）；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版；Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｈ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（４巻セット），第１版，Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第５版，Ｒ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙら，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（２００２）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ら（編），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．ら（編），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３巻，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）が挙げられる。
【０３１９】
上記の参考文献すべて、ならびに本明細書で挙げた参考文献はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３２０】
（実施例１）
Ｓｐ３５は種々の型のニューロン内でＴｒｋＡと共局在している
種々のニューロン内でのＳｐ３５およびＴｒｋＡの発現を、ラットの皮質、海馬、脳幹、小脳、嗅球ならびに脳および脊髄の組織の脊髄後根神経節（ＤＲＧ）由来のニューロンのインサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学検査によって確認した。ラットの脳、脊髄および脊髄後根神経節の凍結切片を調製し、Ｍｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：７８５−７８９（２０００）に記載のようにして加工処理した。切片を、ジゴキシゲニン標識Ｓｐ３５アンチセンスおよびセンスＲＮＡとプローブ結合させた。Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋蛍光抗ジゴキシゲニンコンジュゲート抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って切片を染色した。インサイチュ解析と免疫組織化学解析の併用のため、培養物を、まずジゴキシゲニン標識Ｓｐ３５  ＲＮＡとプローブ結合させ、次いで抗ＴｒｋＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とプローブ結合させた。核をＤＡＰＩで染色した。種々のニューロンにおけるＳｐ３５のインサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学実験の結果を図１に示す。Ｓｐ３５とＴｒｋＡは、調べた種々のニューロン内で共局在している。
【０３２１】
また、Ｓｐ３５とＴｒｋＡの共局在を培養ＤＲＧニューロンにおいても調べた。胚性脊髄後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを、Ｍｉら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−５１（２００５）およびＫｌｅｉｔｍａｎら“Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．”Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ．ＢａｎｋｅｒおよびＧｏｓｌｉｎ編  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ：ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，３３７−３７７（１９９１）に既報のとおりにインビトロで培養した。簡単には、Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎラットの第１５日胚（Ｅ１５）から切除分離した脊髄後根神経節を、ポリ−Ｄ−リジン（１００μｇ／ｍｌ）コートカバースリップ上で２週間平板培養し、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下または非存在下で培養した。増殖しているグリア細胞を除去するため、培養物を、第２〜６日および第８〜１０日にフルオロデオキシウリジン（２０μＭ）で２回パルス処理した。