(57)【要約】  本発明は、因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様タンパク質に対して高親和性を示す化合物およびそれらの使用に関する。本化合物は、一般式Ｂ−Ｑ−Ｘを特徴とし、式中、Ｂは、ジペプチド、トリペプチド、またはペプチド模倣物を表し；Ｑは、スペーサーを表し、Ｘは、アンカー分子を表し；ＱおよびＸは任意選択である。これらの化合物は、固体支持体材料をコーティングするために使用できる。得られた固体支持体材料は、親和性クロマトグラフィ法により因子ＶＩＩＩを精製するために使用できる。さらに、本発明の化合物は、因子ＶＩＩＩを安定化させ、その活性を増強させるために使用できる。したがって、本発明はまた、活性増大の医薬品を含有する安定化因子ＶＩＩＩを製造するための方法に関する。本発明の化合物はさらに、診断用キットおよび研究用ツールとして使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
Ｂ−Ｑ−Ｘ                  （Ｉ）
の化合物であって、
式中ＢはＺ１−Ｚ２−Ｚ３を表し、
式中Ｚ１は、炭素原子の１個以上がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子により置換されていてもよい６個から２５個の炭素原子を持つ単環式、二環式または三環式側鎖を有する天然または非タンパク質起源のアミノ酸残基あるいはその誘導体であるか、または
Ｚ１は、式
Ａｒ−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨＲ１）ｎ−（ＣＨ２）Ｏ−Ａ１            （ＩＩ）
の残基であり、
式中
Ａ１は、ＮＲ２、ＣＯ、ＯＣＯ、ＣＨＲ２、ＯまたはＳから選択される基を表し、
Ｒ１は、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ベンジル、およびＮ（Ｒ２）２から選択される基を表し、前記アルキル、フェニルまたはベンジル基が、ＡおよびＮ（Ｒ２）２から独立して選択される１つ以上の置換基を有していてもよく、２つ以上のＡおよび／または２つ以上のＲ２が、互いに同じであっても異なっていてもよく、
Ａｒは、６個から１４個の炭素原子を持つ単環式、二環式または三環式芳香族環系、飽和または部分的に不飽和Ｃ５〜１４の単環式または二環式アルキル基を有する芳香族基であり、それらの各々は、非置換であるか、又はＡ、Ａｒ１、Ｏ−Ａｒ１、Ｃ（Ｏ）−Ａｒ１、ＣＨ２−Ａｒ１、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、およびＨａｌから独立して選択される１つから３つの置換基を有していてもよく；またはＡｒはＨｅｔであってもよく；
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩから選択され、
Ａｒ１は、６個から１４個の炭素原子を持つ単環式、二環式または三環式芳香族環系を有する芳香族基、好ましくはフェニル基またはナフチル基、より好ましくはフェニル基であり、Ａｒ１はそれ自体、非置換であっても、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、およびＨａｌから独立して選択される１つから３つの置換基を有してもよく；
Ｈｅｔは、１個から３個のＮ原子および／または１個のＳ原子またはＯ原子を含み、５員環から１２員環を有する任意に置換された飽和、部分的または完全不飽和単環式または二環式へテロ環式残基を表し、
Ａは、ＣＯＯＲ２、Ｎ（Ｒ２）２または非置換であっても、ＣＯＯＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよい１〜６個のＣ原子を有する線状、分枝状または環式アルキル基を表し、
ｍおよびｏは、０、１、２、３および４から独立して選択され、
ｎは、０または１であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニルまたはベンジル、あるいはペプトイド−アミノ酸の場合、アミノ酸側鎖であり；
Ｚ２は、その側鎖に芳香族基を有さない天然または非天然アミノ酸を表し；
Ｚ３は、Ｚ１に関して上記に定義された基を表し、前記化合物内のＺ１およびＺ３の異なる位置が、それぞれ結合または遊離原子価の位置でさらなる水素原子の非存在または存在によって占められるという条件で、Ｚ１およびＺ３は、互いに同じであっても異なっていてもよく；
Ｑは、存在しないか、または１個から１００個の主鎖原子を有する有機スペーサー分子であり；
Ｘは、存在しないか、またはＳＨ、Ｎ３、ＮＨ−ＮＨ２、Ｏ−ＮＨ２、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ≡ＣＨ、ＣＲ５Ｏ、またはカルボキシルから選択される末端基を有する有機アンカー分子であり、
式中、Ｒ５は、非置換であってもＡ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２またはＨａｌにより独立して１重、２重、または３重に置換されていてもよいＨ、Ｃ１〜４アルキルまたはフェニルもしくはベンジル基から選択される、化合物ならびにその塩類。
【請求項２】
式Ｉ
Ｂ−Ｑ−Ｘ                  （Ｉ）
の化合物であって、
ＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩ様タンパク質に対する親和性を提供するジペプチド、トリペプチドまたはペプチド模倣物であるＢ、
欠損しているか、または有機スペーサー分子であるＱおよび
欠損しているか、または有機アンカー分子であるＸ、を含んでなる化合物
ならびにその塩類。
【請求項３】
Ｂが、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３である請求項２に記載の化合物であって、
天然または非タンパク質起源のアミノ酸残基またはその誘導体もしくはＡｒ−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨＲ１）ｎ−（ＣＨ２）Ｏ−Ａ１であるＺ１、
欠損しているか、天然あるいは非タンパク質起源のアミノ酸残基またはその誘導体であるＺ２、
天然または非タンパク質起源のアミノ酸残基またはその誘導体もしくはＡｒ−（ＣＨ２）ｎ−（ＣＨＲ１）ｍ−（ＣＨ２）Ｏ−Ａ１であるＺ３、
ＮＲ２、ＣＯ、ＯＣＯ、ＣＨＲ２、ＯまたはＳであるＡ１、
Ｃ１〜４アルキル、フェニルまたはベンジルであるＲ１、
非置換であるか、または非置換または置換ビフェニルが創製されるような様式で、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２あるいはＨａｌにより１重、２重、または３重で置換できる置換フェニルであり、非置換であるか、またはＡ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２あるいはＨａｌにより１重、２重、または３重に置換されるフェニルであるか、またはＨｅｔであるＡｒ、
Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであるＨａｌ、
１個から３個のＮ原子および／または１個のＳ原子またはＯ原子を含み、５員環から１２員環を有する飽和、部分的または完全不飽和単環式または二環式へテロ環式残基であり、前記へテロ環式残基が、ＣＮ、Ｈａｌ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、Ａ、ＮＯ２、ＡｒまたはＯＣＦ３により１重または２重で置換できるＨｅｔ、
ＣＯＯＨ、ＮＨ２または非置換もしくはＣＯＯＨまたはＮＨ２で置換された１〜６個のＣ原子を有するアルキルであるＡ、
０、１、２、３または４であるｍ、ｏ、
０または１であるｎ、を含んでなり、
これによって、
Ｚ１およびＺ３またはＺ１およびＺ２ならびにＺ２およびＺ３は、酸−アミド結合−ＣＯ−ＮＲ２−または−ＮＲ２−ＣＯ−を介して、優先的にはいわゆる還元ペプチド結合の−ＣＨ２−ＮＲ２−または−ＮＲ２−ＣＨ２−を介して、ならびに−ＣＯ−ＣＨＲ２−、−ＣＨＲ２−ＣＯ−、−ＣＲ２＝ＣＨ−または−ＣＨ＝ＣＲ２−結合を介して結合でき、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニルまたはベンジル、あるいはペプトイド−アミノ酸の場合、アミノ酸側鎖である、化合物。
【請求項４】
Ｑが、以下の群
［−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ］ｗ、
［−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｙＣＨ２−ＣＯ］ｗ、
［ＣＯ−（ＣＨ２）ｚ−ＣＯ−］、
［−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚ−ＮＨ−］、
［ＣＯ−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−］、
［ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−］、
アミノ酸類、ペプチド類、糖類またはポリエーテル類ならびにそれらの組み合わせの１つから選択される有機スペーサー分子であり、
式中
ｗは、それぞれ独立して１から８までであり、
ｘは、１〜５であり、
ｙは、１〜６であり、
ｚは、１〜６である、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘが、以下の群
天然または非タンパク質起源のアミノ酸、
−Ａ１−（ＣＨ２）ｐ−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ｏ−ＣＨ２−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ａ２、
＝ＣＲ２−（ＣＨ２）ｐ−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ（ＮＨＲ３）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、
＝ＣＲ２−ＣＨ（ＮＨＲ３）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ（ＣＯＲ４）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、または
＝ＣＲ２−ＣＨ（ＣＯＲ４）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２
の１つから選択される有機アンカー分子であり、
式中
Ａ１は、ＮＲ２、ＣＯ、ＣＨＲ２、ＯまたはＳであり、
Ａ２は、ＳＨ、Ｎ３、ＮＨ−ＮＨ２、Ｏ−ＮＨ２、ＮＨ２、Ｈａｌ１、Ｃ≡ＣＨ、ＣＲ５Ｏ、またはカルボキシルであり、
Ｒ２は、請求項２に定義されたとおりであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｒ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６であり、
Ｒ４は、ＯＲ６または−ＮＨＲ３であり、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたは非置換であるか、あるいはＡ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２またはＨａｌにより１重、２重、または３重で置換されたフェニルもしくはベンジルであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたは非置換であるか、あるいはＡ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２またはＨａｌにより１重、２重、または３重で置換されたフェニルもしくはベンジルであり、
ｐは、１〜２０であり、
ｑは、１〜２０であり、
ｙは、１〜６であり、
ｚは、１〜６であり、
Ｈａｌは、請求項３に定義されたとおりであり、
Ｈａｌ１は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
請求項２、３、４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚ１が、Ａｒ−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨＲ３）ｎ−（ＣＨ２）Ｏ−ＣＯ−であり、
それにより
Ａｒは
【化１】
2009518345.tif 000013
であり、ｍ、ｎおよびｏは請求項３に定義されたとおり
であることをさらに特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
ｍが１、２または３であり、ｎが０であり、ｏが０であることをさらに特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｚ１が、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、ＢｐａまたはＲ７−Ｔｒｐであり、
それにより
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ８、−ＣＯＲ８、−ＣＯＯＲ８であり、式中
Ｒ８は、Ｃ１〜４アルキルまたは非置換であるか、あるいはＡ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２またはＨａｌにより１重、２重、または３重に置換されたフェニルもしくはベンジルであり、
ＡおよびＨａｌは、請求項３に定義されたとおりであることをさらに特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ７がＨまたは−ＣＯＲ８をであり、
Ｒ８がメチルであることをさらに特徴とする請求項２乃至８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｚ２が、グルタミン酸またはアスパラギン酸側鎖を有するアミノ酸残基であることをさらに特徴とする請求項２乃至９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｚ３が、１−ナフチルアラニン、フェニルアラニン、チロシンまたはＯ−メチル化チロシン側鎖を有するアミノ酸残基であることをさらに特徴とする請求項２乃至１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｑが、［−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ］ｗであり、ｘおよびｗが請求項４に定義されたとおりであることをさらに特徴とする請求項２乃至１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
ｘが１または５であり、ｗが０または１であることをさらに特徴とする請求項２乃至１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘが、−Ａ１−ＣＨ（ＣＯＲ４）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２を示し、
式中
Ａ１はＮＨであり、
Ｒ４はＯＨまたはＮＨ２であり、
Ａ２はＳＨであり、
ｑが請求項５に定義されたとおりであることをさらに特徴とする請求項２乃至１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
ｑが、１または２であることをさらに特徴とする請求項２乃至１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｘが、−Ａ１−ＣＨ（ＮＨＲ３）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２であり、
式中
Ａ１はＣＯであり、
Ｒ３はＨであり、
Ａ２はＳＨであり、
ｑは請求項５に定義されたとおりであることをさらに特徴とする請求項２乃至１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
ｑが、１を示すことをさらに特徴とする請求項２乃至１６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記アミノ酸残基が、α−アミノ炭酸残基、β−アミノ炭酸残基、アザ−アミノ炭酸残基およびペプトイド−アミノ炭酸残基から独立して選択できることをさらに特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記アミノ酸残基が、α−アミノ酸残基から選択されることをさらに特徴とする請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
残基Ｚ１およびＺ３またはＺ１およびＺ２またはＺ２およびＺ３が、それぞれ酸−アミド結合−ＣＯ−ＮＨ−を介して互いに結合していることをさらに特徴とする請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
１つ以上のペプチド結合が、請求項２に記載されたとおり独立して修飾できることをさらに特徴とする請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
残基Ｚ１およびＺ３またはＺ１およびＺ２またはＺ２およびＺ３が、−ＣＨ２−ＮＨ−結合を介して互いに結合していることをさらに特徴とする請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
ペプチドおよび／またはペプチド模倣物の配列の方向が、反転している（「レトロペプチド」）ことをさらに特徴とする請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
疾患治療のための請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物が結合している表面を有する支持体マトリックス。
【請求項２６】
