(57)【要約】  グリコシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼから成る群から選択されるトランスフェラーゼ酵素に特異的な基質を決定する方法。前記方法は以下の工程を含む：a）MeO-、EtO-、AHyI-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの−>GlcNAcβ1糖類を含み、さらに−>3GalNAcα-OR、−>3GlcNAcβ-OR、又は−>3Galα-O-R（式中、Rは、いずれも１つから8つの炭素原子を有するアルキル、アリール、アジド又はアリルであり、Rはハロ、-OH、低級アルキル、-SO3又は-NO2で置換されえる）で終わる三、四又は五糖類化合物から、スルホトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼに対する特異性についてテストしようとする基質を選択する工程；b）個々のグリコシル又はスルホ部分を糖類へ移転させるために、前記基質を別々に一連のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々と、前記個々の部分のための供与体化合物と合わせて、約6から約7のpHの緩衝水溶液中で一緒にしてインキュベーション混合物を形成する工程（ここで前記部分は放射能標識される）；c）前記インキュベーション混合物を約18から約40℃の温度で約30分から約4時間インキュベートする工程；d）グリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々のそれぞれ別々に得られたインキュベーション混合物を、基質及び個々の部分の化合を含む反応生成物についてテストして、個々の部分を前記基質へ移転させる、グリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々のそれぞれ別々の有効性を決定する工程；及びe）前記個々の部分を移転させる、グリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々の有効性を比較して、個々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼが、他のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼが前記個々の部分を基質に移転させるように機能しないときに、前記個々の部分を基質に移転させるように機能しているか否かを決定し、したがって基質が個々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼと特異的に作用するか否かを決定する工程。本発明はまた、スルホトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼから選択される、特異的部分のための特異的トランスフェラーゼを特異的に検出する方法を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、グリコシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼから成る群から選択されるトランスフェラーゼ酵素に特異的な基質を決定する方法：
a）MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの−>GlcNAcβ1糖類を含み、さらに−>3GalNAcα-OR、−>3GlcNAcβ-OR、又は−>3Galα-O-R（式中、Rは、いずれも１つから8つの炭素原子を有するアルキル、アリール、アジド又はアリルであり、Rはハロ、-OH、-SO3又は-NO2で置換されえる）で終わる三、四又は五糖類化合物から、スルホトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼに対する特異性についてテストしようとする基質を選択する工程；
b）個々のグリコシル又はスルホ部分を糖類へ移転させるために、前記基質を別々に一連のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々と、前記個々の部分のための供与体化合物と併せて、約6から約7のpHの緩衝水溶液中で組み合わせてインキュベーション混合物を形成する工程（ここで前記部分は放射能標識される）；
c）前記インキュベーション混合物を約18から約40℃の温度で約30分から約4時間インキュベートする工程；
d）グリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々のそれぞれ別々に得られたインキュベーション混合物を、基質及び個々の部分の化合を含む反応生成物についてテストして、個々の部分を前記基質へ移転させる、それぞれ別々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの有効性を決定する工程；及び
e）前記個々の部分を移転させる、グリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々の有効性を比較して、個々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼが、他のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼが前記個々の部分を基質に移転させるように作用しないときに、前記個々の部分を基質に移転させるように作用しているか否かを決定し、したがって基質が個々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼと特異的に作用するか否かを決定する工程。
【請求項２】
前記基質が−>3GalNAcα-ORで終わる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記基質がまた、少なくとも１つのGalβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1を含み、ここで前記Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1は、MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスフェラーゼが、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びガラクトシルトランスフェラーゼから成る群から選択されるグリコシルトランスフェラーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーション温度が約35から約40℃である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベーション温度が約37℃である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、スルホトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼから成る群から選択される、特異的部分のための特異的なトランスフェラーゼ酵素を特異的に検出する方法：
a）MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの前末端糖類を含み、さらに−>3GalNAcα-OR、−>3Galα-O-R、又は−>3GlcNAcβ-OR（式中、Rは１つから12の炭素原子を含み、アルキル、アリール、又はアリルであり、さらにRはハロ、-OH、低級アルキル、-SO3、アジド、又は-NO2で置換されえる）で終わる三、四又は五糖類化合物から、前記トランスフェラーゼに特異的な基質を選択する工程；
b）前記特異的トランスフェラーゼについてテストしようとするサンプルと前記基質を、前記個々の部分のための供与体化合物と併せて、pH約6からpH約7の緩衝水溶液中で組み合わせてインキュベーション混合物を形成する工程；
c）前記インキュベーション混合物を約18から約40℃の温度で約30分から約4時間インキュベートする工程；及び
d）得られたインキュベーション混合物を基質及び個々の部分の化合を含む反応生成物についてテストして、サンプル中の個々のトランスフェラーゼの存在を決定する工程。
【請求項８】
前記基質が少なくとも１つのGlcNAcβ1糖類を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が−>3GalNAcα-ORで終わる、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が、糖類及び末端結合を除いて置換されない、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がまた、少なくとも１つのGalβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1を含み、ここで前記Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1は、MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
糖類結合を除いて、前記Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1が置換されない、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーション温度が約35から約40℃である、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
前記インキュベーション温度が約37℃である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
工程a）からd）までを異なる濃度の基質を用いて繰り返し、得られる基質及び個々の部分の組み合わせの量を最大にするために必要な基質の最小濃度を決定し、前記決定された最小濃度がサンプル中の特異的なトランスフェラーゼの量と相関する、請求項7に記載の方法。
【請求項１６】
Rが、-OH、ハロ、又は低級アルキルで置換されえるアリールである、請求項7に記載の方法。
【請求項１７】
Rが、アリル、ベンジル、メチル、アジド、又はニトロフェニルである、請求項7に記載の方法。
【請求項１８】
前記特異的な基質がGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-3Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼIV（ST IV）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項１９】
前記特異的な基質がMeO-Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質がGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-3Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼIV（ST IV）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２１】
前記基質がF-3Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２２】
前記基質がGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-4Galβ1−>4)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがα1,4NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII（α1,4-GNTII）であり、さらに前記供与体化合物がウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２３】
前記基質が(MeO-4Galβ1−>4)GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがα1,4N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI（α1,4-GNTI）であり、さらに前記供与体化合物がウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２４】
前記基質がGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがα1,4N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII（α1,4-GNTII）であり、さらに前記供与体化合物がウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２５】
前記基質がF-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがα1−>4 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI（α1,4-GNTI）であり、さらに前記供与体化合物がウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２６】
前記基質がNeuAcα2−>3Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-3Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがスルホトランスフェラーゼ、ガラクトース6スルホトランスフェラーゼI（Gal-6-SulfoTI）であり、さらに前記供与体化合物が3'ホスホアデノシン5'ホスホスルフェート（PAPS）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２７】
前記基質がMeO-3Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(NeuAcα2−>3)Galβ1−>3GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがスルホトランスフェラーゼ、ガラクトース6スルホトランスフェラーゼII（Gal-6-SulfoTII）であり、さらに前記供与体化合物が3'ホスホアデノシン5'ホスホスルフェート（PAPS）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２８】
前記基質がGalβ1−>4MeO-3GlcNAcβ1−>6(GalNAcβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがα1,2 L-フコシルトランスフェラーゼI（α1,2-L-FT I）であり、さらに前記供与体化合物がグアノシンジホスフェートフコース（GDP-フコース）である、請求項7に記載の方法。
【請求項２９】
前記基質がGalNAcβ1−>4(MeO-3GlcNAc)β1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがα1,2 L-フコシルトランスフェラーゼII（α1,2-L-FT II）であり、さらに前記供与体化合物がグアノシンジホスフェートフコース（GDP-フコース）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３０】
前記基質がGalNAcβ1−>4GlcNAcβ1−>6(GalNAcβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがα1,3 L-フコシルトランスフェラーゼ（α1,3-L-FT）であり、さらに前記供与体化合物がグアノシンジホスフェートフコース（GDP-フコース）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３１】
前記基質がGalβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがβ1−>3/4 N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β1−>3/4 GalNAc-T）であり、さらに前記供与体化合物がウリジンジホスフェートガラクトサミン（UDP-GalNAc）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３２】
前記基質がMeO-3Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-Rであり、前記特異的なトランスフェラーゼがαXN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（αXGlcNAc-T）であり、さらに前記供与体化合物がウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３３】
前記基質が2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼIV（Gal3ST IV）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３４】
前記基質が4-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼIV（Gal3ST IV）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３５】
前記基質がD-Fucβ1−>3GalNAcβ1−>3Galα-O-メチルであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼI/II（Gal3ST I/II）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３６】
前記基質が2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３７】
前記基質が2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３８】
前記基質が2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項３９】
前記基質が2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、前記特異的なトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに前記供与体化合物がシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である、請求項7に記載の方法。
【請求項４０】
MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの−>GlcNAcβ1糖類を含み、さらに−>3GalNAcα-OR（式中、Rは、いずれも１つから8つの炭素原子を有するアルキル、アリール、又はアリルであり、Rはハロ、-OH、-SO3又は-NO2で置換されえる）で終わり、さらに少なくとも1つのGalβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1（ここで前記Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1はMeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる）を含む、3つから5つの結合した単糖類を含むオリゴ糖化合物。
【請求項４１】
Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；MeO-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；F-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；MeO-3Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-R；D-Fucβ1−>3GalNAcβ1−>3Galα-O-メチル；及びGalNAcβ1−>4GlcNAcβ1−>6(GalNAcβ1−>3)GalNAcα−>O-Rから成る群から選択される請求項40に記載の化合物。
【請求項４２】
Rがベンジルである、請求項41に記載の化合物。
【請求項４３】
