(57)【要約】  本発明は、癌を処置する薬剤の調製に、配列番号１のアミノ酸配列（ヒト抗菌タンパク質ＬＬ−３７のＮ末端の２５アミノ酸フラグメントに対応する）を含むポリペプチド又はその生物活性フラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を使用することを提供する。特に本発明は、癌細胞、例えば乳癌細胞の増殖及び／又は転移を阻害するために、このようなポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を使用することを提供する。本発明はさらに、患者の癌を処置する方法を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置する薬剤の調製での配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその生物活性フラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体の使用。
【請求項２】
薬剤が癌細胞の増殖を阻害し得るものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
薬剤が癌細胞の転移を阻害し得るものである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
薬剤が癌細胞の増殖及び／又は転移を選択的に阻害し得るものである、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
薬剤に曝露されていない癌細胞の増殖と比較して、薬剤が癌細胞の増殖を２０％またはそれ以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得るものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
薬剤に曝露されていない癌細胞の転移と比較して、薬剤が癌細胞の転移を２０％またはそれ以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得るものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
癌細胞が上皮細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
癌細胞が扁平上皮細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
癌細胞が、乳癌細胞、胆管癌細胞、脳腫瘍細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器癌細胞、肺癌細胞及び気道癌細胞、皮膚癌細胞、胆嚢癌細胞、肝臓癌細胞、鼻咽頭癌細胞、神経細胞癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、リンパ腺癌細胞並びに消化管癌細胞からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
乳癌細胞が、ＥｌｓｔｏｎグレードＩＩＩ細胞である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
乳癌細胞が転移性である、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又は配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のフラグメントを含むか又はこのフラグメントからなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
フラグメントが、少なくとも５個隣接した配列番号１のアミノ酸、例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４個隣接した配列番号１のアミノ酸を含むか又はこのアミノ酸からなる、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
フラグメントが、配列番号１のアミノ酸２〜２５個、例えば、配列番号１のアミノ酸３〜２５、４〜２５、５〜２５、６〜２５、７〜２５、８〜２５、９〜２５、１０〜２５、１１〜２５、１２〜２５、１３〜２５、１４〜２５、１５〜２５、１６〜２５、１７〜２５、１８〜２５、１９〜２５、２０〜２５又は２１〜２５個を含むか又はこのアミノ酸からなる、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１８】
フラグメントが、配列番号１のアミノ酸１７〜２５個、例えば、配列番号１のアミノ酸１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１又は１７〜２０個を含むか又はこのアミノ酸からなる、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１９】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含むか又はこの変異体からなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
変異体が、天然に存在しない変異体である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
変異体が、配列番号１のアミノ酸配列又はそのフラグメントと少なくとも４５％の同一性、例えば少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１９又は２０に記載の使用。
【請求項２２】
薬剤が、融合タンパク質を含むか又は融合タンパク質からなる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、Ｌ−アミノ酸を含むか又はＬ−アミノ酸からなる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、修飾されるか又は誘導体化されるアミノ酸を１個又はそれ以上含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が線状である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が環状である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、組換えポリペプチドであるか又は組換えポリペプチドを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
患者の癌を処置する方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその生物活性フラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を患者に投与することを含む方法。
【請求項２９】
患者がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、癌細胞の増殖を阻害し得る、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、癌細胞の転移を阻害し得る、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、癌細胞の増殖及び／又は転移を選択的に阻害し得る、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
薬剤に曝露されていない癌細胞の増殖と比較して、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が癌細胞の増殖を２０％またはそれ以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得る、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
薬剤に曝露されていない癌細胞の転移と比較して、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が癌細胞の転移を２０％またはそれ以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得る、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
癌細胞が上皮細胞である、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
癌細胞が扁平上皮細胞である、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
癌細胞が、乳癌細胞、胆管癌細胞、脳腫瘍細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器癌細胞、肺癌細胞及び気道癌細胞、皮膚癌細胞、胆嚢癌細胞、肝臓癌細胞、鼻咽頭癌細胞、神経細胞癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、リンパ腺癌細胞並びに消化管癌細胞からなる群より選択される、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
乳癌細胞が、ＥｌｓｔｏｎグレードＩＩＩ細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
乳癌細胞が転移性である、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又は配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項２８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のフラグメントを含むか又はこのフラグメントからなる、請求項２８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
フラグメントが、少なくとも５つ隣接した配列番号１のアミノ酸、例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４個隣接した配列番号１のアミノ酸を含むか又はこのアミノ酸からなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
フラグメントが、配列番号１のアミノ酸２〜２５個、例えば、配列番号１のアミノ酸３〜２５、４〜２５、５〜２５、６〜２５、７〜２５、８〜２５、９〜２５、１０〜２５、１１〜２５、１２〜２５、１３〜２５、１４〜２５、１５〜２５、１６〜２５、１７〜２５、１８〜２５、１９〜２５、２０〜２５又は２１〜２５個を含むか又はこのアミノ酸からなる、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
フラグメントが、配列番号１のアミノ酸１７〜２５、例えば、配列番号１のアミノ酸１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１又は１７〜２０を含むか又はこのアミノ酸からなる、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４７】
ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含むか又はこの変異体からなる、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
変異体が、天然に存在しない変異体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
変異体が、配列番号１のアミノ酸配列又はそのフラグメントと少なくとも４５％の同一性、例えば少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項２８〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ポリペプチドが、Ｌ−アミノ酸を含むか又はＬ−アミノ酸からなる、請求項２８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
ポリペプチドが、修飾されるか又は誘導体化されるアミノ酸を１つ又はそれ以上含む、請求項２８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が線状である、請求項２８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が環状である、請求項２８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、組換えポリペプチドであるか又は組換えポリペプチドを含む、請求項２８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置に、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはこの配列からなるポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を使用することに関する。特に本発明は、乳癌細胞の増殖及び／又は転移を阻害する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌タンパク質は、先天性免疫系の主要なエフェクターである。ヒトカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）抗菌タンパク質ｈＣＡＰ１８（ヒトで唯一公知のカテリシジン）は、保存されたカテリン（ｃａｔｈｅｌｉｎ）ドメイン及びＬＬ−３７と呼ばれる可変性のＣ末端からなる（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎら、１９９６、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２３８：３２５〜３２；Ｚａｎｅｔｔｉら、１９９５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３７４：１〜５）。ホロタンパク質の細胞外タンパク質分解プロセシングは、広範な抗菌活性を有するＬＬ−３７ペプチドを放出し（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：７０８５〜９；Ａｇｅｒｂｅｒｔｈら、１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１９５〜９９）、そして宿主細胞に影響を及ぼしており、これらのうちのいくつかは、Ｇタンパク質共役受容体、ホルミルペプチド受容体様１（ＦＰＲＬ１）によって媒介される（Ｙａｎｇら、２０００、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０６９〜７４；Ｋｏｃｚｕｌｌａら、２００３、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１１：１６６５〜７２）。ヒトＣＡＰ１８は白血球に存在し（Ｃｏｗｌａｎｄら、１９９５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３６８：１７３〜７６）、そして皮膚及び他の上皮で発現されており、ここでは、先天性のバリア保護の役割と一致して、炎症（Ｃｏｗｌａｎｄら、１９９５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３６８：１７３〜７６；Ｆｒｏｈｍら、１９９７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１５２５８〜６３）及び損傷（Ｄｏｒｓｃｈｎｅｒら、２００１、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１７：９１〜９７；Ｈｅｉｌｂｏｒｎら、２００３、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２０：３７９〜８９）に関連してアップレギュレートされる。
【０００３】
ある種の抗菌タンパク質が、腫瘍に対して非特異的な宿主防御の役割を果たし得ることがいくつかの研究で示唆されている。例えば、セクロピン及びメリチンは、腫瘍由来の細胞系において抗腫瘍活性を表すことが示されている（Ｗｉｎｄｅｒら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４２：６０８〜１２を参照のこと）。プロリンリッチな抗菌ペプチド、ＰＲ−３９は、ヒト肝癌細胞において浸潤活性及びアクチン構造を変化させた（Ｏｈｔａｋｅら、１９９９、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １８１：３９３〜４０３を参照のこと）。
【０００４】
対照的に、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、乳癌において腫瘍細胞の増殖を阻害するというよりもむしろ促進し得ることが最近のデータで示唆されている（Ｈｅｉｌｂｏｒｎら、２００５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１４：７１３〜９を参照のこと）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一の局面は、癌を処置する薬剤の製造に、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその生物活性フラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を使用することを提供するものである。
【０００６】
ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫ  ［配列番号１］
【０００７】
好ましい実施態様において、薬剤は、癌細胞の増殖を阻害し得る。
【０００８】
本発明者らは、「増殖」によって、癌細胞の数及び／又はサイズが増大することを包含している。
【０００９】
あるいは又はさらに好ましくは、薬剤は、癌細胞の転移を阻害し得る。
【００１０】
