(57)【要約】本発明は、ソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体を発現する腫瘍の治療のための、脱メチル化剤およびＨＤＡＣ阻害剤の群から選択される少なくとも１つの化合物、ならびにソマトスタチン類似体またはドーパミン・アゴニストの少なくとも１つを含む、薬学的組成物を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱メチル化剤またはヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の少なくとも１つ、およびソマトスタチン類似体またはドーパミン・アゴニストの少なくとも１つを含む、薬学的組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの脱メチル化剤、少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤、およびソマトスタチン類似体またはドーパミン・アゴニストの少なくとも１つを含む、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの脱メチル化剤、少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤、少なくとも１つのソマトスタチン類似体および少なくとも１つのドーパミン・アゴニストを含む、請求項１または２記載の薬学的組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの脱メチル化剤が、５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ、デシタビン）、５−アザシチジン（５−アザＣ）、アラビノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）およびジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤が、ヒドロキサム酸（ｈｙｄｒｏｘａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄｓ）（トリコスタチンＡ、ＳＡＨＡ、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４２５、ＰＸＤ−１０１など）、カルボン酸（ブタン酸、バルプロ酸、４−フェノキシブタン酸など）、ベンズアミド（Ｎ−アセチルジナリン（ａｃｅｔｙｌｄｉｎａｌｉｎｅ）、ＭＳ−２７５およびその誘導体など）、エポキシド（デピューディシン（ｄｅｐｅｕｄｉｃｉｎ）、トラポキシンＡなど）、ＦＫ２２８、アピシジンＡ、ＢおよびＣからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのソマトスタチン類似体が、ソマトスタチン−１４、ソマトスタチン−２８、コルチスタチン−１４、コルチスタチン−１７、コルチスタチン−２９、オクトレオチド、バプレオチド、ランレオチド、ＣＨ２７５、ＣＨ−２８８、ＢＩＭ−２３０５６、ＢＩＭ−２３２０６、ＢＩＭ−２３２６８、ＢＩＭ−２３９２６、ＢＩＭ−２３０５２、ＢＩＭ−２３２４４、ＢＩＭ−２３Ａ７５８、ＢＩＭ−２３Ａ７６０、ＢＩＭ−２３２Ａ７６１、ＢＩＭ−２３Ａ７６５、Ｌ−およびＤ−Ｔｙｒ（８）ＣＹＮ１５４８０６、Ｌ−７７９，９７６、Ｌ−８０３，０８７、Ｌ−８１７，８１８、ＢＩＭ２３Ａ３８７、ＳＯＭ−３２０ならびにＫＥ−１０８からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのドーパミン・アゴニストが、アマンタジン、ブロモクリプチン、カベルゴリン、キナゴリド、リスリド、ペルゴリド、ロピニロール、プラミプレキソール（ｐｒａｍｉｐｒｅｘｏｌｅ）、ラサギリン、ＢＩＭ２３Ａ３８７、ＢＩＭ−２３Ａ７５８、ＢＩＭ−２３Ａ７６０、ＢＩＭ−２３２Ａ７６１およびＢＩＭ−２３Ａ７６５からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項７】
ソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体を表面上に発現する腫瘍の治療のための、あるいはサルコイドーシス、関節リウマチなどの、慢性免疫疾患の治療のための、請求項１〜６のいずれか記載の薬学的組成物の使用。
【請求項８】
前記腫瘍が、下垂体腺腫、膵島腫瘍、インスリノーマ、カルチノイド、褐色細胞腫、傍神経節腫（ｐａｒａｇａｇｌｉｏｍａ）、甲状腺髄様癌などの神経内分泌腫瘍；乳房、腎臓、結腸、膵臓、前立腺または卵巣腫瘍などの腺癌；髄膜腫などの脳腫瘍；ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫ならびに急性および慢性白血病などの血液学的悪性病変；肝細胞癌のような他の悪性病変である、請求項７記載の使用。
【請求項９】
腫瘍または慢性免疫疾患の治療用の薬剤の製造のための、少なくとも１つの脱メチル化剤、およびソマトスタチン類似体またはドーパミン・アゴニストの少なくとも１つの組成物の使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか記載の薬学的組成物の投与によって、癌を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の分野に、より具体的には、腫瘍治療に、より具体的には、ソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体を発現する腫瘍の治療に関する。
【０００２】
哺乳動物細胞において、ゲノムＤＮＡ中のおよそ３５〜５％のシトシン残基は、５−メチルシトシンとして存在する（Ｅｈｒｌｉｃｈら，  １９８２，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：２７０９−２７２１）。シトシンのこの修飾は、ＤＮＡ複製後に行われ、そしてメチル・ドナーとしてＳ−アデノシル−メチオニンを用い、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒される。およそ７０％〜８０％の５−メチルシトシン残基が、ＣｐＧ配列中に見られる（Ｂｉｒｄ，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：２０９−２１３）。この配列がゲノム中に高頻度で見られる際、ＣｐＧアイランドと称される。非メチル化ＣｐＧアイランドはハウスキーピング遺伝子と関連し、一方、多くの組織特異的遺伝子のアイランドは、発現される組織を除いて、メチル化されている（ＹｅｖｉｎおよびＲａｚｉｎ，  １９９３，  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．中  Ｂｉｒｋｈａｕｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  バーゼル，  ｐ．  ５２３−５６８）。ＤＮＡのこのメチル化は、胚発生中、真核細胞において、異なる遺伝子の発現の制御に重要な役割を果たすと提唱されてきた。この仮説と一致して、ＤＮＡメチル化の阻害は、哺乳動物細胞において、分化を誘導することが見いだされてきた（ＪｏｎｅｓおよびＴａｙｌｏｒ，  １９８０，  Ｃｅｌｌ  ２０：８５−９３）。
【０００３】
遺伝子の制御領域におけるＤＮＡのメチル化は、該遺伝子の転写を阻害可能である。これはおそらく、ＤＮＡらせんの主溝内に５−メチルシトシンが侵入して、これが転写因子の結合に干渉することによって引き起こされる。
【０００４】
