(57)【要約】  癌を有する疑いのある、または癌を有すると診断された個人の予後を決定するための方法であって、高CD24/低FLJ13639比が望ましくない予後を示す方法が提供される。化学治療剤の活性を高めるための方法、および、個人の予後を改善することにおける使用のための、および化学治療剤の活性を高めるための、単離され、精製されたFLJ13639蛋白質も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有すると診断された、または癌を有する疑いのある個人の予後を決定する方法であって、
i) 前記個人から生物学的サンプルを得ること;
ii)前記サンプル中のCD24mRNAまたはCD24蛋白質の量を測定すること;
iii)前記サンプル中のFLJ13639mRNAまたはFLJ13639蛋白質の量を測定すること;
iv)前記CD24mRNAの量を前記FLJ13639mRNAの量と比較して、または、前記CD24蛋白質の量を前記FLJ13639蛋白質の量と比較して、CD24対FLJ13639発現比を得ること;
を含み、3:1以上のCD24対FLJ13639発現比が、前記個人における望ましくない予後を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記CD24mRNAの量および前記FLJ13639mRNAの量を、RT-PCRを行うことにより、またはマイクロアレイ分析により決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
FLJ13639mRNAのRT-PCRを行うことにより、配列番号1の配列を含むcDNAを増幅し、および/または、CD24mRNAのRT-PCRを行うことにより、配列番号6の配列を含むcDNAを増幅することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記CD24蛋白質の量および前記FLJ13639蛋白質の量を、ウエスタンブロッティング、フロー・サイトメトリー、免疫組織化学またはELISAにより決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的サンプルが血液、骨髄または腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記個人が、前立腺癌、乳癌、直腸結腸癌、肺癌（小細胞および非小細胞肺癌を含む）、卵胞癌、メラノーマ、泌尿器系の癌、子宮癌、子宮内膜癌、膵臓癌、口腔癌、甲状腺癌、胃癌、脳の癌、血液の癌およびこれらの組合せから選択される癌を有すると診断されたか、またはその疑いがあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血液の癌が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、白血病および骨髄腫から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記個人の望ましくない予後により、当該個人を、組換えFLJ13639蛋白質での治療のための候補者として同定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
配列番号2の配列を含む、単離され、精製された蛋白質。
【請求項１０】
前記蛋白質が組換え蛋白質であることを特徴とする請求項９に記載の蛋白質。
【請求項１１】
蛋白質精製タグおよび/または蛋白質形質導入ドメインをさらに含む請求項１０に記載の蛋白質。
【請求項１２】
前記蛋白質が配列番号5のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の蛋白質。
【請求項１３】
癌を有すると診断された、または癌を有する疑いのある個人の予後を改善するための方法であって、当該個人に、FLJ13639蛋白質を含む組成物を、当該個人の予後を改善するのに有効な量で投与することを含む方法。
【請求項１４】
前記組成物が医薬上許容されるキャリアを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記FLJ13639蛋白質の投与により、前記個人における癌細胞の増殖が阻害されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記FLJ13639蛋白質の投与により、前記個人における癌細胞の転移が阻害されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記FLJ13639蛋白質が配列番号2の配列を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
化学治療剤を前記個人に投与することをさらに含み、前記FLJ13639蛋白質を含む前記組成物の投与が、当該化学治療剤の活性を高めることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学治療剤が、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個人が、前立腺癌、乳癌、直腸結腸癌、肺癌（小細胞および非小細胞肺癌を含む）、卵胞癌、メラノーマ、泌尿器系の癌、子宮癌、子宮内膜癌、膵臓癌、口腔癌、甲状腺癌、胃癌、脳の癌、血液の癌およびこれらの組合せから選択される癌を有すると診断されたか、またはその疑いがあることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2005年12月8日に出願された米国仮出願第60/748,652号に対する優先権を主張するものであり、当該出願の開示内容を出典明示により本明細書中に組み込むものである。
本発明は、概して、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の予後インジケータ、および本発明の蛋白質を用いるこれらの治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
13q14領域は、いくつかの血液悪性腫瘍ならびに固形腫瘍において、頻繁に変更されている。この例には、限定を意図するものではないが、前立腺癌、乳癌および結腸直腸癌が含まれる。13q14の変更、主に欠失は、急性白血病(1)、多発性骨髄腫およびマントル細胞リンパ腫で頻繁に認められる。13q14の変更(サンプルの25〜40%に見られる)は、骨髄腫の患者の、統計学的に有意な独立の不利な予後因子を構成する(2〜4)。染色体13の欠失が、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン増多症(MGUS)から多発性骨髄腫への移行に関係することも示されている(5)。13q14の欠失はまた、マントル細胞リンパ腫の症例の50%でも観察されている(6)。同様に、13q14の変更は様々な固形腫瘍に関して記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、13q14染色体の変更に関連する遺伝子およびそのような変更の悪性腫瘍表現型との関連性は十分には特定されていない。さらに、13q14の変更に伴う悪性腫瘍に関する、確立された所定の予後パラメーターが公知であるが、それらは、個々の患者における悪性腫瘍の挙動を予測することに限られている。つまり、13q14の変更に伴う悪性腫瘍を有する人のための、個々人に合わせた予後評価で使用するための、患者に特異的な情報が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明では、癌を有すると診断されたまたはその疑いのある個人の予後を決定するための方法が提供される。当該方法は、前記個人から生物学的サンプルを採取し、次いで、当該サンプルをアッセイして、CD24の発現のFLJ13639の発現に対する比を決定することを含む。高CD24/低FLJ13639発現レベルにより、望ましくない予後が予測される。
