(57)【要約】本発明は、強磁性、フェリ磁性および／または超常磁性粒子の群から選択される磁性粒子を含む、磁性粒子が架橋ポリアクリレートまたはポリアルキルアクリレートマトリクスに包埋されている、磁性ポリマー粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子がポリアクリレートまたはポリ[（アルキルアクリレート）]マトリクスに包埋されている点で特徴づけられ、磁性ポリマー粒子が２０ないし５００ｎｍの範囲の最大孔半径を有する点で特徴づけられる、磁性ポリマー粒子。
【請求項２】
３０ないし４００ｎｍの範囲の最大孔半径を有する点で特徴づけられる、請求項１で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項３】
８０ないし２５０ｎｍの範囲の最大孔半径を有する点で特徴づけられる、請求項２で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項４】
５から２５μｍの範囲の平均粒子サイズを有する点で特徴づけられる、請求項１から３のいずれかで請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項５】
６ないし２０μｍの範囲の平均粒子サイズを有する点で特徴づけられる、請求項４で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項６】
１０ないし１５μｍの範囲の平均粒子サイズを有する点で特徴づけられる、請求項５で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項７】
強磁性、フェリ磁性および／または超常磁性挙動を示す点で特徴づけられる、請求項１から６のいずれかで請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項８】
磁性粒子が、γ−Ｆｅ2Ｏ3（磁赤鉄鉱）、Ｃｒ2Ｏ3から成る群からの強磁性および／またはフェリ磁性粒子、請求項７で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項９】
磁性粒子が（Ｍ2+Ｏ）Ｆｅ2Ｏ3型のフェライトの群から選択される強磁性またはフェリ磁性粒子であり、Ｍ2+が二価遷移金属陽イオンである、請求項８で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項１０】
磁性材料がＦｅ3Ｏ4（磁鉄鉱）である点で特徴づけられる、請求項９で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項１１】
架橋剤含量１〜９５ｗｔ％、官能化ポリマー含量１〜９９ｗｔ％、および磁性材料含量１〜９５ｗｔ％を有する点で特徴づけられる、請求項１から１０のいずれかで請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項１２】
架橋剤含量１０〜８０ｗｔ％、官能化ポリマー含量１０〜８０ｗｔ％、および磁性材料含量１０〜８０ｗｔ％を有する点で特徴づけられる、請求項１１で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項１３】
架橋剤含量２０〜７０ｗｔ％、官能化ポリマー含量２０〜７０ｗｔ％、および磁性材料含量２０〜７０ｗｔ％を有する点で特徴づけられる、請求項１２で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項１４】
架橋剤含量１５〜４０ｗｔ％、官能化ポリマー含量３０〜６０ｗｔ％、および磁性材料含量３０〜６０ｗｔ％を有する点で特徴づけられる、請求項１３で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項１５】
強磁性、フェリ磁性および／または超常磁性粒子が、一般式（Ｉ）の官能基を含む架橋ポリアクリレートまたはポリ[アルキルアクリレート]マトリクスに包埋されている点で特徴づけられる、前記請求項のいずれかで請求される磁性ポリマー粒子であって
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｍ−Ｒ        （Ｉ）
ここで
Ｍは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−でありうる；
Ｒは水素またはＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
アルキレン基−（ＣＨ2）l−、および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは互いに独立して−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−または−Ｏ−でありえ、およびａは整数１、２、３、４、５または６でありえ、およびｂは整数１、２、３、４、５、６、７または８でありうる；
Ｘは下記でありうる
水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10−アリール、１、２、３、４、５または６炭素原子から成るアルキレン鎖を有する−Ｏ−Ｃ7−Ｃ14−アルキルアリールおよびＣ6−Ｃ12−アリールラジカル；
−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、−Ｃ6−Ｃ12−アリール、ヘテロアリール、随意的にＣ1−Ｃ6−アルキレン基を介して結合しているイミダゾリルラジカル；
１、２、３、４、５または６炭素原子から成るアルキレン鎖を有するＣ7−Ｃ14−アルキルアリールおよびＣ6−Ｃ12−アリールラジカル；
次の一般式の置換基であって、
【化１】
2009518489.tif 000007
ここで
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキルおよび／またはＣ6−Ｃ10−アリール；
−ＣＮ、−ＮＣ、−Ｎ3；
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4およびＲ4は水素、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ6−Ｃ10−アリールまたは−Ｏ−Ｃ6−Ｃ12−アリールでありうる；
−ＮＨ2、−ＮＨＲ5およびＲ5は水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキルおよび／またはＣ6−Ｃ10−アリールでありうる；
Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ；
−ＳＨまたは−Ｓ−Ｓ−Ｈ；
２−チオピリジルまたは４−チオピリジル；
−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＦ3；
アシルイミダゾール、マレイミドまたはアズラクトン基でありうる；
または
ＲはＹ'Ｘ'Ｌ基でありうるが、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２、３、４、５または６でありうる；
ヒドロキシ置換アルキレン基
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは互いに独立して−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−または−Ｏ−でありえ、およびａは整数１、２、３、４、５または６でありえ、およびｂは整数１、２、３、４、５、６、７または８でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは−ＮＨ−でありえ、ａは整数１または２でありえ、およびｂは６でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−；
Ｌは下記でありうる
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）u−[ＮＨ−（ＣＨ2）2]v−ＮＨ2およびｕおよびｖはそれぞれの場合に互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１、２、３、４、５または６でありうる；
たとえばε−Ｎを介して結合するニトリロ三酢酸残基のような三座、四座または五座キレート剤、好ましくは分子量５００から２０００００Ｄａのいわゆる低分子量、高分子量または直鎖ポリエチレンイミン残基、アミノラジカル、好ましくはポリアミン残基、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、カルボン酸残基、または結合した抗体、好ましくは二次抗体、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチドまたはストレプトアビジン、ＩＤＡ、ＤＥＯまたはＴＥＤまたは
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【請求項１６】
一般式（Ｉ）の官能基を含む点で特徴づけられる、請求項１５で請求される磁性ポリマー粒子であって、
Ｍは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−でありうる；
Ｒは水素
または
−ＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
アルキレン基−（ＣＨ2）l−、および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
ヒドロキシ置換アルキレン基
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−、
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは−ＮＨ−でありえ、ａは整数１または２でありえ、およびｂは６でありうる；
Ｘは下記でありうる
水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10−アリール、１、２、３、４、５または６炭素原子から成るアルキレン鎖を有する−Ｏ−Ｃ7−Ｃ14−アルキルアリールおよびＣ6−Ｃ12−アリールラジカル；
次の一般式の置換基であって、
【化２】
2009518489.tif 000008
ここで
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して水素、Ｃ1−Ｃ3−アルキル；
−ＮＨ2、−ＮＨＲ5およびＲ5は水素、Ｃ1−Ｃ4−アルキルでありうる；
Ｆ、ＣｌまたはＢｒ；
−ＣＮ、−ＮＣ；
−ＳＨまたは−Ｓ−Ｓ−Ｈ；
２−チオピリジルまたは４−チオピリジル；
−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＦ3（トレシル）；
アシルイミダゾール、マレイミドまたはアズラクトン基でありうる；
または
ＲはＹ'Ｘ'Ｌ基でありうるが、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−；
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは−ＮＨ−でありえ、ａは整数１または２でありえ、およびｂは６でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−；
Ｌは下記でありうる
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）u−[ＮＨ−（ＣＨ2）2]v−ＮＨ2およびｕおよびｖはそれぞれの場合に互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１、２、３または４でありうる；
たとえばε−Ｎを介して結合するニトリロ三酢酸残基のような三座、四座または五座キレート剤、好ましくは分子量５００から２０００００Ｄａのいわゆる低分子量、高分子量または直鎖ポリエチレンイミン残基、ポリアミン残基、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、カルボン酸残基、または結合した抗体、好ましくは二次抗体、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチドまたはストレプトアビジン、ＩＤＡ、ＤＥＯ、ＴＥＤまたは
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【請求項１７】
一般式（Ｉ）の官能基を含む点で特徴づけられる、請求項１６で請求される磁性ポリマー粒子であって、
Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−でありうる；
Ｒは水素
または
ＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）l−および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
ヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１または２でありうる；
ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−；
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１または２でありうる、
Ｘは下記でありうる
水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10−アリール；
次の一般式の置換基であって、
【化３】
2009518489.tif 000009
ここで、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して水素またはＣ1−Ｃ2−アルキル；
−ＮＨ2；
ＣｌまたはＢｒ；
−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＦ3でありうる；
または
ＲはＹ'Ｘ'Ｌ基でありうるが、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２または３でありうる；
ヒドロキシ置換アルキレン基
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１または２でありうる；
−[ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）]−または
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１または２でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−；
−ＮＨ−；
Ｌは下記でありうる
たとえばε−Ｎを介して結合するニトリロ三酢酸残基のような三座、四座または五座キレート剤、好ましくは分子量５００から２０００００Ｄａのいわゆる低分子量、高分子量または直鎖ポリエチレンイミン残基、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、カルボン酸残基、または結合した抗体、好ましくは二次抗体、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチドまたはストレプトアビジン
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−[ＮＨ−（ＣＨ2）u]v−ＮＨ2、ここでｕは２でありえ、およびｖは２でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１または２でありうる；
ＮＴＡ、ＩＤＡ、ＴＥＤまたは
