(57)【要約】  本発明は、担体上に少なくとも１つの多量体ペプチドを固定する工程を包含する、担体に機能性を付与する方法であって、上記少なくとも１つの多量体ペプチドは少なくとも１つの第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖を含んでおり、上記第１ペプチド鎖は、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基と、少なくとも１つの機能性部分とを含んでおり、上記少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つの機能性部分は、疎水性面および機能性部分を含む実質的に非疎水性の面となるように、上記ペプチドの一次構造中に位置しており、上記ペプチドと上記担体とを接触させることによって、上記ペプチドを上記担体上に固定する方法に関するものである。
2009518621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に機能性を付与する方法であって、
少なくとも１つの多量体ペプチドを上記担体上に固定する工程を包含し、
上記少なくとも１つの多量体ペプチドは、少なくとも１つの第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖を含み、
第１ペプチド鎖は、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つの機能性部分を含み、
上記少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つの機能性部分は、疎水性面、および上記機能性部分を含む実質的に非疎水性の面を形成するように、上記ペプチドの一次構造中に配置され、
上記ペプチドと上記担体とを接触させることによって、上記ペプチドを上記担体上に固定することを特徴とする方法。
【請求項２】
上記担体は、疎水性担体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記担体は、疎水性の層によって被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１ペプチド鎖は、上記担体と上記ペプチドの上記疎水性面との間の疎水性相互作用によって、上記担体上に固定されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
側鎖が上記疎水性面を形成する上記疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、およびフェニルアラニンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンであることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記疎水性アミノ酸モノマーのそれぞれは、実質的に鏡像異性的に単一であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記機能性部分は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸、または他のキラルアミノ酸モノマーからなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記機能性部分を形成しているアミノ酸モノマーのそれぞれは、実質的に鏡像異性的に単一であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記第１ペプチド鎖は、疎水性アミノ酸残基と実質的に非疎水性のアミノ酸残基とを交互に含む一次構造を有していることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記第１ペプチド鎖は、疎水性アミノ酸残基を２０％〜８０％含んでいることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記機能性部分は、１０個以下のアミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記多量体ペプチドは、第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖を含むペプチド二量体を含んでいることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記ペプチド二量体は、上記疎水性担体上にてアセンブルされていることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
上記第２ペプチドは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基と、少なくとも１つの非疎水性アミノ酸残基とを含んでおり、
上記アミノ酸の側鎖が、疎水性面と上記機能性部分を含む実質的に非疎水性の面とを形成するように、上記アミノ酸が、上記ペプチド一次構造中に配置されていることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記第２ペプチド鎖は、上記第１ペプチド鎖よりも少ないアミノ酸を含んでいることを特徴とする請求項１３〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
上記第２ペプチド鎖は、１個〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項１３〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
上記第２ペプチド鎖は、上記機能性部分を形成する１０個以下のアミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項１３〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
上記第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖のそれぞれは、少なくとも１つの反応基を含んでいることを特徴とする請求項１３〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
上記第１ペプチド鎖にある上記反応基は、一次アミノ酸構造において、上記実質的に非疎水性の面上で、かつ上記機能性部分のＮ末端側に位置しており、上記第２ペプチド鎖にある上記反応基は、上記疎水性面上で、かつ上記機能性部分のＮ末端側に位置していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記反応基は、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基によって活性化されていることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記機能性部分は、リガンドが上記固定されたペプチドに結合するのを可能にするものであることを特徴とする請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法によって機能性が付与された担体。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法によって機能性が付与された担体を含むアレイであって、複数の固定されたペプチドを含むことを特徴とするアレイ。
【請求項２６】
個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることを特徴とする請求項２５に記載のアレイ。
【請求項２７】
上記アレイ上の所定の部位にある上記ペプチドの実質的に全てが、実質的に同一であることを特徴とする請求項２５または２６に記載のアレイ。
【請求項２８】
上記アレイ上における各部位は、異なる固定化されたペプチドを含んでいることを特徴とする請求項２５〜２７の何れか１項に記載のアレイ。
【請求項２９】
リガンド結合用の捕捉剤であって、
少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドを含んでおり、
第１ペプチドは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つのリガンド結合部位を含んでおり、
上記少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つのリガンド結合部位は、上記第１ペプチドが疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を含むように、上記ペプチドの一次構造中に配置されていることを特徴とする捕捉剤。
【請求項３０】
上記第１ペプチドは、６個〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項２９に記載の捕捉剤。
【請求項３１】
上記リガンド結合部位は、水酸基、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、グアニジン基、イミダゾール基、芳香族基、発色団、蛍光団、同位標識、キレート基、ハプテンおよびビオチンからなる群より選択されることを特徴とする請求項２９または３０に記載の捕捉剤。
【請求項３２】
上記リガンド結合部位は、少なくとも１つのアミノ酸を含むことを特徴とする請求項２９〜３１の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項３３】
上記リガンド結合面に位置するように配置されたアミノ酸はそれぞれ、６個よりも少ないアミノ酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項２９〜３２の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項３４】
上記第１ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と非疎水性アミノ酸残基とを交互に含む一次構造を有していることを特徴とする請求項２９〜３３の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項３５】
上記第１ペプチドは、２０％〜８０％の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項２９〜３４の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項３６】
上記疎水性面を形成する上記疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されることを特徴とする請求項２９〜３５の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項３７】
上記疎水性面にある上記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンであることを特徴とする請求項２９〜３６の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項３８】
上記第２ペプチドは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つの非疎水性アミノ酸残基を含んでおり、
上記アミノ酸残基の側鎖が、疎水性面および実質的に非疎水性のリガンド結合面を形成するための空間に配置されるように、上記アミノ酸が、上記ペプチド一次構造中に配置されていることを特徴とする請求項２９〜３７の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項３９】
上記第２ペプチドは、第１ペプチドよりもアミノ酸の数が少ないことを特徴とする請求項２９〜３８の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項４０】
上記第２ペプチドは、上記第１ペプチドよりも疎水性残基の数が少ないことを特徴とする請求項２９〜３９の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項４１】
上記第２ペプチドは、１個〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項２９〜４０の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項４２】
上記第１ペプチドに含まれる、上記実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置しているリガンド結合残基の数は、１０以下であることを特徴とする請求項２９〜４１の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項４３】
上記第２ペプチドに含まれる、上記実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置しているリガンド結合残基の数は、１０以下であることを特徴とする請求項２９〜４２の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項４４】
上記実質的に非疎水性であるリガンド結合面が、リガンドと結合しやすいように、担体に結合していることを特徴とする請求項２９〜４３の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項４５】
上記担体は、疎水性担体であることを特徴とする請求項４４に記載の捕捉剤。
【請求項４６】
上記疎水性担体に、疎水性相互作用によって付着していることを特徴とする請求項４５に記載の捕捉剤。
