(57)【要約】【課題】分解可能な高分子磁気共鳴イメージング造影剤を調製するための新規な方法が開示される。種々の診断法における使用のための規定又は制御された分子量分布の、分解可能な高分子磁気共鳴イメージング造影剤と、これらの薬剤を合成し、使用し、かつ分解するための方法とが開示される。【解決手段】本発明の種々の観点において開示された高分子造影剤は、分解可能な常磁性ポリジスルフィド化合物であり、延長された血漿保持と、種々の組織、臓器、又は腫瘍における増大された透過性及び保持時間とを示すが、そしてなお身体から迅速に除去され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性高分子造影剤を調製するための方法であって、少なくとも１つの、水性媒体中での重合化の工程を含んでなり、これにおいて前記重合化が結果としてポリジスルフィドを生じる該方法。
【請求項２】
前記水性媒体が塩基性水溶液である、請求項１の方法。
【請求項３】
ポリジスルフィドをＧｄ３＋と錯化することを含んでなる、請求項１又は４の方法。
【請求項４】
ポリジスルフィド造影剤を調製するための方法であって：
反応条件を選択することを含んでなり、これにおいて前記反応条件が、該造影剤の分子量及び／又は分子量分布を決定する該方法。
【請求項５】
前記反応条件が反応温度である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記反応条件が、重合化反応体の供給比である、請求項４の方法。
【請求項７】
請求項１，３、又は４の方法であって：
サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、及び／又は透析により、該造影剤を精製することを含んでなる該方法。
【請求項８】
請求項１，３、又は４の方法であって：
サイズ排除クロマトグラフィーにより該造影剤を分画することを含んでなる該方法。
【請求項９】
請求項１，３、又は４の方法であって：
少なくとも１つの反応体を反応媒体中に溶解すること、
該反応媒体のｐＨを必要に応じて調整すること、
少なくとも１つの他の反応体を該反応媒体に添加すること、
該反応体及び該反応媒体を、一定時間にわたり攪拌すること、及び
該反応媒体のｐＨを必要に応じて調整すること、
を含んでなる該方法。
【請求項１０】
請求項３の方法であって、さらに：
ｐＨ＝１０又は＞１０において、過剰のＧｄ３+を沈澱することを含んでなる該方法。
【請求項１１】
該造影剤の分子量が、４０乃至２００ｋＤａである、請求項１，３、又は４の方法。
【請求項１２】
該造影剤の分子量が、５乃至４０ｋＤａである、請求項１，３、又は４の方法。
【請求項１３】
請求項９の方法であって、さらに：
該反応体の結果として得られた生成物を凍結乾燥することを含んでなる該方法。
【請求項１４】
請求項９の方法であって、さらに：
該反応体の結果として得られた生成物を、透析、クロマトグラフィー、及び／又は限外濾過により精製することを含んでなる該方法。
【請求項１５】
請求項９の方法であって、さらに：
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて造影剤を分画することを含んでなる方法。
【請求項１６】
請求項１又は請求項３又は請求項４の方法により調製された高分子造影剤であって、該造影剤が、ＧＤＣＣ、ＧＤＣＰ、ＧＤＣＥＰ、ＧＤＧＰ、米国特許第６，９８２，３２４号の構造式ＩからＶＩＩまでの化合物、及び米国特許第６，９８２，３２４号の薬剤１から１１までの化合物からなる群より選択される化合物を含んでなり、これにおいて該造影剤が、制御又は規定された分子量及び／又は分子量分布を有する該造影剤。
【請求項１７】
少なくとも１つの標的化分子を含んでなる、請求項１６の高分子造影剤。
【請求項１８】
請求項１６の高分子造影剤であって、前記造影剤が、心臓及び血管系のイメージングについて延長されかつ有効なコントラスト増強を提供することができ、かつ前記造影剤の分子量が４０乃至２００ｋＤａである該造影剤。
【請求項１９】
請求項１６の高分子造影剤であって、前記造影剤が、腫瘍組織のイメージングについて有効なコントラスト増強を提供することができ、かつ前記造影剤の分子量が５乃至４０ｋＤａである該造影剤。
【請求項２０】
請求項１６の造影剤を医学的方法において適用する方法であって：
請求項１６の造影剤か、又はその薬学的に許容される塩、或いは請求項１６の造影剤を一種以上の薬学的に許容される薬剤と一緒に、哺乳類に投与することを含んでなる該方法。
【請求項２１】
前記医学的方法が、磁気共鳴イメージング、Ｘ線コンピュータトモグラフィー、シンチグラフィー、ポジトロンエミッショントモグラフィー、及び放射線療法を含んでなる、請求項２０の方法。
【請求項２２】
該造影剤が内在性の薬剤により分解される、請求項２０の方法。
【請求項２３】
哺乳類に対し、一種以上のジスルフィド還元剤が、該造影剤と同時か又は連続的に投与される、請求項２０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２００６年６月１６日出願の、「生分解性高分子ＭＲＩ造影剤並びにその調製及び使用法（ＢＩＯＤＥＧＲＡＤＡＢＬＥ  ＭＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＭＲＩ  ＣＯＮＴＲＡＳＴ  ＡＧＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＯＦ）」に関する米国仮特許出願第６０／８１４，４４９号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
合衆国政府の支援による研究開発に関する陳述
本明細書に記載の研究は、合衆国国立衛生研究所助成金（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｒａｎｔｓ）ＣＡ０９５８７３により支援された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有してよい。
【０００３】
本発明は、全般的に、診断用イメージングにおいて使用される生分解性高分子造影剤、並びにかかる化合物を合成し、精製し、使用し、かつ分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、医療診断用の非侵襲的な方法である。常磁性金属錯体は、正常組織と疾病組織との間のイメージコントラストを増強するための造影剤としてしばしば使用される。診断法において通常使用される常磁性金属イオンは、マンガン（Ｍｎ２＋）、鉄（Ｆｅ３＋）、及びガドリニウム（Ｇｄ３＋）を包含する。Ｇｄ３＋のキレートは、その長い電子緩和時間及び高い磁気モーメントの故に、ＭＲＩ造影剤としてしばしば使用される。低分子ガドリニウム錯体、例えばＧｄ（ＩＩＩ）（ＤＴＰＡ）［ジエチレントリアミンペンタアセテート］、Ｇｄ（ＩＩＩ）（ＤＯＴＡ）［１，４，７，１０−テトラアザドデカン四酢酸］、Ｇｄ（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）（ジエチレントリアミン五酢酸ビスメチルアミド）、及びその誘導体を含む、ガドリニウムを主成分とする造影剤が、臨床診療におけるＭＲＩ用の造影剤として日常的に使用されている。こうした薬剤は、細胞外造影剤であって、血管から細胞外の体液間隙内へ迅速に溢出し、かつ、その小さいサイズの故に組織保持時間が短く、短いイメージングタイムウインドウ及び低いシグナル対ノイズ比を含む、いくつかの不都合を生じる。造影剤の循環及び保持を引き延ばすため、医用高分子へのＧｄ（ＩＩＩ）キレートの化学的コンジュゲーション（非特許文献１）か、又はポリマー主鎖への取込み（非特許文献２）によって造影剤のサイズを増大することに、かなりの量の努力がなされてきた。
【０００５】
