(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病に関連する遺伝子多型の発見に基づく。特に、本発明は、多型を含む核酸分子、このような核酸分子によってコードされる改変タンパク質、多型核酸分子および多型タンパク質を検出するための試薬、ならびに核酸分子およびタンパク質を用いる方法、ならびにこれらの検出のための試薬の使用方法に関する。特に、本発明は、ヒトゲノムにおける特定の一塩基多型（ＳＮＰ）、ならびにアルツハイマー病および関係する病理とのそれらの関連に関する。正常個体に対しての、アルツハイマー病患者集団における対立遺伝子頻度の違いに基づいて、本明細書において開示される天然に存在するＳＮＰは、診断試薬の設計および治療剤の開発のため、ならびに疾患関連性解析および連鎖解析のための標的として、使用され得る。
2009528023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を発症する危険性が変更された個体を同定する方法であって、該方法は、該個体の核酸において、１以上の一塩基多型（ＳＮＰ）の対立遺伝子の存在または非存在を検出する工程を包含し、該ＳＮＰは、配列番号１１〜１５および２０〜３１のヌクレオチド配列のいずれか１つから選択され、該対立遺伝子の存在または非存在が、該個体のアルツハイマー病を発症する危険性と相関する、方法。
【請求項２】
前記ＳＮＰが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなるヌクレオチド配列の群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記個体の前記核酸を検出試薬と接触させる工程、および、特定のＳＮＰ位置においてヌクレオチドが存在するかしないかを決定する工程を包含する、方法。
【請求項４】
前記核酸が、前記個体の血球から調製される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出試薬が、ポリヌクレオチドプローブである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブの３’末端が、前記核酸における前記ＳＮＰにハイブリダイズする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが、レポーター色素で標識される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子において一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法であって、該方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜５および１１〜３１のヌクレオチド配列のいずれか１つにおけるＳＮＰに特異的にハイブリダイズする試薬と、試験サンプルとを接触させる工程、ならびにハイブリダイズした二重鎖の形成を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、以下：対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、配列決定、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、サイズ分析、および一本鎖立体配座多型からなる群より選択されるプロセスにより検出が実施される、方法。
【請求項１０】
アルツハイマー病を発症する危険性が変更された個体を同定する方法であって、該方法は、該個体の核酸において、多型の存在または非存在を検出する工程を包含し、該多型は、配列番号１１〜１５および２０〜３１のヌクレオチド配列のいずれか１つにおけるＳＮＰとの連鎖不平衡の状態にあり、該多型の存在または非存在は、該個体のアルツハイマー病を発症する危険性と相関する、方法。
【請求項１１】
前記ＳＮＰが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなるヌクレオチド配列の群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＮＰ含有核酸分子によりコードされる改変タンパク質を検出するための試薬であって、該試薬は、別の核酸分子によりコードされるタンパク質と比較して、該改変タンパク質に選択的に結合し、該ＳＮＰ含有核酸分子は、配列番号１１〜１５および２０〜３１のヌクレオチド配列のいずれか１つにおけるＳＮＰを含む、試薬。
【請求項１３】
前記試薬が、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド、リガンド、または、低分子化合物である、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
前記試薬が、レポーター色素または画像化剤で標識される、請求項１３に記載の試薬。
【請求項１５】
請求項１２に記載の試薬と、緩衝液とを含む、キット。
【請求項１６】
配列番号１〜５および１１〜３１のヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される一塩基多型（ＳＮＰ）を含む増幅されたポリヌクレオチドまたはその相補体であって、該増幅されたポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチドと約１，０００ヌクレオチドとの間の長さである、増幅されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１〜５および１１〜３１のヌクレオチド配列のいずれか１つを含む、請求項１６に記載の増幅されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号１〜５および１１〜３１におけるヌクレオチド配列のいずれか１つにおける一塩基多型（ＳＮＰ）を含む核酸分子に特異的にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
８ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
対立遺伝子特異的なプローブである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
対立遺伝子特異的なプライマーである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
核酸において一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するためのキットであって、請求項１８に記載のポリヌクレオチドと、緩衝液と、酵素とを含む、キット。
【請求項２３】
配列番号６〜１０からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号６〜１０からなるアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２３に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
【請求項２６】
アルツハイマー病を治療的もしくは予防的に処置する際に有用な因子を同定するための方法であって、該方法は、候補因子に請求項２４に記載のポリペプチドを、該ポリペプチドと該候補因子との間で結合複合体を形成させるために適切な条件下で接触させる工程、ならびに該結合複合体の形成を検出する工程を包含し、ここで、該複合体の存在が、該因子を同定する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年１０月２６日に出願された、米国仮特許出願第６０／７３０，９１８号の利益を主張し、この仮出願の内容は、その全体が、本明細書により参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、アルツハイマー病の診断および治療の分野に属する。特に、本発明は、ヒトゲノムにおける特定の一塩基多型（ＳＮＰ）、ならびにアルツハイマー病および関係する病理とのそれらの関連に関する。正常個体に対しての、アルツハイマー病患者集団における対立遺伝子頻度の違いに基づいて、本明細書において開示される天然に存在するＳＮＰは、診断試薬の設計および治療剤の開発のため、ならびに疾患の関連性解析および連鎖解析のための標的として、使用され得る。特に、本発明のＳＮＰは、アルツハイマー病を発症する危険性が増加した状態または減少した状態にある個体を同定するため、および疾患の早期検出のため、アルツハイマー病の予防および／または処置のために臨床的に重要な情報を提供するため、ならびに治療剤をスクリーニングして選択するために有用である。本明細書において開示されるＳＮＰはまた、ヒト同定の用途のために有用である。これらの多型およびそれらのコードする産物の存在を検出するための方法、アッセイ、キットおよび試薬が提供される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（神経変性疾患）
多様な種類の中枢神経系障害（神経変性疾患）が加齢に関係している。神経変性疾患は、神経組織または神経細胞の漸次的および進行性の喪失により特徴付けられる。これらの疾患は、直接的または間接的に、世界中の数百万の人々を冒している。神経変性疾患に冒される個体の数は、人類の平均寿命の増加に伴って増加することが予想される。
【０００４】
このクラスの障害を代表する特定の疾患としては、加齢性痴呆（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ））；白質萎縮症（例えば、副腎脳白質萎縮症、異染性白質萎縮症、クラッベ病（球様細胞白質萎縮症）、キャナヴァン病、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病など））；その他（例えば、神経セロイドリポフチノーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリグ病）、半鎮トン病（ＨＤ）、歯状核赤核小脳萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脳卒中など）が挙げられる。
【０００５】
パーキンソン病は、５０歳を超える人口の１〜２％、そして、８０歳を超える人口の１０〜１５％を冒している。ハンチントン病およびＡＬＳは、各々、米国において約３０，０００人を苦しめている。脳卒中は、神経学的欠陥の主要な原因であり、５０万人の新しい脳卒中の犠牲者が、毎年、ある程度の永続的な神経学的損傷をもって生き延びている。
【０００６】
アルツハイマー病（以下の節により詳細に記載する）は、単独で、世界中の２０００万人の人々を冒している。アルツハイマー病は、工業化社会における第四の主要な死因であり、６５歳を超える人口の５〜１１％、そして、８５歳を超える人口の３０％を苦しめている。アルツハイマー病は、世界中の老齢人口が増え続けるにつれ、急速に主要な健康上の問題となりつつある。
【０００７】
（アルツハイマー病）
アルツハイマー病は、先進国における痴呆の最も重要かつ一般的な原因であり、痴呆の全症例の６０％以上の割合を占める。アルツハイマー病は、微かな到来の記憶喪失と、それに続く数年の経過を有するゆっくりと進行する痴呆とによって臨床上特徴付けられる、進行性の神経変性障害である。アルツハイマー病の脳の病理は、大脳皮質の肉眼的な広範性の萎縮と、心室系の続発的な拡大とによって特徴付けられる。顕微鏡では、Ａβアミロイドを含む神経炎性斑、神経細胞質における銀染色神経原線維変化、および、大脳血管の動脈壁におけるＡβアミロイドの蓄積が観察される。アルツハイマー病のはっきりとした診断は、検死時にのみなされ得、検死ではアミロイド斑の存在と神経原繊維変化とが確認される。
【０００８】
アルツハイマー病の頻度は、成人寿命の１０年毎に増加し、８５歳を超える人口では２０〜４０％に達する。より多くの人々が８０歳および９０歳まで生存するようになっているので、患者数は、この先２０年で３倍になると予想される。米国において４００万人を超える人々がアルツハイマー病を罹患しており、毎年８００，０００人の死がアルツハイマー病に関連している。米国におけるアルツハイマー病のコストは、医療ケア、介護人員および生産性の喪失で、年間８００億ドル〜１０００億ドルであると推定される。アルツハイマー病はまた、家族構成員および介護者に重い感情的犠牲を強いる：米国において、約２７０万人の人々が、アルツハイマー病患者を介護している。アルツハイマー病患者は、診断後７〜１０年生存し、そして、自宅または療養所のいずれかにおいて、看護下で平均５年間を過ごす。
【０００９】
今日のアルツハイマー病の高い有病率と、その予測される有病率が、老齢人口において増加するにもかかわらず、現在、痴呆の原因を決定し、アルツハイマー病と他の型の痴呆との間を適切に区別するのに利用可能な診断試験は存在しない。医師が疾患進行の早期においてアルツハイマー病を同定すること、または、この疾患を発症する危険性が高い個体を同定することを可能にする診断試験は、疾患進行の早い段階で介入する選択肢を提供する。疾患プロセスにおける早期の介入は、実際に、より遅い介入と比較して、疾患の発症または進行を遅延することにより、良好な処置結果をもたらしている。
【００１０】
アルツハイマー病は、罹患した個体の一親等の親類の間でアルツハイマー病に対する危険が増えていることによって実証されるように、遺伝的な要素を有すると推定される。今までのところ、早期発症型アルツハイマー病患者において、あまり一般的ではない劣性遺伝形式の痴呆をもたらす、３つの遺伝子が同定されている。これらの３つの遺伝子、β−アミロイド前駆体タンパク質（非特許文献１）およびプレセニリン１（非特許文献２）およびプレセニリン２（非特許文献３）における変異は、アミロイド斑における主要な成分である長鎖アミロイドβ（Ａβ４２）の生成の増加をもたらす。早期発症型アルツハイマー病は、アルツハイマー病症例の５％未満を構成するが、これらの遺伝子の同定は、実質的に、疾患進行の理解に寄与している。
【００１１】
この痴呆のなおより一般的な形態である晩期発症型アルツハイマー病（ＬＯＡＤ）は、非メンデル様式で遺伝し、そして、遺伝的な感受性要因と環境要因とが関与する。アルツハイマー病の早期の遺伝的研究は、ＡｐｏＥ遺伝子を含む第１９染色体における同じ領域に対する関連性と連鎖とを実証した（非特許文献４、非特許文献５）。ＡｐｏＥ遺伝子について、３つの共通する対立遺伝子ε２、ε３、ε４が同定された。ε４対立遺伝子の頻度は、対照群における１４％に対し、罹患した個体においては５０％に増加する（非特許文献６）。ＡｐｏＥ−ε４対立遺伝子とは、多くの研究において反復された強い関連性が存在するが、多くの研究者は、ＡｐｏＥ−ε４対立遺伝子を、アルツハイマー病の発症に必須でも十分でもないと考える。ＡｐｏＥは、主要な危険因子と考えられるが、ＡｐｏＥの試験は、独立した診断試験として使用するために十分な感度および特異性を提供せず、それゆえ、アルツハイマー病の予測のための診断マーカーとして推奨されない（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ／Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，１９９６）。
【００１２】
少なくとも２つの研究において二重にした、ＬＯＡＤ患者におけるゲノム−ワイド連鎖スクリーニングは、４つの染色体、第６染色体、第９染色体、第１０染色体および第１２染色体における領域を同定し（非特許文献７、非特許文献８により総説される）、これは、ＡｐｏＥに加えて、他の遺伝的な危険因子が存在するにちがいないことを意味する。例えば、第１０染色体における、Ａβ４２についての定量的な形質と、ＬＯＡＤについての感受性座との同時局在化は、座が、Ａβ４２ペプチドのレベルの増加によりＬＯＡＤの危険性に影響を与えることを示唆する（非特許文献９）。
【００１３】
推定ＬＯＡＤ感受性座の大半は、対立遺伝子の共有が増加した領域を調べることにより、罹患同胞対（ＡＰＳ）の連鎖研究により同定された。ＬＯＡＤについての遺伝子および変異を同定するために、連鎖研究よりも、中程度もしくは小さな効果の遺伝子を検出するのに比較的良好な検出力を有する、関連性解析を行うことが有益である。関連性解析は、関連のない症例を対照と比較し、そして、罹患した個体と罹患していない個体との間で対立遺伝子頻度の差を解析する。
【００１４】
明らかに、疾患の早期段階でのアルツハイマー病の検出を可能にする新規の診断マーカーに対するはっきりとした需要が存在する。遺伝子試験が利用可能であることはまた、個体がアルツハイマー病を発症する危険性を評価する非侵襲性の方法も提供する。さらに、疾患の発症を防止もしくは有意に遅延するため、または、発症後の疾患の進行を逆行もしくは減速させるための、アルツハイマー病のための新しくかつ改善された処置に対する緊急の需要が存在する。
【００１５】
（ＤＡＰＫ１：神経病理学との関連および薬物標的としての使用）
細胞死に関連するプロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１）は、プログラムされた細胞死のカスケードにおいてアポトーシスを促進する役割を果たす、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性のセリン／スレオニンキナーゼである。ＤＡＰＫ１は、第９染色体の９ｑ２２座に位置し、そして、キナーゼドメイン、Ｃａ２＋／カルモジュリン結合ドメイン、８回アンキリンリピート、２つの推定Ｐループコンセンサス部位、細胞骨格結合ドメインおよび細胞死ドメインを有する、構造的に珍しい１６０ｋＤのタンパク質をコードする。
【００１６】
ＤＡＰＫ１は、最初に、インターフェロン−γにより誘導される細胞死における関与について同定されたが、その後、他の刺激／傷害によって引き起こされるアポトーシス（神経細胞のアポトーシスを含む）における関与が見出された。多数の研究が、ＤＡＰＫ１は神経学的疾患に関連し得ることを強く示唆し、そして、特に、ＬＯＡＤに対する感受性に影響を及ぼす遺伝的因子の１つとしてＤＡＰＫ１に対する強い支持がある。証拠は以下のように要約され得る：（ｉ）ＤＡＰＫ１は、これまでに報告されてきたＡＤに関連する連鎖ピークの中心にある、（ｉｉ）ＤＡＰＫ１は、脳において高く発現され、そして、成人においては、主として海馬および皮質に制限される、（ｉｉｉ）ＤＡＰＫ１は、プログラムされた細胞死の経路においてアポトーシス促進性のメディエーターである、（ｉｖ）ＤＡＰＫ１におけるＳＮＰは、ＬＯＡＤに有意に関連する（以下に記載する）、および（ｖ）ＤＡＰＫ１は、そのＲＮＡレベルにおいて対立遺伝子の変化を示し、そして、ＬＯＡＤの危険性に関連するＳＮＰは、この対立遺伝子特異的な遺伝子発現を直接的または間接的に調節し得る。重要なことに、ＤＡＰＫ１は、その活性が神経細胞死と相関する酵素であるので、ＤＡＰＫ１の阻害は、薬物開発のための非常に魅力的な標的である。
【００１７】
ＤＡＰＫ１は、ＡＤに関連するいくつかの研究において示された連鎖ピークの中心にある（例えば、非特許文献１０；非特許文献１１）。
【００１８】
ＤＡＰＫ１は、小脳および肺において最も豊富に発現し、そして、胃、小腸、精巣などからの筋肉細胞または組織においては乏しいか、または、検出されない（非特許文献１２）。胎児ラットの脳において、ＤＡＰＫ１  ｍＲＮＡは、大脳皮質、小脳プルキンエ細胞および海馬において高いレベルで検出され；成体ラットの脳のいくつかの研究においては、ＤＡＰＫ１  ｍＲＮＡは、海馬に限定されるようであった（同上）。しかし、ラット脳の他の研究においては、ウェスタンブロット分析が、海馬、皮質および嗅球においてＤＡＰＫ１タンパク質を検出したが、小脳、菱脳または中脳においては検出しなかった（非特許文献１３）。この発現パターンは、ＡＤにとても関連している。なぜならば、海馬および皮質は、この疾患において最も重篤に影響を受ける領域であるからである。
【００１９】
ＤＡＰＫ１の活性または発現の増加は神経細胞死に関連しており、この酵素をＡＤおよび他の神経学的病理の処置における薬物開発のための魅力的な候補にしている。ＰＣ１２細胞（神経細胞死の研究のためのモデル細胞）を細胞透過性セラミドアナログであるＣ２−セラミドに暴露すると、アポトーシスにつながるＤＡＰＫ１活性の増加をもたらした（非特許文献１４；セラミドは、神経細胞を含む種々の細胞型の細胞周期停止およびアポトーシスの１つの調節因子として提案されている）。逆に、ＤＡＰＫ１を欠く神経細胞は、細胞培養においてアポトーシスによる傷害に対して感受性が低く（非特許文献１５）、そして、ノックアウト動物モデルにおける研究は、ＤＡＰＫ１活性の減少と神経保護との関連性を支持する（非特許文献１６）。ヒトにおける研究は、ＤＡＰＫ１の発現およびリン酸化が、正常な脳と比較したときに、てんかんの脳において有意に増加したことを示した（非特許文献１７）。さらに、ＤＡＰＫ１の低分子インヒビターは、低酸素性虚血から来る脳の損傷を減少することが示された（非特許文献１８）。
【００２０】
ＤＡＰＫ１における２つの多型およびハプロタイプは、ＬＯＡＤと有意に関連することが見出される（以下に結果を示す）。３つのマーカーは、ＤＡＰＫ１のみを含み、他の既知の遺伝子も予測された遺伝子も含まない、高いＬＤ（連鎖不平衡）の領域に位置し、したがって、ＬＯＡＤの遺伝学におけるＤＡＰＫ１についての役割を支持することに注意すべきである。
【００２１】
ＤＡＰＫ１の発現は、他の複雑な疾患における遺伝的な危険因子（カルパイン−１０と２型糖尿病など）について見られる現象である、対立遺伝子不平衡を示す（非特許文献１９）。対立遺伝子発現における差は、シス作用する要素によって制御され、そして、特定の遺伝子の調節領域内にＳＮＰを含み得る。本発明者らの研究は、２つのＤＡＰＫ１イントロン性のＬＯＡＤ関連ＳＮＰの遺伝子型が、特に、ＤＡＰＫ１対立遺伝子特異的な発現と有意に関連するが、これらは、単独のシス作用変異ではないようであることを示す。この関連性は、ＳＮＰが、他の同定されていない多型によるシス作用調節因子と相互作用して、ＤＡＰＫ１転写産物のレベルに影響を及ぼすことを示唆する。また、これらは、ＤＡＰＫ１の転写を支配する他の多型によるシス作用要素と高度に連鎖不平衡であることも可能である。それにもかかわらず、ＤＡＰＫ１対立遺伝子特異的な発現が、ＤＡＰＫ１タンパク質活性における変化を予測し、したがって、ニューロンのアポトーシスの可能性を予測するということを考慮すると、ＤＡＰＫ１改変体の対立遺伝子特異的な発現は、実際、疾患に関連する機能的な結果に対して、ＬＯＡＤとの遺伝的関連をリンクさせるもっともらしい機構を提供する。ＤＡＰＫ１の発現は、ニューロンのアポトーシスの間に誘導され得る（例えば、非特許文献１２を参照のこと）。このことは、異なる程度のアポトーシスを有する患者からのサンプルがアッセイされるときに、ＤＡＰＫ１の対立遺伝子特異的な発現の効果を遮蔽し得る可能性がある。実際、本発明者らは、種々の疾患重篤度の被験体にわたるＤＡＰＫ１転写産物レベルの広い分布を観察し、これはおそらく、アポトーシス中のＤＡＰＫ１の対立遺伝子特異的な効果および誘導を反映するものであった。それゆえ、正常な脳においては、ＤＡＰＫ１の対立遺伝子特異的な発現を観察する可能性が高い。
【００２２】
まとめると、脳細胞におけるＤＡＰＫ１の発現、ＤＡＰＫ１活性の神経細胞死との関連、および、ＤＡＰＫ１を欠失する神経細胞のアポトーシス傷害に対する相対的な免疫は全て、ＤＡＰＫ１の神経学的疾患との関連を支持する。その活性が神経細胞のアポトーシスに関与する酵素として、ＤＡＰＫ１は、ＡＤおよび他の神経変性疾患の処置のための薬物開発のための魅力的な候補である。本発明者らの研究において観察されたＤＡＰＫ１のＬＯＡＤとの遺伝的な関連は、特に、ＤＡＰＫ１をＡＤ感受性に対する潜在的な寄与因子として暗示する。
【００２３】
（ＳＮＰ）
全ての生体のゲノムは、それらの継続的な進化の過程で、自然発生性の突然変異を起こし、前駆遺伝子配列の改変形態を生じる（非特許文献２０）。改変形態は、前駆形態に対して、進化上の利益もしくは不利益を与え得るか、または中立的である。いくつかの例において、改変形態は、その種に進化上の利益を与え、最終的に、その種の多くかまたはほとんどのメンバーのＤＮＡに組み込まれ、効率的にその前駆形態になる。さらに、改変形態の効果は、環境に依存して、有益でもあり有害でもある。例えば、ヘテロ接合性の鎌形赤血球突然変異はマラリアに対する耐性を与えるが、ホモ接合性の鎌形赤血球突然変異は通常は致死性である。多くの場合、前駆形態および改変形態の両方が生き残り、種の集団内で共存する。遺伝子配列の複数の形態の共存は、ＳＮＰを含む遺伝的多型をもたらす。
【００２４】
ヒトのゲノムにおける全多型のおよそ９０％は、ＳＮＰである。ＳＮＰは、異なる対立遺伝子または代替的ヌクレオチドが集団内に存在するＤＮＡ中の一塩基の配置である。ＳＮＰ位置（本明細書において、交換可能に、ＳＮＰ、ＳＮＰ部位、ＳＮＰ座、ＳＮＰマーカー、またはマーカーと呼ばれる）には、通常、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団のメンバーの１／１００もしくは１／１０００未満で異なる配列）が先行するか、または対立遺伝子の高度に保存された配列が後に続く。個体は、各ＳＮＰ位置における対立遺伝子に関して、ホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。ＳＮＰは、いくつかの例において、「ｃＳＮＰ」と呼ばれ、そのＳＮＰを含むヌクレオチド配列がアミノ酸をコードする配列であることを表し得る。
【００２５】
ＳＮＰは、多型部位における一ヌクレオチドの他への置換から生じ得る。置換は、転移または塩基転換であり得る。転移は、一プリンヌクレオチドの、他のプリンヌクレオチドによる置換、または一ピリミジンの他のピリミジンによる置換である。塩基転換は、ピリミジンによるプリンの置換またはその逆である。ＳＮＰはまた、「ｉｎｄｅｌ」（非特許文献２１）と呼ばれる一塩基が挿入または欠失した改変体であり得る。
【００２６】
同義的コドン変化またはサイレント突然変異／ＳＮＰ（「ＳＮＰ」、「多型」、「突然変異」、「突然変異体」、「改変」、および「改変体」のような用語は、本明細書において、交換可能に使用される）は、遺伝暗号の縮重に起因する、アミノ酸の変化をもたらさないものである。一アミノ酸をコードするコドンを異なるアミノ酸をコードするコドンに変化させる置換（すなわち、非同義的コドン変化）は、ミスセンス変異と呼ばれる。ナンセンス変異は、非同義的コドン変化の１つの型を生じる。その中では、終止コドンが形成され、それによってポリペプチド鎖の早期終止および短縮型タンパク質を生じる。リードスルー突然変異（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、停止コドンの破壊を引き起こし、それよって延長されたポリペプチド産物をもたらす、別の型の非同義的コドン変化である。ＳＮＰは、二対立遺伝子性（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）、三対立遺伝子性（ｔｒｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）、または四対立遺伝子性（ｔｅｔｒａ−ａｌｌｅｌｉｃ）であり得るが、大部分のＳＮＰは、二対立遺伝子性であり、したがって、多くの場合、「二対立遺伝子マーカー」または「ジアレリック（ｄｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）マーカー」と呼ばれる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、ＳＮＰおよびＳＮＰ遺伝子型への言及は、個別のＳＮＰおよび／またはハプロタイプを含み、これらは、一般的に互いに遺伝するＳＮＰの群である。ハプロタイプは、個別のＳＮＰと比較して、疾患または他の表現型効果とより強い相関を有し得、したがって、いくつかの場合、診断精度の上昇を提供し得る（非特許文献２２）。
【００２８】
原因（Ｃａｕｓａｔｉｖｅ）ＳＮＰは、遺伝子発現または遺伝子産物の発現、構造、および／または機能における変化を生じるＳＮＰであり、したがって、最も可能性のある臨床表現型として予測される。このような分類の１つとしては、ポリペプチド産物をコードする遺伝子領域に含まれるＳＮＰ（すなわち、ｃＳＮＰ）が挙げられる。これらのＳＮＰは、ポリペプチド産物のアミノ酸配列の変化をもたらし得（すなわち、非同義的コドン変化）、そして欠損型または他の改変タンパク質の発現を生じる。さらに、ナンセンス変異の場合、ＳＮＰは、ポリペプチド産物の早期終結を生じ得る。このような変異体産物は、病的状態（例えば、遺伝病）を生じ得る。コード配列中のＳＮＰが遺伝病を引き起こす遺伝子の例としては、鎌形赤血球貧血および嚢胞性線維症が挙げられる。
【００２９】
原因ＳＮＰは、必ずしもコード領域に生じる必要はない；原因ＳＮＰは、例えば、最終的に核酸にコードされたタンパク質の発現、構造および／または活性に影響し得るあらゆる遺伝子領域に起こり得る。このような遺伝子領域としては、例えば、転写に関与する領域（例えば、転写因子結合ドメインにおけるＳＮＰ、プロモーター領域におけるＳＮＰ）、転写産物のプロセシングに関する部位に関与する領域（例えば、不完全なスプライシングを引き起こし得るイントロン−エキソン境界におけるＳＮＰ、または、ｍＲＮＡプロセシングシグナル配列（例えば、ポリアデニル化シグナル領域）におけるＳＮＰ）、が挙げられる。いくつかのＳＮＰは、原因ＳＮＰではないが、やはり疾患を引き起こす配列に密接に関連し、したがって、疾患を引き起こす配列に分けられる。この状況において、ＳＮＰの存在は、疾患の存在、疾患の素因、または疾患発症の危険性の増加と関連する。これらのＳＮＰはまた、原因ＳＮＰでなくとも、やはり診断、疾患の素因のスクリーニング、および他の用途に有用である。
【００３０】
ＳＮＰと特定の障害との関連性の研究は、目的の障害（例えば、アルツハイマー病）を有する個体由来の生物学的サンプル中のＳＮＰ対立遺伝子の存在または頻度の決定、およびその情報と、好ましくは同様の年齢および人種の対照（すなわち、障害を有さない個体；対照は、「健康」個体、「正常」個体ともいわれる）との比較に関係する。患者および対照の適切な選択は、ＳＮＰの関連性の研究の成功に重要である。したがって、十分特徴付けられた表現型を有する個体のプールが、非常に望ましい。
【００３１】
ＳＮＰは、疾患組織サンプルまたは疾患個体から得られた任意の生物サンプルにおいてスクリーニングされ得、対照サンプルと比較され得、特定の病的状態（例えば、アルツハイマー病に関連する病態）の発生の増加（または減少）について選択され得る。一旦統計学的に有意な関連が、一以上のＳＮＰと目的の病的状態（または他の表現型）との間に確立された場合、このＳＮＰ周辺の領域は、必要に応じて十分にスクリーニングされて、この病的状態または表現型に影響する原因遺伝子座または配列（例えば、原因となるＳＮＰ／突然変異、遺伝子、調節領域など）を同定し得る。関連性の研究は、一般的な集団内で行われ得、罹患家系中の関係する個体において行われる研究（連鎖研究）に限定されない。
【００３２】
臨床試験は、医薬品による処置に応答する患者が、多くの場合、異種性であることを示した。医薬品の設計および治療を改善することへの必要性が引き続いて存在する。これに関して、ＳＮＰは、特定の医薬品による治療に最も適した患者を同定するために使用され得る（これは、多くの場合、薬理ゲノム科学と称される）。同様に、ＳＮＰは、患者が毒性の副作用を発現する可能性の増加、または患者がその処置に応答しない可能性に起因して、特定の処置から患者を除外するために使用され得る。薬理ゲノム科学はまた、薬学的研究に使用されて、薬物の開発および選択のプロセスを支援し得る。（非特許文献２３；非特許文献２４；特許文献１，Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；および非特許文献２５）。
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ  ９７／４０４６２，Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
【非特許文献１】Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１、３４９：７０４−７０６
【非特許文献２】Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９５、３７５：７５４−７６０
【非特許文献３】Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６、２６９：９７３−９７７
【非特許文献４】Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔ．１９８７、４：９７−１０８
【非特許文献５】Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．１９９１、４８：１０３４−１０５０
【非特許文献６】Ｃｏｒｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３、２８１：９２１−９２３
【非特許文献７】ＭｙｅｒｓおよびＧｏａｔｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００１、１４：４３３−４４０
【非特許文献８】ＬｅｎｄｏｎおよびＣｒａｄｄｏｃｋ、ＴＩＮＳ  ２００１、２４：５５７−５５９
【非特許文献９】Ｅｒｔｅｋｉｎ−Ｔａｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００、２９０：２３０３−２３０４
【非特許文献１０】Ａ．Ｍｙｅｒｓら、「Ｆｕｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｓｔａｇｅ  ＩＩ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１１４、２３５−２４４［２００２］
【非特許文献１１】Ｄ．Ｂｌａｃｋｅｒら、「Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃｒｅｅｎ  ｏｆ  ４３７  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ」、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２、２３−３２［２００３］
【非特許文献１２】Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｒｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｍＲＮＡｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５８、６７４−６８３［１９９９］
【非特許文献１２】Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｍＲＮＡｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５８、６７４−６８３［１９９９］
【非特許文献１３】Ｊ．Ｈ．Ｔｉａｎら、「Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔａｘｉｎ−１Ａ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ［ＤＡＰ］Ｋｉｎａｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｉｔｓ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｎｃ１８」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８［２８］：２６２６５−２６２７４［２００３年７月１１日］
【非特許文献１４】Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏら、「ＤＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  Ｃ２−ｃｅｒａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：１３９−１４７［２００２］
【非特許文献１５】Ｄ．Ｐｅｌｌｅｄら、「Ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ［ＤＡＰ］Ｋｉｎａｓｅ  Ｐｌａｙｓ  ａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９５７−１９６１  ［２００２年１月１８日］
【非特許文献１６】Ｈ．Ｓｃｈｏｒｉら、「Ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６、５５７−５６４［２００２］
【非特許文献１７】Ｄ．Ｃ．Ｈｅｎｓｈａｌｌら、「Ｄｅａｔｈ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｌｏｂｅ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ」、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５：４８５−４９４［２００４］
【非特許文献１８】Ａ．Ｖ．Ｖｅｌｅｎｔｚａら、「Ａｎ  ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄａｚｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１３、３４６５−３４７０［２００３］
【非特許文献１９】Ｙ．Ｈｏｒｉｋａｗａら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃａｌｐａｉｎ−１０  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ」、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６、１６３−１７５［２０００］
【非特許文献２０】Ｇｕｓｅｌｌａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５，８３１−８５４［１９８６］
【非特許文献２１】Ｗｅｂｅｒら、「Ｈｕｍａｎ  ｄｉａｌｌｅｌｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７１［４］：８５４−６２［２００２年１０月］
【非特許文献２２】Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，４８９−４９３［２００１年７月２０日］
【非特許文献２３】Ｌｉｎｄｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，２５４［１９９７］
【非特許文献２４】Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，１２４９［１９９７］
【非特許文献２５】Ｓｃｈａｆｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，３［１９９８］
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＳＮＰ、このようなＳＮＰの固有の組み合わせ、ならびにアルツハイマー病および関連の神経病理に関連するＳＮＰのハプロタイプの同定に関する。本明細書において開示される多型は、診断用試薬の設計のための標的として、ならびにアルツハイマー病そして他の神経病理の処置および診断に使用するための治療剤の開発における薬物とすることが可能な標的（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔ）として、直接的に有用である。
【００３４】
アルツハイマー病に関連するＳＮＰの同定に基づいて、本発明はまた、これらの改変体を検出する方法、ならびにこの課題の遂行のために必要とされる検出試薬の設計および調製を提供する。本発明は、以下を具体的に提供する：アルツハイマー病に関与する遺伝子配列における新規のＳＮＰ、これらのＳＮＰを含む単離された核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含む）、このようなＳＮＰを含む核酸分子にコードされた改変タンパク質、このコードされた改変タンパク質に対する抗体、この新規のＳＮＰ情報を含む、コンピュータベースのデータ保存システム、試験サンプルにおいてこれらのＳＮＰを検出する方法、本明細書において開示された１以上のＳＮＰ部位における１以上の特定のヌクレオチド（対立遺伝子）の存在もしくは非存在、または、１以上のコードされる改変産物（例えば、改変ｍＲＮＡ転写産物または改変タンパク質）の検出に基づいて、アルツハイマー病を発症する危険性が変化（すなわち、増加または減少）した個体を同定する方法、処置に応答する可能性がより高いかまたはより低い（または、処置から望ましくない副作用を経験する可能性がより高いかもしくはより低い、など）個体を同定する方法、改変型遺伝子／タンパク質に関連する障害の処置に有用な化合物をスクリーニングする方法、これらの方法によって同定される化合物、改変型遺伝子／タンパク質によって媒介される障害を処置する方法、ヒトの同定のために本発明の新規ＳＮＰを用いる方法など。
【００３５】
表１〜２において、本発明は、本発明のＳＮＰを含む、遺伝子情報、転写産物配列（配列番号１〜５）、コードされたアミノ酸配列（配列番号６〜１０）、ゲノム配列（配列番号１６〜１９）、転写産物に基づいたコンテキスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）配列（配列番号１１〜１５）およびゲノムに基づいたコンテキスト配列（配列番号２０〜３１）を提供し、そして大規模ＳＮＰ情報（観察された対立遺伝子、対立遺伝子頻度、対立遺伝子が観察された集団／民族集団、ＳＮＰの型および対応する機能的効果についての情報、ならびに、ｃＳＮＰに関して、コードされたポリペプチド産物についての情報を含む）を提供する。転写産物配列（配列番号１〜５）、アミノ酸配列（配列番号６〜１０）、ゲノム配列（配列番号１６〜１９）、転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列（配列番号１１〜１５）、およびゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列（配列番号２０〜３１）もまた、配列表に提供される。
【００３６】
本発明の特定の実施形態において、ヒトゲノムにおいて天然に存在するＳＮＰは、単離された核酸分子として提供される。個別またはハプロタイプのいずれかにおいて、これらのＳＮＰは、アルツハイマー病に関連し、したがってアルツハイマー病および関連する病理の診断および／または処置における種々の用途を有し得る。本発明の一局面は、少なくとも１つのヌクレオチドが、表３および／または表４に開示されたＳＮＰであるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子に関する。代替の実施形態において、本発明の核酸は、増幅されたポリヌクレオチドであり、これは、ＳＮＰを含む核酸テンプレートの増幅によって生成される。別の実施形態において、本発明は、本明細書において開示されたＳＮＰを含む核酸分子によってコードされた、改変タンパク質を提供する。
【００３７】
本発明のなお別の実施形態において、ＳＮＰを、その天然に存在する隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチド配列（これは例えば、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡのいずれかであり得る）と関連させて検出する試薬が提供される。特に、このような試薬は、例えば、目的とするＳＮＰの特異的検出に有用なハイブリダイゼーションプローブまたは増幅用プライマーの形態であり得る。代替の実施形態において、タンパク質検出試薬は、本明細書において開示されるＳＮＰを含む核酸分子によってコードされる改変タンパク質を検出するために使用され得る。タンパク質検出試薬の好ましい実施形態は、抗体または抗原応答性抗体フラグメントである。
【００３８】
本発明の種々の実施形態はまた、ＳＮＰ検出試薬を含むキット、および検出試薬を用いることにより本明細書で開示されるＳＮＰを検出するための方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書において開示される１以上のＳＮＰ対立遺伝子の存在または非存在を検出することによって、アルツハイマー病を発症する危険性の増加または減少を有する個体を同定する方法を提供する。別の実施形態においては、本明細書において開示される１以上のＳＮＰ対立遺伝子の存在または非存在を検出することによってアルツハイマー病を診断する方法が、提供される。
【００３９】
本発明の核酸分子は、発現ベクター（例えば、宿主細胞において改変タンパク質を産生するためのもの）に挿入され得る。したがって、本発明はまた、ＳＮＰを含む核酸分子を含むベクター、このベクターを含む遺伝的に操作された宿主細胞、およびこのような宿主細胞を用いて組み換え改変タンパク質を発現させる方法を提供する。
【００４０】
別の特定の実施形態において、宿主細胞、ＳＮＰを含む核酸分子、および／または改変タンパク質は、アルツハイマー病および他の神経病理の処置に有用な治療剤または薬学的化合物をスクリーニングおよび同定するための方法において、標的として使用され得る。
【００４１】
本発明の一局面は、ヒト被験体においてアルツハイマー病を処置するための方法である。ここで、このヒト被験体は、表１〜２に同定されたＳＮＰ、遺伝子、転写産物、および／またはコードされたタンパク質を有する。本方法は、このヒト被験体に、疾患の影響を相殺する（例えば、この表１〜２に同定された遺伝子、転写産物、および／またはコードされたタンパク質の活性を阻害（または刺激）することによって相殺する）治療的有効量または予防的有効量の１種以上の薬物を投与する工程を包含する。
【００４２】
本発明の別の局面は、ヒト被験体においてアルツハイマー病を治療的または予防的に処置するのに有用な因子を同定するための方法である。ここで、このヒト被験体は、表１〜２に同定されたＳＮＰ、遺伝子、転写産物、および／またはコードされたタンパク質を有する。本方法は、遺伝子、転写産物、またはコードされたタンパク質と候補因子との間の結合複合体の形成を可能にするのに適切な条件下で、この遺伝子、転写産物、および／またはコードされたタンパク質とこの候補因子とを接触させる工程、およびこの結合複合体の形成を検出する工程を包含する。ここで、この複合体の存在は、前述の因子の存在を同定する。
【００４３】
本発明の別の局面は、ヒト被験体においてアルツハイマー病を処置するための方法であって、この本方法は、以下を包含する：
（ｉ）このヒト被験体が、表１〜２で同定されたＳＮＰ、ＳＮＰハプロタイプ、遺伝子、転写産物、および／またはコードされたタンパク質を有することを決定する工程、および
（ｉｉ）この被験体に、この疾患の影響を相殺する、治療的有効量または予防的有効量の１種以上の因子を投与する工程。
【００４４】
本発明の多くの他の用途および利点は、本明細書における好ましい実施形態の詳細な説明を概説することによって、当業者に明らかとなる。考察の明確さのためにのみ、本発明は、非限定的な実施例によって以下の節に記載される。
【００４５】
（ＣＤ０００００３ＯＲＤ  ＣＤＲ  ＤＵＰＬＩＣＡＴＥ  ＣＯＰＹ  １およびＤＵＰＬＩＣＡＴＥ  ＣＯＰＹ  ２と名付けられたＣＤ−Ｒに含まれるファイルの説明）
各Ｒは、以下のテキスト（ＡＳＣＩＩ）ファイルを含む：
１）ファイルＳＥＱＬＩＳＴ＿０００００３ＯＲＤ．ＴＸＴは、配列表を提供する。この配列表は、一以上の本発明のＳＮＰを含む各アルツハイマー病関連遺伝子に関して、表１に示される転写産物配列（配列番号１〜５）およびタンパク質配列（配列番号６〜１０）を、そして表２に示されるゲノム配列（配列番号１６〜１９）を提供する。各ＳＮＰに隣接するコンテキスト配列もまた、配列表に提供され、これらは、表１に示される転写産物に基づいたコンテキスト配列（配列番号１１〜１５）および表２に示されるゲノムに基づいたコンテキスト配列（配列番号２０〜３１）の両方を含む。コンテキスト配列は、一般的に、各ＳＮＰの１００ｂｐ上流（５’）および１００ｂｐ下流（３’）を提供し、各ＳＮＰの周囲の全体で２００ｂｐのコンテキスト配列について、このコンテキスト配列の中央にＳＮＰを有する。
【００４６】
ファイルＳＥＱＬＩＳＴ＿ＣＤ０００００３ＯＲＤ．ＴＸＴは、サイズ９６ＫＢであり、２００６年１０月２０日に作製された。配列表のコンピュータにより読み取り可能な形式もまた、ＣＲＦとラベルされた別のＣＤＲ中に、本明細書において提出される。このＣＲＦ  ＣＤＲに記録される情報は、ＣＤＲ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  Ｃｏｐｙ  １およびＤｕｐｌｉｃａｔｅ  Ｃｏｐｙ  ２に提供される配列表と同一である。
【００４７】
ＣＲＦとラベルされたＣＤ−Ｒに含まれる資料は、本明細書によって、米国特許法施行規則１．７７（ｂ）（４）に従って、参考として援用される。
【００４８】
（表１および表２の説明）
表１および表２（どちらもＣＤ−Ｒで提供される）は、本発明のＳＮＰおよび関連する遺伝子／転写産物／タンパク質情報を開示する。各遺伝子について、表１および表２の各々は、遺伝子／転写産物／タンパク質情報を含むヘッダーを提供し、このヘッダーの後に、転写産物配列およびタンパク質配列（表１）またはゲノム配列（表２）、ならびにその遺伝子／転写産物に見出される各ＳＮＰに関するＳＮＰ情報が続く。
【００４９】
注意：ＳＮＰは、表１および表２の両方に含まれ得る；表１は、それらの転写産物配列およびコードされるタンパク質配列に関するＳＮＰを示し、一方表２は、それらのゲノム配列に関するＳＮＰを示す（いくつかの例では、表２はまた、最後の遺伝子配列の後に、一以上の遺伝子間領域のゲノム配列、ならびにそれらの遺伝子間領域内に位置する任意のＳＮＰについてのＳＮＰコンテキスト配列および他のＳＮＰ情報を含み得る）。ＳＮＰは、それらのｈＣＶ（または、いくつかの例では、ｈＤＶ）識別番号に基づいて、表の間で容易に相互参照可能である。
【００５０】
遺伝子／転写産物／タンパク質情報は、以下を含む：
−遺伝子番号（１〜ｎ、ここでｎ＝表中の遺伝子の総数）；
−遺伝子についてのＣｅｌｅｒａ  ｈＣＧおよびＵＩＤ内部識別番号；
−転写産物についてのＣｅｌｅｒａ  ｈＣＴおよびＵＩＤ内部識別番号（表１のみ）；
−転写産物についての公開Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号（例えば、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ番号）（表１のみ）；
−ｈＣＴ転写産物によりコードされるタンパク質についてのＣｅｌｅｒａ  ｈＣＰおよびＵＩＤ内部識別番号（表１のみ）；
−タンパク質についての公開Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号（例えば、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ番号）（表１のみ）；
−当該分野で公知の遺伝子記号；
−当該分野で公知の遺伝子／タンパク質名；
−Ｃｅｌｅｒａゲノム軸位置（開始ヌクレオチド位置〜終止ヌクレオチド位置を示す）；
−遺伝子が位置する染色体の染色体番号；
−各遺伝子の医学的重要性に関するさらなる情報を得るための、ＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ；Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学／ＮＣＢＩ）公開参照番号；
−ＯＭＩＭエントリにおける代替の遺伝子／タンパク質名および／または記号。
【００５１】
注意：代替的スプライス形態の存在に起因して、表１における単一の遺伝子エントリに対して複数の転写産物／タンパク質エントリが提供され得る；すなわち、単一の遺伝子番号に対して、複数のエントリが、それらの転写産物／タンパク質情報および転写産物／タンパク質配列が異なるシリーズで、提供され得る。
【００５２】
以下の遺伝子／転写産物／タンパク質情報は、以下のような各遺伝子に対する転写産物の配列およびタンパク質配列（表１）またはゲノム配列（表２）である：
−ＩＵＢコードによって同定されたＳＮＰを有する転写産物の配列（表１のみ）（配列表の配列番号１〜５に相当する）（転写産物の配列は、５’ＵＴＲ領域、タンパク質コード領域、および３’ＵＴＲ領域を含み得る）。
【００５３】
以下に留意すること：ｈＣＴ転写産物のヌクレオチド配列とＧｅｎｅｂａｎｋ登録番号により同定される対応する公開された転写産物の配列との間の相違が存在する場合、公開配列がＮＭ番号により同定されるＲｅｆＳｅｑ転写産物配列でない限り、ｈＣＴ転写産物の配列（およびコードされたタンパク質）が提供され、公開配列がＮＭ番号により同定されるＲｅｆＳｅｑ転写産物配列である場合、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ転写産物配列（およびコードされるタンパク質）が提供される。しかし、このｈＣＴ転写産物またはこのＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ転写産物が転写産物の配列として使用される場合、開示されるＳＮＰは、この転写産物内のＩＵＢコードによって表される。
【００５４】
−コードされるタンパク質配列（表１のみ）（配列表の配列番号６〜１０に相当する）。