【請求項４７】
上記疎水性担体は、疎水性有機チオール処理によって加工された金、表面処理により加工されたガラス、またはプラスチックから選択されることを特徴とする請求項４５または４６に記載の捕捉剤。
【請求項４８】
上記ペプチド二量体が、上記担体上にてアセンブルされることを特徴とする請求項４４〜４７の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項４９】
上記第１ペプチドおよび第２ペプチドはそれぞれ、少なくとも１つの反応基を含んでいることを特徴とする請求項２９〜４８の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項５０】
上記第１ペプチドにある上記反応基は、一次アミノ酸構造において、実質的に非疎水性であるリガンド結合面上で、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置しており、上記第２ペプチドにある上記反応基は、上記疎水性面上で、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置していることを特徴とする請求項４９に記載の捕捉剤。
【請求項５１】
上記反応基は、チオール、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項４９または５０に記載の捕捉剤。
【請求項５２】
上記反応基は、チオール基であることを特徴とする請求項５１に記載の捕捉剤。
【請求項５３】
少なくとも１つのチオール基は、活性化チオールであることを特徴とする請求項５２に記載の捕捉剤。
【請求項５４】
上記チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基のいずれかによって活性化されていることを特徴とする請求項５３に記載の捕捉剤。
【請求項５５】
上記第１ペプチドは、配列番号１に示される配列を有していることを特徴とする請求項２９〜５４の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項５６】
上記第２ペプチドは、配列番号２に示される配列を有していることを特徴とする請求項２９〜５４の何れか１項に記載の捕捉剤。
【請求項５７】
請求項２９〜５６の何れか１項に記載の捕捉剤が、少なくとも１つ固定されていることを特徴とする担体。
【請求項５８】
請求項２９〜５６の何れか１項に記載の捕捉剤を含んでいることを特徴とするアレイ。
【請求項５９】
個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることを特徴とする請求項５８に記載のアレイ。
【請求項６０】
上記アレイ上の所定の部位にある上記捕捉剤の実質的に全てが、実質的に同一であることを特徴とする請求項５８または５９に記載のアレイ。
【請求項６１】
上記アレイ上の各部位には、互いに異なる捕捉剤が含まれていることを特徴とする請求項６０に記載のアレイ。
【請求項６２】
目的のリガンドに結合している多量体型捕捉剤の同定方法であって、
請求項２９〜５６の何れか１項に記載のコンビナトリアル捕捉剤のアレイを作製する工程と、
上記目的のリガンドを上記アレイに接触させる工程と、
上記リガンドに結合している捕捉剤を同定する工程と、を含むことを特徴とする同定方法。
【請求項６３】
上記リガンドは、真核細胞、原核細胞、ウイルスおよびバクテリオファージ、プリオン、胞子、花粉粒、アレルゲン、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、有機化合物ならびに無機化合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項６２に記載の同定方法。
【請求項６４】
上記リガンドは、生理代謝産物または薬理代謝産物であることを特徴とする請求項６２または６３に記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、疎水性担体に機能性を付与する新規な方法に関し、さらに、リガンドに結合する捕捉剤及び当該捕捉剤の作製方法に関する。同様に、目的とする特定のリガンドに結合する捕捉剤を同定する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
例えばガラスまたはシリコンのような様々な担体を、その表面にリガンドが結合し得、または様々な種類のアレイを形成し得るように、様々な分子で機能性を付与する方法が知られている。
【０００３】
Ｐｒｏ．  ＳＰＩＥ，  ４２０５，  ７５  （２００１）には、エポキシドで誘導した結晶表面に結合する、又は直接金属表面に結合する、シクロヘキサペプチドの使用が記載されている。この文献においては、全ての他のアミノ酸を変化させたペプチドが記載されている。このペプチドは、リシル残基又はシステイル残基により、表面に付着している。そして、表面結合ペプチドに対するアミノ酸の結合が分析されている。
【０００４】
Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ３９２，  ２１３，  （１９９９）には、さらに、エポキシドで誘導した結晶表面に結合したシクロヘキサペプチドが記載されている。この文献においては、１つまたは３つのリシル残基を、表面アンカーとして用いている。環状ペプチドは線状ペプチドよりもよく機能性し、単一のリシル残基による固定は、３つのリシル残基による固定よりもよく機能していた。揮発性の有機化合物に対する結合を、分光偏光解析法を用いて分析している。
【０００５】
Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ４１，  １２７，  （２００２）には、ペプチドから作製したＬａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルムを、カーボンナノチューブチップを利用した原子力顕微鏡を用いて調査している。結晶配列を、原子力顕微鏡で観察した。これは、ベータシートの凝集の結果であることを示している。
【０００６】
Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １０７，  ７６８４，  （１９８５）においては、気水界面において、構造が定義されたペプチドを作製するために、リシル残基およびロイシル残基が用いられた。この文献においては、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔ手法を用いて、これらを担体に移すことができる。同じ構造であるが、疎水周期性が異なるペプチドから、アルファヘリックス及びベータシートの両方が、形成され得る。１４量体ではなく７量体として形成されたベータシートが、アルファヘリックスを生成するために要求される。
【０００７】
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  １２，  ３４６，  （２００１）において、ペプチドマイクロアレイ、および分子量の小さいマイクロアレイを作製している。この文献においては、化学選択的ライゲーションを、ペプチドとスライド表面との間に用いることができる。スライド表面において、Ｎ末端システイル残基と、アルファケトアルデヒドとが、チアゾリジン環を生じさせるために作用する。その他には、遊離チオールとマレイミドとの間で、フリーラジカルマイケル付加が用いられた。複数のチオールがある場合には、これらの間を区別することができないので、この方法を用いることができない。
【０００８】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １２６，  １４７３０，  （２００４）には、ネイティブケミカルライゲーションによる表面への、タンパク質の選択的な共有接着が記載されている。この文献において、タンパク質チオエステルは、システイン誘導ガラス表面と作用する。
【０００９】
〔発明の開示〕
したがって、本発明は、疎水性表面に機能性を付与する新規な方法を提供することを目的としている。
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、少なくとも第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖を含む、少なくとも１つの多量体ペプチドを担体上に固定する工程を包含し、第１ペプチド鎖は少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つの機能性部分とを含み、上記少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基と、少なくとも１つの機能性部分とは、疎水性面、および上記機能性部分を含む実質的に非疎水性の面になるように、上記ペプチドの一次構造中に位置し、上記ペプチドと上記担体とを接触させることによって、上記ペプチドを上記担体上に固定する、担体に機能性を付与する方法が提供される。
【００１１】
上記少なくとも第１ペプチド鎖および第２ペプチド鎖は、好ましくは、上記多量体ペプチドを形成するために共有結合している。
【００１２】
上記担体は、好ましくは、疎水性担体である。
【００１３】
第１ペプチド鎖は、好ましくは、担体とペプチドの疎水性表面との間の疎水性相互作用によって、担体上に固定されている。
【００１４】
疎水性材料または疎水性溶媒のように、担体自身が疎水性であってもよいこと、あるいは疎水性の層によって覆われていてもよいことは、理解される。
【００１５】
上記担体は、好ましくは、実質的に水性溶媒の存在化において、上記疎水性担体上におけるペプチドのセルフアセンブリによって機能性にされている。好ましくは、セルフアセンブリが、上記疎水性担体と接触した水性溶媒において、エントロピー効果により引き起こされる。
【００１６】
上記疎水性アミノ酸残基は、好ましくは、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸、または他のキラルアミノ酸モノマーからなる群より選択されるアミノ酸である。実質的に単一である上記アミノ酸は、好ましくは、Ｌ型アミノ酸および／またはＤ型アミノ酸である。
【００１７】
その側鎖が上記疎水性表面を形成する上記疎水性アミノ酸は、好ましくは、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される。より好ましくは、上記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンである。
【００１８】
第１ペプチド鎖は、好ましくは、４〜４０個の疎水性アミノ酸残基を含み、より好ましくは６〜２５個、最も好ましくは６〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含む。
【００１９】
各疎水性アミノ酸モノマーは、好ましくは、実質的に鏡像異性的に単一である。
【００２０】
上記機能性部分は、当該技術分野において公知の合成方法を用いて、ペプチドを組み込むことが可能ないずれかの適切な部分を含むことが理解される。このような機能性部分は、例えば、水酸基、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、グアニジン基、イミダゾール基、芳香族基、発色団、蛍光団、同位標識、キレート基、ハプテン及び多数の他の部分から選択されてもよい。
【００２１】
上記機能性部分は、好ましくは、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸、または他の何れかのキラルアミノ酸モノマーを含む群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。アミノ酸は、好ましくは、Ｌ型アミノ酸および／またはＤ型アミノ酸である。
【００２２】
その側鎖が上記機能性部分を形成する、アミノ酸モノマーのそれぞれは、好ましくは、実質的に鏡像異性的に単一である。
【００２３】
第１ペプチド鎖は、好ましくは、図１に示すように、疎水性アミノ酸と実質的に非疎水性アミノ酸とを交互に含む一次構造を含んでいる。
【００２４】
結果として側鎖を分布するように配列することによって、結果として疎水性表面及び実質的に非疎水性表面となるような、他のペプチドを、容易に設計し得ることを当業者は理解するだろう。このようなペプチドは、例えば、疎水性残基の間、またはいずれかの奇数個のアミノ酸の組合せの間に、３つの非疎水性アミノ酸残基があってもよい。あるいは、上記ペプチドは、例えば、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸およびベータアミノ酸の組合せを含むことによって、結果として、疎水性表面および実質的に非疎水性表面となってもよい。
【００２５】
好ましい実施形態において、機能性部分を形成する各アミノ酸側鎖は、第１ペプチド鎖の実質的に非疎水性の表面に位置するように配置され、基本的に２０アミノ酸より少ないアミノ酸からなる群から選択される。このような群は、１２アミノ酸より少ないことがより好ましく、６アミノ酸より少ないことがさらにより好ましく、４アミノ酸からなることが最も好ましい。
【００２６】
第１ペプチド鎖は、好ましくは、疎水性アミノ酸残基を１０％〜９０％含み、より好ましくは２０％〜８０％、さらに好ましくは３０％〜７０％含み、４０％〜６０％疎水性アミノ酸残基を含むことが最も好ましい。
【００２７】
特に好ましい実施形態において、第１ペプチド鎖は、疎水性アミノ酸残基を５０％含む。
【００２８】
機能性部分を形成する、実質的に非疎水性の表面に、側鎖が配置されたアミノ酸もまた、例えばアミノ酪酸残基のように、疎水性残基を含んでもよいことが理解される。
【００２９】