特異的グリコシル又はスルホトランスフェラーゼ酵素のための特異的基質として作用する化合物であって、前記基質が、Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-4Galβ1−>4)GalNAcα−>O-R；MeO- Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；及びF-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R（式中、Rは１つから12の炭素原子を含み、アルキル、アリール、アジド又はアリルであり、さらにRはハロ、-OH、-SO3又は-NO2で置換されえる）から成る群から選択される、前記特異的基質として作用する化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本願は、米国仮出願第６０／７２７，３５９号（参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本研究は、ＮＩＨ（ＵＳＡ）グラントＣＡ３５３２９による支援を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、トランスフェラーゼ、より具体的にはグリコシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼのための受容体、並びに特異的なトランスフェラーゼの検出及び定量のために既知及び新規の両受容体（基質）をスクリーニング及び使用することに関する。
【０００４】
背景技術
癌研究のための重要な領域は、この疾患を極めて早期に検出する（したがって癌の拡散及び転移を回避する）ためのバイオマーカーの探索である。前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺癌のバイオマーカー（Chu, 1997；Brawer, 1999；Milford et al. 2001）は、前立腺癌を良性の前立腺過形成と区別するために用いるときはほとんど機能を発揮しない（Bonn, 2002）。膵臓癌は、西洋諸国の癌関連死のもう1つの主要な原因である（Magnani et al. 1983；Mangray & King, 1998；Lillemoe et al. 2000）。CA19-9（ムチン関連シアリルLewisa）のモノクローナル抗体は、他の血清腫瘍マーカーと合わせてこれら疾患の診断及び追跡のために提唱されてきた（Magnani et al. 1983）。CA125は、卵巣癌の検出及び追跡のためのマーカーとして世界的に広く用いられているがいくらかの限界がある（Bast et al. 2002）。現時点では、乳房、結腸、胃、肺及び他の器官の癌に固有のバイオマーカーは事実上存在しない。
癌研究に対するゲノミクス的及びプロテオミクス的アプローチで顕著な進歩が達成されたが、ほとんどの報告が癌のグリコミクスについては記載していない。例示すれば、ヒトの結腸組織での細胞性グリコシルトランスフェラーゼmRNAの発現を測定するために、遺伝子チップが用いられてきた。しかしながら、mRNAの発現は酵素レベルを反映しえない（言い換えれば、前記はグリコシル化パターンを予測しえない）。
【０００５】
それにもかかわらず、グリコシル化における変化はヒトの癌腫で一般的に観察され（Dennis et al. 1999；Brockhausen, 1999）、ある種の腫瘍形成事象の下流において悪性表現型に寄与することができる。癌に付随する炭水化物抗原は以下の3つの主要なクラスに分類される：（i）ガングリオのグリコスフィンゴリピド及びグロボシリーズ、(ii)腫瘍関連糖脂質及び糖タンパク質に存在しえるシアリルLea及びシアリルLex決定基を保有するラクトシリーズ1型（Galβ1, 3GlcNAc）及び2型（Galβ1, 4GlcNAc）、（iii）腫瘍関連糖タンパク質抗原はN-又はO-グリカンでありえる。最近の研究は、少なくとも2つの臨床的要請に適合する、腫瘍組織に存在する炭水化物の構造を理解することの重要性を説く。ある局面では、腫瘍関連抗原（特に血中に分泌される抗原）中の固有の炭水化物に対する抗体は、新規でより良好なバイオマーカーを提供しえる。第二に癌細胞で唯一発現されるグリカンは新規な癌療法のための標的を提供する。グリコシルトランスフェラーゼ活性レベルは癌細胞で変化し、したがって標的構造は、これらの複雑な炭水化物抗原のアッセンブリーに必要とされる具体的な酵素の特異性を考慮しながら、酵素的基準で選別することができる。既に知られている腫瘍関連抗原の炭水化物鎖の詳細な構造決定により、CA125におけるN-及びO-グリカン鎖の両方の存在（Wong et al.2003）、前立腺癌細胞のPSAと正常PSAとの間のグリコシル化の相違（Okada et al. 2001；Peracaula et al. 2003a；Prakash & Robbins, 2000；Ohyama et al. 2004）、並びに健常な膵臓及び膵臓癌から単離されたヒト膵臓リボヌクレアーゼのN-グリカン鎖の相違（Peracaula et al. 2003b）が明らかにされた。グリカンのこれらの構造的解析から、主要な変化は癌関連抗原の炭水化物鎖の外側端に存在することが明らかになった。このことは、癌関連糖結合物の外側端のグリコシル化の変化を検出するためにレクチンの使用を促した。グリコシルトランスフェラーゼ活性における変化は癌細胞によって発現されるグリカンの構造に反映される。したがって、癌細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性の知識は、癌細胞によって発現される可能性の高い構造に関する重要な情報をあきらかにし、癌の免疫組織化学的検出のためのより良好な炭水化物エピトープの特定及び選別を可能にしえる。乳癌、膵臓癌及び結腸癌由来の腫瘍関連ムチンはムチンコア2の分枝構造を含むことが知られている（Fukuda, 1996；Hollingsworth & Swanson, 2004）。癌に付随するコア2 O-結合糖タンパク質の部分として存在しえる標的エピトープは、規定の受容体で多様なグリコシルトランスフェラーゼの活性を測定することによって特定することができる。ムチンコア2構造Galβ1、3(GlcNAcβ1,6) GalNAcα-Ser/Thrは、セレクチンリガンドの担体として機能することができる（Li et al. 1996）。腫瘍細胞の悪性潜在性は、それでもなお、シアリルLewisx及びシアリルLewisaの、同じ腫瘍細胞によって発現されるシアリルTn及びTnエピトープの量に対する相対量の関係で規定することができる（Komminoth et al. 1991；Piller et al. 1991）。グリコシルトランスフェラーゼの細胞内レパートリーにおける癌関連特異的変化は糖結合物の最終的なグリコシル化プロフィルを規定するので（Muller & Hanisch, 2002）、本研究では、いくつかの癌細胞における種々のグリコシルトランスフェラーゼの活性パターンを調べ、続いてこれらのパターンを2つの腫瘍組織で立証した。グリカンの構造的可変性は、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の組織特異的調節、糖ヌクレオチドの利用可能性、及びグリカン伸長時の受容中間体に対する酵素の競合によって指図される。４つの乳癌細胞株で発現された組換えMUC1プローブに関するMuller & Hanisch（2002）の研究は、ゴルジ通過及びゴルジ区画内のタンパク質基質のトポロジーのような後成的パラメーターは、最終的グリコシル化プロフィルに関してはグリコシルトランスフェラーゼの細胞内レパートリーほど重要でないことを示している。いくつかのグリコシルトランスフェラーゼ及びGal3-O-スルホトランスフェラーゼは、ムチンコア2四糖類をGlobo骨格単位と同様に伸張することができる。これら酵素のそのような作用は、図1に示すように、癌関連の最終グリカン構造の複雑さをもたらしえるであろう。Muller & Hanisch（2002）は、乳癌細胞株ZR-75-1、MDA-MB-231、MCF-7及びT47DでMUC1融合タンパク質MFP6を発現させ、ヒドラジノ分解による遊離及び2-アミンベンゾアミドによる標識の後で融合タンパク質のO-グリカンを調べた。
【０００６】
シアリン酸（sialic acid）は、多様な生物学的プロセス、例えば細胞-細胞情報伝達、細胞-基質相互作用、粘着、循環内の血清糖タンパク質の維持、及びタンパク質の標的誘導において重要な役割を果たす。細胞表面のシアリン酸は多様な構造で存在し、前記は、発生、分化及び腫瘍形成形質転換時に調節的態様で変化する。細胞表面のシアリルオリゴ糖の調節についてはほとんど分かっていない（前記は細胞性プロセスに必要である）。シアリン酸は、糖タンパク質及び糖脂質の炭水化物基の末端位に存在する。CMP-Siaからこれらの位置へのシアリン酸の移転は、シアリルトランスフェラーゼと称されるグリコシルトランスフェラーゼファミリーによって翻訳後に触媒される。
【０００７】
今日までに、糖タンパク質及び糖脂質の炭水化物の末端位のα2,3-、α2,6-又はα2,8-結合へのCMP-Siaのシアリン酸の移転を触媒する19の異なるヒトシアリルトランスフェラーゼが特定された。シアリルトランスフェラーゼのタンパク質配列の分析によって、ほとんどのグリコシルトランスフェラーゼのように、2型トランスメンブレンタンパク質に特徴的な局所構造の特徴が示された。今日までにクローニングされた全てのシアリルトランスフェラーゼは2つの保存されたシアリルモチーフをこの酵素の触媒部分に含んでいる。ほぼ48アミノ酸の大きなシアリルモチーフは、供与体基質CMP-Neu5ACの結合に参画する“L(大きい)-シアリルモチーフ”と称され、さらにC-末端方向の約23アミノ酸の小配列は“S(短い)-シアリルモチーフ”と称され、供与体及び受容体の両方の結合に参画する。さらにまた、非常に短い配列“VS-モチーフ”（さらにC-末端方向にあり、3−5アミノ酸のみを含む）が、酵素活性のために重要な保存配列として特定された。
異なる細胞表面炭水化物が、発生時及び成熟期に組織特異的及び細胞特異的態様で発現される。細胞表面炭水化物の異常は、しばしば悪性形質転換及び他の病的状態に付随する。種々の細胞型特異的炭水化物の中で、シアリルLewisx（NeuNAcα2−>3Galβ1−>4(Fucα1−>3)GlcNAcβ−>R）は、好中球、単球及びある種のTリンパ球上で発現され、白血球の補充に重要な役割を果たす。活性化された内皮細胞上で発現されたE-及びP-セレクチンは、シアリルLewisxとの結合を介してこれらの白血球を捕捉し、それらのローリングを可能にする（前記によって炎症部位への白血球浸出がもたらされる）。リンパ球循環は、リンパ球上のL-セレクチン及びL-セレクチンレセプター（高内皮性小静脈に限定される）に存在するシアリルLewisxの硫酸化型との間の相互作用によって誘導される。そのような最初の相互作用が、血管内区画からリンパ管区画へのリンパ球の溢出をもたらす。
【０００８】
シアリルLewisx及びシアリルLewisa（NeuNAcα2−>3Galβ1−>3(Fucα1−>4)GlcNAc−>R）（前記はまたE-セレクチンと結合することが示された）の量は、腫瘍細胞、例えば癌及び白血病で顕著に増加する。乳癌及び結腸癌患者では、シアリルLewisx及びシアリルLewisaの存在は予後不良と相関性を有する。これらの結果は、血液媒介腫瘍細胞は、腫瘍細胞が転移部位で内皮に粘着するとき、炭水化物セレクチン（又はセレクチン関連分子）の相互作用を利用する可能性があることを強く主張している。
したがって、腫瘍の播種は、アンタゴニストとしてシアリルLewisxオリゴ糖を使用することによって阻害することができる。Lewisxは、NK細胞上のCD94によって認識される。明らかに、D94は、担体グリカンにまばらに結合したシアリルLewisxに対するよりも、担体グリカンに密に結合したシアリルLewisxとより効率的に結合する。対比すると、まばらに又は適度に結合したシアリルLewisxは腫瘍の転移を促進する。したがって、シアリルLewisx発現における相違は完全に異なる生物学的結果をもたらす。
グリコシルトランスフェラーゼの細胞レパートリーにおける癌関連特異的変化は、したがって糖結合物の最終的なグリコシル化プロフィルを規定する。グリカンの構造的分析は、癌関連抗原の炭水化物鎖の外側端で行われている。グリコシルトランスフェラーゼ活性における変化は、癌細胞によって発現されるグリカンの改変された構造を反映する。したがって、癌細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼの知識は、癌細胞によって発現される可能性が高い構造物についての価値ある情報を明らかにし、モノクローナル抗体の開発のためのより良好な炭水化物エピトープ（癌のためのより良好なバイオマーカーであると証明することができる）の特定及び選別を可能にすることができる。この情報を得るために、癌血清、癌細胞及び腫瘍組織中の種々のグリコシルトランスフェラーゼの活性レベルを測定するために、特異的で感受性の高い受容体が利用可能にならねばならないということは絶対的である。上述の重大な見地から、シアリルトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼ活性を他のシアリルトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼ活性の存在下で本発明にしたがって測定するために、十分に規定された受容体の開発が促された。
【０００９】
発明の要旨
本発明は、個々の癌とシグナチャー炭水化物構造とを結びつけることを可能にする。
したがって、十分に規定された受容体は酵素活性を調べるツールを提供し、これは、他の実験方法を用いて得ることができる結果を拡張することができる。これらの酵素のための本発明の固有の受容体は、前記受容体の他の位置に糖を移転させる別の酵素の存在下で用いることができる。したがって、本発明によれば、フルオロ又はメチル基をもつ受容体の改変類似体はトランスフェラーゼ酵素のためにより良好で特異的でありえることが見出された。例えば、我々は、MeO-2Galβ1−>3GlcNAcβ1-O-ベンジルはSTIVのための新規な受容体であることを認めた。なぜならば、この化合物はα2,3シアリルトランスフェラーゼSTI、II及びα2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性に抵抗するからである。
本発明は、したがって、グリコシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼから成る群から選択されるトランスフェラーゼ酵素に特異的な基質を決定する方法を含む。この方法は以下の工程を含む：
a）MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの−>GlcNAcβ1糖類を含み、さらに−>3GalNAcα-OR、−>3GlcNAcβ-OR、又は−>3Galα-O-R（式中、Rは、いずれも１つから8つの炭素原子を有するアルキル、アリール、アジド又はアリルであり、Rはハロ、-OH、低級アルキル、-SO3又は-NO2で置換されえる）で終わる三、四又は五糖類から、スルホトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼに対する特異性についてテストしようとする基質を選択する工程；
b）個々の（particular）グリコシル又はスルホ部分を糖類へ移転させるために、前記基質を別々に一連のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々と、前記個々の部分のための供与体化合物と併せて、pH約6から7の緩衝水溶液中で組み合わせてインキュベーション混合物を形成する工程（ここで前記部分は放射能標識される）；
c）前記インキュベーション混合物を約18から約40℃の温度で約30分から約4時間インキュベートする工程；
d）各々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼのそれぞれ別々に得られたインキュベーション混合物を、基質及び個々の部分の化合（chemical combination）を含む反応生成物についてテストして、個々の部分を前記基質へ移転させる、それぞれ別々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々の有効性を決定する工程；及び
e）前記個々の部分を移転させる、グリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼの各々の有効性を比較して、個々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼが、他のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼが前記個々の部分を基質に移転させるために作用しないときに、前記個々の部分を基質に移転させるために作用しているか否かを決定し、したがって基質が個々のグリコシルトランスフェラーゼ又はスルホトランスフェラーゼと特異的に作用するか否かを決定する工程。
【００１０】
本発明はまた、スルホトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼから選択される、特異的部分に特異的なトランスフェラーゼ酵素を特異的に検出する方法を含み、この方法は以下の工程を含む：
a）MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの前末端糖類（pre-terminal saccharide）を含み、さらに−>3GalNAcα-OR、−>3Galα-O-R、又は−>3GlcNAcβ-OR（式中、Rは１つから12の炭素原子を含み、アルキル、アリール、アジド又はアリルであり、さらにRはハロ、-OH、低級アルキル、-SO3又は-NO2で置換されえる）で終わる三、四又は五糖類化合物から、前記トランスフェラーゼに特異的な基質を選択する工程；
b）前記特異的トランスフェラーゼについてテストしようとするサンプルと前記基質を、前記個々の部分のための供与体化合物と合わせて、pH約6からpH約7の緩衝水溶液中で一緒にしてインキュベーション混合物を形成する工程；
c）前記インキュベーション混合物を約18から約40℃の温度で約30分から約4時間インキュベートする工程；及び
d）基質及び個々の部分の化合を含む反応生成物について得られたインキュベーション混合物をテストして、サンプル中の個々のトランスフェラーゼの存在を決定する工程。
工程a）からd）までは、通常、異なる濃度の基質を用いて繰り返し、基質及び個々の部分の得られた組み合わせ（combination）の量を最大にするために必要な基質の最小濃度を決定し、この決定された最小濃度は、サンプル中の特異的なトランスフェラーゼの量と相関する。
本発明はまた、新規に発見された基質、Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-4Galβ1−>4)GalNAcα−>O-R；MeO-Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；及びF-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rを含み、式中、Rは１つから12の炭素原子を含み、さらにアルキル、アリール、アジド又はアリルであり、前記はハロ、-OH、-SO3又は-NO2で置換されえる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明にしたがえば、本発明で用いられる基質の多くは、−>3GalNAcα-ORで終わり、さらに本発明で用いられる基質の多くはまた少なくとも1つのGalβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1を含むことが見出された（ここで前記Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1はMeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる）。トランスフェラーゼは、一般的にシアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びガラクトシルトランスフェラーゼから選択される。
本方法のインキュベーション温度は通常は約35から約40℃であり、もっとも一般的には約37℃である。
基質は、MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの−>GlcNAcβ1糖類を含み、さらに−>3GalNAcα-OR（式中、Rは、いずれも１つから8つの炭素原子を有するアルキル、アリール又はアリルであり、Rはハロ、-OH、-SO3又は-NO2で置換されえる）で終わり、さらに少なくとも1つのGalβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1（ここで前記Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1はMeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる）を含む、3つから5つの結合した単糖類を含む新規なオリゴ糖化合物でありえる。
