(57)【要約】本発明は、被験体の生存能力を高めることに加え、無呼吸を誘導し、かつショックを処置するために活性化合物を使用することに関する。本発明には、生存能力を高めるため、およびこれらの効果を達成するための、組成物、方法、製品および装置が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化合物の有効量を被験体に提供する段階を含む、被験体において無呼吸を誘導するための方法。
【請求項２】
活性化合物が酸素アンタゴニストである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
活性化合物がカルコゲニドまたはカルコゲニド塩である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
活性化合物が、式I、式II、式III、または式IVの化学構造を有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験体に、式I、式II、式III、または式IVの化学構造の前駆体が提供される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
活性化合物が、式II（a）、式II（b）、または式II（c）の化学式を有する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
少なくとも一つの活性化合物が（c）群に由来する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
活性化合物が、式III（a）、式III（b）、式III（c）、式III（d）、式III（e）、式III（f）、式III（g）、または式III（h）の化学式を有する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
活性化合物が硫黄を含む、請求項3記載の方法。
【請求項１０】
活性化合物がセレンを含む、請求項3記載の方法。
【請求項１１】
カルコゲニドまたはカルコゲニド塩が、H2S、Na2S、NaHS、K2S、KHS、Rb2S、Cs2S、(NH4)2S、(NH4)HS、BeS、MgS、CaS、SrS、およびBaSからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項１２】
被験体に、活性化合物の組み合わせが提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
被験体における、傷害、手術、外傷の発生もしくは進行、または大量出血の、前、最中、または後に、活性化合物が被験体に提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
傷害が大量出血を伴う、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
傷害が外因性の物理的起源に由来する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
活性化合物が、手術もしくは傷害の前、または疾患の発生もしくは進行の前に提供される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
活性化合物が、傷害もしくは手術、または疾患の発生もしくは進行の、最中または後には提供されない、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
被験体が、出血しているかまたは出血のリスクを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
被験体から血液サンプルを得る段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
硫化水素曝露に関して血液サンプルを評価する段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
処置を必要とする被験体を同定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を提供する、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
患者に、硫化水素を約5分間またはそれ未満提供する、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を、約5分間またはそれ未満提供する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
患者に、硫化水素を約3分間またはそれ未満提供する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
活性化合物を、気体、半固体液体、液体、または固体として被験体に提供する、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
被験体に、活性化合物の少なくとも一つを気体として提供する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
被験体が、酸素アンタゴニストの一つに約10秒間〜約1時間の期間曝露される、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
被験体が、吸入、注射、カテーテル法、液浸、洗浄、灌流、局所適用、吸収、吸着、または経口投与を通じて活性化合物を提供される、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
被験体が、生物学的被験体に対する、静脈内、皮内、動脈内、腹膜内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、髄腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹膜内、眼球内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所、局部、吸入、注射、注入、持続的注入、局所灌流、カテーテルを介する、または洗浄を介する投与によって、活性化合物を提供される、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
処置を必要とする被験体を同定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
被験体から血液サンプルを得る段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
任意の変化に関して血液サンプルを評価する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
変化が色の変化である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
活性化合物由来の毒性に関して被験体をモニターする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３６】
活性化合物が、生物学的被験体に薬学的組成物として提供される、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
活性化合物の有効量を、傷害、疾患の発生もしくは進行、または死亡の前に被験体に提供する段階を含む、傷害、疾患の発生もしくは進行、または死亡から生物学的被験体を保護する方法であって、該有効量が生物学的被験体においてスタシス(stasis)を誘導することができる量より少ない量である、方法。
【請求項３８】
生物学的被験体が大量出血している、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
出血している生物に活性化合物の有効量を提供して死を防止する段階を含む、生物が出血により死亡するのを防止する方法。
【請求項４０】
生物が出血性ショックに至る、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
被験体に対する気体様カルコゲニド、その塩またはプロドラッグの有効量を該被験体に投与する段階を含む、被験体において無呼吸を誘導するための方法。
【請求項４２】
カルコゲニドが硫黄を含有する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
カルコゲニドが気体である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
カルコゲニドがH2Sである、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
被験体が、出血しているかまたは出血のリスクを有する、請求項41記載の方法。
【請求項４６】
被験体がショックのリスクを有する、請求項41記載の方法。
【請求項４７】
被験体から血液サンプルを得る段階をさらに含む、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
硫化水素曝露に関して血液サンプルを評価する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
処置を必要とする被験体を同定する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項５０】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を提供する、請求項41記載の方法。
【請求項５１】
患者に、硫化水素を約5分間またはそれ未満提供する、請求項41記載の方法。
【請求項５２】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を、約5分間またはそれ未満提供する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
患者に、硫化水素を約3分間またはそれ未満提供する、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
気体様硫化水素の有効量を提供する段階を含む、患者における出血性ショックを処置するための方法。
【請求項５５】
噴霧器を用いて患者に硫化水素を提供する、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を提供する、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
患者に、硫化水素を約5分間またはそれ未満提供する、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を、約5分間またはそれ未満提供する、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
患者に、硫化水素を約3分間またはそれ未満提供する、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
患者に、硫化水素を持続的に提供する、請求項54記載の方法。
【請求項６１】
患者に、単回用量の硫化水素を提供する、請求項54記載の方法。
【請求項６２】
患者が硫化水素を吸入することによって、硫化水素が提供される、請求項54記載の方法。
【請求項６３】
被験体に対する気体様カルコゲニド、その塩、またはプロドラッグの有効量を該被験体に提供する段階を含む、被験体におけるショックを予防または処置するための方法。
【請求項６４】
カルコゲニドが硫黄を含有する、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
カルコゲニドが気体である、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
カルコゲニドがH2Sである、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
被験体が、出血しているかまたは出血のリスクを有する、請求項63記載の方法。
【請求項６８】
被験体が出血性ショックのリスクを有する、請求項63記載の方法。
【請求項６９】
被験体が、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグを提供された後に無呼吸となる、請求項63記載の方法。
【請求項７０】
被験体がカルコゲニド、その塩またはプロドラッグを提供された後に、骨格筋運動が停止する、請求項63記載の方法。
【請求項７１】
被験体から血液サンプルを得る段階をさらに含む、請求項67記載の方法。
【請求項７２】
硫化水素曝露に関して血液サンプルを評価する段階をさらに含む、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
処置を必要とする被験体を同定する段階をさらに含む、請求項63記載の方法。
【請求項７４】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を提供する、請求項63記載の方法。
【請求項７５】
患者に、硫化水素を約5分間またはそれ未満提供する、請求項63記載の方法。
【請求項７６】
患者に、3,000 ppmより多い硫化水素を、約5分間またはそれ未満提供する、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
患者に、硫化水素を約3分間またはそれ未満提供する、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
患者に、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグの単回用量を提供する、請求項63記載の方法。
【請求項７９】
患者が、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグを含む組成物を吸入することによって、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグを提供される、請求項63記載の方法。
【請求項８０】
カルコゲニド、その塩またはプロドラッグが含まれない気体様組成物を、続いて患者に提供する段階をさらに含む、請求項63記載の方法。
【請求項８１】
気体様組成物が酸素を含む、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
以下の段階を含む、生物物体の生存能力を高めるための方法：
（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および
（b）生物物体を低酸素状態に置く段階。
【請求項８３】
スタシスが段階（a）の最中またはそれに続いて誘導される、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
スタシスが段階（a）の最中またはそれに続いて誘導されない、請求項82記載の方法。
【請求項８５】
段階（b）が段階（a）に続いて行われる、請求項82記載の方法。
【請求項８６】
低酸素状態が約5％O2を含む、請求項82記載の方法。
【請求項８７】
生物物体に、少なくとも一つの活性化合物を、約60分またはそれ未満の期間提供する、請求項82記載の方法。
【請求項８８】
生物物体に、少なくとも一つの活性化合物を、約20分またはそれ未満の期間提供する、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
段階（b）が、強まる低酸素状態に対する生物物体の連続的曝露によって行われる、請求項82記載の方法。
【請求項９０】
強まる低酸素状態に対する生物物体の連続的曝露が、生物物体を約5％O2に対する曝露の後に、約4％O2、約3％O2、約2％O2、約1％O2、無O2状態、またはそのような条件の任意の連続的組み合わせに曝露する段階を含む、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
生物物体が、約5％O2に対して約7時間またはそれ未満の期間曝露される、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
生物物体が、約5％O2に対して約60分またはそれ未満の期間曝露される、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
生物物体が、約3％O2に対して約4時間またはそれ未満曝露される、請求項90記載の方法。
【請求項９４】
生物物体に、活性化合物の少なくとも一つを気体として提供する、請求項82記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも一つの活性化合物がH2Sである、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
段階（b）が、強まる低酸素状態に対する生物物体の連続的曝露によって行われる、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
強まる低酸素状態に対する生物物体の連続的曝露が、生物物体を約5％O2に対する曝露の後に、約4％O2、約3％O2、約2％O2、約1％O2、無O2状態、またはそのような条件の任意の連続的組み合わせに曝露する段階を含む、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
少なくとも一つの活性化合物とO2気体とが気体混合器を用いて投与される、請求項94記載の方法。
【請求項９９】
生物物体が出血性ショックのリスクを有する生物である、請求項82記載の方法。
【請求項１００】
生物物体が大量出血している、請求項82記載の方法。
【請求項１０１】
生物物体の代謝活性がモニターされる、請求項82記載の方法。
【請求項１０２】
生物物体によるCO2産生がモニターされる、請求項82記載の方法。
【請求項１０３】
少なくとも一つの活性化合物の提供が同時または連続的に行われた後に、傷害もしくは外傷、または疾患の発生もしくは進行の、前、最中、および／または後に提供される、強まる低酸素状態の提供が行われる、請求項82記載の方法。
【請求項１０４】
生物物体が保護される、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および
（b）生物物体を低酸素状態に置く段階
を含む、有害な条件下での生物物体に対する損傷を予防または低減するための方法であって、該損傷が予防または低減される、方法。
【請求項１０６】
（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および
（b）生物物体を低酸素状態に置く段階
を含む、生物における代謝を可逆的に阻害するための方法。
【請求項１０７】
（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および
（b）生物物体を低酸素状態に置く段階
を含む、生物が出血により死亡するのを防止する方法であって、死が防止される、方法。
【請求項１０８】
大量出血している生物物体および／または出血性ショックに罹患している生物物体にH2Sを最初に投与し、かつその後連続的に、生物物体に強まる低酸素状態を施す方法。
【請求項１０９】
（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および
（b）生物物体を無酸素状態に置く段階
を含む、生物物体の生存能力を高めるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その双方が参照により本明細書に組み入れられる、2006年4月20日に提出された米国特許仮出願第60/793,520号および2006年12月7日に提出された米国特許仮出願第60/869,054号に対する優先権の恩典を主張する。
【０００２】
米国政府は、 National Institute of General Medical Sciences（NIGMS）の助成金番号GM048435号に従って、本発明に一定の権利を保有する可能性がある。
【０００３】
1．発明の分野
本発明は、概して外傷のケアおよび生理学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、ショックに至る状態のような特に有害な病態における生物の生存能力を高めるための方法、組成物、および装置に関する。一定の態様において、作用物質（「活性化合物」と呼ばれる）を用いて出血性ショックに関するリスクを有する被験体を処置するための方法、組成物、および装置が存在する。特異的態様において、作用物質は硫化水素（H2S）のような気体、または液体もしくは他の剤形である。
【背景技術】
【０００４】
2．関連技術の説明
ショックは、介入が遅れると急速に進行する生命を脅かす病態である。ショックは、臓器組織の生理的要求を維持するために適切な灌流が存在しない状態である。これは、生命に必須の臓器の適切な灌流を循環系が維持できないことを特徴とする、深刻な血液動力学および代謝障害の病態である。ショックは、不適切な血液量（循環血液量減少性ショック）、不適切な心機能（心原性ショック）、または分配性ショック（神経原性ショック、敗血症ショック、アナフィラキシーショック）とも呼ばれる不適切な血管運動緊張が原因で起こる可能性がある。これによってしばしば患者の急激な死亡が起こる。敗血症、失血、自己調節障害、および自律神経緊張の喪失が含まれる多くの病態が、ショックまたはショック様状態を生じる可能性がある。本発明は、上記のショック状態の全ての有害な効果を予防して、そのようなショックを受けている生物物体の生命を維持すると期待される。
【０００５】
William Bozeman博士（eMedicine.com）の論文によれば、出血性ショックは、大量の血液が失われて、体が適切な組織灌流および酸素飽和を代償および提供することができない場合に起こる。外傷はしばしば、消化管出血、出産、または手術のような自然発生出血を引き起こし、同様に、出血によって引き起こされる可能性がある。孤立性の促進事象を伴う急性の出血エピソードは、臨床的な出血性ショックの原因であることが最も多いが、これは時に亜急性の失血を伴う慢性病態によって引き起こされる。
【０００６】
出血に対する体の生理的反応には、中心循環に血液をそらせる最初の末梢および腸間膜血管収縮のような機構が含まれる。進行性の頻拍も同様に、これらの効果を増加させる。心指数、酸素送達（即ちDO2）の増加、組織による酸素消費（即ちVO2）の増加が、出血性ショックの患者において観察される可能性がある。乳酸塩レベル、酸-塩基状態、および他のマーカーの評価も同様に、生理的状態に関する有益な情報を与える可能性がある。出血性ショックに対する被験体の反応は、被験体の年齢に応じて非常に有意に異なり得る、即ち非常に若いかまたは非常に高齢の被験体は、失血後に早期の代償不全を引き起こしがちである。
【０００７】
代償機構が失血を代償することができない場合、死が起こり得る。医学的介入がなければ、重度の出血性ショックを経験した患者では、古典的な三相の死亡分布が認められる。この分布は、出血の数分以内に起こる即時の失血による死亡の初回ピークを示す。第二のピークは、進行性の代償不全により1〜数時間の期間に観察される。最後に、敗血症および臓器不全の結果として数日後から数週間後に起こる第三のピークが存在する。
【０００８】
2004年の米国死亡統計報告書（National Vital Statistics Report）によれば、2001年に米国において150,000人より多くの人が、彼らが受けた傷害のために死亡した。これらの中で64.6％が非意図的であると分類され、19.5％が自殺、12.9％が殺人、2.7％が意図不明、および0.3％が法的介入または従軍であると分類された。交通事故、爆発、および転落はこれらの死因の上位三位であった。これらの致死の大多数が、出血性ショックに至る、外傷による大量出血が原因である。
【０００９】
外傷性傷害の多数は手術または救急車によるケアを必要としないが、重篤な傷害を有する患者の何人かは、生存の見込みを改善して後遺障害を最小限にするために、傷害後の「ゴールデンアワー」の間に安定化を必要とする。
【００１０】
ほとんどのショック症例は、事故によって引き起こされた傷害によるものであるため、患者が生存するためには病院に到着前のケアが肝要である。これには、迅速な査定、安定化、ならびに評価および処置のために適当な施設への迅速な搬送が含まれてもよい。
【００１１】
ショック症候群を有する全ての患者において、気道の開口の維持、適切な呼吸および適切な循環は、救急処置の主な中心である。依頼者の病態の変化はショック症候群の進行を示すことから、査定は必須である。早期介入は、組織および臓器に対する損傷を最小限にして、永続的な後遺障害を最小限にするために極めて重要であり、かつ主な臨床原因の早期同定は不可欠である。処置は、ショック症候群の原因を修正して、進行を遅らせる方向に向けられる。静脈内アクセスおよび輸液蘇生（典型的に、生理食塩液の静脈内注射）が標準であるが、血液量過多の急速な逆転は出血の増加、凝固因子の希釈、または部分的に形成された凝血の移動を引き起こす可能性があることから、これについては何らかの論争がある。血液量減少性ショックが大量出血に起因する場合、選択される置換液は、全血または赤血球濃縮液である。晶質溶液は循環量を一時的に改善するが、患者はまた、組織に酸素を送るために赤血球の置換も必要とする。ショックの処置は、体液管理、酸-塩基バランス、および心筋収縮の改善を中心とする。ショックの基礎となる原因の処置も同様に、ショック症候群の進行を減損させるために処置されるべきである。
【００１２】
ショックには二つの主な段階が存在する：初期代償段階および進行段階。本発明の態様は、いずれかまたは双方の段階の患者に応用してもよいと企図される。
【００１３】
全身の冬眠状態をマウスにおいて誘導すると、全体の代謝状態（CO2発生によって測定）は直ちに低下する。これは可逆的であり、マウスは繰り返し曝露後であっても機能的に正常であるように思われる。したがって、本発明は、患者の生命に必須の臓器および生命を保持するために、H2S（または他の酸素アンタゴニストもしくは他の活性化合物）を用いて、全身の冬眠状態を誘導することに関する。これによって、制御された環境（例えば、手術）への搬送が可能となり、そこで、ショックの最初の原因に対処することができ、その後患者は制御された方法で正常な機能を回復した。この適応に関して、「ゴールデンアワー」と呼ばれる傷害後1時間は、転帰の成功にとって非常に重大である。この期間における患者の安定化、および傷害に適切に対処することができる救急施設（例えば、救急救命室、手術室等）への搬送は、主な目標である。このように、これを可能にする状態で患者を維持すること、およびショック源のような即時の懸念に対処すること、失血を補充すること、および恒常性を再度確立することが理想である。出血性ショックから生存する確率を増加させるためにそのような処置が必要である。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
したがって、本発明は、ショックおよび他の有害な病態を処置、予防、または病態から生存する機会を高めるための方法、組成物、製品、および装置を提供する。そのような方法、組成物、製品、および装置は、被験体がヒトである場合が含まれる、被験体をショックまたは他の有害な病態に屈しないよう保護するために用いることができる。さらに、本発明のそのような局面は、例えば、死亡が含まれるショックのリスクおよびショックの負の転帰を低減させる可能性がある。
【００１５】
本発明の一定の態様において、活性化合物の有効量を被験体に提供する段階を含む、被験体において無呼吸を誘導する方法が存在する。「無呼吸」という用語は、その通常の意味に従って、「被験体が10％またはそれより少ない回数の呼吸を行うように、呼吸が有意に低減される期間」を指すために用いられる。
【００１６】
本発明の他の局面は、出血している生物に活性化合物の有効量を提供して死を防止する段階を含む、生物が出血により死亡するのを防止するための方法に関する。
【００１７】
本発明の他の方法において、生物学的被験体においてスタシス(stasis)を引き起こし得る量より少ない有効量の活性化合物を、傷害、疾患の発症もしくは進行、または死亡の前に被験体に提供する段階を含む、生物学的被験体を傷害（医原性であっても非医原性であってもよい）、疾患の発症もしくは進行、または死亡から保護するための方法が存在する。
【００１８】
同様に、気体様カルコゲニド、その塩またはプロドラッグの有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体において無呼吸を誘導する方法も本発明の一部として企図される。
【００１９】
さらに、本発明の他の方法には、気体様硫化水素の有効量を提供する段階を含む、患者における出血性ショックを処置するための方法が含まれる。「患者」という用語は、ヒト被験体を指すために用いられる。
【００２０】
本発明のなおさらなる方法は、気体様カルコゲニド、その塩またはプロドラッグの有効量を被験体に提供する段階を含む、被験体におけるショックを予防または処置するための方法に関する。
【００２１】
異なる態様は、本発明のこれらの方法に関するがそれらに限定されない。
【００２２】
活性化合物は、記載の目標に到達することができる化合物を指す。一定の態様において、活性化合物は酸素アンタゴニストである。他の態様において、活性化合物は保護的代謝物質であるか、または保護的代謝物質でもある。さらなる態様において、活性化合物は酸素アンタゴニストでなくてもよく、かつ／または保護的代謝物質でなくてもよい。酸素アンタゴニストまたは保護的代謝物質に関して議論されるいかなる態様も、一般的に任意の活性化合物に関して実行されてもよく、その逆もまた同じである。
【００２３】
特定の態様において、活性化合物は、カルコゲニドまたはカルコゲニド塩である。その上、活性化合物は、以下に考察される式I、式II、式III、または式IVの化学構造を有してもよい。一定の場合において、被験体に、式I、式II、式III、または式IVの化学構造の前駆体が提供される。なおさらなる態様において、活性化合物は、式II（a）、式II（b）、または式II（c）の化学式を有し、他の態様において、活性化合物は、式III（a）、式III（b）、式III（c）、式III（d）、式III（e）、式III（f）、式III（g）、または式III（h）の化学式を有する。
【００２４】
特定の態様において、活性化合物は、硫黄および／またはセレンを含む。さらなる態様において、活性化合物は、カルコゲニドまたはカルコゲニド塩を含む。一定の場合において、カルコゲニドまたはカルコゲニド塩は、H2S、Na2S、NaHS、K2S、KHS、Rb2S、Cs2S、(NH4)2S、(NH4)HS、BeS、MgS、CaS、SrS、およびBaSからなる群より選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの方法において、被験体に活性化合物の組み合わせを提供する。
【００２６】
本発明は、被験体における傷害、外傷の発生もしくは進行、または大量出血の、前、最中、もしくは後に、被験体に活性化合物を提供する態様に関する。特異的態様において、傷害は大量出血を伴う。その上、傷害は外因性の物理的起源が原因であってもよい。
【００２７】
特定の例において、活性化合物は、傷害前、または疾患の発症もしくは進行の前に提供される。その上、他の態様において、活性化合物は、傷害または疾患の発症もしくは進行の、最中または後に提供されない。
【００２８】
一定の状況において、被験体は、出血しているかまたは出血のリスクを有する。その上、被験体はショック状態であるか、またはショック状態となるリスクを有する場合がある。
【００２９】
いくつかの態様において、被験体は、約10秒から約1時間の期間、酸素アンタゴニストの一つに曝露されることが企図される。
【００３０】
いくつかの態様において、被験体は、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグを提供された後に無呼吸となる。さらなる態様において、被験体は、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグを提供された後に骨格筋の運動を停止する。
【００３１】
いくつかの方法は、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグの単回用量を被験体または患者に提供する段階を伴う。本発明の他の方法において、患者は、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグを含む組成物を吸入することによって、カルコゲニド、その塩またはプロドラッグを提供される。その上、さらなる態様において、方法は、カルコゲニド、その塩、またはプロドラッグが含まれない気体様組成物を続いて患者に提供する段階を伴う。これは、例えば酸素が含まれてもよい組成物であってもよい。
【００３２】
本発明は、保護機能を有することが決定され、このように保護的物質として作用することが決定された化合物に関する研究に一部基づいている。その上、異なる化合物を伴う試験の全体的な結果は、一定の化合物が一定の生理状態を誘導し得ることを示している。一定の態様において、これらの化合物は、無呼吸、スタシス、またはプレスタシス(prestasis)を誘導するために特に有用である。さらに、これらの化合物は、可逆性のスタシスを誘導し、このことは、それらが生物物体が死亡するかまたは消耗するほど特定の生物物体にとって毒性ではないことを意味する。本発明は、有害な病態に供されるかまたは有害な病態下に置かれる可能性がある生物物体の生存能力を高め、かつ／または生物物体に対する損傷を予防もしくは低減させるために用いることができるとさらに企図される。本発明の主題は、活性化合物、用量、投与様式、応用、および実験概念の証明に関する教示に関してその全てが参照により本明細書に組み入れられる、2006年9月28日に提出された米国特許仮出願第60/827,337号、いずれも2005年4月20日に提出された米国特許仮出願第60/673,037号と同第60/673,295号と共に、2005年8月31日に提出された米国特許仮出願第60/713,073号、2005年10月28日に提出された米国特許仮出願第60/731,549号、および2006年1月26日に提出された米国特許仮出願第60/762,462号、ならびにこれらの出願の恩典を主張し、Mark Roth, Mike Morrison, and Eric Blackstoneの名前で2006年4月20日に提出された米国特許非仮出願において記述されている。
【００３３】
本発明のいくつかの用法は、活性化合物の「前処置」と一般的に呼ばれている方法を伴う。前処置には、生物物体が有害な病態（例えば、傷害または疾患の発症もしくは進行）に供される前と最中の両方、ならびに前、最中、および後に活性化合物を提供する方法、ならびに生物物体が有害な病態に供される前に限って、生物物体に活性化合物を提供する方法が含まれる。一般的に、前処置は、生物物体が有害な病態に供される前、最中、および／または後に活性化合物を提供する段階を伴い得ると企図される。いくつかの態様において、活性化合物は、有害な病態に供される前および後に提供される。
【００３４】
特定の態様では、活性化合物による処置は、生物物体がスタシスに達するために通過しなければならない低代謝状態とされる「プレスタシス」を誘導する。プレスタシスは、代謝に於ける生物物質の量の減少が、スタシスとして定義されたものよりは小さいことを特徴とする。活性化合物を用いてスタシスを達成するには、生物物体は、生物物体に於ける酸素消費およびCO2産生の低下が2倍未満に等級分けされる低代謝状態を必ず通過しなければならない。活性化合物によって代謝または細胞の呼吸が2倍未満の程度まで低下するこのような一連の現象を「プレスタシス」の状態と表すことができる。
【００３５】
スタシスがCO2産生またはO2消費のいずれかの2倍低下(即ち50%またはそれ未満に低下)を含む範囲では、2倍未満の低下を検出する、当業者に公知の方法を用いた生物物体のこれらパラメータの直接測定がプレスタシスを示す。それゆえに本発明においては、血液中の二酸化炭素および酸素レベル、ならびに血液のpO2、VO2、pCO2、pH、および乳酸塩レベルを含むが、これらに限定されない当業者に馴染みのある他の代謝マーカーの確実な測定を利用して、プレスタシスの開始または進行をモニタリングすることができる。代謝活性の指標、例えば細胞呼吸を介したCO2産生およびO2消費が、正常な状態に比べて2倍未満まで低下すると同時に、プレスタシスに伴って、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%のCO2発生が低下することがあるが、これは肺から放出されるCO2の量に関連する。これに加えて、様々な態様において、プレスタシスは、正常な生理学的状態に比べて1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%より低いか、またはそれに等しい、代謝活性の一つまたは複数の指標の低下によって特徴付けられる。別の態様では、プレスタシスは、別の刺激(この場合、別の刺激として同一活性作用物質による長期処置を含んでよい)に反応してスタシスへ入るのを早めるか、または促進する能力、あるいは傷害から生じた損傷、疾患の発生もしくは進行、または出血、特に不可逆的な組織損傷、出血性ショック、または死に至る可能性のある出血から生物物体の生存を高めるか、または保護するその能力を特徴とする。
【００３６】
本明細書に明示的に例示された本発明の方法は、「スタシス」の誘導に関連するものであるが、これらの方法は、「プレスタシス」の誘導にも容易に適応させることができること、および本発明によりプレスタシスを誘導するこのような方法が企図されることが理解される。これに加えて、スタシス誘導に用いられたものと同一の活性化合物を用いて、それらをスタシス誘導に使用した場合より低用量、および／または短時間、生物物体に提供することによってもプレスタシスを誘導できる。
【００３７】
ある態様では、本発明は生物物体を一定量の作用物質に曝露し、生物物体のスタシスを達成させることを含む。いくつかの態様では、本発明は、以下を含む、インビボの生物物体をスタシスに誘導する方法に関係している：a)スタシスが望まれる生物を同定する段階；およびb)生物を有効量の活性化合物に曝露してインビボの生物物体をスタシスに誘導する段階。生物物体に「スタシス」を誘導するということは、生物物体は生きているが、以下事項の一つまたは複数を特徴とすることを意味している：生物物体が産生する二酸化炭素の速度または量が少なくも2倍低下すること；生物物体による酸素消費の速度または量が少なくとも2倍(即ち50%)低下すること；および行動または運動性の少なくとも10%の減少(精子細胞または心臓もしくは四肢のような動く細胞または組織、あるいは生物全体にスタシスが誘導される場合にのみ適用される)(「細胞呼吸インジケータ」と総称される)。本発明の態様において、生物物体による酸素消費の速度は、約、少なくとも約、または最大でも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、5000、6000、7000、8000、9000もしくは10000倍またはそれ以上の減少、あるいはそこから導き出せる任意の範囲であることが企図される。または、本発明の態様は、生物物体による酸素消費の速度の減少に関して、約、少なくとも約、または最大でも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲として検討され得ることが企図される。酸素消費を測定する任意のアッセイが利用できること、ならびに典型的なアッセイは閉鎖された環境が利用できることおよび環境内に持ち込また酸素と一定時間後に環境内に残っている酸素の差を測定することを含むことが企図される。さらには、二酸化炭素の産生を測定して、生物物体による酸素消費量を決定できることも企図される。したがって二酸化炭素産生が低下した場合は、上記のようにそれに対応して酸素消費量も低下するだろう。
【００３８】
本発明の方法では、スタシスまたはプレスタシスは一時的および／または可逆的であるが、このことはいくらか後の時点で生物物体がもはやスタシスの特徴を示さないことを意味する。本発明のいくつかの態様では、酸素アンタゴニストに代わって、酸素アンタゴニストとしての資格を持たない化合物が投与される。酸素アンタゴニストに関連して論じた方法は、酸素アンタゴニスト、保護的代謝作用物質、式I、II、III、またはIVの構造を有する化合物、本明細書の中で論ずる任意の他の活性化合物、あるいはそれらの塩または前駆体である任意の化合物に対して応用できることが企図される。本発明の任意の方法を達成し、酸素アンタゴニストとしての資格を持ち得る化合物、保護的代謝作用物質、式I、II、III、またはIVの構造を有する化合物、あるいはそれらの塩または前駆体は、全て「活性化合物」と見なされ得る。特定の態様では、スタシスの誘導は、化合物が「活性スタシス化合物」と呼ぶことができる例で望まれる。本発明のいくつかの態様では、方法はスタシスを誘導することによって達成されることが企図される。例えば、治療方法は、スタシスを誘導する段階を含むことができるが、その場合活性化合物は活性スタシス化合物である。活性化合物を検討する態様では、本発明は酸素アンタゴニストを含み、かつこれに限定できることが特に企図される。
【００３９】
本発明のある態様では、生物物体は、それ自体はスタシスを誘導しない(少なくとも提供されたレベルおよび／または期間内では)が、しかし生物物体を誘導して、治療的便益を有するプレスタシス状態、ならびに例えば傷害、疾患状態、もしくは別の活性化合物による、またはより長期間もしくは高用量で用いた同一活性化合物による処置などの別の刺激に反応してスタシスを達成する生物物体の能力を高めるプレスタシス状態に入れる活性化合物で処置される。
【００４０】
用語「生物物体」（好ましい態様では哺乳類の生物物質）は、細胞、組織、臓器、および／または生物、ならびにそれらの組み合わせを含む任意の生きている生物物質を指す。スタシスは、その部分が生物内にとどまっているか、または生物の外に取り出されているか、または生物全体がスタシス状態に置かれるかどうかに関わらず、生物の一部分(細胞内、組織内、および／または一つもしくは複数の臓器内など)に誘導できることが企図される。さらには、細胞および組織との関係では、均一および不均一な細胞集団が本発明の態様の被験体になり得ることが企図される。用語「インビボの生物物体」は、インビボ、即ちまだ生物内に存在しているか、または付着している生物物体を指す。さらには、用語「生物物体」は、用語「生物物質」と同義であるものとして理解される。ある態様では、一つまたは複数の細胞、組織、または臓器が生物から分離されることが企図される。用語「単離された」は、このような生物物体を表すのに用いることができる。スタシスは単離された生物物体に誘導できることが企図される。
【００４１】