上記機能性部分は、好ましくは、側鎖が実質的に非疎水性の表面に位置する、１０個以下のアミノ酸残基を含む。この機能性部分は、より好ましくは８個以下の上記アミノ酸残基を含み、より好ましくは６個以下の上記アミノ酸残基を含み、さらにより好ましくは４個以下の上記アミノ酸残基を含み、３個以下の上記アミノ酸残基を含むことが最も好ましい。
【００３０】
上記多量体ペプチドは、好ましくは、第１ペプチドおよび第２ペプチドを含むペプチド二量体を含む。
【００３１】
第１ペプチドが上記疎水性担体に接触する前、接触と同時、または接触した後に、第１ペプチドおよび第２ペプチドから、上記ペプチド二量体をアセンブル可能であることは明白である。特に好ましい実施形態においては、ペプチド二量体を上記疎水性担体上にてアセンブルする。
【００３２】
最も好ましい実施形態において、上記担体は、ペプチドを上記担体上に分注することによって得られる。上記ペプチドは、好ましくは、非接触ディスペンサー（例えば、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を用いて上記担体上に個々に分注され、ｉｎ  ｓｉｔｕでアセンブルされる。
【００３３】
第２ペプチド鎖もまた、好ましくは、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基、および少なくとも１つの非疎水性アミノ酸残基を含み、上記アミノ酸は、上記ペプチドの一次構造中に位置し、上記アミノ酸の側鎖が、疎水性表面および上記機能性部分を含む実質的に非疎水性表面を生成するように配置されている。
【００３４】
より好ましい実施形態において、第２ペプチド鎖は、第１ペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、上記ペプチドと上記疎水性表面との間の相互作用が相対的に弱くなるように、より少ない疎水性残基を含む。この実施形態において、第２ペプチド鎖は、第１ペプチドと二量体化するとき、上記疎水性表面にのみ保持される。
【００３５】
上記担体上に保持されるのに要求される、第１ペプチドおよび第２ペプチドの長さ、並びに疎水性アミノ酸残基の数は、上記表面の疎水性、第１ペプチドおよび第２ペプチドに存在する疎水性アミノ酸、さらに、結合するリガンドの性質に依存するかもしれないことは、当業者にとって明らかである。
【００３６】
また、上記担体に保持されるペプチドの量は、上記担体を対象とする洗浄の厳密さに依存するだろうことは、当業者に明白である。好ましくは、上記ペプチドの固定後、上記担体を、例えば、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の１．０  Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。
【００３７】
第２ペプチドは、好ましくは、その側鎖が上記疎水性面を形成する、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含み、２〜５個の疎水性アミノ酸残基を含むことがより好ましく、２〜４個の疎水性アミノ酸残基を含むことが最も好ましい。
【００３８】
第１ペプチドおよび第２ペプチドはそれぞれ、好ましくは、側鎖が上記実質的に非疎水性の表面の機能性部分に位置する、１０個以下の残基を含み、より好ましくは８個以下の残基を含み、より好ましくは６個以下の残基を含み、さらに好ましくは４個以下の残基を含み、最も好ましくは３個の残基を含む。
【００３９】
少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドは、同一のまたは異なる一次アミノ酸配列を有していてもよいことは、明白である。
【００４０】
第１ペプチドおよび第２ペプチドが、第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成され得ること、ならびに、各アミノ酸群は、同じであってもよく、また異なるものであってもよいことは、さらに明白である。
【００４１】
上記ペプチドは、好ましくは、当該技術分野において公知のコンビナトリアルな方法によって、上記アミノ酸群から作製される。
【００４２】
好ましい実施形態において、上記ペプチドは、例えば、上記ペプチドにおける各アミノ酸の最小レベルおよび最大レベルを定義し得る基準の群として作製される。または、組み込まれた疎水性アミノ酸の比率の最大レベルおよび最小レベルが提供され得る。
【００４３】
上記ペプチドは、固相上で合成されることが好ましく、第一の態様において、使用する前に上記固相から上記ペプチドが切り離されることがより好ましい。
【００４４】
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、当該技術分野において十分に確立されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（たとえば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。たとえば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
【００４５】
上記第１ペプチドおよび第２ペプチドはそれぞれ、少なくとも１つの反応基を有することが好ましい。好ましい実施形態において、ペプチドに存在する反応基は、多量体捕捉剤の形成の結果として作用する。
【００４６】
好ましい実施形態において、上記反応基は、ペプチド合成の間、保護されており、第１の態様における捕捉剤の生成に使用する前に保護がはずされる。このような技術は当業者において周知であり、たとえば、ＦＭＯＣに基づく標準的な固相ペプチドアセンブリを用いることができる。この技術によれば、側鎖が保護されておりアミノ末端がフリーである樹脂結合ペプチドを産出できる。Ｎ末端のアミノ基は、その後、標準ペプチド合成条件において、共役できるカルボン酸／反応基共役の任意のものと反応する。たとえば、トリチルまたはメトキシトリチルによって保護されたチオール基を保持するシステインを、組み込むことができる。トリフルオロ酢酸を用いた脱保護により、保護されていないペプチドが、溶液中に生じる。
【００４７】
ペプチド多量体を形成するために、任意の適した反応を用いることができることは理解され、たとえば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（たとえば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。
【００４８】
反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造における任意の適した場所に配置され得ることは理解され、例えば、ペプチドの実質的に非疎水性の面で、かつ機能性部分のＮ末端側にあるように、反応基を一次ペプチド配列中に配置することができる。
【００４９】
または、ペプチドの実質的に非疎水性の面に位置し、第１ペプチドにおいてはリガンド結合部位のＮ末端側に位置し、第２ペプチドにおいては機能性部分のＣ末端側に位置するように、反応基を、第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置することができる。
【００５０】
さらなる実施形態では、第１ペプチドにおいては、ペプチドの実質的に非疎水性である面であり、機能性部分のＮ末端側に位置するように、また第２ペプチドにおいては、機能性部分の反対側の（疎水性の）面であり、この部位のＣ末端側に位置するように、反応基を第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に配置することができる。
【００５１】
好ましい実施形態において、図２に示すように、第１ペプチドの反応基は、一次アミノ酸構造中において、実質的に非疎水性である面で、機能性部分のＮ末端側に位置しており、第２ペプチド中において、疎水性面で、機能性部分のＮ末端側に位置している。
【００５２】
上記反応基としては、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールから選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。反応基としては、チオール基がより好ましい。反応基がチオール基である場合には、少なくとも１つのチオール基が活性チオールであることが好ましい。好ましくは、チオール基は、ニトロチオピリジル基またはチオピリジル基のいずれかで活性化されている。
【００５３】
好ましくは、機能性部分は、固定されたペプチドにリガンドを結合させることを可能にする。
【００５４】
リガンドが公知の分子であってもよいこと、または機能性部分が未知の分子を結合するために機能し得ることは、明白である。
【００５５】
さらに、ペプチドに存在するアミノ酸残基に依存して、機能性部分が異なる特性を有することは明白である。例えば、アミノ酸側鎖は、リガンド結合に対して正電荷を提供し得る。好ましくは、リシル残基（ペプチド鎖と正電荷との間の４つのＣＨ２基）、オルニチル残基（ペプチド鎖と正電荷との間の３つのＣＨ２基）、またより好ましくは、ジアミノブチリル残基（ペプチド鎖と正電荷との間の２つのＣＨ２基）によって、正電荷が提供される。
【００５６】
アミノ酸側鎖は、また、水素結合のドナーおよび／またはリガンド結合のレセプターとして機能し得る水酸基を提供することができる。好ましくは、セリル残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間の１つのＣＨ２基）、またより好ましくは、ホモセリル残基（ペプチドとＯＨ基との間の２つのＣＨ２基）によって、水酸基が提供される。
【００５７】
アミノ酸側鎖は、リガンド結合のための疎水性部分を提供することができる。好ましくは、アラニル残基（ペプチド鎖とメチル基との間にＣＨ２基がない）、またより好ましくは、アミノブチリル残基（ペプチド鎖とメチル基との間の１つのＣＨ２基）が、疎水性部分を提供する。
【００５８】
また、アミノ酸側鎖は、リガンド結合のための負電荷を提供することができる。好ましくは、グルタミル残基（ペプチド鎖とカルボキシル基との間の２つのＣＨ２基）、またより好ましくは、アスパルチル残基（ペプチド鎖とカルボキシル基との間の１つのＣＨ２基）によって、負電荷が提供される。
【００５９】
さらに、機能性が付与された担体は、複数の固定化されたペプチドを含み得ることは明白であり、また、これらのペプチドは同一ペプチドの複数のコピーであり得ること、またはこれらのペプチドが複数の異なるペプチドを含み得ることは明白である。
【００６０】
分子（例えば、ペプチド）の担体への固定に関する場合、用語「固定された」および「付着した」は本明細書において交換可能に使用され、いずれの用語とも、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、疎水性相互作用を包含することを意図している。一般に、例えば、ペプチドリガンド結合を必要とする用途など、担体の使用を意図している条件下において、分子（例えば、ペプチド）が、担体に固定化されている状態または付着している状態に通常とどまりさえすればよい。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、“官能化された”不活性担体またはマトリクス（たとえばガラススライド、ポリマービーズなど）を含んで構成されている固体支持体を使用しており、官能化は、たとえば、ペプチドなどの生体分子への共有結合を可能とする反応基を含む介在物質の層またはコーティングを塗布することによってなされる。
【００６２】
担体が、例えば、疎水性有機チオール処理により加工されたガラスまたはプラスチックのような、任意の適した疎水性担体であり得ることは理解される。好ましくは、担体はプラスチックである。
【００６３】
好ましくは、固定されたペプチドは、表面上のアレイに配列される。アレイは、個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることが好ましい。好ましくは、アレイ上の各部位には、異なる固定されたペプチドが含まれており、より好ましくは、各部位には、ペプチドの多数のコピーが含まれている。
【００６４】
マルチペプチドアレイにおいては、アレイ上の個別の領域に複数のペプチド分子が含んでいる。好ましくは、アレイ上の各部位に単一のペプチドを多コピー含んでいる。
【００６５】
固定されたペプチド分子のマルチペプチドアレイは、当業者において一般的に知られている技術を用いて作製できる。
【００６６】
固定されたペプチドに対するリガンドの結合に関する場合、用語「結合」は、本明細書において、明白にまたは前後関係から他の内容が示されていない限り、直接的または間接的な、共有結合または非共有結合を包含することを意図している。本発明の特定の実施形態において、共有結合が好ましい。しかしながら、たとえばリガンドレセプター相互作用を必要とする用途など、担体の使用を意図している条件下において、分子（たとえばペプチド）が、固定されたペプチドにリガンドが結合している状態に通常とどまりさえすればよい。
【００６７】
本発明の第２の実施形態によれば、リガンドに結合する捕捉剤を提供する。当該捕捉剤は少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドを含んでおり、第１ペプチドは少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つのリガンド結合部位を含んでおり、第１ペプチドが疎水性表面および実質的に非疎水性のリガンド結合表面を含を含むように、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つのリガンド結合部位は、ペプチド一次構造内に位置する。
【００６８】
好ましくは、第１ペプチドおよび第２ペプチドは、捕捉剤を形成するために共有結合している。  
