(57)【要約】  本発明は、妊娠患者において子癇前症を検出し、且つ妊娠初期においてリスクを有する患者を同定するためのヒスチジン及びケトン体のような新規バイオマーカー及びその使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠患者において子癇前症を診断し、又は妊娠患者において子癇前症を発症する可能性を予測する方法であって、前記患者から得られる試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の存在について前記試料を分析するステップと、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップとを含み、前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度上昇が、前記患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示す方法。
【請求項２】
前記メチル誘導体が、１−メチルヒスチジン又は３−メチルヒスチジンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の脂質の存在について前記患者から得られる試料を分析するステップと、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップとを更に含み、前記試料中の脂質の濃度低下が、前記患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示す請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒスチジン若しくはそのメチル誘導体及び脂質の濃度の評価が、同一患者から得られる同一又は異なる試料に対して独立して、又は同時に行われ得る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、ヒトである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、全血、血漿、羊水、血清、尿、滑液及び脳脊髄液を含む群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、血漿である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、新鮮であり、又は凍結されている請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、第１２週から出産までの期間に得られる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、在胎２０週頃に採取される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ケトン体の存在について前記試料を分析するステップを更に含み、同様の妊娠期間の妊婦から得られる値と比較したケトン体の濃度低下が子癇前症の更なる指標である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ケトン体が、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、アセトアセテート（ＡＡ）又はα−ケトグルタレートを含む群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ケトン体が、３ＨＢである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分光法によって分析される請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒスチジンを検出する場合、子癇前症のリスクを有する患者のパターンが、δ７．７４２−７．７５８及び７．０４２−７．０５８において最大の固有ベクトルを有する２つの領域を示す請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出方法が、酵素法、抗体検出又は分離技術を含む群から選択される請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
妊娠患者における子癇前症の検出又は子癇前症を発症する高リスクを有する妊娠患者の同定におけるヒスチジンの使用。
【請求項１８】
妊娠患者における子癇前症の検出又は子癇前症を発症する高リスクを有する妊娠患者の同定における、血漿中脂質及びヒスチジン若しくはそのメチル誘導体の使用。
【請求項１９】
請求項２〜１６に記載の特徴のうち任意の１つ以上の特徴を更に含む請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２０】
妊娠患者における子癇前症の処置方法であって、
（ｉ）前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の存在を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度上昇が、前記患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示し、
（ｉｉ）前記患者から得られる試料中の脂質を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中の脂質の濃度低下が、前記患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示し、
（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉ）及び／又は（ｉｉ）から得られる結果を用いて病状の臨床治療を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ｉｉ）が、前記ステップ（ｉ）に先立って行われる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記病状の重症度に応じて臨床医が緊急治療又は治療の先送りを決定することができ、又は治療の強度を決定することができる請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２〜１６に記載の特徴のうち任意の１つ以上の特徴を更に含む請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
在胎１５〜２５週頃に患者から得られる試料を分析するステップを含む、子癇前症を発症するリスクを有する妊娠患者を同定する方法であって、
（ｉ）前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度上昇が、前記患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示し、
（ｉｉ）前記試料中の脂質の濃度を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中の脂質の濃度低下が、前記患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示すこと
を含む方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｉｉ）が、前記ステップ（ｉ）に先立って行われる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
子癇前症の進行をモニタリングし、又は前記病状に対抗するために前記患者に施行される介入療法の有効性をモニタリングするため、その後の数週間の妊娠期にわたって前記分析を繰り返すステップを更に含む請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２〜１６に記載の特徴のうち任意の１つ以上の特徴を更に含む請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
血漿中脂質及びヒスチジン若しくはそのメチル誘導体の濃度を求めるために必要な試薬を含む診断キット。
【請求項２９】
請求項２〜１６に記載の特徴のうち任意の１つ以上の特徴を更に含む請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠患者において子癇前症を検出するとともに、妊娠初期においてリスクを有する患者を同定するための新規バイオマーカー及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト特異的妊娠障害である子癇前症（ＰＥ）の病因は十分に理解されていない。該疾患は妊娠のほぼ１０％に発現し、母親（血管機能障害により）と胎児（子宮内発育制限により）の両者に影響を及ぼし、胎児の分娩によってのみ阻止され得、全早産の最大１５％を占める。通常、該症候群は在胎２０週後に顕在化し、母親及び胎児に高リスクを与え、母親と胎児の罹病及び死亡の主要原因である。
【０００３】