より具体的には、前記新規な化合物は、Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；MeO-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；F-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-R；MeO-3Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-R；Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-R；D-Fucβ1−>3GalNAcβ1−>3Galα-O-メチル；及びGalNAcβ1−>4GlcNAcβ1−>6(GalNAcβ1−>3)GalNAcα−>O-Rから成る群から選択することができる。
【００１２】
トランスフェラーゼに特異的な基質は通常、三、四又は五糖類であり、前記は、MeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる少なくとも１つの前末端糖類を含み、さらに−>3GalNAcα-OR、−>3Galα-O-R、又は−>3GlcNAcβ-OR（式中、Rは１つから12の炭素原子を含み、アルキル、アリール、又はアリルであり、さらにRはハロ、-OH、低級アルキル、-SO3、アジド、又は-NO2で置換されえる）で終わる。Rは、通常は-OH、ハロ又は低級アルキルで置換されえるアリールである。Rは、一般的にはアリル、ベンジル、メチル、アジド又はニトロフェニルであり、もっとも一般的にはベンジルである。
基質は、通常は少なくとも1つのGalNAcβ1糖類を含み、もっとも一般的には−>3GalNAcα-ORで終わる。前記基質はまた、一般的には少なくとも1つのGalβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1（ここで前記Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1はMeO-、EtO-、アリル-O又はN3-で置換されえる）を含む。
基質は、糖類結合、NAc基及び末端基を除いてもっとも一般的には置換されない。糖類結合を除いて、Galβ1、DFucβ1又は追加の−>GlcNAcβ1は通常置換されない。
以下は、特異的な基質、それらの対応する特異的なトランスフェラーゼ、及び移転される部分を提供する適切な供与体化合物の具体例である。
１．特異的な基質はGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-3Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼIV（ST IV）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
２．特異的な基質はMeO-Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
３．基質はGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-3Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼIV（ST IV）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
４．基質はF-3Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-Nアセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
５．基質はGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-4Galβ1−>4)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはα1,4NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII（α1,4-GNTII）であり、さらに供与体化合物はウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である。
６．基質は(MeO-4Galβ1−>4)GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはα1,4NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI（α1,4-GNTI）であり、さらに供与体化合物はウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である。
７．基質はGalβ1−>4GlcNAcβ1−>6(F-4Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはα1,4N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII（α1,4-GNTII）であり、さらに供与体化合物はウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である。
８．基質はF-4Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはα1−>4 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI（α1,4-GNTI）であり、さらに供与体化合物はウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である。
９．基質はNeuAcα2−>3Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(MeO-3Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはスルホトランスフェラーゼ、ガラクトース6スルホトランスフェラーゼI（Gal-6-SulfoTI）であり、さらに供与体化合物は3'ホスホアデノシン5'ホスホスルフェート（PAPS）である。
10．基質はMeO-3Galβ1−>4GlcNAcβ1−>6(NeuAcα2−>3)Galβ1−>3GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはスルホトランスフェラーゼ、ガラクトース6スルホトランスフェラーゼII（Gal-6-SulfoTII）であり、さらに供与体化合物は3'ホスホアデノシン5'ホスホスルフェート（PAPS）である。
11．基質はGalβ1−>4MeO-3GlcNAcβ1−>6(GalNAcβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはα1,2 L-フコシルトランスフェラーゼI（α1,2-L-FT I）であり、さらに供与体化合物はグアノシンジホスフェートフコース（GDP-フコース）である。
12．基質はGalNAcβ1−>4(MeO-3GlcNAc)β1−>6(Galβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはα1,2 L-フコシルトランスフェラーゼII（α1,2-L-FT II）であり、さらに供与体化合物はグアノシンジホスフェートフコース（GDP-フコース）である。
13．基質はGalNAcβ1−>4GlcNAcβ1−>6(GalNAcβ1−>3)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはα1,3 L-フコシルトランスフェラーゼ（α1,3-L-FT）であり、さらに供与体化合物はグアノシンジホスフェートフコース（GDP-フコース）である。
14．基質はGalβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはβ1−>3/4 N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β1−>3/4 GalNAc-T）であり、さらに供与体化合物はウリジンジホスフェートガラクトサミン（UDP-GalNAc）である。
15．基質はMeO-3Galβ1−>3(GlcNAcβ1−>6)GalNAcα−>O-Rであり、特異的なトランスフェラーゼはαXN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（αXGlcNAc-T）であり、さらに供与体化合物はウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）である。
16．基質は2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼIV（Gal3ST IV）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
17．基質は4-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼIV（Gal3ST IV）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
18．基質はD-Fucβ1−>3GalNAcβ1−>3Galα-O-メチルであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼI/II（Gal3ST I/II）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
19．基質は2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
20．基質は2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
21．基質は2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
22．基質は2-O-MeGalβ1−>4GlcNAcβ-O-ベンジルであり、特異的なトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼI/II（ST I/II）であり、さらに供与体化合物はシチジン-5'モノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸（CMP-シアリン酸）である。
【００１３】
シアリン酸は、生物学的な認識で必要とされる多くの炭水化物において重要な決定基である。本発明のさらに別の特徴として、我々は、シアリル-、フコシル-、スルホ-、メチル-、又はフルオロ-置換基を含むムチンコア-2四糖類［Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn］及びGlobo[Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me]構造物に対する、3つのクローン化シアリルトランスフェラーゼ（ST）、α2,3(N)ST、α2,3(O)ST及びα2,6(N)ST、並びに前立腺癌細胞LNCapに存在するまた別のα2,3(O)STの受容体特異性を、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析及び他の生化学的態様によって生成物を特定することにより調べた。Globo前駆体は、α2,3(N)ST及びα2,3(O)STの両方にとって効率的な受容体であったが、α2,3(N)STのみはそのデオキシ類似体［D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3-Gal-α-O-Me］を用い、2-O-MeGalβ1,3GlcNAc及び4-OMeGalβ1,4GlcNAcは、α2,3(N)STにとって特異的な受容体であった。この実験における他の主要な発見は以下のとおりであった：i）ムチンコア2のβ1,3Galのα2,3シアリル化は、β1,6-結合LacNAcのα1,3フコシル化の後でさえ進行しえる；ii）β1,3Galのシアリル化は、ムチンコア2化合物の良好な生合成のためにβ1,4Galのシアリル化に先行する必要がある；iii）ムチンコア2の6-O-スルホLacNAc部分（例えばGlyCAM-1）のα2,3シアリル化は、β1,3Galが既にα2,3シアリル化されているときに促進される；iv）α2,3(N)ST、は、ムチンコア2のβ1,4Galに完全に特異的であった。GlcNAc部分のα1,3フコシル化又は6-O-硫酸化は活性を低下させた。GlcNAc部分の6-O-硫酸化に加えてβ1,3Galのシアリル化は活性を失わせた。；v）β1,3Galの以前のα2,3-シアリル化又は3-Ｏ-硫酸化は、ムチンコアのGalβ1,4GlcNAcのα2,6-シアリル化に影響を与えないであろう；vi）β1,4Galの3-又は4-フルオロ置換基は、クローン化α2,6(N)ST及びα2,3(N)STのための不良な受容体を生じ、一方、4-フルオロ又は4-OMe Galβ1,3GalNAcαはクローン化α2,3(O)STのための良好な受容体であった；vii）β1,4Galの4-Oメチル化は、α2,6(N)STに対する受容体の能力を消失させたが、α2,3(N)STに対する受容体効率を顕著に増加させた；viii）LNCaPα1,2-FT及びGal-3-OスルホトランスフェラーゼT2のように、Galβ1,4GlcNAcの末端Galを改変するクローン化α2,3(N)STはまたGlobo骨格の末端β1,3Galを効率的に利用する。C-3ブロック化合物、例えば3-O-スルホ-Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-OMeのクローン化α2,3(O)STによる受容体としての利用、並びにレクチンクロマトグラフィー及び質量分析による生じた生成物の分析は、α2,3(O)STはC-3置換β1,3Galのもう1つの位置にNeuAcを結合させることができることを示している。
【００１４】
細胞表面及び分泌された糖結合物（1,2）のシアリル基は、ウイルス、細菌、寄生虫及び毒素（3,4）のための結合標的として作用し、さらにまた哺乳動物のセレクチン及びSiglecレクチン（3）を認識することができる。シアリルトランスフェラーゼ（ST）はシアリン酸に対して、α2,3及びα2,6グリコシド結合を介してガラクトースと、さらにα2,6結合を介してGalNAcと結合し、さらにまたα2,8結合を介してポリシアリン酸を形成する。  タンパク質リガンドを認識する免疫グロブリン上科メンバーの大半とは対照的に、Siglecは、特異的なシアリル化グリカンと結合する（5−7）。Siglec-2、Siglec-5及びSiglec-7の炭水化物認識モチーフは、NeuAcα2,6Galβ1,4Glcと特定された（8−10）。B-細胞における免疫細胞相互作用の調製物質としてのα2,6結合シアリン酸の役割は、ポリクローナル抗IgM及びインターフェロンγによるB-細胞活性化が、α2,6結合シアリン酸の特異的な低下をもたらし、さらに、これによって細胞表面のための同時刺激分子への接近がもたらされるという発見から明らかである（11）。
セレクチンは、粘着分子を認識するシアリン酸のもう1つのファミリーであり、アミノ末端C-型レクチンドメインを含む（12−15）。それらは、シアリルLewis-x又はシアリルLewis-aモチーフを認識する（16−18）。我々の実験は、リガンドのセレクチン認識のためにα2,3結合シアリン酸及びα1,3/4結合フコースが重要であることを確認し、さらにL-及びP-セレクチンの炭水化物との結合の強化におけるムチンコア2構造の役割を明示した（19）。我々はまた、L-及びP-セレクチン結合機能の調節におけるムチンコア2構造のNeuAcα2,3Galβ1,3GalNAcα-配列の寄与を示した(20)。最後に、我々はまた、E-セレクチンのためのリガンドとして作用しえると思われる、シアリン酸を欠く固有の炭水化物配列、すなわちGalNAcβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ-(GalNAc Lewis x)を示した(20)。NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ-O-Me（シアリルLewis-x）と比較したとき、我々は、GalNAcβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-MeはL-及びP-セレクチン結合の5−6倍強い阻害剤であることを見出した。
【００１５】
以前に我々は、Galβ1,3GalNAcα-で作用する精製ブタ肝臓α2,3ST及びGalβ1,3/4GlcNAcβ-を利用するクローン化α2,3STの特異性を調べるために受容体として種々の改変二糖類を用いた（21）。種々の生物学的認識低下におけるシアリン酸残基の重要さを考えて、我々は、3つのクローン性シアリルトランスフェラーゼ及びGaβ1,3GalNAcα-配列に対して厳密に特異的なもう1つのシアリルトランスフェラーゼの受容体基質特異性を詳細に調べることにした。複雑な炭水化物リガンドの生合成におけるシアリル化配列についての識見を得るために、種々のムチンコア2及びGlobo系合成化合物並びに関連する単純な構造を受容体として利用した。この研究によって、C-3置換基を含むGalβ1,3GalNAc部分のガラクトースの別の部位へのシアリン酸の結合を触媒する、クローン化α2,3(O)シアリルトランスフェラーゼの新規な作用もまた明らかになった。
前立腺癌細胞株（LNCaP）を、10％ウシ胎児血清及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンホテリシンB）を補充したRPMI1640中でアメリカ菌培養収集所（Manassas, VA）が推奨する条件下で増殖させた。2％トリトンX-100を含むトリス-マレイン酸（pH6.3）とともに完全ガラスの手動ダウンスホモジナイザーを用いて、細胞を均質化した。この均質化物を4℃にて1時間16,000gで遠心した。標準物としてBSAを用い、上清のタンパク質濃度をBCAアッセイ（Pierce Biotech, Inc., Rockford, IL）で測定した。必要な量の抽出緩衝液を添加することにより、上清を5mgタンパク質/mLに調整し、使用まで-20℃で凍結保存した。この抽出物の10μL部分をデュープリケートでアッセイに用いた。
【００１６】
クローン化シアリルトランスフェラーゼ：
ラットの組換え体α2,3(O)ST、α2,3(N)ST及びα2,6(N)STはカルビオケム社（Calbiochem）から購入し、供給元の推奨にしたがい-20℃又は-70℃で保存した。適切な量を1.0mLの0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）（2％トリトンCF-54及び2％BSAを含む）で稀釈して実験に使用した。上記のように稀釈したα2,3(O)ST及びα2,6(N)STは、-20℃で凍結保存したとき少なくとも3ヶ月間完全な活性を維持することが見出された。α2,3(N)STは実験の使用直前に稀釈した。前記稀釈酵素の10μL量をアッセイにデュープリケートで用いた。
合成受容体：
実験で受容体として用いられるいくつかの化合物の合成は報告されている（20、22−24）。Globo H前駆体構造を含む受容体、すなわちGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Al；Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；3-O-スルホGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；及び3-O-スルホ-D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me、並びに4-O-Me基及び複雑な構造ユニットを含むムチンコア2四糖類の合成は別の場所で報告されるであろう。これら化合物の多くの質量分析は本明細書で提供される。3-F基を含むムチンコア2四糖類の合成は既に報告されている（25）。
巨大分子性及び天然受容体：
Horejsiら（26）の方法によって合成されたGalβ1,3GalNAcα-O-Alのアクリルアミドコポリマー及びフェチュイントリアンテナリー（triantennary）アシアロ糖ペプチドは、本研究室の以前の実験から入手可能であった（21、27−29）。
【００１７】
シアリルトランスフェラーゼのアッセイ：
デュープリケートのインキュベーション混合物は20μLの総体積中に以下を含んでいた：0.1Mのカコジル酸緩衝液（pH6.0）、受容体（典型的には7.5mM、又はいくつかの実験では表示のとおり）、CMP-[9-3H]NeuAc（典型的には0.2μci；いくつかの実験では20μci/nmol又は表示のとおり）、及び酵素。コントロールインキュベーション混合物は受容体を除き全てのものを含んでいた。インキュベーションは37℃で2時間実施した。酵素による受容体への[9-3H]NeuAcの典型的な転移は2時間の間直線的であり、30％未満のCMP-[9-3H]NeuAcが利用された。下記に記載するように、クロマトグラフィー（Dowex-１-フォルメート、Sep-Pak C18又はBiogel P2を使用）を適用して、未反応[9-3H]NeuAcから放射性生成物を分離した。デュープリケートで得られた値は5％を超えて変動することはなかった。
