(57)【要約】組換え型アデノウイルスに対して第２の繊維を提供する組換え細胞を使用することによって組換え型アデノウイルスの親和性を変更することを含む、組換え型アデノウイルスの組織親和性を増加するための、方法、組成物、および使用法を提供する。アデノウイルスを含む組換え型アデノウイルスベクターであって、該アデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含み、該アデノウイルスに対して異種である第２の繊維遺伝子をさらに含み、該第２の繊維遺伝子が、該第２の繊維遺伝子を安定して発現する細胞株中で該組換え型アデノウイルスを増殖させることにより該組換え型アデノウイルスによって取得される、組換え型アデノウイルスベクター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスを含む組換え型アデノウイルスベクターであって、該アデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含み、該アデノウイルスに対して異種である第２の繊維遺伝子をさらに含み、該第２の繊維遺伝子が、該第２の繊維遺伝子を安定して発現する細胞株中で該組換え型アデノウイルスを増殖させることにより該組換え型アデノウイルスによって取得される、組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項２】
前記アデノウイルスベクターが、ブタ、ヒト、トリ、ウシ、ウマおよびヒツジのアデノウイルスからなる群より選択されるアデノウイルスベクターである、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクターを含む、組成物。
【請求項４】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記アデノウイルスが、組換え型ＰＡｄＶ−１、組換え型ＰＡｄＶ−２、組換え型ＰＡｄＶ−３、組換え型ＰＡｄＶ−４、組換え型ＰＡｄＶ−５、組換え型ＰＡｄＶ−６、および組換え型ＰＡｄＶ−７からなる群より選択される組換え型ブタアデノウイルスである、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記アデノウイルスが、組換え型ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）、組換え型ウシアデノウイルス（ＢＡｄＶ）、組換え型ヒツジアデノウイルス（ＯＡｄＶ）、組換え型マウスアデノウイルス（ＭＡｄＶ）、組換え型サルアデノウイルス（ＳＡｄＶ）、または組換え型イヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）である、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記第２の繊維タンパク質が、ＰＡｄＶ−１、ＰＡｄＶ−２、ＰＡｄＶ−３、ＰＡｄＶ−４およびＰＡｄＶ−５から選択される繊維タンパク質である、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記組換え型アデノウイルスベクターが、前記第１の繊維タンパク質または前記第２の繊維タンパク質とは異なる第３の繊維タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項９】
前記組換え型ＰＡｄＶが組換え型ＰＡｄＶ−３である、請求項５に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項１０】
前記組換え型ベクターが、ＰＡｄＶ−４由来の繊維タンパク質を含む、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項１１】
前記組換え型アデノウイルスベクターが複製可能型である、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項１２】
前記組換え型ＰＡｄＶが複製欠損型である、請求項１に記載の組換え型ブタアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
前記組換え型ＰＡｄＶが、前記ＰＡｄＶゲノムの必須領域に挿入される異種ヌクレオチド配列を含み、前記繊維遺伝子を安定して発現する前記細胞株が、該異種ヌクレオチド配列が内部に挿入された該ＰＡｄＶゲノムの該必須領域も発現する、請求項１２に記載の組換え型ブタアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
前記組換え型アデノウイルスが、前記アデノウイルスゲノムの非必須領域内に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター。
【請求項１５】
前記異種ヌクレオチド配列が、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ブタアデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含むアデノウイルスを含む宿主細胞であって、該宿主細胞が、該アデノウイルスとは異種であってブタアデノウイルスによって感染され得る繊維遺伝子を発現する組換え細胞である、宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳類細胞またはトリ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、ブタ細胞、ヒト細胞、ウシ細胞、およびヒツジ細胞からなる群より選択される哺乳類細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞が組換え型ブタ細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
哺乳類被験体に免疫応答を誘発することが可能な組成物であって、該組成物が、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、組成物。
【請求項２１】
哺乳類被験体に免疫応答を誘発するための方法であって、請求項２０に記載の組成物を該哺乳類被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記哺乳類被験体がブタである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アデノウイルスを調製する方法であって、
ａ．アデノウイルス繊維遺伝子を発現する組換え型宿主細胞を、該細胞がアデノウイルスに感染するのに適する条件下で培養することと、
ｂ．キャプシド形成に必須の前記アデノウイルス配列と、異種タンパク質をコードする異種遺伝子とを含む組換え型アデノウイルスベクターに該細胞を接触させることであって、該組換え型アデノウイルスが、該宿主細胞中の該繊維遺伝子とは異なる繊維遺伝子を含むことと、
必要に応じて該アデノウイルスを収集することと
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記収集されたアデノウイルスベクターが、前記組換え型宿主細胞に接触しない前記アデノウイルスベクターと比べて、より広範な組織特異性を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アデノウイルスベクターは、複製に非必須の１つ以上のアデノウイルスタンパク質の一部または全部が必要に応じて欠失されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記異種タンパク質が、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳類宿主を感染症に対して防御するためのワクチンであって、請求項１に記載の組換え型アデノウイルスベクター、および必要に応じて薬学的に許容可能な賦形剤を含む、ワクチン。
【請求項２８】
前記非必須領域が、ブタアデノウイルスゲノムの、Ｅ３領域、Ｅ４のＯＲＦ１−２および４−７、Ｅ４の末端とＩＴＲとの間の領域からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
アデノウイルス繊維遺伝子を発現する宿主細胞、および発現制御配列の制御下に異種タンパク質をコードする核酸を含む組換え型アデノウイルスベクターを含む組成物であって、該組換え型アデノウイルスベクターが、該ベクターのアデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含む、組成物。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、前記組換え型ブタアデノウイルスベクターに感染している、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
動物にワクチンを接種する方法であって、治療上有効な量の請求項２７に記載のワクチンを該動物に投与することを包含する、方法。
【請求項３２】
組換え型アデノウイルスベクターの宿主組織細胞特異性を増大させる方法であって、該組換え型アデノウイルスの繊維タンパク質と異なる第２の繊維タンパク質を含む宿主細胞中で該組換え型アデノウイルスを増殖させることを包含する、方法。
【請求項３３】
前記組換え型アデノウイルスベクターが、組換え型ＰＡＤＶ−１、組換え型ＰＡＤＶ−２、組換え型ＰＡＤＶ−３、組換え型ＰＡＤＶ−４、および組換え型ＰＡＤＶ−５から選択される組換え型ブタアデノウイルスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の繊維タンパク質が、ＰＡＤＶ−１、ＰＡＤＶ−２、ＰＡＤＶ−３、ＰＡＤＶ−４、およびＰＡＤＶ−５から選択される繊維タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組換え型ＰＡＤＶが、前記第１の繊維タンパク質または前記第２の繊維タンパク質と異なる第３の繊維タンパク質をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記組換え型ＰＡＤＶが組換え型ＰＡＤＶ−３である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換え型ＰＡＤＶ−３が、ＰＡＤＶ−４由来の繊維タンパク質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組換え型ＰＡＤＶが複製可能型である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記組換え型ＰＡＤＶが複製欠損型である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記組換え型ＰＡＤＶが、ＰＡＤＶゲノムの非必須領域に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記異種ヌクレオチド配列が、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組換え型アデノウイルスの組織親和性（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒｏｐｉｓｍ）を増大させるための方法および組成物であって、組換え型アデノウイルスに第２の繊維を提供する組換え細胞を使用し、それによって組換え型アデノウイルスの親和性を変更することを含む方法および組成物に関する。本発明はまた、親和性が変更された組換え型アデノウイルスを製造および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
アデノウイルスは、腸感染症または呼吸感染症をヒト並びに家畜および実験用動物に生じる。アデノウイルス繊維タンパク質は、感受性の宿主細胞中への侵入を促進する特異的細胞受容体と相互作用することによって、ウイルスの付着に必須の役割を果たす。したがって、繊維タンパク質は、特定のアデノウイルスの特異的な組織親和性を決定する（非特許文献１）。したがって、この繊維は、標的細胞に対するビリオンの付着において、最も重要なウイルス表面分子であると考えられる。
【０００３】
この標的化特性を活かすため、特定のヒトアデノウイルスによって保有される繊維タンパク質を変更しようと、いくつかの方法が使用されてきた。アデノウイルス粒子を異なる細胞型に再標的化するため、いくつかのアプローチが行われてきており、例えば、組換え型アデノウイルスの改変した繊維構造とともに使用すること（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）（非特許文献５；非特許文献６）、キメラ繊維タンパク質（非特許文献７；非特許文献８）、および血清型が異なる繊維タンパク質の交換（非特許文献９）が挙げられる。これらのアプローチは、外来遺伝子をウイルスゲノム内に組み込むために、既に制限されている使用可能な空間を減少させるアデノウイルスゲノムの遺伝子操作、あるいは、二重特異性結合体とアデノウイルス粒子との複合体化のいずれかを必要とする。
【０００４】
非特許文献１０は、異なるアプローチを使用して、ヒトアデノウイルス血清型５（ＨＡｄＶ５）の繊維タンパク質を安定して発現する細胞株を構築した。ＨＡｄＶ３をこの細胞株を通して継代した後、ウイルス粒子は、血清型５の繊維タンパク質を含んでいた。この細胞株中における繊維欠損変異体ＨＡｄＶの増殖は、繊維陽性ヒトアデノウイルスの生成を可能にした。
【０００５】
さらに、多数の調節遺伝子が欠失されたアデノウイルスベクターの補完を可能にする遺伝子を発現する細胞株も報告されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．，Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｒ．Ｗ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｃｕｓａｃｋ，Ｓ．（１９９５）．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｉｂｒｅ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９，１６３−２００．
【非特許文献２】Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｚｅｎｇ，Ｅ．，Ｓｈｅａｒｓ  ＩＩ，Ｌ．Ｌ．，Ｒｏｅｌｖｉｎｋ，Ｐ．Ｗ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．，Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．（１９９７）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｉｂｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１，８２２１−８２２９．
【非特許文献３】Ｄｍｉｔｒｉｅｖ，Ｌ，Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．，Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＲ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｋａｓｈｅｎｔｓｅｖａ，Ｅ．，Ｍｉｋｈｅｅｖａ，Ｇ．，Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．（１９９８）．Ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｉｂｒｅｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｖｉａ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｔｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，９７０６−１３．
【非特許文献４】Ｗｉｒｔｚ，Ｓ．，Ｇａｌｌｅ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｍ．Ｆ．（１９９９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｂｙ  ｌｏｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｒｍａｌ  ｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｉｂｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｇｕｔ  ４４，８００−８０７．
【非特許文献５】Ｗａｔｋｉｎｓ，ＳＪ．，Ｍｅｓｙａｎｚｈｉｎｏｖ，Ｖ．Ｖ．，Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎａ，Ｌ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．（１９９７）．Ｔｈｅ  ’ａｄｅｎｏｂｏｄｙ’  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｖｉｒａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４，１００４−１０１２．
【非特許文献６】Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｍ．，Ｄｍｉｔｒｉｅｖ，Ｉ，Ｍｉｋｈｅｅｖａ，Ｇ．，Ｋｒａｓｈｎｙｋｈ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．（１９９９）．Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７，４７０−４７５．