通常、正常組織と比較して、癌で、ＤＮＡメチル化の３つの主な変化が生じる。まず、癌細胞は、ゲノム全般の低メチル化を示し、これは染色体不安定性（Ｅｄｅｎら，  ２００３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：４５５；  Ｇａｕｄｅｔら，  ２００３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：４８９−４９２）、ならびに通常はサイレンシングされている反復ＤＮＡ要素の活性化（Ｗａｌｓｈら，  １９９８，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０，  １１６−１１７）と関連づけられている。
【０００５】
第二に、ＣｐＧアイランドの新規メチル化が、腫瘍発展を通じて生じうる。腫瘍においては、正常組織と比較して、異常にメチル化されたＣｐＧアイランドが平均６００あると概算されるが、これは、腫瘍タイプ間および特定の組織学的サブタイプ内で非常に多様でありうる。さらに、多数の腫瘍タイプでメチル化されるＣｐＧアイランドがある一方、他のＣｐＧアイランドは、特定の腫瘍タイプでのみメチル化されるように、メチル化はランダムに起こるのではない（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，  Ｊ．Ｆ．ら，  ２０００，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４：１３２−１３８；  Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｈｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｇ．，  ２００２，  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １９６：１−７）。これは、特定の遺伝子でのＣｐＧアイランドのメチル化が、癌細胞に増殖または生存上の利点を与え、そしてしたがって、調べている腫瘍タイプにおける、遺伝子サイレンシングの選択圧に応じて、メチル化のパターンが生じるというモデルと一致する。
【０００６】
第三に、ＤＮＡ中のメチル化シトシン、５−メチルシトシンは、シトシンからウラシルへの脱アミン化よりもはるかに高い率で、チミンを形成する自発的脱アミン化を経ることが可能である（Ｓｈｅｎら，  １９９４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：９７２−９７６）。５−メチルシトシンの脱アミン化が修復されなければ、ＣからＴの転移突然変異を生じるであろう。これは、コード領域中に見いだされうるが、多くの腫瘍サプレッサー遺伝子はまた、プロモーター領域中のＣｐＧアイランドの異常なメチル化によっても不活性化されうる。ＤＮＡの異常なメチル化が腫瘍形成中に行われる分子機構は明らかではない。親鎖中の相補的ＣｐＧを伴わずに、新生するＤＮＡ鎖中のＣｐＧアイランドをメチル化することによって、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが、誤りを犯すことも可能である。異常なメチル化が、これらの部位がメチル化されないように保護するＣｐＧ結合タンパク質を除去したためであることもまた、可能である。機構がどのようなものであれ、異常なメチル化の頻度は、正常哺乳動物細胞においては、まれな事象である。
【０００７】
上記に基づいて、２’−デオキシシチジンの誘導体などの、メチル化を阻害する化合物（５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ、デシタビン）、５−アザシチジン（５−アザＣ）、アラビノシル−５−アザシトシン（ファザラビン）およびジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ））が、腫瘍抑制遺伝子を含む後成的にサイレンシングされた遺伝子の発現を活性化しうるため、これらは抗腫瘍特性を有すると提唱されてきている。さらに、これらの脱メチル化剤は、シスプラチン、エピルビシンおよびテモロゾミド（ｔｅｍｏｌｏｚｏｍｉｄｅ）を含む、ある範囲の化学療法剤に対する感受性を回復しうる（Ｐｌｕｍｂ，  Ｊ．Ａ．ら，  ２０００，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０：６０３９−６０４４；  Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ，  Ｇ．ら，  １９９９，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２３３５−２３４１）。特異的ターゲットに対して現在開発中である、多くの他の新規療法剤と同様、脱メチル化剤は、腫瘍細胞において、異常にメチル化されている腫瘍サプレッサーおよび細胞周期遺伝子の抑制を特異的に逆転させることによって、腫瘍増殖を阻害し、そしてしたがって非特異的な慣用的化学療法よりも副作用がより少ないと期待される（Ｉｓｓａ，  Ｊ．Ｐ．，  ２００３，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １５：４４６−４５１）。デシタビン、ならびにアムサクリン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンン、インターフェロン・アルファ、レチノイン酸、トポテカンおよびテモゾロミドを含む、多様な臨床的に重要な細胞傷害剤の相乗的細胞傷害性が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで報告されてきている（Ｆｒｏｓｔ，  Ｐ．ら，  １９９０，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０：４５７２−４５７７；  Ｋｒｉｔｚら，  １９９６，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ５１（２）：要約；  Ｃｏｌｏｍｂｏら，  １９８６  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｐ．  ７０（１２）：  要約；  Ｍｏｍｐａｒｌｅｒ，  Ｒ．Ｌ．ら，  １９９０，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ５４：２１−２８；  Ａｎｚａｉら，  １９９２，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２（８）：  要約；  Ｄｏｒｅら，  １９９２，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ３（３）：  要約；  Ｓｃｈｗａｒｔｓｍａｎｎら，  １９９７，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１（補遺１）：  要約；  Ｗｉｌｌｅｍｚｅら，  １９９７，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１（補遺１）：  要約；  Ｐｌｕｍｂら、上記）。Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ，  Ｊ．ら（ＷＯ  ２００２／０６７６８１）によって、脱メチル化剤およびすべての既知の抗腫瘍薬剤の併用が請求されているが、立証されてはいない。
【０００８】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）を通じて、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を遮断することによってもまた、後成的サイレンシングが阻害されうる。上述のようなＤＮＡ中のシトシン残基のメチル化の次に、アセチル基の除去が遺伝子サイレンシングの主な機構である。
