(57)【要約】  優れた生物医学的活性を有する帯電したケラチンの最適なフラクションを製造する方法を提供する。これらのケラチン調製品でコーティングされた医療用インプラントも提供する。血液凝固の治療の必要がある患者において血液凝固を治療する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチンの帯電したフラクションを製造する方法であって、
酸性および／または塩基性の複数のケラチンを含むケラチン溶液を用意するステップと、
前記ケラチン溶液から、前記酸性および／または塩基性の複数のケラチンの複数のフラクションを分離するステップと、
前記複数のフラクションのうちの少なくとも１つを回収するステップと
を含み、ケラチンの少なくとも１つの帯電したフラクションを製造する、方法。
【請求項２】
前記分離ステップをイオン交換クロマトグラフィーによって行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離ステップをアニオン交換クロマトグラフィーによって行う請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分離ステップをアニオン交換クロマトグラフィーによって行い、このアニオン交換クロマトグラフィーを弱アニオン交換樹脂によって行う請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ケラチン溶液のケラチン濃度が０〜５重量／容量％である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ケラチン溶液のｐＨが６〜７である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ケラチンが、アルファまたはガンマケラチンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ケラチンが、アルファケラチンから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ケラチンが、ガンマケラチンから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ケラチンが、ケラトースを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ケラチンが、ケラトースから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ケラチンが、アルファケラトースから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ケラチンが、ガンマケラトースから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ケラチンが、ケラテインを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ケラチンが、ケラテインから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ケラチンが、アルファケラテインから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ケラチンが、ガンマケラテインから実質的になる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記帯電したケラチンを、変性溶液および／または緩衝溶液に、任意に微量金属と錯体を形成するキレート剤の存在下で、再び溶解するステップと、
前記変性溶液および／または緩衝溶液から前記帯電したケラチンを再沈殿させるステップと
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ケラチンが、ケラトースから実質的になるとともに、前記用意するステップが、
人毛を過酢酸と反応させるステップと、
トリス塩基を含む溶液でケラトースを抽出するステップと
によって、ケラトースから実質的になるケラチン溶液を用意する請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ケラトースが、アルファケラトースから実質的になるとともに、前記用意するステップが、
ケラトースから実質的になる前記ケラチン溶液に、ｐＨが約４になるまで無機酸を添加することにより、アルファケラトースを沈殿させるステップと、
この沈殿したアルファケラトースを前記溶液から分離するステップと、
この沈殿したアルファケラトースを回収するステップと、
任意に、このアルファケラトースをｐＨ９で再溶解し、ｐＨ４で再沈殿させて、さらに精製するステップと
を含み、前記アルファケラトースから実質的になるケラトースを用意する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ケラチンが、ケラテインから実質的になるとともに、前記用意するステップが、
人毛をチオグリコール酸と反応させるステップと、
トリス塩基を含む溶液でケラテインを抽出するステップと
によって、ケラテインから実質的になるケラチン溶液を用意する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ケラテインが、アルファケラテインから実質的になるとともに、前記用意するステップが、
前記ケラテインから実質的になるケラチン溶液に、ｐＨが約４になるまで無機酸を添加することにより、アルファケラテインを沈殿させるステップと、
この沈殿したアルファケラテインを前記溶液から分離するステップと、
この沈殿したアルファケラテインを回収するステップと、
任意に、このアルファケラテインをｐＨ９で再溶解し、ｐＨ４で再沈殿させて、さらに精製するステップと
をさらに含み、前記アルファケラテインから実質的になるケラテインを用意する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
基体と、前記基体上のケラチン誘導体とを備えた移植可能な生体用器具であって、
前記ケラチン誘導体が、前記基体に細胞および組織が付着するのを減少させるのに有効な量で存在するとともに、
前記ケラチン誘導体が、塩基性ケラトース、塩基性ケラテインまたはそれらの組み合わせから実質的になる器具。
【請求項２４】
前記器具が、人工血管、血管ステント、カテーテル、リード、ペースメーカー、または電気除細動器である請求項２３に記載の器具。
【請求項２５】
生理学的に許容される固体状の基体と、
前記基体上のケラチン誘導体と
を備えた移植可能な組織付着防止用バリアであって、
前記ケラチン誘導体が、塩基性ケラトース、塩基性ケラテインまたはそれらの組み合わせから実質的になるバリア。
【請求項２６】
血液凝固の治療の必要がある対象において血液凝固を治療する方法であって、ケラチン誘導体を、前記対象における血液凝固を抑制するために有効な量で前記対象に投与するステップを含むみ、前記ケラチン誘導体が、塩基性ケラトース、塩基性ケラテインまたはそれらの組み合わせから実質的になる方法。
【請求項２７】
前記対象が、血栓塞栓性疾患に罹患している請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記血栓塞栓性疾患が、不安定性狭心症、急性冠症候群、初回心筋梗塞、再発性心筋梗塞、虚血性突然死、一過性虚血発作、卒中、アテローム性動脈硬化症、末梢閉塞性動脈疾患、静脈血栓症、深在静脈血栓症、血栓性静脈炎、動脈塞栓症、冠動脈血栓症、脳動脈血栓症、脳塞栓症、腎臓塞栓症、肺塞栓症、および（ａ）人工弁もしくは他のインプラント、（ｂ）留置カテーテル、（ｃ）ステント、（ｄ）心肺バイパス、（ｅ）血液透析または（ｄ）他の処置（血栓を促進する人工表面に血液を暴露するもの）に起因する血栓症から選択される請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００６年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７７４，４４２号、２００６年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７７４，５８７号、および２００６年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７７４，９２０号の恩典を合衆国法典３５巻１１９条（ｅ）項に従って主張するものである（前記米国仮特許出願のそれぞれの開示は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる）。
【０００２】
本出願は、２００５年８月１７に出願されたＡｍｂｉｅｎｔ  Ｓｔｏｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｘｐａｎｄｅｒｓと題するＭａｒｋ  Ｅ．Ｖａｎ  Ｄｙｋｅの米国特許出願第１１／２０５，８００号、２００７年２月９日に出願された（整理番号が付与される）Ｎｅｒｖｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｋｅｒａｔｉｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓと題するＭａｒｋ  Ｅ．Ｖａｎ  Ｄｙｋｅの米国特許出願、ならびに２００７年２月１６日に出願された（整理番号が付与される）Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｅｒａｔｉｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓと題するＭａｒｋ  Ｅ．Ｖａｎ  Ｄｙｋｅの米国特許出願およびＰＣＴ出願に関する。
【０００３】
［政府支援］
本発明は、米国陸軍からの契約番号Ｗ８１ＸＷＨ−０４−１−０１０５のもとでの政府支援を受けて行ったものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
［発明の分野］
本発明は、一般に、ケラチン医用生体材料、および生物医学用途でのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
医療におけるケラチンの使用を最も早く文献に記載したのは、Ｌｉ  Ｓｈｉ−Ｚｈｅｎという名の中国人植物学者である（Ｌｉ  Ｓｈｉ  Ｚｈｅｎによって書かれた、Ｂｅｎ  Ｃａｏ  Ｇａｎｇ  Ｍｕ．Ｍａｔｅｒｉａ  Ｍｅｄｉｃａ，ａ  ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈｅｒｂｓ（１５１８−１５９３））。３８年の時をかけて、彼は、Ｂｅｎ  Ｃａｏ  Ｇａｎｇ  Ｍｕとして知られている８００冊の蔵書を書き上げた。これらの本は、彼の死の３年後、１５９６年に出版された。これらの書物に記載された１１，０００を超える処方の中に、熱分解された人毛からの粉砕された灰からなる、血余炭（Ｘｕｅ  Ｙｕ  Ｔａｎ）として知られている、Ｃｒｉｎｉｓ  Ｃａｒｏｎｉｓａｔｕｓとしても知られている、物質がある。血余炭について述べられている効能は、創傷治癒および血液凝固の促進であった。