【非特許文献７】Ｋｒａｓｈｎｙｋｈ，Ｖ．Ｎ．，Ｍｉｋｈｅｅｖａ，Ｇ．Ｖ．，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．（１９９６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｉｂｒｅｓ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｔｒｏｐｉｓｍ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０，６８３９−６８４６．
【非特許文献８】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｒｏｌｌｅｎｃｅ，Ｍ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ−Ｎｅｆｆ，Ｊ．，ａｎｄ  ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ａ．（１９９７）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｉｂｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１，４７８２−９０．
【非特許文献９】Ｇａｌｌ，Ｊ．，Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ，Ａ．，Ｌｅｉｎｗａｎｄ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．（１９９６）．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５  ａｎｄ  ７  ｃａｐｓｉｄ  ｃｈｉｍｅｒａ：  ｆｉｂｒｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｌｔｅｒｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０，２１１６−２１２３．
【非特許文献１０】ｖｏｎ  Ｓｅｇｇｅｒｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｋｅｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｅｎｄｏ，Ｒ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｎｅｍｅｒｏｗ，Ｇ．Ｒ．（１９９８）．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｉｂｒｅ  ｍｕｔａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｓｔａｂｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５  ｆｉｂｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，１４６１−１４６８．
【非特許文献１１】Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｊｉａ，Ｘ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｆｉｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．（１９９５）．Ａ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｗｏ  ｌｅｔｈａｌ  ｇｅｎｅ−ｒｅｇｉｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２，７７５−７８３．
【非特許文献１２】Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，Ａ．，Ｂｅｇｙ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９６）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９３，３３５２−３３５６．
【非特許文献１３】Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９７）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１，ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ａｎｄ  ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４，２５８−２６３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、繊維を対象とした標的化に関してこれまでに公開されたすべての研究は、アデノウイルスをある特異的な標的組織型から別の特異的な標的組織に再度指向させ、場合により、アデノウイルスが付着可能な標的細胞を大いに制限することに焦点を合わせているように思われる。組換え型アデノウイルスが結合可能な動物中の標的組織型を広げるために、さらなる方法が依然として必要である。このような方法は、特定の抗原に対して生成される免疫応答または免疫調節分子の治療効果の量および／または質のいずれかを増大または上方調節するのに有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、第２の繊維遺伝子を組換え型アデノウイルスゲノム中に遺伝子挿入することを必要とせずに、第２の繊維の添加を組換え型アデノウイルスベクターに提供するために、繊維タンパク質を発現する細胞株を活用する。そのため、これらの細胞、およびこの細胞を使用する方法は、特定のアデノウイルスの特異的な組織親和性を増大させることを可能にする。さらに、第２遺伝子を組換え型アデノウイルス中に遺伝子挿入する必要がないという事実によって、ウイルスゲノム中でより大きな空間を外来遺伝子の挿入に使用することが可能になる。
【０００９】
したがって、本発明は、一態様では、アデノウイルスを含む組換え型アデノウイルスベクターであって、アデノウイルスに固有の（ｎａｔｉｖｅ）繊維遺伝子を含み、アデノウイルスと異種の第２の繊維遺伝子をさらに含み、第２の繊維遺伝子が、第２の繊維遺伝子を安定して発現する細胞株中における組換え型アデノウイルスの増殖により組換え型アデノウイルスによって取得される、組換え型アデノウイルスベクターを提供する。アデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルスベクターであってもよく、これにはブタ、ヒト、トリ、ウシ、ウマ、およびヒツジのアデノウイルスからなる群より選択されるアデノウイルスベクターが挙げられるが、これらだけに限らない。当業者は、多くのアデノウイルスの血清型があることを十分承知しており、本発明のアデノウイルスベクターが、任意の特定の血清型に限る必要はないことを理解すべきである。本発明は、特に、本発明の組換え型アデノウイルスベクターを含む組成物を意図する。このような組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物である。
【００１０】
特定の実施態様では、アデノウイルスは、組換え型ブタアデノウイルス血清型（ＰＡｄＶ−１）、組換え型ＰＡｄＶ−２、組換え型ＰＡｄＶ−３、組換え型ＰＡｄＶ−４、組換え型ＰＡｄＶ−５、組換え型ＰＡｄＶ−６、および組換え型ＰＡｄＶ−７からなる群より選択される組換え型ブタアデノウイルスであってよい。ブタアデノウイルス血清型ＰＡｄＶ−１〜ＰＡｄＶ−５は、当業者に周知であり、十分に特徴付けられている。ＰＡｄＶ−６およびＰＡｄＶ−７も、Ｋａｄｏｉによって存在が示されており、特徴付けられている（Ｋａｄｏｉ等、Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０：２１５−２２０、１９９７年；およびＫａｄｏｉ、Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０：８９−９１、１９９７年）。好ましい実施態様では、組換え型アデノウイルスベクターは組換え型ＰＡｄＶ−３である。
【００１１】
他の実施態様では、アデノウイルスは、組換え型ＨＡｄＶ、組換え型ウシアデノウイルス（ＢＡｄＶ）、組換え型ヒツジアデノウイルス（ＯＡｄＶ）、組換え型マウスアデノウイルス（ＭＡｄＶ）、組換え型サルアデノウイルス（ＳＡｄＶ）、または組換え型イヌアデノウイルス（ＣＡｄＶ）である。
【００１２】
本発明の特定の組換え型アデノウイルスベクターでは、第２の繊維タンパク質は、ＰＡｄＶ−１、ＰＡｄＶ−２、ＰＡｄＶ−３、ＰＡｄＶ−４、およびＰＡｄＶ−５から選択される繊維タンパク質である。
【００１３】
本発明の特定の態様では、組換え型アデノウイルスベクターは、第１の繊維タンパク質または第２の繊維タンパク質と異なる第３の繊維タンパク質をさらに含むアデノウイルスベクター（例えば、ＰＡｄＶベースのベクター）である。
【００１４】
好ましい態様では、組換え型ベクター中の第２の繊維タンパク質は、ＰＡｄＶ−４からの繊維タンパク質を含む。
【００１５】
本発明の組換え型アデノウイルスベクターは、複製可能型であっても、または複製欠損型であってもよい。例えば、複製欠損ベクターは、ＰＡｄＶゲノムの必須領域中に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む組換え型ＰＡｄＶであってもよく、そして繊維遺伝子を安定して発現する細胞株は、異種ヌクレオチド配列が挿入されたＰＡｄＶゲノムの必須領域も発現する。
【００１６】
複製可能型である例示的な組換え型アデノウイルスベクターは、組換え型アデノウイルスが、アデノウイルスゲノムの非必須領域中に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む、組換え型アデノウイルスベクターである。異種ヌクレオチド配列は、実施態様によっては、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質をコードする異種遺伝子であってもよい。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、ブタアデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含むアデノウイルスを含む宿主細胞であって、アデノウイルスと異種であってかつブタアデノウイルスによって感染され得る繊維遺伝子を発現する組換え細胞である宿主細胞に関する。この細胞は、哺乳類細胞であっても、またはトリ細胞であってもよい。例示的な哺乳類細胞としては、ブタ細胞、ヒト細胞、ウシ細胞、およびヒツジ細胞が挙げられるが、これらだけに限らない。特定の態様では、細胞は組換え型ブタ細胞である。
【００１８】
本発明のさらに他の態様は、哺乳類被験体に免疫応答を誘発することが可能な組成物であって、本発明の組換え型アデノウイルスベクター、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に関する。
【００１９】
他の態様では、本発明は、哺乳類被験体において免疫応答を誘発し、このような組成物を哺乳類被験体に投与することを含む方法について説明する。たとえば、哺乳類被験体はブタである。
【００２０】
本発明はまた、アデノウイルスを調製する方法であって、細胞がアデノウイルスに感染するのに適する条件下で、アデノウイルス繊維遺伝子を発現する組換え型宿主細胞を培養することと、キャプシド形成に必須のアデノウイルス配列および異種タンパク質をコードする異種遺伝子を含む組換え型アデノウイルスベクターに細胞を接触させ、組換え型アデノウイルスが、宿主細胞中の繊維遺伝子とは異なる繊維遺伝子を含むことと；必要に応じてアデノウイルスを収集することとを包含する方法に関する。特定の実施態様では、異種タンパク質は、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質である。
【００２１】
特定の実施態様では、この方法は、収集されたアデノウイルスベクターが、組換え型宿主細胞と接触されていないアデノウイルスベクターと比べて、より広範な組織特異性を含む方法である。
【００２２】
さらに、上記の方法では、アデノウイルスベクターは、複製に必須でない１つ以上のアデノウイルスタンパク質の一部または全部が必要に応じて欠失されていてもよい。
【００２３】
本発明はさらに、哺乳類宿主を感染から防御するためのワクチンであって、本発明の組換え型アデノウイルスベクター、および必要に応じて薬学的に許容可能な賦形剤を含むワクチンに関する。特定の実施態様では、非必須領域は、ブタアデノウイルスゲノムの、Ｅ３領域、Ｅ４のＯＲＦ１−２および４−７、Ｅ４の末端とＩＴＲとの間の領域からなる群より選択される。
【００２４】
また、本明細書では、アデノウイルス繊維遺伝子を発現する宿主細胞、および発現制御配列の制御下で異種タンパク質をコードする核酸を含む組換え型アデノウイルスベクターを含む組成物であって、組換え型アデノウイルスベクターがこのベクターのアデノウイルスに固有の繊維遺伝子を含む組成物が記載される。好ましい態様では、宿主細胞を、組換え型ブタアデノウイルスベクターに感染させた。
【００２５】
本発明は、たとえば、動物にワクチンを接種する方法などの処置方法であって、治療上有効な量の本明細書に記載するワクチンを動物に投与することを包含する方法にさらに関する。
【００２６】
本発明のその他の方法は、組換え型アデノウイルスベクターの宿主組織細胞の特異性を増大させることに関しており、この方法は組換え型アデノウイルスの繊維タンパク質とは異なる第２の繊維タンパク質を含む宿主細胞中で組換え型アデノウイルスを増殖させることを包含する。このような方法では、組み換え型アデノウイルスベクターは、組換え型ＰＡｄＶ−１、組換え型ＰＡｄＶ−２、組換え型ＰＡｄＶ−３、組換え型ＰＡｄＶ−４、および組換え型ＰＡｄＶ−５から選択される組換え型ＰＡｄＶであってもよい。好ましくは、第２の繊維タンパク質は、ＰＡｄＶ−１、ＰＡｄＶ−２、ＰＡｄＶ−３、ＰＡｄＶ−４、およびＰＡｄＶ−５から選択される繊維タンパク質である。本発明の方法では、組換え型ＰＡｄＶは、第１の繊維タンパク質または第２の繊維タンパク質とは異なる第３の繊維タンパク質をさらに含んでもよい。
【００２７】
組換え型アデノウイルスベクターの宿主組織細胞の特異性を増大させる好ましい方法では、使用される組換え型ＰＡｄＶは組換え型ＰＡｄＶ−３である。特定の実施態様では、このような組換え型ＰＡｄＶ−３は、ＰＡｄＶ−４由来の繊維タンパク質を含む。これらの方法では、組換え型ＰＡｄＶは複製可能型であっても、または複製欠損型であってもよい。特定の好ましい実施態様では、組換え型ＰＡｄＶは、ＰＡｄＶゲノムの非必須領域に挿入された異種ヌクレオチド配列を含む。例示的な実施態様では、異種ヌクレオチド配列は、免疫調節剤、抗原、病原体、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチド、成長ホルモン、およびサイトカインからなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２８】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、単に具体的に説明するためのものであることを理解すべきである。なぜなら、つまり、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改変は、当業者にとって、この詳細な説明から明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
以下の図面は、本発明の明細書の一部を構成し、本発明の態様をさらに具体的に示すために含まれる。本発明は、本明細書に提示する具体的な実施態様の詳細な説明と組み合わせてこの図面を参照することによって、より良く理解され得る。
【図１】ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むプラスミドの構成。ａ）ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子は、ＰＣＲによってＰＡｄＶ−４  ＤＮＡから増幅され、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングされて、プラスミドＰＪＪ３９２を生じた。ｂ）ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むｐＪＪ３９２由来のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントは、前初期プロモーター−エンハンサー（ＣＭＶ）プロモーターおよびＰＡＶ−３  ＴＰＬ配列の直前のヒトサイトメガロウイルスの下流で、プラスミドｐＣＩ−ＰＡｄＶ−３トリパータイト（ｔｒｉｐｅｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）のＢａｍＨＩ部位に挿入され、ｐＪＪ７４１を生じた。ｃ）移入ベクターｐＪＪ７４３は、ＰＡｄＶ−３ＴＰＬおよびＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むｐＪＪ７４１のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントをｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入することによって構築した。
【図２】細胞株中のＰＡｄＶ−４繊維ＤＮＡのＰＣＲ検出。トランスフェクトした細胞からのゲノムＤＮＡを精製して、ＰＣＲによってＰＡｄＶ−４繊維遺伝子の存在を試験した。ａ）レーン１＝ＰＫ１５クローン８、レーン２＝ＰＫ１５クローン９、レーン３＝ｐＪＪ７４３対照、Ｍ＝１Ｋｂ  ＤＮＡラダー。ｂ）レーン１〜５＝ＳＴクローン２〜６、レーン６は非トランスフェクトＳＴ  ＤＮＡ、レーン７はＰＡＤＶ−４  ＤＮＡ、レーン８はｐＪＪ７４３対照。ｃ）レーン９〜１５＝ＳＴクローン７〜１４、Ｍ＝１Ｋｂ  ＤＮＡラダー。
