(57)【要約】【課題】リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを提供する。【解決手段】本発明に係る、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの前記各ＲＮＡ分子は、（ａ）（ｉ）実質的にランダム配列であるか、或いは（ｉｉ）実質的にランダム配列の第１のサブ領域と前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とから成るかのいずれかの第１の領域、（ｂ）非自己相補的な第２の領域、及び（ｃ）前記第１の領域に実質的に相補的な第３の領域を有し、前記非自己相補的な第２の領域は、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、
前記各ＲＮＡ分子が、
（ａ）（ｉ）実質的にランダム配列であるか、或いは（ｉｉ）実質的にランダム配列の第１のサブ領域と前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とから成るかのいずれかの第１の領域、
（ｂ）非自己相補的な第２の領域、及び
（ｃ）前記第１の領域に実質的に相補的な第３の領域を有し、
前記非自己相補的な第２の領域が、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通することを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、
前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの個々の組換え型発現ベクターが、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータをそれぞれさらに含有することを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項３】
請求項１に記載の組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、
前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの個々の組換え型発現ベクターが、既知の機能のＲＮＡ阻害性（ＲＮＡｉ）分子をエンコードする遺伝子をそれぞれさらに含有することを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、
前記非自己相補的な第２の領域が、前記組換え型ＲＮＡ分子の分子内でループを形成することができることを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項５】
請求項１に記載の組換え型ベクターのセット若しくはライブラリであって、
前記第１の領域の長さが８〜３０ヌクレオチドであることを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項６】
請求項１に記載の組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、
前記サブ領域の長さが８〜２９ヌクレオチドであることを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項７】
目的とする生物学的パラメータに作用することができるＲＮＡ分子を同定する方法であって、
ａ．細胞集団に、請求項１に記載の組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを接触させ、それによって、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ又はその断片が前記細胞集団の個々の細胞に取り込まれるようにするステップと、
ｂ．前記細胞集団の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとを含み、
前記細胞集団における特定細胞が、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値について変化を示す場合は、前記特定細胞が、前記目的とする生物学的パラメータに作用することができる特定のＲＮＡ分子をエンコードする特定の組換え型発現ベクターを含有すると判断するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値が、目的とするタンパク質の発現であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、
前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値が、悪条件下における細胞の生存又は増殖維持能力であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、
前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値が、細胞内病原体に対する細胞の感受性、又は細胞内での病原体の複製能力であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記細胞内病原体がウイルスであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の方法であって、
前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値が、目的とする細胞型への細胞の分化であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項７に記載の方法であって、
前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値が、細胞の長期増殖を誘導する能力又は細胞の多分化能を維持する能力であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
ウイルス感染に対する耐性を細胞に付与する方法であって、
前記細胞に、請求項１１の方法によって同定された特定の組換え型発現ベクター若しくはそれにエンコードされたＲＮＡ分子を接触させるステップを含み、
それによって、ウイルス感染に対する耐性を細胞に付与するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１５】
対象内でのウイルスの複製能力を抑制又は阻害する方法であって、
前記対象に、請求項１１の方法によって同定された特定の組換え型発現ベクター若しくはそれにエンコードされたＲＮＡ分子を接触させるステップを含み、
それによって、対象内でのウイルスの複製能力を抑制又は阻害するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１６】
目的とする細胞型への標的細胞の分化を誘導する方法であって、
前記標的細胞に、請求項１２の方法によって同定された特定の組換え型発現ベクター若しくはそれにエンコードされたＲＮＡ分子を接触させるステップを含み、
それによって、目的とする細胞型への標的細胞の分化を誘導するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１７】
細胞の長期増殖を誘導する又は細胞の多分化能を維持する方法であって、
前記細胞に、請求項１３の方法によって同定された特定の組換え型発現ベクター若しくはそれにエンコードされたＲＮＡ分子を接触させるステップを含み、
それによって、細胞の長期増殖を誘導する又は細胞の細胞の多分化能を維持するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項７に記載の方法であって、
前記特定の発現ベクター、その挿入部位又はその断片を、単離又は増幅し、
（ａ）前記特定の発現ベクター、或いは（ｂ）前記特定の発現ベクターの断片であって前記特定のＲＮＡ分子のためのコード配列を含有する該断片を配列決定するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項７に記載の方法であって、
さらなる細胞に、前記特定の発現ベクターを接触させるステップと、
前記さらなる細胞の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項７に記載の方法であって、
前記特定のＲＮＡ分子のコピーを作成するステップと、
さらなる細胞に、前記特定のＲＮＡ分子の前記コピーを接触させるステップと、
前記さらなる細胞の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項７に記載の方法であって、
ａ．第２の発現ベクターのバックボーンに、（ａ）前記特定のＲＮＡ分子、又は（ｂ）前記特定のＲＮＡ分子の断片をエンコードする配列を挿入し、それによって、
（ｉ）前記特定のＲＮＡ分子、或いは
（ｉｉ）前記特定のＲＮＡ分子の改変型であって前記特定のＲＮＡ分子の二本鎖領域と相同性を持つ領域を有する改変型のいずれかをエンコードする第２の組換え型発現ベクターを生成するステップと、
ｂ．さらなる細胞に、前記第２の発現ベクターを接触させるステップと、
ｃ．前記さらなる細胞の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項７に記載の方法であって、
ａ．第２の発現ベクターのバックボーンに、前記特定のＲＮＡ分子、又は前記特定のＲＮＡ分子の断片をエンコードする配列を挿入し、それによって、前記特定のＲＮＡ分子の二本鎖領域と相同性を持つ領域を有する前記特定のＲＮＡ分子の改変型をエンコードする第２の発現ベクターを生成するステップと、
ｂ．前記特定のＲＮＡ分子の前記改変型のコピーを作成するステップと、
ｃ．さらなる細胞に、前記特定のＲＮＡ分子の前記改変型の前記コピーを接触させるステップと、
ｄ．前記さらなる細胞の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項７に記載の方法であって、
ａ．（ｉ）前記特定の発現ベクター、（ｉｉ）前記特定の発現ベクターの挿入部位、或いは（ｉｉｉ）前記特定の発現ベクターの断片であって前記特定のＲＮＡ分子をエンコードする領域を有する該断片を単離又は増幅するステップと、
ｂ．前記特定の発現ベクターの断片を突然変異させ、それによって、前記特定の発現ベクターの前記断片の変異体を含むヌクレオチド分子のサブライブラリを作成するステップと、
ｃ．前記ヌクレオチド分子のサブライブラリを含む組換え型発現ベクターのサブライブラリを作成するステップと、
ｄ．第２の細胞集団に、前記組換え型発現ベクターのサブライブラリを接触させ、それによって、前記組換え型発現ベクターのサブライブラリ又はその一部が前記第２の細胞集団の個々の細胞に取り込まれるようにするステップと、
ｅ．前記第２の細胞集団の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとを含み、
前記第２の細胞集団における特定の細胞の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値がさらに変化した場合は、前記特定の細胞が、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値に対して請求項７に記載の特定のＲＮＡ分子よりも作用する改良されたＲＮＡ分子をエンコードする改良された発現ベクターを含有すると判断するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、
前記突然変異させる前記ステップは、
前記特定の発現ベクターの断片を低忠実度な方法によってコピーするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
前記低忠実度な方法が、変異性ポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法であって、
前記改良された発現ベクター若しくはその断片であって前記改良されたＲＮＡ分子のコード配列を含有する該断片を単離又は増幅するステップと、
（ａ）前記改良された発現ベクター、或いは（ｂ）前記改良された発現ベクターの前記断片を配列決定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法であって、
さらなる細胞に、前記改良された発現ベクターを接触させるステップと、
前記さらなる細胞の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
目的とする疾患又は障害の薬剤標的を同定する方法であって、
ａ．前記目的とする疾患又は障害により変化する目的とする生物学的パラメータに作用するＲＮＡ分子を、請求項７に記載の方法によって同定するステップと、
ｂ．その発現が前記ＲＮＡ分子によって変化する細胞ＲＮＡ分子を同定するステップとを含み、
それによって、前記細胞ＲＮＡ分子を、前記目的とする疾患又は障害の薬剤標的として同定するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項２９】
リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法であって、
ａ．一本鎖核酸中間体Ｉから核酸中間体ＩＩを得るステップであって、
前記一本鎖核酸中間体Ｉが、
（ｉ）第１の定常領域、
（ｉｉ）（ｉ）実質的にランダム配列であるか、或いは（ｉｉ）実質的にランダム配列の第１のサブ領域と前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とから成るかのいずれかの可変領域、及び
（ｉｉｉ）第２の定常領域を有し、
前記核酸中間体ＩＩが、
（ｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉ、
（ｉｉ）介在領域、及び
（ｉｉｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズする領域を有する該ステップと、
ｂ．前記核酸中間体ＩＩから、前記核酸中間体ＩＩ及び前記核酸中間体ＩＩとハイブリダイズするさらなる核酸分子を含有する二本鎖中間体ＩＩＩを得るステップであって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩが、
（ｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉ）前記可変領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉｉ）前記第２の定常領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｖ）前記介在領域の二本鎖コピー、
（ｖ）前記第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピー、
（ｖｉ）前記可変領域の第２の逆位二本鎖コピー、及び
（ｖｉｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第２の逆位二本鎖コピーを有し、
前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーと前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーとが、
（ｉ）前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは第１の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは前記第１の制限酵素の基質とならないような、かつ
（ｉｉ）前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは第２の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは前記第２の制限酵素の基質とならないような、制限酵素部位の非対称性を有する該ステップとを含み、
それによって、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９の方法であって、
前記可変領域の長さが８〜２９ヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９の方法であって、
前記サブ領域の長さが８〜２９ヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法であって、
前記第１の定常領域が、二本鎖形態の場合に、切断エンドヌクレアーゼの基質となることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法であって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩを得る前記ステップは、
前記核酸中間体ＩＩに、前記切断エンドヌクレアーゼを接触させるステップを含み、それによって、プライマーとしての使用に適する３´末端を生成するステップと、
前記核酸中間体ＩＩの未切断鎖を、前記３´末端をプライマーとして使用するＤＮＡポリメラーゼによってコピーするステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、
前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２９に記載の方法であって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩを得る前記ステップは、
（ａ）プライマーを前記核酸中間体ＩＩにアニールするステップと、
（ｂ）前記プライマーを伸長させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、
前記プライマーが、前記核酸中間体ＩＩに対してミスマッチな残基を含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、
前記ミスマッチな残基が、
（ａ）前記第１の定常領域又はその断片の前記第１の二本鎖コピー、及び（ｂ）前記第１の定常領域又はその断片の前記第２の逆位二本鎖コピーのいずれか一方を制限酵素が消化するようなさらなる制限酵素部位の非対称性を、
前記二本鎖中間体ＩＩＩに形成することを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、
前記伸長させるステップは、鎖置換型ポリメラーゼを用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項２９に記載の方法であって、
前記制限酵素部位の非対称性が、
（ａ）前記一本鎖核酸中間体Ｉと、前記一本核酸中間体Ｉとハイブリダイズする前記領域との間にミスマッチな残基を組み込み、それによって、前記二本鎖中間体ＩＩＩにおいて前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーが前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーと異なる配列を有するようにするステップ、
（ｂ）改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基を、前記一本鎖核酸中間体Ｉ又は前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズする前記領域に組み込むステップ、或いは
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）を組み合わせたステップのいずれかによって形成されることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩが、
（ａ）前記第１の定常領域の前記第１の二本鎖コピー又はその断片は第３の制限酵素の基質となるが、前記第１の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは前記第３の制限酵素の基質とならないような、或いは、
（ｂ）前記第１の定常領域又はその断片の前記第２の逆位二本鎖コピーは第３の制限酵素の基質となるが、前記第１の定常領域又はその断片の前記第１の二本鎖コピーは前記第３の制限酵素の基質とならないような、制限酵素部位の非対称性を有し、
当該方法が、前記二本鎖中間体ＩＩＩに前記第３の制限酵素を接触させるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
前記さらなる制限酵素部位の非対称性が、
（ａ）前記一本鎖核酸中間体Ｉと、前記一本核酸中間体Ｉとハイブリダイズする前記領域との間にミスマッチな残基を組み込み、それによって、前記二本鎖中間体ＩＩＩにおいて前記第１の定常領域又はその断片の前記第１の二本鎖コピーが前記第１の定常領域又はその断片の前記第２の逆位二本鎖コピーと異なる配列を有するようにするステップ、
（ｂ）改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基を、前記一本鎖核酸中間体Ｉ又は前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズする前記領域に組み込むステップ、或いは
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）を組み合わせたステップのいずれかによって形成されることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項２９に記載の方法であって、
前記核酸中間体ＩＩを得る前記ステップは、
ａ．前記一本鎖核酸中間体Ｉから、前記一本鎖核酸中間体Ｉ及び前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズするさらなる一本鎖核酸分子を有する二本鎖中間体ＩＢを得るステップと、
ｂ．前記二本鎖中間体ＩＢから前記核酸中間体ＩＩを得るステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、
前記二本鎖中間体ＩＢを得る前記ステップは、
（ａ）前記一本鎖核酸中間体Ｉの前記第２の定常領域にプライマーをアニールするステップと、
（ｂ）前記プライマーを伸長させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
前記プライマーが、前記第２の定常領域に対してミスマッチな残基を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、
前記二本鎖中間体ＩＢから前記核酸中間体ＩＩを得る前記ステップは、
リンカー核酸分子を、前記一本鎖核酸中間体Ｉの３´末端、及び前記さらなる一本鎖核酸分子の５´末端に連結させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、
前記リンカー核酸分子がヘアピン状であることを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項２９に記載の方法であって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩから環状中間体ＩＶを得るステップをさらに含み、
前記環状中間体ＩＶが、
発現ベクターのバックボーン、及び
挿入部位としての、（ａ）前記二本鎖中間体ＩＩＩ、或いは（ｂ）前記二本鎖中間体ＩＩＩの断片であって前記可変領域の第１の二本鎖コピー及び前記可変領域の第２の逆位二本鎖コピーを有する該断片を有することを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、
前記環状中間体ＩＶを請求項２９に記載の前記第１及び第２の制限酵素によって消化し、それによって、線状中間体Ｖを生成するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、
前記線状中間体Ｖを分子内で連結し、それによって、環状の産物ＶＩを生成するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの個々の組換え型発現ベクターが、前記ＲＮＡ分子をエンコードする及び転写終結部位を有する遺伝子を含有することを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項２９に記載の方法であって、
前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの個々の組換え型発現ベクターが、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含有することを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項２９に記載の方法であって、
前記組換え型発現ベクターの前記セット若しくはライブラリが、組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリであることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項２９に記載の方法であって、
前記発現ベクターのセット若しくはライブラリにＲＮＡポリメラーゼを接触させるステップを含み、それによって、前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを作成するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項２９に記載の方法によって作成された組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項５５】
請求項５４に記載の組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、
組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリであることを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項５６】
リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法であって、
ａ．ヌクレオチド中間体Ｉを合成するステップであって、
前記ヌクレオチド中間体Ｉが、
ｉ．（１）実質的にランダム配列であるか、或いは（２）実質的にランダム配列の第１のサブ領域と前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とから成るかのいずれかの、長さが６〜３０ヌクレオチドの可変領域、
ｉｉ．長さが３〜２０ヌクレオチドの非パリンドロームの定常領域、及び
ｉｉｉ．前記可変領域とハイブリダイズすることができる相補領域を有する該ステップと、
ｂ．前記ヌクレオチド中間体Ｉとハイブリダイズすることができる第２のヌクレオチド分子を合成するステップと、
ｃ．前記ヌクレオチド中間体Ｉを前記第２のヌクレオチド分子にアニールすることによって、前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域及び前記相補領域の二本鎖コピーを有する二本鎖産物を生成するステップとを含み、
それによって、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、
前記可変領域の長さが８〜２９ヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項５６に記載の方法であって、
前記サブ領域の長さが８〜２９ヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５６に記載の方法であって、
前記二本鎖産物の各末端が、制限酵素認識部位及び付着末端から互いに独立して選択される機構をさらに有し、
前記機構は、前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域及び前記相補領域の前記各二本鎖コピーに隣接していることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５６に記載の方法であって、
前記二本鎖産物から環状産物を得るステップをさらに含み、
前記環状産物が、
発現ベクターのバックボーン、及び
挿入部位としての、（ａ）前記二本鎖産物、或いは（ｂ）前記二本鎖産物の断片であって前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域及び前記相補領域の前記二本鎖コピーを有する該断片を有することを特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項５６に記載の方法であって、
前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの個々の組換え型発現ベクターが、前記ＲＮＡ分子をエンコードする及び転写終結部位を有する遺伝子を含有することを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項５６に記載の方法であって、
前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの個々の組換え型発現ベクターが、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含有することを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項５６に記載の方法であって、
前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリが、組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリであることを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項５６に記載の方法であって、
前記発現ベクターの前記セット若しくはライブラリにＲＮＡポリメラーゼを接触させるステップを含み、それによって、前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを作成するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項５６に記載の方法によって生成された組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項６６】
請求項６５に記載の組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、
組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリであることを特徴とする組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ。
【請求項６７】
前記目的とする生物学的パラメータに作用することができるるＲＮＡ分子変異体を同定する方法であって、
ａ．前記ＲＮＡ分子をエンコードする核酸分子を変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、それによって、前記ＲＮＡ分子の変異体を含むヌクレオチド分子のサブライブラリを作成するステップと、
ｂ．前記サブライブラリを発現ベクターのバックボーンにサブクローンし、それによって、発現ベクターのサブライブラリを作成するステップと、
ｃ．細胞集団に、前記発現ベクターのサブライブラリを接触させ、それによって、前記発現ベクターのサブライブラリ又はその断片が前記細胞集団の個々の細胞に取り込まれるようにするステップと、
ｄ．前記細胞集団の前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとを含み、
前記細胞集団における特定の細胞が、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値について変化を示す場合は、前記特定の細胞が、前記目的とする生物学的パラメータに作用する改変された能力を有する特定のＲＮＡ分子をエンコードする特定の発現ベクターを含有すると判断するようにしたことを特徴とする方法。
【請求項６８】
目的とする生物学的パラメータに作用する改変された能力を有するＲＮＡ分子変異体を同定する方法であって、