ＰＥは高血圧及びタンパク尿の発症の他にも全身性血管収縮による臓器損傷のエビデンスを特徴とする。分娩後のこれらの徴候の緩和は該疾患の確定的な指標である。高血圧は該障害の結果であって原因ではなく、高血圧とタンパク尿の両方の発症が子癇前症患者を妊娠性高血圧のみを起こしている患者と判別する。症状及び徴候には、頭痛、腹痛、尿量の減少、息切れ、手及び顔面浮腫、視覚障害、錯乱及び不安、悪心及び嘔吐が含まれ得る。子癇前症は妊娠の約０．２％において痙攣（子癇）ももたらし得、昏睡のような合併症、稀に妊産婦死亡と関連し得る。
【０００４】
ＰＥの発症には複数の病因が関与し、例えば、異常な胎盤形成に起因する内皮機能障害又は活性酸化種の侵蝕に起因する酸化ストレスなどである。内皮機能障害及び酸化ストレスの複数の指標が提示されている。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ酵素（ＳＯＤ）は活性酸素種に対する主要な防御機構であり、従って、血中ＳＯＤ濃度の低下が酸化ストレスの簡易な感受性マーカーとして用いられている。タンパク質ベースのアッセイにて提示されている他のマーカーには、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、一酸化窒素合成酵素（ｎｉｔｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）並びにビタミンＣ、Ｅ及びβ−カロチンのような外因性化合物が含まれる。
【０００５】
酸化状態の指標として低分子量系を用いることも従来技術から公知である。例えば、システイン及びメチオニンのようなアミノ酸を含む血清中チオールは、ＲＯＳによる酸化を特に受けやすい。内因性抗酸化物質であるグルタチオンの酸化バランスは、グルタチオンの還元型と酸化二量体であるジグルタチオンとの比率を求めることにより、酸化ストレスレベルを確定することができる。これらの血漿中濃度は、正常な妊婦より妊娠高血圧を患う女性においてはるかに低いことが見出されている。
【０００６】
無制御脂質過酸化もＰＥと関連し、ＲＯＳによる多価不飽和脂肪酸の脂質ヒドロペルオキシドへの侵蝕及び変換が、ＰＥにおける血管内皮機能障害をもたらす初期因子であることが示唆されている。高濃度の（脂質ラジカルの再配置による）共役ジエンのような脂質過酸化の小分子一次生成物、並びにマロンジアルデヒド及びイソプロスタンのような安定な二次生成物は、ＰＥのような妊娠における高血圧疾患の良好なマーカーであることが示されている。高毒性小分子であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は脂質過酸化マーカーであるのみならず、ＤＮＡと相互作用し、変異原性となる可能性も有する。両因子とも既にＰＥの重症度と個々に相関している、マロンジアルデヒド濃度（また、従って、脂質過酸化）と自己免疫応答とに相互関係があることも示唆されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多くの代謝産物が子癇前症の発症と相関することが報告され、未解明なことはこれらの相互関係である。メタボノミクスはこれを確定すると同時に、最終的に早期診断をもたらし得る、病状の新規バイオマーカーを提供する可能性を有する。
【０００８】
本発明は、妊娠患者における子癇前症の特異的予測のための新規バイオマーカーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様に従って、妊娠患者において子癇前症を診断し、又は子癇前症を発症する可能性を予測する方法が提供され、該方法は、前記患者から得られる試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の存在について前記試料を分析するステップと、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップとを含み、前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度上昇が、該患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示す。
【００１０】
本明細書の記載及び特許請求の範囲全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」及び該語の変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、それに限定されない」という意味であり、他の部分、付加物、成分、整数又はステップを除外することを意図しない（また、除外しない）。
【００１１】
本明細書の記載及び特許請求の範囲全体にわたり、文脈上、別様に必要としない限り、単数形は複数系を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、文脈上、別様に必要としない限り、本明細書では単数のみならず複数も意図するものであると理解されるべきである。
【００１２】
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と関連して述べられる特徴、整数、特性、化合物、化学的部分又は化学基は、不適合でない限り、本明細書で述べられる他の任意の態様、実施形態又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。
【００１３】
好ましくは、検出されるヒスチジンのメチル誘導体は１−メチルヒスチジン又は３−メチルヒスチジンであるが、より好ましくは、図１５に示されるような１−メチルヒスチジンである。
【００１４】
好ましくは、該方法は、試料中の脂質の存在について前記患者から得られる前記試料を分析するステップと、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップとを含み、前記試料中の脂質の濃度低下が、該患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示す。
【００１５】
本明細書での「バイオマーカー」への言及は、生物学的機能と関連する分子又は化学マーカーをいうことを目的とする。本発明のバイオマーカーは、子癇前症に特異的な生物学的プロセスを示し、あるいは測定するのに用いられ得、罹患した患者及びリスクを有し得るがまだ症状を示さない女性の同定、診断及び処置に役立ち得る。
【００１６】
本発明の方法において、ヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度上昇について試料を分析するステップは独立して、又は該患者から得られる同一又は異なる試料での脂質濃度の分析ステップと併せて行われ得ることが理解される。
【００１７】
試験試料が比較され得る一組の対照値として、様々な妊娠期間の正常血圧妊婦の一組の「正常」値が確定されることが企図される。従って、該対照値は子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦から得られ、試験が比較され得る基準として用いられ得る。
【００１８】
好ましくは、患者はヒトであるが、本発明の方法は、他の哺乳動物、例えば、限定されずに、類人猿、ウマ、ウシ、イヌ及びネコ又は子癇前症に罹患し得る他の任意の哺乳類種に対しても用いられ得る。
【００１９】
試料は、全血、血漿、羊水及び血清を含む群から選択されることが好ましいが、他の体液、例えば、尿、滑液及び脳脊髄液も適用され得る。
【００２０】
試料は新鮮であり、又は凍結され、又はその後の試験のために保存され得る。
【００２１】
好ましくは、患者がヒト妊婦である場合、試料は妊娠期間の第１２週と終了期との間に採取され、より好ましくは、第２０週妊娠期頃に採取される。第２０週期は子癇前症が最初に明らかとなり得る時期であり、介入が可能である。しかし、試料は、他のルーチンの母親の血液検査が行われるこの時期前又はこの期日後、例えば、限定されずに、１２週目の検査又は１６週目の「トリプル検査」期又は３０週目の検診時に採取され得ることが理解される。従って、試料はルーチンの検査及びモニタリングが行われる時期と一致するように、都合の良い時期に採取され得る。
【００２２】
本発明の方法が妊娠患者から得られる試料からエクスビボ又はインビトロにて行われ、また、該試料が新鮮であり、あるいは保存され得ることが理解される。
【００２３】
該方法はケトン体の存在について試験試料を分析するステップを更に含むことが好ましい。
【００２４】
検出されるケトン体は、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、アセトアセテート（ＡＡ）又はα−ケトグルタレートを含む群から選択されることが好ましい。
【００２５】
本出願人らは、血漿中脂質濃度が子癇前症に罹患している妊婦において低下し、また、一部のケトン体が一部の点において脂質シグナルとオーバーラップし、そのため、脂質及びケトン体の双方が子癇前症において減少する可能性があることを示した。本発明の脂質マーカーは異なる位置でシグナルを生じさせ、ある位置ではケトン体とのオーバーラップはないが、別の位置では同じ脂質に対して減少したケトン体とのオーバーラップが認められる。
【００２６】
好ましくは、本発明の一実施形態では、試料は核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって分析され、より好ましくは、１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって分析される。