中性アリル及びメチルグリコシド並びに非グリコシド由来の放射性生成物は、以下のようにDowex-1-フォルメート（Bio-Rad：AG-1X8；200−400メッシュ；フォーマット形式）での分画によって測定した：インキュベーション混合物を1.0mLの水で稀釈し、AG-1-フォルメートカラム（パスツーツピペット中で1.0mLのベッド容積、前記を5mLのギ酸（2M）、続いて10mLの水で洗浄した）を通過させた。サンプルを導入した後、カラムを2回1.0mLの水で洗浄し、続いて3.0mLのNaCl（0.1M）で溶出させた。水及び0.1MのNaCl溶出物に存在する放射能を別々に3a70シンチレーションカクテル（Research Products International, Mount Prospect, IL）及びBeckman LS6500シンチレーションカウンターを用いて測定した。CPMはブランクのCPMを差し引くことによって修正した。水の溶出物に存在する一切の放射能（いくつかのメチルグリコシドの事例で観察される）を、対応する0.1MのNaCl溶出物のCPMに加えた。硫酸化及び／又はシアリル化メチルグリコシド由来の放射性生成物もまた上記の方法によって測定した。放射性生成物の完全な溶出を達成するために、3.0mLのNaCl（0.2M）でAG-1-フォルメートカラムの溶出をさらに継続した。修正は対応するブランクの値を差し引くことによって上記のように実施した。
ベンジルグリコシド及びモノシアリル化ベンジルグリコシド由来の放射性生成物は、Sep-Pak C18カートリッジ（Waters, Milford, MA）での疎水性クロマトグラフィー及び3.0mLのメタノールによる生成物の溶出によって測定した（30）。放射能は上記のように液体シンチレーションによって決定した。
硫酸化ベンジルグリコシドに由来する放射能をもつシアリル化生成物は、BioGel P2カラムでの反応混合物の分画によって定量した。なぜならば、これらの生成物は0.2MのNaClでもAG-1-フォルメートカラムから溶出させることができず、さらにSep-Pak C18に結合しなかったからである。そのような作業のために、溶出剤として0.1M酢酸ピリジン（pH5.4）とともに、Biogel P2カラム（Fine Mesh；1.0ｘ116.0cm）を室温で用いた。溶出液分画を放射能についてモニターし、放射能を含む最初のピークを採集し、凍結乾燥させ、200μLの水に溶解して薄層クロマトグラフィー（TLC）及び他の実験のために-20℃で凍結保存した。
【００１８】
薄層クロマトグラフィー：
TLCはシリカゲルGHLF（250μm、20ｘ20cmでスコア実施；Analtech, Newark DE）で実施した。1-プロパノール/NH4OH/H2O（v/v 12/2/5）及びCHCl3/CH3OH/H2O（v/v 5/4/1）の溶媒系を用いた。受容体化合物は、エタノール中の硫酸とともにスプレーし、100℃に加熱することによって分布させた。放射性生成物は、シリカゲルの0.5cm幅の部分をこすり落とし、バイアル中で2.0mLの水に浸漬し、続いて液体シンチレーション計測することによって位置を決定した。TLCプレートのフルオログラフィーは、エンハンサー（Dupont）をTLCプレートにスプレーした後でBio-Max MSフィルム（Eastman Kodak）を用い-70℃で実施した。
WGA-、PNA-及びRCA-I-アガロースアフィニティークロマトグラフィー：
5mLのベッド容積のレクチン-アガロース（Vector Lab, Burlingame, CA）カラムを用い、泳動緩衝液として、0.1mMのCaCl2、0.01mMのMnCl2及び0.1％のNaN3を含む10mMヘペス（pH7.5）を用いた。1.0mLの分画を採集した。続いて、製造業者の推奨にしたがって同じ緩衝液中で、WGA-アガロースの場合には10番目の分画の後で0.5MのGlcNAcを用い、又はRCA-I-アガロース及びPNA-アガロースカラムについては12番目の分画の後で0.2Mガラクトースを用い結合物質を溶出させた。分画は室温で実施した。
酵素的にシアリル化した化合物の質量分析：
反応混合物は、0.3μmolの受容体、0.2μmolのCMP-NeuAc、1.0μCiのCMP[9-3H]NeuAc、30μgのBSA、0.1Mのカコジル酸ナトリウム（pH6.0）及び20ミリユニットのクローン化シアリルトランスフェラーゼを100μLの総体積中に含んでいた。前記を37℃で18時間インキュベートした。インキュベーション後、前記反応混合物を1.0mLの水で稀釈し、続いて上記に記載したようにBiogel P2カラム（1.0ｘ116.0cm）でのカラムクロマトグラフィーに付した。放射性生成物を含む最初のピークを採集し、凍結乾燥させて200μLの水に溶解し質量分析まで-20℃で凍結保存した。
MSn実験（31）は、Esquire-LC、Bruker-イオントラップ（Bremen, Germany）を用いて実施した。流速5μL/分のシリンジポンプを用いて内径50μmの融合シリカキャピラリーによりエレクトロスプレー源に、MeOH中で10pM/μLのサンプルを注入した。窒素をネブライジングガス（5−6psi）として、さらにまた乾燥用ガス（5−7L/分）として用いた。スプレー針、キャピラリーの出口及びスキマーの電位は、それぞれ±4,000、90−150及び25−50Vに設定した。ヘリウムは緩衝／衝突ガスであった。各スペクトルについて100−500スキャンの平均を出した。分断化の振幅は、実験設計に応じて0.8から1.5の間で変動した。分断化の振幅は、MS2については1.15、MS3については1.20であった。分断化時間は40分であった。典型的には低質量カットオフを前駆体のm/z値の1/3よりわずかに低く設定した。
全ての一シアリル化又は一硫酸化オリゴ糖は容易にプロトンを失い、マイナスモードでは[M-H]-イオンを生じることが見いだされた。シアリル基及び硫酸基の両方を有するオリゴ糖は、マイナスモードでは二重荷電イオン[M-2H]2-として検出された。一シアリル化又は一硫酸化オリゴ糖は、プラスモードでは単荷電二重ナトリウム化イオン[M-H+2Na]+を生じた。シアリル基及び硫酸基の両方を有するオリゴ糖は、プラスモードでは二重荷電四重ナトリウムイオン[M-2H+4Na]2+として検出された。プラスモードと対照的に、マイナスモードは、不純物に由来するイオンの干渉を容易に回避することができ、これによって生成物イオンのより高いシグナル強度が得られた。しかしながら、プラスモードで検出されたナトリウム化アダクツイオンは、分子質量に関するさらに追加の情報を提供し、さらにそれらは、マイナスの極性のエレクトロスプレー質量スペクトルから得られた結果を裏付けた。
【００１９】
シアリルトランスフェラーゼアッセイ
シアリルトランスフェラーゼ活性は、我々が別のところで述べた方法（21）を用いて測定した。これらの公表されたプロトコルに加えて、本原稿では、BioGel P2カラムを用いて、硫酸化及びシアリル化された[9-3H]標識ベンジルグリコシドを未反応CMP-[9-3H]NeuAcから分離した（図1）。この図では、サンプルのBiogel P2溶出プロフィルは、3つの放射能を有する生成物をTLC後のこれら生成物の対応するオートラジオグラフとともに示している。
改変二糖類及びGlobo H系受容体はクローン化酵素間で識別されえる（表I、パートA）
クローン化α2,3(N)ST及びα2,6(N)STは、Galβ1,3GalNAcα-OAlよりもGalβ1,4GlcNAcβ-OAlに対して嗜好性を示したが、ただしα2,3(N)STは後者の化合物に対して24.1％の活性を示した。他方、α2,3(O)ST及びLNCaP STは、Galβ1,4GlcNAcβ-O-Alと比較してGalβ1,3GalNAcα-O-Alに対してより高い特異性を示し、Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Alに対してもまた効率的に作用した。
我々は、上記の二糖類の種々の改変を調べ、固有の受容体が特定されえるか否かを決定した。我々は、α2,6(N)STはGalβ1,4GlcNAcβ-O-Al及び2-O-MeGalβ1,4GlcNAcを受容体として利用するが(100.0％及び90.1％の活性)、3-O-MeGalβ1,4GlcNAc（8.7％の活性）、Galβ3GlcNAcβ-O-Al（3.0％）、2-O-MeGalβ1,3GlcNAc（3.7％）及び2-O-MeGalβ1,3GlcNAcβ-O-Bn（0％）に対しては非常に低い活性を有することを観察した。α2,3(O)STは、受容体2-O-MeGalβ1,3GlcNAc(2.9％)、2-O-MeGalβ1,4GlcNAc（0.2％）及び3-O-MeGalβ1,3GlcNAc（3.6％）に関しては非常に低いか又は無視しえる活性を示した。α2,3(N)STは、2-O-MeGalβ1,3GlcNAc（115.3％）をシアル化するために効率よく作用する唯一の酵素であり、前記は、この酵素に対する固有の受容体でありえことを提唱している。前記はまた、Galβ1,3GlcNAcβ-O-Al（123.1％）及び2-O-Me-Galβ1,4GlcNAc（60.0％）に対しても効率的に作用した。
Globo H前駆体Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me及びそのデオキシ類似体D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3-Gal-O-Meは、酵素間の識別のために用いることができる。α2,3(O)STは、Globo H前駆体（120.8％の活性）及びそのデオキシ類似体（115.6％）の両方を利用した。他方、α2,3(N)STは、Globo H前駆体（106.8％の活性）に対して効率的に作用したが、そのデオキシ類似体（3.1％の活性）には作用せず、Globo H前駆体のβ1,3結合GalのC-6ヒドロキシル基はこの酵素の活性に絶対的に必要であることを示した。対照的に、α2,6(N)STは、Globo H系受容体（1.1％）及びそのデオキシ類似体（2.5％）の両方で活性を示さなかった。LNCaPのシアリルトランスフェラーゼは、これら2つの受容体をそれぞれ34.3％及び9.6％の低い活性で利用した。Globo H前駆体に対する特異性に関する重要な結果は、表VIの質量分析を用いて立証された。全般的に、これらの結果は、2-O-MeGalβ1,3GlcNAcは、α2,3(N)STの固有の受容体であるということを示している。全ての酵素はまた、Globo H前駆体及びそのデオキシ類似体に対するそれらの作用によって識別することができる。
【００２０】
コア-2構造に対するシアリルトランスフェラーゼの特異性
STは、コア-2四糖類及びこの分子の3-O-メチル類似体に対して、上記の二糖類に関する我々の実験（表I、パートB）から主として予想される態様で作用した。α2,3(N)ST及びα2,6(N)STは、四糖類のGalβ1,4GlcNAcβ側鎖に対して特異性を示し、一方、LNCaPのシアリルトランスフェラーゼは、Galβ1,3GalNAcα部分に作用することを好んだ。α2,3(N)STはGalβ1,3GalNAcα-O-Alに対して24.1％の活性を示したが、3-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnに対しては幾分低い活性を示した（6.1％の活性）。驚くべきことに、α2,3(O)STはこの四糖類の両メチル類似体に対して活性を示し、前記が、Galβ1,3GalNAcαのGalの3位（ただしこれに限定されない）を含む多数の作用部位を有しえることが示唆された。この発見は後の結果の項で丹念に考察する。
LNCaPのシアリルトランスフェラーゼとα2,3(O)STとを区別する特異的受容体の規定
LNCaPのシアリルトランスフェラーゼはGalβ1,3GalNAcαに対する厳密な特異性を示すが、α2,3(O)STはより広い特異性を示した。これは、2つのメチル化四糖類、3-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn及びGalβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bnの比較で明白である。これらの受容体に対して前記クローン化酵素はそれぞれ100.0％及び49.6％の活性を示したが、一方、LNCaP酵素はそれぞれ100.9％及び3.0％の活性を示した。Galβ1,3GalNAcαに対するLNCaP酵素の厳密な特異性はまた、クローン化酵素（37.2％）と比較してGalβ1,3GlcNAcβ1,3Galβ-O-Meに対するその極めてわずかな活性（1.4％）から明白である。さらにまた、これら2つの酵素は作用が異なる。なぜならば、クローン化酵素は、Galβ1,3GalNAcα-O-Al及びムチンコア2構造のT-ハプテンの両方を受容体として同じ程度（それぞれ112％及び100.0％）に利用するが、LNCaP酵素はGalβ1,3GalNAcα-O-Alに対しては1/3（34.4％）しか有効ではなかった。クローン化酵素及びLNCaP酵素はGalβ1,3GlcNAcβ-O-Alの利用で相違した（それぞれ42.1％及び3.7％の活性）。最後に、ムチンコア2構造のβ1,6結合GlcNAcにGalを添加することによって、クローン化酵素の応答（120.5％から100.0％）とは対照的にLNCaP酵素の活性は増加した（60.4％から100.0％）。
他のα2,3(N)ST（LNCaPシアリルトランスフェラーゼに類似するST）の存在下でのクローン化α2,3(O)STのアッセイのための単純な特異的受容体を規定するために、我々は、両酵素の一連の二糖類類似体（すなわち、3-O-MeGalβ1,3GalNAcα-O-Bn；4-O-MeGalβ1,3GalNAcα-O-Bn；4-FGalβ1,3GalNAcα-O-Bn；Galβ1,3(6-OMe)GalNAcα-O-Bn；及び3-O-MeGalβ1,3(6-O-Me)GalNAcα-O-Bn）に対する作用をGalβ1,3GalNAcα-O-Bnと併せて調べた（表II）。表VIで考察するように、酵素生成物のいくつかに関して質量分析を実施した。これらの実験は、2つの異なる受容体濃度で実施された。我々は、クローン化酵素は、0.75mM（これは最大活性のための飽和点である）でGalβ1,3GalNAcα-O-Bnと比較したとき、3-O-MeGalβ1,3GalNAcα-O-Bn及び3-O-MeGalβ1,3(6-O-Me)GalNAcα-O-Bnに対しそれぞれ70.4％及び55.9％の活性を示すことを観察した。LNCaP α2,3(O)STはこれらの受容体に対して極めてわずかの活性を示した（それぞれ2.6％及び1.1％）。したがって、3-O-MeGalβ1,3GalNAcα-O-Bn及び3-O-MeGalβ1,3(6-O-Me)GalNAcα-O-Bnは、クローン化α2,3(O)ST酵素のための特異的な受容体として用いることができよう。実際、後者の化合物はこの酵素に対して完全に特異的でありえる。なぜならばα-GalNAcに作用するα2,6シアリルトランスフェラーゼはこの受容体に作用することができないからである。
【００２１】
ムチンコア-2系グリカンの生合成
本実験の酵素特異性データ（表I、パートB）は、グリカン、例えばPSGL-1、GalNAc Lewis-x、GlyCAM-1及び潜在的Siglecリガンドの生合成経路におけるシアリル化の可能な配列を示す（図2）。しかしながら、以下のようなin vivoにおける可能性は認識されねばならない：a）組換え酵素は天然の酵素の配座を完全には獲得できない；b）細胞内の基質の濃度は、多数の糖結合物の合成に含まれる競合経路の酵素の作用を指令することができる；c）これらの酵素の活性部位の配座は温度及びpHに鋭敏である；及びd）同じグリカンの伸長のためのマイナーではあるがまた別の経路が細胞内に存在する。
A．PSGL-1及びGalNAc-Lewis x：
末端シアリルLewis x構造及びチロシン硫酸化ペプチドをもつ単フコシル化ムチンコア-2系グリカンは、P-及びL-セレクチンに対し高親和性結合を示す（32）。いくらかの研究者はまた、フコシル化は、PSGL-1上で保持されるグリカンの生合成における最後の工程でありえることを示した（33−37）。我々の酵素的実験は、そのようなムチンの生合成に関するさらに別の識見を提供する。
先ず初めに、我々の結果は、Gal残基のα2,3シアリル化は、GlcNAc残基のα1,3フコシル化の後でさえ進行しえることを示唆している。この提案を支持するものとして、我々は、Lewis x及びコア-2ムチン上の(GalNAc)Lewis x決定基は、クローン性α2,3(O)STの活性に影響を与えないことを観察した［Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Me：133.4％、GalNAcβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Me：134.9％］。LNCaPのシアリルトランスフェラーゼもまた、ムチンコア2受容体を含むGalNAc Lewis-xに対してレベルは低いが（21.1％の活性）活性を示し、さらにα2,3(
N)STのための受容体として機能するGalβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Me及びGalβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnに対して有意ではあるが低いレベル（それぞれ19.0％及び27.1％の活性）の活性を示した。
第二に、シアリル化配列に関して、我々の結果は、ムチンコア2骨格化合物の好ましい生合成のためには、β1,3結合Galのシアリル化はβ1,4結合Galのシアリル化に先行しなければならないことを示唆している。この示唆は以下の証拠によって支持される：i）ムチンコア2のβ1,3-結合Galのシアリル化は、α2,3(N)STによるβ1,4結合Galのα2,3シアリル化を強化し、前記は、この酵素のGalβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-及びGalβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-に対する活性（それぞれ19.0％及び27.1％）の比較から、及びGalβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-とGalβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-との比較（それぞれ28.1％及び50.8％）から明らかであった；ii）ムチンコア2のLacNAc部分がα2,3シアリル化されたとき、受容体としてNeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Meを用いた場合に明らかなように、Galβ1,3GalNAcα部分のα2,3シアリル化は大きく低下した（クローン化α2,3(O)ST酵素は35.2％、LNCaP酵素は5.1％）。
総合すれば、上記の結果は、ロイコシアリンは、ムチンコア2四糖類からα2,3(O)ST及びα2,3(N)STの連続的作用によって生じ、PSGL-1グリカンはさらにFTVIIの作用から生じるのであろうということを示唆している。PSGL-1はまた、ムチンコア2四糖類からFTIV（又はおそらくはFTIII、FTV又はFTVI）に続いてα2,3(O)ST及びα2,3(N)STの連続的作用によって生じえる（図2）。コア-2四糖類上のGalNAc-Lewis x型構造は、同様にβ1,4GalNAcトランスフェラーゼ、α1,3フコシルトランスフェラーゼ及びα2,3(O)STの連続作用によって生成されえる（図2）。
【００２２】
B．GlyCAM-1：
以前の実験から、GlcNAc:6-O-スルホトランスフェラーゼは、その作用のために末端GlcNAcを必要とするので、コア-2四糖類には作用しないことは明白である（38-40）。このことは、6-硫酸化はコア-2ムチンのβ1,4ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に先行することを示唆している。この観察に基づいて、これまでの実験では、我々は、一連の6-O-硫酸化構造におけるシアリルトランスフェラーゼの作用を調べ、硫酸化コア-2構造の形成をもたらす潜在的な生合成経路を決定した。最初に、我々は、Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Me（28.1％の活性）と比較して、α2,3(N)STは、シアリル化された硫酸化ムチンコア-2化合物Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-Me（50.8％の活性）に対してより効率的に作用することを観察した。さらにまた、この3'シアリル,6-O-スルホLewis x決定基は、クローン性α2,3(O)STの活性を7.4％に劇的に低下させた。これらの観察は、PSGL-1のように、ムチンコア2の6-O-スルホLacNAc部分のα2,3シアリル化は、β1,3結合Gal部分が既にα2,3シアリル化されているときに促進されるという提案を支持する。換言すれば、α2,3(O)ST作用はGlyCAM-1生合成の場合にはα2,3(N)ST作用におそらく先行する。