ａ．ヌクレオチド中間体Ｉを合成するステップであって、
前記ヌクレオチド中間体Ｉが、
ｉ．実質的にランダム配列の第１のサブ領域と目的とする生物学的パラメータに作用する前記ＲＮＡ分子の対応する領域と同一の第２のサブ領域とを有する長さが８〜３０ヌクレオチドの可変領域、
ｉｉ．長さが３〜２０ヌクレオチドの非パリンドロームの定常領域、及び
ｉｉｉ．前記可変領域とハイブリダイズすることができる相補領域を有する該ステップと、
ｂ．前記ヌクレオチド中間体Ｉとハイブリダイズすることができる第２のヌクレオチド分子を合成するステップと、
ｃ．前記ヌクレオチド中間体Ｉを前記第２のヌクレオチド分子にアニールすることによって、前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域及び前記相補領域の二本鎖コピーを有する二本鎖産物を生成するステップとを含み、
それによって、前記目的とする生物学的パラメータに作用する改変された能力を有するＲＮＡ分子の変異体を同定するようにしたことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するリボ核酸（ＲＮＡ）分子の発現ベクター、そのセット及びライブラリ、その生成方法、並びに、生物学的パラメータに影響を及ぼす能力を有するＲＮＡ薬剤若しくはＲＮＡ分子を同定するための、目的とする疾患又は障害を標的にする薬剤を同定するための、及び目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす改変された能力を有するＲＮＡ分子変異体を同定するための各方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
当該技術分野では、長年に渡り、ランダム配列の阻害性ヘアピンＲＮＡライブラリが求められていた。そのようなライブラリは、生物活性を有する治療用ＲＮＡ分子及び生物活性を有するＲＮＡ分子の同定において重要な役割を果たすが、ＲＮＡライブラリのランダム化及び生成のための従来の方法には限界があるため、合成するのは非常に困難であった。このような限界のため、ランダムｄｓ（二本鎖）ＲＮＡ配列を含有するライブラリは完全にパリンドロームであり、そのためにＲＮＡｉ用途に使用するのには適さない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するリボ核酸（ＲＮＡ）分子の発現ベクター、そのセット若しくはライブラリ、その生成方法、並びに、生物学的パラメータに影響を及ぼす能力を有するＲＮＡ薬剤若しくはＲＮＡ分子を同定するための、目的とする疾患又は障害を標的にする薬剤を同定するための、及び目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす改変された能力を有するＲＮＡ分子変異体を同定するための各方法を提供する。
【０００４】
ある実施形態では、本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを提供する。前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリの個々のＲＮＡ分子は、（ａ）実質的にランダム配列の第１の領域、（ｂ）非自己相補的な第２の領域、及び（ｃ）前記第１の領域に実質的に相補的な第３の領域を有する。他の実施形態では、前記個々のＲＮＡ分子は、部分的に二本鎖の二次構造を持っている。他の実施形態では、前記非自己相補的な第２の領域は、前記ランダム配列の二本鎖領域における二本鎖の間に位置している。他の実施形態では、前記二本鎖領域（本明細書中では「ｄｓ領域」とも称する）は、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリによって異なる。他の実施形態では、前記非自己相補的な領域は、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０００５】
他の実施形態では、本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法を提供する。
当該方法は、
ａ．一本鎖核酸中間体Ｉから核酸中間体ＩＩを得るステップであって、
前記一本鎖核酸中間体Ｉが、（ｉ）第１の定常領域、（ｉｉ）ランダム配列領域、及び（ｉｉｉ）第２の定常領域を有し、
前記核酸中間体ＩＩが、（ｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉ、（ｉｉ）介在領域、及び（ｉｉｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズする領域を有する該ステップと、
ｂ．前記核酸中間体ＩＩから、前記核酸中間体ＩＩ及び前記核酸中間体ＩＩとハイブリダイズする核酸分子を含む二本鎖中間体ＩＩＩを得るステップであって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩが、
（ｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉ）前記ランダム配列領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉｉ）前記第２の定常領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｖ）前記介在領域の二本鎖コピー、
（ｖ）前記第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピー、
（ｖｉ）前記ランダム配列領域の第２の逆位二本鎖コピー、及び
（ｖｉｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第２の逆位二本鎖コピーを有し、
前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーと前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーとが、
（ｉ）前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは第１の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは前記第１の制限酵素の基質とならないような、或いは
（ｉｉ）前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは第２の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは前記第２の制限酵素の基質とならないような、制限酵素部位の非対称性を有する該ステップとを含み、
それによって、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する。他の実施形態では、前記一本鎖核酸中間体Ｉの前記３つの構成要素は、記載した順に、一本鎖核酸中間体Ｉの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩの前記３つの構成要素は、記載した順に、核酸中間体ＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＩＩの前記７つの構成要素は、記載した順に、二本鎖中間体ＩＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０００６】
他の実施形態では、本発明は、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法を提供する。当該方法は、
（ａ）ヌクレオチド中間体Ｉを合成するステップであって、
前記ヌクレオチド中間体Ｉが、
（ｉ）（１）実質的にランダム配列であるか、或いは（２）実質的にランダム配列の第１のサブ領域と前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とから成るかのいずれかの、長さが６〜３０ヌクレオチドの可変領域、
（ｉｉ）長さが３〜２０ヌクレオチドの非パリンドロームの定常領域、及び
（ｉｉｉ）前記可変領域とハイブリダイズすることができる相補領域を有する該ステップと、
（ｂ）前記ヌクレオチド中間体Ｉとハイブリダイズすることができる第２のヌクレオチド分子を合成するステップと、
（ｃ）前記ヌクレオチド中間体Ｉを前記第２のヌクレオチド分子にアニールすることによって、前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域及び前記相補領域の各二本鎖コピーを有する二本鎖産物を生成するステップとを含み、
それによって、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する。
【０００７】
他の実施形態では、本発明は、二本鎖の二次構造を持つランダム配列領域を有するＲＮＡ分子を生成する組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリであって、本発明に係る方法によって作成された組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリを提供する。
【０００８】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するリボ核酸（ＲＮＡ）分子の発現ベクターであって、本発明に係る方法によって同定された発現ベクターを提供する。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は、ウイルス感染に対する耐性を細胞に付与する方法であって、前記細胞に、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、ウイルスの対象内での複製能力を抑制又は阻害する方法であって、前記対象に、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、細胞の目的とする細胞型への分化を誘導する方法であって、前記細胞に、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、細胞の長期増殖を誘導する又は細胞の多分化能を維持する方法であって、前記細胞に、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る方法によって生成された発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子を生成する発現ベクターのセット若しくはライブラリを提供する。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の発現ベクターであって、本発明に係る方法によって同定された発現ベクターを提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る発現ベクターによってエンコードされたＲＮＡ分子を提供する。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子であって、本発明に係る方法によって同定されたＲＮＡ分子を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するリボ核酸（ＲＮＡ）分子の発現ベクター、そのセット若しくはライブラリ、その生成方法、並びに、生物学的パラメータに影響を及ぼす能力を有するＲＮＡ薬剤若しくはＲＮＡ分子を同定するための、目的とする疾患又は障害を標的にする薬剤を同定するための、及び目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす改変された能力を有するＲＮＡ分子変異体を同定するための各方法を提供する。
【００１８】
ある実施形態では、本明細書中の実施例５に例示するように、本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを提供する。前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリの個々のＲＮＡ分子はそれぞれ、（ａ）第１の可変領域、（ｂ）非自己相補的な第２の領域、及び（ｃ）前記第１の領域に実質的に相補的な第３の領域を有する。他の実施形態では、前記非自己相補的な第２の領域は、前記二本鎖可変領域における二本鎖の間に位置している。他の実施形態では、前記二本鎖領域は、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリによって異なる。他の実施形態では、前記非自己相補的な領域は、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する。他の実施形態では、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの個々の組換え型発現ベクターはそれぞれ、１種類のＲＮＡ分子を発現する。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリの各ＲＮＡ分子は、上記に列挙した前記３つの領域を有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００１９】
他の実施形態では、前記組換え型ＲＮＡ分子内のランダム配列又は可変領域は、ヌクレオチド混合物をオリゴヌクレオチド合成装置に添加することによって生成される（実施例３〜５）。他の実施形態では、前記配列は、コンピューターを使用して生成される（実施例１９）。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２０】
他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子の可変領域は、その全長に渡って実質的にランダムな配列を示す。他の実施形態では、前記可変領域は、実質的にランダム配列の第１のサブ領域と、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とを有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２１】
他の実施形態では、実質的にランダム配列の前記サブ領域の長さは、２７ヌクレオチド（ｎｔ）である。他の実施形態では、前記長さは、１９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１１ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１２ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１３ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１４ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２１ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２２ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２３ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２４ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２９ｎｔである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２２】
他の実施形態では、前記サブ領域の長さは、６〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１１〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１２〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１３〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１１〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１２〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１３〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１１〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１２〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１３〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２１ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１１〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１２〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１３〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜１９ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１１〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１２〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１３〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜１７ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１１〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜１３ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１３ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜１３ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜１３ヌクレオチドである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２３】
「実質的にランダム」なる語は、他の実施形態では、例えばオリゴヌクレオチド合成装置における混合ｎｔのプールの使用などのランダムプロセスによって作成された配列を指す。他の実施形態では、この語は、検出可能な配列バイアスの欠失を指す。他の実施形態では、この語は、最小配列バイアスを含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２４】
「非自己相補的」なる語は、他の実施形態では、パリンドロームでない配列を指す。他の実施形態では、この語は、部分的に自己相補的である配列を包含し、非自己相補的な領域も含む。他の実施形態では、この語は、部分的に自己相補的である配列を包含し、（非自己相補的な）ループ形成領域も含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２５】
「実質的に相補的」なる語は、他の実施形態では、本発明に係る方法において用いられる条件下で別の配列とハイブリダイズする配列を指す。他の実施形態では、この語は、オーバーハング以外は別の配列と相補的である配列を含む。他の実施形態では、前記配列は、１〜２のミスマッチを除いて他の配列と相補的である。他の実施形態では、前記配列は、１つのミスマッチを除いて相補的である。他の実施形態では、前記配列は、２つのミスマッチを除いて相補的である。他の実施形態では、前記配列は、３つのミスマッチを除いて相補的である。他の実施形態では、前記配列は、４つ以上のミスマッチを除いて相補的である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２６】
他の実施形態では、前記組換え型発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータをさらに含む。他の実施形態では、前記各組換え型発現ベクターは、各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２７】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物の前記組換え型発現ベクターは、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現させることができる。他の実施形態では、前記組換え型発現ベクターは、細胞集団に接触させた又は導入した場合に、前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現させることができる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２８】
他の実施形態では、前記組換え型発現ベクターは、既知の機能の阻害性ＲＮＡ（inhibitory RNA：ＲＮＡｉ）分子をエンコードする遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、前記組換え型発現ベクターのそれぞれが、既知の機能のＲＮＡｉ分子をエンコードする遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリの大部分が、既知の機能のＲＮＡｉ分子をエンコードする遺伝子をさらに含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００２９】
他の実施形態では、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリによって生成された前記ＲＮＡ分子は、前記ランダム配列の二本鎖領域の二本鎖を連結するループ形成領域を有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００３０】
「パリンドローム（palindromic）」は、ある実施形態では、その逆相補鎖と同一の配列を有する一本鎖核酸分子を指す。ＡＡＧＧＣＣＴＴ配列は、パリンドロームの一例である。
【００３１】
他の実施形態では、本明細書中の実施例５に例示するように、本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法を提供する。
当該方法は、
ａ．一本鎖核酸中間体Ｉから核酸中間体ＩＩを得るステップであって、
前記一本鎖核酸中間体Ｉが、（ｉ）第１の定常領域、（ｉｉ）可変領域、及び（ｉｉｉ）第２の定常領域を有し、
前記核酸中間体ＩＩが、（ｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉ、（ｉｉ）介在領域、及び（ｉｉｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズする領域を有する該ステップと、
ｂ．前記核酸中間体ＩＩから、前記核酸中間体ＩＩ及び前記核酸中間体ＩＩとハイブリダイズする核酸分子を含む二本鎖中間体ＩＩＩを得るステップであって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩが、
（ｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉ）前記可変領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉｉ）前記第２の定常領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｖ）前記介在領域の二本鎖コピー、
（ｖ）前記第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピー、
（ｖｉ）前記可変領域の第２の逆位二本鎖コピー、及び
（ｖｉｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第２の逆位二本鎖コピーを含有し、
【００３２】
前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーと前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーとが、
（ｉ）前記第２の定常領域の前記第１のコピーは第１の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第２の逆位コピーは前記第１の制限酵素の基質とならないような、或いは
（ｉｉ）前記第２の定常領域の前記第２の逆位コピーは第２の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第１のコピーは前記第２の制限酵素の基質とならないような、制限酵素部位の非対称性を有する該ステップとを含み、
それによって、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する。他の実施形態では、前記一本鎖核酸中間体Ｉの前記３つの構成要素は、記載した順に、一本鎖核酸中間体Ｉの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩの前記３つの構成要素は、記載した順に、核酸中間体ＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＩＩの前記７つの構成要素は、記載した順に、二本鎖中間体ＩＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００３３】
他の実施形態では、本明細書中の実施例５に例示するように、本発明は、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法を提供する。
当該方法は、
（ａ）ヌクレオチド中間体Ｉを合成するステップであって、
前記ヌクレオチド中間体Ｉが、
（ｉ）（１）実質的にランダム配列であるか、或いは（２）実質的にランダム配列の第１のサブ領域と前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とから成るかのいずれかの、長さが６〜３０ヌクレオチドの可変領域、
（ｉｉ）長さが３〜２０ヌクレオチドの非パリンドロームの定常領域、及び
（ｉｉｉ）前記可変領域とハイブリダイズすることができる相補領域を有する該ステップと、
（ｂ）前記ヌクレオチド中間体Ｉとハイブリダイズすることができる第２のヌクレオチド分子を合成するステップと、
（ｃ）前記ヌクレオチド中間体Ｉを前記第２のヌクレオチド分子にアニールすることによって、前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域及び前記相補領域の各二本鎖コピーを含む二本鎖産物を生成するステップとを含み、
それによって、リボ核酸（ＲＮＡ）分子のセット若しくはライブラリを発現することができる組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する。他の実施形態では、前記ヌクレオチド中間体Ｉ及び前記ヌクレオチド分子の配列は、コンピューターを使用して生成される。他の実施形態では、前記配列は、当該技術分野で周知の他の任意の方法を用いて生成される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００３４】
他の実施形態では、前記二本鎖産物の各末端は、制限酵素認識部位及び付着末端から、互いに独立して選択される機構（feature）をさらに含む。他の実施形態では、前記機構は、前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域、及び前記相補領域の前記各二本鎖コピーに隣接している。他の実施形態では、末端は、終端から約１０ヌクレオチド以内の位置を指す。他の実施形態では、末端は、終端の位置を指す。他の実施形態では、末端は、前記可変領域、前記非パリンドロームの定常領域、及び前記相補領域の前記各二本鎖コピーに隣接する任意の位置を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００３５】
他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子の可変領域は、その全長に渡って実質的にランダムな配列を示す。他の実施形態では、前記可変領域は、実質的にランダム配列の第１のサブ領域と、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリに共通する第２のサブ領域とを有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００３６】
本発明に係る方法及び組成物の核酸中間体ＩＩは、他の実施形態では、一本鎖である。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、部分的に二本鎖の構造を有する。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、ヘアピン構造を有する。他の実施形態では、本発明に係る方法は、その後のステップを容易にするために、核酸中間体ＩＩの部分的な二本鎖構造を開くステップを含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００３７】
実施例５で説明する方法における第１及び第２の制限酵素の一例は、それぞれＰｍｅＩ及びＡａｒＩである。様々な制限酵素がこの方法に適することは、当業者であれば理解できるであろう。
【００３８】
他の実施形態では、本発明は、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法を提供する。
当該方法は、
（ａ）一本鎖核酸中間体Ｉから核酸中間体ＩＩを得るステップであって、
前記一本鎖核酸中間体Ｉが、（ｉ）第１の定常領域、（ｉｉ）ランダム配列領域、及び（ｉｉｉ）第２の定常領域を有し、
前記核酸中間体ＩＩが、（ｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉ、（ｉｉ）介在領域、及び（ｉｉｉ）前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズする領域を有する該ステップと、
（ｂ）前記核酸中間体ＩＩから、前記核酸中間体ＩＩ及び前記核酸中間体ＩＩとハイブリダイズする核酸分子を含む二本鎖中間体ＩＩＩを得るステップであって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩが、
（ｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉ）前記ランダム配列領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉｉ）前記第２の定常領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｖ）前記介在領域の二本鎖コピー、
（ｖ）前記第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピー、
（ｖｉ）前記ランダム配列領域の第２の逆位二本鎖コピー、及び
（ｖｉｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第２の逆位二本鎖コピーを有し、
【００３９】
前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーと前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーとが、
（ｉ）前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは第１の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは前記第１の制限酵素の基質とならないような、或いは
