(57)【要約】  本発明は、神経組織（神経系の中のニューロン、神経膠、および血管を含む）のＮＣｃａ−ＡＴＰチャンネルに影響を与える治療用化合物、処置方法、およびキット、そしてそれらを使用する方法に関する。ＮＣｃａ−ＡＴＰチャンネルは、虚血のような損傷後の神経組織の中で新しく発現され、スルホニルウレア受容体ＳＵＲ１によって調節されている。これは、スルホニルウレア化合物（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミド）によって阻害されジアゾキシドによって開かれる。ＮＣｃａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニスト（ＳＵＲ１アンタゴニストを含む）は、虚血、組織の外傷、脳腫脹、および組織圧の上昇、または脳もしくは脊髄疾患もしくは損傷の他の形態が原因である、損傷を受けたか、または疾患状態にある神経組織（星状細胞、ニューロン、および毛細管内皮細胞を含む）の予防、減少、および処置に有用である。ＮＣｃａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストは、組織（例えば、グリア被膜）の損傷または破壊が所望される場合に、神経組織の処置において有用であり得る。
2009527579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の虚血性疾患または損傷における梗塞周辺の脳組織の血流の減少の影響を緩和する方法であって、前記被験体に、神経細胞、神経膠細胞、または神経内皮細胞の中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害するために有効な化合物の量を投与する工程が含まれる、方法。
【請求項２】
前記化合物が、前記被験体の低血糖に影響を与えることができる化合物であり、前記被験体に、前記被験体中の前記低血糖の影響を少なくとも一部緩和するために重要なグルコースを投与する工程がさらに含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体の脳の中での神経細胞の膨張を阻害する方法であって、前記被験体に、有効量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる、方法。
【請求項４】
前記神経細胞の膨張の阻害が、神経細胞の膨張の予防としてさらに定義される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記処方物に、前記被験体の低血糖に影響を与えることができる化合物が含まれ、前記被験体に、前記被験体の前記低血糖を少なくとも一部緩和するために有効なグルコースを投与する工程がさらに含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記神経細胞の膨張の阻害が、神経細胞の膨張の予防としてさらに定義される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記血流の減少の影響の緩和に、細胞傷害性浮腫、イオン性浮腫、および／または血管原性浮腫の軽減が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記神経膠細胞が、星状細胞、上衣細胞、乏突起膠細胞、小神経膠細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子が、グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステイン、ジエチルスチルベストロール、クメステロール、ゼアラレノン、ＫＡＴＰチャンネルを阻害または遮断する化合物からなる群より選択される１型スルホニルウレア受容体アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
被験体において脳腫脹を緩和する方法であって、前記被験体に、有効量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる、方法。
【請求項１１】
前記処方物が、前記被験体の低血糖に影響を与えることができる処方物であり、前記被験体に、前記被験体の前記低血糖を少なくとも一部緩和するために有効なグルコースを投与する工程がさらに含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害するために有効な化合物が、栄養によって、非経口で、局所的に、粘膜に、または脳実質への注射によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する治療有効量の化合物、またはその薬学的に許容される塩が含まれている薬学的組成物であって、ここでは、前記治療有効量が、脳中の虚血性疾患または脳損傷に罹患している被験体における梗塞周辺の脳組織の血流の減少の影響のうちの少なくとも１つを緩和するために有効な量である、薬学的組成物。
【請求項１４】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物が、グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステイン、ジエチルスチルベストロール、クメステロール、およびゼアラレノンからなる群より選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物にさらにグルコースが含まれている、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する前記化合物またはその薬学的に許容される塩の量が、薬学的組成物が投与される被験体において低血糖作用を有している量である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記グルコースの量が、薬学的組成物が投与される被験体への前記化合物または薬学的に許容される塩による血中グルコース濃度の低下を小さくする、または排除するために有効である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記薬学的組成物には神経防御作用がある、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記薬学的組成物には神経防御作用がある、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
被験体の急性脳虚血を処置する方法であって、被験体に、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物またはその薬学的に許容される塩の量を投与する工程が含まれる、方法。
【請求項２１】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの上で発現される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子が、グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステイン、ジエチルスチルベストロール、クメステロール、およびゼアラレノンからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子の投与態様が、ボーラス注射、注入、および注入と組み合わせたボーラス注射からなる投与態様のグループから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子がグリベンクラミドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体にグルコースを投与する工程がさらに含まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子が、グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステイン、ジエチルスチルベストロール、クメステロール、およびゼアラレノンからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子の投与態様が、ボーラス注射、注入、および注入と組み合わせたボーラス注射からなる投与態様のグループから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害するために有効な化合物が、栄養によって、非経口で、局所的に、粘膜に、または脳実質への注射によって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物と、静脈内（ＩＶ）注入溶液が含まれている、神経防御作用のある注入キット。
【請求項３０】
前記ＩＶ注入用液が、グルコースが補充されているＩＶ注入溶液である、請求項２９に記載の神経防御作用のある注入キット。
【請求項３１】
神経防御作用のあるボーラスキットがさらに含まれており、前記神経防御作用のあるボーラスキットには、ＩＶ溶液中の神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物が予め充填された注射器が含まれている、請求項２９に記載の神経防御作用のある注入キット。
【請求項３２】
前記ＩＶ溶液が、グルコースが補充されたＩＶ溶液である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
被験体の脳の中での神経細胞の膨張を予防する方法であって、前記被験体に、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する有効量の化合物、グルコース、および薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる、方法。
【請求項３４】
被験体において神経細胞の膨張によって生じる外傷性脳損傷または脳虚血の１つ以上の影響を緩和する方法であって、前記被験体に、有効量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる、方法。
【請求項３５】
被験体の外傷性脳損傷または脳虚血の１つ以上の影響を緩和する方法であって、前記被験体に、有効量のスルホニルウレア化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年３月２０日に提出された米国仮特許出願番号６０／３６５，９３３、２００４年９月１８日に提出された米国仮特許出願番号６０／６１０，７５８、および、２００５年７月１１日に提出された米国仮特許出願番号６０／６９８，２７２に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて優先権を主張する。さらに、本出願は、２００３年３月２０日に提出された米国仮特許出願番号１０／３９１，５６１と、２００５年９月１６日に提出された米国仮特許出願番号１１／２２９，２３６の一部継続出願であり、これらに対して米国特許法第１２０条に基づいて優先権を主張する。これらの仮特許出願および仮ではない特許出願は全て、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
（連邦政府により委託された研究開発に関する状況）
本発明は米国国立衛生研究所により助成された助成金番号ＮＳ０４８２６０、Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより助成された助成金（ＨＬ０８２５１７）、およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓによるメリットレビュー）助成金のもとで、一部が政府支援によって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、一般的に、細胞生物学、神経生理学、および医薬品の分野に関する。具体的には、本発明は、神経系細胞（星状細胞、ニューロン、および神経内皮細胞を含む）の中の１型スルホニルウレアに結合した新規の非選択性の１価の陽イオン性ＡＴＰ感受性イオンチャンネル（本明細書中以後、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと呼ぶ）、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性を調節することができる化合物および処置、ならびに、脳卒中または脳の外傷のような疾患または損傷の症状の処置に有用な化合物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
神経系の損傷は重篤な結果となる。外傷性の脳損傷および脳卒中後には、周辺の脳の正常な応答が細胞性の応答を高める。これには、損傷部位の「封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎ）」と「一掃（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）」に重要であると考えられている反応性星状細胞の形成が含まれる。神経細胞の膨張は、脳虚血および外傷性の脳損傷における脳の損傷の特徴である細胞傷害性または細胞の膨張反応の一部であり、罹患率および致死率の主原因である。Ｓｔａｕｂら，１９９３；Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇら，１９９５を参照のこと。神経細胞の膨張を開始する多数の媒介因子が同定されており、これには、細胞外Ｋ＋の上昇、アシドーシス、神経伝達物質の放出、および遊離の脂肪酸が含まれる。Ｋｅｍｐｓｋｉら，１９９１；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ，１９９６；Ｍｏｎｇｉｎら，１９９９を参照のこと。細胞傷害性浮腫は、脳腫脹を引き起こす、十分に理解されている臨床症状であり、これは、脳の損傷および脳卒中の結果をさらに悪くし、そして罹患率と致死率を高める。
【０００５】
反応性星状細胞および他の細胞のアポトーシスによる死の根底にある機構は研究されている。Ｔａｎａｋａら，２０００；Ｙｕら，２００１を参照のこと。星状細胞、ニューロン、および神経内皮細胞の壊死による細胞死の原因となる機構は特性決定されていない。アポトーシスによる細胞死には、細胞の収縮と、Ｋ＋の純粋な減少が先行する。Ｙｕら，１９９７；Ｙｕら，１９９９を参照のこと。対照的に、壊死による細胞死においては、血漿膜が破壊さて、細胞質ゾルの内容物の放出が引き起こされ、それにより組織の炎症が誘発される。Ｌｅｉｓｔ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｔｅｒａ，１９９７を参照のこと。壊死による細胞死は、二次的な炎症による損傷が開始されることを考慮すると、隣接している生存組織に対してさらに有害である可能性がある。
【０００６】
壊死による細胞死は、Ｎａ＋（主要な細胞外オスモライト）の流入後の浸透圧による膨張によって開始される。ほとんどの細胞のタイプにおいては、Ｎａ＋の細胞内での蓄積は、特異的なエフェクターの活性化は必要ではないが、その代わりに、低い細胞内アデノシン３リン酸濃度（［ＡＴＰ］ｉ）の条件下での外側向きのＮａ’ポンプの欠損が原因である受動的なプロセスと考えられている。Ｌｅｉｓｔ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｔｅｒａ，１９９７；Ｔｒｕｍｐら，１９９７を参照のこと。細胞内Ｎａ’の過負荷の指標である細胞のブレブ形成または膨張は、一般的には、壊死による細胞死の初期の兆候と考えられている。Ｌｅｉｓｔ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｔｅｒａ，１９９７；Ｍａｊｎｏ  ａｎｄ  Ｊｏｒｉｓ，１９９５を参照のこと。
【０００７】
ＡＴＰ合成またはＡＴＰ枯渇の阻害もまた、神経細胞の膨張、ブレブ形成を、そして、症状があまりに重篤な場合には、血漿膜の破壊と細胞死を引き起こす。Ｊｕｒｋｏｗｉｔｚ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９９３。ＡＴＰの枯渇が関係している神経細胞の膨張の機構は、まだ完全には明らかにされていない。Ｌｏｍｎｅｔｈ  ａｎｄ  Ｇｒｕｅｎｓｔｅｉｎ，１９８９；Ｊｕｕｒｌｉｎｋら，１９９２；Ｒｏｓｅら，１９９８を参照のこと。
【０００８】
１つの可能性のある機構は、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプの阻害が原因であるＮａ＋とＫ＋濃度の変化である。しかし、神経細胞中のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプのウアバイン媒介性の阻害によって誘導される同程度の浸透圧膨張によっては、大きな脱分極、ブレブ形成、または細胞死を生じない。Ｊｕｒｋｏｗｉｔｚ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９９２；Ｂｒｉｓｍａｒ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９３を参照のこと。したがって、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプの故障は、神経細胞の膨張については重要な機構ではない。これらの研究のいずれでも、脳虚血、さらには外傷性脳損傷および脊髄損傷における脳損傷に伴う細胞の膨張に関係している細胞性機構は同定されていない。
【０００９】
ＡＴＰ感受性陽イオンチャンネルの１つのサブタイプは、非選択性陽イオンチャンネルであり、これは、Ｃａ２＋とＡＴＰに対して感度がある。さらに具体的には、いくつかの非選択性陽イオンチャンネルは、細胞性Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）によって活性化され、そして細胞内ＡＴＰ（［ＡＴＰ］ｉ）によって阻害される。Ｃａ２＋感受性陽イオンチャンネルとＡＴＰ感受性陽イオンチャンネルは、多数の神経細胞ではないタイプの細胞において同定されているが、星状細胞においても、またいずれの他の神経細胞においても同定されていない。Ｓｔｕｒｇｅｓｓら，１９８７；Ｇｒａｙ  ａｎｄ  Ａｒｇｅｎｔ，１９９０；Ｒａｅら，１９９０；Ｃｈａｍｐｉｇｎｙら，１９９１；Ｐｏｐｐ  ａｎｄ  Ｇｏｇｅｌｅｉｎ，１９９２；Ｏｎｏら，１９９４を参照のこと。これらのそれぞれは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。これらの非星状細胞チャンネルには、完全には定義されていない特徴を有している異種グループが含まれる。これらは、２５−３５  ｐＳの範囲の単一チャンネルコンダクタンスを示し、Ｎａ＋とＫ＋の間をほとんど識別せず、陰イオンについては不透過であり、２価の陽イオンの大部分を不透過とする。これらは、細胞質側でのアデニンヌクレオチドＡＴＰ、ＡＤＰ、およびＡＭＰの同程度の濃度によって遮断される。これらの非神経細胞タイプの中のこれらの非選択性ＡＴＰ感受性陽イオンチャンネルの機能は、Ｃａ２＋の生理学的ではない濃度がチャンネルの活性化に一般的に必要であることが一部原因で、依然として謎めいている。
【００１０】
ＡＴＰ感受性陽イオンチャンネルの別のサブタイプは、膵臓β細胞中のＡＴＰ感受性カリウムチャンネル（ＫＡＴＰチャンネル）である。インシュリン分泌促進剤の１つのクラスである抗糖尿病薬スルホニルウレアは、真性糖尿病においてこれらのＫＡＴＰチャンネルを阻害し、そしてインシュリンの放出を刺激するために使用されている。Ｌｅｂｏｖｉｔｚ，１９８５を参照のこと。抗糖尿病薬スルホニルウレアは、高親和性スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ）を介してＫＡＴＰチャンネルに対するそれらの効果を媒介する。Ｐａｎｔｅｎら，１９８９；Ａｇｕｉｌａｒ−Ｂｒｙａｎら，１９９５を参照のこと。ＳＵＲ１、ＳＵＲ２Ａ、ＳＵＲ２Ｂ、およびＳＵＲ２Ｃと呼ばれるＳＵＲのいくつかのイソ型が同定され、クローニングされている。Ａｇｕｉｌａｒ−Ｂｒｙａｎら，１９９５；Ｉｎａｇａｋｉら，１９９６；Ｉｓｏｍｏｔｏら，１９９６；Ｌａｗｓｏｎ，２０００を参照のこと。これらの受容体はＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーに属し、そのうち、別のイオンチャンネル調節因子である嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）もまた、メンバーである。Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９９２；Ａｇｕｉｌａｒ−Ｂｒｙａｎら，１９９５を参照のこと。注目すべきは、ＣＦＴＲが、その遺伝的欠損が致死的疾患である嚢胞性線維症を引き起こすので、主に治療上の重要性を有していることである。
【００１１】
スルホニルウレア受容体は、抗糖尿病薬スルホニルウレア（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミド）に対する感受性を付与する。また、ＳＵＲは、Ｋ＋チャンネルオープナー（ＳＵＲ活性化因子）と呼ばれる物質（例えば、ジアゾキシド、ピナシジル、およびクロマカリン）の多様な化学的物質のグループによるカリウムチャンネルの活性化に関与している。Ａｇｕｉｌａｒ−Ｂｒｙａｎら，１９９５；Ｉｎａｇａｋｉら，１９９６；Ｉｓｏｍｏｔｏら，１９９６；Ｎｉｃｈｏｌｓら，１９９６；Ｓｈｙｎｇら，１９９７ｂを参照のこと。様々な組織の中で、分子的に異なる複数のＳＵＲが異なるチャンネル部分に結合して、識別することができる生理学的特性と薬物動態特性を有している様々なＫＡＴＰチャンネルを形成する。膵臓β細胞の中のＫＡＴＰチャンネルは、Ｋ＋チャンネルに連結したＳＵＲ１によって形成され、一方、心筋と平滑筋のＫＡＴＰチャンネルは、Ｋ＋チャンネルに結合した、それぞれ、ＳＵＲ２ＡとＳＵＲ２Ｂによって形成される。Ｆｕｊｉｔａ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｃｈｉ，２０００を参照のこと。
【００１２】
（グリア被膜）
脳の中の異物を取り囲むように形成するグリア被膜は重要であるが、顧みられていない生物学的システムである。一方、グリア皮膜は、損傷性の刺激に対する脳の反応−異物をとり囲む、隔離する、廃棄するため、および別の方法でそれ自身を異物から保護することによる試み−を示す。他方、グリア被膜は、それから脳腫脹に関係する浮腫液が生じ、そしてその構成成分である細胞が細胞傷害性の浮腫を受ける、組織の有害となる可能性のある塊を形成し、これはさらに脳を腫脹させる。また、グリア被膜は、免疫監視機構により外来細胞を保護する。
【００１３】
グリア被膜の形成に関与している必須のエレメントは、多くのタイプのＣＮＳ疾患において一様であるようであり、これは、外傷によって埋まってしまった異物、転移性腫瘍、脳膿瘍、または脳卒中後の梗塞を起こした壊死組織である。最初に、小神経膠細胞と星状細胞は、損傷部位の近くで活性化され、星型のＧＦＡＰ陽性反応性星状細胞を伴って、応答についての最も顕著な細胞性成分を形成する。第２に、外来物質の性質が認識され、それを取り囲み、そして封じ込めるための応答が開始される。「異物」の概念には、多種多様な病理学的症状が含まれるが、ほとんどの場合には、応答は、互いにかなりの類似性を有している。
【００１４】
異物とグリア被膜の間の界面は、グリア被膜の内部域と呼ばれ、損傷に対する全体的な応答の決定において非常に重要であると思われる。
【００１５】
したがって、脳虚血および外傷性脳損傷における脳の損傷、ならびに結果としての罹患率および致死率に関係している細胞の膨張に関係している生理学的標的が必要である。脳損傷および脳卒中において結果をさらに悪くし、そして罹患率と致死率を上昇させる脳腫脹を引き起こす細胞傷害性浮腫についての特異的な処置もまた必要である。他の、そしてさらなる目的、特徴、および利点は、開示の目的のために提供される本発明の現在のところ好ましい実施形態についての以下の記載から明らかであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、特異的チャンネルであるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの発見に一部基づく。これは、例えば、脳の外傷後に、ニューロン、神経膠、および神経内皮細胞の中で発現される。この特有の非選択性陽イオンチャンネルは、細胞内カルシウムによって活性化され、そして細胞内ＡＴＰによって遮断される（ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル）。これは、外傷性の損傷（例えば、急性神経損傷（例えば、低酸素症、虚血、組織圧迫、機械的変形、脳水腫、または細胞の膨張）、毒性化合物もしくは代謝物、急性の傷害、ガン、脳膿瘍など）にさらされてしまったか、または外傷性の傷害にさらされている神経細胞、神経膠細胞（神経膠、または神経膠細胞とも呼ばれ、例えば、星状細胞、上衣細胞、乏突起膠細胞、小神経膠細胞）、あるいは神経内皮細胞（例えば、毛細血管内皮細胞）の中で発現され得る。
【００１７】
さらに具体的には、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、２５から５０ｐＳの間にカリウムイオン（Ｋ＋）に対する単一チャンネルコンダクタンスを有している。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、生理学的濃度範囲にある細胞膜の細胞質側でのＣａ２＋によって刺激される。この場合、濃度範囲は、１０−８から１０−５Ｍまでである。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、生理学的濃度範囲の細胞質ＡＴＰによっても阻害され、この場合、濃度範囲は、１０−１から１０Ｍである。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、任意の２種類の陽イオンの間での透過性の比が０．５より大きく２未満である程度までは、以下の陽イオンに対しても透過性である；Ｋ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋。
【００１８】
さらに具体的には、本発明は、このＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの制御および／または調節に、ならびに、様々な疾患および／または症状（例えば、急性の神経学的損傷（例えば、脳卒中、虚血／低酸素傷害、外傷性または機械的傷害）、およびグリア被膜の形成を導く疾患または症状）を処置するためにその調節を使用することができる方法に関する。さらに、本発明は、このＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節および／または制御と、グリア被膜の完全性の維持もしくは破壊におけるその役割に関する。チャンネルの調節および／または制御は、チャンネルの活性化因子もしくはアゴニスト、またはチャンネルのアンタゴニストもしくは阻害因子の投与によって生じる。したがって、疾患に応じて、細胞死を防ぐため（例えば、組織の外傷が原因である虚血によって生じる脳水腫を処置するため、または組織圧を上昇させるため）には、チャンネルを遮断あるいは阻害する組成物（アンタゴニストまたは阻害因子）が投与される。これらの場合には、チャンネルは、細胞の脱分極を防ぐまたは減少させるまたは調節するために遮断される。あるいは、グリア被膜を処置あるいは破壊するためには、罹患した標的細胞の細胞死を生じる細胞の脱分極を引き起こすために、アゴニストまたは活性化因子化合物を投与することにより、チャンネルを開くあるいは活性化させることが所望される。
【００１９】
１つの態様においては、本発明により、細胞内カルシウムによって活性化され、そして細胞内ＡＴＰによって遮断される特有の非選択性陽イオンチャンネル（ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル）を標的化する治療用化合物を投与する工程を含む、患者を処置する新規の方法が提供される。特異的な実施形態においては、治療用化合物はアンタゴニストであり得、治療（例えば、脳虚血または浮腫の処置）においてそれが使用され、それによってＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの遮断および／または阻害による利点がもたらされる。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する細胞の死が治療目的のために望まれるさらなる実施形態においては、治療用化合物はアゴニストであり得る。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む組成物もまた意図される。
【００２０】
本発明にはまた、脳腫脹を処置するためにＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性を調節するそのような化合物および組成物の使用も含まれる。例えば、本発明は、脳の外傷または脳虚血によって生じる脳腫脹の処置のための方法に関し、それにより、神経細胞の腫脹、細胞死、およびイオン性浮腫と血管原性浮腫の経毛細管性形成の増大が生じる。さらに、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対するアンタゴニストの治療的使用による、脳腫脹と、それによって生じる脳の損傷を予防する方法が提供される。１つの実施形態においては、治療用アンタゴニストは、脳に、または脳の中に投与することができる。そのような脳への投与には、脳への直接の注射（特に、例えば、頭蓋骨への外傷が原因で脳に注射しやすい場合）が含まれる。本発明によりさらに、脳内での細胞の膨張を防ぐための、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対するアンタゴニストとしてのスルホニルウレア化合物の治療的使用が提供される。１つの実施形態においては、スルホニルウレア化合物はグリベンクラミドである。別の実施形態においては、スルホニルウレア化合物はトルブタミド、または本明細書中で別の場所に列挙したような、膵臓β細胞の中のＫＡＴＰチャンネルに対して作用することによってインシュリンの分泌を促進することが明らかになっている任意の他の化合物である。
【００２１】
本発明にはまた、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストとアンタゴニスト（低分子、巨大分子、および抗生物質を含む）、さらには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遺伝子の発現を阻害するために使用することができるヌクレオチド配列（例えば、アンチセンス、およびリボザイム分子）も含まれる。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストには、（１）チャンネルを遮断することができる；（２）チャンネルが開くことを防ぐことができる；（３）チャンネルを通過する膜電流の大きさを小さくすることができる；（４）チャンネルの転写発現を阻害することができる；ならびに／あるいは（５）チャンネルサブユニットの翻訳後のアセンブリおよび／または輸送を阻害することができる、１つ以上の化合物が含まれる。
【００２２】
本発明は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを調節する化合物または組成物（特に、このチャンネルのアンタゴニストとして作用し、それによって神経細胞の膨張と、同時に起こる脳腫脹を調節する化合物または組成物）をスクリーニングするために設計されたアッセイに関する。この目的のためには、細胞をベースとするアッセイ、または細胞をベースとしないアッセイを、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの外側（すなわち、細胞外ドメイン）および／またはその会合したＳＵＲ１調節サブユニットと相互作用する（例えば、それらに結合する）化合物を検出するために使用することができる。細胞をベースとするアッセイには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの生物学的活性（すなわち、脱分極）に影響を与える化合物を同定するために使用することができるという利点がある。本発明によってはまた、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストをスクリーニングし、同定するための方法も提供される。この方法は、神経細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害するかどうかを決定することによる。１つの実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰのアンタゴニストである化合物を同定するための方法が提供される。１つの実施形態においては、本発明の治療用化合物（ＮＣＣａ−ＡＴＰアンタゴニストを含む）は、開いたチャンネルを遮断するか、またはチャンネルが開くことを防ぐ化合物の能力によって、例えば、チャンネルを通過する膜電流を測定するための電気生理学的技術を使用してチャンネル機能を定量することによって同定される。ＮＣＣａ−ＡＴＰアンタゴニストには、例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遮断因子、ＳＵＲ１アンタゴニスト、ＳＵＲ１阻害因子である化合物、および／またはチャンネルを通過する膜電流の大きさを小さくする化合物が含まれる。この実施形態においては、チャンネル機能は、ヒトまたは動物由来の神経細胞の調製物の中で測定することができ、そして試験化合物は、溶液中の細胞調製物の上でそれを洗浄することにより細胞調製物と接触させることができる。本発明によってはさらに、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストとして作用し得るスルホニルウレア化合物をスクリーニングする方法が提供される。
【００２３】
本発明は、標的としてＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを使用することによる、脳腫脹（例えば、脳損傷または脳虚血後に起こる腫脹）の処置のための化合物を同定するための薬物スクリーニングアッセイに関する。本発明はまた、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを介して神経細胞の膨張を調節する化合物にも関する。本発明はまた、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを標的化することによる、脳腫脹の処置にも関する。
【００２４】
本発明はまた、Ｃａ２＋によって活性化される新規の［ＡＴＰ］ｉ感受性非特異的陽イオンチャンネルを含む、精製された組成物にも関する。本発明の好ましい実施形態においては、組成物には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する哺乳動物の神経細胞または膜調製物が含まれ、最も好ましくは、ここでは、哺乳動物の神経細胞は、新しく単離された反応性星状細胞、ニューロン、または神経内皮細胞である。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含むそのような精製された組成物の好ましい例は、天然の反応性星状細胞に由来する膜調製物である。本明細書中に示されるように、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する神経細胞が細胞内ＡＴＰの枯渇状態にある場合には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが開き、細胞が膨張し、そして死滅する。しかし、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルがそのような細胞上で遮断されている場合には、細胞は膨張することはなく、死滅しない。本発明はまた、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが１型スルホニルウレア受容体によって調節されること、およびこの受容体のアンタゴニストがＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断することができ、そして神経細胞の膨張を阻害することの発見にも一部基づく。
【００２５】
本発明の組成物（単数または複数）は食事によって投与される場合も、また非経口的に投与される場合もある。栄養による投与の例としては、経口投与、口腔投与、経直腸投与、または舌下投与が挙げられるがこれらに限定されない。非経口投与としては、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、心室内投与、腔内投与、膀胱内投与、クモ膜下投与、または莢膜内投与を挙げることができるがこれらに限定されない。他の投与の形態としてはまた、局所投与、粘膜投与、経皮投与、脳の柔組織への直接の注射も挙げることができる。
【００２６】
細胞に投与することができるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストまたはアンタゴニストの有効量としては、例えば、約０．０００１ｎＭから約２０００μＭの用量が挙げられる。さらに具体的には、投与されるアゴニストの用量は、例えば、約０．０１ｎＭから約２０００μＭ；約０．０１μＭから約０．０５μＭ；約０．０５μＭから約１．０μＭ；約１．０μＭから約１．５μＭ；約１．５μＭから約２．０μＭ；約２．０μＭから約３．０μＭ；約３．０μＭから約４．０μＭ；約４．０μＭから約５．０μＭ；約５．０μＭから約１０μＭ；約１０μＭから約５０μＭ；約５０μＭから約１００μＭ；約１００μＭから約２００μＭ；約２００μＭから約３００μＭ；約３００μＭから約５００μＭ；約５００μＭから約１０００μＭ；約１０００μＭから約１５００μＭ；および約１５００μＭから約２０００μＭである。もちろん、これらの量は全て例であり、そしてこれらの点の間のあらゆる量もまた、本発明で使用されると予想される。
【００２７】
治療薬としてのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはそれらの関連化合物の有効量は、処置される宿主、および特定の投与形式に応じて様々である。本発明の１つの実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはそれらの関連化合物の用量範囲は、約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約２０，０００μｇ／ｋｇ体重であろう。用語「体重」は、動物が処置される場合に適用することができる。単離された細胞が処理される場合には、「体重」は、本明細書中で使用される場合には、「細胞体の重量の合計」を意味すると読み取られるべきである。用語「全体重」は、単離された細胞の処理と動物の処置の両方に適用されるように使用することができる。濃度および処置レベルは全て、「体重」として表現されるか、または本出願の中の単なる「ｋｇ」もまた、同様の「細胞体の重量の合計」と「全体重」の集合を含むと考えられる。しかし、当業者は例えば以下のような様々な投与量範囲の有用性を認識するであろう：０．０１μｇ／ｋｇ体重から２０，０００μｇ／ｋｇ体重、０．０２μｇ／ｋｇ体重から１５，０００μｇ／ｋｇ体重、０．０３μｇ／ｋｇ体重から１０，０００μｇ／ｋｇ体重、０．０４μｇ／ｋｇ体重から５，０００μｇ／ｋｇ体重、０．０５μｇ／ｋｇ体重から２，５００μｇ／ｋｇ体重、０．０６μｇ／ｋｇ体重から１，０００μｇ／ｋｇ体重、０．０７μｇ／ｋｇ体重から５００μｇ／ｋｇ体重、０．０８μｇ／ｋｇ体重から４００μｇ／ｋｇ体重、０．０９μｇ／ｋｇ体重から２００μｇ／ｋｇ体重、または０．１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重。さらに、当業者は、例えば以下のような多種多様の投与量レベルが使用されるであろうことを理解するであろう：０．０００１μｇ／ｋｇ、０．０００２μｇ／ｋｇ、０．０００３μｇ／ｋｇ、０．０００４μｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ、０．０００７μｇ／ｋｇ、０．００１μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、２．０μｇ／ｋｇ、５．０μｇ／ｋｇ、１０．０μｇ／ｋｇ、１５．０μｇ／ｋｇ、３０．０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および／または３０ｍｇ／ｋｇ。特定の実施形態においては、極めて少量の範囲（例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日以下；５ｍｇ／ｋｇのボーラス；または１ｍｇ／ｋｇ／日）から中用量（例えば、２ｍｇのボーラス、１５ｍｇ／日）から高用量（例えば、５ｍｇのボーラス、３０〜４０ｍｇ／日；およびさらに高い用量）が投与される場合がある。もちろん、これらの投与量は全て例であり、そしてこれらの点の間の���らゆる量もまた、本発明で使用されると予想される。上記の投与量範囲または投与量レベルは全て、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはそれら両方、あるいはそれらの関連化合物について使用され得る。
【００２８】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）のアンタゴニストによって遮断され、そしてＳＵＲ１活性化因子によって開かれる。さらに具体的には、１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）のアンタゴニストにはＫＡＴＰチャンネルの遮断因子が含まれ、そしてＳＵＲ１活性化因子にはＫＡＴＰチャンネルの活性化因子が含まれる。このチャンネルは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遮断因子、１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）アンタゴニスト、ＳＵＲ１阻害因子、またはチャンネルを通過する膜電流の大きさを小さくすることができる化合物によって阻害することができる。さらの具体的には、ＳＵＲ１アンタゴニストは、以下からなる群より選択され得る：グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストロゲン関連化合物（エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステイン、非ステロイド系エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、フィトエストロゲン（例えば、クメステロール）、ゼアラレノンなど）、およびＫＡＴＰチャンネルを阻害または遮断することがわかっている化合物。ＭｇＡＤＰもまた、このチャンネルを阻害するために使用することができる。ＫＡＴＰチャンネルを遮断または阻害するために使用することができる他の化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：トルブタミド、グリブライド（１［ｐ−２［５−クロロ−Ｏ−アニサミド）エチル］フェニル］スルホニル」−３−シクロヘキシル−３−ウレア）；クロロプロパミド（１−［［（ｐ−クロロフェニル）スルホニル］−３−プロピルウレア；グリピジド（１−シクロヘキシル−３［［ｐ−［２（５−メチルピラジンカルボキサミド）エチル］フェニル］スルホニル］ウレア）；またはトラザミド（ベンゼンスルホンアミド−Ｎ−［［（ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１イル）アミノ］カルボニル］−４−メチル）。さらなる実施形態においては、非スルホニルウレア化合物（例えば、２，３−ブタンジオンおよび５−ヒドロキシデカン酸、キニーネ、ならびにそれらの等価物である塩および誘導体が、本発明において使用され得る。
【００２９】
このチャンネルは、例えば、神経細胞、神経膠細胞、神経上皮細胞、神経内皮細胞上で、またはそれらの組み合わせにおいて発現される。阻害因子は、細胞へのＮａ＋の流入を遮断し、それによって細胞の脱分極を防ぐ。それによる細胞へのＮａ＋の流入の阻害は、少なくとも、細胞傷害性の浮腫および／またはイオン性の浮腫を防ぐかまたは少なくし、そして出血性の転換を防ぐかまたは少なくする。したがって、この処置によって、神経細胞および／または神経内皮細胞の細胞死あるいは壊死による死は少なくなる。
【００３０】
特定の実施形態においては、被験体に投与されるＳＵＲ１アンタゴニストの量は、約０．０００１μｇ／ｋｇ／日から約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ／日、または約１００μｇ／ｋｇ／日から約２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。さらに、ＳＵＲ１アンタゴニストは、１日あたり（１、２、３、４など）、１週あたり（１、２、３、４など）、１か月あたり（１、２、３、４など）に投与されるＳＵＲ１アンタゴニストの量、あるいはＳＵＲ１アンタゴニストの用量が含まれ得る処置の形態で、被験体に投与することができる。処置は、被験体に投与されるＳＵＲ１アンタゴニストの量が、約０．０００１μｇ／ｋｇ／処置から約２０ｍｇ／ｋｇ／処置、約０．０１μｇ／ｋｇ／処置から約１００μｇ／ｋｇ／処置、または約１００μｇ／ｋｇ／処置から約２０ｍｇ／ｋｇ／処置の範囲となるように投与され得る。
【００３１】
本発明の別の実施形態には、脳卒中に罹患している被験体の致死率を低下させる方法が含まれる。この方法には、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害するために有効な化合物を被験体に投与する工程が含まれる。この化合物は脳卒中の大きさを小さくし、そして梗塞組織周辺に存在する浮腫を軽減する。この化合物は、食事によって投与すること（例えば、経口投与、口腔投与、経直腸投与、または舌下投与）も、また非経口的に投与すること（例えば、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、動脈内投与、クモ膜下投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与）も、および／または、局所投与すること（例えば、経皮投与）、粘膜に投与することも、あるいは、脳の柔組織への直接の注射によって投与することもできる。
【００３２】
さらに、別の実施形態には、被験体の梗塞組織領域周辺の浮腫を軽減する方法が含まれる。この方法には、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害するために有効な化合物を被験体に投与する工程が含まれる。
【００３３】
さらなる実施形態には、脳卒中を発症するリスクがある被験体を処置する方法が含まれる。この方法には、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害するために有効な化合物を被験体に投与する工程が含まれる。
【００３４】
特定の実施形態においては、被験体は心臓の症状についての処置を受けており、したがって、この症状によって脳卒中を発症する被験体のリスクが高まる。例えば、この処置には、心筋梗塞を処置するための血栓溶解剤の使用が含まれ得る。さらに、被験体には、被験体が動脈のフィブリル化または凝固障害に罹患していることが原因で、脳卒中を発症するリスクがある場合がある。脳卒中を発症するリスクのある他の被験体としては、肺動脈塞栓を発症するリスクがある被験体、外科手術（例えば、血管手術または神経外科手術）を受けている被験体、あるいは、脳卒中を発症するそのリスクを高める処置（例えば、処置に脳／血管内の処置、血管造影法、またはステント留置術が含まれ得る）を受けている被験体が挙げられる。他の実施形態においては、被験体は、虚血のリスクがある脊髄が存在する可能性がある血管系の疾患の処置（例えば、動脈を交差するクランプが必要な外科手術、腹部大動脈瘤の外科手術など）を受けている場合がある。他の実施形態においては、患者は、背骨のまたは脊髄の症状についての外科手術（椎間板切除術、癒着、椎弓切除術、損傷のリスクがある脊髄が存在している腫瘍もしくは塊についての硬膜外または硬膜内の手術を含む）を受けている場合がある。本発明のいくつかの実施形態においては、被験体は慢性的な症状を有しており、一方、本発明の他の実施形態においては、被験体は慢性的な症状を有しておらず、例えば、短期的な症状を有する。
【００３５】
本発明の別の実施形態には、脳水腫を発症するリスクのある被験体を処置する方法が含まれる。この方法には、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害するために有効な化合物を被験体に投与する工程が含まれる。リスクのある被験体は、前静脈奇形もしくは腫瘤性病変（例えば、血腫）に罹患している場合があり、また、脳の外傷について高いリスクがある活性に関与している場合もある。
【００３６】
本発明の別の実施形態には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する神経内皮細胞に由来する膜調製物を含む組成物が含まれる。ここでは、チャンネルは、１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）のアンタゴニストによって遮断され、そしてＳＵＲ１活性化因子によって開かれる。さらに具体的には、このチャンネルは以下の特性を有している：（ａ）３５ｐＳ型チャンネルである；（ｂ）約１０−８から約１０−５Ｍの濃度範囲の細胞質Ｃａ２＋によって刺激される；（ｃ）細胞質ＡＴＰが約０．８μＭ未満である場合に開く；そして（ｄ）１価の陽イオンＫ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、およびＮａ＋について透過性である。
【００３７】
さらなる実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物は、血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ）、抗凝固剤または抗血小板物質（例えば、アスピリン、ワーファリン、またはクマディン）、スタチン、利尿剤、血管拡張剤（例えば、ニトログリセリン）、マンニトール、ジアゾキシド、または虚血性の前症状を刺激もしくは促進する同様の化合物と組み合わせて投与することができる。
【００３８】
さらに、本発明の別の実施形態には、血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ）、抗凝固剤または抗血小板物質（例えば、アスピリン、ワーファリン、またはクマディン）、スタチン、利尿剤、血管拡張剤、マンニトール、ジアゾキシド、または、虚血の前症状を刺激もしくは促進する同様の化合物、あるいはそれらの薬学的に許容される塩と、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物が含まれる。この薬学的組成物は、特異的な実施形態においては、神経防御作用があると考えることができる。例えば、血栓溶解剤とＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物の組み合わせを含む薬学的組成物は、これが数時間まで血栓溶解剤の投与についての治療域を高めるとの理由から、神経防御作用がある。例えば、血栓溶解剤の投与についての治療域は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの同時投与によって数時間（例えば、約４時間〜約８時間）延長することができる。
【００３９】
さらに、別の実施形態には、被験体の急性脳虚血を処置する方法が含まれる。この方法には、一定量の血栓溶解剤またはその薬学的に許容される塩を、一定量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて被験体に投与する工程が含まれる。特定の実施形態においては、血栓溶解剤は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせである。ＳＵＲ１アンタゴニストは、任意の標準的な非経口経路または食事による経路によって投与することができ、例えば、ＳＵＲ１アンタゴニストは、ボーラス注射として、もしくは点滴として、またはそれらの併用で投与することができる。
【００４０】
本発明の別の実施形態には、グリア被膜を破壊する方法（例えば、被験体の脳の中の腫瘍を取り囲む腫瘍−脳関門の完全性を崩壊させるための方法）が含まれる。この方法には、神経細胞、もしくは神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを活性化させるために有効な化合物を被験体に投与する工程が含まれる。
【００４１】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する細胞の崩壊が所望される場合には、ＳＵＲ１活性化因子またはアゴニストが、例えば、グリア被膜を小さくするまたは除去するために、投与される場合がある。活性化因子化合物またはアゴニストは、１型スルホニルウレア受容体アゴニストであり得る。例えば、本発明において使用することができるアゴニストとしては、ＳＵＲ１のアゴニスト、例えば、ジアゾキシド、ピナシジル、Ｐ１０７５、クロマカリン、またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。他のアゴニストとしては、以下を挙げることができるがこれらに限定されない：ジアゾキシド誘導体、例えば、３−イソプロピルアミノ−７−メトキシ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキサイド（ＮＮＣ５５−９２１６）、６，７−ジクロロ−３−イソプロピルアミノ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ１５４）、７−クロロ−３−イソプロピルアミノ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ７３）、６−クロロ−３−イソプロピルアミノ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＮＮＣ５５−０１１８）４，６−クロロ−３−（１−メチルシクロプロピル）アミノ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＮＮ４１４）、３−（３−メチル−２−ブチルアミノ）−４Ｈ−ピリド［４，３−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ４４）、３−（１’，２’，２’−トリメチルプロピル）アミノ−４Ｈ−ピリド（４，３−ｅ）−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ６２）、３−（１’，２’，２’−トリメチルプロピル）アミノ−４Ｈ−ピリド（２，３−ｅ）−１，２，４−チアジアジン，１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ７９）、２−アルキル−３−アルキルアミノ−２Ｈ−ベンゾ−および２−アルキル−３−アルキルアミノ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド、６−クロロ−３−アルキルアミノ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド誘導体、４−Ｎ−置換および−非置換３−アルキル−および３（アルキルアミノ）−４Ｈ−ピリド［４，３−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド、あるいはそれらの組み合わせ。加えて、６−クロロ−２メチルキノリン−４（１Ｈ）−オン（ＨＥＩ７１３）およびＬＮ５３３０２１を含む他の化合物、さらには、複数の薬物のクラス、アリールシアノグアニジンが、ＳＵＲ１について知られている活性化因子またはアゴニストである。使用できる他の化合物としては、ＫＡＴＰチャンネルを活性化することが知られている化合物が挙げられる。
【００４２】
さらに、本発明の別の実施形態には、神経細胞または神経膠細胞または神経内皮細胞の１つ以上の細胞死を誘導する方法が含まれる。この方法には、細胞中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを活性化させるために有効な化合物を細胞に投与する工程が含まれる。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性化によっては、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）の流入が生じ、これによって細胞の脱分極が引き起こされる。Ｎａ＋の流入により浸透圧勾配が変化して、細胞傷害性である浮腫に至る細胞への水の流入が起こり、最終的には壊死性の細胞死が生じる。
【００４３】
さらに、本発明の別の実施形態には、被験体の脳膿瘍を取り囲むグリア被膜の完全性を維持する方法が含まれる。この方法には、被験体に、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中の少なくとも１つのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害するおよび／または遮断するために有効な化合物を投与する工程が含まれる。
【００４４】
さらに、本発明の別の方法には、神経細胞の浮腫および／または脳の中の細胞傷害性の損傷を診断する方法が含まれる。この方法には、ＳＵＲ１のアンタゴニストを標識する工程；被験体に対してＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストを投与する工程；被験体の脳の中のＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストのレベルを測定する工程が含まれる。ここでは、ＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストの存在が神経細胞の浮腫および／または脳の中の細胞傷害性の損傷を示す。
【００４５】
さらなる実施形態においては、これらの方法には、脳卒中後のペナンブラ領域を決定する方法が含まれ得る。この方法には、ＳＵＲ１のアンタゴニストを標識する工程；被験体に対してＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストを投与する工程；被験体の脳の中のＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストを視覚化する工程が含まれる。ここでは、ＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストの存在がペナンブラ領域を示す。
【００４６】
さらに、本発明には、脳卒中による神経障害をモニターする方法が含まれる。この方法には、ＳＵＲ１のアンタゴニストを標識する工程；被験体に対してＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストを投与する工程；被験体の脳の中のＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストを視覚化する工程が含まれる。ここでは、ＳＵＲ１の標識されたアンタゴニストの存在が疾患の進行を示す。特定の実施形態においては、視覚化の工程は、脳卒中の進行をモニターするために日常的に行われているように行われる。
【００４７】
別の実施形態には、神経防御作用のある輸液キットが含まれる。このキットには、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物と、ＩＶ溶液が含まれる。化合物と溶液は、同じ容器の中に含まれるか、または別の容器の中に含まれる。さらに具体的には、化合物は溶液の容器の中に含まれる。
【００４８】