【０００６】
タンパク質がまだアルブミノイドと呼ばれていた１８００年代初期（アルブミンは、その当時、周知のタンパク質であった）、多くの異なる種類のタンパク質が発見された。１８４９年ごろ、動物の角および蹄などの硬質組織を構成する物質を記述するために、文献に「ケラチン」という語が出現した（ケラチンは、角を意味するギリシャ語「ｋｅｒａ」に由来する）。この新たなタンパク質は、他のタンパク質のように動作しないので、科学者たちの興味をそそった。例えば、タンパク質を溶解するために用いられる通常の方法がケラチンには無効であった。燃焼および粉砕などの方法が、暫くの間、知られていたが、多くの科学者および発明者たちは、より良い製品を造るために毛および角を溶解することに、より大きな関心をもった。
【０００７】
この不溶性の問題の解決は、７００年を超える歴史をもつ商い − 製革産業 − からもたらされた。第一次世界大戦前の数年間、ケラチンゲルの製造に石灰が適用された。１９０５年に発行された米国特許に、Ｊｏｈｎ  Ｈｏｆｆｍｅｉｅｒは、石灰を使用して動物の角からケラチンを抽出するプロセスを記載した（１９０５年１２月１８日、ドイツ特許第１８４，９１５号）。その後、彼は、ホルムアルデヒドの添加によって強化することができるゲルを作るために、その抽出ケラチンを使用した（ホルムアルデヒド「架橋」は、こうしたゲルの世間一般的な強化法であり、ケラチンおよびコラーゲンのような構造タンパク質を含有する組織を「固定」するために今日、尚、用いられている）。
【０００８】
１９０５年から１９３５年までの数年間に、酸化および還元化学を用いてケラチンを抽出する多数の方法が開発された（Ｂｒｅｉｎｌ  Ｆ  ａｎｄ  Ｂａｕｄｉｓｃｈ  Ｏ，Ｚ  ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９０７；５２：１５８−６９；Ｎｅｕｂｅｒｇ  Ｃ，米国特許第９２６，９９９号，１９０９年７月６日；Ｌｉｓｓｉｚｉｎ  Ｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｕｌｌ  １９１５；４：１８−２３；Ｚｄｅｎｋｏ  Ｓ，Ｚ  ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９２４；１３６：１６０−７２；Ｌｉｓｓｉｚｉｎ  Ｔ，Ｚ  ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９２８；１７３：３０９−１１）。１９２０年代後期までに、毛、角および蹄の構造を分解する多くの技術が開発されたが、科学者たちは、これらの精製タンパク質の一部についての動作に困惑した。すぐに、科学者たちは、多くの異なる形態のケラチンがこれらの抽出物中に存在する、および毛髪繊維は複雑な構造であるに違いなく、単純なタンパク質鎖であるはずがない、という結論に達した。１９３４年、異なる分子量を有することで主として区別された異なるタイプのケラチンを記載した重要な研究論文が公表された（Ｇｏｄｄａｒｄ  ＤＲ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９３４；１０６：６０５−１４）。この独創性に富んだ論文は、多くの異なるケラチン同族体があること、およびそれぞれが、毛包の構造および機能に関して異なる役割を果すことを論証した。
【０００９】
第二次世界大戦年間およびその直後、毛髪繊維の構造および化学に関する最も広範囲にわたる調査プロジェクトが行われた。ナイロンおよびポリエステルなどの合成繊維の商品化に追い立てられ、オーストラリアの科学者たちは、国の巨大羊毛産業を保護する責任を負わされた。合成繊維は、羊毛生産に関するオーストラリアの支配的立場に脅威をもたらすものと見られ、ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（後のオーストラリア連邦科学産業研究機構（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）、すなわちＣＳＩＲＯ）は、１９４０年にタンパク質化学部門を設立した。この基礎研究の目的は、繊維の構造および化学をよりよく理解して、羊毛およびケラチンの潜在的用途を拡大できるようにすることであった。
【００１０】
ＣＳＩＲＯ科学者たちは、ケラチンの抽出、分離および同定のための多くの方法を開発した。１９６５年、ＣＳＩＲ科学者Ｗ．Ｇｏｒｄｏｎ  Ｃｒｅｗｔｈｅｒおよび彼の同僚は、ケラチンの化学に関する決定版を出版した（Ｃｒｅｗｔｈｅｒ  ＷＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｋｅｒａｔｉｎｓ．Ａｎｆｉｎｓｅｎ  ＣＢ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９６５．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９１−３４６）。Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおけるこのチャプターは、ケラチンに関する６４０を超える公表された研究への参照を含んでいた。科学者たちが、毛髪繊維からケラチンを抽出し、それらを精製および特性付けする方法を知るやいなや、ケラチンを用いて製造することができる誘導材料の数は、指数関数的に増大した。１９７０年から１０年の間に、いくつかの研究グループによって世界中で抽出ケラチンを粉末、フィルム、ゲル、コーティング、繊維およびフォームにする方法が、開発され、公表された（Ａｎｋｅｒ  ＣＡ，米国特許第３，６４２，４９８号，１９７２年２月１５日；Ｋａｗａｎｏ  Ｙ  ａｎｄ  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｓ，化学から生物へ（Ｋａｇａｋｕ  Ｔｏ  Ｓｅｉｂｕｔｓｕ）１９７５；１３（５）：２９１−２２３；Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｓ，日本食品工業学界誌（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｏｋｕｈｉｎ  Ｋｏｇｙｏ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ）１９７７；２４（１）：４０−５０）。これらの方法のすべてが、数十年前に開発された酸化および還元化学を利用していた。
【００１１】
１９８２年、日本の科学者は、血液凝固の排除方法として人工血管に対するケラチンコーティングの使用を説明する最初の研究（Ｎｏｉｓｈｉｋｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，高分子論文集（Ｋｏｂｕｎｓｈｉ  Ｒｏｎｂｕｎｓｈｕ）１９８２；３９（４）：２２１−７）、ならびにケラチンの生体適合性に関する実験（Ｉｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，高分子論文集１９８２：３９（４）：２４９−５６）を公表した。その後、間もなく、１９８５年に、英国からの２人の研究者が、新たな医用生体材料開発のための構成単位としてケラチンを使用する見通しを思索する総説を公表した（Ｊａｒｍａｎ  Ｔ  ａｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｊ，Ｗｏｒｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｒｅｐ  １９８５；１：５０５−１２）。１９９２年、ケラチンに基づく医用生体材料の開発および宿主の試験は、フランス人大学院生Ｉｓａｂｅｌｌｅ  Ｖａｌｈｅｒｉｅの博士論文の主題であった（Ｖａｌｈｅｒｉｅ  Ｉ  ａｎｄ  Ｇａｇｎｉｅｕ  Ｃ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎｓｔ  Ｎａｔｌ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ  １９９２）。その後、間もなく、日本の科学者たちは、ケラチンが就くことのできる医用生体材料開発の最前線の卓越した位置に関する解説を１９９３年に公表した（様々な著者，工業材料（Ｋｏｇｙｏ  Ｚａｉｒｙｏｕ）１９９３；４１（１５）特別号（Ｓｐｅｃｉａｌ  ｉｓｓｕｅ）２：１０６−９）。
【００１２】
考えあわせると、前述の公表された研究の主要部分は、ケラチンの独特な化学的、物理的および生物学的特性を例証するものである。しかし、優れた生物医学的活性を有するケラチンの最適な分画を生じさせる必要が依然としてある。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、例えばクロマトグラフィー等を用いて、互いに分離することによって、更に任意に残りの１つ又は複数のフラクション（画分）を加工または精製することによって、帯電（charged）した（すなわち、酸性および塩基性の）ケラチンを製造する方法を提供する。一部の実施形態において、酸性度に基づいて分画される（fractionated）ケラチンは、アルファケラトース、ガンマケラトースまたはそれらの混合物から実質的になる。他の実施形態において、分画されるケラチンは、アルファケラテイン、ガンマケラテインまたはそれらの混合物から実質的になる。
【００１４】
本発明のもう１つの態様は、基体とその基体上のケラチン誘導体とを含む、移植可能な生体用器具であり、この場合のケラチン誘導体は、その基体への細胞および組織の付着を減少させるために有効な量で存在する。一部の実施形態において、前記ケラチン誘導体は、塩基性アルファケラトース、塩基性ガンマケラトース、塩基性アルファケラテイン、塩基性ガンマケラテインまたはそれらの組み合わせからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、生理学的に許容される固体状の基体と、その基体上のケラチン誘導体とを備えた移植可能な組織付着防止用バリアである。一部の実施形態において、前記ケラチン誘導体は、塩基性アルファケラトース、塩基性ガンマケラトース、塩基性アルファケラテイン、塩基性ガンマケラテインまたはそれらの組み合わせからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの態様は、その必要がある対象において血液凝固を治療する方法であり、この方法は、該対象に、該対象における血液凝固を抑制するために有効な量で、ケラチン誘導体を投与することを含み、この場合、該ケラチン誘導体は、塩基性ケラトース、塩基性ケラテインまたはそれらの組み合わせから実質的になる。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、本明細書に記載するとおりの治療方法を行うための組成物もしくは薬物を調製するための、または本明細書に記載するとおりの製品を製造するための、本明細書に記載するとおりのケラチン誘導体の使用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ケラチンのサブファミリーの独特な特性は、より高度な精製手段によって明らかにすることができ、利用することができる。