【００５５】
−遺伝子のゲノム配列（表２のみ）、遺伝子の境界の両端の６ｋｂ（すなわち、遺伝子の５’側の６ｋｂ＋遺伝子の３’側の６ｋｂ）を含む（配列表の配列番号１６〜１９に相当する）。
【００５６】
最後の遺伝子配列の後、表２は、遺伝子間の領域の追加のゲノム配列（そのような場合、これらの配列は、「遺伝子間領域」により同定され、数値の識別番号を与えられる）ならびにＳＮＰコンテキスト配列および各遺伝子間領域内に存在する任意のＳＮＰ（そして、このようなＳＮＰは、ＳＮＰ型に関して「ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣ」として同定される）についての他のＳＮＰ情報を含み得る。
【００５７】
以下に留意すること：転写産物、タンパク質および転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、表１および配列表の両方に提供される。ゲノムおよびゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、表２および配列表の両方に提供される。各転写産物配列に対する配列番号（配列番号１〜５）、タンパク質配列に対する配列番号（配列番号６〜１０）および転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列に対する配列番号（配列番号１１〜１５）は、表１に示され、各ゲノム配列に対する配列番号（配列番号１６〜１９）およびゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列に対する配列番号（配列番号２０〜３１）は、表２に示される。
【００５８】
ＳＮＰ情報は、以下を含む：
−コンテキスト配列（表１の転写産物配列から選択され、そして、表２のゲノム配列から選択される）は、そのＩＵＢコードによって表されるＳＮＰを有し、ＳＮＰ位置の上流（５’）に１００ｂｐ＋ＳＮＰ位置の下流（３’）に１００ｂｐを含む（表１の転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列表中に配列番号１１〜１５として提供され、表２のゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列表中に配列番号２０〜３１として提供される）；
−ＳＮＰに対するＣｅｌｅｒａ  ｈＣＶ内部識別番号（いくつかの場合、「ｈＤＶ」番号が、「ｈＣＶ」番号の代わりに示される）；
−ＳＮＰの位置（所定の転写産物配列内のＳＮＰの位置［表１］または所定のゲノム配列内のＳＮＰの位置［表２］）；
−ＳＮＰの供給源（これは、内部配列決定プロジェクトおよび／または公開データベースに依存する以下の５個のコードの１つ以上の任意の組合せを含み得、ＳＮＰは、以下に見出されている：「Ａｐｐｌｅｒａ」＝３９の個体の遺伝子および調節領域の再配列決定の間に見出されたＳＮＰ、「Ｃｅｌｅｒａ」＝ショットガン配列決定およびＣｅｌｅｒａヒトゲノム配列のアセンブリの間に見出されたＳＮＰ、「Ｃｅｌｅｒａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」＝アルツハイマー病または関連する病理を有する個体由来の核酸サンプルの再配列決定の間に見出されたＳＮＰ、「ｄｂＳＮＰ」＝ｄｂＳＮＰ公開データベースに見出されたＳＮＰ、「ＨＧＢＡＳＥ」＝ＨＧＢＡＳＥ公開データベースに見出されたＳＮＰ、「ＨＧＭＤ」＝Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ［ＨＧＭＤ」公開データベースに見出されたＳＮＰ、「ＨａｐＭａｐ」＝国際ＨａｐＭａｐプロジェクトの公開データベースに見出されたＳＮＰ、「ＣＳＮＰ」＝ＳＮＰコード領域［ｃＳＮＰ］のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ［Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ］の内部データベースに見出されたＳＮＰ；
以下に留意すること：複数の「Ａｐｐｌｅｒａ」供給源の単一ＳＮＰへのエントリは、同一のＳＮＰが、複数の重複する増幅産物によって網羅されたこと、およびこれらの増幅産物のそれぞれの再配列決定結果（例えば、観察された対立遺伝子の数）が提供されることを示唆する。
【００５９】
−［集団１（第１対立遺伝子，数｜第２対立遺伝子，数）集団２（第１対立遺伝子，数｜第２対立遺伝子，数）総数（第１対立遺伝子，総数｜第２対立遺伝子，総数）］の形式における母集団／対立遺伝子／対立遺伝子数の情報。この欄における情報は、集団／特定のＳＮＰ対立遺伝子が観察された人種群（「ｃａｕ」＝白色人種、「ｈｉｓ」＝ラテン系アメリカ人、「ｃｈｎ」＝中国人、および「ａｆｒ」＝アフリカ系アメリカ人、「ｊｐｎ」＝日本人、「ｉｎｄ」＝インド人、「ｍｅｘ」＝メキシコ人、「ａｉｎ」＝アメリカインディアン、「ｃｒａ」＝Ｃｅｌｅｒａドナー、「ｎｏ＿ｐｏｐ」＝母集団の情報が利用可能ではない）、同定されたＳＮＰ対立遺伝子、および観察された対立遺伝子数（各母集団群内および対立遺伝子の総数）を含む、ここで以下が適用される；利用可能な［対立遺伝子の欄における「−」は、挿入／欠失（「ｉｎｄｅｌ」）多型の欠失対立遺伝子を表し、（この場合対応する挿入対立遺伝子は、１つ以上のヌクレオチドから構成され得るが、「｜」の反対側の対立遺伝子の欄に示される）；数の欄における「−」は、対立遺伝子数情報が利用可能ではないことを示す］。公開されたｄｂＳＮＰデータベースからの特定のＳＮＰについて、母集団／人種の情報は、以下のとおりに示される（この母集団情報は、ｄｂＳＮＰにおいて公的に利用可能である）：「ＨＩＳＰ１」＝署名した（ｓｅｌｆ−ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ）ラテンアメリカ系継承者（ｈｅｒｉｔａｇｅ）の２３人の個体に由来するヒト個体ＤＮＡ（匿名化されたサンプル）；「ＰＡＣ１」＝署名した環太平洋地域の人種の継承者の２４人の個体に由来するヒト個体ＤＮＡ（匿名化されたサンプル）；「ＣＡＵＣ１」＝署名した白色人種継承者の３１人の個体に由来するヒト個体ＤＮＡ（匿名化されたサンプル）；「ＡＦＲ１」＝署名したアフリカ人／アフリカ系アメリカ人継承者の２４人の個体に由来するヒト個体ＤＮＡ（匿名化されたサンプル）；「Ｐ１」＝署名した継承者の１０２人の個体に由来するヒト個体ＤＮＡ（匿名化されたサンプル）；「ＰＡ１３０２９９５１５」；「ＳＣ＿１２＿Ａ」＝Ｃｏｒｉｅｌｌｅ細胞寄託物に由来するアジア人起源の１２のＳＡＮＧＥＲ  ＤＮＡ、うち６人が男性で、６人が女性；「ＳＣ＿１２＿Ｃ」＝ＣＥＰＨ／ＵＴＡＨライブラリーからのＣｏｒｉｅｌｌｅ細胞寄託物に由来する白色人種起源の１２のＳＡＮＧＥＲ  ＤＮＡ。うち６人が男性で、６人が女性；「ＳＣ＿１２＿ＡＡ」＝Ｃｏｒｉｅｌｌｅ細胞寄託物に由来するアフリカ系アメリカ人起源の１２のＳＡＮＧＥＲ  ＤＮＡ、うち６人が男性で、６人が女性；「ＳＣ＿９５＿Ｃ」＝ＣＥＰＨ／ＵＴＡＨライブラリーからのＣｏｒｉｅｌｌｅ細胞寄託物に由来する白色人種起源の９５のＳＡＮＧＥＲ  ＤＮＡ；「ＳＣ＿１２＿ＣＡ」＝Ｃｏｒｉｅｌｌｅ細胞寄託物に由来する白色人種の１２のＤＮＡ、うち６人が男性で、６人が女性；
以下に留意すること：「Ａｐｐｌｅｒａ」ＳＮＰ供給源のＳＮＰに関しては、３９人の個体（２０人の白色人種および１９人のアフリカ系アメリカ人）の遺伝子／調節領域を再配列決定し、そして、各ＳＮＰの位置は、各個体の二本の染色体によって表される（男性のＸ染色体およびＹ染色体上のＳＮＰを除く、これらについては、各ＳＮＰ位置は、一本の染色体によって表される）ので、７８本以下の染色体を、各ＳＮＰ位置に関して遺伝子型決定した。従って、アフリカ系アメリカ人（「ａｆｒ」）の対立遺伝子の数の合計は、３８以下であり、白色人種の対立遺伝子の数の合計（「ｃａｕ」）は、４０以下であり、そして、全ての対立遺伝子の数の合計は、７８以下である。
【００６０】
以下に留意すること：セミコロンは、それぞれの示されたＳＮＰ供給源に対応する母集団／対立遺伝子／数情報を隔てる；すなわち、四つのＳＮＰ供給源（例えば、「Ｃｅｌｅｒａ」、「ｄｂＳＮＰ」、「ＨＧＢＡＳＥ」および「ＨＧＭＤ」）が示される場合、母集団／対立遺伝子／数情報は、セミコロンによって隔てられる４つの群において提供され、ＳＮＰ供給源の一覧と同じ順序で列挙され、各母集団／対立遺伝子／数情報群は、順序に基づくそれぞれのＳＮＰ供給源に対応する；従って、この例において、最初の母集団／対立遺伝子／数情報群は、最初に列挙したＳＮＰ供給源（Ｃｅｌｅｒａ）に対応し、セミコロンによって隔てられた三番目の母集団／対立遺伝子／数情報群は、三番目に列挙したＳＮＰ供給源（ＨＧＢＡＳＥ）に対応する；任意の特定のＳＮＰ供給源に対する母集団／対立遺伝子／数情報が利用可能ではない場合、一対のセミコロンがなお、ＳＮＰ供給源のリストと母集団／対立遺伝子／数情報の対応するリストとの間の対応を維持するために、プレースホルダー（ｐｌａｃｅ−ｈｏｌｄｅｒ）として挿入される。
【００６１】
−ＳＮＰ型（例えば、遺伝子／転写産物における位置および／または予測される機能効果）［「ミスセンス変異（ＭＩＳ−ＳＥＮＳＥ  ＭＵＴＡＴＩＯＮ）」＝ＳＮＰは、コードされたアミノ酸に変化を引き起こす［すなわち、コードＳＮＰと同義語ではない］；「サイレント変異（ＳＩＬＥＮＴ  ＭＵＴＡＴＩＯＮ）」＝ＳＮＰは、コードされたアミノ酸に変化を引き起こさない［すなわち、コードＳＮＰの同義語］；「終止コドン変異（ＳＴＯＰ  ＣＯＤＯＮ  ＭＵＴＡＴＩＯＮ）」＝ＳＮＰは、終止コドンに位置する；「ナンセンス変異（ＮＯＮＳＥＮＳＥ  ＭＵＴＡＴＩＯＮ）」＝ＳＮＰは、終止コドンを作製するかまたは破壊する；「ＵＴＲ  ５」＝ＳＮＰは、転写産物の５’ＵＴＲに位置する；「ＵＴＲ３」＝ＳＮＰは、転写産物の３’ＵＴＲに位置する；「推定５’ＵＴＲ（ＰＵＴＡＴＩＶＥ  ＵＴＲ  ５）」＝ＳＮＰは、推定５’ＵＴＲに位置する；「推定３’ＵＴＲ（ＰＵＴＡＴＩＶＥ  ＵＴＲ  ３）」＝ＳＮＰは、推定３’ＵＴＲに位置する；「スプライシングドナー部位（ＤＯＮＯＲ  ＳＰＬＩＣＥ  ＳＩＴＥ）」＝ＳＮＰは、スプライシングドナー部位［５’イントロン境界］に位置する；「スプライシングアクセプター部位（ＡＣＣＥＰＴＯＲ  ＳＰＬＩＣＥ  ＳＩＴＥ）」＝ＳＮＰは、スプライシングアクセプター部位［３’イントロン境界］に位置する；「コード領域（ＣＯＤＩＮＧ  ＲＥＧＩＯＮ）」＝ＳＮＰは、転写産物のタンパク質コード領域に位置する；「エキソン（ＥＸＯＮ）」＝ＳＮＰは、エキソンに位置する；「イントロン（ＩＮＴＲＯＮ）」＝ＳＮＰは、イントロンに位置する；「ｈｍＣＳ」＝ＳＮＰは、ヒト−マウス保存セグメントに位置する；「ＴＦＢＳ」＝ＳＮＰは、転写因子結合部位に位置する；「未知（ＵＮＫＮＯＷＮ）」＝ＳＮＰ型は定義されない；「遺伝子間（ＩＮＴＥＲＧＥＮＩＣ）」＝ＳＮＰは、遺伝子間である、すなわち、任意の遺伝子境界の外側である］；そして
−タンパク質コード領域情報（表１のみ）、関連する場合、（タンパク質配列番号、アミノ酸位置［アミノ酸−１，コドン１］［アミノ酸−２，コドン２］）の形式におけるタンパク質コード領域情報。この欄における情報としては、コードタンパク質配列の配列番号、ＳＮＰを含むコドンによってコードされる配列番号によって同定されるタンパク質内のアミノ酸残基の位置、代替的なＳＮＰ対立遺伝子によってコードされるアミノ酸（一文字アミノ酸コードによって表される）（終止コドンの場合には、一文字アミノ酸コードに対して、「Ｘ」が使用される）、およびアミノ酸残基をコードする代替的なＳＮＰヌクレオチドを含む代替的なコドン（従って、例えば、ミスセンス変異型ＳＮＰに関しては、少なくとも２つの異なるアミノ酸および少なくとも２つの異なるコドンが、一般に示される；サイレント変異型ＳＮＰに関しては、１つのアミノ酸および少なくとも２つの異なるコドンが一般に示される、など）が挙げられる。ＳＮＰがタンパク質コード領域の外側（例えば、ＵＴＲ領域）に位置する場合、「なし（Ｎｏｎｅ）」は、タンパク質配列番号の後に示される。
【００６２】
（表３および表４の説明）
表３および４は、３つのサンプルセットにおける２つの非ＤＡＰＫ１  ＳＮＰとアルツハイマー病との関連性の統計学的な結果を示す（以下の、実施例：アルツハイマー病に関連するＳＮＰの統計学的解析を参照のこと）。２つのＳＮＰは、ｈＣＶ８７１５１１５およびｈＣＶ１９２０６０９である。
【００６３】
表３は、ＰＯＭＴ１  ＳＮＰ  ｒｓ２０１８６２１（ｈＣＶ８７１５１１５）の対立遺伝子検定解析を示す。表４は、ＤＦＮＢ３１  ＳＮＰ  ｒｓ２２７４１５９（ｈＣＶ１９２０６０９）の対立遺伝子検定解析を示す。欄の見出しの説明については、表についての凡例を参照のこと。
【００６４】
（表５および表６の説明）
表５〜６は、３つのサンプルセットにおけるＤＡＰＫ１  ＳＮＰのアルツハイマー病との関連性の統計学的な結果を示す（以下の、実施例：アルツハイマー病に関連するＳＮＰの統計学的解析を参照のこと）。
【００６５】
表５は、ｈＣＶ１３８６９８２およびｈＣＶ１３８６８８８について解析された種々の遺伝子型についての症例および対照のサンプル数と、各遺伝子型とアルツハイマー病との関係性とを示す。この表において、「対立遺伝子のＰ（Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｐ）」＝ｐ値であり、「対立遺伝子のＯＲ（Ａｌｌｅｌｉｃ  ＯＲ）」＝オッズ比である。
【００６６】
表６は、ＤＡＰＫ１マーカーであるｈＣＶ１３８６９７３、ｈＣＶ１３８６９７８、ｈＣＶ１３８６９８２のハプロタイプ解析についての統計学的な結果を示す。欄の見出しについての定義は以下のとおりである：「サンプル（Ｓａｍｐｌｅ）」＝研究セット、「ハプロタイプ（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）」＝解析されたハプロタイプ、「対照の頻度（ｃｏｎｔｒｏｌ＿ｆｒｅｑ）」＝対照サンプルにおけるハプロタイプの頻度、「症例の頻度（ｃａｓｅ＿ｆｒｅｑ）」＝症例における頻度、「ハプロタイプのＰ（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  Ｐ）」＝ハプロタイプについての関連性のｐ値測度、および「汎用（Ｇｌｏｂａｌ）」＝このハプロタイプについての汎用のｐ値（ハプロタイプおよび汎用のｐ値は、以下の研究設計に記載される）。
【００６７】
（表７の説明）
表７は、照会ＳＮＰに関連し、そして、照会ＳＮＰから導出される、サンプルＬＤ  ＳＮＰのリストを提供する。これらのＬＤ  ＳＮＰは、そのＬＤである存在に基づいた照会ＳＮＰとの疾患の関連性についてのマーカーとしても機能し得る、ＳＮＰ群の一例として提供される。このようなＬＤ  ＳＮＰを選択する基準およびプロセス（ｒ２値およびｒ２閾値の計算を含む）は、以下の実施例に記載される。
【００６８】
表７において、「照会ＳＮＰ」とラベルされる欄は、その固有の識別子であるｈＣＶ番号によって識別される各マーカーを表す。「照会ｒｓ」とラベルされる欄は、対応するｈＣＶ番号に対する公的に知られる識別子であるｒｓ番号を表す。「ＬＤ  ＳＮＰ」とラベルされる欄は、その対応する照会ＳＮＰに由来するＬＤ  ＳＮＰのｈＣＶ番号を表す。「ＬＤ  ＳＮＰ  ｒｓ」とラベルされる欄は、対応するｈＣＶ番号に対する公的に知られるｒｓ番号を表す。「検出力（Ｔ）」とラベルされる欄は、ｒ２閾値が設定される検出力レベルを表す。例えば、検出力が５１％に設定される場合、ＬＤ  ＳＮＰが５１％より大きい可能性で疾患の表現型と関連し得るマーカーとして分類されるために、そこから計算されるｒ２閾値は、ＬＤ  ＳＮＰが照会ＳＮＰに関して有さなければならない最小ｒ２となる。「閾値
【００６９】
【数１】
2009528023.tif 000003
」とラベルされる欄は、ＬＤ  ＳＮＰとして適格にするために、ＬＤ  ＳＮＰが照会ＳＮＰに関して満たさなければならない最小ｒ２値を表す。「ｒ２」とラベルされる欄は、ＬＤ  ＳＮＰが関連する照会ＳＮＰに関する実際のＬＤ  ＳＮＰのｒ２値を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アルツハイマー病と関連するＳＮＰ、これらのＳＮＰを含む核酸分子、本明細書中に開示されるＳＮＰの検出ための方法および試薬、検出試薬の開発のためのこれらのＳＮＰの使用、ならびにこのような試薬を利用するアッセイまたはキットを提供する。本明細書中に開示されるアルツハイマー病関連ＳＮＰは、ヒトにおけるアルツハイマー病に対する素因および関連する神経学的病理を診断し、スクリーニングし、そして評価するために有用である。さらに、このようなＳＮＰおよびそれらにコードされる産物は、アルツハイマー病および他の神経学的病理を処置する際の治療薬の開発のための有用な標的である。
【００７１】
多数のＳＮＰが、３９の個体のＤＮＡを再配列決定することにより同定されてきた。そして、それらは、表１〜２では、「Ａｐｐｌｅｒａ」ＳＮＰ供給源と示されている。白色人種人種群およびアフリカ系アメリカ人人種群のそれぞれにおいて見出されたそれらの対立遺伝子頻度が提供される。本明細書中に含まれるさらなるＳＮＰは、既にショットガン配列決定およびヒトゲノムのアセンブリの間に同定され、そして、それらは、表１〜２では、「Ｃｅｌｅｒａ」ＳＮＰ供給源として示されている。さらに、表１〜２に提供される情報、特に、３９の個体から得た対立遺伝子頻度情報、および各遺伝子／転写産物内の各ＳＮＰの正確な位置の同定は、ハプロタイプ（すなわち、同時に遺伝するＳＮＰの群）を、容易に推測することを可能にする。本発明は、ＳＮＰハプロタイプならびに個々のＳＮＰを含む。
【００７２】
従って、本発明は、アルツハイマー病と関連する個々のＳＮＰならびにアルツハイマー病と関連する遺伝子領域におけるＳＮＰおよびハプロタイプの組合せ、多型／改変転写産物配列（配列番号１〜５）およびＳＮＰを含むゲノム配列（配列番号１６〜１９）、コードされるアミノ酸配列（配列番号６〜１０）、ならびに転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列（配列番号１１〜１５）およびゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列（配列番号２０〜３１）の両方（転写産物配列、タンパク質配列および転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、表１および配列表に提供され；ゲノム配列およびゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、表２および配列表に提供される）、試験サンプルにおいて、これらの多型を検出する方法、アルツハイマー病を有するか、または発症する個体の危険性を決定する方法、アルツハイマー病などの改変遺伝子／タンパク質と関連する神経学的病理を処置するために有用な化合物についてスクリーニングする方法、これらのスクリーニング方法によって同定された化合物、処置計画を選択するために開示されたＳＮＰを使用する方法、改変遺伝子／タンパク質と関連する障害を処置する方法（すなわち、治療方法）、ならびにヒト識別に関して本発明のＳＮＰを使用する方法を提供する。
【００７３】
本発明は、アルツハイマー病と関連する新規ＳＮＰ、ならびに当該分野で既知であるが、アルツハイマー病と関連することが既知ではなかったＳＮＰを提供する。従って、本発明は、本明細書中に開示される新規ＳＮＰに基づいた新規組成物および新規方法を提供し、また、アルツハイマー病に関連する方法（例えば、アルツハイマー病を診断するための方法）における、既知ではあるが、関連していなかったＳＮＰを使用する新規の方法を提供する。表１〜２において、既知のＳＮＰは、それらが見出された公的データベースに基づいて同定され、ＳＮＰ型のうちの１つ以上として示される：「ｄｂＳＮＰ」＝ｄｂＳＮＰに見出されるＳＮＰ、「ＨＧＢＡＳＥ」＝ＨＧＢＡＳＥに見出されるＳＮＰ、および「ＨＧＭＤ」＝Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ）に見出されるＳＮＰ。
【００７４】
本発明の特定のＳＮＰ対立遺伝子は、アルツハイマー病を有するかもしくは発症する危険性の増加、またはアルツハイマー病を有するかもしくは発症する危険性の減少のいずれかと関連し得る。アルツハイマー病を有するかまたは発症する危険性の減少と関連するＳＮＰ対立遺伝子は、「保護」対立遺伝子と称され得、そしてアルツハイマー病を有するかまたは発症する危険性の増加と関連するＳＮＰ対立遺伝子は、「感受性」対立遺伝子、「危険性」対立遺伝子または「危険因子」と称され得る。従って、特定のＳＮＰ（またはそれらにコードされる産物）は、個体が、アルツハイマー病を有するかまたは発症する危険性が増加したことを示すＳＮＰ対立遺伝子（すなわち、感受性対立遺伝子）を保有するか否かを決定するためにアッセイされ得るのに対して、他のＳＮＰ（またはそれらにコードされる産物）は、個体が、アルツハイマー病を有するかまたは発症する危険性が減少したことを示すＳＮＰ対立遺伝子（すなわち、保護対立遺伝子）を保有するか否かを決定するためにアッセイされ得る。同様に、本発明の特定のＳＮＰ対立遺伝子は、特定の処置または治療化合物に対する応答の可能性の増加もしくは減少、あるいは特定の処置または治療化合物由来の毒作用を受ける可能性の増加または減少のいずれかと関連し得る。用語「変化した」は、本明細書中では、これらの２つの可能性（例えば、危険性／可能性の増加または減少）のいずれかを含むように使用され得る。
【００７５】
当業者は、核酸分子が二本鎖分子であり得、一本鎖上の特定の部位に対する参照はまた、相補鎖上の対応する部位も参照するということを容易に認識する。ＳＮＰ位置、ＳＮＰの対立遺伝子またはヌクレオチド配列の規定において、核酸分子の一本鎖上の特定の部位におけるアデニン、チミン（ウリジン）、シトシン、グアニンに対する参照はまた、核酸分子の相補鎖上の対応する部位におけるチミン（ウリジン）、アデニン、グアニンまたはシトシン（それぞれ）を規定する。従って、参照は、特定のＳＮＰ位置、ＳＮＰの対立遺伝子またはヌクレオチド配列を参照するために、どちらかの鎖上でなされ得る。プローブおよびプライマーは、どちらかの鎖にハイブリダイズするように設計され得、そして、本明細書中に開示されるＳＮＰ遺伝子型決定方法は、一般にどちらかの鎖を標的とし得る。本明細書を通して、ＳＮＰ位置を同定することにおいて、参照は、便宜上、一般に、タンパク質コード鎖に対してなされる。
【００７６】
本発明の改変ペプチド、改変ポリペプチドまたは改変タンパク質に対する参照は、当該分野で公知のペプチド／ポリペプチド／タンパク質の対応するアミノ酸配列とは異なる少なくとも１つのアミノ酸残基を含むペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはこれらのフラグメントを含む（当該分野で公知のタンパク質は、相互変換可能に、「野生型」タンパク質、「参照」タンパク質または「正常」タンパク質と称され得る）。このような改変ペプチド／ポリペプチド／タンパク質は、本発明により開示されるＳＮＰ位置をコードするタンパク質での非同義的ヌクレオチド置換（すなわち、ミスセンス変異）により引き起こされるコドン変化から生じ得る。本発明の改変ペプチド／ポリペプチド／タンパク質はまた、ナンセンス変異（すなわち、早すぎる終止コドンを作製するＳＮＰ、終止コドンをなくすことによるリードスルー突然変異を作製するＳＮＰ）から、または他の方法でタンパク質の構造、機能／活性、もしくは発現を変える、本発明により開示される任意のＳＮＰ（例えば、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節領域におけるＳＮＰまたは代替的なスプライシング、または不完全なスプライシングを生じるＳＮＰ（例えば、イントロン内のＳＮＰもしくはエキソン／イントロン境界でのＳＮＰ））に起因して生じ得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は相互変換可能に使用される。
【００７７】
（単離された核酸分子ならびにＳＮＰ検出試薬およびキット）
表１および表２は、アルツハイマー病と関連する本発明の各ＳＮＰについての種々の情報を提供し、コードされる遺伝子産物（核酸配列中に、ＩＵＢコードによって示されるＳＮＰを有する）の転写産物配列（配列番号１〜５）、ゲノム配列（配列番号１６〜１９）およびタンパク質配列（配列番号６〜１０）を含む。さらに、表１および表２は、ＳＮＰコンテキスト配列を含み、この配列は、一般に、各ＳＮＰの位置の上流（５’）に１００ヌクレオチド＋下流（３’）に１００ヌクレオチド（配列番号１１〜１５は、表１に開示される転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列に対応し、配列番号２０〜３１は、表２に開示されるゲノムに基づいたコンテキスト配列に対応する）、各ＳＮＰ位置における代替的なヌクレオチド（対立遺伝子）、および例えば、ＳＮＰ型（コード部位、ミスセンス部位、スプライシング部位、ＵＴＲなど）、ＳＮＰが見出されたヒト集団、見出された対立遺伝子頻度、コードされるタンパク質についての情報などに関連する改変体についてのさらなる情報を含む。
【００７８】
（単離された核酸分子）
本発明は、表１および／または表２に開示された１つ以上のＳＮＰを含む単離された核酸分子を提供する。好ましい単離された核酸分子は、表３および／または表４に同定された１つ以上のＳＮＰを含む。表１〜４の少なくとも１つに開示された１つ以上のＳＮＰを含む単離された核酸分子は、本文を通して相互変換可能に、「ＳＮＰ含有核酸分子」と言われ得る。単離された核酸分子は、必要に応じて全長改変タンパク質またはそれらのフラグメントをコードし得る。本発明の単離された核酸分子はまた、プローブおよびプライマー（「ＳＮＰ検出試薬」と題された以下の節により詳細に記載される）を含み、これらは、開示されたＳＮＰ、および単離された全長遺伝子、転写産物、ｃＤＮＡ分子、およびこれらのフラグメントをアッセイするために使用され得、これらは、例えば、コードされたタンパク質を発現する目的で使用され得る。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、「単離された核酸分子」は、一般に、本発明のＳＮＰを含む核酸分子、またはこのような分子（例えば、相補的配列を有する核酸）にハイブリダイズする核酸分子を含み、そして、核酸分子の天然供給源に存在するほとんどの他の核酸から分離される。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、本発明のＳＮＰを含むｃＤＮＡ分子）は、他の細胞物質、または組換え技術によって産生される場合、培養培地、または化学合成される場合、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を、実質的に含み得ない。核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合され得、それでもなお、「単離された」と考えられ得る。非ヒトトランスジェニック動物に存在する核酸分子は、動物には、天然には存在しないが、やはり「単離された」と考えられる。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、「単離された」と考えられる。「単離された」ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞内で維持される組換えＤＮＡ分子、および溶液中の（部分的に、または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子はとしては、本発明の単離されたＳＮＰ含有ＤＮＡ分子のインビボＲＮＡ転写産物またはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明に従う単離された核酸分子としては、さらに、合成により生成されたこのような分子が挙げられる。
【００８０】
一般に、単離されたＳＮＰ含有核酸分子は、本発明によって開示される一以上のＳＮＰ位置を含み、それらのＳＮＰ位置の両側の隣接ヌクレオチド配列を有する。隣接配列は、上記ＳＮＰ部位と天然で結合しているヌクレオチド残基および／または非相同ヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、上記隣接配列は、特に上記ＳＮＰ含有核酸分子が、タンパク質またはタンパク質フラグメントを産生するために使用される場合、ＳＮＰ位置の両側の約５００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約８ヌクレオチドまたは約４ヌクレオチド（もしくはこれらの間の任意の他の長さ）、あるいは全長遺伝子または全タンパク質コード配列（またはエキソンのようなその任意の一部分）までである。
【００８１】
全長遺伝子および全タンパク質コード配列について、ＳＮＰ隣接配列は、例えば、ＳＮＰの両側の約５ＫＢ、約４ＫＢ、約３ＫＢ、約２ＫＢ、約１ＫＢまでである。さらに、この場合には、単離された核酸分子は、エキソンの配列を含む（タンパク質をコードするエキソン配列および／または非コードエキソン配列を含む）が、イントロンの配列も含み得る。従って、任意のタンパク質コード配列は、隣接しているか、またはイントロンによって分離され得る。重要な点は、核酸が、遠く離れかつ重要ではない隣接配列から隔離され、そして適切な長さであり、その結果、特定の処置または組換えタンパク質の発現、ＳＮＰ位置をアッセイするためのプローブおよびプライマーの調製、およびＳＮＰ含有核酸配列特異的な他の用途のような本明細書中で所望される用途に供され得る。
【００８２】
単離されたＳＮＰ含有核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡから単離された遺伝子（例えば、クローニングまたはポリメラーゼ連鎖反応［ＰＣＲ］増幅による）、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ転写分子のような全長遺伝子または転写産物を含み得る。多型の転写配列は、表１および配列リスト（配列番号１〜５）に提供され、そして多型ゲノム配列は、表２および配列リスト（配列番号１６〜１９）に提供される。さらに、本明細書中に開示される一以上のＳＮＰを含むこのような全長遺伝子および転写産物もまた、本発明に包含され、そしてこのようなフラグメントは、使用され、例えば、特定の機能ドメインまたは抗原エピトープのようなタンパク質の任意の一部分を発現し得る。
【００８３】
従って、本発明はまた、表１〜２に提供される核酸配列（転写配列は、配列番号１〜５のような表１に提供され、ゲノム配列は、配列番号１６〜１９のような表２に提供され、転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号１１〜１５のような表１に提供され、そしてゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号２０〜３１として表２に提供される）およびその相補体のフラグメントも含む。フラグメントは代表的に、少なくとも約８以上のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１２以上のヌクレオチド、そしてさらに好ましくは、少なくとも約１６以上のヌクレオチチドの隣接したヌクレオチド配列を含む。さらに、フラグメントは、少なくとも約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、または約５００ヌクレオチドの長さを含み得る。フラグメントの長さは、意図される用途に基づく。例えば、このフラグメントは改変体ペプチドのエピトープ保有領域または、正常／野生型のタンパク質と異なる改変体ペプチドの領域をコードし得るか、またはポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーとして有用であり得る。このようなフラグメントは、ポリヌクレオチドプローブの合成ために表１および／または表２に提供さえるヌクレオチド配列を使用して単離され得る。次いで、標識されたプローブが、使用され、上記コード領域に一致する核酸を単離するために、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、またはｍＲＮＡをスクリーニングし得る。さらに、プライマーが、一以上のＳＮＰ部位をアッセイする目的で、または遺伝子の特定領域をクローニングするために、増幅反応において使用され得る。
【００８４】
本発明の単離された核酸分子はさらに、核酸サンプル中の目的のポリヌクレオチドのコピー数を増加するために使用される種々の核酸増幅方法のうちの１つの産物である、ＳＮＰ含有ポリヌクレオチドをさらに含む。このような増幅方法は、当該分野において周知であり、そしてこれらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９２］）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０［１９８９］；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７［１９８８］）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５，２７０，１８４号；および同第５，４２２，２５２号）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）（米国特許出願第５，３９９，４９１号）、連鎖直線増幅（ｌｉｎｋｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＬＡ）（米国特許第６，０２７，９２３号）など、ならびに等温増幅方法［例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）ならびに自己維持配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のような（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４［１９９０］）が挙げられるがこれらに限定されない。このような方法論に基づいて、当業者は、本明細書中に開示されるＳＮＰの５’側および３’側の領域任意の適切なにプライマーを容易に設計し得る。このようなプライマーは、その配列中に目的のＳＮＰを含む限り任意の長さのＤＮＡを増幅するために使用され得る。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、本発明の「増幅された核酸分子」は、ＳＮＰ含有核酸分子であり、その量は、試験サンプル中のその開始量と比較した場合、インビトロで実施された任意の核酸増幅方法によって少なくとも２倍に増加している。他の好ましい実施形態において、増幅された核酸分子は、試験サンプル中のその開始量と比較した場合、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはさらに１０，０００倍の増加の結果である。代表的なＰＣＲ増幅において、目的のポリヌクレオチドは、増幅していないゲノムＤＮＡの少なくとも５０，０００倍の量を上回ってしばしば増幅されるが、アッセイのために必要とされる増幅の正確な量は、その後使用される検出方法の感度に依存する。
【００８６】
一般に、増幅された核酸分子は、少なくとも約１６ヌクレオチドの長さである。より代表的には、増幅された核酸分子は、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。本発明の好ましい実施形態において、増幅された核酸分子は、少なくとも約３０ヌクレオチドの長さである。本発明のより好ましい実施形態において、増幅された核酸分子は、少なくとも約３２ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、または約６０ヌクレオチドの長さである。本発明のさらに別の好ましい実施形態において、増幅された核酸分子は、少なくとも約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチドまたは約５００ヌクレオチドの長さである。本発明の増幅された核酸分子の全長は、目的のＳＮＰが存在するエキソン、イントロン、または遺伝子全体程度の長さであり得るが、増幅産物は、代表的には約１，０００ヌクレオチドまでの長さである（しかし、特定の増幅方法は、１０００ヌクレオチドの長さよりも長い増幅産物を生じ得る）。より好ましくは、増幅された核酸分子は、約６００〜７００ヌクレオチド以下の長さである。増幅された核酸分子の長さに関わらず、目的のＳＮＰは、その配列に沿って至る所に位置し得ることが理解される。
【００８７】
本発明の具体的な実施形態において、増幅産物は、少なくとも約２０１ヌクレオチドの長さであり、表１〜２に示される転写産物に基づいたコンテキスト配列またはゲノムに基づいたコンテキスト配列の１つを含む。このような産物は、その５’末端もしくは３’末端またはその両方に付加的な配列を有し得る。別の実施形態において、増幅産物は、約１０１ヌクレオチドの長さであり、そして本明細書中に開示されるＳＮＰを含む。好ましくは、そのＳＮＰは、増幅産物の中央に位置する（例えば、２０１ヌクレオチドの長さである増幅産物において１０１位、または１０１ヌクレオチドの長さである増幅産物において５１位）か、または増幅産物の中央から１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、もしくは２０ヌクレオチド以内に位置する（しかし、上に示したように、目的のＳＮＰは、増幅産物の長さに沿って至る所に位置し得る）。
【００８８】
本発明は、本明細書中に開示される一以上のＳＮＰ、その相補体およびそのＳＮＰ含有フラグメントを含む、一以上のポリヌクレオチド配列を含むか、このポリヌクレオチドからなるか、または本質的にこのポリヌクレオチドから構成される単離された核酸分子を提供する。
【００８９】
従って、本発明は、表１および／もしくは表２に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれかから核酸分子（転写産物配列は、配列番号１〜５として表１に提供され、ゲノム配列は、配列番号１６〜１９として表２に提供され、転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号１１〜１５として表１に提供され、そしてゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号２０〜３１として表２に提供される）または表１に提供される改変タンパク質のうちのいずれか（配列番号６〜１０）をコードする任意の核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の全長ヌクレオチド配列である場合、核酸分子は、そのヌクレオチド配列からなる。
【００９０】
本発明はさらに、表１および／もしくは表２に示されるヌクレオチド配列のいずれかから本質的になる核酸分子（転写配列は、配列番号１〜５として表１に提供され、ゲノム配列は、配列番号１６〜１９として表２に提供され、転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号１１〜１５として表１に提供され、そしてゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号２０〜３１として表２に提供される）または表１に提供される改変タンパク質（配列番号６〜１０）のいずれかをコードする任意の核酸分子を提供する。核酸分子は、そのヌクレオチド配列が、最終の核酸分子において少数の付加的なヌクレオチド残基しか伴わずに存在する場合、本質的にそのようなヌクレオチド配列から成る。
【００９１】
本発明はさらに、表１および／もしくは表２に示されるヌクレオチド配列のいずれかまたはそのＳＮＰ含有フラグメントを含む核酸分子（転写産物配列は、配列番号１〜５として表１に提供され、ゲノム配列は、配列番号１６〜１９として表２に提供され、転写産物に基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号１１〜１５として表１に提供され、そしてゲノムに基づいたＳＮＰコンテキスト配列は、配列番号２０〜３１として表２に提供される）または表１に提供される改変タンパク質（配列番号６〜１０）のうちのいずれかをコードする任意の核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列がその核酸分子の最終のヌクレオチド配列の少なくとも一部である場合、核酸分子は、そのヌクレオチド配列を含む。このような様式において、その核酸分子は、ヌクレオチド配列のみであっても、付加的なヌクレオチド残基（例えば、天然にそれに関係する残基）を有しても、異種ヌクレオチド配列を有してもよい。このような核酸分子は、１個〜少数の付加的なヌクレオチドを有しても、さらに多くの付加的なヌクレオチドを含んでもよい。種々の型のこれら核酸分子がどのようにして容易に作製され得、そして単離され得るのかの簡単な説明を、以下に提供する。そしてこのような技術は、当業者にとって周知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［２０００］）。
【００９２】
単離された核酸分子は、成熟タンパク質に加え付加的なアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸またはその両方、あるいは成熟ペプチド内のアミノ酸（成熟形態が、例えば、一より多くのペプチド鎖を有する場合）をコードし得る。このような配列は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシングにおいて一定の役割を果たし得、タンパク質の輸送を容易にすること、タンパク質の半減期を延長もしくは短縮し得、またはアッセイもしくは産生のためにタンパク質の操作を容易にし得る。インサイチュの場合に一般的であるように、付加的なアミノ酸は、細胞の酵素によって成熟タンパク質からプロセッシングされ除去され得る。
【００９３】
従って、単離された核酸分子としては、ペプチドをコードする配列のみを有する核酸分子、成熟ペプチドをコードする配列およびさらなるコード配列（例えば、リーダー配列または分泌配列（例えば、プレ−プロタンパク質配列またはプロタンパク質配列））を有する核酸分子、付加的なコード配列を有する成熟ペプチドをコードする配列または付加的なコード配列を有さない成熟ペプチドをコードする配列に加えて、付加的な非コード配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセッシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合、および／または、ｍＲＮＡの安定性において一定の役割を果たす、転写されるが翻訳されない配列のような、例えば、イントロンおよび非コード５’配列および非コード３’配列）、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、核酸分子は、例えば、精製を容易にするペプチドをコードする異種マーカー配列へ融合され得る。
【００９４】
単離された核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ形態であり得、例えば、分子クローニングによって得られ得るかまたは化学合成技術による産生またはその組合せにより産生され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［２０００］）。さらに、単離された核酸分子（特にプローブおよびプライマーのようなＳＮＰ検出試薬）はまた、部分的または全体的に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような一以上の型の核酸アナログ形態（米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，５２７，６７５号；同第５，６２３，０４９号；同第５，７１４，３３１号）であり得る。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）または相補的非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント、またはＰＮＡセグメントは、例えば、ヒトゲノムのフラグメント（ＤＮＡまたはＲＮＡの場合）、または単一のヌクレオチド、短いオリゴヌクレオチドリンカーから、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから構築され、合成核酸分子を提供し得る。核酸分子は、参考として本明細書中に提供される配列を使用して容易に合成され得、オリゴヌクレオチドおよびＰＮＡオリゴマーの合成技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｏｒｅｙ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｃｏｐｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５［６］：２２４−９［１９９７年６月］、およびＨｙｒｕｐら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ［ＰＮＡ］：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；４［１］：５−２３［１９９６年１月］を参照のこと）。さらに、大規模な自動化オリゴヌクレオチド／ＰＮＡ合成（アレイまたはビーズ表面または他の固体支持体上での合成を含む）が、市販の核酸合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）３９００  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＤＮＡ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒまたはＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）、および本明細書中に提供される配列情報を使用して容易に達成され得る。
【００９５】
本発明は、当該分野で公知の改変されたヌクレオチド、合成ヌクレオチド、もしくは天然に生じないヌクレオチド、または改変された構造エレメント、合成の構造エレメント、もしくは天然に生じない構造エレメント、または他の代替的な／改変された核酸化学を含む、核酸アナログを含む。このような核酸アナログは、例えば、表１および／または表２において同定される一以上のＳＮＰを検出するための検出試薬（例えば、プライマー／プローブ）として有用である。さらに、これらアナログを含むキット／システム（例えば、ビーズ、アレイなど）もまた、本発明に含まれる。例えば、具体的には、本発明の多型配列に基づくＰＮＡオリゴマーが企図される。ＰＮＡオリゴマーは、ＤＮＡのアナログであり、そのリン酸骨格は、ペプチド様骨格で置換されている（Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２［１９９４］、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６［１９９６］、Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３［９］：１２６９−１２７２［２００１］、ＷＯ９６／０４０００）。ＰＮＡは、従来のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログよりも、高い親和性および特異性で、相補的なＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズする。このＰＮＡの特性は、従来のオリゴヌクレオチドおよびペプチドを用いては達成し得ない新規な分子生物学および生化学の用途を可能とする。
【００９６】
核酸の結合特性および／または安定性を改善する核酸改変のさらなる例は、イノシンのような塩基アナログ、インターカレーター（米国特許第４，８３５，２６３号）および副溝の結合体（米国特許第５，８０１，１１５号）の使用を含む。従って、核酸分子、ＳＮＰ含有核酸分子、ＳＮＰ検出試薬（例えば、プローブおよびプライマー）、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドに対する本明細書中における言及は、ＰＮＡオリゴマーおよび他の核酸アナログを含む。当該分野で公知の核酸アナログおよび選択的核酸化学／改変核酸化学の他の例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００２）に記載される。
【００９７】
本発明はさらに、本明細書中に開示される改変体ポリペプチドのフラグメントをコードする核酸分子および改変体ポリペプチドの明白な改変体をコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子は、パラログ（ｐａｒａｌｏｇ）（異なる遺伝子座）およびオルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）（異なる生物体）のように、天然に生じ得るか、または組換えＤＮＡ方法もしくは化学合成によって構築され得る。天然に生じない改変体は、核酸分子、細胞、または生物への適用されるものを含む、変異誘発技術によって作製され得る。従って、その改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失、転位、および挿入を含み得る（表１〜２において開示されるＳＮＰに加えて）。改変体は、コード領域および非コード領域のいずれかまたは両方に生じ得る。この改変体は、保存的および／または非保存的なアミノ酸置換を生じ得る。
【００９８】
さらに、天然に存在する対立遺伝子改変体（ならびにオルソログおよびパラログ）ならびに変異誘発技術によって産生される合成改変体のような、表１〜２に開示される核酸分子の改変体は、当該分野において周知の方法を使用して同定および／または産生され得る。さらにこのような改変体は、表１および／または表２において開示される核酸配列（またはそのフラグメント）と少なくとも、７０％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有し、かつ表１および／または表２に開示される新規ＳＮＰ対立遺伝子を含む、ヌクレオチド配列を含み得る。さらに、改変体は、表１に開示されたポリペプチド配列（またはそのフラグメント）と少なくとも７０％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有し、かつ表１および／または表２に開示される新規ＳＮＰ対立遺伝子を含む、ヌクレオチド配列を含み得る。従って、特に企図される本発明の一局面は、表１〜２において示される配列と比較した場合ある程度の配列改変体を有するが、本明細書中に開示される新規ＳＮＰ対立遺伝子を含む、単離された核酸分子である。言い換えれば、単離された核酸分子が、本明細書中に開示された新規ＳＮＰ対立遺伝子を含む限り、この新規ＳＮＰ対立遺伝子に隣接する核酸分子の他の部分は、表１〜２に示される特定の転写産物配列、ゲノム配列、およびコンテキスト配列からある程度変化し得、表１に示される特定のポリペプチド配列からある程度変化したポリペプチにコードし得る。
【００９９】
配列相同性を共有する２つの分子の２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の同一性のパーセントを決定するために、これらの配列は、最適な比較を目的としてアライメントされる（例えば、ギャップが、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同性配列は、比較目的のために、無視され得る）。好ましい実施形態において、参照配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上は、比較の目的でアライメントされる。次いで対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、その分子は、その位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等しい）。２つの配列の間の同一性のパーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要性があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【０１００】
２つの配列間の配列の比較および同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９８８］；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９３］；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １、Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ［１９９４］；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ［１９８７］；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｍ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９１］）。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ギャップウェート（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）１６、１４、１２、１０、８、６または４、長さウェート（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５または６）を使用して、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３［１９７０］）を用いて決定され、これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムへ組み込まれている。