スタシスを必要とする生物またはその他生物物体は、生物の全体または一部のスタシスが直接または間接的な生理学的便益を生じ得る生物または生物物体である。例えば、出血性ショックのリスクを伴う患者は、スタシスが必要であると見なすことができ、または冠動脈バイパス手術を受ける患者は、虚血／再潅流傷害から心臓を保護することから便益を受けるであろう。他の応用は、本出願の中で論じられている。いくつかの例では、生物または他の生物物体は、スタシスを経験したことによって防止もしくは処置できる状態もしくは疾患、または状態もしくは疾患のリスクを示す、一つまたは複数の試験、スクリーニング、または評価に基づいて、スタシスが必要であることが確認または決定される。または、患者の病歴または家族の病歴(患者インタビュー)を得ることは、生物または他の生物物体がスタシスを必要としているかについての情報をもたらすことがある。当業者には明らかにであるように、本発明の一つの応用は、スタシスを誘導することによって生物物質の全体的なエネルギー需要を下げることである。
【００４２】
あるいは、生物または他の生物物体は、生存能力を高めるための活性化合物を必要とすることもある。例えば、患者は本明細書で論じた傷害もしくは疾患、または任意の他の応用について処置を必要とすることがある。それらは、前述のパラグラフで開示したように生存能力を高める必要性に関して必要である、または処置を必要とすると決定されるかもしれない。
【００４３】
用語「酸素アンタゴニスト」は、それが生存するために酸素を必要としている生物物体(「酸素利用生物物体」)が用いる範囲に於いて、酸素と競合する物質を指す。酸素は、典型的には、容易に利用可能なエネルギーの生物物体の一次供給源を作り出す様々な細胞のプロセスに用いられる、または必要とされる。酸素アンタゴニストは、酸素利用生物物体が入手できる酸素の量、および／または酸素利用生物物体による利用が可能な酸素の量を効果的に減らすか、もしくは排除する。一つの態様では、酸素アンタゴニストは、その酸素拮抗作用を直接的に実現できる。別の態様では、酸素アンタゴニストは、その酸素拮抗作用を間接的に実現できる。
【００４４】
直接酸素アンタゴニストは、酸素結合部位または酸素結合能力を有する分子(例えばタンパク質)への結合について分子酸素と競合する。アンタゴニストは、薬理学または生化学の分野に公知の競合的でも、不競合的でも、非競合的なものでよい。直接酸素アンタゴニストである活性化合物の例としては、ヘモグロビンおよびチトクロームCオキシダーゼへの酸素の結合を競合する一酸化炭素(CO)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
間接酸素アンタゴニストは、酸素結合分子への酸素の結合について直接競合しない状態で、エネルギー産生(例えば細胞呼吸において)のために酸素を使用する細胞への酸素の利用可能度または送り込みに影響する。間接酸素アンタゴニストの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：(i)ボーア効果として公知のプロセスを通して、ヘモグロビン(またはミオグロビンなどの他のグロビン)の、酸素利用動物の血液または血液リンパ中の酸素と結合する能力を低下させ、それによって生物の酸素利用細胞、組織、および臓器へ送られる酸素の量を減らし、それにより酸素を用いる細胞への酸素の利用可能度を低下させる、二酸化炭素；(ii)肺または他の呼吸器官中の二酸化炭素の水和を阻害することによって二酸化炭素の濃度を上げ、それによって酸素利用動物の血液または血液リンパ中の酸素に結合するへモグロビン(またはミオグロビンなどの他のグロビン)の能力を低下させ、それによって生物の酸素利用細胞、組織、および臓器へ送られる酸素の量を減らし、それにより酸素を用いる細胞への酸素の利用可能度を低下させる、炭酸脱水酵素阻害薬(Supuran et al., 2003、全体が参照により組み入れられる)；および(iii)酸素に結合し、酸素結合分子から酸素を隔離するか、またはそれを酸素結合分子に結合できないようにする酸素キレート剤、抗体等が挙げられるが、これらに限定されない、分子。
【００４６】
いくつかの態様では、酸素アンタゴニストは直接および間接酸素アンタゴニストの両方である。例としては、チトクロームcオキシダーゼへの酸素の結合について直接競合する化合物、薬剤、または作用物質、および炭酸脱水酵素に結合しその酵素活性を阻害できる化合物、薬剤、または作用物質も挙げられるが、これらに限定されない。したがっていくつかの態様では、酸素アンタゴニストは、例えば、その他の場合は酸素に結合するチトクロームcオキシダーゼの部位に結合することによって、細胞内で起こる細胞呼吸を阻害、またはその量を減らす。チトクロームcオキシダーゼは、酸素に特異的に結合し、次にそれを水に変換する。いくつかの態様では、チトクロームcオキシダーゼへのこのような結合は、解除可能および可逆的な結合であることが好ましい(例えば、少なくとも10-2、10-3、または10-4Mのインビトロ解離定数、Kdを有し、かつ10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、または10-11Mより大きくないインビトロ解離定数Kdを有する)。いくつかの態様では、酸素アンタゴニストは、ATPおよび／または二酸化炭素排出量を測定することによって評価される。
【００４７】
用語「有効量」は、規定の結果を達成し得る量を意味する。本発明のある方法では、「有効量」は、例えば無呼吸になることを必要とする生物物体を無呼吸に誘導する量である。さらなる態様では、「有効量」は、生物またはその他の生物物体の生存能力を高める量、即ち本発明の化合物の有効量を曝露されたよりも長く生存する量を指してもよい。
【００４８】
組織または臓器にスタシスを誘導する場合は、有効量は、組織または臓器の合計細胞呼吸量に基づき決定する時に、組織または臓器にスタシスを誘導する量であることが理解されるだろう。したがって、例えば心臓による酸素消費レベル(心臓の細胞に関する集計)が、ある酸素アンタゴニストまたは他の活性スタシス化合物の特定量に曝露された後に少なくとも約2倍(即ち50%)低下すれば、この量が心臓にスタシスを誘導する有効量であることが理解されるだろう。同様に、ある生物をスタシスに誘導する作用物質の有効量は、スタシスの特定パラメータの集計または総計レベルについて評価された量である。ある生物をスタシスに誘導した時に、有効量は、生物の特定部分が標的でない限り、生物全体に一般にスタシスを誘導する量であることも理解されるだろう。これに加えて、有効量は、それ自体がスタシスを誘導するのに十分な量でも、または別の作用物質もしくは刺激、例えば別の活性化合物、傷害、もしくは疾患状態と組み合わせてスタシスを誘導するのに十分な量でもよいことも理解される。
【００４９】
特定化合物の有効量の概念は、いくつかの態様では、生物物体が利用できる利用可能な酸素がどれだけあるかに関係する。一般的には、少しの酸素アンタゴニストも存在しない状態では、約100,000ppmまたはそれ未満の酸素が存在する時に(大気中には約210,000ppmの酸素が存在する)スタシスを誘導できる。酸素アンタゴニストは、有効に利用できる酸素の量を変える役割を果たす。10ppmの酸素濃度で仮死状態が誘導される。したがって、生物物体が曝露される実際の酸素濃度が10ppmよりも高くとも、はるかに高い場合でさえ、生物物体に於ける、必須酸素代謝タンパク質への結合のための酸素に対する酸素アンタゴニストの競合効果によりスタシスを誘導することができる。換言すれば、酸素アンタゴニストの有効量は、存在する酸素を使用することができない程度まで有効酸素濃度を下げる。これは、前記量の酸素アンタゴニストが有効酸素濃度を、必須酸素代謝タンパク質に対する酸素結合のKm未満にした時(即ち、10ppmの酸素と同程度)に起こるだろう。したがって、いくつかの態様において、酸素アンタゴニストは有効酸素濃度を、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、5000、6000、7000、8000、9000もしくは10000倍またはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲で減少させる。または、本発明の態様は、約、少なくとも約、または最大でも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%もしくはそれ以上の、あるいはそこから導き出せる任意の範囲に有効酸素濃度の減少に関して検討できることが企図される。これは細胞呼吸における減少を示す別の方法であると理解される。
【００５０】
さらには、いくつかの態様では、スタシスは生物の中心体温の低下によって間接的に測定できる。本発明の方法では、約、少なくとも約、または最大でも約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50°Fまたはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲での中心体温の低下が観察できることが企図される。本発明のいくつかの態様では、中度低体温(少なくとも10゜Fの低下)または高度低体温(少なくとも20゜Fの低下)などの低体温を誘導できる。
【００５１】
よりさらには、有効量は、曝露時間の長さの制限が付いた、または付かない濃度として表すことができる。いくつかの態様では、スタシスを誘導する、または本発明の記載の他の最終目標を達成するために、生物物体を約、少なくとも約、または最大でも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60秒、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日、1、2、3、4、5週、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年またはそれ以上、およびそこから導き出せる任意の組み合わせまたは範囲の活性化合物に曝露することが一般的に企図される。さらには、活性化合物の投与の理由または目的によっては時間を定めないことも企図される。その後、生物物体を継続して活性化合物に曝露しても、または、本発明の別の態様では、生物物体をそれ以上活性化合物に曝露しなくともよい。この後者の段階は、スタシスが望まれる生物物体の存在場所から活性化合物を取り除くまたは効果的に取り除くのいずれかによって達成できるが、あるいは生物物体を活性化合物を含む環境から取り除いてもよい。これに加えて、生物物体を任意の活性化合物に継続的に(曝露の中断がなく、一定期間)、間欠的に(複数回に分けての曝露)または定期的に(規則的な、複数回に分けての曝露)曝露してもよい。これら異なる方針での活性化合物の投与量は同一でも変更してもよい。ある態様において、活性化合物を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分ごとに、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間ごとに、1、2、3、4、5、6、7日ごとに、1、2、3、4、5週ごとに、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月ごとに、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年、またはそれ以上ごとに、あるいはそこから導き出せる任意の範囲ごとに、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回、活性化合物に生物物体を提供するまたは曝露することによって定期的に提供される。
【００５２】
さらには、本発明のいくつかの態様では、生物物体は、活性化合物に持続した期間曝露されるか、またはそれが提供されるが、この場合「持続した」とは、少なくとも約2時間の期間を意味する。別の態様では、生物物体は、一日より多い日数、持続的な形で活性化合物に曝露されても、またはそれが提供されてもよい。このような状況では、生物物体には、連続的に、持続した形で活性化合物が提供される。ある態様では、生物物体は、活性化合物に約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12時間またはそれ以上(あるいはそこから導き出せる任意の範囲)、2、3、4、5、6、7日間、および／または1、2、3、4、5週間、および／または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ヶ月間、および／または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年またはそれ以上(あるいはそこから導き出せる任意の範囲)連続的に、間欠的に(複数回に分けての曝露)または定期的に(規則的に反復して曝露する)曝露しても、あるいはそれが提供されてもよい。
【００５３】
いくつかの態様では、生物物体は、特定の傷害、外傷、または処置(例えば手術)、有害状態、あるいは他の関連事象または状況の少なくとも前および最中；前、最中、および後；最中および後；または後にだけ、活性物質に曝露するか、またはそれを与えてもよい。この曝露は、持続してもしなくともよい。
【００５４】
これら異なる方針での活性化合物の投与量は、同一でも変えてもよい。
【００５５】
よりさらには、特定の態様では、活性化合物は、「低」レベルと見なされるレベルで連続的に、持続した形で提供することができるが、この場合の低レベルは、CBT、心拍数、またはCO2もしくはO2の消費もしくは産生の低下を伴って見られるような代謝的順応性を引き起こす量に比べ少ないレベルを意味する。
【００５６】
ある態様では、生物物体は、無呼吸(「被験体の呼吸数が10%またはそれ以下まで呼吸が顕著に減少している期間」)、観察可能な骨格筋運動の欠如、失調、および／または過敏症などの有害な生理学的悪影響の前に、従来は最大許容用量と考えられていた量を超える量の代謝性作用物質などの活性化合物に曝露されるか、またはそれが提供される。このような量は、本発明のいくつかの態様での生存能力の上昇、例えば、出血性ショックによる死を誘導するであろう有害な状態から生き延びる機会を増やすことに関係する。
【００５７】
生理学的状態は、生存能力の増強を必要とする生物において生存能力を高めかつ活性化合物の有効量に反応する一連の観察可能な生理学的変化を含む、本発明の活性化合物によって誘導することができ、該変化は過呼吸、無呼吸、および筋神経系緊張もしくは持続的心拍を伴う運動の随意制御の随伴的もしくは後続的な消失、の一つ、複数、または全てを含む。動脈血の色の、一過性の測定可能な変化も観察できる。過呼吸は、せわしない浅い呼吸を指す。無呼吸は、上記のような呼吸の停止または減少を指す。
【００５８】
ある態様では、呼吸が停止して、および続いて短時間後の無呼吸を特徴とする無呼吸になる。ラットでは、これは約20秒後に起こる。それゆえに、無呼吸に誘導された被験体は、活性化合物へ曝露された後に0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10%の呼吸数を示すことがある。被験体は、その後偶発的呼吸を行うことがあるが、これは無呼吸の一つと考えることができる。本発明のある態様では、無呼吸は被験体が活性化合物にそれ以上曝露されなくなるまで継続する。
【００５９】
本発明のいくつかの態様では、有効量は、LD50として表すことができるが、これは動物の集団の半数を殺す(50%死亡率をもたらす)投与用量を意味する「半数致死用量」を指す。よりさらには、さらなる態様では、有効量は生物物体の重量に無関係である(「重力非依存的」)。齧歯類およびヒトでは、例えばH2SガスのLD50は、有害事象が発生する前は、おおよそ700ppmである。よりさらには、本発明のいくつかの態様では、生存能力の上昇は一般的により長く生きることを指し、これは本発明の一つの態様である。
【００６０】
本発明は、生物に活性化合物の有効量を投与することを含む、生物に無呼吸を誘導する方法にも関係する。ある態様では、生物もまた、活性化合物の結果として骨格筋運動を示さない。生物はヒトを含む哺乳類でよいことが特に企図される。別の態様では、有効量は致死濃度と考えられる濃度を超える。さらなる態様では、曝露時間が約、少なくとも約、または最大でも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60秒、1、2、3、4、5分、またはそれ以上(あるいはあるいはそこから導き出せる任意の範囲またはこの開示に明記されているその他の期間)であっても、濃度は致死量でよい。特定の態様では、哺乳類は少なくとも約600ppmの、H2Sなどの活性ガス化合物に曝露される。
【００６１】
これに加えて、ある態様では、処置を必要とする動物を同定する段階が存在する。別の態様では、生物の無呼吸を観察する段階が存在する。よりさらなる態様では、方法は、生物から血液サンプルを得る段階、および／または生物の血液の色を評価する段階を含む。H2Sへの曝露により動物の血液の色が変わることが観察されている；血液は鮮血色からより濃い、赤ワイン色に、さらに赤レンガ色になる。色の評価は、任意の機器または機械を使わず目視で行うことができ、一方他の態様では、分光光度計などの機器を用いることができる。さらには、血液サンプルは、生物から得ることができ、それについて別のタイプの分析を行うことができる。あるいは、血液サンプルは必要ないが、その代わりにサンプルなしに血液を評価することができる。例えば、指でIRまたは可視光を照射する改良型パルスオキシメータを用いて、血液の色変化をモニタリングできる。
【００６２】
ある態様では、生物物体は、スタシスまたはプレスタシスに導かない活性化合物の有効量に曝露される。いくつかの態様では、活性化合物は存在しているが、酸素消費量または二酸化炭素産生の低下を示す証拠は存在しない。
【００６３】
さらなる態様では、生物は睡眠中に活性化合物に曝露することができる。よりさらには、上で検討したように、曝露は、毎日(少なくとも1日1回の曝露を意味する)など定期的でよい。
【００６４】
いくつかの態様では、活性化合物は、噴霧器によって被験体に提供されることが特に企図される。これは、本発明の任意の態様と共に用いることができる。ある例では、噴霧器は出血性ショックの処置に用いられる。さらなる態様では、活性化合物は単回用量として被験体に提供される。特定の例において、単回用量または複数回用量が被験体に無呼吸を誘導する用量である。いくつかの態様では、被験体には、少なくとも約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000ppm、またはそれ以上のH2Sガスが与えられる。曝露時間は、約、またはほぼ最大で10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1分またはそれ未満(あるいはそこから導き出せる任意の範囲)を含む、本明細書内で論じられる任意の時間でよい。
【００６５】
さらなる態様では、活性化合物に曝露後、生物物体の代謝速度は変わることがある。ある態様では、生物物体のRQ比(CO2産生／O2消費)は、活性化合物に曝露した後で変化する。これは、初回曝露または曝露を反復した後、あるいは急性曝露後に起こることがある。いくつかの態様では、RQ比は曝露後に低下する。この低下は、約、少なくとも約、または最大でも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80%、またはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲の低下であろう。低下は、O2消費に対するCO2産生の減少によるO2消費の増加の結果であろう。
【００６６】
いくつかの態様では、そのRQ比が曝露後に変化すること以外、活性化合物に曝露された生物物体には生理学的変化は観察されない。それゆえに、本発明のいくつかの態様では、方法は被験体のRQ比を測定することを含む。これは、活性化合物への曝露の前、および／または後でもよい。
【００６７】
したがって、スタシスが誘導される本発明のいくつかの態様では、本発明の方法のさらなる段階は、スタシスの状態にある関連する生物物体を維持することである。これは、生物物体を活性化合物に曝露し続けること、および／または生物物体を非生理学的温度またはその他の活性化合物に曝露することによって達成できる。あるいは、生物物体は、保存剤または保存液に入れても、あるいは酸素正常状態または低酸素状態に曝露してもよい。生物物体は、約、少なくとも約、最大でも約30秒、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日、1、2、3、4、5週、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年またはそれ以上および任意の組み合わせ、あるいはそこから導き出せる任意の範囲でスタシスで維持することができることが企図される。よりさらには、温度を変更することに加えて、またはそれに代わって、圧力の変化または凍結保護物質もしくは凍結保存環境(例えばグリセロールを含有するもの)を達成するなどの環境の別の変化を実施できることが企図される。
【００６８】
動物全体に関する「スタシス」および細胞または組織に関する「スタシス」は、異なる長さのスタシス時間を必要とすることがあることが認識されるだろう。したがって、ヒト被験体、例えば外科的処置、悪性低体温症に対する処置、または外傷性の被害を受けている被験体に関しては、12、18、または24時間までのスタシス時間が一般的に企図される。ヒト以外の動物被験体、例えば商業目的で発送または保管されているヒト以外の動物に関しては、2または4日間、2または4週間、あるいはそれ以上の期間のスタシスが企図される。
【００６９】
用語「曝露する」は、その通常の意味に従って用いられ、生物物体が活性物質の作用を受けるようにすることを示す。これは、いくつかの態様では、生物物体を酸素アンタゴニストまたは活性化合物と接触させることによって達成できる。別の態様では、これは、生物物体を、酸素アンタゴニストでも酸素アンタゴニストでなくともよい活性化合物と接触させることによって達成される。インビボの細胞、組織、または臓器の場合、「曝露する」は、これらの物体を、活性化合物と接触できるように「さらすこと(to lay open)」をさらに意味することもある。これは、例えば手術的に行うことができる。活性化合物への生物物体の曝露は、アンタゴニストの中での、もしくはアンタゴニストとの(浸漬を含む)インキュベーション、アンタゴニストの潅流もしくは注入、活性化合物と一緒の生物物体の注射、または活性化合物を生物物体に作用させることによって行える。これに加えて、動物全体のスタシスが望ましい場合は、活性化合物の使用に関しては、活性化合物の吸入または摂取、あるいは他の任意の薬学的投与経路が企図される。さらには「提供する」は、その通常かつ平易な意味で用いられており、「供給する」ことを意味する。化合物は生物物体にある形で提供することができ、化学的反応によってその形を活性化合物に変換されることが企図される。用語「提供する」は、本発明に従った用語「有効量」と関連した場合の用語「曝露する」を含む。
【００７０】
いくつかの態様では、有効量は、活性化合物の致死未満量として特徴付けられる。細胞、組織、または臓器(生物全体ではない)のスタシス誘導との関連では、「致死未満量」は、投与24時間以内に、生物物体中の少なくとも大部分の細胞に死をもたらす酸素アンタゴニストまたは他の活性化合物の量の半量より少ない量の酸素アンタゴニストまたは活性化合物の単回投与を意味する。生物全体のスタシスが望ましい場合には、「致死未満量」は、投与24時間以内に生物に死をもたらす酸素アンタゴニストの量の半量より少ない量の酸素アンタゴニストまたは活性化合物の単回投与を意味する。別の態様では、有効量は、酸素アンタゴニストまたは活性化合物の近致死量として特徴付けられる。同様に、細胞、組織、または臓器(生物全体ではない)のスタシス誘導との関連では、「近致死量」は、投与24時間以内に、少なくとも大部分の細胞に死をもたらす阻害剤の量の25%以内である酸素アンタゴニストまたは活性化合物の単回投与を意味する。生物全体のスタシスが望ましい場合は、「近致死量」は、投与24時間以内に生物に死をもたらす阻害剤の量の25%以内である酸素アンタゴニストまたは活性化合物の単回投与を意味する。いくつかの態様では、致死未満量は、所定量の酸素アンタゴニストまたは活性化合物を生物物質に投与することによって投与される。これは、任意の活性化合物に対し実施できることが特に企図される。
【００７１】
さらには、いくつかの態様では、有効量は活性化合物の超致死量として特徴付けられる。細胞、組織、または臓器(生物全体ではない)のスタシス誘導との関連では、「超致死量」は、投与24時間以内に、生物物体中の少なくとも大部分の細胞に死をもたらす活性化合物の量の少なくとも1.5倍(1.5x)である活性化合物の単回投与を意味する。生物全体のスタシスが望ましい場合は、「超致死量」は、投与24時間以内に生物に死をもたらす活性化合物の量の少なくとも1.5倍である活性化合物の単回投与を意味する。超致死量は、投与24時間以内に生物物体(または生物全体)中の少なくとも大部分の細胞に死をもたらす活性化合物の量の、約、少なくとも約、または最大でも約1.5x、2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x、200x、250x、300x、400x、500x、600x、700x、800x、900x、1000x、1100x、1200x、1300x、1400x、1500x、1600x、1700x、1800x、1900x、2000x、3000x、4000x、5000x、6000x、7000x、8000x、9000x、10,000x、またはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。
【００７２】
生物物体に提供される活性化合物の量は、約、少なくとも約、または最大でも
2009534422.tif 000002
あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。または、前記量は
2009534422.tif 000003
あるいはそこから導き出せる任意の範囲として表すことができる。
【００７３】
いくつかの態様では、有効量は、投与された活性化合物の量を、単独または組み合わせでのモニタリングによって、活性化合物の投与期間をモニタリングによって、活性化合物の投与に対する生物物体の生理学的反応(例えば脈拍、呼吸、疼痛反応、運動もしくは運動性、細胞のエネルギー産生もしくはレドックス状態などの代謝パラメータ等)をモニタリングによって、ならびにその反応に於ける変化に関し予め定められていた下限および上限値が測定された時等には、化合物の投与を減量、中断、または中止することによって、投与される。よりさらには、これらの段階は、本発明の任意の方法に於いて、追加的に実施できる。
【００７４】
スタシス状態にあるか、またはスタシスを経験した組織は、多くの応用に用いることができる。それらは、例えば、輸血または移植(臓器移植を含む治療応用)；研究目的；スタシスを誘導するその他化合物を同定、特徴付け、または製造するためのスクリーニングアッセイ；それら組織を得たサンプルの試験(診断応用)；それらを得た生物に戻される組織の保存または損傷防止(保護的応用)；および輸送または貯蔵中のそれらの保存、または損傷防止に用いることができる。そのような応用および他の使用の詳細は、以下に記載される。用語「単離された組織」は、生物内に存在していない組織を意味する。いくつかの態様では、組織は、臓器全体または一部である。用語「組織」および「臓器」はそれらの通常かつ平易な意味に用いられる。組織は細胞から構成されているが、用語「組織」は、一定の構造物体を形作っている類似細胞の集合体を指すことが理解されよう。よりさらには、臓器は特定のタイプの組織である。
【００７５】
本発明は、以下を含む、単離された組織にスタシスを誘導する方法に関する：a)スタシスが望まれる組織を特定する段階；およびb)スタシスを導入するために組織を酸素アンタゴニストの有効量に曝露する段階。
【００７６】
本発明は、関心対象の生物物体に於ける代謝性要求、酸素必要量、温度、またはそれらの任意の組み合わせを低下させることによって、有害状態下での生物物体の生存能力を高め、かつ／またはそれらに対する損傷を軽減するための方法、組成物、および器具も提供する。本発明のいくつかの態様では、生物物体の生存能力は、それに有効量の保護的代謝作用物質を提供することによって高められる。作用物質は、作用物質に曝露していない生物物体に対して、生物物体を保護または生物物体への損傷を軽減すること、瀕死の状態もしくは老化から生物物体の全体もしくは一部を保護すること、および／または生物物体の全体もしくは一部の寿命を延長することによって、生存能力を高める。または、いくつかの態様では、作用物質は、作用物質が無い場合には生存できない組織および／または臓器の生存期間を延長する。
【００７７】
「保護的代謝作用物質」は、それに曝露するかまたは接触した生物物体の代謝を可逆的に変えることができ、かつ該生物物体の生存能力を促進または高める、物質または化合物である。
【００７８】
ある態様では、保護的代謝活性物質は、処理された生物物体をスタシスに誘導する；一方、他の態様では、保護的代謝活性物質は、それ自体は、処理された生物物体に直接スタシスを誘導しない。保護的代謝活性物質、および他の活性化合物は、生物物体自体にスタシスを誘導することなく、むしろ細胞の呼吸およびそれに対応する代謝活性を、酸素消費量または二酸化炭素産生量で約50%低下より低いレベルまで下げることによって、生物物体の生存能力を高め、かつ／または生物物体に対する損傷を軽減できる。これに加えて、このような化合物は、傷害または疾患状態に反応して、例えば生物物体を誘導してプレスタシス状態を達成することによって、生物物体をより素早く、容易に、または効果的にスタシス状態に移すか、または達成することができる。
【００７９】
生存能力は、有害状態、即ち生物物体に対し有害かつ不可逆的な損傷または傷害が存在する状態に生物物体が在る時の生存能力を含む。有害状態としては、以下の場合を含むがこれらに限定されない：環境内で酸素濃度が低下している場合(高所または水中などの低酸素または無酸素環境)；以下の原因であり得る、生物物体がその酸素を受け取ることができない場合(虚血中など) i) 血管閉塞(例えば心筋梗塞、および／または卒中)の結果としての臓器(例えば心臓、脳、および／もしくは腎臓)への血流減少、ii) 心臓／肺バイパス手術中に起こる体外血液分流(例えば、心肺バイパスの結果として、心臓または脳組織が損傷を受ける「ポンプヘッド症候群」)、あるいはiii) 外傷(出血性ショックまたは手術)による失血の結果；低体温状態、この場合、生物物質が、生物物質の適切な酸素化が維持できなくなるような寒冷環境または生物物質の低温状態に曝露することにより亜生理学的温度に付される；高体温状態、この場合、生物物質が、高温環境または悪性熱などによる生物物質の高温状態に曝露することによって、亜生理学的温度に付される；重金属過剰状態、例えばヘモクロマトーシス、後天性鉄過剰、鎌状赤血球貧血、若年性ヘモクロマトーシス・アフリカ鉄沈着症、地中海貧血、晩発性皮膚ポルフィリン症、鉄芽球性貧血、鉄欠乏性貧血、および慢性疾患の貧血などの鉄疾患(遺伝性および環境性)。保護的代謝作用物質は、本発明のある態様では、酸素アンタゴニストであることが企図される。ある別の態様では、酸素アンタゴニストは保護的代謝作用物質でないことが企図される。本発明の別の態様では、一または複数の化合物を用いて、生物物体の生存能力を高め；生物物体の代謝および／または活性を可逆的に阻害し；生物物体の酸素要求を下げ；有害条件下での生物物体への損傷を軽減または予防し；生物物体への損傷または傷害を予防または軽減し；生物物体のエージングまたは老化を予防し；および、酸素アンタゴニストに関する応用全体を通して記載されているような治療的便益を提供することができる。スタシス誘導に関係する態様は、これらその他態様にも同様に応用できることが企図される。したがってスタシスに関連して論じる態様は、これらその他の態様にも実施できる。
【００８０】
スタシスの誘導、またはこれらの任意のその他態様に用いられる作用物質は、それらの所望効果を、それらが生物物体と関連している時だけ導き、もしくは提供でき(即ち、持続的効果を持たない)、および／またはそれらは、生物物体がもはやそれに曝露されなくなった後24時間を超えてそれらの効果を提供できる。よりさらには、これは、活性化合物の組み合わせを用いた場合にも当てはめることができる。
【００８１】
ある態様では、生物物体は、生物物体による二酸化炭素産生の速度もしくは量を少なくとも2倍、約、少なくとも約、または最大で約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500倍、またはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲で低下させる量の活性化合物に曝露させられる。または、本発明の態様は、生物物体による二酸化炭素産生の速度または量の、約、少なくとも、または最大で約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%、またはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲で低下に関して論じることができることが企図される。さらに別の態様では、生物物体は、生物物体による酸素消費の速度または量を、少なくとも2倍、約、少なくとも、または最大で約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、300、400、500倍、もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲で低下させる量の活性化合物に曝露させられる。または、本発明の態様は、生物物体による酸素消費の速度または量の、約、少なくとも、または最大で約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%またはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲で低下に関して論じることができることが企図される。さらに別の態様では、生物物体は運動または運動性を少なくとも10%まで、約、少なくとも、または最大で約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、または100%、あるいはそこから導き出せる任意の範囲まで低下させる量の活性化合物に曝露される。別の態様と同様に、これらの特徴およびパラメータは、スタシス状態に誘導される生物物体に関係する。したがって、スタシスが生物の心臓で導かれる場合は、これらのパラメータは心臓について評価され、生物全体については評価されない。生物との関係では、およそ約8倍の酸素消費低下は、「冬眠」と呼ばれるスタシスの種類である。よりさらには、この応用では、およそ約1000倍の酸素消費低下は、「仮死状態」と見なせることが理解されるだろう。スタシスに関係する本発明の態様は、適切であれば、冬眠または仮死状態のレベルで達成できることが理解されるだろう。「-倍の低下」は、低下した量に関係することが理解される；例えば、冬眠していない動物が800単位の酸素を消費する場合、冬眠中の動物は100単位の酸素を消費する。
【００８２】
これに加えて、本発明のいくつかの態様では、細胞の呼吸を低下させるための方法が提供され、これはスタシスに達するのに必要な程度のものでもそうでなくともよい。本発明の方法では、約、少なくとも約、または最大で約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100%までの酸素消費の低下が提供される。これはまた任意の細胞呼吸指標の形で表現および評価することもできる。
【００８３】
生物物体は、一つまたは複数の活性化合物に、一回を超えて曝露できることが企図される。生物物体は、生物物体を複数回曝露する場合、その間に小休止があることを意味しながら(活性化合物への曝露に関して)、一つまたは複数の活性化合物に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10回、またはそれ以上曝露できることが企図される。
【００８４】
活性化合物は、傷害性の発作または疾患状態が発生または進行する前、最中、後、またはそれらの組み合わせに投与できることも企図される。ある態様では、生物物体の活性化合物への予備処置は、生存能力を高め、かつ／または傷害性または疾患性の発作からの損傷を軽減するのに十分である。予備処置は、傷害性または疾患性の発作が発生または検出される前に、活性化合物に生物物体を曝露することと定義される。前処置については、発作の発生時またはその前後に曝露を中止しても、または発作の発生後も曝露を継続することもできる。
【００８５】
ある態様では、活性化合物への予備曝露(即ち予備処置)を含む方法を用いて、傷害性または疾患性の発作が 1) 事前に予定されているかもしくは決定されているか、または 2) 事前に発生するらしいと予想されている状態を処置する。1を満たす条件の例は、突発的または作業の結果として失血が起こることがある大手術、血液の酸素化に悪影響が及ぶかまたは血管への血液供給量が減ることがある(冠動脈バイパスグラフト(CABG)手術の状況などの)心肺バイパス、あるいは輸送および臓器移植が必要なレシピエントへの移植のためにドナーの臓器を除去する前のドナー臓器の処置が挙げられるが、これらに限定されない。2を満たす状態の例としては、傷害または疾患進行のリスクを伴う状態(例えば不安定狭心症、血管形成術後、出血性動脈瘤、出血性卒中、大きな外傷または失血後)、あるいは医学的診断試験を用いてリスクが診断できる状態が挙げられる、これらに限定されない。
【００８６】
活性化合物への曝露は、曝露が傷害性または疾患性発作の発生または検出後に行われて治療効果を達成する場合は、生存能力を高めるか、または損傷を軽減できる。活性化合物への曝露は、短時間でも長時間でもよい。曝露時間は、スタシス活性またはプレスタシスの指標(例えば血液pCO2、pO2、pH、乳酸、もしくはスルホヘモグロビンのレベル、または体温)に到達するのに必要なだけの長さでも、それよりも長くともよい。ある態様では、曝露は外傷性傷害後に生物に対し行われ、これを用いて生物全体またはその中の傷害された組織にスタシスまたはプレスタシスを誘導し、処置前、最中、および／または後に、例えば虚血および再潅流傷害などの傷害を防止または最小限に止める。
【００８７】
一つの態様では、本発明は、手術前に哺乳類をプレスタシスに入るのを誘導するのに十分な量の硫化水素または他の活性化合物を哺乳類に提供することを含む、手術による細胞損傷を哺乳類が被らないように保護する方法を含む。手術は、選択的(elective)、計画的、または、例えば心肺手術などの緊急手術でもよい。硫化水素は、例えば静脈内または吸入を含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって投与できる。特定の態様において、硫黄は患者の静脈内に提供される。
【００８８】
別の態様では、本発明は、疾患または有害な医学的状態が発生または進行する前に、哺乳動物がプレスタシスまたはスタシスに入るのを誘導するのに十分な量の硫化水素または他の活性化合物を哺乳類に提供することを含む、疾患または有害な医学的状態による細胞損傷を哺乳類が被らないように保護する方法を含む。この態様は、不安定狭心症、血管形成術後、出血性動脈瘤、出血性卒中もしくはショック、外傷、および失血を含む様々な疾患および有害な医学的状態と関係して用いることができる。
【００８９】
特定の態様において、本発明は、出血により動物が死なないようにするのに十分な量の硫化水素または他の活性化合物を哺乳類に提供することによって、哺乳類などの生物が出血によって死亡する、または出血の結果としての不可逆的な組織損傷を被ることを防止する方法に関する。さらなる態様では、生物は出血性ショックに陥るものの、大量出血によって死亡することはないだろう。用語「出血」および「大量出血」は互換的に用いられて、血管からの血液の放出を指す。これには内出血および外出血、傷害による出血(内的原因であっても、銃創、刺し傷、物理的外傷等の外的な物理的原因でもよい)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
よりさらには、本発明のさらなる態様は、失血または適切な血液供給の欠如などの他の細胞または組織の酸素化の欠如による、死または不可逆的な組織損傷の防止に関係する。これは、例えば、実際の失血の結果か、または細胞または組織への潅流を妨げる状態または疾患(例えば、再潅流傷害)によるものであり、これが細胞または組織への血液を遮断するか、生物の血圧を局所または全身性に下げるか、血液によって運ばれる酸素の量を減らすか、または血液中の酸素運搬細胞の数を減らす。関係する可能性のある状態および疾患としては、血液凝固および塞栓症、嚢胞、増殖、腫瘍、貧血(鎌状赤血球貧血を含む)、血友病、他の血液凝固疾患(例えばフォン・ウィルブランド病、ITP)、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。このような状態および疾患は、傷害、疾患、または状態のために、生物中の細胞または組織に低酸素または無酸素状態を必ず作り出すものも含んでいる。
【００９１】
いくつかの例では、半致死的集計用量(sublethal collective dose)または非致死的集計用量(nonlethal collective dose)が生物物体に投与される。上記で論じたように、生物全体ではない生物物体へのスタシス誘導に関連しては、「半致死的集計用量」は、合計しても、一回の投与で、24時間以内に少なくとも大部分の細胞を死滅させる活性化合物量の半分よりも少ない活性化合物を複数回投与した時の量を意味する。他の態様では、有効量は、酸素アンタゴニストまたは他の活性化合物の近致死的用量として特徴付けられる。同様に、「近致死的集計用量」(near-lethal collective dose)は、一回の投与で24時間以内に少なくとも大部分の細胞を死滅させる活性化合物量の25%以内である、酸素アンタゴニストまたは他の活性化合物を複数回投与した時の量を意味する。また、「超致死的集計用量」(supra-lethal collective dose)は、一回の投与で24時間以内に少なくとも大部分の細胞(または生物全体)を死滅させる活性化合物量の少なくとも1.5倍である、活性化合物を複数回投与した時の量を意味する。複数回投与は、生物全体にスタシスを誘導するために投与できることが企図される。「半致死的集計用量」、「近致死的集計用量」、および「超致死的集計用量」の定義は、先に論じた生物全体へのスタシスに関する個別用量に基づいて推定できる。
【００９２】
生物物体は、一つより多い活性化合物に曝露または接触させてもよい。生物物体は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくはそれ以上の活性化合物、あるいはそこから導き出せる任意の範囲を含む、少なくとも一つの活性化合物に曝露できる。複数の活性化合物を用いる場合、用語「有効量」は、活性化合物の集計量を指す。例えば、生物物体を第1活性化合物に曝露してから、次に第2活性化合物に曝露することができる。または、生物物体は、同時または重複する形で、一つより多い活性化合物に曝露できる。さらには、一つより多い活性化合物を、単一組成物のように含ませ、または一つに混合し、これに生物物体を曝露できることが企図される。したがって、いくつかの態様では、本発明の組成物、方法、および製造物に活性化合物の組み合わせを用いることが企図される。