標準プロトコルを用いて試料を４％パラホルムアルデヒド中で事前固定し、表示した抗体とともにインキュベートした。簡単には、組織切片を一次抗体中で一晩４℃でインキュベートし、充分洗浄し、適切にＡｌｅｘａ標識した二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）とともに２時間インキュベートし、次いでＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｉｃｔｏｒ）にマウントし、蛍光顕微鏡使用によって可視化した。培養物を、一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ）中で２時間およびＡｌｅｘａ標識二次抗体中で１時間インキュベートし、蛍光顕微鏡使用によって可視化した。抗Ｓｐ３５抗体をヒトＦａｂファージディスプレイライブラリー（Ａｎｔｂｏｄｙ  １９６８−Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）から生成させた。抗ＴｒｋＡ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手した。核をＤＡＰＩで染色した。Ｓｐ３５とＴｒｋＡは、図２に示されるように、組織培養状態のＤＲＧニューロン内でも共局在している。
【０３２２】
（実施例２）
Ｓｐ３５は免疫沈降によってＴｒｋＡに結合する
培養２９３Ｔ細胞内でのＳｐ３５とＴｒｋＡ間の直接相互作用が、抗Ｓｐ３５または抗ＴｒｋＡ抗体を用いた免疫沈降によって示された（図３参照）。２９３細胞（１００ｍｍプレート）を、Ｓｐ３５、ＴｒｋＡ、またはＳｐ３５／ＴｒｋＡ、Ｓｐ３５／ｐ７５、ＴｒｋＡ／ｐ７５およびＳｐ３５／ｐ７５／ＴｒｋＡの組合せのいずれかを含有するプラスミドでトランスフェクトされた。細胞を４８時間後に回収し、１ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％グリセロール）中で４℃にて３０分間溶解させた。１４，０００ｘｇで１５分間の遠心分離後、上清みをプロテインＡ／Ｇ−セファロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とともに４℃で１時間インキュベートし、次いで、４℃で１時間、アフィニティ精製ウサギ抗Ｓｐ３５抗体またはマウス抗Ｔｒｋ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）のいずれかとともにインキュベートした。ビーズを溶解バッファーで３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファー中で煮沸し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、マウス抗Ｔｒｋ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）または抗Ｓｐ３５抗体（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｅ）を用いたウエスタンブロッティングによって解析した。ＴｒｋＡおよびＳｐ３５抗体を、それぞれ、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰおよび抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて可視化した。Ｓｐ３５は、ｐ７５の存在下で、ＴｒｋＡ単独とも同様に相互作用した。図３を参照のこと。
【０３２３】
（実施例３）
Ｓｐ３５は、ＴｒｋＡのリン酸化を阻害する
ＴｒｋＡリン酸化を、希乏突起膠細胞−ＤＲＧ共培養物において調べた。希乏突起膠細胞は、いくつかの発達段階を経由して成熟し、Ａ２Ｂ５前駆細胞（これは、Ａ２Ｂ５を発現する）から、ミエリン形成前希乏突起膠細胞（これは、Ｏ１およびＯ４を発現する）に分化し、最終的に成熟髄鞘形成性の希乏突起膠細胞（これは、Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰを発現する）になる。したがって、Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰマーカーの存在および非存在をモニタリングすることにより、所与の細胞の発達段階を調べることが可能である。希乏突起膠細胞生物学の一般的な概説については、例えば、ＢａｕｍａｎｎおよびＰｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）を参照のこと。
【０３２４】
