(57)【要約】  ｇａｇポリペプチドを含むウイルス様キメラ粒子が記載されている。ウイルス様粒子は、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結された脂質ラフト会合ポリペプチドとから生成される。上記抗原は、脂質ラフトと天然には会合しないものである。好ましい生成方法は、昆虫細胞内で発現させる工程を含んでいる。
2009544322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｇａｇポリペプチドと、
（ｂ）非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドとを含んでいる、キメラウイルス様粒子。
【請求項２】
上記脂質ラフト会合ポリペプチドが、ＧＰＩアンカーのポリペプチド、ミリストイル化配列のポリペプチド、パルミトイル化配列のポリペプチド、ダブルアセチル化配列のポリペプチド、シグナル伝達のポリペプチド、および膜輸送のポリペプチドから成る群から選択される、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
上記脂質ラフト会合ポリペプチドが、ＧＰＩアンカーのポリペプチド、ミリストイル化配列のポリペプチド、パルミトイル化配列のポリペプチド、ダブルアセチル化配列のポリペプチド、カベオリンのポリペプチド、フロチリンのポリペプチド、シンタキシン−１のポリペプチド、シンタキシン−４のポリペプチド、シナプシンＩのポリペプチド、アデューシンのポリペプチド、ＶＡＭＰ２のポリペプチド、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンのポリペプチド、シナプトブレビンＩＩのポリペプチド、ＳＮＡＲＥのポリペプチド、ＳＮＡＰ−２５のポリペプチド、ＳＮＡＰ−２３のポリペプチド、シナプトタグミンＩのポリペプチド、およびシナプトタグミンＩＩのポリペプチドから成る群から選択される、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
ヘマグルチニンのポリペプチドをさらに含んでいる、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
ノイラミニダーゼのポリペプチドをさらに含んでいる、請求項４に記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
（ａ）ｇａｇポリペプチドと、
（ｂ）抗原に連結されて結合を形成している脂質ラフト会合ポリペプチドとを含んでおり、
上記抗原が、脂質ラフトと天然に会合しないものである、キメラウイルス様粒子。
【請求項７】
上記結合が、共有結合、イオン相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、および抗体−抗原相互作用から成る群から選択される、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項８】
上記結合が共有結合である、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項９】
上記共有結合が、ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、およびジスルフィド結合から成る群から選択される、請求項８に記載のウイルス様粒子。
【請求項１０】
上記脂質ラフト会合ポリペプチドが内在性膜タンパク質である、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
上記脂質ラフト会合ポリペプチドが、ヘマグルチニンのポリペプチド、ノイラミニダーゼのポリペプチド、融合タンパク質のポリペプチド、糖タンパク質のポリペプチド、およびエンベロープタンパクのポリペプチドから選択される、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項１２】
上記脂質ラフト会合ポリペプチドがヘマグルチニンのポリペプチドである、請求項１１に記載のウイルス様粒子。
【請求項１３】
ノイラミニダーゼのポリペプチドをさらに含んでいる、請求項１２に記載のウイルス様粒子。
【請求項１４】
上記脂質ラフト会合ポリペプチドがノイラミニダーゼのポリペプチドである、請求項１１に記載のウイルス様粒子。
【請求項１５】
ヘマグルチニンポリペプチドをさらに含んでいる、請求項１４に記載のウイルス様粒子。
【請求項１６】
上記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、糖ポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、ポリサッカリドの接合体、ポリサッカリドのペプチド模擬体または非ペプチド模擬体、低分子、脂質、糖脂質、および炭水化物から成る群から選択される、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項１７】
上記ウイルス様粒子が昆虫細胞のグリコシル化を含んでいる、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項１８】
上記ウイルス様粒子が哺乳類細胞のグリコシル化を含んでいる、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項１９】
第２脂質ラフト会合ポリペプチドをさらに含んでいる、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項２０】
上記ウイルス様粒子と混合されたアジュバントをさらに含んでいる、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項２１】
上記アジュバントが、上記ウイルス様粒子の内側に配置されている、請求項２０に記載のウイルス様粒子
【請求項２２】
上記アジュバントが、上記ｇａｇポリペプチドに共有的に連結されて共有結合を形成している、請求項２１に記載のウイルス様粒子。
【請求項２３】
上記アジュバントが、上記ウイルス様粒子の外側に配置されている、請求項２０に記載のウイルス様粒子。
【請求項２４】
上記アジュバントが、上記脂質ラフト会合ポリペプチドに共有的に連結されて共有結合を形成している、請求項２３に記載のウイルス様粒子。
【請求項２５】
上記アジュバントがフラジェリンのアジュバント活性断片を含んでいる、請求項２０に記載のウイルス様粒子。
【請求項２６】
（ａ）ｇａｇポリペプチドと、
（ｂ）ＲＳＶの脂質ラフト会合ポリペプチドとを含んでいるキメラウイルス様粒子。
【請求項２７】
上記ウイルス様粒子が昆虫細胞のグリコシル化を含んでいる、請求項２６に記載のウイルス様粒子。
【請求項２８】
上記ウイルス様粒子が哺乳類細胞のグリコシル化を含んでいる、請求項２６に記載のウイルス様粒子。
【請求項２９】
第２脂質ラフト会合ポリペプチドをさらに含んでいる、請求項２６に記載のウイルス様粒子。
【請求項３０】
ＲＳＶ脂質ラフト会合ポリペプチドに連結されて結合を形成している抗原をさらに含んでいる、請求項２６に記載のウイルス様粒子。
【請求項３１】
上記第２脂質ラフト会合ポリペプチドが、第２ＲＳＶ抗原であるか、または第２ＲＳＶ抗原に連結されている、請求項２９に記載のウイルス様粒子。
【請求項３２】
上記第２脂質ラフト会合ポリペプチドが、ＲＳＶ抗原に連結されている、請求項２９に記載のウイルス様粒子。
【請求項３３】
上記ウイルス様粒子と混合されたアジュバントをさらに含んでいる、請求項２６に記載のウイルス様粒子。
【請求項３４】
（ａ）ｇａｇポリペプチドと、
（ｂ）エンベロープウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチドとを含んでおり、
昆虫細胞のグリコシル化を含んでいる、キメラウイルス様粒子。
【請求項３５】
上記エンベロープウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチドが、パラミクソウイルス科の脂質ラフト会合ポリペプチド、およびヘルペスウイルス科の脂質ラフト会合ポリペプチドから成る群から選択される、請求項３４に記載のウイルス様粒子。
【請求項３６】
上記脂質ラフト会合ポリペプチドが、パラインフルエンザウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチド、ムンプスウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチド、麻疹ウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチド、呼吸器合胞体ウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチド、トリニューモウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチド、ヒトメタニューモウイルスの脂質ラフト会合ポリペプチド、単純疱疹ウイルス１型（ＨＨＶ−Ｉ）の脂質ラフト会合ポリペプチド、単純疱疹ウイルス２型（ＨＨＶ−２）の脂質ラフト会合ポリペプチド、水痘帯状疱疹ウイルス（ＨＨＶ−３）の脂質ラフト会合ポリペプチド、ＥＢウイルス（エプスタインバーウイルス）（ＨＨＶ−４）の脂質ラフト会合ポリペプチド、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＨＨＶ−５）の脂質ラフト会合ポリペプチドから成る群から選択される、請求項３５に記載のウイルス様粒子。
【請求項３７】
第２脂質ラフト会合ポリペプチドをさらに含んでいる、請求項３４に記載のウイルス様粒子。
【請求項３８】
上記ウイルス様粒子と混合されたアジュバントをさらに含んでいる、請求項３４に記載のウイルス様粒子。
【請求項３９】
（ａ）ｇａｇポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列と、
（ｂ）抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列とを含んでおり、
上記抗原は脂質ラフトと天然には会合しないものであり、
上記ポリペプチドは、宿主細胞内で発現すると、ウイルス様粒子を形成するものである、キメラウイルス様粒子の発現ベクターシステム。
【請求項４０】
上記第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列が、１つの発現ベクター内に存在している、請求項３９に記載のウイルス様粒子の発現ベクターシステム。
【請求項４１】
上記第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列が、１つのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４０に記載のウイルス様粒子の発現ベクターシステム。
【請求項４２】
上記第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列が、複数の発現ベクター内に存在している、請求項３９に記載のウイルス様粒子の発現ベクターシステム。
【請求項４３】
（ａ）ｇａｇポリペプチドと抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドとを一緒に発現する、１つ以上の発現ベクターを提供する工程、
（ｂ）上記１つ以上の発現ベクターを細胞に導入する工程、および、
（ｃ）上記ｇａｇポリペプチドと上記抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドとを発現させて、キメラウイルス様粒子を製造する工程を含んでおり、
上記抗原は、脂質ラフトと天然には会合しないものである、キメラウイルス様粒子を製造する方法。
【請求項４４】
上記細胞が培養されている培地から上記ウイルス様粒子を回収する工程をさらに含んでいる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
上記１つ以上の発現ベクターがウイルスベクターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
上記ウイルスベクターが、バキュロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスから成る群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
上記ウイルスベクターがバキュロウイルスである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
上記細胞が昆虫細胞および哺乳類細胞から成る群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
上記細胞が昆虫細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
上記１つ以上の発現ベクターがバキュロウイルスであり、上記細胞が昆虫細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
上記細胞が培養されている培地から上記ウイルス様粒子を回収する工程をさらに含んでいる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
免疫系の症状あるいは病気を治療または予防する方法であって、
免疫原性量のキメラウイルス様粒子の投与を含んでおり、
上記粒子は、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結された脂質ラフト会合ポリペプチドとを含んでおり、
上記抗原は、脂質ラフトと天然には会合しないものである、方法。
【請求項５３】
上記投与は、感染防御免疫応答を被検体に誘導するものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
上記投与は、皮下投与、経皮投与、皮内投与、真皮下投与、筋肉内投与、経口投与、鼻腔内投与、バッカル投与、舌下投与、腹腔内投与、膣内投与、肛門投与、および頭蓋内投与から成る群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
免疫原性量のキメラウイルス様粒子を含んでいる薬学的組成物であって、上記キメラウイルス様粒子は、ｇａｇポリペプチド、および抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドを含んでおり、上記抗原は脂質ラフトと天然には会合しないものである、薬学的組成物。
【請求項５６】
薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいる、請求項５５に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス様粒子の分野に関する。本明細書には、特に（ａ）ｇａｇポリペプチド、および（ｂ）脂質ラフトと天然には会合しない抗原に連結された脂質ラフト会合ポリペプチドを有する、キメラウイルス様粒子が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、従来のワクチン技術を凌駕する利点をいくつか有している。ワクチン開発のためのＶＬＰの重要な利点は、３次元構造の観点と、エピトープの一次構造および立体構造の両方に対する中和抗体応答を誘導できるという観点から、ＶＬＰが天然のウイルスと似ていることである。それ故、ＶＬＰは他のワクチン製剤よりも免疫原性が強いことが分かっているといえる。ウイルスベクターを使ったアプローチとは異なり、ＶＬＰは、既存の免疫に関する問題を孕んでいないために、繰り返し使用することができる。
【０００３】
伝統的なワクチンの多くは、非経口投与され、それらの大部分は下気道を防御する全身性ＩｇＧ応答を引き起こす（または増幅する）。粘膜応答を誘導するウイルスを使った新しいアプローチは、該アプローチが上気道および下気道でのウイルスの増殖を制限することができるので、より望ましいものであり、この新しいアプローチは、それぞれを防御したり、感染を減少させたりするための、ワクチンを使った最も優れたアプローチであると思われる（１５）。鼻腔内ワクチンは、上気道および下気道を防御することに加えて、針を使った接種の複雑な作業を避けたり、微粒子状の抗原および／または可溶性の抗原と鼻咽頭会合リンパ性組織（ＮＡＬＴ）との相互作用による、粘膜ならびに全身性の体液性応答および細胞性応答を誘導する手段を提供したりする（１６−１９）。ＶＬＰは一般的に、ロタウイルス、ノロウイルス、およびパピローマウイルスのＶＬＰについて示されたような、鼻腔内投与の後に、粘膜免疫および全身免疫を誘導するのに十分適していると思われる（２８−３１）。
【０００４】
ＶＬＰのこうした利点にも拘らず、ワクチンとしてのエンベロープＶＬＰ（内在性膜タンパク質（（integral membrane protein）を含むエンベロープウイルスに由来するＶＬＰ）の開発は、現在のところ数種の問題によって制限されている。最も重要な問題の１つは、抗原の範囲が制限されていることであり、このためエンベロープＶＬＰワクチンを開発できる病気も制限されている。ＶＬＰへの抗原の組み込みには、ウイルスのキャプシドタンパク質が、ウイルス粒子の集合を開始する脂質ラフトドメインと会合することが必要になると考えられる。ＶＬＰを製造するための現在の方法では、脂質ラフトと天然に会合する天然ウイルス抗原を含むＶＬＰを形成するための、ウイルスキャップシドタンパク質の使用が制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、（脂質ラフトと天然に会合しないウイルス抗原、キャプシドタンパク質の源以外のウイルス由来の抗原、他の病原体（細菌、真菌、原虫、蠕虫、酵母など）由来の抗原、腫瘍抗原、ならびにアレルゲンを含む）あらゆる種類の抗原を含有するＶＬＰを製造することができるＶＬＰの基盤技術が必要とされている。
【０００６】
既存のＶＬＰ技術が有するもう１つ別の重要な問題は、十分な収量のＶＬＰを製造することができないことである。例えば、インフルエンザマトリックスに由来するＶＬＰは免疫原性を有しているが、該ＶＬＰは、その収量が低いために、今までは、インフルエンザワクチンの従来のものに取って代わるものとして良好な選択ではなかった。したがって、ワクチンを製造するための十分な量のＶＬＰを生成することができるＶＬＰワクチンの基盤技術も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、キメラＶＬＰを製造および使用するための、本明細書に開示されているような種々の方法および組成物を提供することによって、これらの必要性を満たすものである。上記キメラＶＬＰは、あらゆる種類の病原体の脂質ラフトと天然に会合しない抗原を含んでおり、ワクチンを製造するために十分な量で生成され得るものである。
【０００８】
１態様では、本発明は、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結された脂質ラフト会合ポリペプチドとを有しているキメラウイルス様粒子であって、上記抗原は脂質ラフトと天然には会合しないものであるキメラウイルス様粒子を提供する。結合は、共有結合、イオン相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、または抗体−抗原相互作用であってもよい。共有結合は、ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、またはジスルフィド結合であってもよい。ｇａｇポリペプチドは、レトロウイルスに由来するものであることが好ましい。レトロウイルスには、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、デルタレトロウイルス、およびレンチウイルスが含まれてもよい。
【０００９】
脂質ラフト会合ポリペプチドは、脂質ラフトと直接的にまたは間接的に会合する任意のポリペプチドであってもよく、例えば、内在性膜タンパク質であってもよい。好ましい実施形態では、脂質ラフト会合ポリペプチドは、ヘマグルチニンのポリペプチド、ノイラミニダーゼのポリペプチド、融合タンパク質のポリペプチド、糖タンパク質のポリペプチド、またはエンベロープタンパク質のポリペプチドである。
【００１０】
抗原は、免疫応答を誘発することができる任意の物質であってもよい。そのような抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、糖ポリペプチド（glycopolypeptide）、リポポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、ポリサッカリドの接合体、ポリサッカリドのペプチド模擬体または非ペプチド模擬体、低分子、脂質、糖脂質、あるいは炭水化物などが挙げられる。抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真核生物の病原体の抗原、腫瘍抗原、またはアレルゲンであることが好ましい。
【００１１】
また別の態様では、本明細書に記載のウイルス様粒子は、ウイルス様粒子と会合したアジュバントを含んでいる。アジュバントは、ＶＬＰの内側に配置されてもよい。なお、該アジュバントは、ｇａｇポリペプチドに共有連結されていることによって、ＶＬＰの内側に配置されていることが好ましい。他の実施形態では、アジュバントは、ＶＬＰの外側に配置されている。なお、該アジュバントは、脂質ラフト会合ポリペプチドに共有連結されていることによって、ＶＬＰの外側に配置されていることが好ましい。ポリペプチドアジュバントの好ましい例には、フラジェリンおよびそのアジュバント活性断片、サイトカイン、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦなど）、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン−２，−７，−１２、ならびに他の成長因子が含まれる。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、ｇａｇポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列と、抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列とを有しており、上記抗原は脂質ラフトと天然には会合しないものであり、上記ポリペプチドは、宿主細胞内で発現すると、ウイルス様粒子を形成するものである、ウイルス様粒子の発現ベクターシステムを提供する。１実施形態では、第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列は、１つの発現ベクター内に存在しており、別々のプロモーターに作動可能に連結されていることが好ましいが、１つのプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。別の実施形態では、第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列は、複数の発現ベクター内に存在している。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）ｇａｇポリペプチドと抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドとを一緒に発現する、１つ以上の発現ベクターを提供する工程、（ｂ）上記１つ以上の発現ベクターを細胞に導入する工程、および、（ｃ）上記ｇａｇポリペプチドと上記抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドとを発現させて、ウイルス様粒子を製造する工程とによって、ウイルス様粒子を製造する方法を提供する。ここで、上記抗原は、脂質ラフトと天然には会合しないものである。好ましい実施形態では、１つ以上の発現ベクターはウイルスベクターである。該ウイルスベクターは、バキュロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、またはレトロウイルスであってもよい。上記細胞は、昆虫細胞または哺乳類細胞であってもよい。ある実施形態では、上記方法は、上記細胞が培養されている培地から上記ウイルス様粒子を回収する工程をさらに含んでいる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、免疫原性量の本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子の何れかの投与によって、免疫系の症状あるいは病気を治療または予防する方法を提供する。ある実施形態では、上記投与は、感染防御免疫応答を被検体に誘導するものである。ある実施形態では、上記投与は、皮下投与、経皮投与、皮内投与、真皮下投与、筋肉内投与、経口投与（peroral delivery、oral delivery）、鼻腔内投与、バッカル投与、舌下投与、腹腔内投与、膣内投与、肛門投与、または頭蓋内投与である。
【００１５】
本明細書に開示されているキメラインフルエンザウイルス様粒子の別の態様は、免疫原性量または治療量の本明細書に開示のキメラウイルス様粒子の何れかを含んでいてもよい薬学的組成物である。そのような薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでいることが好ましい。該担体は、好ましい投与方法用に製剤化されていることが好ましい。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されているようなＶＬＰを含んでいる薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態では、該薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでいる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ｇａｇポリペプチドおよび非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドを含んでいる、キメラウイルス様粒子を提供する。そのようなＶＬＰは、本明細書に開示された他のＶＬＰの種々の実施形態の全てを含んでいる。ある実施形態では、脂質ラフト会合ポリペプチドは、ＧＰＩアンカーのポリペプチド、ミリストイル化配列のポリペプチド、パルミトイル化配列のポリペプチド、ダブルアセチル化配列のポリペプチド、シグナル伝達のポリペプチド、または膜輸送のポリペプチド、あるいは好ましくはカベオリン（ｃａｖｅｌｉｎ）のポリペプチド、フロチリンのポリペプチド、シンタキシン−１のポリペプチド、シンタキシン−４のポリペプチド、シナプシンＩのポリペプチド、アデューシンのポリペプチド、ＶＡＭＰ２のポリペプチド、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンのポリペプチド、シナプトブレビンＩＩのポリペプチド、ＳＮＡＲＥのポリペプチド、ＳＮＡＰ−２５のポリペプチド、ＳＮＡＰ−２３のポリペプチド、シナプトタグミンＩのポリペプチド、またはシナプトタグミンＩＩのポリペプチドであってもよい。また、上記ｇａｇポリペプチドおよび非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドを含んでいるキメラウイルス様粒子は、本明細書のあらゆる箇所に開示されている上記態様および実施形態の全て（特に限定されないが、発現ベクターシステム、製造の方法、治療および予防の方法、ならびに薬学的組成物を含む）を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｇａｇ、ＨＡまたはコントロールベクターのそれぞれで、およびＨＡ−ｇａｇ−ＮＡのトリプルベクターに感染された、Ｓｆ９細胞からの培養液のウエスタンブロットを示す図であり、（Ａ）は、抗Ｇａｇ抗体によるウエスタンブロットを示す図であり、（Ｂ）は抗ＨＡ抗体によるウエスタンブロットを示す図である。