【０００９】
複製独立プロセスによる細胞周期全体でのヒストンの沈着は、あらかじめ存在したヌクレオソームがほどけて、そしてそのヒストンが放出されることを暗示する。転写プロセスは、クロマチン・ファイバーの局所アンフォールディングおよび「開いた」クロマチン立体配置を生じることが知られる。細菌ポリメラーゼでのヌクレオソーム・テンプレートの転写は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＤＮＡからヒストン八量体を置換することなく、起こることも可能であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって、真核生物の核では、測定可能な量の転写依存性ヒストン置換が起こることが立証された。実際、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであっても、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、生理学的条件下で、実質的に、ヌクレオソームＤＮＡを転写不能である。転写は、ポリメラーゼがヌクレオソームＤＮＡを通過するために、ヒストン−ＤＮＡ接触が破壊されることを必要とする。ヒストン八量体がＤＮＡとのある程度の接触を解放して、そして他の接触を維持する場合、転写はヒストン置換を伴わずに起こりうるが、ある程度の頻度で、すべての接触が解放されうる。その結果、ヒストン八量体は、単純にはがれ落ちるであろう。さらに、局在性リモデリング因子が作用する際に、ヌクレオソーム構造を破壊するであろう。ヌクレオソームが破壊される際にヒストン置換が時々起こるならば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ観察を一致させることも可能である。圧縮されたクロマチン・ファイバー（すなわち、「閉じた」クロマチン）中のヌクレオソームに対する制約は、ヒストン置換を制限するであろう。
【００１０】
ある範囲の生物由来のヘテロクロマチン・ドメインと関連する低アセチル化、特にヒストンＨ３およびＨ４の低アセチル化が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で最も詳細に研究されてきている。テロメアおよびＨＭＬ／ＨＭＲ遺伝子座でのサイレント状態を確立し、そして維持するのに必要な、多くのシスおよびトランス作用因子が同定されてきている。これらの研究は、低アセチル化ヒストンの必要性を立証してきた。サイレンシングは、特定のＤＮＡ結合タンパク質との相互作用によって補充される多タンパク質、ヌクレオソーム結合性ＳＩＲ（１−４）複合体によって仲介される。Ｓｉｒ３およびＳｉｒ４は、低アセチル化状態のヒストンＨ３およびＨ４のＮ末端テールと特異的に相互作用する。ヒストンのＮ末端テールは、酵母の増殖に、個々に必要とはされないが、これらはサイレンシングに本質的な役割を果たし、Ｈ３のアミノ酸４〜２０およびＨ４のアミノ酸１６〜２９が必要である。特定のｓｉｒ３アレルは、ヒストンＨ４テール突然変異のサイレンシング欠陥を抑制可能であり、そしてＳｉｒ３およびＳｉｒ４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒストンＨ３およびＨ４のアミノ末端に結合可能であり、直接の相互作用が示唆される。異なるヒストン・アセチル化アイソフォームに対する抗体を用いた最近の研究によって、テロメアおよびＨＭＬ／ＨＭＲヘテロクロマチン中のヒストンが、すべての修飾部位で、低アセチル化されていることが示されている。
【００１１】
ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞培養に該薬剤を添加した最初の２４時間中にヒストン・アセチル化に影響を及ぼし、通常は、最初の１６時間以内にピークとなる（正確な時間は、細胞株、化合物等に応じる）。この効果は、薬剤を含まない新鮮な培地中で細胞を増殖させることによって逆転させることも可能である。遺伝子発現プロフィール上の変化もまた、処理の最初の２４時間の間であるようであり、この際にヒストンが高アセチル化される。すべての既知のＨＤＡＣ阻害剤が、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１ＷＡＦ１のｍＲＮＡおよびタンパク質レベル両方での増加、ならびに細胞周期停止を引き起こす。これらは、類似の機構によって（例えば、すべてのＨＤＡＣにおいて非常に保存されている、ＨＤＡＣ触媒ポケットへの、アセチル−リジン残基のアクセスを遮断することによって）作用するが、これらの物質は、顕著に異なる効果を有する：同じ細胞株において、いくつかの化合物の作用を観察すると、多様な遺伝子発現パターンが見いだされ、そして細胞周期停止は、Ｇ２／Ｍ（最も頻繁）またはＧ／Ｓで生じうる。
【００１２】
神経内分泌腫瘍において、ならびに乳癌、前立腺癌および結腸癌などの未分化上皮腫瘍において、ソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体が腫瘍細胞表面で発現されている（Ｒｅｕｂｉ，  Ｊ．Ｃ．およびＬａｎｄｏｌｔ，  Ａ．Ｍ．，  １９８９，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ６８：８４４−８５０；  Ｃｈａｎｓｏｎ，  Ｐ．ら，  １９９３，  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  １１９：２３６−２４０；  Ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ，  Ｔ．Ｗ．Ａ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔ．  ７５：１３１０−１３１７；  Ｄｅ  Ｈｅｒｄｅｒ，  Ｗ．Ｗ．，  １９９４，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ９６：３０５−３１２；  Ｒｅｕｂｉ，  Ｊ．Ｃ．ら，  １９９０，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３９（補遺２）：７８−８１；  Ｌａｍｂｅｒｔｓ，  Ｓ．Ｗ．Ｊ．，  １９９１，  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  １２：４５０−４８２；  Ｌｅｍｍｅｒ，  Ｋ．ら，  ２００２，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ７１：６６７−６７８）。ソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体陽性腫瘍患者において、これらのＧタンパク質共役型受容体は、それぞれ、ソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニストでの治療のターゲットとなるであろうが、これは、こうした類似体およびアゴニストが腫瘍細胞によるホルモンおよび生物活性ペプチドの産生を阻害する結果、関連する重度の臨床的総体症状のよりよい制御を生じるためである。ソマトスタチン類似体およびドーパミン・アゴニストが、いくつかの実験モデルにおいて、腫瘍細胞増殖を阻害する（Ｌａｍｂｅｒｔｓら、１９９１、上記；  Ｓｃｈａｌｌｙ，  Ａ．Ｖ．，  １９８８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：６９７７−６９８５；  Ｌａｍｂｅｒｔｓ，  Ｓ．Ｊ．Ｗ．