無機または有機、特にポリマー材料を含んでなる請求項２５に記載の支持体マトリックス。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の支持体マトリックスにおいて、前記化合物または請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物が、支持体マトリックスの表面、例えば樹脂に化学的に結合している支持体マトリックス。
【請求項２８】
請求項２５又は２６に記載の支持体マトリックスにおいて、前記化合物または請求項１乃至２３のいずれか一項に記載の化合物が、支持体マトリックスの表面、例えば樹脂に有機スペーサーを介して結合している支持体マトリックス。
【請求項２９】
請求項２５又は２６に記載の支持体マトリックスにおいて、前記化合物または請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物が、支持体マトリックスの表面、例えば樹脂に有機アンカー分子を介して結合している支持体マトリックス。
【請求項３０】
請求項２５又は２６に記載の支持体マトリックスにおいて、前記化合物または請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物が、支持体マトリックスの表面、例えば樹脂に有機スペーサーおよび有機アンカー分子を介して結合している支持体マトリックス。
【請求項３１】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物、請求項２５乃至３０のいずれか１項に記載の支持体マトリックスおよび必要ならば、補助的手段ならびに任意に別の手段と共に化合物に関する標識を備える診断用デバイスまたはキット。
【請求項３２】
ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質の標識、検出、同定、単離および精製するための、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項３３】
ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質を含んでなるサンプルと、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の固定化化合物を含んでなるマトリックスとを、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質と前記化合物との間の結合に好適な条件下で接触させることを含むＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質を検出、同定、単離および精製する方法。
【請求項３４】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物が、支持体上に固定化され、前記支持体が、ポリマー材料である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物が、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５，Ｐ１６、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４およびＰ２５からなる群から選択される請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリマー材料が、樹脂である請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、細胞培養上澄液である請求項３３乃至３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが、体液である請求項３３乃至３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記体液が、血液を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（１）請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の化合物、（２）前記化合物がポリマー材料上に固定化されているポリマー材料、を含むマトリックスを備えるビットまたはウェル。
【請求項４１】
前記化合物が、標識をさらに含んでなる請求項４０に記載のビットまたはウェル。
【請求項４２】
前記化合物が、前記ポリマー材料に対する化学的結合を介してポリマー材料上に固定化される請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペプチドまたはペプチド模倣物が、前記ポリマー材料に対して化学的に結合している有機アンカー分子を介してポリマー材料に固定化される請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記有機アンカー分子が、
−Ａ１−（ＣＨ２）ｐ−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ｏ−ＣＨ２−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ａ２、
＝ＣＲ２−（ＣＨ２）ｐ−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ（ＮＨＲ３）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、
＝ＣＲ２−ＣＨ（ＮＨＲ３）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、
−Ａ１−ＣＨ（ＣＯＲ４）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、
＝ＣＲ２−ＣＨ（ＣＯＲ４）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２であり、
式中Ａ１、Ａ２、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｐ、ｑおよびｙは請求項５に定義されるとおりである請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記ペプチドまたはペプチド模倣物が、有機スペーサー分子をさらに含んでなる請求項３３、３４、４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機スペーサー分子が、
以下の群
［−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ］ｗ、
［−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｙＣＨ２−ＣＯ］ｗ、
［ＣＯ−（ＣＨ２）ｚ−ＣＯ−］、
［−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚ−ＮＨ−］、
［ＣＯ−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−］、
［ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−］、
またはアミノ酸、ペプチド、糖またはポリエーテルならびにそれらの組み合わせの１つから選択され、
式中ｗ、ｘ、ｙおよびｚは請求項４に定義されるとおりである請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、小分子組成物及びタンパク質の単離および精製の分野におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
特に、本発明は、凝固因子ＶＩＩＩおよび／または因子ＶＩＩＩ様ポリペプチドに対する親和性を有する小型ペプチドおよびペプチド模倣物を備える化合物の合成および最適化に関する。これらの化合物は、それらを含んでなる生理的および非生理的溶液からの因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様ポリペプチドの標識、検出、同定、単離、好ましくは精製に有用である。さらにこれらの化合物は、本発明の方法において因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様ポリペプチドを結合するリガンドとして使用できる。
【０００３】
本発明の目的のために、本明細書に引用される全ての参照文献は、それらの全体が参照として組込まれている。
【背景技術】
【０００４】
背景
因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、血液凝固の内因性経路の必須成分である（Bolton-Maggs, P. H. B; K. J. Pasi Lancet 2002, 361, 1801）。この血漿タンパク質は、それを保護し、安定化するvon Willebrand因子（ｖＷｆ）との複合して血中に循環している。ＦＶＩＩＩ機能の遺伝子欠損は、最もよく見られる出血性疾患の１つである血友病Ａとして知られている生命を危うくする出血疾患をもたらし、これは、ＦＶＩＩＩの反復注入により処置される。血友病Ａは、因子ＶＩＩＩの内因的欠損の結果である。医療処置に関しては、患者は、血液血漿または組換え細胞由来の因子ＶＩＩＩを投与される。
【０００５】
血友病Ａ、すなわち凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）の欠損または構造的欠陥により引き起こされる遺伝性Ｘ染色体関連出血疾患には、５０００人の男性中、凡そ１人が罹患している。血友病Ａの臨床的重症度は、因子欠損の程度と相関し、１％未満のＦＶＩＩＩレベルでの重度の疾患、中等度疾患（１〜５％のＦＶＩＩＩレベル）および軽度疾患（５〜２５％ＦＶＩＩＩレベル）として分類される。この疾患は、自然発生的出血、ならびに外傷または手術の場合、制御不能な出血により特徴付けられる。血友病Ａの他の臨床的特徴は、急性再発性疼痛性の関節血症であり、これは、軟骨および隣接骨の進行的破壊、筋血腫、脳内出血および血尿を特徴とする慢性関節症に進行し得る（Klinge, J.; Ananyeva, N. M.; Hauser, C. A.; Saenko, E. L. Semin. Thromb. Hemost. 2002, 28, 309-322）。
【０００６】
血友病Ａは、ＦＶＩＩＩを発現するヒト血液血漿または組換え細胞に由来するＦＶＩＩＩの反復注入により処置される。
【０００７】
ＦＶＩＩＩ分子（約３００ｋＤａ、２３３２のアミノ酸残基）は、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２の順序で配列される３つの相同性Ａドメイン、２つの相同性Ｃドメインおよび独特なＢドメインからなる。血漿中への分泌前に、ＦＶＩＩＩは、細胞内でＢ−Ａ３接合部での開裂により生じるＭｅ２＋−結合ヘテロ二量体に処理される。この開裂により、Ａ１（１−３７２）、Ａ２（３７３−７４０）およびＢドメイン（７４１−１６４８）からなる重鎖（ＨＣｈ）ならびにＡ３（１６９０−２０１９）、Ｃ１（２０２０−２１７２）およびＣ２（２１７３−２３３２）ドメインからなる軽鎖（ＬＣｈ）が生じる。生じたタンパク質は、Ｂドメイン内での多くのさらなる開裂のためにサイズが非相同的であり、異なる長さのＢ−ドメインを有する分子を与える。Ａ１（アミノ酸３３７〜３７２）およびＡ２（アミノ酸７１１〜７４０）のＣ−末端部分およびＬＣｈ（アミノ酸１６４９〜１６８９）のＮ−末端部分は、多数の負電荷残基を含有し、酸性領域（それぞれ、ＡＲ１、ＡＲ２およびＡＲ３）と呼ばれる。
【０００８】
ＦＶＩＩＩのより良好な供給に対する既存の要求に対処するため、ならびにウィルスおよびプリオン汚染の危険性を軽減するために、最近数年間、組換えＦＶＩＩＩの使用が大いに増加している（Ananyeva N., Khrenov A., Darr F., Summers R., Sarafanov A., Saenko E. Expert Opin. Pharmacother/ 2004; 1061-1070）。１９８４年に因子ＶＩＩＩ遺伝子が単離されて以来（Vehar, G. A.; Keyt, B.; Eaton, D.; Rodriguez, H.; O'Brien, D. P.; Rotblat, F.; Oppermann, H.; Keck, R.; Wood, W. I.; Harkins, R. N.; Nature 1984, 312, 337-342; Toole, J. J.; Knopf, J. L.; Wozney, J. M.; Sultzman, L. A.; Buecker, J. L.; Pittman, D. D.; Kaufman, R. J.; Brown, E.; Shoemaker, C.; Orr, E. C. Nature 1984, 312, 342-347)、新規な組換えＶＩＩＩ分子の製剤が大いに改善されている。さらに、因子ＶＩＩＩの構造−機能関係のより深い洞察ならびに分子生物学におけるより精巧な技術により、組換え因子ＶＩＩＩの生成において新たな可能性が開かれている。
【０００９】
幾つかの治療用組換えＦＶＩＩＩ産物が、凍結乾燥濃縮物として現在利用できる。
【００１０】
（１）RECOMBINATE（Baxter）およびBIOCLATE（Centeon）の合成のために、ＦＶＩＩＩおよびｖＷｆに関する遺伝子が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に挿入されている。ｖＷＦは、細胞培養においてＦＶＩＩＩに対する安定化剤として作用する。マウスモノクローナル抗体を用いる単一の免疫親和性クロマトグラフィに次いで、精製処理を完了させるために２つのイオン交換クロマトグラフィステップにより組換えタンパク質が精製される。最後に精製組換えＦＶＩＩＩを、低温殺菌されたヒトアルブミンの添加により安定化させる。この精製処理は、別個のウィルス不活化ステップを含まない（Kaufman, R. J.; Wasley, L. C.; Furie, B. C.; Furie, B.; Shoemaker, C. B. J. Biol. Chem. 1986, 261, 9622-9628）。
【００１１】
（２）KOGENATE（Bayer）およびHELIXATE（Centeon）の場合、因子ＶＩＩＩに関する遺伝子が、新生児ハムスター腎（ＢＨＫ）から確立された細胞に挿入されている。分泌された組換えＦＶＩＩＩは、２つのイオン交換クロマトグラフィゲルろ過およびサイズ排除クロマトグラフィ、ならびにマウスモノクローナル抗体を用いる二重の免疫親和性クロマトグラフィなど、多数の精製ステップにより処理される。次に精製タンパク質を、低温殺菌されたヒトアルブミンにより安定化させる。ウィルス不活化は、加熱処理により達成される（Addiego, J. E. Jr.; Gomperts, E.; Liu, S. L.; Bailey, P.; Courter, S. G.; Lee, M. L.; Neslund, G. G.; Kingdon, H. S.; Griffith, M. J. Thrombosis and haemostasis 1992, 67, 19-27）。
【００１２】
（３）KOGENATE FS（Bayer）は、第二世代製品として開発された。KOGENATEとは異なり、KOGENATE FSは、組換えインスリンおよびヒト血漿タンパク質液（ＨＰＰＳ）を含有するが、動物源に由来するタンパク質を含有しない細胞培養培地中で培養される。
【００１３】
（４）REFACTO（Wyeth-Ayerst Pharmacia and Upjohn）は、最初に認可されたＢドメイン削除組換えＦＶＩＩＩ分子（ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ）である。単鎖１７０  ｋＤａポリペプチドをコードするｒ−ＦＶＩＩＩ  ＳＱ遺伝子は、Ｂ−ドメインをコードする領域の大部分を除くことにより完全長ｃＤＮＡから得られた。ｒ−ＦＶＩＩＩ  ＳＱベクター系をＣＨＯ細胞に導入し、ヒトアルブミンおよび組換えインスリンを添加した無血清培地中で培養した。この精製は、ＦＶＩＩＩの重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫親和性を含む５つの異なるクロマトグラフィステップおよび化学的な溶媒／界面活性剤ウィルス不活化ステップを含む（Eriksson, R. K.; Fenge, C.; Lindner-Olsson, E.; Ljungqvist, C.; Rosenquist, J.; Smeds, A. L.; Ostlin, A.; Charlebois, T.; Leonard, M.; Kelley, B. D.; Ljungqvist, A. Sem. Hematol. 2001, 38, 24-31）。
【００１４】
安全性を向上するために、動物またはヒトタンパク質のいずれの使用を避けることが、ＦＶＩＩＩ産物の開発において重要である。現在認可されている組換えＦＶＩＩＩ製剤とは対照的に、次世代のＦＶＩＩＩ産物は、ヒトまたは動物起源のいずれの成分をも含有しない培養培地にＦＶＩＩＩの産生方法を適応させることになろう。したがって、最終目標は、動物またはヒトの原材料に由来する成分との接触を完全に回避するところまでＦＶＩＩＩの産生を改善することである。また、ＦＶＩＩＩに関する精製法を改善する必要性もある。精製ステップ数、および関連コストを減少させる、血液または細胞培養上澄液などの種々の溶液から直接得られた高純度で活性のＦＶＩＩＩを提供する方法が、望まれ続けている。ＦＶＩＩＩをより迅速に、より効率的でコスト効率の良い方法で得るための新しい方法は、現在の技術においてはまだ実現されていない。
【００１５】