我々は、ヒトFTVII酵素（FTVII cDNAをトランスフェクトしたCOS-7細胞の抽出物から得られた）は、受容体NeuAcαGalβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,3Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ-O-Meに効率的に[14C]Fucを移転させることができることを観察した（Chandrasekaran, Xia, Neelamegham and Matta, 未発表データ）。さらにフコシル化された受容体Galβ1,4(6-O-スルホ)(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-Meは、α2,3(N)STに対して非常に低い活性を示し、フコシル化はシアリル化の後で生じなければならないことを示唆した。上記に基づいて、我々は、GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-から始まるGlyCAM-1の生合成は、GlcNAc:6-O-スルホ-T、β1,4Gal-T、α2,3(O)ST、α2,3(N)ST及び最後にFTVIIの連続作用を必要とすると提唱する（図2）。この反応スキームのシアリル化工程は、質量分析を用いて反応生成物を分析することによって立証された（表VI）。
上記の我々のデータは、硫酸化は生合成経路の最初の工程の1つであるにちがいないことを示唆しているが、一方、我々はまた、ムチンコア2のβ1,6結合GlcNAcの6-O-硫酸化はα2,3(O)STの活性を低下させることを観察している。これに関して、Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Meはクローン性α2,3(O)STに対して27.2％の活性を示し、LNCaPのシアリルトランスフェラーゼに対しては14.8％の活性を示した。同様に、クローン化α2,3(O)STは、受容体6-O-スルホGlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn及びGalβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnについてそれぞれ49.4％及び69.4％の活性を示した。LacNAc部分の6-O-硫酸化だけでなく、3-O-硫酸化もまた、コア-2ムチンに作用するα2,3(O)STの酵素活性を低下させた。なぜならば、3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβ１,6(Galβ１,3)GalNAcα-O-Bnは70.3％しか活性を示さなかったからである。我々の以前の実験は、シアリル化コア-2受容体（すなわちNeuAcα2,3Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn）は、GlcNAc:6-O-スルホトランスフェラーゼのための受容体として作用することができることを示した（40）。したがって、また別のスキーム（図2には示されていない）として、α2,3(O)STの作用は、GlyCAM-1生合成経路でGlcNAcの6-O-硫酸化に先行しえることが可能であろう。
【００２３】
C．Siglecリガンド：
本実験では、Siglecの潜在的リガンドとして機能しえるα2,6シアリル化及び6-O-硫酸化ムチンコア-2系化合物の形成を報告する。我々の実験（表I、パートB）では、我々は、α2,6(N)STは、ムチンコア2のβ1,4結合Gal部分に完全に特異的であることを観察した。GlcNAc部分のα1,3フコシル化又は6-O-硫酸化は活性を減じた（それぞれ31.0％及び30.6％）。GlcNAcの6-O-硫酸化に加えて、ムチンコア2のβ1,3結合Galのシアリル化は劇的に活性を現じた。すなわち、Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-Meは0.9％の活性を示し、Galβ1,4(6-O-スルホ)(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-Meは0％の活性を示した。このことは、6-O-硫酸化コア2ムチンの場合には、α2,3(O)STの作用の後にα2,6(N)STの作用が続きえないことを示唆している（概念は図2に示されている)。他方、Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnは、α2,6(N)STのための合理的な受容体として機能し(31.0％)、β1,3結合Galの先のα2,3-シアリル化は、非硫酸化ムチンコア2四糖類のβ1,4結合Galのα2,6-シアリル化に影響を与えないであろうということを示唆した。さらにまた、ムチンコア2のβ1,3-結合Galの3-O-硫酸化は、α2,6(N)STの活性に影響を与えなかった（127.4％）。これらの結果から、複雑なSiglecリガンド、すなわちNeuAcα2,6Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-は、α2,6(N)ST及び α2,3(O)STの連続作用によって、Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-から生じえよう。より複雑なリガンド、すなわちNeuAcα2,6Galβ1,4(Fucα1,3)(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-の生成は不可能であるように思われる。なぜならば、NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAcは、α1,3-L-フコシルトランスフェラーゼのための受容体として活性を持たないからである（41）。
【００２４】
シアリルトランスフェラーゼのための受容体としてのムチンコア2系化合物
我々は、重要なヒドロキシル基がO-メチル又はフルオロ置換基で置き換えられた改変コア-2構造に対するシアリルトランスフェラーゼの作用を調べた（表III）。我々は、クローン化α2,3(O)STは、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(3-FGalβ1,3)GalNAcα-O-Bn、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bn、及びGalβ1,4GlcNAcβ1,6(4-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bnを含む全ての受容体を利用することを観察した（それぞれ77.2％、49.6％及び101.3％の活性を示す)。他方、LNCaPのα2,3(O)STは、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(4-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bnでのみ作用し（112.0％）、β1,3結合Galの3-O-メチル及び3-フルオロ置換基は酵素作用を失わせた。クローン化α2,6(N)STは、4-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnに対して非常に低い活性を示し(12.6％)、一方、α2,3(N)STはこの受容体に99.8％の活性を示した。反対に、β1,4結合Gal中のGalの3-O-メチル1,3-フルオロ及び4-フルオロ置換基は両酵素にとって不良な受容体をもたらした。これらの結果は、β1,3結合Galの3位へのシアリン酸の移転に加えて、α2,3(O)STはまた、もう1つの位置で（すなわちβ1,4結合GalのC-3ヒドロキシル基で、又はβ1,4若しくはβ1,3結合Galのまた別の-OH基で）受容体のシアリル化を誘発することを示している。
我々は、シアリルトランスフェラーゼに対するムチンコア2受容体の効率に対するGal部分の4-O-メチル化の影響を詳細に調べた（図3）。種々の濃度のGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn及び4-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnで別々にα2,6(N)STの活性を測定したとき、後者の化合物はテストした最大濃度（0.75mM）でほぼ活性をもたず、一方、前者の化合物はテストした最低濃度（0.15mM）でさえも顕著な活性を示すことが見出された（図3A）。上記2つの受容体を同じ態様で用いてα2,3(N)STの活性を測定したとき（図3B）、対応する濃度の前者の化合物の活性と比較して、後者の化合物は、テストした最低濃度（0.05mM）で4倍の活性、テストした最大濃度（0.25mM）で2倍の活性を示した。したがって、β1,4-結合Galの4-O-メチル化はα2,6(N)STに対する受容体の能力を停止させるが、α2,3(N)STに対する受容体の効率を顕著に増加させた。
種々の濃度のGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn及びGalβ1,4GlcNAcβ1,6(4-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bnで別々に、クローン化α2,3(O)STの活性を測定したとき（図3C）、前者の化合物は標準的なインキュベーション条件でわずかにより良好な受容体として見出された。反応混合物でより高濃度の供与体CMP-NeuAcが存在するとき、これら2つの受容体間における効率の相違ははるかに大きかった。対照的に、LNCaPのα2,3(O)ST（図3D）は、後者の化合物を受容体としてより効率的に利用し、0.15mMで最大活性に達したが、前者の化合物は0.60mMで最大活性を示した。したがって、β1,3-結合Galの4-O-メチル化は、クローン化α2,3(O)ST及びLNCaPのα2,3(O)STの活性に対して完全に異なる影響をもたらした。
【００２５】
クローン化α2,3(O)STによる受容体GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bnにおけるシアリル化の位置の探索
クローン化α2,3(O)STによるシアリル化はGlcNAcと結合したβ1,4結合Galで生じるか否かを決定するという目的のために、我々は、受容体3-O-MeGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、Fucα1,2Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、及び3-O-スルホGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bnから生じる酵素生成物を調べた。受容体3-O-MeGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn及びFucα1,2Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bnから生じる[9-3H]シアリル化生成物をSep-Pak C18による方法によって単離した。受容体Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Al及び3-O-スルホGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bnから生じる[9-3H]シアリル化生成物は、Biogel P2カラムクロマトグラフィーによって単離した。これらの[9-3H]シアリル化合物を2つの異なる溶媒系を用いてTLCに付した（図4）。1/2cm幅の部分を掻きとり、続いて液体シンチレーション計測を実施することによって、放射能を有する化合物の位置を決定した。そのような実験によって、ただ1つの生成物が形成されることが示された。これらの受容体に対して、参照分子Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Alに対する酵素の活性を100％と設定したとき、酵素はそれぞれ24.7％、45.4％及び54.7％の活性を示すことが見出された（表IV）。
3-O-スルホGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bnを除いて、前記全ての受容体から生じるシアリル化生成物は、GlcNAcを介してWGA-アガロースと結合することを示した（図5A、B、C及びD）。このことは、ムチンコア2四糖類のβ1,3結合Gal上の3-O-スルホ基は、ムチンコア2のβ1,6結合GlcNAcとWGAとの結合を停止させることを示している。これらの放射性生成物をβ-N-アセチルヘキソースアミダーゼ（ジャックビーン）で消化した後、得られた放射性化合物はGlcNAcが存在しないためにWGA-アガロースと結合しなかった（図5E、F及びG）。全体として、この一式の実験は、α2,3(O)STによるシアリル化は3-ヒドロキシル基以外の場所のβ1,3結合Galで生じえることを示唆している。
【００２６】
クローン化α2,3(O)STの作用によりGalβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bnから生じたシアリル化生成物の性状決定
我々は、Sep-Pak C18による方法によって前記生成物を単離し、続いて前記をRCA-I-アガロースクロマトグラフィーに付した（データは示されていない)。予想したとおり、α2,3(N)STの作用から生じる[9-3H]NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bnはこのカラムに結合しなかった。しかしながら、クローン化α2,3(O)STの作用によりGalβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bn及びGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnから形成されたシアリル化化合物はこのカラムとの弱い結合を示した。これらの結果は、α2,3(O)STによるシアリル化はβ1,4結合Gal部分で生じないことを非常に強く主張し、このことは、WGA-アガロースクロマトグラフィーを用いて上記に報告したデータと一致する。
β1,3結合Gal部分のC-3又はC-6ヒドロキシル基以外のシアリル化の証拠
α2,3(O)STの特異性をより明確に規定するために、多様な受容体濃度にわたって一連の化合物に対するα2,3(O)STの作用を調べた。分子のいくつかで、GalをD-Fucと置換した。なぜならば、D-Fuc（6-デオキシGal）はC-6位にヒドロキシル基を欠く点を除いて、両方の単糖類は同一であるからである。上記に示したように、化合物D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meは、クローン化α2,3(O)STのための良好な受容体として機能し、β1,3結合GalのC-6 OH基はシアリル化の標的ではない可能性がある。この論戦を支援する証拠を得るために、我々はまた、クローン化α2,3(O)STのための受容体として、D-Fucβ1,3GalNAcα-O-Bn；D-Fucβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn；D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；及び3-O-スルホD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meを調べた（図6A及び6C）。D-Fucβ1,3GalNAcα-O-Bn及びD-Fucβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAc-O-Bnの両者は、3-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnと比較して、0.75mMの濃度で受容体として100％有効であることが見出された。さらにまた、前者から生じた[9-3H]シアリル化合物はWGA-アガロースカラムと結合しなかったが、後者から生じた[9-3H]シアリル化合物はこのカラムに結合し(データは示されていない)、シアリル化はD-フコシル部分でのみ生じることが示唆された。
クローン化α2,3(O)STの活性をGlobo H類似体の濃度を変化させることによって測定したとき、我々は、Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me及びD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meは有効な受容体であるが、一方、3-O-スルホGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me及び3-O-スルホD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meはともに受容体として機能するがその程度は低いことを見出した（図6C）。3-O-スルホD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me（表IVの化合物S4）及びMSn分析を用いるその反応生成物（化合物14）の断片化分析を用いて詳細な質量分析を実施した（補充データ）。これによって、シアリン酸とこの分子（C-3及びC-6位のヒドロキシルを欠く）との結合が立証された。D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meは、Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meと比較して0.15mM及び0.75mMでそれぞれ50％及び100％有効であり、C-6ヒドロキシル基は前記受容体に対する最大の酵素親和性のために要求されることを示唆した。さらにまた、3-O-スルホGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me及び3-O-スルホD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meのほぼ同じ受容体有効性（図6C；表V）によって、Gal部分のC-6ヒドロキシル基は、受容体3-O-スルホD-Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meのシアリル化の部位ではおそらくないであろうと提唱されよう。シアリル化はおそらくβ1,3結合GalのC-2又はC-4位で生じる。
【００２７】
改変された末端β1,3ガラクトシル残基に対するクローン化α2,3(O)STの固有の触媒活性
種々の濃度の多様な受容体でのクローン性α2,3(O)STの活性の測定とそれに続くLineweaver-BurkeプロットによるKm及びVmax値の決定（図6及び表Vを参照されたい）は、Globo骨格化合物Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；3-O-スルホGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me；T-ハプテン化合物4-O-MeGalβ1,3GalNAcα-O-Bn；4-FGalβ1,3GalNAcα-O-Bn及びD-Fucβ1,3GalNAcα-O-Bn、並びにムチンコア2化合物D-Fucβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn及びFucα1,2Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bnは、0.12から2.00までの範囲のKm値（mM）及び197から1873の範囲のVmax値（pmol/時間）を有することを示した。前記の結果は、これらの固有のシアリル化化合物の合成はこの酵素を用いて実現可能であることを示していよう。
【００２８】
酵素的にシアリル化した化合物のESI-MS/MSn分析
α2,3(O)STは新規なシアリル化を触媒することができるという我々の発見を確認するために、我々は、酵素的に合成した生成物を用いて衝突誘発解離（CID)下でMSnスペクトル分析を実施した。異なるシアリル結合（siaα2,3、siaα2,2/4及びsiaα2,6）及びスルフェート残基を（ムチンコア-2四糖類のどちらかのガラクトース末端の3位に）有する異性体の4つの五糖類（化合物6、7、18及び23）(図7)を、マイナスモードにてm/z 604で二重荷電イオン[M-2H]2-として、及びプラスモードにてm/z 650で二重荷電四ナトリウム化イオン[M-2H+4Na]2+として検出した(表VI)。前記4異性体に由来するm/z 650における分子種MS2スペクトルは図8に示されている。図8及び図9で特定された分断化は、確立されたDomon-Costello命名法を用いて図7に示した（42）。シアリル基と分枝ムチンコア-2間のグリコシド切断によってシアリル基を表すBイオン（B'1イオン又はB1イオン）及び硫酸化分枝ムチンコア-2四糖類を表すYイオン（Y'2イオン又はY3イオン）を生じた。図から分かるように、Bイオン対Yイオンの比は種々の結合間で有意に異なっている（図8参照）。同じCIDパターンが図8A及び8Bで認められ、化合物6及び23は共通の結合を共有することを示している(前記結合は化合物及び18とは異なっている)。前記酵素実験に基づき、これはおそらくα2,3結合であろう。化合物18のY3イオンはm/z 913にあり、これは、化合物6及び23由来のm/z 917における対応するイオンとは有意に異なっている。分子量におけるこの相違は、Ulrikら(43)により報告されているメカニズムに基づく、分枝ムチンコア2四糖類のGalβ1,4GlcNAc結合中のGal及びGlcNAcの2つの主要なヒドロキシル基間のラクトン結合の形成に帰することができよう。化合物7（図8C）のスペクトルは、化合物6、18及び23のスペクトルとは全く異なり、別個のシアリル結合、したがっておそらくシアリル酸α2,2またはα2,4結合を表していると示唆される。
