(57)【要約】  ナトリウム利尿ペプチド受容体に結合し、複数のアミノ酸残基および式I(式中、R、R'、Q、Y、W、Z、J、xおよびnは本明細書に記載の通りである)の少なくとも1つのアミノ酸代用残基、ならびに場合によって少なくとも1つの補欠分子族を含む、N末端およびC末端を有する環状構築物、このような環状構築物を含む医薬組成物、ならびに、鬱血性心不全、または抗高血圧、心臓血管、腎臓もしくは内分泌の作用の誘発が望ましい他の状態、症候群もしくは疾患を治療する方法。2009532384.tif 000137
2009532384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウム利尿ペプチド受容体に結合し、複数のアミノ酸残基および少なくとも1つの下記式Iのアミノ酸代用残基を含む、N-末端およびC-末端を有する環状構築物：
【化１】
2009532384.tif 000119
(式中、
RおよびR'は、それぞれ独立に、H、天然もしくは非天然のアミノ酸側鎖部分、またはアミノ酸側鎖部分の誘導基であり;
xは、1または2であり;
Yは、CH2またはC=Oであり;
Wは、CH2、NH、またはNR'''であり;
Zは、HまたはCH3であり;
Jは、前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にない場合は-C(=O)-であり、C-末端位置にある場合は、-H、-OH、-C(=O)-OH、-C(=O)-NH2、またはC-末端キャッピング基であり;
Qは、前記代用残基が前記構築物のN-末端位置にない場合は結合であり、N-末端位置にある場合は、-Hまたはアミンキャッピング基であり;
R'''は、アシル、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;
nは、0、1、または2であり;
アスタリスクを付した炭素原子は基任意の立体化学配置を有し得る)
であって、
前記少なくとも1つの式Iの代用残基が、前記複数のアミノ酸残基の少なくとも1つに共有結合しており、かつ、
前記構築物が、2つの非隣接アミノ酸残基の側鎖の間、アミノ酸残基の側鎖と非隣接アミノ酸代用残基との間、アミノ酸残基の末端基と非隣接アミノ酸残基の側鎖との間、アミノ酸残基の末端基と非隣接アミノ酸代用残基との間、または2つの非隣接アミノ酸代用残基の間の結合形成によって環化されている、構築物。
【請求項２】
前記アミノ酸残基の少なくとも1つの側鎖もしくは末端基内の反応性基、前記代用残基が前記構築物のN-末端位置にある場合のアミン基もしくはアミンキャッピング基内の反応性基、または、前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にある場合のカルボキシル基、アミン基、もしくはC-末端キャッピング基内の反応性基に共有結合した、少なくとも1つの補欠分子族をさらに含む、請求項1に記載の構築物。
【請求項３】
前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にあり、かつ、Jが、
-(CH2)m-OH、
-C(=O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(=O)-O-(CH2)m-CH3、
-O-(CH2)m-CH3、
-O-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-O-(CH2)m-OH、
-C(=O)-NH-(CH2)m-S(v1)、
-C(=O)-NH-(CH2)m-CH3、
-C(=O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(=O)-N-((CH2)m-N(v1)(v2))2、
-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))、または
-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)
(これらの基の全ての(R)または(S)配置を含み、式中、v1およびv2は、それぞれ独立に、HまたはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖であり、mは、それぞれの場合に独立に、0〜17である)
からなるC-末端キャッピング基である、請求項1に記載の構築物。
【請求項４】
前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にあり、かつ、Jが、オメガアミノ脂肪族、末端アリール基もしくはアラルキル基、または任意の単一の天然もしくは非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸、α,α-二置換アミノ酸、N-置換アミノ酸（これらの基の全ての(R)または(S)配置を含み、場合により請求項2に定義した通りのC-末端キャッピング基との組合せを含む）からなるC-末端キャッピング基である、請求項1に記載の構築物。
【請求項５】
前記代用残基が前記構築物のN-末端位置にあり、かつ、Qが、
-(CH2)m-N(v3)(v4)、
-(CH2)m-CH3、
-(CH2)m-O(v3)、
-(CH2)m-C(=O)-(v3)、
-(CH2)m-C(=O)-O-(v3)、
-(CH2)m-S(v3)、
-C(=O)-(CH2)m-CH3、
-C(=O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、
-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-(v3)、
-C(=O)-(CH2)m-O(v3)、または
-C(=O)-(CH2)m-S(v3)
[式中、v3およびv4は、それぞれ独立に、H、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖またはC2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖であり（但し、v3またはv4の一方がアルキルアシル鎖である場合、v3またはv4の他方はHであることを条件とする）、mは0〜17である]
からなるアミンキャッピング基である、請求項1に記載の構築物。
【請求項６】
前記構築物が、少なくとも1つの式II:
【化２】
2009532384.tif 000120
の代用残基を含み、前記代用残基がN-末端またはC-末端以外の任意の位置にあり、破線はペプチド結合を示す、請求項1に記載の構築物。
【請求項７】
少なくとも1つの式Iの代用残基が、前記構築物のC-末端にあり且つペプチド結合によって前記構築物に共有結合しており、前記代用残基が式:
【化３】
2009532384.tif 000121
(式中、破線はペプチド結合を示す)
を有する、請求項1に記載の構築物。
【請求項８】
少なくとも1つの式Iの代用残基が、前記構築物のN-末端にあり且つ1つのペプチド結合によって前記構築物に共有結合しており、前記代用残基が、式:
【化４】
2009532384.tif 000122
(式中、破線はペプチド結合を示す)
を有する、請求項1に記載の構築物。
【請求項９】
少なくとも1つの式Iの代用残基が前記構築物のC-末端にあり、Qが結合であり、RおよびR'が、それぞれ独立に、H、天然もしくは非天然のアミノ酸側鎖部分、または少なくとも1個の窒素原子を含むヘテロ原子基を有するアミノ酸側鎖部分の誘導基である（但し、RおよびR'の少なくとも一方はHではないことを条件とする）、請求項1に記載の構築物。
【請求項１０】
少なくとも1個の窒素原子を含むヘテロ原子基を有するRおよびR’の少なくとも一方が式：(CH2)y-R''（式中、yは1〜5であり、R''は少なくとも1個の窒素原子を含むヘテロ原子基である）で表される、請求項9に記載の構築物。
【請求項１１】
R''が、
-NH2、
-NH-C(=NH)-NH2、
-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH-CH3、
-C(=O)-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=NH)-NH-Me、
-NH-C(=NH)-NH-Et、
-NH-C(=NH)-NH-Pr、
-NH-C(=NH)-NH-Pr-i、
-NH-C(=O)-CH3、
-NH-C(=O)-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-CH-(CH3)2、
-NH-C(=O)-O-CH3、
-NH-C(=O)-O-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-NH-C(=O)-NH-CH3、
-NH-C(=N-C(=O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-N(C(=O)-O-C-(CH3)3)-C(=NH)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
【化５】
2009532384.tif 000123
（式中、yは1〜5である）
である、請求項10に記載の構築物。
【請求項１２】
前記ナトリウム利尿ペプチド受容体が、ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-bまたはTNP-cに対する受容体である、請求項1に記載の構築物。
【請求項１３】
前記複数のアミノ酸残基が、天然もしくは非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸、N-置換アミノ酸、もしくはα,α-二置換アミノ酸（これらの基の全ての(R)または(S)配置を含む）、または前記基の任意の組合せを含む、請求項1に記載の構築物。
【請求項１４】
前記複数のアミノ酸残基の少なくとも2つが非ペプチド結合によって連結されている、請求項1に記載の構築物。
【請求項１５】
前記少なくとも1つの非ペプチド結合が、-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-O-、もしくは-C(=O)-CH2-、これらの結合の任意の等配電子体、または-CH2-CH2-もしくは-CH=CH-である、請求項14に記載の構築物。
【請求項１６】
12〜15のアミノ酸残基および1つの式Iの代用残基を含む、請求項1に記載の構築物。
【請求項１７】
11〜14のアミノ酸残基および2つの式Iの代用残基を含む、請求項1に記載の構築物。
【請求項１８】
11〜14のアミノ酸残基、N-末端またはC-末端のいずれかにある1つの式IIの代用残基、およびN-末端またはC-末端のいずれかにある1つの式Iの代用残基を含む、請求項1に記載の構築物。
【請求項１９】
前記構築物が、ヒトに投与する際に、アミノ酸代用残基を含まない相当するアミノ酸配列と比較して１つ以上の利点を示し、前記利点が、酵素分解に対する抵抗性の増大、循環半減期の増大、生物学的利用能の増大、有効性の増大、および効果の持続の長期化からなる群から選択される、請求項1に記載の構築物。
【請求項２０】
少なくとも1つの代用残基について、RおよびR''の一方がHであり、xが1であり、YがC=Oであり、WがNHであり、ZがHであり、nが0である、請求項1に記載の構築物。
【請求項２１】
前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にあり、かつ、Jが、-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-CH2-OH、-C(=O)-NH-(CH2)4-NH2、-C(=O)-NH-(CH2)5-NH2、-C(=O)-NH-(CH2)6-NH2、-C(=O)-NH-(CH2)7-NH2、または-C(=O)-NH-(CH2)8-NH2である、請求項3に記載の構築物。
【請求項２２】
前記補欠分子族が、炭素原子および水素原子を含む繰返し単位を含む少なくとも1つのポリマー配列を含む、請求項2に記載の構築物。
【請求項２３】
前記繰返し単位が、追加の原子をさらに含む、請求項22に記載の構築物。
【請求項２４】
前記繰返し単位が、酸素原子をさらに含む、請求項22に記載の構築物。
【請求項２５】
前記ポリマー配列が、水溶性ポリマー配列である、請求項22に記載の構築物。
【請求項２６】
前記ポリマー配列が、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキサゾリン、またはポリ(アクリロイルモルホリン)である、請求項22に記載の構築物。
【請求項２７】
前記ポリ(アルキレンオキシド)が、ポリ(エチレングリコール)（PEG）である、請求項26に記載の構築物。
【請求項２８】
PEGを含む前記補欠分子族が、連結基で誘導体化されている、請求項27に記載の構築物。
【請求項２９】
前記PEGが、約200MW〜約40,000MWの分子量範囲を有する、請求項27に記載の構築物。
【請求項３０】
前記補欠分子族が、アミン反応性基を含む、請求項2に記載の構築物。
【請求項３１】
前記補欠分子族が、前記アミノ酸残基の少なくとも1つの側鎖における反応性アミンに共有結合している、請求項30に記載の構築物。
【請求項３２】
前記補欠分子族が、前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にある場合のC-末端キャッピング基内の反応性アミンに共有結合している、請求項30に記載の構築物。
【請求項３３】
前記補欠分子族が、前記代用残基が前記構築物のN-末端位置にある場合のアミンキャッピング基内の反応性アミンに共有結合している、請求項30に記載の構築物。
【請求項３４】
前記補欠分子族が、前記代用残基が前記構築物のN-末端位置にある場合の前記代用残基のアミン基内の反応性アミンに共有結合している、請求項30に記載の構築物。
【請求項３５】
前記補欠分子族が、カルボキシル反応性基を含む、請求項2に記載の構築物。
【請求項３６】
前記補欠分子族が、前記アミノ酸残基の少なくとも1つの側鎖における反応性カルボキシルに共有結合している、請求項35に記載の構築物。
【請求項３７】
前記補欠分子族が、前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にある場合のC-末端キャッピング基内の反応性カルボキシルに共有結合している、請求項35に記載の構築物。
【請求項３８】
前記補欠分子族が、チオール反応性基を含む、請求項2に記載の構築物。
【請求項３９】
前記補欠分子族が、前記アミノ酸残基の少なくとも1つの側鎖における反応性チオールに共有結合している、請求項38に記載の構築物。
【請求項４０】
前記補欠分子族が、前記代用残基が前記構築物のN-末端位置にある場合のアミンキャッピング基内の反応性チオールに、あるいは前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にある場合のC-末端キャッピング基内の反応性チオールに共有結合している、請求項38に記載の構築物。
【請求項４１】
11〜13のアミノ酸残基と、C-末端位置以外の任意の位置にある、以下の式:
【化６】
2009532384.tif 000124
(式中、Q、R、R'、Y、W、Z、x、およびnは、式Iについて請求項1に定義した通りである)
の少なくとも1つのアミノ酸代用残基と、C-末端位置にある、以下の式:
【化７】
2009532384.tif 000125
[式中、C-末端位置にある前記アミノ酸代用残基について、Y、W、Z、およびxは、式Iについて請求項1に定義した通りであり、かつ、Jは、請求項3に定義した通りであり、少なくとも1個の窒素原子を含むヘテロ原子基を有するRおよびR'の少なくとも1つは、式：(CH2)y-R''(式中、yは1〜5であり、R''は請求項11に定義した通りである)を有する]
の少なくとも1つのアミノ酸代用残基とを含む構築物。
【請求項４２】
アミノ酸残基の少なくとも1つの側鎖または末端基内の反応性基、代用残基が前記構築物のN末端位置にある場合のアミン基またはアミンキャッピング基内の反応性基、または、前記構築物のC末端位置にある代用残基のC-末端キャッピング基内のカルボキシル基、アミン基、もしくは反応性基に共有結合した、少なくとも1つの補欠分子族をさらに含む、請求項41に記載の構築物。
【請求項４３】
式IIIの構築物。
【化８】
2009532384.tif 000126
[式中、
Aaa1は、Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)、もしくはMet(O2)を含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはNle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)、もしくはMet(O2)から誘導されるα,α-二置換アミノ酸（置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む）であるか、あるいはAaa1は、C2〜C18の直鎖アルキル、C3〜C17の分岐アルキル、C2〜C18の直鎖アルケニルもしくはアルキニル、またはC3〜C18の分岐アルケニルもしくはアルキニルを有するアシルであるか、あるいはAaa1は、構造:
【化９】
2009532384.tif 000127
(式中、破線は、ペプチド結合を示し;RおよびR'は、独立に、H、直鎖もしくは分岐のC1〜C6脂肪族鎖、-(CH2)y-S-CH3、-(CH2)y-S(=O)-CH3、-(CH2)y-S(O2)-CH3、結合および(シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、もしくはシクロへキサン)環、またはC1〜C3脂肪族鎖および(シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、もしくはシクロへキサン)環であり;xは1または2であり;YはCH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NH、またはNR'''であり;ZはHまたはCH3であり;Qは、-H、-(CH2)m-N(v3)(v4)、-(CH2)m-CH3、-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-C(=O)-(v3)、-(CH2)m-C(=O)-O-(v3)、-(CH2)m-S(v3)、-C(=O)-(CH2)m-CH3、-C(=O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-(v3)、-C(=O)-(CH2)m-O(v3)、または-C(=O)-(CH2)m-S(v3)であり;R'''は、アシル、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;nは、0、1または2であり;mは0〜17であり;yは1〜5であり;v3およびv4は、それぞれ独立に、H、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖またはC2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖であり（但し、v3またはv4の一方がアルキルアシル鎖である場合、v3またはv4の他方はHであることを条件とする）;アスタリスクを付した炭素原子は基、任意の立体化学配置を有し得る)
のアミノ酸代用残基であり;
Aaa2およびAaa13は、同じであるかまたは異なって、それぞれ、Aaa2およびAaa13のそれぞれの側鎖を介して環状の橋かけを形成するL-もしくはD-異性体のアミノ酸残基であり、前記環状の橋かけは、-S-S-、-S-CH2-S-、-S-CH2-、-CH2-S-、-C(=O)-NH-、-NH-C(=O)-、-CH2-NH-、-NH-CH2-、-CH2-S(O)n-（式中nは1または2である）、-S(O)n-CH2-（式中nは1または2である）、-CH2-CH2-、-CH=CH-（EまたはZ）、-C≡C-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-C(=O)-CH2-、-CH2-C(=O)-、-O-C(=O)-NH-、-NH-C(=O)-O-、または-NH-C(=O)-NH-であり;
Aaa3は、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、DapもしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはHis、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa3は、構造:
【化１０】
2009532384.tif 000128
(式中、RおよびR'は、独立に、H、あるいはHis、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、DapもしくはDabのアミノ酸側鎖部分であるか、またはHis、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、DapもしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基であり;xは1または2であり;yはCH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NHまたはNR'''であり;ZはHまたはCH3であり;R'''は、アシル、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;nは、0、1または2である)
のアミノ酸代用残基であり;
Aaa4は、(置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、または置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa4は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleのアミノ酸側鎖部分、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa5は、Gly、Sar、(Alaを含むかあるいはこれから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはAibであるか、あるいはAaa5は、RおよびR'が独立にHまたは-CH3であるAaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa6は、Gly、Sar、(Alaを含むかあるいはこれから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはAibであるか、あるいはAaa6は、RおよびR'が独立にHまたは-CH3である場合のAaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa7は、Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap、もしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはArg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa7は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはArg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分、またはArg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa8は、Gly、(Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa8は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa9は、Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはAsp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいは、Aaa9は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはAsp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分、またはAsp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa10は、Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはArg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa10は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはArg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分、またはArg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基である)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa11は、Gly、または(Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のD-もしくはL-異性体、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa11は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa12は、Gly、(Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはSer、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa12は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはSer、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分、またはSer、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa2についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa14は、(置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸またはβ-アミノ酸のL-またはD-異性体、または(置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleから誘導される)α,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)または(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa14は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についての式IIの構造のアミノ酸代用残基と同じであり;
Aaa15は、Ala、Arg、Orn、Lys、Dap、Dab、HArg、もしくはHLysを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のD-もしくはL-異性体、またはAla、Arg、Orn、Lys、Dap、Dab、HArg、もしくはHLysから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa15は、構造:
【化１１】
2009532384.tif 000129
(式中、破線は、ペプチド結合を示し;RおよびR'の少なくとも一方は、(CH2)y-R''であり、1つが(CH2)y-R''である場合はRおよびR'の残りはHであり、
R''は、
-NH2、
-NH-C(=NH)-NH2、
-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH-CH3、
-C(=O)-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=NH)-NH-Me、
-NH-C(=NH)-NH-Et、
-NH-C(=NH)-NH-Pr、
-NH-C(=NH)-NH-Pr-i、
-NH-C(=O)-CH3、
-NH-C(=O)-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-CH-(CH3)2、
-NH-C(=O)-O-CH3、
-NH-C(=O)-O-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-NH-C(=O)-NH-CH3、
-NH-C(=N-C(=O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-NH(C(=O)-O-C-(CH3)3)-C(=NH)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
【化１２】
2009532384.tif 000130
xは、1または2であり;Yは、CH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NH、またはNR'''であり;ZはHまたはCH3であり;Jは、-H、-(CH2)m-OH、-C(=O)-(CH2)m-OH、-C(=O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-N(v1)(v2)、-O-(CH2)m-OH、-C(=O)-NH-(CH2)m-CH3、-C(=O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-NH-(CH2)m-S(v1)、-C(=O)-N-((CH2)m-N(v1)(v2))2、-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))、-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)、オメガアミノ脂肪族、末端アリール基またはアラルキル基、あるいは任意の単一の天然または非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸またはα,α-二置換アミノ酸とJを定義する前述の基の1つとの組合せ、あるいは任意の単一の天然または非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸またはα,α-二置換アミノ酸(前記の任意の全ての(R)および(S)配置を含む)であり;R'''は、アシル、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;v1およびv2は、それぞれ独立に、H、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖であり;nは、0、1または2であり;mは0〜17であり;yは1〜5であり;アスタリスクを付した炭素原子は基、任意の立体化学配置を有し得る)
のアミノ酸代用残基であり;
但し、Aaa1、Aaa3からAaa12、Aaa14、またはAaa15の少なくとも1つは、アミノ酸代用残基であることを条件とする]
【請求項４４】
Aaa1、Aaa3からAaa12、Aaa14、またはAaa15の1つが、アミノ酸代用残基である、請求項43に記載の構築物。
【請求項４５】
Aaa1、Aaa5、およびAaa15のうちの1つが、アミノ酸代用残基である、請求項43に記載の構築物。
【請求項４６】
Aaa1、Aaa3からAaa12、Aaa14、およびAaa15のうちの任意の2つが、アミノ酸代用残基である、請求項43に記載の構築物。
【請求項４７】
Aaa1、Aaa5、およびAaa15のうちの2つが、アミノ酸代用残基である、請求項43に記載の構築物。
【請求項４８】
Aaa1、Aaa3からAaa12、Aaa14、およびAaa15のうちの3つ以上が、アミノ酸代用残基である、請求項43に記載の構築物。
【請求項４９】
前記構築物が、Aaa2の側鎖とAaa13の側鎖との間のジスルフィド結合形成によって環化されている、請求項43に記載の構築物。
【請求項５０】
Aaa3、Aaa5、Aaa6、Aaa7、Aaa9、Aaa10、またはAaa12の少なくとも1つが、AlaのL-またはD-異性体である、請求項49に記載の構築物。
【請求項５１】
前記アミノ酸残基の少なくとも1つの側鎖もしくは末端基内の反応性基、前記代用残基が前記構築物のN-末端位置にある場合のアミンキャッピング基内のアミン基もしくは反応性基、または前記代用残基が前記構築物のC-末端位置にある場合のC-末端キャッピング基内のカルボキシル基、アミン基もしくは反応性基に共有結合した、少なくとも1つの補欠分子族をさらに含む、請求項43に記載の構築物。
【請求項５２】
式IVの構築物。
【化１３】
2009532384.tif 000131
[式中、
Aaa3、Aaa4、Aaa5、Aaa6、Aaa7、Aaa8、Aaa9、Aaa10、Aaa11、Aaa12、およびAaa14は、請求項43に定義した通りのα-アミノ酸、β-アミノ酸、またはα,α-二置換アミノ酸であり;
Aaa2およびAaa13は、同じであるかまたは異なって、それぞれ、Aaa2およびAaa13のそれぞれの側鎖を介して環状の橋かけを形成するアミノ酸残基であり、R1は、Aaa2およびAaa13のそれぞれの側鎖の一部を形成し;
R1は、-S-S-、-S-CH2-S-、-S-CH2-、-CH2-S-、-C(=O)-NH-、-NH-C(=O)-、-CH2-NH-、-NH-CH2-、-CH2-S(O)n-（式中nは1または2である）、-S(O)n-CH2-（式中nは1または2である）、-CH2-CH2-、-CH=CH-（EまたはZ）、-C≡C-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-C(=O)-CH2-、-CH2-C(=O)-、-O-C(=O)-NH-、-NH-C(=O)-O-、または-NH-C(=O)-NH-であり;
R2およびR2'の一方は、Hであり、他方は、Hあるいは直鎖もしくは分岐のC1〜C6脂肪族鎖、-(CH2)y-S-CH3、-(CH2)y-S(=O)-CH3、-(CH2)y-S(O2)-CH3であるか、結合および(シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、もしくはシクロヘキサン) 環、またはC1〜C3脂肪族鎖および(シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、もしくはシクロヘキサン) 環を表し;
R3およびR3'の一方は、Hであり、他方は、(CH2)y-R5であり;
R4は、OH、
【化１４】
2009532384.tif 000132
であり;
R5は、-NH2、
-NH-C(=NH)-NH2、
-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH-CH3、
-C(=O)-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=NH)-NH-Me、
-NH-C(=NH)-NH-Et、
-NH-C(=NH)-NH-Pr、
-NH-C(=NH)-NH-Pr-i、
-NH-C(=O)-CH3、
-NH-C(=O)-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-CH-(CH3)2、
-NH-C(=O)-O-CH3、
-NH-C(=O)-O-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-NH-C(=O)-NH-CH3、
-NH-C(=N-C(=O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-N(C(=O)-O-C-(CH3)3)-C(=NH)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
【化１５】
2009532384.tif 000133
であり;
R6およびR7は、それぞれ独立に、H、C1〜C4の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖であり;
xは、それぞれの場合において、独立に1または2であり;
yは1〜5であり;
zは1〜7であり;
ここで、アスタリスクを付した炭素原子は基、任意の立体化学配置を有し得る]
【請求項５３】
R1が-S-S-であり、Aaa2およびAaa13がそれぞれ、Cys、Pen、またはHCysである、請求項52に記載の構築物。
【請求項５４】
R1が、-C(=O)-NH-または-NH-C(=O)-であり、Aaa2またはAaa13の1つが、AspまたはGluであり、Aaa2またはAaa13の他方が、Lys、Orn、Dab、またはDapである 、請求項52に記載の構築物。
【請求項５５】
式Vの構築物。
【化１６】
2009532384.tif 000134
(式中、Aaa2からAaa14までのそれぞれ、R1、およびxは、請求項43に定義した通りであり、R4は、OHまたはNH2である)
【請求項５６】
式VIの構築物。
【化１７】
2009532384.tif 000135
(式中、Aaa2からAaa14までのそれぞれおよびR1は、請求項43に定義した通りであり、R4は、OHまたはNH2である)
【請求項５７】
式VII、式VIII、式IX、式X、式XI、または式XIIの構築物。
【化１８】
2009532384.tif 000136
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2006年3月30日に出願された「環状ナトリウム利尿ペプチド構築物」と題された米国仮特許出願第60/743960号、および2006年3月30日に出願された「補欠分子族を有する環状ナトリウム利尿ペプチド構築物」と題された米国仮特許出願第60/743961号の出願の優先権および恩典を主張し、それぞれのその明細書および特許請求の範囲を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
「ペプチド構築物のためのアミノ酸代用残基（Amino Acid Surrogates for Peptidic Constructs）」と題された関連出願(国際特許出願第PCT/US07/65632号、代理人事件整理番号No.0307-043-PCT)が本出願と同時に出願されており、その明細書および特許請求の範囲を参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
本発明は、複数のアミノ酸残基、1個または複数の環-拘束アミノ酸代用残基（ring-constrained amino acid surrogates）、および場合によって、1個または複数の補欠分子族を含む環状ナトリウム利尿ペプチド構築物に関し、この構築物は、ナトリウム利尿ペプチド受容体に結合し、治療目的に用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