【００１９】
本明細書に記載する方法および組成物で治療される「対象」（または「患者」）は、ヒト対象と、獣医学的目的で動物対象（特に、他の哺乳動物対象、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、サルなど）の両方を含む。ヒト対象が特に好ましい。対象は、男性であってもよいし、または女性であってもよく、ならびにいずれの年齢であってもよく、新生児、乳児、年少者、青少年、成人および老人対象を含む。
【００２０】
本明細書に引用するすべての米国特許参考文献の開示は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００２１】
マイクロメートル規模で自然に自己組織化する抽出ケラチン溶液の能力は、１９８６年および１９８７年に２つの論文において発表された（Ｔｈｏｍａｓ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  １９８６；８：２５８−６４；ｖａｎ  ｄｅ  Ｌｏｃｈｔ  Ｍ，Ｍｅｌｌｉａｎｄ  Ｔｅｘｔｉｌｂｅｒｉｃｈｔｅ  １９８７；１０：７８０−６）。この現象は、毛髪ケラチンが得られる高度に制御された高次構造を考えると、意外ではない。適切に加工すると、この自己組織化能力を保つことができ、この能力を用いて、細胞浸潤に導くことができるサイズ規模で規則正しい構築物を作ることができる。ケラチンが、（例えば、酸または塩基で）加水分解されると、それらの分子量は低減され、それらは自己組織化能力を喪失する。従って、加水分解を最小にする加工条件が好ましい。
【００２２】
この自己組織化能力は、２つの理由で組織工学スキャホールドの特に有用な特徴である。第一に、自己組織化は、再現性のある構築物、寸法および気孔率を伴う高規則構造を生じさせる。第二に、これらの構築物が良性条件下で自発的に形成することにより、マトリックスが形成されたとき、細胞の組み込みが可能となる。これら２つの特徴は、天然細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の模倣を試みるいずれのシステムにとっても極めて重要である。
【００２３】
細胞認識も、ＥＣＭを模倣しようと努める医用生体材料の重要な特性である。そうした認識は、構成要素ＥＣＭタンパク質によって提示される特異的アミノ酸モチーフへの細胞表面インテグリンの結合によって助長される。主なタンパク質としては、コラーゲンおよびフィブロネクチンが挙げられ、これらの両方が、細胞結合について広範に研究されている。両方のタンパク質は、多種多様な細胞タイプによる付着を支持する幾つかの領域を含有する。広く知られているアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフに加えて、フィブロネクチン上の「Ｘ」−アスパラギン酸−「Ｙ」モチーフもインテグリンα４β１によって認識される（この場合、Ｘは、グリシン、ロイシンまたはグルタミン酸に相当し、Ｙは、セリンまたはバリンに相当する）が証明された。人毛から誘導されるケラチン医用生体材料は、これらの同じ結合モチーフを含有する。ＮＣＢＩタンパク質データベースの検索により、７１の別個の固有人毛ケラチンタンパク質についての配列が判明した。これらのうちの５５は、高分子量、低硫黄、アルファ−ヘリカルファミリーからのものである。タンパク質のこのグループは、多くの場合、アルファ−ケラチンと呼ばれ、人毛繊維に靭性を付与する要因である。これらのアルファ−ケラチンは、４０ｋＤａより大きい分子量、および４．８モルパーセントの平均システイン（分子間および分子内タンパク質結合の原因である主タンパク質）含有率を有する。さらに、これらのアルファケラチンタンパク質のアミノ酸配列の分析により、７８％が少なくとも１つのフィブロネクチン様インテグリン受容体結合モチーフを含有し、２５％が、少なくとも２つ以上を含有することが証明された。２つの最近の論文は、加工ケラチンフォーム上への優れた細胞付着を実証することにより、これらの結合部位がケラチン医用生体材料の表面に存在する可能性が高いことを強調した（Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００２；９３：１６５−７０；Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００５；２６（３）：２９７−３０２）。
【００２４】
本開示ケラチン調製品と同様に利用することができる天然ポリマーの他の例としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブリン、ムチン、エラスチン、ニドジェン（エンタクチン）、プロテオグリカンなどが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋａｔｓｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６９１，２０３号参照）。
【００２５】
人毛抽出物の生物活性については２つの学説がある。第一は、人毛ケラチン（「ＨＨＫ」）それら自体が生物活性であるという説である。７０を超える人毛ケラチンが知られ、それらのｃＤＮＡ由来配列が公表されている。しかし、ＨＨＫの全補体は分かっておらず、１００を超える推定値が提案されている（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＪＭ，  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｈａｉｒ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ＬＡ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  （１９８３），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；４７５−５１０）。ＨＨＫの全範囲の中の少数は、創傷拘縮および細胞移動に関与することが証明された（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７；２７６：７５−８１）。特に、ケラチンＫ−６およびＫ−１６は、創傷治癒中に表皮で発現され、毛包の外毛根鞘においても見出される（Ｂｏｗｄｅｎ  ＰＥ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９３），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：１９−５４）。人毛抽出物中のこれらのＨＨＫの存在、およびその後のそれらの創傷床への直接投与は、そうしなければ非常に長い分化、移動および増殖プロセスを「ショートカットする」要因となる場合があり、または何らかの生化学物質の欠乏を解消し、その結果、組織修復および再生プロセスを促進する要因となる場合がある。
【００２６】
形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの骨形態発生タンパク質−４（ＢＭＰ−４）および他のメンバーなどの増殖因子が発育中の毛包に存在することは、１０年より長きにわたって知られている（Ｊｏｎｅｓ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９１；１１１：５３１−４２；Ｌｙｏｎｓ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９０；１０９：８３３−４４；Ｂｌｅｓｓｉｎｇｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  １９９３；７：２０４−１５）。実際、３０を超える増殖因子およびサイトカインが、周期的毛包増殖に関与する（Ｈａｒｄｙ  ＭＨ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １９９２；８（２）：５５−６１；Ｓｔｅｎｎ  ＫＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏ  Ｓｃｉ  １９９４；７Ｓ：Ｓ  １０９−２４；Ｒｏｇｅｒｓ  ＧＥ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００４；４８（２−３）：１６３−７０）。これらの分子の多くは、様々な組織再生の際に重要な役割を果す。サイトカインが毛包の膨らんだ領域にある幹細胞に結合すると、多数の増殖因子が人毛の中に運び込まれてくる可能性が高い（Ｐａｎｔｅｌｅｙｅｖ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００１；１１４：３４１９−３１）。これらの増殖因子は、毛先をカットした人毛からケラチンと一緒に、ほぼ間違いなく、抽出される。多くの異なるタイプの増殖因子が様々な組織に存在すること、およびそれらの活性が化学的な抽出後であっても残存することは以前に証明されているが、この所見は、前例がない。これらのような所見は、毛先をカットした人毛の中に多数の増殖因子が存在し得る、およびケラチンが、特にこれらの増殖因子の非常に有効な送達マトリックスとして動作し得るという証拠の漸増を示す。
【００２７】
ケラチンは、脊椎動物の毛、皮膚および他の組織において見出されるタンパク質の１ファミリーである。毛は、容易に入手でき、高価でない、数少ないヒト組織の１つであるため、唯一のヒトケラチン源である。他のケラチン源は、本発明に許容される原料ではあるが、（例えば、羊毛、毛皮、角、蹄、くちばし、羽、うろこなど）、ヒト対象での使用には、人毛が、その生体適合性の故に好ましい。
【００２８】
ケラチンは、当該技術分野において公表された方法を用いる酸化または還元により、人毛繊維から抽出することができる（例えば、Ｃｒｅｗｔｈｅｒ  ＷＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｓ，ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９６５；２０：１９１−３４６参照）。これらの方法は、ケラチンの架橋構造を酸化または還元のいずれかによって破壊する二段法を一般に利用する。これらの反応では、システインアミノ酸残基におけるジスルフィド結合を切断して、ケラチンを可溶性にする（スキーム１）。そのキューティクルは、この処理による影響を実質的に受けず、そのため、大部分のケラチンは、キューティクルの保護構造の中に捕捉されたままである。これらのケラチンを抽出するために、変性溶液を使用する第二段階を用いなければならない。あるいは、還元反応の場合にはこれらの段階を組み合わせることができる。当該技術分野において公知の変性溶液としては、尿素、遷移金属水酸化物、界面活性剤溶液、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい方法は、０．１Ｍと１．０Ｍの間の濃度のトリスの水溶液、および０．１Ｍと１０Ｍの間の尿素溶液を酸化反応および還元反応のためにそれぞれ使用する。