硫酸化分枝ムチンコア2構造を表すYイオンのMS3スペクトルは図9に示されている。図9Aに示されているm/z 444におけるB2イオンは、化合物6のスルフェート基がムチンコア2のβ1,4結合Gal上にあることを立証する。同様に、図9B及び9Cのm/z 552におけるY1イオンは、化合物23、7及び18のスルフェート基が前記四糖類のGalβ1,3GalNAcのGal上にあることを示している。ラクトン結合の形成はまた、図9Cに示されている化合物18のm/z 753におけるY2イオン、及びm/z 807におけるB4イオンによって確認された（前記は図9A及び9Bのm/z 755及びm/z 809における対応するイオンとは異なっている）。
3つのクローン化したラットのシアリルトランスフェラーゼ及び前立腺癌細胞株LNCaP由来のヒトのシアリルトランスフェラーゼの受容体特異性を調べた。コア2及びGlobo構造を土台にする一連の炭水化物受容体に対するこれら酵素の特異性を規定することによって、我々は、i）複雑なグリコシルトランスフェラーゼ混合物中のこれらの酵素の各々の性状を決定するために用いることができる固有の受容体を規定し、ii）セレクチン及びSiglecのためのリガンドの合成を先導することができる潜在的な生化学経路を記述し、さらにiii）コア2ムチン中のβ1,3結合GalのC-2又はC-4位は、C-3位がシアリン酸以外の置換基を有することを条件として、クローン化α2,3(O)STの作用部位でありえることを提案する。
【００２９】
ラットの組換えシアリルトランスフェラーゼ及びLNCaPシアリルトランスフェラーゼにおけるいくつかの関連する観察
他の研究者らは、本明細書で調べたシアリルトランスフェラーゼに関する実験を実施している。Takanoら（44）は、化学的酵素的実験でラットの組換えα2,3(O)STとともに四糖類受容体を37℃でインキュベートしたとき、ただ1つの生成物（すなわちGalβ1,4GlcNAcβ1,6(NeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-R）を特定した。他方、彼らは、前記四糖類受容体をラットのα2,3(N)STとともにpH7.4で24時間インキュベートしたとき、典型的な生成物（すなわちNeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-R（57％））の他に、上記のモノシアリル化合物（8％）及びジシアリル化合物（15％）を特定した。Senguptaら（45）は、前記四糖類受容体をpH7.4で37℃にて18時間インキュベートしたとき、ラット組換えα2,3(N)STに関して同様な観察を得た。我々の発見とこれらの研究者らのものと比較するために、我々はまた、受容体Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnについて、我々の標準的な実験条件の下で（37℃でpH6.0）我々の実験の反応時間を2時間から20時間に延長し、さらに3つのラット組換え酵素α2,3(N)ST、α2,6(N)ST及びα2,3(O)STの全てを利用した。四糖類受容体から生じる[9-3H]シアリル生成物をSep-Pak C18カートリッジを用いて単離した。放射能を有する生成物のPNA-アガロースアフィニティクロマトグラフィーは、それぞれ92％、93％及び0％の放射能が特異的にカラムに結合することを示し、結合した生成物の実体は、α2,3(N)ST及びα2,6(N)STの場合には[9-3H]NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn及び[9-3H]NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnであり、未結合生成物はα2,3(O)STの場合にはGalβ1,4GlcNAcβ1,6(9-3HNeuAcα2,3Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnであることを示した。LNCaP細胞のトリトンX-100可溶化抽出物は、95.0％を越えるα2,3(O)ST活性を含んでいた。前記は以下の受容体の活性から明らかであった：3-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（100.0％）；Galβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAc（3.0％）；及びGalβ1,4GlcNAcβ-O-Al（0.5％）。全体として、我々の結果は文献の他のデータと一致し、いくつかの観察された相違は、実験間のインキュベーション条件の変動に帰すことができる。
【００３０】
β1,3-結合Gal以外の種々の位置に対するクローン性α2,3(O)STの固有の活性
クローン性α2,3(O)STは、3-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（100％）及びGalβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bn（49.6％）に関して活性を示したが、Galβ1,4GlcNAcβ-O-Al（4.7％）に対してはほとんど活性がなかった。Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bnを受容体として用いたとき、単離された[9-3H]シアリル生成物の100％がPNA-アガロースカラムに結合せず、シアリル化はβ1,3結合Gal部分でのみ生じることを示唆した。このことは2つの可能性を示している。１つは、β1,3結合Gal部分にC-3ブロックが存在するときにシアリル化はβ1,4結合Galで発生する可能性があること、2つ目は、シアリル化はβ1,3結合Gal部分で他のいくつかの場所で発生しえるということである。これらの可能性を調べるために、我々は、クローン性α2,3(O)STのための受容体として、β1,3結合Gal部分に種々の置換基を含むムチンコア2四糖類を用いた。タンデム質量分析、β-N-アセチルヘキソースアミダーゼ処理の前後の[9-3H]シアリル生成物についてのWGA-アガロースアフィニティークロマトグラフィー、及びムチンコア2四糖類受容体由来の[9-3H]シアリル生成物についてのRCA-アガロースアフィニティクロマトグラフィーを用いて、我々は、シアリル化は3-O-置換β1,3結合Galの種々の位置で生じることを明確に示した。3-O-スルホD-Fucβ1,3GalNAβ1,3Galα-O-Me及び3-O-スルホGalβ1,3GalNAβ1,3Galα-O-Meは両方とも、クローン性α2,3(O)STに対してほぼ同じ効率で受容体として機能するので、C-3がブロックされたβ1,3結合GalのC-6位がシアリル化のための部位であるとは考えにくい。残りのヒドロキシル基の1つ（C-2又はC-4）がこの酵素の作用部位である可能性がある。しかしながら、Kobataとそのグループ（46）は、ウシ血漿から単離した低温不溶性グロブリンにNeuAcα2,4Gal末端N-グリカン鎖が存在することを報告した。さらにまた、3-スルホGalβ1,3GalNAβ1,3Galα1,4Galβ−>Glcβセラミドがラットの腎臓に存在することが報告された（47）。実際、3-スルホGalβ1,3GalNAcβなる配列がいくつかの糖脂質に存在することが知られている（48）。
【００３１】
Siglec結合の潜在的阻害物質の予測
我々の生化学的な研究は、そのリガンドとのSiglec結合の効率的な阻害剤として作用しえる新規な分子を示唆している。これに関して、最近、Blixtら（49）は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ結合物と結合したビオチニル化シアロシドを含む新規な多価プラットフォームを用いて、Siglecファミリーのシアロシド特異性を評価した。ヒトSiglec2、3、7、8、9及び10は、NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAcを含むシアロシド-SAAPプローブHと有意に結合することが示された。彼らは、IC50値と対応するSAAPの固定Siglecキメラと結合する能力との間に相関性はほとんどないことを観察した。彼らはまた、スペーサーアームの長さはシアロシド配列と与えられたSiglecとの相互作用に影響を及ぼしえることを結合アッセイで見出した。これらの陥穽にもかかわらず、前記の著者らは、NeuAcα2,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Thr、NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAcα-O-Thr、及びNeuAcα2,3Galβ1,3(NeuAcα2,6)GalNAcα-O-Thrは、Siglec 4（MAG）結合の阻害においてNeuAcα2,6GalNAcα-O-Thrよりも100倍、600倍及び3,000倍強力であるという驚くべき発見に到達した。我々の実験によれば、以下のムチンコア2系化合物はまたSiglec 4に対し及びおそらく他のSiglec結合に対してもまた、強力な阻害物質でありえる：
NeuAcα2,3Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-；NeuAcα2,3Galβ1,3(NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,6)GalNAcα-；NeuAcα2,3Galβ1,3(NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAcβ1,6)GalNAcα-；NeuAcα2,3Galβ1,3(6-O-スルホ)GalNAcα-；NeuAcα2,3Galβ1,3(3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβ1,6)GalNAcα-；NeuAcα2,3Galβ1,3[Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ1,6]GalNAcα-；及びNeuAcα2,3Galβ1,3(6-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβ1,6)GalNAcα-。実際、Blixら（50）は、NeuAcα2,6Galβ1,4(6-O-スルホ)GlcNAcβ-は、ヒトCD22との結合において対応する非硫酸化構造物よりもはるかに良好であることを最近報告している。
【００３２】
LacNAc中のGalのC-3位で作用する酵素はまたGlobo受容体で効率的に作用する
以前に、我々は、前立腺癌細胞のLNCaP α1,2-L-FTは、ムチンコア2四糖類中のβ1,3結合Galに対する活性と比較したとき、β1,4結合Galに対して4倍高い活性を示すこと、この同じ酵素はまたGlobo骨格構造のGalβ１,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me及びD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meを非常に効率的に利用することを見出した。その後、我々は、Gal:3-O-スルホトランスフェラーゼ、Gal3ST-2（前記はLacNAc 2型構造に対して特異性を示す）はまたGlobo構造に対して効率的に作用することを観察した（52）。これらの観察を拡大して、我々は、本実験でα2,3(N)STは、LacNAc及びGlobo構造Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Meに対して同等に効率的に作用することを示す。したがって、我々は、末端β1,4結合Galを改変する種々の酵素はまたGlobo骨格中の末端β1,3結合Galを効率的に利用するという生理学的相関性を発見した。
【００３３】
肝臓及び前立腺由来α2,3(O)STの受容体特異性における相違についての理論的根拠
全ての哺乳動物のクローン化シアリルトランスフェラーゼは、L-、S-及びVS-シアリルモチーフを含んでいる（53−55）。L-シアリルモチーフは供与体CMP-NeuAcと結合することが示され（56）、一方、S-モチーフは供与体および受容体グリカンの両方との結合に参画した（59）。触媒過程におけるVS-モチーフの正確な役割は未だ特定されてはいない。Kitazume-Kawaguchiら（60）は、全てのシアリルトランスフェラーゼにとってHisが触媒残基でありえると提唱した。
3つの遺伝子が、ヒトシアリルトランスフェラーゼST-4a、b及びc（前記はGalβ1,3GalNAcα-のα2,3シアリル化を触媒する）をコードすることが確認された。各酵素は組織特異的発現について別個のパターンにしたがう（59）。ST-4a mRNAのレベルは、脳及び骨格筋（前記組織ではそれぞれほとんど発現されないか強く発現されることが示されている）を除いて、調べられたほぼ全ての組織で比較的同じであった（59）。ST-4bは肝臓でのみ確認され、驚くべきことにはHepG2では検出されなかった。ST-4cは心臓、胎盤、精巣及び卵巣でもっとも強く発現された。前立腺組織はまた主としてST-4cを含んでいた（57）。我々の実験では、組換えラット肝α2,3(O)STのヒト対応物はおそらくST-4bであり、由来組織を基準にすれば、前立腺細胞LNCaP由来シアリルトランスフェラーゼはST-4cでありえる。そのような肝臓と前立腺との間におけるST-4転写物発現の相違は、これら供給源に由来する酵素の複雑な基質特異性における相違によるものでありえるか否かは未だ明らかではない。
【００３４】
合成受容体による酵素実験は通常のレクチン及び抗体実験を補完することができる
α2,3及びα2,6シアリルトランスフェラーゼのmRNAの弁別的発現がラット及びヒトの組織で観察された（60、61）。しかしながら、mRNAの発現は実際の酵素レベルと常に相関するとは限らず、換言すればグリコシル化を常に予測できるとは限らない。Martinら（62）は、正常マウス及びST6Gal I又はST3Gal I欠損マウスの組織で組織化学的プローブとして植物レクチンを用いることによって末端グリカンを調べた。彼らは、多様なマウス組織において末端シアリン酸の種々の結合について細胞型特異的発現を見出し、欠損マウスの多様な組織において細胞型特異的グリカン構造に多数の変化を特定した。本実験は、シアリルトランスフェラーゼの複雑な基質特異性に関する重要な情報を提供することができた。そのような情報は、正常マウス及びノックアウトマウスでレクチン及び抗体を用いて得られる組織学データの有意義な解釈に役立つであろう。一連の炭水化物受容体を用いるグリコシルトランスフェラーゼ活性の研究はまた、多様な高処理アッセイから入手できるようになったゲノムデータ及びタンパク質データを保管することができる。
グリコシルトランスフェラーゼ活性のパターンからグリカンシグナチャーを予測するという仮説を調べるために、我々は、先ず初めに4つの細胞株ZR-75-1、T47D、MDA-MB-23、及びMCF-7を、続いて表IIに報告した他の細胞株で多様な酵素の活性レベルを調べた。おそらくこれらの酵素活性から生じる炭水化物構造物のレベルは表IIIに提示されている。Muller ＆ Hanisch（2002）は、NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAcα-ユニットはT47D（68.6％）、MDA-MB-231（65.5％）及びZR-75-1（86.1％）で発現されるMFP6タンパク質の主要な構造を構成することを見出した。本発明はまた、α2,3-Sia-TI又はTIIは、α2,3-sia-TIVと比較してこれらの細胞株のいずれにおいてももっとも優勢な酵素であることを示す。彼らはまた、シアリル化炭水化物鎖はわずかに5.2％のO-グリカン鎖を含むことをMCF-7で観察した。
ZR-75-1を除き(前記は高いシアリルトランスフェラーゼ活性を示す)、本発明で見出されたように、T47D、MDA-MB-231及びMCF-7はほぼ同じレベルのα2,3-sia-TI又はTIIを発現する。MDA-MB231及びZR75-1細胞抽出物は、NeuAc2,3Galβ1,4GlcNAcを構築するα2,3-Sia-T IV酵素を含み、さらにMuller & Hanisch（2002）は、細胞株MDA-MB231及びZR75-1のO-グリカンのオリゴ糖鎖にこの配列が存在し、MCF-7細胞株には存在しないことを報告している。
標的化合物は、個々のシアリルトランスフェラーゼ活性を他のシアリルトランスフェラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼ活性の存在下で測定するために特異的に設計され、したがって生物学的サンプルでこれらの活性を正確に測定する際に非常に有用であろう。
本発明の更なる拡大として、癌関連糖タンパク質抗原から遊離された炭水化物鎖に関する、本発明の特異的基質を用いる構造的研究は、癌でオリゴ糖鎖の外側端に主要な変化があることを示した。本発明にしたがって、癌細胞によって発現されるシグナチャーグリカン構造を特定するために、フコシル-、β-ガラクトシル-、β-N-アセチルガラクトサミニル-、シアリル-、及びスルホトランスフェラーゼ活性レベルについて（前記活性はグリカンのオリゴ糖鎖の外側端を生成する）、多様な癌細胞株を調べた。我々は、乳癌細胞株T47D、ZR75-1、MCF-7及びMDA-MB-231で他の研究者が報告したように、O-グリカンの非還元炭水化物末端を生じるようなレベルのグリコシルトランスフェラーゼを確認した。2つの別個のGal:3-O-スルホトランスフェラーゼ（１つはT-ハプテンGalβ1−>3GalNAcα-に特異的であり、他方はO-グリカン内のGalβ1−>4GlcNAc末端ユニットに強い嗜好性を示す）が、それぞれ乳癌及び結腸癌細胞株で発現される。我々は、我々の実験を卵巣癌細胞SW626 & PA-1及び肝癌細胞HepG2に広げた。我々の実験は、ムチンコア2四糖類Galβ1,4GlcNAcβ1,6(3-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-で作用することができるα1,2-L-フコシル-T、α2,3(N)シアリル-T、及び3-O-スルホ-Tは、Globo H抗原骨格Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-で作用することができることを示している。したがって、我々の実験は、ある種の癌関連糖脂質に属するシグナチャー炭水化物部分を特定することができる。略記すれば、本実験で以下が見出された：i）乳癌細胞株における潜在的腫瘍原性の基準としての3'-スルホ-T-ハプテン、並びに優勢な構造として3'-シアリルT-ハプテン及びLewisa；ii）結腸癌細胞に付随する固有構造として、3'-スルホLewisx、3-O-スルホGloboユニット及び3-フコシルキトビオースコア；iii）卵巣癌細胞でのポリラクトースアミン鎖及びT-ハプテンの有利な合成（それらは非常にわずかなシアリルトランスフェラーゼを含むため）；及びiv）肝癌細胞グリカンの優勢な構造として、6'-シアリルLacNAcユニット及び3'-シアリルT-ハプテン。したがって、本実験から、種々の癌細胞が固有のグリカンエピトープを発現し、したがって癌診断及び治療用の新規な標的を提供することは明白である。
【００３５】
グリカンの構造の変動性は、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の組織特異的調節、糖ヌクレオチドの利用可能性、及びグリカン伸張時の受容体中間体の酵素間競合によって指令される。4つの乳癌細胞株で発現される組換えMUCIプローブに関するMuller ＆ Hanisch（2002）の実験は、ゴルジ通過速度及びゴルジ区画内のタンパク質基質の局所解剖学のような後成的パラメーターは、最終的グリコシル化プロフィルに関してはグリコシルトランスフェラーゼの細胞内レパートリーほど重要ではないことを示している。いくつかのグリコシルトランスフェラーゼ及びGal3-O-スルホトランスフェラーゼは、Globo骨格ユニットと同様にムチンコア2四糖類を伸張させることができる。これら酵素の前記のような作用は、図10に示すように、癌関連末端グリカン構造の複雑さをもたらしえる。