生後第２日（Ｐ２）の雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット由来の希乏突起膠細胞の富化集団を培養した。簡単には、前脳を切除により取り出し、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に入れた。組織を１ｍｍ片に切り分け、０．０１％のトリプシンと１０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ中、３７℃で１５分間インキュベートした。切除分離した細胞を、ポリ−Ｌ−リジンコートＴ７５組織培養フラスコ上で平板培養し、２０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃にて１０日間培養した。希乏突起膠細胞の前駆細胞（Ａ２Ｂ５＋）を、３７℃にて２００ｒｐｍで一晩フラスコを振とうすることにより回収すると、９５％純粋な集団が得られた。ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地中に、培養物を１週間維持した。
【０３２５】
ＤＲＧ培養物を以下のとおりに調製した。胚性脊髄後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを、Ｍｉら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−５１（２００５）およびＫｌｅｉｔｍａｎら“Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．”  Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ．ＢａｎｋｅｒおよびＧｏｓｌｉｎ編  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ：ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，３３７−３７７（１９９１）に既報のとおりにインビトロで培養した。簡単には、Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットの第１５日胚（Ｅ１５）から切除分離した脊髄後根神経節を、ポリ−Ｄ−リジン（１００μｇ／ｍｌ）コートカバースリップ上で２週間平板培養し、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下または非存在下で培養した。増殖しているグリア細胞を除去するため、培養物を、第２〜６日および第８〜１０日にフルオロデオキシウリジン（２０μＭ）で２回パルス処理した。
【０３２６】
希乏突起膠細胞−ＤＲＧ共培養物を以下のとおりに調製した。Ａ２Ｂ５＋希乏突起膠細胞の前駆細胞およびＤＲＧニューロン懸滴培養物を上記のとおりに調製した。希乏突起膠細胞の前駆細胞をＤＲＧニューロンに添加した１日後、共培養物を、ＧＦＰ（対照）、ドミナントネガティブＳｐ３５または完全長Ｓｐ３５を発現するレンチウイルスに２ＭＯＩ／細胞で感染させた。レンチウイルスの構築に使用したＤＮＡ配列は、マウスＳｐ３５完全長（ＦＬ−Ｓｐ３５、アミノ酸残基３４〜６１４をコード）、Ｓｐ３５ドミナントネガティブ（ＤＮ−Ｓｐ３５、アミノ酸残基３４〜５８１をコード）であった。ＤＮＡ配列をＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウイルスベクターのＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位内に挿入した。Ｒｕｂｉｎｓｏｎら  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：４０１−４０６（２００３）に記載のようにして、プラスミドを２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、レンチウイルスを生成させた。
【０３２７】
新鮮培地を３日毎に交換した。細胞を４８時間後に回収し、１ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％グリセロール）中で４℃にて３０分間溶解させた。ライセートを４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、マウス抗Ｔｒｋ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはリン酸化ＴｒｋＡに対する抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたウエスタンブロッティングによって解析した。
【０３２８】
図４に示すように、ＤＮ−Ｓｐ３５の存在下では、ＴｒｋＡのリン酸化が、完全長Ｓｐ３５または対照（ＧＦＰ）の存在下でのＴｒｋＡと比べて増大する。