ら，  １９９６，  Ｎｅｗ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３４：２４６−２５４）一方、こうした腫瘍増殖阻害効果は、臨床的には観察されないか、またはまれにしか観察されない（Ｈｅｊｎａ，  Ｍ．ら，  ２００２，“Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：  ｍｕｃｈ  ａｄｏ  ａｂｏｕｔ  ｎｏｔｈｉｎｇ？”  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １３：  ６５３−６６８）。何らかの効果がある場合、ドーパミン・アゴニストは、主に、タンパク質合成を阻害し、そして細胞体積を減少させることによって、腫瘍退行を引き起こす（ＭｃＮｉｃｈｏｌ，  Ａ．Ｍ．ら，  ２００５，  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．  １４７（７）：２００５−２００７）。ソマトスタチン類似体に関して、下垂体における成長ホルモン産生性腫瘍の退行が記載されてきている（ＷＯ  ００／７５１８６；  ＵＳ  ５，５３８，７３９）が、治療を停止すると、しばしば、腫瘍体積の迅速な増加が導かれ、したがって、潜在的な増殖阻害効果は否定される。ソマトスタチン類似体がヒトにおいて有効でないようであるのはなぜか、いくつかのありうる理由が提供されてきている（Ｌａｍｂｅｒｔｓ，  Ｓ．Ｗ．Ｊ．ら，  ２００２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌ．  １３：４５１−４５７）：（ｉ）大部分のヒト癌は、間質組織および上皮腫瘍細胞の異なるクローンの混合物を含み、これらはソマトスタチン受容体（ｓｓｔ）を均一に発現しない。これは、大部分の場合、すべての腫瘍細胞上にｓｓｔを均一に発現する、動物における大部分の単クローン性の腫瘍モデルとはまったく対照的である；（ｉｉ）ヒト乳癌、前立腺癌および結腸癌の一部でのｓｓｔ発現は、しばしば、腫瘍分化の喪失の指標である。一般的に、神経内分泌細胞分化を伴うこれらの未分化腫瘍は、その発展段階で劣った予後を有する；（３）腫瘍学における新規臨床試験の性質のため、しばしば、研究に含まれるのは、主に、疾患開始末期の患者である。さらに、以前の化学療法がｓｓｔの数を減少させうる予備的証拠がある；そして（ｉｖ）これまでに、臨床試験において適用されたｓｓｔ２特異的類似体が、使用すべき最高の化合物であるかどうかは不明なままである。
【００１３】
発明の概要
本発明者らはここで、驚くべきことに、ソマトスタチン類似体、ドーパミン・アゴニストまたはソマトスタチン−ドーパミン・キメラ分子（ソマトスタチンおよびドーパミンＤ２受容体の両方を同時にターゲットとする）と、脱メチル化剤との併用が、ソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニストの単剤治療の療法的有効性に伴う問題を克服し、そしてソマトスタチン類似体、ドーパミン・アゴニストまたはソマトスタチン−ドーパミン・キメラ分子と、脱メチル化剤の併用治療が、それぞれ、ソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体を発現する腫瘍の有効療法を提供することを見いだした。後成的サイレンシングは、ＤＮＡメチル化によってのみでなく、ヒストン脱アセチル化によっても引き起こされるため、ＨＤＡＣ阻害剤の、ソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニストとの併用、あるいはソマトスタチン−ドーパミン・キメラ分子との併用での、匹敵する相乗効果が想定される。
【００１４】
したがって、本発明は、脱メチル化剤またはＨＤＡＣ阻害剤の少なくとも１つ、およびソマトスタチン類似体またはドーパミン・アゴニストの少なくとも１つを含む、薬学的組成物、ならびにソマトスタチンまたはドーパミン受容体を発現する腫瘍の治療用の前記薬学的組成物の使用を含む。
【００１５】
発明の詳細な説明
導入部分に記載した問題のため、腫瘍増殖および発展の制御のためにソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニストを用いる多くの試みは、失敗したか、または予期したようには成功しなかった。本発明者らが試験してきた仮説の１つは、これらの化合物で適切な腫瘍増殖制御を得るのに失敗したのは、腫瘍遺伝子、特にソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体の活性化を介した腫瘍増殖阻害効果に関与する遺伝子の高メチル化のためであったというものである。したがって、本発明者らは、実験セクションに報告するような実験を設定し、そして驚くべきことに、ソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニスト、またはソマトスタチン−ドーパミン・キメラ分子と、デシタビンなどの脱メチル化剤の併用治療が、ソマトスタチン類似体、ドーパミン・アゴニストまたはソマトスタチン−ドーパミン・キメラ分子の有効性を劇的に増加させることを観察した。観察された強力な相乗的腫瘍増殖阻害効果は、少なくとも部分的に、ＤＮＡ断片化（アポトーシス）の増加のためであると考えられる。
【００１６】
本発明で適用可能な、いくつかの脱メチル化剤が当該技術分野に知られる。１つの主な群は、２’−デオキシシチジンの誘導体によって形成され、このうち、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）が、現在最も使用されている。デシタビンおよび天然ヌクレオシド、デオキシシチジンの間の構造的相違は、シトシン環の５位の炭素原子に比較して、この位に窒素が存在することである。デシタビンの２つの異性体型が区別可能であり、このうち、β−アノマーが活性型である。デカビチン（ｄｅｃａｂｉｔｉｎｅ）は、多数の薬理学的特性を所持する。分子レベルでは、ＤＮＡへの取り込みのため、該薬剤はＳ期依存性である。細胞レベルでは、デシタビンは、細胞分化を誘導し、そして血液学的毒性を発揮することも可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏで短い半減期を有するにも関わらず、デシタビンは、優れた組織分布を有する。
【００１７】
デシタビンの最も顕著な機能は、ＤＮＡメチル化を特異的にそして強力に阻害する能力である。細胞内部で、デシタビンは、主に、細胞のＳ期中に合成される、デオキシシチジン・キナーゼによって、まず活性型に変換される。三リン酸型に変換された後、デシタビンは、複製中のＤＮＡに、天然基質ｄＣＴＰと類似の速度で取り込まれる（ＢｏｕｃｈａｒｄおよびＭｏｎｐａｒｌｅｒ，  １９８３，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２４：１０９−１１４）。メチル化の特定の部位での５−メチルシトシンのデシタビンでの置換は、おそらく、酵素およびデシタビン間に共有結合が形成されるため、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの不可逆的な不活性化を生じる。ＤＮＡメチル化に必要な酵素であるＤＮＡメチルトランスフェラーゼを特異的に阻害することによって、腫瘍遺伝子の異常なメチル化が防止可能である。
【００１８】
研究者らはまた、脱メチル化剤での処理が、腫瘍細胞表面上のソマトスタチンおよびドーパミン受容体の発現を増加させることも見いだした（データ未提示）。
【００１９】
