(57)【要約】静脈内電流測定バイオセンサ用の流束制限層は、基板の上に形成され、血液から酵素電極への検体の拡散速度を制限するようにする。層は、パラキシレンなどの溶媒に溶解されたエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）から形成され、電極の一部を被覆するように溶射され、電極を基板に対して封止するように硬化させてもよい。グルコースオキシダーゼが電極の上に配置されるグルコースセンサにおいて、ＥＶＡ層の厚さおよび濃度は、血中グルコース濃度の関数として、電極電流の線形出力を促進するように最適化される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
静脈内電流測定バイオセンサのための流束制限膜であって、
該バイオセンサの電極の上に配置された試薬を少なくとも部分的に被膜することにより、血液からの反応物が該試薬に拡散する速度を制限する、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）ポリマーを含む、流束制限膜。
【請求項２】
前記反応物はグルコースを含む、請求項１に記載の流束制限膜。
【請求項３】
前記ＥＶＡポリマーは、溶媒に溶解されたＥＶＡを含む溶液から蒸着される、請求項１に記載の流束制限膜。
【請求項４】
前記溶液は、約０．５重量％と約６．０重量％との間のＥＶＡ組成を含む、請求項３に記載の流束制限膜。
【請求項５】
前記ＥＶＡ組成は、約９重量％と約５０重量％と間の酢酸ビニル含有量を有する、請求項４に記載の流束制限膜。
【請求項６】
前記溶媒は、シクロヘキサノン、パラキシレン、およびテトラヒドロフランを含む群から選択される、請求項３に記載の流束制限膜。
【請求項７】
前記ＥＶＡポリマーは、約０．５ミクロンと約１０ミクロンとの間の平均拡散層の厚さを含む、請求項１に記載の流束制限膜。
【請求項８】
生体適合性の層をさらに含む、請求項１に記載の流束制限膜。
【請求項９】
前記生体適合性の層はヘパリンを含む、請求項８に記載の流束制限膜。
【請求項１０】
前記ＥＶＡポリマーと混合されたポリ（メタクリル酸メチル−コ−メタクリル酸ブチル）をさらに含む、請求項１に記載の流束制限膜。
【請求項１１】
前記ＥＶＡポリマーはジグリシジル（ｄｉｇｌｙｃｉｄｉｌ）エーテルと架橋される、請求項１に記載の流束制限膜。
【請求項１２】
前記ＥＶＡポリマーはジイソシアネートと架橋される、請求項１に記載の流束制限膜。
【請求項１３】
基板と、
該基板に結合された電極と、
該電極に配置された試薬と、
血液からの反応物が該試薬に拡散する速度を制限するために、該試薬を少なくとも部分的に被膜するエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）流束制限膜と
を備える、静脈内電流測定バイオセンサ。
【請求項１４】
前記試薬はグルコースオキシダーゼを含み、前記反応物はグルコースを含む、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記ＥＶＡ流束制限膜は、前記電極の一部に接着する、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記ＥＶＡ流束制限膜は、前記電極を前記基板に対して封止する、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記ＥＶＡ流束制限膜は、溶媒に溶解されたＥＶＡを含む溶液から蒸着される、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
前記溶液は、約０．５重量％と約６．０重量％との間のＥＶＡ組成を含む、請求項１７に記載のバイオセンサ。
【請求項１９】
前記ＥＶＡ組成は、約９重量％と約４０重量％との間の酢酸ビニル含有量を有する、請求項１８に記載のバイオセンサ。
【請求項２０】
前記溶媒は、シクロヘキサノン、パラキシレン、およびテトラヒドロフランを含む群から選択される、請求項１７に記載のバイオセンサ。
【請求項２１】
前記ＥＶＡ流束制限は、約０．５ミクロンと約１０ミクロンとの間の平均拡散層の厚さを含む、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項２２】
前記ＥＶＡ流束制限膜と混合されたポリ（メチルメタクリル酸塩−コ−ブチルメタクリル酸塩）をさらに含む、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項２３】
前記ＥＶＡ流束制限膜はジグリシジル（ｄｉｇｌｙｃｉｄｉｌ）エーテルと架橋される、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項２４】