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【請求項１８】
一般式（Ｉ）の官能基を含む点で特徴づけられる、請求項１７で請求される磁性ポリマー粒子であって、
Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−でありうる；
Ｒは水素または
ＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
アルキレン基−（ＣＨ2）l−および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１または２でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−；
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１または２でありうる；
Ｘは下記でありうる
水素；
次の一般式の置換基であって、
【化４】
2009518489.tif 000010
ここで、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、水素；
−ＮＨ2でありうる；
または
Ｙ'Ｘ'Ｌ基であって、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２、３、４、５、または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１または２でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−または
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１または２でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合、
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−、
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＮＨ−；
Ｌは下記でありうる
たとえばニトリロ三酢酸残基のような三座、四座または五座キレート剤、ポリエチレンイミン残基、アミノラジカル、好ましくはポリアミン残基、カルボン酸残基または結合した抗体、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチド、スペルミンまたはストレプトアビジン、二次抗体
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−[ＮＨ−（ＣＨ2）u]v−ＮＨ2、ここでｕは１または２でありえ、およびｖは２でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１または２でありうる；
ＮＴＡ、ＩＤＡ／ＤＥＯ、ＴＥＤまたは
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【請求項１９】
ポリマーマトリクスがジまたはポリアクリレートまたはジまたはポリアルキルアクリレートと架橋している、前記請求項のいずれかで請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項２０】
架橋剤が、エチレングリコールアクリレート、エチレングリコール（アルキル）アクリレート、特にエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコール（アルキル）アクリレート、特にポリエチレングリコールメタクリレートまたはエチレングリコールアクリレート、エチレングリコール（アルキル）アクリレート、特にエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコール（アルキル）アクリレート、特にポリエチレングリコールメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレートおよびペンタエリスリトールトリアクリレートまたはプロピレングリコールアクリレート、プロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にプロピレングリコールメタクリレート、ポリプロピレングリコールアクリレート、ポリプロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にポリプロピレングリコールメタクリレートまたはプロピレングリコールアクリレート、プロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にプロピレングリコールメタクリレート、ポリプロピレングリコールアクリレート、ポリプロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にポリプロピレングリコールメタクリレートから成る群から選択される、請求項１９で請求される磁性ポリマー粒子。
【請求項２１】
ａ）強磁性、フェリ磁性または超常磁性粒子から選択される磁性粒子の、第一の有機相中の分散物の調製、ここで第一の有機相は少なくとも下記を含む
ａ．１．）アクリル酸、メタクリル酸、または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｙ−Ｘ型の置換カルボキシル基を有しＹがスペーサー基でありおよびＸが反応基であるアクリレートおよびメタクリレートから成る群から選択される、一つ以上のアクリル酸モノマー、
ａ．２．）二つ以上のアクリル酸または（アルキル）アクリル酸基を含む、少なくとも一つの架橋剤、
ａ．３．）少なくとも一つの親油性フリーラジカル開始剤、および
ａ．４．）少なくとも一つの有機細孔形成剤
ｂ）該分散物および第二の有機相をホモジナイズして乳液を形成、ここで第二の有機相は
ｂ１）少なくとも一つの液体疎水性化合物および
ｂ２）少なくとも一つの界面活性物質を含む、および
ｃ）乳液のフリーラジカル重合、
の段階を含み、
この方法で得られた磁性ポリマー粒子が、好ましくは５ないし２５μｍの範囲、特に好ましくは６ないし２０μｍの範囲、非常に特に好ましくは１０ないし１５μｍの範囲の平均粒子サイズ、および、好ましくは２０ないし５００ｎｍの範囲、特に好ましくは３０ないし４００ｎｍの範囲、非常に特に好ましくは８０ないし２５０ｎｍの範囲の最大孔半径を有する、
磁性ポリマー粒子を調製するための方法。
【請求項２２】
フリーラジカル重合前に乳液が不活性ガス流で洗浄され、およびフリーラジカル重合が不活性ガス雰囲気中で実施される、請求項２１で請求される方法。
【請求項２３】
分散物の調製前または調製中に、磁性粒子が磨砕および／または脱凝集化される、請求項２１または２２で請求される方法。
【請求項２４】
フリーラジカル重合が温度５０℃ないし１２０℃にて実施される、請求項２１から２３のいずれかで請求される方法。
【請求項２５】
フリーラジカル重合が温度６０℃ないし９０℃にて実施される、請求項２４で請求される方法。
【請求項２６】
第一の有機相中のモノマーが一般式ＩＩに記載の化合物である、前記請求項のいずれかで請求される方法：
Ｈ2Ｃ＝ＣＲ'−Ｃ（＝Ｏ）−    （ＩＩ）
ここでＲ'はＨ−またはＣ1−Ｃ3−アルキルである、
および
Ｒは水素または請求項１５から１８のいずれかに記載の一般式−Ｙ−Ｘの基である、
および
Ｘは好ましくは−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、ｈａｌ、トレシル、マレイミドおよびエポキシ基を含む群から選択される。
【請求項２７】
スペーサーＹが−（ＣＨ2）l−基でありおよび１が整数１、２、３、４、５または６である、請求項２６で請求される方法。
【請求項２８】
第一の有機相中のモノマーが、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸およびアクリル酸、および一般式（ＩＩＩ）のアクリル酸誘導体から成る群から選択される、請求項２１から２７のいずれかで請求される方法。
Ｈ2Ｃ＝ＣＲ'Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）cＺ    （ＩＩＩ）
ここで
Ｒ1はＨまたはメチルである；
ｃは整数１、２、３、４、５または６である；
Ｚは−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、トレシル、マレイミドおよびエポキシ基を含む群から選択される。
【請求項２９】
架橋剤が少なくとも一つのアルキリデングリコールジアクリレートまたは一般式（ＩＶ）のアルキリデングリコール（アルキル）アクリレートである、請求項２１から２８のいずれかで請求される方法：
Ｈ2Ｃ＝ＣＲ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−[（ＣdＨ2dＯ）]e（Ｃ＝Ｏ）ＣＲ'"＝  ＣＨ2     （ＩＶ）
ここで一般式（ＩＶ）でＲ"およびＲ'"は互いに独立してＨまたはＣ1−Ｃ3−アルキルであり、および好ましくはＲ"およびＲ'"は共にＨまたはメチルであり、ｄは整数１、２、３または４−好ましくは１または２−であり、およびｅは１ないし１００の整数−好ましくは整数１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０および特に好ましくは整数１、２、３、または４である。
【請求項３０】
ｄが整数１または２でありおよびｅが整数１、２、３、４である点で特徴づけられる、請求項２９で請求される方法。
【請求項３１】
架橋剤がエチレングリコールジアクリレートまたはエチレングリコールジメタクリレートまたはその混合物である点で特徴づけられる、請求項２１から３０のいずれかで請求される方法。
【請求項３２】
架橋剤が少なくとも二つのアクリルまたはメタクリル基を有するポリアクリレートまたはポリメタクリレートである点で特徴づけられる、請求項２１から３０のいずれかで請求される方法。
【請求項３３】
架橋剤が３または４個のアクリルまたはメタクリル基を有するポリアクリレートまたはポリメタクリレートである点で特徴づけられる、請求項２１から３０のいずれかで請求される方法。
【請求項３４】
架橋剤がペンタエリスリトールテトラアクリレート、ペンタエリスリトールテトラメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレートおよびペンタエリスリトールトリメタクリレートまたはその混合物から成る群から選択される点で特徴づけられる、請求項２１から３０のいずれかで請求される方法。
【請求項３５】
有機細孔形成剤が、
ａ）一つ以上の水酸基、好ましくは１、２または３個の水酸基を有し、４から２０個のＣ原子、好ましくは４から１６個のＣ原子および特に好ましくは４から８個のＣ原子を有する、脂肪族、分枝または非分枝アルコールまたは
ｂ）アルキリデングリコール、特にエチレングリコールおよび
ｃ）質量−平均分子量Ｍwが２００ないし１０００００ｇ／ｍｏｌでありおよびポリアルキリデングリコール誘導体、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドンおよびポリスチレンから成る群から選択されるポリマー化合物
から成る群から選択される、請求項２１から３４のいずれかで請求される方法。
【請求項３６】
親油性フリーラジカル開始剤が、アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２'−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、２，２'−アゾビス（２，４−ジメチル吉草酸ニトリル）、および１，１'−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）から成る群から選択される、請求項２１から３５のいずれかで請求される方法。
【請求項３７】
疎水性液体が、脂肪族または環状アルカン、特に一般式Ｃ2Ｈ2n+2でｎが＞６である脂肪族アルカン、脂肪族および環状アルケン、特に一般式Ｃ2Ｈ2nでｎが＞６である脂肪族アルケンから成る群から選択される、請求項２１から３５のいずれかで請求される方法。
【請求項３８】
疎水性液体が、アルキルまたはアルケン基で置換されうる芳香族またはヘテロ芳香族化合物である、請求項２１から３５のいずれかで請求される方法。
【請求項３９】
疎水性液体がトルエンである、請求項３８で請求される方法。
【請求項４０】
界面活性物質が、陽イオン性、陰イオン性および非イオン性乳化剤から成る群から選択される乳化剤である、請求項２１から３９のいずれかで請求される方法。
【請求項４１】
磁性粒子が強磁性および／またはフェリ磁性粒子である、請求項２１から４０のいずれかで請求される方法。
【請求項４２】
磁性粒子が、γ−Ｆｅ2Ｏ3（磁赤鉄鉱）、Ｃｒ2Ｏ3、およびフェライトから成る群から選択される点で特徴づけられる、請求項４１で請求される方法。
【請求項４３】
フェライトが（Ｍ2+Ｏ）Ｆｅ2Ｏ3であり、Ｍ2+が二価遷移金属陽イオンである点で特徴づけられる、請求項４２で請求される方法。
【請求項４４】
磁性粒子が好ましくはＦｅ3Ｏ4（磁鉄鉱）である点で特徴づけられる、請求項４２で請求される方法。
【請求項４５】
架橋剤が０．１〜２０ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項２１から４４のいずれかで請求される方法。
【請求項４６】
架橋剤が０．５ないし５ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項４５で請求される方法。
【請求項４７】
架橋剤が１ないし４ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項４６で請求される方法。
【請求項４８】
官能化モノマーが０．１ないし２０ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項２１から４７のいずれかで請求される方法。
【請求項４９】
官能化モノマーが０．５ないし５ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項４８で請求される方法。
【請求項５０】
官能化モノマーが好ましくは１ないし４ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項４９で請求される方法。
【請求項５１】
磁性材料が０．１ないし２０ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項２１から５０のいずれかで請求される方法。
【請求項５２】
磁性材料が０．５ないし５ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項５１で請求される方法。
【請求項５３】
磁性材料が１ないし４ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項５２で請求される方法。
【請求項５４】
開始剤が０ないし５ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項２１から５３のいずれかで請求される方法。
【請求項５５】
開始剤が０．０１ないし３ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項５４で請求される方法。
【請求項５６】
開始剤が０．０５ないし０．５ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項５５で請求される方法。
【請求項５７】
洗浄剤が０ないし２０ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項２１から５６のいずれかで請求される方法。