Muller & Hanisch（2002）は、乳癌細胞株ZR75-1、MDA-MB-231、MCF-7及びT47DでMUC1融合タンパク質MFP6を発現させ、ヒドラジン分解によって遊離させ、続いて2-アミノベンザミドで標識した後で融合タンパク質のO-グリカンを調べた。グリコシルトランスフェラーゼ活性のパターンからグリカンシグナチャーを予測するという仮説をテストするために、先ず初めに我々は、多様な酵素の活性レベルを前記4つの細胞株と続いて表VIIに報告するように他の細胞株で調べた。おそらくこれらの酵素活性から生じると思われる炭水化物構造のレベルは表VIIIに提供される。Muller & Hanisch（2002）は、NeuAc2,3Galβ1,4GlcNAcα-ユニットは、T47D（68.6％)、MDA-MB-231（65.5％）及びZR-75-1（86.1％）で発現されるMFP6タンパク質の主要構造を構成することを見出した。我々の本実験もまた、α2,3-Sia-TI又はTIIは、α2,3-sia-TIVと比較してこれら全ての細胞株でもっとも優勢であることを示した。彼らはまた、MCF-7ではシアリル化炭水化物鎖はわずか5.2％のO-グリカン鎖を含むだけであることを観察した。本実験では、ZR-75-1（高いシアリルトランスフェラーゼ活性を示す）を除いて、T47D、MDA-MB-231及びMCF-7はほぼ同じレベルのα2,3-sia-TI又はTIIを発現し、ZR-75-1細胞抽出物はα2,3-Sia-T IV酵素（前記はNeuAc2,3Galβ1,4GlcNAcを構築し、さらに、Muller & Hanisch（2002）は、細胞株MDA-MB231及びZR-75-1でO-グリカンのオリゴ糖鎖にこの配列が存在するがMCF-7細胞株では存在しないこと報告した）を含むことが見出された。我々の酵素実験は、MCF-7はα2,3-Sia-T IVを含まないが、α1,2-L-FT及びα1,3-L-FT（それぞれFucα1,2Gal及びFucα1,3GlcNAc結合を生成することができる）を発現することを示した。したがって、これらのフコシルトランスフェラーゼの存在は、Fucα1,2Galβ1,3GalNAc及びGalβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc（前記構造はMCF-7ではO-グリカンの部分であると報告された（Muller & Hanisch, 2002））の存在を示唆した。α2,3-シアリル-T IV活性の欠如はMCF-7にLewisx構造が存在しないことを示唆し、このことは、別の報告（Kumamoto et al. 1998）と一致する。しかしながら、GalNAcのC-6位と結合したLewisx構造部分はMCF-7ではO-グリカンの部分であると報告されている。全体として、我々の実験でのα(2,3)-シアリル-T及びフコシルトランスフェラーゼの発現プロフィルは、Muller & Hanisch（2002）がこれらの乳癌細胞株について報告した構造と一致する。
【００３６】
スルホトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼは受容体の同じ部位について競合しえるので、スルホトランスフェラーゼを調べることが重要になった。乳癌細胞株の間で、DU4475は、極めてわずかなシアリルトランスフェラーゼ活性を有するが、Galβ1,4GlcNAcに特異的な高レベルの3-O-スルホトランスフェラーゼを有するのでユニークである。MCF-7及びZR-75-1はまたこの酵素を低レベルで発現することができる。1,3FTの存在は、これらの細胞株でスルホLewisxを生じるであろう。MCF-7はα1,2-L-FT及びα1,3-L-FT活性の両方を含む。前記活性はLewisy部分を生成することができるが、O-グリカンでは報告されていない（Muller & Hanisch 2002）。Gal3-O-スルホ-TはGalβ1,4GlcNAcに対するα1,2-L-FTの作用を妨げるように思われる。細胞株MDA-435/LCC6、MDA-435/LCC6MDR1、及びDU4475でさえスルホトランスフェラーゼ活性を有する（前記はT抗原のガラクトースのC-3位にスルフェートを取り込み、3'-スルホ-T-ハプテンを生じる）。我々は、コア2構造は乳房及び結腸細胞株でスルホトランスフェラーゼ活性を区別することを報告した最初の者であった（Chandrasekaran et al. 1997；Chandrasekaran et al. 1999）。Gal:3-O-スルホトランスフェラーゼの2つの別個のタイプが明らかにされた。1つはGalβ1,3GalNAcα-部分に特異的で乳癌細胞株で発現され、他方はムチンコア2のGalβ1,4GlcNAc分枝に嗜好性を示し結腸癌細胞株及びいくつかの乳癌細胞株に存在する（Chandrasekaran et al. 1999）。この関係では、コア2四糖類の改変類似体の利用可能性がこれら酵素のユニークさの決定に重要であることを証明した。結腸癌細胞株及びDU4475乳癌細胞株のスルホトランスフェラーゼの特異性は、3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-の存在を予測させる。他方、Sekoら（2001）がクローニングしたGal3スルホT-4は乳癌細胞株に存在し、Galβ1,4GlcNAcβ1,6 (3-O-スルホGalβ1,3)GalNAcα配列を合成する。これらのコア2構造は、α(2,3)-シアリルトランスフェラーゼ及びα(1,3)L-フコシルトランスフェラーゼのための受容体として機能し、より複雑な炭水化物構造を生成するであろう。結腸癌細胞のグリコシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼのレベル及び比較としての卵巣癌細胞株のそれは、表IXに記載されている。これらの酵素活性から生じる予想される炭水化物構造物のレベルの比較は表VIIIに提供される。我々がテストした3つの結腸細胞株は非常に低いα1,2-FT活性を有したが、α1,3-及びα1,4-FT活性についてはともに高いレベルを有し、α1,4-FT活性はColo205でもっとも高かった。それらはいずれもFTVI活性を発現し、そのレベルはLS180でもっとも高い。Colo205は、Galβ1,4GlcNAcβに対する3-O-スルホトランスフェラーゼ活性の非常に弱い発現を示した。反対に、高レベルの前記酵素がLS180及びSW1116に存在する。α2,3-sia-TIV及びα1,2-FTの活性レベル両方とも低いようであり、全ての事例で、コア2四糖類のGalβ1,4GlcNAcβアームはGal3-O-スルホトランスフェラーゼの作用を受け易く、3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβを生じることを示唆しているであろう。LS180及びSW1116の3'スルホLewisx決定基が優勢であることは、これらの細胞は高レベルのα1,3-L-フコシルトランスフェラーゼ活性を含むので予想されえる。酵素α2,3-sia-TI又はTII活性は、LS180及びSW1116で優勢である。3'スルホLewisx決定基の存在はまた、LS174T-HM7（結腸癌LS174Tの高度に転移性の亜株）によって発現���れるムチン糖タンパク質で示された（Capon et al. 1997）。ジ-O-硫酸化ムチンコア2四糖類の発現はDU4475に関しては有利であるように思われる。なぜならば前記は全てのシアリルトランスフェラーゼ活性を欠くからである。我々のこの発見は、これら酵素の研究のために十分に規定された受容体の威力を示している。Brownら（2003）はGlyco-V1ジーンチップマイクロアレーを用いてLS180細胞由来mRNAを分析し、α2,3-Sia-TIVのみを検出した。対照的に、本実験では、LS180だけでなく他の結腸細胞株Colo205及びSW1116でも過剰なシアリルトランスフェラーゼ活性としてα2,3-Sia-TI又はTIIが特定された。フコシルトランスフェラーゼ活性に関する我々のこのデータと一致して、彼らはまたLS180細胞でFTIII及びFTVIを検出した。しかし、フェチュイントリアント（triant）シアリル糖ペプチドが結腸癌細胞株のFTのための良好な受容体として作用することを考慮するとき、結腸癌細胞でFTVIIが存在することを排除することはできなかった。Klemmerら（2003）はオリゴヌクレオチドマイクロアッセイを用いて、ヒト結腸組織でのグリコシルトランスフェラーゼ発現を調べた。彼らのジーンチップU95Aに存在する39のグリコシルトランスフェラーゼの限定的な分析によって、シアリルトランスフェラーゼα2,6-Sia-TI、α2,3-Sia-TIV、フコシルトランスフェラーゼFTIII、FTVI及びFTVIII（α1,6-L-FT）、並びにGalNAcT-1（ポリペプチド：GalNAc-T）及びβ1,4GalT-2もまた、結腸の癌形成及び転移における炭水化物の異常な生合成の原因でありえる。かれらの発見は、結腸癌細胞株について得られたグリコシルトランスフェラーゼ活性のほとんどのパターンで、本データと適合するように思われる。
【００３７】
本発明にしたがって、我々はまた、コア2分枝構造及びGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-配列（Globo H前駆体として糖脂質に存在する）を用いて、α(2,3)Sia-T、Gal-3-Oスルホ-T及びα1,2-Fuc-Tの特異性を解明した。Globo H抗原は、当初Hakomoriおよび共同研究者によってヒト乳癌細胞株で正常が決定された（Bremer et al. 1984）。ネズミMoAb MBr1を用いた免疫染色は、前立腺癌及び小細胞肺癌を含む他のヒトの組織でこの抗原の存在を示した。我々は、LNCaP細胞のα1,2-Fuc-Tは、ムチンコア2のGalβ1,3GalNAcβアームに対するその活性と比較して、ムチンコア2のGalβ1,4GlcNAcβユニットで、Globo H前駆体三糖類と同様により効率的に（4倍）作用することを報告した（Chandrasekaran et al. 2002）。別の実験では、我々は、3つのクローン化Gal3スルホトランスフェラーゼの特異性を調べた（Chandrasekaran et al. 2004）。Galβ1,4GlcNAcβのガラクトースのC-3位にスルフェートを取り込むことが知られているGal3スルホT-2は、これらの基質に対して、α1,2-Fuc-Tトランスフェラーゼ及びα2,3-Sia-TIVと同様な態様で作用した。すなわち、前記は、Globo三糖類及びコア2四糖類の両方に対して同じ効率で作用した。Gal-3-スルホT4はまたGlobo H前駆体を、Galβ1,3GalNAcα-と同じ程度に利用することができる。α2,3-Sia-TI又はTIIは、ムチンのNeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc-を生成し、さらにまたGlobo H前駆体で作用してNeuAcα2,3Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα−>配列を生じる。α2,3-sia-TIIは、NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα,3Galβ1,4GlcβCerの生合成で必要とされることが報告された（Saito et al. 2003；Maccioni et al. 1999）。α2,3-Sia-TIVの特異性に関してはいくつかの矛盾が存在する（Kono et al. 1997）。いくつかのグループは、この酵素は糖脂質中のNeuAc2,3Galβ1,3GalNAcβの合成に必要であることを報告し、一方、他のグループは、前記は、NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβを生成し、フコシル化に続いてSLexを生じることを提唱している（Kitagawa, 1994；Sasaki et al. 1993）。我々の実験は、ムチンコア2 Galβ1,4GlcNAcユニットとともにGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-配列に対してα2,3-Sia-TIVの特異性を明確に示した。
【００３８】
我々の実験は、癌細胞のシグナチャーとして、3つのタイプの硫酸化炭水化物エピトープ3-O-スルホGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-、3-O-スルホGalβ1,3GalNAcα-、及び3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβを示している。DU4475のGalβ1,4GlcNAcβ-に対する3-O-スルホ-T活性は、MCF-7及びZR-75-1（前記はこの活性を発現するただ2つの他の乳癌細胞株である）のそれの18倍である。これらの結果は、シグナチャー炭水化物構造はDU4475によって3'-スルホLewisxとして発現されることを示していよう。腫瘍形成性乳癌細胞株MDA-MB-435/LCC6及びMDA-MB-435/LCC6MDR1は、腫瘍非形成性親細胞株MDA-MB-435Sにおけるそのレベルと比較してGalβ1,3GalNAcα-ユニットに特異的な約9倍及び約4倍のGal:3-O-スルホトランスフェラーゼ活性を示すことが観察されたのは興味深い。さらにまた、前者の細胞株は、後者の細胞株と比較したとき、4−5倍のGlcNAc:β1,4Gal-T活性、及びより低いシアリルトランスフェラーゼ活性を含む。すなわち、Galβ1,3GalNAcα-に作用するGal:3-O-シアリルトランスフェラーゼの同時低下を伴うGal:3-O-スルホトランスフェラーゼの増加は、乳癌細胞株の腫瘍形成潜在能力と関係を有するように思われる。MDA-MB-435シリーズにおけるFT活性の欠如は、3-O-スルホGalβ1,3GalNAcα-が、3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβと同様に腫瘍形成性乳癌細胞のシグナチャー構造でありえることを示唆していよう。
【００３９】
比較のために、2つの卵巣癌細胞株SW626及びPA-1（表IV）の酵素活性レベルを調べ、予想される炭水化物構造を表IIIに提示する。これらの細胞株は、結腸癌細胞株と比較してほんの少量のシアリルトランスフェラーゼ及びグリカンスルホトランスフェラーゼ活性並びに顕著に低レベルのα1,3-L-フコシルトランスフェラーゼ活性を含み、ポリラクトサミン鎖の生合成はこれらの細胞株では極めて有利であることを示している。肝癌細胞株HepG2は、α2,6-シアリル化N-グリカン及びα2,3-シアリルT-ハプテンを合成することができるようである。顕著なレベルのα1,6-L-FT活性の存在を除いて、HepG2では他のFT活性は極めて少ないか又は存在せず、したがってα2,6(N)シアリルトランスフェラーゼ並びにα1,2及びα1,3/4-L-フコシルトランスフェラーゼの発現における逆の関係の存在が示唆されるという観察は興味深い。α1,6-L-FT活性のレベルから、T47D細胞株と比較したとき、他の乳癌細胞株BT20、MCF-7及びMDA-MB-435シリーズは、それぞれ約2倍、3倍及び4倍、さらに残りの細胞株、すなわちMDA-MB-231、DU4475及びZR-75-1は約5倍のα1,6-フコシル化N-グリカンを発現することは明白である。結腸癌細胞Colo205、LS180及びSW1116は、ほぼ同じレベルのα1,6-FT活性を含み、同じ量のα1,6-フコシル化N-グリカンの存在を示唆する。シアロ及びアシアロフェチュイントリアンテナリー糖ペプチドは両方とも、結腸癌細胞株のフコシルトランスフェラーゼのための良好な受容体として機能し、シアリルLewisx及びシアリルLewisaの円滑な合成を示唆する。アンクロドもまた、シアリルLewisaの形成をさらに示す受容体として利用した。したがって、Colo205、LS180及びSW1116はシアリルLewisa、シアリルLewisx及びシアリルT-ハプテンを発現しえる。
【００４０】
我々は、乳房腫瘍と結腸の腫瘍とをグリコシルトランスフェラーゼ活性について比較した（表V参照）。乳房腫瘍と比較した結腸腫瘍は18倍のα1,3-FT活性を有していた。乳房腫瘍のα1,4-FT活性は比較的わずかであるが、顕著なレベルのα1,2-FT活性が存在した。したがって、これらのFT活性は、Muller ＆ Hanischが報告したようにMCF-7のMUC1融合タンパク質由来のO-グリカン鎖を反映した。MCF-7、ZR-75-1及びDU4475でGal:3-O-スルホトランスフェラーゼを利用するGalβ1,4GlcNAcの存在とは対照的に、Galβ1,3GalNAcに特異的な他のスルホ-Tがこの乳房腫瘍で発見された。我々は、MDA-MB-435シリーズ及びDU4475、並びに初期の実験の乳房腫瘍標本の多数で後者の酵素を確認した（Chandrasekaran et al. 1999）。
腫瘍形成性細胞株MDA-435/LCC6及びMDA-435/LCC6MDR1は、腫瘍非形成性親細胞株MDA-MB-435Sと比較して、4−5倍のGlcNAc:β1,3/4Gal-T活性を発現し、他の細胞株と比較して極めて少量のシアリルトランスフェラーゼ活性とともに低レベルのGlcNAcβ1,3/Gal-T活性を発現するDU4475は、高レベルのGlcNAc:β1,3/4Gal-T活性とともにαGalNAc:β1,3Gal-T活性を含むという観察は興味深い。この関係では、乳房腫瘍の状態とこのデータを比較することは道理にかなう。結腸腫瘍標本と比較して、乳房腫瘍標本は、高レベルのGlcNAc:β1,3/4GalNAc-T並びに低レベルのα2,3(O)ST及びαGalNAc:β1,3Gal-T活性を示した。
結腸腫瘍組織におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性の我々の分析（表IV参照）は、結腸癌細胞のフコシルトランスフェラーゼ活性パターンと類似するパターンがこの組織で提示されることを示した。4つの異なる受容体を用いて測定した（表III参照）腫瘍標本のα1,2-FT活性レベルから、Globo系受容体（すなわちGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me及びD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me）は、腫瘍のα1,2-FTに対してコア1受容体（Galβ1,3GalNAcα-O-Al及びGalβ-O-Bn）よりも良好な受容体であることが明らかになった。さらにまた、結腸癌細胞株及び結腸腫瘍組織における、Galβ1,4GlcNAcに特異的なGal:3-O-スルホトランスフェラーゼのα2,3(N)シアリルトランスフェラーゼを越える優位性は、3-スルホLewisx末端炭水化物が結腸癌関連シグナチャー炭水化物構造であることを示唆していよう。
【００４１】
さらにまた、乳癌細胞株に類似する乳房腫瘍組織はFTVI活性をほぼ欠いていたが、結腸腫瘍組織は有意なレベルのこの活性を含み、したがって結腸癌細胞株と類似するという観察は極めて興味深い。3-フコシルキトビオースコアを有するN-グリカンは、結腸癌関連シグナチャー炭水化物構造でありえよう。
α2,3(O)ST活性は、調査した2つの腫瘍組織とともに乳癌及び結腸癌細胞株において、全シアリル化活性の70−90％の範囲にあるもっとも優勢なシアリルトランスフェラーゼであるということを、本発明は詳しく記載してきた。我々はまた、クローン化α2,3(O)ST（STS GalII）は、T-ハプテン（Galβ1,3GalNAcα-）及びGlobo骨格（Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-）だけでなく、LacNac 1型（Galβ1,3GlcNAcβ-）もまた非常に効率的にシアリル化できることを見出した（Chandrasekaran et al. 投稿中）。ヒト乳房及び結腸の腫瘍組織のGal:3-O-スルホトランスフェラーゼ（それぞれGalβ1,3GalNAcα-及びGalβ1,4GlcNAcβ-に作用する）は、Galβ1,3GlcNAcβ-には不完全に作用することを以前に我々は示した（Chandrasekaran et al. 1997；Chandrasekaran et al.）。したがって、3'-シアリルLewisa及び3'-スルホトランスフェラーゼLewisxの形成は結腸癌では有利な事象であろうと思われる。さらにまた、乳癌及び結腸癌細胞におけるα2,3(O)ST活性の優位性は、これらの細胞におけるムチンコア1鎖（Galβ1,3GalNAcα-O-Ser/Thr）の伸張の可能性を排除する。しかし、卵巣癌細胞は極めてわずかな量のシアリルトランスフェラーゼ活性を発現するので、そのような可能性は卵巣癌細胞では存在するように思われる。
【００４２】
糖結合物の生合成及び存在しているグリカンの構造に関する情報は、グリコシルトランスフェラーゼ活性パターンの解釈に役立つ。例えば、α2,6-Sia-TIは、N-グリカンのα1-3結合マンノース分枝に存在するLacNAc II型グリカン分枝を嗜好する（Joziasse et al.）。コア2のβ1,6GlcNAc-T活性の欠如は、伸張コア1を有するO-グリカンをもたらすことができる（Ellies et al. 1998）。Lea、Leb及びシアリルLeaは、GalNAcαのC-3分枝に分布することが知られている。3-O-硫酸化Lewisa四糖類に特異的なモノクローナル抗体は、スルホムチン（結腸粘膜の高分子量糖タンパク質）と結合することができ、スルホムチンの部分として3-O-スルホGalβ1,3(Fucα,4)GlcNAcβ1,3,Galβ1,3が存在することを示唆している（Yamachika et al. 1997）。結腸癌におけるこのエピトープの減少が報告され、一方、Lewisxの発現は変化しない（Yamachika et al. 1997）。したがって、本発明によれば、鎖を終止させる酵素、例えば癌細胞及び組織由来のフコシル-、N-アセチルガラクトサミニル、シアリル-及びスルホトランスフェラーゼの活性及び特異性は、オリゴ糖の生合成に関する情報と併せて、公知及び未確認癌関連抗原の外側端に存在する炭水化物エピトープを決定し、免疫学的標的として選択するために役立つであろう。