【図２】サッカロースステップ勾配を用いて、ペレット状のＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ  ＶＬＰを再遠心分離することによって得られた画分のウエスタンブロットを示す図であり、（Ａ）は、抗Ｇａｇ抗体によるウエスタンブロットを示す図であり、（Ｂ）は抗ＨＡ抗体によるウエスタンブロットを示す図である。
【図３】以下の実施例１に関するトリプル発現ベクターのコード配列の配置を示す図である。
【図４】ＰＡ修飾されたＨＡ、ならびにＧａｇおよびＮＡをコードするトリプルバキュロウイルス発現ベクターのコード要素の配置を示す図である。
【図５】ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＧａｇをコードするダブルバキュロウイルス発現ベクター内のコード要素の配置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、キメラウイルス様粒子を形成するための基礎となるｇａｇポリペプチドを含んでいる。ＶＬＰを生成する好ましい方法は、昆虫細胞内での発現によるものである。該昆虫細胞内での発現は、ポリペプチド抗原の共発現を含んでいることが好ましい。これは、バキュロウイルス発現システムの様々なレトロウイルスによって、ｇａｇＶＬＰの収量を大幅に上げることができるからである（２３、２４、４６、４９、５２−５８）。ｇａｇポリペプチドは、天然のレトロウイルスの組立過程の際には、本質的にＣ末端延長領域を含んでいる。つまり、機能的なｇａｇタンパク質は、レトロウイルスのプロテアーゼ、逆転写酵素、およびリボソームのフレームシフトによるインテグラーゼ活性を含んでいる巨大なＣ末端延長領域を天然に有している。人工の延長領域を有する機能的なｇａｇタンパク質の製造は、ＲＳＶｇａｇ（５９）およびＭＬＶｇａｇ（６０）に対して達成されている。ｇａｇＣ末端の操作におけるこの適応性は、他の抗原および免疫賦活タンパク質の配列などの他のポリペプチドを含有させるための重要な部位を提供する。
【００２０】
あるウイルス由来のコア粒子と、それとは異なるウイルス由来の表面抗原を含んでいるキメラＶＬＰの製造は、シュードタイピングと呼ばれる。ｇａｇポリペプチドは、インフルエンザＨＡおよびＮＡでもって効率よくシュードタイプされている。これは、おそらく、これらタンパク質が脂質ラフトドメイン（６１、６２）の内部に濃縮する一方、ミリストイル化されたｇａｇタンパク質は、出芽過程の間に、脂質ラフトドメインの内表面に濃縮する（６３）からである。
【００２１】
本明細書に記載の本発明は、キメラＶＬＰを形成するための基礎としての、脂質ラフトと天然には会合しない抗原に、連結された脂質ラフト会合ポリペプチドをさらに含んでいる。どのような理論にも束縛されることなく、該抗原が上記脂質ラフト会合ポリペプチドへ会合するという長所によって、該抗原を含んでいるキメラＶＬＰが形成されると考えられる。
【００２２】
本明細書に開示の方法およびプロトコールは、他に示されない限り、当業者が実施できる範囲内の従来の化学的手法、分子生物学的手法、微生物学的手法、組み換えＤＮＡの手法、および免疫学的手法を使用するものである。そのような手法は、文献において説明されており、例えば、「J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press」、「Ausubel, F. M.ら (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)」、「B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons」、「J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press」、「M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press」、および「D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press」を参照のこと。これら一般的なテキストのそれぞれは、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００２３】
〔定義〕
本明細書で使用されるような「Ｇａｇポリペプチド」は、本明細書に記載のウイルス様粒子の形成に関与するレトロウイルス由来の構造ポリペプチドである。ある実施形態では、ＲＮＡをパッケージングするための傾向（propensity）、または粒子の形成および出芽の効率などのある種の特徴に影響を及ぼすために、ｇａｇポリペプチドは、意図的に突然変異させられる。レトロウイルスのゲノムは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖという３つの主要遺伝子産物をコードしている。ｇａｇ遺伝子は、構造タンパク質をコードするものであり、ｐｏｌ遺伝子は、逆転者酵素、関連するタンパク質分解性のポリペプチド、ヌクレアーゼ、およびインテグラーゼに関連する機能をコードするものであり、ｅｎｖは、コードされた糖タンパク質の膜タンパク質が感染細胞の表面上で検出され、成熟し放出されたウイルス粒子の表面上で検出されるものである。全てのレトロウイルスのｇａｇ遺伝子の全体構造は類似しており、レトロウイルスの各グループ内では、ｇａｇ遺伝子はアミノ酸レベルで保存されている。ｇａｇ遺伝子は、逆転写酵素を除く、コアタンパク質を生じさせるものである。
【００２４】
ＭＬＶに関しては、ｇａｇの前躯体タンパク質は、Ｐｒ６５Ｇａｇであり、前躯体での順番がＮＨ２−ｐ１５−ｐｐ１２−ｐ３０−ｐ１０−ＣＯＯＨとなっている４つのタンパク質に開裂される。これらの開裂は、ウイルスプロテアーゼに仲介され、ウイルスに依存するが、ウイルスの放出の前後に起こり得る。ＭＬＶのＧａｇタンパク質は、グリコシル化された形態およびグリコシル化されていない形態で存在する。グリコシル化された形態は、ｇＰｒ８０Ｇａｇから開裂される。なおｇＰｒ８０Ｇａｇは、グリコシル化されていないＰｒ６５ＧａｇのＡＵＧコドンから上流に位置する、異なったインフレームの開始コドンから合成されるものである。グリコシル化されるＧａｇを合成しないＭＬＶの欠失変異体でも感染性を有し、グリコシル化されないＧａｇでもウイルス様粒子を形成することができる。このことから、グリコシル化が起こることの重要性について疑問が生じる。ＨＩＶ−１のＧａｇ前躯体であるｐｒ５５Ｇａｇの、ウイルスにコードされたプロテアーゼによる翻訳後開裂から、Ｎ−ミリストイル化され、内部にリン酸化されたｐ１７マトリックスタンパク質（Ｐ１７ＭＡ）、リン酸化されたｐ２４キャップシドタンパク質（ｐ２４ＣＡ）、およびヌクレオキャップシドタンパク質Ｐ１５（ｐ１５ＮＣ）が生じる。ｐ１５ＮＣは、ｐ９およびｐ６にさらに開裂される。
【００２５】
構造的に原型のＧａｇポリタンパク質は、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、キャプシドタンパク質（ＣＡ）、およびヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）の３つの主要タンパク質に分けられる。これら主要タンパク質は、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子に常に同じ順番で存在している。なお、マトリックスタンパク質（ＭＡ）は、インフルエンザのマトリックスタンパク質Ｍ１と混同されるものではない。マトリックスという名称を共有しているが、Ｍ１はＭＡと異なるタンパク質である。Ｇａｇポリタンパク質の成熟タンパク質へのプロセッシングは、レトロウイルスにコードされたプロテアーゼによって触媒され、新たに出芽するウイルス粒子として成熟させる。機能上、Ｇａｇポリタンパク質は、膜結合ドメイン、相互作用ドメイン、レイトドメインの３つのドメインに分けられる。膜結合ドメインは、Ｇａｇポリタンパク質に細胞膜を狙わせるものであり、相互作用ドメインは、Ｇａｇの重合化を促進するものであり、レイトドメインは、宿主細胞から発生するウイルス粒子の放出を促進するものである。組立を仲介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。このため組立ドメインが、より後に形成する開裂産物の何れかの内にきちんと位置する必要は無い。このように、本明細書に包含されるようなＧａｇポリペプチドは、ＶＬＰを形成および放出させるために重要な機能要素を含んでいる。これらの重要な機能要素に関して、最新技術はかなり進んでいる。例えば「Hansenら J. Virol 64, 5306-5316, 1990」、「Willら, AIDS 5, 639-654, 1991」、「Wangら J. Virol. 72, 7950-7959, 1998」、「McDonnellら, J. Mol. Biol. 279, 921-928, 1998」、「Schultz and Rein, J. Virol. 63, 2370-2372, 1989」、「Accolaら, J. Virol. 72, 2072-2078, 1998」、「Borsettiら, J. Virol., 72, 9313-9317, 1998」、「Bowzardら, J. Virol. 72, 9034-9044, 1998」、「Krishnaら, J. Virol. 72, 564-577, 1998」、「Willsら, J. Virol. 68, 6605-6618, 1994」、「Xiangら, J. Virol. 70, 5695-5700, 1996」、「Garnierら, J. Virol. 73, 2309-2320, 1999」を参照のこと。
【００２６】
本発明のＶＬＰにおいて使用されるようなｇａｇポリペプチドは、最低でもＶＬＰを形成するための機能要素を含んでいる。ｇａｇポリペプチドは、場合によっては１つ以上の別のポリペプチドを含んでいてもよい。該１つ以上の別のポリペプチドは、ｇａｇポリペプチドをコードする配列へ、該１つ以上の別のポリペプチドをコードする配列をスプラスすることによって生成されるものであってもよい。別のポリペプチドをｇａｇポリペプチドに挿入するための部位は、Ｃ末端であることが好ましい。
【００２７】
Ｇａｇポリペプチドのための好ましいレトロウイルスの源は、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス（トリ白血病ウイルス（avian leucosis virus）、またはラウス肉腫ウイルスなど）、ベータレトロウイルス（マウス乳癌ウイルス，ヤーグジークテヒツジレトロウイルスおよびマソン・ファイザー・サルウイルスなど）、ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびテナガザル白血病ウイルスなど）、デルタレトロウイルス（ヒトＴ細胞白血病ウイルスおよびウシ白血病ウイルスなど）、イプシロンレトロウイルス（ウォールアイ皮膚肉腫ウイルスなど）、あるいはレンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス）を包含する。
【００２８】
本明細書で使用されているような「脂質ラフト」は、ｇａｇポリペプチドがウイルス粒子の組立過程の間に濃縮する細胞膜の微小ドメインのことをいう。
【００２９】
本明細書で使用されているような「脂質ラフト会合ポリペプチド」は、脂質ラフトと直接的にまたは間接的に会合される任意のポリペプチドのことをいう。本発明において使用される具体的な脂質ラフト会合ポリペプチドは、キメラウイルス様粒子の望まれる使用に依存する。
【００３０】
脂質ラフト会合ポリペプチドは、内在性膜タンパク質、膜との会合を引き起こすタンパク質の修飾を介して脂質ラフトと直接的に会合されるタンパク質、または脂質ラフト会合ポリペプチドを介して脂質ラフトと間接的に会合されるポリペプチドであってもよい。
【００３１】
脂質アンカーを有する多くのタンパク質は、脂質ラフトと会合する。ポリペプチドを脂質ラフトに連結させる脂質アンカーには、ＧＰＩアンカー、ミリストイル化、パルミトイル化、およびダブルアセチル化が含まれる。
【００３２】
多種多様なポリペプチドが脂質ラフトと会合する。脂質ラフトは、シグナル伝達、膜輸送、ウイルスの侵入、ウイルスの組立、および組立られた粒子の出芽を含む無数の生物学的活動の基盤として機能する。それ故、これらの過程に関連する様々なポリペプチドが脂質ラフトと会合する。
【００３３】
シグナル伝達カスケードに関与する様々な種類のポリペプチドは、シグナル伝達の基盤として機能する脂質ラフトと会合する。シグナル伝達の基盤として機能する脂質ラフトの一つの形式は、カベオラと呼ばれる。カベオラは、形質膜のフラスコ型の陥入であり、カベオリンファミリー（例えばカベオリンおよび／またはフロチリン）に由来するポリペプチドを含んでいる。
【００３４】
膜輸送ポリペプチドは、膜輸送の基盤として機能する脂質ラフトと会合する。膜輸送ポリペプチドの例には、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスに関与するタンパク質、例えば、シンタキシン−１、シンタキシン−４、シナプシンＩ、アデューシン、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、シナプトブレビンＩＩ、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シナプトタグミンＩ、およびシナプトタグミンＩＩなどが含まれる。
【００３５】
ウイルス受容体、受容体−補助受容体の複合体、侵入過程を調節するのに役立つ他の任意の成分は、ウイルスの侵入のために特殊化した膜輸送の基盤として機能する脂質ラフトと会合する。脂質ラフトと会合するウイルス受容体には、例えば、分解促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、多くのエンテロウイルスの受容体であるＧＰＩアンカー型膜糖タンパク質、グループＡのロタウイルスの受容体、複数の成分（ガングリオシド、ＨＳＣ７０タンパク質、アルファ２−ベータ１インテグリン、およびアルファ５−ベータ２インテグリンを含む）をガ乳する複合体；数種のエンベロープウイルス（ＨＩＶ、ＭＬＶ、麻疹ウイルス、エボラウイルスなど）の糖タンパク質、およびＨＩＶの侵入に関与するポリペプチド（ＣＤ５、ＣＣＲ５およびｎｅｆなど）が含まれる。「Chazal and Gerlier, 2003, Virus Entry, Assembly, Budding, and Membrane Rafts, Microbiol. & Mol. Bio. Rev. 67(2):226-237」を参照のこと。
【００３６】
ウイルス粒子の組立に関与するポリペプチドは、ウイルスの組立の基盤として機能する脂質ラフトと会合される。そのようなポリペプチドには、例えば、ＨＡおよびＮＡというインフルエンザのエンベロープ糖タンパク質、麻疹ウイルスのＨおよび成熟Ｆ１−Ｆ２融合タンパク質、ならびにＨＩＶのｇｐ１６０、ｇｐ４１、およびＰｒ５５ｇａｇが含まれる。「Chazal and Gerlier, 2003, Virus Entry, Assembly, Budding, and Membrane Rafts, Microbiol. And Mol. Bio. Rev. 67(2):226-237」を参照のこと。
【００３７】
組立られたウイルスの出芽に関与するポリペプチドは、ウイルスの出芽の基盤として機能する脂質ラフトと会合される。宿主細胞からのＨＩＶ−１の出芽が膜のラフトにおいて起こっていることを示唆するデータがある。「Chazal and Gerlier, 2003, Virus Entry, Assembly, Budding, and Membrane Rafts, Microbiol. And Mol. Bio. Rev. 67(2):226-237」を参照のこと。ウイルスの出芽に関与するポリペプチドに関する一般的な情報は、「Fields Virology (4th ed.) 2001」に見出される。
【００３８】
好ましい脂質ラフト会合ポリペプチドには、ヘマグルチニンポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質のポリペプチド、糖タンパク質のポリペプチド、およびエンベロープタンパク質のポリペプチドなどのウイルスポリペプチドが含まれる。これらポリペプチドのそれぞれは、あらゆる種類のウイルスに由来するものであってもよい。しかしながら、ある実施形態では、ＨＩＶ−１ウイルスに由来するエンベロープタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスまたは麻疹ウイルスに由来する融合タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、単純疱疹ウイルスまたはエボラウイルスに由来する糖タンパク質、および麻疹ウイルスに由来するヘマグルチニンタンパク質が含まれる。
【００３９】
好ましい非ウイルス性病原体の脂質ラフト会合ポリペプチドは、以下の原虫、蠕虫、および他の真核微生物病原体から得られてもよい：特に限定されないが、マラリア原虫（Plasmodium）（熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、および三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）など）；トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）；トリパノソーマ・ブルーセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）；ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）；ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）；ランブル鞭毛虫（Giardia intestinalis）；およびクリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）など。そのような非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドは、該脂質ラフト会合ポリペプチドそれ自体が抗原として作用するときは、脂質ラフトと天然に会合しない抗原と連結されることなく使用されてもよい。
【００４０】
ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい例は、ヘマグルチニンポリペプチドである。本明細書で使用されているような「ヘマグルチニンポリペプチド」は、インフルエンザウイルスのタンパク質に由来するものであり、感染される細胞へのウイルスの結合を仲介するものである。またヘマグルチニンポリペプチドは、類似する麻疹ウイルスのタンパク質に由来するものであってもよい。該タンパク質は、１つの膜貫通ドメインを介して、インフルエンザウイルスの表面に固定されることが発見された抗原性糖タンパク質である。インフルエンザのヘマグルチニンには、少なくとも１６のサブタイプが同定されており、Ｈ１からＨ１６と名づけられている。Ｈ１、Ｈ２およびＨ３は、ヒトのインフルエンザウイルスにおいて発見されているものである。Ｈ５またはＨ７のヘマグルチニンを有する病原性が高いトリインフルエンザウイルスは、割合が低いもののヒトに感染することが発見されている。ヒトの患者において、アミノ酸が１つ変更しているトリインフルエンザウイルス株のＨ５型のヘマグルチニンが発見されており、アミノ酸のこの変更によって、Ｈ５のヘマグルチニンがＨ５Ｎ１のトリインフルエンザウイルスの受容体特異性を顕著に変更することができるように、受容体特異性が変化し、該ウイルスがヒトの受容体に結合できるようになったと報告されている（１０９および１１０）。この発見は、普通はヒトに感染しないＨ５Ｎ１型ウイルスがどのようにして突然変異し、効率よくヒト細胞に感染できるようになったかを説明するものである。
【００４１】
ヘマグルチニンは、ホモトリマーの内在性膜ポリペプチドである。膜貫通ドメインは、ラフト脂質ドメインと天然に会合しているため、ヘマグルチニンがＶＬＰに組み込まれるためのｇａｇポリペプチドと会合することができる。ヘマグルチニンはシリンダーのような形状をしており、約１３５Åの長さである。ＨＡを構成する３つの同じモノマーは、中心のコイルドコイルと、ＶＬＰの表面に露出されるシアル酸結合部位を含む球状の頭部とを形成する。ＨＡのモノマーは、１つのポリペプチド前躯体として合成され、該前躯体は、グリコシル化されて、そして２つのより小さいポリペプチド（ＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニット）に開裂される。ＨＡ２サブユニットは、膜に固定されるトリマーのコイルドコイルを形成し、ＨＡ１サブユニットは球状の頭部を形成する。
【００４２】
本発明のＶＬＰに使用されるようなヘマグルチニンポリペプチドは、最低でも膜アンカードメインを含んでいるべきである。ヘマグルチニンポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルスの型、亜型、株または亜株に由来するものであってもよく、好ましくはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９のヘマグルチニンに由来するものであってもよい。さらに、ヘマグルチニンポリペプチドは、様々なインフルエンザのへマグルチニンのキメラであってもよい。ヘマグルチニンポリペプチドは、脂質ラフトと天然に会合しない１つ以上の別の抗原を含んでいることが好ましい。該抗原は、ヘマグルチニンポリペプチドをコードする配列へ、上記１つ以上の別のポリペプチドをコードする配列をスプライスすることによって生成されるものであってもよい。ヘマグルチニンポリペプチドに別のポリペプチドを挿入する部位は、Ｎ末端であることが好ましい。
【００４３】
ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましいもう１つ別の例は、ノイラミニダーゼポリペプチドである。本明細書で使用されているような「ノイラミニダーゼポリペプチド」は、インフルエンザウイルスのタンパク質に由来し、糖タンパク質から末端のシアル酸残基を開裂することによって、インフルエンザウイルスの細胞からの放出を仲介するタンパク質である。ノイラミニダーゼ糖タンパク質は、ウイルスの表面に発現される。ノイラミニダーゼタンパク質は、四量体であり、ベータ−ピンホイール構造を有する球状頭部、細い茎領域、および小さい疎水性領域からなる共通の構造を有している。この疎水性領域は、１つの膜貫通ドメインにより、ウイルス膜にノイラミニダーゼタンパク質を固定させるものである。シアル酸残基の開裂のための活性部位は、全てのインフルエンザＡウイルスに保存されている１５個の荷電アミノ酸によって形成される各サブユニットの表面上のポケットを含んでいる。インフルエンザのノイラミニダーゼには、少なくとも９のサブタイプが同定はされており、Ｎ１からＮ９と名づけられている。
【００４４】
本発明のＶＬＰに使用されるようなノイラミニダーゼポリペプチドは、最低でも膜アンカードメインを含んでいるべきである。機能領域についての最先端の技術水準は、極めて高い。例えば、「Vargheseら, Nature 303, 35-40, 1983」、「Colmanら, Nature 303, 41-44, 1983」、「Lentzら, Biochem, 26, 5321-5385, 1987」、「Websterら, Virol. 135, 30-42, 1984」を参照のこと。ノイラミニダーゼポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルスの型、亜型、株または亜株に由来するものであってもよく、好ましくはＮ１およびＮ２のノイラミダーゼに由来するものであってもよい。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドは、様々なインフルエンザのノイラミニダーゼのキメラであってもよい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、脂質ラフトと天然に会合しない１つ以上の別の抗原を１つ以上含んでいることが好ましい。該抗原は、ヘマグルチニンポリペプチドをコードする配列へ、上記１つ以上の別のポリペプチドをコードする配列をスプライスすることによって生成されるものであってもよい。ノイラミニダーゼポリペプチドをコードする配列に別のポリペプチドを挿入する部位は、Ｃ末端であることが好ましい。
【００４５】
脂質ラフト会合ペプチドの好ましいもう１つ別の例は、ファシクリンI(FasＩ)と呼ばれる昆虫由来の接着タンパク質である。本明細書で使用されているような「ファシクリンＩポリペプチド」は、胚発生に関与する昆虫タンパク質に由来するものである。この非ウイルス性タンパク質が、昆虫細胞バキュロウイルス発現系にて発現されると、ＦａｓＩの脂質ラフト会合が引き起こされ得る（J. Virol. 77, 6265-6273, 2003））。それ故、異種抗原がファシクリンIポリペプチドに接着されることによって、ｇａｇと共発現されたとき、キメラ分子がＶＬＰへ組み込まれるということになる。本発明のＶＬＰに使用されるようなファシクリンIポリペプチドは、最低でも膜アンカードメインを含んでいるべきである。
【００４６】
脂質ラフト会合ペプチドのもう１つ別の好ましい例は、Ｇ糖タンパク質と名づけられたＲＳＶからのウイルス由来の接着タンパク質である。本明細書で使用されているような「Ｇ糖タンパク質」は、ＲＳＶのＧ糖タンパク質に由来するものである。最近のデータによれば、脂質ラフトドメインは、該ドメインがインフルエンザの出芽に重要であるように、ＲＳＶ粒子の出芽にも重要であることが実証されている（Virol 327, 175-185, 2004; Arch. Virol. 149, 199-210, 2004; Virol. 300, 244-254, 2002）。ＲＳＶのＧ糖タンパク質は、３２．５ｋｄの内在性膜タンパク質であり、ウイルスの接着タンパク質として機能するだけでなく、ＲＳＶ感染のための感染防御抗原としても機能する。インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと同じように、その抗原性は、それに接着される非脂質ラフト抗原の抗原性を増強し得る。ＲＳＶは、ノイラミニダーゼ活性を有するタンパク質を天然に発現しないために、ｇａｇおよびＲＳＶのＧ糖タンパク質から構成されるＶＬＰは、産生および放出を効率よくするためのＮＡが存在することを必要としない。それ故、ＭＬＶのｇａｇおよびＧ糖ポリペプチドをコードする発現ベクターを開発することにより、膜に組み込まれるＧ糖ポリペプチドを含むＶＬＰが産生されることになる。非脂質ラフト外来抗原接着をするように、該Ｇ糖ポリペプチドを任意に修飾することにより、該外来抗原に対する顕著な免疫応答を誘導することができるキメラＶＬＰを得ることができる。