【請求項５８】
洗浄剤が０．１ないし１０ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項５７で請求される方法。
【請求項５９】
洗浄剤が０．１ないし３ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項５８で請求される方法。
【請求項６０】
細孔形成剤が０．１ないし２０ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項２１から５９のいずれかで請求される方法。
【請求項６１】
細孔形成剤が０．５ないし５ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項６０で請求される方法。
【請求項６２】
細孔形成剤が１ないし４ｗｔ％の割合で使用される点で特徴づけられる、請求項６１で請求される方法。
【請求項６３】
段階ｄ）好ましくは生体分子を磁性ポリマーへ固定化できるリガンドを結合することによる磁性ポリマー粒子の官能化、をさらに含む、請求項２１から６２のいずれかで請求される方法。
【請求項６４】
リガンドが、第一の段階ｄ１）で、少なくとも二つの反応基を有するスペーサー化合物を磁性ポリマー粒子のカルボキシル基と共有結合することによって結合され、およびその後、第二の段階ｄ２）で、リガンドの結合が磁性ポリマー粒子を固定化できる、請求項６３で請求される方法。
【請求項６５】
生体分子を含む試料から少なくとも一つの生体分子種を単離および／または分析するための、下記の段階を含む方法：
ａ）少なくとも一つの生体分子種を含む試料を提供する、
ｂ）試料を請求項１から２０のいずれかで請求される磁性ポリマー粒子と、少なくとも一つの生体分子種が磁性ポリマー粒子と結合する条件下で、接触させる、
ｃ）結合した生体分子と共に磁性ポリマー粒子を、少なくとも一つの磁場を用いて除去する。
【請求項６６】
方法がさらなる段階：
ｄ）少なくとも一つの生体分子種の、磁性ポリマー粒子からの溶出
を含む、請求項６５で請求される方法。
【請求項６７】
少なくとも一つの生体分子種が、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖質、脂質、およびその組み合わせから成る群から選択され、および特に、核酸およびオリゴヌクレオチド、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、および化学的に合成または修飾された核酸またはオリゴヌクレオチドから選択される、請求項６５または６６で請求される方法。
【請求項６８】
少なくとも一つの生体分子種を含む試料が、血液、組織、細胞、植物材料、またはＰＣＲ溶液といった増幅溶液から成る群から選択される、請求項６５から６７のいずれかで請求される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式（Ｉ）の官能基を含む架橋ポリアクリレートまたはポリ[（アルキルアクリレート）]マトリクスに包埋されている強磁性、フェリ磁性および／または超常磁性粒子を含む磁性ポリマー粒子に関し、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｍ−Ｒ               （Ｉ）
ここで
Ｍは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−でありうる；
Ｒは水素またはＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
アルキレン基−（ＣＨ2）l−、および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）]−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは互いに独立して−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−または−Ｏ−でありえ、およびａは整数１、２、３、４、５または６でありえ、およびｂは整数１、２、３、４、５、６、７または８でありうる；
Ｘは下記でありうる
水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10−アリール、１、２、３、４、５または６炭素原子から成るアルキレン鎖を有する−Ｏ−Ｃ7−Ｃ14−アルキルアリールおよびＣ6−Ｃ12−アリールラジカル；
−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、−Ｃ6−Ｃ12−アリール、ヘテロアリール、随意的にＣ1−Ｃ6−アルキレン基を介して結合しているイミダゾリルラジカル；
１、２、３、４、５または６炭素原子から成るアルキレン鎖を有するＣ7−Ｃ14−アルキルアリールおよびＣ6−Ｃ12−アリールラジカル；
次の一般式の置換基であって、
【化１】
2009518489.tif 000002
ここで
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキルおよび／またはＣ6−Ｃ10−アリール；
−ＣＮ、−ＮＣ、−Ｎ3；
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ4およびＲ4は水素、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ6−Ｃ10−アリールまたは−Ｏ−Ｃ6−Ｃ12−アリールでありうる；
−ＮＨ2、−ＮＨＲ5およびＲ5は水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキルおよび／またはＣ6−Ｃ12−アリールでありうる；
Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ；
−ＳＨまたは−Ｓ−Ｓ−Ｈ；
２−チオピリジルまたは４−チオピリジル；
−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＦ3；
アシルイミダゾール、マレイミドまたはアズラクトン基でありうる；
または
ＲはＹ'Ｘ'Ｌ基でありうるが、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは互いに独立して−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−または−Ｏ−でありえ、およびａは整数１、２、３、４、５または６でありえ、およびｂは整数１、２、３、４、５、６、７または８でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは−ＮＨ−でありえ、ａは整数１または２でありえ、およびｂは６でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−；
Ｌは下記でありうる
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）u−[ＮＨ−（ＣＨ2）2]v−ＮＨ2およびｕおよびｖはそれぞれの場合に互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１、２、３、４、５または６でありうる；
たとえばε−Ｎを介して結合するニトリロ三酢酸残基のような三座、四座または五座キレート剤、分子量約５００から２０００００Ｄａのいわゆる低分子量、高分子量または直鎖ポリエチレンイミン残基、アミノラジカル、好ましくはポリアミン残基、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、カルボン酸残基、または結合した抗体、好ましくは二次抗体、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチドまたはストレプトアビジン、ＩＤＡ、ＤＥＯまたはＴＥＤ（トリスカルボキシ−メチルエチレンジアミン）または
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【０００２】
好ましい磁性ポリマーは一般式（Ｉ）の官能基を含み、ここで
Ｍは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−でありうる；
Ｒは水素；
または
−ＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
アルキレン基−（ＣＨ2）l−、および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる、
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−、
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは−ＮＨ−でありえ、ａは整数１または２でありえ、およびｂは６でありうる；
Ｘは下記でありうる
水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10−アリール、１、２、３、４、５または６炭素原子から成るアルキレン鎖を有する−Ｏ−Ｃ7−Ｃ14−アルキルアリールおよびＣ6−Ｃ12−アリールラジカル；
−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、−Ｃ6−Ｃ12−アリール、ヘテロアリール、随意的にＣ1−Ｃ6−アルキレン基を介して結合しているイミダゾリルラジカル；
次の一般式の置換基であって、
【化２】
2009518489.tif 000003
ここで
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに独立して水素、Ｃ1−Ｃ3−アルキル；
−ＮＨ2、−ＮＨＲ5およびＲ5は水素、Ｃ1−Ｃ4−アルキルでありうる；
Ｆ、ＣｌまたはＢｒ；
−ＣＮ、−ＮＣ；
−ＳＨまたは−Ｓ−Ｓ−Ｈ；
２−チオピリジルまたは４−チオピリジル；
−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＦ3（トレシル）；
アシルイミダゾール、マレイミドまたはアズラクトン基でありうる；
または
ＲはＹ'Ｘ'Ｌ基でありうるが、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−、
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、
ここでＡおよびＢは−ＮＨ−でありえ、ａは整数１または２でありえ、およびｂは６でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＮＨ−または−Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−；
Ｌは下記でありうる
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）u−[ＮＨ−（ＣＨ2）2]v−ＮＨ2およびｕおよびｖはそれぞれの場合に互いに独立して整数１、２、３または４でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１、２、３または４でありうる；
たとえばε−Ｎを介して結合するニトリロ三酢酸残基のような三座、四座または五座キレート剤、好ましくは分子量５００から２０００００Ｄａのいわゆる低分子量、高分子量または直鎖ポリエチレンイミン残基、ポリアミン残基、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、カルボン酸残基、または結合した抗体、好ましくは二次抗体、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチドまたはストレプトアビジン、ＩＤＡ、ＤＥＯ、ＴＥＤ（トリスカルボキシメチルエチレンジアミン），
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【０００３】
特に好ましい磁性ポリマーは一般式（Ｉ）の官能基を含み、ここで
Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−でありうる；
Ｒは水素；
または
ＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
アルキレン基−（ＣＨ2）l−および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１または２でありうる、
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−；
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１または２でありうる、
Ｘは下記でありうる
水素、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ1−Ｃ4−アルキル、−Ｏ−Ｃ6−Ｃ10−アリール；
次の一般式の置換基であって、
【化３】
2009518489.tif 000004
ここで、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して水素またはＣ1−Ｃ2−アルキル；
−ＮＨ2；
ＣｌまたはＢｒ；
−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＦ3でありうる；
または
ＲはＹ'Ｘ'Ｌ基でありうるが、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２または３でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１または２でありうる；
−[ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）]−，
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１または２でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合；
−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ1−Ｃ3−アルキル）−；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＮＨ−；
Ｌは下記でありうる
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−[ＮＨ−（ＣＨ2）u]v−ＮＨ2、ここでｕは１または２でありえ、およびｖは２でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１または２でありうる；
たとえばε−Ｎを介して結合するニトリロ三酢酸残基のような三座、四座または五座キレート剤、好ましくは分子量５００から２０００００Ｄａのいわゆる低分子量、高分子量または直鎖ポリエチレンイミン残基、ポリアミン残基、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、カルボン酸残基、または結合した抗体、好ましくは二次抗体、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチドまたはストレプトアビジン、ＩＤＡ、ＤＥＯまたはＤＥＯまたはＴＥＤ（トリスカルボキシメチルエチレンジアミン）、
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【０００４】
非常に特に好ましい磁性ポリマーは一般式（Ｉ）の官能基を含み、ここで
Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−でありうる；
Ｒは水素または