【０３２９】
（実施例４）
可溶性Ｓｐ３５−ＦｃおよびＴｒｋＡ−Ｆｃは、神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で、髄鞘形成および希乏突起膠細胞分化を促進させる
髄鞘形成の状態を、ＴｒｋＡリガンドＮＧＦおよびＳｐ３５アンタゴニストの存在下において調べた。すべての実験においてＳｐ３５アンタゴニストＳｐ３５−Ｆｃを使用した。Ｓｐ３５−Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合されたヒトＳｐ３５の細胞外部分（残基１〜５３２）を含む。
これを、米国特許出願公開公報番号２００６／０００９３８８  Ａ１（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようにして調製した。
【０３３０】
希乏突起膠細胞／ＤＲＧ共培養物を実施例３に記載のようにして調製した。共培養物を漸増濃度のＳｐ３５−Ｆｃまたは対照−Ｆｃで３週間処理した。ＭＢＰに対するモノクローナル抗体を、ＭＢＰタンパク質濃度を測定するため、および免疫蛍光検査実験（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ）に使用した。図５を参照のこと。
【０３３１】
髄鞘形成は、通常、ＮＧＦの存在下の共培養において阻害される。しかしながら、図５に示されるように、この共培養にＳｐ３５アンタゴニストＳｐ３５−Ｆｃを添加すると、ＭＢＰ＋希乏突起膠細胞の数は増加した。ＭＢＰ＋細胞の数は、Ｓｐ３５アンタゴニストの濃度が増大するにつれて増加した。
【０３３２】
さらに、１４日後、対照ＩｇＧタンパク質または１Ａ７  Ｓｐ３５モノクローナル抗体（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ）の存在下、希乏突起膠細胞／ＤＲＧ共培養物を１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ中で、ミエリンタンパク質ＭＢＰの発現について調べた。また、希乏突起膠細胞／ＤＲＧ共培養物を、ＮＧＦの非存在下およびＴｒｋＡ−Ｆｃタンパク質の存在下でのＭＢＰタンパク質の発現についても調べた。同様のアッセイにおけるＴｒｋＡ−Ｆｃタンパク質の使用は、Ｃｈａｎら，Ｎｅｕｒｏｎ  ４３：１５４−５（２００４）に報告されている。ＭＢＰタンパク質を、共培養物において免疫蛍光染色により以下の手順を用いて可視化した。標準プロトコルを用いて試料を４％パラホルムアルデヒド中で事前固定し、ＭＢＰ抗体とともにインキュベートした。試料を一次抗体中で一晩４℃にてインキュベートし、充分洗浄し、適切なＡｌｅｘａ標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）とともに２時間インキュベート（ｉｎｃｌｕｂａｔｅ）し、次いでＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ）にマウントし、蛍光顕微鏡使用によって可視化した。
【０３３３】
Ｓｐ３５−Ｆｃの存在下では、対照と比べるとＭＢＰ陽性希乏突起膠細胞とミエリンの節間部の増強がみられる（図１３）。さらに、ＮＧＦスカベンジャーＴｒｋＡ−Ｆｃによる外来ＮＧＦの除去によって、希乏突起膠細胞の分化と髄鞘形成の同様の増強がもたらされた（図１３）。
【０３３４】
（実施例５）
ドミナントネガティブＳｐ３５およびドミナントネガティブＴｒｋＡは、神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下で、髄鞘形成および希乏突起膠細胞分化を促進させる
ＣＮＳ髄鞘形成を、ＮＧＦおよびＳｐ３５アンタゴニスト（Ｓｐ３５−ＤＮ）またはＴｒｋＡアンタゴニスト（ＴｒｋＡ−ＤＮ）のいずれかの存在下で調べた。３週齢のＤＲＧと希乏突起膠細胞の共培養物（実施例３に記載のようにして調製）を、完全長もしくはドミナントネガティブＳｐ３５、完全長もしくはドミナントネガティブＮｏｇｏ受容体、完全長もしくはドミナントネガティブＴａｊ、完全長もしくはドミナントネガティブｐ７５、および完全長もしくはドミナントネガティブＴｒｋＡのいずれかを発現するレンチウイルスに２ＭＯＩ／細胞で感染させた。レンチウイルスは、実施例３に記載のようにして以下のとおりに調製した。ラットｐ７５完全長（ＦＬ−ｐ７５、アミノ酸残基１〜４２５）、ｐ７５ドミナントネガティブ（ＤＮ−ｐ７５、アミノ酸残基１〜２７５）、ヒトＴｒｋＡ完全長（ＦＬ−ＴｒｋＡ、アミノ酸残基１〜７９６）、ＴｒｋＡドミナントネガティブ（ＤＮ−ＴｒｋＡ、アミノ酸残基１〜４４１）、ヒトＴａｊ完全長（ＦＬ−Ｔａｊ、アミノ酸残基１〜４１７）、Ｔａｊドミナントネガティブ（ＤＮ−Ｔａｊ、アミノ酸残基１〜１９２）、ラットＮｏｇｏ受容体完全長（ＦＬ−ＮｇＲ、アミノ酸残基１〜４７３）、Ｎｏｇｏ受容体ドミナントネガティブ（ＤＮ−ＮｇＲ、アミノ酸残基２８−３１０）。