【００４７】
用語「キメラウイルス様粒子」と「ＶＬＰ」とは、ＶＬＰがその文脈から、本明細書に開示されているようなｇａｇポリペプチドを用いて形成されないウイルス様粒子のことを言っている場合を除いて、本明細書を通して交換可能に使用される。
【００４８】
〔抗原〕
本発明は、ｇａｇポリペプチドおよび脂質ラフト会合ポリペプチドを、脂質ラフトと天然に会合しない抗原を含んでいるＶＬＰを形成するための、容易に改変できる基盤として、提供する。この項には、開示されたＶＬＰと一緒に使用されるのが好ましい抗原が記載されている。
【００４９】
＜抗原と脂質ラフト会合ポリペプチドとの結合＞
脂質ラフトと天然に会合しない抗原を含んでいるＶＬＰを形成する手段として、抗原と脂質ラフト会合ポリペプチドとの間に結合が形成される。該脂質ラフト会合ポリペプチドは、１つの抗原に連結されてもよいし、複数の抗原に連結されてもよい。これにより、ＶＬＰの免疫原性が増加されたり、様々な病原体に対する免疫原性が付与されたり、または特定の病原体の様々な株に対する免疫原性が付与されたりする。
【００５０】
抗原と脂質ラフト会合ポリペプチドとの結合は、抗原がＶＬＰへ組み込まれるのに十分などのような種類の結合であってもよい。該結合は、共有結合、イオン相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、または抗体−抗原相互作用であってもよい。好ましい実施形態では、結合は、共有結合（ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、またはジスルフィド結合など）である。
【００５１】
抗原は、組み換えによって、脂質ラフト会合ポリペプチドに既に結合した状態で製造されてもよいし、あるいは分離した物質として製造され、その後脂質ラフト会合ポリペプチドに連結されてもよい。
【００５２】
＜抗原の種類＞
本明細書で使用されているような抗原は、免疫応答を誘発することができ、脂質ラフトと天然には会合しない任意の物質であってもよい。抗原には、特に限定されないが、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質、およびタンパク質内の各ポリペプチドエピトープ）、糖ポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、ポリサッカリドの接合体、ポリサッカリドおよび他の分子のペプチド模擬体または非ペプチド模擬体、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が含まれる。抗原が脂質ラフトと直接的にまたは間接的に天然に会合しない場合、脂質ラフト会合ポリペプチドと結合することなく、ＶＬＰに組み込まれることは考えられない。抗原は、病気または疾患に関与する任意の抗原であってもよく、例えば微生物抗原（例えばウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、蠕虫抗原、酵母抗原など）、腫瘍抗原、およびアレルゲンなどである。
【００５３】
＜抗原の源＞
本明細書に記載の抗原は、化学的にまたは酵素を用いて合成されてもよいし、組み換えによって産生されてもよいし、天然源から単離されてもよいし、あるいはそれらの組み合わせによって得られてもよい。抗原は、精製されてもよいし、部分的に精製されてもよいし、粗抽出物であってもよい。
【００５４】
ポリペプチド抗原は、技術的に知られているタンパク質精製の標準的な方法を使用して、天然源から単離されてもよい。そのような方法には、特に限定されないが、液体クロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含む）、親和性クロマトグラフィー、または他の精製手法が包含される。多くの実施形態では、抗原は、例えば、約５０％から約７５％までの純度、約７５％から約８５％までの純度、約８５％から約９０％までの純度、約９０％から約９５％までの純度、約９５％から約９８％までの純度、約９８％から約９９％までの純度、あるいは９９％よりも高い純度の精製抗原である。
【００５５】
固相ペプチド合成手法を使用してもよい。そのような手法は、当業者に公知である。「Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994)」参照。一般的に、そのような方法では、ペプチドは、活性化されたモノマーユニットが、固相に結合されている成長ペプチド鎖に連続的に付加されることによって産生される。
【００５６】
十分に確立されている組み換えＤＮＡ手法を、脂質ラフト会合ポリペプチドと同じベクターにおいて、ポリペプチドを製造するために使用してもよい。例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる発現コンストラクトが、適切な宿主細胞（例えば、インビトロの細胞培養において単細胞として成長する真核宿主細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）、あるいは原核細胞（インビトロの細胞培養において成長するもの）に導入されて、遺伝的に修飾された宿主細胞が生成される場合、適切な培養条件下において、タンパク質は該遺伝的に修飾された宿主細胞によって製造される。
【００５７】
＜ウイルス抗原＞
適したウイルス抗原には、以下のグループの１つ以上のウイルスと関連するもの（例えば以下のグループの１つ以上のウイルスによって合成されたもの）を包含する：レトロウイルス科（例えばＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離種；ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Calciviridae）（例えば、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルスを含む、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えばウマ脳脊髄炎ウイルス、三日はしかウイルス）；フラビウイルス科（Flaviridae）（例えばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、メタニューモウイルス科（例えばトリニューモウイルス、ヒトメタニューモウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Bungaviridae）（例えばハンタンウイルス、ブニヤウイルス（bungavirus）、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Bimaviridae）；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（乳頭腫ウイルス、ポリオームウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノビールス）；ヘルペスウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型（ＨＨＶ−１）および２型（ＨＨＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＨＨＶ−３）、ＥＢウイルス（エプスタインバーウイルス）（ＨＨＶ−４）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＨＨＶ−５））；ポックスウイルス（Poxyiridae）（天然痘ウイルス、ワクシニア・ウイルス、発疹ウイルス）；およびイリドウイルス科（例えばアフリカ豚コレラウイルス）；ならびに、分類されていないウイルス（例えば海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトウイルスであると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの病原因子、（クラス１＝体内伝染されるもの；クラス２＝非経口的に伝染されるもの（すなわち肝炎Ｃ）；ならびに、アストロウイルス。
【００５８】
＜非ウイルス性抗原＞
本明細書に開示のＶＬＰは、ノロウイルスファミリーに由来する様々な抗原を含んでいることが好ましい。「ノーウォーク様ウイルス」とも呼ばれるノロウイルスは、カリシウイルス科のウイルスファミリーに含まれる４つの属のうちの１つを代表するものである。ノロウイルス属には、ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩおよびＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩと命名された２つの主要な遺伝群が存在する。ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩのノロウイルス株は、ノーウォークウイルス、サウサンプトンウイルス、デザートシールドウイルス、およびチバウイルスを包含している。ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩのノロウイルス株は、ヒューストンウイルス、ハワイウイルス、ローズデイルウイルス（Lordsdale virus）、グリムズビーウイルス（Grimsby virus）、メキシコウイルスおよびスノーマウンテンエージェント（Snow Mountain agent）を包含している（「Parker, T.D., ら J Virol. (2005) 79(12):7402-9」、「Hale, A.D., ら J Clin. Micro. (2000) 38(4):1656-1660」））。ノーウォークウイルス（ＮＶ）は、急性ウイルス性胃腸炎の世界規模の流行的発生の大部分に関与する、ヒトカリシウイルスの１つのグループの原型株である。ノーウォークウイルスのキャプシドタンパク質は、シェルドメイン（Ｓ）および突出ドメイン（Ｐ）という２つのドメインを有している。Ｐドメイン（ノーウォーク株の番号付けで、ａａ２２６−５３０）は、Ｐ１およびＰ２という２つのサブドメインに分けられる。Ｐ２ドメインは、Ｐ１ドメイン内の１２７ａａの挿入部分（ａａ２７９−４０５）であり、折りたたまれたモノマーの最も末端の表面に位置する。Ｐ２ドメインは、ノロウイルス株の中で、ＶＰ１の最も保存されていない領域であり、Ｐ２内の超可変領域は、受容体結合と免疫反応性とに重要な役割を果たしていると考えられる。Ｐドメインが外側に位置していることを考慮すると、Ｐ２ドメインは、本明細書に開示のＶＬＰワクチン用の抗原として使用するために、好ましい抗原またはポリペプチドエピトープの源であるといえる。Ｐ２ドメインは、ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩまたはＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩのノロウイルス株に対する好ましい抗原である。各種ノロウイルス株を超えて保存されたＰ２ドメインの領域に位置していると、同定されたｍＡｂ  ６１．２１エピトープ、およびｍＡｂ５４．６エピトープが、さらに好ましい（「Lochridge, V.P., ら  J Gen. Virol. (2005) 86:2799-2806)」）。
【００５９】
＜インフルエンザ抗原＞
本明細書に開示のＶＬＰは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ以外の、またはそれらに加えて、インフルエンザに由来する様々な抗原を含んでいてもよい。追加のインフルエンザ抗原としては、Ｍ２ポリペプチドが好ましい。インフルエンザウイルスのＭ２ポリペプチドは、スプライシングが起こった後のＲＮＡの断片７（マトリックス断片）にコードされているクラスＩＩＩの小さい内在性膜タンパク質（９７アミノ酸）である（８０、８１）。Ｍ２はウイルス粒子上にはほとんど存在しないが、感染細胞上にはより豊富に発見され得る。Ｍ２は、ウイルスの侵入に必要なプロトン選択的なイオンチャネルとして機能する（８２、８３）。感染または従来のワクチン接種の間、Ｍ２の免疫原性は最小であるが（このことは、その保存性を説明している）、別の形態で存在するときには、Ｍ２の免疫原性および防御性は、より強くなる（８４−８６）。このことは、Ｍ２のモノクローナル抗体をインビボにおいて受動的に移動させると、ウイルスの排除が促進され、その結果、防御がもたらされるという観察と一致する（８７）。Ｍ２の外部ドメインエピトープがＨＢＶのコア粒子に融合タンパク質として連結されるとき、該エピトープはマウスでは非経口で接種されたり、鼻腔内から接種されたりすることによって、防御をもたらし、さらに３つの直列に配置されたコピーが、コアタンパク質のＮ末端に融合されたとき、免疫原性が最も強くなる（８８−９０）。このことは、エピトープの密度が増加すると、免疫原性が増加するということを示す他の担体−ハプテンのデータと一致する（９１）。
【００６０】
Ｍ２ワクチンの鼻腔内投与に関して、良好な防御を得るためにアジュバントが必要であり、良好な結果は、ＬＴＲ１９２Ｇ（８８、９０）およびＣＴＡ１−ＤＤ（８９）を用いたときに得られている。また上記ペプチドは、ＫＬＨなどの担体、または髄膜炎菌（N.meningitides）の外膜タンパク質複合体、またはヒトパピローマウイルスのＶＬＰと化学的に接合されてもよく、上記ペプチドは、ワクチンとしてマウスおよび他の動物に防御をもたらす（９２、９３）。
【００６１】
Ｍ２タンパク質が高度に保存されている限りにおいて、Ｍ２タンパク質の配列は相違点を必ず有している。共通株であるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２）のＭ２の外部ドメインエピトープは、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）を除く、他の配列決定された現代のヒト株の全てと、免疫学的に交差反応することが示された（９２）。また、インフルエンザのデータベース上の配列を調査することにより、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４などの他のより最近見つかった病原性のヒト単離株（Ｈ５Ｎ１）のＭ２配列に、同様の相違点が存在することが示された。この発見によって明らかになることは、Ｍ２エピトープを組み込んだ、有効でかつＨ５に特異的なパンデミックワクチンは、ヒトのＨ１およびＨ３の単離株において現在流行しているＭ２配列というよりは、病原性のトリ株に独特なＭ２の配列を反映することが必要になるであろうということである。
【００６２】
インフルエンザウイルス由来の別のタンパク質（ＨＡ、ＮＡおよびＭ２以外のタンパク質）は、共発現されることによって、あるいは別の抗原の全てもしくは一部をｇａｇポリペプチドまたはＨＡポリペプチドに結合されることによって、ＶＬＰワクチンに含まれてもよい。これらの別の抗原には、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、ＮＳ１、ＮＳ２が包含される。これらの後者の抗原は、一般的に中和抗体応答の標的ではないが、Ｔ細胞によって認識される重要なエピトープを含んでいる可能性がある。ＶＬＰワクチンによってそのようなエピトープに対して誘導されるＴ細胞応答が、感染防御免疫を高めることに有益であると判明する可能性がある。
【００６３】
＜他の病原性抗原＞
適切な細菌抗原には、以下の様々な病原性細菌の何れかと関連する抗原（例えば、様々な病原性細菌の何れかによって合成される抗原、および様々な病原性細菌の何れかの内部に生じた抗原）が包含される：例えば、病原性グラム陽性菌（病原性パスツレラ種（pathogenic Pasteurella species）、スタフィロコッカス種（Staphylococci species）、およびストレプトコッカス種（Streptococcus species）など）；ならびに、病原性グラム陰性菌（ナイセリア（Neisseria）属、エシェリキア（Escherichia）属、ボルデテラ（Bordetella）属、カンピロバクター（Campylobacter）属、レジオネラ（Legionella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シゲラ（Shigella）属、ビブリオ（Vibrio）属、エルシニア（Yersinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、ブルセラ（Brucella）属、フランシセラ（Francisella）属、およびバクレリオイデス（Bacterioides）属の病原性グラム陰性菌など）など。例えば「Schaechter, M, H. Medoff, D. Schlesinger, Mechanisms of Microbial Disease. Williams and Wilkins, Baltimore (1989))」を参照のこと。
【００６４】
感染性病原性真菌と関連する適切な抗原（例えば、感染性病原性真菌によって合成される抗原、および感染性病原性真菌の内部に生じた抗原）には、以下の感染性真菌と関連する抗原が包含される：特に限定されないが、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、アスペルギルス・フリガータ（Aspergillus fumigata）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、およびスポロトリックス・シェンキィ（Sporothrix schenckii）など。
【００６５】
病原性の原虫、蠕虫および他の真核微生物病原体と関連する適切な抗原（例えばこれらによって合成される抗原、およびこれらの内部に生じた抗原）には、以下の原虫、蠕虫および他の真核微生物病原体と関連する抗原が包含される：特に限定されないが、マラリア原虫（Plasmodium）（熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、および三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）など）；トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）；トリパノソーマ・ブルーセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）；ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）；ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）；ランブル鞭毛虫（Giardia intestinalis）；およびクリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）など。
【００６６】
適切な抗原には、以下の病原性微生物と関連する抗原（例えば病原性微生物によって合成される抗原、および病原性微生物の内部に生じた抗原）が包含される：ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borelia burgdorferi）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、マイコバクテリウム属（Mycobacteria sps）（例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（M. tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M. intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサイ（M. kansaii）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（M. gordonae））、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、クラミジア・トラコーマティス（Chlamydia trachomatis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌（グループＡストレプトコッカス（Group A Streptococcus））、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）（Ｂ群連鎖球菌（グループＡストレプトコッカス（Group B Streptococcus）））、ストレプトコッカス（ビリダンス群（viridans group））、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス（嫌気性（anaerobic sps.））、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、病原性のカンピロバクター（pathogenic Campylobacter sp.）、エンテロコッカス（Enterococcus sp.）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリア（corynebacterium sp.）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ・マルトシダ（Pasturella multocida）、バクテロイド（Bacteroides sp.）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidium）、トレポネーマ・ペルテニュ（Treponema pertenue）、レプトスピラ（Leptospira）、リケッチア（Rickettsia）、およびアクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israeli）など。病原性エシェリキア・コリ（E. coli）株としては、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）の整理番号３１６１８、２３５０５、４３８８６、４３８９２、３５４０１、４３８９６、３３９８５、３１６１９、および３１６１７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
細胞内病原体と関連する様々なポリペプチドもしくは他の抗原の何れかは、ＶＬＰに含まれてもよい。細胞内病原体と関連するポリペプチドおよびペプチドのエピトープは、細胞内病原体と関連する（例えば細胞内病原体によってコードされている）ポリペプチドであって、該ポリペプチドの断片がＭＨＣクラスＩ分子と一緒に感染細胞の表面上に提示され、該断片が、ＣＤ８．ｓｕｐ．＋のリンパ球の表面上のＴ細胞抗原受容体に認識される（例えば該受容体に結合される）というポリペプチドであれば、どのようなものでもよい。細胞内病原体と関連するポリペプチドおよびペプチドのエピトープは、技術的に知られており、特に限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（例えばＨＩＶ  ｇｐ１２０）と関連する抗原、またはその抗原断片；サイトメガロウイルス抗原；マイコバクテリウム抗原（例えばマイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）など）；ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystic carinii）（ＰＣＰ）抗原；マラリア抗原（特に限定されないが、熱帯熱マラリア原虫または他のあらゆるマラリア種と関連する抗原（４１−３、ＡＭＡ−１、ＣＳＰ、ＰＦＥＭＰ−１、ＧＢＰ−１３０、ＭＳＰ−１、ＰＦＳ−１６、ＳＥＲＰなど）を含む）；真菌抗原；酵母抗原（例えばカンジダ（Candida spp.）の抗原）；トキソプラズマ（toxoplasma）抗原（特に限定されないが、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、トキソプラズマ脳炎（Toxoplasma encephalitis）、または他のあらゆるトキソプラズマ種と関連する抗原を含む）；ＥＢウイルス（ＥＢＶ）抗原；プラスモディウム（Plasmodium）抗原（例えばｇｐ１９０／ＭＳＰ１など）；などを包含する。
【００６８】
好ましいＶＬＰワクチンは、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）を対象とするものであってもよい。バチルス・アントラシスは、好気性または通性嫌気性でグラム陽性の、幅１．０μｍ、長さ３．０−５．０μｍの非運動性桿菌である。悪条件下では、バチルス・アントラシスは、高耐性の内生胞子を形成する。この内生胞子は、感染動物が以前に死亡した場所の土壌で発見され得る。本明細書に開示されているようなＶＬＰワクチンに使用するための好ましい抗原は、感染防御抗原（ＰＡ）である。該感染防御抗原は、８３ｋＤａのタンパク質であって、哺乳類細胞の受容体に結合し、バチルス・アントラシスが病気を引き起こすことができるのに極めて重要なものである。より好ましい抗原は、バチルス・アントラシスのＰＡにおけるＣ末端側の１４０アミノ酸の断片であり、該断片はバチルス・アントラシスに対する感染防御免疫を被検体に誘導するために使用され得るものである。炭疽菌に対するＶＬＰワクチンに使用するための他の典型的な抗原は、炭疽菌の胞子に由来する抗原（例えばＢｃｌＡ）、この細菌の栄養生長期からの抗原（例えば、細胞壁抗原、莢膜抗原（例えばポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸、すなわちＰＧＡ）、分泌抗原（例えば感染防御抗原、致死因子、または浮腫因子などの外毒素）である。ＶＬＰワクチンに使用するためのもう１つ別の好ましい抗原は、バチルス・アントラシスに独特な、アントロース（anthrose）を含むテトラ−サッカリドである（Daubenspeck J.M., ら J. Biol. Chem. (2004), 279:30945）。該テトラ−サッカリドは、脂質ラフト会合ポリペプチドと共役されてもよい。これにより、抗原をＶＬＰワクチンと会合させることができる。
【００６９】
＜腫瘍関連抗原＞