他の態様では、正常な、非悪性腫瘍細胞に比して低いFLJ13639発現レベルにより、望ましくない予後が予測される。
【０００５】
組換えFLJ3639蛋白質等の単離され、精製されたFLJ3639蛋白質および、癌を有すると診断されるまたはその疑いのある個人、および高CD24/低FLJ13639発現レベル特性を示す個人の予後を改善するための、当該蛋白質を使用する方法もまた、提供される。前記個人の予後を改善する方法には、当該個人へ組換えFLJ3639蛋白質を、当該個人の予後を改善するのに有効な量で投与することを含む。一態様では、前記個人の予後は、当該個人における癌細胞の増殖および/または転移を減じることにより改善される。
本発明によりまた、化学治療剤の効果を高めるための方法も提供される。この方法は、化学治療剤を、当該化学治療剤の効果を高めるのに有効な量のFLJ3639蛋白質と組合せて投与することを含む。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明により、癌を有すると診断されたまたは癌を有する疑いのある個人の予後を決定する方法が提供される。当該方法は、当該個人から生物学的サンプルを採取し、次いで、当該サンプルをアッセイして、CD24の発現のFLJ13639の発現に対する比を決定することを含み、高CD24/低FLJ13639発現レベルが望ましくない予後を予測するものである。他の態様では、正常細胞に比して低いFLJ13639発現レベルのみにより、望ましくない予後が予測される。
FLJ13639蛋白質での治療のための候補者としての個人を同定するための方法も提供される。当該方法は、個人から生物学的サンプルを採取し、次いで当該サンプルをアッセイして、CD24の発現のFJL13639の発現に対する比を決定することを含み、高CD24/低FLJ13639発現比が、当該個人を、FLJ13639蛋白質での治療のための候補者と同定するものである。
【０００７】
本発明の他の方法では、単離され、精製されたFLJ13639蛋白質および、これを含む組成物、並びに、癌を有すると診断されたまたは癌を有する疑いのある個人の予後を改善するためのそのような組成物の使用法が提供される。当該方法は、前記個人に、当該個人の予後を改善するのに十分な量のFLJ13639蛋白質を投与することを含む。かかる個人の予後は、当該個人における癌細胞の増殖および/または転移を減じることにより改善されると考えられる。
【０００８】
さらに他の態様では、化学治療剤の効果を高めるための方法が提供される。当該方法は、化学治療剤を、当該化学治療剤の効果を高めるのに有効な量のFLJ13639蛋白質と組み合わせて投与することを含む。この方法が、化学治療剤に耐性のある細胞に対する化学治療剤の活性を高めるために有効であることが立証される。
FLJ13639は、「DHRS12」とも称される。つまり、本記載の目的のために、DHRS12データベースエントリーに対する言及は、FLJ13639遺伝子および/またはFLJ13639遺伝子の発現から生じるmRNAおよび蛋白質産物に対する言及と同義である。
【０００９】
FLJ13639遺伝子は、本明細書中、「P1」、「P2」および「P3」と称される少なくとも３つの異なる転写産物サイズとして発現される。これらの中で、いかなる特定の理論により拘束されることを意図せずに、P1はFLJ13639の活性形態であると考えられる。P1をコードしているcDNAの配列をここに配列番号1として提供する。P2をコードしているcDNAのDNA配列をここに配列番号3として提供する。P3をコードしているcDNAの配列をここに配列番号4として提供する。P2およびP3蛋白質のアミノ酸配列を、その各々のcDNA配列から推定できることが当業者には明らかであろう。同じ事がP1蛋白質に当てはまるが、便宜のために、そのアミノ酸をここに配列番号2として提供する。
FLJ13639遺伝子は、GenBankアクセス番号NT_024524、2006年8月26日エントリー下に入手可能なヒト染色体13ゲノムコンティグ参照アセンブリ(genomic contig reference assembly)内にある。本発明によりFLJ13639発現を決定する場合、P1mRNAの量またはP1mRNAから発現された蛋白質の量のいずれかを測定することが好ましい。
【００１０】
CD24は27アミノ酸の小さな、ムチン様のグリコシル化蛋白質コアである(Lim SC, Biomed Pharmacother. (2005) Vol: 59 (Suppl 2):S351-4)。その遺伝子は染色体6q21に位置する(Kristiansen G等、 J Molec Histol 2004 Mar; 35(3): 255-262)。CD24は、P-セレクチンの特異的リガンドとして役立つ(Aigner S等、Blood. (1997) Vol. 89(9): 3385-95)。後者は、活性化された血小板および内皮細胞上に見出され、特定のシアリル化された炭化水素と相互作用することにより接着およびローリングを媒介する(Lim SC)。いかなる特定の理論により拘束されることを意図せずに、CD24ポジティブ腫瘍細胞は、新たな転移の増大に先行する細胞接着の増加傾向を有する可能性があると考えられ、また、この経路が、標的器官への腫瘍細胞の漸増(recruiting)および退去(exiting)において重要な要素である可能性があると考えられる。CD24cDNAの配列を配列番号6として提供する。
【００１１】
本発明は、様々な悪性腫瘍のいずれかを有すると診断されたまたはその疑いのある個人の予後の決定および/または当該予後の改善を容易にするものである。例えば、そのような悪性腫瘍には、固形腫瘍（前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌（小細胞性および非小細胞性）、卵胞細胞、メラノーマ、泌尿器系の癌、子宮癌、子宮内膜癌、膵臓癌、口腔癌、甲状腺癌、胃癌、脳および他の神経系の癌、肝臓癌および食道癌等)、または、血液の癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、慢性白血病および他の白血病および骨髄腫等が含まれ得る。
【００１２】
本発明における使用に適した生物学的サンプルは、通常の方法により得ることができる。本発明における使用のための生物学的サンプル源の選択は、個人が有する疑いのある、または個人が有すると判断された癌のタイプにより指示される。例えば、白血病のためには、骨髄のサンプルからのFLJ13639およびCD24の発現比を決定することが好ましい。しかし、固形腫瘍のためには、腫瘍の生体組織検査が好ましい。