本発明者らは、「転移」によって、被験体の体の原発腫瘍部位から被験体の体内の１つ又はそれ以上の他の領域へと癌細胞が移動又は遊走する（例えば侵襲性）（ここでこの細胞は、次いで続発性腫瘍を形成し得る）ことを表わす。従って一実施態様において、本発明は、癌を有する被験体において続発性腫瘍の形成を全体的又は部分的に阻害する薬剤及び方法を提供する。「転移」に対する本明細書に記載の薬剤の効果は、このような薬剤が癌細胞の増殖に対して有するかもしれないし有さないかもしれないいかなる効果とも異なることを当業者なら認識している。
【００１１】
癌細胞の増殖及び／又は転移を選択的に阻害し得る薬剤が有利である。
【００１２】
本発明者らは、「選択的」によって、薬剤が、非癌細胞の機能（例えば増殖）を調節するよりも高い程度で癌細胞の増殖及び／又は転移を阻害することを表している。好ましくは、薬剤は、癌細胞の増殖及び／又は転移のみを阻害するものである。従って本発明者らは、細胞機能に対して非特異的な効果を有する薬剤を除外している。
【００１３】
癌細胞の増殖及び／又は転移の阻害は、全体的かもしれないし部分的かもしれないことをまた当業者なら認識している。好ましい実施態様において、薬剤は、薬剤に曝露されていない癌細胞の増殖と比較して、癌細胞の増殖を２０％以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得る。あるいは又はさらに好ましくは、薬剤は、薬剤に曝露されていない癌細胞の転移と比較して、癌細胞の転移を２０％またはそれ以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得る。
【００１４】
薬剤は、すべての癌タイプの処置に使用するのに好適である。しかし、癌細胞が、上皮細胞又は扁平上皮細胞である場合が特に好ましい。
【００１５】
例えば癌細胞は、乳癌細胞、胆管癌細胞、脳腫瘍細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器癌細胞、肺癌細胞及び気道癌細胞、皮膚癌細胞、胆嚢癌細胞、肝臓癌細胞、鼻咽頭癌細胞、神経細胞癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、リンパ腺癌細胞並びに消化管癌細胞からなる群より選択され得る。
【００１６】
好ましくは、癌細胞は乳癌細胞である。より好ましくは、乳癌細胞はＥｌｓｔｏｎグレードＩＩＩ細胞である。最も好ましくは、乳癌細胞は転移性のものである。
【００１７】
本発明の第一の局面の好ましい実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又は配列番号１のアミノ酸配列からなる。ＬＬ−２５と呼ばれるこの配列は、ヒトカテリシジン抗菌タンパク質ｈＣＡＰ１８由来のＣ末端ＬＬ−３７ペプチドのＮ末端の２５アミノ酸に対応している（登録番号ＮＰ＿００４３３６及びＡＡＨ５５０８９を参照のこと）。
【００１８】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、標準的な２０個の遺伝的に符号化されたアミノ酸及びそれらに対応する「Ｄ」型の立体異性体（天然の「Ｌ」型と比較して）、ω−アミノ酸及び他の天然に存在するアミノ酸、特殊なアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）並びに化学的に誘導体化されるアミノ酸（以下参照）を含む。
【００１９】
しかし好ましくは、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、Ｌ−アミノ酸を含むか又はＬ−アミノ酸からなる。
【００２０】
アミノ酸が、例えば「アラニン」又は「Ａｌａ」もしくは「Ａ」と具体的に列挙されるとき、この用語は、明確に別段の定めがない限り、Ｌ−アラニン及びＤ−アラニンの両方を指すものとする。所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、他の特殊なアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドとして好適な成分であり得る。示されるペプチドに関して、コードされる各々のアミノ酸残基は、しかるべき場合に慣習的なアミノ酸の慣用名に対応する一文字呼称で表される。
【００２１】
特に好ましい実施態様において、薬剤は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
【００２２】
別の実施態様において、薬剤は、配列番号１のアミノ酸配列の生物活性フラグメント、変異体、融合体又は誘導体を含む。
【００２３】
本発明者らは、「生物活性」によって、フラグメント、変異体、融合体又は誘導体が、配列番号１のアミノ酸配列の抗癌活性を保持することを表わす。例えば、このフラグメント、変異体、融合体又は誘導体は、癌細胞の増殖及び／又は転移を少なくとも部分的に阻害する能力を保持し得る。当該分野で周知の方法を用いて、このような生物活性の保持が測定され得る（実施例を参照のこと）。例えば、ＭＡＰＫのリン酸化の阻害が、このフラグメント、変異体、融合体又は誘導体の抗癌活性のマーカーとして使用され得る。さらに好適な方法は、ＬＬ−３７によって誘導され得る半流動寒天中での癌細胞コロニーの転移性表現型の抑制、又はＬＬ−３７誘導性の細胞遊走の抑制を調べるものである。インビボでは、ＬＬ−３７を過剰発現する乳癌細胞で処置されたＳＣＩＤマウスにおいて転移の抑制をモニターすることがまた可能である。
【００２４】
本発明の第一の局面に使用するポリペプチドが、ＬＬ−３７タンパク質の生物活性フラグメント、変異体、融合体又は誘導体を含み得ることを当業者なら認識している。
【００２５】
ＬＬ−３７のアミノ酸配列を、以下の配列番号２に示す。
ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ
［配列番号２］
【００２６】
好ましい実施態様において、ポリペプチド又はその生物活性フラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、細胞毒性を与えない用量で使用するために提供される。本発明者らは、「細胞毒性を与えない」によって、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、宿主細胞に直接細胞毒性効果を与えない用量、すなわちそれ自身が細胞（好ましくはヒト細胞）を殺傷しない用量で提供されることを表わす。しかし、低レベルの細胞毒性が存在し得ることは認識されることであるので、従って本発明者らは、細胞毒性を与えない用量によって、細胞の５％未満、好ましくは細胞の４％、３％、２％、１％未満を殺傷する用量、そして最も好ましくはどの細胞も殺傷しない用量を包含する。細胞毒性は、当該分野で周知の方法（例えばＭＴＴアッセイ；Ｌｉら、２００６、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：５７７６〜５７８５を参照のこと；この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）を用いて測定され得る。
【００２７】
さらに好ましい実施態様において、本発明は、全長のＬＬ−３７ペプチドの使用も包含しないし、２５アミノ酸長を超えるＬＬ−３７ペプチドのＮ末端フラグメントの使用も包含しない。
【００２８】
別の好ましい実施態様において、本発明が、２５アミノ酸長を超えるＬＬ−３７ペプチドのＮ末端フラグメントの使用に関する場合、薬剤は、乳癌を処置するためのものである。
【００２９】
好ましくは、フラグメント、変異体、融合体又は誘導体は、ヒトＬＬ−３７ペプチドのアミノ酸１７〜２９に対応するアミノ酸配列（次の配列番号２の下線部のアミノ酸を参照のこと）を含まない。
ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ
［配列番号２］
【００３０】
従って、本発明の第一の局面の好ましい実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のフラグメントを含むか又はこのフラグメントからなる。
【００３１】
有利には、フラグメントは、少なくとも５つ隣接した配列番号１のアミノ酸、例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４隣接した配列番号１のアミノ酸を含むか又はこのアミノ酸からなる。従ってフラグメントは、配列番号１のＮ末端（すなわち左）から少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４隣接したアミノ酸を含み得る。
【００３２】
好都合なことには、フラグメントは、配列番号１のアミノ酸２〜２５、例えば、配列番号１のアミノ酸３〜２５、４〜２５、５〜２５、６〜２５、７〜２５、８〜２５、９〜２５、１０〜２５、１１〜２５、１２〜２５、１３〜２５、１４〜２５、１５〜２５、１６〜２５、１７〜２５、１８〜２５、１９〜２５、２０〜２５又は２１〜２５を含み得るか又はこのアミノ酸からなり得る。
【００３３】
あるいはフラグメントは、次を含み得るか又は次からなり得る：
（ａ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０〜アミノ酸２４；
（ｂ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９〜アミノ酸２３；
（ｃ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８〜アミノ酸２２；
（ｄ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７〜アミノ酸２１；
（ｅ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６〜アミノ酸２０；
（ｆ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５〜アミノ酸１９；
（ｇ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４〜アミノ酸１８；
（ｈ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３〜アミノ酸１７；
（ｉ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２〜アミノ酸１６；
（ｊ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１〜アミノ酸１５；
（ｋ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０〜アミノ酸１４；
（ｌ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８又は９〜アミノ酸１３；
（ｍ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７又は８〜アミノ酸１２；
（ｎ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６又は７〜アミノ酸１１；
（ｏ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５又は６〜アミノ酸１０；
（ｐ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３、４又は５〜アミノ酸９；
（ｑ）    配列番号１のアミノ酸１、２、３又は４〜アミノ酸８；
（ｒ）    配列番号１のアミノ酸１、２又は３〜アミノ酸７；
（ｓ）    配列番号１のアミノ酸１又は２〜アミノ酸６；又は
（ｔ）    配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸５。
【００３４】
最も好ましくは、フラグメントは、配列番号１のアミノ酸１７〜２５、例えば配列番号１のアミノ酸１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１又は１７〜２０を含むか又はこのアミノ酸からなる。
【００３５】
本発明の第一の局面の別の実施態様において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含むか又はこの変異体からなる。
【００３６】
本発明者らは、ポリペプチドの「変異体」によって、保存的又は非保存的のいずれかである挿入、欠失及び置換を包含している。例えば、変異体ポリペプチドは、天然に存在しない変異体であり得る。
【００３７】
変異体が、配列番号１のアミノ酸配列又はそのフラグメントと少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
【００３８】
２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを用いて測定され得るものであり、そして配列が最適に整列されたポリペプチドに対してパーセント同一性が計算されることは理解されることである。
【００３９】
別法として、整列化は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０に記載の通りであり、この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）を用いて行われ得る。
【００４０】
使用されるパラメータは、以下の通りであり得る：
高速対整列化パラメータ（Ｆａｓｔ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）ｓｉｚｅ；１、ｗｉｎｄｏｗ  ｓｉｚｅ；５、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ；３、ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｏｐ  ｄｉａｇｏｎａｌｓ；５。得点法：ｘパーセント。
多重整列化パラメータ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）：ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ；１０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ；０．０５。
得点マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００４１】
別法として、局所配列の整列化を決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムが使用され得る。
【００４２】
変異体は、当該分野で周知のタンパク質工学法及び部位特異的突然変異誘発法を用いて作製され得る（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００４３】
本発明の第一の局面のさらに別の実施態様において、薬剤は、融合タンパク質を含むか又は融合タンパク質からなる。
【００４４】
本発明者らは、タンパク質又はポリペプチドの「融合体」によって、任意の他のポリペプチドに融合したポリペプチドを包含している。例えば、当該ポリペプチドの精製を容易にするために、当該ポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はプロテインＡのようなポリペプチドに融合され得る。このような融合体の例は、当業者に周知である。同様に当該ポリペプチドは、オリゴヒスチジンタグ（例えばＨｉｓ６）又は抗体によって認識されるエピトープ（例えば周知のＭｙｃタグエピトープ）に融合され得る。当該ポリペプチドの任意のフラグメント、変異体又は誘導体との融合体もまた、本発明の範囲に包含される。所望の性質、すなわち抗癌活性を保持する融合体（又はその変異体若しくは誘導体）が好ましいことは認識されることである。融合体が、本明細書に記載される方法での使用に好適なものである場合がまた特に好ましい。
【００４５】
例えば融合体は、当該本発明のポリペプチドに所望の特徴を与えるさらなる部分を含み得るものであり、すなわち例えばこの部分は、ポリペプチドの検出若しくは単離に有用であり得るか、又はポリペプチドの細胞取り込みの促進に有用であり得る。この部分は、例えば当業者に周知のビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば、低分子フルオロフォア又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）フルオロフォアであり得る。この部分は、当業者に公知の免疫原性タグ、例えばＭｙｃタグであり得るか、又は当業者に公知の親油性分子若しくはポリペプチドの細胞取り込みを促進し得るポリペプチドドメインであり得る。
【００４６】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、修飾又は誘導体化されるアミノ酸を１つ又はそれ以上含み得ることは、当業者に認識されることである。
【００４７】
１つ又はそれ以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能性側基との反応によって達成され得る。このような誘導体化分子としては、例えば、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するように遊離アミノ基が誘導体化される分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステル及びエチルエステル又は他のタイプのエステル及びヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。化学的誘導体としてまた包含されるものは、２０の標準的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンに対して置換され得るものであり、５−ヒドロキシリジンは、リジンに対して置換され得るものであり、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに対して置換され得るものであり、ホモセリンは、セリンに対して置換され得るものであり、そしてオルニチンは、リジンに対して置換され得る。誘導体はまた、必要な活性が維持される限りは、１つ又はそれ以上の付加又は欠失を含んだペプチドを含む。含まれる他の修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いる）及び同様の末端修飾である。
【００４８】