高分子ＭＲＩ造影剤は、長時間循環型又は血液プール剤と呼ばれることもあり、血液プール中でのその長い保持時間の故に特に有用である。例えば、アルブミン−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）コンジュゲートの半減期は、血中で約３時間である（非特許文献３）。Ｇｄ−ＤＴＰＡ標識デキストラン（分子量  〜７５ｋＤａ）は、ラットでは、Ｇｄ−ＤＴＰＡの１３分間に比較して６．１時間の長い半減期を有する（非特許文献４）。高分子造影剤はまた、小サイズの分子に比較して長い回転時間からの結果として生じる、増大されたプロトンＴ１緩和度も有する（非特許文献５）。増大された透過性及び保持の故に、これらの造影剤は固形腫瘍中に効果的に蓄積し、そしてＭＲ癌イメージングにおけるコントラスト増強に可能性を有する。
【０００６】
しかしながら、高分子造影剤には、遅い排出と長期間の組織Ｇｄ蓄積とに関連した潜在的毒性があり、そのためそのさらなる開発を妨げている。低いクリアランス速度のため、Ｇｄ高分子剤の使用は、骨及び他の組織中にＧｄの蓄積を生じる結果となり、結果的に毒性及び有害な副作用を生じることがある。高分子ＭＲＩ造影剤のプロトタイプ、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−アルブミンコンジュゲートは、その遅い排出の結果として起こる高いＧｄ蓄積を、骨及び肝臓において示し（非特許文献３）、このことが、エンドサイトーシスによる該薬剤の細胞取込みと、リソゾーム内での低いｐＨ及び酵素的分解に起因するＧｄ−ＤＴＰＡ錯体の解離との可能性を高めた（非特許文献６，７）。Ｇｄの高く長期間の組織蓄積はまた、他の高分子Ｇｄ（ＩＩＩ）錯体についても観察された。Ｇｄ−ＤＯ３Ａの、カルボキシメチルヒドロキシエチルデンプンへのコンジュゲーションが、注射後７日のラットの体内で、注射用量の約４７％が検出された微分子剤（７２ｋＤａ）になったことが報告されている（非特許文献８）。Ｇｄ−ＤＴＰＡポリプロピレンイミンデンドリマー（第２世代）コンジュゲート（７ｋＤａ）は、注射後１４日のラットで、注射した用量の４５％の保持を生じる結果となった（非特許文献９）。造影剤の長期間のインビボの高い蓄積は、キレートからの毒性Ｇｄ（ＩＩＩ）の代謝的放出の可能性を有意に高めている。
【０００７】
本発明者らは最近、高分子剤のインビボ分解によりＧｄキレートの排出を促進するための、ポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体を主成分とする生分解性高分子ＭＲＩ造影剤をデザイン及び開発した（非特許文献１０−１２）。ポリマー主鎖中のジスルフィド結合は、遊離の血漿チオール、例えばグルタチオン及びシステインによるか、又は酵素的分解により、迅速に還元可能である。最初のポリジスルフィドＭＲＩ造影剤、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスタミンコポリマー（ＧＤＣＣ）は、臨床的に利用可能なＭＲＩ造影剤、Ｇｄ−（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）よりも、ラットにおいてより有意な血液プールを生じ、次いで血液プールから素早く除去されたことが示されている。ＧＤＣＣは、臨床的に使用されるＧｄ−（ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）に匹敵する、最小の長期間Ｇｄ組織蓄積を示した。
【０００８】
ジスルフィド結合の周りの官能基は、常磁性のポリジスルフィド剤の分解速度を調整するため、及び種々の薬物動態学的特性をもつ生分解性高分子剤を調製するために導入されてきた。２つの修飾されたジスルフィドＭＲＩ造影剤、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンコポリマー（ＧＤＣＰ）及び（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンジエチルエステルコポリマー（ＧＤＣＥＰ）と、コントラスト増強腫瘍ＭＲイメージングにおけるこれらの薬剤の予備的な結果とが、非特許文献１１に報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，９８２，３２４号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ラウファー（Ｒ．Ｂ．Ｌａｕｆｆｅｒ）、ブラディ（Ｔ．Ｊ．Ｂｒａｄｙ）著、「常磁性金属キレートで標識されたタンパク質の調製及び水緩和特性（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｗａｔｅｒ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅｓ）、マグネチック・レゾナンス・イメージング（Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ）」、１９８５年、第３巻、第１号、ｐ．１１−１６。
【非特許文献２】デサー（Ｔ．Ｓ．Ｄｅｓｓｅｒ）、ルビン（Ｄ．Ｌ，Ｒｕｂｉｎ）、ミュラー（Ｈ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ）、クイング（Ｆ．Ｑｉｎｇ）、コーダー（Ｓ．Ｋｈｏｄｏｒ）、ザナジ（Ｇ．Ｚａｎａｚｚｉ）、ヤング（Ｓ．Ｗ．Ｙｏｕｎｇ）、ラッド（Ｄ．Ｌ．Ｌａｄｄ）、ウェロンズ（Ｊ．Ａ．Ｗｅｌｌｏｎｓ）、ケラー（Ｋ．Ｅ．Ｋｅｌｌａｒ）著、「Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ポリエチレングリコールポリマーによる腫瘍イメージングの動力学：分子量への依存（Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）、ジャーナル・オブ・マグネチック・レゾナンス・イメージング（Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ）」、１９９４年、第４巻、第３号、ｐ．４６７−４７２。
【非特許文献３】シュミードル（Ｕ．Ｓｃｈｍｉｅｄｌ）、オガン（Ｍ．Ｏｇａｎ）、パーヤネン（Ｈ．Ｐａａｊａｎｅｎ）、マロッティ（Ｍ．Ｍａｒｏｔｔｉ）、クルクス（Ｌ．Ｅ．Ｃｒｏｏｋｓ）、ブリート（Ａ．Ｃ．Ｂｒｉｔｏ）、ブラッシュ（Ｒ．Ｃ．Ｂｒｕｓｃｈ）著、「ＭＲイメージング用の血管内血液プール増強剤としての、Ｇｄ−ＤＴＰＡで標識されたアルブミン：生体分布及びイメージングの研究（Ａｌｂｕｍｉｎ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇｄ−ＤＴＰＡ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ，ｂｌｏｏｄ  ｐｏｏｌ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ：  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ）、ラジオロジー（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）」、１９８７年、第１６２巻、ｐ．２０５−２１０。
【非特許文献４】ワン（Ｓ．Ｃ．Ｗａｎｇ）、ウィクストロエム（Ｍ．Ｇ．Ｗｉｋｓｔｒｏｅｍ）、ホワイト（Ｄ．Ｌ．Ｗｈｉｔｅ）、クラベネス（Ｊ．Ｋｌａｖｅｎｅｓｓ）、ホルツ（Ｅ．Ｈｏｌｔｚ）、ロングベド（Ｐ．Ｒｏｎｇｖｅｄ）、モウズリー（Ｍ．Ｅ．Ｍｏｓｅｌｅｙ）、ブラッシュ（Ｒ．Ｃ．Ｂｒａｓｃｈ）著、「血管内ＭＲ造影剤としてのガドリニウム−ＤＴＰＡ標識されたデキストランの評価：正常ラット組織におけるイメージング特性（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ−ＤＴＰＡ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ＭＲ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ: ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｔｉｓｕｕｅｓ）、ラジオロジー」、１９９０年、第１７５巻、第２号、ｐ．４８３−４８８。