CD24/FLJ13639の発現の比は、生物学的サンプルからのmRNAまたは蛋白質を、いずれかの適当な方法を用いて分析することにより決定することができる。mRNAまたは蛋白質は、別個のサンプルから、または同じサンプルの異なる部分から測定され得る。しかし、当業者により認識されるように、CD24/FLJ13639比は、特定の生物学的サンプルに関して決定されたFLJ13639mRNAレベルを、同じ生物学的サンプルに関して決定されたCD24mRNAレベルと比較することにより、または、特定の生物学的サンプルに関して決定されたFLJ13639蛋白質レベルを、同じサンプルに関して決定されたCD24蛋白質レベルと比較することにより、得られることが好ましい。
【００１３】
FLJ13639およびCD24mRNAの発現のレベルを決定するためのあらゆる適当な方法を用いることができる。例えば、mRNAレベルは、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、リボヌクレアーゼプロテクション、定量または半定量RT-PCR、またはマイクロアレイ分析を含む標準的な方法により決定することができる。これら方法のいずれかでの使用のために適したプライマーまたはプローブは、本明細書中に提供されるFLJ13639およびCD24cDNAの配列に基づき、および、当業者に周知の核酸ハイブリダイゼーションパラメータに影響するファクターと関連して、標準的な方法により調製することができる。
【００１４】
CD24および/またはFLJ13639蛋白質レベルは、あらゆる適切な方法により決定することができる。好ましい方法には、免疫検出法が含まれる。例えば、ウエスタンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学、ELISA等を用いて、FLJ13639およびCD24蛋白質の存在および量を検出することができる。この点について、本発明はまた、FLJ13639蛋白質を検出するのに、およびFLJ13639蛋白質の発現レベルを測定するのに使用するためのモノクローナル抗体(mAbs)をも提供する。我々は、mAbs4B3、4B4、1A9、2C12、9A11、4E8、10F11、2F5、10D1、4G7、8E1、8H9を含むFLJ13639mAbsを調製した。このようなmAbsを、例えば、CD24/FJL13639蛋白質レベルの比を、生物学的サンプルのフローサイトメトリ分析により検出するために、または、パラフィン包埋されたまたは、凍結されたサンプルの免疫細胞組織化学分析におけるような免疫染色のために使用することができる。
【００１５】
本発明により、組換えFLJ13639蛋白質等の、単離され、精製されたFLJ13639蛋白質も提供される。組換えFLJ13639蛋白質は、あらゆる適切な方法を用いて調製することができる。一態様では、FLJ13639PIcDNAを含む蛋白質翻訳発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することができ、この宿主細胞から、Sambrook等、モレキュラークローニング(MOLECULAR CLONING)：研究室マニュアル、第２版(A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.)、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(Cold Spring Harbor, N.Y.)、(1989)に記載されている方法のような常套の方法を用いて、組換え蛋白質を生産および抽出することができる。通常の蛋白質精製タグを組み込むことによる等、蛋白質の精製を促進するための、または当該蛋白質の薬理学的送達を改善するための、蛋白質配列に対する常套の修飾が、当業者の技術範囲内にあることも、理解されるであろう。例えば、FLJ13639蛋白質は、古典的レセプター(classical receptor)またはエンドサイトーシス媒介経路とは無関係の、当該蛋白質の生物膜の貫通を促進するための蛋白質の形質導入ドメイン、HIV-1TATドメイン等を含むように修飾されることができる。このように修飾された蛋白質も、本明細書中、組換えFLJ13639蛋白質とみなす。FJL13639をコードしている核酸を、かかる核酸を公知の遺伝子治療法を用いて個人に投与することにより、治療剤として使用し得ることも、意図される。
【００１６】
組換えFLJ13639蛋白質は、当該蛋白質を標準的な医薬上許容されるキャリアと組み合わせることにより調製される常套の投与形態で投与されることができる。蛋白質との使用のために許容される医薬キャリアは、レミントンの医薬化学(Remington's Pharmaceutical Sciences)（第18版、A.R.Gennaro等 Eds.、Mack Publishing Co、Easton、Pa、1990）に記載されている。
当該分野の専門家に公知の様々な方法を、個人に組換えFLJ13639蛋白質製剤を投与するのために使用することができる。これらの方法には、限定するものではなく、皮内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻内経路が含まれる。使用されるべきFLJ13639蛋白質の投与量は、投与の経路、個人のサイズおよび疾患の段階などの周知の変動要素に基づき決定されることが認識されるであろう。
化学治療剤の効果を高めるために本発明の方法中で使用される場合、組換えFLJ13639蛋白質は、当該化学治療剤の投与の前に、当該化学治療剤の投与と同時に、または当該化学治療剤の後で、投与されることができる。適当な化学治療剤の例には、限定するものではないが、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチンが含まれる。他の態様では、組換えFLJ13639蛋白質の投与は、放射線療法および/または光線力学的療法(PDT)の抗癌効果を高めるために、行われることができる。
【００１７】
以下の実施例から、我々が、t(12;13)染色体の転座により破壊される染色体13q14上に位置する推定デヒドロゲナーゼ遺伝子として、FLJ13639を特定したことが、当業者には明らかとなるであろう。FLJ13639の発現の喪失または低下の結果の一つが、CD24の過剰発現であること、およびFLJ13639とCD24の発現の比が患者の生存を予測することを、我々は立証した。我々はFLJ13639組換え蛋白質を開発し、FLJ13639レベルの、この組換え蛋白質を用いた回復が、CD24のダウンレギュレーションを誘導し、癌細胞の侵襲および運動性を低下または遮断し、その増殖を阻害し、かつ、高CD24/低FLJ13639特性を示す細胞における化学療法感受性(chemosensitivity)を高めることを示した。我々は、また、FLJ13639蛋白質の再導入が、ミトコンドリアに関連する本質的な細胞機能を回復することも立証した。しかし、これら実施例は、例を意味するものであって、本発明を限定するものではない。
【００１８】
[実施例１]