このキットにはさらに、神経防御作用のあるボーラスキットが含まれ得る。ここでは、このボーラスキットには、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物が予め充填された注射器が含まれる。
【００４９】
さらに、別の実施形態には、神経細胞、神経膠細胞、内皮細胞、またはそれらの組み合わせの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物と、血栓溶解剤（例えば、ｔＰＡ）、抗凝固剤（例えば、ワーファリンまたはクマディン）、抗血小板物質（例えば、アスピリン）、利尿剤（例えば、マンニトール）、スタチン、または血管拡張剤（例えば、ニトログリセリン）を含む神経防御作用のあるキットが含まれる。
【００５０】
上記では、以下の本発明の詳細な記載をさらに理解できるようにするために、本発明の特徴と技術的利点がより広くおおまかに述べられた。本発明のさらなる特徴と利点は、本明細書中で以下に記載され、これは本発明の特許請求の範囲の主部を構成する。開示される概念と特異的な実施形態が本発明の同じ目的を実行するための変更または他の構成の設計の基準として容易に利用され得ることは、当業者に明らかなはずである。そのような同等の構成が、添付の特許請求の範囲に示される本発明の精神および範囲から逸脱することがないこともまた、当業者に理解されるはずである。本発明の特性と考えられる新規の特徴は、その構成および操作方法のいずれについても、さらなる目的と利点とともに、添付の図面と結びつけて考慮すると、以下の記載からさらによく理解されるであろう。しかし、個々の図面が説明と記載の目的だけのために提供され、そして本発明の境界の定義とは意図されないことは明らかに理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、その機能が哺乳動物の神経細胞の膨張の根底にある、例えば、ＡＴＰの枯渇に反応する、新規のイオンチャンネル；そのようなチャンネルの発現を導く疾患、外傷、および症状に関する処置方法に関する。この方法には、脳虚血および外傷性脳障害における脳の損傷を特徴とするこの細胞の膨張反応を防ぐためのチャンネル機能の阻害因子の使用が含まれる。本発明はまた、チャンネル阻害因子および活性化因子をスクリーニングするためのチャンネルの使用、ならびに他の使用にも関する。
【００５２】
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは特定の機能的特性によって識別され、その組み合わせが、それを公知のイオンチャンネルと識別する。本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを識別する特性としては、以下が挙げられるが必ずしもこれらに限定されない：１）Ｎａ、Ｋ、および他の１価の陽イオンを容易に透過させる非選択性陽イオンチャンネルである；２）細胞内カルシウムの増加によって、および／または細胞内ＡＴＰの減少によって活性化される；３）ＫＡＴＰチャンネル（例えば、膵臓β細胞の中で見られるもの）と排他的に会合するとこれまで考えられてきた１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）によって調節される。
【００５３】
さらに具体的には、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、２０から５０ｐＳの間の、カリウムイオン（Ｋ＋）に対する単一チャンネルコンダクタンスを有している。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、生理学的濃度範囲にある細胞膜の細胞質側でのＣａ２＋によっても刺激される。この場合、上記濃度範囲は、１０−８から１０−５Ｍまでである。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、生理学的濃度範囲の細胞質ＡＴＰによっても阻害され、この場合、上記濃度範囲は、１０−１から１０μＭである。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、上記陽イオンのうちの任意の２種類の間での透過性の比が、０．５より大きく２未満である程度までは、以下の陽イオンに対しても透過性である；Ｋ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態のいくつかは、添付の図面に関連して詳細に記載されるであろう。
【００５５】
本発明は多くの様々な形態で具体化することができ、本明細書中に示される実施形態に限定されるようには解釈されるべきではない。
【００５６】
Ｉ．ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル
特有の非選択性の１価陽イオン性ＡＴＰ感受性チャンネル（ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル）は、最初に天然の反応性星状細胞（ＮＲＡ）において同定され、そして後に、本明細書中に記載されるように、脳卒中または外傷性脳損傷もしくは脊髄損傷後のニューロンおよび毛細血管内皮細胞の中で同定された（少なくとも、Ｓｉｍａｒｄら，の国際特許出願番号ＷＯ０３／０７９９８７、およびＣｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍａｒｄ，２００１を参照のこと、それぞれがその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。膵臓β細胞中のＫＡＴＰチャンネルと同様に、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、１型スルホニルウレア受容体１（ＳＵＲ１）調節サブユニットと孔を形成するサブユニットからなるヘテロ多量体構造であると考えられている（Ｃｈｅｎら，２００３）。孔を形成するサブユニットは生物物理学的に特性決定されているが、まだ分子的には特性決定されていない。
【００５７】
本発明は、米国特許出願公開番号２００３０２１５８８９（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）において星状細胞上のチャンネルとして定義された特異的チャンネルであるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの発見に一部基づく。さらに詳細には、本発明はさらに、このチャンネルが星状細胞上だけで発現されるのではなく、少なくとも、脳および脊髄の外傷（例えば、低酸素の事象、虚血事象、またはこれらの事象に関係している他の二次的な神経の損傷）後の神経細胞、神経膠細胞、および／または神経内皮細胞上でも発現されていることを定義する。
【００５８】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）によって活性化され、そしてＡＴＰに感受性である。したがって、このチャンネルは、細胞内Ｃａ２＋によって活性化され、そして細胞内ＡＴＰによって遮断される非選択性陽イオンチャンネルである。細胞内ＡＴＰの枯渇によって開かれると、このチャンネルは、大量のＮａ＋の流入が原因で完全な脱分極に関与する。これは、Ｃｌ−の電気的勾配とＨ２Ｏについての浸透圧勾配を作成し、それによって細胞傷害性の浮腫と細胞死が生じる。チャンネルが遮断または阻害されると、大量のＮａ＋は生じず、それによって細胞傷害性の浮腫が妨げられる。
【００５９】
特定の機能的特性によって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは他の公知のイオンチャンネルから識別される。これらの特性には、以下の少なくともいくつかが含まれ得るが、これらに限定されない：１）Ｎａ＋、Ｋ＋、および他の１価の陽イオンを容易に透過させる非選択性陽イオンチャンネルである；２）細胞内カルシウムの増加によって、および／または細胞内ＡＴＰの減少によって活性化される；３）ＫＡＴＰチャンネル（例えば、膵臓β細胞の中で見られるもの）と排他的に会合するとこれまで考えられてきた１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）によって調節される。
【００６０】
さらに具体的には、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、２０から５０ｐＳの間の、カリウムイオン（Ｋ＋）に対する単一チャンネルコンダクタンスを有している。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、生理学的濃度範囲にある細胞膜の細胞質側でのＣａ２＋によっても刺激される。この場合、濃度範囲は、１０−８から１０−５Ｍまでである。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、生理学的濃度範囲の細胞質ＡＴＰによっても阻害され、この場合、濃度範囲は、１０−１から１０Ｍである。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはまた、任意の２種類の陽イオンの間での透過性の比が、０．５より大きく２未満である程度までは、以下の陽イオンに対しても透過性である；Ｋ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋。
【００６１】
ＳＵＲは、抗糖尿病薬であるスルホニルウレア（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミド）に対する感受性を付与する。また、ＳＵＲは、「Ｋ＋チャンネルオープナー」と呼ばれる物質（例えば、ジアゾキシド、ピナシジル、およびクロマカリン）の多様な化学的物質のグループによる活性化に関与している（Ａｇｕｉｌａｒ−Ｂｒｙａｎら，１９９５；Ｉｎａｇａｋｉら，１９９６；Ｉｓｏｍｏｔｏら，１９９６；Ｎｉｃｈｏｌｓら，１９９６；Ｓｈｙｎｇら，１９９７）。様々な組織の中で、分子的に異なる複数のＳＵＲが、異なる孔を形成するサブユニットに結合して、識別することができる生理学的特性と薬物動態特性を有している様々なＫＡＴＰチャンネルを形成する。膵臓β細胞の中のＫＡＴＰチャンネルは、Ｋｉｒ６．２と連結したＳＵＲ１によって形成され、一方、心筋と平滑筋のＫＡＴＰチャンネルは、それぞれ、Ｋｉｒ６．２およびＫｉｒ６．１と連結したＳＵＲ２ＡとＳＵＲ２Ｂによって形成される（Ｆｕｊｉｔａら，２０００）。明確に異なる孔を形成するサブユニットから構成されているにもかかわらず、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルもまたスルホニルウレア化合物に対して感受性である。
【００６２】
また、ＫＡＴＰチャンネルとは異なり、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルはナトリウムイオン、カリウムイオン、セシウムイオン、および他の１価の陽イオンをほぼ同等の容易さで伝導する（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍａｒｄ，２００１）。このことは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルがＫＡＴＰチャンネルとは異なることの特性であり、結果として、特定の化合物に対する親和性をさらに示唆している。
【００６３】
細胞内Ｃａ２＋によって活性化され、そして細胞内ＡＴＰによって阻害される他の非選択性陽イオンチャンネルは、他の研究者によって同定されているが、本明細書中で開示したように星状細胞またはニューロンにおいては同定されていない。さらに、星状細胞の中で発現され、見られるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、カルシウム感受性およびアデニンヌクレオチド感受性に関して他のチャンネルとは生理学的に異なる（Ｃｈｅｎら，２００１）。
【００６４】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの特性の概要
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する細胞およびＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含む組成物の特性の少なくとも一部が表１にまとめられる（新しく単離された未処理の反応性星状細胞［ＮＲＡ］を用いた実験により得られた）。
【表１】
2009527579.tif 000003
【００６５】
ＩＩ．グリア被膜
グリア被膜は、脳腫脹と腫瘤効果に関係しており、そして免疫系による監視によって異質細胞を非難させることができる、有害となる可能性のある組織の塊を形成する。出願人らは、最初に、ラットとヒトの両方において様々な病理学的条件下で、グリア被膜の内部領域の中の反応性星状細胞（Ｒ１星状細胞）が新規のＳＵＲ１調節型の陽イオンチャンネルであるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現すること、およびこのチャンネルが細胞の生存性を直接制御することを決定した。このチャンネルの開口は壊死による細胞死に関係しており、そしてチャンネルの閉鎖はエネルギー（ＡＴＰ）の枯渇によって誘導される細胞死による防御に関係している。
【００６６】
本明細書中に記載されるように、出願人らは、最初に、グリア被膜の内部領域がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現するＲ１星状細胞の中に存在することを決定した。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する星状細胞の選択的な死滅は、グリア被膜の形成を導く症状の処置を助ける可能性がある。例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する星状細胞の選択的死滅によって「腫瘍脳関門」（ＴＢＢ）が破壊し、それによって、ＴＢＢを通過する白血球の移動を引き起こし、脳の中の腫瘍の処置を助ける。
【００６７】
脳の損傷を防ぐためには、この標的の活性を調節することができる治療用化合物もまた必要である。本発明は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと呼ばれる、新しく特性決定された非選択性カルシウムおよびＡＴＰ感受性の１価の陽イオンチャンネルに関する。これは神経細胞の中に存在しており、ＳＵＲに連結される。本発明によってはさらに、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性のアンタゴニストをスクリーニングまたは同定するための方法が提供される。さらに、本発明によっては、このチャンネル活性を阻害し、それによって神経細胞の膨張および細胞死と、付随する神経系の損傷（これには脳腫脹と脳の損傷が含まれる）を予防するための、アンタゴニスト（例えば、スルホニルウレアおよび他のＳＵＲ１遮断因子）の治療的使用のための方法が提供される。
【００６８】
アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）は、細胞内ＡＴＰの枯渇によって「化学的低酸素症（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ）」を誘導するために使用される代謝毒素である。Ｓｗａｎｓｏｎ，１９９２を参照のこと。ＮａＮ３に対する神経細胞の形態学的応答と電気生理学的応答は、新規の細胞調製物において試験される。成体ラットの脳から新しく単離された未処理の反応性星状細胞（ＮＲＡ）が使用され、それらの単離の直後に未処理の状態で研究される。反応性星状細胞は、脳または神経の損傷に関係しているもののような、インビボで活性化されたかまたは刺激された星状細胞である。外傷性脳損傷（ＴＢＩ）患者の死後の脳においては、反応星状細胞は損傷の近くで見られる。脳の損傷部位を取り囲む反応性星状細胞の大部分は反応性星状細胞である。１型反応性星状細胞は回収できる反応性星状細胞の＞８０％を占め、一方、２型反応性星状細胞は約５％を占める。反応性星状細胞は、通常は、静止状態では分極した状態にある。
【００６９】
様々な実施形態と改良を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本出願に開示されている本発明に対して行うことができることは当業者に容易に明らかである。
【００７０】
ＩＩＩ．定義
用語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」と組み合わせて使用される場合には、「１つ」を意味する場合があるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより大きい」の意味とも一致する。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つ以上のエレメント、方法の複数の工程、および／または複数の方法からなるか、あるいは、それらから原則として構成され得る。本明細書中に記載される任意の方法または組成物が、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関して実行され得ることが意図される。
【００７１】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、あるいはだけを意味するように明記されていない限りは「および／または」を意味するように使用されるか、または、別のものが互いに排他的であるが、本開示はあるいはだけと「および／または」を意味する定義を支持する。
【００７２】
本明細書中で使用される場合は、用語「急性」は、健康への影響の開始を意味し、通常はこの影響は、短期間と考えられる迅速な開始であり、持続しない。
【００７３】
本明細書中で使用される場合は、用語「急性脳虚血」は、迅速に開始し、長くは続かない脳虚血の事象を意味する。用語「急性脳虚血」および「脳卒中」は互換的に使用することができる。
【００７４】
本明細書中で使用される場合は、用語「アゴニスト」は、細胞上の受容体と一体化し、そして内因性の物質の結合によって生じる反応もしくは活性と同じまたは同等の反応もしくは活性を開始する生物学的あるいは化学的物質を意味する。本発明においては、アゴニストは、神経細胞、神経膠細胞、または神経内皮細胞のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと一体化する、結合する、および／または会合し、その結果、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが開かれる（活性化される）。特定の実施形態においては、アゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節サブユニット（具体的には、ＳＵＲ１）と一体化する、結合する、および／または会合する。あるいは、アゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの孔を形成するサブユニットと一体化する、結合する、および／または会合し、その結果、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが開かれる（活性化される）。用語アゴニストおよび／または活性化因子は、互換的に使用することができる。
【００７５】
本明細書中で使用される場合は、用語「アンタゴニスト」は、体内で別の化学的または生物学的物質の生理学的活性を低下させるように作用する、生物学的または化学的物質を意味する。本発明においては、アンタゴニストは、神経細胞、神経膠細胞、または神経内皮細胞（例えば、毛細血管内皮細胞）のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性を遮断する、阻害する、低下させる、および／または下げる。本発明においては、アンタゴニストは、神経細胞、神経膠細胞、または神経内皮細胞（例えば、毛細血管内皮細胞）のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと一体化する、結合する、会合し、その結果、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが閉じられる（不活化される）。このことは、罹患状態での生物学的活性に関する生物学的活性の低下を意味する。特定の実施形態においては、アンタゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節サブユニット（具体的には、ＳＵＲ１）と一体化する、結合する、および／または会合する。あるいは、アンタゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの孔を形成するサブユニットと一体化する、結合する、および／または会合し、その結果、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは閉じられる（不活化される）。用語「アンタゴニスト」または「阻害因子」は、互換的に使用することができる。
【００７６】
本明細書中で使用される場合は、用語「脳膿瘍（ｂｒａｉｎ  ａｂｓｃｅｓｓ）」または「脳膿瘍（ｃｅｒｅｂｒａ  ａｂｓｃｅｓｓ）」は、膿状の滲出物の限局性集積を意味する。これは通常、腫脹と関係している。
【００７７】
本明細書中で使用される場合は、用語「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、脳血管と脳組織の間のバリアを意味し、その効果は、血液から脳内へと通過するできるものを制限することである。
【００７８】
本明細書中で使用される場合は、用語「脳虚血」は、ある領域への適切な血流がないこと、例えば、脳または脊髄への適切な血流がないことを言う。これによっては、血餅、血管の閉塞、出血、または塊が大きくなることによる組織圧迫の結果が起こり得る。
【００７９】
本明細書中で使用される場合は、用語「脱分極」は、ナトリウムイオンに対する細胞膜の透過性の増大を意味する。ここでは、細胞膜を通過する電位差が小さくなるかまたは解消される。
【００８０】
本明細書中で使用される場合は、用語「有効量」または「治療有効量」は互換的に使用され、そして、その疾患もしくは症状の兆候の改善または回復を生じる量を意味する。当業者は、有効量によって患者または被験体の症状を改善できる場合があるが、疾患および／または症状の完全な治癒に至らない場合もあることを理解している。
【００８１】
本明細書中で使用される場合は、用語「内皮」は、体腔、血管、およびリンパ管の表面の内側を覆うか、または毛細血管を形成する細胞の層を意味する。
【００８２】
本明細書中で使用される場合は、用語「内皮細胞」は、内皮の細胞、あるいは体腔（例えば、血管もしくはリンパ管、または毛細血管）の表面の内側を覆う細胞を意味する。特定の実施形態においては、用語内皮細胞は、神経内皮細胞、または神経系（例えば、中枢神経系または脳または脊髄）の一部である内皮細胞を意味する。
【００８３】
本明細書中で使用される場合は、用語「グリア皮膜」は、異物（転移性腫瘍、脳膿瘍、または病理学的状態を除き脳において通常は見られない他の塊を含む）の全体または一部を取り囲む物理的バリアを意味する。特定の実施形態においては、グリア被膜には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する神経細胞、神経膠細胞（例えば、星状細胞）、および／または内皮細胞を含む内部領域が含まれる。
【００８４】
本明細書中で使用される場合は、用語脳または神経組織の中の「イオン性浮腫」は、その中の血液−脳関門が実質的に完全なままであり、そして脳の柔組織への電解質（例えば、Ｎａ＋、Ｃｌ−）と水の移動に関係している組織において生じる浮腫を意味する。
【００８５】
本明細書中で使用される場合は、用語「阻害する」は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのようなチャンネルを遮断する、部分的に遮断する、妨害する、低下させる、少なくする（ｒｅｄｕｃｅ）、または不活化させる化合物の能力を意味する。したがって、当業者は、用語「阻害する」に、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのようなチャンネルの活性が完全におよび／または部分的な喪失が含まれる。チャンネル活性は、チャンネルの遮断（孔領域の閉塞または閉鎖、チャンネルを通じるイオン性電流を妨げること）によって、開口速度または平均開口時間の変化、閉鎖速度または平均閉鎖時間の変化によって、あるいは他の手段によって阻害され得る。例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性の完全なおよび／または部分的な喪失は、細胞の脱分極の減少、ナトリウムイオンの流入もしくは任意の他の１価のイオンの流入の減少、水の流入の減少、血液溢出の減少、細胞死の減少、ならびに虚血性の変化に続く細胞の生存性の改善によって示され得る。
【００８６】
用語「病的状態（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）」は、本明細書中で使用される場合は、罹患した状態である。さらに、「罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）」はまた、所定の集団の中での罹患率（ｄｉｓｅａｓｅ  ｒａｔｅ）、あるいは、病気である被験体または疾患の症例の割合をも意味することができる。
【００８７】
用語「死亡（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）」は、本明細書中で使用される場合は、死を免れない運命にある状態、または死を引き起こす状態である。さらに、致死率（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）はまた、所定の集団の中での死亡率、または死の数の割合をも意味することができる。
【００８８】
本明細書中で使用される場合は、用語「ニューロン」は神経細胞（ｎｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ）を意味し、これは神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）とも呼ばれる。
【００８９】
本明細書中で使用される場合は、用語「神経細胞」は、神経系の形態学的および機能的単位である細胞を意味する。この細胞には、神経細胞体、樹状突起、および軸索が含まれる。用語「ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）」、「神経細胞」、「ニューロンの」、「ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｅ）」、および「神経細胞（ｎｅｕｒｏｃｙｔｅ）」は互換的に使用することができる。神経細胞のタイプとしては、内部構造を示す典型的な神経細胞体、大脳皮質に由来する（カハール（Ｃａｊａｌ）の）水平細胞；Ｍａｒｔｉｎｏｔｔｉｃ細胞、双極細胞、単極細胞、Ｐｕｋｉｎｊｅ細胞、および大脳皮質の運動野の錐体細胞を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００９０】
本明細書中で使用される場合は、用語「神経の」は、神経系に関係しているあらゆるものを意味する。本明細書中で使用される場合は、用語「神経細胞」には、ニューロンと神経膠（星状細胞を含む）が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「単離された神経細胞」は、脳から単離された神経細胞を意味する。
【００９１】
本明細書中で使用される場合は、用語「神経膠」または「神経膠細胞」は、神経系の神経細胞ではない細胞性エレメントである細胞を意味する。用語「神経膠」、「神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｃｙｔｅ）」、および「神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）」は互換的に使用することができる。神経膠細胞としては、上衣細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、または小神経膠細胞を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００９２】
用語「予防すること」は、本明細書中で使用される場合は、疾患状態を発症するリスク、あるいは、疾患の状態もしくは進行、または他の異常な症状もしくは有害な症状に関係しているパラメーターを最小にする、低下させる、または抑制することを意味する。
【００９３】
用語「反応性星状細胞」は、脳において病変または虚血の部位で見られる星状細胞を意味する。用語「未処理の反応性星状細胞」または「ＮＲＡ」は、脳から新しく単離された反応性星状細胞を意味する。用語「新しく単離された」は、本明細書中で使用される場合は、脳から精製されたＮＲＡ、特に、約０時間前から約７２時間前の間に精製されたＮＲＡを意味する。ＮＲＡが「脳から精製された」と言われる場合には、用語「精製された」は、ＮＲＡが他の脳組織および／または移植されたゼラチンもしくはスポンジから単離されていることを意味し、そして細胞のさらなる単離を行うことなく脳から細胞の集団を単に回収するプロセスをいうのではない。本明細書中に記載される場合は、反応性星状細胞の中で見られるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、新しく単離された細胞の中にのみ存在する。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、典型的な正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下では細胞の培養直後に失われる。ＮＲＡは、これが培養物中で増殖させられた星状細胞ではなく、脳の中にインビボで存在するので、反応性星状細胞により類似しているインビトロモデルを提供する。用語「未処理の」および「新しく単離された」は同義的に使用される。
【００９４】
本明細書中で使用される場合は、用語「少なくする（ｒｅｄｕｃｅ）」は、本発明の化合物での処置が行われなかった場合と比較した、細胞死、炎症応答、出血性の転換、血液溢出などの減少を意味する。したがって、当業者は、処置が行われなかった場合、および／または別の方法で介入が行われなかった場合と比較して、本発明の処置が投与された被験体の脊髄損傷に関係している兆候および／または症状の任意のものが小さくなった範囲を決定することができる。
【００９５】
本明細書中で使用される場合は、用語「脳卒中」は、脳循環の機能的障害に関係している任意の急性の臨床的事象を意味する。用語「急性脳虚血」と「脳卒中」は互換的に使用することができる。
【００９６】
用語「処置する」および「処置」は、本明細書中で使用される場合は、被験体が疾患または症状の改善が得られるように、治療有効量の組成物を被験体に投与することを意味する。改善は、任意の観察できるかまたは測定できる改善である。したがって、当業者は、処置によって患者の症状を改善できる場合があるが、疾患の完全な治癒に至らない場合もあることを明確に理解する。処置にはまた、疾患および／または症状を発症するリスクがある被験体を処置することも含まれ得る。
【００９７】
本明細書中で使用される場合は、用語脳または神経組織の「血管原性浮腫」は、脳−血液関門が実質的に完全ではなく、何らかの電解質の移動に加えて、脳の柔組織に巨大分子と水が浸入する組織を生じる浮腫を意味する。
【００９８】
反応性星状細胞はインビボで生じ、Ｐｅｒｉｌｌａｎによって記載された方法システムと同様の方法システムにしたがって脳から回収される。例えば、Ｃｈｅｎら，２００３；Ｃｈｅｎら，２００１を参照のこと。回収された細胞は、その後、単離されるが、培養はされない。むしろ、新しく単離された反応性星状細胞は、脳からのそれらの単離の直後に未処理の状態で研究される。Ｐｅｒｉｌｌａｎら，（１９９９；２０００）に記載されているように、培養された星状細胞は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現しない。
【００９９】
本明細書中に記載される実施例では、成体ラットの脳に由来するＮＲＡが、生理学的濃度の［Ｃａ２＋］ｉでの［ＡＴＰ］ｉの枯渇によって活性化される非選択性陽イオンチャンネルを発現することが明らかにされる。本発明のこのＮＡＣａ−ＡＴＰチャンネル（これは、ＮＲＡの中で新しく同定され、そしてそのような細胞由来の膜パッチの＞９０％に存在している）は、これまでに報告された非選択性カルシウムおよびＡＴＰチャンネルとは、有意に異なる特性を示すことによって識別される。本発明のＮＡＣａ−ＡＴＰチャンネルのこれらの識別特性としては以下が挙げられる：マイクロモル未満の［Ｃａ２＋］によって活性化されること、および様々なアデニンヌクレオチドによる遮断に対して様々な感度を示すこと。ＡＴＰの枯渇による本発明のＮＡＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口によっては、著しい膜の脱分極が引き起こされる。これは、細胞膜のブレブ形成へと進行する。ＡＴＰが枯渇すると、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが開いてＮａ＋の流入が生じ、これによって細胞の膨張が導かれる。このチャンネルは、１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）によって調節される。このチャンネルは、スルホニルウレア（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミド）によって遮断することができる。グリベンクラミドでの処置によっては、化学的なＡＴＰの枯渇によって誘導される腫脹およびブレブ形成および細胞死の有意な減少が生じる。このチャンネルは、細胞の膨張と細胞死に関係している陽イオンの流入に関与している。本発明の方法には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを流れる電流を阻害し、そしてチャンネルの開口に関係しているブレブ形成を阻害するための、スルホニルウレア化合物の使用が含まれる。また、したがって、スルホニルウレア化合物とＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを流れる電流を阻害する他の化合物の使用には、脳と脊髄の細胞の膨張および細胞死に対する、治療上の予防効果を有し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、本発明は治療用組成物とそれを使用する方法に関する。１つの実施形態においては、治療用組成物は、神経細胞、神経膠細胞、または神経内皮細胞の少なくとも１つのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストおよび／またはアンタゴニストである。本発明のさらなる実施形態によっては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する膜調製物を含む組成物が提供される。例えば、膜調製物は神経細胞（例えば、単離された反応性星状細胞（ＮＲＡ）、好ましくは、新しく単離された未処理の反応性星状細胞）に由来する。組成物中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは以下の特性を有する：（ａ）３５ｐＳ型チャンネルである；（ｂ）細胞質Ｃａ２＋によって刺激される；（ｃ）細胞質ＡＴＰが約０．８μＭ未満である場合に開く；そして（ｄ）１価の陽イオンＫ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、およびＮａ＋について透過性であり、１型スルホニルウレア受容体のアンタゴニストによって遮断することができる。
【０１０１】
さらに、本発明の目的は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの１つ以上のアンタゴニストをスクリーニング方法を提供することである。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含む組成物と接触させる工程；および（ｂ）上記チャンネルの活性を阻害する試験化合物を、上記試験化合物の存在下と上記試験化合物が存在しない条件下で上記活性を測定することにより同定する工程。ここでは、上記活性を阻害する試験化合物が、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストとして同定される。例えば、組成物には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する神経細胞の調製物、またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する膜調製物（例えば、単離された未処理の反応性星状細胞（ＮＲＡ）もしくはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する他の細胞に由来する膜調製物）が含まれ得る。このチャンネルに対する化合物の作用としては以下を挙げることができる：（ａ）ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する；（ｂ）ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを閉鎖する；（ｃ）ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口を妨げる；および（ｄ）ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを通過する膜電流の大きさを小さくする。ＮＣＣａ−ＡＴＰアンタゴニストである化合物（ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遮断因子、ＳＵＲ１アンタゴニスト、ＳＵＲ１阻害因子、および／またはこのチャンネルを通過する膜電流の大きさを小さくすることができる化合物を含む）を同定することもまた、本発明の目的である。
【０１０２】
神経細胞の膨張を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含む組成物と接触させる工程；および（ｂ）試験化合物がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルチャンネルを遮断するかどうかを同定する工程。ここでは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する試験化合物が、神経細胞の膨張の阻害のための化合物として同定される。
【０１０３】
脳腫脹を阻害する化合物を同定するための方法を提供することもまた、本発明のさらなる目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含む組成物と接触させる工程；および（ｂ）試験化合物がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルチャンネルを遮断するかどうかを同定する工程。ここでは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する試験化合物が、脳腫脹の阻害のための化合物として同定される。
【０１０４】
脳腫脹を阻害する化合物を同定するための方法を提供することは、本発明のなお別の目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含む組成物と接触させる工程；および（ｂ）試験化合物が神経細胞の膨張を阻害するかどうかを同定する工程。ここでは、神経細胞の膨張を阻害する試験化合物が、脳腫脹の阻害のための化合物として同定される。
【０１０５】
本発明のさらなる目的により、動物において神経細胞の膨張を阻害する化合物を同定するための方法が提供される。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含む組成物と接触させ、そして、試験化合物がこのチャンネルを遮断するかどうかを同定する工程、および（ｂ）脳損傷または脳虚血を有している動物に試験化合物を投与し、そして試験化合物が処置された動物の脳腫脹を阻害するかどうかを決定する工程。ここでは、脳腫脹を阻害する試験化合物が、動物において神経細胞の膨張を阻害する化合物として同定される。
【０１０６】
脳腫脹を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを含む組成物と接触させ、そして、試験化合物がこのチャンネルを遮断するかどうかを同定する工程、および（ｂ）脳損傷または脳虚血を有している動物に試験化合物を投与し、そして試験化合物が処置された動物の脳腫脹を阻害するかどうかを決定する工程。ここでは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する試験化合物が、脳腫脹を阻害する化合物として同定される。
【０１０７】
本発明のこれらの目的のそれぞれにおいて、組成物には好ましくは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する神経細胞の調製物またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する膜調製物（これは好ましくは、単離された未処理の反応性星状細胞（ＮＲＡ）に由来する）が含まれる。１型スルホニルウレア受容体のアンタゴニストである化合物（例えば、スルホニルウレア化合物、ベンズアミド誘導体、またはイミダゾリン誘導体）を使用する上記方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【０１０８】
決定工程に、未処理の反応性星状細胞の膨張を、例えば、細胞の外観の顕微鏡観察（正常、ブレブ形成、膨張）；チャンネル電流の測定；膜電位の測定；アネキシンＶの発現の検出；ヨウ化プロピジウムの発現の検出；インビトロでの結合アッセイ；およびそれらの組み合わせによって検出あるいは同定する工程が含まれる（これらに限定されない）これらの方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【０１０９】
被験体の脳の中の神経細胞の膨張を予防する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。上記方法には、被験体に、有効量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる。
【０１１０】
被験体の神経細胞の膨張が原因である外傷性脳損傷または脳虚血のネガティブな作用を緩和する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法には、被験体に、有効量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる。そのような投与は、脳への直接の投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、胃内投与、および経口投与でありえる。そのような化合物の例としては、１型スルホニルウレア受容体のアンタゴニスト（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミドのようなスルホニルウレア）、ならびに他のインシュリン分泌促進剤（例えば、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、ＭｇＡＤＰ、およびそれらの組み合わせ）が挙げられる。
【０１１１】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を使用する、被験体の脳の中の神経細胞の膨張を防ぐまたは阻害するための処方物を提供することが、本発明のなお別の目的である。ここでは、上記化合物の量は、糖尿病を処置するための処方物の中の前記化合物の量未満である。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を使用する、被験体の脳の中の神経細胞の膨張を防ぐまたは阻害するための処方物を提供することが、本発明のさらなる目的である。ここでは、上記化合物の量は、糖尿病を処置するための処方物の中の前記化合物の量の少なくとも２分の１未満である。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を使用する、被験体の脳の中の神経細胞の膨張を防ぐまたは阻害するための処方物を提供することが、本発明のさらなる目的である。ここでは、上記化合物の量は、糖尿病を処置するための処方物の中の前記化合物の量の少なくとも５分の１未満である。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を使用する、被験体の脳の中の神経細胞の膨張を防ぐまたは阻害するための処方物を提供することが、本発明のなお別の目的である。ここでは、上記化合物の量は、糖尿病を処置するための処方物の中の前記化合物の量の少なくとも１０分の１未満である。
【０１１２】
したがって、神経細胞の膨張を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明の別の目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＫｉｒ２．３チャンネルを含む組成物と接触させる工程、および（ｂ）試験化合物がＫｉｒ２．３チャンネルを開口させるかどうかを決定する工程。ここでは、Ｋｉｒ２．３チャンネルを開口させる試験化合物が、神経細胞の膨張を阻害するための化合物として同定される。
【０１１３】
脳腫脹を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のなお別の目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＫｉｒ２．３チャンネルを含む組成物と接触させる工程、および（ｂ）試験化合物がＫｉｒ２．３チャンネルを開口させるかどうかを決定する工程。ここでは、Ｋｉｒ２．３チャンネルを開口させる試験化合物が、脳腫脹を阻害するための化合物として同定される。
【０１１４】
動物において神経細胞の膨張および／または脳腫脹を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のなお別の目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＫｉｒ２．３チャンネルを含む組成物と接触させる工程、および（ｂ）試験化合物がＫｉｒ２．３チャンネルを開口させるかどうかを決定する工程。ここでは、Ｋｉｒ２．３チャンネルを開口させる試験化合物が、動物において神経細胞の膨張および／または脳腫脹を阻害するための化合物として同定される。
【０１１５】
被験体において脳腫脹を予防する、阻害する、および／または緩和する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＫｉｒ２．３チャンネルを含む組成物と接触させ、そして、試験化合物がＫｉｒ２．３チャンネルを開口させるかどうかを決定する工程、および（ｂ）脳損傷または脳虚血を有している被験体に試験化合物を投与し、そして試験化合物が被験体において脳腫脹を予防する、阻害する、および／または緩和するかどうかを決定する工程。ここでは、Ｋｉｒ２．３チャンネルを開口させる試験化合物が、脳腫脹を阻害するための化合物として同定される。
【０１１６】
動物において神経細胞の膨張を阻害する化合物を同定するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法には以下の工程が含まれる：（ａ）試験化合物をＫｉｒ２．３チャンネルを含む組成物と接触させ、そして、試験化合物がＫｉｒ２．３チャンネルを開口させるかどうかを決定する工程、および（ｂ）脳損傷または脳虚血を有している動物に試験化合物を投与し、そして試験化合物が処置された動物において脳腫脹を阻害するかどうかを決定する工程。ここでは、脳腫脹を阻害する試験化合物が、動物において神経細胞の膨張を阻害する化合物として同定される。
【０１１７】
被験体において脳の中の神経細胞の膨張を防ぐ方法を提供することもまた、本発明の１つの目的である。上記方法には、被験体に、有効量のＫｉｒ２．３チャンネルを開口させる化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる。
【０１１８】
被験体の神経細胞の膨張が原因である外傷性脳損傷または脳虚血のネガティブな作用を緩和する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法には、被験体に、有効量のＫｉｒ２．３チャンネルを開口させる化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を投与する工程が含まれる。Ｋｉｒ２．３チャンネルに対する化合物の作用を評価する方法を提供する本発明の目的においては、好ましい化合物は、Ｔｅｎｉｄａｐ（５−クロロ−２，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシ−２−チエニルメチレン）−２−オキソ−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミド）である。例えば、処方物は、約１０ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日の１日量のＴｅｎｉｄａｐを提供することができ、また、脳に直接投与される場合には、Ｔｅｎｉｄａｐの１日量は、約５００ｍｇ／日から１．５ｇｍｓ／日、またはそれ以上である。
【０１１９】
ＩＶ．本発明の例示的な実施形態
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの一部としてＲ１星状細胞の中で発現されるスルホニルウレア受容体１（ＳＵＲ１）に加えて、本発明にはさらに、このチャンネルのＳＵＲ１調節サブユニットが、虚血後にニューロンおよび毛細血管内皮細胞の中でアップレギュレートされること、およびこの受容体の遮断によって、脳卒中の大きさ、脳水種が小さくなり、そして致死率が下がることが記載される。したがって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストは、細胞傷害性浮腫およびイオン性浮腫の形成を予防する、緩和する、阻害する、および／または撤回させることにおいて重要な役割を有している可能性がある。
【０１２０】
他の実施形態においては、本発明の治療用化合物には、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストが含まれる。アンタゴニストは、中枢神経系の頭蓋内圧の上昇および／または細胞傷害性浮腫を生じる、低酸素症および／または虚血を付随する有害な症状の処置における使用が想定される。そのような症状としては、外傷性虚血性脳損傷、すなわち、二次的な神経損傷、および出血性の梗塞が挙げられる。アンタゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する細胞を防御し、これはグリア被膜の完全性が重要である臨床的処置に望ましく、そして感染の拡大（例えば、脳膿瘍を伴う）を予防するために維持されなければならない。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの阻害による防御には、脳水腫の軽減が伴う。
【０１２１】
１つの態様においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが遮断されるか阻害されるか、あるいは別の方法で活性が低下させられる。そのような例においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストが投与され、そして／または塗布される。アンタゴニストはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを調節し、その結果、このチャンネルを通過する流れが少なくなる、廃止される、減少する、および／または停止する。アンタゴニストは、神経細胞、神経膠細胞、内皮細胞、またはそれらの組み合わせのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性に関して、可逆的活性を有する場合も、また不可逆的活性を有する場合もある。アンタゴニストは、細胞の脱分極を妨げるかまたは弱くし得、それによって細胞の脱分極によって生じる可能性がある浸透圧の変化が原因である細胞の膨張を弱める。したがって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの阻害によって内皮細胞の細胞傷害性の浮腫および死を減少させることができる。
【０１２２】
本発明の治療用組成物を用いて処置することができる被験体としては、中枢神経系（ＣＮＳ）の頭蓋内圧の上昇および／または細胞傷害性浮腫を生じる、低酸素症および／または虚血を付随する症状に罹患しているか、あるいは、そのような症状を発症するリスクがある被験体が挙げられるがこれらに限定されない。そのような症状としては、外傷（例えば、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または外傷性脊髄損傷（ＳＣＩ）、脳震盪）、虚血性脳損傷、出血性の梗塞、脳卒中、心房性細動、凝固障害、肺動脈塞栓、動脈−静脈奇形、腫瘤性病変（例えば、血腫）などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような症状を発症するリスクがあるなおさらなる被験体としては、脳卒中のリスクを高める処置（例えば、外科手術（血管の手術または神経の手術）、血栓溶解剤を用いる心筋梗塞の処置、脳／血管内の処置、ステント留置術、血管造影法など）を受けている被験体を挙げることができる。
【０１２３】
虚血、脳の外傷、または他の脳損傷の処置のための本発明の別の態様には、有効量のＳＵＲ１アンタゴニストの投与とグルコースの投与が含まれる。グルコースの投与は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニスト（例えば、ＳＵＲ１アンタゴニスト）での処置と同時に行われる場合も、また、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストでの処置に続いて（例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストでの処置の１５分後に、またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストでの処置の０．５時間後に、またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストでの処置の１時間後に、またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストでの処置の２時間後に、またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストでの処置の３時間後に）行われる場合もある。グルコースの投与は、静脈内または腹腔内に行われる場合も、また、任意の適切な投与経路および手段によって行われる場合もある。さらなるグルコースによって、別の方法で可能であるよりも高用量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの投与が可能となる。その結果、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストと組み合わせられたグルコースはより大きな防御を提供し、そしてＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストだけを用いた場合よりも後の時点での処置が可能となり得る。より多量のグルコースは、より高用量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストが投与される場合に投与される。
【０１２４】
本発明の別の態様には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの血栓溶解剤との同時投与が含まれる。これらの２つの化合物の同時投与によっては、出血性の転換が少なくなることにより血栓溶解剤の治療域が長くなる。血栓溶解剤についての治療域は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの同時投与によって、数時間（４〜８）時間長くなり得る。血栓溶解剤に加えて、他の薬剤（例えば、抗血小板物質、抗凝固剤、血管拡張剤、スタチン、利尿剤などであるがこれらに限定されない）を本発明のアンタゴニストと組み合わせて使用することができる。
【０１２５】
本発明の別の態様には、脳卒中、脳水腫の病期を診断する、決定する、またはモニターする、あるいは、腫瘍および／または脳卒中の大きさ／境界／縁を視覚化するための、標識されたＳＵＲ１アンタゴニストの使用が含まれる。例えば、脳卒中後の周辺部は、標識されたＳＵＲ１アンタゴニストを使用してモニターするか、または視覚化することができる。
【０１２６】
さらに、本発明の組成物は、細胞傷害性の脳水腫に付随する症状のリスクがあるかまたはそれに罹患している被験体を処置するために使用される、神経防御作用のあるキットを生産するために使用することができる。
【０１２７】
Ｖ．本発明の例示的な方法
本発明により、細胞の膨張および脳腫脹において役割を担っている、哺乳動物の神経細胞中で見られるこれまでは知られていなかったイオンチャンネルが提供される。本発明によりさらに、このチャンネルのアンタゴニストをスクリーニングする方法、および哺乳動物の脳腫脹の処置としてのこのチャンネルのアンタゴニスト（スルホニルウレア化合物（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミド）を含む）の新規の使用が提供される。
【０１２８】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと相互作用する（例えば、結合する、開口させる、遮断する）化合物を同定するための本発明の方法では、（ｉ）細胞をベースとするアッセイ、および／または（ｉｉ）細胞をベースとしないアッセイシステムが使用される。そのような化合物は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用し得る。本発明の好ましい実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの透過性を遮断するおよび／または阻害するアンタゴニストが、神経細胞の膨張および／または脳腫脹を処置するための方法において利用される。
【０１２９】
細胞をベースとするアッセイでは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル（好ましくは、機能性のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル）を発現する神経細胞が使用される。好ましい細胞はＮＲＡである。細胞をベースとしないアッセイシステムには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル（好ましくは、機能性のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル）を発現する膜調製物が含まれる。細胞をベースとするアッセイとしては、化合物の結合アッセイ、細胞の状態の顕微鏡観察（正常、ブレブ形成、膨張、細胞死）、および化合物に曝される前と後の両方のチャンネル電流を測定することが挙げられるがこれらに限定されない。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する膜調製物が含まれている組成物は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルもしくはＳＵＲ１と相互作用する、それに結合する、それを遮断する、またはそれを開口させる化合物を同定するために使用され得る。用語「ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現している」または「ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する」は、機能性のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを有していることを意味する。用語「機能性のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル」は、本明細書中で使用される場合は、検出することができるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを意味する。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを検出する１つの好ましい方法は、チャンネルが開いている、閉じている、および／または遮断されているかどうかを、インビトロまたはインビボで決定することによる。