【００９３】
生物物体は、吸入、注射、カテーテル法、液浸、洗浄、潅流、局所適用、吸収、吸着、または経口投与により、活性化合物を提供されまたは活性化合物に曝露されることができる。よりさらには、生物物体は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹膜内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、髄腔内に、硝子体内に、膣内に、内部直腸に、局所に、腫瘍内に、筋肉内に、腹膜内に、眼球内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、経口的に、局所に、局部に、吸入によって、注射によって、注入によって、持続性点滴によって、局所化潅流によって、カテーテルを介して、または洗浄を介して、生物物体への投与によって活性化合物を提供されまたは活性性化合物に曝露されることができる。
【００９４】
本発明の方法および器具は、いくつかの態様では酸素アンタゴニストである保護剤を含む。そしてさらなる態様では、酸素アンタゴニストは還元剤である。これに加えて、酸素アンタゴニストはカルコゲニド化合物と特徴付けることができる。活性化合物は、保護剤でもよいことが理解されるだろう。
【００９５】
ある態様では、カルコゲニド化合物は硫黄を含み、一方、別の態様では、それはセレン、テルル、またはポロニウムを含む。ある態様では、カルコゲニド化合物は、一つまたは複数の露出したスルフィド基を含有する。このカルコゲニド化合物は、1、2、3、4、5、6、またはそれ以上の露出したスルフィド基、あるいはそこから導き出せる任意の範囲を含有することが企図される。特定の態様では、このスルフィド含有化合物はCS2 (二硫化炭素)である。
【００９６】
よりさらには、本発明のいくつかの方法では、スタシスは、次式(式Iと呼ぶ)の化学構造を有する還元剤に細胞を曝露することによって細胞で誘導される：
2009534422.tif 000004
式中、
Xは、N、O、Po、S、Se、またはTeであり；
Yは、NまたはOであり；
R1は、H、C、低級アルキル、低級アルコール、またはCNであり；
R2は、H、C、低級アルキル、低級アルコール、またはCNであり；
nは、0または1であり；
mは、0または1であり；
kは、0、1、2、3、または4であり；かつ
pは、1または2である。
【００９７】
用語「低級アルキル」および「低級アルコール」はそれらの通常の意味で用いられており、記号は化学元素を指すのに用いられる記号である。この化学構造は、「還元剤構造」とも呼ばれ、この構造を有する任意の化合物は、還元剤構造化合物と呼ばれる。さらなる態様では、還元剤構造中では、kは0である。さらには、別の態様では、R1および／またはR2基はアミンまたは低級アルキルアミンでよい。他では、R1および／またはR2は単鎖アルコールまたは単鎖ケトンでよい。これに加えて、R1および／またはR2は直鎖または分岐鎖の架橋でよく、かつ／または化合物は環式化合物でよい。そしてさらなる態様では、Xはまたハロゲンでよい。用語「低級」は、1、2、3、4、5、もしくは6個、またはそこから導き出せる任意の範囲の炭素原子を指すことを意味する。よりさらには、R1および／またはR2は、C2〜C5エステル、アミド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エーテル、ニトリル、アンヒドリド、ハライド、アシルハライド、スルフィド、スルホン、スルホン酸、スルホキシド、および／またはチオールを含む他の小型有機基でもよい。このような置換基は、R1および／またはR2に関して明確に企図される。ある他の態様では、R1および／またはR2は、上記小型有機基の単鎖型でよい。「単鎖」とは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個の炭素分子、あるいはそこから導き出せる任意の範囲を意味する。
【００９８】
還元剤構造化合物は、いくつかの例ではカルコゲニド化合物のことがあることが企図される。ある態様では、カルコゲニド化合物は、曝露されたカルコゲニドを持つアルキル鎖を有する。他では、カルコゲニド化合物は、生物物体内に取り込まれると露出するようになるカルコゲニドを有する。この点に関してカルコゲニド化合物は、酸素アンタゴニストなどのプロドラッグに似ている。したがって、カルコゲニド化合物への生物物体の曝露に続いて、化合物上の一つまたは複数の硫黄、セレン、酸素、テルル、ポロニウム、またはウンウンヘキシウム分子が利用可能となる。この場合、「利用可能」とは、硫黄、セレン、酸素、テルル、ポロニウム、またはウンウンヘキシウムが負の電荷を保持することを意味する。
【００９９】
ある態様では、カルコゲニドは塩であり、好ましくはカルコゲンが-2酸化状態にある塩である。本発明の態様に包含されるスルフィド塩としては、硫化ナトリウム(Na2S)、亜硫酸水素ナトリウム(NaHS)、硫化カリウム(K2S)、硫化水素カリウム(KHS)、硫化リチウム(Li2S)、硫化ルビジウム(Rb2S)、硫化セシウム(Cs2S)、硫化アンモニウム((NH4)2S)、硫化水素アンモニウム(NH4)HS、硫化ベリリウム(BeS)、硫化マグネシウム(MgS)、硫化カルシウム(CaS)、硫化ストロンチウム(SrS)、硫化バリウム(BaS)等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の態様は、同様の様式で、対応するセレニドおよびテルニド塩を含むが、これらに限定されない。本発明は、カルコゲニド塩(塩であるカルコゲニド化合物)を薬学的に許容される担体と一緒に含有するか、または薬学的に許容される製剤として調製された組成物を含むことが特に企図される。よりさらなる態様では、還元剤構造化合物は、H2S、H2Se、H2Te、およびH2Poからなる群より選択される。いくつかの例では、式(I)の還元剤構造は、SであるXを有する。他では、XはSeであるか、またはXはTeであるか、またはXはPoであるか、またはXはOである。さらには、いくつかの態様では、還元剤構造中のkは0または1である。ある態様では、還元剤構造化合物は、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルスルフィド(DMS)、一酸化炭素、メチルメルカプタン(CH3SH)、メルカプトエタノール、チオシアナート、シアン化水素、メタンチオール(MeSH)、またはCS2である。特定の態様では、酸素アンタゴニストは、H2S、H2Se、CS2、MeSH、またはDMSである。これら分子のおおよそのサイズの化合物が特に企図される(つまり、それらの分子量の50%以内)。
【０１００】
ある態様では、H2Seなどのセレン含有化合物が用いられる。H2Seの量は、本発明のいくつかの態様では、1〜1000ppbの範囲内でよい。硫黄含有化合物の関係で論じる任意の態様は、セレン含有化合物で実施できることがさらに企図される。これは、硫黄含有分子中の一つまたは複数の硫黄原子を対応するセレン原子で置換することを含む。
【０１０１】
本発明の一つの局面は、式IIによって表される化合物が含まれる、メルカプトエチルアミンに由来する化合物に関する：
2009534422.tif 000005
式中、
nは、0、1、または2であり；
pおよびmは、0または1であり；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立して、水素、ヒドロキシル、チオ、アルキル（例えば、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル）カルボキシル、アミノ、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオスルホン酸、シクロアルケニルであり；または
R1もしくはR2は、R5もしくはR6と共に、bが2、3、4、5、もしくは6である-(CH2)b-であり；または
R1もしくはR2とR3もしくはR4、またはR3もしくはR4とR5もしくはR6は、共にC=Cを形成し；または
R1およびR2はR3およびR4と共に、もしくはR3およびR4はR5もしくはR6と共に、C≡Cを形成し；または
R1およびR2もしくはR3およびR4はXと共に、-(CHR9)c-S-、-(CHR9)c-SO2-を形成し、式中R9はHまたはCH3であり、かつcは1または2であり；ならびに
R7およびR8は、独立して、水素、ヒドロキシル、アルキル（例えば、ヒドロキシアルキル、アリールアルキル、アリールチオアルキル、アリールスルホニル、アルキルチオアルキル、アルコキシアルキル、アシルアルキル（例えば、（ハロアルキルカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル））、アルキルスルホニル、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、アシル（例えば、ホルミル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニル、アルキルイミノカルボニル、アルキルチオカルボニル）、アミジル、アミジノ、グアニジノ、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシアルキル、ヘテロアリールオキシアルキル、ニトロソ、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリル、ヒドラジノ、ヒドラジド、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシであり；
R1およびR2、R3およびR4、またはR5およびR6は、共に、=NH、=NOH、=S、=O、aが3、4、または6である-(CH2)a-を形成し；ならびに
R7およびR8はXと共に、R10がHもしくはC1〜C2アルキル、C1〜C2ハロアルキルであり、YがO、S、もしくはNHであり、dが0、1、もしくは2であり、eが0もしくは1であり、fが0もしくは1であり、gが0もしくは1である-(CHR10)d-(N)e-C(=Y)f-(S)g-を形成するか、またはR11がC1-C3アルキルもしくはC1-C3アルコキシであるP(=S)R11を形成し；または
R7およびR8はXと共に、R10がチオ、アミノ、アルキルアミノ、もしくはヒドラジノである=C(R10)-を形成し；または
R7もしくはR8は、R1、R2、R3、R4、R5、もしくはR6と共にヘテロシクリル環を形成し；または
R7もしくはR8は、R1もしくはR2と共に、pが0の場合R3もしくはR4と共に、またはpおよびmが0の場合R5もしくはR6と共に、-N=C-を形成し；または
R7およびR8は、R1もしくはR2と共に、pが0の場合R3もしくはR4と共に、またはpおよびmが0の場合R5もしくはR6と共に、N≡C-を形成し；または
R7およびR8はNと共に、ヘテロシクリル置換基を形成し；およびXが原子価結合である場合、R5またはR6はSと共に、C=Sを形成し；ならびに
Xは水素、シアノ、イソシアノ、ホスフェート、アルキル（例えば、アミノアルキル、シアノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシハロアルキル）アルケニル、アルキニル、アルキルスルホン酸、アルキルチオスルホン酸、アルキルチオアルキル、アリールチオ、アリールアルキル、アリールチオ、アミノアルキルチオ、ヒドロキシアルキルチオ、アシル（例えば、チオカルボニル、アルキルカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルキルアミノチオカルボニル、ハロアルキルカルボニル）、スルホン酸、スルホン酸アルキルエステル、チオカルボニル、チオスルフェート、スルホンアミド、アシルチオール、アシルジスルフィド、アルコキシチオカルボニル、原子価結合であり；またはXは
2009534422.tif 000006
であり、式中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、およびR8は、先に定義した通りである。
【０１０２】
いくつかの態様において、式IIの化合物は、以下である式II（a）の化合物によって表される：
n＝0、p＝1、m＝1であり；
XはH、SO3H、PO3H2、または
2009534422.tif 000007
であり、
式中、
R1もしくはR2は、R5もしくはR6と共に、bが2、3、4、5、もしくは6である-(CH2)b-であり；または
R1もしくはR2とR3もしくはR4、またはR3もしくはR4とR5もしくR6は、共にC=Cを形成し；または
R1およびR2はR3およびR4と共に、またはR3およびR4はR5もしくはR6と共に、C≡Cを形成し；または
R1およびR2、もしくはR3およびR4はXと共に、-(CHR9)c-S-、-(CHR9)c-SO2-を形成し、式中R9はHまたはCH3であり、ならびにcは1もしくは2であり；ならびに
R7およびR8は、Hであり；ならびに
R1はC1-C3アルキルであって、R2、R3およびR4はHであり；または
R3はCH3であって、R1、R2、およびR4はHであり；または
R1およびR3は共に、hが4または5である-(CH2)h-を形成し、R2およびR4はHであり；または
R1は、jが1、2、3、4、もしくは5であるNH2(CH2)j-であり、R2、R3、およびR4はHである。
【０１０３】
いくつかの態様において、式IIの化合物は、以下である式II（b）の化合物によって表される：
n＝0、p＝1、m＝1であり；
XはH、SO3H、またはPO3H2であり；
R1、R2、R3およびR4はHであり；
R7はHであり；
R8は、kが1、2、3、8、9、もしくは10であるCH3(CH2)k-であり；または
R8は、qが4もしくは5であって、C6H5がm-OCH3またはp-OCH3によって置換されてもよいC6H5(CH2)q-であり；
R8は、-CH2CH2OH、-CH2CHOHCH3、-CH(CH2OH)CHOHCH2OH、-CH2CHOHCH(CH3)CH2C(CH3)3であってもよいヒドロキシアルキルであり；または
R8は、uが3、4、5、6、7、もしくは8であって、R11が、wが4、5もしくは6である(CH2)wCH-であるか、またはR11が一つもしくは二つのメチル基によって置換されてもよいシクロヘキシルである、R11-O-(CH2)u-であってもよいシクロアルキルオキシであり；
R8は、vが4、5、もしくは6であって、C6H5-が一つまたは二つのハロ、ニトロソ、メトキシ、またはC1-C2アルキルによって置換されてもよいC6H5-O-(CH2)v-であってもよいフェノキシアルキルであり；または
R8は、R13がC4アルキルであって、R12が、メチルもしくはメトキシによって置換されてもよいシクロヘキシルもしくはシクロヘキセニルである、R12R13-であってもよいシクロアルキルアルキルであり；または
R8は、置換されてもよいピリジルオキシアルキルもしくはキノイルオキシアルキルであり；または
R8は、R15およびR16が独立してH、CH3、またはH2NC(=N)-であり、R17がC3-C5アルキルであるR15R16N-R17-であり；または
R8は、R17がH、CH3、もしくはH2NC(=N)-であるR17NH(CH2)3-である。
【０１０４】
いくつかの態様において、式IIの化合物は、以下である式II（c）の化合物によって表される：
n＝0、p＝1、m＝1であり；
R1およびXは共に、チアゾリジンを形成するために-(CH2)2を形成し；および
R2、R3、およびR4はHであり；および
R7はHであり；および
R8は、置換されてもよいピリジルオキシアルキルもしくはキノイルオキシアルキルであり；または
R8は、R14が、置換されてもよい2-ピリジルであってもよい置換されてもよいピリジルであり、aaが3、4、5、6、もしくは7であるR14-S-(CH2)aa-であり；または
R8は、bbが4もしくは5であるCH3(CH2)bbS(CH2)5-である。
【０１０５】
本発明において用いられる化合物は以下の亜群の式II（a）、式II（b）、または式II（c）のいずれかに由来してもよいと企図される。その上、複数の化合物を用いる場合、それらの化合物の一つまたは複数は、同じ亜群に由来してもよく、由来しなくてもよい。その上、本発明のいくつかの態様において、化学的または酵素的手段によってなど、生物物体に曝露することによって式IIの化合物の活性型となる前駆体化合物を生物物体に提供することが企図される。さらに、化合物は、化合物の塩として生物物体に提供されてもよい。
【０１０６】
本発明の一つの局面は、式III、R18およびR19が独立して水素、アルキル、アルキルチオアルキルであるR18SR19、またはR20がアリール、アルキルアリールもしくはアルキルであるSR20によって表される化合物を対象とする。
【０１０７】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は、式III（a）によって表され、式中R20はアリール、アルキルアリールまたはアルキルであり、一つまたは複数のスルホニルナトリウム（-SO3Na）またはスルホニルメチルナトリウム（-CH3SO3Na）基によって置換され、一つまたは複数のハロ基によって置換されてもよい。
【０１０８】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は、式III（b）によって表され、式中R20は、ビフェニル、ナフチル、ベンジル、C3-C4ヒドロキシアルキルであってもよいC3-C4アルキルである。
【０１０９】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は式III（c）によって表され、式中R20は1'-ナトリウムスルホニル-3,3'-ジクロロ-ビフェニル-1-イルであってもよい1'-ナトリウムスルホニル-ビフェニル-1-イルであってもよいビフェン-1-イルであってもよいビフェニルである。
【０１１０】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は式III（d）によって表され、R20は、7-ナトリウムスルホニル-ナフト-1-イルであってもよいナフト-1-イルであってもよいナフチルである。
【０１１１】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は、式III（e）によって表され、R20は、オルト-ナトリウムスルホニルメチル-ベンジルであってもよい。
【０１１２】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は式III（f）によって表され、R20はC4であってもよく、および／またはCH3-CO-O-であってもよい一つもしくは複数のアルキルカルボニルオキシ基、一つもしくは複数のヒドロキシ基および／またはナトリウムスルホニル基によって置換されてもよいC1-C6アルキルであってもよいアルキルであり、そのような基には、-CH2(CHOCOCH3)2CH2SO2Na, -(CH2)4SO2Naおよび-CH2CHOHCH3が含まれる。
【０１１３】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は、式III（g）によって表され、式中R18および／またはR19は、CH3(CH2)3S(CH2)2-であってもよい(C1-C6アルキル)-チオ-(C1-C6アルキル)であってもよいアルキルチオアルキルである。
【０１１４】
いくつかの態様において、式IIIの化合物は式III（h）によって表され、式中R18および／またはR19は、-(CH2)4SO3Naであってもよい一つもしくは複数のナトリウムスルホニル基によって置換されてもよく、またはCH2CHOHCH3であってもよい一つもしくは複数のヒドロキシ基によって置換されてもよいC1-C6アルキルであってもよいアルキルである。
【０１１５】
本発明において用いられる化合物は、亜群の式III（a）、式III（b）、式III（c）、式III（d）、式III（e）、式III（f）、式III（g）、または式II（h）のいずれであってもよいと企図される。その上、複数の化合物を用いる場合、それらの化合物の一つまたは複数は、同じ亜群に由来しても由来しなくてもよい。その上、本発明のいくつかの態様において、化学的または酵素的手段によってなど、生物物体に対する曝露によって式IIIの化合物の活性型となる前駆体化合物を生物物体に提供することが企図される。さらに、化合物は、化合物の塩として生物物体に提供されてもよい。
【０１１６】
本発明のさらなる局面は、式IVで表される化合物を包含する：
2009534422.tif 000008
式中、
Xは、N、O、P、Po、S、Se、Te、O-O、Po-Po、S-S、Se-SeまたはTe-Teであり；
nおよびmは、独立に、0または1であり；ならびに
式中、R21およびR22は、独立に、水素、ハロ、シアノ、リン酸、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アミノアルキル、シアノアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシハロアルキル、アルキルスルホン酸、チオスルホン酸、アルキルチオスルホン酸、チオアルキル、アルキルチオ、アルキルチオアルキル、アルキルアリール、カルボニル、アルキルカルボニル、ハロアルキルカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アルキルアミノチオカルボニル、ハロアルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノアルキルチオ、ヒドロキシアルキルチオ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、スルホン酸、スルホン酸アルキルエステル、チオ硫酸またはスルホンアミドであり；ならびに
Yは、シアノ、イソシアノ、アミノ、アルキルアミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルカルボニルアミノ、アミジノ、グアニジン、ヒドラジノ、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロ アリールオキシ、シロアルキルオキシ、カルボニルオキシ、アルキルカルボニルオキシ、ハロアルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、カルボニルペルオキシ、アルキルカルボニルペルオキシ、アリールカルボニルペルオキシ、リン酸、アルキルリン酸エステル類、スルホン酸、スルホン酸アルキルエステル、チオ硫酸、チオスルフェニル、スルホンアミド、-R23R24であり、ここで、R23は、S、SS、Po、Po-Po、Se、Se-Se、Te、またはTe-Teであり、およびR24は、本明細書でR21についての定義の通りであるか、あるいは
Yは
2009534422.tif 000009
であり、
式中、
X、R21およびR22は、本明細書に定義の通りである。
【０１１７】
よりさらには、本発明のいくつかの態様では、化学的または酵素的手段などにより生物物体への曝露によって、式IまたはIVの化合物の活性型になる前駆体化合物が生物物体に提供されることが企図される。これに加えて、化合物は、遊離ラジカルの形、または負に帯電した、正に帯電した、または多価の種の形をした化合物の塩として生物物体に提供することもできる。いくつかの化合物は、式Iおよび式IVの化合物の両方としての資格を与え、このような場合、「式Iまたは式IV」という表現の使用は、このような化合物を排除することを暗示するものではない。
【０１１８】
式Iまたは式IVの構造により区別される化合物は、ある態様では、酸素アンタゴニスト、保護的代謝剤、またはその前駆体、プロドラッグ、もしくは塩としても特徴付けることができる。化合物は、それが本発明の特定の方法を達成できる限りにおいては、そのようなものとして特徴付けることも、または本発明の中で用いられる化合物であるものに制限する必要もないことがさらに企図される。いくつかの他の態様では、化合物はカルコゲニド化合物と考えられる。式Iもしくは式IVの構造により同定されるか、または本開示に記載されている、任意の化合物は、本発明の方法、組成物、および器具の中で、酸素アンタゴニストに代わって、またはそれに追加して用いることができる；同様に、式Iもしくは式IVを有するか、さもなければ本開示に記載されている任意の構造に関して論じられる任意の態様は、酸素アンタゴニストの代わり、またはそれに追加して用いることができることが特に企図される。よりさらには、式Iもしくは式IVの構造によって同定されるか、または本開示に記載されている任意の化合物は、本明細書に記載されている任意の活性化合物と組み合わせることができる。このような化合物の任意の組み合わせは、本発明の方法、組成物、および他の製造物の中で、連続的に(重複もしくは重複しない)、および／または重複して連続する形で(一つの化合物の投与を開始し、それが完了する前に別の化合物の投与を開始する)提供されるか、または一緒に調合されて、本明細書に記載の所望効果を達成できることも企図される。
【０１１９】
ある態様では、式Iまたは式IVの構造を有する一つより多い化合物が提供される。ある態様では、同一式(即ち式Iまたは式IV)由来の構造を持つ複数の異なる化合物が用いられるが、一方、別の態様では、複数の化合物を用いる時、それらは異なる式に由来する。
【０１２０】
特定の態様において、複数の活性化合物が用いられ、その内の化合物の一つが二酸化炭素(CO2)であることが企図される。少なくとも一つの他の化合物は、いくつかの態様での式Iおよび／または式IV化合物でもあることが企図される。ある例では、二酸化炭素は、H2S、またはH2S前駆体と組み合わせて(一緒に、連続して、または重複する形で連続的に)生物物体に提供される。
【０１２１】
生物物体に曝露できる二酸化炭素の量は、約、少なくとも約、または最大で約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30%、またはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。ある態様では、量はppmの単位で表すことができ、例えば、約、少なくとも約、または最大で
2009534422.tif 000010
ppmまたはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲、ならびに同等のモルで表される。これら濃度は、気体の形の任意の他の活性化合物にも応用できることが企図される。
【０１２２】
別の態様では、活性化合物は硫化ナトリム、チオメトキシドナトリウム、システアミン、またはテトラヒドロチオピラン-4-オールであることが特に企図される。さらなる態様では、活性化合物はチオシアン酸ナトリウム、システアミン-S-リン酸塩、ジメチルスルホキシド、チオ酢酸、セレノウレア、アミホスチン、2-メルカプトエタノール、チオグリコール酸エーテル、ナトリウムセレナイド、ナトリウムメタンスルフィナート、チオウレア、またはジメチルスルフィドである。これらの化合物、または式IもしくはIVを有する任意の化合物を含む本明細書で論じる任意の他のものは、約、少なくとも約、もしくは最大で
2009534422.tif 000011
またはmmol/kg (生物物体の)、あるいはそこから導き出せる任意の範囲の量を生物物体に提供し、または投与できることが特に企図される。
【０１２３】
名称または構造によって同定される活性化合物の任意のサブセットは、方法、組成物、および製造物に用いてよいことが特に企図される。これら化合物の任意のサブセットは、本発明の態様を構成しないものとして放棄できることも特に企図される。本発明は、一つまたは複数の活性化合物を治療有効量含む薬学的組成物にも関する。このような薬学的組成物は、薬学的に許容される組成物に調合されることが理解される。例えば、組成物は薬学的に許容される希釈剤を含んでよい。
【０１２４】
ある態様では、薬学的組成物は、患者に投与した時に、活性化合物のCmaxまたは定常状態血漿濃度を提供して、治療有効便益をもたらす活性の有効用量を含有する。ある態様では、到達するCmaxまたは定常状態血漿濃度は、約、少なくとも約、または最大で
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もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。ある態様では、H2Sなどの場合、所望のCmaxまたは定常状態血漿濃度は、約10μM〜約10mMの間、または約100μM〜約1mMの間、または約200μM〜約800μMの間である。適切な測定を行って、硫黄などの血中に存在している化合物のレベルを考察および評価できる。
【０１２５】
ある態様では、薬学的組成物は、患者に投与した時に有効用量のH2Sを提供し、約10μM〜約10mMの間、約100μM〜約1mMの間、または約200μM〜約800μMの間のCmaxまたは定常状態血漿濃度を提供する。硫化水素の投与と硫化塩の形での投与との関係では、典型的な態様では、塩の投与は、H2Sの場合とほぼ同じ硫黄当量を投与することに基づく。適切な測定を行って、血中に存在する硫黄のレベルを考察および評価できる。
【０１２６】
ある態様では、組成物は、気体の形をした一つまたは複数の上に特記した活性化合物を含む。別の態様では、組成物はこれら化合物の一つまたは複数の塩を含む。一つの特定の態様では、薬学的組成物は、式I、II、III、もしくはIVの形をした気体、またはそれらの塩を含む。本発明のいくつかの局面では、気体の形をした、または塩であるH2Sが特に企図される。生物物体に提供される気体の量は、約、少なくとも約、または最大で
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ppmもしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。または、気体の有効量は、生物物体が曝露される空気中の濃度に関して、約、少なくとも約、または最大で
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、あるいはそこから導き出せる任意の範囲で表してもよい。よりさらには、いくつかの態様では、生物物体に提供される気体の量は、約、少なくとも約、または最大で10億分率で
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ppb、あるいはそこから導き出せる任意の範囲であることが企図される。特定の態様では、生物物体に提供されるセレン化水素の量はおおよそこの規模である。
【０１２７】
本発明のいくつかの態様では、薬学的組成物は脂質である。他所で論ずるように、組成物は、組成物中に関係化合物を溶解または気泡化した脂質でよい。いくつかの例では、薬学的組成物は医療ガスである。United Staes Food and Drug Administrationによれば、「医療ガス」は、Federal Food, Drug and Cosmetic Act (「法令」)の§201(g)(1)(21 U.S.C.§321(g)の意味する範囲内であり、かつ法令(21 U.S.C.§353(b)(1)(A)の§503(b)(1)(A)に従う薬物であり、かつ処方にしたがって製剤化されることが求められる気体である。このようにして、このような医用ガスは、適切なFDAラベルを必要とする。医療ガスは、少なくとも一つ活性化合物を含む。
【０１２８】
本発明は、以下を含む、器具および製造物をさらに含む：包装材料、および包装材料の中に活性スタシス化合物を収容し、該包装材料はインビボ生物物体内にスタシスを誘導するために用いることができることを示すラベルを含む。
【０１２９】
いくつかの態様では、器具または製造物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。特定の他の態様では、器具または製造物は、緩衝化剤を有する。活性化合物は第1密封容器内に収められ、薬学的に許容される希釈剤は第2密封容器に提供される。他の態様では、器具または物品は、活性化合物と希釈剤を混合するための指示を有している。これに加えて、活性化合物は、インビボ生物物体をスタシスに誘導するなどの本発明の任意の方法を達成するために再構成することができる。ラベルは、達成される結果およびその結果が必要とする患者への化合物の使用を明示することが企図される。
【０１３０】
本発明はまた、以下を含む、一緒に包装された製造物にも関する：活性化合物、活性スタシス化合物の使用に関する以下を含む、指示：(a)スタシス処置を必要とするインビボ組織を同定すること；および(b)活性化合物の有効量をインビボ生物物体に投与すること。
【０１３１】
本発明のさらなる態様では、活性化合物を含む医療ガス、ならびに生物物体をスタシスに誘導するための詳細、または使用および投与、または本発明の他の任意の方法を含むラベルを含む製造物が存在する。
【０１３２】
本発明は、キットおよびこれらキットの使用方法にも関する。いくつかの態様では、スタシス処置または本発明が請求する任意の他の処置を必要とする組織部位に活性化合物を送達するための以下を含む、キットが存在する：組織部位を密封したエンベロープを形成するのに適したドレープ；酸素アンタゴニストを含む容器；およびドレープ内の注入口、ここで、活性物質を含む容器は注入口と連絡している。ある態様では、キットはドレープ内に排出口を備えており、前記排出口は陰圧源に連絡している。いくつかの例では、ドレープは、エラストマー材料を含み、かつ／またはドレープの周囲を覆う圧感受性接着剤を有している。排出口は、陰圧源と流体連絡させてもよく、陰圧源は真空ポンプであってもなくともよい。また排出口と陰圧源間を連絡する可撓性導管が存在してもよい。いくつかの態様では、キットは取り外し可能でもなくともよい、排出口と陰圧源の間が流体連絡しているキャニスターを含む。容器は、注入口と気体連絡している活性化合物を含むことが企図される。ある態様では、容器は、気体または液化ガスである活性化合物を含む。キットは、酸素アンタゴニストの入った容器と排出口との間を連絡する気化器を備えてもよい。これに加えて、キットは活性化合物の入った容器と連絡している戻り排出口を有してもよい。
【０１３３】
特定の態様では、キット内の活性化合物は一酸化炭素、二酸化炭素、H2Se、および／またはH2Sである。ある態様では、キットまたは方法が用いられる組織部位は傷を負っている。
【０１３４】
よりさらには、本明細書で酸素アンタゴニストとして論じる任意の化合物は、生物物体にプロドラッグの形で提供することができると一般的に理解されるが、これは生物物体または生物物体の環境内にある他の物質が該プロドッグをその活性型、即ち酸素アンタゴニストに変えることを意味する。用語「前駆体」は、「プロドラッグ」と見なされる化合物もその範囲に含むことが企図される。
【０１３５】
活性化合物は、気体、半固体液体(ゲルまたはペーストなどの)、液体、または固体として提供することができる。生物物体は、一つより多いこれら化合物および／または一つより多い状態のその化合物に曝露できることが企図される。よりさらには、作用物質は、本明細書に論ずるように、投与の固有の形態に合わせて調合できる。ある態様では、作用物質は、静脈内送達のための薬学的に許容される調合である。
【０１３６】
ある態様では、活性化合物は気体である。特定の態様では、気体化合物としては、一酸化炭素、二酸化炭素、窒素、硫黄、セレン、テルル、もしくはポロニウム、またはそれらの混合物が挙げられる。よりさらには、化合物は、気体のカルコゲニド化合物であることが特に企図される。いくつかの態様では、化合物は一つより多い気体を含む気体混合物である。他の気体は、いくつかの態様で、非毒性および／または非反応性気体である。いくつかの態様では、他の気体は希ガス(ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン、ラドン、もしくはウンウンオクチウム)、窒素、亜酸化窒素、水素、またはそれらの混合物である。例えば、非活性気体は、単純に「大気」を構成する混合物でよく、それは窒素、酸素、アルゴン、および二酸化炭素、ならびにネオン、ヘリウム、メタン、クリプトン、および水素などの微量の他の分子の混合物である。典型的なサンプルは、約窒素78%、酸素21%、アルゴン0.9%、および二酸化炭素0.04%を含むが、それぞれの正確な量は変わる。本発明との関係では、「大気」は窒素を約75〜81%、酸素の約18〜約24%、アルゴンを約0.7〜約1.1%、および二酸化炭素を約0.02%〜約0.06%を含有する混合物であることが企図される。気体活性化合物は、生物物体に投与または曝露する前に、まず非毒性および／または非反応性気体を用いて希釈してよい。これに加えて、またはこれに代わって、生物物体に投与または曝露する前に任意の気体活性化合物を大気と混合するか、あるいは化合物を生物物体に大気中で投与または曝露してよい。
【０１３７】
いくつかの例では、気体混合物は酸素も含む。本発明の別の態様では、活性化合物の気体を酸素と混合して酸素気体(O2)混合物を作る。酸素気体混合物中の酸素の量が、該混合物中の他の全ての気体の総量よりも少ない酸素気体混合物が特に企図される。
【０１３８】
いくつかの例では、活性化合物の量は、酸素の量に対する量であるが、一方、他では、それは絶対量である。例えば、いくつかの本発明の態様では、酸素の量は、標準温度および20℃の圧での空気100万部中の酸素の容積の割合の量である「百万分の一(ppm)」で表され、一大気圧および気体容積のバランスは一酸化炭素で取られる。この関係では、酸素に対する活性化合物の量は、活性化合物でバランスが取られた100万分の一で表された量に関係する。生物物体が曝露する、またはインキュベートされる大気は、活性化合物でバランスが取られた、少なくとも0、50、100、200、300、400、500、1000、または2000百万分の一(ppm)の酸素であり、いくつかの例では、活性化合物が非毒性および／または非反応性の気体と混合されることが企図される。用語「環境」は、生物物体の直近の環境、即ちそれが直接接触している環境を指す。したがって生物物質は、活性化合物に直接曝露されなければならず、生物物体と同じ空間に活性化合物の密封タンクに存在するだけでは不十分であり、本発明にしたがって「環境」とインキュベートされると見なされる。または、大気は、kPaを用いて表すことができる。一般には、1気圧で100万部 = 101 kPaであると理解されている。本発明の態様では、生物物質がインキュベートまたは曝露される環境は、約、少なくとも約、または最大で約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20. 0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.5、0.90、0.95、1.0 kPaのO2もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。上記したように、このようなレベルは、一酸化炭素および／またはその他非毒性および／または非反応性規定でバランスを取ることができる。また、大気は、kPaの単位の活性化合物のレベルで定義してもよい。ある態様では、大気は、約、少なくとも約、または最大で約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、101、101.3 kPa、あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。
【０１３９】
いくつかの態様では、本発明は一つまたは複数の活性化合物を含有する組成物および製造物に関する。ある態様では、組成物は、これら活性化合物の一つまたは複数を、生物物体が組成物に曝露した時に生物物体に化合物を提供するようにその中に泡立てられた気体として有している。このような化合物は、ゲル、液体、または他の半固形物でよい。ある態様では、気体の形で泡立てられた量は、溶液に曝露した生物物体に適切量の化合物を提供することが企図される。ある態様では、溶液は、その中を通し泡立てられた気体として酸素アンタゴニストを有している。気体として泡立てられた量は、溶液に曝露される生物学的物質に相応しい量の化合物を提供するだろうと企図される。溶液中に泡立てられる気体の量は、生物物体に効果的に提供される量の約、少なくとも約、または最大で約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍、もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲である。
【０１４０】
生物物体は、本発明のいくつかの態様では、閉鎖された容器内でガスに曝露されてもよい。いくつかの例では、閉鎖容器は、特定の環境を維持できるか、または環境を所望通りに変えられる。環境とは、生物物体が曝露される酸素アンタゴニストの量、および／または環境の温度、気体組成、もしくは圧を指す。いくつかの例では、生物物体は、活性化合物に曝露する前、最中、または後に真空に置かれる。
【０１４１】
よりさらには、他の例では、生物物体は、活性化合物に曝露した後で正常酸素環境に曝露される。ある態様では、本発明は、別のスタシス誘導活性化合物または環境条件を生物物体に提供するのに合わせて、生物物体に活性化合物を提供することを含む、スタシスを誘導するかまたは傷害または疾患から生物物体を保護するための方法を含む。このような組み合わせ処置は、任意の順番、例えば同時または連続的に行える。
【０１４２】
一定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、生物物体の生存能力を高める方法を企図する：（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階、および（b）生物物体を低酸素状態に置く段階。そのような方法において、低酸素状態は、無酸素状態であるとさらに定義されてもよい。一定の態様において、段階（a）および（b）は、連続的または同時に行ってもよい。特定の態様において、段階（b）は、段階（a）の後に行われる。一定の態様において、生物物体を低酸素状態に供しながら活性化合物が提供される。他の態様において、活性化合物は、生物物体への提供が中止され、次に生物物体は低酸素状態に供される。
【０１４３】
H2SまたはCO2を含む任意の活性化合物が、生物物体を低酸素状態に供する前、または生物物体を低酸素状態に供する最中の投与のために企図される。一定の態様において、一つの活性化合物のみを生物物体に提供する。特定の態様において、H2Sを単独または一つもしくは複数の活性化合物と併用して提供する。生物物体を低酸素状態に供する前に、少なくとも一つの化合物の有効量を提供する最中、または提供後に、スタシスを誘導してもよく、誘導されなくともよい。本明細書において記述した任意のタイプの低酸素状態を提供してもよい。低酸素状態の提供は、生物物体に約30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、もしくは1％O2、または無O2状態、またはそれに由来し得る任意の範囲の条件を供する段階を含んでもよい。特定の態様において、生物物体は、5％O2に供される。
