(57)【要約】本発明は、一つまたは複数の免疫調節配列（IMS）を有する免疫調節核酸の投与を含む、疾患を処置または予防する方法および組成物に関する。本発明は、疾患を予防または処置するIMSを同定する手段および方法に関し、さらに特に自己免疫疾患または炎症性疾患の処置および予防に関する。本発明の方法は、免疫調節核酸を単独または自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドもしくは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドと併用して投与する段階を含む、疾患の処置または予防に関する。本発明はまた、被験者に存在し非生理的状態に関与する一つまたは複数の自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する被験者の疾患を処置するための方法および組成物に関する。2009540016.tif 000023
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）（i）XおよびYが、
a. XおよびYがシトシン-グアニンではない、
b. ピリミジン[2]がチミンである場合、XおよびYがシトシン-シトシンではない、
c. ピリミジン[1]がシトシンである場合、XおよびYがシトシン-チミンではない
ということ以外、任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸ならびに
（b）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項４】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項５】
六量体配列のXおよびYが、グアニン-グアニンである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項６】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ベクターが、発現ベクターである、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項９】
（a）（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸ならびに
（b）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
六量体配列が、GTGGTTである、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
六量体配列が、GTGGTTであり、CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつCCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
免疫調節配列が、
2009540016.tif 000020
である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ベクターが、発現ベクターである、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
（i）XおよびYが、
d. XおよびYがシトシン-グアニンではない、
e. ピリミジン[2]がチミンである場合、XおよびYがシトシン-シトシンではない、
f. ピリミジン[1]がシトシンである場合、XおよびYがシトシン-チミンではない
ということ以外、任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む免疫調節配列を対象に投与する段階を含む、対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子（self-molecule）に関連する対象における疾患を処置するための方法。
【請求項２２】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
六量体配列のXおよびYが、グアニン-グアニンである、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
六量体配列が、GTGGTTである、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
六量体配列が、GTGGTTであり、CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつCCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列が、
2009540016.tif 000021
である、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項21記載の方法。
【請求項３３】
ベクターが、発現ベクターである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項21記載の方法。
【請求項３５】
（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む免疫調節配列を対象に投与する段階を含む、対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する対象における疾患を処置するための方法。
【請求項３６】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
六量体配列が、GTGGTTである、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつCCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
六量体配列が、GTGGTTであり、CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
ヌクレオチド配列が、
2009540016.tif 000022
である、請求項35記載の方法。
【請求項４４】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項35記載の方法。
【請求項４５】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項35記載の方法。
【請求項４６】
ベクターが、発現ベクターである、請求項35記載の方法。
【請求項４７】
対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項35記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、2006年6月13日に出願された米国特許仮出願第60/813,538号および2006年10月5日に出願された米国特許仮出願第60/849,901号の恩典を主張する。これらの両方の全開示は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
1.  発明の分野
本発明は、疾患を処置または予防するための方法および組成物に関する。本方法は、免疫調節配列の投与を含む。本発明は、さらに、疾患を予防または処置するための改良された免疫調節配列に関し、さらに特に自己免疫疾患または炎症性疾患の処置および予防に関する。本発明はまた、免疫調節配列単独の投与を含む疾患の処置または予防に関する。本発明はまた、免疫調節配列を、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドと併用して投与する段階を含む疾患の処置または予防に関する。例えば、本発明の免疫調節配列は、自己抗原を発現する発現ベクターに取り込まれ得る。本発明は、さらに、免疫調節配列を自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質などの自己分子（self-molecule）と併用して投与する段階を含む疾患の処置または予防に関する。本発明はまた、免疫調節配列を一つまたは複数の追加の免疫調節療法と併用して投与する段階を含む疾患の処置または予防に関する。
【０００３】
本発明はまた、被験者に存在し、非生理的状態に関与する一つまたは複数の自己-タンパク質、自己-抗原、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する被験者の疾患を処置するための方法および組成物に関する。本発明はまた、被験者に存在し、非生理的状態に関与する一つまたは複数の自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する被験者の疾患を予防するための方法および組成物に関する。本発明はまた、免疫調節配列と、非生理的状態に存在し、疾患に関連する自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む併用療法の投与に関する。本発明はまた、動物に存在し、非生理的状態に関与し、疾患に関連する自己分子に対する免疫応答を調節することに関する。本発明は、さらに特に、多発性硬化症（MS）、関節リウマチ（RA）、インスリン依存性糖尿病（DDM）、自己免疫性ブドウ膜炎（AU）、原発性胆汁性肝硬変（PBC）、重症筋無力症（MG）、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡（PV）、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス（SLE）およびグレーブス病などの非生理的状態にある動物に存在する一つまたは複数の分子に関連する自己免疫疾患を処置または予防するための方法および組成物に関する。本発明は、さらに、骨関節炎、脊椎損傷、消化性潰瘍疾患、通風、片頭痛、高脂血症および冠動脈疾患などの非生理的状態にある動物に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する他の疾患に関する。
【背景技術】
【０００４】
2.  背景
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、生体の健康な細胞および/または組織に誤って誘導された適応免疫によって生じる疾患である。自己免疫疾患は米国の人口の3%が罹患しており、先進工業国の人口のほぼ同じパーセントが罹患していると思われる（Jacobson et al., Clin Immunol Immunopathol, 84, 223-43, 1997）。自己免疫疾患は、自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質ならびにそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない自己分子をTおよびBリンパ球が誤って標的とし、それによって生体内の器官、組織または細胞種（例えば、膵臓、脳、甲状腺または消化管）の損傷または機能不全を生じて疾患の臨床発現を生じることによって特徴付けられる（Marrack et al., Nat Med, 7, 899-905, 2001）。自己免疫疾患は、特定の組織に影響する疾患および多数の組織に影響することがある疾患を含む。これは、一部には、ある疾患については、自己免疫応答が特定の組織に限定される自己抗原分子または生体に広く分布する自己抗原分子に向かうかどうかに依存する場合がある。組織-特異的な自己免疫の特徴的な特徴は、1つの組織または個々の細胞種の選択的な標的化またはこれに対する影響である。にもかかわらず、偏在的な自己抗原分子を標的とするある種の自己免疫疾患が特定の組織に影響することもある。例えば、多発性筋炎では、自己免疫応答は偏在性タンパク質ヒスチジル-tRNA合成酵素を標的とするが、その臨床発現は、主に、筋肉の自己免疫破壊に関係する。
【０００５】
免疫系は、種々の外来病原体から哺乳類を保護する応答を形成すると同時に、自己-抗原に対する応答を防止するように設計された高度に複雑な機序を使用する。免疫系は、応答するかどうかを決定する（抗原特異性）以外に、各病原体に対応する適当なエフェクター機能を選択する必要もある（エフェクター特異性）。これらのエフェクター機能を媒介し、調節する際に重要な細胞はCD4+ T細胞である。さらに、T細胞がそれらの機能を媒介する主要な機序の1つであると思われるのはCD4+ T細胞由来の特異的なサイトカインの精巧さである。従って、CD4+ T細胞が作製するサイトカインの種類およびそれらの分泌が制御される方法を特徴付けることは、免疫応答が調節される方法を理解する上で極めて重要である。
【０００６】
マウスCD4+ T細胞長期クローンによるサイトカイン産生の特徴付けは、最初は、10年以上前に報告された（Mosmann et al., J. Immunol., 136:2348-2357, 1986）。これらの検討では、CD4+ T細胞は、Tヘルパー1（Th1）およびTヘルパー2（Th2）と命名された2つの別個のパターンのサイトカイン産生を生じることが示された。Th1細胞は、インターロイキン-2（IL-2）、インターフェロン-γ（IFN-γ）およびリンホトキシン（LT）を選択的に産生することが見出されたが、Th2はIL-4、IL-5、IL-6およびIL-13を選択的に産生した（Cherwinski et al., J. Exp. Med., 169: 1229-1244, 1987）。数年後に、追加のサイトカインIL-9およびIL-10がTh2クローンから単離された（Van Snick et al., J. Exp. Med., 169: 363-368, 1989；Fiorentino et al., J. Exp. Med., 170: 2081-2095, 1989）。最後に、IL-3、顆粒球マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF）および腫瘍壊死因子-α（TNF-α）などの追加のサイトカインは、Th1細胞およびTh2細胞の両方によって分泌されることが見出された。
【０００７】
自己免疫疾患は、以降の表に示す生体内の多数の異なる器官および組織に影響を与えることがある多種多様の疾患を含む。例えば、
2009540016.tif 000002
を参照されたい。
【０００８】
ヒトの自己免疫疾患の現在の治療には、糖質コルチコイド、細胞障害剤および最近開発された生物療法が挙げられる。一般に、ヒトの全身性自己免疫疾患の管理は経験的で、満足のいくものではない。通例、概して糖質コルチコイドなどの免疫抑制剤は多種多様の重症自己免疫疾患および炎症性疾患に使用される。糖質コルチコイド以外に、他の免疫抑制剤が全身性自己免疫疾患の管理に使用される。シクロホスファミドは、T-およびB-リンパ球の顕著な欠損を生じ、細胞性免疫の障害を生じるアルキル化剤である。シクロスポリン、タクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチルは、特異的なT-リンパ球抑制特性を有する天然産物であり、SLE、RAを処置するために使用されており、限られた程度であるが、血管炎および筋炎に使用されている。これらの薬剤は、重大な腎毒性に関連がある。メトトレキセートもRAの「セカンドライン」として、疾患の進行を低下することを目的に使用される。メトトレキセートはまた、多発性筋炎および他の結合組織疾患に使用される。試されたことがある他の方法には、サイトカインの作用を遮断するまたはリンパ球を枯渇させるモノクローナル抗体が挙げられる。例えば、Fox, D. A. Am. J. Med., 99: 82-88, 1995。MSの処置には、再発率を20〜30%低下し、疾患の進行に中程度の影響しか与えないインターフェロンβおよびコポリマー1が挙げられる。MSはまた、メチルプレドニゾロン、他のステロイド、メトトレキセート、クラドリビンおよびシクロホスファミドを含む免疫抑制剤でも処置される。これらの免疫抑制剤は、MSの処置にわずかに影響するだけである。現在のRA治療は、メトトレキセート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド（lefluamide）、プレドニゾンならびに最近開発されたTNFαアンタゴニストのエタネルセプトおよびインフリキシマブ（Moreland et al., J Rheumatol, 28, 1431-52, 2001）などの、免疫機能を非-特異的に抑制または調節する薬剤を使用する。エタネルセプトおよびインフリキシマブは全身的にTNFαを遮断し、敗血症、慢性放線菌感染症の悪化および脱髄性事象の発症による死亡を患者に生じやすくする。
【０００９】
器官特異的自己免疫の場合には、数多くの異なる治療方法が試されている。可溶性タンパク質抗原は、その抗原に対するその後の免疫応答を阻止するために全身投与されている。このような治療には、実験的自己免疫脳脊髄炎（EAE）の動物および多発性硬化症患者へのミエリン塩基性タンパク質、その主要なペプチドまたはミエリンタンパク質の混合物の送達（Brocke et al., Nature, 379, 343-6, 1996；Critchfield et al., Science, 263, 1139-43, 1994；Weiner et al., Annu Rev Immunol, 12, 809-37, (1994)；コラーゲン-誘発性関節炎動物または関節リウマチ患者へのII型コラーゲンまたはコラーゲンタンパク質の混合物の投与（Gumanovaskaya et al., Immunology, 97, 466-97, 1999；McKown et al., Arthritis Rheum, 42, 1204-8, 1999；Trentham et al., Science, 261, 1727-30, 1993）；自己免疫糖尿病動物および患者へのインスリンの送達（PozzilliおよびGisella Cavallo、Diabtes Metab Res Rev, 16, 306-7, 2000）ならびに自己免疫ブドウ膜炎動物および患者へのS-抗原の送達（Nussenblat et al., Am J Ophthalmol, 123, 583-92, 1997）が挙げられる。この方法に関連する問題は、抗原の全身注射によって誘発されるT-細胞の無応答性である。別の方法は、T-細胞受容体と主要組織適合性（MHC）分子に結合するペプチドの特異的な相互作用に基づいて、ペプチド抗原を全身投与するための合理的な治療方法を設計する試みである。糖尿病の動物モデルにおいてペプチド方法を使用する検討により、そのペプチドに対する抗体作製が開発された（Hurtenbach U. et al., J Exp. Med, 177: 1499, 1993）。別の方法は、TCRペプチド投与による免疫化である。例えば、Vandenbark AA et al., Nature, 341: 541, 1989を参照されたい。さらに別の方法は、ペプチドまたはタンパク質抗原摂取による経口耐性の誘導である。例えば、Weiner HL, Immunol Today, 18: 335, 1997を参照されたい。
【００１０】
病原体または腫瘍に対する免疫応答は、現在では、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを単独またはアジュバントと併用して送達することによって変更される。例えば、B型肝炎ワクチンは、アジュバントとして作用する水酸化アルミニウムを用いて製剤化した、非-自己抗原である組換えB型肝炎ウイルス表面抗原を含有する。このワクチンは、B型肝炎表面抗原に対する免疫応答を誘導して感染から防御する。別の方法は、病原体に対する宿主の防御免疫応答を誘発するために、各々非-自己抗原である、弱毒化型、複製欠損型および/または非-病原型のウイルスまたは細菌の送達に関係する。例えば、経口ポリオワクチンは、細胞に感染して、ワクチン投与した個体中で複製し、臨床疾患を生じないで外来すなわち非-自己抗原であるポリオウイルスに対する効果的な免疫を誘発する、非-自己抗原である弱毒生ワクチンを含む。または、不活性化ポリオワクチンは、感染または複製能力がなく、皮下投与すると、ポリオウイルスに対する感染防御免疫を誘発する不活性化したすなわち「死滅させた」ウイルスを含有する。
【００１１】
免疫応答の開始および伝播機序
「非自己分子」に関連する炎症性疾患：マイコプラズマ、ウイルス、細菌、寄生虫および放線菌を含む微生物の感染は、標的器官の炎症を生じ、場合によっては全身炎症を生じる。顕著な例には、細菌性敗血症性関節炎、ライム関節炎、感染性ブドウ膜炎および敗血症性ショックが挙げられる。自然免疫系の一部として、凝固カスケードの成分、ブラジキニンおよび補体などの炎症メディエーターが活性化され、炎症および病的状態に寄与する。感染性疾患における免疫応答は、タンパク質、脂質、糖質および核酸を含む微生物に存在する非-自己分子に対する。以下にさらに詳細に規定する「CpG」モチーフと呼ばれるある種のモチーフを含有する細菌DNAは、動物モデルにおいて炎症応答を開始することができる。例えば、共に非-自己分子である細菌DNAまたはCpGモチーフを滑膜関節に注射すると、敗血症性関節炎を特徴とする炎症徴候および症状の多くに類似した徴候および症状を呈する。
【００１２】
「自己分子」に関連する炎症性疾患：多数のヒトの疾患は、任意の既知の感染性病因が存在しない急性または慢性炎症に関連する。これらの疾患では、免疫系は活発で、罹患組織は炎症を生じており、白血球およびリンパ球の異常な浸潤が見られるが、関連する感染症はないと思われる。例として、骨関節炎、冠動脈疾患、アルツハイマー病、ある種の形態の皮膚炎、胃炎および間質性肺炎が挙げられる。適応免疫応答が存在しない場合には、主要な免疫応答は自然免疫応答である。
【００１３】
「自己分子」に関連する自己免疫疾患：関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、糖尿病、乾癬等を含む多数の自己免疫疾患が記載されている。上記の自己分子に関連する炎症性疾患と同様に、免疫系は活発で、罹患組織は炎症を生じ、白血球およびリンパ球の異常な浸潤が見られ、関連する感染症はないと思われる。自己分子に関連する炎症性疾患と異なり、自己免疫疾患の決定的な特徴は、宿主が発現する自己分子に特異的な自己抗体および/またはT細胞の存在である。自己分子が宿主TおよびBリンパ球によって選択的に標的とされる機序は不明である。自己免疫疾患は、微生物病原体の感染によって誘発または悪化されると示唆している研究者もいる。微生物のCpG配列による刺激は、EAE（Segal et al., J. Immunology, 158: 5087, 1997）およびSLE（Gilkeson et al., J. immunology, 142: 1482, 1989）などの自己免疫疾患の動物モデルの形成しやすさに関連する；しかし、CpG配列または微生物産物自体が健康な動物に自己免疫疾患を誘発できるという仮説を支持する証拠はほとんどないが、炎症性疾患は誘発することができる。例えば、ノトバイオート系（すなわち、無菌環境で生育した動物）を使用したいくつかの重要な実験は、自己免疫疾患の自然発症は、天然型微生物または微生物CpGに接触しないで生じることを実証している。例として、強直性脊椎炎の無菌遺伝子組換え齧歯類モデルにおける自己免疫皮膚および生殖器疾患の発症（Taurog, J. Exp Med, 180: 2359, 1994）；および2つの異なるSLEモデルにおける狼瘡の発症（Maldonadoi et al., J Immunol, 162: 6322, 1999；Unni et al., J Rheum, 2: 35, 1975）が挙げられる。炭化水素油、プリスタンを任意のマウス株に単回注射することにより、特徴的な自己抗体の産生および免疫複合体-媒介性腎疾患によって特徴付けられるSLEが発症する誘導性SLEモデルも記載されている。総合すると、これらの実験モデルは、自然発症性および誘導性自己免疫疾患は微生物DNAまたはCpGへの接触がない場合に発症することがあることを示唆している。
【００１４】
免疫活性化配列（ISS）：自然免疫系は、微生物および病原体に対する最初の防御ラインとみなされる。自然免疫系の最も強力な刺激物質の1つは、免疫活性化配列（ISS）を含有する微生物DNAである。細菌DNAの特定の免疫活性化配列による自然免疫の活性化には、マウスにおいて刺激するためには5'-プリン-プリン-シトシン-グアニン-ピリミジン-ピリミジン-3'、ヒトにおいて刺激するためには5'-プリン-ピリミジン-シトシン-グアニン-ピリミジン-ピリミジン-3'を有する中心の非メチル化六量体配列モチーフを必要とする（Krieg et al., Annu Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002）。細菌DNAおよび免疫活性化配列モチーフ内に「CpG」と呼ばれるこのジヌクレオチドモチーフを含有する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）は、B細胞を刺激して増殖させ、IL-6、IL-10および免疫グロブリンを分泌させる能力を有する（Krieg et al., Nature, 374: 546-549, 1995；Yi et al., J. Immunol., 157: 5394-5402, 1996）。ISS DNAはまた、樹状細胞、マクロファージおよび単球を直接活性化して、TNA-α、IL-6およびIL12などのTh1-様サイトカインを分泌させ、MHCおよび同時刺激分子の発現をアップレギュレートする（Klimann et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 93: 2879-2883, 1996；Martin-Orozco et al., Int. Immunol., 11: 1111-1118, 1999；Sparwasser et al., Eur. J. Immunol., 28: 2045-2054, 1998）。マウスでは、トール様受容体-9（TLR-9）はCpGモチーフの認識の際の主要な受容体として同定されている。
【００１５】
脊椎動物のDNAでは、CpGジヌクレオチドの出現頻度は予測値（期待値）の約1/4に抑えられており、CpGジヌクレオチドのCは当時の約80%メチル化されている。一方、合成ODNのような細菌DNAでは、CはCpGジヌクレオチドにおいて選択的にメチル化されない。従って、微生物DNAは、非メチル化CpGモチーフ含有量が20倍以上多いという点において脊椎動物DNAと構造的に異なる。数多くの検討が、免疫細胞を活性化する細菌DNA内の分子パターンとしての非メチル化CpGモチーフを確立している（Krieg et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002）。
【００１６】
CpG DNAは、鶏卵リゾチームおよび卵白アルブミンのような非自己抗原に対する強力な抗体応答およびTh1-様T-細胞応答を誘導する能力について強力なアジュバントとして認識されている（Chu et al., J. Exp. Med., 186: 1623-1631, 1997；Lipford et al., Eur. J. Immunol., 27: 2340-2344, 1997）。現在、CpG DNAおよびCpG ODNは、感染性疾患、腫瘍、アレルギー疾患および自己免疫疾患の種々の動物モデルにおいて治療用ワクチンとして使用されている（Krieg et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002）。CpGのワクチンとしての成功は、主に強力なTh1-様応答を誘導するその有効性に明らかに依存しており、場合によっては、アレルギー性喘息などのように、Th2応答をTh1応答に再誘導化する有効性に主に依存している（Kline et al., J. Immunol., 160: 2555-2559, 1998；Broide et al., J. Immunol., 161: 7054-7062, 1998）。
【００１７】
CpG DNAによる自然免疫活性化の治療適用に大きな注目が寄せられている。CpG DNAによって誘導される強力な非-抗原特異的な自然免疫細胞活性は、マウスを細菌負荷から保護するのに十分である、細胞内病原体によって確立されている感染の治療にも十分である（Agrawal et al., Trends Mol. Med., 8: 114-121, 2002）。CpG DNAはまた、マウスにおいて腫瘍に対する自然免疫耐性および樹立腫瘍の退行を誘発する（Dow et al., J. Immunol., 163: 1552-1561, 1999；Carpenter et al., Cancer Res., 59: 5429-5432, 1999；Smith et al., J. Natl. Cancer Inst., 90: 1146-1154, 1998）。CpG DNAの強力なTh1アジュバント作用は既存のTh2免疫応答より優位になる；それはアレルギーワクチンのアジュバントとして使用されており、既存のTh2応答の存在下において抗原に対するTh1応答を誘導して、その後のアレルゲン吸入による症状を低下する（Van Uden et al., J. Allergy Clin. Immunol., 104: 902-910, 1999）。
【００１８】
免疫抑制配列（IIS）：免疫活性化配列オリゴデオキシヌクレオチド（ISS-ODN）の阻害剤は、ISS-ODNの免疫活性化作用を阻害するために、例えば、特に遺伝子治療に関連して組換え発現ベクターに存在する任意のISS-ODNの免疫活性化作用を抑制するために、細菌およびウイルスのISS-ODNに対する宿主の免疫応答を低下するための抗-炎症剤として、ISS-ODN刺激されたTh1媒介性のIL-12産生を阻害するために自己抗原または自己抗体結合物と併用した自己免疫モジュレーターとして、細胞外抗原に対するTh2免疫応答のためのアジュバントとして使用するために、および一般的に免疫応答をTh1からTh2応答にシフトするために使用されている。例えば、国際公開公報第04/047734号および米国特許第6,255,292号を参照されたい。
【００１９】
Yamada et al., J. Immunol., 169; 5590-5594, 2002は、種々のインビトロ免疫活性化細胞系を使用して、CpG誘導性免疫活性化においてIISオリゴデオキシヌクレオチドを評価した。IISオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制はオリゴデオキシヌクレオチドによる刺激を上回り、CpG-誘導性免疫応答に特異的であることをYamadaらは見出した。彼らは、最も抑制作用の強いオリゴヌクレオチドはポリGまたはG-Cリッチ配列を含有することを見出したが、特異的な六量体モチーフは発見されなかった。直接反復クラスター形態または5'側にCもしくは3'側にGを有するCpGジヌクレオチドとKreigによって規定された中和モチーフを含有する合成オリゴヌクレオチドは、免疫活性化CpGモチーフによる免疫活性化を遮断することができることをKreig et al., PNAS, 95; 12631-12636, 1998は見出した。この場合も、六量体免疫抑制配列は発見されなかった。Zeuner et al., Arthritis and Rheumatism, 46: 2219-2224, 2002では、上記のKreigらによって記載されているIISは、動物モデルにおいてCpG誘導性関節炎を低下することが証明されている。付加的なIISは、Gリッチオリゴマーの5'側のCCジヌクレオチドによって特徴付けられるUS 20050239732, Jurk et al.および遠位GGGトリプレットに対して3〜5ヌクレオチド5'側の近位ピリミジンリッチCCT配列によって特徴付けられるLenert et al.,（2003, DNA Cell Biol. 22:621-31）において記載されている。しかしながら、六量体免疫抑制性配列は、どちらにおいても発見されなかった。米国特許第6,225,292号において、Razらは、CpGの免疫活性化配列の刺激作用を遮断する5'-プリン-プリン-[Y]-[Z]-ピリミジン-ピリミジン-3'（式中、Yはシトシン以外の任意のヌクレオチドであり、Zは任意のヌクレオチドであり、Yがグアノシンまたはイノシンでない場合には、Zはグアノシンまたはイノシンである）と指定された特定の六量体モチーフを記載している。上記の例の各々において、IISは、刺激作用のあるCpG配列によって生じる免疫活性化を特異的に阻害することが証明されている。