【図３】細胞株からのＰＡｄＶ−４繊維ｍＲＮＡの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）検出。トランスフェクトされた細胞から総ＲＮＡを調製し、ＰＣＲによってＰＡｄＶ−４繊維遺伝子が陽性のクローンを、ＲＴ−ＰＣＲによってＰＡｄＶ−４繊維ｍＲＮＡの合成に関して試験した。ａ）レーン１＝ＰＫ１５クローン８、レーン２＝ＰＫ１５クローン９、Ｍ＝１Ｋｂ  ＤＮＡラダー。ｂ）レーン１〜６＝ＳＴクローン２、３、５、６、７および８、Ｍ＝１Ｋｂ  ＤＮＡラダー。
【図４】ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の繊維タンパク質の完全アミノ酸配列、およびペプチドの位置。ウサギの抗血清を生成するために使用される共通ペプチドおよび特異的ペプチドの配列は、太字および下線で強調表示されている（Ｒｅｄｄｙ等、１９９５年；Ｋｌｅｉｂｏｅｋｅｒ、１９９５年）。
【図５】改変したワクチンにおけるＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の繊維の実証。組換え型ＰＡｄＶ−糖タンパク質５５（ｇｐ５５）は、ＰＫ１５Ａ細胞（未改変）またはＰＫ７４３細胞（改変）中で増やした。複製ウイルスサンプル中に存在するタンパク質を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離して、ニトロセルロース上にブロットして、共通繊維ペプチドに対して産生されたウサギ抗体（パネルａ）、またはＰＡｄＶ−４の特異的な繊維ペプチドに対して産生されたウサギ抗体（パネルｂ）のいずれかで染色した。レーン１＝非改変ウイルス、レーン２＝改変ウイルス。広範囲の分子量マーカー、繊維タンパク質の位置およびおおよその分子量を示す。
【図６】チャレンジ後のブタの体温。０日目にブタにワクチンを接種し、２２日目にブースター用量を投与した。４９日目にブタに古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）を使ってチャレンジした。各々のブタの直腸温度を、毎日、ＣＳＦＶチャレンジ後に測定した。ブタの各々の群の平均温度および標準誤差バーを示す。◆＝非改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ｓ／ｃ、■＝改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ｓ／ｃ、▲＝改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５経口、□＝対照、＋＝安楽死させた。
【図７】ワクチン接種後のＮＰＬＡ力価。０日目にブタにワクチンを接種し、２２日目にブースター投与を与えた。４９日目にブタにＣＳＦＶを使ってチャレンジした。０日目に全血サンプルを収集し、次に、１週間間隔でＮＰＬＡ抗体の存在について血清をアッセイした。ワクチンを接種した群の平均ＮＰＬＡの力価を示す。□＝非改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ｓ／ｃ、□＝改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ｓ／ｃ、■＝改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５経口、↓＝ワクチンを接種。
【図８】ワクチンを経口接種したブタにおけるＣＳＦＶ特異的な中和抗体の発達。０日目にブタにワクチンを経口接種し、２２日目に１回分のブースター投与を与えた。４９日目に、ＣＳＦＶを使ってブタにチャレンジした。０日目に全血サンプルを収集し、次いで１週間間隔でＮＰＬＡ抗体の存在について血清をアッセイした。ワクチンを接種した群の平均ＮＰＬＡ力価を示す。□＝非改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５＊、ドット入り□＝改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５。＊＝Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００３年における別個の実験データ。↓＝ワクチン接種。
【図９】ワクチンを接種したブタにおけるＣＳＦＶ特異的中和抗体の発達の比較。０日目にブタにワクチンを経口接種し、２２日目に１回分のブースターの投与を与えた。４９日目に、ＣＳＦＶを使ってブタにチャレンジした。０日目に全血サンプルを収集し、次に、１週間間隔でＮＰＬＡ抗体の存在について血清をアッセイした。ワクチンを接種した群の平均ＮＰＬＡ力価を示す。↓＝ワクチン接種。ｓ／ｃ＝非改変ワクチンを皮下投与、改変ｓ／ｃ＝改変ワクチンを皮下投与、経口＝非改変ワクチンを経口投与＊、改変経口＝改変ワクチンを経口投与。＊＝Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００３年における別個の実験データ。
【図１０】ブタの脾臓におけるＣＳＦＶ抗原の検出。死後後、脾臓サンプルを抗原捕捉ＥＬＩＳＡによってＣＳＦＶ抗原の存在について分析した。群の平均抗原力価を示す。陽性＝陽性対照の脾臓サンプル、陰性＝陰性対照の脾臓サンプル、＋＝安楽死させた。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（発明の例示的な実施形態の詳細な説明）
本発明は、改良されたアデノウイルスベクターの知見および構築に関連する。本明細書に記載する方法および組成物は、ブタアデノウイルスベクターをモデルシステムとして使用して例示されるが、本発明の方法を、ブタ以外の宿主に感染する組換え型アデノウイルスベクターを調製する際の使用に容易に適応させることができることは、容易に明らかである。本発明の方法および組成物は、組換え型アデノウイルスベクターの親和性を変更し、それによって、このベクターが通常はベクターが感染しない組織を標的とするようにしてこのベクターの有用性を高めるために使用される。本発明では、第２の繊維遺伝子を、このような第２の繊維遺伝子を発現する細胞株中で、組換え型アデノウイルスベクターを増殖させることによって組換え型アデノウイルスに提供し、このような細胞株中の増殖が、組換え型アデノウイルスベクターの親和性の変化に関連する。組換え型アデノウイルスを繁殖させる細胞株中に含まれる第２の繊維は、細胞株中の繊維遺伝子が特異的である組織にアデノウイルスが感染することを可能にする。この知見を活用するための方法および組成物が、本発明により意図されている。
【００３１】
「アデノウイルスベクター」（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）という用語は、本明細書では、「アデノウイルスベクター」（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）と相互に交換可能に使用される。本明細書で使用するアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターによって送達されるべきタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチド構築物を含む組換え型ベクターである。ポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、送達されるべきタンパク質をコードするＤＮＡを含む。このようなＤＮＡは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧからなってもよいが、このような塩基の任意のアナログおよび修飾型を含んでもよい。このようなアナログおよび修飾塩基は、当業者には周知であり、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間修飾（たとえば、非荷電性結合およびチオエート）、糖アナログの使用、並びに修飾されたかおよび／または代替的な骨格の構築物（たとえば、ポリアミド）が挙げられるが、これらだけに限らない。
【００３２】
本明細書で使用されるアデノウイルスベクターは、標的細胞中で複製可能型であっても、または複製欠損型であってもよい。ベクターが、複製欠損である場合、ベクターは、複製を促進するために、ヘルパー細胞またはヘルパーウイルスを使用することを必要とし得る。ヘルパー細胞またはヘルパーウイルスを使用して、複製欠損型アデノウイルスベクターの複製を促進することは慣用的であり、当該分野で周知である。一般に、このようなヘルパー細胞は、複製欠損型にするために組換え型アデノウイルスベクターがノックアウトされている実体の機能を提供する。一方、複製可能型ベクターは、ベクター中で欠陥のある何かを供給するために、第２のウイルスまたは細胞株のいずれをも必要としないという点で、「ヘルパーなしのウイルスベクター（ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）」と呼ばれ得る。
【００３３】
上記のとおり、本発明は、所定のアデノウイルスベクターの親和性を変更させる、すなわちアデノウイルスの特異性を変更するために使用される。「改変された親和性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ）」という用語は、種の特異性の変更、およびアデノウイルスの組織または細胞の特異性の変更を包含する。本発明の例示的な実施態様では、アデノウイルスベクターの特異性は、ベクターに第２の繊維タンパク質を提供することによって変更される。アデノウイルスベクターに２つの繊維タンパク質が存在することによって、アデノウイルスベクターの親和性の所望の変更が達成される。
【００３４】
Ａ．繊維遺伝子
本発明は、これらのベクターの親和性を変更するために、組換え型アデノウイルスに第２の繊維を提供する。好ましい実施態様では、本発明の方法は、組換え型ブタアデノウイルスベクターの親和性を変更することを包含する。ＰＡｄＶ感染症は、脳炎、肺炎、腎臓障害および下痢と関連付けられた。（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ（１９９２年）Ｉｎ：「Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ」（編集者Ｌｅｍａｎ等），第７版，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ．２２５〜２２７ページ）。さらに、ＰＡｄＶは、感染した子豚の腸における体液性応答および粘膜抗体応答の両方を刺激することができる。Ｔｕｂｏｌｙ等（１９９３年）Ｒｅｓ．ｉｎ  Vｅｔ．Ｓｃｉ．５４：３４５〜３５０ページ。記載されている少なくとも５つのＰＡｄＶ血清型がある（ＰＡｄＶ−１、ＰＡｄＶ−２、ＰＡｄＶ−３、ＰＡｄＶ−４、ＰＡｄＶ−５；Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ等（１９７５年）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８５：４３７〜４４３ページ；およびＨｉｒａｈａｒａ等（１９９０年）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．５２：４０７〜４０９ページ）。これらの血清型の各々は、たとえばブタ用のワクチン製造に使用される組換え型アデノウイルスベクターを調製するために、容易に使用することができる。ＰＡｄＶ−３の配列全体はクローニングされた（Ｒｅｄｄｙ等、１９９８年；米国特許第６，４９２，３４３号、引用することにより本明細書に援用する）。さらに、制限マッピングを使用し、制限フラグメントをクローニングすることで、ＰＡｄＤＶ−３並びにＰＡｄＶ−１およびＰＡｄＶ−２のゲノムの広範囲にわたる特徴付けが行われている。Ｒｅｄｄｙ等（１９９３年）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３６：１６１−１６８；Ｒｅｄｄｙ等（１９９５ｂ）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１９５〜２００ページを参照。
【００３５】
様々なＰＡｄＶ血清型の様々なセグメントのヌクレオチド配列が、当業者に周知である。たとえば、ＰＡｄＶ−３のＥ３、ｐＶＩＩＩおよび繊維の遺伝子は、Ｒｅｄｄｙ等（１９９５年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３６：９７〜１０６ページに示される。ＰＡｄＶ−１およびＰＡｄＶ−２のＥ３、ｐＶＩＩＩおよび繊維の遺伝子は、Ｒｅｄｄｙ等（１９９６年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ４３：９９〜１０９に示される。Ｋｌｅｉｂｏｃｋｅｒは、ＰＡｄＶ−４のＥ３、ｐＶＩＩＩおよび繊維の遺伝子配列の配列を提供する（Ｋｌｅｉｂｏｅｋｅｒ  １９９４年  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３１：１７〜２５ページ）。ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子配列は、Ｋｌｅｉｂｏｅｋｅｒ（１９９５年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３９：２９９〜３０９によって決定された。ＰＡｄＶ−１、ＰＡｄＶ−２、ＰＡｄＶ−３、ＰＡｄＶ−４、およびＰＡｄＶ−５の各々の逆方向末端反復配列も、当該分野で公知である（Ｒｅｄｄｙ等（１９９５年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１２：２３７〜２３９ページ）。ＰＡｄＶ−３  ペントンの配列は、ＭｃＣｏｙ等（１９９６年）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：１３６７〜１３７５によって決定された。ＰＡｄＶ−４のＥ１領域のヌクレオチド配列は、Ｋｌｅｉｂｏｅｋｅｒ（１９９５年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３６：２５９〜２６８ページに示された。ＰＡｄＶ−３のプロテアーゼ（２３Ｋ）遺伝子の配列は、ＭｃＣｏｙ等（１９９６年）ＤＮＡ  Ｓｅｑ．６：２５１〜２５４ページによって決定された。ＰＡｄＶ−３ヘキソン遺伝子（および２３Ｋプロテアーゼ遺伝子の１４個のＮ末端コドン）の配列は、登録番号Ｕ３４５９２でＧｅｎＢａｎｋのデータベースに寄託されている。ＰＡｄＶ−３  １００Ｋ遺伝子の配列は、登録番号Ｕ８２６２８でＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている。ＰＡｄＶ−３  Ｅ４領域の配列は、当該分野で公知である（Ｒｅｄｄｙ等（１９９７年）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １５：８７〜９０ページ）参照。Ｖｒａｔｉ等（１９９５年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０９：４００〜４０８ページ）は、ＯＡｄＶの配列を開示している。ＰＡｄＶ−５の繊維およびＨＮＦ−６１  ｐＶＩＩＩ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１８６６２１に示される。ＰＡｄＶ−５の完全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ＿０００００９  ＢＫ０００４１１に示され、そこでは、繊維遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＰ＿０００２５４に割り当てられており、２６４８７．．２７９８９の間にあることが示されている。ブタアデノウイルスＣの完全な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２７０２にあり、ここでは、繊維遺伝子は、２６４８７．．２７９８９間にあり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿１０８６７５．１を割り当てられていると示されている。ＰＡｄＶ−４の繊維配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ２５１２０に示される。
【００３６】