1984年にヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)配列および遺伝子構造の同定がされて以来、ナトリウム利尿ペプチド系は、広範に探求されてきた。ANPは、時に、「ANF」、すなわち心房性ナトリウム利尿因子とも呼ばれる。ANPはナトリウム利尿ペプチド系の一部であり、このナトリウム利尿ペプチド系には、ヒトにおいてはANP遺伝子(この遺伝子は翻訳後の処理の相違によってANPおよびウロジラチンの両方を生じる)、BNP（すなわち脳性ナトリウム利尿ペプチド）を産生する遺伝子、CNP（すなわちC型ナトリウム利尿ペプチド）を産生する遺伝子が含まれる。ANP、ウロジラチン、BNP、およびCNPは、それぞれ環構造であり、システイン-システインジスルフィド結合によって形成された17アミノ酸ループを有する。図１に、ヒトANP（hANP）のアミノ酸配列および構造を示す。ANP、ウロジラチン、BNP、およびCNPは、密接に関連しており、環内で一部の5個または6個のアミノ酸が異なるが、N-およびC-末端尾部は実質的に異なっている。
【０００５】
ANP、BNP、およびCNPは、別個の受容体であるナトリウムペプチド受容体A、B、およびC(NPRA、NPRB、およびNPRC)にそれぞれ特異的である。NPRAおよびNPRBは、グアニリルシクラーゼに結合している一方、NPRCは、G-タンパク質に結合したクリアランス受容体である。ANP、BNP、およびCNPは、今日までに同定された、主要な内因性哺乳動物ナトリウム利尿ペプチドである。しかし、同定され、かつ哺乳動物において治療用途を有し得る多数の非哺乳動物ナトリウム利尿ペプチドが存在する。これらには、サケナトリウム利尿すなわち心臓ペプチド(sCP)、心室ナトリウム利尿ペプチド(VNP)（ウナギおよび様々な魚において同定された心臓ナトリウム利尿ペプチド）、デンドロアスピスナトリウム利尿ペプチド(DNP)（マンバヘビ毒において同定されたナトリウム利尿ペプチド）、およびタイパンヘビ毒から単離された3つのナトリウム利尿様ペプチド(TNP-a、TNP-b、およびTNP-c)が含まれる。全体として、Tervonen V、Ruskoaho H、Lecklin T、Ilves M、Vuolteenaho O. Salmon cardiac natriuretic peptide is a volume-regulating hormone. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283:E353〜61頁(2002年); Takei Y、Fukuzawa A、Itahara Y、Watanabe TX、Yoshizawa Kumagaye K、Nakajima K、Yasuda A、Smith MP、Duff DW、Olson KR. A new natriuretic peptide isolated from cardiac atria of trout、Oncorhynchus mykiss. FEBS Lett. 414:377〜80頁(1997年); Schweitz H、Vigne P、Moinier D、Frelin C、Lazdunski M. A new member of the natriuretic peptide family is present in the venom of the green mamba (Dendroaspis angusticeps). J. Biol. Chem. 267:13928〜32頁(1992年); Lisy O、Jougasaki M、Heublein DM、Schirger JA、Chen HH、Wennberg PW、Burnett JC. Renal actions of synthetic dendroaspis natriuretic peptide. Kidney Int. 56:502〜8頁(1999年);およびFry BG、Wickramaratana JC、Lemme S、Beuve A、Garbers D、Hodgson WC、Alewood P. Novel natriuretic peptides from the venom of the inland (Oxyuranus microlepidotus); isolation, chemical and biological characterisation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 327: 1011〜1015頁(2005年)を参照されたい。
【０００６】
ANPは、心房圧増加に反応して優位に内因性に分泌されるが、サイトカイン受容体刺激を含む他の因子が内因性分泌に寄与し得る。一旦放出されると、ANPは、血圧、ナトリウム、および体液ホメオスタシスのホルモン調節因子であり、血管緊張低下作用を与え、心臓血管再構築に影響する、などする。したがって、内因性ANPを含むANPは、慢性的に活性化されたレニン-アンギオテンシン-アルドステロン系に対して防御を与えることによって部分的に、鬱血性心不全および他の心臓血管疾患に有効である。循環ANPは、ナトリウムペプチド受容体に結合し、酵素的に分解するという2つの機構によって循環系から迅速に取り除かれる。
【０００７】
ヒトANPは、野生型ヒトANP、hANP、ANP(1-28)およびANP(99-126)(後者はproANP(1-126)内の関連配列を表し、分泌中にC-末端領域のArg98-Ser99で通常切断される)とも言及される。以降、ヒトANPを、「hANP」とも称する。
【０００８】
一般に、ナトリウム利尿ペプチドおよびその変異体は、鬱血性心不全、腎臓高血圧、急性腎不全および関連状態、ならびに、利尿、ナトリウム利尿、および/または血管拡張反応が治療または予防効果を有するであろう任意の状態、疾患または症候群の治療に利用性を有すると考えられている。ANPを含むナトリウム利尿ペプチド、および心不全におけるこのナトリウム利尿ペプチド系の利用について記載する1つの総論は、Schmitt M.、Cockcroft J.R.、およびFrenneaux M.P. Modulation of the natriuretic peptide system in heart failure: from bench to bedside? Clinical Science 105:141〜160頁(2003年)である。
【０００９】
多数のANP模倣体および変異体が作られてきており、それらの一部は大きさがANPから実質的に減少している。ANPについて、大きさが減少しているが、生物学的に活性であるバージョンは、Li B、Tom JY、Oare D、Yen R、Fairbrother WJ、Wells JA、Cunningham BC. Minimization of a polypeptide hormone. Science 270:1657〜60頁(1995年)に記載されている15-merジスフフィド環状ペプチド：H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(配列番号1)である。この15-merペプチドは、通常「mini-ANP」と称される。
【００１０】
1つまたは複数の要因に基づいて野生型ナトリウム利尿ペプチドよりも優れていると主張されて、ナトリウム利尿ペプチドの異なる合成類似体について多くの特許および特許出願が出願されている。これらには、以下の米国特許第4496544号;同第4609725号;同第4656158号;同第4673732号;同第4716147号;同第4757048号;同第4764504号;同第4804650号;同第4816443号;同第4824937号;同第4861755号;同第4904763号;同第4935492号;同第4952561号;同第5047397号;同第5057495号;同第5057603号;同第5091366号;同第5095004号;同第5106834号;同第5114923号;同第5159061号;同第5204328号;同第5212286号;同第5352587号;同第5376635号;同第5418219号;同第5665704号;同第5846932号;同第5583108号;同第5965533号;同第6028055号;同第6083982号;同第6124430号;同第6150402号;同第6407211号;同第6525022号;同第6586396号および同第6818619号;ならびに以下の米国特許出願公開第2004/0002458号;同第2004/0063630号;同第2004/0077537号;同第2005/0113286号;同第2005/0176641号;同第2006/0030004号に開示された構築物が含まれる。さらに、様々な非米国特許および特許出願が構築物について開示しており、これらには、国際公開第85/04870号;同第85/04872号;同第88/03537号;同第88/06596号;同第89/10935号;同第89/05654号;同第90/01940号;同第90/14362号;同第92/06998号;同第95/13296号;同第99/08510号;同第99/12576号;同第01/016295号;同第2004/047871号;同第2005/072055号;EPO0291999号;同0323740号;同0341603号;同0350318号;同0356124号;同0385476号;同0497368号;および同0542863号が含まれる。キメラナトリウム利尿ペプチド、例えば、「バソナトリンペプチド」と呼ばれるペプチドならびにANPおよびCNPのキメラとして記載されるペプチドは、米国特許第5583108号、または、デンドロアスピスのキメラペプチドを開示する米国特許第6407211号および同第6818619号におけるように記載されている。上記の特許および特許出願のそれぞれの教示を、あたかも全て述べたように参照により組み込む。
【００１１】
米国における食品医薬品局によって認可された1つのナトリウム利尿ペプチド製品があり、一般名ネシリチドおよび商標Natrecor(登録商標)(Scios Inc.)のもとに販売されている。これは、組換えDNA技術を用いて大腸菌(E.coli)から製造されたヒトB型ナトリウム利尿ペプチドである。この製品は、安静時呼吸困難または最小活動度を伴う急性非代償性鬱血性心不全を有する患者の治療に対する静脈内注射のためのみに認められている。有効であるが、ネシリチドの薬物動態学および半減期は、この製品が静脈内注射によってのみ用いることができるようなものであり、これは病院または熟練医療センター環境へのこの薬剤の使用を制限する。
【特許文献１】米国仮特許出願第60/743963号
【特許文献２】米国仮特許出願第60/743964号
【特許文献３】国際特許出願第PCT/US07/65632号
【特許文献４】米国特許第4496544号
【特許文献５】米国特許第4609725号
【特許文献６】米国特許第4656158号
【特許文献７】米国特許第4673732号
【特許文献８】米国特許第4716147号
【特許文献９】米国特許第4757048号
【特許文献１０】米国特許第4764504号
【特許文献１１】米国特許第4804650号
【特許文献１２】米国特許第4816443号
【特許文献１３】米国特許第4824937号
【特許文献１４】米国特許第4861755号
【特許文献１５】米国特許第4904763号
【特許文献１６】米国特許第4935492号
【特許文献１７】米国特許第4952561号
【特許文献１８】米国特許第5047397号
【特許文献１９】米国特許第5057495号
【特許文献２０】米国特許第5057603号
【特許文献２１】米国特許第5091366号
【特許文献２２】米国特許第5095004号
【特許文献２３】米国特許第5106834号
【特許文献２４】米国特許第5114923号
【特許文献２５】米国特許第5159061号
【特許文献２６】米国特許第5204328号
【特許文献２７】米国特許第5212286号
【特許文献２８】米国特許第5352587号
【特許文献２９】米国特許第5376635号
【特許文献３０】米国特許第5418219号
【特許文献３１】米国特許第5665704号
【特許文献３２】米国特許第5846932号
【特許文献３３】米国特許第5583108号
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【特許文献３６】米国特許第6083982号
【特許文献３７】米国特許第6124430号
【特許文献３８】米国特許第6150402号
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【特許文献６８】EPO0356124号
【特許文献６９】EPO0385476号
【特許文献７０】EPO0497368号
【特許文献７１】EPO0524863号
【特許文献７２】米国特許第5583108号
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【特許文献７５】米国特許第5672662号
【特許文献７６】米国特許第6737505号
【特許文献７７】米国特許出願公開第2004/0235734号
【特許文献７８】米国特許第5567662号
【特許文献７９】米国特許第5932462号
【特許文献８０】米国特許第5359030号
【特許文献８１】米国特許第5681811号
【特許文献８２】米国特許第6309633号
【特許文献８３】米国特許第6858580号
【特許文献８４】米国公開特許出願第2004/0203081号
【特許文献８５】米国特許第5693608号
【特許文献８６】米国特許第5977070号
【特許文献８７】米国特許第5908825号
【特許文献８８】米国特許第4938763号
【特許文献８９】米国特許第6432438号
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
開発されてきた多くの化合物にもかかわらず、市販化されているか、または活発な臨床開発にあるものは事実上存在しない。1種または複数の治療適応に有効であり、かつ好ましくは外来患者基準で投与し得る、改善された効能、半減期、投与方式、バイオアベイラビリティーまたは作用の長期持続を含む改善された特性を有する製品への実質的な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
1つの態様では、本発明では、限定されないが、ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b、またはTNP-cに対する受容体を含む、ナトリウム利尿ペプチドに対する受容体に結合する環状構築物を提供する。ここで、このような構築物には、複数のアミノ酸残基および一般式I:
【００１４】
【化１】
2009532384.tif 000003
【００１５】
(式中、RおよびR'は、それぞれ独立に、H、あるいは天然もしくは非天然のアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖部分の誘導基であり;xは、1または2であり;Yは、CH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NH、またはNR'''であり;Zは、HまたはCH3であり;nは、0、1または2であり;代用残基が構築物のC-末端位置にない場合、Jは、-C(=O)-であり、C-末端位置にある場合、Jは、-H、-OH、-C(=O)-OH、-C(=O)-NH2、またはC-末端キャッピング基であり;代用残基が構築物のN-末端位置にない場合、Qは結合であり、N-末端位置にある場合、Qは、-Hもしくはアミンキャッピング基であり;R'''は、アシル、C1〜C17直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;場合によって、アミノ残基の少なくとも1個の側鎖の反応性基、代用残基が構築物のN-末端位置にある場合のアミンキャッピング基、または代用残基が構築物のC-末端位置にある場合のC-末端キャッピング基に共有結合した少なくとも1つの補欠分子族を含み;アスタリスクを付した炭素原子は基任意の立体化学配置を有し得る)
の少なくとも1つのアミノ酸代用残基が含まれる。この構築物は、環状構築物であり、2つのアミノ酸残基の側鎖の間、アミノ酸残基の側鎖とアミノ酸代用残基のRまたはR’基との間、2つのアミノ酸代用残基のRまたはR’基の間、構築物の末端基とアミノ酸残基の側鎖との間、または構築物の末端基とアミノ酸代用残基のRまたはR’基との間の結合によって環化されている。好ましくは、その側鎖間の結合を形成している2つのアミノ酸残基は、約8〜10アミノ酸残基および場合により0個、1個、または2個のアミノ酸代用残基で隔てられている。複数のアミノ酸残基は、天然もしくは非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸、α,α-二置換アミノ酸、およびN-置換アミノ酸（これらの基の全ての(R)または(S)配置を含む）からなる群から選択される任意のアミノ酸残基を含んでいてよい。
【００１６】
補欠分子族(複数可)には、1個または複数の炭素原子および水素原子、ならびに場合によって、酸素を含む他の原子を含む繰返し単位を含むポリマー基が含まれていてよい。このようなポリマー基は、好ましくは、水溶性ポリマーであり、好ましくは、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキサゾリン、またはポリ(アクリロイルモルホリン)である。好ましいポリ(アルキレンオキシド)は、場合によって連結基で誘導体化されている、ポリ(エチレングリコール)(PEG)である。
【００１７】
1つの態様では、Jは、
-(CH2)m-OH、
-C(=O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(=O)-O-(CH2)m-CH3、
-O-(CH2)m-CH3、
-O-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-O-(CH2)m-OH、
-C(=O)-NH-(CH2)m-S(v1)、
-C(=O)-NH-(CH2)m-CH3、
-C(=O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(=O)-N-((CH2)m-N(v1)(v2))2、
-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、
-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))、または
-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)
(これらは、前記の全ての(R)または(S)配置を含み、ここで、v1およびv2は、それぞれ独立に、HまたはC1〜C17直鎖もしくは分岐のアルキル鎖であり、mは、それぞれの場合に、独立に0〜17である)
から選択されるC-末端キャッピング基である。
【００１８】
アミノ酸代用残基が構築物のC-末端位置にある別の態様では、Jは、場合によって上記に定義した通りのC-末端キャッピング基と組み合わせて、オメガアミノ脂肪族、末端アリール基もしくはアラルキル基、あるいは任意の単一の天然もしくは非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸、またはα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)からなるC-末端キャッピング基である。
【００１９】
別の態様では、Qは、
-(CH2)m-N(v3)(v4)、
-(CH2)m-CH3、
-(CH2)m-O(v3)、
-(CH2)m-C(=O)-(v3)、
-(CH2)m-C(=O)-O-(v3)、
-(CH2)m-S(v3)、
-C(=O)-(CH2)m-CH3、
-C(=O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、
-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-(v3)、
-C(=O)-(CH2)m-O(v3)、または
-C(=O)-(CH2)m-S(v3)
(ここで、v3およびv4は、それぞれ独立に、H、C1〜C17直鎖もしくは分岐のアルキル鎖またはC2〜C19直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖であり(ただし、v3またはv4の一方がアルキルアシル鎖である場合、v3またはv4の他方はHであることを条件とする)、mは0〜17である)
から選択されるアミンキャッピング基である。
【００２０】
1つの関連する態様では、式Iのアミノ酸代用残基は構築物のC末端位置にあり、RおよびR'の少なくとも一方は、天然もしくは非天然のアミノ酸側鎖部分または少なくとも1個の窒素原子を含むヘテロ原子基を有するアミノ酸側鎖部分の誘導基であり、RおよびR'の残りの一方は、H、あるいは天然もしくは非天然のアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖部分の誘導基である。
【００２１】
1つの関連する実施形態では、本発明は、限定されないが、ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-bまたはTNP-cに対する受容体を含むナトリウム利尿ペプチドに対する受容体に結合する構築物を提供する。ここで、このような構築物には、複数のアミノ酸残基と、C-末端位置またはN-末端位置以外の任意の位置にあり、2つのペプチド結合によって共有結合された、式II:
【００２２】
【化２】
2009532384.tif 000004
【００２３】
(式中、RおよびR'は、それぞれ独立に、H、あるいは天然もしくは非天然のアミノ酸側鎖部分またはアミノ酸側鎖部分の誘導基であり;xは1または2であり;YはCH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NH、またはNR'''であり;ZはHまたはCH3であり;R'''は、アシル、C1〜C17直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19直鎖または分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;nは、0、1または2であり;アスタリスクを付した炭素原子は、任意の立体化学配置を有することができ;破線は、ペプチド結合を形成する結合を示す)
の少なくとも1つのアミノ酸代用残基とが含まれる。
【００２４】
式Iの代用残基が構築物のC-末端にある場合、この代用残基は、式:
【００２５】
【化３】
2009532384.tif 000005
【００２６】
(式中、破線はペプチド結合を形成する結合を示す)
を有するように、単一のペプチド結合によって構築物に共有結合される。代用残基が構築物のN-末端にある場合は、好ましくは式Iで表され、代用残基が式:
【００２７】
【化４】
2009532384.tif 000006
【００２８】
(式中、破線はペプチド結合を形成する結合を示す)
を有するように、単一のペプチド結合によって構築物に共有結合される。しかし、代用残基が構築物のN-末端またはC-末端以外にある場合は、好ましくは式IIで表され、2つのペプチド結合によって構築物に共有結合される。
【００２９】
本発明の異なる実施形態では、1つのアミノ酸代用残基を本発明の構築物に用いてもよく、2つのアミノ酸代用残基を本発明の構築物に用いてもよく、または3つ以上のアミノ酸代用残基を本発明の構築物に用いてもよい。
【００３０】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明では、アミノ酸残基間の1つまたは複数のペプチド結合が非ペプチド結合で置換された構築物が提供される。
【００３１】
本発明の第1の目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することである。
【００３２】
本発明のもう1つの目的は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、環-拘束アミノ酸代用残基によって置換されたナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することである。
【００３３】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することであり、ここで、構築物は、哺乳類に投与する際に、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列に比べて1つまたは複数の利点を示し、利点は、酵素的分解に対する耐性増加、循環半減期増加、バイオアベイラビリティー増加、効果増加、作用の長期持続およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３４】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列の同じ濃度の最大cGMP刺激活性の少なくとも10%を有する構築物を提供することである。
【００３５】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列の同じ濃度の最大cGMP刺激活性の少なくとも50%を有する構築物を提供することである。
【００３６】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列の同じ濃度の最大cGMP刺激活性の少なくとも100%を有する構築物を提供することである。
【００３７】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列の同じ濃度の最大cGMP刺激活性の100%を超える刺激活性を有する構築物を提供することである。
【００３８】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、Ki(nM)値で測定して、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列のKi(nM)値より2 logオーダー以下高い平衡受容体結合親和性を有する構築物を提供することである。
【００３９】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、Ki(nM)値で測定して、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列のKi(nM)値の3倍以下の平衡受容体結合親和性を有する構築物を提供することである。
【００４０】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、Ki(nM)値で測定して、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列のKi(nM)値以下の平衡受容体結合親和性を有する構築物を提供することである。
【００４１】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、Ki(nM)値で測定して、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列のKi(nM)値未満の平衡受容体結合親和性を有する構築物を提供することである。
【００４２】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、ナトリウム利尿ペプチド受容体に関して、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列の受容体結合親和性を超える受容体結合親和性を有する構築物を提供することである。
【００４３】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、経時的な血圧低下または尿量増加によって測定して、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列の同じ用量と少なくとも同じであるかまたはより効果的な生物学的有効性を有する構築物を提供することである。
【００４４】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、経時的な血圧低下または尿量増加によって測定して、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列の同じ用量より効果的な生物学的有効性を有する構築物を提供することである。
【００４５】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、ナトリウム利尿ペプチドの配列と少なくとも約60%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００４６】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、ナトリウム利尿ペプチドの配列と少なくとも約80%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００４７】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-bまたはTNP-cに対する受容体に結合するペプチドの配列と少なくとも約60%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００４８】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-bまたはTNP-cに対する受容体に結合するペプチドの配列と少なくとも約80%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００４９】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、配列：H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(配列番号1)と少なくとも約60%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００５０】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、配列：H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(配列番号1)と少なくとも約80%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００５１】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、配列：H-Met-cyclo(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH2(配列番号2)(ここで、Xaaは、それぞれ独立に、環状ペプチドを一緒に形成する任意のアミノ酸残基である)と少なくとも約60%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００５２】
本発明のもう1つの目的は、ナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、配列：H-Met-cyclo(Xaa-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Xaa)-Tyr-Arg-NH2(配列番号2)(ここで、Xaaは、それぞれ独立に、環状ペプチドを一緒に形成する任意のアミノ酸残基である)と少なくとも約80%の相同性を有する構築物を提供することである。
【００５３】
本発明のもう1つの目的は、本明細書において定義された通りの代用残基を含むナトリウム利尿受容体-特異的構築物であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列が、ANPに対する受容体に結合するペプチドである構築物を提供することである。
【００５４】
本発明のもう1つの目的は、本明細書において定義された通りの代用残基を含むナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供であって、アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列は、BNPに対する受容体に結合するペプチドである構築物を提供することである。
【００５５】
本発明のもう1つの目的は、ANPまたはBNPの天然または組換え形態より大きいバイオアベイラビリティーおよび半減期を有するナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することである。
【００５６】
本発明のもう1つの目的は、鬱血性心不全を有する患者に投与し得るナトリウム受容体-特異的構築物を提供することである。
【００５７】
本発明のもう1つの目的は、静脈内投与に加えて少なくとも1の経路の投与によって投与し得るナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することである。
【００５８】
本発明のもう1つの目的は、皮下または筋肉内注射によって患者に投与し得るナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することである。
【００５９】
本発明のもう1つの目的は、分解に対する増加した耐性を有するが、受容体に対して顕著に高い結合親和性を有するナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することである。
【００６０】
本発明のもう1つの目的は、持続放出配合のナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供することである。
【００６１】
本発明の他の目的、利点および新規な特徴、ならびにさらなる利用性の範囲は、一部は以下に続く詳細な説明において添付の図を参照しながら記載され、一部は、以下の実験後当業者に明らかになり、または本発明の実施によって知ることができる。本発明の目的および利点は、特に添付の請求項で指摘される手段および組合せによって実現および達成することができる。
本明細書に組み入れられ、その一部分をなす添付の図面は、本発明の1つまたは複数の実施形態を例示するものであり、本明細書とともに本発明の原理を説明する役割を果たすものである。図面は、本発明の1つまたは複数の好ましい実施形態を説明する目的のためにすぎず、本発明を制限するものとして解釈すべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
本発明は、複数のアミノ酸残基と、少なくとも1つの環-拘束アミノ酸代用残基と、場合により少なくとも1つの補欠分子族とから構成されるナトリウム利尿受容体-特異的構築物を提供する。本発明に用いる環-拘束アミノ酸代用残基は、好ましくは、Fmocなどの保護基を用いる従来のアミノ保護N-末端と、反応性カルボキシルC-末端とを有し、したがって、従来のペプチド合成法に用いることができ、アミノ酸代用残基が構築物のC-末端位置にある場合、このような代用残基上のカルボキシル末端以外の基を用いることができることが理解される。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、必要に応じて改変したペプチド合成法を用いて合成した、複数のアミノ酸残基および少なくとも1つの環-拘束アミノ酸代用残基を含む、合成的に作製した構築物を提供する。関連する好ましい実施態様では、この構築物は、少なくとも1つの補欠分子族をさらに含む。
【００６３】
好ましい補欠分子族には、1個または複数の炭素原子および水素原子、ならびに場合によって、酸素を含む他の原子を含む繰返し単位を含むポリマー基が含まれる。このようなポリマー基は、好ましくは水溶性ポリマーであり、好ましくはポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキサゾリン、またはポリ(アクリロイルモルホリン)である。好ましいポリ(アルキレンオキシド)は、場合によって連結基で誘導体化されたポリ(エチレングリコール) (PEG)である。
【００６４】
1つの態様では、本発明は、ANPもしくはBNPなどの公知のナトリウム利尿ペプチドのホモログ、またはナトリウム利尿ペプチドの任意の公知のペプチド変異体のホモログであるアミノ酸配列を有する構築物を提供する。ここで、この構築物には、式IまたはIIのアミノ酸代用残基が少なくとも1つ含まれる。アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列は、公知のナトリウム利尿ペプチドまたは公知のペプチド変異体と同一であってもよく、それらと相同性であってもよく、例えば、少なくとも60%相同性であるか、またはより好ましくは少なくとも約80%相同性である対応するアミノ酸配列である。本明細書において、語句「アミノ酸代用残基を含まない対応するアミノ酸配列」は、ナトリウム利尿ペプチドに対する受容体に結合し、かつ代用残基を含まない公知のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を意味する。このような公知のアミノ酸配列は、1つまたは複数のアミノ酸代用残基による置換または付加を除いてアミノ酸配列が同じである場合、構築物と同一である。同様に、1つまたは複数のアミノ酸代用残基による置換または付加を除いて構築物と公知のアミノ酸配列との同一性を照合することによって、相同性を決定する。
【００６５】
別の態様では、本発明では、ナトリウム利尿ペプチドに対する受容体に結合する公知のペプチドをモデルに作られる構築物であるが、1つまたは複数のアミノ酸代用残基、例えば、公知のペプチドに含まれる1つまたは複数のアミノ酸残基の代りに置換されているか、または公知のペプチドを含む配列に加えられている代用残基を含む公構築物を提供する。公知のペプチドは、当技術分野で公知の任意のナトリウム利尿ペプチドであることができ、これらには、限定されないが、米国特許第4496544号;同第4609725号;同第4656158号;同第4673732号;同第4716147号;同第4757048号;同第4764504号;同第4804650号;同第4816443号;同第4824937号;同第4861755号;同第4904763号;同第4935492号;同第4952561号;同第5047397号;同第5057495号;同第5057603号;同第5091366号;同第5095004号;同第5106834号;同第5114923号;同第5159061号;同第5204328号;同第5212286号;同第5352587号;同第5376635号;同第5418219号;同第5665704号;同第5846932号;同第5583108号;同第5965533号;同第6028055号;同第6083982号;同第6124430号;同第6150402号;同第6407211号;同第6525022号;同第6586396号もしくは同第6818619号;米国特許出願公開第2004/0002458号;同第2004/0063630号;同第2004/0077537号;同第2005/01132860号;同第2005/0176641号;もしくは同第2006/0030004号;または国際公開第85/04870号;同第85/04872号;同第88/03537号;同第88/06596号;同第89/10935号;同第89/05654号;同第90/01940;同第90/14362号;同第92/06998号;同第95/13296号;同第99/08510号;同第99/12576号;同第01/016295号;同第2004/047871号;同第2005/072055号;EPO0291999号;同0323740号;同0341603号;同0350318号;同0356124号;同0385476号;同0497368号;または同052863号を含む様々な非米国特許および特許出願に開示されたナトリウム利尿ペプチドを含む、限定されないが、本明細書に引用される任意の刊行物、特許、出願または参考文献に開示されたものが含まれる。1つの態様では、公知のペプチドは、米国特許第4656158号、同第4824937号、同第4935492号、同第5159061号、同第5204328号、同第5376635号、同第5665704号、同第5846932号、同第6028055号、同第6407211号、同第6525022号、同第6586396号、もしくは同第6818619号、米国特許出願公開第2004/0002458号、同第2004/0063630号、もしくは同第2005/0176641号、または国際特許出願公開第2004/047871号もしくは同第2005/072055号に開示されたペプチドまたはそれらのホモログである。これらのの特許および特許出願のそれぞれの教示を、全部記載したように参照により組み込む。