本実施例により、急性白血病における13qの切断点の特定を立証する(1)。この特定を促進するために、我々は、ユニークなt(12,13)(p12;q14)転座(7)を有する患者サンプルから細胞系統を誘導した。我々は、白血病の発症およびその持続に潜在的に帰着する病原的事象の分子的特徴付けを確立するために、この細胞系統を用いて、この転位に関与する遺伝子(複数)を同定したが、血液悪性腫瘍に加えて、この白血病モデルは、広範な固形腫瘍にも同様に意味がある。
【００１９】
我々は初めに、染色体12p12上での単一の転座に関与する遺伝子を、多くの均衡型転座(balanced translocation)に関与するETV6遺伝子であると同定した(1)。我々は、対の遺伝子を、分子RACE(molecular RACE)法を用いてクローン化することを試みたが失敗に終わった。我々は、それゆえ、転座切断点に及ぶBACクローンを同定することを可能とする、一連の市場入手可能なRPCIBACクローン(RPCIBACクローンRP11-147H23、GenBankアクセス番号AL136525、2005年5月18日エントリー)を用いて、染色体13上でのFISHウォーキングアプローチを採用した。それゆえ、このBACクローンに関する配列を分析して、(存在するならば)どの遺伝子がこの領域に存在するのかを同定した。2つの遺伝子のみ−他の遺伝子WDFY1に対するその相同性にちなんで命名されたWDFY2、および予測された遺伝子FLJ13639−が同定された。
【００２０】
これらの遺伝子の何れがt(12,13)転座により変更されたのかを決定するために、RT-PCRを、本質的にMUTZ-5細胞系統に関して実施例６に記載されているように、EBV-LIN、正常対照としてのリンパ芽球細胞系統を用いて行った。簡単には、全RNAを、細胞培養物から常套法を用いて抽出し、逆転写を行った。WDFY2に関するRT-PCRにて用いたプライマーは、フォーワード配列5' TCTGTCTCAACCTGTGTCCC3' (配列番号7)およびリバース配列5'GAAGAGTCCCCTTGCGAGT3'(配列番号8)を有する。FLJ13639P1を増幅するために、配列5'CATCCGGGAGAGCGGTAACC3'(配列番号9)を有するフォーワードプライマーおよび、配列5'AGCACAGGGATCAGGCCGGTC3'(配列番号10)を有するリバースプライマーを使用した。
結果は、両細胞系統において、WDFY2は正常な発現を示す（図１B）が、MUTZ-5においてFLJ13639に関しては発現が検出されないこと(図１A)を示す。(G519は、非ホジキンリンパ腫(NHL)細胞系統から確立された細胞系統である。）つまり、t(12,13)染色体の破壊は、FLJ13639の発現の排除を生じる。
【００２１】
[実施例２]
本実施例により、FLJ13639遺伝子の特定を示す。我々は、バイオインフォマティクス(bioinformatics)分析により、FLJ13639が、短鎖デヒドロゲナーゼレダクターゼ・スーパーファミリー(SDR)と相同性を有することを決定した。FLJ13639蛋白質は、NAD(H)またはNADP(H)補酵素結合モチーフを表している共通のGlyXXXGlyXGlyパターン、AsnAsnAsnAlaGly(配列番号11)ホールディングモチーフ、並びに示唆される基質結合ポケットおよび触媒作用部位を表しているTyrXXXLysセグメントを含むSDRの古典的な特徴を有する(11)。我々は、EST配列のアライメントを用いるバイオインフォマティクス分析により、FLJ13639の3つのmRNA変種(P1、P2およびP3)を作り出し、これら3つの転写産物が、(図2に要約する)当該遺伝子の5'および3'末端における選択的スプライシングから生じることを決定した。これらの3つの転写産物は、3つの蛋白質であってミトコンドリアに位置することが示されるもの(P1、P2およびP3)を生じる(図3)。特に、図3は、FLJ13639蛋白質が、増強された緑の蛍光蛋白質融合物(図3中のEGFP）として発現される場合に、ミトコンドリアに局在することを示す。最初の20N末端アミノ酸（EGFP融合蛋白質としてのみ（「P120AAN-末端」;図3））のサブクローニングにより、その発現パターンが、全FLJ13639-GFP融合蛋白質を用いて得られるものと同じであるので、P1のこの領域がミトコンドリア標的配列であることが確証される。しかし、当該蛋白質の残りが、最初の20AA無しで (「P1-C末端」)、 GFPと共に発現される場合、ミトコンドリアのサインは喪失される。如何なる特定の理論に拘束されることを意図せずに、P2およびP3は、P1上で逆制御（retrocontrol）ループまたは「ゲートキーパー(gatekeepers)」として作用する可能性があると考えられる。
【００２２】
[実施例３]
FLJ13639の機能を分析するために、P1をpCDNA3発現ベクター(Invitrogen(商標登録)から入手可能)中にアンチセンス配向でサブクローン化し、次いでこの構築物を、不滅化した繊維芽細胞（並びに対照としての空のベクター）に、リン酸カルシウム法を用いて形質転換した。この意図は、どの遺伝子が、FLJ13639のダウンレギュレーションにより直接的または間接的に影響されるかを評価することにあった。トランスフェクト産物(transfectant)の選択後、全RNAをこれらの細胞から抽出し、リバース・トランスクリプターゼを用いてcDNAとして増幅した。cDNAをヒトアフィメトリックス(Human Affymetrix)U133アレイを用いて分析した。発現特性を、ベクターのみまたはアンチセンス構築物で形質転換した細胞間で比較した。アンチセンスアッセイによるFLJ13639のダウンレギュレーションは、RT-PCRにより確認した。
遺伝子の過半数がダウンレギュレートされた(223がダウンレギュレートされ、14がアップレギュレートされた）。我々は、過剰発現された遺伝子の一つがCD24であること、および、これが、FLJ13639の発現が失われる場合に（5倍まで）過剰発現されることを確定した。
【００２３】
[実施例４]
この実施例により、FLJ13639の低下した発現が、白血病、卵胞癌、肺癌、乳癌および前立腺癌におけるCD24の増加した発現に関連することを示す。
CD24およびFJL13639の発現レベルを、B細胞(UoCB1、ALL-1、OM9;22、ALLCJ)、T-細胞(207/CEM)起源、並びにCML急性転化芽球(K562)の急性白血病細胞系統におけるRT-PCRにより評価した。EBV-LIN細胞系統も対照として含めた。CD24およびFLJ13639の発現レベルの決定を、本質的に実施例6に記載されているようにRT-PCRにより行った。RT-PCR増幅により、CD24およびFLJ13639P1の各々300および233bpのアンプリコンが作成された。これらの増幅産物を、アガロースゲルにて、電気泳動分離により取り出し、エチジウム・ブロマイドを用いて可視化した。
【００２４】