ＹＸ基でありうるが、ここで
Ｙは下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）l−および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１または２でありうる；
−[ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）]−
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１または２でありうる；
Ｘは下記でありうる
水素；
次の一般式の置換基であって、
【化４】
2009518489.tif 000005
ここで、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、水素；
−ＮＨ2でありうる；
または
ＲはＹ'Ｘ'Ｌ基でありうるが、ここで
Ｙ'は下記でありうる
単結合；
アルキレン基−（ＣＨ2）q−およびｑは整数１、２、３、４、５、または６でありうる；
下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]i−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]o−
ここでｉおよびｏは互いに独立して整数１または２でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−または
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]r−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]s−
ここでｒおよびｓは互いに独立して整数１または２でありうる；
Ｘ'は下記でありうる
単結合；
ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−；
−ＣＲ1Ｒ2−Ｒ3ＣＨ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＲ1Ｒ2−ＣＨＲ3−、ここでＲ1、Ｒ2およびＲ3は上記の意味を有する；
−ＮＨ−；
Ｌは下記でありうる
−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−[ＮＨ−（ＣＨ2）u]v−ＮＨ2、ここでｕは１または２でありえ、およびｖは２でありうる；
−（ＣＨ2）w−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨおよびｗは整数１または２でありうる；
ε−Ｎを介して結合するニトリロ三酢酸残基、
ＮＴＡ、ＩＤＡ／ＤＥＯ、ＴＥＤ、スペルミンまたは二次抗体
−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ−（ＣＨ2ＣＯＯ-）[ＣＨ（ＣＯＯ-）ＣＨ2ＣＯＯ-）]。
【０００５】
本発明はさらに、磁性ポリマーを調製するための方法に、および試料から少なくとも一つの生体分子種を単離および／または分析するための方法に関する。
【０００６】
近年、磁性粒子は、さまざまな生体分子を精製、分離および分析するための方法にますます用いられている。そのような磁性粒子は通常、ガラス様のまたはポリマー性のマトリクスに結合した、磁性のまたは磁化できる無機材料を含む。磁性粒子の表面はこの場合、たとえば細胞溶解物といった試料由来の特定の生体分子がこの表面へ選択的に結合されうるように構成されている。生体分子が結合した磁性粒子は、外部磁場を試料へ加えることによって試料から容易に除去されうる。生体分子はその後、磁性粒子の適当な処理によって溶出でき、およびそのようにして純粋な形でまたは濃縮された状態で得ることができる。
【０００７】
米国特許出願２００１／００１４４６８ Ａ１はポリビニルアルコールを基礎とする磁性ポリマー粒子を記載する。これらの粒子は、コロイド状に分散した磁性粒子を含むポリビニルアルコール水溶液が、ポリマー相と不混和性である少なくとも二つの乳化剤を含む有機溶媒と懸濁される方法によって調製される。有機溶液はさらに、水溶性架橋剤を含み、それによってポリビニルアルコール小滴が懸濁される間に架橋される。この方法で得られた磁性ポリマー粒子はその後、使用目的に基づいて活性化でき、または適当な官能基を有するポリマー側鎖によって官能化されうる。
【０００８】
仏国特許出願ＦＲ ２５３１４５２ Ａ１は、内部に強磁性粒子が分散している、多孔質高融点金属酸化物を含む磁性キャリヤーマトリクスを記載する。酸化物は過剰の二官能性側基を有する架橋ポリアミドを含浸されている。このマトリクスは、酵素を固定化するために使用される。
【０００９】
米国特許第４，７９５，６９８号明細書は、少なくとも二種の遷移金属イオンをポリマーの存在下で共沈澱させることによって得られる磁性ポリマー粒子を記載する。該ポリマーは、磁性ポリマー沈澱を結合するために、適当な配位部位を含む。この方法で得られた粒子は、官能化ポリマーを適当に選択することによって、イムノアッセイ法に使用されうる。
【００１０】
米国特許第４，３５８，３８８号明細書は、有機重合可能相中の磁性粒子の分散物、および少なくとも一つの乳化剤を含む水相から構成される均一な乳液の乳化重合によって調製される磁性ポリマー粒子を記載する。有機相は、重合可能なモノマーとして、少なくとも一つの芳香族ビニル化合物または少なくとも一つの芳香族ビニル化合物および共重合可能なモノマー、たとえばアルキルアクリル酸またはアルキルメタクリレートの混合物を含む。
【００１１】
一つ以上の種の生体分子を磁性ポリマー粒子の表面上に特異的に結合する能力は、使用するポリマーの性質およびこのポリマー上に存在する官能基によって相当な程度決定される。さらに、固定化する反応の選択性が満たすべき必要条件は、固定化された生体分子の以降の使用目的に依存する。しばしば単に、固定化によって目的の生体分子種の濃縮を達成すれば十分である；別の用途では、可能な限り純粋な状態で、直接に、または以降の精製段階が少数で、目的の生体分子種を得るために、より高い選択性が必要であるかまたは少なくとも望ましい。磁性ポリマー粒子はさらに、磁性ポリマー粒子の使用を効率的および費用効果的にするために、固定化すべき生体分子種について可能な限り高い結合容量を有するべきである。しかし、原則として、高い結合容量は通常は、小さい粒子サイズまたは高い多孔性によってのみ達成されうるということが正しい。しかし、小さい粒子サイズは、ポリマー粒子の十分な磁性化を達成することを困難にする。
【００１２】
先行技術で公知である磁性ポリマーは、しかし、せいぜい非常に低い多孔性を有するか、または全く有しないため、したがって固定化に利用可能な表面に不利な影響を与える。
【００１３】
別の問題は、磁性粒子を適当なポリマーマトリクス中に組み込むことについてである。特に、磁性粒子および有機相の分離、重合の前または間の磁性粒子の凝集、およびポリマーマトリクスおよび磁性粒子の間の適当な接着を達成することが、しばしば問題を提示する。
【００１４】
このように、十分に高い選択性で生体分子を固定化できる磁性ポリマー粒子の必要性がある。特に、さまざまな方法で官能化でき、および簡単に、好ましくは従来の化学的方法によって、適当な選択性で試料由来の生体分子を固定化できるリガンドで修飾されうる、磁性ポリマー粒子の必要性がある。さらに、修飾ポリマー粒子が各生体分子について最大の結合容量を有すること、および、同時に、最大の磁性化可能性を有することが意図された。
【００１５】
本発明の目的は、したがって、上記で考察した先行技術の欠点を除去または少なくとも軽減することである。
【００１６】
この目的は、独立請求項１で請求される磁性ポリマー粒子および独立請求項２１で請求される方法によって達成される。本発明の他の実施形態、態様、詳細および長所は、従属請求項および下記の説明から明らかである。
【００１７】
第一の態様では、本発明は、強磁性、フェリ磁性および／または超常磁性粒子の群から選択される磁性ポリマー粒子に関する。磁性粒子は架橋ポリアクリレートまたはポリ[アルキルアクリレート]マトリクスに包埋されている。ポリマーマトリクスはカルボキシ基−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨまたはカルボキシルエステルまたはカルボキサミド基または一般式Ｉに記載される他の適当な誘導体化カルボキシル構造を含み、そのそれぞれが特にスペーサー基Ｙおよび反応基Ｘを有しうる。磁性ポリマー粒子は、好ましくは５ないし２５μｍの範囲の、特に好ましくは６ないし２０μｍの範囲の、非常に特に好ましくは１０ないし１５μｍの範囲の平均粒子サイズ、および、好ましくは２０ないし５００ｎｍの範囲の、特に好ましくは３０ないし４００ｎｍの範囲のおよび非常に特に好ましくは８０ないし２５０ｎｍの範囲の最大孔半径を有する孔を有する。
【００１８】
官能化可能なカルボキシル基、または置換基を有しおよび官能化可能なカルボキシル基を持つポリアクリレートまたはポリ[（アルキル）アクリル酸]マトリクスの使用は、適当な磁化可能性を確実にする相対的に大きいポリマー粒子の調製、および同時に、生体分子の固定化に適した多数のリガンドを用いたさらなる官能化を簡単な方法で可能にする。
【００１９】
ポリマーマトリクスは最初は、遊離のアクリル酸またはたとえばメタクリル酸のような（アルキル）アクリル酸が重合すべきモノマーとして用いられている場合は、エステル化されていないカルボキシ基を含む。ポリマーマトリクスが他の官能化可能な基を含むべき場合は、適当に誘導体化されたアクリルまたは（アルキル）アクリルエステル−特にメタクリルエステル−をモノマーとして使用でき、そのエステル残基を少なくとも以降の段階で反応基へ変換することが可能であり、これは必要に応じて、さらなる官能化、特に生体分子を固定化するリガンド、またはリガンドが最終的に結合するスペーサー基の共有結合化を可能にする。
【００２０】
したがって、磁性ポリマー粒子のポリマーマトリクスは、一般構造−Ｙ−Ｘを有する官能基を含むことができ、ここでＹはスペーサーであり、およびＸは好ましくは反応基である。
【００２１】
官能基の反応基Ｘとして、目的のリガンドをスペーサーへ結合する化学反応を可能にする任意の基を使用することが可能である。たとえば、スペーサー上での置換反応を可能にする、それによってリガンドがスペーサーへ共有結合される、反応基Ｘを使用することができる。そのような反応の例は、エーテル化、エステル化、アミド生成、イミノ結合の生成などである。
【００２２】
官能基の反応基Ｘは、好ましくは、水素、ヒドロキシ、エポキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、イミダゾリル−必要に応じてＣ1からＣ6アルキレン架橋を介して結合している、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、アジド、シアノ、イソシアノ、−ＳＨ、−ＳＳＨ、チオピリジニル（２−または４−チオピリジル）、アリール、ハロゲン（ｈａｌ）、トレシル（２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル）、アシルイミダゾリルおよびマレイミドリルまたはアズラクチル基から成る群から選択される。
【００２３】
エポキシ基のうち、オキシラン−２−イル基が好まれるが、しかし下記に示す式に記載の置換エポキシ基を使用することもまた可能である：
【化５】
2009518489.tif 000006
この場合、ラジカルＲ1、Ｒ2、およびＲ3は互いに独立して、水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ6−Ｃ12−アリール−好ましくはＣ1−Ｃ3−アルキルから成る群から選択されうる。
【００２４】
Ｃ1−Ｃ6−アルキル基とは、本発明との関連では 特に下記の基を意味する：Ｃ1：メチル；Ｃ2：エチル；Ｃ3：プロピル、イソプロピル、Ｃ4：ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、Ｃ5：ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、Ｃ6：ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピルおよび／または１−エチル−２−メチルプロピル。アルキル基は随意的に、同一かまたは異なりうる、一つ以上の置換基−たとえばニトロ基、アミノ基および／または一つ以上のハロゲン原子によって置換されうる。低級、たとえば−Ｃ1−Ｃ3−アルキルラジカルは対応して定義される。
【００２５】
シクロアザアルキル基とは、本発明に関連して、１から１５個−好ましくは１から１２個の炭素原子および１から１５個−好ましくは１から６個、特に好ましくは３および４個の−窒素原子を有する、下記の群から選択される一つ以上の置換基で随意的に置換されうる、５から１６員環の飽和環系を意味する：同一かまたは異なりうる、１から６炭素原子を有する低級アルキルラジカル（Ｃ1−Ｃ6−アルキル基）、１から６炭素原子を有するアルコキシ基（Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ基）、ニトロ基、アミノ基、今度は随意的に１個、２個または３個の炭素原子を有するアルキレン基を介して環状部分構造へ結合されうる、および／または一つ以上のハロゲン原子。これらの環系のうち、ピロリジン、ピペリジンおよびピペラジンが好ましい。シクロアザアルキル系はさらにまた、たとえばモルホリンでの場合のように、窒素の他に、１、２、３または４個の酸素原子も環のメンバーとして有しうる。
【００２６】
６から１２炭素原子（Ｃ6−Ｃ12−アリール）を有するアリールラジカルとは、下記の群から選択される一つ以上の置換基で随意的に置換されうる芳香族置換基を意味する：同一かまたは異なりうる、１から６炭素原子を有する低級アルキルラジカル（Ｃ1−Ｃ6−アルキル基）、１から６炭素原子を有するアルコキシ基（Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ基）、ニトロ基、アミノ基および／または一つ以上のハロゲン原子。好ましいアリールラジカルの実施形態は、たとえばフェニル、またはナフチル、またはフルオレニルといった縮合芳香族系、またはビフェニルといった他の系である。より小さいアリールラジカル（たとえばＣ6−Ｃ10−アリール）でも同様である。
【００２７】
ヘテロアリールラジカルとは、本発明によると、少なくとも一つのヘテロ原子を有する主に５または６員環系である。実施形態の例は、一方ではピロリルおよびフラニルまたはイソチアゾリル、および他方ではピリジル、ピラジニルまたはトリアジニルである。
【００２８】
７から１４炭素原子を有するアラルキルラジカルとは、アルキレン架橋を介して結合しているアリールラジカルを意味する。さらに、芳香族部分構造および下記の群から選択される置換基によって随意的に芳香族部分構造が可能である：同一または異なりうる、１から６炭素原子を有する低級アルキルラジカル（Ｃ1−Ｃ6−アルキル基）、１から６炭素原子を有するアルコキシ基（Ｃ1−Ｃ6−アルコキシ基）、ニトロ基、アミノ基および／または一つ以上のハロゲン原子。アリールラジカルに６から１０炭素原子を有しおよび脂肪族部分構造に１から３炭素原子を有するアラルキルラジカル、たとえばベンジルまたはフェネチルが本発明によると好ましい；ベンジルラジカルが特に好ましい。
【００２９】
適当な反応性ハロゲン置換基は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ、特にＣｌおよびＢｒである。
【００３０】