【００６６】
1つの特に好ましい実施形態では、本発明では、ナトリウム利尿ペプチド受容体に結合するアミノ酸配列を含む構築物を提供する。ナトリウム利尿ペプチド受容体に結合するこのようなアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸残基は、式Iのアミノ酸代用残基で置換されている。1つの態様では、ナトリウム利尿ペプチド受容体に結合するアミノ酸配列は、置換前に、H-Met-cyclo(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(配列番号1)である。
【００６７】
さらに別の態様では、本発明は、ANPまたはBNPに対する受容体を含むナトリウム利尿ペプチドに対する受容体に結合し、式IまたはIIの少なくとも1つのアミノ酸代用残基を含む構築物であるが、ナトリウム利尿ペプチドに対する受容体に結合するいずれの公知のペプチドとも相同ではない構築物を提供する。
【００６８】
1つの実施形態では、本発明では、式IIIの環状構築物を提供する。
【化５】
2009532384.tif 000007
[式中、Aaa1は、α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはα-アミノ酸から誘導されたα,α-二置換アミノ酸であり〔Aaa1が、Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)、もしくはMet(O2)を含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはNle、Ala、Leu、Ile、Val、Arg、Phe、Lys、Tyr、Asp、Nva、Met、Met(O)、もしくはMet(O2)から誘導されるα,α-二置換アミノ酸（置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む）である場合を含む〕、あるいはAaa1は、C2〜C18の直鎖アルキル、C3〜C17の分岐アルキル、C2〜C18の直鎖アルケニルもしくはアルキニル、またはC3〜C18の分岐アルケニルもしくはアルキニルを有するアシルであるか、あるいはAaa1は、構造:
【００６９】
【化６】
2009532384.tif 000008
【００７０】
(式中、破線は、ペプチド結合を示し;RおよびR'は、独立に、H、直鎖もしくは分岐のC1〜C6脂肪族鎖、-(CH2)y-S-CH3、-(CH2)y-S(=O)-CH3、-(CH2)y-S(O2)-CH3、結合および(シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、もしくはシクロへキサン)環、またはC1〜C3脂肪族鎖および(シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、もしくはシクロへキサン)環であり;xは1または2であり;YはCH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NH、またはNR'''であり;ZはHまたはCH3であり;Qは、-H、-(CH2)m-N(v3)(v4)、-(CH2)m-CH3、-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-C(=O)-(v3)、-(CH2)m-C(=O)-O-(v3)、-(CH2)m-S(v3)、-C(=O)-(CH2)m-CH3、-C(=O)-(CH2)m-N(v3)(v4)、-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-(v3)、-C(=O)-(CH2)m-O(v3)、または-C(=O)-(CH2)m-S(v3)であり;R'''は、アシル、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;nは、0、1または2であり;mは0〜17であり;yは1〜5であり;v3およびv4は、それぞれ独立に、H、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖またはC2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖であり（但し、v3またはv4の一方がアルキルアシル鎖である場合、v3またはv4の他方はHであることを条件とする）;アスタリスクを付した炭素原子は基、任意の立体化学配置を有し得る)
のアミノ酸代用残基であり;
【００７１】
Aaa2およびAaa13は、同じであるかまたは異なって、それぞれ、Aaa2およびAaa13のそれぞれの側鎖を介して環状の橋かけを形成するL-もしくはD-異性体のアミノ酸残基であり、前記環状の橋かけは、-S-S-、-S-CH2-S-、-S-CH2-、-CH2-S-、-C(=O)-NH-、-NH-C(=O)-、-CH2-NH-、-NH-CH2-、-CH2-S(O)n-（式中nは1または2である）、-S(O)n-CH2-（式中nは1または2である）、-CH2-CH2-、-CH=CH-（EまたはZ）、-C≡C-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-C(=O)-CH2-、-CH2-C(=O)-、-O-C(=O)-NH-、-NH-C(=O)-O-、または-NH-C(=O)-NH-であり;
【００７２】
Aaa3は、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、DapもしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはHis、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa3は、構造:
【００７３】
【化７】
2009532384.tif 000009
【００７４】
(式中、RおよびR'は、独立に、H、あるいはHis、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、DapもしくはDabのアミノ酸側鎖部分であるか、またはHis、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、DapもしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基であり;xは1または2であり;yはCH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NHまたはNR'''であり;ZはHまたはCH3であり;R'''は、アシル、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;nは、0、1または2である)
のアミノ酸代用残基であり;
【００７５】
Aaa4は、(置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、または置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa4は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleのアミノ酸側鎖部分、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Nle、NvaもしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００７６】
Aaa5は、Gly、Sar、(Alaを含むかあるいはこれから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはAibであるか、あるいはAaa5は、RおよびR'が独立にHまたは-CH3であるAaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００７７】
Aaa6は、Gly、Sar、(Alaを含むかあるいはこれから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはAibであるか、あるいはAaa6は、RおよびR'が独立にHまたは-CH3である場合のAaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００７８】
Aaa7は、Arg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap、もしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはArg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Cit、Abu、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa7は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはArg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分、またはArg、His、Ala、Ser、HSer、Thr、Lys、HLys、Orn、Cys、HCys、Abu、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００７９】
Aaa8は、Gly、(Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa8は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Met(O)、Met(O2)、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００８０】
Aaa9は、Asp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはAsp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいは、Aaa9は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはAsp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分、またはAsp、Glu、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Met(O2)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００８１】
Aaa10は、Arg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはArg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa10は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはArg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Cit、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分、またはArg、His、Ala、Ser、Thr、Lys、HLys、Cys、HCys、Met(O)、Orn、Dap、もしくはDabのアミノ酸側鎖部分の誘導基である)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００８２】
Aaa11は、Gly、または(Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のD-もしくはL-異性体、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa11は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分、またはNle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００８３】
Aaa12は、Gly、(Ser、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のL-もしくはD-異性体、またはSer、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa12は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいはSer、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分、またはSer、Nle、Ile、Leu、Val、Phe、Ala、Nva、Arg、Lys、Orn、Cys、HCys、AbuもしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についてのアミノ酸代用残基と同じであり;
【００８４】
Aaa14は、(置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleを含むかあるいはこれらから誘導される)α-アミノ酸またはβ-アミノ酸のL-またはD-異性体、または(置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleから誘導される)α,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)または(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa14は、(RおよびR'が、独立に、H、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分、あるいは置換または非置換のPhe、HPheもしくはPgl、またはTyr、Leu、Ile、Val、Ala、Lys、Orn、Nle、Nva、もしくはTleのアミノ酸側鎖部分の誘導基である場合の)Aaa3についての式IIの構造のアミノ酸代用残基と同じであり;
【００８５】
Aaa15は、Ala、Arg、Orn、Lys、Dap、Dab、HArg、もしくはHLysを含むかあるいはこれらから誘導されるα-アミノ酸もしくはβ-アミノ酸のD-もしくはL-異性体、またはAla、Arg、Orn、Lys、Dap、Dab、HArg、もしくはHLysから誘導されるα,α-二置換アミノ酸(置換基が異なる場合はα,α-二置換アミノ酸の全ての(R)もしくは(S)配置を含む)であるか、あるいはAaa15は、構造:
【００８６】
【化８】
2009532384.tif 000010
【００８７】
(式中、破線は、ペプチド結合を示し;RおよびR'の少なくとも一方は、(CH2)y-R''であり、1つが(CH2)y-R''である場合はRおよびR'の残りはHであり、
R''は、
-NH2、
-NH-C(=NH)-NH2、
-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH2、
-C(=O)-NH-CH3、
-C(=O)-NH-(CH2)y-NH2、
-NH-C(=NH)-NH-Me、
-NH-C(=NH)-NH-Et、
-NH-C(=NH)-NH-Pr、
-NH-C(=NH)-NH-Pr-i、
-NH-C(=O)-CH3、
-NH-C(=O)-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-CH-(CH3)2、
-NH-C(=O)-O-CH3、
-NH-C(=O)-O-CH2-CH3、
-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-NH-C(=O)-NH-CH3、
-NH-C(=N-C(=O)-O-C-(CH3)3)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
-NH(C(=O)-O-C-(CH3)3)-C(=NH)-NH-C(=O)-O-C-(CH3)3、
【化９Ａ】
2009532384.tif 000011
【化９Ｂ】
2009532384.tif 000012
【００８８】
xは、1または2であり;Yは、CH2またはC=Oであり;Wは、CH2、NH、またはNR'''であり;ZはHまたはCH3であり;Jは、-H、-(CH2)m-OH、-C(=O)-(CH2)m-OH、-C(=O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-CH3、-O-(CH2)m-N(v1)(v2)、-O-(CH2)m-OH、-C(=O)-NH-(CH2)m-CH3、-C(=O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-NH-(CH2)m-S(v1)、-C(=O)-N-((CH2)m-N(v1)(v2))2、-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))、-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-N(v1)(v2))-(CH2)m-N(v1)(v2)、オメガアミノ脂肪族、末端アリール基またはアラルキル基、あるいは任意の単一の天然または非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸またはα,α-二置換アミノ酸とJを定義する前述の基の1つとの組合せ、あるいは任意の単一の天然または非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸またはα,α-二置換アミノ酸(前記の任意の全ての(R)および(S)配置を含む)であり;R'''は、アシル、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、C2〜C19の直鎖もしくは分岐のアルキルアシル鎖、C1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のオメガアミノ脂肪族アシルであり;v1およびv2は、それぞれ独立に、H、またはC1〜C17の直鎖もしくは分岐のアルキル鎖であり;nは、0、1または2であり;mは0〜17であり;yは1〜5であり;アスタリスクを付した炭素原子は基、任意の立体化学配置を有し得る)
のアミノ酸代用残基であり;
但し、Aaa1、Aaa3からAaa12、Aaa14、またはAaa15の少なくとも1つは、アミノ酸代用残基であることを条件とする。
【００８９】
式IIIの関連する実施形態は、Aaa1、Aaa3からAaa12、Aaa14、またはAaa15の1つ以上が上述したアミノ酸代用残基である構築物であって、以下に定義する補欠分子族が結合した構築物を提供する。この補欠分子族は、Aaa1、Aaa3からAaa12、Aaa14、またはAaa15の位置の1つ以上のアミノ酸残基の側鎖の反応性基に、Aaa3からAaa12またはAaa14の位置のアミノ酸代用残基の反応性のRまたはR’基に、Aaa1の位置のアミノ酸代用残基の末端アミン基に直接またはQ基を介して、Aaa15の位置のアミノ酸代用残基の反応性末端カルボキシル基に、あるいは、Aaa15の位置のアミノ酸代用残基のJの部分を形成する反応性基に結合する。1つまたは複数の補欠分子族が共有結合する反応性基は、第一級アミン、第二級アミン、カルボキシル基、チオール基、またはヒドロキシル基であり得る。1つの態様では、補欠分子族は、位置Aaa1、Aaa3、Aaa7、Aaa10、Aaa12、もしくはAaa15における反応性アミン、またはこれらの反応性アミンの組合せに共有結合していてよい。別の態様では、補欠分子族は、位置Aaa9もしくはAaa15、または両方における反応性カルボキシルに共有結合していてよい。別の態様では、補欠分子族は、位置Aaa3、Aaa7、Aaa9、Aaa10、Aaa11、もしくはAaa12、またはこれらの位置の組合せにおいて反応性チオールに共有結合していてよい。
【００９０】
式IIIの構築物の好ましい実施形態では、Aaa1〜Aaa15（Aaa2およびAaa13を除く）の1つ、2つ、または3つが前記式の1つのアミノ酸代用残基である。第1の特に好ましい態様では、Aaa1、Aaa5およびAaa15の1つがアミノ酸代用残基である。第2の特に好ましい態様では、Aaa1、Aaa5およびAaa15の2つがアミノ酸代用残基である。第3の特に好ましい態様では、Aaa1、Aaa5およびAaa15のそれぞれがアミノ酸代用残基である。もう1つの特に好ましい態様では、Aaa1、Aaa5およびAaa15の1つ、2つ、または3つがアミノ酸代用残基であり、その構築物は、Aaa2およびAaa13の側鎖を介するジスルフィド結合形成によって形成された環状構築物である。別の特に好ましい態様では、Aaa1〜Aaa15の2つ以上がアミノ酸代用残基である場合、アミノ酸代用残基は連続しておらず、すなわち、それぞれのアミノ酸代用残基は、一次配列において間に挿入されている少なくとも1つのアミノ酸残基によって互いに他のアミノ酸代用残基から隔てられている。
【００９１】
さらに別の好ましい実施形態では、式IIIの構築物において、Aaa3、Aaa5、Aaa6、Aaa7、Aaa9、Aaa10、またはAaa12の少なくとも1つは、AlaのL-またはD-異性体、好ましくは、AlaのL-異性体である。
【００９２】
さらに別の実施形態では、本発明は、1つまたは複数の非ペプチド結合をさらに含む式IIIの構築物を提供する。例えば、個々のLysまたはArg残基の前の未変性ペプチド結合を、非ペプチド結合、例えばアミドの等配電子体、置換アミド、またはペプチド類似結合で置き換えることによって、トリプシン様プロテアーゼに対する構築物の生体内安定性を改善するなど、分解に対する本発明の構築物の感受性を低下させるために、非ペプチド結合を用いることができる。1つの特定の実施形態では、未変性のペプチド結合を、逆の極性を有するペプチド結合で置き換えることができる。一般に、任意の非ペプチド結合を、任意の2つの残基間で用いるかまたは利用することができる。非ペプチド結合には、2つの残基間の結合に関与する炭素原子が、カルボニル炭素からメチレン炭素、例えば、非ペプチド結合-CH2-NH-またはその等配電子体-NH-CH2-に還元される結合が含まれ、あるいは他の結合、例えば、-CH2-S-、-CH2-O-、もしくは-C(=O)-CH2-または前記のいずれかの結合の等配電子体、または-CH2-CH2-もしくは-CH=CH-を利用することができる。一般に、非ペプチド結合には、イミノ、エステル、ヒドラジン、セミカルバジド、オキシム、またはアゾ結合が含まれる。
【００９３】
上述により定義した構築物には、1つまたは複数の補欠分子族が含まれ得る。補欠分子族は、循環における滞留時間を調節するため、バイオアベイラビリティーを調節するため、構築物の免疫原性を調節するためなどに用いることができる。一般に、補欠分子族は、滞留時間、バイオアベイラビリティーなどを増加させることによって「調節」するが、補欠分子族は、場合によって、滞留時間、バイオアベイラビリティーなどを場合によって減少させ得る。したがって、「補欠分子族」には、構築物の薬物動態特性または薬力学特性を改善する目的で、構築物についての任意の式の構築物に例えば共有結合によって結合された、任意の化合物が含まれる。好ましい補欠分子族は、1個または複数の炭素原子および水素原子、ならびに場合によって、酸素原子を含む他の原子を含む繰返し単位を含むポリマー基である。このようなポリマー基は、好ましくは水溶性ポリマーであり、好ましくはポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキサゾリン、またはポリ(アクリロイルモルホリン)である。好ましいポリ(アルキレンオキシド)は、ポリ(エチレングリコール) (PEG)である。PEGに加えて、他のポリ(アルキレングリコール)ポリマー、例えば、ポリ(プロピレングリコール)およびポリ(ブチレングリコール)を用いることができる。
【００９４】
1つの実施形態では、補欠分子族は、構築物の反応性基に共有結合した1つまたは複数のPEGポリマーである。PEGポリマー、または、他の補欠分子族を、1つまたは複数のアミノ酸残基の側鎖上の反応性基に共有結合させることができ、あるいはアミノ酸代用残基上の反応性基に共有結合させることができる。アミノ酸代用残基のこのような反応性基には、QまたはJに直接にまたは1つもしくは複数の中間基を介して共有結合した基が含まれ、あるいは、RまたはR'の一部を形成する反応性基が含まれ得る。
【００９５】
PEGを補欠分子族として用いる場合、このPEGポリマーは、約200MWから約50000MWの分子量を有し得る。PEGポリマーは、線状であってもよく、線状である場合は、単官能性(一端に反応性基および他端に非反応性基を有する)、同一二官能性(それぞれの端に同一の反応性基を有する)、または異種二官能性(それぞれの端に異なる反応性基を有する)であってよい。あるいは、PEGポリマーは、分岐であってよく、一般に「Y」形配置、多枝、例えば、2つ、3つ、4つまたは8つの枝、あるいは当技術分野で公知の他の配置を有する。PEGポリマーは、好ましくは、式IIIからXIIIの任意の構築物上の1つまたは複数の規定された基に、好ましくは共有結合によって結合するための少なくとも1個の誘導化反応性基を有する。この誘導体化反応性基は、構築物上（アミノ酸残基の末端基上、アミノ酸残基の側鎖上、代用残基のQ基上、代用残基のJ基上、または代用残基のRもしくはR'基上を含む）の、例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、またはカルボキシルに結合することができる。
【００９６】
PEGポリマーは、好ましくは、一端において、末端封止基、例えば、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ、または置換アリールオキシなどを有する。このPEGポリマーは、さらに好ましくは、少なくとも1つの他端において誘導体化反応性基を有する。1つの実施形態では、PEGポリマーは、末端ヒドロキシル基を有する線状または分岐状のポリエーテル、例えば、モノメトキシPEGであり、これを、連結基、例えば、アミン、マレイミド、またはカルボン酸を用いて誘導体化する。構築物の利用可能な反応性基が、PEGポリマー上で用いる誘導体化連結基を決定づける。したがって、1つの実施形態では、構築物のN-末端アミンを用い、カルボン酸誘導体化PEGを用いる。別の実施形態では、構築物のC-末端アミンを用い、再度カルボン酸誘導体化PEGを用いる。さらに別の実施形態では、Lys残基またはそのホモログが構築物に存在する場合、そのαまたはεアミノ基を用いることができ、再度カルボン酸誘導体化PEGを用いる。マレイミド誘導体化PEGは、構築物上の反応性チオール基またはヒドロキシル基のいずれかと共に用いることができる。同様に、アミン誘導体化PEGは、任意の末端基もしくはアミノ酸残基の側鎖上、代用残基のQ基上、代用残基のJ基上、または代用残基のRもしくはR'基上の反応性カルボキシル基と共に用いることができる。
【００９７】
したがって、1つの態様では、PEGは、1個または複数の求電子性基で活性化され、側鎖のεアミノ基またはN-末端もしくはC-末端アミンへのカップリングを含む、構築物のアミノ基へのカップリングのために用いることができる。代表的な求電子性反応性基には、米国特許第5672662号および同第6737505号に開示されているようなスクシンイミジルα-メチルブタン酸エステルおよび他のα-メチル酪酸エステルが含まれ、米国特許出願公開第2004/0235734号に開示されているようにタンパク質と共に用いることができる。あるいは、スクシンイミジルプロピオン酸エステルは、米国特許第5567662号に開示されるように反応性基として用いることができ、またはN-ヒドロキシスクシンイミドは、米国特許第5932462号に開示されるように分岐のPEGと共に用いることができる。前述の特許および特許出願のそれぞれの教示を、全部を記載したように参照により組み込む。
【００９８】
別の態様では、PEGポリマーは、1個または複数の反応性アルデヒド基を備え、末端第一級アミン、例えば、N-末端またはC-末端アミンにカップリングさせるために用いられる。別の態様では、PEGポリマーは、1個または複数のチオール反応性基、例えば、マレイミド、オルト-ピリジルジスルフィド、またはチオール基を備え、式III〜XIIIのいずれかの構築物における反応性チオール、例えば、システイン側鎖における反応性チオールまたは構築物のQ基内の反応性チオールなどにカップリングさせるために用いられる。
【００９９】
1つの態様では、国際公開第2004/047871号またはこれらに引用された任意の参考文献に開示されているような任意の方法、結合体、もしくはスキームを、本発明の構築物と共に用いることができる。これらの特許出願の教示を、全部が記載したように参照により組み込む。
【０１００】
一般に、化学的修飾のいくつかの形態を、反応性基を有する活性PEG誘導体を作製するために用いることができる。反応性基は、活性炭酸エステル、活性エステル、アルデヒド、またはトレシレートであり得る。ある程度、PEGの反応性基が、PEG誘導体が結合するアミノ酸末端基または側鎖部分を決定する。一般に、得られる構築物が均一であり、生物学的活性の喪失を最小化し、免疫原性を減少させるため、部位特異的ペグ化が1つには好ましい。
【０１０１】
1つの実施形態では、PEGは、約200MW〜約50,000MW、より好ましくは約2,000MW〜約20,000MWの分子量を有する。別の実施形態では、モノメトキシPEG、例えば、式CH3-O(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OHまたはCH3-O(CH2-CH2-O)n-H(式中、nは、2〜約1200の任意の整数である)を用い、好ましくは、アミン、マレイミド、またはカルボン酸連結基で誘導体化して用いる。
【０１０２】
別の実施形態では、補欠分子族、例えば、PEGを、Veronese FMおよびPasut G. PEGylation、successful approach to drug delivery. Drug Discovery Today 10:1451〜1458頁(2005年)に記載されるような酵素的に不安定なリンカーによって構築物に結合させる。ここに開示された方法を、参照により本明細書に組み込む。
【０１０３】
別の実施形態では、用いる補欠分子族は、米国特許第5359030号および同第5681811号に開示されているような、脂肪親和性部分および親水性ポリマー部分の両方を有するポリマーである。関連する実施形態では、用いる補欠分子族は、米国特許第6309633号に開示されているような、加水分解可能な結合（例えば、エステル結合など）によって結合された、親水性成分（例えば、PEGポリマーなど）および脂肪親和性成分（例えば、分岐の脂肪酸またはアルキル鎖など）を有するオリゴマー結合体である。もう1つの関連する実施形態では、用いる補欠分子族は、米国特許第6858580号に開示されているような、ポリ(プロピレングリコール)、好ましくは少なくとも2つのポリ(プロピレングリコール)サブユニットを含むオリゴマーである。これらの個々の特許および特許出願の教示を、全て記載したように参照により組み込む。
【０１０４】
さらに別の実施形態では、米国特許出願公開第2004/0203081号の教示を参照により本明細書に組み込む。この出願には、様々なナトリウム利尿化合物に結合した「修飾部分」と称される補欠分子族、特に、様々な長さおよび配置を有するオリゴマー構造に関連する教示が特に含まれている。関連する実施形態では、国際公開第2004/047871号の教示を参照により組み込まむ。この出願には、NPRAに結合するナトリウム利尿分子に「修飾部分結合部位」を使って結合した「修飾部分」に関連する教示が含まれる。同様な方法が、他のナトリウム利尿受容体に結合するナトリム利尿分子と共に用いられ得ることが理解される。
【０１０５】
明細書および特許請求の範囲を通して使用する特定の用語を、以下に定義する。
【０１０６】
本発明の「構築物」および「アミノ酸残基配列」は、a)天然に存在する、b)化学合成によって生成させる、c)組換えDNA技術によって生成させる、d)比較的大きい分子の生化学的または酵素的断片化によって生成させる、e)上記方法a)からd)の組合せから得られる方法によって生成させる、あるいはf)ペプチドもしくはアミノ酸配列を生成させる任意の他の方法によって生成させるものであってよい。
【０１０７】
好ましい製造方法である化学合成を用いることによって、天然に存在しない様々なアミノ酸を構築物に導入する、N-末端またはC-末端を修飾するなどが可能になり、これによって、改善された安定性および配合、プロテアーゼ分解抵抗性などがもたらされ、構築物中に1つまたは複数のアミノ酸代用残基を導入することが可能になる。
【０１０８】
本明細書および特許請求の範囲を通して用いる用語「ペプチド」は、アミノ酸の化学的修飾および誘導体を含むアミノ酸を2つ以上含む任意の構造を含むことが意図される。ペプチドの全てまたは一部を形成するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、このようなアミノ酸の立体異性体および修飾体、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素修飾アミノ酸などであってよい。用語「ペプチド」には、ペプチドのダイマーまたはマルチマーも含まれる。「製造された」ペプチドには、化学合成、組換えDNA技術、比較的大きい分子の生化学的もしくは酵素的断片化、これらのの組合せによって生成させた、または一般に、任意の他の方法によって作製したペプチドが含まれる。
【０１０９】
本明細書および特許請求の範囲で用いたものを含み、本発明に用いる用語「アミノ酸側鎖部分」には、本明細書において定義した用語「アミノ酸」と同様に、任意のアミノ酸の任意の側鎖が含まれる。したがって、これには、天然に存在するアミノ酸に存在する側鎖部分が含まれる。これには、天然に存在するタンパク質アミノ酸の修飾体（例えば、グリコシル化アミノ酸など）の側鎖部分がさらに含まれる。これには、天然に存在するタンパク質アミノ酸、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、アミノ酸を模倣するべく設計された構築物または構造などの立体異性体および修飾体の側鎖部分がさらに含まれる。例えば、本明細書において開示する任意のアミノ酸の側鎖部分は、この定義の範囲内に含まれる。以下に定義する「アミノ酸側鎖部分の誘導基」は、アミノ酸側鎖部分のこの定義の範囲内に含まれる。
【０１１０】
「アミノ酸側鎖部分の誘導基」は、任意のアミノ酸側鎖部分への修飾またはそれにおける変形であり、これには、天然に存在するアミノ酸または非天然のアミノ酸の側鎖部分のいずれかへの修飾またはそれにおける変形が含まれ、ここで、修飾または変形には、(a)既存のアルキル、アリール、またはアラルキル鎖に1個または複数の飽和または不飽和炭素原子を加えること;(b)側鎖中の炭素を別の原子、好ましくは酸素または窒素に置換すること;(c) メチル(-CH3)、メトキシ(-OCH3)、ニトロ(-NO2)、ヒドロキシル(-OH)、またはシアノ(-C≡N)を含む側鎖の炭素原子に末端基を付加すること;(d)ヒドロキシ、チオールまたはアミノ基を含む側鎖部分に、好適なヒドロキシ、チオールまたはアミノ保護基を付加すること;あるいは、(e)環構造を含む側鎖部分について、1個または複数の置換基(ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、または直接もしくはエーテル結合を介して結合したアリール基を含む)を付加することが含まれる。アミノ基のための、好適なアミノ保護基には、これらだけに限定されないが、Z、Fmoc、Boc、Pbf、Pmcなどが含まれる。
【０１１１】
本発明の実施形態に用いる「アミノ酸」、および本明細書および特許請求の範囲に用いる用語には、公知の天然に存在するタンパク質アミノ酸が含まれ、これらは、それらの一般の三文字略語および一文字略語の両方によって言及される。Synthetic Peptides :A User's Guide、G.A.Grant編、W.H.Freeman & Co.、New York(1992年)(11〜24頁に記載された本文および表を含むこれらの教示を、参照により本明細書に組み込む)を参照されたい。「アミノ酸」には、従来のα-アミノ酸が含まれ、β-アミノ酸、α,α-二置換アミノ酸、およびN-置換アミノ酸(ここで、少なくとも1つの側鎖は、本明細書に定義した通りのアミノ酸側鎖部分である)がさらに含まれる。「アミノ酸」には、N-アルキルα-アミノ酸がさらに含まれ、この場合においてN-末端アミノ基は、C1〜C6直鎖または分岐のアルキル置換基を有する。したがって、用語「アミノ酸」には、天然に存在するタンパク質アミノ酸、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、アミノ酸を模倣すべく設計された構築物または構造などの立体異性体および修飾体が含まれることが理解されるであろう。修飾および異形アミノ酸は、Synthetic Peptides: A User's Guide、上記に引用; Hruby V. J.、Al-obeidi F.、Kazmierski W.、Biochem. J.、268:249〜262頁(1990年);およびToniolo C.、Int. J. Peptide Protein Res. 35:287〜300頁(1990年)に一般的に記載されている;これらの全ての教示を参照により本明細書に組み込む。さらに、アミノ酸ならびにその保護基および修飾基を含む以下の略語は以下に記載する意味を有する:
Abu      - ガンマ-アミノ酪酸
12-Ado   - 12-アミノドデカン酸
Aib      - アルファ-アミノイソ酪酸
6-Ahx    - 6-アミノへキサン酸
Amc      - 4-(アミノメチル)-シクロヘキサンカルボン酸
8-Aoc    - 8-アミノオクタン酸
Bip      - ビフェニルアラニン
Boc      - t-ブトキシカルボニル
Bzl      - ベンジル
Bz       - ベンゾイル