【０１３０】
例えば、膜調製物を使用する典型的な実験においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現するＮＲＡは、膜調製物を生産するために使用される。全細胞および組織全体から膜を得るための方法は当該分野で周知である。１つのそのような方法によっては、不連続なスクロース勾配遠心分離により、破壊された細胞または組織試料から単離された精製されたミクロソーム画分の形態で精製された細胞膜が生産される。細胞が付着したパッチ、インサイドアウトパッチ、またはアウトサイドアウトパッチからなる膜もまた含まれる。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する組織試料の一例は、脳損傷に隣接している脳組織である。
【０１３１】
膜調製物は多数のアッセイにおいて使用され、これには、化合物への曝露の前および後の両方でのチャンネル電流の測定；ならびに、インビトロでの結合アッセイが含まれるがこれらに限定されない。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの状態を決定し、定量するためのそのようなアッセイについての実験条件は、本明細書を通じて記載され、これには、結合アッセイ条件、浴組成物、ピペット溶液、必要なＡＴＰおよびＣａ２＋の濃度、膜電圧、膜電位、化合物の量の範囲、対照物などが含まれる。
【０１３２】
結合アッセイおよび競合結合アッセイでは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの標識されたリガンドまたはアンタゴニストが使用される。１つのそのような実験においては、標識されたグリベンクラミド（例えば、ＦＩＴＣ結合グリベンクラミドまたはＢＯＤＩＰＹ結合グリベンクラミドまたは放射性同位元素で標識されたグリベンクラミド）が膜に結合させられ、特異的活性についてアッセイされる。特異的結合は、過剰の未標識のアンタゴニストの存在下で行われた結合アッセイとの比較によって決定される。
【０１３３】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの遮断因子を同定するための１つの方法においては、膜は、試験化合物の存在下または試験化合物が存在しない条件下のいずれかで、このチャンネルを遮断することが示されている標識された化合物とともにインキュベートされる。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断し、膜への結合について標識された化合物と競合する化合物は、媒体対照試料と比較すると、低いシグナルを有するであろう。本発明の別の態様においては、スクリーニングは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと公知の（本明細書中で先に特定された）ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルアンタゴニストまたはＳＵＲ１アンタゴニスト（例えば、グリベンクラミド）との間での相互作用と競合する化合物を同定するように設計され得る。そのようなスクリーニングにおいては、公知のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルアンタゴニストまたはＳＵＲ１アンタゴニストは標識され、そしてその後、試験化合物は、標識されたアンタゴニストの結合と競合するかまたはその結合をアンタゴナイズするそれらの能力についてアッセイされる。
【０１３４】
本明細書中に記載されるアッセイは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性を調節するまたはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性に影響を与える化合物を同定するために使用することができる。例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性に影響を与える化合物としては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルまたはＳＵＲ１に結合する化合物、同定された遮断因子またはリガンド（例えば、グリベンクラミド）の結合を阻害する化合物、およびこのチャンネルを開口／活性化させる（アゴニスト）かまたはこのチャンネルを遮断／阻害する（アンタゴニスト）かのいずれかである化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
記載されるアッセイによってはまた、神経細胞の膨張を調節する化合物（例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対するリガンドの結合またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの遮断によって活性化される神経細胞の膨張に関係している他の事象に影響を与える化合物）を同定することもできる。
【０１３６】
ＶＩ．本発明にしたがってスクリーニングされた化合物
本発明にしたがってスクリーニングされる化合物としては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに結合して、このチャンネルを開口させる（すなわち、アゴニスト）かまたはこのチャンネルを遮断する（すなわち、アンタゴニスト）かのいずれかである、有機化合物、ペプチド、抗体およびその断片、ペプチド模倣物が挙げられるがこれらに限定されない。神経細胞の膨張または脳腫脹の処置での使用については、このチャンネルを遮断する化合物が好ましい。このチャンネルを開口させるかまたは開口した状態で維持するアゴニストとしては、ペプチド、抗体またはその断片、およびＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのＳＵＲ１サブユニット（またはその一部）を含み、そしてＳＵＲ１の循環しているリガンドに結合してこれを「中和する」他の有機化合物が挙げられる。
【０１３７】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに影響を与える化合物のスクリーニングに関して、公知の化合物のライブラリーを、阻害因子または活性化因子である化合物についてスクリーニングすることができる。これには、天然の産物または合成の化学物質、および生物学的活性のある物質（タンパク質を含む）が含まれる。好ましくは、そのような化合物は、ＮＣＣａ−ＡＴＰアンタゴニストであり、これには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遮断因子、ＳＵＲ１アンタゴニスト、ＳＵＲ１阻害因子、および／またはチャンネルを通過する膜電流の大きさを小さくすることができる化合物が含まれる。
【０１３８】
化合物としては、有機低分子または無機低分子、化合物のライブラリーにおいて利用できる化合物、ペプチド（例えば、可溶性ペプチド）を挙げることができるがこれらに限定されない。これには、ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照のこと）、ならびに、Ｄ−および／またはＬ−立体構造のアミノ酸から構成されている組み合わせの化学的に誘導された分子ライブラリー、ホスホペプチド（ランダムライブラリー、または部分的縮合のライブラリー、特異的なホスホペプチドのライブラリーのメンバーが含まれるがこれらに限定されない；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら，１９９３、Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照のこと）、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体、ならびに、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂ発現ライブラリーの断片およびそれらのエピトープ結合断片が含まれるがこれに限定されない）が含まれるがこれに限定されない。
【０１３９】
本発明にしたがってスクリーニングすることができる他の化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：血液−脳関門を通過することができるか有機低分子または通過することができない有機低分子、適切な神経細胞の侵入することができる有機低分子または侵入することができない有機低分子、ならびに、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遺伝子またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性に関係しているいくつかの他の遺伝子の発現に（例えば、遺伝子発現に関係している調節領域または転写因子との相互作用により）影響を与えることができる有機低分子または影響を与えることができない有機低分子；あるいは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性に関与しているいくつかの他の細胞内因子の活性に影響を与えるそのような化合物。
【０１４０】
コンピューターによるモデル化および検索技術によっては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性またはその発現を調節することができる化合物の同定、またはすでに同定された化合物の改良が可能である。そのような化合物または組成物が同定されると、活性部位または領域が同定される。そのような活性部位は、通常、リガンド結合部位であり得る。活性部位は、例えば、関連化合物の複合体または他のリガンドを含む組成物の研究による方法、ペプチドのアミノ酸配列からの方法、または核酸のヌクレオチド配列からの方法を含む、当該分野で公知の方法を使用して同定することができる。化学的方法またはＸ線結晶解析方法を、活性部位を見出すために関連化合物の複合体を試験するために使用することができる。活性部位の３次元幾何学構造が決定される。これは、完全な分子構造を決定することができる公知の方法（Ｘ線血漿解析を含む）によって行うことができる。一方、固相ＮＭＲまたは液相ＮＭＲを、特定の分子内距離を決定するために使用することができる。構造の決定のための任意の他の実験方法を、部分的または完全な幾何学的構造を得るために使用することができる。幾何学的構造は、決定された活性部位の構造の正確さを高めることができる天然の複合体を形成したリガンドを用いて測定することができる。
【０１４１】
不完全なまたは不十分な精度の構造が決定される場合には、コンピューターによる数的モデル化の方法を使用して、その構造を完全にするか、またはその精度を高めることができる、任意の認識されているモデル化方法を使用することができる。これには、以下が含まれる：特定の生体高分子（例えば、タンパク質または核酸）に特異的なパラメーター化されたモデル、分子運動のコンピューターでの計算に基づく分子力学モデル、熱アンサンブルに基づく統計力学的モデル、または組み合わせモデル。ほとんどのタイプのモデルについては、構成要素である原子と基との間の力を示す標準的な分子力場が必要であり、物理化学において公知の力場から選択することができる。不完全な、または精度の低い実験構造は、これらのモデル化方法によってコンピューターで計算された完全なより精度の高い構造の拘束となってしまう可能性がある。
【０１４２】
最後に、活性部位の構造が実験によって、モデル化によって、またはそれらの組み合わせによって決定されると、候補の調節化合物を、それらの分子構造についての情報を用いて、複数の化合物が含まれているデータベースを検索することによって同定することができる。そのような検索によっては、決定された活性部位の構造と適合する構造を有している化合物、および活性部位を定義する基と相互作用する構造を有している化合物が探される。そのような検索は手作業で行うことができるが、好ましくは、コンピューターを使用して行われる。この検索によって見出されるこれらの化合物は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを調節する、好ましくは、化合物を遮断する可能性がある。
【０１４３】
あるいは、これらの方法は、すでに知られているモデル化された化合物またはリガンドから、改良されたモデル化された化合物を同定するために使用することができる。公知の化合物の組成は改良することができ、そして改良による構造上の効果は、新規の組成物に適用される上記に記載された実験方法とコンピューターによるモデル化方法を使用して決定することができる。その後、変更された構造は、適合または相互作用の改善が生じたかどうかを決定するために、化合物の活性部位の構造と比較される。この様式で、例えば、側鎖基を変化させることによる組成物の合成によるバリエーションを迅速に評価して、特異性もしくは活性が改善された改良されたモデル化された化合物またはリガンドを得ることができる。
【０１４４】
分子モデル化のシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギーの最小化と分子力学的機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックによるモデル化と分析を行う。ＱＵＡＮＴＡによっては、複数の分子の互いの作用の構築、修飾、視覚化、および分析が可能である。多数の論文に特異的なタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターによるモデル化：例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら（１９８８，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７：１５９−１６６）；Ｒｉｐｋａ（１９８８  Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７）；ＭｃＫｉｎａｌｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｍａｎｎ（１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９：１１１−１２２）；Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．１８９−１９３  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９；Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．ＳＯＣ．Ｌｏｎｄ．２３６：１２５−１４０および１４１−１６２）；ならびに、核酸成分についてのモデル受容体に関して（Ａｓｋｅｗら，（１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ＳＯＣ．１１１：１０８２−１０９０））がまとめられている。化合物をスクリーニングし、そしてグラフィックで示す他のコンピュータープログラムは、企業（例えば、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ））から入手することができる。これらは主に、特定のタンパク質に特異的な薬物への適用のために設計されるが、これらは、一旦その領域が同定されると、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異的な薬物を設計するために適応させることができる。
【０１４５】
本明細書中に記載されたようなアッセイによって同定された化合物は、例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの生物学的機能を詳しく調べることにおいて、および脳腫脹の緩和に有用であり得る。
【０１４６】
細胞のスクリーニングにおいて同定された化合物の効力を試験するためのアッセイは、脳または脊髄の腫脹についての動物モデルシステムにおいて試験することができる。そのような動物モデルは、脳または脊髄の腫脹の処置に有効である可能性がある薬物、医薬品、治療薬、および介入の同定のための試験物質として使用することができる。例えば、脳腫脹（例えば、脳損傷）の動物モデルは、脳腫脹を阻害する能力を示すと推測される化合物に対して、曝される動物においてそのような脳腫脹の阻害を誘発するために十分な濃度で、そして十分な時間の間、曝され得る。曝露に対する動物の応答は、視覚的手段（例えば、放射性物質、ＣＡＴ、ＭＲＩ）、頭蓋内圧の測定、および／または脳腫脹に付随する症状の反転を使用してモニターすることができる。介入に関しては、脳腫脹に付随する症状の任意の態様を反転させる任意の処置が、脳腫脹についての治療的介入の候補と考えられるべきである。試験物質の投与量は、本明細書中で議論されるように、用量応答曲線を導くことによって決定され得る。
【０１４７】
したがって、本発明は、神経細胞の膨張および死、ならびに脳腫脹の処置または緩和、特に、外傷性損傷、脊髄損傷、中枢神経系もしくは末梢神経系の損傷、脳虚血（例えば、脳卒中）、あるいは、浮腫、損傷または外傷が関係しているおよび／または原因である合併症に関係している脳損傷において有用である。本明細書中に記載される有効量の活性のある化合物または物質の投与を含む本発明の方法によってその症状を軽減することができるそのような損傷または合併症は、明らかな脳の損傷または異常を特徴とし得る。本発明の特異的な実施形態にしたがうと、有効量の活性のある化合物の投与によって、それが開いたままであれば神経細胞の膨張と細胞死に至ってしまうチャンネルを遮断することができる。ＳＵＲ１の様々なアンタゴニストがこのチャンネルを遮断するために適している。適切なＳＵＲ１アンタゴニストの例としては、グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、ＭｇＡＤＰ、およびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の好ましい実施形態においては、ＳＵＲ１アンタゴニストは、グリベンクラミドおよびトルブタミドからなる群より選択される。神経細胞を分極した状態に維持する方法、および強い脱分極を防ぐ方法を含む（しかし、これらに限定されない）、神経細胞の膨張および細胞死を予防するためのなお他の治療「ストラテジー」を採用することができる。
【０１４８】
Ａ．ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子
本発明には、チャンネルの調節因子、例えば、チャンネルの１つ以上のアゴニストおよび／または１つ以上のアンタゴニストが含まれる。本発明のアンタゴニストまたはアゴニストの例には、米国特許出願公開番号２００３０２１５８８９（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）において同定されたそれぞれのアンタゴニストおよび／またはアゴニストが含まれ得る。当業者は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが少なくとも２つのサブユニット：調節サブユニットＳＵＲ１と孔を形成するサブユニットから構成されていることを知っている。
【０１４９】
Ｂ．ＳＵＲ１の調節因子
特定の実施形態においては、スルホニルウレア受容体−１（ＳＵＲ１）のアンタゴニストが、このチャンネルの遮断に適している。適切なＳＵＲ１アンタゴニストの例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストロゲン関連化合物、エストロゲン関連化合物（エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステイン、非ステロイド系エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、フィトエストロゲン（例えば、クメステロール）、ゼアラレノンなど）、ならびにそれらの組み合わせ。本発明の好ましい実施形態においては、ＳＵＲ１アンタゴニストは、グリベンクラミドおよびトルブタミドからなる群より選択される。さらに、別のアンタゴニストはＭｇＡＤＰであり得る。他のアンタゴニストとしては、ＫＡＴＰチャンネルの遮断因子（例えば、トルブタミド、グリブライド（１［ｐ−２［５−クロロ−Ｏ−アニサミド）エチル］フェニル］スルホニル」−３−シクロヘキシル−３−ウレア）；クロロプロパミド（１−［［（ｐ−クロロフェニル）スルホニル］−３−プロピルウレア；グリピジド（１−シクロヘキシル−３［［ｐ−［２（５−メチルピラジンカルボキサミド）エチル］フェニル］スルホニル］ウレア）；またはトラザミド（ベンゼンスルホンアミド−Ｎ−［［（ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１イル）アミノ］カルボニル］−４−メチル）であるがこれらに限定されない］が挙げられる。
【０１５０】
本発明において使用することができるアゴニストとしては、ＳＵＲ１の１つ以上のアゴニスト（例えば、ジアゾキシド、ピナシジル、Ｐ１０７５、クロマカリン、またはＫＡＴＰチャンネルの活性化因子が挙げられるがこれらに限定されない。他のアゴニストとしては、例えば、以下を挙げることができるがこれらに限定されない：ジアゾキシド誘導体、例えば、３−イソプロピルアミノ−７−メトキシ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキサイド（ＮＮＣ５５−９２１６）、６，７−ジクロロ−３−イソプロピルアミノ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ１５４）、７−クロロ−３−イソプロピルアミノ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ７３）、６−クロロ−３−イソプロピルアミノ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＮＮＣ５５−０１１８）４，６−クロロ−３−（１−メチルシクロプロピル）アミノ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＮＮ４１４）、３−（３−メチル−２−ブチルアミノ）−４Ｈ−ピリド［４，３−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ４４）、３−（１’，２’，２’−トリメチルプロピル）アミノ−４Ｈ−ピリド（４，３−ｅ）−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ６２）、３−（１’，２’，２’−トリメチルプロピル）アミノ−４Ｈ−ピリド（２，３−ｅ）−１，２，４−チアジアジン，１，１−ジオキサイド（ＢＰＤＺ７９）、２−アルキル−３−アルキルアミノ−２Ｈ−ベンゾ−および２−アルキル−３−アルキルアミノ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド、６−クロロ−３−アルキルアミノ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド誘導体、４−Ｎ−置換および−非置換３−アルキル−および３−（アルキルアミノ）−４Ｈ−ピリド［４，３−ｅ］−１，２，４−チアジアジン１，１−ジオキサイド。加えて、６−クロロ−２メチルキノリン−４（１Ｈ）−オン（ＨＥＩ７１３）およびＬＮ５３３０２１を含む他の化合物、さらには、複数の薬物のクラス、アリールシアノグアニジンが、ＳＵＲ１について知られている活性化因子またはアゴニストである。
【０１５１】
Ｃ．ＳＵＲ１の転写および／または翻訳の調節因子
特定の実施形態においては、調節因子には、ＳＵＲ１（調節サブユニット）の転写および／または翻訳を調節する化合物（タンパク質、核酸、ｓｉＲＮＡなど）、ならびに／あるいは孔を形成するサブユニットを含む分子成分が含まれ得る。
【０１５２】
Ｄ．転写因子
転写因子は、特異的なＤＮＡ配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）に結合し、ＤＮＡのコード領域の転写を調節する調節タンパク質である。したがって、転写因子は、ＳＵＲ１の発現を調節するために使用することができる。通常、転写因子には、ＤＮＡに結合する結合ドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン）と転写を制御する調節ドメインが含まれる。調節ドメインが転写を活性化する場合には、この調節ドメインは活性化ドメインと呼ばれる。調節ドメインが転写を阻害する場合には、この調節ドメインは抑制ドメインと呼ばれる。さらに具体的には、Ｓｐ１、ＨＩＦ１α、およびＮＦκＢのような転写因子を使用して、ＳＵＲ１の発現を調節することができる。
【０１５３】
本発明の特定の実施形態においては、転写因子は本発明の組成物によって標的化され得る。転写因子は、ＳＵＲ１が関与している経路に関係しているものであり得る。転写因子は、本発明のアンタゴニスト（転写因子をダウンレギュレートするｓｉＲＮＡを含む）で標的化され得る。そのようなアンタゴニストは、当該分野で標準的である方法によって同定することができ、特定の実施形態においては、アンタゴニストは、それが必要な個体の処置および予防のために使用される。さらなる実施形態においては、アンタゴニストは、さらなる化合物（例えば、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを調節する組成物）と組み合わせて使用される。例えば、アンタゴニストは、本発明のチャンネルの阻害因子と組み合わせて使用され得る。組み合わせて使用される場合には、ＳＵＲ１が関係している経路の転写因子のアンタゴニストが、さらなる化合物の前に、さらなる化合物の途中で、および／またはさらなる化合物に続いて投与され得る。
【０１５４】
Ｅ．アンチセンスおよびリボザイム
転写もしくは翻訳開始部位、またはスプライシングの接合部位に結合するアンチセンス分子が理想的な阻害因子である。アンチセンス、リボザイム、および二本鎖のＲＮＡ分子は、特定の配列を標的として、特定のポリペプチド（例えば、ＳＵＲ１）の減少または排除を行う。したがって、アンチセンス、リボザイム、および二本鎖のＲＮＡ、ならびにＲＮＡ干渉分子が構築され、ＳＵＲ１の発現を調節するために使用されることが想定される。
【０１５５】
Ｆ．アンチセンス分子
アンチセンス方法論では、核酸には相補性配列と対合する傾向があるという事実が利用される。相補性によっては、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリック相補性規則にしたがって塩基を対合させることができるものであることが意味される。すなわち、より大きなプリンがより小さいピリミジンと塩基対合して、シトシンと対合したグアニンの組み合わせ（Ｇ：Ｃ）と、ＤＮＡの場合にはチミンと対合したアデニンとチミン（Ａ：Ｔ）またはＲＮＡの場合にはウラシルと対合したアデニン（Ａ：Ｕ）のいずれかが形成される。イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチン、およびハイブリダイズしている配列の中の他の塩基のような、あまり一般的ではない塩基が含まれていても、対合は妨害されない。
【０１５６】
ポリヌクレオチドで二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを標的化することによっては、三重ヘリックスの形成が生じる。標的化ＲＮＡは二重ヘリックスの形成を生じるであろう。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に導入されると、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合して、転写、ＲＮＡのプロセシング、輸送、翻訳、および／または安定性を妨害する。アンチセンスＲＮＡ構築物またはそのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、宿主細胞の中で、インビトロまたはインビボ（例えば、ヒト被験体を含む宿主動物の中）のいずれにおいても、遺伝子の転写あるいは翻訳を阻害するために使用される。
【０１５７】
アンチセンス構築物は、プロモーター、および他の制御領域、エキソン、イントロン、あるいはさらには遺伝子のエキソン−イントロンの境界に結合するように設計される。最も有効なアンチセンス構築物に、イントロン／エキソンスプライシングの接合部分に相補的な領域が含まれる可能性があることが想定される。したがって、イントロン−エキソンスプライシングの接合部分の５０〜２００塩基の中の複数の領域に対して相補性を有しているアンチセンス構築物が使用される。いくつかのエキソン配列を、その標的選択性に大きな影響を与えることなく構築物の中に含めることができることが観察されている。含まれるエキソン材料の量は、使用される特定のエキソンとイントロン配列に応じて様々なであろう。当業者は、正常な細胞機能に影響があるかどうか、または相補性配列を有している関連する遺伝子の発現に影響があるかどうかを決定するために、インビトロで構築物を試験することによって簡単に、含まれているエキソンＤＮＡが多すぎるかどうかを容易に試験することができる。
【０１５８】
特異的な構築物を作成するために、ゲノムＤＮＡの複数の部分をｃＤＮＡまたは合成配列と組み合わせることが有利である。例えば、イントロンが最終的な構築物の中に存在することが所望される場合には、ゲノムクローンが使用されることが必要であろう。ｃＤＮＡまたは合成されたポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分についてより便利な制限部位を提供することができ、したがって、配列の休止のために使用されるであろう。
【０１５９】
Ｇ．ＲＮＡ干渉
二本鎖ＤＮＡが干渉分子として使用されること（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））もまた、本発明において想定される。ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＤＮＡ分子を目的の生物体に、単純に注射すること、浴びさせること、または摂取させることによって、目的の特定の遺伝子を「ノックダウン」させるかまたは阻害するために使用される。この技術は、トランスフェクションまたは組み換え技術を必要とすることなく遺伝子機能を選択的に「ノックダウン」させる（Ｇｉｅｔ，２００１；Ｈａｍｍｏｎｄ，２００１；Ｓｔｅｉｎ  Ｐら，２００２；Ｓｖｏｂｏｄａ  Ｐら，２００１；Ｓｖｏｂｏｄａ  Ｐら，２０００）。
【０１６０】
別のタイプのＲＮＡｉは、多くの場合に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。これもまたＳＵＲ１を阻害するために使用することができる。ｓｉＲＮＡには、二本鎖構造または一本鎖構造が含まれ得、その配列は標的遺伝子の少なくとも一部と「実質的に同一」である（ＷＯ０４／０４６３２０（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。「同一性」は、当該分野で公知であるように、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリヌクレオチド（またはポリペプチド）配列の間での関係である。当該分野では、同一性はまた、そのような配列の間でのヌクレオチドの順序の一致によって決定される、複数のポリヌクレオチド配列の間の配列の関係性の程度も意味する。同一性は容易に計算することができる。例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅａ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、ならびに、引用により本明細書中に具体的に組み入れられるＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／６８８３６、ＷＯ００／４４９１４、およびＷＯ０１／３６６４６に開示されている方法を参照のこと。２つのヌクレオチド配列の間での同一性を測定するための多数の方法が存在しているのと同時に、この用語は当該分野で周知である。同一性を決定するための方法は、通常、最大程度のヌクレオチド配列の適合を生じるように設計され、そしてまた、通常は、コンピュータープログラムにおいて具体化される。そのようなプログラムは、関連する分野の当業者であれば容易に利用できる。例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら，）、およびＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓら，１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４）。
【０１６１】
したがって、ｓｉＲＮＡには、標的遺伝子（例えば、ＳＵＲ１）、またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに関係している任意の他の分子部分（例えば、孔を形成するサブユニット）の少なくとも一部に原則として同一であるヌクレオチド配列が含まれる。当業者は、ＳＵＲ１の核酸配列をＧｅｎＢａｎｋにおいて、例えば、ＧｅｎＢａｎｌ登録番号Ｌ４０６２４（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）として容易に入手できることを認識している。好ましくは、ｓｉＲＮＡには、標的遺伝子の少なくとも一部の完全に同一であるヌクレオチド配列が含まれる。もちろん、ＲＮＡ配列をＤＮＡ配列と比較する場合には、「同一である」ＲＮＡ配列には、ＤＮＡ配列にデオキシリボヌクレオチドが含まれている場合にはリボヌクレオチドが含まれるであろうし、さらに、ＲＮＡ配列には通常、ＤＮＡ配列にチミジンが含まれている複数の位置にウラシルが含まれるであろう。
【０１６２】
当業者は、より長い断片の長さ全体にわたって異なる長さの２つのポリヌクレオチドを比較できることを理解するであろう。あるいは、小さい領域が比較される場合もある。通常、同じ長さの配列が、本発明の実施におけるそれらの有用性についての最終的な判断のために比較される。ｓｉＲＮＡとして使用されるｄｓＲＮＡと、標的遺伝子（例えば、ＳＵＲ１）の少なくとも１５個の連続しているヌクレオチドとの間に１００％の配列同一性が存在することが好ましいが、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、あるいはそれ以上を有しているｄｓＲＮＡもまた本発明において使用される場合がある。標的遺伝子の少なくとも一部に対して本質的には同一であるｓｉＲＮＡもまたｄｓＲＮＡであり得、この場合、２つの相補鎖のうちの一方（または、自己相補ＲＮＡの場合には、２つの自己相補性領域のうちの一方）が、その部分または標的遺伝子の配列と同一であるか、あるいは、標的遺伝子のその部分のヌクレオチド配列と比較して挿入、欠失、もしくは単一の点変異を１つ以上含むかのいずれかである。したがって、ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子の変異、株による多形、または進化による多様化の結果であると予想され得る配列のバリエーションを寛容化することができる特性を有している。
【０１６３】
ｓｉＲＮＡを調製するためには、化学合成、インビトロでの転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、およびＰＣＲ発現カセットのようないくつかの方法がある。使用される方法とは無関係に、ｓｉＲＮＡ分子の設計における最初の工程は、標的遺伝子の中の任意の部位であり得るｓｉＲＮＡ標的部位を選択することである。特定の実施形態においては、当業者は、遺伝子の標的選択領域を手作業によって選択する場合がある。これは、標的選択領域としてのＰＲＦ（オープンリーディングフレーム）である場合も、また、好ましくは、「ＡＴＧ」開始コドンの下流にある５０〜１００個のヌクレオチドでもある場合もある。しかし、ｓｉＲＮＡ分子の設計を助けるために利用することができるプログラムのいくつか（例えば、ＰｒｏｍｅｇａによるｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．によるｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、Ｉｍｇｅｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．によるｓｉＲＮＡ  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ、ＥＭＢＯＳＳ  ｓｉＲＮＡアルゴリズム、ＱｉａｇｅｎによるｓｉＲＮＡプログラム、Ａｍｂｉｏｎ  ｓｉＲＮＡ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ、Ａｍｂｉｏｎ  ｓｉＲＮＡ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｓｉＲＮＡ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、およびＳｆｏｌｄ））を容易に利用することができる。したがって、上記プログラムのうちの任意のものを利用して、本発明において使用することができるｓｉＲＮＡ分子を得ることができると想定される。
【０１６４】
Ｈ．リボザイム
リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有している特異的触媒ドメインを含む（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，１９８７；Ｆｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｓ，１９８７）。例えば、多数のリボザイムは、高い特異性でホスホエステルトランスファー反応を加速させ、多くの場合には、オリゴヌクレオチド基質の中のいくつかのホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら，１９８１；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ  ａｎｄ  Ｓｈｕｂ，１９９２）。この特異性は、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に対して、特異的な塩基対合相互作用によって基質が結合することの必要性の結果である。
【０１６５】
リボザイムによる触媒は、主に、核酸が関与している配列特異的切断／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ，１９８９；Ｃｅｃｈら，１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号には、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも大きな配列特異性、およびＤＮＡ制限酵素の接近配列特異性よりも大きな接近配列特異性でエンドヌクレアーゼとして作用できることが報告されている。したがって、配列特異的リボザイムによって媒介される遺伝子発現の阻害は治療的適用に特に適している（Ｓｃａｎｌｏｎら，１９９１；Ｓａｒｖｅｒら，１９９０；Ｓｉｏｕｄら，１９９２）。標的ｍＲＮＡの修飾が関係しているこの作業の大部分は、特異的リボザイムによって切断される特異的変異体コドンに基づく。本明細書中に含まれる情報、および当業者の知見を考慮して、特定の遺伝子に対して特異的に標的化させられるさらなるリボザイムの調製と使用が、ここで直接記載されるであろう。
【０１６６】
他の適切なリボザイムとしては、ＲＮＡ切断活性を有しているＲＮａｓｅ  Ｐに由来する配列（Ｙｕａｎら，１９９２；Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ，１９９４）、ヘアピンリボザイム構造（Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚら，１９９２；Ｃｈｏｗｒｉｒａら，１９９３）、およびδ肝炎ウイルスをベースとするリボザイム（Ｐｅｒｒｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｂｅｅｎ，１９９２）が挙げられる。リボザイムによって指示されるＤＮＡ切断活性の一般的な設計と最適化は詳細に議論されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８；Ｓｙｍｏｎｓ，１９９２；Ｃｈｏｗｒｉｒａら，１９９４；およびＴｈｏｍｐｓｏｎら，１９９５）。
【０１６７】
リボザイムの設計についての他の変数は、特定の標的ＲＮＡ上の切断部位の選択である。リボザイムは、相補性塩基の対合相互作用によって１つの部位にアニーリングすることにより、特定の配列に対して標的化させられる。２つの相同性のストレッチがこの標的化に必要である。相同性配列のこれらのストレッチは、上記で定義された触媒性リボザイム構造に隣接している。相同性配列のそれぞれのストレッチは、７から１５ヌクレオチドの長さで変化させることができる。相同性配列を定義するための唯一の要件は、標的ＲＮＡ上で、これらが切断部位である特異的配列によって隔てられていることである。ハンマーヘッドリボザイムについては、切断部位は、標的ＲＮＡ上の２ヌクレオチドの配列であり、ウラシル（Ｕ）とそれに続くアデニン、シトシン、またはウラシル（Ａ、Ｃ、またはＵ）のいずれかである（Ｐｅｒｒｉｍａｎら，１９９２；Ｔｈｏｍｐｓｏｍら，１９９５）。任意の特定のＲＮＡの中にこの２ヌクレオチドが生じる頻度は、統計学的には１６分の３である。
【０１６８】
標的ＲＮＡの効率的な切断のためのリボザイムを設計し、試験することは、当業者に周知のプロセスである。リボザイムを設計し、試験するための化学的方法の例は、Ｃｈｏｗｒｉｒａら，（１９９４）およびＬｉｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ（１９９５）（それぞれが引用により組み入れられる）に記載されている。ＳＵＲ１標的化リボザイムにおいて使用される操作および好ましい配列の同定は、特定の配列の調製および試験のうちの単なる１つの工程であり、当業者に公知である日常的に行われているスクリーニング方法である。
【０１６９】
Ｉ．翻訳後アセンブリとトラフィッキングの阻害
チャンネルの個々の調節サブユニットタンパク質および孔を形成するサブユニットタンパク質の発現後、そして本発明の特定の態様においては、これらのタンパク質は、細胞のゴルジ体の中でのグリコシル化によって修飾され、チャンネルを含む機能性のヘテロ多量体になるようにアセンブリされ、その後、機能性チャンネルを形成するようにそれらが挿入される原形質膜へと輸送される。これらのプロセスの最後は、「トラフィッキング」と呼ばれる。
【０１７０】
本発明の特異的な実施形態においては、構成要素であるタンパク質のいずれかに結合する分子が、翻訳後アセンブリおよびトラフィッキングを妨害し、それによって機能性チャンネルの発現を妨害する。１つのそのような例は、ＳＵＲ１サブユニットに対するグリベンクラミドの結合による妨害である。さらなる実施形態においては、ＳＵＲ１に対してフェムトモルの親和性で結合するグリベンクラミドは、機能性チャンネルの発現に必要な翻訳後アセンブリとトラフィッキングを妨害する。
【０１７１】
ＶＩＩ．調節因子の例示的なスクリーニング方法
本発明のさらなる実施形態には、活性および／または発現を変化させるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定するための方法が含まれ得る。これらのアッセイには、候補の物質の大きなライブラリーのランダムスクリーニングが含まれ得る。あるいは、アッセイは、それらをさらにＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの機能もしくは活性もしくは発現を調節できるようにすると考えられる構造特性に配慮して選択された特定のクラスの化合物に焦点を絞るように使用され得る。
【０１７２】
機能によっては、ｍＲＮＡの発現、タンパク質の発現、タンパク質活性、またはチャンネル活性、さらに具体的には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを開口させるまたは阻害するまたは遮断する調節因子の能力についてアッセイできることが意味される。したがって、本発明にしたがってスクリーニングされる化合物としては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに結合して、このチャンネルを開口させる（例えば、アゴニスト）またはこのチャンネルを遮断する（例えば、アンタゴニスト）、天然のまたは合成の有機化合物、ペプチド、抗体およびその断片、ペプチド模倣物が挙げられるがこれらに限定されない。神経細胞の膨張または脳腫脹の処置における使用については、このチャンネルを遮断する化合物が好ましい。このチャンネルを開口させるか、またはこのチャンネルを開いた上体に維持するアゴニストとしては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのＳＵＲ１サブユニット（またはその一部）を含み、ＳＵＲ１の循環しているリガンドンイ結合してこれを「中和する」、ペプチド、抗体またはその断片、および他の有機化合物が挙げられる。
【０１７３】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに影響を与える化合物のスクリーニングに関して、公知の化合物のライブラリーを阻害因子または活性化因子である化合物についてスクリーニングすることができ、これには、天然の産物または合成の化学物質、および生物学的活性のある物質（タンパク質を含む）が含まれる。好ましくは、そのような化合物は、ＮＣＣａ−ＡＴＰアンタゴニストであり、これには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル阻害因子、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遮断因子、ＳＵＲ１アンタゴニスト、ＳＵＲ１阻害因子、および／またはチャンネルを通過する膜電流の大きさを小さくすることができる化合物が含まれる。
【０１７４】
化合物としては、有機低分子または無機低分子、化合物のライブラリーにおいて利用できる化合物、ペプチド（例えば、可溶性ペプチド）を挙げることができるがこれらに限定されない。これには、ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照のこと）、ならびに、Ｄ−および／またはＬ−立体構造のアミノ酸から構成されている組み合わせの化学的に誘導された分子ライブラリー、ホスホペプチド（ランダムライブラリー、または部分的縮合のライブラリー、特異的なホスホペプチドのライブラリーのメンバーが含まれるがこれらに限定されない；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら，１９９３、Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照のこと）、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体、ならびに、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂ発現ライブラリーの断片およびそれらのエピトープ結合断片が含まれるがこれに限定されない）が含まれるがこれに限定されない。
【０１７５】
本発明にしたがってスクリーニングすることができる他の化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：血液−脳関門を通過することができるか有機低分子または通過することができない有機低分子、適切な神経細胞もしくは内皮細胞の侵入することができる有機低分子または侵入することができない有機低分子、ならびに、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遺伝子またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性に関係しているいくつかの他の遺伝子の発現に（例えば、遺伝子発現に関係している調節領域もしくは転写因子との相互作用によるか、または翻訳後のチャンネルのアセンブリもしくはトラフィッキングを妨害することにより）影響を与えることができる有機低分子または影響を与えることができない有機低分子；あるいは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性に関与しているいくつかの他の細胞内因子の活性に影響を与えるそのような化合物。
【０１７６】
調節因子を同定する、作成する、生じさせる、提供する、製造する、または得るためには、当業者は一般的には、候補の物質の存在下、候補の物質が存在しない条件下、またはそれらの両方でのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性を決定するであろう。この場合、阻害因子またはアンタゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの発現もしくは活性をダウンレギュレートする、下げる、阻害する、遮断する、もしくは低下させる任意の物質と定義され、そして、活性化因子もしくはアゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルをアップレギュレートする、促進する、活性化させる、高める、または開口させる任意の物質と定義される。例えば、１つの方法には一般的に、以下の工程が含まれ得る：
【０１７７】
（ａ）インビトロまたはインビボで、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの発現もしくは活性を活性化または阻害すると期待される候補の物質を提供する工程；
【０１７８】
（ｂ）インビトロまたはインビボで、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの発現もしくは活性を活性化または阻害する候補の物質の能力を評価する工程；
【０１７９】
（ｃ）調節因子を選択する工程；および
【０１８０】
（ｄ）調節因子を製造する工程。
【０１８１】
特定の実施形態においては、別の評価工程によって、インビトロまたはインビボで、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに特異的に結合する候補の物質の能力を評価することができる。
【０１８２】
さらなる実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが、細胞中に、または細胞を含まないシステムの中に提供され得、そしてＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、候補の物質と接触させられ得る。次に、調節因子は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性または発現に対する候補の物質の作用を評価することによって選択される。調節因子が同定されると、この方法によってさらに、調節因子の製造も提供される場合がある。
【０１８３】
細胞に投与することができるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（アゴニストである場合も、もしくはアンタゴニストである場合もあり、好ましくはアンタゴニストである）の有効量としては、約０．０００１ｎＭから約２０００μＭの用量が挙げられる。より具体的には、投与されるアゴニストの用量は、約０．０１ｎＭから約２０００μＭ；約０．０１μＭから約０．０５μＭ；約０．０５μＭから約１．０μＭ；約１．０μＭから約１．５μＭ；約１．５μＭから約２．０μＭ；約２．０μＭから約３．０μＭ；約３．０μＭから約４．０μＭ；約４．０μＭから約５．０μＭ；約５．０μＭから約１０μＭ；約１０μＭから約５０μＭ；約５０μＭから約１００μＭ；約１００μＭから約２００μＭ；約２００μＭから約３００μＭ；約３００μＭから約５００μＭ；約５００μＭから約１０００μＭ；約１０００μＭから約１５００μＭ、および約１５００μＭから約２０００μＭである。もちろん、これらの量は全て例であり、そしてこれらの点の間のあらゆる量もまた、本発明で使用されると予想される。
【０１８４】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子またはそれらの関連化合物は、非経口的にも、または栄養によっても投与することができる。非経口投与としては、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、動脈内投与、クモ膜下投与、脳室内投与、腫瘍内投与、皮下投与、または腹腔内投与が挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号；および同第５，３９９，３６３号（それぞれが具体的にそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。栄養による投与としては、経口投与、口腔投与、直腸投与、または舌下投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８５】
本発明の治療用化合物および／または治療薬の投与としては、全身投与、局所投与、および／または局部投与を挙げることができ、また、経口投与、静脈内投与、および筋肉内投与も挙げることができる。あるいは、他の投与経路、例えば、動脈潅流、腔内投与、腹腔内投与、胸膜内投与、脳室内投与、腫瘍内投与、実質内投与、および／またはクモ膜下投与もまた想定される。所望される場合には、治療用化合物は、治療用化合物と化学療法薬が同時には投与されない場合でもなお、化学療法薬と同じ経路によって投与することができる。当業者は、標準的な方法と手順を使用して適切な投与経路を決定する方法を知っている。周辺への投与と中心への投与の両方による化学療法薬に対する応答の評価が所望される一例においては、医療の専門家によって全身投与が使用され得る。
【０１８６】
処置方法には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストまたはそれらの関連化合物が含まれている組成物の有効量で個体を処置する工程が含まれるであろう。有効量は、一般的には、疾患またはその症状の程度を、検出可能であるように、そして繰り返して緩和する、小さくする、最小にする、または限定するために十分なその量として記載される。さらに具体的には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物での処置によっては、脳卒中、脳の外傷、または他の脳損傷後の細胞の膨張および脳腫脹が軽減され、そして、脳卒中、脳の外傷、または他の脳損傷もしくは脊髄損傷後の脳障害が軽減されるであろうと想像される。
【０１８７】
使用されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物の「治療有効量」の有効量は、レシピエントである動物または患者において、特に、脳卒中または脳の外傷の処置に関して有益な結果を生じるために有効なそれらの量である。そのような量は、公開されている文献を参考にすることによって、インビトロでの試験を行うことによって、または健常な実験動物において代謝実験を行うことによって最初に決定され得る。薬が使用される状況で使用される前に、動物モデル（好ましくは、処置される特定の疾患についての広く受け入れられている動物モデル）において確認実験を行うことが有効であり得る。特定の実施形態での使用に好ましい動物モデルは齧歯類モデルであり、これらは、使用が経済的であるとの理由から、特に、得られる結果が臨床的価値の推定として広く受け入れられていることの理由から好ましい。
【０１８８】
当該分野で周知であるように、任意の特定の患者についての活性のある化合物（例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物）の特異的な服用レベルは、多様な要因に応じて変化する。これには、使用される特異的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事療法、投与のタイミング、投与経路、排泄速度、薬物の併用、および治療を受けている特定の疾患の重篤度が含まれる。投与に対するヒトの応答によって、個々の被験体についての適切な用量が決定されるであろう。さらに、ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄによって求められる滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
【０１８９】
治療薬としてのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物の有効量は、処置される宿主、および特定の投与形式に応じて様々である。本発明の１つの実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはそれらの関連化合物の用量範囲は、約０．０００１μｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重であろう。用語「体重」は、動物が処置される場合に適用することができる。単離された細胞が処理される場合には、「体重」は、本明細書中で使用される場合には、「細胞体の重量の合計」を意味すると読み取られるべきである。用語「全体重」は、単離された細胞の処理と動物の処置の両方に適用されるように使用することができる。濃度および処置レベルは全て、「体重」として表現されるか、または本出願の中の単なる「ｋｇ」もまた、同様の「細胞体の重量の合計」と「全体重」の集合を含むと考えられる。しかし、当業者は例えば以下のような様々な投与量範囲の有用性を認識するであろう：０．０００１μｇ／ｋｇ体重から４５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００２μｇ／ｋｇ体重から４００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００３μｇ／ｋｇ体重から３５０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００４μｇ／ｋｇ体重から３００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００５μｇ／ｋｇ体重から２５０ｍｇ／ｋｇ体重、５．０μｇ／ｋｇ体重から２００ｍｇ／ｋｇ体重、１０．０μｇ／ｋｇ体重から１５０ｍｇ／ｋｇ体重、１００．０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重、または１０００μｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重。さらに、当業者は、例えば以下のような多種多様の投与量レベルが使用されるであろうことを理解するであろう：約０．０００１μｇ／ｋｇまで、約０．０００２μｇ／ｋｇまで、約０．０００３μｇ／ｋｇまで、約０．０００４μｇ／ｋｇ未満、約０．００５μｇ／ｋｇ未満、約０．０００７μｇ／ｋｇ未満、約０．００１μｇ／ｋｇ未満、約０．１μｇ／ｋｇ未満、約１．０μｇ／ｋｇ未満、約１．５μｇ／ｋｇ未満、約２．０μｇ／ｋｇ未満、約５．０μｇ／ｋｇ未満、約１０．０μｇ／ｋｇ未満、約１５．０μｇ／ｋｇ未満、約３０．０μｇ／ｋｇ未満、約５０μｇ／ｋｇ未満、約７５μｇ／ｋｇ未満、約８０μｇ／ｋｇ未満、約９０μｇ／ｋｇ未満、約１００μｇ／ｋｇ未満、約２００μｇ／ｋｇ未満、約３００μｇ／ｋｇ未満、約４００μｇ／ｋｇ未満、約５００μｇ／ｋｇ未満、約１ｍｇ／ｋｇ未満、約２ｍｇ／ｋｇ未満、約３ｍｇ／ｋｇ未満、約５ｍｇ／ｋｇ未満、約１０ｍｇ／ｋｇ未満、約１００ｍｇ／ｋｇ未満。さらに、当業者は、例えば以下のような多種多様の投与量レベルが使用されるであろうことを理解するであろう：０．０００１μｇ／ｋｇ、０．０００２μｇ／ｋｇ、０．０００３μｇ／ｋｇ、０．０００４μｇ／ｋｇ、０．００５μｇ／ｋｇ、０．０００７μｇ／ｋｇ、０．００１μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、２．０μｇ／ｋｇ、５．０μｇ／ｋｇ、１０．０μｇ／ｋｇ、１５．０μｇ／ｋｇ、３０．０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、１４０μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１６０μｇ／ｋｇ、１８０μｇ／ｋｇ、２０��μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および／または３０ｍｇ／ｋｇ。もちろん、これらの投与量は全て例であり、そしてこれらの点の間のあらゆる量もまた、本発明で使用されると予想される。上記の投与量範囲または投与量レベルは全て、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニスト、またはそれらの関連化合物について使用され得る。