前記ＥＶＡ流束制限膜はジイソシアン酸エステルと架橋される、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項２５】
基板の上に配置された酵素電極を有するバイオセンサに関して、該酵素電極の上に流束制限膜を形成する方法であって、
エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）を溶媒中に溶解することと、
該溶解されたＥＶＡを、該酵素電極の少なくとも一部を含む該基板の範囲に塗布することと、
該塗布された層を硬化することと
を含む方法。
【請求項２６】
前記溶媒は、シクロヘキサノン、パラキシレン、およびテトラヒドロフランを含む群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記溶解することは、前記溶媒に約０．５重量％と約６．０重量％との間のＥＶＡ組成を溶解することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＥＶＡ組成は、約９重量％と約４０重量％との間の酢酸ビニル含有量を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記塗布することは、前記基板の前記範囲の上に前記ＥＶＡ溶液を溶射被覆することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記塗布することは、約０．５ミクロンと約１０ミクロンとの間の厚さを有する前記ＥＶＡ溶液の層を生成することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（米国特許法１１９条の優先権主張）
本特許出願は、２００６年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７７７，１３９号の優先権を主張し、この仮特許出願はその譲受人に譲渡され、これにより本明細書において明白に参考として援用される。
【０００２】
（分野）
本発明は、血液化学を測定するための電流測定バイオセンサに関する。具体的には、本発明は、血中グルコース濃度などの生物学的指標を測定するための静脈内センサに関する。
【背景技術】
【０００３】
電流測定バイオセンサは、血液化学を分析するために、医療産業において周知である。初期のバイオセンサは、酵素電極としても周知であり、ＣｌａｒｋとＬｙｏｎｓとが提案したことから始まり、ＵｐｄｉｋｅとＨｉｃｋｓとが実行に移した。酵素電極は、一般的に、グルコースオキシダーゼなどのオキシダーゼ酵素を含み、そのオキシダーゼ酵素は、電極表面で透析膜の背後に固定される。血液の存在下で、膜は、グルコースなどの対象検体を、例えば、酸素の過酸化水素への還元などの酸化または還元が行なわれるオキシダーゼ酵素に選択的に通過させる。電流測定バイオセンサは、反応を維持するのに十分な電位が、反応物の存在下で２つの電極に加えられる際に、電流を生成することによって機能する。例えば、グルコースとグルコースオキシダーゼの反応において、過酸化水素反応生成物は、その後、電極への電子移動によって酸化されてもよい。その結果生じる電極における電流の流れは、対象検体の濃度を示す。
【０００４】
電流測定バイオセンサの用途には、血液連行ガス中の検体、血中の電解質レベル、特に、血中グルコース濃度の測定が含まれる。グルコースの測定には、皮下方法が提案されている。例えば、非特許文献１を参照されたい。これらの低侵襲的グルコース監視システムは、血漿グルコース濃度の傾向を適切に表示するが、強化インスリン療法に使用するほどにはグルコースを精度良く探知せず、例えば、低血糖症状において精度を欠くと、非常に高い危険性が患者にもたらされうる。さらに、酵素グルコースオキシダーゼに基づくセンサは、線形グルコース応答をもたらすために十分な酸素へのアクセスが必要である。皮下組織用に最適化されたセンサシステムは、酵素分圧が２０ｍｍＨｇ以下の場合、静脈血において必ずしも十分に機能するとは限らない。
【非特許文献１】Ｒｅｎａｒｄ、「Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ」、Ｍｉｎｉｍ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｔｈｅｒ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、Ｖｏｌ．１３、Ｎｏ．２、ｐｐ．７８−８６（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、ＩＣＵ患者の精度の高い血中グルコース測定を入手するための最も信頼性のある方法として、直接時点方法が挙げられるが、この方法は、血液サンプルを採取し、研究室で分析するために発送することを含む。この方法は、時間を要し、タイミング良く必要な結果を出すことができない場合が多い。本分野における研究が継続されているにも関わらず、依然としてグルコース監視における多くの改善が必要とされている。
