(57)【要約】  損傷治癒プロセスは、フィブリンシーラントの追加によって補強され得る。シーラント組成物及び適用方法によって、損傷治癒プロセス及び組織再生は、更に促進され得る。本発明は、改良されたシーラント組成物及びその用途を提供する。
2009534058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液相組成物であって、所望の部位への適用時に該組成物の液状成分がフィブリンシーラントを形成し、以下：
a. フィブリンモノマー又はポリマー；
b. フィブリノゲン-開裂剤；及び
c. ポリグルコサミン型物質
を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記フィブリンシーラントが、所望の部位への適用後少なくとも１分間で、部分的に架橋されるか又は部分的に重合される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリグルコサミン型物質が、少なくとも50%のグルコサミンモノマーを含む、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリグルコサミン型物質が、ヒアルロン酸物質、ヒアルロン酸誘導体物質、キチン物質、キチン誘導体物質、キトサン物質及びキトサン誘導体物質からなる群より選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリグルコサミン型物質が１以上の異なった物質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前記グルコサミン型物質が、１以上の異なった分子サイズの物質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
前記グルコサミン型物質が、１以上の異なった分子サイズを有する１以上の異なった物質を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリグルコサミン型物質のアセチル化度が0〜100%である、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
細胞を更に含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞が、血小板、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞及び骨細胞からなる群より選ばれる、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
増殖因子を更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
前記増殖因子が、上皮増殖因子（EGF）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、形質転換成長因子α（TGFα）、形質転換成長因子β（TGFβ）及びインターロイキン-1からなる群より選ばれる、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物の成分が、使用まで低pH緩衝剤中での保存によって重合されない、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物の製造法。
【請求項１４】
前記pHが4である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物の成分が、使用まで２以上の別個のリザーバでの保存によって重合されない、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物の製造法。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物を適用する方法であって、以下のステップ：
a. 該組成物の成分を準備し；
b. アプリケータ装置を準備し、該装置は、少なくとも２つの試薬出口及び少なくとも１つの空気出口を含む；並びに
該アプリケータ装置を用いて、該組成物の該成分を所望の部位に適用すること、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記装置が、３、４又は５つの試薬出口、及び少なくとも１つの空気出口を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
細胞増殖を支持するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１９】
生物活性物質のための送達ビヒクルとしての、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項２０】