【０１９０】
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの治療用アゴニストの患者または被験体への投与の後には、存在する場合にはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストの毒性を考慮して、化学療法薬の投与のための一般的なプロトコールが続くであろう。処置サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。様々な標準的な治療、ならびに外科的介入が記載される治療と組み合わせて適用され得ることもまた想定される。
【０１９１】
処置には様々な「単位用量」が含まれ得る。単位用量は、その投与（例えば、適切な経路および処置レジュメ）に伴い所望される応答を生じるように計算された治療用組成物（ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストまたはそれらの関連化合物）の予め決定された量を含むと定義される。投与される量、ならびに特定の経路および処方は、臨床分野の当業者の能力の範囲内である。処置される被験体、特に、被験体の状態および所望される防御もまた重要である。単位用量は必ずしも１回の注射として投与される必要はなく、一定の時間をかけた持続注入もまた含まれ得る。
【０１９２】
本発明にしたがって、当業者は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたは関連化合物の組成物を用いた、全身投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与）によって、ポンプによる投与によって、または脳もしくは脳室への直接の注射によって、脳卒中、脳の外傷、または他の脳もしくは脊髄の損傷を処置することができる。あるいは、脳または脊髄には、任意の適切な投与媒体を使用して組成物が注入され得るか、または潅流させられ得る。全身投与または経口投与を行うことができ、本発明の実施形態においては、局所投与または局部投与が好ましい場合がある。持続的な投与もまた、適切である場合、例えば、患者が継続的にモニターされ得る場合に適用され得る。注射器またはカテーテル留置による投与が１つの有効な方法である。持続的な潅流は、処置の開始後約１〜２時間、約２〜６時間、約６〜１２時間、約１２〜２４時間、約１〜２日間、約１〜２週間、またはそれ以上の期間にわたり行われ得る。一般的には、持続的潅流による治療用組成物の用量は、潅流が起こる期間にわたって調整された、１回の注射または複数回の注射によって投与される量と同じであろう。単回用量として投与される複数回の注射には、約０．１から約１ｍｌの容量が含まれる。複数の実施形態においては、投与される容量は約４〜１０ｍｌ（好ましくは、１０ｍｌ）であり得るが、さらなる実施形態においては、約１〜３ｍｌの容量が使用されるであろう（好ましくは、３ｍｌ）。
【０１９３】
ＶＩＩＩ．脳虚血の処置方法
アンタゴニストでの処置
他の実施形態においては、本発明の治療用化合物には、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストが含まれる。アンタゴニストは、中枢神経系の頭蓋内圧および／またはイオン性もしくは細胞傷害性浮腫を付随する有害な症状の処置における使用が想定される。そのような症状としては、外傷（例えば、外傷性脳損傷または外傷性脊髄損傷（それぞれ、ＴＢＩまたはＳＣＩ））、虚血性脳または脊髄損傷、原発性および二次的な神経損傷、脳卒中、動脈静脈奇形（ＡＶＭ）、腫瘤性病変（例えば、血腫）、ならびに出血性の梗塞などが挙げられる。アンタゴニストは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを発現する細胞を防御する。これは、イオン性もしくは細胞傷害性浮腫が形成される臨床的処置に所望される。ここでは、毛細血管の完全性が虚血後に失われ、そしてグリア被膜の完全性が重要であり、脳膿瘍を伴うような感染の拡大を防ぐために維持されなければならない。当業者は、脳膿瘍が完全に閉じられ、結果として脳腫脹が生じることを完全に理解している。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの阻害による防御には、脳のイオン性または細胞傷害性浮腫の軽減が伴う。したがって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを阻害する化合物には神経防御作用がある。
【０１９４】
１つの態様においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは遮断されるか、阻害されるか、または別の方法で活性が低下させられる。そのような例においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストが投与され、そして／または塗布される。アンタゴニストはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを調節し、その結果、このチャンネルを通過する流れ（イオンおよび／または水）が少なくなる、廃止される、減少する、および／または停止する。アンタゴニストは、神経細胞、神経膠細胞、神経内皮細胞、またはそれらの組み合わせのＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性に関して、可逆的活性を有する場合も、また不可逆的活性を有する場合もある。したがって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの阻害によって、イオン性の浮腫を付随する、および出血性の転換を付随する内皮細胞の細胞傷害性の浮腫および死を減少させることができる。
【０１９５】
したがって、本発明は、急性脳虚血の処置または緩和に有用である。本発明の特異的な実施形態にしたがうと、有効量の活性のある化合物の投与によって、それが開いたままであれば神経細胞の膨張と細胞死に至ってしまうチャンネルを遮断することができる。ＳＵＲ１の様々なアンタゴニストがこのチャンネルを遮断するために適している。適切なＳＵＲ１アンタゴニストの例としては、グリベンクラミド、トルブタミド、レパグリニド、ナテグリニド、メグリチニド、ミダグリゾール、ＬＹ３９７３６４、ＬＹ３８９３８２、グリクラジド、グリメピリド、エストロゲン、エストロゲン関連化合物、およびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の好ましい実施形態においては、ＳＵＲ１アンタゴニストは、グリベンクラミドおよびトルブタミドからなる群より選択される。使用することができる別のアンタゴニストは、ＭｇＡＤＰである。神経細胞を分極した状態に維持する方法、および強い脱分極を防ぐ方法を含む（しかしこれらに限定されない）、神経細胞の膨張および細胞死を予防するためのなお他の治療「ストラテジー」を採用することができる。
【０１９６】
さらなる実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの阻害因子またはアンタゴニストを、出血性の転換を小さくするかまたは緩和するかまたは撤回するために使用することができる。虚血後に毛細血管の中で起こる病的状態の順序は、血管内区画から脳の柔組織へと移動する主な構成成分に基づいて３つの段階に分けることができる（Ａｙａｔａ  ２００２；Ｂｅｔｚ，１９９６；Ｂｅｔｚ  １９８９）。最初の段階は、ＢＢＢが完全なまま維持されている間の「イオン性」浮腫の形成を特徴とし、これには、電解質（Ｎａ＋、Ｃｌ−）と水の脳の柔組織への移動が伴う。第２の段階は、ＢＢＢの崩壊が原因である「血管原性」浮腫の形成を特徴とし、この間には、巨大分子と水が脳の柔組織へと流入する。第３の段階は、出血性の転換を特徴とし、毛細血管の突然の壊滅が原因である。この間には、血液の全ての構成成分が脳の柔組織へと浸出する。Ｓｔａｒｌｉｎｇの法則にしたがうと、これらの病期の理解には２つのことが同定されることが必要である：（ｉ）柔組織へと物質を「パルスする」駆動力；および（ｉｉ）これらの物質の柔組織への通過を可能にする透過性の孔。
【０１９７】
したがって、アンタゴニストまたはそれらの関連化合物の使用によっては、脳卒中に罹患している被験体の致死率を下げることができ、そして／または、周辺領域を救出するか、または不可逆的損傷になるリスクがある組織の領域を含む周辺組織中の損傷を予防することができる。
【０１９８】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの投与により、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口の理由により、内皮細胞の脱分極が撤回される、遅らせられる、軽減される、または阻害される。したがって、細胞の脱分極の撤回により、浸透圧勾配の変化を防ぎ、それによって内皮細胞への水の流入を防いで細胞の膨張、出血、および細胞傷害性浮腫を停止させる、Ｎａ＋の流入の撤回または阻害が生じる。したがって、内皮細胞の脱分極を妨げること、または阻害すること、または弱めることによって出血性の転換を防ぐかまたは小さくすることができる。
【０１９９】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストが投与され得る神経細胞としては、ＳＵＲ１を発現する任意の細胞、例えば、任意の神経細胞、神経膠細胞、または神経内皮細胞を挙げることができる。
【０２００】
アンタゴニストまたはそれらの関連化合物で処置することができる被験体としては、外傷（例えば、外傷性脳損傷または外傷性脊髄損傷（ＴＢＩまたはＳＣＩ））、虚血性脳または脊髄損傷、原発性および二次的な神経損傷、脳卒中、動脈静脈奇形（ＡＶＭ）、脳膿瘍、腫瘤性病変（例えば、血腫）、出血性の梗塞、ならびに、脳水腫および／もしくは頭蓋内圧の上昇を生じる脳の低酸素症または脳虚血を付随する任意の他の症状（例えば、腫瘤、脳水腫、血腫、末期脳水腫、脳症など（しかしこれらに限定されない））に罹患しているか、あるいはそれらを発症するリスクがある被験体が挙げられる。したがって、アンタゴニストは治療的処置であり得る。ここでは、治療的処置には、予防または予防的処置が含まれる。アンタゴニストまたはそれらの関連化合物には、神経防御作用がある。
【０２０１】
本発明のアンタゴニストで処置することができる他の被験体としては、脳卒中を発症するリスクがあるか、または脳卒中を発症する素因のある被験体が挙げられる。そのような被験体としては、心房細動、凝固障害に罹患している被験体、および／または肺動脈塞栓のリスクがある被験体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
特定の実施形態においては、脳卒中を発症するリスクがある被験体としては、例えば、脳／血管内処置、外科手術（例えば、開頭術、頭蓋手術、脳腫瘍（例えば、血腫）の除去、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）、血管造影法、ステント留置術、他の血管手術、および／または他のＣＮＳもしくは神経外科手術）、および血栓溶解剤での心筋梗塞（ＭＩ）の処置、ならびに、腹部大動脈瘤および脊髄に血液の供給をもたらす主要な血管の外科手術（これらに限定されない）を受けている被験体を挙げることができる。このような場合には、被験体は、実際の処置の前に、本発明のアンタゴニストまたはそれらの関連化合物で処置される場合がある。処置には、実際の処置もしくは外科手術の数ヶ月（１、２、３など）、数週間（１、２、３など）、数日（１、２、３など）、数時間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）、または数分（１５、３０、６０、９０など）前のアンタゴニストおよび／または関連化合物の投与が含まれ得る。アンタゴニストおよび／または関連化合物の処置は、処置および／または外科手術の間、そして被験体が脳卒中を発症するリスクが低下する、小さくなる、または緩和されるまで、処置および／または外科手術後も続けることができる。
【０２０３】
さらなる実施形態においては、本発明のアンタゴニストは、頭／頸部の外傷を発症するリスクがある被験体（例えば、頭／頸部の外傷のリスクが高いスポーツまたは他の活動に従事している被験体）に投与することができる。
【０２０４】
細胞に投与することができるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの有効量としては、例えば、約０．０００１ｎＭから約２０００μＭの用量が挙げられる。さらに具体的には、投与されるアゴニストの用量は、例えば、約０．０１ｎＭから約２０００μＭ；約０．０１μＭから約０．０５μＭ；約０．０５μＭから約１．０μＭ；約１．０μＭから約１．５μＭ；約１．５μＭから約２．０μＭ；約２．０μＭから約３．０μＭ；約３．０μＭから約４．０μＭ；約４．０μＭから約５．０μＭ；約５．０μＭから約１０μＭ；約１０μＭから約５０μＭ；約５０μＭから約１００μＭ；約１００μＭから約２００μＭ；約２００μＭから約３００μＭ；約３００μＭから約５００μＭ；約５００μＭから約１０００μＭ；約１０００μＭから約１５００μＭ；および約１５００μＭから約２０００μＭである。もちろん、これらの量は全て例であり、そしてこれらの点の間のあらゆる量もまた、本発明で使用されると予想される。
【０２０５】
アンタゴニストまたはそれらの関連化合物は、非経口的にも、または栄養によっても投与することができる。非経口投与としては、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、動脈内投与、クモ膜下投与、皮下投与、または腹腔内投与が挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号；および同第５，３９９，３６３号（それぞれが具体的にそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。栄養による投与としては、経口投与、口腔投与、直腸投与、または舌下投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０６】
本発明の治療用化合物および／または治療薬の投与としては、全身投与、局所投与、および／または局部投与を挙げることができ、例えば、局所投与（皮膚への投与、経皮投与）、カテーテルによる投与、埋め込み型のポンプによる投与などである。あるいは、他の投与経路、例えば、動脈潅流、腔内投与、腹腔内投与、胸膜内投与、脳室内投与、および／またはクモ膜下投与もまた想定される。当業者は、標準的な方法と手順を使用して適切な投与経路を決定する方法を知っている。他の投与経路が本明細書中で別の場所で議論され、そしてこれらは引用により本明細書中に組み入れられる。
【０２０７】
処置方法には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物が含まれている組成物の有効量で個体を処置する工程が含まれるであろう。有効量は、一般的には、疾患またはその症状の程度を、検出可能であるように、そして繰り返して緩和する、小さくする、最小にする、または限定するために十分なその量として記載される。さらに具体的には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物での処置によっては、細胞の脱分極が阻害される、Ｎａ＋の流入が阻害される、浸透圧勾配の変化が阻害される、細胞への水の流入が阻害される、細胞傷害性の細胞の浮腫が阻害される、脳卒中の大きさが小さくなる、出血性の転換が阻害される、そして被験体の致死率が低下するであろうと想像される。
【０２０８】
使用されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物の有効量は、レシピエントである動物または患者において、特に、脳卒中の処置に関して有益な結果を生じるために有効なそれらの量である。そのような量は、公開されている文献を参考にすることによって、インビトロでの試験を行うことによって、または健常な実験動物において代謝実験を行うことによって最初に決定され得る。薬が使用される状況で使用される前に、動物モデル（好ましくは、処置される特定の疾患についての広く受け入れられている動物モデル）において確認実験を行うことが有効であり得る。特定の実施形態での使用に好ましい動物モデルは齧歯類モデルであり、これらは、使用が経済的であるとの理由から、特に、得られる結果が臨床的価値の推定として広く受け入れられていることの理由から好ましい。
【０２０９】
当該分野で周知であるように、任意の特定の患者についての活性のある化合物（例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物）の特異的な服用レベルは、多様な要因に応じて変化する。これには、使用される特異的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事療法、投与のタイミング、投与経路、排泄速度、薬物の併用、および治療を受けている特定の疾患の重篤度が含まれる。投与に対するヒトの応答によって、個々の被験体についての適切な用量が決定されるであろう。さらに、ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄによって求められる滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
【０２１０】
当業者は、アンタゴニストまたはそれらの関連化合物の有効量が、以下のような所望される結果を得るために必要な量であり得ることを明確に理解する：脳卒中のリスクの低下、頭蓋内圧の低下、細胞死の減少、脳卒中の大きさの縮小、脊髄損傷の減少など。この量はまた、患者の合理的な血中グルコース濃度を維持する量でもあり、例えば、アンタゴニストの量によって、少なくとも６０ｍｍｏｌ／ｌの血中グルコース濃度が維持される。さらに好ましくは、血中グルコース濃度は、約６０ｍｍｏｌ／ｌから約１５０ｍｍｏｌ／の範囲で維持される。したがって、これらの量によって、被験体は低血糖になることが防がれる。グルコース濃度が正常ではない場合には、当業者は、患者が低血糖であるか高血糖であるかに応じて、インシュリンまたはグルコースのいずれかを投与するであろう。
【０２１１】
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの治療用アンタゴニスト組成物の患者または被験体への投与の後には、存在する場合にはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの毒性を考慮して、脳卒中の処置に使用される療法薬（例えば、血栓溶解剤）の投与のための一般的なプロトコールが続くであろう。処置サイクルは必要に応じて繰り返されるであろうと予想される。様々な標準的な治療、ならびに外科的介入が記載される治療と組み合わせて適用され得ることもまた想定される。
【０２１２】
ＩＸ．神経細胞の膨張と脳腫脹の処置のための薬学的処方物と方法
Ａ．本発明の組成物
本発明によってはまた、本明細書中に開示される活性のある物質が含まれている組成物を使用する治療方法も意図される。好ましくは、これらの組成物には、治療有効量の１つ以上の活性のある化合物または物質が薬学的に許容される担体とともに含まれている薬学的組成物が含まれる。
【０２１３】
本明細書中で使用される場合には、用語「薬学的に許容される」担体は、毒性のない不活性な固体、半固体、液体の増量剤、希釈剤、カプセル化材料、任意のタイプの処方補助剤、または単なる滅菌の水性媒体（例えば、生理食塩水）を意味する。薬学的に許容される担体となり得る材料のいくつかの例は、以下である：糖（例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース）；粉末状トラガカント；麦芽、ゼラチン、タルク；賦形剤（例えば、ココアバターおよび坐剤用ワックス）；油（例えば、ピーナッツ油、菜種油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）、ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）、寒天；緩衝化剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質が含まれていない水；等張性の生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝溶液、ならびに薬学的処方物において使用される他の毒性のない適合性の物質。
【０２１４】
湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料、防腐剤および抗酸化剤もまた、処方者の判断にしたがって組成物の中に存在させることができる。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；油溶性抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アロハ−トコフェロールなど；ならびに、金属キレート化剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）。
【０２１５】
Ｂ．用量の決定
活性のある化合物（例えば、グリベンクラミドまたはトルブタミド）の「治療有効量」または単なる「有効量」によっては、任意の医学的処置に適用される合理的な利点／リスクの割合で、脳腫脹を処置または緩和するための化合物の十分な量が意味される。しかし、本発明の活性のある化合物および組成物の１日使用量の合計は、正常な医学的判断の範囲内で、かかりつけの医師によって決定されるであろう。任意の特定の患者についての特異的な治療有効用量のレベルは、多様な要因に応じて変化するであろう。これには、処置される障害、および脳損傷または虚血の重篤度；使用される特異的な化合物の活性；使用される特異的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事療法；使用される特異的な化合物の投与のタイミング、投与経路、および排泄速度；処置期間；使用される特異的な化合物と併用される、または同時期に使用される薬物；ならびに医学の分野で周知の同様の要因が含まれる。
【０２１６】
そのような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％を死に至らしめる用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％に対して治療上有効である用量）を決定するための、細胞アッセイまたは実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果の間での用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用される場合があるが、感染していない細胞を損傷してしまう可能性を最少にし、それによって副作用を小さくするためには、罹患した組織の部位にそのような化合物を標的化させる投与システムを設計することに注意が払われなければならない。
【０２１７】
細胞培養アッセイおよび動物実験によって得られたデータを、ヒトでの使用のための投与量範囲を明確に表すことにおいて使用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性をほとんど伴わずに、または毒性を全く伴わずにＥＤ５０を有する循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される投与形態と利用される投与経路に応じてこの範囲にはいるように変化させることができる。本発明の方法で使用される任意の化合物については、治療有効用量は、細胞をベースとする圧制によって最初に推定することができる。用量は、細胞培養物中で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分が得られる試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲となるように、動物モデルにおいて策定され得る。そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中での濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２１８】
１回の用量の中で、または分けられた用量の中で被験体に投与される本発明の活性のある化合物の合計日用量は、例えば、０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重、またはより通常は、０．１から１５ｍｇ／ｋｇ体重の量であり得る。１用量の組成物には、そのような量が含まれる場合も、また、日用量の代わりにその約数が含まれる場合もある。一般的には、本発明にしたがう処置レジュメには、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇから、複数回投与の中の、または１用量の中の、１日あたり約１ｍｇから約１０００ｍｇまでの本発明の活性のある物質（単数または複数）の、そのような処置が必要なヒトまたは他の哺乳動物への投与が含まれる。
【０２１９】
特定の状況、特に処置の初期には、患者の血流の中で極めて高用量の有効成分を維持することが重要な場合がある。そのような相当の高用量には、他の適応症におけるその使用よりも数倍高い用量が含まれ得る。例えば、経口またはＩＶによるグリベンクラミドについての典型的な糖尿病に対する用量は、１日あたり約２．５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇであり、経口またはＩＶによるトルブタミドについての典型的な糖尿病に対する用量は、１日あたり約０．５ｇｍ／ｋｇから約２．０ｇｍ／ｋｇであり、経口によるグリクラジドについての典型的な糖尿病に対する用量は、１日あたり約３０ｍｇ／ｋｇから約１２０ｍｇ／ｋｇであるが、はるかに高い用量が神経細胞の膨張および脳腫脹を遮断するために必要であり得る。
【０２２０】
例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する有効量の化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を被験体に投与することによる、被験体の脳の中での神経細胞の膨張を防ぐ方法に関する本発明の１つの実施形態においては、そのような処方物には、約０．１から約１００グラムのトルブタミド、または約０．５から約１５０ミリグラムのグリベンクラミドが含まれ得る。本発明の別の実施形態においては、有効量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物と薬学的に許容される担体が含まれている処方物を被験体に投与することによる、被験体の神経細胞の膨張が原因である外傷性の脳損傷または脳虚血のネガティブな作用を緩和する方法に関する。
【０２２１】
外傷性脳損傷もしくは脳虚血（例えば、脳卒中）、または脳の低酸素症の状況においては、特に、処置の初期には、患者の脳への送達を確実にするために、有効成分を極めて高用量で維持することが重要であり得る。したがって、少なくとも最初は、所定の期間の間（好ましくは、少なくとも約６時間以上の時間、より好ましくは、少なくとも約１２時間以上の時間、最も好ましくは、少なくとも約２４時間以上の時間）、比較的高い用量、および／または実質的に一定の濃度を保つことが重要であり得る。外傷性脳損傷または脳虚血（例えば、脳卒中）の状況では、特に、処置の初期に、患者の脳への送達を確実にするために、有効成分を極めて高用量で維持することが重要であり得る。
【０２２２】
本発明の方法が脳内出血を含む症状（例えば、外傷性脳損傷または脳虚血（例えば、脳卒中））を処置するために使用される場合には、血管系からの投与が利用され、化合物が血液−脳関門を容易に通過することは必ずしも必要ではない。
【０２２３】
Ｃ．処方物と投与
本発明の化合物は、特に、脳の選択された領域に、単独で投与される場合も、また、中枢神経系もしくは末梢神経系に影響を及ぼす他の薬剤と併用してまたは併用療法において投与される場合もある。
【０２２４】
経口投与のための液体の投薬形態としては、当該分野で一般的に使用されている不活性な希釈剤（例えば、水、等張溶液、または生理食塩水）が含まれている、薬学的に許容される乳化剤、マイクロエマルジョン、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。そのような組成物にはまた、アジュバント（例えば、湿潤剤）；乳化剤および懸濁化剤；甘味剤、香味剤、および香料も含まれる場合がある。
【０２２５】
注射することができる製剤（例えば、滅菌の注射することができる水性または油性懸濁液）が、適切な分散剤または湿潤剤と懸濁化剤を使用して、公知の分野にしたがって処方され得る。滅菌の注射することができる製剤はまた、非毒性の非経口投与に許容される希釈剤または溶媒の中の滅菌の注射することができる溶液、懸濁液、またはエマルジョン（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）でもあり得る。使用することができる許容される媒体および溶媒の中には、水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体としての使用には便利である。この目的については、任意の味の薄い固定油を使用することができ、これには、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。加えて、脂肪酸（例えば、オレイン酸）が注射することができる製剤において使用される。
【０２２６】
注射することができる処方物は、例えば、細菌保定フィルターを通す濾過によって、または滅菌された固体組成物（滅菌水または他の滅菌の注射することができる媒体の中に使用の直前に溶解または分散させることができる）の形態の中に滅菌化剤を配合することによって滅菌することができる。
【０２２７】
薬物の作用を持続させるためには、多くの場合には、皮下注射または筋肉内注射によって薬物の吸収を遅らせることが所望される。これを行うための最も一般的な方法は、水溶性の低い結晶性または不定形材料の懸濁液を注射することである。薬物の吸収速度は、薬物の溶解速度に依存するようになり、次いで、薬物の物理的状態（例えば、結晶の大きさと結晶形態）に依存する。薬物の吸収を遅らせるための別のアプローチは、油中の溶液または懸濁液として薬物を投与することである。注射することができるデポー形態はまた、薬物のマイクロカプセルマトリックスおよび生体適合性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコシド）を形成させることによって作成することもできる。ポリマーおよびポリマーの組成物に対する薬物の割合に応じて、薬物の放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリオルトエステルおよびポリ無水物が挙げられる。注射することができるデポー製剤はまた、体組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンの中に薬物を捕捉させることによって作成することもできる。
【０２２８】
薬物の直腸投与のための坐剤は、薬物を、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって、直腸の中で融解して薬物を放出するであろう適切な刺激性のない賦形剤（例えば、ココアバターおよびポリエチレングリコール）と混合することによって調製することができる。
【０２２９】
経口投与のための固体の投薬形態としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤、ジェルキャップ、および顆粒剤を挙げることができる。このような固体の投薬形態においては、活性のある化合物は、少なくとも１つの不活性な希釈剤（例えば、スクロース、ラクトース、またはデンプン）と混合され得る。そのような投薬形態にはまた、通常の慣行と同様に、不活性な希釈剤以外のさらに別の物質（例えば、錠剤用の潤滑剤および他の錠剤化補助剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロース））も含まれる場合がある。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合には、投薬形態にはまた、緩衝化物質も含まれ得る。錠剤および丸剤はさらに、腸溶コーティング、および他の放出を制御するコーティングを用いて調製することができる。
【０２３０】
同様のタイプの固体組成物はまた、例えば、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、ソフトおよびハードの充填用ゼラチンカプセルの中の増量剤としても使用され得る。
【０２３１】
活性のある化合物はまた、上記の１つ以上の賦形剤でマイクロカプセル化された形態でもあり得る。錠剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体の投与形態は、コーティングおよび殻（例えば、腸溶コーティングおよび薬学的処方の分野で周知の他のコーティング）を用いて調製することができる。これらには状況に応じて乳白剤を含めることができ、これはまた、状況に応じて遅らせられた様式で、これらが有効成分（単数または複数）だけを、また好ましくは、腸管の特定の部分において放出する組成物でもあり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【０２３２】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための投薬形態には、さらに、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉末剤、溶液剤、シロップ剤、吸入薬、またはパッチ剤が挙げられる。経皮パッチには、体への活性のある化合物の制御された送達を提供するさらなる利点がある。そのような投薬形態は、適切な媒体の中に化合物を溶解または分散させることによって作成することができる。吸収促進剤はまた、皮膚を通過する化合物の流れを大きくするためにも使用され得る。速度は、速度制御膜を提供すること、またはポリマーマトリックスもしくはゲルの中に化合物を分散させることのいずれかによって制御することができる。軟膏、ペースト剤、クリーム剤、およびゲル剤には、本発明の活性のある化合物に加えて、賦形剤（例えば、動物性および植物性の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物）が含まれる場合がある。
【０２３３】
本発明の方法では、インビトロおよびインビボの両方での用途について本明細書中で同定された化合物が使用される。インビボでの用途については、本発明の化合物は、投与のための薬学的に許容される処方物の中に取り込ませることができる。当業者であれば、本発明の化合物がそのように使用される場合には適切な投与量レベルを容易に決定できる。
【０２３４】
本明細書中で使用される場合は、表現「適切な投与量レベル」は、インビボでＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを効率よく遮断し、そして神経細胞の膨張を防ぐまたは軽減するために十分な高い循環濃度を提供するために十分な化合物のレベルを意味する。
【０２３５】
本発明の特定の実施形態にしたがうと、少なくとも１つのＳＵＲ１アンタゴニスト化合物（上記）と薬学的に許容される担体が含まれている組成物が想定される。
【０２３６】
例示的な薬学的に許容される担体としては、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与などに適している担体が挙げられる。クリーム剤、ローション剤、錠剤、分散させることができる粉末剤、顆粒剤、シロップ剤、エリキシル剤、滅菌の水溶液または非水性溶液、懸濁液、もしくはエマルジョンなどの形態での投与が想定される。
【０２３７】
経口用の液体の調製のためには、適切な担体としては、エマルジョン、溶液、懸濁液、シロップなどが挙げられ、これらには状況に応じて、添加剤（例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、甘味剤、香料、香味剤など）が含まれる。
【０２３８】
非経口投与用の液体の調製のためには、適切な担体としては、滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、またはエマルジョンが挙げられる。非水性の溶媒または媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油（例えば、オリーブ油およびトウモロコシ油）、ゼラチン、および注射することができる有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。そのような投薬形態にはまた、アジュバント（例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤）も含まれる場合がある。これらは、例えば、細菌保定フィルターを通す濾過によって、または組成物の中に滅菌化剤を配合することによって、組成物中に滅菌化剤を導入することによって、組成物に放射線を照射することによって、または組成物を加熱することによって滅菌することができる。これらは、使用の直前に滅菌水またはいくつかの他の滅菌性の注射することができる媒体の形態にすることもできる。活性のある化合物は、薬学的に許容される担体と、必要な場合には任意の必要な防腐剤または緩衝化剤とともに滅菌条件下で混合される。
【０２３９】
処置には様々な「単位用量」が含まれ得る。単位用量は、その投与（例えば、適切な経路および処置レジュメ）に伴い所望される応答を生じるように計算された治療用組成物（ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストまたはそれらの関連化合物）の予め決定された量を含むと定義される。投与される量、ならびに特定の経路および処方は、臨床分野の当業者の能力の範囲内である。処置される被験体、特に、被験体の状態および所望される防御もまた重要である。単位用量は必ずしも１回の注射として投与される必要はなく、一定の時間をかけた持続注入もまた含まれ得る。
【０２４０】
Ｘ．併用療法
本発明の状況では、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物が、脳虚血の事象をより効率よく処置するため、および／または頭蓋内圧を下げるために、さらに別の治療薬と組み合わせて使用される場合があることが想定される。いくつかの実施形態においては、従来の治療または薬剤（薬理学的治療薬が含まれるがこれに限定されない）を、本発明のアンタゴニストまたは関連化合物と併用することができる。
【０２４１】
薬理学的治療薬と、投与方法、投与量などは、当業者に周知であり（例えば、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、および「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，第１１版」（関連する部分が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）、そして、本明細書中の開示を参照して本発明と組み合わせられ得る。投与量におけるいくつかのバリエーションが、処置される被験体の症状に応じて必然的に生じるであろう。投与の当業者は、全ての事象において、個々の被験体について適切な用量を決定するであろう。そのような個々の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０２４２】
本発明において使用することができる薬学的治療薬の限定ではない例としては、抗高リポタンパク血症薬、抗動脈硬化剤、抗コレステロール剤、抗炎症薬、抗血栓剤／線維素溶解薬、抗凝固剤、抗血小板薬、血管拡張剤、および／または利尿剤が挙げられる。使用される血栓溶解剤としては、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を挙げることができるが、これらに限定されない。抗コレステロール剤としては、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸抑制薬、ニコチン酸およびその誘導体、フィブリン酸およびその誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤としては、スタチン（例えば、アトルバスタチンカルシウム（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標））、セリバスタチンナトリウム（Ｂａｙｃｏｌ（登録商標））、フルバスタチンナトリウム（Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標））、ロバスタチン（Ａｄｖｉｃｏｒ（登録商標））、プラバスタチンナトリウム（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標））、およびシムバスタチン（Ｚｏｃｏｒ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。摂取されたコレステロールの吸収を下げることが公知の物質としては、例えば、Ｚｅｔｉａ（登録商標）が挙げられる。胆汁酸抑制剤としては、コレストリラミン、コレスチポール、およびコレセバラムが挙げられるがこれらに限定されない。他の抗コレステロール薬としては、フィブリン酸およびその誘導体（例えば、ジェムフィブロジル、フェノフィブラート、およびクロフィブラート）；ニコチン酸およびその誘導体（例えば、ナイアシン、ロバスタチン）、およびニコチン酸の放出を延ばす薬剤（例えば、ナイアスパン）が挙げられる。抗炎症薬としては、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ナプロキセン、イブプロフェン、セレオキシブ）、およびステロイド系抗炎症薬（例えば、グルココルチコイド）が挙げられるがこれらに限定されない。抗凝固剤としては、ヘパリン、ワーファリン、およびクマディンが挙げられるがこれらに限定されない。抗血小板薬としては、アスピリンおよびアスピリン関連化合物（例えば、アセトアミノフェン）が挙げられるがこれらに限定されない。利尿剤としては、例えば、フロセミド（Ｌａｓｉｘ（登録商標））、ブメタニド（Ｂｕｍｅｘ（登録商標））、トルセミド（Ｄｅｍａｄｅｘ（登録商標））、チアジドおよびチアジド様利尿剤（例えば、クロロチアジン（Ｄｉｕｒｉｌ（登録商標））およびヒドロクロロチアジド（Ｅｓｉｄｒｉｘ（登録商標）、ベンズチアジン、シクロチアジン、インダパミド、クロルサリドン、ベンドロフルメチジド、メトラゾン）、アミロライド、トリアムテレン、およびスピノラクトンが挙げられるがこれらに限定されない。血管拡張剤としては、ニトログリセリンが挙げられるがこれに限定されない。
【０２４３】
したがって、特定の実施形態においては、本発明には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストの血栓溶解剤との同時投与が含まれる。これらの２つの化合物の同時投与によっては、出血性の転換が少なくなることにより血栓溶解剤の治療域が長くなるであろう。本発明の方法および薬学的組成物において使用することができる適切な血栓溶解剤の例は、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である。
【０２４４】
特定の実施形態においては、適切な血清グルコース濃度を維持するための、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストのグルコースまたは関連する糖質との同時投与が含まれる。適切な血中グルコース濃度は、約６０ｍｍｏｌ／ｌから約１５０ｍｍｏｌ／リットルの範囲内である。したがって、グルコースまたは関連する糖質は、血清グルコース濃度をこの範囲内に維持するために、組み合わせて投与される。
【０２４５】
さらなる治療薬が、さらに別の治療薬の用量が先に記載された毒性レベルを上回らない限りにおいて使用される場合には、さらに別の治療薬の有効量は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストまたはそれらの関連化合物と組み合わせて動物に投与された場合に、脳水腫を軽減するために有効な量として簡単に定義され得る。これは、動物または患者をモニターし、そして所定の処置の成功の指標である健康状態および疾患の物理的および生化学的パラメーターを測定することによって容易に決定することができる。このような方法は、動物試験および臨床診療において日常的である。
【０２４６】
本発明の方法および組成物を使用して出血性の転換を阻害する、細胞の膨張を軽減するなどのためには、当業者は一般的には、細胞を、さらに別の治療薬（例えば、ｔＰＡ、アスピリン、スタチン、利尿剤、ワーファリン、クマディン、マンニトールなど）と組み合わせられたＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物と接触させる。これらの組成物は、出血性の転換、細胞の膨張、および浮腫を阻害するために有効な組み合わせられた量として提供されるであろう。このプロセスには、細胞を、さらに別の治療薬または因子（単数または複数）と組み合わせられたＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアゴニストまたはそれらの関連化合物と、同時に接触させる工程が含まれる場合もある。これは、細胞を両方の薬剤が含まれている１つの組成物または薬学的処方物と接触させることによって、あるいは、細胞を２つの異なる組成物または処方物と同時に接触させること（この場合、一方の組成物にはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの誘導体が含まれ、他方にはさらに別の薬剤が含まれる）によって行うことができる。
【０２４７】
あるいは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストまたはそれらの関連化合物での処置の前または後に、数分から数時間から数週間から数ヶ月間の間隔が隔てられて、さらに別の薬剤での処置が行われる場合がある。さらに別の薬剤が細胞に対して別に適用される実施形態においては、当業者は一般的には、それぞれの送達の時間の間に有意な時間が過ぎすぎてしまわないことを確保するであろう。その結果、薬剤は、細胞に対して有利な組み合わせによる効果を発揮することがなお可能である。そのような場合には、細胞を、互いに約１〜２４時間、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に、両方の様式と接触させることが想定される。
【０２４８】
典型的には、血栓溶解剤の利点を最大に得るためには、治療は、脳卒中の症状の発症、迅速な診断、および脳卒中の差別化、および脳卒中型の臨界が行われてから３時間以内に治療が開始されなければならない。しかし、本発明においては、血栓溶解剤を伴うＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの投与によって、この治療域は長くなる。血栓溶解剤についての治療域は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストを同時投与することにより、数時間（４〜８時間）長くなり得る。
【０２４９】
さらなる実施形態には、ＳＵＲ１のアンタゴニスト、血栓溶解剤、およびグルコースでの処置が含まれる。グルコースの投与は、ＳＵＲ１アンタゴニストでの処置と同時である場合も、また、ＳＵＲ１アンタゴニストでの処置の後に行われる場合もある（例えば、ＳＵＲ１アンタゴニストでの処置の１５分後、またはＳＵＲ１アンタゴニストでの処置の３０分後、またはＳＵＲ１アンタゴニストでの処置の１時間後、またはＳＵＲ１アンタゴニストでの処置の２時間後、またはＳＵＲ１アンタゴニストでの処置の３時間後）。グルコースの投与は、静脈内、または腹腔内、または他の適切な経路および投与手段によって行われ得る。さらなるグルコースによって、別の方法で可能であるよりも高用量のＳＵＲ１アンタゴニストの投与が可能となる。ＳＵＲ１アンタゴニストでの処置と組み合わせられたグルコースでの処置（ＳＵＲ１アンタゴニストでの処置と同時であるか、または、ＳＵＲ１アンタゴニストでの処置より遅い時間）は、血栓溶解剤での処置が開始され得る場合には、脳卒中、外傷、または他の脳損傷後の猶予時間をさらに長くできる場合がある。
【０２５０】
さらに、アンタゴニストとｔＰＡの組み合わせによっては、再潅流後の出血性の転換の軽減または予防が得られる。出血性の転換は、循環の回復後の、無菌性梗塞から出血性の梗塞への転換である。脳卒中および再潅流のこれらの合併症が、虚血が進行するとさらに悪くなる毛細血管内皮細胞の障害に関係していることが、一般的に認められている。したがって、本発明は、虚血事象の結果として起こる内皮細胞の障害について防御作用がある。
【０２５１】
内皮細胞の障害には３つの期が含まれる。１期は、血液脳関門がまだ完全であるイオン性の浮腫の形成を特徴とする。２期は、血液脳関門がもはや完全ではない血管原性の浮腫の形成を特徴とする。３期は、毛細血管の完全性の崩壊が原因である出血性の転換を特徴とし、この間には、血液の全ての構成成分（赤血球を含む）が脳の柔組織へと浸出してしまう。ＢＢＢの崩壊には、内皮細胞の虚血によって誘導される活性化が関係しており、これによってＭＭＰ（特に、ＭＭＰ−２（ゲラチナーゼＡ）およびＭＭＰ−９（ゲラチナーゼＢ））の発現および放出が生じる。
【０２５２】
出血性の転換によっては患者の致死率が高まるので、これらの患者には緊急で処置を行うことが必要である。例えば、再潅流とｔＰＡでの処置が、血栓性脳卒中後３時間またはそれよりもさらに遅れている場合には、通常は出血性の転換が患者の中でおきていることが知られている。したがって、本発明のアンタゴニストの投与によって、虚血性の内皮細胞の壊死が少なくなり、それによりｔＰＡの治療域が長くなるであろうし、それによって患者の致死率が下がるであろう。
【０２５３】
ＸＩ．診断
アンタゴニストまたは関連化合物は、虚血もしくはニューロン、神経膠細胞の損傷を診断する、モニターする、または予後診断のために、あるいは、脳水腫、転移性腫瘍などの領域の中の神経細胞をモニターすることにおいて使用することができる。
【０２５４】
Ａ．遺伝的診断
本発明の１つの実施形態には、ＮａＣａ−ＡＴＰチャンネルの任意の部分の発現、例えば、調節ユニットＳＵＲ１の発現および／または孔を形成するサブユニットの発現を検出するための方法が含まれる。これには、発現されたＳＵＲ１のレベルおよび／または発現された孔を形成するサブユニットのレベルを決定する工程が含まれる場合がある。本発明によって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの発現のアップレギュレーションまたは高い発現がＳＵＲ１の高いレベルに関係していること、これが神経損傷（例えば、脳水腫）の拡大に関係していることが理解される。
【０２５５】
最初に、生物学的試料が被験体から得られる。生物学的試料は組織であっても、また、体液であってもよい。特定の実施形態においては、生物学的試料には、脳および／または脳の内皮細胞、あるいは微細血管および／またはグリア皮膜に由来する細胞が含まれる。例えば、転移性腫瘍においては、神経膠細胞は活性化され、そして腫瘍を取り囲む被膜を形成する。
【０２５６】
使用される核酸は、生物学的試料中に含まれている細胞から標準的な方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）にしたがって単離される。核酸は、ゲノムＤＮＡまたは分画された細胞ＲＮＡもしくは全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡが使用される場合には、ＲＮＡを相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換させることが所望される場合がある。１つの実施形態においては、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、別の実施形態においては、これはポリＡ  ＲＮＡである。通常は、核酸は増幅させられる。
【０２５７】
形式に応じて、目的の特異的核酸が、増幅を使用して直接、または増幅後に第２の公知の核酸を用いて、試料中で同定される。次に、同定された産物が検出される。特定の適用においては、検出は視覚的手段（例えば、ゲルのエチジウムブロマイド染色）によって行われ得る。あるいは、検出としては、化学発光、放射標識もしくは蛍光標識の放射シンチグラフィーによる、さらに、電気的または熱的なインパルス信号を使用するシステム（Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｌｌｕｓ，１９９４）による、生成物の間接的同定を挙げることができる。
【０２５８】
検出後、当業者は、特定の被験体において見られた結果を、正常な被験体と、脳卒中、ガン、脳水腫などと診断されている被験体の統計学的に有意な参照グループ結果と比較することができる。
【０２５９】
さらに、チップをベースとするＤＮＡ技術（例えば、Ｈａｃｉａら，（１９９６）およびＳｈｏｅｍａｋｅｒら，（１９９６）によって記載されたもの）を診断に使用できることが想定される。簡単に説明すると、これらの技術には、多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量方法が含まれる。オリゴヌクレオチドで、または固定されたプローブアレイを使用して遺伝子にタグをつけることにより、当業者は、高密度アレイとして標的分子を分離し、ハイブリダイゼーションに基づいてこれらの分子をスクリーニングするためにチップ技術を使用することができる。Ｐｅａｓｅら，（１９９４）；Ｆｏｄｏｒら，（１９９１）もまた参照のこと。
【０２６０】
Ｂ．他のタイプの診断
診断薬としての分子（例えば、化合物および／またはタンパク質および／または抗体）の効力を高めるためには、少なくとも１つの所望される分子もしくは部分を連結させる、または共有結合させる、または複合体化させることが便利である。
【０２６１】
結合体の特定の例は、分子（例えば、タンパク質、抗体、および／または化合物）が検出することができる標識に連結させられている結合体である。「検出することができる標識」は、それらの特異的な機能特性および／または化学的特性の理由により検出することができる化合物および／またはエレメントであり、その使用によって、それに付着した抗体を検出、および／または所望される場合にはさらに定量することが可能となる。
【０２６２】
結合体は、一般的には、診断薬としての使用に好ましい。診断薬は、一般的には２つのクラスに分かれ、インビトロでの診断（例えば、様々な免疫アッセイ）において使用されるもの、および／またはインビボでの診断プロトコール（一般的には、分子特異的画像化として知られている）において使用されるものである。
【０２６３】
多くの適切な造影剤が、分子（例えば、抗体）に対してそれらを付着させるための方法と同様に当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号；および同第４，４７２，５０９号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。使用される造影剤部分は、常磁性イオン；放射性同位元素；蛍光団；ＮＭＲで検出することができる物質；Ｘ線造影剤であり得る。
【０２６４】
常磁性イオンの場合には、例としてイオン、例えば、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロジウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、および／またはエルビウム（ＩＩＩ）を挙げることができ、ガドリニウムが特に好ましい。他の状況（例えば、Ｘ線撮影法）において有用なイオンとしては、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、そして特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６５】
治療的および／または診断的な適用のための放射性同位元素の場合には、２１１アスタチン、１１炭素、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、６７銅、１５２Ｅｕ、６７ガリウム、３水素、１２３ヨウ素、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１１１インジウム、５９鉄、３２リン、１８６レニウム、１８８レニウム、７５セレニウム、３５イオウ、９９ｍテクネシウム、および／または９０イットリウムを挙げることができる。１２５Ｉが、特定の実施形態での使用について多くの場合に好ましく、９９ｍテクネシウムおよび／または１１１インジウムもまた、多くの場合に、それらの低いエネルギーと長期にわたる検出に適しているとの理由から好ましい。
【０２６６】
結合体としての使用が想定される蛍光標識としては、中でも、以下が挙げられる：Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッド。
【０２６７】
本発明において想定されるリガンド結合体の別の型は、分子が、色素形成基質と接触すると有色産物を生成するであろう二次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に連結される、主にインビトロでの使用について意図される結合体である。適切な酵素の例として、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンならびに／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は、当業者に周知であり、そして、例えば、以下に記載される：米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）。
【０２６８】
様々な他の有用な免疫検出方法の工程は、学術文献（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら，（１９８７））に記載されている。免疫アッセイは、それらの最も簡単な直接の意味において、結合アッセイである。特定の好ましい免疫アッセイは、様々なタイプの放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）および免疫ビーズ捕捉アッセイである。組織切片を使用する免疫組織化学的検出もまた、特に有用である。しかし、検出がそのような技術、およびウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ分析に限定されないこと、そして同様の検出もまた、本発明と組み合わせて使用される場合があることが容易に理解されるであろう。