【００２０】
核酸治療
アンチセンス治療：アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最初は、標的遺伝子の発現を低下するために、特定の標的遺伝子に相補的であるように設計された（Kreig、Annu. Rev. Immunol., 20: 709-760, 2002）。これらのオリゴヌクレオチドの分解を防止するために、骨格は、一般に、ホスホロチオエート骨格のように修飾された。多くの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは組織培養細胞において標的遺伝子の発現を抑制したが、インビボにおける実験は発現を変更するという点ではうまくいかなかった。代わりに、多数の研究者は、これらのオリゴヌクレオチドのいくつかはインビボにおいて免疫応答を刺激することを予期しないことに見出した。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のrev遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、B細胞増殖増加および脾腫によって発現される免疫活性化作用を有する（Branda et al., Biochem. Pharmacol., 45: 2037-2043, 1993）。これらの早期検討からは即時型免疫活性化配列モチーフは同定されなかったが、結果としてこれらの所見により、特定の免疫活性化モチーフが探索された。
【００２１】
遺伝子治療：ペプチドおよび/またはポリペプチドをコードするネーキッドDNA、沈降-および形質移入-促進剤の形態で製剤化されるDNAおよびウイルスベクターを含むポリヌクレオチド治療は「遺伝子治療」に使用されている。遺伝子治療は、タンパク質またはペプチドの発現を提供するため、宿主において欠損しているまたは存在しないタンパク質またはペプチドの代わりをするおよび/または望ましい生理機能を増加するためにポリヌクレオチドを送達することである。遺伝子治療には、治療的目的のために個体のゲノムにDNAを組み込む方法が挙げられる。遺伝子治療の例として、血友病のための凝固因子、重症複合型免疫不全症のためのアデニンデアミナーゼ、家族性高コレステロール血症のための低密度リポタンパク質受容体、ゴーシェ病のためのグルコセレブロシダーゼ、α-アンチトリプシン欠損症のためのα1-アンチトリプシン、異常血色素症のためのα-またはβ-グロビン遺伝子および嚢胞性線維症のための塩化物チャネルをコードするDNAの送達が挙げられる（VermaおよびSomia、Nature, 389, 239-42, 1997）。
【００２２】
感染症を処置するためのDNA免疫化：DNA免疫化では、非-複製転写単位が、宿主において特定の免疫応答を誘導または提供するタンパク質またはタンパク質セグメントの合成のための鋳型を提供することができる。ネーキッドDNAを注射すると、種々の微生物および腫瘍に対するワクチン化が促進される（RobinsonおよびTorres、Semin Immunol, 9, 271-83., 1997）。全て非-自己抗原であるウイルス（B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルスおよびインフルエンザウイルス）、細菌（結核菌(mycobacterium tuberculosis)）および寄生虫（マラリア）に存在する特定のタンパク質をコードするDNAワクチンはこれらの感染症を予防および処置するために開発されている（Le et al., Vaccine、18, 1893-901, 2000；RobinsonおよびPertmer、Adv Virus Res, 55, 1-74, 2000）。
【００２３】
癌を処置するためのDNA：腫瘍組織適合抗原クラスI、サイトカイン（IL-2、IL-12およびIFN-γ）および腫瘍抗原をコードするDNAワクチンは癌を処置するために開発されている（WlazloおよびErtl、Arch Immunol Ther Exp, 49: 1-11, 2001）。例えば、B細胞免疫グロブリンイディオタイプ（抗原結合領域）をコードするウイルスDNAは、B細胞リンパ腫を排除し、B細胞リンパ腫から防御するために投与されている（Timmerman et al., Blood, 97: 1370-1377, 2001）。
【００２４】
自己免疫疾患を処置するためのDNA免疫化：他は、自己免疫疾患を処置するための免疫分子をコードするDNA治療を記載している。このようなDNA治療は、自己免疫応答を誘導する自己反応性T細胞のレベルを変更するためのT細胞受容体の抗原-結合領域をコードするDNAを含む（Waisman et al., Nat Med, 2: 899-905, 1996；米国特許第5,939,400号）。自己抗原をコードするDNAは粒子に結合され、多発性硬化症およびコラーゲン誘導性関節炎を予防するために皮膚に遺伝子銃で送達される（国際公開公報第97/46253号；Ramshaw et al., Immunol., and Cell Bio., 75: 409-413, 1997）ｖ。接着分子、サイトカイン（TNFα）、ケモカイン（C-Cケモカイン）および他の免疫分子（Fas-リガンド）をコードするDNAは、自己免疫疾患の動物モデルを処置するために使用されている（Youssef et al., J Clin Invest, 106: 361-371, 2000；Wildbaum et al., J Clin Invest, 106: 671-679, 2000；Wildbaum et al., J Immunol, 165: 5860-5866, 2000；Wildbaum et al., J Immunol, 161: 6368-7634, 1998；およびYoussef et al., J Autoimmun, 13: 21-9, 1999）。
【発明の概要】
【００２５】
本発明の目的は、免疫調節核酸の投与を含む、疾患、特に自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防するための方法および組成物を提供することである。本発明の別の目的は、疾患を処置するための免疫調節配列を同定する手段を提供することである。本発明のさらに別の目的は、免疫調節配列を、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドと併用投与することを含む、動物の非生理的過程に存在および関与する自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する疾患を処置する方法および手段を提供することである。本発明の別の目的は、動物の自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する疾患を処置または予防するための組成物を提供することである。本発明はさらに、免疫調節核酸を自己分子と併用投与することを含む、疾患の処置または予防に関する。本発明のこれらの目的および他の目的は、全体として本明細書から明らかになる。
【００２６】
発明の簡単な概要
本発明は、単独または併用により、自己分子に関連する自己免疫疾患または炎症性疾患を予防または処置するために使用することができる改良された免疫調節配列の発見に基づいている。
【００２７】
特に、本発明は、
（1）XおよびYが、
a. XおよびYがシトシン-グアニンではない、
b. ピリミジン[2]がチミンである場合、XおよびYがシトシン-シトシンではない、
c. ピリミジン[1]がシトシンである場合、XおよびYがシトシン-チミンではない
ということ以外、任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（2）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（3）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない改善された免疫調節配列（IMS）を提供する。
【００２８】
あるいは、本発明は、
（1）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン-[X]-[Y]-ピリミジン-ピリミジン-3'；
（2）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（3）ポリGが2と10との間の連続Gを含みかつ六量体配列の2〜10ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない改善された免疫調節配列を提供する。
【００２９】
本発明のいくつかの態様において、六量体配列のXおよびYは、GpGである。特定の態様において、六量体配列は、5'-GTGGTT-3'である。いくつかの態様において、CCジ-ヌクレオチドは、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる。特定の態様において、ポリG領域は、3連続グアニン塩基を含み、六量体配列から2ヌクレオチド3'側に位置付けられる。特定の態様において、改善された免疫調節配列は、
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である。
【００３０】
本発明の目的は、一つまたは複数の免疫調節配列を有する免疫調節核酸の投与を含む、疾患、特に自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防するための新規方法および組成物によって達成される。免疫調節核酸は単独で投与しても、または自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチド、自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドと併用して投与してもよい。免疫調節核酸はまた、個体に非生理的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための他の自己分子と併用して投与してもよい。
【００３１】
本発明はさらに、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防するためであって、DNAポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの形態の免疫調節配列を含む薬学的組成物に関する。免疫調節配列は、自己免疫疾患または炎症性疾患などの、被験者に非生理的に存在する自己分子に関連する疾患に関して使用する場合には、抑制性ジヌクレオチドモチーフをさらに含む免疫調節配列モチーフを含むようにベクターヌクレオチド配列の要素を改変することによってベクター内に統合されてもよい。
【００３２】
本発明の他の目的は、免疫調節配列を動物に投与する段階を含む、動物に非生理的に存在する一つまたは複数の自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する動物の疾患を処置または予防する新規方法によって達成される。本発明はさらに、免疫調節配列を、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドと併用して動物に投与する段階を含む、動物に非生理的に存在する一つまたは複数の自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する動物の疾患を処置または予防する新規方法に関する。
【００３３】
本発明の一局面において、動物に、免疫調節配列を単独または自己免疫疾患に関連する自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む自己-ベクターと併用して投与する段階を含む、多発性硬化症、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス（SLE）、強直性脊椎炎、自己免疫性皮膚疾患およびグレーブス病などの自己免疫疾患を処置または予防するための方法を提供する。本発明の別の局面において、免疫調節配列は、非生理的状態の被験者に存在し、疾患に関連する自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするDNAを含むポリヌクレオチドと併用して投与される。
【００３４】
本発明の別の局面において、免疫調節配列を単独または併用して動物に投与する段階を含む、骨関節炎、痛風、偽痛風、ハイドロキシアパタイト沈着疾患、喘息、滑液包炎、腱炎、結膜炎、尿道炎、膀胱炎、亀頭炎、皮膚炎、冠動脈疾患または片頭痛などの炎症性疾患を処置または予防するための方法を提供する。
【００３５】
本発明のさらに別の局面において、動物に免疫調節配列を単独またはGVHDもしくは移植による拒絶反応に関連する自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む自己-ベクターと併用して投与する段階を含む、GVHDまたは移植による拒絶反応を含むが、これらに限定されない臓器または細胞移植に関連する疾患を処置または予防する方法を提供する。免疫調節配列、および自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む自己-ベクターの投与は、自己-ベクターによって発現される自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに対する免疫応答を調節する。
【００３６】
方法および組成物のいくつかの態様において、複数（すなわち、2つ以上）の免疫調節配列が、別個にまたは連結して、例えば、連続してまたは並行して使用される。2つ以上のIMSは、同じである場合もあり、または異なる場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】抑制性IMSによる、ヒトPBMC細胞のCpG依存性増殖の抑圧を示す。ヒトPBMC（5×105/ml）を、刺激性CpG-ODN（5μg/ml）またはCpGおよび抑制性IMSの混合物の存在下でインキュベートした。細胞を96時間DNAとともにインキュベートし、ウェルを培養の最終の24時間1μCi[3H]TdRでパルスし、取り込まれた放射能を測定した。各々のデータポイントは、4反復の平均値を示す。a,b）刺激性CpG-ODN 2395（5μg/ml）を、2つの異なる細胞ドナー-QB8（a）およびQB10（b）において、独立に（左から2番目のバー）または増加する濃度の抑制性IMS（括弧内に示されるように1〜25μg/ml+5μg/ml 2395）とともにインキュベートした。
【図２】CpG刺激サイトカイン産生に対するIMS GpG.1およびI18効果の用量応答分析を示す。ヒトPBMC（5×106/ml）を、単独でまたは増加する用量のIMS GpG.1およびI18と組み合わせて、CpG ODN（2006、2395、C274、D19）の存在下で48時間インキュベートした（全てのIMS試料は、5μg/mlのCpGオリゴを含んだ）。培地におけるサイトカインレベルを、ELISAによって測定した。各々のデータポイントは、3反復の平均を示す。IL-10およびIL-12（aおよびb）に対して、増加するIMS用量にともなうサイトカイン産生の増加する抑圧がある。IFN-γ（c）およびIFN-α（d）に対して、増加するIMS用量は、両方のIMSに対して増加するサイトカイン発現を引き起こすが、IMS I18に対して、低用量は、IFN-γレベル全体を抑圧し、全てのI18用量は、CpG単独試料に対してIFN-αレベルを抑圧する。
【図３】IMS GpG.1およびI18のConAおよびPolyI:C抑制性効果を示す。（a）ヒトPBMC（5×106/ml）を、48時間単独でまたは増加する濃度のIMSとともに、PolyI:C（10μg/ml）とともにインキュベートした。上清IFN-αタンパク質レベルを、ELISAによって測定した。各々のデータポイントは、3反復の平均を示す。5μg（25μg/ml）用量のI18およびGpG.1は、PolyI:C誘導IFN-αを抑圧するのに有効であった。（b）PBMCを、単独でまたはGpG.1およびI18（各々25μg/ml）と組み合わせて、10μg/mlのConAとともにインキュベートし、図1において記載されるように、増殖を分析した。
【図４】抑制性IMSにより可能である、CpGとは無関係なサイトカイン産生の誘導を示す。CpGオリゴの非存在下での増加する用量のIMSを、48時間PBMC（ドナーQB11およびQB12）とともにインキュベートし、サイトカインをELISAによって分析した。各々のデータポイントは、3反復の平均を示す。（a）IL-6 （b）IL-10 （c）IFN-α （d）IFN-γ。
【図５】抑制性IMSにより可能である、刺激性CpG ODNの非存在下でのPBMC増殖の刺激を示す。ヒトPBMC（5×105/ml）を、刺激性CpG-ODN 2395（5μg/ml）または増加する濃度のIMS GpG.1およびI18の存在下でインキュベートした。上（図1）で記載されるように、細胞増殖を測定した。
【図６】抑制性IMSにより可能である、インビボでのCpG誘導IL-12発現の抑圧を示す。オリゴヌクレオチドを腹腔内注射によって投与し、24時間後に後眼窩出血によって血清を引き出した。血清を、ELISAによってIL-12レベルに対して分析した。
【図７】50μgでの毎週のIMSオリゴ投薬が、狼瘡のマウスモデルにおけるタンパク尿への進行に有意に影響を与えないことを示す。TpTまたはGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBSで処置された対照群を、尿におけるタンパク質の存在に対して毎週スコア化した。Albustix Reagent Stripsによってスコア化されるような>300mg/dlの2連続スコアとして定義されるタンパク尿を示すマウスの割合を、時間にわたってプロットした。タンパク尿の発症における有意な遅延は、どの処置群においても観測されなかった。
【図８】50μgでの毎週のIMSオリゴ投薬が、狼瘡のマウスモデルにおける抗DNA自己抗体力価に有意に影響を与えないことを示す。TpTまたはGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBSで処置された対照群からの血清を、犠牲死の時に採取した。市販されているキットを使用して、抗二本鎖DNA抗体力価を測定した。オリゴでの処置は、抗DNA応答全体をわずかに低くするが、どれも統計的有意性に達しなかった。
【図９】経口強制飼養によって投与されたGpG IMSオリゴが、狼瘡のマウスモデルにおける腎臓における炎症の重症度を有意に低下させたことを示す。タンパク尿に進行したTpTまたはGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBSで処置された対照群から取られた腎臓に対して、病理組織をスコア化した。スコアリングシステムは、炎症の程度を測定するようにデザインされ、以下のように定義された：1＝最小；2＝軽度；3＝中度；および4＝顕著/重度。スコアリングは、契約獣医病理学者によって盲検法で行われた。組織学スコアを各々の群に対して平均化し、平均±SEMとして以下に示される。両方のGpG処置群で腎臓炎症における軽減が観測されたが、経口強制飼養によって投与されたGpGのみが、統計的有意性に達した。
【図１０】狼瘡のマウスモデルにおけるGpG IMSオリゴ処置にともなうタンパク尿発症における用量依存性の遅延を示す。毎週IPによって増加する投薬量（50、200、および500μg）のGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBS媒体で処置された対照動物を、尿におけるタンパク質の存在に対して毎週スコア化した。Albustix Reagent Stripsによってスコア化されるような>300mg/dlの2連続スコアとして定義されるタンパク尿を示すマウスの割合を、時間にわたってプロットした。タンパク尿発症における用量依存性の遅延があり、最高用量のGpGが、最も有意な遅延を提供した（p＝0.03）。
【図１１】狼瘡のマウスモデルにおけるGpG IMSオリゴ処置にともなう抗DNA抗体応答における用量依存性の低下を示す。毎週IPまたはIDによって増加する投薬量（50、200、および500μg）のGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBS媒体で処置された対照動物からの血清を、犠牲死の時に採取した。市販されているキットを使用して、抗二本鎖DNA抗体を測定した。抗体力価のプロットは、増加するGpG濃度にともなう抗DNA応答における用量依存性の低下を明らかにする。
【図１２】I-18m IMSオリゴ処置が、狼瘡のマウスモデルにおける抗DNA抗体応答を有意に低下させることを示す。IP注射によって毎日50μgのGpG、I-18h、I18m、またはTpTで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBS媒体単独で処置された対照群からの血清を、犠牲死の時に収集した。市販されているキットを使用して、抗二本鎖DNA抗体を測定した。抗体力価のプロットは、I-18m処置が、対照と比較してDNAに対する自己抗体レベルを有意に低くしたことを明らかにする。
【図１３】低用量ステロイドと組み合わせたGpG IMSオリゴが、EAUに関連する炎症を低下させることを示す。hIRBP161-180ペプチドで免疫されたB10.RIIIマウスに、200μg GpGまたはTpTプラス低用量デプロメドロール（1mg/kg）を毎週IDで投薬した。各々の実験群に対する平均的重症度スコアを与えるために、21日目の目の組織学的評価を、EAUにおける専門家によって盲検法でスコア化した。ステロイド単独またはステロイドプラスTpT IMSオリゴの投与は、ブドウ膜炎の重症度に対する有意な影響を有しないが、ステロイドプラスGpGでの処置は、疾患スコアを有意に低くした。
【図１４】GpG IMSオリゴ処置が単独でEAUにおける炎症の重症度を有意に低下させることを示す。hIRBP161-180ペプチドで免疫されたB10.RIIIマウスに、単独でまたは腹腔内もしくは皮内低用量デプロメドロール（1mg/kg）と組み合わせて、200μg GpGまたはTpTオリゴを投与し、犠牲死させ、組織学的評価のために目を採取した。目を、EAUにおける専門家によって盲検法でスコア化した。ブドウ膜炎の重症度に対する単独またはGpGオリゴと組み合わせたステロイドの有意な効果は観測されなかったが、GpG単独のIP送達は、抗CD3陽性対照と同様の重症度スコアにおける有意な改善を提供した。
【図１５】IMSオリゴの毎日のIP送達が、EAU疾患重症度に影響を与えないことを示す。hIRBP161-180ペプチドで免疫されたB10.RIIIマウスに、0日目に開始してIP注射によってI-18h、I-18m、GpG、またはTpTを毎日投薬した。21日目に、動物を犠牲死させ、組織学のために目を採取した。目組織学を、EAUにおける専門家によって盲検法でスコア化した。IMSオリゴは、EAU疾患重症度に対する有意な効果を有しなかった。
【図１６】GpG IMSオリゴでの処置が、養子免疫伝達後のEAU疾患重症度スコアを低くすることを示す。hIRBP161-180免疫マウスからのリンパ節および脾臓細胞を、誘導ペプチドとともに3日間インビトロで培養した。4日目に、3×107細胞をナイーブB10.RIII動物へ移し、次いで、IP送達によって200μgのGpGオリゴまたはPBSで毎週処置した。疾患重症度を低くする傾向が観測された。
【図１７】I-18h IMSオリゴが、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける平均関節炎罹患率を有意に低下させることを示す。0日目にモノクローナル抗コラーゲン関節炎発症抗体をIVで注射されたBalb/cマウスを、4〜10日目にIP注射によって毎日投与される50μg IMSオリゴで処置した。動物を観測し、疾患を毎日スコア化した。各々の実験群に対する平均関節炎スコアが、時間にわたって示される。I-18hオリゴでの処置は、PBS対照群およびGpGオリゴでの処置の両方と比較して、平均関節炎スコアを有意に軽減した。
【図１８】I-18hが、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける関節炎の罹患率を有意に低下させることを示す。0日目にモノクローナル抗コラーゲン関節炎発症抗体をIVで注射されたBalb/cマウスを、4〜10日目にIP注射によって毎日投与される50μg IMSオリゴで処置した。動物を観測し、疾患を毎日スコア化した。I-18hオリゴでの処置は、PBS対照群およびGpGオリゴでの処置の両方と比較して、関節炎罹患率を有意に軽減した。
【図１９】GpGオリゴでの前処置が、TNBS誘導大腸炎に応じたその後の体重損失を低下させることを示す。-5日目に大腸炎発症用量以下のTNBS（0.5％）で経直腸的に処置されたC3Hマウスに、-5日目から大腸炎発症用量のTNBS（3.5％）が投与された0日目まで毎日GpGオリゴを投与した。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、TNBSを与えられなかった動物である。媒体対照は、TNBSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSで処置された。統計分析により、10または100μg用量のGpGオリゴでの処置は、媒体処置対照群よりも有意に良いが、GpGオリゴ50μg用量群は、統計的有意性に達しないことが明らかになった。
【図２０】I-18hオリゴでの前処置が、TNBS誘導大腸炎に応じたその後の体重損失を低下させることを示す。-5日目に大腸炎発症用量以下のTNBS（0.5％）で経直腸的に処置されたC3Hマウスに、-5日目から大腸炎発症用量のTNBS（3.5％）が投与された0日目まで毎日I-18hオリゴを投与した。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、TNBSを与えられなかった動物である。媒体対照は、TNBSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSで処置された。統計分析により、全ての投薬量でのI-18hオリゴでの処置は、媒体処置対照群よりも有意に良いことが明らかになった。
【図２１】I-18mオリゴでの前処置が、TNBS誘導大腸炎に応じたその後の体重損失を低下させることを示す。-5日目に大腸炎発症用量以下のTNBS（0.5％）で経直腸的に処置されたC3Hマウスに、-5日目から大腸炎発症用量のTNBS（3.5％）が投与された0日目まで毎日I-18hオリゴを投与した。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、TNBSを与えられなかった動物である。媒体対照は、TNBSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSで処置された。統計分析により、50μgのI-18mオリゴでの処置は、媒体処置対照群よりも有意に良いが、100μg用量レベルは、統計的有意性に達しないことが明らかになった。
【図２２】GpGでの前処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失を有意に低下させることを示す。50または200μgのGpGオリゴのIP注射で-2日目に開始して前処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μg GpGオリゴ処置群において体重損失における有意な低下が明らかになった（p<0.05；ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。200μg用量レベルは、統計的有意性に達しなかった（p>0.05）。
【図２３】I-18hオリゴでの前処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失を有意に低下させることを示す。50または200μgのI-18hオリゴのIP注射で-2日目に開始して前処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μg I-18h処置群において体重損失における有意な低下が明らかになった（p<0.05；ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。200μg用量レベルは、統計的有意性に達しなかった（p>0.05）。
【図２４】疾患誘導の時に開始するGpGオリゴでの処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失を有意に低下させることを示す。GpGオリゴのIP注射で0日目に処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μg（p<0.01）および200μg（p<0.05）GpGオリゴ処置群において体重損失における有意な低下が明らかになった（ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。さらに、50μg GpGオリゴ処置群は、非処置（DSS無し）対照群と有意に異ならず（p>0.05）、GpGオリゴのこの用量レベルでのDSS誘導大腸炎の完璧な阻害を示唆する。
【図２５】疾患誘導の時に開始するI-18hオリゴでの処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失に対する有意な効果を有しないことを示す。I-18hオリゴのIP注射で0日目に処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μgまたは200μg I-18hオリゴ処置群において体重損失における有意な低下は明らかにならなかった（ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。
【図２６】I18突然変異生成を示す。ヒトPBMCを、刺激性CpG-ODN（5μg/ml）およびI18に由来する抑制性IMSの存在下でインキュベートした。細胞を96時間DNAとともにインキュベートし、ウェルを培養の最終の24時間1μCi[3H]TdRでパルスし、取り込まれた放射能を測定した。I18由来配列（上）は、CpG刺激増殖の割合抑制（下）とともに示される。ポリG領域内の突然変異（I18.M3〜6および8）は、2つの異なるドナーからのPBMC増殖を抑制する六量体配列 5'-GTGGTT-3'を含むオリゴヌクレオチドの能力を有意に軽減した。