ヒトアデノウイルスＨＡｄＶ−３、ＨＡｄＶ−４、ＨＡｄＶ−５、ＨＡｄＶ−９およびＨＡｄＶ−３５は全て、当該分野で十分に特徴付けられ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣから入手可能である。Ａｄ５のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、Ｍ７３２６０／Ｍ２９９７８であり；Ａｄ９に関してはＸ７４６５９であり；そしてＡｄ３５に関してはＵ１０２７２である。Ｃｈｏｗ等（１９７７年、Ｃｅｌｌ  １２：１〜８ページ）は、ヒトアデノウイルス２の配列を開示しており；Ｄａｖｉｓｏｎ等（１９９３年、Ｊ．Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．２３４：１３０８〜１３１６ページ）は、ＨＡｄＶ−４０のＤＮＡ配列を開示しており；Ｓｐｒｅｎｇｅｌ等（１９９４年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３７９〜３８９ページ）は、ＨＡｄＶ−１２  ＤＮＡのＤＮＡ配列を開示しており；Ｖｒａｔｉ等（１９９５年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０９：４００〜４０８）は、ＯＡｄＶの配列を開示しており；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等（１９９７年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：８７３〜８７８ページ）は、ＣＡｄＶ−１のＤＮＡ配列を開示しており；Ｒｅｄｄｙ等（１９９８年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５１：４１４）は、ＰＡｄＶのＤＮＡ配列を開示している。様々なヒトアデノウイルスの繊維配列は、登録番号Ｙ１４２４１（ＨＡｄＶ−２８繊維遺伝子）、Ｙ１４２４１（ＨＡｄＶ−１７繊維遺伝子）としてＧｅｎＢａｎｋから入手可能である；ＨＡｄＶ−１７の完全ゲノム配列は完全ゲノムに示されており、ＡＣ＿０００００６  ＢＫ０００４０６にあり、ここで繊維ＣＤＳは３０９３５．．３２０３５間にあり、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＰ＿０００１５７．１が割り当てられている；Ｘ７６７０６（ＨＡｄＶ−１５Ｈ９（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）繊維遺伝子）、Ｘ７６５４８（繊維タンパク質のＨＡｄＶ−３１遺伝子）；ＡＢ１２５７５１（ＨＡｄＶ−６繊維遺伝子の完全ｃｄｓ）、ＡＢ１２５７５０（ＨＡｄＶ−１繊維遺伝子の完全ｃｄｓ）、ＡＢ０７３１６８（ＨＡｄＶ−３４繊維遺伝子の完全ｃｄｓ）；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ７５１３６は、ＨＡｄＶ−８の繊維遺伝子の配列を示す。ＨＡｄＶ−３繊維遺伝子の部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ  ２４４０９５に寄託され、ヒトアデノウイルスの完全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ０８６４６６に割り当てられ、これは、繊維配列が、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢＢ１７８０９．１が割り当てられた位置３１３６８．．３２３２７に位置することを示している。ＨＡｄＶ−１２の完全配列は、繊維遺伝子ＣＤＳが、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＰ＿０００１３５．１が割り当てられた位置２９３６８．．３１１３１にあるＡＣ＿０００００５  ＢＫ０００４０５に示される。ヒトアデノウイルス５の完全配列は、繊維ＣＤＳが、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＰ＿０００２２６．１が割り当てられた３１０４２．．３２７８７にあるＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ＿０００００８に示される。ヒトアデノウイルス２の完全配列は、繊維ｃｄｓが、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＰ＿０００１９０．１が割り当てられた３１０３０．．３２７���８にあるＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ＿０００００７  ＢＫ０００４０７に示される。繊維タンパク質株：１３０ＨのＨＡｄＶ−９遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０９８５６５に示される。別のＨＡｄＶ−９繊維遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７４６５９に位置する。ＨＡｄＶ−３７の繊維遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９４４８４に示される。ＨＡｄＶ−１９の繊維遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９４４８５に示される。ＨＡｄＶ−１５の繊維遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７２９３４に示される。ＨＡｄＶ−７（Ｅ３領域を伴う）の繊維遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ４８９５４に示される。ＨＡｄＶ−４繊維遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７６５４７に示される。ＨＡｄＶ−３１繊維遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７６５４８に示される。ＨＡｄＶ−８繊維遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７４６６０に示される。ＨＡｄＶ−３繊維遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０１９９８  Ｍ１２４１１に示される。ＨＡｄＶ−２１繊維遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ３８０３３２に示される。ＨＡｄＶ−７繊維遺伝子の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ３８０３２６に示される。
【００３７】
サルアデノウイルス１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００６８７９に示され、ここでは繊維は、位置２８７３１．．２９８２２に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿２１３９８８．１を割り当てられ、繊維２変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿２１３９８９．１を割り当てられる。サルアデノウイルスＡの完全配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００６１４４が割り当てられ、繊維は２９６０６．．３１２４６に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿０６７９３０を割り当てられる。サルアデノウイルス２５の完全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３９４１９６に示され、ここでは繊維ｃｄｓは３２１３７．．３３４１４にあり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＬ３５５３６．１を割り当てられる。
【００３８】
Ｒｅｄｄｙ等（１９９８年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：１３９４）は、ＢＡｄＶ−３のヌクレオチド配列を開示している。この配列では、ＢＡｄＶ−３のペントン領域は１２９１９で開始し、１４３６７で終了し；ヘキソン領域は１７８０９で開始し、２０５１７で終了し；ＢＡｄＶ−３の繊維領域は２７９６８で開始し、３０８９８で終了する。繊維配列、およびウシアデノウイルス３型のｐＶＩＩＩ遺伝子、初期領域３、および繊維タンパク質の配列は、登録番号Ｄ１６８３９でＧｅｎＢａｎｋ登録番号に寄託されている。ウシアデノウイルスＤの完全ゲノムは、ＮＣ＿００２６８５が与えられており、ここでは、繊維遺伝子は、２２３４３．．２３９５０間に位置するとアノテーションされ、繊維遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７７４０４．１において与えられる。同様に、ウシアデノウイルスＡの完全ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ＿００６３２４に与えられており、ここでは、繊維は位置２７４８３．．２９２９４に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＹＰ＿０９４０４９．１に示される。ウシアデノウイルス４のＴＨＴ／６２株の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３６０９２に示され、ここで繊維遺伝子は位置２２３４３．．２３９５０に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＫ１３１８５．１を割り当てられている。ＢＡｄＶ−３の完全配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ＿０００００２  ＢＫ０００４０１に示され、ここでは、繊維ｃｄｓは２７９６８．．３０８９８にあり、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＰ＿００００４１．１を割り当てられている。ＢＡｄＶ−２繊維および１７Ｋタンパク質の配列は、ＡＦ３０８８１１に示される。
【００３９】
ＣＡｄＶ−１の完全ゲノム配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＣ＿０００００３  ＢＫ０００４０２が与えられており、ここで繊維ｃｄｓは、位置２５８８７．．２７５１８にあるとアノテーションされ、ここでタンパク質および関連コード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＰ＿００００６９．１に寄託されている。ＣＡｄＶ−２のコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＣ＿００００２０  ＢＫ０００４０３に示されており、ここでは繊維ｃｄｓは、位置２６５９２．．２８２２０にあるとアノテーションされ、このタンパク質および関連コード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＰ＿０００６３２．１に寄託されている。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ３７４９８は、ＣＡｄＶ−２繊維遺伝子の配列を示す。
【００４０】
ＯＡｄＶ−７の完全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００４０３７に示されており、ここでは、繊維ｃｄｓは、位置２２２７３．．２３９０４にあるとアノテーションされ、タンパク質および関連コード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６５９５２９．１に寄託されている。
【００４１】
ネコアデノウイルスの繊維配列は、登録番号ＡＹ５１８２７０の下にＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【００４２】
マウスアデノウイルスＡの完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿０００９４２に示されており、ここでは、繊維遺伝子ｃｄｓは２５４１２．．２７２５３に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１５５５４．１を割り当てられている。
【００４３】
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ＿００００１３  ＢＫ００１４５１は、ニワトリアデノウイルス９の完全ゲノムを示し、ここでは、繊維ＣＤＳは、タンパク質とともに位置３０１６１．．３１８７６にあるとあのテーションされており、このタンパク質および関連コード配列は、ＡＰ＿０００３９０．１に寄託されている。ＦＡｄＶ−１０繊維配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ００７５７９に示される。ニワトリアデノウイルスＤの完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿０００８９９に示されており、ここでは、繊維遺伝子ｃｄｓは３０１６１．．３１８７６に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５０２９３．１を割り当てられている。ニワトリアデノウイルスＡの完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１７２０に示されており、ここでは、繊維遺伝子ＣＤＳは２８３６３．．３０４９５に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０４３８９１．１を割り当てられている。シチメンチョウアデノウイルス３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ＿００００１６  ＢＫ００１４５４に示されており、ここでは、その繊維は、位置２２５１８．．２３８８２にあるとアノテーションされ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＰ＿０００４９５．１を割り当てられている。
【００４４】
カエルアデノウイルスのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２５０１に与えられており、ここでは、その繊維ｃｄｓは位置２２３４３．．２３６３２に位置し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６２４５２．１を割り当てられている。
【００４５】
特定の例示的な実施態様では、本発明は、ＰＡｄＶ−４由来の繊維配列を使用する。ＰＡｄＶ−４の新規な繊維コード配列のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。ＰＡｄＶ−１由来の新規な繊維コード配列のヌクレオチド配列は、配列番号２に示される。ＰＡｄＶ−２由来の新規な繊維コード配列のヌクレオチド配列は、配列番号３に示される。
【００４６】
上記の説明から容易に明らかなとおり、当業者は、多様なアデノウイルス型からの繊維遺伝子に関する多くのコード配列を認識している。本明細書の発明は、これらの繊維配列のうちの何れか１つの使用に限定されないことを理解すべきである。実際、本発明の方法および組成物は、上記の任意の繊維、これらの繊維の任意の改変体、およびアデノウイルスのその他の様々な株から同定される繊維を使用して実施することができる。当業者は、アデノウイルスのゲノム構成の知識、および上記の例示的な配列の知識から、このようなその他の繊維を簡単に同定することができる。この点に関して、米国特許出願公開第２００２００３４５１９号（引用することにより、全体を本明細書に援用する）において、その図１２〜１７は、様々な繊維タンパク質（ＨＡｄＶ−５繊維タンパク質（その中の図１２）、ＢＡｄＶ−３（その中の図１３）、ヒツジアデノウイルス２８７繊維タンパク質（その中の図１４）；ＰＡｄＶ−３繊維タンパク質（その中の図１５）；ＣＡｄＶ−２繊維タンパク質（その中の図１６）；および図１７Ａ〜１７Ｇを含む）は、多重整列プログラムのｃｌｕｓｔａｌ法を使用して、哺乳類のアデノウイルス繊維領域のアミノ酸整列を示しているので、特に着目されることが留意される。
【００４７】
本発明の例示的な実施態様では、組換え型アデノウイルスベクターの調製に使用される従来の方法により調製された組換え型アデノウイルスベクターは、組換え型アデノウイルス中に存在する繊維遺伝子とは異なる繊維遺伝子を発現する組換え細胞株である細胞株中で繁殖される。組換え型アデノウイルスは、好ましくは、その血清型に関連する繊維遺伝子を含むが（たとえば、組換え型アデノウイルスがＰＡｄＶ−３ベースの組換え型アデノウイルスである場合、当該組換え型アデノウイルス中の繊維遺伝子は、固有のＰＡｄＶ−３繊維遺伝子である）、本発明を使用して、固有の繊維遺伝子が改変された（たとえば、別のアデノウイルスの繊維と交換されたか、あるいは固有の野生型繊維遺伝子とは異なるように変異させた）組換え型アデノウイルスの親和性を変更することもまた可能であることを理解すべきである。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「繁殖する」という用語は、「複製する」と相互に交換可能に使用され、アデノウイルスベクターが、再生または増殖する能力を指す。これらの用語は、当該分野で十分に理解されている。本明細書で使用する場合、複製は、アデノウイルスタンパク質の生成を伴い、一般に、アデノウイルスベクターの再生産に関する。複製は、当該分野で標準的で、本明細書に記載するアッセイ、たとえばバーストアッセイまたはプラークアッセイを使用して測定することができる。「複製」および「繁殖」は、ウイルスの生成過程に直接的または間接的に関連する任意の活動を含み、たとえば、ウイルス遺伝子の発現；ウイルスのタンパク質、核酸、またはその他の成分および生成；完全なウイルス中へのウイルス成分のパッケージング；および細胞溶解が挙げられるが、これらだけに限らない。
【００４９】
例示的な実施態様では、第２の繊維タンパク質をコードするコードポリヌクレオチド配列の一部または全部は、このアデノウイルスベクターが繁殖される組換え型宿主細胞中で発現される。この宿主細胞中における組換え型アデノウイルスベクターの繁殖は、アデノウイルスの親和性を変える。本明細書に開示する特定の実施態様では、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を発現する組換え細胞が調製される。例示的な実施態様では、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を安定して発現する細胞株が生成された。ＰＡｄＶ−３繊維は、ウイルスがブタの腸内の細胞に付着するのを促進し、ＰＡｄＶ−４血清型繊維は、ブタの気道細胞への付着を可能とする。ＣＳＦＶ［Ｈａｍｍｏｎｄ等、２０００年］のｇｐ５５遺伝子を発現する既存のブタアデノウイルス組換え型ベクターは、これらの細胞株中で増殖させることができ、結果として得られる先祖ウイルスは、固有のＰＡｄＶ−３繊維および追加のＰＡｄＶ−４繊維タンパク質の両方を含む。２つの異なる繊維タンパク質がウイルスキャプシド上に存在すると、ベクターの細胞親和性が広まる。したがって、ベクターが動物中のより多様な細胞型を標的とし、送達された外来遺伝子をより広範囲の宿主免疫応答に暴露することが可能になる。さらに、繊維遺伝子を欠失させて外来遺伝子を挿入するためのより多くの空間を提供するように設計されたＰＡｄＶベクターは、繊維タンパク質を発現する細胞株でこれらのベクターを継代することによって補完させることも可能である。このアプローチは、さらにＤＮＡのパッケージング能を有する繊維陽性ウイルスの生成を可能にする。
【００５０】