外科用接着バリアとしての、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項２１】
過剰液体の吸着剤としての、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項２２】
瘢痕組織形成を減少させるための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
全体的な損傷治癒プロセスは、損傷時に始まり、何ケ月から何年までの間続くことがある、複雑な一連の事象である。最初の２〜５日間は、炎症期と呼ばれ、血管収縮、血小板凝縮及びトロンボプラスチンによるクロット形成が起こり、次いで血管拡張及び食作用によって特徴付けられる炎症が起こる。次の約３週間は、増殖期と呼ばれ、繊維芽細胞がコラーゲン床を置く肉芽形成で始まり、次いで異常毛細血管が満たされ、新規なものが形成される。収縮損傷縁が張り合わされ、上皮形成の間に、表面は、細胞で被覆される。再構築期は、３週間〜２年間続くことがある。ここで、引張強度を増加する新しいコラーゲンが形成する。
【０００２】
フィブリン接着剤（fibrin adhesives）又はフィブリン接着剤（fibrin glues）とも呼ばれる従来のフィブリンシーランはまた、不溶性ネットマーク（クロット）へのフィブリノゲンモノマーの重合に基づく。このプロセスは、トロンビンがフィブリノゲンを開裂してフィブリンII酸-溶解性モノマーになる時、及びCa++の存在下でトロンビンが第XIII因子を第XIIIaに活性化する時に開始される。フィブリンII酸-溶解性モノマーは、次いで第XIIIa因子によって酸-不溶性架橋フィブリンIIポリマーに変換される。
【０００３】
フィブリンシーラントの使用は、様々な医療手段、例えば止血剤、過剰液体の吸収剤、外科用接着バリア、損傷包帯及び生物活性物質の送達ビヒクル、について記載されてきた。フィブリンシーラントを適用する多数の方法は当該分野で知られている。フィブリノゲン成分とトロンビン成分とを混合した後のフィブリンシーラントの迅速な重合に関して、それらはすべて開発されている。１つの方法では、その混合物は、好適なサイズのシリンジに満たされ、迅速に所望の部位に適用されなければならない。別の方法では、二重バレルシリンジが使用される。他の方法は、微滴送達システムを採用するか、又はスプレイ塗布システムを採用する。この方法の中には、特別のアプリケータを必要とするものもある。更に他の方法では、成分は、担体物質に結合され、あるいは成分の１以上は非-液状形態、例えば粉末でもよい。生物適合性及び生分解性ポリマーは、フィブリンシーラント成分のための好適な担体物質として特定されてきた。このようなポリマーは、フィブリンシーラント繊維が予め調製され、損傷部位に置かれる時に活性化される、という利点を与える（米国特許第6,503,527号明細書）。有用なポリマーの例は、ポリグルコサミン型物質、例えばヒアルロン酸（HA）及びキチン/キトサンである。HAは、適用部位からフィブリンシーラントが移動しないようにするための、好ましい粘度増強ポリマーとして記載されてもきた（欧州特許第0590015号明細書）。
【０００４】
ポリグルコサミン型物質は、上記の用途に加えて、他の利点も有することがある。例えば、HAは、皺の除去のための形成外科において使用され、医師は、過去２０年間、骨粗鬆症の治療としての膝の滑液にHAを直接注入してきた。しかしながら、HA自体の生物的利用能は、その速いターンオーバー及び短い半減期のために限定されている。キトサンは、体重を減少させるための栄養補助食品として使用されてきたが、損傷治癒においても有用であることが見出されている（米国特許第4,532,134号明細書）。
【０００５】
止血を制御することに加えて、組織再生のための最も可能性のある条件を提供することによって損傷治癒を刺激し、それによって損傷治癒を促進することが更に望ましい。細胞療法および典型的な増殖因子の使用は、ますます、損傷を治癒するのが困難な現在の治療方に使用されている。増殖因子は、損傷の治癒において、外科的創面切除と相乗的に働くことがある。
【０００６】
様々な種類の物質は、細胞又は増殖因子送達のための媒体として試験されており、だれも最適であることを示さなかった。しかしながら、自己フィブリンは、自己ケラチノサイトの送達のために有用であると考えられる（Grant 2002 Br J Plast Surg vol. 55: 219-227）。更に、今日、自己フィブリンは、血小板-由来増殖因子のファミリーを含み及び送達するように開発されている。
【０００７】