適当なスペーサーＹは、適当な重合可能モノマーを与える合成上の考慮、またはその市販入手可能性に基づいて選択でき、または他にスペーサー基は固定化するリガンドを用いて後で実施すべき官能化を目的に選択される。「スペーサー」または「スペーサー基」は、本発明に関連して、ポリマーマトリクスのカルボキシ基と結合できおよびそれによってスペーサーに結合している反応基を付けることができ、およびリガンドと反応してマトリクスのポリマー構造から少し離れて結合を形成できる、すべての化学基を意味する。これらの「スペーサー」を用いることによって、リガンドに関して反応基の接近可能性を改善することが可能である。
【００３１】
本発明の一実施形態では、官能基のスペーサーＹは下記から成る群から選択される：
１．−（ＣＨ2）l−および１は整数１、２、３、４、５または６でありうる；
２．下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−および／または−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
３．たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのような、アルキリデングリコール；
１．単糖、二糖または多糖；
２．ポリエチレンイミン；
３．ポリアクリル酸；
４．−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2または−ＣＨ2−Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）Ｈ−
５．−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ２）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、ここでＡおよびＢは互いに独立して−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−または−Ｏ−基、好ましくは−ＮＨ−でありうる、ａは整数１、２、３、４、５または６−好ましくは１または２−でありうる、およびｂは整数１、２、３、４、５、６、７または８−好ましくは６でありうる。
６．二官能性および／または三官能性架橋剤（たとえば下記の官能基を有する二官能性スペーサー：イミドエステルＲ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＲ'、ヒドラジド、マレイミド、アルデヒド、エポキシド、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、アシルイミダゾール、ジアゾニウムアリール、ハロゲン化物、およびＢＡＳＥＤ（ビス[ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル]ジスルフィド）のような光反応性二官能性スペーサー；
７．ペプチドスペーサー。
【００３２】
エポキシ官能化（Ｘ）ポリマーマトリクスとの関連において−ＣＨ2−スペーサー基（Ｙ）の使用は、アクリル酸のカルボキシ基が特に単純な方法でエピクロロヒドリンまたはエピブロモヒドリンと反応できるため、特に有利である。同様に、アクリル酸モノマーのカルボキシ基が第一の段階でエピクロロヒドリンまたはエピブロモヒドリンとエステル化され、およびその後に反応基Ｘ、または反応基Ｘを含む基がエポキシ基を介して導入される場合、上記７）項のスペーサーを使用することが有利である。
【００３３】
別の態様では、本発明は、架橋ポリアクリレートまたはポリ（アルキル）アクリル酸マトリクスに包埋されている強磁性、フェリ磁性または超常磁性粒子を含む磁性ポリマー粒子に関する。この場合、ポリアクリレートまたはポリ[（アルキル）アクリル酸]マトリクスは、Ｒ＝Ｙ'Ｘ'Ｌ型の基を含む。
【００３４】
この態様に記載の磁性ポリマー粒子は、本発明の上記の第一の態様に記載の磁性ポリマー粒子の官能化によって単純な方法で得ることができる。したがって、第一の態様に記載の磁性ポリマー粒子に関してなされた記述は、本発明の第二の態様に記載の磁性ポリマー粒子にも同様に当てはまる。磁性ポリマー粒子に関する差はしたがって、第二の態様に記載される、適当なリガンド（一般式ではＲで表される構造的性質−Ｙ'−Ｘ'−Ｌ）を用いた追加の官能化に関して現れる。
【００３５】
本発明のこの態様の一実施形態では、連結基Ｘ'によってリガンドがポリアクリレートまたはポリアルキルアクリレートマトリクスに結合される連結基Ｘ'は、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲから成る群から選択され、およびここでＲはＣ1−Ｃ3−アルキル基である。リガンドはこのように、イミノ基（−ＮＨ−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−）、カルボキシ基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、オキソ基（−Ｏ−）またはチオ基（−Ｓ−）を介してポリマーマトリクスへ結合されうる。リガンドがポリアクリレートまたはポリ（アルキル）アクリル酸マトリクスの遊離カルボキシ基へ直接結合される場合には、共有結合化は、エステル化、アミド生成または、最新技術から公知であるカルボキシ基の他の誘導体化によって起こる。リガンドが共有結合されうる反応基−Ｘを有するスペーサー−Ｙの使用は、カルボキシ基への直接結合と比較して、可能な結合型の範囲をさらに拡大し、および（たとえば立体効果の消去によって）リガンドに関する反応基の接近可能性を改善しうる。
【００３６】
したがって、本発明の一実施形態では、生体分子を固定化できるリガンドが、ポリマーマトリクスのカルボキシ基へ直接結合されている。代替的に、それらは上記の反応基の少なくとも一つを有するスペーサーを介してポリマーマトリクスのカルボキシ基へ間接的に結合されている。
【００３７】
本発明のこの態様の別の一実施形態では、リガンドが適当な反応基Ｘを介して結合されうるスペーサーＹとして使用されるラジカルは、下記から成る群から選択される：
ａ）−（ＣＨ2）l−、ｌ＝整数１、２、３、４、５、または６である；
ｂ）下記の種類のヒドロキシ置換アルキレン基：
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]g−および／または−[ＣＨ2-ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−]h−
ここでｇおよびｈは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）および／またはＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）]−
−[ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）]m−および／または−[ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2]n−
ここでｍおよびｎは互いに独立して整数１、２、３、４、５または６でありうる；
ｃ）たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのような、アルキリデングリコール；
ｄ）単糖、二糖または多糖；
ｅ）ポリエチレンイミン；
ｆ）ポリアクリル酸；
ｇ）−（ＣＨ2）a−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ａ−（ＣＨ2）b−Ｂ−Ｃ（＝Ｏ）−[シクロ−Ｃ6Ｈ10]−ＣＨ2−、ここでＡおよびＢは互いに独立して−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ6−アルキル）−または−Ｏ−基、好ましくは−ＮＨ−である、ｎは１〜６、好ましくは１または２である、およびｍは１〜８、好ましくは６である。
ｈ）二官能性および／または三官能性架橋剤（たとえば下記の官能基を有する二官能性スペーサー：イミドエステルＲ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＲ'、ヒドラジド、マレイミド、アルデヒド、エポキシド、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、アシルイミダゾール、ジアゾニウムアリール、ハロゲン化物、およびＢＡＳＥＤ（ビス[ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル]ジスルフィド）のような光反応性二官能性スペーサー；
ｉ）ペプチドスペーサー。
【００３８】
これらのスペーサーは、マトリクスのカルボキシ基へ直接結合でき、または、他のスペーサー、特に本発明の第一の態様に関連して記載されたものを介して、スペーサーへ結合した反応基によって、カルボキシ基へ同様に結合できる。
【００３９】
好ましくは生体分子を固定化できるリガンドは、特に、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチドまたは一次または二次抗体を固定化できるリガンドでありうる。特にリガンドとして三座、四座または五座キレート剤、好ましくはニトリロ三酢酸残基を使用することが可能である。ポリエチレンイミン残基もまた使用されうる。これらは分枝または非分枝でありうる。別の可能性は、アミノ基を含むラジカル、たとえば−（ＣＨ2）n−ＮＲ10Ｒ20型のアルキルアミノ基を使用することであり、ここでｎは、０の他に、整数、好ましくは１、２、３、４、５または６、特に２、３、４、５または６であり、およびＲ10およびＲ20は互いに独立して−ＨおよびＣ1−Ｃ6−アルキル、特にＣ1−Ｃ3−アルキル、アミンおよび／またはポリアミン残基から成る群から選択される。別の可能性は、カルボン酸残基、タンパク質、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ストレプトアビジンまたは結合した抗体を使用することである。ポリアミンは、好ましくは、２、３、４、５または６アミノ基を有する開鎖および環状ポリアミンから成る群から選択される．ポリアミンは、好ましくは、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカンおよびｔｒｉｓ（２−アミノエチル）アミンなどから成る群から選択されうる。
【００４０】
使用されうるカルボン酸残基は、特にカルボキシラジカル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）自体、アルキレンカルボキシラジカル（−アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）であり、ここでアルキル架橋は分枝または非分枝Ｃ1−Ｃ12−アルキル基、好ましくは随意的に分枝または非分枝Ｃ2−Ｃ6−アルキル基でありうる；アリール部分構造へ結合したカルボキシ基（アリール−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）を使用することが皿に可能であり、たとえばフェニルカルボキシ基、すなわちこの場合には上述のアルキレン架橋がフェニル系によって置換されている。
【００４１】
好ましくは本発明に関連して、好ましくは下記から成る群から選択される、強磁性またはフェリ磁性粒子の使用がある：γ−Ｆｅ2Ｏ3（磁赤鉄鉱）、Ｃｒ2Ｏ3、およびフェライト、特に（Ｍ2+Ｏ）Ｆｅ2Ｏ3型、ここでＭ2+は二価遷移金属陽イオンである、および好ましくはＦｅ3Ｏ4（磁鉄鉱）である。しかし、同様に他の強磁性またはフェリ磁性粒子を使用することが可能である。これらの粒子は、５μｍ未満、好ましくは１μｍ未満、特に好ましくは０．０５ないし０．８μｍの範囲の、非常に特に好ましくは０．１ないし０．４μｍの範囲の平均粒子直径を有する。
【００４２】
適当な市販の強磁性またはフェリ磁性粒子の例は、バイオキサイド（Ｂａｙｏｘｉｄｅ）Ｅ ＡＢ ２１（ランクセス社（Ｌａｎｘｅｓｓ ＡＧ）、ドイツ、レーバークーゼン（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ））のようなγ−Ｆｅ2Ｏ3を基礎とする強磁性粒子、ランクセス社（ドイツ、レーバークーゼン）からバイオキサイドＥ ８７０６、Ｅ ８７０７、Ｅ ８７１０およびＥ ８７１３Ｈ型として、およびＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ ＡＧ）（ドイツ、ルートヴィヒスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ））から磁性色素（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｉｇｍｅｎｔ）３４０および磁性色素３４５として入手可能なフェリ磁性磁鉄鉱である。
【００４３】
さらにまた超常磁性粒子を使用することが可能である。適当な超常磁性材料は、Ｆｅ、Ｆｅ3Ｏ4、Ｆｅ2Ｏ3、超常磁性フェライト、Ｃｏ、Ｎおよび二元および／または三元化合物（合金）である。ここで例として直径約３００A以下の酸化鉄結晶に言及できる。
【００４４】
ポリマーマトリクスは、本発明と関連して好ましくはジまたはポリアクリレートまたはジまたはポリ（アルキル）アクリレートを用いることによって架橋されている。これらは好ましくは、エチレングリコールアクリル酸、エチレングリコール（アルキル）アクリレート、特にエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコール（アルキル）アクリレート、特にポリエチレングリコールメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレートおよびペンタエリスリトールトリアクリレート、グリセロールトリアクリレート、グリセロールトリメタクリレート、グリセロールプロピレートトリアクリレート、グリセロールプロピレートトリメタクリレートまたは他にジビニルベンゼンおよびその有機修飾された誘導体、たとえば、２−ヒドロキシ−１，４−ジビニルベンゼン、から成る群から選択される。これらの架橋剤は、使用されるアクリル酸および（アルキル）アクリル酸モノマーに関して特に適することが証明されている。
【００４５】
別の態様では、本発明は磁性ポリマー粒子を調製するための方法に関する。この方法は：
ａ）第一の有機相中の磁性粒子の分散物の調製、ここで磁性粒子は強磁性、フェリ磁性または超常磁性粒子から成る群から選択され、およびここで第一の有機相は下記を含む
ａ．１．）アクリル酸、（アルキル）アクリル酸、または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｙ−Ｘ型の置換カルボキシル基を含みここでＹはスペーサー基でありおよびＸは反応基であるアクリレートおよび（アルキル）アクリレートから成る群から選択される、一つ以上のアクリル酸モノマー、
ａ．２．）二つ以上のアクリル酸または（アルキル）アクリル酸基を含む、少なくとも一つの架橋剤、
ａ．３．）少なくとも一つの親油性フリーラジカル開始剤、および
ａ．４．）少なくとも一つの有機細孔形成剤、
ｂ）その分散物を第二の有機相に混合およびホモジナイズして乳液を形成、ここで第二の有機相は
ｂ１）少なくとも一つの液体疎水性化合物および
ｂ２）少なくとも一つの界面活性物質を含む、
および
ｃ）乳液のフリーラジカル重合、
の段階を含み、
ここで、この方法で得られた磁性ポリマー粒子は、好ましくは５ないし２５μｍの範囲、特に好ましくは６ないし２０μｍの範囲、非常に特に好ましくは１０ないし１５μｍの範囲の平均粒子サイズ、および好ましくは２０ないし５００ｎｍの範囲、特に好ましくは３０ないし４００ｎｍの範囲、非常に特に好ましくは８０ないし２５０ｎｍの範囲の最大孔半径を有する孔を有する。
【００４６】
既に上述したもののような磁性ポリマー粒子は、この方法によって得ることができる。
【００４７】