現在、天然存在および合成ＨＤＡＣ阻害剤に、製薬会社が興味を持っており、これは、これらが癌および他のヒト病変に対して使用される大きな可能性があるためである。ＨＤＡＣ阻害剤の生化学的構造は、非常に不均一であり、バルプロエートのような単純な化合物から、ＭＳ−２７５（ベンズアミド）のようなより精巧な設計に渡る。全体として、ＨＤＡＣ阻害剤は、すべてのＨＤＡＣに対して、広い範囲の活性を示すが、いくつかの例外が知られる。以下のような化学的性質および阻害機構にしたがって、これらの化合物を分類してもよい。
【００２０】
１．ヒドロキサム酸。これはおそらく、ＨＤＡＣ阻害剤の最も広範囲のセットである。これらの物質の一般構造は、ヒドロキサム酸部分がＨＤＡＣ触媒ポケットの底部の陽イオンをキレートするのを可能にする疎水性リンカーからなり、一方、分子のかさばった部分は、チューブのキャップとして作用する。この群の化学物質の大部分は、非常に強力である（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでナノモルからマイクロモル濃度で機能する）が、クラスＩ／ＩＩ  ＨＤＡＣの可逆的阻害剤である。これらの化合物の中に、本発明者らは、この分野の研究における参照物質として広く用いられるＴＳＡ（トリコスタチンＡ）を見いだしている。しかし、患者への毒性および特定のＨＤＡＣに対する特異性の欠如が、他の物質を検索する動機となってきた。ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）またはＳｃｒｉｐｔａｉｄの単純なものから、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４２５およびＰＸＤ−１０１を含む、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（スイス・バーゼル）などの製薬会社によって開発された最新薬剤に渡る、多くの合成薬剤の設計が、ＴＳＡ構造によって着想されてきており、試験され（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびいくつかの場合、臨床試験で）、そして許容されうる成功度を有することが示された、広い範囲の構築ブロックの組み合わせがある。
【００２１】
２．カルボン酸。この群には、いくつかの薬剤しかない：ブタン酸、バルプロ酸および４−フェニルブタン酸。ヒドロキサム酸よりもはるかにより強力でなく（阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではミリモル濃度で起こり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでは非常に高用量で起こる）、そして多面的な効果であるにもかかわらず、これらは現在、最もよく研究されているＨＤＡＣ阻害剤の１つである：バルプロ酸およびフェニルブチレートは、すでに、それぞれ、癲癇およびいくつかの癌を治療する際に使用するために認可されており、一方、ブタン酸（またはそのプロドラッグ型、例えばピバロイルオキシメチルブチレート）は、臨床試験中である。
【００２２】
３．ベンズアミド。ＭＳ−２７５およびその誘導体のいくつかは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、マイクロモル濃度で、ＨＤＡＣを阻害するが、その機構は明らかには理解されていない。ジアミノフェニル基が阻害性の振る舞いに非常に重要であると考えられる；おそらく、両方のアミノ官能性が、触媒部位中の金属イオンをキレートする。ＭＳ−２７５およびＮ−アセチルジナリンが、臨床試験中である。
【００２３】
４．エポキシド。これらの化学物質は、結合ポケットにおいて、エポキシド部分と亜鉛陽イオンまたはアミノ酸の反応（共有結合を形成する）を通じて、ＨＤＡＣを捕捉すると推定される。しかし、エポキシド官能性の不安定性が、有意なｉｎ  ｖｉｖｏ活性を防止し、このため、これらは薬理学的にほとんど興味を持たれない。このセットの化合物中の唯一のＨＤＡＣ阻害剤は、デピューデシン（ｄｅｐｅｕｄｅｃｉｎ）、トラポキシンＡなどの、有意なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を持つ、いくつかの天然産物である。トラポキシンは、少なくとも１つの非タンパク質生成アミノ酸を持つ環状テトラペプチドであり、そしてその構造は、新規ヒドロキサム酸に基づくＨＤＡＣ阻害剤設計のモデルとして用いられてきている。
【００２４】
５．その他。先の群のベンズアミド同様、デプシペプチドＦＫ２２８（真菌代謝産物）もまた、臨床試験中であるが、古典的なＨＤＡＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する機構は未知のままである。１つの仮説は、細胞または生物内部のジスルフィド架橋が還元され、そして次いで、４−メルカプト−ブト−１−エニル残基がＨＤＡＣ触媒ポケット内部に適合して、他の阻害剤のものと類似の方式で、Ｚｎ２＋をキレートすることを提唱する。培養細胞中では、ナノモル濃度で、ヒストン高アセチル化および増殖停止を誘導可能である。アピシジンＡは、別の真菌代謝産物であり、原生動物からヒトまでの多くの生物において、マイクロモル濃度で、ＨＤＡＣを阻害することが可能である。化学的には、該物質は、アルキルケトン残基を所持する環状テトラペプチドである。ケトン基は、触媒性Ｚｎ２＋をキレートすると提唱され、脂肪族鎖がスペーサーとして働き、そしてペプチド環の残りが「キャップ」である。アピシジンＢおよびＣ（やはり天然産物）は、同じ構造を有し、アピシジンＡと１残基異なる。実際、アピシジンのペプチド性の性質から、アミノ酸を変化させることによって、類似体の化学合成（固相方法論を使用するものを含む）を容易に設計することが可能であり、それによって、より強く、そしてより特異的なＨＤＡＣ阻害剤の検索が容易になる。トラポキシン（上記を参照されたい）もまた、アピシジンと緊密に関連する、環状テトラペプチドである。しかし、２群の物質間の主な相違は、前者が、アルキルケトン官能性でなく、エポキシケトン官能性を所持することであり、このため、該化合物は、生理学的条件下で、はるかにより安定でない。
【００２５】
これはおそらく、ソマトスタチン受容体またはドーパミン受容体の活性化の結果として作用する腫瘍抑制性遺伝子の、高メチル化および／または脱アセチル化、そしてそれによる不活性化が、ソマトスタチン、ドーパミンおよび／またはその類似体またはアゴニストの適用によって起こる、事象の正常なカスケードを防止することを意味する。この高メチル化および／または脱アセチル化効果にもかかわらず、抗腫瘍療法にこれらの化合物を用いることがなお可能であるためには、少しでも活性を観察するのに、非常に高用量のこれらの化合物が必要であろう。しかし、本発明では、強い相乗効果のため、ソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニストおよび脱メチル化剤および／またはＨＤＡＣ阻害剤の両方に関して、より低い用量が使用可能である。これは、正常組織に対して負の効果を有しうる、これらの化合物の副作用を最小限にするため、好適である。脱メチル化剤が、腫瘍細胞表面でのソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体の発現を増加させるようであるという事実によって、相乗効果が増進されさえする。
【００２６】
導入部分に論じるように、ソマトスタチン類似体のかなりの数が当該技術分野に知られる。これらは、ソマトスタチン自体（ソマトスタチン−１４およびソマトスタチン−２８など）またはコルチスタチン（コルチスタチン−１４、コルチスタチン−１７、コルチスタチン−２９）の誘導体を含む。薬学的に好ましいソマトスタチン類似体は、オクトレオチド、バプレオチド、ランレオチド、ＣＨ２７５、ＣＨ−２８８、ＢＩＭ−２３９２６、ＢＩＭ−２３２０６、ＢＩＭ−２３０５６、ＢＩＭ−２３２６８、ＢＩＭ−２３０５２、ＢＩＭ−２３２４４、Ｌ−およびＤ−Ｔｙｒ（８）ＣＹＮ１５４８０６、ならびに近年開発された非ペプチドＬ−７７９，９７６、Ｌ−８０３，０８７およびＬ−８１７，８１８である（Ｏｌｉａｓ，  Ｇ．ら，  ２００４，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ８９：１０５７−１０９１）。