【０１０１】
さらに別の好ましい実施形態においては、２つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびにギャップウェート（４０、５０、６０、７０、または８０）および長さウェート（１、２、３、４、５、または６）を使用してＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム（Ｊ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２［１］：３８７［１９８４］）を用いて決定される。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間の同一性のパーセントは、ＰＡＭ１２０ウェート残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へ組み込まれているＥ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７［１９８９］）を使用して決定される。
【０１０２】
本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、さらに「照会配列」として使用され、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、配列データベースに対して検索を実施し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０［１９９０］）のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施し得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２）を用いて実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることが可能である。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて実施し、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることが可能である。比較目的のためにギャップを入れたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５［１７］：３３８９−３４０２［１９９７］）に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用した場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが、使用され得る。ＢＬＡＳＴに加えて、当該分野で使用される他の検索プログラムおよび配列比較プログラムの例としては、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，３６５−３８９［１９９４］）およびＫＥＲＲ（Ｄｕｆｒｅｓｎｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０［１２］：１２６９−７１［２００２年１２月］）が挙げられるが、これらに限定されない。生命情報科学技術に関するさらなる情報については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１０３】
本発明はさらに、表１および／または表２に開示される核酸分子の非コードフラグメントを提供する。好ましい非コードフラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、イントロン配列、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’非翻訳領域、遺伝子調節配列および遺伝子終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。このようなフラグメントは、例えば、異種遺伝子の発現を制御することおよび遺伝子調節因子を同定するためにスクリーニングを開発することにおいて有用である。
【０１０４】
（ＳＮＰ検出試薬）
本発明の特定の局面において、表１および／または表２に開示されたＳＮＰおよびその関連転写産物配列（配列番号１〜５として表１に提供される）、ゲノム配列（配列番号１６〜１９として表２に提供される）およびコンテキスト配列（転写産物に基づいたコンテキスト配列が、配列番号１１〜１５として表１に提供され、ゲノムに基づいたコンテキスト配列が、配列番号２０〜３１として表２に提供される）は、ＳＮＰ検出試薬の設計のために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＰ検出試薬」は、本明細書中に開示される特定の標的ＳＮＰ位置を特異的に検出し、好ましくは、標的ＳＮＰ位置の特定のヌクレオチド（対立遺伝子）に対して特異的である（すなわち、検出試薬は、好ましくは、標的ＳＮＰ位置にある異なる選択的ヌクレオチドを区別し得、これによって標的ＳＮＰ位置に存在するヌクレオチドの正体を決定することを可能とする）。代表的に、このような検出試薬は、標的ＳＮＰ含有核酸分子に対して配列特異的な様式の相補的な塩基対合によってハイブリダイズし、試験サンプル中において当該分野で公知の形態のような他の核酸配列から標的改変体の配列を区別する。検出試薬の例は、表１および／または表２に提供される一以上のＳＮＰを含有する標的核酸にハイブリダイズするプローブである。好ましい実施形態において、このようなプローブは、同一の標的ＳＮＰ位置において異なるヌクレオチドを有する他の核酸から標的ＳＮＰ位置で特定のヌクレオチド（対立遺伝子）を有する核酸を区別し得る。さらに、検出試薬は、ＳＮＰ位置に対して５’側および／または３’側にある特定の領域にハイブリダイズし得、特に表１および／または表２に提供されるコンテキスト配列（転写産物に基づいたコンテキスト配列が、配列番号１１〜１５として表１に提供され；ゲノムに基づいたコンテキスト配列が、配列番号２０〜３１として表２に提供される）に対応している領域にハイブリダイズし得る。検出試薬の別の例は、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に沿うヌクレオチドの伸長の開始点として作用するプライマーである。本明細書中に提供されるＳＮＰ配列の情報はまた、本発明の任意のＳＮＰを（例えば、ＰＣＲを使用して）増幅するためのプライマー（例えば、対立遺伝子特異的プライマー）を設計するためにも有用である。
【０１０５】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ＳＮＰ検出試薬は、単離もしくは合成されたＤＮＡまたはＲＮＡのポリヌクレオチドプローブ、またはプライマー、またはＰＮＡオリゴマー、またはＤＮＡ、ＲＮＡおよび／もしくはＰＮＡの組合せであり、表１および／または表２に同定されたＳＮＰを含有する標的核酸分子のセグメントに対してハイブリダイズする。ポリヌクレオチドの形態の検出試薬は必要に応じて、改変塩基アナログ、インターカレート剤、または副溝の結合体を含み得る。プローブのような複数の検出試薬は、ＳＮＰ検出キットを形成するために、例えば、固体支持体（例えば、アレイもしくはビーズ）に付着させられるか、または溶液中にて供給され得る（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイ、もしくはプライマー伸長反応のような酵素反応のためのプローブ／プライマーセット）。
【０１０６】
プローブまたはプライマーは代表的には、精製されたオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーである。このようなオリゴヌクレオチドは、代表的に、ストリンジェントな条件下で、標的核酸分子の少なくとも約８個、約１０個、約１２個、約１６個、約１８個、約２０個、約２２個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１２０個（またはこれらの間のいずれか他の個数）またはこれ以上の連続するヌクレオチドに対してハイブリダイズする、相補的なヌクレオチド配列の領域を含む。特定のアッセイに依存して、その連続するヌクレオチドは、標的ＳＮＰ位置を含み得るか、あるいは所望されるアッセイを実施するためにＳＮＰ位置に十分に近い、５’側および／または３’側の特定の領域含み得るかのいずれかである。
【０１０７】
他の好ましいプライマー配列およびプローブ配列は、配列表および表１〜２に開示される転写産物配列（配列番号１〜５）、ゲノム配列（配列番号１６〜１９）およびＳＮＰコンテキスト配列（転写産物に基づいたコンテキスト配列が、配列番号１１〜１５として表１に提供され、ゲノムに基づいたコンテキスト配列が、配列番号２０〜３１として表２に提供される）を使用して容易に決定される。このようなプライマーおよびプローブが、本発明のＳＮＰの遺伝子型分類のための試薬として直接的に有用であり、任意のキット／システム形態へ組込まれ得ることは、当業者に明らかである。
【０１０８】
標的ＳＮＰ含有配列に特異的なプローブまたはプライマーを作製するために、目的のＳＮＰ周辺の遺伝子配列／転写産物配列および／またはコンテキスト配列が代表的には、そのヌクレオチド配列の５’末端または３’末端において開始する、コンピュータアルゴリズムを使用して調べられる。次いで代表的なアルゴリズムは、その遺伝子配列／ＳＮＰコンテキスト配列に特有である、規定された長さのオリゴマーを規定し、このオリゴマーは、ハイブリダイゼーションのために適切な範囲内のＧＣ含量を有し、ハイブリダイゼーションを妨げ得る推定二次構造を有さず、そして／または所望される他の特性を保有するか、あるいは、所望されない他の特質を欠く。
【０１０９】
本発明のプライマーまたはプローブは、代表的には、少なくとも約８ヌクレオチドの長さである。本発明の一実施形態において、プライマーまたはプローブは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、プライマーまたはプローブは、少なくとも約１２ヌクレオチドの長さである。より好ましい実施形態において、プライマーまたはプローブは、少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、または少なくとも約２５ヌクレオチドの長さである。プローブの最大長は、そのプローブが使用されるアッセイの型に依存して、検出される標的配列と同じ程度までの長さであり得るが、代表的には、約５０ヌクレオチド未満、約６０ヌクレオチド未満、約６５ヌクレオチド未満、または約７０ヌクレオチド未満の長さである。プライマーの場合には、その最大長は、代表的には、約３０ヌクレオチド未満の長さである。本発明の具体的な好ましい実施形態において、プライマーまたはプローブは、約１８ヌクレオチド〜約２８ヌクレオチドの長さの範囲内にある。しかし、他の実施形態（例えば、核酸アレイ、およびプローブが基材に付着する他の実施形態）において、上記プローブは、より長い（例えば、３０〜７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド以上の長さ）ものであり得る（以下の「ＳＮＰ検出キットおよびシステム」と題する節を参照のこと）。
【０１１０】
ＳＮＰを解析するために、選択的ＳＮＰ対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを使用することが、適切であり得る。標的配列における単一ヌクレオチド変化を検出するそのようなオリゴヌクレオチドは、「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」、「対立遺伝子特異的プローブ」または「対立遺伝子特異的プライマー」のような用語によって呼ばれ得る。多型を解析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｔｔｏｎら編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ［１９９８］；Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４，１６３〜１６６［１９８６］；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ，ＥＰ２３５，７２６；およびＳａｉｋｉ，ＷＯ８９／１１５４８に記載される。
【０１１１】
各々の対立遺伝子特異的プライマーまたは対立遺伝子特異的プローブの設計は、変数（例えば、標的核酸分子中のＳＮＰ位置に隣接するヌクレオチド配列の正確な組成、ならびにそのプライマーまたはプローブの長さ）に依存するが、プライマーおよびプローブの使用における別の要因は、そのプローブまたはプライマーと、標的配列との間のハイブリダイゼーションが実施される条件のストリンジェンシーである。より高いストリンジェンシー条件は、より低いイオン強度の緩衝液および／またはより高い反応温度を利用し、そして安定な二重鎖を形成するためには、プローブ／プライマーと標的配列との間のより完全な一致を必要とする傾向がある。しかし、そのストリンジェンシーが高すぎる場合、ハイブリダイゼーションは、全く生じない場合がある。対照的に、より低いストリンジェンシー条件は、より高いイオン強度の緩衝液および／またはより低い反応温度を利用し、そしてプローブ／プライマーと標的配列との間のよりミスマッチした塩基による安定な二重鎖の形成を可能にする。例としてであって限定としてではないが、対立遺伝子特異的プローブを使用する高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件についての例示的な条件は、以下の通りである：５×標準的生理食塩水リン酸ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．５％  ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）を含む溶液を用いる５５℃でのプレハイブリダイゼーション；同じ溶液中にある標的核酸分子とともに同じ温度でプローブをインキュベートすること、その後、２×ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液を用いて５５℃または室温で洗浄すること。
【０１１２】
中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が、例えば、約５０ｍＭ  ＫＣｌを含む溶液を用いて、約４６℃にて、対立遺伝子特異的プライマー伸長反応のために使用され得る。あるいは、上記反応は、高温（例えば、６０℃）にて実行され得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）反応（この反応において、２つのプローブが標的配列と完全に相補的な場合に、これら２つのプローブが連結される）のために適切な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１００ｍＭ  ＫＣｌの溶液を、温度４６℃にて利用し得る。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて、ある個体由来の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体由来の対応するセグメントには、その２つの個体由来の個々のＤＮＡセグメントにおける異なる多型形態（例えば、選択的ＳＮＰ対立遺伝子／ヌクレオチド）の存在に起因してハイブリダイズしない、対立遺伝子特異的プローブが、設計され得る。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における検出可能な有意な差異が存在し、好ましくは、本質的には二元の応答が存在し、それによって、プローブが対立遺伝子のうちの一方のみにハイブリダイズするかまたは一方の対立遺伝子に対して有意により強くハイブリダイズするに充分に、ストリンジェントであるべきである。プローブは、ＳＮＰ部位を含む標的配列にハイブリダイズしてそのＳＮＰ部位がそのプローブの配列に沿ったどこかに整列するように設計され得るが、そのプローブは、好ましくは、標的配列のセグメントにハイブリダイズして、そのＳＮＰ部位が、そのプローブの中心位置（例えば、そのプローブのいずれかの末端から少なくとも３ヌクレオチド離れているそのプローブ内の位置）と整列するように設計される。このプローブ設計は、一般的には、異なる対立遺伝子形態間でのハイブリダイゼーションにおける良好な識別を達成する。
【０１１４】
別の実施形態において、プローブまたはプライマーは、標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズして、そのＳＮＰがそのプローブまたはプライマーの最も５’側の末端または最も３’側の末端のいずれかと整列するように、設計され得る。オリゴヌクレオチド連結アッセイ（米国特許第４，９８８，６１７号）における使用のために特に適切な具体的な好ましい実施形態において、上記プローブの最も３’側のヌクレオチドは、その標的配列中のＳＮＰ位置と整列する。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーは、当該分野で周知の方法によって調製され得る。化学合成方法としては、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８：９０［１９７９］により記載されるホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８：１０９［１９７９］により記載されるホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９［１９８１］により記載されるジエチルホスホロアミデート法；および米国特許第４，４５８，０６６号に記載される固体支持体法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
対立遺伝子特異的プローブは、しばしば、対の状態で（または、より一般的ではないが、３個または４個の組の状態で（例えば、ＳＮＰ位置がそれぞれ３個または４個の対立遺伝子を有することが公知である場合、あるいは、標的ＳＮＰ対立遺伝子の核酸分子の両方の鎖をアッセイするために））使用され、そのような対は、そのＳＮＰ位置で対立遺伝子改変体を示す１ヌクレオチドミスマッチ以外は同一であり得る。一般的に、１つの対のうちの一方のメンバーは、より一般的なＳＮＰ対立遺伝子（すなわち、標的集団中においてより頻繁である対立遺伝子）を有する標的配列参照形態と完全に一致し、その対のうちのもう一方のメンバーは、より一般的ではないＳＮＰ対立遺伝子（すなわち、その標的集団において稀な対立遺伝子）を有する標的配列形態と完全に一致する。アレイの場合には、複数のプローブ対が、複数の異なる多型を同時に解析するために同じ支持体上に固定され得る。
【０１１７】
ある型のＰＣＲベースのアッセイにおいて、対立遺伝子特異的プライマーは、ＳＮＰ位置と重複し、そのプライマーが完全相補性を示す対立遺伝子形態の増幅のみをプライミングする、標的核酸分子上の領域にハイブリダイズする（Ｇｉｂｂｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：２４２７〜２４４８［１９８９］）。代表的には、それらのプライマーの最も３’側のヌクレオチドは、その標的核酸分子のＳＮＰ位置と整列し、かつそのＳＮＰ位置と相補的である。このプライマーは、遠位部位にてハイブリダイズする第２のプライマーと整列の結合に使用される。増幅は、これらの２つのプライマーから進行し、どの対立遺伝子形態が試験サンプル中に存在するかを示す検出可能な産物を生じる。コントロールが、通常、第２のプライマー対を用いて実施される。この第２のプライマー対のうちの一方は、その多型部位で一塩基ミスマッチを示し、この第２のプライマー対のうちのもう一方は、遠位部位に対して完全相補性を示す。この一塩基ミスマッチは、増幅を防止するかまたは増幅効率を実質的に減少させ、その結果、検出可能な産物が形成されないか、または検出可能な産物がより低量もしくはより低速度で形成される。上記の方法は、一般的には、そのミスマッチがそのオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置にある（すなわち、そのオリゴヌクレオチドの最も３’側の位置が、標的ＳＮＰ位置と整列する）場合に、最も効率的に作用する。なぜなら、この位置は、上記プライマーからの伸長に対して最も不安定であるからである（例えば、ＷＯ９３／２２４５６参照）。このＰＣＲベースのアッセイは、下記のＴａｑＭａｎアッセイの一部として利用され得る。
【０１１８】
本発明の具体的実施形態において、本発明のプライマーは、標的ＳＮＰを含む核酸分子のセグメントに対して実質的に相補的な配列を含み、但し、そのプライマーは、そのプライマーの最も３’側の末端にある３つのヌクレオチド位置のうちの１つにおいてミスマッチヌクレオチドを有し、その結果、そのミスマッチヌクレオチドは、そのＳＮＰ部位において特定の対立遺伝子と塩基対形成しない。好ましい実施形態において、上記プライマー中のミスマッチヌクレオチドは、そのプライマーの最も３’側の位置にある最後のヌクレオチドから２番目にある。より好ましい実施形態において、上記プライマー中のミスマッチヌクレオチドは、そのプライマーの最も３’側の位置にある最後のヌクレオチドである。
【０１１９】
本発明の別の実施形態において、本発明のＳＮＰ検出試薬は、検出可能なシグナルを発する蛍光発生レポーター色素で標識される。好ましいレポーター色素は、蛍光色素であるが、検出試薬（例えば、オリゴヌクレオチドまたはプライマー）に結合され得る任意のレポーター色素が、本発明における使用のために適切である。そのような色素としては、アクリジン、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ダブシル、エダンス、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、６−Ｆａｍ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｈｅｘ、オレゴングリーン、ローダミン、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、Ｔａｍｒａ、Ｒｏｘ、およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明のなお別の実施形態において、その検出試薬は、特に、その試薬が自己クエンチングプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ）（米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，５３８，８４８号）または分子ビーコンプローブ（米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号）または他のステムレスプローブもしくは直鎖状ビーコンプローブ（Ｌｉｖａｋら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌ．４：３５７〜３６２［１９９５］；Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３〜３０８［１９９６］；Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５１６〜２５２１［１９９７］；米国特許第５，８６６，３３６号および同第６，１１７，６３５号）として使用される場合に、クエンチャー色素（例えば、Ｔａｍｒａ）でさらに標識され得る。
【０１２１】
本発明の検出試薬はまた、他の標識（ストレプトアビジン結合のためのビオチン、抗体結合のためのハプテン、および別の相補的オリゴヌクレオチド（例えば、ジップコードの対）に結合するためのオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１２２】
本発明はまた、本明細書中で同定されたＳＮＰヌクレオチドを含まない（またはそのＳＮＰヌクレオチドと相補的である）が、本明細書中に開示される１つ以上のＳＮＰをアッセイするために使用される、試薬も企図する。例えば、本明細書中に提供される標的ＳＮＰ位置に隣接はするが直接的にはハイブリダイズしないプライマーが、それらのプライマーが、その標的ＳＮＰ位置と近接する（すなわち、その標的ＳＮＰ部位から１ヌクレオチド以上以内にある）領域にハイブリダイズプライマー伸長反応において、有用である。そのプライマー伸長反応の間に、プライマーは、代表的には、特定のヌクレオチド（対立遺伝子）が標的ＳＮＰ部位に存在する場合にはその標的ＳＮＰ部位を過ぎては伸長できず、そのプライマー伸長産物は、ＳＮＰ対立遺伝子がどの標的ＳＮＰ部位に存在するかを決定するために容易に検出され得る。例えば、特定のｄｄＮＴＰが、一旦ｄｄＮＴＰが上記伸長産物（その最も３’側の末端にｄｄＮＴＰを含み、そのｄｄＮＴＰが本明細書中に開示されるＳＮＰのヌクレオチドである、プライマー伸長産物は、本発明により具体的に企図される組成物である）に組み込まれるとプライマー伸長を終結させるために、上記プライマー伸長反応において使用される。従って、ＳＮＰ部位に近接する領域中の核酸分子に結合し、そして、ＳＮＰ部位のアッセイのために使用される試薬は、結合した配列はそのＳＮＰ部位自体を必ずしも含まないけれども、これもまた本発明によって企図される。
【０１２３】
（ＳＮＰ検出キットおよびＳＮＰ検出システム）
当業者は、本明細書中に開示されるＳＮＰおよび関連する配列情報に基づいて、検出試薬が、本発明の任意のＳＮＰを個別にかまたは組み合わせてアッセイするために開発および使用され得、そのような検出試薬は、当該分野で周知である確立されたキット形態またはシステム形態のうちの１つに容易に組み込まれ得ることを、認識する。用語「キット」および「システム」とは、本明細書中でＳＮＰ検出試薬の文脈で使用される場合、複数のＳＮＰ検出試薬の組み合わせ、または１つ以上の他の型のエレメントまたは構成要素（例えば、他の型の生化学試薬、容器、パッケージ（例えば、市販用に意図されるパッケージング）、ＳＮＰ検出試薬が結合している基材、電子ハードウェア構成要素など）と組み合わせた１種以上のＳＮＰ検出試薬のようなものを指す。従って、本発明は、ＳＮＰ検出キットおよびＳＮＰ検出システム（パッケージされたプローブとプライマーとの組（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーの組）、核酸分子のアレイ／マイクロアレイ、および本発明の１種以上のＳＮＰを検出するための１種以上のプローブ、プライマー、または他の検出試薬を含むビーズが挙げられるが、これらに限定されない）をさらに提供する。上記キット／システムは、種々の電子ハードウェア構成要素を必要に応じて含み得る。例えば、種々の製造業者により提供されるアレイ（「ＤＮＡチップ」）および微小流体システム（「ラボ・オン・ア・チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」システム）は、代表的には、ハードウェア構成要素を含む。上記キット／システム（例えば、プローブ／プライマーの組）は、電子ハードウェア構成要素を含まないかもしれないが、例えば、１つ以上の容器中にパッケージングされた１種以上のＳＮＰ検出試薬を（必要に応じて、他の生化学試薬とともに）含み得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ＳＮＰ検出キットは、代表的には、１種以上の検出試薬と、アッセイまたは反応（例えば、ＳＮＰ含有核酸分子の増幅および／または検出）を実行するための必要な他の構成要素（例えば、緩衝液、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼもしくはリガーゼ）、鎖伸長ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸）、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応の場合には鎖終結ヌクレオチド、ポジティブコントロール配列、ネガティブコントロール配列など）を含む。キットは、標的核酸の量を決定するための手段、およびその量を標準物と比較するための手段をさらに含み得る。キットは、そのキットを使用して目的のＳＮＰ含有核酸分子を検出するための指示書を含み得る。本発明の一実施形態において、１種以上のアッセイを実行して本明細書中に開示される１種以上のＳＮＰを検出するための必要試薬を含むキットが、提供される。本発明の好ましい実施形態において、ＳＮＰ検出キット／システムは、核酸アレイの形態、または区画分けされたキット（微小流体システム／ラボ・オン・ア・チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）システムを含む）の形態である。
【０１２５】
ＳＮＰ検出キット／システムは、例えば、各標的ＳＮＰ位置またはその付近にある核酸分子にハイブリダイズする１つ以上のプローブまたはプローブ対を含み得る。複数の対立遺伝子特異的プローブ対が、多数のＳＮＰを同時にアッセイするためにこのキット／システム中に含まれ得る。上記多数のＳＮＰのうちの少なくとも１つは、本発明のＳＮＰである。いくつかのキット／システムにおいて、上記対立遺伝子特異的プローブは、基材（例えば、アレイまたはビーズ）に固定される。例えば、同じ基材は、表１および／または表２に示されるＳＮＰのうちの少なくとも１個、１０個、１００個、１０００個、１０，０００個、１００，０００個（もしくはこれらの間の他の任意の個数）または実質的にすべてを検出するための、対立遺伝子特異的プローブを含み得る。
【０１２６】
用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、および「ＤＮＡチップ」とは、基材（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ナイロン、または他の型の膜、フィルター、チップ、もしくは他の適切な固体支持体）に付着された、別個のポリヌクレオチド群を指すために本明細書中で互換可能に使用される。上記ポリヌクレオチドは、上記基材上で直接合成され得るか、または上記基材とは別個に合成された後で上記基材に付着される。一実施形態において、上記マイクロアレイは、米国特許第５，８３７，８３２号（Ｃｈｅｅら）、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５（Ｃｈｅｅら）、Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５〜１６８０［１９９６］）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４〜１０６１９［１９９６］）（これらすべては、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載される方法に従って、調製されそして使用される。他の実施形態において、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号により記載される方法により生成される。
【０１２７】
核酸アレイは、以下の参考文献中に概説されている：Ｚａｍｍａｔｔｅｏら「Ｎｅｗ  ｃｈｉｐｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．８：８５〜１０１（２００２）；Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら「Ａｃｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｇｅｎｅｔ．１２（４）：１８１〜９２（２００２年１２月）；Ｈｅｌｌｅｒ「ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｄｅｖｉｃｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．４：１２９〜５３（２００２）、電子出版２００２年３月２２日；Ｋｏｌｃｈｉｎｓｋｙら「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＳＮＰｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｉｐｓ」Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．１９（４）：３４３〜６０（２００２年４月）；およびＭｃＧａｌｌら「Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｅｎｅｃｈｉｐ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｒｒａｙｓ」Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２１〜４２（２００２）。
【０１２８】
多数のプローブ（例えば、対立遺伝子特異的プローブ）が、アレイにおいて実施され得、各プローブまたはプローブ対は、異なるＳＮＰ位置にハイブリダイズし得る。ポリヌクレオチドプローブの場合、これらのプローブは、光指向性化学プロセスを使用して、基材上の指定領域で合成され得る（かまたは、別個に合成され得、その後、指定領域に付着され得る）。各ＤＮＡチップは、格子様パターンで整列され（例えば、１０セント銀貨の大きさまで）小型化された、例えば、数千〜数億個の個々の合成ポリヌクレオチドプローブを含み得る。好ましくは、プローブは、順序立ったアドレス指定可能なアレイ状に固体支持体に付着される。
【０１２９】
マイクロアレイは、固体支持体に付着した多数の独特の一本鎖ポリヌクレオチド（通常は、合成アンチセンスポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡフラグメントのいずれか）から構成され得る。代表的なポリヌクレオチドは、好ましくは、約６ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは約１８ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さである。特定の型のマイクロアレイまたは他の検出キット／システムについて、ほんの約７ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドを使用することが、好ましくあり得る。他の型のアレイ（例えば、化学発光検出技術と組み合わせて使用されるアレイ）において、好ましいプローブの長さは、例えば、約１５ヌクレオチド〜８０ヌクレオチドの長さ、好ましくは約５０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約５５ヌクレオチド〜６５ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約６０ヌクレオチドの長さであり得る。このマイクロアレイまたは検出キットは、遺伝子／転写産物または標的ＳＮＰ部位の既知の５’配列または３’配列を網羅するポリヌクレオチド；遺伝子／転写産物の全長配列を網羅する連続するポリヌクレオチド；または標的遺伝子／転写産物配列の長さに沿った特定の領域（特に、表１および／または表２に開示される１つ以上のＳＮＰに対応する領域）から選択される独特のポリヌクレオチドを含み得る。上記マイクロアレイまたは検出キットにおいて使用されるポリヌクレオチドは、目的のＳＮＰに対して特異的（例えば、標的ＳＮＰ部位の特定のＳＮＰ対立遺伝子に対して特異的、または複数の異なるＳＮＰ部位にある特定のＳＮＰ対立遺伝子に対して特異的）であり得るか、あるいは目的の多型遺伝子／転写産物に対して特異的であり得る。
【０１３０】
ポリヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、完全に一致する標的配列改変体およびミスマッチ標的配列改変体に対する、上記プローブのハイブリダイゼーション安定性の差異に依存する。ＳＮＰ遺伝子型決定のために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用されるストリンジェンシー条件は、１ＳＮＰ位置程度にしか互いと異ならない核酸分子が区別され得るのに充分に高いことが、一般的には好ましい（例えば、代表的ＳＮＰハイブリダイゼーションアッセイが、１つの特定のヌクレオチドがＳＮＰ位置に存在する場合にハイブリダイゼーションが生じるが、代替的ヌクレオチドがそのＳＮＰ位置に存在する場合にはハイブリダイゼーションは生じないように、設計される）。そのような高いストリンジェンシーの条件は、例えば、ＳＮＰ検出のために対立遺伝子特異的プローブの核酸アレイを使用する場合に、好ましくあり得る。そのような高いストリンジェンシーの条件は、先の節において記載されており、当業者にとって周知であり、そして例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６．３．１〜６．３．６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）において見出され得る。
【０１３１】
他の実施形態において、上記アレイは、化学発光検出技術と組み合わせて使用される。以下の特許および特許出願（これらはすべて、本明細書により参考として援用される）は、化学発光検出に関するさらなる情報を提供する：米国特許出願１０／６２０３３２および同１０／６２０３３３は、マイクロアレイ検出のための化学発光アプローチを記載し、米国特許第６１２４４７８号、同第６１０７０２４号、同第５９９４０７３号、同第５９８１７６８号、同第５８７１９３８号、同第５８４３６８１号、同第５８００９９９号、および同第５７７３６２８号は、化学発光検出を実施するためのジオキセタンの方法および組成物を記載し；公開された米国出願ＵＳ２００２／０１１０８２８は、マイクロアレイコントロールのための方法および組成物を開示する。
【０１３２】
本発明の一実施形態において、核酸アレイは、約１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さのプローブのアレイを含み得る。さらなる実施形態において、核酸アレイは、多数のプローブを含み得、ここで、少なくとも１つのプローブは、表１および／もしくは表２において開示される１つ以上のＳＮＰを検出可能であり、かつ／または少なくとも１つのプローブは、表１、表２、配列表、およびそれらの相補的な配列に開示される配列からなる群より選択される配列のうちの１つのフラグメントを含み、そのフラグメントは、少なくとも約８個連続するヌクレオチド（好ましくは、１０個、１２個、１５個、１６個、１８個、２０個、より好ましくは２２個、２５個、３０個、４０個、４７個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、８０個、９０個、１００個（またはこれらの間の他の任意の個数）以上連続するヌクレオチドを含み、かつ表１および／または表２において開示される新規なＳＮＰ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記ＳＮＰ部位に対して相補的なヌクレオチドは、上記プローブの中心から５ヌクレオチド内、４ヌクレオチド内、３ヌクレオチド内、２ヌクレオチド内、または１ヌクレオチド内、より好ましくは上記プローブの中心にある。
【０１３３】
ポリヌクレオチドプローブは、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら）（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載されるように、化学カップリング手順およびインクジェット適用装置を使用することによって、基材表面上で合成され得る。別の局面において、ドット（またはスロット）ブロットと類似する「格子状」アレイが、真空系、熱的結合手順、ＵＶ結合手順、機械的結合手順、または化学結合手順を使用して、基材表面にｃＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを整列させて結合するために使用され得る。アレイ（例えば、上記のアレイ）は、手によってか、あるいは利用可能なデバイス（スロットブロット装置またはドットブロット装置）、材料（適切な任意の固体支持体）、および機器（ロボット機器を含む）を使用することによって、生成され得、そして８個、２４個、９６個、３８４個、１５３５個、６１４４個以上のポリヌクレオチド、または市販の機器の効率的な使用のために適する他の任意の数のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１３４】
そのようなアレイまたは他のキット／システムを使用して、本発明は、試験サンプル中にある本明細書中に開示されるＳＮＰを同定するための方法を提供する。そのような方法は、代表的には、試験核酸サンプルを、本発明の少なくとも１つのＳＮＰ位置に対応する１つ以上のプローブを含むアレイとともにインキュベートする工程、ならびに上記試験サンプル由来の核酸と上記プローブのうちの１つ以上との結合についてアッセイする工程を包含する。ＳＮＰ検出試薬（またはそのような１種以上のＳＮＰ検出試薬を使用する、キット／システム）を、インキュベーション条件は、上記アッセイにおいて使用される形式、使用される検出方法、ならびに上記アッセイにおいて使用される検出試薬の型および性質に依存する。当業者は、市販のハイブリダイゼーション形式、増幅形式、およびアレイアッセイ形式のうちのいずれか１つが、本明細書中に開示されるＳＮＰを検出するために容易に適合され得ることを、認識する。
【０１３５】
本発明のＳＮＰ検出キット／システムは、ＳＮＰ含有核酸分子の後の増幅および／または検出のために、試験サンプルから核酸を調製するために使用される構成要素を含み得る。そのようなサンプル調製構成要素は、任意の体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、粘液質、胃液、精液、涙、汗など）、皮膚、毛髪、細胞（特に、有核細胞）、生検、口腔スワブまたは組織標本からの、核酸抽出物（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む）、タンパク質抽出物もしくは膜抽出物を生成するために使用され得る。上記の方法において使用される試験サンプルは、上記アッセイ形式、上記検出方法の性質、およびアッセイされるべき試験サンプルとして使用される具体的な組織、細胞、または抽出物に基づいて、変化する。核酸抽出物、タンパク質抽出物、および細胞抽出物を調製する方法は、当該分野で周知であり、利用されるシステムと適合するサンプルを得るために容易に適合され得る。試験サンプルから核酸を抽出するための自動サンプル調製システムは、市販されており、その例は、ＱｉａｇｅｎのＢｉｏＲｏｂｏｔ  ９６００、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＲＩＳＭ  ６７００、およびＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＳｙｓｔｅｍｓのＣＯＢＡＳ  ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍである。
【０１３６】
本発明により企図される別の形態のキットは、区画分けされたキットである。区画分けされたキットは、試薬が別個の容器中に含まれる任意のキットを包含する。そのような容器としては、例えば、小さいガラス容器、プラスチック容器、プラスチック片、ガラス片、または紙片、またはアレイ形成材料（例えば、シリカ）が挙げられる。そのような容器によって、試験サンプルおよび試薬が相互混入しないようにある区画から別の区画へと試薬を効率的に移動することが可能であるか、またはある区画からそのキット中に含まれない別の容器に移動することが可能であり、各容器の薬剤または溶液は、ある区画から別の区画または別の容器へと、定量的様式で添加され得る。そのような容器としては、例えば、試験サンプルを受容する１つ以上の容器、本発明の１つ以上のＳＮＰを検出するための少なくとも１つのプローブまたは他のＳＮＰ検出試薬を含む１つ以上の容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を含む１つ以上の容器、および結合したプローブまたは他のＳＮＰ検出試薬の存在を明らかにするために使用される試薬を含む１つ以上の容器が、挙げられ得る。上記キットは、例えば、核酸増幅反応または他の酵素反応（例えば、プライマー伸長反応）、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、電気泳動（好ましくは、キャピラリー電気泳動）、質量分析法、および／またはレーザー誘導蛍光検出のための、区画および／もしくは試薬を必要に応じてさらに含み得る。上記キットはまた、そのキットを使用するための指示書を備え得る。例示的な区画分けされたキットとしては、当該分野で公知の微小流体デバイス（例えば、Ｗｅｉｇｌら「Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２４，５５［３］：３４９〜７７［２００３年２月］参照）が挙げられる。そのような微小流体デバイスにおいて、上記容器は、例えば、微小流体「容器」、微小流体「チャンバ」、または微小流体「チャネル」と呼ばれ得る。
【０１３７】
マイクロ流体デバイスは、「ラボ・オン・ア・チップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」システムとも称され得、生物医学的なマイクロ電気機械システム（ｂｉｏＭＥＭ）または多構成要素一体型システムは、ＳＮＰを解析するための本発明の典型的なキット／システムである。このようなシステムは、単一の機能性デバイスにおいてプローブ／標的ハイブリダイゼーション、核酸増幅、およびキャピラリー電気泳動法の反応のような過程を縮小化および分画化する。このようなマイクロ流体デバイスは代表的に、システムの少なくとも１つの局面において検出試薬を利用し、そしてこのような検出試薬は使用され、本発明の一以上のＳＮＰを検出し得る。マイクロ流体システムの１つの例は、米国特許第５，５８９，１３６号に開示され、この開示はチップにおいてＰＣＲ増幅の統合およびキャピラリー電気泳動が記載される。典型的なマイクロ流体システムは、マイクロチップ上に含まれるガラス、シリコン、石英、またはプラスチックのウエハ上に設計されるマイクロチャネルのパターンを含む。サンプルの移動は、電気、電気浸透性、または流体静力学の力によって制御され得、この力は、機能的顕微鏡バルブおよび可動部分を伴わないポンプを作成するためにマイクロチップの異なる範囲にわたって適用される。電圧の変化は、マイクロ機械加工されたチャネル間の交点で液体の流動を制御する方法およびマイクロチップの異なるセクションにわたりポンプ注入するための液体流量を変化させるための方法として使用され得る。例えば、米国特許第６，１５３，０７３号（Ｄｕｂｒｏｗら）および同第６，１５６，１８１号（Ｐａｒｃｅら）を参照のこと。
【０１３８】
ＳＮＰを遺伝子型決定するために、典型的なマイクロ流動システムは、例えば、核酸増幅、プライマー伸長、キャピラリー電気泳動、およびレーザー光誘導蛍光検出のような検出方法を統合し得る。このような典型的なシステムを使用するための典型的なプロセスの最初の工程において、核酸サンプルは、好ましくはＰＣＲによって増幅される。次いで、増幅産物は、ｄｄＮＴＰ（各ｄｄＮＴＰに対して特異的な蛍光）および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する自動プライマー伸長反応に供され標的ＳＮＰのちょうど上流にハイブリダイズするプライマー伸長反応を実施する。３’末端において伸長が一旦完了すると、このプライマーは、キャピラリー電気泳動によって組込まれていない蛍光ｄｄＮＴＰから分離される。キャピラリー電気泳動に使用される分離培地は、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールまたはデキストランであり得る。単一のヌクレオチドプライマーの伸長産物中に組込まれたｄｄＮＴＰは、レーザー光誘導蛍光検出によって同定される。このような典型的なマイクロチップが、使用され例えば、少なくとも９６サンプル〜３８４サンプル、またはそれ以上が同時に処理され得る。
【０１３９】
（核酸分子の使用）
本発明の核酸分子は、特にアルツハイマー病症の診断および処置において種々の用途を有する。例えば、核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、転写産物、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡまたは他の核酸分子においてＳＮＰを遺伝子型決定するために、ならびに全長ｃＤＮＡおよび表１に開示される改変体ペプチドをコードするゲノムクローンおよびそのオーソログを単離するために有用である。
【０１４０】
プローブは、表１および／または表２に提供される核酸分子の全長に沿って任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。好ましくは本発明のプローブは、表１および／または表２に示されるＳＮＰ位置を含む標的配列の領域にハイブリダイズする。より好ましくは、プローブは、配列特異的な様式でＳＮＰ含有標的配列にハイブリダイズし、その結果、標的配列を、どのヌクレオチドがＳＮＰ部位に存在するかによって標的配列と異なる他のヌクレオチド配列とを識別する。このようなプローブは、試験サンプル中のＳＮＰ含有核酸の存在を検出するために、またはどのヌクレオチド（対立遺伝子）が、特定のＳＮＰ部位に存在するかを決定する（すなわち、ＳＮＰ部位の遺伝子型決定）ために特に有用である。
【０１４１】
核酸のハイブリダイゼーションプローブは、核酸発現の存在、レベル、形態、および／または分布を決定するために使用され得る。レベルが決定される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。従って、本明細書中に記載されるＳＮＰに特異的なプローブが、使用され所定の細胞、組織、または生物において存在、発現および／または遺伝子のコピー数を調べ得る。これらの用途は、正常なレベルに対する遺伝子発現の増加または減少に関連する障害の診断に関連する。ｍＲＮＡ検出のためのインビトロ技術としては、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンブロットハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［２０００］）。
【０１４２】
プローブは、例えば、被験体に由来する細胞のサンプルにおいて改変タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルを測定することによって、またはポリヌクレオチドが、目的のＳＮＰを含有するか否かを決定することによって、改変タンパク質が発現される細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用され得る。
【０１４３】
従って、本発明の核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され本明細書中に開示されるＳＮＰを検出し得、それによって多型を有する個体が、アルツハイマー病症の危険性にあるか否か、または初期段階のアルツハイマー病症に罹っているか否かを決定し得る。疾患の表現型に関連するＳＮＰの検出は、活性な疾患および／または疾患に対する遺伝的な素因についての診断ツールを提供する。
【０１４４】
さらに、本発明の核酸分子は、それゆえに、本明細書中に開示されるＳＮＰを含む遺伝子（例えば、遺伝子情報は表２に開示される）および／または、発現されるｍＲＮＡ転写産物分子のようなこのような遺伝子の産物（例えば、転写産物の情報は表１に開示される）を検出するために有用であり、したがって、遺伝子発現を検出するのに有用である。核酸分子は、必要に応じて、例えば、遺伝子発現を検出する際に使用するためのアレイまたはキットの様式で実施され得る。
【０１４５】
本発明の核酸分子はまた、核酸分子の任意の所定領域、特に表１および／または表２に同定されるＳＮＰ含有領域を増幅するためのプライマーとしても有用である。
【０１４６】
本発明の核酸分子はまた、組換えベクターを構築するためにも有用である（以下により詳細に記載される）。このようなベクターとしては、表１に提供される任意の改変ペプチド配列の一部または全体を発現する発現ベクターが挙げられる。ベクターはまた、例えば細胞のゲノムのような別の核酸分子配列へ組み込むために使用され、遺伝子および／または遺伝子産物のインサイチュでの発現を変化させる、挿入ベクターも含む。例えば、内因性のコード配列は、相同組換えを介して、一以上の特異的に導入されたＳＮＰを含有するコード領域の全体または一部分と置換され得る。
【０１４７】
本発明の核酸分子はまた、改変タンパク質の抗原部分、特に、表１および／または表２に開示されるＳＮＰによって生じる改変アミノ酸配列（例えば、アミノ酸置換）を含む抗原部分を発現するのにも有用である。
【０１４８】
本発明の核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調節領域を含むベクターを構築するのにも有用である。