【図２７】I18突然変異生成を示す。ヒトPBMCを、刺激性CpG-ODN（5μg/ml）およびI18に由来する抑制性IMSの存在下でインキュベートした。細胞を96時間DNAとともにインキュベートし、ウェルを培養の最終の24時間1μCi[3H]TdRでパルスし、取り込まれた放射能を測定した。I18由来配列（上）は、CpG刺激増殖の割合抑制（下）とともに示される。六量体配列に対して5'側の突然変異（I18.M10〜12）は、PBMC増殖を抑制する六量体配列 5'-GTGGTT-3'を含むオリゴヌクレオチドの能力を有意に軽減した。さらに、六量体配列とポリGとの間のヌクレオチドの付加は、PBMC増殖を緩やかに軽減した（I18.M13〜16）。
【図２８】ヒトI18およびマウスI18の核酸配列の比較を図示する。
【図２９】I18が、TLR3、5、7、および9を抑制することを示す。TLR2、3、4、5、7、8、または9を発現するHEK 293細胞を、対応するTLRリガンドの存在下で25μg/mLでI18を含む免疫調節配列とともにインキュベートし、NF-κBの活性化を決定した。リガンドの非存在下でのベースラインシグナリングが、第一列に示され（リガンド無し）、TLRのそれらの対応するリガンドによる活性化が、最終列に示される（対照+）。リガンドの存在下でのI18は、TLR3、5、7、および9によるシグナリングを抑制する（I18+リガンド；前から2番目の列）。
【図３０】I18が、pDCによるIFN-αのTLR7リガンド誘導産生を抑制することを示す。A. TLR7リガンドロキソリビンまたはR-837とともにインキュベートされる場合、ドナー1から単離されたpDCは、IFN-αを産生する。IFN-α産生は、5μg/mLまたは25μg/mLでI18によって完璧に阻害される。B. 同様に、5μg/mLでのI18は、TLR7リガンドに応じたドナー2から単離されたpDCによるIFN-α発現を完璧に阻害する（ロキソリビン対lox+I18）。
【図３１】I18が、PBMCによるIFN-αのTLR3リガンド誘導産生を抑制することを示す。A. ドナー1から単離されたPBMCは、PolyI:Cに応じてIFN-αを産生し、これは、25μg/mLでI18によって阻害される。B. ドナー2から単離されたPBMCにおけるTLR3活性化によるIFN-αの産生は、5μg/mLおよび25μg/mL I18の両方によって阻害される。
【図３２】I18が、pDCによるIFN-αのCpG誘導産生を抑圧することを示す。A, B. 単独で（CpG）または増加する量のI18の存在下で（CpG+I18）、免疫刺激性CpG配列とともにインキュベートされたドナー1および2から単離されたpDCによるIFN-α産生を、ELISAによって測定した。I18は、IFN-α産生を抑圧する。C, D. 単独で（C274）または24時間等モル比でI18（I18(1)(To)+C274(1)(24時間)）もしくは5倍過剰のI18（I18(5)(To)+C274(1)(24時間)）でプレインキュベートされた後に、CpG配列とともにインキュベートされたドナー1および2から単離されたpDCによるIFN-α産生。I18でのプレインキュベーションは、IFN-α産生を完璧に阻害する。
【図３３】抗dsDNA抗体を有するSLE患者からの免疫複合体が、pDCによるIFN-αの産生を誘導することを示す。A. 4人のSLE患者（SLE 19558；SLE 22914；SLE KP491；SLE KP504）対正常対照（正常）からの血清を、ELISAによって抗dsDNA抗体に対してアッセイした。B. 血清免疫複合体を、4人のSLE患者（SLE 19558；SLE 22914；SLE KP491；SLE KP504）および正常対照（正常）から単離した。C. 単離免疫複合体を、単離ヒトpDCとともにインキュベートし、IFN-αの産生を、ELISAによってアッセイした。pDC単独（細胞のみ）は、IFN-αをほとんど産生しないが、免疫刺激性CpG配列および抗dsDNA抗体を有するSLE患者（19558および22914）からの免疫複合体によって誘導される。対照的に、抗dsDNA抗体を有しないSLE患者（KP491およびKP504）からの免疫複合体または正常対照（正常SG）は、IFN-α産生を誘導しない。
【図３４】I18が、pDCによるIFN-αのSLE-免疫複合体誘導を抑制することを示す。血清が抗dsDNA抗体を含むSLE患者からの精製Igおよび正常対照を、I18とともにまたはともなわずに、単離pDCとともに24時間インキュベートした。単離pDC（細胞のみ）または正常対照からの免疫複合体とともにインキュベートされたpDC（正常）は、IFN-αをほとんど産生しなかった。対照的に、SLE患者からの免疫複合体とともにインキュベートされたpDCは、有意な量のIFN-αを産生した（SLE 19558；SLE 22914）。IFN-αの産生は、I18によって抑制される（SLE 19558+I18；SLE 22914+I18）。
【図３５】I18が、正常末梢CD19+ B細胞のCpG活性化を抑制することを示す。A, B. CD19+ B細胞を、単独で（DNA無し）、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG(5)）、または5μg/mL I18の存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG+I18(5)）インキュベートし、サイトカインレベルをELISAによって分析した。I18は、CpG刺激IL-6（A）およびIL-10（B）発現の両方を抑圧した。C. CD19+ B細胞を、単独で（DNA無し）、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG）、5μg/mL I18の存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG+I18(5)）、または25μg/mL I18の存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG+I18(25)）インキュベートした。細胞増殖を、[3H]チミジン取り込みによってアッセイした。I18は、両方の投薬量でCpG刺激B細胞増殖を有意に抑圧した。
【図３６】I18が、SLEと診断された患者からの末梢CD19+ B細胞のCpG活性化を抑制することを示す。A, B. CD19+ B細胞を、単独で（細胞のみ）、5μg/mL刺激性CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mLの存在下で5μg/mL刺激性CpGとともに（CpG+I18(5)）、または5μg/mL刺激性CpGおよび25μg/mL I18とともに（CpG+I18(25)）インキュベートし、サイトカインレベルをELISAによって分析した。I18は、CpG刺激IL-6（A）およびIL-10（B）発現の両方を抑圧した。C. CD19+ B細胞を、単独で（細胞のみ）、5μg/mL刺激性CpGとともに（CpG-5）、1μg/mL（CpG+I18-1）、5μg/mL（CpG+I18-5）、または25μg/mL（CpG+I18-25）I18の存在下で5μg/mL刺激性CpGとともにインキュベートした。細胞増殖を、[3H]チミジン取り込みによってアッセイした。I18は、全ての用量でCpG刺激C細胞増殖を有意に抑圧した。
【図３７】I18が、正常B細胞におけるIL-6の発現を活性化することを示す。A. 単離CD19+CD27+記憶B細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-6発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と比較して、記憶B細胞におけるIL-6のより低いレベルの発現を誘導する。B. 単離CD19+CD27-ナイーブB細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-6発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と同様の度合にナイーブB細胞におけるIL-6発現を活性化する。
【図３８】I18が、正常B細胞におけるIL-10の発現を活性化することを示す。A. 単離CD19+CD27+記憶B細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-10発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と比較して、記憶B細胞におけるIL-10のより低いレベルの発現を誘導する。B. 単離CD19+CD27-ナイーブB細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-10発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と比較して、ナイーブB細胞におけるIL-10のより低いレベルの発現を誘導する。
【図３９】I18が、正常B細胞における共刺激性マーカーの発現を活性化することを示す。単離CD19+ B細胞を、単独で（dna無し）、単独で（CpG-1826）もしくはクロロキンの存在下で（CpG-1826+Chl）5μg/mL CpGとともに、または単独で（I18）もしくはクロロキンの存在下で（I18+Chl）5μg/mL I18とともにインキュベートした。CD80およびCD86の発現を、FACsにより決定し、各々の共刺激性マーカーを発現する細胞の割合が示される。I18は、CpG配列よりも低いレベルで発現CD80およびCD86を活性化する。
【図４０】I18が、正常B細胞の長期生存または増殖を刺激しないことを示す。単離CD19+ B細胞を、単独で（細胞のみ）；1μg/mLの3つの異なるCpG配列（1018；2395；2006）；または0.2μg/mL、1μg/mL、もしくは5μg/mL I18とともにインキュベートした。細胞の開始濃度が示され、13日後の各々の条件下での細胞の全数がグラフにされる。I18は、B細胞の生存または増殖を増加させなかった。
【図４１】I18が、狼瘡B細胞の弱い活性化因子であることを示す。狼瘡患者からの単離CD19+ B細胞を、単独で（dna無し）；1μg/mL、5μg/mL、もしくは25μg/mL I18とともに、5μg/mL CpGとともに；または5μg/mLもしくは25μg/mL I18の存在下で5μg/mL CpGとともにインキュベートした。IL-6発現（A）、IL-10発現（B）、および細胞増殖（C）を分析した。I18は、IL-6およびIL-10の両方の発現を弱く活性化し、細胞増殖をわずかに増加させた。
【図４２】SLE動物モデルにおけるI18投与が、抗dsDNS抗体を発現する動物の割合を低下させることを示す。I18 IMSオリゴを、皮内送達によって10μg、50μg、および250μgで毎週NZB/W F1メスマウスに投与した。抗dsDNA抗体を有する動物の割合を、PBS陰性対照およびステロイド陽性対照（Depo+シトキサン）と比較してグラフにした。抗dsDNA抗体を有する動物の割合は、50μg（p＝0.17）および250μg（p＝0.04）の毎週の用量のI18を受けた群において統計的に少なかった。
【図４３】SLE動物モデルにおけるI18投与が、疾患発症を遅らせることを示す。NZB/W F1メスに、全部で45週間毎日、週に3回、または毎週10μg、50μg、または250μg I18を投与した。タンパク尿発症を査定し、タンパク尿を有する動物の割合を、時間にわたって各々の群に対して示した。A. 10μg I18の投与は、疾患発症に影響を与えなかった。B. 50μg I18の毎日、週に3回、および毎週の投与は、PBS対照と比較して低下した疾患発症の傾向を示した。C. 250μg I18の毎週および週に3回の投与は、PBS対照と比較して低下した疾患発症の傾向を示した。
【図４４】SLE動物における250μgでのI18投与が、疾患発症を遅らせることを示す。NZB/W F1メスに、全部で45週間毎日、週に3回、または毎週10μg、50μg、または250μg I18を投与した。タンパク尿発症を査定し、タンパク尿を有する動物の割合を、時間にわたって各々の群に対して示した。A. 10μgまたは50μgでのI18の毎日の投与は、疾患発症に影響を与えなかった。B. 250μgでの週に3回のI18の投与は、10μgおよび50μg I18での投与と比較して統計的に有意な傾向を示した（ログランク検定p＝0.31）。C. 250μgでのI18の毎週の投与は、10μgおよび50μg I18での投与と比較して統計的に有意な傾向を示した（ログランク検定p＝0.03）。
【図４５】I18由来オリゴヌクレオチドが、ヒトB細胞によるIL-6のCpG刺激産生を抑制することを示す。単離ヒトB細胞を、5μg/mL刺激性CpG-ODNもしくはI18由来オリゴヌクレオチド単独で（左カラム）、または5μg/mL I18もしくはI18由来オリゴヌクレオチドの存在下で刺激性CpG-ODNとともに（右カラム）48時間インキュベートした。培養培地におけるサイトカインレベルを、ELISAによって分析し、y軸のpg/mlとして記録した。
【図４６】I18とM49との間の配列比較を図示する。
【図４７】インビトロでのI18およびM49抑制性活性の比較を図示する：マウス脾細胞を、健康なC57Bl/6マウスから単離し、（a）TLR9（10μg/mlでCpGオリゴ1018）および（b）TLR7（1μg/mlでガルジキモド（gardiquimod））アゴニストならびに抑制性オリゴヌクレオチドの用量範囲の存在下で1×106細胞/mlの密度で培養した。抑制性オリゴおよびアゴニストを、培養に同時に添加した。培養上清を、オリゴおよびアゴニストの添加の24時間後に単離し、IL-6レベルを、市販のELISAキットを使用して決定した。アゴニスト単独のレベルに対して各々のオリゴ用量に対するIL-6レベルの量を計算することによって、％抑制を決定した。I18化合物は、これらのアッセイにおいて、TLR9およびTLR7の両方の緩やかにより良い抑制剤である。
【図４８】インビボでのI18およびM49抑制性活性の比較を図示する：I18と比較して、M49は、TLR9抑制性活性を緩やかに低下させ、CD40Lシナジーアッセイにおいて査定されたB細胞アゴニスト活性を低下させた。それは、I18よりも優れて、NZB/Wモデルにおいて生存率を改善しかつタンパク尿スコアおよび抗dsDNA抗体力価を低くする効能を有する。M49は、六量体コア領域における配列変化が、I18における「CCC」対「GTT」の置換のように、活性に影響を与えることを示す。NZBモデルにおけるM49の増加した効能および低下したアゴニスト活性。M49は、脾細胞アッセイにおいてあまり有効ではないTLR9抑制剤であるが、より良いインビボ効能を有する。NZB/W F1マウス（群あたりn＝15）に、21週齢に開始して40週齢まで継続して、週に1回250μg（5mg/ml PBS溶液の0.05 mL）のオリゴヌクレオチド（I18、M49）の皮下注射を与えた。対照マウスに、0.05 mLのPBSを毎週投薬した。プレ出血および毎月の出血を、自己抗体プロファイリングのために取り、タンパク尿レベルを毎週測定した。重さを測定し、体重における25％低下が観測された後に動物を安楽死させた。M49オリゴ処置は、研究の終了ポイント（20週の処置）で市販のELISAキットによって測定されるように、タンパク尿レベルにおける低下（a）、致死性の完璧な予防（b）、および抗dsDNA抗体レベルにおける軽減（c）を引き起こした。
【図４９】組換えCD40リガンドおよびオリゴヌクレオチドM49の組み合わせとともにインキュベートされたヒトB細胞の低下した活性化を図示する。健康なドナーの血液から精製されたヒトB細胞を、単独でまたは1μM用量の抑制性オリゴヌクレオチド（I18またはM49）の存在下で、組換えCD40リガンドとともにインキュベートした。24時間インキュベーションの後に培養から上清を除去し、IL-6タンパク質のレベルをELISAによって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、当然のことながら、変更しうる特定の製剤またはプロセスパラメーターに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書において使用する用語は本発明の特定の態様を記載するためだけであり、限定する意図のものではないことが理解されるべきである。
【００３９】
定義
本明細書において使用する「核酸」および「ポリヌクレオチド」は同義であり、ヌクレオチドのポリマー（例えば、一本鎖または二本鎖の形態を含むデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの類似物）をいう。
【００４０】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」とは、長さ約6〜約175ヌクレオチド以上の核酸のサブセットをいう。本発明の典型的なオリゴヌクレオチドは、長さが約14ヌクレオチドから最長約50、75または100ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドをいい、以降ODNと呼ばれる。ODNはオリゴヌクレオチドおよび他の有機塩基を含有するポリマーを含む。
【００４１】
ヌクレオチドは、リン酸基および置換プリン（グアニン(G)、アデニン(A)またはイノシン(I)）または置換ピリミジン（チミン(T)、シトシン(C)またはウラシル(U)）であってもよい交換可能な有機塩基に結合した糖（好ましくは、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子である。
【００４２】
免疫調節配列（IMS）
本明細書において使用する「免疫調節配列」または「IMS」は、自己免疫疾患または炎症性疾患を調節することができる核酸または核酸領域のヌクレオチドの配列をいう。例えば、IMSは、オリゴヌクレオチドまたは例えば発現ベクターなどのベクターに取り込まれたヌクレオチドの配列であってもよい。本発明のIMSは、典型的には、長さが約14〜約50ヌクレオチドであり、より通常では、約15〜約30ヌクレオチドである。本明細書において使用される「免疫調節核酸」は、一つまたは複数のIMSを含む核酸分子を意味する。IMSという用語は、免疫抑制性配列（IIS）と同じ意味で使用される。
【００４３】
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する「同一性」または「同一性の割合」という用語は、例えば、PILEUPもしくはBLASTなどの配列比較アルゴリズムまたは同様のアルゴリズム（例えば、HigginsおよびSharp、CABIOS, 5: 151-153, 1989；Altshul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を使用して測定するとき、一致が最大になるように比較整列するとき、同一であるまたは同一である特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つ以上の配列またはサブ配列をいう。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison、WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）または目視検査（一般に、Ausubel et al., 上記を参照されたい）によって実施することができる。
【００４４】
2つの核酸またはポリペプチドに関して「実質的に同一である」というフレーズは、一致が最大になるように比較整列するとき、少なくとも60%、好ましくは少なくとも約70%、さらに好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約90%または少なくとも約95%、97%もしくは99%のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する2つ以上の配列またはサブ配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は長さが少なくとも約50残基である配列の領域に存在し、さらに好ましくは少なくとも約100残基の領域に存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約150残基にわたって実質的に同一である。好ましい態様において、配列は、所定の核酸またはポリペプチドの全長にわたって実質的に同一である。本発明のある態様において、核酸またはポリペプチド（例えば、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドもしくは自己-ペプチドまたは自己-タンパク質、自己-ポリペプチドもしくは自己-ペプチドをコードする核酸）は、本明細書に開示する特定の核酸またはポリペプチドと実質的に同一である。
【００４５】
本明細書において使用する「自己分子」とは、自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾された自己-タンパク質、-ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。「自己タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたは断片もしくは誘導体」は、動物のゲノムにコードされているタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを含み；動物内で作製もしくは形成され；動物の生涯のどこかで翻訳後修飾されることがあり；または動物に非生理的に存在する。本発明の自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドを記載するために使用する場合の「非生理的な」または「非生理的に」という用語は、動物におけるその自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドの正常な役割または過程からの逸脱または偏移を意味する。本発明の自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドはまた、自己抗原も指す。自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドを「疾患に関連する」または「疾患に関与する」という場合には、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドは形態もしくは構造が改変されており、従ってその生理的役割もしくは過程を実施できない；または病態生理学を誘導することによって、病態生理学的過程を媒介もしくは促進することによっておよび/または病態生理学的過程の標的であることによって状態もしくは疾患の病態生理学に関与することがあることを意味すると理解される。例えば、自己免疫疾患では、免疫系は、自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾された自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質などの自己分子を異常に攻撃し、自己分子が発現されるおよび/または存在する細胞および組織の損傷および機能不全を生じる。または、分子自体が、非生理的レベルで発現されるおよび/または非生理的に機能することがある。例えば、神経変性性疾患では、自己-タンパク質が異常に発現されて、脳の病巣に集まり、それによって神経の機能不全を生じる。他の場合では、自己分子は望ましくない状態または過程を悪化する。例えば、骨関節炎では、コラゲナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼを含む自己-タンパク質は、関節面を覆う軟骨を異常に分解する。自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドの翻訳後修飾の例は、グリコシル化、脂質基の付加、ホスファターゼによる脱リン酸化、ジメチルアルギニン残基の付加、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）によるフィラグリンおよびフィブリンのシトルリン化；αB-クリスタリンリン酸化；MBPのシトルリン化ならびにカスパーゼおよびグランザイムによるSLE自己抗原タンパク質分解である。免疫学的には、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドは全て宿主の自己-抗原であると思われ、正常な生理的条件下では、「免疫寛容」と名づけられる過程により自己-抗原を認識する能力を有する免疫細胞の排除、不活性化または活性化の欠如によって宿主の免疫系によって無視される。自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドは、免疫機能を調節する目的のために免疫系の細胞によって生理的、特異的および独占的に発現される分子である免疫タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含まない。免疫系は、動物界に住む無数の病原性であると思われる微生物に対して迅速で、高い特異性の防御応答をする手段を提供する防御機序である。免疫タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの例は、T-細胞受容体、免疫グロブリンを含むタンパク質、インターフェロンおよびIL-10、TNF-α、リンフォトキシンを含むI型インターロイキンおよびII型サイトカインを含むサイトカイン、マクロファージ炎症性タンパク質-1αおよびβ、単球-走化性タンパク質およびRANTESなどのケモカインならびにFas-リガンドなどの免疫機能に直接関与する他の分子である。本発明の自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに含まれるある種の免疫タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドがあり、それらは：クラスI MHC膜糖タンパク質、クラスII MHC糖タンパク質およびオステオポンチンである。自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドは、代謝的または機能的障害を生じる遺伝的または後天性不全によって完全または実質的に被験者に存在せず、そのタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの投与またはそのタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与（遺伝子治療）によって代えられるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含まない。このような障害の例には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症およびホモシスチン尿症が挙げられる。自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドは、（1）悪性細胞のクローンを形成する遺伝子変化を有する1つの細胞の増殖を示すクロナリティ、（2）増殖が適切に調節されていないことを示す自律性および（3）退形成すなわち正常な協調的細胞分化の欠如を含む、正常な相手から識別する特徴を有する細胞によって特異的および独占的に発現されるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含まない。細胞は、腫瘍、癌または悪性細胞といわれる上記の3つの基準の一つまたは複数を有する。
【００４６】
「プラスミド」および「ベクター」は、小文字のpに続く文字および/または数字によって示される。出発のプラスミドは購入可能であり、自由に公的に入手可能であり、または報告されている手法に添って入手可能なプラスミドから構築することができる。また、記載されているものと等価なプラスミドは当技術分野において既知であり、当業者に明らかである。「ベクター」または「プラスミド」は、宿主細胞に存在する場合に、適切な制御および調節要素を含むことによって複製することができる任意の遺伝的要素をいう。本発明の目的のために、ベクターまたはプラスミドの例には、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書において使用する「ネーキッド核酸」とは、（例えば、ウイルス粒子、細菌細胞またはリポソーム内などのように）被包されておらず、（例えば、DEAE-デキストランなどのように）核酸に結合するまたは（例えば、金粒子または多糖-系支持体のように）核酸に接合する分子と複合体を形成しない核酸分子をいう。
【００４８】
疾患または障害を「処置する」、疾患または障害の「処置」または「治療」とは、本発明の免疫調節核酸の投与によって、臨床症状または診断症状の減少、停止または排除によって明らかなように、確立した疾患の進行を遅くすること、停止することまたは回復させることを意味する。「確立した疾患」は、免疫系が活発で、罹患組織に炎症が見られ、白血球およびリンパ球の異常な浸潤が見られることを意味する。疾患または障害を「処置する」、疾患または障害の「処置」または「治療」は、また、免疫調節核酸を自己分子と併用して投与することによって疾患の進行を遅くすること、停止することまたは回復させることを意味する。本明細書において使用する「自己分子」は、自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾された自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質をいう。疾患または障害を「処置する」、疾患または障害の「処置」または「治療」は、免疫調節核酸を免疫調節治療薬と併用して投与することによって疾患の進行を遅くすること、停止することまたは回復させることをさらに意味する。免疫調節核酸および別の化合物、例えば、自己-タンパク質、-ペプチドまたは-ポリペプチドをコードするDNAを含む治療法をいう場合の「併用」は、2つ以上の化合物が別個であるが、バイアルでの同時投与のように物理的に一体として投与されこと、例えば、接合によって一体として結合されること、一つまたは複数のベクターのDNAによってコードされることまたは異なる部位に別個に投与されるが、「併用」投与されると当業者に考えられるように時間的に近接して一体として投与されることを含む。本明細書において使用される疾患を軽減することと疾患を処置することは等価である。
【００４９】