因子ＶＩＩＩは通常、リガンドとしてモノクローナル抗体を使用して親和性クロマトグラフィにより濃縮される（Amatschek, K.; Necina, R.; Hahn, R.; Schallaun, E.; Schwinn, H.; Josic, D.; Jungbauer, A. J. High Resol. Chromatogr. 2000, 23, 47-58）。全米血友病協会および世界血友病連盟の医療審議会の最近の報告書によれば、組換え産物の製造工程からヒトおよびウシタンパク質を排除するためにあらゆる努力が成されるべきである（Medical and Scientific Advisory Council（MASAC）文書#151《MASAC RECOMMENDATIONS CONCERNING THE TREATMENT OF HEMOPHILIA AND OTHER BLEEDING DISORDERS》、National Hemophilia Foundationのウェブサイトから入手できる）。
【００１６】
親和性リガンドポリペプチド類のパートナーとしてのオリゴペプチドおよびポリペプチドの使用が示唆されている（各々が参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている国際公開第９９１４２３２号明細書；または米国特許出願公開第２００３１６５８２２号明細書を参照）。それにもかかわらず、この方法には依然として不利な点がある。第一に、オリゴペプチド類の大規模な合成および精製は、大変なことであり、極めてコスト集約的である。さらに、血液または細胞培養に由来する原材料が、アフィニティーカラムに適用される場合、オリゴペプチド類は、タンパク質分解に影響されやすい上に、プロテアーゼの存在を完全に避けることはできない。このため、急速に非能率的となり、アフィニティー精製ステップの選択性が減少することとなり、さらに溶出された因子サンプルの純度および半減期ならびに高価なカラム材料の半減期が減少することとなる。
【００１７】
このように、現在市販されている組換えＦＶＩＩＩ製剤とは異なり、本発明は、ヒトまたは動物起源のいずれの成分も無い培養倍地中で次世代の製品を調製するための化合物および方法に関するものである。さらに、本発明はまた、血漿由来のＦＶＩＩＩ製剤の精製にも関する。
【００１８】
我々の発明は、モノクローナル抗体に代わることができ、上記の既知のオリゴペプチド類と比較してタンパク質分解安定性を改善させた、化学的に合成された独特な高親和性ペプチド類およびペプチド模倣物を含んでなる化合物を含む。さらに、我々の化合物は、大規模な溶液合成に好適であり、したがって製造コストを最少にするであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の概要
本発明は、ペプチド類および／またはペプチド模倣物を含む特定の化合物に関する。これらの化合物は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連ポリペプチド類を結合し、および／または遊離させる特定の性質を示し、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連ポリペプチド類のアフィニティー分離のためのリガンドとして役立ち得る。
【００２０】
特定の実施形態において、ペプチド類および／またはペプチド模倣物を含む本発明の化合物は、ＦＶＩＩＩのクロマトグラフィ精製に十分な親和性を有するＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩ関連タンパク質を結合するジペプチド類、トリペプチド類またはペプチド模倣物である。
【００２１】
一定の実施形態において、本化合物は、標的因子ＶＩＩＩポリペプチド類の結合について顕著な特徴、ならびに標的ポリペプチド類の遊離（溶出）のための特定の特徴（すなわち、特定の組成および適用ｐＨならびに溶出用緩衝液）を示す結合分子である。緩和な条件下での産物の溶出を促進するために、既存の化学的方法により化合物を容易に修飾できる。このような修飾は、従来から使用される抗体に対しては技術的に実行可能ではない。
【００２２】
さらなる実施形態は、固定化化合物、好ましくはペプチドおよび／またはペプチド模倣物を含む支持体材料としての不活性マトリックスに関する。特定の実施形態において、支持体材料は、ポリマー材料である。さらに特定の実施形態において、化合物を、支持体マトリックスに化学的に結合させる。別の特定の実施形態において、化合物は、アンカー分子を介して支持体マトリックスに化学的に結合させる。さらに特定の実施形態において、化合物は、スペーサー分子を介して支持体マトリックスに化学的に結合させる。化合物は、アンカー分子ならびにさらなるスペーサー分子を介して支持体マトリックスに化学的に結合させることもまた考慮されている。
【００２３】
本発明は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質に特異的に結合する、マトリックス上に固定化された本発明の化合物を含む診断用デバイスまたはキットに関する。一定の実施形態において、化合物は直接的、または例えば、樹脂などのポリマー材料であり得るマトリックス上に固定化された係留化合物および／またはスペーサー分子を介するものである。
【００２４】
さらに別の実施形態において、化合物は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質の標識として方法に使用される。
【００２５】
本発明の実施形態において、化合物は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質の同定および／または精製の方法に使用される。
【００２６】
本発明は、さらに疾患の治療における本発明の化合物の医療使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
親和性クロマトグラフィは、タンパク質などの複雑な分子の精製に用いられる最先端のの手法であり、十分に確立された強力な技法である（Jack, G. W.; Beer, D. J. Methods Mol. Biol. 1996, 59, 187-196）。親和性クロマトグラフィは、樹脂に固定されたリガンドと標的分子との間の強い相互作用により、夾雑タンパク質から優れた選択性により標的タンパク質を単離する独特の可能性を提供する。通常、リガンド類は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかである。モノクローナル抗体は、単一特異的であり、精度よく作製できることからモノクローナル抗体が好ましい（Scopes, R. K. Protein purification: Principles and Practice. Springer, New York, 1994）。小型の化学リガンドは、アフィニティー分離において今まで限定された適用のみであった。しかしながら、組み合わせライブラリーの使用により、ペプチドリガンド類に関する免疫親和性クロマトグラフィ法のレパートリーは拡大している（Lowe, C. R. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 248-256）。生物学的または化学的系に基づく組み合わせ方法の使用により、標的タンパク質を捕捉し、緩和な条件下で溶出させるために適度な、またはさらに高い結合親和性を提供する独特なペプチド類が生成されている。
【００２８】
Huang, Ping Y.らは、例えば、「Bioorganic & Medicinal Chemistry」, Vol. 4, No. 5. pp. 699-708, 1996にフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の免疫親和性クロマトグラフィ精製に関する固定化ペプチド類の使用を記載している。分子量が、５０万から１千万ダルトンの巨大なサイズの間の範囲にあることから、多量体ｖＷＦの精製は大きな課題となる。フォン・ヴィレブランド因子は、血液凝固カスケードに直接関与する多機能血漿タンパク質である。これは、出血の正常な制止に導く事象において顕著な役割を有する。ｖＷＦとＦＶＩＩＩとの間の相互作用により、ＦＶＩＩＩが安定化され、輸送される。２つの高親和性結合部位により、効率的な捕捉が確保される（Sadler, J. E.; Mannucci, P. M.; Berntorp, E.; Bochkov, N.; Boulyjenkov, V.; Ginsburg, D.; Meyer, D.; Peake, I.; Rodeghiero, F.; Srivastava, A. Thromb. Haemost., 2000,84,160-174）。
【００２９】
ＦＶＩＩＩは、血液凝固カスケードにおいて重要な機能を果たし、大きな治療的重要性を有する大型で複雑なタンパク質である。遺伝子変異により引き起こされたインビボＦＶＩＩＩ産生の欠失により、ヒトＦＶＩＩＩの精製製剤の注入により治療される血友病をもたらし得る（Lee, C. Thromb. Haemost. 1999, 82, 516-524）。血友病患者の治療のためのヒトＦＶＩＩＩの現供給源は、血漿由来のＦＶＩＩＩおよび組換えＦＶＩＩＩであり、後者はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Kaufman, R. J.; Wasley, L. C.; Dorner, A. J. J. Biol. Chem. 1988, 263, 6352-6362）およびベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（Boedeker, B. D. G. Sem. Thromb. Hemost. 2001, 27, 385-394）において合成される。高純度判定基準に加えて、免疫学的およびウィルス安全性を確保することは重要である。
【００３０】
クロマトグラフィ技法を用いるヒトＦＶＩＩＩの精製に関して幾つかの公知の方法がある。免疫親和性クロマトグラフィ樹脂の使用は、全ての組換えＦＶＩＩＩおよび多くの血漿由来のＦＶＩＩＩ製品に関する通常の製造法である。親和性クロマトグラフィを含む現在の製造法は、ＦＶＩＩＩに特異的であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する（Lee, C., Recombinant clotting factors in the treatment of hemophilia, Thromb. Haemost. 1999, 82, 516-524）。製造目的のために、ＦＶＩＩＩに対する抗体は、マウスハイブリドーマ細胞系により製造され、次いでクロマトグラフィ用樹脂に固定化される。現在の産業用ＦＶＩＩＩの精製には、ＤＮＡおよび宿主細胞などの工程関連不純物の優れた除去を提供するｍＡｂ免疫アフィニティーステップが利用される。
【００３１】
しかしながら、固定されたモノクローナル抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィの現在の工程に関連した、種々の懸念と限界がある。不利な点の１つは、分子サイズが巨大な少数の抗体分子が、樹脂表面のかなりの部分を覆うことから、樹脂の容量に限界がある。さらに、抗体の調製は、長時間かかる高価な方法であり、抗体の純度および活性は、各反復調製に依って変動する。抗体は、ウィルス、特にレトロウィルスが、標的タンパク質の製造工程に導入され得るという、低いがゼロではない危険性に抗体が影響されやすくする、製造宿主としてのハイブリドーマ培養により製造される。最後に、支持体マトリックス、すなわち樹脂からの抗体の漏出が、産物の重大な汚染をもたらし、結果として免疫原性による産物の損失をもたらす可能性がある。したがって、現在の工程を、より正確でコスト効率の良い工程により置き換えるのに十分な動機が存在する。本発明は、免疫親和性クロマトグラフィ精製法において、化学的に合成された小型ペプチドまたはペプチド模倣誘導体である化合物を提供することによりこの必要性を満たし、記載された困難の幾つかの減少または除去を提供する。
【００３２】
Pflegertら（J. Peptide Res. 2002, 59, 174-182）は、ＦＶＩＩＩに対する高親和性を有する種々のオクタペプチドの開発を報告している。必須アミノ酸配列は、ペプチド類のＣ−末端側に配置されるＷＥＹであることが判明している。
【００３３】
小型ペプチドまたはペプチド模倣誘導体を含む本発明の化合物は、生成物へ漏出した場合に免疫応答を刺激する可能性が低いことから、リガンドとしての利点を有している。小型ペプチドまたはペプチド模倣誘導体はまた、抗体と比較してはるかに安定である。別の利点としては、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）下、それらを、無菌的に大量に容易に製造できることから、製造コストがかなりより低いことである。小型ペプチドまたはペプチド模倣誘導体および本発明の方法の使用により、動物由来またはヒト由来でない原材料を用いる精製産物を得られる。最後に大切なことであるが、本明細書に記載された精巧な化学合成により工程が洗練され、標的タンパク質に対する小型ペプチドまたはペプチド模倣誘導体の親和性を改善する。
【００３４】
したがって、本発明は、当該技術分野の通常の技術者に、一般的に採用されているＦＶＩＩＩの精製方法を改善する化合物および方法を提供する。
【００３５】
本明細書に記載されるように、本発明は、ＦＶＩＩＩの免疫アフィニティー精製のためのマウスモノクローナル抗体の使用が避けられるＦＶＩＩＩ精製法を提供する。本発明は、モノクローナル抗体に取って代わることができ、上記の既知のオリゴペプチド類と比較してタンパク質分解の安定性を改善した、化学的に合成された独特な高親和性ペプチドおよびペプチド模倣物を含む。このことにより、生物学的安全性に関する最新の要件が満たされるであろう。さらに、我々の化合物は、大規模な溶液合成に好適であり、したがって親和性リガンドの製造コストを最小にする。
【００３６】
本発明は、このようなタンパク質を含有する溶液から活性な因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様タンパク質を検出、同定、単離および精製ならびに標識するためのリガンドとしての新規な化合物、好ましくはジペプチド類、トリペプチド類およびペプチド模倣物を含んでなる。本発明の因子ＶＩＩＩ結合分子は、顕著な安定性ならびに因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様タンパク質に対する高い親和性を示す。
【００３７】
他に明記または指定されない限り、本明細書に用いられる用語の「因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様タンパク質」は、任意の動物由来の任意の因子ＶＩＩＩタンパク質分子、任意の組換えまたはハイブリッドの因子ＶＩＩＩまたは任意の修飾因子ＶＩＩＩを包含する。好ましい実施形態において、このような「因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様タンパク質」は、因子ＶＩＩＩの天然ヒト形態の活性の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも８０％の活性（例えば、Bowie, E. J. W., and C. A. Owen, in Disorders of Hemostasis (Ratnoff and Forbesら) pp. 43-72, Grunn & Stratton, Inc. Orlando, Fla. (1984)に記載される標準的な１段階凝固アッセイにより測定される）を特徴とする。
【００３８】
因子ＶＩＩＩ様タンパク質はまた、任意の供給源の因子ＶＩＩＩタンパク質のドメイン、断片およびエピトープ、ならびにそれらのハイブリッド組み合わせを包含する。用語「因子ＶＩＩＩ様タンパク質」は、研究目的のためのプローブとして、または診断用試薬として使用できる因子ＶＩＩＩの断片をさらに含むが、このような断片は血液凝固活性を殆ど示さないか、全く示さない場合もある。このようなタンパク質またはポリペプチド類は、好ましくは少なくとも５０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００のアミノ酸を備える。因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様タンパク質の好ましいドメイン、エピトープおよび断片は、その軽鎖、ドメインＡ３〜Ｃ１、Ｃ１〜Ｃ２、Ａ３、Ｃ１、またはＣ２および個々のドメインＡ３、Ｃ１ならびにＣ２を含有する軽鎖の一部を含む。本発明により精製できる因子ＶＩＩＩおよび因子ＶＩＩＩ様タンパク質としてはまた、米国特許第７，１２２，６３４号明細書、米国特許第７，０４１，６３５号明細書、米国特許第７，０１２，１３２号明細書、および米国特許第６，８６６，８４８号明細書に記載された全ての組換えタンパク質、ハイブリッド、誘導体、変異体、ドメイン、断片、およびエピトープが挙げられ、これらの全ては、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書の他に明記されない限り、用語「アミノ酸」は、少なくとも１つのアミノ基および少なくとも１つの酸性基を含む任意の有機化合物を包含する。アミノ酸は、天然化合物であり得るか、または合成起源であり得る。アミノ酸は、少なくとも１つの第一級アミノ基および／または少なくとも１つのカルボン酸基を含有することが好ましい。また、用語「アミノ酸」とは、このようなアミノ酸化合物から誘導され、ペプチド結合またはペプチド模倣結合により隣接残基に結合されるペプチドおよびタンパク質などのより大きな分子に含まれる残基のことである。
【００３９】
本発明は、血友病Ａの治療および研究に有用なタンパク質および関連物質の商業的量の迅速分離および精製を確保する、コスト効率の良い手段を提供する。
【００４０】
本発明は、式Ｉ
（Ｉ）                          Ｂ−Ｑ−Ｘ                  
のペプチドおよび／またはペプチド模倣物を含んでなる化合物であって、
式中
Ｂは、ＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩ様タンパク質に対する親和性を提供するジペプチド、トリペプチドまたはペプチド模倣物であり、
Ｑは、欠落しているか、または有機スペーサー分子であり