Cit       - シトルリン
Dab      - ジアミノ酪酸
Dap      - ジアミノプロピオン酸
Dip      - 3,3-ジフェニルアラニン
Disc      - 1,3-ジヒドロ-2H-イソインドールカルボン酸
Et        - エチル
Fmoc     - フルオレニルメトキシカルボニル
Hept     - ヘプタノイル(CH3-(CH2)5-C(=O)-)
Hex      - ヘキサノイル(CH3-(CH2)4)-C(=O)-)
HArg     - ホモアルギニン
HCys     - ホモシステイン
HLys     - ホモリシン
HPhe     - ホモフェニルアラニン
HSer     - ホモセリン
Me       - メチル
Met(O)   - メチオニンスルホキシド
Met(O2)  - メチオニンスルホン
Nva      - ノルバリン
Pgl      - フェニルグリシン
Pr       - プロピル
Pr-i      - イソプロピル
Sar      - サルコシン
Tle      - tert-ブチルアラニン
Z        - ベンジルオキシカルボニル
【０１１２】
本発明による構築物のリストにおいて、従来のアミノ酸残基は、Manual of Patent Examining Procedure、第8版の2400章に与えられるような従来の意味を有する。したがって、「Nle」は、ノルロイシンであり;「Asp」は、アルパラギン酸であり;「His」は、ヒスチジンであり;「Arg」は、アルギニンであり;「Trp」は、トリプトファンであり;「Lys」は、リシンであり;「Gly」は、グリシンであり;「Pro」は、プロリンであり;「Tyr」は、チロシンであり;「Ser」は、セリンであるなどである。全ての残基は、D-アラニンについて「D-Ala」におけるようにD-異性体が特定されない限り、L-異性体配置にある。
【０１１３】
天然に存在するタンパク質アミノ酸、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、これらのいずれかから誘導されたα,α-二置換アミノ酸(すなわち、少なくとも1つの側鎖がそれが誘導された残基の側鎖と同じであるα,α-二置換アミノ酸)、これらのいずれかから誘導されたβ-アミノ酸(すなわち、β-炭素の存在を除いて、ほかの点ではそれが誘導化される残基と同じであるβ-アミノ酸)などの立体異性体および修飾体（前述の全てのアミノ酸を含む）は、本明細書において「残基」と呼ぶこともある。
【０１１４】
「α,α-二置換アミノ酸」には、α-位置にさらなる置換基を有する任意のα-アミノ酸が含まれ、この置換基は、α-アミノ酸の側鎖部分と同じであってもよいし、異なっていてもよい。α-アミノ酸の側鎖部分に加えて、好適な置換基には、C1〜C6直鎖または分岐のアルキルが含まれる。Aibは、α,α-二置換アミノ酸の一例である。α,α-二置換アミノ酸は、従来のL-およびD-異性体対照標準を用いて言及することができる一方、このような対照標準は便宜のためであり、α-位置における置換基が異なる場合、このようなアミノ酸は、必要に応じて、指定されたアミノ酸側鎖部分を有する残基のL-またはD-異性体から誘導されるα,α-二置換アミノ酸と同義的に称し得る。したがって、(S)-2-アミノ-2-メチル-ヘキサン酸は、L-Nleから誘導されたα,α-二置換アミノ酸またはD-Alaから誘導されたα,α-二置換アミノ酸のいずれかと称し得る。同様に、Aibは、Alaから誘導されたα,α-二置換アミノ酸と称し得る。α,α-二置換アミノ酸を示す場合はいつも、その全ての(R)および(S)配置を含むことが理解されるべきである。
【０１１５】
「N-置換アミノ酸」には、アミノ酸側鎖部分が骨格アミノ基に共有結合した、場合によりα-炭素位置にH以外の置換基が存在しない、任意のアミノ酸が含まれる。サルコシンは、N-置換アミノ酸の一例である。一例として、サルコシンは、AlaのN-置換アミノ酸誘導体と称することができ、ここで、サルコシンのアミノ酸側鎖部分とAlaとは、同じであり、メチルである。
【０１１６】
用語「アミノ酸代用残基」には、残基の模倣物である本明細書に開示される分子が含まれ、限定されないが、ピペラジンコア分子、ケト-ピペラジンコア分子、およびジアゼピンコア分子が含まれる。他に特記しない限り、アミノ酸代用残基は、カルボキシル基とアミノ基の両方、およびアミノ酸側鎖に対応する基を含む。すなわち、グリシンのアミノ酸代用残基の場合は、水素以外の側鎖を含まないと理解される。したがって、アミノ酸代用残基には、上記式IまたはIIの一般式の分子が含まれる。アミノ酸代用残基には、以下の構造の任意の分子がさらに含まれる。便宜のために、このような構造を、その単離された代用残基として示す。これらの構造は、いかなる保護基も含まず、かつ本発明の構築物の一部を形成する1つまたは2つのアミノ酸残基に1つまたは2つのペプチド結合によって結合されていないと理解される。
【０１１７】
【化１０】
2009532384.tif 000013
【０１１８】
(式中、R、R'、xおよびアスタリスクは、式Iの代用残基について定義した通りである)。アミノ酸代用残基には、以下の構造の任意の分子がさらに含まれる。再度、便宜のために、このような構造を、その単離された代用残基として示す。これらの構造は、いかなる保護基も含まず、かつ本発明の構築物の一部を形成する1つまたは2つのアミノ酸残基に1つまたは2つのペプチド結合によって結合されていないと理解される。
【０１１９】
【化１１】
2009532384.tif 000014
【０１２０】
(式中、R、R'、xおよびアスタリスクは、式Iの代用残基について定義した通りである)。合成のために、任意のアミノ酸代用残基のカルボキシル基またはアミノ基のいずれかは、好ましくは、保護基によって保護され、保護基が存在する間、反応性でないようにし、同様に、RまたはR’の一部を形成する任意の反応性基は、同様に、保護基によって保護されていてもよい。本発明の代用残基は、2つ以上の不斉中心を有し、したがって、2つ以上の立体異性形態で存在することができる。化合物のいくつかは、幾何異性体および回転異性体として存在していてもよい。さらに、本発明のいくつかの化合物は、アトロプ異性体を生じる立体配座軸性キラリティーを有してもよい。本発明は、これらの形態のそれぞれに個別に、およびラセミ体を含むその混合物に及ぶ。1つの態様では、代用残基異性体は、クロマトグラフィー法によって、または分割剤を用いて従来の方法で分離することができる。別の態様では、個別の代用残基異性体、すなわち光学異性体的に純粋な代用残基は、合成スキーム、例えば、キラル中間体、試薬または触媒を使用する不斉合成を用いて、本明細書において開示される合成スキーム、またはこのようなスキームの変形によって調製される。
【０１２１】
用語「C-末端キャッピング基」には、構築物のC-末端の末端環炭素原子、または与えられる場合、末端カルボキシル基を介して結合した任意の末端基が含まれる。末端環炭素原子、または与えられる場合、末端カルボキシル基は、残基の一部を形成していてもよく、またはアミノ酸代用残基の一部を形成していてもよい。好ましい態様では、C-末端キャッピング基は、構築物のC-末端位置にあるアミノ酸代用残基の一部を形成する。C-末端キャッピング基には、これらだけに限定されないが、-(CH2)n-OH、-(CH2)n-C(=O)-OH、-(CH2)m-OH、-(CH2)n-C(=O)-N(v1)(v2)、-(CH2)n-C(=O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-(CH2)n-O-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(=O)-NH-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(=O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、-(CH2)n-C(=O)-N-((CH2)m-N(v1)(v2))2、-(CH2)n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))、もしくは-(CH2)n-C(=O)-NH-CH(-C(=O)-NH2)-(CH2)m-N(v1)v2)(これらの全ての(R)または(S)配置を含み、ここで、v1およびv2は、それぞれ独立に、H、C1〜C17直鎖もしくは分岐のアルキル鎖、mは0〜17、nは0〜2である);または任意のオメガアミノ脂肪族、末端アリールもしくはアラルキル(例えば、メチル、ジメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、アリル、シクロプロパンメチル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、アセチル、プロピオノイル、ブタノイル、フェニルアセチル、シクロヘキシルアセチル、ナフチルアセチル、シンナモイル、フェニル、ベンジル、ベンゾイル、12-Ado、7'-アミノヘプタノイル、6-Ahx、Amc、または8-Aocを含む)、あるいは任意の単一の天然もしくは非天然のα-アミノ酸、β-アミノ酸、またはα,α-二置換アミノ酸(前記の全ての(R)または(S)配置を含む)（場合によって、前記の非アミノ酸キャッピング基と任意に組み合わせたもの）である。前記において、例えば、-C(=O)-NH-(CH2)m-NH-C(=O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))は、以下であることが理解されるべきである:
【０１２２】
【化１２】
2009532384.tif 000015
【０１２３】
用語「N-末端キャッピング基」には、構築物のN-末端の末端アミンを介して結合した任意の末端基が含まれる。末端アミンは、残基の一部を形成していてもよいし、またはアミノ酸代用残基の一部を形成していてもよい。好ましい態様では、N-末端キャッピング基は、構築物のN-末端位置にあるアミノ酸代用残基の一部を形成する。N-末端キャッピング基には、これらだけに限定されないが、任意のオメガアミノ脂肪族、アシル基または末端アリールもしくはアラルキル(例えば、メチル、ジメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、アリル、シクロプロパンメチル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、アセチル、プロピオノイル、ブタノイル、フェニルアセチル、シクロヘキシルアセチル、ナフチルアセチル、シンナモイル、フェニル、ベンジル、ベンゾイル、12-Ado、7'-アミノヘプタノイル、6-Ahx、Amc、または8-Aocの基を含む)が含まれ、あるいは、N-末端キャッピング基は、-(CH2)m-NH(v3)、-(CH2)m-CH3、-C(=O)-(CH2)m-CH3、-C(=O)-(CH2)m-NH(v3)、-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-OH、-C(=O)-(CH2)m-C(=O)-(v4)、-(CH2)m-C(=O)-OH、-(CH2)m-C(=O)-(v4)、C(=O)-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-O(v3)、C(=O)-(CH2)m-S(v3)、もしくは-(CH2)m-S(v3)であり、ここで、v3は、HまたはC1〜C17直鎖もしくは分岐のアルキル鎖であり、v4は、C1〜C17直鎖もしくは分岐のアルキル鎖であり、mは0〜17である。
【０１２４】
フェニル環に、ヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、または、直接もしくはエーテル連結基を介して結合したアリール基を独立に含む1個または複数の置換基が含まれる場合、フェニル環は「置換されて」いる。フェニル環がこのように置換されている場合、そのアミノ酸残基は、置換Phe、置換HPheまたは置換Pglにおけるように置換されていると称し得る。
【０１２５】
用語「アルケン」には、1個または複数の炭素-炭素二重結合を含む不飽和炭化水素が含まれる。アルケン基の例には、エチレン、プロペンなどがある。
【０１２６】
用語「アルケニル」には、少なくとも1個の二重結合を含む、2〜6個の炭素原子の直鎖一価炭化水素基または3〜6個の炭素原子の分岐一価炭化水素基が含まれ;その例には、エテニル、2-プロペニルなどがある。
【０１２７】
本明細書において特定される「アルキル」基には、直鎖または分岐の配置のいずれかの指定した長さのアルキル基が含まれる。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシルなどがある。
【０１２８】
用語「アルキニル」には、少なくとも1つの三重結合を含む、2〜6個の炭素原子の直鎖一価炭化水素基または3〜6個の炭素原子の分岐一価炭素原子基が含まれ;その例には、エチニル、プロピニル、ブチニルなどがある。
【０１２９】
用語「アリール」には、6〜12個の環原子の単環式または二環式芳香族炭化水素基(場合によって、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ニトロ、アシル、シアノ、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはアルコキシ-カルボニルから選択される1個または複数の置換基で独立に置換された基)が含まれる。アリール基の例には、フェニル、ビフェニル、ナフチル、1-ナフチル、および2-ナフチル、これらの誘導体などが含まれる。
【０１３０】
用語「アラルキル」には、基-RaRbが含まれ、ここで、Raは、アルキレン(二価アルキル)基であり、Rbは、上述により定義した通りのアリール基である。アラルキル基の例には、ベンジル、フェニルエチル、3-(3-クロロフェニル)-2-メチルフェニルなどが含まれる。
【０１３１】
用語「脂肪族」には、炭化水素鎖、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、およびこれらの誘導体などを有する化合物が含まれる。
【０１３２】
用語「アシル」には、基R-C(=O)-が含まれ、ここで、Rは有機基である。一例は、アセチル基CH3-C(=O)-であり、本明細書において「Ac」と称する。
【０１３３】
上述により定義した通りのアリール、アルキル、または置換アルキル基が、1個または複数のカルボニル{-(C=O)-}基を介して結合されている場合、ペプチドまたは脂肪族部分は、「アシル化」されている。ペプチドは、N-末端で最も普通にアシル化される。
【０１３４】
「オメガアミノ脂肪族」には、末端アミノ基を有する脂肪族部分が含まれる。オメガアミノ脂肪族の例には、7'-アミノ-ヘプタノイルならびにオルニチンおよびリシンのアミノ酸側鎖部分が含まれる。
【０１３５】
用語「ヘテロアリール」には、窒素、酸素、および硫黄から選択される1〜4個のヘテロ原子を含む単環式および二環式芳香族環が含まれる。5-または6-員ヘテロアリールは、単環式ヘテロ芳香族環であり;その例には、チアゾール、オキサゾール、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、トリアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、などが含まれる。二環式ヘテロ芳香族環には、限定されないが、ベンゾチアジアゾール、インドール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンズイミダゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、ベンゾトリアゾール、ベンズオキサゾール、イソキノリン、プリン、フロピリジン、およびチエノピリジンなどが含まれる。
【０１３６】
「アミド」には、カルボニル基(-C(=O)-NH2)、例えば、メチルアミド、エチルアミド、プロピルアミドなどに結合した三価窒素を有する化合物が含まれる。
【０１３７】
「イミド」には、イミド基(-C(=O)-NH-C(=O)-)を含む化合物が含まれる。
【０１３８】
「アミン」には、アミノ基(-NH2)を含む化合物が含まれる。
【０１３９】
「ニトリル」には、カルボン酸誘導体であり、有機基に結合した(-CN)基を含む化合物が含まれる。
【０１４０】
用語「ハロゲン」は、ハロゲン原子フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素、ならびに1個または複数のハロゲン原子を含む基（例えば、-CF3など）を含むことを意図する。
【０１４１】
医薬組成物におけるように、用語「組成物」は、活性化合物(複数可)、およびその担体を構成する不活性成分(複数可)、ならびに、任意の2種以上の成分の組合せ、錯化、もしくは凝集から、1種もしくは複数の成分の解離から、あるいは1種もしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接に生じる任意の生成物を含む生成物を包含することを意図する。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の構築物と医薬的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。
【０１４２】
用語「EC50」は、そのアゴニストについての最大可能反応の50%を生じるアゴニストのモル濃度を含むことを意図する。一例として、cGMPアッセイにおいて測定して、濃度72nMでその構築物に対する最大可能反応の50%を生じる構築物は、72nMのEC50を有する。別に特記されない限り、EC50測定と関連するモル濃度は、ナノモル(nM)で表す。
【０１４３】
用語「Ki(nM)」は、競合相手の不存在下における平衡状態での受容体の結合部位の半分に結合する競合化合物のモル濃度を表す平衡受容体結合親和性を包含することを意図する。一般に、Kiは、Kiが低い場合、その親和性が高くなるように、受容体に対する化合物の親和性と逆相関している。Kiは、ChengおよびPrusoffの下記式(CHeng Y.、Prusoff W.H.、Biochem. Pharmacol.、22:3099〜3108頁(1973年))：
【０１４４】
【数１】
2009532384.tif 000016
【０１４５】
(式中、「リガンド」は、放射性リガンドであってもよいリガンドの濃度であり、Kdは、50%受容体占有を生じる受容体親和性の逆測定値である)
を用いて決定することができる。特に指定しない限り、Ki決定に関連するモル濃度は、nMである。
【０１４６】
本明細書において用いる化学命名規則および構造図は、ChemDrawプログラム(Cambridgesoft Corp.、Cambridge、Mass.から入手可能)によって利用されるような化学命名特徴を用いるか、またはそれに依存する。特に、特定の化合物の名称は、Chemdraw Ultra  またはISISベース(MDL Corp.)によって利用されているAutonomプログラムを用いて構造から導いた。一般に、構造図には、末端基および他の特別の状況における以外、炭素原子と結合した水素原子は描かない。
【０１４７】
表1および表2に含まれるものなどの本明細書における特定の構造図および図面は、構造図によって識別される代用残基および三文字略語によって識別されるアミノ酸残基を用いて、アミノ酸代用残基およびアミノ酸残基から構成される構築物を描く。特に指定しない限り、代用残基と残基との間の結合、または残基と代用残基との間の結合、またはそのN-末端上およびC-末端上の両方における代用残基と残基との間の結合は、従来のペプチド結合、-C(=O)-NH-であるか、またはペプチド結合が代用残基のN-末端上の環窒素への結合である場合、-C(=O)-N-である。一般に、このような結合の描写において、アミノ酸代用残基の原子は、描かれるが(例えば、-C(=O)-または-N)、アミノ酸残基の原子は描かれない。
【０１４８】
配合および利用性
本明細書に開示する構築物は、医療用途および動物畜産または獣医用途の両方に用いることができる。通常、構築物、または構築物を含む医薬組成物は、ヒトに用いられるが、他の哺乳動物にも用いることができる。用語「患者」は、哺乳類個体を意味することを意図し、本明細書を通しておよび特許請求の範囲においてそのように用いる。本発明の主な適用にヒト患者が含まれるが、本発明は、実験室、農場、動物園、野生生物、ペット、スポーツまたは他の動物に適用することもできる。
【０１４９】
本明細書に開示される構築物は、抗高血圧、心臓血管、腎臓、および/または内分泌作用の誘発が望まれる任意の状態、症候群、または疾患の治療に用いることができる。これには特に、未変性ナトリウム利尿ペプチドが用いられ得る任意の状態、症候群、または疾患が含まれる。したがって、本明細書に開示する構築物は、患者における望ましいナトリウム利尿、利尿作用、および/または血管拡張を起こすために用いることができる。
【０１５０】
1つの態様では、本明細書に開示する構築物は、早期、例えば、クラス1の鬱血性心不全の治療に用いられる。別の態様では、本明細書に開示される構築物は、慢性または非代償性鬱血性心不全の治療に用いられる。別の態様では、本明細書に開示する構築物は、安静時呼吸困難または最小活動度を有する患者の急性非代償性鬱血性心不全を含む急性鬱血性心不全の治療に用いられる。
【０１５１】
構築物の塩形態。本発明の構築物は、任意の医薬的に許容可能な塩の形態であることができる。用語「医薬的に許容可能な塩」は、無機または有機の塩基と無機または有機の酸とを含む医薬的に許容可能な非毒性塩基または酸から調製される塩をいう。無機塩基から誘導される塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩などがある。アンモニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、およびナトリウムの塩が特に好ましい。医薬的に許容される有機非毒性塩基由来の塩には、第一級、第二級、および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂(例えば、アルギニン)、ベタイン、カフェイン、コリン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イロプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどがある。
【０１５２】
本発明の構築物が塩基性である場合、酸付加塩は、無機酸および有機酸を含む医薬的に許容される非毒性酸から調製され得る。このような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、カルボン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、マロン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、プロピオン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、p-トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などがある。本発明の構築物の酸付加塩は、好適な溶媒中、構築物と、過剰の酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸、またはメタンスルオン酸とから調製される。酢酸塩形態が特に有用である。本発明の実施形態の構築物が酸性部分を含む場合、好適な医薬的に許容される塩には、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩、あるいはアルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩が含まれ得る。
【０１５３】
さらに、パモン酸塩、オクタン酸塩、デカン酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、タンニン酸ナトリムおよびパルミチン酸塩形態を含む、本発明のペプチド構築物の特定の塩形態が、一部の症例で対応する酢酸塩形態に対して2倍の循環半減期増加を示すことを出願人らは有利に発見した。これらの塩形態は、比較的長い半減期の結果として達成することができる投与頻度減少により、特に長期にわたる治療のための皮下注射または筋内注射による投与に、特に適切である。理論によって制限されないが、半減期増加は、酢酸塩形態に比べての溶解度の減少に関係していることが考えられる。本発明のペプチド構築物の半減期増加の塩形態は、例えば、イオン交換、構築物の酢酸塩形態溶液とパモン酸二ナトリウムとを混合してパモン酸塩懸濁液を形成すること、または構築物の製造における最終精製工程(複数可)の間の所望の塩の使用を含む任意の方法によって製造することができる。
【０１５４】
医薬組成物。本発明の別の実施形態では、本発明の構築物と医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が提供される。担体は、液体配合物であることができ、好ましくは、緩衝された等張性水溶液である。医薬的に許容可能な担体には、以下に記載するような、賦形剤、例えば、希釈剤、担体など、および、添加剤、例えば、安定剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤なども含まれる。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態の構築物は、賦形剤（例えば、希釈剤、担体など）および添加剤（例えば、安定剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤など）を必要に応じて含む、1種または複数の医薬的に許容可能な担体と共に、少なくとも1種の本発明の構築物を含む医薬組成物に配合することができる。配合賦形剤には、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリム、およびクエン酸ナトリウムが含まれ得る。注射または他の液体投与配合物として、少なくとも1種または複数の緩衝成分を含む水が好ましく、安定剤、保存剤、および可溶化剤も用いることができる。固体投与配合物として、任意の様々な増粘剤、充填剤、膨張性薬剤、および担体添加剤、例えば、デンプン、糖、脂肪酸などを用いることができる。局所投与配合物として、任意の様々なクリーム、軟膏、ゲル、ローションなどを用いることができる。大部分の医薬配合物について、非活性成分は、重量または容量で、調製物の比較的大きい部分を構成する。医薬配合物として、本発明の構築物の送達が長時間にわたって有効であるように投薬量を配合することができるように、任意の様々な計られた放出、遅延放出または持続放出の配合物および添加剤を用いることができることも企図される。特に、皮下および筋肉内注射による投与のための、持続放出または遅延放出の配合物を提供するために、例えば、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリム、および/または他のセルロース賦形剤を含むことができる。
【０１５６】
一般に、患者に投与する構築物の実際の量は、投与方式、用いる配合物、および所望される反応に依存してかなり広範にわたって変化する。
【０１５７】
実際の使用において、構築物は、従来の医薬混合技術に従って医薬担体と混合した活性成分として組み合わせることができる。担体は、投与、例えば、経口、非経口(静脈内を含む)、尿道、膣、鼻、皮膚、経皮、肺、深肺、吸入、口腔、舌下などに望まれる調製物の形態に依存して広範で様々な形態を取り得る。経口剤形の組成物を調製する場合には、任意の通常の医薬媒体、例えば、水、グリコール、油、アルコール、風味剤、保存剤、着色剤など、経口液体調製物の場合には、例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液など;または担体、例えば、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤など、ならびに、経口固体調製物の場合には、例えば、粉末、硬いカプセルと軟かいカプセル、および錠剤を用いることができる。
【０１５８】
投与の容易性のために、錠剤およびカプセルは、有利な経口投薬単位形態を示す。必要に応じて、本発明の構築物を含む組成物は、標準的な水性または非水性技術によってコーティングすることができる。このように治療的に有用な組成物における活性構築物の量は、有効な投薬量が得られるような量である。もう1つの有利な投薬単位形態において、舌下医薬組成物は、例えば、シート、ウエハー、錠剤または同様のものを用いることができる。活性構築物は、例えば、液体滴下またはスプレーのように鼻内に投与することもできる。
【０１５９】
錠剤、丸薬、カプセルなどは、結合剤（例えば、ガムトラガカント、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン）;賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）;崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはアルギニン酸）;潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）;および甘味剤（例えば、蔗糖、乳糖またはサッカリン）を含んでもよい。投薬単位形態がカプセルである場合、上記種類の物質に加えて、脂肪油などの液体担体を含むことができる。
【０１６０】
様々な他の物質は、コーティング剤として用いることができるか、または投薬単位の物理形態を変更するために用いることができる。例えば、錠剤は、シェラック、糖または両方でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は、活性成分に加えて、甘味剤として蔗糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料および風味剤、例えば、チェリーまたはオレンジ風味を含んでもよい。
【０１６１】
構築物は非経口投与することもできる。これらの活性ペプチドの溶液または懸濁液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシ-プロピルセルロース）と好適に混合された水中で調製することができる。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油中のそれらの混合物中で調製することができる。これらの調製物は、微生物の増殖を抑制するための保存剤を場合によって含んでもよい。投与直前に例えば生理食塩水と一緒に再構成される、凍結乾燥された単回単位配合物を利用することもでき、したがって、保存剤を要しない。
【０１６２】
注射用使用に好適な医薬形態には、例えば、滅菌水溶液または分散液、および滅菌粉末、例えば、滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための凍結乾燥配合物が含まれる。全ての場合に、形態は滅菌でなければならず、注射器によって投与できる程度に流動性でなければならない。形態は、製造および保管条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、溶媒または分散媒、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールまたは液体ポリエチレングリコール)、これらの好適な混合物、および植物油であることができる。
【０１６３】
本明細書において開示するような構築物は、経鼻投与によって治療的に適用することができる。「経鼻投与」は、本発明の任意の構築物の鼻内投与の任意の形態を意味する。構築物は、水溶液、例えば、生理的食塩水、クエン酸塩、または他の通常の賦形剤もしくは保存剤を含む溶液であってもよい。構築物は、乾燥配合物または粉末配合物中にあってもよい。
【０１６４】
1つの代替の実施形態では、構築物は肺に直接投与することができる。肺内投与は、計量用量吸入器（吸気中に患者により作動される場合に、本発明の構築物の計量ボーラスの自己投与を可能にする装置）によって行うことができる。乾燥粉末吸入および噴霧エアロゾルの両方を用いることができる。
【０１６５】
本発明の別の実施形態によれば、本発明の構築物を、ペプチド薬剤を含む薬剤の有効鼻吸収を増加させる任意の様々な薬剤と一緒に配合することができる。これらの薬剤は、粘膜に許容されない損傷を与えることなく鼻吸収を増加させなければならない。とりわけ、米国特許第5693608号、同5977070号および同5908825号には、吸収促進薬を含め、採用可能な多くの医薬組成物が教示されている。前述の個々の教示およびこれらに引用された全ての参考文献および特許を、参照により組み込む。
【０１６６】
水溶液中である場合、本発明の特定の構築物は、生理食塩水、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、または他の緩衝剤によって、生理学的に許容可能な任意のpH、一般に約pH4〜約pH7に、適切に緩衝させることができる。緩衝剤の組合せも用いることができ、例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水、生理食塩水と酢酸塩緩衝剤などを用いることができる。生理的食塩水の場合、0.9%の生理食塩水溶液を用いることができる。酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩などの場合、50mM溶液を用いることができる。緩衝剤に加えて、細菌および他の微生物の増殖を抑制または制限するために好適な保存剤を用いることができる。用いることのできるこのような保存剤の1つは、0.05%の塩化ベンザルコニウムである。
【０１６７】
構築物を、乾燥形態または粒状形態で存在させることも可能であり、かつ企図される。1つの好ましい実施形態では、粒子は、肺表面に定着して、吐き出されないために十分な質量を有するが、肺に達する前に気道の表面に堆積しないように十分小さいように、約0.5〜6.0μmである。限定されないが、ミクロ製粉、スプレー乾燥、および迅速冷凍エアロゾルに続けての凍結乾燥を含む様々な異なる技術のいずれかを用いて、乾燥粉末微粒子を作製することができる。微粒子によって、構築物は、肺深部に堆積することができ、これにより血流への迅速かつ効率的な吸収が実現される。さらに、時に、このような手法をもってすれば、経皮、鼻または口粘膜送達経路における場合のように、透過促進剤は不要である。推進剤系エアロゾル、噴霧器、単回用量乾燥粉末吸入器、および多回用量乾燥粉末吸入器を含む様々な任意の吸入器を用いることができる。現在用いられている通常の装置には、計量用量吸入器が含まれ、これは、喘息、慢性閉塞性肺疾患などの治療用の薬剤を送達するために使用される。好ましい装置には、常に約6.0μm未満である粒径を有する微細粉末の霧またはエアロゾルを形成するように設計された乾燥粉末吸入器が含まれる。
【０１６８】
平均粒度分布を含む微粒子の大きさは、作製する方法によって調節することができる。ミクロ製粉については、ミリングヘッドの寸法、ローターの速度、処理時間などにより微粒子の大きさを調節する。スプレー乾燥については、ノズル寸法、流量、乾燥機熱などにより微粒子の大きさを調節する。迅速冷凍エアロゾルに続けて凍結乾燥によって作製することについては、ノズル寸法、流量、エアロゾル化溶液の濃度などにより微粒子の大きさを調節する。これらのパラメータおよびその他は、微粒子の大きさを調節するために用いることができる。
【０１６９】
本発明の構築物は、持続放出注射可能配合物の注射、典型的には、例えば、臀部または三角筋におけるような深部筋内注射によって治療的に投与することができる。1つの実施形態では、本発明の構築物は、PEG、例えば、ポリ(エチレングリコール) 3350、および場合によって、限定されないが、賦形剤、例えば、塩、ポリソルベート80、pHを調整するための水酸化ナトリウムまたは塩酸を含む1種または複数の追加的な賦形剤および保存剤と一緒に配合される。別の実施形態では、本発明の構築物は、ポリ(オルトエステル)(これは、ポリマー骨格中に任意の変化し得るパーセントの乳酸を有する自己触媒ポリ(オルトエステル)であり得る)、および場合によって1種または複数の追加的な賦形剤と一緒に配合される。1つの実施形態では、ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド)ポリマー(PLGAポリマー)、好ましくは、親水性末端基を有するPLGAポリマー、例えば、Boehringer Ingelheim社(Ingelheim、独国)製のPLGA RG502Hを用いる。例えば、好適な溶媒、例えば、メタノール中の本発明の構築物を、塩化メチレン中のPLGAの溶液と混合し、反応器内の好適な混合条件下でポリビニルアルコールの連続相溶液をそれに加えることによって、このような配合物を作製することができる。一般に、好ましくは接着性ポリマーでもある多くの注射可能かつ生分解性のポリマーのうちのいずれかを、持続放出注射可能な配合物に用いることができる。米国特許第4938763号、同6432438号、および同6673767号の教示ならびにこれらに開示された生分解性ポリマーおよび配合の方法を、参照により本明細書に組み込む。配合物は、構築物の濃度および量、ポリマーの生分解速度、ならびに当業者に公知の他の要因次第で、注射が、週1回、月1回または他の期間基準で必要とされるような配合物とすることができる。
【０１７０】
投与経路。注射によって投与する場合、注射は、静脈内、皮下、筋内、腹腔内または当技術分野で公知の他の手段であることができる。本発明の構築物は、限定されないが、錠剤、カプセル、カプレット、懸濁液、粉末、凍結乾燥調合剤、坐薬、点眼薬、皮膚パッチ、口可溶性配合物、スプレー、エアロゾルなどの配合物を含む当技術分野で公知の任意の手段によって配合できるか、あるいは緩衝剤、結合剤、賦形剤、安定剤、酸化防止剤、および当技術分野で公知の他の剤と一緒に混合および配合することができる。一般に、本発明の構築物が細胞の表皮層を通って導入される任意の投与経路を用いることができる。したがって、投与手段には、粘膜を通しての投与、口腔投与、経口投与、経皮投与、吸入投与、肺投与、経鼻投与、尿道投与、膣投与などが含まれ得る。
【０１７１】
1つの態様では、本発明の構築物を、持続放出注射可能な配合物、例えば、PEG、ポリ(オルトエステル)、またはPLGAポリマーと一緒の配合物における本発明の構築物によって投与する。別の態様では、本発明の構築物は、連続的または断続的のいずれかの皮下送達を与える自動送達装置によって投与される。任意の前述の方法および配合物は、慢性鬱血性心不全および特に慢性非代償性鬱血性心不全を含む慢性状態または症候群の治療に特に適用できる。
【０１７２】
1つの態様では、本発明の任意の構築物は、米国特許第6586396号に開示される全ての方法を含む皮下投与によって投与することができる。別の態様では、患者、特に、比較的代償性である患者または外来患者環境における鬱血性心不全を有する患者である患者は、米国特許出願公開第2004/0077537号および国際公開第2003/079979号に開示されるような方法および用量によって本発明の構築物が投与される。別の態様では、米国特許出願公開第2005/0113286号に開示されているような方法によって患者に本発明の構造物を投与してよい。さらに別の態様では、心筋障害を経験した患者は、米国特許出願公開第2006/0019890号に開示されるような方法によって心臓再造形のために治療され得る。