このような細胞株による組換え型ＰＡｄＶの増殖は、ベクターの、宿主細胞の標的範囲を拡張することによってベクターの効力を増大させ、ベクター中に挿入可能な外来遺伝物質の量を増加し、その結果、いくつかの抗原、あるいは抗原およびサイトカインなどの免疫調節剤を１つのベクターに組み入れ、その後送達することを可能にすることが予想される。
【００５１】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって形質転換された細胞であるか、あるいは形質転換が可能な細胞である。本発明では、宿主細胞は、アデノウイルスベクターの複製を支援することが可能であって（つまり、アデノウイルスによる感染が可能であり、その内部でアデノウイルスが複製することを可能にする）、繊維タンパク質の全部または一部をコードする外因性ＤＮＡ配列によって形質転換された宿主細胞である。細胞の「形質転換」は、外因性ＤＮＡを細胞中に導入することを含む。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれる（共有結合される）かまたは組み込まれなくてもよいことが理解されるべきであるが、本発明では、細胞は、繊維コードポリヌクレオチドによって安定して形質転換される。安定して形質転換される細胞は、外因性ＤＮＡが染色体中に組み込まれており、その結果、染色体複製により該ＤＮＡが娘細胞によって遺伝する細胞である。哺乳類細胞では、この安定性は、細胞が外因性ＤＮＡを含む娘細胞の集団から成る細胞株またはクローンを確立する能力によって実証される。
【００５２】
例示的な実施態様では、本発明は、安定して形質転換されたブタ細胞であって、ＰＡｄＶ−４繊維をコードする外因性ＤＮＡによって安定して形質転換されたブタ細胞の例を提供する。より詳細には、２つの例示的な連続（安定した）細胞株であるブタの腎臓１５（ＰＫ１５）およびブタの睾丸（ＳＴ）は、ＰＡｄＶ−４由来の繊維遺伝子を含み、発現するように操作された。これらの細胞株は、それぞれＰＫ−７４３およびＳＴ−７４３と命名された。この繊維遺伝子は、両方の細胞株中にＰＡｄＶ−４繊維のｍＲＮＡが存在することを実証することによって、発現が実証された。両方の繊維に共通のペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体、またはＰＡｄＶ−４繊維に特異的なペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体のいずれかを使用するウェスタンブロット分析は、改変ウイルス中の両方の繊維の存在を明確に実証した。この細胞株は、感染研究に使用され、この研究では、ＰＫ１５Ａ（非改変対照）およびＰＫ−７４３（改変）細胞を組換え型ＰＡｄＶ−３−ｇｐ５５によって感染させ、細胞が８０％の細胞病理効果を示した時に、子孫ウイルスを収集した。
【００５３】
子孫ウイルスは、当業者に公知の標準的な技術を使用して分析することができる。たとえば、子孫ウイルスのタンパク質内容物のウェスタンブロット分析は、ビリオン中にＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の繊維タンパク質が両方存在することを実証した。ＰＡｄＶ−３繊維の予想分子量（４５ｋＤ）のバンドは、両方のウイルス調製品に存在したが、ＰＡｄＶ−４繊維の予想分子量（７７ｋＤ）のバンドは、改変ウイルスの調製品に特異的に検出された。
【００５４】
本発明は、例示的なブタ宿主細胞を提供するが、その他の適切な宿主細胞は容易に調製することができ、宿主細胞中のアデノウイルスゲノムおよびアデノウイルス繊維間の組換えを支援する任意の細胞を含む。宿主細胞は、組換え型アデノウイルスゲノムを含むプラスミドでトランスフェクトされ、これらの宿主細胞中にウイルス粒子を生成する。真核細胞および哺乳類細胞株の増殖は、当業者に周知の手順である。
【００５５】
上記のとおり、組換え型アデノウイルスベクターの調製は、当業者が十分に周知している技術を使用する。このような技術を使用して、１つ以上の異種ポリヌクレオチド配列は、アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域中に挿入され、組換え型アデノウイルスベクターが生成される。これらのベクターの調製は、所定のアデノウイルスゲノムの挿入能力、および組換え型アデノウイルスベクターが、挿入された異種配列を発現する能力のみによって限定される。一般に、アデノウイルスゲノムは、組換え型アデノウイルスのサイズを野生型ゲノムの長さの約１０５％に増加させるとともに、ウイルス粒子中にパッケージングされることが可能な状態を保つ挿入物を受け入れることが可能である。挿入能力は、非必須領域を欠失させ、そして／またはたとえばＥ１の機能などの必須領域を欠失させることにより増やすことが可能であり、その機能は、Ｅ１の機能を提供するヘルパー細胞株のようなヘルパー細胞株によって提供することができる。実施態様によっては、タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドは、アデノウイルスのＥ３遺伝子領域に挿入される。その他の実施態様では、Ｅ３領域の非必須部分を欠失させており、タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドが、欠失によって生じた隙間に挿入される。組換え型アデノウイルスベクターが、ＰＡｄＶ−３ベースのアデノウイルスベクターであるいくつかの好ましい実施態様では、異種遺伝子は、ＰＡｄＶ−３  Ｅ３のポリアデニル化シグナルの後ろでかつＰＡｄＶ−３繊維遺伝子のＯＲＦの開始点前に位置するＰＡｄＶ−３ゲノムの領域内に挿入することができる。
【００５６】
実施態様によっては、アデノウイルスが生成され、ここで、挿入、または欠失とその後の挿入がアデノウイルスのＥ１遺伝子領域にあり、次に、該ベクターが、Ｅ１機能を提供するヘルパー細胞株中で繁殖される。異種遺伝子が挿入され得るその他の領域としては、Ｅ４領域がある。組換え型アデノウイルスベクターが、ＰＡｄＶ−３ベースのベクターである場合、ＯＲＦ３をコードする領域を除くＥ４領域全体を欠失させて、異種遺伝子のための空間を作ることができる。Ｌｉ等（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０４（２００４年）１８１〜１９０ページ）に示されているように、ゲノムの右側末端に位置するＰＡｄＶ−３  Ｅ４領域は、左方向に転写され、７つの（ｐ１〜ｐ７）ＯＲＦをコードする潜在能力を有する。これらのうち、ＯＲＦ  ｐ３のみが、複製に必須である。したがって、他のＥ４領域の残りの全部ではないにしても多くは、ウイルスを複製欠損型にすることなく容易に欠失させることができ、その結果、異種挿入物のためのより多くの空間が可能になる。
【００５７】
本発明の一実施態様では、挿入は、たとえば、望ましい治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドなどを挿入することが望ましいアデノウイルスゲノムの領域を含むプラスミドを構築することによって達成することができる。プラスミドは、次に、プラスミドのアデノウイルス部分に認識配列を有する制限酵素によって消化され、そして異種ポリヌクレオチド配列は制限消化部位に挿入される。挿入された異種配列と共にアデノウイルスゲノムの一部分を含むプラスミドは、アデノウイルスゲノム、またはアデノウイルスゲノムを含む直鎖状プラスミドとともに、細菌細胞（たとえば、大腸菌など）に共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）される。プラスミド間の相同組換えは、挿入された異種配列を含む組換え型アデノウイルスゲノムを生成する。これらの実施態様では、アデノウイルスゲノムは、全長ゲノムであるか、あるいは本明細書に記載するように、１つ以上の欠失を含むことができる。
【００５８】
たとえば、異種配列を挿入する部位を提供するか、あるいは別の部位に追加の挿入能力を提供するためのアデノウイルス配列の欠失は、当業者が十分に周知している方法で行うことができる。たとえば、プラスミド中にクローンされるアデノウイルス配列の場合、１つ以上の制限酵素による消化（アデノウイルス挿入物中に少なくとも１つの認識配列がある）、およびその後の連結は、場合によって、制限酵素認識部位間の配列の欠失を生じる。あるいは、アデノウイルス挿入物中の単一の制限酵素認識部位における消化、その後のエクソヌクレアーゼ処理、その後の連結は、該制限部位に隣接するアデノウイルス配列の欠失を生じる。上記のように構築され、１つ以上の欠失を含むアデノウイルスゲノムの１つ以上の部分を含むプラスミドは、アデノウイルスゲノム（全長または欠失された）、あるいは全長かまたは欠失されたかのいずれかのゲノムを含むプラスミドとともに、細菌細胞中に共トランスフェクトされ、相同組換えによって、１つ以上の特異的な部位に欠失を有する組換え型ゲノムを含むプラスミドを生成する。次に、この欠失を含むアデノウイルスビリオンは、哺乳類細胞（たとえば、ただしこれらだけに限らないが、安定して形質転換された、本明細書に記載する追加の繊維遺伝子を含む細胞）を、組換え型アデノウイルスゲノムを含むプラスミドでトランスフェクトすることによって獲得することが可能である。
【００５９】
挿入部位は、アデノウイルス中の内因性プロモーターに隣接し、転写的に下流でよい。「内因性」のプロモーター、エンハンサー、または制御領域は、アデノウイルスの固有のものであるか、または、それに由来する。所定のプロモーターの下流の、挿入部位として使用可能な制限酵素認識配列は、挿入が望ましいアデノウイルスゲノムの配列の一部または全部の知識から、当業者が容易に決定することができる。あるいは、様々なインビトロ技術を利用して、制限酵素認識配列を特定の部位に挿入すること、あるいは制限酵素認識配列を含まない部位に異種配列を挿入することが可能である。このような方法としては、１つ以上の制限酵素認識配列を挿入するための、オリゴヌクレオチドが媒介するヘテロ二重鎖形成（たとえば、Ｚｏｌｌｅｒ等（１９８２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｂｒｅｎｎａｎ等（１９９０年）Ｒｏｕｘ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：８９〜９６年；およびＫｕｎｋｅｌ等（１９８７年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５４：３６７〜３８２ページ参照）、およびより長い配列を挿入するための、ＰＣＲによって媒介される方法が挙げられるが、これらだけに限らない。たとえば、Ｚｈｅｎｇ等（１９９４年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：１６３〜１８６ページ参照。
【００６０】
内因性プロモーターの下流ではない部位に挿入される異種配列の発現も、真核細胞中で活性のある転写制御配列を、異種配列とともに提供することによって達成することができる。このような転写制御配列は、細胞プロモーター、たとえばウイルスプロモーター、たとえばヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびパポーバウイルスのプロモーター、並びにレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）配列のＤＮＡコピーを含むことができる。このような実施態様では、異種遺伝子は、異種遺伝子が、そような転写調節要素に作動可能に連結される発現構築物中に導入される。
【００６１】
特定の例示的実施態様では、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子は、強力な構成的転写を実現するように、ＣＭＶプロモーターの制御下に配置された。ウイルスの感染の後期に生じるウイルスパッケージング時にも、繊維の生成を継続することが望ましい。ヒトアデノウイルスは、宿主細胞の翻訳開始因子を不活性化することによって、宿主細胞のタンパク質合成を遮断することが実証された（Ｚｈａｎｇ等、１９９４年）。したがって、後期ウイルスメッセージの効率的な翻訳は、ＰＡｄＶ−３  ＴＰＬ配列を含むことによって維持されると予想された。ＴＰＬは、合計２４８個のヌクレオチド（ｎｔ）を有する３つのエキソンから構成され、これらは、後期ウイルスｍＲＮＡの５’末端にスプライスされる（Ｒｅｄｄｙ等、１９９８年）。この配列は、比較的不規則な構造をｍＲＮＡの５’末端に提供して宿主細胞の開始複合体からの独立性を与えることによって機能すると考えられる（Ｄｏｌｐｈ等、１９８８年；Ｄｏｌｐｈ等、１９９０年）。組換え型繊維ｍＲＮＡの継続的な翻訳を確保するために、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子は、ｐＣＩ−ＴＰＬ中のＰＡｄＶ−３  ＴＰＬ配列の下流に配置された。ルシフェラーゼを発現する構築物にＨＡｄＶ  ５  ＴＰＬを添加すると、感染していない細胞中でも、発現レベルが上昇することが報告されている（Ｓｈｅａｙ等、１９９３年）。
【００６２】
異種遺伝子の発現を調節するために使用することが可能な制御配列は、たとえば、転写制御配列、プロモーター、エンハンサー、上流の制御ドメイン、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、翻訳制御配列、リボソーム結合部位、および翻訳終止配列であってよい。
【００６３】
組換え型アデノウイルスベクターの調製は、プラスミドとしてのクローン化アデノウイルスゲノムの繁殖、およびプラスミドを含む細胞からの感染性ウイルスの回収を含むと理解すべきである。
【００６４】
ウイルス核酸の存在は、当業者に公知の技術によって検出することができ、こうした技術としては、ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応、およびその他のタイプの増幅反応が挙げられるが、これらだけに限らない。同様に、タンパク質の検出方法は、当業者が十分に周知しており、様々なタイプの免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、酵素アッセイ、免疫組織化学などが挙げられるが、これらだけに限らない。本発明のヌクレオチド配列を含む診断キットは、細胞破壊および核酸精製のための試薬、並びにハイブリッドの形成、選択、および検出のための緩衝剤および溶媒も含み得る。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列を含む診断キットは、タンパク質の単離、ならびに免疫複合体の形成、単離、精製、および／または検出のための試薬も含み得る。
【００６５】
本発明は、組換え型アデノウイルスベクターを改変させて、その親和性を変更する。これらのベクターは、好ましくは、様々な外来遺伝子またはヌクレオチド配列またはコード配列（原核性、および真核性）を標的細胞に送達するために使用される。このようなベクターは、広範な疾病に対する防御を提供するためのワクチンとして特に有用であり、多くのこのような遺伝子は、当該分野で既に公知である。ウイルスワクチンとしては、ＤＮＡワクチン（つまり、プラスミド、ベクター、または、ＤＮＡをブタ中に直接注入するための従来からあるその他の担体を使用したもの）、生ワクチン、改変生ワクチン、不活性化ワクチン、サブユニットワクチン、弱毒ワクチン、遺伝子操作されたワクチンなどが挙げられるが、これらだけに限らない。
【００６６】
アデノウイルス中に組み入れられる外因性（つまり、外来）ヌクレオチド配列は、１つ以上の目的の遺伝子、または遺伝子ではないが他の機能（好ましくは目的の治療上の機能）を持つ他のヌクレオチド配列からなることができる。本発明との関連で、目的のヌクレオチド配列または遺伝子は、アンチセンスＲＮＡ、ショートヘアピン型ＲＮＡ、リボザイム、またはその後目的のタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡをコードすることができる。このようなヌクレオチド配列または遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または混合型（少なくとも１つのイントロンが欠失しているミニ遺伝子）を含み得る。ヌクレオチド配列または遺伝子は、制御または治療機能、成熟タンパク質、成熟タンパク質の前駆体、特に、シグナルペプチドを含む前駆体、多様な起源の配列の融合から生じるキメラタンパク質、あるいは改良または改変された生物学的特性を呈する、天然タンパク質の変異体をコードすることができる。このような変異体は、天然タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、および／または付加、あるいは、たとえば転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）または逆位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）など、天然タンパク質をコードする配列の任意のその他のタイプの変更によって取得し得る。
【００６７】
ベクターによって送達される遺伝子は、遺伝子が宿主細胞中で発現するのに適する要素の制御下に配置され得る（ＤＮＡ制御配列）。適切なＤＮＡ制御配列は、遺伝子をＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に転写し、このｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するために必要な要素のセットを意味すると理解される。たとえば、これらの要素は、少なくとも１つのプロモーターを含む。このプロモーターは、構成的プロモーターまたは調節可能なプロモーターでよく、真核性、原核性、またはウイルス源、さらにアデノウイルス源の任意の遺伝子から単離することができる。あるいは、プロモーターは、目的遺伝子の天然プロモーターでよい。一般的に述べるなら、本発明に使用されるプロモーターは、制御配列を含むように改変させてもよい。例示的なプロモーターは、遺伝子が所定の組織タイプを標的とすべき時に、組織に特異的なプロモーターを含み得る。使用し得るその他の従来のプロモーターとしては、たとえば、多くの細胞型で発現することを可能にする、ＨＳＶ−１  ＴＫ（ヘルペスウイルス型１のチミジンキナーゼ）遺伝子プロモーター、アデノウイルスＭＬＰ（主要後期プロモーター）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ（長い末端反復）、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ−４０前初期プロモーター、およびＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらだけに限らない。