Ｘは、欠落しているか、または有機アンカー分子である、
化合物ならびにそれらの塩類に関する。さらに、本発明に係る化合物は、互いに同じであっても異なっていてもよい２つ以上のＢ基を含む。これらのＢ基は、同じスペーサーＱに結合でき、それによって２から４の範囲にあるｒを有する一般式（Ｂ）ｒ−Ｑ−Ｘにより表される化合物を形成できる。あるいは、それらは、さらなるスペーサーＱ（個々のスペーサーＱは、互いに同じであっても異なっていてもよい）によって互いに結合でき、それによって２から４の範囲にあるｓを有する一般式（Ｂ−Ｑ）ｓ−Ｘ型のオリゴマー化合物を形成できる。
【００４１】
本発明の別の実施形態によれば、そのようなもののＢ基、またはＢ基およびＱ基が一緒になって、またはＢ基およびＸ基が一緒になって、またはＢ基およびＱ基およびＸ基が一緒になって、サイクルを形成できる。このサイクルは、任意に置換されたアルキレン基、アミノ酸、ジ−またはトリペプチド、およびそれらの組み合わせなどの有機二価基から任意に選択されるさらなる環形成成分を、任意に含みうる。
【００４２】
用語「ペプチド模倣物」は、親ペプチドの生物学的作用を模倣できるかまたは拮抗できる非ペプチド構造成分を含有する化合物を含む。このような化合物は、選択的に、わずかな（または皆無の）のペプチド結合を含む。本発明の好ましい実施形態は、Ｒ２が一般式（ＩＩ）に関して下記に定義される−ＣＯ−ＮＲ２−、−ＮＲ２−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＮＲ２−または−ＮＲ２−ＣＨ２−、−ＣＯ−ＣＨＲ２−、−ＣＨＲ２−ＣＯ−、−ＣＲ２＝ＣＲ２−および−ＣＲ２＝ＣＲ２−からなる群から選択される１つ以上の官能基により１つ以上のペプチド結合を置換することによって本発明のジペプチド類およびトリペプチド類から誘導されるペプチド模倣物に関する。−ＮＲ２−基を含有する選択肢において、置換基Ｒ２は、それぞれのアミノ酸（ペプトイドアミノ酸）の側鎖であり得ることを理解されたい。この場合、隣接Ｃαは、側鎖を有しない。一方、他の置換基Ｒ２は、Ｃαに結合された側鎖に付加して存在する。さらに、２つ以上のＲ２が存在する場合、個々のＲ２は、互いに同じであっても異なっていてもよいことを理解されたい。
【００４３】
ペプチド模倣物の特に好ましい基は、（下記に定義される）残基Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３を含有するこれらの化合物を含んでなり、（少なくとも）Ｚ２とＺ３との間のペプチド結合は、−ＣＨ２−ＮＲ２−または−ＮＲ２−ＣＨ２−、−ＣＲ２＝ＣＲ２−および−ＣＲ２＝ＣＲ２−からなる群から選択される。
【００４４】
「親和性（アフィニティー）」は、原子間または分子間引力であり、それらの組み合わせを維持するのを補助する。このことは、親和性クロマトグラフィに関する基本である。本発明の文脈において、ＦＶＩＩＩに対する結合が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも４０％である下記の試験プロトコルに従って測定された場合、ペプチドまたはペプチド模倣物はＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ様タンパク質に対する親和性を示すように考慮されている。この結合程度は、１２５Ｉ標識ＦＶＩＩＩを用いた下記の実施例１に記載された実験を再現することにより測定される。
【００４５】
本発明のペプチドまたはペプチド模倣誘導体Ｂ（本明細書に用いられる用語の「ペプチド模倣物」および「ペプチド模倣誘導体」は、交互に使用される）は、好ましくは、支持体マトリックスの表面に化学的に結合でき、それによってペプチドで覆われた支持体マトリックスを形成できる。これは、アンカー分子Ｘおよび／またはスペーサー分子Ｑの補助により、またはＱおよびＸを欠く場合、好ましくは、化合物ＢのＳＨ、Ｎ３、ＮＨ−ＮＨ２、Ｏ−ＮＨ２、ＮＨ２、−ＣＨ２−Ｌ、Ｃ≡ＣＨ、カルボニルまたはカルボキシル基により遂行されることが好ましい。ここでＬは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉのような遊離基を含む。
【００４６】
本発明はまた、ペプチドで覆われた支持体マトリックスに関する。
【００４７】
用語「化学結合」は、２個（またはそれ以上）の原子間、または１個（またはそれ以上）の原子（またはそれ以上）と１つ（またはそれ以上）の化合物（またはそれ以上）との間、または２つ（またはそれ以上）の化合物間の共有結合性、イオン性、疎水性および／または他の複雑な相互作用、ならびにそれらの混合および組み合わせを含む。
【００４８】
支持体材料は、無機または有機、特にポリマー材料を含む。したがって、生体高分子のクロマトグラフィに通常使用される同じポリマー材料（すなわち、線状多糖類）を利用できる。特に、親水性表面を用いるポリマー類は、クロマトグラフィ支持体材料、すなわち樹脂として好適である。例えば、Toyoperral AF-Epoxy-650M樹脂が使用される。
【００４９】
このような支持体材料はまた、例えば、式Ｉに従ったペプチドまたはペプチド模倣物のような化合物の固定化のためのＳＨ、Ｎ３、ＮＨ−ＮＨ２、Ｏ−ＮＨ２、ＮＨ２、−ＣＨ２−Ｌ、Ｃ≡ＣＨ、エポキシ、カルボニルまたはカルボキシル基のような、さらなるアンカー分子の提供と共に供されることが可能である。
【００５０】
本発明の好ましい化合物は、ＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩ様タンパク質と相互作用するという事実により、ペプチドまたはペプチド模倣誘導体を含む好ましい化合物は、診断用デバイスおよびキットに好適である。好ましい診断用デバイスまたはキットは、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ関連タンパク質に対して高親和性を有する少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの化合物が任意に化学的に結合できる支持体マトリックス、および必要ならば、他の試薬を備える。
【００５１】
本発明の化合物、好ましくは、ペプチドまたはペプチド模倣誘導体とＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ様タンパク質との反応結果を追跡するために、化合物は標識される。例えば、放射性マーカーの使用、蛍光リガンドの使用、アビジン／ストレプトアビジン系の使用、またはＥＬＩＳＡ技法に一般的である、着色反応を引き起こす酵素の使用など、化合物を標識するための幾つかの選択肢がある。
【００５２】
本発明は、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ様タンパク質の標識、検出、同定、単離および／または精製に好適であるペプチドおよびペプチド模倣誘導体を含む化合物に関する。
【００５３】
上記および下記に示されたアミノ酸の略字は、以下のアミノ酸残基の略である：
Ａｂｕ              ４−アミノ酪酸
Ａｈａ              ６−アミノヘキサン酸
Ａｌａ              アラニン
Ａｓｎ              アスパラギン
Ａｓｐ              アスパラギン酸
Ａｒｇ              アルギニン
Ｂｐａ              ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン
Ｃｙｓ              システイン
Ｄａｂ              ２，４−ジアミノ酪酸
Ｄａｐ              ２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｇｌｎ              グルタミン
Ｇｌｐ              ピログルタミン酸
Ｇｌｙ              グリシン
Ｈｉｓ              ヒスチジン
ホモ−Ｃｙｓ        ホモ−システイン
ホモ−Ｐｈｅ        ホモ−フェニルアラニン
ＩＡＡ              ２−（インドール−３−イル）酢酸
ＩＢＡ              ４−（インドール−３−イル）酪酸
ＩＰＡ              ３−（インドール−３−イル）プロピオン酸
Ｉｌｅ              イソロイシン
Ｌｅｕ              ロイシン
Ｌｙｓ              リシン
Ｍｅｔ              メチオニン
１−Ｎａｌ          １−ナフチルアラニン
２−Ｎａｌ          ２−ナフチルアラニン
Ｎｌｅ              ノルロイシン
Ｏｒｎ              オルニチン
Ｐｈｅ              フェニルアラニン
Ｐｈｇ              フェニルグリシン
４−Ｈａｌ−Ｐｈｅ  ４−ハロゲン−フェニルアラニン
Ｐｒｏ              プロリン
Ｓｅｒ              セリン
Ｔｈｒ              トレオニン
Ｔｒｐ              トリプトファン
Ｔｙｒ              チロシン
Ｖａｌ              バリン
【００５４】
さらに以下の略字が、下記に使用される：
Ａｃ                  アセチル
ＢＯＣ                ｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ                ｔ−ブチル
ＣＢＺまたはＺ        ベンジルオキシカルボニル
ＤＣＣＩ              ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ            Ｎ−エチルジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ                ジメチルホルムアミド
ＥＤＣＩ              Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
Ｅｔ                  エチル
Ｆｍｏｃ              ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ              １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｍｅ                  メチル
ＭＢＨＡ              ４−メチル−ベンズヒドリルアミン
Ｍｔｒ                ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニル−スルホニル
ＨＡＴＵ              Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＮＳｕ            Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＯｔＢｕ              ｔ−ブチルエステル
Ｏｃｔ                オクタノイル
ＯＭｅ                メチルエステル
ＯＥｔ                エチルエステル
ＰＯＡ                フェノキシアセチル
Ｐｂｆ                ペンタメチルベンゾフラニル
Ｐｍｃ                ２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
Ｓａｌ                サリシロイル
Ｓｕ                  スクシニル
ＴＩＰＳ              トリイソプロピルシラン
ＴＦＡ                トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ                トリメチルシリルブロミド
Ｔｒｔ                トリチル（トリフェニルメチル）
【００５５】
式Ｉの化合物の構成単位（すなわち、上記のアミノ酸）が、複数の鏡像異性体の形態で生じ得る場合、これら全ての形態およびそれらの混合物（例えば、ＤＬ体）もまた含まれる。
【００５６】
さらに、アミノ酸は、例えば、式Ｉの化合物の構成成分として、それ自体が知られている対応する保護基を伴って提供できる。好ましい基は、ＡｓｐおよびＧｌｕの誘導体、特に側鎖のメチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、ｔ−ブチル−、ネオペンチル−またはベンジルエステルまたはＴｙｒの誘導体、特に側鎖のメチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、ｔ−ブチル−、ネオペンチル−またはベンジルエステルである。さらにこの化合物は、本発明の化合物の調製に関連して下記の１つ以上のさらなる保護基を有することができる。
【００５７】
さらに、Ｎ−末端修飾またはカルボキシ末端修飾誘導体などの構造成分も、本発明の一部である。好ましい基は、アミノ末端メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、ｔ−ブチル−、ネオペンチル−、フェニル−またはベンジル基、ＢＯＣ、Ｍｔｒ、ＣＢＺ、Ｆｍｏｃのようなアミノ末端基、特にアセチル、ベンゾイルまたは（インドール−３−イル）カルボン酸基、さらにカルボキシ末端メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、ｔ−ブチル−、ネオペンチル−またはベンジルエステル、メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、ｔ−ブチル−、ネオペンチル−またはベンジルアミド、特にカルボキサミド類である。
【００５８】
アルファアミノ基は、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）およびｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニル−イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）などの置換ベンジルオキシカルボニルなど、芳香族ウレタンタイプ保護基；ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、およびイソプロピルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタンタイプ保護基から選択される適切な保護基により保護できる。本明細書において、Ｆｍｏｃが、アルファアミノ保護のために最も好ましい。
【００５９】
本発明に係るペプチドおよびペプチド模倣物の形成に使用できるアミノ酸は、天然および非タンパク質起源のアミノ酸双方に属することができる。アミノ酸およびアミノ酸残基を誘導でき、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−、Ｎ−プロピル−またはＮ−ベンジル誘導体が好ましい。例えば、メチルが使用される場合、アミド結合のＮ−アルキル化は、対応する化合物の活性に対して強い影響を及ぼすことができる（Levian-Teitelbaum, D.; Kolodny, N.; Chorev, M.; Selinger, Z.; Gilon, C. Biopolymers 1989, 28, 51-64、これは参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）。さらに使用できるアミノ酸の構造的代替物としては、側鎖修飾のアミノ酸、β−アミノ酸、アザアミノ酸（α−ＣＨ−基がＮ−原子により置換されるα−アミノ酸の誘導体）および／またはペプトイド−アミノ酸（アミノ酸側鎖がα−Ｃ−原子の代わりにアミノ基に結合されるα−アミノ酸の誘導体）または上記修飾からの環化誘導体が挙げられる。
【００６０】
本発明の一実施形態によれば、構成単位として天然アミノ酸のホモ−誘導体を使用することも可能である。これらは、メチレン基がＣαに即隣接した側鎖に挿入される天然アミノ酸の誘導体である。同様に、本発明に係る天然アミノ酸のα−メチル化誘導体を使用することが可能である。
【００６１】
上記および下記において、残基Ｂ、ＱおよびＸは、他に明白に述べられない限り、式Ｉに定義されるとおりである。
【００６２】
本発明の一実施形態において、式Ｉの化合物は、添付の請求項２〜１７のいずれか一項に定義されるとおりである。
【００６３】
別の実施形態において、Ｂは、一般式
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３
により表されることが好ましく、
式中Ｑ、Ｘまたは支持体が残基Ｚ１、Ｚ２およびＺ３のいずれか１つに結合できる。この結合は、残基Ｚ１またはＺ３を介すること好ましく、残基Ｚ３を介することがより好ましい。
【００６４】
この実施形態において、Ｚ１は、大きな側鎖を有する天然または非タンパク質起源アミノ酸残基またはその誘導体である。このことは、この側鎖が少なくとも３個の炭素原子、好ましくは少なくとも５個の炭素原子、より好ましくは少なくとも６個から２５個までの炭素原子を含むことを意味する。１個以上のこれらの炭素原子は、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子により置換できる。Ｚ１の側鎖は、単環式、二環式または三環式であってもよい環式基を含有することが好ましい。さらに、この環式基は、飽和、不飽和または芳香族であってもよい。芳香族基は、二環式基と同様により好ましい。芳香族二環式基が特に好ましい。他の実施形態に関して添付の請求項４から１７までに指定された形態はまた、この実施形態のさらに好ましい化合物を特徴付ける。
【００６５】
この実施形態において、Ｚ１は、好ましくは式
Ａｒ−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨＲ１）ｎ−（ＣＨ２）０−Ａ１            （ＩＩ）