【００２９】
【化１】
2009527274.tif 000002
スキーム１．ケラチンにおけるジスルフィド架橋の（ａ）酸化および（ｂ）還元の一般図。これらの反応は、シスチン残基における硫黄−硫黄結合を切断し、それによってその高次構造を破壊し、ケラチンを反応媒質に可溶性にする。結果として生ずるフラクションは、ケラトース（ａ）およびケラテイン（ｂ）である。
【００３０】
酸化処理を利用する場合、結果として生ずるケラチンは、「ケラトース」と呼ばれる。還元反応を用いる場合、結果として生ずるケラチンは、「ケラテイン」と呼ばれる（スキーム１参照）。
【００３１】
ケラチンの粗抽出物は、酸化還元状態にかかわらず、例えば等電沈殿により、さらに「ガンマ」フラクションおよび「アルファ」フラクションへと精製することができる。高分子量ケラチン、すなわち「アルファケラチン」、（アルファヘリックス状）、は、毛包のミクロフィブリル領域に由来すると考えられ、一般に、分子量は約４０〜８５キロダルトンの範囲である。低分子量ケラチン、すなわち「ガンマケラチン」、（球状）、は、毛包の細胞外マトリックス領域に由来すると考えられ、一般に、分子量は約１０〜１５キロダルトンの範囲である。（Ｃｒｅｗｔｈｅｒ  ＷＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｓ，ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９６５；２０：１９１−３４６参照）。
【００３２】
アルファおよびガンマケラチンは独特な特性を有するにもかかわらず、より高度な精製手段によってしか、アルファケラチンとガンマケラチン両方のサブファミリーの特性を明らかにすることができない。例えば、ケラチンは、「酸性」タンパク質フラクションおよび「塩基性」タンパク質フラクションに分画することができる。好ましい分画方法は、イオン交換クロマトグラフィーである。これらのフラクションは、独特な特性、例えば、血球凝集に対するそれらの異なる効果、を有する（下の表１参照；米国特許出願公開第２００６／００５１７３２号参照）。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「ケラチン誘導体」は、単独または他のケラチン誘導体または他の成分との組み合わせでの、任意のケラチン分画物、誘導体、サブファミリーなど、またはそれらの混合物を指し、アルファケラトース、ガンマケラトース、アルファケラテイン、ガンマケラテイン、メタケラチン、ケラチン、ケラチン中間径フィラメント、およびこれらの組み合わせ（本開示にかんがみて当業者には明らかとなるだろうそれらの変形に加えて、特にそれ以外の指定がない限りそれらの酸性および塩基性成分を含む）を含むが、それらに限定されない。一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、ケラチンの特定のフラクションまたは亜フラクションからなるか、実質的になるか、又は含む。前記誘導体は、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９（またはそれを超える）重量パーセントの前記フラクションまたは亜フラクションからなるか、実質的になるか、又は含むことがある。
【００３４】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、酸性アルファケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００３５】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、アルファケラトースからなる、または実質的になるものを含み、この場合、該アルファケラトースは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９（またはそれを超える）重量パーセントの酸性アルファケラトース、からなる、または実質的になるものを含み、ならびに前記アルファケラトースは、２０、１０、５もしくは１重量パーセント以下（またはそれ未満）の塩基性アルファケラトース、からなるか、実質的になるか、又は含む。
【００３６】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、塩基性アルファケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００３７】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、アルファケラトースからなる、または実質的になるものを含み、この場合、該アルファケラトースは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９（またはそれを超える）重量パーセントの塩基性アルファケラトース、からなる、または実質的になるものを含み、ならびに前記アルファケラトースは、２０、１０、５もしくは１重量パーセント以下（またはそれ未満）の酸性アルファケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００３８】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、酸性アルファケラテインからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００３９】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、アルファケラテインからなる、または実質的になるものを含み、この場合、該アルファケラテインは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９（またはそれを超える）重量パーセントの酸性アルファケラテインからなる、または実質的になるものを含み、ならびに前記アルファケラテインは、２０、１０、５もしくは１重量パーセント以下（またはそれ未満）の塩基性アルファケラテインから成らなる、または実質的になるものを含む。
【００４０】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、塩基性アルファケラテインからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００４１】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、アルファケラテインからなる、または実質的になるものを含み、この場合、該アルファケラテインは、少なくとも８０、９０、９５もしくは９９（またはそれを超える）重量パーセントの塩基性アルファケラテインからなる、または実質的になるものを含み、ならびに前記アルファケラテインは、２０、１０、５もしくは１重量パーセント以下（またはそれ未満）の酸性アルファケラテインからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００４２】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、未分画アルファ＋ガンマ−ケラテインからなるか、実質的になるか、又は含む。一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、酸性アルファ＋ガンマ−ケラテインからなるか、実質的になるか、又は含む。一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、塩基性アルファ＋ガンマ−ケラテインからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００４３】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、未分画アルファ＋ガンマ−ケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、酸性アルファ＋ガンマ−ケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、塩基性アルファ＋ガンマ−ケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００４４】
一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、未分画ベータ−ケラトース（例えば、キューティクルに由来するもの）からなるか、実質的になるか、又は含む。一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、塩基性ベータ−ケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。一部の実施形態において、ケラチン誘導体は、酸性ベータ−ケラトースからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００４５】
塩基性アルファケラトースは、酸性および塩基性アルファケラトースを含む混合物から、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより、塩基性アルファケラトースを分離することによって好ましくは製造され、この塩基性アルファケラトースは、場合によっては１０から１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。さらに好ましくは、前記平均分子量は、３０または４０から、９０または１００キロダルトンである。場合により、しかし好ましくは、前記プロセスは、前記塩基性アルファ−ケラトースを変性および／または緩衝溶液に、場合によっては、微量金属と錯体を形成するキレート剤の存在下で、再び溶解するステップ、およびその後、その変性溶液から塩基性アルファケラトースを再び沈殿させるステップをさらに含む。この組成物が、好ましくは、５、２、１重量パーセント以下、またはそれ未満の酸性アルファケラトースを含有することは、理解される。
【００４６】
酸性アルファケラトースは、上述のものとは逆の技法によって、すなわち、酸性アルファケラトースと塩基性アルファケラトースの混合物から、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより、酸性アルファケラトースを分離し、保持することによって好ましくは製造され、この酸性アルファケラトースは、場合によっては、１０から１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。さらに好ましくは、前記平均分子量は、３０または４０から、９０または１００キロダルトンである。場合によっては、しかし好ましくは、前記プロセスは、前記酸性アルファ−ケラトースを変性溶液および／または緩衝溶液に、場合によっては、微量金属と錯体を形成するキレート剤の存在下で、再び溶解するステップ、およびその後、その変性溶液から塩基性アルファケラトースを再び沈殿させるステップをさらに含む。この組成物が、好ましくは、５、２、１重量パーセント以下、またはそれ未満の塩基性アルファケラトースを含有することは、理解される。