フィブリン-開裂剤によるフィブリンモノマーの、重合フィブリンの不溶性ネットワークへの変換は、迅速なプロセスであり、よって、使用直前にフィブリンシーラント混合物の調製を必要とする。速い重合は、アプリケータの目詰まりによる適用上の問題点、及びフィブリンシーラントの所望の引張強度を得るための正確な投与形態を適用する点での更なる困難性を起こすことがある。従って、フィブリンシーラント組成物であって、含まれる成分の１以上が固体相、例えば繊維、シート又は粉末である前記組成物が採用され、固体相担体物質の手段によって送達されてきた。このような部分的に固体の組成物は、重合プロセスの開始における遅れのために使用前の好適な時間に調製され得る。これらの部分的に固体相のフィブリンシーラント組成物は、医療専門家によってより簡便に取り扱われるように見えるかもしれないが、ある限界により制限されてもいる。例えば、組織再生のために適した他の成分、例えば細胞のためのビヒクルとしてのフィブリンシーラントの使用は、半-固体相又は非-水溶性環境と適合しないかもしれない。加えて、液相のフィブリンシーラント組成物は、損傷縁に対してフィルム又はシートよりも容易に適合する。従って、液体フィブリンシーラント組成物及びその適用の簡便な方法には強い要求が依然として存在する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の簡単な概要
第１の態様では、本発明は、液相組成物であって、所望の部位への適用時に、該組成物の液体成分がフィブリンモノマー又はポリマー、フィブリノゲン-開裂剤及びポリグルコサミン型物質を含むフィブリンシーラントを形成する。
【０００９】
第２の態様では、本発明は、本組成物の製造法であって、該組成物の成分が使用まで低pH緩衝剤中での保存によって重合しないようにされる、前記方法に関する。
【００１０】
第３の態様では、本発明は、本組成物の成分を提供するステップを含む該組成物の適用法であって、アプリケータ装置を準備し、該装置は少なくとも２つの試薬出口及び少なくとも１つの空気出口を含む、及びアプリケータ装置を用いて所望に部位に該組成物の成分を適用すること、含む前記方法に関する。
【００１１】
第４の態様では、本発明は、細胞増殖を支持するための組成物の使用に関する。
【００１２】
本発明を以下の図面を参考に詳細に説明する。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明の１つの態様は、液相組成物であって、該組成物の液体成分が、所望の部位への該組成物の適用時に、所望の部位への適用後少なくとも１分間に部分的に架橋され又は部分的に重合される、フィブリンモノマー又はポリマー、フィブリノゲン-開裂剤及びポリグルコサミン型物質を含むフィブリンシーランを形成する、前記組成物に関する。
【００１４】
液体フィブリンシーラント組成物の能力は、重合中に形成される、その物理的性質、例えば場所を移動することなく適用部位に接着する能力、弾性及び引張強度によって決定される。臨床的用途では、特定された物理的性質を有するフィブリンシーラントの瞬間的な重合が求められる。そのため、フィブリンシーラントを取り扱うために必要とされる時間とのバランスをとらなければならない。
【００１５】
本明細書で使用される「部分的に架橋された又は部分的に重合された」は、クロット形成のプロセスが十分に完了していないことを示す。
【００１６】
本発明の液体組成物は、フィブリンシーラントが適用部位に適合するので、ほとんどの用途に適している。迅速な重合は、フィブリンシーラントが適用部位に残り、体液又は標的の動きによって除かれないことを確実にする。そのため、本発明は、増加した粘度又担体物質を提供するための成分の添加を必要としない。該液相組成物の１以上の適用によって、所望の弾性及び引張強度を有するフィブリンシーラント構造をつくることができる。
【００１７】
本明細書で使用する「フィブリン」は、フィブリン、フィブリンI又はフィブリンIIを意味する。本明細書で使用する「フィブリノゲン開裂剤」は、ペプチドAもしくはペプチドB又はその両方をフィブリノゲンから開裂することができる酵素を意味する。通常フィブリンシーラントで使用されるフィブリノゲン-開裂剤はトロンビンであり、それは、任意の好適な供給源、例えばヒト又はウシ、ヘビ毒由来の酵素、例えばバトロキソビン、カロビン、フィブロザイム、及びアメリカハブ属ハラクスのヘビ由来の酵素から得られる。
【００１８】
本明細書で使用される「ポリグルコサミン型物質」は、該グルコサミンがある分子の反復部分である分子を意味する。それは、生物適合性及び生物吸収性物質、例えばヒアルロンサン、キチン/キトサン及びそれらの誘導体を含む。
【００１９】
キチンは、植物及び動物界に広く分布している。その主な機能は、構造的及び骨格的な支持体を提供することである。キチンは、2-アセトアミド-2-デオキシ-D-グルコピラノース（N-アセチルグルコサミン）単位に結合されたβ-D(1-4)の直鎖ホモポリマーである。その一部分、典型的には、約15%はN-脱アセチル化されている、完全にアセチル化されたポリマーは、キチン（chitan）と称され、完全に脱アセチル化されたポリマーはキトサンと称される。