乳液は好ましくは、混合物中に存在する酸素を追い出すため、フリーラジカル重合の前に、不活性ガスで洗浄される。相応に、その後の重合は好ましくは保護ガス雰囲気下で実施される。これに関連して保護ガスまたは不活性ガスとして特に適しているのは窒素またはアルゴンであり、より低いコストのため窒素が好ましい。しかし、他の保護ガス、特にヘリウムまたはクリプトンといった他の希ガスもまた使用されうる。
【００４８】
磁性粒子は、分散物の調製前または調製中に、好ましくは磨砕および／または脱凝集化される。最初の磁性粒子の凝集はそれによって防がれ、および分散およびその後の乳液のホモジナイズが促進および改善される。超音波法、撹拌法および／またはたとえばボールミルでの粉砕法が、粉砕または脱凝集化に使用されうる。
【００４９】
フリーラジカル重合は好ましくは、５０℃以上の温度で、好ましくは５０℃ないし１２０℃、好ましくは６０℃ないし９０℃の温度で実施される。
【００５０】
本発明の方法の一実施形態では、第一の有機相中のモノマーは一般式（ＩＩ）に記載の化合物であり：
Ｈ2Ｃ＝ＣＲ'−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＺ     （ＩＩ）
ここでＲ'はＨ−またはＣ1−Ｃ3−アルキルであり、Ｚは水素（−Ｈ）または一般式−Ｙ−Ｘの基であり、およびＹはスペーサーでありおよびＸは上記で定義される通りであり、たとえば−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、ハロゲン（ｈａｌ）、トレシル、マレイミドおよびエポキシ基を含む群から選択される。スペーサーは、たとえば１が整数１、２、３、４、５または６である−（ＣＨ2）l−基、または−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−基でありうる。これに関連して適当なスペーサーは同様に、始めに定義されたすべての基の他に、前述の態様、特に本発明の第一の態様に記載の磁性ポリマー粒子に関連して言及されている基である。
【００５１】
好ましい一実施形態では、第一の有機相中のモノマーは、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸およびアクリル酸、および一般式（ＩＩＩ）のアクリル酸誘導体から成る群から選択される：
Ｈ2Ｃ＝ＣＲ'Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）cＺ    （ＩＩＩ）
ここでＲ'はＨまたはメチルでありうる、およびｃは整数１、２、３、４、５、または６である、およびＺはたとえば−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、ｈａｌ−、トレシル、マレイミドおよびエポキシ基を含む群から選択される。
【００５２】
本発明の方法に使用されうる架橋剤は、一つ以上のアルキリデングリコールジアクリレートまたは一般式（ＩＩＩ）アルキリデングリコール（アルキル）アクリレートである：
Ｈ2Ｃ＝ＣＲ"Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−[（ＣdＨ2dＯ）]e（Ｃ＝Ｏ）ＣＲ'"＝ ＣＨ2    （ＩＶ）
ここで式（ＩＶ）においてＲ"およびＲ'"は互いに独立してＨまたはＣ1−Ｃ3−アルキルであり、および好ましくはＲ"およびＲ'"は共にＨまたはメチルであり、ｄは整数１、２、３または４−好ましくは１または２−であり、およびｅは１ないし１００の整数−好ましくは整数１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、および特に好ましくは整数１、２、３、または４である。
【００５３】
特にエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレートまたは、ω−ジ[アクリル酸（メタクリル酸）]−官能化ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール−たとえば、プロピレングリコールアクリレート、プロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にプロピレングリコールメタクリレート、ポリプロピレングリコールアクリレート、ポリプロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にポリプロピレングリコールメタクリレートまたはプロピレングリコールアクリレート、プロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にプロピレングリコールメタクリレート、ポリプロピレングリコールアクリレート、ポリプロピレングリコール（アルキル）アクリレート、特にポリプロピレングリコールメタクリレートまたはその混合物を、架橋剤として使用することが可能である。別の可能性は、少なくとも２個、好ましくは３個または４個の、アクリル酸または（アルキル）アクリル酸基を有するポリアクリレートまたはポリ（アルキル）アクリレートを使用することであり、ここでアルキル基は好ましくはＣ1−Ｃ3−アルキル基の群から選択され、および特に好ましくはメチルである。たとえば、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、ペンタエリスリトールテトラメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、グリセロールトリアクリレート、グリセロールトリメタクリレート、グリセロールプロピレートトリアクリレート、グリセロールプロピレートトリメタクリレートまたは他にジビニルベンゼンおよびその有機修飾された誘導体、たとえば、２−ヒドロキシ−１，４−ジビニルベンゼンまたはその混合物またはこれらの化合物の上記の他の架橋剤との混合物が使用されうる。
【００５４】
特に有機細孔形成剤として使用されうる化合物は、
ａ）一つ以上の水酸基、好ましくは１〜３個の水酸基を有し、４から２０個のＣ原子、好ましくは４から１６個のＣ原子および特に好ましくは４から８個のＣ原子を有する、脂肪族、分枝または非分枝アルコール
ｂ）アルキリデングリコール、特にエチレングリコール、グリセロールなど
ｃ）グルコースのような糖質、および
ｄ）質量−平均分子量Ｍwが２００ないし１０００００ｇ／ｍｏｌでありおよびポリアルキリデングリコール誘導体、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドンおよびポリスチレン、または上記ａ）、ｂ）およびｃ）で言及された化合物の混合物から成る群から選択されるポリマー化合物
から成る群から選択される化合物である。
【００５５】
特に、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（Ｍｗ：２００〜２００００ｇ／ｍｏｌ）、ポリプロピレングリコール（Ｍｗ：２００〜１００００ｇ／ｍｏｌ）、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテル（Ｍｗ：２００〜５０００ｇ／ｍｏｌ）、ポリエチレングリコールジアルキルエーテル（Ｍｗ：２００〜５０００ｇ／ｍｏｌ）、ポリエチレングリコールモノアルキルエステル（Ｍｗ：２００〜２００００ｇ／ｍｏｌ）、ポリエチレングリコールジアルキルエステル（Ｍｗ：２００〜５０００ｇ／ｍｏｌ）、ポリエチレングリコール二酸（Ｍｗ：１０００〜２００００ｇ／ｍｏｌ）、ポリエチレンイミン（Ｍｗ：２００〜１０００００ｇ／ｍｏｌ）、ポリビニルピロリドン（Ｍｗ：１００００〜４００００ｇ／ｍｏｌ）および／またはポリスチレン（Ｍｗ：２００〜５０００ｇ／ｍｏｌ）から成る群から選択される細孔形成剤を使用することが可能である。特に本発明で使用されうる細孔形成剤は、エチレングリコールおよびポリエチレングリコール（Ｍｗ：１０００〜６０００ｇ／ｍｏｌ）である。先端技術でいわゆるジェファーミン（ｊｅｆｆａｍｉｎｅ）としてよく知られているアミノ官能化ポリエチレングリコールもまた適している。
【００５６】
使用されうる親油性フリーラジカル開始剤は、特にアゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２'−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、２，２'−アゾビス（２，４−ジメチル吉草酸ニトリル）、および１，１'−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）である。しかし、十分に親油性であって分散物に加えることができるならば、たとえば、過酸化ベンゾイルといった他のフリーラジカル開始剤を使用することもまた可能である。
【００５７】
乳液を調製するのに用いられる疎水性液体は、フリーラジカル重合に対して有害作用を持たないように、十分に化学的に不活性であるべきである。その液体は、第一の有機相中の分散物の乳液が第二の有機相中に生じうるように、好ましくは第一の有機相と本質的に不混和性であるべきである。重合中にポリマーが系に不溶であることは、系の選択に重大である。
【００５８】
疎水性液体は、必要に応じて、脂肪族または環状アルカン、特に一般式Ｃ2Ｈ2n+2でｎが＞６である脂肪族アルカン、脂肪族および環状アルケン、特に一般式Ｃ2Ｈ2nでｎが＞６である脂肪族アルケン、芳香族化合物、特にアルキルまたはアルケン基で置換されうる単環、二環または三環化合物、特にトルエン、キシレン、鉱物油、シリコン油、植物油またはパラフィン油、脂肪酸およびアルコールの化合物を基礎とする物質、および前述の物質の混合物、特に脂肪族アルカンおよび芳香族化合物の混合物から成る群から選択されうる。
【００５９】
第二の有機相中の界面活性物質は、好ましくは、陽イオン性、陰イオン性および非イオン性乳化剤から成る群から選択される乳化剤である。界面活性物質として、たとえばソルビタンエステル、エトキシ化ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテルおよび他の市販の界面活性化合物または化合物混合物を使用することが可能である。適当な界面活性物質の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（登録商標）Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、スパン（Ｓｐａｎ）８５（登録商標）（ソルビタントリオレエート）（すべてシグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ドイツ、タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ））から入手可能）、ハイパーマー（Ｈｙｐｅｒｍｅｒ）２２９６（ユニケマ社（Ｕｎｉｑｅｍａ）、オランダ、ゴーダ（Ｇｏｕｄａ）から入手可能）および同様の物質といった市販の物質である。
【００６０】
本方法に使用されうる磁性粒子は、本発明の磁性粒子に関連して上に記載されるのと同一の粒子である。
【００６１】
上述の成分は、本発明にしたがって下記の量比（重量％、ｗｔ％）（反応混合物に基づく）で混合される：
【００６２】
架橋剤は好ましくは０．１〜２０ｗｔ％の割合で、好ましくは０．５ないし５ｗｔ％の範囲で、特に好ましくは１〜４ｗｔ％で導入される。
【００６３】
官能化モノマーは、０．１〜２０ｗｔ％、好ましくは０．５〜５ｗｔ％、特に好ましくは１〜４ｗｔ％の割合で導入される。
【００６４】
磁性材料または磁鉄鉱は、０．１〜２０ｗｔ％、好ましくは０．５〜５ｗｔ％、特に好ましくは１〜４ｗｔ％の割合で導入される。
【００６５】
開始剤またはフリーラジカル開始剤は、０〜５ｗｔ％、好ましくは０．０１〜３ｗｔ％、特に好ましくは０．０５〜０．５ｗｔ％の割合で導入される。
【００６６】
洗浄剤（界面活性剤）は、０〜２０ｗｔ％、好ましくは０．１〜１０ｗｔ％、特に好ましくは０．１〜３ｗｔ％の割合で導入される。
【００６７】
細孔形成剤は、０．１〜２０ｗｔ％、好ましくは０．５〜５ｗｔ％、特に好ましくは１〜４ｗｔ％の割合で導入される。
【００６８】
本発明に記載の使用に適した、結果として生じるポリマーは、有利に下記の組成を有する：
【００６９】
架橋剤含量は、１〜９５ｗｔ％、好ましくは１０〜８０ｗｔ％、特に好ましくは２０〜７０ｗｔ％および非常に特に好ましくは１５〜４０ｗｔ％である。
【００７０】
本発明に記載の官能化モノマーから生じるポリマーは、磁性粒子中に１〜９９ｗｔ％、好ましくは１０〜８０ｗｔ％、特に好ましくは２０〜７０ｗｔ％および非常に特に好ましくは３０〜６０ｗｔ％の比率で存在する。
【００７１】
磁鉄鉱または磁性材料の含量は、１〜９５ｗｔ％、好ましくは１０〜８０ｗｔ％、特に好ましくは２０〜７０ｗｔ％および非常に特に好ましくは３０〜６０ｗｔ％である。
【００７２】
本発明の方法の別の一実施形態では、さらなる段階ｄ）として、本方法によって得られた磁性ポリマー粒子に対して官能化が実施され、生体分子を固定化できる少なくとも一つのリガンドがポリマーマトリクスへ結合される。磁性粒子は、重合後に、たとえば官能化のようにさらに反応される前に、好ましくは単離および洗浄される。粒子は単純なろ過によって単離でき、および次いで溶媒で洗浄することによって精製されうる。洗浄に適する溶媒は、たとえば、トルエン、アセトンまたは水といった、有機および無機溶媒の両方である。
【００７３】
本発明の方法の一変形では、リガンドは磁性ポリマー粒子の官能基の反応基へ直接結合される。その代替として、リガンドは、第一の段階ｄ１）で、少なくとも２個の反応基を有するスペーサー化合物を磁性ポリマー粒子の官能基へ結合し、および次いで、第二の段階ｄ２）で、好ましくは生体分子を固定化できるそのリガンドを、磁性ポリマー粒子へ共有結合することによって結合されうる。
【００７４】
適当なリガンドおよびスペーサーは、たとえば、本発明の磁性粒子に関連して上に記載された基である。これらの基は、少なくとも２個の反応基を含む適当な化合物によって、ポリマー粒子へ結合されうる。
【００７５】
本発明の第一のおよび第二の態様で上に記載された本発明の磁性ポリマー粒子は、上に記載の本発明の方法によって得ることができる。
【００７６】
別の態様では、本発明は、下記の段階を含む、試料から少なくとも一つの種の生体分子を単離および／または分析する方法に関する：
ａ）少なくとも一つの生体分子種を含む試料の提供，
ｂ）試料を本発明の磁性ポリマー粒子と、少なくとも一つの生体分子種が磁性ポリマー粒子へ結合する条件下で、接触させる、および
ｃ）結合した生体分子と共に磁性ポリマー粒子を、少なくとも一つの磁場を用いて除去する。
【００７７】
この方法の一実施形態では、少なくとも一つの生体分子種の、磁性ポリマー粒子からの溶出が、さらなる段階ｄ）として後続する。
【００７８】
本発明の方法によって調製された磁性ポリマー粒子は、このように、好ましくは生体分子を固定化または結合するのに使用されうる。これに関連して、磁性粒子に結合した生体分子種は、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖質、脂質、およびその組み合わせから成る群から選択されうる。特に、核酸およびオリゴヌクレオチド、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、および化学的に合成または修飾された核酸またはオリゴヌクレオチドを磁性粒子へ結合することが可能である。「結合した」とはこれに関連して一般的に、生体分子が磁性ポリマー粒子と強い相互作用を生じるため、磁場の影響下で磁性ポリマー粒子と共に除去されうるほどであることを意味する。これらの相互作用は性質が異なりうる。たとえば、相互作用は共有結合および／または水素結合の形成および／またはファンデルワールス力に基づきうる。
【００７９】
リガンドとしてたとえばＮｉ−ＮＴＡのようなキレート剤で官能化された磁性ポリマー粒子は、特にタンパク質精製に使用されうる。
【００８０】
ポリエチレンイミンのようなアミノ基を含むリガンドで、またはカルボン酸を含むリガンドで修飾された磁性ポリマー粒子は、特に核酸の単離および精製に使用されうる。二次抗体がリガンドとして磁性ポリマー粒子へ結合している場合、これらは一次抗体を単離および精製するために使用されうる。