ペプチド模倣化合物もまた有用であり得ることはさらに当業者に認識されることである。従って本発明者らは、「ポリペプチド」によって、抗癌活性を示すペプチド模倣化合物を包含している。用語「ペプチド模倣物」は、治療剤としての特定のポリペプチドのコンホメーション及び所望の特徴を模倣する化合物のことをいう。
【００４９】
例えば、本明細書に記載されるポリペプチドは、アミノ酸残基が、ペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結される分子だけではなく、ペプチド結合が逆転される分子も含む。このようなレトロインバース（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド模倣物は、当該分野で公知の方法、例えば、Ｍｅｚｉｅｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９、３２３０〜３２３７に記載される方法（この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）を用いて作製され得る。このアプローチは、主鎖（側鎖の配向ではない）に関わる変化を含んだ偽ペプチドの作製を含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロインバース（Ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）ペプチドは、タンパク質分解にさらに抵抗性である。あるいは本発明のポリペプチドは、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、慣用のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ2ＮＨ）−結合によって連結されるペプチド模倣化合物であり得る。
【００５０】
さらなる別法において、アミノ酸残基の炭素原子間にスペーシングを保持する適切なリンカー部分が使用されるという条件で、ペプチド結合は完全に不要なものとなり得るので、このリンカー部分が、ペプチド結合と実質的に同じ電荷分布及び実質的に同じ平面性を有する場合が特に好ましい。
【００５１】
例えばアミド化によるエキソタンパク質分解消化に対する感受性を減少させるのに役立つように、ポリペプチドは、好都合なことには、そのＮ末端又はＣ末端でブロックされ得ることは認識されることである。
【００５２】
種々の非コードアミノ酸又は修飾アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸もまた、哺乳動物ペプチドの修飾に使用されている。さらに、推定される生理活性コンホメーションは、共有結合性修飾、例えば環化又はラクタム若しくは他のタイプの架橋の取り込みによって安定化され得る。（例えば、Ｖｅｂｅｒら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：２６３６及びＴｈｕｒｓｅｌｌら、１９８３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６を参照のこと。この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。）
【００５３】
多くの合成戦略の中での共通のテーマは、いくつかの環状部分をペプチドベースの骨格に導入することである。環状部分は、ペプチド構造のコンホメーション空間を制限しており、これはしばしば、特定の生物学的受容体に対するペプチドの親和性の増大をもたらす。この戦略のさらなる利点は、ペプチドに環状部分を導入すると、細胞性ペプチダーゼに対する感受性が減少したペプチドをまたもたらし得ることである。
【００５４】
従って好ましいポリペプチドは、末端にシステインアミノ酸を含むものである。このようなポリペプチドは、末端のシステインアミノ酸のメルカプチド基のジスルフィド結合形成によりヘテロデチック環状形態で存在し得るか、又は末端アミノ酸間のアミドペプチド結合形成によりホモデチック形態で存在し得る。上記の通り、Ｎ末端システインとＣ末端システインとの間のジスルフィド結合又はアミド結合を通じて低分子ペプチドを環化させると、タンパク質分解を減少させ、そしてまた構造の剛性を増大させることによって、線状ペプチドで時折観察される親和性及び半減期の問題を回避し得ることになり、より親和性の高い化合物を得ることができる。ジスルフィド結合によって環化されたポリペプチドは、タンパク質分解の影響をなお受けやすいものであり得る遊離アミノ末端及びカルボキシ末端を有しており、一方Ｎ末端アミンとＣ末端カルボキシルとの間のアミド結合の形成によって環化されたペプチドは、それ故もはや遊離アミノ末端又はカルボキシ末端を含まない。従って本発明のペプチドは、Ｃ−Ｎ結合又はジスルフィド結合のいずれかによって連結され得る。
【００５５】
本発明は、ペプチドの環化方法によって決して限定されるものではなく、環状構造が任意の好適な合成方法によって達成され得るペプチドを包含している。従って、ヘテロデチック結合としては、ジスルフィド架橋、アルキレン架橋又はスルフィド架橋をを介した形成が挙げられ得るがこれらに限定されない。環状ホモデチックペプチド及び環状ヘテロデチックペプチドの合成方法（ジスルフィド架橋、スルフィド架橋及びアルキレン架橋を含む）は、ＵＳ  ５，６４３，８７２に開示されている。環化方法の他の例は、ＵＳ  ６，００８，０５８で議論及び開示されており、この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５６】
環状安定化ペプチド模倣化合物の合成に対するさらなるアプローチは、閉環メタセシス（ＲＣＭ）である。この方法は、ペプチド前駆物質を合成する工程、及びこれをＲＣＭ触媒と接触させて、コンホメーションが制限されたペプチドを得る工程を含む。好適なペプチド前駆物質は、２つ又はそれ以上の不飽和Ｃ−Ｃ結合を含み得るものである。この方法は、固相ペプチド合成技術を用いて行われ得る。この実施態様において、固体支持体に固着される前駆物質をＲＣＭ触媒と接触させ、次いで生成物がこの固体支持体から切断されて、コンホメーションが制限されたペプチドを得る。
【００５７】
Ｄ．Ｈ．Ｒｉｃｈによって、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｂａｒｒｅｔｔ及びＳｅｌｖｅｓｏｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６；この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）に開示される別のアプローチは、酵素阻害剤の設計に遷移状態アナログの概念を適用することを通じて、ペプチド模倣物を設計している。例えば、スタリン（ｓｔａｌｉｎｅ）の第二級アルコールが、ペプシン基質の切断可能なアミド結合の四面体遷移状態を模倣することが公知である。
【００５８】
要約すれば、末端修飾は、周知の通りプロテイナーゼ消化による感受性を減少させるのに有用であり、従って溶液、特にプロテアーゼが存在し得る体液中でのペプチドの半減期を延長させるのに有用である。環化によって形成される安定な構造のため、そして環状ペプチドに対して観察された生物学的活性に鑑みて、ポリペプチドの環化もまた有用な修飾であり、そして好ましい。
【００５９】
従って一実施態様において、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は環状である。
【００６０】
しかし別の実施態様において、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は直線である。
【００６１】
本発明はまた、上記のポリペプチドの薬学的に受容可能な酸付加塩又は塩基付加塩を含む薬剤の使用を包含する。本発明に有用な上記の塩基化合物の薬学的に受容可能な酸付加塩の製造に使用される酸は、無毒性の酸付加塩、すなわち薬理学的に受容可能な陰イオンを含む塩、例えば特に塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩［すなわち１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエート）］を形成するものである。
【００６２】
薬学的に受容可能な塩基付加塩もまた、ポリペプチドの薬学的に受容可能な塩形態を製造するために使用され得る。本来は酸性である本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩基塩を製造するための試薬として使用され得る化学塩基は、このような化合物と無毒性の塩基塩を形成するものである。このような無毒性の塩基塩としては、特にこのような薬理学的に受容可能な陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン（例えばカリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属陽イオン（例えばカルシウム及びマグネシウム）、アンモニウム又は水溶性アミン付加塩、例えばＮ−メチルグルカミン−（メグルミン）、並びに低級アルカノールアンモニウム及び薬学的に受容可能な有機アミンの他の塩基塩が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、貯蔵のために凍結乾燥され得るものであり、そして使用前に好適な担体中で再構成され得る。すべての好適な凍結乾燥方法（例えば噴霧乾燥、ケーク（ｃａｋｅ）乾燥）及び／又は再構成技術が使用され得る。凍結乾燥及び再構成は、種々の程度の活性の損失を導き得るものであり、そして補償目的のため、使用レベルが上方に調整される必要があり得ることを当業者なら認識している。好ましくは、凍結乾燥されたポリペプチドは、再水和されるときにその活性（凍結乾燥前）のおよそ２０％以下、又はおよそ２５％以下、又はおよそ３０％以下、又はおよそ３５％以下、又はおよそ４０％以下、又はおよそ４５％以下、又はおよそ５０％以下を失う。
【００６４】
本発明のさらなる局面において、
（Ａ）    本発明の第一の局面に対して上記で定義されるポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を含むか又はこれからなる第一の薬剤；及び
（Ｂ）    上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体の生物活性を阻害する第二の薬剤
を含む併用製品が提供され、ここで構成要素（Ａ）及び（Ｂ）の各々は、薬学的に受容可能な補助剤、希釈剤又は担体と混合して配合される。
【００６５】
本発明者らは、「薬剤」によって、すべての化学物質、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物及び低分子化合物を包含している。
【００６６】
好ましい実施態様において、本発明の併用製品は、上記で定義された第一の薬剤、ＥＧＦ受容体の生物活性を阻害する第二の薬剤、及び薬学的に受容可能な補助剤、希釈剤又は担体を含む薬学的製剤を含む。
【００６７】
別の実施態様において、本発明の併用製品は、次の構成要素：
（Ａ）    上記で定義されるポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を含むか又はこれからなる第一の薬剤を、薬学的に受容可能な補助剤、希釈剤又は担体と混合して含む薬学的製剤；及び
（Ｂ）    ＥＧＦ受容体の活性を阻害する第二の薬剤を、薬学的に受容可能な補助剤、希釈剤又は担体と混合して含む薬学的製剤
を含むパーツからなるキットを含み、この構成要素（Ａ）及び（Ｂ）は、他方と一緒に投与されるに好適な形態で各々提供される。
【００６８】
本発明者らは、２つの構成要素を互いに「関連させる」ことによって、キットのパーツである構成要素（Ａ）及び（Ｂ）が、次であり得ることを包含している：
（ｉ）  別個の製剤として（すなわち互いに独立して）提供され、これはその後併用治療でお互い一緒に使用するためにまとめられること；又は
（ｉｉ）  併用治療でお互い一緒に使用するために、別個の構成要素の「併用包装」として一緒に包装され、与えられること。
【００６９】
従って本発明の併用製品に関して、用語「一緒に投与すること」は、併用製品の２つの構成要素（第一の薬剤及び第二の薬剤）が、一緒に、又は上記で定義された第一の薬剤を含む製剤若しくはＥＧＦ受容体の活性を阻害する第二の薬剤を含む製剤のいずれかが、同一状態の処置の間に他の構成要素の非存在下で単独で（場合により反復して）投与される場合よりも、関連する状態の処置の間に患者に対する有益な効果がより大きくなるに十分近い時間でのいずれかで（場合により反復して）投与されることを包含している。特定の状態に関して、そして特定の状態の処置の間に、併用によって有益な効果がより大きくなるか否かを決定することは、処置又は予防されるべき状態如何ではあるが、当業者の常用の手段によって達成され得る。
【００７０】
好ましくは、阻害されるＥＧＦ受容体は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦ−Ｒ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４からなる群より選択される。最も好ましくは、ＥＧＦ受容体はＥｒｂＢ２である。
【００７１】
有利には第二の薬剤は、ＥＧＦ受容体の転写、翻訳及び／又は結合性質を改変することによって、ＥＧＦ受容体の生物活性を阻害する。
【００７２】
このような薬剤は、例えば次のような当該分野で周知の方法：
（ａ）    例えばノーザンブロット又は定量ＲＴ−ＰＣＲによって、ＥＧＦ受容体のｍＲＮＡの発現レベルに対する試験薬剤の効果を測定すること；
（ｂ）    例えば抗ＥＧＦ受容体抗体を用いたイムノアッセイによって、ＥＧＦ受容体タンパク質のレベルに対する試験薬剤の効果を測定すること；及び
（ｃ）    ＥＧＦ受容体活性の機能的マーカー、例えばＥｒｂＢ２のリン酸化に対する試験薬剤の効果を測定すること
を用いて同定され得る。
【００７３】
好ましい実施態様において、第二の薬剤は、ＥＧＦ受容体の転写阻害剤である。
【００７４】
別の実施態様において、第二の薬剤は、ＥＧＦ受容体の翻訳阻害剤である。
【００７５】
さらに別の実施態様において、第二の薬剤は、ＥＧＦ受容体の結合性質阻害剤である。
【００７６】
さらに別の実施態様において、第二の薬剤は、ＥＧＦ受容体アンタゴニストである。受容体の機能を直接遮断すること、すなわち受容体アンタゴニストとして作用すること、又は間接的に遮断することによって、薬剤が生物活性を阻害し得ることを当業者なら認識している。
【００７７】
第二の薬剤によるＥＧＦ受容体の阻害は、全体的又は部分的であり得ることを当業者なら認識している。例えば薬剤は、薬剤に曝露されていない癌細胞のＥＧＦ受容体の生物活性と比較して、ＥＧＦ受容体の生物活性を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％、そして最も好ましくは１００％阻害し得る。
【００７８】
有利には第二の薬剤は、薬剤に曝露されていない癌細胞のＥＲＢＢ２の生物活性と比較して、ＥＲＢＢ２の生物活性を５０％またはそれ以上阻害し得る。
【００７９】
好ましくは第二の薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＥＧＦ受容体との結合親和性を有する化合物及び低分子阻害剤化合物からなる群より選択される。
【００８０】
ＥＧＦ受容体阻害剤の特に好ましい例としては、薬物ハーセプチン（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（ＥｒｂＢ２との特異性を有するモノクローナル抗体）、薬物アービタックス（セツキシマブ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）（ＥＧＦ−Ｒ（ＥｒｂＢ１）との特異性を有するモノクローナル抗体）、他のモノクローナル抗体、例えばＭＡＢ２２５、チロシンキナーゼを阻害することによりＥＧＦ受容体を阻害する低分子ＩＲＥＳＳＡ（ゲフィチニブ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）並びに他のチロシンキナーゼ阻害剤（例えばＰＤ１５３０３５、ＧＷ５７２０１６及びＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋのような供給業者から市販される他のもの）が挙げられる。
【００８１】
本発明の第一の局面で使用するポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体の生産方法は、当該分野で周知である。好都合なことには、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、組換えポリペプチドであるか又は組換えポリペプチドを含む。
【００８２】
従って、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体をコードする核酸分子（すなわちポリヌクレオチド）は、好適な宿主中で発現され得るものであり、そしてポリペプチドは、その宿主から得られ得る。このような組換えポリペプチドの好適な生産方法は、当該分野で周知である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。）
【００８３】
手短に言えば、核酸分子によってコードされるポリペプチドを適切な宿主中で発現し得る核酸分子を含む発現ベクターが構築され得る。
【００８４】
例えば相補的な付着末端を介して、核酸分子、特にＤＮＡをベクターに作動可能に連結する種々の方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマー領域が、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加され得る。次いで、ベクター及びＤＮＡセグメントが、相補的なホモポリマー末端間の水素結合によって連結されて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【００８５】
１つ又はそれ以上の制限部位を含む合成リンカーにより、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する別の方法が提供される。例えば、エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成されるＤＮＡセグメントが、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又はＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩで処理されることになり、この酵素は、その３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性によって、突出した３’一本鎖末端を除去し、そしてその重合活性によって、陥凹した３’末端を満たす。