【００２７】
本発明の方法では、血漿の１Ｈ−ＮＭＲ分析を用いて代謝に対する子癇前症の影響が検査された。このデータに対するケモメトリックスの使用により、複数のバイオマーカーが同定され、最も顕著なことは、対照群と子癇前症群との間における脂質及びケトン体（３−ヒドロキシブチレート及びアセトアセテート）及びヒスチジン濃度の変化であった。試験にわたって変動が最も有意であるスペクトルの各「ビン（ｂｉｎｓ）」又は領域において、脂質又はケトン体又はヒスチジンに割り当てられた共鳴が位置特定される。
【００２８】
本出願人らは、対応するローディングプロットがこの識別における脂質の重要性を強調することを示した。δ１．１９−１．２３（ビン（ｂｉｎ）１７８）、δ２．３６−２．４０（ビン（ｂｉｎ）１５３）及びδ４．０９−４．１７（ビン（ｂｉｎｓ）１１５−６）を含む、スペクトルの複数の影響力の大きい領域において３−ヒドロキシブチレートを同定し、後者の領域はラクテート及びプロリンからの共鳴も含有した。２つの群の区分に役割を果たす他の成分は、δ２．２２−２．２６（ビン（ｂｉｎ）１５６）のアセトアセテート及びバリンであった。
【００２９】
ローディングプロットは、患者のクラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）においてヒスチジンが最も重要な成分であるように思われる事実に影響力があるスペクトルの芳香族領域の重要な同じセクションを一貫して示した。最大の固有ベクトルを有する２領域、δ７．７４２−７．７５８及び７．０４２−７．０５８は共に、ヒスチジンに割り当てられたシグナルに対応する。従って、本発明の一実施形態では、子癇前症はピークのこの特異的パターンによって検出され得る。
【００３０】
本発明のバイオマーカーの分析及び／又は検出は、バイオマーカーのレベルを測定することが可能な、ＮＭＲ以外の当分野における技法によっても行われ得ることが理解される。例えば、試料中の脂質及びケトン体及びヒスチジンもしくはそのメチル誘導体の濃度は、酵素法、抗体検出又は分離技術によって測定され得、分析技術の選択は本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３１】
本発明の第二の態様に従って、妊娠患者において子癇前症の検出又は子癇前症を発症する高リスクを有する患者の同定における、ヒスチジン又はそのメチル誘導体の使用が提供される。
【００３２】
本発明の第三の態様に従って、妊娠患者における子癇前症の検出又は子癇前症を発症する高リスクを有する患者の同定における、血漿中脂質及びヒスチジン若しくはそのメチル誘導体の使用が提供される。
【００３３】
好ましくは、本発明の第二及び第三の態様は、本発明の第一の態様に関して前述した任意の１つ以上の特徴を含む。
【００３４】
本発明の第四の態様に従って、妊娠患者における子癇前症の処置方法が提供され、該方法は、
（ｉ）前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の存在を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度上昇が、該患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示し、
（ｉｉ）前記患者から得られる試料中の脂質を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中の脂質の濃度低下が、該患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示し、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）から得られる結果を用いて、病状の臨床治療を決定するステップと
を含む。
【００３５】
ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を実施する順序は逆にされ得ることが理解される。
【００３６】
本発明の第四の態様の方法において、病状の重症度、即ち、対照値と比べて有意に減少した脂質及び／又は対照値と比べて有意に上昇したヒスチジンもしくはメチルヒスチジン濃度に応じ、臨床医は緊急治療を決定し、あるいは治療を先送りし得、その結果は必要な治療の強度を決定するのにも役立ち得る。
【００３７】
好ましくは、本発明の第四の態様は、本発明の第一の態様に関して前述した特徴を含む。
【００３８】
本発明の第五の態様に従って、子癇前症を発症するリスクを有する妊娠患者を同定する方法が提供され、該方法は、第１５〜２５週妊娠期頃に前記患者から得られる試料を分析するステップを含み、該方法は、
（ｉ）前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中のヒスチジン又はそのメチル誘導体の濃度上昇が、該患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示し、
（ｉｉ）前記試料中の脂質の濃度を検出し、その濃度を、同様の妊娠期間にあって子癇前症に罹患していないことが既知である妊婦について得られる値の濃度と比較するステップと、該ステップは、前記試料中の脂質の濃度低下が、該患者が子癇前症に罹患し、又は子癇前症を発症する可能性があることを示すこと
を含む。
【００３９】
好ましくは、該方法は、該疾患の進行をモニタリングし、又は病状に対抗するために該患者に施行される介入療法の有効性をモニタリングするため、その後の数週間の妊娠期にわたって分析を繰り返すステップを更に含む。
【００４０】
好ましくは、本発明の第五の態様は、本発明の第一及び第三の態様に関して前述した特徴を含む。
【００４１】
本発明の第六の態様に従って、本発明のバイオマーカーの濃度を求めるために必要な試薬を含む診断キットが提供される。
【００４２】
該キットは、本発明の任意の前述の態様による任意の１つ以上の前述の特徴を含むことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１Ａは、ＰＥに罹患している女性の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの拡大を示す。図１Ｂは、正常血圧妊婦の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの拡大を示す。
【図２】ＮＭＲメタボノミクスデータの主成分分析（ＰＣＡ）分析からのスコアプロット及びローディングラインプロットを示す。図２Ａは、対象患者及び対照患者のプロットデータの主成分１（ＰＣ１）対主成分２（ＰＣ２）のスコアを示す。図２Ｂは、図２Ａに対応するローディングプロットを示す。図２Ｃは、グルコースに割り当てられた領域が０に設定された後のデータのプロットを示す。図２Ｄは、図２Ｃに対応するローディングプロットを示す。
【図３】図２Ａ〜Ｄと同じメタボノミクスデータの部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）分析からのスコアプロット及びローディングラインプロットを示す。
【図４】図２Ａのスコアプロットを示す。
【図５】（Ａ）ＰＣＡ分析及び（Ｂ）ＰＬＳ−ＤＡにおけるローディングラインプロットの拡大を示す。
【図６】図６Ａは、幅０．０１６ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎｓ）」が用いられ、データがスペクトル積分の単位総計（ｕｎｉｔ  ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ）へ正規化された際のスピンエコー試験からのデータのＰＬＳ−ＤＡスコアプロット及び対応するローディングプロット（図６Ｂ）を示す。スペクトルの影響力の大きい領域及びこれらが生じる方向がローディングプロット（ｐｐｍにて）示され、ＰＥに罹患している女性、正常妊娠を享受している女性、初回妊婦及び２回以上の妊婦間の差異を生じさせている。
【図７】ＮＭＲメタボノミクスデータのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡ分析からのプロット及びローディング散布プロットを示す。図７Ａは、ＰＣＡスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）を示す。図７Ｂは、図７Ａに対応する散布プロットのローディングを示す。図７Ｃは、ＰＬＳ−ＤＡスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）を示す。図７Ｄは、図７Ｃの散布プロットのローディングを示す。
【図８】図８Ａは、妊婦の血漿のＮＯＥＳＹシーケンスの最初の増分を示す。図８Ｂは、ＰＥに罹患している女性の芳香族領域を示す。図８Ｃは、正常血圧妊婦の芳香族領域を示す。図８Ｄは、同一集団及び領域に対応するが、ＣＰＭＧスピンエコー試験から得られたプロット図である。図８Ｅは、同一集団及び領域に対応するが、ＣＰＭＧスピンエコー試験から得られたプロット図である。図８Ｆは、同一集団及び領域に対応するが、ＣＰＭＧスピンエコー試験から得られたプロット図である。