【００２０】
ヒアルロナンとも称されるヒアルロン酸（HA）は、二糖繰り返し単位、D-グルクロン酸及びN-アセチルD-グルコサミンの直鎖ポリマーである。このムコ多糖は、分子量によって、異なった生物的性質を有することが示されている。HAは、動物組織において２〜５分の半減期という異常に速い速度のターンオーバーを有し、最大分子量を有する場合でさえも、時間と共に分解によって除かれる。更に、高分子量溶液の粘度は、適用中に主な問題を与える。
【００２１】
本発明は、実施例１において、HAのようなポリグルコサミンが、驚くべきことに、フィブリンシーラントクロット内で捕捉され、それによってその速いターンオーバー及び短い半減期が遅れる、ことを証明する。このことは、様々な分子量のポリグルコサミンの選択及び用途においてより広範な採用を提供するものである。フィブリンクロット中のHAの保持は、フィブリンシーラントと組み合わせて低分子量ポリグルコサミンの使用を可能にし、それによって成分の低粘度に起因して送達をより制限している。
【００２２】
感染は、慢性損傷の治療における課題であり、よって抗菌剤の使用が望ましい。本願の実施例は、キトサンの抗菌効果を証明する。他の研究はまた、キトサンのこの性質を報告している（米国特許第US 4,532,134号明細書）。更に、それらは、単独で適用された時にキトサンは、損傷治癒プロセスの初期段階での損傷の引張強度を減少させ、そして、より後の段階で顕著な効果を提供しなかった、ことを見出した。初期の研究は、HAが気管支炎における細菌感染の発生を減らすために役立つことがある、ことを示している（Venge, P., 1996 Am J Respir Crit Care Med 153(1): 312-6）。従って、キトサン、HA又は他のポリグルコサミンの、フィブリンシーラントとの同時適用は、本発明で提案されるように、抗菌活性の付加的特徴を組成物に与えることがある。
【００２３】
高フィブリン密度は、フィブリンマトリックス中の細胞の増殖及び挙動に影響を与え、それによって損傷治癒プロセスに影響を与えことがある。初期の研究は、高フィブリン密度が軟骨細胞の内部成長が抑制される圧縮ネットワークを生じるが、比較的低いフィブリン密度はHAを増大させ、それによって細胞が増殖するネットワークを更に失う、ことを示している。従って、最良の可能な細胞増殖環境を提供するために、ポリグルコサミンのような細胞適合性媒体を取り込むことによって、フィブリンシーラントネットワークを広げることが望ましい。
【００２４】
本発明の１つの実施態様では、ポリグルコサミン型物質は、少なくとも50%グルコサミンモノマーを含む。
【００２５】
本発明の１つの実施態様では、ポリグルコサミン型物質は、ヒアルロン酸物質、ヒアルロン酸誘導体、キチン物質、キチン誘導体物質、キトサン物質及びキトサン誘導体物質からなる群より選ばれる。
【００２６】
ポリグルコサミン型物質はまた、少なくとも1つの修飾されたモノマーを含む物質を包含する。該修飾は、例えば化学的であり、修飾の原則的な標的の非-限定的な例は、N-アセチル D-グルコサミンに存在するカルボキシル基及びD-グルクロン酸に存在するヒドロキシル基であり、更なる部位は、末端修飾又はN-アセチルを還元することができる。更に、モノマーは、当該分野で知られている多数の架橋方法によって修飾され得る。それらの多くは、www.glycoforum.gr.jp.に記載されている。
【００２７】
本発明の１つの実施態様では、ポリグルコサミン型物質は、異なった物質の混合物を含む。
【００２８】
本発明の１つの実施態様では、ポリグルコサミン型物質は、異なった分子量の混合物を含む。
【００２９】
本発明の１つの実施態様では、ポリグルコサミン型物質は、異なった物質及び異なった分子量の混合物を含む。キトサン及びHAの併せた使用は、酵素的加水分解からHAを保護し、よってポリグルコサミン型物質の分解に対する抵抗性の要件によって、異なった分子量の異なった物質が選択され得る。
【００３０】
本発明の１つの実施態様では、ポリグルコサミン型物質のアセチル化度は、0〜100%である。
【００３１】
本発明の１つの実施態様は、細胞を更に含む組成物に関する。細胞は、任意の他の成分と共に溶液中に含有されるか、又は細胞は別個の溶液中で維持されうる。このことは、細胞の起源及び生細胞のための最もよい環境の選択に依拠して決定され得る。例えば、血小板は、フィブリンと同一の起源から単離され、よってフィブリン含有溶液に既に存在する。細胞が培養される場合には、細胞は細胞増殖培地中に懸濁して提供されてもよく、あるいは、細胞は、１以上の他の成分を更に含む他の好適な溶液中に懸濁されてもよい。
【００３２】
本発明の１つの実施態様では、細胞は、血小板、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞及び骨細胞からなる群より選ばれる。