（ｉｉ）前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは第２の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは前記第２の制限酵素の基質とならないような、制限酵素部位の非対称性を有する該ステップと、
（ｃ）組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを遺伝子操作して、二本鎖中間体ＩＩＩ又はその断片を含有させるステップとを含み、
それによって、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する。他の実施形態では、前記一本鎖核酸中間体Ｉの前記３つの構成要素は、記載した順に、一本鎖核酸中間体Ｉの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩの前記３つの構成要素は、記載した順に、核酸中間体ＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＩＩの前記７つの構成要素は、記載した順に、二本鎖中間体ＩＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００４０】
他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリの各ＲＮＡ分子は、ランダム配列の二本鎖領域を有する。
【００４１】
他の実施形態では、上記の方法の１つは、図６〜８に示したようにして実施される。他の実施形態では、図６〜８に示したステップの全てが、本発明に係る方法では実施されるとは限らない。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００４２】
「一本鎖」なる語は、他の実施形態では、全てのヌクレオチド塩基が共有結合によって互いに結合されている核酸分子を指す。この語は、他の実施形態では、部分的な二本鎖特性を有する核酸分子を含む。他の実施形態では、この語は、その大部分が二本鎖である核酸分子を含む。他の実施形態では、この語は、二本鎖領域を含む核酸分子を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００４３】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、「第１のコピー」、「第２のコピー」なる語は、領域やヌクレオチド分子などの同一のコピーを指す。他の実施形態では、「コピー」なる語は、ほぼ正確なコピーを指す。他の実施形態では、配列の第２のコピーは、配列の第１のコピーに対するミスマッチを含む。他の実施形態では、第２のコピーは、第１のコピーに対する２つのミスマッチを含む。他の実施形態では、第２のコピーは、第１のコピーに対する２つ以上のミスマッチを含む。他の実施形態では、第２のコピーは、第１のコピーに対する３つ以上のミスマッチを含む。他の実施形態では、第１及び第２のコピーは、互いに少なくとも６０％相同である。他の実施形態では、両コピーは、互いに少なくとも７０％相同である。他の実施形態では、両コピーは、互いに少なくとも８０％相同である。他の実施形態では、両コピーは、互いに少なくとも９０％相同である。他の実施形態では、両コピーは、互いに１００％相同である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００４４】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピーは、第２の定常領域の第１のコピーの正確なコピーである。他の実施形態では、第２の逆位二本鎖コピーは、第１のコピーのほぼ正確なコピーである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００４５】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、ランダム配列領域の第２の逆位二本鎖コピーは、ランダム配列領域の第１のコピーの正確なコピーである。他の実施形態では、第２の逆位二本鎖コピーは、第１のコピーのほぼ正確なコピーである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００４６】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、第１の定常領域の第２の逆位二本鎖コピー又はその断片は、第１の定常領域の第１のコピー又はその断片の正確なコピーである。他の実施形態では、第２の逆位二本鎖コピーは、第１のコピーのほぼ正確なコピーである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００４７】
他の実施形態では、本明細書中の実施例５に例示するように、核酸中間体ＩＩを得る前記ステップは、
ａ．前記一本鎖核酸中間体Ｉから、前記一本鎖核酸中間体Ｉ及び前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズするさらなる一本鎖核酸分子を有する二本鎖中間体ＩＢを得るステップと、
ｂ．前記二本鎖中間体ＩＢから前記核酸中間体ＩＩを得るステップとを含む。
【００４８】
他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、二本鎖中間体ＩＢを使用せずに得られる（例えば、ヘアピン状の第２の定常領域を使用して得られる）。
【００４９】
他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、当該技術分野で周知の技術を用いて、一本鎖核酸中間体Ｉから得られる。前記を核酸中間体ＩＩ得るための各方法は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００５０】
他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＢを得る前記ステップは、
（ａ）前記一本鎖核酸中間体Ｉの前記第２の定常領域にプライマーをアニールするステップと、
（ｂ）前記プライマーを伸長させるステップとを含む。他の実施形態では、前記プライマーは、前記第２の定常領域に対する１つ以上のミスマッチの残基を含む。他の実施形態では、前記プライマーの５´末端は、厳密には、前記一本鎖核酸中間体Ｉの３´末端と対合しない。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００５１】
他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＢから前記二本鎖中間体ＩＢを得るステップは、リンカー核酸分子を、前記一本鎖核酸中間体Ｉの３´末端、及び前記さらなる一本鎖核酸分子の５´末端に連結させることを含む。他の実施形態では、前記リンカー核酸分子は、ヘアピン状である。他の実施形態では、前記リンカー核酸分子は、ヘアピン状ではない。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００５２】
本発明に係る方法の他の実施形態では、二本鎖中間体ＩＢ及びリンカー核酸分子は各々、異なる制限酵素の半分の部位を含み、平滑末端又は適合する付着末端を有する異なるコンセンサス配列を有するので、適切に連結させた産物は、前記酵素のいずれの基質ではない。一方、前記伸長されたプライマー又は前記ヘアピンループリンカーのいずれかのホモ二量体が切断され、その後、適切に連結させた産物を精製するためにサイズ分離法が用いられる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。付着末端は、便宜上、実施例３〜５で用いられるが、本発明に係る方法に必須ではない。
【００５３】
本発明に係る方法及び組成物の核酸中間体は、他の実施形態では、ヘアピン構造を有する。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、二本鎖構造を有する。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、一本鎖構造を有する。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、一本鎖であるが、二本鎖の二次構造を有する（実施例５）。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、初期は二本鎖構造を有するが、本発明に係る方法における或る過程で一本鎖構造に開かれる（実施例３及び４）。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００５４】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、前記二本鎖（double-stranded：ｄｓ）中間体ＩＩＩから環状中間体ＩＶが得られる。前記環状中間体ＩＶは、発現ベクターのバックボーンと、挿入部位としての、（ａ）前記ｄｓ中間体ＩＩＩ、或いは（ｂ）前記ｄｓ中間体ＩＩＩの断片であって前記ランダム配列領域の前記第１のｄｓコピー及び前記ランダム領域の前記第２の逆位ｄｓコピーを含有する該断片とを有している。他の実施形態では、前記ｄｓ中間体ＩＩＩの断片は、前記ランダム配列領域の前記第１及び第２のｄｓコピーの間のｄｓ中間体ＩＩＩの全ての配列を含む。他の実施形態では、前記環状中間体ＩＶは、（ａ）前記ランダム配列領域の前記第１のｄｓコピー、（ｂ）前記前記ランダム配列領域の前記第２の逆位ｄｓコピー、及び（ｃ）それらの間のｄｓ中間体ＩＩＩの配列の断片を含む。他の実施形態では、前記環状中間体ＩＶは、連結とによって、ｄｓ中間体ＩＩＩから得られる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００５５】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、前記ｄｓ中間体ＩＩＩから環状産物が得られる。前記環状産物は、発現ベクターのバックボーンと、挿入部位としての、（ａ）前記ｄｓ中間体ＩＩＩ、或いは（ｂ）前記ｄｓ中間体ＩＩＩの断片であって、前記ランダム配列領域の前記第１のｄｓコピー、及び前記ランダム配列領域の前記第２の逆位ｄｓコピーを有する該断片とを有している。他の実施形態では、前記ｄｓ中間体ＩＩＩの断片は、前記ランダム配列領域の前記第１及び第２のｄｓコピーの間のｄｓ中間体ＩＩＩの全ての配列を含む。他の実施形態では、前記環状産物は、（ａ）前記ランダム配列領域の前記第１のｄｓコピー、（ｂ）前記ランダム配列領域の前記第２の逆位ｄｓコピー、及び（ｃ）それらの間のｄｓ中間体ＩＩＩの配列の断片を含む。他の実施形態では、前記環状産物は、連結によって、ｄｓ中間体ＩＩＩから得られる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００５６】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、前記環状中間体ＩＶを、上記した前記第１及び第２の制限酵素で消化することによって、線状中間体Ｖを形成する。
【００５７】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、前記線状中間体Ｖを分子内で連結することによって、環状産物ＶＩを形成する。他の実施形態では、本明細書中の実施例５に例示するように、前記分子内の結合によって、（ｉ）一本鎖核酸中間体Ｉのランダム配列領域、（ｉｉ）非パリンドロームの介在領域、及び（ｉｉｉ）前記ランダム配列領域とハイブリダイズする領域を有する転写物を発現する発現ベクターが形成される。他の実施形態では、前記非パリンドロームの介在領域は、核酸中間体ＩＩの介在領域の断片である。他の実施形態では、前記非パリンドロームの介在領域は、ループを形成することができる。他の実施形態では、前記線状中間体Ｖの前記３つの構成要素は、記載した順に、前記転写物の５´末端から３´末端へ配列される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００５８】
各可能なさらなるステップは、本発明の別の実施形態に相当する。
【００５９】
他の実施形態では、本明細書中の実施例５に例示するように、本発明は、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する方法を提供する。
前記方法は、
（ａ）一本鎖核酸中間体Ｉから二本鎖中間体ＩＢを得るステップであって、
前記一本鎖核酸中間体Ｉが、５´末端から３´末端への順に、（ｉ）第１の定常領域、
（ｉｉ）ランダム配列領域、及び（ｉｉｉ）第２の定常領域を有し、
前記二本鎖中間体ＩＢが、一本鎖核酸中間体Ｉ及び前記一本鎖核酸中間体Ｉとハイブリダイズするさらなる一本鎖核酸分子を有する該ステップと、
（ｂ）前記二本鎖中間体ＩＢから、（ｉ）一本鎖核酸中間体Ｉ、（ｉｉ）介在領域、及び（ｉｉｉ）前記さらなる一本鎖核酸分子を有する核酸中間体ＩＩを得るステップと、
（ｃ）前記核酸中間体ＩＩから、核酸中間体ＩＩ、及び前記核酸中間体ＩＩとハイブリダイズするさらなる第３の一本鎖核酸分子を有する二本鎖中間体ＩＩＩを得るステップであって、
前記二本鎖中間体ＩＩＩが、
（ｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉ）前記ランダム配列領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｉｉ）前記第２の定常領域の第１の二本鎖コピー、
（ｉｖ）前記介在領域の二本鎖コピー、
（ｖ）前記第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピー、
（ｖｉ）前記ランダム配列領域の第２の逆位二本鎖コピー、及び
（ｖｉｉ）前記第１の定常領域又はその断片の第２の逆位二本鎖コピーを有し、
前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーと前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーとが、
（ｉ）前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは第１の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは前記第１の制限酵素の基質とならないような、或いは
（ｉｉ）前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーは第２の制限酵素の基質となるが、前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピーは前記第２の制限酵素の基質とならないような、制限酵素部位の非対称性を有する該ステップと、
（ｄ）前記二本鎖中間体ＩＩＩから、発現ベクターのバックボーン、及び挿入部位としての前記二本鎖中間体ＩＩＩ若しくはその断片を有する環状中間体ＩＶを得るステップと、
（ｅ）前記第１及び第２の制限酵素によって前記環状中間体ＩＶを消化することによって線状中間体Ｖを生成するステップと、
（ｆ）前記線状中間体Ｖを分子内で連結することによって、５´末端から３´末端への順に、（ｉ）前記第２の定常領域の前記第１の二本鎖コピー、（ｉｉ）ループ形成領域、及び（ｉｉｉ）前記第２の定常領域の前記第２の逆位二本鎖コピーを含む転写物を発現する発現ベクターを生成するステップとを含み、
それによって、ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリを発現する組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成する。他の実施形態では、前記一本鎖（single-stranded：ｓｓ）核酸中間体Ｉの前記３つの構成要素は、記載した順に、一本鎖核酸中間体Ｉの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩの前記３つの構成要素は、記載した順に、核酸中間体ＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＩＩの前記７つの構成要素は、記載した順に、二本鎖中間体ＩＩＩの５´末端から３´末端へ配列される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６０】
他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリによってエンコードされる個々のＲＮＡ分子は、ランダム配列領域の二本鎖、及びランダム配列領域の２本の相補鎖の間にループ形成領域を有する。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子のセット若しくはライブラリの各ＲＮＡ分子は、ランダム配列領域の二本鎖、及びランダム配列領域の２本の相補鎖の間にループ形成領域を有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６１】
他の実施形態では、上記の方法は、図６〜８に示したようにして実施される。他の実施形態では、図６〜８に示したステップの全ては、本発明に係る方法では実施されない。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する
【００６２】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、前記一本鎖核酸中間体Ｉは、ヌクレオチド合成装置をプログラムすることによって生成され、（１）前記第１の定常領域の配列、（２）各位置でヌクレオチド混合物を使用して、ランダム領域、及び（３）第２の定常領域の配列を合成する。他の実施形態では、ｓｓ核酸中間体Ｉが、当該技術分野で周知の他の方法によって作成される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６３】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、本明細書中の実施例３〜５に例示するように、本発明に係る方法で使用される前記核酸分子及び中間体の各々は、ＤＮＡ、又はその長さに沿って部分的に若しくは完全にバックボーン若しくは塩基組成（他の実施形態では、ホスホロチオエート結合）を改変したＤＮＡから構成される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６４】
「定常」なる語は、他の実施形態では、核酸分子のライブラリ又はセット内で改変されていない又は不変の領域を指す。他の実施形態では、「定常」なる語は、核酸分子のライブラリのサブセット内で改変されていない又は不変の領域を指す。例えば、図１〜図８に示した方法における開始ヌクレオチド分子は各々、ランダム領域の５´及びランダム領域の３´において２つの定常領域を有する。他の実施形態では、この語は、ライブラリ内の異なる分子の定常領域間で生じる僅かな変化を含む。他の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子の第１の定常領域及び第２の定常領域は互いに異なる定常配列を有する。他の実施形態では、第１の定常領域及び／又は第２の定常領域は、ライブラリ内で実質的に定常である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６５】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の発現ベクターを生成する方法であって、上記の方法と同様であるが、発現ベクターのバックボーンに挿入する前に、二本鎖中間体ＩＩＩを消化する、或いは前記ランダム配列領域の２つのコピー間の前記介在配列の大部分を除去するために処理する方法を提供する。上記に列挙した全ての実施形態に対して、この方法を適用することができる。
【００６６】
上述した方法の他の実施形態では、環状中間体ＩＶを生成するのに使用されるｄｓ中間体ＩＩＩの断片は、前記ランダム配列領域の前記第１のｄｓコピー、及び前記ランダム配列領域の前記第２の逆位ｄｓコピーを有する。他の実施形態では、前記断片は、ｄｓ中間体ＩＩＩの５つの中間部分を有する。前記５つの中間部分は、例えば、（ｉ）前記ランダム配列領域の第１のｄｓコピー、（ｉｉ）前記第２の定常領域の第１のｄｓコピー、（ｉｉｉ）前記介在領域のｄｓコピー、（ｉｖ）前記第２の定常領域の第２の逆位ｄｓコピー、及び（ｖ）前記ランダム配列領域の第２の逆位ｄｓコピーである。他の実施形態では、前記断片は、ｄｓ中間体ＩＩＩの７つの中間部分全てを有する。前記７つの中間部分は、例えば、（ｉ）前記第１の定常領域の第１のｄｓコピー、（ｉｉ）前記ランダム配列領域の第１のｄｓコピー、（ｉｉｉ）前記第２の定常領域の第１のｄｓコピー、（ｉｖ）前記介在領域のｄｓコピー、（ｖ）前記第２の定常領域の第２の逆位ｄｓコピー、（ｖｉ）前記ランダム配列領域の第２の逆位ｄｓコピー、及び（ｖｉｉ）前記第１の定常領域の第２の逆位ｄｓコピーの断片である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６７】
「ハイブリダイズ」なる語は、本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、本発明に係る方法が実行される条件下で標的分子とハイブリダイズする分子を指す。例えば、本明細書の実施例３〜５に例示するように、使用される二本鎖中間体の各々は、前の中間体とハイブリダイズする新たな鎖を含む。他の実施形態では、この語は、厳密な条件下でのハイブリダイゼーションを指す。他の実施形態では、この語は、緩やかな条件下でのハイブリダイゼーションを指す。他の実施形態では、「厳密な条件下でのハイブリダイズ」なる語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件であって、その条件下で、長さが１８残基でかつ６０％自己相補的である二本鎖ヌクレオチド分子が典型的にはハイブリダイズされたままであるような条件を指す。他の実施形態では、長さが１８残基でかつ７０％自己相補的である二本鎖ヌクレオチド分子が使用される。他の実施形態では、長さが１８残基でかつ８０％自己相補的である二本鎖ヌクレオチド分子が使用される。他の実施形態では、この語は、当該技術分野で周知の任意の他の定義に従って定義される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６８】
他の実施形態では、上記した方法の第１の定常領域又は本発明の類似方法の対応する定常領域は、二本鎖の形であるとき、ニッキングエンドヌクレアーゼの基質である。他の実施形態では、前記ニッキングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡニッキングエンドヌクレアーゼである。他の実施形態では、前記ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｂ．ＢｂｖＣ Ｉである。他の実施形態では、本明細書の実施例５に例示するように、前記二本鎖中間体ＩＩＩを得る前記ステップは、核酸中間体ＩＩにニッキングエンドヌクレアーゼを接触させ、それによって、プライマーとしての使用に適した３´末端を生成し、前記プライマーを伸長させるステップを含む。他の実施形態では、前記核酸中間体ＩＩは、前記ニッキングエンドヌクレアーゼによって消化される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００６９】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、本明細書の実施例５に例示するように、伸長させる前記ステップは、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって実行される。他の実施形態では、前記ポリメラーゼは、高い鎖置換活性を有する。他の実施形態では、鎖置換活性を有する前記ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施形態では、前記ポリメラーゼはｐｈｉ２９である。他の実施形態では、前記ポリメラーゼはＢｓｔである。他の実施形態では、ポリメラーゼはＶｅｎｔである。他の実施形態では、前記Ｖｅｎｔはｅｘｏ−Ｖｅｎｔである。他の実施形態では、前記ポリメラーゼは９ｏＮｍである。他の実施形態では、前記ポリメラーゼは、鎖置換活性を有する当該技術分野で周知の任意の他のポリメラーゼである。他の実施形態では、前記ポリメラーゼは、高度に前進型のポリメラーゼである。他の実施形態では、鎖置換因子の存在下で鎖置換複製を行うことができるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換因子の非存在下ではＤＮＡポリメラーゼが鎖置換複製を行わないとしても、本発明に係る方法において使用するのに適している。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７０】
「鎖置換活性」なる語は、他の実施形態では、合成中に遭遇する下流ＤＮＡを置換する能力を指す。
【００７１】
「高度に前進型」なる語は、他の実施形態では、使用される条件下で、長いストレッチのＤＮＡを連続合成することができるポリメラーゼを指す。他の実施形態では、前記ポリメラーゼは、１キロベースを超えるＤＮＡを連続合成することができる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７２】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物で使用されるニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｂ．Ｂｓｍ Ｉである。他の実施形態では、ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｔ．Ａｌｗ Ｉである。他の実施形態では、ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｔ．ＢｂｖＣ Ｉである。他の実施形態では、ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢ Ｉである。他の実施形態では、ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩである。他の実施形態では、ニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｂ．ＢｔｓＩである。他の実施形態では、ニッキングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で周知の任意のエンドヌクレアーゼである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７３】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＢを得る前記ステップは、（ａ）前記一本鎖核酸中間体Ｉの前記第２の定常領域にプライマーをアニールするステップと、（ｂ）前記プライマーを伸長させるステップとを含む。他の実施形態では、前記プライマーは、前記第２の定常領域に対する１つ以上のミスマッチを含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７４】
他の実施形態では、本明細書中の実施例３〜５に例示するように、本発明に係る方法及び組成物で使用されるプライマーの５´末端は、厳密には、標的核酸分子の３´末端と対合しない。他の実施形態では、この意図的な不対合は、サブクローンに使用される「付着末端」を有する二本鎖（ｄｓ）核酸分子を生成する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。「付着末端」は、ある実施形態では、オーバーハングを有する末端を指す。「平滑末端」は、ある実施形態では、オーバーハングを有さない末端を指す。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７５】
他の実施形態では、本明細書の実施例３〜５に例示するように、上記した方法の核酸中間体ＩＩ又は本発明の類似方法の対応する中間体を得るステップは、リンカー核酸分子を、一本鎖核酸中間体Ｉの３´末端及びさらなる一本鎖核酸分子の５´末端に連結させるステップを含む。他の実施形態では、リンカー核酸分子はヘアピン状である。他の実施形態では、リンカー核酸分子は一本鎖である。他の実施形態では、リンカー核酸分子は、一本鎖核酸中間体Ｉ及びさらなる一本鎖核酸分子と共に、ヘアピン状構造を形成する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７６】
他の実施形態では、ヘアピンループリンカーのホモ二量体が分子間でアニールし、伸長するのならば、この発生は、前記ホモ二量体を融解温度まで予熱し、前記ホモ二量体を冷却し、その後、前記ホモ二量体を連結反応温度まで昇温させることによって、最小にされる。
【００７７】
他の実施形態では、本明細書の実施例３に例示するように、上記方法のｄｓ中間体ＩＩＩ又は本発明の類似方法の対応する中間体を得るステップは、核酸中間体ＩＩにプライマーをアニールし、前記プライマーを伸長させ、それによって第３の一本鎖核酸分子を合成するステップを含む。他の実施形態では、伸長させる前記ステップは、鎖置換ポリメラーゼを用いて行われる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７８】
他の実施形態では、プライマーは、核酸中間体ＩＩに対して１若しくは複数のミスマッチを含む。他の実施形態では、前記ミスマッチは、核酸中間体ＩＩと第３のｓｓ核酸分子との間に、制限酵素部位の非対称性を形成する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００７９】
本明細書の実施例５に例示するように、制限部位の非対称性の例としての環状中間体ＩＶは制限部位の非対称性を有し、第２の定常領域の第１のコピーはＡａｒＩの基質となり（しかし、Ｐｍｅ Ｉの基質とはならない）、第２の定常領域の第２のコピーはＰｍｅＩの基質となる（しかし、Ａａｒ Ｉの基質とはならない）。この場合、非対称性は、ｓｓ Ｉ Ｂを生成するために使用されるミスマッチなプライマーによって形成される。様々な制限酵素がこの方法に適することは、当業者であれば理解できるであろう。
【００８０】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、制限酵素部位の非対称性は、制限酵素の認識部位又は切断部位に対応する領域において、ミスマッチな残基を、本発明に係る方法及び組成物に使用される２つの別の相補的ヌクレオチド分子の間に組み入れることによって形成される。したがって、各鎖を後からコピーしてできた産物は、非対称配列を有することとなる。例えば、他の実施形態では、上記の方法において、ミスマッチな残基は、ｓｓ核酸中間体Ｉとその相補鎖の間に組み入れられる。その結果、ｄｓ中間体ＩＩＩでは、第２の定常領域の第１の二本鎖コピーは、第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピーとは異なる配列を有することとなる。
【００８１】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、制限酵素部位の非対称性は、制限酵素の認識部位又は切断部位に対応する領域において、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基を本発明のヌクレオチド分子に組み入れることによって形成される。本明細書の実施例５に例示するように、改変されたバックボーンの例は、一本鎖核酸中間体Ｉのホスホロチオエート結合である。様々な種類の改変されたバックボーンがこの方法に適することは、当業者であれば理解できるであろう。
【００８２】
他の実施形態では、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基が、ｓｓ核酸中間体Ｉに組み入れられる。他の実施形態では、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基が、ｓｓ核酸中間体Ｉの相補体に組み入れられる。その結果として、ｄｓ中間体ＩＩＩでは、（ｉ）第２の定常領域の第１の二本鎖コピー又は（ｉｉ）第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピーのいずれかが、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基を含むこととなる。他の実施形態では、バックボーンの１つの結合が改変される。他の実施形態では、バックボーンの２つの結合が改変される。他の実施形態では、バックボーンの３つ以上の結合が改変される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００８３】