【０１４９】
本発明の核酸分子はまた、本明細書中に記載されるＳＮＰ含有核酸分子に由来する発現されたｍＲＮＡ分子の全体または一部分に対応するリボザイムを設計するのにも有用である。
【０１５０】
本発明の核酸分子はまた核酸分子および改変ペプチドの一部分または全体を発現する宿主細胞を構築するのにも有用である。
【０１５１】
本発明の核酸分子はまた、核酸分子および改変ペプチドの全体または一部分を発現するトランスジェニック動物を構築するためにも有用である。表１および／または表２に開示されるＳＮＰを含有する核酸分子を有する組換え細胞およびトランスジェニック動物の産生は、例えば、処置化合物および投薬レジメンの効果的な臨床設計を可能とする。
【０１５２】
本発明の核酸分子はまた、例えば、核酸の発現を調節する化合物を同定するための薬物スクリーニングのアッセイにおいても有用である。
【０１５３】
本発明の核酸分子はまた、細胞が異常な遺伝子発現をしている患者の遺伝子治療においても有用である。従って、エキソビボで操作されそして患者に戻された患者の細胞を含む組換え細胞は、個体へ導入され、ここで組換え細胞は、所望されるタンパク質を産生し個体を処置する。
【０１５４】
（ＳＮＰ遺伝子決定方法）
どの特定のヌクレオチド（すなわち対立遺伝子）が、一以上のＳＮＰ位置の各々に存在するかを決定するプロセス（例えば、表１および／または表２に開示される核酸分子のＳＮＰ位置）は、ＳＮＰ遺伝子型決定と称される。本発明は、アルツハイマー病もしくは関連病理についてのスクリーニングまたはその素因の決定、または処置形態に対する応答性の決定、あるいはゲノムマッピングまたはＳＮＰ関連性解析などにおいて用途のための、ＳＮＰ遺伝子型決定の方法を提供する。
【０１５５】
核酸サンプルは、当該分野において周知の方法によって遺伝子型決定され、どの対立遺伝子が、目的の任意の所定遺伝子領域（例えば、ＳＮＰ位置）に存在するかを決定し得る。隣接する配列が、オリゴヌクレオチドプローブのようなＳＮＰ検出試薬を設計するために使用され得、このプローブは必要に応じてキットの形式で与えられ得る。代表的なＳＮＰ遺伝子型決定方法は、Ｃｈｅｎら、「Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｃｏｓｔ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ．３（２）：７７−９６（２００３）；Ｋｗｏｋら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５（２）：４３−６０（２００３年４月）；Ｓｈｉ、「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ」、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２（３）：１９７−２０５（２００２）；およびＫｗｏｋ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２：２３５−５８（２００１）に記載される。ハイスループットのＳＮＰ遺伝子型決定についての代表的な技術は、Ｍａｒｎｅｌｌｏｓ、「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＳＮＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．６（３）：３１７−２１（２００３年５月）に記載される。一般的なＳＮＰ遺伝子型決定方法としては、ＴａｑＭａｎアッセイ、分子ビーコンアッセイ、核酸アレイ、対立遺伝子特異的なプライマー伸長、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、配列されたプライマー伸長、均質なプライマーの伸長アッセイ、質量分析法による検出を伴うプライマー伸長、高熱配列決定（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、遺伝子アレイで選別される複合プライマーの伸長、周期的増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ）を伴うライゲーション、均質なライゲーション、ＯＬＡ（米国特許第４，９８８，１６７号）、遺伝子アレイで選別される複合ライゲーション反応、制限断片長の多型、一塩基の伸長タグアッセイおよびインベーダーアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は、例えば、発光または化学発光の検出、蛍光検出、時間分解型蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー伝達、蛍光偏光、質量分析、および電気検出のような検出機構と組み合わせて用いられ得る。
【０１５６】
多型を検出するための種々の方法としては、切断因子からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖においてミスマッチの塩基を検出するために使用される方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２［１９８５］；Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ８５：４３９７［１９８８］およびＳａｌｅｅｂａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５［１９９２］）、改変体および野生型の核酸分子の電気泳動の移動度の比較（Ｏｒｉｔａら、ＰＮＡＳ  ８６：２７６６［１９８９］；Ｃｏｔｔｏｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４［１９９３］；およびＨａｙａｓｈｉら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９［１９９２］）ならびに変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおいて多型フラグメントまたは野生型フラグメントの移動をアッセイすること（Ｍｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５［１９８５］）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の位置での配列の変化はまた、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１保護のような、ヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学切断法によっても調べられ得る。
【０１５７】
好ましい実施形態において、ＳＮＰ遺伝子型決定は、５’ヌクレアーゼアッセイとしても公知であるＴａｑＭａｎアッセイを用いて実施される（米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，５３８，８４８号）。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＰＣＲの間に特定の増幅産物の蓄積を検出する。ＴａｑＭａｎアッセイは、蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素を用いて標識されたオリゴヌクレオチドプローブを利用する。レポーター色素は、適切な波長での放射線照射によって励起され、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）と呼ばれるプロセスを介して同一のプローブ中のクエンチャー色素へエネルギーを伝達する。このプローブへ取り付けられた場合、励起されたレポーター色素は、シグナルを放射しない。インタクトなプローブにおけるクエンチャー色素とレポーター色素との近さは、レポーターについての減少した蛍光を維持する。レポーター色素およびクエンチャー色素は、それぞれ最も５’側の末端および最も３’側の末端に有っても、その逆であってもよい。あるいは、レポーター色素は、最も５’側の末端または最も３’側の末端にあり得、一方で、クエンチャー色素は、内部のヌクレオチドに結合される（またはこの逆もあり得る）。さらに別の実施形態において、レポーターおよびクエンチャーの両方が、互いに間隔を空けて内部のヌクレオチドへ結合され得、その結果レポーターの蛍光は、減少される。
【０１５８】
ＰＣＲの間、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、それによってレポーター色素とクエンチャー色素とを分離し、そして結果として、レポーターの蛍光の上昇を生じる。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の上昇を直接モニタリングすることにより検出される。ＤＮＡポリメラーゼは、プローブがＰＣＲの間に増幅される標的ＳＮＰ含有鋳型にハイブリダイズする場合にのみ、レポーター色素とクエンチャー色素との間のプローブを切断し、かつプローブは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在する場合にのみ、標的ＳＮＰ部位にハイブリダイズするように設計されている。
【０１５９】
好ましいＴａｑＭａｎプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブの配列は、本明細書中で提供されるＳＮＰおよび関連する核酸配列情報を用いて、容易に決定され得る。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のようなコンピュータプログラムの多くは、最適なプライマー／プローブのセットを容易に得るために使用され得る。本発明のＳＮＰを検出するためのこのようなプライマーおよびプローブが、アルツハイマー病および関連する病理のための診断アッセイにおいて有用であり、かつキット形式に容易に組み込まれることが、当業者に明らかである。本発明はまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブ（米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号）ならびに他の改変形式（米国特許第５，８６６，３３６号および同第６，１１７，６３５号）の使用のような、当該分野において周知のＴａｑｍａｎアッセイの改変を含む。
【０１６０】
本発明のＳＮＰの遺伝型を決定するための別の好ましい方法は、ＯＬＡにおける２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用である（例えば、米国特許第４，９８８，６１７号を参照）。この方法において、１つのプローブは、その最も３’末端にＳＮＰ部位が整列した、標的核酸のセグメントにハイブリダイズする。第２のプローブは、標的核酸分子の第１のプローブのすぐ３’に隣接するセグメントにハイブリダイズする。２つの並列したプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズし、そして、もし第１のプローブの最も３’のヌクレオチドとＳＮＰ部位との間に完全な相補性があれば、リガーゼのような結合剤の存在下で連結される。ミスマッチがある場合、連結は起こらない。反応後、連結されたプローブは、標的核酸分子から分離され、そしてＳＮＰの存在の指標として検出される。
【０１６１】
以下の特許、特許出願、および公開されている国際特許出願は、全て、本明細書で参考により援用され、種々の形式のＯＬＡを実施するための技術に関するさらなる情報を提供する：米国特許第６０２７８８９号、同第６２６８１４８号、同第５４９４８１０号、同第５８３０７１１号、および同第６０５４５６４号は、ＳＮＰ検出を実施するためのＯＬＡストラテジーを記載する；ＷＯ  ９７／３１２５６およびＷＯ  ００／５６９２７は、ユニバーサルアレイを用いたＳＮＰ検出を実施するためのＯＬＡストラテジーを記載し、ここで、ジップコード配列は、ハイブリダイゼーションプローブの１つに導入され得、かつ結果として生じた産物（もしくは増幅産物）は、ユニバーサルジップコードアレイにハイブリダイズし得る；米国特許出願ＵＳ０１／１７３２９（および０９／５８４，９０５）は、ＯＬＡ（もしくはＬＤＲ）、続いてＰＣＲを記載し、ここで、ジップコードはＯＬＡプローブに組み込まれ、かつ増幅されたＰＣＲ産物は、電気泳動もしくはユニバーサルジップコードアレイ読み出し装置により決定される；米国特許出願６０／４２７８１８、同６０／４４５６３６および同６０／４４５４９４は、ＳＮＰｌｅｘ法およびＯＬＡに続くＰＣＲを用いた多重ＳＮＰ検出のためのソフトウェアを記載し、ここで、ジップコードは、ＯＬＡプローブに組み込まれ、かつ増幅されたＰＣＲ産物は、ジップシュート（ｚｉｐｃｈｕｔｅ）試薬とハイブリダイズし、かつＳＮＰの同定は、ジップシュートの電気泳動読み出し装置により決定される。いくつかの実施形態において、ＯＬＡは、ＰＣＲ（もしくは別の核酸増幅方法）の前に実施される。他の実施形態において、ＰＣＲ（もしくは他の核酸増幅方法）は、ＯＬＡの前に実施される。
【０１６２】
ＳＮＰを遺伝子型決定するための別の方法は、質量分析に基づく。質量分析は、ＤＮＡの４種のヌクレオチドの各々の固有の質量を利用する。ＳＮＰは、代替的なＳＮＰ対立遺伝子を有する核酸の質量の差異を測定することにより、質量分析によって明白に遺伝子型決定され得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析技術が、ＳＮＰのような分子質量のきわめて正確な決定のために好ましい。ＳＮＰ解析に対する数多くのアプローチが、質量分析に基づいて開発されている。好ましい質量分析に基づくＳＮＰを遺伝子型決定する方法は、プライマー伸長アッセイを含み、これも、従来のゲルに基づく形式およびマイクロアレイのような他の適用と組み合わせて利用され得る。
【０１６３】
代表的に、プライマー伸長アッセイは、標的ＳＮＰ部位から（５’）上流の鋳型ＰＣＲアプリコンに対する、プライマーの設計およびアニールを含む。ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）および／もしくはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物を、鋳型（例えば、ＰＣＲなどにより代表的に増幅されている、ＳＮＰ含有核酸分子）、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含有する反応混合物に添加する。プライマーの伸長は、混合物中のｄｄＮＴＰのうちの１つに対して相補的なヌクレオチドが生じる鋳型中の最初の部位で、終結する。プライマーは、ＳＮＰ部位に直接隣接する（すなわち、プライマーの３’末端のヌクレオチドは、標的ＳＮＰ部位の隣のヌクレオチドにハイブリダイズする）か、もしくはＳＮＰ部位から２つ以上のヌクレオチド離れているかのどちらかであり得る。プライマーが、標的ＳＮＰ部位から数ヌクレオチド離れている場合、唯一の制限は、プライマーの３’末端とＳＮＰ部位との間の鋳型配列が、検出されるべきものと同じ型のヌクレオチドを含まないこと、またはこのことが、伸長プライマーの未完成な終結を引き起こすことである。あるいは、全ての４種のｄｄＮＴＰのみが、ｄＮＴＰなしで反応混合物に添加される場合、プライマーは常に、標的ＳＮＰ部位に対応するただ１つのヌクレオチドにより伸長される。この場合、プライマーは、ＳＮＰ部位より１つ上流のヌクレオチドに結合するために設計される（すなわち、プライマーの３’末端のヌクレオチドは、標的ＳＮＰ部位の５’側で標的ＳＮＰ部位に直接隣接するヌクレオチドにハイブリダイズする）。ただ１つのヌクレオチドによる伸長は、伸長されるプライマーの全体の質量を最小にし、それにより、代替的なＳＮＰヌクレオチドの間の質量の差異の分解能を上昇させるので、ただ１つのヌクレオチドによる伸長が好ましい。さらに、非改変ｄｄＮＴＰのプライマー伸長反応に代えて、質量標識されたｄｄＮＴＰが用いられ得る。このことは、これらのｄｄＮＴＰにより伸長されたプライマーの間の質量の差異を上昇させ、それにより、上昇する感度および精度を提供し、そして特に、ヘテロ接合の塩基部位を決定するために有用である。質量標識はまた、集中的なサンプル調製手順の必要性を軽減し、そして質量分析の必要とされる分解能を低下させる。
【０１６４】
伸長されたプライマーは、次に精製され得、そして、標的ＳＮＰ部位に存在しているヌクレオチドの同一性を決定するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析され得る。分析の１つの方法において、プライマー伸長反応からの生成物は、マトリックスを形成する光吸収結晶と組み合わせられる。次に、このマトリックスは、核酸分子をイオン化し、そして気体相に脱着するために、レーザーのようなエネルギー源により打ち付けられる。次に、イオン化された分子は、飛行管内に放射され、そして加速されて検出器に向かってこの管を下る。レーザーパルスのようなイオン化現象と分子が検出器と衝突する間の時間は、その分子の飛行時間である。飛行時間は、イオン化された分子の電荷に対する質量比（ｍ／ｚ）と正確に相関する。より小さいｍ／ｚを有するイオンは、より大きいｍ／ｚを有するイオンよりも早くこの管を下って進行し、そしてそのため、このより軽いイオンは、より重いイオンの前に検出器に到達する。したがって、飛行時間は、対応する、かつ非常に正確なｍ／ｚに変換される。この様式で、ＳＮＰは、一塩基部分に異なるヌクレオチドを有する核酸分子において固有の、質量のわずかな差異、および対応する飛行時間の差異に基づいて同定され得る。ＳＮＰ遺伝子型決定のための、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析と関連するプライマー伸長反応アッセイの使用に関するさらなる情報については、例えば、Ｗｉｓｅら、「Ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１７（１１）：１１９５−２０２（２００３）を参照のこと。
【０１６５】
以下の参考は、ＳＮＰ遺伝子型決定のための質量分析に基づく方法を記載する、さらなる情報を提供する：Ｂｏｃｋｅｒ、「ＳＮＰ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｎｄ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１９  補遺１：Ｉ４４−Ｉ５３（２００３年７月）；Ｓｔｏｒｍら、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２１２：２４１−６２（２００３）；Ｊｕｒｉｎｋｅら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」、Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：５７−７４（２００２）；およびＪｕｒｉｎｋｅら、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ＭａｓｓＡｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１８７：１７９−９２（２００２）。
【０１６６】
ＳＮＰはまた、直接のＤＮＡ配列決定によっても評価され得る。種々の自動化配列決定手順が利用され得（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８［１９９５］）、これらとしては、質量分析による配列決定が挙げられる（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２［１９９６］；およびＧｒｉｆｆｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９［１９９３］を参照のこと）。本発明の核酸配列は、当業者がこのような自動化配列決定手順のための配列決定プライマーを容易に設計することを可能にする。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７、３１００、３７００、３７３０、および３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のような商業的な機器が、自動化配列決定のために、当該分野において一般的に使用される。
【０１６７】
本発明のＳＮＰの遺伝子型を決定するために使用され得る他の方法としては、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５（１９８５））。ＳＳＣＰは、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．に記載のように、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動度の変化により、塩基の差異を識別する。一本鎖ＰＣＲ産物は、二本鎖ＰＣＲ産物を加熱するか、もしくはそれ以外で変性させることにより生成され得る。一本鎖核酸は、塩基配列に部分的に依存する二次構造を、再び折りたたむか、もしくは形成し得る。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、ＳＮＰ部位の塩基配列の差異に関連する。ＤＧＧＥは、多型ＤＮＡに固有の異なる配列依存的安定性および融解特性、ならびに変性勾配ゲルにおける電気泳動移動度パターンの対応する差異に基づいて、ＳＮＰ対立遺伝子を識別する（「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第７章、Ｅｒｌｉｃｈ，Ｗ．Ｈ．（編）、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、［１９９２］）。
【０１６８】
配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）がまた、リボザイム切断部位の発生もしくは消失に基づいてＳＮＰを評価するために、使用され得る。完全にマッチする配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイによるか、もしくは融解温度の差異により、ミスマッチ配列と区別され得る。ＳＮＰが制限酵素切断部位に影響する場合、ＳＮＰは、制限酵素消化パターンの変化、およびゲル電気泳動により決定される核酸フラグメントの長さの対応する変化により確認され得る。
【０１６９】
ＳＮＰ遺伝子型決定は、例えば、ヒト被験体から生物学的サンプル（例えば、組織、細胞、流体、分泌物などのサンプル）を収集する工程、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは両方）を単離する工程、標的核酸領域のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、標的ＳＮＰを含む単離された核酸の領域に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーに、核酸を接触させる工程、そして、本発明のＳＮＰ部位に存在するヌクレオチドを決定する工程、または、いくつかのアッセイにおいては、増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程（アッセイは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在するか、もしくは存在しない場合にのみ、ハイブリダイゼーションおよび／もしくは増幅が生じるように設計され得る）を包含し得る。いくつかのアッセイにおいて、増幅産物の大きさは、検出され、そしてコントロールサンプルの長さと比較される；例えば、欠損および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物の大きさの変化により検出され得る。
【０１７０】
ＳＮＰ遺伝子型決定は、以下に記載のような数多くの実用的な適用のために有用である。このような適用の例としては、ＳＮＰ−疾患関連性解析、疾患素因スクリーニング、疾患診断、疾患予後判断、疾患経過モニタリング、個体の遺伝子型に基づく治療ストラテジーの決定（薬理ゲノミクス）、疾患もしくは薬物に対する応答の見込みに関連したＳＮＰ遺伝子型に基づく治療剤の開発、処置レジメンについての臨床試験のための患者母集団の層化、個体が治療剤により有害な副作用を経験する可能性の予測、ならびに法医学のようなヒトの確認適用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
（ＳＮＰと表現型形質との間の遺伝的関連性の解析）
疾患診断、疾患素因スクリーニング、疾患予後、薬物反応性の決定（薬理ゲノム学）、薬物毒性スクリーニングおよび本明細書中に記載される他の用途のためのＳＮＰ遺伝子型決定は、代表的に、１種以上の特定のＳＮＰと目的の特定の表現型形質との間の遺伝的関連性を最初に確立することに依存する。
【０１７２】
異なる研究設計が、遺伝的関連性研究のために使用され得る（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，６０９−６２２［１９９８］）。観察研究は最も頻繁に実施され、この研究において、患者の応答は妨害されない。第１の型の観察研究は、疾患の予測される原因が存在する人のサンプルと、予測される原因が存在しない人の別のサンプルを同定し、次いで、２つのサンプルにおける疾患の発症頻度が比較される。これらの標本抽出された集団はコホートと呼ばれ、この研究は、前向き研究である。他の型の観察研究は、症例−対照または後向き研究である。代表的な症例−対照研究において、サンプルは、疾患の特定の徴候のような目的の表現型を有する個体（症例）、および、結論が導かれる集団（標的集団）における表現型を有さない個体（対照）から、収集される。次いで、疾患の可能な原因が、過去に遡って調査される。症例−対照研究においてサンプルを収集する時間および費用が、前向き研究にかかるものよりもかなり少ないので、症例−対照研究は、少なくとも、探索および発見の段階の間、遺伝的関連の研究において、最も一般的に使用される研究設計である。
【０１７３】
両方の型の観察研究において、考慮されるべき強力な交絡因子が存在し得る。交絡因子は、疾患の実際の原因および疾患自体の両方に関連するものであり、そして、年齢、性別、民族性ならびに環境因子のような人口統計学的情報を含む。研究において、交絡因子が症例および対照で適合せず、そして、適切に制御されない場合、偽の関連結果が生じ得る。強力な交絡因子が同定される場合、これらは、以下に説明される解析方法により制御されるべきである。
【０１７４】
遺伝的関連研究において、試験されるべき目的の原因は、特定の対立遺伝子またはＳＮＰ、またはいくつかのＳＮＰからの対立遺伝子もしくはハプロタイプの組合せである。従って、標本抽出された個体からの組織生検（例えば、全血）が収集され得、ゲノムＤＮＡが、目的のＳＮＰについて遺伝子型決定される。目的の表現型形質に加えて、人口統計学的情報（例えば、年齢、性別、民族性など）、臨床的情報および環境的情報のような、形質の出現に影響を及ぼし得る他の情報が収集されて、サンプルセットをさらに特徴付け、そして定義し得る。多くの場合、これらの因子は、疾患および／またはＳＮＰ対立遺伝子頻度に関連することが知られている。見込みのある遺伝子−環境および／または遺伝子−遺伝子の相互作用もまた存在する。遺伝子−環境および遺伝子−遺伝子の相互作用に取り組むための解析方法（例えば、２つの異なる遺伝子における両方の感受性対立遺伝子の存在の効果が、２つの遺伝子における個々の対立遺伝子の効果を合わせたものよりも大きい可能性がある）は、以下に議論される。
【０１７５】
全ての関連する表現型および遺伝子型情報が得られた後、統計的解析を実施して、対立遺伝子または遺伝子型の存在と個体の表現型特徴との間に任意の有意な相関があるかどうかを決定する。好ましくは、遺伝的関連性についての統計的試験を実施する前に、データの検査および精選がまず実施される。サンプルの疫学的および臨床的データは、表およびグラフを用いて、記述統計学によりまとめられ得る。データの評価は、好ましくは、データの完成性、矛盾したエントリおよび異常値についてチェックするために実施される。次いで、χ二乗検定およびｔ検定（分布が正常でない場合は、ウィルソン順位和検定）を用いて、それぞれ、離散型変数および連続型変数についての症例と対照との間の有意差についてチェックし得る。遺伝子型決定の質を保証するために、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不平衡検定が症例および対照について別個に実施され得る。個々のマーカーについての症例および対照の両方におけるＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（ＨＷＥ）からの有意な偏差は、遺伝子型決定の誤差の指標であり得る。ＨＷＥがマーカーの大半で違反される場合、これは、さらに調査されるべき集団下部構造の指標となる。さらに、症例のみにおいて、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不平衡は、マーカーの疾患との遺伝的関連性を示唆し得る（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｅｉｒ  Ｂ．，Ｓｉｎａｕｅｒ［１９９０］）。
【０１７６】
単一のＳＮＰの対立遺伝子が、表現型形質の症例または対照の状態に関連するかどうかを試験するために、当業者は、症例および対照における対立遺伝子の頻度を比較し得る。標準的なχ二乗検定およびフィッシャーの正確検定が、２×２の表（２つのＳＮＰ対立遺伝子×２つの目的の分類形質における結果）について実施され得る。ＳＮＰの遺伝子型が関連するかどうかを試験するために、χ二乗検定が、３×２の表（３つの遺伝子型×２つの結果）について実施され得る。スコア検定がまた、遺伝子型関連性について実施され、症例および対照における３つの遺伝子型頻度（主なホモ接合型、ヘテロ接合型および少数のホモ接合型）を対照させ、そして、遺伝の３つの異なる様式、すなわち、優性（対比係数２，−１，−１）、相加的（対比係数１，０，−１）および劣性（対比係数１，１，−２）を用いて、傾向を探索する。少数の対立遺伝子  対  主要な対立遺伝子についてのオッズ比、ならびに、ヘテロ接合性改変体およびホモ接合性改変体  対  野生型の遺伝子型についてのオッズ比が、所望の信頼限界（通常は９５％）を用いて算出される。
【０１７７】
混同（ｃｏｎｆｏｕｎｄｅｒ）を制御し、交互作用および効果モディファイアを試験するために、人口統計学的情報（例えば、年齢、民族および性別）または交互作用する要素もしくは効果モディファイア（例えば、公知の主要遺伝子（例えば、アルツハイマー病についてのＡＰＯＥ、または自己免疫疾患についてのＨＬＡ））または環境因子（例えば、肺癌における喫煙）を含む、混乱を生じる可能性のある層化した因子を用いて、層化した解析が実施され得る。層化した関連試験は、０、１および２の改変体の対立遺伝子を有する遺伝子型の序数的性質を考慮に入れるＣｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定を用いて実施され得る。ＳｔａｔＸａｃｔによる完全検定（ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）がまた、計算的に可能な場合実施され得る。混乱モディファイア効果を調節し、交互作用について試験するための別の方法は、ＳＡＳまたはＲのような統計的パッケージを用いて、逐次重ロジスティック回帰解析を実施することである。ロジスティック回帰は、モデル構築技術であり、ここで、最もフィットし、かつ最も倹約な（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ）モデルが構築され、二分法の結果（例えば、特定の疾患を有するか否か）と、一連の独立した変数（例えば、別個の関連する遺伝子の遺伝子型、ならびに関連す得る人口統計学因子および環境因子）との間の関連を記述する。最も一般的なモデルは、オッズ比のロジット変換が、変数（主要効果）とそのクロス積項（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｔｅｒｍｓ）（交互作用）との一次結合（ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）として表されるものである（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ，Ｈｏｓｍｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｍｅｓｈｏｗ，Ｗｉｌｅｙ［２０００］）。特定の変数または交互作用が、結果と有意に関連するかどうかを試験するために、このモデルにおける係数をまず推定し、次いで、ゼロからのその逸脱（ｄｅｐａｒｔｕｒｅ）の統計的有意差について試験される。
【０１７８】
１つのマーカーについての関連性の検定を同時に実施することに加え、ハプロタイプ関連性解析がまた、互いに密接に連鎖される多数のマーカーを調べるために実施され得る。試験されるマーカーが、それ自体疾患を生じる変異ではないが、このような変異と連鎖不平衡である場合、ハプロタイプ関連性試験は、遺伝子型関連性試験または対立遺伝子関連性試験よりも強力であり得る。この試験は、なお、疾患が、実際に、ハプロタイプに関する対立遺伝子の組み合わせにより生じる場合により強力である（例えば、ＡＰＯＥは、互いに非常に密接している２つのＳＮＰにより形成されたハプロタイプである）。ハプロタイプ関連性を効果的に実施するために、マーカー−マーカー連鎖不平衡の指標（Ｄ’およびＲ２の両方）が、代表的には、ハプロタイプ構造を明らかにするために、遺伝子内のマーカーについて算出される。連鎖不平衡における最近の研究（Ｄａｌｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２９，２３２−２３５［２００１］）は、遺伝子内のＳＮＰが、ブロックパターンで組織化され、ブロック内に高い程度の連鎖不平衡が存在し、そして、ごくわずかの連鎖不平衡しかブロック間に存在しないことを示している。一旦これらが明らかにされると、疾患状態とのハプロタイプ関連性が、このようなブロックを用いて実施され得る。
【０１７９】
ハプロタイプ関連性試験は、対立遺伝子関連性試験および遺伝子型関連性試験と同じ様式で実施され得る。遺伝子における各ハプロタイプは、多対立遺伝子マーカーにおける対立遺伝子と類似する。当業者は、症例および対照におけるハプロタイプの頻度を比較するか、または、異なる対のハプロタイプとの遺伝的関連性を試験し得る。プログラム「ｈａｐｌｏ．ｓｃｏｒｅ」を用いて、ハプロタイプについてスコア試験がなされ得ることが提案されている（Ｓｃｈａｉｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７０，４２５−４３４［２００２］）。この方法において、ハプロタイプはまず、ＥＭアルゴリズムによって推測され、そして、他の因子の調節を可能にする一般化線形モデル（ＧＬＭ）フレームワークを用いて、スコア試験が実施される。
【０１８０】
遺伝的関連性試験の実施における重要な決定は、有意性レベルの決定であり、試験のＰ値がそのレベルに到達するときに、有意な関連性が示され得る。正のヒットがその後の確認試験において追跡される、探索解析において、調節されていないＰ値＜０．１（寛大な側の有意差レベル）が、ＳＮＰの、疾患の特定の表現型特徴との有意な関連性についての仮説を作成するために使用され得る。ＳＮＰが疾患と関連性を有するとみなされるためには、Ｐ値＜０．０５（当該分野で従来使用されている有意差レベル）が達成されることが好ましい。関連性が示されるためには、Ｐ値＜０．０１（厳密な側の有意差レベル）が達成されることがより好ましい。ヒットが、同じ供給源のより多くのサンプル、または、異なる供給源の異なるサンプルにおける確認解析において追跡される場合、複数の試験についての調節が、実験−ワイズ（ｗｉｓｅ）誤差率を０．０５に維持しつつ、過剰数のヒットを避けるように実施される。異なる種類の誤差率をコントロールするための複数の試験について調節するための異なる方法が存在するが、一般に使用されるがやや保守的な方法は、実験−ワイズ誤差率またはファミリー−ワイズ誤差率を制御するためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正である（Ｗｅｓｔｆａｌｌら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｅｓｔｓ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［１９９９］）。誤り発見率（ＦＤＲ）を制御するための並べ替え検定が、より強力であり得る（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  ５７，１２８９−１３００［１９９５］，Ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｗｅｓｔｆａｌｌ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｗｉｌｅｙ［１９９３］）。多様性を制御するためのこのような方法は、試験が依存的である場合に好まれ、誤り発見率の制御は、実験−ワイズ誤差率の制御と対抗するのに十分である。
【０１８１】
統計学的に有意なマーカーが探索段階で同定された後の、異なる集団に由来するサンプルを用いる再現研究において、次いで、メタ解析が異なる研究の証拠を合わせることによって実施され得る（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，６４３−６７３，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ［１９９８］）。利用可能な場合、同じＳＮＰについての当該分野で公知の関連性結果がメタ解析に包含され得る。
【０１８２】
遺伝子型決定と疾患状態の分類との両方が、誤りを含み得るので、オッズ比およびＰ値が、遺伝子型決定および疾患分類の誤差率についての種々の推定の際にどのように変化するかを見るために、感度解析を実施し得る。
【０１８３】
疾患の有病率が異なる下位集団群と関連する場合、症例と対照との間の下位集団ベースの標本抽出の偏りが、症例−対照関連性研究における偽の結果をもたらし得ることは周知である（ＥｗｅｎｓおよびＳｐｉｅｌｍａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６２，４５０−４５８［１９９５］）。このような偏りはまた、遺伝的関連性研究における統計学的な力の消失をもたらし得る。集団の層化を検出するために、ＰｒｉｔｃｈａｒｄおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇは、疾患と連鎖しないマーカーを分類し、これらのマーカーに関する関連性試験の結果を使用して、任意の集団層化が存在するかどうかを決定することを示唆した（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．６５：２２０−２２８［１９９９］）。層化が検出される場合、ＤｅｖｌｉｎおよびＲｏｅｄｅｒに提案されたようなゲノムコントロール（ＧＣ）法（Ｄｅｖｌｉｎら、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ５５：９９７−１００４［１９９９］）が、集団層化に起因する試験統計のインフレーションを調節するために使用され得る。ＧＣ法は、集団構造レベルの変化に対して堅固であり、かつ、ＤＮＡプール設計に適用可能である（Ｄｅｖｌｉｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｐｉｄｅｍ．２１：２７３−２８４［２００１］）。
【０１８４】
１５〜２０のリンクしないマイクロサテライトマーカーを用いる、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ法が推奨されるが、集団層化を検出するのに十分な力を得るために、３０以上の二対立遺伝子マーカーを使用することを示唆した。ＧＣ法については、約６０〜７０の二対立遺伝子マーカーが、集団層化に起因する試験統計についてのインフレーション因子を推定するために十分であることが示されている（Ｂａｃａｎｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６６：１９３３−１９４４［２０００］）。従って、７０の遺伝子間のＳＮＰは、ゲノムスキャンにおいて示されるものとリンクしない領域において選択され得る（Ｋｅｈｏｅら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８：２３７−２４５［１９９９］）。
【０１８５】
一旦、個々の危険因子（遺伝的または非遺伝的）が、疾患に対する素因について見出されると、次の工程は、カテゴリー（例えば、疾患または疾患なし）を予測するための分類／予測スキームを設定することであり、このカテゴリーは、個体がその関連するＳＮＰの遺伝子型および他の非遺伝的危険因子に依存しているかということである。別個の形質についてのロジスティック回帰、および、連続的な形質についての線形回帰は、このような仕事についての標準的な技術である（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｄｒａｐｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｗｉｌｅｙ（１９９８））。さらに、他の技術がまた、分類を設定するために使用され得る。このような技術としては、異なる方法の性能の比較における用途に適切なＭＡＲＴ、ＣＡＲＴ、神経ネットワークおよび判別解析が挙げられるが、これらに限定されない（Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｈａｓｔｉｅ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ＆  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ［２００２］）。
【０１８６】
（疾患の診断および素因のスクリーニング）
遺伝子型と疾患に関連する表現型との間の関連性／相関に関する情報は、いくつかの方法で活用され得る。例えば、１つ以上のＳＮＰと、処置が利用可能な疾患に対する素因との間に高度に統計的に有意な関連性がある場合は、個体におけるこのような遺伝子型パターンの検出は、処置の即時実行、または、少なくとも、個体の定期的なモニタリングの制度を正当化し得る。子供をもうけようと意図している夫婦における、深刻な疾患に関連する感受性対立遺伝子の検出はまた、その生殖決定において、夫婦に価値あるものであり得る。ＳＮＰとヒトの疾患との間の、弱いが、なお統計学的に有意な関連の場合、即時の治療的介入またはモニタリングは、感受性対立遺伝子またはＳＮＰを検出した後に正当化されないこともある。それにもかかわらず、被験体は、単純なライフスタイルの変化（例えば、食事、運動）を始めることを動機付けされ得、このライフスタイルの変化は、個体がほとんど、または全く費用をかけずに達成され得るが、個体が感受性対立遺伝子を有することによって危険性が増加し得る、状態を発症する危険性を減少するという、強力な利点を与え得る。
【０１８７】
本発明のＳＮＰは、異なる方法で、個体におけるアルツハイマー病に対して寄与し得る。いくつかの多型は、タンパク質コード配列内で生じ、そして、タンパク質の構造に影響を及ぼすことによって、疾患の表現型に寄与する。他の多型が、非コーディング領域で生じるが、例えば、複製、転写および／または翻訳への影響を介して、間接的に表現型上の効果を発揮し得る。単一のＳＮＰが、１つ以上の表現型形質に影響を及ぼし得る。同様に、単一の表現型形質は、異なる遺伝子の複数のＳＮＰにより影響を受け得る。
【０１８８】
本明細書中で使用される場合、用語「診断する」、「診断」および「診断学」としては、以下のいずれかが挙げられるがこれらに限定されない：個体が現在有し得るアルツハイマー病の検出、素因のスクリーニング（すなわち、個体が将来的にアルツハイマー病を発症する危険性の増加の決定、または、個体が将来的にアルツハイマー病を発症する危険性を減少するかの決定）、アルツハイマー病を有することが知られている個体におけるアルツハイマー病の特定の型もしくはサブクラスの決定、以前になされたアルツハイマー病の診断の確認もしくは補足、どの治療ストラテジーに個体が最も積極的に応答する可能性があるかを決定するため、もしくは、患者が特定の処置に応答する可能性があるかを予測するための個体の薬理ゲノム学的評価、患者が特定の処置もしくは治療化合物から毒性効果を経験する可能性があるかの予測、ならびにアルツハイマー病を有する個体の将来的な予後の評価。このような診断的用途は、個々のＳＮＰもしくは固有の組合せのＳＮＰ、または、本発明のＳＮＰハプロタイプに基づく。
【０１８９】
ハプロタイプは、例えば、特定のゲノム領域が、特定の表現型に影響を与える遺伝子座を有するかどうかを決定するために、より少ない数のＳＮＰが遺伝子型決定され得る点で、特に有用である（例えば、連鎖不平衡ベースのＳＮＰ関連性解析）。
【０１９０】
連鎖不平衡（ＬＤ）とは、所定の集団における各対立遺伝子の不規則な存在の別個の頻度から予測されるものよりも多い頻度での、２つ以上の異なるＳＮＰ部位における対立遺伝子の同時遺伝（例えば、選択的なヌクレオチド）をいう。独立して遺伝される２つの対立遺伝子の同時遺伝の予測される頻度は、第１の対立遺伝子の頻度に第２の対立遺伝子の頻度を乗じたものである。予測された頻度で同時に生じる対立遺伝子は、「連鎖不平衡」であると言われる。対照的に、ＬＤは、２つ以上の異なるＳＮＰ部位における対立遺伝子の間の任意の非ランダムな遺伝的関連をいい、この遺伝的関連は一般に、染色体に沿う２つの遺伝子座の物理的な近接性に起因する。ＬＤは、２つ以上のＳＮＰ部位が、所定の染色体上で互いに密接に物理的に近接している場合に生じ得、従って、これらのＳＮＰ部位における対立遺伝子は、１つのＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（対立遺伝子）が、近くに位置する別のＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（対立遺伝子）と非ランダムな関連を示す結果のために、複数の世代について分離されていないままである傾向がある。従って、ＳＮＰ部位の１つを遺伝子型決定することにより、ＬＤであるもう一方のＳＮＰを遺伝子型決定したものとほとんど同じ情報が生じる。互いにＬＤであるＳＮＰを含む染色体の物理的な領域は、ＬＤブロックと呼ばれる。
【０１９１】
種々の程度のＬＤが、いくつかのＳＮＰが他よりもより密接に関連している（すなわち、より強いＬＤである）という結果を有する２つ以上のＳＮＰの間で遭遇され得る。さらに、染色体に沿ってＬＤが延びる物理的な距離は、ゲノムの異なる領域間で異なり、従って、ＬＤが生じるために必要とされる２つ以上のＳＮＰ部位の間の物理的分離の程度は、ゲノムの異なる領域の間で異なり得る。
【０１９２】
診断目的および類似の用途のために、特定のＳＮＰ部位が、アルツハイマー病の診断に有用であることが見出される場合（例えば、その状態と有意な統計的関連性を有するか、そして／または、その状態に対する原因となる多型として認識される場合）、当業者は、このＳＮＰ部位とＬＤである他のＳＮＰ部位がまた、その状態を診断するために有用であることを認識する。従って、実際に疾患を生じる（原因となる）多型ではないが、このような原因となる多型とＬＤである多型（例えば、ＳＮＰおよび／またはハプロタイプ）がまた、有用である。このような場合、原因となる多型とＬＤである多型の遺伝子型は、原因となる多型の遺伝子型の予測となり、従って、原因となるＳＮＰにより影響を受ける表現型（例えば、アルツハイマー病）の予測となる。従って、原因となる多型とＬＤである多型マーカーは、診断マーカーとして有用であり、そして、実際の原因となる多型が未知である場合、特に有用である。
【０１９３】
１以上の原因となる多型とＬＤ（および／または、ある状態と有意な統計的関連性を有する１以上の多型とＬＤ）であり得、それゆえ、その原因となる／関連するＳＮＰが診断のために使用される同じ状態を診断するために有用であり得る、多型の例としては、例えば、その原因となる／関連するＳＮＰと同じ遺伝子、タンパク質コード領域、またはｍＲＮＡ転写産物コード領域における他のＳＮＰ、その原因となる／関連するＳＮＰと同じエキソンまたは同じイントロンにおける他のＳＮＰ、その原因となる／関連するＳＮＰと同じハプロタイプブロックにおける他のＳＮＰ、その原因となる／関連するＳＮＰと同じ遺伝子間領域における他のＳＮＰ、ある原因となる／関連するＳＮＰを有する遺伝子の外側であるがその近く（例えば、遺伝子の境界のいずれかの側（５’または３’）から６ｋｂ以内）にあるＳＮＰ、などが挙げられる。このような有用なＬＤ  ＳＮＰは、例えば、表１〜２に開示されるＳＮＰの中から選択され得る。
【０１９４】