【０１７３】
本発明の構築物は、米国特許出願公開第2006/0034903号に開示されるような装置を含む送達系および方法によることを含む経皮投与によって投与することもできる。同様に、ここに開示されたヒドロゲル配合物および固体状態配合物を、本発明の構築物と共に用いるために適応させることができる。
【０１７４】
治療有効量。一般に、患者に投与される本発明の構築物の実際の量は、投与方式、使用する配合物、および所望の反応に依存してかなり広範囲に変化する。治療のための投薬量は、所望の治療効果をもたらすに十分な量の、任意の前述の手段または当技術分野で公知の任意の他の手段による投与である。したがって、治療有効量には、所望の作用、特に抗高血圧、心臓血管、腎臓および/または内分泌作用を含む作用を誘発するのに十分である本発明の構築物もしくは医薬組成物の量が含まれる。1つの態様では、治療有効量は、所望のナトリウム利尿、利尿および/または血管拡張をもたらす量である。
【０１７５】
一般に、本発明の構築物は、高度に活性である。例えば、選択した特定の構築物、所望の治療反応、投与経路、配合物、および当業者に公知の他の要因に依存して、構築物は、約0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、または100μg/kg体重で投与することができる。
【０１７６】
併用療法
本発明のいくつかの実施形態による構築物は、他の薬剤または剤と併用して、特に鬱血性心不全の治療に使用する。
【０１７７】
本発明の別の態様によれば、鬱血性心不全を治療するための方法が提供される。この方法には、鬱血性心不全鬱を有する患者に、鬱血性心不全の治療に有用である治療有効量の別の化合物、または患者において本発明の構築物のバイオアベイラビリティーを拡張するのに有用である治療有効量の代替物と併用して、本明細書に開示する治療有効量の構築物を投与することが含まれる。1つの態様では、患者に、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第2004/0063630号に開示されている方法および利尿薬のように、利尿薬と併用して本発明の構築物を投与することができる。併用に用い得る利尿薬にはサイアザイド系利尿薬、ループ利尿薬、およびカリウム保持性利尿薬が含まれ、限定されないが、例えば、ヒドロクロロチアジド(Hydrodiuril(登録商標))、クロルサリンドン、フロセミド(Lasix(登録商標))、スピロノラクトン(Aldactone(登録商標))、およびトリアムテレンなどの利尿薬が含まれる。
【０１７８】
本発明の別の態様では、利尿薬以外の治療有効量の抗高血圧薬と併用して本明細書に開示する治療有効量の構築物を投与することによる、鬱血性心不全の治療方法を提供する。このような抗高血圧薬には、一般に、カルシウムチャネル遮断薬(ジヒドロピリジン類および非ジヒドロピリジン類を含む)、交感神経遮断薬、非特異的アドレナリン遮断薬、α-アドレナリンアンタゴニスト(非選択的および選択的α1-遮断薬を含む)、β-遮断薬(非選択的ならびに選択的遮断薬および内因性交感神経様作用活性を有するものを含む)、血管拡張薬(抵抗性および緊急高血圧の治療用)、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、およびアンギオテンシンIIアンタゴニストが含まれる。併用に用いられ得る抗高血圧薬には、混合αおよびβアンタゴニスト、例えば、ラベトロール(Normodyne(登録商標));血管拡張薬、例えば、ヒドララジン(Apresoline(登録商標))、ミノキシジル(Loniten(登録商標))、ニトロプルシド(Nipride(登録商標))、またはジアゾキシド(Hyperstat IV(登録商標));カルシウム遮断薬、例えば、ニフェジピン(Adalat(登録商標))、ジルチアゼム(Cardizem(登録商標))、またはベラパミル(Calan(登録商標));交感神経遮断薬、例えば、クロニジン(Catapres(登録商標))、メチルドーパ(Aldomet(登録商標))、レセルピン(Serpasil(登録商標))、またはグアネチジン(イスメリン(登録商標));ACE阻害薬、例えば、カプトプリル(Capoten(登録商標))、エナラプリル(Vasotec(登録商標))、またはリシノプリル(Prinivil(登録商標));α-アドレナリンアンタゴニスト、例えば、フェントールアミン(Regitine(登録商標))またはプラゾシン(Minipress(登録商標));アンギオテンシンIIアンタゴニスト、例えば、ロサルタン(Cozaar(登録商標));あるいは、β-アドレナリンアンタゴニスト、例えば、プロプラノロール(Inderal(登録商標))、ナドロール(Corgard(登録商標))、メトプロロール(Lopressor(登録商標)またはピンドールなどがある。
【０１７９】
他の適応
本発明の構築物の主な使用は、鬱血性心不全、急性腎不全、および腎臓高血圧の症状の治療および改善においてである一方、本発明の構築物は、ナトリウム利尿薬、利尿薬、および/または血管拡張薬化合物が治療有用性を有する任意の治療計画またはスキームに用いることができる。したがって、1つの態様では、本発明の構築物は、米国特許第5965533号に開示されているように、腹腔内透析溶液への添加剤として用いることができる。別の態様では、本発明の構築物は、国際公開第00/18422号に開示されるているように、眼科用途に用いることができる。
【０１８０】
アミノ酸代用残基の合成方法
本発明のアミノ酸代用残基の合成方法の以下の例は例示を意図しており、当業者がこれに変更を加え得ること、およびそのような変更は本明細書に含まれることが意図されていることを理解されたい。
【０１８１】
官能化R側鎖を有さないアミノ酸を模倣するケトピペラジン骨格の合成(方法AおよびB)
この構築物を、方法AおよびBで記載した通りの様々な方法によって調製した。
【０１８２】
方法A:ジペプチド(3)を、Boc-セリン(OBn)-OH(1)およびα-アミノエステル(2)を使用する混合無水物方法で形成させた。ジペプチドは高収率で得られ、通常精製は不要であった。メチルエステルおよびアミド基の両方の還元はジボラン-テトラヒドロフランを使用して行い、第二級アミンを保護してジ-Boc保護アミノアルコール中間体(4)を得た。アルコールを二クロム酸ピリジニウム(PDC)で同時に環化させながら酸化して、ピペラジン-2-オン(5)を1ステップで得た。水素化によってベンジルエーテルを除去し、次いで保護基交換によってFmoc保護ピペラジン-2-オン(6)を得た。最後に、第一級アルコールをいくつかの異なる方法のいずれか(PDC、ジョーンズ酸化、塩化ルテニウム-過ヨウ素酸ナトリウム、2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ、フリーラジカル(TEMPO)酸化)によって酸化して酸にして最終生成物(7)を得た。
【０１８３】
【化１３】
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【０１８４】
2-(3-ベンジルオキシ-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオニルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(3)の合成:窒素下、-20℃に維持したBocセリンベンジルエーテル(1)10mmolの乾燥テトラヒドロフラン30mL溶液に、トリエチルアミン22mmolを加え、次いでクロロギ酸イソブチル11.4mmolをゆっくりと加えた。白色の固体が沈殿した。スラリーを15分間撹拌し、次いで11.1mmolのα-アミノエステル(2)を一度に加えた。スラリーを-20℃で30分間撹拌し、次いで室温まで加温し、2時間撹拌し、次いで濃縮乾固した。次いで混合物を酢酸エチル50mL/1N塩酸30mLの溶液間に分配した。層を分離し、有機層を1×20mLの1N塩酸、および1×20mLの飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。化合物(3)が90%超の収率で通常得られ、精製は必要なかった。
【０１８５】
【表１】
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【０１８６】
ジ-Boc-2-置換-(2-アミノ-3-ベンジルオキシ-プロピル-アミノ)-エタノール(4)の合成:窒素下、室温に維持した35mmolの(3)の乾燥テトラヒドロフラン50mL溶液にテトラヒドロフラン中の1Nジボラン溶液200mLを加えた。溶液を室温で終夜撹拌し、次いで1N塩酸溶液200mLの氷冷溶液にゆっくりと注いだ。次いで、この二相溶液を固体の水酸化ナトリウムで中和した。重炭酸ナトリウムの飽和溶液140mL、次いでジ-tert-ブチル-ジカーボネート70mmolを加え、混合物を2日間室温で撹拌し、酢酸エチル200mLで希釈し、層を分離した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。生成物(4)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１８７】
【表２】
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【０１８８】
1,4-ジ-Boc-6-ベンジルオキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(5)の合成:70mmolの(4)および二クロム酸ピリジニウム400mmolの乾燥ジメチルホルムアミド300mL溶液を、48℃にて窒素下において6時間撹拌し、室温まで冷却し、水1500mLに注ぎ、4×500mLのエチルエーテルで抽出した。エーテル層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。生成物(5)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(6)の合成:19mmolの(5)および10%炭素上パラジウム2gのエタノール200mL懸濁液を、室温および大気圧で終夜水素化した。この懸濁液をセライトで濾過し、濃縮した。残渣をジクロロメタン中の50%トリフルオロ酢酸40mLに再溶解した。溶液を室温で2時間撹拌し、次いで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン60mL/水40mLに再溶解し、固体の重炭酸ナトリウムで中和し、次いで固体の重炭酸ナトリウム40mmolおよびFmocクロリド20mmolを加えた。次いで混合物を室温で2時間撹拌し、酢酸エチル300mLで希釈し、層を分離した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１９１】
【表４】
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【０１９２】
4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(7)の合成:化合物(7)をいくつかの方法で調製した。
【０１９３】
(a)0℃に冷却したアセトニトリル180mL、四塩化炭素180mLおよび水240mL中の10mmolの(6)の二相溶液に、固体の過ヨウ素酸ナトリウム112mmol、次いで塩化ルテニウム340mgを加えた。反応を室温まで戻し、2時間撹拌し、次いでセライトで濾過した。層を分離し、水層を2×75mLの酢酸エチルで再抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。
【０１９４】
(b)12mmolの(6)および59mmolのPDCの乾燥ジメチルホルムアミド60mL溶液を48℃で窒素下において約5時間撹拌し、室温に冷却し、水600mLに注ぎ、3×200mLのジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。
【０１９５】
(c)室温に維持した17mmolの(6)のアセトン350mL溶液にジョーンズ試薬(クロム酸8.0g、水17.4mL、および濃硫酸6.9mLから調製)25mLを加えた。この混合物を1時間撹拌し、イソプロパノール150mLを加え、混合物をセライトで濾過した。セライトは酢酸エチルで洗浄した。有機層を合わせ、濃縮した。残渣を酢酸エチル250mLに溶解し、2×50mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。
【０１９６】
(d)室温で維持した81mmolのアルコール(6)のアセトニトリル810mL溶液に、リン酸バッファー溶液(水295mL中の一塩基リン酸ナトリウム7.2gおよび二塩基リン酸ナトリウム14.3gから調製)を加え、次いで3.3g(20.7mmol)のTEMPOおよび亜塩素酸ナトリウム18.6g(164.4mmol)を加え、この二相溶液を43℃に維持した油浴中に置き、次いで次亜塩素酸ナトリウム溶液(10〜13%次亜塩素酸ナトリウム溶液19.3mLおよび水24mLを混合することによって調製)43.3mL(25.9mmol)をゆっくりと加えた。反応を43℃で4時間撹拌した。溶液を室温に冷却し、10%亜硫酸水素ナトリウム溶液200mLを加え、10分間撹拌し、酢酸エチル500mLで希釈し、層を分離した。有機層を1×100mLのブライン、1×160mLの1N塩酸溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。
【０１９７】
生成物(7)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
方法B:方法Aで記載した通りに調製した中間体ジ-Boc-2-置換-(2-アミノ-3-ベンジルオキシ-プロピル-アミノ)-エタノール(4)を、TEMPO/イソシアヌル酸試薬を使用して酸化して酸にし、次いでヨードメタンでエステル化して完全に保護された還元ジペプチド類似体(8)を得た。Boc基およびベンジルエーテルを脱保護して3-置換5-ヒドロキシメチル-ピペラジン-2-オンを得、これをFmoc誘導体として保護して(6)を得、これを方法Aで記載した通りに酸化して最終生成物にした。
【０２００】
【化１４】
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【０２０１】
ジ-Boc-(2-アミノ-3-ベンジルオキシ-プロピルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(8)の合成:0℃に維持した76mmolの(4)のアセトン680mL懸濁液および飽和重炭酸ナトリウム溶液210mLに、固体の臭化ナトリウム21mmolおよび2.9mmolのTEMPOを加え、次いでトリクロロイソシアヌル酸156mmolをゆっくりと加えた。反応を30分間0℃にて撹拌し、次いで室温で終夜撹拌し、1N塩酸溶液で酸性化し、2×300mLの酢酸エチルで抽出した。有機層を3×50mLの1N塩酸で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣を乾燥ジメチルホルムアミド40mLおよび固体の重炭酸ナトリウム95mmolに再溶解し、ヨードメタン112mmolを加え、室温で窒素下においてHPLCが反応の完了を示すまで混合物を撹拌した。次いでエチルエーテル200mLで溶液を希釈し、2×100mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。生成物(8)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(6)の合成:ジクロロメタン中の50%トリフルオロ酢酸40mL中の36mmolの(8)の溶液を室温で2時間撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液200mLに注いだ。層を分離し、有機層を濃縮した。残渣を酢酸エチル100mLに再溶解し、2×50mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をエタノール100mLに再溶解し、10%炭素上パラジウム5gおよび1N塩酸溶液35mLを加え、HPLCが反応の完了を示すまで室温および大気圧で混合物を水素化した。次いで溶液をセライトで濾過し、濃縮した。酢酸エチル80mLに残渣を再溶解し、水30mL中の重炭酸ナトリウム70mmolを加え、混合物を室温で終夜撹拌した。酢酸エチルを除去し、テトラヒドロフラン100mL、次いで固体の重炭酸ナトリウム178mmolおよびFmocクロリド43mmolを加え、HPLCが反応の完了を示すまで混合物を撹拌し、酢酸エチル300mLで希釈し、層を分離した。有機層を2×50mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。生成物(6)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２０４】
4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(7)の合成:化合物(7)を方法Aで記載した通りに調製した。
【０２０５】
官能化R側鎖を有する化合物または有さない化合物に適用可能なケトピペラジン骨格の調製のための一般汎用合成スキーム(方法C、E、F)
【０２０６】
方法C:(2-Fmoc-アミノ-3-R'-O-プロピルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(10)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、α-アミノエステル(2)でFmoc O-保護セリナール(9)を還元的アミノ化することによって調製した。還元的アミノ化に必要なFmoc O-保護セリナール(9)は、方法Dに従って、エステル(12)を水素化ジイソブチルアルミニウムで還元すること、Fmoc O-保護セリノール(13)をDess-Martinペルヨージナンで酸化すること、またはFmoc O-保護セリンワインレブアミド(14)を水素化アルミニウムリチウムで還元することのいずれかで調製した。Fmoc O-保護セリナール(9)を調製する好ましい方法は、ワインレブアミド類似体の還元であった。次いで(2-Fmoc-アミノ-3-R'-O-プロピルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(10)をNおよびO脱保護し、環化し、Fmoc保護して3-置換6-ヒドロキシメチル-ピペラジン-2-オン(6)を得、次いでこれを方法Aで記載した通りに酸化して最終生成物にした。
【０２０７】
合成に使用したFmoc-O-保護セリナール(9)のヒドロキシル基上の保護基(R')は、アミノエステルの側鎖Rの性質に依存する。Rが官能基を含まない場合、Fmocセリンの側鎖はtBuエーテルとして保護した。Rが官能基を含む場合、Fmocセリンの側鎖はトリチルエーテルとして保護した。
【０２０８】
【化１５】
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【０２０９】
【化１６】
2009532384.tif 000026
【０２１０】
方法D:種々のFmoc-O-保護セリナール(9)の合成。Fmoc-O-R'セリンメチルエステル(12)の合成:窒素下で維持した乾燥ジメチルホルムアミド80mL中のFmoc O-R'セリン(11)80mmol、固体重炭酸ナトリウム10.0g(120mmol)、およびヨードメタン10.0mL(160mmol)の微懸濁液を室温で終夜撹拌した。次いで反応混合物を水500mLに注ぎ、固体を濾過した。固体を酢酸エチル800mLに再溶解し、1×200mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。精製は必要なかった。
【０２１１】
【表７】
2009532384.tif 000027
【０２１２】
Fmoc-O-R'セリノール(13)の合成:窒素下で-20℃に維持した10.0mmolのFmoc O-R'セリン(11)の乾燥テトラヒドロフラン50mL溶液に、トリエチルアミン1.77mL(12.7mmol)を加え、次いでクロロギ酸イソブチル1.57mL(12.0mmol)をゆっくりと加えた。混合物を30分間撹拌し、次いで温度を5℃未満に維持しながら水素化ホウ素ナトリウム3.77g(99.6mmol)の水10mL氷冷溶液にゆっくりと注いだ。反応を0℃で15分間撹拌し、次いで1N塩酸溶液でクエンチした。反応混合物を酢酸エチル100mLで希釈し、層を分離した。有機層を2×25mLの1N塩酸溶液、2×25mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２１３】
【表８】
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【０２１４】
Fmoc-O-R'セリンワインレブアミド(14)の合成: 20.2mmolのFmoc O-R'セリン(11)、6.98g(21.6mmol)の2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)、およびN-メチル-モルホリン2.5mL(22.7mmol)の乾燥ジクロロメタン80mLの懸濁液を、室温で窒素下において20分間撹拌し、次いでN,O-ジ-メチルヒドロキシルアミン塩酸塩3.02g(31mmol)およびN-メチル-モルホリン3.3mL(30mmol)を加え、この懸濁液を室温で終夜撹拌した。次いで、形成された溶液を濃縮乾固し、酢酸エチル200mLと水100mLとの間に再分配し、2×40mLの1N塩酸溶液、次いで2×40mLの飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。精製は必要なかった。
【０２１５】
【表９】
2009532384.tif 000029
【０２１６】
エステル(12)からのFmoc-O-R'セリナール(9)の合成:-78℃で窒素下において維持した3.5mmolの(12)のテトラヒドロフラン5mL溶液に、1N水素化ジイソブチルアルミニウム(DIBAL)溶液10mLをゆっくりと加え、15分間撹拌し、酒石酸ナトリウムおよびカリウムの飽和溶液をゆっくりと加えることによってクエンチした。反応物を室温まで戻し、酢酸エチル50mLで希釈し、酒石酸ナトリウムおよびカリウムの飽和溶液50mLを加えた。層を分離し、水層を1×50mLの酢酸エチルで再抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。化合物(9)をさらに精製することなく次のステップで使用した。
【０２１７】
【表１０】
2009532384.tif 000030
【０２１８】
アルコール(13)からのFmoc-O-R'セリナール(9)の合成:窒素下で室温に維持した80mmolのFmoc-O-R'セリノール(13)の乾燥ジクロロメタン200mL溶液に、Dess-Martinペルヨージナン88mmolを加え、反応を2.5時間撹拌し、10%チオ硫酸ナトリウム水溶液400mLを加えることによってクエンチした。層を分離し、有機層を濃縮し、エチルエーテル300mLで希釈し、10%チオ硫酸ナトリウムを含有する飽和重炭酸塩水溶液で3回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。
【０２１９】
ワインレブアミド(14)からのFmoc-O-R'セリナール(9)の合成:窒素下で-78℃に冷却した8.8g(20.2mmol)の粗製Fmoc-O-R'セリンワインレブアミド中間体(14)の乾燥テトラヒドロフラン60mL溶液に、テトラヒドロフラン中の1N水素化アルミニウムリチウム溶液30mLを加えた。溶液を15分間撹拌し、次いで硫酸水素カリウムの1.4N溶液30mLをゆっくりと加えることによってクエンチした。室温に戻した後、固体を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣を酢酸エチル50mLと1N塩酸溶液25mLとの間に再分配した。層を分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。
【０２２０】
(2-Fmoc-アミノ-3-R'-O-プロピルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(10)の合成:シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを還元剤として使用する還元的アミノ化によって化合物(10)を調製した。
【０２２１】
シアノ水素化ホウ素ナトリウム法:窒素下で室温に維持した8.5mmolの(2)の塩酸塩のメタノール20mL溶液に、固体の水酸化カリウム2.3mmolを加え、混合物を25分間撹拌した。Fmoc-O-R'セリナール(9)のメタノール10mL溶液を上記懸濁液に加え、反応混合物を1時間撹拌した。1Nシアノ水素化ホウ素ナトリウム8.5mLのテトラヒドロフラン溶液をゆっくりと加え、反応をさらに1時間撹拌し、濾過し、濃縮した。残渣を酢酸エチルと水との間に分配し、有機層を1×20mLの飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。
【０２２２】
ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド法:21mmolの(2)の塩酸塩およびトリエチルアミン2.9mL(21mmol)の乾燥テトラヒドロフラン50mL中の懸濁液を、室温で45分間撹拌し、次いで約20mmolの粗製Fmoc-(O-R')-セリナール(9)のテトラヒドロフラン30mL溶液、次いで4A粉末モレキュラーシーブ1.7gを加え、この懸濁液をさらに2時間撹拌した。固体のナトリウムトリアセトキシボロヒドリド6.4g(30mmol)を加え、この懸濁液を室温で終夜撹拌した。懸濁液をメタノールで希釈し、モレキュラーシーブを濾過し、濾液を濃縮した。残渣を酢酸エチル100mLと水50mLとの間に分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。
【０２２３】
化合物(10)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２２４】
【表１１Ａ】
2009532384.tif 000031
【０２２５】
【表１１Ｂ】
2009532384.tif 000032
【０２２６】
4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(6)の合成:化合物(6)の調製には、3つのステップが必要であった:(a)同時環化を伴うFmoc脱保護、(b)Fmoc保護、および(c)ヒドロキシル基脱保護。
【０２２７】
Fmoc基の除去および環化:酢酸エチル溶液中の30%ジエチルアミン30mL中の環式化合物10mmolの溶液を室温で終夜撹拌し、次いで濃縮乾固した。
【０２２８】
(a)Fmoc保護:テトラヒドロフラン20mLおよび水10mL中の化合物10mmolの二相溶液に、固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)、次いで3.36g(13mmol)のFmoc-Clを加えた。混合物を3時間撹拌し、酢酸エチルで希釈し、層を分離し、有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。
【０２２９】
(b)ヒドロキシル基脱保護:tBuエーテル保護基含有化合物について:90%トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いて化合物を1〜2時間脱保護し、次いで濃縮乾固した。残渣を酢酸エチルに溶解し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濃縮した。Trtエーテル保護基を含有する化合物について:2〜10%トリ-イソプロピルシランを含有するジクロロメタン中の1〜10%トリフルオロ酢酸の溶液を加えることによって化合物を脱保護した。反応は瞬間的であった。次いで、重炭酸ナトリウムの飽和溶液に注ぐことによって溶液を中和した。層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。
【０２３０】
化合物(6)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２３１】
【表１２Ａ】
2009532384.tif 000033
【０２３２】
【表１２Ｂ】
2009532384.tif 000034
【０２３３】
4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(7)の合成:化合物(7)を方法Aで記載した通りに調製した。化合物(7)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２３４】
【表１３】
2009532384.tif 000035
【０２３５】
方法E:(2-Fmoc-アミノ-3-ヒドロキシ-プロピル-Cbz-アミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(15)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、αアミノエステル(2)でFmocセリナール(OR')(9)を還元的アミノ化することによって調製した。第二級アミンをクロロギ酸ベンジルで保護し、次いでヒドロキシル基をトリフルオロ酢酸溶液で脱保護した。次いで、化合物(15)をFmoc脱保護した。アミノエステル中間体が即座に環化して4-Cbz-3-置換6-ヒドロキシメチル-ピペラジン-2-オン(16)が形成された。Fmoc3-置換6-ヒドロキシメチル-ピペラジン-2-オン(6)を保護基交換によって調製し、次いで方法Aで記載した通りに酸化して所望の生成物(7)にした。
【０２３６】
【化１７】
2009532384.tif 000036
【０２３７】
(2-Fmoc-アミノ-3-ヒドロキシ-プロピル-Cbz-アミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(15)の合成:メタノール80mL中の67mmolのアミノエステル塩酸塩(2)および固体の水酸化カリウム20.9mmolの懸濁液を室温で25分間撹拌し、次いで(9)のメタノール250mL懸濁液に加えた。反応混合物を1.5時間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン中の1Nシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液70mLをゆっくりと加えた。反応を終夜撹拌し、次いで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン300mLと1N塩酸溶液50mLとの間に分配した。層を分離し、有機層を重炭酸ナトリウム239mmolの水50mL溶液で中和し、次いでクロロギ酸ベンジル66mmolをゆっくりと加え、反応を3時間撹拌し、酢酸エチル200mLで希釈し、層を分離した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をトリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液に溶解し、室温で2時間撹拌した。溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液200mLに注いだ。層を分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。化合物(15)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２３８】
【表１４】
2009532384.tif 000037
【０２３９】
4-Cbz-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(16)の合成:酢酸エチル中の30%ジエチルアミン100mL中の24mmolの(15)の溶液を室温で終夜撹拌し、次いで濃縮乾固した。化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２４０】
【表１５】
2009532384.tif 000038
【０２４１】
4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(6)の合成:15mmolの(16)および10%炭素上パラジウム1.8gのエタノール50mL中の懸濁液を、室温および大気圧でHPLCが反応の完了を示すまで水素化した。次いで混合物をセライトで濾過し、濃縮し、残渣をテトラヒドロフラン35mLおよび水10mLに溶解し、次いで固体の重炭酸ナトリウム62mmol、次いで16mmolのFmoc-Clを加え、混合物を3時間撹拌し、酢酸エチル100mLおよび水10mLで希釈した。層を分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。化合物(6)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２４２】
【表１６】
2009532384.tif 000039
【０２４３】
4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(7)の合成:化合物(7)を方法Aで記載した通りに調製し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２４４】
【表１７】
2009532384.tif 000040
【０２４５】
方法F:(2-Cbz-アミノ-3-ベンジルオキシ-プロピルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(20)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、α-アミノエステル(2)でCbzセリナール(OBn)(19)を還元的アミノ化することによって調製した。還元的アミノ化に必要なCbzO-ベンジルセリナール(19)は、Cbzセリノール(OBn)(18)をDess-Martinペルヨージナンで酸化することによって得た。(20)を水素化し、次いで環化することによって3-置換6-ヒドロキシメチル-ピペラジン-2-オンを得、次いでこれをFmoc保護して4-Fmoc-3-置換6-ヒドロキシメチル-ピペラジン-2-オン(6)にした。最終生成物(7)を方法Aで記載した通りに得た。
【０２４６】
【化１８】
2009532384.tif 000041
【０２４７】
Cbz-セリノール(OBn)(18)の合成:化合物(18)は化合物(13)について記載した通りに調製した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製後、化合物(18)を収率79%で得た。1H NMR δ (CDCl3) 3.57〜3.74 (2つのm, 3H, CHN, およびCH2O)、3.76〜3.96 (2つのm, 2H, CH2O)、4.50 (s, 2H, CH2O)、5.10 (s, 2H, CH2O)、5.40〜5.50 (br. d, 1H, NH)、7.22〜7.38 (m, 10H, Ph); HPLC tR = 5.33分、(M+ + Na+) = 337.64。
【０２４８】
Cbzセリナール(OBn)(19)の合成:化合物(19)を、化合物(9)について記載した通りに調製した。窒素下で室温に維持した乾燥ジクロロメタン200mL中の80mmolのCbz-O-Bnセリノール(18)の溶液にDess-Martinペルヨージナン88mmolを加え、反応を2.5時間撹拌し、次いで10%チオ硫酸ナトリウム水溶液400mLを加えることによってクエンチした。層を分離し、有機層を濃縮し、エチルエーテル300mLで希釈し、10%チオ硫酸ナトリウムを含有する飽和重炭酸塩水溶液で3回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。化合物(19)を粗製収率99%で得、さらに精製することなく使用した。1H NMR δ (CDCl3) 3.69〜3.78 (dd, 1H, CH2O)、3.99〜4.06 (dd, 1H, CH2O)、4.37〜4.46 (m, 1H, CHN)、4.47〜4.52 (d, 2H, CH2O)、5.14 (s, 2H, CH2O)、5.65〜5.75 (br. d, 1H, NH)、7.14〜7.48 (一連のm, 9H, Ph)、7.98〜8.08 (dd, 1H, Ph)、9.63 (s, 1H, CHO)。
【０２４９】
(2-Cbz-アミノ-3-ベンジルオキシ-プロピルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(20)の合成:化合物(20)は、化合物(10)について記載した通りに調製したが、Cbzセリナール(19)をアルデヒドとして使用した。化合物(20)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２５０】
【表１８】
2009532384.tif 000042
【０２５１】
4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(6)の合成:エタノール160mL中の38mmolの(20)、1N塩酸38mL、および10%炭素上パラジウム20gの懸濁液を、室温および大気圧でHPLCが反応の完了を示すまで水素化した。次いで混合物をセライトで濾過し、濃縮乾固した。残渣をテトラヒドロフラン75mLで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で中和した。固体の重炭酸ナトリウム106mmolおよびFmocクロリド53mmolを加え、反応を室温でHPLCが反応の完了を示すまで撹拌し、酢酸エチル300mLおよびブライン300mLで希釈した。層を分離し、有機層をブラインで2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。生成物(6)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２５２】
4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(7)の合成:化合物(7)を方法Aで記載した通りに調製した。
【０２５３】
官能化側鎖を有さないアミノ酸を模倣する2,2-二置換ケトピペラジン骨格の合成(方法G)
官能化側鎖を有さないアミノ酸を模倣する4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-メチル-2-カルボン酸骨格の合成を方法Gを使用して実施した。2-Boc-アミノ-3-メトキシカルボニル-1-置換-メチルアミノ-2-メチル-プロピオン酸tert-ブチルエステル(23)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、α-アミノエステル(2)で2-Boc-アミノ-2-メチル-3-オキソ-プロピオン酸メチルエステル(22)を還元的アミノ化することによって調製した。還元的アミノ化に必要な化合物(22)は、α-メチル-Bocセリンtert-ブチルエステル(21)をDess-Martinペルヨージナンで酸化することによって得た。(23)のBoc基をジオキサン中の2N塩化水素で除去し、アミノエステルを環化して、保護されていない5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-メチル-2-カルボン酸tert-ブチルエステル(24)を得、これをFmocクロリドで保護して4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-メチル-2-カルボン酸tert-ブチルエステルを得、これをトリフルオロ酢酸で脱保護して最終生成物(25)を得た。