【図９】図９Ａは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。図９Ｂは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。図９Ｃは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。図９Ｄは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。
【図１０】図１０Ａは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＬＳ−ＤＡローディングプロットを示す。図１０Ｂは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＬＳ−ＤＡローディングプロットを示す。図１０Ｃは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＣＡローディングプロットを示す。図１０Ｄは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＬＳ−ＤＡローディングプロットを示す。図１０Ｅは、幅０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＣＡローディングプロットを示す。
【図１１】図１１Ａは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＣＡスコアプロットを示す。図１１Ｂは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＣＡスコアプロットを示す。図１１Ｃは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。図１１Ｄは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験からの生データのＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。
【図１２】図１２Ａは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からの生データのＰＣＡスコアプロットを示す。図１２Ｂは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からの生データのＰＣＡスコアプロットを示す。図１２Ｃは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からの生データのＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。図１２Ｄは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられた際のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分からの生データのＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。
【図１３】図１３Ａは、幅０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎｓ）が用いられ、スペクトル積分の単位合計（ｕｎｉｔ  ｓｕｍ）へ正規化された際のスピンエコー試験からのデータのＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示し、対応するロードプロット（図１３Ｂ）を示す。
【図１４】図１４Ａは、データが正規化され、正規化が適切ではないことを示す場合のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹ試験からのデータのスコアプロットを示す。図１４Ｂは、データが正規化され、正規化が適切ではないことを示す場合のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹ試験からのデータのスコアプロットを示す。図１４Ｃは、データが正規化され、正規化が適切ではないことを示す場合のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹ試験からのデータのスコアプロットを示す。図１４Ｄは、データが正規化され、正規化が適切ではないことを示す場合のスピンエコー試験及びＮＯＥＳＹ試験からのデータのスコアプロットを示す。
【図１５】ヒスチジンとその２つのメチル誘導体、１−メチルヒスチジン及び３−メチルヒスチジンの化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
メタボノミクスは、「病理学的刺激又は遺伝子改変に対する生体系の動的マルチパラメトリック代謝反応の定量的測定」と定義づけられ、生体液、細胞及び組織の多成分代謝組成物を研究するため、１Ｈ−ＮＭＲ分光法の適用から生じた。メタボノミクスは生物のあらゆるレベル−細胞小器官、細胞、組織又は生物全体において機能し得る。本発明では、分析を受ける生体液は妊婦の血漿であるが、尿のような他の体液も適切であり得る。
【００４５】
ＮＭＲは極少の試料の前処理又は調製という利点を有し、迅速且つ非破壊的であり、また、分析される血液が妊婦から採取される必要があるが、それは入院時にルーチンに行われるという点から非侵襲的でもあるように、メタボノミクス及びＰＥにおけるバイオマーカーの研究に特に適している。
【００４６】
生体液中に水が高濃度で存在するため、そのＮＭＲピークは巨大であり、他の分子情報を不明瞭にし、ＮＭＲ検出器においてダイナミックレンジ問題を引き起こすほどである。加えて、血清及び血漿の低分子量要素の共鳴は、アルブミンのような高分子量血漿タンパクの共鳴の広帯域エンベロープによって不明瞭にされるため、分析が非常に困難である。
【００４７】
従って、シーケンスの遅延時に微弱なｒｆ磁界を用いた共鳴の選択照射によって水を抑制するため、ＮＯＥＳＹ試験の最初の増分のように、ＮＭＲパルスシーケンスが用いられる。巨大分子（例えば、血漿タンパク）及び小分子（例えば、代謝産物）のスピン特性に基づくスペクトル編集法が用いられ、Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）パルスシーケンスのようなスピンエコーループがこれを達成することができる。巨大分子は長い回転相関時間及び制約された並進運動を有し、従って、小分子より短いＴ１及びＴ２緩和時定数並びに小さい並進拡散係数を有し、ＮＭＲスペクトルがこれらの特性に基づいて編集されることを可能とする。
【００４８】
代謝産物のオーバーラップするシグナルもスペクトルの複雑性を高め得る。血漿の多成分性状とは、その１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが複雑であるだけでなく、密集領域内のどのピークがＰＥの見込みのあるバイオマーカーに割り当てられたものであるかを確認することがはるかに困難となるということである。約６ｐｐｍ〜９．５ｐｐｍの化学シフトから、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの芳香族領域は、更なる高磁場と比べてシグナルがはるかに少ない領域であり、従って、複雑性がはるかに低い領域であり、オーバーラップする共鳴が少なく、見込みのあるバイオマーカーの同定をはるかに容易にする。
【００４９】
全スペクトルの取得後、「計量化学」手法にて多変量統計が試験に適用され得る。計量化学は概してパターン認識（ＰＲ）に帰する用語であり、多変量統計手法は化学数値データに適用される。多くの試料が処理されるため、自動データ処理及びＰＲ解析が必要とされ、これは、ＮＭＲスペクトルを同等の化学シフト範囲の領域に分割し、次に、それらの範囲（「ビン化（ｂｉｎｎｉｎｇ）」）内にて信号積分を行うことによって達成される。主成分分析（ＰＣＡ）を用いることにより、強度変化が最も大きいスペクトルの領域が同定され得、対照試料と子癇前症患者との判別を可能とするとともに、この変化を生じさせる、見込みのあるバイオマーカーを同定する。妊婦群間での識別を向上させるため、主成分を回転させて最大分離及び潜在的バイオマーカーのより容易な同定を果たすことにより、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を行うこともできる。
【００５０】
材料及び方法
患者の選択
本試験のために選択された妊婦は全員が妊産婦クリニックに通院し、対照被験者として用いられた患者は同様の妊娠期間の正常血圧妊婦であり、一方、子癇前症に罹患していると分類された女性は米国産科婦人科学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ）（ＡＣＯＧ）の基準、即ち、以前には正常血圧であった女性における、６時間間隔での２回以上の第２０週妊娠期後の１４０／９０ｍｍＨｇ超の血圧上昇とタンパク尿との組合せに従って診断された。タンパク尿は尿路感染の不在下、２つ以上の中間尿試料においてタンパクディップスティックで１＋超又はタンパク０．３ｇ超の２４時間の尿排泄と定義づけられた。１６０／１１０ｍｍＨｇ超の血圧が認められた場合、重症子癇前症と診断された。女性は第一子を妊娠している女性と、既に一人以上の子どもを出産している女性との２期に選別された。
【００５１】
試料の調製