【００６９】
好ましくは、第１ペプチドは、疎水性アミノ酸を複数含んでいる。
【００７０】
第２ペプチドは、好ましくは４〜４０個の疎水性アミノ酸残基を含み、より好ましくは６〜２５個、最も好ましくは６〜１２個の疎水性アミノ酸残基を含む。
【００７１】
リガンド結合部位は、当該分野において公知の合成方法を用いてペプチドに組み込まれることが可能な、任意の適した部位を含む。このような部位は、例えば、水酸基、チオール基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、グアニジニウム基、イミダゾール基、芳香族基、発色団、蛍光団、同位体標識、キレート基、ハプテン、および他の多数の部位から選択することができる。
【００７２】
好ましくは、リガンド結合部位は、少なくとも１つのアミノ酸を含む。より好ましくは、リガンド結合部位は、アミノ酸を複数含む。
【００７３】
各アミノ酸モノマーが、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、アミノ酸模倣物、スペーサーアミノ酸、ベータアミノ酸、または任意の他のキラルアミノ酸モノマーであり得ることは理解される。好ましくは、アミノ酸はＬ型アミノ酸および／またはＤ型アミノ酸である。
【００７４】
好ましくは、各アミノ酸モノマーは、実質的に鏡像異性的に単一である。
【００７５】
リガンド結合面上に位置するアミノ酸は、例えば、アミノ酪酸残基のような疎水性残基もまた含み得ることは理解される。
【００７６】
好ましくは、図１に示すように、第１ペプチドは、疎水性アミノ酸残基と非疎水性アミノ酸残基とを交互に含む一次構造を含む。
【００７７】
疎水性面および実質的な非疎水性面となるような側鎖の配置となる他のペプチド配列を容易に設計できることは、当業者によって理解される。たとえば、疎水性残基の間にある３つの非疎水性アミノ酸残基、または奇数個のアミノ酸の任意の組み合わせが挙げられる。または、ペプチドは、疎水性面および実質的な非疎水性面となるように、たとえば、Ｌ型、Ｄ型およびベータアミノ酸の組み合わせを含んでいてもよい。
【００７８】
好ましくは、その側鎖がリガンド結合面に位置するように配置された各アミノ酸は、実質的に２０アミノ酸より少ないアミノ酸からなる群から選択される。より好ましくは、１２アミノ酸より少ない、さらにより好ましくは６アミノ酸より少ない、最も好ましくは４アミノ酸からなる群から選択される。
【００７９】
好ましくは、第１ペプチドは、疎水性アミノ酸残基を１０％〜９０％含み、より好ましくは、疎水性アミノ酸残基を２０％〜８０％含み、さらにより好ましくは、疎水性アミノ酸残基を３０％〜７０％含み、最も好ましくは、疎水性アミノ酸残基を４０％〜６０％含む。
【００８０】
特に好ましい実施形態において、第１ペプチドは、疎水性アミノ酸残基を５０％含む。
【００８１】
好ましくは、疎水性面を形成する疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、チロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される。より好ましくは、疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンである。
【００８２】
好ましい実施形態において、実質的に非疎水性のリガンド結合面がリガンドに結合しやすいように、捕捉剤は疎水性担体上に位置している。
【００８３】
好ましくは、捕捉剤は、担体と第１ペプチドの疎水性面との間の疎水性相互作用によって、疎水性担体に結合している。
【００８４】
担体としては、任意の適した疎水性担体、例えば、疎水性有機チオール処理によって加工された金、表面処理によって加工されたガラス、またはプラスチックが使用可能であることが理解される。好ましくは、担体はプラスチックである。
【００８５】
または、実質的に水性である溶媒の存在下において、捕捉剤を自身に固定化できる疎水性化合物によって、担体をコートしてもよい。
【００８６】
好ましくは、捕捉剤は、第１ペプチドおよび第２ペプチドを含むペプチド二量体を含む。
【００８７】
より好ましくは、ペプチド二量体は、第１ペプチドと第２ペプチドとの間の共有結合を介して形成される。
【００８８】
好ましくは、上記ペプチド二量体は、疎水性担体に結合される。第１ペプチドを疎水性担体に接触させる前に、または接触と同時に、または接触させた後に、ペプチド二量体を第１ペプチドおよび第２ペプチドからアセンブルできることは明白である。特に好ましい実施形態において、ペプチド二量体は疎水性担体上にてアセンブルされる。
【００８９】
好ましくは、第２ペプチドはまた、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基および少なくとも１つの非疎水性アミノ酸残基を含み、アミノ酸側鎖が、疎水性表面および実質的に非疎水性のリガンド結合面を形成するための空間に位置するように、上記アミノ酸がペプチド一次構造中に位置する。
【００９０】
好ましくは、第２ペプチドは、非疎水性アミノ酸残基を複数含んでいる。
【００９１】
好ましい実施形態において、第２ペプチドは、第１ペプチドよりもアミノ酸の数が少なく、また、ペプチドと疎水性面との間の相互作用が相対的に弱くなるように、疎水性残基の数がより少なくなっている。この実施形態において、第２ペプチドは、第１ペプチドと二量体化したときにのみ、疎水性担体に保持される。
【００９２】
第１ペプチドおよび第２ペプチドの長さならびに担体上に保持されるのに必要な疎水性アミノ酸残基の数は、表面の疎水性ならびに第１ペプチドおよび第２ペプチド内の疎水性アミノ酸次第であり、また結合されるリガンドの性質にもよることは、当業者にとって明白である。
【００９３】
担体に保持されるペプチドの量は、担体が供される洗浄のストリンジェンシー次第であることは、当業者にとって、一見して明白である。ペプチドの固定化の後、担体をたとえば１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により洗浄することが好ましい。
【００９４】
第２ペプチドは、疎水性面に、好ましくは、１〜６個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、２〜５個の疎水性アミノ酸残基を含んでおり、最も好ましくは、２〜４個の疎水性アミノ酸残基を含んでいる。
【００９５】
好ましくは、第１ペプチドおよび第２ペプチドのそれぞれは、その側鎖が実質的に非疎水性であるリガンド結合面に位置する、１０またはより少ないリガンド結合残基を含み、より好ましくは、８またはより少ないリガンド結合残基を含み、より好ましくは６またはより少ないリガンド結合残基を含み、さらに好ましくは４またはより少ないリガンド結合残基を含み、最も好ましくは３またはより少ないリガンド結合残基を含む。
【００９６】
好ましくは、ペプチドは、当該技術分野において周知のコンビナトリアル手法によって、アミノ酸の群から生成される。
【００９７】
好ましい実施形態において、ペプチドは、例えばペプチド中の各アミノ酸の最小および最大レベル、または組み込まれる疎水性アミノ酸の比率を定義し得る基準の群として生成される。
【００９８】
第１ペプチドおよび第２ペプチドは固相上に合成されることが好ましく、第２の態様の方法において使用する前に、ペプチドは固相から切り離されることがより好ましい。
【００９９】
固相ペプチド合成および液相ペプチド合成などの、ペプチドおよびそれらの塩ならびにそれらの誘導体の合成は、当該技術分野において十分に確立されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄ．）；および、Ｃｈａｎ（２０００）“ＦＭＯＣ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照。ペプチドは、自動ペプチド合成装置（たとえば、Ｐｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ペプチド合成機、アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア）を用いて合成できる。たとえば、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成によりペプチドをリンクアミド樹脂上に調製した後に、トリフルオロ酢酸（９５％）により保護をはずし、樹脂から切り離す。
【０１００】
少なくとも第１ペプチドおよび第２ペプチドが、互いに同じ一次アミノ酸配列または異なる一次アミノ酸配列であり得ることは、一見して明白である。
【０１０１】
第１ペプチドおよび第２ペプチドは第１アミノ酸群および第２アミノ酸群から合成でき、また、各アミノ酸群は互いに同じでも異なるものでもよいことはさらに明白である。
【０１０２】
好ましくは、上記第１ペプチドおよび第２ペプチドはそれぞれ、少なくとも１つの反応基を含む。好ましい実施形態において、ペプチド上にある反応基は、多量体捕捉剤を形成するように反応する。
【０１０３】
好ましい実施形態において、上記反応基は、ペプチド合成の間、保護されており、第２の態様における捕捉剤の生成に使用する前に保護がはずされる。このような技術は当業者において周知であり、たとえば、ＦＭＯＣに基づく標準的な固相ペプチドアセンブリがある。この技術によれば、側鎖が保護されておりアミノ末端がフリーである樹脂結合ペプチドを産出できる。Ｎ末端のアミノ基は、その後、標準ペプチド合成条件において、共役できるカルボン酸反応基共役の任意のものと反応する。たとえば、トリチルまたはメトキシトリチルによって保護されたチオール基を保持するシステインを、組み込むことができる。トリフルオロ酢酸を用いた脱保護により、保護されていないペプチドが、溶液中に生じる。
【０１０４】
ペプチド多量体を形成するために、任意の適した反応を用いることができることは理解され、たとえば、シクロペンタジエニル官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のディールス−アルダー反応、チオール官能化ペプチドとマレイミド官能化ペプチドとの間のマイケル反応、チオール官能化ペプチドと活性化チオール基（たとえば、（ニトロ）チオピリジン部分によって活性化）含有ペプチドとの間でジスルフィドを形成する反応、アジド官能化ペプチドとホスフィン酸チオエステル官能化ペプチドとの間のシュタウディンガーライゲーション、およびチオエステルとＮ末端システインとの間のネイティブケミカルライゲーションが、挙げられる。好ましい実施形態においては、ペプチド多量体は、ジスルフィド結合形成によって形成される。
【０１０５】
反応基は、第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中の任意の位置に位置し得ることは、理解される。例えば、反応基は、ペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面上であり、かつリガンド結合部位のＮ末端部位に位置し得るように、一次ペプチド配列中に位置することができる。
【０１０６】
または、ペプチドの実質的に非疎水性であるリガンド結合面上であって、かつ第１ペプチドにおいては、リガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、第２ペプチドにおいては、リガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に位置することができる。
【０１０７】
さらなる実施形態において、第１ペプチドにおいては、ペプチドの実質的に非疎水性のリガンド結合面上であり、かつリガンド結合部位のＮ末端側に位置するように、第２ペプチドにおいては、リガンド結合部位に対して反対側の（疎水性の）面上であ、かつリガンド結合部位のＣ末端側に位置するように、反応基が第１ペプチドおよび第２ペプチドの一次ペプチド構造中に位置することができる。
【０１０８】
好ましい実施形態において、図２に示すように、第１ペプチドの反応基は、一次アミノ酸構造において、実質的に非疎水性であるリガンド結合面で、リガンド結合部位のＮ末端側に位置しており、第２ペプチド中において、疎水性面で、リガンド結合部位のＮ末端側に位置している。
【０１０９】
上記反応基としては、チオール基、マレイミド、シクロペンタジエン、アジド、ホスフィン酸チオエステル、チオエステル、および（ニトロ）チオピリジル活性化チオールから選択されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、反応基がチオール基である場合、少なくとも１つのチオール基は活性化チオールである。好ましくは、チオール基は、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基のいずれかで活性化されている。
【０１１０】
ペプチド内に存在するアミノ酸残基によって、捕捉剤が異なる特性を有することになることは明白である。例えば、アミノ酸側鎖は、リガンド結合のための正電荷を提供することができる。好ましくは、正電荷は、リシル残基（ペプチド鎖と正電荷との間の４つのＣＨ２基）、オルニチル残基（ペプチド鎖と正電荷との間の３つのＣＨ２基）、またより好ましくは、ジアミノブチリル残基（ペプチド鎖と正電荷との間の２つのＣＨ２基）によって、正電荷が提供される。
【０１１１】
アミノ酸側鎖は、また、水素結合のドナーおよび／またはリガンド結合の受容体として機能し得る水酸基を提供することができる。好ましくは、セリル残基（ペプチド鎖とＯＨ基との間の１つのＣＨ２基）、またより好ましくは、ホモセリル残基（ペプチドとＯＨ基との間の２つのＣＨ２基）によって、水酸基が提供される。
【０１１２】
アミノ酸側鎖は、リガンド結合のための疎水性部分を提供することができる。好ましくは、アラニル残基（ペプチド鎖とメチル基との間にＣＨ２基がない）、またより好ましくは、アミノブチリル残基（ペプチド鎖とメチル基との間の１つのＣＨ２基）が、疎水性部分を提供する。