【００３３】
本発明の１つの実施態様は、増殖因子を更に含む組成物に関する。増殖因子は、任意の他の成分と共に溶液中に含有されてもよく、又は別個の溶液で供給されてもよい。かかる増殖因子は、損傷部位に送達される又は損傷部位に既に存在するエフェクター細胞に最も可能性のある条件をつくる点で補助することがある。フィブリンシーラントを用いる増殖因子の適用は、損傷治療方法のステップを省く。
【００３４】
本発明の１つの実施態様では、増殖因子は、上皮増殖因子（EGF）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、形質転換成長因子α（TGFα）、形質転換成長因子β（TGFβ）及びインターロイキン-1からなる群より選ばれる。
【００３５】
本発明の１つの実施態様は、組成物の調製法であって、該組成物の成分が使用まで低pH（該pHが４である）緩衝剤中での保存によって重合できないようにされる、前記方法に関する。
【００３６】
本発明の別の実施態様では、該組成物の成分は、使用まで２以上の別個のリザーバでの保存によって重合できないようにされる。
【００３７】
本発明の１つの実施態様は、該組成物の所望の部位への適用方法であって、以下のステップ：該組成物の成分を準備し；アプリケータ装置を準備し、該装置は、少なくとも２つの試薬出口及び少なくとも１つの空気出口を含む；並びに該アプリケータ装置を用いて、該組成物の該成分を所望の部位に塗布すること、を含む、前記方法に関する。
【００３８】
本発明の１つの実施態様では、該装置は、３、４又は５個の試薬用出口、及び少なくとも１つの空気用出口を含む。スプレイアプリケータ装置、例えばVivostat（登録商標）適用装置（Dodd, R. A., 2002 Technology and Health Care 10: 401-11）の使用は、簡便な適用、投薬量及び成分の均一混合物を提供する。
【００３９】
本発明の１つの実施態様は、細胞増殖を支持する液相組成物の使用に関する。これは、例えば、細胞増殖、細胞活性化、細胞移動又は細胞分化のための条件を改善するための、該組成物に更なる（支持）細胞、増殖因子等を加えることによってなされる。
【００４０】
本発明の１つの実施態様では、該組成物は、生物活性物質のための送達ビヒクルとして使用される。非-限定的な例は、抗菌物質、薬物、細胞、増殖因子、含水物質などでよい。
【００４１】
本発明の１つの実施態様では、該組成物は、外科的接着バリアとして使用される。
【００４２】
本発明の１つの実施態様では、該組成物は、過剰の液体の吸収剤として使用される。ヒアルロン酸は、潤滑の特定の機能を果たす身体のすべての結合組織中で見出される。HAはまた、大量の水と結合し保持する能力によってハイドロゲルと称される。
【００４３】
１つの実施態様では、該組成物は、瘢痕組織形成を減少させるために使用される。キトサンのみの適用は、繊維芽細胞による瘢痕組織と考えられる線維形成を抑制することが明らかになっており、代わりに内皮裏層が観察された（米国特許第4,532,134号明細書）。従って、ポリグルコサミン、例えばキトサン、その誘導体又は他のポリグルコサミンは、瘢痕組織の形成を減少させることがある。
【００４４】
以下において、発明は非-限定的な例によってより詳細に記載される。
【実施例】
【００４５】
実施例１：フィブリンシーラント中のヒアルロン酸（HA）の保持  
目的は、フィブリンクロットから抽出可能なHAの量を決定し、それによってどのくらい保持されるかを決定することである。更に、該抽出可能なHAの分子量を決定した。
【００４６】
材料
３つのフィブリンクロットを調製した：
試料A ラベルされた「0.484 gフィブリン」は、20 mg/mlフィブリンを含んだ。
試料B ラベルされた「0.568 gフィブリン」は、約10 mg/mlフィブリン及び1% HA (v/v) を含んだ。
試料C ラベルされた「0.535 g フィブリン」は、20 mg/mlフィブリン及び1% HA (v/v) を含んだ。
【００４７】
800 kDaの分子量を有するHA（NovoZymesによって供給されたMAG 30014）は、フィブリンを含む1%溶液（フィブリン:HAは１：８の比）で同時適用した。HAは、クロットの調製物として同日に抽出した。すべての試料は、同一のドナーから得た。
【００４８】
抽出法
クロットは、ガラス壁をへらで押しつぶし、その後、穏かに攪拌しながら、4℃で4x24時間、10 ml PBS緩衝液で抽出した。抽出物を遠心（10分、3000 rpm、4℃）によって回収し、5 mlの脱イオン化ミリQ H2Oを加えた後、0.45μmシリンジフィルターを通過させた。抽出物を2日後の分析の前に、4℃で保存した。
【００４９】
定量及び特徴付け