【０１４４】
少なくとも一つの活性化合物の有効量の提供および生物物体が低酸素状態または無酸素状態に置かれる時間はそれぞれ、本明細書において記述される任意の持続時間であってもよい。期間はまた、
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もしくはそれより多い範囲、またはそれに由来し得る任意の範囲の期間であってもよい。一定の態様において、生物物体に、少なくとも一つの活性化合物を約60分間またはそれ未満の期間提供する。一定の態様において、生物物体は、約5％O2の低酸素状態に約360分（6.5時間）曝露される。一定の態様において、生物物体は約5％O2の低酸素状態に約60分（1時間）またはそれ未満曝露される。一定の態様において、生物物体は、約3％O2の低酸素状態に約240分（4時間）曝露される。一定の態様において、生物物体は無酸素状態に約2400分（40時間）またはそれ未満の期間曝露される。
【０１４５】
一定の態様において、少なくとも一つの活性化合物が生物物体に提供され、生物物体はその後低酸素状態に置かれる。本明細書において記述される任意のタイプの低酸素状態を提供してもよい。一定の態様において、低酸素状態は、最大で約、または約 20.8、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、または0％O2に生物物体を提供する段階を含んでもよい。一定の態様において、生物物体に約5％O2の低酸素状態を提供する。さらなる態様において、生物物体を低酸素状態に供した後に、生物物体を強まる低酸素状態に連続的に曝露する：例えば約5％O2に対する曝露の後に約4％O2、3％O2、2％O2、1％O2、もしくは無O2状態、またはそのような条件の任意の連続的な組み合わせに曝露する。一定の態様において、活性化合物のそのような投与の後に、強まる低酸素状態（同時または連続的に）が、傷害もしくは外傷、または疾患の発症もしくは進行の、前、最中、もしくは後（もしくはその任意の組み合わせ）に投与される。そのような態様において、生物物体は保護されてもよい。一定の態様において、H2Sは、大量出血している生物物体および／または出血性ショックに罹患している生物物体に投与され、次に、強まる低酸素状態（例えば、約5％O2の次に約4％O2）が投与される。
【０１４６】
一定の態様において、気体である活性化合物を生物物体に提供し、その後生物物体は低酸素状態に置かれる。気体様活性化合物は、例えばH2Sであってもよい。一定の態様において、H2Sを生物物体に提供し、その後生物物体に強まる低酸素状態を連続的または同時に提供する。
【０１４７】
一つまたは複数の気体様活性化合物を生物物体に適用した後、低酸素状態および／または強まる低酸素状態を生物物体に同時または連続的に提供する場合、気体混合器を用いてもよい。気体混合器は、一つまたは複数の気体の、哺乳動物のなどの生物物体への自動的投与を可能にする。例えば、気体混合器を用いて生物物体にH2Sを提供した後に、5％O2を提供して、その後強まる低酸素状態（例えば、約4％O2または3％O2）を提供してもよい。気体混合器は当業者に周知であり、本明細書においてより詳細に記述される。
【０１４８】
一定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、出血性ショックのリスクを有する、出血性ショックに罹患している、および／または大量出血している生物物体の生存能力を高めるための方法を企図する：（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および（b）生物物体を低酸素状態に置く段階。方法はさらに、強まる低酸素状態に生物物体を供する段階を含んでもよい。一定の態様において、大量出血している生物物体および／または出血性ショックに罹患している生物物体にH2Sを最初に投与し、かつその後連続的に、強まる低酸素状態を生物物体に施す方法が企図される。
【０１４９】
本発明はまた、（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する；および（b）生物物体の代謝活性がモニターされる、低酸素状態に生物物体を置く方法を企図する。例えば、一定の態様において、生物物体によるO2消費および／またはCO2産生をモニターしてもよい。一定の態様において、生物物体に少なくとも一つの活性化合物を提供すること、および低酸素状態を同時または連続的に提供すること（任意で、強まる低酸素状態が含まれる）によって、生物物体による酸素要求は減少する。一定の態様において、少なくとも一つの活性化合物の生物物体への提供および低酸素状態の同時または連続的提供（任意で、強まる低酸素状態が含まれる）によって、チトクロームcオキシダーゼ活性の減少が起こる。チトクロームcオキシダーゼ活性に関するアッセイは当業者に周知である。例えば、Sigma- Aldrich（St. Louis, MO）チトクロームcオキシダーゼアッセイキットカタログ番号CYTOCOXl；MitoScience（Eugene, OR）チトクロームcオキシダーゼ比色定量アッセイキットカタログ番号MS400Aを参照されたい。
【０１５０】
一定の態様において、少なくとも一つの活性化合物の提供の後に、低酸素および／または強まる低酸素状態が同時または連続的に提供され、これは傷害もしくは外傷、または疾患の発症もしくは進行の、前、最中、および／または後に提供される。一定のさらなる態様において、生物物体は保護される。
【０１５１】
一定の態様において、本発明は、以下を含む、生物学的被験体を傷害、疾患の発症もしくは進行、または死亡から保護する方法を企図する：（a）傷害、疾患の発症もしくは進行、または死亡の前に、被験体に少なくとも一つの活性化合物の有効量を提供する段階；および（b）生物物体を低酸素状態に置く段階。
【０１５２】
他の態様において、本発明は、（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および（b）低酸素状態に生物物体を置く段階を含む、有害な条件下での生物物体に対する損傷を予防または低減させるための方法を企図し、ここで、損傷が予防または低減される。
【０１５３】
以下の段階を含む、生物における代謝を可逆的に阻害する方法も同様に本発明によって企図される：（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および（b）低酸素状態に生物物体を置く段階。
【０１５４】
他の態様において、本発明は、（a）少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階；および（b）低酸素状態に生物物体を置く段階を含む、生物が出血により死亡するのを防止する方法を企図し、ここで死が防止される。
【０１５５】
少なくとも一つの活性化合物の有効量を生物物体に提供する段階、および生物物体を低酸素状態に置く段階を含む、生物物体の生存能力を高める方法に関して考察されるいかなる態様も、本明細書において記述される任意の他の態様に関して実行されてもよい。
【０１５６】
よりさらには、別の態様では、生物物体が含まれる環境を少なくとも一回、異なる量または濃度の活性化合物のサイクルにかけられるが、このとき量または濃度の差は、少なくとも1%の差である。環境は、活性化合物の一つまたは複数の量または濃度の間を行ったり来たりしてもよいか、あるいは前記化合物の量または濃度を徐々に増しても減らしてもよい。いくつかの例では、量または濃度の差は、生物物体が最初に曝露された活性物質の量または濃度の約0〜99.9%の間である。量および／または濃度の差は、約、少なくとも約、または最大で約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%、もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲であることが企図される。
【０１５７】
本発明の方法は、また生物物体を制御された温度環境下に置く段階を含むことができる。ある態様では、生物物体は、生物物体が96時間を超えて生存することができない温度を指す「非生理学的温度環境」である温度に曝露される。制御された温度環境は、約、少なくとも約、または最大で
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もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲の温度を取ることができる。生物物体はまた、室温で活性化合物に曝露されてもよく、これは室温が約20℃から約25℃の間の温度を意味する。さらには、生物物体は論じた任意の量または量の範囲の中心温度に到達することが企図される。
【０１５８】
生物物体は、活性化合物に曝露させる前、最中、または後に非生理学的温度環境、または制御温度環境下に付すことができることが企図される。さらには、いくつかの態様では、生物物体は、約1分間〜約1年間の間の期間、非生理学的温度環境または制御温度環境下に付される。期間は、約、少なくとも約、または最大で約30秒間、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日間、1、2、3、4、5週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲でよい。よりさらには、下げられた温度に対し室温を上昇させる段階が存在してもよい。
【０１５９】
よりさらには、温度は、温度が制御される工程の間、変えるか、または循環させてもよいことが企図される。いくつかの態様では、生物物体の温度は、活性物質が存在する環境内にそれを置く前に最初に下げてよいが、一方他では、生物物体は、生物物体の温度より低い環境内に活性化合物と一緒にそれを入れることによって冷却されるだろう。生物物体または環境の温度は、ある温度から始まり次に別の温度に到達するように、生物物体および／または環境は、徐々に冷却または加熱してもよい。
【０１６０】
本発明の方法は、生物物体を制御圧環境下に付す段階を含むことができる。ある態様では、生物物体は、生物が典型的に存在している圧力より低い圧力に曝露される。ある態様では、生物物体は、その下では96時間を超えて生物物体が生存できない圧力を指す「非生理学的圧力環境」の下に付される。制御圧環境は、約、少なくとも約、または最大で約10-14、10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、0.2、0.3、0.4、または0.5atm、もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲の圧力を有することができる。
【０１６１】
生物物体は、活性化合物に曝露する前、最中、または後に非生理学的圧力環境、または制御圧力環境下に付することができることが企図される。さらには、いくつかの態様では、生物物体は、約1分間〜約1年間の間の期間、非生理学的圧力環境または制御圧力環境下に付される。前記時間の量は、約、少なくとも約、または最大で30秒間、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日間、1、2、3、4、5週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲でよい。
【０１６２】
よりさらには、圧力は、圧力が制御される工程の間、変えるか、または循環させてもよいことが企図される。いくつかの態様では、生物物体が曝露される圧力は、活性化合物が存在する環境内にそれを置く前に最初に下げられるが、一方他では、生物物体は、生物物体の活性化合物に曝露させられた後に圧力の下に置かれる。環境の圧力は、ある圧力から始まり次に10、20、30、40、50、60秒間、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、および／または1、2、3、4、5、6、7日間、もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出せる任意の範囲以内に別の圧力に達するように、圧力は徐々に下げてよい。ある態様では、方法は、環境の酸素レベルを変更する段階、または酸素を含む環境から生物物質を移動する段階を含む。場合によっては、生物物質を酸素が減少または存在しない環境内に曝露する段階は、酸素アンタゴニストへの生物物質の曝露を模擬してもよい。本発明のいくつかの態様では、生物物体は、以下さらに詳しく記載するように、生物物体の環境が低酸素または無酸素である状態で活性化合物に曝露されるか、それと共に提供されることが企図される。これは、意図的であってもなくともよい。したがって、本発明のいくつかの態様では、生物物体は無酸素もしくは低酸素の環境または無酸素または低酸素にされた環境に意図的に置かれる。他の態様では、生物物体は、例えば生物物体を虚血または潜在的虚血状態に置かれた場合などの意図的でない状況の結果としての状態の下に置かれる。したがって、いくつかの例では、活性化合物が存在しない状態で、低酸素または無酸素状態が生物物体を損傷することが企図される。
【０１６３】
本発明のある方法では、スタシスが誘導された生物物体の、酸素アンタゴニストおよび／または酸化的リン酸化のレベルを評価する段階も存在する。よりさらには、本発明のいくつかの態様では、生物物体に一般的に起こる細胞代謝のレベルを評価する段階が存在する。いくつかの例では、生物物体中の活性化合物の量は測定され、かつ／または生物物体の温度の低下が評価される。よりさらには、本発明のいくつかの方法では、一つまたは複数の治療効果の程度が評価される。
【０１６４】
ある別の態様では、活性化合物および／または環境変化(温度、圧力)からの生物物体への任意の有毒効果がモニタリングまたは制御される。毒性は、生物物体が曝露される活性化合物および／または環境変化のレベル、量、期間、または頻度を変えることによって制御できることが企図される。ある態様では、変化は減少であるが、ある他の態様では、変化は増加である。当業者は、生物物体での毒性効果を評価する多くの方法を承知していることが企図される。
【０１６５】
本発明の方法に関する他の段階としては、以下が挙げられる：適切な活性化合物を同定する段階；患者を診断する段階；患者病歴を得る段階、および／または患者に活性化合物を投与または処方する前に、患者に一つまたは複数の検査を受けさせる段階。
【０１６６】
本発明の方法は、生物物体をスタシスに入るために有効な時間、低酸素状態を作り出す活性化合物と生物物体をインキュベートする段階を含む、インビボ生物物体をスタシスに誘導する方法にも関する。
【０１６７】
さらには、本発明の別の態様は、生物物体を活性化合物の有効量と接触させて、それらの酸素要求を下げる段階を含む、インビボ生物物体の酸素要求を下げる方法を含む。酸素要求は、活性化合物に曝露していないか、またはもはや曝露していない生物物体の細胞または生物物体からの細胞の代表的サンプルの酸素要求量に関して、約、少なくとも約、または最大で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%、あるいはそこから導き出せる任意の範囲で低下することが企図される。
【０１６８】
本発明の別の局面は、インビボ生物物体を活性化合物の有効量に曝露して生物物体をインビボで保存する段階を含む、インビボ生物物体の保存方法に関する。
【０１６９】
本発明は、外傷のリスクを持つ生物物体を活性化合物の有効量に曝露する段階を含む、生物物体表面または内部への外傷の影響を遅延または軽減する方法にも関する。
【０１７０】
本発明の他の局面では、患者を活性化合物の有効量に曝露する段階を含む、患者の出血性ショックを処置する、または予防するための方法が存在する。あるいは、いくつかの態様では、方法は出血および／または出血性ショックの結果としての患者の致死性(lethality)を予防する。出血による患者の死亡を防止、または出血患者に於ける致死性を予防するこのような方法では、患者を活性化合物の有効量に曝露する段階が含まれる。ある態様では、活性化合物は、H2Sなどのカルコゲニド化合物であることが特に企図される。
【０１７１】
生物の心拍数を下げるための方法もまた、本発明の一部に含まれる。このような方法は、生物学的サンプルまたは生物を活性化合物の有効量に接触させる段階を含む。
【０１７２】
生物物体の温度制御は、酸素アンタゴニストを用いることで達成できる。いくつかの態様では、以下を含む、低体温の被験体を処置する方法が存在する：(a)被験体を酸素アンタゴニストの有効量に接触させる段階、および次に(b)被験体を、被験体の温度より高い環境温度に付す段階。別の態様では、(a)被験体を酸素アンタゴニストの有効量に接触させる段階を含む、高体温の被験体を処置する方法が存在する。いくつかの例では、高体温の処置は、(b)被験体を、被験体の体温よりも少なくとも約20℃低い環境温度に付す段階も含む。上記のように、被験体を非生理学的または制御温度環境に曝露することは、さらなる態様に用いることができる。この方法は、一般的には、活性化合物を用いて達成できることが企図される。
【０１７３】
本発明の他の局面は、患者に活性化合物の有効量を投与する段階を含む、患者の出血性ショックを予防するための方法に関する。
【０１７４】
本発明はまた、生物物体の酸素要求を低下させることもその範囲に含み、これは生物物体が生存するのに要求する酸素の量を下げることを意味する。これは、酸素アンタゴニストまたは一つまたは複数の活性化合物の有効量を提供することによって達成できる。特定の生物物体が生存に必要とする酸素量は公知であり、それは時間、圧力、および温度にも依存するだろう。本発明のある態様では、生物物体の酸素要求は、活性化合物が有効量存在しない場合の生物物体の要求に比べて、約、少なくとも約、または最大で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%あるいはそこから導き出せる任意の範囲まで下げられる。
【０１７５】
生物物体を損傷またはさらなる損傷から保護する例では、最初の傷害(外傷または創傷または変性)が起こった後で、生物物体を約、少なくとも約、または最大で約30秒間以内、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間以内、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日間以内、1、2、3、4、5週間以内、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20年間以内、もしくはそれ以上、および任意の組み合わせ、あるいはそこから導き出せる任意の範囲以内で酸素アンタゴニストに曝露できることが企図される。
【０１７６】
本発明の他の局面は、細胞を酸素アンタゴニストの有効量に接触させて一つまたは複数の細胞を保存する段階を含む、生物から分離された一つまたは複数の細胞を保存するための方法に関する。上記および本出願中の他所に論じた細胞または細胞型に加えて、本発明との使用についてエビの胚を特に想定することが企図される。
【０１７７】
一つの態様では、酸素低下技術は、キットの形に具現化できる。例えば、現在Becton Dickinsonから製品番号261215で販売されているキットは、ここに記載の選択技術を利用している。このキットには、嫌気性発生装置(例えば水素ガス発生装置)、パラジウム触媒、嫌気性インジケータ、および上記構成要素(気体透過性バッグに入れられた血小板と一緒に)が入れられて密封される気体透過性の密封性「BioBag」を含む。
【０１７８】
本発明の他の態様では、活性化合物の有効量を提供し、それにより損傷または傷害から生物物体を保護し、それによって生物物体の生存を高めることによって、傷害または疾患に反応してスタシスに入る生物物体の能力を高めるための方法が提供される。関係する態様は、活性化合物の有効量を提供することによって傷害または疾患に反応してスタシスに入るように生物物体を調製またはプライミングする方法を含む。他の関係する態様は、生物物体をプレスタシスに入れ、それによって損傷または傷害から生物物体を保護する方法を含む。例えば、スタシスの誘導に必要なものより少ない投与量または時間の活性化合物での処置によって生物物体は、傷害または疾患に反応して、より簡便またはより完全にスタシスの便益状態に到達できるようになるが、一方活性化合物による処置がない場合は、生物物体は、それがスタシスの保護的レベル、例えば生物物体に致死的低酸素状態に対する耐性を付与するのに十分なレベルに到達する前に死亡するか、または損傷もしくは傷害を被るだろう。
【０１７９】
ある傷害および疾患状態は、生物物体の代謝および／または体温をスタシスが達成されない程度まで下げさせる。例えば低酸素状態、虚血、および失血は全て利用可能なおよび酸素利用生物物体に供給される酸素の量を減らし、それによって生物物体の細胞での酸素利用を減らし、酸化的リン酸化から生ずるエネルギー産生を減らし、ならびにそれによって熱発生を減らして低体温をもたらす。「スタシス」は、傷害または疾患発作の重篤度または発生もしくは進行に続く経過時間に応じて、達成することもあればしないこともある。活性化合物による処置は、スタシス誘導の閾値(即ちスタシス達成に必要な発作の重篤度または期間)を下げるか、または傷害もしくは疾患の刺激に付加もしくは相乗して、活性化合物処置がなければスタシスを起こさない傷害状態に置かれた生物物体をスタシスに誘導することができる。活性化合物のこのような活性は、傷害または疾患刺激単独のスタシス誘導効果(大きさ、動態)を、生物物体を活性化合物に事前、同時、事後、またはそれらの任意の組み合わせで曝露した時のスタシス誘導効果と比較することによって決定される。例えば、本出願の実施例11に記載されているように、マウスを空気中で150ppmのH2Sに予備曝露させると、低酸素状態(5% O2)に曝露させる前に比べてCO2の産生は約2倍低下した。その後予備処理されたマウスのCO2産生は、低酸素状態で約50倍低下した。これに対し、コントロールのH2S未処置マウスでもCO2産生は低下するもののマウスの低酸素状態での生存は得られなかったが、これはマウスがスタシスを達成する前に死亡したためと思われた。
【０１８０】
上記で論じた方法では、生物をスタシスに誘導できる量より少ない有効量は、期間および／または量に関係して減らすことができる。その減少は、スタシスを誘発する量の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%、またはそこから導き出せる任意の範囲の量の減少でよい。減少は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日間、1、2、3、4、5週間、および／または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月間、またはそこから導き出せる任意の範囲の、期間(曝露時間の長さ)の減少でよい。または、減少は、生物物体に提供される全体の有効量に関してであってもよく、それは、その種および／またはサイズの有機体にスタシスを誘導する全体の有効量に対して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%、またはそこから導き出せる任意の範囲の減少であってよい。
【０１８１】
本発明の方法は、生物物体がその中に置かれるか、曝露される環境を維持する器具またはシステムを使用する段階を含むことができる。本発明は、活性化合物が特に気体として供給される器具を含む。いくつかの態様では、器具は、生物物体を保持するためのサンプルチャンバーを持つ容器を含むが、この場合容器は酸素アンタゴニストを含む気体供給元に連結している。容器は固体容器でも、バッグなどの柔軟な容器でもよい。
【０１８２】
いくつかの態様では、本発明は、以下を含む、生物物体を気体に曝露するための器具を含む：該器具は775リットルを超えない容積を持つサンプルチャンバーを有する容器；およびサンプルチャンバーと流体連絡している第1気体供給源を備えており、該第1気体供給源は一酸化炭素または硫化水素などの活性化合物を含んでいる。さらなる態様では、器具は、サンプルチャンバー内側の温度を制御する冷却ユニット、および／あるいはチャンバー内の活性化合物の量、またはチャンバー内に存在する溶液内の活性化合物の量を制御する気体制御装置も備えている。
【０１８３】
第2もしくは追加の気体のための気体供給源、または活性化合物のための第2もしくは追加の気体供給源が存在できることが企図される。第2気体供給源はサンプルチャンバーに連結しても、または第1気体供給源に連結してもよい。上に論じたように、追加の気体は非毒性および／または非反応性気体でよい。
【０１８４】
気体制御装置は、本発明のいくつかの態様では器具の一部である。1、2、3個、またはそれ以上の気体制御装置を用いることができる。いくつかの例では、気体制御装置は、第1気体供給源からサンプルチャンバーへ供給される気体を制御する。または、それはサンプルチャンバーまたは第2気体供給源から第1気体供給源に供給される気体を制御するか、あるいは第1および第2気体供給源の両方について制御装置が存在してもよい。気体制御装置は、サンプルチャンバーおよび／または別の気体供給源に供給される気体の量を制御するようにプログラムできることがさらに企図される。制御は、指定された期間であってもなくともよい。サンプルチャンバーに直接または間接的に連結している任意の気体供給源について、プログラムできてもできなくともよい気体制御装置が存在してよい。いくつかの例では、気体制御装置は電子的にプログラムすることができる。
【０１８５】
いくつかの例では、チャンバー内の圧力および／または温度は、圧力制御装置または温度制御装置のいずれかによってそれぞれ制御できる。気体制御装置と同様に、これら制御装置は電子的にプログラムできてもよい。本発明の器具は、上に論じた温度を達成するための冷却および／または加熱ユニットを有してもよい。ユニットは、電子的にプログラムできてもできなくともよい。
【０１８６】
さらなる態様では、器具は、その上に容器を乗せる車輪の付いたカートを含むか、またはそれが一つまたは複数のハンドルを有してよい。
【０１８７】
本発明は、生物全体のための器具を含み、器具はその中に、以下を含むことが特に企図される：サンプルチャンバーを有する容器；サンプルチャンバーと流体連絡している第1気体供給源であって、活性化合物を含む第1気体供給源；および第1気体供給源からサンプルチャンバーに供給される気体を制御する、電子的なプログラムが可能な気体制御装置。
【０１８８】
いくつかの態様では、器具は、サンプルチャンバー内に真空を提供するように作られた構造も有している。
【０１８９】
よりさらには、本出願に記載されている活性化合物は、本発明の器具と一緒の使用が企図される。特定の態様において、一酸化炭素はこの器具を用いて投与することができる。別の例では、カルコゲニド化合物を投与することができるか、または化合物は還元剤構造を有する。よりさらなる態様では、活性化合物は、器具を用いて投与される。特定の態様において、本発明は装置またはその使用を範囲に含む。ある態様では、装置は、単回用量送達装置である。別の態様では、装置は吸入器または噴霧器である。よりさらには、これら装置は単回用量送達装置であってもなくともよいことが企図される。
【０１９０】
これに加えて、本発明はスクリーニングアッセイに関する。いくつかの態様では、候補物質を、酸素アンタゴニストまたは、特に保護的代謝剤を含む活性化合物として機能する能力についてスクリーニングにかけられる。これは二酸化炭素排出量を測定することによるような本明細書に記載されるアッセイを用いて実施できる。酸素アンタゴニストの特徴を示すことが確認された任意の物質については、さらに特徴付けまたは試験することができる。よりさらには、このような物質を生物物体に投与してスタシスを誘導できること、またはこのような物質をその後製造できることが企図される。
【０１９１】
ある態様では、ショックを処置または予防するために使用し得る活性化合物のためのスクリーニング法が存在する。さらには、スクリーニング法は、本明細書で論ずる方法に影響を及ぼし得る任意の化合物についてのものでよい。いくつかの態様では、以下を含むスクリーニング法が存在する：a) 哺乳動物を物質に曝露する段階；b) 哺乳動物を、ショックのリスクにさらされる条件に置く段階；c) 物質に曝露された哺乳動物と物質に曝露されていない哺乳動物の転帰を比較する段階を含み、物質に曝露された哺乳動物における転帰の改善により、物質が候補活性化合物と同定される。
【０１９２】
いくつかの態様では、方法はまずスクリーニング対象となる適切な物質を同定する段階を含む。ある態様では、物質はカルコゲニド、還元剤であるか、または式I、式II、式III、もしくは式IVの構造を有するか、または本明細書で論ずる任意の他の化合物であろう。
【０１９３】
予備または初回スクリーニングに用いられた生物よりも高等または複雑と考えられる生物について、続いてスクリーニングが実施できることがさらに企図される。したがって、一つまたは複数の細胞呼吸要素がこれら別の生物でアッセイされ、候補化合物をさらに評価することが企図される。ある態様では、続くスクリーニングは、マウス、ラット、イヌ等の使用を含む。
【０１９４】
本発明のスクリーニング方では、複数の異なる生物または生物物体(その他細胞もしくは組織)を用いることができ、かつ複数の異なる細胞呼吸要素をアッセイできることが企図される。これに加えて、いくつかの態様では、複数のこのようなスクリーニングが同時に実施されることが企図される。
【０１９５】
物質が候補活性化合物(または酸素アンタゴニストもしくはスタシス誘導剤、もしくは保護的代謝剤等)と見なされるためには、該物質はアッセイ時に生物または細胞を殺してはならず、かつ作用が可逆的でなければならない(即ち、改変される特質については、物質曝露前にそのレベルを測る必要がある)ことが当然理解されるだろう。
【０１９６】
指定された疾患または状態に対する処置または予防のための医薬品の調製には、任意の処置法を用いてよいことが当然理解される。これには、出血性もしくは血液学的ショック、創傷および組織損傷、高体温、低体温、神経変性、敗血症、癌、および外傷のための医薬品の調製が挙げられるが、これらに限定されない。よりさらには、本発明は、死、ショック、外傷、臓器もしくは組織拒絶、癌治療による損傷、神経変性、および創傷もしくは組織損傷を予防する処置のための医薬品の調製を包むが、これらに限定されない。
【０１９７】
上記で論じたように、生物のスタシスは次のいずれの状態でもない：睡眠、昏睡、死、麻酔、または大発作。しかしながら、本発明のいくつかの態様では、これらの状態は、本発明の方法、組成物、および製造物を使用することに望まれる目的であることが企図される。本発明の一つの局面について論じられた態様は、本発明の別の局面に同様に適用される。よりさらには、態様は組み合わせてもよい。
【０１９８】
生物物体を活性化合物に「曝露すること」を含む態様は、生物物体に活性化合物を提供するか、または活性化合物を投与することによって実施することもできる。用語「提供する」は、通常の平易な意味で用いられる：「使用のために供給または支給すること」(Oxford English Dictionary)であり、患者の場合は、特定の活性化合物を処方または患者に直接それを投与する医師またはその他医療従事者が行う活動を指す。
【０１９９】
実施例の項の態様は、本発明の全ての局面に応用できる本発明の態様と理解すべきである。
【０２００】
請求項での用語「もしくは、または、あるいは」の使用は、たとえ開示が選択肢だけ、および「および、ならびに／もしくは、または、あるいは」を指す定義を支持していても、特に選択肢だけを明確に指示しているか、または選択肢が相互排他的でない限り「および、ならびに／もしくは、または、あるいは」を意味する。
【０２０１】
本出願全体を通して、用語「約」は、数値が、数値決定に用いられる装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すのに用いられる。
【０２０２】
長年の特許法にしたがって、語「a」および「an」は、請求項または明細書の中で用語「含む／具備する」と一緒に用いられる場合、特に明記されない限り一つまたは複数を意味する。
【０２０３】
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、この詳細な説明より当業者には本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正は明らかとなることから、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を示すものの、例示のみを目的として示されているものであることを理解しなければならない。
【０２０４】
例示的態様の説明
I. スタシス
「スタシス」または「仮死状態」では、細胞、組織、臓器、または生物(「生物物質」と総称する)は生存しているが、細胞分裂、発生進行、および／または代謝状態に必要な細胞機能は減速または停止している。この状態は、様々な状況に於いて望ましい状態である。スタシスは単独で保存方法として用いることができ、または低温保存レジメンの一部として導入することもできる。生物物質は、研究使用、輸送、移植、治療的処置(エキソビボ治療)、および、例えば外傷の発生を予防するために保存することができる。生物全体が関係するスタシスも同様の用途がある。例えば、生物の輸送は、生物がスタシス状態になっていれば容易に行うことができる。これによってストレスまたは物理的傷害を軽減または排除し、生物への物理的および生理学的傷害を軽減できる。これらの態様を以下にさらに詳しく論じる。スタシスは、生物物質の酸素需要を下げ、それにより血流を下げることによって便益を示すことができる。スタシスは、生物物質は生命維持環境から分離されてから死誘導環境に曝露されるまでの期間を延長できるだろう。
【０２０５】
事故による比較的長期間の低体温からの回復は報告されているが(Gilbert et al., 2000)、最近、生物に仮死状態を意図的に誘導することに関心が集まっている(参照資料の考察は、参照が先行技術を構成することを是認するものと解釈してはならない。事実、本明細書の中で論じるいくつかの参照は、優先権出願に関する先行技術ではない。)。管理された高体温だけでなく、動脈内への溶液のコールドフラッシュ投与(Tisherman、2004)、心臓停止誘導(Behringer et al., 2003)、または一酸化窒素誘導仮死状態(Teodoro et al., 2004)が検討されている。
【０２０６】
スタシスにある生物は、全身麻酔をかけられた生物と区別できる。例えば室内空気に曝露された軽度のスタシスにある生物(細胞呼吸の約2〜約5倍の低下)は、身震いを始めるが、一方、麻酔をかけられた生物は身震いを始めることはないだろう。また、軽度のスタシスにある生物は、つま先の圧迫に反応することが期待されるが、一方、麻酔をかけられた生物は、通常は反応しない。したがってスタシスは、一般に行われている麻酔下の状態とは同じではない。
【０２０７】
CO2産生は、生物の代謝に関係する細胞呼吸の直接的なマーカーである。これは、肺から排出されるCO2量を指す「CO2放出」とは区別できる。ある活性化合物、例えば硫化水素は、肺内で炭酸脱水素酵素活性を阻害し、これが炭酸塩からCO2への変換および肺血液からのCO2遊離を阻害し、それによって、それに応じた細胞のCO2産生を低下させることなく、それに伴うCO2の放出の減少を示す。
【０２０８】
本発明は、ある化合物が酸素アンタゴニストまたは保護的代謝作用物質として作用し、それは可逆的スタシスまたはプレスタシスを効率的に誘導し得る、またはしないという観察に基づく。以下を含む、他の特許出願がこれらの化合物および使用について論じている：米国特許出願10/971,576、10/972,063、および10/971,575；米国特許出願10/971,576；米国特許出願10/972,063；ならびに米国特許出願10/971,575、これらの全ては、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０９】
A. 体温制御
温血動物のスタシスは、体温制御に影響するであろう。体温制御は、いわゆる「温血」動物の特徴であり、これにより生物は、大きく変動する(低温または高温)環境温度に曝露された時でさえ、比較的一定の中心体温を維持できる。スタシスの誘導による体温制御を制御する能力は本発明の一つの局面であり、上に論じたのと同様の使用を可能にする。
【０２１０】
体温制御は、生物、脚部、または単離された臓器もしくは組織をチャンバー／装置内に入れることによって促進することができ、その温度を制御できる。例えば、暖かな部屋、または高圧チャンバーに似たチャンバー様の装置は、生物全体を取り囲むことができ、体温制御装置に連結できる。毛布、スリーブ、カフ、または手袋(例えばAVAcore Technologies, Palo Alto, CA,製CORE CONTROL冷却システム、米国特許第6,602,277号)などの小型の装置も企図される。このようなチャンバー／装置は、室温の上昇・下降の両方に用いることができる。
【０２１１】
B. 生物物体
ヒトに加えて、本発明は、次の分類に由来する哺乳類を含む、獣医学的および農業的に重要な哺乳類に関して用いることができる：イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ネズミ、ブタ、ヤギ、齧歯類、ウサギ、オオカミ(lupine)、およびクマ。本発明は、魚および鳥にも拡張される。他の例を以下に開示する。
【０２１２】
非仮出願米国特許出願第10/971,576号、第10/972,063号、および第10/971,575号は、本発明に関連する様々な化合物および用途について開示している。これらの全ての出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１３】
本発明のある局面では、哺乳動物は、カモノハシ目、有袋目、食虫目、皮翼目、翼手目、ツパイ目、霊長目、異節亜目、有鱗目、管歯目、ウサギ、齧歯目、鯨目、食肉目、長鼻目、イワダヌキ目、シレニア(Sirenia)、奇蹄目または偶蹄目である。
【０２１４】
3. アッセイ
スタシスは、生物学的サンプルが消費する酸素量、サンプルが産生する二酸化炭素の量を定量化する(細胞呼吸の間接的測定)、または運動性を特徴付けることを含む、様々な方法で測定できる。
【０２１５】
酸素消費速度または二酸化炭素産生速度を決定するためには、生物物体を二つの開口部：気体取り入れ口および排出口を備えた、密封チャンバーに入れる。気体(室内空気またはその他の気体)を所与流速でチャンバー内に通し、かつチャンバー内の圧力をほぼ1大気圧に保つために出口から出す。チャンバーを曝露する前後に、気体を二酸化炭素検出器および酸素検出器に通して、混合気体中の各化合物の量を測定する(毎秒)。これらの値を経時的に比較して、酸素消費速度または二酸化炭素産生速度を得る。
【０２１６】
II.活性化合物および他の関連する環境条件
本発明は、以下を含みこれに限定されないが、生物物体に働いて、様々な効果を生み出す、一つまたは複数の作用物質が関与する方法、組成物、および製造物に関する：スタシス誘導、生存能力の強化または増加、代謝の可逆的阻害、細胞もしくは生物代謝および活動の低下、酸素要求の低下、損傷の軽減もしくは予防、虚血損傷の予防、加齢もしくは老化の予防、ならびに／または本明細書に論ずる様々な治療応用の達成。ある態様では、作用物質は「活性化合物」としての資格を有する。
【０２１７】
本発明の他の態様において、活性化合物の有効量を提供することによって、細胞および／または生物の代謝を可逆的に阻害する段階を含む方法が存在する。ロテノンは、この方法において、またはおそらく本発明の他の方法において用いられる化合物ではないことが特に企図される。その上、いくつかの態様において、ロテノンが活性化合物として除外されることも企図される。同様に、酸化窒素が活性化合物として除外される可能性があることも企図される。
【０２１８】
いくつかの態様では、作用物質は酸素アンタゴニストであり、それは直接または間接的に作用できる。酸素代謝は、好気性後生動物の生活にとって基本的要求である。有気呼吸は、多くの動物においてほとんどのエネルギーを産生するものであり、かつ重要な細胞反応の遂行に必要な酸化還元電位を維持する働きもしている。低酸素状態では、酸素利用度の低下によって電子伝達鎖の最終段階に於ける分子酸素への電子の伝達の効率が悪化する。この非効率化は、主に複合体IIIでの早過ぎる電子放出およびチトクロームオキシダーゼによるO2- 形成によって、好気的エネルギー産生の低下と損傷性のフリーラジカルの産生増加の両方をもたらす(Semenza, 1999)。エネルギー供給が制限されたことと、フリーラジカル損傷は、タンパク質合成および膜の極性維持などの必要不可欠な細胞プロセスを妨害でき(Hochachka et al., 1996)、最終的に細胞死に導くだろう。
【０２１９】
別の態様では、作用物質は保護的代謝作用物質である。代謝は、生活に必要な(細胞または生物内の)化学的プロセスと称されることが一般的に理解されている；それらにはエネルギー産生を維持し、かつ複雑な分子を合成(同化)および分解(異化)する様々な反応が関係している。
【０２２０】
本発明のある態様では、活性化合物は、本明細書に記載の式IもしくはIVで表される化学構造を有するか、または式I、II、III、もしくはIVの前駆体である。
【０２２１】
本明細書には、様々な化学構造および化合物が記載されている。本明細書で論ずるこれらの構造および化合物を記載するために用いられる用語には、次の定義が適用される。
【０２２２】
「アルキル」は、単独または他の用語の中に用いられるかのいずれかで、例えば「アリールアルキル」、「アミノアルキル」、「チオアルキル」、「シアノアルキル」、および「ヒドロキシアルキル」のように、1〜12個の炭素原子を有する、直鎖または分岐ラジカルを指す。用語「低級アルキル」は、C1〜C6アルキルラジカルを指す。本明細書で使用する用語アルキルは、ヒドロキシ、ハロ(F、Cl、Br、Iなど)、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルチオ、シアノ、イソシアノ、カルボキシ(-COOH)、アルコキシカルボニル(-COOR)、アシル、アシルオキシ、アミノ、アリカミノ(alykamino)、ウレア(--NHCONHR)、チオール、アルキルチオ、スルホキシ、スルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アミジル、アルキルイミノカルボニル、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、ヒドラジド、ナトリウムスルホニル(-SO3Na)、ナトリウムスルホニルアルキル(-RSO3Na)などの基で置換されるラジカルを含む。このようなラジカルの例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソ−アミル、ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