【００２７】
ドーパミン・アゴニストとして、周知のアマンタジン、ブロモクリプチン、カベルゴリン、キナゴリド、リスリド、ペルゴリド、ロピニロール、プラミプレキソール（ｐｒａｍｉｐｒｅｘｏｌｅ）およびラサギリンを用いてもよい。ごく最近、ソマトスタチン−ドーパミン・ハイブリッドまたはキメラ分子が合成されてきており、例えば、すべて、ソマトスタチンおよびドーパミン受容体の両方に高アフィニティーを示す、ＢＩＭ−２３Ａ３８７（Ｓａｖｅａｎｕ，  Ａ．ら，  ２００２，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  Ｍｅｔａｂ．  ８７：５５４５−５５５２）、ＢＩＭ−２３Ａ７５８、ＢＩＭ−２３Ａ７６０、ＢＩＭ−２３Ａ７６１およびＢＩＭ−２３Ａ７６５（Ｊａｑｕｅｔ，  Ｐ．ら，  ２００５，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５３：  １３５−１４１）、ならびに大部分のソマトスタチン受容体サブタイプに高アフィニティーで結合する、「普遍的な」ソマトスタチン・リガンドＳＯＭ−３２０（Ｂｒｕｎｓ，  Ｃ．ら，  ２００２，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １４６：７０７−７１６）およびＫＥ−１０８（Ｒｅｕｂｉ，  Ｊ．Ｃ．ら，  ２００２，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４５６：４５−４９）がある。ＳＯＭ−２３０およびＫＥ−１０８は、適切な半減期特性を有する。ドーパミン−ソマトスタチン・ハイブリッド分子および普遍的ソマトスタチン類似体は、本発明において、特に好ましい。
【００２８】
上述の化合物は、通常、単剤療法で投与される方式で投与されるであろう。これは、これらを、固形または液体型で（錠剤、ロゼンジ、顆粒、粉末、サシェー、カプセル、座薬、エマルジョン、溶液、リニメント剤、チンキ、ゲル等として）、あるいは遅延放出配合物を介して（脂質、リポソームまたは移植物などのキャリアー中またはキャリアー上、プロドラッグ型または緩慢代謝誘導体等で）、単一用量として、または反復投薬として、投与してもよいことを意味する。
【００２９】
ドーパミン・アゴニストに関しては、これは、本発明の方法および組成物で用いられる他の化合物との併用投与が容易であるため、他の投薬型（ゲル、液体、スプレー、注射液等）および他の投与経路（皮下、筋内、臀筋内、静脈内、局所送達を介して（例えば移植によって）、経皮等）もまた可能であるが、これらが、好ましくは、錠剤型で経口投与されることを意味する。タンパク質性ソマトスタチン類似体は、好ましくは注射を介して投与される。オクトレオチドは、好ましくは、皮下注射または深部臀筋内注射として投与される（オクトレオチド−ＬＡＲ）一方、ランレオチドは、好ましくは、筋内または皮下注射として投与される（ランレオチド−オートゲル）。
【００３０】
ＨＤＡＣの投与経路は、用いる化合物の種類に応じ、そして好ましくは経口であるか、または注射による。上に論じる脱メチル化剤に関しては、類似のアプローチが適している。
【００３１】
適用を要する用量は、上記薬剤の通常の投与で用いる用量および投与スキームに由来してもよいが、本発明の併用の相乗効果のため、より少量の薬剤（単数または複数）で開始することが勧められる。したがって、上記の所定の物質の各々に関して、先行技術から適切な投与スキームを得て、そして適切であるように、新規相乗効果にしたがって適応させてもよい。
【００３２】
ドーパミン・アゴニスト、ブロモクリプチンの典型的な用量は、経口投与（錠剤）によって、毎日２．５〜４０ｍｇである。同様に、カベルゴリンに関しては、１回または２回の用量で投与される、０．５〜４．５ｍｇ／週の経口用量が適切である。オクトレオチドは、好ましくは注射によって投与され；８〜１２時間ごとに、皮下注射によって、０．０５〜０．５ｍｇの用量で投与してもよいし、またはオクトレオチド−ＬＡＲに関しては、１０〜４０ｍｇの用量で、深部臀筋内注射によって、４週間ごとに１回投与してもよい。長期活性ランレオチドを、１〜２週間ごとに、３０ｍｇ筋内注射によって投与してもよく、またはランレオチド−オートゲルに関しては、６０〜１２０ｍｇの用量で、深部皮下注射を通じて、３〜４週間ごとに投与してもよい。これらは、本発明で使用可能ないくつかの化合物に関して適用可能な、多様な用量および投与経路の制限されない例に過ぎない。当業者は、上述のこれらの化合物および他の化合物に適した用量および投与経路を選択する知識および技術を有するであろう。
【００３３】
脱メチル化剤および／またはＨＤＡＣ阻害剤を、ソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニストと同時に投与してもよいし、またはこれらを別個に投与してもよい。本明細書において、表現「薬学的組成物」は、上に論じるような薬剤の２以上の組成物の慣用的な意味を有することも可能である；が、薬剤を別個に、例えば異なる時間間隔で投与するが、薬剤の併用が療法効果を提供する、治療のための用量も含むこともまた意味する。特に、ソマトスタチン類似体は、好ましくはデポ注射（数日または数週間有効である）として投与されるため、脱メチル化剤（単数または複数）および／またはＨＤＡＣ阻害剤（単数または複数）の同時経口投与スキームが想定可能である。しかしまた、これらを緩慢放出配合物として投与して、患者の不快感を最小限にし、そして／またはノンコンプライアンスを最小限にすることもまた可能である。好ましくは、脱メチル化剤および／またはＨＤＡＣ阻害剤は、ソマトスタチン類似体および／またはドーパミン・アゴニストの投与前に投与される。この方式で、ソマトスタチンおよび／またはドーパミンをシグナル伝達し、そしてその効果を発揮する細胞機構（受容体（単数または複数）、シグナル伝達カスケード等）の機能する形での用意が達成される。研究者らは、ＡＺＡ（デシタビン）で１日間、前処理するとすでに、ＤＮＡ断片化（アポトーシス）または細胞増殖に対して、ソマトスタチン類似体またはドーパミン・アゴニストまたはソマトスタチン−ドーパミン・キメラ分子での、増進された相乗的活性が誘導されることを見いだした。
【００３４】
本発明にしたがった治療は、基本的に、２つの構成要素（１つの構成要素は、脱メチル化剤およびＨＤＡＣ阻害剤の群より選択され、第二の構成要素は、ソマトスタチン類似体およびドーパミン・アゴニストの群より選択される）を含むが、好ましい態様において、組成物または治療は、３つまたは４つの構成要素を含む。３つの構成要素の系では、組成物は、少なくとも１つの脱メチル化剤、少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤、ならびにソマトスタチン類似体およびドーパミン・アゴニストの群より選択される、少なくとも１つの構成要素を含む。２つまたは３つの構成要素の系において、ソマトスタチン類似体およびドーパミン・アゴニストの群より選択される構成要素は、好適には、ＢＩＭ−２３Ａ３８７、ＢＩＭ−２３Ａ７５８、ＢＩＭ−２３Ａ７６０、ＢＩＭ−２３Ａ７６１またはＢＩＭ−２３Ａ７６５などのソマトスタチン−ドーパミン・キメラリガンド、あるいはＳＯＭ−３２０またはＫＥ−１０８などの普遍的ソマトスタチン類似体である。４つの構成要素の系では、組成物または治療は、少なくとも１つの脱メチル化剤、少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤、少なくとも１つのソマトスタチン類似体および少なくとも１つのドーパミン・アゴニストを含む。