【０１１３】
また、アミノ酸側鎖は、リガンド結合のための負電荷を提供することができる。好ましくは、グルタミル残基（ペプチド鎖とカルボキシル基との間の２つのＣＨ２基）、またより好ましくは、アスパルチル残基（ペプチド鎖とカルボキシル基との間の１つのＣＨ２基）によって、負電荷が提供される。
【０１１４】
好ましくは、第２実施形態の捕捉剤は、アレイを形成するように担体に結合している。アレイが任意の使いやすい形態をとることができることは理解される。したがって、本発明の方法は、一分子アレイを含め、“高密度”アレイの全てのタイプに適用できる。
【０１１５】
アレイは、個別のアドレス可能な空間符号化部位を複数含んでいることが好ましい。好ましくは、アレイ上の各部位には、異なる捕捉剤が含まれており、より好ましくは、各部位には、捕捉剤の多数のコピーが含まれている。
【０１１６】
特に好ましい実施形態において、第１ペプチドは、配列番号１に示される構造を有している；
（Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）ｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｐｈｅ−Ｚ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
ここでＸ、ＹおよびＺはリガンド結合残基であり、Ｃｙｓは二量体形成に用いられる求核チオールを提供する。
【０１１７】
第２ペプチドは、配列番号２に示される好ましい構造を有している；
ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐ−Ｘ’−Ｐｈｅ−Ｙ’−Ｐｈｅ−Ｚ’−Ｐｈｅ
ここで、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はリガンド結合残基であり、ＣｙｓＳ（Ｎ）Ｐは二量体形成に用いられる活性化チオール（最も好ましくは、チオニトロピリジル基またはチオピリジル基のいずれかで活性化されているチオール）である。
【０１１８】
上記の好ましい実施形態は、例示のみを目的としており、限定して解釈すべきではないことは理解すべきである。多くの他の反応基および活性化基を本発明に採用できることは、当業者にとって明白である。
【０１１９】
最も好ましい実施形態において、本発明のいずれの態様における捕捉剤も、組み合わせが多様な二量体の、アドレス可能な空間符号化アレイを形成するために、適した担体上に分注される。好ましくは、ペプチドは、非接触型ディスペンサー（たとえばＰｉｅｚｏｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、パーキンエルマーＬＡＳ）を用いて個々に担体上に分注され、ｉｎ  ｓｉｔｕでアセンブルされる。
【０１２０】
本発明の第３の態様によれば、本発明の第２の態様における少なくとも１つの捕捉剤が固定化されている担体を提供する。
【０１２１】
本発明の第４の態様によれば、本発明の第１の態様における方法によって誘導した担体もまた提供する。
【０１２２】
本発明によれば、目的とするリガンドに結合している多量体型捕捉剤の同定方法であって、第２の態様によるコンビナトリアル捕捉剤のアレイを作製する工程と、目的とするリガンドをアレイに接触させる工程と、リガンドに結合している捕捉剤を同定する工程とを含むことを特徴とする同定方法もまた提供される。
【０１２３】
捕捉剤へのリガンドの結合を当該技術分野において周知であるさまざまな方法によって同定できることは、当業者にとって明白であり、たとえば、リガンドが結合しているアレイ上の位置を同定できるように、リガンドまたは捕捉剤を標識化してもよい。この標識は、たとえば、放射性標識、または、たとえば蛍光プローブを用いた蛍光標識が可能である。または、関心のあるリガンドの捕捉剤への結合を、当該技術分野において周知の他のさまざまな技術を用いて検出してもよく、たとえば、熱量測定、吸光光度法、ＮＭＲ法、原子間力顕微鏡および走査型トンネル顕微鏡を用いた方法、電気泳動またはクロマトグラフィー、質量分析、キャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴検出、弾性表面波検出ならびにマイクロカンチレバーに基づく多くのアプローチがある。
【０１２４】
捕捉剤が結合する特定のリガンドは、捕捉剤を形成しているペプチドの長さおよび配列によって決まるので、本発明に係る多量体型捕捉剤および多量体型捕捉剤のアレイは、選択した任意の検出物質（ａｎａｌｙｔｅ  ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ）の同定に使用できる。好ましい実施形態において、リガンドとしては、真核細胞、原核細胞、ウイルス、バクテリオファージ、プリオン、胞子、花粉粒、アレルゲン、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、有機化合物または無機化合物が含まれる。リガンドは、好ましくは、生理代謝産物または薬理代謝産物であり、最も好ましくは、診断または予後医療マーカーとして用いることができ、人もしくは動物の体液中にある生理代謝産物または薬理代謝産物である。
【０１２５】
本発明のさらなる目的、特徴および長所は、以下の記述で明らかになる。さらに、本発明の利点は、図面を参照する以下の説明によってはっきりとする。
【０１２６】
本発明は以下の実施例および添付の図面を参照することにより、さらに理解される。
【０１２７】
〔発明を実施するための最良の形態〕
ここで使用される用語「スペーサーアミノ酸」は、側鎖がリガンド結合に関与しないアミノ酸であって、アミノ酸、合成アミノ酸、アミノ酸類似物又はアミノ酸模倣物を称する。
【０１２８】
ここで使用される用語「捕捉剤」は、リガンドが当該捕捉剤に接触したとき、リガンドに結合するような構造をペプチド分子を称する。
【０１２９】
ここで使用される用語「多量体型捕捉剤」は、少なくとも２つの連結サブユニットを含む捕捉剤を称する。
【０１３０】
ここで使用される用語「ペプチド」は、２つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含む鎖を称し、合成アミノ酸、アミノ酸類似物、アミノ酸模倣物又はこれらのいずれかの組合せを称する。用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書中において、交換可能に使用される。
【０１３１】
ここで使用される用語「実質的に鏡像異性的に単一」は、残基が実質的に１種類の鏡像異性体を含み、他の種類の鏡像異性体は不純物としてのみ含むことを意図している。
【０１３２】
ここで使用される用語「リガンド結合に好ましいように配置する」は、多量体捕捉剤を形成するペプチドの側鎖が、リガンドに接触し相互作用し得るように配置することを意図している。
【０１３３】
ここで使用される用語「実質的に非疎水性」は、疎水性残基よりも親水性残基を実質的に含むことを意味している。
【０１３４】
〔実施例１〕
有機溶媒層中又は疎水性表面上におけるペプチドのセルフアセンブリを実証するために、以下の一連のペプチドを合成した。ペプチドのセルフアセンブリは、上記有機溶媒層又は疎水性表面に接触する水性溶媒中において、エントロピー効果により引き起こされる。
【０１３５】
全てのペプチドのＮ末端を、ローダミン色素ＴＡＭＲＡで標識した。５−ＴＡＭＲＡ及び６−ＴＡＭＲＡの混合物を標識に用いた。
【０１３６】
【表１】
2009518621.tif 000003
【０１３７】
以下では、紙面の前に突き出す残基の側鎖は、組合せ多様な「リガンド結合面」に相当する。紙面の後ろから突き出す残基の側鎖は、「疎水性面（あるいはネガティブコントロール残基）」に相当する。
【０１３８】
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−８のペプチド群において、４つの側鎖（アスパルチル、アラニル、セリル、及びリシル）の混合物を用いた。２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１６のペプチド群において、４つの親水性（アスパルチル）の鎖を用いた。
【０１３９】
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−４のペプチド群、及び２ＤＯＳ−９〜２ＤＯＳ−１２のペプチド群において、５残基の側鎖を「疎水性面（又はネガティブコントロール残基）」に用いた。２ＤＯＳ−５〜２ＤＯＳ−８のペプチド群、及び２ＤＯＳ−１３〜２ＤＯＳ−１６のペプチド群において、３残基の側鎖を「疎水性面（又はネガティブコントロール残基）」に用いた。
【０１４０】
２ＤＯＳ−１，  ２ＤＯＳ−５，  ２ＤＯＳ−９，  及び  ２ＤＯＳ−１３のペプチドにおいて、ノルロイシル残基を「疎水性面」に用いた。２ＤＯＳ−２，  ２ＤＯＳ−６，  ２ＤＯＳ−１０，  及び２ＤＯＳ−１４のペプチドにおいて、フェニルアラニル残基を「疎水性面」に用いた。２ＤＯＳ−３，  ２ＤＯＳ−７，  ２ＤＯＳ−１１，  及び２ＤＯＳ−１５のペプチドにおいて、セリル残基を、「疎水性面」に対する弱いネガティブコントロールとして用いた。２ＤＯＳ−４，  ２ＤＯＳ−８，  ２ＤＯＳ−１２，  及び２ＤＯＳ−１６のペプチドにおいて、アスパルチル残基を、「疎水性面」に対する強いネガティブコントロールとして用いた。
【０１４１】
【表２】
2009518621.tif 000004
【０１４２】
【表３】
2009518621.tif 000005
【０１４３】
【表４】
2009518621.tif 000006
【０１４４】
標準ＦＭＯＣ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ａｌｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ペプチドを２μｍｏｌ単位で合成し、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリル中に１０μＭ溶解させた。
【０１４５】
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチドを疎水性面（ポリプロピレンマイクロタイタープレートのウエル）上の保持を調べた。
【０１４６】
５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリル中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、ペプチド及びＴＡＭＲＡの溶媒として用いた。
【０１４７】
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド  １０μＭ及びＴＡＭＲＡ  １０μＭを、１００μｌずつ等分し、図３に示すように、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウエルに入れた。
【０１４８】
このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。
【０１４９】
ペプチドが乾燥するように、一晩中暗所で乾燥させ、マイクロタイタープレートを再び上述したようにスキャニングした。
【０１５０】
ついで、２５０μＬの水でウエルを１０回洗浄した。
【０１５１】
残りの表面結合ペプチドを、最後に、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  １００μｌに再懸濁した。
【０１５２】
３回の実験で得られた、６００Ｖ、５００Ｖ、４００Ｖ及び３００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図４に示す。
【０１５３】
定量化データ（４００Ｖでスキャンしたときのデータを用いた）を表２に示し、グラフを図５に示した。
【０１５４】
【表５】
2009518621.tif 000007
【０１５５】
この結果から、フェニルアラニル残基は、ノルロイシル残基よりも強い保持を引き起こすことが示された。この結果から、さらに、５つの疎水性「アンカー残基」を有するペプチドが、３つの疎水性「アンカー残基」を有する同等ペプチドよりもよく保持されることが示された。リガンド結合残基を、アスパルチル、アラニル、セリル及びリシルから、４つのアスパルチル残基の一連に変更すると、ポリプロピレン表面における保持の低下が引き起こされる。
【０１５６】
さらなる実験を、表３に示すＰ１−１〜Ｐ１−５のペプチド、及びＰ２−１〜Ｐ２−２までのペプチドの、ポリプロピレン表面における保持を調べるために行った。
【０１５７】
【表６】
2009518621.tif 000008
【０１５８】
ポリプロピレンシートを、使用前に５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液を用いて拭いた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＰ１−１〜Ｐ１−５のペプチド  １μＭ、及びＰ２−１〜Ｐ２−２のペプチド  １μＭ、並びにＴＡＭＲＡ  １μＭの、８×複製２０ｎｌ量を、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を用いて、１ｍｍ間隔で、３”ｘ１”ｘ１  ｍｍポリプロピレンシートに分注した。「サイドシュート」オプションを用いて、前もって５００滴分注した。チューニングを３０μｓ、７２Ｖに群した。このスライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。蛍光画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１５９】