本発明に関して使用する疾患または障害を「予防する」、疾患または障害の「予防（prophylaxis）」または「予防（prevention）」とは、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全ての出現または発症を予防するため、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下するために、免疫調節配列を単独または本明細書に記載する別の化合物と併用して投与することをいう。本発明に関して使用する疾患または障害を「予防する」、疾患または障害の「予防（prophylaxis）」または「予防（prevention）」は、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全ての出現または発症を予防するため、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下するために、免疫調節配列を自己分子と併用して投与することをいう。本発明に関して使用する疾患または障害を「予防する」、疾患または障害の「予防（prophylaxis）」または「予防（prevention）」は、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全ての出現または発症を予防するため、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下するために、免疫調節配列を免疫調節治療薬と併用して投与することをいう。本明細書において使用する「免疫調節治療薬」は、被験者に投与されるとき、免疫調節または調整機能を有するような分子をいう。このような免疫調節治療薬には、サイトカイン、ケモカイン、ステロイドまたは抗原もしくは自己抗原に対する抗体が挙げられる。
【００５０】
「被験者」とは、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットまたはウサギなどの任意の動物をいう。
【００５１】
自己免疫疾患
本明細書に記載する組成物および方法は自己免疫疾患の処置または予防に有用である。動物に非生理的に存在する自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾された自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質または自己分子の誘導体を含む自己分子に関連する自己免疫疾患の例のいくつかは以下の表に記載されており、以下に記載されている。
【００５２】
（表１）
2009540016.tif 000004
【００５３】
多発性硬化症：多発性硬化症（MS）は中枢神経系（CNS）の最も一般的な脱髄性障害であり、350,000人の米国人および世界の100万人が罹患している。例えば、
2009540016.tif 000005
を参照されたい。
【００５４】
症状の発症は、典型的には、20〜40歳に生じ、一側性の視覚障害、筋脱力、知覚異常、失調症、眩暈、尿失禁、構語障害または精神障害（出現頻度が高い順）の急性または亜急性発作として発現する。このような症状は、軸索伝導の遅延による負の伝導異常および異所性活動電位発生による正の伝導異常（例えば、レルミット症状）を生じる脱髄の局所性病変によって生じる。MSの診断は、時間的に間隔があり、神経学的機能不全の他覚的臨床徴候を生じ、CNS白質の別個の領域に関係する神経学的機能不全の少なくとも2回の別個の発作を含む病歴に基づく。MSの診断を裏付ける追加の他覚的証拠を提供する実験室における研究は、CNS白質病変の核磁気共鳴画像法（MRI）、脳脊髄液（CSF）のIgGのオリゴクローナルバンドおよび異常な誘導電位応答が挙げられる。ほとんどの患者は、徐々に進行する再発寛解型疾患経過を経験するが、MSの臨床経過は個人によって大きく異なり、生涯にわたって軽度の発作が数回しか起こらないものから劇症型の慢性進行性疾患まで多岐にわたる。IFN-γを分泌する能力を有するミエリン-自己反応性T細胞の定量的な増加がMSおよびEAEの病因に関連している。
【００５５】
関節リウマチ：関節リウマチ（RA）は、世界人口の0.8%が罹患している慢性自己免疫性炎症性滑膜炎である。関節リウマチは、びらん性関節破壊を生じる慢性炎症性滑膜炎によって特徴付けられる。例えば、
2009540016.tif 000006
を参照されたい。RAは、T細胞、B細胞およびマクロファージによって媒介される。
【００５６】
T細胞がRAに重大な役割を果たす証拠には、（1）多量のCD4+ T細胞が滑膜に浸潤すること、（2）シクロスポリンなどの薬物によりT細胞機能の抑制に関連する臨床症状の改善が見られることおよび（3）RAとある種のHLA-DR対立遺伝子の関連が挙げられる。RAに関連するHLA-DR対立遺伝子は、ペプチド結合およびT細胞への提示に関与するβ鎖の第3の高頻度可変領域の67〜74位に同様の配列のアミノ酸を含有する。RAは、宿主の滑膜関節等に存在する自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾される自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドもしくは糖タンパク質または未同定の自己生体分子を認識する自己反応性T細胞によって媒介される。自己抗原とも言われる本発明の自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドはRAにおいて標的とされ、II型コラーゲン；hnRNP；A2/RA33；Sa；フィラグリン；ケラチン；シトルリン；gp39を含む軟骨タンパク質；I、III、IV、V、IX、XI型コラーゲン；HSP-65/60；IgM（リウマチ因子）；RNAポリメラーゼ；hnRNP-B1；hnRNP-D；カルジオリピン；アルドラーゼA；シトルリン-修飾フィラグリンおよびフィブリン由来のエピトープを含む。修飾アルギニン残基（脱-イミノ化されてシトルリンを形成する）を含有するフィラグリンペプチドを認識する自己抗体は、大多数のRA患者の血清中で同定されている。自己反応性TおよびB細胞応答が共に、免疫優性の同一のII型コラーゲン（CII）のペプチド257〜270に向かう患者もいる。
【００５７】
インスリン依存性糖尿病：ヒトI型すなわちインスリン依存性糖尿病（IDDM）は、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞の自己免疫的な破壊によって特徴付けられる。B細胞が欠損すると、血中のグルコース濃度を調整することができなくなる。例えば、
2009540016.tif 000007
を参照されたい。
【００５８】
血中のグルコース濃度が特定の濃度、通常約250 mg/dlを超えると顕性の糖尿病が生じる。ヒトでは、長期間の前駆症状期間が糖尿病発症の前に存在する。この期間中に、膵臓のβ細胞の機能が徐々に損失する。疾患の発症は、本発明による自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドの各々の例として、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素およびチロシンホスファターゼIA2（IA2）に対する自己抗体の存在に関係する。
【００５９】
前駆症状段階中に評価することができるマーカーは、膵臓における膵島炎の存在、島細胞抗体のレベルおよび頻度、島細胞表面抗体、膵臓のβ細胞におけるクラスII MHC分子の異常な発現、血中グルコース濃度ならびに血漿インスリン濃度である。膵臓におけるTリンパ球の数、島細胞抗体および血中グルコースの増加は、インスリン濃度の低下と同様に、疾患を示す。
【００６０】
非肥満性糖尿病（NOD）マウスは、ヒトIDDMに共通する多数の臨床的、免疫学的および組織病理学的特徴を有する動物モデルである。NODマウスは島の炎症およびβ細胞の破壊を自然に生じ、高血糖および顕性の糖尿病を生じる。糖尿病を発症させるためにはCD4+およびCD8+ T細胞が必要であるが、各々の役割は不明である。負荷条件下でタンパク質として投与するとき、疾患を予防し、他の自己-抗原に対する応答をダウンレギュレーションすることができるのはインスリンおよびGADを用いて示されている。
【００６１】
重要なことには、NODマウスは、清潔な無菌の飼育室で、無菌環境において自己免疫性糖尿病を発症する。
【００６２】
ヒトIDDMは、現在、組換えインスリンの注射またはポンプを利用した送達をガイドするために、血中グルコース濃度をモニタリングすることによって処置される。食事および運動療法は、適当な血中グルコースコントロールの達成に貢献する。
【００６３】
自己免疫性ブドウ膜炎：自己免疫性ブドウ膜炎は、米国で400,000人が罹患していると推定され、年間43,000人の発現頻度で新たな症例が報告されている眼の自己免疫疾患である。自己免疫性ブドウ膜炎は、現在、ステロイド、メトトレキセートおよびシクロスポリンなどの免疫抑制剤、静注免疫グロブリンならびにTNFα-アンタゴニストで処置されている。例えば、
2009540016.tif 000008
を参照されたい。
【００６４】
実験的自己免疫ブドウ膜炎（EAU）は、眼の網膜神経、ブドウ膜および関連組織を標的とするT細胞-媒介性の自己免疫疾患である。EAUは、ヒト自己免疫性ブドウ膜炎と多数の臨床的および免疫学的特徴が共通しており、ブドウ膜炎誘発性（uveitogenic）ペプチドを完全フロイントアジュバント（CFA）に乳化したものを抹消投与することによって誘発される。
【００６５】
ヒト自己免疫性ブドウ膜炎において自己免疫応答が標的とする自己-タンパク質には、S抗原、光受容体間（interphotorecepter）レチノイド結合タンパク質（IRBP）、ロドプシン、リカバリンを挙げることができる。
【００６６】
原発性胆汁性肝硬変：原発性胆汁性肝硬変（PBC）は、40〜60歳の女性が主に罹患する臓器-特異的自己免疫疾患である。このグループで報告されている有病率は1,000人当たりについて1人に近い。PBCは、肝内小胆管の下層の肝内胆管上皮細胞（IBEC）の進行性の破壊によって特徴付けられる。これにより、胆汁分泌が閉塞され、妨害されて、結果として肝硬変が生じる。シェーグレン症候群、CREST症候群、自己免疫性甲状腺疾患および関節リウマチを含む、上皮の被覆／分泌系の損傷によって特徴付けられる他の自己免疫疾患との関連が報告されている。ドライビング（driving）抗原に関する関心は、50年以上の間ミトコンドリアに焦点を合わせ、抗ミトコンドリア抗体（AMA）の発見をもたらした（Gershwin et al., Immunol Rev, 174:210-225 (2000); Mackay et al., Immunol Rev, 174:226-237 (2000)）。AMAはすぐに、臨床症状が現れるよりも極めて早い時期に90〜95％の患者の血清に存在するPBCの検査室診断にとって、不可欠なものになった。ミトコンドリアにおける自己抗原反応性は、M1およびM2として表された。M2反応性は、48〜74 kDaの成分のファミリーに向けられる。M2は、2-酸素酸デヒドロゲナーゼ複合体（2-OADC）の酵素の複数の自己抗原サブユニットを示し、本発明の自己-タンパク質、自己-ポリペプチド、または自己-ペプチドの別の例である。
【００６７】
PBCの原因病理論におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（PDC）抗原の役割を同定する研究は、PDCが、疾患の誘導において中心的な役割を果たすという概念を支持する（Gershwin et al., Immunol Rev, 174:210-225 (2000); Mackay et al., Immunol Rev, 174:226-237 (2000)）。PBCのケースの95％における最も頻繁な反応性は、PDC-E2に属するE2 74 kDaサブユニットである。2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（OGDC）および分岐鎖（BC）2-OADCを含む、関係するが別個の複合体が存在する。3つの構成酵素（E1、2、3）は、NAD+のNADHへの還元をともなう、2-酸素酸基質をアシル補酵素A（CoA）に変換する触媒機能に貢献する。哺乳類PDCは、タンパク質XまたはE-3結合タンパク質（E3BP）と呼ばれる付加的な成分を含む。PBC患者において、主要な抗原応答は、PDC-E2およびE3BPに向けられる。E2ポリペプチドは、2つの並行して繰り返されるリポイルドメインを含み、E3BPは、単一のリポイルドメインを有する。PBCは、グルココルチコイドならびにメトトレキサートおよびシクロスポリンAを含む免疫抑圧性薬剤で処置される。例えば、
2009540016.tif 000009
を参照されたい。
【００６８】
実験的自己免疫胆管炎（EAC）のネズミモデルは、メスSJL/Jマウスにおける哺乳類PDCでの腹腔内（i.p.）感作を使用し、非化膿性破壊性胆管炎（NSDC）およびAMAの産生を誘導する（Jones, J Clin Pathol, 53:813-21 (2000)）。
【００６９】
他の自己免疫疾患および関連する自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチド：重症筋無力症の自己抗原には、アセチルコリン受容体内のエピトープを挙げることができる。尋常性天疱瘡で標的とされる自己抗原には、デスモグレイン-3を挙げることができる。シェーグレン症候群抗原には、SSA（Ro）；SSB（La）およびフォドリンを挙げることができる。尋常性天疱瘡の主な自己抗原にはデスモグレイン-3を挙げることができる。筋炎のパネルには、tRNA合成酵素（例えば、スレオニル、ヒスチジル、アラニル、イソロイシルおよびグリシル）；Ku；Scl；SS-A；U1-sn-リボ核タンパク質；Mi-1；Mi-1；Jo-1；KuおよびSRPを挙げることができる。強皮症のパネルには、Scl-70；セントロメア；U1-sn-リボ核タンパク質およびフィブリラリンを挙げることができる。悪性貧血のパネルには、内因子および胃のH/K ATPaseの糖タンパク質βサブユニットを挙げることができる。全身性エリテマトーデス（SLE）の抗原であるエピトープには、DNA；リン脂質；核抗原；U1リボ核タンパク質；Ro60（SS-A）；Ro52（SS-A）；La（SS-B）；カルレチクリン；Grp78；Scl-70；ヒストン；Smタンパク質；セリン-アルギニンスプライシング因子およびクロマチン等を挙げることができる。グレーブス病では、エピトープには、Na+/I-共輸送体；甲状腺刺激ホルモン受容体；TgおよびTPOを挙げることができる。
【００７０】
他の疾患
動物に非生理的に存在する自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドに関連する他の疾患のいくつかの例を表に記載し、以下に記載する。
【００７１】
炎症性疾患
骨関節炎および変性性関節疾患：骨関節炎（OA）は60歳以上の30%が罹患しており、ヒトの最も一般的な関節疾患である。骨関節炎は滑膜関節の変性および不全を示し、関節軟骨の破壊に関係する。
【００７２】
軟骨は、主に、硬さおよび負荷に耐える能力を提供するプロテオグリカンと垂直の力に対する伸張性および抵抗性を提供するコラーゲンを含む。軟骨細胞は、各々が単独または組み合わせて、本発明の自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾される自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質である潜在型コラゲナーゼ、潜在型ストメライシン、潜在型ゲラチナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよび他の関連酵素を産生し、分泌することによって正常な軟骨をターンオーバーし、再構築する。メタロプロテイナーゼの組織阻害因子（TIMP）およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害因子（PAI-I）を含むいくつかの阻害因子も軟骨細胞によって産生され、中性の（neutral）メタロプロテイナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよび他の酵素の分解作用を制限する。これらの分解酵素および阻害因子は、単独または組み合わせて、本発明の自己-抗原、自己-タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。これらの分解酵素および阻害因子は、正常な軟骨の再構築および維持を調整する。OAでは、この過程の調節不全により、軟骨の劣化および分解が生じる。ほとんどのOA患者は、関節の熱感および腫脹を含むある程度の炎症も有する。初期OAでは、コラーゲン線維の配列およびサイズの異常な変更が見られる。単独または組み合わせて、本発明の自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾される自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質であるメタロプロテイナーゼ、カテプシン、プラスミンおよび他の自己分子は、軟骨基質のかなりの損失を生じる。軟骨細胞によるプロテオグリカンおよび軟骨の産生が最初に増加すると、関節軟骨は通常より厚くなる。次いで、単独または組み合わせて、本発明の自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾される自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質であるコラゲナーゼ、ストロメライシン、ゲラチナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよび他の関連酵素を含む分解酵素の作用の結果として関節軟骨は薄くなり、軟らかくなる。IL-1、カテプシンおよびプラスミンなどの炎症分子は、単独または組み合わせて軟骨の変性および分解を促進することがあり、本発明の自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾される自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質である。軟らかく薄くなった軟骨は、機械的ストレスによる損傷をはるかに受けやすい。これらの要因により、軟骨表面が崩壊し、垂直の割れ目が生じる（線維化）。軟骨表面のびらんが形成し、末期疾患では骨に及ぶ。軟骨細胞は、最初は、複製し、クラスターを形成するが、末期では、軟骨は低細胞である。骨の再構築および肥大はOAの重要な特徴である。
【００７３】
OAの現在の治療法には、安静、関節を支える筋肉を強化する理学療法、関節を安定させるための装具および他の支持装置、非-ステロイド性抗-炎症剤、アセトアミノフェンおよび他の鎮痛薬が挙げられる。膝または股関節などの日常生活の活動に重要な関節の末期の骨が擦れ合うOAでは、外科的関節置換が実施される。
【００７４】
脊椎損傷：米国では毎年約11,000例の脊椎損傷の新たな症例が報告され、全体的な罹病率は現在米国において合計183,000〜230,000例であると推定される（Stover et al., Arch Phys Med Rehabil, 80, 1365-71, 1999）。脊椎損傷からの回復は非常に悪く、悲惨な回復不可能な神経性の身体障害が生じる。急性脊椎損傷の現在の処置は、例えば、外科的介入による損傷部位の機械的安定化および非経口的ステロイドの投与を含む。これらの介入は、脊椎損傷による永久的な麻痺の発現を低下するためにはほとんど効を奏していない。慢性脊椎損傷の処置は、疼痛、痙縮および膀胱機能の管理などの生活の質の管理に集中している。現在利用可能な処置は神経機能の回復に対処していない。損傷直後の急性期では、炎症は顕著で、脊椎損傷に関連する膨潤が罹病状態の主要な原因である。この炎症は、高用量の全身コルチコステロイドで一部抑制される。
【００７５】
移植片対宿主病：ヒトへの組織および臓器移植の最も大きな限界の1つは、レシピエントの免疫系による移植組織の拒絶である。ドナーとレシピエントのMHCクラスIおよびII（HLA-A、HLA-BおよびHLA-DR）の一致性が大きいほど、移植片の生存は良好であることが十分に確立されている。移植片対宿主病（GVHD）は、同種間の造血細胞を含む移植を受けた患者の大きな罹病率および死亡率を生ずる。これは、一部には、皮膚および他の標的臓器の炎症による。造血細胞は、骨髄移植、幹細胞移植および他の移植に存在する。HLA-一致兄弟姉妹からの移植を受けた患者の約50%は中等度から重症のGVHDを発症し、その発現頻度は非-HLA-一致移植片でははるかに高い。中程度から重症のGVHDを発症する患者の1/3は結果として死亡する。ドナー移植片のTリンパ球および他の免疫細胞が、アミノ酸配列におけるポリペプチドの変異、特にヒトの第6染色体の主要組織適合性抗原複合体（MHC）遺伝子複合体中にコードされているタンパク質の変異を発現するレシピエント細胞を攻撃する。同種造血細胞に関係する移植においてGVHDに最も影響力のあるタンパク質は、高度多形性（ヒトごとのアミノ酸変異が大きい）クラスIタンパク質（HLA-A、-Bおよび-C）およびクラスIIタンパク質（DRB1、DQB1およびDPB1）である（Appelbaum、Nature 411: 385-389, 2001）。MHCクラスI対立遺伝子がドナーとレシピエント間で血清学的に「一致する」場合でも、DNA配列は、症例の30%では対立遺伝子-レベルのミスマッチがあることを明らかにしており、ドナー-レシピエント一致ペアにおけるクラス-I誘導性GVHDの基礎を提供している（Appelbaum、Nature, 411, 385-389, 2001）。GVHDは、しばしば、皮膚、腸、肝臓、肺および膵臓への損傷を生じる。GVHDは、グルココルチコイド、シクロスポリン、メトトレキセート、フルダラビンおよびOKT3で処置される。
【００７６】
組織移植拒絶：肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓ならびに他の臓器および組織を含む組織移植の免疫拒絶は、移植された臓器に対する移植レシピエントにおける免疫応答によって媒介される。同種移植された臓器は、移植レシピエントのアミノ酸配列と比較すると、アミノ酸配列に変異があるタンパク質を含有する。移植される臓器のアミノ酸配列は移植レシピエントのアミノ酸配列と異なるので、しばしば移植される臓器に対するレシピエントの免疫応答を誘発する。免疫応答は自然および獲得免疫系による反応を含み、標的臓器の炎症によって特徴付けられる。移植される臓器の拒絶は主な合併症であり、組織移植を制限し、レシピエントにおいて移植される臓器の不全を生じることがある。拒絶によって生じる慢性炎症は、移植される臓器の機能不全を生じることが多い。移植レシピエントは、拒絶を予防し、抑制するために、現在種々の免疫抑制剤で処置されている。これらの薬剤には、グルココルチコイド、シクロスポリンA、セルセプト、FK-506およびOKT3が挙げられる。
【００７７】
免疫調節核酸および使用方法
特定の態様において、本発明は、（a）（i）XおよびYがシトシン-グアニンではない、ピリミジン[2]がチミンである場合XおよびYがシトシン-シトシンではない、ピリミジン[1]がシトシンである場合XおよびYがシトシン-チミンではないということ以外、XおよびYが任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００７８】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）XおよびYがシトシン-グアニンではない、ピリミジン[2]がチミンである場合XおよびYがシトシン-シトシンではない、ピリミジン[1]がシトシンである場合XおよびYがシトシン-チミンではないということ以外、XおよびYが任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００７９】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）XおよびYがシトシン-グアニンではない、ピリミジン[2]がチミンである場合XおよびYがシトシン-シトシンではない、ピリミジン[1]がシトシンである場合XおよびYがシトシン-チミンではないということ以外、XおよびYが任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリG領域が少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８０】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）XおよびYがシトシン-グアニンではない、ピリミジン[2]がチミンである場合XおよびYがシトシン-シトシンではない、ピリミジン[1]がシトシンである場合XおよびYがシトシン-チミンではないということ以外、XおよびYが任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリG領域が少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８１】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８２】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８３】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８４】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８５】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）GTGGTTである六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；および（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８６】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）GTGGTTである六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；および（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８７】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）GTGGTTである六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；および（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８８】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）（i）GTGGTTである六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；（ii）六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；および（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸；ならびに（b）薬学的に許容される担体を含む。
【００８９】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）
2009540016.tif 000010
である免疫調節配列を含む免疫調節核酸；および（b）薬学的に許容される担体を含む。特定の態様において、薬学的組成物は、オリゴヌクレオチドである本発明の免疫調節核酸を含む。特定の態様において、薬学的組成物は、ベクターへ取り込まれる本発明の免疫調節核酸を含む。特定の態様において、薬学的組成物は、発現ベクターへ取り込まれる本発明の免疫調節核酸を含む。
【００９０】
特定の態様において、本発明は、本発明の免疫調節配列を対象に投与する段階を含む、対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する対象における疾患を処置するための方法を提供する。特定の態様において、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する対象における疾患を処置するための方法を提供する。特定の態様において、本発明は、本発明の免疫調節配列を対象に投与する段階を含む、対象における全身性エリテマトーデスを処置するための方法を提供する。特定の態様において、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における全身性エリテマトーデスを処置するための方法を提供する。
【００９１】
1つの局面において、本発明の改善された免疫調節配列は、
（I）
（1）XおよびYが、
a. XおよびYがシトシン-グアニンではない、
b. ピリミジン[2]がチミンである場合、XおよびYがシトシン-シトシンではない、
c. ピリミジン[1]がシトシンである場合、XおよびYがシトシン-チミンではない
ということ以外、任意の天然または合成ヌクレオチドである六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（2）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（3）ポリGが3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない。
【００９２】
あるいは、本発明の改善された免疫調節配列は、
（1）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン-[X]-[Y]-ピリミジン-ピリミジン-3'；
（2）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側に位置付けられる、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（3）（a）2と10との間の連続Gを含みかつ（b）六量体配列の2〜10ヌクレオチド3'側に位置付けられる、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない。
【００９３】
本発明の特定の態様において、六量体配列のXおよびYは、GpGである。特定の態様において、六量体配列は、5'-GTGGTT-3'である。特定の態様において、CCジ-ヌクレオチドは、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である。特定の態様において、ポリG領域は、3連続グアニン塩基を含み、かつ六量体配列から2ヌクレオチド3'側に位置付けられる。特定の態様において、改善された免疫調節配列は、
2009540016.tif 000011
である。
【００９４】
ジヌクレオチドモチーフを含む免疫調節配列モチーフと本明細書において言及される、本発明のIMSのコア六量体は、任意の組成または数のヌクレオチドまたはヌクレオシドが5'または3'に隣接していてもよい。いくつかの態様において、一つまたは複数の免疫調節配列モチーフを含む免疫調節核酸は、サイズが14〜50、75〜100塩基対、好ましくはサイズが16〜50塩基対のオリゴヌクレオチドである。免疫調節核酸は、例えば100〜100,000塩基対の範囲であるDNAのより大きな断片であってもよく、例えば発現ベクターおよびその他のプラスミドであってもよい。本発明の免疫調節配列モチーフに隣接する存在する配列は、任意の公知の免疫抑制性配列に存在する隣接配列に実質的に合致するように構築され得る。例えば、Nが任意のヌクレオチドである配列TGACTGTG-CCNN-プリン-ピリミジン-X-Y-ピリミジン-ピリミジン-NNGGG-AGAGATGAを有するIMSは、隣接配列TGACTGTGおよびAGAGATGAを含む。別の好ましい隣接配列は、個々のピリミジンの2回以上の反復または長さ2以上の異なるピリミジンの混合物としてピリミジンシリーズ（C、TおよびU）を組み込む。異なる隣接配列は、抑制性調節配列を試験する際に使用されている。抑制性核酸の隣接配列のさらに別の例は、以下の参照文献に含まれている：米国特許第6,225,292号および同第6,339,068号；Zeuner et al., Arthritis and Rheumatism, 46: 2219-24, 2002。