【０２６９】
ウェスタンブロッティングと組み合わせて使用される免疫学をベースとする検出方法としては、酵素で、放射性標識で、または蛍光でタグ化されたＳＵＲ１に対する二次分子／抗体が挙げられるか、またはＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節サブユニットが、これに関して特に使用されると考えられる。そのような標識の使用に関する米国特許としては、第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）が挙げられる。もちろん、当業者であれば、当該分野で公知であるように、二次抗体のような二次結合リガンドまたはビオチン／アビジンリガンド結合配置の使用によるさらなる利点を見出すことができる。
【０２７０】
上記画像化技術に加えて、当業者はまた、陽電子放出断層撮影、ＰＥＴ撮影法、またはＰＥＴスキャンもまた診断試験として使用できることを知っている。ＰＥＴスキャンには、陽電子の放出による放射線の検出に基づく生理学的画像の獲得が含まれる。陽電子は、被験体に投与された放射性物質から放射される微粒子である。
【０２７１】
したがって、本発明の特定の実施形態においては、アンタゴニストまたはそれらの関連化合物は、上記に記載されたように、酵素で、放射標識で、または蛍光でタグ化され、そして脳水腫による神経損傷を診断する、モニターする、および／または病期を決定するために使用される。例えば、酵素で、放射標識で、もしくは蛍光でタグ化されたアンタゴニストまたはそれらの関連化合物は、腫瘍の大きさ、限界、および／または境界を決定するために使用することができる。特定の腫瘍（例えば、転移性腫瘍）の境界を決定することは困難である。転移性腫瘍においては、神経膠細胞が活性化され、腫瘍を取り囲む被膜またはグリア被膜が形成される。したがって、標識されたアンタゴニストまたはそれらの関連化合物は、腫瘍の境界を決定するために使用することができ、このことは、外科医によるその除去の効率を高めることができる。さらに、標識されたアンタゴニストまたはそれらの関連化合物は、脳卒中後の遅れた梗塞または損傷のリスクがある周辺部または領域を決定あるいは定義するために使用される場合もある。
【０２７２】
Ｃ．化合物の投与のための処方物と経路
本発明の薬学的組成物には、有効量のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの１つ以上の調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）またはそれらの関連化合物、あるいは、薬学的に許容される担体の中に溶解または分散させられたさらに別の薬剤が含まれる。表現「薬学的または薬理学的に許容される」は、動物（例えば、適切である場合にはヒト）に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の望ましくない反応を生じることのない分子実体および組成物を意味する。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの少なくとも１つの調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物、あるいはさらに別の有効成分が含まれている薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（引用により本明細書中に組み入れられる）によって説明されているように、本開示を参照して当業者に公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与については、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄによって求められる滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならないことが理解されるであろう。
【０２７３】
本明細書中で使用される場合には、「薬学的に許容される担体」としては、当業者に公知であるように、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様の物質、およびそれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，１２８９−１３２９頁（引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。任意の従来の担体が有効成分と適合しない場合を除いて、薬学的組成物におけるその使用が想定される。
【０２７４】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物には、固体、液体、またはエアゾール形態でそれが投与されるかどうか、および注射のようなそのような投与経路に滅菌が必要かどうかに応じて、様々なタイプの担体が含まれ得る。本発明は、当業者に公知であるように、静脈内投与、皮内投与、経皮投与、クモ膜下投与、脳室内投与、動脈内投与、腹腔内投与、鼻内投与、膣内投与、直腸投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、粘膜投与、経口投与、局部投与、局所投与、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、注入、点滴、カテーテルにより、洗浄液により、クリーム剤の中で、液体組成物（例えば、リポソーム）の中で、もしくは他の方法により直接標的細胞に浴びさせられる局所潅流、あるいは上記の任意の組み合わせで投与することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。
【０２７５】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物は、遊離の塩基、中性の形態、または塩の形態の組成物に処方され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（例えば、タンパク質様組成物の遊離のアミノ基を用いて形成されたもの、あるいは、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマンデル酸）を用いて形成されたものが挙げられる。遊離のカルボキシル基を用いて形成された塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄）；または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、またはプロカイン）から導くことができる。処方の際には、溶液は、投与量の処方と適合する様式で、そして治療上有効なそのような量で投与されるであろう。処方物は、様々な投薬形態で（例えば、非経口投与のために処方された投薬形態（例えば、注射することができる溶液、または肺への投与のためのエアゾール）、または栄養による投与のために処方された投薬形態（例えば、薬物放出カプセル）など）で容易に投与される。
【０２７６】
さらに本発明にしたがうと、投与に適している本発明の組成物は、不活性な希釈剤を含むかまたは含まない薬学的に許容される担体の中に提供される。担体は吸収されるものでなければならず、これには、液体、半固体（すなわち、ペースト）、または固体の担体が含まれる。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤、または担体が、レシピエントに対して、またはその中に含まれる組成物の治療有効性に対して有害ではない限りにおいて、本発明の方法の実施において使用される投与することができる組成物の中でのその使用は適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油、水、生理食塩溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、増量剤など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。組成物には、１つ以上の成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤も含まれ得る。加えて、微生物の作用の阻止は、防腐剤（例えば、様々な抗菌剤および抗真菌剤）によってもたらされ得る。これには、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【０２７７】
本発明にしたがい、組成物は、任意の従来の、そして実践的な様式において（すなわち、溶液、懸濁液、乳化、混合、カプセル化、吸着などによって）担体と混合される。そのような手順は当業者にとっては日常的である。
【０２７８】
本発明の特異的な実施形態においては、組成物は、半固体または固体の担体と徹底的に組み合わせられるかまたは混合される。混合は、粉砕のような任意の従来の様式で行うことができる。安定剤もまた、治療活性が失われること（すなわち、胃での変性）から組成物を保護するために、混合プロセスに加えることができる。組成物において使用される安定剤の例としては、緩衝液、アミノ酸（例えば、グリシンおよびリジン）、糖質（例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなど）が挙げられる。
【０２７９】
さらなる実施形態においては、本発明は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物、１つ以上の脂質と、水性溶媒を含む、薬学的脂質媒体組成物の使用に関係し得る。本明細書中で使用される場合には、用語「脂質」は、特徴として水に不溶であり、有機溶媒で抽出することができる広範囲の物質の全てを含むと定義されるであろう。化合物のこの広いクラスは当業者に周知であり、用語「脂質」が本明細書中で使用される場合には、任意の特定の構造に限定されない。例として、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体が含まれている化合物が挙げられる。脂質は、自然界に存在しているものであっても、また合成のもの（すなわち、人間によって設計されたかまたは生産されたもの）であってもよい。しかし、脂質は通常は、生物学的物質である。生物学的脂質は当該分野で周知であり、これには、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リソリピッド、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテルおよびエーテル結合脂肪酸を含む脂質、および重合させることができる脂質、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。もちろん、脂質として当業者によって理解されている本明細書中に具体的に記載された化合物以外の化合物もまた、本発明の組成物および方法に含まれる。
【０２８０】
当業者は、脂質媒体の中に組成物を分散させるために使用することができる広範囲の技術をよく知っているであろう。例えば、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物は、液体を含むよう液の中に分散させること、液体を用いて溶解させること、液体で乳化させること、液体と混合すること、液体と組み合わせること、液体に共有結合させること、液体中の懸濁液として含ませること、ミセルもしくはリポソームとともに含ませるかまたはそれらと複合体化させること、あるいは別の方法で、当業者に公知の任意の手段によって脂質または脂質構造と会合させることができる。分散は、リポソームの形成の結果である場合も、またそうではない場合もある。
【０２８１】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、物理的および生理学的要因（例えば、体重、症状の重篤度、処置される疾患のタイプ、以前のもしくは現在の治療的および／または予防的介入、患者の特発性疾患、ならびに投与経路）に応じて決定することができる。投与量と投与経路に応じて、好ましい投与量の投与回数および／または有効量の投与の回数は被験体に応答にしたがって変化するであろう。いずれにしても、投与を担う医師が、個々の被験体についての組成物中の有効成分（単数または複数）の濃度と適切な用量（単数または複数）を決定するであろう。
【０２８２】
特定の実施形態においては、薬学的組成物には、例えば、少なくとも約０．１％の活性のある化合物が含まれ得る。他の実施形態においては、活性のある化合物は、単位重量の約２％から約７５％を占めるか、または例えば、約２５％から約６０％を占め、そしてその範囲の中で変化するであろう。当然ながら、個々の治療上有用な組成物の中の活性のある化合物（単数または複数）の量は、適切な投与量が任意の所定の単位用量の化合物の中に得られるであろう方法で調製され得る。溶解度、生体利用性、生物学的半減期、投与経路、生成物の有効期限のような要因、ならびに他の薬理学的考慮事項は、そのような薬学的処方物を調製する当業者によって想定されるであろう。そして、そのような様々な投与量と処置レジュメが所望され得る。
【０２８３】
薬学的処方物は、任意の適切な投与経路または手段（栄養による投与、非経口投与、局所投与、粘膜投与、または他の投与経路もしくは手段）によって投与することができる。栄養による投与経路としては、経口経路、口腔経路、直腸経路、および舌下経路での投与が挙げられる。非経口の投与経路としては、脳の柔組織への注射、ならびに、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、動脈内投与、クモ膜下投与、皮下投与、腹腔内投与、および静脈内投与の投与経路が挙げられる。局所的な投与経路としては、皮内投与が挙げられる。
【０２８４】
Ｄ．栄養による投与のための組成物および処方物
本発明の好ましい実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物が、栄養経路により投与されるように処方される。栄養による経路としては、組成物が消化管と直接接触する全ての可能な投与経路が挙げられる。具体的には、本明細書中に開示される薬学的組成物は、経口投与することも、口腔投与することも、直腸投与することも、また、舌下投与することもできる。このように、これらの組成物は、不活性な希釈剤とともに、または吸収される食用の担体とともに処方される場合があり、また、ハードもしくはソフトゼラチンカプセルの中に封入される場合があり、また、これらは、錠剤になるように圧縮される場合も、また、食事療法様の食品に直接取り込ませられる場合もある。
【０２８５】
特定の実施形態においては、活性のある化合物は賦形剤とともに取り込まれ得、そして摂取可能な錠剤、口腔用錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、坐剤、シロップ剤、ウエハーなどの形態で使用される（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら，１９９７；Ｈｗａｎｇら，１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０，５７９号、および同第５，７９２，４５１号（それぞれ、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる））。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などにはまた、以下も含まれる場合がある：結合剤（例えば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、またはそれらの組み合わせ）；賦形剤（例えば、第二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはそれらの組み合わせ）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、またはそれらの組み合わせ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン、またはそれらの組み合わせ）；香味剤（例えば、ペッパーミント、ウィンターグリーンの油、サクランボ香料、オレンジ香料など）。単位投与量形態がカプセル剤である場合には、これには上記のタイプの材料に加えて液体担体も含まれる場合がある。様々な他の材料が、コーティングとして、または別の方法で投与量単位の物理的形態を修飾するために存在する場合がある。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖、またはそれらの両方でコーティングすることができる。投与量形態がカプセル剤である場合には、これには上記のタイプの材料に加えて、液体担体のような担体も含まれる場合がある。ゼラチンカプセル、錠剤、または丸剤は、腸溶コーティングされる場合がある。腸溶コーティングにより、ｐＨが酸性である胃または腸の上部での組成物の変性が妨げられる。例えば、米国特許第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に達すると、その中の塩基性ｐＨによってコーティングが溶解して、組成物が放出させられ、特定の細胞（例えば、腸上皮細胞およびＰｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ  Ｍ細胞）によって吸収される。エリキシル剤のシロップには、甘味剤としての活性のある化合物スクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびに、サクランボまたはオレンジ香料のような香味剤が含まれ得る。もちろん、任意の単位投薬形態の調製において使用されるあらゆる材料は、使用される量において、薬学的に純粋でなければならず、そして実質的に非毒性でなければならない。加えて、活性のある化合物は、徐放調製物および処方物に取り込ませられ得る。
【０２８６】
あるいは、経口投与のためには、本発明の組成物は、うがい薬、歯磨き剤、口腔用錠剤、経口用噴霧剤、または舌下に経口投与される処方物の形態に、１つ以上の賦形剤とともに取り込ませられえる。例えば、うがい薬は、適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））の中に必要量の有効成分を取り込ませることによって調製することができる。あるいは、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含むもののような経口溶液に取り込ませることも、また、歯磨き剤の中に分散させることも、また、水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、および保湿剤を含めることができる組成物に治療有効量で添加することもできる。あるいは、組成物は、舌下に置くことができるか、または別の方法で口の中で溶解させることができる、錠剤あるいは溶液の形態にされる場合もある。
【０２８７】
栄養による投与の他の形態に適しているさらなる処方物としては、坐剤が挙げられる。坐剤は、通常は直腸への挿入によって投薬される、様々な重量および形状の固体の投薬形態である。挿入後、坐剤は体腔液中で柔らかくなる、融解する、または溶解する。一般的には、坐剤については、従来の担体（例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせ）を挙げることができる。特定の実施形態においては、坐剤は、例えば、約０．５％から約１０％の範囲、そして好ましくは、約１％から約２％の有効成分を含む混合物から形成させることができる。
【０２８８】
Ｅ．経口用の組成物および処方物
さらなる実施形態においては、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物は、非経口経路によって投与することができる。本明細書中で使用される場合は、用語「非経口」には、消化管をバイパスする経路が含まれる。具体的には、本明細書中に開示される薬学的組成物は、例えば、静脈内投与、皮内投与筋肉内投与、動脈内投与、脳室内投与、クモ膜下投与、皮下投与、または腹腔内投与することができるが、これらに限定されない（米国特許第６，７５３７，５１４号、同意第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号；および同第５，３９９，３６３号（それぞれが具体的にそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる））。
【０２８９】
遊離の塩基または薬学的に許容される塩としての活性のある化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水の中に調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物の中に、ならびに油の中に調製することができる。通常の保存および使用の条件下では、これらの調製物には、微生物の増殖を防ぐための防腐剤が含まれる。注射することができる用途に適している薬学的形態としては、滅菌の水溶液または分散液、および滅菌の注射することができる溶液もしくは分散液の即座の調製のための滅菌の粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる））。全ての場合において、これらの形態は滅菌された状態でなければならず、そして容易に注射できる程度に流動体でなければならない。これは製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）による汚染作用に対して守られなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ＤＭＳＯ、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物性油を含む溶媒あるいは分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子の大きさの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合には、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射することができる組成物のより長期間にわたる吸収は、組成物の中での吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によってもたらされ得る。
【０２９０】
水溶液中での非経口投与については、例えば、溶液は、必要である場合には適切に緩衝化されなければならず、そして液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にさせられる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。これに関して、使用することができる滅菌の水性媒体は、本発明の開示を参照して当業者に公知であろう。例えば、１投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解させることができ、そしてこれを、１０００ｍｌの皮下注入用の液体に添加するか、または提案された注入部位に注射するかのいずれかを行うことができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１５版、１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。投与量についてのいくつかのバリエーションが、処置される被験体の症状に応じて必然的に存在するであろう。いずれにしても、投与を行うヒトが個々の被験体についての適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって求められる滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
【０２９１】
滅菌の注射することができる溶液は、必要量の活性のある化合物を適切な溶媒の中に、必要に応じて上記の様々な他の成分とともに取り込ませること、その後、滅菌濾過することによって調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、塩基性分散媒体と上記から必要な他の成分を含む滅菌の媒体の中に取り込ませることによって調製される。滅菌の注射することができる溶液の調製のための滅菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は減圧乾燥および凍結乾燥技術であり、これらにより予め滅菌濾過されたそれらの溶液から有効成分と任意のさらなる所望される成分の粉末が得られる。粉末状にされた組成物は、安定剤を伴ってまたは伴わずに、液体担体（例えば、水または生理食塩溶液）と共に組み合わせられる。
【０２９２】
Ｆ．混合型の薬学的組成物および処方物
本発明の他の好ましい実施形態においては、ＮＣＣａＡＴＰチャンネルの活性のある化合物である調節因子（アンタゴニストおよび／またはアゴニスト）または関連化合物は、様々な混合型の経路（例えば、局所投与（すなわち、経皮投与）、粘膜投与（鼻内投与、膣投与など）、および／または吸入）による投与のために処方することができる。
【０２９３】
局所投与のための薬学的組成物としては、医学的用途のために処方された活性のある化合物（例えば、軟膏、ペースト剤、クリーム剤、または粉末剤）を挙げることができる。軟膏には、局所塗布のための全ての油性のもの、吸着性のもの、エマルジョン、および水溶性のものをベースとする組成物が含まれるが、クリーム剤およびローション剤は、エマルジョン基剤だけを含むそのような組成物である。局所投与される医薬品には、皮膚からの有効成分の吸収を促進する浸透促進剤が含まれる場合がある。適切な浸透促進剤としては、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、およびラウロカプラムが挙げられる。局所塗布用の組成物について可能な基剤としては、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、およびワセリン、ならびに、任意の他の適切な吸収性のもの、エマルジョン、または水溶性軟膏基剤が挙げられる。局所用調製物にはまた、乳化剤、ゲル化剤、および有効成分の保存および均質な混合物を提供するために必要な場合には、抗微生物性の防腐剤も含まれる場合がある。本発明の経皮投与にはまた、「パッチ」の使用も含まれ得る。例えば、パッチによっては、予め決定された速度、および固定された期間にわたる持続的な様式での１つ以上の活性のある物質が供給され得る。
【０２９４】
特定の実施形態においては、薬学的組成物は、点眼薬、鼻内スプレー、吸入、および／または他のエアゾール送達媒体によって送達され得る。鼻内エアゾールスプレーによって肺に組成物を直接の送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（それぞれ、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。同様に、鼻内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら，１９９８）およびリソホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が具体的に引用により本明細書中に組み入れられる）を使用する肺への送達もまた、薬学の分野では周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での粘膜を介する薬物の投与は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が具体的に引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
【０２９５】
用語「エアゾール」は、液化ガスまたは圧縮ガスである推進剤の中に分散させられた液体粒子の微粉化させられた固体のコロイドシステムを意味する。吸入用の本発明の典型的なエアゾールは、液体推進剤中の、または液体推進剤と適切な溶媒の混合物中の有効成分の懸濁液から構成されるであろう。適切な推進剤としては、炭化水素および炭化水素エーテルが挙げられる。適切な容器は、推進剤の圧力要件にしたがって様々であろう。エアゾールの投与は、被験体の年齢、体重、ならびに、症状の重篤度および応答によって様々であろう。
【０２９６】
ＸＩＩ．診断用または治療用キット
本明細書中に記載される組成物の任意のものがキットの中に含まれ得る。限定ではない例においては、ＳＵＲ１に選択的に結合するかまたはＳＵＲ１を同定する化合物が診断用キットに含まれ得ると想定される。そのような化合物は、「ＳＵＲ１マーカー」と呼ぶことができ、これには、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、ＳＵＲ１オリゴヌクレオチド、ＳＵＲ１ポリペプチド、低分子またはそれらの組み合わせ、アンタゴニスト、アゴニストなどが含まれ得るが、これらに限定されない。これらのＳＵＲ１マーカーのうちの任意のものを、迅速な決定のために、放射性物質および／または蛍光マーカーおよび／または酵素タグに連結させることができることが想定される。キットにはまた、適切な容器手段の中に、脂質、および／またはさらに別の物質（例えば、放射性マーカーまたは酵素マーカーまたは蛍光マーカー）が含まれる場合もある。
【０２９７】
キットには、標識されているかまたは未標識であるかにはかかわらず、検出アッセイのための検量線を調製するために使用することができる、本発明の適切にアリコートされたＳＵＲ１マーカー、脂質、および／またはさらに別の薬剤組成物が含まれる場合がある。キットの組成物は、水性媒体の中、または凍結乾燥させられた形態のいずれかでパッケージ化され得る。キットの容器手段には、一般的には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、注射器、または他の容器手段が含まれるであろう。その中には、１つの成分を入れることができ、好ましくは適切にアリコートされる。キットの中に１種類以上の成分が存在する場合には、キットにはまた、通常は、第２、第３、または他のさらなる容器が含まれるであろう。その中には、さらに別の成分が別々に入れられ得る。しかし、複数の成分の様々な組み合わせが１つのバイアルの中に含まれる場合がある。本発明のキットにはまた、通常は、ＳＵＲ１マーカー、脂質、さらに別の薬剤、そして委託販売のための厳重な管理下にある任意の他の試薬容器を含めるための手段も含まれるであろう。そのような容器には、所望されるバイアルが保持される射出または吹き込み成型されたプラスチック製の容器が含まれ得る。
【０２９８】
本発明の治療用キットは、アンタゴニスト、アゴニスト、またはそれらの関連化合物が含まれているキットである。処置される症状および／または疾患に応じて、キットには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断および／もしくは阻害するためのＳＵＲ１アンタゴニストまたはそれらの関連化合物が含まれ得るか、あるいは、キットには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口のためのＳＵＲ１アゴニストまたはそれらの関連化合物が含まれ得る。そのようなキットには、一般的には、適切な容器手段の中に、ＳＵＲ１アンタゴニスト、アゴニスト、またはそれらの関連化合物の薬学的に許容される処方物が含まれるであろう。キットには、１つの容器手段が含まれる場合も、そして／また、これには、それぞれの化合物についての別々の容器手段が含まれる場合もある。例えば、治療用化合物および溶液は、同じ容器の中に含まれる場合も、あるいは、治療用化合物と溶液が、別の容器の中にそれぞれ含まれる場合もある。キットには、溶液の容器の中に含まれる治療用化合物を含む１つの容器が含まれる場合もある。
【０２９９】
キットの成分が１つの液体溶液および／または複数の液体溶液の中に提供される場合には、液体溶液は水溶液であり、滅菌の水溶液が特に好ましい。ＳＵＲ１アンタゴニスト、アゴニスト、またはそれらの関連化合物もまた、注射器に入れることができる組成物に処方することができる。この場合は、容器手段は、注射器、ピペット、および／または他の同様の装置自体であり得、そこから処方物を体の感染した領域に適用することができ、動物に注射することができ、そして／また、キットの他の成分にさらに加えることおよび／またはキットの他の成分と混合することもできる。
【０３００】
水溶液の例としては、エタノール、ＤＭＳＯ、および／またはＲｉｎｇｅｒ’ｓ溶液が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、使用されるＤＭＳＯまたはエタノールの濃度は、０．１％または（１ｍｌ／１０００Ｌ）を超えない。
【０３０１】
しかし、キットの成分は、乾燥粉末（単数または複数）として提供される場合もある。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合には、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒は別の容器手段の中に提供される場合もあることが想定される。
【０３０２】
容器手段には、通常、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、注射器、および／または他の容器手段が含まれるであろう。それらの中には、ＳＵＲ１アンタゴニスト、アゴニスト、またはそれらの関連化合物が適切に配分される。キットには、滅菌の薬学的に許容される緩衝液および／または他の希釈剤を含めるための第２の容器手段も含まれる場合がある。
【０３０３】
本発明のキットにはまた、通常は、委託販売のための厳重な管理下にバイアルを含めるための手段（例えば、その中に所望されるバイアルが保持される射出または吹き込み成型されたプラスチック製の容器）もまた含まれるであろう。
【０３０４】
容器の数および／またはタイプにはかかわらず、本発明のキットにはまた、ＳＵＲ１アンタゴニスト、アゴニスト、またはそれらの関連化合物の動物の体内への注射／投与および／または配置を助けるための危機が含まれる場合も、そして／また、そのような機器と共にパッケージ化される場合もある。そのような機器は、注射器、ピペット、鉗子、および／または任意のそのような医療用の承認されている送達媒体であり得る。
【０３０５】
ＳＵＲ１アンタゴニスト、アゴニスト、またはそれらの関連化合物に加えて、キットにはまた、第２の有効成分も含まれ得る。第２の有効成分の例としては、低血糖を防ぐための物質（例えば、グルコース、Ｄ５Ｗ、グルカゴンなど）、血栓溶解剤、抗凝固剤、抗血小板薬、スタチン、利尿剤、血管拡張剤などが挙げられる。これらの第２の有効成分は、ＳＵＲ１アンタゴニスト、アゴニスト、またはそれらの関連化合物と同じバイアルの中で組み合わせられる場合も、また、別のバイアルの中に含められる場合もある。
【０３０６】
さらに、本発明のキットにはまた、グルコース試験キットも含まれ得る。したがって、患者の血中グルコース濃度が、グルコース試験キットを使用して測定され、その後、ＳＵＲ１アンタゴニスト、アゴニスト、またはその関連化合物を被験体に投与することができ、続いて、患者の血中グルコース濃度を測定することができる。
【０３０７】
上記のキットに加えて、本発明の治療用キットは、ＩＶバッグに、ＩＶバッグの中に化合物を放出させるために開口させるまたは破ることができる隔壁またはチャンバーが含まれるように組み立てることができる。別のタイプのキットとしてはボーラスキットを挙げることができる。この場合、ボーラスキットには、予め充填された注射器、または使用が同様に容易であり迅速に投与することができるデバイスが含まれる。注入キットには、バイアルまたはアンプルと、注入前に加えられるバイアルまたはアンプルのためのＩＶ溶液（例えば、Ｒｉｎｇｅｒ溶液）が含まれる場合がある。注入キットにはまた、注入前、その間、または後に被験体に投与されるボーラス用量／負荷量のためのボーラスキットも含まれ得る。
【実施例】
【０３０８】
以下の実施例は、本発明のさらなる説明のために提供され、本発明を限定することはない。本明細書中に提供される実施例は、説明の目的のためのものにすぎず、決して本発明の範囲を限定するようには意図されない。本発明は詳細に、そしてその特異的な実施形態に関して記載されているが、様々な変更および改良を、開示される特異的な実施形態において行うことができ、そしてそれらがなおも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似する結果をもたらすことは、当業者に明らかであろう。実験手順および例示的な手順が以下に記載され、これにより、本発明についてのさらに可能なサポートを提供する。具体的には、新しく単離された反応性星状細胞を使用するインビトロでの実験と、適切な動物モデルを使用するインビボでの実験が開示される。
【０３０９】
細胞の調製
反応性星状細胞は、以下の様式でインビボで生産させ、生体の脳から回収した：本明細書中に記載するように、ゼラチンスポンジ（Ｇｅｌｆｏｒｍ（登録商標）、Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏ．，Ｋａｌａｍａｚｏｏ  ＭＩ）を８週齢のＷｉｓｔａｒラットの頭頂葉の刺創に埋め込んだ。スポンジの断片を８日目に回収し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の中で３回洗浄して、付着している組織を除いた。特定の研究に必要なＮＲＡの数に応じて、スポンジの断片を、刺創への埋め込み後、早い段階で回収することも、また遅い時期に回収することもできる。回収は、埋め込み後、約２日から約３０日までに行われることが好ましく、最も好ましい範囲は、埋め込み後、約２日から約３日までに行われることである。
【０３１０】
ＲＮＡを、以下の様式でスポンジの断片から新しく単離した：洗浄した断片を、以下から構成されている（ｍＭ）人工の脳脊髄液（ａＣＳＦ）を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れた：１２４ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭ、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、および１０ｍＭのＤ−グルコース；ｐＨ７．４、約２９０ｍＯｓｍ。ここでは、ａＣＳＦには、パパイン２０Ｕ／ｍｌ、トリプシン阻害剤１０ｍｇ／ｍｌ、およびＤＮａｓｅ  ０．００１％（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）が含まれる。その全体を「消化システム」と呼ぶ。
【０３１１】
この消化システムを２０分間、インキュベーター（加湿した９０％／１０％空気／ＣＯ２、３７℃）に移し、５分毎にゆっくりと粉砕した。細胞懸濁液を３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ペレット化した細胞をＣＳＦの中に再度懸濁させ、研究するまで４℃で保存した。
【０３１２】
いくつかの研究のためには、ＣＳＦ中への再懸濁の前に、ペレット化した細胞をさらに、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１  ０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の中での密度勾配遠心分離を使用して赤血球（ＲＢＣ）を除去することによって精製することができる。このさらなる精製プロセスによっては、位相差顕微鏡法によって決定するとＲＢＣが＜＜１％である細胞の集団を得ることができる。
【０３１３】
走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
細胞のブレブ形成と膨張を研究するために、新しく単離した細胞をＮａＮ３に対して室温で曝し、次いで、様々な時間的間隔の後、細胞を氷冷した４％のホルムアルデヒド＋１％のグルタルアルデヒドを使用して２４時間固定し、その後、段階的濃度（３５、５０、７５、９５、１００％）のエタノールを使用して脱水した。検体を臨界点乾燥させ（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ）、金でコーティングし（Ｔｅｃｈｎｉｃｓ）、そしてＡＭＲ  １０００走査電子顕微鏡を使用して観察した。
【０３１４】
電気生理学
実験は、細胞の単離から２４時間以内のＮＲＡを使用して、室温（２２〜２５℃）で行った。これらの新しく単離したＮＲＡのアリコートを、以下を含む細胞外浴溶液（ａ）を満たした記録チャンバーの中に入れた：ＮａＣｌ  １３０、ＫＣｌ  １０、ＣａＣｌ２  １、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  ３２．５、グルコース  １２．５、ｐＨ７．４。表面に生存している細胞が付着した後に、過剰量の溶液をフラッシュすることによって遠心分離によって先に除去することができなかった残っていた破片を洗い流した。膜電流を増幅させ（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、そしてデジタルボード（ｄｉｇｉｔｉｚｉｎｇ  ｂｏａｒｄ）（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １２００Ａ，Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と実行用のＣｌａｍｐｅｘソフトウェア（バージョン８．０、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を取り付けたマイクロコンピューターを使用して５ｋＨｚでオンラインサンプリングした。膜電流を、Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｙ，１９８８に記載されている方法にしたがって、細胞が付着した完全な細胞構造と、ナイスタチンで孔をあけた完全な細胞構造の両方を使用して完全な細胞の中で記録した。膜電流を、細胞を含まない単離された膜パッチの中で、インサイドアウト構造とアウトサイドアウト構造の両方を使用して、Ｈａｍｉｌｌら，１９８１に記載されているように記録した。ホウケイ酸塩ガラスから引っ張り出されたパッチクランプピペット（Ｋｉｍａｘ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｅ，ＰＡ）は、単一チャンネルの記録については６〜８ＭΩ、そしてナイスタチンで孔をあけた完全な細胞の技術を使用した実験については２〜４ＭΩの抵抗を有していた。浴電極はＡｇ／ＡｇＣｌペレット（Ｃｌａｒｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｅｎｇｌａｎｄ）である。これを、３ＭのＫＣｌから作成されたアガーブリッジを使用して浴に繋いだ、浴［Ｃｌ−］を交換する場合を除き、浴の中に直接入れた。
【０３１５】
用語「細胞内」および「細胞質」は、用語「細胞外」および「外部」と同様に、互換的に使用することができる。用語「電圧」および「電位」は、膜電圧または膜電位について言及する場合には、互換的に使用される。細胞膜を「クランプする（ｃｌａｍｐｉｎｇ）」は、細胞膜を通過する電圧を一定に保ち、そしてイオンチャンネルの開口と閉鎖が原因である膜抵抗の変化として膜電流の変化を測定すること（「電圧クランプ」）、あるいは、細胞膜を通過する電流を一定に保ち、そしてイオンチャンネルの開口と閉鎖が原因である膜抵抗の変化として膜電圧の変化を測定すること（「電流クランプ」）をいう。膜電圧が細胞にかかる（例えば、「ランプ」または「パルス」によって）と、細胞膜は電圧クランプされ、そして膜電流が測定されることが理解される。膜の「静止電位」が測定される場合には、細胞膜が電流クランプされ、そして膜電圧が測定されることが理解される。
【０３１６】
「完全な細胞」の実験構造は、記録ピペットが細胞膜を透過し、その結果、ピペット溶液が細胞質と連続するか、またはピペットの下の膜にナイスタチンを使用して孔があげられ、外部溶液が細胞膜と接触し、そして電流または電圧の記録が完全な細胞膜からの測定を示す状況をいう。「細胞が付着したパッチ」の実験構造は、ピペットが細胞に接触し、その結果、パッチがなおも完全な細胞膜の一部を形成し、パッチの中のチャンネルが記録される状況をいう。「アウトサイドアウトパッチ」の実験構造は、細胞膜の切除されたパッチが記録ピペットのチップに対してシールされ、その結果、ピペット溶液が膜の細胞外側と接触し、外部溶液が膜の細胞質側と接触し、そして電流または電圧の記録が膜の切除されたパッチからの測定を示す状況をいう。「インサイドアウトパッチ」の実験構造は、細胞膜の切除されたパッチが記録ピペットのチップに対してシールされ、その結果、ピペット溶液が膜の細胞質側と接触し、外部溶液が膜の細胞外側と接触し、そして電流または電圧の記録が膜の切除されたパッチからの測定を示す状況をいう。
【０３１７】
用語「パッチ」には、インサイドアウトパッチ、アウトサイドアウトパッチ、細胞膜の切除されたパッチ、または細胞が付着したパッチが含まれるが、これらに限定されない。用語「膜調製物」には、パッチ、ならびに、哺乳動物細胞または組織から単離された細胞膜が含まれる。単離された哺乳動物細胞膜は当該分野で周知の方法によって生産される。そのような膜調製物の一例は、不連続なスクロース勾配遠心分離によって破裂させられた細胞または組織試料から精製されたミクロソーム画分である。
【０３１８】
＜３ＧΩのシール抵抗と＞５０ＭΩのアクセス抵抗を有しているパッチを廃棄した。微小な膜電流を、−６７ｍＶの保持電位から、ステップパルス（６００ｍｓ）の間に、またはランプパルス（０．３２ｍＶ／ｍｓで−１４０から＋５０ｍＶ）の間に測定した。
【０３１９】
記録溶液
完全な細胞の顕微鏡による記録のために、ナイスタチンで孔をあけたパッチの技術を、以下を含む（ｍＭ）浴溶液とともに使用した：ＮａＣｌ  １３０、ＫＣｌ  １０、ＣａＣｌ２  １、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  ３２．５、グルコース  １２．５、ｐＨ７．４。ピペット溶液には以下を含めた（ｍＭ）：ＫＣｌ  ５５、Ｋ２ＳＯ４  ７５、ＭｇＣｌ２  ８、およびＨＥＰＥＳ  １０、ｐＨ７．２。５０ｍｇのナイスタチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。作業溶液を１６．５μｌのナイスタチンストック溶液を５ｍｌの基本のピペット溶液に添加して、１６５μｇ／ｍｌのナイスタチンと３．３μｌ／ｍｌのＤＭＳＯの最終濃度とすることによって、実験の前に作成した。このピペット溶液の組成には、別の場合に含まれるＫＣｌの一部の代わりにＫ２ＳＯ４が含まれている。ＳＯ４２−陰イオンは、Ｃｌ−とは異なり、ナイスタチンの孔を透過することはできない。ピペット［Ｃｌ−］が減少すると、細胞の中へのＣｌ−についての駆動力が低下し、それによって細胞の浸透圧による膨張が最少になる。これは、別の方法で電気生理学的記録の間に起こる可能性もある（Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｙ，１９８８）。
【０３２０】
細胞が結合したパッチの記録のためには、以下を含む（ｍＭ）浴溶液を使用した：ＮａＣｌ  １３０、ＫＣｌ  １０、ＣａＣｌ２  １、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  ３２．５、グルコース  １２．５、ｐＨ７．４。ピペットには以下を含めた（ｍＭ）：ＫＣｌ  １４５、ＭｇＣｌ２  １、ＣａＣｌ２  ０．２  ＥＧＴＡ  ５、ＨＥＰＥＳ  １０、ｐＨ７．２８。測定した細胞外溶液の浸透圧は約３００ｍＯｓｍであった（Ｐｒｅｃｉｓｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）。
【０３２１】
ほとんどのインサイドアウトパッチの記録のためには、以下を含む（ｍＭ）浴溶液を使用した：ＣｓＣｌ  １４５、ＣａＣｌ２  ４．５、ＭｇＣｌ２  １、ＥＧＴＡ  ５、ＨＥＰＥＳ  ３２．５、グルコース  １２．５、ｐＨ７．４。ピペットには以下を含めた（ａ）：ＣｓＣｌ  １４５、ＭｇＣｌ２  １、ＣａＣｌ２  ０．２、ＥＧＴＡ  ５、ＨＥＰＥＳ  １０、ｐＨ７．２８。他のインサイドアウトパッチの記録のためには、上記溶液中のＣｓ＋を等モルのＫ＋で置き換えた。
【０３２２】
無機陽イオン置換実験のためには、ピペットの中のＣｓ＋を、通常は、等モル濃度の個々の試験イオンで置き換えた（Ｃｏｏｋら，１９９０）。
【０３２３】
アウトサイドアウトパッチの記録のためには、ピペット溶液には以下を含めた（ｍＭ）：ＣｓＣｌ  １４５、ＭｇＣｌ２  １、ＣａＣｌ２  ０．２、ＥＧＴＡ  ５、ＨＥＰＥＳ  １０、ｐＨ７．２８。標準的な浴溶液には以下を含めた（ｍＭ）：ＣｓＣｌ  １４５、ＣａＣｌ２  ２４．５、ＭｇＣｌ２  １、ＥＧＴＡ  ５、ＨＥＰＥＳ  ３２．５、グルコース  １２．５、ｐＨ７．４。有機陽イオン置換実験のためには、浴中のＣｓ＋を、等モル濃度の試験陽イオンで置き換えた。
【０３２４】
浴溶液中の低濃度の遊離のＣａ２＋が必要な実験については、Ｃａ２＋−ＥＧＴＡ緩衝溶液を使用し、遊離の［Ｃａ２＋］をプログラムＷＥＢＭＡＸＣ  ｖ２．１０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／−ｃｐａｔｔｏｎ／ｍａｘｃ．ｈｔｍｌ）を使用して計算した。［Ｃａ２＋］＝１μＭについては、５ｍＭのＥＧＴＡと４．５ｍＭのＣａ２＋塩を使用した。［Ｃａ２＋］＝１μＭはまた、細胞内ＡＴＰとＭｇ２＋活性を試験するための溶液中でも使用した。
【０３２５】
コンダクタンスの傾斜を計算するために使用した単一チャンネル増幅は、様々な電位で得た記録の全点増幅ヒストグラムに対してガウス関数をフィットさせることによって得た。様々な電位で、そして様々な試験試薬を用いた場合のチャンネル開口確立（ｎ・Ｐｏ）を計算するためには、全点ヒストグラムをガウス関数にフィットさせ、チャンネルの開口についてフィットさせた曲線下の面積を、チャンネルの閉鎖と開口についてフィットさせた曲線下の面積で割り算した。試験薬剤の様々な濃度でのｎ・Ｐｏの値を、最小二乗法を使用して標準的なロジスティック方程式にフィットさせた。
【０３２６】
Ｋ＋についてのイオン透過性に対して相対的な様々な陽イオンのイオン透過性を推定するために、それぞれの透過性（Ｐｘ／ＰＫ）を、当該分野で周知のＧｏｌｄｍａｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ−Ｋａｔｚ（ＧＨＫ）方程式にフィットさせることによりその逆転電位（Ｅｒｅｖ）から得た。Ｇｏｌｄｍａｎ  １９４３；Ｈｏｄｇｋｉｎ  ａｎｄ  Ｋａｔｚ，１９４９を参照のこと。電流−電圧データをＧＨＫ方程式にフィットさせて、Ｋ＋と試験イオンの両方を透過させることができることを仮定した。
【０３２７】
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの孔の大きさを推測するために、有機陽イオンの相対的な透過性を評価した。Ｓｔｏｋｅ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ半径（ｒｓｅ）を、式：ｒＳＥ・λ＝定数を用いて、イオンの極限伝導率（・）から計算した。定数は、２５℃でのＴＥＡの反応から決定し、これについては、λ＝４４．９ｃｍ２Ω−１、ｒＳＥ＝０．２０４ｎｍであった。Ｓｔｏｋｅ−Ｓｉｎｓｔｅｉｎ半径を、その後、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｓ，１９７０において、図６．１から読み取った相関係数を使用してモル半径に変換した。エタノールアミンについての同等の極限伝導率を得（前記の箇所）、そして他のイオンについての極限伝導率を、式ＭＷ０．５・λ＝定数によってそれらの分子量から計算した。定数は、２５℃でのエタノールアミンについての値から決定した：ＭＷ＝６２．１およびλ＝４．４２ｃｍ２Ω−１等量。その後、相対的な透過性（Ｐｘ／ＰＣｓ）を、計算したイオン半径に対してプロットした。孔を通過する透過速度（透過性）に対する溶質の大きさの効果は、Ｒｅｎｋｉｎ方程式（Ｒｅｎｋｉｎ，１９５５）によって表す：
ａ／ａ０＝［１−（ｒ／Ｒ）］２・［１−２．１０４（ｒ／Ｒ）＋２．０９（ｒＲ）３−０．９５（ｒ／Ｒ）５］（１）
式中、ａ、ａ０、ｒ、およびＲは、それぞれ、孔の有効面積、孔の全断面積、溶質の半径、および孔の半径である。
【０３２８】
接合部位電位は、透析膜を通過する確立された拡散電位を測定することによって電位計を用いて決定し、適切である場合には引き算した。保持電流は、いずれの記録からも引き算しなかった。拡散電流は、ＮａＮ３の潅流の前後の電流の記録を単純に引き算することによって、他の処理を使用することなく得た。
【０３２９】
（実施例１）
ＮａＮ３を用いたＡＴＰ枯渇に伴う形態学的変化
培養した神経細胞は、ＡＴＰが枯渇すると膨張することが示されている。Ｊｕｒｋｏｗｉｔｚ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９９２；Ｊｕｒｋｏｗｉｔｚ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９９３を参照のこと。ＡＴＰを枯渇させた新しく単離したＮＲＡもまた、細胞の膨張を生じた。脳の虚血または外傷性損傷もまた、脳の神経細胞においてＡＴＰの枯渇を引き起こす。
【０３３０】
新しく単離したＮＲＡの表面は高度に複雑であり、図１４Ａの走査電子顕微鏡写真に示すように、細胞表面全体を飾る小さい膜外転や細かい突起を示している。ＮａＮ３（１ｍＭ）に対するＮＲＡの曝露によってその外観に変化が生じ、これは、初期には複雑な構造が失われること、および表面のブレブの発生が特徴的であり（図１４Ｂ）、続いて遅れて、細かい構造が完全に失われること、および複数の大きなブレブの形成を伴う、著しく膨張した外観が特徴的である（図１４Ｃ）。したがって、ＮＲＡは、ＮａＮ３によって誘導したＡＴＰの枯渇後にブレブ形成を生じ、膨張する。
【０３３１】
位相差顕微鏡法もまたこのプロセスの評価に有用であるが、微細な構造を分析することはできない。ブレブ形成は、ＮａＮ３への曝露後１０〜１５分で目に見えるほどに明らかである。この種の形態学的変化は、細胞の膨張を引き起こす浸透圧力の作用と組み合わさった、細胞骨格の完全性が失われることに原因がある。
【０３３２】
細胞の膨張に対する浸透圧勾配の寄与を評価するために、実験を、非透過性膨張剤であるマンニトールの存在下で繰り返した。３００から３５０ｍＯｓｍに細胞外溶液の浸透圧を上げるために十分な濃度のマンニトール（５０ｍＭ）は、ＮａＮ３への曝露後、ブレブ形成を＞３０分遅らせた。細胞性ＡＴＰもまた、ＮａＣＮ（２．５ｍＭ）と２−デオキシグルコース（１０ｍＭ）への曝露を使用して枯渇させることができる。Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９４を参照のこと。同様の形態学的変化（マンニトールによる細胞膜のブレブ形成とブレブ形成の遅延を含む）が、ＮａＣＮと２−デオキシグルコースへの曝露後に得られた。このことは、ＮａＮ３の作用が実はＡＴＰの枯渇が原因であって、ＮａＮ３の任意の他の非特異的作用が原因ではないことを明らかに示している。
【０３３３】
（実施例２）
ＮＲＡの一般的な電気生理学的特性
Ｎ  ｕ  ｓの全細胞調製物の微小電流は、負電位での小さな内側への電流、正電位での大きな外側への電流、そして中間の電位でのフラットな「プラトー」領域を特徴とする。ＮＲＡは微小電流を示し、これは、同じ起源の初代培養細胞の中での観察と一致する。Ｃｈｅｎら，２００３；Ｃｈｅｎら，２００１を参照のこと。Ｋ＋平衡電位（ＥＫ）に対してネガティブである、ＮＲＡが示した内側への電流は、通常は＜１００ｐＡであり、これは培養された新生児の星状細胞において報告された値（Ｒａｎｓｏｍ  ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，１９９５）よりもはるかに小さいが、損傷した脳から新しく単離された星状細胞の中での知見と一致している（Ｂｏｒｄｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，１９９８；Ｓｃｈｒｏｄｅｒら，１９９９）。ＮＲＡの中での大きな外側向きの電流は、カリブドトキシン（１００ｎＭ）とイベリオトキシン（１００ｎＭ）、そして塩化テトラエチルアンモニウム（５ｍＭ）によって一部遮断され、これは、Ｃａ２＋によって活性化されるＫ＋チャンネルの大きなコンダクタンスの存在と一致する。Ｐｅｒｉｌｌａｎら，１９９９を参照のこと。カリブドトキシンの存在下に存在する外側向きの電流は、４−アミノピリジン（５ｍＭ）によってさらに遮断することができ、遅れる整流器Ｋ＋チャンネルに典型的な速度論特性を示す。これまでの報告（Ｐｅｒｉｌｌａｎら，１９９９）と一致して、Ｎａ＋チャンネルに起因する早い内側への電圧に依存する電流は、ＮＲＡＳの１％未満にしか観察されない。
【０３３４】
ＮａＮ３は、３５ＤＳチャンネルが原因である脱分極性の内側への電流を誘発する
電流クランプの記録を使用して、ＮＲＡ中でのＮａＮ３によるＡＴＰ枯渇の効果を研究した。これらの実験には、ナイスタチンで孔をあけたパッチの方法を使用して、代謝による破壊が薬物の適用によって生じるものであって、細胞の透析によるものではないことを確実にした。ＮａＮ３の細胞外への適用（１ｍＭ；室温）によっては、細胞の大きな、そして即座の脱分極が生じた（図１Ａ）。ＮａＮ３は、細胞をＥｍ約０ｍＶ（−４．３±０．９ｍＶ）に迅速に脱分極させた。脱分極は、通常、ＮａＮ３の添加後約１分で開始し、＜３分で完了する。そして薬物を洗い流しても元に戻すことはできない。ウアバインは公知のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ遮断因子である。Ｂｒｉｓｍａｒ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９３を参照のこと。ＮａＮ３を用いて観察した脱分極の大きさは、ウアバイン（１ｍＭ）によって誘導した小さな可逆的な脱分極よりもはるかに大きかった。このことは、ＮａＮ３に対する曝露後に観察された大きな脱分極がＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプの障害によって引き起こされるものではないことを示している。
【０３３５】
ＮａＮ３を用いた脱分極の時間的経過は、同じ処理を用いて観察された細胞膜のブレブ形成の発生についての時間的経過よりも明らかにより迅速である。また、時間的経過も脱分極の大きさも、ブレブ形成を実質的に遅らせる処置である５０ｍＭのマンニトールを用いた細胞外透過性を高めることによっては影響を受けなかった。したがって、脱分極は初期事象であり、細胞の膨張または伸張に対して二次的な事象ではない。
【０３３６】
電圧−クランプの記録は、ＮａＮ３への曝露によって、ＮＲＡ中の内側への電流の正味の増大が生じることを示している。ランプ（図１Ｂ）およびステップパルス（図１Ｃ）の両方を使用して得た記録は、ＮａＮ３処理の前（ａ）および後（ｂ）の記録と比較することによって示されように、ＮａＮ３処理後に有意に大きな電流を示した。薬物後の電流−電圧曲線から薬物前の電流−電圧曲線を引き算することによって得た「電流差」のプロット（図１Ｂの線ｃ）は、ＮａＮ３によりスイッチが入った新しい電流がほぼ０ｍＶに戻ったことを示している。ほぼ０ｍＶの可逆的電位は、ＮａＮ３によって誘導された電流が非特異的陽イオンコンダクタンスによって生じたことを示している。
【０３３７】
ＮａＮ３によって誘導された電流をさらに特性決定するために、細胞が結合したパッチの記録を使用した。ＮａＮ３への曝露によって、薬物の添加の前には単一チャンネル電流を示さなかったパッチの中で単一チャンネル電流が誘発された（図１Ｄ）。ＮａＮ３の添加後、低い時間分解能での記録によって、電流の分散の大きな増大が明らかになり、すなわち、時間分解能を高くした後には、これが単一チャンネル事象が原因であることが明らかになった（図１Ｅ、３および４）。様々な膜電位で記録した単一チャンネル事象の振幅を図１Ｆにプロットした。これは、ＮａＮ３が約３５ｐＳの単一チャンネルコンダクタンスを活性化し、これが細胞が結合した構造において測定した場合には弱い内側への整流を示すことを示している。
【０３３８】