PL アクアゲルOH-40/0H-50/0H60カラムでのSEG-MALLS-VISG (移動相: 150 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 7.0, 0.5 ml/分)で、抽出物を分析した。装置: Waters Alliance HPLC装置 Waters 2410 RI検出器及びWyatt MALLS検出器。
【００５０】
定量はRIシグナルを評価することによって行った。0.5 mlの各試料をカラムに注入した。データは、Wyatt Technology Corp.製のASTRA Vソフトウェアによって処理した。試料はラベルした：A: 14919-037-1、B: 14919-037-2、及びC: 14919-037-3。
【００５１】
結果
クロマトグラム（図１及び２参照）は、試料B及びCを含むHAの3種の異なったピークを示したが、ピーク1は、HAが欠けている試料Aが存在しなかった。
【００５２】
抽出物のSEG-MALLS-VISG分析からの結果を表１〜５に示す。
【００５３】
【表１】
2009534058.tif 000003
【００５４】
【表２】
2009534058.tif 000004
【００５５】
【表３】
2009534058.tif 000005
【００５６】
【表４】
2009534058.tif 000006
【００５７】
高分子量ピーク（ピーク1）は、HAを含む試料B及びC中に現われただけなので、HAと同定した。更に、分子量（表２）と、固有粘度（表３）と回転径（表４）とを比較すると、すべて、ピーク1が実際にHAであることを示している。ピーク2及び3は、クロットからのタンパク質又はタンパク質断片のいずれかである。計算された量を表５に纏める。
【００５８】
【表５】
2009534058.tif 000007
【００５９】
抽出可能なHAの総量は、使用されたフィブリノゲンの量に比例しているようである。明らかに、かなりの量のHAが布に含まれている/結合している（約90〜95%）。
【００６０】
結論
これらの結果は、約90〜95%のHAがフィブリンクロットに保持されていることを示す。HAの分解は、10 mg/mlのフィブリノゲンの存在下で調製されたクロットからの抽出物で観察されたが、20 mg/ml HAの存在下で調製された抽出物では分解は観察されなかった。
【００６１】
実施例２：更にキトサンを含むフィブリン又は血小板が豊富なフィブリン組成物の抗菌性
この試験の目的は、ミュラー・ヒントン・アガー上に蒔かれたスタフィロコッカス・アウレウス又はエスチェリシア・コリ菌に対する、フィブリン及び血小板豊富フィブリン（PRF）の抗菌効果を試験することであった。フィブリン又はPRFと混合された様々な濃度のキトサンを試験した。
【００６２】
本試験で使用したアガー拡散は、錠剤からの抗菌物質の拡散、又は細菌と一緒に蒔かれたアガー上に直接置かれた抗菌物質の拡散に基いている。蒔かれた細菌は、抗菌物質（複数）の静菌（micro-static）濃度を有する領域を除いて、プレート全体で増殖する。このことは、錠剤又は物質の周囲に環の形成をももたらし、この環の径は、蒔かれた菌に対する添加された抗菌物質の能力と関連している。この方法の限界は、使用された媒体（例えば、アガー）中で拡散することができる抗菌物質の必要性である。
【００６３】
実験
細菌S.オーレウスS29（KVLから生じる抗生物質に感受的）及びE.コリ株Top10/F'TetR（テトラサイクリンに対する耐性）の新鮮コロニーは、殺菌0.9% NaCl（Nycomed）で約0.1のOD625（Spectrophotometer Cecil 2040）に希釈し、細菌溶液中に綿棒を漬け、アガープレート上に数回拭くことにより、アガープレート上に蒔いた。30分以内にこのプレートに試験物質を加えた。
【００６４】
フィブリン及びPRFは、クエン酸緩衝液04.41.002（PRF）及び02.23.007（RC）で、それぞれ、RC Preparation Unit 05.17.003又はPRF Preparation Unit 05.17.003（フィルターで除去）を用いてドナーBX051901から得た。フィブリン又はPRFは、本目的のために作成した環（径10 mm、高さ3 mm、内容積235 mm3、図３参照）にスプレイし、短いチューブを有するAutomated Processor Unit 75002を用いてオートクレーブした。pHシフトのために、pH 10緩衝剤03.11.001を使用した。重合フィブリン又はPRF錠剤を、S.アーレウス又はE.コリのいずれかを蒔いたミュラーヒントンアガープレート（バッチ番号2105008）に移した。
【００６５】