【００６８】
アデノウイルスベクターによって送達されるべき遺伝子は、任意の遺伝子でよく、サイトカイン、たとえばインターフェロンおよびインターロイキンをコードする遺伝子、；リンホカインをコードする遺伝子；たとえば、病原生物（ウイルス、細菌または寄生生物）、好ましくはＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）によって認識される受容体などの膜受容体をコードする遺伝子などの膜受容体をコードする遺伝子；第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子などの凝固因子をコードする遺伝子；ジストロフィンをコードする遺伝子；宿主細胞の免疫性を高めるための抗原性エピトープをコードする遺伝子；主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩおよびＩＩタンパク質をコードする遺伝子、並びにこれらの遺伝子の誘導因子であるタンパク質をコードする遺伝子；抗体をコードする遺伝子；イムノトキシンをコードする遺伝子；毒素をコードする遺伝子；増殖因子または成長ホルモンをコードする遺伝子；細胞受容体およびそのリガンドをコードする遺伝子；腫瘍抑制因子をコードする遺伝子；心血管疾患に関わる遺伝子であって、腫瘍遺伝子を含むがこれだけに限らない遺伝子；繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および神経成長因子（ＮＧＦ）を含むが、これらだけに限らない成長因子をコードする遺伝子；ｅ−ｎｏｓ、腫瘍抑制遺伝子であって、Ｒｂ（網膜芽細胞腫）遺伝子を含むが、これだけに限らないもの；リポタンパク質リパーゼ；スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）；カタラーゼ；酸素およびフリーラジカルスカベンジャー；アポリポタンパク質；ｐａｉ−１（プラスミノーゲン活性化阻害剤−１）；細胞性酵素、または病原生物によって生成される酵素をコードする遺伝子；自殺遺伝子が挙げられるが、これらだけに限らない。
【００６９】
特定の好ましい実施態様では、本発明のワクチンは、動物の疾病の原因に対してブタにワクチンを接種するように調製される。たとえば、ワクチンは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐ５０；伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）Ｓ遺伝子；ブタロタウイルスのＶＰ７およびＶＰ８遺伝子；ブタ呼吸および生殖症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、特にＯＲＦ３、５および７の遺伝子；ブタ流行性下痢ウイルスの遺伝子；ブタコレラウイルスの遺伝子；ブタパルボウイルスの遺伝子；および口蹄疫ウイルスの遺伝子；ブタサーコウイルスに関連する遺伝子；並びにブタインフルエンザウイルスの遺伝子に関するものであり得る。代表的なウシ病原体抗原としては、ウシヘルペスウイルス１型、ウシ下痢ウイルス；ウシコロナウイルス；および口蹄疫ウイルスの遺伝子が挙げられる。代表的なヒト病原体抗原としては、ＨＩＶウイルス抗原および肝炎ウイルス抗原が挙げられるが、これらだけに限らない。
【００７０】
サイトカインおよび増殖因子、たとえば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、プレイオトロフィン、血小板由来増殖因子、エリスロポエチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＮＦ−α；インターフェロン、たとえばインターフェロン−γ、インターフェロンβ、インターフェロン−α、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；ストロマ細胞由来因子−１、マクロファージコロニー刺激因子、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＧＦ−１、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ−１およびＭＣＰ−２、エオタキシン、エオタキシン３、エオタキシン４、ＬＫＮ１、ＭＰＩＦ−２およびＬＤ７８ベータ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン、たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＴＯＬＬ様受容体およびリガンド、インテグリン受容体なども、本発明のベクターを使用して送達され得る。
【００７１】
場合によっては、遺伝子全体をベクター中に組み入れることが望ましいかもしれないが、野生型の生物に見られるような完全配列ではなく、使用され得る遺伝子のヌクレオチド配列の一部分のみ（これらが防御免疫応答または特異的な生物学的効果を生成するのに十分な場合）を含むその他のベクターも構築されることができることを理解すべきである。遺伝子が多数のイントロンを含む場合、ｃＤＮＡが好適であり得る。
【００７２】
上記のとおり、遺伝子は、適切なプロモーターの制御下に挿入され得る。さらに、ベクターは、エンハンサー要素およびポリアデニル化配列も含み得る。哺乳類細胞における外来遺伝子の成功裏の発現および発現カセットの構築を提供するプロモーターおよびポリアデニル化配列は、当該分野、たとえば米国特許第５，１５１，２６７号で公知であり、この特許の開示は、引用することにより本明細書に援用される。
【００７３】
「発現カセット」という用語は、細胞内で遺伝子または遺伝子配列を発現することが可能な、天然または組換え技術で生成される核酸分子を指す。発現カセットは、一般に、プロモーター（転写開始を可能にする）、および１つ以上のタンパク質またはＲＮＡをコードする配列を含む。必要に応じて発現カセットは、転写エンハンサー、非コード配列、スプライシングシグナル、転写終止シグナル、およびポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡ発現カセットは、一般に、翻訳開始コドン（翻訳の開始を可能にする）、および１つ以上のタンパク質をコードする配列を含む。必要に応じて、発現カセットは、翻訳終止シグナル、ポリアデノシン配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および非コード配列を含み得る。必要に応じて、発現カセットは、タンパク質に翻訳されない、遺伝子または部分遺伝子配列を含み得る。この核酸は、標的細胞のＤＮＡまたはＲＮＡの配列に変化を生じさせることが可能である。これは、ハイブリダイゼーション、多重鎖核酸の形成、相同組換え、遺伝子のコンバージョン、ＲＮＡ干渉、またはその他の未だ記述されていないメカニズムにより達成することができる。
【００７４】
アデノウイルスベクターは、１種より多くの外来遺伝子を含み得る。本発明の方法は、ブタ、ヒト、ウシ、およびその他の哺乳類に感染する多様な疾病に対する防御を提供するために使用することができる。本発明の任意の組換え型抗原決定基または組換え型生ウイルスは、抗原決定基ワクチンまたは生ワクチンベクターに関して記載されている方法と実質的に同じ方法で処方および使用することができる。
【００７５】
本発明の例示的な実施態様では、異種ヌクレオチド（本明細書では、異種核酸とも呼ぶ）が、タンパク質をコードするヌクレオチドであるが、異種ヌクレオチドは、実際上、細胞内に存在または転写することが望ましい配列を含む任意のポリヌクレオチドで良いと理解すべきである。したがって、ベクターは、たとえば、遺伝子の機能、転写、または翻訳の配列特異的な崩壊または抑制を引き起こす任意のポリヌクレオチドを送達するために使用され得る。このような異種ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスポリヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンス核酸をコードするＤＮＡ発現カセットからなる群より選択され得る。ＳｉＲＮＡは、一般に１５〜５０塩基対、好ましくは１９〜２５塩基対を含み、かつ細胞内で発現される標的遺伝子またはＲＮＡと同一またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。ｓｉＲＮＡは、２個のアニールしたポリヌクレオチド、またはヘアピン構造を形成する１個のポリヌクレオチドから構成され得る。マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、それぞれのｍＲＮＡ標的の破壊または翻訳抑制を導く約２２ヌクレオチド長の小さい非コードポリヌクレオチドである。アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子またはｍＲＮＡに対して相補的な配列を含む。アンチセンスポリヌクレオチドとしては、モルホリン、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、これらだけに限らない。このような異種ヌクレオチド配列は、インビトロで重合させるか、組換え体であるか、キメラ配列を含むか、あるいは、これらの基の誘導体でよい。これらの配列は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、あるいは標的ＲＮＡおよび／または遺伝子が抑制されるような任意の適切な組合せを含み得る。
【００７６】
例示的な実施態様では、改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５をＰＫ１５−７４３細胞中で増殖させたか、あるいはｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を非改変ＰＫ１５Ａ細胞中で増殖させた。次に、これは、市販の大型白色ブタに対し、皮下または経口経路で投与された。改変ワクチンは、皮下注射または経口経路によって投与した時に、ＣＳＦＶによる致命的なチャレンジからブタを完全に防御した。さらに、皮下経路によって与えられた改変ワクチンは、非改変ワクチン群で検出されたレベルより高い最高レベルのＮＰＬＡ抗体を生成した。従来の研究では、非改変ワクチンを経口経路で投与すると、チャレンジ以前に、１回分の用量のブースターの後でも、ＮＰＬＡ抗体の力価は検出できないことが実証された［Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００１年；Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００３年］。しかし、経口群では、１回の用量の改変ワクチンの後、非常に著しいレベルのＮＰＬＡ抗体が検出され、これらのレベルは、２回目の用量の投与によって増進された。これは、ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の繊維タンパク質の両方を含む改変ワクチンが、非改変ワクチンと比べて、ブタ内のより多様な組織へと標的化され、その結果、宿主中でより広範囲の免疫応答を生成していることを実証する。
【００７７】
本明細書では、本発明の方法に従って調製された治療上有効な量の組換え型アデノウイルスベクター、組換え型アデノウイルス、または組換え型タンパク質を、薬学的に許容可能な賦形剤および／またはアジュバントと組み合わせて含む薬学的組成物を特に意図している。このような薬学的組成物は、当該分野で周知の技術に従って調製され、用量を決定することが可能である。本発明の薬学的組成物は、任意の公知の投与経路で投与することができ、たとえば、全身的（たとえば、静脈内、気管内、経脈管的、肺内、腹腔内、鼻腔内、非経口、経腸的、筋肉内注射、皮下、腫瘍内または頭蓋内）、経口投与により、エアロゾル投与により、あるいは肺内点滴が挙げられるが、これらだけに限らない。投与は、単回投与で行われるか、あるいは一定の時間間隔の後に１回以上反復して行うことができる。適切な投与経路および投薬量は、状況（たとえば、処置される個体、処置される障害、あるいは目的の遺伝子またはポリペプチド）によって異なるが、当業者が決めることができる。
【００７８】
本発明は、さらに、繊維遺伝子を含む細胞株中で繁殖されなかった組換え型ベクターと比べて、改変された親和性を有する治療上有効な量の組換え型アデノウイルスベクター（たとえば、ＰＡｄＶ−３アデノウイルスベクター）が、処置を要する哺乳類被験体に投与される処置方法を提供する。
【００７９】
本発明に使用される抗原は、固有または組換え型の抗原ポリペプチドまたはフラグメントのいずれであってよい。これらは、部分配列、全長配列、またはさらにｈ融合体（たとえば、組換え型宿主に適するリーダー配列を有するか、あるいは別の病原体のための追加の抗原配列を含む）であってもよい。本発明のウイルス系によって発現される好ましい抗原性ポリペプチドは、抗原をコードする全長（またはほぼ全長）配列を含む。あるいは、抗原性の（つまり、１つ以上のエピトープをコードする）、より短い配列を使用することができる。より短い配列は、インビトロアッセイでウイルスの感染力を中和する抗体を誘発することが可能なエピトープとして定義される「中和エピトープ」をコードすることができる。好ましくは、このペプチドは、宿主中で「防御免疫応答」、つまり免疫された宿主を感染症から防御する抗体媒介免疫応答および／または細胞媒介免疫応答を誘起することが可能な「防御エピトープ」をコードするべきである。
【００８０】
本発明に使用される抗原は、特に、短いオリゴペプチドから構成される場合、ワクチン担体に結合することができる。ワクチン担体は、当該分野で周知であり、たとえば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）がある。
【００８１】
挿入可能な所望の抗原またはそのコード配列の遺伝子としては、哺乳類の疾病を引き起こす生物、特にウシ病原体、たとえば口蹄疫ウイルス、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス１型、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）、ウシ下痢ウイルス、パスツレラヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ヘモフィルスソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｕｎｕｓ）などの遺伝子が挙げられる。ヒト病原体の抗原をコードする遺伝子も、本発明の実施に有用である。外来遺伝子またはフラグメントを保有する本発明のワクチンは、適切な経口担体、たとえば腸溶性コーティング剤形において経口投与することもできる。経口製剤は、たとえば、医薬品等級のマンニトール、乳糖、デンプン類、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリンセルロース、炭酸マグネシウムなどの一般的に使用されている賦形剤を含む。経口ワクチン組成物は、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を含む、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出剤、または散剤の形態を取り得る。経口および／または鼻腔内ワクチン投与は、全身免疫と組み合わせて、粘膜免疫（呼吸および消化管に感染する病原体を防御する上で重要な役割を果たす）を高めるために好適であり得る。
【００８２】
さらに、ワクチンは、坐剤中に処方することができる。坐剤の場合、ワクチン組成物は、従来の結合剤および担体、たとえばポリアルカリグリコールまたはトリグリセリドを含む。このような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。
【００８３】
本発明のワクチン組成物（単数または複数）を動物に投与するためのプロトコルは、本開示を考慮すると、当該分野の技術範囲内である。当業者は、抗原性フラグメントに対する抗体および／またはＴ細胞媒介免疫応答、あるいは別のタイプの治療または予防効果を誘発するのに効果的である用量のワクチン組成物の濃度を選択する。広範な制限内では、投与量は、臨界的であるとは考えられない。一般的に、ワクチン組成物は、好都合な体積、たとえば約１〜１０ｃｃの賦形剤中に約１〜約１，０００マイクログラムのサブユニット抗原を送達する方法で投与される。好ましくは、１回の免疫における投与量は、約１〜約５００マイクログラム、より好ましくは約５〜１０から約１００〜２００マイクログラムまで（たとえば、５〜２００マイクログラム）のサブユニット抗原を送達する。
【００８４】
投与のタイミングも、重要な場合がある。たとえば、一次接種の次に、必要な場合、好ましくはブースター接種を行うことができる。必要に応じてではあるが、最初の免疫から数週間から数ヶ月後に、動物に対して第２のブースター免疫を行うことが好ましい場合もある。疾病に対して持続的な高レベルの防御を確実に行うために、一定の間隔で、たとえば数年ごとに１回、動物にブースター免疫を再度投与すると役立つ場合がある。あるいは、初期投与量を経口投与し、次に、その後の接種を行うか、あるいはこの逆に行うことができる。好ましいワクチン接種プロトコルは、慣用的なワクチン接種プロトコル実験により確立することができる。
【００８５】
インビボの組換え型ウイルスワクチンのすべての投与経路に関する投与量は、宿主／患者のサイズ、防御が必要な感染症の性質、担体などを含む様々な要因によって決まり、当業者が容易に決定することができる。非制限的な例により、１０３ｐｆｕ〜１０１５ｐｆｕ、好ましくは１０４〜１０１３ｐｆｕ、より好ましくは１０５〜１０１１ｐｆｕなどの投与量を使用することができる。インビトロのサブユニットワクチンと同様、追加の投与量は、関連する臨床要因によって決定されるとおりに投与することができる。