【００８１】
少なくとも一つの生体分子種を含む試料は、たとえば、血液、組織、細胞、植物材料などといった、相対的に複雑な試料でありうる。他の試料は、精製、増幅、または分析法の途中に得られる溶液、たとえばＰＣＲ溶液である。
【００８２】
本発明の磁性粒子が使用されうる他の方法は、ハイブリダイゼーションによる核酸検出、抗体または有機高分子の結合、および生体分子または細胞の結合および検出である。磁性粒子は一般的に、生体分子または細胞の結合、検出および精製に使用されうる。
【００８３】
本発明はさまざまな実施例によってさらに記載される。これらの実施例は単に本発明をさらに説明する役割を果たし、および限定的と理解してはならない。
【実施例】
【００８４】
実施例１：多孔質ヒドロキシ官能化磁性ポリマー粒子の合成
第一の段階で、８ｍｌのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ドイツ、タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）、アルドリッチ品番２７，４３４８）を、４００ｍｌのパラフィン油（シグマ・アルドリッチ社、ドイツ、タウフキルヒェン、アルドリッチ品番３３，０７６−０）に溶解した。次いで、本質的に阻害剤を含まない、２ｍｌのエチレングリコールジメタクリレート（シグマ・アルドリッチ社、ドイツ、タウフキルヒェン、アルドリッチ品番３３，５６８−１）および９ｍｌのヒドロキシエチルメタクリレート（シグマ・アルドリッチ社、ドイツ、タウフキルヒェン、アルドリッチ品番４７，７０２−８）を、プラスチック容器、好ましくは５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブ（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））へピペットで入れ、および１０ｍｌのポリエチレングリコール３４００（シグマ・アルドリッチ社、ドイツ、タウフキルヒェン、アルドリッチ品番２０，２４４−４）、０．３ｇのアゾビス−２−メチルプロピオニトリル（シグマ・アルドリッチ社、ドイツ、タウフキルヒェン、フルカ（Ｆｌｕｋａ）品番１１６３０）および７．５ｇのＢＡＳＦ磁鉄鉱３４５（ＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ ＡＧ）、ドイツ、ルートヴィヒスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ））を加える。この混合物を次いでポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーで最高設定にて１分間ホモジナイズする。パラフィン油溶液の半分を５００ｍｌナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）ボトルへ入れる。磁鉄鉱懸濁液を次いで加え、および混合物を氷中で冷却しながら１２０秒間ホモジナイズする。パラフィン油溶液の残り半分を保護ガス下で還流冷却器およびＫＰＧスターラーを備えた１０００ｍｌ三つ口フラスコへ入れる。最初の撹拌速度５００ｒｐｍを後で６００ｒｐｍへ上げる。酸化鉄懸濁液を次いで加える。反応混合物から次いで、保護ガスをフラスコに通じることによって酸素を除去する。反応温度を７０℃へ上げて１時間および次いで８０℃にて一夜保つ。翌日、混合物をろ過し、トルエン、アセトンおよび水で洗浄し、および真空乾燥器内で５０℃にて乾燥する。この方法で得られた粒子は、ヒドロキシ官能化されており、マクロ孔を有し、および１０ないし１５μｍの粒子直径を有する。
【００８５】
実施例２：多孔質エポキシ官能化磁性ポリマー粒子の合成
第一の段階で、８ｍｌのスパン（Ｓｐａｎ）６０（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アルドリッチ品番３１，８２２−１）を４００ｍｌのパラフィン油（シグマ・アルドリッチ社、アルドリッチ品番３３，０７６−０）に溶解する。次いで、本質的に阻害剤を含まない、５ｍｌのエチレングリコールジメタクリレートおよび５ｍｌのグリシジルメタクリレート（シグマ・アルドリッチ社、アルドリッチ品番１５−１２３−８）をファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブへピペットで入れ、および１０ｍｌのポリエチレングリコール（ＭＷ４６００）（シグマ・アルドリッチ社、アルドリッチ品番３７，３００−１）、０．３ｇのアゾビス−２−メチルプロピオニトリルおよび７．５ｇのバイエル・バイオキサイド（Ｂａｙｅｒ Ｂａｙｏｘｉｄｅ）Ｅ ８７１０（ランクセス社（Ｌａｎｘｅｓｓ ＡＧ）、ドイツ、レーバークーゼン（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ））を加える。この混合物をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーで最高設定にて１分間ホモジナイズする。
【００８６】
パラフィン油溶液の半分を５００ｍｌナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）ボトルへ入れる。次いで磁鉄鉱懸濁液を加え、および混合物を氷中で冷却しながら１２０秒間ホモジナイズする。パラフィン油溶液の残り半分をその後、保護ガス下で還流冷却器およびＫＰＧスターラーを備えた１０００ｍｌ三つ口フラスコへ入れる。最初の撹拌速度５００ｒｐｍを後で６００ｒｐｍへ上げる。酸化鉄懸濁液を次いで加え、および保護ガスをフラスコに通じることによって反応混合物から酸素を除去する。反応温度を６０℃に上げて１時間、および次いで７０℃にて一夜保つ。翌日、混合物をろ過し、およびトルエン、アセトンおよび水で洗浄し、および真空乾燥器内で５０℃にて乾燥するこの方法で得られた粒子は、エポキシ官能化されており、マクロ孔を有し、および１０ないし１５μｍの粒子直径を有する。
【００８７】
実施例３：多孔質カルボキシ官能化磁性ポリマー粒子の合成
第一の段階で、８ｍｌのスパン（Ｓｐａｎ）６０を４００ｍｌのパラフィン油（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アルドリッチ品番３３，０７６−０）に溶解する。次いで、本質的に阻害剤を含まない、３ｍｌのエチレングリコールジメタクリレートおよび７ｍｌのメタクリル酸（シグマ・アルドリッチ社、アルドリッチ品番３９，５３７−４）をファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブへピペットで入れ、および１０ｍｌのポリエチレングリコールＭＷ２０００（シグマ・アルドリッチ社、品番２９，５９０−６）、０．３ｇのアゾビス−２−メチルプロピオニトリルおよび７．５ｇのバイエル・バイオキサイド（Ｂａｙｅｒ Ｂａｙｏｘｉｄｅ）Ｅ ８７１３Ｈを加える。この混合物をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーで最高設定にて１分間ホモジナイズする。パラフィン油溶液の半分を５００ｍｌナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）ボトルへ入れる。磁鉄鉱懸濁液を次いで加え、および混合物を氷中で冷却しながら１２０秒間ホモジナイズする。パラフィン油溶液の残り半分を次いで保護ガス下で還流冷却器およびＫＰＧスターラーを備えた１０００ｍｌ三つ口フラスコへ入れる。最初の撹拌速度５００ｒｐｍを６００ｒｐｍへ上げる。酸化鉄懸濁液を加える。反応混合物から次いで、保護ガスをフラスコに通じることによって酸素を除去する。反応温度を７０℃へ上げて１時間および次いで８０℃にて一夜保つ。翌日、混合物をろ過し、トルエン、アセトンおよび水で洗浄し、および真空乾燥器内で５０℃にて乾燥する。この方法で得られた粒子は、カルボキシ官能化されており、マクロ孔を有し、および１０ないし１５μｍの粒子直径を有する。
【００８８】
実施例４：多孔質磁性ポリマー粒子のＮｉ−ニトリロ三酢酸での化学修飾
実施例１からの多孔質磁性ポリマー粒子５ｇを２５０ｍｌ丸底フラスコ内で０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液１００ｍｌに懸濁する。次いでエピブロモヒドリン２ｍｌを加え、および混合物をロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）内で４０℃にて４時間反応させる。懸濁液を次いでガラス吸引ろ過器を通してろ過し、および脱イオン水で６回洗浄する。残留物を次いで２５０ｍｌ丸底フラスコへ移し、ａ−Ｎ，Ｎ'−ビス（カルボキシメチル）リジンの０．５Ｍ溶液１００ｍｌに懸濁し（デーベリ（Ｄｏｅｂｅｌｉ）他、ＥＰ ０ ２５３ ３０３によって開示される合成）、およびロータベーパー内で一夜加熱する。混合物を次いで吸引ろ過し、および脱イオン水で４回洗浄する。磁性粒子を次いで２％濃度硫酸ニッケル溶液５０ｍｌに懸濁し、およびさらに３時間撹拌する。その後、磁気除去を用いて、粒子を水で３回洗浄し、５０ｍｌの２０％エタノール含有１００ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ６．０中に再懸濁しおよび保存する。
【００８９】
実施例５：多孔質磁性ポリマー粒子のＮｉ−ニトリロ三酢酸での化学修飾
実施例２からのポリマー粒子４ｇを２５０ｍｌ丸底フラスコ内で脱イオン水５０ｍｌに懸濁する。次いで２ｇのａ−Ｎ，Ｎ'−ビス（カルボキシメチル）リジンリガンド（デーベリ（Ｄｏｅｂｅｌｉ）他、ＥＰ ０ ２５３ ３０３に記載される合成）を加え、および反応混合物をゆっくり撹拌しながら６０℃にて１０時間加熱する。混合物を次いで、磁気除去を用いて脱イオン水で４回洗浄する。磁性粒子を次いで２％濃度硫酸ニッケル溶液５０ｍｌに懸濁し、およびさらに３時間撹拌する。その後、磁気除去を用いて、粒子を水で３回洗浄し、５０ｍｌの２０％エタノール含有１００ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ６．０中に再懸濁しおよび保存する。
【００９０】
実施例６：多孔質磁性ポリマー粒子のポリエチレンイミンでの化学修飾
実施例３からのポリマー粒子４ｇを、高分子量ポリエチレンイミン（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アルドリッチ品番４０，８７２−７）の１０％濃度水溶液ｐＨ１０の５０ｍｌに懸濁し、および丸底フラスコへ移す。次いで２００ｍｇのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（シグマ・アルドリッチ社、フルカ（Ｆｌｕｋａ）品番５６４８５）および２００ｍｇのＮ−３−ジメチルアミノ−Ｎ'−プロピルカルボジイミド塩酸塩（シグマ・アルドリッチ社、フルカ品番０３４４９）を加え、および混合物をロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）内で室温にて３時間撹拌する。混合物を次いで、磁気除去を用いて脱イオン水で６回洗浄し、および最後に脱イオン水５０ｍｌに懸濁する。
【００９１】
実施例７：多孔質磁性ポリマー粒子のポリエチレンイミンでの化学修飾
実施例２からのポリマー粒子４ｇを、高分子量ポリエチレンイミン（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アルドリッチ品番４０，８７２−７）の１０％濃度水溶液ｐＨ１０の５０ｍｌに懸濁し、および丸底フラスコへ移し、および撹拌しながら６０℃にて１０時間加熱する。混合物を次いで、磁気除去を用いて脱イオン水で６回洗浄し、および最後に脱イオン水５０ｍｌに懸濁する。
【００９２】
実施例８：多孔質磁性ポリマー粒子のアミンでの化学修飾
実施例３からのポリマー粒子４ｇを、５０ｍｌの５％濃度スペルミン溶液（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）品番８５５９０）、ｐＨ１０に懸濁し、および丸底フラスコへ移す。次いで２００ｍｇのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（シグマ・アルドリッチ社、上記参照）および２００ｍｇのＮ−３−ジメチルアミノ−Ｎ'−プロピルカルボジイミド塩酸塩（シグマ・アルドリッチ社、上記参照）を添加し，および混合物をロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）内で室温にて３時間撹拌する。混合物を次いで、磁気除去を用いて脱イオン水で６回洗浄し、および最後に脱イオン水５０ｍｌに懸濁する。
【００９３】
実施例９：多孔質磁性ポリマー粒子のアミンでの化学修飾
実施例２からのポリマー粒子４ｇを、５０ｍｌの５％濃度スペルミン溶液（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、上記参照）、ｐＨ１０中で丸底フラスコへ移し、および撹拌しながら６０℃にて１０時間撹拌する。混合物を次いで、磁気除去を用いて脱イオン水で６回洗浄し、および最後に脱イオン水５０ｍｌに懸濁する。
【００９４】
実施例１０：多孔質カルボキシ官能化磁性ポリマー粒子の化学合成
実施例２からのポリマー粒子４ｇを、５０ｍｌの１０％濃度６−アミノヘキサン酸溶液（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アルドリッチ品番Ａ４，４６０−６）、ｐＨ９．５に懸濁し、丸底フラスコへ移し、および撹拌しながら６０℃にて１０時間加熱する。混合物を次いで、磁気除去を用いて脱イオン水で６回洗浄し、および最後に脱イオン水５０ｍｌに懸濁する。
【００９５】
実施例１１：多孔質磁性ポリマー粒子への二次抗体の結合
実施例２からのポリマー粒子２ｇを、１００ｍＭ塩化ナトリウム中の１，６−ジアミノヘキサン（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、アルドリッチ品番Ｈ１−１，１６９−６）１０％濃度溶液ｐＨ９．５の５０ｍｌへ加え、および１００ｍｌ丸底フラスコへ移す。次の段階で、２５０ｍｇのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドおよび２５０ｍｇのＮ−３−ジメチルアミノ−Ｎ'−プロピルカルボジイミド塩酸塩を加える。フラスコを次いでロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）へ移し、および反応混合物を室温にて３時間反応させる。
【００９６】
冷却後、ポリマー懸濁液を、磁気除去を用いて脱イオン水で３回洗浄する。ビーズをリン酸緩衝生理食塩水４ｍｌに懸濁し、およびリン酸緩衝生理食塩水中のスルホ−ＳＭＣＣ（ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）から入手可能）１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌを加える。懸濁液を直ちにボルテックスし、および次いで転倒型振とう機内で２時間反応させる。反応産物を上清から磁気除去によって除去し、および１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄する。次いで１ｍｌの抗体溶液（１ｍｇ／ｍｇヤギ抗マウスＩｇＧ；シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、シグマ品番Ｍ８６４２）および１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水を加え、および反応混合物を転倒型振とう機内で２時間反応させる。上清を次いで産物から磁気除去によって除去する。磁性粒子をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、および−２０℃にて保存できる。