ヘパリン化（リチウム塩）抗凝固チューブ内に静脈血を採取し、その後、９００ｇで１０分間遠心分離した。試料から血漿を取り除き、必要とするまで−８０℃で保存した。手の温もりはそのままの状態にして血漿を室温で解凍し、その後、９００ｇで１分間遠心分離した。重水（Ｄ２Ｏ）（Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ、英国）中、３−（トリメチルシリル）−２，２，３，３−ｄ４プロピオン酸（ＴＳＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、英国）の０．１７％（ｗ／ｖ）ナトリウム塩溶液を調製した。その３５０μｌをエッペンドルフチューブ内の３００μｌの血漿に加えた。その混合物を３回反転させ、その後、６５０μｌをすべて５ｍｍＮＭＲチューブ（５２８ＰＰ−ＷＩＬＭＡＤ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、英国）に移した。
【００５２】
ＮＭＲ分光法
Ｖａｒｉａｎ社製Ｕｎｉｔｙ  Ｉｎｏｖａ  ５００スペクトロメーターにおいて、４９９．９７ＭＨｚにて２１℃で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。短いＴ２値を有する巨大分子及び他の物質からのシグナルを抑制するため、Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）スピンエコーパルスシーケンス［ＲＤ−９０°−（τ−１８０°−τ）ｎ−ａｃｑ］を用いた。関連遅延（Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ）（ＲＤ）は１０．５秒の緩和遅延を表し、この間、水の共鳴が選択的に照射される。すべての試料に対して４５０ミリ秒のスピン・スピン緩和遅延２ｎτを用いた。スピンエコー試験に加え、水のピークを抑制するため、ＮＯＥＳＹパルスシーケンス［ＲＤ−９０°−ｔ１−９０°−ｔｍ−９０°−ａｃｑ］の最初の増分を用い、水の周波数の照射を再生遅延（ｒｅｃｙｃｌｅ  ｄｅｌａｙ）ＲＤ（９．９３秒）及び混合時間ｔｍ（１５０ミリ秒）の間とした。ｔ１を４μ秒に設定した。スピンエコー試験及びＮＯＥＳＹ試験の最初の増分では、各スペクトルに対して５１２の過渡信号を３２，７６８データポイントに回収し、８３８９．３Ｈｚのスペクトル幅となった。
【００５３】
データ解析、計量化学及び統計的有意性
６５，５３６ポイントに対するゼロフィリング前に各自由誘導減衰（ＦＩＤｓ）に０．５Ｈｚの指数関数的線幅拡大を適用し、次に、フーリエ変換を行った。その結果生じたスペクトルを整相し、ＶｎｍｒＪ  １．１Ｄ（米国カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．）を用いてベースラインを補正した。δ−０．５−９．５の範囲にわたって各々が０．０４５ｐｐｍの幅を有する２２４セグメントにスペクトルを「ビン化（ｂｉｎｎｅｄ）」し、水抑制の種々の効率の影響を除去するため、δ４．４８−５．９７の範囲をゼロに設定した。スペクトルをＴＳＰに対して正規化し、次に、スペクトル積分の単位総計（ｕｎｉｔ  ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ）への正規化により第二の解析を行った。
【００５４】
ＳＩＭＣＡ−Ｐ＋  １１（スウェーデン・ウーメオ（Ｕｍｅａ）、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ社）を用いて、平均中心の（ｍｅａｎ−ｃｅｎｔｒｅｄ）Ｐａｒｅｔｏスケールのデータに対して主成分分析（ＰＣＡ）及び部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を行った。データの可視化はＰＣスコア（ｔ）プロットの形態にて可能であり、該スコアプロット上の各ポイントが本試験における試料であり、アウトライアー及びクラスタ化を示す。ローディングプロット（ｐ）は各ＮＭＲスペクトルの「ビン（ｂｉｎ）」を示し、試料の位置に関与するスペクトル領域を明らかにすることにより、これらの入力変数のスコア（ｔ）に対する影響、従って、対応するスコアプロットにおけるクラスタ化の可能性を際立たせる。
【００５５】
血漿中グルコース濃度がデータのクラスタ化に関与しないことを検証しようとして、この手順を更に繰り返し、δ３．２０−３．９４の更なる範囲をゼロに設定した。
【００５６】
正規性検定を行った後、ＳＰＳＳ  １３．０ソフトウェア（米国イリノイ州シカゴ、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）にてｔ検定又はマン・ホイットニー検定を用いてＰＥ群と対照群との間でスペクトルの優勢領域（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ）からの絶対積分の平均値の比較を行った。Ｒ２．４．１ソフトウェア（オーストリア・ウィーン、Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）における誤検出率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を用いて、多重比較のためにＰ値を調整し、０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
【実施例１】
【００５７】
図１を参照すると、（Ａ）ＰＥに罹患している女性及び（Ｂ）正常妊娠を享受している女性の血漿の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの拡大が示される（省略形：３−ＨＢ、３−ヒドロキシブチレート；ａｌａ、アラニン；ａｒｇ、アルギニン；ｇｌｎ、グルタミン；ｉｌｅ、イソロイシン；ｌｅｕ、ロイシン；ｌｙｓ、リシン；ｍｅｔ、メチオニン；ｔｈｒ、トレオニン；ＴＭＡＯ、トリメチル−アミン  Ｎ−オキシド；ｔｙｒ、チロシン；ｖａｌ、バリン）。子癇前症女性の血漿の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、表面上、対照妊婦と同様であるように思われたが（図１）、ＰＣＡ分析により２つの群に明確に区分され、その区分はＰＣ１及び２にまたがる（図２）。図２はＮＭＲメタボノミクスデータのＰＣＡ分析からのスコアプロット及びローディングｐ［１］ラインプロットを示す。図２Ａはデータのスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）プロットを示し、白色三角形はＰＥに罹患している女性を表し、黒色三角形は正常に妊娠している女性を表し、ＰＣ１及び２はデータ分散の９２％を占める。図２Ｂは図２Ａのスコアに対応するローディングプロットを示し、女性の２つの群間の識別に関与するスペクトルの最も有意な領域及びグルコースの共鳴に割り当てられた領域（囲まれた部分）を示す。図２Ｃはグルコースに割り当てられた領域δ３．２０−３．９４の積分がゼロに設定された後のデータのスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）プロットを示す。ＰＣ１及び２はデータ分散の９４％を占める。図２Ｄは図２Ｃのスコアに対応するローディングプロットを示す。三角形は第一子を妊娠していた女性を表し、逆三角形は一人以上の子どもを既に出産していた妊婦を表す。予期したように、ＰＥに罹患している女性由来の試料は相当クラスタ化しているが、対照試料では、はるかに大きい群内ばらつきが認められる。
【００５８】
女性の２つの群間のこの分離はＰＬＳ−ＤＡを用いて確認された。図３は同一ＮＭＲメタボノミクスデータのＰＬＳ−ＤＡ分析からのスコアプロット及びローディングｐ［１］ラインプロットを示し、ＰＣＡ分析にて見出された結果を裏付ける。図３Ａはこの場合もデータのスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）プロットを示し、白色三角形はＰＥに罹患している女性を表し、黒色三角形は正常に妊娠している女性を表す。ＰＣ１及び２はデータ分散の８４％を占める。図３Ｂは図３Ａのスコアに対応するローディングプロットを示し、女性の２つの群間の識別に関与するスペクトルの最も有意な領域及びグルコースの共鳴に割り当てられた領域（囲まれた部分）を示す。図３Ｃはグルコースに割り当てられた領域δ３．２０−３．９４の積分がゼロに設定された後のデータのスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）プロットを示す。ＰＣ１及び２はデータ分散の８８％を占め、図３Ｄは図３Ｃのスコアに対応するローディングプロットを示す。
【００５９】
データには一部の対照アウトライアーが存在し、患者の病歴を確認したところ、ＰＣスコア上に明確に併存する試料２１３５及び２１４０は、非常に高い体格指数（ＢＭＩ）を有する女性に由来するものである。他の対照アウトライアーである試料２１５３及び２０２０は共に、サイロキシン薬剤を処方されていた女性に由来するものである。一対照試料は分析における全ポイントから明確に区別される。この患者は、「妊娠中のビタミン（Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」試験に参加していた。図４は図２Ａからのスコアプロットを示し、モデルにおいてアウトライアーである対照女性及びこの例外的な挙動の明らかな理由を示す。