の残基であり得、
式中
Ａ１は、ＮＲ２、ＣＯ、ＯＣＯ、ＣＨＲ２、ＯまたはＳから選択される基を表し、
Ｒ１は、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ベンジル、およびＮ（Ｒ２）２から選択される基を表し、アルキル、フェニルまたはベンジル基が、ＡおよびＮ（Ｒ２）２から独立して選択される１つ以上の置換基を有することができ、２つ以上のＡおよび／または２つ以上のＲ２が、互いに同じであっても異なってもよく、
Ａｒは、６個から１４個の炭素原子を持つ単環式、二環式または三環式芳香族環系、飽和または部分的に不飽和Ｃ５〜１４の単環式または二環式アルキル基を有する芳香族基であり、その各々は、非置換であっても、Ａ、Ａｒ１、Ｏ−Ａｒ１、Ｃ（Ｏ）−Ａｒ１、ＣＨ２−Ａｒ１、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、Ｈａｌから独立して選択される１つから３つの置換基を有していてもよく；またはＡｒはＨｅｔであってもよく；
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩから選択され、
Ａｒ１は、６個から１４個の炭素原子を持つ単環式、二環式または三環式芳香族環系を有する芳香族基、好ましくはフェニル基またはナフチル基、より好ましくはフェニル基であり、Ａｒ１は、非置換であっても、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、およびＨａｌから独立して選択される１つから３つの置換基を有していてもよく；
Ｈｅｔは、１個から３個のＮ原子および／または１個のＳ原子またはＯ原子を含み、５員環から１２員環を有する飽和、部分的または完全不飽和単環式または二環式へテロ環式残基を表す。
【００６６】
ヘテロアリール基または単環式または二環式５員乃至１２員へテロ環式環基が基礎となり得るへテロ環の例は、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、インダゾール、フタラジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、β−カルボリンまたはこれらのへテロ環のベンゾ融合、シクロペンタ融合、シクロヘキサ融合またはシクロヘプタ融合誘導体である。
【００６７】
窒素へテロ環は、Ｎ−オキシド類としても存在し得る。
【００６８】
ヘテロアリールであり得る基または単環式または二環式５員から１２員へテロ環式環の基は、例えば、２−または３−ピロリル、フェニルピロリル、例えば、４−または５−フェニル−２−ピロリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、４−イミダゾリル、メチルイミダゾリル、例えば、１−メチル−２−、−４−または−５−イミダゾリル、１，３−チアゾリル−２−イル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、Ｎ−オキシド−２−、−３−または−４−ピリジル、２−ピラジニル、２−、４−または５−ピリミジニル、２−、３−または５−インドリル、置換２−インドリル、例えば、１−メチル−、５−メチル−、５−メトキシ−、５−ベンジルオキシ、５−クロロ−または４，５−ジメチル−２−インドリル、１−ベンジル−２−または−３−インドリル、４，５，６，７−テトラヒドロ−２−インドリル、シクロヘプタ［ｂ］−５−ピロリル、２−、３−または４−キノリル、１−、３−または４−イソキノリル、１−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−イソキノリル、２−キノキサリニル、２−ベンゾフラニル、２−ベンゾチエニル、２−ベンゾオキサゾリルまたは２−ベンゾチアゾリルまたは部分水素化または完全水素化へテロ環式環の基として、例えば、またジヒドロピリジニル、ピロリジニル、例えば、２−または３−（Ｎ−メチルピロリジニル）、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロチエニル、ベンゾジオキソラニルである。
【００６９】
Ｈｅｔ基を表すへテロ環式基は、炭素原子および／または環窒素原子上の非置換であるか、またはモノ置換またはポリ置換、例えば、同一かまたは異なる置換基によるジ置換、トリ置換、テトラ置換またはペンタ置換であり得る。炭素原子は、例えば、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、特に（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、特に（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシ（前述の置換基のアルキル部分は、それ自体非置換であっても、ＣＯＯＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよい）、ハロゲン、ニトロ、Ｎ（Ｒ２）２、トリフルオロメチル、ＯＣＦ３、ヒドロキシル、オキソ、シアノ、ＣＯＯＲ２、アミノカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシカルボニル、フェニル、フェノキシ、ベンジル、ベンジルオキシ、テトラゾリルにより、特に（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル、例えば、メチル、エチルまたはｔ−ブチル、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシ、例えば、メトキシ、ヒドロキシル、オキソ、フェニル、フェノキシ、ベンジル、ベンジルオキシにより置換できる。硫黄原子は、スルホキシドまたはスルホンに酸化できる。Ｈｅｔ基の例は、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、４−置換１−ピペラジニル、４−モルホリニル、４−チオモルホリニル、１−オキソ−４−チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−４−チオモルホリニル、ペルヒドロアゼピン−１−イル、２，６−ジメチル−１−ピペリジニル、３，３−ジメチル−４−モルホリニル、４−イソプロピル−２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペラジニル、４−アセチル−１−ピペラジニル、および４−エトキシカルボニル−１−ピペラジニルである。
【００７０】
Ａは、ＣＯＯＲ２、Ｎ（Ｒ２）２、または非置換であっても、ＣＯＯＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよい１〜６個のＣ原子を有する線状、分枝状または環式アルキル基を表し、
ｍおよびｏは、０、１、２、３および４から独立して選択され、
ｎは、０または１であり、および
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニルまたはベンジル、あるいはペプトイド−アミノ酸の場合、アミノ酸側鎖である。
【００７１】
より好ましいＺ１基としては、タンパク質起源芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ）およびそれらの誘導体が挙げられ、特にこれらの誘導体は、その側鎖においてＲ６（下記に定義される）から独立して選択される１つから３つの置換基を有する。このような誘導体の典型的な例は、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ｔｙｒ（ＯＢｎ）およびＴｒｐ（Ｍｅ）である。より好ましいＺ１基としては、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）およびＴｙｒ（ＯＢｎ）の誘導体が挙げられ、その置換基は、フェニル基のメタ位またはオルト位に結合される。さらにより好ましいＺ１基としては、シクロヘキシルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−チエニルアラニン、３−チエニルアラニン、ベンゾチエニルアラニン（この二環式環系は、環系の任意の位置、好ましくは、チエニル環の２位または３位において分子の残部に結合できる）、フェニルグリシン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ホモチロシン、ホモトリプトファン、ホモヒスチジンおよび天然アミノ酸に関して上記のそれらの誘導体が挙げられる。
【００７２】
他のより好ましいＺ１基は、上記一般式（ＩＩ）により表される基を含み、これは以下の一般式（ＩＩＩ）：
Ａｒ２−（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨＲ３）ｎ−（ＣＨ２）０−            （ＩＩＩ）
により表され、
式中
Ａｒ２は、フェニル、２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ｐ−ベンゾイルフェニル、（オルト−、メタ−、またはパラ−）ビフェニル、２−インドリル、３−インドリル、２−チオフェニル、３−チオフェニル、２−ベンゾチオフェニル、３−ベンゾチオフェニルなどのＡｒにより定義される芳香族基の好ましいサブ基を表し、それらの各々は、ＡおよびＨａｌから独立して選択される１つから３つの置換基を有することができ、
式（ＩＩＩ）の残りの置換基は、式（ＩＩ）に関して定義されたとおりであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｒ６、−ＣＯＲ６、−ＣＯＯＲ６であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニルまたはベンジルを表し、それらの各々は、非置換であっても、Ａ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２または独立してＨａｌで１重、２重、または３重に置換されてもよい。
【００７３】
特に好ましいＺ１基は、Ａｃ−Ｔｒｐ、Ｔｒｐ、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、および上記一般式（ＩＩＩ）の基から選択され、Ａｒは、３−インドリル、１−ナフチル、２−ナフチルまたはｐ−ベンゾイルフェニルを表し、ｍ＝０〜３、ｎ＝０、ｏ＝０を表す。
【００７４】
最も好ましいのは一般式（ＩＩＩ）によって表されるＺ１基であり、Ａｒが、３−インドリルを意味し、ｍ＝１、ｎ＝０、ｏ＝０である。
【００７５】
Ｚ２は欠損しているか、天然または非タンパク質起源アミノ酸残基またはその誘導体である。Ｚ２は芳香族でないことが好ましい。
【００７６】
Ｚ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびこれらの誘導体（例えば、ホモ誘導体およびＯｒｎなどの修飾側鎖長を有するＮ−アルキル化およびＣα−メチル化極性アミノ酸ならびに極性アミノ酸誘導体など）などの極性アミノ酸であることがより好ましい。
【００７７】
特に好ましいＺ２基は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモ−Ｇｌｕおよびホモ−Ａｓｐなど、生理的条件下で負電荷を有する上記に定義された極性アミノ酸から選択される。最も好ましいＺ２基は、ＧｌｕまたはＡｓｐである。
【００７８】
Ｚ３は、Ｚ１に関して上記に定義された残基である。すなわち、Ｚ３は、天然または非タンパク質起源アミノ酸残基またはその誘導体、あるいは一般式（ＩＩ）により表される基であり、式中
Ａ１は、ＮＲ２、ＣＯ、ＣＨＲ２、ＯまたはＳを表し、
Ｒ１は、Ｃ１〜４アルキル、フェニル、ベンジル、およびＮ（Ｒ２）を表し、アルキル、フェニルまたはベンジル基が、少なくとも１つのＮ（Ｒ２）基ならびに任意にＡおよびＮ（Ｒ２）２から独立して選択される１つ以上の置換基を有し、２つ以上のＡおよび／または２つ以上のＲ２が、互いに同じであっても異なっていてもよく、
Ａｒは、６個から１４個の炭素原子を持つ単環式、二環式または三環式芳香族環系、飽和または部分的に不飽和Ｃ５〜１４の単環式または二環式アルキル基を有する芳香族基であり、それらの各々は、非置換であっても、Ａ、Ｏ−Ａｒ１、Ｃ（Ｏ）−Ａｒ１、ＣＨ２−Ａｒ１、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２またはＨａｌから独立して選択される基で１重、２重、または３重に置換されていてもよく、あるいはＨｅｔであってもよく；
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩから選択され、
Ｈｅｔは、Ｚ１に関して上記に定義されたへテロ環式残基であり、
Ａは、ＣＯＯＲ２、Ｎ（Ｒ２）２または非置換であっても、ＣＯＯＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されてもよい１〜６個のＣ原子を有する線状、分枝状または環式アルキル基を表し、
ｍおよびｏは、０、１、２、３および４から独立して選択され、
ｎは、０または１であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、フェニルまたはベンジル、あるいはペプトイド−アミノ酸の場合、アミノ酸側鎖である。
【００７９】
より好ましいＺ３基としては、タンパク質起源芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ）およびそれらの誘導体が挙げられ、特にこれらの誘導体は、その側鎖においてＣ１〜４アルキル基、ハロゲン原子またはベンジル基から独立して選択される１つから３つの置換基を有する。このような誘導体の典型的な例は、Ｔｙｒ（ＯＭｅ）、Ｔｙｒ（ＯＢｎ）およびＴｒｐ（Ｍｅ）である。さらにより好ましいＺ３基としては、シクロヘキシルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、チエニルアラニン、ベンゾチエニルアラニン、フェニルグリシン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ホモチロシン、ホモトリプトファン、ホモヒスチジンおよび天然アミノ酸に関して上記のそれらの誘導体が挙げられる。
【００８０】
他のより好ましいＺ３基としては、上記一般式（ＩＩＩ）により表される基が挙げられ、Ａｒは、フェニル、２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ｐ−ベンゾイルフェニル、ビフェニル、２−インドリル、３−インドリル、チオフェン、ベンゾチオフェンを表し、それらの各々は、ＡおよびＨａｌから独立して選択される１つから３つの置換基を有することができ、式（ＩＩＩ）の残りの置換基は、Ｚ１に関して上記に定義されたとおりである。
【００８１】
最も好ましいＺ３基は、１−Ｎａｌ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｙｒ（ＯＭｅ）から選択される。
【００８２】
本発明のジペプチドおよびトリペプチド基Ｂにおける残基Ｚ１およびＺ３またはＺ１およびＺ２ならびにＺ２およびＺ３は、各々ペプチド結合を介して結合する。
【００８３】
本発明の好ましい化合物としては、以下の組み合わせ残基から選択されるこれらのジペプチド基およびトリペプチド基Ｂが挙げられる：
（ｉ）Ｚ１のより好ましい実施形態とＺ２およびＺ３の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｉｉ）Ｚ１の特に好ましい実施形態とＺ２およびＺ３の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｉｉｉ）Ｚ１の最も好ましい実施形態とＺ２およびＺ３の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｉｖ）Ｚ２のより好ましい実施形態とＺ１およびＺ３の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｖ）Ｚ２の特に好ましい実施形態とＺ１およびＺ３の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｖｉ）Ｚ２の最も好ましい実施形態とＺ１およびＺ３の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｖｉｉ）Ｚ３のより好ましい実施形態とＺ１およびＺ２の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｖｉｉｉ）Ｚ３の最も好ましい実施形態とＺ１およびＺ２の好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｉｘ）Ｚ１のより好ましい実施形態とＺ２およびＺ３のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘ）Ｚ１の特に好ましい実施形態とＺ２およびＺ３のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｉ）Ｚ１の最も好ましい実施形態とＺ２およびＺ３のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｉｉ）Ｚ２のより好ましい実施形態とＺ１およびＺ３のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｉｉｉ）Ｚ２の特に好ましい実施形態とＺ１およびＺ３のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｉｖ）Ｚ２の最も好ましい実施形態とＺ１およびＺ３のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｖ）Ｚ３のより好ましい実施形態とＺ１およびＺ２のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｖｉ）Ｚ３の最も好ましい実施形態とＺ１およびＺ２のより好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｖｉｉ）Ｚ１のより好ましい実施形態とＺ２およびＺ３の最も好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｖｉｉｉ）Ｚ１の特に好ましい実施形態とＺ２およびＺ３の最も好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｉｘ）Ｚ１の最も好ましい実施形態とＺ２およびＺ３の最も好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｘ）Ｚ２のより好ましい実施形態とＺ１およびＺ３の最も好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｘｉ）Ｚ２の特に好ましい実施形態とＺ１およびＺ３の最も好ましい実施形態との組み合わせ；