さらなる実験を、細胞が結合した構造において、様々な薬物を補充したピペット溶液を用いて行った。ＮａＮ３によって誘導された単一チャンネル電流は、１０ｍＭのＴＥＡ、５ｍＭの４−ＡＰ、１００ｎＭのイベリオトキシン、１００ｎＭのカリブドトキシン、または１μＭのテトロドトキシン（それぞれの化合物について４〜６パッチ）によっては遮断されなかった。これらの実験は、典型的なＫ＋またはＮａ＋チャンネルが関与していないことを示している。また、０．２ｍＭのＣａ２＋がピペット溶液の中に含まれるので、これらの単一チャンネルの開口は、Ｌ型のＣａ２＋チャンネルを介する１価の陽イオンの流入が原因ではあり得ない。
【０３３９】
同様の脱分極および３５ｐＳチャンネルの活性化は、ＮａＣＮ（２．５ｍＭ）と２−デオキシグルコース（１０ｍＭ）への曝露を使用して細胞性のＡＴＰを枯渇させた場合にも得られた。このことは、ＮａＮ３の効果がＡＴＰの枯渇によって引き起こされ、そしてＮａＮ３の任意の他の非特異的効果によるものではないことを明らかに示している。
【０３４０】
ＡＴＰの枯渇とは別に、パッチの切除はまた、チャンネルの活性化のための信頼性の高い方法である。細胞が付着した構造で実験した１２０個を超える細胞のうち、約３５ｐＳコンダクタンスに起因すると考えられる自発的なチャンネル活性は、わずかに２個の細胞でしか検出されなかった。したがって、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、通常、代謝が正常である細胞においてはサイレントである。対照的に、約３５−ｐＳチャンネルは、ＮａＮ３または他の代謝毒素に曝されていないＮＲＡから形成されたインサイドアウトパッチの＞９０％に存在しており、したがって、パッチの切除の際に失われた細胞内エレメントが、通常はチャンネルの活性化を妨げていることを明らかに示している。
【０３４１】
チャンネル活性化についてのパッチの切除以外の別の可能性のある機構は、調節容量の減少（ＲＶＤ）である。細胞の膨張は、（いくつかのシステムの中の非選択性陽イオンチャンネルを含む）様々な電流の活性化に付随して起こる表現形であるＲＶＤを開始する刺激として広く認識されている。Ｏｎｏら，１９９４を参照のこと。膜パッチを細胞が結合した構造において実験した場合には、低浸透圧の刺激（２１０ｍｏｓｍｏ／ｋｇＨ２Ｏ）によって単一チャンネルの事象が活性化されたが、いずれも約３５ｐＳチャンネルコンダクタンスは示さなかった。この知見は、ＮａＮ３を用いて観察した脱分極とチャンネルの活性化がＮａＮ３によって誘導された細胞の膨張に対して二次的なＲＶＤ応答の一部ではなく、ＮａＮ３によって誘導される脱分極が細胞の膨張に先立って起こるという先に記載した観察と一致することを示している。この事実は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが正常な細胞に由来する細胞が結合したパッチにおいてはほとんど観察されないが、インサイドアウト構造への変換後にはパッチの＞９０％において明らかとなるという観察によってサポートされる。また、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、反応性星状細胞の培養後すぐに失われる。
【０３４２】
（実施例３）
相対的な透過性と孔の大きさ
チャンネルを、インサイドアウト構造の膜パッチを使用してさらに特性決定した。膜の両側に等しい［Ｋ＋］を持たせて、様々な電位への試験パルスの間に得られた記録を図２Ａに示す。振幅ヒストグラムを、−１４０ｍＶから＋１００ｍＶまでの電位で観察した事象から構築し、４個のパッチについての値（平均±ＳＥ）をプロットし、これを図２Ｂに示した。一次方程式へのデータのフィットは、３５ｐＳの傾斜コンダクタンスを示しており、０ｍＶの期待されるＫ＋逆転電位（ＥＫ）に近い＋０．１ｍＶの推定の逆転電位（Ｅｒｅｖ）を有していた。
【０３４３】
Ｋ＋を誘導することに加えて、このチャンネルは様々なアルカリイオンを輸送する（図３Ａ）。このことは、これが非選択性陽イオンチャンネルであることを示している。インサイドアウトパッチにおいて、このチャンネルのコンダクタンスをピペット溶液の中で様々なアルカリイオン（Ｃｓ＋、Ｎａ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、およびＬｉ＋を含む）を用いて、浴溶液中のＫ＋と常に等モルとなるようして測定した。電流−電圧データをＧＨＫ方程式にフィットさせた。Ｎａ＋が、Ｋ＋（３５．２ｐＳ）と比較してほぼ等しい傾斜コンダクタンス（３２．６ｐＳ）を有していることが示されたが、傾斜コンダクタンスは、他の陽イオンを用いた場合には低下した（図３Ｂ）。Ｅｒｅｖの測定を使用して、一連のアルカリイオンについて相対的な透過性を推定した。ＧＨＫ方程式から導いた相対的な透過性の値は、ＰＣｓ＋／ＰＫ＋＝１．０６、ＰＮａ＋／ＰＫ＋＝１．０４、ＰＲｂ＋／ＰＫ＋＝１．０２、およびＰＬｉ＋／ＰＫ＋＝０．９６であり、これは、このチャンネルが全ての１価の陽イオンをほぼ等しく透過させることを示している。
【０３４４】
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの陰イオン（例えば、Ｃｌ−）に対する透過性もまた評価した。１４５ｍＭのＫＣｌを用いた様々な電位での単一チャンネル電流の振幅の測定の後、浴溶液を等モルのグルコン酸Ｋ＋に交換した。アガーブリッジを使用する時には、溶液の交換によってＥｒｅｖ＜０．５ｍＶの電荷が生じた。このことは、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが原則として陰イオンを透過させないことを示している。
【０３４５】
本発明のチャンネルの２価の陽イオン（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）に対する透過性もまた調べた（図３Ｃ）。ピペット溶液中のカリウムイオンを７５ｍＭのＣａ２＋またはＭｇ２＋で置き換えた場合には、内側向きの電流は検出されなかった。ＧＨＫ方程式へのフィットによっては、＜＜０．００１のＫ＋に対する相対的な透過性を仮定すると、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋について、それぞれ、＜＜−６５ｍＶのＥｒｅｖについての最良のフィット値が得られ、このことは、このチャンネルが２価の陽イオンを原則として透過させないことを示している。
【０３４６】
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは１価の無機陽イオンをほとんど区別しない（図３ＡおよびＢ）ので、広範囲の有機陽イオンについて、Ｃｓ＋と比較してチャンネルの透過性を測定することによってチャンネルの等しい孔の大きさを決定するための実験を行った。アウトサイドアウトパッチの構造を使用して、単一チャンネル電流−電圧の関係をプロットして、多数の有機陽イオンについてのＥｒｅｖを得た。その後、ＧＨＫ方程式にフィットさせることによって、透過性の比を導いた。有機陽イオン（ａ）メタノールアミン（ｎｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、（ｂ）、グアニジウム、（ｃ）エタノールアミン、（ｄ）ジエチルアミン、（ｅ）ピペラジン、（ｆ）Ｔｒｉｓ、および（ｇ）Ｎ−メチルグルカミンのそれぞれについて、測定した相対的な透過性の平均値を、その水和された分子半径に対してプロットした（図３Ｄ、白丸）。透過性の比は、Ｒｅｎｋｉｎ方程式に十分にフィットする、ゆるやかに低下する一連の値を定義する。Ｒｅｎｋｉｎ方程式によっては、円筒状の細孔を通じた剛球の透過が記載される。Ｒｅｎｋｉｎ，１９９５。方程式にフィットさせる最小二乗法は、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルについての０．６７ｎｍの等しい孔半径を示している。０．６７ｎｍの孔半径は、Ｃａ２＋チャンネルについて明かにされている６Ａの穴の大きさ（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ  ａｎｄ  Ａｌｍｅｒｓ，１９８５）と、ｎＡＣｈＲチャンネルについて明らかにされている７．４Ａ（Ａｄａｍｓら，１９８０）に類似している。本明細書中に記載した方法にしたがって決定した接合部位電位は、一般的には、５ｍＶを超えることはなかった。
【０３４７】
（実施例４）
［ＡＴＰ］ｉによる阻害
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、ＮａＮ３に対する曝露（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、および１Ｅを参照のこと）またはＣａＣＮと２−デオキシグルコースへの曝露によって細胞内ＡＴＰを枯渇させた後にこのチャンネルがオンになるという知見に基づくと、細胞内ＡＴＰによって阻害される。この事実は、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが、正常な細胞に由来する細胞が結合したパッチにおいてはほとんど観察されなかったが、インサイドアウト構造への変換後にはパッチの＞９０％において明らかとなったという観察によってサポートされる。
【０３４８】
インサイドアウトパッチを使用して、このチャンネルが膜の細胞質側にあるＡＴＰによる遮断に感受性があることを明らかにした。パッチを電荷担体としてＣｓ＋を使用して実験して、Ｋ＋チャンネル（例えば、Ｋｉｒ２．３またはＫＡＴＰ）がパッチの活性に寄与していないこと確認した。浴の中にＡＴＰを含めず、１μＭのＣａ２＋を含めた場合には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは活発な開口を示した。１ｍＭのＡＴＰは、チャンネル活性の完全な低下を引き起こし、これは、洗い流すことによって容易に元に戻すことができる効果であった（図４Ａ）。しかし、チャンネルの有効性は、１ｍＭのＡＭＰまたはＤＰによっては影響を受けなかった。チャンネルの開口確立（ｎ・Ｐｏ）を様々な［ＡＴＰ］ｉで測定し、これらの値を［ＡＴＰ］ｉ＝０ｍＭで得られた値に対して正規化し、標準的なロジスティック方程式にフィットさせた。図４Ｂに示すように、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは用量依存性の様式で［ＡＴＰ］ｉによって遮断された。最大阻害の半分（ＩＣ５０）を、１のＨｉｌｌ係数を用いて［ＡＴＰ］ｉ＝０．７９μＭで観察した。チャンネル活性は［ＡＴＰ］ｉ＞３０μＭで完全に止められた。ＡＤＰとＡＭＰは、インサイドアウトパッチの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性に対しては影響はなかった。
【０３４９】
チャンネル活性の最大阻害の半分（ＩＣＳＯ）を達成する試験化合物の濃度を決定するためのインビボでのアッセイを使用して、ＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲を得るための動物モデルの中での用量を策定することができる。
【０３５０】
（実施例５）
［Ｃａ２＋］ｉによる活性化
膜の細胞質側でのＣａ２＋濃度もまた、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性を調節することを明らかにした。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性と［Ｃａ２＋］ｉとの間での関係を、膜電位（Ｅｍ）＝−８０ｍＶで実験したインサイドアウトパッチを使用して試験した。［Ｃａ２＋］ｉの変化は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性に明らかに影響を与えていた（図５Ａ）。遊離の［Ｃａ２＋］ｉが＜３０ｎＭである場合には、チャンネル活性は見られなかった。［Ｃａ２＋］ｉ＞３０ｎＭを用いた場合には、開口確立（ｎ・Ｐｏ）は、［Ｃａ２＋］ｉにしたがって、約１μＭの［Ｃａ２＋］ｉまでは増大し、ここでは活性はほぼ最大であった。チャンネルの有効性に対するＣａ２＋の効果が、膜電圧に依存していることが明らかになった。３つの異なる電位Ｅｍ＝−４０ｍＶ、−８０ｍＶ、および−１２０ｍＶで得られた４〜９個のパッチによるｎ・Ｐｏの値を、３μＭの［Ｃａ２＋］ｉで観察された値に対して正規化した。これらのデータは、１．５のＨｉｌｌ係数を使用する標準的なロジスティック方程式にフィットし、−４０ｍＶ、−８０ｍＶ、および−１２０ｍＶで、それぞれ、０．１２μＭ、０．３１μＭ、および１．５μＭの最大の半分の値を有していた（図５Ｂ）。これらのデータは、チャンネル活性が生理学的に関連している濃度では［Ｃａ２＋］ｉに強く依存していること、およびＣａ２＋の効果が電圧依存性であり、膜の電場の内側のＣａ２＋結合部位と一致していることを示している。
【０３５１】
（実施例６）
内部Ｍｇ２＋は整流を引き起こす
特定のチャンネルは細胞内Ｍｇ２＋に感受性があるので（Ｃｈｕａｎｇら，１９９７；Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２０００）、細胞が結合したパッチの記録において観察されたチャンネルの整流（図１Ｆを参照のこと）が細胞内Ｍｇ２＋に起因するものであるかどうかを決定するための実験を行った。膜の両側に等モルのＫ＋を持たせて実験したインサイドアウトパッチを使用して、［Ｍｇ２＋］を細胞質側で変化させた。様々な［Ｍｇ２＋］ｉを用いて観察した単一チャンネルの記録とチャンネルの振幅を示す（図６）。整流は［Ｍｇ２＋］ｉが３０μＭであった場合には明らかではなかったが、［Ｍｇ２＋］ｉが約１００μＭであった時には、徐々に強くなる整流が存在した。１００μＭでは、Ｍｇ２＋は、徐々に消える遮断を生じたことが明らかとなった。
【０３５２】
（実施例７）
ＮＲＡ中のＳＵＲの存在の同定
ＳＵＲ受容体がＮＲＡ中に存在しているかどうかを決定するために、これらの細胞に対するグリベンクラミドの結合を蛍光顕微鏡で評価した。８週齢のＷｉｓｔａｒラットに皮質下白質に刺創、および本明細書中に先に記載したゼラチンスポンジの埋め込みによって損傷させた。８日後、損傷させた動物に由来するホルムアミドで固定した脳の組織切片を、２０ｎＭのＦＩＴＣ結合グリベンクラミドで、室温で６０分間インキュベートした。ゼラチンスポンジの蛍光画像は、スポンジの孔を内層している標識された細胞を示している。損傷に隣接している脳においては、グリベンクラミドの結合は原則として明らかにならなかった。これらのデータは、皮質下白質の中には通常は存在しないＳＵＲが、外傷性損傷後に神経細胞の中で発現されることを示している。
【０３５３】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを細胞から抽出し、反応性星状細胞から増幅させたｃＤＮＡを合成するために使用し、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル上でのＲＴ−ＰＣＲによって分析した。図７Ａは、ＳＵＲ１およびＳＵＲ２についてのＲＴ−ＰＣＲを示しているゲルの写真である。図７Ｂは、Ｋｉｒ６．１とＫｉｒ６．２についてのＲＴ−ＰＣＲを示しているゲルの写真である。図７Ａおよび７Ｂのレーン３と４は、インシュリノーマ細胞についてのＲＴ−ＰＣＲを示している。レーン５と６は、反応性星状細胞についてのＲＴ−ＰＣＲを示している。図７Ａおよび７Ｂのレーン１はラダーのサイズマーカーを示す。図７Ａおよび７Ｂのレーン２は、ブランクとした対照である。図７Ａにおいては、レーン３と４は、それぞれ、インシュリノーマ細胞の中でのＳＵＲ１およびＳＵＲ２の実験を示す。インシュリノーマ細胞は、ＳＵＲ１を発現するが、ＳＵＲ２は発現しないことが公知である。図７Ａのレーン５と６は、それぞれ、反応性星状細胞の中でのＳＵＲ１とＳＵＲ２についての実験を示す。図７Ａは、ＳＵＲ１  ｍＲＮＡが反応性星状細胞の中に存在し、さらには、対照であるインシュリノーマ細胞の中にも存在することを示している。ＳＵＲ２はいずれの細胞のタイプの中にも存在しなかった。図７Ｂにおいては、レーン３と４は、インシュリノーマ細胞の中でのＫｉｒ６．１およびＫｉｒ６．２についての実験をそれぞれ示している。Ｋｉｒ６．１はインシュリノーマ細胞の中に存在しているが、Ｋｉｒ６．２は存在していない。Ｋｉｒ６はインシュリノーマ細胞の中でＳＵＲ１と会合しているカリウムチャンネルである。図７Ｂのレーン５と６は、Ｋｉｒ６．１もＫｉｒ６．２も反応性星状細胞の中には存在しないことを示している。したがって、反応性星状細胞は、ＳＵＲ１  ｍＲＮＡを発現するが、Ｋｉｒ６．１とＫｉｒ６．２のｍＲＮＡはこの細胞には存在しない。
【０３５４】
ＳＵＲアンタゴニストによる星状細胞の中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節と組み合わせた反応性星状細胞の中のＳＵＲ１の存在は、ＳＵＲが本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを調節することを示している。
【０３５５】
（実施例８）
トリプシン消化
ＳＵＲによって調節されるＫＡＴＰ機能についての特徴的な特性は、チャンネルの細胞質表面（その細胞外表面ではない）のトリプシン消化によってスルホニルウレアによる阻害の消滅が生じ、これには、ＡＴＰに対する感受性の変化は伴わず、また、チャンネルの生物物理学的特性の変化も伴わないことである。ＮＣＣａ−ＡＴＰ機能に対するトリプシンの効果を図８に示す。対照条件下では、インサイドアウトパッチの構造でのチャンネル活性は、１μＭのグリベンクラミドによって強く阻害された。膜の細胞質側での１００ｐｇ／ｍｌのトリプシンに対する３分間の曝露によっては、なお強いチャンネル活性を示すパッチが生じたが、チャンネル活性はグリベンクラミドによっては全く影響を受けなかった。そのようなトリプシンでの細胞質側の処理の後、チャンネルの生物物理学的特性（チャンネル開口コンダクタンス、チャンネル開口時間、Ｃａ２＋によって媒介される活性化を含む）は変化せず、チャンネルはなおもＡＴＰに対してその典型的な感受性を維持していた。対照的に、膜の細胞外側の曝露はグリベンクラミドでの阻害に対して効果はなかった。本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対するこれらのトリプシン消化についてのデータは、ＳＵＲ１がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調節に関与していることをさらにサポートする証拠を提供する。これは、結果を、ＳＵＲ１によって調節されるＫＡＴＰチャンネルからの先の知見と比較することの理由による。非選択性ＡＴＰ感受性陽イオンチャンネルに対するＳＵＲの連結は、これまでには示されていない。
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断し神経細胞の膨張を阻害する化合物または組成物についてのアッセイ
【０３５６】
（実施例９）
スルホニルウレア化合物の効果
スルホニルウレア化合物はスルホニルウレア受容体を調節することが公知である。スルホニルウレア受容体は一般的には、調節性の構成成分としてＫＡＴＰチャンネルと会合し、様々な組織（ラットＮＲＡを含む）の中で見られる。注目すべきは、ＫＡＴＰチャンネルであるＫｉｒ６．１とＫｉｒ６．２がラットＮＲＡの中には存在しないことである（図７Ｂ）。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを、アウトサイドアウトパッチの中でＳＵＲリガンドであるジアゾキシドで活性化させることが可能である（図９Ａおよび９Ｂ）。ＮａＮ３は、単離された膜パッチの中ではチャンネル活性を誘発せず、このことは、チャンネルに対する何らかの直接的な作用ではなく、ＡＴＰの枯渇によってこれが作動することを示している。
【０３５７】
（実施例１０）
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの用量依存性の遮断を決定するためのインビトロアッセイ
ＳＵＲ１遮断化合物（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミド）が、ＫＡＴＰチャンネルに対する阻害作用を有していることは公知である。１つの実施形態においては、本発明は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対するグリベンクラミドおよびトルブタミドの直接的な阻害作用を決定する方法を提供することを本発明の目的とする（図１０および１１）。インサイドアウトパッチを使用して、スルホニルウレアの阻害作用を示した。Ｋ＋チャンネル（特に、ＫＡＴＰ）がパッチ電流に関係していないことを確実にするために、Ｃｓ＋を電荷担体として使用した。チャンネル活性は、１０μＭのグリベンクラミドの添加によって大幅に小さくなり（図１０Ａ、ｂ）、そしてこの活性は、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと一致する３５ｐＳ陽イオンチャンネルが原因であることが示された。このことは、（図１０Ｃ）。別のスルホニルウレアであるトルブタミドもまた、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性を阻害することが示された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。図１１Ｂに示すように、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは、用量依存性の様式でスルホニルウレアによって遮断された。トルブタミドを用いた場合には、最大阻害の半分（ＥＣ５０）は１．３のＨｉｌｌ係数を用いて１６．１μＭで観察され、チャンネル活性は＞３００μＭの濃度で完全になくなった。グリベンクラミドを用いた場合には、ＥＣ５０は、１．２のＨｉｌｌ係数で４８μＭで観察された。これらのスルホニルウレア化合物の両方を用いたＮＲＡの中での遮断に対する本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの感受性は、膵臓β細胞の中で、および発現システムにおいて、ＳＵＲ１（ＳＵＲ２ではない）を用いて報告された感受性と密接に相関していた。
【０３５８】
チャンネル活性の最大阻害の半分を行う試験化合物の濃度を決定するためのこのインビトロアッセイは、循環血漿濃度の範囲を得るための動物モデルの中での用量を策定するために使用することができる。
【０３５９】
（実施例１１）
スルホニルウレアによるチャンネルの調節機構
本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルは２つの開口状態を示し、これらは短いドウェル時間と長いドウェル時間であり、それぞれ１０ｍｓ未満である。図１２は、１．９と８．２ｍｓの開口ドウェル時間値τ０−１、τ０−２を用いた場合には、０．６３のチャンネル開口確立（ｎ・Ｐｏ）を示したパッチによるデータを示す。３μＭのトルブタミド（図１２Ｂおよび１２Ｅ）および３０μＭのトルブタミド（図１２Ｃおよび１２Ｆ）の連続適用の後、ｎ・Ｐｏはそれぞれ、０．４４および０．０９に低下したが、開口ドウェル時間値はこの薬物によっては明白な影響は受けなかった。チャンネルの閉鎖ドウェル時間は、トルブタミドによって期間および頻度ともに大きくなった（図１２Ｈおよび１２Ｉ）。したがって、本発明のチャンネルは、遮断化合物がチャンネル開口ドウェル時間、および長い閉鎖の段階的な増加に対しては効果がないチャンネル遮断の形態を示す。この形態のチャンネル阻害は、膵臓β細胞の中のＫＡＴＰチャンネルに対するスルホニルウレアの作用によって生じるものと類似している（Ｇｉｌｌｉｓら，１９８９；Ｂａｂｅｅｎｋｏら，１９９９を参照のこと）。
【０３６０】
（実施例１２）
１００μＭのＳＵＲ活性化因子ジアゾキシドの適用によっては、本発明の３５ｐＳチャンネルが活性化され、それによって細胞が結合したパッチの中に弱い内側向きの整流が引き起こされた（図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃ）。本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性化に影響を与えるＳＵＲのタイプを決定するために、ＳＵＲ１よりもＳＵＲ２を優先的に活性化させるスルホニルウレア化合物（すなわち、クロマカリンおよびピナシジル）を使用して実験を行った。クロマカリンおよびピナシジルはいずれも、本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対して影響はなく、このことは、ＳＵＲ１が本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと会合すること、そしてこのチャンネルの活性化はＳＵＲ２によっては媒介されないことを示している本明細書中に記載した他のデータと一致していた。
【０３６１】
（実施例１３）
Ｓｕｒによって媒介される細胞の膨張
細胞中のＡＴＰを枯渇させるためのＮａＮ３の添加後、細胞のブレブ形成は、通常、７〜１０分以内に明らかになる。ジアゾキシドはＳＵＲ１アゴニストまたはＳＵＲ１活性化因子である。ジアゾキシドだけを細胞に添加した場合には、ブレブ形成が、ＡＴＰを枯渇させなかった場合にも起こった。したがって、ジアゾキシドは、ＳＵＲ１を活性化させることによるＡＴＰの枯渇を伴わずに、このチャンネルを直接開口させる。しかし、細胞をグリベンクラミドで予め処理した場合には、ＮａＮ３の添加によっても、３０分後にもまだブレブ形成は起こらなかった。したがって、ＡＴＰの枯渇による、またはチャンネルオープナーであるジアゾキシロによるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性化によって、ＮＲＡのブレブ形成と膨張を生じさせることができ、そしてこの膨張はグリベンクラミドでのチャンネルの遮断によって阻止することができる。アジ化ＮａによるＡＴＰの枯渇によっては、ＮＲＡの壊死による細胞死を生じさせることができる。これらの知見は、グリベンクラミドがＡＴＰの枯渇後にＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが開口することを防ぐこと、そしてこのチャンネルの開口が細胞のブレブ形成に関係していることについての本明細書中に記載したデータと一致する。
【０３６２】
本発明の方法で使用したアンタゴニストには、ＮＣＣａ−ＡＴＰ機能を妨害する化合物を含めた。典型的には、アンタゴニストの作用を、このチャンネルが活性化される条件下でのＮＣＣａ−ＡＴＰ電流の遮断として観察し、そして、電流はアンタゴニストが存在しない条件でも測定することができた。
【０３６３】
ＳＵＲ１特異的スルホニルウレア化合物に加えて、ＳＵＲ１を遮断する物質としては、スルホニルウレアとは構造的には関係のない化合物も挙げられる。そのようなＳＵＲ１遮断因子としては、ＳＵＲに結合するインシュリン分泌促進剤である化合物のクラスが挙げられ、これは、２型糖尿病の処置用に同定されており、開発されている。ベンズアミド誘導体：レパグリニド、ナテグリニド、およびメグリチニドは、ＳＵＲ１に結合するそのようなインシュリン分泌促進剤の１つのクラスを示す。ナテグリニドはアミノ酸誘導体である。また、ミダグリゾール（ＫＡＤ−１２２９）、ＬＹ３９７３６４、およびＬＹ３８９３８２のようなスルホニルウレア受容体（ＳＵＲ）１サブユニットと相互作用するイミダゾリン誘導体が同定されている。
【０３６４】
本発明の１つの好ましい実施形態においては、ＳＵＲ１を優先的に遮断し、ＳＵＲ２は遮断しない化合物が本発明の方法で使用される。そのような化合物としては、トルブタミドおよびグリクラジドが挙げられる。以下の化合物はＳＵＲ１およびＳＵＲ２の両方を遮断する：グリベンクラミド、グリメピリド、レパグリニド、およびメグリチニド。本発明の方法のなお別の実施形態においては、投与は、ＳＵＲ１を含むがＳＵＲ２は含まないチャンネルに対するスルホニルウレアの効力の明らかな増大を生じることが示されているＭｇＡＤＰと組み合わせられる。
【０３６５】
（実施例１４）
ＡＴＰ枯渇によるＮＣＣａ−ＡＴＰの活性化によってこのチャンネルを発現する反応性星状細胞の壊死が始まるかどうかを決定するために、グリベンクラミドが、ＳＵＲ１に対するその作用によってＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性を阻害することにより反応性星状細胞を細胞死から防御できるかどうかを決定するための実験を行った。２つのタイプの細胞死（アポトーシスと壊死）をＡＴＰの枯渇後に評価した。
【０３６６】
したがって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性化は、ＡＴＰ枯渇後のＮＲＡの壊死に関係しており、グリベンクラミドはこの形態の細胞死を防ぐことができた。
【０３６７】
本実施例では、＜１％のＲＢＣを含む細胞集団を得るために、本明細書中に記載したように、新しく単離したＮＲＡの調製物をＲＢＣの除去によってさらに精製した。９５％を上回る細胞がＥＫに近い静止電位を有しており、このことは、酵素による解離方法は感知できるほどに細胞に害を及ぼすことがないことを示唆している。免疫蛍光によって決定した場合には、９５％を上回る細胞が星状細胞マーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）についてポジティブであった。位相差顕微鏡によって試験した場合には、ＮＲＡは、１１〜４５μｍの直径の範囲の様々な大きさのものであり、そのいくつかは明位相差像を示し、そして他のものは暗位相差像を示す。明位相差像を示す細胞のサブグループは、複数の短い、しかし異なる細胞突起を有しており、これは体細胞よりも短い。この実施例においては、短い突起（＜１細胞の長さ）を有している（大きい（約３０μｍの直径）の明位相差像を示す細胞だけを実験した。ＮＲＡのこの集団は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを確実に発現する。
【０３６８】
実験は、細胞の単離から２４時間以内に室温（２２〜２５℃）で行った。細胞のアリコートを、以下を含む細胞外浴溶液（ａ）を満たしたチャンバースライド（ＬＡＢ−ＴＥＫ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）上に置いた：ＮａＣｌ  １３０、ＫＣｌ  １０、ＣａＣｌ２  １、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  ３２．５、グルコース  １２．５、ｐＨ７．４。表面に生存している細胞が付着した後に、過剰量の溶液をフラッシュすることによって、遠心分離によって先に除去することができなかった残っていた破片を洗い流した。細胞を、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを活性化（開口）させるために１ｍＭのアジ化ＮａによるＡＴＰの枯渇に供し、その後、グリベンクラミド（１μＭ）とともにインキュベートした。
【０３６９】
その後、細胞を、初期の浸透圧膨張による細胞死または壊死による細胞死の指標である、細胞膜の透過性の証明のためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって試験した。Ｂａｒｒｏｓら，２００１を参照のこと。細胞をまた、アポトーシスの初期の指標である、血漿膜の内表面から外表面へのホスホアミノリピッドホスホチジルセリンの外面化の証明のために、フルオレセインタグ化アネキシンＶ結合によって試験した。Ｃｌｏｄｉら，２００１；Ｒｕｃｋｅｒ−Ｍａｒｔｉｎら，１９９９を参照のこと。染色手順は、製造業者による指針にしたがって行った（Ｖｙｂｒａｎｔ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。スライドを、ＰｒｏＬｏｎｇアンチフェード取り付け媒体（ＰｒｏＬｏｎｇ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｍｏｌｅｃｉｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して取り付けた。シグナルを、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔエピ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ  Ｗｅｔｚｌａｒ）を使用して視覚化した。画像をＳｅｎＳｙｓデジタルカメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）とＩＰＬａｂソフトウェア（バージョン３．０；Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を使用して撮影し、保存した。アネキシンＶポジティブ細胞またはＰＩポジティブ細胞を、２０倍の対物レンズを使用して２０個の別々の視野においてカウントした。様々な処理グループについての２０個の視野の中のポジティブ細胞の平均数を、ＡＮＯＶＡ  Ｐａｉｒｗｉｓｅ多重比較を使用して比較した。ｐ＜０．０５を、有意な差を示すと見なした。
【０３７０】
図１５Ａに示す蛍光顕微鏡写真は、ベースライン（対照）条件下では、アネキシンＶポジティブ細胞とＰＩポジティブ細胞（それぞれ、写真ａおよびｂ）はいずれも、細胞単離物の中では稀であることを示している。アジ化Ｎａ（１ｍＭ）との１０分間のインキュベーション後、ＰＩポジティブ細胞の数は実質的に増加した（ｐ＜０．０５）（図１５Ａ、写真ｂ、および図１５Ｂ）。これは、ＡＰＴの枯渇がこれらの細胞の中で壊死を誘発したことを示している。対照的に、アジ化Ｎａでの処理によっては、アネキシンＶポジティブ細胞の数のわずかな増大しか生じず、この増大は統計的には有意ではかった（Ｐ＞０．０５）（図１５Ａ、写真ｅ、および図１５Ｃ）。このことは、アポトーシスによる死がこれらの細胞の中でのＡＴＰの枯渇の主要な最終点ではないことを示している。
【０３７１】
アジ化Ｎａの投与のタイミングでのグリベンクラミド（１μＭ）での細胞の処理によっては、ＰＩポジティブ細胞の数が劇的に減少した（ｐ＜０．０５；図１５Ａ、写真ｃ、および図１５Ｂ）。このことは、ＡＴＰの枯渇後の壊死からの有意な防御を示している。アポトーシスによる死を受けたＮＲＡの数もまた、アネキシンＶ標識によって示されたものと同様に、グリベンクラミドを用いた場合に減少した（図１５Ａ、写真ｆ、および図１５Ｃ）が、このグループについての値には有意な差はなかった。
【０３７２】
このデータは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが反応性星状細胞の壊死による細胞死の機構に関係していることを示している。本実施例は、アポトーシスではなく壊死による細胞死が、これらの細胞の中でのＡＴＰの枯渇の主要な最終点であることを示している。したがって、アジ化ＮａによるＡＴＰの枯渇によって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのＡＴＰによる遮断が取り除かれることにより細胞死が始まり、したがって細胞の浸透圧膨張が始まる。細胞の浸透圧膨張におけるこのチャンネルの関与は、壊死もまた、これらの細胞の中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを活性化させるチャンネルオープナーであるジアゾキシドによっても誘導することができ、そしてＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口を妨げるグリベンクラミドによって遮断することができることを示すことによって確認した。反応性星状細胞の細胞死におけるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの関与により、これらの細胞の中での死の機構と標的、さらには、外傷性脳損傷が起こった反応性星状細胞の死を防ぐためにＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断することの重要性が提供される。
【０３７３】
（実施例１５）
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの用量依存性の遮断を提供する試験化合物の能力を決定するためのインビトロアッセイ
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断する化合物は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対する試験化合物の直接的な阻害作用を決定する方法において同定することができる。インサイドアウトパッチを使用して、化合物の阻害作用を示した。Ｋ＋チャンネル（特に、ＫＡＴＰ）がパッチ電流に関係していないことを確実にするために、Ｃｓ＋を電荷担体として使用した。チャンネル活性を大幅に小さくする化合物および活性が、３５ｐＳ陽イオンチャンネルが原因であることが示された。そのような化合物を、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断し、そして神経細胞の膨張および脳腫脹を阻害することができる化合物として同定した。様々な濃度の化合物を使用して、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが用量依存性の様式でその化合物によって遮断されるかどうかを決定した。最大阻害の半分（ＥＣ５０）が観察された濃度、およびチャンネル活性が完全になくなった濃度を決定した。試験化合物でのＮＲＡ中での遮断に対する本発明のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの感受性を比較することができる。チャンネル活性の最大阻害の半分を行う試験化合物の濃度を決定するためのこのインビトロアッセイは、循環血漿濃度の範囲を得るための動物モデルの中での用量を策定するために使用することができる。
【０３７４】
（実施例１６）
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの用量依存性の遮断を決定するためのインビボアッセイ
チャンネル活性の最大阻害の半分を行う試験化合物の濃度を使用して、循環血漿濃度の範囲を得るための動物モデルの中での用量を策定した。当該分野で公知の方法によって計算した循環血漿濃度の範囲が得られる試験化合物の用量を、脳損傷または脳虚血を有している動物に投与した。試験化合物が脳腫脹を防ぐ、阻害する、または小さくするかどうかを決定するために、動物の硬膜外圧および／または頭蓋内圧を、脳腫脹を定量的にモニターするための、例えば、マイクロバルーンを使用することによって測定した。また、腫脹は、磁気共鳴（ＭＲ）撮影法によってもモニターすることができる。３つの異なる実験で、脳損傷の前に、脳損傷の時点で、またはその後に投与を開始した。対照と比較して脳腫脹の縮小をもたらした化合物を、神経細胞の膨張および脳腫脹を阻害できる化合物として同定した。様々な濃度の化合物を使用して、化合物が用量依存性の様式で効力を発揮するかどうかを決定した。最大阻害の半分が観察された用量と、脳腫脹が最も迅速に緩和された濃度を決定した。薬学的に許容される担体と共に、脳腫脹を予防する、阻害する、または小さくするための試験化合物の最適な有効量を含む処方物を産生した。
【０３７５】
（実施例１７）
分極した状態でＮＲＡを維持するためのさらに別の機構
反応性星状細胞が、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口が原因で強く脱分極している場合には、これらはブレブ形成と膨張を示し、最終的には壊死による細胞死が認められる。上記のように、反応性星状細胞は、Ｃａ２＋とＡＴＰに感受性がある非選択性チャンネル（ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル）の開口が原因で強く脱分極している場合には、これらはブレブ形成と膨張を示し、最終的には壊死による細胞死が認められる。これらの反応性星状細胞の死は、強い脱分極を防ぐことができれば、言い換えると、細胞を分極した状態に維持することができれば防ぐことができる。
【０３７６】
ＮＲＡを分極した状態に維持するための１つの可能性がある方法は、Ｋｉｒ２．３チャンネルを開口させることである。ＮＲＡを、Ｋｉｒ２．３チャンネルを開いた状態に維持するために、Ｋｉｒ２．３チャンネルオープナーであるＴｅｎｉｄａｐ（５−クロロ−２，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシ−２−チエニルメチレン）−２−オキソ−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミド）に曝した。損傷後の成体のラットの脳から新しく回収した未処理の反応性星状細胞をＴｅｎｉｄａｐに曝して、これらの細胞の中のＫｉｒ２．３チャンネルを開口させるこの薬物の能力を評価した。好ましくは、１型反応性（Ｒ１）星状細胞を回収し、このアッセイで使用した。反応性星状細胞の１つのサブタイプはＲ１型星状細胞である。Ｒ１型星状細胞には、脳損傷の部位で回収することができる星状細胞の最も大きな集団が含まれる。これらは、損傷部位を取り囲む組織の領域に存在する点で特徴的であり、その多くは、損傷部位自体の中に移動したことが明らかである。Ｐｅｒｉｌｌａｎら，１９９９を参照のこと。
【０３７７】
ＴＢＩおよび脳卒中に対する細胞性の応答の一部である反応性星状細胞は少なくとも２つのサブタイプから構成されている。反応性星状細胞の１つのサブタイプはＲ１型星状細胞である。Ｒ１型星状細胞には、脳損傷の部位で回収することができる星状細胞の最も大きな集団が含まれる。これらは、損傷部位を取り囲む組織の領域に存在する点で特徴的であり、これらの細胞の多くが、損傷部位自体の中に移動したこともまた見られた。Ｐｅｒｉｌｌａｎら，１９９９を参照のこと。
【０３７８】
Ｒ１型星状細胞は、ＮＲＡ調製物中の反応性星状細胞の優勢なタイプである。Ｒ１型星状細胞は、それらの細胞膜の中で２つの非常に重要なイオンチャンネルを発現する：（ａ）培養された細胞、さらには新しく単離された細胞の中に存在しているＫｉｒ２．３チャンネル；および（ｂ）新しく単離された反応性星状細胞の中にだけ存在し、培養後すぐに失われるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル。Ｋｉｒ２．３は内向き整流チャンネルであり、これは、カリウムの逆転電位（約−７５ｍＶ）に近い正常な静止電位に脱分極された状態で細胞を維持するために極めて重要である。このチャンネルが不活化または阻害されると、細胞は、塩素の逆転電位（約−２５ｍＶ）に近い電位に脱分極する。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの特徴的な特性は以下である：１）Ｎａ＋、Ｋ＋、および他の１価の陽イオンのきわめて容易な通貨を可能にする非選択性陽イオンチャンネルである；２）細胞内カルシウムの増加によって、および／または細胞内ＡＴＰの減少によって活性化される；ならびに３）１型スルホニルウレア受容体（ＳＵＲ１）によって調節される。ＳＵＲ１は、膵臓β細胞中で見られるように、ＫＡＴＰチャンネルと排他的に会合していると考えられている。
【０３７９】
ＡＴＰの枯渇後のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口は、虚血または低酸素症と一緒になった場合には、Ｎａ＋の流入が原因で細胞の脱分極を引き起こす。このＮａ＋の流入によっては、細胞内の浸透圧負荷が増大し、結果として、Ｈ２Ｏが浸透圧負荷を平衡化させるために細胞に侵入する。この結果は、細胞内でのＮａ＋とＨ２Ｏの過剰、細胞のブレブ形成と細胞の膨張を生じる病理学的応答であり、これは細胞傷害性浮腫として公知である。抑制がかけられないまま放置されると、この病理学的応答は最終的には細胞死を導く。本明細書中に開示したように、この細胞死がほとんどの壊死による細胞死であり、アポトーシスによる細胞死ははるかに少ない。
【０３８０】
細胞傷害性浮腫が原因である脳腫脹を緩和するためには、多数のアプローチを使用することができる。関連する臨床状況の患者を処置するための現在使用されている１つの処置は、Ｈ２Ｏの流入の駆動力を下げる細胞外浸透圧の上昇に基づく。このストラテジーによってはまた、単離された細胞の中でのブレブ形成が減少する。
【０３８１】
細胞傷害性浮腫を軽減するためのより特異的なストラテジーは、細胞内にＨ２Ｏを引き込み、実際に細胞傷害性の浮腫を引き起こすＮａ＋の流入に主に関与しているＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの不活化あるいは遮断である。このチャンネルを不活化させるための１つの高度に選択的なアプローチは、このチャンネルと制御を行う調節サブユニットＳＵＲ１との間での特有の関係を利用することである。膵臓β細胞中のＳＵＲ１と相互作用してこれらの細胞の中のＫＡＴＰチャンネルを遮断し、それによって糖尿病を処置する様々な薬物が開発されている。これらの薬物のうちのいくつかは、スルホニルウレアと呼ばれる物質のクラスに属する。本明細書中に記載したように、ＫＡＴＰチャンネルを遮断する薬物（例えば、グリベンクラミドおよびトルブタミド）は、Ｒ１型星状細胞の中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの遮断にきわめて有効である。ＮＲＡ中でＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを遮断することができる薬物は、（ａ）ＡＴＰの枯渇に応答して細胞のブレブ形成を妨げる、（ｂ）ＡＴＰの枯渇後の細胞死を有意に減少させる。また、脳卒中もしくは脳損傷に罹患している動物において脳腫脹を処置するためのグリベンクラミドの使用も、本明細書中に記載する。
【０３８２】
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの効果に対抗するため、および細胞傷害性の浮腫を軽減するためのなお別のストラテジーは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの開口を行う細胞の脱分極を中和することであろう。これを行うための１つの方法は、Ｋｉｒ２．３チャンネル（これもまたこれらの細胞の中に存在する）の開口を促進することである。抗炎症性化合物Ｔｅｎｉｄａｐ（５−クロロ−２，３−ジヒドロ−３−（ヒドロキシ−２−チエニルメチレン）−２−オキソ−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミド）は、Ｋｉｒ２．３チャンネルのオープナーである。Ｐｏｐｐら，１９９２；Ｌｉｕら，２００２を参照のこと。Ｔｅｎｉｄａｐを、単離した細胞の中、ならびに損傷したラットの脳の中でインサイチュでのＡＴＰの枯渇に応答する、細胞のブレブ形成と細胞の膨張、および壊死による細胞死を減少させるそれらの能力について評価した。ＴｅｎｉｄａｐがＲ１型星状細胞の中のＫｉｒ２．３チャンネルを開口させるかどうかを評価するためには、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの状態を評価するための本明細書中に記載した方法と同様の方法を使用した。ＴｅｎｉｄａｐがＲ１型星状細胞の中のＫｉｒ２．３チャンネルを開口させること、およびＡＴＰの枯渇に応答した細胞のブレブ形成と細胞死を減少させることを示すそのような実験による結果は、ＴＢＩまたは脳虚血によって生じる脳腫脹および細胞傷害性浮腫の処置におけるＴｅｎｉｄａｐの有用性を示しているであろう。Ｔｅｎｉｄａｐの有効量は、神経細胞の膨張および壊死による細胞死を阻害する薬物の能力の理由により、脳腫脹または脳虚血を軽減することができる量である。
【０３８３】
ＳＵＲ遮断因子は、最も特異的な信頼できる遮断因子であり、そして望ましくない副作用を最も少なくしかもたらさないと考えられている。さらに、２種類以上の浸透圧性の利尿剤、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遮断因子（例えば、グリベンクラミド）、およびＫｉｒ２．３チャンネルオープナー（例えば、Ｔｅｎｉｄａｐ）の使用を含む処置の組み合わせによっては、細胞傷害性浮腫の緩和において、および脳損傷と脳卒中における罹患率と致死率の低下において優れた効果をもたらす可能性がある。したがって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル遮断因子とＫｉｒ２．３チャンネルオープナーの同時投与または連続投与によっては、細胞傷害浮腫を緩和することにおいて、ならびに脳損傷および脳卒中の罹患率と致死率を下げることにおいて優れた効果をもたらすと期待される。例えば、グリベンクラミドとＴｅｎｉｄａｐの投与は、細胞傷害性浮腫を緩和するために、そして脳損傷および脳卒中における罹患率と致死率を下げるために有用であろう。
【０３８４】
（実施例１８）
エストロゲンによる調節
ＫＡＴＰチャンネル（Ｋｉｒ６．１、Ｋｉｒ６．２）の特徴的特性は、ＡＴＰに対するチャンネルの親和性が膜脂質ＰＩＰ２の存在によって調節されることである。ＫＡＴＰチャンネルの開口状態の安定性は、膜の細胞質側へのＰＩＰ２の添加によって高まる（Ａｓｈｃｒｏｆｔ，１９９８；Ｂａｕｋｒｏｗｉｔｚら，１９９８；Ｒｏｃｈａｃｓら，１９９９）。開口状態の安定性の上昇は、ＡＴＰが存在しない条件でのチャンネルの開口確立の増大と、これに対応する、ＡＴＰによる阻害に対する感受性の低下として現れる（Ｅｎｋｖｅｔｃｈａｋｕｌら，２０００；Ｈａｒｕｎａら，２０００；Ｋｏｓｔｅｒら，１９９９；およびＬａｒｓｓｏｎら，２０００）。
【０３８５】
ＫＡＴＰチャンネルとＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルとの間での多数の類似点を考慮して、本発明者らは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのＡＴＰ感受性が同じ方法でＰＩＰ２に応答すると仮定した。これを、電荷担体としてＣｓ＋を用いて、そして浴中で１μＭのＣａ２＋と１０μＭのＡＴＰを用い、チャンネルが後に完全に遮断されることを期待して、インサイドアウトパッチの中でＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを試験することによって試験した。これらの条件下では、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルだけがＲ１星状細胞の中で記録された。ＰＩＰ２（５０μＭ）を浴に添加した場合には、ＫＡＴＰチャンネルに対するＰＩＰ２の効果との類似性から予想したとおり、チャンネル活性は高くなった（図１６）。このチャンネル活性はグリベンクラミドによって遮断され、このことによってチャンネルの実体を確認した。
【０３８６】
受容体によって媒介される機構がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性の調節に関係しているかどうかを決定するために、周知のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を使用して、ＰＬＣの活性化がＰＩＰ２の分解および消費を引き起こすかどうか、それによってＡＴＰに対する親和性が増大する（例えば、チャンネルの開口が少なくなる）かどうかを実験した。エストロゲンは、脳ならびに別の場所での周知のＰＬＣ活性化因子である（Ｂｅｙｅｒら，２００２；Ｌｅ  Ｍｅｌｌａｙら，１９９９；Ｑｕｉら，２００３）。この実験のために、細胞が付着したパッチを、細胞内シグナル伝達機構の変化を防ぐために実験した。ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性は、細胞性ＡＴＰの枯渇を引き起こすためのアジ化Ｎａへの曝露によって生じた（図２、記録の最初の部分）。
【０３８７】
エストロゲン（Ｅ２；１０ｎＭ）を浴に加えた場合には、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが原因である活性はすぐに終わった（図１７）。このことは、エストロゲンがＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対して調節性の制御を発揮することを示唆しており、シグナル伝達カスケードの迅速な（ゲノムによるものではない）活性化が可能なエストロゲン受容体がこれらの細胞上に存在していることを示唆している。
【０３８８】
次に、エストロゲン受容体を雄および雌に由来するＲ１星状細胞の中で検出できるかどうかを決定した。ゼラチンスポンジ移植物を、３匹の雌のラットのグループ（Ｆ）と別のグループの３匹の雄のラット（Ｍ）への埋め込みの７日後に回収した。それぞれのグループに由来するプールしたタンパク質を、２段階の希釈（４倍＝５０μｇの全タンパク質；１倍＝１２．５μｇの全タンパク質）で、ウェスタンブロッティングによって、対照として子宮由来のタンパク質を使用して分析した（図１８Ａ）。膜を、αエストロゲン受容体およびβエストロゲン受容体の両方を認識した抗体でブロットした。雄と雌はいずれも、α受容体（６６ｋＤａ）およびβ受容体（５５ｋＤａ）についての適切な分子量で突出したバンドを示した（図１８）（Ｈｉｒｏｉら，１９９９）。雄および雌に由来するタンパク質の同じ試料をまた使用して、ＳＵＲ１の存在を確認した。ポジティブ対照として膵臓由来のタンパク質を使用した（図１８Ｂ）。明らかに、エストロゲン受容体は、雄および雌に由来する星状細胞においてこれまでに報告されていた（Ｃｈｏｉら，２００１）。大脳皮質においては、βイソ型がより豊富であることがウェスタンブロットによって示唆されている（Ｇｕｅら，２００１）。
【０３８９】
次に、図１７の電気生理学的実験を、雄のラットから回収したＲ１星状細胞を使用して繰り返した。上記したように、細胞が結合したパッチを試験した。ここでは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネル活性をアジ化Ｎａへの曝露後の細胞内ＡＴＰの枯渇によって活性化させた（図４Ａ）。高い時間分解能で記録した試験によって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルについての適切なコンダクタンスの十分に定義されたチャンネルの活性を確認した（図４Ｂ）。エストロゲンを浴に加えた場合には（図４、Ｅ２、１０ｎＭ、矢印）、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに起因する活性は迅速に終結した（図１９）。これらのデータは、エストロゲンがＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに対して調節性の制御を発揮することのさらなる証拠を提供し、加えて、この応答が雄および雌に由来するＲ１星状細胞において同じように強かったことを示唆していた。
【０３９０】
エストロゲンの作用に対する類似性から、ＰＩＰ２を枯渇させる他の機構（他の受容によって媒介される機構、さらには、Ｇタンパク質のようなＰＬＣのより直接的な活性化因子などを含む）が、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性に対して同様の阻害作用を有し、それによってポジティブな効果を発揮すると期待される。
【０３９１】
（実施例１９）
グリア被膜
標準的なモデルには、麻酔したラットの頭頂葉に刺傷を配置すること、および滅菌された異物（ゼラチンスポンジ；Ｇｅｌｆｏｒｍ（登録商標））を刺傷による創傷の中に埋め込むことを含めた。標準的なモデルの変形には、スポンジに物質（例えば、リポ多糖、ＬＰＳ）を含浸させること、またはスポンジの中に直接配置された送達カテーテルを用いて浸透圧ミニポンプを使用してインビボで連続して物質を注入することを含めた。損傷手順は動物によって十分に寛容化され、これには実質的な罹患率または致死率は伴わず、また最小限の痛みしか伴わない。インビボでの適切な時間の後、脳全体を組織切片の組織学的または免疫組織学的実験のために回収した。あるいは、スポンジ自体を脳からゆっくりと取り出す場合には、グリア被膜の内部領域がスポンジに付着しており、これをスポンジとともに切除した。このようにして、スポンジをタンパク質（例えば、ウェスタン）またはｍＲＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲ）についてアッセイしたか、あるいはこれを、電気生理学的測定または他の単細胞測定のための構成要素である細胞を得るために酵素によって解離させた。
【０３９２】
グリア被膜は、損傷の７〜１０日後には十分に成長していた。グリア被膜を、Ｅｖａｎｓ  Ｂｌｕｅを動物に潅流することによって冠状断面の中で視覚化させ、その後、脳の潅流−固定を行った（図２０Ａ）。浮腫の領域（暗い部分）は、ゼラチンスポンジ（暗い部分）を取り囲む、血管がないグリア被膜（明るい部分）の輪郭を描くように見られた。抗ＧＦＡＰ抗体を用いた免疫組織化学試験は、スポンジの近くの脳実質が多くのＧＦＡＰポジティブである反応性星状細胞を有していることを示していた（図２０Ｂ；矢印はゼラチンスポンジが存在している場所を示している）。より高倍率では、これらの実質内のＧＦＡＰポジティブ細胞は大きくなり、多くの突出する細胞突起を有することが示された（図２０Ｃ、矢印）。ゼラチンスポンジ自体の試験は、ＧＦＡＰポジティブ反応性星状細胞がスポンジの隙間に移動したことを示していた（図２０Ｄ、矢印）。
【０３９３】
（実施例２０）
グリア被膜からの細胞の単離
グリア被膜の内部領域およびゼラチンスポンジのパパインでの消化によって新しく単離した細胞の位相差顕微鏡観察によって、３つのタイプの細胞が明らかになった。ほとんどの細胞（＞９０％）は大きく、丸く、細胞突起を有しておらず、そして明位相差像を示した（図２１Ａ）。多数の細胞（３〜５％）は小さく、丸く、細胞突起を有しておらず、そして暗位相差像を示した（図２１Ｂ）。時折、大きさに関しては中程度であり、明位相差像を示し、そして１つの細胞の直径の長さよりも大きな複数の突起を有している細胞が見られた（Ｃｈｅｎら，２００３）。免疫蛍光実験は、これらの細胞の全てが典型的な複数の星状細胞のマーカー（ＧＦＡＰ（図２１Ｃ、Ｄ）、およびビメンチン（図２１Ｅ、Ｆ）を含む）について強くポジティブであったことを示していた。小神経膠細胞は、ＯＸ−４２についてのまばらな標識によって示されたように、グリア被膜自体の内部領域においては優性ではなかった。グリア被膜の内部領域の細胞は、Ｏ２Ａ先祖マーカーであるＡ２Ｂ５、および線維芽細胞マーカーであるプロリル４−ヒドロキシラーゼについてはネガティブであった（Ｄａｌｔｏｎら，２００３）。
【０３９４】
新しく単離した細胞を用いた場合と同様に、３種類の形態学的に異なる細胞のタイプが初代培養物において観察された。ほとんどの細胞（＞９０％）は大きな多角形の細胞であり（図２１Ｇｂ）、少数（３〜５％）が小さい双極細胞であり（図２１Ｇａ）、ごく時折しか、突起を有している星型の細胞は観察されなかった（Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２０００）。これらの細胞は全て、抗ＧＦＡＰ抗体で強く標識された（図２１Ｈ）。酵素消化によって得た細胞を初代培養物の中で別々にフォローした実験は、大きな明位相差像を示す細胞が、大きな多角形の細胞に成長したこと（図２１Ｇｂ）、そして小さい暗位相差像を示す細胞が小さな双極細胞に成長したこと（図２１Ｇａ）を示していた（Ｄａｌｔｏｎら，２００３）。
【０３９５】
グリア被膜の内部領域に由来するＧＦＡＰポジティブである星状細胞の形態学的に区別することができる３つのタイプは、極めて異なる微視的な全細胞の電気生理学的プロフィールを示した：
【０３９６】
（ｉ）星型の星状細胞についての電気生理学的実験は、これらがＫｉｒ２．３およびＫｉｒ４．１の内向き整流チャンネルを発現したことを示しており、免疫標識実験は、これらがまた、ＳＵＲ１とＫｉｒ６．１サブユニットから構成されるＫＡＴＰチャンネルを発現したことを示唆していた（Ｃｈｅｎら，２００３；Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２０００）。
【０３９７】
（ｉｉ）Ｒ２星状細胞についての電気生理学的実験は、これらが、サソリ（Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ）由来のポリペプチド毒素に対して感受性がある新規のＣａ２＋活性化Ｃｌ−チャンネルを発現することを示していた（Ｄａｌｔｏｎら，２００３）。Ｒ２星状細胞だけがコンチャンネルを発現した。
【０３９８】