【００８６】
従って、これらの活性を組み合わせることにより、平滑末端のＤＮＡセグメントを生成する。次いでこの平滑末端セグメントは、平滑末端のＤＮＡ分子の連結反応を触媒し得る酵素、例えばバクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、極めてモル過剰のリンカー分子とインキュベートされる。従ってこの反応生成物は、重合したリンカー配列を末端に保有するＤＮＡセグメントである。次いでこれらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素で切断され、そして発現ベクターに連結されるのであり、このベクターは、このＤＮＡセグメントの末端に適合した末端を生産する酵素で切断されている。
【００８７】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＮ、ＵＳＡを含む多くの供給源から市販されている。
【００８８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、ＰＣＲを用いることである。この方法は、例えば好適な制限部位に操作することによって、ＤＮＡを好適なベクターに導入するのに使用され得るか、又はこれは、当該分野で公知の他の有用な方法でＤＮＡを修飾するのに使用され得る。
【００８９】
この方法において、酵素的に増幅されるべきＤＮＡは、この増幅されたＤＮＡにそれ自身が組み込まれる２つの特異的なプライマーに挟まれている。この特異的なプライマーは、当該分野で公知の方法を用いた発現ベクターへのクローニングに使用され得る制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。
【００９０】
次いでこのＤＮＡ（又はレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）は、好適な宿主中で発現されてポリペプチドを生産する。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知の技術（これは本明細書中に含まれる教示に鑑みて適切に修飾される）に従って、発現ベクターを構築するために使用され得るようになり、次いでこれは、本発明の化合物又はその結合部分を発現及び生産するために、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。このような技術としては、Ｒｕｔｔｅｒらに対して１９８４年４月３日に発行された米国特許第４，４４０，８５９号、Ｗｅｉｓｓｍａｎに対して１９８５年７月２３日に発行された同第４，５３０，９０１号、Ｃｒｏｗｌに対して１９８６年４月１５日に発行された同第４，５８２，８００号、Ｍａｒｋらに対して１９８７年６月３０日に発行された同第４，６７７，０６３号、Ｇｏｅｄｄｅｌに対して１９８７年７月７日に発行された同第４，６７８，７５１号、Ｉｔａｋｕｒａらに対して１９８７年１１月３日に発行された同第４，７０４，３６２号、Ｍｕｒｒａｙに対して１９８７年１２月１日に発行された同第４，７１０，４６３号、Ｔｏｏｌｅ，Ｊｒ．らに対して１９８８年７月１２日に発行された同第４，７５７，００６号、Ｇｏｅｄｄｅｌらに対して１９８８年８月２３日に発行された同第４，７６６，０７５号及びＳｔａｌｋｅｒに対して１９８９年３月７日に発行された同第４，８１０，６４８号に開示されるものが挙げられ、これらのすべては、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９１】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ（又はレトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）は、適切な宿主へ導入するために、広範な種々の他のＤＮＡ配列に連結され得る。相手のＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入様式及びエピソームでの保持又はエピソームへの組み込みが所望されるか否かに左右される。
【００９２】
一般にＤＮＡは、発現のために、適切な配向及び正しいリーディングフレームで発現ベクター、例えばプラスミドに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結され得るが、このような制御は、発現ベクターで一般に利用可能である。次いでベクターは、標準的な技術を通じて宿主に導入される。一般に、すべての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。従って、形質転換される宿主細胞を選択する必要がある。一つの選択技術は、形質転換される細胞において選択可能な形質、例えば抗生物質耐性をコードするＤＮＡ配列を、任意の必要な調節領域とともに発現ベクターに組み込むことを伴うものである。あるいはこのような選択可能な特色に関する遺伝子は、別のベクター上に存在し得るものであり、これは、所望の宿主細胞を同時形質転換するために使用される。
【００９３】
次いで、発現ベクターによって形質転換された宿主細胞は、十分な時間、そして本明細書に開示される教示に鑑みて当業者に公知の適切な条件下で培養されてポリペプチドを発現し得るようになり、次いでこれは回収され得る。
【００９４】
多くの発現系が公知であり、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。
【００９５】
たとえベクターが、原核生物ではない他の細胞型での発現に使用されても、ベクターは代表的には、原核生物の増殖のための原核生物レプリコン、例えばＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含んでいる。ベクターはまた、それとともに形質転換される細菌性宿主細胞、例えば大腸菌内で遺伝子の発現（転写及び翻訳）を指向し得る適切なプロモーター、例えば原核生物プロモーターも含み得る。
【００９６】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写開始を可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現調節領域である。代表的な細菌性宿主に適合したプロモーター配列は、代表的には、ＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。
【００９７】
代表的な原核生物のベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、並びにＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡから入手可能なｐＴｒｃ９９Ａ及びｐＫＫ２２３−３である。
【００９８】
代表的な哺乳動物細胞のベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローニングされた遺伝子の発現駆動にＳＶ４０後期プロモーターを使用しており、最も高い発現レベルは、Ｔ抗原産生細胞、例えばＣＯＳ−１細胞で見出されている。
【００９９】
誘導性の哺乳動物発現ベクターの例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａからまた入手可能なｐＭＳＧである。このベクターは、クローニングされた遺伝子の発現駆動に、マウス乳癌ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導性プロモーターを使用する。
【０１００】
有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３〜４０６及びｐＲＳ４１３〜４１６であり、そして一般に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐ）であり、そして酵母選択マーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は、酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐ）である。
【０１０１】
種々の宿主細胞とともに使用する他のベクター及び発現系は、当該分野で周知である。
【０１０２】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。細菌細胞は、好ましくは原核生物宿主細胞であり、代表的には大腸菌株、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡから入手可能な大腸菌株ＤＨ５、及びＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ番号３１３４３）のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能なＲＲ１である。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞、好ましくは、脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サル又はヒトの線維芽細胞系及び腎臓細胞系由来の細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡから一般に入手可能なＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＲＬ  １６５８として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びヒト胚腎臓細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトされ得るＳｆ９細胞である。
【０１０３】
ＤＮＡ構築物での適切な細胞宿主の形質転換は、周知の方法によって達成されるものであり、これは、使用されるベクタータイプに主として左右される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９、２１１０並びにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されている。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５、１０４〜１０９の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関して、このような細胞のトランスフェクトに有用な試薬、例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン又はリポソーム製剤は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ２０８７７、ＵＳＡから入手可能である。上記の文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
エレクトロポレーションはまた、細胞の形質転換及び／又はトランスフェクトに有用であり、そして酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞及び脊椎動物細胞の形質転換に関して当該分野で周知である。
【０１０５】
例えば多くの細菌種は、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２、６３７〜６４６（この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって形質転換され得る。２．５  ＰＥＢ中に懸濁されたＤＮＡ−細胞混合物を、２５μＦＤで１ｃｍ当たり６２５０Ｖを用いてエレクトロポレーションした後に、最多数の形質転換体が常に回収される。
【０１０６】
エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、Ｂｅｃｋｅｒ及びＧｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４、１８２（この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１０７】
首尾良く形質転換された細胞、すなわちポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を含む細胞は、周知の技術によって同定され得る。例えば、本発明の発現構築物の導入から得られる細胞が成長して、本発明のポリペプチドを生産し得るようになる。細胞は、収集され、そして溶解され得ることになり、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３又はＢｅｒｅｎｔら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８（これらの文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）によって記載される方法を用いて、ＤＮＡの存在についてこのＤＮＡ内容物が試験され得ることになる。あるいは、上清中のタンパク質の存在が、抗体を用いて検出され得る。
【０１０８】
組換えＤＮＡの存在について直接アッセイすることに加えて、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を指向し得るときには、形質転換の成功は、周知の免疫学的方法によって確認され得る。例えば、発現ベクターで首尾良く形質転換された細胞は、適切な抗原性を示すタンパク質を生産する。
【０１０９】
形質転換されたと思われる細胞サンプルが収集され、そして好適な抗体を用いてタンパク質についてアッセイされる。
【０１１０】
宿主細胞は、非ヒト動物体内の宿主細胞であり得る。従って、導入遺伝子の存在によってポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物が包含される。好ましくはトランスジェニック非ヒト動物は、げっ歯類、例えばマウスである。トランスジェニック非ヒト動物は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る（次を参照のこと）。
【０１１１】
宿主細胞の培養方法及び組換えタンパク質の単離方法は、当該分野で周知である。宿主細胞如何により、生産される本発明の化合物（又はその結合部分）が異なり得ることは認識されることである。例えば、ある宿主細胞、例えば酵母又は細菌細胞は、本発明の化合物（又はその結合部分）形態（これは、違った方法で翻訳後に修飾され得る）を生産し得る翻訳後修飾系を有さないか、又は異なる方法で翻訳後修飾され得る異なる翻訳後修飾系を有するかのいずれかである。
【０１１２】
本発明の方法で使用するポリペプチドは、真核細胞系、例えば哺乳動物細胞内で生産されることが好ましい。
【０１１３】
ポリペプチドはまた、市販のインビトロ翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶菌液又はコムギ胚芽溶菌液（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）を用いてインビトロで生産され得る。好ましくは翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶菌液である。好都合なことには、翻訳系は、転写系と共役し得るもの、例えばＴＮＴ転写−翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。この系は、翻訳と同じ反応の間にコードＤＮＡポリヌクレオチドから好適なｍＲＮＡ転写産物を生産するという利点を有する。
【０１１４】
また、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体及び薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤又は担体を含む薬学的組成物が本明細書に記載される。
【０１１５】
本明細書で使用される「薬学的組成物」は、本発明の方法で使用する治療に有効な製剤を意味する。
【０１１６】
本明細書で使用される「治療有効量」又は「有効量」又は「治療に有効な」は、与えられた状態（癌）及び投与計画に治療効果を与える量のことをいう。これは、必要とされる添加剤及び希釈剤、すなわち担体又は投与媒体と共同して、所望の治療効果を生み出すと予測される活性物質の所定量である。さらに、宿主の活性、機能及び応答の臨床的に重大な欠損を減少、最も好ましくは妨げるに十分な量を意味することが意図される。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に重大な状態を改善させるに十分なものである。当業者に認識されるように、化合物量は、その特定の活性如何により変化し得る。好適な投薬量は、必要とされる希釈剤と共同して、所望の治療効果を生み出すと予測される活性な組成物の所定量を含み得る。本発明の組成物の製造方法及び使用方法において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該分野で周知の患者の特性、例えば年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などに基づいて、通常の技量の医療労働者又は獣医学労働者によって決定され得る。
【０１１７】
使用されている化合物の有効性／毒性如何により、ポリペプチドは種々の濃度で配合され得る。好ましくは製剤は、活性薬剤を０．１μＭと１ｍＭとの間、より好ましくは１μＭと１００μＭとの間、５μＭと５０μＭとの間、１０μＭと５０μＭとの間、２０μＭと４０μＭとの間、そして最も好ましくはおよそ３０μＭの濃度で含む。インビトロ適用に関しては、製剤は、ポリペプチドをより低い濃度、例えば０．００２５μＭと１μＭとの間で含み得る。
【０１１８】
従って、薬学的製剤は、癌を処置するに十分な量のポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を含み得る。
【０１１９】
薬剤は一般に、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択される好適な薬学的賦形剤、希釈剤又は担体と混合して投与されることは当業者に認識される。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ（この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。）