（ｘｘｉｉ）Ｚ３のより好ましい実施形態とＺ１およびＺ２の最も好ましい実施形態との組み合わせ。
【００８４】
ペプチドおよび／またはペプチド模倣配列の方向は反転されることができる（「レトロペプチド」と呼ばれる）。
【００８５】
Ｑとは、任意の有機スペーサー分子のことである。
【００８６】
有機スペーサー分子は、それ自体が知られている。「有機」とは、炭化物およびカーボネート化合物を除いた全ての炭素化合物のことであり、またBeilstein's Handbook of Organic Chemistryを参照されたい。通常、有機スペーサー分子は、一末端または両末端において官能基を有する線状炭化水素である。この炭化水素鎖は修飾されうる。好ましい有機スペーサー分子としては、アミノ酸または［−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＣＯ］ｗ、［−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｙＣＨ２−ＣＯ］ｗ、［ＣＯ−（ＣＨ２）ｚ−ＣＯ−］、［−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚ−ＮＨ−］、［ＣＯ−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−］、または［ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−］残基ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。指標ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ１〜８；１〜５；１〜６；および１〜６である。さらにペプチド類、糖類および他のポリエーテル類は、有機スペーサー分子として作用できる。
【００８７】
Ｘとは、任意の有機アンカー分子のことである。
【００８８】
有機アンカー分子は、断片（すなわち、化合物および樹脂）を結合させるために適用されうる分子または分子群である。このような有機アンカー分子は、それ自体知られている。通常、有機アンカー分子は、化学結合を形成できる２つ以上の官能基を含んでいる。
【００８９】
好ましい有機アンカー分子としては、天然または非タンパク質起源のアミノ酸、あるいは−Ａ１−（ＣＨ２）ｐ−Ａ２、−Ａ１−ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ｏ−ＣＨ２−Ａ２、−Ａ１−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−Ａ２、＝ＣＲ２−（ＣＨ２）ｐ−Ａ２、−Ａ１−ＣＨ（ＮＨＲ３）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、＝ＣＲ２−ＣＨ（ＮＨＲ３）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２、−Ａ１−ＣＨ（ＣＯＲ４）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２または＝ＣＲ２−ＣＨ（ＣＯＲ４）−（ＣＨ２）ｑ−Ａ２残基が挙げられる。
【００９０】
Ａ１は、ＮＨが好ましいが、ＣＯ、ＣＨＲ２、ＯまたはＳでもよく、そしてＡ２はＳＨであることが好ましいが、Ｎ３、Ｃ≡ＣＨ、ＮＨ−ＮＨ２、Ｏ−ＮＨ２、ＮＨ２、Ｈａｌ１、ＣＲ５Ｏ、またはカルボキシルでもよく、
Ｒ２は、上記に定義されたとおりであり、
Ｒ３は、Ｚ１に関して上記に定義されたとおりであり、
Ｒ４は、ＯＲ６または−ＮＨＲ３であり、
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１〜４アルキルまたは非置換であるか、あるいはＡ、ＯＨ、ＯＡ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２またはＨａｌにより１重、２重、または３重に置換されたフェニルもしくはベンジルであり、
Ｒ６は、Ｚ１に関して上記に定義されたとおりであり、
ｐは、１〜２０であり、
ｑは、１〜２０であり、
ｙは、１〜６であり、
ｚは、１〜６であり、
Ｈａｌは、上記に定義されたとおりであり、
Ｈａｌ１は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態において、−Ｑ−Ｘ基は、−ホモ−Ｃｙｓ−ＯＨ、−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ、−Ａｈａ−Ｃｙｓ−ＯＨ、−Ｇｌｙ−Ａｈａ−Ｃｙｓ−ＯＨおよびそれらの誘導体から選択される残基の１つを特徴とする。好ましい誘導体は、隣接残基（好ましくはＺ３）とのペプチド結合の形成に関与するチオール基ならびに窒素原子を含有する部分であり、前記窒素原子とチオール基の硫黄原子とは、Ｃ、ＮおよびＯから独立して選択される２個から１４個の原子の直鎖により結合される。このような誘導体は、好ましくは非置換であるか、またはＺ１に関して上記に定義されたＲ３から選択される１つから３つの置換基を有する。
【００９２】
さらに本発明は、式Ｉの化合物およびそれらの塩類の調製工程に関する。Ｎ−末端修飾またはカルボキシ末端修飾誘導体のような構造成分は、本発明の一部であると意図される。
【００９３】
式Ｉの化合物は、１つ以上のキラリティー中心を有することができ、したがって種々の立体異性体で生じ得る。全てこのような立体異性体は、本発明に包含される。
【００９４】
したがって、本発明は特に、前記残基の少なくとも１つが好ましく説明される式Ｉの化合物に関する。
【００９５】
式Ｉの以下の化合物に対して特に好ましく示される（本明細書に用いられる結合分子Ｂは、太字で印され、スペーサーＱは、イタリックで印される）：
【００９６】
【表１】
2009518345.tif 000002
【００９７】
【表２】
2009518345.tif 000003
【００９８】
式Ｉの化合物は、非天然ペプチドまたはペプチド模倣誘導体として理解することができ、例えば、適切なアミノまたはカルボキシ構成単位を適用して、当該技術分野において公知の溶液または固相状態の合成技法を用いて、部分的に、または完全に合成できる（Gysin, B. F.; Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 3102;またはMerrifield, R. B. Angew. Chemie Int. Ed. 1985, 24 (10), 799-810）。連続合成が考慮されている。他の有機合成法は、Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgartに記載された方法など、式Ｉに従った化合物の合成に使用できる）。
【００９９】
所望ならば、出発物質は、反応混合物からそれらを単離することなくインサイチュでも形成できるが、その代わりとして引き続き、式Ｉの化合物へとさらにそれらを変換できる。
【０１００】
好適な不活性溶媒は、例えば、ヘキサン、石油エーテル、ベンゼン、トルエン、またはキシレンなどの炭化水素；トリクロロエチレン、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロメタン、クロロホルムまたはジクロロメタンなどの塩素化炭化水素；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールまたはｔ−ブタノールなどのアルコール類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジオキサンなどのエーテル類；１，２−ジメトキシエタンなどのグリコールエーテル類、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミドまたはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアセトアミド；アセトニトリルなどのニトリル類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのスルホキシド類；二硫化炭素；ギ酸または酢酸などのカルボン酸類；ニトロメタンまたはニトロベンゼンなどのニトロ化合物；酢酸エチルなどのエステル類、水、または前記溶媒の混合物である。
【０１０１】
式Ｉの化合物は、加水分解などの加溶媒分解、または水素化分解により官能性誘導体からの遊離によってもさらに得ることができる。
【０１０２】
加溶媒分解または水素化分解のために好ましい出発物質は、１つ以上の遊離アミノ基および／またはヒドロキシル基の代わりに対応する保護アミノ基および／またはヒドロキシル基を有するもの、好ましくは、Ｎ原子に結合されたＨ原子の代わりにアミノ保護基を有するもの、例えば、式Ｉに合致するが、ＮＨ２基の代わりにＮＨＲ’基（Ｒ’はアミノ保護基であり、例えば、ＢＯＣまたはＣＢＺである）を含有するものである。
【０１０３】
ヒドロキシ基のＨ原子の代わりにヒドロキシル保護基を有する出発物質、例えば、式Ｉに合致するが、ヒドロキシ−フェニル基の代わりにＲ’’Ｏ−フェニル基（Ｒ’’が、ヒドロキシル保護基、例えば、ｔ−ブチルまたはベンジルである）を含有するものがさらに好ましい。言い換えれば、芳香族環に共有結合されたヒドロキシル基は、保護基による変換から保護される。
【０１０４】
カルボキシ基のＨ原子の代わりにカルボキシル保護基を有する出発物質、例えば、式Ｉに合致するが、カルボキシ基の代わりにＲ’’’Ｏ−ＣＯ基（Ｒ’’’が、カルボキシル保護基、例えば、ｔ−ブチルまたはベンジルである）を含有するものがさらに好ましい。言い換えれば、カルボキシル基の酸素原子は、保護基による変換から保護される。
【０１０５】
１つ以上の−同一または異なる−保護基が分子に存在することも可能である。１つ以上の存在する保護基が互いに異なる場合、このことは、それらが選択的に開裂されうるという利点を提供する。
【０１０６】
用語の「アミノ保護基」は、一般的な用語で知られており、化学反応に対してアミノ基を保護する（遮断する）のに好適であるが、除去し易い基に関するものである。このような典型的な基は、特に非置換または置換アシル、アリール、アラルコキシメチルまたはアラルキル基である。アミノ保護基は、所望の反応（または反応順序）が生じた後に除去することから、それらのタイプおよびサイズはとりたてて重要ではないが；１〜２０個、特に１〜８個の炭素原子を有するものが好ましい。用語の「アシル基」としては、脂肪族、芳香脂肪族、芳香族またはへテロ環式カルボン酸もしくはスルホン酸、特にアルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、特にアラルコキシカルボニル基由来のアシル基を含む。
【０１０７】
このようなアシル基の例は、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのアルカノイル；フェニルアセチルなどのアラルカノイル；ベンゾイルまたはトルイルなどのアロイル；ＰＯＡなどのアリールオキシアルカノイル；メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、ＢＯＣ、２−ヨードエトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル；ＣＢＺ（「カルボベンゾキシ」）、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｆｍｏｃなどのアラルキルオキシカルボニル；Ｍｔｒ、ＰｂｆまたはＰｍｃなどのアリールスルホニルである。好ましいアミノ保護基は、ＢＯＣ、Ｍｔｒ、ＣＢＺ、Ｆｍｏｃ、ベンジルおよびアセチル基である。
【０１０８】
用語の「ヒドロキシル保護基」は、同様に一般的な用語で知られており、化学反応に対してヒドロキシ基を保護するのに好適であるが、所望の化学反応が分子の他の位置で実施された後に除去し易い基に関するものである。このような典型的な基は、上記の非置換または置換アリール、アラルキルまたはアシル基、さらにまたアルキル基である。ヒドロキシル保護基の性質およびサイズは、所望の化学反応または反応配列後にそれらを再び除去することから、とりたてて重要ではないが；１〜２０個、特に１〜１０個の炭素原子を有する基が好ましい。ヒドロキシル保護基の例は、とりわけ、ベンジル、ｐ−ニトロベンゾイル、ｔ−ブチルおよびアセチルであり、ベンジルおよびｔ−ブチルが特に好ましい。
【０１０９】
用語の「カルボキシル保護基」は、同様に一般的な用語で知られており、化学反応に対してカルボキシル基を保護するのに好適であるが、所望の化学反応が分子の他の位置で実施された後に除去し易い基に関するものである。このような典型的な基は、上記の非置換または置換アリール、アラルキルまたはアシル基、さらにまたアルキル基である。ヒドロキシル保護基の性質およびサイズは、所望の化学反応または反応配列後にそれらを再び除去することから、とりたてて重要ではないが；１〜２０個、特に１〜１０個の炭素原子を有する基が好ましい。カルボキシル保護基の例は、とりわけ、ベンジル、ｔ−ブチルおよびアセチルであり、ベンジルおよびｔ−ブチルが特に好ましい。
【０１１０】
式Ｉの化合物は、例えば、強酸を用いて、有利にはＴＦＡまたは過塩素酸、また塩酸または硫酸などの強無機酸、トリクロロ酢酸などの強有機カルボン酸、またはベンゼンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸類を用いて−使用される保護基に依って−それらの官能誘導体から遊離される。さらに不活性溶媒の存在は可能であるが、必ずしも必要ではない。好適な不活性溶媒は、好ましくは有機溶媒であり、例えば、酢酸などのカルボン酸類、テトラヒドロフランまたはジオキサンなどのエーテル類、ＤＭＦなどのアミド類、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素、さらにまた、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコール類、および水である。上記溶媒の混液は、さらに好適である。ＴＦＡは、さらなる溶媒の添加なしで過剰に使用されることが好ましく、過塩素酸は、９：１の比率で酢酸と７０％過塩素酸を混合した態様で使用されることが好ましい。開裂に関する反応温度は、有利には約０℃と約５０℃との間、好ましくは１５℃と３０℃（室温）との間である。
【０１１１】
ＢＯＣ、ＯＢｕｔ、ＰｂｆおよびＭｔｒ基は、例えば、好ましくはジクロロメタン中ＴＦＡを用いるか、または１５〜３０℃でジオキサン中のおおよそ３Ｎから５ＮのＨＣｌを用いて開裂でき、Ｆｍｏｃ基は、１５〜３０℃でＤＭＦ中の、ジメチルアミン、ジエチルアミンまたはピペリジンのおおよそ５％から５０％の溶液を用いて開裂できる。
【０１１２】
トリチル基は、アミノ酸のヒスチジン、アスパラギン、グルタミンおよびシステインを保護するために使用される。それらは、前記アミノ酸の全てを開裂されるトリチル基を有し、ＴＦＡ／１０％チオフェノール、ＴＦＡ／アニソール、ＴＦＡ／チオアニソール、またはＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏを用いて開裂する。
【０１１３】
Ｐｂｆ（ペンタメチルベンゾフラニル）基は、Ａｒｇを保護するために使用される。それは、例えば、ジクロロメタン中ＴＦＡを用いて開裂される。
【０１１４】
水素化分解で除去可能な保護基（例えば、ＣＢＺまたはベンジル）は、例えば、触媒存在下（例えば、有利には炭素などの支持体上、パラジウムなどの貴金属触媒）、水素による処理により開裂できる。ここでの好適な溶媒は、上記に示されたもの、例えば、メタノールまたはエタノールなどのアルコール類、ＤＭＦなどのアミド類である。水素化分解は、０℃と１００℃との間の温度、および１バールと２００バールとの間の圧力で、好ましくは１０〜３０℃および１〜１０バールで一般に実施される。ＣＢＺ基の水素化分解は、例えば、メタノール中５％から１０％Ｐｄ／Ｃ上で、または１０〜３０℃でメタノール／ＤＭＦ中Ｐｄ／Ｃ上でギ酸アンモニウム（水素の代わりに）を用いて十分に成功する。
【０１１５】
式Ｉの塩基は、例えば、エタノールなどの不活性溶媒中当量の塩基と酸との反応、次いで蒸発により、酸を用いる関連酸付加塩に変換できる。したがって、無機酸、例えば、硫酸、硝酸、塩酸または臭化水素酸などのハロゲン化水素酸、オルトリン酸などのリン酸またはスルファミン酸を使用することが可能である。有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香脂肪族、芳香族またはヘテロ芳香族一塩基または多塩基カルボン酸、スルホン酸または硫酸、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、メタン−およびエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンモノ−および−ジスルホン酸、ならびにラウリル硫酸などが使用できる。塩類、例えば、ピクリン酸塩は、式Ｉの化合物の単離および／または精製にも使用できる。
【０１１６】