公知の様々な腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の何れかを、ＶＬＰに含めてもよい。完全なＴＡＡが使用されてもよいが、使用されなくてもよい。その代わりに、ＴＡＡの一部（例えばエピトープ）を使用してもよい。ＶＬＰに使用されてもよい腫瘍関連抗原（またはエピトープを含むその断片）には、特に限定されないが、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＨＥＲ−２、高分子量のメラノーマ関連抗原ＭＡＡ、ＧＤ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、卵巣関連抗原ＯＶ−ＴＬ３およびＭＯＶ１８、ＴＵＡＮ、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＯＦＰ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−５０、ＣＡ−１９−９、腎腫瘍関連抗原Ｇ２５０、ＥＧＰ−４０（ＥｐＣＡＭとしても知られている）、Ｓ１００（悪性メラノーマ関連抗原）、ｐ５３、およびｐ２１ｒａｓが包含される。（上述したＴＡＡのいずれかを含む）任意のＴＡＡ（またはそのエピトープ）の合成類似体が、使用されてもよい。さらに、１つ以上のＴＡＡ（またはそのエピトープ）の組み合わせが、組成物に含まれてもよい。
【００７０】
＜アレルゲン＞
１態様では、ＶＬＰワクチンの一部である抗原は、様々なアレルゲンの何れかであってもよい。アレルゲンを基本とするワクチンは、アレルゲンに対する寛容を被検体に誘導するために使用されてもよい。チロシンとの共沈に関与するアレルゲンワクチンの例は、米国特許第３，７９２，１５９号明細書、米国特許第４，０７０，４５５号明細書、および米国特許第６，４４０，４２６号明細書において見つけることができる。なお、特にアレルゲンワクチンの製剤化に関して、これら文献のそれぞれは参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００７１】
様々なアレルゲンの何れかは、ＶＬＰに含まれてもよい。アレルゲンには、特に限定されないが、環境エアロアレルゲン；ブタクサ／枯草熱などの植物の花粉；雑草の花粉のアレルゲン；草の花粉のアレルゲン；セイバンモロコシ（Johnson grass）；木の花粉のアレルゲン；ライグラス；イエダニのアレルゲン（例えばDer p I、Der f Iなど）などのクモ類のアレルゲン；ストレージダニのアレルゲン；スギ花粉／枯草熱；カビ胞子のアレルゲン；動物のアレルゲン（例えばイヌ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、マウスなどのアレルゲン）；食物のアレルゲン（例えば甲殻類；ピーナッツなどのナット；柑橘系果物のアレルゲン）；昆虫のアレルゲン；毒：（膜翅目、イエロー・ジャケット、ミツバチ、ワスプ、ホーネット、ハリアリ（fire ant））；ゴキブリ、ノミ、蚊などからの他の環境昆虫のアレルゲン；ストレプトコッカスの抗原などの細菌のアレルゲン；アスカリス属抗原などの寄生虫のアレルゲン；ウイルス抗原；真菌の胞子；薬物のアレルゲン；抗生物質；ペニシリンおよび関連化合物；他の抗生物質；ホルモン（インシュリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）などの総タンパク質；不完全な抗原またはハプテンとして作用することが可能なすべての薬物およびそれらの代謝産物；ハプテンとして作動することが可能な、およびアレルゲンとして機能することが可能な、工業用化学薬品および代謝産物（例えば酸無水物（無水トリメリット酸など）およびイソシアネート（トルエンジイソシアネートなど））；小麦粉（例えばパン屋喘息（Baker’s asthma）を起こすアレルゲン）、トウゴマ、コーヒー豆、および上記工業用化学薬品などの職業性アレルゲン；ノミのアレルゲン；ならびにヒト以外の動物の中のヒトタンパク質が包含される。
【００７２】
アレルゲンには、特に限定されないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、ポリサッカリドの接合体、ポリサッカリドおよび他の分子のペプチド模擬体および非ペプチド模擬体、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が包含される。
【００７３】
具体的な天然の動物および植物のアレルゲンには、例えば特に限定されないが、以下の属に特有のタンパク質が包含される：イヌ科（カニスファミリアリス（Canis familiaris））；デルマトファゴイデス属（Dermatophagoides）（例えばデルマトファゴイデス・ファリナエ（コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）））；ネコ属（フェリス・ドメスチカス（Felis domesticus））；アンプローシア属（Ambrosia）（アンプローシア・アルテミスフォリア（Ambrosia artemiisfolia）；ロリウム属（Lolium）（例えばペレニアルライグラス（Lolium perenne）またはイタリアンライグラス（Lolium multiflorum））；スギ属（Cryptomeria）（スギ（Cryptomeria japonica））；アルテマリア属（Altemaria）（アルテマリア・アルテマタ（Altemaria altemata））；アルダー属（Alder）；ハンノキ属（アルヌス・グルチノアス（Alnus gultinoas））；ベツラ属（Betula）（ベツラ・ベルコサ（Betula verrucosa））；ケルクス属（Quercus）（ケルクス・アルバ（Quercus alba））；オリーブ属（Olea）（オリーブ（Olea europa））；アルテミシア属（Artemisia）（アルテミシア・バルガリス（Artemisia vulgaris））；プランタゴ属（例えばヘラオオバコ（Plantago lanceolata））；パリエタリア属（Parietaria）（例えばパリエタリア・オフィシナリス（Parietaria officinalis）またはパリエタリア・ジュダイカ（Parietaria judaica））；チャバネゴキブリ属（Blattella）（例えばチャバネゴキブリ（Blattella germanica））；アピス属（Apis）（例えばアピス・ムルチフロルム（Apis multiflorum））；カプレサス属（Cupressus）（例えばカプレサス・センパーヴァイレンス（Cupressus sempervirens）、カプレサス・アリゾニカ（Cupressus arizonica）、およびカプレサス・マクロカルパ（Cupressus macrocarpa））；ジュニペルス属（例えばジュニペルス・サビノイデス（Juniperus sabinoides）、ジュニペルス・ヴィルギニアナ（Juniperus virginiana）、ジュニペルス・コムニス（Juniperus communis）、およびジュニペルス・アシェイ（Juniperus ashei））；ツヤ属（Thuya）（例えばツヤ・オリエンタリス（Thuya orientalis））；ヒノキ属（Chamaecyparis）（例えばヒノキ（Chamaecyparis obtusa））；ペリプラネタ属（Periplaneta）（例えばワモンゴキブリ（Periplaneta americana））；アグロピロン属（例えばシバムギ（Agropyron repens））；セカレ属（Secale）（例えばライムギ（Secale cereale））；トリチカム属（Triticum）（例えばコムギ（Triticum aestivum））；ダクチリス属（Dactylis）（例えばオーチャードグラス（Dactylis glomerata））；フェスツカ属（Festuca）（例えばフェスツカ・エラチオル（Festuca elatior））；ポア属（Poa）（例えばポアプラテンシス（Poapratensis）またはポア・コンプレッサ（Poa compressa））；カラスムギ属（Avena）（例えばマカラスムギ（Avena sativa））；ホルクス属（Holcus）（例えばホルクス・ラナタス（Holcus lanatus））；アンソキサスム属（Anthoxanthum）（例えばハルガヤ（Anthoxanthum odoratum））；アルヘナセラム属（Arrhenatherum）（例えばアルヘナセラム・エラチウス（Arrhenatherun elatius））；アグロスチス属（例えばアグロスチス・アルバ（Agrostis alba））；フレウム属（Phleum）（例えばチモシー（Phleum pratense））；ファラリス（Phalaris）属（例えばファラリス・アルンジナセア（Phalaris arundinacea））；スズメノヒエ属（Paspalum）（例えばバヒアグラス）（Paspalum notatum）；ソルガム属（Sorghum）（例えばソルガム・ハレペンシス（Sorghum halepensis））；そしてブロムス属（Bromus）（例えばブロムス・イネルミス（Bromus inermis））。
【００７４】
＜ＶＬＰを作成する好ましい方法＞
ＶＬＰは、（ａ）脂質ラフトと天然に会合しない抗原に連結された脂質ラフト会合ポリペプチドおよび（ｂ）ｇａｇポリペプチドを含んでいるＶＬＰが、組立られることが好ましい技術分野の当業者の一人に利用可能な任意の方法によって、容易に組立られ得る。好ましい実施形態では、上記ポリペプチドは、あらゆる利用可能なタンパク質発現システムにおいて共発現されてもよい。また該タンパク質発現システムは、脂質内にラフト脂質ドメインを含む細胞を基本とするシステム（哺乳類細胞発現システム、および昆虫細胞発現システムなど）であることが好ましい。
【００７５】
ｇａｇポリペプチドを用いて形成されたＶＬＰの発現の多くの例は、公開されており、ＶＬＰを作製するのに利用可能な発現システムの範囲が実証されている。いくつかのレトロウイルスを用いた研究によれば、他のウイルス成分の非存在下において発現されたＧａｇポリペプチドは、ＶＬＰの形成および細胞表面における出芽に十分であることが実証された（「Wills and Craven AIDS 5, 639-654, 1991」、「Zhouら, 3. Virol. 68, 2556-2569, 1994」、「Morikawaら, Virology 183, 288-297, 1991」、「Royerら, Virology 184, 417-422, 1991」、「Gheysenら, Cell 59, 103-112, 1989」、「Hughesら, Virology 193, 242-255, 1993」、「Yamshchikovら, Virology 214, 50-58, 1995」）。バキュロウイルスベクターを用いた、昆虫細胞内でのＧａｇ前躯体の発現によるＶＬＰの形成は、いくつかのグループによって実証されている（「Delchambreら, EMBO J. 8, 2653-2660, 1989」、「Luoら, Virology 179, 874-880, 1990」、「Royerら, Virology 184, 417-422, 1991」、「Morikawaら, Virology 183, 288-297, 1991」、「Zhouら, J. Virol. 68, 2556-2569, 1994」、「Gheysenら, Cell 59, 103-112, 1989」、「Hughesら, Virology 193, 242-255, 1993」、「Yamshchikovら, Virology 214, 50-58, 1995」）。これらのＶＬＰは、未成熟のレンチウイルス粒子に類似しており、効率的に組立られ、昆虫細胞の形質膜から出芽によって放出される。
【００７６】
Ｇａｇ前躯体のアミノ末端領域が、細胞表面への移送と、ウイルスの組立に必要な膜結合とのための、標的シグナルであることが報告されている（「Yuら, J. Virol. 66, 4966-4971, 1992」、「an, Xら, J. Virol. 67, 6387-6394, 1993」、「Zhouら, J. Virol. 68, 2556-2569, 1994」、「Lee and Linial J. Virol. 68, 6644-6654, 1994」、「Dorfmanら, J. Virol. 68, 1689-1696, 1994」、「Fackeら, J. Virol. 67, 4972-4980, 1993」）。ワクシニア・ウイルス発現システムを用いた、Ｇａｇ構造タンパク質とＥｎｖ糖タンパク質であるｇｐ１２０およびｇｐ４１とを含む、組み換えＨＩＶを基本とするＶＬＰの組立が、報告されている（「Haffarら, J. Virol. 66, 4279-4287, 1992」）。
【００７７】
ＶＬＰのためのポリペプチドの組み換え発現には、上記ポリペプチドの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターのコンストラクションが必要である。上記ポリペプチドの１つ以上をコードするポリヌクレオチドが得られれば、該ポリペプチドを製造するためのベクターは、公知手法を用いる組み換えＤＮＡ技術によって製造され得る。したがって、本明細書には、ＶＬＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の何れかを含んでいるポリヌクレオチドを発現させることによって、タンパク質を調製する方法が記載されている。当業者に公知の方法を用いることにより、ＶＬＰポリペプチドをコードする配列、適切な転写制御シグナル、および適切な翻訳制御シグナルを含んでいる発現ベクターがコンストラクトされることができる。これらの方法には、例えば、イントロでの組み換えＤＮＡ手法、合成の手法、およびインビボでの遺伝子組み換えが包含される。したがって、本発明は、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドとをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、これらの全てが１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、複製可能なベクターを提供する。
【００７８】
上記発現ベクターは、従来手法によって宿主細胞に移動させられてもよく、トランスフェクションされた細胞は、それからＶＬＰポリペプチドを製造するように従来手法によって培養される。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結されたＶＬＰポリペプチドの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含んでいる宿主細胞を包含する。ＶＬＰを生成するための好ましい実施形態では、ｇａｇポリペプチド、および抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドの両方をコードするベクターは、ＶＬＰを生成するための宿主細胞内で共発現されてもよい。この点について以下で詳細に説明する。
【００７９】
様々な宿主−発現ベクターシステムが、ＶＬＰポリペプチドを発現させるために利用されてもよい。そのような宿主−発現システムは、ＶＬＰを生成するために（好ましくは共発現によって）ＶＬＰポリペプチドが製造され得るための媒体を表す。多様な宿主が、適切な発現ベクターのコンストラクトに使用されてもよく、好ましい宿主−発現システムは、ＶＬＰの組立に適した脂質ラフトを有する宿主である。該宿主には、ＶＬＰポリペプチドをコードする配列（ＶＬＰポリペプチドコード配列）を含んでいる、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換される、細菌などの微生物（例えばエシェリキア・コリ、バシラス・サブティリス（B. subtilis））；ＶＬＰポリペプチドコード配列を含んでいる組み換え酵母発現ベクターで形質転換される、酵母（例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））；ＶＬＰポリペプチドコード配列を含んでいる組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染される昆虫細胞システム；ＶＬＰポリペプチドコード配列を含んでいる組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されるか、ＶＬＰポリペプチドコード配列を含んでいる組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換される、植物細胞システム；あるいは、哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインのプロモーター）、または哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルスの後期プロモーター；ワクシニア・ウイルスの７．５Ｋのプロモーター）由来のプロモーター、を含んでいる組み換え発現コンストラクトが導入される、哺乳類細胞システム（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が包含されるが、これらに限定されない。好ましくは哺乳類細胞、より好ましくは昆虫細胞が、ＶＬＰの組立に適したラフト脂質を有しているので、ＶＬＰポリペプチドの発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせられる、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞は、ＶＬＰポリペプチドにとって効果的な発現システムであるといえる（「Foeckingら, Gene 45:101 (1986)」、「Cockettら, Bio/Technology 8:2 (1990)」）。
【００８０】
昆虫システムでは、キンウワバ科(Autographa californica)の核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるベクターとして使用され得る。該ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞において成長する。ＶＬＰポリペプチドコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にそれぞれクローニングされて、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれてもよい。
【００８１】
哺乳類宿主細胞では、ウイルスを基本とする発現システムの多くが利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、関心のあるＶＬＰポリペプチド配列が、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体（例えば後期プロモーターおよび３部分からなるリーダー配列）に結合されてもよい。このキメラ遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボでの組み換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）に挿入することによって、感染宿主内で生存することができ、ＶＬＰポリペプチドを発現することができる組み換えウイルスが得られる（例えば、「Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)」参照）。また特定の開始シグナルが、挿入されたＶＬＰポリペプチドコード配列を効率よく翻訳するために必要とされてもよい。該シグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が包含される。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これら外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々なものに由来してもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、翻訳ターミネーターなどを含めることによって、上昇され得る（「Bittnerら, Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)」参照）。
【００８２】
また、挿入された配列の発現を調節するか、遺伝子産物を特定の望まれる方法で修飾および加工する宿主細胞株が、選択されてもよい。タンパク質産物のそのような修飾（例えばグリコシル化）および加工（例えば開裂または膜への移送）は、ＶＬＰの生成、ＶＬＰポリペプチドの機能、または別のポリペプチド（アジュバントもしくは別の抗原）にとって重要である可能性がある。種々の宿主細胞は、タンパク質ならびに遺伝子産物の翻訳後加工および翻訳後修飾に対して、特徴的かつ特異的な機構を有している。適切な細胞または宿主システムは、発現された外来タンパク質の正しい修飾および加工が確実に行われるように選択されてもよい。これのためには、一次転写産物の適切なプロセッシングや、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化に対する細胞機構を有する、真核宿主細胞が使用されてもよい。
【００８３】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクターで共トランスフェクションされてもよい（第１ベクターは、ｇａｇポリペプチドをコードするベクターであり、第２ベクターは、抗原に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドをコードするベクターである）。２つのベクタ−は、各ＶＬＰポリペプチドを等しく発現させることができる、同じ選択マーカーを含んでいてもよい。また代わりに、ｇａｇポリペプチドと、脂質に連結される脂質ラフト会合ポリペプチドとの両方をコードし、これらを発現させることができる１つのベクターを使用してもよい。
【００８４】
ＶＬＰが宿主細胞によって産生されれば、該ＶＬＰは、ポリペプチドの精製に関して技術的に知られている任意の方法によって、精製され得る。そのような方法としては、例えば、クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（特にポリペプチドに付加された任意の親和性精製タグに対する親和性を利用する、親和性クロマトグラフィー）、大きさを分けるクロマトグラフィー）、遠心、または溶解度差を用いる方法、あるいはタンパク質もしくは他の高分子を精製するための他の任意の標準的な手法を用いる方法が挙げられる。また、ＶＬＰポリペプチドは、ＶＬＰの精製を容易にするための、本明細書に記載されているか、さもなければ技術的に公知である異種のポリペプチド配列と融合されてもよい。精製後、別の抗原またはアジュバントなどの別の要素が、ＶＬＰポリペプチドに対する共有結合を介するか、または他の非共有結合の機構によってＶＬＰに物理的に連結されてもよい。ＶＬＰポリペプチドが、ラフト脂質ドメインを有する宿主細胞（哺乳類細胞および昆虫細胞など）内で共発現される好ましい実施形態では、ＶＬＰは、自ら組立られて放出される。これにより、上記方法の何れかによってＶＬＰが精製され得る。
【００８５】
〔ＶＬＰを使用する好ましい方法〕
＜製剤＞
本明細書に記載のＶＬＰは、ワクチン調製物として使用されることが好ましい。通常、そのようなワクチンは、注射剤として液体溶液または懸濁液として調製される。また該ワクチンは、注射前の時点では、液体溶液または懸濁液に適した固形剤として調製されてもよい。またそのような調製物は、乳化されてもよいし、乾燥粉末として製造されてもよい。しばしば、活性免疫原性成分が、該活性免疫原性成分と適合する薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。適した賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、右旋性グルコース、グリセロール、エタノール、または同類のもの、およびそれらの組み合わせである。さらに、希望に応じて、ワクチンは、補助物質（湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンの有効性を向上させるアジュバントなど）を含んでもよい。
【００８６】
ワクチンは、従来どおり、例えば皮下に、経皮的に、皮内に、真皮下に、または筋肉内に注入されることによって非経口的に投与されてもよい。他の投与様式に適した別の製剤は、坐薬を含んでおり、場合によっては経口製剤、鼻腔内製剤、バッカル製剤、舌下製剤、腹腔内製剤、膣内製剤、肛門製剤および頭蓋内製剤を含んでいる。坐薬については、在来の結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含んでいてもよい。そのような坐薬は、上記活性免疫原性成分を、０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲で含んでいる混合物から形成されてもよい。ある実施形態では、低融点のワックス（脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物など）が初めに溶かされ、本明細書記載のＶＬＰが攪拌などによって均質に分散させられる。溶解した均一混合物は、それから従来の大きさの型に注がれ、冷却されてから凝固される。
【００８７】
鼻腔内投与に適した製剤には、液体および乾燥粉末が包含される。製剤には、普通に使用される賦形剤（例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、サッカロース、トレハロースおよびキトサンなど）が含まれる。キトサンなどの粘膜接着剤（Mucosadhesive agent）は、鼻腔内投与された製剤の粘液線毛クリアランスを遅らせるために、液体製剤または乾燥粉末製剤に使用されることができる。マンニトールおよびサッカロースなどの糖は、液体製剤においては安定剤として、乾燥製剤においては安定剤および充填剤として使用されることができる。また、アジュバント（例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、および単なる例であり特に限定されないが、二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリイノシン酸、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、イミキモド（imiquimod）、コレラ毒素およびその誘導体、易熱性エンテロトキシンおよびその誘導体、ならびに本明細書の全体に挙げられているアジュバントの多く）は、液体製剤および乾燥粉末製剤に、免疫賦活性アジュバントとして使用されることができる。
【００８８】
経口投与に適した製剤には、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、およびトローチ剤などが包含される。経口投与に適した製剤には、錠剤、トローチ剤、カプセル、ゲル、液体、食品、飲み物、および栄養補給食品などが包含される。製剤には、普通に使用される賦形剤（例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなど）が含まれる。他のＶＬＰワクチン組成物は、溶液、懸濁液、丸剤、徐放性製剤、または粉末の形態を取ってもよく、１０％から９５％、好ましくは２５％から７０％の活性免疫原性成分を含んでいる。経口製剤に関しては、コレラ毒素が製剤の相手として興味深い物質である（また接合の相手としても可能性がある）。
【００８９】
ＶＬＰワクチンは、膣内投与用に製剤化されるときは、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、またはスプレーの形態になってもよい。上記製剤の何れかは、ＶＬＰに加えて、技術的に公知の適切な作用物質を含んでいてもよい。