【０２５４】
【化１９】
2009532384.tif 000043
【０２５５】
2-Boc-アミノ-2-メチル-3-オキソ-プロピオン酸tert-ブチルエステル(22)の合成:Bocα-メチルセリンtert-ブチルエステル(21)の酸化をDess-Martinペルヨージナンを使用してこれまで記載した通りに実施して、所望の生成物(22)を粗製収率96%で得た。この化合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。1H NMR δ (CDCl3): 1.44 (s, 18H, tBu)、1.46 (s, 3H, CH3)、5.63〜5.70 (br. s, 1H, NH)、9.5 (s, 1H, CHO)
【０２５６】
2-Boc-アミノ-3-メトキシカルボニル-1-置換-メチルアミノ-2-メチル-プロピオン酸tert-ブチルエステル(23)の合成:化合物(23)を、化合物(10)について記載したものと同様の手順を用いて、しかしアルデヒドとして化合物(22)を使用して調製した。化合物(23)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２５７】
【表１９】
2009532384.tif 000044
【０２５８】
2-メチル-6-オキソ-5-置換-ピペラジン-2-カルボン酸(25)の合成:ジオキサン中の2N塩化水素8mL中の4mmolの(23)の溶液を室温で5時間撹拌し、次いで濃縮乾固した。残渣をテトラヒドロフラン20mLに懸濁し、トリエチルアミン10mmolで中和し、60℃で2日間撹拌した。次いでこれを濃縮乾固し、テトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに再懸濁し、固体の重炭酸ナトリウムを加えてpHを調整して塩基性にし、次いで固体のFmocクロリド5.6mmolを加え、反応混合物を終夜室温で撹拌した。pHを1N塩酸溶液で1に調整し、酢酸エチル100mLで希釈し、層を分離した。有機層を2×100mLのブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣をジクロロメタン中の50%トリフルオロ酢酸10mLに溶解し、溶液を室温で3時間撹拌した。溶媒を濃縮し、生成物(25)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２５９】
【表２０】
2009532384.tif 000045
【０２６０】
官能化側鎖を有するアミノ酸を模倣する2,2-二置換ケトピペラジン骨格の合成(方法H)
官能化側鎖を有するアミノ酸を模倣する4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-メチル-2-カルボン酸骨格の合成を、方法Hを使用して実施する。2-Alloc-アミノ-3-メトキシカルボニル-1-置換-メチルアミノ-2-メチル-プロピオン酸メチルエステル(30)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、α-アミノアリルエステル(29)で2-Alloc-アミノ-2-メチル-3-オキソ-プロピオン酸メチルエステル(28)を還元的アミノ化し、次いで第二級アミンをクロロギ酸ベンジルで保護することによって調製する。還元的アミノ化に必要な化合物(28)は、(27)をDess-Martinペルヨージナンで酸化することによって得る。類似体(30)のアリルエステルおよびAlloc基はテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)を使用して除去し、このアミノ酸をペプチドカップリング試薬と反応させることによって環化して5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-メチル-2-カルボン酸メチルエステル(31)を得る。4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-メチル-2-カルボン酸(25)は、メチルエステルの鹸化、それに次ぐ保護基交換で得る。
【０２６１】
【化２０】
2009532384.tif 000046
【０２６２】
Allocα-メチルセリンメチルエステル(27)の合成:窒素下で維持した乾燥ジメチルホルムアミド8mL中の、8mmolのBocα-メチルセリン(26)、固体の重炭酸ナトリウム1.0g(12mmol)、およびヨードメタン1.0mL(16mmol)の溶液を、終夜撹拌する。次いで反応混合物を水50mLに注ぎ、ジエチルエーテル50mLで抽出し、1×20mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。残渣をジクロロメタン中の90%トリフルオロ酢酸20mLに溶解し、溶液を室温で3時間撹拌し、次いで濃縮乾固する。残渣をテトラヒドロフラン35mLおよび水10mLに溶解し、次いで固体の重炭酸ナトリウム30mmolを加え、クロロギ酸アリル12mmolをゆっくりと加える。混合物を室温で2時間撹拌し、酢酸エチル50mLで希釈し、層を分離する。次いで有機層を1×10mLの飽和重炭酸ナトリウム、および1×10mLの1N塩酸、および1×10mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。化合物(27)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０２６３】
2-Alloc-アミノ-2-メチル-3-オキソ-プロピオン酸メチルエステル(28)の合成:Allocα-メチルセリンメチルエステル(27)をDess-Martinペルヨージナンを使用して上記の通りに酸化して、所望の生成物(28)を得る。
【０２６４】
2-Alloc-アミノ-3-メトキシカルボニル-1-置換-メチル-Cbz-アミノ-2-メチルプロピオン酸アリルエステル(30)の合成:化合物(30)を、化合物(15)について記載したものと同様の手順を使用して、しかしアルデヒドとして化合物(28)を使用して調製する。
【０２６５】
4-Cbz-2-メチル-6-オキソ-5-置換-ピペラジン-2-カルボン酸メチルエステル(31)の合成:窒素下で室温に維持した10mmolの化合物(30)のジクロロメタン30mL溶液に、2当量のフェニルシランおよび0.3当量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)を加え、この溶液を2時間撹拌し、次いで11mmolのTBTUおよびN-メチルモルホリン14mmolを加え、この溶液を室温で2時間撹拌し、次いで濃縮乾固する。
【０２６６】
4-Fmoc-2-メチル-6-オキソ-5-置換-ピペラジン-2-カルボン酸(25)の合成:窒素下で室温に維持した10mmolの化合物(31)のメタノール25mL溶液に、1N水酸化ナトリウム溶液11mmolをゆっくりと加え、反応を室温で終夜撹拌し、1N塩酸溶液21mLで中和し、10%炭素上パラジウム1gを加え、この懸濁液を室温および大気圧で3時間水素化する。この懸濁液をセライトで濾過し、濃縮する。残渣をテトラヒドロフラン25mLおよび水10mLに再溶解し、次いで固体の重炭酸ナトリウム30mmol、および10mmolのFmocクロリドを加え、反応を室温で窒素下において2時間撹拌する。次いで反応物を酢酸エチル50mLで希釈し、1N塩酸溶液で酸性化する。次いで層を分離し、有機層を1×20mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。化合物(25)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０２６７】
(5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-酢酸骨格の合成(方法I、J、K)
(5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-酢酸骨格の合成をいくつかの方法で実施した。
【０２６８】
方法I:(tert-ブチル3-保護-アミノ-4-(メトキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート(35)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、α-アミノエステル(2)でtert-ブチル3-保護-アミノ-4-オキソ-ブチレート(34)を還元的アミノ化することによって調製した。還元的アミノ化に必要なtert-ブチル3-保護-アミノ-4-オキソ-ブチレート(34)は、ワインレブアミド誘導体(33)の水素化アルミニウムリチウム(LAH)還元によって調製した。次いでtert-ブチル(3-保護-アミノ-4-(メトキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート類似体(35)を脱保護し、環化し、Fmoc保護して、tert-ブチル(5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-アセテート(36)を得、次いでこれを脱保護して最終生成物(37)を得た。
【０２６９】
【化２１】
2009532384.tif 000047
【０２７０】
アミノ保護Asp-(OtBu)ワインレブアミド(33)の合成:化合物(33)を、化合物(14)について記載したものと同様の手順を使用して調製した。
【０２７１】
【表２１】
2009532384.tif 000048
【０２７２】
tert-ブチル3-アミノ保護-アミノ-4-オキソ-ブチレート(34)の合成:化合物(34)を、化合物(9)について記載したものと同様の手順を使用して調製した。
【０２７３】
【表２２】
2009532384.tif 000049
【０２７４】
tert-ブチル3-保護-アミノ-4-(メトキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート(35)の合成:化合物(35)を、化合物(10)について記載したものと同様の手順を使用して、しかしアルデヒドとして化合物(34)を使用して調製した。
【０２７５】
【表２３】
2009532384.tif 000050
【０２７６】
tert-ブチル(4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-アセテート(36)の合成:Fmocアミノ保護基を含有する化合物について、酢酸エチル溶液中の30%ジエチルアミン30mL中の10mmolの化合物(35)の溶液を室温で終夜撹拌し、次いで濃縮乾固した。Cbzアミノ保護基を含有する化合物について、10mmolの化合物(35)のエタノール30mL溶液を室温および大気圧で2時間水素化し、セライトで濾過し、濃縮乾固した。Fmoc保護について、残渣をテトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに溶解し、固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)を加え、次いで3.3g(13mmol)のFmoc-Clを加えた。混合物を3時間撹拌し、酢酸エチルで希釈した。層を分離し、有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。化合物(36)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２７７】
【表２４】
2009532384.tif 000051
【０２７８】
(4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-アセテート(37)の合成:化合物(36)をジクロロメタン中の90%トリフルオロ酢酸溶液で3時間脱保護し、次いで濃縮乾固した。最終生成物(37)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２７９】
【表２５】
2009532384.tif 000052
【０２８０】
方法J:ジフェニルメチル3-Fmoc-アミノ-4-(メトキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート(41)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、α-アミノエステル(2)でジフェニルメチル3-Fmoc-アミノ-4-オキソ-ブチレート(40)を還元的アミノ化することによって調製した。還元的アミノ化に必要なジフェニルメチル3-Fmoc-アミノ-4-オキソ-ブチレート(40)は、β-エステルをMitsunobu条件下で保護することにより市販のFmoc-アスパラギン酸α-アリルエステル誘導体(38)から形成させたワインレブアミド誘導体(39)を、水素化アルミニウムリチウム還元することによって調製した。パラジウム(0)触媒を使用してアリルエステルを除去し、次いでTBTUをカップリング剤として使用してワインレブアミドを形成させた。次いでジフェニルメチル3-Fmoc-アミノ-4-(メトキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート(41)をFmoc脱保護し、環化し、ジフェニルメチルエステルを水素化で除去し、次いでFmoc保護して、最終生成物(4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-酢酸(37)を得た。
【０２８１】
【化２２】
2009532384.tif 000053
【０２８２】
Fmoc-Asp-(OCHPh2)ワインレブアミド(39)の合成:窒素下で0℃に維持した、トリフェニルホスフィン3.4g(13mmol)およびジフェニルメタノール2.41g(13.1mmol)を含有する、5.1g(13.0mmol)のFmoc-アスパラギン酸α-アリルエステル(38)の乾燥テトラヒドロフラン30mL溶液に、アゾジカルボン酸ジイソプロピル2.6mL(13.4mmol)をゆっくりと加えた。氷浴を除去し、反応を室温で終夜撹拌し、濃縮乾固し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。1H NMR δ (CDCl3) 2.96〜3.06 (dd, 1H, CH2CO)、3.15〜3.26 (dd, 1H, CH2CO)、4.18〜4.76 (一連のm, 3H, CH, CH2)、5.14〜5.32 (m, 1H, CHN)、5.76〜5.86 (m, 1H, CHO)、7.20〜7.80 (一連のm, 18H, フルベン, およびPh); HPLC tR = 7.68分、(M+ + Na+) = 583.90。
【０２８３】
次いで、この生成物(9.8mmol)を、1.5g(1.3mmol)のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)を含有する37:2:1のジクロロメタン:酢酸:N-メチルモルホリン溶液40mLに溶解し、溶液を室温で終夜撹拌し、濃縮乾固し、酢酸エチル100mLと水30mLとの間に分配した。層を分離し、有機層を1×50mLの水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣を乾燥ジクロロメタン20mLに懸濁し、N-メチルモルホリン1.65mL(15mmol)および4.07g(12.7mmol)のTBTUを加え、懸濁液を室温で20分間撹拌し、次いでN-メチルモルホリン1.65mL(15mmol)およびN,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩1.52g(15.6mmol)を加えた。懸濁液を室温で2時間撹拌し、濃縮し、酢酸エチル100mLと水50mLとの間に分配した。有機層を1×30mLの水、1×30mLの飽和重炭酸ナトリウム溶液、および1×30mLの1N塩酸溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。1H NMR δ (CDCl3) 2.76〜2.88 (dd, 1H, CH2CO)、2.89〜3.00 (dd, 1H, CH2CO)、3.16 (s, 3H, CH3N)、3.70 (s, 3H, CH3O)、4.14〜4.22 (dd, 1H, CH)、4.28〜4.40 (t, 2H, CH2)、5.07〜5.16 (dd, 1H, CHN)、5.69〜5.76 (d, 1H, CHO)、7.24〜7.8 (一連のm, 18H, フルベン, およびPh); HPLC tR = 7.08、(M+ + Na+) = 587.03。
【０２８４】
ジフェニルメチル3-Fmoc-アミノ-4-オキソ-ブチレート(40)の合成:化合物(40)を、化合物(9)について記載したものと同様の手順を使用して調製する。
【０２８５】
ジフェニルメチル3-Fmoc-アミノ-4-(メトキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート(41)の合成:化合物(41)は、化合物(10)について記載したものと同様の手順を使用して、しかしアルデヒドとして化合物(40)を使用して調製した。
【０２８６】
【表２６】
2009532384.tif 000054
【０２８７】
(4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-酢酸(37)の合成:酢酸エチル中の30%ジエチルアミン30mL中の10mmolの化合物(41)の溶液を、室温で3時間撹拌した。次いで溶液を濃縮乾固し、2×30mLの酢酸エチルに再溶解し、再濃縮した。残渣をエタノール50mLおよび1N塩酸溶液20mLに溶解し、室温および大気圧で終夜水素化し、セライトで濾過し、濃縮乾固した。残渣をテトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに溶解し、固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)を加え、次いで3.3g(13mmol)のFmoc-Clを加えた。混合物を3時間撹拌し、酢酸エチル100mLで希釈し、層を分離し、有機層を2×50mlの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０２８８】
【表２７】
2009532384.tif 000055
【０２８９】
方法K:(5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル)-酢酸骨格を、市販のFmoc-アスパラギン酸αtert-ブチルエステル(42)から出発して合成する。Fmoc-アスパラギン酸αtert-ブチルエステルを水素化ホウ素ナトリウムで、その混合無水物を経由させて、Fmoc-ホモセリンαtert-ブチルエステルに還元し、次いでアルコールを臭化ベンジルで保護して、Fmoc-ホモセリンベンジルエーテルαtert-ブチルエステル(43)を得る。次いでtert-ブチルエステルをトリフルオロ酢酸で除去し、この酸を水素化ホウ素ナトリウムで混合無水物を介してアルコールに還元して2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-1-ブタノール(44)を得る。次いで上述の通りにDess-Martinペルヨージナンを使用して、アルコール(44)を2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシブタノール(45)に変換する。2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシブタナール(45)およびα-アミノエステル(2)を還元的アミノ化することによって、(2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-ブチルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(46)を得る。ジエチルアミンでFmoc脱保護することによって遊離の第一級アミンを得、これが自然に環化して6-ベンジルオキシエチル-3-置換-ピペラジン-2-オンになる。ベンジルエーテルを水素化で除去し、第二級アミンをそのFmoc誘導体として保護して4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(47)を得る。最後に、第一級アルコールを酸化して酸にして、方法Aで記載した通りに最終生成物(48)を得る。
【０２９０】
【化２３】
2009532384.tif 000056
【０２９１】
Fmoc-ホモセリン(OBn)αtert-ブチルエステル(43)の合成:窒素下で-20℃に維持した10.0mmolのFmoc Asp-OtBu(42)の乾燥テトラヒドロフラン50mL溶液に、トリエチルアミン1.77mL(12.7mmol)を加え、次いでクロロギ酸イソブチル1.57mL(12.0mmol)をゆっくりと加える。混合物を30分間撹拌し、次いで水素化ホウ素ナトリウム3.77g(99.6mmol)の水10mL冷溶液に、温度を5℃未満に維持しながらゆっくりと注ぐ。反応を0℃で15分間撹拌し、次いで1N塩酸溶液でクエンチする。反応混合物を酢酸エチル100mLで希釈し、層を分離する。有機層を2×25mLの1N塩酸溶液、2×25mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。次いで精製した化合物をテトラヒドロフラン30mLに溶解し、鉱油中の60%水素化ナトリウム分散液12mmol、次いでヨウ化テトラブチルアンモニウム0.2mmolおよび臭化ベンジル12mmolを加え、混合物を終夜撹拌し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液50mLでクエンチし、酢酸エチル100mLで抽出する。次いで化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０２９２】
2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-1-ブタノール(44)の合成:方法Iの化合物(37)について記載した通りに90%トリフルオロ酢酸を使用してtert-ブチルエステルを脱保護し、次いでこの酸を化合物(13)について記載した通りに水素化ホウ素ナトリウムで混合無水物中間体を介してアルコールに還元する。
【０２９３】
2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-ブタナール(45)の合成:(9)の合成について記載した通りにDess-Martinペルヨージナンを使用して2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-l-ブタノール(44)を酸化してアルデヒドにする。
【０２９４】
(2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-ブチルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(46)の合成:(10)の合成について記載した通りにシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用してα-アミノエステル(2)で2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-ブタナール(45)を還元的アミノ化する。
【０２９５】
4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(47)の合成:(2-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-ブチルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(46)を同時環化を伴ってFmoc脱保護し、次いで方法Jで化合物(37)について記載した通りに脱ベンジル化およびFmoc再保護する。
【０２９６】
4-Fmoc-5-置換-6-オキソ-ピペラジン-2-イル-酢酸(37)の合成:方法Aで記載した通りに4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(47)を酸化して酸にする。使用する酸化剤の選択は5位の基の性質に基づく。
【０２９７】
2-置換3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボン酸骨格の合成(方法L、M、N)
いくつかの方法を使用して2-置換3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボン酸骨格の合成を実施する。
【０２９８】
方法L:tert-ブチル2-Cbz-アミノ-4-(ベンジルオキシカルボニル-置換-メチル-Bocアミノ)-ブチレート(52)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、アミノエステル(51)でtert-ブチルCbz-2-アミノ-4-オキソ-ブチレート(50)を還元的アミノ化し、次いで第二級アミンをBoc保護することによって調製する。還元的アミノ化に必要なtert-ブチルCbz-2-アミノ-4-オキソ-ブチレート(50)は、ワインレブアミド誘導体(49)の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製する。ジアゼパン環は、保護基を除去し、次いでペプチド形成試薬で環化させて(53)を得ることによって形成させる。最後に、4-Fmoc-2-置換3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボン酸(54)を、保護基交換によって形成させる。
【０２９９】
【化２４】
2009532384.tif 000057
【０３００】
Cbz-Asp-(ワインレブアミド)-OtBu(49)の合成:化合物(49)を、化合物(14)について記載したものと同様の手順を使用して調製する。
【０３０１】
tert-ブチル3-Cbz-アミノ-4-オキソ-ブチレート(50)の合成:化合物(50)を、化合物(9)について記載したものと同様の手順を使用して調製する。
【０３０２】
tert-ブチル2-Cbz-アミノ-4-(ベンジルオキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート(52)の合成:還元的アミノ化は、化合物(10)について記載したものと同様の手順で行う。第二級アミンは、粗製混合物を2当量のBocジカーボネートとテトラヒドロフラン中で反応させることによって保護する。
【０３０３】
tert-ブチル1-Boc2-置換-3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボキシレート(53)の合成:10mmolの化合物(52)のエタノール30mL溶液を、室温および大気圧で2時間水素化し、セライトで濾過し、濃縮乾固する。残渣をジクロロメタン100mLおよび1.2当量のTBTUに溶解し、2.6当量のN-メチル-モルホリンを加える。この溶液を室温で終夜撹拌し、次いで濃縮する。残渣を酢酸エチル50mLと1N塩酸溶液25mLとの間に分配し、1×20mLの飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。
【０３０４】
1-Fmoc2-置換-3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボン酸(54)の合成:ジクロロメタン中の90%トリフルオロ酢酸10mL中の10mmolの化合物(53)の溶液を室温で2時間撹拌し、次いで溶液を濃縮乾固する。残渣をテトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに溶解し、固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)を加え、次いで3.36g(13mmol)のFmoc-Clを加える。混合物を3時間撹拌し、次いで酢酸エチルで希釈する。層を分離し、有機層を2×50mLの水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。
【０３０５】
方法M:還元ジペプチド類似体(60)を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、アミノエステル(29)でジフェニルメチルAlloc-2-アミノ-4-オキソ-ブチレート(59)を還元的アミノ化し、次いで第二級アミンをCbz保護することによって調製する。還元的アミノ化に必要なジフェニルメチルAlloc-2-アミノ-4-オキソ-ブチレート(59)は、ワインレブアミド誘導体(58)を水素化アルミニウムリチウム還元することによって調製する。ワインレブアミド誘導体(58)はワインレブアミド誘導体(57)の保護基交換によって調製する。次いで、ジアゼパン環を、アリルおよびAlloc基の除去、次いでペプチド形成試薬の存在下で閉環させることによって形成させる。2-置換3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボン酸骨格(54)を保護基交換によって形成させる。
【０３０６】
【化２５】
2009532384.tif 000058
【０３０７】
Fmoc-Asp-(ワインレブアミド)-OCHPh2(57)の合成:化合物(57)を、化合物(39)について記載したものと同様の手順を使用して調製する。
【０３０８】
Alloc-Asp-(ワインレブアミド)-OCHPh2(58)の合成:酢酸エチル中の30%ジエチルアミン20mL中の10mmolの化合物(56)の溶液を2時間撹拌し、濃縮乾固する。残渣をテトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに溶解し、固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)を加え、次いで13mmolのAlloc-Clを加える。混合物を3時間撹拌し、次いで酢酸エチルで希釈する。層を分離し、有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。化合物(58)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３０９】
ジフェニルメチル3-Alloc-アミノ-4-オキソ-ブチレート(59)の合成:化合物(59)を、化合物(9)について記載したものと同様の手順を使用して調製する。
【０３１０】
ジフェニルメチル2-Alloc-アミノ-4-(アリルオキシカルボニル-置換-メチルアミノ)-ブチレート(60)の合成:化合物(60)を、化合物(15)について記載したものと同様の手順を使用し、しかしアルデヒドとして化合物(59)を使用する還元的アミノ化によって調製する。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３１１】
ジフェニルメチル1-Cbz2-置換-3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボキシレート(61)の合成:窒素下で室温に維持した10mmolの化合物(60)のジクロロメタン30mL溶液に、2当量のフェニルシランおよび0.3当量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)を加え、この溶液を2時間撹拌し、次いで1.2当量のTBTUおよび1.3当量のN-メチル-モルホリンを加える。溶液を室温で終夜撹拌し、濃縮する。残渣を酢酸エチル50mLと1N塩酸溶液25mLとの間に分配し、1×20mLの飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。
【０３１２】
1-Fmoc2-置換-3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボン酸(54)の合成:10mmolの化合物(61)のエタノール30mL溶液を室温で2時間水素化し、セライトで濾過し、次いで溶液を濃縮乾固する。残渣をテトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに溶解し、固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)を加え、次いで3.36g(13mmol)のFmoc-Clを加える。混合物を3時間撹拌し、次いで酢酸エチルで希釈する。層を分離し、有機層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。
【０３１３】
方法N:Fmoc-アスパラギン酸βtert-ブチルエステルを、水素化ホウ素ナトリウムで混合無水物を介してFmoc-アスパルタノールβtert-ブチルエステル(63)に還元し、次いでアルコールを臭化アリルで保護してFmoc-アスパルタノールアリルエーテルβtert-ブチルエステル(64)を得る。次いで、tert-ブチルエステルをトリフルオロ酢酸で除去し、酸を水素化ホウ素ナトリウムで混合無水物を介してアルコールに還元して3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-1-ブタノール(65)を得る。次いで上述の通りにDess-Martinペルヨージナンを使用してアルコール(65)を3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシブタナール(66)に変換する。3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシブタナール(66)およびαアミノエステル(51)を還元的アミノ化し、次いで第二級アミンをalloc保護して、(3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-ブチル-alloc-アミノ)-2-置換酢酸ベンジルエステル(67)を得る。Alloc7-アリルオキシメチル-3-置換-[1,4]-ジアゼパン-2-オン(68)を、ベンジルエステルを鹸化し、次いでジエチルアミンでFmoc脱保護して遊離の第一級アミンを得、これをTBTUなどのペプチド形成試薬を使用して環させることによって形成させる。最終生成物(54)は、保護基交換によって形成させる：アリルエーテルおよびallocはパラジウム(0)で除去し、第二級アミンをそのFmoc誘導体として保護して4-Fmoc-7-ベンジルオキシメチル-3-置換-[1,4]-ジアゼパン-2-オンを得、次いで第一級アルコールで酸化して酸にして最終生成物(54)を得る。使用する酸化剤の選択は2位の基の性質に基づく。
【０３１４】
【化２６】
2009532384.tif 000059
【０３１５】
Fmoc-アスパルタノールβtert-ブチルエステル(63)の合成:化合物(63)を、化合物(13)の合成について記載した通りに、Fmoc-アスパラギン酸βtert-ブチルエステル(62)を出発物質として使用して調製する。
【０３１６】
3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-酪酸tert-ブチルエステル(64)の合成:窒素下で室温に維持した10mmolの(63)のテトラヒドロフラン30mL溶液に、鉱油中の60%水素化ナトリウム分散液12mmol、ヨウ化テトラブチルアンモニウム2mmol、および臭化アリル13mmolを加え、混合物を終夜撹拌し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液10mLでクエンチし、酢酸エチル50mLで抽出する。
【０３１７】
3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-1-ブタノール(65)の合成:化合物(65)を、化合物(44)の合成について記載した通りに調製する。
【０３１８】
3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-ブタナール(66)の合成:3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-1-ブタノール(65)を、(9)の合成について記載した通りにDess-Martinペルヨージナンを使用して酸化してアルデヒドにする。
【０３１９】
(3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-ブチル-alloc-アミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(67)の合成:化合物(10)について記載した通りにシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリウムトリアセトキシボロヒドリドのいずれかを還元剤として使用して、α-アミノエステル(51)で3-Fmoc-アミノ-4-ベンジルオキシ-ブタナール(66)を還元的アミノ化し、次いで第二級アミンをalloc誘導体として保護することを、化合物(15)について記載した通りに、しかしクロロギ酸ベンジルの代わりにクロロギ酸アリルを使用して行う。
【０３２０】
4-Alloc-7-アリルオキシメチル-3-置換-[1,4]-ジアゼパン-2-オン(68)の合成:メタノール20mLおよび水10mL中、10mmolの(3-Fmoc-アミノ-4-アリルオキシ-ブチル-alloc-アミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(67)、炭酸カリウム20mmolの溶液を室温で3時間撹拌し、1N塩酸溶液21mLで中和し、次いで濃縮乾固する。残渣を酢酸エチル中の30%ジエチルアミン20mLに溶解し、3時間撹拌し、次いで濃縮乾固する。残渣をジクロロメタン100mLに溶解し、12mmolのTBTUおよびN-メチルモルホリン24mmolを加え、この溶液を室温で終夜撹拌し、次いで濃縮乾固する。残渣を酢酸エチル30mLと1N塩酸溶液30mLとの間に分配し、次いで層を分離する。有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液30mLで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３２１】
4-Fmoc-2-置換-3-オキソ-[1,4]-ジアゼパン-5-カルボン酸(54)の合成:窒素下で室温に維持した10mmolの化合物(68)のジクロロメタン30mL溶液に、2当量のフェニルシランおよび0.3当量のテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)を加え、次いで溶液を2時間撹拌し、濃縮乾固する。この第二級アミンをテトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに溶解し、次いで固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)および1.2当量のFmoc-Clを加え、この二相溶液を室温で2時間撹拌し、酢酸エチル30mLで希釈し、層を分離する。方法Aで記載した通りに4-Fmoc-7-ヒドロキシメチル-3-置換-[1,4]-ジアゼパン-2-オンを酸化して最終生成物(54)にする。方法Aでの(6)から(7)への変換と同様に、使用する酸化剤の選択は2位の基の性質に基づく。