【０１２０】
例えば薬剤又は物質は、即時放出適用、遅延放出適用又は制御放出適用のために、錠剤、カプセル、小卵、エリキシル剤、溶液又は懸濁液（これらは、着香料又は着色料を含み得る）の形態で、経口、口腔内又は舌下に投与され得る。薬剤又は物質はまた、静脈内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｓａｌ）注射を介して投与され得る。
【０１２１】
このような錠剤は、賦形剤、例えば微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシン、崩壊剤、例えばデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及びある種のシリケート錯体（ｃｅｒｔａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｉｌｉｃａｔｅ）並びに顆粒結合剤、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアを含み得るものである。さらに、平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート及びタルクが包含され得る。
【０１２２】
類似のタイプの固体組成物もまた、ゼラチンカプセルの充填剤として使用され得る。これに関する好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤に関しては、ポリペプチドは、種々の甘味剤又は着香料、着色剤又は色素、乳化剤及び／又は懸濁剤、及び希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン、並びにそれらの混合物と混合され得る。
【０１２３】
薬剤はまた、非経口で、例えば静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内若しくは皮下で投与され得るものであるか、又は薬剤は、注入技術によって投与され得る。これらは、他の物質、例えば血液と等張の溶液を作製するに十分な塩又はグルコースを含み得る滅菌水溶液の形態で最良には使用される。水溶液は、必要ならば適切に（好ましくは、３〜９のｐＨに）緩衝化されるべきである。滅菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学技術によって容易に達成される。
【０１２４】
非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性及び非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単回用量又は複数回用量容器、例えば密閉アンプル及びバイアルで与えられ得るものであり、そして使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用の水を添加するだけが必要な凍結乾燥状態で保管され得る。即時の注射溶液及び懸濁液は、上記のような種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【０１２５】
ヒト患者への経口及び非経口投与に関しては、薬剤の日用量レベルは、大人で通常１〜１０００ｍｇ（すなわち、およそ０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）であり、単回用量又は分割用量で投与される。例えば、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば３ｍｇ／ｋｇが使用され得る。
【０１２６】
薬剤はまた、鼻腔内又は吸入により投与され得るものであり、そして好都合なことには、乾燥粉末吸入器、又は好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素又は他の好適な気体を使用した加圧容器、ポンプ、スプレー又は噴霧器からのエーロゾルスプレー提供の形態で送達される。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達する弁を提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー又は噴霧器は、例えば溶媒としてエタノール及び噴霧剤の混合物を使用して、活性化合物の溶液又は懸濁液を含み得るものであり、これはさらに、潤滑剤、例えばソルビタントリオレエートを含み得る。吸入器又は注入器で使用するカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチンからできている）は、本発明の化合物の混合粉末及び好適な粉末基剤、例えばラクトース又はデンプンを含むように配合され得る。
【０１２７】
エーロゾル又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、各々の定量又は「一吹き」が、患者に送達するための本発明の化合物を少なくとも１ｍｇ含むように準備される。エーロゾルを用いた全日用量は、患者によって異なり、一日を通して単一用量又はより通常は分割用量で投与され得ることは認識されることである。
【０１２８】
あるいは薬剤は、坐剤若しくは膣坐剤の形態で投与され得るものであるか、又はローション、溶液、クリーム、軟膏若しくは散剤の形態で局所に適用され得る。本発明の化合物はまた、例えば皮膚パッチの使用によって経皮投与され得る。これらはまた、眼経路を通じて投与され得る。
【０１２９】
皮膚への局所適用に関して、薬剤は、例えば１つ又はそれ以上の次のもの：鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう及び水との混合物中に懸濁又は溶解される活性化合物を含む好適な軟膏として配合され得る。あるいはこれらは、例えば１つ又はそれ以上の次のもの：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水の混合物中に懸濁又は溶解された好適なローション又はクリームとして配合され得る。
【０１３０】
口への局所投与に好適な製剤としては、活性成分を香味基剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカント中に含むロゼンジ；活性成分を不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア中に含む香錠；並びに活性成分を好適な液体担体中に含むうがい薬が挙げられる。
【０１３１】
薬剤又は物質がポリペプチドの場合、徐放性の薬物送達系、例えばミクロスフェアを使用することが好ましい。これらは、特に注射の頻度を減少させるように設計されている。このような系の例は、生分解性ミクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）をカプセル化したＮｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔであり、これは、一回注射すると、持続的な期間にわたってゆっくりとｒｈＧＨを放出する。
【０１３２】
徐放性のポリペプチド組成物としてはまた、リポソームに封入されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドを含むリポソームは、本質的に公知の方法によって調製される。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３６８８〜９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０〜４（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号；同第４，５４４，５４５号；同第６，１３９，８６９号；及び同第６，０２７，７２６号（この文書中の関連する開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。通常リポソームは、小さな（約２００〜約８００オングストローム）の単層型であり、この脂質含量は、およそ３０モルパーセント（ｍｏｌ．％）のコレステロールを超え、選択される比率は、最適なポリペプチド治療に対して調整される。
【０１３３】
あるいはポリペプチド薬剤及び物質は、薬物を必要な部位に直接放出する外科的に埋め込まれた装置によって投与され得る。
【０１３４】
エレクトロポレーション治療（ＥＰＴ）系はまた、タンパク質及びポリペプチドの投与に使用され得る。細胞にパルス電場を加える装置は、薬物に対する細胞膜の透過性を増大させて、細胞内の薬物送達を著しく増強させる。
【０１３５】
タンパク質及びポリペプチドはまた、エレクトロインコーポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＥＩ）によって送達され得る。皮膚表面上の直径３０ミクロンまでの小粒子が、エレクトロポレーションで使用されるものと同じか又は類似の電気パルスを受けるときに、ＥＩが生じるのである。ＥＩにおいて、これらの粒子は、角質層を通り抜けて、皮膚の深層へと向かう。粒子は、薬物若しくは遺伝子を装填され得るものであるか、若しくは薬物若しくは遺伝子でコーティングされ得るものであるか、又は単に、薬物が進入し得る皮膚の孔を生成する「弾丸」として作用し得る。
【０１３６】
タンパク質及びポリペプチドの別の送達方法は、感熱性のＲｅＧｅｌ注射剤である。体温より低いと、ＲｅＧｅｌは注射可能な液体であるが、一方体温では、徐々に破壊され、そして公知の安全な生分解性ポリマーに溶解するゲルリザーバーを即時に形成する。活性な薬物は、そのバイオポリマーが溶解するにつれて徐々に送達されるのである。
【０１３７】
タンパク質及びポリペプチドの医薬品はまた、経口で送達され得る。このような系の一つは、体内へのビタミンＢ１２の経口摂取に関する自然作用を利用して、タンパク質及びポリペプチドを同時に送達する。ビタミンＢ１２の摂取系に乗って行くことによって、タンパク質又はポリペプチドは、腸壁を通過し得る。ビタミンＢ１２アナログと薬物との間に複合体が形成され、これは、複合体のビタミンＢ１２部分に内因子（ＩＦ）に対する著しい親和性、及び複合体の薬物部分に著しい生物活性の両方を保持する。
【０１３８】
本発明の第二の局面は、本発明の第一の局面に関して上記で定義されたように、患者の癌を処置する方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその生物活性フラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体を患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１３９】
本発明の使用及び方法は、医学分野及び獣医学分野の両方で有用性を有することを当業者ならさらに認識しているであろう。従って薬剤は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、ウマ、イヌ及びネコ）の両方の処置に使用され得る。しかし好ましくは、患者はヒトである。
【０１４０】
本発明者らは、「処置」によって、患者の治療的処置及び予防的処置の両方を包含している。用語「予防的」は、患者又は被験体の癌の可能性を予防するか又は減少させるかのいずれかである本明細書に記載のポリペプチド又は製剤の使用を包含するように使用される。
【０１４１】
上記で議論される用語「有効量」は、処置される疾患又は状態に有利な変化を生じさせるように使用され得る本発明の化合物の濃度又は量を記載するために本明細書中で使用され、この変化が、処置される疾患又は状態の寛解、有利な生理学的結果、回復又は減衰であるか、状態又は疾患が生じる可能性の予防又は減少であるかどうかは、処置される疾患又は状態如何である。
【０１４２】
本明細書に記載される薬剤は、１つ又はそれ以上のさらなる治療薬、例えば１つ又はそれ以上の慣用の癌処置と併用して患者に投与され得ることは認識されることである。
【０１４３】
好ましい実施態様において、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、癌細胞の増殖を阻害し得る。
【０１４４】
あるいは又はさらに好ましくは、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、癌細胞の転移を阻害し得る。
【０１４５】
有利には、ペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、癌細胞の増殖及び／又は転移を選択的に阻害し得る。
【０１４６】
本発明者らは、「選択的」によって、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体が、非癌細胞の機能（例えば増殖）を調節するよりも高い程度で癌細胞の増殖及び／又は転移を阻害することを表している。好ましくは、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、癌細胞の増殖及び／又は転移のみを阻害する。
【０１４７】
癌細胞の増殖及び／又は転移の阻害は、全体的かもしれないし部分的かもしれないことをまた当業者なら認識している。好ましい実施態様において、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、薬剤に曝露されていない癌細胞の増殖と比較して、癌細胞の増殖を２０％またはそれ以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得る。あるいは又はさらに好ましくは、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、薬剤に曝露されていない癌細胞の転移と比較して、癌細胞の転移を２０％またはそれ以上、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上阻害し得る。
【０１４８】
上記で議論されるように、ポリペプチド又はそのフラグメント、変異体、融合体若しくは誘導体は、すべての癌タイプの処置に使用するのに好適である。しかし、癌細胞が、上皮細胞又は扁平上皮細胞である場合が特に好ましい。
【０１４９】
例えば癌細胞は、乳癌細胞、胆管癌細胞、脳腫瘍細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、生殖器癌細胞、肺癌細胞及び気道癌細胞、皮膚癌細胞、胆嚢癌細胞、肝臓癌細胞、鼻咽頭癌細胞、神経細胞癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、リンパ腺癌細胞並びに消化管癌細胞からなる群より選択され得る。
【０１５０】
好ましくは、癌細胞は乳癌細胞である。より好ましくは、乳癌細胞は、ＥｌｓｔｏｎグレードＩＩＩ細胞である。最も好ましくは、乳癌細胞は、転移性のものである。
【０１５１】
本発明の好ましい局面は、次の図面に関連して、次の非限定的な実施例に記載される：
【０１５２】
図１−ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、乳癌で高度に発現される。
（Ａ）間質島（ｓｔ）を取り囲む腫瘍細胞（赤色沈殿物）において、ｈＣＡＰ１８タンパク質に対する強い免疫反応性を示す腺管乳癌グレードＩＩＩの切片（患者番号７、表２）。（Ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションは、同じ組織由来の切片において、ｈＣＡＰ１８  ｍＲＮＡに対するマッチングシグナルを示す。強いオートラジオグラフィーシグナルは、暗視野照明下で白色粒子として現れる。（Ｃ）癌細胞の強力な視像は、免疫反応性を欠く腫瘍細胞に隣接した、強い免疫反応性の細胞を示す。（Ｄ）血管内のｈＣＡＰ１８免疫反応性の乳癌細胞。（Ｅ）ｈＣＡＰ１８免疫反応性を完全に消失したカテリン組換えペプチドでの免疫吸収（図１Ａと同じ組織）。（Ｆ）免疫吸収の間のポジティブコントロールとしてのｈＣＡＰ１８の通例の免疫染色（図１Ａと同じ組織）。（Ｇ）正常な乳腺上皮は、ｈＣＡＰ１８に対して弱い免疫反応性を示す。顕微鏡写真（Ａ、Ｃ〜Ｇ）は、１：５００希釈のｈＣＡＰ１８抗体を用いて得られた結果を示す。スケールバー（Ａ、Ｂ）＝１００μｍ；（Ｃ、Ｄ）＝２５μｍ；（Ｅ、Ｆ、Ｇ）＝１０μｍ。
【０１５３】
図２−ｈＣＡＰ−１８／ＬＬ−３７は、乳癌のイムノブロッティングによって検出される。
患者の臨床データを、表２に示す（サンプル１〜１０）。組換えカテリン（Ｃ）及びＬＬ−３７ペプチド（Ｌ）を、サイズの基準として用いた。正常な乳房組織を、レーン１に示す。ＥｌｓｔｏｎグレードＩ腫瘍を、レーン２、４及び５に示す。グレードＩＩ腫瘍を、レーン３に示し、そしてグレードＩＩＩ腫瘍を、レーン６〜１０に示す。すべての組織において、プロセシングされていないインタクトな１８ｋＤａのホロタンパク質に対応する免疫反応性のバンドが存在した。プロセシングされたＬＬ−３７ペプチド（４ｋＤ）は、５つのグレードＩＩＩ腫瘍のうちの４つ（番号７〜１０）で認識できた。
【０１５４】
図３−上皮細胞のｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、細胞増殖を増大させる。
（Ａ）上部パネル、左レーン；抗ＬＬ３７抗血清を用いたＨＥＫ２９３抽出物に対するイムノブロッティング。バイシストロニックベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）でトランスフェクトされた細胞は、ｈＣＡＰ１８タンパク質発現を示す。上部パネル、右レーン；ＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞。下部パネル；ＨＥＫ２９３細胞（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）は、コントロール細胞（Ｅ）と比較して、著しく高い増殖速度を示す（フローサイトメトリーで評価）。ポンソー染色を、ローディングコントロールとして示す。（Ｂ）上部パネル、左レーン；（Ａ）に記載されるようにトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞。下部パネル；ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞は、コントロール細胞と比較して、著しく高い増殖速度を示す（３Ｈ−チミジン取り込みで評価）。
【０１５５】