【００９０】
ある実施形態では、ＶＬＰワクチンは、全身投与用に、または局所投与用に製剤化されてもよい。そのような製剤は、技術的によく知られている。非経口投与用の媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガー右旋性グルコース、右旋性グルコースおよび塩化ナトリウムの溶液、乳酸加リンゲル溶液、または不揮発性油が包含される。静脈内投与用の媒体には、流動性で栄養性の補充液、および電解質補充液（リンガー右旋性グルコースに基づくものなど）などが包含される。全身投与および局所投与の経路には、経皮投与、皮内投与、局所適用、静脈内投与、筋肉内投与などが包含される。
【００９１】
ＶＬＰは、中性製剤または塩に基づく製剤を包含するワクチンに製剤化されてもよい。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と一緒に形成された塩）が包含される。なお、該酸付加塩は、無機酸（例えば塩酸またはリン酸）、あるいは有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマンデル酸など）と一緒に形成された塩である。また、遊離カルボキシル基と一緒に形成された塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄など）、および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなど）から得られてもよい。
【００９２】
ワクチンは、製剤の用量（dosage formulation）と適合するように、治療効果および免疫原性がもたらされるような量で、投与されてもよい。投与される量は、治療される被検体（例えば免疫応答を開始するための個々の免疫系の能力、および希望される防御の程度など）に依存する。適切な用量の範囲では、接種一回の当たりの活性成分は、数百マイクログラムの桁であり、（１から１０ｍｇの範囲というより多い量が考慮されるが）好ましくは約０．１μｇから２０００μｇの範囲であり、例えば、約０．５μｇから１０００μｇの範囲であり、好ましくは１μｇから５００μｇの範囲であり、特に好ましくは約１０μｇから１００μｇの範囲である。また、初回投与および追加免疫に適した投薬計画は、変更可能であるが、初回投与が行われてから、その後の接種または他の投与が行われるというのが典型である。
【００９３】
適用の様式は大きく変更されてもよい。ワクチンを投与するための従来の方法の何れかを適用することができる。これらには、生理学的に許容可能な固形の基質を利用して経口投与する方法、または生理学的に許容可能な分散形態で注射などによって投与する方法などが含まれる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、ワクチン接種されるものの年齢および抗原の剤形に基づいて変更される。
【００９４】
ワクチン製剤には、それ自体ワクチンとして十分な免疫原性を有しているものがあるが、残りのワクチン製剤のいくつかには、ワクチンがアジュバント物質をさらに含んでいる場合に、免疫応答が増強されるものがある。
【００９５】
また、粘膜接着を改善するための送達剤が使用されることにより、特に鼻腔内投与製剤、経口投与製剤、肺に基づく投与製剤に対する、送達および免疫原性が改善され得る。そのような化合物の１つであるキトサン（キチンのＮ−デアセチル化形態）が、多くの薬学的製剤に使用される（３２）。キトサンは、粘液線毛クリアランスを遅らせることができ、粘膜での抗原の取り込みおよび加工により長く時間を費やすことができるため、鼻腔内ワクチンにとって魅力的な粘膜接着剤である（３３、３４）。さらに、キトサンは、一時的に密着結合を広げることができ、抗原のＮＡＬＴへの経上皮輸送を向上させる可能性がある。最近のヒトでの試験において、他のアジュバントとは一緒に投与されず、キトサンと一緒に鼻腔内投与された３価の不活性化インフルエンザワクチンは、抗体陽転を引き起こすとともに、筋肉内接種の後に得られるＨＩの力価よりも僅かに低いＨＩの力価をもたらした（３３）。
【００９６】
またキトサンは、遺伝的に解毒されたE. coliの易熱性エンテロトキシンの突然変異体であるＬＴＫ６３などの、鼻腔内で良好に機能するアジュバントと一緒に製剤化されることもできる。これにより、キトサンによって与えられる送達と接着との利点に加えて、免疫賦活効果が追加される。その結果、粘膜応答および全身応答が増強されることになる（３５）。
【００９７】
最後に、キトサンの製剤は、乾燥粉末の形式で製剤され得ることに注意されたい。この形式は、ワクチンの安定性を改善することが示されており、液体製剤よりもさらに粘液線毛クリアランスを遅らせることができる（４２）。このことは、キトサンと一緒に製剤化された鼻腔内乾燥粉末であるジフテリアトキソイドワクチンを用いた、最近のヒトでの臨床試験において確かめられた。さらに、該臨床試験では、鼻腔内経路は、従来の筋肉内経路と同じくらい効果的であり、分泌型のＩｇＡ応答の利点が加えられることが確かめられた（４３）。また上記ワクチンの耐性は、非常に強かった。キトサンおよびＭＰＬを含んでいる炭疽菌用の鼻腔内乾燥粉末ワクチンは、筋肉内接種よりも強い応答をウサギに誘導し、またエアロゾルである胞子によるアレルギーの誘発に対する防御も誘導した（４４）。
【００９８】
鼻腔内ワクチンは、それが、非経口投与されるワクチンとは対照的に上気道および下気道に影響を与えることができるので、好ましい製剤である（なお、非経口投与されるワクチンは、下気道に影響を与える点においてより優れている）。このことは、アレルゲンを基本とするワクチンに対する寛容を誘導することや、また病原体を基本とするワクチンに対する免疫を誘導することにとって利点となり得る。
【００９９】
鼻腔内ワクチンが使用されることにより、上気道および下気道に防御が与えられることに加えて、針を使った接種につきまとう厄介な問題が回避されるし、粒状および／または可溶性の抗原と鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）との相互作用により、粘膜性ならびに全身性の体液性応答および細胞性応答の両方を引き起こすという手段が提供される（１６−１９）。鼻腔内経路の効果は、歴史的に、非経口接種の効果よりも弱かったが、新しい投与製剤、アジュバント、およびＶＬＰの使用は、このパラダイムを変え始めている。実際のところ、機能的なヘマグルチニンポリペプチドを含んでいるＶＬＰは、鼻腔内投与に特に適している可能性がある。なぜなら、鼻粘膜に豊富に存在するシアル酸含有受容体が、ＨＡ抗原の結合を向上させ、粘液線毛クリアランスを減少させることになり得るからである。
【０１００】
＜アジュバント＞
ワクチンに対するアジュバント効果を得る方法としては、種々の方法が知られており、それらは本明細書に開示のＶＬＰと併用して使用され得る。一般的な原理および方法の詳細は、「”The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6」、および「”Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants”, 1995, Gregoriadis Gら (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9」に記載されている。これら文献は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
ある実施形態では、ＶＬＰワクチンは、少なくとも１つのアジュバントと混合されたＶＬＰを含んでいる。上記ＶＬＰワクチンに含まれている上記ＶＬＰと上記アジュバントとの割合は、重量比で約１０：１から約１０１０：１までであり、例えば、約１０：１から約１００：１まで、約１００：１から約１０３：１まで、約１０３：１から約１０４：１まで、約１０４：１から約１０５：１まで、約１０５：１から約１０６：１まで、約１０６：１から約１０７：１まで、約１０７：１から約１０８：１まで、約１０８：１から約１０９：１まで、または約１０９：１から約１０１０：１までである。当業者の一人は、アジュバントおよび最適な比を決定するための慣例的な実験を通して、適切な比を容易に決定することができる。本明細書に記載されているようなＶＬＰとアジュバントとの混合物は、当業者に利用可能なあらゆる組み合わせの形態を含んでいてもよい。そのような形態には、特に限定されないが、同じ溶液内においてＶＬＰとアジュバントとが分離されているという混合物、ＶＬＰとアジュバントとが共有連結されているという混合物、ＶＬＰとアジュバントとがイオン的に連結されているという混合物、ＶＬＰとアジュバントとが疎水的に連結されているという混合物（ＶＬＰ膜に部分的にまたは完全に埋め込まれている形態を含む）、ＶＬＰとアジュバントとが親水的に連結されているという混合物、ならびにそれらの任意の組み合わせが包含される。
【０１０２】
アジュバントの好ましい例はポリペプチドアジュバントである。該ポリペプチドアジュバントは、ＶＬＰポリペプチドと一緒に共発現されることによって、またはＶＬＰポリペプチドと融合されてキメラポリペプチドが製造されることによって、本明細書に記載のＶＬＰに容易に付加されるものであってもよい。鞭毛の主要タンパク質成分である細菌のフラジェリンは、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ５により先天性免疫系から認識されるために、アジュバントタンパク質として注目されている（６５）。ＴＬＲ５を介したフラジェリンのシグナルは、ＤＣの成熟および遊走を誘導することによって、ならびに前炎症性メディエータの産生をもたらすマクロファージ、好中球および腸上皮細胞の活性化を誘導することによって、先天性免疫機能と獲得免疫機能との両方に効果を及ぼす（６６−７２）。
【０１０３】
ＴＬＲ５は、フラジェリンモノマーに保存された、このタンパク質に独特で鞭毛の機能に必須の構造を認識するが、免疫学的圧力に応じた該構造の突然変異体は認識しない（７３）。ＴＬＲ５は、１００ｆＭの濃度に対して感受性があるが、完全なフィラメントを認識しない。鞭毛のモノマーへの分解には、結合と刺激とが要求される。
【０１０４】
アジュバントとしてのフラジェリンは、非経口でまたは鼻腔内に投与される異種抗原に対する防御応答を誘導するための強力な活性を有しているし（６６、７４−７７）、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果も報告されている（７８）。フラジェリンが使用されたとき、Ｔｈ２への偏りが観察され、このことはインフルエンザなどの呼吸器ウイルスに対して適しているであろうが、マウスまたはサルにおいてＩｇＥが誘導されたという証拠は見つかっていない。また、サルに鼻腔内投与または全身投与した後に、局所的炎症反応または全身性炎症反応が起こらなかったということも報告されている（７４）。ＭｙＤ８８に依存する様式でＴＬＲ５を経由するフラジェリンシグナル、およびＴＬＲを経由する他の全てのＭｙＤ８８依存性のシグナルは、Ｔｈ１へ偏ることになることが示されていたために、フラジェリンを使用した後に誘発される応答に関するＴｈ２の特徴には、ある程度驚かされる（６７、７９）。重要なことは、フラジェリンに対する予め存在していた抗体が、アジュバントの有効性に対して、あまり効果を及ぼさず（７４）、このことが、フラジェリンを複数回使用されるアジュバント（multi-use adjuvant）として魅力あるものにしていることである。
【０１０５】
多くの最近の鼻腔内ワクチンの試験に共通するテーマは、ワクチンの有効性を改善するためのアジュバントおよび／または投与系の使用である。そのような研究によれば、遺伝的に解毒されたE. coliの易熱性エンテロトキシンアジュバント（LT R192G）を含んでいるインフルエンザのＨ３ワクチンを鼻腔内投与した後にだけ、Ｈ５の暴露に対するヘテロサブタイプな防御がもたらされている。防御は、中和抗体の交差の誘導に基づいており、新たなワクチンを開発する上で鼻腔内経路が重要であることを実証した（２２）。
【０１０６】
またサイトカイン、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦなど）；腫瘍壊死因子；インターロイキン−２、−７、−１２、インターフェロン、および他の成長因子もアジュバントとして使用されてもよく、それらはＶＬＰポリペプチドと混合するか、融合することによってＶＬＰワクチン内に容易に含まれ得るために、好ましいものでもある。
【０１０７】
ある実施形態では、本明細書に開示のＶＬＰワクチンは、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する他のアジュバントを含んでいてもよい。そのようなアジュバントとしては、ＴＬＲ９のリガンドであるＣｐＧオリゴヌクレオチドを含んでいる核酸；ＴＬＲ７のリガンドであるイミダゾキノリン；ＴＬＲ７／８のリガンドである置換グアニン；ロキソリビン（Loxoribine）、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリイノシン酸、イミキモド（Imiquimod）（Ｒ−８３７）およびレシキモド（Resiquimod）（Ｒ−８４８）などのＴＬＲ７受容体；あるいはＭＰＬ（登録商標）または合成誘導体などのＴＬＲ４のアゴニストなどが挙げられる。
【０１０８】
あるアジュバントは、樹状細胞などのＡＰＣによって、ワクチン分子の取り込みを促進し、該ワクチン分子を活性化する。非限定的な例は、免疫標的アジュバント；免疫調節アジュバント（毒素、サイトカインおよび細菌の誘導体など）；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫賦活複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス（ISCOM matrix））；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；ＭＰＬ；およびカプセル化アジュバント（encapsulating adjuvant）からなる群から選択される。
【０１０９】
アジュバントのさらに別の例には、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（みょうばん）（通常、０．０５％から０．１％のアルミニウム塩の緩衝生理食塩水溶液として使用される（例えばNicklas (1992) Res. Immunol. 143:489-493参照））などの作用物質、０．２５％の溶液として使用される糖の合成ポリマーとの混合物（例えばカルボポル（Carbopol（登録商標）））、７０℃から１０１℃の範囲の温度で、３０秒から２分間熱処理することによって得られる、ワクチン中のタンパク質の凝集体が包含される。また、アジュバントとしては、架橋剤を使って得られた凝集体も可能である。さらに、（ｉ）ペプシン処理されたアルブミンに対する抗体（Ｆａｂ断片）を用いた再活性化による凝集体、（ｉｉ）クリプトスポリジウム・パルバム（C. parvum）などの細菌細胞、またはグラム陰性菌のエンドトキシンもしくはリポ多糖体成分との混合物、（ｉｉｉ）マンニドモノオレイン酸などの生理学的に許容可能な油媒体の乳濁液（アラセルＡ（Aracel A））、あるいは（ｉｖ）ブロック置換体として使用されるパーフルオロカーボンの２０％溶液との乳濁液（フルオソル−ＤＡ（Fluosol-DA））、が使われてもよい。スクアレンおよびＩＦＡなどの油との混合物も好ましい。
【０１１０】
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド）は、アジュバントの興味深い候補であるし、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、ならびにキラヤ属のサポニン（クイルＡ（QuilA）およびＱＳ２１など）も興味深い候補である。他の候補には、リポ多糖体のポリ［ジ（エアロボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）の誘導体（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、およびトレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）など）が包含される。リポ多糖類を基本とするアジュバントは、優勢なＴｈ１型応答を産生するためのものであることが好ましい。そのようなアジュバントとしては例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、グラクソスミスクラインから入手することができる（例えば米国特許第４，４３６，７２７号明細書、米国特許第４，８７７，６１１号明細書、米国特許第４，８６６，０３４号明細書、および米国特許第４，９１２，０９４号免疫原性参照。これら文献のそれぞれは、リポ多糖類に関連する教示に特に関して、参照することによって完全に組み込まれる）。
【０１１１】
またリポソーム製剤も、アジュバント効果を奏することが知られており、それ故、リポソームアジュバントがＶＬＰと併用される好ましい例である。
【０１１２】
免疫賦活複合体マトリックス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）アジュバントは、特にこの形式のアジュバントがＭＨＣクラスＩＩの発現をＡＰＣによって上方調節できることが示されたために、本発明にとって好ましい選択肢である。ＩＳＣＯＭマトリックスは、キラヤ由来の（場合によっては分画された）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、およびリン脂質から成るものである。免疫原性タンパク質（例えばＶＰＬ中の免疫原性タンパク質）と混合されたときに生じる粒状製剤は、ＩＳＣＯＭ粒子として知られているものである。サポニンは、該ＩＳＣＯＭ粒子の６０−７０％ｗ／ｗを構成してもよく、コレステロールおよびリン脂質は該ＩＳＣＯＭ粒子の１０−１５％ｗ／ｗを構成してもよく、上記タンパク質は該ＩＳＣＯＭ粒子の１０−１５％ｗ／ｗを構成してもよい。免疫賦活複合体の組成および使用に関する詳細は、例えば、アジュバントを扱っている上記テキストブックにおいて見つけることができるが、例えば、「Morein Bら, 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475」および「Barr I G and Mitchell G F, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25」（これらは参照することによって本明細書に組み込まれる）にも、完全な免疫賦活複合体を調製するために役に立つ説明が記載されている。
【０１１３】
本明細書に開示のＶＬＰワクチンを有するアジュバント組み合わせに使用されてもよいサポニンは、ＩＳＣＯＭの形態であってもなくても、クイルＡと呼ばれるキラヤサポナリアモリナ（Quillaja Saponaria Molina）の皮から得られたもの、およびそれの画分を包含する。なお、これらは、米国特許第５，０５７，５４０号明細書（特にクイルＡの画分ならびにその単離方法および使用に関して、参照されることによって本明細書に完全に組み込まれる）、「”Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55」、および欧州特許第0362279号明細書に記載されている。クイルＡの特に好ましい画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、およびＱＳ１７である。
【０１１４】
β−エスチンは、本発明のアジュバント組成物に使用される、もう１つ別の好ましい溶血性サポニンである。エスチンは、メルクの索引（第１２版：項目３７３７）に、トチノキの実に生じるサポニンの混合物として記載されており、ラテン語は、Aesculus hippocastanumである。それのクロマトグラフィーおよび精製による単離は、「Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)」に記載されており、それのイオン交換樹脂による単離は、「Erbringら, 米国特許第３，２３８，１９０号明細書」」に記載されている。エスチンの画分は、精製されており、生物活性を有することが示されている（「Yoshikawa M, ら (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8):1454-1464)」）。β−エスチンは、アセスチン（aescin）としても知られている。
【０１１５】
本発明に使用されるもう１つべつの好ましい溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンは、メルクの索引（上記第１２版：項目３２０４）に、ジギタリス・プルプレア（Digitalis purpurea）の実から得られ、「Gisvoldら, J.Am.Pharm.Assoc., 1934, 23, 664」および「Ruhenstroth-Bauer, Physiol.Chem., 1955, 301, 621」に記載の手法によって精製される、サポニンとして記載されている。その使用は、コレステロール測定のための臨床試薬として記載されている。
【０１１６】
アジュバント効果を得るもう１つ別の（そして好ましい）可能性は、「Gosselinら, 1992」（参照によって、本明細書に組み込まれる）に記載の手法を使うことである。要するに、本発明の抗原などの関連抗原の提示は、単球／マクロファージ上のＦＣ受容体に対する抗体（または抗原結合性の抗体断片）へ、該抗原を接合することによって改善されることができる。特に抗原と抗−ＦＣＲＩとの間の接合によって、ワクチン接種のための免疫原性が向上されることが実証された。上記抗体は、発現によって、ＶＬＰポリペプチドの何れか１つとの融合体として生成した後に、または該融合体の生成の一環として、ＶＬＰに接合されてもよい。
【０１１７】
他の候補には、標的物質および免疫調節物質（すなわちサイトカイン）の使用が含まれる。また、サイトカインの合成誘発物質（ポリＩ：Ｃなど）が使用されてもよい。
【０１１８】
適切な微生物誘導体は、ムラミルジペプチド、フロイント完全アジュバント、ＲＩＢＩ（Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Mont.）、およびトレハロースのジエステル体（ＴＤＭおよびＴＤＥなど）から成る群から選択されてもよい。
【０１１９】
適切な免疫標的アジュバントには、例えばＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０抗体、またはその特異的な結合性断片（上記の考察を参照）、マンノース、Ｆａｂ断片、ＣＴＬＡ−４が包含される。
【０１２０】
適切なポリマーアジュバントには、例えばデキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、およびマンノースなどの炭水化物；プラスチックポリマー；およびラテックスビーズなどのラテックスが包含される。
【０１２１】
免疫応答を調節するさらにもう１つ別の興味深い方法は、免疫源を、「仮想リンパ節（ＶＬＮ）」に含ませることである（場合によってはアジュバントならびに薬学的に許容可能な担体および溶媒と一緒に含ませることである）。ＶＬＮは、「ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, N.Y. 10017-6501」によって開発された専売医療機器である。ＶＬＮ（細い管状の機器）は、リンパ節の構造および機能を模倣している。ＶＬＮが皮下へ挿入されることによって、サイトカインおよびケモカインの激増を伴う無菌の炎症部位が生まれる。Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＡＰＣは、この危険シグナルに迅速に反応し、炎症部位に向かい、ＶＬＮの多孔性マトリックス中に蓄積する。ＶＬＮを使用すると、抗原に対する免疫応答を開始するために要求される必須抗原の用量が減少すること、およびＶＬＮを使ったワクチン接種によって得られる免疫防御は、アジュバントとしてＲｉｂｉを使った従来の免疫化を凌ぐことが示された。この技術の概要は、「Gelber Cら, 1998, ”Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node”」、および「”From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Oct. 12-15, 1998, Seascape Resort, Aptos, Calif.”」に記載されている。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドが、ＶＬＰワクチンと併用されるアジュバントとして使用されてもよい。該オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも６つ、またはそれ以上のヌクレオチドによって分離されたジヌクレオチドＣｐＧモチーフを、２つ以上含んでいることが好ましい。（ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない）ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、優勢なＴｈ１応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは、公知であり、例えば国際公開第９６／０２５５５号パンフレット、国際公開第９９／３３４８８号パンフレット、米国特許第６，００８，２００号明細書、および米国特許第５，８５６，４６２号明細書に記載されている（これら文献のそれぞれは、特にアジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドを作製および使用する方法に関して、参照することによって完全に本明細書に組み込まれる）。
【０１２３】
そのようなオリゴヌクレオチドアジュバントは、デオキシヌクレオチドであってもよい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド骨格は、ホスホロジチオエート、より好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド骨格（ＰＮＡなど）も、（混合された骨格結合を有するオリゴヌクレオチドを含む）本発明の範囲に含まれる。ホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを製造するための方法は、米国特許第５，６６６，１５３号明細書、米国特許第５，２７８，３０２号明細書、および国際公開第９５／２６２０４号パンフレットに記載されており、これら文献のそれぞれは、特にホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートの教示に関して、参照することによって完全に本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば以下の配列を有している。これら配列は、ホスホロチオエートで修飾されたヌクレオチド骨格を含んでいることが好ましい。