【００３５】
組成物の次に、上述のような治療法もまた、本発明の一部である。示すように、こうした治療法は、少なくとも１つの脱メチル化剤または少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤、および少なくとも１つのソマトスタチン類似体または少なくとも１つのドーパミン・アゴニストまたは少なくとも１つのソマトスタチン−ドーパミン・キメラリガンドまたは少なくとも１つの普遍的ソマトスタチン類似体の同時または連続投与を含んでもよい。連続する場合、すなわち非同時投与を適用する場合、他の化合物の投与前に、脱メチル化剤および／またはＨＤＡＣ阻害剤を投与することが好ましい。好ましくは、脱メチル化剤および／またはＨＤＣＡ阻害剤での治療は、ソマトスタチン類似体またはドーパミン・アゴニストの投与の数日前（少なくとも１日）から最大２週間前に開始する。
【００３６】
本発明の組成物を、表面上にソマトスタチンおよび／またはドーパミン受容体を発現する腫瘍を有する患者において、腫瘍の療法に用いてもよい。多くの腫瘍が、両受容体の少なくとも一方を含むことが見いだされてきており、そして一般的に、両受容体が一緒に発現される。本発明の組成物を用いた療法に適しているであろう腫瘍は、下垂体腺腫、膵島腫瘍、インスリノーマ、カルチノイド、褐色細胞腫、傍神経節腫（ｐａｒａｇａｇｌｉｏｍａ）、甲状腺髄様癌などの神経内分泌腫瘍；乳房、腎臓、結腸、膵臓、前立腺または卵巣腫瘍などの腺癌；髄膜腫などの脳腫瘍；ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫ならびに急性および慢性白血病などの血液学的悪性病変；肝細胞癌のような他の悪性病変を含み、そして組成物はまた、サルコイドーシスおよび関節リウマチなどの、慢性免疫疾患においても有用であろう。
【００３７】
腫瘍増殖と戦う利点に加えて、本発明の組成物はまた、腫瘍からの過剰なホルモン分泌も防止し、それによって、これらの腫瘍を持つ患者が経験するホルモン過剰によって誘導される多面的効果も減少させるであろう。
【００３８】
実施例
方法
細胞株および培養条件
ヒト膵臓カルチノイドＢＯＮ細胞をＴｏｗｎｓｅｎｄ博士（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ、米国テキサス州ガルベストン）から得た。５％ＣＯ２を含有する、３７℃の加湿インキュベーター中で、細胞を培養した。培地は、１０％ＦＣＳ、ペニシリン（１ｘ１０５Ｕ／ｌ）、ファンギゾン（０．５ｍｇ／ｌ）およびｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／ｌ）を補充した、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＦ１２Ｋ培地の１：１混合物からなった。定期的に、細胞がマイコプラズマ不含であることを確認した。トリプシンＥＤＴＡ１０％で細胞を採取し、そして培地中に再懸濁した。プレーティング前に、標準的血球計算板を用いて、細胞を顕微鏡的に計数した。トリパンブルー染色を用いて、細胞生存度を評価し、これは常に９５％を超えていた。培地および補充物を、ＧＩＢＣＯ  Ｂｉｏ−ｃｕｌｔ  Ｅｕｒｏｐｅ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、オランダ・ブレダ）から得た。
【００３９】
細胞増殖アッセイ
トリプシン処理後、細胞を１ｍｌの培地中、０．４〜２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレートにプレーティングした。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に入れた。３日後、用量曲線反応実験において、異なる濃度の５−アザ−２’−デオキシシチジン（０、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍおよび１０−９Ｍ）を含有するか、あるいはソマトスタチン類似体、オクトレオチド（１０−８Ｍ）またはドーパミン・アゴニスト、カベルゴリン（１０−８Ｍ）を含むまたは含まない、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ｘ１０−８Ｍ）を含有する１ｍｌ／ウェル培地で、細胞培地を交換した。５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびオクトレオチドまたはカベルゴリンの併用を評価する実験においては、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ｘ１０−８Ｍ）での前処理を２４時間行った。
【００４０】
プレートを３７℃および５％ＣＯ２でさらにインキュベーションした。処理の３日後および６日後、ＤＮＡ測定のため、細胞を採取した。６日のプレートは、３日後に培地を新しくして、そして化合物を再び添加した。各処理を４つ一組で行った。先に記載されるように（Ｈｏｆｌａｎｄ  ＬＪ，  ｖａｎ  Ｋｏｅｔｓｖｅｌｄ  ＰＭ，  Ｌａｍｂｅｒｔｓ  ＳＷ．  Ｐｅｒｃｏｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅｓ，  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ａｎａｌｏｇ  ＳＭＳ  ２０１−９９５．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９０；２６：３７−４４．）、ビスベンズイミド蛍光色素（ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ  ３３２５８）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて、細胞数を表す総ＤＮＡ含有量の測定を行った。
【００４１】
アポトーシス・アッセイ（ＤＮＡ断片化）
トリプシン処理後、１．５〜２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で、ＢＯＮ細胞を２４ウェルプレートにプレーティングした。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に入れた。３日後、用量曲線反応実験における、異なる濃度の５−アザ−２’−デオキシシチジン（１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍおよび１０−９Ｍ）、あるいはソマトスタチン類似体、オクトレオチド（１０−８Ｍ）またはドーパミン・アゴニスト、カベルゴリン（１０−８Ｍ）を含むまたは含まない、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ｘ１０−８Ｍ）の存在下または非存在下（対照群）で、細胞培地を新しくした。５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびオクトレオチド、カベルゴリンまたは新規ソマトスタチン類似体ＢＩＭ−２３２０６、ＢＩＭ−２３９２６、およびソマトスタチン−ドーパミン・キメラＢＩＭ−２３Ａ７６５の併用を評価する実験においては、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ｘ１０−８Ｍ）での前処理を２４時間行った。
【００４２】