ＤＮＡ配列をＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウイルスベクターのＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位内に挿入した。Ｒｕｂｉｎｓｏｎら  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：４０１−４０６（２００３）に記載のようにして、プラスミドを２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、レンチウイルスを生成させた。
【０３３５】
共培養ライセートを第３週に調べ、既報のとおりにウエスタンブロットによって解析した。ブロットを、ＭＡＧおよびＭＢＰに対するポリクローナル抗体とプローブ結合させた。ミエリンタンパク質ＭＡＧおよびＭＢＰを、髄鞘形成のマーカーとして使用した。
【０３３６】
図６に示されるように、共培養物中でのＤＮ−ＴｒｋＡまたはＤＮ−Ｓｐ３５の発現により、ＭＢＰとＭＡＧの発現の増大もたらされ、これは、対照細胞またはＦＬ−ＴｒｋＡもしくはＦＬ−Ｓｐ３５レンチウイルスに感染させた細胞と比べて、希乏突起膠細胞の分化および髄鞘形成が増大したことを示す。Ｔａｊ、Ｎｏｇｏ受容体およびｐ７５に対するアンタゴニストは、ミエリンタンパク質の発現をもたらさなかった。
【０３３７】
また、ＴｒｋＡ化合物アンタゴニストＫ５２５ａを、その髄鞘形成促進能について、ＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物中で試験した。３ｎＭおよび１ｎＭの濃度において、Ｋ５２５ａは、Ｓｐ３５アンタゴニストＳｐ３５−Ｆｃと同様に髄鞘形成を促進させた（ＭＢＰの存在によって測定）。図７を参照のこと。
【０３３８】
（実施例６）
ＯＰＣ、ＳＣおよびＤＲＧにおけるＳｐ３５とＴｒｋＡの発現の試験−ＮＧＦはＳｐ３５発現をＤＲＧにおいて誘導するが希乏突起膠細胞では誘導しない
ＴｒｋＡとＳｐ３５の発現を、希乏突起膠細胞の前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣ）および脊髄後根神経節細胞（ＤＲＧ）において調べた。ＯＰＣの富化集団を生後第２日（Ｐ２）の雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットから単離した。簡単には、前脳を取り出し、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れた。組織を１ｍｍ片に切り分け、０．０１％のトリプシンと１０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼ中、３７℃で１５分間インキュベートした。切除分離した細胞を、ポリ−Ｌ−リジンコートＴ７５組織培養フラスコ上で平板培養し、２０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃にて１０日間培養した。ＯＰＣ（Ａ２Ｂ５＋）を、３７℃にて２００ｒｐｍで一晩フラスコを振とうすることにより回収すると、９５％純度が得られた。ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地中に、培養物を１週間維持した。
【０３３９】
富化シュワン細胞を生後第２日（Ｐ２）のＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットから収集した。簡単には、坐骨神経を抜き出し、Ｌ１５培地（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｅ）中で小片に細分した。組織を、まず０．１％コラーゲナーゼＩ中で３０分間インキュベートし、次いで、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３７℃にて３０分間インキュベートした。切除分離した細胞を、ポリ−Ｄ−リジンコート６０ｍｍ組織培養プレート上で平板培養し、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ培地中で３７℃にて培養した。培養時の第２日から第５日まで、５μＭのシトシンアラビノシドで処理することにより夾雑細胞型を排除し、第４日に新鮮培地を交換した。シトシンアラビノシドの除去後、培地にフォルスコリン（４μＭ）およびウシ下垂体抽出物を添加した。ＤＲＧを既報のとおりに培養した。
【０３４０】