【０３２２】
6-置換-5-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸骨格の合成(方法O)
6位に非官能化側鎖を含有する6-置換-5-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸骨格を、方法Oで概略を述べた通りに、市販の3-Fmoc-アミノ-1,2-プロパン-ジオール1-クロロ-トリチル樹脂(69)から出発して合成し、これをDess-Martinペルヨージナンを使用して酸化してケトン(70)にする。ケトン(70)をαアミノエステル(2)で還元的アミノ化して樹脂結合型の(1-アミノメチル-2-クロロ-トリチルオキシ-エチルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(71)を得、これを、アミンを脱保護した後に環化させて、5-クロロトリチルオキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(72)にする。第二級アミンを再保護し、次いで樹脂から切断してFmoc-5-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(73)を得、これを、方法Aで記載した手順のいずれかを使用して酸化して、6-置換-5-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(74)を得る。
【０３２３】
【化２７】
2009532384.tif 000060
【０３２４】
1-アミノ-3-クロロトリチルオキシ-プロパン-2-オン(70)の合成:樹脂結合型のアルコール(69)を、三酸化硫黄酸化、NMO/TPAP(N-メチルモルホリン-N-オキシド/過レニウム酸テトラプロピルアンモニウム)酸化、またはPDC酸化によって酸化する。三酸化硫黄酸化については、Parikh, J. R.およびDoering, W. V.、J. Am. Chem. Soc. 89:5505〜5507(1967)に記載されている手順と同様の手順を使用する。NMO/TPAP酸化については、樹脂結合型のアルコール0.3mmolに、N-メチルモルホリンN-オキシド3mmolの乾燥ジメチルホルムアミド10mL溶液を加え、次いで過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム(TPAP)0.06mmolを樹脂懸濁液に加える。反応を80分間振とうする。溶媒を排液し、樹脂をテトラヒドロフランおよびジクロロメタンで洗浄し、次いで真空乾燥する。PDC酸化については、ジメチルホルムアミド中の0.2M重クロム酸ピリジニウム中の樹脂結合型のアルコールの懸濁液を37℃で4時間振とうし、溶媒を排液し、樹脂をジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランおよびジクロロメタンで洗浄する。
【０３２５】
(1-アミノメチル-2-クロロ-トリチルオキシ-エチルアミノ)-2-置換酢酸メチルエステル(71)の合成:樹脂結合型のケトン(70)を2つの異なる方法の1つによってアミノエステルで還元的アミノ化する。1つの方法では、ジメチルホルムアミド中の1%酢酸20mL中の2.6mmolのαアミノエステル(2)の溶液にナトリウムトリアセトキシボロヒドリド2.6mmolを加え、次いで即座に0.5mmolのケトン官能化樹脂(70)を加え、混合物を60分間振とうし、メタノール、10%ジ-イソプロピルエチルアミン、ジメチルホルムアミド、およびメタノールでリンスする。第2の方法では、0.05Mシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含有する、メタノール中の0.05mmolのケトン官能化樹脂(70)および2.0Mαアミノエステル塩酸塩(2)の懸濁液を、室温で5時間振とうし、排液し、洗浄する。
【０３２６】
5-クロロトリチルオキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(72)の合成:ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン10mL中の樹脂0.05mmolの懸濁液を室温で2時間振とうする。
【０３２７】
Fmoc-5-ヒドロキシメチル-3-置換-ピペラジン-2-オン(73)の合成:0.25mmolのFmoc-Clおよびトリエチルアミン0.25mmolを含有する、0.05mmolの(72)のジクロロメタン10mL懸濁液を、室温で6時間撹拌し、排液し、ジクロロメタンで洗浄する。樹脂をジクロロメタン中の95%トリフルオロ酢酸10mLに再懸濁させ、懸濁液を2時間振とうし、濾過し、濾液を濃縮する。
【０３２８】
Fmoc-6-置換-5-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(74)の合成:方法Aについて記載した手順のいずれかによって(73)を酸化して所望の生成物にする。
【０３２９】
α,α-二置換アミノ酸の合成(方法PおよびQ)
本発明の特定の構築物においては、置換基が同じか異なるα,α-二置換アミノ酸などの二置換アミノ酸残基を用いることが可能であり、企図される。一態様では、α,α-二置換アミノ酸をAaa1またはAaa8位置のいずれかで用い、ここで、α,α-二置換アミノ酸の側鎖の少なくとも1つは、Nle、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Met(O)またはMet(O2)の側鎖である。以下の合成方法PおよびQは、α,α-ジ-n-ブチルグリシン(2-アミノ-2-ブチル-ヘキサン酸)の作製を記載しており、ここで、側鎖のそれぞれは-(CH2)3-CH3であり、したがってそれぞれはNleの側鎖と同じである。しかし、同様の方法およびスキームは、置換基が同じか異なるその他のα,α-二置換アミノ酸の作製で用い得ることは理解されよう。さらに、α,α-二置換アミノ酸を作製する任意の方法を、本発明の実施で用いることができ、本発明の実施は以下の合成スキームの方法に限定されない。よって、α,α-二置換アミノ酸の合成について当技術分野で知られている任意の方法を、本発明の実施で用いることができる。以下の文献は、α,α-二置換アミノ酸を作製するための代替方法を教示している:Clark J.S.およびMiddleton M.D.: Synthesis of novel alpha-substituted and alpha,alpha-disubstituted amino acids by rearrangement of ammonium ylides generated from metal carbenoids. Org. Lett. 4(5):765-8(2002); Guino M.、Hii K.K.: Wang-aldehyde resin as a recyclable support for the synthesis of alpha,alpha-disubstituted amino acid derivatives. Org Biomol. Chem. 3(17):3188-93(2005);およびKotha S.、Behera M.: Synthesis and modification of dibenzylglycine derivatives via the Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction. J. Pept. Res. 64(2):72-85(2004)。
【０３３０】
【化２８】
2009532384.tif 000061
【０３３１】
ベンゾイルジ-n-ブチルグリシン(80)の合成:窒素下で0℃に維持した10mmolのベンゾイルグリシン(75)のジクロロメタン20mL溶液に、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)12mmolをゆっくりと加え、反応を2時間撹拌して、化合物(76)を得る。固体を濾別し、濾液を濃縮する。残渣をテトラヒドロフラン15mLに溶解し、0℃に冷却し、次いで水素化ナトリウム24mmol、次いで臭化n-ブチル30mmolを加える。この懸濁液を0℃で2時間撹拌し、次いで室温まで戻し、溶液を濃縮乾固して化合物(77)を得る。別法として、化合物(77)はまた、水素化ナトリウム12mmolおよび臭化n-ブチル15mmolを使用すること以外は同様にして、ベンゾイルノルロイシン(78)から調製できる。化合物(77)をメタノールに溶解し、1N塩酸溶液50mLを加え、溶液を2時間撹拌し、濃縮する。化合物(80)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３３２】
Fmocジ-n-ブチルグリシン(81)の合成:10mmolの化合物(80)をジオキサン30mLに溶解し、6N塩酸溶液10mLを加え、この溶液を終夜還流する。反応を室温まで冷却し、濃縮乾固し、テトラヒドロフラン30mLに再溶解し、水10mLおよび重炭酸ナトリウム30mmol、次いで15mmolのFmoc-Clを加える。この二相溶液を1時間撹拌し、テトラヒドロフランを真空除去する。水溶液を1×50mLのジエチルエーテルで抽出し、1N塩酸溶液で酸性化し、2×50mLの酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮する。化合物(81)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３３３】
任意の適切なアミノ酸誘導体(化合物78と同様のもの)から出発し、適切なアルキルブチル、アリールブチル、またはアラルキルブチル試薬を使用することによって、同様の方法を用いることができる。このスキームにより、RとR'が異なる種々の二置換(R,R')アミノ酸代用残基が得られる。
【０３３４】
【化２９】
2009532384.tif 000062
【０３３５】
Fmoc-α,αジ-n-ブチルグリシン(87)の合成:室温で維持した20mmolのグリシンメチルエステル塩酸塩(82)および粉末モレキュラーシーブ2gの乾燥テトラヒドロフラン40mL懸濁液に、水酸化カリウム24mmol、次いでベンズアルデヒド22mmolを加える。この懸濁液を2時間撹拌し、濾過し、濾液を濃縮する。残渣を乾燥トルエン40mLに再溶解し、次いで水素化ナトリウム60mmolのトルエン懸濁液に加え、次いで臭化n-ブチル60mmolを加える。この懸濁液を12時間撹拌し、次いで6N塩酸の溶液30mLを加え、室温で2時間撹拌し、次いで層を分離する。このように得た(84)の塩酸塩をin situで使用して(87)を調製する。(84)を塩酸塩として単離するためには、水層を濃縮乾固し、生成物を乾燥メタノール-エーテルから結晶化する。
【０３３６】
別法として、化合物(84)を、ノルロイシンメチルエステル塩酸塩から、(86)から(84)への変換のために水素化ナトリウム30mmolおよび臭化n-ブチル30mmolを使用する以外は、同様の合成手順を使用して調製できる。
【０３３７】
上記で得た化合物(84)の塩酸塩形態の水性混合物を1時間加熱還流し、次いで室温に冷却する。これを固体の水酸化ナトリウムで中和し、次いでテトラヒドロフラン30mLで希釈する。重炭酸ナトリウム(30mmol)、次いで15mmolのFmoc-Clを加える。この二相溶液を1時間撹拌し、テトラヒドロフランを真空除去する。水溶液を1×50mLのジエチルエーテルで抽出し、1N塩酸溶液で酸性化し、2×50mLの酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮する。化合物(87)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３３８】
任意の適切なアミノ酸誘導体(化合物85と同様のもの)から出発し、適切なアルキルブチル、アリールブチル、またはアラルキルブチル試薬を使用することによって、同様の方法を用いることができる。このスキームにより、RとR'が異なる種々の二置換(R,R')アミノ酸代用残基が得られる。
【０３３９】
二置換(R,R')骨格の合成(方法R)
本発明は、2つのR基、RおよびR'を有するアミノ酸代用残基が用いられる構築物をさらに提供する。以下の方法は、RおよびR'がそれぞれノルロイシン側鎖部分に対応する基であるFmoc保護(R)-5,5-ジブチル-6-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸の合成を説明する。以下の方法を部分的に上述の方法に基づいて変更して同様の二置換(R,R')アミノ酸代用残基を生成し得ることは分かるであろう。任意の適切なアミノ酸誘導体(化合物(84)と同様の化合物)で出発する同様の方法を用いてもよい。このスキームにより、RとR'が異なる種々の二置換(R,R')アミノ酸代用残基を得ることができる。
【０３４０】
【化３０】
2009532384.tif 000063
【０３４１】
(2-Fmoc-アミノ-3-tert-ブトキシ-プロピルアミノ)-2,2,ジ-n-ブチル酢酸メチルエステル(88)の合成:21mmolの(84、スキームQ)、およびトリエチルアミン2.9mL(21mmol)の乾燥テトラヒドロフラン50mL懸濁液を室温で45分間撹拌し、次いで、約20mmolの粗製Fmoc-(O-t-ブチル)-セリナール(9、スキームD)のテトラヒドロフラン30mL溶液、次いで1.7gの4Å粉末モレキュラーシーブを加え、この懸濁液をさらに2時間撹拌する。固体のナトリウムトリアセトキシボロヒドリド6.4g(30mmol)を加え、この懸濁液を室温で終夜撹拌する。この懸濁液をメタノールで希釈し、モレキュラーシーブを濾過し、濾液を濃縮する。残渣を酢酸エチル100mLと水50mLとの間に分配する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮する。化合物(88)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３４２】
4-Fmoc-6-ヒドロキシメチル-3,3-ジ-n-ブチル-ピペラジン-2-オン(89)の合成:酢酸エチル中の30%ジエチルアミン30mL中の10mmolの化合物(88)の溶液を室温で終夜撹拌し、次いで濃縮乾固する。残渣をテトラヒドロフラン20mLおよび水10mLに溶解し、固体の重炭酸ナトリウム2.52g(30mmol)、次いで3.36g(13mmol)のFmoc-Clを加える。混合物を3時間撹拌し、酢酸エチル50mLで希釈し、層を分離し、有機層を水30mLで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。粗製混合物を90%トリフルオロ酢酸10mLのジクロロメタン溶液に溶解し、2時間撹拌し、次いで濃縮乾固する。残渣を酢酸エチルに溶解し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液50mLで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮する。化合物(89)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３４３】
4-Fmoc-5,5-ジ-n-ブチル-6-オキソ-ピペラジン-2-カルボン酸(90)の合成:室温で維持した8mmolのアルコール(89)のアセトニトリル81mL溶液に、リン酸バッファー溶液(水29.5mL中の一塩基リン酸ナトリウム0.72gおよび二塩基リン酸ナトリウム1.43gで調製)を加え、次いで0.33g(2.1mmol)のTEMPO、および亜塩素酸ナトリウム1.86g(16.5mmol)を加え、この二相溶液を、43℃で維持した油浴中に置く。4.3mL(2.6mmol)の次亜塩素酸ナトリウム溶液(10〜13%次亜塩素酸ナトリウム溶液1.9mLおよび水2.4mLを混合することによって調製)をゆっくりと加える。反応を43℃で4時間撹拌し、室温まで冷却し、10%亜硫酸水素ナトリウム20mLを加え、10分間撹拌し、酢酸エチル50mLで希釈し、層を分離する。有機層を1×10mLのブライン、1×10mLの1N塩酸溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮する。化合物(90)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。
【０３４４】
本発明の構築物の合成
本発明のいくつかの実施形態に開示する構築物は、アミノ酸間のペプチド結合形成のための任意の公知の従来の手順によって容易に合成することができる。このような従来の手順には、例えば、カルボキシル基もしくは保護された他の反応性基を有するアミノ酸残基の遊離のアルファアミノ基と、アミノ基もしくは保護された他の反応性基を有するもう1つのアミノ酸残基の遊離の第一級カルボキシル基との間の縮合を可能とする任意の溶液相手順が含まれる。好ましい従来の手順において、本発明の構築物は、固相合成によって合成し、当技術分野で公知の方法によって精製することができる。本発明のアミノ酸代用残基は、残基で用いられるものと実質的に同様または同一の方法によって本発明の構築物中に取り込むことができる。様々な樹脂および試薬を用いる任意の多くの周知の手順を用いて、本発明の構築物を調製することができる。
【０３４５】
所望の配列のそれぞれのアミノ酸もしくはアミノ酸代用残基が、別のアミノ酸残基もしくはアミノ酸代用残基に相次いで1つずつ添加される手順、または1つもしくは複数のアミノ酸代用残基を含んでいてもよい所望のアミノ酸配列を有するペプチド断片を最初に従来通り合成し、次いで、縮合して所望の構築物を得る手順によって、構築物を合成するプロセスを行うことができる。
【０３４６】
固相ペプチド合成法は、当技術分野において周知であり、かつ実施されている。このような方法において、本発明の構築物の合成は、固相法の一般原理に従って成長するペプチド鎖の中に1つずつ所望のアミノ酸残基またはアミノ酸代用残基を逐次的に取り込ませることによって行うことができる。これらの方法は、Merrifield R.B.、Solid phase synthesis (Nobel lecture). Angew. Chem. 24:799〜810頁(1985年)およびBaranyら、The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology、Vol.2、Gross E. およびMeienhofer J.編、Academic Press、1〜284頁(1980年)を含む多数の参考文献に開示されている。
【０３４７】
構築物の化学合成において、様々なアミノ酸残基またはアミノ酸代用残基の反応性側鎖基は、好適な保護基で保護され、これにより保護基が除かれるまでその部位に化学反応が起こることを防止する。アミノ酸残基またはアミノ酸代用残基のアルファアミノ基の保護も一般的であるが、これは、カルボキシル基と反応し、その後、アルファアミノ保護基を選択的に除去し、その後の反応がその部位に起こることを可能にする。特定の保護基が開示され、固相合成法および液相合成法において知られている。
【０３４８】
アルファアミノ基は、好適な保護基によって保護することができ、これには、ウレタン型保護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル(Z)および置換ベンジルオキシカルボニル（例えば、p-クロロベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル、p-ビフェニルイソプロポキシカルボニル、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)およびp-メトキシベンジルオキシカルボニル(Moz)など）;脂肪族ウレタン型保護基、例えば、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルなどがある。Fmocは、アルファアミノ保護に好ましい。
【０３４９】
グアニジノ基は、好適な保護基、例えば、ニトロ、p-トルエンスルホニル(Tos)、Z、ペンタメチルクロマンスルホニル(Pmc)、アダマンチルオキシカルボニル、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル(Pbf)、FmocおよびBocによって保護することができる。Pbfは、Argのための1つの好ましい保護基である。他の好ましい保護基には、Z、Fmoc、およびBocがある。特に、グアニジノ保護基は、合成処理中に切断および除去されてもよく、あるいは切断または除去されなくてもよく、この事象において、保護基を有する側鎖は、本明細書において定義した通りのアミノ酸側鎖部分の誘導基を形成する。特に、保護基が不安定であり、患者に投与後生体内(in vivo)の機構によって除去され得る場合、構築物は、「プロドラッグ」、すなわち、患者への投与後、ある化学的または生理学的処理を介してin vivoで所望の薬剤に変換される薬剤前駆体である構築物となる(例えば、プロドラッグは、生理学的pHまたは酵素作用下に置かれると、所望の薬剤形態に変換される)。
【０３５０】
本明細書に記載する本発明の構築物は、手作業によって、あるいは、製造業者により与えられたプログラミングモジュールを用い、製造業者により提供されたプロトコルに従うかもしくは困難なカップリングの収率を改善するために製造業者のプロトコルを修正することによる自動ペプチド合成機によって、固相合成を用いて調製することができる。
【０３５１】
固相合成は、保護されたα-アミノ酸、α-アミノ酸代用残基、またはα-アミノアルコール模倣物を好適な樹脂にカップリングさせることによって構築物のC-末端から開始する。このような出発物質は、α-アミノ保護アミノ酸またはα-アミノ保護アミノ酸代用残基を、p-ベンシルオキシベンジルアルコール(Wang)樹脂もしくは2-クロロトリチルクロライド樹脂にエステル結合により結合させることによって、ベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂にFmoc-リンカー〔例えば、p-[(R,S)-α-[1-(9H-フルオル-エン-9-イル)-メトキシホルムアミド]-2,4-ジメチルオキシベンジル]-フェノキシ酢酸(Rinkリンカー)〕との間のアミド結合により結合させることによって、あるいは当技術分野で良く公知の他の手段、例えば、α-アミノ保護アルコール模倣物を、クロロメチルポリスチレン樹脂に結合した3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2イル-メタノールリンカーに結合させることによって調製する。Fmoc-リンカー-BHA樹脂支持体は、市販されており、可能な場合に一般的に使用される。この樹脂に、必要に応じて反復サイクル処理によって、アミノ酸を順次付加する。アルファアミノFmoc保護基は、塩基性条件下で除かれる。N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中のピペリジン、ピペラジン、ジエチルアミン、またはモルホリン(20〜40%v/v)を、この目的に用いることができる。
【０３５２】
アルファアミノ保護基を除去した後、次の保護アミノ酸またはアミノ酸代用残基を、所望の順序で段階的に結合させて、中間体の保護ペプチド-樹脂を得る。ペプチドの固相合成におけるアミノ酸のカップリングに用いられる活性化剤は、当技術分野でよく知られている。構築物が合成された後、必要ならば、当技術分野でよく公知の方法を用いて、直交して保護された側鎖保護基を除去し、構築物のさらなる誘導体化のために用いることができる。
【０３５３】
構築物における反応性基は、固相合成の間または樹脂からの除去後のいずれかの際に、選択的に修飾することができる。例えば、構築物を、樹脂上にある間に修飾して、あるいは切断剤を用いて樹脂から除去し次いで修飾して、N-末端修飾体、例えば、アセチル化物を得ることができる。N-末端修飾（例えば、アセチル化）またはC-末端修飾（例えば、N-アセチル基のアミド化もしくは導入）の方法は、当技術分野に公知である。同様に、アミノ酸の側鎖を修飾する方法は、ペプチド合成の当業者に周知である。構築物上に存在する反応性基への修飾の選択は、1つには構築物に望まれる特性によって決定する。
【０３５４】
構築物を、1つの実施態様では、樹脂からの切断に先立って環化させる。反応性側鎖部分による環化のために、所望の側鎖を脱保護し、構築物を好適な溶媒に懸濁させ、環化カップリング剤を添加する。好適な溶媒には、例えば、DMF、ジクロロメタン（DCM）、または1-メチル-2-ピロリドン（NMP）が含まれる。好適な環化カップリング剤には、例えば、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)、ベンゾトリアゾール1-イル-オキシ-トリス(ピロリジノ) ヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TATU)、2-(2-オキソ-1(2H)-ピリジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TPTU)、またはN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド/1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(DCCI/HOBt)が含まれる。カップリングは、通常、適切な塩基、例えば、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA), sym-コリジン、またはN-メチルモルホリン(NMM)を用いて開始させる。
【０３５５】
合成に次ぐ固相からの構築物の切断後、構築物を、多くの方法のいずれか、例えば、C18カラムなどの好適なカラムを用いる逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって、精製することができる。分離または精製の他の方法、例えば、構築物の大きさまたは電荷に基づく方法も用いることができる。精製後、構築物を、多くの方法のいずれか、例えば、高性能液体クロマトグラフ(HPLC)、アミノ酸分析、質量分析法などによって特性決定することができる。
【０３５６】
置換アミド誘導体C-末端（典型的にはN-アルキル基）を有する本発明の構築物は、保護されたアルファアミノ酸またはアミノ酸代用残基を好適な樹脂に結合させることによって構築物のC-末端から開始させる固相合成法によって調製する。置換アミド誘導体を調製するための固相上でのこのような方法は、当技術分野において記載されている。例えば、Barn D.R.、Morphy J.R.、Rees D.C.、Synthesis of an array of amides by aluminum chloride assisted cleavage of resin-bound esters. Tetrahedron Lett. 37、3213〜3216頁(1996年);DeGrado W.F. Kaiser E.T. Solid-phase synthesis of protected peptides on a polymer bound oxime: Preparation of segments comprising the sequences of a cytotoxic 26-peptide analogue. J. Org. Chem. 47:3258〜3261頁(1982年)を参照されたい。このような出発物質は、公知の手段によって、アルファアミノ保護アミノ酸またはアミノ酸代用残基をP-ベンジルオキシベンジルアルコール(Wang)樹脂にエステル結合によって結合させることによって調製することができる。ペプチド鎖は、ジクロロメタン中の適切なアミン(例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミンなど)および塩化アルミニウムの溶液と共に、環化および樹脂処理することにより、所望の配列のアミノ酸もしくはアミノ酸代用残基を用いて成長させる。得られたアミド誘導体構築物は、溶液中で樹脂から放出される。この樹脂をろ過し、アミド誘導体構築物を溶媒の濃縮によって回収し、その後エーテルで沈殿させる。この粗構築物を乾燥し、残存するアミノ酸側鎖保護基を水およびトリイソプロピルシラン(TIS)の存在下でトリフルオロ酢酸(TFA)を用いて切断する。最終生成物を冷エーテルを添加することによって沈殿させ、ろ過によって収集する。最終精製は、C18カラムを用いるRP-HPLCによる。
【０３５７】
1つの好ましい方法において、実施例1の構築物を以下の方法によって合成した。それぞれの構築物は、ケト-ピペラジン構造に基づく1つまたは2つのアミノ酸代用残基を有していた。これらのアミノ酸代用残基は上述した通りに合成した。構築物をFmoc化学を用いて合成した。ケト-ピペラジンアミノ酸代用残基の取込み直前および直後のカップリングに手作業の合成手法を用いた。
【０３５８】
例えば、アミノ酸代用残基が末端位置にあった場合には、アミノ酸代用残基を樹脂に結合させるために以下のプロトコルを用いた。Rinkアミド樹脂(0.3ミリモル/gで充填、Advanced Chem Tech)をDMF中で30分間膨潤させた。樹脂のFmoc脱保護を、20%ピペリジン/DMF条件を20分間用いて達成した。この樹脂と選択されたFmoc-保護ケト-ピペラジンアミノ酸代用残基(2当量)とのカップリングを、PyBop(2当量)およびDIEA(4当量)と一緒にDMF中で一晩インキュベーションすることによって達成した。カイザー試験後に陽性結果が得られた場合、2回目のカップリング反応を行った。アセチル化は、DMF中のAc2O(10当量)およびピリジン(20当量)を用いて行った。
【０３５９】
以下のプロトコルを用いて、ケト-ピペラジンアミノ酸代用残基をペプチド-樹脂に結合させた。カップリングは、DMF中で、Fmoc-保護ケトピペラジンアミノ酸代用残基(2当量)、TBTU(2当量)、およびDIEA(4当量)を混合することによって行い、一晩インキュベートさせ、陽性のカイザー試験が得られた場合は、再度カップリング反応を繰り返した。アセチル化は、DMF中のAc2O(10当量)およびピリジン(20当量)を使用して行った。
【０３６０】
以下のプロトコルを用いて、Fmoc-保護アミノ酸（4当量）を、固相上のケト-ピペラジンアミノ酸代用残基とカップリングさせた。多くの場合、少なくとも2回のカップリングサイクルが必要であり、しばしば3サイクルを用いた。典型的なサイクルでは、Fmoc-保護アミノ酸（4当量）を、DMF中のHOAt（4当量）およびDIC（4当量）と混合した。次いで、得られた混合物を、樹脂に直接または介在基を介して結合したケト-ピペラジンアミノ酸代用残基が入ったSPEチューブ中で一晩混合した。
【０３６１】
配列においてケト-ピペラジンアミノ酸代用残基に直接隣接していないアミノ酸間のカップリングは、固相ペプチド合成のための標準プロトコルを用いて行った。次の保護基を用いた:LysおよびOrnに対してBoc、TyrおよびSerに対してt-ブチル、CysおよびHisに対してトリチル、Aspに対してO-t-ブチル、およびArgに対してPbf。
【０３６２】
構築物は、TFA/チオアニソール/フェノール/H2O/DTT/TIS(87.5/2.5/2.5/5/2.5/11)(5mL)の混合物を用い、3時間で、樹脂から切断した。得られた物質をろ過し、凍結条件下で冷エーテルから1時間で沈殿させた。沈殿したシステイニルペプチドを、酸化工程に用いる前に、冷エーテルで少なくとも3回洗浄した。
【０３６３】
ジスルフィド結合を空気酸化によって形成させる環化反応のために、粗製システイニル構築物を、アセトニトリルおよび水の混合物に溶解させた。反応混合物のpHを、5％NH4OHを用いて7〜8に調節した。得られた溶液を、150mgの粒状活性炭と共に2日間ゆっくりと撹拌した。環化反応の完了を、次の工程に進む前にLC-MS分析によって確認した。環化反応の後、固体炭素を溶液から濾別した。濾液を凍結乾燥するかまたはスピードバック中で乾燥して、粗製環状構築物を得た。
【０３６４】
代用残基が樹脂または他のペプチド固体支持体に結合しており、かつC-末端位置にある場合、本発明の特定の化合物は、以下のスキームによって合成することができる。以下のスキームは構築物1-132の合成によって例証されているが、代用残基が樹脂または他の固体支持体に結合している任意の構築物に対して、実質的に同様の方法を用いることができることを理解されたい。
【０３６５】
【化３１】
2009532384.tif 000064
【０３６６】
代用残基(7)は、上記方法Aまたは任意の他の方法によって調製する。Fmoc保護Sieberアミド樹脂は、樹脂23.8g（0.53mmol/g置換、15mmol）をジメチルホルムアミドとジクロロメタンの1:1混合物200ml中で45分間膨潤させることによって処理し、その後濾過し、ジメチルホルムアミド2×125mLで洗浄した。次いで、洗浄した樹脂を、ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン2×125mLを用いて15分間脱保護し、濾過して、ジメチルホルムアミド4×125mLで洗浄した。
【０３６７】
ジメチルホルムアミド160mL中の21.5g（MW=717、30mmol）のFmoc-保護代用残基(7)の溶液を、上述により調製した脱保護Sieberアミド樹脂に加え、その後、15.6g（MW=520.3、30mmol）の固体PyBopおよび10.4mL（MW=129.25、d=0.742、60mmol）のジイソプロピルエチルアミン、その後追加のジメチルホルムアミド40mLを加えた。混合物を窒素バブリングで一晩激しく攪拌した。この樹脂をろ過し、4×130mLのジメチルホルムアミドで洗浄して、ジメチルホルムアミド:無水酢酸:ピリジンの3:2:1溶液からなるキャッピング溶液150mLで30分間キャッピングし、濾過し、4×130mLのジメチルホルムアミドで洗浄して、樹脂に結合した代用残基(7)を得た。
【０３６８】
得られた、樹脂に結合させたFmoc-保護代用残基(7)を、ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン2×130mLで15分間脱保護し、濾過し、4×130mLのジメチルホルムアミドで洗浄し、樹脂に結合した代用残基(7)を得た。ジメチルホルムアミド（200mL）中のFmoc-Tyr-(tBu)-OH(60mmol、4当量)の溶液を、樹脂に結合させた代用残基(7)に加え、次いで、DMF中のHCTU 24.8g(60ミリモル、4当量)およびジイソプロピルエチルアミン20.8mL(120ミリモル、8当量)溶液を加え、窒素バブリングさせながら一晩カップリングさせた。得られたFmoc-Tyr-(tBu)-代用残基(7)-樹脂を濾過によって単離し、ジメチルホルムアミド2×130mLで洗浄した。完全なカップリングを確実にするために、生成物に、27.6gのFmoc-Tyr-(tBu)-OH（MW=459.6、60mmpl、4当量）のジメチルホルムアミド溶液を加えて最終的に200mLとして再度処理し、次いで、24.8gのHCTU（60mmol、4当量）およびジイソプロピルエチルアミン（20.8mL、120mmol、8当量）のジメチルホルムアミド溶液を加えて最終的に200mLとし、窒素バブリングさせながら一晩カップリングさせた。樹脂をろ過し、ジメチルホルムアミド2×130mLで洗浄した。HPLCおよびLC/MSにより、代用残基(7)-樹脂とFmoc-Tyr-(tBu)-OHとの間のカップリングが完了していることが明らかとなった。
【０３６９】
次いで、得られたFmoc-Tyr-(tBu)-代用残基(7)-樹脂を、上述したキャッピング溶液150mLを用いて30分間キャッピングした。次いで、この樹脂をろ過し、4×130mLのジメチルホルムアミド、4×130mLのジクロロメタン、2×130mLのMeOH、および2×130mLのジエチルエーテルで洗浄し、次いで、真空下で乾燥させて、36.7gを得た。
【０３７０】
その後、後続の各アミノ酸をカップリングさせることができる。1回目のアミノ酸のカップリングの前に、得られたFmoc-Tyr-(tBu)-代用残基(7)-樹脂を、ジメチルホルムアミドとジクロロメタンの1:1混合物200ml中で45分間膨潤させた。各アミノ酸（Fmoc-AA-OH）を、以下のサイクルを繰り返すことによってカップリングさせた。末端アミノ酸残基をジメチルホルムアミド中の20％ピペリジン2×125mLを用いて15分間脱保護し、濾過し、4×125mLのジメチルホルムアミドで洗浄した。ビーズをニンヒドリン試験でチェックした。Fmoc-AA-OH（60mmol、4当量）のジメチルホルムアミド溶液を最終的に200mLとし、樹脂に加え、HBTU（60mmol、4当量）およびN-メチルモルホリン（120mmol、8当量）のジメチルホルムアミド溶液を最終的に200mLとしたもの（Fmoc-AA-OHの濃度=150mM溶液）を加え、窒素バブリングさせながら30分カップリングさせた（カップリング反応はニンヒドリン試験でチェックした）。ニンヒドリン試験が陰性になると、樹脂を濾過し、4×130mLのジメチルホルムアミドで洗浄した。
【０３７１】
全てのアミノ酸をカップリングさせた後、樹脂を4×130mLのジクロロメタン、4×130mLのメタノール、4×130mLのジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて生成物を得た。重量の増加は定量的であった。
【０３７２】
トリフルオロ酢酸:フェノール:チオアニソール:水:DDT:トリイソプロピルシランの81.5:5:5:5:2.5:1溶液からなる切断剤100mLを、32g（約6.4mmol）の以下の線状構築物に加えた。
【０３７３】
【化３２】
2009532384.tif 000065
【０３７４】
この懸濁液を室温に5分間置いた後、濾過した。別の100mLの切断剤を樹脂に加え、室温に5分間置いた後、濾過した。このプロセスを繰り返した。
【０３７５】
その後、得られた樹脂を、2×40mLのトリフルオロ酢酸で洗浄した。濾液を合わせ、室温で2.5時間撹拌した後、減圧下で100mLの体積まで濃縮した。この濾液に、冷ジエチルエーテル（1.5L、-20℃に予備冷却したもの）を加えた後、冷凍庫（-20℃）に1時間置き、焼結ガラス漏斗で濾過し、固体を3×200mLの冷ジエチルエーテルで洗浄した。その後、固体を15分ごとに滴定して溶媒が効果的に除去されているか確認しながら、真空下で1時間乾燥させた。以下の構築物が得られた（15.4g）（粗製全収率103％）。
【０３７６】
【化３３】
2009532384.tif 000066
【０３７７】
上述した構築物（15.4g、6.4mmol）を、水中の30％アセトニトリル16Lに溶解させた。そのpHを、5％水酸化アンモニウムを用いて8.4に調節した。微粉活性炭（15.4g）を加え、懸濁液を一晩撹拌した。炭素をセライトを通した濾過により除去した。セライトを、水中の50％アセトニトリル3×100mLで洗浄した。濾液を合わせ、水で希釈して最終的に10％のアセトニトリル濃度にし、精製のためのカラムにチャージした。得られた構築物のトリフルオロアセテート塩の精製を、以下の条件で行った。
カラム：Luna C18、10μ、50×33mm
流量：70mL/分