各処理を４つ一組で行った。さらに３日間インキュベーションした後、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰｌｕｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ペンツベルグ）を用いて、アポトーシスを評価した。このアッセイは、それぞれＤＮＡおよびヒストンに対して向けられるマウス・モノクローナル抗体を用いた、定量的サンドイッチ−酵素−イムノアッセイ原理に基づく。これは、アポトーシスに典型的な、細胞溶解物の細胞質分画中のモノ−およびオリゴ−ヌクレオソームの特異的測定を可能にする。製造者に供給される標準的なプロトコルを用いた。簡潔には、吸引によって培地を注意深く除去し、１００μｌの溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰｌｕｓアッセイとともに提供される）中で細胞をインキュベーションした。細胞溶解後、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート中で、抗ＤＮＡおよび抗ヒストン抗体とともに、溶液を２時間インキュベーションした。洗浄後、４０５ｎｍでの分光光度検出のため、免疫複合体に結合したペルオキシダーゼを２，２’−アジノ−ジ［３−エチルベンズチアゾリン・スルホネート］（発色基質）で探査して、プレートに結合したヌクレオソームの量を定量化した。対照ウェルの平均吸光度に対する、処理ウェルの平均吸光度の比によって、相対的アポトーシスを決定した。
【００４３】
結果
細胞増殖に対するオクトレオチドおよびカベルゴリンの効果
オクトレオチド（１０−８Ｍ）またはカベルゴリン（１０−８Ｍ）との３日間または６日間のインキュベーション中、細胞数を反映するＤＮＡ含有量として測定すると、ＢＯＮカルチノイド細胞増殖に対する両薬剤の統計的に有意な効果はなかった。各々、２回の独立の実験の平均±ＳＥＭを表す、図１Ａおよび２Ａは、インキュベーション６日後のオクトレオチドまたはカベルゴリンの効果を示す。
【００４４】
細胞増殖に対する５−アザ−２’−デオキシシチジンの効果
５−アザ−２’−デオキシシチジンとの３日間または６日間のインキュベーション中、時間および用量依存方式で、ＢＯＮカルチノイド細胞増殖は、有意に阻害された（データ未提示）。６日間のインキュベーション後、５−アザ−２’−デオキシシチジンの腫瘍細胞増殖阻害効果のＩＣ２５値は、およそ５ｘ１０−８Ｍであった。図１Ａおよび２Ａは、低用量の５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ｘ１０−８Ｍ）が、ＢＯＮカルチノイド細胞増殖を有意に阻害したことを示す（対照に対して、ｐ＜０．００１）。
【００４５】
細胞増殖に対する５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびオクトレオチドまたはカベルゴリンの併用処理の効果
インキュベーション６日後、５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびオクトレオチド（１０−８Ｍ）またはカベルゴリン（１０−８Ｍ）の併用処理によって、５−アザ−２’−デオキシシチジン単独の効果と比較して、細胞増殖に対して、ＢＯＮカルチノイド細胞成長の、統計的に有意なより高い阻害が誘導された（それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）。
【００４６】
アポトーシス（ＤＮＡ断片化）に対するオクトレオチドおよびカベルゴリンの効果
オクトレオチド（１０−８Ｍ）またはカベルゴリン（１０−８Ｍ）との３日間のインキュベーション中、ＢＯＮカルチノイド細胞において、ＤＮＡ断片化として測定すると、アポトーシスに対する両薬剤の統計的に有意な効果はなかった。２回の独立の実験の平均±ＳＥＭを表す、図１Ｂおよび２Ｂは、ＤＮＡ断片化の誘導に対する、オクトレオチドまたはカベルゴリンの効果を示す。ソマトスタチン類似体ＢＩＭ−２３９２６およびＢＩＭ−２３２０６、ならびにソマトスタチン−ドーパミン・キメラＢＩＭ−２３Ａ７６５単独での処理に関して、同様の結果を得た。
【００４７】
アポトーシス（ＤＮＡ断片化）に対する５−アザ−２’−デオキシシチジンの効果
５−アザ−２’−デオキシシチジンとの３日間のインキュベーションによって、用量依存方式で、ＢＯＮカルチノイド細胞におけるＤＮＡ断片化が有意に誘導された（データ未提示）。３日間のインキュベーション後、５−アザ−２’−デオキシシチジンのアポトーシス誘導効果のＥＣ２５値は、およそ５ｘ１０−８Ｍであった。図１Ｂおよび２Ｂは、低用量の５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ｘ１０−８Ｍ）が、ＢＯＮカルチノイド細胞において、ほぼ１００％のＤＮＡ断片化を有意に誘導したことを示す（対照に対して、ｐ＜０．００１）。
【００４８】
アポトーシス（ＤＮＡ断片化）に対する５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびオクトレオチドまたはカベルゴリンでの併用処理の効果
図１Ｂおよび２Ｂは、５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびオクトレオチド（１０−８Ｍ）またはカベルゴリン（１０−８Ｍ）の併用処理が、３日後、５−アザ−２’−デオキシシチジン単独の効果と比較して、ＢＯＮカルチノイド細胞におけるＤＮＡ断片化の、統計的に有意なより高い誘導を誘導したことを示す（それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１）。
【００４９】
アポトーシスに対する５−アザ−２’−デオキシシチジン、ならびに新規ソマトスタチン類似体ＢＩＭ−２３９２６およびＢＩＭ−２３２０６での併用処理の効果
図３は、ソマトスタチン類似体を単独で投与すると、ヒトＢＯＮカルチノイド細胞のアポトーシス（ＤＮＡ断片化）にはまったく効果がないことを示す。しかし、新規類似体のいずれかと一緒にＡＺＡを投与すると、ＡＺＡ単独の中程度の効果から、劇的な増加が観察された。
【００５０】
アポトーシスに対する５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびソマトスタチン−ドーパミン・キメラＢＩＭ−２３Ａ７６５での併用処理の効果
図４は、ソマトスタチン−ドーパミン・キメラを単独で投与すると、ヒトＢＯＮカルチノイド細胞のアポトーシス（ＤＮＡ断片化）にはまったく効果がないことを示す。しかし、ＢＩＭ−２３Ａ７６５と一緒にＡＺＡを投与すると、ＡＺＡ単独の中程度の効果から、劇的な増加が観察された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】パネルＡは、ヒトＢＯＮカルチノイド腫瘍細胞における細胞増殖に対する、ＡＺＡ（デシタビン）、オクトレオチド、および両方の併用の効果を示す。パネルＢは、ＢＯＮ細胞におけるＤＮＡ断片化（アポトーシス）に対するこれらの化合物の効果を示す。
【図２】ＡＺＡおよびカベルゴリンに関して、図１と同様である。
【図３】ヒトＢＯＮカルチノイド細胞のＤＮＡ断片化に対する、ＡＺＡ（５ｎＭ）およびソマトスタチン類似体ＢＩＭ−２３９２６（ｓｓｔ１選択的）およびＢＩＭ−２３２０６（ｓｓｔ５選択的）（どちらも１０ｎＭ）の相乗効果。値は、２回の独立の実験の平均を表す。
【図４】ヒトＢＯＮカルチノイド細胞のＤＮＡ断片化に対する、ＡＺＡ（５ｎＭ）およびソマトスタチン−ドーパミン・キメラＢＩＭ−２３Ａ７６５（１０ｎＭ；ｓｓｔ２＋ｓｓｔ５＋Ｄ２選択的アゴニスト）の相乗効果。値は、２回の独立の実験の平均を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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