【００９５】
本発明の特定のIMSは以下の六量体配列を含む。
1. GGジヌクレオチドコア：
2009540016.tif 000012
等を含有する 5'-プリン-ピリミジン-[X]-[Y]-ピリミジン-ピリミジン-3'IMS；
2. GCジヌクレオチドコア：
2009540016.tif 000013
等を含有する5'-プリン-ピリミジン-[X]-[Y]-ピリミジン-ピリミジン-3'IMS；
3. グアニンおよびイノシンがアデニンと置換し、ならびに/またはウリジンがシトシンまたはチミンと置換し、そのような置換は、上記のガイドラインに基づいて記載されているように作製することができる。
【００９６】
以前に開示されている免疫抑制配列またはIISは、コアジヌクレオチド、CpGを含有する免疫活性化配列（ISS）の作用を阻害することが示された。米国特許第6,225,292号。このIISは、ISSの非存在下において、単独またはDNAポリヌクレオチド治療と併用して自己免疫疾患を予防および処置することが国際公開公報第04/047734号において示されている。このIISは、配列AAGGTTを有するコア六量体領域を含有した。本発明のIMSに含まれるものと同様のモチーフを有する他の関連するIISは以下である。
1.  GGジヌクレオチドコア：
2009540016.tif 000014
等を含有する5'-プリン-プリン-[X]-[Y]-ピリミジン-ピリミジン-3'IMS；
2.  GCジヌクレオチドコア：
2009540016.tif 000015
等を含有する5'-プリン-プリン-[X]-[Y]-ピリミジン-ピリミジン-3' IMS；
3.  グアニンおよびイノシンがアデニンと置換し、ならびに/またはウリジンがシトシンもしくはチミンと置換し、そのような置換は、上記のガイドラインに基づいて記載されているように作製することができる。
【００９７】
本発明のある態様において、IMSのコア六量体領域は5'もしくは3'末端のどちらかまたは両方にポリG領域が隣接している。本明細書において使用する「ポリG領域」または「ポリGモチーフ」は、少なくとも2つの隣接グアニン塩基、典型的には2〜30または2〜20の隣接グアニンを含有する核酸領域を意味する。いくつかの態様において、ポリG領域は2〜10、4〜10または4〜8の隣接グアニン塩基を有する。ある種の態様において、隣接するポリG領域はコア六量体に隣接する（すなわち、接している）。ある特定の態様において、ポリG領域は、非-ポリG領域（非-ポリGリンカー）によってコア六量体に連結する。いくつかの態様では、非-ポリGリンカー領域はわずか6つ、さらに典型的にはわずか4つのヌクレオチドを有し、最も典型的には、わずか2つのヌクレオチドを有する。
【００９８】
本発明の特定の態様において、IMSのコア六量体領域は、CCジヌクレオチド領域によって、5'もしくは3'端で、または5'および3'端の両方で隣接される。本明細書において使用される「CCジヌクレオチド領域」または「CCジヌクレオチドモチーフ」は、2連続シトシン塩基を含む核酸領域を意味する。いくつかの態様において、CCジヌクレオチド領域は、長さが2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド塩基であるが、より長くてもよい。特定の態様において、隣接CCジヌクレオチドは、コア六量体に近接している（すなわち、接している）。特定の態様において、CCジヌクレオチドは、非CCジヌクレオチド領域（非CCジヌクレオチドリンカー）によってコア六量体に連結される。いくつかの態様において、非CCジヌクレオチドリンカー領域は、約8、7、6、5、4、3、または2ヌクレオチドを有する。
【００９９】
免疫調節核酸は、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ウイルスDNAおよびcDNAを含む既存の核酸源から入手することができる。ある種の態様において、免疫調節核酸は、オリゴヌクレオチド合成によって作製される合成オリゴヌクレオチドである。IMSは、一本鎖または二本鎖のDNA、RNAおよび/またはオリゴヌクレオチドの一部であってもよい。
【０１００】
免疫調節核酸は、主に、非メチル化GpGオリゴヌクレオチドを含有する一つまたは複数のIMS領域を有する核酸である。別の態様において、IMS領域のアデニンまたはシトシン残基の一つまたは複数はメチル化されている。真核細胞では、典型的には、シトシンおよびアデニン残基はメチル化されていることがある。
【０１０１】
免疫調節核酸は安定化および/または不安定化されたオリゴヌクレオチドであってもよい。安定化されたオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよび他の分解経路によるインビボにおける分解を比較的受けないオリゴヌクレオチドを意味する。好ましい安定化オリゴヌクレオチドは修飾されたリン酸骨格を有し、最も好ましいオリゴヌクレオチドは、リン酸塩の酸素の少なくとも1つが硫黄で置換されているホスホロチオエート修飾リン酸骨格を有する。メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロ（phophoro）アミデートおよびホスホロジチオネートヌクレオチド間結合を含む骨格のリン酸基修飾はIMSに抗菌作用を提供することができる。免疫調節核酸は、好ましくは、安定化オリゴヌクレオチドであり、主にホスホロチオエート安定化オリゴヌクレオチドを使用する。
【０１０２】
別の安定化オリゴヌクレオチドには：荷電酸素がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルおよびホスホジエステル；荷電ホスホネートの酸素がアリールまたはアルキル基で置換されている非イオン性DNA類似物であるアリールホスホネートおよびアルキルホスホネートおよび/または一方または両方の末端にヘキサエチレングリコールもしくはテトラエチレングリコールまたは別のジオールを含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。IMS領域のヌクレオシド塩基に糖部分を結合するために別の立体配座を使用してもよい。
【０１０３】
調節ジヌクレオチドに隣接するIMS領域のヌクレオチド塩基は、既知の天然型塩基または合成非-天然塩基であってもよい。オリゴヌクレオチドは、結合ポイントとして、すなわち自己分子を含む他の化合物のために他の分子を結合もしくは連結するための手段としてまたは追加の免疫調節治療法のための結合ポイントとして使用するために従来の技法を使用してIMS-ONの内部領域および/または末端に組み込まれてもよい。IMS-ONの塩基、糖部分、リン酸基および末端は、IMS-ONの調節作用以外に望ましい特性を有するIMS-ONを構築するために、当業者に既知の任意の方法で修飾することもできる。例えば、任意の立体配座において糖部分をIMS-ONのヌクレオチド塩基に結合することができる。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドにこれらのリン酸基を修飾するための技法は当技術分野において既知であり、詳細な説明は必要ない。このような有用な技法の概略は、標的オリゴヌクレオチド産物のための中間体リン酸トリエステルを製造し、ヨウ素水溶液または無水アミンなどの他の薬剤で天然型リン酸トリエステルに酸化する。得られたオリゴヌクレオチドホスホルアミデートは硫黄で処理してホスホロチオエートを産生することができる。同じ一般的な技法（硫黄処理段階を除く）を適用して、メチルホスホネートからメチルホスホアミダイトを産生することができる。リン酸基修飾技法に関するさらに詳細な説明については、当業者は、免疫調節核酸の組成物および製造に関する当技術分野の知識レベルを例示するために開示内容が本明細書に組み入れられている、米国特許第4,425,732号；同第4,458,066号；同第5,218,103号および同第5,453,496号ならびにTetrahedron, Lett. の 21:414925（1995）、7:5575（1986）、25:1437（1984）ならびにJournal Am. ChemSoc., 93: 6657（1987）を参考にすることを希望することができる。
【０１０５】
特に有用なリン酸基修飾は、IMS-ONオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート型への変換である。ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートは、未修飾のオリゴヌクレオチド対応物と比較してインビボにおいて分解されにくく、本発明のIMS-ONを宿主により利用可能にする。
【０１０６】
IMS-ONは、当技術分野において既知の技法および核酸合成装置を使用して合成することができる。これに関する参照文献は、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology、2章および4章（Wiley Interscience、1989年）；Maniatis et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Lab.、New York、1982年）；米国特許第4,458,066号および米国特許第4,650,675号を参照されたい。これらの参照文献は、合成オリゴヌクレオチドの製造に関する当技術分野における知識レベルを実証するために参照として本明細書に組み入れられている。
【０１０７】
または、IMS-ONは、天然型CpGモチーフおよび隣接ヌクレオチドを競合するジヌクレオチドに置換するように、単離した微生物ISS-OSNを突然変異することによって得ることができる。核酸ハイブリダイザーションを使用するスクリーニング手法により、適当なプローブまたは抗体が入手可能である場合には、任意の生物から任意のポリヌクレオチド配列を単離することができる。関心対象のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成することができる。これには、短いオリゴペプチド鎖のアミノ酸配列が既知でなければならいことが必要となる。タンパク質をコードするDNA配列は遺伝コードから推定することもできるが、遺伝コードの縮重を考慮しなければならない。
【０１０８】
例えば、ISS-含有ポリヌクレオチドを含有すると考えられるcDNAライブラリーは、cDNA由来の種々のmRNAを卵母細胞に注入し、cDNA遺伝子産物の発現を十分な時間生じさせ、例えば、関心対象のポリヌクレオチドがコードするペプチドに特異的な抗体を使用することによってまたは関心対象のポリヌクレオチドがコードするペプチドに特徴的な反復モチーフのプローブおよび組織発現パターンを使用することによって、望ましいcDNA発現産物の存在について試験することによってスクリーニングすることができる。または、cDNAライブラリーは、ペプチドに特異的な抗体を使用して、少なくとも1つのエピトープを有する関心対象のペプチドの発現について間接的にスクリーニングすることができる。このような抗体はポリクローナルまたはモノクローナル由来であってもよく、関心対象のcDNAの存在を示す発現産物を検出するために使用することができる。
【０１０９】
ISS-含有ポリヌクレオチドが得られたら、例えば、従来の技法を使用する酵素消化によって望ましい長さに短くすることができる。次いで、CpGモチーフを、本発明の方法を使用して同定される-「抑制作用のある」ジヌクレオチドに置換するようにISS-ODNオリゴヌクレオチド産物のCpGモチーフを突然変異させる。既知の配列を有するDNAの特定部位に置換突然変異を生じる技法は既知であり、例えば、PCRによるM13プライマー突然変異誘発がある。IMSは非-コード性であるので、置換突然変異を生ずる際にオープンリーディングフレームを維持することに関する懸念はない。しかし、インビボにおいて使用するためには、ポリヌクレオチド出発物質、ISS-ODNオリゴヌクレオチド中間体またはIMS突然変異産物は実質的に純粋にされなければならない（すなわち、当業者に既知で、当業者によって選択される利用可能な技法を使用して、天然の不純物およびLPSをできるだけ含まない）。
【０１１０】
本発明の免疫調節核酸は、IMSを単独または他の核酸領域とシスまたはトランス配置で、例えば、組換え発現ベクターによって送達可能な任意の自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードすることができる組換え自己-ベクター（プラスミド、コスミド、ウイルスまたはレトロウイルス）に組み込まれて含有することができる。ある態様において、IMSは、ベクターに組み込まれないで投与される。特定の態様において、IMSは、例えば発現ベクターなどのベクターに組み込まれ、これは、例えば当業者に既知の従来の技法を使用して実施することができる（例えば、Ausubel、Current Protocols in Molecular Biology、上記を参照されたい）。
【０１１１】
例えば、組換え発現ベクターの構築は標準的なライゲーション技法を使用する。ベクターに正しい配列が構築されたことを確かめる分析は、ライゲーション混合物を使用して宿主細胞を形質転換し、形質転換の成功を適宜抗生物質抵抗性で選択することができる。形質転換体からベクターを作製し、制限によって分析および/または例えば、Messing et al., Nucleic Acids Res.、9:309, 1981の方法、Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499, 1980の方法または当業者に既知の他の好適な方法によって配列決定される。切断断片のサイズ分離は、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning、133〜134、1982年によって記載されている従来のゲル電気泳動を使用して実施される。
【０１１２】
宿主細胞に本発明の発現ベクターを形質転換して、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択するまたは遺伝子を増幅するために適宜改変した従来の栄養培地で培養することができる。温度、pH等などの培養条件は、発現について選択する宿主細胞に以前から使用されているものであり、当業者に明らかである。
【０１１３】
組換えベクターを本発明のIMS-ONの担体として使用する場合には、プラスミドおよびコスミドは、病原性がないので、特に好ましい。しかし、プラスミドおよびコスミドはウイルスと比較してインビボにおいて分解が早いので、炎症性疾患または自己免疫疾患を予防または処置するのに十分な投与量のIMS-ONを送達することができない。
【０１１４】
関連のある局面において、式5'-プリン-ピリミジン-C-G-ピリミジン-ピリミジン-3'または5'-プリン-ピリン-C-G-ピリミジン-ピリミジン-3'の一つまたは複数のCpGの代わりに非-CpGジヌクレオチドが置換している核酸ベクターが提供され、それによってIIS-関連免疫活性化作用が低下されるベクターを作製する。このようなベクターは、例えば、免疫調節核酸を投与するための方法および/または自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドを一つまたは複数コードする自己ベクターを投与するための方法において有用である。例えば、CpGジヌクレオチドのシトシンをグアニンと置換することができ、それによって、式5'-プリン-ピリミジン-C-G-ピリミジン-ピリミジン-3'または5'-プリン-プリン-G-G-ピリミジン-ピリミジン-3'のGpGモチーフを有するIMS領域を作製することができる。シトシンはまた、任意の他の非-シトシンヌクレオチドと置換することもできる。置換は、例えば、部位-特異的突然変異誘発を使用して実施することができる。典型的には、置換CpGモチーフは、ベクターの重要な制御領域（例えば、プロモーター領域）に位置しないようなCpGである。また、CpGが発現ベクターのコード領域内に位置する場合には、非-シトシン置換は、典型的には、サイレント突然変異またはコードされるアミノ酸の保存置換に対応するコドンを作製するように選択される。
【０１１５】
例えば、ある態様において、式5'-プリン-ピリミジン-C-G-ピリミジン-ピリミジン-3'の一つまたは複数のCpGジヌクレオチドが、CpGジヌクレオチドのシトシンを非-シトシンヌクレオチドと置換することによって突然変異化される修飾pVAX1ベクターが提供される。pVAX1ベクターは当技術分野において既知であり、Invitrogen（Carlsbad、CA）から購入可能である。1つの例示的な態様において、修飾pVAX1ベクターは、CpGモチーフ内に以下のシトシンから非-シトシン置換を有する：
ヌクレオチド784、1161、1218および1966においてシトシンからグアニンへ；
ヌクレオチド1264、1337、1829、1874、1940および1997においてシトシンからアデニンへ；
ヌクレオチド1963および1987においてシトシンからチミンへ；
追加として、ヌクレオチド1831、1876、1942および1999においてシトシンからグアニンへの突然変異。（上記のヌクレオチド番号指定は、Invitrogenによって提供されるpVAX1のナンバリングシステムによる）（以下の実施例3を参照されたい）。
【０１１６】
方法および組成物のいくつかの態様において、本明細書において記載されるように、複数（すなわち、2つ以上）の免疫抑制性配列が使用される。複数のIMSまたはIIS分子は、別個にまたは連結して、例えば、並行してまたは連続して、投与または製剤され得る。2つ以上の免疫抑制性配列は、同じまたは異なる配列であってもよく、同じ分子上で連結されてもよい。1つの態様において、IMSまたはIISは、2つ以上のM49配列を含む。1つの態様において、IMSまたはIISは、2つ以上のI18配列を含む。
【０１１７】
IMSの機能的特性
IMSの免疫調節特性を説明する機序はいくつかあり、これらには、ISS（CpG）-媒介性免疫活性化に関係ない機序が含まれる。
【０１１８】
本明細書において使用する「免疫応答の調節、免疫応答を調節または変更すること」は、免疫調節核酸の投与の結果として生ずる、核酸、脂質、リン脂質、糖質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチド、自己-ペプチド、タンパク質複合体、リボ核タンパク質複合体またはそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない自己分子に対する既存の免疫応答または起こりうる免疫応答の任意の変更をいう。このような調節には、免疫応答に関与するまたは関与することができる任意の免疫細胞の存在、能力または機能の任意の変更を含む。免疫細胞には、B細胞、T細胞、NK細胞、NK T細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、ノン-プロフェッショナル抗原提示細胞、炎症細胞または免疫応答に関与もしくは影響することができる任意の他の細胞が挙げられる。調節は、既存の免疫応答、進行性の免疫応答、起こりうる免疫応答または免疫応答を誘発する、調節する、免疫応答に影響するもしくは応答することができる能力に与えられる任意の変化を含む。調節は、免疫応答の一部として免疫細胞内の遺伝子、タンパク質および/または他の分子の発現および/または機能の任意の変更を含む。
【０１１９】
免疫応答の調節には、免疫細胞の排除、欠損または隔離；自己反応性リンパ球、APCまたは炎症細胞などの他の細胞の機能的能力を調節することができる免疫細胞の誘導または作製；アネルギーと名づけられる、免疫細胞の反応欠如状態の誘導；これらの細胞によって発現されるタンパク質のパターンの変更を含むが、これに限定されない免疫細胞の活性もしくは機能またはそうする能力の増加、低下または変更が挙げられるが、これらに限定されない。例として、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、転写因子、キナーゼ、同時刺激分子もしくは他の細胞表面受容体などのあるクラスの分子の産生および/または分泌の変更またはこれらの調節事象の任意の組み合わせが挙げられる。
【０１２０】
免疫応答は、IL-12およびIFNγを含むサイトカインを産生するヘルパーT細胞および免疫応答によって特徴付けられ、あるアイソタイプ（一般に、マウスではIgG2a；一般に、ヒトではIgG1およびIgG3）の抗体を産生するB細胞に関連する。Th1-型免疫応答は自己免疫疾患において優位であり、自己免疫-媒介性の組織損傷に関連する。一方、Th2免疫応答は、IL-4およびIL-10を含むサイトカインを産生するヘルパーT細胞および免疫応答によって特徴付けられ、あるアイソタイプ（一般に、マウスではIgG1；一般に、ヒトではIgG2およびIgG4）の抗体を産生するB細胞に関連する。Th2-型免疫応答は、齧歯類およびヒトの自己免疫における自己免疫-媒介性の組織損傷に対する防御に関連する。
【０１２１】
免疫調節核酸は、望ましくない免疫応答を媒介するもしくは媒介することができる免疫細胞を排除、隔離もしくは遮断することによって；防御免疫応答を媒介するもしくは媒介することができる免疫細胞を誘導、形成もしくはターンオンすることによって；免疫細胞の物理的もしくは機能的特性を変更することによって（Th1-型応答を抑制することによっておよび/またはTh2-型応答を誘導するなどによって）またはこれらの影響の組み合わせてによって免疫応答を調節することができると思われる。免疫応答の調節の測定の例には、（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する）免疫細胞集団の有無の調査；（T細胞増殖アッセイおよび抗-CD3抗体、抗-T細胞受容体抗体、抗-CD28抗体、カルシウムイオノフォア、PMA、ペプチドまたはタンパク質抗原を負荷した抗原提示細胞で刺激することによる3H-チミジンの取り込みに基づいたペプスカン（pepscan）分析；B細胞増殖アッセイを使用するなどの）信号に応答して増殖もしくは分裂する能力または信号に応答する増殖もしくは分裂への抵抗性を含む免疫細胞の機能的能力の測定；（細胞障害性T細胞アッセイなどの）他の細胞を死滅または溶菌する能力の測定；（フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体および細胞の他の産物の測定；免疫細胞の活性化または免疫細胞内の信号伝達経路の生化学マーカーの測定（チロシン、セリンおよびスレオニンリン酸化、ポリペプチド切断およびタンパク質複合体の形成または解離のウェスタンブロット法および免疫沈降分析；タンパク質アレイ分析；DNAアレイまたはサブトラクティブハイブリダイザーションを使用するDNA転写プロファイリング）；アポトーシス、壊死または他の機序による細胞死の測定（アネキシンV染色、TUNELアッセイ、DNAラダーリングを測定するゲル電気泳動、組織学；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウェスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生される遺伝子、タンパク質および他の分子の測定（ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、2-次元ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；および自己免疫疾患、神経変性性疾患および他の疾患の成果の改善などの臨床成果の測定（臨床スコア、追加の治療法を使用する必要性、機能的状態、画像による検討）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
他の研究者らは、IISの作用機序を評価する実験を実施している。中和または抑制性IIS（GpG）モチーフはISS（CpG）免疫活性化を遮断することをそれらの研究者らは実証した（Krieg et al., PNAS, 95: 12631, 1998；米国特許第6,225,292号および米国特許第6,339,068号）。そのような実験におけるIISは、（細菌、ウイルス、寄生虫およびDNAワクチン化または遺伝子治療などにおいて外因的に生じさせたDNAなどの起源由来の）ISSの影響を相殺、阻害、競合または克服するために使用された。ISSおよびIISは同じ細胞に流入することが示されており、IISがISSを阻害する機序は同一細胞内の直接的な競合によることを示唆している（Yamada et al., J. Immunology, 2002, 169:5590）。
【０１２３】
投与方法
免疫調節核酸は、薬学的に許容されうる担体を含む組成物として作製される。本発明の免疫調節核酸に使用するのに好ましい薬学的に許容されうる担体には、滅菌水性または非-水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを挙げることができる。非-水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩液および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口基剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーまたは不揮発性油が挙げられる。静注基剤には、液体および栄養補充薬、（リンガーのデキストロースに基づいたものなどの）電解質補充薬等が挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス等などの保存剤および他の添加剤が存在してもよい。免疫調節核酸の組成物は、本発明によりその後再構成して使用するために、当技術分野において既知の手段を使用して凍結乾燥してもよい。個々のIMSの多数のコピー、異なるIMSの組み合わせ、各々が同じ相対モル濃度で存在するIMSの組み合わせ、各々が異なる相対モル濃度で存在するIMSの組み合わせ含有する免疫調節核酸を混合して薬学的組成物を形成しても、または個々のIMSおよび/または異なるIMSを、組換え発現ベクタープラスミド、鎖状ポリヌクレオチド、ウイルスおよびウイルスベクター、細菌およびオリゴヌクレオチドを含有する他の生、不活性化または合成組成物に組み込んでもよい。
【０１２４】
本発明の免疫調節核酸は、薬剤として使用するための塩を用いて製剤化することができる。免疫調節核酸は、非毒性の無機または有機塩基を用いて製剤化することができる。無機塩基塩には、ナトリウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム等が挙げられる。無毒性の有機塩基には、一級、二級および三級アミン等の塩が挙げられる。このような免疫調節核酸は、滅菌水溶液または塩溶液などの、送達前に再構成するために凍結乾燥された形態で製剤化することができる。または、免疫調節核酸は、送達のための水性-または油性-基剤に関係する溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態で製剤化することができる。免疫調節核酸を凍結乾燥し、投与前に滅菌水で再構成することができる。
【０１２５】
当業者には既知であるように、被験者に核酸を送達するために多種多様の方法が存在する。いくつかの態様において、免疫調節核酸はネーキッド核酸として投与される。例えば、ある態様において、ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス粒子、例えば、Curiel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 6: 247-52, 1992、上記を参照されたい）に、投与前にネーキッド核酸を混合して、核酸を封入するのではなく、送達を容易にするウイルス粒子を含有する製剤を作製する。特定の態様において、免疫調節核酸を、陽イオン物質（例えば、DEAE-デキストランまたは陽イオン脂質）などの、核酸に結合する分子で封入するかまたは複合体を形成する。例えば、リポソームは、オリゴヌクレオチドおよび/または自己-ポリヌクレオチドを製剤化し、送達するための効果的な手段である。Pack, et al. (2005) "Design and Development of Polymers for Gene Delivery" Nature Drug Discovery 4:581-493を参照されたい。特定の態様において、免疫調節核酸を、薬理学的な送達のためのウイルスベクター、ウイルス粒子または細菌に組み込む。ウイルスベクターは感染能力があっても、弱毒化型であっても（疾患を誘発する力を低下する突然変異を有する）または複製-欠損型であってもよい。いくつかの態様において、核酸は、注射、吸入または微粒子銃（弾道的な（ballistic）送達）によって送達することができる金粒子、多糖系支持体または他の粒子もしくはビーズを含む固相支持体に結合される。
【０１２６】
核酸製剤を送達する方法は当技術分野において既知である。例えば、米国特許第5,399,346号、同第5,580,859号、同第5,589,466号を参照されたい。数多くのウイルス系システムが哺乳類細胞に導入するために開発されている。例えば、レトロウイルスシステムが記載されている（米国特許第5,219,740号;（Miller et al., Biotechniques, 7:980-990, 1989; Miller, A.D., Human Gene Therapy, 1:5-14, 1990; Scarpa et al., Virology, 180:849-852, 1991; Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:8033-8037, 1993）; および（Boris-Lawrie and Temin, Cur. Opin. Genet. Develop., 3:102-109, 1993）。数多くのアデノウイルスベクターも記載されており、例えば、（Haj-Ahmad et al., J. Virol, 57:267-274, 1986; Bett et al., J. Virol, 67:5911-5921, 1993; Mittereder et al., Human Gene Therapy, 5:717-729, 1994; Seth et al., J. Virol, 68:933-940, 1994; Barr et al., Gene Therapy, 1:51-58, 1994; Berkner, K.L., BioTechniques, 6:616-629, 1988）; および（Rich et al., Human Gene Therapy, 4:461-476, 1993）を参照されたい。アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターシステムも核酸送達のために開発されている。AAVベクターは、当技術分野において既知の技法を使用して容易に構築することができる。例えば、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号；国際公開公報第92/01070号（1992年1月23日公開）および国際公開公報第93/03769号（1993年3月4日公開）；Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol,. 8:3988-3996, 1988; Vincent et al., Vaccines, 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1990; Carter, B.J., Current Opinion in Biotechnology, 3:533-539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiol. And Immunol., 158:97-129, 1992; Kotin, R.M., Human Gene Therapy, 5:793-801, 1994; Shelling et al., Gene Therapy, 1:165-169, 1994; およびZhou et al., J. Exp. Med., 179:1867-1875, 1994）を参照のこと。