【００４７】
他のケラトースの塩基性および酸性フラクションは、塩基性および酸性アルファケラトースについて上で説明したのと同様の手法で調製することができる。
【００４８】
塩基性アルファケラテインは、酸性および塩基性アルファケラテインの混合物から、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより、塩基性アルファケラテインを分離することによって好ましくは製造され、この塩基性アルファケラテインは、場合によっては、１０から１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。さらに好ましくは、前記平均分子量は、３０または４０から、９０または１００キロダルトンである。場合により、しかし好ましくは、前記プロセスは、前記塩基性アルファ−ケラテインを変性および／または緩衝溶液に、場合によっては、微量金属と錯体を形成するキレート剤の存在下で、再び溶解するステップ、およびその後、その変性溶液から塩基性アルファケラテインを再び沈殿させるステップをさらに含む。この組成物が、好ましくは、５、２、１重量パーセント以下、またはそれ未満、の酸性アルファケラテインを含有することは、理解される。
【００４９】
酸性アルファーケラテインは、上述のものとは逆の技法によって、すなわち、酸性ケラテインと塩基性ケラテインの混合物から、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより、酸性アルファケラテインを分離し、保持することによって好ましくは製造され、この酸性アルファケラテインは、場合によっては、１０から１００または２００キロダルトンの平均分子量を有する。場合によっては、しかし好ましくは、前記プロセスは、前記酸性アルファ−ケラテインを変性溶液および／または緩衝溶液に、場合によっては、微量金属と錯体を形成するキレート剤の存在下で、再び溶解するステップ、およびその後、その変性溶液から塩基性アルファケラテインを再び沈殿させるステップをさらに含む。この組成物が、好ましくは、５、２、１重量パーセント以下、またはそれ未満、塩基性アルファケラテインを含有することは、理解される。
【００５０】
他のケラテインの塩基性および酸性フラクションは、塩基性および酸性アルファケラテインについて上で説明したのと同様の手法で調製することができる。
【００５１】
ケラチン材料は、羊毛および人毛をはじめとする（しかし、これらに限定されない）任意の適する源から得られる。１つの実施形態において、ケラチンは、理髪店および美容院から入手した、毛先をカットした人毛から得られる。その材料を熱水および中性洗浄剤で洗浄し、乾燥させ、非極性有機溶媒（一般に、ヘキサンまたはエーテル）で抽出して、残留油を除去した後、使用する。
【００５２】
ケラトース：ケラトースフラクションは、任意の適する技法によって得られる。１つの実施形態において、それらは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒおよび同僚の方法（Ｐ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４６，２７−３２（１９５０））を用いて得られる。基本的には、室温で２４時間、１０パーセント未満の濃度の過酢酸の水溶液と毛を反応させる。その溶液を濾過し、約４のｐＨまで無機酸を添加することによって、アルファ−ケラトースフラクションを沈殿させる。そのアルファケラトースを濾過によって分離し、追加の酸で洗浄し、続いてアルコールで脱水し、その後、フリーズドライする。純度上昇は、ケラトースを変性溶液、例えば７Ｍの尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭのトリス塩基緩衝溶液（例えば、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基）に再び溶解し、再び沈殿させ、再び溶解し、脱イオン水に対して透析し、ｐＨ４で再び沈殿させることによって達成することができる。
【００５３】
ケラトースの好ましい製造方法は、過酸化水素、過酢酸または過ギ酸での酸化による方法である。最も好ましい酸化剤は、過酢酸である。好ましい濃度は、１から１０重量／容量パーセント（ｗ／ｖ％）の範囲であり、約２ｗ／ｖ％が最も好ましい。濃度へのわずかな修飾を行って酸化度を変化させることができ、同時に反応時間、温度および液体対固体比の変更を行うこともできることは、当業者にはわかる。過ギ酸は、過酢酸と比較して、ほとんどペプチド結合を切断しないという点で有利であることも、Ｃｒｅｗｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって論じられている。しかし、コストおよび入手可能性の点では、過酢酸が有利である。好ましい酸化温度は、０と１００摂氏度（℃）の間である。最も好ましい酸化温度は、３７℃である。好ましい酸化時間は、０．５時間と２４時間の間である。最も好ましい酸化時間は、１２時間である。好ましい液体対固体比は、５から１００：１である。最も好ましい比は、２０：１である。酸化後、大量の蒸留水を使用してその毛をすすいで、残留酸化剤をなくす。
【００５４】
変性剤の水溶液を使用して、ケラトースを酸化された毛から抽出することができる。タンパク質変性剤は、当該技術分野において周知であるが、好ましい溶液としては、尿素、遷移金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウムおよびカリウム）、水酸化アンモニウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基）が挙げられる。好ましい溶液は、０．０１から１Ｍの濃度範囲でのＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基（トリス塩基の商標）である。最も好ましい濃度は、０．１Ｍである。濃度へのわずかな修飾を行って抽出度を変化させることができ、同時に反応時間、温度および液体対固体比の変更を行うこともできることは、当業者にはわかる。好ましい抽出温度は、０摂氏度と１００摂氏度の間である。最も好ましい抽出温度は、３７℃である。好ましい抽出時間は、０．５時間と２４時間の間である。最も好ましい抽出時間は、３時間である。好ましい液体対固体比は、５から１００：１である。最も好ましい比は、４０：１である。トリス塩基または脱イオン（ＤＩ）水でのその後の抽出で、追加の収量を獲得することができる。抽出後、遠心分離および／または濾過によって溶液から残留固体を除去する。
【００５５】
その粗抽出物は、先ず、その溶液を７．０と７．４の間のｐＨに中和することによって、単離することができる。最も好ましいｐＨは、７．４である。残留変性剤は、ＤＩ水に対する透析によって除去する。透析保持液を濃縮し、続いて、凍結乾燥または噴霧乾燥させて、ガンマ−ケラトースとアルファ−ケラトース両方の乾燥粉末混合物を得る。あるいは、溶液のｐＨが約４．２に達するまで酸を１滴ずつ添加することによって抽出溶液からアルファ−ケラトースを単離する。好ましい酸としては、硫酸、塩酸および酢酸が挙げられる。最も好ましい酸は、濃塩酸である。ｐＨ６．０付近でそのアルファフラクションの沈殿が始まり、約４．２まで続く。分別沈殿法を用いて、異なる等電特性を有する異なる範囲のタンパク質を単離することができる。固体アルファ−ケラトースは、遠心分離または濾過によって回収することができる。
【００５６】
アルファケラトースは、それらの固体を変性溶液に再び溶解させることによって、さらに精製することができる。抽出に利用したものと同じ変性溶液を使用できるが、好ましい変性溶液は、トリス塩基である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加して、毛の中にある微量金属を錯化させ、除去することができる。好ましい変性溶液は、２０ｍＭのトリス塩基と２０ｍＭのＥＤＴＡ、またはＤＩ水と２０ｍＭのＥＤＴＡである。微量金属の存在が、対象とする用途に有害でない場合、ＥＤＴＡは、省いてもよい。約４．２の最終ｐＨまで塩酸を１滴ずつ添加することにより、この溶液からアルファ−ケラトースを再び沈殿させる。固体の単離は、遠心分離または濾過による。このプロセスを数回繰り返して、アルファ−ケラトースをさらに精製してもよい。
【００５７】
ガンマケラトースフラクションは、ｐＨ４で溶液中に残存し、これを、アルコールなどの水混和性有機溶媒への添加、続いての濾過によって単離し、追加のアルコールで脱水し、フリーズドライする。純度上昇は、ケラトースを変性溶液、例えば７Ｍの尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭのトリス緩衝溶液に再び溶解し、無機酸の添加によりそのｐＨを４に低下させ、形成される一切の固体を除去し、上清を中和し、アルコールでそのタンパク質を再び沈殿させ、再び溶解し、脱イオン水に対して透析し、アルコールへの添加により再び沈殿させることによって達成することができる。これらのステップで消費されるアルコールの量は、最初に蒸留によってケラトース溶液を濃縮することにより、最小限にすることができる。
【００５８】
アルファケラトースの除去後、一般的な抽出溶液からのガンマケラトースの濃度は、約１〜２％である。このガンマケラトースフラクションは、水混和性非溶媒への添加によって単離することができる。沈殿させるために、過剰な水を蒸発させることによってそのガンマケラトース溶液を濃縮してもよい。この溶液は、９０％の水を除去することにより、約１０〜２０％に濃縮することができる。これは、真空蒸留を用いて、または流下薄膜型蒸発によって、行うことができる。濃縮後、そのガンマケラトース溶液を、過剰な冷非溶媒に１滴ずつ添加する。適する非溶媒としては、エタノール、メタノール、アセトンなどが挙げられる。最も好ましい非溶媒は、エタノールである。最も好ましい方法は、ガンマケラトース溶液を約１０ｗ／ｖ％のタンパク質に濃縮し、それを８倍過剰な冷エタノールに１滴ずつ添加する方法である。沈殿したガンマケラトースは、遠心分離または濾過によって単離し、乾燥させることができる。適する乾燥方法としては、フリーズドライ（凍結乾燥）、空気乾燥、真空乾燥、または噴霧乾燥が挙げられる。最も好ましい方法は、フリーズドライである。
【００５９】