ＴｒｋＡ、Ｓｐ３５およびＧＡＰＤＨに関するＲＴ−ＰＣＲを精製ＯＰＣ、ＳＣおよびＤＲＧに対して、ＮＧＦまたはＢＤＮＦの存在下または非存在下で、以下のとおりに行なった。ＯＰＣ、ＳＣおよびＤＲＧの培養物を上記のとおりに調製した。ｍＲＮＡ単離の前に、組織培養プレートのウェルを１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦまたは１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦのいずれかで２４時間処理した。細胞のｍＲＮＡは、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて抽出した、等量のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーセットは以下のとおりである。
【０３４１】
【化１５】
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ＯＰＣは、Ｓｐ３５を発現したが、検出可能なレベルのＴｒｋＡ  ｍＲＮＡは発現しなかった（図９Ａに図示のとおり）。ＳＣは、いずれの分子についても検出可能な量のｍＲＮＡを発現しなかったが、ＤＲＧは、ＴｒｋＡおよびＳｐ３５の療法を発現し、ＮＧＦで処理すると、Ｓｐ３５  ｍＲＮＡが誘導された。
【０３４２】
希乏突起膠細胞−ＤＲＧ共培養物を既報のようにして調製した。種々の濃度のＮＧＦ（０、１０、５０および１００ｎｇ／ｍｌ）を、希乏突起膠細胞ＤＲＧ共培養物、ＤＲＧニューロン培養物および希乏突起膠細胞培養物に添加した。すべての培養物において、Ｓｐ３５およびリン酸化ＴｒｋＡの発現をノザンブロットまたは免疫組織化学的染色によって調べた。
【０３４３】
ＮＧＦの存在下では、Ｓｐ３５発現は、希乏突起膠細胞／ＤＲＧ  共培養物において増大した（図８に図示のとおり）。しかしながら、培養希乏突起膠細胞を試験すると、Ｓｐ３５発現は一定のままであり、上方調節されなかった。図９を参照のこと。ＤＲＧニューロンにおけるＳｐ３５の上方調節は、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの存在下でのＤＲＧニューロンの免疫蛍光検査によってさらに確認された。図１０を参照のこと。
【０３４４】
（実施例７）
ＴｒｋＡはＳｐ３５上流のシグナル伝達分子である
ミエリンタンパク質ＭＡＧおよびＭＢＰを使用し、髄鞘形成の阻害においてＴｒｋＡがＳｐ３５の上流であるか否かを、ＤＲＧ−希乏突起膠細胞共培養物中で調べた。希乏突起膠細胞−ＤＲＧ共培養物を実施例３に記載のようにして調製した。希乏突起膠細胞の前駆細胞をＤＲＧニューロンに添加した１日後、共培養物を、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの存在下で、ＧＦＰ（対照）、ドミナントネガティブＳｐ３５、完全長Ｓｐ３５、完全長ＴｒｋＡまたはドミナントネガティブＴｒｋＡを発現するレンチウイルスに２ＭＯＩ／細胞で感染させた。レンチウイルスの構築に使用したＤＮＡ配列は、マウスＳｐ３５完全長（ＦＬ−Ｓｐ３５、アミノ酸残基３４〜６１４をコード）、Ｓｐ３５ドミナントネガティブ（ＤＮ−Ｓｐ３５、アミノ酸残基３４〜５８１をコード）、ヒトＴｒｋＡ完全長（ＦＬ−ＴｒｋＡ、アミノ酸残基１〜７９６をコード）およびＴｒｋＡドミナントネガティブ（ＤＮ−ＴｒｋＡ  アミノ酸残基１〜４４１をコード）であった。レンチウイルスは、実施例３および４に記載のようにして構築した。
【０３４５】
新鮮培地をを３日毎に交換した。細胞を４８時間後に回収し、１ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％グリセロール）中で４□Ｃにて３０分間溶解させた。ライセートを４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＭＢＰ、ＭＡＧおよびＳｐ３５に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによって解析した。ブロットを、ＭＡＧおよびＭＢＰに対するポリクローナル抗体とプローブ結合させた。
【０３４６】
ＤＮ−Ｓｐ３５および完全長ＴｒｋＡの存在下では、ミエリンタンパク質ＭＡＧおよびＭＢＰは検出可能であった。しかしながら、ＤＮ−ＴｒｋＡと完全長Ｓｐ３５をコトランスフェクトすると、ＭＢＰとＭＡＧは検出され得ず、Ｓｐ３５による髄鞘形成と希乏突起膠細胞の分化の阻害は、髄鞘形成を阻害するＴｒｋＡシグナルの下流であることを示す。図１１を参照のこと。
【０３４７】
（実施例８）
軸索Ｓｐ３５はシュワン細胞の髄鞘形成に影響を及ぼさない