【００８６】
本発明の実施態様によっては、組換え細胞株は、実施例に示されているように、繊維領域、たとえばＰＡＤＶ−４の繊維領域を含む発現カセットを構築し、これらによって宿主細胞を形質転換し、組換え型アデノウイルスの親和性を変更するという本発明の目的のための第２の繊維遺伝子を含む細胞を提供することによって生成される。これらの組換え細胞株は、第２の繊維をアデノウイルスベクター中に挿入することを可能にすることができる。これらの細胞株は、ＤＮＡが介在する共トランスフェクトおよびその後のインビボにおける組換えにより、繊維遺伝子の欠失を、外来遺伝子またはフラグメントをコードする異種ヌクレオチド配列で置き換えた組換え型ベクターを生成する際にきわめて有用でもある。さらに、宿主細胞はまた、アデノウイルスゲノムにおいてコードされる１つ以上の必須の機能を提供することもでき、ここで、該細胞株は、特定の欠損型組換え型アデノウイルスベクターで欠けている１つまたは複数の機能を提供する。したがって、繊維を含む組換え細胞株はまた、たとえば、ヘルパーウイルスとの同時感染により、あるいは特定のウイルス機能をコードするウイルスゲノムのフラグメントを安定した形態で組み込むかさもなければ維持することによりウイルス機能を提供することが可能な補完細胞株でもよい。
【００８７】
本発明の組換え型の哺乳類（特にブタ）の細胞株も、タンパク質の組換え生成に使用することができる。
【００８８】
本発明は、遺伝子送達を必要とするブタ、ウシ、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコまたはその他の哺乳類などの哺乳類に遺伝子送達を提供するか、遺伝子の欠損を制御するか、治療用遺伝子もしくはヌクレオチド配列を提供するか、および／または遺伝子の変異体を誘発もしくは改変するための方法も含む。この方法は、たとえば、遺伝性疾患、感染性疾患、心血管疾患、およびウイルス感染症を含むが、これらだけに限らない状態の処置に使用することができる。この種の技術は、現在、当業者によって、多様な疾患状態の処置に使用されている。従来の遺伝子療法に使用するために組み込むことが可能な外来遺伝子、ヌクレオチド配列、またはその一部分の例としては、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御遺伝子、ヒトミニジストロフィン遺伝子、α−１−抗トリプシン遺伝子、心血管疾患に関連する遺伝子などが挙げられる。
【００８９】
特に、ヒトにおける遺伝子の送達に関連する本発明の実施は、遺伝性疾患（たとえば、血友病、サラセミア、気腫、ゴーシェ病、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、デュシェンヌ型またはベッカー型の筋障害など）、癌、ウイルス性疾患（たとえば、ＡＩＤＳ、ヘルペスウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症およびパピローマウイルス感染症）、心血管疾患などを含むがこれらに限定されない疾患の予防または処置を意図している。本発明の目的上、本発明の方法により調製されるベクター、細胞およびウイルス粒子は、エキソビボで（つまり、患者から取り出された１つ以上の細胞内で）、あるいは処置されるべき体内にインビボでのいずれかにより、被験体内に直接導入され得る。
【実施例】
【００９０】
本発明の実施例では、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を安定して発現する細胞株を生成するための方法および組成物の例示的な教示を提供する。古典的ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）のｇｐ５５遺伝子を発現する既存のブタアデノウイルスの組換え型ベクター、たとえばＰＡｄＶ−３ベクター［Ｈａｍｍｏｎｄ等、２０００年］は、これらの細胞株中で増殖し得、結果として生じる先祖ウイルスは、固有のＰＡｄＶ−３繊維および追加のＰＡｄＶ−４繊維タンパク質の両方を含む。２つの異なる繊維タンパク質がウイルスキャプシド上に存在することによって、ベクターの細胞親和性が広げられる。このようにすることにより、ベクターは、動物中のより多様な細胞型を標的とし、送達された外来遺伝子をより広範囲の宿主免疫応答に暴露することが可能になる。さらに、組換え型ベクターは、繊維遺伝子を欠損させて、外来遺伝子を挿入するためのより多くの空間を提供するように操作され得、繊維タンパク質を発現する細胞株にこれらのベクターを継代させることによって補完することができる。このアプローチは、さらなるＤＮＡパッケージング能力を有する繊維陽性ウイルスの生成を可能にする。
【００９１】
（実施例１：材料および方法）
細胞およびウイルス：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ番号ＣＣＬ−３３（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−３３）から取得したブタ腎臓細胞（ＰＫ−１５）を、５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタン−スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１％のピルビン酸Ｎａおよび２ｍＭのグルタミンを補充したＥａｒｌｅの改変イーグル培地（ＥＭＥＭ）中で増殖させた。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ−Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ）からのブタ睾丸細胞（ＳＴ）を、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ピルビン酸Ｎａ、０．２５％ラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ）および２ｍＭのグルタミンを補充したＥＭＥＭ中で維持した。
【００９２】
ブタアデノウイルスは、２％ＦＣＳを補充したＥＭＥＭ中に維持された初代ブタ腎臓（１０ＰＫ）細胞で増殖させ、９０％の細胞が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す時に収集した。すべての培地に、２．５μｇ／ｍｌのフンギゾーン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（Ｓｑｕｉｂｂ）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＣＳＬ）をさらに補充した。
【００９３】
ウイルスＤＮＡの調製：ウイルスＤＮＡを、Ｓｈｉｎａｇａｗａ等（１９８３年）に記載されているように多少変更したＨｉｒｔ（１９６７年）の方法によって調製し、製造業者の指示書に従って制限酵素消化を行った。
【００９４】
プラスミドＤＮＡの調製：Ｑｉａｇｅｎシステムを製造業者の指示書に従って使用してプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９５】
ＰＡｄＶ−４  ＤＮＡからのＰＡｄＶ−４繊維遺伝子の単離：以下のプライマー対を使用してＰＡｄＶ−４  ＤＮＡからＰＡＤＶ−４繊維遺伝子を増幅した：
【００９６】
【化１】
2009544303.tif 000002
ＰＣＲスーパーミックス（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を９４℃で１分間、５０℃で２分間、および７２℃で３０秒間を３０サイクル行い、サイクルごとに３０秒間伸長する伸長プロトコルで使用してＰＣＲを実施した。
【００９７】
プラスミド構築物：ＰＡｄＶ−４繊維ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結して、プラスミドＰＪＪ３９２を生じさせた（図１ａ）。制限酵素消化の後、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むｐＪＪ３９２からのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを、プラスミドｐＣＩ−ＴＰＬのＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＪＪ７４１を生じさせた（図１ｂ）。次に、ＴＰＬ−ＰＡＤＶ−４繊維遺伝子を含むｐＪＪ７４１のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントをｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入することによって、転移ベクターｐＪＪ７４３を構築した（図１ｃ）。プラスミド構築物を、制限酵素消化によって正しい挿入物の存在についてチェックし、ＴＰＬ配列の５’に結合するプライマー５’ＴＴＴ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  Ｇ  ３’を使用する配列決定によって確認した。
【００９８】
安定した細胞株の生成および特徴付け：ＳＴおよびＰＫ−１５細胞をそれぞれの培地中で増殖させ、約５×１０６の細胞を、３００Ｖ、９６０μＦおよび∞Ωの設定のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒを使用して、２０μｇのＸｍｎＩ直鎖状プラスミドｐＪＪ７４３  ＤＮＡで電気穿孔した。細胞を、１．２５％ＤＭＳＯを補充したそれぞれの培地（Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ等、１９９６年）中で、一晩放置して回復させた。次に、８００μｇ／ｍｌ（ＳＴ）または１０００μｇ／ｍｌ（ＰＫ１５）のいずれかのＧ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ）を培養物に添加してＧ４１８耐性細胞を選択した。個々のクローンを限界希釈によって単離し、増やした。クローンを、繊維遺伝子の存在についてＰＣＲでスクリーニングし、ＲＴ−ＰＣＲで繊維ｍＲＮＡの発現を確認した。
【００９９】
ゲノムＤＮＡの精製：トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して精製した。
【０１００】
ＰＣＲの条件およびプライマー：ＰＣＲスーパーミックス（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、９４℃で１０分間を１サイクル、９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で２分間を３０サイクル、７２℃で１０分間の最終伸長という標準プロトコルでＰＣＲを実施した。プライマー対５’  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡおよび３’  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＣＴ  ３’を、８０４ｂｐの予想バンドを有するＰＡＤＶ−４繊維遺伝子の検出に使用した。
【０１０１】
細胞ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ精製：トランスフェクト細胞からの総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して精製した。
【０１０２】
ＲＴ−ＰＣＲ第１鎖ｃＤＮＡの合成：ｍＲＮＡを、第１鎖ｃＤＮＡ合成用ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプレ増幅システム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造業者の指示書に従って使用してｃＤＮＡに変換した。
【０１０３】
標的ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅：標的ｃＤＮＡを、上記のＰＣＲプロトコルおよびプライマーを使用して増幅した。
【０１０４】
ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ストックの生成：ＰＫ１５Ａ、ＰＫ１５−７４３、ＳＴおよびＳＴ−７４３細胞を、ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５による感染前に９０％の密集度まで培養した。２００μｌのｒＰＡｄＶｇｐ５５を細胞シートに添加し、３７℃で１時間にわたって吸着させた。２０ｍｌのＥＭＥＭ（２％の最終濃度のＦＣＳを補充した）を添加した。フラスコを３７℃で５％ＣＯ２中でインキュベートし、毎日、細胞変性効果について観察した。フラスコが７０〜８０％の細胞変性効果を示した時、３回凍結／融解することによってウイルスを収集した。
【０１０５】
精製ウイルスストックの調製：フラスコの各々の群からの上清をプールし、Ｊｏｕａｎ  Ｃ３０００ベンチ遠心分離機内において２０００ｒｐｍで２０分間にわたって遠心分離することによって澄明とした。次に、上清をＳＷ２８超遠心分離チューブ中にデカントし、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＭ−８０超遠心分離機において２５，０００ｒｐｍ、２０℃で９０分間にわたって遠心分離した。上清を廃棄し、ウイルスのペレットを５００μｌのＴＥ中に再懸濁させた。材料を、必要になるまで、１．５ｍｌのスクリューキャップチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内に−２０℃で保管した。
【０１０６】
不連続ショ糖密度勾配を使用する精製：粗製ウイルス調製物を、さらに、ＮＴＥ中で６０％（ｗ／ｖ）、３０％（ｗ／ｖ）および２０％（ｗ／ｖ）の３種類の濃度のショ糖を含むＳＷ２８超遠心分離チューブ内に用意した不連続ショ糖勾配を使用して精製した。１ｍｌのウイルスストックを勾配の上に注意深く重層し、このチューブをＢｅｃｋｍａｎ  ＬＭ−８０超遠心分離機内で２８，０００ｒｐｍにて４℃で２時間にわたって遠心分離した。精製されたウイルスを５ｍｌのシリンジおよび１９ゲージの針を使って取り出し、ＳＷ２８超遠心分離チューブ内に入れ、次いでこの遠心分離チューブにはＴＥを充填した。次に、精製されたウイルスを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＭ−８０超遠心分離機内で２５，０００ｒｐｍで２０℃で９０分間遠心分離してペレット状にして、ショ糖を除去した。ペレットを最後にＴＥ中に再懸濁させて、必要になるまで−２０℃で保存した。
【０１０７】
繊維特異的ペプチドのウサギ抗血清の生成：ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の繊維タンパク質（Ｒｅｄｄｙ等、１９９５年；Ｋｌｅｉｂｏｅｋｅｒ  １９９５年）のアミノ酸配列を比較し、２つの合成ペプチド（Ａｕｓｐｅｐ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ−オーストラリア）を設計および生成した。ペプチド１は、ＰＡｄＶ−３とＰＡｄＶ−４との間で保存された繊維タンパク質の領域を含み、ペプチド２は、ＰＡｄＶ−４繊維に特異的な配列を構成した。
【０１０８】
【化２】
2009544303.tif 000003
ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４繊維タンパク質の完全アミノ酸配列、並びに２つのペプチドの位置を図５に示す。ウサギにおいて免疫応答を生成するため、両方のペプチドをＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合した。両ペプチド結合体を表１に示すようにウサギ中に注入して、特異的な抗血清を生成させた。
【０１０９】
【表１】
2009544303.tif 000004
ＰＡｄＶ−４繊維の存在についての精製したウイルスの検査：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析。精製したウイルスのサンプルを、８〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＰＡＤＶ−３およびＰＡＤＶ−４の繊維タンパク質の存在について分析した。電気泳動後、１００Ｖで１時間にわたって免疫ブロットを行うことにより、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写した。次に、膜は、ＴＢＳ／３％のウシ血清アルブミン中で、４℃で一晩にわたってブロックした。
【０１１０】
ＰＡｄＶ−４繊維の存在に関する精製したウイルスの検査：ウェスタンブロット分析。洗浄および抗体のインキュベーションをすべて、室温で実施した。膜を、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／Ｔｒｉｔｏｎ中で５分間にわたって２回、およびＴＢＳで１０分間にわたって１回洗浄した。ＴＢＳ／３％ＢＳＡ中で２００倍に希釈したウサギ抗繊維ポリクロナール抗体を膜に添加し、次に１時間にわたってインキュベートした。膜を、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／Ｔｒｉｔｏｎ中で５分間を２回、ＴＢＳ中で１０分間を１回洗浄した。膜を、次に、５％の脱脂粉乳／ブロット（ｂｌｏｔｔｏ）溶液中で５００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ）に結合したヤギ抗ウサギとともにインキュベートした。膜を、次に、上記のように洗浄し、化学発光強化（ＥＣＬ）検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）を使用して、タンパク質バンドを視覚化した。
【０１１１】