【０００６】
静脈内電流測定センサの開発を妨げる問題点の１つとして、センサが血管内で浮遊するのに十分小型でなければならないが、十分長い時間反応が維持できるように酵素を固定するのに十分丈夫でなければならないことが挙げられる。また、静脈内センサは、生体適合性でなければならず、患者に毒素を放出しないようにし、例えば、大腿静脈にカテーテルを介して移植される場合に、膜表層における凝血を阻止して血漿が酵素層に拡散しないようにする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、静脈内使用ならび連続的検体監視のために設計された電流測定バイオセンサ用の、生体適合性の流束制限膜を開示する。流束制限膜は、センサ電極の上に形成されてもよく、このセンサ電極は、血中の物質と反応するように選択された試薬によって少なくとも部分的に被膜される。流束制限膜は、物質が流束制限膜を介して拡散し、試薬と反応する速度を制限する。流束制限膜には、その生体適合性、付着性、物理的特性、および拡散性について選択されたエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）ポリマーが含まれてもよい。一実施形態において、膜は、ＥＶＡの１つ以上の硬化された層を含んでもよく、そのＥＶＡは、パラキシレンに溶解されたＥＶＡの割合を有する溶液を溶射することによって塗布される。
【０００８】
静脈内電流測定バイオセンサは、ＥＶＡ膜を流束制限層として使用して、酵素電極の表面を少なくとも部分的に被覆することによって形成されてもよい。バイオセンサは、フレックス回路基板の上に形成されてもよく、そのフレックス回路基板の上には参照電極、対極、および作用電極が装着され、１つの作用電極は酵素含有電極であってもよい。一実施形態において、バイオセンサはグルコースセンサであってもよく、作用電極はグルコースオキシダーゼで少なくとも部分的に被膜されてもよく、ＥＶＡ膜は作用電極の上に形成されてもよく、血液からグルコースオキシダーゼへの酸素およびグルコースの拡散を選択的に可能にする流束制限障壁を提供するようにする。ＥＶＡの接着性は、グルコースオキシダーゼを電極に対して機械的に封止し、また、電極を基板に対して機械的に封止することによって、静脈内挿入中の機械的完全性が改善される。ＥＶＡ膜の組成は、作用電極が励起されている状態でバイオセンサが静脈の中に位置する場合に、作用電極の出力電力が血中グルコース濃度の線形関数であるように、最適化されてもよい。
【０００９】
また、電流測定バイオセンサの基板に結合された酵素電極の上に、流束制限層を形成するための関連方法も開示される。その方法は、パラキシレンなどの溶媒中にＥＶＡを溶解するステップと、溶解されたＥＶＡを、酵素電極の少なくとも一部を含む基板の範囲に塗布するステップと、塗布された層を硬化するステップと、を含んでもよい。ＥＶＡは、溶射によって塗布することを容易にするためにパラキシレンに溶解されてもよく、ＥＶＡ膜の厚さと濃度は、血中グルコース濃度の関数として、電極電流の線形出力を促進するように最適化されてもよい。
【００１０】
本発明の特徴、目的、および利点は、図面を併用して、以下に記載される詳細な説明により明白になるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、静脈内電流測定バイオセンサにおける酵素含有電極上の流束制限膜を形成するための、接着性かつ生体適合性のポリマーを開示する。血液化学の測定のためにセンサが患者に導入されると、酸素が血液からセンサに通過するが、大型分子の通過を制限することによってセンサの精度が膜により改善される。膜の生体適合性により、血流に入りうる毒素の数が制限され、接着性により設置および操作中のセンサの機械的完全性が向上する。
【００１２】
一実施形態において、膜は、血液からセンサ電極へのグルコース流束の量を制限するように、グルコースセンサで使用されてもよい。膜を形成する生体適合性ポリマーは、最適化された含有量の溶解エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）を含んでもよい。パラキシレンなどの溶媒を使用して、溶射またはその他の手段によって電極に塗布するのに適切な溶媒にＥＶＡを溶解してもよい。
【００１３】