Ｓｐ３５、ＴｒｋＡ、ＭＢＰ、ＭＡＧおよびβ−アクチンの発現に関する発達プロフィールを、発達中のラット坐骨神経（末梢）において調べ、脊髄（中枢神経系）を調べた。生後第０、２、４、６、８、１０、２０日および成体由来の組織を単離し、ウエスタンブロット解析用に調製した。ラット脊髄では、発達中、Ｓｐ３５の下方調節がＴｒｋＡ発現および髄鞘形成の開始（ＭＢＰとＭＡＧの発現）の減少と相関した。図１２Ａを参照のこと。坐骨神経では、Ｓｐ３５下方調節とＴｒｋＡ発現の低減間の相関性の低下がみられた。図１２Ａおよび１２Ｂを参照のこと。
【０３４８】
ＮＧＦ／ＴｒｋＡは、希乏突起膠細胞による髄鞘形成を阻害する一方、ＳＣによる髄鞘形成を促進させる（Ｃｈａｎら，Ｎｅｕｒｏｎ  ４３：１８３−９１（２００４））。したがって、ＳＣによる髄鞘形成の促進における軸索Ｓｐ３５の役割を調べた。精製ＳＣ培養物を既報のとおりに確立した。細胞が８０〜９０％コンフルエントになった後、シュワン細胞を精製ＤＲＧニューロン上に播種し、ＳＣ／ＤＲＧ共培養物を得た。ＴｒｋＡ、Ｓｐ３５、ＭＡＧおよびＰＯの発現をウエスタンブロットによって解析した。ＳＣをＤＲＧ上に３日間播種した後（ＤＲＧ／ＳＣ）、アスコルビン酸によって髄鞘形成を誘導した日（第０日）、ならびに誘導の２、４、６、８および１０日後に培養物を抽出した。培養時、Ｓｐ３５発現は、ＴｒｋＡの下方調節またはＳＣ髄鞘形成の開始と相関していないようであった。図１２Ｃを参照のこと。
【０３４９】
ＦＬ−Ｓｐ３５とＤＮ−Ｓｐ３５を発現するレンチウイルス（上記）をＳＣ／ＤＲＧ共培養物の感染に使用した。ＳＣ／ＤＲＧ共培養物は、２ＭＯＩでレンチウイルスに感染させた。ＭＡＧ、ＰＯおよびβ−アクチンについて、髄鞘形成をウエスタンブロットによって解析した。ミエリンタンパク質の発現はＦＬ−Ｓｐ３５またはＤＮ−Ｓｐ３５の発現によって改変されず、これは、Ｓｐ３５がシュワン細胞の髄鞘形成に影響を及ぼさないことを示す。図１２Ｄを参照のこと。
【０３５０】
（実施例９）
ＴｒｋＡアンタゴニストは、インビボで髄鞘形成を促進させる
成体野生型Ｃ５７Ｂ１／６雄マウスにクプリゾン（粉砕したもの０．２重量％、粉末マウス用飼料を含む）６週間摂取させ、脳梁内に髄鞘脱落を誘導する。ＴｒｋＡの種々のアンタゴニストを、クプリゾン摂取の第２、２．５および３週に脱髄性脳梁内に定位注射する。対照マウスには、ＴｒｋＡアンタゴニストを含有しない滅菌培地を同じ時間間隔で定位注射する。クプリゾン摂取の６週間後、マウスを２、４および６週間、通常の食餌（粉末マウス用飼料のみ）に戻し、髄鞘を再形成させる。
【０３５１】
クプリゾン処置マウスをケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、定位脳手術用に設計された固定化装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内に置く。頭皮を切開し、ブレグマに対して０．７ｍｍ後方および０．３ｍｍ側方で１．７ｍｍ深部の定位座標を使用し、１０ｍｌ容のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジで滅菌化合物を（１ｍｌのＨＢＳＳ中１μＭ）を野生型レシピエントマウスの急性脱髄性脳梁の片側に注射する（Ｍｅｓｓｉｅｒら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６３（２）：３１３−１８（１９９９））。さらに、対照レシピエントマウスには、化合物を含有しないＨＢＳＳを定位注射する。頭蓋内の開口部にＧｅｌｆｏａｍを充填し、この領域をペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で拭き、創傷部を縫合する。注射後、実験中毎週マウスを致死させ、その脳を取り出し、分子解析、生化学的および組織学的解析用に加工処理する。
【０３５２】
ＴｒｋＡアンタゴニスト処置を受けた動物を軸索の髄鞘形成について、抗ＭＢＰタンパク質抗体またはルクソールファストブルーを用いたＩＨＣによって調べ、対照動物と比較する。
【０３５３】
（実施例１０）
ＴｒｋＡアンタゴニスト（ａｎａｔｇｏｎｉｓｔ）は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後のニューロンの生存をインビボで促進させる