（ｉｉｉ）Ｒ１星状細胞についての電気生理学的実験は、これらが、ＰＫＣδを介してＴＧＦβ１によって調節されるＫｉｒ２．３内向き整流チャンネルを発現することを示した（Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２００２；Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２０００）。新しく単離された、しかし培養後ではない場合には、Ｒ１星状細胞はまた、新規のＳＵＲ１によって調節されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルも発現した（Ｃｈｅｎら，２００３；Ｃｈｅｎら，２００１）。
【０３９９】
（実施例２１）
ＳＵＲ１の発現
グリベンクラミドはスルホニルウレア受容体であるＳＵＲ１およびＳＵＲ２に結合し、ＳＵＲ１に対して高い親和性を有している。免疫蛍光実験を、抗ＳＵＲｘ抗体を使用して行った。ゼラチンスポンジのすぐ外側のグリア被膜の内部領域（図２２のｇｆ）は、抗ＳＵＲ１抗体で強く標識された（図２２Ａ）が、抗ＳＵＲ２抗体によっては標識されなかった（図２２Ｂ）。個々の細胞は低倍率では識別できなかったが、高倍率では、ＳＵＲ１標識が単離後の個々の細胞において均一に分布していることが示された（図２２Ｃ）。
【０４００】
ＳＵＲ２ではなくＳＵＲ１の転写についての証拠はまた、埋め込みの７日後に単離したゼラチンスポンジに由来するｍＲＮＡに対して行ったＲＴ−ＰＣＲ実験でも見られた。星状細胞の中で観察されたシグナル（図２２Ｄ、レーン３）は、ゲルの適切な位置に存在しており、これは、対照であるインシュリノーマＲＩＮ−ｍ５ｆ細胞による位置と同様であった（図２２Ｄ、レーン２）。対照的に、ＳＵＲ２のｍＲＮＡは反応性星状細胞の中では転写されていなかった（図２２Ｄ、レーン５）が、対照として使用した心筋細胞の中には存在していた（図２２Ｄ、レーン４）。
【０４０１】
（実施例２２）
グリア被膜の内部領域の特性決定
グリア被膜の中の全てのＧＦＡＰポジティブである反応性星状細胞がＳＵＲ１ポジティブであるかどうかを試験するために、ゼラチンスポンジを１週間早く埋め込み、次いで潅流−固定し、そしてＰＢＳ中の４０％グルコース中で２日間平衡化させたラットに由来する脳を実験した。凍結切片を抗ＧＦＡＰ抗体と抗ＳＵＲ１抗体で二重標識し、免疫蛍光を用いて実験した。この免疫標識実験および他の免疫標識実験のために、標準的な対照プロトコールには、利用できる場合には適切な免疫原性ペプチドの使用または、一次抗体の省略を含めた。
【０４０２】
５匹の動物を切片状にし、低倍率で画像を撮影した。画像は常に、ゼラチンスポンジの縁からのＧＦＡＰ応答の深さ（厚み）が、ＳＵＲ１応答の深さよりも数倍大きいことを示していた。ＧＦＡＰ応答の深さの測定によっては、約４００〜５００μｍの値が得られた（図２３Ａ、図２３Ａ〜２３Ｉ、ゼラチンスポンジ移植物の位置は常に左とした；図２３Ｆの棒は１００μｍに等しい）。対照的に、ＳＵＲ１応答の優勢な位置は、２５〜５０μｍの深さに拡がっていた（図２３Ｄ）。ＳＵＲ１ポジティブ領域の外側はＧＦＡＰポジティブ反応性星状細胞の広い領域であり、これらはほとんどがＳＵＲ１ネガティブであった。ＳＵＲ１応答は常に、グリア皮膜の最も内部の領域にある異物との界面に正確に存在していた。ＳＵＲ１ポジティブである細胞は常にＧＦＡＰポジティブであった。この実験から、ゼラチンスポンジにくっついており、それとともに回収された細胞がＳＵＲ１を発現していることが最も有力であることが明らかになった。また、この最も内部の領域にあるＲ１星状細胞が、反応性星状細胞の特有のサブ集団から構成されていることも明らかであった。この観察から、グリア被膜の「内部領域」が、グリア被膜の残りの部分とは異なり、特有の構成要素であるとの概念が浮上した。
【０４０３】
（実施例２３）
グリア被膜の内部領域の他の特徴
他の実験を、グリア被膜の内部領域をさらに評価するために行った。これまでの実験では、正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）の培養条件下でのＲ１星状細胞の一次培養によっては、３日後に、ＳＵＲ１によって調節されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの消失が生じたが、低酸素条件下で培養した場合には、このチャンネルの発現が続いて生じていたことが明らかにされている（Ｃｈｅｎら，２００３）。したがって、このチャンネルの発現に低酸素条件が必要であることを決定した。したがって、ＳＵＲ１を発現するＲ１星状細胞が見られたグリア被膜の内部領域もまた低酸素状態である可能性があった。これを評価するために、組織化学的マーカーであるピモニダゾールを、ｐＯ２＜１０ｍｍＨｇで使用して、免疫組織化学的に検出することができる細胞性のタンパク質を有している不可逆的共有結合による付加物を形成させた（Ａｒｔｅｅｌら，１９９８；Ｈａｌｅら，２００２；Ｋｅｎｎｅｄｙら，１９９７）。
【０４０４】
簡単に説明すると、ラットを、刺傷とゼラチンスポンジの埋め込みによって準備した。ラットを１週間生存させた。ピモニダゾールを屠殺の前に投与し、そして凍結切片を、ピモニダゾール付加物を検出するための適切な抗体を使用する免疫蛍光実験のために処理した。凍結切片をＧＦＡＰで二重標識した。この実験によって、低酸素条件の存在がグリア被膜のＳＵＲ１ポジティブである内部領域を制限し、最も顕著なピモニダゾール標識がわずか２０〜５０μｍの深さまでにしか広がるないことを確認した（図２３Ｂ；ＧＦＡＰは示さないが、ＧＦＡＰの応答の深さは図２３Ａのものと似ていた）。高倍率の画像は、ピモニダゾール標識（図２３Ｇ、上段右）が大きなＧＦＡＰポジティブ星状細胞の中に存在することを示していた（図２３Ｇ、下段左）。
【０４０５】
内部領域の低酸素状態が、低酸素状態に反応する転写因子であるＨＩＦ−１のアップレギュレーション／活性化を導く可能性があることは理にかなっている。これを試験するために、切片の免疫標識を、ＧＦＡＰについての同時標識とともに抗ＨＩＦ−１α抗体を用いて行った。この実験により、ＨＩＦ−１α標識がグリア被膜のＳＵＲ１ポジティブである内部領域にほぼ限定され、標識はわずか２０〜５０μｍの深さにしか広がらないことを確認した（図２３Ｃ；ＧＦＡＰは示さないが、ＧＦＡＰ応答の深さは図２３Ａのものと似ていた）。高倍率の画像は、ＨＩＦ−１α標識（図２３Ｈ、上段右）が大きなＧＦＡＰポジティブ星状細胞（図２３Ｈ、下段左）の中に存在することを示していた。
【０４０６】
密着結合タンパク質の発現もまた試験した。２つの密着結合タンパク質ＺＯ−１とオクルジン−５（ｏｃｃｌｕｄｉｎ−５）を、これらのタンパク質に対する抗体で互いの凍結切片を標識することによって実験した。切片をＧＦＡＰで二重標識した。再び、最も内部の層の２０〜５０μｍの深さだけが、ＺＯ−１またはオクルジン−５のいずれかについて標識された（図２３Ｅおよび２３Ｆ；ＧＦＡＰは示さないが、ＧＦＡＰ応答の深さは図２３Ａのものと似ていた）。高倍率の画像は、オクルジン−５標識（図２３Ｉ、上段右）が大きなＧＦＡＰポジティブ星状細胞（図２３Ｉ、下段左）の中に存在することを示していた。
【０４０７】
したがって、グリア被膜の内部領域は、ＳＵＲ１によって調節されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと密着結合タンパク質を発現するそのＲ１星状細胞とともに、異物と脳の間の重要なバリア（例えば、異物−脳バリア（ＦｂＢＢ））として作用する可能性がある。これが正しい場合には、バリアのブリーチングが損傷に対する全体的な応答に有意な影響を与える可能性があると予想されるであろう。
【０４０８】
（実施例２４）
内部領域の操作
ラットを、本発明者らの通常のプロトコールにしたがって刺傷とゼラチンスポンジの埋め込みによって準備し、１週間生存させた。外科手術の時点で、ラットには、脳の損傷部位に埋め込んだ送達カテーテルとともに皮下用の浸透圧ミニポンプも埋め込んだ。動物には、グリベンクラミド（０．５μｌ／ｈｒで１μＭ×７日間）またはジアゾキシド（０．５μｌ／ｈｒで１０μＭ×７日間）のいずれかをポンプで投与した。全身的な毒性は観察されず、神経学的作用は損なわれることはなく、そして動物は健康であるように見え、熱もなかった。
【０４０９】
損傷を受けた脳の凍結切片をＧＦＡＰについて試験した。グリベンクラミドを投与した動物においては、明確なグリア被膜が見られ、これは、周辺の脳とは境界が極めてはっきりしており、ＧＦＡＰポジティブ細胞が密集していると見える内部領域を有していた（図２４Ａ；右手にゼラチンスポンジ）。対照的に、ジアゾキシドを投与した動物は、異物から遠くにまで伸びる広いＧＦＡＰポジティブ応答を示し、ほとんど境界がはっきりしない外部領域と、はっきりしない小さくない内部領域を有していた（図２４Ｂ；右手にゼラチンスポンジ）。
【０４１０】
凍結切片もまた、核標識ＤＡＰＩで試験した。グリベンクラミドで処理した動物に由来する切片においては、標識のほとんどは、ＧＦＡＰポジティブ星状細胞に起因していた。しかし、ジアゾキシドで処置した動物に由来する切片の中では、ＤＡＰＩ標識は、小さい有核細胞の「シート」を示した（図２５Ａのぼんやりとしたスポット）。調べたところによると、細胞のこれらのシートは、多形角白血球であることが明らかとなった（ＰＭＮ、好中球）。これを、ＰＭＮ特異的マーカーであるＭＭＰ−８で標識することによって確認した（図２５Ｂ）。感染の証拠が存在せず、移植された物質の微生物培養が細菌の増殖を示さなかったこと（好気培養と嫌気培養を含む）に留意することが重要であり、このことは、炎症応答が感染には起因しないことを示していた。
【０４１１】
したがって、グリベンクラミドでの内部領域Ｒ１星状細胞の保護は、損傷に対する全体的なＧＦＡＰ応答に制限され、一方、ジアゾキシドでの内部領域Ｒ１星状細胞の死滅は、全体的なＧＦＡＰ応答の拡がりと、極めて多数の好中球の動員を引き起こしたようであった。これらの観察は、グリア被膜の「内部領域」が特有の構成要素であり、損傷に対する全体的な応答を決定することにおいて重要な機能を有しているとの概念を強く補強した。
【０４１２】
（実施例２５）
複数の脳の病状におけるＳＵＲ１
組織を３つのラットモデル（外傷、膿瘍、および脳卒中）から、およびヒトの転移性腫瘍を取り囲むグリア被膜から入手し、ＧＦＡＰに対する抗体とＳＵＲ１に対する抗体を用いて二重免疫標識を行った。低倍率での観察はＳＵＲ１についてのポジティブな免疫標識と一致したＧＦＡＰについてのポジティブな免疫標識を有していた、ゼラチンスポンジ移植物に隣接していた組織の層を示した（図２６Ａ、Ｂ）。高倍率での個々の細胞の試験は、ＳＵＲ１免疫標識が大きな星型の星状細胞の中に存在していることを示していた。このことによって、異物である移植物を取り囲むグリア被膜の内部領域の中のＳＵＲ１ポジティブＲ１星状細胞の存在を確認した（図２６Ｃ）。
【０４１３】
ラットの脳膿瘍モデルを実験した。膿瘍を一般的な麻酔下で皮下に自家糞石（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｅｃａｌ）を移植することによって作成した。これらの動物は極めて良好に生存していたが、これらはゆるやかな体重の減少の証拠を示した。外科手術の１週間後に屠殺した際には、化膿した孔が、グリア被膜を取り囲むように見られた。膿の領域に近いグリア被膜の低倍率での観察は、ＳＵＲ１についてのポジティブな免疫標識と一致したＧＦＡＰについてのポジティブな免疫標識を有している細胞を示した（図２６Ｄ、Ｅ）。高倍率での個々の細胞の試験は、ＳＵＲ１免疫標識が大きな星型の星状細胞の中に存在していることを示しており、このことによって、脳膿瘍を取り囲むグリア被膜の中のＳＵＲ１ポジティブＲ１星状細胞の存在が確認された（図２６Ｆ）。
【０４１４】
ラットの標準的な脳卒中モデルを実験した。脳卒中を、一般的な麻酔下で留置した、内頚動脈の分岐点に進む経路への頚動脈内挿入によって作成した。脳卒中を生き延びた動物を１週間で屠殺し、脳を試験した。脳卒中の領域に隣接している組織の低倍率での試験は、ＳＵＲ１についてのポジティブな免疫標識と一致したＧＦＡＰについてのポジティブな免疫標識を有している細胞を示した（図２６Ｇ、Ｈ）。高倍率での個々の細胞の試験は、ＳＵＲ１免疫標識が大きな星型の星状細胞の中に存在していることを示しており、このことによって、脳卒中を取り囲むグリア被膜の中のＳＵＲ１ポジティブＲ１星状細胞の存在が確認された（図２６Ｉ）。
【０４１５】
転移性脳腫瘍の切除のための外科手術を受けたヒトから組織を得た。外科手術の際には、転移を取り囲むグリア皮膜は、腫瘍自体から、そして水腫状の白質から簡単に区別できた。転移に隣接しているグリア被膜の低倍率での観察はＳＵＲ１についてのポジティブな免疫標識と一致したＧＦＡＰについてのポジティブな免疫標識を有している細胞を示した（図２６Ｊ、Ｋ）。高倍率での個々の細胞の試験は、ＳＵＲ１免疫標識が、複数の十分に成長した突起を有している大きな星型の星状細胞の中に存在していることを示しており、このことによって、ヒトでの転移性脳腫瘍を取り囲むグリア被膜の中のＳＵＲ１ポジティブＲ１星状細胞の存在が確認された（図２６Ｌ）。
【０４１６】
これらのデータは、グリア被膜の形成部位での反応性星状細胞の中での最初のＳＵＲ１のアップレギュレーションについての、Ｒ１星状細胞の中のＳＵＲ１によって調節されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの発現との一致を示している。このデータは、グリア被膜の中のＲ１星状細胞の中でのＳＵＲ１の発現が、脳に影響を与える多数の病理学的症状における共通の表現形であることを示している。これらのデータは、ＳＵＲ１に作用し、したがってこれらの細胞の死または生存を決定することができる薬理学的物質を活用することにより、内部領域のＲ１星状細胞を選択的に操作する唯一の機会を強調する。
【０４１７】
全体的には、これらの観察は、グリア被膜の残りの部分とは異なり、グリア被膜の「内部領域」が特有の構成要素であるとの概念を強く補強する。
【０４１８】
（実施例２６）
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと壊死
ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルを脳卒中の齧歯類モデルにおいて実験した。周辺部においては、ＳＵＲ１標識は星型の細胞において見られ（図２７Ａ）、これはまたＧＦＡＰポジティブでもあった。脳卒中の中央部分には星型の細胞は存在しなかったが、ＳＵＲ１標識が丸い細胞の中に見られ、これは、これもまたＧＦＡＰポジティブである（データは示さない）ブレブ様の外観を呈していた（図２７Ｂ、Ｃ）。インサイチュでブレブ形成を伴っていた丸い細胞は、アジ化Ｎａへの曝露後に壊死を受けているインビトロでの反応性星状細胞と似ていた。グリベンクラミド対生理食塩水の作用を決定した。グリベンクラミドまたは生理食塩水を、皮下に埋め込んだ浸透圧ミニポンプによって投与した（０．５μｌ／ｈｒで１μＭ）。生理食塩水で処理したラットにおいては、脳卒中の３日後の死亡率は６８％であったが、グリベンクラミドで処置したラットにおいては、３日後の死亡率は２８％にまで下がった（それぞれのグループにおいてｎ＝２９；ｐ＜０．００１、χ２による）。別の動物においては、グリベンクラミドで処置したラットの脳卒中の半球には、生理食塩水で処置したラットの中のはるかに過剰量の水のわずか半分しか含まれていなかった（それぞれのグループにおいて＝５；ｐ＜０．０１、ｔ検定による）。このことによって、浮腫の形成におけるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの重要な役割を確認した。
【０４１９】
ＳＵＲ１をまた、外傷の齧歯類モデルにおいても実験した。外傷の部位への薬物の直接の注入の効果を、埋め込んだ浸透圧ミニポンプを使用して試験した。チャンネル阻害因子であるグリベンクラミドを使用して、反応性星状細胞の死を減少させ、そしてチャンネル活性化因子であるジアゾキシドを使用して星状細胞の死を促進した。グリベンクラミドの注入によっては、全体的な損傷応答が減少し、異物である移植物を取り囲むグリア被膜が安定化し、そして対照と比較して炎症応答は最少となった。
【０４２０】
反対に、ジアゾキシドは、原則としてグリア被膜を破壊し、多形角細胞（ＰＭＮ）の大量の流入を特徴とするとてつもなく大きな炎症応答を引き起こした（図２５Ａ、Ｂ）。これらのデータは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが損傷応答において重要な役割を担っていることを示唆しており、これらは、炎症がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性と反応性星状細胞の壊死に密接に関係しているという仮説を強くサポートする。
【０４２１】
（実施例２７）
永久的なＭＣＡモデル
成体の雄または雌のＷｉｓｔａｒラット（２７５〜３５０ｇｍ）を一晩絶食させ、その後麻酔した（ケタミン６０ｍｇ／ｋｇとキシラジン７．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。右大腿動脈にカニューレを挿入し、病理学的パラメーター（温度、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、およびグルコースを含む）をモニターした。腹部頸部切開を使用して、右外頸動脈と翼口動脈を繋いだ。共通の頚動脈を近位で結紮し、内頚動脈を塞栓させるためにカテーテルを挿入した。
【０４２２】
血栓塞栓性（ＴＥ）脳卒中については、７〜８個の他発的血餅（１．５ｍｍの長さ）で血栓を発生させた。他発的な血栓によって誘導したフィブリンを多く含む血餅を準備した（Ｔｏｏｍｙら，２００２）。
【０４２３】
悪性脳水腫（ＭＣＥ）を有している大きなＭＣＡ脳卒中については、本発明者らは最初に、微粒子で血栓を発生させ（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉら，１９９７）［ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）粒子；Ｔａｒｇｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ；１５０−２５０μｍの直径、６００μｇ、１．５ｍｌのヘパリン化した生理食塩水中］、続いてＩＣＡ分岐点まで進行させ、結紮糸で適切な位置に確保したモノフィラメント縫合糸（４−０ナイロン、先端が丸く、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされている）を使用して、標準的な管腔内での縫合糸による閉塞（Ｋａｗａｍｕｒａら，１９９１）を行った。
【０４２４】
脳卒中後、動物に、１０ｍｌのグルコースを含まない通常の生理食塩水をｄｅｒｍｏｃｌｙｓｉｓによって投与した。直腸温度は、動物が麻酔から醒めるまで、サーボ制御型の加温毛布（ｗａｒｍｉｎｇ  ｂｌａｎｋｅｔ）を使用して約３７℃に維持した。脳卒中の時点での血液ガスと血清グルコースは、対照については、ｐＯ２、９４±５ｍｍＨｇ；ｐＣＯ２、３６±５ｍｍＨｇ；ｐＨ７．３３±０．０１；グルコース１４２±６ｍｇ／ｄｌであり、グリベンクラミドで処置した動物については、ｐＯ２、９３±３ｍｍＨｇ；ｐＣＯ２、３８±２ｍｍＨｇ；ｐＨ７．３４±０．０１；グルコース１５２±７ｍｇ／ｄｌであった。
【０４２５】
いずれのモデルを用いた場合にも、動物は、麻酔から直ちに醒め、動き回り、そして通常は異常な神経学的機能を、典型的には円を描くような行動と片側不全麻痺を示した。血栓塞栓症（ＴＥ）モデルを用いた場合の致死率は最も小さかったが、悪性脳水腫（ＭＣＥ）モデルを用いた場合には、動物は遅れて悪化を示し、多くの場合には死に至った。ほとんどの死はＭＣＡ閉塞後１２〜２４時間で起こり、検死によって死が無菌性梗塞の理由によるものであることを確認した。稀に、動物は脳卒中後＜６時間で死亡し、検死によってクモ膜下出血を有していたことが明らかになった。この場合には、これは実験から除外した。ＭＣＥと無菌性梗塞を有している未処置の動物の致死率は約６５％であり、これは、大きなＭＣＡ脳卒中を有しているヒトの致死率と同様であった（Ａｙａｔａ  ＆  Ｒｏｐｐｅｒ，２００２）。
【０４２６】
（実施例２８）
脳卒中の大きさ、致死率、組織−水、および薬物の局在化についての実験
ＭＣＡ閉塞（ＴＥモデルとＭＣＥモデルの両方）の後、浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  ２００２、Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を皮下に埋め込んで、これによって生理食塩水またはグリベンクラミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；３００μＭまたは１４８μｇ／ｍｌ、０．５μｌ／ｈｒ、皮下、負荷量なし）のいずれかを投与した。脳卒中の大きさ（ＴＥモデル）（連続する２ｍｍ厚の切片においてＴＴＣ（−）組織の容積として測定し、半球容積の割合として表した）を、２つの処置グループ（それぞれ、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかで処置した１０匹の雄のラットを含む）において、脳卒中の４８時間後に比較した。致死率（ＭＥＣモデル）を、２つの処置グループにおいて脳卒中後の１週間の間に比較した。それぞれのグループには２９匹のラット（１９匹の雌と１０匹の雄）を含め、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかで処置した。水腫（ＭＣＥモデル）は、２つの処置グループにおいて脳卒中の８週間後に比較した。それぞれのグループには、１１匹の雄のラットを含め、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかで処置した。これらの２つの処置グループのそれぞれのラットを２つのサブグループにさらにわけ、これらのうちの第１のサブグループは、罹患している半球全体の中の水を分析するために使用し（ＴＣＣ処置なし）、そして第２のグループは、罹患している半球のＴＣＣ（−）部分に対してＴＣＣ（＋）部分の中の水を分析するために使用した。蛍光タグをつけた薬物の局在化について、２０匹の雄のラットをＭＣＡ脳卒中に供し（ＭＣＥモデル）、そして浸透圧ミニポンプを埋め込んだ。これにより、ＢＯＤＩＰＹを結合させたグリベンクラミド（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−グリブライド、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；３００μＭまたは２３５μｇ／ｍｌ、０．５μｌ／ｈｒ皮下、負荷量なし）を送達した。これらのうち、１５匹のラットを、薬物作用の確認（致死率、組織、水、およびグルコース）のために使用し、そして５匹のラットを薬物の分布の決定のために使用した。
【０４２７】
（実施例２９）
免疫標識
脳を潅流−固定し（４％のパラホルムアルデヒド）、そして凍結防止処理をした（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）（３０％のスクロース）。凍結切片（１０μｍ）を準備し、標準的な技術を使用して免疫標識した（Ｃｈｅｎら，２００３）。透過処理（０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間）の後、切片をブロックし（２％のロバ血清で１時間；Ｓｉｇｍａ  Ｄ−９６６３）、その後、ＳＵＲ１に対する一次抗体とともにインキュベートした（１：３００；室温で１時間、その後４℃で４８時間；ＳＣ−５７８９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。洗浄後、切片を蛍光二次抗体（１：４００；ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ）とともにインキュベートした。同時標識のために、ＮｅｕＮに対する一次抗体（１：１００；ＭＡＢ３７７；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）；ＧＦＡＰ（１：５００；ＣＹ３を結合させた；Ｃ−９２０５；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびｖＷｆ（１：２００；Ｆ３５２０，Ｓｉｇｍａ）を使用して、組織を製造業者に推奨されるように処理した。種に適している蛍光二次抗体を必要に応じて使用した。蛍光シグナルを、エピ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ１０００）を使用して視覚化した。
【０４２８】
（実施例３０）
ＴＣＣ染色、脳卒中の大きさ
新しく回収した脳を２ｍｍ厚になるように冠状断面で切断し、切片をＴＣＣ（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５％のジメチルホルムアミド中の０．１２５％ｗ／ｖ）に、３７℃で３０分間曝した。脳卒中の大きさについては、染色した切片の写真を撮影し、画像を分析して（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ）、罹患している半球のうちのＴＣＣ（−）組織が占める割合を決定した。浮腫についての補正は行わなかった。水またはＳＵＲ１タンパク質含有量についてのいくつかの決定のためには、個々の冠状断面の切片を拡大下で３つの部分に分けた：（ｉ）罹患していない対照半球；（ｉｉ）罹患している半球のＴＣＣ（＋）部分；（ｉｉｉ）罹患している半球のＴＣＣ（−）部分。それぞれの動物について、３つの部分に由来するプールした組織を、その後、組織の水分量の測定のため、またはウェスタンブロットのために処理した。
【０４２９】
（実施例３１）
組織の水分含有量
組織水を、湿／乾重量法（Ｈｕａら，２００３）によって定量した。組織試料をブロットして、少量の吸収された液体を除去した。試料を、精密スケールで秤量して湿重量（ＷＷ）を得、８０℃および減圧下で乾燥させて恒量とし、その後、再度秤量して乾燥重量（ＷＤ）を得た。その後、それぞれの組織試料のＨ２Ｏの割合を、（ＷＷ−ＷＤ）×１００／ＷＷとして計算した。
【０４３０】
（実施例３２）
免疫ブロット
組織溶解物とゲルを準備した（Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２００２）。膜をＳＵＲ１（ＳＣ−５７８９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ）、Ｋｉｒ６．１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、またはＫｉｒ６．２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）について染色した。膜を細片とし、β−アクチン（１：５０００、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）について再びブロットした。これを最初のデータを正規化するために使用した。検出は、日常的に行われる画像化および定量（Ｆｕｊｉ  ＬＡＳ−３０００）とともにＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。
【０４３１】
（実施例３３）
インサイチュハイブリダイゼーション
非放射性ジゴキシゲニンで標識したプローブを、製造業者のプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）にしたがって、ＳＰ６またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して作成した。ＲＮＡ  ｄｉｇ標識プローブ（センスおよびアンチセンス）は、以下のプライマーを隣接させたＳＵＲ１挿入断片（６１３ｂｐ）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）から作成した：５’ＡＡＧＣＡＣＧＴＣＡＡＣＧＣＣＣＴ３’（正方向；配列番号１）；５’ＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＧＧＣＴＴＧＴＣ３’（逆方向；配列番号２）。ラットの脳（ＭＣＡ脳卒中の３、６、８時間後）の新しい凍結切片（１０μｍ）またはパラフィンに包埋した切片（４μｍ）を、インサイチュハイブリダイゼーション（Ａｎｉｓｉｍｏｖら，２００２）に使用した。
【０４３２】
（実施例３４）
グリア被膜の内部領域
低酸素症の他の原因（例えば、動脈閉塞）がＳＵＲ１のアップレギュレーションを生じるかどうかを評価するために、実施例に記載した永久的な局所性脳虚血の２つの齧歯類モデルを使用した。
【０４３３】
ＭＣＥモデルを、ＳＵＲ１タンパク質とｍＲＮＡを評価するために、そして浮腫および生存性に対するＳＵＲ１の阻害の効果を評価するために使用し、一方、ＴＥモデルを、脳卒中の大きさに対するＳＵＲ１の阻害の効果を測定するために使用した。潅流を行わなかった場合（図２９Ａ）は、ＴＣＣ染色（Ｍａｔｈｅｗｓら，２０００）（図２９Ｂ）とＧＦＡＰ免疫標識を使用して、梗塞を梗塞周辺領域から区別した。
【０４３４】
ＳＵＲの発現は、梗塞の核の中で一次的に増大した。ここでは、ＳＵＲ１の増大は、壊死の発症の十分に前である、ＭＣＡ閉塞後２〜３時間程度の早い段階で（図２９Ｄ）明らかになり、そして後に、壊死が発症するとともに消滅した（図２９Ｃ、図の右側）。壊死の前のこれらの早い時間では、ＳＵＲ１は、ＮｅｕＮで同時標識されたニューロンの中で極めて優性であった（図２９Ｄ〜Ｆ）。
【０４３５】
梗塞周辺領域（前方大脳動脈（ＡＣＡ）とＭＣＡ領域の間の伝統的な虚血の「分水界（ｗａｔｅｒｓｈｅｄ）」領域を含む）においては、ＳＵＲ１の発現は、核の中よりも遅れて増大したが、維持された。６〜１２時間では、ＳＵＲ１の発現は梗塞と梗塞周辺領域の境界を明確に区切った（図２９Ｃ）。ここでは、ＳＵＲ１の発現は、それぞれＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ（図２９Ｇ〜Ｉ）、およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（図２９Ｊ〜Ｌ）との同時標識によって示されたように、ニューロン、星状細胞、および毛細血管内皮細胞において見られた。ＳＵＲ１は、通常は、反対側の組織において明らかであるように（図２９Ｃ、図の左側）、これらの皮質領域および皮質下領域ではこのような豊富な量では発現されない（Ｔｒｅｈｅｒｎｅ  ＆  Ａｓｈｆｏｒｄ，１９９１；Ｋａｒｓｃｈｉｎら，１９９７）。
【０４３６】
ウェスタンブロットは、梗塞周辺の領域で最も著しいＳＵＲ１タンパク質の発現の増大を示していた（図３０Ａ〜Ｄ）。しかし、ＫＡＴＰチャンネルの孔を形成しているサブユニットであるＫｉｒ６．１またはＫｉｒ６．２はアップレギュレートされなかった（図３０Ｃ〜Ｄ）。インサイチュハイブリダイゼーションは虚血の領域に由来するニューロンと毛細血管の中でのＳＵＲ１の転写を示し、これは対照組織の中には存在していなかった（図３０Ｅ〜Ｇ）。このことは、ＫＡＴＰチャンネルではなくＳＵＲ１が、脳虚血において転写によってアップレギュレーションされたことを示唆していた。
【０４３７】
したがって、これらのデータは、Ｋｉｒ６．１またはＫｉｒ６．２ではなくＳＵＲ１が、脳虚血において、最初は壊死を受ける運命にある領域において、そして後に梗塞周辺領域において転写によってアップレギュレートされることを示唆している。
【０４３８】
（実施例３５）
ＳＵＲ１のアップレギュレーション
実施例３４で考察した図３０Ａ〜Ｇは、ＳＵＲ１が脳卒中において有意にアップレギュレーションされることを示していた。孔を形成するサブユニットであるＫｉｒ６．１およびＫｉｒ６．２は脳卒中においてはアップレギュレーションされないこともまた示され、このことは、ＫＡＴＰチャンネルが関係していないことを示唆している。ＳＵＲ１のアップレギュレーションがＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルに起因するものであって、ＫＡＴＰチャンネルに起因するものではないことを証明するために、虚血領域に由来するニューロンと内皮細胞のパッチクランプ記録を行った。大きなニューロン様の細胞を、脳卒中の３時間後（図３１Ａ）と６時間後に酵素によって（ｅｎｘｙｍａｔｉｃａｌｌｙ）単離した。パッチクランプ実験は、全てのＫ＋チャンネル（ＫＡＴＰチャンネルを含む）を遮断するために、浴とピペットの中でＣｓ＋を使用して行った。これらの実験は、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルと予想される、グリベンクラミドによって遮断された強い陽イオンチャンネル活性を示した（図３１Ｂ）。加えて、チャンネル活性をＫ＋を用いて記録した場合には、傾斜コンダクタンスは、新しく単離したＲ１星状細胞において以前に報告したものと同様の３４ｐＳであり（図３１Ｃ、Ｄ）、ＫＡＴＰチャンネルについて報告した７０〜７５ｐＳよりもはるかに小さかった。
【０４３９】
（実施例３６）
脳虚血におけるＳＵＲ１の機能
脳虚血の中で新しく発現されたＳＵＲ１の機能を決定するために、ＳＵＲ１の高選択性阻害因子であるグリベンクラミドの効果を実験した。致死率に対するグリベンクラミドの効果（ＭＣＥモデル）を実験した。動物の大きなグループにおいては、雄および雌のいずれもが、グリベンクラミドでの処置によって、生理食塩水での処置と比較して致死率の劇的な低下（６５％から２４％）を生じた（ｐ＜０．００２；図３２Ａ）。
【０４４０】
グリベンクラミドはエネルギーの枯渇によって誘導される星状細胞の細胞傷害性浮腫を緩和することが示されている（Ｃｈｅｎら，２００３）ので、致死率に対する有利な作用は浮腫に関係していると推論した。脳卒中（ＭＣＥモデル）の誘導の８時間後の浮腫の形成に対するグリベンクラミドの効果を試験した。これは、致死率の実験において任意の動物が死に至る時間である。２つの実験のうちの第１の実験においては、罹患した半球と罹患していない半球の中の水分含有量を、上記の方法を使用して測定した。対照半球については、水分は、７７．９±０．２％であった。罹患した半球については、生理食塩水で処置したグループについては水分は３．４％増加して８１．３±０．５％となり、一方、グリベンクラミドで処置したグループについては、わずかに２．０％しか上昇せず、７９．９±０．３％にしかならなかった。これらの値は有意な差であり（ｐ＜０．０５）、浮腫の形成におけるＳＵＲ１の重要な役割と一致していた。
【０４４１】
次に、浮腫の位置をさらに特性決定するために、脳の冠状断面の切片を生存しているＴＴＣ（＋）部分と生存していないＴＴＣ（−）部分に分けた後の水分含有量を試験した。罹患していない半球の中の水分は７８．０±０．１％であり（図３２Ｂ）、これは７７．９±０．２％の以前の値と同様であった。これは、ＴＴＣ処置により水分含有量が変化しなかったことを示していた。罹患した半球については、生理食塩水で処置したグループについてはＴＴＣ（＋）組織の水分は５．４％増加して、８３．４±１．１％になり、一方、グリベンクラミドで処置したグループについては２．５％しか増加せず、８０．５±０．３％にしかならなかった（図３２Ｂ）。これらの値は有意な差であった（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＴＴＣ（−）組織中の水分についての値は、生理食塩水を用いた場合とグリベンクラミドを用いた場合についてそれぞれ、７８．７±１．０％と７８．６±０．４％であり、差はなかった（ｐ＝０．９７）。これらは罹患していない半球についての値（７８．０％）よりもわずかに高いだけであって、組織の水分量を増加させるために血流を流し続けることの必要性を反映している（図３２Ｂ）（Ａｙａｔａ  ＆Ｒｏｐｐｅｒ，２００２）。
【０４４２】
これらの動物においては、浮腫を測定した８時間の時点での血清グルコースは、虚血によって誘導される損傷に対する影響がおそらくない範囲に留まっていた（Ｌｉら，１９９４；Ｗａｓｓ  ＆  Ｌａｎｉｅｒ，１９９６）（生理食塩水で処置した動物とグリベンクラミドで処置した動物についてそれぞれ、１２２±４対９３±３ｍｇ／ｄｌ；１１匹のラット／グループ）。まとめると、これらのデータは、浮腫が、脳卒中の初期の核に隣接している生存している梗塞周辺（半影）組織にほぼ完全に局在化していること、そしてグリベンクラミドがそれを軽減するために極めて有効であることを示しており、これらは、浮腫の形成におけるＳＵＲ１の重要な役割と一致していた。
【０４４３】
したがって、低用量のグリベンクラミド（これはＳＵＲ１について高度に選択性である（Ｇｒｉｂｂｌｅ  ＆  Ｒｅｉｍａｎｎ，２００３；Ｍｅｙｅｒら，１９９９））を用いたデータは、脳水腫の形成におけるＳＵＲ１の重要な役割についての説得力のある証拠を提供した。
【０４４４】
（実施例３７）
脳卒中の大きさの効果
致死性ではない血栓塞栓症（ＴＥ）モデルを使用して、脳卒中の誘導の４８時間後の脳卒中の大きさを評価した。
【０４４５】
ＴＥモデルを用いた場合には、グリベンクラミドでの処置によっては、生理食塩水を用いた対照と比較して、脳卒中の容積において極めて有意な減少が生じた（３２．５±４．９％対１５．５±２．３％；ｐ＜０．０１）（図３２Ｃ〜Ｅ）。原則として、処置グループとは無関係に、全ての動物を基底核を含む梗塞に罹患させ、これらはレンズ核線条体動脈によって供給した。しかし、グリベンクラミドグループにおける脳卒中の大きさの縮小は、多くの場合には、減圧頭蓋骨切除術を用いた場合に以前に報告された表現形である（Ｄｏｅｒｆｌｅｒら，２００１）大脳皮質の顕著なやせに関係していた（図３２Ｃ〜Ｄ）。グリベンクラミドを用いた場合には、大脳皮質のやせは、脳水腫の軽減と頭蓋内圧の低下が原因である、軟髄膜側枝の血流の改善を反映している可能性がある。
【０４４６】
（実施例３８）
脳卒中後のＭＣＥモデル
蛍光誘導体であるＢＯＤＩＰＹ−グリベンクラミドを使用して、脳卒中（ＭＣＥモデル）後にインビボで組織を標識した。
【０４４７】
元の化合物と同じ様式で送達した場合には、蛍光誘導体は、同様の防御作用を示したが、効力は弱く［７日致死率、４０％（ｎ＝１０）；８時間での罹患した半球のＴＴＣ（＋）部分の中の水、８２．７±１．４％（ｎ＝５）；血清グルコース、１０９±４ｍｇ／ｄｌ］、これは、標識した薬物の効力の低下と一致していた（Ｚｕｎｋｌｅｒら，２００４）。低い全身用量で薬物を使用した場合には、罹患していない半球（図３３Ｂ）および膵臓においては最小限の標識が生じたが、脳卒中の非潅流核の中には標識は生じなった。しかし、梗塞周辺領域の細胞は明確に標識され、大きなニューロン様細胞の明確な標識と、微小血管（図３３Ａ）（毛細血管（図３３Ｃ）を含む）の明確な標識を伴って明らかに標識された、このことは、ＳＵＲ１の突出した発現を示していた（図３３Ｄ）。虚血脳の中での優先的な細胞標識は、おそらく、グリベンクラミド結合部位の中での増大だけではなく、血液脳関門の変化が原因である可能性がある取り込みの増大も反映したのであろう。
【０４４８】
したがって、データは、先に記載した星状細胞の中でのそれらの存在に加えて、毛細血管内皮細胞とニューロンの中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの存在を示していた（Ｃｈｅｎら，２００１；Ｃｈｅｎら，２００３）。ＭＣＡ閉塞（ＭＣＥモデル）の１〜６時間後に虚血の大脳皮質から単離したニューロンと微小血管についてのさらなるパッチクランプ実験によって、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの存在を確認した。これは、電荷担体としてＣｓ＋を用いて容易に記録することができ、そして、グリベンクラミドによって遮断された、およそ３０〜３５ｐＳコンダクタンスの非選択性陽イオンチャンネルを示していた。このチャンネルは、虚血を起こしていない脳組織に由来する細胞の中には存在しなかった。
【０４４９】
上記の観点から、ＡＴＰの枯渇によって開かれ、そして虚血性ニューロン、星状細胞、および内皮細胞の中で新たに発現される、ＳＵＲ１によって調節されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが、細胞傷害性浮腫およびイオン性浮腫の形成に必要なＮａ＋の流入についての、重要な、これまでには同定されていない経路を構成していることが示唆されている。まとめると、これらの知見は、脳虚血後の浮腫の形成を決定付ける新しい経路におけるＳＵＲ１の重要な関与を示唆している。ＳＵＲ１に特異的な分子治療によって、虚血に関係する多くのタイプのＣＮＳ損傷の処置のための重要な新しい途を提供できる可能性がある。
【０４５０】
（実施例３９）
グリベンクラミドとｔＰＡの同時投与
血栓塞栓性の脳卒中についての齧歯類モデルを使用した（Ａｏｋｉら，２００２；Ｋｉｊｋｈｕｉｚｅｎら，２００１；Ｋａｎｏら，２０００；Ｓｕｍｉｉら，２００２；Ｔｅｊｉｍａら，２００１）。簡単に説明すると、一晩絶食させた雄の自然発生的な高血圧症のラットに、ハロタン（Ｎ２Ｏ／Ｏ２の７０／３０混合物中の１〜１．５％）を使用して、自発的な吸引によって麻酔した（Ｌｅｅら，２００４；Ｓｕｍｉｉら，２００２）。直腸温度を、サーモスタット制御型の加温パッドで約３７℃に維持した。右側の大腿動脈にカニューレを挿入し、病理学的パラメーター（温度、平均血圧、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、グルコースを含む）をモニターした。一時的な局所性虚血を、ＭＣＡを閉塞させるために他発的な血餅を使用した塞栓症モデルを用いて行った。他発的な血栓によって誘導したフィブリンを多く含む血餅を、Ｎｉｅｓｓｅｎらによって採用された方法を使用して準備した（Ａｓａｈｉら，２０００；Ｎｉｅｓｓｅｎら，２００３；Ｓｕｍｉｉら，２００２）。７個の血餅（１．５ｍｍの長さ）を、閉塞を起こさせるために使用した。
【０４５１】
腹部頸部切開を使用して、内頚動脈と外頚動脈を露出させた。外頚動脈と翼口動脈を繋いだ。取り外し可能な外科用クリップを、共通の頚動脈と内頚動脈に適用した。血餅を含む改良型ＰＥ−５０カテーテルを、外頚動脈に逆向きに挿入し、内頚動脈にまで進めた。一時的なクリップを取り外し、血餅を注入した。切開部を閉じた。
【０４５２】
脳卒中後に、動物に、グルコースを含まない通常の生理食塩水（合計１０ｍｌ）を、ｄｅｒｍｏｃｌｙｓｉｓによって投与した。動物が覚醒し、動き回るまで温度を維持した。
【０４５３】
処置（再潅流）について設定した時間の直前に、動物を再度麻酔し、大腿静脈にカニューレを挿入した。処置について設定した時点で、生理食塩水またはグリベンクラミドの負荷量（１．５μｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を最初に投与した。その後、再潅流を、ｒｔＰＡを用いて行った（１０ｍｇ／ｋｇ、Ａｌｔｅｐｌａｓｅ，Ｇｅｎｅｔｅｃｈ；２ｍｌの蒸留水に溶解させ、３０分かけて投与した）（Ｂｕｅｓｓｅｂら，２００２）。その後、背面胸部切開を使用して、浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  ２００２、Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を皮下に埋め込み、これによって生理食塩水またはグリベンクラミド（３００μＭまたは１４８μｇ／ｍｌ、０．５μｌ／ｈｒ  ｓ．ｑ．）のいずれかを送達した。生理学的パラメーター（温度、平均血圧（尾血圧プレチスモグラフィー）、血液ガス、およびグルコースを含む）をモニターした。
【０４５４】
６時間で同時に、動物を、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかを用いて、同時に処置した（１．５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．の負荷量と、１／２μｌ／ｈｒで送達される１４８μｇ／ｍｌ＝３００μＭを含む浸透圧ミニポンプの埋め込み）。動物を、脳卒中の２４時間後に安楽死させ、脳を潅流させて、血管内区画から血液を取り出した。新しい脳の冠状切片を準備し、写真を撮影し、その後、切片をＴＴＣ染色のために処理して、梗塞の領域を特定した。
【０４５５】
生理食塩水で同時に処置した全ての動物（５／５）は、皮質領域と、梗塞の皮質下の実質領域において大きな出血性の転換の領域を示し、これは、血管内出血の証拠と一致していた（図３４Ａ〜Ｄ）。対照的に、グリベンクラミドで同時に処置した５匹の動物のうちでは１匹だけが出血性の転換を示し、４／５は出血の証拠は示さなかった（図３４Ｅ〜Ｈ）。
【０４５６】
これらのデータは、グリベンクラミドの投与を用いた場合には、出血性の転換からの防御が生じ、さらには、脳卒中の大きさ、イオン性浮腫、および血管原性浮腫の軽減が生じたことを示唆している。
【０４５７】
（実施例４０）
脳の毛細血管と内皮細胞の単離
以前に報告されたような改良（Ｓｅｉｄｅｌ，１９９１）を加えて、Ｈａｒｄｅｒら，（１９９４）による方法を一部採用した。簡単に説明すると、ラットを深く麻酔し、下行大動脈を結紮し、右心房を開き、左心室にカニューレを挿入して、酸化イオン粒子（粒子の大きさ１０μｍ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の１％懸濁液を含む５０ｍｌの生理食塩水溶液を潅流させた。脳を取り出し、軟膜と軟膜血管を剥ぎ取り、そして皮質のマンテル（ｍａｎｔｅｌ）をかみそりの刃を用いて１〜２ｍｍ３の断片になるようにミンチにした。組織の断片をトリプシンとＤＮＡｓｅとともにインキュベートし、その後、ナイロンメッシュ（２１０μｍ）を通して篩にかけた。保持された微細血管をコラゲナーゼの中に再度懸濁させ、攪拌し、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。消化を終わらせるために、微細血管を磁石を用いて容器の側部に付着させ、繰り返し洗浄して酵素と細胞の破片を除去した。
【０４５８】
これらの方法を使用して、さらなる実験のための単細胞（図３６）を得るためのさらなる消化に適している、正常に見える微細血管構造が得られた。
【０４５９】
単離した内皮細胞を、ナイスタチンで孔をあけたパッチ技術を使用した新しく単離した内皮細胞を使用して実験した。生理学的溶液を用いた場合には、細胞は、負電位で、突出した強い整流内向き電流を示し、正電位では中程度の外向き電流を示した（図３７Ａ）。これによって、中程度の電位では、ほぼゼロ電流を有している特徴的な電流−電圧曲線が得られ（図３７Ｃ）、これは、新しく単離した内皮細胞における以前の観察と同様であった（Ｈｏｇｇら，２００２）。ピペット溶液中のＫ＋をＣｓ＋で置き換えた場合には、Ｋ＋チャンネル電流は完全に遮断された。内皮細胞中では、これによって直線的な電流−電圧曲線が生じた（図３７Ｅ）。これらのデータは、新しく単離した内皮細胞中の電圧依存性チャンネルが、Ｎａ＋を有していない唯一のＫ＋チャンネルであることを明らかに示している。
【０４６０】
（実施例４１）
ニューロンの単離
ニューロンを、マイクロスライサー（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）切片から単離した。免疫標識実験は、虚血性のＮｅｕＮポジティブニューロンが、ＭＣＡＯ後、２〜３時間以内に、壊死が明らかになる前にＳＵＲ１を発現したことを示していた。したがって、組織を、ＭＣＡＯ後、２〜３時間で調製した。脳をブレグマのレベルで冠状に分け、凍結切片を一方の半分から調製し、マイクロスライサー切片を他方の半分から調製した。凍結切片（１０μｍ）を、虚血の領域の特定のためのＴＴＣ染色（Ｍａｔｈｅｗｓら，２０００）あるいは高コントラスト銀梗塞染色（ＳＩＳ）（Ｖｏｇｅｌら，１９９９）のために、そしてＮｅｕＮについて二重標識されたニューロンの中でのＳＵＲ１のアップレギュレーションを確認するための免疫標識のために使用した。マイクロスライサー切片（３００μｍ）は、パッチクランプのための１つのニューロンを得るために処理した（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈら，２０００；Ｋａｙら，１９８６；Ｍｏｙｅｒら，１９９８）。冠状切片の選択した部分を、空気を泡立てたＨＢＳＳ中で３５℃でインキュベートした。少なくとも３０分後に、断片を、１．５ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳに移した。プロテアーゼ処理の３０〜４０分後に、断片を、酵素を含まないＨＢＳＳ中でリンスし、機械で滴定した。対照には、罹患していない半球の鏡像である皮質領域に由来する細胞を使用した。細胞を、倒立顕微鏡の台の上に取り付けたプラスチック製のペトリ皿の中のＨＢＳＳ中で１０〜１２分間処理した。大きな大きさ、および中程度の大きさのピラミッド型のニューロンを、記録のために選択した。２〜３時間のこの早い段階では、ニューロンと毛細血管はＳＵＲ１のアップレギュレーションを示したが、星状細胞は示さなかった。
【０４６１】
一旦細胞を単離すると、全細胞、インサイドアウト、アウトサイドアウト、および孔をあけたパッチを含む周知の方法を使用して、パッチクランプ実験を使用した（Ｃｈｅｎら，２００３；Ｃｈｅｎら，２００１；Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２００２；Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２０００；Ｐｅｒｉｌｌａｎら，１９９９）。
【０４６２】
（実施例４２）
グリベンクラミドによるＭＭＰの阻害
脳卒中組織の中でのＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の活性化を対照と比較した。簡単に説明すると、対照条件（ＣＴＲ）下、グリベンクラミド（１０μＭ）の存在下、およびＭＭＰ阻害因子ＩＩ（３００ｎＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下の、組み換え体である酵素のゼラチナーゼ活性と脳卒中組織である。
【０４６３】
次に、上清についてゼラチン−セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゼラチナーゼ精製プロセスを行い、Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙを、ゼラチンを含むドデシル硫酸ナトリウムゲル中で、精製した上清について行った（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９９４）。乾燥させたゲルを、透明性スキャナ（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ  ｓｃａｎｎｅｒ）でスキャンし、画像を濃度測定器によって分析した。個々の試料の相対的な溶解度を、そのバンドの密度の値を積分し、試料のタンパク質含有量で割り算することによって表した。
【０４６４】
Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙによって、ゼラチナーゼ活性が脳卒中後に上昇したことを確認し（図３５Ａ）、そしてグリベンクラミドの存在下でアッセイしたゼラチナーゼ活性（図３５Ｂ、グリベンクラミド）がグリベンクラミドを用いることなくアッセイした場合（図３５Ｂ、ＣＴＲ）と同じあったが、ゼラチナーゼ活性が市販されているＭＭＰ阻害因子ＩＩ（図３５Ｂ、ＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９阻害因子）によって強く阻害されたことを示していた。これらのデータは、グリベンクラミドはゼラチナーゼ活性を直接は阻害しないことを明らかに示しており、このことは、グリベンクラミドを用いた場合に観察された出血性の転換の減少が、おそらくは、虚血性内皮細胞に対する有効なグリベンクラミドの防御作用の理由によってもたらされたことを示唆していた。
【０４６５】
（実施例４３）
脳卒中におけるＳＵＲ１−ｍＲＮＡのアップレギュレーション
脳卒中におけるＳＵＲ１の関与についてのさらなる分子的証拠を、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して得た。
【０４６６】
全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネートを使用して、ＭＣＡＯ（ＳＴＲＯＫＥ）に対して反対側（ＣＴＲ）と同側のホモジナイズした脳組織の試料から抽出し、精製した。ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ  ＲＴキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して５０μｌの反応混合物あたり４μｇの全ＲＮＡを用いて合成した。ＳＵＲ１−ｍＲＮＡの相対値は、Ｈ１ｆ０（ヒストン１メンバー０）に対して正規化することによって得た。以下のプローブを使用した：ＳＵＲ１正方向：ＧＡＧＴＣＧＧＡＣＴＴＣＴＣＧＣＣＣＴ（配列番号３）；ＳＵＲ１逆方向：ＣＣＴＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＧＡＡＣＣ（配列番号４）；ＳＵＲ１  ＴａｑＭａｎプローブ：６−ＦＡＭ−ＴＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＴＡＭＲＡ（配列番号５）；Ｈ１ｆ０正方向：ＣＧＧＡＣＣＡＣＣＣＡＡＧＴＡＴＴＣＡ（配列番号６）；Ｈ１ｆ０逆方向：ＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号７）；Ｈ１ｆ０  ＴａｑＭａｎプローブ：６−ＦＡＭ−ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＡ  ＴＣＣＡＧＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号８）。
【０４６７】
これらのデータは、ＳＵＲ１のｍＲＮＡが、ＭＣＡＯの３時間後に核領域において有意に増加したことを示していた（図３８）。
【０４６８】
（実施例４４）
ＳＵＲ１のノックダウン（ＳＵＲ１ＫＤ）には防御作用がある
ＳＵＲ１の関与をさらに試験するために、Ｒ１星状細胞の単離のために本発明者らが使用した別の標準的なモデルにおいて、ＳＵＲ１の発現を、脳のゲルフォーム埋め込み部位に留置した送達カテーテルとともに浸透圧ミニポンプを使用して、１４日間にわたりオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を注入することによって、インサイチュで「ノックダウン」させた（Ｐｅｒｉｌｌａｎら，１９８０、Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２００２、Ｐｅｒｉｌｌａｎら，２０００、Ｐｅｒｉｌｌａｎら，１９９９）。ＳＵＲ１の発現のノックダウン（ＳＵＲ１ＫＤ）は、対照として使用したスクランブル（ＳＣＲ；５’−ＴＧＣＣＴＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１０））ＯＤＮとともに、アンチセンス（ＡＳ；５’−ＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＴＴＣＴＣＧＧＴ−３’（配列番号９））（Ｙｏｋｏｓｈｉｋｉら，１９９９）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を使用して行った。
【０４６９】
グリア被膜の免疫ブロットは、スクランブル配列ＯＤＮを投与した対照と比較して、ＳＵＲ１ノックダウン（ＳＵＲ１ＫＤ）組織におけるＳＵＲ１の発現の有意な低下を示した（図３９Ａおよび３９Ｂ）。
【０４７０】
本発明者らは、ＳＵＲ１ＫＤと対照から、上記の標準的な細胞単離プロトコール（Ｃｈｅｎら，２００３）を使用して単細胞を酵素的に単離して、アジ化Ｎａによって誘導したＡＴＰの枯渇に対する機能的応答を評価した。対照組織に由来するＲ１星状細胞中では、アジ化Ｎａ（１ｍＭ）によって迅速な脱分極が生じ、これは、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性化に関係しているＮａ＋の流入が原因であった（図３９Ｃ）。注目すべきは、この脱分極応答が、ＫＡＴＰチャンネルが活性化された場合に観察された過分極応答とは反対であったことである。しかし、ＳＵＲ１ＫＤ由来のＲ１星状細胞においては、アジ化Ｎａは静止膜電位に対してはほとんど影響はなかった（図３９Ｄ）。対照においては、アジ化Ｎａを加えることによっては、６４±３．７ｍＶの脱分局が生じ、一方、ＳＵＲ１ＫＤの細胞の中では脱分極はわずか８．７±１．７ｍＶであった（図３９Ｅ）。
【０４７１】
加えて、通常はアジ化Ｎａへの曝露に続いて生じる膜のブレブ形成は、ＳＵＲ１ＫＤ由来の細胞の中では観察されず、このことによってＲ１星状細胞の細胞傷害性浮腫におけるＳＵＲ１の役割を確認した。
【０４７２】
（実施例４５）
ＳＵＲ１の発現を調節する分子因子
膵臓β細胞中での作用に基づいて、多数のＳＰ１転写因子結合部位が、ＳＵＲ１転写活性の活性化に重要と考えられている近位ＳＵＲ１プロモーター領域の中で同定された（Ａｓｈｆｉｅｌｄら，１９９８；Ｈｉｌａｌｉら，２００４）。注目すべきは、ＳＰ１が原則として脳卒中においては実験されていないことである（Ｓａｌｍｉｎｅｎら，１９９５）。
【０４７３】
簡単に説明すると、虚血性の梗塞周辺組織を、ＳＵＲ１の発現に重要なＳＰ１について、脳虚血においてアップレギュレートされることが広く理解されているＨＩＦ１αについて（Ｓｅｍｅｎｚａ  ２００１；Ｓｈａｒｐら，２０００）、そして、ＳＵＲ１自体について免疫標識した。ＳＰ１は、ＨＩＦ１αの発現（図４０Ｂ）の理由によって虚血性であることが確認された領域の中の、大きなニューロン様細胞の中と毛細血管の中（図４０Ａ、４０Ｃ）で顕著に発現されていた。注目すべきは、ＳＰ１を発現していた毛細血管はまた、ＳＵＲ１の顕著な発現も示したことである（図４０Ｃ、４０Ｄ）。反対側の対照組織は、ＳＰ１についてはほとんど免疫標識を示さず、そしてＨＩＦ１αについては全く示さなかった（図４０Ｅ、４０Ｆ）。
【０４７４】
核ＳＰ１局在化は、脳卒中においては早い時期に有意に増大し（図４１Ａ、４１Ｂ）、そして核Ｓｐ１は、ＭＣＡＯ後にＳＵＲ１を発現する大きなニューロン様細胞において見られた（図４１Ｃ）。
【０４７５】
ＨＩＦ１αノックダウン動物を、ゲルフォームの移植部位へのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの注入によって得た。図４２によって、ＨＩＦ１αノックダウン動物がＳＵＲ１の発現の有意な低下を生じたことを確認した（図４２Ｂ、４２Ｄ）。これにより、ＳＰ１だけではなく、ＨＩＦ１αもまた、おそらくＳＵＲ１の発現についての重要な調節因子であることの強い証拠が提供された。
【０４７６】
（実施例４６）
梗塞周辺組織の中の血流はＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアンタゴニストでの処置によって保護される
低用量のグリベンクラミドの全身投与によるＳＵＲ１の遮断によっては、脳水腫、梗塞の容積が小さくなり、そして致死率が低下し、梗塞容積の低下は皮質のやせに関係していた。ＭＣＡＯによる非致死性の梗塞を伴う血栓塞栓性（ＴＥ）脳卒中モデルを使用して、ラットにおける梗塞の容積に対する影響を実験した。致死率および浮腫に対する特筆しべき作用を考えて、本発明者らは、グリベンクラミドが梗塞の容積に対して好ましい作用を有しているかどうかを決定しようと考えた。これは、ＭＣＥモデルを用いた場合には実現不可能であった。なぜなら、早い段階での致死率が高いからである。したがって、本発明者らは、ＭＣＡＯの２日目および７日目に梗塞の容積を評価することができる、非致死性の血栓梗塞症（ＴＥ）モデルを利用した。２日目には、グリベンクラミドでの処置によっては、生理食塩水を用いた対照と比較して、梗塞の容積の極めて有意な減少が生じた（３５．５±４．４％対１６．７±２．２％；ｐ＜０．０１）。同様の観察を７日目にも行い（１５．２±１．２％；ｐ＜０．０１）、これは、処置の効果が恒久的であったことを再び示していた。
【０４７７】
全ての動物を、処置グループとは無関係に、基底核を含む梗塞に罹患させ、これらは末端細動脈によって供給した。しかし、グリベンクラミドグループにおける脳卒中の大きさの縮小は、多くの場合には、減圧頭蓋骨切除術を用いた場合に以前に報告された表現形である（Ｄｏｅｒｆｌｅｒら，２００１）大脳皮質の顕著なやせに関係していた。グリベンクラミドを用いた場合の大脳皮質のやせは、脳水腫の軽減が原因であり得る、軟髄膜側枝の血流の改善を反映している可能性がある。グリベンクラミドの有効用量は７５ｎｇ／ｈｒであった。直接の血管拡張は、グリベンクラミドが通常はＫＡＴＰチャンネルの遮断が原因で血管収縮性であるので、予想されなかった（Ｌｉｎｄａｕｅｒら，（２００３）およびＴｏｍｉｙａｍａら，（１９９９））。
【０４７８】