図４−合成ＬＬ−３７ペプチドでの処理は、上皮細胞の細胞増殖を増大させる。
血清飢餓によって７２時間同調され、次いで１０μｇ／ｍｌの合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチド（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ中）で３６時間処理されたＨａＣａＴ細胞は、非処理の（コントロール）ＨａＣａＴ細胞と比較して著しく増大した細胞増殖を示す。増殖速度は、［3Ｈ］−チミジン取り込みで評価した。
【０１５６】
図５−ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は、乳癌及び正常な乳腺上皮で発現される。
（Ａ）腫瘍細胞のＦＰＲＬ１受容体に対して顕著な免疫反応性を有する腺管乳癌Ｅｌｓｔｏｎグレード２（患者番号１２、表２）の切片（赤色沈殿物）。（Ｂ）腺管領域のＦＰＲＬ１に対して免疫反応性を示す正常な乳腺上皮の切片（赤色沈殿物）。顕微鏡写真は、１：４００希釈のＦＰＲＬ１抗血清を用いて得られた結果を示す。スケールバー（ａ）＝５０μｍ；（ｂ）＝１０μｍ。（Ｃ）イムノブロッティングにより、ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は、正常（Ｎ）組織及び乳癌（Ｔ）組織の両方で発現されることが明らかになった。（Ｄ）バイシストロニックベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）でトランスフェクトされたＨａＣａＴは、ＦＰＲＬ１受容体のｍＲＮＡ発現が著しく増大することを、リアルタイムＰＣＲにより示す。ＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞は、コントロールの役割をした。
【０１５７】
図６−エストロゲン受容体（ＥＲ）及びリンパ節（Ｎ）に陽性な乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７発現の増大（対数目盛で表示）。
１４０の乳房腫瘍及び４の影響を受けない乳房組織サンプルからＲＮＡを抽出し、そしてプライマーとしてランダムヘキサマーを用いて逆転写した。標準的なプロトコルに従ってｃＤＮＡ  １０ｎｇを用いたリアルタイムＰＣＲによって、ｈＣＡＰ１８転写産物の発現を測定した。１８Ｓ−ＲＮＡの定量化によって、サンプルを規準化した。影響を受けないサンプルの平均発現を、任意的に１と設定した。平均及び偏差を、分散分析統計学によって評価する。
【０１５８】
図７−ＬＬ−３７を発現する乳癌系統ＺＲ７５−１において、ＬＬ−２５は、ヘレグリンを通じたＭＡＰＫリン酸化を阻害する。
ＺＲ７５−１細胞を、ヘレグリン（２ｎｇ／ｍｌ）、ＬＬ−２５若しくはＬＬ−３７又は示されるような組み合わせとともに２０分間処理した。タンパク質抽出物を、リン酸化ＭＡＰＫに対するウエスタンブロット分析によって分析した。図７Ａはウエスタンブロットを示し、そして図７Ｂは、ウエスタンブロット実験の三重反復の定量評価を示す。この研究は、内因性ＬＬ−３７の活性が抑制され得ることを実証している。
【０１５９】
図８−ヘレグリン誘導性のＭＡＰＫリン酸化に対するＬＬ−２５によるＬＬ−３７の競合阻害
ヘレグリン（２ｎｇ／ｍｌ）を、それ自体ではＬＬ−３７をほとんど生産できない乳癌系統ＭＣＦ７に、ＬＬ−３７（２μＭ）及び示される濃度のＬＬ−２５とともに添加した。コントロール実験において、溶媒（ＰＢＳ）又はＬＬ−３７、ＬＬ−２５若しくはヘレグリン（ＨＲＧ）を、唯一の基質として添加した。三重反復測定の定量評価は、三重反復のうちの１つのウエスタンブロットとともに示される。結果は、ＬＬ−３７の濃度が１０％であっても、ＬＬ−２５は、ＬＬ−３７に対して競合的かつ高性能な阻害剤であることを実証している。データはまた、ＬＬ−３７の内因性効果は、たとえ少ししか生産されていなくてもＨＲＧを通じたＭＡＰＫ活性化に決定的に寄与しており、そしてＬＬ−２５によって著しく遮断され得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１−１】（Ａ）は腺管乳癌グレードＩＩＩの切片を示し、（Ｂ）は同じ組織由来の切片における、インサイチュハイブリダイゼーション及びオートラジオグラフィーシグナルを示し、（Ｃ）は癌細胞の強力な視像を示す。
【図１−２】（Ｄ）は血管内のｈＣＡＰ１８免疫反応性の乳癌細胞を示し、（Ｅ）はｈＣＡＰ１８免疫反応性を完全に消失したカテリン組換えペプチドでの免疫吸収を示し、（Ｆ）は免疫吸収の間のポジティブコントロールとしてのｈＣＡＰ１８の通例の免疫染色を示し、（Ｇ）は正常な乳腺上皮は、ｈＣＡＰ１８に対して弱い免疫反応性を示す。
【図２】ｈＣＡＰ−１８／ＬＬ−３７は、乳癌のイムノブロッティングによって検出されることを示す。
【図３】（Ａ）上部パネル、左レーンは抗ＬＬ３７抗血清を用いたＨＥＫ２９３抽出物に対するイムノブロッティングを示し、上部パネル、右レーンはＥＧＦＰ（Ｅ）のみでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を示す。下部パネルはＨＥＫ２９３細胞は、コントロール細胞と比較して、著しく高い増殖速度を示す。  （Ｂ）上部パネル、左レーンは（Ａ）に記載されるようにトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞を示す。下部パネルはｈＣＡＰ１８でトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞は、コントロール細胞と比較して、著しく高い増殖速度を示す。
【図４】合成ＬＬ−３７ペプチドでの処理は、上皮細胞の細胞増殖を増大させることを示す。
【図５−１】（Ａ）は腺管乳癌Ｅｌｓｔｏｎグレード２の切片を示し、（Ｂ）は正常な乳腺上皮の切片を示す。
【図５−２】（Ｃ）はＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は、正常（Ｎ）組織及び乳癌（Ｔ）組織の両方で発現されることを示し、（Ｄ）はバイシストロニックベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）でトランスフェクトされたＨａＣａＴは、ＦＰＲＬ１受容体のｍＲＮＡ発現が著しく増大することを示す。
【図６Ａ】エストロゲン受容体（ＥＲ）及びリンパ節（Ｎ）に陽性な乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７発現の増大を示す。
【図６Ｂ】エストロゲン受容体（ＥＲ）及びリンパ節（Ｎ）に陽性な乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７発現の増大を示す。
【図７Ａ】ＬＬ−３７を発現する乳癌系統ＺＲ７５−１において、ＬＬ−２５は、ヘレグリンを通じたＭＡＰＫリン酸化を阻害することを示す（ウエスタンブロット分析）。
【図７Ｂ】ＬＬ−３７を発現する乳癌系統ＺＲ７５−１において、ＬＬ−２５は、ヘレグリンを通じたＭＡＰＫリン酸化を阻害することを示す（ウエスタンブロット実験の三重反復）。
【図８】ヘレグリン誘導性のＭＡＰＫリン酸化に対するＬＬ−２５によるＬＬ−３７の競合阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
実施例Ａ−抗菌タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は、乳癌で高発現され、そして推定される上皮細胞の増殖因子である。
【０１６２】
序論
本実施例においては、一連の乳癌におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現パターンを調べており、腫瘍細胞では、ｈＣＡＰ１８  ｍＲＮＡ及びタンパク質の顕著なアップレギュレーションが実証されたが、隣接した間質では実証されなかった。興味深いことに、最も高い組織学的グレードの腫瘍間で、最も高いレベルのｈＣＡＰ１８タンパク質が検出されたが、一方いくつかの低いグレードの腫瘍のｈＣＡＰ１８レベルは、正常な乳房組織で検出されたレベルに等しかった。これらの知見は、抗菌ペプチドとして提唱されている仮説的な抗腫瘍効果とは明らかに対照的であるが、上皮修復及び新脈管形成5、10におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の役割を示唆する最近の知見と一致していた。増殖促進因子としてのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７をさらに支持するように、本発明者らは、上皮細胞の増殖が、合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドでの処理及びｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の両方によって著しく増強されることをここで実証した。
【０１６３】
材料及び方法
組織
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｄｅｒｙｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎから、２８人の乳癌患者由来の凍結腫瘍組織を得た（表２）。確立されたガイドライン13に従ったＥｌｓｔｏｎ及びＥｌｌｉｓ  Ｉ〜ＩＩＩに従って、腫瘍にスコアをつけた。増殖マーカーとして、サイクリンＡを使用した（Ｎｏｖａ−Ｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ、ＵＫ）。ルーチン的に加工処理されたパラフィン切片のエストロゲン受容体状態を評価した。８人の乳癌患者由来及び乳房縮小（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）術を受けた２人の健康な個体由来の腫瘍の浸潤のない乳房組織は、コントロールの役割をした。すべてのサンプルを、同じ病理学者（Ｂ．Ｓ．）によって試験し、そして正常と分類した（表２）。すべての患者によって、文書によるインフォームドコンセントが与えられた。この研究は、地方倫理委員会によって承認された。
【０１６４】
ｈＣＡＰ１８のインサイチュハイブリダイゼーション
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングされた４３５ｂｐのｈＣＡＰ１８全長ｃＤＮＡを使用して、［35Ｓ］標識されたアンチセンス及びセンスプローブをインビトロで転写し、そしてサンプル０〜１７に対して、本質的に記載される通りに8インサイチュハイブリダイゼーションを行った（表２）。
【０１６５】
免疫組織化学
サンプル０〜１７に対して、免疫組織化学を行った（表２）。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＵＳＡ）を用いた間接的なペルオキシダーゼ法に従って、以前に記載された通りに10、組換えｈＣＡＰ１８に対するカテリン親和性の精製ウサギ抗血清14を１：５００希釈で用いた。染色の特異性を確認するために、以前に報告された通りに10免疫吸収を行った。ＦＰＲＬ１受容体を検出するために、間接的なペルオキシダーゼ法に従って、親和性精製されたヤギポリクローナル抗体を１：４００希釈で用いた（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）。
【０１６６】
タンパク質抽出及びウエスタンブロット分析
凍結腫瘍組織１６〜６０ｍｇを、電動ホモジナイザーを用いてリジン緩衝液中でホモジナイズした。標準的なプロトコル15に従って、腫瘍組織及び細胞系由来のタンパク質を、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液中で抽出した。分光光度アッセイによってタンパク質濃度を測定し、そしてＳＤＳ含有サンプル緩衝液を用いて、等しいタンパク質濃度に調整した16。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７を検出するために、１６．５％  Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  Ｒｅａｄｙゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で抽出物を分離した。組換えカテリン17及び合成ＬＬ−３７ペプチドを、サイズの基準として用いた。ＥＲＫ１／２及びＦＰＲＬ１を検出するために、タンパク質を、それぞれ１２％及び８％のトリス−グリシンゲル上で分離した。各サンプルにおいて、ほぼ等量のタンパク質がブロットされたことを確認するために、一次抗体とのインキュベーション前に、フィルターを、３％  ＴＣＡ中の３％ポンソーＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で可逆的に染色した。親和性精製された抗カテリン抗血清17、親和性精製された抗ＬＬ−３７抗血清10、抗ＦＰＲＬ１抗血清（ｓｃ１８１９１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）及びモノクローナル抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ）を、すべて１：１０００希釈で用いた。ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上へのエレクトロブロッティング、並びに一次抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）との逐次インキュベーション後、高感度化学ルミネセンス（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）由来のシグナルを、ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ  １０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で捕捉した。
【０１６７】
ＥＬＩＳＡ
以前に記載された17サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、正常乳腺及び腫瘍組織由来のタンパク質抽出物中のｈＣＡＰ１８を定量化した。
【０１６８】
リアルタイムＰＣＲによるｈＣＡＰ１８の発現分析
４つの正常サンプル及び４つの腫瘍由来のＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出し、そしてファーストストランド（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いて逆転写した。標準的なプロトコルに従ってｃＤＮＡ  １０ｎｇを用いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でのリアルタイムＰＣＲによってＲＮＡを定量化した。サンプルを、三重反復で評価した。プライマー配列は、５’−ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡ−３’［配列番号３］及び５’−ＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＡ−３’［配列番号４］であり、そして蛍光発生プローブ配列は、６−ＦＡＭ−５’−ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴ−３’−ＢＨＱ１［配列番号５］であった。サンプルを、１８Ｓ−ＲＮＡの定量化によって規準化した（Ａｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。正常サンプルの平均発現を、任意に１と設定した。
【０１６９】
合成ＬＬ−３７ペプチド
ＬＬ−３７ペプチドを合成し、そしてＨＰＬＣによって９８％の純度まで精製した（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｈｉｌｌｅｒｏｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）。抗菌アッセイ18によって、ペプチドの生物活性を確認した。
【０１７０】
上皮細胞のＬＬ−３７ペプチド処理
自然に不死化したヒトケラチノサイト細胞系（ＨａＣａＴ）19を、１０％  ＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ、Ｂｏｕｌｅ  Ｎｏｒｄｉｃ  ＡＢ  Ｈｕｄｄｉｎｇｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）及び抗生物質（ＰＥＳＴ＝ペニシリン５０Ｕ／ｌ及びストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で培養した。細胞を７０％の集密で収集し、そして９６ウェルプレートに、培地（ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳ及びＰＥＳＴ）１００μｌ中２０００の細胞で播種した。１２時間後、培地を無血清培地（ＤＭＥＭ＋ＰＥＳＴ）に変え、そして７２時間の血清飢餓によって、細胞をＧ０／Ｇ１に同調させ、次いで合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドを１ｍｌ当たり１０μｇ含む培地（ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ）１００μｌで処理した。ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ及びＰＥＳＴのみで処理した細胞は、コントロールの役割をした。実験を、四重反復で行った。［3Ｈ］−チミジン取り込みによって、細胞増殖を評価した。細胞を、１ウェル当たり１μＣｉの［3Ｈ］−チミジン（２０．００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で１２時間処理し、そしてガラス繊維ろ紙（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ  Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）上で収集した（Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ  ９６、Ｔｏｍｔｅｃ、Ｏｒａｇｅ、ＣＴ）。液体シンチレーションカウンター（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｐｌｕｓｓ、Ｗａｌｌａｃ  Ｓｖｅｒｉｇｅｓ  ＡＢ）を用いて、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。実験を、六重反復で２回繰り返した。