流束制限膜の形成に有利な多くの特性により、ＥＶＡが選択される。ＥＶＡは、生体適合性で線状のポリマーである。バイオセンサ電極上の膜層として形成され、全体的に疎水性がもたらされ、酸素運搬の特徴を示すことが可能であるが、十分な親水性部分を備えるため、依然として制限されたグルコース運搬が可能である。これは、血漿においてグルコースが酸素分子よりも多い場合の静脈内の適用に重要になる。したがって、ＥＶＡ膜によって、多量の酸素を通過させる一方で、グルコースの通過を抑制する所望の拡散障壁を提供することができる。さらに、本明細書で適用されるＥＶＡポリマーにより、長期にわたる連続的な静脈内の使用に適したフレックス回路基板に、酵素含有電極を被膜するのに機械的に強力な接着性を提供することができる。また、ＥＶＡの薄膜は、弾性が高く、電極が静脈構造などの蛇行経路を進める必要がある場合に重要になる。さらに、ＥＶＡの濃度および塗布される層の厚さは、製造過程において制御され、血中グルコース濃度の関数として電極電流を線形出力するようにしてもよい。
【００１４】
流束制限膜の用途の１つは、フレックス回路の上に形成される薄膜電流測定バイオセンサの中にある。フレックス回路は、生体内用途の微小電極基板として医療機器に適用されている。例えば、フレックス回路設計の１つは、柔軟性のある誘電体基板（例えば、ポリアミド）の上において導体箔（例えば、銅）の積層を使用する。フレックス回路は、マスキングおよびフォトリソグラフィー技術を使用して、導体箔の上に形成されてもよい。フレックス回路は、低製造コスト、容易な設計統合、および輸送中の物理的柔軟性により、中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）挿入などの用途に望ましい。
【００１５】
図１は、フレックス回路形状の電流測定バイオセンサ１１であり、本発明の実施形態に係る流束制限膜を組み込んでいる。バイオセンサまたはセンサ１１は、基板１３（例えば、フレックス基盤）の上に形成されてもよい。１つ以上の電極１５、１７、および１９は、基板１３の表面に取り付けまたは結合されてもよい。バイオセンサ１１は、参照電極１５、対極１７、および作用電極１９とともに示されている。別の実施形態において、１つ以上の付加的な作用電極を基板１３上に備えてもよい。電線２１は、酸化反応または還元反応を維持するように電力を電極に伝送してもよく、また、測定されるパラメータを示す検出回路（図示せず）に信号電流を伝導してもよい。測定されるパラメータは、血液化学で発生またはそれから得られるいかなる対象検体であってもよい。一実施形態において、対象検体は、グルコースをグルコースオキシダーゼと反応させることにより形成され、かつ血中グルコース濃度に比例する濃度を有する過酸化水素であってもよい。
【００１６】
図２の拡大断面側面図は、作用電極１９付近にある基板１３の遠位部を示す。作用電極１９は、試薬または酵素層２３によって少なくとも部分的に被膜されてもよく、この試薬または酵素層２３は、血流中の特定の反応物にセンサが露出される際に化学反応を起こすように選択される。例えば、グルコースバイオセンサに関する実施形態において、酵素層２３は、黒色アスペルギルス（ＥＣ１．１．３．４）、ＩＩ型またはＶＩＩ型に由来するようなグルコースオキシダーゼを含んでもよい。
【００１７】
酵素と血液との反応を促進するために、表面が活性であるマトリクスの中に酵素層２３を形成してもよい。これは、例えば、酵素を活性ヒドロゲルに添加または架橋することによって達成されてもよい。ヒドロゲル層は、吸水性であってもよく、また、血液から酵素への血中の反応物（例えば、グルコース）の能動輸送をもたらすように膨張してもよい。マトリクスの接着および密度を生成するために、分子間結合がヒドロゲル層を介して形成されることにより、ヒドロゲル表面およびヒドロゲル層に試薬を分散することが可能になる。次に、反応生成物は、電極層に連通されてもよい。
【００１８】
図３は、センサ基板１３の上の作用電極部分の拡大断面側面図を示す。流束制限膜２５は、膜２５が少なくとも部分的に酵素層２３を被覆するように酵素層２３の上に付加される。センサ１１が静脈内の位置に設置された状態で、流束制限膜２５は、酵素と反応する血液成分の、血液から酵素層２３への拡散を選択的に可能にしてもよい。グルコースセンサの実施形態において、流束制限膜２５は、酵素層２３へ、多量の酸素を通過させ、グルコースを選択的に制限する。さらに、接着性を有する流束制限膜２５は、酵素層２３を作用電極１９に対して機械的に封止し、また、センサ基板１３に対して作用電極１９を封止してもよい。本明細書において、ＥＶＡポリマーから形成された流束制限膜は、電極の上部において流束制限剤としての役割を果たすだけでなく、酵素／電極境界および電極／基板境界において封止剤または封入剤としての役割を果たすことが開示される。ヘパリンなどの生体適合性の抗血栓性物質を含む、付加的な生体適合性の層（図示せず）を、流束制限膜２５の上に付加してもよい。
【００１９】