「ヒドロキシアルキル」は、本明細書に定義されるように、1個または複数のヒドロキシルラジカルで置換された、アルキルラジカルを指す。ヒドロキシアルキルラジカルの例としては、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシブチル、3-ヒドロキシブチル、4-ヒドロキシブチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、1-(ヒドロキシメチル)-2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシブチル、3,4-ジヒドロキシブチル、および2-(ヒドロキシメチル)-3-ヒドロキシプロピル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
「アリールアルキル」は、式中のアルキルラジカル「R」がアリールラジカル「R'」で置換されたラジカルR'R-を指す。アリールアルキルラジカルの例としては、ベンジル、フェニルエチル、3-フェニルプロピル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
「アミノアルキル」は、ラジカルH2NR'-を指し、ここで、アルキルラジカルはアミノラジカルで置換されている。このようなラジカルの例としては、アミノメチル、アミノエチル等が挙げられる。「アルキルアミノアルキル」は、アルキルアミノラジカルで置換されたアルキルラジカルを指す。
【０２２６】
「アルキルスルホンアミド」は、本明細書に定義されているようなアルキル基に付加されたスルホンアミド基(-S(O)2-NRR')を指す。
【０２２７】
「チオアルキル」は、アルキルラジカルが1個または複数のチオールラジカルで置換されていることを指す。「アルキルチオアルキル」は、アルキルラジカルが一つまたは複数のアルキルチオラジカルで置換されていることを指す。例としては、メチルチオメチル、エチルチオイソプロピル等が挙げられるが、これらに限定されない。「アリールチオアルキル」は、本明細書に定義されるようなアルキルラジカルが、1個または複数のアリールチオジカルで置換されていることを指す。
【０２２８】
「カルボキシアルキル」は、ラジカル-RCO2Hを指し、ここで、アルキルラジカルはカルボキシルラジカルで置換されている。例としては、カルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
「アルキレン」は、架橋されたアルキルラジカルを指す。
【０２３０】
用語「アルケニル」は、少なくとも一つの二重結合を含んでいる、不飽和の非環式炭化水素ラジカルを指す。このようなアルケニルラジカルは、約2〜約20個の炭素原子を含んでいる。用語「低級アルケニル」は、C1〜C6アルケニルラジカルを指す。本明細書で使用する用語アルケニルラジカルは、アルキルラジカルに関して置換されたラジカルを含む。好適なアルケニルラジカルの例としては、プロペニル、2-クロロプロペニル、ブテン-1-イル、イソブテニル、ペンテ-1-エン-1-イル、2-2-メチル-1-ブテン-1-イル、3-メチル-1-ブテン-1-イル、ヘキサ-2-エン-1-イル、3-ヒドロキシヘキサ-1-エン-1-イル、ヘプト-1-エン-1-イル、およびオクト-1-エン-1-イル等が挙げられる。
【０２３１】
用語「アルキニル」は、約2〜約20個の炭素原子を含むラジカルなどの、一つまたは複数の三重結合を含む不飽和の、非環式炭化水素ラジカルを指す。用語「低級アルキニル」は、C1〜C6アルキニルラジカルを指す。本明細書で使用する、用語アルキニルラジカルは、アルキルラジカルに関して置換されたラジカルを含む。好適アルキニルラジカルの例としては、エチニル、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、ブタ-1-イン-1-イル、ブタ-1-イン-2-イル、ペンタ-1-イン-1-イル、ペンタ-1-イン-2-イル、4-メトキシペンタ-1-イン-2-イル、3-メチルブタ-1-イン-イル、ヘキサ-1-イン-1-イル、ヘキサ-1-イン-2-イル、ヘキサ-1-イン-3-イル、3,3-ジメチル-1-ブチン-1-イルラジカル等が挙げられる。
【０２３２】
「アルコキシ」はラジカルR'O-を指し、ここで、R'は本明細書に定義されているアルキルラジカルである。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、イソプロポキシ、tert-ブトキシアルキル等が挙げられるが、これらに限定されない。「アルコキシアルキル」は、1個または複数のアルコキシラジカルで置換されたアルキルラジカルを指す。例としては、メトキシメチル、エトキシエチル、メトキシエチル、イソプロポキシエチル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３３】
「アルコキシカルボニル」は、ラジカルR-O-C(O)-を指し、ここで、Rは本明細書に定義されたアルキルラジカルである。アルコキシカルボニルラジカルの例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、sec-ブトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル等が挙げられるが、これらに限定されない。アルコキシチオカルボニルはR-O-C(S)-を指す。
【０２３４】
「アリール」は、1個の個別の環からなるか、または少なくとも1個の環が実際に芳香族である1個もしくは複数の縮合環からなる、一価芳香族炭素環ラジカルであり、別に記載がない限り、それは任意で、ヒドロキシ、ハロ(F、Cl、Br、Iなど)、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルチオ、シアノ、カルボキシ(-COOH)、アルコキシカルボニル(-COOR)、アシル、アシルオキシ、アミノ、アリカミノ、ウレア(--NHCONHR)、チオール、アルキルチオ、スルホキシ、スルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アミジル、アルキルイミノカルボニル、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、ヒドラジド、ナトリウムスルホニル(-SO3Na)、ナトリウムスルホニルアルキル(-RSO3Na)などの1個または複数、好ましくは1個または2個の置換基で置換されていることができる。または、アリール環の二つの隣接する原子をメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ基で置換することもできる。アリールラジカルの例としては、フェニル、ナフチル、ビフェニル、インダニル、アントラキノリル、tert-ブチル−フェニル、1,3-ベンゾジオキソリル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３５】
「アリールスルホンアミド」は、本明細書に定義されるアリール基に付加された、本明細書に定義されるスルホンアミド基を指す。
【０２３６】
「チオアリール」は、1個または複数のチオールラジカルで置換されたアリール基を指す。
【０２３７】
「アルキルアミノ」は、1個または2個のアルキルラジカルで置換されたアミノ基を指す。例としては、一置換N-アルキルアミノラジカルおよびN,N-ジアルキルアミノラジカルが挙げられる。例としては、N-メチルアミノ、N-エチルアミノ、N,N-ジメチルアミノN,N-ジエチルアミノ、N-メチル、N-エチル-アミノ等が挙げられる。
【０２３８】
「アミノカルボニル」は、ラジカルH2NCO-を指す。「アミノカルボニルアルキル」は、1個または複数のアミノカルボニルラジカルによる、本明細書に定義されるアルキルラジカルの置換を指す。
【０２３９】
「アミジル」は、RCO-NH-を指し、ここで、RはHまたは本明細書に定義するアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールである。
【０２４０】
「イミノカルボニル」は、四つある供給結合部位の内の二つをアミノ基と共有している炭素ラジカルを指す。このようなイミノカルボニルラジカルの例としては、例えばC=NH、C=NCH3、C=NOH、およびC=NOCH3が挙げられる。用語「アルキルイミノカルボニル」は、アルキル基で置換されたイミノラジカルを指す。用語「アミジノ」は、二つの利用可能なイミノカルボニルラジカルの結合の内の一つに結合した置換または非置換アミノ基を指す。このようなアミジノラジカルの例としては、例えばNH2-C=NH、NH2-C=NCH3、NH-C=NOCH3、およびNH(CH3)-C=NOHが挙げられる。用語「グアニジノ」は、上記に定義されたアミノ基に結合したアミジノ基を指し、該アミノ基は第３の基に結合できる。このようなグアニジノラジカルの例としては、例えばNH2-C(NH)-NH-、NH2-C(NCH3)-NH-、NH2-C(NOCH3)-NH-、およびCH3NH-C(NOH)-NH-が挙げられる。用語「ヒドラジノ」は、-NH-NRR'を指し、この時のRおよびR'は独立に水素、アルキル等である。「ヒドラジド」は、-C(O=)-NH-NRR'を指す。
【０２４１】
用語「ヘテロシクリル」は、飽和および一部飽和した、4〜15個の環メンバーを有する、ヘテロ原子を含む環形状のラジカルであり、ここでは炭素、窒素、硫黄、および酸素より選択される「C4〜C15ヘテロシクリル」を指し、ここで、少なくとも一つの環原子はヘテロ原子である。ヘテロシクリルラジカルは、1個、2個、または3個の環を含むことができ、ここで、このような環はペンダント様式につなぐか、または融合することができる。飽和複素環ラジカルの例としては、1〜4個の窒素原子を含む飽和3〜6員複素単環式基［例えばピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル等］；1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含む飽和3〜6員複素単環式基［例えばモルホリニル等］；1〜2個の硫黄原子および1〜3個の窒素原子を含む飽和3〜6員複素単環基［例えばチアゾリジニル等］が挙げられる。部分飽和ヘテロシクリルラジカルの例としては、ジヒドロチオフェン、ジヒドロピラン、ジヒドロフラン、およびジヒドロチアゾールが挙げられる。複素環ラジカルの非限定例としては、2-ピロリニル、3-ピロリニル、ピロリンジニル、1,3-ジオキソラニル、2H-ピラニル、4H-ピラニル、ピペリジニル、1,4-ジオキサニル、モルホニリル、1,4-ジチアニル、チオモルホリニル等が挙げられる。このようなヘテロシクリル基は、任意で、ヒドロキシ、ハロ(F、Cl、Br、Iなどの)、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルチオ、シアノ、カルボキシ(-COOH)、アルコキシカルボニル(-COOR)、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ウレア(-NHCONHR)、チオール、アルキルチオ、スルホキシ、スルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アミジル、アルキルイミノカルボニル、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、ヒドラジド、ナトリウムスルホニル (-SO3Na)、ナトリウムスルホニルアルキル(-RSO3Na)などの置換基などの基で置換されていてもよい。
【０２４２】
「ヘテロアリール」は、環当たり4〜8個の原子の、1個または複数の環、好ましくは１〜3個の環を有し、環中に1個または複数のヘテロ原子、好ましくは1個または2個のヘテロ原子(窒素、酸素、または硫黄から選択される)を組み入れた、一価芳香族環ラジカルを指し、別に記載がない限り、それは任意で、ヒドロキシ、ハロ(F、Cl、Br、Iなど)、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルチオ、シアノ、カルボキシ(-COOH)、アルコキシカルボニル(-COOR)、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ウレア(-NHCONHR)、チオール、アルキルチオ、スルホキシ、スルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アミジル、アルキルイミノカルボニル、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、ヒドラジド、ナトリウムスルホニル(-SO3Na)、ナトリウムスルホニルアルキル(-RSO3Na)などの置換基から選択される1個または複数、好ましくは1個または2個の置換基で置換されていることができる。ヘテロアリールラジカルの例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチオピラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾピラニル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、キノリニル、イソキノリニル、ナフチリジニル、ベンゼンスルホニル-チオフェニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
「ヘテロアリールオキシ」は、オキシラジカルに結合したヘテロアリールラジカルを指す。このようなラジカルの例としては、2-チオフェニルオキシ、2-ピリミジルオキシ、2-ピリジルオキシ、3-ピリジルオキシ、4-ピリジルオキシ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４４】
「ヘテロアリールオキシアルキル」は、1個または複数のヘテロアリールラジカルで置換されたアルキルラジカルを指す。このようなラジカルの例としては、2-ピリジルオキシメチル、3-ピリジルオキシエチル、4-ピリジルオキシメチル等が挙げられる。
【０２４５】
「シクロアルキル」は、環当たり3〜8個の炭素の、1個または複数の環、典型的には1個または2個の環からなる、一価飽和炭素環ラジカルを指し、特に指示がない限り、それは、典型的にはヒドロキシ、ハロ(F、Cl、Br、Iなど)、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルチオ、シアノ、カルボキシ(-COOH)、アルコキシカルボニル(-COOR)、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ウレア(-NHCONHR)、チオール、アルキルチオ、スルホキシ、スルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アミジル、アルキルイミノ、カルボニル、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、ヒドラジド、ナトリウムスルホニル(-SO3Na)、ナトリウムスルホニルアルキル(-RSO3Na)などの1個または複数の置換基で置換することができる。シクロアルキルラジカルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、3-エチルシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘプチル等が挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルケニル」は、3〜10個の炭素原子および一つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有するラジカルを指す。典型的なシクロアルケニルラジカルは、3〜7個の炭素原子を有する。例としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等が挙げられる。「シクロアルケニルアルキル」は、本明細書に定義されるアルキルラジカルが、1個または複数のシクロアルケニルラジカルで置換されているラジカルを指す。
【０２４６】
「シクロアルコキシ」は、オキシラジカルに結合したシクロアルキルラジカルを指す。例としては、シクロヘキソオキシ、シクロペントキシ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
「シクロアルコキシアルキル」は、1個または複数のシクロアルコキシラジカルで置換されたアルキルラジカルを指す。例としては、シクロへキソオキシエチル、シクロペントキシメチル等が挙げられる。
【０２４８】
スルフィニルは-S(O)-を指す。
【０２４９】
「スルホニル」は-S(O)2-を指し、ここで、「アルキルスルホニル」はアルキルラジカル、RSO2-で置換されたスルホニルラジカルを指し、アリールスルホニルは、スルホニルラジカルに結合したアリールラジカルを指す。「スルホンアミド」は、-S(O)2-NRR'を指す。「スルホン酸」は、-S(O)2OHを指す。「スルホン酸エステル」は、-S(O)2ORを指し、ここで、Rはスルホン酸アルキルエステル中などのアルキルなどの基である。
【０２５０】
「チオ」は、-S-を指す。「アルキルチオ」は、チオールラジカルがアルキルラジカルRで置換されたRS-を指す。例としては、メチルチオ、エチルチオ、ブチルチオ等が挙げられる。「アリールチオ」はR'S-を指し、ここで、チオラジカルは本明細書に定義されるアリールで置換されている。例としては、フェニルチオ等が挙げられるが、これに限定されない。例としては、フェニルチオメチル等が挙げられるが、これに限定されない。「アルキルチオスルホン酸」は、ラジカルHO3SR'S-を指し、ここで、アルキルチオラジカルはスルホン酸ラジカルで置換されている。
【０２５１】
「チオスルフェニル」は-S-SHを指す。
【０２５２】
「アシル」は、単独または組み合わせて、例えばヒドリド、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルスルフィニルアルキル、アルキルスルホニルアルキル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニル、アルキリルチオ、アリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アラルコキシ、アリールチオ、およびアルキルチオアルキルより選択されるラジカルに結合しているカルボニルまたはチオノカルボニル基を指す。「アシル」の例は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、フタロイル、マロニル、ニコチニル等である。
【０２５３】
用語「アシルチオール」および「アシルジスルフィド」は、それぞれラジカルRCOS-およびRCOSS-を指す。
【０２５４】
用語「チオカルボニル」は、硫黄原子に二重結合で結合している炭素-C(=S)-を含む化合物および成分を指す。「アルキルチオカルボニル」は、チオカルボニル基が本明細書に定義されているアルキルラジカルRで置換され、一価のラジカルRC(=S)-を形成しているものを指す。「アミノチオカルボニル」は、アミノ基で置換されたチオカルボニル基、NH2C(=S)-を指す。
【０２５５】
「カルボニルオキシ」は-OCORを指す。
【０２５６】
「アルコキシカルボニル」は-COORを指す。
【０２５７】
「カルボキシル」は-COOHを指す。
【０２５８】
立体異性体を持つ化合物の場合、cis／trans幾何異性体、ジアステレオマー、および個々のエナンチオマーを含む、それらの全ての立体異性体が企図される。
【０２５９】
A. 一酸化炭素
一酸化炭素(CO)は、ヒトを含む動物にとって有毒な無色、無臭、無味な気体である。Center for Disease Controlによれば、毎年450名を越える人々が一酸化炭素により事故死している。
【０２６０】
一酸化炭素は、血液が酸素を運搬してその生存を維持している生物にとって有毒であり得る。それは、正常な呼吸を通して肺に入り、血流の酸素と置き換わることで毒性を発揮するだろう。正常な酸素供給の中断は、心臓、脳、および体の他の生命機能を脅かす。しかしながら、医学的用途での一酸化炭素の使用が模索されている(Ryter et al., 2004)。
【０２６１】
一酸化炭素は、50の百万分の一(ppm)の量では、それに曝露したヒトは何の兆候も示さない。しかし200ppmでは、一酸化炭素は、2〜3時間内に軽い頭痛を引き起こす；400ppmでは、1〜2時間以内に前頭部頭痛を引き起こし、それは3時間以内に広がるだろう；さらに800ppmでは、それは45分以内に目眩、悪心、および／または痙攣を引き起こし、2時間以内に被験体を無意識状態にするだろう。約1000ppmのレベルでは、生物は、約1〜2分を越えて曝露すると死亡に至る。
【０２６２】
生物に対する一酸化炭素の毒作用は周知かつ十分裏付けられていることから、一酸化炭素を用いて生きている生物学的サンプルのスタシス誘導および／または保存を補助できることは意外かつ予想外である。したがって、一酸化炭素を用いて、無血生物物体(スタシス誘導に関係する以外の経路のヘモグロビンに対する一酸化炭素の作用を考慮して)などの単離された生物物体をスタシスに誘導できることが企図される。
【０２６３】
一酸化炭素に曝露してスタシスを誘導するか、またはスタシス誘導剤が引き起こす損傷を制限もしくは防止することのいずれかに加えて、本発明は、一酸化炭素を生物物体の保存および／または移植／グラフティングのプロセスを補助する作用物質または方法と一緒に用いることを企図する。
【０２６４】
B. カルコゲニド化合物
カルコゲン元素：酸素を除く周期律表第6属の元素を含む化合物は、一般的に「カルコゲニド」または「カルコゲニド化合物(本明細書では互換的に用いられる)」と呼ばれている。これら元素は、硫黄(S)、セレン(Se)、テルル(Te)、およびポロニウム(Po)である。一般的なカルコゲニドは、他の元素に加えて、一つまたは複数のS、Se、およびTeを含む。カルコゲニドは、SおよびSeのコロイド状のミクロン単位および／またはナノ単位に加工された微粒子などの要素形態を含む。カルコゲニド化合物は、還元剤として用いることができる。
【０２６５】
本発明者らは、以下の理論に拘束されることはないが、細胞にスタシスを誘導し、動物の中心体温を変えることができるカルコゲニドの能力は、これら分子がチトクロームオキシダーゼに結合できることに由来すると確信している。そうすることでカルコゲニドは酸化的リン酸化の活性を阻害または低下する。カルコゲニドの自律的体温調整を遮断する能力、即ち環境温度の制御を通して「温血」動物の中心体温を操作できるようにする能力は、上記と同じメカニズム−チトクロームオキシダーゼへの結合、および酸化的リン酸化の活性遮断または低下に由来するものと信じられる。カルコゲニドは、液体だけでなく気体の形でも提供できる。
【０２６６】
カルコゲニドは哺乳類に対し有毒となり、あるレベルでは致死的になり得る。本発明によれば、カルコゲニドのレベルは、適切な環境において致死レベルを超えないと予想される。カルコゲニドの致死レベルは、例えば各カルコゲニドに関するMaterial Safety Data Sheetsまたは米国政府のOccupational Safety and Health Administration(OSHA)から入手できる情報シートに見出せる。
【０２６７】
一酸化炭素およびカルコゲニド化合物は共に、酸素アンタゴニストとして作用することでスタシスを誘導することができるが、それらは、スタシスを誘導するそれらの能力とは別に、異なる有毒作用も有している。よりさらには、スタシス作用を伝達するのに必要な濃度は、チトクロームオキシダーゼの親和性が多様であることから様々である。酸素に関するチトクロームオキシダーゼの親和性は一酸化炭素と比較した場合、約1：1であるのに対し、H2Sに関する親和性は酸素と比較した場合、おおよそ約300：1と思われる。これは、スタシス誘導濃度で観察される有毒作用に大きく影響する。したがってカルコゲニド化合物は、生物全体の中にある生物物体のスタシス誘導、および生物全体のスタシス誘導に特に適していると企図される。
【０２６８】
カルコゲニド撤去前に追加の刺激を生物物体に提供することが有用であることも証明できる。具体的には、カルコゲニド供給源を取り除く前に、動物に高い室温を作用させることが考えられる。
【０２６９】
1. H2Sおよび他の硫黄含有化合物
硫化水素(H2S)は、石油化学および天然ガス、下水、製紙用パルプ、皮のなめし、ならび食品加工に付随することの多い、極めて毒性の高い気体である。細胞レベルでの主な作用は、チトクロームオキシダーゼおよび他の酸化酵素の阻害と思われ、細胞を低酸素状態にする。高レベル(500ppm)への曝露は、いわゆる「ノックダウン」効果である突然の虚脱および意識消失を招き、その後回復する。曝露後作用は数年間持続することがあり、協調運動障害、記憶喪失、運動機能障害、人格変化、幻覚、および不眠症が挙げられる。
【０２７０】
しかしながら、H2Sとの接触の多くは、このような急性毒性レベルよりはるかに低い。しかしながら、亜急性レベルでの長期接触については一般的な問題が存在する。平衡感覚および記憶の持続的欠陥を示すいくつかの報告があり、さらに慢性的な低レベルH2Sへの曝露によってヒトに感覚運動機能が変化することもある。Kilburn and Warshaw (1995); Kilburn (1999)。他に、ラットを、妊娠期間から出産後21日目まで低(20または50 ppm)レベルのH2Sに、1日7時間周産期に曝露すると、樹状細胞の枝がより長くなり、それに伴って小脳のプルキンエ細胞の定着化が低下するという報告がある。比較的低レベルのH2Sに関係する他の神経学的欠陥としては、脳の神経伝達物質濃度の変化および海馬θEEG活動の上昇などの神経学的反応の変化が挙げられる。
【０２７１】
行動毒性は、中レベルのH2Sに曝露されたラットで研究された。結果は、H2Sが曝露直後に同定型回避反応を阻害すること(Higuchi and Fukamachi, 1997)およびラットの餌付けによるラジアルアーム迷路作業の学習能力も妨げられることを示した(Partlo et al., 2001)。80ppmのH2Sを用いた別の周産期研究では、曝露された子ラットについて、神経病理的作用は認められず、または運動活動の変化、受動回避、または音響に対する驚愕反射の変化も認められなかった。Dorman et al. (2000)。最後に、Struveら(2001)は、ラットを様々なレベルの気体を使って、1日当たり3時間、5連続日H2Sに曝露させた。80ppmまたはそれ以上のH2Sに曝露すると、運動活動、水迷路成績、および体温の顕著な低下が観察された。まとめると、これらの報告は、H2Sが哺乳類組織の生化学に様々な影響を有し得るが、行動に関して明瞭な反応パターンが存在しないことを示している。
【０２７２】
血漿中に一度溶解すると、H2Sは様々な化学反応に関与するようになる。化学反応は：(1)分子状H2Sの解離によるビスルフィドイオンの形成、(2)ビスルフィドイオンのスルフィドイオンへの解離、および(3)水の自己イオン化である。反応は次式で表される。
H2S(aq) ⇔ HS(aq) + H+(aq)
HS-(aq) ⇔ S2(aq) + H+(aq)
H2O ⇔ H+(aq) + OH-(aq)
【０２７３】
平衡定数をK1=1.039 E-07、K2=6.43 E-16、およびKW=1.019 E-14、pH7.4とすると、全S濃度に対するそれぞれの種の計算量はおおよそ23%H2Sおよび77%HS-となり、一方S2-の量はゼロに近くなる。
【０２７４】
本発明者らは、ガスクロマトグラフィーおよび質量特異的検出器に抽出アルカリ化法を組み合わせた方法を用いて硫化水素を定量化する(Hyspler et al., 2002より採用)。この方法は、最初に、窒素パージして脱酸素化した水で濃度1mg/mlに希釈した、50μLの血液サンプル、血清、または組織抽出サンプルを、5mM塩化ベンズアルコニウム(BZK)からなる反応バッファー150μLと一緒に飽和ホウ酸バッファーに加える段階を含む。これに、最初に15μMの4-クロロ-ベンジル硫化メチル(4CBMS)酢酸エチル溶液100μLを加え、次に20mMのペンタフルオロベンジルブロミド(PFBBr)のトルエン溶液100μLを加える。次にこの溶液を密封して、回転または撹拌しながら2時間、55℃でインキュベートする。このインキュベーション期間後、次にKH2PO4の飽和溶液200μLを加えて、有機相を取り出し、Hysplerら、2002に記載されている方法にしたがって、ガスクロマトグラフィーおよび質量特異的検出器により分析する。次にこれら測定値を、内在硫化水素のレベルの濃度を決定するために、上記と同じ方法を用いて作成する、窒素パージした脱酸素化H2Oで調製した1μM〜1mMの範囲のNa2Sの公知標準濃度を用いた標準曲線と比較する。結合および／または酸化した硫化物のレベルを分析するために、上記反応バッファーに代わって、1%の水酸化テトラエチルアンモニウム(TEAH)および1mMのトリス(2-カルボキシエチル)-塩酸化ホスフィン(TCEP)を含む5mMのBZKの飽和ホウ酸バッファーからなる変性／還元反応バッファーを用いることを除いて同じ方法を用いる。
【０２７５】
本発明による使用に企図される硫化水素の典型的なレベルとしては、約1〜約150ppm、約10〜約140ppm、約20〜約130ppm、および約40〜約120ppmの値、または同等のその経口、静脈内、もしくは経皮用量が挙げられる。他の関連域としては、約10〜約80ppm、約20〜約80ppm、約10〜約70ppm、約20〜約70ppm、約20〜約60ppm、および約30〜約60ppm、または同等のその経口、静脈内、もしくは経皮的範囲が挙げられる。所与の動物について、所与の期間カルコゲニド雰囲気を下げて、被験体内に潜在的に致死的なカルコゲニドの蓄積を回避することも企図される。例えば、80ppmの初期環境濃度を30分後に60ppmに下げ、1時間目(40ppm)および2時間目(20ppm)にさらに下げることができる。
【０２７６】
一定の態様において、コロイド状硫黄を用いてもよい。コロイド状硫黄は、Monaghan and Garai, 1924におおよそ基づく方法を用いて調製することができる。コロイド状硫黄は、本明細書において記述されるいかなる方法で生物物体に提供されてもよい。調製は、元素としての硫黄分子（S6-S20）を形成するために、血清タンパク質の存在下で酸を用いてチオスルフェートからチオール硫黄を除去する段階を含む。
【０２７７】
2 Mチオ硫酸ナトリウム（Na2S2O4）1容積に対して、2容積の水および1/10容積の血清を加える。次に2Nメタリン酸1容積を加えて、混合物を10分間まで反応させる。次に、混合物のpHを水酸化ナトリウム（NaOH）を用いて中和した後、通常の生理食塩液（0.9％）に対して終夜透析する。次に、コロイド状硫黄を有する液体製剤を被験体に投与してもよい。一定の態様において、これは静脈内投与される。
【０２７８】
a. H2S前駆体
本発明は、生物物体に曝露した時、またはその後すぐなどの一定の条件の下でH2Sを生ずることができる化合物および作用物質にも関する。このような前駆体は、一つまたは複数の酵素的または化学的反応によってH2Sを生ずることが企図される。
【０２７９】
3. その他のカルコゲニド
ある態様では、還元剤構造化合物はジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルスルフィド(DMS)、メチルメルカプタン(CH3SH)、メルカプトエタノール、チオシアナート、シアン化水素、メタンエチオール(MeSH)、またはCS2である。特定の態様では、酸素アンタゴニストは、CS2、MeSH、またはDMSである。これら分子のおおよそのサイズの化合物が特に企図される(即ち、これら分子量の約50%以内)。
【０２８０】
スタシス誘導に有用と考えられる追加の化合物としては、以下の構造物が挙げられるが、これらに限定されず、その多くは容易に入手可能であり、かつ当業者に公知である(CAS番号により同定される)：104376-79-6 (セフトリアキソンナトリウム塩)；105879-42-3；1094-08-2 (エトプロパチンHCl)；1098-60-8 (トリフルプロマジンHCl)；111974-72-2；113-59-7；113-98-4 (ペニシリン G K+)；115-55-9；1179-69-7；118292-40-3；119478-56-7；120138-50-3；121123-17-9；121249-14-7；1229-35-2；1240-15-9；1257-78-9 (プロクロルペラジンエジシル酸塩 )；128345-62-0；130-61-0 (チオリダジンHCl) 132-98-9 (ペニシリンV K+)；13412-64-1 (ジクロキサシリンNa+ 水和物)；134678-17-4；144604-00-2；146-54-3；146-54-5 (フルフェナジン 2HCl)；151767-02-1；159989-65-8；16960-16-0 (アドレノコルチコトロパ酸ホルモンフラグメント1-24)；1982-37-2；21462-39-5 (クリンダマイシンHCl)；22189-31-7；22202-75-1；23288-49-5 (プロブコール)；23325-78-2；24356-60-3 (セファピリン)；24729-96-2 (クリンダマイシン)；25507-04-4；26605-69-6；27164-46-1 (セファゾリンNa+)；2746-81-8；29560-58-8；2975-34-0；32672-69-8 (メソリダジンベンゼンスルホナート)；32887-01-7；33286-22-5 ((+)-cis-ジルチアゼムHCl)；33564-30-6 (セホキシチンNa+)；346-18-9；3485-14-1；3511-16-8；37091-65-9 (アズロシリンNa+)；37661-08-8；3819-00-9；38821-53-3 (セフラジン)；41372-02-5；42540-40-9 (セファマンドールナファート)；4330-99-8 (トリメプラジンヘミ-(+)-酒石酸塩)；440-17-5 トリフロペラジン 2HCl；4697-14-7 (チカルシリン2Na+)；4800-94-6 (カルベニシリン2Na+)；50-52-2；50-53-3；5002-47-1；51481-61-9 (シメチジン)；52239-63-1 (6-プロピル-2-チオウラシル)；53-60-1 (プロマジンHCl)；5321-32-4；54965-21-8 (アルベンダゾール)；5591-45-7 (チオチキセン)；56238-63-2 (セフロキシムNa+)；56796-39-5 (セフメタゾールNa+)；5714-00-1；58-33-3 (プロメタジン HCl)；58-38-8；58-39-9 (ペルフェナジン)；58-71-9 (ファロチンNa+)；59703-84-3 (ピペラシリンNa+)；60-99-1 (メトトリメプラジンマレイン酸塩)；60925-61-3；61270-78-8；6130-64-9 (ペニシリンG プロカイン塩水和物)；61318-91-0 スルコナゾール硝酸塩)；61336-70-7アモキシシリン三水和物)；62893-20-3セホペラゾンNa+)；64485-93-4 (セホタキシムNa+)；64544-07-6；64872-77-1；64953-12-4 (モキサラクタムNa+)；66104-23-2 (ペルゴリドメシラート塩)；66309-69-1；66357-59-3 (ラニチジン HCl)；66592-87-8 (セホドロキシル)；68401-82-1；69-09-0 (クロルプロマジンHCl)；69-52-3 (アンピシリンNa+)；69-53-4 (アンピシリン)；69-57-8 ペニシリンG Na+)；70059-30-2；70356-03-5；7081-40-5；7081-44-9 (クロキサシリンNa+ H2O)；7177-50-6 ナフシリンNa+ H2O)；7179-49-9；7240-38-2 (オキサシリンNa H2O)；7246-14-2；74356-00-6；74431-23-5；74849-93-7；75738-58-8；76824-35-6 (ファモチジン)；76963-41-2；79350-37-1；81129-83-1；84-02-6 (プロクロルペラジンジマレイン酸塩)；87-08-1 (フェノキシメチルペニシリン酸)；87239-81-4；91-33-8 (ベンズチアジド)；91832-40-5；94841-17-5；99294-94-7；154-42-7 (6-チオグアニン)；36735-22-5；536-33-4 (エチオナミド)；52-67-5 (D-ペニシラミン)；304-55-2 (メソ-2,3-ジメルカプトコハク酸)；59-52-9 2,3-ジメルカプト+ プロパノール 6112-76-1 (6-メルカプトプリン)；616-91-1 (N-アセチル-L-システイン)；62571-86-2 (カプトプリル)；52-01-7 (スピロノラクトン)；および 80474-14-2 (フルチカゾンプロピオン酸)。スタシスのためにおそらく有用なものとして企図するさらなる化合物は、式IまたはIVの化学構造を有する化合物である。
【０２８１】
C. 他のアンタゴニストまたは活性化合物
1. 低酸素状態および無酸素状態
低酸素状態は、一般的な自然のストレスであり、低酸素環境への細胞の適応を促進するいくつかの、よく保存された反応が存在する。低酸素状態での好気的エネルギー産生能力の低下を補償するためには、細胞は嫌気的エネルギー産生を増やすか、またはエネルギー要求量を下げなければならないのいずれかである(Hochachka et al., 1996)。これら両反応の例は、後生動物では普通であり、用いられる具体的な反応は、一般的には、細胞が利用できる酸素の量に依存する。
【０２８２】
軽度の低酸素状態では、酸化的リン酸化は依然として一部活性であり、したがっていくつかの好気的エネルギー産生が可能である。この状態に対する、低酸素誘導転写因子、HIF-1によって一部伝達される細胞の反応は、解糖系酵素およびグルコーストランスポータなどの、嫌気的エネルギー産生に関わる遺伝子をアップレギュレーションすることによって低下した好気的エネルギー産生を補うものである(Semenza, 2001; Guillemin et al., 1997)。この反応は、フリーラジカルが誘発する損傷を防御するカタラーゼおよびスーパーオキシドジムスターゼなどの抗酸化剤のアップレギュレーションも促進する。結果として、細胞は、軽度の低酸素状態では、活動をほぼ正常酸素レベルに保つことができる。
【０２８３】
「無酸素状態」と呼ばれる、−本明細書では<0.001kPa O2として定義される、極端な低酸素状態では、酸化的リン酸化は停止し、その結果エネルギー産生能力は劇的に低下する。この環境で生存するために、細胞は、細胞活動を下げることによってエネルギー要求を下げなければならない(Hochachka et al., 2001)。例えば、酸素が取り除かれたカメの肝細胞では、タンパク質合成、イオンチャンネル活動、および好気的経路などの活動を細胞自身が直接制限することによってATPの需要を94%低下させる(Hochachka et al., 1996)。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)胚では、無酸素状態への曝露は心臓拍動、運動、細胞周期の進行、および発生進行を完全に停止する(Padilla et al., 2001)。同様に、シノラブディス・エレガンス(C. elegans)は無酸素状態に反応して仮死状態に入り、細胞分裂および発生進行を含む観察可能な運動が停止する(Padilla et al., 2002; Van Voorhies et al., 2000)。C.エレガンスは、24時間またはそれ以上停止状態を保つことができ、正常酸素状態に戻すと、高い生存率で回復する。この反応は、C.エレガンスを、高エネルギープロセスの比率を下げ、異数性などの、損傷性の不可逆的事象の発生を予防することによって、低酸素状態ストレスから生き延びさせる(Padilla et al., 2002; Nystul et al., 2003)。
【０２８４】
最近発見された一つの反応は、低酸素状態が誘導するヘモオキシゲナーゼ-1による一酸化炭素の生成である(Dulak et al., 2003)。内因的に産生された一酸化炭素は、抗アポトーシス(Brouard et al., 2003)および抗炎症(Otterbein et al., 2000)活性を通して低酸素状態による損傷を軽減するシグナルカスケードを活性化することができ、また同様の細胞保護作用は、外因性の一酸化炭素の注入によって移植モデルに達成することができる(Otterbein et al., 2003; Amersi et al., 2002)。より高い濃度では、一酸化炭素は、ミトコンドリアチトクロームおよびヘモグロビンなどの鉄含有タンパク質への結合を巡り酸素と競合するが(Gorman et al., 2003)、この活性が低酸素状態で有する可能性がある細胞保護作用についてはこれまでに研究されていない。
【０２８５】
これら精巧な低酸素損傷に対する防御メカニズムの存在にもかかわらず、低酸素状態は今なお損傷性ストレスであることが多い。例えば、哺乳類は、ヘモオキシゲナーゼ-1およびHIF-1の両方を有しており、いくつかの証拠は哺乳類でも仮死状態が可能であることを示唆している(Bellamy et al., 1996; Alam et al., 2002)。それでもなお心臓発作、卒中、または失血などの外傷による低酸素損傷は主要な死亡原因である。低酸素ストレスを生き延びるための二つの基本的ストラテジー、即ち活気維持および仮死状態の限界を理解することは、それが様々な条件の下での様々なシステムの研究に基づいてきたという事実によって妨げられている。
【０２８６】
「低酸素」は、酸素の正常な生理学的レベルが細胞または組織に供給されない時に起こる。「正常酸素」は、特定の細胞タイプ、問題の細胞または組織の状態にとって正常な生理学的な酸素レベルを指す。「無酸素」は、酸素が無いことを指す。「低酸素状態」は、細胞に低酸素をもたらす状態である。これらの状態は、細胞のタイプ、および組織もしくは臓器内の細胞の具体的構造または位置、ならびに細胞の代謝状態に依存する。本発明の目的に関しては、低酸素状態としては、酸素濃度が正常大気条件またはそれ未満、即ち20.8、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0%未満の濃度が挙げられる；または、これらの数は、1大気圧(101.3kPa)における大気のパーセントを表してもよい。ゼロパーセントの酸素濃度は無酸素状態と定義される。したがって、低酸素状態は無酸素状態を含むが、いくつかの態様では、少なくとも0.5%未満の低酸素状態を組み入れている。本明細書に用いる「正常酸素状態」は、おおよそ20.8%またはそれ以上の酸素濃度からなる。
【０２８７】