【０１２５】
（配列番号１）オリゴ１：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)；
（配列番号２）オリゴ２：TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)；
（配列番号３）オリゴ３：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG；
（配列番号４）オリゴ４：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)；
（配列番号５）オリゴ５：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)。
【０１２６】
他の好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドには、重要でない欠失または付加を有する上記配列が含まれる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、技術的に公知の任意の方法（例えば欧州特許公開第４６８５２０号明細書）によって合成されてもよい。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動合成機を利用して合成されてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドアジュバントの長さは、１０−５０塩基の間であってもよい。もう１つ別のアジュバントシステムは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと、サポニン誘導体との組み合わせを含んでいる。特にＣｐＧとＱＳ２１との組み合わせは、国際公開第００／０９１５９号パンフレットに開示されている。
【０１２７】
多くの一相または多相乳濁液システムが記載されている。当業者の一人は、乳濁液によってＶＬＰの構造が破壊されないように、そのような乳濁液システムをＶＬＰとの使用に容易に適応させることができる。水中油型乳濁液のアジュバントは、それ自体、アジュバント組成物として有用であると示唆されており（欧州特許第０３９９８４３号明細書）、水中油型乳濁液と他の活性剤との組み合わせもワクチン用のアジュバントとして記載されている（国際公開第９５／１７２１０号パンフレット、国際公開第９８／５６４１４号パンフレット、国際公開第９９／１２５６５号パンフレット、国際公開第９９／１１２４１号パンフレット）。油中水型乳濁液、および水中油中水型乳濁液（water in oil in water emulsion）などの他の油乳濁液のアジュバントは、それぞれ、米国特許第５，４２２，１０９号明細書および欧州特許第０４８０９８２号明細書、ならびに米国特許第５，４２４，０６７号明細書および欧州特許第０４８０９８１号明細書に記載されている。
【０１２８】
本明細書に記載されたＶＬＰワクチンとともに使用するための油乳濁液アジュバントは、天然または合成されたものであってもよく、かつ無機的または有機的なものであってもよい。無機的および有機的な油の例は、当業者に容易に理解される。
【０１２９】
人への投与に好適な任意の水中油型組成物のために、乳濁系の上記油層は、好ましくは新陳代謝させることができる油を含む。新陳代謝させることができる油という用語の意味は、当業者によく知られている。新陳代謝させることができるという用語は「新陳代謝により変化される能力を有する」と定義できる(Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25th edition (1974))。上記油は、受容者に有毒ではなく、かつ新陳代謝により変化する能力を有する任意の植物性油、魚油、動物油、または合成油であってよい。ナッツ（ピーナッツ油など）、種、および種子は、植物油の一般的な源である。合成油も本発明の一部であり、かつＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などのような市販されている油を包含できる。スクアレン(2,6,10,15, 19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaene)は、サメの肝臓油中に多量に見出され、かつオリーブ油、小麦の胚種油、ぬか油、および酵母に少量見出される不飽和油である。該スクアレンは、本発明の使用に特に好ましい油である。スクアレンは、新陳代謝させることができる油であり、事実、コレステロールの生合成における中間体であるという長所を有する(Merck index, 10th Edition, entry no.8619)。
【０１３０】
特に好ましい油乳濁液は、水乳濁液中の油であり、特にスクアレンの水乳濁液が好ましい。
【０１３１】
加えて、加工していない酸化防止剤において本発明の最も好ましい油乳濁液アジュバントは、好ましくはα−トコフェロール油（vitamin E, EP 0 382 271 Bl）である。
【０１３２】
国際公開第９５／１７２１０号パンフレットおよび国際公開第９９／１１２４１号パンフレットは、随意的に免疫賦活剤ＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬとともに製剤されたスクアレン、α−トコフェロール、およびＴＷＥＥＮ８０に基づく乳濁液アジュバントを開示している。国際公開第９９／１２５６５号パンフレットは、油層にステロールを添加したこれらのスクアレン乳濁液の改良点について開示している。さらに、トリカプリリン（tricaprylin）(Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６)のようなトリグリセリドは、乳濁液の安定化のために油層を添加してもよい。
【０１３３】
水乳濁液における安定した油内に見出される油滴の大きさは、好ましくは１ミクロンよりも小さく、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲であってよく、好ましくは、実質的に直径約３０〜５００ｎｍであり、最も好ましくは実質的に直径１５０〜５００ｎｍであり、特に光相関分光法により測定した直径において約１５０ｎｍである。この点で、油滴の８０％は、型どおりに好ましい範囲内であるべきで、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の油滴が定義された範囲の大きさ内であるべきである。本発明の油乳濁液に存在する構成要素の量は、スクアレンのように通常２〜１０％の範囲が油である。また、構成要素が存在する場合、２から１０％のアルファトコフェロール；およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのような０．３％〜３％の界面活性剤が存在する。好ましい油の比率は、アルファトコフェロールは、１に等しいか、または１よりも小さく、この条件では、より安定な乳濁液が提供される。スパン８５（Span 85）は、約１％のレベルで存在してもよい。いくつかの場合では、本明細書に開示されたＶＬＰワクチンは、さらに安定化剤を含むことが好都合であってよい。
【０１３４】
水乳濁液中に油を形成する方法は、当業者によく知られている。通常、上記方法は、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）のような界面活性剤と油層を混合する工程を含み、その後のホモジナイザーを用いるホモジナイゼーションにおいて、上記ミキサーにシリンジの針を通して２回混合することを含むことは、少量の液体のホモジナイゼーションにとって好適であることは当業者にとって明らかである。
【０１３５】
同様に、マイクロフルイダイザー（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス機、最大５０回、６バールの入力最大圧において２分間（約８５０バールの出力圧力））における乳状化処理は、当業者によって少量または大量の乳濁液を形成するために採用できる。この採用は、調製物が所望の直径の油滴により達成されるまで、得られた乳濁液の測定を含む通常の実験により達成できる。
【０１３６】
本明細書において開示された上記ＶＬＰワクチンの調製物は、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮的投与、静脈内投与、または皮下投与によるワクチン投与によってウイルスに感染しやすい、またはウイルスの感染に苦しんでいる哺乳類または鳥を保護または処理するために用いられてよい。ワクチン調製物の全身性の投与方法は、従来型のシリンジおよび針、または固体のワクチンの弾道輸送（ballistic delivery）のために設計された装置（国際公開第９９／２７９６１号パンフレット）、無針圧液体噴出装置（米国特許出願公開第４，５９６，５５６号明細書；米国特許出願公開第５，９９３，４１２号明細書）、または経皮貼布（transdermal patches）(国際公開第９７／４８４４０号パンフレット；国際公開第９８／２８０３７号パンフレット)を含み得る。ＶＬＰワクチンは、皮膚にも適用され得る（経皮的（transdermal）または経皮投与（transcutaneous delivery）（国際公開第９８／２０７３４号パンフレット；国際公開９８／２８０３７号パンフレット）。本明細書において開示されている上記ＶＬＰワクチンは、それゆえ、全身投与のための輸送ＶＬＰワクチンまたはアジュバント組成物で前もって満たされた輸送装置を含む。従って、本明細書においては、好ましくは哺乳類または鳥といった個体において、本明細書に記載された任意のＶＬＰ組成物を含むワクチンの投与を含み、かつ任意に個体へのアジュバントおよび／またはキャリアを含む免疫応答を誘導する方法を提供する。ここで、ワクチンは、非経口または全身経路を介して投与される。
【０１３７】
好ましくは、本発明の上記ワクチン調製物は、経口（oral）／消化管（alimentary）または鼻（nasal）経路のような粘膜（mucosal）経路を介するワクチンの投与方法により、ウイルス感染に影響を受けやすい、また、ウイルス感染に苦しんでいる哺乳類または鳥の保護または処理のために用いられてよい。選択的な粘膜岐路は、膣内および直腸内（intra-rectal）である。投与の好ましい粘膜経路は鼻経路を介し、鼻腔ワクチン接種と称される。鼻腔ワクチン接種の方法は、当業者に公知であり、免疫性をあたえられた個体の鼻咽頭中のワクチンにおいて、小滴、噴霧、または乾燥粉末形態の投与を含む。霧状またはエアロゾル化されたワクチンの製剤は、それゆえ、本明細書に開示されたＶＬＰワクチンの好ましい形状である。経口投与のための腹痛抵抗性カプセルおよび顆粒のような腸溶性の製剤、直腸または膣内投与のための座薬も、本明細書において開示されたＶＬＰワクチンの製剤である。
【０１３８】
本明細書において開示された好ましいＶＬＰワクチン組成物は、ワクチン接種による全身性ワクチン接種に換えて、ヒトにおいて好適に適用できる粘膜ワクチンの種類を表す。
【０１３９】
上記ＶＬＰワクチンは、経口経路を介して投与されてもよい。このような場合、薬学的に許容可能な賦形剤は、アルカリ緩衝液、または腸溶性カプセルもしくは顆粒を含んでもよい。上記ＶＬＰワクチンは、膣経路により投与されてもよい。このような場合、薬学的に許容可能な賦形剤は、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）のようなポリマー、およびその他の公知の膣クリームおよび座薬の安定剤を含んでもよい。上記ＶＬＰワクチンは、直腸経路により投与されてもよい。この場合、賦形剤は、直腸にいれる座薬を形作るために当業者に知られたワックスおよびポリマーを含んでもよい。
【０１４０】
また、上記ＶＬＰワクチン製剤は、キトサン（上述したように）または他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチド粒子およびポリラクチド−コグリコライド（polylactide-coglycolide）粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグリコサミンに基づくポリマーマトリックス、ポリサッカライドからなる粒子または化学的に修飾されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームに基づく粒子および脂質に基づく粒子、ならびにグリセロールモノマーからなる粒子などからなるワクチン媒体と結合してもよい。上記サポニンは、リポソームまたはＩＳＣＯＭｓのような粒子の構造を形作るためにコレステロールの存在下で製剤されてもよい。さらに、上記サポニンは、非粒子的な溶液または懸濁液のどちらか、もしくは、小ラメラリポソーム（paucilamelar liposome）またはＩＳＣＯＭのような粒子構造において、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと共に製剤されてもよい。
【０１４１】
本明細書に記載されたような薬学的組成物およびワクチン組成物における使用のための追加の実例となるアジュバントは、ＳＡＦ(Chiron, Calif., United States)、ＭＦ‐５９(Chiron, 例えば、Granoffら(1997) Infect Immun. 65 (5):1710-1715を参照のこと)、アジュバンドのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢ‐ＡＳ２(SmithKline Beecham adjuvant system #2; an oil-in- water emulsion containing MPL and QS21)）;SmithKline Beechamから市販されているＳＢＡＳ‐４(SmithKline Beecham adjuvant system #4; contains alum and MPL)、Ｄｅｔｏｘ(Enhanzyn)（登録商標）(GlaxoSmithKline)、ＲＣ‐５１２、ＲＣ‐５２２、ＲＣ‐５２７、ＲＣ‐５２９、ＲＣ‐５４４、およびＲＣ‐５６０(GlaxoSmithKline)ならびにその全体が本明細書に組み込まれ開示される米国特許第０８／８５３，８２６号明細書および米国特許第０９／０７４，７２０号明細書に記載されたような他のアミノアルキルグルコサミド  ４−ホスフェート（ＡＧＰｓ）を含む。
【０１４２】
アジュバントの他の実施例は、限定されないが、ハンターズタイターマックス（Hunter's TiterMax）（登録商標）アジュバント(CytRx Corp., Norcross, Ga.)；ゲルブアジュバント（Gerbu adjuvants）(Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany)；ニトロセルロース(Nilsson and Larsson (1992) Res. Immunol. 143:553-557)；モンタミドアジュバントセピックＩＳＡシリーズ（Seppic ISA series of Montamide adjuvants）(例えば、ＩＳＡ‐５１、ＩＳＡ‐５７、ＩＳＡ‐７２０、ＩＳＡ‐１５１など；Seppic, Paris, France)のような鉱物油、非鉱物油、油中水型乳剤、または水中油型乳剤を含む製剤に基づくミョウバン（alum）(例えば、アルミニウム水酸化物（aluminum hydroxide）、アルミニウムリン酸塩（aluminum phosphate）乳濁液；およびＰＲＯＶ  ＡＸ（登録商標）(IDEC Pharmaceuticals)；ＯＭ‐１７４（脂質Ａに関連するグルコサミンニ糖類）；リーシュマニア属伸長因子（Leishmania elongation factor）；ＣＲＬ１００５のようなミセルを形作る非イオン化ブロック共重合体；およびシンテックスアジュバント製剤（Syntex Adjuvant Formulation）を含む。例えば、O'Haganら(2001) Biomol Eng. 18(3):69-85；および「Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols」D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Pressを参照のこと。
【０１４３】
その他の好ましいアジュバントは、以下の製剤のアジュバント分子を含む。
【０１４４】
HO(CH2CH2O)n-A-R、(Ｉ)
ここで、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０のアルキル基またはフェニルＣ１〜５０のアルキル基である。
【０１４５】
本発明の実施形態の１つは一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含む。ここで、ｎは１から５０の間であり、好ましくは４から２４であり、最も好ましくは９である；上記Ｒの構成要素は、Ｃ．ｓｕｂ．１−５０であり、好ましくはＣ．ｓｕｂ．４‐Ｃ．ｓｕｂ．２０アルキルおよび最も好ましくはＣ．ｓｕｂ．１２アルキルであり、かつＡは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％であり、好ましくは０．１〜１０％であり、最も好ましくは０．１〜１％の範囲である。好ましくは、ポリオキシエチレンエーテルは以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル（polyoxyethylene-9-steoryl ether）、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル（polyoxyethylene-8-steoryl ether）、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、メルクインデックスに記載されている（12.sup.th edition: entry 7717）。これらのアジュバント分子は、国際公開第９９／５２５４９号パンフレットに記載されている。
【０１４６】
上記一般式（Ｉ）によるポリオキシエチレンエーテルは、もし望むのであれば、他のアジュバントに結合されてもよい。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは上記したようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０１４７】
本明細書に開示されたＶＬＰワクチンと共に使用するための薬学的に許容可能な好ましい賦形剤の例は、水、リン酸緩衝液、および等浸透圧緩衝液を含む。
【０１４８】
本発明は、以下の限定されない参考文献により、さらに理解される。本明細書に記載したように、本発明は、天然に脂質ラフトと関連しない抗原に結合する脂質ラフト関連ポリペプチドの任意のものに組み込まれるキメラＶＬＰを含む。以下の例は、インフルエンザ抗原とキメラＶＬＰについての本発明の代表的な実施形態を記載する。
【実施例】
【０１４９】
〔実施例１−キメラインフルエンザＶＬＰの生成〕
上記ＭＬＶgagをコードする配列は、全モロニームリー白血病（Moloney murin leukemia）ウイルス両宿主性のプロウイルス配列を含むプラスミドｐＡＭＳ（ＡＴＣＣ）からＰＣＲにより得られた。上記gagをコードする配列は、ｐＦａｓｔＢａｃＩ（インビトロジェン）のポリヘドリンプロモーター後に挿入された。また、得られたプラスミドは、バキュロウイルスゲノムに組み込むためにＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞にトランスフォームされた。高分子量のＢａｃｍｉｄＤＮＡは、続いて、精製され、gagを発現する組み換えバキュロウイルスの創出のためにＳｆ９細胞にトランスフェクトされた。Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）において、それぞれ、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼをコードする２つの他の組み換えバキュロウイルスは、ウイルスＲＮＡに由来するＨＡおよびＮＡをコードする配列のＲＴ‐ＰＣＲクローニング後、同じように（similar fashion）形成された。最後に、全ての３つの産生物（ＨＡ−gag−ＮＡ）をコードしている単一のバキュロウイルスベクターは、各ｐＦａｓｔＢａｃＩプラスミドから個々のｐＦａｓｔＢａｃＩプラスミドに由来するＨＡ、gag、およびＮＡ発現ユニット（ポリへドリンプロモーターをコードする配列―ポリＡ部位）を単一のｐＦａｓｔＢａｃＩベクターに組み込むことで形成された。最初の分析について、gagまたはＨＡまたはgag‐ＨＡ‐ＮＡをコードする組み換えバキュロウイルスは、ＭＯＩ＞１で６ウェルプレートにおいてＳｆ９細胞に感染された。感染の３日後、培地上清は、夾雑物を取り除かれ、続いて、２０％スクロース勾配により１００，０００×ｇで沈殿された。沈殿は、gagおよびＨ１Ｎ１−特異的抗血清ウエスタンブロット分析により分析された（図１ＡおよびＢを参照のこと）。
【０１５０】
図１ＡおよびＢにおいて、それぞれ左側の３つのレーンは、gagまたはＨＡまたはコントロール（ＥＶ＝空ベクター）のそれぞれに感染したＳｆ９細胞の結果を示す。予期したように、gagのみを感染させたバキュロウイルスの結果は、ＶＬＰ出芽のために高分子量培地においてgag抗原に顕著な量をもたらす（図１Ａ、レーン「Gag」）。対照的に、ＨＡのみに感染したバキュロウイルスは、培地にＨＡをほとんど放出していない。しかし、ＨＡ−gag‐ＮＡのトリプルベクターによるＳｆ９細胞の感染は、gagの発現が細胞外のＨＡを引き付けられることを示す１００，０００×ｇ画分（レーン１−９、図１ＡおよびＢ）において出現するgagおよびＨＡの両者に顕著な量をもたらす。
【０１５１】
図２ＡおよびＢは、２０−６０％スクロースステップ勾配を用いて、ペレット状のＨＡ−gag‐ＮＡ  ＶＬＰを再遠心分離した後に、各勾配の画分をウエスタンブロットした結果を示す図である。gagおよびＨＡを誘導する同じ画分におけるgagおよびＨＡの両者のピークは、約１．１６ｇ／ｍｌの密度において共結合していることを表し、このことはgagとＨＡはＶＬＰ中に存在することを示す。
【０１５２】
〔実施例２−ＨＡに結合した炭疽菌ＰＡエピトープを含んでいるＨＡ-gag‐ＮＡ  ＶＬＰの産生、特徴付け、および免疫原性試験〕
実施例１に記載したように、Ａ／ＰＲ／８／３４の生産物ＭＬＶgag、およびＨＡ、およびＮＡを発現している個々のバキュロウイルスが作製された。加えて、全ての３つの生成物をコードしているトリプル発現組み換えバキュロウイルスもコンストラクトされ、感染した昆虫細胞由来の沈殿した培地上清のスクロース密度勾配遠心分離は、ＨＡで形成されたＶＬＰを誘導するウェスタンブロッティングにより検出されたため、gagおよびＨＡの同時結合を示す。トリプル発現ベクターにおけるコーディング配列の配置を、図３に示した。ＨＡ、gag、およびＮＡをコードしている要素は、頭−尾形態（head-to-tail fashion）において自身のプロモーター（Ｐｒ）およびポリアデニル化配列（ｐＡ）と共に並んでいる。単一のバキュロウイルスへの全てのコーディング配列の結合は、分離されたウイルスに共通感染する必要を回避し、３つの分離されたウイルスの感染の一貫的な多様性（consistent multiplicity）を達成することの困難さと関連する。
【０１５３】
実施例２における上記ＶＬＰワクチンは、ＨＡ遺伝子がＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの保護抗原（ＰＡ）によるＨＡ免疫原性の決定の大部分を入れ替えることにより修飾されたＨＡ遺伝子を除いて、同じように生成される。このことは、ＨＡ遺伝子（アミノ酸位置１８−３４３）のＨＡ１部位をコードしている配列（ＰＡのＣ末端断片の１４０アミノ酸）を入れ替えることにより達成される。上記ＰＡをコードしている配列は、ＨＡ１をコードしている配列（アミノ酸位置１８−３４３）（図４）の直接入れ替えとして、ＨＡシグナルペプチドをコードしている配列（アミノ酸位置１−１７）とＨＡ２をコードしている配列（アミノ酸位置３４４−５６５）の間のＨＡ遺伝子に挿入される。修飾されたＰＡ−ＨＡ遺伝子を含むトリプルバキュロウイルス発現ベクターは、ＭＬＶgagポリペプチド、ＮＡポリペプチド、および入れ替え要素を含む修飾されたＰＡ−ＨＡポリペプチドを発現する。培養中の感染したＳｆ９細胞に上記トリプル発現ベクターが使用された場合、炭疽菌ＰＡエピトープを含むＶＬＰが培地中に観察される。これは、修飾されたＰＡ−ＨＡポリペプチドが、脂質ラフトホーミング配列に残っており、脂質ラフトドメインから出芽している修飾されたＰＡ粒子に組み込まれるからである。この証拠は、（ＰＡ）ＨＡ−gag−ＮＡトリプル発現ベクターに感染した細胞由来の培地の回収、夾雑物の培地のクリーニング、および２０％以上のスクロース勾配において１００，０００×ｇで遠心分離によりキメラＶＬＰの回収により示される。ＶＬＰへのＰＡの組み込みの証拠は、ＰＡに特異的な抗体を用いるウエスタンブロットにより得られる。定義により、これらの条件下において２０％スクロース緩衝（sucrose cushion）による沈殿物は、天然には粒子であり、ＶＬＰ形成の証拠を提供する。
【０１５４】
（サイズ排除クロマトグラフィー）
ＶＬＰを精製したスクロース勾配は、セファロースＣＬ−４Ｂを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより実行される。また、画分はウエスタンブロットによりＭＬＶ  gagおよび炭疽菌ＰＡエピトープを観察される。ＶＬＰは、空隙容量で抽出され、ＭＬＶ  gag、ＮＡ、およびＰＡに修飾されたＨＡを含んでいる。
【０１５５】
（電子顕微鏡）
スクロース勾配に由来するＶＬＰ試料は、２％のグルタルアルデヒドで処理され、ＥＭグリッド上で吸収され、ナトリウムホスホタングステート（sodium phosphotungstate）でネガティブ染色され、電子顕微鏡で観察される。
【０１５６】
（免疫原性）
キメラＶＬＰ（炭疽菌ＰＡ修飾ＨＡ含有ＶＬＰ）の免疫原性は、参考文献（４４）に記載のように、メスＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、炭疽菌感染防御抗原（ＰＡ）構造に類似する鼻腔内キトサン／ＭＰＬ構造を用いて評価することができる。ＶＬＰは、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水に再懸濁して、２０〜６０％スクロース密度勾配（sucrose density gradient）にバンドした後、２０％スクロースクッションを介したＶＬＰ含有培養培地を、１００，０００×ｇで１時間、ペレット形成することによって精製することができる。ＶＬＰ含有画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウエスタンブロットによって同定して、保管することができる。ＶＬＰサンプルをＰＢＳ中において透析し、遠心マイクロ濃縮器（centrifuge microconcentrators）を用いて、または１００，０００×ｇで遠心分離することによって、濃縮させることができる。
【０１５７】