センサ１１は、作用電極１９が対極１７に対して正電位に保持されるという、電流測定に関する測定原理において作用する。その正電位は、グルコースオキシダーゼとのグルコース反応の結果である過酸化水素の酸化反応を維持するのに十分である。したがって、作用電極１９は、陽極として機能し、酸化反応により作用電極１９の表面で生成される電子を収集する。収集された電子は、電流として作用電極１９に流れ込む。作用電極がグルコースオキシダーゼで被膜された一実施形態において、作用電極１９が約＋４５０ｍＶと約＋６５０ｍＶとの間の電位で保持される場合、グルコースの酸化により、グルコース分子毎に過酸化水素分子が生成される。生成された過酸化水素は、以下の式に従って作用電極１９の表面で酸化される。
Ｈ２Ｏ２  →  ２Ｈ＋＋Ｏ２＋２ｅ−
式は、酸化される過酸化水素分子毎に２つの電子が生成されることを示す。したがって、特定の状態下において、電流量は過酸化水素濃度に比例してもよい。陽電極において酸化されるグルコース分子毎に１つの過酸化水素分子が生成されるため、血中グルコース濃度と結果的に生じる電流との間に線形関係が存在してもよい。電流測定グルコースバイオセンサの電子検知理論に関するさらなる情報として以下の記事を参照してもよい。Ｊ．Ｗａｎｇ，「Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：  ４０  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」、  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｙｌｓｉｓ、Ｖｏｌ．１３、Ｎｏ．１２、ｐｐ．９８３〜９８８（２００１）．
線形関係または実質的な線形関係を達成するために、作用電極１９は、所望の化学反応を促進するように設計される。電流測定センサ１１において、化学反応は、様々な組成の１つ以上の膜または層をフレックス回路基板の表面に適用することによって制御されてもよい。一実施形態において、基板１３は、ポリイミド材料であってもよく、酵素層２３は、架橋ヒドロゲルであってもよく、また、流束制限層２５は、本発明の実施形態に係るＥＶＡポリマーであってもよい。薬剤送達速度を制御するような、ポリマー製移植装置における接着性かつ生体適合性の性質を有するＥＶＡが、特に選択される。
【００２０】
基板１３により、電極および膜層を装着する絶縁構造が提供される。一実施形態において、基板１３は、約０．０５０と０．０６０インチとの間の幅を有し、約１．０と２．０インチとの間の長さを有してもよい。膜層の厚さは、約０．５ミクロンと約１０ミクロンとの間で変化してもよい。一実施形態において、１つ以上の流束制限膜層は、約０．５ミクロンから約１０ミクロンの範囲の厚さを有してもよい。
【００２１】
電線２１は、フレックス回路技術を使用して、基板１３の上に形成された導電性トレースに連結またははんだ付けされてもよい。例えば、トレースは、金めっきの銅であってもよい。一実施形態において、センサ１１は、フレックス回路が３−ピン、１ｍｍピッチＺＩＦ  Ｍｏｌｅｘコネクタなどの多数ピンコネクタに嵌合するタブを終端処理するように設計されてもよい。このような連結によって、例えば、ポテンショスタットまたはその他の制御装置を使用して、作用電極の励起および電流信号の測定が容易になる。
【００２２】
電極１５、１７、および１９は、厚膜過程および市販のインキを使用して、基板１３に塗布してもよい。一実施形態において、参照電極１５は、基板１３上に蒸着または形成される銀／塩化銀型であってもよい。参照電極１５は固定電位を定め、その固定電位から、対極１７および作用電極１９の電位が定められもよい。参照電位はネルンストである。銀／塩化銀の電極について、参照電位は、以下の半反応によって維持される。
Ａｇ０  →  Ａｇ＋＋ｅ−
対極１７は、白金または黒鉛などの導電性材料から構成されてもよい。これらの材料は、インキとして生成されて、厚膜過程を使用して基板１３に塗布され、適宜硬化されてもよい。対極１７によって、酸化化学反応から生成された電子の大部分を伝導して、血液溶液に戻す作用部分が提供される。もし対極がなければ、全ての電流は、恐らく参照電極１５を通過し、その寿命が短くなる場合がある。一実施形態において、対極１７は、作用電極１９の表面部分よりも大きく形成されてもよい。
【００２３】
作用電極１９は、対極１７の形成で使用されたものと同様に、白金／黒鉛材料を使用して形成されてもよい。その他の実施形態において、作用電極１９は、その他の導電性材料から形成されてもよい。その動作は、その表面における過酸化水素の陽極酸化を促進するようなものとして上に記載している。その他の実施形態も可能であり、例えば、作用電極１９は負電位で保持されてもよい。この場合、作用電極１９で生成される電流は、酸素の還元によるものであってもよい。
【００２４】