脊髄損傷を成体雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラット（１９０〜２１０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において誘導する。背側半側切除をＴ６／Ｔ７において行ない、大きな背内側部分と小さな背外側皮質脊髄路（ＣＳＴ）成分に完全に分ける。脊髄を表面１．８ｍｍの深部で、マイクロメスを用いて定位的に離断する。ＣＳＴ離断の直後、髄腔内カテーテルをクモ膜下腔内のＴ７に挿入し、プライムミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  ２００４型、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）（皮下空間内に挿入）に接続する。ミニ浸透圧ポンプにより、０．２５μｌ／ｈの２５μＭのＴｒｋＡ−Ｆｃ融合タンパク質、またはアンタゴニストＴｒｋＡ抗体、または対照としてヒトＩｇＧ（５ｍｇ／ｍｌ）もしくはＰＢＳのいずれかを送達する。術後ケアには、術後の無痛法（ブプレノルフィン／ブプレネックス（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）、Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｔ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．，０．０５ｍｇ／ｋｇ  皮下）を８〜１２時間毎に３日間および抗生物質処置（アンピシリン、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、１００ｍｇ／ｋｇ  皮下、１日２回）を７日間を含める。試験起案中（４週間）または機能の回復まで、膀胱を１日２回、手で圧出（ｅｘｐｒｅｓｓ）する。試験が終了したら、ラットに麻酔し、ヘパリン加生理食塩水を、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経噴門的に（ｔｒａｎｓ−ｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流する。脊髄を取り出し、パラフィン内に包埋し、組織学的解析用に１０μｍ切片を切り出す。
【０３５４】
ＳＣＩ後のアポトーシス細胞死を定量するため、ＳＣＩの３日または７日後に動物を安楽死させ、抗活性化型カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴＵＮＥＬ染色（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて染色する。また、切片を抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および抗ＣＣ１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でも染色し、それぞれ、ニューロンおよび希乏突起膠細胞を同定する。
【０３５５】
ＴｒｋＡ−Ｆｃ処置動物における活性化型カスパーゼ３陽性のニューロンおよび希乏突起膠細胞の数を、ＳＣＩの３日後に対照と比較する。さらに、ＳＣＩの４週間後、ＴｒｋＡ−Ｆｃ処置動物の病変部位周囲の脊髄組織内の生存ニューロンおよび希乏突起膠細胞を、抗βＩＩＩ−チューブリン抗体（ニューロンの生存）および抗Ｏ４抗体（希乏突起膠細胞生存）での染色に基づいて対照と比較する。
【０３５６】
本発明は、記載した具体的な実施形態の範囲に限定されず、該実施形態は本発明の個々の態様の一例であることが意図され、機能的に等価な任意の組成物または方法が本発明の範囲である。実際、本明細書に図示および記載したものに加え、前述の記載および添付の図面から本発明の種々の変形例が当業者に自明となろう。かかる変形例は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０３５７】
本明細書に挙げた刊行物および特許出願はすべて、引用によって、引用により組み込まれる個々の各刊行物または特許出願が、あたかも具体的に個々に示されているのと同程度に本明細書に組み込まれる。
【０３５８】
概要および要約書のセクションではなく詳細説明のセクションが特許請求の範囲の解釈に使用されることは認識されよう。概要および要約書のセクションは、本発明者（１名または複数）が想定する本発明の例示的な実施形態の１つ以上（だが全部ではない）を示すものであり得、したがって、本発明および特許請求の範囲をなんら限定することを意図しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2009544703.tif 000029
【図１０】
2009544703.tif 000030
【図１１】
2009544703.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年4月9日(2009.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009544703000001.app
【国際調査報告】
2009544703.tif 000034
2009544703.tif 000035
2009544703.tif 000036