免疫処置のために、キトサン  ４０μｇ、ＶＬＰ  ２０μｇ（ｇａｇに基づく）およびＭＰＬ  ５μｇを含む液体構成物（１５μｌ）を、免疫処置一人分のための、２つの鼻孔用に分割することができる。０〜４週間の鼻腔内投与の前に、イソフルレンを用いて、動物を軽度に麻酔にかけることができる。また、ポジティブコントロールとしての腹腔内予防接種のために、ＶＬＰをＭＰＬまたはコレラ毒素と一緒にＰＢＳ中で製剤化することができる。全身ＩｇＧ反応を、ＰＡ特異的免疫反応のためのＥＬＩＳＡ法によって観察することができる。犠牲の時点において、ブロンコバスター洗浄（broncoaveolar lavage）サンプルもまた、ＰＡ特異的ＩｇＡ反応の決定のために収集することができる。
【０１５８】
実施例２および以下の他の実施例における典型的な免疫処置実験は、スチューデントの対立ｔ−検定（Student’s unpaired t-test）を用いて示されるように、統計的優位性に達する適切な可能性を提供し得る、１グループにつき最小限の８匹のマウスを使用することができる。免疫処置は、典型的に、各免疫処置の後１０〜１４日間行う血液サンプリングから４週間間隔をあけて、最初のおよび追加の免疫予防接種を伴うことができる。上述したように、ブロンコバスター洗浄サンプルは、ＩｇＡ決定のための犠牲動物から収集することができる。
【０１５９】
〔実施例３：機能強化ＶＬＰの生成および免疫原性試験〕
本実施例３は、ＮＡに取り付けられた炭疽菌ＰＡエピトープに対する適応免疫反応の長さを促進するために、ＴＬＲ５アゴニストフラジェリンを組み込むことによる、免疫原性および防御の向上のためのＶＬＰの機能強化を証明することができる。
【０１６０】
（フラジェリン組み込みによるアジュバント効果）
フラジェリンコード配列は、最近、Ｓ．ティピムリアム（S. typimurium）のゲノムＤＮＡからクローン化し、ｇａｇコード配列の３’末端に、ちょうど５’から終止コドンまで挿入した。フラジェリンコード配列はまた、A/PR/8/34 HAコード配列のＮ末端に、シグナルペプチドと成熟コード配列との間の境界に位置するＰｓｔＩ部位を利用して組み込むことも可能である。ＨＡにおけるこの部位の組み込みは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって示されるように、予想される分子量増加を伴う、キメラＨＡ分子の適切な発現を引き起こす。ＮＡポリペプチドは、そのＣ末端に融合された１４０アミノ酸炭疽菌Ｃ末端ＰＡドメインを有することができる。ＮＡのＣ末端は、Ｃ末端の伸長部分が分子の外側に露出することが予想されるように、分子包囲の外側において見られる。フラジェリン修飾ｇａｇおよびＨＡコード配列は、三種類のバキュロウイルスの組換え体（ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ（ＰＡ））の生成に用いることができる。フラジェリン修飾ｇａｇまたはフラジェリン修飾ＨＡを有するＶＬＰをコードするバキュロウイルス組換え体を生成し、基準ＶＬＰ欠失フラジェリン配列に対する免疫原性試験のための、ＶＬＰを生成するために用いることができる（全てのＶＬＰは、標的エピトープとしてＰＡ修飾ＮＡを含むことが可能であり、ｇａｇまたはＨＡに取り付けられたフラジェリン配列を含んでいても欠失していてもよい。実施例２において述べたように、全ての免疫処理実験は、最初のおよび追加の免疫予防接種を４週間間隔で採用することができる。免疫学的計測は、上述したように、全身ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡ反応の両方を試験する、ＥＬＩＳＡ分析を介して行うことができる。
【０１６１】
フラジェリン組み込みのためのＨＡおよびｇａｇ挿入部位は、ＶＬＰの外側および内側のそれぞれにあるので、異なる程度のアジュバント効果が観察され得る。ＨＡのＮ末端におけるフラジェリン挿入は、上皮粘膜の細胞におけるＴＬＲ５レセプターへのフラジェリンの接近を容易にするという結果をもたらし得る。一方、ｇａｇ部位における挿入は、異なる接近をもたらす。細胞に対するＶＬＰ結合、および正常なインフルエンザウイルス侵入経路を介した内在化は、細胞内におけるｇａｇ−フラジェリン生成の堆積という結果をもたらし得る。これは、ｇａｇ−フラジェリンのコンストラクトとＨＡ−フラジェリンのコンストラクトとの間の異なるＴＬＲ５−介在アジュバント効果の結果をもたらし得る。自身の粘膜上皮細胞への結合および侵入のためのＶＬＰの能力は、免疫原性において効果を有しているので、本発明者らは、ＴＰＣＫ−トリプシン処理を伴うおよび伴わない、フラジェリン修飾ＶＬＰおよび正常なＶＬＰにおけるＶＬＰ免疫原性実験を行い得る。トリプシン処理したＶＬＰのＨＡ開裂は、ＶＬＰ侵入の重要性を試験する免疫原性試験の開始前に、ウエスタンブロットによって確認することができる。さらに、細胞に融合および侵入するためのトリプシン処理したＶＬＰの能力を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）修飾ｇａｇ産物を含むＶＬＰを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける蛍光顕微鏡検査法によって試験することができる。この試験が、その出芽活性を破棄せずに、ＭＬＶ  ｇａｇがそのＣ末端においてＧＦＰにより修飾され得ることが、すでに示されている（６０）。
【０１６２】
フラジェリンの非ＴＬＲ５結合領域の多くを除去することによりｇａｇ出芽活性を最大化するための、フラジェリンコード配列のサブフラグメントの使用もまた試験することができる。フラジェリンモノマー内におけるＴＬＲ５認識部位の最近の解析は、この努力によって促進することができる（７３）。
【０１６３】
【表１】
2009544322.tif 000003
【０１６４】
〔実施例４：ｇａｇ−ＮＡ−（Ｎｏｒｗａｌｋ−Ｐ２）ＶＬＰの生成、特徴付け、および免疫原性試験〕
本実施例４におけるＶＬＰワクチンは、実施例３と同様のベクターにおいて生成することができる。ベクターは、ＭＬＶ  ｇａｇポリペプチドおよびＮＡポリペプチドのＣ末端に融合したノーウォーク（Norwalk）ウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１）のＰ２ドメインを有するＮＡポリペプチドを発現し得る。
【０１６５】
（初期分析）
本実施例において生成されたＶＬＰは、ノーウォークウイルスキャプシドタンパク質特異的抗体を用いたウエスタンブロットによって特徴付けることが可能である。ノーウォークキャプシドタンパク質のＰ２ドメインは、優勢抗体結合部位であるので、ノーウォークキャプシド特異的抗体は、Ｐ２−修飾ＮＡタンパク質を認識することが期待され得る。
【０１６６】
（サイズ排除クロマトグラフィー）
スクロース密度勾配で精製したＶＬＰは、セファロースＣＬ−４Ｂを用いたサイズ排除クロマトグラフィーの対象となり得、画分をウエスタンブロットすることによって、ＭＬＶ  ｇａｇおよびノーウォークＰ２ドメインを観察することができる。ＶＬＰは、空隙容量（void volume）において抽出され、ＭＬＶ  ｇａｇ、Ｐ２修飾ＮＡを含むことができる。
【０１６７】
（電子顕微鏡検査）
スクロース勾配からのＶＬＰサンプルを、２％  グルタルアルデヒドを用いて処理し、ＥＭグリッド（EM grids）上に吸収させ、タングストリン酸ナトリウムを用いてネガティブ染色し、電子顕微鏡検査によって試験した。
【０１６８】
（免疫原性）
ＶＬＰ免疫原性は、参考文献（４４）に記載のように、メスＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、炭疽菌感染防御抗原（ＰＡ）構造に類似する鼻腔内キトサン／ＭＰＬ構造を用いて評価することができる。ＶＬＰは、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中に再懸濁して、２０〜６０％スクロース密度勾配にバンドした後、２０％  スクロースクッションを介したＶＬＰ含有培養培地を、１００，０００×ｇで１時間、ペレット形成することによって精製することができる。ＶＬＰ含有分画を、ウエスタンブロット分析によって同定し、保管することができる。ＶＬＰサンプルをＰＢＳ中において透析し、遠心マイクロ濃縮器を用いて、または１００，０００×ｇで遠心分離して、濃縮することができる。
【０１６９】
免疫処理のために、キトサン  ４０μｇ、ＶＬＰ  ２０μｇ（ｇａｇに基づく）およびＭＰＬ  ５μｇを含む液体構成物（１５μｌ）を、免疫処置一人分のための、２つの鼻孔用に分割することができる。０〜４週間の鼻腔内投与の前に、イソフルレンを用いて、動物を軽度に麻酔にかけることができる。また、ポジティブコントロールとしての腹腔内予防接種のために、ＶＬＰをＭＰＬまたはコレラ毒素を有するＰＢＳ中に構築することができる。追加のポジティブコントロール動物は、ＥＬＩＳＡによって観察され得るノーウォーク  Ｐ２に特異的な全身ＩｇＧ反応を伴う筋肉内予防接種を受けることができる。ＥＬＩＳＡのための抗原の源は、バキュロウイルス生成ノーウォークＶＰ１キャプシドタンパク質であることができる。ＥＬＩＳＡによるノーウォークＰＡ特異的ＩｇＡ反応の測定のために、ブロンコバスター洗浄（broncoaveolar lavage）サンプルもまた、最終免疫処理後１０〜１４日間収集することができる。
【０１７０】
〔実施例５：機能強化ＶＬＰの生成および免疫原性試験〕
本実施例５は、適応免疫反応の長さを促進するために、ＴＬＲ５アゴニストフラジェリンを組み込むことによる、免疫原性および防御を向上させるためのＶＬＰの機能強化を証明することができる。
【０１７１】
（フラジェリン組み込みのためのアジュバントの効果）
フラジェリンコード配列は、最近、Ｓ．ティピムリアム（S. typimurium）のゲノムＤＮＡからクローン化し、ｇａｇコード配列の３’末端に、ちょうど５’から終止コドンまで挿入した。フラジェリンコード配列はまた、A/PR/8/34 HAコード配列のＮ末端に、シグナルペプチドと成熟コード配列との間の境界に位置するＰｓｔＩ部位を利用して組み込むことも可能である。ＨＡにおけるこの部位の組み込みは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって示されるように、予想される分子量増加を伴う、キメラＨＡ分子の適切な発現を引き起こす。ＮＡポリペプチドは、そのＣ末端に融合されたノーウォークウイルス（アミノ酸２７９〜４０５）のＰ２ドメインを有することができる。フラジェリン修飾ｇａｇおよびＨＡコード配列は、実施例５に示すように、三種類のバキュロウイルスの組換え体（ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ（Ｐ２））を生成するために用いることができる。ＶＬＰをコードし、フラジェリン修飾ｇａｇまたはフラジェリン修飾ＨＡを有する組換えバキュロウイルスを生成し、基準ＶＬＰ欠失フラジェリン配列に対する免疫原性試験のためのＶＬＰを生成するために用いることができる（全てのＶＬＰは、標的エピトープとしてノーウォーク  Ｐ２修飾ＮＡを含むことが可能であり、ｇａｇまたはＨＡに取り付けられたフラジェリン配列を含んでいても欠失していてもよい。上述した実施例で述べたように、全ての免疫処理実験は、最初のおよび追加の免疫予防接種を４週間間隔で採用することができる。免疫学的計測は、上述したように、全身ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡ反応の両方で試験する、ＥＬＩＳＡ分析を介して行うことができる。
【０１７２】
フラジェリン組み込みのためのＨＡおよびｇａｇ挿入部位は、ＶＬＰの外側および内側のそれぞれにあるので、異なる程度のアジュバント効果が観察され得る。ＨＡのＮ末端におけるフラジェリン挿入は、上皮粘膜の細胞におけるＴＬＲ５レセプターへのフラジェリンの接近を容易にするという結果をもたらし得る。一方、ｇａｇ部位における挿入は、異なる接近をもたらし得る。細胞に対するＶＬＰ結合および正常なインフルエンザウイルス侵入経路を介した内在化は、細胞内におけるｇａｇ−フラジェリン生成の堆積という結果をもたらし得る。これは、ｇａｇ−フラジェリン構築物とＨＡ−フラジェリン構築物との間の異なるＴＬＲ５−介在アジュバント効果の結果をもたらし得る。自身の粘膜上皮細胞への結合および侵入のためのＶＬＰの能力は、免疫原性において効果を有しているので、本発明者らは、ＴＰＣＫ−トリプシン処理を伴うおよび伴わない、フラジェリン修飾ＶＬＰおよび正常なＶＬＰにおけるＶＬＰ免疫原性実験を行い得る。トリプシン処理したＶＬＰのＨＡ開裂は、ＶＬＰ侵入の重要性を試験する免疫原性試験の開始前に、ウエスタンブロットによって確認することができる。さらに、細胞に融合および侵入するためのトリプシン処理したＶＬＰの能力を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）修飾ｇａｇ産物を含むＶＬＰを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける蛍光顕微鏡検査法によって試験することができる。この試験がその出芽活性を破棄せずに、ＭＬＶ  ｇａｇがそのＣ末端においてＧＦＰにより修飾され得ることはすでに示されている（６０）。
【０１７３】
フラジェリンの非ＴＬＲ５結合領域の多くを除去することによりｇａｇ出芽活性を最大化するための、フラジェリンコード配列のサブフラグメントの使用もまた試験することができる。フラジェリンモノマー内におけるＴＬＲ５認識部位の最近の解析は、この努力によって促進することができる（７３）。
【０１７４】
【表２】
2009544322.tif 000004
【０１７５】
〔実施例６：ＲＳＶ−Ｆ−ｇａｇ  ＶＬＰの生成、特徴付けおよび免疫原性試験〕
本実施例における呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のためのＶＬＰワクチンは、インフルエンザＨＡおよびＮＡの脂質ラフト標的特性と同様である、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質の脂質ラフト標的特性を利用することができる。これらの特性のお陰で、ＲＳＶ  Ｆタンパク質自身がポリペプチドに関連する脂質ラフトであり、それゆえに、キメラタンパク質の形成を必要とせずに、インフルエンザＨＡおよびＮＡと酷似のｇａｇベースのＶＬＰに直接組み込むことができる。
【０１７６】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、最後まで、以下に示す５’プライマーおよび３’プライマーを用いて、標準ＲＴ−ＰＣＲクローン技術によってクローン化することができる（プライマー中に下線を付した配列は、ＲＳＶ  Ｆ  ５’末端および３’末端コード配列のホモログであり、残りの配列は、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター中にクローニングするのに便利な制限酵素認識部位を含む）。
【０１７７】
(SEQ ID NO:6)
5’プライマー: ATATAGGCGCGCCACCATGGAGTTGCTAATCCTCAAAGC
(SEQ ID NO:7)
3’プライマー: ATATAGCGGCCGCTTAGTTACTAAATGCAATATTATTTATACCACTCAG
【０１７８】
上述したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによるＲＳＶ  Ｆ遺伝子の生成によって、ｐＦＢ−Ｆと称するベクターとなるｐＦａｓｔＢａｃ１に挿入するための結合性のある端部を生成するために、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩのいずれかの端部において切断され得るフラグメントを得ることができる。ｐＦＢ−Ｆベクターの完成において、このベクターは、ｐＦＢ−ｇａｇからのＳｎａＢＩ−ＨｐａＩフラグメントの挿入のために、ＨｐａＩにおいて切断されることができる。これにより。ＭＬＶ−ｇａｇおよびＲＳＶ−Ｆの両方をコードする二種類のバキュロウイルスを発現するベクターを得ることができる。このプラスミドのＦおよびＧａｇ発現領域の主要な特徴の配置図を、図５に示す。
【０１７９】
ダブル発現（Ｆ−Ｇａｇ）ベクターを、培地中においてＳｆ９細胞の感染のために用いた場合、Ｆ遺伝子産物は、脂質ラフトホーミング配列（lipid raft homing sequence）を保持することが可能であり、脂質ラフトドメインから出芽した分子に組み込むことが可能であるので、ＲＳＶ  Ｆ産物を含むＶＬＰを、培養培地中において観察することができる。Ｆ−Ｇａｇダブル発現ベクターに感染した細胞からの培養培地を収穫し、培地の残骸を取り除き、２０％  スクロースクッション上において１００，０００×ｇで遠心分離して収集することによって、この証拠を示すことができる。ＦのＶＬＰへの組み込みの証拠は、特異的抗体を用いてウエスタンブロット解析によって得ることができる。当然、これらの条件下での２０％  スクロースクッションを介して堆積する材料は、本質的に粒子状物質であり、ＶＬＰ構成物の証拠を提供する。
【０１８０】
同様のアプローチを、ＲＳＶ  Ｇ  糖タンパク質のような、追加のＲＳＶ抗原を組み込むために用いることができる。
【０１８１】
（免疫原性）
ヒトＲＳＶストックＡ２のような、アレルギーの誘発に適切なＲＳＶを用いること以外は、他のＶＬＰの免疫原性を測定するために前述の実施例において用いた技術によって、ＲＳＶ  ＶＬＰの免疫原性を測定することができる。
【０１８２】
〔追加の参考文献〕
以下の参考文献は、それらが教示する全てのものに関して、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
１．Katz, J. M., W. Lim, C. B. Bridges, T. Rowe, J. Hu-Primmer, X. Lu, R. A. Abernathy, M. Clarke, L. Conn, H. Kwong, M. Lee, G. Au, Y. Y. Ho, K. H. Mak, N. J. Cox, and K. Fukuda. 1999. Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts. J Infect Dis 180:1763.
２．Peiris, J. S., W. C. Yu, C. W. Leung, C. Y. Cheung, W. F. Ng, J. M. Nicholls, T. K. Ng, K. H. Chan, S. T. Lai, W. L. Lim, K. Y. Yuen, and Y. Guan. 2004. Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease. Lancet 363:617.
３．Horimoto, T., N. Fukuda, K. Iwatsuki-Horimoto, Y. Guan, W. Lim, M. Peiris, S. Sugii, T. Odagiri, M. Tashiro, and Y. Kawaoka. 2004. Antigenic differences between H5N1 human influenza viruses isolated in 1997 and 2003. J Vet Med Sci 66:303.
４．Tran, T. H., T. L. Nguyen, T. D. Nguyen, T. S. Luong, P. M. Pham, V. C. Nguyen, T. S. Pham, C. D. Vo, T. Q. Le, T. T. Ngo, B. K. Dao, P. P. Le, T. T. Nguyen, T. L. Hoang, V. T. Cao, T. G. Le, D. T. Nguyen, H. N. Le, K. T. Nguyen, H. S. Le, V. T. Le, D. Christiane, T. T. Tran, J. Menno de, C. Schultsz, P. Cheng, W. Lim, P. Horby, and J. Farrar. 2004. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam. N Engl J Med 350:1179.
５．Li, K. S., Y. Guan, J. Wang, G. J. Smith, K. M. Xu, L. Duan, A. P. Rahardjo, P. Puthavathana, C. Buranathai, T. D. Nguyen, A. T. Estoepangestie, A. Chaisingh, P. Auewarakul, H. T. Long, N. T. Hanh, R. J. Webby, L. L. Poon, H. Chen, K. F. Shortridge, K. Y. Yuen, R. G. Webster, and J. S. Peiris. 2004. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature 430:209.
６．Lipatov, A. S., E. A. Govorkova, R. J. Webby, H. Ozaki, M. Peiris, Y. Guan, L. Poon, and R. G. Webster. 2004. Influenza: emergence and control. J Virol 78:8951.
７．Lipatov, A. S., R. J. Webby, E. A. Govorkova, S. Krauss, and R. G. Webster. 2005. Efficacy of H5 influenza vaccines produced by reverse genetics in a lethal mouse model. J Infect Dis 191:1216.
８．Stephenson, I., K. G. Nicholson, J. M. Wood, M. C. Zambon, and J. M. Katz. 2004. Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic. Lancet Infect Dis 4:499.
９．Liu, M., J. M. Wood, T. Ellis, S. Krauss, P. Seiler, C. Johnson, E. Hoffmann, J. Humberd, D. Hulse, Y. Zhang, R. G. Webster, and D. R. Perez. 2003. Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics. Virology 314:580.
１０．Subbarao, K., H. Chen, D. Swayne, L. Mingay, E. Fodor, G. Brownlee, X. Xu, X. Lu, J. Katz, N. Cox, and Y. Matsuoka. 2003. Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics. Virology 305:192.
１１．Webby, R. J., D. R. Perez, J. S. Coleman, Y. Guan, J. H. Knight, E. A. Govorkova, L. R. McClain-Moss, J. S. Peiris, J. E. Rehg, E. I. Tuomanen, and R. G. Webster. 2004. Responsiveness to a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines. Lancet 363:1099.
１２．Treanor, J. J., B. E. Wilkinson, F. Masseoud, J. Hu-Primmer, R. Battaglia, D. O'Brien, M. Wolff, G. Rabinovich, W. Blackwelder, and J. M. Katz. 2001. Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans. Vaccine 19:1732.
１３．Stephenson, I., R. Bugarini, K. G. Nicholson, A. Podda, J. M. Wood, M. C. Zambon, and J. M. Katz. 2005. Cross-reactivity to highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses after vaccination with nonadjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a potential priming strategy. J Infect Dis 191:1210.
１４．Nicholson, K. G., A. E. Colegate, A. Podda, I. Stephenson, J. Wood, E. Ypma, and M. C. Zambon. 2001. Safety and antigenicity of non-adjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomised trial of two potential vaccines against H5N1 influenza. Lancet 357:1937.
１５．Subbarao, K., B. R. Murphy, and A. S. Fauci. 2006. Development of effective vaccines against pandemic influenza. Immunity 24:5.
１６．Kuper, C. F., P. J. Koornstra, D. M. Hameleers, J. Biewenga, B. J. Spit, A. M. Duijvestijn, P. J. van Breda Vriesman, and T. Sminia. 1992. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol Today 13:219.
１７．Liang, B., L. Hyland, and S. Hou. 2001. Nasal-associated lymphoid tissue is a site of long-term virus-specific antibody production following respiratory virus infection of mice. J Virol 75:5416.
１８．Zuercher, A. W., S. E. Coffin, M. C. Thurnheer, P. Fundova, and J. J. Cebra. 2002. Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses. J Immunol 168:1796.
１９．Brandtzaeg, P. 1989. Overview of the mucosal immune system. Curr Top Microbiol Immunol 146:13.