【非特許文献５】ケラー（Ｋ．Ｅ．Ｋｅｌｌａｒ）、ヘンリクス（Ｐ．Ｍ．Ｈｅｎｒｉｃｈｓ）、ホリスター（Ｒ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ）、コーニング（Ｓ．Ｈ．Ｋｏｅｎｉｎｇ）、エック（Ｊ．Ｅｃｋ）、ウェイ（Ｄ．Ｗｅｉ）著、「高緩和度直鎖Ｇｄ（ＤＴＰＡ）−ポリマーコンジュゲート：疎水性相互作用の役割（Ｈｉｇｈ  ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ  ｌｉｎｅａｒ  Ｇｄ（ＤＴＰＡ）−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、マグネチック・レゾナンス・イン・メディスン（Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．）」、１９９７年、第３８巻、第５号、ｐ．７１２−７１６。
【非特許文献６】ダンカン（Ｊ．Ｒ．Ｄｕｎｃａｎ）、フラナーノ（Ｆ．Ｎ．Ｆｒａｎａｎｏ）、エドワード（Ｗ．Ｂ．Ｅｄｗａｒｄ）、ウェルシュ（Ｍ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ）著、「タンパク質−ＤＴＰＡ−ダドリニウム錯体からのガドリニウム解離の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＴＰＡ−ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、インベスティゲイティブ・ラジオロジー（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第２９巻、付録２、ｓ５８−ｓ６１。
【非特許文献７】フラナーノ（Ｆ．Ｎ．Ｆｒａｎａｎｏ）、ニコラス（Ｆ．Ｎｉｃｈｏｌａｓ）、エドワーズ（Ｗ．Ｂ．Ｅｄｗａｒｄｓ）、ウェルシュ（Ｍ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ）、ブレキビエル（Ｍ．Ｗ．Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ）、ガンソー（Ｏ．Ａ．Ｇａｎｓｏｗ）、ダンカン（Ｊ．Ｒ．Ｄｕｎｃａｎ）著、「標的化及び非標的化タンパク質−キレート−ガドリニウム錯体の生体分布及び代謝：インビトロ及びインビボでのガドリニウム解離に関する証拠（Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｋｉｓｍ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈｅｌａｔｅ−Ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）、マグネチック・レゾナンス・イメージング」、１９９５年、第１３巻、第２号、ｐ．２０１−２１４。
【非特許文献８】ヘルビッヒ（Ｔ．Ｈ．Ｈｅｌｂｉｃｈ）、ゴスマン（Ａ．Ｇｏｓｓｍａｎ）、マレスキ（Ｐ．Ａ．Ｍａｒｅｓｋｉ）、ラデューヘル（Ｂ．Ｒａｄｕｃｈｅｌ）、ロバーツ（Ｔ．Ｐ．Ｔ．Ｒｏｂｅｒｔｓ）、シャーメス（Ｄ．Ｍ．Ｓｈａｍｅｓ）、ミューラー（Ｍ．Ｍｕｈｌｅｒ）、トゥレチェック（Ｋ．Ｔｕｒｅｔｓｃｈｅｋ）、ブラスク（Ｒ．Ｃ．Ｂｒａｓｃｈ）著、「ＭＲイメージング用の新規多糖高分子造影剤：生体分布及びイメージング特性（Ａ  ｎｅｗ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ：  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）、ジャーナル・オブ・マグネチック・レゾナンス・イメージング」、２０００年、第１１巻、第６号、ｐ．６９４−７０１。
【非特許文献９】ワン（Ｓ．Ｊ．Ｗａｎｇ）、ブレキビエル（Ｍ．Ｗ．Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ）、ウィーナー（Ｅ．Ｃ．Ｗｉｅｎｅｒ）著、「ポリプロピレンイミンデンドリマー、第２世代、から調製された新規ＭＲＩ造影剤の特徴（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  ＭＲＩ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔ  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ２）、インベスティゲイティブ・ラジオロジー」、２００３年、第３８巻、第１０号、ｐ．６６２−６６８。
【非特許文献１０】ワン（Ｘ．Ｗａｎｇ）、ファング（Ｙ．Ｆｅｎｇ）、キー（Ｔ．Ｋｅ）、シャベル（Ｍ．Ｓｃｈａｂｅｌ）、ルー（Ｚ．Ｒ．Ｌｕ）著、「生分解性高分子磁気共鳴イメージング造影剤、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスタミンコポリマーの薬物動態及び組織保持（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  （Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，ａ  ｂｉｏｄｅｔｒａｄａｂｌｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｎｔａｓｔ  ａｇｅｎｔ）、ファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００５年、第２２巻、第４号、ｐ．５９６−６０２。
【非特許文献１１】ゾング（Ｙ．Ｚｏｎｇ）、ワン（Ｘ．Ｗａｎｇ）、グッドリッチ（Ｋ．Ｃ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）、モウス（Ａ．Ｍ．Ｍｏｈｓ）、パーカー（Ｄ．Ｌ．Ｐａｒｋｅｒ）、ルー（Ｚ．Ｒ．Ｌｕ）著、「担腫瘍マウスにおける、新規生分解性高分子Ｇｄ（ＩＩＩ）錯体でコントラスト増強されたＭＲＩ（Ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＭＲＩ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｄ（ＩＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ）、マグネチック・レゾナンス・イン・メディスン」、２００５年、第５３巻、ｐ．８３５−８４２。