リンパ芽球細胞系統(EBV-LIN)は、両CD24およびFLJ13639の穏やかな発現を示したが、試験した全ての他の白血病細胞系統は、高CD24/低FLJ13639P1を有することが見出された（図4A)。他の腫瘍(卵胞癌、肺癌、乳癌)からの細胞系統を試験した処、同様の高CD24/低FLJ13639P1特性を示した(図4B-C)。ここに提示される細胞系統は、白血病(ALLCJ、UOCB1、K562、ALL-1、OM9;22)、卵胞癌(A2780、A2780CP3、SKOV3、OVCAR3);肺癌(A549、H520、H522);前立腺癌(DU145、PC3、LNCAP);および乳癌(SKBR3、MCF7、MDA453、MDA341、MDA435、MDA468、ZR75、BT54911)から誘導された。同様の結果を前立腺癌(図4D)および乳癌(図4E)に関して得た。図4Bにより、A2780がシスプラチン耐性A2780CP3細胞系統になる際に、A2780と対比して高CD24/低FLJ13639特性を示していることから、高CD24/低FLJ13639発現特性からのシフトが、化学治療剤耐性と関連することが立証されることに注目すべきである。
【００２５】
我々は、FLJ13639/P1に対するモノクローナル抗体も開発し、FLJ13639mRNAの低下がFLJ13639蛋白質産生の低下に対応することを立証した。特に、図16は、我々が開発したFLJ13639/P1-TAT(実施例6に記載されているもの)を用いたウェスタン・ブロットの写真画像およびFLJ13639/P1-TAT組換え蛋白質（当該ブロットの左部分）ならびにALL細胞系統（OM9;22)および対照リンパ芽球細胞系統EBV-LINを検出するためのその使用を示すものである。二量体のサイズに対応する単一のバンドが認められるが、急性白血病系統対対照系統の蛋白質発現のレベルの差は、RT-PCRにより検出される差を反映しており、これは、FLJ13639mRNAの低下がFLJ1363蛋白質の発現の低下を生じることを示す。
【００２６】
[実施例５]
本実施例により、実施例4に示す細胞系統の結果と矛盾無く、FLJ13639の低下した発現が、癌患者から得られた生物学的サンプル中のCD24の増加した発現と関連することが立証される。本実施例はまた、高CD24/低FLJ13639P1比が白血病患者の低い生存を予測することも立証する。
【００２７】
図5A〜5Cに示すデータを得るために、我々は、急性白血病、卵胞癌および肺癌からの一連の患者サンプルにおいてRT-PCRアッセイを行った。全10個の高度に侵襲性の卵胞腫瘍は、試験した10個の肺腫瘍(5C)と同様に、対応する隣接組織−これは低CD24/高FLJ13639P1特性を示す(T=腫瘍、N=隣接正常組織）−とは異なり、高CD24/低FLJ13639P1特性を示した(図5B)。急性白血病において、我々は、29個の診断サンプルにおいてCD24/FLJ13639RT-PCRアッセイを行った。サンプルの半分が、高CD24/低FLJ13639P1を示した（図5A)。
図6に示すように、29個の患者サンプルの分類に基づくカプラン-メヤー生存曲線は、高CD24/低FLJ13639/P1特性を示すサンプルが、中程度/低群（低CD24/高FLJ13639/P1を示すサンプル、並びにCD24およびFLJ13639/P1レベルが1に近い比を示すサンプル（中程度））よりも、統計学的に有意に低い生存率を有したことを示す。ログ-ランク検定により、有意なP-V値(p=0.04)が得られた。
【００２８】
[実施例６]
本実施例により、CD24のFLJ13639に対する発現レベルの比が乳癌における独立の予後因子であることが立証される。
組織
適当な臨床受託研究審査委員会承認後、1993年〜2001年の間にロスウェル・パーク・キャンサー・インスティテュートで処理された、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された乳癌腫の非選択群から、組織マイクロアレイ(TMAs)を構築した。2つの1mmの核を、各腫瘍からレシピエントブロックへ移した。
【００２９】
分子研究のために用いる組織の調達は、常套技術(即ち、Varma G等、Cancer (2005)19; 93(6): 699-708)により行った。乳癌の新鮮なサンプルを、適当な臨床受託研究審査委員会承認後、ウェスタンニューヨークおよびベラルーシからの患者から採取した。乳癌の強い家族歴を有する患者または、BRCA変異を有することが分かっている患者は除外した。全サンプルはRPCIで加工した。ベラルーシからのサンプルは、2002年8月〜2003年1月の間に収集され、急速に凍結して、ドライアイス上で米国まで輸送した。これらの患者に関するデータは、処置の時点での疾患の臨床的および病理的記載にのみ限定された(Varma G、等、Cancer、2005年9月19日; 93(6): 699-708)。RNAの定量により、3つのサンプルが変性したことが示された。ウェスタンニューヨークサンプルは、ロスウェル・パーク・キャンサー・インスティテュート(RPCI)の組織調達施設から入手された。2人の患者に関するデータは入手できなかった。
【００３０】
固形腫瘍からのRNAの抽出
液体窒素中に凍結され、-80℃で保存された新鮮な組織サンプルをTekmar Tissumizer(Tekmar, Cincinnati, OH)を用いてホモジェナイズした。全RNAの単離を、トリゾール(Trizol)試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、製造業者のプロトコルにより行った。RNAの質および量は、Agilent2100バイオアナライザー(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)並びに分光光度計により決定した。
【００３１】
逆転写およびポリメラーゼ鎖反応
逆転写を、最低1.25μgの全RNA、1μl の10mMデオキシヌクレオチドトリホスフェート(NEB、Ipswitch、MA)、1μl の0.5μg/μlオリゴ(dT)18(IDT、Coralville、Iowa)、1μl の40U/μlリボヌクレアーゼインヒビター(Fermentas、Hanover、MD)、2μl の10×反応バッファー(NEB)、および0.25μl の200U/μｌMMLVリバーストランスクリプターゼ(NEB)を含む20μl中で行った。1μl の5UμlのRNaseH(NEB)と共に20分間培養後、CD24およびFLJ13639発現レベルの同時検出を可能とする多重PCR反応を行った。プライマーは次の通りである。:CD24(300bpの増幅産物を生じる）フォーワード: 5'TCTCTTCGTGGTCTCACTCT3'（配列番号12）、リバース: 5'GATGTTGCCTCTCCTTCATC3'（配列番号13）。FLJ13639P1のためのプライマー（233bpの増幅産物を生じる）は、実施例１に記載するものと同じである。反応は、95℃にて10分間の初期変性、次いで35サイクル: 95℃にて50秒の変性、54℃にて50秒のアニーリング、および75℃にて60秒の延長から成った。アクチン増幅を、内部対照として、次のプロトコルに従い行った。:95℃にて15秒、60℃にて30秒、および75℃にて60秒。
【００３２】
組織マイクロアレイ免疫組織化学
抗原検索後、5μmのTMAセクションを、抗-CD24マウスモノクローナル抗体(クローンML5-Pharmingen, San Diego, CA)を1μg/mlで2時間用いて反応させた。シグナルを、マウスEnvisionキット(Dako, Carpentaria, CA)を用いて検出した。ジアミノベンジジン(DAB)をクロモゲンとして、およびヘマトキシリンを対比染色として用いた。CD24-ポジティブ乳癌細胞を、外部ポジティブ対照として含めた。核および細胞質染色強度を、別個に、0(なし)、1＋(弱い)、2＋(中程度)、および3＋(強い)として評価した。