【０１２７】
本発明のIMSはベクターを用いないで送達することもできる。例えば、被験者に送達する前に、分子をリポソームに封入することができる。脂質封入化は、一般に、安定して核酸に結合または核酸を封入して保持することができるリポソームを使用して達成される。核酸を送達するための担体としてリポソームを使用するための概略は、（Hug et al., Biochim. Biophys. Acta., 1097: 1-17, 1991；Straubinger et al., Methods of Enzymology、101巻、512〜527ページ、1983年）を参照されたい。例えば、本発明により使用することができる脂質には、DOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロールおよびCUDMEDA(N-(5-コレストラム-3-オール3ウレタニル)-N',N'-ジメチルエチレンジアミン)が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、DNAを、以下の陽イオンリポソーム製剤の1つを含有する溶液の形態で投与することができる：Lipofectin（商標）（LTI/BRL）、Transfast（商標）（Promega Corp）、Tfx50（商標）（Promega Corp）、Tfx10（商標）（Promega Corp）またはTfx20（商標）（Promega Corp）。さらに、Pack, et al., (2005) "Design and Development of Polymers for Gene Delivery" Nature Drug Discovery 4:581-493も参照されたい。
【０１２８】
免疫調節核酸の「治療的に有効な量」は、本発明の教示内容により投与され、例えば、疾患の症状および/または原因を軽減または排除することによって、疾患を処置または予防するのに十分である。例えば、治療的に有効な量は広い範囲に入り、臨床試験によって決定され、特定の患者には、疾患の重症度、患者の体重、年齢および他の因子を含む、通常に技術のある臨床医に既知の因子に基づいて決定される。免疫調節核酸の治療的に有効な量は約0.001マイクログラム〜約1グラムの範囲内である。免疫調節核酸の好ましい治療量は、各々の約5マイクログラム〜約1000マイクログラムの範囲内である。免疫調節核酸の最も好ましい治療量は、約50〜200マイクログラムの範囲内である。免疫調節核酸治療は、毎日、1日おきに、1週間に2回、毎週、2週間ごとにまたは毎月継続的に送達される。自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチド治療と併用して送達される場合には、治療法は6〜12ヶ月などの種々の期間にわたって投与することができ、次いで維持投与として3〜12ヶ月ごとに投与することができる。別の治療法は、疾患の重症度、患者の年齢、投与される自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドならびに担当医が考慮すると思われる他の因子に応じて作製することができる。
【０１２９】
特定の態様において、免疫調節核酸は筋肉内注射によって送達される。特定の態様において、免疫調節核酸は鼻腔内送達、経口送達、皮下送達、皮内送達、静脈内送達、皮膚への押し付け、眼球内送達、関節内送達、膣内送達、直腸内送達、粘膜送達または皮膚に送達されるもしくは皮膚を通過して送達される金粒子に結合される（例えば、WO97/46253号を参照されたい）。または、核酸は、リポソームまたは荷電脂質を使用するまたは使用しない局所適用によって皮膚細胞に送達することができる（例えば、米国特許第6,087,341号を参照されたい）。さらに別の方法は、核酸を吸入剤として送達することである。免疫調節核酸と、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチド、または自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドとの投与を含む併用療法の場合には、免疫調節核酸およびポリヌクレオチドは同じ部位または異なる部位に、同時にまたは別の時間に投与することができる。
【０１３０】
免疫調節核酸を送達する前に、その後のポリヌクレオチド治療の送達を増強することができるブピバカイン（bupivicane）、カルジオトキシンまたは別の薬剤で処理することによって事前調整することができる。このような事前調整療法は、一般に、治療用ポリヌクレオチドの送達の12〜96時間前に送達され、さらにしばしば治療用免疫調節核酸の送達の24〜48時間前に送達される。または、IMS治療の前に、事前調整処理を行わない。
【０１３１】
免疫調節核酸および/または自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ポリペプチドまたは自己-ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む自己-ベクターは、薬剤、アジュバント、サイトカイン、自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾される自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、DNAを用いる治療などの他の物質と併用してまたはサイトカインをコードするベクターの送達と併用して投与することができる。
【０１３２】
本発明の特定の態様において、免疫調節核酸は他の治療と併用投与される。このような治療には、例えば、ポリヌクレオチド治療の場合には、表1に記載される自己分子をコードするDNAを含むが、これらに限定されない自己分子と併用投与される、免疫調節核酸（米国特許出願第20030148983号を参照されたい）、または自己-脂質、自己-抗原、自己-タンパク質、自己-ペプチド、自己-ポリペプチド、自己-糖脂質、自己-糖質、自己-糖タンパク質および翻訳後修飾される自己-タンパク質、ペプチド、ポリペプチドまたは糖タンパク質または自己免疫疾患を治療するために使用される任意の他の治療用化合物と併用投与される免疫調節核酸が挙げられる。特定の態様において、免疫調節核酸は、表1において記載されるようなSLEに関連する自己分子の一つまたは複数を使用するポリヌクレオチド治療と組み合わせてSLEを有する患者に投与される。特定の態様において、本発明の免疫調節核酸は、非ステロイド抗炎症薬（NAIDS）；抗マラリア薬；コルチコステロイド；細胞毒性薬、および免疫抑制剤を含むがそれらに限定されない狼瘡の処置において使用される薬物と組み合わせてSLEを有する患者に投与される。特定の態様において、SLEを有する患者に投与される免疫調節核酸は、I18である。特定の態様において、免疫調節核酸は、表1において記載されるような多発性硬化症に関連する自己分子の一つまたは複数を使用するポリヌクレオチド治療と組み合わせて多発性硬化症を有する患者に投与される。いくつかの態様において、免疫調節核酸は、α-インターフェロン、β-インターフェロン、およびコパクソンを含むがそれらに限定されない多発性硬化症の処置において使用される薬物と組み合わせて多発性硬化症を有する患者に投与される。特定の態様において、多発性硬化症を有する患者に投与される免疫調節核酸は、I18である。特定の態様において、免疫調節核酸は、表1において記載されるようなインスリン依存性糖尿病に関連する自己分子の一つまたは複数を使用するポリヌクレオチド治療と組み合わせてインスリン依存性糖尿病を有する患者に投与される。特定の態様において、インスリン依存性糖尿病を有する患者に投与される免疫調節核酸は、I18である。
【０１３３】
本発明のさらなる理解は、実例的な態様を示す以下の説明を参照することにより得られると考えられる。
【０１３４】
実施例1：IMSによる、ヒト末梢血単核球（hPBMC）におけるCpG-ODN誘導細胞増殖およびサイトカイン産生の抑制
一連の実験は、IMSがCpG含有オリゴヌクレオチド（CpG-ODN）に対するPBMC応答を抑制し得ることを実証するために実施された。刺激性CpG-ODNは、ヒトB細胞および形質細胞様樹状細胞（pDC）に直接的に作用し、B細胞における増殖ならびにIL-6およびIL-10の分泌、ならびにpDCによるIFN-αの産生を刺激することが公知である（Hartmann et al., PNAS 96:9305; Krug et al., Eur. J. Immunol. 31:2154; Vollmer et al., Eur. J. Immunol. 34:251; Fearon et al., Eur. J. Immunol. 33:2114; Marshall et al., J. Leuk. Biol. 73:781; Hartmann et al., Eur. J. Immunol. 33:1633）。加えて、PBMC培養において、「バイスタンダー」細胞（単球、NK細胞、マクロファージ）は、BおよびpDC細胞によって産生されるサイトカインに応答し、付加的な免疫調節因子を産生し得る（Hornung et al., J. Immunol. 168:4531; Krug et al., Eur. J. Immunol. 31:2154; Krieg, Ann. Rev. Immunol. 20:709; Kranzer, Immunol. 99:170）。
【０１３５】
表2に載せられているIMSのパネルは、これらのCpG-ODN刺激応答を抑制する能力に対して合成されかつテストされた。全てのIMSは、コア「RYGGYY」モチーフの少なくとも1つのコピーを含んだが、長さ（〜14〜42塩基）およびこのコアモチーフに隣接する塩基の配列同一性の両方において変化した。いくつかのオリゴは、オリゴヌクレオチド多量体またはG-四重鎖を形成する潜在性を有するポリG配列を含んだ（Gursel et al., J. Immunol. 171:1393; Petraccone et al., International J. Biol. Macromolecules 31:131; Wu et al., J. Biol. Chem. 279:33071; Lee et al., NAR 8:4305; Phillips et al., J. Mol. Biol. 273:171）。表2において示されるように、ほとんどのオリゴは、完全にホスホロチオエート化された骨格を有したが、その他は、部分的にホスホロチオエート化され、オリゴの5'および3'端に数個の修飾塩基を保有した。
【０１３６】
【表２】
2009540016.tif 000016
2009540016.tif 000017
2009540016.tif 000018
【０１３７】
Stanford Blood Bankにおける健康なドナーから、ヒトPBMCを単離した。抗凝固剤としてクエン酸デキストロースを使用し、白血球リッチバフィーコート（およそ30ml）。3つの50mlコニカルにおいて、10mlの各々のバフィーコートをPBSで1：4に希釈し、8 mlのIsoPrep（1.077g/ml、pH 6.8、9.6％ w/vメトリゾ酸ナトリウム、5.6％ w/vポリサッカライド）でアンダーレイ（underlay）し、室温で30分間400gで間断なく遠心分離した。間期細胞（リンパ球および単球）を新しい50mlコニカルチューブに移し、PBSで満たし、混合し、室温で10分間200gで遠心分離した。上清を除去し、洗浄段階を繰り返した。最終細胞ペレットを5mlビーズバッファー（PBS pH7.2、0.5％ BSA、2mM EDTA）に再懸濁し、ViCell（Beckman-Coulter）を使用して細胞を数え、10％ FBSを含むRPMI-1640において培養した。
【０１３８】
IMSが細胞増殖のCpG ISS ODN刺激を抑制する可能性があるかどうかを判定するために、PBMCを、4日間5μg/ml ISS ODNの存在下で、単一または増加する用量のIMSとともにインキュベートした。インキュベーションの最後の24時間の間の[3H]チミジン取り込みを測定することによって、細胞増殖をアッセイした。抑制の有効性は、IMS ODN間で有意に変化し（5μg/ml用量で〜15〜70％抑制；図1a、b）、1〜25μg/mlでテストされたIMSの用量を増加させると、ISSに対する増殖応答の抑制が増加した。
【０１３９】
CpG-ODN刺激サイトカイン産生に対するIMSの効果をプロファイルするために、hPBMCを、示される濃度のIMSおよび刺激性CpG-ODNとともに48時間インキュベートし、培養培地におけるサイトカインレベルをELISAによって分析した。図2において示されるように、IMSは、用量依存性の様式でCpG刺激IL-10およびIL-12発現を抑圧した。対照的に、IMSは、特に25μg/ml用量でCpG誘導IFN-γ発現を全般的に強化したが、IFN-α発現に対する異なったIMS影響が観測された。IMS I18は、典型的には、IFN-αのCpG誘導を抑圧したが、GpG.1などのIMSは、発現を強化した（図2c、d）。
【０１４０】
CpG刺激免疫応答を抑制することに加えて、I18およびGpG.1オリゴは、PBMC培養におけるConA依存性細胞増殖およびPolyI:C刺激IFN-α発現も抑制する（図3）。ConAは、T細胞に直接的に作用し、PolyI:Cは、ヒト単球のサブセットにおいてIFN-α発現を誘導することが示されている。刊行されたデータは、これらの細胞が機能的TLR9受容体を発現しないことを示唆し（Hornung et al., J. Immunol. 168:4531）、本発明のIMSが、マウス免疫細胞に対する刊行された結果（Shirota et al., J. Immunol. 173:5002）と一致するTLR9非依存性様式で、免疫応答に影響を与えることを示唆する。
【０１４１】
刊行された研究は、ホスホロチオエート化非CpG ODNが、CpG ODNのものと同様の免疫刺激性特性を有し得ることを実証した。具体的に、これらのオリゴは、B細胞活性化を引き起こし、B細胞増殖ならびにIL-6およびIL-10の分泌を引き起こし得る（Vollmer et al., Immunol. 113:212; Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119; Vollmer et al., 2002, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 12:165-75）。本発明のIMSが、PBMC培養におけるこれらの効果を刺激するかどうかを判定するために、本発明者らは、CpG-ODNの非存在下で、増加する濃度のIMSとともに細胞をインキュベートした。増殖（図5）およびIL-6、IL-10の分泌、ならびにIFN-γ産生は、全て、>25μg/mlのIMSによって刺激された（図4a、b、d）。対照的に、IFN-αの誘導は、使用されたどのオリゴ濃度でも観測されなかった（図4c）。
【０１４２】
実施例2：IMS-ODNによる、インビボでのCpG-ODN誘導サイトカインおよびケモカイン産生の抑制
IMS-ODNが、インビボでCpG-ODN効果を抑圧する可能性があるかどうかを判定するために、マウスにCpGおよびIMSオリゴの混合物を注射した。IMS作用のインビボ動態を調べるために、50μgのI18を4群のマウスへIPで注射した（D0〜D3；n＝3）。刺激性CpG-ODN（mCpG）を、群1（D0）へI18と同時に；群2（D1）-I18の24時間後；群3（D2）-I18の48時間後；および群4（D3）-I18の72時間後に注射した。注射の24時間後、血清を収集し、炎症誘発性タンパク質IL-12およびMCP-1の発現に対してELISAによって分析した。図6は、IMS：CpG ODNの1：1および1：3の質量比の両方で、IL-12の有意な抑制が観測され得ることを実証する。MCP-1レベルの有意な抑制も観測された（データ非呈示）。
【０１４３】
実施例3：IMS生物学的効果の、インビボでの数日間の持続
インビトロ研究により、CpG-ODNに対するあるIMSの抑制効果が、16時間持続する可能性があることが示された（Stunz et al., Eur. J. Immunol. 32:1212）。インビボでのIMS効果の持続性を調べるために、0日目にIMSを、次いで1、2、または3日目に刺激性CpG ODNをマウスに注射した。CpG注射の24時間後に血清を収集し、IL-12を測定した。図6は、0日目に注射されたIMSが、3日後に注射されたCpGの効果をまだ抑制することを実証する。
【０１４４】
実施例4：IMSによる、SLEのマウスモデルにおける疾患発症の遅延
IMSオリゴを、狼瘡の動物モデルにおける疾患発症に影響を与えるそれらの能力に対してテストした。NZB/W F1メスマウスは、全身性エリテマトーデス（SLE）を有する個人と同様のタンパク尿、腎臓病理、およびDNAに対する抗体を自然に発現する。TpTおよびGpG IMSオリゴを、皮内送達（ID）によって毎週50μgでNZB/W F1メスマウスに投与した。あるいは、GpG IMSオリゴは、経口強制飼養による投与であった（PO；50μg、QW）。対照動物は、媒体、PBSの毎週の注射を受けた。実験群のいずれにおいても、タンパク尿発症における有意な遅延は観測されず（図7）、DNAに対する自己抗体応答は、統計的に有意な量は低下しなかったが（図8）、腎臓の分析により、オリゴが経口強制飼養によって投与される場合に、炎症を低下させることにおけるGpGオリゴの有意な効果が明らかになった（図9）。ID投与によって送達されるGpGは、スコアも低くしたが、これは、統計的有意性に達しなかった。
【０１４５】
このSLEのマウスモデルにおける腎臓病理に対する50μg GpG IMSオリゴの効果を鑑みて、本発明者らは、用量応答を調べるための実験を行った。50、200、および500μgのGpG IMSオリゴを、IP注射によって毎週NZB/W F1メスマウスに投与した。タンパク尿発症における用量依存性の遅延およびDNAに対する自己抗体応答における低下が観測され、500μg GpG IMSオリゴを注射されたマウスにおいて、タンパク尿発症における高度に有意な遅延および最低中央値DNA自己抗体力価であった（図10および11）。腎臓病理は、これらの動物に対して行われる。
【０１４６】
上で記載されるインビトロ実験は、第三のオリゴ、I-18が、TpTおよびGpGオリゴと質的に異なる可能性があることを実証した。狼瘡におけるこれらの異なるオリゴの効果を比較するために、50μgのTpT、GpG、およびI-18（ヒトおよびマウスの両方、それぞれI-18hおよびI-18m）オリゴを、IP注射によって毎日NZB/W F1メスマウスに投与した。34週目、対照群のおよそ30％がタンパク尿を示した時に、動物を犠牲死させた。自己抗体分析により、媒体処置対照群と比較してI-18m処置群において抗DNA応答における有意な低下が明らかになった（図12）。腎臓病理は、これらの動物に対して行われる。
【０１４７】
実施例5：IISオリゴによる、実験的誘導ブドウ膜炎を有するマウスにおける炎症の重症度の低下
狼瘡動物モデルにおいて観測された効能が、その他の自己免疫疾患に一般化されるかどうかを判定するために、ブドウ膜炎、目における自己免疫疾患に対するIMSオリゴの効果を調べた。実験的誘導自己免疫ブドウ膜炎（EAU）は、ヒト疾患と多くの共通の特徴を有するブドウ膜炎のマウスモデルである（Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease, Current Protocols in Immunology, 2003 Chapter 15.6）。CFAにおいて乳化されたヒト網膜内結合タンパク質、hIRBP161-180のペプチドフラグメントでの免疫付与によって、B10.RIIIマウスにおいてEAUを誘導した。次いで、200μgの各々のIMSオリゴを、ヒトブドウ膜炎に対する標準治療である低用量のステロイドデプロメドロール（1 mg/kg）と組み合わせて、ID注射によって毎週投与した。EAUの程度を、21日目に眼窩病理によってスコア化した。GpG IMSオリゴおよび低用量ステロイドの投与で疾患重症度が低くなる傾向が観測されたが（図13）、TpTは、ステロイドとの相乗効果を示さなかった。
【０１４８】
これらの観測を広げるために、ステロイド処置の非存在下でのIMSオリゴおよび皮内対腹腔内投薬を調べた。CFAにおいて乳化されたhIRBP161-180ペプチドでの免疫付与によって、B10.RIIIマウスにおいてEAUを誘導した。次いで、200μgの各々のIMSオリゴを、単独でまたは低用量のステロイドデプロメドロール（1 mg/kg）と組み合わせて、IPまたはID注射によって毎週投与した。陽性対照として、抗CD3抗体を、IV投与によって動物あたり5μgで0日目に開始して5日間毎日投与した。GpG IMSオリゴプラスステロイド群の毎週の皮内または腹腔内送達は、ステロイドのみよりも低い重症度スコアを引き起こしたが、どちらも統計的に有意ではなかった（図14）。対照的に、IPによるGpGオリゴ単独の投与は、ステロイド処置と組み合わせて使用される場合よりも効能があり、非処置対照と比較して疾患重症度における統計的に有意な改善を引き起こした（p<0.01）（図14）。この効果は、抗CD3で処置された陽性対照群（p<0.05）と同程度であった。
【０１４９】
EAUに対するIMSオリゴの効果をさらに分析し、最低有効用量を決定するために、本発明者らは、50μg GpG、TpT、I18h、およびI18mオリゴのIP投与を比較した。200μgのGpGでの毎週のIP投薬（図14）とは対照的に、GpGまたはその他のIMSオリゴのいずれかでの毎日の50μg投薬は、疾患重症度における有意な改善を提供しなかった（図15）。
【０１５０】
EAUはCFAで誘導されるので、GpGオリゴが疾患重症度を低くする作用の1つの可能性のあるメカニズムは、CFAのマイコバクテリウム成分におけるCpGと競合することによるものである。CFAの非存在下での疾患経過に対するGpG IMSオリゴの効果を調べるために、養子免疫伝達実験を行った。hIRBP161-180ペプチド/CFAで処置された動物において誘導されたブドウ膜炎発症細胞を採取し、hIRBP161-180ペプチドとともに3日間インビトロで成長させた。4日目に、細胞をナイーブレシピエントに養子免疫伝達し、その半分は、200μg GpGオリゴの毎週のIP注射を受け、半分は、対照としてPBS媒体を受けた。GpGオリゴで処置された動物は、媒体処置群よりも重度でない炎症を示し（図16）、GpGがCpG阻害効果に関係しない疾患に対する効果を有する可能性があることを示唆する。
【０１５１】
実施例6：IISオリゴによる、関節炎の動物モデルにおける、発症の遅延、重症度の低下
次に、EAUにおけるようなT細胞の代わりに、抗体が炎症を駆り立てている自己免疫疾患の関節炎モデルにおいて、本発明のIMSオリゴをテストした。コラーゲン抗体誘導関節炎（CIA）を、0日目に200μgの4つのモノクローナル抗コラーゲン関節炎発症抗体の単一のIV注射によってBalb/cマウスにおいて誘導し（Terato, K. et al. 1992）、2日後にLPSの注射によって疾患を同期させた。従って、マイコバクテリアDNAまたはCpGのその他の外因性源は、疾患を誘導するのに利用されなかった。次いで、GpGおよびI18h IMSオリゴを、4日目〜10日目にIPによって50μgで投与した。以下のスコアリングシステムを使用して、動物を毎日観測した：0＝正常；1＝中足（足根骨）または足関節に限られた軽度の腫れを有する紅斑；2＝足首から中足に広がる紅斑および軽度の腫れ；3＝足首から中足骨関節に広がる紅斑および中度の腫れ；ならびに4＝紅斑および重度の腫れが、足首、足、および指を包含する。各々の足は、4の最大スコアに、各々のマウスは、16の最大スコアに割り当てられる可能性があると考えられる。平均関節炎スコアは、各々の実験群における動物からの各々の足に対する関節炎スコアを平均化することによって決定された。50μg GpGオリゴでの処置は、疾患重症度または疾患罹患率における低下を提供しなかったが、I18hオリゴで処置された動物において、関節炎重症度における有意な低下および発症における遅延が観測された（図17および18）。
【０１５２】
実施例7：IISオリゴによる、大腸炎のマウスモデルにおける体重損失の抑制
刊行された研究により、CpGオリゴが大腸炎の動物モデルにおける体重損失を最小にすることが示唆された（Rachmilewitz, D. et al. 2002）。しかしながら、いくつかの研究において、投薬のタイミングが重大であり、前処置は有意な保護効果を提供したが、疾患発症後の処置は、疾患を悪化させた（Obermeier, F. et al., 2003; Obermeier, F., 2002）。本発明のIMSオリゴが、大腸炎に同様に影響を与える可能性があるかどうかを判定するために、炎症性腸疾患のIL-12媒介動物モデル、TNBS誘導大腸炎モデルを使用した（Animal Models of Autoimmune Disease, Current Protocols in Immunology, Chapter 15.19, 2003）。C3Hマウスを-5日目に大腸炎発症用量以下のTNBS（0.5％）で経直腸的に処置した。同じ日に、GpG、I18h、またはI18mオリゴでのIP処置を開始し、5日間継続した。次いで、第二のTNBS投与（3.5％経直腸的）によって疾患を誘導し、その後、オリゴ処置を停止した。動物を毎日秤量し、各々の処置群に対する平均体重損失を決定するために、元の体重（0日目）で除算された体重における変化を使用した。オリゴで処置された全ての動物は、媒体対照群と比較した場合、低下した体重損失を示した（図19、20、および21）。
【０１５３】
炎症性腸疾患の第二のモデルも調べた。デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の経口投与は、TNBSと異なり、先天性免疫システムによって排他的に媒介される急性大腸炎を誘導する。メスC3Hマウスを、腹腔内注射によって毎日50または200μgのGpG、I-18h、またはI-18mオリゴで-2日目に開始して前処置し、次いで、7日間（0〜7日目）飲料水における3.5％ DSSを与えた。あるいは、オリゴ処置を、疾患誘導の日に始めた。動物を毎日秤量し、元の体重（0日目の重さ）によって除算された体重における変化を決定した。予防および処置実験の両方において、IMSオリゴは、媒体処置対照群と比較した場合、体重損失からの有意な保護を提供した（図22、23、24、および25）。各々のケースで、0日目に始められた処置が、最大保護を提供した。
【０１５４】
実施例8：I18突然変異生成
I18による免疫調節に関与する構造的モチーフをさらに評価するために、上で記載されるように、ヒト末梢血単核球（PBMC）のCpG媒介増殖に対するI18突然変異生成の効果を決定した。ポリG領域内（I18.M3〜6および8；図26）および六量体配列に対して5'側（I18.M10〜12；図27）の突然変異は、PBMC増殖を抑制する六量体配列 5'-GTGGTT-3'を含むオリゴヌクレオチドの能力を有意に軽減した。さらに、六量体配列とポリGとの間のヌクレオチドの付加は、PBMC増殖を緩やかに軽減した（I18.M13〜16；図27）。
【０１５５】
実施例9：I18およびToll様受容体を介するシグナリング
I18が免疫応答を調節するメカニズムを決定するために、Toll様受容体（TLR）活性化に対するI18の効果を査定した。TLR2、3、4、5、7、8、および9を発現する培養HEK293細胞におけるNF-κB活性化によって、TLRシグナリングを調べた。TLRアゴニストに対してスクリーニングするために、最高濃度（25μg/ml）で2回、I18を含む各々の免疫調節オリゴヌクレオチドをテストし、TLR活性化を、対応するTLRに対する対照リガンド（以下に載せられる）と比較した。同様に、免疫調節オリゴヌクレオチドおよび対照リガンドの混合物を対照リガンド単独の活性に対して比較することによって、TLRアンタゴニストを同定した。I18は、TLR3、5、7、および9のそれらの対応するリガンドによる活性化を抑制した。図29を参照されたい。使用された対照リガンドは以下を含む：TLR2: 108細胞/mlでのHKLM（熱殺菌リステリア菌（Listeria monocytogenes））；TLR3: 100 ng/mlでのポリ(I:C)；TLR4: 10 ng/mlでの大腸菌（E. coli）K12 LPS；TLR5：10 ng/mlでのネズミチフス菌（S. typhimurium）フラジェリン；TLR7: 1 mMでのロキソリビン；TLR8: 50μg/mlでのssPolyU/LyoVec；TLR9: 1μg/mlでのCpG ODN 2006。
【０１５６】
実施例10：I18による、IFN-αのTLR7およびTLR3リガンド誘導産生の抑制
形質細胞様樹状細胞（pDC）は、IFN-αの主要な内因性源であり、全身性エリテマトーデス（SLE）を有する患者における上昇IFN-αレベルの源である。IMS I18が、TLR7アゴニストに応じたpDCによるIFN-α産生に影響を与える可能性があるかどうかを判定するために、pDCを単離し、I18とともにまたはともなわずに、TLR7アゴニストとともにインキュベートした。
【０１５７】
ヒトpDCを、IsoPrepを使用して2つの異なるドナーから密度勾配遠心分離によって単離されたPBMCから分離した。細胞懸濁液を10分間300gで遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを、108細胞あたり400μLのビーズバッファー（PBS pH 7.2、0.5％ BSAおよび2mM EDTA）に再懸濁した。108細胞あたり100μLのNon-PDC Biotin-Antibody Cocktailを添加し、混合し、4〜8℃で10分間インキュベートした。細胞を108細胞あたり5〜10mlのビーズバッファーで洗浄し、10分間300gで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをビーズバッファー（400μl/108全細胞）およびAnti-Biotin Microbeads（100μl/108全細胞）に再懸濁し、よく混合し、4〜8℃で15分間インキュベートした。次いで、108細胞あたり5〜10mLのビーズバッファーを添加することによって細胞を洗浄し、10分間300gで遠心分離し、上清を除去した。細胞を500μL/108細胞の最終容積に再懸濁し、前もって3mLのビーズバッファーでリンスすることによって洗浄され、MACS磁気カラムホルダーに位置付けられたLSカラムに添加した。カラムを3回3 mLのビーズバッファーで洗浄し、非ラベル濃縮形質細胞様樹状細胞画分を含む全流出物を収集した。