ケラテイン。ケラテインフラクションは、ＢｒａｄｂｕｒｙおよびＣｈａｐｍａｎの方法（Ｊ．Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１７，９６０−７２（１９６４））とＧｏｄｄａｒｄおよびＭｉｃｈａｅｌｉｓの方法（Ｄ．Ｇｏｄｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０６，６０５−１４（１９３４））を併用することによって得ることができる。実質的には、超音波を用いて毛髪繊維のキューティクルを除去して過度の加水分解を回避し、第二段階で、皮質のジスルフィド結合を効率的に還元することができる。その毛をジクロロ酢酸の溶液に入れ、超音波プローブでの処理に付す。この方法のさらなる改良により、８０％ジクロロ酢酸、１：１６の固体対液体比および１８０ワットの超音波出力を用いる条件が最適であることが示されている（Ｈ．Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，繊維学会誌（Ｓｅｎ’ｉ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ）３１（３），Ｔ８１−８５（１９７５））。固体フラクションを濾過によって溶液から除去し、すすぎ、空気乾燥させ、その後、篩にかけて、除去されたキューティクル細胞から毛髪繊維を分離する。
【００６０】
一部の実施形態において、キューティクルの超音波除去後、それらの表皮剥離繊維とメルカプトエタノールの反応によって、アルファ−およびガンマ−ケラテインが得られる。具体的には、低加水分解法を酸性ｐＨで用いる（Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１５，７５７−６８（１９６２））。典型的な反応では、０．０２Ｍの酢酸緩衝液および０．００１Ｍの界面活性剤を含有する脱酸素水中の水酸化カリウムの少量を添加することによってｐＨ５に調整した４Ｍのメルカプトエタノールで、２４時間、毛を抽出する。
【００６１】
その溶液を濾過し、約４のｐＨまで無機酸を添加することによってアルファ−ケラテインフラクションを沈殿させる。そのアルファ−ケラテインを濾過によって分離し、追加の酸で洗浄し、続いてアルコールで脱水し、その後、真空下で乾燥させる。純度上昇は、ケラテインを変性溶液、例えば７Ｍの尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭのトリス緩衝溶液に再び溶解し、再び沈殿させ、再び溶解し、脱イオン水に対して透析し、ｐＨ４で再び沈殿させることによって達成される。
【００６２】
ガンマケラテインフラクションは、ｐＨ４では溶液中に残存し、これを、アルコールなどの水混和性有機溶媒への添加、続いての濾過によって単離し、追加のアルコールで脱水し、真空下で乾燥させる。純度上昇は、ケラテインを変性溶液、例えば７Ｍの尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭのトリス緩衝溶液に再び溶解し、無機酸の添加によりそのｐＨを４に低下させ、形成される一切の固体を除去し、上清を中和し、アルコールでそのタンパク質を再び沈殿させ、再び溶解し、脱イオン水に対して透析し、アルコールへの添加により再び沈殿させることによって達成することができる。これらのステップで消費されるアルコールの量は、最初に蒸留によってケラテイン溶液を濃縮することにより、最小限にすることができる。
【００６３】
代替法では、チオグリコール酸ナトリウムの水溶液と毛を反応させることによって、ケラテインフラクションが得られる。
【００６４】
ケラテインの好ましい製造方法は、チオグリコール酸またはベータ−メルカプトエタノールでの毛の還元による方法である。最も好ましい還元剤は、チオグリコール酸（ＴＧＡ）である。好ましい濃度は、１から１０Ｍの範囲であり、約１．０Ｍが、最も好ましい。濃度へのわずかな修飾を行って還元度を変化させることができ、同時にｐＨ、反応時間、温度および液体対固体比の変更を行うこともできることは、当業者にはわかる。好ましいｐＨは、９と１１の間である。最も好ましいｐＨは、１０．２である。還元溶液のｐＨは、塩基の添加によって変えられる。好ましい塩基としては、遷移金属水酸化物、水酸化ナトリウム、および水酸化アンモニウムが挙げられる。最も好ましい塩基は、水酸化ナトリウムである。ｐＨ調整は、水中の水酸化ナトリウムの飽和溶液を還元剤溶液に１滴ずつ添加することによって行う。好ましい還元温度は、０℃と１００℃の間である。最も好ましい還元温度は、３７℃である。好ましい還元時間は、０．５時間と２４時間の間である。最も好ましい還元時間は、１２時間である。好ましい液体対固体比は、５から１００：１である。最も好ましい比は、２０：１である。前に説明した酸化反応とは異なり、還元は、塩基性ｐＨで行う。そうした訳で、ケラチンは、還元媒質に非常に溶けやすく、抽出されると予想される。従って、還元溶液は、後続の抽出溶液と併せられ、しかるべく加工される。
【００６５】
還元されたケラチンは、それらの酸化された対照物ほど親水性ではない。それ故、還元された毛髪繊維は、酸化された毛のように膨潤したり、裂けて開いたりせず、その結果、比較的低収率となる。還元／抽出プロセスの動態に影響を及ぼすもう１つの因子は、ケラテインの相対溶解度である。水への相対溶解度の格付けは、最大可溶性から最小可溶性へと、ガンマ−ケラトース＞アルファ−ケラトース＞ガンマ−ケラテイン＞アルファ−ケラテインである。従って、還元された毛髪繊維からの抽出収率は、さほど高くない。こうした訳で、後続の抽出は、追加の還元剤＋変性剤溶液を用いて行う。後続の抽出に好ましい溶液としては、ＴＧＡ＋尿素、ＴＧＡ＋トリス塩基、またはＴＧＡ＋水酸化ナトリウムが挙げられる。抽出後、ケラトースについて説明した手順を用いて、アルファ−およびガンマ−ケラテインの粗フラクションを単離することができる。しかし、ガンマ−およびアルファ−ケラテンの沈殿物は、酸素に暴露されるとそれらのシスチン架橋を再び形成する。従って、沈殿物を迅速に再溶解して、精製ステップ中の不溶を回避するか、酸素が不在の状態で沈殿させる。
【００６６】
残留還元剤および変性剤は、透析によって溶液から除去することができる。典型的な透析条件は、２４から７２時間、ＤＩ水に対して透析される、ケラテインの１から２％溶液である。透析に加えて、低分子量不純物の他の除去方法（例えば、マイクロフィルター法、クロマトグラフィーなど）が存在することは、当業者にはわかる。トリス塩基の使用は、ケラテインの最初の可溶化にしか必要でない。一旦、溶解したら、変性剤がなくとも、ケラテインは溶液中で安定している。従って、ｐＨが中性以上のままである限り、ケラテインの沈殿を生じさせることなく、変性剤を除去することができる。これらの精製溶液中のケラテインの最終濃度は、水の添加／除去によって調整することができる。
【００６７】
ケラチンの形態（すなわち、ケラトースまたはケラテイン）に関係なく、さらなる精製に向けての幾つかの異なるアプローチをケラチン溶液に対して用いることができる。しかし、ケラチンの独特な溶解特性にそれらを導く技法を選択するように注意しなければならない。最も簡単な分離法の１つは、等電沈殿法である。この方法では、溶液のｐＨを調整し、沈殿した材料を除去することによって、様々な等電点のタンパク質を単離することができる。ケラチンの場合、ガンマ形態とアルファ形態の両方が、ｐＨ＞６．０では可溶性である。しかし、ｐＨが６より下に低下すると、アルファ−ケラチンは沈殿し始める。所与のｐＨで沈殿を停止させ、その沈殿物を遠心分離および／または濾過により分離することによって、ケラチンフラクションを単離することができる。約４．２のｐＨで、実質的にすべてのアルファ−ケラチンは、沈殿していることだろう。これらの別個のフラクションを中性ｐＨの水に再び溶解し、透析し、濃縮し、凍結乾燥または噴霧乾燥によって粉末にすることができる。しかし、ケラテインフラクションは、架橋を回避するために、酸素不在下でまたは希薄溶液で保管しなければならない。
【００６８】
もう１つの一般的なケラチン分離方法は、クロマトグラフィーである。サイズ排除またはゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電収束法、ゲル電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィーをはじめとする幾つかのタイプのクロマトグラフィーを用いて、ケラチン溶液を分画することができる。これらの技法は、当該技術分野において周知であり、ならびに分子量、化学官能基、等電点、電荷または特異的抗体との相互作用によってタンパク質をはじめとする化合物を分離することができ、ならびに単独で、または高い分離度および結果として高い純度をもたらす任意の組み合わせで、用いることができる。
【００６９】
好ましい精製方法は、イオン交換（ＩＥｘ）クロマトグラフィーである。ＩＥｘクロマトグラフィーは、一般にはタンパク質および特にケラチンの両親媒性によるタンパク質分離に特に適する。溶液の出発ｐＨ、および保持する予定の所望フラクションに依存して、カチオン性またはアニオン性いずれかのＩＥｘ（それぞれ、ＣＩＥｘまたはＡＩＥｘ）技術を用いることができる。例えば、６以上のｐＨでは、ガンマ−ケラチンとアルファ−ケラチンの両方が、可溶性であり、それらの等電点より上である。それ故、それらはアニオン性であり、アニオン交換樹脂に結合させることができる。しかし、ケラチンの亜フラクションは、弱アニオン交換樹脂に結合せず、それどころか、そうした樹脂が充填されたカラムを通過することがわかった。ＡＩＥｘクロマトグラフィーに好ましい溶液は、精製水中、０重量／容量％と５重量／容量％の間の濃度の、前に説明したとおり単離された精製または分画ケラチンである。好ましい濃度は、０ｗ／ｖ％と４ｗ／ｖ％の間である。最も好ましい濃度は、約２ｗ／ｖ％である。ＡＩＥｘカラムへの結合を助長するために、前記溶液のイオン強度を最初は相当低く保つほうが好ましい。これは、ケラチンの精製水溶液をｐＨ６とｐＨ７の間に滴定するために最少の量の酸を使用することによって達成される。最も好ましいｐＨは6である。この溶液をＡＩＥｘカラム、例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂カラムに充填することができる。好ましいカラム樹脂は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂である。カラムを通過する溶液を回収し、前に説明したとおりさらに加工して、酸性ケラチン粉末のフラクションを単離することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、ケラチンを製造するためにＡＩＥｘカラムを使用することによってケラチンマトリックスの活性を強化し、これは、特に、細胞付着の促進に有用であり得る。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、アニオンカラムを通過するフラクション、すなわち、酸性ケラチンは、細胞付着を促進すると考えられる。
【００７１】