【非特許文献１２】ゾング（Ｙ．Ｚｏｎｇ）、キー（Ｔ．Ｋｅ）、モウス（Ａ．Ｍ．Ｍｏｈｓ）、グオ（Ｊ．Ｇｕｏ）、パーカー（Ｄ．Ｌ．Ｐａｒｋｅｒ）、ルー（Ｚ．Ｒ．Ｌｕ）著、「ポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体のインビボのＭＲＩコントラスト増強に対するサイズ及び電荷の影響（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｃｈａｒｇｅ  ｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｇｄ（ＩＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリーズ（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ．）」、２００６年、第１１２巻、ｐ．３５０−３５６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、なかんずく、規定又は制御された分子量及び／又は分子量分布をもつ、分解可能な高分子造影剤を提供する。好ましい実施態様においては、該造影剤はポリジスルフィドを含んでなる。もう１つの好ましい実施多様においては、これらの造影剤は金属、例えば、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、及びＧｄ３＋との錯体である。種々の造影剤の例は、特許文献１、非特許文献１０、非特許文献１１、又は非特許文献１２に開示されている。これらの造影剤は、種々の医学的方法、例えば診断及び治療法において使用可能である。１つの実施態様においては、これらの造影剤は磁気共鳴イメージングにおいて使用される。別の実施態様においては、これらの造影剤はＸ線コンピュータトモグラフィー（断層撮影法）において使用される。別の実施態様においては、分解可能なポリマーは、シンチグラフィー、ポジトロンエミッショントモグラフィ、及び放射線療法用の、放射性金属イオンとキレートを形成し得る。本発明のもう１つの観点においては、造影剤錯体は、標的化分子を包含する。制限なく、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、他のタンパク質、及び他の化学的実体を含む標的化分子の取込みは、標的化能をもつ高分子造影剤を生じる結果となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、分解可能な高分子造影剤を、水性媒体中で調製する方法を提供する。好ましい実施態様においては、反応媒体は塩基性水溶液である。重合化用の媒体として水溶液を使用することは、溶液の汚染を避け、また製造のための容易なスケールアップも促進する。
【００１３】
本発明は、分解可能な高分子リガンド及び造影剤を精製する方法を提供する。１つの実施態様においては、該リガンド及び造影剤は、クロマトグラフ法により精製される。もう１つの実施態様においては、該造影剤は限外濾過により精製される。Ｇｄを含んでなる生分解性高分子ＭＲＩ造影剤はまた、造影剤溶液のｐＨを上げて、任意の残留する遊離Ｇｄ（ＩＩＩ）イオンを、Ｇｄ２Ｏ３沈澱として除去することによっても精製可能である。
【００１４】
本発明はまた、分解可能な高分子造影剤を分画して、より狭くかつ所望の分子量分布をもつ造影剤を与える方法も提供する。本発明の１つの実施態様においては、造影剤は、サイズ排除クロマトグラフィーのようなクロマトグラフ法により分画される。
【００１５】
本発明はまた、分解可能な高分子造影剤の分子量及び／又は分子量分布を制御する方法も提供する。１つの実施態様においては、造影剤の分子量は、重合化条件、例えば反応温度及び／又は重合化反応体の供給比を変えることにより制御される。
【００１６】
本発明は、一種以上の分解可能な高分子造影剤を投与すること、及び磁気共鳴イメージを得ることにより、哺乳類の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法を提供する。いくつかの実施態様においては、高分子造影剤は、内在性及び外来性の双方の化合物により分解されることが可能である。１つの実施態様においては、高分子造影剤は、内在性のメルカプタン及び／又は酵素により、小さい安定なキレートへ分解される。
【００１７】
本発明はまた、一種以上のジスルフィド結合還元化合物か、又は高分子造影剤の分解を刺激する他の化合物を投与することにより、高分子造影剤を分解するか、又は分解を刺激する方法も提供する。１つの実施態様においては、外来性メルカプタンが哺乳類へ送達される。本発明のいくつかの実施態様のもう１つの目的は、高分子造影剤を他の薬剤と組合せて投与することである。様々な観点において、薬学的に許容される薬剤、例えば希釈剤及び担体もまた投与される。
【００１８】
本発明の１つの観点は、哺乳類の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、有効量の一種以上の高分子造影剤を該哺乳類に投与すること、及び磁気共鳴イメージを得ることによる該方法を包含する。好ましい実施態様においては、一種以上の高分子造影剤は、内在性メルカプタン及び／又は酵素により分解される。
【００１９】
本発明の１つの観点によれば、前記高分子造影剤の分解を刺激する一種以上の化合物もまた投与される。もう１つの観点においては、一種以上のジスルフィド結合還元化合物もまた投与される。ジスルフィド結合還元化合物は、以下の一種以上からなる群より選択される：メルカプタン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ヒドラジン、ホスフィン、亜鉛、スズ（ＩＩ）、硫化ナトリウム、過ギ酸、過酸化水素。
【００２０】
本発明の種々の観点において使用されるメルカプタンは、以下の一種以上からなる群より選択される：システイン及びその誘導体、グルタチオン及びその誘導体、システイニルグリシン及びその誘導体、２，３−ジメルカプトコハク酸その誘導体、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸及びその誘導体、２−メルカプトエタノール、ペニシラミン及びその誘導体、メルカプト酢酸及びその誘導体、メルカプトアニソール、２−メルカプト安息香酸及びその誘導体、４−メルカプト安息香酸及びその誘導体、２−メルカプト−５−ベンズイミダゾールスルホン酸及びその誘導体、２−メルカプトベンゾチアゾール、３−メルカプトイソ酪酸、メルカプトシクロヘキサン、２−メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、３−メルカプト−１−プロパノール、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、ジエチルジチオカルバメート、ジチオエリトリトール、及びジチオグリコール。
【００２１】
本発明の１つの観点によれば、二種以上の高分子造影剤が同時に投与される。１つの実施態様においては、高分子コントラスト製剤は、第１の高分子造影剤と第２の高分子造影剤とを含んでなり、これにおいて該第２の高分子造影剤は、前記第１の高分子造影剤の投与後に投与される。
【００２２】
もう１つの実施態様においては、少なくとも１つの高分子造影剤は、希釈剤、担体、抗体、抗体Ｆａｂ’フラグメント、抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及び送達系からなる群より選択される、一種以上の生理学的に許容される薬剤と一緒に投与される。
【００２３】
好ましい実施態様においては、少なくとも１つの高分子造影剤は、常磁性金属錯体、放射性金属錯体、治療薬、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、薬物送達系、及び遺伝子送達系からなる群より選択される、一種以上の造影剤と一緒に投与される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施態様の目的は、制限なく、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、腫瘍、卵巣、膵臓、胆管系、腹膜、筋肉、頭部、頸部、食道、骨髄、リンパ節、リンパ管、神経系、脳、脊髄、毛細血管、胃、小腸、及び大腸を含む、健康又は腫瘍性の組織又は臓器の、磁気共鳴イメージを得ることである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施態様の目的は、健康又は腫瘍性の組織又は臓器の、磁気共鳴イメージを得るための方法を提供することであり、該方法は、一種以上の造影剤について適当な分子量範囲を選択することを含んでなる。１つの実施態様においては、高い（好ましくは４０ｋＤａより大きい）分子量の造影剤が、心臓及び血管系のイメージングについて、より長くかつ有意なコントラスト増強を提供する。もう１つの実施態様においては、低い（好ましくは４０ｋＤａより小さい）分子量の造影剤が、腫瘍組織において、高分子量の薬剤よりも有意な増強を生じる結果となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】表１にも例示されている、ポリマーリガンドＤＴＰＡ−シスチンコポリマーの分子量分布に対する反応温度の影響を示す図である。