ヒトのゲノムにおける連鎖不平衡は、以下で総説されている：Ｗａｌｌら、「Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｂｌｏｃｋｓ  ａｎｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００３年８月；４（８）：５８７−９７；Ｇａｒｎｅｒら、「Ｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ａｎｄ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉａｌｌｅｌｉｃ  ｌｏｃｉ」，Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２００３年１月；２４（１）：５７−６７；Ａｒｄｌｉｅら、「Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００２年４月；３（４）：２９９−３０９（ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２年７月；３（７）：５６６）；およびＲｅｍｍら、「Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ」；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００２年２月；６（１）：２４−３０；Ｈａｌｄａｎｅ  ＪＢＳ（１９１９）Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｖａｌｕｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｌｏｃｉ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  ８：２９９−３０９；Ｍｅｎｄｅｌ，Ｇ．（１８６６）Ｖｅｒｓｕｃｈｅ  ｕｅｂｅｒ  Ｐｆｌａｎｚｅｎ−Ｈｙｂｒｉｄｅｎ．Ｖｅｒｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ  ｄｅｓ  ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｅｎｄｅｎ  Ｖｅｒｅｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｂｒｕｅｎｎ  ［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｕｅｎｎ］；Ｌｅｗｉｎ  Ｂ（１９９０）Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｒｔｌ  ＤＬ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ  ＡＧ（１９８９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ；Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＪＨ（２００４）Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｇｕｉｄｅ．第２版，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＵＳＡ；Ｌｅｗｏｎｔｉｎ  ＲＣ（１９６４）Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｎｋａｇｅ．Ｉ．Ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ；ｈｅｔｅｒｏｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９：４９−６７；Ｈｏｅｌ  ＰＧ（１９５４）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈｕｄｓｏｎ  ＲＲ（２００１）Ｔｗｏ−ｌｏｃｕｓ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５９：１８０５−１８１７；Ｄｅｍｐｓｔｅｒ  ＡＰ，Ｌａｉｒｄ  ＮＭ，Ｒｕｂｉｎ  ＤＢ（１９７７）Ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄａｔａ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＥＭ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｊ  Ｒ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ  ３９：１−３８；Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ  Ｌ，Ｓｌａｔｋｉｎ  Ｍ（１９９５）Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １２（５）：９２１−９２７；Ｔｒｅｇｏｕｅｔ  ＤＡ，Ｅｓｃｏｌａｎｏ  Ｓ，Ｔｉｒｅｔ  Ｌ，Ｍａｌｌｅｔ  Ａ，Ｇｏｌｍａｒｄ  ＪＬ（２００４）Ａ  ｎｅｗ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  ｔｈｅ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ−ＥＭ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６８（Ｐｔ  ２）：１６５−１７７；Ｌｏｎｇ  ＡＤ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｌｅｙ  ＣＨ（１９９９）Ｔｈｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｉ  ｔｏ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：７２０−７３１；Ａｇｒｅｓｔｉ  Ａ（１９９０）Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｌａｎｇｅ  Ｋ（１９９７）Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２００３）Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２６：７８９−７９６；Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２００５）Ａ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：１２９９−１３２０；Ｔｈｏｒｉｓｓｏｎ  ＧＡ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＶ，Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｌ，Ｓｔｅｉｎ  ＬＤ（２００５），Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｗｅｂ  Ｓｉｔｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１５９１−１５９３；ＭｃＶｅａｎ  Ｇ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＣＣＡ，Ｃｈａｉｘ  Ｒ（２００５）Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＨａｐＭａｐ  ｐｒｏｊｅｃｔ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １（４）：４１３−４１８；Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ  ＪＮ，Ｄａｌｙ  ＭＪ（２００５）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ６：９５−１０８；Ｓｃｈｒｏｄｉ  ＳＪ（２００５）Ａ  ｐｒｏｂａｂｉ���ｉｓｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｃａｎｓ：ａ  ｓｅｍｉ−Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ  ａｌｌｅｌｅｓ．ＳＡＧＭＢ  ４（１）：３１；Ｗａｎｇ  ＷＹＳ，Ｂａｒｒａｔｔ  ＢＪ，Ｃｌａｙｔｏｎ  ＤＧ，Ｔｏｄｄ  ＪＡ（２００５）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｃｏｎｃｅｒｎｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ６：１０９−１１８；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  ＪＫ，Ｐｒｚｅｗｏｒｓｋｉ  Ｍ（２００１）Ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｄａｔａ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６９：１−１４。
【０１９５】
上述のように、本発明の１つの局面は、照会ＳＮＰから特定のＬＤの距離にあるＳＮＰがまた、ＶＴを有するかまたはＶＴを発症する増加した危険性または減少した危険性を同定するための確実なマーカーとして使用され得るという発見である。本明細書において使用される場合、用語「照会ＳＮＰ」とは、遺伝子型決定の結果および解析、または、本願に記載される実際に行った実施例において例示されるような他の適切な実験方法を用いて、疾患の増加した危険性または減少した危険性に関連することが見出されたＳＮＰをいう。本明細書において使用される場合、用語「ＬＤ  ＳＮＰ」とは、本願に記載される計算方法の下で、「照会ＳＮＰ」とＬＤであることに起因して、疾患の増加した危険性または減少した危険性に関連するＳＮＰとして特徴付けられたＳＮＰをいう。以下、出願人は、特定のＳＮＰが照会ＳＮＰとＬＤであるかどうかを当業者が決定し得る計算方法を記載する。パラメーターｒ２は、マーカー間の連鎖不平衡の程度を特徴付けるために、遺伝学の分野において一般に使用される（Ｈｕｄｓｏｎ，２００１）。本明細書において使用される場合、用語「〜とＬＤである」とは、照会ＳＮＰに対し、ｒ２のようなパラメーターの閾値の上で測定される特定のＳＮＰをいう。
【０１９６】
現在、ある集団から得られた染色体のサンプルにおいて遺伝子の改変を直接観察することは、通常行われていることである。マーカーＡおよびＢについて、同じ染色体上に位置する２つの遺伝子マーカーにおいて、遺伝子型のデータを有すると仮定する。さらに、２つの対立遺伝子が、これらの２つのマーカーの各々において分離しており、その結果、対立遺伝子Ａ１およびＡ２がマーカーＡにおいて見出され得、そして、対立遺伝子Ｂ１およびＢ２がマーカーＢにおいて見出され得ると仮定する。また、これらの２つのマーカーが、ヒトの常染色体上にあると推定する。特定の個体について試験し、そして、これらの対立遺伝子が、両方のマーカーにおいてヘテロ接合性であることを見出し、その結果、その２つのマーカーの遺伝子型がＡ１Ａ２Ｂ１Ｂ２である場合、２つの可能な構成が存在する：問題の個体が、１つの染色体上に対立遺伝子Ａ１Ｂ１を有し得、そして、残りの染色体上に対立遺伝子Ａ２Ｂ２を有し得る；あるいは、個体は、一方の染色体上に対立遺伝子Ａ１Ｂ２を有し得、そして、もう一方の染色体上に対立遺伝子Ａ２Ｂ１を有し得る。染色体上の対立遺伝子の配列は、ハプロタイプと呼ばれる。この例において、個体は、ハプロタイプＡ１Ｂ１／Ａ２Ｂ２またはＡ１Ｂ２／Ａ２Ｂ１を有し得る（より完全な説明については、ＨａｒｔｌおよびＣｌａｒｋ（１９８９）を参照のこと）。連鎖平衡の概念は、ハプロタイプの頻度を、対立遺伝子の頻度に対して関連付ける。
【０１９７】
個体のサンプルが、より大きな集団から選択されると推定する。各々が２つの対立遺伝子を有する上記２つのマーカーを考慮すると、以下の４つの可能なハプロタイプが存在する：Ａ１Ｂ１、Ａ１Ｂ２、Ａ２Ｂ１およびＡ２Ｂ２。以下の式を用いて、これらの４つのハプロタイプの頻度を表す：
Ｐ１１＝ｆｒｅｑ（Ａ１Ｂ１）                    （１）
Ｐ１２＝ｆｒｅｑ（Ａ１Ｂ２）                    （２）
Ｐ２１＝ｆｒｅｑ（Ａ２Ｂ１）                    （３）
Ｐ２２＝ｆｒｅｑ（Ａ２Ｂ２）                    （４）。
【０１９８】
２つのマーカーにおける対立遺伝子の頻度は、異なるハプロタイプの頻度の合計であり、単一のマーカーの対立遺伝子の頻度を２つのマーカーのハプロタイプの頻度に対して関連付ける、類似の式のセットを記述することは簡単である：
ｐ１＝ｆｒｅｑ（Ａ１）＝Ｐ１１＋Ｐ１２            （５）
ｐ２＝ｆｒｅｑ（Ａ２）＝Ｐ２１＋Ｐ２２            （６）
ｑ１＝ｆｒｅｑ（Ｂ１）＝Ｐ１１＋Ｐ２１            （７）
ｑ２＝ｆｒｅｑ（Ｂ２）＝Ｐ１２＋Ｐ２２            （８）。
【０１９９】
各マーカーにおける４つのハプロタイプの頻度と、対立遺伝子の頻度とは、合計して１の頻度にならなければならないことに注意されたい：
Ｐ１１＋Ｐ１２＋Ｐ２１＋Ｐ２２＝１                （９）
ｐ１＋ｐ２＝１                                （１０）
ｑ１＋ｑ２＝１                                （１１）。
【０２００】
２つのマーカーにおける対立遺伝子の間に相関がない場合、ハプロタイプの頻度は、複合対立遺伝子の積に近似することを予想する。したがって、
【０２０１】
【数２】
2009528023.tif 000004
となる。
【０２０２】
これらの近似式（１２）〜（１５）は、２つのマーカーの間に独立した組み合わせが存在する、すなわち、２つのマーカーにおける対立遺伝子は、一緒に、不規則に生じる、という連鎖平衡の概念を表す。これらは、近似値として表される。なぜならば、連鎖平衡および連鎖不平衡は、代表的には、染色体のサンプルの特性と考えられる概念であり；したがって、これらは、サンプル収集のプロセスに起因して、確率変動に対して感度が高いからである。経験的に、多くの対の遺伝子マーカーが、連鎖平衡であるが、確実に、全ての対が連鎖平衡であるわけではない。
【０２０３】
上記の連鎖平衡の概念を確立したので、出願人は、連鎖不平衡（ＬＤ）の概念を説明し得る。ＬＤは、連鎖平衡からの逸脱である。Ａ１Ｂ１ハプロタイプの頻度が、（１２）において数学的に記述された連鎖平衡の仮定の下のＡ１およびＢ１についての対立遺伝子の積に近似するので、連鎖平衡からの偏差の量についての単純な指標は、これら２つの量における差、Ｄ
Ｄ＝Ｐ１１−ｐ１ｑ１                          （１６）
であり、Ｄ＝０は、完全な連鎖平衡を示す。Ｄ＝０からの実質的な偏差は、試験される染色体のサンプルにおけるＬＤを示す。Ｄがとり得る最大値および最小値を含めた、Ｄの多くの特性が、Ｌｅｗｏｎｔｉｎ（１９６４）において考察される。数学的には、基本的な代数学を用いて、Ｄがハプロタイプの観点だけから記述され得ることが示され得る：
Ｄ＝Ｐ１１Ｐ２２−Ｐ１２Ｐ２１                  （１７）。
【０２０４】
Ｄを二乗し、その後、Ａ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２の対立遺伝子の頻度の積で割ることによってＤを変換すると、その結果得られるｒ２と呼ばれる量は、統計学において一般に使用されるピアソンの相関係数の二乗と等価である（例えば、Ｈｏｅｌ，１９５４）。
【０２０５】
【数３】
2009528023.tif 000005
Ｄについて、０に近いｒ２の値は、サンプルセットにおいて試験される２つのマーカー間の連鎖平衡を示す。ｒ２の値が増加するにつれて、これら２つのマーカーは連鎖不平衡であるといわれる。ｒ２がとり得る値の範囲は、０〜１である。ｒ２＝１のとき、これら２つのマーカーにおける対立遺伝子の間には完全な相関が存在する。
【０２０６】
さらに、上述の量はサンプル特異的なものである。従って、研究されるサンプルに特異的な表記を公式化する必要がある。ここで考察されるアプローチにおいて、主要な関心となるのは以下の３つの型のサンプルである：（ｉ）疾患に関連する表現型により影響を受ける個体からの染色体のサンプル（症例）、（ｉｉ）疾患に関連する表現型により影響を受けない個体から得られた染色体のサンプル（対照）、ならびに（ｉｉｉ）ハプロタイプの構築およびペアワイズの連鎖不平衡の計算のために使用される標準的なサンプルセット。以下に記載される方法の展開において使用される対立遺伝子の頻度について、症例または対照のいずれかのサンプルセットを示すために、さらなるサブスクリプトが追加される。
【０２０７】
ｐ１，ｃｓ＝ｆｒｅｑ（症例におけるＡ１）                （１９）
ｐ２，ｃｓ＝ｆｒｅｑ（症例におけるＡ２）                （２０）
ｑ１，ｃｓ＝ｆｒｅｑ（症例におけるＢ１）                （２１）
ｑ２，ｃｓ＝ｆｒｅｑ（症例におけるＢ２）                （２２）
同様に、
ｐ１，ｃｔ＝ｆｒｅｑ（対照におけるＡ１）                （２３）
ｐ２，ｃｔ＝ｆｒｅｑ（対照におけるＡ２）                （２４）
ｑ１，ｃｔ＝ｆｒｅｑ（対照におけるＢ１）                （２５）
ｑ２，ｃｔ＝ｆｒｅｑ（対照におけるＢ２）                （２６）。
【０２０８】
ロバストな連鎖不平衡の計算には、十分に容認されるサンプルセットが必要であるので、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ２００３，２００５；Ｔｈｏｒｉｓｓｏｎら、２００５；ＭｃＶｅａｎら、２００５）から得られるデータが、ペアワイズのｒ２値の計算のために使用され得る。実際、国際ＨａｐＭａｐプロジェクトのために遺伝子型決定されたサンプルは、観察される遺伝的バリエーションのパターンから、十分な数の染色体が試験して有意義かつロバストな結論を導くように、種々のヒト部分集団からの代表例として選択された。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔのウェブサイト（ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ）は、プロジェクトの説明、利用された方法および試験されたサンプルを含む。このようなデータ中に存在するパターンの意味を得るために経験的なデータを試験することも有用である。
【０２０９】
ハプロタイプの頻度は、上記の式（１８）においては明白な独立変数であった。しかし、２マーカーのハプロタイプの頻度を知るためには、位相が二重ヘテロ接合性サンプルについて決定されることを必要とする。試験されるデータにおいて位相が未知であるとき、遺伝子型データから位相を推論するために種々のアルゴリズムが使用され得る。この問題は、以前に考察されており、その考察においては、Ａ１Ａ２Ｂ１Ｂ２の２つのＳＮＰ遺伝子型を有する二重ヘテロ接合性の個体は、以下の２つの異なる染色体セットのうちの１つを有し得る：Ａ１Ｂ１／Ａ２Ｂ２またはＡ１Ｂ２／Ａ２Ｂ１。ハプロタイプの頻度を推定するための１つのこのようなアルゴリズムは、Ｄｅｍｐｓｔｅｒら（１９７７）によって最初に公式化された、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムである。このアルゴリズムは、しばしば、遺伝子型データからハプロタイプの頻度を推論するために、遺伝学において使用される（例えば、ＥｘｃｏｆｆｉｅｒおよびＳｌａｔｋｉｎ、１９９５；Ｔｒｅｇｏｕｅｔら、２００４）。２つのＳＮＰについての場合がここで検査されているが、ＥＭアルゴリズムは、対立遺伝子の頻度とサンプルサイズとが小さ過ぎないという条件で、誤差がほとんどないということに注意すべきである。ｒ２値に対するインパクトは、代表的には無視できる。
【０２１０】
相関する遺伝子マーカーは情報を共有するので、疾患に関連するＳＮＰマーカーを用いたＬＤにおけるＳＮＰマーカーの照会もまた、疾患の関連を検出するために十分な検出力を有し得る（ＬｏｎｇおよびＬａｎｇｌｅｙ、１９９９）。疾患に関連する対立遺伝子を直接見出す検出力と、疾患との関連性を間接的に検出する検出力との間の関係性は、ＰｒｉｔｃｈａｒｄおよびＰｒｚｅｗｏｒｓｋｉ（２００１）によって調査された。真っ直ぐに向かう（ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｆｏｒｗａｒｄ）偏差において、疾患に関連する遺伝子座と比較して、サンプルサイズが係数
【０２１１】
【数４】
2009528023.tif 000006
（式（１８）の逆数）によって増加される場合、疾患に関連する遺伝子座と連鎖不平衡であるマーカーの遺伝子座において疾患との関連性を間接的に検出する検出力は、疾患に関連する遺伝子座において疾患との関連性を直接検出する検出力とほぼ同じであることが示され得る。
【０２１２】
従って、Ｎ個のサンプルを有する実験を用いて、疾患との関連性を間接的に検出する検出力を計算した場合、（実際の疾患に感受性のある遺伝子座において）疾患との関連性を直接検出するのと等価な検出力は、およそｒ２Ｎ個のサンプルを用いる実験を必要とする。検出力、サンプルサイズおよび連鎖不平衡の間のこの基本的な関係性を用いて、疾患状態に直接関連するＳＮＰマーカーと連鎖不平衡状態にある遺伝子型決定マーカーが、疾患との関連性を間接的に検出する十分な検出力を有するかどうかを決定する際に有用なｒ２閾値を導出し得る。
【０２１３】
間接的なプロセスによる疾患に関連するマーカーを検出する検出力の導出を開始するために、以下のように有効な染色体サンプルサイズを規定する：
【０２１４】
【数５】
2009528023.tif 000007
上記式において、ＮｃｓおよびＮｃｔは、それぞれ、二倍体の症例および対照の数である。この式は、症例と対照の数が等価ではない状況を扱うために必要となる。症例と対照のサンプルサイズが等しい場合、すなわち、Ｎｃｓ＝Ｎｃｔ＝Ｎである場合、染色体の有効数の値は、予想通り、単に、ｎ＝２Ｎである。検出力を、有意性レベルαについて計算させる（その結果、αを下回る従来のＰ値が、統計的に有意であるとみなされる）。標準的なガウス分布の関数を
【０２１５】
【数６】
2009528023.tif 000008
として定義する。数学的には、
【０２１６】
【数７】
2009528023.tif 000009
である。あるいは、以下の誤差関数表記（Ｅｒｆ）
【０２１７】
【数８】
2009528023.tif 000010
がまた使用され得る。
【０２１８】
例えば、Φ（１．６４４８５４）＝０．９５である。ｒ２の値は、間接的な照会により疾患との関連性を検出する検出力の予め特定された最小量を得るために導出され得る。ＬＤ  ＳＮＰマーカーが、疾患に関連する対立遺伝子を有するものであり得、それゆえ、このアプローチが、全ての間接的なプロセスによる検出力の結果が少なくとも照会したＳＮＰマーカーと同程度に大きいと予測されるような、下界モデルを構成することに注意されたい。
【０２１９】
βにより、本当に疾患に関連するマーカーを検出しない誤り率を示す。従って、１−βは、統計学的な検出力の古典的な定義である。Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ−Ｐｚｒｅｗｏｒｓｋｉの結果をサンプルサイズへと代入すると、αの有意性レベルにおいて疾患との関連性を検出する検出力は、以下の近似
【０２２０】
【数９】
2009528023.tif 000011
により与えられ、上記式において、Ｚｕは、ｕ（ｕ∈（０，１））において評価した標準的な正規累積分布の逆数である。Ｚｕ＝Φ−１（ｕ）（ここで、Φ（Φ−１（ｕ））＝Φ−１（Φ（ｕ））＝ｕである）。例えば、α＝０．０５に設定し、従って、１−α／２＝０．９７５である場合、Ｚ０．９７５＝１．９５９９６が得られる。次に、Ｔの最小検出力の閾値に等しい検出力を設定し、
【０２２１】
【数１０】
2009528023.tif 000012
そして、ｒ２について解くと、以下の閾値ｒ２が得られる：
【０２２２】
【数１１】
2009528023.tif 000013
あるいは、
【０２２３】
【数１２】
2009528023.tif 000014
。
【０２２４】
ｒ２が、照会ＳＮＰと、この照会ＳＮＰと種々のレベルのＬＤにある他の多数のＳＮＰとの間で計算されると仮定する。閾値
【０２２５】
【数１３】
2009528023.tif 000015
は、照会ＳＮＰと、潜在的なＬＤ  ＳＮＰとの間の連鎖不平衡の最小値であり、その結果、ＬＤ  ＳＮＰは、依然として、疾患との関連性を検出するためのＴ以上の検出力を保持する。例えば、ＳＮＰ  ｒｓ２００が症例−対照の疾患−関連性研究において遺伝子型決定され、ＳＮＰ  ｒｓ２００が疾患の表現型と関連することが見出されると仮定する。さらに、１，０００個の症例の染色体においては、少数の対立遺伝子の頻度が１６％であると見出され、１，０００個の対照の染色体においては、少数の対立遺伝子の頻度が１０％であると見出されたと仮定する。これらの測度を考慮すると、０．０５の有意性レベルにおいて疾患との関連性を検出する検出力は、極めて高い、すなわち、対立遺伝子関連性試験を用いて、およそ９８％であったことを、実験前に、推測し得る。式（３２）を適用すると、ｒ２の最小値を計算して、疾患との関連性を間接的に評価し、検出力の閾値レベルについて、ＳＮＰ  ｒｓ２００における少数の対立遺伝子が、本当に疾患に対する素因であると考えることができる。検出力の閾値レベルを８０％に設定するとき、
【０２２６】
【数１４】
2009528023.tif 000016
＝０．４８９は、上記のものと同じ有意性レベルおよび染色体の数を与える。従って、ｒｓ２００が０．４８９よりも大きいペアワイズのｒ２値を有するあらゆるＳＮＰは、８０％より大きい疾患との関連性を検出する検出力を有すると期待される。さらに、この結果は、ＬＤ  ＳＮＰが、照会ＳＮＰ  ｒｓ２００との連鎖不平衡によってのみ疾患に関連付けられるような保存的なモデルを考慮する。
【０２２７】
疾患の表現型（例えば、アルツハイマー病）を有する特定のＳＮＰおよび／またはＳＮＰハプロタイプの寄与または関連は、本発明のＳＮＰを使用して、その遺伝子型を有さない個体と比較して、特定の遺伝子型の結果として検出可能な形質（例えば、アルツハイマー病）を発現する個体、または、その後に、検出可能な形質（例えば、アルツハイマー病）を発現する危険性を増加もしくは減少してその遺伝子型を配置する個体を同定し得る、優れた診断試験を開発し得る。本明細書中で使用される場合、診断は、単一のＳＮＰまたは一群のＳＮＰに基づき得る。複数のＳＮＰ（例えば、表１および／または表２に提供されるＳＮＰの、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、２５、３０、３２、４８、５０、６４、９６、１００、または、これらの間の任意の数、もしくはこれ以上）の組合せた検出は、代表的に、正確な診断の可能性を増加する。例えば、アルツハイマー病と相関することが公知の単一のＳＮＰの存在は、個体がアルツハイマー病を有するか、もしくは、アルツハイマー病を発症する危険性があるという、２０％の可能性を示唆し得るのに対して、各々がアルツハイマー病と相関する５つのＳＮＰの検出は、個体がアルツハイマー病を有するか、もしくは、アルツハイマー病を発症する危険性があるという、８０％の可能性を示唆し得る。診断もしくは素因のスクリーニングの精度をさらに高めるために、本発明のＳＮＰの解析は、アルツハイマー病の他の多型もしくは他の危険因子（例えば、疾患の症状、病理学的特徴、家族歴、食事、環境因子またはライフスタイル因子）の解析と組合せられ得る。
【０２２８】
当然、アルツハイマー病の処置もしくは診断において、本発明は一般に、アルツハイマー病を発症する危険性のある（または危険性の低い）個体、および／または、アルツハイマー病に関連する病理の絶対的な同定は提供しないが、むしろ、統計的に有意な関連結果に基づいて、疾患を発症する程度もしくは可能性の特定の増加（または減少）を示唆することは、当業者により理解される。しかし、この情報は、例えば、予防処置を開始するため、または、１つ以上の有意なＳＮＰもしくはＳＮＰハプロタイプを保有する個体に、軽微な臨床症状のような警告的な徴候を予見するため、または、初期段階で状態の処置を同定および開始するために、状態の発生をモニターする、定期的な健康診断を有するために使用され得るものとして、非常に価値がある。適時処置されないと非常に衰弱するかまたは致死である疾患の場合特に、潜在的な素因の知識が、たとえ、この素因が絶対的なものでないとしても、効率的に処置するためのまさに有意な様式に貢献する可能性がある。
【０２２９】
本発明の診断技術は、種々の方法論（例えば、ハプロタイプ決定のための個体の染色体の解析を可能にする方法、家族研究、単一精子ＤＮＡ解析または体細胞ハイブリッドが挙げられる）を採用して、検出可能な形質を発症する危険性の増加もしくは減少に関連するＳＮＰもしくはＳＮＰパターンを試験被験体が有するかどうか、または、個体が特定の多型／変異の結果として検出可能な形質を罹患するかどうかを決定し得る。本発明の診断を用いて解析された形質は、アルツハイマー病に関連する病理および傷害において通常観察される、任意の検出可能な形質であり得る。
【０２３０】
本発明の別の局面は、個体が、１つ以上の形質を発症する危険性がある（または危険性が低い）かどうか、または、個体が、特定の形質が原因となる対立遺伝子もしくは形質が影響を与える対立遺伝子を保有する結果として、１つ以上の形質を発現するかどうかを決定する方法に関連する。これらの方法は一般に、個体から核酸サンプルを得る工程、および、この核酸サンプルをアッセイして、１つ以上のＳＮＰ位置にどのヌクレオチドが存在するかを決定する工程を包含し、ここで、アッセイされるヌクレオチドは、形質を発症する危険性の増加もしくは減少の指標、または、個体が、特定の形質が原因となる対立遺伝子もしくは形質が影響を与える対立遺伝子を保有する結果として、１つ以上の形質を発現することの指標である。
【０２３１】
別の実施形態において、本発明のＳＮＰ検出試薬を用いて、個体が、遺伝子発現（集合的に、細胞もしくは体液の「遺伝子応答」）のレベル（例えば、サンプル中のｍＲＮＡもしくはタンパク質の濃度など）またはパターン（例えば、発現の反応速度論、分解速度、安定性プロフィール、Ｋｍ、Ｖｍａｘなど）に影響を及ぼす、１つ以上のＳＮＰ対立遺伝子を有するかどうかを決定する。このような決定は、（例えば、核酸アレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイもしくは質量分析を用いることによって）ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現をスクリーニングすること、個体において変更された発現を有する遺伝子を同定すること、変更された発現を有する遺伝子の発現に影響を与え得る、表１および／もしくは表２に開示されるＳＮＰの遺伝子型（例えば、変更された発現を有する遺伝子内および／もしくはその周囲にあるＳＮＰ、調節／制御領域にあるＳＮＰ、変更された発現を有する遺伝子の発現に影響を与え得る経路に関与する他の遺伝子内および／もしくはその周囲にあるＳＮＰ、または、遺伝子型が特定され得る全てのＳＮＰ）を特定すること、ならびに、ＳＮＰ遺伝子型を変更された遺伝子発現と相関させることによって達成され得る。この様式において、特定のＳＮＰ部位における特定のＳＮＰ対立遺伝子は、遺伝子発現に影響を与えると同定され得る。
【０２３２】
（薬理ゲノム学および治療学／薬物開発）
本発明は、特定の治療剤もしくは薬学的化合物、またはこのような化合物のクラスに対して、特定のＳＮＰ対立遺伝子もしくはハプロタイプを有する被験体の薬理ゲノム学を評価するための方法を提供する。薬理ゲノム学は、臨床的に有意な遺伝性のバリエーション（例えば、ＳＮＰ）が、影響を受けた人における変化した薬物の性質および／または異常作用に起因する薬物に対する応答において機能する役割を扱う。例えば、Ｒｏｓｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５、８５７−８６５（２０００）；Ｇｏｕｌｄ  Ｒｏｔｈｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９、２０９−２１１（２００１）；Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６）；およびＬｉｎｄｅｒ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７）を参照のこと。こららのバリエーションの臨床結果は、代謝における個々のバリエーションの結果として、特定の個体における治療用薬物の重篤な毒性、または特定の個体における薬物の治療不全を生じ得る。従って、個体のＳＮＰ遺伝子型は、治療用化合物が身体に作用する様式、または身体がその化合物を代謝する様式を決定し得る。例えば、薬物代謝酵素におけるＳＮＰは、これらの酵素の活性に影響を与え得、これは次々に薬物作用の強度および期間の両方、ならびに薬物代謝および薬物クリアランスに影響を与え得る。
【０２３３】
薬物代謝酵素、薬物輸送体、製剤用のタンパク質、および他の薬物標的におけるＳＮＰの発見は、なぜ数名の患者が期待された薬物効果を得ず、過度の薬物効果を示すのか、またはなぜ標準的な薬物投薬量から重篤な毒性を受けるのかを説明してきた。ＳＮＰは、代謝の速い人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）の遺伝子型、および代謝の遅い人（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）の表現型において発現し得る。従って、ＳＮＰは、タンパク質の対立遺伝子改変体をもたらし得、その改変体において、ある集団の１以上のタンパク質機能が、別の集団におけるタンパク質機能と異なる。従って、ＳＮＰおよびコードされる改変ペプチドは、処置様式に影響を与え得る遺伝的素因を確認するための標的を提供する。例えば、リガンドベースの処置において、ＳＮＰは、リガンド結合においてほぼ活性なアミノ末端細胞外ドメインおよび／またはレセプターの他のリガンド結合領域に対する上昇を与え得、それによって、その後のタンパク質活性化に影響を与える。従って、リガンド投薬量は、必然的に特定のＳＮＰ対立遺伝子もしくはハプロタイプを含む所定の集団内の治療効果を最大化するように修正される。
【０２３４】
遺伝子型決定の代替として、代替のＳＮＰ対立遺伝子によってコードされる改変アミノ酸配列を含む特定の改変タンパク質が同定され得る。従って、個体の薬理ゲノム的特徴付けは、個々のＳＮＰ遺伝子型に基づく予防的用途または治療的用途のために有効な化合物およびそのような化合物の有効投薬量の選択を可能にし、それによって、治療の有効性を増強および最適化する。さらに、特定のＳＮＰ／ハプロタイプを含む組み換え細胞およびトランスジェニック動物の作製は、有効な臨床設計ならびに処置化合物および投薬レジメンの試験を可能にする。例えば、トランスジェニック動物は、ヒト疾患感受性遺伝子に対してオーソログな遺伝子における特定のＳＮＰ対立遺伝子のみが異なるように作製され得る。
【０２３５】
本発明のＳＮＰの薬理ゲノム学的使用は、患者の介護に対して（特に、アルツハイマー病を処置することにおいて）いくつかの有意な利点を提供する。個々のＳＮＰ遺伝子型に基づく個体の薬理ゲノム学的特徴付けは、特定の医薬での処置に対して応答しそうにない個体を同定し得、それによって、医師が、それらの個体に対して効果のない医薬を処方するのを回避することを可能にする。一方で、個体のＳＮＰ遺伝子型決定は、医師に、個々のＳＮＰ遺伝子型に基づいて最も有効な適切な医薬および投薬レジメンを選択することを可能にし得る。この情報は、医薬を処方することにおける医師の信頼を増加させ、そして患者に彼らの薬物レジメンに従うように動機付けする。さらに、薬理ゲノム学は、毒性に対する素因のある患者、および特定の薬物または薬物投薬に対する副作用を同定し得る。薬物副作用は、米国単独で１年あたり１００，０００件を超える可避可能な死亡をもたらし、従って、入院および死亡の重要な原因、ならびに保健医療システムにおける重要な経済的な負担を表す（Ｐｆｏｓｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［２０００年８月］）。従って、本明細書中に開示されるＳＮＰに基づく薬理ゲノム学は、生命を維持することおよび保健医療費を実質的に減少させることの両方に対する可能性を有する。
【０２３６】
薬理ゲノム学は、一般的には、Ｒｏｓｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．８５：２２５−３７（２００３）においてさらに議論されている。アルツハイマー病および他の神経変性障害に関する薬理ゲノム学は、Ｃａｃａｂｅｌｏｓ、「Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｍｅｎｔｉａ」、Ａｎｎ  Ｍｅｄ．３４（５）：３５７−７９（２００２）、Ｍａｉｍｏｎｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１３（１）：１１−２９（２００１年２月９日）、およびＰｏｉｒｉｅｒ、「Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ：ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．４（４）：３３５−４１（１９９９年１２月）において議論されている。心血管疾患に関する薬理ゲノム学は、Ｓｉｅｓｔら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．４１（４）：５９０−９（２００３年４月）、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｐｒｏｇ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ．４４（６）：４７９−９８（２００２年５月〜６月）、およびＭｏｏｓｅｒら、「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＮＰ  ｅｒａ」、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１（７）：１３９８−４０２（２００３年７月）において議論されている。癌に関連する薬理ゲノム学は、ＭｃＬｅｏｄら、「Ｃａｎｃｅｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ：ＳＮＰｓ、ｃｈｉｐｓ、ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐａｔｉｅｎｔ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．２１（４）：６３０−４０（２００３）、およびＷａｔｔｅｒｓら、「Ｃａｎｃｅｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７；１６０３（２）；９９−１１１（２００３年３月）において議論されている。
【０２３７】
本発明のＳＮＰはまた、アルツハイマー病に対する新規な治療標的を同定するために使用され得る。例えば、疾患に関連する改変体（「改変遺伝子」）もしくはそれらの産物、ならびにこれらの改変遺伝子もしくはそれらの産物と相互作用することによって直接的もしくは間接的に調節される遺伝子またはそれらの産物を含む遺伝子は、例えば、疾患を処置するかまたは疾患の発症を予防もしくは遅延させる治療剤の開発のために標的化され得る。その治療剤は、例えば、標的遺伝子もしくは遺伝子産物の機能またはレベルを調節する低分子、タンパク質、タンパク質フラグメントもしくはペプチド、抗体、核酸、またはそれらの誘導体もしくは模倣物から構成され得る。
【０２３８】
本明細書中で開示されるＳＮＰ含有核酸分子、およびそれらの相補的核酸分子は、細胞、組織、および生物における遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構築物として使用され得る。アンチセンス技術は、当該分野で十分に確立されており、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）において広範に概説されている。アンチセンス核酸分子は、一般的には、遺伝子によって発現されるｍＲＮＡの領域に相補的であるように設計され、その結果、アンチセンス分子がｍＲＮＡとハイブリダイズし、それによってタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳をブロックする。種々のクラスのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、当該分野で使用され、そのうちの２つが切断剤（ｃｌｅａｖｅｒ）および遮断剤（ｂｌｏｃｋｅｒ）である。切断剤は、標的ＲＮＡに結合することによって、その標的ＲＮＡを切断する細胞内のヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨまたはＲＮａｓｅＬ）を活性化する。遮断剤（これもまた、標的ＲＮＡに結合する）は、リボソームの立体障害を通してタンパク質翻訳を阻害する。例示的な遮断剤としては、ペプチド核酸、モルホリノ、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、およびメチルホスホネートが挙げられる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、７［１７］：９１２−９１７［２００２］）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療剤として直接的に有用であり、そして（例えば、遺伝子ノックアウト実験または遺伝子ノックダウン実験において）遺伝子機能を決定および確認するためにもまた有用である。
【０２３９】
アンチセンス技術は、以下：Ｌａｖｅｒｙら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ＲＮＡｉ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．６（４）：５６１−９（２００３年７月）；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５（２）：１１８−２２（２００３年４月）；Ｋｕｒｒｅｃｋ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０（８）：１６２８−４４（２００３年４月）；Ｄｉａｓら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｂａｓｉｃ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１（５）：３４７−５５（２００２年３月）；Ｃｈｅｎ、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．７５：６２１−３６（２００３）；Ｗａｎｇら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．１（３）：１７７−９６（２００１年１１月）；およびＢｅｎｎｅｔｔ、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２（３）：２１５−２４（２００２年６月）においてさらに概説されている。
【０２４０】
本発明のＳＮＰは、特定の核酸改変体に対して特異的なアンチセンス試薬を設計するために特に有用である。本明細書中に開示されるＳＮＰ情報に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１以上の特定のＳＮＰヌクレオチドを含むｍＲＮＡ分子を特異的に標的するように生成され得る。この様式において、１以上の望ましくない多型（例えば、欠損タンパク質（例えば、触媒ドメインにおけるアミノ酸置換をもたらすＳＮＰヌクレオチド）を含むｍＲＮＡ分子の発現は、阻害され得るかまたは完全にブロックされ得る。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の多型形態（例えば、欠損タンパク質をコードするＳＮＰ対立遺伝子）に特異的に結合するように使用され得、それによって、この形態の翻訳を阻害するが、代替の多型形態（例えば、正常な機能を有するタンパク質をコードする代替のＳＮＰヌクレオチド）には結合しない。
【０２４１】
アンチセンス分子は、遺伝子発現および欠損タンパク質の産生を阻害するために、ｍＲＮＡを不活性化するように使用され得る。従って、これらの分子は、異常な遺伝子発現もしくは望ましくない遺伝子発現、または特定の欠損タンパク質の発現によって特徴付けられる障害（例えば、アルツハイマー病）を処置するために使用され得る。この技術は、翻訳されるべきｍＲＮＡの能力を減弱する、ｍＲＮＡにおける１以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むリボザイムによる切断に関与し得る。考え得るｍＲＮＡ領域としては、例えば、タンパク質コード領域、特に、タンパク質の触媒活性、基質／リガンド結合、もしくは他の機能的活性に対応するタンパク質コード領域が挙げられる。
【０２４２】
本発明のＳＮＰはまた、特定のＳＮＰ改変体を有する核酸分子を特異的に標的にするＲＮＡ干渉試薬を設計するために有用である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（遺伝子サイレンシングとしてもまた称される）は、遺伝子をオフ（ｏｆｆ）にするための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の使用に基づいている。細胞に導入される場合、ｄｓＲＮＡは、その細胞によって低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知の短いフラグメント（一般的には、長さが約２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチドまたは２３ヌクレオチド）にプロセシングされ、このｓｉＲＮＡは、細胞が配列特異的様式で使用して、相補的なＲＮＡを認識し、そして破壊する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、７［１７］：９１２−９１７［２００２］）。従って、本発明の一局面は、約１８ヌクレオチド〜２６ヌクレオチドの長さ、好ましくは、１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さ、そしてより好ましくは、２０ヌクレオチドの長さ、２１ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチドの長さもしくは２３ヌクレオチドの長さの単離された核酸分子と、ＲＮＡｉのためのこれらの核酸分子の使用を企図する。ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡを含む）は配列特異的様式で作用するので、本発明のＳＮＰは、特定のＳＮＰ対立遺伝子／ヌクレオチド（例えば、欠損タンパク質の産生をもたらす有害な対立遺伝子）を有する核酸分子を認識し、そして破壊するが、代替のＳＮＰ対立遺伝子（例えば、正常な機能を有するタンパク質をコードする対立遺伝子）を有する核酸分子に影響を与えないＲＮＡｉ試薬を設計するために使用され得る。アンチセンス試薬のように、ＲＮＡｉ試薬は、（例えば、欠損した、疾患を引き起こす遺伝子をターンオフ（ｔｕｒｎ  ｏｆｆ）するための）治療剤として、直接的に有用であり得、また、（例えば、遺伝子ノックアウト実験または遺伝子ノックダウン実験において）遺伝子機能を特徴付けし、そして確認するのに有用であり得る。
【０２４３】
以下の参考文献は、ＲＮＡｉのさらなる概説を提供する：Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、「Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（３）：３２６−３０（２００４年３月）；電子出版２００４年２月１日；Ｃｈｉら、「Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ」、ＰＮＡＳ  １００（１１）：６３４３−６３４６（２００３）；Ｖｉｃｋｅｒｓら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡｓ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ａｇｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：７１０８−７１１８  （２００３）；Ａｇａｍｉ、「ＲＮＡｉ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．６（６）：８２９−３４（２００２年１２月）；Ｌａｖｅｒｙら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ＲＮＡｉ：ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．６（４）：５６１−９（２００３年７月）；Ｓｈｉ、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＲＮＡｉ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｓｓｅｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９（１）：９−１２（２００３年１月）；Ｓｈｕｅｙら、「ＲＮＡｉ：ｇｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ」、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ７（２０）：１０４０−１０４６（２００２年１０月）；ＭｃＭａｎｕｓら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３（１０）：７３７−４７（２００２年１０月）；Ｘｉａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（１０）：１００６−１０（２００２年１０月）；Ｐｌａｓｔｅｒｋら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １０（５）：５６２−７（２０００年１０月）；Ｂｏｓｈｅｒら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２（２）：Ｅ３１−６（２０００年２月）；およびＨｕｎｔｅｒ、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９（１２）：Ｒ４４０−２）（１９９９年６月１７日）。
【０２４４】
ＳＮＰの原因とされる病的状態（例えば、アルツハイマー病）を有する被験体は、遺伝的欠損を修正する（ｃｏｒｒｅｃｔ）ように処置され得る（Ｋｒｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１０３４９−１０３５４（１９９９）を参照のこと）。そのような被験体は、その被験体から取り出された生物学的サンプル中の多型を検出し得る任意の方法によって同定され得る。そのような遺伝的欠損は、そのような被験体にＳＮＰの位置で正常／野生型ヌクレオチドを供給する修復配列を組み込んでいる核酸フラグメントを投与することによって、持続的に修正され得る。この部位特異的修復配列は、被験体のゲノムＤＮＡの内因性修復を促進するように作動するＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。部位特異的修復配列は、適切なビヒクル（例えば、ポリエチレンイミンとの複合体）中で投与されるか、アニオン性リポソーム、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）もしくは投与された核酸の細胞内取り込みを促進する他の薬学的組成物中にカプセル化される。次いで、キメラオリゴヌクレオチドが被験体のゲノムへの正常配列の取り込みを誘導するにつれて、先天的病理をもたらす遺伝的欠損が克服され得る。取り込みの際に、正常な遺伝子産物が発現され、置換が広められ、それによって、被験体の臨床状態の持続的修復および治療的増強が引き起こされる。
【０２４５】
ｃＳＮＰが、病的状態の原因とされるかまたは病的状態の要因とされる改変タンパク質を生じる場合において、そのような状態を処置する方法は、その病理を有する被験体にその改変タンパク質の野生型同族体／正常同族体を投与する工程を包含し得る。一旦、有効な投薬レジメンで投与されると、野生型同族体は、病理状態の補完または改善を提供する。
【０２４６】
本発明はさらに、アルツハイマー病を処置するために使用され得る化合物または薬剤を同定するための方法を提供する。本明細書中で開示されるＳＮＰは、治療剤の同定および／または開発のための標的として有用である。治療剤または治療用化合物を同定するための方法は、代表的には、その薬剤または化合物がＳＮＰ含有核酸またはコードされる産物の活性および／または発現を調節する能力をアッセイする工程、そしてＳＮＰ含有核酸またはコードされる産物の所望でない活性または発現によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る薬剤または化合物を同定する工程を包含する。そのアッセイは、細胞ベースの系および細胞を含まない系で実施され得る。細胞ベースのアッセイは、目的の核酸分子を天然に発現する細胞、または特定の核酸分子を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞を含み得る。
【０２４７】
アルツハイマー病患者における改変遺伝子発現としては、例えば、ＳＮＰ含有核酸配列（例えば、ＳＮＰを含むｍＲＮＡ転写産物分子に転写され得るＳＮＰを含み、順に改変タンパク質に翻訳され得る遺伝子）、または１以上のＳＮＰに起因して発現が変化する正常／野生型核酸配列（例えば、正常な転写産物の発現レベルまたは発現パターンに影響を与えるＳＮＰを含み得る調節／制御領域）の発現のいずれかが挙げられ得る。
【０２４８】
改変遺伝子発現のためのアッセイは、核酸レベル（例えば、ｍＲＮＡレベル）、発現したタンパク質レベル、またはシグナル伝達経路に関連する対応化合物の直接アッセイを含み得る。さらに、シグナル伝達経路に応じてアップレギュレートもしくはダウンレギュレートする遺伝子の発現もまた、アッセイされ得る。この実施形態において、これらの遺伝子の調節領域は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）に対して作動可能に連結され得る。
【０２４９】
改変遺伝子発現の調節因子は、例えば、細胞が候補化合物／薬剤と接触され、そしてｍＲＮＡの発現が決定される方法において同定され得る。候補化合物の存在下でのｍＲＮＡの発現のレベルは、その候補化合物の非存在下でのｍＲＮＡの発現のレベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて改変体遺伝子発現の調節因子として同定され得、そして本発明の１以上のＳＮＰに起因する改変体遺伝子発現（例えば、ＳＮＰ含有核酸の発現、または核酸分子の発現に影響を与える１以上のＳＮＰに起因する正常／野生型核酸分子の発現の変化のいずれか）によって特徴付けられる障害（例えば、アルツハイマー病）を処置するために使用され得る。ｍＲＮＡの発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下において統計的に有意に大きい場合、その候補化合物は、核酸発現の刺激物質として同定される。核酸発現が候補化合物の非存在下よりもその存在下において統計的に有意に小さい場合、その候補化合物は、核酸発現のインヒビターとして同定される。
【０２５０】
本発明はさらに、標的として、改変核酸発現を調節する遺伝子として薬物をスクリーニングすることを通して同定される化合物を使用して、ＳＮＰまたは関連する核酸ドメイン（例えば、触媒ドメイン、リガンド／基質結合ドメイン、調節／制御領域など）または遺伝子、あるいはコードされるｍＲＮＡ転写産物を用いる処置方法を提供する。調節としては、核酸発現のアップレギュレーション（すなわち、活性化または作動化（ａｇｏｎｉｚａｔｉｏｎ））あるいはダウンレギュレーション（すなわち、抑制または拮抗化（ａｎｔａｇｏｎｉｚａｔｉｏｎ））のいずれかが挙げられ得る。
【０２５１】
ｍＲＮＡ転写産物およびコードされるタンパク質の発現は、野生型でも改変体でも、調節／制御エレメント（例えば、発現を調節するプロモーターまたは転写調節因子結合ドメイン）中の特定のＳＮＰ対立遺伝子に伴って個々に変更され得る。この状況において、処置方法および化合物は、本明細書中で議論されるように、改変体調節／制御エレメントを調節または克服し、それによって、野生型タンパク質もしくは改変タンパク質のいずれかの正常または健常な発現レベルを生じることを確認する。
【０２５２】
本発明のＳＮＰ含有核酸分子はまた、臨床試験または処置レジメンにおいて、改変遺伝子またはコードされる産物の発現もしくは活性における化合物を調節することの有効性をモニタリングするのに有用である。従って、遺伝子発現パターンは、化合物（特に、患者が耐性を発達させ得る化合物）を用いる処置の有効性を持続させることについての指標、ならびに毒性についての指標として役立ち得る。遺伝子発現パターンはまた、その化合物に対して影響を受けた細胞の生理学的応答を示すマーカーとして役立ち得る。従って、そのようなモニタリングは、その化合物の投与の増加、または患者が耐性を生じていない代替の化合物の投与のいずれかを可能にする。同様に、核酸発現レベルが、望ましいレベルより低い場合、その化合物の投与は、相応に減少され得る。
【０２５３】