低酸素または無酸素を達成する標準的方法は十分確立されており、化学的触媒の力を借りてチャンバーから酸素を除去する環境チャンバーを使用することを含む。このようなチャンバーは、例えばBD Diagnostic Systems (Sparks, MD)よりGASPAK Disposable Hydrogen + Carbon Dioxide Envelopesとして、またはBIO-BAG Envrionmental Chambersとして市販されている。または、酸素は、チャンバー内の空気を窒素などの酸素以外の気体と交換することによって枯渇させることもできる。酸素濃度は、例えば、FYRITE Oxygen Analyzer(Bacharach, Pittsburgh PA)を用いて決定できる。
【０２８８】
本発明の方法は、活性化合物に曝露することと酸素濃度を室内空気と比べて変えることの組み合わせを利用できることが企図される。よりさらには、生物物体が存在している環境の酸素濃度は、約、少なくとも約、または最大で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%、あるいはそこから導き出せる任意の範囲であり得る。よりさらには、濃度の変化は、室内空気または管理された環境に比べた増減に関して、上記パーセンテージまたは範囲のいずれでもよいことが企図される。
【０２８９】
2. ミトコンドリア標的化剤
ミトコンドリアを選択的に標的にすることは、活性を高めるためのいくつかの局面において本発明の態様である。このような選択的なミトコンドリア標的化は、作用物質を脂肪親和性トリフェニルホスホニウムカチオンに結合することによって達成でき、それは脂質二重層を容易に通過して、ミトコンドリア内膜を横切る大きな電位(150〜180mv)によってミトコンドリアマトリックス内にほぼ1000倍に蓄積される。ビタミンEおよびユビキノンの類似体が両方が調製されており、ミトコンドリアの標的化に上手く用いられている(Smith et al., 1999; Kelso et al., 2001; Dhanasekaran et al., 2004)。チオールの一種、チオブチルトリホスホニウムブロミドが調製され、ミトコンドリアの標的化に用いられ、ここで、それは数百倍蓄積した(Burns et al., 1995; Burns & Murphy), 1997)。
2009534422.tif 000018
【０２９０】
このような錯体は、活性化合物に好適な候補と思われる。遊離チオール作用物質に加えて、チオスルフェニル置換化合物、(H-S-S-R)が有用だろう。いくつかの態様では、作用物質は次式の構造を有することが企図される：
2009534422.tif 000019
式中、
Zは、PまたはNであり；
R1、R2、およびR3はアリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、シクロアルキル、またはアルキル(好適にはフェニル、ベンジル、トリル、ピリジル、シクロヘキシル、C3〜C10アルキル、ハロゲン化してもよい)であり；
R4は-R5SR6であり、ここで、R5はC1〜C10アルキルであり、R6はHまたはSH、SO3H、もしくはPO3Hである。
【０２９１】
III. 治療的または予防的応用
A. 外傷
ある態様では、本発明は、外傷を受けているか、または外傷を受けやすい患者の処置に使用を見出せる。外傷は、火傷、創傷、切断、銃創、もしくは外科的創傷などの外的な傷害、血行の急激な低下をもたらす卒中もしくは心臓発作などの内的な傷害、または冷気または放射線への曝露などの非侵襲性のストレスによる血行の低下によって起こることがある。細胞レベルでは、外傷は、細胞、組織、および／または臓器の低酸素への曝露をもたらし、それによりプログラムされた細胞死または「アポトーシス」を誘導することが多い。全身性には、外傷は、凝固、炎症、低血圧などの一連の生化学的プロセスを誘導し、ショックを起こすことがあるが、ショックが持続すると、臓器の機能不全、不可逆的な細胞損傷、および死に至ることがある。生物学的プロセスは、外傷性の傷害に対し体を守るようにできている；しかしながらそれらは危険であることが分かっている、かつ一部の例では致死的である一連の事象を招くことがある。
【０２９２】
したがって本発明は、組織、臓器、四肢、および、さらに生物全体の、外傷の有害な影響からの保護を企図する。医学的対応が容易でない特定の場合に、スタシスのインビボもしくはエキソビボでの誘導は、または組織、臓器、もしくは生物の温度の低下と組み合わせて、被験体まで医学的対応を運搬するか、または被験体を医学的対応まで運搬するまでのことによって、被験体のために「時間を稼ぐ」ことができる。本発明はまた、創傷治癒および組織再生の遅延を生ずることがある生物学的プロセスを妨害／遅延することによって組織再生および創傷治癒を誘導するための方法も企図する。この関係では、四肢または生物に実質的な創傷が在る場合、インビボまたはエキソビボのスタシス誘導は、または組織、臓器、もしくは生物の体温低下と組み合わせて、治癒および再生を阻害する生物学的プロセスを管理することによって、創傷治癒および組織再生プロセスを支援できる。
【０２９３】
以下に論ずる創傷治癒および出血性ショックに加えて、本発明の方法は、心臓停止または発作などの外傷の予防または処置を行うことができる。本発明は、開胸術、開腹術、および脾臓切除術(splenic transection)などの緊急手術の外傷リスクに関して特に重要である。
【０２９４】
1. 創傷治癒
多くの例では、創傷および組織損傷は、難治性であるかまたは治癒するまでに長い時間がかかる。例は、慢性の開放性創傷(糖尿病性の足部潰瘍ならびにステージ3および4の圧迫潰瘍)、急性および外傷性の創傷、弁およびグラフト、ならびに亜急性の創傷(即ち裂開性の切り口)である。これは、他の組織損傷、例えば火傷および喫煙／熱気吸入による肺の損傷にも当てはまる。
【０２９５】
これまでの実験は、冬眠が傷害(例えば脳内のピン)に対し予防的であることを示しており、したがって冬眠には治癒効果がある可能性がある。結論として、この技術は、より代謝的に制御された環境に組織を持ち込むことによって、創傷の治癒プロセスを制御するのに役立ち得る。より詳しくは、細胞または組織がスタシス状態に保たれる期間は、傷害によって変えることができる。本発明のいくつかの態様では、生物物体は活性化合物に、約、少なくとも約、または最大で約、30秒間、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日、1、2、3、4、5週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月間またはそれ以上曝露される。
【０２９６】
2. 血液学的ショック(出血性ショック)
したがって、本発明は、患者の生存重要臓器および生命を保護するための、H2S(または他の酸素アンタゴニストもしくは他の活性化合物)を用いた（無呼吸および／または骨格筋運動の欠如によって示される）全身状態の誘導に関する。これによって、管理された環境(例えば手術)への運搬が可能となり、そこではショックの初期原因を扱い、次に患者を管理された様式で正常な機能に復帰させることができる。この適応に関して、上首尾な結果にとっては、「ゴールデンアワー」と称される傷害から最初の1時間が重要である。この期間に患者を安定化することが大きな目的であり、患者は傷害に適切に取り組むことができる救急救命施設(例えば救急治療室、外科等)へ搬送される。このように、患者をスタシス状態に維持して、これを可能にし、ショックの原因、失血の補充、およびホメオスタシスの再確立などの緊急の問題に取り組むことが理想である。これは極めて幅があるが、多くの例では、スタシスを維持する時間は傷害後約6〜約72時間の間である。いくつかの態様では、生物物体は活性化合物に、約、少なくとも約、または最大で約、30秒間、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日間またはそれ以上、およびそこからの任意の範囲もしくは組み合わせで曝露される。
【０２９７】
致死的出血ならびにショックおよび最終的には死をもたらす生理学的事象の生物学は完全には理解されていない。しかしながら、H2Sが虚血性の低酸素の致死作用を低下させるメカニズムが存在する。硫化水素はチトクロームCオキシダーゼを阻害し、この酵素を阻害することで酸素要求を低下させる可能性がある3。酸素要求の低下は、代謝性アシドーシスの誘導を含む、低酸素レベルの有害作用を低下させる場合がある。よりさらには、ショックの間、組織の硫水化物は低下する(Beck et al., 1954)。外因性のH2Sは、この低硫化物状態を阻止し、硫黄のホメオスタシスを維持し得る。
【０２９８】
硫化水素は、動物内に自然に作られ、強力な生物学的活性を示す(Kamoun, 2004)。ほとんどのタンパク質がジスルフィド結合したシステイン残基を含んでおり、遊離チオールからジスルフィドへの可逆的変換は、特異的な酵素活性を制御できる(Ziegler, 1985)。さらには、スルフィドは負に帯電しており、遷移金属に対し高い親和性を示す。チトクロームオキシダーゼなどの遷移金属原子を含有するタンパク質は、H2Sによって大きな影響を受け得る。最終的には、H2Sの他の低硫黄含有分子への代謝は、特異的生物活性を示すチオールの数を増やす。このような潜在的な作用様式に加えて(またはおそらくその作用様式によって)、H2Sは、心肺、神経内分泌、免疫、および／または止血系に影響することができ、それが最終的に傷害および疾患にとって有益となる。
【０２９９】
B．他の治療応用
一定の態様において、本発明の活性化合物は、被験体における生存能力を増強させる、および／または熱耐性を増加させることができる。例えば、被験体をH2Sに曝露すると、その被験体に熱耐性および生存能力（例えば、寿命または生存期間）の増加を付与する可能性がある。
【０３００】
サーチュインは、一つにはこのファミリーの一つのメンバーであるSir2が酵母の寿命因子（Kaeberlein et al., 1999）として作用し、類似の遺伝子sir 2.1がC.エレガンス（C. elegans）において検出されている（Tissenbaum and Guarente, 2001; Guarente, 2005）という発見により、最近、関心対象の研究トピックとなっている。細胞および生物における推定の代謝センサーとして、サーチュインは癌、糖尿病、および神経変性障害のような加齢関連疾患と関連づけられている（Long and Kennedy, 2006）。サーチュインは、これまで調べられたほぼ全ての生物において至る所に見出されており、同様に熱または飢餓のようなストレス因子に対する生物の反応において重要な役割を果たしている。例えば、酵母細胞を飢餓状態にすると、寿命の延長がもたらされ、Sir2活性の増加が起こるが、sir2遺伝子を除去すると、カロリー制限の寿命延長効果が消失する。Guarente, 2005。哺乳動物におけるサーチュインタンパク質の例には、SIRTl（Sir2の類似体）、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、およびSIRT7が含まれる。サーチュインおよびその調節はまた、虚血／再灌流および化学保護に関連している。
【０３０１】
いくつかの哺乳動物サーチュインのアミノ酸配列は公式に入手可能である。例えば、ヒトSIRT1に関してGenBankアクセッション番号Q96EB6、AAH12499、NP_036370、およびAAD40849；マウスSIRT1に関してGenBankアクセッション番号Q923E4およびNP_062786；ヒトSIRT2に関してGenBankアクセッション番号NP_085096、NP_036369、AAH03547、およびAAH03012；ラットSIRT2に関してGenBankアクセッション番号AAH86545およびNP 001008369；マウスSIRT2に関してGenBankアクセッション番号NP 071877；マウスSIRT3に関してGenBankアクセッション番号NP_07878およびAAH25878；ヒトSIRT3に関してGenBankアクセッション番号NP_036371、AAH01042、およびAAD40851を参照されたい。
【０３０２】
したがって、本発明の特定の局面において、活性化合物は、被験体の一つまたは複数のサーチュインタンパク質の活性を調節する可能性がある。活性化合物によるサーチュイン調節は、例えば心臓麻痺、心筋梗塞、虚血／再灌流傷害、敗血症、抗炎症関連事象、スタシス、無酸素、低酸素、または出血性ショックのような、本明細書において記述した状態のいずれかの誘導、調節、前処置、または処置に関係する可能性がある。そのような調節によって、例えば、生物物体における熱耐性の増加および／または生存能力の増強が起こる可能性がある。活性化合物によるサーチュイン調節は、虚血／再灌流に影響を及ぼす、および／または化学保護を高める可能性がある。例えば、本発明者らは、意外にもC.エレガンスにおけるSIR-2タンパク質が、H2Sに対する曝露に起因する熱耐性および寿命の増加にとって必要であることを発見した。図19を参照されたい。
【０３０３】
いくつかの態様において、サーチュイン遺伝子発現の検出は、処置目的のために活性化合物の有効性を決定するための診断または予後試験の基礎となる可能性がある。一定の態様において、そのような診断または予後試験は、活性化合物による被験体の前処置の有効性を決定することができるであろう。
【０３０４】
IV．スクリーニング応用
なおさらなる態様において、本発明は、ショックに関するリスクを有する患者における生存能力を高めるために用いることができる化合物を同定するための方法を提供する。これらのアッセイは、候補物質の大きいライブラリのランダムスクリーニングを含んでもよく、またはアッセイは、活性化合物として作用する可能性をより高くすると考えられている属性に着目して選択された特定のクラスの化合物に注目するために用いてもよい。例えば、本発明は一般的に以下の段階を含む：
（a）被験体に試験化合物を提供する段階；
（b）被験体をショックのリスクにさらす条件に被験体を曝露する段階；
（c）候補化合物が提供された被験体における生存能力の任意の増加を評価する段階であって、増加によって試験化合物が候補治療物質であることが示される、段階。
【０３０５】
または、本発明の他の方法において以下の段階を含む方法が存在する：
（a）被験体に試験化合物を提供する段階；
（b）骨格筋運動の欠如および／または無呼吸に関して被験体を評価する段階であって、いずれかが存在すれば、試験化合物が候補治療物質であることが示される、段階。
【０３０６】
有効な候補物質が見出されないとしても、当然本発明のスクリーニング法は全てそれ自体有効であることが理解される。本発明は、単にそれらを発見する方法ではなくて、そのような候補物質に関するスクリーニング法を提供する。しかし、同様に試験化合物は、一つまたは複数のアッセイに従って候補化合物として同定されてもよいと理解され、このことは、化合物が、無呼吸の誘導または出血性ショックによる死亡のリスクを低減させることによるような、生理的効果に至る何らかの能力を有するように思われる。いくつかの態様において、スクリーニングは、候補化合物を同定するために、本開示における実施例または他のどこかで記述されるアッセイを用いることを含む。その上、本章において記述した方法の他に、または代わりに、候補化合物を、酸素アンタゴニストとして、または保護的代謝物質もしくは治療物質のような活性化合物の特性を有するもう一つの化合物のいずれかとして活性に関して試験してもよい。スクリーニング法のいくつかの態様は先に提供された通りである。
【０３０７】
候補化合物を、さらに特徴付けまたはアッセイしてもよい。その上、候補化合物は、インビボ動物もしくは動物モデル（以下に考察されるように）において用いてもよく、または同じ種の動物もしくは異なる動物種を含み得るさらなるインビボ動物もしくは動物モデルにおいて用いてもよい。
【０３０８】
さらに、本発明の態様に従って同定された候補物質はまた、スクリーニング後製造されてもよいことが企図される。同様に、特に治療的または予防的態様に関して、本発明の方法に従って生物物体を候補化合物に曝露または接触させてもよい。
【０３０９】
A．モジュレーター
本明細書において用いられるように、「候補物質」という用語は、例えば被験体において無呼吸を誘導する可能性がある任意の分子を指す。「総当たり的(brute force)」に有用な化合物を同定するための、有用薬物の基礎判断基準を満たすと信じられている小分子ライブラリは、様々な商業的供給元から入手することもできる。コンビナトリアル技術によって作られたライブラリ(例えばペプチドライブラリ)を含む、このようなライブラリのスクリーニングは、非常に多くの関連(および非関連)化合物を活性についてスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法である。コンビナトリアル法はまたそれ自体が、活性ではあるが望ましくない化合物をモデルにして、第2、第3、および第4の世代の化合物を作り出し、可能性のある薬物を急速に発展させるのに役立つ。
【０３１０】
候補化合物は、天然の化合物の断片または一部分を含んでよく、または、そうでない場合には不活性である、公知化合物の活性型の組み合わせとして見出すこともできる。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物供給源、ならびに海産サンプルなどの天然供給源から単離された化合物を、潜在的に有用な薬学的作用物質の存在についての候補としてアッセイできることが提案されている。スクリーニング対象となる薬学的作用物質は、化学的組成物または人工化合物からも誘導または合成できることが理解されるだろう。したがって、本発明で同定された候補物質は、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、もしくは公知阻害剤または刺激因子から出発して、合理的な薬物デザインを経てデザインされる任意の他の化合物でよいことが理解される。
【０３１１】
最初に同定された調節化合物に加えて、本発明者らは、他の構造的に類似する化合物を調合して、モジュレーターの構造の重要部分を模倣できることも企図する。このような化合物は、ペプチドモジュレーターのペプチドミメティクスを含め、最初のモジュレーターと同様の様式で用いることができると考えられる。
【０３１２】
B. インビボアッセイ
インビボアッセイは、様々な動物の使用を必要とする。マウスは、それらのサイズ、取り扱い易さ、それらの生理学および遺伝的性質に関する情報から、好ましい態様である。しかしながら、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、マーモット、マウス、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、およびサル(チンパンジー、テナガザル、およびヒヒを含む)を含む他の動物も同様に適している。インビボアッセイでの使用に関しては、魚も線虫同様に企図される。モジュレーターのアッセイは、これらの種に由来する動物モデルを用いて行うことができる。
【０３１３】
このようなアッセイでは、一つまたは複数の候補物質が動物に投与され、不活性賦形剤(陰性対照)およびH2S(陽性対照)と比較した、候補物質の、無呼吸誘導、生存に影響のある失血、または生物学的材料にショックに陥りながら生き抜く能力を付与する能力からモジュレーターを同定する。試験化合物による動物の処置は、適切な形状をした化合物の動物への投与を含む。候補化合物(気体または液体)の投与は、経口、経鼻(吸入または噴霧)、口腔、または局所を含むがこれらに限定されない、臨床または非臨床的な目的に利用できる任意の経路から行われる。または、投与は気管内注入、気管支注入、皮内、皮下、筋肉内、腹膜内、または静脈内注射でも行うことができる。特に企図される経路は、全身性の静脈内注射、血液またはリンパ供給を介した局所投与、または作用部位への直接経路である。
【０３１４】
V. 投与様式および薬学的組成物
カルコゲニド、酸素アンタゴニスト、または他の活性化合物の薬学的組成物の有効量は、一般的には、関心対象の状態の程度を検知可能に軽減、低下、最小化、または制限するのに十分な量と定義される。疾患の排除、根治、または治癒を含む、より厳しい定義を適用してもよい。
【０３１５】
A. 投与
カルコゲニドの投与経路は、処置対象の状態の場所および性質に伴って必然的に変わり、例えば吸入、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻内、皮下、経皮、気管内、腹膜内、腫瘍内、潅流、洗浄、直接注射、ならびに経口投与および製剤が挙げられる。以下説明するように、活性化合物は、吸入または挿管法によって医用ガスとして、血管内、静脈内、動脈内、脳室内、腹膜内、皮下投与により注射液として、局所液またはゲルとして、あるいは固体経口投与形状として投与できる。
【０３１６】
さらに、量は、生物物体のタイプ(細胞型、組織型、生物の属および種等)ならびに／またはそのサイズ(体重、表面積等)に依存して変わり得る。大型の生物ほど用量は多くなることが一般的である。したがって、マウスにとっての有効量は、ラットにとっての有効量よりも一般的には少なく、ラットにとっての有効量は、イヌにとっての有効量より一般的に少なく、イヌにとっての有効量はヒトにとっての有効量よりも一般的に少ない。ヒトでスタシスを達成する硫化水素の有効濃度は、投与形態または投与経路に依存する。吸入の場合、いくつかの態様では、連続的に送り込まれた場合、有効濃度は50ppm〜500ppmの範囲内である。静脈内投与の場合、いくつかの態様では、連続的に送り込まれた場合の有効濃度は0.5〜50ミリグラム／キログラム体重である。
【０３１７】
同様に、投与期間も生物物体のタイプ(細胞型、組織型、生物の属および種等)ならびに／またはそのサイズ(体重、表面積等)に依存して変わり、かつ投与形態および投与経路に一部依存し得る。特定の態様では、活性化合物は、約または少なくとも約30秒間、1分間、2分間、3分間、5分間、10分間、15分間、30分間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、12時間、24時間、または24時間を超える間提供される。活性化合物は、単回または複数回用量で投与でき、投与間の時間は変えることができる。
【０３１８】
移植例では、本発明は手術前および手術後に、宿主または移植材料を休止させるのに用いることができる。特定の態様において、手術部位にカルコゲニドを含む製剤を注射または潅流してもよい。潅流は、例えば、手術部位に埋め込まれたカテーテルを残すことによって手術後も続けてよい。
【０３１９】
B. 注射可能組成物および製剤
本発明の活性化合物を送達するための好ましい方法は、吸入、静脈内注射、特定領域の潅流、および経口投与である。しかしながら、本明細書に開示された薬学的組成物は、米国特許第5,543,158号；第5,641,515号、および第5,399,363号(各々が、全体として参照により本明細書に特に組み入れられる)に記載されているように、これに代わって非経口的、皮内、筋肉内、経皮的に、または腹膜内的にも投与できる。
【０３２０】
活性化合物の溶液は、水の中に、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と共に好適に混合して調製できる。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中ならびに油中に調製できる。通常の貯蔵および使用条件では、これら調製物は微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。注射使用に好適な薬学的形状としては、無菌水溶液または分散物、および無菌注射液または分散物の即時調合向け無菌粉末が挙げられる(米国特許第5,466,468号、全体として参照により本明細書に特に組み入れられる)。全ての例で、該形状は無菌でなければならず、かつ容易に注射可能性が存在する程度の流体でなければならない。それは、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)を含む溶媒または分散媒体、好適なそれらの混合物、ならびに／または植物油でよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いることによって、分散物の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持できる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等を用いてもたらすことができる。多くの例では、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、作用物質組成物中に遅延吸収剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することでもたらすことができる。
【０３２１】
水溶液の非経口投与では、例えば、溶液は必要に応じて好ましく緩衝化されなければならず、まず希釈液を十分な食塩またはグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、および腹膜内投与に特に好適である。この関係では、使用できる無菌水性媒体は、本発明の開示に照らせば、当業者に公知となると考えられる。例えば、一回投与量を等張NaCl溶液1mlに溶解することができ、1000mlの皮下注入液に加えるか、または推薦された注入部位に注射することができる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」15th Edition, 1035〜1038ページおよび1570〜1580ページを参照されたい)。処置対象の状態に応じて、投与が必然的にいくらか変わることがあると考えられる。投与を担当する者は、いずれにしても、個々の被験体にとって適切な用量を決定する。よりさらには、ヒトへの投与については、調合物は、FDA Office of Biologics標準規格が求める、無菌性、発熱性、一般安全性、および純度の標準規格を満たさなければならない。
【０３２２】
無菌注射液は、要求量の活性化合物を、必要に応じて上記の各種他の成分と共に適切な溶媒中に組み入れ、続いて濾過滅菌して調製される。一般的には、分散物は、様々な無菌活性成分を、基本分散媒体および上記の他の成分から必要な成分を含む無菌賦形剤の中に組み入れることによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって無菌濾過されたその溶液から、活性成分に追加の所望成分が加わった粉末を生ずる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０３２３】
本明細書で使用する「担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散物媒体、賦形剤、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。このような薬学的活性物質のための媒体および作用物質の使用は、当技術分野では周知である。任意の通常の媒体または作用物質が活性成分と不適合でない範囲に於いて、治療組成物でのその使用が企図される。補助活性成分も組成物中に組み入れることができる。
【０３２４】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という表現はヒトに投与された時にアレルギーまたは類似の不利益な反応を起こさない分子成分および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当技術分野で十分理解されている。典型的には、このような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかに調製される；溶液または懸濁液に好適な固体を、使用前に液体に調製することもできる。
【０３２５】
C. 静脈内製剤
一つの態様では、本発明の活性化合物は、非経口投与(例えば静脈内、動脈内)に合わせて調製できる。活性化合物が室温で気体の場合は、非経口投与用の液体または溶液に溶解された既知の所望濃度の気体分子を含有する溶液が企図される。活性化合物溶液の調製は、例えば、気体を溶液と接触(例えば発泡または注入)させて気体分子を溶液中に溶解させることによって達成できる。当業者は、溶液中に溶解する気体の量は、液体または溶液中の気体の溶解性、液体または溶液の化学組成、その温度、そのpH、そのイオン強度、ならびに気体の濃度および接触の強さ(例えば泡立てまたは注入の速度および長さ)を含むが、これらに限定されない様々な変数に依存することを理解するだろう。非経口投与のための液体または溶液中の活性化合物の濃度は、当業者に公知の方法を用いて決定できる。液体または溶液中の活性化合物の安定性は、酸素アンタゴニスト溶液を調製または製造した後に、様々な時間間隔後に溶解した酸素アンタゴニストの濃度を測定することによって決定でき、ここで、出発濃度に対する酸素アンタゴニスト濃度の減少は、活性化合物の消失または化学変換を示している。
【０３２６】
いくつかの態様では、カルコゲニド化合物を含み、塩の形状をしたカルコゲニドを無菌水または食塩水(0.9%塩化ナトリウム)に溶解して薬学的に許容される静脈内投薬形状にした溶液が存在する。液体の静脈内投薬形状は、あるpHに緩衝化して、カルコゲニド化合物の溶解性を高めるか、またはカルコゲニド化合物のイオン化状態に影響することができる。硫化水素またはセレン化水素の場合、ナトリウム、カルシウム、バリウム、リチウム、またはカリウムを含むが、これらに限定されない、当業者に公知のいくつもの塩の形状の任意のもので十分である。別の好ましい態様では、硫化ナトリウムまたはセレン化ナトリウムを無菌リン酸緩衝化食塩水に溶解し、塩酸でpHを7.0に調節して、被験体に静脈内または動脈内投与できる、公知の濃度の溶液が作られる。
【０３２７】
いくつかの態様では、本発明の薬学的組成物は、活性化合物に関して飽和溶液であることが企図される。溶液は、任意の薬学的に許容される製剤でよく、その多くはリンゲル液のように周知である。ある態様では、活性化合物の濃度は、約、少なくとも約、または最大で0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0M、もしくはそれ以上、あるいはそこから導き出される任意の範囲である(標準温度および標準圧力(STP)にて)。例えばH2Sの場合、いくつかの態様では、濃度は約0.01〜約0.5M (STPで)でよい。上記濃度は、溶液中の一酸化炭素および二酸化炭素について、別々または一緒に、適応できることが特に企図される。
【０３２８】
さらには、投与が静脈内の場合、次のパラメータが適用できることが企図される。約、少なくとも約、または最大で約、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100gtts／分またはμgtts／分、あるいはそこから導き出せる任意の範囲の流速。いくつかの態様では、溶液の量は、溶液の濃度に応じて、容積で指定される。時間は、約、少なくとも約、または最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、1、2、3、4、5、6、7日間、1、2、3、4、5週間、および／または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月間、あるいはそこから導き出せる任意の範囲でよい。
【０３２９】
全体または一回のセッションで、
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mlもしくはリットル、またはそこからの任意の範囲の容積が投与できる。
【０３３０】
いくつかの態様では、非経口投与のための活性化合物溶液は、液体または溶液を活性化合物と接触させる前に、酸素を除去しておいた液体または溶液で調製される。ある種の酸素アンタゴニスト、特にある種のカルコゲニド化合物(例えば硫化水素、セレン化水素)は、それらが酸素と化学的に反応して酸化および化学的に変換できる能力のせいで、酸素が存在する場合は安定でない。酸素は、陰圧(真空脱気)を液体または溶液に加える、あるいは溶液または液体を、酸素と結合させるか「キレート化」させて溶液から酸素を効率よく除去する試薬と接触させることを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の方法を用いて液体または溶液から除去できる。
【０３３１】
別の態様では、非経口投与のための酸素アンタゴニストの溶液は、気密容器に貯蔵できる。これは、酸素アンタゴニストの酸化を制限または防止するために酸素が溶液から事前に除去されている場合に特に望ましい。加えて、気密容器での貯蔵は、酸素アンタゴニスト気体の液体または溶液からの揮発を阻止し、溶解した酸素アンタゴニストを一定圧に維持できるようにすると考えられる。気密容器は、当業者に公知であり、気体不透過性構造材料を含む「i.v.バッグ」または密封されたガラス製バイアルが挙げられるが、これらに限定されない。気密貯蔵容器内での空気への曝露を防止するために、窒素またはアルゴンなどの不活性ガスを閉じる前に容器に入れてもよい。
【０３３２】
D. 局所製剤およびその使用
本発明の方法および組成物は、毛嚢細胞、毛細血管内皮細胞、ならびに口腔および舌の上皮細胞を含むが、これらに限定されない、皮膚の表面層および口腔粘膜にスタシスを誘導するのに有用である。癌処置のための放射線療法および化学療法は、毛嚢および口腔粘膜の正常細胞を損傷し、癌治療の意図しない衰弱性の副作用をもたらし、それぞれ脱毛および口腔粘膜炎を起こす。毛嚢細胞および／または毛嚢に血液を供給している血管細胞にスタシスを誘導すると、放射線療法および化学療法に伴う毛嚢細胞への変化および脱毛、あるいは他の脱毛症、男性型脱毛症、女性型脱毛症、または正常では毛が存在する皮膚領域のその他の無毛症を遅らせ、制限し、または防止できる。口腔上皮および間葉細胞へのスタシス誘導は、口腔、食道、および舌内側層の細胞への損傷、ならびに口腔粘膜炎から起こる疼痛状態を遅らせ、制限し、または阻止できる。
【０３３３】
ある態様では、活性化合物は局所的に投与される。これは、活性化合物をクリーム、ゲル、ペースト、または口内洗浄剤に調合し、このような製剤を活性化合物への曝露を必要とする領域(頭皮、口、舌、喉)に直接使用することによって達成される。
【０３３４】
本発明の局所組成物は、適切な担体を選ぶことによって、油、クリーム、ローション、軟膏等として調合できる。好適な担体としては、植物油または鉱油、白色ワセリン(白色軟質パラフィン)、分岐鎖脂肪または油、動物性脂肪、ならびに高分子アルコール(C12を超える)が挙げられる。好ましい担体は、その中では活性成分が可溶性である担体である。必要に応じて、色または芳香を加える物質だけでなく、乳化剤、安定化剤、湿潤剤、および酸化防止剤も含めることができる。これに加えて、これら局所製剤には、経皮浸透促進剤も使用できる。このような促進剤の例は、米国特許第3,989,816号および第4,444,762号に見出すことができる。
【０３３５】
クリームは、その中に少量のアーモンドオイルなどの油に溶解された活性化合物が混合された、鉱油、自己乳化性蜜蝋、および水の混合物から調合されるのが好ましい。このようなクリームの典型例は、水を約40、蜜蝋を約20、鉱油を約40、およびアーモンドオイルを約1の割合で含むものである。
【０３３６】
軟膏は、アーモンドオイルなどの植物油の活性成分溶液を温軟質パラフィンと混合し、混合物を冷ますことによって調合できる。このような軟膏の典型例は、アーモンドオイルを約30重量%および白色軟質パラフィンを約70重量%含むものである。
【０３３７】
ローションは、活性成分を、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどの好適な高分子アルコールに溶解することによって都合良く調製できる。
【０３３８】
直腸に使用できる、可能な薬学的製剤としては、例えば、一つまたは複数の活性化合物と坐薬基剤との組み合わせからなる坐薬が挙げられる。好適な坐薬基剤は、例えば天然もしくは合成トリグリセリド、またはパラフィン系炭化水素である。加えて、活性化合物と基剤の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもできる。可能な基剤材料としては、トリグリセリド液、ポリエチレングリコール、またはパラフィン系炭化水素が挙げられる。
【０３３９】
E. 固体投薬形状
薬学的組成物は、結晶性の固体状態を取ることができる多孔性担体フレームワークの中に活性化合物が捕捉または隔離されている、固体投薬形状を含む。気体貯蔵能力を持つこのような固体投薬形状は、当技術分野で公知であり、薬学的に許容される形状に生成することができる(例えばYaghi et al. 2003)。このような薬学的組成物の特定の利点は、それらの遊離形状の場合、ある濃度である哺乳類にとって有毒となり得るカルコゲニド化合物(例えば硫化水素、一酸化炭素、セレン化水素)に関連する。ある態様では、化合物は経口投与向けに調合できる。
【０３４０】
F. 潅流システム
細胞向けの潅流システムは液体または半固体形状の活性化合物に、組織または臓器を曝露させるのに用いることができる。潅流とは、細胞集団の中または上を流れる、溶液の連続的な流れを指す。これは、連続フロー培養に対し、細胞を培養ユニット内に保持し、細胞を引き込まれた媒体(例えばケモスタット)で洗い流すことを意味する。潅流は、培養環境(pH、pO2、栄養レベル、活性化合物レベル等)のよりよい制御を可能にし、細胞接着用の培養体内の表面積を有意に増やすための手段である。
【０３４１】
潅流の技術は、細胞に血液、リンパ液、または他の体液が連続的に供給されるインビボの細胞環境を模倣して開発された。生理学的栄養液の潅流がないと、培養細胞は相を栄養補給相から飢餓相に変え、その結果それらの成長および代謝的潜在能力の完全な発現が制限される。本発明との関係では、潅流システムは、細胞を酸素アンタゴニストで潅流してスタシスを誘導するのに用いることもできる。
【０３４２】
当業者は、潅流システムを熟知しており、多くの潅流システムが市販されている。本発明には、任意のこれら潅流システムが利用できる。潅流システムの一例は、不繊布のベッドマトリックスを用いた潅流充填層リアクター(CelliGen (商標)、New Brunswick Scientific, Edison, NJ; Wang et al., 1992; Wang et al., 1993; Wang et al., 1994)である。簡単に説明すると、このリアクターは、固定依存細胞または非固定依存細胞の両方を培養するための改良型リアクターを含む。リアクターは、内部再循環を提供する手段を備えた充填層としてデザインされている。好ましくは、繊維マトリックス担体が、リアクター容器内のバスケットの中に配置される。バスケットの頂部および底部には穴が開けられ、バスケットを通して媒体を流すことができる。特別にデザインされた推進器が、繊維マトリックスが占有する空間内の媒体を再循環させ、栄養分の均一な供給および排出物の除去を保証する。これは同時に、媒体中に浮遊する細胞が全体に比べ無視できる程度であることも保証する。バスケットと再循環の組み合わせは、気泡を含まない酸素化媒体の繊維マトリックスを通る流れを提供する。繊維マトリックスは、「孔」直径が10μm〜100μmの不繊布であり、個々の細胞の体積の1〜20倍に相当する孔容積を持つ、高い内部容積を提供する。
【０３４３】
潅流型の充填層リアクターにはいくつかの利点がある。繊維マトリックス担体を用いることで、細胞は、撹拌および発泡の機械的ストレスから保護される。バスケット内を通る自由な媒体の流れは、最適に制御された酸素、pH、および栄養分のレベルを細胞に提供する。産物は連続的に培養体から取り出すことができ、収集した産物は細胞を含まず、かつ低タンパク質媒体の中で産生でき、その後の精製段階を容易にすることができる。この技術は、WO 94/17178(1994年8月4日、Freedman et al.)に詳しく説明されており、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４４】
Cellcube(商標)(Corning-Costar)モジュールは、基質に接着した細胞の固定化および成長のための広いスチレン表面を提供する。それは、一連の平行に連結された培養プレートを有し、隣接するプレート間に、薄い、密封された層流空間を作り出している、一体的に封入された単回使用装置である。
【０３４５】
Cellcube (商標)モジュールは、互いに対角線上に対向し媒体の流れの制御を助ける、注入口および排出口を有している。初回接種後、当初数日間の成長の間、培養は、一般的にはシステム内の媒体によって十分支えられる。初回接種から媒体潅流までの期間は、接種物内の細胞密度および細胞成長速度に依存する。循環中の媒体の栄養濃度の測定は、培養状態のよいインジケータである。手順を確立する時は、様々な潅流速度で栄養組成物をモニタリングして、最も経済的かつ生産的な運転パラメータを決定する必要があり得る。
【０３４６】
市販されている他の潅流システムとしては、例えばCellPerf (登録商標)(Laboratories MABIO International, Tourcoing, France)およびStovall Flow Cell (Stovall Life Science, Inc., Greensboro, NC)が挙げられる。
【０３４７】
培養の生産段階のタイミングおよびパラメータは、具体的な細胞系列のタイプおよび使用に依存する。多くの培養は、培養の成長段階に必要とされたものとは異なる媒体を必要とする。ある段階から別の段階へ移行する場合、伝統的な培養では、複数の洗浄ステップを必要とする可能性がある。しかしながら、潅流システムの便益の一つは、様々な運転段階の間を緩やかに移行できることである。潅流システムは、成長段階から酸素アンタゴニストにより誘導される静的段階への移行も容易にできる。同様に、潅流システムは、酸素アンタゴニストを含む溶液を、例えば生理学的栄養媒体と交換することによる、静的段階から成長段階への移行も容易にできる。
【０３４８】
G. カテーテル
ある態様では、カテーテルを用いて、保護作用物質を生物に提供する。特にこのような作用物質を心臓または血管系に投与する場合が関心対象である。カテーテルは、この目的に使用されることが多い。Yaffeら、2004は、特に仮死状態と関係してカテーテルを論じているが、カテーテルの使用は、この刊行物以前に公知であった。
【０３４９】
H. 気体の送達
1. 呼吸系
例示的な気体送達システム100が図1に描かれている。送達システム100は、活性化合物を含む呼吸可能な気体を、被験体の呼吸系に送るのに適している。気体送達システム100は、一つまたは複数の気体供給源102を含む。各気体供給源102は制御装置104および流量計106に連結している。気体送達システム100は、活性作用物質供給源107、任意の気化器108、および排出口制御装置110、スカベンジャー112、およびアラーム／モニタリングシステム114も含む。
【０３５０】