もう１つのフラクションは、容易に結合し、これは、当該技術分野において公知の塩析技術を用いてカラムから洗い出すことができる。好ましい溶離媒質は、塩化ナトリウム溶液である。好ましい塩化ナトリウム濃度は、０．１Ｍと２Ｍの間である。最も好ましい濃度は、２Ｍである。この溶液のｐＨは、６と１２の間であることが好ましい。最も好ましいｐＨは、１２である。溶離プロセス中、安定なｐＨを維持するために、緩衝塩を添加してもよい。好ましい緩衝塩は、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基である。その塩濃度およびｐＨへのわずかな修飾を行って、様々な特性を有するケラチンフラクションの溶離を行うことができることは、当業者にはわかる。異なるフラクションを生じさせるために、異なる塩濃度およびｐＨを順次使用すること、または塩および／もしくはｐＨ勾配を使用することも可能である。しかし、採用するアプローチに関係なく、カラム溶離液を回収し、前に説明したとおりさらに加工して、塩基性ケラチン粉末のフラクションを単離することができる。
【００７２】
ＣＩＥｘ技術を用いて、相補的手順を実行することもできる。すなわち、ケラチン溶液をカチオン交換樹脂、例えば、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（強カチオン性）またはＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（弱カチオン性）に添加し、塩基性フラクションを通過させて回収することができる。保持された酸ケラチンフラクションは、前に説明したとおり塩析によって単離することができる。
【００７３】
メタケラチン：メタケラチンは、ケラテインのアルファとガンマ、両方のフラクションから、実質的に同じ手順を用いて合成する。基本的には、ケラテインを変性溶液、例えば７Ｍの尿素、水酸化アンモニウム水溶液、または２０ｍＭのトリス緩衝溶液に溶解する。純粋な酸素でその溶液をバブリングして、システイン基の酸化カップリング反応を開始させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定される分子量の増加によって、その反応の進行をモニターする。分子量が二倍または三倍に達するまで、その反応溶液を酸素でバブリングし続ける。無機酸の添加により、変性溶液のｐＨを中性に調整して、タンパク質の加水分解を回避することができる。
【００７４】
ケラチン中間径フィラメント：Ｔｈｏｍａｓおよび同僚の方法（Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．８，２５８−６４（１９８６））を用いて、人毛繊維のＩＦを得る。実質的に、これは、ＩＦを適所に「接着する」（それによってＩＦを残す）役割を果すケラチンマトリックスを反応させて除去する、化学的エッチング法である。典型的な抽出プロセスでは、０．２ＭのＮａ２ＳＯ３、８Ｍの尿素中の０．１ＭのＮａ２Ｏ６Ｓ４、およびｐＨ９の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液を使用して、キューティクルの膨潤およびマトリクスタンパク質の亜硫酸分解を達成する。この抽出は、室温で２４時間、行われる。濃縮後、溶解したマトリックスケラチンおよびＩＦを、約６のｐＨまで酢酸亜鉛溶液を添加することによって、沈殿させる。その後、０．０５Ｍの四ホウ酸塩溶液に対して透析することによって、そのマトリックスケラチンからＩＦを分離する。その透析溶液を酢酸亜鉛で沈殿させ、ＩＦをクエン酸ナトリウムに再び溶解し、蒸留水に対して透析し、その後、そのサンプルをフリーズドライすることによって、純度上昇を達成する。
【００７５】
ケラチン調製についてのさらなる考察は、米国特許出願公開第２００６／００５１７３２号（Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ）において見出すことができる（前記公開出願は、本明細書に参照により組み込まれる）。
【００７６】
製剤：フリーズドライ（凍結乾燥）などの公知の技術に従って、上で説明したとおりのケラチン誘導体の乾燥粉末を作ることができる。一部の実施形態において、本発明の組成物は、可溶化された前記ケラチン誘導体を有する電解質溶液を含む組成物を製造するために、そうした乾燥粉末組成物形を水溶液と混合することによって、製造することができる。前記混合ステップは、任意の適する温度、一般には室温で行うことができ、ならびに任意の適する技法、例えば、攪拌（stirring）、振盪、かき混ぜ（agitation）などによって行うことができる。前記電解質溶液の塩および他の構成成分（例えば、ケラチン誘導体および水を除くすべての成分）は、乾燥粉末にすべて含まれている場合もあり、水性組成物の中にすべて含まれている場合もあり、または乾燥粉末と水性組成物とで分配されている場合もある。例えば、一部の実施形態において、前記電解質溶液の構成要素の少なくとも一部分は、乾燥粉末に含まれている。
【００７７】
上に記載したものなどのケラチン材料を含むマトリックスの形成は、当業者には明らかである、当分野において確立されてから久しい技術またはその変形に従って行うことができる。一部の実施形態において、ケラチン調製品は、使用前に乾燥および脱水させる。例えば、Ｌｕｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第２，４１３，９８３号、Ｓｃｈｏｌｌｋｉｐｆ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第２，２３６，９２１号、およびＡｎｋｅｒの米国特許第３，４６４，８２５号参照。好ましい実施形態において、マトリックス、すなわちヒドロゲル、は、凍結乾燥された材料を適する溶媒、例えば水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、で再び水和することによって形成する。例えばＣｏ６０源を使用するγ線（８００ｋｒａｄ）によって、そのゲルを滅菌することができる。他の適するケラチンマトリックス形成方法としては、米国特許第６，２７０，７９３号（Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）、同第６，２７４，１５５号（Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）、同第６，３１６，５９８号（Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）、同第６，４６１，６２８号（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）、同第６，５４４，５４８号（Ｓｉｌｌｅｒ−Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）および、同第７，０１，９８７号（Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ）において見出されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
一部の組成物実施形態において、ケラチン誘導体（特に、アルファおよび／またはガンマケラテインならびにアルファおよび／またはガンマケラトース）は、約１０から７０または８５または１００キロダルトンの平均分子量を有する。他のケラチン誘導体、特に、メタ−ケラチンは、例えば２００または３００キロダルトン以下の、より高い平均分子量を有することがある。一般に、ケラチン誘導体（この用語は、誘導体の組み合わせを包含する）は、約０．１、０．５または１重量パーセントから、３、４、５または１０重量パーセントまでの量で、組成物に含めることができる。組成物は、混合された場合、好ましくは、約１または１．５から、４、８、１０または２０センチポアズの粘度を有する。いずれの濃度での粘度も、アルファケラトースのガンマケラトースに対する比を変えることによって調節することができる。
【００７９】
ケラチン誘導体組成物または製剤は、増殖もしくは治癒を助長する、凝固を助長もしくは抑制する、または細胞もしくは組織付着を助長もしくは抑制するなどのために、１つ以上の活性成分、例えば１つ以上の増殖因子を（例えば、ケラチン誘導体（単数または複数）を含む組成物の０．００００００１から１または５重量パーセントの範囲の量で）場合によっては含有することがある。適する活性成分の例としては、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子、テストステロン、ガングリオシドＧＭ−１、カタラーゼ、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経細胞増殖因子ガレクチン−１、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，５０６，７２７号およびＨｏｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，８９０，５３１号参照。
【００８０】
ここで用いる場合、「増殖因子」は、組織の再生、増殖および生存を促進する分子を含む。本発明の一部の実施形態において使用する増殖因子は、ケラチン抽出物中に自然に見出されるものであってもよいし、またはケラチン抽出物に添加されるもしくはケラチンマトリックスを形成する添加剤の形態であってもよい。増殖因子の例としては、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。増殖因子の大きなファミリーを構成する、多くの構造的および進化的に関連したタンパク質があり、非常に多数の神経細胞増殖因子ファミリー、例えばニューロトロフィン（ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ３）がある。ニューロトロフィンは、特に神経組織の、増殖および生存を促進する分子の１ファミリーである。ニューロトロフィンの例としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊｒ．らの米国特許第５，８４３，９１４号、Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４８８，０９９号、Ｂａｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４３８，１２１号、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２３５，０４３号、およびＢｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，００５，０８１号参照。
【００８１】
例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）は、様々な組織の再生、増殖および生存を促進するために有効な量で、ケラチンマトリックス組成物に添加することができる。ＮＧＦは、０．１ｎｇ／ｍＬから１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で供給される。さらに好ましくは、ＮＧＦは、１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ、および最も好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で供給される。Ｕｒｓｏの米国特許第６，０６３，７５７号参照。
【００８２】