本発明に係る方法及び組成物で使用される前記改変されたバックボーンは、ある実施形態では、ホスホロチオエート・バックボーンである。他の実施形態では、前記改変されたバックボーンは、メチルホスホネート結合である。他の実施形態では、前記改変されたバックボーンは、当制限酵素の切断を阻害する該技術分野で周知の任意の他の種類の改変されたバックボーンである。前記改変された塩基は、他の実施形態では、任意の種類の修飾ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、又は制限酵素の切断を阻害する当該技術分野で周知の修飾核酸である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００８４】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、制限酵素部位の非対称性は、本発明のヌクレオチド分子への、ミスマッチな残基の組み入れと、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基の組み入れとの組合せによって形成される。いずれか一方又は両方の方法を本発明に係る方法に使用することができることは、当業者には明らかであろう。
【００８５】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、制限酵素部位の非対称性は、制限酵素部位の非対称性を形成する当該技術分野で周知の任意の他の方法によって形成される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００８６】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物で使用される中間体は、第１の定常領域の第１及び第２の両ｄｓコピー間において、さらなる制限酵素部位の非対称性を有する。他の実施形態では、ｄｓ中間体ＩＩＩの場合、第１の定常領域又はその断片の第１のｄｓコピーは第３の制限酵素の基質であるが、第１の定常領域又はその断片の第２の逆位ｄｓコピーは第３の制限酵素の基質ではない。他の実施形態では、前記さらなる制限酵素部位の非対称性は、第１の定常領域又はその断片の第２の二本鎖コピーに、第３の制限酵素の基質であるｄｓ中間体ＩＩＩを生じさせるが、第１の定常領域又はその断片の第２の二本鎖コピーには第３の制限酵素の基質であるｄｓ中間体ＩＩＩを生じさせない。
【００８７】
例えば、本明細書の実施例５に例示するように、二本鎖中間体ＩＩＩ（ｄｓ ＩＩＩ）は、第１の定常領域の第１のコピーがＢｔｇＺ Ｉの基質になり、（初期は、Ｎｏｔ Ｉの基質でもある）、第１の定常領域の第２のコピーがＮｏｔ Ｉの基質になる（しかし、ＢｔｇＺ Ｉの基質ではない）ような、制限部位の非対称性を有する。この場合、ＢｔｇＺ Ｉ非対称性は、ｓｓ核酸中間体Ｉに、ホスホロチオネート化残基の組み入れることによって形成された。ＢｔｇＺ ＩによるｄｓＩＩＩの非対称な消化に続き（ｄｓ ＩＩＩＢを生成する）、第１の定常領域の第１のコピーからＮｏｔ Ｉ部位を除去し、それによって、Ｎｏｔ Ｉによるｄｓ ＩＩＩＢの非対称な消化が可能になった（図７）。実施例４で説明する方法のｄｓＩＩＩは、この場合はプライマーＢ（図４）におけるミスマッチによって生成された、さらなる制限酵素部位の非対称性を有する。
【００８８】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、上述した方法の二本鎖中間体ＩＩＩ又は本発明の類似方法の対応する中間体を、上述した第３の制限酵素に接触させるステップをさらに含む。他の実施形態では、前記接触させるステップは、環状中間体ＩＶ又は類似方法の対応する中間体を得るステップの前に行われる。他の実施形態では、前記二本鎖中間体ＩＩＩは、第３の制限酵素によって消化される。他の実施形態では、前記接触又は接触させるステップは、発現ベクターによって開始される正確な転写に好ましくない二本鎖中間体ＩＩＩの断片若しくは残基を、二本鎖中間体ＩＩＩから除去する。他の実施形態では、前記好ましくない断片は、１つ以上連続するプリン（例えばアデニン）残基のストレッチである。他の実施形態では、前記ストレッチは、２つの連続するアデニンを有する。他の実施形態では、前記ストレッチは、３つの連続するアデニンを有する。他の実施形態では、前記ストレッチは、４つの連続するアデニンを有する。他の実施形態では、前記ストレッチは、５つの連続するアデニンを有する。他の実施形態では、前記ストレッチは、６つの連続するアデニンを有する。他の実施形態では、前記好ましくない断片は、アデニンが豊富な領域である。本発明に係る方法の他の実施形態では、ベクターバックボーン上の前記プロモータは、前記アデニン又は５つの連続するアデニンを元は含んでいた前記ストランドからの転写のためのプロモータである。他の実施形態では、前記ベクター内の前記プロモータは、前記第１の一本鎖ＤＮＡ分子に対応する前記ストランドからの転写を開始する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００８９】
他の実施形態では、本明細書の実施例５に例示するように、５つのチミジンのストレッチ（例えば、第１のｓｓＤＮＡ分子に５つのアデニンをコピーすることによって作成される）は、本発明のＲＮＡ分子をエンコードする遺伝子におけるランダム配列領域の逆相補鎖に続き、当該ストレッチの直後に転写終結することを可能にする。他の実施形態では、チミジンの前記ストレッチは、ランダム配列領域の逆相補鎖の直後に続く。ＤＮＡのコーディング鎖中のチミジン残基は転写されたＲＮＡ中のウリジン残基に対応し、それゆえ、この実施形態では、ＲＮＡはウリジン残基のストレッチを含む。他の実施形態では、ウリジンストレッチの第２のウリジンの後の転写終結は、ＲＮＡ分子上に２ｎｔのオーバーハングをもたらす。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００９０】
他の実施形態では、さらなる制限酵素部位の非対称性は、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基を、一本鎖核酸中間体Ｉ又はさらなる一本鎖核酸分子に組み入れることによって形成され、それによって、二本鎖中間体ＩＩＩにおいて、（ｉ）第１の定常領域の第１の二本鎖コピー若しくはその断片、又は（ｉｉ）第１の定常領域の第２の逆位二本鎖コピー若しくはその断片が、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基を含むこととなる。他の実施形態では、さらなる制限酵素部位の非対称性は、本発明のヌクレオチド分子への、ミスマッチな残基の組み入れと、改変されたバックボーン又は塩基組成を有する残基の組み入れとの組合せによって形成される。他の実施形態では、さらなる制限酵素部位の非対称性は、当該技術分野で周知の任意の他の適切な方法によって形成される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００９１】
他の実施形態では、本明細書の実施例５に例示するように、本発明に係る方法及び組成物の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータをさらに含む。他の実施形態では、発現ベクター又はそのセット若しくはライブラリは、ＲＮＡポリメラーゼと接触させられ、それによってＲＮＡ分子又はそのセット若しくはライブラリを生成する。
【００９２】
他の実施形態では、前記発現ベクター又はそのセット若しくはライブラリは、細胞集団に導入され、内因性ＲＮＡポリメラーゼによって転写される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００９３】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物の発現ベクターは、既知の機能のＲＮＡｉ分子をエンコードする遺伝子をさらに含む。
【００９４】
他の実施形態では、発現ベクターのセット若しくはライブラリは、組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリである。他の実施形態では、発現ベクターのセットは、組換え型ウイルスとしてパッケージされる。他の実施形態では、発現ベクターの各セット若しくはライブラリのコピーは、組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリとしてパッケージされる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００９５】
発現ベクターの各種類は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００９６】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物によって得られるＲＮＡ分子を消化することによって、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子が生成される。他の実施形態では、前記消化は標的細胞の内部で行われる。他の実施形態では、前記消化はエンドヌクレアーゼによって行われる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００９７】
他の実施形態では、本明細書中の実施例６〜７及び１０〜１６に例示するように、本発明は、目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼすことができるＲＮＡ分子を同定する方法を提供する。当該方法は、（ａ）細胞集団に本発明に係る前記発現ベクターのセット若しくはライブラリを接触させることによって、前記組換え型発現ベクターのセット若しくはライブラリ又はその一部が前記細胞集団の個々の細胞に取り込まれるようにするステップと、（ｂ）前記細胞集団における前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとを含み、前記細胞集団の特定細胞が前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値について変化を示す場合は、前記特定の細胞が、前記目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす特定のＲＮＡ分子をエンコードする特定の組換え型発現ベクターを含有すると判断する。
【００９８】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、既知の又は十分理解された作用機序によって機能する。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、前記ＲＮＡ分子の発見後にのみ十分理解された機序によって機能する。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、未知の機序によって機能する。他の実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、前記ＲＮＡ分子の機序の知識又は理解を必要としない。したがって、完全に機能に基づいたスクリーニング、或いはスクリーニングされた配列からバイアスを実質的に除去又は減少させることができる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【００９９】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、生物活性を有することが認められた特定の発現ベクター若しくはその断片が単離又は増幅され、その後、ベクター若しくはその断片が配列決定される。他の実施形態では、前記断片は、特定のＲＮＡ分子に対するコード配列を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１００】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、本明細書の実施例８に例示するように、さらなる細胞に特定の発現ベクターを接触させ、その後、前記さらなる細胞において目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測する。
【０１０１】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、生物活性を有することが認められた特定のＲＮＡ分子のコピーが生成され、さらなる細胞に特定のＲＮＡ分子のコピーを接触させ、その後、前記さらなる細胞において目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測する。
【０１０２】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、本明細書の実施例８に例示するように、生物活性を有することが認められた特定のＲＮＡ分子又はその断片をエンコードする配列が第２の発現ベクターバックボーンに挿入又はサブクローンし、それによって、（ｉ）特定のＲＮＡ分子、或いは（ｉｉ）特定のＲＮＡ分子の改変型のいずれかをエンコードする第２の発現ベクターを生成する。他の実施形態では、さらなる細胞に第２の発現ベクターを接触させ、その後、前記さらなる細胞において目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測する。
【０１０３】
他の実施形態では、特定のＲＮＡ分子の改変型は、特定のＲＮＡ分子のランダム配列領域と相同性を共有する領域を含む。他の実施形態では、特定のＲＮＡ分子の改変型の前記相同性共有領域は二本鎖である。他の実施形態では、前記相同性共有領域は一本鎖である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０４】
他の実施形態では、特定のＲＮＡ分子のｄｓ配列及び前記特定のＲＮＡ分子の改変型のｄｓ配列は、少なくとも７０％の相同性を共有する。他の実施形態では、この２つの配列は少なくとも７５％の相同性を共有する。他の実施形態では、この２つの配列は少なくとも８０％の相同性を共有する。他の実施形態では、この２つの配列は少なくとも８５％の相同性を共有する。他の実施形態では、この２つの配列は少なくとも９０％の相同性を共有する。他の実施形態では、この２つの配列は少なくとも９５％の相同性を共有する。他の実施形態では、この２つの配列は少なくとも９７％の相同性を共有する。他の実施形態では、特定のＲＮＡ分子の改変型は、特定のＲＮＡ分子のｄｓ領域と同じｄｓ領域を含む。他の実施形態では、第２の発現ベクターバックボーンは、１回目のスクリーニングで使用された発現ベクターバックボーンとは異なる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０５】
他の実施形態では、本明細書中の実施例１７に例示するように、本発明に係る方法は、ａ．生物活性を有することが認められた特定の発現ベクター、その挿入部位、又はその断片を単離又は増幅させるステップと（１回目の選択）、ｂ．前記発現ベクターに含まれるランダム配列の二本鎖領域をエンコードする領域を有する前記特定の発現ベクターの断片を突然変異させ、そのことによって、前記ランダム配列領域の変異型を含むヌクレオチド分子のサブライブラリを作成するステップと、ｃ．前記サブライブラリを発現ベクター内へ挿入又はサブクローンし、そのことによって、発現ベクターのサブライブラリを作成するステップと、ｄ．第２の細胞集団に、前記発現ベクターのサブライブラリを接触させ（２回目の選択）、そのことによって、前記発現ベクターのサブライブラリ又はその一部が前記第２の細胞集団に取り込まれるようにするステップと、ｅ．前記第２の細胞集団における前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとを含む。この実施形態では、前記第２の細胞集団の特定の細胞における前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値がさらに変化した場合は、前記特定の細胞が改良された発現ベクターを含有すると判断する。この方法の他の実施形態では、前記サブライブラリにおけるＲＮＡ分子のいくつかは、ランダム配列領域の２つの相補鎖の間に１つ以上のミスマッチを含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０６】
他の実施形態では、前記突然変異を発生させる前記ステップは、前記特定の発現ベクターの断片を低忠実度な方法によってコピーするステップを含む。他の実施形態では、前記 突然変異した配列は、コンピューターを使用して生成される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０７】
他の実施形態では、前記突然変異生成は、コンピューター的方法を用いて実施される。他の実施形態では、前記コンピューター的方法は、同定されたＲＮＡｉ分子の各可能な単一突然変異の生成を含む。他の実施形態では、二重突然変異もまた生成される。他の実施形態では、三重突然変異もまた生成される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０８】
他の実施形態では、ＲＮＡｉのｄｓ部分において突然変異を残基に導入する場合は、対応する突然変異を相補残基に導入することにより、塩基対合が維持される。他の実施形態では、対応する突然変異は導入されない。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１０９】
他の実施形態では、ＲＮＡ分子をエンコードする全配列は、突然変異させられる。他の実施形態では、二本鎖領域の両方の鎖が突然変異させられる。他の実施形態では、二本鎖領域の一本鎖（「ハーフブック（half-book）」）が突然変異させられる。他の実施形態では、二本鎖領域の一本鎖の一部が突然変異させられる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１０】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、生物活性を有するＲＮＡｉ分子の１つ以上の推定標的ｍＲＮＡを同定するステップと、前記標的とより強力に結合することが予測される配列のサブライブラリを作成するステップとをさらに含む。他の実施形態では、前記サブライブラリは、前記予測標的の１つとより強力に結合することが予想される配列を有する。他の実施形態では、前記サブライブラリは、前記予測標的の一部とより強力に結合することが予想される配列を有する。他の実施形態では、前記サブライブラリは、前記予測標的の大部分と強力に結合することが予想される配列を有する。他の実施形態では、前記サブライブラリは、前記予測標的の１つ又は一部と、前記予測標的の他の部分と比較してより優れた選択的な結合を示すと予想される配列を有する。他の実施形態では、前記サブライブラリ内での、ＲＮＡｉ分子の標的への結合は、当該技術分野で周知の方法を用いて、インビトロＲＮＡｉ分析によって直接的に試験される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１１】
ＲＮＡｉ分子の推定上の標的ｍＲＮＡのための方法は、当該技術分野で公知であり、他の実施形態では、コンピュータプログラムを含む。他の実施形態では、前記プログラムは、「miRanda (Enright AJ, John B, Gaul U, Tuschl T, Sander C, Marks DS. MicroRNA targets in Drosophila.Genome Biol 2003;5(l):Rl)」である。他の実施形態では、前記プログラムは、「miRGen (M. Megraw, P.Sethupathy, B. Corda, and A.G. Hatzigeorgiou (2006). Nucleic Acids Res, 35: Dl 49-Dl 55)」である。他の実施形態では、前記プログラムは、「TargetScan (Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Cell, 120:15-16 (2005))」である。他の実施形態では、前記プログラムは、「MiRscan (Lim, LP, Lau, NC, Weinstein, E, Abdelhakim, A, Yekta, S, Rhoades, MW, Burge, CB and Bartel, DP (2003). The microRNAs of Caenorhabditis elegans. Genes & Dev. 17, 991)」である。他の実施形態では、前記プログラムは、「PicTar (Krek et al, Nature Genetics 37:495-500 (2005))」である。他の実施形態では、前記プログラムは、「Microlnspector (Rusinov V,Baev V, Minkov IN, Tabler M. Nucleic Acids Res 2005;33: W696-700)」である。他の実施形態では、前記プログラムは、当該技術分野で公知の任意の他の適切なコンピュータプログラムである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１２】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、上記の方法において、さらなる細胞又は細胞集団に、生物活性を有することが認められた特定の発現ベクターを接触させるステップと、前記さらなる細胞における前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとを含み、前記さらなる細胞における前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値がさらに変化した場合は、前記発現ベクターによってエンコードされたＲＮＡ分子の効果が確認される。他の実施形態では、前記挿入配列は、前記細胞集団から単離される。他の実施形態では、前記１回目の選択において生物活性を示すことが認められた前記ＲＮＡ分子用のコード配列を含む断片は、前記発現ベクターから切除又は増殖、或いは、配列決定後にデノボ合成され、同一又は別の発現ベクター内にサブクローンされ、その後、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するさらなる細胞への接触に使用される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１３】
各種のベクターにおいて（１）二本鎖領域を含むＲＮＡ分子を修飾し、（２）二本鎖領域を含むＲＮＡ分子を発現する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、「Palliser D et al (An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection. Nature.2006 Jan 5;439(7072): 89-94)」に記載されている。各方法は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１４】
他の実施形態では、２回目の後に、１回以上のさらなる増菌が行われる。他の実施形態では、２回以上の増菌の使用により、真陽性クローンの割合を増加させる。他の実施形態では、増菌の複数回の使用により、真陽性クローンの割合を増加させる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１５】
他の実施形態では、１回目の選択で用いられる発現ベクターは、統合ベクターである。他の実施形態では、前記統合ベクターは、その効果の不可逆性から、真陽性の同定を容易にする。
【０１１６】
他の実施形態では、２回目又はそれ以降の回の選択において使用される異なる発現ベクターは、１回目の選択において同定されたものとは異なる形態のＲＮＡ分子（他の実施形態では、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡ）を産出する。その後、前記ＲＮＡ分子自体の異なる形態（他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ）をさらなる細胞に接触させ、目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測する。他の実施形態では、前記さらなる細胞にＲＮＡ分子自体を接触させることにより、標的細胞の大多数（他の実施形態では、高いパーセンテージ）においてＲＮＡ分子によって付与される表現型の観察が容易となる。他の実施形態では、前記表現型は、２回目又はそれ以降の回の増菌を行った際に、前記細胞の６０％以上で観察される。他の実施形態では、前記表現型は、前記細胞の７０％以上で観察される。他の実施形態では、前記表現型は、前記細胞の８０％以上で観察される。他の実施形態では、前記表現型は、前記細胞の９０％以上で観察される。他の実施形態では、前記表現型は、前記細胞の９５％以上で観察される。他の実施形態では、前記表現型は、前記細胞の９７％以上で観察される。他の実施形態では、前記表現型は、前記細胞の９９％以上で観察される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１７】
他の実施形態では、２回目又はそれ以降の回の選択において使用されるＲＮＡ分子の異なる形態は、可逆的な方法でその効果を発揮する。他の実施形態では、本発明に係る方法における阻害性ＲＮＡの可逆的形態の使用は、ＲＮＡ分子の効果のさらなる実験的な研究（他の実施形態では、ＲＮＡ分子の効果の時間的な研究）、又はＲＮＡ分子の除去によるその効果の逆転又は停止の観察を可能にする。他の実施形態では、誘導性又は抑制性プロモータを有する発現ベクターが、ＲＮＡｉの可逆的形態に代わるものとして用いられる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１１８】
他の実施形態では、本明細書の実施例１７に例示するように、ランダム配列の二本鎖領域をエンコードする領域の第１の半分のみ（すなわち、ランダム配列の二本鎖領域の一方の鎖をエンコードする領域、すなわち「ハーフブック」）が、オリジナルの一本鎖ＤＮＡ鋳型に使用される第１及び第２の定常領域の間に置かれ、低忠実度な方法によってコピーされ、それによって、上記方法のうちの１つによってｓｈＲＮＡ発現サブライブラリを作成するために使用されるハーフブックのサブライブラリを作成する。その後、前記サブライブラリは、本発明に係る方法によって生物学的パラメータを検査する。
【０１１９】
他の実施形態では、上記した突然変異生成方法及び／又は低忠実度でコピーする方法のうちの１つが、上記ライブラリを生成する方法のうちの１つに記載されている先行ステップなしに実行される。この実施形態では、上記方法は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１２０】
他の実施形態では、改良された発現ベクターは、目的とする生物学的パラメータに対して、初めに同定された特定のＲＮＡ分子よりも影響を及ぼす改良されたＲＮＡ分子をエンコードする。他の実施形態では、前記改良された発現ベクターは、当初同定されたＲＮＡ分子よりも高い組織特異性を示す。他の実施形態では、前記改良された発現ベクター又はそれによってエンコードされる対応するＲＮＡ分子の必要とされる供与量は、当初同定されたＲＮＡ分子よりも少ない。他の実施形態では、前記改良された発現ベクターは、当初同定されたＲＮＡ分子と比べて、当該技術分野で既知の任意の他の改良された性質を示す。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１２１】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、上記方法によって同定された改良された発現ベクター、その挿入部位又はその断片は単離又は増幅される。他の実施形態では、前記改良された発現ベクター又はその断片が配列決定される。前記断片は、前記改良されたＲＮＡ分子のためのコード配列を含む。他の実施形態では、さらなる細胞に、改良された発現ベクター、そのエンコードされたＲＮＡ、又は、別種のＲＮＡ分子であって同一又は相同の二本鎖領域を有するものに接触させ、さらなる細胞において目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１２２】
本発明に係る方法において用いられる低忠実度でコピーする方法は、他の実施形態では、ＰＣＲ（例えば、変異性ＰＣＲ）によるランダムな突然変異生成である。他の実施形態では、当該方法は、縮重オリゴヌクレオチドを用いた突然変異生成である。他の実施形態では、当該方法は、リンカースキャン（linker-scanning）による突然変異生成である。他の実施形態では、当該方法は、当該技術分野で既知の任意の他の突然変異生成方法である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１２３】
他の実施形態では、本明細書中の実施例１８に例示するように、本発明は、目的とする疾患又は障害を標的にする同定する方法であって、（ａ）前記目的とする疾患又は障害により変化する前記目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼすＲＮＡ分子を本発明に係る方法によって同定するステップと、（ｂ）その発現が前記ＲＮＡ分子によって変化する細胞ＲＮＡ分子を同定するステップとを含み、それによって、前記細胞ＲＮＡ分子を、前記目的とする病又は疾患のための薬剤標的として同定するようにした方法を提供する。
【０１２４】
他の実施形態では、本明細書中の実施例１７に例示するように、本発明は、前記目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす改変された能力を有するＲＮＡ分子変異体を同定する方法を提供する。
当該方法は、
ａ．前記ＲＮＡ分子をエンコードする核酸分子を低忠実度な方法により複製し、それによって、前記ＲＮＡ分子の変異体を含むヌクレオチド分子のサブライブラリを作成するステップと、
ｂ．前記サブライブラリを発現ベクターのバックボーンにサブクローンし、それによって、発現ベクターのサブライブラリを作成するステップと、
ｃ．細胞集団に、前記発現ベクターのサブライブラリを接触させ、それによって、前記発現ベクターのサブライブラリ又はその断片が前記細胞集団に取り込まれるようにするステップと、
ｄ．前記細胞集団における前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値を測定又は計測するステップとを含む。
他の実施形態では、この方法により、前記細胞集団の特定の細胞が、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値について変化を示す場合は、前記特定の細胞が、前記目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす改変された能力を有する特定のＲＮＡ分子をエンコードする特定の発現ベクターを含有すると判断する。他の実施形態では、前記変異体の二本鎖領域の２つのストランドは、互いに相補的である。他の実施形態では、前記２つのストランドは、互いに１つ以上のミスマッチを含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１２５】
他の実施形態では、本発明は、目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす能力を有する改変されたＲＮＡ分子であって、本発明に係る方法によって同定された改変されたＲＮＡ分子を提供する。
【０１２６】
本発明に係る方法の他の実施形態では、目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす前記改変された能力は、オリジナルのＲＮＡ分子に対して改変される。