【００３３】
統計学的分析
統計学的分析を、SASソフトウェア・パッケージ、バージョン9.1(Cary、NC)を用いて行った。ピアソンの相関係数、ロジスティック、累積ロジスティック、およびポアソンモデルを用いて、CD24、FLJ13639およびCD24/FLJ13639の間の関連の統計学的有意性と、臨床病理学的変動を各々評価した。単一変量生存分析を、カプラン-マイヤー法により行い、生存曲線における差をログランク検定を用いて評価した。多変量生存分析を、コックスの比例ハザードモデルを用いて行った。適合されたコックスの比例ハザードモデルは、ログ（-log(生存)）プロットの可視評価に基づき比例ハザード仮定を乱さないと見出された変数を用いて、ステイ=.1のレベルを用いる逆選択により選択した。ハザード比および95%の信頼区間は、適合モデルからのパラメータ評価に基づき算出した。
【００３４】
結果  
CD24の評価のための試験群には、154人の患者が含まれた。この患者群の平均年齢は56.9歳であった。平均腫瘍サイズは2.8cmであり、62人の患者はステージIIBまたはそれより重篤な疾患を有した。65症例はポジティブなリンパ結節を有し、患者当たり5.7のポジティブな結節を有した。乳房温存手術を95人の患者において行った。アジュバント細胞毒性療法を、147人の患者に投与した。ホルモン療法を、全部で116人のホルモンレセプターポジティブ癌を有する患者の内の108人の患者に投与した。
【００３５】
腫瘍は、細胞質配置に関して38個のサンプル(24.7%)で、核配置に関して37個のサンプル（24.0%)で、3＋と評価された。強いCD24染色（3＋として評価されるもの）の症例のみ、異常な発現レベルを有すると見なした（図7B)。
中央値追跡調査は、4.81年であった。25例の再発と、18例の癌関連死があった。CD24の核配置は、いずれの臨床情報にも関連していなかった。強い細胞質染色(3＋)は、疾患ステージ (p=0.007)およびホルモンレセプターの状態(ERp=0.03、PR p=0.04)と、統計学的に有意な関連を有した。壊死、リンパ管侵襲、グレードおよび結節の状態との統計学的関連は無かった。
【００３６】
ヒト乳癌サンプルと臨床との相関に関する分子分析
異常に発現されたCD24の臨床との関連性に関するこれらIHCの結果に基づき、我々は、CD24を過剰発現している乳房の腫瘍が実際、FLJ13639に関して低いかまたはネガティブであるかどうか、および結果として、高CD24/低/無FLJ13639分子特性が悪い結果と関連するかどうかを分析した。多重RT-PCRを40人の、主に更年期前の乳癌患者において行い、かかる患者のうちの8人がベラルーシ出身であり、残りがRPCI出身であった。ベラルーシの患者のデータは、処置の時点での疾患の臨床的および病理学的記載に限定され、追跡調査の情報は含まれなかった。RNA定量は、これらサンプルの3つが変性したことを示した。臨床情報は、RPCIからの2つのサンプルに関しては入手できなかった。これらの5つの症例は、分析から除外された。
【００３７】
診断時の年齢中央値は43歳（範囲29歳〜56歳）であった。平均腫瘍サイズは3.9cmであり、患者はほぼ共通してステージIIBの疾患を有した。28人の患者(80%)が結節ポジティブ疾患を有し、患者当たり平均2のポジティブ結節を有した。24人の患者が放射線療法を受けた。全アメリカ人の患者は全身化学療法も受け、2人は転移性疾患であり、5人はネオアジュバント療法としてであった。ホルモンレセプターの状態は、ベラルーシの患者からは入手できなかった。レセプターポジティブ疾患を有するアメリカ人女性の中で、1人のみが抗ホルモン療法で治療されなかった。42.77ヶ月の中央値追跡調査時点で、8例の再発が証明され、アメリカ人患者の9人が癌に関連する原因で死亡した。
【００３８】
多重RT-PCRの結果を、適当な内部対照を用いて半定量評価した(図7A)。分子発現データを次いで、CD24のFLJ13639に対する比として表した。より高い数値は、高CD24および低/無FLJ13639の病理学的分子発現特性に対応する。3の閾比(threshold ratio)を用いて、あまり望ましくない分子特性を有する患者を規定した。分析のために利用できる35個のサンプルのうちの14個(40.0%)が3以上のCD24/FLJ13639比を有した。CD24およびFLJ13639発現の間には、統計学的に有意な関連(p=0.01)があった。CD24は腫瘍のサイズ (p=0.03)、細胞組織グレード(p=0.04)およびポジティブな結節の数(p<0.0001)とポジティブな関連を有した。FLJ13639は、エストロゲンレセプター(ER)およびプロゲステロンレセプター(PR)の状態と統計学的に有意な関連を有した(各々p値0.02および0.03）。その発現は、核グレード(p=0.09)およびポジティブな結節の数(p<0.0002)とネガティブな関連を有した。CD24およびFLJ13639の間の比(「リスク」特性を規定するもの)は、低下した全生存の有意な予測因子(predictor)であり、単一変量生存分析で1.3のハザード比を有した(p=0.03)(95%CI: 1.0-1.6)。他の因子を調整後、増加したCD24/FLJ13639に関する多重変量分析により評価されたハザード比は、1.51(p=0.005)(95% CI: 1.1-2.0)であった。増加したリスクを規定するための閾値として3の値を用いてCD24/FLJ13639比を分類した場合、より悪性の結果を予言する能力は、単一変量分析でいっそう強い3.65になり(p=0.03)、多重変量分析で8.9のハザード比を伴った (p=0.01)。
【００３９】
[実施例６]
本実施例により、組換えFLJ13639/P1蛋白質の作成を示す。この蛋白質を作成するために、我々は、HIVウイルスからのTAT蛋白質形質導入ドメインを有するフレーム中にFLJ13639/P1cDNAをサブクローン化した。簡単には、全長のFLJ13639/P1cDNAを、FLJ13639/P1コドンスタートを除き、PCRにより増幅した。これを次いで、図8Aに示すTATベクター中にサブクローン化した。このベクターは、それ自身のスタートコドン、精製のために用いられる6×ヒスチジンタグおよびFLJ13639/P1蛋白質をコードしているFLJ13639/P1DNA配列を含む。これにより、組換え蛋白質がインビトロで細菌中で生成されること、および次いで、6×HISタグを用いてニッケルカラム上で精製することが可能となる。P1-TAT-組換え蛋白質のアミノ酸配列を、インビトロでの、レトロウイルスと比較して高効率(16)での、細胞への蛋白質の組込みのために用いることができる。加えて、このアプローチにより、細胞による蛋白質の取込み量(dosage)の分析が潜在的に可能となる。
【００４０】