【００６０】
ＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡ分析のローディングｐ［１］ラインプロットに示される固有ベクトルを検討すると、どのスペクトル領域がクラスの分離に最も寄与するのかが判明した。図２及び３において認められるように、一部の著明な領域はグルコースに起因し得る。後に絶食していることが見出された女性もいれば、絶食していない女性もいたため、血漿中グルコース濃度は制御不能なパラメータである。ＰＣＡ分析においてグルコースに割り当てられた領域の除去は、該「ビン（ｂｉｎｓ）」内の積分をゼロに設定し、統計解析を再度行って群の分離が依然として生じるかを検証することによって達成された。図２及び３は、子癇前症女性のより緊密なクラスタ化及び同一のアウトライアーの存在を伴った、グルコース「除去」後の同一の群の分離を明示し、グルコース濃度が妊娠の健康の指標ではないことを裏付ける。ｐ［１］及びローディングプロットにおける最も有意な固有ベクトルは、この介入前後で依然として疑いなく同一である。
【００６１】
当初、初めて妊娠している女性のみを含めた。後に、２回目、３回目以上の回数の妊婦を加えた。識別は同じであったが、これらの２つの亜群のクラスタ化の「緊密性」は異なった。図５は、（Ａ）ＰＣＡ分析及び（Ｂ）ＰＬＳ−ＤＡにおけるローディングｐ［１］ラインプロットの拡大を示し、妊婦の２つの群の間の差異に関与するスペクトルの領域を際立たせ、両分析ともスペクトルの同一の有意な領域を示す。
【実施例２】
【００６２】
図６は、ＮＭＲスペクトルの最も有意な領域又は「ビン（ｂｉｎｓ）」に対してＰＥ女性群（白色三角形で示される）及び対照女性群（黒色三角形で示される）について得られる積分値のプロットを示し、これらは脂質に割り当てられているため、子癇前症女性のより低い積分値はＰＥにおける脂質過酸化の提唱を実証している。本結果は、ＰＥに罹患している女性と正常妊婦の血漿中脂質濃度の差が２つの群の間の差異の主要原因であることを示している。図６に示される、各試料について得られる積分値のプロットは、脂質の共鳴が認められるスペクトルの全領域でＰＥ試料の数値範囲（従って、濃度範囲）が対照試料について得られる範囲より低いことを示す。
【実施例３】
【００６３】
分離に最も寄与しているスペクトル領域は、化学シフト範囲δ１．２９−１．４２（ビン（ｂｉｎｓ）１７４−６）にあることが見出された。これは、主にＶＬＤＬ脂質であるが異なるタイプの脂質、ラクテート、フコース及びトレオニンからのシグナルが生じる領域である。ＰＥ群の積分値は対照群の積分値より有意に低いことが見出された（ｐ＝０．０４６）。二番目に影響力のある領域δ０．８７−０．９６（ビン（ｂｉｎｓ）１８４−５）も脂質（ＶＬＤＬを含む）、コレステロール並びにイソロイシン及びロイシンに関与し、この場合もＰＥ試料の積分値は対照群の積分値よりはるかに低かったが、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０７５）。領域δ２．２２−２．２６（ビン（ｂｉｎ）１５６）は脂質の重要性のもう１つの有意なレポーターである（ｐ＝０．０１８）。
【００６４】
共にδ２．０４−２．０８（ビン（ｂｉｎ）１６０）の領域に共鳴を有する糖タンパク質及びプロリンは重要な成分であることが判明した。δ１．１９−１．２３（ビン（ｂｉｎ）１７８）、δ２．３６−２．４０（ビン（ｂｉｎ）１５３）及びδ４．０９−４．１７（ビン（ｂｉｎｓ）１１５−６）を含む、スペクトルの複数の影響力のある領域において３−ヒドロキシブチレートが同定され、後者の領域はラクテート及びプロリンからの共鳴も含有した。２つの群の区分に役割を果たす他の成分は、δ２．２２−２．２６間（ビン（ｂｉｎ）１５６）のアセトアセテート及びバリンであった。固有ベクトルのｐ［１］プロットに示された一部の優勢領域（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ）は、種々のアミノ酸、例えば、チロシン、ヒスチジン及びフェニルアラニン（δ３．９４−３．９９、ビン（ｂｉｎ）１１９）、メチオニン（δ２．１３−２．１７、ビン（ｂｉｎ）１５８）、グルタミン（δ２．０８−２．１３、ビン（ｂｉｎ）１５９）、リシン（δ１．４７−１．５１及びδ１．８９−１．９３、それぞれ、ビン（ｂｉｎｓ）１７２，１６３）及びアルギニン（δ１．８９−１．９３、ビン（ｂｉｎ）１６３）並びに他の成分、例えば、グルタメート（δ２．１３−２．１７及びδ２．３６−２．４０、それぞれ、ビン（ｂｉｎｓ）１５８，１５３）、α−ケトグルタレート（δ２．４５−２．４９、ビン（ｂｉｎ）１５１）及びアセテート（δ１．８９−１．９３、ビン（ｂｉｎ）１６３）に割り当てられたスペクトルの領域に対応した。
【００６５】
スペクトルの積分をスペクトル積分の単位総計（ｕｎｉｔ  ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ）へ正規化した場合の第二の分析において、ＰＣＡでは初めて妊娠した女性と２回目（以上）の妊婦とを識別することができた。図７は、積分をスペクトル積分の単位総計（ｕｎｉｔ  ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ）へ正規化した場合のＮＭＲメタボノミクスデータのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡ分析からのスコアプロットとローディング散布プロットとを示す。図７ＡはデータのＰＣＡスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）プロットを示し、白色三角形はＰＥに罹患している女性を表し、黒色三角形は正常に妊娠している女性を表す。三角形は１回目の妊婦を表し、一方、逆三角形は以前に妊娠したことがある女性を表す。ＰＣ１及び２はデータ分散の８２％を占める。図７Ｂは図７Ａのスコアに対応するローディング散布プロットを示し、１回目の妊婦と２回目以上の妊婦との識別に関与するスペクトルの最も有意な領域を示す。図７Ｃは同一データのＰＬＳ−ＤＡスコア（ＰＣ１対ＰＣ２）プロットを示し、黒色四角形は１回目の妊婦を表し、白色円形は以前に妊娠したことがある女性を表す。ＰＣ１及び２はデータ分散の８０％を占める。図７Ｄは図７Ｃのスコアに対応するローディング散布プロットを示す。
【００６６】
ＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡ（図７）は共にこれらの女性の２つの亜群間の優れた分離を生じさせることができ、健康状態にかかわらず、ほぼすべての子癇前症女性及び対照女性がスコアプロット上に正確に分類され、第一子を妊娠している女性一名（ＰＥに罹患）のみが１回目の妊娠ではない女性群の近傍に位置していた。
【００６７】
この場合も、対応するローディングプロットはこの差異における脂質の重要性を際立たせる。分離に最も寄与しているスペクトル領域は、化学シフト範囲δ０．８７−０．９１（ビン（ｂｉｎ）１８５：脂質及びコレステロール）、δ１．２９−１．３３（ビン（ｂｉｎ）１７６：ＶＬＤＬ脂質、イソロイシン、他の脂質及びフコース）及び最も重要なδ１．３３−１．３７（ビン（ｂｉｎ）１７５：脂質、トレオニン及びラクテート）にあることが見出された。これらの３領域はすべて、初めて妊娠した女性の血漿中に初めての妊娠ではない女性より有意に低い強度、従って、脂質濃度を示した（それぞれ、ｐ＝０．００４、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１）。
【００６８】
ＴＳＰの共鳴に対して正規化を行った第一の分析では、データポイントの分類は女性が出産した子どもの数に依存しないように思われたが、一人以上の子どもを出産し、ＰＥに罹患している妊婦は、特に、統計解析からのグルコースの除去後、初めて妊娠した子癇前症女性より緊密に群を形成しているように思われた。しかし、スペクトル積分の単位総計（ｕｎｉｔ  ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ）への正規化は、１回のみ妊娠した女性と２回以上妊娠した女性との識別を可能とした。この場合も、脂質濃度が２つの群の間の判別因子であった。しかし、０ｐｐｍでの基準化合物ＴＳＰの濃度も変化しているように思われるため（図７）、第一子を妊娠している女性における血漿タンパクの濃度が初めての妊娠ではない女性の血漿タンパクの濃度より高いという可能性もある。ＴＳＰはアルブミンに結合するため、このことは、初めて妊娠した女性のスペクトルにおいて認められるこの共鳴に対する強度の明らかな低下の説明となり得る（ｐ＜０．００１）。妊娠回数が本研究の目的ではなかったため、ＴＳＰの共鳴に対する積分の最初の正規化は、ＰＥの病因研究において成分濃度の適正な評価を確実にするため、本結果を分析する最適な方法であることが判明した。
【００６９】
要約すると、妊婦由来の血漿試料の代謝プロファイルの１Ｈ−ＮＭＲ分析は、健常参加者と子癇前症罹患者との判別を可能とした。判別における主要成分の検討により、子癇前症が存在する場合、そのすべてが酸化の増大を示す様々な分子を同定した。多くの分子は関連する代謝事象から生じ、その詳細な分析により、この疾患の原因及び病因の更なる理解がもたらされ得る。