血流を、脳の血流に対するグリベンクラミドでの処置の効果を決定するために、レーザードップラーフローメトリーを使用して測定した。同じＴＥモデルを使用して、相対的な脳の血流の測定を、中大脳動脈（ＭＣＡ）によって供給される体性感覚皮質について行った。レーザードップラーフローメトリーは、生理食塩水で処置したグループおよびグリベンクラミドで処置したグループのいずれにおいても、罹患した半球の中での値が中大脳動脈の閉塞（ＭＣＡＯ）の１時間後に有意に低下したことを示した（図４３）。しかし、流量の測定値は、グリベンクラミドで処置した動物においては４８時間までに完全に回復したが、生理食塩水で処置した動物は回復せず（図４３）、これは観察された皮質のやせと一致していた。
【０４７９】
方法
相対的な脳の血流（ＴＥモデル）を、レーザードップラーフローメトリー（ＬＤＦ）を使用して、２つのグループ（それぞれ、４匹の雄のラットを含み、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかで処置した）において測定した。ＭＣＡＯの前に、２つの１．５ｍｍの穴を、ブレグマに対して３ｍｍ前方、そして３ｍｍ側方に、左および右の体性感覚皮質（ＭＣＡ領域）を越えて頭蓋骨を貫通するように部分的に注意深くドリルで穴を空けた。２チャンネルのＬＤＦ機器（ＤＲＴ４；Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｘｍｉｎｓｔｅｒ，ＵＫ）を使用して、両方の半球の中の血流を同時に測定した。ＬＤＦの読み取りを、両側間で約１．０の血流の速度が得られるように、ピットの深さを調整することによって正規化した。一旦、この速度が得られたら、５セットのＬＤＦ測定を１分の間隔で行い、それぞれの位置についての値を平均し、反対側のＬＤＦの値に対する同側の速度を計算した。この技術によって、プローブの位置、角度、光条件などにおける測定内誤差の影響を最少にした。一旦、ベースラインＣＢＦを決定したら、これらの穴の上の皮膚の切開を閉じ、ＭＣＡＯの手順を開始した。相対的なＣＢＦ測定を、ＭＣＡＯの１時間後および４８時間後に、同じ穴と、１分の間隔で得た５回の両側の測定を平均する同じ方法を使用して、繰り返した。
【０４８０】
浮腫（ＭＣＥモデル）を、動物の２つのシリーズにおいてＭＣＡＯの８時間後に分析した。最初のシリーズにおいては、組織水を、生理食塩水またはグリベンクラミド（ＴＴＣ処置なし）のいずれかで処置した１１匹の雄のラットの２つのグループの、罹患していない半球対罹患した半球において分析した。
【０４８１】
第２のシリーズにおいては、組織水を、生理食塩水のみ、媒体（生理食塩水とＤＭＳＯ）、またはグリベンクラミドのいずれかで処置した６匹の雄のラットの３つのグループにおいて、罹患していない半球の中で、および罹患した半球のＴＴＣ（＋）対ＴＴＣ（−）部分の中で分析した。組織水を、湿／乾重量法によって定量した。組織試料をブロットして、少量の吸収された液体を除去した。試料を、精密スケールで秤量して湿重量（ＷＷ）を得、８０℃および減圧下で乾燥させて恒量とし、その後、再度秤量して乾燥重量（ＷＤ）を得た。その後、それぞれの組織試料のＨ２Ｏの割合を、（ＷＷ−ＷＤ）×１００／ＷＷとして計算した。
【０４８２】
梗塞の容積（ＴＥモデル）（連続する２ｍｍ厚の切片においてＴＴＣ（−）組織の容積として測定し、半球容積の割合として表した）を、３つの処置グループ（生理食塩水で処置し、２日後に評価したか、あるいは、グリベンクラミドで処置し、ＭＣＡＯの２日後または７日後に評価した、９匹、９匹、および７匹の雄のラットからなる）において比較した。
【０４８３】
永久的なＭＣＡ閉塞（ＭＣＡＯ）モデル。この実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインにしたがって行った。成体の雄または雌のＷｉｓｔａｒラット（２７５〜３５０ｇｍ）を一晩絶食させ、その後麻酔した（ケタミン６０ｍｇ／ｋｇとキシラジン７．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。右大腿動脈にカニューレを挿入し、生理学的パラメーター（温度、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、およびグルコースを含む）をモニターした。腹部頸部切開を使用して、右外頸動脈と翼口動脈を繋いだ。共通の頚動脈を近位で結紮し、内頚動脈を塞栓させるためにカテーテルを挿入した。血栓塞栓性（ＴＥ）脳卒モデルについては、７〜８個の他発的血餅（１．５ｍｍの長さ）で血栓を発生させた。他発的な血栓によって誘導したフィブリンを多く含む血餅を、記載されているように準備した。悪性脳水腫（ＭＣＥ）を有している大きなＭＣＡ脳卒中については、本発明者らは最初に、微粒子で血栓を発生させ［ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）粒子；Ｔａｒｇｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ；１５０−２５０μｍの直径、６００μｇ、１．５ｍｌのヘパリン化した生理食塩水中］、続いて、ＩＣＡ分岐点まで進行させ、結紮糸で適切な位置に確保したモノフィラメント縫合糸（４−０ナイロン、先端が丸く、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされている）を使用して、標準的な永久的な管腔内での縫合糸による閉塞を行った。ＭＣＡＯ後、動物に、１０ｍｌのグルコースを含まない通常の生理食塩水をｄｅｒｍｏｃｌｙｓｉｓによって投与した。直腸温度は、動物が麻酔から醒めるまで、サーボ制御型の加温毛布を使用して約３７℃に維持した。脳卒中の時点での血液ガスと血清グルコースは、対照については、ｐＯ２、９４±５ｍｍＨｇ；ｐＣＯ２、３６±５ｍｍＨｇ；ｐＨ７．３３±０．０１；グルコース１４２±６ｍｇ／ｄｌであり、グリベンクラミドで処置した動物については、ｐＯ２、９３±３ｍｍＨｇ；ｐＣＯ２、３８±２ｍｍＨｇ；ｐＨ７．３４±０．０１；グルコース１５２±７ｍｇ／ｄｌであった。いずれのモデルを用いた場合にも、動物は、麻酔から直ちに醒め、動き回り、通常は、異常な神経学的機能を、典型的には円を描くような行動と片側不全麻痺を示した。ＴＥモデルを用いた場合の致死率は最も小さかったが、ＭＣＥモデルを用いた場合には、動物は遅れて悪化を示し、多くの場合には死に至った。ほとんどの死はＭＣＡ後１２〜２４時間で起こり、検死によって死が無菌性梗塞の理由によるものであることを確認した。稀に、動物はＭＣＡＯ後＜６時間で死亡し、検死によってクモ膜下出血を有していたことが明らかになった。この場合には、これは実験から除外した。ＭＣＥと無菌性梗塞を有している未処置の動物の致死率は約６５％であり、これは、大きなＭＣＡ脳卒中を有しているヒトの致死率と同様であった。
【０４８４】
ＭＣＡＯ（ＴＥモデルとＭＣＥモデルの両方）後、２〜３分以内に、浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  ２００２、１４日ポンプ、０．５μｌ／ｈｒ；Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を皮下に埋め込んで、これによって生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）、媒体（生理食塩水とＤＭＳＯ）、または媒体中のグリベンクラミドのいずれかを皮下に送達した（負荷量なし）。グリベンクラミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）はＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック溶液として調製した。１５μｌのストック溶液を５００μｌの生理食塩水に稀釈して、ミニポンプの中で１４８μｇ／ｍｌまたは３００μＭの最終濃度となるようにした。グリベンクラミドの有効用量は７５ｎｇ／ｈｒであった。ＤＭＳＯの有効用量は１５ｎｌ／ｈｒであった。これを、媒体で処置した動物に送達した。
【０４８５】
ＴＴＣ（塩化トリフェニルテトラゾリウム）染色を、梗塞の容積を決定するために測定した。新しく回収した脳を２ｍｍ厚の冠状切片となるように切断し、切片をＴＴＣ（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５％のジメチルホルムアミド中の０．１２５％ｗ／ｖ）に、３７℃で３０分間曝した。梗塞の容積について、染色した切片の写真を撮影し、画像を分析して（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ）、罹患している半球のうちのＴＣＣ（−）組織が占める割合を決定した。浮腫についての補正は行わなかった。水分含有量またはＳＵＲ１タンパク質含有量についてのいくつかの決定のためには、個々の冠状切片を拡大下で３つの部分に分けた：（ｉ）罹患していない対照半球；（ｉｉ）罹患している半球のＴＣＣ（＋）部分；（ｉｉｉ）罹患している半球のＴＣＣ（−）部分。それぞれの動物について、３つの部分に由来するプールした組織を、その後、組織の水分量の測定のため、またはウェスタンブロットのために処理した。
【０４８６】
これらの知見は、ＳＵＲ１−によって調節されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルが、脳水腫の発症に決定的に関与していること、ＳＵＲ１によって調節されるＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの調整によって、梗塞周辺組織の血流の改善を導くことができること、そして、ＳＵＲ１の標的化によって脳卒中についての重要な新規の治療アプローチが提供されることを示している。
【０４８７】
（実施例４７）
グルコースでの処置をさらに加えたＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルアンタゴニストでの処置によってさらに浮腫が軽減する
グリベンクラミドの用量が低い場合にもなお、グリベンクラミドで処置した動物の血清グルコース濃度の低下が、上記実験において記録された。グリベンクラミドによるグルコースの低下から、浮腫に対するグリベンクラミドの有用な作用がＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルによって直接媒介されているか、あるいは血清グルコースの低下によって間接的に媒介されているのかという疑問が生じた。
【０４８８】
浮腫の測定としての組織水を、脳卒中の中脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルにおいてラットで測定した。実施例４６と同様に、グリベンクラミドの有効用量は、皮下に埋め込まれたＡｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプにより送達される７５ｎｇ／ｈｒであった。グリベンクラミドだけで処置した動物（ＧＬＩＢ）は、血清グルコースの低下を経験した。例えば、浮腫を測定した８時間での血清グルコース濃度は、グリベンクラミドで処置した動物（ＧＬＩＢ）についての９３±３ｍｇ／ｄｌに対して、生理食塩水で処置した動物（ＳＡＬＩＮＥ）については１２２±４ｍｇ／ｄｌであった（図４４を参照のこと）。閉塞の４時間後でのグルコースの投与によっては、閉塞の８時間後に１４１±４ｍｇ／ｄｌの血清グルコース濃度が生じた。
【０４８９】
ＧＬＩＢで処置した動物の中の同じ脳の領域の中の、同じ時間での浮腫の測定は、ＧＬＩＢによって、グルコース濃度とは無関係に浮腫の軽減が生じた事を示していた。これらの動物においては、グルコースの補充（１ｇｍ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を、ＭＣＡＯの４時間後に投与した。このグルコースの用量は、投与後すぐに測定すると、３００ｍｇ／ｄｌの高血糖のレベルを生じることが報告された。動物を、浮腫の測定のためにＭＣＡＯの８時間後に屠殺した（図４４、ＧＬＩＢ＋ＧＬＵＣＯＳＥ）。グルコースの投与の４時間後（すなわち、ＭＣＡＯの８時間後の屠殺の時点）の血清グルコースは高いままであった（１４１±４ｍｇ／ｄｌ）。しかし、これらの動物においては、ＧＬＩＢは、高血糖にもかかわらず、浮腫を軽減するためには同様に有効であった。
【０４９０】
これらの結果は、グルコース用量の添加によっては、ＳＵＲ１アンタゴニスト処置の防御作用は損なわれることはなく、ＳＵＲ１アンタゴニスト処置の防御作用が増進され得ることを示している。
【０４９１】
（実施例４８）
グリベンクラミドでの処置が遅れても中脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後のラットの脳卒中の容積は小さくなる
ラットの脳卒中の容積を上記で議論したように測定した。グリベンクラミド（３．３μｇ／ｋｇまたは３３．０μｇ／ｋｇ）を、図４５に示したように投与した。高用量のグリベンクラミドで処置した動物にもまた、グリベンクラミドによって引き起こされる低血糖を妨げるために、１ｇｍ／ｋｇのグルコースを投与した。
【０４９２】
脳卒中モデル：雄のＷｉｓｔａｒラット（２７５〜３２５ｇｍ）の中での内頚動脈を介した他発性の血餅での血栓塞栓症の塞栓。処置：ＭＣＡＯ後、２〜３分以内に、動物に、示した時間の量まで遅れて薬物の送達を開始するように較正した長さのカテーテルを取り付けた浸透圧ミニポンプを埋め込んだ；ポンプには、グリベンクラミド３００μＭを満たした。これによって、０．５μｌ／ｈｒの速度で送達し、グリベンクラミドについては７５ｎｇ／ｈｒの有効注入速度、ＤＭＳＯ（媒体溶媒として使用した）については１５ｎｌ／ｈｒの有効送達速度を得た；設定した時点で、動物にはまた、負荷量のグリベンクラミド（３．３または３３μｇ／ｋｇのいずれか）を腹腔内に、そして高用量のグリベンクラミドの場合には、１ｇｍ／ｋｇのグルコースの補充量を腹腔内に注射した。脳卒中の容積は、ＴＴＣ（−）組織の容積から、ＭＣＡＯの４８時間後に決定し、そして半球の容積に対する割合として図４５に表した。「ｎ」の値は、１つのグループ値のラットの数を示す；アスタリスク（＊）は、図４５に示すように、生理食塩水（ＳＡＬ）の対照と比較した容積の統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）差を示す。
【０４９３】
脳卒中の容積の有意な減少が、グリベンクラミドの注入を（ｉ）脳卒中の直後に、負荷量を伴わずに；（ｉｉ）脳卒中の２時間後に、３．３μｇ／ｋｇの負荷量を用いて；そして、（ｉｉｉ）脳卒中の６時間後までに、３３μｇ／ｋｇの負荷量を用いて開始した場合に観察された。したがって、ＭＣＡＯ後０時間または２時間でグリベンクラミドを投与した場合には、低用量のグリベンクラミド（３．３μｇ／ｋｇ）が、中脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）に罹患している実験動物の脳卒中の容積を小さくすることにおいて有効であった。より低用量のグリベンクラミドを用いた場合には、ＭＣＡＯの４時間後に脳卒中の容積のいくらかの縮小が見られたが、この動物の数を用いた場合には、差は統計学的には有意ではなかった。しかし、ＭＣＡＯの４時間後および６時間後に投与したより高用量のグリベンクラミド（３３．０μｇ／ｋｇ、グルコースの同時投与を用いた）で処置した動物においては、図４５に示すように、統計学的に有意な脳卒中の容積の縮小（対照と比較した）が観察された。したがって、より高用量の３３．０μｇ／ｋｇが、より低用量のグリベンクラミドと同様に、ＭＣＡＯ後、３倍長い時間まで有効であった。
【０４９４】
これらのデータは、グリベンクラミドの有効な作用を、処置が実質的に遅れてもなお得ることができることを示しており、有効な作用が、皮質構造の復旧を助ける軟髄膜側枝フローを可能にする浮腫の軽減の理由によることと一致する。これらのデータはまた、グリベンクラミドのグルコースとの同時投与が、脳卒中の容積を小さくすることにおいて効果的であり、そのようなグルコースとの同時投与により、血中グルコース濃度を下げてしまう有害な作用の可能性を伴うことなく、より高用量のグリベンクラミドでの処置が可能となり、そして、より低いスルホニルウレアの用量を用いた場合に可能であるよりも、脳卒中後に処置を開始するまでにより大きな時間の遅れを伴っても、有効なスルホニルウレアでの処置が可能となることを明らかに示している。
【０４９５】
（実施例４９）
グリベンクラミドは出血性の転換を少なくする
出血性の転換は、多くの場合に脳卒中または虚血性の障害に続いて起こる深刻な症状である。ここでは、虚血組織への再潅流によって、障害が起きた組織に対するさらなる損傷が引き起こされる。なぜなら、潅流されていない組織に蓄積した無酸素性の液体と酸性の液体が、その領域への血流が回復するに伴い、他の組織へと流れるからである。さらに、損傷は、漏れるように、虚血性損傷に対して遠位にある内皮細胞および血管から起こる可能性がある。したがって、結果の実験を、出血性の転換グリベンクラミドの作用を決定するために、示したように設計した。
【０４９６】
この実験では、自然発生による高血圧（ＳＨＲ）株の雄のラットを、血栓塞栓性脳卒中にし、その後、血餅を溶解させるために組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）で処置し、潅流していない脳組織への潅流を回復させた。具体的には、血栓塞栓性脳卒中を、実験による脳卒中の開始後、６時間で行った。ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、３０分間にわたる）を、生理食塩水（対照）またはグリベンクラミドのいずれかとともに静脈内に投与した。グリベンクラミドで処置した動物には、１．５μｇ／ｋｇの負荷量を静脈内に（ｉ．ｖ．）投与し、皮下用（ｓ．ｃ．）浸透圧ミニポンプを埋め込み、これによって、動物に１４８μｇ／ｍｌ（１／２μｌ／ｈｒで３００μＭと等量）を送達した。
【０４９７】
雄のＳＨＲラットの内頚動脈（ＩＣＡ）を、他発性血栓を用いて血管を閉塞させてＭＣＡＯを生じさせた。６時間後、動物を、ｔＰＡで処置し（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、３０分間にわたる）、生理食塩水またはグリベンクラミド（１．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．のボーラス、およびｓ．ｃ．ポンプの埋め込み（これによって、０．５ｍｌ／ｈｒで３００ｍＭの溶液を送達した））のいずれかを用いて同時処置した。脳卒中の２４時間後、脳を潅流させて血管内の血液を除去し、冠状切片とし、写真を撮影し、そしてＴＴＣ染色のために処理した。結果を図４６に示す。１〜２列目（Ａ〜Ｄ）は、生理食塩水で同時処置を行った動物に由来する。３〜４列目（Ｅ〜Ｈ）は、グリベンクラミドで同時処置した動物に由来する。冠状切片の写真の左側の列は、１〜２列目だけにおいて、脳室内出血、および虚血性の皮質領域／皮質下領域での大きな出血性の転換の領域を示した（写真の右側の赤色の領域；矢印）。同じ動物に由来するＴＴＣで処理した切片の写真の右側の列は、梗塞の領域を示している。
【０４９８】
図４６に示したように、脳卒中の領域の中の出血の発生（２４時間で測定した）は、対照と比較すると、グリベンクラミドでの処置によって減少した。生理食塩水で同時処置した６匹の動物のうちの５匹は出血性の転換を示したが、グリベンクラミドで処置した６匹のうちでは１匹だけが出血性の転換を示し、このことは、血栓塞栓性脳卒中後の出血性の転換を少なくするまたは妨げるグリベンクラミドでの処置の効力を明らかに示している。したがって、図４６は、グリベンクラミドでの処置によって、ｔＰＡで処置した動物において出血性の転換が少なくなったこと、そして、ｔＰＡを有害な作用を伴うことなく投与することができる虚血性の損傷後の猶予時間が長くなることを明らかに示している。
【０４９９】
本発明の好ましい実施形態の上記の開示は、説明および記載の目的のために提示されている。これは、網羅的なものである、または本発明を開示される正確な形態に限定するようには意図されない。本明細書中に記載される実施形態の多数のバリエーションおよび改良は、上記の開示を参照して当業者に明らかであろう。本発明の範囲は、本明細書に添付された特許請求の範囲によって、およびそれらの等価物によってのみ定義される。
【０５００】
さらに、本発明の例示的な実施形態の記載においては、明細書は、特定の工程の並びとして本発明の方法および／またはプロセスを示し得る。しかし、これらの方法またはプロセスが本明細書中に示される工程の特定の順序に頼る程度については、これらの方法またはプロセスは、記載される工程の特定の順序に限定されるべきではない。当業者に明らかであろうように、工程の他の順序が可能であろう。したがって、明細書中に示した工程の特定の順序は、特許請求の範囲についての限定とは解釈されるべきではない。加えて、本発明の方法および／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、記載した順序でのそれらの工程の実行に限定されるべきではなく、当業者であれば、その順序を変えてもなお、本発明の精神および範囲内に留まる場合があることを容易に理解できるであろう。さらに、本発明の例示的な実施形態に記載においては、明細書は、工程の特定の順序として、本発明の方法および／またはプロセスを示し得る。しかし、これらの方法またはプロセスが本明細書中に示した工程の特定の順序に頼らない程度に、これらの方法またはプロセスは、記載した工程の特定の順序に限定されるべきではない。当業者に明らかであるように、工程の他の順序も可能であり得る。したがって、明細書中に示した工程の特定の順序は、特許請求の範囲についての限定と解釈されるべきではない。加えて、本発明の方法および／またはプロセスに関する特許請求の範囲は、記載された順序でのそれらの工程の実行に限定されるべきではなく、当業者であれば、その順序を変えてもなお、本発明の精神および範囲にとどまる場合があることを容易に理解できるであろう。
【０５０１】
（実施例５０）
脳挫傷はＳＵＲ１のアップレギュレーションを生じる
挫傷モデル：成体のＷｉｓｔａｒラットを麻酔し（ケタミンおよびキシラジン）、そして無菌的に外科手術を受けさせて右頭骨頭頂部の頭蓋骨切除を行い、硬膜を露出させた。挫傷による損傷は、重錘落下装置（インパクター（ガラス製のシリンダーでガイドをつけた先端に５ｍｍのポリプロピレンボールを有している光の細い筋の（ｔｈｉｎ  ｌｉｇｈｔ）棒からなる）を使用して行った。これを露出させた硬膜の上にゆっくりと配置し、錘を落とすことによって動かした（２．５ｃｍから落とした１０ｇｍの重量）。対照には、錘を落とさずに、頭蓋骨切除術を含む外科手術を受けさせた。脳を２４時間後に回収し、凍結切片とし、免疫組織化学を使用してＳＵＲ１の発現について評価した。免疫組織化学に使用した抗体は、ＳＵＲ１に対する特異性が高く、梗塞周辺の脳組織の中で１１６〜２９０ｋＤａの範囲に１つのバンド（１８０ｋＤａ）だけを標識することが以前に示されている（Ｓｉｍａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００６を参照のこと）。免疫標識は、挫傷の領域においてＳＵＲ１の顕著なアップレギュレーションを示し（図４７および４８を参照のこと）、これは、挫傷によって誘導されたＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのアップレギュレーションと一致していた。
【０５０２】
参考文献
本明細書中で引用した全ての特許および刊行物は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。本明細書中で引用した参考文献についての全ての引用を以下のリストの提供する
特許および特許出願
ＷＯ０３／０７９９８７
米国特許第５，６３７，０８５号
米国特許第６，３９１，９１１号
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【０５０３】
本発明とその利点を詳細に記載したが、様々な変更、置換、および代替えを、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書中で行うことができることが理解されるはずである。さらに、本出願の範囲は、明細書中に記載した物質、手段、方法、および工程のプロセス、機械、製造、組成の特定の実施形態に限定されるようには意図されない。本発明の開示から当業者に容易に明らかであろうように、現在存在しているか、または本明細書中に記載された対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすかもしくは実質的に同じ結果が得られる、後に開発される物質、手段、方法、あるいは工程を、本発明にしたがって利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、物質、手段、方法、または工程のそのようなプロセス、機械、製造、組成がそれらの範囲に含まれるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【０５０４】
【図１】（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆからなる）；図１Ａは、ウアバインに対する曝露の前後、およびＮａＮ３に対する曝露の前後を記録する、全細胞電流クランプを示す。図１Ｂは、ＮａＮ３に対する曝露の（ａ）前と（ｂ）後のランプ波を記録する全細胞電圧−クランプを示す；（ｃ）は電流差である。図１Ｃは、ＮａＮ３に対する曝露の（ａ）前と（ｂ）後のパルス工程の間を記録する全細胞電圧クランプを示す；（ｃ）は電流差である。図１Ｄは、（１）８０ｍＶと（２）−８０ｍＶの膜電位の対照パッチと比較した、（３）−８０ｍＶと（４）８０ｍＶの膜電位でのＮａＮ３によって誘導される単一イオンチャンネルの開口の細胞付着パッチ記録を示す。図１Ｅは、ｈｉｇｈｅｒ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎで示された図１Ｄの細胞付着パッチ電流を示す。図１Ｆは、細胞が付着したパッチ単一チャンネルの電流−電圧の関係を示す。
【０５０５】
【図２】（図２Ａおよび図２Ｂからなる）；図２Ａは、様々な膜電位でのインサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）パッチにおいて記録された単一チャンネル電流を示す。点線は、チャンネルの閉鎖を示す。図２Ｂは、インサイドアウトパッチの単一チャンネルの振幅対膜電位のプロットである。
【０５０６】
【図３】（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄからなる）；図３Ａは、ピペットの中のＫ＋を様々なアルカリイオンで置き換えたインサイドアウトパッチにおいて記録された単一チャンネル電流を示す；点線は、チャンネルの閉鎖を示す。図３Ｂは、ピペットの中のＫ＋を様々なアルカリイオンで置き換えた場合の、チャンネルの振幅対膜電位のプロットである。図３Ｃは、ピペットの中のＫ＋をＣａ２＋およびＭｇ２＋で置き換えた場合の、インサイドアウトパッチの中で測定されたチャンネルの振幅対電圧のプロットである。チャンネルの孔の大きさを概算するために、図３Ｄは、透過性（Ｃｓ＋と比較）と１価の有機陽イオンのシリーズの分子半径との間の関係を示すプロットである。これには、（ａ）メタノールアミン、（ｂ）グアニジウム、（ｃ）エタノールアミン、（ｄ）ジエチルアミン、（ｅ）ピペラジン、（ｆ）Ｔｒｉｓ、および（ｇ）Ｎ−メチルグルカミンを含めた。データは、０．６７ｎｍと同等の孔の大きさを示していた。
【０５０７】
【図４】（図４Ａおよび４Ｂからなる）；図４Ａは、細胞質ＡＴＰが存在しない条件とＡＴＰの存在下でのインサイドアウトパッチの中での単一チャンネルの記録を示す。図４Ｂは、正規化されたチャンネル開口率（ｎ・Ｐｏ）対細胞質ＡＴＰ濃度のプロットである。
【０５０８】
【図５】（図５Ａおよび５Ｂからなる）；図５Ａは、様々な濃度の［Ｃａ２＋］ｉに対して曝露されたインサイドアウトパッチによる電流の記録を示す。図５Ｂは、示された膜電位および［Ｃａ２＋］ｉで測定されたｎ・Ｐｏの値を示す。
【０５０９】
【図６】図６は、実験した様々な電位、および様々な［Ｍｇ２＋］ｉでのインサイドアウトパッチの立体構造において得られた平均の単一チャンネル振幅のプロットである。点線は、３５ｐＳコンダクタンスを示す。
【０５１０】
【図７】図７（図７Ａおよび７Ｂからなる）は、反応性星状細胞中にＳＵＲ１  ｍＲＮＡが存在すること、およびＫｉｒ６．１とＫｉｒ６．２が存在しないことを示す。図７Ａのレーン３と５は、それぞれ、インシュリノーマＲＩＮ−ｍ５ｆ細胞とＮＲＡの中にＳＵＲ１が存在することを示す。図７Ａのレーン４と６は、いずれの細胞のタイプにもＳＵＲ２が存在しないことを示す。図７Ｂのレーン３と４は、Ｋｉｒ６．１はインシュリノーマＲＩＮ−ｍ５ｆ細胞の中に存在し、そしてＫｉｒ６．２はインシュリノーマ細胞には存在しないことを、それぞれ示す。図７Ｂのレーン５と６は、Ｋｉｒ６．１もＫｉｒ６．２も、それぞれ、ＮＲＡの中には存在しないことを示す。
【０５１１】
【図８】図８は、グリベンクラミドとＡＴＰに対して敏感なチャンネルに対するトリプシン消化の効果を示すための、インサイドアウトパッチの中での電流の記録を示す。
【０５１２】
【図９】図９（図９Ａおよび図９Ｂからなる）は、アウトサイドアウトパッチを記録する立体構造下で、チャンネル活性化因子であるジアゾキシドがチャンネルの活性を誘発できることを示す。図９Ａは、膜の細胞外側に加えたアジ化Ｎａおよびジアゾキシドをアウトサイドアウトパッチが認識することを示す。図９Ｂは、ｈｉｇｈｅｒ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎでの、図９Ａの対応する数字で記したセグメントから得られた電流の記録を示す。
【０５１３】
【図１０】（図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃからなる）；図１０Ａは、膜の細胞外側へのグリベンクラミドを加える（ａ）前、（ｂ）間、および（ｃ）後のアウトサイドアウトパッチの記録を示す。図１０Ｂは、ｈｉｇｈｅｒ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎでの、図１０Ａの電流の記録を示す。図１０Ｃは、実験した様々な電位での平均の単一チャンネル振幅のプロットを示す。データの傾きは、グリベンクラミド感受性チャンネルの３５ｐＳコンダクタンスを示す。
【０５１４】
【図１１】図１１（図１１Ａおよび１１Ｂからなる）は、スルホニルウレア化合物がチャンネル活性を阻害することを示す。図１１Ａは、膜の細胞外側に様々な濃度のグリベンクラミドを加えた場合の、アウトサイドアウトパッチの記録を示す。図１１Ｂは、グリベンクラミドとトルブタミドによるチャンネルの開口の確立の阻害についての用量応答曲線を示し、正規化されたチャンネルの開口の可能性（ｎ・Ｐｏ）を提供する。データは、標準的なロジスティック方程式にフィットし、１のＨｉｌｌ係数と４８ｎＭおよび１６．１μＭの最大の半分の阻害を有していた。プロットされた値は、グリベンクラミドとトルブタミドについて、それぞれ、３個および５個のパッチによる平均（±ＳＥ）である。
【０５１５】
【図１２】（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅ、１２Ｆ、１２Ｇ、１２Ｈ、および１２Ｉからなる）；図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、それぞれ、０μＭ、３μＭ、および３０μＭのトルブタミドの存在下でのチャンネルの開口の確率を示す。
【０５１６】
図１２Ｄ、１２Ｅ、および１２Ｆは、それぞれ、０μＭ、３μＭ、および３０μＭのトルブタミドの存在下でのチャンネル開口の停留時間の分布を示す。
【０５１７】
図１２Ｇ、１２Ｈ、および１２Ｉは、それぞれ、０μＭ、３μＭ、および３０μＭのトルブタミドの存在下でのチャンネル閉鎖の停留時間の分布を示す。
【０５１８】
【図１３】（図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃからなる）；図１３Ａは、膜の細胞外側に加えられたジアゾキシドを用いた場合のアウトサイドアウトパッチの記録を示す。
【０５１９】
図１３Ｂは、ジアゾキシドの添加後、そして様々な膜電位での、ｈｉｇｈｅｒ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎでの電流の記録を示す。
【０５２０】
図１３Ｃは、実験した様々な電位での平均の単一チャンネルの振幅のプロットを示す。傾きは、グリベンクラミド感受性チャンネルの３５ｐＳコンダクタンスを示す。
【０５２１】
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、新しく単離された未処理の反応性星状細胞の走査電子顕微鏡写真である。図１４Ａは、対照条件下でホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド固定を開始した場合の細胞を示す。図１４Ｂは、１ｍＭのＮａＮ３への曝露の５分後に固定した細胞を示す。図１４Ｃは、１ｍＭのＮａＮ３への曝露の２５分後に固定した細胞を示す。棒は１２μｍである。
【０５２２】
【図１５】（図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃからなる）；図１５Ａは、様々な化合物に曝され、そしてヨウ化プロピジウムで標識された（上段のパネルａ、ｂ、およびｃ）かまたはアネキシンＶで標識された（下段のパネルｄ、ｅ、およびｆ）細胞の落射蛍光顕微鏡画像の顕微鏡写真である。化合物は以下であった：対照（ａおよびｄ）、１ｍＭのアジ化Ｎａ（ｂおよびｅ）、１ｍＭのアジ化Ｎａと１μＭのグリベンクラミド（ｃおよびｆ）。図１５Ｂは、ヨウ化プロピジウム標識についての細胞数を示す棒グラフである；対にした複数の比較は、アジ化ナトリウムでの処理との有意差（ｐ＜０．０５）を示す。図１５Ｃは、アネキシンＶ染色についての細胞数を示している棒グラフである。対にした複数の比較は、いずれの処理とも有意差がないことを示している。
【０５２３】
【図１６】図１６は、浴溶液中にＡＴＰが存在するにもかかわらず、外因性のホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）の添加によりＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性化が引き起こされることを示している。最初に、チャンネル活性が、Ｒ１星状細胞由来の膜のインサイドアウトパッチの中で、１μＭのＣａ２＋と１０μＭのＡＴＰを含む浴溶液（これは、チャンネル活性を遮断するには十分である）を用いて記録された。５０μＭのＰＩＰ２の添加によってチャンネルの活性化が生じた。これは、ＡＴＰに対するチャンネルの親和性の明らかな低下を反映している。
【０５２４】
【図１７】図１７は、Ｒ１星状細胞中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルがエストロゲンによって阻害されることを示している。記録の最初の部分は、女性から得られたＲ１星状細胞由来の膜の細胞が付着したパッチにおいて記録された、多数の多層チャンネルによるブリスク活性を示している。１０ｎＭのエストロゲンの浴への添加によっては、即座にチャンネル活性の強い阻害が生じた。関与している機構は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）のエストロゲン受容体媒介性の活性化に関係していると考えられ、それにより、膜からのＰＩＰ２の枯渇が生じ、これは、ＡＴＰに対する親和性の明らかな増大を反映している。
【０５２５】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、男性および女性のいずれに由来するＲ１星状細胞も、エストロゲン受容体とＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのマーカーであるＳＵＲ１を発現することを明確に示しているウェスタンブロットである。細胞溶解物を男性（Ｍ）と女性（Ｆ）に由来するゼラチンスポンジ移植物から得、そして２段階の稀釈（４倍と１倍）で実験し、子宮に由来する溶解物を対照として使用した。図１８Ａは、エストロゲン受容体（ＥＲ）に対する抗体を使用して処理し、ＥＲαとＥＲβの両方が、いずれの性別によっても星状細胞の中で発現されていることを示している。ウェスタンブロットは、ＳＵＲ１もまたいずれの性別でも細胞によって発現されていることを示しており、ここでは膵臓組織が対照として使用された（図１８Ｂ）。
【０５２６】
【図１９】図１９は、男性由来のＲ１星状細胞中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルがエストロゲンによって阻害されることを示す。記録の最初の部分は、男性から得られたＲ１星状細胞由来の膜の細胞が付着したパッチにおいて記録された、多数の多層チャンネルによるブリスク活性を示している。１０ｎＭのエストロゲンの浴への添加によっては、即座にチャンネル活性の強い阻害が生じた。
【０５２７】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄはグリア被膜を示す。図２０Ａは、大きなゼラチンスポンジの移植の部位の断面のラットの脳の冠状断面を示す。スポンジ（最も内部の暗い領域）は、グリア被膜（明るい領域）によって封入され、その外側には血管原性浮腫の領域（外側の暗い領域）が見られ、これは、メチレンブルーの死の前の投与によって特定される。図２０Ｂと２０Ｃは、それぞれ、ＧＦＡＰについて免疫標識されたグリア被膜の低倍率の写真と高倍率の写真を示す。図２０Ｄは、ゼラチンスポンジの移植物の内側のＧＦＡＰで標識された細胞の高倍率の写真を示す。
【０５２８】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｈは免疫標識された星状細胞を示す。図２１Ａ、２１Ｃ、２１Ｅは、ＧＦＡＰ（図２１Ｃ）およびビメンチン（図２１Ｅ）について免疫標識された新しく単離された大きな明位相差像を示す（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）Ｒ１星状細胞を示す。図２１Ｂ、Ｄ、Ｆは、ＧＦＡＰ（図２１Ｄ）およびビメンチン（図２１Ｆ）について免疫標識された新しく単離された小さい暗位相差像を示す（ｐｈａｓｅ−ｄａｒｋ）Ｒ２星状細胞を示す。図２１Ｇは、グリア被膜から単離された星状細胞の初代培養物を示し、ここでは、Ｒ１星状細胞は大きな多角形の細胞を生じ（図２１Ｇｂ）、そしてＲ２星状細胞は小さい双極細胞を生じた（図２１Ｇａ）。図２１Ｈは、Ｒ２星状細胞は、サソリ（Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ）由来の蛍光タグ化クロロトキシンで標識されたが、Ｒ１星状細胞は標識されなかった。
【０５２９】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｄは、グリア被膜の内部領域がＳＵＲ１を発現するが、ＳＵＲ２は発現しないことを示す。ＳＵＲ１の免疫標識（図２２Ａ）は、ゼラチンスポンジ（ｇｆ）に隣接している細胞の中での突出した発現を示したが、一方、ＳＵＲ２についての免疫標識は発現を示さなかった（図２２Ｂ）。ゼラチンスポンジ移植物から酵素的に単離され、そしてＳＵＲ１について免疫標識された単一の細胞が示されている（図２２Ｃ）。図２２Ｄは、対照のインシュリノーマ細胞（レーン２）、および単離されたＲ１星状細胞（レーン３）の中でのＳＵＲ１についてのＲＴ−ＰＣＴと、対照の心臓細胞の中でのＳＵＲ２についてのＲＴ−ＰＣＲ（レーン４）を示しており、単離されたＲ１星状細胞の中にはこれらはなかった（レーン５）。
【０５３０】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｉは、グリア被膜の様々な特徴を示している。グリア被膜は、ＧＦＡＰ陽性細胞を特徴とし、これは、いくつかの細胞層が密集している部分である（図２３Ａ）。グリア被膜の内部領域だけが、ピモニダゾール標識によって（図２３Ｂ）、およびＨＩＦ１αについての免疫標識によって（図２３Ｃ）明らかであるように、低酸素状態にある。また、内部領域だけがＳＵＲ１について（図２３Ｄ）、密集結合タンパク質ＺＯ−１について（図２３Ｅ）、および閉鎖帯について（図２３Ｆ）免疫標識されている。図２３Ｇ〜Ｉは、ピモニダゾール、ＨＩＦ１α、および閉鎖帯がすべてＧＦＡＰ陽性星状細胞に局在化し、これがグリア皮膜の内部領域を形成することを示している。
【０５３１】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、グリア被膜に対するＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの阻害（図２４Ａ）とＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルの活性化（図２４Ｂ）の効果を示している。ゼラチンスポンジ移植物を有している動物を、グリベンクラミドの点滴（図２４Ａ）またはジアゾキシドの点滴（図２４Ｂ）によって、ゼラチンスポンジの領域に化合物を直接投与する浸透圧ミニポンプで処置した。ＧＦＡＰについての免疫標識は、グリベンクラミドでのチャンネルの阻害が十分に定義されたグリア被膜の形成を生じ（図２４Ａ）、一方、ジオキシドでのチャンネルの活性化によっては、内部領域の細胞のジオキシド誘導性の壊死が原因で、さらに広い意味での曖昧なグリア被膜の形成が生じること（図２４Ｂ）を示していた。
【０５３２】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｂは、ゼラチンスポンジの周囲の領域へのジオキシドの注入が、多形核白血球（ＰＭＮ）のかなりの浸潤を生じることを示している。ＤＡＰＩでの核の標識は、ＰＭＮ特異的マーカーであるＭＭＰ−８を使用して免疫標識を用いた場合には、ゼラチンスポンジの近くの高密度に集まっている小さい細胞を示し（図２５Ａ）、これらの細胞がＰＭＮであることを示している（図２５Ｂ）。浸潤性のＰＭＮによって示される強い炎症性の応答は、グリア皮膜の内部領域によって通常形成される、脳と異物（ゼラチンスポンジ）との間のバリアの崩壊が原因であると考えられる。
【０５３３】
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｌは、グリア被膜の内部領域の中のＲ１星状細胞は、通常、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのマーカーであるＳＵＲ１を発現することを示している。ゼラチンスポンジ移植物を有しているラットにおいて（図２６Ａ〜２６Ｃ）、脳腫瘍を有しているラットにおいて（図２６Ｄ〜２６Ｆ）、および転移性腫瘍を有しているヒトにおいて（図２６Ｊ〜２６）、グリア被膜の内部領域が示されている。また、中脳動脈の閉塞によって生じたラットの脳卒中に隣接している反応性グロスの領域（図２６Ｇ〜２６Ｉ）も示されている。全ての場合において、示されるように、細胞の領域はＧＦＡＰについて標識され、そしてＳＵＲ１についても一緒に標識される。高倍率での単一の細胞の例もまた、それぞれの条件について示される。
【０５３４】
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃは、脳卒中の境界付近の星型の星状細胞が、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのマーカーであるＳＵＲ１をアップレギュレートすることを示している（図２７Ａ）。脳卒中の中央部分では、出血を含む形態変化を有している細胞もまた、ＳＵＲ１について免疫標識されている（図２７Ｂ、２７Ｃ）。
【０５３５】
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｃは、グリベンクラミドが、アジ化Ｎａによって誘導されるチャンネルの開口と壊死による細胞死から防御することを示している。図２８Ａは、それぞれ３０分間の時間経過にわたって観察された４つの異なる新しく単離されたＲ１星状細胞の位相差画像を示す。媒体溶液だけに曝された細胞は、明位相差像だけを示すままであり、病状の悪化はなかった（対照）。アジ化Ｎａ（１ｍＭ）への曝露によりＡＴＰが枯渇した細胞は、細胞傷害性の浮腫と一致して、進行性の出血を発症した。同様に、ＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルオープナーであるジアゾキシドに曝露させられた細胞は、細胞傷害性の浮腫と一致して進行性の出血を発症した。グリベンクラミドの存在下でアジ化Ｎａに対して曝露させられた細胞は、明位相差像を示すままであり、病状の悪化はなかった。図２８Ｂおよび２８Ｃは、インビトロでのＡＴＰ枯渇によって誘導された単離されたＲ１星状細胞の細胞死を示す。新しく単離されたＲ１星状細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で壊死について（図２８Ｂ）、またはアネキシンＶでアポトーシスによる死について（図２８Ｃ）、対照条件下で、アジ化Ｎａ（１ｍＭ）への曝露後に、またはグリベンクラミド（１μＭ）の存在下でのアジ化Ｎａへの曝露後に標識された。アジ化Ｎａへの曝露によっては、ほとんどの場合に壊死が生じ、これはグリベンクラミドによって大幅に妨げられた。
【０５３６】
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｌは、ＳＵＲ１がＭＡＣ脳卒中においてアップレギュレートされることを示している。ＭＣＡ−ＡＣＡの間の分水界領域が、ＭＣＡ脳卒中の８〜１６時間後に３つの異なる動物において、Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅの死の前の投与とＩｎｄｉａ  ｉｎｋの死後の注入によって（図２９Ａ）、ＴＴＣ染色によって（図２９Ｂ）、およびＳＵＲ１についての免疫蛍光撮影法によって（図２９Ｃ）同定された。神経マーカーＮｅｕＮについて二重標識された（図２９Ｅ）細胞中の脳卒中の核の中の３時間でのＳＵＲ１を示す免疫蛍光画像（図２９Ｄ）、および星状細胞マーカーＧＦＡＰ（図２９Ｈ）と内皮細胞マーカーであるｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（図２９Ｋ）について二重標識された細胞（図１４Ｇ、１４Ｊ）中の梗塞周辺領域の中の８時間でのＳＵＲ１を示す免疫蛍光画像。二重標識された領域の重ね合わせられた画像が示される（図２９Ｆ、２９Ｉ、および２９Ｌ）。
【０５３７】
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｇは、ＳＵＲ１がＭＣＡ脳卒中において転写によってアップレギュレーションされ、Ｋｉｒ６．１またはＫｉｒ６．２はアップレギュレーションされないことを示す。ＭＣＡ脳卒中後の様々な時点（図３０Ａ）および様々な位置（図１５Ｂ）でのＳＵＲ１（約１８０ｋＤａ）についてのウェスタンブロット。図３０Ａにおいては、溶解物は全て、示した時点で得られた病変となった半球のＴＴＣ（＋）梗塞周辺領域に由来する。図３０Ｂにおいては、溶解物は全て、示された領域からＭＣＡ脳卒中の８時間後に得られた。ａおよびｂの中のそれぞれの個々のレーンは１つの動物に由来する。（図３０Ａ）および（図３０Ｂ）によるデータの定量により、それぞれ、Ｋｉｒ６．１とＫｉｒ６．２についての比較可能なデータを組み合わせた；それぞれの個々のブロットについて、データを、そのブロットについてのβ−アクチンの値に対して、および対照データについて正規化し、別々に分析した。＊＊、ｐ＜０．０１。ＳＵＲ１についてのインサイチュハイブリダイゼーションにおいては、ＭＣＡ脳卒中の３時間後に、パラフィン切片は、虚血領域の中の大きなニューロン様細胞（図３０Ｅ）および毛細血管（図３０Ｆ）が標識され、一方、対照側の同じ領域に由来する組織は標識されなかった（図３０Ｇ）ことを示していた。
【０５３８】
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄは、脳卒中のニューロン様細胞の中のＮＣＣａ−ＡＴＰチャンネルのパッチクランプ記録を示す。図３１Ａは、ＭＣＡＯの３時間後の虚血領域から酵素的に単離された大きなニューロン様細胞の位相差画像を示す。図３１Ｂは、電荷担体としてＣｓ＋を使用するインサイドアウトパッチの記録を示す。チャンネル活性は、示されたように（矢印）投与されたグリベンクラミドによって遮断された。ａおよびｂは、示された部分の記録の拡大を示す。図３１Ｃは、電荷担体としてＫ＋を使用するインサイドアウトパッチの示された電位での記録を示す。チャンネル活性はグリベンクラミドによって遮断された。図３１Ｄは、様々な電圧での単一チャンネルの振幅のプロットを示し、これは、３４ｐＳの単一チャンネルの傾斜コンダクタンスを示している。
【０５３９】
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｅは、グリベンクラミドが、ＭＣＡ脳卒中における致死率を低下させ、浮腫を軽減し、そして脳卒中の大きさを小さくすることを示している。図３２Ａにおいては、致死率は、生理食塩水（白色の記号）またはグリベンクラミド（黒色の記号）のいずれかで処置した２つの処置グループ（それぞれ、１９匹のメスと１０匹の雄のラットからなる）における、ＭＣＡ脳卒中［悪性脳水腫（ＭＣＥ）を有している二重閉塞モデル］後７日間にわたり評価された。７日間での致死率は有意に異なった。雄と雌についてのサブグループの分析は同様の結果を示した。図３２Ｂにおいては、浮腫が生理食塩水またはグルベンクラミドのいずれかで処置された、それぞれ６匹のラットからなる２つの処置グループにおいて、ＭＣＡ脳卒中（ＭＣＥモデル）の８時間後に評価された。組織は、最初にＴＴＣで処理されて、病変となった半球と反対側の半球のＴＴＣ（＋）部分とＴＴＣ（−）部分に分離され、その後、湿乾重量が決定された。ＴＣＣ（＋）領域での値は統計学的に差があった。図３２Ｃ〜３２Ｅにおいては、脳卒中の大きさが、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかで処置された、それぞれ１０匹の雄のラットからなる２つの処置グループにおいて、ＭＣＡ脳卒中の４８時間後に評価された［血栓塞栓症（ＴＥ）モデル］。生理食塩水で処置された動物（図３２Ｃ）およびグリベンクラミドで処置された別の動物（図３２Ｄ）のＭＣＡ脳卒中（ＴＥモデル）後のＴＣＣ染色された冠状断面の画像は、グリベンクラミドでの処置に多くの場合に付随する皮膚のスパーリング、半球の容積の割合（％）として表された脳卒中の大きさの値を示している。（図３２Ｅ）。
【０５４０】
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｄは、ＭＣＡ脳卒中におけるＢＯＤＩＰＹ−グリベンクラミドの組織分布を示す。ａ〜ｃ、ＭＣＡ脳卒中（ＭＣＥモデル）およびＢＰＤＩＰＹ−グリベンクラミドの投与の６時間後の動物の脳切片の蛍光画像。蛍光標識は、虚血領域に由来する細胞、微細血管（図３３Ａ）、および毛細血管（図３３Ｃ）において明らかであったが、反対側の半球（図１８Ｂ）では明らかではなかった。（図３３Ａ、３３Ｂ）の画像は同じ動物に由来し、同じ曝露時間で撮影されたものである。（図３３Ｃ）においては、核の単層によって、ＢＯＤＩＰＹ−グリベンクラミドによって明るく標識された構造が毛細血管であることが確認される。図３３Ｄにおいては、抗ＳＵＲ１抗体で標識されたＭＣＡ脳卒中（ＭＣＥモデル）の６時間後の動物に由来する脳切片の免疫蛍光画像が、毛細血管の中、および隣接しているニューロン様細胞の中での強い標識を示している。
【０５４１】
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｈは、グリベンクラミドが出血性の転換を減少させることを示している。図３４Ａ〜３４Ｄは、生理食塩水を用いて同時処置された動物による。図３４Ｅ〜３４Ｈは、グリベンクラミドを用いて同時処置された動物による。冠状切片の写真の左の列は、１〜２列目だけに、脳室内出血、および虚血性の皮質領域／皮質下領域において出血性の転換の大きな領域を示す（穿刺の右側の赤色の領域；矢印）。同じ動物に由来するＴＣＣ処理された切片の写真の右側の列は梗塞の領域を示す。
【０５４２】
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｂは、脳卒中におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のゼラチナーゼ活性、およびグリベンクラミドによるＭＭＰの直接の阻害がないことを示しているザイモグラフィーを示す。図３５Ａは、対照と比較した、脳卒中組織中のＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の活性化を示す。組み換え体ＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の活性は左に示される。図３５Ｂは、対照条件下（ＣＴＲ）、グリベンクラミド（１０μＭ）の存在下、およびＭＭＰ阻害因子ＩＩ（３００ｎＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下での、組み換え体酵素のゼラチナーゼ活性と脳卒中組織を示す。
【０５４３】
【図３６】図３６は、パッチクランプの調製における酵素でのクリーニング後の、正常な脳から新しく単離された脳の毛細血管の位相差顕微鏡写真を示す。
【０５４４】
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｆは、新しく単離された脳の内皮細胞と平滑筋細胞が電気生理学的に容易に崩壊させられることを示している。図３７Ａおよび３７Ｂは、内皮細胞の中（図３７Ａ）、および伸張型の平滑筋細胞（図３７Ｂ）の中での、−１２０ｍＶから＋１２０ｍＶまでの２０ｍＶずつの２００ｍｓの脱分極パルスの間に記録された重ね合わせられた微視的電流を示す；保持電位、−６０ｍＶ；ナイスタチン穴あきパッチ技術；浴溶液、２ｍＭのＣａ２＋を含む標準的なＫｒｅｂｓ；ピペット溶液、１４５ｍＭのＫ＋。図３７Ｃと３７Ｄは、９個の内皮細胞（図３７Ｃ）と７個の平滑筋細胞（図３７Ｄ）において記録された２００ｍｓの試験パルスの終了時の平均（平均±ＳＥ）電流からコンピューターで計算した、電流−電圧曲線を示す；図３７Ａと３７Ｂと同じ保持電位、技術、および溶液。図３７Ｅと３７Ｆは、内皮細胞（図３７Ｅ）と平滑筋細胞（図３７Ｆ）におけるランプパルス（０．４５ｍＶ／ｍｓ、保持電位、−６０ｍＶ）の間に記録された電流電圧曲線を示す；図３７Ａと３７Ｂと同じ保持電位、技術、および溶液を使用したが、Ｋ＋の代わりに１４５ｍＭのＣｓ＋を含むピペット溶液を使用した。
【０５４５】
【図３８】図３８は、脳卒中におけるＳＵＲ１−ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示しているリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。
【０５４６】
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｅは、Ｒ１星状細胞中のノックダウンされたＳＵＲ１（ＳＵＲ１ＫＤ）が、ＡＴＰの枯渇によって誘導される脱分極を防御することを示している。図３９Ａと３９Ｂは、アンチセンスによるＳＵＲ１のノックダウンが確認されたＲ１細胞溶解物のウェスタンブロット（図３９Ａ）とウェスタンブロットの定量（図３９Ｂ）を示す。図３９Ｃ〜３９Ｅは、アジ化ＮａがＳＣＲ−ＯＤＮに曝露された細胞の中では大きな脱分極が生じるが（図３９Ｃ、３９Ｅ）、ＡＳ−ＯＤＮに対して曝露された細胞の中では脱分極ほとんど、または全く起こらないことを示している（図３９Ｄ、３９Ｅ）。
【０５４７】
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｆは、脳卒中における転写因子を示している。ＭＣＡＯの８時間後の同側の梗塞周辺組織に由来する（図４０Ａ〜Ｄ）、および反対側の対照組織に由来する（図４０Ｅ、４０Ｆ）ＡＣＡ領域とＭＣＡ領域の間の皮質下の分水界領域の免疫蛍光画像。梗塞周辺領域は、ニューロン様細胞と毛細血管の中で、両方の転写因子（Ｓｐ１（図４０Ａ、４０Ｃ）とＨＩＦ１α（図４０Ｂ））のアップレギュレーション、さらには、毛細血管の中でのＳＵＲ１のアップレギュレーション（図４０Ｄ）を示した。対照組織は、わずかしかＳＰ１を示さず、およびＨＩＦ１αは全く示さなかった（図４０Ｅおよび４０Ｆ）。
【０５４８】
【図４１】図４１Ａ〜４１Ｃは、脳卒中における転写因子ＳＰ１の核での局在化の増大と、ＳＰ１のＳＵＲ１との共局在を示している。免疫蛍光画像は、反対側（図４１Ａ）と比較して、ＭＣＡＯの３時間後に、虚血領域で核ＳＰ１の標識が増大することを示している（図４１Ｂ）。図４１Ｃでは、大きなニューロン様細胞の二重標識が、同じ細胞の中の核ＳＰ１（緑色）と細胞質／細胞膜ＳＵＲ１（赤色）を示している。
【０５４９】
【図４２】図４２Ａ〜４２Ｄは、転写因子ＨＩＦ１αによるＳＵＲ１の発現の調節を示す。図４２Ａと４２Ｃは、対照（ＣＴＲ）とＨＩＦ１αノックダウン（ＫＤ）のゲルフォーム移植モデル由来のＲ１星状細胞中のＨＩＦ１αタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。図４２Ｂと４２Ｃは、同じ細胞溶解物の中のＳＵＲ１タンパク質を示す。
【０５５０】
【図４３】図４３は、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかで処置された、それぞれ４匹の雄のラットからなる２つのグループにおける、ＭＣＡＯの前（ＣＴＲ）、１時間後、および４８時間後の、レーザードップラー流量計によって測定された相対的な脳の血流を示す。４８時間での値は、統計学的に差があった（ＡＮＯＶＡによる；ｐ＜０．０１）。
【０５５１】
【図４４】図４４。グリベンクラミドは、グルコースが加えられていないので、グルコースが加えられた場合にだけ、脳卒中後の浮腫を軽減することに有効であった。補充用のグルコース（１ｇｍ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）はＭＣＡＯの４時間後に投与され、動物は、浮腫の測定のためにＭＣＡＯの８時間後に屠殺された。
【０５５２】
【図４５】グリベンクラミドは、投与が脳卒中の２時間後にまで（低用量）または６時間後にまで（高用量）遅れた場合にもなお、脳卒中の容積を小さくする。
【０５５３】
【図４６】グリベンクラミドは、出血性の転換を少なくする。血栓塞栓症の病変後に静脈内ｔＰＡ（３０分間にわたり１０ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物もまた、生理食塩水またはグリベンクラミドのいずれかで処置された。生理食塩水を用いて同時処置された６匹の動物のうち５匹は出血性の転換を示したが、グリベンクラミドを用いて同時処置された６匹の動物の中では１匹しか出血性の転換を示さなかった。このことは、血栓塞栓性の脳卒中後の出血性の転換を少なくするかまたは予防するグリベンクラミド処置の効力を明らかに示している。
【０５５４】
【図４７】図４７は、脳の皮質組織の中のＳＵＲ１タンパク質の発現を示す。最小標識が、対照組織の中で観察された（左側のパネル）が、より高い標識が、衝突部位の周辺（「Ｉ」、右側から始まる）、脳挫傷（右側のパネル）で見られた。組織は、挫傷による損傷の２４時間後に回収された。
【０５５５】
【図４８】図４８は、脳挫傷後のＳＵＲ１の発現を示している以前の画像（上記／右側のパネル）の高倍率の写真を示す。ＳＵＲ１の発現は大きなニューロン様細胞の中で（左側のパネル）、そしてＳＵＲ１およびｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子で一緒に標識された毛細血管の中で（中央および右側のパネル）において見られた。
【図１ＡＢ】
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【図１ＣＤ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ＡＢＣ】
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【図１２ＤＥＦ】
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【図１２ＧＨＩ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５ＢＣ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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