本発明の別の局面において、薬学的パッケージが提供され、そのパッケージは、治療剤（例えば、低分子薬物、抗体、ペプチド、アンチセンス核酸分子またはＲＮＡｉ核酸分子など）、および本発明によって提供される１以上のＳＮＰもしくはＳＮＰハプロタイプについて診断的に試験されるヒトへの治療剤の投与のための指示書のセットを含む。
【０２５４】
本発明のＳＮＰ／ハプロタイプはまた、薬物開発プロセスの多くの様々な局面を改良するのに有用である。例えば、本発明の１つの局面は、ＳＮＰ遺伝子型に基づく臨床試験のために個体を選択することを包含する。例えば、個体がその薬物に対して正に応答しそうであることを示すＳＮＰ遺伝子型を有する個体は、その試験に含まれ得、一方で、個体のＳＮＰ遺伝子型が、個体がその薬物に対してあまり応答しそうにないかまたは応答しないことを示すか、あるいは毒性作用もしくは他の副作用に苦しむ危険性のある個体は、その臨床試験から除外され得る。このことは、臨床試験の安全性を改善するだけでなく、その試験が統計学的に有意な効力を示す機会を高め得る。さらに、本発明のＳＮＰは、特定の以前に開発された薬物が、臨床試験において不十分に実施された理由を説明し得、そして臨床試験において以前に不十分に実施された薬物から恩恵を受ける集団のサブセットを同定する一助となり、それによって、以前に開発された薬物を「救い」、そしてその薬物を、それから恩恵を受け得る特定のアルツハイマー病患者集団に利用可能にする。
【０２５５】
ＳＮＰは、薬物発見、薬物スクリーニング、および薬物開発において、多くの重要な用途を有する。潜在的な薬物標的として選択される任意の遺伝子／タンパク質について、その遺伝子／タンパク質の改変体が、患者集団中に存在するという高い確率が存在する。従って、治療剤の選択および送達における遺伝子／タンパク質の改変体の影響を決定することは、薬物発見および薬物開発プロセスの不可欠な局面であるべきである。（Ｊａｚｗｉｎｓｋａ，Ａ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓ３０−Ｓ３６［２００２年３月］）。
【０２５６】
特定の治療標的（例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ転写産物、またはタンパク質）の改変体（例えば、ＳＮＰおよび任意の対応するアミノ酸多型）に関する知識は、改変体を超える効力を示す治療剤候補（例えば、低分子化合物、抗体、アンチセンス核酸化合物またはＲＮＡｉ核酸化合物など）を同定するために、改変体のパラレルスクリーニングを可能にする（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９［３］：２０９−１１［２００１年３月］）。このような治療剤候補は、患者集団のより大きいセグメントにわたって等しい効力を示し、それによって、治療剤候補についてのより大きい潜在的な市場をもたらすことが期待される。
【０２５７】
さらに、潜在的な治療標的の改変体を同定することは、その標的の最も一般的な形態が、治療剤候補の選択のために使用されることを可能にし、それによって、選択された候補物について観察される実験的な活性が、患者集団の最も大きい集団において期待される実際の活性を反映することを確認する一助となる（Ｊａｚｗｉｎｓｋａ，Ａ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓ３０−Ｓ３６［２００２年３月］）。
【０２５８】
さらに、標的の全ての公知の改変体に対して治療候補をスクリーニングすることは、特定の改変体に関連した潜在的毒性および有害な反応の早期同定を可能にし得る。例えば、治療標的または薬物代謝遺伝子におけるＳＮＰによって引き起こされる、例えば、薬物の吸収、分布、代謝および排出（ＡＤＭＥ）における変動性が同定され得、そしてこの情報は、薬物開発プロセスの間に利用されて、薬物の廃棄における変動性が最小にされ得、そして広範囲の患者集団にわたってより安全である治療薬剤が開発され得る。改変タンパク質および表１〜２に提供されるコード多型核酸分子を含め、本発明のＳＮＰは、当該分野で確立された種々の毒物学的方法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される方法）に関連して有用である。
【０２５９】
さらに、当該分野で公知の任意のタンパク質（またはＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかの核酸分子）を標的とする治療薬剤は、表１に開示される改変タンパク質（または多型核酸分子）と交叉反応し得、それにより、薬物の薬物動態特性に顕著に影響を与え得る。その結果、表１〜２に開示されるタンパク質改変体およびＳＮＰ含有核酸分子は、対応する当該分野で公知のタンパク質形態（またはその核酸分子）を標的とする治療薬剤を開発、スクリーニングおよび評価する際に有用である。さらに、上記で考察されるように、特定の薬物標的の全ての多型形態の知識は、この薬物標的のこのような多型形態の大部分または全てに対して有効である治療薬剤の設計を可能にする。
【０２６０】
（薬学的組成物およびその投与）
本明細書中に開示される任意のアルツハイマー病関連タンパク質（およびコードする核酸分子）は、アルツハイマー病および関連の病状を処置するための治療標的として用いられ得（またはそれ自体が治療用化合物として直接用いられ得）、そして本開示は、これらの治療標的のいずれかを標的とする（またはそれらから構成される）治療用化合物（例えば、低分子、抗体、治療タンパク質、ＲＮＡｉおよびアンチセンス分子など）が開発されることを可能にする。
【０２６１】
一般に、治療用化合物は、類似の有用性を果たす薬剤についての容認された投与形態のいずれかによって、治療有効量で投与される。本発明の治療用化合物の実際の量、すなわち、有効成分は、多数の要因（例えば、処置すべき疾患の重篤度、被験体の年齢および関連の健康状態、用いられる化合物の効力、投与経路および投与形態、ならびに他の要因）に依存する。
【０２６２】
治療有効量の治療用化合物は、例えば、１日あたりレシピエントの体重１ｋｇあたり約０．０１〜５０ｍｇ（好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日）の範囲であり得る。従って、一例として、７０ｋｇのヒトに対する投与については、投薬範囲は、最も好ましくは、１日あたり約７ｍｇ〜１．４ｇである。
【０２６３】
一般に、治療用化合物は、以下の経路のうちの任意の１つによって薬学的組成物として投与される：経口投与、全身投与（例えば、経皮投与、鼻腔内投与または坐剤投与）、または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与または皮下投与）。好ましい投与様式は、苦痛の程度に従って調整され得る、従来の毎日の投薬レジメンを用いた、経口投与様式または非経口投与様式である。経口用組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体、散剤、徐放性処方物、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、エアロゾル剤または任意の他の適切な組成物の形態を採り得る。
【０２６４】
処方物の選択は、種々の要因（例えば、薬物の投与形態（例えば、経口投与については、錠剤、丸剤またはカプセル剤の形態の処方物が好ましい）および薬物物質のバイオアベイラビリティ）に依存する。近年、薬学的処方物は、表面積を増大させる、すなわち、粒子サイズを減少させることによってバイオアベイラビリティが増大し得るという原理に基づいて、より乏しいバイオアベイラビリティを示す薬物について特に開発されている。例えば、米国特許第４，１０７，２８８号は、活性な物質が高分子の架橋マトリクス上に保持される、１０ｎｍ〜１，０００ｎｍの〜サイズ範囲の粒子を有する薬学的処方物を記載する。米国特許第５，１４５，６８４号は、薬物物質が、表面モディファイアの存在下でナノ粒子（４００ｎｍの平均粒子サイズ）まで粉砕され、次いで、液体媒体中に分散されて、顕著に高いバイオアベイラビリティを示す薬学的処方物が得られる、薬学的処方物の生産を記載する。
【０２６５】
薬学的組成物は、一般に、少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせた治療用化合物から構成される。受容可能な賦形剤は、無毒性であり、投与を補助し、そしてこの治療用化合物の治療的利益に対して有害には影響を与えない。このような賦形剤は、任意の固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合は気体の、当業者に一般的に入手可能である賦形剤であり得る。
【０２６６】
固体の薬学的賦形剤としては、デンプン、セルロース、滑石、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳などが挙げられる。液体賦形剤および半固体賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールおよび種々の油（石油起源、動物起源、植物起源もしくは合成起源の油（例えば、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油など）を含む）から選択され得る。（特に注射可能溶液用に）好ましい液体キャリアとしては、水、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリコールが挙げられる。
【０２６７】
圧縮ガスは、エアロゾル形態で本発明の化合物を分散させるために使用され得る。この目的で適切な不活性ガスは、窒素、二酸化炭素などである。
【０２６８】
他の適切な薬学的賦形剤およびそれらの処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］）に記載される。
【０２６９】
処方物中のその治療化合物の量は、当業者によって採用される十分な範囲内で変化し得る。代表的には、その処方物は、重量％（ｗｔ％）ベースで、処方物全体に基づいて、約０．０１〜９９．９９ｗｔ％の治療化合物を含み、１種以上の適切な薬学的賦形剤でバランスが取られる。好ましくは、その化合物は、約１〜８０ｗｔ％のレベルで存在する。
【０２７０】
治療化合物は、単独で、または他の治療化合物もしくは１種以上の他の活性成分と組み合わせて投与され得る。例えば、アルツハイマー病関連タンパク質のインヒビターまたは刺激剤は、同じアルツハイマー病関連タンパク質または異なるアルツハイマー病関連タンパク質の活性を阻害するかまたは刺激する別の薬剤と組み合わせて投与されて、それによりアルツハイマー病の影響に対抗し得る。
【０２７１】
薬理学に関するさらなる情報については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０２７２】
（ヒト識別用途）
アルツハイマー病および関連病理におけるそれらの診断用途および治療用途に加えて、本発明により提供されるＳＮＰはまた、法医学、親子鑑定、および生物測定法（例えば、Ｇｉｌｌ，「Ａｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＳＮＰｓ）  ｆｏｒ  ｆｏｒｅｎｓｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｌｅｇａｌ  Ｍｅｄ．１１４（４−５）：２０４−１０［２００１］を参照のこと）のような適用のためのヒト識別マーカーとして有用である。個体間の核酸配列における遺伝的変動は、個体を識別し、生物学的サンプルと個体とを識別するために遺伝マーカーとして使用され得る。どのヌクレオチドが個体におけるＳＮＰ位置のセットを占めるかという決定は、その個体を区別するＳＮＰマーカーのセットを識別する。解析されるＳＮＰ位置が多いほど、１個体におけるＳＮＰのセットが、関連しない個体におけるＳＮＰのセットと同じである確率は、低くなる。好ましくは、複数の部位が解析される場合、その部位は、連鎖していない（すなわち、独立して遺伝する）。従って、ＳＮＰの好ましいセットは、本明細書中に開示されるＳＮＰの中から選択され得、これらのＳＮＰとしては、異なる染色体上のＳＮＰ、異なる染色体アーム上のＳＮＰ、および／または同じ染色体アームに沿って実質的な距離だけ離れて分散されるＳＮＰが挙げられ得る。
【０２７３】
さらに、本明細書中に開示されるＳＮＰの中でも、特定の法医学的適用／ヒト識別用途における使用に好ましいＳＮＰとしては、縮重コドン位置（すなわち、２以上の選択的ヌクレオチドのうちの１つであり得、同じアミノ酸をなおコードし得る特定のコドンにおける三番目の位置）に位置するＳＮＰが挙げられる。なぜなら、これらのＳＮＰは、コードされるタンパク質に影響を及ぼさないからである。そのコードされるタンパク質に影響を及ぼさないＳＮＰは、少ない選択圧下にあると予測され、よって、集団中でより多型性であると予測され、これは、代表的には、法医学適用／ヒト識別用途の利点である。しかし、特定の法医学適用／ヒト識別用途（例えば、ＤＮＡサンプルから表現型的特性を推測する（個体の家系を推論するかまたはその個体の１種以上の物理的特性を推論する））に関して、そのコードされるタンパク質に影響を及ぼすＳＮＰを利用することは望ましいことであり得る。
【０２７４】
表１〜２（これは、「Ａｐｐｌｅｒａ」ＳＮＰソースと識別される）に開示されるＳＮＰの多くについては、表１〜２は、３９個体に由来する染色体のＤＮＡを再配列決定することによって得られたＳＮＰ対立遺伝子頻度を提供する（表１〜２はまた、「Ｃｅｌｅｒａ」ソースＳＮＰ、利用可能な場合、ｄｂＥＳＴ、ＨＧＢＡＳＥ、および／またはＨＧＭＤからの公的なＳＮＰについての対立遺伝子頻度情報を提供する）。表１〜２に提供されるその対立遺伝子頻度は、これらのＳＮＰが、ヒト識別用途のために容易に使用されるようにし得る。表１および／または表２に開示される任意のＳＮＰは、ヒト識別のために使用され得るが、特定のＳＮＰ部位における少数の対立遺伝子の頻度が、５０％に近くなるほど、そのＳＮＰが、集団中の異なる個体の間を区別する能力が大きくなる。なぜなら、２つの無作為に選択された個体が、そのＳＮＰ部位において異なる対立遺伝子を有する可能性は、興味深いことに高くなるからである。表１〜２に提供されるＳＮＰ対立遺伝子頻度を使用すると、当業者は、その少数の対立遺伝子の頻度が、例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％であるか、あるいはその間の任意の他の頻度であるＳＮＰのサブセットを容易に選択し得る。従って、表１〜２は、３９個体に由来する染色体の再配列決定に基づいて対立遺伝子頻度を提供するので、ＳＮＰのサブセットは、ヒト識別について容易に選択され得、そのサブセットにおいて、特定のＳＮＰ部位における少数の対立遺伝子の総対立遺伝子数は、例えは、少なくとも１個、２個、４個、８個、１０個、１６個、２０個、２４個、３０個、３２個、３６個、３８個、３９個、４０個、またはその間の任意の他の数である。
【０２７５】
さらに、表１〜２はまた、広い対立遺伝子頻度情報と合わせて個体群（民族群または人種群と本明細書中で交換可能にいわれる）情報を提供する。例えば、３９個体の群（ＤＮＡを再配列決定した）を、２０名の白色人種および１９名のアフリカ系アメリカ人で構成した。この個体群情報は、ヒト識別のためのＳＮＰ選択をさらに精緻にし得る。例えば、ヒト識別についての好ましいＳＮＰは、白色人種集団およびアフリカ系アメリカ人集団の両方において類似の対立遺伝子頻度を有する表１〜２から選択され得る；従って、例えば、両方の集団において等しく高い識別能を有するＳＮＰが選択され得る。あるいは、白色人種集団とアフリカ系アメリカ人集団との間で対立遺伝子頻度は統計学的に有意に異なる（極端な例として、特定の対立遺伝子が、白色人種個体群またはアフリカ系アメリカ人個体群のいずれかでのみ観察され得るが、他方の個体群においては観察されない）ＳＮＰが選択され得る；このようなＳＮＰは、例えば、ある犯罪現場で回収された生物学的サンプル（例えば、毛髪または血痕）から、未知の加害者の人種／民族を推定するために有用である。統計学的方法を含め、ＳＮＰを使用して、ＤＮＡサンプルから家系を推定するという議論については、Ｆｒｕｄａｋｉｓら、「Ａ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＳＮＰ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｎｃｅｓｔｒｙ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４８［４］：７７１−７８２［２００３］を参照のこと。
【０２７６】
ＳＮＰは、短い直列反復（ＳＴＲ）のような多型マーカーの他のタイプより多くの利点を有する。例えば、ＳＮＰは、容易にスコア付けされ得、自動化しやすく、このことにより、ＳＮＰは、大規模な法医学的データベースについて選択されたマーカーにされる。ＳＮＰは、反復多型よりもゲノム全体を通して遙かに多く見出される。２つの多型形態の集団頻度は、通常、複数対立遺伝子座における複数の多型形態のものよりも高い正確性で決定され得る。ＳＮＰは、反復多型よりも変異として安定である。ＳＮＰは、解析を妨害し得る人工産物（例えば、スタッターバンド（ｓｔｕｔｔｅｒ  ｂａｎｄ））に感受性でない。スタッターバンドは、反復多型を解析する場合に頻繁に遭遇し、サンプル（例えば、多数の供給源に由来するＤＮＡの混合物を含み得る犯行現場サンプル）を解析する場合に、特に煩わしい。ＳＴＲマーカーを超えるＳＮＰマーカーの別の有意な利点は、ＳＮＰをスコア付けするために必要な核酸の長さがより短いことである。例えば、ＳＴＲマーカーは、一般に、長さが数百塩基対である。他方、ＳＮＰは、単一のヌクレオチド、一般には、プライマーおよび／またはプローブ結合のためのＳＮＰ位置のいずれかの側の短い保存領域を含む。これは、ＳＮＰを、ＤＮＡが、短い小片にフラグメント化され得る、法医学的ケースワークにおいて頻繁に遭遇する高度に分解した、または時間が経った生物学的サンプルにおける型決定により扱いやすくする。
【０２７７】
ＳＮＰはまた、ＳＴＲ遺伝子座を解析する場合に頻繁に遭遇する微小改変（ｍｉｃｒｏｖａｒｉａｎｔ）および「オフラダー（ｏｆｆ−ｌａｄｄｅｒ）」対立遺伝子になりにくい。微小改変は、増幅されたＤＮＡ生成物のサイズを変化させる反復単位内の欠失または挿入であり、その結果、その増幅された生成物は、正常サイズの反復単位を有する参照対立遺伝子と同じ速度で移動しない。サイズによって（例えば、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって）分離される場合、微小改変は、標準サイズの反復単位の参照対立遺伝子ラダーと整列しないが、むしろ、参照対立遺伝子の間に移動する。その参照対立遺伝子ラダーは、対立遺伝子分類のために対立遺伝子の正確なサイズ分けのために使用される；従って、参照対立遺伝子ラダーと整列しない対立遺伝子は、実質的な解析の問題をもたらす。さらに、複数対立遺伝子の反復多型を解析する場合、ときおり、その集団中であらかじめ認められるよりも多いかまたは少ない反復単位、あるいは参照対立遺伝子ラダーに含まれるよりも多いかまたは少ない反復単位からなる対立遺伝子が見出される。これらの対立遺伝子は、参照対立遺伝子ラダーにおける既知の対立遺伝子のサイズ範囲の外側に移動し、そのために、「オフラダー」対立遺伝子といわれる。極端な場合、その対立遺伝子は、ごく少数の反復しか含まないかまたは非常に多くの反復を含み得るので、それは、その参照対立遺伝子ラダーの範囲の十分外に移動する。この状況において、その対立遺伝子は、観察すらされないかもしれないか、または、多重解析を用ると、別の遺伝子座についてのサイズ範囲内にまたはそのサイズ範囲近くに移動し得、さらに解析を混乱させる。
【０２７８】
ＳＮＰ解析は、ＳＴＲ解析において遭遇する微小改変体およびオフラダー対立遺伝子の問題を回避する。重要なことに、微小改変体およびオフラダー対立遺伝子は、顕著な問題を生じ得、そして特定の既知の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用する、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアレイのような解析法を使用する場合に、完全に見逃され得る。さらに、ＳＴＲ解析で遭遇するオフラダー対立遺伝子および微小改変体は、たとえ正しく型分類されたとしても、不適切な統計学的解析をもたらし得る。なぜなら、その集団中のそれらの頻度は、一般に、未知であるかまたは特徴付けが乏しく、よって、その適合する遺伝子型の統計学的有意性には疑問が残り得る。ＳＮＰ解析の全てのこれらの利点は、大部分のＤＮＡ識別例の結論（個体の終身刑、または死亡した個体の家族に対する遺体の再関連づけをもたらし得る）に鑑みて、注目に値する。
【０２７９】
ＤＮＡは、生物学的サンプル（例えば、血液、骨、毛髪、唾液、または精液）から単離され得、特定のＳＮＰ位置における参照供給源からのＤＮＡと比較され得る。複数のＳＮＰマーカーは、適合している遺伝子型の識別能および統計学的有意性を増大させるために、同時にアッセイされ得る。例えば、オリゴヌクレオチドアレイは、多数のＳＮＰを同時に遺伝子型決定するために使用され得る。本発明により提供されるＳＮＰは、個体を識別するか、または特定の生物学的サンプルと個体を関連づけるために、他の多型遺伝マーカー（例えば、当該分野で公知の他のＳＮＰ）またはＳＴＲと組み合わせてアッセイされ得る。
【０２８０】
さらに、本発明により提供されるＳＮＰは、ＤＮＡ遺伝子型のデータベース（例えば、犯罪者ＤＮＡデータバンク（例えば、ＦＢＩのＣｏｍｂｉｎｅｄ  ＤＮＡ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＯＤＩＳ）データベース））中に含めるために遺伝子型決定され得る。次いで、未知の供給源の生物学的サンプルから得られた遺伝子型が、適合している遺伝子型を見出すためにデータベースに対して問い合わせられ得、本発明のＳＮＰは、そこで既知のＤＮＡ配列および未知のＤＮＡ配列を同一性について比較するヌクレオチド位置を提供する。従って、本発明は、例えば、法医学的適用、生物測定法適用、または他のヒト識別用途において使用するために、本発明の新規なＳＮＰまたはＳＮＰ対立遺伝子を含むデータベース（例えば、そのデータベースは、集団の個々のメンバーが、本発明の１以上の新規なＳＮＰ部位において、どの対立遺伝子を保有するかを示す情報を含み得る）を提供する。このようなデータベースは、代表的には、本発明のＳＮＰまたはＳＮＰ対立遺伝子が、コンピュータ読み取り可能な媒体（本明細書中の、標題「コンピュータ関連実施形態」の節を参照のこと）上に記録される、コンピュータベースのシステムを含む。
【０２８１】
本発明のＳＮＰはまた、親子鑑定において使用するためにアッセイされ得る。親子鑑定の目的は、通常、ある男性が子供の父親であるか否かを決定することである。大部分の例において、その子供の母親は、既知であり、よって、その子供の遺伝子型に対する母親の寄与が追跡され得る。親子鑑定は、その母親に帰さない子供の遺伝子型の一部が、推定の父親の遺伝子型と一致するか否かを調査する。親子鑑定は、その推定の父親およびその子供における多型のセットを解析することによって行われ得、本発明のＳＮＰは、ここで同一性についてその推定の父親および子供のＤＮＡ配列を比較するためのヌクレオチド位置を提供する。その父親に帰する、子供における多型のセットが、その推定の父親の多型のセットと適合しない場合、実験誤差を除いて、その推定の父親が、その子供の父親でないと結論づけられ得る。その父親に帰する子供における多型のセットが、推定の父親の多型のセットと適合する場合、統計学的計算は、偶然一致した適合の可能性、および推定の父親がその子供の真の生物学的父親であるという可能性に関して引き出される結論を決定するために行われ得る。
【０２８２】
親子鑑定に加えて、ＳＮＰは、血族鑑定の他の型についても（例えば、移民目的の家族関係を確証するため、またはある個人が、死亡した個人からの相続を主張するために、その死亡した個人の血縁関係にあると主張する場合のため、など）に有用である。親子鑑定および他の型の血族鑑定についてのＳＮＰの有用性に関するさらなる情報に関しては、統計学的解析のための方法を含め、Ｋｒａｗｃｚａｋ，「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０（８）：１６７６−８１（１９９９年６月）を参照のこと。
【０２８３】
ヒト識別のための本発明のＳＮＰの用途は、生物測定システムと一般にいわれる種々の鑑定システムにさらに拡張し、代表的には、ヒト（または他の生物）の物理的特性をデジタルデータに変換する。生物測定システムは、このような独自の解剖学的または生理学的特性（人差し指、親指の指紋または掌紋；手の形状；手の甲側の静脈パターン；網膜の血管パターンならびに虹彩の色および外観；顔の特徴；声のパターン；サインおよびタイピングの強弱；ならびにＤＮＡとして）を測定する種々の技術的デバイスを含む。このような生理学的測定値は、同一性を確認し、例えば、その識別に基づいて、アクセスを制限または許容するために使用され得る。生物測定法のための適用の例としては、物理的区域のセキュリティー、コンピュータおよびネットワークのセキュリティー、航空機乗客のチェックインおよび搭乗手続、金銭取引、医療記録アクセス、政府機関配電、投票、法執行、パスポート、査証および入国管理、刑務所、種々の軍事的用途、ならびに高価なもしくは危険な品物（例えば、自動車もしくは銃）へのアクセス制限目的（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｗ  Ｒｅｖｉｅｗおよび米国特許第６，１１９，０９６号を参照のこと）が挙げられる。
【０２８４】
ＳＮＰ（特に、本発明によって提供されるＳＮＰ）の群は、生物測定学的用途（例えば、上記のもの）のために個体を固有に識別するために、分類され得る。このようなＳＮＰ分類は、例えば、ＤＮＡチップ／アレイを用いて、達成され得る。好ましくは、ＤＮＡサンプルを取得するための最小限に侵襲性の手段が利用される。例えば、ＰＣＲ増幅により、頬内のぬぐい液または指紋（これらは、ＤＮＡ含有皮膚細胞および接触する間に自然に移った油を含む）から、解析に十分な量のＤＮＡを得られるようになる。法医学的／ヒト識別用途においてＳＮＰを使用するための技術に関するさらなる情報は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４．１−１４．７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００２）に見出され得る。
【０２８５】
（改変タンパク質、抗体、ベクターおよび宿主細胞、ならびにその使用）
（ＳＮＰ含有核酸分子によりコードされる改変タンパク質）
本発明は、ＳＮＰ含有核酸分子を提供し、その多くは、当該分野で公知の（すなわち、野生型）タンパク質と比較して、改変アミノ酸配列をコードするタンパク質をコードする。本発明の多型核酸分子によりコードされるアミノ酸配列は、表１および配列表において配列番号６〜１０として提供される：これらの改変体は、一般に、本発明の改変タンパク質／ペプチド／ポリペプチド、または多型タンパク質／ペプチド／ポリペプチドといわれる。用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、交換可能に本明細書中で使用される。
【０２８６】
本発明の改変タンパク質は、例えば、本明細書中に開示されるｃＳＮＰ位置のいずれか１つにおいて非類似のヌクレオチド置換によってコードされ得る。さらに、改変タンパク質はまた、発現、構造、および／または機能が本明細書中で開示されるＳＮＰ（例えば、終止コドンを作り出すまたは破壊するＳＮＰ、スプライシングに影響を及ぼすＳＮＰ、および制御エレメント／調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、または転写因子結合ドメイン）におけるＳＮＰ）によって改変されるタンパク質が挙げられ得る。
【０２８７】
本明細書中で使用される場合、タンパク質またはペプチドは、細胞物質も化学的前駆物質も他の化学物質も実質的に含まない場合に、「単離される」または「精製される」といわれる。本発明の改変タンパク質は、均質にまで、または他のより低い純度にまで精製され得る。精製のレベルは、意図される用途に基づく。その重要な特徴とは、その調製物が、他の成分がかなりの量で存在しても、上記改変タンパク質の望ましい機能を可能にすることである。
【０２８８】
本明細書中で使用される場合、「細胞物質を実質的に含まない」とは、約３０％（乾燥重量で）の他のタンパク質（すなわち、夾雑タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、または約５％未満の他のタンパク質しか含まない、その改変タンパク質の調製物を包含する。その改変タンパク質が組換え生成される場合、それはまた、培養培地を実質的に含まないことであり得る（すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満にしか相当しない）。
【０２８９】
語句「化学前駆物質も他の化学物質も実質的に含まない」は、改変タンパク質の合成に関与する化学前駆物質または他の化学物質から分離されている、その改変タンパク質の調製物を包含する。一実施形態において、語句「化学前駆物質も他の化学物質も実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量で）未満の化学前駆物質もしくは他の化学物質または約２０％未満の化学前駆物質もしくは他の化学物質、約１０％未満の化学前駆物質または他の化学物質、または約５％未満の化学前駆物質もしくは他の化学物質しか含まない、その改変タンパク質の調製物を包含する。
【０２９０】
単離された改変タンパク質は、その改変タンパク質を天然に発現する細胞から精製され得るか、これを発現するように改変された細胞（組換え宿主細胞）から精製され得るか、または公知のタンパク質合成方法を使用して合成され得る。例えば、ＳＮＰを含有する、改変タンパク質をコードする核酸分子は、発現ベクターにクローニングされ得、その発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、そしてその改変タンパク質がその宿主細胞において発現され得る。次いで、その改変タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用して、任意の適切な精製スキームによってその細胞から単離され得る。これらの技術の例は、以下に詳細に記載される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ［２０００］）。
【０２９１】
本発明は、本発明のＳＮＰを含む１以上のコドンによってコードされる１以上の改変体アミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなるか、またはこれらから本質的になる、単離された改変タンパク質を提供する。
【０２９２】
従って、本発明は、表１および／または表２に提供されるＳＮＰによってコードされる１以上のアミノ酸多型（または終止コドンの生成または破壊にそれぞれ起因する、短縮または伸長）を含むアミノ酸配列からなる改変タンパク質を提供する。タンパク質は、アミノ酸配列がそのタンパク質のアミノ酸配列全体である場合に、そのアミノ酸配列からなる。
【０２９３】
本発明は、表１および／または表２に提供されるＳＮＰによってコードされる１以上のアミノ酸多型（または終止コドンの生成もしくは破壊にそれぞれ起因する、短縮もしくは伸長）を含むアミノ酸配列から本質的になる改変タンパク質をさらに提供する。タンパク質は、アミノ酸配列が最終的なタンパク質中にわずか数個のさらなるアミノ酸残基とともに存在する場合、このようなアミノ酸配列から本質的になる。
【０２９４】
本発明は、表１および／または表２に提供されるＳＮＰによってコードされる１以上のアミノ酸多型（または終止コドンの生成または破壊にそれぞれ起因する短縮または伸長）を含むアミノ酸配列を含む改変タンパク質をさらに提供する。タンパク質は、アミノ酸配列がそのタンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合に、そのアミノ酸配列を含む。このようにして、そのタンパク質は、その改変体アミノ酸配列のみを含んでいてもよいし、さらなるアミノ酸残基（例えば、そのタンパク質と天然に関連しているか、または異種アミノ酸残基である、連続したコードされる配列）を有していてもよい。このようなタンパク質は、数個のさらなるアミノ酸残基を有し得るか、または多くのさらなるアミノ酸を含み得る。これらのタンパク質のどの程度種々の型が作製されかつ単離され得るかの簡単な説明は、以下に提供される。
【０２９５】
本発明の改変タンパク質は、キメラタンパク質または融合タンパク質を形成するために、異種配列に結合され得る。このようなキメラタンパク質および融合タンパク質は、改変タンパク質に実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に作動可能に連結されたその改変タンパク質を含む。「作動可能に連結される」とは、その改変タンパク質およびその異種タンパク質についてのコード配列が、インフレームで連結されることを示す。その異種タンパク質は、その改変タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。別の実施形態において、その融合タンパク質は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成される融合ポリヌクレオチドによってコードされる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的な突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じる別のプライマーを使用して行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ［１９９２］を参照のこと）。さらに、多くの発現ベクターが、市販されており、これらはすでに融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）をコードしている。改変タンパク質をコードする核酸は、その融合部分がその改変タンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクターにクローニングされ得る。
【０２９６】
多くの場合、その融合タンパク質は、その改変タンパク質の活性に影響を及ぼさない。その融合タンパク質としては、酵素融合タンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ融合物）、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合物、ポリ−Ｈｉｓ融合物、ＭＹＣタグ化融合物、ＨＩタグ化融合物およびＩｇ融合物が挙げられるが、これらに限定されない。このような融合タンパク質（特に、ポリ−Ｈｉｓ融合物）は、組換え発現後のそれらの精製を容易にし得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することで増大され得る。融合タンパク質は、例えば、Ｔｅｒｐｅ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ：ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｔｏ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（５）：５２３−３３（２００３年１月）：電子出版２００２年１１月７日；Ｇｒａｄｄｉｓら，「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｗｏｒｋ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（４）：２８５−９７（２００２年１２月）；およびＮｉｌｓｓｏｎら，「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１１（１）：１−１６（１９９７年１０月）にさらに記載される。
【０２９７】
本発明はまた、本発明の改変体ポリペプチドのさらに明らかな改変体（例えば、天然に存在する成熟形態（例えば、対立遺伝子改変体）、天然に存在しない組換え由来改変体、ならびに配列相同性を共有するこのようなタンパク質のオルソログおよびパラログ）に関する。このような改変体は、組換え核酸技術およびタンパク質生化学の分野における分野で公知の技術を使用して容易に生成され得る。しかし、改変体は、本発明より前の先行技術において公知であるものを除くことが理解される。
【０２９８】
表１に開示される改変体ポリペプチドのさらなる改変体は、表１に開示されるアミノ酸配列（またはそれらのフラグメント）と少なくとも７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有し、かつ表１に開示される新規なアミノ酸残基（対立遺伝子）（新規ＳＮＰ対立遺伝子によってコードされる）を含むアミノ酸配列を包含し得る。従って、具体的に企図される本発明の一局面は、表１に示されるポリペプチド配列と比較して、ある程度の配列の変化を有するが、本明細書中に開示される新規ＳＮＰ対立遺伝子によってコードされる新規アミノ酸残基（対立遺伝子）を含む、ポリペプチドである。言い換えると、ポリペプチドが本明細書中に開示される新規なアミノ酸残基を含む限りにおいて、その新規なアミノ酸残基に隣接するポリペプチドの他の部分は、表１に示されるポリペプチド配列からある程度変化し得る。
【０２９９】
本明細書中に開示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むタンパク質の全長の予めプロセシングされた形態、ならびに成熟プロセシング形態は、本発明の改変タンパク質のうちの１つに対して完全な配列同一性を有し、本明細書中に提供される改変タンパク質と同じ遺伝子座によってコードされるものであると容易に同定され得る。
【０３００】
改変体ペプチドのオルソログは、改変体ペプチドの少なくとも一部に対してある程度有意な配列相同性／同一性を有し、別の生物に由来する遺伝子によってコードされるものであると容易に同定され得る。好ましいオルソログは、ヒト治療標的および因子の開発のために、非ヒト哺乳動物（好ましくは、霊長類）から単離される。このようなオルソログは、そのオルソログタンパク質を生じる２つの生物の関連性の程度に依存して、中程度からストリンジェントな条件下で、改変体ペプチドコード核酸分子にハイブリダイズする核酸配列によってコードされ得る。
【０３０１】
改変タンパク質としては、本発明のＳＮＰによって引き起こされる、アミノ酸配列における欠失、付加および置換を含むタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。１つのクラスの置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸が類似の特性の別のアミノ酸で置換される、保存的アミノ酸置換である。代表的な保存的置換は、脂肪族アミノ酸の中では、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの１つを別のアミノ酸で置換すること；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換；ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの置換である。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントであり得るかに関してのガイダンスは、例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出される。
【０３０２】
改変タンパク質は、完全に機能的でもあり得るし、または１つ以上の活性（例えば、別の分子に結合する能力、基質に触媒作用を及ぼす能力、シグナル伝達を媒介する能力など）において機能を欠き得る。十分に機能的な改変体は、代表的には、保存的改変または重要でない残基または重要でない領域における改変を含む。機能的な改変体はまた、機能において何の変化ももたらさないか、またはわずかな変化しかもたらさない、類似アミノ酸の置換を含み得る。あるいは、このような置換は、ある程度まで、機能に正にまたは負に影響を及ぼし得る。非機能的改変体は、代表的には、１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、短縮もしくは伸長、または重要な残基もしくは重要な領域における置換、挿入、逆位、もしくは欠失を含む。
【０３０３】
タンパク質の機能のために必要不可欠なアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５［１９８９］））によって、特に、表１に提供されるアミノ酸配列および多型情報を用いて同定され得る。後者の手順は、分子中の全ての残基において単一のアラニン変異を誘発する。次いで、生じる変異体分子は、生物活性（例えば、酵素活性）について試験されるか、またはアッセイ（例えば、インビトロ増殖活性）で試験される。結合パートナー／基質結合について重要な部位はまた、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光アフィニティーラベリング）によって決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４［１９９２］；ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２［１９９２］）。
【０３０４】
ポリペプチドは、２０種の天然に生ずるアミノ酸と一般的に言われる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。さらに、多くのアミノ酸（末端アミノ酸を含む）は、天然のプロセス（例えば、プロセシングおよび他の翻訳後修飾）によって、または当該分野で周知の化学的修飾技術によって、修飾され得る。従って、本発明の変異タンパク質はまた、誘導体またはアナログを含み、この誘導体またはアナログにおいては、置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものでないか、置換基が含まれるか、成熟ポリペプチドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されるか、または、さらなるアミノ酸がこの成熟ポリペプチド（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列またはこの成熟ポリペプチドの精製のための配列あるいはプロタンパク質配列）に融合される。
【０３０５】
公知のタンパク質修飾としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン化。
【０３０６】
このようなタンパク質修飾は、当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化は、例えば、以下の最も基本的な教科書に記載される：例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｆ．Ｗｏｌｄ，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１−１２，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；およびＲａｔｔａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）。
【０３０７】
本発明は、変異タンパク質のフラグメントをさらに提供する。このフラグメントは、本明細書中に開示される１つ以上のＳＮＰによってコードされる、１つ以上のアミノ酸配列改変体（例えば、置換、または停止コドンの作製もしくは破壊に起因する切断または伸長）を含む。しかし、本発明が関係するフラグメントは、本発明の前の先行技術で開示されているフラグメントを包含するとは解釈されない。
【０３０８】
本明細書中で使用される場合、フラグメントは、改変タンパク質由来の、少なくとも約４、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１４、少なくとも約１６、少なくとも約１８、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００（もしくは合間の任意の他の数）またはそれ以上連続するアミノ酸残基を含み得る。ここで、少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、本発明によって提供されるｃＳＮＰ位での非同義ヌクレオチド置換によってコードされる改変体アミノ酸残基）は、本発明のＳＮＰによって影響を受ける。ｃＳＮＰによってコードされる改変体アミノ酸は、フラグメントの配列に沿って任意の残基位置を占め得る。このようなフラグメントは、改変タンパク質の１つ以上の生物活性を保持する能力、または機能を行う（例えば、免疫原として作用する）能力に基づいて選択され得る。特別に重要なフラグメントは、生物活性フラグメントである。このようなフラグメントは、代表的には、本発明の改変タンパク質のドメインもしくはモチーフ（例えば、活性部位、膜貫通ドメイン、またはリガンド／基質結合ドメイン）を含む。他のフラグメントとしては、ドメイン含有フラグメントまたはモチーフ含有フラグメント、可溶性ペプチドフラグメント、および免疫原構造を含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。予想されるドメインおよび機能的部位は、当業者に周知のコンピュータプログラムによって容易に同定可能である（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ解析）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［２００２］）。
【０３０９】
（改変タンパク質の使用）
本発明の改変タンパク質は、種々の方法で使用され得、以下が挙げられるが、これらに限定されない：改変タンパク質の生物活性を決定するためのアッセイ（例えば、ハイスループットスクリーニングのための複数タンパク質の一団におけるアッセイ）において使用され得る；抗体を産生させるか、または別の型の免疫応答を誘発するため使用され得る；生体液中の改変タンパク質（またはその結合パートナー）のレベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（標識された試薬を含む）として使用され得る；細胞または組織に対するマーカーとして（この細胞または組織において、このマーカーは、（構成的に、または組織分化もしくは組織発生の特定の段階で、あるいは疾患状態でのいずれかで）優先的に発現される）；治療剤のスクリーニングのための標的として使用され得る；およびヒト被験体に投与される直接的治療剤として使用され得る。本明細書中に開示される任意の改変タンパク質は、研究用製品としての商品化のために試薬等級またはキット型へと開発され得る。上記で列挙された用途を実行するための方法は、当業者に周知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［２０００］ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ［１９８７］を参照のこと）。
【０３１０】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法は、本明細書中に開示される１つ以上の改変タンパク質の検出を含む。改変タンパク質は、配列番号６〜１０として、表１および配列表に開示される。このようなタンパク質の検出は、例えば、抗体、低分子化合物、アプタマー、リガンド／基質、他のタンパク質もしくはタンパク質フラグメント、または他のタンパク質結合剤を用いて達成され得る。好ましくは、タンパク質検出剤は、本発明の改変タンパク質に特異的であり、従って、本発明の改変タンパク質と野生型のタンパク質または別の改変体形態との間を識別し得る。これは、一般的には、例えば、改変タンパク質と野生型タンパク質との間で異なるタンパク質の領域（例えば、本発明の非同義ｃＳＮＰによってコードされた１つ以上のアミノ酸置換を含む、タンパク質の領域、または、停止コドンを作製し、それによってより短いポリペプチドをもたらすナンセンス改変体型ＳＮＰに従うタンパク質の領域、または、停止コドンを破壊し、それによってより長いポリペプチドをもたらすリードスルー改変体型ＳＮＰに従うタンパク質の領域（ここで、このポリペプチドの部分は、このポリペプチドのうちの１つのバージョンでは存在するが、他のバージョンでは存在しない））に結合する検出薬剤を選択するか、または設計することによって達成され得る。
【０３１１】
本発明の別の特定の局面において、本発明の改変タンパク質は、ヒトにおいて、アルツハイマー病を診断するための、またはアルツハイマー病に対する素因を決定するための標的として使用される。従って、本発明は、細胞、組織、または生体における本発明の１つ以上の改変タンパク質の存在もしくはレベルを検出するための方法を提供する。このような方法は、代表的には、試験サンプルと薬剤（例えば、抗体、低分子化合物、またはペプチド）とを接触させる工程を包含する。この薬剤は、改変タンパク質と相互作用することが可能であり、その結果、改変タンパク質への薬剤の特異的な結合が検出され得る。このようなアッセイは、単一検出フォーマットまたはアレイのような複数検出形式（例えば、抗体アレイまたはアプタマーアレイ（タンパク質検出のためのアレイはまた、「タンパク質チップ」とも呼べれ得る））で提供され得る。目的の改変タンパク質は、試験サンプルから単離され得、そして本発明によって開示される１つ以上のＳＮＰによってコードされた改変体アミノ酸配列の存在についてアッセイされ得る。このＳＮＰは、タンパク質および対応するタンパク質機能／活性に対して、（例えば、アミノ酸の置換、欠失、挿入および／もしくは再配列をもたらし得るタンパク質コード領域における非同義置換；停止コドンの形成もしくは破壊；またはプロモーターのような制御要素の変更を介して）変化を引き起こし得る。ＳＮＰはまた、非適切な翻訳後修飾をもたらし得る。
【０３１２】
サンプルにおける改変タンパク質を検出するための１つの好ましい因子は、タンパク質の改変体形態に選択的に結合することが可能な抗体である（抗体は、次節でより詳細に記載される）。このようなサンプルとしては、例えば、被験体から単離された組織、細胞、および生体液、ならびに被験体内に存在する組織、細胞、および液体が挙げられる。
【０３１３】
本明細書中に開示されるアルツハイマー病に関連する改変タンパク質およびそのフラグメントの検出のためのインビトロ法としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降、免疫蛍光、およびタンパク質アレイ／チップ（例えば、抗体またはアプタマーのアレイ）が挙げられるが、これらに限定されない。イムノアッセイおよび関連するタンパク質検出法に関するさらなる情報については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＨａｇｅ，「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（１２）：２９４Ｒ−３０４Ｒ（１９９９年６月１５日）を参照のこと。
【０３１４】
アミノ酸改変体を検出するさらなる解析法としては、電気泳動移動度の変化、トリプシンペプシド消化の変化、細胞ベースのまたは細胞フリーのアッセイにおけるタンパク質活性の変化、リガンドまたは抗体結合パターンにおける変化、等電点の変化、および直接アミノ酸シークエンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１５】
あるいは、改変タンパク質は、改変タンパク質に特異的な標識抗体（または他の型の検出試薬）を被験体に導入することによって、その被験体においてインビボで検出され得る。例えば、この抗体は、放射性マーカーで標識され得る。被験体におけるこの放射性マーカーの存在および位置は、標準画像化技術によって検出され得る。
【０３１６】
本発明の改変タンパク質の他の使用は、そのタンパク質の分類または作用に基づく。例えば、ヒトから単離されたタンパク質およびそれらの哺乳動物オルソログは、特に、このタンパク質を発現する細胞または組織における生物学的応答または病理学的応答を調節するための治療用途での使用のための薬剤（例えば、低分子薬または抗体）を同定するための標的として機能する。タンパク質活性を調節する薬学的薬剤が開発され得る。
【０３１７】
遺伝子発現を調節するための代替物として、治療化合物が、タンパク質機能を調節するように開発され得る。例えば、本明細書中に開示される多くのＳＮＰ（例えば、非同義ｃＳＮＰおよびナンセンス変異型ＳＮＰ）は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列に影響を与える。コードされたアミノ酸配列におけるこのような変化は、特に、このようなアミノ酸配列改変体が機能的タンパク質ドメイン（例えば、触媒ドメイン、ＡＴＰ結合ドメイン、またはリガンド／基質結合ドメイン）において起こる場合、タンパク質機能に影響を与え得る。機能的ドメインにアミノ酸配列の変化を有する改変タンパク質が、病理学的状態を引き起こし得るか、または病状学的状態に影響を与え得るということは当該分野で確立されている。このような例において、改変タンパク質を標的とし、そしてタンパク質機能／活性を調節（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）する化合物（例えば、低分子薬または抗体）が開発され得る。
【０３１８】