【実施例４】
【００７０】
更なる試験では、子癇前症女性の血漿及び対照群の血漿の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの芳香族領域は、外見上酷似しているように思われた（図８）。図８Ａは妊婦の血漿の１  ＣＰＭＧスピンエコースペクトル（左側）及びＮＯＥＳＹパルスシーケンススペクトル（右側）の最初の増分を示す。該スピンエコースペクトルからの芳香族領域は、ＰＥに罹患している女性（図８Ｂ左側）と正常血圧妊婦（図８Ｃ左側）とで酷似しているように思われる。しかし、芳香族領域の１Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルは、子癇前症女性（図８Ｂ右側）と対照妊婦（図８Ｃ右側）との一部の相違を示すが、これらは主に巨大分子の共鳴の広帯域エンベロープにあるものであって代謝産物シグナルではない。
【００７１】
しかし、δ６−９．５領域にまたがる０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎ）幅による最初の分析を用いて、計量化学により、ＰＥに罹患している女性群と健常妊娠を享受している女性群とを良好に判別した（図９）。図９Ａ及びＣ並びに図９Ｂ及びＤは、幅０．０４５ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎｓ）」を用いた場合のスピンエコー試験（図９Ａ及びＢ）及びＮＯＥＳＹパルスシーケンス（図９Ｃ及びＤ）の最初の増分からの生データのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。白色三角形は子癇前症患者を表し、一方、黒色三角形は正常血圧の対照妊婦を表す。逆三角形は既に少なくとも第一子を出産している女性を表し、他はすべて初めて妊娠している女性を表す。この差異はスピンエコー試験よりＮＯＥＳＹ試験の最初の増分の分析においてより明瞭に認められる。該群は１Ｄ  ＮＯＥＳＹからのＰＣＡ（及びＰＬＳ−ＤＡ）スコアプロットにおいて明瞭に分離されるが、この分類はスピンエコーデータのＰＬＳ−ＤＡにおいてのみ認められ、ＰＣＡスコアプロットでは認められない。
【実施例５】
【００７２】
１Ｄ  ＮＯＥＳＹの場合、芳香族領域の最も重要な部分はＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡ分析において同一であり、図１０のローディングラインプロットに認められる。図１０Ｃ及びＥ並びに図１０Ａ、Ｂ及びＤは、幅０．０４５ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎｓ）」を用いた場合のスピンエコー試験（図１０Ａ及びＢ）及びＮＯＥＳＹパルスシーケンス（図１０Ｃ、Ｄ及びＥ）の最初の増分からの生データのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡローディングプロットを示す。上述のプロット（図１０Ａ及びＣの拡大が、それぞれ図１０Ｂ及びＥに示される）上に示されるスペクトルの影響力のある領域は、図９に示されるスコアプロット上の女性の２つの群の間の差異及び分類を生じさせる領域である。これらの固有ベクトルのプロットにより、図９に示されるスコアプロットに示される分類に最も寄与する領域が明らかとなった。最も重要と思われるスペクトル領域はδ７．０５−７．１０であり、成分ヒスチジンに対応した。この領域及び成分は、両方の積分生データを用い、０ｐｐｍでの基準化合物ＴＳＰからのシグナルへデータを正規化すると、最も顕著なものとして明らかとなった。ヒスチジン濃度は子癇前症女性の血漿と対照女性の血漿とにおいて有意に異なることが見出された（生データでｐ＝０．０３０、正規化データで０．００７）。同様に、ローディングプロットに示される第二の影響力のある領域はδ７．７６−７．８１であり、この場合もヒスチジンからのシグナルに対応したが、積分値は、この場合、有意ではなかった（正規化データでｐ＝０．０５６、生データで０．２０２）。最後に、第三の領域δ７．００−７．０５もローディングプロットにおいて顕著であり、これもまたヒスチジンに対応し（しかし、１−メチルヒスチジン及び３−メチルヒスチジンからのシグナルも含有した）、この場合も、データを正規化すると、ＰＥ罹患者において有意に異なることが見出された（ｐ＝０．０１８、生データでは０．１９６）。該群間における濃度の差異を有する他の重要な成分は、様々なＰＥ患者において有意に異なることが見出されたチロシン（δ６．８３−６．８８、正規化データではｐ＝０．０２１、生データでは０．１９４）、並びに前述した３−メチルヒスチジン（δ７．００−７．０５及び７．５８−７．６３）、ヒスチジン（δ７．００−７．０５）、ヒスチジン及びメチルヒスチジン誘導体（δ７．００−７．０５及び７．５８−７．６３）及びフェニルアラニン（δ７．３６−７．４５）であったが、これらの３成分の濃度差は有意であることが見出されなかった（それぞれ、生データではｐ＝０．４７７、０．１９６、０．９５２、正規化データではｐ＝０．１２６、０．０１８（ヒスチジンで）、０．０８８）。
【００７３】
スピンエコー試験はＰＬＳ−ＤＡスコアプロット上に患者の分類を示すが、ＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分ほど良好ではないように思われた。ＰＬＳ−ＤＡモデルのｐ［２］ローディングプロットから、ＮＯＥＳＹ分析の場合と同じ重要な成分がスコアプロット上にポイントのクラスタ化を生じさせていることが見出された。このときの最も重要な領域はδ７．７２−７．７７であり、この範囲内の成分は、この場合もヒスチジン（７．７３ｐｐｍ）及び１−メチルヒスチジン（７．７７ｐｐｍ）であった。ＮＯＥＳＹ分析の場合のように、δ７．０２−７．０７領域における１−メチルヒスチジン（７．０５ｐｐｍ）も該群間の差異に関与していた。領域δ６．８７−６．９３（６．８７ｐｐｍ）及びδ７．１６−７．２１（７．１７ｐｐｍ）におけるチロシン並びに領域δ７．３０−７．３５（７．３３ｐｐｍ）及びδ７．３８−７．４４（７．３８ｐｐｍ、７．４３ｐｐｍ）におけるフェニルアラニンも、影響力があるものとしてローディングプロット上に示された。スピンエコーによって全く同一の成分が抽出されたが、生データではＰＥ患者の血漿と対照患者の血漿におけるこれらの化合物の濃度に有意差は見出されなかった。しかし、データを正規化すると、これらの化合物はすべて、女性の２つの群の間の濃度において有意に異なることが見出された（ｐ＝０．０１９（ｈｉｓ及び１−メチルヒスチジン）、０．０２１（ｈｉｓ）、０．０２８及び０．０４０（ｔｙｒ）、０．０１９及び０．０１５（ｐｈｅ））。
【実施例６】
【００７４】
分析の第二段階では、スペクトルの芳香族領域を分析するため、はるかに狭い０．０１６ｐｐｍ幅の「ビン（ｂｉｎｓ）」を用いた。本研究のこのパートでは、２つの試験の奏功については逆が真となるように思われ、女性の２つの群を最も効率的に判別したのはスピンエコーパルスシーケンスであった（図１１）。図１１Ａ及びＢ並びに図１１Ｃ及びＤは、幅０．０１６ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎｓ）」を用いた場合のスピンエコー試験（図１１Ａ及びＣ）及びＮＯＥＳＹパルスシーケンス（図１１Ｂ及びＤ）の最初の増分からの生データのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。白色三角形は子癇前症患者を表し、一方、黒色三角形は正常血圧の対照妊婦を表す。逆三角形は既に少なくとも第一子を出産している女性を表し、他はすべて初めて妊娠している女性を表す。スピンエコーデータのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡでは、女性らは２つの群に正確に分類された。図１２Ａ及びＣ並びに図１２及Ｂ及びＤは、幅０．０１６ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎｓ）」を用いた場合のスピンエコー試験（図１２Ａ及びＢ）及びＮＯＥＳＹパルスシーケンス（図１２Ｃ及びＤ）の最初の増分からの生データのＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡローディングプロットを示す。上述のプロット（図１２Ｂ及びＣの拡大が、それぞれ右上、右下に示される）上に示されるスペクトルの影響力のある領域は、図１１に示されるスコアプロット上の女性の２つの群の間の差異及び分類を生じさせる領域である。
【００７５】
いずれのモデルからのローディングプロット（図１２）も、スコアプロット上の患者のクラスタ化に影響を与えるスペクトルの芳香族領域の同一の重要なセクションを示し、この場合もヒスチジンが最も重要な成分であるように思われた。固有ベクトルの最大の大きさを有する２つの領域δ７．７４２−７．７５８及び７．０４２−７．０５８は共に、ヒスチジンに割り当てられたシグナルに対応する。この分析では、正常妊娠を享受している女性よりＰＥに罹患している女性において、１−メチルヒスチジンの濃度が有意に高いことが見出された（ｐ＝０．０１９及び０．０２６）。ビン化（ｂｉｎｎｉｎｇ）を芳香族領域に対してのみ行ったため、ＴＳＰ基準ピークへの正規化を行うことができず、そのため生データのみを用いた。この場合もδ６．８８２−６．９１８領域におけるチロシンが、女性の２つの群の間において有意に異なる濃度を有することが見出された（ｐ＝０．０４４）。ＰＥ患者の血漿中に対照群の血漿より高い濃度が見出され、δ７．１８２−７．２０８におけるチロシンのもう１つの影響力のあるシグナルについて同じ結果が生じたが、これは有意であることが見出されなかった。スコアプロット上の患者のクラスタ化を制御している芳香族領域の一部にフェニルアラニン（δ７．３２２−７．３４８及びδ７．４１２−７．４３８）も見出されたが、この成分の濃度は２つの群の間において有意に異なることはなかった。