我々は、BL21細菌中で組換え蛋白質を良好に発現し、さらに、NiNTAカラムを用いて(TATタグの前に位置する6×Hisタグの結合力を用いて)当該蛋白質を精製した（図8B)。この組換え蛋白質は、本明細書中、別に「P1-TAT」および「FLJ13639/P1-TAT」と称する。P1-TATのアミノ酸配列を配列番号5として示す。P1-TATをコードしているDNAの配列を配列番号14として示す。配列5'CTCGAGTCCTGTACCGCAGCG (配列番号15)を有するフォーワードプライマーおよび配列5'GAATTCTCCTATTTAAATGTTCGA (配列番号16)を有するリバースプライマーを用いて、FLJ13639P1を発現ベクターにクローン化した。P1-TAT蛋白質は、塩およびグリセロールを含むバッファー中に可溶性であり、高グレードの精製に続く注入による投与に適している。
【００４１】
[実施例７]
本実施例により、P1-TATを投与することにより、白血病および肺癌細胞におけるCD24の発現を調節できることを示す。
異なる白血病細胞系統をP1-TAT組換え蛋白質と共にインキュベートし、CD24の発現におけるP1機能の効果を評価した。特に、UoCB1細胞系統を、P1-TAT組換え蛋白質の増加量と共にインキュベートした。インキュベーションの48時間後、細胞を回収し、RNAを抽出し、次いでcDNAをRT-PCRによるCD24の発現の評価のために用いた。CD24の発現レベルは、培養物に添加されるP1-TAT蛋白質の量に逆比例した(図9A)。更なる細胞系統(OM9:22、ALL-1.K562、207)を、20μgのP1-TATとのインキュベーションの際のCD24の発現に関してアッセイし、顕著なCD24のダウンレギュレーションを示した(データは示さず)。さらに、同じタイプのアッセイを、肺癌細胞で行い、同様の結果を得た(図9B)。
【００４２】
[実施例８]
本実施例により、P1-TATを投与することにより、白血病細胞における侵襲的表現型を阻害できることを示す。
UoCB1細胞系統を、P1-TAT組換え蛋白質との処理の際の、その侵襲能力の変化に関してアッセイした。細胞を20μgのP1-TATで48時間処理し、標準的なマトリゲル侵襲アッセイを用いてアッセイした(処理有り対処理無し)。マトリゲル侵襲アッセイを行うために、細胞をマトリゲルウェルの頂部に置き、化学誘引物質(chemoattractant)(仔ウシ血清)溶液を当該マトリゲルマトリックスの下に置いた。侵襲能力を有する細胞のみが、マトリゲルを通過して、化学誘引物質溶液に「移動」する。このアッセイからの結果は、P1-TATでの処理が、UoCB1の侵襲能力を2.4の倍率まで低下することを示した(図10A)。
【００４３】
[実施例９]
本実施例により、外来性のP1-TATを投与することにより、白血病細胞および卵胞癌細胞におけるCD24の発現をダウンレギュレートできることを示す。
時間経過インキュベーション(time-course incubation)(即ち、20μgのP1-TATとの0、6、12、16、24および48時間のインキュベーション)を、20μgのP1-TATを用いて行い、当該組換え蛋白質とのインキュベーション後のCD24のダウンレギュレーションに関する時間枠(time frame)を評価した。CD24のレベルは、P1-TATとのインキュベーション後6時間で有意にダウンレギュレートされた(図11A)。加えて、CD24蛋白質の発現は、P1-TATを用いた処理の48時間後にダウンレギュレートされた(図11B)。同じ結果がOVCAR3卵胞癌細胞系統を用いて得られた(データは示さず)。
【００４４】
[実施例１０]
本実施例により、P1-TATを投与することにより、肺癌および乳癌細胞において侵襲性の表現型を阻害でき、その増殖を阻害できることを示す。本実施例に示すデータを得るために、肺癌細胞系統(図12A)(H520)およびMCF7(図12B)をP1-TATと共に、創傷治癒アッセイにおいてインキュベートした（または、対照としてインキュベートしなかった）。これは、細胞をコンフルエンスまで増殖させ、次いで、当該培養物をピペットチップで刻みつけることにより「傷」を形成することにより行った。細胞を次いでP1-TATで処理し、2つの人工的に作成された細胞集団間のギャップを閉じるその能力に関して評価した。12Aおよび12Bから認められるように、P1-TAT処理により、癌細胞の運動性が有意に低下し、これにより、その侵襲能力が大きく低下し、その増殖が阻害されたことが示される。
【００４５】
[実施例１１]
本実施例により、P1-TATを投与することにより、嫌気性解糖から好気性呼吸へエネルギー代謝を変化させることにより好気性呼吸が回復されることが示される。
ミトコンドリアは、細胞呼吸およびアポトーシスにおけるその本質的な役割に関して周知である。癌細胞は、変化したミトコンドリア呼吸を有することが公知であり、ピルビン酸が、かなり効果的にエネルギーを産生するミトコンドリアでのクレブスサイクルにて使用される代わりに、乳酸発酵経路で異化される。ヒーラー細胞は、相対的に多量の乳酸を産生することが示されており、我々は、それらが高CD24/低FLJ13639/P1特性を示すことを立証した(データは示さず)。本実施例では、ヒーラー細胞をP1-TAT組換え蛋白質と共に3日間処理した(または対照として、処理しなかった)。培養培地を乳酸レベルに関して試験した。有意に低レベルの乳酸が、P1-TAT組換え蛋白質との処理において認められた(図13)。
【００４６】
[実施例１２]
本実施例では、外来性のP1-TATの投与により、化学治療剤耐性癌細胞における化学治療剤の活性を高めることができることを示す。
ミトコンドリア膜ポテンシャル(Δψm）の崩壊(disruption)は、アポトーシスに伴う初期現象であり、シトクロムc放出の原因である幾つかの要因の一つである可能性がある(17、18)。JC-1ミトコンドリアポテンシャルセンサー(Molecular Probes, Inc)染色および蛍光顕微鏡検査を用いて、我々は、VCR(ビンクリスチン)で処理されたHL60細胞におけるΔψmを分析した。健康な細胞では、色素がミトコンドリアに蓄積し、集合し、そこで明るい赤色の蛍光を発する。アポトーシス細胞では、しかし、Δψmが変化する場合、それはミトコンドリアに入ることができず、細胞質モノマーとして明るい緑色の蛍光を発する。それゆえ、ミトコンドリアの脱分極は、赤/緑蛍光強度の割合の低下により示される。我々は、非処理のHL60細胞が、蛋白質バッファー、20μgのFLJP1-TATまたは0.1μgのVCRで処理された細胞と同様に、低い緑/赤蛍光の割合を示すことを認めた。しかし、0.1μgのVCR＋20μgのP1-TAT、1μgのVCRまたは1μgのVCR＋20μgのP1-TATでの処理に際し、緑/赤の割合の有意な増加(p<0.01)が検出される(図14AおよびB)。
【００４７】
FLJ13639/P1の回復が、低P1-TAT(高CD24)細胞の化学治療剤感受性に影響するかどうかを評価するために、HL60/VCR(ビンクリスチン耐性)細胞を、ビンクリスチンおよびFLJ13639/P1-TAT蛋白質の別個の組合せ並びに適当な対照と共にインキュベートした(図15)。常套のMTTアッセイプロトコル(Promega)による生存能力アッセイを、試験の開始後48時間の時点で行った。ビンクリスチン(0.1μM)は、HL60細胞の生存能力に殆ど影響を持たず、ビンクリスチン(1μM)は細胞の生存能力を90%まで減じた。0.1μMおよび20μgのFLJ13639/P1-TATの組合せは、ビンクリスチンの10×濃縮溶液とのインキュベーションと同様の効果を有した(図15)。