結腸癌細胞株Colo205、肝癌細胞株HepG2、乳癌細胞株BT20及びMCF-7、及び卵巣テラトカルシノーマ細胞株PA-1を最少必須培養液で増殖させた。結腸癌細胞株LS180及び乳癌細胞株DU4475はRPCI1640で増殖させ、結腸癌細胞株SW1116、卵巣癌細胞株SW626、乳癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-435/LCC6及びMDA-435/LCC6MDRIはリーボビッツ（Leibovitz's）のL-15培養液で増殖させた。全ての培養液は、10％ウシ胎児血清及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）及びアンホテリシンBを、DU4475を除き（前記は懸濁物として増殖させた）アメリカ菌培養収集所の推奨する条件下で250mLのT-フラスコに補充した。MDA-435/LCC6及びMDA-435/LCC6MDRIは本研究所のDr. Ralph Bernackiによって提供された。細胞は、2％トリトンX-100を含む0.1Mトリス-マレイン酸（pH7.2）とともに全ガラス製手動ダウンスホモジナイザーを用いて均質化した。ホモジネートを16,000gにて1時間4℃で遠心した。タンパク質は、標準物としてBSAを用い、BCAマイクロ法（Pierce Chemical Co.）によって上清について測定した。必要な量の抽出緩衝液を添加することによって上清を5mgタンパク質/mLに調整し、続いて-20℃で使用まで凍結保存した（Chandrasekaran et al. 2003）。抽出物の一部分（10μL）をデュープリケートでアッセイに用いた。
【００４３】
ロスウェルパーク癌研究所（Roswell Park Cancer Institute）での手術中に結腸腫瘍組織（CC9338）及び乳房腫瘍組織（BC9400）を入手し、1時間以内に-70℃で凍結保存した。前記組織を0.1Mトリスマレイン酸（pH7.2）0.1％NaN3の4容積を用いて4℃で均質化した。トリトンX-100の濃度を2％に調整した後、Speci-Mix（Thermolyne）を用いてこれらのホモジネートを低温室で1時間混合し、続いて20,000gにて1時間4℃で遠心した。脂肪を含まない清澄な上清を使用まで-20℃で凍結保存した。この抽出物の10μL部分をデュープリケートでアッセイに用いた。細胞溶解物のグリコシルトランスフェラーゼ活性は、受容体及び放射能標識供与体と前記溶解物を下記に詳述する反応条件下で混合し、続いて陰イオンクロマトグラフィー又は疎水性クロマトグラフィーを用いて放射性生成物から未反応供与体を分離することによって決定した。全ての事例で、単離生成物の放射能含有量を3a70シンチレーションカクテル（Research Products International, Mount Prospect, IL）及びベックマンLS6500シンチレーションカウンターを用いて測定した。各アッセイのコントロールは受容体を除く全てを有する反応混合物を含んでいた。生成物の放射能からコントロールのそれを差し引いて、表に提示した結果を得た。全アッセイはデュープリケートで実施した。デュープリケートでの実施により得られた結果は5％を超えて変動することはなかった。
【００４４】
グリコシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ活性を測定するために用いられた受容体は表Iに提供されている。以下は個々の酵素アッセイのための条件である。全ての事例で反応温度は37℃であった。α2,3-及びα2,6-シアリルトランスフェラーゼ（ST）アッセイ反応は、総体積20μLに100mMのカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）、7.5mMの受容体、CMP-［9-3H］NeuAc（典型的には0.2μCi）及び10μLの細胞抽出液を含む混合物中で2時間進行させた（Chandrasekaran et al. 1995）。デュープリケートでのβGlcNAc:β1,4Gal-T及びαGalNAc:β1,3Gal-Tアッセイ混合物は、0.1MのHepes-NaOH（pH7.0）、7mMのATP、20mMの酢酸マンガン、1mMのUDP-Gal、UDP[14C]Gal（0.05μCi；327mCi/mmol；Amersham）、0.5mM（特段の記載がなければ）の受容体及び酵素を20μLの総体積中に含んでいた。前記を4時間インキュベートした（Chandrasekaran et al. 2001）。デュープリケートのβGlcNAc:β1,4GalNAc-Tアッセイ混合物は、0.1MのHepes-NaOH（pH7.0）、7mMのATP、20mMの酢酸マンガン、UDP[3H]GalNAc（0.20μCi；7.8Ci/mmol；New England Nuclear Corp.）、7.5mM（特段の記載がなければ）の受容体及び酵素を20μLの総体積中に含み、4時間インキュベートされた（Chandrasekaran et al. 2001）。
α1,2、α1,6、α1,3及びα1,4-フコシルトランスフェラーゼ（FT)アッセイ反応は、50mMのヘペス（Hepes）緩衝液（pH7.5）、5mMのMnCl2、7mMのATP、3mMのNaN3、3mMの合成受容体又は40μgのフェチュイン系受容体、0,05μCiのGDP[14C]Fuc（290mCi/mmol）及び10μLの細胞抽出物を20μLの総体積中に含んでいた（Chandrasekaran et al. 1996）。スルホトランスフェラーゼ（スルホT)アッセイ反応は2時間を要し、100mMのトリス-マレイン酸（pH7.2）、5mMの酢酸マグネシウム、5mMのATP、10mMのNaF、10mMのBAL、7.5mMの受容体、0.5μCiの[35S]PAPS（比活性2.4Ci/mmol）及び10μLの細胞抽出物を30μLの総体積中に含んでいた（Chandrasekaran et al. 2004）。
Dowex-1-Cl又はSep-Pak C18カートリッジを用いて、反応混合物から放射能標識生成物を単離した。GalT、GalNAc-T及びFTアッセイのためには、インキュベーション混合物を1mLの水で稀釈し、1mLのDowex-1-Clカラムを通過させた（Chandrasekaran et al. 1996；Chandrasekaran et al. 2001）。前記カラムを2回1mLの水で洗浄した。ブレークスルー及び洗浄水は、中性受容体で形成された[14C]-ガラクトシル化又は[14C]-フコシル化生成物を含んでいた。3mLのNaCl（0.1M）を用いて、水溶出後にシアリル化受容体から[14C]-フコシル化生成物を得た。シアリルトランスフェラーゼアッセイのためには、ベンジルグリコシド由来の放射性生成物を疎水性クロマトグラフィーによってSep-Pak C18カートリッジ（Waters, Milford, MA）で分離し、生成物の溶出は3mLのメタノールで実施した（Palcic et al. 1998)。スルホトランスフェラーゼアッセイのために、[35S]-硫酸化化合物のDowex-1-Cカラムからの溶出は、3mLのNaCl（0.2M）によって達成した（Chandrasekaran et al. 2004）。
【００４５】
【表１−１】
2009511082.tif 000002
【００４６】
【表１−２】
2009511082.tif 000003
【００４７】
表II：クローン化α2,3(O)STによる固有のシアリル化は、関連する酵素の存在下でα2,3(O)ST活性を測定することが可能な特異的受容体の特定をもたらす
2009511082.tif 000004
ND：決定せず
8-11：これらの反応生成物の質量分析は表VI及び補充データで実施された。
【００４８】
表III：ムチンコア2系化合物に対するシアリルトランスフェラーゼ活性
2009511082.tif 000005
ND：決定せず
100％は以下を表す；a：30440cpM、b：38140cpM、c：39200cpM、d：30100cpM、
12, 19, 25：これらの反応生成物の質量分析は表VI及び補充データで実施された。
【００４９】
表IV：クローン化α2,3(O)STによるムチンコア2系化合物の固有のシアリル化
2009511082.tif 000006
a：[9-3H]シアリル化生成物はBioGelP2カラムクロマトグラフィーで定量した。
b：Sep-Pak C18分画方法
1：この反応生成物の質量分析は表VI及び補充データで実施された。
【００５０】
表V：改変末端β1,3-ガラクトシル残基を含む一連の合成化合物を受容体として利用することによるクローン化α2,3(O)STの固有の触媒能力の識別
2009511082.tif 000007
a：反応混合物（20μL）は、150μMのCMP-NeuAc中に 0.2μCiのCMP[9-3H]NeuAcを含んでいた。
13-16：これらの反応生成物の質量分析は表VI及び補充データで実施された。S4（表VI）は生成物14を生じる合成受容体である。
【００５１】
【表２−１】
2009511082.tif 000008
【００５２】
【表２−２】
2009511082.tif 000009
【００５３】
【表２−３】
2009511082.tif 000010
【００５４】
表VII：癌細胞株で酵素をアッセイするために用いられる受容体
2009511082.tif 000011
【００５５】
【表３】
2009511082.tif 000012
【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
2009511082.tif 000014
【００５８】
表XI：3つの異なる組織におけるシアリル-、フコシル-、β-ガラクトシル-、β-N-アセチルガラクトサミニル-及びグリカン:3-O-スルホ-トランスフェラーゼ活性
活性：組織抽出物の1mgタンパク質によって触媒される、放射性糖又は[35S]スルフェートの取り込み（CPMｘ10-3）
2009511082.tif 000015
【００５９】
【表６】
2009511082.tif 000016
【００６０】
本明細書で用いられる略語は以下のとおりである：
AA/CP：アクリルアミドコポリマー
Al：アリル
BAL：British anti-Lewisite
Bn：ベンジル
BSA：ウシ血清アルブミン
CPM：カウント/分
FetTA：フェチュイントリアンタネリー（Fetuin triantannery）
FT：フコシルトランスフェラーゼ
GlyCAM-1：グリコシル化依存細胞粘着分子-1
Globo骨格：Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-
GP：糖ペプチド分子-1
LacNAc：Galβ1,4GlcNAc
LacNAc 1型：Galβ1,3GlcNAc
LacNAc 2型：Galβ1,4GlcNAc
Lewisa：Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc
Lewisb：Fucα1,2Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc
Lewisx：Fucα1,2Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc
Me：メチル
PAPS：3'-ホスホアデノシン,5'-ホスホスルフェート
PNA：落花生アグルチニン
PSGL-1：P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1
RCA：リシヌス・コムニス（Ricinus communis）アグルチニン
RM：反応混合物
Siglec：免疫グロブリン上科のシアリン酸結合レクチン
ST：シアリルトランスフェラーゼ
T-ハプテン：Galβ1,3GalNAcα-
TLC：薄層クロマトグラフィー
WGA：コムギ胚芽アグルチニン
【００６１】
参照することにより背景技術として組み込まれる参考文献
2009511082.tif 000017
2009511082.tif 000018
2009511082.tif 000019
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図1Aは、ムチンコア2受容体、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（白丸、実線）、3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（黒丸、実線）及び3-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（黒丸、点線）に対するクローン化α2,3(O)STの作用により生じた[14C]シアリル化生成物についてバイオゲル（Biogel）P2カラム-溶出プロフィルを示す合成図である。CMP[14C] NeuAcは、バイオゲルP2カラムから56−64mL（ピークは60mL）で出現した。図1Bは、図1Aに示した下記受容体から単離した[14C]シアリル生成物について、薄層クロマトグラフィー（溶媒系：1-プロパノール/NH4OH/H2O 12/2/5 v/v）の後のオートラジオグラフィーを示す：3-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（レーン1）、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（レーン2）及び3-O-スルホGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（レーン3）。
【図２】シアリルLexを有するムチンコア七糖類（PSGL-1）、GalNAc Lexを含むコア2六糖類（潜在的セレクチンリガンド）、6'-シアリル,6-スルホLacNacを含む潜在的Siglecリガンド、及び6-スルホシアリルLex(GlyCAM-1)を有するコア2オリゴ糖の提唱される生合成経路を示す。記号：小白四角＝αGalNAc；黒四角＝GlcNAc；黒丸＝Gal；黒ダイヤ＝NeuAc；大白四角＝Fuc、及びS＝スルホ基。
【図３】クローン化α2,6(N)ST（パネルA）、α2,3(N)ST（パネルB）、α2,3(O)ST（パネルC）及びLNCaPα2,3(O)ST（パネルD）のための、ムチンコア2を主剤とする四糖類受容体の種々の濃度におけるシアリルトランスフェラーゼの活性を示す。A及びBで用いられる受容体は、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（黒丸、実線）及び4-O-MeGalβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（白丸、実線）である。パネルC及びDでは、受容体は、Galβ1,4GlcNAcβ1,6(Galβ1,3)GalNAcα-O-Bn（黒丸、実線）及びGalβ1,4GlcNAcβ1,6(4-O-MeGalβ1,3)GalNAcα-O-Bn（白丸、実線）である。パネルCの点線は、供与体CMP-NeuAcが反応混合物中でより高濃度で用いられたときの酵素反応データを示す。
【図４】2つの溶媒系、1-プロパノール/NH4OH/H2O（12/2/5）（パネルA、1回展開）及びCHCl3/CH3OH/H2O（5/4/1）（パネルC、2回展開）における、以下の非放射能受容体の薄層クロマトグラフィーを示す：レーン1．3-O-MeGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、レーン2．Fucα1,2Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、レーン3．3-O-スルホGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、及びレーン4．Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Al。前述の受容体（１から4まで同じ順序）に対するクローン化α2,3(O)STの作用によって得られた[9-3H]シアリル化合物の薄層クロマトグラフィーを示す。パネルBの溶媒は1-プロパノール/NH4OH/H2O（12/2/5）（1回展開）であり、パネルDではCHCl3/CH3OH/H2O（5/4/1）であった。
【図５】以下に対するクローン化α21,3(O)STの作用に続いて得られた[9-3H]シアリル化生成物のWGA-アガロースクロマトグラフィーを示す：A．3-O-スルホGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、B．3-O-MeGalβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、C．Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Al、D．Fucα1,2Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn、E．β-N-アセチルヘキソースアミダーゼの存在下及び非存在下でインキュベートした上記Bの生成物の混合物、F．β-N-アセチルヘキソースアミダーゼの存在下でインキュベートした上記Cの生成物、G．β-N-アセチルヘキソースアミダーゼの存在下でインキュベートした上記Dの生成物、全ての泳動において、溶出は、10番目の分画の後ろで0.5MのGlcNAcを用いて実施された。
【図６】α-GalNAcとβ1,3結合した改変ガラクトシル残基を含む受容体の種々の濃度におけるクローン化α2,3(O)STの活性を示す。A．D-Fucβ1,2Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn（黒丸、実線）、4-O-MeGalβ1,3GalNAcα-O-Bn（白丸、実線）、4-FGalβ1,3GalNAcα-O-Bn（黒三角、実線）及びD-Fucβ1,3GalNAcα-O-Bn（白四角、実線）について受容体濃度対酵素活性。B．パネルAのデータのLineweaver-Burkeプロット。C．Galβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me（白四角、実線）、3-O-スルホGalβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me（黒三角、実線）、D-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me（白丸、実線）、及び3-O-スルホD-Fucβ1,3GalNAcβ1,3Galα-O-Me（黒丸、実線）について受容体濃度対酵素活性。D．パネルCのデータのLineweaver-Burkeプロット。E．Fucα1,2Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα-O-Bn（CMP-NeuAc：150μM）（白四角、実線）、3-O-MeGalβ1,3(GlcNAccβ1,6)GalNAcα-O-Bn（CMP-NeuAc：0.3μM）（小白四角、実線）、及び3-O-MeGalβ1,3(6-O-Me)GalNAcα-O-Bn（CMP-NeuAc：0.3μM）（黒四角、実線）について受容体濃度対酵素活性。F．パネルEのデータのLineweaver-Burkeプロット。
【図７】同じESI-MSのCID条件下における、表VIの化合物6のフラグメント化（A）、化合物23のフラグメント化（B）、化合物7のフラグメント化（C）、及び化合物18のフラグメント化（D）を示す。フラグメントには、Domon ＆ Costello（42）が提唱したスキームにしたがって注釈が付されている。
【図８】表VIの化合物6（A）、化合物23（B）、化合物7（C）及び化合物18（D）から得られた、m/z 604での二重荷電分子種[M-2H]2-のMS2スペクトルを示す。
【図９】表VIの化合物6から得られたm/z 917でのY'2イオン（A）、化合物23又は化合物7から得られたm/z 917でのY3イオン又はY'2イオン（B）、及び化合物18から得られたm/z913でのY3イオン（C）のMS3スペクトルを示す。
【図１０】ムチンコア2及びGlobo骨格に対するグリコシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ作用についての種々の潜在的競合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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