【図２】表２にも例示されている、コポリマーの分子量分布に対する、ＤＴＰＡジアンヒドリド対シスチンの供給比の影響を示す図である。
【図３】ＰＤ−１０カラム対限外濾過による、ポリ（ＧｄＤＴＰＡ−ｃｏ−Ｌ−リジン）（ＧＤＣＰ）の精製の比較を示す図である。
【図４】ＡＫＴＡ  Ｐ−９２０  ＦＰＬＣ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（スーパーロース）６１０／２００  ＧＬカラム、及びＫｎａｕｅｒ（クナウアー）ＲＩ検出器を用いた、Ｇｄ−ＤＴＰＡシスタミンコポリマー（ＧＤＣＣ）の、主要な分画の時間シグナル強度曲線を示す図である。
【図５】尾静脈からの、用量０．１ｍｍｏｌＧｄ／ｋｇにおける、ＧＤＣＰ（Ａ：２３ｋＤａ，Ｂ：４３ｋＤａ，Ｃ：１０９ｋＤａ）及びＧＤＧＰ（Ｄ：２１ｋＤａ，Ｅ：４３ｋＤａ，Ｆ：１０８ｋＤａ）の、注射前（ａ）、及び注射後２分（ｂ）、５分（ｃ）、１０分（ｄ）、１５分（ｅ）、３０分（ｆ）、及び６０分（ｇ）の、マウスの三次元最大強度投影ＭＲイメージを示す図である。
【図６】ＧＤＣＰ（Ａ：２３ｋＤａ，Ｂ：４３ｋＤａ，Ｃ：１０９ｋＤａ）及びＧＤＧＰ（Ｄ：２１ｋＤａ，Ｅ：４３ｋＤａ，Ｆ：１０８ｋＤａ）の、注射前（ａ）、及び注射後２分（ｂ）、５分（ｃ）、１０分（ｄ）、１５分（ｅ）、３０分（ｆ）、及び６０分（ｇ）の、ヒト乳癌（ＭＢ−２３１）（矢印参照）をもつマウスの二次元アキシアルＭＲイメージを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
従来、ポリジスルフィドリガンドは、有機溶媒中で調製されており、例えば、ポリジスルフィドリガンドは、ＤＴＰＡジアンヒドリド及びジスルフィド含有ジアミンの、ＤＭＳＯ中での縮合重合により得られる。一般的に有機溶媒は、それらが大規模な製造プロセスにおいて使用される場合は特に、環境にやさしくない。加えて、それはポリジスルフィド剤の適用に先立ち、有機溶媒を除去するための余分の工程を要する。
【００２８】
本発明は、分解可能な高分子造影剤を水性媒体中で調製する方法であり、したがって、より少ない汚染及びスケールアップの容易さの点で、従来法を超える利点をもつ方法を提供する。好ましくは、該水性媒体は塩基性水溶液である。この新規な方法を用いて、種々の化学構造及び分子量をもつ、ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤が首尾よく作成されてきた。例えば、マウスにおけるインビボのＭＲイメージングは、ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤が、よりサイズの小さい臨床的に使用された薬剤に比較して、血液プール中で長い保持時間をもつことを示した。これらのポリジスルフィド造影剤は、腫瘍及び他の心臓血管疾患の診断に向けて大いに期待できる。
【００２９】
本発明は、分解可能な高分子造影剤を調製する方法を提供する。該造影剤は、種々のクロマトグラフ法、例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）、及びＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）により精製可能である。１つの特別の実施態様においては、該造影剤は、Ｇ−２５媒体でパックされたカラムを具備したＳＥＣにより精製される。該造影剤はまた、種々の濾過法、例えば、所望の分子量カットオフをもつフィルターを用いた限外濾過によっても精製可能である。
【００３０】
本発明はまた、種々の臨床適用のための、様々な分子量、及び／又は狭い分子量分布をもつ、生分解性高分子ＭＲＩ造影剤を調製する方法も提供する。種々の分子量の生分解性高分子ＭＲＩ造影剤は、反応条件を変えることにより、例えば、反応温度を変えることによるか、又は重合化反応体の供給比を変えることにより、容易に制御可能である。反応条件を調整するための方法は、本明細書の実施例に例示されている。他の反応条件、例えば反応媒体のｐＨ、反応時間、反応体の混合速度、及び他の因子もまた、分子量及び／又は分子量分布に影響し得ることに注目されるべきである。
【００３１】
高分子量の生分解性薬剤、例えば、１０８ｋＤａのものは、心臓及び血管系のイメージングについては、対応する低分子量の薬剤よりも、より長くかつ有意なコントラスト増強を提供することが示されている。低分子量のポリマー薬剤、例えば２３ｋＤａのものは、腫瘍組織において、高分子量薬剤よりもさらに有意な増強を生じる結果となった。それ故、本発明はまた、健康又は腫瘍性の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、特定の適用に適した分子量をもつ、一種以上の造影剤を選択することを含んでなる該方法も提供する。
【００３２】
高分子造影剤は、所望よりも広い分子量分布を有してもよい。例えば、常磁性ポリジスルフィドの、その薬物動態及びインビボのコントラスト増強に対するサイズ効果を正確に評価するためには、より狭い分子量分布をもつ常磁性ポリジスルフィドが、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた分画により調製される。限外濾過又は透析といった、他の方法もまた部分的な分画を提供し得ることに注目されるべきである。
【００３３】
ポリジスルフィド造影剤の構造、電荷、及び／又はサイズが、その分解、薬物動態、及びインビボのコントラスト増強に影響を及ぼし得ることが認識されよう。例えば、ポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンコポリマー（ＧＤＣＰ）、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−グルタチオン（酸化型）コポリマー（ＧＤＧＰ）、及び（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンジエチルエステルコポリマー（ＧＤＣＥＰ）は、マウスにおいて様々に挙動する。これらのポリジスルフィド造影剤の分解、薬物動態、及びインビボのコントラスト増強に関するデータ及び分析は、図５及び６に示され、かつ非特許文献１２において詳述されており、その内容全体は参考として本明細書に含まれている。ポリジスルフィド造影剤の、構造、サイズ、及び／又は電荷の影響は、最適のポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体が、構造的最適化によって、種々の臨床適用のための安全かつ効果的な生分解性高分子ＭＲＩ造影剤として、デザイン及び調製され得ることを示唆している。さらに、様々な薬物動態をもつ造影剤が、様々な適用に適切であってよい。一般に、許容できる程度に長い血液循環をもつ薬剤は、コントラスト増強心臓血管イメージング及び癌イメージングにおいてより有効である。それ故、本発明はまた、健康及び腫瘍性の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、特別の適用に向け、適当な薬物動態、分解、及び／又はインビボ増強特性をもつ一種以上の造影剤を選択することを含んでなる、該方法も提供する。
【００３４】