【０１５８】
ドナー1からの単離pDCを、単独でまたは5μg/mLもしくは25μg/mL I18とともに、TLR7アゴニストロキソリビン（Invivogen；Cat # tlrl-lox）およびイミキモド（R-837；Invivogen；Cat # tlrl-imq）とともにインキュベートし、IFN-α産生を、製造業者のプロトコールに従ってELISA（PBL Biomedicals；Cat# 41105-2）によって測定した。いずれの濃度のI18も、pDCによるIFN-α産生を完璧に排除する（図30A）。ドナー2からの単離pDCを、TLR7アゴニストロキソリビンおよびロキソリビンプラス5μg/mL I18とともに、オリゴヌクレオチドをともなわずにインキュベートした。再度、I18は、TLR7によるIFN-α産生を完璧に阻害した（図30B）。
【０１５９】
同様に、TLR3アゴニストPolyI:CをともなうPBMCのインキュベーションは、IFN-α産生を引き起こし、25μg/mL I18によって2つの異なるドナーにおいて阻害される（図31）。
【０１６０】
実施例11：I18による、pDCによるCpG誘導IFN-α産生の抑圧
SLE患者血清における内因性核酸免疫複合体に存在するCpG配列は、形質細胞様樹状細胞（pDC）によるIFN-αの産生を媒介し得る。IMS I18が、CpG配列に応じたpDCによるIFN-α産生に影響を与える可能性があるかどうかを判定するために、pDCを単離し、I18とともにまたはともなわずに、CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。
【０１６１】
上で記載されるように単離されたpDCを、単独でまたは増加する量のI18とともに、CpGとともにインキュベートした。IFN-α産生を、上で記載されるようにELISAによって測定した。I18は、2つの異なるドナーからのpDCにおいて、等モル比でCpGオリゴヌクレオチドとともに提示される場合、IFN-α産生を有意に軽減し、より高い比で産生を事実上排除した（図32A、B）。CpGオリゴヌクレオチドの導入の前の24時間のI18をともなうpDCのプレインキュベーションは、両方のドナーからのIFN-α産生を完璧に排除した（図32C、D）。
【０１６２】
実施例12：I18による、pDCにおけるIFN-αのSLE-免疫複合体誘導の抑制
SLE患者からの血清は、TLR9およびFcγRIIaを介するこれらの患者におけるpDCによるIFN-αの過剰産生に貢献する抗dsDNA抗体および免疫複合体を含む。I18がIFN-α産生に影響を与えるかどうかを判定するために、単離pDCを、4人の異なる患者からのSLE血清またはSLE-ICとともにインキュベートし、I18による抑制を調べた。
【０１６３】
最初に、SLE患者から単離された血清を、正常対照と比較してELISAによって抗dsDNA抗体および免疫複合体の存在に対して査定した。患者19558および22914は、高レベルの抗DNA抗体を有したが、患者KP491およびKP504は、正常に近かった（図33A）。免疫複合体を、5cmクロマトグラフィーカラム（Pharmacia）においてProtein A Agarose Fast Flowビーズ（2ml；Sigma P3476）によってヒト血清から単離した。カラムを、0.02％アジドナトリウムを含む10 ml PBSで洗浄した。ヒト血清（1〜2 mL）を、PBSにおいて1：3に希釈し、0.2μmシリンジフィルターを介して濾過した。希釈血清をカラムにアプライし、カラムを10〜15mLのPBSで洗浄し、10mL 0.1Mクエン酸pH2.6で溶出し、2mL 1M TrisバッファーpH 7.5を含む50mLコニカルへ収集した。溶出液をオーバーナイトでPBSに対して透析し、滅菌濾過し、タンパク質濃度を決定するために吸光係数として1.5を使用してOD280を測定した。全てのSLE患者は、正常対照よりも高レベルの免疫複合体を有した（図33B）。さらに、単離pDCをともなうSLE患者からの1μg/mL精製Igのインキュベーションは、抗dsDNA抗体を有する患者においてのみIFN-αの産生を誘導した（図33C）。
【０１６４】
次に、血清が抗dsDNA抗体を含むSLE患者からの免疫複合体に応じたpDCによるIFN-αの産生を抑制するI18の能力を調べた。SLE患者からの精製Igおよび正常対照を、I18の存在または非存在下で単離pDCとともに24時間インキュベートした。単離pDCまたは正常対照からの免疫複合体とともにインキュベートされたpDCは、IFN-αをほとんど産生しなかった（図34）。対照的に、SLE患者からの免疫複合体とともにインキュベートされたpDCは、有意な量のIFN-αを産生し、IFN-αの産生は、I18によって抑制される。
【０１６５】
実施例13：I18による、正常末梢B細胞（CD19+）のCpG活性化の抑制
免疫刺激性CpG配列によって活性化されるB細胞に対するI18の効果を決定するために、CD19+末梢B細胞をヒト末梢血から単離し、サイトカイン産生および細胞増殖の両方を、免疫調節オリゴヌクレオチドI18の存在または非存在下で調べた。
【０１６６】
CD19+末梢B細胞を、107全細胞に添加されかつ4℃で15分間インキュベートされる20μLのCD19 MicroBeadsを使用して、ヒト血液PBMCから単離した。細胞を2 mL/107細胞で洗浄し、10分間300×gで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをビーズバッファー（500μl/10８細胞）に再懸濁し、MACS Separatorに置かれたLSカラムにロードした。カラムを3 mLのバッファーで3回洗浄し、次いで、溶出バッファーを添加し、カラムとともに供給されたプランジャーをしっかりと適用することによって磁気的にラベルされた細胞をカラムから洗い流した。溶出したCD19+細胞を、10分間300×gで遠心分離し、10mlのRPMI-1640（10％ FBSを含む）に再懸濁した。
【０１６７】
CpG-ODN刺激IL-6およびIL-10サイトカイン産生に対するI18の効果を決定するために、CD19+ B細胞を、単独でまたは5μg/mL I18の存在下で、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに48時間インキュベートした。培養培地におけるサイトカインレベルを、製造業者のプロトコールに従ってELISA（Pharmingen、ヒトIL-6、Cat #555220；ヒトIL-10、Cat #555157）によって分析した。図35において示されるように、I18は、CpG刺激IL-6（図35A）およびIL-10（図35B）発現の両方を抑圧した。
【０１６８】
I18が、細胞増殖のCpG-ODN刺激を抑制する可能性があるかどうかを判定するために、CD19+ B細胞を、4日間単独でまたは5μg/mLもしくは25μg/mL I18の存在下で、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともにインキュベートした。細胞増殖を、インキュベーションの最後の24時間の間の[3H]チミジン取り込みによってアッセイした。I18は、両方の投薬量でCpG刺激C細胞増殖を有意に抑圧した（図35C）。
【０１６９】
実施例14：I18による、狼瘡患者からの末梢B細胞（CD19+）のCpG活性化の抑制
免疫刺激性CpG配列によって活性化される狼瘡B細胞に対するI18の効果を決定するために、CD19+末梢B細胞を、SLEを有する患者から単離し、サイトカイン産生および増殖を、I18の存在または非存在下で調べた。患者は、1年以内にSLEと診断された23歳の女性であり、プラキニルを摂取している。
【０１７０】
CD19+ B細胞を、上で詳細に記載されるように単離した。狼瘡CD19+ B細胞によるCpG-ODN刺激IL-6およびIL-10サイトカイン産生に対するI18の効果を、単独でまたは5μg/mLもしくは25μg/mL I18の存在下で、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに48時間細胞をインキュベートすることによって調べた。培養培地におけるサイトカインレベルを、上で記載されるようにELISAによって分析した。図36において示されるように、I18は、CpG刺激IL-6（図36A）およびIL-10（図36B）発現の両方を抑圧した。
【０１７１】
I18が、CD19+ B細胞のCpG-ODN刺激増殖を抑制する可能性があるかどうかを判定するために、細胞を、4日間単独でまたは1μg/mL、5μg/mL、もしくは25μg/mL I18の存在下で、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともにインキュベートした。細胞増殖を、インキュベーションの最後の24時間の間の[3H]チミジン取り込みによってアッセイした。I18は、全ての投薬量でCpG刺激C細胞増殖を有意に抑圧した（図36C）。
【０１７２】
実施例15：I18による、正常および狼瘡B細胞の活性化
末梢B細胞活性化に対するI18の効果を、免疫刺激性CpG配列と比較した。5μg/mLまたは25μg/mL I18をともなう単離CD19+CD27-ナイーブB細胞のインキュベーションは、CpG配列と同じ度合にIL-6発現を誘導した（図37B）。対照的に、単離CD19+CD17+記憶B細胞とともにインキュベートされた5μg/mLまたは25μg/mL I18は、CpG配列よりもはるかに少ない度合にIL-6発現を誘導した（図37A）。I18は、CpG-ODNによって誘導されるよりも低いレベルではあったが、5μg/mLおよび25μg/mLの両方でナイーブおよび記憶B細胞の両方においてIL-10発現を誘導した（図38）。同様に、I18は、FACSによって決定されるように、CpG配列よりも低いレベルで、クロロキン感受性様式で、B細胞共刺激性マーカーCD80およびCD86発現を活性化した（図39）。しかしながら、B細胞を13日間オリゴヌクレオチドを含むまたは含まない10％ FBSにおいて培養した場合、I18は、CpG配列がしたようにB細胞生存または増殖を増加させなかった（図40）。最後に、I18は、SLE患者からのB細胞のIL-6（図41A）、IL-10（図41B）、および細胞増殖（図41C）のはるかに弱い活性化因子であった。
【０１７３】
実施例16：I18による、SLEのマウスモデルにおける疾患発症の遅延
I18オリゴを、狼瘡の動物モデルにおける疾患発症に影響を与えるそれらの能力に対してテストした。NZB/W F1メスマウスは、全身性エリテマトーデス（SLE）を有する個人と同様のタンパク尿、腎臓病理、およびDNAに対する抗体を自然に発現する。I18 IMSオリゴを、皮内送達によって10μg、50μg、および250μgで毎週NZB/W F1メスマウスに投与した。抗dsDNA抗体を有する動物の割合は、50μg（p＝0.17）および250μg（p＝0.04）の毎週の用量のI18を受けた群よりも統計的に少なかった（図42）。
【０１７４】
次に、異なる投薬量頻度を調べた。NZB/W F1メスに、全部で45週間毎日、週に3回、または毎週10μg、50μg、または250μg I18を投与し、タンパク尿発症を査定した。10μg I18の投与は、疾患発症に影響を与えなかった（図43A）。対照的に、50μgおよび250μgでの全ての投薬計画は、PBS対照と比較して低下した疾患発症の傾向を示した（図43B、C）。重要なこととして、250μg I18の週に3回（図44B）および毎週（図44C）の投与の両方は、10μgおよび50μg I18での投与と比較して統計的に有意な傾向を示した（それぞれ、ログランク検定p＝0.31およびp＝0.03）。
【０１７５】
実施例17：I18でのヒトSLEの処置
免疫調節オリゴヌクレオチドI18は、ヒトSLE患者を処置するために使用される。SLEと診断された患者は、最初にELISAによって彼らの血清における抗dsDNA抗体の存在に対してスクリーニングされる。次いで、抗dsDNA抗体を呈する患者は、約0.001マイクログラム〜約1グラムの範囲における治療的有効量のI18で処置される。I18の好ましい治療的量は、約5マイクログラム〜約500マイクログラムの範囲である。I18の最も好ましい治療的量は、約50〜200マイクログラムの範囲である。I18治療は、継続的に、毎日、隔日、週に2回、毎週、隔週、または毎月送達される。好ましい治療計画において、I18治療は、6〜12ヶ月間毎月、次いで、維持用量として3〜12ヶ月おきに送達される。ヒトSLE患者は、疾患活性に対してモニターされる。
【０１７６】
実施例18：I18および関連オリゴヌクレオチドによる、ヒトB細胞によるIL-6のCpG刺激の抑制
免疫調節オリゴヌクレオチドI18の突然変異生成は、強化された免疫調節活性を有する5つの関連オリゴヌクレオチドを同定した。I18の系統的変更は、関連オリゴヌクレオチド
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を生成した。CpG-ODN刺激IL-6サイトカイン産生に対するI18由来オリゴヌクレオチドの効果を決定するために、ヒトB細胞を、5μg/mL刺激性CpG-ODNもしくはI18-由来オリゴヌクレオチド単独または5μg/mL I18もしくはI18由来オリゴヌクレオチドの存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに48時間インキュベートした（図45）。培養培地におけるサイトカインレベルを、製造業者のプロトコールに従ってELISA（Pharmingen、ヒトIL-6、Cat #555220）によって分析した。I18をともなうヒトB細胞のインキュベーションは、IL-6産生の小さな刺激を引き起こしたが、I18由来オリゴヌクレオチドのどれも、検出可能なサイトカイン産生を誘発しなかった（図1、左カラム）。同様に、I18由来オリゴヌクレオチドは、I18よりも良くCpG-ODNによるIL-6産生を抑制したが、全ての免疫調節オリゴヌクレオチドが、統計的に有意な抑制を引き起こした（図45、右カラム）。
【０１７７】
実施例19：免疫抑制性および刺激性特性の別個のレベルを有するオリゴの特徴付け
抑制性オリゴヌクレオチドを、各々のオリゴによって保有される免疫抑制性および刺激性活性の相対レベルを決定するためのアッセイにおいてスクリーニングした。抑制性活性を決定するために、マウス脾細胞を、単独でおよび抑制性オリゴヌクレオチドの存在下で、TLR7およびTLR9アゴニストとともにインキュベートし、IL-6などの炎症性サイトカインの活性化を測定した（図47）。免疫刺激性特性の存在に対してテストするために、ヒトB細胞を、組換えCD40リガンドおよびオリゴヌクレオチドの組み合わせとともにインキュベートし、B細胞活性化を、短期培養におけるサイトカイン産生または長期培養における生存および免疫グロブリン産生を調べることによって測定した（図49）。活性化および抑制性活性の別個のレベルを有するオリゴを、動物モデルにおけるさらなるテストのために選択した。NZB/W F1血統を使用して、動物研究を行った。オリゴヌクレオチドを、IPまたは皮下経路によって毎週送達し、動物を、生存、タンパク尿レベル、および抗dsDNA抗体のレベルに対して査定した（図48）。
【０１７８】
先の実施例は、本発明を実施するための具体的な態様である。例は例示的な目的のためだけに提供されており、いかなる意味においても本発明の範囲を限定する意図のものではない。本発明の他の形態は当業者に容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書に引用されている全ての文献、特許、特許出願および他の参照文献は参照として本明細書に組み入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月4日(2009.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、2007年6月13日に出願されたPCT/US2007/071130の国内段階であり、2006年6月13日に出願された米国特許仮出願第60/813,538号および2006年10月5日に出願された米国特許仮出願第60/849,901号の恩典を主張する。これらの全開示は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明のいくつかの態様において、六量体配列のXおよびYは、GpGである。特定の態様において、六量体配列は、5'-GTGGTT-3'である。いくつかの態様において、CCジ-ヌクレオチドは、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側に位置付けられる。特定の態様において、ポリG領域は、3連続グアニン塩基を含み、六量体配列から2ヌクレオチド3'側に位置付けられる。特定の態様において、改善された免疫調節配列は、
2009540016.tif 000073
（SEQ ID NO：73）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【図１】抑制性IMSによる、ヒトPBMC細胞のCpG依存性増殖の抑圧を示す。ヒトPBMC（5×105/ml）を、刺激性CpG-ODN（5μg/ml）またはCpGおよび抑制性IMSの混合物の存在下でインキュベートした。細胞を96時間DNAとともにインキュベートし、ウェルを培養の最終の24時間1μCi[3H]TdRでパルスし、取り込まれた放射能を測定した。各々のデータポイントは、4反復の平均値を示す。a,b）刺激性CpG-ODN 2395（5μg/ml）を、2つの異なる細胞ドナー-QB8（a）およびQB10（b）において、独立に（左から2番目のバー）または増加する濃度の抑制性IMS（括弧内に示されるように1〜25μg/ml+5μg/ml 2395）とともにインキュベートした。
【図２】CpG刺激サイトカイン産生に対するIMS GpG.1およびI18効果の用量応答分析を示す。ヒトPBMC（5×106/ml）を、単独でまたは増加する用量のIMS GpG.1およびI18と組み合わせて、CpG ODN（2006、2395、C274、D19）の存在下で48時間インキュベートした（全てのIMS試料は、5μg/mlのCpGオリゴを含んだ）。培地におけるサイトカインレベルを、ELISAによって測定した。各々のデータポイントは、3反復の平均を示す。IL-10およびIL-12（aおよびb）に対して、増加するIMS用量にともなうサイトカイン産生の増加する抑圧がある。IFN-γ（c）およびIFN-α（d）に対して、増加するIMS用量は、両方のIMSに対して増加するサイトカイン発現を引き起こすが、IMS I18に対して、低用量は、IFN-γレベル全体を抑圧し、全てのI18用量は、CpG単独試料に対してIFN-αレベルを抑圧する。
【図３】IMS GpG.1およびI18のConAおよびPolyI:C抑制性効果を示す。（a）ヒトPBMC（5×106/ml）を、48時間単独でまたは増加する濃度のIMSとともに、PolyI:C（10μg/ml）とともにインキュベートした。上清IFN-αタンパク質レベルを、ELISAによって測定した。各々のデータポイントは、3反復の平均を示す。5μg（25μg/ml）用量のI18およびGpG.1は、PolyI:C誘導IFN-αを抑圧するのに有効であった。（b）PBMCを、単独でまたはGpG.1およびI18（各々25μg/ml）と組み合わせて、10μg/mlのConAとともにインキュベートし、図1において記載されるように、増殖を分析した。
【図４】抑制性IMSにより可能である、CpGとは無関係なサイトカイン産生の誘導を示す。CpGオリゴの非存在下での増加する用量のIMSを、48時間PBMC（ドナーQB11およびQB12）とともにインキュベートし、サイトカインをELISAによって分析した。各々のデータポイントは、3反復の平均を示す。（a）IL-6 （b）IL-10 （c）IFN-α （d）IFN-γ。
【図５】抑制性IMSにより可能である、刺激性CpG ODNの非存在下でのPBMC増殖の刺激を示す。ヒトPBMC（5×105/ml）を、刺激性CpG-ODN 2395（5μg/ml）または増加する濃度のIMS GpG.1およびI18の存在下でインキュベートした。上（図1）で記載されるように、細胞増殖を測定した。
【図６】抑制性IMSにより可能である、インビボでのCpG誘導IL-12発現の抑圧を示す。オリゴヌクレオチドを腹腔内注射によって投与し、24時間後に後眼窩出血によって血清を引き出した。血清を、ELISAによってIL-12レベルに対して分析した。
【図７】50μgでの毎週のIMSオリゴ投薬が、狼瘡のマウスモデルにおけるタンパク尿への進行に有意に影響を与えないことを示す。TpTまたはGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBSで処置された対照群を、尿におけるタンパク質の存在に対して毎週スコア化した。Albustix Reagent Stripsによってスコア化されるような>300mg/dlの2連続スコアとして定義されるタンパク尿を示すマウスの割合を、時間にわたってプロットした。タンパク尿の発症における有意な遅延は、どの処置群においても観測されなかった。
【図８】50μgでの毎週のIMSオリゴ投薬が、狼瘡のマウスモデルにおける抗DNA自己抗体力価に有意に影響を与えないことを示す。TpTまたはGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBSで処置された対照群からの血清を、犠牲死の時に採取した。市販されているキットを使用して、抗二本鎖DNA抗体力価を測定した。オリゴでの処置は、抗DNA応答全体をわずかに低くするが、どれも統計的有意性に達しなかった。
【図９】経口強制飼養によって投与されたGpG IMSオリゴが、狼瘡のマウスモデルにおける腎臓における炎症の重症度を有意に低下させたことを示す。タンパク尿に進行したTpTまたはGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBSで処置された対照群から取られた腎臓に対して、病理組織をスコア化した。スコアリングシステムは、炎症の程度を測定するようにデザインされ、以下のように定義された：1＝最小；2＝軽度；3＝中度；および4＝顕著/重度。スコアリングは、契約獣医病理学者によって盲検法で行われた。組織学スコアを各々の群に対して平均化し、平均±SEMとして以下に示される。両方のGpG処置群で腎臓炎症における軽減が観測されたが、経口強制飼養によって投与されたGpGのみが、統計的有意性に達した。
【図１０】狼瘡のマウスモデルにおけるGpG IMSオリゴ処置にともなうタンパク尿発症における用量依存性の遅延を示す。毎週IPによって増加する投薬量（50、200、および500μg）のGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBS媒体で処置された対照動物を、尿におけるタンパク質の存在に対して毎週スコア化した。Albustix Reagent Stripsによってスコア化されるような>300mg/dlの2連続スコアとして定義されるタンパク尿を示すマウスの割合を、時間にわたってプロットした。タンパク尿発症における用量依存性の遅延があり、最高用量のGpGが、最も有意な遅延を提供した（p＝0.03）。
【図１１】狼瘡のマウスモデルにおけるGpG IMSオリゴ処置にともなう抗DNA抗体応答における用量依存性の低下を示す。毎週IPまたはIDによって増加する投薬量（50、200、および500μg）のGpGオリゴで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBS媒体で処置された対照動物からの血清を、犠牲死の時に採取した。市販されているキットを使用して、抗二本鎖DNA抗体を測定した。抗体力価のプロットは、増加するGpG濃度にともなう抗DNA応答における用量依存性の低下を明らかにする。
【図１２】I-18m IMSオリゴ処置が、狼瘡のマウスモデルにおける抗DNA抗体応答を有意に低下させることを示す。IP注射によって毎日50μgのGpG、I-18h、I18m、またはTpTで処置されたNZB/W F1メスマウスおよびPBS媒体単独で処置された対照群からの血清を、犠牲死の時に収集した。市販されているキットを使用して、抗二本鎖DNA抗体を測定した。抗体力価のプロットは、I-18m処置が、対照と比較してDNAに対する自己抗体レベルを有意に低くしたことを明らかにする。
【図１３】低用量ステロイドと組み合わせたGpG IMSオリゴが、EAUに関連する炎症を低下させることを示す。hIRBP161-180ペプチドで免疫されたB10.RIIIマウスに、200μg GpGまたはTpTプラス低用量デプロメドロール（1mg/kg）を毎週IDで投薬した。各々の実験群に対する平均的重症度スコアを与えるために、21日目の目の組織学的評価を、EAUにおける専門家によって盲検法でスコア化した。ステロイド単独またはステロイドプラスTpT IMSオリゴの投与は、ブドウ膜炎の重症度に対する有意な影響を有しないが、ステロイドプラスGpGでの処置は、疾患スコアを有意に低くした。
【図１４】GpG IMSオリゴ処置が単独でEAUにおける炎症の重症度を有意に低下させることを示す。hIRBP161-180ペプチドで免疫されたB10.RIIIマウスに、単独でまたは腹腔内もしくは皮内低用量デプロメドロール（1mg/kg）と組み合わせて、200μg GpGまたはTpTオリゴを投与し、犠牲死させ、組織学的評価のために目を採取した。目を、EAUにおける専門家によって盲検法でスコア化した。ブドウ膜炎の重症度に対する単独またはGpGオリゴと組み合わせたステロイドの有意な効果は観測されなかったが、GpG単独のIP送達は、抗CD3陽性対照と同様の重症度スコアにおける有意な改善を提供した。
【図１５】IMSオリゴの毎日のIP送達が、EAU疾患重症度に影響を与えないことを示す。hIRBP161-180ペプチドで免疫されたB10.RIIIマウスに、0日目に開始してIP注射によってI-18h、I-18m、GpG、またはTpTを毎日投薬した。21日目に、動物を犠牲死させ、組織学のために目を採取した。目組織学を、EAUにおける専門家によって盲検法でスコア化した。IMSオリゴは、EAU疾患重症度に対する有意な効果を有しなかった。
【図１６】GpG IMSオリゴでの処置が、養子免疫伝達後のEAU疾患重症度スコアを低くすることを示す。hIRBP161-180免疫マウスからのリンパ節および脾臓細胞を、誘導ペプチドとともに3日間インビトロで培養した。4日目に、3×107細胞をナイーブB10.RIII動物へ移し、次いで、IP送達によって200μgのGpGオリゴまたはPBSで毎週処置した。疾患重症度を低くする傾向が観測された。
【図１７】I-18h IMSオリゴが、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける平均関節炎罹患率を有意に低下させることを示す。0日目にモノクローナル抗コラーゲン関節炎発症抗体をIVで注射されたBalb/cマウスを、4〜10日目にIP注射によって毎日投与される50μg IMSオリゴで処置した。動物を観測し、疾患を毎日スコア化した。各々の実験群に対する平均関節炎スコアが、時間にわたって示される。I-18hオリゴでの処置は、PBS対照群およびGpGオリゴでの処置の両方と比較して、平均関節炎スコアを有意に軽減した。
【図１８】I-18hが、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける関節炎の罹患率を有意に低下させることを示す。0日目にモノクローナル抗コラーゲン関節炎発症抗体をIVで注射されたBalb/cマウスを、4〜10日目にIP注射によって毎日投与される50μg IMSオリゴで処置した。動物を観測し、疾患を毎日スコア化した。I-18hオリゴでの処置は、PBS対照群およびGpGオリゴでの処置の両方と比較して、関節炎罹患率を有意に軽減した。
【図１９】GpGオリゴでの前処置が、TNBS誘導大腸炎に応じたその後の体重損失を低下させることを示す。-5日目に大腸炎発症用量以下のTNBS（0.5％）で経直腸的に処置されたC3Hマウスに、-5日目から大腸炎発症用量のTNBS（3.5％）が投与された0日目まで毎日GpGオリゴを投与した。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、TNBSを与えられなかった動物である。媒体対照は、TNBSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSで処置された。統計分析により、10または100μg用量のGpGオリゴでの処置は、媒体処置対照群よりも有意に良いが、GpGオリゴ50μg用量群は、統計的有意性に達しないことが明らかになった。
【図２０】I-18hオリゴでの前処置が、TNBS誘導大腸炎に応じたその後の体重損失を低下させることを示す。-5日目に大腸炎発症用量以下のTNBS（0.5％）で経直腸的に処置されたC3Hマウスに、-5日目から大腸炎発症用量のTNBS（3.5％）が投与された0日目まで毎日I-18hオリゴを投与した。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、TNBSを与えられなかった動物である。媒体対照は、TNBSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSで処置された。統計分析により、全ての投薬量でのI-18hオリゴでの処置は、媒体処置対照群よりも有意に良いことが明らかになった。
【図２１】I-18mオリゴでの前処置が、TNBS誘導大腸炎に応じたその後の体重損失を低下させることを示す。-5日目に大腸炎発症用量以下のTNBS（0.5％）で経直腸的に処置されたC3Hマウスに、-5日目から大腸炎発症用量のTNBS（3.5％）が投与された0日目まで毎日I-18hオリゴを投与した。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、TNBSを与えられなかった動物である。媒体対照は、TNBSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSで処置された。統計分析により、50μgのI-18mオリゴでの処置は、媒体処置対照群よりも有意に良いが、100μg用量レベルは、統計的有意性に達しないことが明らかになった。
【図２２】GpGでの前処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失を有意に低下させることを示す。50または200μgのGpGオリゴのIP注射で-2日目に開始して前処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μg GpGオリゴ処置群において体重損失における有意な低下が明らかになった（p<0.05；ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。200μg用量レベルは、統計的有意性に達しなかった（p>0.05）。