一実施形態において、バイオセンサ１１は、プローブまたはカテーテルの中に設置されて、例えば、ＣＶＣを介して患者の静脈の中に挿入されてもよい。バイオセンサ１１は、電流測定センサとして機能する一方で、酵素含有ヒドロゲル層２３を作用電極１９の表面に添加することによって患者の血流に浸漬されてもよい。流束制限層２５を使用することによって、ヒドロゲル層２３を作用電極１９に対して封止してもよく、また、作用電極１９を基板１３に対して封止してもよい。すなわち、その拡散機能の他に、流束制限層２５は、ヒドロゲルと電極とを基板１３に確実に結合する役割も果たす。
【００２５】
実験に基づき、その物質が断面図において開示され、次に、バイオセンサ電極の上の流束制限ＥＶＡ膜を形成する一連の処理ステップとして、方法が展開され、本明細書に開示される。図４は、方法４００のこのような一実施形態を示す。
【００２６】
方法４００は、ＥＶＡが溶媒中で溶解されるステップ４０２を含む。ＥＶＡは約９重量％の酢酸ビニル（ＥＶＡ−９）から約４０重量％の酢酸ビニル（ＥＶＡ−４０）までの組成を有する供給源からもたらされてもよい。ＥＶＡを溶解する能力のある溶媒が選択され、バイオセンサ基板および酵素電極への接着を促進し、かつ効果的に塗布（例えば、溶射）されてもよい溶液を形成するようにする。シクロヘキサノン、パラキシレン、およびテトラヒドロフランなどの溶媒は、本目的において適切であり得る。本ステップにおいて、溶液は、約０．５重量％と約６．０重量％との間のＥＶＡ組成を含んでもよい。さらに、溶媒は、あまり撹拌しなくても蒸発するように十分な揮発性を有することによって、下層の酵素に関する問題を防止するようにするが、溶射過程に関する問題が発生するほど揮発性ではないようにする。
【００２７】
ステップ４０４は、ＥＶＡ溶液の層をバイオセンサ基板の範囲に適用し、少なくとも部分的に酵素電極を被膜することを伴う。一実施形態において、ステップ４０４は、酵素電極を完全に被膜するステップと、電極をバイオセンサ基板に対して封止するステップとを含んでもよい。ステップ４０４は、例えば、ＥＶＡ溶液を基板１３の酵素電極部分に溶射して、均一またはほぼ均一の厚さを有する層を形成することによって実行してもよい。付加的な層を本ステップにおいて付加し、所望の膜厚を達成してもよい。また、本ステップで形成されたＥＶＡ溶液の層は、ブラッシング、浸漬、または同様の技術によって塗布されてもよい。
【００２８】
ステップ４０６において、塗布された１つまたは複数のＥＶＡ層は、流束制限膜を形成するように硬化される。本ステップは、環境大気で乾燥し、低温炉（約３０から約４０℃の間）で硬化し、または代替的に、ＥＶＡの軟化温度範囲である約５０から６５℃の間の温度（好ましくは、６５℃よりも少し低い温度）でアニールすることによって実行してもよい。付加的なステップを方法４００に付加してもよく、そのステップにおいて、硬化された流束制限膜は、ヘパリンなどの生体適合性材料から作製される生体適合性層で被膜される。
【００２９】
方法４００を使用して、８つのプロトタイプセンサ集団は、流束制限層を備えるように作製され、センサ毎にグルコース応答の試験が行なわれた。プロトタイプセンサは、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、およびＧ９で示された。各センサは、白金／黒鉛の作用電極および銀／塩化銀の参照電極を備えて構成されるフレックス回路上に作製された。凹部が作用電極に形成され、グルコースオキシダーゼ酵素層で充填された。２．０重量％のＥＶＡ−４０溶液は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解することによって調製された。次に、各センサの作用電極範囲は、電極をＥＶＡ溶液に１回または複数回浸漬し、その被膜を硬化可能にすることによって、流束制限層で被膜された。硬化は大気温度の空気乾燥または約５９℃で１０分間オーブン硬化することによって実行された。以下の表は、各プロトタイプセンサの作製方法を示し、表において、Ｌの値は、作用電極を被膜するのに各センサがＥＶＡ溶液に浸漬された回数（１ｘまたは３ｘ）を示し、Ｔの値は、環境大気（０）中または５９℃のオーブンの中で１０分間（５９／１０）のどちらにおいてセンサが硬化されたことを示す。
【００３０】
【表１】
2009528084.tif 000003
図５は、応答の線形性を決定するために、プロトタイプセンサ毎に実行したグルコース分析の結果を示す。各センサは、既知のグルコース濃度の溶液に露出され、その作用電極は、約６５０ｍＶの電位で励起された。次に、その結果生じた作用電極の電流出力アンペアを測定し、グルコース濃度ｍｇ／ｄＬに対してグラフ表示された。電力出力は、センサ毎に、０．００、５０．００、１００．００、および１５０．００ｍｇ／ｄＬの４つのグルコース濃度値で測定された。
【００３１】