もう１つの観点においては、本発明は、規定又は制御された分子量及び／又は分子量分布をもつ、ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤を提供する。本発明のポリジスルフィドＭＲＩ造影剤は、制限なく、米国特許第６，９８２，３２４号、非特許文献１０、非特許文献１１、又は参考文献１２に開示された種々の造影剤を包含する。種々の造影剤の１つの実施態様においては、該造影剤は、水性媒体中で調製される。もう１つの実施態様においては、規定された分子量及び／又は分子量分布の造影剤が、反応条件を変えることにより調製される。もう１つの実施態様においては、狭い分布範囲か、又は所望の分布範囲の造影剤が、限外濾過、サイズ排除、及び透析といった精製又は分画法により調製される。
【００３５】
もう１つの実施態様においては、本発明は、哺乳類の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための方法であって、有効量の一種以上の高分子造影剤を該哺乳類へ投与すること、及び磁気共鳴イメージを得ることによる方法を提供する。当業者は、磁気共鳴イメージを得るための多くの既知の方法が、科学及び医学の分野に存在することを理解するであろう。１つの好ましい実施態様においては、ＭＲＩ処置はヒト患者に対し行われる。当業者は、制限なく、肝臓、脾臓、肺、食道、骨髄、リンパ節、リンパ管、神経系、脳、脊髄、毛細血管、胃、小腸、大腸を含む、多様な組織又は臓器が、本発明の様々な観点を用いて検査されてよいことを認識するであろう。当業者は、正常組織及び腫瘍のような異常組織の双方が、検査可能であることを認識するであろう。
【００３６】
本発明のもう１つの観点は、金属錯体を除去する方法に関する。好ましくは、クリアランス処理は、ＭＲＩ処置が完了するか、又は実質的に完了した後に行われる。１つの実施態様においては、メルカプタン又は他の類似の薬剤が、ＭＲＩ処置の後に投与される。種々の実施態様において、これらの薬剤は、高分子主鎖を切断することにより、排出プロセスを促進する。別法として、又は付加的に、ジスルフィド結合の切断によって常磁性金属錯体をポリマー担体から除去することにより、除去を生じる。いくつかの実施態様は、高分子から放出された常磁性金属錯体が、今日臨床的に使用される低分子のコントラスト剤に匹敵する速度で除去され得ることから、特に有利である。
【００３７】
１つの好ましい実施態様においては、該高分子化合物は、固形腫瘍組織中の蓄積には好都合な、延長された血液プール中の保持時間をもち、かつＭＲＩ後に迅速に除去される。これらの高分子剤、及びその記載された方法は、制限なく、血管造影法、プレチスモグラフィー、リンパ管造影法、マンモグラフィー、癌診断、及び機能及び動的ＭＲＩを含む、数多の医学的処置において不可欠なツールであろう。
【００３８】
本発明は、単なる例として示されかついかなる方法によっても本発明を制限することを意図していない、以下の制限しない実施例においてさらに記載される。
【実施例】
【００３９】
ＤＴＰＡ−シスチンコポリマー、ＤＴＰＡ−シスチンジエチルエステルコポリマー、及び常磁性錯体ＧＤＣＰ及びＧＤＣＥＰの調製、ラット血漿中でのＧＤＣＰ及びＧＤＣＥＰの分解、ＭＲイメージング、及びデータ分析の例は、非特許文献１２（ゾング（Ｙ．Ｚｏｎｇ）、キー（Ｔ．Ｋｅ）、モウス（Ａ．Ｍ．Ｍｏｈｓ）、グオ（Ｊ．Ｇｕｏ）、パーカー（Ｄ．Ｌ．Ｐａｒｋｅｒ）、ルー（Ｚ．−Ｒ．Ｌｕ）著、「ポリジスルフィドＧｄ（ＩＩＩ）錯体のインビボのＭＲＩコントラスト増強に対するサイズ及び電荷の影響（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｃｈａｒｇｅ  ｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｇｄ（ＩＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリーズ（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ．）」、２００６年、第１１２巻、ｐ．３５０−３５６）において提示されており、その内容全体は、参考として本明細書に含まれている。
【００４０】
実施例１  水性相におけるポリジスルフィドコポリマーの調製。分子量分布に対する反応温度の影響：
システイン（５ｍｍｏｌ、１．２００ｇ、＞９９％）を、２ｍｌの水溶液中に溶解し、この溶液のｐＨを、室温で、ＮａＯＨを用いて１１に調整した。次に、反応を３つの異なる温度、−１０℃（氷−ＮａＣｌ浴）、０℃（氷水浴）、及び室温において各々行なった。ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−五酢酸ジアンヒドリド（ＤＴＰＡ−ＤＡ）（５ｍｍｏｌ、１．７８７ｇ）を、素早く攪拌しながら、１時間以内に分割添加した。反応混合物のｐＨは、飽和ＮａＯＨ水溶液で１１に維持した。３０％を超えるＤＴＰＡジアンヒドリドは、一定のｐＨ１１において３０分間で分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加して反応混合物のｐＨを７に調整した。コポリマーの分子量分布は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ＴＭを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．）、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いて分析した。図１は、異なる温度において調製されたＤＴＰＡシスチンコポリマーの分子量分布を示す。これは、反応温度が分子量分布に対し、有意なインパクトをもつことを示している。高い反応温度は、コポリマーの分子量を増大する。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
分子量分布に対するＤＴＰＡ−ＤＡ対ジアミンの供給比の影響
シスチン（５ｍｍｏｌ、１．２００ｇ）を２ｍｌの水中に溶解し、室温で、ｐＨをＮａＯＨにより１１に調整した。このシスチン溶液に対し、種々の対シスチンモル比のＤＴＰＡ−ＤＡ（０．９、１．０、１．１、１．２、及び１．３）を、素早く攪拌しながら１．５時間以内に分割添加した。反応混合物のｐＨは、飽和ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１１に維持した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加して反応混合物のｐＨを７に調整した。種々のモル比で調製されたＤＴＰＡ−シスチンコポリマーの分子量を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。表２及び図２参照。シスチンに対する高いモル比（１．２及び１．３）のＤＴＰＡジアンヒドリドは、高い分子量を生じる。コポリマーの分子量は、それ故、モル比の減少と共に減少した。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
ＤＴＰＡ−シスチンの共重合：
シスチン（１０ｍｍｏｌ、２．４０３ｇ）を、室温で、ｐＨ１１において、５ｍｌのＮａＯＨ水溶液中に溶解し、次いで混合物を氷水浴中で冷却した。次に、ＤＴＰＡジアンヒドリド（１０ｍｍｏｌ、３．５７３ｇ）を、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１を維持しながら、１時間以内で分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加してｐＨを７に調整し、この溶液を、６−８０００Ｄａの分子量カットオフをもつ膜を用いて、脱イオン水に対し２４時間透析した。コポリマー溶液を凍結乾燥し、３．２ｇの無色の固形生成物を得た（５４％）。ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ１２カラムを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いたＳＥＣにより測定された、コポリマーの数（Ｍｎ）及び重量（Ｍｗ）平均分子量は、１８及び３３ｋＤａであった。このシステムは、標準のポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド］（ＰＨＰＭＡ）を用いてキャリブレートした。