送達システム100は、麻酔薬送達装置に一般的に用いられているある要素を含んでよい。例えば、麻酔薬送達装置は、一般的に高圧回路、低圧回路、呼吸回路、およびスカベンジャー回路を含む。図1〜3に記載されているように、一つまたは複数の気体供給源102、気化器108、排出口制御装置110、スカベンジャー112、および／またはアラーム／モニタリングシステム114には、高圧、低圧、呼吸、および／またはスカベンジャー回路を有する装置の一部として備えることができ、これら要素は、麻酔薬送達装置に一般的に使用されているものと同様でよい。麻酔薬送達装置は、例えば、米国特許第4,034,753号；第4,266,573号；第4,442,856号；および第5,568,910号に記載されており、これらの内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０３５１】
気体供給源102は、圧縮ガスのタンクにより提供できる；しかしながら気体供給源102は、気体または気体に変換される液体供給源のどちらでもよいことを理解しなければならない。例えば、気化器108を用いて、液体ガス供給源を気化することができる。制御装置104は、各気体供給源102の圧力を下げる弁を含む。低圧された気体は、次に流量計106の一つの中を通り、流量計はそれぞれの気体供給源102からの気体流を測定および制御する。
【０３５２】
気体供給源102は、活性作用物質107の送達に使用する担体気体でよい。担体気体は、供給源107から活性作用物質を送る被験体にとって望ましい環境を提供するように選択することができる。例えば、活性作用物質が呼吸可能な気体として患者に送られる場合は、担体気体は、患者の需要を満たす十分な量の酸素、亜酸化窒素、または空気を含むことができる。他の不活性気体または活性気体も使用できる。
【０３５３】
いくつかの態様では、気体供給源102の一つは、活性作用物質供給源107を含む。供給源107からの活性作用物質は、気化器108によって気化される液体ガス供給源でも、または活性作用物質は高圧下の圧縮気体などの気体供給源でもよい。活性作用物質は、一つまたは複数の気体供給源102と混合できる。排出口制御装置110は、被験体に提供される気体混合物の量を制御する。
【０３５４】
スカベンジャー112は、被験体に提供される気体から不要物を取り除き、かつ／または換気する装置またはシステムである。例えば、供給源107からの活性作用物質が呼吸可能な気体として患者に提供される場合は、スカベンジャー112を用いて吸入物(活性作用物質などの)の廃ガス、未使用の酸素、および排気された二酸化炭素を取り除くことができる。
【０３５５】
アラーム／モニタリングシステム114は、送達システム100内の一カ所または複数カ所に、気体流および／または気体含有量をモニタリングするセンサーを含む。例えば、酸素の流れおよび量は、供給源107からの活性作用物質が呼吸可能な気体として患者に提供される際にモニタリングされ、担体気体が患者にとって十分な酸素を含むことを保証することができる。アラーム／モニタリングシステム114は、デリバリーシステム100の使用者に、視覚的表示装置、光、または聴覚アラームなどの、聴覚または視覚的警告を提供するか、またはモニタリング情報を提供するように作られたユーザーインターフェイスも含む。アラーム／モニタリングシステム114は、所定の状態に合致した時にユーザーに通知し、かつ／または気体レベルに関する情報を提供するように構成することができる。
【０３５６】
図2を参照すると、システム100Aは、高圧回路116、低圧回路118、呼吸回路120、およびスカベンジャー回路112を含んでいる。
【０３５７】
高圧回路116は圧縮気体供給源102を含み、これは制御装置弁104b、104aに連結している。制御弁104aは、各気体供給源102から流れる気体の量を制御し、制御弁104bは開けられて、例えば周囲大気に対し開放することによって、気体の圧力を上げることができる。
【０３５８】
低圧回路118は、流量計106、活性作用物質供給源107、および気化器108を含む。気体供給源102からの気体混合物は流量計106が提供し、流量計は気体供給源102からの各気体の量を制御する。図2に描かれているように、活性作用物質供給源107は液体である。活性作用物質供給源107は、気化器108によって気化され、気体混合物に加えられる。
【０３５９】
呼吸回路120は、排出口制御装置110、二つの一方向弁124、126、および救急装置128を含む。スカベンジャー回路112は、弁112a、リザーバー112b、および排出口112cを含む。被験体130は、気体混合物を排出口制御装置110から受け取り、得られた気体はスカベンジャー回路122によって換気される。より具体的には、排出口制御装置110は、一方向弁124を介して被験体130に送られる気体混合物の量を制御する。吐出された気体は、一方向弁126を通り弁112aおよびリザーバー112bに流れる。余分な気体は、スカベンジャー112の排出口112cから出て行く。気体の一部は再循環でき、吸収装置128を通過して呼吸回路120に流れる。吸収装置128は、吐出された気体から二酸化炭素を減らすための二酸化炭素吸収キャニスターでよい。この構成では、吐出された酸素および／または活性作用物質は再循環および再利用できる。
【０３６０】
システム100Aには、様々な位置に、一つまたは複数のセンサーSを追加できる。センサーSは、システム100A内の気体を感知および／またはモニタリングする。例えば、気体供給源102の一つが酸素だとすると、センサーSの一つは、システム100A内の酸素をモニタリングして、患者が好適な量の酸素を受け取れるように構成および配置された酸素センサーでよい。センサーSは、アラーム／モニタリングシステム114と連絡している(図1参照)。システム100内に望ましくないか有害な気体レベルが存在すると、アラーム／モニタリングシステム114は、被験体130に提供される酸素レベルを上げるか、または被験体130を送達システム100Aから切り離すなどの適切な行動を取るようにシステム100Aの使用者に警告することができる。
【０３６１】
図3を参照すると、活性作用物質供給源107が二つの制御弁104b、104aに連結されている、システム100Bが示されている。活性作用物質供給源107が液体ガスの場合は、液体ガス供給源を気化するための任意の気化器108が提供される。活性作用物質供給源107が気体(例えば高圧ガス)の場合、気化器108は省くことができる。活性作用物質供給源107は、流量計106によって制御された量の低圧回路118中の他の気体供給源102と混合される。低圧回路118は、それが呼吸回路120に流れる時の混合気体のオーバーフローを含む気体リザーバー109を含む。活性作用物質供給源107および／または任意の気体供給源102は、気化器の付いた液体ガス供給源として提供できることを理解しなければならない。図3に描かれたシステム100Bの要素は、本質的に図2に関する上記の要素に同じであるため、これ以上記載しない。
【０３６２】
システム100、100A、100Bを用いて実施できる本発明の態様による方法が図4に描かれている。一つまたは複数の呼吸可能な気体供給源の混合物が提供される(ブロック202)。呼吸可能な気体供給源は、図1〜3に関係して記載されたように、気体供給源102から得ることができる。図1〜3の活性作用物質供給源107に関して示したように、気体混合物に所定量の活性作用物質が加えられる(ブロック204)。気体混合物は、被験体120に投与される(ブロック306)。吐出された気体は、例えばスカベンジャー112によって換気および／または再循環される(ブロック208)。図4の方法は、図1〜3のシステム100、100A、100Bに関して記載されているが、図4の段階の実施には、任意の好適システムまたは装置を用いてよいことを理解しなければならない。
【０３６３】
2. 減圧送達システム
気体送達システム300の態様が、図5に関係して描かれている。気体送達システム300は、被験体302の上に配置されている。気体送達システム300は、気体混合物の活性作用物質を被験体302の組織、例えば創傷組織に送るのに特に適している。
【０３６４】
システム300は、被験体302の処置領域を覆うスクリーン306を有する減圧チャンバー304を含む。減圧チャンバー304は、ポンプ排出口310aにより真空ポンプ310に連結されている。減圧チャンバー304は、注入口308aおよび排出口308bを含み、これらは次に活性作用物質供給源307に連結される。コントローラ320は、活性作用物質供給源307および真空ポンプ310に連結される。減圧チャンバーおよび真空ポンプシステムは、米国特許第5,645,081号および第5,636,643号に論じられており、これらの内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０３６５】
減圧チャンバー304は、被験体302の領域を密閉して、流体密封性または気密性の密閉容器を提供し、減圧または陰圧および作用活性物質供給源307による該領域の処置を実施できるように作られる。圧力チャンバー304は、柔軟で接着性の流体不透過性ポリマーシートなどのカバー(未表示)で被験体302に貼り付けることができる。カバーは、処置対象領域の縁を囲む皮膚を覆い、気密性または流体密封性のシールを提供し、チャンバー304を所定位置に保持するように機能する、接着性の裏面を有することができる。
【０３６６】
スクリーン306は、被験体302の処置領域を覆って配置される。例えば、被験体302の処置領域が創傷を含む場合、スクリーン306は創傷を覆うように配置することができ、その過剰な拡大を防止することができる。スクリーン306のサイズおよび輪郭は、調節して個々の処置領域に合わせることができ、かつ様々な多孔性材料から作ることができる。材料は十分に多孔性であり、酸素および活性作用物質供給源307からの気体などの任意の他の気体が処置領域に到達できようにするものでなければならない。例えば、スクリーン306は、十分多孔性であり、処置領域へ、または処置領域から気体を流すことができる、ポリウレタン発泡体などのオープンセル型のポリマー発泡体であり得る。様々な厚さおよび剛性の発泡体を用いることができるが、処置中、患者がその上に横たわらなければならない場合には、患者の快適さからスポンジ状の材料を用いることが望ましい場合がある。発泡体は、気体の流れを高め、かつシステム300の重量を下げるために、孔を開けることもできる。スクリーン306は、処置領域内に納まるように適切な形およびサイズにカットしてもよく、またはスクリーン306は、周囲の皮膚に重なる十分な大きさでもよい。
【０３６７】
真空ポンプ310は、減圧チャンバー304内に吸引源を提供する。活性作用物質供給源307は、減圧チャンバー内304にある量の活性作用物質を提供する。コントローラ320は、真空ポンプ310によって減圧チャンバー304に加える真空度および活性作用物質供給源307によってチャンバー304に供給される活性作用物質の量を制御する。
【０３６８】
コントローラ320は、真空および／または活性作用物質を、実質的に一定様式、周期的、または様々な変動もしくはパターン、あるいはそれらの任意の組み合わせで加えることができる。いくつかの態様では、活性作用物質は、活性作用物質供給源307とそれに代わる真空ポンプ310によって真空ポンプ作用によって供給される。即ちコントローラ320は、活性作用物質供給源307を停止させながら真空ポンプ310を作動させ、次に真空ポンプ310を停止させながら活性作用物質供給源307を作動させることを交互に行う。減圧チャンバー304内の圧力は、変動してよい。別の態様では、真空ポンプ310によって実質的に一定圧力が維持され、活性作用物質供給源307は実質的に一定量の活性作用物質を、減圧環境にあるチャンバー304に提供する。いくつかの態様では、真空ポンプ310によって実質的に一定圧力が維持され、活性作用物質の量は周期的に変化する。他の態様では、減圧チャンバー304内の圧力は、真空ポンプ310によって変動させられ、供給源307から供給される活性作用物質の量も変動する。真空ポンプ310およびその結果のチャンバー304内の圧力、または供給源307から供給される活性作用物質の量のどちらかの変動は、周期的であってもなくてもよい。
【０３６９】
システム300を用いて実施できる本発明の態様の他の方法が図6に描かれている。チャンバー304は、被験体302の処置領域の上に配置される(ブロック402)。圧力は、室内304で真空ポンプ310によって下げられる(ブロック404)。活性作用物質供給源307から所定量の活性作用物質がチャンバーに加えられる(ブロック406)。図6の方法は、図4のシステム300に関して記載されているが、任意の好適システムまたは装置を用いて図6の段階を実施できることを理解しなければならない。例えば、排出口308bは省くことができ、作用物質を単一の注入口308aからチャンバー304に加えることもできる。他の気体も、例えば単一の注入口を用いるか、または活性作用物質供給源307および注入口308aおよび排出口308bに関して描かれているように一つの注入口および一つの排出口を用いて、チャンバー304に加えることもできる。いくつかの態様では、例えば米国特許第5,636,643号に記載されているように、ポンプ310とチャンバー304の間に、処置領域からの噴出物を収集するための追加の収集容器が真空ポンプに取り付けられる。
【０３７０】
いくつかの態様では、図7Aに描かれているような、陰圧気体送達システム500は、容器502内に、注入口506を介して、導管508によってドレープ504に連結している活性酸素アンタゴニスト供給源を含む。ドレープは、組織部位510に対して密閉エンベロープを形成し、組織部位は創傷部位でもよい。いくつかの態様では、ドレープは陰圧供給源514と、導管516を介して連絡している排出口512を有する。いくつかの態様では、廃棄物キャニスター518が排出口と陰圧供給源の間の連絡内に存在しており、キャニスターは取り外し可能な廃棄物キャニスターでよい。いくつかの態様では、戻り排出口520が導管522を介して容器502と連結している。いくつかの態様では、図7Bに示すように、容器502とドレープ504の間の連絡内に気化器524が置かれている。
【０３７１】
導管は可撓性でよく、ホースの材料などのプラスチックが好適である。陰圧供給源514は、真空ポンプが好適であり、いくつかの態様では、当技術分野で公知のように、排液を容易にするために導管516を介して排出口512に流体連絡している。いくつかの態様では、廃物キャニスター518は真空下に置かれて、流体連絡を通して排液を収集する。好ましくは、キャニスター内に吸引された排液からの汚染を防止するために、キャニスターと陰圧供給源の間にフィルター(未表示)を挿入できるが、このフィルターは疎水性のメンブレンフィルターでよい。いくつかの態様では、ドレープ504はエラストマー性材料を含んでおり、そのため陰圧供給源が間欠的に運転される間の組織部位領域の圧力変化に適応できる。いくつかの態様では、ドレープの外周は、組織部位を覆ってドレープを密封するために粘着剤で覆われており、それはアクリル系接着剤でよい。
【０３７２】
図4および図7A〜Bに描かれている陰圧気体送達システム300および500は、処置対象となる様々な領域の処置、特に創傷を処置するのに有用である。システム300を用いて処置できる創傷には、感染した開放創傷、褥瘡、裂傷、中間層熱傷、およびフラップまたはグラフトが取り付けられた各種傷害が含まれる。創傷の処置は、先に示し説明した気体送達システムを処置部位に固定し、減圧チャンバー304内を実質的に連続的または周期的な減圧状態に維持し、所望する改善状態に創傷が達するまで、実質的に連続的または周期的な様式でチャンバー304に活性作用物質を供給することによって実施できる。選択された改善状態としては、フラップまたはグラフトの付着にとって十分な肉芽組織の形成、創傷内の微生物感染の低下、熱傷貫通の停止または逆行、創傷の閉鎖、フラップまたはグラフトの下部創傷組織との統合、創傷の完治、またはあるタイプの創傷または複合創傷にとって適切な改善または治癒の他の段階が挙げられる。気体送達システムは、処置中、特に創傷の上または中にスクリーンを組み入れた気体送達システムを使用する場合、48時間周期のように周期的に変えることができる。この方法は、0.01〜0.99大気圧の陰圧または減圧を用いて実施できるか、または方法は0.5〜0.8大気圧の範囲の陰圧または減圧を用いて実施できる。創傷に方法を使用する長さは、少なくとも12時間でよいが、例えば一日またはそれ以上に延長できる。方法の使用がもはや有益でない上限は存在しない；方法は、創傷が実際に閉鎖する時間まで閉鎖速度を上げることができる。各種タイプ創傷の十分な処置は、大気圧より約2〜7インチHg低い圧に等しい減圧を用いて得ることができる。
【０３７３】
上記のように、間欠的または周期的な様態の気体送達システムへの減圧の供給は、活性作用物質存在下での創傷の処置にとって有益であり得る。気体送達システムへの低圧の間欠的または周期的な供給は、真空システムの手動または自動制御によって達成できる。間欠的な減圧処置での周期比、「オフ」時間に対する「オン」時間の比率は、1：10ほど低くとも10：1ほど高くともよい。典型的な比率は、おおよそ1：1であり、通常は5分間の減圧の供給と停止が交互に実施される。
【０３７４】
好適な真空システムは、少なくとも0.1ポンド、または3ポンド吸引まで、または14ポンドまでの吸引を創傷に加えることができる吸引ポンプを含む。ポンプは、必要な吸引を提供できる医療目的に適した任意の普通の吸引ポンプでよい。ポンプと低圧器具を相互に連結するチューブの寸法は、作業に求められる吸引レベルを提供するポンプの能力によって調整される。直径が1/4インチのチューブが好適であり得る。
【０３７５】
本発明の態様は、損傷組織を処置する方法も含み、方法は陰圧を創傷に加える段階、および創傷内の細菌密度を下げるのに十分である選択した時間および選択した量、活性作用物質を作用させる段階を含む。開放創傷は、ほぼ常に有害な細菌で汚染されている。一般に、105個／組織グラムの細菌密度を感染と見なす。このレベルの感染では、移植された組織は創傷に接着しないことが、一般に受け入れられている。これらの細菌は、創傷部での、ヒトの自然な免疫反応またはいくつかの外的方法のいずれかによって、創傷が閉鎖する前に殺さなければならない。創傷への陰圧および活性作用物質の使用は、創傷の細菌密度を下げる。この効果は、細菌の陰圧環境への不適合性、または作用物質への曝露と組み合わさり、創傷領域への血流が増加し、血液が創傷に細菌を破壊する細胞および酵素を運ぶためと信じられている。本発明の態様による方法を用いて、創傷の細菌密度を少なくとも半減させることができる。いくつかの態様では、それを用いて、細菌密度を少なくとも1,000倍、または少なくとも1,000,000倍まで減らすことができる。
【０３７６】
本発明の態様は、火傷を処置する方法も含み、該方法は、陰圧および活性作用物質を、火傷が拡がる領域に全層火傷の形成を阻止するために所定の減圧および十分な時間で適用する段階を含む。表面層が死滅し、その下部組織がスタシス状態にある中間層火傷は、しばしば重症の感染を起こし、24〜48時間以内に全ての上皮構造が破壊される全層性火傷に移行する。陰圧およびある量の活性作用物質を創傷に作用させることで、感染が重症化して下部上皮構造が破壊されるのを防ぐことができる。加える圧の強さ、パターン、および期間は、個々の創傷に応じて変えることができる。
【０３７７】
本発明の態様は、生組織を創傷にまず結合して創傷−組織複合体を形成する段階、次に複合体に向かう上皮および皮下組織の移動を促進するのに十分なように、選択した強さの陰圧または減圧およびある量の活性作用物質を領域上の創傷−組織複合体に加え、陰圧および活性作用物質への曝露を、創傷の閉鎖を促進するのに十分な選択した時間維持する段階を含む、生組織の創傷への接着を高める方法も含む。創傷への生組織の付着は、多くの形態を取ることができる一般的な作業である。例えば、一つの一般的技術は、創傷に隣接する領域から皮膚組織を3面について剥離し、第4面は付着した状態で残した状態で創傷の上に移動する、「フラップ」を用いる技術である。別の頻繁に用いられる技術は、皮膚を別の皮膚表面から完全に剥離し、創傷の上に移植する開放皮膚グラフトである。創傷−グラフト複合体への陰圧および活性作用物質の使用は、複合体内の細菌密度を下げ、創傷への血流を改善し、それによって移植された皮膚の付着を向上させる。
【０３７８】
3．一つまたは複数の気体の連続的または同時投与
先に記述したように、本発明の一定の態様は、被験体などの生物物体に、一つまたは複数の気体を投与する段階を含む。記述したように、投与される気体は、完全に一つもしくは複数の活性物質で構成されてもよく、または少なくとも一つの活性物質の担体気体であってもよい。本明細書に記述の方法は、被験体などの生物物体に、一つまたは複数のそのような気体を提供するさらなる手段を提供する。
【０３７９】
一定の態様において、被験体などの生物物体に対する一つまたは複数の気体の自動投与が企図される。一つまたは複数の気体のそのような自動投与のための方法および装置は当業者に周知である。例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,692,497号、同6,109,260号、同6,164,276号、および同6,962,154号；ならびに米国特許出願第2005/0217667号を参照されたい。そのような自動気体送達装置、本明細書において用いられる「気体混合器」（気体ミキサーとも呼ばれる）はまた、手動で操作することができる。自動制御の方法には、例えばそれによって気体送達プログラムをユーザーが装置に入力してもよいプログラム可能な機構が含まれる。気体混合器は当業者に周知である。例えば、Columbus Instruments（Columbus, OH）Pegas 4000MF気体ミキサー；Kojuma Instruments（Tokyo, Japan）Kofloc気体混合器シリーズモデル3610；その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,887,611号および同6,857,443号を参照されたい。
【０３８０】
ヒト被験体に対する一つもしくは複数の気体または気体混合物の自動送達のために用いられる可能性がある顔／鼻マスクは、当業者に公知である。例えば、そのそれぞれの全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,354,488号および同5,474,060号は、そのようなマスクを記述する。
【０３８１】
I. 他の器具
本発明のある態様では、外傷を受けるかまたは受けた患者を処置するために、本発明の方法に患者の中心体温を外から操作する能力を補うことが望まれる。これに関して、患者の中心体温は、本発明の方法と組み合わせて、侵襲的または非侵襲的経路によって操作できる。中心体温を操作するための侵襲的方法としては、例えば、患者の血液を加熱または冷却して患者の中心体温を上げるかまたは冷やす心肺ポンプの使用が挙げられる。中心体温を操作する非侵襲的経路は、患者の内部または外部に熱を送るシステムおよび器具が挙げられる。
【０３８２】
J. さらなる送達装置または器具
いくつかの態様では、方法または組成物は、特殊な送達装置または器具を含むことが企図される。本明細書で論ずる任意の方法は、本明細書に論じられている装置を含むが、これに限定されない送達または投与のための任意の装置を用いて実行できる。
【０３８３】
本発明の活性化合物の局所投与の場合、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等、当技術分野において周知のものに調合できる。全身用製剤としては、注射または注入による投与、例えば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹膜内注射、ならびに経皮、経粘膜、口腔、または肺投与に合わせてデザインされたものが挙げられる。
【０３８４】
経口投与の場合は、本発明の活性化合物は、処置を受ける患者が経口摂取するための錠剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等、または例えば懸濁液、エリキシル、および溶液などの液体製剤に調合される。
【０３８５】
口腔投与の場合、組成物は、通常の様式で調合された錠剤、ロゼンジ等の形を取ることができる。他の粘膜内送達は、坐薬によってまたは鼻腔内に実施される。
【０３８６】
吸入による肺への直接投与の場合、本発明の化合物は、様々な装置によって肺に都合良く送ることができる。例として次のものがある。
【０３８７】
定量吸入器 (MDI)：好適な低沸点発射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素を含むキャニスターを利用する定量吸入器(「MDI」)か、またはその他好適な気体を用いて本発明の化合物を肺に直接送ることができる。MDI装置は、3M Corporation (例えば、www.3m.com/us/healthcare/manufacturers/dds/pdf/idd_valve_canister_brochure.pdf-)、AventisのNasacort(例えばwww.products.sanofi-aventis.us/ Nasacort_HFA/nasacort_HFA.html - 63k -)、Boehringer Ingelheim(例えばwww.boehringer-ingelheim.com/corporate/home/download/r_and_d2003.pdf)、Forest LaboratoriesのAerobid(例えばwww.frx.com/products/aerobid.aspx)、Glaxo-Wellcome(例えば、www.gsk.com/research/newmedicines/newmedicines_pharma.html)、およびSchering Plough (www.shering-plough.com/schering_plough/pc/allergy_respiratory.jsp)などの多くの供給元から入手できる。
【０３８８】
乾燥粉末吸入器(DPI)：DPI装置は、典型的には、ガスの爆発などのメカニズムを用いて容器内に乾燥粉末雲を創出して、次に患者がそれを吸入する。DPI装置も当技術分野で既知であり、例えばSchering CorporationのForadilアエロライザー(例えば、www.spfiles.com/piforadil.pdf)、Glaxo-WellcomのAdvair Diskus (例えば、www.us.gsk.com/products/assets/us_advair.pdf-)が挙げられる。普及している変形は、一回を超える治療用量を送達できる複数回用量DPI(「MDDPI」)である。MDDPI装置は、AstraZenecaのPulmicort Tubuhaler(例えばwww.twistclickinhale.com/GlaxoWellcomem、(例えば、www.us.gsk.com/products/assets/us_advair.pdf-)およびSchering Plough (例えば、www.shering-plough.com/schering_plough/pc/allergy_respiratory.jsp)などの会社から入手できる。このような装置、または本明細書で論ずるその他の装置は、単回使用に変更できることがさらに企図される。
【０３８９】
電磁流体力学(EHD)エアゾール送達：EHDエアゾール装置は、電気エネルギーを用いて薬液溶液または懸濁液をエアゾール化する(例えばNoakes et al.,米国特許第4,765,539号；Coffee、米国特許第4,962,885号；Coffee、PCT出願、WO94/12285；Coffee、PCT出願、WO94/14543；Coffee、PCT出願、WO95/26234；Coffee、PCT出願、WO95/26235；Coffee、PCT出願、WO95/32807を参照)。EHDエアゾール装置は、既存の肺送達技術に比べ、肺へより効率的に薬物を送ることができる。
【０３９０】
噴霧器：噴霧器は、例えば超音波エネルギーを用いて液薬製剤からエアゾールを創り、容易に吸入できる微粒子を形成する。噴霧器の例としては、Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltdから供給されている装置 (例えば、米国特許第5,954,047号；米国特許第5,950,619号；米国特許第5,970,974号を参照)、およびAventisのIntal噴霧器溶液(例えば、www.fda.gov/medwatch/SAFETY/2004/feb_PI/Intal_Nebulizer_PI/pdf)が挙げられる。
【０３９１】
吸入による肺への気体の直接投与については、酸素送達の市場では現在様々な送達方法を用いることができる。例えば、アンビューバッグなどの呼吸回復装置が用いることができる(例えば米国特許第5,988,162号および第4,790,327号を参照)。アンビューバッグは、フェイスマスクに取り付けられた柔軟な圧搾バッグ(squeeze bag)から成り、治療者による負傷者の肺への空気／気体の送り込みに用いられる。
【０３９２】
携帯用の手で持てる医薬送達装置は、呼吸器病を患う患者が噴霧器を通して吸入するのに適した噴霧化された作用物質を生成できる。加えて、このような送達システムは、吸入された作用物質の用量を遠隔的にモニタリングすることができ、必要に応じて、治療者または医師により変更できる。米国特許第7,013,894号を参照されたい。本発明の化合物の送達は、ヒトの換気のモニタリングと組み合わせたヒトに補助気体を送るための方法により達成でき、両方法は米国特許第6,938,619号に記載されているような密封フェイスマスクを使用せずに達成される。患者の呼気の前半部分だけが酸素または他の治療気体を含むような呼吸治療中に用いられる、酸素または他の気体を効率的に分配するための空気式酸素節約装置(米国特許第6,484,721号参照)。患者が吸入を開始した時に発射される気体送達装置が用いられる。気体流の後半は、患者への気体送達の脈動を阻止するタイミングで初期吸入後に患者に送られる。このようにして、気体は吸入の前半中に患者に送られ、患者の肺に至る空気通過路を満たす気体しか送られない事態は防止される。酸素を効率的に使用することによって、患者が移動する際に用いられる酸素のシリンダボトルは長持ちし、より小型になり、運搬しやすくなり得る。空気圧を用いて気体を患者に送るため、電池または電子装置は用いられない。
【０３９３】
気体を送達する電子手段も同様に企図される。電子的に制御されたまたはプログラムされた方法によって一つまたは複数の活性産物の少なくとも一つの気体運搬粒子の用量を供給するための噴霧器、装置および方法は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,560,353号において記述される。
【０３９４】
本明細書に記載される全ての装置は、本発明の化合物を結合または噴霧化する排気システムを有してよい。
【０３９５】
本発明の化合物の経皮投与は、患者の皮膚に貼る薬の入った装置またはパッチによって達成できる。パッチは、パッチ内に含まれる薬効化合物を、皮膚層を通して患者の血流内に吸収できるようにする。このようなパッチは、Nicoderm CQパッチとしてGlaxo Smithkline (www.nicodermcq/NicodermCQ.aspx ＼)およびOrtho-McNeil PharmaceuticalsからOrtho Evraとして(www.ortho-mcneilpharmaceutical.com/healthinfo/womenshealth/products/orthoevra.html)販売されている。経皮薬物送達は、薬物注射および静脈内薬物投与に伴う疼痛だけでなくこれら技術に伴う感染リスクも下げる。経皮薬物送達は、投与された薬物の胃腸管代謝も回避し、肝臓による薬物排除を減らし、投与された薬物の持続的放出を提供する。経皮薬物送達は、比較的投与が容易であり、かつ薬物が持続的に放出されることから、薬物レジメンについての患者のコンプライアンスも高める。
【０３９６】
パッチの別の変更として、パッチ内に蓄えられた医薬の送達を実施し、超音波薬物送達プロセスと一緒に用いられる、パッチの中を超音波が伝導できるようにする材料を用いてデザインされた超音波パッチがある(例えば米国特許第6,908,488号を参照されたい)。パッチインボトル(Patch in a bottle )(米国特許第6,958,154号)は、流体として表面に用いられるが、その後乾燥して、宿主の表面上にパッチなどの被覆要素を形成する流体組成物、例えばいくつかの態様ではエアゾールスプレーを含む。こうして形成された被覆要素は、ベタつきのない外面被覆およびパッチの基体への接着を助ける下部粘着面を有する。
【０３９７】
別の薬物送達システムは、一つまたは複数の球状半導体集合体を含み、リザーバーに貯蔵された薬物の放出を促進する。第1集合体は、感知およびメモリーに用いられ、第2集合体は、薬物のポンプ注入および分配などの制御局面に用いられる。システムは、遠隔制御システムと通信できるか、または患者の要求に基づいて薬物を送達するために局所電源とは無関係に長期間運転でき、システムによる制御の下に定期的放出ができ、または測定されたマーカーにしたがって送達できる。例えば米国特許第6,464,687号を参照されたい。
【０３９８】
PUMPSおよび注入装置：注入ポンプまたは潅流装置は、流体、薬剤、または栄養物を患者の循環系に注入する。注入ポンプは、流体を高信頼性かつ安価に投与できる。例えば、それらは1時間当たり0.1mLなどの少量(点滴には少な過ぎる)を投与し、毎分注射し、患者の要求により、最大の時間当たり回数まで繰り返しボーラスを注射し(患者制御無痛覚)、または時刻に合わせて流体の容積を変えることができる。様々なタイプの注入装置が、以下の米国特許庁への特許出願に記載されている。これらは、米国特許第7,029,455号、米国特許第6,805,693号、米国特許第6,800,096号、米国特許第6,764,472号、米国特許第6,742,992号、米国特許第6,589,229号、米国特許第6,626,329号、米国特許第6,355,019号、米国特許第6,328,712号、米国特許第6,213,738号、米国特許第6,213,723号、米国特許第6,195,887号、米国特許第6,123,524号および米国特許第7,022,107号を含むが、これらに限定されない。これに加えて、注入ポンプは、Baxter International Inc. (www.baxter.com/products/medication_management/infusion_pumps/)、Alaris Medical Systems(www.alarismed.com/products/infusion.shtml)、およびB Braun Medical Inc. (www.bbraunusa.com/index.cfm?uuid=001AA837D0B759A1E34666434FF604ED)からも入手できる。
【０３９９】
酸素／気体ボーラス送達装置：このような、気体を慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者に送るための装置は、Tyco Healthcare (www.tycohealth-ece.com/files/d0004/ty_zt7ph2.pdf)から入手できる。それはまた、本発明の化合物の送達にも用いることができる。上記装置は、経済的で、軽量で、目立たず、かつ携帯可能である。
【０４００】
「パッチインボトル」 (米国特許第6,958,154号)は、流体組成物、例えばいくつかの態様では、流体として表面に用いられるが、続いて乾燥してパッチのように宿主の表面に被覆要素を形成するエアゾールスプレーを含む。こうして形成された被覆要素は、ベタつきのない外面被覆およびパッチの基体への接着を助ける下部粘着面を有する。
【０４０１】
埋め込み可能薬物送達システム：別の薬物送達システムは、一つまたは複数の球状半導体集合体を含み、リザーバーに貯蔵された薬物の放出を促進する。第1集合体は、感知およびメモリーに用いられ、第2集合体は、薬物のポンプ注入および分配などの制御に用いられる。システムは、遠隔制御システムと通信できるか、または患者の要求に基づいて薬物を送達するために局所電源とは無関係に長期間運転でき、システムによる制御の下で持続放出ができ、または測定されたマーカーにしたがって送達できる。米国特許第6,464,687号を参照されたい。
【０４０２】
本節の中で論じた引用特許およびウェブサイトアドレスのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０４０３】
VI. 併用治療
本発明の化合物および方法は、多くの治療および診断応用の中で用いることができる。酸素アンタゴニストなどの本発明の組成物を用いた処置の効果を上げるために、これら組成物を問題の疾患および状態の処置(二次治療)に有効な他の作用物質と組み合わせることが望ましいことがある。例えば、出血性ショックの処置は、以下の一つまたは複数を伴ってもよい：動脈圧を増加させて心拍出量を増加させる物質（例えば、ドーパミン、ドブタミン、ノルエピネフリン）；血管拡張剤または収縮剤；コルチコステロイド；抗生物質；モルヒネ；および血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ（SK）、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、ラノテプラーゼ、およびスタフィロキナーゼ）。
【０４０４】
様々な組み合わせを利用してもよく、例えば、H2Sなどの酸素アンタゴニストは「A」であり、二次治療薬は「B」である。
2009534422.tif 000021
【０４０５】
本発明の活性化合物の生物物体への投与は、存在する場合には、他の活性化合物処置の毒性を考慮しながら、具体的な二次治療の投与に関する一般的なプロトコールに従うと考えられる。処置サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予想される。様々な標準的な治療ならびに手術介入が記載の治療と組み合わせて利用できることも企図される。
【０４０６】
VII. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すために含める。当業者は、以下の実施例に開示する本発明者により発見された技術が、本発明の実行に上手く機能し、それゆえ、本発明をその好ましいモードを構成し得ることを理解するであろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施態様に多数の変更を行うことができ、なお、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、類似のまたは同様の結果が得られることを理解するであろう。
【０４０７】
実施例1
硫化水素は致死的出血から保護する
H2S処置を用いて、虚血性低酸素症のより臨床的に関連する急性傷害モデルに関連する病的状態および／または組織損傷を低減させることができるか否かを決定するために、ラットを、組織に対する酸素供給を低減させてそれによって死亡させる、制御された致死的出血の際にH2Sによって処置した（Blackstone et al., 2005）。本試験において、H2Sによって処置したラットは、致死性の失血から生存して、完全に回復した。
【０４０８】
ラットを制御された致死性の出血（60％の出血）の際にH2Sによって処置した。カテーテルを外科的に埋め込み、回復した後、意識のある動物から血液を40分間除去した。出血開始の20分後（即ち、30％失血後）に、室内の空気と混合した少量（300 ppm）のH2Sを、処置動物に投与した。出血の終了時、H2Sを含まない室内の空気に動物を戻した。出血終了の3時間後に、生存している動物に、出血量の乳酸リンゲル液を静脈内投与した。
【０４０９】
H2S処置ラットの大部分（6/7匹）が出血および3時間のショック期間から生存して、完全に回復した（表1）。これらの生存ラットはいずれも、回復後、行動学的または機能的欠損を示さなかった。H2S処置動物1匹が出血終了後174分に死亡した。無処置動物は全て出血終了後82分以内に死亡した；無処置動物の平均生存期間は、35±26分であった。両側のフィッシャー正確率T-検定を用いたところ、p値は0.0047である。
【０４１０】
出血の最初の20分間（30％失血の前）に、ラットは、失血による酸素運搬能の減少を代償するために呼吸数および1回換気量が増加した。この換気の増加によって、呼吸二酸化炭素産生（VCO2）の減少が起こった（表1）。60％失血後、H2S処置および無処置動物はいずれもVCO2の減少を示した。動脈血乳酸塩は増加したが、pCO2、重炭酸塩（[HCO3-]）、pH、および塩基過剰は減少した（表1）。このように、出血によって、呼吸代償を伴う代謝アシドーシスが起こった。しかし、H2S処置ラットでは、これらの変化は代謝アシドーシスの減少を表す程度がより小さかった。さらに、H2S処置動物において、VCO2は、出血後減少し続けなかった。無処置動物において、VCO2は、動物が呼吸を停止するまで着実に減少した。H2S投与は、ショック反応が死へと進行することを防止するようである。
【０４１１】
（表１）H2Sを用いたラット出血モデルの生存および生理学
2009534422.tif 000022
【０４１２】
実施例2
出血の際の硫化水素に対する短期間曝露の利点
体重275〜350 gの雄性Sprague Dawleyラットを、各実験の1週間前にCharles River Laboratoriesから購入した。実験当日に、カテーテルを右大腿動脈および静脈に外科的に埋め込んだ。カテーテルを肩甲骨の後で出した。
【０４１３】
ラットに、ブプレノルフィンを投与して、回復させた。ヘパリン80〜100単位を静脈内に投与した。意識のある非拘束ラットを、ガラスの蓋付きの2.75 Lの晶化皿に入れた。室内の空気、硫化水素を有する室内の空気（試験動物）、および窒素を含有する室内の空気（対照動物）を、熱式質量流制御機器（Sierra Instruments）を用いて3 L/分で供給した。カテーテル、温度プローブ、および気体サンプリングチューブを、蓋の中央部に開けた穴から通した。温度はほぼ等温（27±2℃）で維持した。
【０４１４】
蠕動ポンプによって、40分以内に出血が完了するような速度で血液を除去した。以下の等式：（0.06×体重）＋0.77（Lee et al. 1985）を用いて血液量を計算した。除去後、血液の重量を測定した。H2Sの原料タンク（窒素によって平衡にした20,000 ppm）はByrne Specialty Gasから購入した。硫化水素を、熱式質量流制御機器を用いて室内の空気によって濃度2000 ppmに希釈して、動物に3 L/分で送達した。
【０４１５】
一定速度出血試験の20分後（中間点）に、動物を2000 ppm硫化水素を含む室内の空気に曝露した。曝露は、動物が無呼吸およびジストニーを示した場合に終了した。曝露の長さは1〜2分であった。チャンバーにおける最高濃度は1000〜1500 ppmであると推定された。無呼吸およびジストニーが観察されると直ちに動物を室内の空気に曝露した。動物は20〜30秒以内に規則正しい呼吸パターンを回復した。対照動物を、硫化水素を含まない同条件に曝露した。対照動物は無呼吸またはジストニーを示さなかった。