【０１２７】
「改変された」なる語は、ある実施形態では効力が増大したことを指す。他の実施形態では、この語は、効力が減少したことを指す。他の実施形態では、この語は、組織特異性が増大したことを指す。他の実施形態では、前記変異体は、生物学的半減期の増大を示す。他の実施形態では、前記変異体は、生物学的半減期の減少を示す。他の実施形態では、前記変異体は、生体利用効率が増大したことを示す。他の実施形態では、前記変異体は、任意の他の生物学的又は目的とする治療パラメータにおいて、初期のＲＮＡ分子に対して改変される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１２８】
他の実施形態では、発現ベクターのバックボーンに挿入されない、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子のライブラリが、本発明に係る方法によって生成される。他の実施形態では、本明細書中に列挙した、組換え型発現ベクターのセットを生成する全ての実施形態に対して、必要に応じて、この方法を適用することができる。他の実施形態では、前記ライブラリはその後、ＲＮＡ分子をスクリーニングするために使用される。他の実施形態では、本発明は、この方法によって生成されたＲＮＡ分子のライブラリを提供する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１２９】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を含むＲＮＡ分子の発現ベクターであって、本発明に係る方法によって生成された発現ベクターを提供する。
【０１３０】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を含むＲＮＡ分子の発現ベクターであって、本発明に係る方法によって同定された発現ベクターを提供する。
【０１３１】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る発現ベクターによってエンコードされたＲＮＡ分子を提供する。
【０１３２】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る発現ベクターによって生成されたＲＮＡ分子を提供する。
【０１３３】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を含むＲＮＡ分子であって、本発明に係る方法によって同定されたＲＮＡ分子を提供する。
【０１３４】
他の実施形態では、本発明は、ウイルス感染に対する耐性を細胞に付与する方法であって、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を前記細胞に接触させるステップを含み、そのことによって、ウイルス感染に対する耐性を細胞に付与するようにした方法を提供する。
【０１３５】
他の実施形態では、本発明は、ウイルスの対象内での複製能力を抑制又は阻害する方法であって、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を前記対象に接触させるステップを含み、そのことによって、ウイルスの対象内での複製能力を抑制又は阻害するようにした方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、ウイルスの細胞内への侵入を抑制又は阻害する方法であって、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を前記対象に接触させるステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記発現ベクター又はＲＮＡ分子は、前記細胞内でウイルス受容体を下方制御する。他の実施形態では、前記発現ベクター又はＲＮＡ分子は、ウイルス複製に必要なタンパク質を下方制御する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１３６】
他の実施形態では、本発明は、細胞の目的とする細胞型への分化を誘導する方法であって、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を前記細胞に接触させるステップを含み、それによって、細胞の目的とする細胞型への分化を誘導するようにした方法を提供する。
【０１３７】
「目的とする細胞型への細胞の分化」なる語は、他の実施形態では、完全な分化を指す。他の実施形態では、この語は部分的な分化を指す。「目的とする細胞型」なる語は、他の実施形態では、治療又は研究用途に必要とされる細胞型を指す。他の実施形態では、この語は、治療又は研究用途に必要とされる細胞型の前駆体である中間体、又は部分的に異なる細胞型を指す。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１３８】
他の実施形態では、本発明は、細胞の長期増殖を誘導する方法であって、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を前記細胞に接触させるステップを含み、それによって、細胞の目的とする細胞型への分化を誘導するようにした方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、細胞の多分化能を維持する方法であって、本発明に係る発現ベクター又はＲＮＡ分子を前記細胞に接触させるステップを含み、それによって、細胞の多分化能を維持するようにした方法を提供する。
【０１３９】
各治療又は予防方法は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１４０】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、特定の組換え型発現ベクター又はそれによってエンコードされたＲＮＡ分子であって、本発明に係る方法によって選択された特定の組換え型発現ベクター又はそれによってエンコードされたＲＮＡ分子を使用する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１４１】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子を生成する発現ベクターのセット若しくはライブラリであって、本発明に係る方法によって生成された発現ベクターのセット若しくはライブラリを提供する。
【０１４２】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子を生成する組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリであって、本発明に係る方法によって生成された組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリを提供する。
【０１４３】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有し、目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼす能力を有するＲＮＡ分子の発現ベクターであって、本発明に係る方法によって同定されたＲＮＡ分子の発現ベクターを提供する。
【０１４４】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、本明細書に記載されているように、低忠実度な改良方法によってベクターの挿入部位又は前記挿入部位の断片のコピーを生成した後に、２回目のスクリーニングによって同定された改良されたベクターを使用する。
【０１４５】
本明細書中の実施例で使用される特定の制限酵素、制限部位、ベクターなどは、本発明の単なる実施形態にすぎない。本明細書中に開示した方法に従って、任意の適切な制限酵素、制限部位、ベクターなどを使用することができる。各酵素、制限部位、ベクターなどは、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１４６】
本発明に係る方法の他の実施形態では、上記した第２及び／又は第３の認識部位は、第１の一本鎖ＤＮＡ分子からの配列に完全に由来するのではなく、むしろ、ヘアピン状のＤＮＡ分子からその配列の全て又は一部を得る。
【０１４７】
他の実施形態では、本発明は、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子を生成する方法を提供する。
当該方法は、
ａ．第１の一本鎖ＤＮＡ分子を得るステップであって、
前記第１の一本鎖ＤＮＡ分子が、５´末端から３´末端への順に、
（ｉ）二本鎖形態の場合に第１の制限酵素の基質となる第１の認識部位を有し、１つ以上のアデニンで終端される第１の定常領域、
（ｉｉ）ランダム配列領域、及び
（ｉｉｉ）二本鎖形態の場合に第２の制限酵素の基質となる第２の認識部位を有する第２の定常領域を有する該ステップと、
ｂ．前記第２の定常領域に第１のプライマーをアニールするステップであって、
（ｉ）前記第１のプライマーが、前記第２の定常領域に対するミスマッチを含む、
（ｉｉ）前記第１のプライマーが、二本鎖形態の場合に、第２の制限酵素の基質とならない、
（ｉｉｉ）前記第１のプライマーが、二本鎖形態の場合に、第３の制限酵素の基質となる、及び
（ｉｖ）前記第２の定常領域が、二本鎖形態の場合に、第３の制限酵素の基質とならない、該ステップと、
ｃ．前記第１のプライマーを伸長させ、それによって、前記第１の一本鎖ＤＮＡ分子、並びに前記ランダム配列領域及び前記第１の定常領域の逆相補鎖を有する第２の一本鎖ＤＮＡ分子を含む二本鎖中間体ＩＢを生成するステップと、
ｄ．ヘアピン状のＤＮＡ分子を前記第１の一本鎖ＤＮＡ分子の３´末端及び前記第２の一本鎖ＤＮＡ分子の５´末端に連結し、それによって、前記二本鎖中間体ＩＢをヘアピン状の中間体ＩＩに変換するステップと、
ｅ．第２のプライマーを前記第１の定常領域の前記逆相補鎖にアニールするステップであって、
（ｉ）前記第２のプライマーが、前記第１の定常領域の前記逆相補鎖に対するミスマッチを含む、及び
（ｉｉ）前記第２のプライマーが、二本鎖形態の場合に、第１の制限酵素の基質とならない、該ステップと、
ｆ．前記第２のプライマーを伸長させ、それによって、ヘアピン状の中間体ＩＩ及び第３の一本鎖ＤＮＡ分子を含む二本鎖中間体ＩＩＩを生成するステップと、
ｇ．前記前記二本鎖中間体ＩＩＩを前記第１の制限酵素で消化し、それによって、前記第１の一本鎖ＤＮＡ分子に対応するストランド上に１つ以上のアデニンを有さない二本鎖中間体ＩＶを生成するステップと、
ｈ．前記二本鎖中間体ＩＶを、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する線状ベクターバックボーンに連結し、それによって、環状中間体Ｖを生成するステップと、
ｉ．前記環状中間体Ｖを前記第２及び第３の制限酵素で消化し、それによって、線状中間体ＶＩを生成するステップと
ｊ．前記線状中間体ＶＩを分子内で連結し、それによって、ランダム配列の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の発現ベクターを生成するステップを含む。
【０１４８】
他の実施形態では、上記の方法は、図３〜５に示したようにして実施される。
【０１４９】
他の実施形態では、本発明のベクターによって発現されるＲＮＡ分子は、その長さの一部に沿って自己相補的である。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、その全長に沿って自己相補的である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５０】
「その長さの一部に沿って自己相補的」なる語は、他の実施形態では、その分子の別の領域とハイブリダイズする領域を有するＲＮＡ分子を指す。
他の実施形態では、前記領域は、前記分子の他の領域に完全に相補的である。他の実施形態では、第１の領域は、他の領域に対してミスマッチを有する。他の実施形態では、前記第１の領域は、他の領域に対して２つ以上のミスマッチを有する。他の実施形態では、第１の領域は、他の領域に対して欠失を有する。他の実施形態では、前記欠失は、細胞酵素によって認識される内部ループをもたらす。他の実施形態では、前記第１の領域は、他の領域に対するオーバーハング又は付着末端を有する。他の実施形態では、前記第１の領域及び他の（相補的な）領域は、非相補的リンカー又は介在領域によって分離されている。他の実施形態では、前記非相補リンカー領域は、ループ構造を形成する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５１】
「その全長に沿って自己相補的」なる語は、他の実施形態では、オーバーハング又はリンカー／介在領域を欠失している二本鎖ＲＮＡ分子を指す。他の実施形態では、前記二本鎖ＲＮＡ分子は、完全に自己相補的である。他の実施形態では、前記二本鎖ＲＮＡ分子は、ミスマッチを有する。他の実施形態では、前記二本鎖ＲＮＡ分子は、２つ以上のミスマッチを有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５２】
本発明の部分的に自己相補的なＲＮＡ分子は、他の実施形態では、図１の下部に示されているような、介在性ループ形成領域（「ループ」）を有する自己相補領域（「ステム」）を含む。
【０１５３】
他の実施形態では、本発明の部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の介在配列は、ランダム配列及び相補配列が互いにアニールシタ場合、ループ構造を形成する。本発明に係る方法の他の実施形態では、前記ループ形成領域はパリンドロームではない。他の実施形態では、前記ループ形成領域は自己相補的ではない。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５４】
他の実施形態では、本発明のベクターによって発現されるＲＮＡ分子は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は小型阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。他の実施形態では、ＲＮＡ分子はａｇＲＮＡ（抗原ＲＮＡ）である。「ａｇＲＮＡ」は、他の実施形態では、ｍＲＮＡとの相互作用及び遺伝子転写のサイレンシングをすることができる二本鎖ＲＮＡを指す。他の実施形態では、ＲＮＡ分子はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。他の実施形態では、ＲＮＡ分子はアンチセンスＬＮＡ（locked-nucleic acid）オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は、「Banan M et al (The ins and outs of RNAi in mammalian cells. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Oct;5(5):441-50)」に列挙又は記載された任意の種類の阻害性ＲＮＡである。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は、当該技術分野で公知の任意の種類のＲＮＡｉである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５５】
他の実施形態では、ｓｓ中間体Ｉの第２の定常領域の第１の残基は、本発明の組換え型発現ベクターによって産生されるｄｓ ＲＮＡにおいてループ配列に隣接する相補的なヌクレオチド対の同一性を判定する。他の実施形態では、本発明に係る方法は、第１の一本鎖ＤＮＡ分子の４セットについて繰り返されるが、ここで、第２の定常領域は４つのグループにおいて４つの異なるヌクレオチドから始まる。他の実施形態では、前記４つのプールを組み合わせて、「ステム」の残基が全てランダム化されたライブラリを作成する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５６】
本発明に係る方法の他の実施形態では、プライマーにおけるミスマッチな残基（あるいは、２つ以上であれば、３´末端に最も近いミスマッチ）は、プライマーの３´末端から１ヌクレオチド（ｎｔ）離れている。他の実施形態では、前記距離は２ｎｔ又はそれ以下である。他の実施形態では、前記距離は３ｎｔ又はそれ以下である。他の実施形態では、前記距離は４ｎｔ又はそれ以下である。他の実施形態では、前記距離を最小にすることにより、プライマーに由来する（それゆえに一定である）ＲＮＡ分子のステムにおける配列の量を減少させる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５７】
「発現ベクター」なる語は、他の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子を発現する手段を指す。他の実施形態では、前記発現ベクターはプラスミドである。他の実施形態では、前記ベクターは組換え型ウイルスベクターである。他の実施形態では、前記ベクターは組換え型細菌ベクターである。他の実施形態では、前記ベクターは裸のＤＮＡベクターである。他の実施形態では、前記ベクターは、自己複製核分子又はそれを含むウイルスであって、本発明のＲＮＡ分子を発現することができるものである。他の実施形態では、前記ベクターは、当該技術分野で既知の任意の他のベクターである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１５８】
組換え型ベクターを作成及び使用する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、「Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 及び Brent et al. (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) 」に記載されている。
【０１５９】
本発明に係る方法の他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物の発現ベクターは組換え型ウイルスである。本発明に係る方法の他の実施形態では、前記発現ベクター又はそのコピーは、組換え型ウイルスとしてパッケージすることができる。他の実施形態では、本発明の組換え型ＲＮＡ分子は、組換え型ウイルスとしてパッケージすることができる。他の実施形態では、前記パッケージングはパッケージング細胞株を使用する。他の実施形態では、多くのランダム配列の領域を含むＲＮＡ分子をエンコードする、前記発現ベクターのライブラリが、本発明に係る又は本発明に係る方法を包含する方法によって生成される。他の実施形態では、前記ライブラリは、レトロウイルス形態（例えば、ベクターのＤＮＡ形態を生成するように形質導入時に逆転写されるＲＮＡの形態）である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６０】
本発明に係る方法の他の実施形態では、前記発現ベクターは、ベクターを試験及び／又は同定するために使用される細胞集団内の細胞のゲノムに組み込まれる。他の実施形態では、前記発現ベクターは、前記標的細胞のゲノムに組み込まれる（例えば治療用に使用するために）。他の実施形態では、前記発現ベクターは、細胞集団内の細胞にエピソーム的に組み込まれる。他の実施形態では、前記発現ベクターは、染色体外ベクターとして細胞集団内の細胞に組み込まれる。他の実施形態では、前記発現ベクターを保持する細胞を選択するために、薬剤耐性遺伝子が用いられる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６１】
本発明に係る方法の他の実施形態では、本明細書の実施例１〜２に例示するように、本発明に係る方法に使用される発現ベクターは、マーカータンパク質（例えば、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））、又は強化ファルネシル化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰｆ）をエンコードする遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、その後のステップ（例えばライブラリスクリーニング又は選択方法）において、形質移入又は形質導入された細胞の検出にマーカータンパク質が使用される。
【０１６２】
他の実施形態では、前記発現ベクターは、目的とする表現型を与えるタンパク質をエンコードする遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、前記遺伝子は、疾患表現型を与える。他の実施形態では、前記発現ベクターは、疾患又は疾患表現型を改善、軽減又は治療する治療ＲＮＡ分子を同定するために使用される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６３】
本発明に係る方法の他の実施形態では、前記発現ベクターは、阻害性ＲＮＡ分子（他の実施形態では、既知の機能の短鎖干渉性（ｓｉＲＮＡ）分子）をエンコードする遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、既知の機能の阻害性ＲＮＡ分子は、ライブラリによりスクリーニングされる細胞上で表現型（他の実施形態では、目的とする疾患の表現型）を与えるために使用される。他の実施形態では、外因的に加えられるｓｉＲＮＡ分子が、表現型を与えるために使用される。他の実施形態では、前記ライブラリが、既知の機能の阻害性ＲＮＡ分子によって与えられる目的とする表現型又は疾患を治療するＲＮＡ分子を同定するために使用される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６４】
他の実施形態では、２つのＲＮＡｉ分子（既知の機能のＲＮＡｉ、及びランダム配列の二本鎖領域を含むＲＮＡ分子）が、２つのＨ１プロモータカセットによってエンコードされる。他の実施形態では、前記２つのＨ１プロモータカセットは、互いに独立的にベクターにサブクローニングすることができる。他の実施形態では、前記２つのＨ１プロモータカセットの一方が、ランダム配列の二本鎖領域を含む。他の実施形態では、前記ランダム配列の二本鎖領域を含むカセットが、上記した方法のうちの１つを用いて生成される。他の実施形態では、前記２つのＲＮＡｉ分子が、当該技術分野で既知の任意の他の方法を用いて発現される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。 
【０１６５】
発現ベクターの各種類は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６６】
本発明に係る方法の他の実施形態では、環状中間体の非対称消化は、それによって生成された線状中間体の２つの端部において第２の定常領域の第１及び第２のコピーの不等部分をもたらす。他の実施形態では、前記不等部分は、前記ループ配列が非自己相補的となることを可能にする。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６７】
本発明に係る方法の他の実施形態では、線状化されたベクターバックボーンに存在するＲＮＡポリメラーゼのプロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。他の実施形態では、前記プロモータは、ＨＩプロモータである。他の実施形態では、前記プロモータは、Ｕ６プロモータである。他の実施形態では、前記プロモータは、ｓｈＲＮＡ発現に適したプロモータである。他の実施形態では、前記プロモータは、当該技術分野で周知の任意の他のＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６８】
本発明に係る方法の他の実施形態では、前記発現ベクター内の前記プロモータは、発現プラスミドにおけるランダム配列領域の開始位置の２５ｎｔ上流である。他の実施形態では、１つ以上の連続したピリミジン（例えば４つ）は、前記発現プラスミドにおける転写開始部位の直前にある。他の実施形態では、ストリングは２つのピリミジンからなる。他の実施形態では、ストリングは３つのピリミジンからなる。他の実施形態では、ストリングは４つのピリミジンからなる。他の実施形態では、ストリングは５つのピリミジンからなる。他の実施形態では、ストリングは異なる数のピリミジンからなる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１６９】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、前記発現ベクター又は発現ベクターのセット若しくはライブラリをＲＮＡポリメラーゼに接触させるステップを含み、それによって、前記ＲＮＡ分子又はそのライブラリを作成するようにする。他の実施形態では、前記接触させるステップは、リボヌクレオチド前駆体の存在下で行われる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１７０】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、ランダム配列のセットと共に、本発明のＲＮＡ分子の発現ベクターを生成する方法を複数回行い、それによって、発現ベクターのセット若しくはライブラリを作成するステップをさらに含む。他の実施形態では、本発明に係る方法は、組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリとして、前記発現ベクターのセット若しくはライブラリをパッケージするステップをさらに含む。他の実施形態では、前記発現ベクターのセット若しくはライブラリは、組換え型ウイルスのセット若しくはライブラリである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１７１】
他の実施形態では、発現ベクターのセット若しくはライブラリをパッケージするために用いられる組換え型ウイルスは、組換え型レトロウイルスである。他の実施形態では、組換え型ウイルスは組換え型レンチウイルスである。他の実施形態では、組換え型ウイルスは組換え型アデノウイルスである。他の実施形態では、組換え型ウイルスは、「Wadhwa R他、Vectors for RNA interference. Curr Opin MoI Ther. 2004 Aug;6(4):367-72」の文献に列挙又は記載されたベクター由来である。他の実施形態では、組換え型ウイルスは、実施形態では、組換え型ウイルスは、真核細胞を感染又は形質導入する能力を有する当該技術分野で周知の任意の他の種類のウイルスに由来する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１７２】
他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、幹細胞からの、再増殖力を有する細胞型の誘導である。他の実施形態では、前記幹細胞から誘導される前記細胞型は、造血幹細胞である。他の実施形態では、前記細胞から誘導される前記細胞型は、長期間の再増殖能力を有する。他の実施形態では、誘導された前記細胞型は、当該技術分野で周知の他の再増殖力を有する細胞型である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１７３】
他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、定義された悪条件下での細胞（分析に使用される前記細胞、或いは生体関連標的細胞）の生存能力である。他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、定義された悪条件下での細胞の増殖維持能力である。他の実施形態では、前記条件は、野生型細胞にとっては致死にならないが、疾患モデルの細胞（例えば、突然変異を含む細胞、又は、タンパク質若しくは酵素の発現が例えば阻害性ＲＮＡによって阻害された細胞）にとっては致死になるような条件である。
【０１７４】
他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、病原体、毒、毒発作に対する細胞（分析に使用される前記細胞、或いは生体関連標的細胞）の感受性である。他の実施形態では、前記毒又は毒発作は、酸化である。他の実施形態では、前記毒又は毒発作は、ストレスである。他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、病原体の存在にかかわらず前記細胞が生存することである。他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、細胞内での病原体の複製能力である。他の実施形態では、前記病原体は、細胞内病原体である。他の実施形態では、前記細胞内病原体は、ウイルスである。他の実施形態では、前記細胞内病原体は、細胞内細菌である。他の実施形態では、前記細胞内病原体は、当該技術分野で周知の任意の他の種類の細胞内病原体である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１７５】
他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、癌細胞（分析に使用される前記細胞、或いは生体関連標的細胞）を殺滅する能力である。前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、アポトーシス又はネクローシス誘導刺激に対して前記癌細胞を敏感にする能力である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１７６】
他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、目的とするタンパク質の発現又は発現レベルである。他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、目的とするｍＲＮＡの発現又は発現レベルである。
【０１７７】
他の実施形態では、病原体に対する感受性又は前記病原体の複製に対して影響を与える前記ＲＮＡ分子は、前記病原体に特異的な核酸とハイブリダイズする。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、前記病原体に使用される細胞核酸とハイブリダイズする。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、細胞防御機構を上方調節する。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、他の機構を介して機能する。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、未知の機構を介して機能する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１７８】
他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、前記細胞の目的とする細胞型への分化である。他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、前記細胞又は細胞型の未分化状態の維持である。他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、細胞の長期増殖を誘導する能力又は多分化能を維持する能力である。他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、幹細胞の未分化状態の維持である。
【０１７９】
前記目的とする細胞型は、他の実施形態では、心筋細胞、ニューロン、骨格筋細胞
肝細胞、皮膚細胞、尿細管上皮細胞、膵島細胞、糸球体細胞、内皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、Ｂ又はＴリンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、赤血球、樹枝状細胞、赤血球、甲状腺細胞、副腎細胞、巨核球である。他の実施形態では、前記目的とする細胞型は、疾患又は障害によって損傷を受けた任意の他の細胞である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８０】