ブタ実験を使用するインビボ分析。ＰＫ１５−７４３細胞中で増殖させた改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５、または非改変ＰＫ１５Ａ細胞中で増殖させたｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を、以下のレジメを使用して市販の大型白色ブタに投与した：
０日目：すべてのブタを採血し、ワクチンを接種した
グループ１：第１回用量−２×１０５  ＴＣＩＤ５０非改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ワクチンを皮下注射
グループ２：第１回用量−２×１０５  ＴＣＩＤ５０改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を皮下注射
グループ３：第１回用量−２×１０５  ＴＣＩＤ５０改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を経口経路
２２日目：
グループ１：第２回ブースター用量−２×１０５  ＴＣＩＤ５０非改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ワクチンを皮下注射
グループ２：第２回ブースター用量−２×１０５  ＴＣＩＤ５０改変ＰＡｄＶ−ｇｐ５５ワクチンを皮下注射
グループ３：第２回ブースター用量−２×１０５  ＴＣＩＤ５０改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５経口経路
４７日目：２匹の、感染の無い、年齢および体重が一致するブタを、チャレンジウイルス対照として持ち込んだ
４９日目：無感染対照を含めてすべてのブタに、致命的な用量のＣＳＦＶ「Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ」株（１０００ＴＣＩＤ５０）を皮下注射によりチャレンジした。抗体投与後、直腸温度を毎日記録し、すべてのブタについて、食欲減退、横臥姿勢、下痢、および足の発赤として明らかになる疾病の臨床的徴候を毎日監視した。ブタを実験の終わりかまたは臨床的に重症な疾病を示した時に安楽死させ、ＣＳＦＶ抗原を検出のために脾臓を取り出した。安楽死させたすべてのブタについて、死後検査を実施した。
【０１１２】
ＣＳＦＶに対する血清中和抗体の検出：ブタから１週間間隔で採血し、Ｔｅｒｐｓｔｒａおよびその同僚［１９８４］によって記載された中和ペルオキシダーゼ結合アッセイ（ＮＰＬＡ）により、ＣＳＦＶに対する中和抗体の存在について血清を試験した。ＮＰＬＡ力価を、複製培養物の５０％において２００ＴＣＩＤ５０のＷｅｙｂｒｉｄｇｅ株を中和した血清希釈度の逆数として表した。
【０１１３】
抗原捕捉ＥＬＩＳＡ：チャレンジされたブタの脾臓におけるＣＳＦＶ抗原の存在を、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ［Ｓｈａｎｎｏｎ等、１９９３年］で決定した。
【０１１４】
（実施例２：ベクター、細胞株、およびウイルスの調製結果）
ＰＡｄＶ−４繊維を含む転移ベクターの生成。ヌクレオチドを配列決定したところ、転移ベクターｐＪＪ７４３が、ＰＡｄＶ−３  ＴＰＬ配列の下流にＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むことが確認された（図１ｃ）。
【０１１５】
ＰＡｄ  Ｖ−４繊維タンパク質を恒常的に発現する細胞株の生成：ＳＴ細胞およびＰＫ−１５細胞を転移ベクターｐＪＪ７４３でトランスフェクトし、次に、Ｇ４１８によって選択し、組み込まれたＤＮＡを含むクローンを確立した。テストした２つのＰＫ−１５クローン（８および９）は、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むことがＰＣＲで示された（図２ａ）。ｐＪＪ７４３（２〜１４）でトランスフェクトした１２個のＳＴクローンをＰＣＲで試験したところ、１０個（２、３、５、６、７、８、および１１〜１４）がＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むことが示された（図２ｂおよびｃ）。次に、陽性クローンを、細胞型、続いて接頭語７４３、およびクローン番号で、すなわち、ＰＫ１５−７４３−９のように命名した。
【０１１６】
次に、これらの細胞クローンにおける繊維ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで評価した。
【０１１７】
細胞株ＰＫ１５−７４３−９およびＳＴ−７４３−２、５、６および８中に、多量の繊維４  ｍＲＮＡが検出された（図３ａおよびｂ）。
【０１１８】
増殖特性：繊維遺伝子を挿入後、ＰＫ−１５−７４３およびＳＴ  ７４３細胞はともに、親系統よりもゆっくりと増殖した。
【０１１９】
ＰＡｄＶ−４繊維の存在に関する精製したウイルスの検査：細胞株ＰＫ１５−７４３−９をｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５に感染させ、細胞が８０％の細胞変性効果を示した時にウイルスを収集した。ウイルスを精製し、８〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでサンプルを分離した。ナイロン膜に転写した後、ウェスタンブロットで、上記の２つのペプチドに対して産生されたウサギ抗血清を使用して、ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４繊維タンパク質の存在についてサンプルを分析した。
【０１２０】
ＰＡｄＶ  ３および４の繊維の共通のエピトープに対して産生されたペプチド抗血清で処理すると、非改変ＰＫ１５細胞中で増殖させたｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を含むレーンに、ＰＡｄＶ−３繊維の予想分子量（４５ｋＤ）に対応するバンドのダブレットが見られた（図５ａ、レーン１）。対照的に、改変ＰＫ１５−７４３−９細胞中で増殖させたｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を含むレーンは、ＰＡｄＶ−３繊維に対応するダブレットを含んでおり、さらにＰＡｄＶ−４繊維の予想分子量（７７ｋＤ）に追加のバンドを含んでいた（図５ａ、レーン２）。ＰＡｄＶ−４繊維上の特異的なエピトープに対して産生されたペプチド抗血清で処理した場合、非改変ＰＫ１５細胞中で増殖させたｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を含むレーンで、バンドは検出されなかったが（図５ｂレーン１）、改変ＰＫ１５−７４３−９細胞中で増殖させたｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を含むレーンでは、ＰＡｄＶ−４繊維の予想分子量における１つのバンドが見られた（図５ｂレーン２）。
【０１２１】
（実施例３：ブタに対するワクチン接種の研究結果）
改変繊維プロファイルを有するｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５の効力をテストするためのブタ臨床試験。ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の血清型の両方の繊維を含む改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５ワクチンの効力をテストするため、大型白色ブタのグループに、非改変または改変のワクチンを２回投与し、致命的ＣＳＦＶチャレンジに対する感受性を決定した。さらに、経口経路で投与した場合に、改変ワクチンが中和抗体を誘発して防御を与える能力をテストした。
【０１２２】
ワクチン接種に対するブタの反応：どちらのワクチン製剤をどちらの経路でワクチン接種しても、ブタに対する悪影響はなかった。体温の上昇も臨床的な徴候の発現もなかった。
【０１２３】
チャレンジ後のブタの体温：対照用ブタ、およびワクチンを接種した各グループのブタにおける、毎日の平均体温および標準誤差を図６に示す。
【０１２４】
対照用ブタ：対照用ブタは、４日目までに発熱し、ＣＳＦの臨床的徴候を示し、１匹のブタは、４日目と５日目の間の晩に死亡し、１匹のブタは、チャレンジ後（ｐ．ｃ）７日目に重篤な疾病に罹病したために安楽死させた。
【０１２５】
グループ１：非改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を皮下投与されたどのブタも、実験が終了するまで、発熱せず、ＣＳＦのどの臨床的徴候も示さなかった。
【０１２６】
グループ２：改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を皮下投与されたどのブタも、実験が終了するまで、発熱せず、ＣＳＦのどの臨床的徴候も示さなかった。
【０１２７】
グループ３：改変ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５を経口投与された３匹のブタのうち２匹は、実験が終了するまで、発熱せず、ＣＳＦのどの臨床的徴候も示さなかった。１匹のブタは、連続しない、別々の２日に４０℃を超える体温を示したが、実験が終了するまで、他のＣＳＦの臨床的徴候は示さなかった。重要なことに、このグループの平均体温は、チャレンジ期間中に４０℃を超えて上昇しなかった。
【０１２８】
ＣＳＦＶ特異的な中和抗体の発達：すべてのブタを０日目に、そして実験が終了するまで１週間間隔で採血し、血清を、ＮＰＬＡ（Ｔｅｒｐｓｔｒａ等、１９８４年）によりＣＳＦＶに対する中和抗体の存在についてテストした。ＮＰＬＡ力価を図７〜９に示す。
【０１２９】
対照用ブタ：対照用ブタは、検出可能なＣＳＦＶ中和抗体を発達させなかった。
【０１３０】
グループ１：すべてのブタは、ワクチン接種後１４日目には検出可能なＣＳＦＶ中和抗体を発達させ、１匹のブタは、７日目に検出可能な力価を示した。このレベルは、２回目の用量を投与することによって上昇した。すべてのブタはチャレンジ後も生き残り、８１９２よりも高いチャレンジ後力価を有した。
【０１３１】
グループ２：すべてのブタは、ワクチン接種後１４日目には、検出可能なＣＳＦＶ中和抗体を発達させ、これらのレベルは、２回目の用量を投与することによって上昇した。すべてのブタはチャレンジ後も生き残り、８１９２よりも高いチャレンジ後力価を有した。
【０１３２】
グループ３：すべてのブタは、ワクチン接種後１４日目には、検出可能なＣＳＦＶ中和抗体を発達させ、これらのレベルは、２回目の用量を投与することによって上昇した。すべてのブタはチャレンジ後も生き残り、８１９２よりも高いチャレンジ後力価を有した。
【０１３３】
ブタの脾臓におけるＣＳＦＶ抗原の存在のテスト：チャレンジされたブタの脾臓におけるＣＳＦＶ抗原の存在を、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ［Ｓｈａｎｎｏｎ等、１９９３］によって決定した。レベルを図９に示す。
【０１３４】
対照用ブタ：対照用のブタは、それぞれの脾臓内に高レベルの抗原を有し、終了時における進行中の感染症を示した。
【０１３５】
グループ１：どのブタも、脾臓においてＣＳＦＶ抗原に陽性ではなく、すべてのブタが、実験の終わりに疾病およびウイルスがないことを実証した。
【０１３６】
グループ２：どのブタも、脾臓においてＣＳＦＶ抗原に陽性ではなく、すべてのブタが、実験の終わりに疾病およびウイルスがないことを実証した。
【０１３７】
グループ３：どのブタも、脾臓においてＣＳＦＶ抗原に陽性ではなく、すべてのブタが、実験の終わりに疾病およびウイルスがないことを実証した。
【０１３８】
上記の研究から、ＰＡｄＶ−４繊維遺伝子を含むプラスミドベクターは、ＰＫ１５細胞およびＳＴ細胞中にトランスフェクトされ、ＰＡｄＶ−４繊維を発現する、安定してトランスフェクトされた細胞株が生成されたことが実証される。
【０１３９】
組換え型ＰＡＤＶ−３（ｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５）は、ＰＡｄＶ−４繊維を発現するＰＫ１５−７４３細胞株を通して継代させた後、ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の血清型繊維の両方を含むことが実証された。この改変された組換え型ワクチンをブタに投与し、ＣＳＦＶチャレンジ臨床試験においてその効力を評価した。
【０１４０】
改変されたワクチンは、皮下注射として、または経口経路により投与した場合、ＣＳＦＶによる致命的なチャレンジからブタを完全に防御した。チャレンジ後の体温反応に関しても、脾臓からのＣＳＦＶ抗原の除去に関しても、改変されたワクチンを投与されたブタと非改変ワクチンを投与されたブタとの間で、有意差は検出されなかった。しかし、改変されたワクチンを皮下経路により投与した場合、３つのグループすべてで、非改変ワクチンのグループで検出されたレベルより大きい、最高レベルのＮＰＬＡ抗体を生成した。さらに、本発明者らは以前、非改変ワクチンを経口経路で投与した場合、チャレンジ前も、１回分の用量のブースター後でさえも、ＮＰＬＡ抗体の力価を検出することができないことを実証した［Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００１年；Ｈａｍｍｏｎｄ等、２００３年］。この実験では、非常に著しいレベルのＮＰＬＡ抗体が、経口グループで、ほんの１回の投与の後に検出され、これらのレベルは、２回目の用量の投与によって上昇した。この知見は、ＰＡＤＶ−３およびＰＡｄＶ−４の繊維タンパク質の両方を含む改変されたワクチンが、非改変ワクチンと比べて、ブタ内のより広範囲にわたる組織を標的とし、その結果、宿主中でさらに大規模な免疫応答を生成するという優れた証拠を提供する。
【０１４１】
上記のデータから、改変されたｒＰＡｄＶ−ｇｐ５５は、経口投与した場合、ｇｐ５５に対して血清中和抗体を生成するのに効果的であるが、非改変ワクチンの場合はそうではないと結論することができる。したがって、ＰＡｄＶ−３およびＰＡｄＶ−４の両方の繊維を含むこのキメラワクチンは、ブタ内の免疫応答の大きさを変更および／または増大させた。このようなワクチンは、効果的な経口送達を可能にするために生産されてもよい。本明細書で教示する例示的な実施態様を前提として、開発された技術は、ＰＡｄＶ−４繊維を任意のＰＡｄＶ−３ベースのワクチン中に組み入れ、送達を標的化することによって効率を改善することを可能にする。
【０１４２】
さらに、二重繊維系の使用により組換え型アデノウイルスワクチンの親和性を増大させることを可能にする、その他のアデノウイルスベクターおよび細胞株を生成することができる。
【０１４３】
文献には、本発明のさらなる背景を提供する多くの参考文献が存在する。これらの参考文献のいくつかを以下に記載し、引用することにより、その全体を本明細書に援用する。
【０１４４】
【表２−１】
2009544303.tif 000005
【０１４５】
【表２−２】
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【０１４６】
【表２−３】
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【０１４７】
【表２−４】
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配列情報
配列番号１：繊維から右側末端（ｒｈｅ）に向かう２２５０塩基の配列からのＰＡｄＶ４繊維遺伝子。ＰＡｄＶ３繊維とよく一致している（太字）が、後続のすべての配列は新規である。
【０１４８】
【化３−１】
2009544303.tif 000009
【０１４９】
【化３−２】
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配列番号２  ＰａｄＶ１からの繊維から右側末端（ｒｈｅ）に向かう１８５８塩基の配列。一部分（太字部分）でＰＡｄＶ３とよく一致している。新規の配列は普通のフォント。
【０１５０】
【化４】
2009544303.tif 000011
配列番号３  ＰＡｄＶ２の繊維から右側末端（ｒｈｅ）に向かう９６９塩基の配列。一部分（太字部分）でＰＡｄＶ３とよく一致しており、ＰＡｄＶ３の完全ｒｈｅを含む。新規な配列は普通のフォント。
【０１５１】
【化５】
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配列番号４：第２セットのデータからのＰＡｄＶ２繊維。１１７６塩基の配列は、ＰＡｄＶ３とよく一致しているが、左側末端（太字）に向かって逆の向きにある。これは、最後のプライマーが、おそらくＩＴＲによりゲノムの両端で働かず、二重配列情報を与えたことを示唆している。
【０１５２】
【化６】
2009544303.tif 000013
配列番号５：ＰＡｄＶ２コンティグの逆相補体
【０１５３】
【化７】
2009544303.tif 000014
（配列表）
【化８】
2009544303.tif 000015
【化９】
2009544303.tif 000016
【化１０】
2009544303.tif 000017
【化１１】
2009544303.tif 000018
【化１２】
2009544303.tif 000019
【化１３】
2009544303.tif 000020
【化１４】
2009544303.tif 000021
【化１５】
2009544303.tif 000022
【化１６】
2009544303.tif 000023
【化１７】
2009544303.tif 000024
【図１】
2009544303.tif 000025
【図２ａ）】
2009544303.tif 000026
【図２ｂ）】
2009544303.tif 000027
【図２ｃ）】
2009544303.tif 000028
【図３ａ）】
2009544303.tif 000029
【図３ｂ）】
2009544303.tif 000030
【図４】
2009544303.tif 000031
【図５ａ）】
2009544303.tif 000032
【図５ｂ）】
2009544303.tif 000033
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
2009544303.tif 000039
2009544303.tif 000040