【０１７１】
ＨＥＫ２９３細胞及びＨａＣａＴ細胞内でのｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現
１６ｂｐの５’非翻訳領域を含む全体のコード配列を含むＩｍａｇｅクローン３０５７９３１20由来のＢｆａ１フラグメントを、バイシストロニックベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のＳｍａ１部位にサブクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞及びＨａＣａＴ細胞を、標準的な条件下でＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてトランスフェクトし、そして４００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で２週間選択した。ＭｏＦｌｏ（登録商標）高速セルソーティングフローサイトメーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）を用いて、データ分析にＳｕｍｍｉｔTMソフトウェアを使用して細胞をＥＧＦＰ発現について選別し、そしてそれらのＣＡＰ１８発現を、イムノブロッティングによって定量化した。コントロールの細胞系を、ＥＧＦＰのみを発現するベクターでのトランスフェクションによって同様に確立した。いかなる選択も行わない数カ月の継続した培養の間、この細胞系は、ＣＡＰ１８の安定な発現を維持した。この実験を、３０回反復で２回繰り返した。
【０１７２】
ｈＣＡＰ１８で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞及びＨａＣａＴ細胞の増殖アッセイ
ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、７０％の集密で収集し、そして２４ウェルプレートに播種した。２４時間後に培地を変え、そして５％  ＦＣＳ及びＰＥＳＴを補充した培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）２ｍｌ中で細胞を培養した。６日目に細胞を収集し、そしてフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）によって計数した。細胞生存率をトリパンブルーで測定した結果、あらゆる条件下で、５％未満の細胞がトリパンブルーに陽性であった。すべての条件を、三重反復で行った。ＥＧＦＰのみを発現するベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、コントロールの役割をした。
【０１７３】
ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞を、７０％の集密で収集し、そして１０％  ＦＣＳ＋ＰＥＳＴを含むＤＭＥＭ中の９６ウェルプレートに、１ウェル当たり２０００の細胞で播種した。１２時間後に、培地を５％  ＦＣＳ＋ＰＥＳＴを補充したＤＭＥＭに変えた。培養２４時間後に、細胞を、上記の通りに１ウェル当たり１μＣｉの［3Ｈ］−チミジンで１２時間処理し、収集し、そして分析した。ＥＧＦＰのみ発現するベクターでトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞は、コントロールの役割をした。
【０１７４】
ＦＰＲＬ１の発現分析
ＨａＣａＴ細胞由来のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、そしてファーストストランド合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて逆転写した。上記の通りに、リアルタイムＰＣＲによってＦＰＲＬ１  ＲＮＡを定量化し、そして１８Ｓ−ＲＮＡに対して規準化した。プライマー配列は、５’−ＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＧＣ−３’［配列番号３］及び５’−ＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧ−３’［配列番号４］であり、そして蛍光発生プローブ配列は、６−ＦＡＭ−５’−ＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡ−３’−ＢＨＱ１［配列番号５］であった。
【０１７５】
百日咳毒素アッセイ
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によって誘導された上皮細胞増殖の刺激の媒介にＦＰＲＬ１が関与していることを評価するために、ＨａＣａＴ細胞を、Ｇタンパク質共役受容体阻害剤である百日咳毒素で処理した。ＬＬ−３７処理の２４時間前に、細胞を、最終毒素濃度２０ｎｇ／ｍｌで百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とプレインキュベートした。細胞播種の４８時間後に培地を変え、そして合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドを１ｍｌ当たりそれぞれ５μｇ又は１０μｇ含む培地（ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ及びＰＥＳＴ）１００μｌで、ＨａＣａＴ細胞を処理した。ＤＭＥＭ＋５％  ＦＣＳ及びＰＥＳＴのみで処理した細胞は、コントロールの役割をした。
【０１７６】
ＬＬ−３７で処理されたＨａＣａＴ細胞内でのリン酸化ＥＲＫ１／２アッセイ
ＨａＣａＴ細胞を、１０％の集密で播種し、そして０．２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で３６時間維持した。次の４８時間は、それぞれ１％又は５％のＦＣＳを含み、そして１０μｇ／ｍｌのＬＬ−３７の存在下又は非存在下のＤＭＥＭ中で細胞を培養し、毎日培地を変えた。１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦは、ポジティブコントロールの役割をした。リン酸化ＥＲＫ１／２の発現を、マウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ）を用いたウエスタンブロット分析によって評価した。
【０１７７】
統計分析
値を、平均細胞数すなわちカウント／分（ＣＰＭ）±ＳＤで示した。群間の比較を、両側ｔ検定によって分析した。＜０．０５のＰ値の結果を、統計学的に有意であるとみなした。腫瘍における発現分析に関しては、ｈＣＡＰ１８タンパク質レベルに対して、＜０．０５の有意水準で片側ｔ検定を行った。
【０１７８】
結果
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌で発現された。
【０１７９】
患者の詳細を、表２に示した。
【０１８０】
インサイチュハイブリダイゼーションによって、健常なコントロール由来の乳房組織（図１ｇ）及び腫瘍の浸潤のない乳癌（示さず）においては、ｈＣＡＰ１８  ｍＲＮＡのシグナルは低く（示さず）、そしてｈＣＡＰ１８タンパク質に対する免疫反応性は弱かった。すべての乳癌組織は、腫瘍細胞においてはｈＣＡＰ１８に対する免疫反応性を示し、間質においては示さなかった（図１ａ、ｃ、ｄ）。腫瘍細胞集団は、ｈＣＡＰ１８免疫反応性に関して均一ではなく、強度に陽性な細胞が、検出可能なｈＣＡＰ１８を欠いている細胞に隣接して見出された（図１ｃ）。カテリン組換えタンパク質での免疫吸収は、ｈＣＡＰ１８免疫反応性を消失させた（図１ｅ、ｆ）。インサイチュハイブリダイゼーションにより、ｈＣＡＰ１８  ｍＲＮＡの陽性シグナルが、免疫組織化学を用いて得られた発現パターンと厳密に適合した同じ領域で検出された（図１ｂ）。シグナル強度にはばらつきがあり、そしてグレードが高い腫瘍間で最も突出していた。センスｈＣＡＰ１８  ｃＲＮＡプローブとハイブリダイズしたコントロール切片は、ｈＣＡＰ１８  ｍＲＮＡに特異的なシグナルを欠失していた（示さず）。
【０１８１】
ＥＬＩＳＡによる乳癌組織抽出物中のｈＣＡＰ１８タンパク質の定量化により、Ｅｌｓｔｏｎ  Ｉグレード腫瘍とＩＩグレード腫瘍との間に差異がないことが明らかになったが、最も高い悪性度の腫瘍において、ｈＣＡＰ１８レベルが明らかにより高かった（表２）。Ｅｌｓｔｏｎ  ＩＩＩグレードと残りの腫瘍との間の差異は、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１）。１３個のグレードＩＩＩ腫瘍のうちの１０個が、総タンパク質１ｍｇ当たり５ｎｇのｈＣＡＰ１８濃度に達するか又はこの濃度を超えた。残りの１８個の腫瘍サンプルのうちの２つのみが、このレベルに達した。本発明者らはまた、４つの健常な乳房組織の検体をアッセイし、Ｅｌｓｔｏｎ  Ｉ又はＩＩ腫瘍と同様のレベルであることを明らかにした。ＥＬＩＳＡによって得られた発現パターンを検証するために、本発明者らは、４つの正常サンプル及び４つの腫瘍に対してリアルタイムＰＣＲを行った。転写産物の定量化の結果は、タンパク質発現のデータと一致した（表２）。
【０１８２】
イムノブロッティングにより、調べられたすべての腫瘍及び正常な乳房組織は、プロセシングされていないインタクトな１８ｋＤａのホロタンパク質に対応する免疫反応性のバンドを示した（図２）。調べられたグレードＩＩＩ腫瘍５つのうちの４つ（表２、サンプル６〜１０）において、本発明者らはまた、ＬＬ−３７（プロセシングされたｈＣＡＰ１８タンパク質）に対応するバンドを検出した（図２）。使用された抗血清は、ｈＣＡＰ１８ホロタンパク質に対して惹起されており、そしてカテリンペプチド10に対して親和性精製されているにもかかわらず、高濃度でＬＬ−３７を検出した。
【０１８３】
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は上皮細胞の増殖を増大させた。
【０１８４】
ｈＣＡＰ１８（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞及びＨａＣａＴ細胞は、ＥＧＦＰのみ（Ｅ）発現するベクターでトランスフェクトされたコントロール細胞よりも著しく高い増殖速度を示した（図３Ａ及びＢ）。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞及びＨａＣａＴ細胞由来のタンパク質抽出物のイムノブロッティングにより、これらのｈＣＡＰ１８ベクター含有細胞はホロタンパク質を産生しており（図３Ａ及びＢ）、そしてＬＬ−３７に対応する４ｋＤの免疫反応性バンドが細胞培養液で検出された（データは示さず）ことを本発明者らは確認した。さらに、５％ウシ胎仔血清で培養し、そして合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチド１０μｇ／ｍｌで処理したＨａＣａＴ細胞は、細胞増殖が著しく増大したことを示した（図４）。
【０１８５】
【表１】
2009541287.tif 000003
【０１８６】
【表２】
2009541287.tif 000004
【０１８７】
ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は、乳癌で発現された。
【０１８８】
Ｇタンパク質共役受容体、ＦＰＲＬ１は、真核生物細胞においてＬＬ−３７誘導性の効果を媒介することが示されており4、5、そして本発明の背景でその潜在的な役割を評価するために、本発明者らは、乳房組織のＦＰＲＬ１タンパク質発現を調べ、そして乳癌細胞及び正常な腺上皮の両方でＦＰＲＬ１に対する強い免疫反応性を見出した（図５ａ、ｂ）。ＦＰＲＬ１が両方の組織で発現されたことが、イムノブロッティングにより確認された（図５ｃ）。さらに、ｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、ＨａＣａＴ細胞のＦＰＲＬ１  ｍＲＮＡ発現を著しく増大させており（図５ｄ）、これは、ＦＰＲＬ１がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７シグナル伝達に関与していることをさらに支持し得るものであった。しかし、百日咳毒素でのＨａＣａｔ細胞の前処理は、これらの細胞増殖を消失はさせなかったがおよそ５０％に抑制しており（示さず）、ＦＰＲＬ１は、これらの細胞においてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７増殖刺激効果の媒介に独自には関与していないかもしれないことを示した。上皮細胞増殖の活性化にＥＲＫ１／２が関与する可能性を試験するために、本発明者らは、ＨａＣａＴ細胞を合成の生物学的に活性なＬＬ−３７で処理したが、ＥＲＫ１／２の著しい活性化は生じず、これは、ＥＧＦＲが、ＨａＣａＴ細胞の増殖に対してＬＬ−３７刺激効果を媒介することを伴わなったことを示した。
【０１８９】
考察
本研究において、本発明者らは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７が、正常な乳腺上皮で恒常的に生産されることを実証した。これは、ヒトでの抗菌バリア保護におけるＬＬ−３７の役割と一致しており、そして損傷及び炎症に関連して見られる明白な発現とは対照的に、低い恒常的なＬＬ−３７発現が、正常な静止状態の上皮で見出されたという以前の報告7-10と一致した。抗菌ペプチドの恒常的な発現は、種々の外分泌腺において以前に検出されており、例えば汗腺中のヒトカテリシジンＬＬ−３７、マウス唾液腺中のカテリシジンＣＲＡＭＰ及びヒト唾液腺中のβデフェンシンである21-23。乳腺でのヒトβデフェンシン−２（ｈＢＤ−２）ｍＲＮＡの発現は、Ｂａｌｓらによって１９９８年に報告されており、そして最近他のグループが、授乳中ではない女性の乳腺組織並びに授乳中の乳房組織及び母乳において、ｈＢＤ−１が恒常的に発現されることを見出した24-26。
【０１９０】
興味深いことに、ｈＣＡＰ１８の生産は、正常な乳腺上皮又は低いグレードの腫瘍と比較して、高いグレードの腫瘍の乳房上皮で最も著しく増大していた。しかし、ｈＣＡＰ１８発現は普遍的でも均一でもなく、すなわち、すべての癌細胞がｈＣＡＰ１８に陽性であるとは限らないが、明らかに陽性な細胞が、検出可能なｈＣＡＰ１８  ｍＲＮＡ及びタンパク質を欠いている細胞に隣接して見出されており（図１ｃ）、そして発現の程度は、すべての腫瘍タイプの細胞間で著しく変動した。これは腎細胞癌のヒトαデフェンシンに対して示唆されているように27、複雑になお厳密に制御されたｈＣＡＰ１８の調節を反映しているのかもしれない。
【０１９１】
本発明者らの研究において、最も高いｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７レベルが、最も高い組織学的グレードの腫瘍間で検出された。一方では、高いグレードの腫瘍と低いグレードの腫瘍と正常な乳房組織との間のｈＣＡＰ１８発現の差異は統計学的に有意であったが、厳密な相関は存在しなかった。すべての群内で、健常サンプルレベルでｈＣＡＰ１８を発現する腫瘍が存在し、そしてグレードＩ腫瘍のうちの２つが比較的高い発現を示したことを別にすれば、グレードＩＩＩ腫瘍間でのみ高発現が観察された。しかしサンプル数に限度があるので、本発明者らの知見は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の悪性度と発現度との間に相関がある可能性を示唆したことになる。乳癌でのｈＣＡＰ１８の過剰発現は、ｈＣＡＰ１８の調節に影響を及ぼす細胞内経路の不全から生じ得るものであり、そしてｈＣＡＰ１８発現は、腫瘍に増殖の利点を与えるよりもむしろ、これらの変更を反映していると主張することができる。しかし、本明細書で示されるインビトロ研究と連関して、このデータは、ＬＬ−３７が腫瘍増殖を促進するという潜在的な役割を強調するものであると本発明者らは信じている。
【０１９２】
癌腫での抗菌ペプチドの生物学的役割は不明である。種々の口腔癌において、高いｈＢＤ−２タンパク質濃度、並びにヒトαデフェンシン及びβデフェンシンの両方に対する顕著な免疫反応性が見出されており、そしてこれらの抗菌ペプチドのレベルが増大することは、サイトカインによる伝染及び／又は刺激の結果であり得ることが示唆されている28-30。昆虫から単離される抗菌ペプチド、例えばメリチン及びセクロピン関連ペプチドは、哺乳動物の腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を発揮することが他の研究により提唱されている31-34。さらに、ヒト膀胱癌細胞系において、セクロピン及びメリチンのコード配列をベクター媒介性で送達及び発現すると、ヌードマウスの腫瘍発生能を抑制した11。同様に、ブタカテリシジンＰＲ−３９のトランスジェニック発現は、ヒト肝癌の浸潤能を減少させた12。
【０１９３】
癌における抗菌ペプチドの機能の解明にはさらなる研究が必要ではあるが、これらのペプチドの幅広い役割は、ますます顕在化している。直接的な膜効果を通じた病原体不活性化に加えて、ＬＬ−３７は、インビトロで走化性効果を発揮しており、ヒト好中球、単球、Ｔ細胞のサブセット及びマスト細胞の遊走を誘導している4、35、36。この遊走活動は、ＦＰＲＬ１（百日咳毒素感受性の膜結合型Ｇタンパク質共役受容体）へのＬＬ−３７の結合に依存している4。さらに示唆されるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の機能としては、皮膚創傷の再上皮化及び新血管新生を促進することによる上皮修復及び新脈管形成の役割が挙げられる5、10。
【０１９４】
従って、本明細書で示される乳癌細胞での顕著なｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７発現は、これらの腫瘍細胞に対する増殖の利点を反映し得るものである。この仮説を試験するために、本発明者らは、ヒト上皮細胞系ＨＥＫ２９３及びＨａＣａＴを、ｈＣＡＰ１８発現ベクターでトランスフェクトし、そしてトランスフェクトされた細胞の増殖が著しく増大したことを見出した。さらに、合成の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドは、ＨａＣａＴ細胞の増殖を著しく増大させた。これらの知見は、抗菌ペプチドに対して提唱された抗腫瘍効果としての提案とは明らかに対照的であるが、ヒトαデフェンシンが、腎細胞癌（ＲＣＣ）の進行を調節し得るというＭｕｅｌｌｅｒらによる最近の知見と一致している。これらのデフェンシンは、ＲＣＣの腫瘍細胞及び腎臓の正常な尿細管上皮細胞で見出されており、そして生理的濃度で腫瘍細胞の増殖を刺激した27。