他の実施形態では、「生物学的パラメータ」は、任意の測定可能な又は観察可能な細胞の遺伝子表現型を指す。前記表現型としては、例えば、形態学的特徴、分化状態、細胞サイクル特性、生化学的性質、又は他の表現型などがある。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８１】
他の実施形態では、前記目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値は、当該技術分野で周知の生物学的パラメータである。各生物学的パラメータ、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８２】
本発明に係る方法の標的となる前記細胞は、ある実施形態では、幹細胞である。他の実施形態では、前記細胞は、胚幹細胞である。他の実施形態では、前記細胞は、当該技術分野で周知の任意の他の種類の幹細胞である。他の実施形態では、前記細胞は、部分的に分化した細胞型である。他の実施形態では、前記細胞は、目的とする細胞型の前駆体である。他の実施形態では、前記細胞は、疾患表現型のモデルである。他の実施形態では、前記細胞は、大人の幹細胞である。他の実施形態では、前記細胞は、組織特異性の幹細胞である。他の実施形態では、前記細胞は、ウイルスに感染しやすい細胞型である。他の実施形態では、前記細胞は、当該技術分野で周知の任意の他の細胞である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８３】
他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子は、ある細胞型を他の細胞型に変換するのに使用される。
【０１８４】
目的とするタンパク質の発現を測定する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、ウェスタンブロット法や蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）などがある。目的とするｍＲＮＡの発現を測定する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、ノーザンブロット法などがある。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８５】
「読取値」なる語は、他の実施形態では、生物学的表現型を測定、評価、計測又は観察するための当該技術分野では既知の任意の手段を指す。他の実施形態では、この語は、生化学的分析、形態学的観察、細胞染色、細胞分取などを含む。他の実施形態では、読取値は、規定されたある条件下での生存である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８６】
他の実施形態では、サブセット又は複数の細胞が、測定される目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値における変化を示す。他の実施形態では、複数の細胞が、測定される目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値における変化を示す。他の実施形態では、前記細胞は、２つ以上の特定の発現ベクターを含む。他の実施形態では、前記細胞に含まれる前記特定の発現ベクター、その生物活性部位、その挿入部位又はその断片の各々を単離及び／又は配列決定し、それにより、目的とする生物学的パラメータ若しくはその読取値に影響を及ぼす２つ以上のＲＮＡ分子を同定する。
【０１８７】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、目的とする生物学的パラメータの変化を仲介する特定の発現ベクターを単離又は増幅するステップをさらに含む。他の実施形態では、前記特定の発現ベクターの挿入部位を、単離又は増幅する。他の実施形態では、前記特定の発現ベクターの断片を、単離又は増幅する。他の実施形態では、発現ベクター、挿入部位又は断片は、ＰＣＲによって増幅される。他の実施形態では、本発明に係る方法は、単離又は増幅される前記特定の発現ベクター、その挿入部位又はその断片を配列決定するステップをさらに含む。他の実施形態では、前記断片は、生物活性を有すると同定されたＲＮＡ分子（例えば、目的とする生物学的パラメータに影響を及ぼすＲＮＡ分子）のコード配列を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８８】
他の実施形態では、配列決定する前記ステップは、ＰＣＲによって生物活性を有するＲＮＡ分子のコード配列を増幅するステップ含む。他の実施形態では、ＰＣＲは、配列からのプライマーを、本発明のＲＮＡ分子のコード配列に隣接するベクターにおいて使用する。他の実施形態では、ＰＣＲは、組込型又は非組込型ベクターのいずれかにおいて実施することができる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１８９】
本発明に係る方法の他の実施形態では、ＰＣＲ産物の配列決定後に、前記産物のアリコートの端部がＰＣＲチューブ内で消化され、親ベクターにサブクローンして戻され、ｓｈＲＮＡ構築物、又は同一又は相同の二本鎖領域を有する対応するＲＮＡｉ分子、又は対応するＲＮＡｉ分子をエンコードする構築物（及び対照ｓｈＲＮＡ）が試験細胞に再び加えられる。この確認試験では、少数の個々の生存細胞ではなくて、細胞集団が比較される。この方法は、他の実施形態では、本発明のスクリーニング又は選択方法において、好ましくない偽陽性の発生を減少させる。
【０１９０】
他の実施形態では、本発明に係る方法で使用される制限酵素は、その認識配列の外側でその基質を切断する。他の実施形態では、前記切断は、前記認識配列の端部からの距離は、少なくとも１ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも２ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも３ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも４ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも５ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも６ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも７ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも８ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも９ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は少なくとも１０ｎｔである。他の実施形態では、前記切断は互い違いの切断であり、その閉鎖切断（closer cut）が上記の距離（前記認識部位の前記端部からの距離）の少なくとも１つである。他の実施形態では、前記距離は１０／１４ｎｔ（すなわち、一方の鎖では１０ｎｔ、他方の鎖では１４ｎｔ）である。他の実施形態では、前記距離は２５／２７ｎｔである。他の実施形態では、前記距離は、制限酵素で用いられる任意の他の距離である。他の実施形態では、その認識配列の外側を切断する制限酵素の使用により、第１の定常配列の３´末端上の５つ以上の連続したアデニンを除去することができる（ＤＮＡ分子の片方でのみ除去する）。他の実施形態では、そのような酵素の使用により、前記５つ以上の連続したアデニンの一部を除去することができる（ＤＮＡ分子の片方でのみ除去する）。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１９１】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、２つ以上の遺伝子を標的にする治療用ＲＮＡ分子の同定を可能にする。他の実施形態では、前記治療用ＲＮＡ分子は、既知のｃＤＮＡ配列と実質的に相同ではない（他の実施形態では、多くて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％相同である）。他の実施形態では、本発明に係る方法によって作成されるライブラリは、作成されたＲＮＡ分子のステム領域又は自己相補領域がランダムであるので、他の方法によって作成されるライブラリより利点を有する。他の実施形態では、前記利点は、任意の他の配列又は期待されるバイアスなしに、機能によって生成されるＲＮＡ分子をスクリーニングする能力である。他の実施形態では、前記利点は、ループ領域における自己相補性の欠如である。他の実施形態では、利点は、ステム領域の長さである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１９２】
他の実施形態では、生成されるランダム配列の数及び／又はスクリーニングされる細胞の数は、ＲＮＡ又はその断片のｄｓ領域の全ての可能な配列をカバーするようにデザインされる。例えば、全ての可能なシード配列（大体、前記ｄｓ領域の残基１〜８）をカバーするために、６５，５００配列を生成する必要がある。他の実施形態では、シード配列は、突然変異生成後に得られた前のＲＮＡ分子に基づいて定常に保持されるが、ｄｓ領域の残りは定常には変異が導入される。他の実験では、シード配列の残基２〜８が定常に維持され、残基１及び９前方が改変させられる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１９３】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、ライブラリ作成中に、アガロースゲルからのＤＮＡ断片のゲル精製のための市販キットにおいて見られるような、高塩溶液の使用を回避する。他の実施形態では、径サイズがＤＮＡより小さいの透析膜バッグ内にＤＮＡを溶出させるために、ゲル切片に電流が流される。他の実施形態では、当該方法は、ＤＮＡのエタノール沈殿をさらに含む。他の実施形態では、ライブラリ精製における全てのステップ（酵素消化を除く）は、０〜４℃で実施される。他の実施形態では、ライブラリ作成の間はずっとｐＨ緩衝液が存在する。他の実施形態では、ライブラリ作成中に、ブロモフェノールブルーの使用が避けられる。他の実施形態では、上記の予防措置のうちの１つが、ライブラリ作成中に分子内ヘアピンが形成される可能性を低下させる。他の実施形態では、本発明に係る方法中に導入されたように、ステムループカセットの両側上のフランキング配列が、後のステップにおける分子内ヘアピンの形成を防ぐ。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１９４】
他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子のステム又は自己相補領域の長さは、２７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１１ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１２ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１３ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１４ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２１ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２２ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２３ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２４ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、３０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、３０ｎｔ以上である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子は、３´にオーバーハングを持つ２９ｎｔの長さのステム又は自己自己相補領域を有する。他の実施形態では、前記オーバーハングの長さは、２ｎｔである。他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子は、３´にオーバーハングを持つ２７ｎｔの長さのステム又は自己自己相補領域を有する。他の実施形態では、前記オーバーハングの長さは、２ｎｔである。他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子は、３´にオーバーハングを持つ１９ｎｔの長さのステム又は自己自己相補領域を有する。他の実施形態では、前記オーバーハングの長さは、２ｎｔである。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、上記に列挙したもの以外の長さを有し、３´にオーバーハングを持つ（他の実施形態では、３´に２ｎｔの長さのオーバーハングを持つ）。
【０１９５】
他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子は、１５〜２５ｎｔ（他の実施形態では１９ｎｔ）の長さのループ介在配列を持つ、２１〜２３ｎｔ（他の実施形態では２２ｎｔ）の長さのステム又は自己相補領域を有する。他の実施形態では、前記ループ介在配列の長さは、１〜３０ｎｔである。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、自己相補領域において１つ以上の塩基対のミスマッチを有する。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、自己相補領域のある一本鎖において欠失を有する。他の実施形態では、前記欠失は、細胞性酵素によって認識される内部ループを引き起こす。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１９６】
他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子のループ領域の長さは、３〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、４〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、５〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、６〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、９〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜２０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、３〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、４〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、５〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、６〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、３〜１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、４〜１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、５〜１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、６〜１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、１０〜１２ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、３〜１０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、４〜１０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、５〜１０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、６〜１０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、７〜１０ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１０ヌクレオチドである。
【０１９７】
他の実施形態では、前記記長さは、約７ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１９ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約６ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約８ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約９ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１０ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１１ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１２ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１３ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１４ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１５ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１６ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１７ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約１８ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２０ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２１ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２２ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２３ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２４ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２５ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２６ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２８ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約２９ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約３０ｎｔである。他の実施形態では、前記記長さは、約３０ｎｔ以上である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０１９８】
本発明のＲＮＡｉ分子のループ領域は、他の実施形態では、既知又は天然のＲＮＡｉ分子から得られる。他の実施形態では、前記ループ配列は、既知又は天然に存在するＲＮＡｉ分子に由来するものではない。当業者には、いまだに認識されていないループ配列を含む様々なループ配列が本発明に係る方法に適することは、当業者であれば理解できるであろう。
【０１９９】
天然に存在するＲＮＡｉ分子は、当該技術分野で公知であり、例えば、「Griffiths- Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. Nucl Acids Res, 2006, 34: D140-D144」及び「Griffiths- Jones S (Nucl Acids Res, 2004, 32: D109-D111)」に記載されている。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２００】
他の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の基質である。他の実施形態では、本発明に係る方法は、本発明のＲＮＡ分子を消化して短鎖干渉性（short-interfering：ｓｉ）ＲＮＡ分子を得るステップをさらに含む。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、ＲＮアーゼＩＩＩファミリー酵素の基質である。他の実施形態では、前記酵素は、クラスＩ ＲＮアーゼＩＩＩファミリー酵素である。他の実施形態では、前記酵素はクラスＩＩ ＲＮアーゼＩＩＩファミリー酵素である。他の実施形態では、前記酵素はクラスＩＩＩ ＲＮアーゼＩＩＩファミリー酵素である。他の実施形態では、前記酵素はダイサー（Dicer）である。他の実施形態では、前記酵素はドローシャ（Drosha）である。他の実施形態では、前記酵素は、二本鎖ＲＮＡに対する特異性を有する任意の他の酵素である。他の実施形態では、ＲＩＳＣ又はＲＮアーゼＨＩファミリー酵素による処理は、前記ＲＮＡ分子を、生物活性を有する形態に変換する。ＲＩＳＣ及びＲＮアーゼＩＩＩファミリー酵素の基質は、当該技術分野では公知であり、例えば、「Jaronczyk K et al (Exploring the functions of RNA interference pathway proteins: some functions are more RISCy than others. Biochem J.2005 May 1 ;387(Pt 3):561 -71)」及び「Banan M et al (The ins and outs of RNAi in mammalian cells. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Oct;5(5):441-50)」に記載されている。他の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、上記酵素のいずれか１つ又は複合体によって切断され、２０ｎｔ及び３´オーバーハング（他の実施形態では、２ｎｔの３´オーバーハング）のステム又は自己相補領域を有する二本鎖ＲＮＡが得られる。基質の各種類は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０１】
他の実施形態では、前記消化は標的細胞内で生じる。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の任意の他の種類のＲＮＡｉ（阻害性ＲＮＡ）分子を生成するために使用される。ＲＮＡ分子の各種類は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０２】
他の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、ＲＮアーゼＩＩＩファミリー酵素の産物を模倣する。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は、２０ヌクレオチドのｄｓ領域、及び２ヌクレオチドの３´オーバーハングを有する。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は、当該技術分野で公知のＲＮアーゼＩＥファミリー酵素の産物の任意の他の構造を有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０３】
他の実施形態では、本発明の生物学的に活性なＲＮＡ分子は、幾つかの遺伝子に共有される配列と結合する。他の実施形態では、前記共有される配列は、標的ｍＲＮＡの３´非翻訳領域（ＵＴＲ）において見られる。他の実施形態では、共有される配列は、標的ｍＲＮＡの５´ＵＴＲにおいて見られる。他の実施形態では、共有される配列は、標的ｍＲＮＡのコード部分において見られる。他の実施形態では、共有される配列はイントロンにおいて見られる。他の実施形態では、共有される配列は、上記領域の組合せにおいて見られる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０４】
他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子の標的は、ｍＲＮＡ分子である。他の実施形態では、前記標的は、他の種類のＲＮＡである。他の実施形態では、前記標的は、リボソームのＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はＸＩＳＴ ＲＮＡである。他の実施形態では、前記標的は、デオキシリボヌクレオチド分子である。他の実施形態では、前記標的は、他の種類のヌクレオチド分子である。他の実施形態では、前記標的は、タンパク質分子である。他の実施形態では、前記標的は、補助因子である。他の実施形態では、前記標的は、脂質である。他の実施形態では、前記標的は、他の種類の細胞非ヌクレオチド分子である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０５】
他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子と、その標的配列との間の前記相補領域の長さは、５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１１ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１２ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１３ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１４ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、１９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２１ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２２ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２３ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２４ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２５ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２６ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２７ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２８ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、２９ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、３０ｎｔである。他の実施形態では、前記長さは、３０ｎｔ以上である。他の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ分子は、異なる遺伝子の異なる標的配列を結合する。他の実施形態では、前記異なる標的配列は、全て同じ長さではない。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０６】
他の実施形態では、本発明のベクターによって発現されるＲＮＡ分子は、その標的配列に完全に相補的である。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、その標的配列に部分的に相補的である。他の実施形態では、前記ＲＮＡ分子は、非相補オーバーハング領域を有するＲＮＡ分子の長さの大部分に沿って、その標的配列に相補的である。他の実施形態では、本発明のベクターによって発現されるＲＮＡ分子は、その標的配列に対して１つ以上のミスマッチな残基を有する。他の実施形態では、ＲＮＡ分子は、生理学的条件下でその標的配列にハイブリダイズする。他の実施形態では、ＲＮＡは、厳密な条件下でその標的配列にハイブリダイズする。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０７】
他の実施形態では、細胞内での本発明のＲＮＡ分子の発現は、標的ＲＮＡ分子の翻訳抑制を引き起こす。他の実施形態では、ＲＮＡ分子の発現は、標的ＲＮＡ分子の切断又は分解を引き起こす。他の実施形態では、翻訳抑制、切断又は分解が引き起こされるか否かは、本発明のＲＮＡ分子と標的ＲＮＡ分子との間の相補性のレベル、及び相補領域の長さに左右される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【０２０８】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、細胞生存、細胞の健康、細胞死、細胞分化又は任意の他の分析可能な表現型の変化に影響を及ぼす配列を同定するために用いられる。他の実施形態では、本発明に係るライブラリを使用して、医学的に目的の細胞型への幹細胞分化に影響を及ぼす配列が同定される。他の実施形態では、同定されたＲＮＡ分子は、幹細胞治療のためのｓｉＲＮＡとしての効用を有する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
【実施例】
【０２０９】
≪実施例１：レトロウイルスベクターによる二重ＲＮＡｉ発現≫
【０２１０】
レトロウイルスベクターを、同時に２つのｓｈＲＮＡを発現するように設計した。感染した細胞又はトランスフェクトされた細胞の直接的なフローソーティングを可能にする強化ファルネシル化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰｆ：enhanced, farnesylated green-fluorescent protein）と、感染した細胞又はトランスフェクトされた細胞の選択を容易にするＧ４１８耐性遺伝子とを含んでいた。レトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＸ（登録商標）（Clontech）のｅＧＦＰをｅＧＦＰｆで置換し、ＰｏｌＩＩＩ依存Ｈ１プロモータカセット（ｐＳｕｐｅｒ−Ｒｅｔｒｏ由来）の２つのコピーを、ｐＱＣＸＩＸの不活性化長末端反復配列にクローンしてベクターｐＱｅ２を作成した。ｐＱｅ２の各Ｈ１プロモータ・カセットには、ｓｈＲＮＡ構築物のクローニングを可能にするために、２つの固有の制限酵素部位を導入した。ｐＱｅ２は、スピンドル・チェックポイントで重要なタンパク質の発現をノックダウンするために使用した（ｓｈＲＮＡによるノックダウン（ウエスタン及び他の解析法を用いて）及びｅＧＦＰの発現の両方を確認した）。図１２は、ｐＱｅに感染した、中程度に感染可能な結腸癌細胞株ＤＬＤ１のフローサイトメトリ分析を示す。図１３は、ｐＱｅ２によるｅＧＦＰの有効なｓｈＲＮＡノックダウンを示す。したがって、ＲＮＡ分子で、標的遺伝子の発現をノックダウンすることができる。また、正常な細胞で目的の特定の遺伝子（例えば、ｆｒａｔａｘｉｎ）の発現を抑制して、所定の表現型（又は、他の実施形態では、疾病表現型）を誘導することができる。さらに、１つ以上のランダムな標的を抑制して、表現型を改変又は逆転させることができる。