【００９７】
実施例１２：多孔質磁性ポリマー粒子への二次抗体の結合
実施例３からのポリマー粒子２ｇを、１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液中の１，６−ジアミノヘキサン（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、上記参照）１０％濃度溶液ｐＨ９．５の５０ｍｌへ加え、および１００ｍｌ丸底フラスコへ移す。フラスコを次いでロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）へ移し、および反応混合物を７０℃にて１０時間反応させる。冷却後、ポリマー懸濁液を、磁気除去を用いて脱イオン水で３回洗浄する。ビーズをリン酸緩衝生理食塩水４ｍｌに懸濁し、およびリン酸緩衝生理食塩水中のスルホ−ＳＭＣＣ１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌを加える。懸濁液を直ちにボルテックスし、および次いで転倒型振とう機内で２時間反応させる。反応産物を上清から磁気除去によって分離し、および１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄する。次いで１ｍｌの抗体溶液（１ｍｇ／ｍｇ、二次ヤギ抗マウス）および１ｍｌの緩衝生理食塩水を加え、および混合物を転倒型振とう機内で２時間反応させる。上清を次いで産物から磁気沈澱によって除去する。磁性粒子をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、および−２０℃にて保存できる。
【００９８】
実施例１３：Ｎｉ−ＮＴＡ修飾された多孔質磁性ポリマー粒子でのタンパク質精製（変性条件）
５ｍｌの細胞培養沈澱（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプラスミドｐＱＥ１６、形質転換および組み換えタンパク質の産生は『キアエクスプレッショニスト』（"ＴｈｅＱｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ"）第３版、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、１９９７に記載されている）を、１ｍｌの溶解緩衝液（６ＭグアニジンＨＣｌ、０．１ Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、０．０１ Ｍ トリス×ＨＣｌ、０．０５％ ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０、ｐＨ ８．０）に、ピペッティングで上下およびチューブを室温にて１時間振とうすることによって再懸濁する。溶解物を次いで１０ ０００ ｇにて３０分間遠心分離によって清澄化し、および上清を別のチューブへ移す。実施例４または５からの多孔質磁性ポリマービーズ５ｍｇを第二のチューブへ入れ、および清澄化された溶解物溶液５００μｌを加える。懸濁液を転倒型振とう機で室温にて３０分間インキュベートする。チューブを次いで適当な磁気分離器に置き、および上清をピペッティングによって除去する。次の段階で、５００μｌの洗浄緩衝液（８Ｍ尿素、０．１ Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、０．０１ Ｍトリス×ＨＣｌ、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０、ｐＨ ６．３、を加え）、チューブを磁気分離器に１分間置き、および上清をピペッティングによって除去する。この洗浄段階を、洗浄緩衝液を用いて１回反復する。次いで１００μｌの溶出緩衝液（８ Ｍ 尿素、０．１ Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、０．０１ Ｍトリス×ＨＣｌ、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０、ｐＨ４．５）を加え、懸濁液を転倒型振とう機で１分間インキュベートし、チューブを磁気分離器に１分間置き、および溶出液を回収する。 溶出段階を反復し、および溶出液を回収する。ブラッドフォード検定法によって測定されたタンパク質結合容量はおよそ１０μｇ／ｇ磁性粒子である。
【００９９】
実施例１４：ポリエチレンイミン修飾された多孔質磁性ポリマービーズを用いるウイルスの濃縮
ウイルス血漿１ｍｌを２ｍｌエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）チューブへ入れる。次いで実施例５からのポリエチレンイミン修飾粒子の懸濁液２００μｌを、濃度１０ｍｇ／ｍｌでＲＮアーゼフリー水２００μｌへ加える。混合物をボルテックスし、続いて室温にて１５分間インキュベートし、およびチューブの上端の粒子の残留物を除去するために２０００ｒｐｍにて２秒間遠心分離する。粒子を次いで５分間にわたって磁気によって除去する。上清を同時に粒子を除去せずに廃棄する。続いて、１３．２ｍｌの「ＡＬ」緩衝液（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、品番１９０７５）を８２．９μｌの定量標準（コバス（Ｃｏｂａｓ）ＴａｑＭａｎ用、ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））およびキャリヤーＲＮＡ（キアンプ（ＱＩＡａｍｐ）（登録商標）ミンエルート・バキューム（ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖａｃｕｕｍ）キットの、キアゲン社、ドイツ、ヒルデン、品番５７７１４）と共に、７５μｌのプロテアーゼ溶液（キアンプ（登録商標）ミンエルート・キットの）および７ｍｌの再懸濁緩衝液（キアンプ（登録商標）ミンエルート・キットの）と混合する。
【０１００】
１５μｌの酵素溶液（スミテスト（Ｓｍｉｔｅｓｔ）溶液Ｉ、ＪＳＲ株式会社、茨城）、３８０μｌの試料希釈剤（スミテスト溶液ＩＩ）、および５μｌの沈澱剤（スミテスト溶液ＩＶ）を加える。スミテスト溶液の添加直後、試料をボルテックスで混合する。その後５５℃にて３０分間インキュベートし、続いて２０００ｒｐｍにて短い遠心分離段階を行う。粒子をピペッティング上下によって再懸濁する。粒子の懸濁液をウルトラフリー（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ）ＭＣフィルター（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に乗せ、チューブに栓をし、およびヒンジ部をはさみで切り開く。ろ過器具を次いで２ｍｌエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）チューブに入れる。それを１００００ｒｐｍにて３分間遠心分離する。ろ過器具を取り外しおよび廃棄する。次いで、ＲＴからの品質標準を含む２５０μｌのスミテスト溶液ＩＩＩ（タンパク質溶液用）およびｃＲＮＡ（キャリヤーＲＮＡ／ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を加える。混合物を直ちにボルテックスし、および５５℃にて１５分間インキュベートする。次いで６００μｌのイソプロパノールを加え、およびチューブを２０回転倒することによって混合する。それを次いで氷上で１５分間インキュベートし、および続いて１５０００ｒｐｍおよび４℃にて１０分間遠心分離する。上清を粒子を再懸濁することなく注意深く除去する。５００μｌの７０％エタノールを加え、およびチューブを３回転倒することによって混合する。それを１２０００ｒｐｍおよび４℃にて３分間遠心分離し、および次いで５００μｌの７０％エタノールを加え、および再びチューブを３回転倒することによって混合する。遠心分離を再び、１２０００ｒｐｍおよび４℃にて３分間実施する。上清を除去および廃棄する。１５０００ｒｐｍにて１０秒間の遠心分離後の上清を除去する。粒子を室温にて１０分間乾燥する。粒子を６０μｌのＲＮアーゼフリー水に再懸濁し、およびサーモミキサーを用いて室温にて１０から１５分間振とうする。溶出液５０μｌを、コバス（Ｃｏｂａｓ）ＴａｑＭａｎ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））のマスターミックス５０μｌと合わせ、およびリアルタイムＰＣＲによって調べる。この手順を用いて、ミンエルート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ）を用いて精製されている非濃縮血清と比較して、ＣＴ値の低下を発見することが可能である。
【０１０１】
実施例１５：アミノ修飾された多孔質磁性ポリマー粒子を用いる核酸精製
標準プラスミドｐＵＣ２１の１ｍｇ／ｍｌ溶液１０μｌを、３００μｌの１００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ５．５、および実施例７または８からのアミノ修飾多孔質磁性ポリマー粒子１００ｍｇ／ｍｌ懸濁液２０μｌへ、１．５ｍｌエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）チューブ内で加える。溶液を１０秒間パルスボルテックスによって徹底的に混合し、およびＤＮＡ結合を、チューブを１１００ｒｐｍにてエッペンドルフ・サーモミキサー内で５分間振とうすることによって補助する。粒子を上清から、マイクロチューブ磁気分離器、たとえば１２チューブ磁気分離器（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、品番３６９１２）での磁気除去によって分離し、および上清を廃棄する。次いで二回蒸留水５００μｌを加え、およびチューブを１０秒間パルスボルテックスする。粒子を次いで上清から磁気除去によって除去し、および上清を廃棄する。この洗浄系列を反復し、および磁気除去後に上清を再び廃棄する。粒子を次いで、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）品番７１７２５）を含む５０μｌの「ＴＥ」緩衝液（１０ ｍＭトリス／Ｃｌ； ｐＨ ８．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、および懸濁液を１０秒間パルスボルテックスすることによって徹底的に混合する。チューブを次いで磁気分離器に置き、および上清を第二のエッペンドルフチューブへ移す。精製後、溶出液のＤＮＡ含量は、ＯＤ320測定によって、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定されうる。その代替として、ＤＮＡは高塩含量の緩衝液（たとえば１．２５ｍｌのＮａＣｌ；５０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ８．５、１５％イソプロパノール）によって溶出されうるが、しかし以降の生化学反応に使用可能にするためにＤＮＡを続いて沈澱しなければならない。
【０１０２】
実施例１６：二次抗体で修飾された多孔質磁性ポリマー粒子への一次抗体の結合
３．４×１０5／ｍｌヒトＣＤ３＋および４．２×１０5／ｍｌ ＣＤ３−懸濁細胞を、１０ ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１００ ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む溶液中で混合する。次いで実験１回当たり３．３２×１０6 細胞を用いる。混合物をＣＤ３特異的モノクローナル抗体（マウス抗ヒトＣＤ３ ＰｅｒＣＰ／ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、品番５５５３３０）と共に振とうせずに３０分間インキュベートする。続いて、１ ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（１０ ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１００ ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ ７．５）を加え、および混合物を１０００ｒｐｍにて遠心分離する。上清をピペッティングで除去し、および粒子をリン酸緩衝生理食塩水１ｍｌに再懸濁する。次いで、実施例１１または１２の通りに二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）で官能化された磁性粒子の２５ｍｇ／ｍｌ懸濁液２００μｌを加える。粒子を時々振とうによって２０分間インキュベートおよび混合する。次の段階で、チューブを磁気分離器に置き、および上清を第二のチューブへ移す。続いて、さらなる段階で、２０μｌのマウス抗ヒトＣＤ３ ＰｅｒＣＰを加えおよび１５分間インキュベートし、洗浄し、および蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分析する。シグナルの分析は、
ａ）染色されていない細胞、
ｂ）ＣＤ３ＰｅｒＣＰ染色された、および分離されていない細胞混合物、
ｃ）分離抗体とインキュベートされ、続いて染色抗体（ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ）とインキュベートされた細胞および
ｄ）ＣＤ３ Ｐｅｒ ＣＰで染色された、磁気除去された細胞
を示した。
ＦＡＣＳ結果は、ＣＤ３発現ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の、３９．３から５．４４％へ少なくとも８５％の枯渇を示した。
【０１０３】
実施例１７：カルボキシル修飾された多孔質磁性ポリマー粒子を用いる核酸精製（ゲル抽出）
ＤＮＡ１μｇを含むゲル断片２００ｍｇを、４００μｌの「ＱＸ１」緩衝液（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、品番２０９１２）に入れ、および５秒間パルスボルテックスすることによって徹底的に混合する。次いで実施例３または１０に記載のカルボキシル修飾多孔質磁性ポリマー粒子の５０ｍｇ／ｍｌ懸濁液５０μｌを加え、および混合物を新たなパルスボルテックスによって混合する。混合物を次いでヒートブロック上で５０℃にて５分間加熱し、および再び１０秒間パルスボルテックスによって混合する。粒子を次いで上清から磁気除去によって除去し、および上清を廃棄する。次の段階で、「ＱＸ１」緩衝液５００μｌを加え、および懸濁液を５秒間パルスボルテックスすることによって徹底的に混合する。除去段階を次いで反復し、および上清を再び廃棄する。続いて「ＰＥ」緩衝液（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン、品番１９０６５）を用いる２回の洗浄段階を行い、および各上清を廃棄する。粒子を次いで、磁気分離器をこの間外さずに、チューブを１０分間回転することによって１回乾燥する。乾燥段階後、１００μｌの「ＥＢ」緩衝液（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン、品番１９０６８）を加え、および懸濁液を１５秒間パルスボルテックスすることによって混合する。上清を粒子から磁気分離器によって除去し、および別のチューブへ移す。溶出段階を反復し、および溶出液を回収しおよび短いパルスボルテックスによってホモジナイズする。精製ＤＮＡの純度および量は、ゲル電気泳動およびＯＤ測定によって測定されうる。
【国際調査報告】
2009518489.tif 000011
2009518489.tif 000012
2009518489.tif 000013
2009518489.tif 000014