【００７６】
ＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡでは共に、ＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分についてもＰＥ群と対照群とを良好に判別した（図１１）。この場合も、いずれのモデルのローディングプロット（図１２）もスピンエコー試験及び分析における場合と同じ芳香族領域の２つの優勢部分、δ７．７４２−７．７５８及び７．０４２−７．０５８を示し、共にヒスチジンに対応した。しかし、これらのピークはどちらも女性の２つの群の間において領域、従って、成分濃度の有意差を示さなかった（ｐ＝０．２０７及び０．１１９）。
【００７７】
スピンエコー及びＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分のすべてのスコアプロットにおいて（生データ及び正規化データを用いて）、また、共に「ビン（ｂｉｎ）」幅を用いて、常に１つのアウトライアーが認められ、このポイントは正常血圧女性と同群にされている子癇前症女性に関連する（図９及び１１）。この患者の病歴を調査したところ、アヘン剤使用者であることが分かった。
【実施例７】
【００７８】
より広いビン（ｂｉｎ）幅の０．０４５ｐｐｍを用いた場合、正規化された全データのスコアプロットも追加のアウトライアーを示した。より狭い０．０１６ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎ）」分析では、基準ＴＳＰピークへの正規化を用いなかったが、後に８．４５ｐｐｍでのホルメートの共鳴を用いてこの処理を試みた。ホルメートの共鳴への正規化も追加のアウトライアーをスコアプロット上に認めさせた（図１４）。図１４は、幅０．０４５ｐｐｍ（図Ａ及びＣ）、次に、０．０１６ｐｐｍ（図Ｂ及びＤ）の「ビン（ｂｉｎｓ）」を用いた場合の、スピンエコー試験（図１４Ａ及びＢ）及びＮＯＥＳＹパルスシーケンス（図１４Ｃ及びＤ）の最初の増分からの正規化データのスコアプロットを示し、該女性群間における差異の減少及びアウトライアー数の増加を示す。
【００７９】
女性が過去に出産した子どもの数は結果に影響を与えるようには思われなかった。第一子を妊娠している女性又は過去に出産している女性の群内クラスタ化は生じなかった。
【００８０】
しかし、０．０１６ｐｐｍのビン（ｂｉｎ）幅を用いた第二の分析からのデータを、スペクトル積分の単位総計（ｕｎｉｔ  ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ）に対して正規化した場合、これは当てはまらなかった。基準化合物ＴＳＰへの正規化が可能でなく、ホルメートへの正規化が特に良好であると思われなかったため、これを行った。スピンエコーデータでは、ＰＥを有する女性と対照妊婦とを判別することができたが、初めて妊娠した女性と初めての妊娠ではない女性とを識別することもできた（図１３）。図１３Ａは、幅０．０１６ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎｓ）」を用い、スペクトル積分の単位総計（ｕｎｉｔ  ｔｏｔａｌ  ｓｕｍ）に対してデータを正規化した場合の、スピンエコー試験からのデータのＰＬＳ−ＤＡスコアプロット及び対応するローディングプロット（図１３Ｂ）を示す。スペクトルの影響力のある領域及びこれらが生じる方向が該ローディングプロット（ｐｐｍ）に示され、ＰＥに罹患している女性、正常妊娠を享受している女性、初めて妊娠している女性及び２回目以上の妊娠となる女性間における差異を生じさせている。ＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分のデータの分析において生じたモデルでも、子癇前症女性と対照女性とを適宜に分類することができたが、各人が経験した妊娠の回数に基づいて女性を分類することはできなかった。
【００８１】
スピンエコー（図１３）及び１Ｄ  ＮＯＥＳＹデータについて対応するローディングプロットは、この場合も、ヒスチジン又はそのメチル誘導体がＰＥを有する女性と正常血圧女性との分離に関与することを示しているが、妊娠回数に基づく女性の分類において最も影響力のある成分はアミノ酸であるフェニルアラニンであり、その濃度は初めて妊娠した女性において過去に一人以上の子どもを出産している女性より有意に低いように思われた（ｐｈｅに割り当てられたスペクトルの４領域では、ｐ＝０．００５、０．００４、０．０１７及び０．００３）。
【実施例８】
【００８２】
下記表１は、対照女性群及びＰＥ女性群の総計２２試料中２１試料について、スピンエコーデータの６．８９及び７．１９ｐｐｍにおけるチロシンシグナル並びに７．０５及び７．７５ｐｐｍにおけるヒスチジンの芳香族領域におけるピークの積分から得られた最大値及び最低値を示す。患者一名を解析から除外した（患者数１４０５、誤って対照妊娠患者に分類された、子癇前症に罹患しているアヘン剤使用者一名）。
【００８３】
【表１】
2009543035.tif 000002
【００８４】
下記表２は、対照女性群及びＰＥ女性群の２２試料中２１試料について、スピンエコーデータの６．８９及び７．１９ｐｐｍにおけるチロシンシグナル並びに７．０５及び７．７５ｐｐｍにおけるヒスチジンの絶対積分中央値（ｍｅｄｉａｎ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｉｎｔｅｇｒａｌ）の対照からＰＥへの実際の増加パーセントを示す。
【００８５】
【表２】
2009543035.tif 000003
【００８６】
下記表３は、対照女性群及びＰＥ女性群の２２試料中２１試料について、スピンエコーデータの６．８９及び７．１９ｐｐｍにおけるチロシンシグナル並びに７．０５及び７．７５ｐｐｍにおけるヒスチジンの絶対積分平均値の対照からＰＥへの実際の増加パーセントを示す。
【００８７】
【表３】
2009543035.tif 000004
【００８８】
本結果は、平均値及び中央値での増加パーセントがチロシンシグナルについては可変であるが（中央値＝５５〜６６％、平均値＝３８〜８１％）、ヒスチジンピークについてはかなり一定していることを示す（中央値＝８３〜９３％、平均値＝６７〜６９％）。
【実施例９】
【００８９】
ビン（ｂｉｎ）が狭くなるほど、スピンエコー試験がより好適となることは明らかである。より狭い０．０１６ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎ）」幅とスピンエコー試験の併用が、子癇前症の芳香族バイオマーカーを調べるのに最も効率的且つ確実な方法であるように思われる。ＮＯＥＳＹパルスシーケンスの最初の増分の分析結果はスピンエコーの分析結果を支持するものであるが、成分濃度の有意差のエビデンスを示さない。あるいは、「従来の」ビン（ｂｉｎ）幅０．０４５ｐｐｍを用いて、１Ｄ  ＮＯＥＳＹ試験はスピンエコー試験を上回り、女性の２つの群の間の優れた識別がなされるのみならず、生データ及び正規化データにおいてＰＥ及び対照患者由来の血漿の成分濃度に有意差も認められ、これはスピンエコーの正規化データのみに示される特性である。
【００９０】
同様に、同一の芳香族バイオマーカー、即ち、１−メチルヒスチジンが試験全体にわたって明らかにすべての分析の中心となったため、「ビン（ｂｉｎ）」幅及び試験は当初考えられていたほど重要ではないと述べられ得る。この明確なバイオマーカーが該群間における差異に最も関与していることは確実であるが、他の芳香族成分、例えば、フェニルアラニン、ヒスチジン又はそのメチル誘導体、そして特にチロシンも研究全体にわたってＰＥ患者と正常血圧女性との判別において常に影響力があることが見出されている。しかし、これらの濃度が２つの群の間において異なる方法を分析すると、特定の試験及び的確な「ビン（ｂｉｎ）」幅が不可欠となる。スピンエコー及び０．０１６ｐｐｍの「ビン（ｂｉｎ）」幅を用いる方法では、１−メチルヒスチジンの濃度がＰＥに罹患している女性の血漿において対照群の血漿より有意に高いという結果が生じる。０．０４５ｐｐｍのビン（ｂｉｎ）幅を１Ｄ  ＮＯＥＳＹスペクトルに適用する方法では、１−メチルヒスチジンの濃度がやはりＰＥ患者の血漿と対照女性の血漿とで有意に異なるという結果が生じる。
【００９１】
本発明において、１Ｈ−ＮＭＲメタボノミクスを用いて、芳香族領域が単独で妊婦において子癇前症の発症を予測する有益な診断ツールとなる可能性を明らかに有するということを見出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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