本発明の治療方法は、本発明の１つ以上の改変タンパク質を標的にする方法をさらに含む。改変タンパク質は、例えば、低分子化合物、抗体、アプタマー、リガンド／基質、他のタンパク質、または他のタンパク質結合剤を用いて、標的され得る。さらに、当業者は、表１に開示される新規のタンパク質改変体（および多型核酸分子）が、対応する当該分野で公知のタンパク質（またはｍＲＮＡ分子のような核酸分子）の競合的インヒビターとして作用することによって、それら自身で治療剤として直接的に使用され得ることを認識する。
【０３１９】
本発明の改変タンパク質は、薬物スクリーニングアッセイ、細胞ベースのシステムまたは細胞を含まないシステムにおいて特に有用である。細胞ベースのシステムは、タンパク質を自然に発現する、生検標本、または細胞培養物細胞を利用し得る。１つの実施形態において、細胞ベースのアッセイは、改変タンパク質を発現する組換え宿主細胞を含む。細胞フリーのアッセイは、改変タンパク質またはその改変タンパク質をコードする対応するＳＮＰ含有核酸フラグメントに直接結合する化合物の能力を検出するために使用され得る。
【０３２０】
本発明の改変タンパク質、およびその適切なフラグメントは、ハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用され、この改変タンパク質を結合する能力および／またはこの改変タンパク質の活性を調節する能力について候補化合物を試験し得る。これらの候補化合物は、正常機能（例えば、野生型／非改変タンパク質）を有するタンパク質に対してさらにスクリーニングされ、タンパク質活性に対する化合物の効果をさらに決定し得る。さらに、これらの化合物は、インビボ活性／有効性を決定するために、動物系または無脊椎動物系において試験され得る。この改変タンパク質を活性化する（アゴニスト）か、または不活性化（アンタゴニスト）する化合物が同定され得、そしてこの改変タンパク質の種々の程度の活性化または不活性化を引き起こす異なる化合物が同定され得る。
【０３２１】
さらに、改変タンパク質は、この改変タンパク質と、このタンパク質と正常に相互作用する標的分子との間の相互作用を刺激するか、または阻害する能力について化合物をスクリーニングするために使用され得る。標的は、リガンド、基質、またはこのタンパク質が正常に相互作用する結合パートナー（例えば、エピネフリンまたはノルエピネフリン）であり得る。このようなアッセイは、代表的に、改変タンパク質またはそのフラグメントをこの標的分子と相互作用させ、そしてこのタンパク質とこの標的との間の複合体の形成を検出するか、またはこの改変タンパク質とこの標的との相互作用の生化学的因果関係（例えば、シグナル伝達の任意の関連する効果）を決定することを可能にする条件下で、この改変タンパク質と候補化合物とを合わせる工程を包含する。
【０３２２】
候補化合物としては、例えば、以下が挙げられる：１）可溶性ペプチドのようなペプチド（Ｉｇテイル融合ペプチド、ならびにランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４［１９９１］；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６［１９９１］を参照のこと）、およびＤ−立体配置アミノ酸および／またはＬ−立体配置アミノ酸から作製されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーを含む）；２）リンペプチド（例えば、ランダムかつ部分的に変性した、リンペプチドライブラリーに指向するメンバー（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら，Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８［１９９３］を参照のこと））；３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント）；そして４）有機低分子および無機低分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然産物ライブラリーから得られる分子）。
【０３２３】
１つの候補化合物は、リガンド結合に対して競合する改変タンパク質の可溶性フラグメントである。他の候補化合物としては、突然変異体タンパク質、または改変タンパク質機能に影響を与え、従ってリガンドに対して競合する突然変異を含む適切なフラグメントが挙げられる。従って、リガンドに対して（例えば、より高い親和性で）競合するフラグメント、またはリガンドに結合するが、放出させないフラグメントは、本発明によって包含される。
【０３２４】
本発明は、改変タンパク質活性を調節する（刺激するか、または阻害する）化合物を同定するための他の終点アッセイをさらに含む。このアッセイは、代表的に、タンパク質活性を示すシグナル伝達経路における現象のアッセイを包含する。従って、改変タンパク質依存性シグナルカスケードに応答してアップレギュレーションされるか、またはダウンレギュレーションされる遺伝子の発現が、アッセイされ得る。１つの実施形態において、このような遺伝子の調節領域は、容易に検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）に作動可能に連結され得る。あるいは、この改変タンパク質のリン酸化、または改変タンパク質の標的もまた、測定され得る。この改変タンパク質によって媒介される生物学的機能および生化学的機能のいずれ、終点アッセイとして使用され得る。これらは、本明細書中、本明細書中で引用される参考文献（これらの終点アッセイの標的および当業者に公知の他の機能について、参考として援用される）に記載される生化学的現象または生物学的現象の全てを含む。
【０３２５】
結合化合物および／または活性化化合物もまた、キメラ改変タンパク質を用いることによってスクリーニングされ得る。ここで、アミノ末端細胞外ドメインもしくはその部分、膜貫通ドメインの全体もしくは部分領域、および／またはカルボキシル末端細胞内ドメインもしくはその部分は、異種ドメインまたは部分領域によって置換され得る。例えば、基質結合領域は、改変タンパク質によって正常に認識される基質とは異なる基質と相互作用するように使用され得る。従って、異なる一組のシグナル伝達成分は、活性化についての終点アッセイとして利用可能である。これは、アッセイが、改変タンパク質が誘導される特異的宿主細胞以外において実行されることを可能にする。
【０３２６】
改変タンパク質はまた、この改変タンパク質と相互作用する化合物を発見するために設計された方法での競合的結合アッセイにおいて有用である。従って、化合物は、化合物を改変タンパク質に結合させるか、または別に改変タンパク質と相互作用させる条件下で、この改変タンパク質に曝露され得る。この改変タンパク質と正常に相互作用する結合パートナー（例えば、リガンド）もまた、混合物に添加される。試験化合物が、この改変タンパク質またはその結合パートナーと相互作用する場合、この改変タンパク質から形成される複合体の量、またはこの改変タンパク質由来の活性を減少させる。この型のアッセイは、改変タンパク質の特定領域と相互作用する化合物についてスクリーニングするのに特に有用である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，Ｓｅｐｔ  １０［９］，９７３−８０［１９９２年９月］）。
【０３２７】
細胞フリーの薬物スクリーニングアッセイを実行するために、改変タンパク質もしくはそのフラグメントのいずれか、またはその標的分子を固定化して、１つまたは両方のタンパク質の非複合形態からの複合体の分離を促進すること、およびアッセイの自動化を適応することが、時に所望される。マトリックスにタンパク質を固定化するための任意の方法が、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。１つの実施形態において、さらなるドメインを含む融合タンパク質が、タンパク質をマトリックスに結合させる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／１２５Ｉ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着され得、これは次いで、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ標識化）および候補化合物（例えば、薬物候補）と合わされ、そしてこの混合物は、複合体形成をもたらす条件下で（例えば、塩およびｐＨについて生理学的な条件で）インキュベートされる。インキュベーションに続いて、このビーズはいずれの未結合標識をも取り除くために洗浄され、そして固定化されたマトリックスおよび放射標識が直接的に、またはこの複合体が解離された後の上清において、決定され得る。あるいは、この複合体は、マトリックスから解離され得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得、そしてビーズ画分に見出される結合物質のレベルは、標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量され得る。
【０３２８】
改変タンパク質またはその標的分子のいずれかは、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定化され得る。あるいは、改変タンパク質と反応するが、この改変タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、プレートのウェルへと誘導体化され、そして、改変タンパク質が抗体結合によってこのウェルにトラップされ得る。標的分子および候補化合物の調製物は、この改変タンパク質が存在するウェル中でインキュベートされ、そしてこのウェルにトラップされた複合体の量が、定量され得る。ＧＳＴ−固定化複合体について上記された方法に加えて、このような複合体を検出するための方法としては、タンパク質標的分子と反応する抗体、または改変タンパク質と反応して標的分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出、および標的分子に関する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０３２９】
これらの薬物スクリーニングアッセイに従って同定される改変タンパク質活性の調節因子は、このタンパク質経路によって媒介される障害（例えば、アルツハイマー病）を有する被験体を処置するために使用され得る。これらの処置方法は、代表的には、このような処置を必要とする被験体に、薬学的組成物におけるタンパク質活性の調節因子を投与する工程を包含する。
【０３３０】
本明細書中に開示される改変タンパク質、またはそのフラグメントは、この改変タンパク質の発現もしくは活性の不適切な欠如、またはこの改変タンパク質の所望しない発現もしくは活性によって特徴付けられる障害を処置するために、それ自身直接的に使用され得る。従って、処置するための方法は、本明細書中に開示される改変タンパク質またはそのフラグメントの使用を包含する。
【０３３１】
本発明のさらに別の局面において、改変タンパク質は、２−ハイブリッドアッセイまたは３−ハイブリッドアッセイで「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２［１９９３］；Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４［１９９３］；Ｂａｒｔｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４［１９９３］；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６［１９９３］；およびＢｒｅｎｔ  Ｗ０９４／１０３００を参照のこと）、この改変タンパク質に結合するか、またはこの改変タンパク質と相互作用し、そして改変タンパク質活性に関係している他のタンパク質を同定し得る。このような改変タンパク質結合タンパク質はまた、例えば、タンパク質媒介シグナル伝達経路の要素として改変タンパク質または改変タンパク質標的によるシグナルの伝達に関係している可能性がある。あるいは、このような改変タンパク質結合タンパク質は、改変タンパク質のインヒビターである。
【０３３２】
２−ハイブリッドシステムは、大部分の転写因子（代表的に、別個のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる）のモジュール的性質に基づく。簡単に言うと、このアッセイは、代表的に、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、改変タンパク質をコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物において、ＤＮＡ配列のライブラリーに由来し、非同定タンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」、すなわち「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト（ｂａｉｔ）」タンパク質と「プレイ（ｐｒｅｙ）」タンパク質とがインビボで相互作用し、改変タンパク質依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、極めて近接する。この近接は、この転写因子に対応する転写調節部位に作動可能に連結されるレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが単離され得、改変タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
【０３３３】
（改変タンパク質に対する抗体）
本発明はまた、本明細書中に開示される改変タンパク質およびそのフラグメントに選択的に結合する抗体を提供する。このような抗体は、本発明の改変タンパク質を定量的に、または定性的に検出するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、抗体が改変タンパク質に結合するが、非改変タンパク質に有意に結合しない場合（すなわち、抗体が、本発明の１つ以上のＳＮＰに起因する改変体アミノ酸配列を含まない、正常タンパク質、野生型タンパク質、または当該分野で公知のタンパク質に有意に結合しない場合）、この抗体は、標的改変タンパク質に選択的に結合する（改変体アミノ酸配列は、例えば、非同義的ｃＳＮＰ、停止コドンを作製し、それによってポリペプチドの短縮を引き起こすナンセンスＳＮＰ、またはポリペプチドの伸長をもたらすリードスルー突然変異を引き起こすＳＮＰに起因し得る）。
【０３３４】
本明細書中で使用される場合、抗体は、当該分野で認識される用語と一致した用語において定義される：抗体は、抗原初回刺激に応答して生体より産生される、複数サブユニットのタンパク質である。本発明の抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方、ならびにこのような抗体の抗原応答性のタンパク質分解性フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、およびＦｖフラグメント）を含む。さらに、本発明の抗体は、任意の種々の操作された抗原結合分子（例えば、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１［１９８４］；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４［１９８４］）、ヒト化抗体（米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５６５，３３２号）、単鎖Ｆｖ（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４［１９８９］）、２つの結合特異的部位を有する二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｓｅｇａｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：１［２００１］；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：７［２００１］）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）（Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８：４７［２００１］））、ならびにＦａｂ接合体（ダイマーまたはトリマー）、およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）をさらに含む。
【０３３５】
所定の標的抗原に対する抗体を産生するか、および／または同定するための多くの方法が、当該分野で公知である（Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９８９］）。一般的に、単離されたペプチド（例えば、本発明の改変タンパク質）が免疫原として使用され、そして哺乳動物生物体（例えば、ラット、ウサギ、ハムスター、またはマウス）に投与される。全長タンパク質、抗原性ペプチドフラグメント（例えば、改変タンパク質と対応する野生型タンパク質との間で変動する領域を含むペプチドフラグメント）、または融合タンパク質のいずれかが使用され得る。免疫原として使用されるタンパク質は、天然に存在し得るか、合成または組換えで産生され得、そしてアジュバントと組み合わせて投与され得る。このアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロイントアジュバント（フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リソレクチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノールなど）。
【０３３６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって産生され得る（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５［１９７５］）。ハイブリドーマ技術は、特異的モノクローナル抗体を分泌する細胞を不死化させる。この不死化細胞株は、２つの異なる細胞型（代表的には、リンパ球、および腫瘍細胞）を融合させることによってインビトロで作製され得る。ハイブリドーマ細胞は、インビトロまたはインビボで培養され得る。さらに、全てのヒト抗体は、トランスジェニック動物によって産生され得る（Ｈｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：５９５［２００２］）。ＦｄファージおよびＦｄファージミド技術は、インビトロで組換え抗体を産生し、選択するために使用され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＣｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１［２０００］；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３［２００２］）。抗体の相補決定領域が同定され得、そしてこのような領域に対応する合成ペプチドが、抗原結合を媒介するために使用され得る（米国特許第５，６３７，６７７号）。
【０３３７】
抗体は、好ましくは、対応する野生型タンパク質と比較して、改変体アミノ酸配列を含む改変タンパク質の領域または別個のフラグメント（例えば、非同義ｃＳＮＰによってコードされるアミノ酸を含む改変タンパク質の領域、停止コドンを作製するナンセンスＳＮＰによってもたらされる短縮によって影響を受ける領域、またはＳＮＰによってもたらされるリードスルー突然変異に起因する停止コドンの破壊から生じる領域）に対して調製される。さらに、好ましい領域は、機能／活性および／またはタンパク質／結合パートナー相互作用に関与する領域を含む。このようなフラグメントは、タンパク質の表面に位置する領域に対応するフラグメント（例えば、親水性領域）のような物理的特性について選択され得るか、あるいは配列のユニークさに基づいて、または本発明によって提供されるＳＮＰによってコードされる改変体アミノ酸残基の位置に基づいて選択され得る。抗原性フラグメントは、代表的に、少なくとも約８〜１０個の連続したアミノ酸残基を含み、ここで、このアミノ酸残基の少なくとも１つは、本明細書中に開示されるＳＮＰによって影響を受けるアミノ酸である。しかし、抗原性ペプチドは、少なくとも、１２個、１４個、１６個、２０個、２５個、５０個、１００個（もしくはこれらの間の任意の他の数）またはそれ以上のアミノ酸残基を含み得、但し、少なくとも１つのアミノ酸は、本明細書中に開示されるＳＮＰによって影響を受ける。
【０３３８】
本発明の抗体の検出は、抗体またはその抗原反応性フラグメントを検出可能物質に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによって促進され得る。検出可能物質としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられるが、これらに限定されない。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０３３９】
抗体（特に、治療剤としての抗体の使用）は、以下で概説される：Ｍｏｒｇａｎ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２（１）：５３−９（２００３年２月）；Ｒｏｓｓら，「Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．ｌ１９（４）：４７２−８５（２００３年４月）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，「Ａｄｖａｎｃｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２（５）：２８１−９６（２００３年５月）；電子出版２００３年３月１１日；Ｒｏｓｓら，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３（１）：１０７−２１（２００３年２月）；Ｃａｏら，「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５（２）：１７１−９７（２００３年２月１０日）；ｖｏｎ  Ｍｅｈｒｅｎら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５４：３４３−６９（２００３）。電子出版２００１年１２月３日；Ｈｕｄｓｏｎら，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（１）：１２９−３４（２００３年１月）；Ｂｒｅｋｋｅら，「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｄａｗｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ  ｃｅｕｔｕｒｙ」，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（１）：５２−６２（２００３年１月）（Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２［３］：２４０［２００３年３月］）；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６２５−９（２００２年１２月）；Ａｎｄｒｅａｋｏｓら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６１５−２０（２００２年１２月）；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：５９３−７（２００２年１２月）；Ｐｉｎｉら，「Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｉｌｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈ��ｏｕｇｈｐｕｔ．Ｓｃｒｅｅｎ．５（７）：５０３−１０（２００２年１１月）；Ｂａｔｒａら，「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６０３−８（２００２年１２月）；およびＴａｎｇｒｉら，「Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｂｓｅｎｔ  ｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ」，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９（２４）：２１９１−９（２００２年１２月）。
【０３４０】
（抗体の使用）
抗体は、標準的な技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降）によって天然の細胞供給源または組換え宿主細胞から、本発明の改変タンパク質を単離するために使用され得る。さらに、抗体は、生物の種々の組織間および正常な発生または疾患の進行の過程にわたって、種々のタンパク質の発現のパターンを決定するために、細胞または組織において本発明の改変タンパク質の存在を検出するのに有用である。さらに、抗体は、発現の量およびパターンを評価するために、インサイチュ、インビトロ、体液中、または細胞溶解物もしくは懸濁液において、改変タンパク質を検出するために使用され得る。また、抗体は、異常な組織分布、発生の間の異常な発現、または異常な状態（例えば、アルツハイマー病）における発現を評価するために使用され得る。さらに、全長改変タンパク質の循環するフラグメントの抗体検出は、代謝回転を同定するために使用され得る。
【０３４１】
本発明の改変タンパク質に対する抗体はまた、遺伝薬理学の解析において有用である。従って、代替のＳＮＰ対立遺伝子によってコードされる改変タンパク質に対する抗体は、改変された処置の様式を必要とする個体を同定するために使用され得る。
【０３４２】
さらに、抗体は、疾患の活性段階のような疾患の状態において、またはタンパク質の機能に関連する疾患（特に、アルツハイマー病）に対する素因を有する個体において、改変タンパク質の発現を評価するために使用され得る。本発明のＳＮＰ含有核酸分子によってコードされる改変タンパク質に特異的な抗体は、改変タンパク質の存在をアッセイするために（例えば、改変タンパク質の存在によって示されるようなアルツハイマー病に対する素因についてスクリーニングするために）、使用され得る。
【０３４３】
抗体はまた、電気泳動度、等電点、トリプシンペプチド消化、および当該分野で周知の他の物理的アッセイによる解析とともに、改変タンパク質を評価するための診断ツールとして有用である。
【０３４４】
抗体はまた、組織型別のために有用である。従って、特定の改変タンパク質が特定の組織における発現と相関している場合、このタンパク質に対して特異的な抗体は、組織型を同定するために使用され得る。
【０３４５】
抗体はまた、種々の組織における細胞内の改変タンパク質の異常な細胞内局在化を評価するために使用され得る。診断的使用は、遺伝的試験だけではなく、処置様式をモニタリングする際にも適用され得る。従って、処置が、改変タンパク質の発現レベルまたは存在、あるいは改変タンパク質の異常な組織分布または発展的な発現を直すことを最終的な目標とする場合、改変タンパク質または関連するフラグメントに対する抗体は、治療効力をモニターするために使用され得る。
【０３４６】
抗体はまた、例えば、結合パートナーに対する改変タンパク質の結合を遮断することによって、改変タンパク質の機能を阻害するために有用である。これらの使用はまた、処置が改変タンパク質の機能を阻害することを包含する治療的文脈において適用され得る。抗体は、例えば、結合を遮断するかまたは競合的に阻害し、従って、改変タンパク質の活性を調節する（作用するかまたは拮抗する）ために使用され得る。抗体は、機能に必要とされる部位を含む特異的改変タンパク質フラグメントに対して、または細胞もしくは細胞膜と関連するインタクトな改変タンパク質に対して調製され得る。インビボ投与にのために、抗体は、放射性核種、酵素、免疫原性エピトープ、または細胞傷害性剤のようなさらなる治療的ペイロードと連結され得る。適切な細胞傷害性剤としては、ジフテリアのような細菌性毒素、およびリシンのような植物性毒素が挙げられるが、これらに限定されない。抗体またはそのフラグメントのインビボ半減期は、ポリエチレングリコールに対する結合を介するペグ化によって延長され得る（Ｌｅｏｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６［２００１］）。
【０３４７】
本発明はまた、抗体を使用するためのキット（例えば、試験サンプル中の改変タンパク質の存在を検出するためのキット）を包含する。例示的なキットは、抗体（例えば、標識された抗体または標識可能な抗体）および生物学的サンプル中の改変タンパク質を検出するための化合物または薬剤；サンプル中の改変タンパク質の量、または存在／非存在を決定するための手段；サンプル中の改変タンパク質の量と標準とを比較するための手段；および使用のための説明書を含み得る。
【０３４８】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本明細書中に記載されるＳＮＰ含有核酸分子を含むベクターを提供する。用語「ベクター」は、ビヒクル、好ましくは、核酸分子をいい、これは、ＳＮＰ含有核酸分子を輸送し得る。このベクターが核酸分子である場合、ＳＮＰ含有核酸分子は、ベクター核酸に共有結合的に連結され得る。このようなベクターとしては、プラスミド、一本鎖ファージもしくは二本鎖ファージ、一本鎖ＲＮＡウイルスベクターもしくは二本鎖ＲＮＡウイルスベクター、または一本鎖ＤＮＡウイルスベクターもしくは二本鎖ＤＮＡウイルスベクター、あるいは人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、またはＭＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４９】
ベクターは、染色体外エレメントとして宿主細胞内で維持され得、ここで、このベクターは、ＳＮＰ含有核酸分子を複製し、そしてそのさらなるコピーを産生する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれ得、宿主細胞が複製する場合にＳＮＰ含有核酸分子のさらなるコピーを産生し得る。
【０３５０】
本発明は、ＳＮＰ含有核酸分子の維持のためのベクター（クローニングベクター）または発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞あるいはその両方（シャトルベクター）において機能し得る。
【０３５１】
発現ベクターは、代表的に、ＳＮＰ含有核酸分子の転写が宿主細胞において許容されるように、ＳＮＰ含有核酸分子に対してベクター内で作動可能に連結されるシス作用性調節領域を含む。ＳＮＰ含有核酸分子はまた、転写に影響し得る別の核酸分子を用いて、宿主細胞中に導入され得る。従って、第２の核酸分子は、ベクターからのＳＮＰ含有核酸分子の転写を可能にするために、シス調節制御領域と相互作用するトランス作用因子を提供し得る。あるいは、トランス作用因子は、宿主細胞によって供給され得る。最終的に、トランス作用因子は、ベクター自体から産生され得る。しかし、いくつかの実施形態において、核酸分子の転写および／または翻訳が無細胞系において行われ得ることが理解される。
【０３５２】
本明細書中に記載されるＳＮＰ含有核酸分子が作動可能に連結され得る調節配列は、ｍＲＮＡ転写を指向するためのプロモーターを含む。これらの調節配列には、バクテリオファージλ由来の左プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃプロモーター、ＴＲＰプロモーター、およびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター、アデノウイルス初期プロモーターおよびアデノウイルス後期プロモーター、ならびにレトロウイルス末端反復配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３５３】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、転写を調節する領域（例えば、リプレッサー結合部位およびエンハンサー）を含み得る。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、およびレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【０３５４】
転写開始および制御のための部位を含むことに加えて、発現ベクターはまた、転写終結に必要な配列、および転写される領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。発現のための他の調節制御エレメントとしては、開始コドンおよび終止コドンならびにポリアデニル化シグナルが挙げられる。当業者は、発現ベクターにおいて有用な多くの調節配列を知っている（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［２０００］を参照のこと）。
【０３５５】
種々の発現ベクターは、ＳＮＰ含有核酸分子を発現するために使用され得る。このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来のベクター（例えば、細菌性プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵素染色体エレメント（酵母人工染色体を含む）由来、バキュロウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、偽狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター）が挙げられる。ベクターはまた、プラスミド由来のものおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント（例えば、コスミドおよびファージミド）由来のもののようなこれらの供給源の組み合わせ由来であり得る。原核生物宿主および真核生物宿主に対する適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）に記載されている。
【０３５６】
ベクター中の調節配列は、１つ以上の宿主細胞における構成的発現（例えば、組織特異的発現）を提供し得るか、または例えば、温度、栄養添加剤、または外来因子（例えば、ホルモンもしくは他のリガンド）によって、１つ以上の細胞型における誘導性発現を提供し得る。原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における核酸配列の構成的発現または誘導性発現を提供する種々のベクターは、当業者に周知である。
【０３５７】
ＳＮＰ含有核酸分子は、当該分野で周知の方法論によってベクター中に挿入され得る。一般的に、最終的に発現されるＳＮＰ含有核酸分子は、ＳＮＰ含有核酸分子および発現ベクターを、１つ以上の制限酵素を用いて切断し、次いで、フラグメントを一緒に連結することによって、発現ベクターに連結される。制限酵素消化および連結についての手順は、当業者に周知である。
【０３５８】
適切な核酸分子を含むベクターは、周知の技術を使用して、増殖または発現のための適切な宿主細胞内に導入され得る。細菌宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物宿主としては、酵母、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞）、ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５９】
本明細書中に記載されるように、融合タンパク質として改変体ペプチドを発現することが望ましくあり得る。従って、本発明は、改変体ペプチドの産生を可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは、例えば、組換えタンパク質の発現を増加し得、組換えタンパク質の溶解性を増加し得、そして例えば、アフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによってタンパク質の精製を補助し得る。タンパク質分解性切断部位は、融合部分の接合において導入され得、その結果、所望の改変体ペプチドが、最終的に、融合部分から分離され得る。このような使用に適切なタンパク質分解性酵素としては、Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ  ６７；３１−４０［１９８８］）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（これらは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する）が挙げられる。適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５［１９８８］）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：６０−８９［１９９０］）が挙げられる。
【０３６０】
組換えタンパク質発現は、宿主細胞が組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を損なっているような遺伝的背景を提供することによって、細菌宿主において最大化され得る（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５  １１９−１２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｎｉａ［１９９０］）。あるいは、目的のＳＮＰ含有核酸分子の配列は、特定の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）についての優先的なコドン利用を提供するように変更され得る（Ｗａｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８［１９９２］）。
【０３６１】
ＳＮＰ含有核酸分子はまた、酵母において作動する発現ベクターによって発現され得る。酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４［１９８７］）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら，Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３［１９８２］）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３［１９８７］）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【０３６２】
ＳＮＰ含有核酸分子はまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５［１９８３］）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９［１９８９］が挙げられる。
【０３６３】
本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載されるＳＮＰ含有核酸分子は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｂ．Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０［１９８７］）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５［１９８７］）が挙げられる。
【０３６４】
本発明はまた、本明細書中に記載されるＳＮＰ含有核酸分子が逆方向でベクター中にクローニングされるが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする調節配列に作動可能に連結されるベクターを包含する。従って、アンチセンス転写は、本明細書中に記載されるＳＮＰ含有核酸配列（コード領域および非コード領域の両方を含む）に対して産生され得る。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関連する上記のパラメーター（調節配列、構成的発現または誘導性発現、組織特異的発現）のそれぞれに供される。
【０３６５】
本発明はまた、本明細書中に記載されるベクターを含む組換え宿主細胞に関連する。従って、宿主細胞としては、例えば、原核生物細胞、下等真核生物細胞（例えば、酵母）、他の真核生物細胞（例えば、昆虫細胞）、および高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）が挙げられる。
【０３６６】
組換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術によって、本明細書中に記載のベクター構築物を細胞に導入することによって調製され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）に記載されるような他の技術が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３６７】
宿主細胞は、１つより多くのベクターを含み得る。従って、異なるＳＮＰ含有ヌクレオチド配列が、同じ細胞中に、異なるベクターで導入され得る。同様に、ＳＮＰ含有核酸分子は、単独で、またはＳＮＰ含有核酸分子に関連しない他の核酸分子（例えば、発現ベクターにトランス作用因子を提供する核酸分子）のいずれかで導入され得る。１つより多くのベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは、独立して導入されてもよいし、同時に導入されてもよいし、または核酸分子ベクターに連結されてもよい。
【０３６８】
バクテリオファージおよびウイルスベクターの場合、これらは、感染および形質導入のための標準的な手順によって、パッケージされたウイルスまたはカプセル化されたウイルスとして細胞に導入され得る。ウイルスベクターは、複製コンピテントであってもよいし、または複製欠損であってもよい。ウイルス複製が欠損である場合、複製は、欠損を補う機能を提供する宿主細胞中で行われ得る。
【０３６９】
ベクターは、一般的に、組換えベクター構築物を含む細胞の亜集団の選択を可能にする選択マーカーを含む。このマーカーは、本明細書中に記載されるＳＮＰ含有核酸分子を含む同じベクター中に挿入され得るか、または別のベクター内に存在し得る。マーカーとしては、例えば、原核宿主細胞についてのテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子、および真核生物宿主細胞についてのジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。しかし、発現型の特性についての選択を提供する任意のマーカーが有効であり得る。
【０３７０】
成熟改変タンパク質が、適切な調節配列の制御下で、細菌、酵母、哺乳動物細胞および他の細胞において産生され得る場合、無細胞転写および翻訳系がまた、本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して、これらの改変タンパク質を産生するために使用され得る。
【０３７１】
改変タンパク質（Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のようなタンパク質を含む複数膜貫通ドメインを用いて達成することが困難である）の分泌が所望される場合、適切な分泌シグナルがベクター中に組み込まれ得る。シグナル配列は、ペプチドに対して内因性であってもよいし、またはこれらのペプチドに対して異種であってもよい。
【０３７２】
改変タンパク質が培地中に分泌されない場合、タンパク質は、標準的な破壊手順（凍結／解凍、超音波、機械的破壊、溶解剤の使用などを含む）によって、宿主細胞から単離され得る。次いで、改変タンパク質は回収され得、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィーを含む周知の精製方法によって精製され得る。
【０３７３】
本明細書中に記載される改変タンパク質の組換え産生が行われる宿主細胞に依存して、これらは、種々のグリコシル化パターンを有し得るか、または細菌において産生される場合、非グリコシル化であり得ることもまた理解される。さらに、改変タンパク質は、宿主媒介プロセスの結果として、いくらかの場合で、初期改変メチオニンを含み得る。
【０３７４】
ベクターおよび宿主細胞に関するさらなる情報について、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと。
【０３７５】
（ベクターおよび宿主細胞の使用、ならびにトランスジェニック動物）
本明細書中に記載される改変タンパク質を発現する組換え宿主細胞は、種々の用途を有する。例えば、細胞は、所望量の改変タンパク質またはそのフラグメントの調製物に精製され得る改変タンパク質を産生するために有用である。従って、発現ベクターを含む宿主細胞は、改変タンパク質産生に有用である。
【０３７６】
宿主細胞はまた、改変タンパク質または改変タンパク質フラグメントを含む細胞ベースのアッセイ（例えば、上記のものおよび当該分野で公知の他の形式）を行うために有用である。従って、改変タンパク質を発現する組換え宿主細胞は、改変タンパク質機能を刺激するかまたは阻害する化合物をアッセイするために有用である。改変タンパク質の機能を調節する化合物のこのような能力は、ネイティブ／野生型タンパク質に対する化合物のアッセイから、または化合物の無細胞アッセイから明らかではないかもしれない。組換え宿主細胞はまた、公知の機能と比較して、改変タンパク質における機能的変化をアッセイするために有用である。
【０３７７】
遺伝的に操作された宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するためにさらに使用され得る。トランスジェニック動物は、好ましくは、動物の１つ以上の細胞が導入遺伝子である非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯類動物（例えば、ラットまたはマウス））である。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム内に組み込まれ、そしてその細胞型または組織の１つ以上において成熟動物のゲノムに残る、本発明のＳＮＰを含む外来ＤＮＡである。このような動物は、インビボで改変タンパク質の機能を研究するため、ならびに改変タンパク質活性のモジュレーターを同定および評価するために有用である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類が挙げられるが、これらに限定されない。トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、ウシおよびヤギ）は、動物の乳に分泌され得、次いで回収され得る改変タンパク質を産生するために使用され得る。
【０３７８】
トランスジェニック動物は、ＳＮＰ含有核酸分子を受精された卵母細胞の雄性前核内に導入し（例えば、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染によって）、そして偽妊娠した雌性養育動物において卵母細胞を発生させることによって作製され得る。本発明の１つ以上のＳＮＰを含む任意の核酸分子は、潜在的に、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入され得る。
【０３７９】
発現ベクターにおいて有用な調節配列または他の配列のいずれも、トランスジェニック配列の一部分を形成し得る。これは、まだ含まれていない場合、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを含む。組織特異的調節配列は、特定の細胞または組織中の改変タンパク質の発現を指向するために、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。
【０３８０】
胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野において慣用的であり、例えば、両方ともＬｅｄｅｒらによる、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号、Ｗａｇｎｅｒらによる米国特許第４，８７３，１９１号、ならびにＢ．Ｈｏｇａｎ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）に記載される。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製に使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノム中の導入遺伝子の存在、および／または動物の組織または細胞におけるトランスジェニックｍＲＮＡの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物に繁殖され得る。トランスジェニック動物はまた、動物全体または動物の組織が本明細書中に記載される相同組換え宿主細胞を使用して作製されている非ヒト動物を含む。
【０３８１】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が作製され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Ｌａｋｓｏら、ＰＮＡＳ８９：６２３２−６２３６［１９９２］）。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５［１９９１］）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が一般的に必要とされる。このような動物は、例えば、２匹のトランスジェニック動物を交配することにより、「二重」トランスジェニック動物を構築することによって提供され得、一方は、選択された改変タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方は、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む。
【０３８２】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンもまた、例えば、Ｉ．Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９７／０７６６８およびＷＯ  ９７／０７６６９に記載される方法に従って作製され得る。簡単に述べると、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）は、単離され、増殖周期を出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止細胞は、静止細胞が単離される同じ種の動物由来の除核された卵母細胞に、例えば、電気パルスの使用によって、融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は、桑実胚または胚盤胞まで発生するように培養され、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０３８３】
本明細書中に記載される改変タンパク質を発現する組換え細胞を含むトランスジェニック動物は、インビボの文脈で、本明細書中に記載されるアッセイを行うために有用である。従って、インビボで存在し、リガンドまたは基質の結合、改変タンパク質活性化、シグナル伝達、または他のプロセスもしくは相互作用に影響し得る種々の生理学的因子は、インビトロ無細胞アッセイまたは細胞ベースのアッセイから明らかではないかもしれない。従って、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、インビトロ改変タンパク質機能および改変タンパク質機能／活性もしくは発現を調節する治療剤または化合物の活性をアッセイするために使用され得る。このような動物はまた、ヌル変異（ｎｕｌｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（すなわち、１つ以上の改変タンパク質を実質的にまたは完全に排除する変異）の効果を評価するために適切である。
【０３８４】