本発明を特定の具体例により記載した。しかし、組成物、方法および装置に対する通常の変更が、当該分野の専門家には明らかであり、そのような変更が本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００４８】
参考文献
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18-Heiskanen等. J Biol Chem. 1999 Feb 26;274(9):5654-8
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図1Aおよび1Bは、MUTZ5細胞系統並びに対照としてのG519およびEBN-Lin細胞系統におけるFLJ13639およびWDFY2遺伝子の各々に関するRT-PCRの結果の写真画像である。
【図２】図2は、3つのFLJ13639転写産物およびその各々のオープンリーディングフレームを図示したものである。
【図３】図3は、FLJ13639P1、P2およびP3の、細胞での位置を示す写真画像である。全3つは、ミトコンドリアの特異的マーカーであるミトトラッカーと同じパターンで、ミトコンドリアでの位置づけを示す。FLJ13638蛋白質の初めの20アミノ酸または残るアミノ酸の選択的サブクローニングにより、P1のミトコンドリアでの位置付けのための最初の20個のアミノ酸の役割が立証される。
【図４】図4Aは、一連の白血病細胞系統および対照におけるCD24およびFLJ13639/P1の発現を示すRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。;図4Bは、4つの卵胞癌細胞系統およびEBV-LIN(リンパ芽球細胞系統)からのCD24/FLJ13639/P1に関するRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。親のA2780とシスプラチン耐性由来の細胞系統A2780CP3(並びに他の耐性細胞系統)の間で特性の逆転があることに注意すべきであり、これは、高CD24/低FLJ13639発現特性からのシフトが化学治療剤耐性と関連していることを示す。;図4Cは、3つの肺癌細胞系統におけるCD24およびFLJ13639の発現を示すRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。;図4Dは、前立腺癌細胞系統におけるCD24およびFLJ13639の発現を示すRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。;図4Eは、一連の侵襲性乳癌細胞系統におけるCD24およびFLJ13639の発現を示すRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。
【図５】図5Aは、白血病患者から得られた生物学的サンプルにおけるCD24およびFLJ13639の発現を示すRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。;図5Bは、卵胞癌患者から得られた生物学的サンプルにおけるCD24およびFLJ13639の発現を示すRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。;図5Cは、肺癌患者から得られた生物学的サンプルにおけるCD24およびFLJ13639の発現を示すRT-PCR産物の電気泳動分離の写真画像である。
【図６】図6は、RT-PCRによりCD24およびFLJ13639/P1発現に関して試験した29個の患者サンプルの分類に基づくカプラン-マイヤー生存曲線を示す。
【図７】図7Aは、乳癌腫瘍の臨床サンプルからのCD24およびFLJ13639/P1cDNAのRT-PCR増幅の電気泳動分離の写真画像である。;図7Bは、組織マイクロアレイに含まれる、パラフィン包埋された侵襲性乳癌腫瘍におけるCD24染色を図示したものである。組織セクションを、市場入手可能な抗-CD24抗体を用いて染色し、CD24染色と疾患のステージの間の関連性を評価した。進行した疾患は、より強いCD24染色と関連する。左上パネル:染色なし(0);右上パネル:低い染色(1＋);左下パネル:中程度の染色(2＋);右下パネル:強い染色(3＋)
【図８】図8Aは、pTAT-HA-FLJ13639/P1ベクターを図示したものである。;図8Bは、FLJ13639/P1-TAT組換え蛋白質のSDS-PAGE分離の写真画像である。
【図９】図9Aは、FLJ13639/P1-TAT組換え蛋白質の増加量とのUoCB1細胞のインキュベーション時のCD24mRNAの発現の変化を示す写真画像である。;図9Bは、FLJ13639/P1-TATとの肺癌細胞系統のインキュベーション時のCD24の発現の変化を示す写真画像である。
【図１０】図10Aは、FLJ13639/P1-TAT組換え蛋白質(右パネル)または対照（左パネル）での処理時の、UoCB1細胞の侵襲能力の変化を示す写真画像である。;図10Bは、図10Aに示すP1-TATでの処理時の侵襲性の低下を図にまとめたものである。
【図１１】図11Aは、20μgのFLJ13639/P1-TATとの6時間、12時間、18時間および24時間のインキュベーション後のUoCB1細胞中でのCD24の発現レベルの時間経過分析を図示したものである。;図11Bは、48時間のP1-TAT処理有りまたは無しでのOM9;22ALL細胞系統における、免疫蛍光により評価されるCD24の発現の写真画像である。
【図１２Ａ】図12Aは、肺癌細胞系統にて行った創傷治癒アッセイの写真画像である。H520細胞をFLJP1-TATで処理し（または処理せずに）、細胞の運動性を光学顕微鏡によりモニターし、作成されたギャップの閉鎖を分析した。この図にて認め得るように、ギャップは5日後にほぼ完全に充填されるが、FLJ13639P1-TAT処理はギャップの充填を阻害し、これは、阻害された運動性および細胞増殖を示す。
【図１２Ｂ】図12Bは、乳癌細胞にて行った図12Aに示す創傷治癒アッセイである。
【図１３】図13は、FLJ13639P1-TAT組換え蛋白質での処理を行ったまたは行わなかったヒーラ細胞における乳酸産生を図示したものである。＊は、統計学的有意差を示す。
【図１４】図14Aは、x-軸に関して示されるような、HL60/VDR細胞(ビンクリスチン耐性細胞系統)の処理に関して測定された緑/赤蛍光強度比データを図示したものである。＊は統計学的有意性を示す。;図14Bは、低いまたは高い緑/赤の割合を示す細胞の写真画像であり、崩壊されていない(non-disrupted)ミトコンドリア膜ポテンシャルを示し（左図）、顕著な緑の染色（右図）は、崩壊されたミトコンドリア膜ポテンシャルを示す。
【図１５】図15は、FLJ13639/P1-TAT組換え蛋白質を用いた、または用いないビンクリスチンの最適未満の投与量での処理時の、HL60/VCRを用いる生存能力アッセイからの結果を図示したものである。
【図１６】図16は、FLJ13639/P1-TATMAbを用いるウエスタンブロットの写真画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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