スライドの下の方の半分（テストアレイを含む）を１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）を含む１  Ｍ  ＮａＣｌ  １００ｍｌ中で１分間洗浄し、上述したように再スキャニングした。
【０１６０】
同じスライドの半分を、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）を含む１  Ｍ  ＮａＣｌ  １００ｍｌ中で３０分間、２回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
【０１６１】
同じスライドの半分を、１００ｍｌの水で３０分間、３回目の洗浄を行い、上述したように再スキャニングした。
【０１６２】
様々なアレイの蛍光画像を図６Ａ及び図６Ｂに示す。
【０１６３】
図６Ａ及び６Ｂに示した、配列した様々なペプチドからの蛍光値を、以下の表４〜６に示す。
【０１６４】
一回目の洗浄後のデータを表４ａ及び表４ｂに示す。
【０１６５】
【表７】
2009518621.tif 000009
【０１６６】
【表８】
2009518621.tif 000010
【０１６７】
二回目の洗浄後のデータを表５ａおよび表５ｂに示す。
【０１６８】
【表９】
2009518621.tif 000011
【０１６９】
【表１０】
2009518621.tif 000012
【０１７０】
三回目の洗浄後のデータを表６ａおよび表６ｂに示す
【０１７１】
【表１１】
2009518621.tif 000013
【０１７２】
【表１２】
2009518621.tif 000014
【０１７３】
これらの結果をグラフ化し、図７に示す。
【０１７４】
この図は、ペプチド鎖長の増加に伴ってペプチドの保持が増加するような勾配があることを明確に示す。明確に理解されるように、１９アミノ酸の鎖長を有するペプチドＰ１−５が、最も高い保持を有する。
【０１７５】
〔実施例２〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着させたペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）のｐＨ耐性を調べた。
【０１７６】
５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の、ペプチド２ＤＯＳ−２を、５０μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートのウエル中で乾燥させた。
【０１７７】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥させた。
【０１７８】
乾燥したペプチドサンプルの最初の１１ウエルを、表７に示すスキームによって、１００ｍＭ  リン酸緩衝液  ２００μｌ中で、室温で３０分間インキュベートした。
【０１７９】
【表１３】
2009518621.tif 000015
【０１８０】
上清を全てピペットで吸い取り、１２ウエルの全てにおいて残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％  （ｖ／ｖ）  アセトニトリル水溶液中の１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  ５０μｌに再懸濁した。そして、このマイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。
【０１８１】
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１８２】
ポリプロピレン上に付着した２ＤＯＳ−２のｐＨ耐性を示す蛍光画像を図８に示す。
【０１８３】
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に対する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表８に示し、グラフ化したものを図９に示す。
【０１８４】
【表１４】
2009518621.tif 000016
【０１８５】
この結果は、ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、幅広いｐＨ範囲において安定しており、低ｐＨおよび高ｐＨにおいて最大の保持を示し、おおよそｐＨ６．５で最小の保持を示した。
【０１８６】
〔実施例３〕
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２（上記参照）の時間依存持続性を、水性バッファの存在下で、以下に示すように調べた。
【０１８７】
７５％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の、５μＭ  ペプチド２ＤＯＳ−２を、１００μｌずつ１２等分し、Ｃｏｓｔａｒマイクロタイタープレートの上部列のウエルに分注した。
【０１８８】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥させた。
【０１８９】
ウエル１〜１０において乾燥したペプチドサンプルを、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中で、１Ｍ  ＮａＣｌ  ２５０μｌと共に、以下に示す時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、全ての上清を、ピペットにより８回出し入れし、その後取り出して、マイクロタイターの下列のウエルに入れた。
【０１９０】
１２ウエル全てに残留する表面結合ペプチドを、最後に、５０％  （ｖ／ｖ）  アセトニトリル水溶液中の１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  ５０μｌ中に再懸濁し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０  フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中サンプルを圧縮した。
【０１９１】
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１９２】
ポリプロピレン疎水性表面上に付着したペプチド２ＤＯＳ−２の、水性バッファ存在下における時間依存持続性に対する蛍光データを、図１０に示す。
【０１９３】
ペプチド２ＤＯＳ−２の保持に関する定量化データ（３００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表９及び図１１に示す。
【０１９４】
【表１５】
2009518621.tif 000017
【０１９５】
この結果は、疎水性ポリプロピレン表面上におけるペプチド２ＤＯＳ−２の保持は、１  Ｍ  ＮａＣｌ  ／  １０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中への懸濁時間を増加させても、安定であったことを示す。
【０１９６】
〔実施例４〕
異なる形状のポリプロピレンウエル上における、２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド（上記参照）の保持を調べた。
【０１９７】
５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）を、ペプチド及びＴＡＭＲＡの溶媒として用いた。
【０１９８】
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド  １０μＭ、及びＴＡＭＲＡ  １０μＭを、１μｌずつ等分し、図１２に示すスキームに従って、ＣｏｓｔａｒＶ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、及びＧｒｅｉｎｅｒ平底ポリプロピレンマイクロタイタープレートにピペットで入れた。
【０１９９】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥した。
【０２００】
マイクロタイタープレートの上部２列のペプチドサンプルを、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の１Ｍ  ＮａＣｌ  ２５０μｌ中で、室温で１５分間インキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウエル中に、洗浄バッファをピペットで８回出し入れした。
【０２０１】
洗浄及び非処理のペプチドサンプルを、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  ５０μｌ中に再懸濁した。
【０２０２】
マイクロタイタープレートを、ａ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、以下に示すＰＭＴ電圧、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定し、スキャニング中サンプルを圧縮した。
【０２０３】
蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２０４】
ＰＭＴ電圧６００Ｖ及び５００Ｖにおいてスキャニングしたプレートの蛍光画像を、図１３に示す。
【０２０５】
Ｖ底ウエルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１０及び図１４に示す。
【０２０６】
【表１６】
2009518621.tif 000018
【０２０７】
平底ウエルにおける定量化データ（５００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１１及び図１５に示す。
【０２０８】
【表１７】
2009518621.tif 000019
【０２０９】
この結果は、異なる形状のポリプロピレンウエル上における、２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチドの保持は同等であり、ペプチドの保持は、Ｖ底形状のウエルでの乾燥に依存しないことが示す。
【０２１０】
〔実施例５〕
ポリプロピレン及びポリスチレン表面における２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド（上記参照）の保持を比較した。
【０２１１】
７５％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の５  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）を、ペプチド及びＴＡＭＲＡの溶媒として用いた。
【０２１２】
２ＤＯＳ−１〜２ＤＯＳ−１６のペプチド  ５μＭ、及びＴＡＭＲＡ  ５μＭを、２０μｌずつ等分し、ＣｏｓｔａｒＶ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、ＧｒｅｉｎｅｒＶ底ポリプロピレンマイクロタイタープレート、及びＧｒｅｉｎｅｒＶ底ポリスチレンマイクロタイタープレートに、図１６に示すスキームに従って、ピペットで入れた。
【０２１３】
ペプチドサンプルが乾燥するように、暗所で乾燥した。
【０２１４】
マイクロタイタープレートの上部２列におけるペプチドサンプルを、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の１  Ｍ  ＮａＣｌ  ２５０μｌ中において、１５分間、室温でインキュベートした。インキュベート後、上清を除去する前のウエルに、ピペットで８回洗浄バッファを出し入れした。
【０２１５】
洗浄及び非処理のペプチドサンプルを、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  ５０μｌ中に再懸濁した。
【０２１６】
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。このとき、以下に示すＰＭＴ電圧、標準解像度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、サンプルをスキャニング中圧縮した。
【０２１７】
６００Ｖ、５００Ｖ及び４００ＶのＰＭＴ電圧でスキャニングしたスライドの蛍光画像を図１７に示す。
【０２１８】
プレートの上側半分のペプチドサンプルを洗浄し、プレートの下側半分のペプチドサンプルを非処理とした。
【０２１９】
ＣｏｓｔａｒポリプロピレンＶ底ウエルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を、表１２に示す。
【０２２０】
【表１８】
2009518621.tif 000020
【０２２１】
ＧｒｅｉｎｅｒポリプロピレンＶ底ウエルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１３に示す。
【０２２２】
【表１９】
2009518621.tif 000021
【０２２３】
ＧｒｅｉｎｅｒポリスチレンＶ底ウエルにおける定量化データ（４００Ｖでスキャニングしたデータを使用）を表１４に示す。
【０２２４】
【表２０】
2009518621.tif 000022
【０２２５】
これらのグラフを図１８に示す。
【０２２６】
この結果は、３つの全ての表面において、同様のペプチドの挙動が見られることを示し、さらに、保持は、ある特定のプラスチック表面に特有の性質というよりもむしろ、ペプチドの配列特異的な性質であることが実施された。
【０２２７】
〔実施例６〕
７つのフェニルアラニル基からなる「表面結合面」を有する４つのペプチドを合成した。これらのペプチドはまた、帯電残基及び非帯電残基からなる中央領域と、末端から２番目の可変残基とを有している。末端から２番目の可変残基は、アラニル、セリル、システイル又はニトロピリジルチオ活性化システイル基である。