【００４５】
ＤＴＰＡ−グルタチオン（酸化型）の共重合：
グルタチオン（８ｍｍｏｌ、４．９０１ｇ酸化型）を、室温で、ｐＨ１１において、５ｍｌのＮａＯＨ水溶液中に溶解し、次いで混合物を氷水浴中で冷却した。次に、ＤＴＰＡジアンヒドリド（８ｍｍｏｌ、２．８５０ｇ）を、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１を維持しながら、１時間以内に分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加してｐＨを７に調整し、この溶液を、６−８０００Ｄａの分子量カットオフをもつ膜を用いて、脱イオン水に対し２４時間透析した。コポリマー溶液を凍結乾燥し、４．００ｇの無色の固形生成物を得た（５２％）。ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６カラムを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いたＳＥＣにより測定された、コポリマーの数（Ｍｎ）及び重量（Ｍｗ）平均分子量は、３７及び６１ｋＤａであった。
【００４６】
ＤＴＰＡ及びシスタミンの共重合：
シスタミン塩酸塩（５ｍｍｏｌ、１．１２６ｇ）を、室温において、２ｍｌの脱イオン水中に溶解し、飽和ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを１１に維持した。次いでＤＴＰＡジアンヒドリド（６ｍｍｏｌ、２．１４４ｇ）を、素早い攪拌下に、ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ１１を維持しながら、室温で１時間以内に分割添加した。最後の部分のＤＴＰＡ−ＤＡの添加の５分後、１０％（重量で）のＨＣｌを添加してｐＨを７に調整し、この溶液を、６−８０００Ｄａの分子量カットオフをもつ膜を用いて、脱イオン水に対し２４時間透析した。コポリマー溶液を凍結乾燥し、１．４６ｇの無色の固形生成物を得た（５０％）。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムを具備したＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定された、コポリマーの数（Ｍｎ）及び重量（Ｍｗ）平均分子量は、３５及び４２Ｄａであった。
【００４７】
実施例２  常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の調製。ＤＴＰＡジスルフィドコポリマーの、Ｇｄ３＋との錯化：
常磁性錯体、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスチンコポリマー（ＧＤＣＰ）、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−グルタチオンコポリマー（ＧＤＧＰ）、及び（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）−シスタミン（ＧＤＣＣ）は、ＤＴＰＡ−シスチンコポリマー（ＤＣＰ）、ＤＴＰＡ−グルタチオンコポリマー（ＤＧＰ）、及びＤＴＰＡ−シスタミンコポリマー（ＤＣＣ）を、各々Ｇｄ３＋との錯化により調製した。手短にいえば、０．５ｇのＤＣＰ又はＤＧＰ又はＤＣＣを、脱イオン水中に溶解した。キシレノールオレンジを、遊離Ｇｄ３＋の指示薬として添加することができる。次いで、ｐＨ５．５−６．０において、わずかに過剰のＧｄ（ＯＡｃ）３を、この溶液に対しその色が橙色から赤色に変わるまで添加した。次に、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを１０に調整して、過剰のＧｄ３＋をＧｄ２Ｏ３として沈澱した。遠心分離の後、上清を収集し、乾燥して、ＧＤＣＰ又はＧＤＧＰ又はＧＤＣＣを得た。
【００４８】
実施例３  常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の精製
常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の精製は、さらに、クロマトグラフ法によるか、又は限外濾過法により、残留Ｇｄ３＋を除去するためのクエン酸の存在下に行った。
【００４９】
第１の精製方法においては、Ｇ−２５媒体でパックされたカラムによるサイズ排除クロマトグラフィーにより、遊離のＧｄ３＋を除去した。カラムは純水で溶出し、ポリマー分画を収集した。
【００５０】
第２の方法においては、ＭＷＣＯ＝１００００Ｄａ（タンパク質）の半透性膜を具備した限外濾過チャンバー内にポリマー溶液を入れた。この溶液を、加圧下に攪拌し、チャンバー内で数回希釈した。濃縮されたポリマー溶液を乾燥するまで蒸発させた。限外濾過で精製されたポリマーからのＳＥＣプロフィールは、ＳＥＣにより精製されたものと類似していた（図３）。
【００５１】
実施例４  常磁性ポリジスルフィドコポリマー錯体の分画
ポリジスルフィドＧｄ−ＤＴＰＡ錯体の分画は、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）により、Ｈｉｌｏａｄ（ハイロード）ＴＭ１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（スーパーデックス）ＴＭ２００、又はＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６  ＸＫ５０／１００調製用グレードカラム（アマシャム・バイオサイエンス）を具備した、ＡＫＴＡＴＭＦＰＬＣシステムを用いて行なった。手短にいえば、５０ｍｇのＧＤＣＰ又はＧＤＧＰを水中に溶解し、前述のカラムに負荷した。流相は、０．０２Ｍのトリス緩衝液ｐＨ７．４であり、流速は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ＴＭ２００カラムでは６０ｍｌ／時間、ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６カラムでは５．０ｍｌ／分であった。分画を収集し、その分子量を、ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６カラムを具備したＳＥＣにより測定した（表３）。ポリジスルフィド造影剤のＧｄ含有量は、誘導結合プラズマ発光分光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を用いて測定した。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
ＡＫＴＡｐｒｉｍｅＴＭプラスＦＰＬＣ及びＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ６調製用グレードＸＫ５０／１００カラムを用いた、Ｇｄ−ＤＴＰＡシスタミン錯体（ＧＤＣＣ）の分画のための方法は、以下のように示される：（１）分画に先立ち、ＦＰＬＣのポンプを、トリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて洗浄し、次いで、カラムを、同じ緩衝液を用いて、全１８時間にわたり４．５ｍｌ／分で洗浄する。（２）２．７ｍｌのＧｄ−ＤＴＰＡシスタミンコポリマー溶液を、２５０ｍｇの凍結乾燥ポリマー／ｍｌの脱イオン水、の濃度に調製し、次いで、０．２μＬのフィルターを通してＦＰＬＣへ注入する。流速を５．０ｍｌ／分にセットする。（３）最初の７００ｍｌの溶出液を捨て、以後の１２００ｍｌ中の分画を収集する。各分画は、２０ｍｌの溶出液を含有する。