【０２１１】
≪実施例２：ベクターの改変≫
【０２１２】
レトロウイルスとしてパッケージングすることができ、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をエンコードする遺伝子及びＧ４１８耐性遺伝子を含むｐＳｕｐｅｒ−Ｒｅｔｒｏ（Oligoengine社, Seattle, WA）を、下記のクローニング手法に使用した。スペーサ配列のＢｇ１ＩＩ−ＭｌｕＩ断片を、Ｂｇ１ＩＩ−ＢｂｓＩ−ＭｌｕＩ断片で置換した。次に、ＢｂｓＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗで補充し、ＮｏｔＩで切断することで、図５に示されている線状のベクターを作成した。ｐＳｕｐｅｒ−Ｒｅｔｒｏは、ＰｍｅＩ（スペーサ配列を作成する際に除去した）以外に関しては、図６〜８に示されている工程に必要な制限酵素部位全てを欠いていた。したがって、本工程に適切である。
【０２１３】
代替ベクターの作成では、ｐＳｕｐｅｒ−ＲｅｔｒｏのＢｇｌＩＩクローニング部位、並びにＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの間のスペーサ配列を、ＸｃｍＩ及びＳｆｉＩで置換し、固有のＰｍｅＩ部位を除去した（ＸｃｍＩ、ＳｆｉＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を含むテール付プライマーを使用して、Ｂｇ１ＩＩの直前から固有のＢｌｐＩ部位までの領域をＰＣＲ増幅した。ベクターのＢｌｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＢｌｐＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したＰＣＲ産物で置換した。）。ＸｃｍＩ及びＳｆｉＩの認識配列を含むテール付プライマーを使用してオリジナルのスペーサ配列をＰｍｅＩ部位までに（しかし、ＰｍｅＩ部位を含むことなく）増幅してできたスペーサ配列を、ＸｃｍＩ及びＳｆｉＩの間に付加した。スペーサ配列を再び付加する理由は、この実験でシングルカットのベクターの除去を容易にし、ライブラリの連結の効率を最大にするためである。ＰｍｅＩ認識部位（上記に記載したように除去した）以外に関しては、ｐＳｕｐｅｒ−Ｒｅｔｒｏは、図３、４、及び５に示されている工程に必要な制限酵素部位全てを欠いていた。
【０２１４】
本実施例及び本明細書に記載の他の実施例における方法には、他の多くのベクターを使用することができ、また、他の多くの制限酵素の組み合わせが適している。例えば、非相補ループ配列の作成に使用できる制限酵素の組み合わせとして、ＥｃｏＮＩ／ＡａｒＩ（ＣＣＴＣＣＣＧＣ）、ＳｍａＩ／ＡａｒＩ（ＣＣＣＣ）、ＳｔｕＩ／ＡｐａＩ（ＡＧＧＣ）、Ｂｓｕ３６Ｉ／ＡａｒＩ（ＣＣＴＣＡＣ）、ＢｂｖＣＩ／ＡａｒＩ（ＣＣＴＣＡＣ）、ＥａｒＩ／ＡａｒＩ（ＴＣＴＴＣＣＧＣ）などがある。
【０２１５】
≪実施例３：部分的に自己相補的ＲＮＡ分子のライブラリの作成≫
【０２１６】
５´から３´の順に、第１の定常領域（「Ｎ２１」）と、それに続くランダムな配列の領域（この実施例では、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のランダムな配列）と、それに続く、第１の制限酵素（この場合、ＥｃｏＮＩ）の部位の一本鎖（ｓｓ）を含む第２の定常領域とを含む一本鎖のＤＮＡ分子を得た。このセットの代表的な一本鎖分子は、図１にて「ｓｓ１」として図示されている（本明細書では、「一本鎖核酸中間体Ｉ」ともいう）。図１に示されているように、２つの部位でミスマッチなプライマー（図１の「プライマーＡ」）をオリゴヌクレオチドにアニールした（図１に示されているように、相補鎖が、二重鎖を形成する際に、第２の制限酵素（この場合、ＡａｒＩ）の基質となるが、第１の制限酵素の基質とならないように）。１回伸長させたところ、ｓｓＩの大部分に対して相補的な鎖（図１のｓｓＩＢの下部の鎖）が形成された。この１回の伸長の後に、ヘアピンループリンカー（図１の「リンカーＢ」）を、伸長させたオリゴヌクレオチドの相補付着末端に連結させて、核酸中間体ＩＩ（図１の「ｎ．ａ．ＩＩ」）を形成した。核酸中間体ＩＩは、５´から３´の順に、（ａ）第１の定常領域の第１コピーと、（ｂ）Ｎ２１の第１コピーと、（ｃ）第２の定常領域の第１コピーと、（ｄ）ヘアピンループのリンカーと、（ｅ）第２の定常領域の逆相補鎖（「Ｎ２１ｃ」）と、（ｆ）ランダムな配列の領域の逆相補鎖と、（ｇ）第１の定常領域の逆相補鎖とを含む（図３の下部に図示されている）。
【０２１７】
他の実施形態では、図２に示されているように、図１の下部に示されている一本鎖産物は、ＰＣＲによる増幅に適しており、ＰＣＲによって二重鎖中間体ＩＩＩ（図２の「ｄｓＩＩＩ」）を形成する。ｄｓＩＩＩは、上部の鎖の５´から３´の順に、（ａ）第１の定常領域の第１の二本鎖コピーと、（ｂ）Ｎ２１の第１の二本鎖コピーと、（ｃ）第２の定常領域の第１の二本鎖コピーと、（ｄ）ヘアピンループリンカーの二本鎖コピーと、（ｅ）第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピーと、（ｆ）Ｎ２１ｃの第２の逆位二本鎖コピーと、（ｇ）第１の定常領域の第２の逆位二本鎖コピーとを含む。
【０２１８】
ＰＣＲの後、第１の定常領域の制限酵素部位を利用して末端を制限酵素で消化し、得られた産物を、所定のベクターのポリメラーゼＩＩＩ−Ｈ１−ＲＮＡプロモータの下流に連結し（図２の第１の連結ステップ）、環状中間体ＩＶを作成した（「ｃｉｒｃ中間体ＩＶ」）。次に、出来上がったプラスミドを、ＥｃｏＮＩ及びＡａｒＩで制限処理した。オリジナルのミスマッチプライマーにより、２つの制限酵素部位のうち１つのみがプラスミドのインサートの各側に存在する。２つ酵素により、付着末端が残る。平滑末端を形成するために付着末端の一本鎖部分を補充した後は、平滑末端連結で、プラスミドを環状になるように同一分子内で連結し（図２の第２の連結ステップ）、環状産物ＶＩ（「ｃｉｒｃ産物ＶＩ」）を作成した。出来上がったプラスミドは、ランダムな配列の領域と、それに続く非保存ループ配列と、それに続く前記ランダムな配列の逆相補配列とを、全て同じＤＮＡコード鎖に含む。このプラスミドは、したがって、ランダムな２１塩基対領域及びそれに続くＴＡ対を含む２２塩基対のステムと、非相補的な８ｎｔのループとを含むｓｈＲＮＡのライブラリを発現した。
【０２１９】
この実施形態では、ループの両端には互いに相補的なＴ−Ａが存在する（図２の下部）。これは、図１の上部に示されているオリジナルのミスマッチ延長部分の先頭の塩基対を対合させるために必要である。さらに別の実験では、それぞれがこの部分で異なる塩基を有する４つのライブラリを作成し、それらを混合することで、可能な全てのランダムな２２塩基対のステムが作成される。これらの構築物は、したがって、ランダムな２２塩基対のステムと、非相補的な８ｎｔのループとを含むｓｈＲＮＡを発現する。
【０２２０】
≪実施例４：部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のライブラリの作成のための別のアプローチ≫
【０２２１】
図３、４、及び５は、ＲＮＡｉの発現ベクターのライブラリを作成するための別のアプローチを図示している。図３の上部のＤＮＡオリゴマ（「オリゴ」）ｓｓＩは、図１のｓｓＩに類似する。「Ｎ２８」は、２８のランダムなヌクレオチドを意味する。ｓｓＩは、第２の定常領域のＮ２８配列の下流にＰｍｅＩ部位の一本鎖を含む。プライマー（２つのミスマッチを含む（図３のプライマーＡ））で単純な延長反応を行ったところ、ｓｓＩの第１の定常領域、ランダムな配列の領域（「ｎ２８」）、及び第２の定常領域の大部分に対して逆相補鎖が形成され、二本鎖中間体ＩＢ（「ｄｓＩＢ」）が得られた。ヘアピンループリンカーを、延長させたオリゴヌクレオチドの１末端に連結させたところ、Ｎ２８及びｎ２８配列を含むｄｓＩＢの二本鎖が互いに共有的に結合した核酸中間体ＩＩ（「ｎ．ａ．ＩＩ」）が形成された。（互いに相補的な、伸長したオリゴヌクレオチドの末端及びヘアピンループリンカーの末端は、それぞれＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位に由来する。ＳａｌＩ及びＸｈｏＩによる消化では、それぞれ延長したオリゴヌクレオチド又はヘアピンループリンカーのホモダイマーは切断されたが、目的のヘテロダイマー産物は切断されなかった。したがって、サイズによるゲル分離が可能となった。）ｎ．ａ．ＩＩは、５´〜３´の順に、（ａ）第１の定常領域の第１コピーと、（ｂ）ランダムな配列の領域の第１コピー「Ｎ２８」と、（ｃ）第２の定常領域の第１コピーと、（ｄ）ヘアピンループリンカーと、（ｅ）第２の定常領域の逆相補鎖と、（ｆ）前記ランダムな配列の領域の逆相補配鎖「ｎ２８」と、（ｇ）第１の定常領域の逆補鎖とを含む。
【０２２２】
ミスマッチなプライマーを使用したことにより、第２の定常領域の逆相補鎖の一本鎖のみに（ｎ２８の直上流）ＡａｒＩ認識配列が形成された。このＡａｒＩ認識配列は、第２の定常領域の第１のコピーには存在していなかった。また、ミスマッチなプライマーにより、第２の定常領域の逆相補鎖から、ＰｍｅＩ認識配列が除去された。これにより、ベクターに挿入した後にＮ２８及びｎ２８の間に非相補的なループを形成するのに必要な非対称性が形成された（下記及び図５を参照）。
【０２２３】
＜ランダムなステム配列の逆相補鎖の作成及びその２つの共有的連結＞
【０２２４】
他の実施形態では、図４に示されているように、ｎ．ａ．ＩＩは、ミスマッチなプライマーＢからの単純な伸長反応に適している（図４の上部）。このプライマーからの伸長反応を行うと、二本鎖中間体ＩＩＩ（「ｄｓＩＩＩ」）が形成される。このプライマーにより、ｄｓＩＩＩにおいて５´付着末端（ＡＧＡ）が形成される（下記参照）。プライマーにおけるミスマッチにより、ｄｓＩＩＩの一端からＢｔｇＺＩ部位が除去される。ｄｓＩＩＩは、上部の鎖の５´〜３´の順に、（ａ）第１の定常領域の第１の二本鎖コピーと、（ｂ）Ｎ２８の第１の二本鎖コピーと、（ｃ）第２の定常領域の第１の二本鎖コピーと、（ｄ）ヘアピンループリンカーの二本鎖コピーと、（ｅ）第２の定常領域の第２の逆位二本鎖コピーと、（ｆ）ｎ２８の第２の逆位二本鎖コピーと、（ｇ）第１の定常領域の第２の逆位二本鎖コピーとを含む。
【０２２５】
上記で記載したように、ｄｓＩＩＩは、ＳｆｉＩで消化された発現ベクターバックボーン（図４）の５´付着末端と相補する５´付着末端（ＡＧＡ）を含み、分子の他端にＢｔｇＺＩを含む。ｄｓＩＩＩをＢｔｇＺＩ（認識部位から１０及び１４ｎｔを切り離す）で処理すると、オリジナルのＮ２８の第１のランダムなｎｔの直前でＤＮＡを切断し、反対側の鎖では、さらに４ｎｔ多く切り離し、陥凹３´末端を残す（ｄｓＩＩＩＢ）。Ｔａｑポリメラーゼでこの末端を補充すると、オリジナルのＮ２８の反対側の鎖において４ｎｔが回復する。また、３´にて余分なアデニンが付加される（ｄｓＩＩＩＣ）。これは、ＸｃｍＩで処理された発現ベクターのバックボーンにおける余分な３´チミジン末端と相補的である。次に、ｄｓＩＩＩＣを発現ベクターのバックボーンと連結し（図４の最初の連結ステップ）、環状中間体ＩＶ（「ｃｉｃＩＭＩＶ」）を作成する。このステップでは、様々な発現ベクターのバックボーンが適している（例えば、実施例２の改変型ｐＳｕｐｅｒ−Ｒｅｔｒｏ）
【０２２６】
＜ベクターのインサートの作成及びベクターへの挿入＞
【０２２７】
ＢｔｇｚＩによる処理及び補充は、オリジナルのｎ２８配列の直下流にｐｏｌＩＩＩ転写終結シグナルとして働く５個のチミジンを保持させ、且つオリジナルのＮ２８配列の上流のアデニンを除去し、ピリミジン（ベクターからの）で置換することである。標準的な開始部位の直上流にプリンが存在する場合にｐｏｌＩＩＩは転写を早く開始するので、直上流にピリミジンが存在すると、標準的な開始部位（Ｈ１プロモータのＴＡＴＡボックスの２５ヌクレオチド下流）での転写開始が促進される。したがって、ｃｉｒｃＩＭＩＶでは、標準的な開始部位は、オリジナルのＮ２８配列の最初のヌクレオチドである（図４の下部で「＋２５」と記されている（下記参照））。
【０２２８】
＜非自己相補的ループ配列の作成＞
【０２２９】
図５の上部には、Ｎ２８及びｎ２８配列の間のｃｉｒｃＩＭＩＶのベクターインサート配列が示されている。インサートの配列は、ｎ．ａ．ＩＩに存在する制限部位非対称性（上記に記載）により、ＰｍｅＩ／ＡａｒＩ制限部位非対称性を含む。ｃｉｒｃＩＭＩＶをＰｍｅＩで処理すると、センス鎖においてＧＧＴＴＴが後に続く平滑末端が形成される。ＤＮＡをＡａｒＩで処理すると、ＤＮＡは、オリジナルのｎ２８の最初のランダムなヌクレオチドから３ヌクレオチド離れた部分で切断され、反対側の鎖では４ヌクレオチド多く切断され、陥凹３´末端が形成される。Ｋｌｅｎｏｗで補充すると、センス鎖においてＡＧＣが後に続く平滑末端が形成される（図５の「線状中間体Ｖ」）。線状ＩＭＶの平滑末端を同一分子内で互いに連結する（図５の第２の連結ステップ）と、配列がＧＴＴＴＡＧである非自己相補ループ領域をＮ２８及びｎ２８の間に含む環状産物ＶＩ（「ｃｉｒｃ産物ＶＩ」）が形成される。
【０２３０】
図３の上部に示されているオリジナルのプライマー伸長の先頭部位において相補的な塩基対を使用したことにより、図５に示されているように、相補的なＧ−Ｃが非自己的なループの両端に位置するようになる。他の実施形態では、図３、４、及び５に示されている工程を繰り返し、且つ毎回最初のプライマー伸長の先頭部位で異なる塩基を使用すると、４つのサブライブラリが作成される。これらのサブライブラリを混合すると、ランダムな２９塩基対ステムとＧＴＴＴＡＧの非自己相補的なループとを有するｓｈＲＮＡライブラリが構成される。ライブラリの各ｓｈＲＮＡ構築物の前方には、４つのピリミジンで終了するｐｏｌＩＩＩプロモータ（Ｈ１）が存在する。また、転写開始部位は最初のランダムなヌクレオチドである。後半２９塩基対ステムの直下流に存在する５つのチミジンは、転写終結シグナルとして働く。
【０２３１】
≪実施例５：部分的に相補的なＲＮＡ分子のライブラリ作成の第３のアプローチ≫
【０２３２】
図６〜８は、ＲＮＡｉの発現ベクターのライブラリを作成するのに使用した第３のアプローチが図示する。
【０２３３】
＜ランダムなステム配列の逆相補鎖の作成、その２つの共有的な連結、及び第２の伸長＞
【０２３４】
前回の方法と同様に、２つの定常領域に挟まれたランダムな配列の領域（ランダムな配列の領域の５´及び３´にそれぞれ「第１の定常領域」及び「第２の定常領域」が連結している）を有する一本鎖ＤＮＡ分子「一本鎖核酸中間体Ｉ」を合成した（図６において、「ｓｓＩ」として示されている）。第２の定常領域は、ＮｓＮｓＮ２６配列の直下流に、ＰｍｅＩ認識部位の一本鎖を含む。ｓｓＩでは、「ＮｓＮｓＮ２６」は２８個のランダムなヌクレオチドを意味する。このランダムなヌクレオチドにおける最初の２つのヌクレオチドの後には、ホスホロチオエート結合が存在する（下記及び図７に示すように、第２の伸長の後にＢｔｇＺＩによる非対称的な切断を形成するため）。ｓｓＩは、ＮｏｔＩ及びＢｔｇＺＩ認識配列の一本鎖をも含んでいた（図６のｄｓＩｂに示されている）。
【０２３５】
２つのミスマッチ残基を有する陥凹プライマー（recessed primer）からの単純な伸長反応を行うと、（ａ）第１の定常領域の断片、（ｂ）ＮｓＮｓＮ２６配列、及び（ｃ）第２の定常領域のそれぞれの逆相補鎖を含むｄｓＩＢが形成された。
【０２３６】
ミスマッチなプライマーを使用したところ、第２の定常領域の逆相補鎖におけるｎ２６ｎｎの配列の直上流にＡａｒＩ認識配列が形成された。また、ミスマッチなプライマーにより、第２の定常領域の逆相補鎖は、ＰｍｅＩ認識配列を有さない。これにより、ベクター挿入後に、ＮｓＮｓＮ２６及びｎ２６ｎｎの間に非相補的なループを形成するのに利用される非対称性が形成された（下記及び図８を参照）。
【０２３７】
ヘアピンループリンカー（「リンカーＢ」）をｄｓＩｂの陥凹プライマー末端に連結すると、ＮｓＮｓＮ２６及びｎ２６ｎｎ配列を含むｄｓＩｂの２つの鎖が互いに共有的に連結し、第１の定常領域の逆相補鎖が完結し、核酸中間体ＩＩ（「ｎ．ａ．ＩＩ」）が形成された。（ｄｓＩｂ及びリンカーＢの相補的な付着末端は、それぞれＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位に由来する。ＳａｌＩ及びＸｈｏＩによる消化では、それぞれｄｓＩｂ又はリンカーＢのホモダイマーは切断されたが、目的のヘテロダイマー産物は切断されなかった。したがって、サイズによるゲル分離が容易となった。）ｎ．ａ．ＩＩは、５´〜３´の順に、（ａ）第１の定常領域の第１コピーと、（ｂ）ランダムな配列の領域の第１コピー（「ＮｓＮｓＮ２６」）と、（ｃ）第２の定常領域の第１コピーと、（ｄ）ヘアピンループリンカーと、（ｅ）第２の定常領域の逆相補鎖と、（ｆ）ランダムな配列の領域の逆相補鎖（「ｎ２６ｎｎ」）と、（ｇ）第１の定常領域の逆相補鎖とを含む。
【０２３８】
第２の伸長反応（図６の下部〜図７の上部）を容易にするために、ＤＮＡの一本鎖のみを切断する切断酵素Ｎ．ＢｂｖＣでニック部位を形成した（図６の矢印で示された部分）。次に、出来上がった５´断片を、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ（図６の下部及び図７の上部に図示されている）で伸長させ、ｎ．ａ．ＩＩの逆相補鎖を形成した。その結果、二本鎖中間体ＩＩＩ（ｄｓＩＩＩ）が形成された。ｄｓＩＩＩは、上部の鎖の５´〜３´の順に、（ａ）第１の定常領域の第２の逆位コピーと、（ｂ）ランダム領域の第２の逆位コピー（ｎ２８）と、（ｃ）第２の定常領域の第２の逆位コピーと、（ｄ）ヘアピンループリンカーのコピーと、（ｅ）第２の定常領域の第１コピーと、（ｆ）ランダム領域の第１コピー（Ｎ２８）と、（ｇ）第１の定常領域の第１コピーとを含む。本実施例のｄｓＩＩＩでは、それぞれの領域が前の実施例とは逆の順で合成されており、したがって、前の実施例とは逆の順に図示されている。
【０２３９】
ｓｓＩ（図６の上部）に本来存在するホスホロチオエート結合により、ｄｓＩＩＩにおいて、ＢｔｇＺＩがｄｓＩＩＩの一端のみを切断する制限部位非対称性が形成された。ｄｓＩＩＩをＢｔｇＺＩで消化すると、ＤＮＡは、新しく合成されたＮ２８の最初のランダムなヌクレオチドの直前で切断され、反対側の鎖においてはさらに４ヌクレオチド多く切断され、陥凹３´末端が形成される（図７のｄｓＩＩＩＢ）。Ｋｌｅｎｏｗで補充すると、新しく合成されたＮ２８の反対側の鎖において、前記４つのヌクレオチドが再生され、平滑末端が形成された。上記の実施例で記載したように、非対称的なＢｔｇＺＩの切断により、最後のランダムなヌクレオチドの後にＴＴＴＴＴ終結配列を維持すると同時に、Ｈ１転写開始部位の直上流、最初のランダムなヌクレオチドに接する相補的なＡＡＡＡＡを５つのピリミジンに変えることができた。
【０２４０】
＜第２の伸長の終了によるベクターインサートの形成、及びベクターへの挿入＞
【０２４１】
非対称的なＢｔｇＺＩ消化により、２つのＮｏｔＩ部位のうちの１つもまた、除去された。ＮｏｔＩで処理したところ、ライブラリインサート（ｄｓＩＩＩＣ）が形成された。このインサートを、ベクターのバックボーンに連結し（図７の第１の連結ステップ）、環状中間体ＩＶを作成した。図８の上部には、Ｎ２８及びｎ２８の間のベクターインサートの配列が示されている。プライマーＡのミスマッチにより（図６）、インサートの一端に１つのＡａｒＩ部位が存在し、反対側に１つのＰｍｅＩ部位が存在していた。ＰｍｅＩで消化すると、センス鎖において、ＡＡＡＣＣＣが後に続く平滑末端が形成された。ＡａｒＩで消化すると、ＤＮＡは、オリジナルのｎ２８の最初のランダムなヌクレオチドから３ヌクレオチド前で切断され、反対側の鎖においてはさらに４ヌクレオチド多くで切断され、陥凹３´末端が形成される。Ｋｌｅｎｏｗで補充したところ、転写鎖においてＮ２８の直後にＧＣＴを有する平滑末端が形成された（「線状中間体Ｖ」）。線状中間体Ｖの平滑末端を互いに同一分子内で連結させる（図８の第２の連結ステップ）と、Ｎ２８及びｎ２８の間に非相補的なＣＴＡＡＡＣループ配列を含む環状産物ＶＩ形成された。
【０２４２】
インサートの転写鎖は、転写開始部位の上流に５つのピリミジン（＋１部位（ｐｏｌＩＩＩにはプリンが所望される）における転写開始の効率を増大させるため）と、それに続く２８ヌクレオチドを含む２９ヌクレオチドのステムと、それに続く非相補的なループ配列と、それに続く前記２９ヌクレオチドのランダムな配列の逆相補配列と、それに続く５つのチミジン（ｐｏｌＩＩＩ転写を終了させるため（第２のチミジンで終了する））とを含む。したがって、ベクターは、２９ヌクレオチドのステムとそれから突出した２つのヌクレオチドとを含むｓｈＲＮＡをエンコードする。
【０２４３】
この方法の有効性を確認するために、大腸菌を環状ＩＭＩＶでトランスフェクトし、３００，０００コロニーを得た。これらのコロニーのうちの１５コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、それらのインサートの塩基配列を決定した。１５個のインサート全ての配列は、予想通り、ＡａｒＩ−ＰｍｅＩ断片で分離したランダムな配列とその逆相補鎖（図８の上部に示されている）とを含んでいた。また、中間体のプールの塩基配列を決定した。図９に示されているように、配列データによって、予想される定常領域の存在、及びランダム領域におけるバイアスの非存在が確認された。これは、本方法の有効性を示すものである。ランダムな配列に使用された塩基対の割合は、Ａ／Ｔが５０．９％、Ｇ／Ｃが４９．１％であった。これは、ランダム領域が、ランダム性を有することを示す。
【０２４４】
残りのコロニー（約３００，０００個）からＤＮＡを調製し、連続的にＡａｒＩ及びＰｍｅＩで消化し、再連結した。連結した産物で大腸菌をトランスフェクトし、１，０００，０００コロニーを得た。これらのコロニーのうちの５個のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。５つのＤＮＡ全てが、正しい大きさを有していた。
【０２４５】
本方法の終了後、１４クローンのランダムの領域（ｎ２９）を配列決定した。図１０に示されているように、配列にはスキューイング（skewing）が検出されなかった。これは、本方法が有効であり、最終産物が目的の産物と一致したことを示す。
【０２４６】
また、完成したライブラリからの個々の「クローン」からのインサート全体の塩基配列決定を行った。図１１では、代表的なクローンからの配列が示されている。このクローンは、Ｎ２８のランダムな配列と、それに続くＧ残基（オリジナルのｓｓＤＮＡ分子の３´定常領域由来）と、それに続くループ配列と、それに続く「Ｃ」残基と、それに続くＮ２８の逆相補配列（「ｎ２８」として示されている）とを含んでいた。この配列は、図８の下部の鎖に対応する。したがって、最終産物は、目的の産物と完全に一致していることになる。これは、本方法の有効性を再確認するものである。
【０２４７】
≪実施例６：ｓｈＲＮＡライブラリをスクリーニングするための、アポトーシス阻害アッセイの確立≫
【０２４８】
２９３Ｔ細胞（ヒトの胚腎臓細胞株）を、２、４、６、及び８μＭの合成トリテルペノイドであるＣＤＤＯで一晩処理した。ＣＤＤＯを含まない培地と交換した後、４、６、又は８μＭのＣＤＤＯで処理したプレートには、付着細胞が存在していなかったのに対して、２μＭのＣＤＤＯで処理したプレートには、付着細胞が幾つか見られた。この実験を４μＭのＣＤＤＯで繰り返したところ、ＣＤＤＯ欠失培地で５日間処理した後も、付着コロニーが確認されなかった。
【０２４９】
他の実験では、２９３Ｔ細胞の培地を、５０％、２０％、１０％、５％、２％、及び０％の血清欠失培地を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換して２４時間処理した。その後、細胞を標準培地で５日間培養した。５％、２％、又は０％の血清欠失培地で処理したプレートには、細胞は残存していなかった。一方、５０％及び２０％の血清欠失培地を含むＰＢＳで処理したプレートでは、細胞はほとんど生存していた。１０％の血清欠失培地を含むＰＢＳで処理した約７５０，０００細胞のうち、２つのコロニーがプレート上で見られた。したがって、５〜１０％の血清欠失培地を含むＰＢＳで２４時間処理すると、２９３Ｔ細胞の約１００％が死滅することになる。
【０２５０】
別の実験では、１００％の細胞が死滅する最低条件を確立し、ｓｈＲＮＡライブラリによる救済をさらに容易にするために、２９３Ｔ細胞を、３μＭのＣＤＤＯ及び／又は６％、７％、８％、又は９％の血清欠失培地を含むＰＢＳで処理した。
【０２５１】
他の実験では、グルコース／グルコース酸化酵素（Ｇ／ＧＯ）技術を使用して、２９３Ｔ細胞にアポトーシスを誘発した。グルコース酸化酵素は、実質的に持続的な速度で過酸化水素の生成を触媒する。グルコース酸化酵素の最適な濃度及びインキュベーション時間を決定するために、様々なグルコース酸化酵素の濃度（２〜１２８ｍＵ／ｍｌ）、並びに様々なインキュベーション時間で実験し、その後、細胞を顕微鏡観察した。細胞を洗浄し、標準培地を再び加え、コロニー形成を観察したところ、１００％の細胞が死滅する最低条件を確認することができた。
【０２５２】
≪実施例７：アポトーシスを阻害できるＲＮＡ分子を特定するための、ｓｈＲＮＡの使用≫
【０２５３】
＜材料及び実験方法＞
【０２５４】
細胞：
【０２５５】
Craig Thompson博士からＦＬ５．１２細胞を調達した。
【０２５６】
高力価のレトロウイルスの生成：
【０２５７】
Effectene（登録商標）トランスフェクションキット（Qiagen）を使用して、２９３Ｔ細胞を、レトロウイルス及びｐＣＬ−Ｅｃｏ（エコトロピックなエンベロープ及びｇａｇ−ｐｏｌタンパク質をエンコードする）で共トランスフェクトすることで、高力価のレトロウイルスが生成された。トランスフェクションの２４〜７２時間後毎日、培養液の上清を採取し、ＦＬ５．１２細胞に感染させるか、或いは、後の使用のために−８０℃で冷凍した。２４ウエル付のプレートの各ウエルに１００〜２００万細胞を播種し、ウイルス上清、５μｇ／ｍｌのポリブレン、及び０．３ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）と共に２５００×ｇ、１時間遠心分離した。次に、細胞をインキュベータ内で２時間保存した。ウイルスの上清を、新鮮なものと交換し、回転／インキュベーションの工程をさらに２回繰り返した。２４〜４８時間後、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリ分析で感染効率を求めた。
【０２５８】
＜結果＞
【０２５９】
マウスの前Ｂ細胞株であるＦＬ５．１２はＩＬ−３依存である。ＩＬ−３を３日間除去すると、１００％の細胞がアポトーシスによって死滅し、＞９０％の細胞がＢｃｌ−ｘＬ５９の発現によって救われる。細胞をアポトーシスから救ったＲＮＡ分子を特定するプロトコールを画定するために、ＦＬ５．１２細胞をＩＬ−３含有の培地で培養し、その後、ＩＬ−３を欠く培地に切り替え、１２、２４、４８、又は７２時間培養した。その後、細胞をＩＬ−３含有の培地に戻した。トリパンブルー排除法、及びＩＬ−３含有の培地に切り替えた後の数日間の培養によって、１００％の死滅率を確実にするのに上記の４８又は７２時間の培養が十分であることが示された。
【０２６０】
陽性対照としてｐＳｉｒｅｎ、ｐＣＬ−Ｅｃｏを２：１（モル比）を使用して、高力価のレトロウイルスの感染を３０％ＧＦＰ陽性ＦＬ５．１２細胞になるように調製（calibrate）した。つまり、約３０％の細胞が、ＲＮＡを発現するレトロウイルスのベクターで形質導入されたことになる。
【０２６１】
３０％のＧＦＰ陽性細胞から、ＲＩＳＣ複合体を過剰に含むものを避けるように選択した。各細胞に無限のＲＩＳＣ複合体が存在するため、同時に存在する２つ又は３つ以上のＲＮＡｉ構築物の効果は、ＲＮＡｉ配列が強力でない限り、より低くなり得る。例え効果が低くても、有効なｓｈＲＮＡ配列を特定できる可能性を最大限にするために、細胞ごとに１つのランダムなｓｈＲＮＡについて調べた。ポアゾン分布から、０．３及び０．４の感染多重度は、それぞれ約２６％及び３３％のＧＦＰ陽性細胞に相当する。それぞれの感染多重度における感染細胞のうち、たった１つのｓｈＲＮＡエンコード構築物に感染している細胞は、それぞれ約８５％及び８０％である。
【０２６２】
１００万個のＦＬ５．１２細胞を、３０％がＧＦＰ陽性になるように感染させ、実施例８に記載の３００，０００のコロニーライブラリーが得られた。発現後のＧＦＰ発現は、図１４に示されている。生存を高めるｓｈＲＮＡを選択するために、ＩＬ−３を除去した。細胞を、ＩＬ−３陰性培地で３日間培養した後、０．３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３含有の標準生育培地に移し、３日間培養した。真陽性細胞を濃縮するために、ＩＬ−３の除去及び標準培地への戻しのプロセスを繰り返した。ＩＬ−３の除去及び標準培地の戻し（Ｒｅｃ）のプロセスを４回行った後、ライブラリ感染細胞のウエル（対照感染細胞のウエルではなく）におけるＧＦＰ陽性細胞の比率は６０％に上昇した。これは、比較的な生存効果を付与したＲＮＡ分子が存在することを示す（図１５）。
【０２６３】
ＰＣＲで１０のｓｈＲＮＡエンコード配列（「ブック」）を調べ、ｐＳｉｒｅｎに再クローンし、配列決定を行った。１０の配列のうち、２つの配列が同じであった（ブック１及び７）。これは選択的濃縮（selective enrichment）を示す。３つの推定ｓｈＲＮＡ分子（ブック１、３、及び８）を個別にＦＬ５．１２細胞に感染させた。なお、各種類ｓｈＲＮＡ分子に関しては、個別に６回感染させて分析した。細胞には、ＩＬ−３の除去及び戻しのプロセスを１回行い、その後、再びＩＬ−３を除去した。１５時間後細胞をフローサイトメトリで分析し、感染細胞をＧＦＰ蛍光で同定し、死細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で特定した。実験の開始（１回目のＩＬ−３除去の直前）に対する相対的なＧＦＰ陽性（感染）、ＰＩ陰性（生）細胞の画分が図１６に示されている。ブック１及び３に感染した細胞の生存率は、ランダムなブック（対照５３）又はベクターのみ（ｐＳｉｒｅｎ）に感染した細胞のものよりも統計的に有意な改善を示した（各ケースのスチューデントｔ−検定において、ｐ＜０．０００１であった）。ブック１及び３における生存率の改善は、カスパーゼ３酵素活性の低下と一致した。ＩＬ−３の除去のサイクリングは、回復部分を含んでいたので、ブック１及び３を、増殖率に対する効果について調べたが、そのような効果は見られなかった。ブック１及び３のステム配列は、下記の通りである。
【０２６４】
ブック１：５´−ＧＧＧＴＡＧＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧ−３´（配列認識番号１）
【０２６５】
ブック３：５´−ＧＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＧＧ−３´（配列認識番号２）
【０２６６】
したがって、本発明に係る方法は、治療活性を有する組換え型ＲＮＡ分子の特定に有効である。
【０２６７】
他の実験では、上記の方法と類似する方法を使用して、アポトーシスから保護するＲＮＡ分子を特定するために、Ｇ１Ｅ、２９３Ｔ、又はＦＲＤＡ細胞を使用した。
【０２６８】
≪実施例８：本発明に係るＲＮＡ分子の機能の確認≫
【０２６９】
他の実験では、上記の実施例又は他の実施例で記載されているＲＮＡｉライブラリ・スクリーニングの後、目的の効果が発生した細胞又は細胞群を単離し、効果のあるベクターを単離し、他の細胞集団に加えた。他の実施例では、有効なＲＮＡｉ配列をＰＣＲで調べ（例えば、上記の方法では、レトロウイルスベクターのｓｈＲＮＡインサート部位の両端に存在するＭｆｅＩ及びＢｌｐＩを挟むプライマーを使用することで）、同じランダム配列を含む同じ又は他の形態の阻害ＲＮＡ（他の実施形態では、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）を別の細胞集団に加えた。別の細胞集団に同じ表現形が再発生すれば、阻害ＲＮＡ分子が目的の表現形を引き起こすことができることを意味する。他の実施形態では、新しい形態のＲＮＡｉはＲＮＡｉの可逆的な形態である（他の実施形態ではインビトロで合成されたｓｉＲＮＡ、他の実験では、培地から取り出すことによって効果が反転する形態のもの）。また、新しい形態のＲＮＡｉは、目的の表現形を可逆的に付与することが示されている。他の実験では、陽性ｓｈＲＮＡ候補を、それらが特定されたモデルシステム以外のモデルシステムで試験する。