【０２２８】
さらに、ＴＡＭＲＡ標識した４つの蛍光ペプチドもまた合成した。これらの蛍光ペプチドは、可変のＣ末端基が取り付けられたグリシル残基に取り付けられたＮ末端ＴＡＭＲＡ蛍光団を含む。
【０２２９】
実施例１に示した５−ＴＡＭＲＡ異性体及び６−ＴＡＭＲＡ異性体の混合物を標識として用いた。
【０２３０】
８つのペプチドの全ての群を表１５及び表１６に示した。
【０２３１】
【表２１】
2009518621.tif 000023
【０２３２】
【表２２】
2009518621.tif 000024
【０２３３】
ＳＢ−１〜ＳＢ−４のペプチド、及びＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４のペプチドを二量体形成の調査に用いた。
【０２３４】
２つの異なるプロトコルを使用した。「液相」プロトコルにおいて、ＳＢペプチドをポリプロピレン表面において乾燥した。ＴＬＳＰペプチドを水溶液に添加し、ウエルを洗浄して、保持された蛍光材料を分析した。
【０２３５】
「共乾燥」プロトコルにおいて、ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを混合し、これらの両方をポリプロピレン表面において共に乾燥した後、ウエルを洗浄し、保持された蛍光材料を分析した。
【０２３６】
ＳＢペプチドとＴＬＳＰペプチドとを、水溶液中で混合し、ペプチド二量体を生成させるために反応させ、ポリプロピレン表面上で乾燥させる、さらに他のプロトコルは、従来公知の方法により容易に行い得る。
【０２３７】
「液相」プロトコルにおいて、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０  μＭのＳＢ−１ペプチド〜ＳＢ−４までのペプチド  ５０μｌを、表１７に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ  Ｖ底マイクロタイタープレートのウエルに添加した。
【０２３８】
【表２３】
2009518621.tif 000025
【０２３９】
サンプルを一晩、暗所にて乾燥した。１０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の１００μＭのＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４のペプチド  ５０μｌを、表１８に示すスキームに従って、ウエルに添加した。
【０２４０】
【表２４】
2009518621.tif 000026
【０２４１】
サンプルを室温で１時間、暗所にてインキュベートした。上清を除去し、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の１  Ｍ  ＮａＣｌ  ２００μｌを用いて２回洗浄した。５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  ５０μｌを、最後にウエルに添加した。
【０２４２】
マイクロタイタープレートをＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中サンプルを圧縮した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２４３】
「共乾燥」プロトコルにおいて、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１０μＭのＳＢ−１〜ＳＢ−４のペプチド  ５０μｌを、表１９に示すスキームに従って、Ｃｏｓｔａｒ  Ｖ底マイクロタイタープレートのウエルに添加した。
【０２４４】
【表２５】
2009518621.tif 000027
【０２４５】
５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのＴＬＳＰ−１〜ＴＬＳＰ−４のペプチド  ５０μｌを、表２０に示すスキームに従って、ウエルに添加した。
【０２４６】
【表２６】
2009518621.tif 000028
【０２４７】
サンプルを一晩、暗所で乾燥した。
【０２４８】
ウエルを、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の１  Ｍ  ＮａＣｌ  ２００μｌで２回洗浄した。５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  ５０μｌを、最後にウエルに添加した。
【０２４９】
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度２００μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧  ５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さを＋３ｍｍに設定し、スキャニング中、サンプルを圧縮した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２５０】
「液相」プロトコルを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図１９Ａに示す。
【０２５１】
「液相」プロトコルにより得られた蛍光データを表２１に示した。
【０２５２】
【表２７】
2009518621.tif 000029
【０２５３】
結果をグラフ化し、図１９Ｂに示す。
【０２５４】
「共乾燥」プロトコルを用いた実験から得られたマイクロタイタープレートの蛍光画像を図２０Ａに示す。
【０２５５】
「共乾燥」プロトコルにより得られた蛍光データを表２２に示す。
【０２５６】
【表２８】
2009518621.tif 000030
【０２５７】
結果をグラフ化し、図２０Ｂに示す。
【０２５８】
ポリプロピレン表面と蛍光標識したペプチドとの両方に結合可能な、非標識ペプチドの存在を条件として、蛍光標識されたペプチドの保持によって、二量体の収率を分析した。
【０２５９】
「液相」プロトコルにおける二量体の収率は、「共乾燥」プロトコルにおける二量体の収率よりも低いが、二量体の化学特異性はより良かった。最大二量体形成は、表面ペプチドが遊離チオール基を有するとき、及び溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに見られた。表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときの二量体形成、表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有するときの二量体形成、及び表面ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有し、溶液ペプチドが遊離チオール基を有する時の二量体形成も観測した。
【０２６０】
遊離チオールに連結される遊離チオールは、ジスルフィド結合を形成する、単純な好気性酸化によるかもしれない。Ｓ−ニトロピリジル活性チオールに結合するＳ−ニトロピリジル活性チオールは、残りのＳ−ニトロピリジル活性チオールと反応し得るいくつかの遊離チオールを残すような、不完全なチオール活性の結果、又はいくつかの他のメカニズムによるかもしれない。
【０２６１】
「共乾燥」プロトコルの結果は、上述した結果に酷似している。この方法においては、二量体の収率は徐々に高くなるが、非特異性結合もまた高くなった。特に、表面に付けられたヒドロキシル化ペプチドと、遊離チオール基及びＳ−ニトロピリジル活性チオール基の両方を含む溶液ペプチドとの間で、いくつかの反応が観察された。
【０２６２】
〔実施例７〕
本実施例では、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）非接触ディスペンサーを用いて、平面プラスチック表面上においてペプチド二量体を生成した。Ｔｈｅ  Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を、密度の高いアレイに、ナノリットル量をピペットで移すように、厳密に設計した。液量を、圧電性電動チップにより制御した。Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムには、ソースプレートホルダー、超音波ウォッシュボウル、コンピュータおよびモニタならびにシステム液体ボトルを含む。
【０２６３】
ポリプロピレンシートをＳＢＡプラスチック（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂａ．ｃｏ．ｕｋ／，  Ｐｒｏｐｙｌｅｘ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｓｈｅｅｔ  ２４４０  ｘ  １２２０  ｘ  １  ｍｍ）から得た。このポリプロピレンシートを、使用前に、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液によりふき取った。
【０２６４】
表２３に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中又はコントロール溶液中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中の、１００μＭのＳＢ−１〜ＳＢ−３のペプチド  ５ｎｌの６つの１０×１０配列を、３”ｘ１”にカットされた１ｍｍポリプロピレンシートに、分配した。
【０２６５】
【表２９】
2009518621.tif 000031
【０２６６】
表２４に示すスキームに従って、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙシステムを用いて、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中、あるいは、５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液及び１０％  （ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中のいずれかにおける、１００μＭのＴＬＳＰ−４ペプチド  ５ｎｌの６つの１０×１０配列を、上記スポット上に分配した。
【０２６７】
【表３０】
2009518621.tif 000032
【０２６８】
サンプルを室温で３０分間、暗所においてインキュベートした。スライドを、１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の５０  ｍＭ  ＮａＣｌ  １００ｍｌで洗浄し、スライド上に水道水を１分間流した。
【０２６９】
マイクロタイタープレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧  ４００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザ及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定し、スキャニング中、サンプルを圧縮した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２７０】
ポリプロピレンスライドの蛍光画像を図２１に示した。
【０２７１】
ポリプロピレン表面及び蛍光標識したペプチドの両方に結合可能な非標識ペプチドの存在を条件として、蛍光標識したペプチドによって、二量体収率を分析した。
【０２７２】
表面ペプチドが遊離チオール基を有し、溶液ペプチドがＳ−ニトロピリジル活性チオール基を有するときに、二量体形成が見られた。単純なプロトコル（蒸発を防ぐためのグリセロールなしで）より、より高い二量体収率が得られた。
【０２７３】
〔実施例８〕
本実施例では、Ｌ１−Ｐ１−１〜Ｌ１−Ｐ１−１６のペプチド、およびＬ１−Ｐ２−１〜Ｌ１−Ｐ２−１６のペプチドを含む二量体の、２０個の２５６分子マイクロアレイを、平行して生成した。
【０２７４】
１ｍｍポリプロピレンシートを、１３６  ｍｍ  ｘ  ８０ｍｍにカットし、グラスペーパーでそっと研磨し、使用前に５０％  （ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液でふき取った。
【０２７５】
Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を用いて、表２５に示すように、Ｐ１ペプチドの１８×６ｎｌ等分を、０．７２ｍｍ間隔で、ポリプロピレンスライドのカラムに配列した。
【０２７６】
【表３１】
2009518621.tif 000033
【０２７７】
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide）
ＴＣＥＰ＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（tris (2-carboxyethyl) phosphine）
Ｐ１ペプチドの配列:
P1-5       TAMRA-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Ser-Phe-Ala-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-1    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-2    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-3    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-4    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-5    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-6    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-7    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-8    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-9    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-10    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-11    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-12    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P1-13    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P1-14    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P1-15    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P1-16    Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Cys-Phe-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥させた後、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ）を用いて、表２６に示すように、０．７２ｍｍ間隔で、９０％  （ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ、  １  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中のＬ１−Ｐ２ペプチドの１８×１２ｎｌ等分を、ポリプロピレンスライドの列に沿って配列した。
【０２７８】
【表３２】
2009518621.tif 000034
【０２７９】
Ｐ２ペプチドの配列:
L1-P2-1    CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-2    CysSTP-DAB-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-3    CysSTP-DAB-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-4    CysSTP-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-5    CysSTP-Hse-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-6    CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-7    CysSTP-Hse-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-8    CysSTP-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-9    CysSTP-Abu-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-10   CysSTP-Abu-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-11   CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-12   CysSTP-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-13   CysSTP-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-14   CysSTP-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-15   CysSTP-Asp-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-16   CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
L1-P2-17   TAMRA-CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly-Phe
L1-P2-18   TAMRA-CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe
L1-P2-19   TAMRA-CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-Phe
L1-P2-20   TAMRA-CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe
サンプルを乾燥した後、０．１％  （ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０  ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）  ５０ｍｌ中で、スライドを１０分間洗浄した。
【０２８０】
スライドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｐｌｕｓ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｉｍａｇｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、解像度１０μｍで画像化した。ここで、ＰＭＴ電圧５００Ｖ、標準感度で、緑色（５３２ｎｍ）レーザー及び５８０  ＢＰ  ３０フィルターを用いた。走査高さをプラテンに設定した。蛍光画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００３．０３  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０２８１】
二量体の１つの１８×１８配列の蛍光画像およびコントロールスポットを図２２に示した。
【０２８２】
配列させて分配した各Ｌ１−Ｐ１ペプチドカラムの蛍光シグナルを観察した。この結果は、Ｌ１−Ｐ１ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であったことを示した。また、配列させて分配したＬ１−Ｐ２ペプチド列の蛍光シグナルを観察した。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドのそれぞれが、首尾よく分配され、二量体の形成が可能であったことを示した。
【０２８３】
Ｌ１−Ｐ１ペプチドのチオール基に匹敵する、非標識Ｐ２ペプチド及びＴＡＭＲＡ標識されたＰ２ペプチドの両方と共に生成された、１６×１６配列の二量体蛍光と比較して、ＴＡＭＲＡ標識したＰ２ペプチドのみを有するサンプルの二量体蛍光がより多かった。この結果は、Ｌ１−Ｐ２ペプチドは全て、首尾よくＴＡＭＲＡ標識されたそのカウンターパートに匹敵し、それゆえに、１６個の全てのＬ１−Ｐ１ペプチドと、１６個の全てのＬ１−Ｐ２ペプチドとの間で、首尾よくペプチド二量体が形成されることを示している。
【０２８４】
上述した本発明は、同様の方法が、多くの方法に変更され得ることは明確である。このような変更は発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者にとって明白なこのような変更のすべてが、本発明の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２８５】
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、配列多様性が向上した合成捕捉剤を提供する。本発明に係る捕捉剤は、例えばガラス又はシリコンのような様々な表面において機能し得るので、上記表面へのリガンド結合を可能にし、又は様々なタイプのアレイを形成する。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】疎水性アミノ酸と非疎水性アミノ酸とを交互に含むペプチドを示す図である。
【図２】疎水性面および実質的に非疎水性であるリガンド結合面を有する二量体型捕捉剤の一例を示す図である。
【図３】９６ウェルプレート中のさまざまな疎水性ペプチドの場所を示す図である。
【図４】ウェル中に様々なペプチドがあることを示している、図３の９６ウェルプレートの蛍光画像である。
【図５】図４の４００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。
【図６Ａ】ポリプロピレン表面上に、ペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。
【図６Ｂ】ポリプロピレン表面上に、ペプチドＰ１−１〜Ｐ１−５およびＰ２−１〜Ｐ２−２を保持していることを示す蛍光画像である。
【図７】図６Ａおよび図６Ｂを定量化した結果を示すグラフである。
【図８】ポリプロピレン疎水性表面上に沈着させたペプチド２ＤＯＳ−２のｐＨ抵抗性を示す蛍光画像である。
【図９】図８の３００Ｖスキャンを定量化した結果を示すグラフである。
【図１０】水性バッファー存在下における、ポリプロピレン疎水性表面上に沈着させたペプチド２ＤＯＳ−２の時間依存持続性を示す蛍光画像である。
【図１１】図１０の３００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。
【図１２】平底９６ウェルプレートおよびＶ型底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。
【図１３】洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図１０のプレートの蛍光画像である。
【図１４】図１３のＶ型底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。
【図１５】図１３の平底プレートにおける５００Ｖスキャンの結果を示すグラフである。
【図１６】ポリプロピレンおよびポリスチレンＶ型底９６ウェルプレートに添加した様々な疎水性ペプチドの場所を示す図である。
【図１７】洗浄ありおよび洗浄なしの条件における疎水性ペプチドの保持を示す図１６のプレートの蛍光画像である。
【図１８】図１６のポリプロピレンプレートおよびポリスチレンプレートにおける、洗浄後のさまざまなペプチドの保持率をパーセント表示したグラフである。
【図１９Ａ】“液相”プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。
【図１９Ｂ】表１９に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。
【図２０Ａ】“共乾燥（co-drying）”プロトコールを用いた実験から得られるマイクロタイタープレートの蛍光画像である。
【図２０Ｂ】表２２に示す蛍光画像のデータを示すグラフである。
【図２１】ポリプロピレンシート上における二量体形成を示す蛍光画像である。
【図２２】ペプチド二量体の２５６成分マイクロアレイの蛍光画像である。
【図１】
2009518621.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
2009518621.tif 000040
【図８】
2009518621.tif 000041
【図９】
2009518621.tif 000042
【図１１】
2009518621.tif 000043
【図１２】
2009518621.tif 000044
【図１４】
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【図１５】
2009518621.tif 000046
【図１６】
2009518621.tif 000047
【図１８】
2009518621.tif 000048
【図１９Ａ】
2009518621.tif 000049
【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
2009518621.tif 000051
【図２０Ｂ】
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【図２２】
2009518621.tif 000053
【図６Ａ】
2009518621.tif 000054
【図６Ｂ】
2009518621.tif 000055
【図１０】
2009518621.tif 000056
【図１３】
2009518621.tif 000057
【図１７】
2009518621.tif 000058
【図２１】
2009518621.tif 000059
【配列表】
2009518621000001.app
【国際調査報告】
2009518621.tif 000060
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