一方、式Ｉの酸は、塩基との反応によりアンモニウム塩類の金属の１つに変換できる。ここでの好適な塩類は、特にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウム塩類、さらに置換アンモニウム塩類、例えば、ジメチル−、ジエチル−またはジイソプロピル−塩類、モノエタノール−、ジエタノール−またはジイソプロパノリルアンモニウム塩類、シクロヘキシル−、ジシクロヘキシルアンモニウム塩類、ジベンジルエチレンジアンモニウム塩類、さらに例えば、アルギニンまたはリシンとの塩類である。
【０１１７】
本発明の一実施形態によれば、Ｚ２とＺ３との間の還元ペプチド結合を有する上記のペプチド模倣物を調製するために有利な工程が提供される：
【０１１８】
このようなペプチドおよびペプチド模倣物をより大量に得るために、一般に固相状態の合成工程を用いることよりも溶液での合成を実施することが好ましいと考えられる。しかしながら、固相状態の合成工程に反して、溶液中の合成は、緩和な酸性条件下の幾つかの反応ステップを含み、これは、トリチル保護基などの酸不安定保護基の偶発的開裂を潜在的にもたらす可能性がある（Zervas, L.; Photaki, I. On Cystein and Cystin Peptides. 1. New S-Protecting Groups for Cystein. Journal of the American Chemical Society 1962, 84, 3887-3897）。
【０１１９】
この問題は、以下の理由のため本発明の多くの化合物に対して、特に明白である。本発明の多くの化合物は、システインのチオール基がこの化合物を樹脂支持体に結合させるために使用できることから、Ｃ−末端にシステイン残基を含有する。しかしながら、溶液状態の合成は、通常にはＣ−末端からＮ−末端へと実施されることによって、ラセミ化副反応の問題を抑制する。このことが、本発明の化合物で行われる場合、システイン残基は、多ステップ反応配列の極めて早期の段階で導入される。次にこのことは、システイン残基のトリチル保護基が、比較的多数の反応ステップに耐えなければならないことを意味する。このことは前記トリチル関連の安定性問題を、明らかに悪化させる。
【０１２０】
本発明のこの実施形態によれば、ラセミ化副反応の危険性を低く維持しながら、前記トリチル関連安定性問題を最少にさせるような合成工程を提供する。すなわち、多ステップ反応配列の終わりにシステイン残基が分子に導入されるように合成方向が反転される場合、トリチル関連安定性問題を効率的に避け得ることが現在判明している。ペプチドの合成に反して、Ｚ２とＺ３との間の結合がカルボニル基を含有しない場合、ラセミ化問題は生じないことがさらに判明している。このように、本発明は、残基Ｚ２とＺ３との間の結合にカルボニル基が存在しないことを特徴とし、好ましくは、アンカー分子としてシステイン残基を含む、本発明に係るペプチド模倣物を調製する方法を提供し、システイン残基が導入される最後の残基であるように、前記方法は溶液中で実施される。
【０１２１】
説明目的のために、本発明のこの実施の形態に係るペプチド模倣物Ｐ２２合成の一般的な説明を下記に示す：
【０１２２】
（Ｐ２２の液相合成）
この合成は、文献手法に従ってインドール窒素が、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護される３−インドリル酢酸（３５）から出発し（スキーム１）：化合物３５を、ＭｅＯＨ中ＳＯＣｌ２で処理することにより、そのメチルエステルに変換し、引き続きインドール窒素は、３６を達成するためにアセトニトリル中、ｔ−ブチルジカーボネートとＤＭＡＰとを反応させることによってＢｏｃ基で保護される。次いでケン化により、所望のインドリル酢酸３７を生じる。
【０１２３】
スキーム１．Ｎ−置換グルタモール４０の合成
【化１】
2009518345.tif 000004
試薬および条件：（ａ）ＳＯＣＬ２、ＭｅＯＨ、１８時間；（ｂ）Ｂｏｃ２Ｏ、ＤＭＡＰ、アセトニトリル、４時間、（２ステップ）；（ｃ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、１８時間；（ｄ）ピペリジン、ＤＭＦ、１時間；（ｅ）ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、０℃→室温、４時間、（２ステップ）。
【０１２４】
４０への変換は、カップリング試薬としてＨＯＢｔおよびＴＢＴＵを用いて、３７の側鎖保護グルタモール３９へのカップリング３７によって達成できる。３９は、ピペリジンで処理することにより市販のＦｍｏｃ−グルタモール（ＯｔＢｕ）（３７）から容易に入手でき、さらに精製することなく使用できる。３９における遊離ヒドロキシル官能基の保護は必要ではなく、この反応は手際よく進行してＮ−置換グルタモール４０を得る。標的化合物Ｐ２２におけるグルタミン酸残基およびチロシン残基を結合する還元ペプチド結合は、対応するアルデヒド４１と市販Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＭｅとの還元的アミノ化により形成される（スキーム２）。
【０１２５】
スキーム２．ペプチド模倣物Ｐ２２（化合物３３と称される）の合成
【化２】
2009518345.tif 000005
試薬および条件：（ａ）デス・マーチン・ペルヨージナン(Dess-Martin periodinane)、ＤＣＭ、６時間；（ｂ）１）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）ＯＭｅ＊ＨＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＤＣＭ、３０分；２）ＮａＢ（ＯＡｃ）３Ｈ、１８時間、（３ステップ）；（ｃ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、ジオキサン、Ｈ２Ｏ、１．５時間；（ｄ）Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）ＯｔＢｕ＊ＨＣｌ、ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ、２，４，６−コリジン、１０℃→室温、１８時間、（２ステップ）；（ｅ）ＴＩＰＳ、Ｈ２Ｏ、ＴＦＡ  ０→９５％、８時間。
【０１２６】
アルデヒド形成時にラセミ化をもたらし得るので、塩基性反応条件を避けることは重要である。したがって、デス・マーチン・ペルヨージナン酸化の使用および塩基不在下でインサイチュでイミンの短い前形成、次いで迅速な還元剤の添加によりラセミ化を完全に避けることができる。この手法は、３ステップにわたって所望の第二級アミン４２を得る。微量の二重のアルキル化副産物だけがＨＰＬＣ−ＭＳにより観察される。４２のメチルエステルは、ケン化により開裂され、生じた遊離酸は、ＨＯＢｔ／ＴＢＴＵおよび緩和な塩基２，４，６−コリジンの存在下、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）ＯｔＢｕ＊ＨＣｌに結合され、４３を生じる（２ステップ）。適用されるシステインｔ−ブチルエステルは、市販で入手できないが、これは容易に合成できるので市販のメチルエステルよりも好ましく、酸性条件下、４３のワンステップ脱保護により所望の遊離ペプチド模倣物Ｐ２２への生成を可能にする。さらに、このことにより、ケン化後の光学純度の大きな喪失を避けることが可能である。
【０１２７】
最後の脱保護および精製は、Ｐ２２を経済的に製造するという観点から重要なステップである。これらのステップは、水およびＴＩＰＳ（１：１）の激しく攪拌された混液中にＰ２２を懸濁し、ＴＦＡを８時間に亘って最終濃度が９５％となるよう、ゆっくりと加えることによって、副産物を生成しないで実施できる。この手法により、副産物の形成が大いに減少して、エーテル／ペンタン中沈澱後、高収率かつ高純度で最終遊離ペプチド模倣物Ｐ２２が得られる。
【０１２８】
本発明の化合物は、下記のとおり使用できる。
【０１２９】
（診断適用）
血友病Ａに関する確定診断は、ＦＶＩＩＩアッセイを実施し、凝固時間を測定することによって評価される。したがって、患者の血漿を、ＦＶＩＩＩを先天的に欠く患者から、または人工的欠失源からのＦＶＩＩＩ欠損血漿と混合する。凝固時間を短くする有効性の程度が、正常な血漿の程度と比較される。プールされた新鮮な正常ヒト血漿の希釈液と、血友病の血漿を用い、希釈液に対する凝固時間をプロッティングして、標準曲線が作成される。
【０１３０】
凝固試験は、術前医療スクリーニングにおいて、治療モニタリングに対して使用される依然として最も頻繁に実施されるアッセイであるが、これらの試験は、全て酵素的ステップに依存する。血漿中の凝固因子は、通常不活性であり、第一のステップとしてタンパク質分解活性化を必要とする。さらに、これらの酵素的ステップは、活性化凝固因子のみならず、活性化補因子、リン脂質およびカルシウムイオンを必要とする。このことは、比較的不安定なタンパク質の極めて複雑な混合物が、実際のＦＶＩＩＩレベルを過小評価し得るアッセイに関与していることを意味する。この問題を克服するために、患者におけるＦＶＩＩＩの絶対的レベルをさらに評価することは重要である。これは、不安定な抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いるＥＬＩＳＡにより通常実施される。これらの抗体を、本発明のペプチド類およびペプチド模倣物に置き換えられる。この目的のために使用される場合、本発明に係るペプチド類は、ＥＬＩＳＡ試験に採用される現在用いられる不安定な抗ＦＶＩＩＩ抗体と比較して、大きな利点を有する。患者の血漿中の総ＦＶＩＩＩ量を検出するための高感度スクリーニングキットの開発は、それらのより大きな安定性、より高感度およびより低いアッセイコストに見られるペプチド類の利点から利益を得ることを可能にする。
【０１３１】
（安定化目的のための使用）
ＦＶＩＩＩは、急速な不活化ならびに短い半減期を示す。ＦＶＩＩＩの半減期は、Ａ２サブユニットが、イオン性相互作用を介して、Ａ１およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２サブユニットと弱く会合している、活性なヘテロ三量体ＦＶＩＩＩ（Ａ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）からのＡ２サブユニットの自然発生的な解離速度により規定される。ヘテロ三量体におけるＡ２の存在は、活性なＦＶＩＩＩの正常な安定性に必要である。
【０１３２】
本発明のペプチド類およびペプチド模倣物は、ＦＶＩＩＩに対する高い親和性を示すのみならず、結合時にそれらは、ヘテロ三量体を安定化させるために役立つ。したがって、これらの発明化合物のＦＶＩＩＩに対する結合は、血友病Ａ療法において有利な様式で使用でき、それによって医療処置時にＦＶＩＩＩの安定性および半減期を増加させる。補充療法の間のＦＶＩＩＩのより長い半減期により、ＦＶＩＩＩ注入頻度を減らすことができるので、患者を楽にするであろう。前記安定化効果は、それらの投与前のＦＶＩＩＩ含有医薬品の有効期間を効果的に延長するためにも使用できる。
【０１３３】
（標識、検出および同定のための使用）
本発明の化合物はまた、着色反応などを受けることができる放射性同位元素または官能基などのマーカー基を有することができる。
【０１３４】
本発明のこのような化合物とＦＶＩＩＩとの接触によって、ＦＶＩＩＩにマーカーペプチドまたはペプチド模倣物が結合されるであろう。次にこれを検出することが可能であり、場合によっては、サンプルに存在するＦＶＩＩＩを定量化することも可能となる。
（療法に使用）
上記の安定化効果に加えて、本発明の化合物は、ＦＶＩＩＩの生物学的活性をさらに増加させ得る。さらに、本発明の化合物は、投与されたＦＶＩＩＩへの抗体結合を阻止する有利な効果を有し得る。これらの有益な効果は、ＦＶＩＩＩと投与前の本発明の化合物とを接触させることにより、療法に使用できる。本発明の化合物をＦＶＩＩＩに結合するので、複合体を形成する。純粋なＦＶＩＩＩの代わりにこの複合体の投与することは、向上した生物学的効果をもたらしうる（あるいは、低い用量のＦＶＩＩＩを投与してよいことになる）。さらにこの複合体の投与により、抗体の効果を不活性化してしまうことを低減するのに役立ち得る。要約すると、本発明の化合物は、従来のＦＶＩＩＩと比較してより高い安定性および優れた活性を示すＦＶＩＩＩベースの医薬品を製造するために使用できる。前記ＦＶＩＩＩベースの医薬品は、前記従来のＦＶＩＩＩが抗体により不活化される場合に、従来のＦＶＩＩＩに代えて使用することもできる。さらに、本発明はまた、ＦＶＩＩＩと本発明の化合物との前記複合体の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む血友病Ａを治療する方法に関する。
（ＦＶＩＩＩベースの医薬品の製造に使用）
本発明の別の実施形態は、未加工のＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ様タンパク質を精製するための本発明の化合物の使用に関する。これは、固体支持体上に本発明の化合物を固定化することを含むことが好ましい。親和性クロマトグラフィは、本発明の化合物で覆われた樹脂を用いて実施されることがさらに好ましい。このような使用は、下記の実施例３から５により詳細に記載されている。
【０１３５】
（診断用および／または研究用ツールの製造における使用）
本発明はさらに、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ様タンパク質のドメイン、エピトープおよび断片を精製するための本発明の化合物の使用に関する。このように精製されたドメインなどは、ＦＶＩＩＩと同等の凝固活性を示し得ないが、それにもかかわらず、それらは診断用キットにおいて、研究用ツールとして有用であり得る。
【実施例】
【０１３６】
クロマトグラフィ法は、以下のパラメータに従って使用された：
ＲＴ＝以下のシステムにおいてＨＰＬＣに対する保持時間（分）：
カラム：ＹＭＣ  ＯＤＣ  Ａ  ＲＰ５Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍ
溶出Ａ：水中０．１％ＴＦＡ
溶出Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ
流速：１ｍＬ／分
勾配：１０−＞５０％Ｂ／３０分。
【０１３７】
質量分析（ＭＳ）：ＥＳＩ（電気スプレー電離）（Ｍ＋Ｈ）＋
【０１３８】
ＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）：ＦＶＩＩＩ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１０％  Tris-Glycine Bio-Rad ReadyGelを用いて実施した。サンプルは、２−メルカプトエタノールを含有する添加液で希釈し、ゲルに適用した。電気泳動は、氷上に置かれたBio-Rad Mini-Protean 3装置内で定電流（２５ｍＡ／ゲル）で実施された。電気泳動後、ゲルを、標準的な銀染色プロトコルを用いて染色した。
【０１３９】
免疫ブロット法：タンパク質を、Bio-Rad Mini-Protean 3装置内で移動ブロックによりニトロセルロース膜に転写した。転写は、インストールされた凍結クーリングブロックにより７０Ｖ定電圧（約２５０ｍＡ）で４時間実施された。膜は、ｐＨ８．０のＴＢＳ中、５％脱脂ドライミルクで一晩ブロックされた。次に膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ＝７．４のＴＢＳ中、５％脱脂粉ミルク溶液で１μｇ／ｍＬに希釈された一次抗体と共に１時間インキュベートした。
【０１４０】
膜は、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で３回洗浄し、ｐＨ＝７．４のＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中、５％脱脂粉ミルクで１：３０００に希釈されたペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（Ｍａｂ  Ｃ５およびＭａｂ４１３）と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳによる３回の洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０膜は、ＥＣＬ化学発光基質（Pharmacia）中で現像され、化学発光をBioMax-XLフィルム（Kodak）を用いて検出した。
【０１４１】
リンク−アミド樹脂は、例えば、ペプチド、およびＣ−末端に−ＣＯＮＨ２基を有するペプチド模倣誘導体の合成を可能にする４−（２’、４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂を表し、ＴＣＰ樹脂は、トリチルクロリド−ポリスチレン樹脂を示す。
【０１４２】
化合物Ｐ１からＰ２０までは、ＴＣＰ樹脂上で、化合物Ｐ２に関してはリンク−アミド樹脂上でそれぞれＦｍｏｃ方式を用いて固相ペプチド合成を介して合成された（Fields, G. B.; Nobie, R. L. Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 35, 161を参照）。
【０１４３】
Ｎ−末端アセチル化（化合物Ｐ２）は、最終開裂および脱保護ステップ前に、対応するＮ−末端脱保護化合物を、ＮＭＰ／Ａｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ（９１：７：２）混合物で処理することにより、固相上で達成された（下記参照）。
【０１４４】
化合物Ｐ２１からＰ２５は、Ｆｍｏｃ方式を用いてＴＣＰ樹脂上で連続的に完全合成された。「還元ペプチド結合」は、アミノ酸に対応するアルデヒドを用いてそれ自体知られている固相上で還元的アルキル化を介して形成された（「アミノアルデヒド」、Krchnak, V.; Weichsel, A. S.; Cabel, D.; Flegelova, Z.; Lebl, M. Mol. Diversity 1995, 1, 149を参照）。この反応は、室温でトリメトキシメタンのような水捕捉溶媒中で実施された。中間生成物として形成された対応するイミン化合物の還元は、ジクロロメタンなどの非極性溶媒中室温で実施された。還元剤として、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３のような錯体水素化ホウ素が使用された。