溶媒A：0.1％トリフルオロ酢酸を含有する水
溶媒B：0.1％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル
勾配：5％の溶媒Bを5分間
26％のB〜52％のBを30分間
【０３７８】
純粋なフラクションを合わせ、凍結乾燥して、精製された構築物のトリフルオロ酢酸塩を得た。Dowex SER、LCNG-OH樹脂（450g）を2Lの水に懸濁させ、15分間穏やかに撹拌し、15分間静置した後、デカンテーションした。この処理を繰り返した後、0.5Lの水を加え、スラリーを6×60cmのカラムに移した。水を排出させ、4Lの水で洗浄し、6.5Lの20％酢酸溶液でイオン交換させた。この樹脂を室温にて一晩置いた後、濾液のpHが約4になるまで水で洗浄した（8Lの水を使用した）。上述により調製した構築物のトリフルオロ酢酸塩（11.1g）を、80mLの水に溶解させ、イオン交換樹脂にロードし、水で溶出させた。79-1を含有するフラクションを合わせ、20％酢酸溶液を加えて最終的に5％の酢酸濃度に調節した後、凍結乾燥させた。以下の構築物1-132（10.4g）が得られた。
【０３７９】
【化３４】
2009532384.tif 000067
【０３８０】
同様の方法を、代用残基がC-末端位置にあり、樹脂または他のペプチド固体支持体に結合している場合の任意の構築物に用いることができる。
【０３８１】
本発明のペプチド構築物の場合によるペグ化を任意の方法、例えば、下記方法で行うことができる。
【０３８２】
反応性アミン基、例えば、リシンもしくはオルニチンの側鎖、位置Aaa1のオメガアミノ脂肪族、または位置Aaa15のアミノ酸代用残基のJにおけるアミン基のペグ化は、ジメチルスルホキシド2mLに0.005ミリモルの精製構築物を溶解させ、その後、55.5mg(0.011ミリモル、2当量)のPEG-5K-OSu(スクシンイミジルプロピオネート反応性基を有する5,000Da MWメトキシ-PEG)を添加し、次いで、17.7μL(0.13ミリモル、20当量)のトリエチルアミンを添加し、わずかに曇った溶液を室温で3時間攪拌することによって達成した。7μL(0.111ミリモル、10当量)のエタノールアミンを添加することによって過剰のPEG-5K-OSuをクエンチし、この反応液を一晩攪拌した。
【０３８３】
反応性カルボキシル基、例えば、AspもしくはGlu側鎖、または位置Aaa15の残基もしくは代用残基のいずれかの末端カルボキシルのペグ化は、PEG-NH2(PEG-アミン)を、AspもしくはGluの側鎖またはC-末端におけるカルボンキシレート基を含む構築物にカップリングさせることによって達成する。このペプチド構築物(0.005ミルモル)をDMSO(2mL)中に溶解し、その後55.5mg(0.011ミリモル、2当量)のPEG-NH2およびHOBt(0.01ミリモル)を添加した。0.0055ミリモルのカップリング試薬N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDAC)を添加することによって、カップリングを開始させる。わずかに曇った溶液を室温で一晩攪拌した。次いで、ペグ化されたペプチド構築物をHPLCで精製する。
【０３８４】
反応性チオール基、例えば、CysもしくはHcys側鎖、または位置Aaa1のアミノ酸代用残基のQにおけるチオール基のペグ化は、DMSO中でペプチド構築物をPEG-メチル-マレイミド試薬(SunBio、Orinda、California)で一晩処理することによって達成する。次いで、ペグ化ペプチド構築物を、HPLCによって精製する。
【０３８５】
ペグ化後、得られた粗混合物をHPLCによって精製し、1つまたは複数のアミノ酸代用残基を含むPEG誘導体化構築物を得た。
【０３８６】
インビトロおよびインビボ試験系
選択した構築物を、結合および機能状態を決定するためにアッセイで試験した。以下のアッセイを用いた。
【０３８７】
細胞培養液。ヒトナトリウム利尿ペプチド受容体A(NPRA)についてコードするcDNAクローンをBio S&T社(Montreal、Quebec)から購入した。このcDNAクローンを哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen)中に挿入し、HEK-293細胞にトランスフェクトした。安定クローンをG418硫酸塩の存在下での細胞の培養によって選択した。NPRAの発現を[125I]-心房ナトリウム利尿ペプチド([125I]-ANP)を、クローン細胞系から調製した膜ホモジェネートに結合させることによって調べた。10%FBS、G418硫酸塩(300μg/mL)、グルタミン酸ナトリウム(0.29mg/mL)、ペニシリン(100単位/mL)、およびストレプトマイシン(100μg/mL)で補充したDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)中で5%CO2において37℃で培養液中にHEK-hNPRA細胞を維持した。
【０３８８】
競合結合アッセイ。競合阻止結合アッセイを、HEK-hNPRA細胞から調製した粗膜ホモジュネートを用いて行った。膜ホモジェネートを調製するために、細胞をリン酸緩衝生理食塩水ですすぎ洗いし、低張溶解緩衝液(10mM  トリス、pH7.4 +5mM EDTA)中、4℃で15分間インキュベートした。細胞をプレートからポリプロピレンチューブに移し、均質化した。ホモジェネートを25,000×gで20分間遠心分離した。ペレットを50mMトリス(pH7.4)および1mM EDTAからなる緩衝液に再懸濁させ、均質化して、25,000×gで20分間遠心分離した。ペレットを100mMトリス(pH7.4)および10mM MgCl2からなる緩衝液に再懸濁させ、必要とされるまで-80℃で保存した。アッセイの当日にホモジェネートを解凍して、均質化した。25mMのHepes(pH7.4)、100mMのNaCl、2mMのCaCl2、5mMのMgCl2、0.1%BSA、および1mMの1,10-フェナントロリンを含む緩衝液中で、[125I]-ANPの結合を行った。ホモジェネート（1〜10μgプロテイン／ウェル）を、[125I]-ANP(25〜30pM)と共に、Milliporeフィルタープレート中の競合リガンドの濃度を増加させつつ4℃で120分間インキュベートした。アッセイを冷洗浄緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水)の添加によって止めて、その後真空マニホールドを用いてろ過した。結合放射活性を、ガンマカウンターを用いて測定した。非特異的結合は、[125I]-hANPの非トランスフェクト化HEK293膜への結合によって規定した。データを、GraphPad Prism(登録商標)曲線適合ソフトウェアを用いて分析した。
【０３８９】
EC50の測定のための一般方法。組換えhNPRAを発現するHEK-293細胞における細胞内cGMPの蓄積を測定することによって、構築物の機能評価を行った。HEK-NPRA細胞を洗浄およびCell Dissociation Buffer(Gibco、Life Technologies)中での遠心分離によって採集した。ペレット化した細胞を、10mMのHepes(pH7.4)、5mMのMgCl2、200mMのL-グルタミン、1mMの1,10-フェナントロリン、およびBSA(0.5mg/mL)を含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)中に再懸濁させた。遠心分離後、細胞を0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)で補充した上記緩衝液中に再懸濁した。細胞(約2×105個/ウェル)を96-ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、37℃で15分間インキュベートした。プレインキュベーション期間に続けて、増加させた濃度の構築物の存在下で細胞をさらなる15分間インキュベートした。反応を、温度ショックで細胞を溶解させることによって終了させた。反応プレートをドライアイス/エタノール浴中で15分間インキュベートし、その後90℃で10分間インキュベートした。cGMPの蓄積を、cGMPフラッシュプレートRIA(Perkin-Elmer)を用いて測定した。GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアでの非線形回帰分析を用いることによって、データ分析して、EC50値を決定した。
【０３９０】
質量および核磁気共鳴分析の測定。マトリックスとしてアルファ-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を用いるMALDI-TOF質量分析法(陽イオンモード)によって、PEG結合構築物の質量値を分析した。構築物対マトリックス比1:10、1:20、および1:30の試料調製にメタノールを用いた。あるいは、他のマトリックス、例えば、シナピン酸(SA)および2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)、ならびに溶媒、例えば、アセトニトリル-0.1%TFA水溶液を試料調製に用いることができる。質量値の他の測定は、陽イオンモードを用いるWaters MicroMass ZQ装置を用いて行った。別に特記しない限り、ペグ化されていない構築物について、質量測定値は、計算値と比較し、質量プラス2を2で割る(M+2)/2の形式で表した。
【０３９１】
プロトンNMRデータを、Bruker300MHz分光計を用いて得た。重水素化溶媒、例えば、クロロホルム、DMSO、または必要に応じてメタノールに構築物を溶解した後にスペクトルを得た。
【０３９２】
YMC Pack Pro C-18カラム(4.6×50mm、3μ)を備えたWaters Alliance HTを用いてステップワイズ法で1mL/分で溶出させて、HPLC測定を行った。溶媒A(0.1%トリフルオロ酢酸を含む水v/v)および溶媒B(0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルv/v)を移動相として用いた。ケトピペラジン中間体の分析について、カラムを10%Bで平衡化し、次いで、Bを8分の期間をかけて90%に高めた。ペプチドの分析のためには、カラムを2%Bで平衡化し、次いで、Bを8分の期間をかけて90%に高めた。
【０３９３】
動物モデル--血圧トランスデューサ移植。ラットを、イソフルランを用いて麻酔の外科手術面に誘導し、加熱パッド上に保持した。腹部を剃り、70%アルコールおよびベタジン溶液で洗い落とす。無菌法を用いて、下行大動脈および大静脈を暴露するために正中腹部切開を行う。腹部の内容物を湿った滅菌ガーゼおよび開創器を用いて穏やかに納める。製造業者の説明書(Data Sciences International's Multiplus TL Series Device Surgical Manual 2000:3.1〜3.10頁に記載)に基づいて、腹大動脈を周囲脂肪および結合組織から慎重に切断し、血圧トランスデューサのカテーテルを挿入する。トランスデューサのカテーテルは、外科手術用糊を用いて所定の位置に固定し、トランスデューサの本体を腹壁に縫合することによって安定化する(4-0絹縫合糸)。操作中にホメオスタシスが維持され、血流が損なわれない(例えば、大動脈は一度に3分を超えて閉塞しない)ことを確保するために注意をする。トランスデューサ設置を、テレメトリー無線信号を用いて確認する。トランスデューサ設置後、ガーゼスポンジを取り除き、腹腔を滅菌生理食塩水で洗い流す。次いで、腹部切開を単純断続パターンで非吸収性縫合糸(4-0絹縫合糸)を用いて縫合して閉じる。皮膚を、吸収性縫合糸(4-0 vicryl)を用いて閉じる。最後に、この動物をイソフルランから外し、温かい環境に置いて完全に覚醒するまで監視する。
【０３９４】
鬱血性心不全の外科的誘発(容量負荷)
この操作において、テレメトリー装置のための移植操作におけるのと同じ方法で下行大動脈と大静脈を暴露する。腎臓と腸骨分岐部との間の血管へ接近すると直ちに、1.8mmの針(外径)で下行大動脈に穿刺した。針を下大静脈中に進めて、引き出す。下行大動脈における腹側穿刺部位を組織接着剤で密封する。大静脈の膨れおよび静脈血と動脈血との混合によって、大動脈と大静脈との間の分流の持続を目視で確認する。圧力トランスデューサも移植する場合、2つの操作を同時に行う。Flaim, S.F.、W.J. Minteer、S.H. Nellis、およびD.P. Clark:Chronic arteriovenous shunt:evaluation of a model for heart failure in rat、Am.J.Physiol.、236:H698〜H704頁(1979年)ならびにGarcia, R.およびS. Diebold:Simple, rapid and effective method of producing aortocaval shunts in the rat.、Cardiovasc. Res.、24:430〜432頁(1990年)に記載された一般的な方法を、参照により本明細書に組み込む。
【０３９５】
血圧モニタリング。血圧トランスデューサ(model TA11PA-C40、Data Sciences International、St Paul、MN)からのテレメトリー信号を集め、Dataquest A.R.T. Gold software version 3.0(Data Sciences International)を用いて分析する。ラットは、毎日ほぼ同じ時間に観察した。ホームケージ内のそれぞれのラットは観察室の受信部上に置き、30分間場所の変化に対して順応させた。ベースライン記録を投与直前30分間取り、治療記録をIV投与直後135分間およびSC投与後210分間取った。参照により本明細書に組み込む、Clemens, L.E.、R.G. Almirez、K.A.Baudouin、E.B. GrossbardおよびA.A. Protter:Human brain natriuretic peptide reduces blood pressure in normotensive and acute norepine phrine-induced hypertensive rabbits.、Am. J. Hypertens.、10:654〜661頁(1997年)に以前に発表された方法と同様の方法で、データを生理食塩水投与後の結果と比較した。
【０３９６】
利尿およびナトリウム利尿。ラットを、ペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔の外科手術面に誘導し、加熱パッド上に保持する。腹部を剃り、70%アルコールおよびベタジン溶液で洗い落とす。無菌法を用いて、膀胱を暴露するために正中腹部切開を行う。膀胱の腹側表面に巾着縫合を導入し、小切開を縫合領域内で行う。カテーテルの張り出し端部を開口部に挿入し、その周りに巾着縫合を堅く締めて所定の場所に固定する。参照により本明細書に組み込まれる、Abassi, Z.A.、J.R. Powell、E. Golomb、およびH.R. Keiser:Renal and systemic effects of urodilatin in rats with high-output heart failure、Am. J. Physiol.、262:F615〜F621頁(1992年)に発表された方法と同様の方法で投与前および後の種々の時間間隔で予め重量を量ったミクロ遠心分離管中に尿を集める。
【実施例】
【０３９７】
［実施例１］
1つまたは複数の前記方法のアミノ酸代用残基を用いて、以下の構築物を合成し、精製し、質量を測定した。結果を下の表1に示す。
【０３９８】
【表２８Ａ】
2009532384.tif 000068
【０３９９】
【表２８Ｂ】
2009532384.tif 000069
【０４００】
【表２８Ｃ】
2009532384.tif 000070
【０４０１】
【表２８Ｄ】
2009532384.tif 000071
【０４０２】
【表２８Ｅ】
2009532384.tif 000072
【０４０３】
【表２８Ｆ】
2009532384.tif 000073
【０４０４】
【表２８Ｇ】
2009532384.tif 000074
【０４０５】
【表２８Ｈ】
2009532384.tif 000075
【０４０６】
【表２８Ｉ】
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【０４０７】
【表２８Ｊ】
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【０４０８】
【表２８Ｋ】
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【０４０９】
【表２８Ｌ】
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【０４１０】
【表２８Ｍ】
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【０４１１】
【表２８Ｎ】
2009532384.tif 000081
【０４１２】
【表２８Ｏ】
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【０４１３】
【表２８Ｐ】
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【０４１４】
【表２８Ｑ】
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【０４１５】
【表２８Ｒ】
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【０４１６】
【表２８Ｓ】
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【０４１７】
【表２８Ｔ】
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【０４１８】
【表２８Ｕ】
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【０４１９】
【表２８Ｖ】
2009532384.tif 000089
【０４２０】
【表２８Ｗ】
2009532384.tif 000090
【０４２１】
【表２８Ｘ】
2009532384.tif 000091
【０４２２】
【表２８Ｙ】
2009532384.tif 000092
【０４２３】
【表２８Ｚ】
2009532384.tif 000093
【０４２４】
【表２９Ａ】
2009532384.tif 000094
【０４２５】
【表２９Ｂ】
2009532384.tif 000095
【０４２６】
【表２９Ｃ】
2009532384.tif 000096
【０４２７】
【表２９Ｄ】
2009532384.tif 000097
【０４２８】
【表２９Ｅ】
2009532384.tif 000098
【０４２９】
【表２９Ｆ】
2009532384.tif 000099
【０４３０】
【表２９Ｇ】
2009532384.tif 000100
【０４３１】
【表２９Ｈ】
2009532384.tif 000101
【０４３２】
［実施例２］
1つまたは複数の前記方法のアミノ酸代用残基を用いて、以下の表2の構築物を合成し、精製し、質量を測定した。
【０４３３】
【表３０Ａ】
2009532384.tif 000102
【０４３４】
【表３０Ｂ】
2009532384.tif 000103
【０４３５】
【表３０Ｃ】
2009532384.tif 000104
【０４３６】
【表３０Ｄ】
2009532384.tif 000105
【０４３７】
［実施例３］
以下の構造を有する構築物1-1を上記のように試験した。
【化３５】
2009532384.tif 000106
【０４３８】
受容体結合研究において、この構築物は、hANPが0.05nMのKiを有し、ミニ-ANPが0.6nMのKiを有したアッセイ系において0.3nMの平均Kiを有した。構築物1-1は、hANPが0.6nMのEC50を有し、ミニ-ANPが3.3nMのEC50を有したアッセイ系において2nMのEC50を有した。
【０４３９】
［実施例４］
以下の構造を有する構築物1-9を上記のように試験した。
【化３６】
2009532384.tif 000107
受容体結合研究において、この構築物は、hANPが0.05nMのKiを有し、ミニ-ANPが0.6nMのKiを有したアッセイ系において0.9nMの平均Kiを有した。構築物1-9は、hANPが0.6nMのEC50を有し、ミニ-ANPが3.3nMのEC50を有したアッセイ系において3.5nMのEC50を有した。
【０４４０】
［実施例５］
以下の構造を有する構築物1-8を上記のように試験した。
【化３７】
2009532384.tif 000108
受容体結合研究において、この構築物は、hANPが0.05nMのKiを有し、ミニ-ANPが0.6nMのKiを有したアッセイ系において0.2nMの平均Kiを有した。構築物1-8は、hANPが0.6nMのEC50を有し、ミニ-ANPが3.3nMのEC50を有したアッセイ系において3.3nMのEC50を有した。
【０４４１】
［実施例６］
以下の構造を有する構築物1-18を上記のように試験した。
【化３８】
2009532384.tif 000109
受容体結合研究において、この構築物は、hANPが0.05nMのKiを有し、ミニ-ANPが0.6nMのKiを有したアッセイ系において0.027nMの平均Kiを有した。構築物1-18は、hANPが0.6nMのEC50を有し、ミニ-ANPが3.3nMのEC50を有したアッセイ系において0.2nMのEC50を有した。
【０４４２】
構築物1-18は、ラットおよびヒトの双方の血漿中、37℃にて約2時間のT1/2で安定であった。IVによる投与の場合、ラットにおけるインビボのT1/2は約20分であった。皮下投与経路によって投与した場合、ラットにおいて、注入用量の約25〜50％が生物学的に利用可能であった。図2は、構築物1-18のラットにおける構築物の経時的な濃度（ng/kg）を示す。「SC」についての曲線は、5mg/kgの用量での皮下投与を示し、「IV」についての曲線は、2mg/kgの用量での静脈内投与を示す。
【０４４３】
［実施例７］
「動物モデル-血圧トランスデューサ移植」の題のもとで記述したようにラットに血圧トランスデューサを移植した。「血圧モニタリング」の題のもとで記述したように研究を行った。研究には、本発明の構築物の投与後の最大血圧における変化を、生理食塩水の投与と比較した測定が含まれる。1つの研究では、ラットに構築物1-63を、IV経路で0.03mg/体重kg（n=4）、0.1mg/kg（n=7）、または0.3mg/kg（n=8）で投与した。血圧を、IVの投与5分前、および投与5、10、および15分後、その後15分間隔で投与135分後まで測定した。全ての用量についていずれの時点でも、測定した最大血圧は生理食塩水対照より低く、血圧の低下は、通常、用量に依存して、最小約5％〜最大約19％の範囲であり、最も大きい反応は投与10〜45分後に見られた。
【０４４４】
第二の研究では、ラットに構築物1-63を、皮下投与経路で0.3mg/体重kg（n=8）、1.0mg/kg（n=7）、または3.0mg/kg（n=7）で投与した。血圧を、SC投与の15分前、5分前、および投与5、10、および15分後、その後15分間隔で投与210分後まで測定した。全ての用量についていずれの時点でも、測定した最大血圧は生理食塩水対照より低かった。0.3mg/kgのSCで、最大血圧の低下は、投与後2時間の時点で2％の範囲であり、誤差の範囲内であった。しかし、0.3mg/kgのSCでの他の時点、および1.0および3.0mg/kgの全ての時点において、統計的に異なり、生理食塩水対照より低かった。3.0mg/kgでの最大血圧の約20％〜23％の最大の低下は、投与45〜120分後に見られ。1.0mg/kgでの同じ経過時点における最大の低下は、約17％〜19％であった。
【０４４５】
第三の研究では、ラットに構築物1-18を、IV経路によって0.3mg/体重kg（n=8）で投与した。血圧を、IVの投与5分前、および投与5、10、および15分後、その後15分間隔で投与135分後まで測定した。全ての用量についていずれの時点でも、測定した最大血圧は生理食塩水対照より低く、血圧の低下は最小約5％〜最大約13％の範囲であり、最も大きい反応は投与15分後に見られた。
【０４４６】
第四の研究では、ラットに構築物1-18を、皮下投与経路によって0.1mg/体重kg（n=4）、0.3mg/kg（n=7）、または1.0mg/kg（n=8）で投与した。血圧を、SC投与の15分前、5分前、および投与5、10、および15分後、その後15分間隔で投与225分後まで測定した。全ての用量についていずれの時点でも、測定した最大血圧は生理食塩水対照より低かった。0.1mg/kgのSCで、最大血圧の低下は、投与後約2.5時間の時点で統計的に関連がなかった。しかし、0.1mg/kgのSCでの他の時点、0.3 mg/kgの投与約2.5時間後より前の時点、および1.0mg/kgの全ての時点において、統計的に異なり、生理食塩水対照より低かった。1.0mg/kgでの最大血圧の約9％〜13％の最大の低下は、投与45〜120分後に見られた。
【０４４７】
［実施例８］
ラットの総尿排出量を、「利尿およびナトリウム利尿」の題のもとで記述したように測定した。4匹の動物の群に、IV経路によって構築物1-18および1-63を投与した。動物は、構築物1-18の投与を0.03mg/体重kg、0.1mg/kg、および0.3mg/kgの用量で受け、構築物1-63の投与を0.1mg/体重kg、0.3mg/kg、および1.0mg/kgの用量で受けた。投与後30分にわたる総尿排出量を測定した。結果を図３に示す。
【０４４８】
別の研究では、総尿排出量を、SC経路による構築物1-63の投与を、0.3、1.0、および3.0mg/体重kgの用量で受けた4匹の動物の群について、生理食塩水を対照として使用して、同様に測定した。投与後45分にわたる総尿排出量を測定した。結果を図４に示す。
【０４４９】
［実施例９］
静脈内(IV)投与後または皮下（SC）投与後の雄Sprague-Dawleyラットにおいて、本発明の選択した構築物の薬物動態学を研究した。選択した構築物のラットにおける薬物動態を測定し、表3および4に要約した。
【０４５０】
表4および5に示した本発明の構築物をTFA塩として調製し、IVおよびSC投与経路の両方について1mL/kgで生理食塩水に溶解した。IV用量は、目標用量0.3および2mg/kgで大腿動脈カニューレを介して投与した。SC用量は、目標用量1および5mg/kgで投与した。動物は、投与前一晩絶食していなかった。血液は、頚静脈に前に移植したカニューレからEDTA二カリウムを含む容器中に所定の時間間隔で収集した。血漿をこの血液の遠心分離によって得て、分析するまで-70℃で保存した。
【０４５１】
データ分析は、100μL注入ループ、2つのShimazuポンプおよびSciex API4000質量分析計を備え、Leap Technologies HTS-PAL自動試料採取器を含むLC-MS/MSシステムを利用した。分析物のクロマトグラフィー分離は、ステップワイズ法で1mL/分で溶出させるLuna C18カラム(4.6×100mm;3μ)で達成した。溶媒A(0.1%ギ酸を含む水v/v)および溶媒B(0.1%ギ酸を含むアセトニトリルv/v)を移動相として使用した。最初に、カラムを5%Bで平衡化し、そして試料注入2分後に、Bを0.5分の期間にわたって60%に増加させ、この濃度で1.1分間保持した。Bの組成を1.4分で80%に増加させ、0.3分保持した。Bの組成を0.2分で5%に戻した。総分析時間は6分であった。陽イオンモードで操作するTurboイオンスプレーインターフェースを用いて、分析物の質量分析検出を達成した。プロトン化前駆体イオンの選択生成物イオンへの遷移の多反応モニタリング(MRM)によって、分析物の反応を測定した。
【０４５２】
血漿のアリコート(100μL)を内部標準(IS)と混合して、96ウェル様式のC8カートリッジを用いて固相抽出した。1mLのメタノールおよび水中の2%水酸化アンモニウム1mLでC8カートリッジを予備調整後、血漿試料をカートリッジに入れた。カートリッジを40%メタノール中の2%水酸化アンモニウムで洗浄後、構築物を60%メタノール中の1mLの2%酢酸でカートリッジから溶出させた。溶出物を清浄プレートに移し、N2気流下で蒸発させ、残渣をLC-MS/MS分析前に20mMの酢酸アンモニウムおよびアセトニトリル(6:4、v:v)100μL中に再懸濁させた。同様の方法で、種々の濃度の構築物およびそのそれぞれのISを100μLの未処理ラット血漿に添加することによって、較正標準(2〜1000ng/mL)を調製した。同様に、構築物およびISを構築物の3つの異なる濃度(3.5、75、および750ng/mL)で100μLの対照血漿に添加することによって品質管理試料を調製した。
【０４５３】
データを取得して、Sciex Analyst 1.4.1ソフトウェアによって処理した。構築物対ISのピーク面積比を、構築物の名目濃度の関数としてプロットした。1/xの重み付け因子を用いる線形回帰を用いて血漿試料中の構築物の濃度を計算した。このアッセイについて定量の下限(LLOQ)は、典型的に2または5ng/mLであった。
【０４５４】
薬物動態学パラメータを、確立された非区画法(WinNonlin version2.1;Consulting Inc.、Palo Alto、CA)によって計算した。血漿濃度対時間曲線下面積(AUC)を、上向き勾配の線形台形補間法および下向き勾配の対数台形補間法を用いて決定した。最後の測定可能な濃度から無限大のAUC部分は、式Ct/Kelから推定したが、ここで、Ctは最後の測定可能な濃度を表し、Kelは消失速度定数である。後者は、片対数プロットの終末段階における線形回帰によって濃度対時間曲線から決定した。
【０４５５】
【表３１】
2009532384.tif 000110
【０４５６】
【表３２】
2009532384.tif 000111
【０４５７】
［実施例１０］
1-32の配合を、医薬用途のために調製した。1-132は、酢酸塩の形態で用いた。配合を、栓をし、密封した1mLのバイアルに分配した。各バイアルは、
0.1mgの1-132酢酸塩（酢酸塩のペプチド正味重量に基づく）、
1.181mgのコハク酸（NF）、
47.0マンニトール（USP）、
1N NaOH（USP）（pHを調整するための必要量）
1N HCl（USP）（pHを調整するための必要量）
注入のための水（体積1mLにするための適量）
を含有していた。
最終生成物のpHを、1N NaOHまたは1N HClで必要に応じてpH 4.00±0.05に調整した。得られた溶液を、バイアルに入れる前に滅菌0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、使用するまで5℃にて保管した。
【０４５８】
1-132の代替的な配合を、医薬用途のために調製した。上述の配合と同様であるが、追加的に約0.02mg〜0.06mgのパモ酸二ナトリウム塩を含み、得られる懸濁液がパモエート懸濁液となるようにした。
【０４５９】
［実施例１１］
下記の構築物を、前述の1つ以上の方法のアミノ酸代用残基を用いて合成し、PEG-5K-OSuを用いて精製しかつ結合させて、質量測定した。結果を表5に示す。
【０４６０】
【表３３Ａ】
2009532384.tif 000112
【表３３Ｂ】
2009532384.tif 000113
【０４６１】
［実施例１２］
下記の表6の構築物を、前述の1つ以上の方法のアミノ酸代用残基を用いて合成し、PEG-5K-OSuまたは別の反応性PEGを用いて精製しかつ結合させて、質量測定した。
【０４６２】
【表３４Ａ】
2009532384.tif 000114
【表３４Ｂ】
2009532384.tif 000115
【０４６３】
［実施例１３］
下記構造を有する構築物5-1を、上述した通りに試験した。
【化３９】
2009532384.tif 000116
受容体結合研究において、この構築物は、hANPが0.05nMのKiを有し、ミニ-ANPが0.6nMのKiを有したアッセイ系において70nMの平均Kiを有した。
【０４６４】
［実施例１４］
下記構造を有する構築物5-9を、上述した通りに試験した。
【化４０】
2009532384.tif 000117
受容体結合研究において、この構築物は、hANPが0.05nMのKiを有し、ミニ-ANPが0.6nMのKiを有したアッセイ系において2nMの平均Kiを有した。構築物5-9は、hANPが0.6nMのEC50を有し、ミニ-ANPが3.3nMのEC50を有したアッセイ系において9.5nMのEC50を有した。
【０４６５】
［実施例１５］
限定することなしに、構築物1-1〜1-248、2-1〜2-21、5-1〜5-18、および6-1〜6-12を含む本発明の任意の構築物は、持続放出注射のために配合することができる。任意の構築物を、PEG（例えば、ポリ(エチレングリコール)3350）および場合により1種または複数の追加の賦形剤および保存剤（限定されないが、例えば、塩などの賦形剤、ポリソルベート80、pHを調整するための水酸化ナトリウムまたは塩酸を含む）と一緒に配合することができる。あるいは、任意の構築物を、ポリ(オルトエステル)（ポリマー骨格内に任意の可変割合の乳酸を有する自己触媒ポリ(オルトエステル)を含む）および場合により1種または複数の追加の賦形剤と一緒に配合することができる。ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド)ポリマー(PLGAポリマー)、好ましくは親水性末端基を有するPLGAポリマーを用いることができる。
【０４６６】
［実施例１６］
鬱血性心不全、例えば、安静時呼吸困難または最小活動度を伴う急性非代償性鬱血性心不全を有する患者に、構築物1-1〜1-248、2-1〜2-21、5-1〜5-18、および6-1〜6-12の1つ以上を含む配合物（例えば、実施例１０の任意の方法による配合物を含む）を、皮下注射によって投与する。
【０４６７】
［実施例１７］
慢性鬱血性心不全を有する患者に、実施例１５の持続放出注射可能な配合物を、例えば、深部筋肉内注射（例えば、臀部または三角筋への筋肉内注射）などによって投与する。
【０４６８】
［実施例１８］
出願人らは、下記表7に示すように、本発明の構築物の中性エンドペプチダーゼによる消化に対する耐性と、薬物動態学的クリアランス（CL）との程度の間に逆相関あることも発見した。中性エンドペプチダーゼ（「NEP」）は、3つのヒトナトリウム利尿ペプチドの全てを非活性化および失活させる内因性酵素である。NEPは、腎尿細管細胞および血管細胞内に存在する。NEPは、哺乳動物種間で高度に相同性を有する。ラットとマウスとの間のNEPの同一性パーセントは98.5％であり、ヒトとマウスとの間は93.6％であり、ヒトとラットとの間は93.7％である。
【０４６９】
本発明の種々の構築物のNEP耐性を、以下の実験手順を用いて評価した。構築物はいずれも、0.1Mトリス-HCl緩衝液（pH7.4）で希釈して100μMとした。希釈した構築物40μLを、各チューブに加え、チューブをいずれも氷上に維持した。40μLの希釈したNEP、および、8ng/μLのヒト組み換えNEP（R&D Systems、Minneapolis、MN、カタログ#1182-ZN）または2.5ng/μLのマウスNEP（R&D Systems、カタログ#1126-ZN）のいずれかを各チューブに加えた。チューブを穏やかに混合し、回転させた。その後、全てのチューブを37℃にて、0、0.5、1、1.5、および2時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、5μLの10％TFAを加えることによって反応を停止させた。構築物を、TCEP（トリス[2-カルボキシエチル]ホスフィン）を用いて線状化した。その後、NEPが構築物に対して活性である程度を、HPLCおよび／またはLC/MSによって分析した。データの分析には、残存出発物質（すなわち、未消化のペプチド構築物）の割合、ならびに、各タンパク質分解性フラグメントの割合および配列を測定することが含まれる。
【０４７０】
【表３５】
2009532384.tif 000118
【０４７１】
したがって、本発明の1つの実施態様は、本発明の式のいずれかを有する構築物であって、記述したhNEP耐性アッセイ条件下で1時間後に出発物質の少なくとも80％の残存を示す構築物を提供する。本発明の関連する実施態様は、本発明の式のいずれかを有する構築物であって、記述したhNEP耐性アッセイ条件下で1時間後に出発物質の少なくとも90％の残存を示す構築物を提供する。本発明の関連する実施態様は、本発明の式のいずれかを有する構築物であって、記述したhNEP耐性アッセイ条件下で1時間後に出発物質の少なくとも95％の残存を示す構築物を提供する。これらの実施態様のいずれかの変形では、構築物は、アッセイ条件下で2時間後に出発物質の少なくとも80％の残存も示す。関連する変形では、アッセイ条件下で2時間後に出発物質の少なくとも90％の残存も示す。
【０４７２】
本発明の別の実施態様は、本発明の式のいずれかを有する構築物であって、記述したhNEP耐性アッセイ条件下で1時間後に出発物質の90％以下の残存を示す構築物を提供する。本発明の関連する実施態様は、本発明の式のいずれかを有する構築物であって、記述したhNEP耐性アッセイ条件下で1時間後に出発物質の80％以下の残存を示す構築物を提供する。これらのいずれか実施態様の変形では、構築物は、アッセイ条件下で2時間後に出発物質の90％以下の残存も示す。関連する変形では、アッセイ条件下で2時間後に出発物質の80％以下の残存も示す。
【０４７３】
このように、本発明の構築物は、これらが示すNEP耐性の程度に基づく薬物動態学的特性に関して選択するすることができる。
【０４７４】
前述した実施例は、一般的にあるいは特に記載した本発明の反応物質および／または操作条件を、前述した実施例に用いたものに置き換えることによって、同様に首尾よく繰り返すことができる。
【０４７５】
本発明について、これらの好ましい実施形態に特に関連して詳細に述べてきたが、他の実施形態も同様の結果を達成することができる。本発明の変形および変更は当業者に明らかであり、本発明は全てのこのような変更物および均等物を包含することを意図している。上述により引用した全ての参考文献、出願、特許、および刊行物、および/または添付書類、ならびに対応する出願の全体の開示を、参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０４７６】
【図１】図１は、野生型内因性ヒトANP（hANP）の配列を示す。
【図２】図２は、5 mg/kgの皮下投与および2 mg/kgの静脈内投与によって投与した場合の、ラットにおける構築物1〜18の経時的な濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、構築物1〜18および1〜63をIV経路で投与した場合の、4つのラット群の30分にわたる総尿排泄量を示すグラフである。
【図４】図４は、構築物1〜18をSC経路でさまざまな用量で投与した場合の、4つのラット群の45分にわたる総尿排泄量を示すグラフである。
【図１】
2009532384.tif 000138
【図２】
2009532384.tif 000139
【図３】
2009532384.tif 000140
【図４】
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【国際調査報告】
2009532384.tif 000142