【図２３】I-18hオリゴでの前処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失を有意に低下させることを示す。50または200μgのI-18hオリゴのIP注射で-2日目に開始して前処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μg I-18h処置群において体重損失における有意な低下が明らかになった（p<0.05；ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。200μg用量レベルは、統計的有意性に達しなかった（p>0.05）。
【図２４】疾患誘導の時に開始するGpGオリゴでの処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失を有意に低下させることを示す。GpGオリゴのIP注射で0日目に処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μg（p<0.01）および200μg（p<0.05）GpGオリゴ処置群において体重損失における有意な低下が明らかになった（ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。さらに、50μg GpGオリゴ処置群は、非処置（DSS無し）対照群と有意に異ならず（p>0.05）、GpGオリゴのこの用量レベルでのDSS誘導大腸炎の完璧な阻害を示唆する。
【図２５】疾患誘導の時に開始するI-18hオリゴでの処置が、DSS誘導大腸炎に関連する体重損失に対する有意な効果を有しないことを示す。I-18hオリゴのIP注射で0日目に処置されたメスC3Hマウスに、急性大腸炎を誘導するために0〜7日目に飲料水における3.5％DSSを与えた。各々の群の平均体重損失および標準誤差（SEM）を計算し、グラフにした。非処置対照は、DSSを与えられなかった動物である。媒体対照群は、DSSで処置され、オリゴ処置と同じスケジュールでPBSを与えられた。統計分析により、媒体処置対照群と比較して50μgまたは200μg I-18hオリゴ処置群において体重損失における有意な低下は明らかにならなかった（ダネットの多重比較を用いる一元配置ANOVA）。
【図２６】I18突然変異生成を示す。ヒトPBMCを、刺激性CpG-ODN（5μg/ml）およびI18に由来する抑制性IMSの存在下でインキュベートした。細胞を96時間DNAとともにインキュベートし、ウェルを培養の最終の24時間1μCi[3H]TdRでパルスし、取り込まれた放射能を測定した。I18由来配列（上；SEQ ID NO：33および74〜81）は、CpG刺激増殖の割合抑制（下）とともに示される。ポリG領域内の突然変異（I18.M3〜6および8）は、2つの異なるドナーからのPBMC増殖を抑制する六量体配列 5'-GTGGTT-3'を含むオリゴヌクレオチドの能力を有意に軽減した。
【図２７】I18突然変異生成を示す。ヒトPBMCを、刺激性CpG-ODN（5μg/ml）およびI18に由来する抑制性IMSの存在下でインキュベートした。細胞を96時間DNAとともにインキュベートし、ウェルを培養の最終の24時間1μCi[3H]TdRでパルスし、取り込まれた放射能を測定した。I18由来配列（上；SEQ ID NO：33および82〜90）は、CpG刺激増殖の割合抑制（下）とともに示される。六量体配列に対して5'側の突然変異（I18.M10〜12）は、PBMC増殖を抑制する六量体配列 5'-GTGGTT-3'を含むオリゴヌクレオチドの能力を有意に軽減した。さらに、六量体配列とポリGとの間のヌクレオチドの付加は、PBMC増殖を緩やかに軽減した（I18.M13〜16）。
【図２８】ヒトI18（SEQ ID NO：100）およびマウスI18（SEQ ID NO：91）の核酸配列の比較を図示する。
【図２９】I18が、TLR3、5、7、および9を抑制することを示す。TLR2、3、4、5、7、8、または9を発現するHEK 293細胞を、対応するTLRリガンドの存在下で25μg/mLでI18を含む免疫調節配列とともにインキュベートし、NF-κBの活性化を決定した。リガンドの非存在下でのベースラインシグナリングが、第一列に示され（リガンド無し）、TLRのそれらの対応するリガンドによる活性化が、最終列に示される（対照+）。リガンドの存在下でのI18は、TLR3、5、7、および9によるシグナリングを抑制する（I18+リガンド；前から2番目の列）。
【図３０】I18が、pDCによるIFN-αのTLR7リガンド誘導産生を抑制することを示す。A. TLR7リガンドロキソリビンまたはR-837とともにインキュベートされる場合、ドナー1から単離されたpDCは、IFN-αを産生する。IFN-α産生は、5μg/mLまたは25μg/mLでI18によって完璧に阻害される。B. 同様に、5μg/mLでのI18は、TLR7リガンドに応じたドナー2から単離されたpDCによるIFN-α発現を完璧に阻害する（ロキソリビン対lox+I18）。
【図３１】I18が、PBMCによるIFN-αのTLR3リガンド誘導産生を抑制することを示す。A. ドナー1から単離されたPBMCは、PolyI:Cに応じてIFN-αを産生し、これは、25μg/mLでI18によって阻害される。B. ドナー2から単離されたPBMCにおけるTLR3活性化によるIFN-αの産生は、5μg/mLおよび25μg/mL I18の両方によって阻害される。
【図３２】I18が、pDCによるIFN-αのCpG誘導産生を抑圧することを示す。A, B. 単独で（CpG）または増加する量のI18の存在下で（CpG+I18）、免疫刺激性CpG配列とともにインキュベートされたドナー1および2から単離されたpDCによるIFN-α産生を、ELISAによって測定した。I18は、IFN-α産生を抑圧する。C, D. 単独で（C274）または24時間等モル比でI18（I18(1)(To)+C274(1)(24時間)）もしくは5倍過剰のI18（I18(5)(To)+C274(1)(24時間)）でプレインキュベートされた後に、CpG配列とともにインキュベートされたドナー1および2から単離されたpDCによるIFN-α産生。I18でのプレインキュベーションは、IFN-α産生を完璧に阻害する。
【図３３】抗dsDNA抗体を有するSLE患者からの免疫複合体が、pDCによるIFN-αの産生を誘導することを示す。A. 4人のSLE患者（SLE 19558；SLE 22914；SLE KP491；SLE KP504）対正常対照（正常）からの血清を、ELISAによって抗dsDNA抗体に対してアッセイした。B. 血清免疫複合体を、4人のSLE患者（SLE 19558；SLE 22914；SLE KP491；SLE KP504）および正常対照（正常）から単離した。C. 単離免疫複合体を、単離ヒトpDCとともにインキュベートし、IFN-αの産生を、ELISAによってアッセイした。pDC単独（細胞のみ）は、IFN-αをほとんど産生しないが、免疫刺激性CpG配列および抗dsDNA抗体を有するSLE患者（19558および22914）からの免疫複合体によって誘導される。対照的に、抗dsDNA抗体を有しないSLE患者（KP491およびKP504）からの免疫複合体または正常対照（正常SG）は、IFN-α産生を誘導しない。
【図３４】I18が、pDCによるIFN-αのSLE-免疫複合体誘導を抑制することを示す。血清が抗dsDNA抗体を含むSLE患者からの精製Igおよび正常対照を、I18とともにまたはともなわずに、単離pDCとともに24時間インキュベートした。単離pDC（細胞のみ）または正常対照からの免疫複合体とともにインキュベートされたpDC（正常）は、IFN-αをほとんど産生しなかった。対照的に、SLE患者からの免疫複合体とともにインキュベートされたpDCは、有意な量のIFN-αを産生した（SLE 19558；SLE 22914）。IFN-αの産生は、I18によって抑制される（SLE 19558+I18；SLE 22914+I18）。
【図３５】I18が、正常末梢CD19+ B細胞のCpG活性化を抑制することを示す。A, B. CD19+ B細胞を、単独で（DNA無し）、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG(5)）、または5μg/mL I18の存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG+I18(5)）インキュベートし、サイトカインレベルをELISAによって分析した。I18は、CpG刺激IL-6（A）およびIL-10（B）発現の両方を抑圧した。C. CD19+ B細胞を、単独で（DNA無し）、5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG）、5μg/mL I18の存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG+I18(5)）、または25μg/mL I18の存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに（CpG+I18(25)）インキュベートした。細胞増殖を、[3H]チミジン取り込みによってアッセイした。I18は、両方の投薬量でCpG刺激B細胞増殖を有意に抑圧した。
【図３６】I18が、SLEと診断された患者からの末梢CD19+ B細胞のCpG活性化を抑制することを示す。A, B. CD19+ B細胞を、単独で（細胞のみ）、5μg/mL刺激性CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mLの存在下で5μg/mL刺激性CpGとともに（CpG+I18(5)）、または5μg/mL刺激性CpGおよび25μg/mL I18とともに（CpG+I18(25)）インキュベートし、サイトカインレベルをELISAによって分析した。I18は、CpG刺激IL-6（A）およびIL-10（B）発現の両方を抑圧した。C. CD19+ B細胞を、単独で（細胞のみ）、5μg/mL刺激性CpGとともに（CpG-5）、1μg/mL（CpG+I18-1）、5μg/mL（CpG+I18-5）、または25μg/mL（CpG+I18-25）I18の存在下で5μg/mL刺激性CpGとともにインキュベートした。細胞増殖を、[3H]チミジン取り込みによってアッセイした。I18は、全ての用量でCpG刺激C細胞増殖を有意に抑圧した。
【図３７】I18が、正常B細胞におけるIL-6の発現を活性化することを示す。A. 単離CD19+CD27+記憶B細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-6発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と比較して、記憶B細胞におけるIL-6のより低いレベルの発現を誘導する。B. 単離CD19+CD27-ナイーブB細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-6発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と同様の度合にナイーブB細胞におけるIL-6発現を活性化する。
【図３８】I18が、正常B細胞におけるIL-10の発現を活性化することを示す。A. 単離CD19+CD27+記憶B細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-10発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と比較して、記憶B細胞におけるIL-10のより低いレベルの発現を誘導する。B. 単離CD19+CD27-ナイーブB細胞を、単独で（dna無し）、5μg/mL CpGとともに（CpG(5)）、5μg/mL I18とともに（I18(5)）、または25μg/mL I18とともに（I18(25)）インキュベートし、IL-10発現をELISAによって分析した。I18は、CpG配列と比較して、ナイーブB細胞におけるIL-10のより低いレベルの発現を誘導する。
【図３９】I18が、正常B細胞における共刺激性マーカーの発現を活性化することを示す。単離CD19+ B細胞を、単独で（dna無し）、単独で（CpG-1826）もしくはクロロキンの存在下で（CpG-1826+Chl）5μg/mL CpGとともに、または単独で（I18）もしくはクロロキンの存在下で（I18+Chl）5μg/mL I18とともにインキュベートした。CD80およびCD86の発現を、FACsにより決定し、各々の共刺激性マーカーを発現する細胞の割合が示される。I18は、CpG配列よりも低いレベルで発現CD80およびCD86を活性化する。
【図４０】I18が、正常B細胞の長期生存または増殖を刺激しないことを示す。単離CD19+ B細胞を、単独で（細胞のみ）；1μg/mLの3つの異なるCpG配列（1018；2395；2006）；または0.2μg/mL、1μg/mL、もしくは5μg/mL I18とともにインキュベートした。細胞の開始濃度が示され、13日後の各々の条件下での細胞の全数がグラフにされる。I18は、B細胞の生存または増殖を増加させなかった。
【図４１】I18が、狼瘡B細胞の弱い活性化因子であることを示す。狼瘡患者からの単離CD19+ B細胞を、単独で（dna無し）；1μg/mL、5μg/mL、もしくは25μg/mL I18とともに、5μg/mL CpGとともに；または5μg/mLもしくは25μg/mL I18の存在下で5μg/mL CpGとともにインキュベートした。IL-6発現（A）、IL-10発現（B）、および細胞増殖（C）を分析した。I18は、IL-6およびIL-10の両方の発現を弱く活性化し、細胞増殖をわずかに増加させた。
【図４２】SLE動物モデルにおけるI18投与が、抗dsDNS抗体を発現する動物の割合を低下させることを示す。I18 IMSオリゴを、皮内送達によって10μg、50μg、および250μgで毎週NZB/W F1メスマウスに投与した。抗dsDNA抗体を有する動物の割合を、PBS陰性対照およびステロイド陽性対照（Depo+シトキサン）と比較してグラフにした。抗dsDNA抗体を有する動物の割合は、50μg（p＝0.17）および250μg（p＝0.04）の毎週の用量のI18を受けた群において統計的に少なかった。
【図４３】SLE動物モデルにおけるI18投与が、疾患発症を遅らせることを示す。NZB/W F1メスに、全部で45週間毎日、週に3回、または毎週10μg、50μg、または250μg I18を投与した。タンパク尿発症を査定し、タンパク尿を有する動物の割合を、時間にわたって各々の群に対して示した。A. 10μg I18の投与は、疾患発症に影響を与えなかった。B. 50μg I18の毎日、週に3回、および毎週の投与は、PBS対照と比較して低下した疾患発症の傾向を示した。C. 250μg I18の毎週および週に3回の投与は、PBS対照と比較して低下した疾患発症の傾向を示した。
【図４４】SLE動物における250μgでのI18投与が、疾患発症を遅らせることを示す。NZB/W F1メスに、全部で45週間毎日、週に3回、または毎週10μg、50μg、または250μg I18を投与した。タンパク尿発症を査定し、タンパク尿を有する動物の割合を、時間にわたって各々の群に対して示した。A. 10μgまたは50μgでのI18の毎日の投与は、疾患発症に影響を与えなかった。B. 250μgでの週に3回のI18の投与は、10μgおよび50μg I18での投与と比較して統計的に有意な傾向を示した（ログランク検定p＝0.31）。C. 250μgでのI18の毎週の投与は、10μgおよび50μg I18での投与と比較して統計的に有意な傾向を示した（ログランク検定p＝0.03）。
【図４５】I18由来オリゴヌクレオチドが、ヒトB細胞によるIL-6のCpG刺激産生を抑制することを示す。単離ヒトB細胞を、5μg/mL刺激性CpG-ODNもしくはI18由来オリゴヌクレオチド単独で（左カラム）、または5μg/mL I18もしくはI18由来オリゴヌクレオチドの存在下で刺激性CpG-ODNとともに（右カラム）48時間インキュベートした。培養培地におけるサイトカインレベルを、ELISAによって分析し、y軸のpg/mlとして記録した。
【図４６】I18（SEQ ID NO：100）とM49（SEQ ID NO：92）との間の配列比較を図示する。
【図４７】インビトロでのI18およびM49抑制性活性の比較を図示する：マウス脾細胞を、健康なC57Bl/6マウスから単離し、（a）TLR9（10μg/mlでCpGオリゴ1018）および（b）TLR7（1μg/mlでガルジキモド（gardiquimod））アゴニストならびに抑制性オリゴヌクレオチドの用量範囲の存在下で1×106細胞/mlの密度で培養した。抑制性オリゴおよびアゴニストを、培養に同時に添加した。培養上清を、オリゴおよびアゴニストの添加の24時間後に単離し、IL-6レベルを、市販のELISAキットを使用して決定した。アゴニスト単独のレベルに対して各々のオリゴ用量に対するIL-6レベルの量を計算することによって、％抑制を決定した。I18化合物は、これらのアッセイにおいて、TLR9およびTLR7の両方の緩やかにより良い抑制剤である。
【図４８】インビボでのI18およびM49抑制性活性の比較を図示する：I18と比較して、M49は、TLR9抑制性活性を緩やかに低下させ、CD40Lシナジーアッセイにおいて査定されたB細胞アゴニスト活性を低下させた。それは、I18よりも優れて、NZB/Wモデルにおいて生存率を改善しかつタンパク尿スコアおよび抗dsDNA抗体力価を低くする効能を有する。M49は、六量体コア領域における配列変化が、I18における「CCC」対「GTT」の置換のように、活性に影響を与えることを示す。NZBモデルにおけるM49の増加した効能および低下したアゴニスト活性。M49は、脾細胞アッセイにおいてあまり有効ではないTLR9抑制剤であるが、より良いインビボ効能を有する。NZB/W F1マウス（群あたりn＝15）に、21週齢に開始して40週齢まで継続して、週に1回250μg（5mg/ml PBS溶液の0.05 mL）のオリゴヌクレオチド（I18、M49）の皮下注射を与えた。対照マウスに、0.05 mLのPBSを毎週投薬した。プレ出血および毎月の出血を、自己抗体プロファイリングのために取り、タンパク尿レベルを毎週測定した。重さを測定し、体重における25％低下が観測された後に動物を安楽死させた。M49オリゴ処置は、研究の終了ポイント（20週の処置）で市販のELISAキットによって測定されるように、タンパク尿レベルにおける低下（a）、致死性の完璧な予防（b）、および抗dsDNA抗体レベルにおける軽減（c）を引き起こした。
【図４９】組換えCD40リガンドおよびオリゴヌクレオチドM49の組み合わせとともにインキュベートされたヒトB細胞の低下した活性化を図示する。健康なドナーの血液から精製されたヒトB細胞を、単独でまたは1μM用量の抑制性オリゴヌクレオチド（I18またはM49）の存在下で、組換えCD40リガンドとともにインキュベートした。24時間インキュベーションの後に培養から上清を除去し、IL-6タンパク質のレベルをELISAによって測定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
特定の態様において、薬学的組成物は、（a）
2009540016.tif 000074
（SEQ ID NO：73）である免疫調節配列を含む免疫調節核酸；および（b）薬学的に許容される担体を含む。特定の態様において、薬学的組成物は、オリゴヌクレオチドである本発明の免疫調節核酸を含む。特定の態様において、薬学的組成物は、ベクターへ取り込まれる本発明の免疫調節核酸を含む。特定の態様において、薬学的組成物は、発現ベクターへ取り込まれる本発明の免疫調節核酸を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本発明の特定の態様において、六量体配列のXおよびYは、GpGである。特定の態様において、六量体配列は、5'-GTGGTT-3'である。特定の態様において、CCジ-ヌクレオチドは、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である。特定の態様において、ポリG領域は、3連続グアニン塩基を含み、かつ六量体配列から2ヌクレオチド3'側に位置付けられる。特定の態様において、改善された免疫調節配列は、
2009540016.tif 000075
（SEQ ID NO：73）である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
ジヌクレオチドモチーフを含む免疫調節配列モチーフと本明細書において言及される、本発明のIMSのコア六量体は、任意の組成または数のヌクレオチドまたはヌクレオシドが5'または3'に隣接していてもよい。いくつかの態様において、一つまたは複数の免疫調節配列モチーフを含む免疫調節核酸は、サイズが14〜50、75〜100塩基対、好ましくはサイズが16〜50塩基対のオリゴヌクレオチドである。免疫調節核酸は、例えば100〜100,000塩基対の範囲であるDNAのより大きな断片であってもよく、例えば発現ベクターおよびその他のプラスミドであってもよい。本発明の免疫調節配列モチーフに隣接する存在する配列は、任意の公知の免疫抑制性配列に存在する隣接配列に実質的に合致するように構築され得る。例えば、Nが任意のヌクレオチドである配列TGACTGTG-CCNN-プリン-ピリミジン-X-Y-ピリミジン-ピリミジン-NNGGG-AGAGATGA（SEQ ID NO：93）を有するIMSは、隣接配列TGACTGTGおよびAGAGATGAを含む。別の好ましい隣接配列は、個々のピリミジンの2回以上の反復または長さ2以上の異なるピリミジンの混合物としてピリミジンシリーズ（C、TおよびU）を組み込む。異なる隣接配列は、抑制性調節配列を試験する際に使用されている。抑制性核酸の隣接配列のさらに別の例は、以下の参照文献に含まれている：米国特許第6,225,292号および同第6,339,068号；Zeuner et al., Arthritis and Rheumatism, 46: 2219-24, 2002。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
本発明のある態様において、IMSのコア六量体領域は5'もしくは3'末端のどちらかまたは両方にポリG領域が隣接している。本明細書において使用する「ポリG領域」または「ポリGモチーフ」は、少なくとも2つの隣接グアニン塩基、典型的には2〜30（SEQ ID NO：94）または2〜20の隣接グアニンを含有する核酸領域を意味する。いくつかの態様において、ポリG領域は2〜10、4〜10または4〜8の隣接グアニン塩基を有する。ある種の態様において、隣接するポリG領域はコア六量体に隣接する（すなわち、接している）。ある特定の態様において、ポリG領域は、非-ポリG領域（非-ポリGリンカー）によってコア六量体に連結する。いくつかの態様では、非-ポリGリンカー領域はわずか6つ、さらに典型的にはわずか4つのヌクレオチドを有し、最も典型的には、わずか2つのヌクレオチドを有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表２】
2009540016.tif 000076
2009540016.tif 000077
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
実施例18：I18および関連オリゴヌクレオチドによる、ヒトB細胞によるIL-6のCpG刺激の抑制
免疫調節オリゴヌクレオチドI18の突然変異生成は、強化された免疫調節活性を有する5つの関連オリゴヌクレオチドを同定した。I18の系統的変更は、関連オリゴヌクレオチド
2009540016.tif 000078
を生成した。CpG-ODN刺激IL-6サイトカイン産生に対するI18由来オリゴヌクレオチドの効果を決定するために、ヒトB細胞を、5μg/mL刺激性CpG-ODNもしくはI18-由来オリゴヌクレオチド単独または5μg/mL I18もしくはI18由来オリゴヌクレオチドの存在下で5μg/mL刺激性CpG-ODNとともに48時間インキュベートした（図45）。培養培地におけるサイトカインレベルを、製造業者のプロトコールに従ってELISA（Pharmingen、ヒトIL-6、Cat #555220）によって分析した。I18をともなうヒトB細胞のインキュベーションは、IL-6産生の小さな刺激を引き起こしたが、I18由来オリゴヌクレオチドのどれも、検出可能なサイトカイン産生を誘発しなかった（図1、左カラム）。同様に、I18由来オリゴヌクレオチドは、I18よりも良くCpG-ODNによるIL-6産生を抑制したが、全ての免疫調節オリゴヌクレオチドが、統計的に有意な抑制を引き起こした（図45、右カラム）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）（i）XおよびYが、
a. XおよびYがシトシン-グアニンではない、
b. ピリミジン[2]がチミンである場合、XおよびYがシトシン-シトシンではない、
c. ピリミジン[1]がシトシンである場合、XおよびYがシトシン-チミンではない
ということ以外、任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸ならびに
（b）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項４】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項５】
六量体配列のXおよびYが、グアニン-グアニンである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項６】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ベクターが、発現ベクターである、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項９】
（a）（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む、免疫調節核酸ならびに
（b）薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
六量体配列が、GTGGTTである、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
六量体配列が、GTGGTTであり、CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつCCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
免疫調節配列が、
2009540016.tif 000079
である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ベクターが、発現ベクターである、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
（i）XおよびYが、
d. XおよびYがシトシン-グアニンではない、
e. ピリミジン[2]がチミンである場合、XおよびYがシトシン-シトシンではない、
f. ピリミジン[1]がシトシンである場合、XおよびYがシトシン-チミンではない
ということ以外、任意の天然または合成ヌクレオチドである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む免疫調節核酸を対象に投与する段階を含む、対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子（self-molecule）に関連する対象における疾患を処置するための方法。
【請求項２２】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
六量体配列のXおよびYが、グアニン-グアニンである、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
六量体配列が、GTGGTTである、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
六量体配列が、GTGGTTであり、CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつCCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列が、
2009540016.tif 000080
である、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項21記載の方法。
【請求項３３】
ベクターが、発現ベクターである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項21記載の方法。
【請求項３５】
（i）XおよびYがグアニン-グアニンである、六量体配列 5'-プリン-ピリミジン[1]-[X]-[Y]-ピリミジン[2]-ピリミジン[3]-3'；
（ii）六量体配列から起算して1〜5ヌクレオチド5'側である、六量体配列に対して5'側のCCジヌクレオチド；ならびに
（iii）ポリGが少なくとも3連続Gを含みかつ六量体配列から起算して2〜5ヌクレオチド3'側である、六量体配列の3'側のポリG領域
を含み、シトシン-グアニン配列を含まない免疫調節配列を含む免疫調節核酸を対象に投与する段階を含む、対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する対象における疾患を処置するための方法。
【請求項３６】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
ポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
六量体配列が、GTGGTTである、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつCCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側である、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
六量体配列が、GTGGTTであり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
六量体配列が、GTGGTTであり、CCジヌクレオチドが、六量体配列から起算して2ヌクレオチド5'側であり、かつポリG領域が、六量体配列から起算して2ヌクレオチド3'側である、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
ヌクレオチド配列が、
2009540016.tif 000081
である、請求項35記載の方法。
【請求項４４】
免疫調節核酸が、オリゴヌクレオチドである、請求項35記載の方法。
【請求項４５】
免疫調節核酸が、ベクターへ取り込まれる、請求項35記載の方法。
【請求項４６】
ベクターが、発現ベクターである、請求項35記載の方法。
【請求項４７】
対象に非生理学的に存在する一つまたは複数の自己分子に関連する疾患が、全身性エリテマトーデスである、請求項35記載の方法。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009540016000001.app
【国際調査報告】
2009540016.tif 000082
2009540016.tif 000083