線形回帰技術を試験データに適用し、４つのデータ点の各グループを通る理論線の勾配を導出し、応答の線形性を測定した。多重決定係数ｒ２を以下のようにセンサ毎に計算し、線形回帰モデルの妥当性を決定した。
ｒ２＝ＳＳＲ／ＳＳＴ
ここで、ＳＳＲは回帰による平方和、ＳＳＴは全平方和を示す。結果を以下の表に示す。
【００３２】
【表２】
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その結果は、８つのプロトタイプのセンサに対して０．８５６３と０．９９９８との間で変化するｒ２値を有する優れた線形性を示しており、３つのセンサは、０．９９９０を上回るｒ２値を示した。流束制限層の平均の厚さに関する厳密な値は、浸漬技術の使用により達成された膜厚に一貫性がないため、決定するのが困難であった。
【００３３】
図６のグラフは、経時的な電流出力の関数としての、センサＧ６に関するグルコース分析の結果を示す。簡素化するために、図６には、８つの全センサの反応の代表として、センサＧ６の曲線のみが含まれている。図示された時間には、５０、１００、および１５０ｍｇ／ｄＬ濃度に相当するグルコース濃度の３つのステップ変化が含まれている。これらのステップ変更は、約３１０、３７２、および４３２秒でそれぞれ発生した。グラフに示されるように、各ステップ変更と同時に発生する電流信号の初期過渡スパイク後、各濃度における応答は、すぐに定常状態応答に安定した。異なるグルコース濃度に対するこの経時的な応答の線形性は、広範囲の血中グルコースの濃度に対して、流束制限膜が、適切な酸素／グルコース比率を通過させることが可能であることが示される。同様の定性的挙動が、その他のプロトタイプセンサにおいて認められた。
【００３４】
パラキシレンに溶解されたＥＶＡポリマーを溶射する方法を使用して、センサ集団について付加的な試験を実行し、膜厚に対して優れた制御を達成した。本発明者によって行なわれた研究に基づくと、パラキシレンにおけるＥＶＡの溶射により、センサのポリイミド基板に接着する膜層が一貫性を有し、かつ均一であることが示された。溶射適用において効果を示すように、パラキシレンが溶媒として選択された。パラキシレンは、電子技術において一般的に使用されており、例えば、プリント基板の上に薄い絶縁保護コーティングを形成する低圧力蒸着過程において使用されている。パラキシレンは、溶射の効果的な蒸発を可能にする範囲の中に沸点を有するが、噴射ノズルを詰まらせるような過度に急速な蒸発を防止する。蒸着すると、パラキシレンの蒸発時間によって合理的に短時間の乾燥が可能になる。さらに、パラキシレンは、一定の接着促進性を有し、その特性によりポリマーに基づくセンサ基板に結合し易い。それは、溶射として、非常に小型のフレックス回路の基板への塗布に役立ち、一実施形態において、その回路の上に作用電極が静脈内使用のために効果的に装着され得る。
【００３５】
パラキシレンに溶解された０．５重量％から６．０重量％のＥＶＡ−４０を使用してＥＶＡ溶液を生成し、作用電極の上に溶射し、所望の流束制限膜を形成するように硬化させた。前述の方法でグルコース分析を実施した。その結果から、各層の厚さが約１ミクロンである、ＥＶＡ溶液を溶射した約４または５層の流束制限膜を形成することによって、優れた線形性が達成可能であることが示された。溶射方法によって、様々な特性の層、つまり、表面領域よって平坦性または隙間の平均深さが異なる層が蒸着されるため、最終の膜厚は工程依存的であり得る。したがって、優れた線形性に必要な層の数は、使用されるＥＶＡの処方ならびに溶射の適用に使用される過程によって決まる。しかしながら、リニアセンサが、平均膜厚、つまり拡散層の厚さを約０．５ミクロンから約１０ミクロンの間で生成することによって製造されてもよいことが発見された。厚さの好適な範囲は、約４ミクロンから約６ミクロンの間であってもよく、十分な材料量が蒸着されることによって、静脈内挿入の機械的応力に耐えるようにする。
【００３６】
前述の実験において、４０重量％（ＥＶＡ−４０）のＥＶＡ組成を使用して流束制限膜を形成する溶液を生成した。しかしながら、本発明に係る膜は本組成に限られない。膜は、任意のＥＶＡ組成、例えば、約９重量％と約５０重量％との間の範囲の酢酸ビニル組成を有するＥＶＡを使用して形成されてもよい。酢酸ビニルをポリエチレン含有量内で変化させると、溶解性も変化し（つまり、ＥＶＡ組成が低減されると溶解性が低くなる）、効果的に溶射できなくなる。ＥＶＡ組成の好適な範囲は、優れた溶解性および接着性を促進するように約２５重量％と約４０重量％との間であってもよい。また、ＥＶＡは、グルコースの異なる酢酸係数を生成するように、ポリ（メチルメタクリル酸塩−コ−ブチルメタクリル酸塩）などのその他のポリマーに架橋されてもよい。また、ＥＶＡは、ジグリシジルエーテルまたはジイソシアン酸エステルなどのその他の化合物と架橋され、例えば、使用されるＥＶＡの組成の低減を可能に、あるいはより優れた溶射性能を達成するようにしてもよい。