２０．Takada, A., S. Matsushita, A. Ninomiya, Y. Kawaoka, and H. Kida. 2003. Intranasal immunization with formalin-inactivated virus vaccine induces a broad spectrum of heterosubtypic immunity against influenza A virus infection in mice. Vaccine 21:3212.
２１．Tamura, S. I., H. Asanuma, Y. Ito, Y. Hirabayashi, Y. Suzuki, T. Nagamine, C. Aizawa, T. Kurata, and A. Oya. 1992. Superior cross-protective effect of nasal vaccination to subcutaneous inoculation with influenza hemagglutinin vaccine. Eur J Immunol 22:477.
２２．Tumpey, T. M., M. Renshaw, J. D. Clements, and J. M. Katz. 2001. Mucosal delivery of inactivated influenza vaccine induces B-cell-dependent heterosubtypic cross-protection against lethal influenza A H5N1 virus infection. J Virol 75:5141.
２３．Kang, S. M., L. Guo, Q. Yao, I. Skountzou, and R. W. Compans. 2004. Intranasal immunization with inactivated influenza virus enhances immune responses to coadministered simian-human immunodeficiency virus-like particle antigens. J Virol 78:9624.
２４．Guo, L., X. Lu, S. M. Kang, C. Chen, R. W. Compans, and Q. Yao. 2003. Enhancement of mucosal immune responses by chimeric influenza HA/SHIV virus-like particles. Virology 313:502.
２５．Yao, Q., R. Zhang, L. Guo, M. Li, and C. Chen. 2004. Th cell-independent immune responses to chimeric hemagglutinin/simian human immunodeficiency virus-like particles vaccine. J Immunol 173:1951.
２６．Latham, T., and J. M. Galarza. 2001. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. J Virol 75:6154.
２７．Galarza, J. M., T. Latham, and A. Cupo. 2005. Virus-like particle vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge. Viral Immunol 18:365.
２８．Fromantin, C., B. Jamot, J. Cohen, L. Piroth, P. Pothier, and E. Kohli. 2001. Rotavirus 2/6 virus-like particles administered intranasally in mice, with or without the mucosal adjuvants cholera toxin and Escherichia coli heat-labile toxin, induce a Th1/Th2-like immune response. J Virol 75:11010.
２９．Harrington, P. R., B. Yount, R. E. Johnston, N. Davis, C. Moe, and R. S. Baric. 2002. Systemic, mucosal, and heterotypic immune induction in mice inoculated with Venezuelan equine encephalitis replicons expressing Norwalk virus-like particles. J Virol 76:730.
３０．Shi, W., J. Liu, Y. Huang, and L. Qiao. 2001. Papillomavirus pseudovirus: a novel vaccine to induce mucosal and systemic cytotoxic T-lymphocyte responses. J Virol 75:10139.
３１．Han, M. G., S. Cheetham, M. Azevedo, C. Thomas, and L. J. Saif. 2006. Immune responses to bovine norovirus-like particles with various adjuvants and analysis of protection in gnotobiotic calves. Vaccine 24:317.
３２．Illum, L. 1998. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharm Res 15:1326.
３３．Illum, L., I. Jabbal-Gill, M. Hinchcliffe, A. N. Fisher, and S. S. Davis. 2001. Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines. Adv Drug Deliv Rev 51:81.
３４．Soane, R. J., M. Hinchcliffe, S. S. Davis, and L. Illum. 2001. Clearance characteristics of chitosan based formulations in the sheep nasal cavity. Int J Pharm 217:183.
３５．Baudner, B. C., M. M. Giuliani, J. C. Verhoef, R. Rappuoli, H. E. Junginger, and G. D. Giudice. 2003. The concomitant use of the LTK63 mucosal adjuvant and of chitosan-based delivery system enhances the immunogenicity and efficacy of intranasally administered vaccines. Vaccine 21:3837.
３６．Fujihashi, K., T. Koga, F. W. van Ginkel, Y. Hagiwara, and J. R. McGhee. 2002. A dilemma for mucosal vaccination: efficacy versus toxicity using enterotoxin-based adjuvants. Vaccine 20:2431.
３７．Mutsch, M., W. Zhou, P. Rhodes, M. Bopp, R. T. Chen, T. Linder, C. Spyr, and R. Steffen. 2004. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med 350:896.
３８．Baldridge, J. R., Y. Yorgensen, J. R. Ward, and J. T. Ulrich. 2000. Monophosphoryl lipid A enhances mucosal and systemic immunity to vaccine antigens following intranasal administration. Vaccine 18:2416.
３９．Baldrick, P., D. Richardson, G. Elliott, and A. W. Wheeler. 2002. Safety evaluation of monophosphoryl lipid A (MPL): an immunostimulatory adjuvant. Regul Toxicol Pharmacol 35:398.
４０．Baldridge, J. R., P. McGowan, J. T. Evans, C. Cluff, S. Mossman, D. Johnson, and D. Persing. 2004. Taking a Toll on human disease: Toll-like receptor 4 agonists as vaccine adjuvants and monotherapeutic agents. Expert Opin Biol Ther 4:1129.
４１．Baldridge, J. GlaxoSmithKline, Personal Communication.
４２．Huang, J., R. J. Garmise, T. M. Crowder, K. Mar, C. R. Hwang, A. J. Hickey, J. A. Mikszta, and V. J. Sullivan. 2004. A novel dry powder influenza vaccine and intranasal delivery technology: induction of systemic and mucosal immune responses in rats. Vaccine 23:794.
４３．Mills, K. H., C. Cosgrove, E. A. McNeela, A. Sexton, R. Giemza, I. Jabbal-Gill, A. Church, W. Lin, L. Illum, A. Podda, R. Rappuoli, M. Pizza, G. E. Griffin, and D. J. Lewis. 2003. Protective levels of diphtheria-neutralizing antibody induced in healthy volunteers by unilateral priming-boosting intranasal immunization associated with restricted ipsilateral mucosal secretory immunoglobulin a. Infect Immun 71:726.
４４．Wimer-Mackin, S., M. Hinchcliffe, C. R. Petrie, S. J. Warwood, W. T. Tino, M. S. Williams, J. P. Stenz, A. Cheff, and C. Richardson. 2006. An intranasal vaccine targeting both the Bacillus anthracis toxin and bacterium provides protection against aerosol spore challenge in rabbits. Vaccine in press.
４５．Noad, R., and P. Roy. 2003. Virus-like particles as immunogens. Trends Microbiol 11:438.
４６．Yao, Q., V. Vuong, M. Li, and R. W. Compans. 2002. Intranasal immunization with SIV virus-like particles (VLPs) elicits systemic and mucosal immunity. Vaccine 20:2537.
４７．Pushko, P., T. M. Tumpey, F. Bu, J. Knell, R. Robinson, and G. Smith. 2005. Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice. Vaccine 23:5751.
４８．Baumert, T. F., S. Ito, D. T. Wong, and T. J. Liang. 1998. Hepatitis C virus structural proteins assemble into viruslike particles in insect cells. J Virol 72:3827.
４９．Yao, Q., Z. Bu, A. Vzorov, C. Yang, and R. W. Compans. 2003. Virus-like particle and DNA-based candidate AIDS vaccines. Vaccine 21:638.
５０．Tacket, C. O., M. B. Sztein, G. A. Losonsky, S. S. Wasserman, and M. K. Estes. 2003. Humoral, mucosal, and cellular immune responses to oral Norwalk virus-like particles in volunteers. Clin Immunol 108:241.
５１．Gomez-Puertas, P., C. Albo, E. Perez-Pastrana, A. Vivo, and A. Portela. 2000. Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding. J Virol 74:11538.
５２．Gheysen, D., E. Jacobs, F. de Foresta, C. Thiriart, M. Francotte, D. Thines, and M. De Wilde. 1989. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell 59:103.
５３．Johnson, M. C., H. M. Scobie, and V. M. Vogt. 2001. PR domain of rous sarcoma virus Gag causes an assembly/budding defect in insect cells. J Virol 75:4407.
５４．Kakker, N. K., M. V. Mikhailov, M. V. Nermut, A. Burny, and P. Roy. 1999. Bovine leukemia virus Gag particle assembly in insect cells: formation of chimeric particles by domain-switched leukemia/lentivirus Gag polyprotein. Virology 265:308.
５５．Luo, L., Y. Li, and C. Y. Kang. 1990. Expression of gag precursor protein and secretion of virus-like gag particles of HIV-2 from recombinant baculovirus-infected insect cells. Virology 179:874.
５６．Morikawa, S., T. F. Booth, and D. H. Bishop. 1991. Analyses of the requirements for the synthesis of virus-like particles by feline immunodeficiency virus gag using baculovirus vectors. Virology 183:288.
５７．Takahashi, R. H., K. Nagashima, T. Kurata, and H. Takahashi. 1999. Analysis of human lymphotropic T-cell virus type II-like particle production by recombinant baculovirus-infected insect cells. Virology 256:371.
５８．Yamshchikov, G. V., G. D. Ritter, M. Vey, and R. W. Compans. 1995. Assembly of SIV virus-like particles containing envelope proteins using a baculovirus expression system. Virology 214:50.
５９．Weldon, R. A., Jr., C. R. Erdie, M. G. Oliver, and J. W. Wills. 1990. Incorporation of chimeric gag protein into retroviral particles. J Virol 64:4169.
６０．Andrawiss, M., Y. Takeuchi, L. Hewlett, and M. Collins. 2003. Murine leukemia virus particle assembly quantitated by fluorescence microscopy: role of Gag-Gag interactions and membrane association. J Virol 77:11651.
６１．Leser, G. P., and R. A. Lamb. 2005. Influenza virus assembly and budding in raft-derived microdomains: a quantitative analysis of the surface distribution of HA, NA and M2 proteins. Virology 342:215.
６２．Takeda, M., G. P. Leser, C. J. Russell, and R. A. Lamb. 2003. Influenza virus hemagglutinin concentrates in lipid raft microdomains for efficient viral fusion. Proc Natl Acad Sci U S A 100:14610.
６３．Campbell, S. M., S. M. Crowe, and J. Mak. 2001. Lipid rafts and HIV-1: from viral entry to assembly of progeny virions. J Clin Virol 22:217.
６４．Sandrin, V., and F. L. Cosset. 2006. Intracellular versus cell surface assembly of retroviral pseudotypes is determined by the cellular localization of the viral glycoprotein, its capacity to interact with Gag, and the expression of the Nef protein. J Biol Chem 281:528.
６５．Salazar-Gonzalez, R. M., and S. J. McSorley. 2005. Salmonella flagellin, a microbial target of the innate and adaptive immune system. Immunol Lett 101:117.
６６．Cuadros, C., F. J. Lopez-Hernandez, A. L. Dominguez, M. McClelland, and J. Lustgarten. 2004. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infect Immun 72:2810.
６７．Didierlaurent, A., I. Ferrero, L. A. Otten, B. Dubois, M. Reinhardt, H. Carlsen, R. Blomhoff, S. Akira, J. P. Kraehenbuhl, and J. C. Sirard. 2004. Flagellin promotes myeloid differentiation factor 88-dependent development of Th2-type response. J Immunol 172:6922.
６８．Tsujimoto, H., T. Uchida, P. A. Efron, P. O. Scumpia, A. Verma, T. Matsumoto, S. K. Tschoeke, R. F. Ungaro, S. Ono, S. Seki, M. J. Clare-Salzler, H. V. Baker, H. Mochizuki, R. Ramphal, and L. L. Moldawer. 2005. Flagellin enhances NK cell proliferation and activation directly and through dendritic cell-NK cell interactions. J Leukoc Biol 78:888.
６９．Hayashi, F., T. K. Means, and A. D. Luster. 2003. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function. Blood 102:2660.
７０．Hayashi, F., K. D. Smith, A. Ozinsky, T. R. Hawn, E. C. Yi, D. R. Goodlett, J. K. Eng, S. Akira, D. M. Underhill, and A. Aderem. 2001. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 410:1099.
７１．Gewirtz, A. T., P. O. Simon, Jr., C. K. Schmitt, L. J. Taylor, C. H. Hagedorn, A. D. O'Brien, A. S. Neish, and J. L. Madara. 2001. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J Clin Invest 107:99.
７２．Means, T. K., F. Hayashi, K. D. Smith, A. Aderem, and A. D. Luster. 2003. The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J Immunol 170:5165.
７３．Smith, K. D., E. Andersen-Nissen, F. Hayashi, K. Strobe, M. A. Bergman, S. L. Barrett, B. T. Cookson, and A. Aderem. 2003. Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility. Nat Immunol 4:1247.
７４．Honko, A. N., N. Sriranganathan, C. J. Lees, and S. B. Mizel. 2006. Flagellin is an effective adjuvant for immunization against lethal respiratory challenge with Yersinia pestis. Infect Immun 74:1113.
７５．Jeon, S. H., T. Ben-Yedidia, and R. Arnon. 2002. Intranasal immunization with synthetic recombinant vaccine containing multiple epitopes of influenza virus. Vaccine 20:2772.
７６．Levi, R., and R. Arnon. 1996. Synthetic recombinant influenza vaccine induces efficient long-term immunity and cross-strain protection. Vaccine 14:85.
７７．Lee, S. E., S. Y. Kim, B. C. Jeong, Y. R. Kim, S. J. Bae, O. S. Ahn, J. J. Lee, H. C. Song, J. M. Kim, H. E. Choy, S. S. Chung, M. N. Kweon, and J. H. Rhee. 2006. A bacterial flagellin, Vibrio vulnificus FlaB, has a strong mucosal adjuvant activity to induce protective immunity. Infect Immun 74:694.
７８．Applequist, S. E., E. Rollman, M. D. Wareing, M. Liden, B. Rozell, J. Hinkula, and H. G. Ljunggren. 2005. Activation of innate immunity, inflammation, and potentiation of DNA vaccination through mammalian expression of the TLR5 agonist flagellin. J Immunol 175:3882.
７９．Ramos, H. C., M. Rumbo, and J. C. Sirard. 2004. Bacterial flagellins: mediators of pathogenicity and host immune responses in mucosa. Trends Microbiol 12:509.
８０．Holsinger, L. J., and R. A. Lamb. 1991. Influenza virus M2 integral membrane protein is a homotetramer stabilized by formation of disulfide bonds. Virology 183:32.
８１．Lamb, R. A., S. L. Zebedee, and C. D. Richardson. 1985. Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface. Cell 40:627.
８２．Holsinger, L. J., D. Nichani, L. H. Pinto, and R. A. Lamb. 1994. Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-function analysis. J Virol 68:1551.
８３．Takeda, M., A. Pekosz, K. Shuck, L. H. Pinto, and R. A. Lamb. 2002. Influenza a virus M2 ion channel activity is essential for efficient replication in tissue culture. J Virol 76:1391.
８４．Frace, A. M., A. I. Klimov, T. Rowe, R. A. Black, and J. M. Katz. 1999. Modified M2 proteins produce heterotypic immunity against influenza A virus. Vaccine 17:2237.
８５．Neirynck, S., T. Deroo, X. Saelens, P. Vanlandschoot, W. M. Jou, and W. Fiers. 1999. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat Med 5:1157.
８６．Slepushkin, V. A., J. M. Katz, R. A. Black, W. C. Gamble, P. A. Rota, and N. J. Cox. 1995. Protection of mice against influenza A virus challenge by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein. Vaccine 13:1399.
８７．Treanor, J. J., E. L. Tierney, S. L. Zebedee, R. A. Lamb, and B. R. Murphy. 1990. Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice. J Virol 64:1375.
８８．De Filette, M., W. Min Jou, A. Birkett, K. Lyons, B. Schultz, A. Tonkyro, S. Resch, and W. Fiers. 2005. Universal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs. Virology 337:149.
８９．De Filette, M., A. Ramne, A. Birkett, N. Lycke, B. Lowenadler, W. Min Jou, X. Saelens, and W. Fiers. 2006. The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection. Vaccine 24:544.
９０．Fiers, W., M. De Filette, A. Birkett, S. Neirynck, and W. Min Jou. 2004. A "universal" human influenza A vaccine. Virus Res 103:173.
９１．Liu, W., Z. Peng, Z. Liu, Y. Lu, J. Ding, and Y. H. Chen. 2004. High epitope density in a single recombinant protein molecule of the extracellular domain of influenza A virus M2 protein significantly enhances protective immunity. Vaccine 23:366.
９２．Fan, J., X. Liang, M. S. Horton, H. C. Perry, M. P. Citron, G. J. Heidecker, T. M. Fu, J. Joyce, C. T. Przysiecki, P. M. Keller, V. M. Garsky, R. Ionescu, Y. Rippeon, L. Shi, M. A. Chastain, J. H. Condra, M. E. Davies, J. Liao, E. A. Emini, and J. W. Shiver. 2004. Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys. Vaccine 22:2993.
９３．Ionescu, R. M., C. T. Przysiecki, X. Liang, V. M. Garsky, J. Fan, B. Wang, R. Troutman, Y. Rippeon, E. Flanagan, J. Shiver, and L. Shi. 2006. Pharmaceutical and immunological evaluation of human papillomavirus viruslike particle as an antigen carrier. J Pharm Sci 95:70.
９４．Hatziioannou, T., E. Delahaye, F. Martin, S. J. Russell, and F. L. Cosset. 1999. Retroviral display of functional binding domains fused to the amino terminus of influenza hemagglutinin. Hum Gene Ther 10:1533.
９５．Li, Z. N., S. N. Mueller, L. Ye, Z. Bu, C. Yang, R. Ahmed, and D. A. Steinhauer. 2005. Chimeric influenza virus hemagglutinin proteins containing large domains of the Bacillus anthracis protective antigen: protein characterization, incorporation into infectious influenza viruses, and antigenicity. J Virol 79:10003.
９６．Haynes, J. R., S. X. Cao, B. Rovinski, C. Sia, O. James, G. A. Dekaban, and M. H. Klein. 1991. Production of immunogenic HIV-1 viruslike particles in stably engineered monkey cell lines. AIDS Res Hum Retroviruses 7:17.
９７．Rovinski, B., J. R. Haynes, S. X. Cao, O. James, C. Sia, S. Zolla-Pazner, T. J. Matthews, and M. H. Klein. 1992. Expression and characterization of genetically engineered human immunodeficiency virus-like particles containing modified envelope glycoproteins: implications for development of a cross-protective AIDS vaccine. J Virol 66:4003.
９８．Fynan, E. F., R. G. Webster, D. H. Fuller, J. R. Haynes, J. C. Santoro, and H. L. Robinson. 1995. DNA vaccines: a novel approach to immunization. Int J Immunopharmacol 17:79.
９９．Fynan, E. F., R. G. Webster, D. H. Fuller, J. R. Haynes, J. C. Santoro, and H. L. Robinson. 1993. DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. Proc Natl Acad Sci U S A 90:11478.
１００．Kodihalli, S., J. R. Haynes, H. L. Robinson, and R. G. Webster. 1997. Cross-protection among lethal H5N2 influenza viruses induced by DNA vaccine to the hemagglutinin. J Virol 71:3391.
１０１．Robinson, H. L., S. Lu, D. M. Feltquate, C. T. Torres, J. Richmond, C. M. Boyle, M. J. Morin, J. C. Santoro, R. G. Webster, D. Montefiori, Y. Yasutomi, N. L. Letvin, K. Manson, M. Wyand, and J. R. Haynes. 1996. DNA vaccines. AIDS Res Hum Retroviruses 12:455.
１０２．Drape, R. J., M. D. Macklin, L. J. Barr, S. Jones, J. R. Haynes, and H. J. Dean. 2006. Epidermal DNA vaccine for influenza is immunogenic in humans. Vaccine in press.
１０３．Kretzchmar, E., R. Geyer, and H. D. Klenk. 1994. Baculovirus infection does not alter N-glycosylation in Spodoptera frugiperda cells. Biol Chem Hoppe Seyler 375:23.
１０４．Lu, D., and A. J. Hickey. 2005. Liposomal dry powders as aerosols for pulmonary delivery of proteins. AAPS PharmSciTech 6:E641.
１０５．Cowdery, S., M. Frey, S. Orlowski, and A. Gray. 1976. Stability characteristics of freeze-dried human live virus vaccines. Dev Biol Stand 36:297.
１０６．Peetermans, J., G. Colinet, A. Bouillet, E. D'Hondt, and J. Stephenne. 1976. Stability of live, freeze-dried virus vaccines. Dev Biol Stand 36:291.
１０７．Yannarell, D. A., K. M. Goldberg, and R. N. Hjorth. 2002. Stabilizing cold-adapted influenza virus vaccine under various storage conditions. J Virol Methods 102:15.
１０８．Sampson, H. A., J. Bernhisel-Broadbent, E. Yang, and S. M. Scanlon. 1991. Safety of casein hydrolysate formula in children with cow milk allergy. J Pediatr 118:520.
１０９．Gambaryan A, A. Tuzikov, G. Pazynina, N. Bovin, A. Balish, and A. Klimov. 2005. Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology (electronic publication ahead of print version).
１１０．Suzuki, Y, 2005. Sialobiology of Influenza: Molecular Mechanism of Host Range Variation of Influenza Viruses. Biological and Pharmaceutical Bulletin 28:399-408.
【０１８４】
〔政府の支援〕
本発明は、米国政府の支援によって、米国陸軍医療研究および材料部隊（U.S. Army Medical Research and Material Command）からの助成金番号W81XWH-05-C-0135および助成金番号W81XWH-05-C-0150のもとでなされた。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【図１】
2009544322.tif 000005
【図２】
2009544322.tif 000006
【図３】
2009544322.tif 000007
【図４】
2009544322.tif 000008
【図５】
2009544322.tif 000009
【配列表】
2009544322000001.app
【国際調査報告】
2009544322.tif 000010