【０１４５】
固相からのペプチドまたはペプチド模倣誘導体の開裂およびそれら側鎖保護基の開裂は、９０％ＴＦＡ，５％Ｈ２Ｏおよび５％ＴＩＰＳを用いて同時に行われた。
【０１４６】
全ての化合物は、分取ＨＰＬＣにより精製された。
【０１４７】
（実施例１）
ＦＶＩＩＩおよびｐｄ−ＦＶＩＩＩの結合に対する親和性リガンドとして化合物の調製
ペプチドＰ１からＰ２５を、Jungbauerらにより記載されたトヨパール AF-Epoxy-650M樹脂（Tosoh Biosep）上に固定化した。固定化に関して、２．５ｍｇの各ペプチドを０．２５ｍＬの固定化用緩衝液（０．２Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．３）中に溶解し、０．０３６ｇの乾燥樹脂粉末（０．１２５ｍＬの膨潤樹脂に相当）を加え、次いで混合物を緩やかに回転させながら４８時間インキュベーションを行った。４８時間のインキュベーションの際に、樹脂を固定化用緩衝液で１回、１Ｍ  ＮａＣｌで１回、次いで結合用緩衝液で３回洗浄し、ペプチドで覆われた樹脂および対照樹脂への１２５Ｉ−標識ｐｄ−ＦＶＩＩＩの結合を試験した。報告された各々の実験において各々のペプチドのカップリング濃度は、表１に記載したとおりであった。樹脂の対照０．２５ｍＬ部分を、ペプチド不在下の平行実験で同様に処理し、引き続き１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩ結合実験において対照（バックグラウンドと称される）として用いた。１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩ結合／バックグラウンド比は、上記のとおり調製された非コーティング対照樹脂に結合されたもので割った固定化ペプチドに結合された１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩの量として算出された。ペプチドに結合した１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩはシグナル値を表し、ペプチドに覆われていない樹脂に結合した１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩはバックグラウンド（ノイズ）値を表すことから、この比は、ミクロビーズアッセイに関するシグナル／ノイズ比を表す。
【０１４８】
血漿由来（ｐｄ−）のヒト因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体カラム上の免疫親和性クロマトグラフィにより濃縮物から精製し、次いでResource Q HR5/5カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィによりｐｄ−ＦＶＩＩＩを濃縮した。ｖＷｆからＦＶＩＩＩを分離するために、濃縮物を、アフィニティー精製前に０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０４Ｍ  ＣａＣｌ２中でインキュベートした。
【０１４９】
ｐｄ−ＦＶＩＩＩ製剤に存在しうる微量のｖＷｆは、ｐｄ−ＦＶＩＩＩ製剤を、樹脂１ｍＬ当り１．４ｍｇの濃度で固定化された抗ｖＷｆ高親和性モノクローナル抗体を有するカラムを通過させることにより除去された。
【０１５０】
１０μｇの精製ｐｄ−ＦＶＩＩＩを、ラクトペルオキシダーゼビーズおよび０．５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉを用いてヨウ素化した。
【０１５１】
固定化ペプチドを有する樹脂を、結合用緩衝液（０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０）で洗浄した。引き続き、樹脂を結合用緩衝液中で１：７スラリとして希釈し、エッペンドルフチューブに分配した（１チューブ当り４０μｌ）。１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩ（１０μｌ中１０００００ｃｐｍ）をこのチューブに加え、この混合物の容量を、４％ＢＳＡを含有する５０μｌの結合用緩衝液で１００μｌに調節して最終的に２％濃度のＢＳＡを得た。回転器上、室温で２時間のインキュベーション後、サンプルを結合用緩衝液で４回洗浄した。各洗浄後、チューブをエッペンドルフミクロ遠心分離機において５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄液を捨てて樹脂を洗浄用緩衝液で再度懸濁し、次いで同じ条件下で遠心分離する。４回洗浄後、上澄液なしのペレットを有するチューブは、放射性に関して計測された。ペプチドなしの樹脂は、チューブおよび樹脂自体に結合する非特異的ｐｄ−ＦＶＩＩＩの原因を説明するために同様に処理し、この対照チューブにおける放射性は、バックグラウンド値として考慮された。１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩは、放射性標識時に損傷を受けた幾らかのフラクションを含有することから、結合は、抗ＦＶＩＩＩ  Ｍａｂ８８６０−コーティング樹脂と共に別個の実験で測定された最大達成可能な結合パーセントとして算出された。
【０１５２】
全ての測定は、繰り返し実施された。各実験は、２つの独立して調製された固定ペプチドサンプルを用いて実施された。各図に示されたデータは、４つの測定値の平均値である：ペプチドは、異なる日に独立して固定化されたビーズを用いて実施された２つのアッセイにおける重複測定。上記の四通りの測定値の標準偏差値（２つの独立した実験における重複測定値）は、典型的にペプチドに結合する１２５Ｉ−ｐｄ−ＦＶＩＩＩの１０％未満の測定値であった。
【０１５３】
【表３】
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【０１５４】
【表４】
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【０１５５】
【表５】
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【０１５６】
（比較例１）
ＦＶＩＩＩおよびｐｄ−ＦＶＩＩＩ結合のための比較リガンドとしてスクランブル配列を有する比較化合物の調製
実施例１に記載された手法を、任意のスクランブルアミノ酸配列（ＥＣＹＹＥＨＷＳ）を有するペプチドを用いて反復した。引き続き、このスクランブルペプチドを担持する樹脂に結合するＦＶＩＩＩならびに非コーティング樹脂に結合するＦＶＩＩＩを、実施例１に関して上記と同じ様式で調べた。結果は下表２に示す。
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
実施例１に報告された結果と比較例１の結果との比較は、本発明の化合物が、スクランブルペプチドと比較してＦＶＩＩＩに対して有意により高い親和性を提示することを示している。
【０１５９】
（実施例２）
Ｐ１５で覆われた樹脂およびＰ２２で覆われた樹脂に対する組換えＦＶＩＩＩの結合
Kogenate（登録商標）およびReFacto（登録商標）は、それぞれBayerならびにWyeth-Ayerst PharmaciaおよびUpjohnから市販されているＦＶＩＩＩの組換え体である。
【０１６０】
Kogenate（登録商標）を、免疫親和性クロマトグラフィに次いで、直線勾配のＮａＣｌによりResource Q HR5/5カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィにより、全量４０００ＩＵ（５本のバイアル）から精製した。精製Kogenate（登録商標）は、１３０μｇ／ｍｌの濃度、７４０ＩＵ／ｍＬの活性、および５７００ＩＵ／μｇの比活性を有した。ReFacto（登録商標）を、免疫親和性クロマトグラフィに次いで、Resource Q HR5/5カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィにより、全量５０００ＩＵ（５本のバイアル）から精製した。精製ReFacto（登録商標）は、８９μｇ／ｍｌの濃度、８６４ＩＵ／ｍＬの活性、および９７０７ＩＵ／μｇの比活性を有した。
【０１６１】
Kogenate（登録商標）およびReFacto（登録商標）を、ｐｄ−ＦＶＩＩＩに関して実施例１に記載されたのと同じ様式でヨウ素化した。タンパク質結合は、上記実施例１に記載されたのと同じ手法を用いて測定した。実験結果は、下表３に要約している。
【０１６２】
【表７】
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【０１６３】
この実験結果により、本発明の化合物はまた、組換えＦＶＩＩＩなどのＦＶＩＩＩ様タンパク質に関して高親和性を示したことを立証している。
【０１６４】
（実施例３）
Ｐ２２で覆われた樹脂を用いる活性ｐｄ−ＦＶＩＩＩの精製
ペプチド模倣誘導体Ｐ２２を、実施例１に記載されたトヨパール樹脂上に固定化した。２５ｍｇのペプチドおよび３６０ｍｇの樹脂を用いた。生じた樹脂（約１ｍｌ）を、ガラスカラム（Pharmacia-Biotech）に詰めた。精製手法は、Waters 650E Advanced Protein Purifiction Systemを用いて実施した。緩衝液Ａは、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０であり、緩衝液Ｂは、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０であった（ｐＨ６．８）。溶出は、２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）での吸光度により流動液ＵＶ検出器（Waters 490 E）によりモニターされた。次に溶出フラクションは、ＯＤ２８０を測定することによってタンパク質含量を分析し、ＦＶＩＩＩ活性は、ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ−８００自動凝固タイマーを用いるワンステージＡＰＴＴアッセイにおいて測定した。溶出フラクションからのサンプルを、１０％ＰＡＧＥに次いで、銀染色およびＦＶＩＩＩに対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット法により解析した。
【０１６５】
上記のとおり免疫親和性およびイオン交換クロマトグラフィにより予め精製したＦＶＩＩＩ（０．５ｍｇ）を、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０により、０．１Ｍ  ＮａＣｌの最終塩濃度に希釈した。この混合物を、Ｐ２２カラムに適用し、次いでＯＤ２８０がバックグラウンドに戻るまで緩衝液Ａで洗浄した。結合タンパク質を、２０％緩衝液Ａ−８０％緩衝液Ｂにより溶出した。溶出プロフィールは図１に示す。
【０１６６】
ＦＶＩＩＩの精製は、ＦＶＩＩＩが入っている細胞馴化ＦＢＳ含有ＳＦ９培地より実施した。上記のとおり免疫親和性およびイオン交換クロマトグラフィにより予め精製したＦＶＩＩＩ（０．５ｍｇ）を、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０により、０．１Ｍ  ＮａＣｌの最終塩濃度で希釈された細胞馴化ＦＢＳ含有ＳＦ９培地と混合した。この混合物をカラムに適用し、次いでＯＤ２８０がバックグラウンドに戻るまで緩衝液Ａで洗浄した。１５％緩衝液Ａ−８５％緩衝液Ｂによる洗浄は、多少の結合不純タンパク質を溶出させるために実施した。この結合タンパク質は、４０％緩衝液Ａ−６０％緩衝液Ｂにより溶出された。溶出プロフィールは図２に示す。
【０１６７】
【表８】
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【０１６８】
双方の精製において、十分に満足すべきカラム保持および好結果の溶出が達成された（図３および図４）。ＦＢＳ含有培地からＦＶＩＩＩの精製時に、供給源液中のＦＶＩＩＩに対して大過剰で存在した不純タンパク質を首尾よく除去した（図３および図４、表４）。
【０１６９】
ペプチド模倣精製ＦＶＩＩＩサンプルは、市販の純粋ＦＶＩＩＩ製剤（図３のレーン２、図４のレーン２）を陽性対照としてとった、以下のバンド：Ｂ−ドメインの異なるタンパク質分解のため不均一な２３０〜９０ｋＤａの重鎖バンド、および約８０ｋＤａの軽鎖二重バンド（異なるグリコシル化のため）から視覚的に識別され、それらは、しばしば、約５５ｋＤａの分子量を有する分解できない単一のタンパク質分解バンド、約４５ｋＤａの分子量を有する別のタンパク質分解バンドである。いずれの調製物も、４５ｋＤａ重鎖由来のタンパク質分解バンドの何らかのより深いタンパク質分解の検出可能な量を含有しなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、予め精製されたＦＶＩＩＩからの精製物、およびＦＶＩＩＩが入っているＦＢＳ含有ＤＭＥＭ馴化培地からの精製物からの溶出フラクションは、基本的に同じ数のタンパク質バンドを有し、バンド間の物質分布は、陽性対照ＦＶＩＩＩと本質的に異ならない。これらの結果により、細胞馴化または純粋バックグラウンドのいずれからのペプチドで精製されたＦＶＩＩＩ調製物は、市販の免疫アフィニティー精製ＦＶＩＩＩ対照と同じＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットパターンを示したことを裏付けている。
【０１７０】
（実施例４）
Ｐ１で覆われた樹脂によるＦＶＩＩＩの精製
ペプチドＰ１を、実施例１に記載された樹脂に結合させた。２５ｍｇのペプチドおよび３６０ｍｇの樹脂を用いた。生じた樹脂（約１ｍｌ）を、ガラスカラム（Pharmacia-Biotech）に詰めた。ＦＶＩＩＩ含有サンプルは、実施例３に関して記載されたとおり精製し、２つの実験の間の唯一の相違は、本実験において緩衝液Ａによる前溶出ステップを含まないことである。
【０１７１】
精製の詳細は、下表５に要約している：
【０１７２】
【表９】
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【０１７３】
双方の精製において、十分に満足すべきカラム保持および好結果の溶出が達成された（図５および図６）。ＦＢＳ含有培地からＦＶＩＩＩの精製時に、供給源液中のＦＶＩＩＩに対して大過剰で存在した不純タンパク質を首尾よく除去した（図６、表５）。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
図面の説明
【図１】実施例３に記載されるとおり、予め精製されたＦＶＩＩＩの精製に関する精製プロフィールを示す図である。
【図２】実施例３に記載されるとおり、ＦＶＩＩＩが入っている細胞馴化ＦＢＳ含有培地からのＦＶＩＩＩに関する精製プロフィールを示す図である。
【図３】実施例３に記載されるように、純粋ＦＶＩＩＩの吸着および溶出からのフラクション（レーン２〜６）およびＦＶＩＩＩが入っている細胞馴化ＦＢＳ含有培地からの精製によるフラクション（レーン７〜１２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。レーン１：分子量標品；レーン２：純粋ＦＶＩＩＩ；レーン３：純粋ＦＶＩＩＩのカラムへの供給源溶液；レーン４：流液；レーン５および６：溶出フラクション；レーン７：培地；レーン８：カラムへのＦＶＩＩＩを有する培地；レーン９：流液；レーン１０および１１：０．２Ｍ  ＮａＣｌによる前洗浄液からの溶出フラクション；１Ｍ  ＮａＣｌによる溶出フラクション。
【図４】実施例３に記載されるように、純粋ＦＶＩＩＩの吸着および溶出からのフラクション（レーン２〜６）およびＦＶＩＩＩが入っている細胞馴化ＦＢＳ含有培地からの精製によるフラクション（レーン８〜１２）のウェスタンブロットを示す写真である。レーン１：純粋ＦＶＩＩＩ；レーン２：純粋ＦＶＩＩＩのカラムへの供給源溶液；レーン３：流液；レーン４および５：溶出フラクション；レーン６：カラムへのＦＶＩＩＩを有する培地；レーン７：流液；レーン８および９：０．２Ｍ  ＮａＣｌによる前洗浄液からの溶出フラクション；レーン１０：１Ｍ  ＮａＣｌによる溶出フラクション。
【図５（ａ）】実施例４に記載されるように、予め精製されたＦＶＩＩＩの精製に関する精製プロフィールを示す図である。
【図５（ｂ）】実施例４に記載されるように、予め精製されたＦＶＩＩＩからの精製によるフラクション（レーン１〜４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。レーン１：純粋ＦＶＩＩＩ；レーン２：流液；レーン３：洗浄液フラクション；レーン４：１Ｍ  ＮａＣｌによる溶出フラクション。
【図５（ｃ）】実施例４に記載されるように、予め精製されたＦＶＩＩＩからの精製によるフラクションのウェスタンブロット解析を示す写真である。レーン５：純粋ＦＶＩＩＩ；レーン６：流液；レーン７：１Ｍ  ＮａＣｌによる溶出フラクション。
【図６（ａ）】実施例４に記載されるように、ＦＶＩＩＩが入っているＦＢＳ含有ＤＭＥＭ馴化培地からの精製に関する精製プロフィールを示す図である。
【図６（ｂ）】実施例４に記載されるように、ＦＶＩＩＩが入っているＦＢＳ含有ＤＭＥＭ馴化培地からの精製によるフラクション（レーン１〜４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。レーン１：粗製培地；レーン２：カラムへの供給源液；レーン３：流液；レーン４：１Ｍ  ＮａＣｌによる溶出フラクション。
【図６（ｃ）】実施例４に記載されるように、ＦＶＩＩＩが入っているＦＢＳ含有ＤＭＥＭ馴化培地からの精製によるフラクションのウェスタンブロット解析を示す写真である。レーン５：純粋ＦＶＩＩＩ；レーン６：流液；レーン７：１Ｍ  ＮａＣｌによる溶出フラクション。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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