【０４１６】
Licor Li7000を用いてCO2産生を測定することによって、代謝速度を決定した。温度およびCO2データは、ADI PowerLabを用いて収集した。動脈血の値は、I-Stat血液化学分析装置によって測定した。死亡までの時間は、動物が呼吸を停止して、CO2産生を中止した場合に宣告された。生存ラットに、出血終了の3時間後に乳酸リンゲルを自由に与えた。蘇生後、ラットを餌および水のあるきれいなケージに移して、30℃で約16時間収容した。カテーテルを外科的に除去して動物を30℃で数時間回復させた後、コロニーに戻した。SHIRPAプロトコール（Rogers et al., 1997）において記述される一連の検査から、行動および機能試験を選択した。
【０４１７】
これらの実験において、硫化水素動物8匹中7匹が処置から生存した。試験した対照動物の2匹はいずれも死亡した。
【０４１８】
予測的実施例3
ヒトにおける硫化水素の用量選択
硫化水素は、硫化水素溶液の気体様剤形の吸入または静脈内投与が含まれるがこれらに限定されるわけではない、多数の任意の投与剤形および投与経路によってスタシスを誘導するために動物またはヒトに投与することができる。スタシスを必要とする生物全体においてスタシスを誘導するために十分な硫化水素の投与剤形および投与経路を決定する方法を記述する。試験生物（例えば、ラット、イヌ、ブタ、サル）をボーラス投与、間欠投与、または連続投与のいずれかによって投与した硫化水素の増加濃度に曝露して、血液サンプル（0.5 mL）を採取する様々な時点で、中心体温、酸素消費、二酸化炭素産生、心拍数、血圧、呼吸数、血液pH、運動、および虚弱が含まれるがこれらに限定されるわけではない生理状態をモニターする。試験動物の血液由来血漿に存在する硫化水素濃度は、X誘導体化、Y抽出、ならびにガスクロマトグラフィーおよび質量分析を用いる定量が含まれるがこれらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の方法を用いて測定される。
【０４１９】
試験動物において特定の投与療法によって発生した硫化水素の定常状態血漿レベルを、試験動物における様々な程度のスタシスの達成と相関させることによって、試験動物においてスタシスを誘導するために十分な硫化水素の有効量を定義する。スタシスを必要とするヒトにおいてスタシスを誘導するために有効な用量は、スタシスが誘導された条件で試験動物において達成される場合と同じ硫化水素の定常状態血漿濃度をヒトにおいて達成する硫化水素の用量、投与経路、および投与療法を同定することによって決定される。ヒトにおいてスタシスを達成するための硫化水素の有効濃度は、投与剤形および投与経路に依存する。吸入の場合、いくつかの態様において、有効濃度は連続的に送達される50 ppm〜500 ppmの範囲である。静脈内投与の場合、いくつかの態様において、有効濃度は連続的に送達された0.5〜50 mg/kg体重の範囲である。
【０４２０】
それぞれの場合における範囲は、硫化水素の用量が増加すれば達成されるスタシスの程度が増加するという特徴を有する。院外心停止に遭った人ならびに蘇生および心拍再開後も意識がない人の中心体温を持続的に12〜24時間3〜5℃下落させて32〜34℃に維持するために十分な硫化水素の用量は、Bernard et al. 2002において記述されるように、硫化水素に曝露されない類似のヒトに対して有意な生存優位性を有すると予想される。
【０４２１】
実施例4
悪条件からの保護
A. マウスにおける低酸素耐性の向上
マウスが通常死亡する条件で、「冬眠様」状況のマウスの生存能力を試験する実験を実施した。悪条件は低酸素であり、文献では、マウス(C57BL6/J雄)が5%酸素で一般に20分間生存し得ることが記述されている。Zhang et al. 2004。
【０４２２】
表2に示すように、この実験では、マウスを80ppm (別に示さない限り)H2Sに指定時間曝露し、次に、H2S下にある間に、チャンバー内の酸素張力を低下させた。低酸素曝露を時間を定め(下に示す)、マウスの生存率を測定した。
【０４２３】
H2S (少なくとも80ppmの)に対するマウスの短時間の曝露は、低酸素からのマウスの保護にて成功率が低かったが、少なくとも1匹は、H2S中に8分間のみ曝露された後、低酸素を50分間生き延びた。さらに、90ppm H2Sに10分間のみ曝露したマウスは、最終的には死亡したが、5%酸素条件内でより長く生き延びることを観察した。
【０４２４】
マウスを80ppm H2Sにより長時間曝露すると、1時間まで、それらを低酸素から保護する強い効果があった。
【０４２５】
（表２）
2009534422.tif 000023
【０４２６】
B. ハエにおける無酸素耐性の向上
1. 背景
二酸化炭素(CO2)および硫化水素(H2S)の使用が、無酸素中の複雑な後生動物、キイロショウジョウバエの生存率を上昇させることを研究した。これらの実験は、これらの薬剤、特にH2Sが、成虫キイロショウジョウバエの無酸素耐性を増大させ得ることを示した。
【０４２７】
C.エレガンス胚は、仮死状態に入ることで無酸素(<10ppm O2)を生き延び、そして発達は、0.5% O2中で進行し得る。しかしながら、10倍の範囲(0.01〜0.1% O2)の致死的酸素濃度が存在する。よりさらに、胚において酸素利用を一酸化炭素で防止すれば、低酸素損傷を防止することができる。したがって、効率的な生物活性に利用し得る酸素が十分存在しなければ、幾分の酸素を有さない(または使用しない)方がよい。
【０４２８】
より複雑な後生動物では、細胞酸素濃度は、必ずしも環境酸素レベルと同一ではない。C.エレガンスでは、酸素は分散により組織に送達される。しかしながら、より高次の生物では、組織に輸送するために酸素に結合する、例えばヘモグロビンなどのタンパク質が存在する。したがって、環境酸素レベルが低下した際、細胞に残留酸素が存在し得る。
【０４２９】
ほとんどの生物は、無酸素環境への曝露を生き延びることができない。一つの可能性は、細胞レベルでの残留酸素が、C.エレガンス胚に観察された致死的酸素範囲内に対応する毒性を有することである。この筋書きにおいて、無酸素中での生存は、残留酸素が除去されるか、または利用不可能となれば向上するであろう。CO2は、ヘモグロビンからのO2の放出を促進し、H2Sは、酸化的リン酸化の強力な阻害剤である。
【０４３０】
2. 材料および方法
基礎的実験の設定
成虫のハエを、気密ゴム栓を備えたガラス製の35mL管(Balsh管)に導入した。これは、通常、ハエをCO2で麻酔し、ハエのグループを食物を備えたバイアルに移動して、少なくとも2時間回復させた後、該ハエをBalsh管内に移動することにより遂行される。Balsh管内の気体環境を交換するために、2個の18ゲージ針をゴム栓に挿入し、100mL/分の速度で、針内に気体を吹き込む。乾燥を防止するために、Balsch管に通す前に、水10mLを介して気体を泡立て入れることにより加湿した。実験の開始前に、バブラー内の水を気体で少なくとも20分間平衡化した。
【０４３１】
「ストップフロー」実験のために、管を封止する前に、気体交換を60分間進行させた。「低流量」実験のために、実験全体を通して、気体流を持続させた。CO2は、ハウス源(100%)に由来し、100%窒素(N2)で室内空気をフラッシュして出して、無酸素環境を確立した。雰囲気をCO2からN2に切り替える間、システム内へ室内空気が導入されるのを防ぐように注意した。
【０４３２】
無酸素処置後、ハウス空気を20分間フラッシュして、Balsh管内に酸素を再導入した。次に、ゴム栓を除去し、パラフィルムを有するBalsh管の頂部上にて食物バイアルを反転させた。動きが再開した場合、生きているとしてハエをスコアした。無酸素処置後、生存率を少なくとも18時間記録した。2週間後、食物バイアルが幼虫および／または蛹を含んでいた場合、ハエは繁殖力を有すると考慮した。
【０４３３】
3. 結果
無酸素曝露前のCO2による処置
成虫のハエは、最初にCO2で前処置された場合に、無酸素生存率がより高いことが示された。ストップフロー実験における19時間の無酸素曝露後、CO2で30分間または90分間前処置した成虫のハエは、各々54%または28%の生存率を示した。CO2前処置を伴わない、または続く無酸素曝露を伴わないCO2では、無酸素に曝露した対照には全く生存が観察されなかった。さらに、無酸素曝露の直後にCO2にも20分間曝露された場合、CO2前処置を伴う無酸素曝露を生き延びたハエは全く存在しなかった。
【０４３４】
CO2に対する短時間の曝露は、無酸素に対する生存率を十分高めた。22時間無酸素曝露を伴うストップフロー実験において、生き延びたハエの割合は、窒素雰囲気に切り替える前に、CO2が0.5〜5分間投与された場合に最高であった(図8)。したがって、続く実験のための標準的なプロトコールは、無酸素曝露前にCO2で10分間処置することであった。このプロトコールを用いた低流量実験において、6%の成虫ハエが20時間無酸素曝露を生き延び、この生存は、CO2前処置を必要とした。
【０４３５】
実験は、CO2処置と、N2環境の確立との間に、O2の再導入を防止することが重要であることを示唆した。空気の加湿に使用したバブラー内の水を、CO2をフラッシュして出す前に、N2と平衡化しなかった場合、N2を10、50、または100mL/分にて導入したいずれの場合のこれらの実験において、1匹のハエも13時間無酸素曝露を生き延びなかった。これらの条件下で、水中に溶解したO2から得られたN2/O2混合物で、CO2雰囲気をフラッシュして出した。
【０４３６】
一連の低流量実験を実施して、CO2曝露により耐え得る無酸素曝露の時間を、前処置を行わなかった場合と比較して、各条件を2回試験して決定した(図9)。これらのデータにおいて、CO2前処置が生存を非常に高める傾向がある。重要な補足として、これらの実験は、CO2処置の開始前に、ハエにCO2で麻酔をかけ、Balsh管に移動して10〜20分間のみ回復させる、標準的なプロトコールから逸脱している(試験2の18時間点を除く)。
【０４３７】
CO2による前処置が有益であるか否かの情報を提供しない、数種の他の実験を実施した。例えば、一実験において、10分間のCO2前処置時間を行う低流量実験では、17、22、および24時間の無酸素後に、生存は全く観察されなかった。しかしながら、他の実験では、17時間後に多数のハエが生き延びた。これは、ある場合に、例えば成虫の年齢、概日リズムまたは室温の変化等、他の因子が結果に影響することを示し得る。ストップフロー設定を、低流量設定と比較する他の一実験では、1匹のハエも17時間または19.5時間の無酸素曝露を生き延びず；しかしながら、この場合、ハエの死に、かび汚染が寄与していた可能性がある。
【０４３８】
無酸素曝露前のH2Sによる処置
前処置プロトコールにH2Sを含めると、成虫ハエが無酸素を生き延びる能力を、より劇的に向上させる。図9に示した実験と類似した一連の実験において、CO2前処置(H2S/CO2)に50ppm H2Sを追加すると、処置を生き延びたハエの割合が増大した(図10)。これらのハエは健康に見え、曝露後に子孫を産出した。しかしながら、同様の実験にて、H2S/CO2中で10分間後、18、20、25、または30時間の無酸素を生き延びたハエは全く存在しなかった。この矛盾の原因は、明らかでない。H2S処置の有益な影響と一致して、15時間の無酸素曝露後、H2Sで前処置したハエの50%が生き延びたが、一方、H2Sに曝露しなかった対照のハエは全く回復しなかった。この実験において、ハエは、低流量実験の継続期間中、CO2で10分間処置された後、H2S/CO2で10分間処置され、次にN2/H2Sで10分間処置され、最後にN2で処置された。
【０４３９】
無酸素での生存率のH2S依存的な上昇に、CO2処置は必要としない。18.5時間無酸素にされる前に、50ppm H2S室内空気中で処置したハエの25%が生き延びた。生き延びたハエの割合は、無酸素環境の確立前にH2S/CO2への10分間の曝露が追加されても影響を受けなかった。ハエを無酸素曝露前にCOのみで10分間処置する対照実験では、ハエの11%のみが回復した。
【０４４０】
H2Sの投与時間が無酸素での生存の向上に重要であるようだ。CO2前処置中にH2Sが存在するか否かに関わらず、H2Sが無酸素曝露(20時間)中を通して存在する場合、ハエは全く回復しない。しかしながら、CO2前処置中に50ppm H2Sが存在し、続く無酸素環境を確立する際に除去された場合、35%のハエが生き延びる。平行実験において、CO2 (H2Sはなし)を用いた10分間の前処置後、無酸素に曝露したハエの6%が生き延びた。
【０４４１】
幼虫および胚を用いた予備実験
COと、COおよびH2Sとを用いた処置後の、無酸素での生存の向上は、胚および幼虫にも観察される。無酸素に24時間曝露後、0〜19時間齢の胚のプールから7匹の蛹が形成された。しかしながら、CO2で10分間前処置した同等のプールからは、20匹の蛹が観察された。同様に、無酸素に24.5時間曝露した幼虫は、それらがCO2またはH2S/CO2で前処置された場合にのみ、再酸素化により動きを再開し得る。CO2またはH2S/CO2のいずれかで前処置した0〜24時間齢の胚は、18.5時間無酸素曝露を生き延び、成虫まで発達する。
【０４４２】
無酸素中の低温処置
環境温度の低下は、成虫ハエが無酸素曝露を生き延び得る時間の長さを延長し得る。室温では、ストップフロー設定において15.5時間の無酸素曝露を生き延びたハエは全く存在しなかったが、無酸素中に4℃に保ったハエの20%は回復した。同様に4℃の無酸素に遷移し、次に室温に移動して16.5時間のハエは、全く生き延びなかった。しかしながら、16.5時間後、および40時間後でさえも、完全曝露中に4℃に保たれたハエは、回復し、繁殖力を有した。無酸素環境確立前のCO2による前処置は、これらの実験において、顕著な相違を有さなかった。
【０４４３】
実施例5
活性化合物および低酸素状態を用いた動物試験
実施例4に示した試験は、H2Sによる雄C57BL/6マウスの前処置および連続的な処置が、5%酸素または4%酸素の低酸素状態下で生存する能力を向上させ得ることを示した。
【０４４４】
低酸素状態下での生存能に関するH2S前処置単独の効果を測定するために(低酸素中の連続的なH2S曝露を行わず)、マウスを、5% O2 (5%)、4% O2 (4%)、1時間5% O2の次に4% O2 (4%+1時間5%)、または1時間5% O2の次に3% O2 (3%+1時間5%)に曝露する前に、室内空気(PTなし)に30分間、または室内空気10分間の次に室内空気(PT)中150ppm H2Sに20分間のいずれかに曝露し、その生存時間を測定した。実験は60分間で停止し、なお生存する動物を、それらのケージに戻した。図11に示すように、室内空気中150ppm H2Sに20分間予め曝露した動物集団中の全マウスは、続く5% O2への曝露を生き延びたが、一方、室内空気単独に曝露した全対照動物は、5% O2に曝露した15分間以内に死亡した。したがって、マウスをH2Sへ予め曝露することは、さもなくば致死的な低酸素における生存を延長させる、マウスの生理学的状態を確立する。H2S前処置マウスに観察された保護は、5% O2中での生存能が2倍のみ延長した(Zhang et al. 2004)、文献に報告されている全身低酸素プレコンディショニングの公知の保護効果をはるかに越える。図11に示していないが、数匹のH2S前処置マウスは、5% O2中で4時間を越えて生き延びることでき、動きまたは挙動に顕著な欠陥を有さずに回復できた。
【０４４５】
H2S前処置がさらにより低い酸素張力に対する生存能を向上させることを測定するために、マウスをより低いO2濃度に曝露した。図12に示すように、H2S前処置は、5% O2の存在下、生存率を多大に向上させる。対照的に、H2S前処置は、4% O2の存在下、生存率をわずかに増加した。しかしながら、H2S前処置したマウスが段階的に低下するO2レベルに曝露された場合、例えば最初に前処置した後、5% O2に1時間曝露し、次に4% O2または3% O2のいずれかに曝露した場合、マウスの生存時間は、H2S前処置に続いて5% O2に曝露した場合に観察されたものと同じレベルに延長した(図13)。したがって、H2Sに前曝露することにより、80%を越える酸素張力の段階的な低下(21%正常酸素圧が3% O2に低下)を生き延び得る生理学的状態が確立される。さらに、数個の実験において、H2S前処置後の酸素張力の段階的な低下により、マウスが2.5%もの低い酸素張力を1時間生き延び得ることが示された。
【０４４６】
これらのおよび実施例4で示したデータは、H2Sに対する曝露が、さもなくば致死的な低酸素中での生存が非常に向上される薬理作用を有することを示す。この文脈において、H2Sの薬理作用は、当業者が、致死的低酸素に対する最適な生存能を達成するよう変更することができるパラメータである、H2Sの用量レベルおよび曝露の持続時間に依存する。当業者は、哺乳動物において、投与経路(例、吸入対非経口投与)もまた、致死的低酸素に対する耐性の所望の効果を達成するよう変更し得ることを理解するであろう。加えて、薬理作用は、H2S曝露が前処置に限定され、または低酸素期間内に延長された場合のいずれにおいても観察し得る。同様に、致死的低酸素の開始に関するH2Sへの曝露のタイミングは、生存能の向上を最大にするために変更し得る。これらのデータは、活性化合物、例えば酸素アンタゴニストを用いた前処置の結果としての酸素要求の低下が、さもなくば動物に致命的である低下した酸素供給で生存することを可能にする仮説と一致する。
【０４４７】
H2S処置により得られた、致死的低酸素に対する生存能向上の開始時に生じる代謝の変化を特徴付けるために、H2Sへの曝露中と、その後のH2S処置終了に続く5% O2に対する曝露中の、マウスによるCO2生産を測定した。図14に、CO2生産の変化を示す。5% O2または4% O2のいずれかへの移行によるCO2生産の変化は、室内空気に30分間(PTなし)または室内空気に10分間のいずれか曝露した後、150ppm H2Sに20分間(PT)曝露したマウスで測定した。加えて、5% O2への段階的な移行にて1時間と、続く4% O2におけるCO2生産の変化を測定した。これらの実験の結果を、図15に提供する。
【０４４８】
CO2生産は、H2S前処置の最初の5〜10分間で約2〜3倍低下し、室内空気中150ppm H2Sによる20分間前処置中に、マウスにスタシスが誘導されたことが示唆される。しかしながら、動物のO2消費および中心体温は、H2S前処置中有意に変化せず、H2S曝露中に、マウスに致死的低酸素に対する生存能を向上させるスタシス以外の生理学的状態が確立し得ることが示唆される。そのような状態は、スタシスに定義された大きさ未満の、生物物質の代謝の低下の大きさにより特徴付けられ得る。活性化合物を用いてスタシスを達成するために、生物物体は、生物物体における酸素消費およびCO2生産が2倍未満に低下される、段階的代謝低下状態を遷移する必要がある。代謝または細胞呼吸が活性化合物により2倍未満の程度に低下されるこのような連続体は、「プレスタシス」の状態として説明される。図14に示すH2S前処置終了後のCO2生産と、致死的低酸素誘導の連続的監視は、CO2生産の約50倍の低下を示し、致死的低酸素に対する曝露中に、スタシスが達成されていることが示される。致死的低酸素に対する曝露中のマウスの付随するO2消費の低下および運動性の強い源弱は、致死的低酸素に対する曝露中に、続いてスタシスが達成されていることの観察をさらに支持する。
【０４４９】
H2S前処置後の、または前処置を行わない後の、5% O2または4% O2のいずれかの低酸素状態への移行に関連したCO2生産の変化を測定した。図13に示すように、H2S前処置の不在下で5% O2に曝露した、またはH2S前処置の存在下で4% O2に曝露したマウスは、CO2生産が実質的に低下した。対照的に、H2S前処置し、続いて5% O2、または5% O2それに続く4% O2のいずれかに曝露したマウスは、H2S前処置後の新たなベースラインレベルと比較して、CO2生産の有意な変化を全く示さなかった。これらの結果は、代謝活性の低下と、H2S前処置の不在下での5% O2への曝露またはH2S前処置した4% O2への曝露に関連した死との間の相関を示す。加えて、これらのデータは、H2S前処置後の5% O2、または5% O2から4% O2への段階的な低下への曝露が、代謝活性のさらなる低下を誘導しないことを示す。これらの結果をまとめると、正常酸素圧から致死的低酸素への移行により生じるCO2発生の低下は、H2Sで前処置したマウスにおいて鈍化された。正常酸素圧から致死的低酸素への移行により、CO2発生は40%低下するが、しかしH2Sによる前処置は、それ自体がCO2発生の新たな、より低いベースラインへの50〜60%の低下をもたらす一方で、致死的低酸素への移行におけるCO2発生の任意のさらなる低下を全く防止した。これらのデータは、H2S前処置単独が、一般的に致死的低酸素への移行に関連した代謝活性のさらなる低下を防止し、それによって低酸素状態下での生存率を向上させることを示す。加えて、これらのデータは、生物物体を活性化合物に予め曝露することが、生存能の向上に十分であり、および／または外傷または疾病発作からの損傷を低下させるというモデルを支持する。
【０４５０】
前処置したマウスが5％酸素に曝露される最長期間は6.5時間であり、マウスは明らかな有害な効果もなく生存した。これは、試験した最長の曝露時間であったが、処置および無処置マウスの間に有意な差を示している。5％酸素に対するこの長い曝露の間、マウスの代謝速度は、本発明者らが既に報告した（Blackstone et al., 2005）期間と同じ期間（図16）で、H2S単独を用いた場合の10倍下落と比較して、50倍より多く下落した。これらの代謝速度実験は、Ta＝13℃で行われ、そのためそれらは本発明者らのこれまでの試験と直接比較することができなかった。Ta＝23℃では、代謝速度は同様に下落する。
【０４５１】
考察
前処置対無処置マウスには根本的な差があるように思われる。150 ppm H2Sの20分間のみの前処置は、生存時間を劇的に増加させるために十分に長い。これらの前処置マウスは、5％O2において6時間より長く生存することができるが、無処置マウスがこのO2濃度で生存することができるのは20分未満である。さらに、本発明者らは、わずか3％O2でマウスが数時間生存することができるように、前処置プロトコール（結果を参照されたい）を改訂した。これらの前処置プロトコールは、致死O2圧に対する曝露前にマウスの代謝速度を低減させる。前処置の場合に認められる代謝速度の下落は、冬眠動物において認められるものと類似であり（Heldmaier et al. 2004）、これまで認められた冬眠により近づく状態を表す可能性がある（Blackstone et al. 2005）。
【０４５２】
細胞エネルギーの供給と要求は、生物の生存にとって平衡でなければならないと考えられている（Hochachka and Lutz, 2001）。歩行性の生物は、酸素／硫化物勾配に沿って自身を最適な点に置き（Fenchel et al. 1995）、これは、生物がエネルギーバランスを維持する方法である可能性がある。おそらく、より大きい生物の細胞内で働く類似のエネルギー系が存在する。代謝の供給側のエネルギー学は広く調べられているが、要求側はおそらく細胞内でのプロセスを用いるエネルギーの明らかな複雑さにより、大部分は無視されている（Suarez and Darveau, 2005）。興味深いことに、酸素を利用するプロセスである、チトクロームcオキシダーゼ（COX）は、一般的に供給プロセスとひとまとめにされる（一例としてBishop et al. 2002を参照されたい）。おそらく、これは誤った考えであり、そうではなくてCOXは、好気性細胞において供給と要求が一致する場所として考えられ得る。要求の酸素部分を消費するプロセスを作製することは、代謝制御に関係するプロセスを解明するために役立つ可能性がある。
【０４５３】
H2Sは、COXの可逆的阻害剤であり（Beauchamp et al. 1984において論評）、哺乳動物細胞によって内因的に産生され（Kimura et al. 2005において論評）、哺乳動物を、低レベルで投与した場合に、完全に可逆的である仮死様状態にすることができる（Blackstone et al. 2005）。このCOX阻害剤の低いレベルは、動物の酸素要求を低下させて、従って代謝曲線をより供給に依存しなくなるようにシフトさせる可能性がある。この効果は、先に考察した酸化還元状態におけるシフトの結果となりえて、または酸化還元状態に対する細胞の感受性対この阻害剤に対するCOXの感受性に応じて、その効果とは無関係となりえた。COXを等式の要求側に置くことは、低酸素供給のようなストレスに満ちた状況が、これらの虚血細胞／組織／生物において認められる実際の損傷を引き起こす可能性がある大量の反応性酸素種（ROS）を生じさせるという考え方によって支持される（ROSに関する論評に関しては、Becker 2004を参照されたい）。これらの場合において、O2供給は、要求時のチェックがなければ大きく低減し、これらの状況における電子輸送系の無効力さによりROSが生じると考えられる。しかし、供給の低減より前に要求が抑制されると、ROSは生成されず、細胞に対する損傷は回避されるであろう。先に示した結果は、COXが代謝的要求の一部であるという考え方と一致する。今後の試験において、本発明者らは、細胞レベルで発生している可能性がある保護に関する重要なプロセスを解明するために多様な組織における硫化物濃度の変化を測定することを考えている。
【０４５４】
要約すると、H2Sを用いて、マウスにおける仮死様状態を要求に応じて誘導することは、おそらく酸素消費を緩衝すること、細胞内の酸化還元環境を変更すること、およびエネルギー供給と要求との致死的不均衡を予防することによって、致死的な低酸素症における生存期間を劇的に増加させる。
【０４５５】
実施例6
H2Sに対する適応はC.エレガンスにおける熱耐性および寿命を増加させる
本発明者らは、H2Sに対する適応の生理的変化が他の利点を有し得るという仮説を立てた。H2Sに対する適応によって、C.エレガンスにおける熱耐性の増加がもたらされた（図17）。高温では、適応動物は典型的に、非適応対照より最大8倍長い平均生存期間を有する。観察された生存期間の最大延長は、実験により異なるが、無処置の動物が全て死亡した時期に、H2S処置動物の平均で80％が生存していることから、効果はかなり強かった（データは示していない）。非適合マウスは一般的に、H2Sの存在下で熱ストレスに対してより感受性が強く、H2Sが熱ストレスに関連する損傷を直接予防するように作用しないことを証明している（図17B）。その上、熱ショックまたはアジ化物などの先のストレスによって誘導される熱耐性とは異なり、H2Sに対する持続的な曝露は、適応動物の熱耐性にとって必要である（図17C）。これらのデータは、H2Sに対する適応が熱耐性を可能にすることを示し、この表現型は、高濃度のH2Sに対する耐性とは区別され得ることを示唆している。
【０４５６】
C.エレガンスにおいて、高温に対する抵抗性はしばしば寿命の増加と相関する。実際に、本発明者らは、H2Sに適応した動物が対照と比較して長命であることを観察した（図18）。適応動物の平均寿命は、非適応集団と比較して70％増加して、最大寿命も同様に延長された。本発明者らはまた、期待寿命の増加が全体的な増加であると共に「成体」（性的成熟後）の期待寿命の増加であるように思われることを観察した。寿命の増加は、寿命実験の開始（L4幼虫として）時に動物をH2S含有環境に移動させた場合には観察されず、この効果がH2Sに対する適応を予め必要とすることを示している（図18B）。実際に、これらの動物の寿命は、無処置対照よりわずかに短い。本発明者らは、寿命の増加が、H2Sに対する適応に起因する生理的変化の特徴であるという結論に達する。
【０４５７】
適応動物の熱耐性および寿命の増加は、代謝活性の低減に関連しないように思われる。低いH2Sにおいて飼育された動物は無処置対照と肉眼的には区別できず、類似の数の子孫を生じる（対照条件における234±15匹と比較してH2Sにおいて221±35匹）。適応動物では胚発生も後胚発生も遅延を認めない（表1）。さらに、産卵率はH2Sによって顕著に変化しない（表2）。産卵率は、代謝能の感度のよい読み出しであるエネルギー消費活性である卵母細胞の産生と厳密に相関する。これと一致して、本発明者らは、周囲のO2圧を2％（空気中の21％O2から）に低減させた場合に、産卵率が2倍減少することを観察し、これは線虫の代謝速度を約30％減少させる原因である。H2Sは、低減された周囲のO2を有する環境において産卵率をさらに変化させない（表2）。本発明者らはまた、H2Sに対して初期に曝露された動物が野生型から遅れることなく同時に性的成熟に達することも観察した。本発明者らは、ミトコンドリアエネルギー産生が本発明者らの条件において影響を受けないという結論に最終的に達することができないが、これらのデータは、全体的な代謝の出力が認識可能に減少しないことを証明している。
【０４５８】
（表１）発達速度
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a 一つの代表的な実験からの二細胞胚が室温でふ化するまでの時間の中央値。
b 一つの代表的な実験における餌を再度与えた後に飢餓第一段階幼虫が妊娠成体となるまでの時間の中央値。
c 室内空気における野生型動物。
d 50 ppm H2Sにおける野生型動物。
e この変異体は発達が遅い（wong ref）ことが報告されている。
* 野生型、非適応対照と有意に異なるp＜0.05。
【０４５９】
（表２）H2S室内空気における産卵率
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a 一つの代表的な実験における胚／時間±SDで表した平均産卵率。n＝10個体。nd；行っていない。
b 室内の空気で生育した野生型動物。
c 50 ppm H2Sにおける野生型動物。
* 同じ欄における野生型の非適応対照と有意に異なる（両側のt-検定によってp＜0.05）。
【０４６０】
寿命を増加させることができるいくつかの遺伝的に無関係な経路が、C.エレガンスにおいて特徴付けされている。本発明者らは、H2Sに対する適応によって、これらの経路の一つに影響を及ぼすことによって、熱耐性および寿命の増加が起こる可能性があると推論した。この可能性を評価するために、本発明者らはそれぞれの経路を欠損する変異体がH2Sに対する適応後に熱耐性の増加を示すか否かを試験した。
【０４６１】
C.エレガンスにおいて、インスリン／IGFシグナル伝達（IIS）経路は、高い集団密度、少ない餌、または高温のような不都合な条件に曝露された場合に、もう一つの幼虫段階である永続蛹に入る決定を制御する。IISを低減させるインスリン様受容体DAF-2における変異は、永続蛹状態に入る確率を増加させ、成体の場合には永続蛹に入らなくとも熱耐性を増加させて、寿命を延長させる。DAF-16はdaf-2の全ての表現型にとって必要である。本発明者らのデータは、H2Sに対する適応によってIISの減少が起こらないことを示唆している。第一に、成体期に開始するH2S曝露は寿命を増加させないが（図17B）、成体期に開始するdaf-2のRNAiは寿命を増加させるために十分である。第二に、H2Sに対する適応は、daf-16（m26）変異体において起こり、daf-2（el370）変異体はH2Sに対する曝露後熱ストレスに対してさらにより抵抗性である（データは示していない）。最後に、後胚発生時間が延長されないことから、H2Sは、野生型線虫において永続蛹状態に入ることを誘導せず、daf-2（el370）変異体において永続蛹に入るまたはそれを終了することも防止しない。これらのデータは、H2Sが寿命および熱耐性を増加させる機構が、IIS経路とは無関係であることを示唆している。
【０４６２】
ミトコンドリア機能の低減は、C.エレガンスの寿命を増加させるための十分に確立された機構である。インビトロにおいて、H2Sは、電子輸送鎖における末端酵素であるチトクロームcオキシダーゼの阻害剤である。このように、魅力的な仮説は、H2Sに対する適応が、ミトコンドリア活性を低減させることによって、寿命および熱耐性を延長するように作用するというものである。成体におけるRNAiによるミトコンドリア機能の減少は、成体にH2Sを付加しても寿命を増加させないのと同様に、寿命を増加させない（図18B）。しかし、適応動物は、長命isp-1およびclk-1変異体（表1）が含まれる、ミトコンドリア機能が欠損しているC.エレガンスにおいて、一般的に観察される低代謝表現型を共有しない。本発明者らは、ミトコンドリア機能を欠損する長命変異体isp-1（qml50）およびclk-1（qm30）がH2Sに適応して、熱耐性となることを観察し（データは示していない）、H2Sに対する適応にとって必要な機構がミトコンドリアの機能障害とは遺伝的に異なることを示唆している。
【０４６３】
食事制限（DR）は、多様な生物において寿命を延長する。咽頭ポンピング速度が低減したC.エレガンスは、おそらくDRの結果として長命である。これらの動物は、薄く青白く見えて、発達が遅く、繁殖力が低減し、これらはH2Sに適応させた動物において観察されない表現型である。したがって、本発明者らは、H2SがDR経路を通して作用する可能性は低いと考えた。この解釈と一致して、DRのために長命であるeat-2（ad1116）変異体動物は、H2Sに対する適応により熱耐性となる（データは示していない）。本発明者らは、H2Sに対する適応がDRとは異なる方法で線虫の生理学を変化させ、それによってこれが異なる機構を通して作用することが示唆されると結論づける。
【０４６４】
これらの遺伝的に定義された経路の他に、しかしおそらくそれと重なって、サーチュインは、多くの生物の寿命に影響を及ぼす。したがって、本発明者らは、H2Sに対する適応におけるサーチュイン機能の役割を調べた。本発明者らは、sir-2.1（ok434）動物の熱耐性および寿命がH2Sに対する適応によって増加しないことを観察した（図19）。これらのデータは、SIR-2.1活性がH2Sに対する適応の際の熱耐性および寿命の増加にとって必要であることを示している。しかし、SIR-2.1は、H2Sに対する適応に関連する全ての表現型にとって必要ではない。低濃度のH2Sにおいて生育したsir-2.1（ok434）動物は、全て、野生型と同様に高濃度のH2Sから生存した（データは示していない）。本発明者らはSIR-2.1活性がH2Sに対する適応に関連する表現型のサブセットにとって必要であるという結論に達する。さらに、SIR-2.1活性がH2Sにおける熱耐性および寿命の増加にとって必要であるという知見は、これらの表現型が非特異的代謝抑制によるものではないことをさらに示唆している。
【０４６５】
要約すると、このデータはC.エレガンスがH2Sに適応して、この適応によって熱ストレスに対する抵抗性の増加、寿命の増加、およびそうでなければ致死的なH2S濃度に対する耐性として現れる生理的変化が起こることを証明している。このように、H2SはC.エレガンスが生存することができる条件の範囲を拡大する。おそらく、内因性のH2Sは、本来、環境の変化に対する反応と協調させるためにSIR-2.1活性を調節する。H2Sに曝露されたマウスも同様に、そうでなければ致死性の低酸素症に対してそれらを保護する生理学上の劇的な変化を示す。これらの結果は、H2Sが多くの病理状態に対して有用な治療物質である可能性があることを示唆している。生物がH2Sに対してどのように適応するかを決定することは、ヒトが含まれる高等生物において類似の機構に洞察を与える可能性があり、基礎研究および臨床の実践の双方においておそらく広範囲の意味を有するであろう。
【０４６６】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されるそれらへの補足の模範的手順であるかまたは他の詳細を提供する程度まで、参照によって本明細書に特に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０４６７】
以下の図面は、本明細書の一部を形作っており、本発明のある局面をさらに示すために含まれている。本発明は、本明細書に示した具体的な態様の詳細な説明と一緒に、これら図面の一つまたは複数を参照することによって、より理解され得る。
【０４６８】
【図１】本発明の態様の呼吸気体送達システムを描いたブロック図である。
【図２】本発明の態様の呼吸気体送達システムを描いた概略図である。
【図３】本発明のさらなる態様の呼吸気体送達システムを描いた概略図である。
【図４】本発明の態様の運転を描いたフローチャートである。
【図５】本発明の態様の組織処置気体送達システムを描いた概略図である。
【図６】本発明の態様の運転を描いたフローチャートである。
【図７】図7A〜Bは、活性化合物の送達または投与に使用できる陰圧装置を示す。
【図８】短時間のCO2予備処理は、無酸素生存率を最大化する。成虫のハエを、表示した時間100% CO2に曝露し、N2を吹き込んで雰囲気を無酸素状態にしてからチューブを密閉した。22時間後、チューブを大気に対し開放した。ハエを24時間回復させてから、生存率のスコアをつけた。
【図９】CO2は無酸素生存率を不安定に高める。成虫のハエを、大気(予備処理なし)から直接、または100% CO2に10分間曝露した後、低流実験の中で無酸素状態にした。示した時間の後にチューブを大気に対し開放した。ハエを24時間回復させてから、生存率のスコアをつけた。
【図１０】COに加えた50ppmのH2Sは、無酸素状態を生存するハエの割合を増やす。成虫のハエを、大気(予備処理なし)から直接、またはCOでバランスを取った50ppmのH2Sに曝露した後、低流実験の中で無酸素状態にした。
【図１１】5%酸素内でのマウスの生存。マウスを、5% O2に曝露させる前に30分間室温に曝露させるか(対照群；黒線；n＝9)または5% O2に曝露させる前に10分間大気に曝露させ、続いて20分間150ppmのH2Sに曝露させるか(実験群；赤線；n＝20)、のいずれかで、それらの生存期間を測定した。60分の時点で実験を停止し、動物がまだ生きている場合(実験群の全例、対照群なし)は、それらを元のケージに戻した。
【図１２】H2Sは致死的酸素圧での生存を増加させる。グラフは、図11に記載した実験の結果を示す。x軸は、マウスが低酸素圧で生存した時間を分単位で示す。暗いバーはH2Sが存在しない場合を、一方明るいバーはH2Sが存在する場合を示す。後者のグループでは、マウスを酸素圧を5%〜2.5%の間に下げる前に150ppmのH2Sに曝露させた。生存時間を測定したところ、生存時間はH2S処置群では全例で少なくとも60分であった。
【図１３】H2S予備処理は低酸素状態でのマウス生存率を高める。マウスを大気(PTなし)に30分間、または大気に10分間曝露させてから、5% O2 (5%)、4% O2 (4%)、5% O2に1時間、その後4% O2 (4%＋1時間5%)、または5% O2に1時間、その後3% O2 (3%＋1時間5%)に曝露させる前に150ppmのH2Sに20分間曝露させ、生存期間を測定した。実験は60分の時点で停止し、動物がまだ生存している場合は、元のケージに戻した。
【図１４】5%酸素中でのマウスの代謝速度。マウスを、10分間大気に曝露させた後、5% O2に曝露させる前に20分間150ppmのH2Sに曝露させた。代謝速度をCO2排出量で測定した。予備曝露時のCO2排出量はほぼ2500ppmであり、20分間のH2S曝露後に代謝速度はほぼ2倍低下し、5% O2に数時間曝露した後CO2排出量はおおよそ50ppmまで、予備曝露時のレベルに比べ約50倍低下した。6時間目の時点でマウスを大気に戻して回復させた。このデータは、図11に含まれるマウス(実験群)の1匹から得た。
【図１５】致死的な低酸素状態へ移行中のCO2産生。5% O2または4% O2のいずれかに移行する際のCO2産生の変化を、大気に30分間(PTなし)曝露させるか、または大気に10分間曝露させた後に150ppmのH2Sに20分間曝露させた(PT)マウスについて測定した。これに加え、1時間かけて5% O2に、さらに後4% O2まで段階的に移行した際のCO2産生の変化を測定した。CO2産生のパーセント変化は、表中誤差を付けてプロットされている。
【図１６】マウスにおいてH2Sと5％O2とを用いた代謝速度試験の結果を示す。前処置して5％O2に曝露したマウスの相対的二酸化炭素産生および酸素消費。曝露前レベルを用いて、他の観察を標準化した。+6時間H2Sは、80 ppm H2Sに6時間曝露後の代謝速度である。+6時間5％O2は、150 ppm H2Sによる20分間の前処置後に5％O2に6時間曝露後の代謝速度である。これらの実験は、本発明者らのこれまでの試験と比較できるように、Ta＝13℃で行った。値は、動物3匹の平均値であり、誤差のバーは、標準偏差を表す。p-値は、同じ記号の棒グラフ間の有意性を示す。
【図１７】H2Sに対する適応は、野生型C.エレガンスにおいて熱耐性を増加させる。A：適応動物は、非適応対照より高温で生存する。適応動物を、若い成体の時期にH2Sにおいて高温に曝露した。適応動物の平均生存期間は、室内の空気、高温で非適応動物の9.1時間（n＝96）と比較して、65.5時間（n＝136）であった。B：H2Sに対する適応は、H2Sにおいて高温を生存するために必要である。非適応動物を、50 ppm H2Sを含有する環境において高温に移動した。非適応動物の平均生存時間は2.1時間であったのに対し、室内の空気で高温に曝露した群は7.3時間生存した。C：適応動物は、高温での生存の増加のためにH2Sの持続的な存在を必要とする。室内の空気、高温で適応させた動物は、7.3時間生存し、これは非適応対照（7.0時間）より有意に長くない。
【図１８】H2Sに対する適応は、C.エレガンスにおいて寿命を増加させる。A：H2Sにおいて生育させた動物は、無処置対照より長い寿命を有する。H2Sにおける適応動物の平均寿命は、室内の空気における非適応対照に関する13.0±1.0日と比較して22.6±1.0日（n＝80）であった。最大寿命も同様に4日間増加した。B：成体においてH2Sに曝露しても寿命を増加させない。室内の空気で飼育した動物を、寿命実験の最初にH2S含有環境に移動させた。これらの動物の寿命は14.8±0.3日であり、これは室内の空気で飼育した対照より短い（平均寿命18.2±0.4日）。
【図１９】sir-2.1は、H2Sに適応後の熱耐性および寿命の増加にとって必要である。A：H2Sに対する適応は、sir-2.1（ok434）動物の熱耐性を増加させない。H2Sにおいて生育させて、H2Sにおいて高温に曝露したsir-2.1（ok434）動物の平均生存期間は、9.8±0.3時間（n＝20）であり、これは室内の空気における非適応対照より有意に長くない。（平均生存期間9.6±0.3時間、n＝20）。B：H2Sに対する適応は、sir-2.1（ok434）動物の寿命を増加させない。H2Sにおいて飼育したsir-2.1（ok434）動物の寿命は、20.0±1.6日（n＝47）であり、室内の空気における対照動物と統計学的に差がない（22.2±1.2日、n＝26）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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