1%又は2%（w/v）キトサン（0.02 g又は0.04 g Protasan B 0/500, Novamatrix バッチ番号FP-412-03は、各々、2 mlのpH 4緩衝剤に溶解した）の添加は、3番目のシリンジを用いて行った。シリンジは、Vivostat（登録商標）適用装置の空いている弁口に連結した。このことは、最終フィブリン/PRF（0.14%及び0.28%の最終濃度）の約７分の１の量のキトサンの添加をもたらした。フィブリン/PRFを含むキトサンは、上記のように調製し、アガープレート上に蒔いた。追加の対照は、アガー表面又はアガー上のウェルに純粋な2%キトサンを添加することによって調製した。すべてのプレートは二点で作製した。プレートを37℃で約20時間インキュベートし、次いで写真を撮った（図４〜６参照）。
【００６６】
結論
本実験は、フィブリン又はPRFクロットによる細菌阻害を証明する先の結果を確認するものである。試験した濃度では、キトサン単独も、細菌増殖に阻害的であった。フィブリン又はPRFとキトサンとの混合の顕著な相乗効果は検出されなかった。
【００６７】
完全な耐性（バンコマイシン又はテトラサイクリンでのE.コリ）に関して対照は、阻害、すなわち２つの細菌株に対するPRF、フィブリン及びキトサン単独の抗菌効果を示唆する、を全く示さなかった。このことが表面上の物質の拡散又は簡単な「波及」に因るものであるかどうかは、わかっていない。
【００６８】
実施例３：キトサン又はヒアルロン酸の添加による血小板豊富フィブリン
本目的は、ヒアルロン酸（HA）又はキトサンを更に含む自己血小板豊富フィブリン（PRF）を含む組成物の水吸収性を試験することである。
【００６９】
実験
１日。2% HA（NovoZymes製の0.08 gヒアルロンをNaCl バッチ番号R052002に溶解した）又は2%キトサン（0.08 g Protasanバッチ番号FP-412-03, 4mlのpH 4緩衝剤04.49.001に溶解したNovaMatrix）のいずれかを含む成形フィブリン及びフィブリンをつくるために、短いチューブラインを有する自動アプリケータUnit番号30002を用いた。血漿ドナーAX052001及びAX052002からフィブリンを得た。pHシフトのために、pH 10緩衝剤03.11.001を用いた。成形クロットの質量を決定し（0時間）、クロットを生理食塩水に浸漬し（図７参照）、表６及び図８で示す間隔で質量を決定した。
【００７０】
２日。約18時間後、生理食塩水中で、第１血漿由来のフィブリン試料はそのままであったが、第２血漿由来の試料は完全に溶解した、これは、おそらくフィブリン溶解活性における相違に因るものであった。ラン１の質量を記録した後、クロットを湿度100%に置いた。試料間には明らかな相違はなかった。
【００７１】
３日。クロットはすべて透明であり、部分的に溶解した。
４日。クロットを含むゼリー様キトサンを除いて、すべてのクロットは溶解した。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
結論
本実験は、2%キトサン又は2%HAの添加は、フィブリンクロットの水吸収性に影響を与えず、またクロットのフィブリン溶解に影響を与えなかった、ことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、HAを添加又は添加されていないクロットからの抽出物のSEC-MALLS-VISC分析の結果を示すクロマトグラムである（各々、試料C及びA）。凡例：試料A；下の線、試料C；下の線。
【図２】図２は、HAが添加されたクロットからの抽出物のSEC-MALLS-VISC分析の結果を示すクロマトグラムである（試料B）。
【図３】図３は、重合フィブリン又は血小板豊富フィブリンクロットをつくるための環の図である。
【図４Ａ】図４Ａは、S.オーレウス又はE.コリのいずれかが蒔かれたミュラーヒルトンアガープレートの図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、S.オーレウス又はE.コリのいずれかが蒔かれたミュラーヒルトンアガープレートの図である。
【図５Ａ】図５Ａは、S.オーレウス又はE.コリのいずれかが蒔かれたミュラーヒルトンアガープレートの図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、S.オーレウス又はE.コリのいずれかが蒔かれたミュラーヒルトンアガープレートの図である。
【図６Ａ】図６Ａは、S.オーレウス又はE.コリのいずれかが蒔かれたミュラーヒルトンアガープレートの図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、S.オーレウス又はE.コリのいずれかが蒔かれたミュラーヒルトンアガープレートの図である。
【図７】図７は、成形されたクロットの説明である。
【図８】図８は、最初の18時間内の成形クロットの重量減少を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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