【０２７０】
≪実施例９：真陽性のものを濃縮するための反復プーリング及び再試験≫
【０２７１】
他の実験では、上記のアポトーシス・アッセイの１つにおける対照培養では、１００％の死滅率が観察されない。この場合、ライブラリ感染培養における生存細胞をプールし、推定の有効ｓｈＲＮＡ配列をＰＣＲで調べ、親ベクターに再クローンし、サブライブラリとして反復プーリング及び再試験で再試験した。プーリング及び試験を繰り返すことで、真陽性のものを濃縮することができる。
【０２７２】
例えば、偽陽性の比率が１％のスクリーニング検定（つまり、９９％の死滅率が達成される）を使用して、本発明に係るＲＮＡｉライブラリをスクリーニングした。ライブラリの１００，０００配列の１つが真陽性（例えば、アポトーシスに対して有意な耐性をもたらす）である。２００，０００細胞を感染させると、平均して２つの真陽性及び２０００の偽陽性が発生する。ライブラリ感染培養における生存細胞をプールし、推定上有効なｓｈＲＮＡをＰＣＲで調べ、親ベクターに再クローンし、サブライブラリとして反復プーリング及び再試験で再試験する（例えば、上記の方法で、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩ部位を導入するプライマーを使用して）と、２００の真陽性（２／２０００×２００，０００）及び２０００の偽陽性が確認される。２回目のプーリング及び再試験の後、２０，０００の真陽性（２００／２０００×２００，０００）及び２０００の偽陽性が得られる。したがって、２回のプーリング及び再試験の後、真陽性の比率（全陽性に対して）約１％から９０％以上増加する。ライブラリに感染した細胞、及び対照の感染細胞に対する生存クローンの数が同程度である上記の如何なる選択アッセイにおいて、プールした陽性のものの再導入の後に生存クローンの数が増加した場合は、真の陽性が存在することを意味する。
【０２７３】
したがって、本発明のスクリーニング方法は、偽陽性率が著しく高いアッセイにおいても使用できる。
【０２７４】
≪実施例１０：アポトーシスを阻害することができるＲＮＡ分子を特定するための別のアポトーシス・アッセイの使用≫
【０２７５】
他の実験では、ｓｈＲＮＡライブラリをマウスの前Ｂ細胞株であるＦＬ．５．１２と共に使用してアポトーシスを阻害するＲＮＡ分子を特定する。１００％のＦ．Ｌ５．１２の細胞が死滅し、且つＢｃｌ−ｘＬによって＞９０％の細胞が救われる条件を画定した（ＩＬ−３除去）。他の実施形態では、本技術をわずかに改変することで他の様々な種類の細胞を使用することができる。
【０２７６】
他の実験では、２９３Ｔ細胞にアポトーシスを誘発するためにスタウロスポリン又は他の酸化剤を使用する。他の実験では、ＦＬ５．１２細胞の代わりに異なるＩＬ−３依存細胞株（例えば、３２Ｄ又はＢａ／Ｆ３）を使用する。他の実験では、３２Ｄ細胞の、感染率の高いサブ細胞株（Warren Pear博士から調達可能）を使用する。他の実験では、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−ＧをｐＨＩＴ１２３の代わりに使用する。フローソーティングによる生存細胞の選別法の代わりに、表面マーカ又は選別可能なレポータを使用する。他の実験では、ｔｅｔ存在下で、ライブラリをｔｅｔ−誘導ＧＦＰ保有細胞株に感染又はトランスフェクトさせ、ｔｅｔを除去した後のＧＦＰを選択し、クローンする。他の実験では、Ｇ１Ｅ細胞（マウスの前赤芽球細胞株）に、幹細胞因子（stem-cell factor：ＳＣＦ）を除去することでアポトーシスを引き起こす。
【０２７７】
他の実験では、通常の致死条件下を生存できる細胞の選択を可能にするモデルシステムでＲＮＡｉ選択を使用する。例えば、幾つかの疾患では、それらの疾患を引き起こす変異は、正常な細胞が耐える条件下で細胞死を引き起こす。変異細胞にランダムなｓｈＲＮＡライブラリを導入し、細胞を選択条件下で培養し、生存する細胞を選択することによって、細胞を救うＲＮＡｉ配列を特定することができる。
【０２７８】
≪実施例１１：生存能力の高いフリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）細胞の選択のためのインビトロ・モデルシステムの画定≫
【０２７９】
初代ＦＲＤＡ線維芽細胞は、正常な対照線維芽細胞よりも酸化的ストレスに対しての感受性がより高い。Jauslinら（Hum Molec Gen 11 : 3055, 2002）は、グルタチオン合成における律速酵素を阻害するためにＬ−ブチオニン（Ｓ，Ｒ）−スルホキシミン（ＢＳＯ）を使用したところ、全ての初代ＦＲＤＡ線維芽細胞が実質的に死滅し、正常な対照線維芽細胞が生存を維持する濃度（０．０５ｍＭ）を発見した。
【０２８０】
他の実験では、ＢＳＯの処理時間を１６〜４８時間、ＢＳＯの濃度を０．００１、０．０５、及び０．１ｍＭに設定して試験を行った。０．３ｍｇ／ｍｌの完全飽和ヒトトランスフェリン（これらの細胞がミトコンドリア鉄を蓄積する傾向を悪化させる）を添加した１ｍＭのＢＳＯ含有の培地にこれらの細胞を培養することでグルタチオンを欠失させると、４８時間後、６ウエルのプレート上の全ての細胞は死滅した。一方、齢及び継代が一致する対照細胞は生存していた。細胞を洗浄し、標準培地を再び加え、コロニーの形成をみることで、１００％の細胞が死滅する最低条件を確認した。
【０２８１】
≪実施例１２：ＦＲＤＡ線維芽細胞の死を阻害することができるＲＮＡ分子を特定するための、ｓｈＲＮＡの使用≫
【０２８２】
本発明に係るランダムなＲＮＡのライブラリをレトロウイルスベクターとしてパッケージングした。ヒト細胞への感染のための高力価のレトロウイルスを生成するために、２９３Ｔ細胞を、レトロウイルスベクターのライブラリ、ｐＨＩＴ４５６（ヒト細胞に対して両指向性）、及びｐＣＰＧ（ｇａｇ−ｐｏｌを発現するプラスミド）で共トランスフェクトし、３６時間後に培養液の上清を採取した。ライブラリを初代ＦＲＤＡ線維芽細胞に加え、ＦＲＤＡ細胞に対して致死的であるが、正常な対照細胞に対して致死的でない濃度の酸化剤の存在下で生存する線維芽クローンを選択した（２９３Ｔ細胞に関する上記の実施例で記載したように、付着細胞を選択）。有効な配列をＰＣＲで調べ、実施例７〜９に記載したように、陽性ベクターを初代ＦＲＤＡ線維芽細胞に再接触させることで確認した。
【０２８３】
≪実施例１３：幹細胞の長期の増殖を誘発することができるＲＮＡ分子を特定するｓｈＲＮＡライブラリの使用≫
【０２８４】
細胞表面マーカであるＣＤ３４は、造血幹細胞が分化するときにその細胞から消失することが知られている。他の実験では、ｓｈＲＮＡのライブラリを、これらの細胞に感染又はトランスフェクトさせ、細胞を培養し、対照培養液における細胞がＣＤ３４の発現を完全に失う後もＣＤ３４を保持する細胞を選択する。このように、造血幹細胞を分化させずに培養することを可能にするＲＮＡｉを決定することができる。他の実験では、確認試験のために、実施例８に記載したように、特定したＲＮＡｉ配列を含む可逆的な形態の阻害ＲＮＡ（例えば、インビトロで合成したｓｉＲＮＡ）を作成する。この新しい形態のＲＮＡを造血幹細胞に加えると、ＣＤ３４の発現が可逆的に維持されることが示される。
【０２８５】
≪実施例１４：幹細胞の多分化能を維持させることができるＲＮＡ分子を特定するための、ｓｈＲＮＡライブラリの使用≫
【０２８６】
他の実験では、幹細胞の多分化能を維持させることができるＲＮＡ配列を特定するために、本発明に係るランダムなＲＮＡライブラリを使用する。ランダムなｓｈＲＮＡライブラリを、幹細胞株（例えば、ＬＲＫ１細胞）に感染又はトランスフェクトさせ、細胞が分化する条件下（ＬＲＫ１細胞の場合、ＩＬ−６の非存在下）で培養し、幹細胞のコロニーを確認する。幹細胞コロニーが保有するベクターを回収し、幹細胞の多分化能を維持させることができるＲＮＡを特定するために、配列決定を行う。他の実験では、確認試験のために、実施例８に記載したように、特定したＲＮＡｉ配列を含む可逆的な形態の阻害ＲＮＡを作成する。この新しい形態のＲＮＡをＬＲＫ１細胞に加えると、自己複製及び／又は未分化状態が可逆的に維持されることが示される。
【０２８７】
他の実験では、多分化能を維持する配列を特定するために、Chambersらが記載した方法（Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem (ES) cells. Cell 113, 643-55 (2003)）において、ＬＲＫ１細胞を使用する。本発明に係るＲＮＡｉライブラリを、ＬＲＫ１細胞にトランスフェクト／感染させ、サイトカイン非存在下の自己複製細胞を選択し、プールする。次に、ｓｈＲＮＡ配列をＰＣＲで調べ、親ベクターに再連結する。次に、単一の未分化コロニーからプラスミドを調製する前に真陽性細胞が十分に濃縮するようにするために、これらのベクターを１回以上ＬＲＫ１細胞に再導入する。他の実験では、活性配列を含むクローンは、サイトカイン非存在下の幹細胞コロニー（形態的に、且つアルカリンホスファターゼ染色によって特定可能）の形成で確認する。
【０２８８】
≪実施例１５：前駆細胞が目的の細胞型に分化するのを誘導することができるＲＮＡ分子を特定するための、ｓｈＲＮＡの使用≫
【０２８９】
他の実験では、前駆細胞が目的の細胞型に分化するのを誘導することができるＲＮＡ配列を特定するために、本発明に係るランダムなＲＮＡライブラリを使用する。例えば、前骨髄細胞であるＨＬ６０細胞の分化（例えば、好中球への）、白血病細胞株であるＵ９３７細胞の分化（例えば、単球への）、又は赤血球細胞株であるＧ１Ｅの分化（例えば、赤血球系細胞への）を確認する。分化は、マーカタンパク質（例えば、Ｔｅｒ−１１９又はＣＤ１１ｂ）の発現又は形態的基準（例えば、プラスチックへの付着性）で特定することができる。
【０２９０】
他の実験では、細胞を未分化培地で培養し、ＧＦＰ及びＣＤ１１ｂ（ＨＬ６０及びＵ９３７細胞）、又はＧＦＰ及びＴｅｒ−１１９（Ｇ１Ｅ細胞）に関してフローサイトメトリを行う。ＧＦＰ（ベクターの存在の指標である）、及び最も高いレベルの適切な分化マーカを発現する対照細胞よりも高いレベルの分化マーカを発現する細胞をゲートオン（gate on）（選択）する。フローソーティングしたＨＬ６０及びＵ９３７細胞の分化は、細胞のプラスチックへの付着でさらに確認することができる。分化の他のマーカとして、ＣＤ１４発現、及びWright-Giemsa染色による細胞形態がある。Ｃ１Ｅ細胞は、小さなヘモグロビン化コロニーを形成し、ベンジジン及びバンド３陽性になり、前赤芽球形態にシフトする。
【０２９１】
他の実験では、ランダムなＲＮＡライブラリを、胚幹（ＥＳ）細胞（他の実施形態では、ヒトＥＳ細胞又はマウスＥＳ細胞）の分化を誘導するＲＮＡ配列を特定するために使用する。他の実施形態では、トランスフェクトされたＥＳ細胞をマウスに導入し、数週間後にマウスを屠殺し、様々な組織からＧＦＰ陽性細胞を単離し、細胞が有する配列を調べる。これらの配列は、細胞が特定の種類の細胞に分化する際に重要な役割を果たす。
【０２９２】
他の実施形態では、血管内皮細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、骨細胞、早期胚中葉細胞、内胚葉由来細胞、原始内胚葉細胞（例えば、内胚葉）、卵黄嚢内臓内胚葉（yolk sac visceral endoderm）、外胚葉由来細胞、神経様細胞、又は他の公知の細胞へのＥＳ細胞の分化を検出する。他の実験では、目的の細胞型へ分化した細胞を選択するために、細胞分類法を使用する。ランダムなｓｈＲＮＡライブラリを前駆細胞に感染又はトランスフェクトさせ、完全に又は部分的に分化した細胞を単離する。分化した細胞が保有するベクターを回収し、その配列を決定することで、目的の細胞型への前駆細胞の分化を誘導するＲＮＡ配列を特定する。他の実験では、確証試験を行うため、特定したＲＮＡｉ配列を含む阻害ＲＮＡの可逆的な他の形態のものを、実施例８に記載したように作成する。この新しい形態のＲＮＡｉを前駆細胞に加え、分化を誘導するのを確認する。
【０２９３】
≪実施例１６：ウイルスの複製を防止する、又はウイルス感染若しくは細胞変性から細胞を保護することができるＲＮＡ分子を特定するための、ｓｈＲＮＡライブラリの使用≫
【０２９４】
他の実験では、ウイルスの複製を防止する、又はウイルス感染若しくは細胞変性から細胞を保護することができるＲＮＡ分子を特定するために、本発明に係るＲＮＡライブラリを使用する。本発明に係るＲＮＡｉライブラリを初代細胞又は細胞株に感染又はトランスフェクトさせ、その後に細胞変性ウイルス（他の実施形態では、ヒトリンパ球及びＨＩＶ−１ウイルス、又はカモ胚線維芽細胞（ＤＥＦ）及びＡＨＶ−１を使用する）を前記細胞又は細胞株に感染させ、生存細胞を特定する。他の実験では、確証試験を行うため、特定したＲＮＡｉ配列を含む阻害ＲＮＡの可逆的な他の形態のものを、実施例８に記載したように作成する。この新しい形態のＲＮＡｉを細胞に加え、可逆的に、ウイルス複製が防止される、又は細胞がウイルス感染若しくは細胞変性から保護されることを確認する。
【０２９５】
≪実施例１７：本発明に係るＲＮＡ分子のさらなる改善≫
【０２９６】
上記の実施例の１つに記載したようにＲＮＡｉライブラリをスクリーニングした後に特定した配列を改善するために、ランダム変異導入法を使用する。他の実施形態では、変異性複製法（error-prone copying）を使用する。他の実施形態では、変異性ＰＣＲを使用する。変異性ＰＣＲによるランダム変異導入法は、Ｍｎ２＋、高濃度のＭｇ２＋、及び濃度が互いに異なるｄＮＴＰの存在下にあるＴａｑポリメラーゼの低忠実度性を利用する。この方法、当該技術分野で公知である。ランダムに変異導入されたＲＮＡｉ配列は、ある条件下では、ｓｈＲＮＡのためのマッチした逆相補鎖を必要とするので、反復選択には、上記の実施例に記載されているライブラリ合成プロトコールの繰り返しが必要である。目的の効果が生じた細胞又は細胞群を単離し、変異性ＰＣＲ法を使用して、図３又は図６に上部に示されているオリゴヌクレオチドの配列と一致する配列を増幅する。前記増幅は、例えば、（最終ｓｈＲＮＡステムの２９番目のヌクレオチドにも変異が導入できるように）Ｎ２８配列の端から下流側へ１ヌクレオチド延びる完全にマッチしたプライマーを使用して、オリゴヌクレオチド配列の末端まで行われる。その結果、「ハーフブック」のライブラリが形成される。
【０２９７】
ランダムな変異導入の後に、上記の実施例の１つに記載したようにライブラリ構築を行った。第１のミスマッチ伸長プライマーは、他の実施形態では、異なるヌクレオチド（Ｎ２８の直下流のランダムなヌクレオチドに相補的）で終端する４つのプライマーの等モル混合物であり、（最初のライブラリ作成で行ったような、４つのサブライブラリの混合が必要ではない）、それぞれの「２９番目」のヌクレオチドは異なる。図４の上部に示されているオリゴヌクレオチドの同等物に相補的なＤＮＡ鎖が１回の伸長反応で存在するが、第１の陥凹伸長プライマーの１回の伸長産物のみがヘアピンループリンカーにアニールする。
【０２９８】
所定の配列のサブライブラリを、上記の実施例の１つの記載にしたがって（オリジナルの配列が対照に含まれる点を除いて）、標的細胞に導入する。幾つかの実験では、ｓｈＲＮＡ構築産物の効果の増大は、（１）選択に使用された元の条件下でより多くの細胞が生存している、（２）選択に使用された元の条件下で生存期間がより長い、又は（３）より悪い条件下で生存すると定義される。対照ｓｈＲＮＡに対してわずかな改善を示す（選択に使用した元の条件下での生存期間がよりわずかであるなど）、最初に特定されたＲＮＡ分子に関しては、より有効な配列を選択するのに第２の基準が最も重要なものとなるであろう。最初の確認分析でより長期間に細胞を救うＲＮＡ分子に関しては、より有効な配列を選択するのに第２の基準が最も重要なものとなるであろう。このような配列に関しては、１００％の死滅率ための新たな最低条件を確立するために、より悪い条件で試験する必要がある。
【０２９９】
他の実験では、本発明に係るＲＮＡｉ分子をエンコードする全遺伝子（即ち、二本鎖領域を形成する両方の部分及び介在領域、又は「ブック全体」（whole book））を低忠実度的な方法で複製、ブック全体のサブライブラリ発現ベクターなどに挿入又はサブクローンし、得られたサブライブラリを、上記の方法にしたがって、標的細胞に導入する。
【０３００】
他の実験では、ＨＬ６０、Ｕ９３７、及びＧ１Ｅ細胞に関して、ｓｈＲＮＡ構築物の効果の増大は、分化マーカの発現がより高い、分化マーカを発現する細胞がより多い、又は発現されている分化マーカの範囲がより広いと定義される。ＬＲＫ１細胞に関しては、ｓｈＲＮＡ構築物の効果の増大は、未分化コロニーの数がより多い、又はより多くの経路にわたる未分化の維持を意味する。
【０３０１】
他の実験では、ＲＮＡ分子をエンコードするベクターを感染又はトランスフェクトさせた細胞を追跡し、その配列のサブライブラリで感染又はトランスフェクトさせた細胞と比較する。他の実施形態では、特定した配列をＰＣＲで調べる。他の実施形態では、配列が正しいか否か及びその活性は、実施例８に記載したように確認する。
【０３０２】
他の実施形態では、２次配列の効果が１次配列のものよりも著しく向上している場合は、２次配列に対して反復選択をもう１回行う。他の実施形態では、他の方法（例えば、テトラゾリウム染色還元アッセイを使用して）で改善配列を試験する。ＦＲＤＡに関して記載した選択アッセイは酸化的ストレスに基づくが、抗酸化保護自体に関連しないＦＲＤＡ細胞の特徴を改善するＲＮＡ分子を得るのにこのアッセイを使用することができる。その理由は、選択アッセイが、正常な対照線維芽細胞が生存できる酸化的ストレス条件下で行われるためである。したがって、ＦＲＤＡ細胞を正常な細胞に近づける干渉は、他の実施形態では、アッセイでの生存性を改善する。一部のｓｈＲＮＡは、フラタキシン（frataxin）発現を阻害するトリヌクレオチド反復伸長（tri-nucleotide repeat expansion）又はトリヌクレオチド反復伸長によって形成されるトリプレックスＤＮＡに影響を及ぼすことが知られている。これは、ノーザン又はウエスタンブロットを使用してフラタキシン発現の増加を測定することで確認できる。他の実施形態では、上記のプロセスにより、改善した配列を特定することができる。
【０３０３】
≪実施例１８：疾患の薬剤標的の特定及び幹細胞への応用のための、本発明に係るＲＮＡ分子の使用≫
【０３０４】
他の実施形態では、改善した配列は、薬剤標的の可能性を有する個々の遺伝子に関与する。候補遺伝子は、ヒトゲノムのデータベースをホモロジー検索することで特定する（とりわけ、改善した配列の最初の２２ヌクレオチドで）。候補遺伝子は、同じ遺伝子からの異なるｍＲＮＡ配列を標的にする個々のｓｈＲＮＡを使用することで確認する。ウエスタン分析、ノーザン分析、及び／又は量的ＲＴ−ＰＣＲを行って対照ｓｈＲＮＡと比較し、非特異的な効果を除外することでさらに確証することができる。所望に応じて、ｓｈＲＮＡの効果を無効にするが、エンコードされたアミノ酸を改変しない変異で標的遺伝子を再発現させて表現形（例えば、酸化的ストレスからの救済）を反転させることで最終確認を行う。
【０３０５】
他の実験では、改善した配列は、複数の標的遺伝子に関与する。これは、マイクロアレイ解析によって確認することができる。
【０３０６】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ分子の作用機構を決定し、薬剤標的を特定するための追加実験を行う。前記ＲＮＡｉ分子の作用機構として、例えば、ＦＲＤＡ細胞の場合、ミトコンドリア鉄の排出の増加及びミトコンドリア鉄の取り込みの減少、鉄硫黄クラスターの安定化又はフラタキシン安定性及び機能の増大、抗酸化保護の増大、代謝効果を介してミトコンドリアに対する要求性の回避、ＦＲＤＡ遺伝子の最初のイントロンでトリヌクレオチド反復伸長によって形成されたトリプレックスＤＮＡへの作用によるフラタキシン発現の増大がある。
【０３０７】
≪実施例１９：治療ＲＮＡ配列を特定するための、コンピュータで作成されたｓｈＲＮＡの使用≫
【０３０８】
コンピュータ及びオリゴヌクレオチド合成器を使用して、下記のように、６５，５００個のランダムなｓｈＲＮＡ分子を含むｓｈＲＮＡライブラリを作成した。
【０３０９】
サブクローニングのための適切なフランキング配列と、ＲＮＡ分子をエンコードする遺伝子を含む内部分とを含む６５，５００個の配列のセットを作成した。尚、エンコードされた前記ＲＮＡ分子の（ａ）１〜２２番目の残基はランダムであり、（ｂ）その次の３〜２０残基は定常及び非パリンドロームであり、（ｃ）次の２２残基は最初の２２残基に対して相補的である。或いは、エンコードされた前記ＲＮＡ分子の（ａ）１〜８番目の残基はランダムであり、（ｂ）９〜２２番目の残基は定常であり、（ｃ）その次の５〜２０残基は定常及び非パリンドロームであり、（ｄ）その次の２２残基は最初の２２残基に対して相補的である。或いは、二本鎖領域の１及び９〜２２番目の残基は定常であり、一方、他の部分はランダムである。或いは、二本鎖部分の他の任意の部分が定常であり、残りの部分がランダムである。幾つかの実験では、公知及び／又は天然型ＲＮＡｉ分子由来のループ配列を使用する。しかしながら、当業者ならば、非公知のループ配列などの様々な配列がこの方法に適切であることを理解できるであろう。また、二本鎖領域のＲＮＡ分子が２２ヌクレオチドである必要がなく、６〜３０ヌクレオチドの間（６及び３０ヌクレオチドを含めて）なら如何なる長さであってもよいことを理解できるであろう。他の実験では、２９ヌクレオチドの二本鎖領域が使用されている場合、全２９ヌクレオチド領域に変異が導入されている。
【０３１０】
コンピュータ作成の配列でオリゴヌクレオチド合成器をプログラム化する。６５，５００個のｓｈＲＮＡをエンコードする配列のそれぞれをその相補配列とアニールさせ、プールとして、適切な発現ベクターに連結する。これによって、１８兆個の可能な２２ｍｅｒｓｈＲＮＡコード配列のランダムなサンプリングを代表する６５，５００のランダムなｓｈＲＮＡコード配列のライブラリが作成される。
【０３１１】
他の実験では、実施例７〜１６に記載したように、このライブラリを目的の疾患又は表現形の細胞モデルで試験する。有効な配列をＰＣＲで調べ、実施例７〜１３に記載したように、陽性ベクターを細胞に再接触させることでその有効性を再確認する。
【０３１２】
≪実施例２０：ＲＮＡ分子のさらなる改善≫
【０３１３】
上記の実施例に記載したようにＲＮＡｉライブラリをスクリーニングした後に特定した配列を改善するために、配列に突然変異を導入する。他の実施形態では、変異性複製法（error-prone copying）を使用する。他の実験では、変異性ＰＣＲを使用する。変異性ＰＣＲによるランダム変異導入法は、Ｍｎ２＋、高濃度のＭｇ２＋、及び濃度が互いに異なるｄＮＴＰの存在下にあるＴａｑポリメラーゼの低忠実度性を利用する。この方法、当該技術分野で公知である。ランダムに変異導入されたＲＮＡｉ配列は、ある条件下では、ｓｈＲＮＡのための逆相補鎖を必要とするので、反復選択には、上記の実施例に記載されているライブラリ合成プロトコールの繰り返しが必要である。目的の効果が生じた細胞又は細胞群を単離し、図３又は図６の上部に示されているオリゴヌクレオチドの配列と一致する配列を増幅する。前記増幅は例えば、（最終ｓｈＲＮＡステムの２９番目のヌクレオチドにも変異が導入できるように）Ｎ２８配列の端から下流側へ１ヌクレオチド延びる完全にマッチしたプライマーを使用して、オリゴヌクレオチド配列の末端まで行われる。その結果、「ハーフブック」のライブラリが形成される。
【０３１４】
ランダムな変異導入の後に、上記の実施例の１つに記載したようにライブラリ構築を行った。第１のミスマッチ伸長プライマーは、他の実施形態では、異なるヌクレオチド（Ｎ２８の直下流のランダムなヌクレオチドに相補的）で終了する４つのプライマーの等モル混合物であり、（最初のライブラリ作成で行ったような、４つのサブライブラリの混合が必要ではない）、それぞれの「２９番目」のヌクレオチドは異なる。図４の上部に示されているオリゴヌクレオチドの同等物に相補的なＤＮＡ鎖が１回の伸長反応で存在するが、第１の陥凹伸長プライマーの１回の伸長産物のみがヘアピンループリンカーにアニールする。
【０３１５】
他の実験では、上記の実施例で特定された配列の変異体は、下記のようにコンピュータ及びオリゴヌクレオチド合成器を使用して作成した。
【０３１６】
サブクローニングのための適切なフランキング配列と、ＲＮＡ分子をエンコードする遺伝子を含む内部分とを含む配列のセットを作成した。エンコードされた前記ＲＮＡ分子の（ａ）１〜２２番目の残基の一部は定常である（上記の実施例で特定されたＲＮＡ配列に基づいて）のに対して、残りの部分はランダムであり、（ｂ）その次の３〜２０残基は定常及び非パリンドロームであり、（ｃ）その次の２２残基は最初の２２残基に対して相補的である。他の実験では、シード配列（二本鎖領域の約１〜８番目の残基）は定常であるのに対して、二本鎖領域の残りの部分は多様である。他の実験では、シード配列は多様であるのに対して、二本鎖領域の他の部分は定常である。他の実験では、シード配列の２〜８番目の残基は定常である。
【０３１７】
コンピュータ作成の配列でオリゴヌクレオチド合成器をプログラム化する。６５，５００個のｓｈＲＮＡをエンコードする配列のそれぞれをその相補配列とアニールさせ、プールとして、適切な発現ベクターに連結する。これによって、１８兆個の可能な２２ｍｅｒｓｈＲＮＡコード配列のランダムなサンプリングを代表する６５，５００のランダムなｓｈＲＮＡコード配列のライブラリが作成される。
【０３１８】
変異導入又はコンピュータのランダム化によるｓｈＲＮＡのランダム化の後、上記の実施例の１つに記載したように（オリジナルの配列が対照内に含まれる点を除いて）、所定の配列に関するサブライブラリを標的細胞に導入する。幾つかの実験では、ｓｈＲＮＡ構築産物の効果の増大は、（１）選択に使用された元の条件下でより多くの細胞が生存している、（２）選択に使用された元の条件下で生存期間がより長い、又は（３）より悪い条件下で生存すると定義される。対照ｓｈＲＮＡに対してわずかな改善を示す（選択に使用した元の条件下での生存期間がよりわずかであるなど）、最初に特定されたＲＮＡ分子に関しては、より有効な配列を選択するのに第２の基準が最も重要なものとなるであろう。最初の確認分析でより長期間に細胞を救うＲＮＡ分子に関しては、より有効な配列を選択する上で、第３の基準が最も重要なものとなるであろう。このような配列に関しては、１００％の死滅率のための新たな最低条件を確立するために、より悪い条件下で試験する必要がある。
【０３１９】
他の実験では、改善した配列を特定するために、実施例１７に記載されたプロトコールの１つを使用してサブライブラリを試験する。
【図面の簡単な説明】
【０３２０】
【図１】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のための発現ベクターライブラリの作成方法（パートＩ）を示す図である。実施例３に記載。１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号３〜６に示されている。
【図２】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のための発現ベクターライブラリの作成方法（パートＩＩ）を示す図である。実施例３に記載。上記以外の１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号７〜１２に示されている。
【図３】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のための発現ベクターライブラリの別の作成方法（パートＩ）を示す図である。実施例４に記載。上記以外の１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号１３〜１７に示されている。
【図４】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のライブラリの別の作成方法（パートＩＩ）を示す図である。実施例４に記載。上記以外の１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号１８〜２７に示されている。
【図５】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のライブラリの別の作成方法（パートＩＩ、非相補的なループ配列の作成）を示す図である。実施例４に記載。上記以外の１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号２８〜３３に示されている。
【図６】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のライブラリの第３の作成方法（パートＩ）を示す図である。実施例５に記載。上記以外の１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号３４〜３７に示されている。
【図７】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のライブラリの第３の作成方法（パートＩＩ）を示す図である。実施例５に記載。上記以外の１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号３８〜５１に示されている。
【図８】部分的に自己相補的なＲＮＡ分子のライブラリの第３の作成方法（パートＩＩＩ）を示す図である。実施例５に記載。上記以外の１０以上のヌクレオチドを有する配列は、配列番号５２〜５３に示されている。
【図９】実施例５に記載の方法（のＡａｒＩ／ＰｍｅＩ消化（図７の下部）の前の段階）にしたがって作成されたライブラリの中間体の配列データを示す図である。全クローンの配列が重なっているので、ランダム領域の各残基には、４種類の塩基が存在することが示されている。これは、これらの領域のランダム製を示すものである。この配列データは、予想通りの定常領域が存在し、ランダム領域においてバイアスが存在しないことを確認するものである。
【図１０】完全なライブラリからの１４クローンのランダムな（ｎ２９）領域の配列を示すデータである。配列にスキューイングが見られなかったことにより、方法が正確に行われ、最終産物が目的の産物に完全に一致したことがわかる。
【図１１】最終ライブラリからの単一「クローン」の配列を示す図である。ここに、示されているのは、Ｎ２８のランダム配列、それに続く「Ｇ」残基（オリジナルの一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ分子の第２の定常領域の５´末端由来）、それに続くループ配列、「Ｃ」残基、及びＮ２８の逆相補鎖（ｎ２８）である。この配列は、図８の下部の下の鎖（上下を逆にした場合）と一致する。これは、最終産物が目的の産物に完全に一致することを示すものである。
【図１２】４８時間前にｐＱｅ２に感染させられたＤＬＤ１細胞のフローサイトメトリ解析を示す図である。Ａ：生細胞をゲートするための前方散乱対側方散乱である。非凝集細胞を濃縮するために、第２のゲーティング（前方散乱対側方散乱幅）を行った。Ｂ：ｅＧＦＰ発現に関する感染細胞のフローサイトメトリ解析である。パネルＡからゲートされた細胞の約３０％がｅＧＦＰを発現する。Ｃ：ｅＧＦＰ発現に関する感染細胞のフローサイトメトリ解析である。ゲートされた細胞の約５０％がｅＧＦＰを発現した。
【図１３】抗ＧＦＰｓｈＲＮＡを使用したｐＱｅ２試験を示す図である。左のパネル：ｐＱｅ２のみでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞。右のパネル：ＧＦＰを標的にしたｓｈＲＮＡ構築物を含むｐＱｅ２でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞。トランスフェクションの有効性は、細胞におけるＧＦＰの低レベルの発現によって確認された。
【図１４】約３０％のＦＬ５．１２細胞のレトロウイルス感染を示す図である。
【図１５】複数回のＩＬ−３除去及び再添加の後の、３００Ｋライブラリで感染したＧＦＰ陽性細胞の濃縮を示す図である。
【図１６】ＩＬ−３除去の１５時間後の、選択されたｓｈＲＮＡ配列（「ブック」）に感染させられたＦＬ５．１２細胞の生存率（ｙ軸）を示す図である。２日後にも同様の２：１の生存比が確認された（レベルはより低かった）。尚、対照５３はランダムなブックであり、ｐＳｉｒｅｎはベクターである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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