【００５４】
Ｇｄ−ＤＴＰＡシスタミン錯体の分画のキャラクタリゼーションは、ＡＫＴＡ Ｐ−９２０  ＦＰＬＣ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６  １０／２００  ＧＬカラム、及びＫｎａｕｅｒＲＩ検出器により、ＰＨＰＭＡを標準として用いて行なう。流速は５．０ｍｌ／分にセットする。主要な分画のキャラクタリゼーションを図４に示す。いくつかの組合せた分画、及び分画の、数平均、重量平均分子量、及び多分散指数（ＰＤＩ）を、表４にリストする。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
実施例５  ＭＲイメージングにおけるＧｄ−含有ポリジスルフィドＭＲＩ造影剤の適用
ＧＤＣＰ及びＧＤＧＰによるインビボのコントラスト増強を、ヒト乳癌（ＭＢ−２３１）をもつ雌の無胸腺ヌードマウス（チャールズ・リバー・ラボ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ））において、ヒトのリストコイルを具備したシーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）Ｔｒｉｏ  ３Ｔスキャナーを用いて調べた。マウスは、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉内投与により麻酔した。このマウスのコントラスト増強ＭＲイメージを、尾静脈からの、用量０．１ｍｍｏｌ−Ｇｄ／ｋｇにおける造影剤の、注射前、及び注射後２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び６０分において、スピンエコーシーケンスを用いて得た。イメージングパラメータは、２．７ｍｓ  ＴＥ、７．８ｍｓ  ＴＲ、２５℃ＲＦチップアングル、アキシアルスライス厚０．５ｍｍであった。
【００５７】
種々の分子量のＧＤＣＰ及びＧＤＧＰの、注射前及び注射後の種々の時点におけるマウスの、三次元の最大値投影法（ＭＩＰ）ＭＲイメージングが、図５に示されている。強いコントラスト増強が、肝臓、腎臓、及び、心臓及び血管系内の血液において、全ての薬剤について投与２分後に観察され、シグナル強度はその後徐々に減少した。最大のＭＷをもつ双方の薬剤は、３０分まで血管を強く増強し得る。ＧＤＣＰ及びＧＤＧＰの、シグナル強度及び増強持続時間の双方が、分子量と共に増大した。膀胱における漸進的な増強は、全ての化合物について観察され、この薬剤の尿によるクリアランスを示唆している。高分子量の生分解性薬剤（１０８ｋＤａ）は、対応する低分子量の薬剤よりも、さらに延長されかつ有意なコントラスト増強を、心臓及び血管系のイメージングについて提供する。
【００５８】
腫瘍のＴ１強調アキシアルイメージはまた、ヒトのリストコイルにより、１０ｍｓ  ＴＥ、４００ｍｓ  ＴＲ、９０°ＲＦチップアングル、アキシアルスライス厚２ｍｍでのスピンエコーシーケンスを用いて得られた。Ｔ１強調腫瘍イメージは、ＧＤＣＰ及びＧＤＧＰの双方による強い増強を、注射後２分及び６０分までの腫瘍周辺部において示した（図６）。
腫瘍中心部におけるコントラスト増強は、周辺部よりも弱い。低分子量（２３ｋＤａ）のポリマー薬剤は、高分子量の薬剤よりもより有意な増強を、腫瘍組織において生じる結果となった。
【００５９】
本発明は、いくつかの実施態様において記載されてきたが、本発明は、本開示の精神及び範囲内において、さらに修飾可能である。本出願はそれ故、本発明のその一般原則を用いての任意の変形、使用、及び適用をカバーすることを意図している。さらに本出願は、本開示からのかかる逸脱を、本発明がそれに属する当該技術分野において既知の又は慣例的なプラクティスの範囲内に入るものとしてカバーすることを意図しており、それらは添付のクレイムの制限内に入る。
【００６０】
本明細書に引用された、出版物、特許、及び特許出願を含む全ての非特許文献は、あたかも各非特許文献が個別にかつ特別に参考として含まれるべきことが示され、かつその記載全体が本明細書において示されたかのごとく同程度に、参考として本明細書に含まれる。本明細書において議論された非特許文献は、本出願の出願日に先立つその開示についてのみ提供されている。本明細書の何らも、本発明者らが、先行発明の力によって、かかる開示を先んじる権利を与えられないことを承認するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月9日(2009.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリジスルフィドを調製するための方法であって、チオール含有化合物をジアンヒドリ
ド化合物と、水性媒体中で、塩基の存在下に反応させることを含んでなり、これにおいて
該塩基が水酸化物塩基である該方法。
【請求項２】
該チオール含有化合物が、システイン、グルタチオン、又はシスタミン塩酸塩であり、
かつ、該ジアンヒドリド化合物が、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−
五酢酸ジアンヒドリドである、請求項１の方法。
【請求項３】
該塩基がアルカリ金属水酸化物である、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
該アルカリ金属水酸化物がＮａＯＨである、請求項３の方法。
【請求項５】
該水酸化物塩基の量が、該水性媒体のｐＨがｐＨ１１に維持されるようにする量で存在
する、請求項１乃至４のいずれかの方法。
【請求項６】
該反応が室温以下の温度において行なわれる、請求項１乃至５のいずれかの方法。
【請求項７】
該チオール含有化合物に比較して、モル過剰のジアンヒドリド化合物がある、請求項１
乃至６のいずれかの方法。
【請求項８】
該チオール含有化合物が、シスタミン塩酸塩であり、該ジアンヒドリド化合物が、ジエ
チレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−五酢酸ジアンヒドリドであり、かつ該水
酸化物塩基がＮａＯＨである方法であって、これにおいて、反応が、ｐＨ１１において室
温で行なわれる、請求項１の方法。
【請求項９】
ポリジスルフィドを調製するための方法であって、チオール含有化合物をジアンヒドリ
ド化合物と、水性媒体中で、塩基の存在下に反応させることを含んでなり、これにおいて
塩基の量が、該水性媒体のｐＨをｐＨ１１に維持するようにする量で存在する該方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかの方法により製される、ポリジスルフィド。
【請求項１１】
該ポリジスルフィドの分子量が４０乃至２００ｋＤａである、請求項１０のポリジスル
フィド。
【請求項１２】
生分解性のポリジスルフィド高分子造影剤を調製するための方法であって、Ｇｄ３＋を
、請求項１乃至９のいずれかの方法により製されるポリジスルフィドと錯化することを含
んでなる該方法。
【請求項１３】
該Ｇｄ３＋が、Ｇｄ（ＯＡｃ）３である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
過剰のＧｄ３＋を、１０以上のｐＨにおいて沈澱することをさらに含んでなる、請求項
１２又は１３の方法。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４のいずれかの方法により製造される、生分解性ポリジスルフィド高
分子造影剤。
【請求項１６】
哺乳類の組織又は臓器の磁気共鳴イメージを得るための、請求項１５の生分解性ポリジ
スルフィド高分子造影剤の使用。
【国際調査報告】
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