【０１９５】
本発明者らのインビトロ研究は、ＬＬ−３７が、部分的にＦＰＲＬ１を通じて上皮細胞の増殖を刺激していることを示唆しており、これはなぜなら、百日咳毒素での受容体の遮断が、外因性のＬＬ−３７増殖効果をおよそ５０％に減少させているからであり、これはおそらく、他の受容体もまた関与していることを示している。最近の研究において、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のトランス活性化を介したマイトジェン活性化プロテインキナーゼ／細胞外シグナル制御キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ＝ＭＥＫ）の活性化によって、ＬＬ−３７が、気道上皮細胞を活性化することが示唆された37。しかし本発明者らの実験において、本発明者らは、ＥＲＫ１／２の著しい活性化をまったく検出しなかった。
【０１９６】
結論として、本明細書中で示される結果は、ＬＬ−３７が腫瘍増殖を促進することを示している。
【０１９７】
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１８．    Ｆｒｏｈｍ  Ｍ，  Ｇｕｎｎｅ  Ｈ，  Ｂｅｒｇｍａｎ  ＡＣ，  Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ  Ｂ，  Ｂｅｒｇｍａｎ  Ｔ，  Ｂｏｍａｎ  Ａ，  Ｌｉｄｅｎ  Ｓ，  Ｊｏｅｒｎｖａｌｌ  Ｈ，  Ｂｏｍａｎ  ＨＧ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｗｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｆｌｕｉｄ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９６；２３７：８６−９２．
１９．    Ｂｏｕｋａｍｐ  Ｐ，  Ｐｅｔｒｕｓｓｅｖｓｋａ  ＲＴ，  Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｔｚ  Ｄ，  Ｈｏｒｎｕｎｇ  Ｊ，  Ｍａｒｋｈａｍ  Ａ，  Ｆｕｓｅｎｉｇ  ＮＥ．  Ｎｏｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８８；１０６：７６１−７１．
２０．    Ｌｅｎｎｏｎ  Ｇ，  Ａｕｆｆｒａｙ  Ｃ，  Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ｍ，  Ｓｏａｒｅｓ  ＭＢ．  Ｔｈｅ  Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９６；３３：１５１−２．
２１．    Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｍ，  Ｏｈｔａｋｅ  Ｔ，  Ｄｏｒｓｃｈｎｅｒ  ＲＡ，  Ｇａｌｌｏ  ＲＬ．  Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａ．  Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ２００２；８１：８４５−５０．
２２．    Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｍ，  Ｏｈｔａｋｅ  Ｔ，  Ｄｏｒｓｃｈｎｅｒ  ＲＡ，  Ｓｃｈｉｔｔｅｋ  Ｂ，  Ｇａｒｂｅ  Ｃ，  Ｇａｌｌｏ  ＲＬ．  Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｗｅａｔ，  ａｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２；１１９：１０９０−５．
２３．    Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅ  ＫＳ，  Ｋｉｍｂａｌｌ  ＪＲ，  Ｍｏｒｔｏｎ  ＴＨ，  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ａ，  Ｄａｌｅ  ＢＡ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ，  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  １，  ｉｎ  ｄｕｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｍｉｎｏｒ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓａｌｉｖａ．  Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ２０００；７９：１６６９−７４．
２４．    Ｂａｌｓ  Ｒ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｗｕ  Ｚ，  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｔ，  Ｂａｆｎａ  Ｖ，  Ｚａｓｌｏｆｆ  Ｍ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＭ．  Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ２  ｉｓ  ａ  ｓａｌｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；１０２：８７４−８０．
２５．    Ｔｕｎｚｉ  ＣＲ，  Ｈａｒｐｅｒ  ＰＡ，  Ｂａｒ−Ｏｚ  Ｂ，  Ｖａｌｏｒｅ  ＥＶ，  Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＬ，  Ｗａｔｓｏｎ−ＭａｃＤｏｎｅｌｌ  Ｊ，  Ｇａｎｚ  Ｔ，  Ｉｔｏ  Ｓ．  Ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ２０００；４８：３０−５．
２６．    Ｊｉａ  ＨＰ，  Ｓｔａｒｎｅｒ  Ｔ，  Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  Ｍ，  Ｋｉｒｂｙ  Ｐ，  Ｔａｃｋ  ＢＦ，  ＭｃＣｒａｙ  ＰＢ，  Ｊｒ．  Ａｂｕｎｄａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｌｋ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  ２００１；１３８：１０９−１２．
２７．    Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＣＡ，  Ｍａｒｋｏｖｉｃ−Ｌｉｐｋｏｖｓｋｉ  Ｊ，  Ｋｌａｔｔ  Ｔ，  Ｇａｍｐｅｒ  Ｊ，  Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｇ，  Ｂｅｃｋ  Ｈ，  Ｄｅｅｇ  Ｍ，  Ｋａｌｂａｃｈｅｒ  Ｈ，  Ｗｉｄｍａｎｎ  Ｓ，  Ｗｅｓｓｅｌｓ  ＪＴ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｖ，  Ｍｕｌｌｅｒ  ＧＡ，ら。Ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ＨＮＰｓ−１，  −２，  ａｎｄ  −３  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２；１６０：１３１１−２４．
２８．    Ｍｉｚｕｋａｗａ  Ｎ，  Ｓａｗａｋｉ  Ｋ，  Ｙａｍａｃｈｉｋａ  Ｅ，  Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｊ，  Ｕｅｎｏ  Ｔ，  Ｔａｋａｇｉ  Ｓ，  Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｔ．  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；２０：２００５−７．
２９．    Ｍｉｚｕｋａｗａ  Ｎ，  Ｓａｗａｋｉ  Ｋ，  Ｎａｇａｔｓｕｋａ  Ｈ，
Ｋａｍｉｏ  Ｍ，  Ｙａｍａｃｈｉｋａ  Ｅ，  Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｊ，  Ｕｅｎｏ  Ｔ，  Ｔａｋａｇｉ  Ｓ，  Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｔ．  Ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；２１：２１７１−４．
３０．    Ｓａｗａｋｉ  Ｋ，  Ｍｉｚｕｋａｗａ  Ｎ，  Ｙａｍａａｉ  Ｔ，  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｎａｋａｎｏ  Ｍ，  Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｔ．  Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；２２：２１０３−７．
３１．    Ｊａｙｎｅｓ  ＪＭ，  Ｊｕｌｉａｎ  ＧＲ，  Ｊｅｆｆｅｒｓ  ＧＷ，  Ｗｈｉｔｅ  ＫＬ，  Ｅｎｒｉｇｈｔ  ＦＭ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｙｔｏｃｉｄａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｙｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  １９８９；２：１５７−６０．
３２．    Ｓｈａｒｍａ  ＳＶ．  Ｍｅｌｉｔｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎｆｌｕｘ  ｉｎ  ｒａｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９３；８：９３９−４７．
３３．    Ｍｏｏｒｅ  ＡＪ，  Ｄｅｖｉｎｅ  ＤＡ，  Ｂｉｂｂｙ  ＭＣ．  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ．  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  １９９４；７：２６５−９．
３４．    Ｈｕｉ  Ｌ，  Ｌｅｕｎｇ  Ｋ，  Ｃｈｅｎ  ＨＭ．  Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；２２：２８１１−６．
３５．    Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ  Ｂ，  Ｃｈａｒｏ  Ｊ，  Ｗｅｒｒ  Ｊ，  Ｏｌｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｉｄａｌｉ  Ｆ，  Ｌｉｎｄｂｏｍ  Ｌ，  Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ  Ｒ，  Ｊｏｅｒｎｖａｌｌ  Ｈ，  Ｗｉｇｚｅｌｌ  Ｈ，  Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ  ＧＨ．  Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ＬＬ−３７  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０００；９６：３０８６−９３．
３６．    Ｎｉｙｏｎｓａｂａ  Ｆ，  Ｉｗａｂｕｃｈｉ  Ｋ，  Ｓｏｍｅｙａ  Ａ，
Ｈｉｒａｔａ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｄａ  Ｈ，  Ｏｇａｗａ  Ｈ，  Ｎａｇａｏｋａ  Ｉ．  Ａ  ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＬＬ−３７  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２；１０６：２０−６．
３７．    Ｔｊａｂｒｉｎｇａ  ＧＳ，  Ａａｒｂｉｏｕ  Ｊ，  Ｎｉｎａｂｅｒ  ＤＫ，  Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ  ＪＷ，  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，  Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ，  Ｒａｂｅ  ＫＦ，  Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＰＳ．  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＬＬ−３７  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｙ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７１：６６９０−６．
【０１９８】
実施例Ｂ−エストロゲン受容体（ＥＲ）及びリンパ節（Ｎ）に陽性な乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７発現の増大
材料及び方法
１４０の乳房腫瘍及び４の病気にかかっていない乳房組織サンプルからＲＮＡを抽出し、そしてランダムヘキサマーをプライマーとして用いて逆転写した。標準的なプロトコル（上記の通り）に従ってｃＤＮＡ  １０ｎｇを用いたリアルタイムＰＣＲによって、ｈＣＡＰ１８転写産物の発現を測定した。
【０１９９】
結果及び考察
結果を図６に示した。病気にかかっていないサンプルの平均発現を、任意に１と設定した。平均及び偏差を、分散分析統計学によって評価した。
【０２００】
ｈＣＡＰ１８の発現は、リンパ節がないときよりもリンパ節が発達しているときのＥＲ陽性腫瘍において著しく高かった（およそ５倍）。
【０２０１】
実施例Ｃ−ＭＡＰＫのリン酸化に対するＬＬ−２５の効果
ＺＲ７５−１細胞を、Ｏｐｔｉｍｅｍ及び１０％  ＦＣＳ中で増殖させ、そして７０％の集密に相当する１ウェル当たり１０００００細胞で１２ウェルプレートにプレーティングした。再付着後、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で４８時間細胞を飢餓させた。ＰＢＳ  ５０μｌに溶解した試験基質を培地に加え、そして細胞を２０分間インキュベートした。１ｍＭ  ＮａＦ、１００μＭ  Ｎａ3ＶＯ4及び２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む氷冷ＰＢＳで細胞を洗浄することにより刺激を停止し、次いで上記の阻害剤を含むＳＤＳ溶解緩衝液３００μｌに溶解した。標準的な条件に従って、タンパク質を８％ゲル中で分離し、そしてニトロセルロースフィルターにブロッティングした。フィルターを、３％ポンソーＳで可逆的に染色し、ＴＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０中の４％  ＮＦＤＭでブロッキングし、そして一次抗体とともに一晩（ｏ．ｎ．）インキュベートした。リン酸化ＭＡＰＫ  １／２（ｐＴｈｒ  ２０２／ｐＴｙｒ  ２０４）を検出するために、モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ）を１／２０００で使用した。洗浄及びＨＲＰ結合体化二次抗体とのインキュベーション後、ＥＣＬ及びＥＣＬ  ａｄｖａｎｃｅｄを９：１の比で用いて展開することによって、化学発光を誘導した。シグナルを、ＣＣＤカメラ（Ｆｕｊｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で１分間捕捉し、そしてＩｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで評価した。定量化するために、同じソフトウェアを用いてスキャンし、そして定量化しておいたポンソーＳ染色に対してシグナルを規準化させた。
【０２０２】
図７ａは、ウエスタンブロットを示し、そして図７ｂは、ウエスタンブロット実験の三重反復の定量評価を示した。この研究は、内因性ＬＬ−３７の活性が抑制され得ることを実証した。
【０２０３】
さらなる実験において、ヘレグリン（２ｎｇ／ｍｌ）を、それ自体ではＬＬ−３７をほとんど生産できない乳癌系統ＭＣＦ７に、外因性のＬＬ−３７（２μＭ）及び示される濃度のＬＬ−２５とともに添加した。コントロール実験において、溶媒（ＰＢＳ）又はＬＬ−３７、ＬＬ−２５若しくはヘレグリン（ＨＲＧ）を、唯一の基質として添加した。三重反復測定の定量評価は、三重反復のうちの１つのウエスタンブロットとともに示した。図８に示される結果は、ＬＬ−３７の濃度が１０％であっても、ＬＬ−２５は、ＬＬ−３７の競合的かつ高性能な阻害剤であることを実証した。データはまた、ＬＬ−３７の内因性効果は、たとえ少ししか生産されていなくてもＨＲＧを通じたＭＡＰＫ活性化に決定的に寄与しており、そしてＬＬ−２５によって著しく遮断され得ることを示した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
2009541287.tif 000010
【図５−２】
2009541287.tif 000011
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2009541287.tif 000014
【図７Ｂ】
2009541287.tif 000015
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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