本開示ケラチン調製品と同様に調製および利用することができる天然ポリマーの他の例としては、当業者には明らかな必要な修飾を施した、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニン（例えば、Ｋａｔｓｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６９１，２０３号参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本組成物は、好ましくは、無菌であり、非発熱性である。本組成物は、予備成形し、軟質ポリマーバッグもしくはボトルまたはホイル容器などの適する容器内に無菌包装して提供することができ、あるいは使用直前に混合するために、１つの容器の中の滅菌乾燥粉末と別の容器の中の滅菌水溶液とのキットとして提供することができる。予備成形し、滅菌容器内に包装して提供するときの組成物は、ケラチン誘導体の実質的な（例えば、１０もしくは２０パーセントを超える）粘度喪失および／または実質的な沈殿（例えば、目視検査で検出可能な沈降）前に、室温で少なくとも４または６ヶ月（２または３年まで、またはそれ以上）の貯蔵寿命を好ましくは有する。
【００８４】
コーティングおよび生体用インプラント：上で述べたように、本発明は、基体とその基体上のケラチン誘導体とを含む移植可能な生体用器具を提供し、この場合のケラチン誘導体は、その基質への細胞および／または組織付着を減少させるために有効な量で存在する。一部の実施形態において、前記ケラチン誘導体は、塩基性アルファケラトース、塩基性アルファケラテインまたはそれらの組み合わせからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００８５】
ケラチンの化学的性質を利用して、ケラチン系コーティングの特性を最適化することができる。アルファおよびガンマケラトースは、不活性硫黄残基を有する。その酸化反応は、最終ステップであり、シスチン残基を２つの非反応性スルホン酸残基に転化させる。一方、ケラテインは、不安定な硫黄残基を有する。ケラテイン生成中、シスチンは、さらなる化学的修飾の源となり得るシステインへと転化される（スキーム１参照）。１つのそうした有用な反応は、硫黄−硫黄酸化カップリングである。この反応は、単にシステインを転化させてシスチンに戻し、タンパク質間の架橋を再形成する。これは、対象となるガンマまたはアルファフラクションの分子量を増加させるために有用な反応であり、そしてまた、それは、その材料のバルク特性を修飾する。分子量の増加は、材料の特性、例えば、粘度、乾燥フィルム強度、ゲル強度などに影響を及ぼす。そうした再形成ケラチンは、メタケラチンと呼ばれる。
【００８６】
メタケラチンは、ガンマもしくはアルファフラクションまたは両方の組み合わせから誘導することができる。ケラテインの酸化的再架橋は、過酢酸または過酸化水素などの酸化剤の添加による影響を受ける。好ましい酸化剤は、酸素である。この反応は、単に、ケラチン溶液を酸素でバブリングすることにより、またはそうでなければサンプルを空気に暴露することにより、遂行することができる。メタ−ケラチンの使用による分子量の最適化によって、製剤を、粘度、フィルム強度および弾性、繊維強度および加水分解の受けやすさをはじめとする様々な特性について、最適化することができる。空気中での架橋は、ほとんど異物を伴わない医用生体材料を生じさせることで生体適合性の改善に役立つ。
【００８７】
移植片、例えば人工血管、血管ステント、カテーテル、リード、ペースメーカー、電気除細動器、弁、ファスナーまたはポート、例えば心臓弁などをはじめとする（しかし、これらに限定されない）任意の適する基体（典型的には、ヒトまたは動物対象に移植または挿入することを目的とした器具）を、本明細書に記載するとおりのケラチン材料またはケラチン誘導体でコーティングまたは処理することができる。
【００８８】
前記基体は、有機ポリマー（安定なポリマーおよび生体分解性または生体侵食性ポリマーを含む）、天然材料（例えば、コラーゲン）、金属（例えば、白金、金、ステンレス鋼など）、無機材料、例えばケイ素、ガラスなど、およびこれらの複合材をはじめとする（しかし、それらに限定されない）、任意の適する材料から形成することができる。
【００８９】
前記基体のコーティングは、任意の適する手段、例えば、吹付コーティング、浸漬コーティングなどによって行うことができる。一部の実施形態において、そう所望される場合には、シランカップリング剤などで基体にケラチンをカップリングまたは共有結合カップリングさせるステップを行うことができる。その後、そのケラチン誘導体を別の材料でコーティングすることができ、および／または、他の材料、例えば１つ以上の追加の活性薬剤、安定剤、コーティング剤など、をケラチン誘導体と共に堆積させることができる。
【００９０】
本発明のもう１つの態様は、固体で生理学的に許容される基体（典型的には、有機ポリマーまたは天然材料から形成されたフィルムならびに織シート材料および不織シート材料をはじめとする（しかし、これらに限定されない）シート材料）とその基体上のケラチン誘導体とを含む、移植可能な付着防止用組織バリアである。一部の実施形態において、前記ケラチン誘導体は、塩基性アルファケラトース、塩基性アルファケラテイン、またはこれらの組み合わせからなるか、実質的になるか、又は含む。
【００９１】
本発明を、以下の非限定的実施例において、より詳細に説明する。
【実施例１】
【００９２】
（粗ケラトースサンプル）
ケラトースフラクションは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒおよび同僚の方法に基づく方法を用いて得た。しかし、実質的には、ペプチド結合の加水分解を最小にするようにその方法を修正した。簡単に言うと、地元の理髪店から収集した５０グラムの清浄な乾燥した毛髪を、室温で１２時間、２ｗ／ｖ％過酢酸（ＰＡＡ）の水溶液（１０００ｍＬ）と反応させた。５００マイクロメートルの篩を使用してその酸化された毛髪を回収し、大量のＤＩ水ですすぎ、過剰な水を除去した。１０００ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基を用いて、その酸化された毛髪繊維からケラトースを抽出した。３時間後、篩によって毛髪を分離し、塩酸（ＨＣｌ）を１滴ずつ添加することによってその液体を中和した。１０００ｍＬの０．１ＭのＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基および１０００ｍＬのＤＩ水をそれぞれ使用する後続の２回の抽出で、残っている毛髪から追加のケラトースを抽出した。各回、毛髪を篩で分離し、その液体をＨＣｌで中和した。３つすべての抽出物を併せ、遠心分離し、濾過によって一切の残留固形物を除去した。併せた抽出物を、１ＫＤａ公称低分子量カットオフ膜でのＤＩ水に対する接線流式透析によって精製した。その溶液を濃縮し、凍結乾燥させて、粗ケラトース粉末を製造した。
【実施例２】
【００９３】
（粗ケラテインサンプル）
ケラテインフラクションは、ＧｏｄｄａｒｄおよびＭｉｃｈａｅｌｉｓによって記載された方法の改良法を用いて得た。簡単に言うと、毛髪を、３７℃で２４時間、１ＭのＴＧＡの水溶液と反応させた。そのＴＧＡ溶液のｐＨは、飽和ＮａＯＨ溶液を１滴ずつ添加することにより、ｐＨ１０．２に調整しておいた。その抽出溶液を濾過して、還元された毛髪繊維を除去し、保持した。１０００ｍＬの１００ｍＭのＴＧＡでｐＨ１０．２で２４時間、１０００ｍＬの１０ｍＭのＴＧＡでｐＨ１０．２で２４時間、およびＤＩ水でｐＨ１０．２で２４時間、順次抽出することによって、繊維から追加のケラチンを抽出した。各抽出後、溶液を遠心分離し、濾過し、透析システムに添加した。最後に、すべての抽出物を併せ、１ＫＤａの公称低分子量カットオフ膜でＤＩ水に対して透析した。その溶液を濃縮し、ｐＨ７に滴定し、約５％の全タンパク質濃度で、４℃で保管した。あるいは、濃縮した溶液を凍結乾燥させ、窒素下で冷凍保存した。
【実施例３】
【００９４】
（イオン交換クロマトグラフィー）
分画直前に、ケラトースサンプルを超純水に再び溶解し、希ＨＣｌ溶液の添加によってｐＨ６に滴定した。ケラテインサンプルも、希ＨＣｌ溶液を注意深く添加することによってｐＨ６に滴定した。それらのサンプルを、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（弱アニオン性）またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（強アニオン性）交換樹脂（５０〜１００メッシュ；ウィスコンシン州、ミルウォーキーのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかが入っている２００ｍＬフラッシュクロマトグラフィーカラムに充填し、穏やかな圧力で負荷し、フロースルー（酸性ケラチン）を回収した。ｐＨ６の少量の１０ｍＭのＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基（約２００ｍＬ）を使用して、そのサンプルを完全に洗浄した。ｐＨ１２の１００ｍＭのトリス塩基＋２ｍＭのＮａＣｌでそのカラムから塩基性ケラチンを溶出させた。それぞれのサンプルを別々に中和し、１ＫＤａのＬＭＷＣＯでの接線流式透析を用いてＤＩ水に対して透析し、回転蒸発によって濃縮し、フリーズドライした。
【実施例４】
【００９５】
（粘度および赤血球凝集の評価）
前に説明したとおり、アルファ−ケラトースのサンプルを製造し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＩＥｘカラムで酸性および塩基性フラクションに分離し、ＰＢＳに溶解し、そのｐＨを７．４に調整した。これらの溶液を５重量パーセント濃度で調製し、それらのＲＢＣ凝集特性を、１：１比で混合することにより、新鮮なヒト全血で肉眼的に評価した。２０分後、サンプルを取り、光学顕微鏡によって評価した。イオン交換クロマトグラフィーは、凝集現象の分離に非常に有効であった（データは示さない）。塩基性アルファ−ケラトースには、血球との相互作用が実質的になく、一方、酸性アルファ−ケラトースは、過度の凝集を生じさせた。
【００９６】
酸性および塩基性アルファケラトース、未分画アルファ＋ガンマ−ケラテイン、未分画アルファ＋ガンマ−ケラトースおよびベータ−ケラトース（キューティクルから得たもの）のサンプルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、約４ｗ／ｖ％およびｐＨ７．４で調製した。サンプルを粘度および赤血球（ＲＢＣ）凝集について試験した。これらの結果を表１に示す。
【００９７】
【表１】
2009527274.tif 000003
【００９８】
上述したことは、本発明の実例となるものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明は、後続の特許請求の範囲によって定義され、本特許請求の範囲と等価のものは、本発明に包含される。
【国際調査報告】
2009527274.tif 000004