【００３７】
流束制限膜の溶射は、バイオセンサの大量生産の品質管理改善において特に効果的であってもよい。例えば、約５０から１００個のバイオセンサの生産ロットは、通常のフレックス回路基板から形成されてもよい。作製中、通常の基板の上にＥＶＡ溶液を溶射するステップが実行されてもよい。硬化後、多数の均一な切片に基板を切断またはスライスして、各バイオセンサの流束制限膜がほぼ同一の厚さを有することが可能になる。
【００３８】
流束制限膜の生体適合性および機械的強度の試験を行うために、ブタの生体試験として急性的な調査を実行した。プロトタイプセンサを方法４００に従って製造し、オーバーザワイヤー技術でブタの内頸静脈に挿入したカテーテルの管腔に装着することによって静脈内に設置した。６時間に渡ってグルコースを周期的に豚の侵入部位に注入した。センサの電力出力を本時間帯に監視した。また、血液サンプルを採取し、ＹＳＩ  ２３００グルコース分析器を使用してグルコース濃度を決定することによって、グルコース濃度を同じ時間帯に定期的に測定した。血液サンプルは、同一のカテーテルの異なる管腔から採取された。
【００３９】
図７はブタの試験の結果を示す。７００〜７２０分と８６０〜８８０分との２つの過渡期を例外として、この結果から、試験の初期段階の６００から７００分の時間帯に、センサの読み取りが参照基準と十分一致することが分かる。８６０分の非一致区分の後、電極が血壁に押し付けられていることが発見された。カテーテルが再配置されると、応答が再びＹＳＩ  ２３００分析器に十分一致した。試験時間帯のほぼ終わりの９００から９５０分に、読み取りは、目立って逸脱することなく依然として一致していた。長時間の試験時間に渡る一貫性のある性能により、流束制限膜の脱離ならびにセンサの性能を経時的に低下させるタンパク質増加、凝血、またはその他の生物付着が発生しないことが示された。過渡部分は、多少の非線形性またはその他の不安定性が、異常に高いグルコースレベル中またはカテーテルの配置困難中に発生した逸脱として説明され得る。
【００４０】
前述の開示および実験結果により、ＥＶＡポリマーを使用して流束制限膜を形成する有効性が実証された。グルコースセンサの具体的な事例において、ＥＶＡは、的確な接着性、生体適合性、溶射に適した溶解性、および疎水性／親水性を有することにより、グルコースと酸素との流束差を生成して、センサが線形グルコース応答を提示できるようにする。つまり、ＥＶＡは、静脈内電流測定バイオセンサの上に流束制限膜を形成するために適切な材料的、化学的、性能的、および製造的な特性を有することが判った。
【００４１】
本発明は、実例的な態様で開示された。したがって、全体で使用された専門用語は、限定的な態様ではなく例示的な態様において解釈されるべきである。本発明の変更が当業者に考案されても、本明細書で保証される特許の範囲内に含まれる対象が、このような全ての実施形態であって、本明細書で提供される当該技術分野に対する進歩の範囲内に合理的に入ること、ならびにその範囲が、添付の請求項およびその同等物以外の観点から制限されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本発明の実施形態に係る流束制限膜で被膜された作用電極を有する、フレックス回路の形状の電流測定バイオセンサを示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態に係る流束制限膜の塗布前の、図１のバイオセンサの作用電極部分の拡大側面断面図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態に係る流束制限膜の塗布後の、図１のバイオセンサの作用電極部分の拡大断面図である。
【図４】図４は、本発明の実施形態に係る、バイオセンサ基板上に流束制限膜を形成するためのステップを示す過程フローチャートである。
【図５】図５は、本発明の実施形態に係る流束制限膜で形成されたバイオセンサに関する、電力出力対グルコース濃度のグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施形態に係る流束制限膜で形成されたバイオセンサに関する、グルコース濃度における多数のステップ変化を含む経時的な電力出力についてのグルコース分析結果のグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施形態に係る流束制限膜を有するグルコースセンサの応答についての急性生体内ブタ試験に関する結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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