トランスジェニック動物に関するさらなる情報について、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３（６）：６２５−９（２００２年１２月）；Ｐｅｔｔｅｒｓら，「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｓ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．９（４−５）：３４７−５１（２０００）；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３４５−６；Ｗｏｌｆら，「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０（６）：５６７−７４（１９９８年６月）；Ｅｃｈｅｌａｒｄ，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７（５）：５３６−４０（１９９６年１０月）；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ」，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．９（４−５）：３０５−２０（２０００）；Ｐｉｒｉｔｙら，「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５７：２７９−９３（１９９８）；およびＲｏｂｌら，「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ」，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．５９（１）：１０７−１３（２００３年１月１日）を参照のこと。
【０３８５】
（コンピュータ関連実施形態）
本発明において提供されるＳＮＰは、その使用を容易にするために、種々の媒体中に「提供され」得る。この節において使用される場合、「提供される」とは、単離された核酸分子以外の製品をいい、この製品は、本発明のＳＮＰ情報を含む。このような製品は、それらが天然もしくは精製された形態にある場合、ＳＮＰもしくはその部分集合の試験に直接には適用可能でない手段を用いて、当業者が製品を試験することを可能にする形態で、ＳＮＰ情報を提供する。このような形態で提供され得るＳＮＰ情報は、例えば、配列番号１〜５、配列番号６〜１０、配列番号１６〜１９、配列番号１１〜１５、および配列番号２０〜３１のような多型核酸配列ならびに／または多型アミノ酸配列の情報；観察されたＳＮＰ対立遺伝子、代替的なコドン、母集団、対立遺伝子出現率、ＳＮＰ型、および／もしくは影響を受けるタンパク質についての情報；または表１〜２および／もしくは配列表において本発明により提供される任意の他の情報のような、本発明により提供される任意のＳＮＰ情報を含む。
【０３８６】
本実施形態の１つの適用において、本発明のＳＮＰは、コンピュータ読取可能媒体に記録され得る。本明細書中で使用される場合、「コンピュータ読取可能媒体」とは、コンピュータにより直接読まれ、かつ直接アクセスされ得る任意の媒体をいう。このような媒体としては、：フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープのような磁気保存媒体；ＣＤ−ＲＯＭのような光学保存媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電気保存媒体；ならびに磁気／電気保存媒体のようなこれらの分類のハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、そこに本発明のヌクレオチド配列が記録されたコンピュータ読取可能媒体を備える製品を生成するために、現在公知の任意のコンピュータ読取可能媒体がどのように使用され得るかを、容易に理解し得る。１つのこのような媒体は、本願を提供され、すなわち、本願は、詳細なＳＮＰおよび配列の情報（配列番号１〜５として転写産物の配列が提供され、配列番号６〜１０としてタンパク質配列が提供され、配列番号１６〜１９としてゲノム配列が提供され、配列番号１１〜１５として転写産物に基づくコンテキスト配列が提供され、そして配列番号２０〜３１としてゲノムに基づくコンテキスト配列が提供される）を含む添付の表に加えて、配列表において、ＡＳＣＩＩテキスト形式で、そこに提供／記録されているＳＮＰを含む核酸配列（およびコードされたタンパク質配列）を有するコンピュータ読取可能媒体（ＣＤ−Ｒ）を含む。
【０３８７】
本明細書中で使用される場合、「記録された」とは、コンピュータ読取可能媒体に情報を保存するためのプロセスをいう。当業者は、本発明のＳＮＰ情報を含む製品を生成するためにコンピュータ読取可能媒体に情報を保存するために、現在公知の任意の方法を、容易に採用可能である。
【０３８８】
そこに本発明のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が記録されているコンピュータ読取可能媒体を生成するために、種々のデータ保存構造体が当業者に入手可能である。データ保存構造体の選択は、一般的に、保存された情報にアクセスするために選択される手段に基づく。さらに、種々のデータ処理のプログラムおよび形式が、本発明のヌクレオチド／アミノ酸配列情報をコンピュータ読取可能媒体に保存するために使用され得る。例えば、配列情報は、ワードプロセシングテキストファイルで表わされ得るか、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄのような市販のソフトウェアにおいてフォーマットされ得るか、ＡＳＣＩＩファイルの形態で表わされ得るか、もしくはＯＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなどのようなデータベースアプリケーションに保存され得る。当業者は、本発明のＳＮＰ情報がそこに記録されているコンピュータ読取可能媒体を得るために、任意の数のデータ処理構造化形式（例えば、テキストファイルもしくはデータベース）を容易に採用し得る。
【０３８９】
コンピュータ読取可能な形態において本発明のＳＮＰを提供することにより、当業者は、種々の目的のために慣用的にＳＮＰ情報にアクセスし得る。コンピュータソフトウェアは、公的に利用可能であり、当業者は、コンピュータ読取可能媒体において提供される配列情報にアクセスし得る。公的に利用可能なコンピュータソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０［１９９０］）およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３−２０７［１９９３］）検索アルゴリズムが挙げられる。
【０３９０】
本発明は、システム、特にコンピュータに基づくシステムをさらに提供し、このシステムは、本明細書中において記載されるＳＮＰ情報を含む。このようなシステムは、例えば、数多くのＳＮＰ位置に関する情報、もしくは数多くの個体からのＳＮＰ遺伝子型に関する情報を保存および／または解析するように設計され得る。本発明のＳＮＰ情報は、貴重な情報源となる。コンピュータに基づくシステムにおいて保存／解析される本発明のＳＮＰ情報は、母集団におけるＳＮＰ対立遺伝子の出現率を決定するか、もしくは解析し、疾患遺伝子をマッピングし（遺伝子型−表現型関連研究）、ＳＮＰをハロタイプに分類し、ＳＮＰハロタイプを特定薬物への応答と関連付けるようなコンピュータ集約的な適用のため、または種々の他のバイオインフォマティクス、薬理ゲノミクス、薬物開発もしくはヒトの同定／法医学の適用のために使用され得る。
【０３９１】
本明細書中で使用される場合、「コンピュータに基づくシステム」とは、本発明のＳＮＰ情報を解析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ保存手段をいう。本発明のコンピュータに基づくシステムの最小のハードウェア手段は、代表的に、中央処理装置（ＣＰＵ）、インプット手段、アウトプット手段、およびデータ保存手段を含む。当業者は、現在入手可能なコンピュータに基づくシステムのうちの任意の１つが、本発明における使用のために適切であることを容易に理解し得る。このようなシステムは、ＣＤ−Ｒで提供されるＳＮＰ情報もしくはその部分集合を利用することにより、いずれの実験も行うことなく本発明のシステムに変化され得る。
【０３９２】
上に述べられるように、本発明のコンピュータに基づくシステムは、そこに本発明のＳＮＰが保存されているデータ保存手段、ならびに検索手段を支え、かつ実行するために必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段を含む。本明細書中で使用される場合、「データ保存手段」とは、本発明のＳＮＰ情報を保存し得る記憶装置もしくはそこに本発明のＳＮＰ情報が記録されている製品にアクセスし得る、メモリ接近手段をいう。
【０３９３】
本明細書中で使用される場合、「検索手段」とは、データ保存手段の中に保存されているＳＮＰ情報に基づいて、標的配列のＳＮＰを同定するか、もしくは解析するために、コンピュータに基づくシステムで実行される１つ以上のプログラムもしくはアルゴリズムをいう。検索手段は、どのヌクレオチドが標的配列の特定のＳＮＰ部位に存在するかを決定するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、検索されるか、もしくは問われるべきＳＮＰ部位を含有する任意のＤＮＡ配列であり得る。
【０３９４】
本明細書中で使用される場合、「標的構造モチーフ」、もしくは「標的モチーフ」とは、ＳＮＰ部位を含有する任意の合理的に選択された配列もしくは配列の組み合わせをいい、ここで、この配列は、標的モチーフの折り畳みで形成されている三次元構造に基づいて選択される。当該分野に公知の種々の標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチーフとしては、酵素活性部位およびシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。核酸標的モチーフとしては、プロモーター配列、ヘアピン構造、および誘導可能発現エレメント（タンパク質結合配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９５】
インプット手段およびアウトプット手段のための種々の構造的形態が、本発明のコンピュータに基づくシステムにおいて情報をインプットおよびアウトプットするために使用され得る。アウトプット手段のための例示的な形態は、目的の特定のＳＮＰ部位の特定のヌクレオチド（対立遺伝子）の存在もしくは非存在を示すディスプレイである。このような表示は、同時に多くのＳＮＰについて、迅速に二進法で評価するシステムを提供し得る。
【０３９６】
本発明のＳＮＰ情報を含むコンピュータに基づくシステムの１つの例示的な実施形態は、図１において提供される。図１は、本発明を実行するために使用され得るコンピュータシステム１０２のブロック図を提供する。コンピュータシステム１０２は、ＢＵＳ  １０４に結合されたプロセッサ１０６を備える。メインメモリ１０８（好ましくは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）として実行される）ならびにハードドライブ１１２および取り外し可能媒体記憶デバイス１１４のような種々の二次記憶デバイス１１０もまた、ＢＵＳ  １０４に結合されている。取り外し可能媒体記憶デバイス１１４には、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、磁気テープドライブなどが相当し得る。そこに記録されている制御理論および／もしくはデータを含む（フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどのような）取り外し可能記憶媒体１１６は、取り外し可能媒体記憶デバイス１１４に挿入され得る。コンピュータシステム１０２は、取り外し可能媒体記憶デバイス１１４に一度挿入された取り外し可能記憶媒体１１６からの制御理論および／もしくはデータを読むために適切なソフトウェアを備える。
【０３９７】
本発明のＳＮＰ情報は、メインメモリ１０８、二次記憶デバイス１１０のいずれか、および／もしくは取り外し可能記憶媒体１１６に、周知の様式で保存され得る。（ＳＮＰ評価ツール、調査ツール、比較ツールなどのような）ＳＮＰ情報に接近し、そしてこれを処理するためのソフトウェアは、実行の間、好ましくはメインメモリ１０８に属する。
【実施例】
【０３９８】
（実施例１：アルツハイマー病に関連するＳＮＰの統計的解析）
以下の実施例は、特許請求される本発明を制限するためではなく、例示するために提供される。
【０３９９】
以前の全ゲノムスクリーニングからの結果は、晩期発症型アルツハイマー病（ＬＯＡＤ）との連鎖を示すいくつかの染色体領域を同定した（Ｍ．Ａ．Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅら，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３５［９−１０］：１３４３−１３５２［２０００］；Ｄ．Ｃｕｒｔｉｓら，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ  ６５［Ｐｔ．５］：４７３−４８１［２００１］；Ａ．Ｍｙｅｒｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１１４［２］：２３５−２４４［２００２］；Ｊ．Ｍ．Ｏｌｓｏｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７１［１］：１５４−１６１［２００２］；Ｄ．Ｂｌａｃｋｅｒら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２［１］：２３−３２［２００３］）。第９染色体上の遺伝子改変およびＬＯＡＤに関連する遺伝子を同定するために、非痴呆の個体とマッチングさせたＬＯＡＤ患者から集めたＤＮＡサンプルを用いて、全染色体にわたり、一塩基多型（ＳＮＰ）についてのスキャンを行った。特定のＳＮＰまたはＳＮＰの組み合わせ（ハプロタイプ）の頻度の統計的解析を行い、疾患に関連する改変を同定した。偽の関連性を同定する可能性を減らすために、３つの個々に集めたＬＯＡＤ症例−対照のサンプルセットを用い、そして、２段階で遺伝子型決定解析を行った。
【０４００】
（研究設計）
関係する個体からのインフォームドコンセント／同意と、関係機関からの承認と共に集めた３つの晩期発症型アルツハイマー病の症例−対照サンプルセットを、この研究において使用した。症例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）に従ってアルツハイマーの型を持つ痴呆と診断され（Ｇ．ＭｃＫｈａｎｎら，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ  Ｗｏｒｋ  Ｇｒｏｕｐ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ａｕｓｐｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４，９３９−４４（１９８４））、疾患発症の最少年齢は６５歳であった。対照は、６５歳以上の年齢の、神経生理学検査および医者による問診により確認された、認知的に健康な個体をマッチングさせた。３つのサンプルセットは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＤＲＣ）の患者登録簿から得られたＷＵサンプルセット、ＡＤＲＣ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏから得られたＵＣＳＤサンプルセット、および、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｌａｔｅ  Ｏｎｓｅｔ  ＡＤ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅから得られたＵＫサンプルセット（Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｌｅｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅからのサンプルＫｉｎｇ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎからのサンプルを含んだ）である。各サンプルセットにおける症例および対照の数は、表５および他の表に見出され得る。これらのサンプルセットは、本発明者らの最近の研究において使用されており、そして、詳細な表現型の情報がその中に見出され得る（Ｌｉ，Ｙ．ら「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅ−ｏｎｓｅｔ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＰＤ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，１５６８８−９３（２００４）；Ｌｉ，Ｙ．ら，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｇｅｎｅ（ＡＰＢＢ２）  ｗｉｔｈ  ｌａｔｅ  ｏｎｓｅｔ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２５，２７０−２７７（２００５））。これらは全て、予想されるＡＰＯＥ  ε４−遺伝子型の分布を示し、母集団層化の証拠を有するように思われるものはなかった。
【０４０１】
ＳＮＰの遺伝子型決定を、社内で設計および確認したプライマーを用いた、個々のサンプルについての対立遺伝子特異的なリアルタイムＰＣＲにより行った（Ｇｅｒｍｅｒ，Ｓ．，Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＳＮＰ  ａｌｌｅｌｅ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｏｌｅｄ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｂｙ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ＰＣＲ．「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １０，２５８−６６（２０００））。全体的に、遺伝子型決定の精度は、同じマーカーについての別に設計されたアッセイの内部比較、および、異なる群にわたる同じマーカーについての比較によって決定したとき、９９％よりも良かった。
【０４０２】
遺伝子型決定についてのＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの平衡を、Ｗｅｉｒにより記載された正確な試験を用いて評価した（「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＩＩ」，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＭＡ，１９９６，第２版）。ＳＮＰの疾患状態との対立遺伝子の関連性についての検定を、χ二乗検定を用いて行った。症例または対照のいずれかにおいて少数の対立遺伝子の頻度（ＭＡＦ）が２％以上のマーカーを解析した。
【０４０３】
異なるサンプルセットからのデータを組み合わせる場合、関連性は、層化変数としてサンプルセットを用いる、Ｃｏｃｈｒａｎ  ＭａｎｔｅｌおよびＨａｅｎｚｓｅｌの方法を用いたメタ解析により評価した（Ａｇｒｅｓｔｉ，Ａ．Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０）。
【０４０４】
ハプロタイプの頻度の推定、および、ハプロタイプと疾患状態との間の関連性の検定を、Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｈａｐｌｏ．ｓｔａｔｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１．１（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｕｓ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇを参照のこと）を用いて行った。このパッケージは、Ｄａｖｉｄ  Ｃｌａｙｔｏｎによるソフトウェア「ｓｎｐｈａｐ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｇｅｎｅ．ｃｉｍｒ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌａｙｔｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）において実行されるアルゴリズムに基づいた累進的な挿入を伴うＥＭアルゴリズムを用いて、ハプロタイプの頻度を推定する。ハプロタイプと疾患状態との間の関連性の「汎用の」検定およびハプロタイプ特異的な検定を、Ｓｃｈａｉｄらにより記載されるようなスコア検定（Ｓｃｈａｉｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｔｉｎｅｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．およびＰｏｌａｎｄ，Ｇ．Ａ．Ｓｃｏｒｅ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｒａｉｔｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｗｈｅｎ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｐｈａｓｅ  ｉｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７０，４２５−３４（２００２））を用いて計算する。
【０４０５】
ＤＮＡおよび総ＲＮＡを、正常な供血者の末梢血単核細胞から抽出した。ランダムなヘキサマーおよびＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＡＢＩ）を用いて、総ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製した。ＤＡＰＫ１について、２つの高頻度なエキソン上のＳＮＰであるｈＣＶ２７０４８６１またはｈＣＶ２７０４９３１を用いて、対立遺伝子特異的な遺伝子の発現を測定した。高頻度なマーカーを選択して、ヘテロ接合体の数を増やした。遺伝子型決定について記載したのと同じリアルタイムＰＣＲ条件を用いて、ｃＤＮＡサンプルについて対立遺伝子特異的な発現アッセイを行った。遺伝子型決定と対立遺伝子特異的な発現アッセイとに、同じプライマーを使用した。
【０４０６】
対立遺伝子特異的な発現の試験のために、ゲノムＤＮＡの９２の個体のサンプルを、まず、２つの発現マーカー（ｈＣＶ２７０４８６１またはｈＣＶ２７０４９３１）について遺伝子型決定した。次いで、ｈＣＶ２７０４８６１またはｈＣＶ２７０４９３１についてヘテロ接合性である、白色人種の家系の６９の供血者を、対立遺伝子特異的な遺伝子の発現について試験した。ｃＤＮＡを適切なＰＣＲコントロールと一緒に３８４ウェルプレート上に四重または二重に並べ、そして、標準的な条件下で、ＡＢＩ−７９００リアルタイムＰＣＲシステムにおいてリアルタイムＰＣＲを実行した。ゲノムＤＮＡもまた、サンプルプレートの上に、コントロールとして並べた。各発現マーカーについての両方の対立遺伝子の相対的な発現を、一方の対立遺伝子のＰＣＲ反応の小さい方のＣｔ値を、別の対立遺伝子のＰＣＲ反応の大きい方のＣｔ値から引くことによって決定した（ｄＣｔ）。２つの対立遺伝子特異的な転写産物の割合を、２＾ｄＣｔとして計算した（すなわち、本発明者らのリアルタイムＰＣＲをベースにしたアッセイにおける１サイクルの差は、２倍の相対的な差を生じる）。統計的解析のために、各サンプルおよびデータ点につき、２〜４回の反応の平均としてｄＣｔ値を得た（各アッセイについての標準誤差＝０．１１、全てのサンプルにわたり平均化）。コントロールとして、ヘテロ接合性のゲノムＤＮＡを用いたｄＣｔ値（これは、理論上０に等しいはずである（実際は、ｈＣＶ２７０４８６１について−０．０５［＋／−０．１３］であり、そして、ｈＣＶ２７０４９３１について-０．０２［＋／−０．１３］であった；平均ｄＣｔ［＋／−Ｓｔｄｅｖ］））もまた得た。
【０４０７】
疾患に関連する改変と対立遺伝子特異的な発現との間の関係性を試験するために、次いで、発現マーカーについてヘテロ接合性である個体を、２つのＤＡＰＫ１疾患関連マーカーについて遺伝子型決定した。次いで、発現マーカーにより測定した対立遺伝子特異的な発現レベルを、疾患関連マーカーの遺伝子型状態（ホモ接合性またはヘテロ接合性）により層化した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて、ＬＯＡＤに関連するＳＮＰのヘテロ接合性およびホモ接合性が、対立遺伝子特異的な発現の割合と有意に関連するかどうかを評価した。コントロールとして、ヘテロ接合性のゲノムＤＮＡにおける実験的に決定された遺伝子型の割合について同じ検定を行った（Ｐ＝０．４５〜０．９５）。発現マーカー  対  疾患関連マーカーの各組み合わせについて、統計的有意差を別個に計算した。
【０４０８】
（結果）
最初の「発見」期に、１つのサンプルセットにおいて、６７４個のＳＮＰを遺伝子型決定および解析した（図２）。これらのＳＮＰは、３４７個の遺伝子、または、染色体を超えた他の領域に位置する。このうち４７個は、対立遺伝子の関連性についてのχ二乗検定においてＬＯＡＤと有意に関連していた（ｐ値＜０．０５）（図２）。第２期または「確認」期には、これらのマーカーのうち４７個を、２つの他のサンプルセットにおいて遺伝子型決定した。３個のマーカーを、組み合わせた確認用サンプルセットにおいて再現した（対立遺伝子のｐ値＜０．０５，片側）。１つのマーカー、ｈＣＶ１３８６９８２は、３つのサンプルセットの各々においてＬＯＡＤと有意に関連しており（表５）、そして、３つのサンプルセット間の症例および対照内で、対立遺伝子の頻度に顕著な一貫性を示した。３つ全てのサンプルセットのメタ解析は、０．０００６の対立遺伝子のＰ値と、０．７９のオッズ比（ＯＲ）（９５％信頼区間［ＣＩ］：０．６９〜０．９０）とを示し、少数の対立遺伝子の保護的な性質を示唆した。劣性モデルの下では、この効果は主な対立遺伝子のホモ接合体と比較して、少数の対立遺伝子のホモ接合体においてより強く（３つの研究においてｐ値＜０．０５）、一方で、ヘテロ接合性の被験体は、主な対立遺伝子についてホモ接合性である被験体とは有意に異なる危険にさらされてはいなかった（図３）。マーカーｈＣＶ１３８６９８２は、ＤＡＰＫ１遺伝子内に位置し、これは、Ｄ．Ｂｌａｃｋｅｒらにより報告された、以前に同定された連鎖ピークの中心である（「Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃｒｅｅｎ  ｏｆ  ４３７  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ」，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２，２３−３２［２００３］）。ＤＡＰＫ１は、アポトーシス促進性の細胞死に関連するプロテインキナーゼをコードし、したがって、ＡＤのための優良な生物学的候補遺伝子である。
【０４０９】
別のマーカーｈＣＶ８７１５１１５は、ＰＯＭＴ１内にあってプロテイン−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１をコードし、これは、確認用のサンプルセットおよび組み合わせた確認用サンプルのメタ解析の一方において有意であった。しかし、このマーカーの対立遺伝子頻度は比較的低く、対照において３．１％であるのに対し、症例において５．３％であった。第３のマーカーｈＣＶ１９２０６０９はＤＦＮＢ３１内にあり、２つの確認用サンプルセットのいずれにおいても個々には有意ではなかったが、これら２つのサンプルセットを組み合わせたとき有意性に到達した。ＤＨＮＢ３１における欠陥は、遺伝性、非症候性でありかつ劣性の聴覚障害をもたらす。ＰＯＭＴ１マーカーおよびＤＦＮＢ３１マーカーは、それぞれ、ＤＡＰＫ１マーカーから４４．２Ｍｂｐおよび２７．０Ｍｂｐの距離にあり、そして、これらの間にはほとんどＬＤを共有しない。したがって、ＤＡＰＫ１は、この染色体スキャンからの最も突出した調査結果ということになった。
【０４１０】
続いて、ＤＡＰＫ１  ＳＮＰ  ｈＣＶ１３８６９８２を含む領域の連鎖不平衡（ＬＤ）構造を、ＨａｐＭａｐ（ＨａｐＭａｐ公開リリース＃１６ｃ．１；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇを参照のこと）において調べた。マーカーｈＣＶ１３８６９８２は、ｒｓ９１３７７８からｒｓ８８８３３３までの高いＬＤの５８．５ｋｂｐの領域内にあり、２１０．７ＫｂｐのＤＡＰＫ１遺伝子内にのみ含まれ、他の公知の遺伝子または予想される遺伝子は存在しない。この領域を細かくマッピングするために、ｒ２＜０．８である１４個のタグを付けたＳＮＰを同定した。これらのタグを付けたＳＮＰのうちの１つは、ｈＣＶ１３８６９８２自体であった。残りの１２個のタグを付けたＳＮＰは、ＷＵサンプルセット（各セットにおけるサンプル数については表５を参照のこと）において遺伝子型決定した。１つのタグを付けたマーカーｈＣＶ１３８６８８８は、０．６４のｒ２を有し、ｈＣＶ１３８６９８２から３７．３Ｋｂｐ離れており、そして、ＬＯＡＤと有意に関連していた（ｐ値＝０．０２０）。３つのＳＮＰのすべり窓法（ｔｈｒｅｅ−ＳＮＰ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いたハプロタイプ解析は、ｈＣＶ１３８６９７３、ｈＣＶ１３８６９７８およびｈＣＶ１３８６９８２からなる有意なハプロタイプを同定した（表６；最良の個々のハプロタイプＡＡＴのｐ値は０．００２５であり、汎用のハプロタイプのｐ値は０．０４６である）。次いで、有意な個々のマーカーおよび有意なハプロタイプマーカーの両方を、ＵＫサンプルおよびＵＣＳＤサンプルにおいて型決定した。マーカーｈＣＶ１３８６８８８を、確認用サンプルセットの組み合わせ解析において再現した。このマーカーは、ＵＣＳＤサンプルセットにおいて有意であり、そして、ＵＫサンプルセットにおいても有意である傾向にあった（表５）。３つ全てのサンプルセットにおけるこのマーカーのメタ解析は、有意な関連性を示した（ｐ値＝０．００１７）。ｈＣＶ１３８６９７３、ｈＣＶ１３８６９７８およびｈＣＶ１３８６９８２からなる有意なハプロタイプは、組み合わせた確認用サンプルにおいても再現された（ＡＡＴハプロタイプについてのｐ値は０．００４１であり、汎用のｐ値は０．０５６であった；表６）。
【０４１１】
有意なＳＮＰのイントロン性の性質から、本発明者らは、疾患に関連する改変が、ＤＡＰＫ１転写産物レベルに直接的な効果（シス効果）を有するかどうかを決定することを考えた。この情報は、対立遺伝子１に特異的な転写産物と対立遺伝子２に特異的な転写産物の相対的な発現レベルを測定することによって直接的に得られ得る。この方法は同じサンプルにおいて両方の対立遺伝子に特異的な転写産物を測定するので、この測定は、異なるサンプル間で発現レベルを比較したときに生じるものよりも、生物学的な改変により受ける衝撃がかなり少ない。さらに、この方法は、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化する必要がない。というのも、各サンプルにおける転写産物レベルは、１つの対立遺伝子／ハプロタイプのみに存在し、そして、その相対的な発現レベルを変更するシス制御因子（例えば、対立遺伝子１／ハプロタイプ１における抑制要素における変異は、対立遺伝子２よりも対立遺伝子１についてより高い発現割合をもたらす）が存在しない限り、対立遺伝子１および対立遺伝子２について同一であるべきであるからである。従って、対立遺伝子特異的な発現解析は、発現レベルにおける小さな相対的変化に対してかなりより感受性であり、一方で、サンプル間にわたる比較は、かなり多くのノイズ（サンプル間の生物学的な変化、および、ハウスキーピング遺伝子に対する正規化からの技術的なノイズ）を含み、比較的大きい発現の差を検出し得るのみである。従って、本発明者らは、対立遺伝子における発現の差についてＤＡＰＫ１を試験し、そして、ｈＣＶ１３８６９８２またはｈＣＶ１３８６８８８が、その対立遺伝子における発現の差に関連するかどうかを評価した。この疾患に関連するマーカーは、ＤＡＰＫ１イントロン内に位置するので、この解析には直接使用され得ない；それゆえ、本発明者らは、２段階のアプローチを用いた。第１に、本発明者らは、ＤＡＰＫ１転写産物にマッピングされる２つの高頻度なＳＮＰを遺伝子型決定し、そして、これらの発現マーカーのうち少なくとも１つについてヘテロ接合性である６９人の白色人種を同定した（ｈＣＶ２７０４８６１について４６人、ｈＣＶ２７０４９３１について４８人；少数の対立遺伝子頻度：ｈＣＶ２７０４８６１について０．４４、ｈＣＶ２７０４９３１について０．４７）。２つの対立遺伝子特異的な転写産物における差は、せいぜい２倍までであった。
【０４１２】
２つの疾患に関連するＳＮＰ、ｈＣＶ１３８６９８２およびｈＣＶ１３８６８８８が、観察されたＤＡＰＫ１対立遺伝子特異的な発現と関連するかどうかを決定するために、本発明者らは、次に、ｈＣＶ２７０４８６１および／またはｈＣＶ２７０４９３１の６９人全てのヘテロ接合性保有者において、これら２つのＳＮＰを遺伝子型決定した。この２つのＳＮＰの発現は、これら２つの疾患に関連するマーカーのうち近い方のｈＣＶ１３８６９８２から７２Ｋｂｐおよび１２９Ｋｂｐであり、そして、これら２つの疾患に関連するマーカーにより共有される高いＬＤ領域には存在しない。ｈＣＶ１３８６９８２またはｈＣＶ１３８６８８８のいずれかが唯一の原因要素である場合、疾患に関連する改変のヘテロ接合性の保有者のみが、対立遺伝子特異的な発現の差を示し、一方で、ホモ接合性の保有者は対立遺伝子特異的な発現の差を示さないことが予想される（図４Ａ）。図４Ｂに示すように、ｈＣＶ１３８６９８２およびｈＣＶ１３８６８８８のホモ接合性の保有者およびヘテロ接合性の保有者の両方が、対立遺伝子特異的な発現の差を示した。しかし、対立遺伝子特異的な発現の割合は、ホモ接合性の保有者と比べて、ｈＣＶ１３８６９８２またはｈＣＶ１３８６８８８のいずれかのヘテロ接合性の保有者の方が有意に高く（Ｐ＜０．０５、図４Ｂ）、一方で、ゲノムＤＮＡコントロールは、このような遺伝子型に依存する差を示さなかった。これらの結果は、ＬＯＡＤに関連する両方のＳＮＰの遺伝子型の状態が、ＤＡＰＫ１対立遺伝子特異的な発現に有意に関連することを示す。
【０４１３】
（考察）
上記の結果は、ＤＡＰＫ１における２つのＳＮＰおよび１つのハプロタイプが、ＬＯＤＡに有意に関連することが分かったことを示す。マーカーｈＣＶ１３８６９８２は、母集団層化の証拠を示さない３つの症例−対照サンプルセットにおいてＬＯＡＤと一貫して関連していた（対立遺伝子のｐ値＜０．０５）。これらの３つのサンプルのメタ解析において、この多型は、０．７９の対立遺伝子のＯＲ（９５％ＣＩ：０．６９〜０．９０）を与え、劣性モデルの下では、効果がより強かった（ＯＲ＝０．５５；９５％ＣＩ：０．４０〜０．７４）。ここで同定されたＤＡＰＫ１対立遺伝子は、比較的一般的であり、症例または対照において３０％を超える頻度を有し、これは、一般的な疾患−一般的な改変の仮説と一致する。別のＳＮＰであるｈＣＶ１３８６８８８は、３つのサンプルセットのうちの２つにおいてＬＯＡＤと有意に関連しており、３番目のサンプルセットにおいても有意である傾向にあった。２つのＳＮＰのロジスティック回帰解析は、他方について調整したときに、いずれのＳＮＰも有意ではなくなることを示し、両方の多型の関連性が、互いに関して、そして／または、別の原因となるＳＮＰに関してのその比較的高いＬＤに起因し得ることを示唆した。さらに、ｈＣＶ１３８６９８２を含む３つのＳＮＰからなるハプロタイプは、ｈＣＶ１３８６９８２単独の関連性に匹敵するＬＯＡＤとの関連性を示した。これらの有意なマーカーは、ＤＡＰＫ１のみを含み、他の既知の遺伝子も予測された遺伝子も含まない高いＬＤの領域に位置し、それゆえに、ＬＯＡＤの遺伝学におけるＤＡＰＫ１の役割を支持していることに注意すべきである。
【０４１４】
本発明者らの機能的な研究は、ＤＡＰＫ１の発現が、他の複雑な疾患における遺伝的な危険因子（カルパイン−１０と２型糖尿病など（Ｈｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｏｄａ，Ｎ．，Ｃｏｘ，Ｎ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｏｒｈｏ−Ｍｅｌａｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｈａｒａ，Ｍ．，Ｈｉｎｏｋｉｏ，Ｙ．，Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｔ．Ｈ．，Ｍａｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｐ．Ｅ．らＧｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃａｌｐａｉｎ−１０  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２６，１６３−７５（２０００））について見られる、対立遺伝子不均等な現象を示し（Ｐａｓｔｉｎｅｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，６４７−５０（２００４））、そして、ＤＡＰＫ１のＬＯＡＤとの遺伝的な関連性を説明し得ることを明らかにした。さらに、本発明者らの研究は、２つのイントロン性のＬＯＡＤに関連するＳＮＰの遺伝子型が、ＤＡＰＫ１対立遺伝子に特異的な発現と有意に関連することを示す。この関連性は、これらのＳＮＰが、ＤＡＰＫ１転写産物のレベルに影響を与える他の同定されていない多型性シス作用調節因子と相互作用し得ることを示唆する。本発明者らは、これらのＳＮＰが、ＤＡＰＫ１の転写を支配する他の多型性シス作用要素とＬＤである可能性は排除できない。この調節の分子機構とは無関係に、ＤＡＰＫ１対立遺伝子特異的な発現がＤＡＰＫ１タンパク質／活性における変化を予測し、したがって、ニューロンのアポトーシスの可能性を予測するということを考慮すると、ＤＡＰＫ１改変体の対立遺伝子特異的な発現は、疾患に関連する機能的な結果に対して、ＬＯＡＤとの遺伝的関連性をリンクさせるもっともらしい説明を提供する。この知見は、疾患の素因、臨床的な診断の確認、または、疾患の進行が、ＤＡＰＫ１遺伝子型に基づいて評価され得るＡＤの診断に対し、直接的に適用され得る。遺伝子型決定は、配列決定のような標準的な方法、または、対立遺伝子特異的なプライマーおよび遺伝子型を区別する一般的なプライマーを用いる対立遺伝子特異的なリアルタイムＰＣＲのような他の検出方法によりなされ得る。さらに、その活性が神経細胞のアポトーシスに関与する酵素として、ＤＡＰＫ１は、ＡＤおよび他の神経学的病理の処置のための新規な薬物標的を代表する。さらに、ＡＤおよび他の疾患の処置の決定は、患者の特異的なＤＡＰＫ１遺伝子型に基づいてなされ得る。
【０４１５】
ＤＡＰＫ１におけるＳＮＰを含めた種々のＳＮＰを検出するための遺伝子型決定キットは、ＡＤの診断、ならびに、ＡＤおよび他の神経学的病理の管理における処置の応答のために設計され得る。新規の医薬（低分子、タンパク質、タンパク質フラグメントもしくはペプチド、抗体または核酸が挙げられるがこれらに限定されない）は、ＡＤおよび他の神経学的病理の処置のためにＤＡＰＫ１を標的とするように設計され得る。
【０４１６】
（実施例２：アルツハイマー病に関連する照会ＳＮＰマーカーとＬＤであるさらなるＳＮＰ）
表３〜６に示すように、アルツハイマー病と関連していることが分かったＳＮＰと連鎖不平衡（ＬＤ）であるＳＮＰマーカーを同定するために、調査を行った。簡単に述べると、ＬＤマーカーを用いて疾患との関連性を検出するために、検出力の閾値（Ｔ）を５１％に設定した。この検出力の閾値は、以前の疾患との関連性の研究からの対立遺伝子頻度データと、本当に疾患に関連するマーカーを検出しない予想された誤り率と、０．０５の有意性レベルとを組み込む上記の式（３１）に基づく。各照会ＳＮＰ（表７）について、この検出力の計算およびサンプルサイズを用いて、ＬＤの閾値レベルすなわちｒ２値（
【０４１７】
【数１５】
2009528023.tif 000017
、式（３２）および（３３））を導出した。閾値
【０４１８】
【数１６】
2009528023.tif 000018
は、照会ＳＮＰとその可能なＬＤ  ＳＮＰとの間の連鎖不平衡の最小値であり、その結果、非照会ＳＮＰは依然として疾患との関連性を検出するためにＴ以上の検出力を有する。
【０４１９】
上記方法論に基づき、ＬＤ  ＳＮＰを表３〜６に示される全ての照会ＳＮＰについて見出した。ＬＤ  ＳＮＰを表７に列挙する。この各々が、そのそれぞれの照会ＳＮＰと関連する。また、照会ＳＮＰおよびＬＤ  ＳＮＰについての公開ＳＮＰ番号（ｒｓ番号）、閾値ｒ２値およびこれを決定するために用いた検出力、ならびに、照会ＳＮＰと、この照会ＳＮＰとマッチングするＬＤ  ＳＮＰとの間の連鎖不平衡のｒ２値も示される。表７における一例として、アルツハイマー病に関連するＳＮＰであるｈＣＶ１９２０６０９は、５１％の検出力での計算に基づいて、０．８９の
【０４２０】
【数１７】
2009528023.tif 000019
においてｈＣＶ９３９５０９とＬＤであると計算された。従って、２つのＳＮＰ間のｒ２値が１であり、すなわち、
【０４２１】
【数１８】
2009528023.tif 000020
よりも大きいので、ｈＣＶ９３９５０９もまた、アルツハイマー病と関連するマーカーであるということになる。
【０４２２】
本明細書中に引用される全ての刊行物および特許は、本明細書中で完全に参考として援用される。記載されている本発明の組成物、方法およびシステムの種々の改変および変化は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態および特定の実施例と関連して記載されているが、特許請求されているような本発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学、遺伝学および関連する分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための上に記載された様式の種々の改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０４２３】
［表１］
表１．転写産物のSNP情報および関連する遺伝子／タンパク質情報
遺伝子番号:                                   1
Celera遺伝子:                                   hCG29235 - 83000099300842
Celera転写産物:                       hCT1950602 - 83000099300914
公開転写産物受託番号:
Celeraタンパク質:                             hCP1766647- 197000064928072
公開タンパク質受託番号:
遺伝子記号:                                   POMT1
タンパク質名:                                 タンパク質-O-マンノシルトランスフェラーゼ1
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32W1V9(18396310..18438527)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   607423
OMIM情報:                         Walker-Warburg症候群,236670 (3); 筋ジストロフィー, 肢帯/2K型, 609308 (3)
転写産物の配列 (配列番号1):
タンパク質の配列 (配列番号6):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号11):
CTGGGCAGCCTCGCCTCTTGGCCTCTGCAGGTGCCTCTGTATGGGAGGCCAGAGTTTCTGTCACTAACTTTTTCTAAGCTCACAATGTCTAGAGGTGGGT
R
CGCTTTTCCACGCAGTGGAACATGACTTTTCTTTGAATCTCTGGCAGGTCTGTGTGTTCTGTCACTTGCTCGCCCGAGCAGTGGCTTTGCTGGTCATCCC
Celera SNP ID:                              hCV8715115
公開SNP ID:                               rs2018621
転写産物の配列中のSNP       配列番号1
転写産物におけるSNPの位置:           1094
SNPの供給源:                                     dbSNP;  HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(A,9|G,111)
SNPの型:                                         UTR5
遺伝子番号:                                   1
Celera遺伝子:                                   hCG29235 - 83000099300842
Celera転写産物:                       hCT1959916 - 83000099300937
公開転写産物受託番号:
Celeraタンパク質:                             hCP1770695- 197000064928073
公開タンパク質受託番号:
遺伝子記号:                                   POMT1
タンパク質名:                                 タンパク質-O-マンノシルトランスフェラーゼ1
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32W1V9(18396310..18438527)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   607423
OMIM情報:                         Walker-Warburg症候群,236670 (3); 筋ジストロフィー, 肢帯/2K型, 609308 (3)
転写産物の配列 (配列番号2):
タンパク質の配列 (配列番号7):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号12):
CTGGGCAGCCTCGCCTCTTGGCCTCTGCAGGTGCCTCTGTATGGGAGGCCAGAGTTTCTGTCACTAACTTTTTCTAAGCTCACAATGTCTAGAGGTGGGT
R
CGCTTTTCCACGCAGTGGAACATGACTTTTCTTTGAATCTCTGGCAGGTCTGTGTGTTCTGTCACTTGCTCGCCCGAGCAGTGGCTTTGCTGGTCATCCC
Celera SNP ID:                              hCV8715115
公開SNP ID:                               rs2018621
転写産物の配列中のSNP       配列番号2
転写産物におけるSNPの位置:           1019
SNPの供給源:                                     dbSNP;  HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(A,9|G,111)
SNPの型:                                         UTR5
遺伝子番号:                                   2
Celera遺伝子:                                   hCG32519 - 84000314391801
Celera転写産物:                       hCT1965717 - 84000314391824
公開転写産物受託番号:
Celeraタンパク質:                             hCP1781822- 197000064927550
公開タンパク質受託番号:
遺伝子記号:                                   DFNB31
タンパク質名:                                 難聴, 常染色体の劣性31
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32W1V9(1289841..1413275)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   607928
OMIM情報:                         難聴, 常染色体の劣性 31,607084 (3)
転写産物の配列 (配列番号3):
タンパク質の配列 (配列番号8):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号13):
CTCTCCCAGCTCTCGGACAGCGGGCAGACTCTAAGCGAGGACAGTGGTGTGGATGCTGGCGAGGCAGAGGCCAGCGCCCCAGGCCGAGGAAGGCAGTCGG
Y
GTCCACCAAGAGCAGGAGTAGCAAGGAGCTGCCTCGGAACGAGAGGCCCACAGATGGGGCCAACAAACCGCCTGGACTTCTGGAGCCCACGTCCACTCTG
Celera SNP ID:                              hCV1920609
公開SNP ID:                               rs2274159
転写産物の配列中のSNP       配列番号3
転写産物におけるSNPの位置:           1796
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(T,58|C,62)
SNPの型:                                         ミスセンス突然変異
タンパク質コード領域:                             配列番号8, 400位,(V,GTG)(A,GCG)
遺伝子番号:                                   2
Celera遺伝子:                                   hCG32519 - 84000314391801
Celera転写産物:                       hCT1965719 - 84000314391840
公開転写産物受託番号:
Celeraタンパク質:                             hCP1781858- 197000064927551
公開タンパク質受託番号:
遺伝子記号:                                   DFNB31
タンパク質名:                                 難聴, 常染色体の劣性31
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32W1V9(1289841..1413275)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   607928
OMIM情報:                         難聴, 常染色体の劣性 31,607084 (3)
転写産物の配列 (配列番号4):
タンパク質の配列 (配列番号9):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号14):
CTCTCCCAGCTCTCGGACAGCGGGCAGACTCTAAGCGAGGACAGTGGTGTGGATGCTGGCGAGGCAGAGGCCAGCGCCCCAGGCCGAGGAAGGCAGTCGG
Y
GTCCACCAAGAGCAGGAGTAGCAAGGAGCTGCCTCGGAACGAGAGGCCCACAGATGGGGCCAACAAACCGCCTGGACTTCTGGAGCCCACGTCCACTCTG
Celera SNP ID:                              hCV1920609
公開SNP ID:                               rs2274159
転写産物の配列中のSNP       配列番号4
転写産物におけるSNPの位置:           1717
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(T,58|C,62)
SNPの型:                                         ミスセンス突然変異
タンパク質コード領域:                             配列番号9, 432位,(V,GTG)(A,GCG)
遺伝子番号:                                   2
Celera遺伝子:                                   hCG32519 - 84000314391801
Celera転写産物:                       hCT23708 - 84000314391808
公開転写産物受託番号:   NM_015404
Celeraタンパク質:                             hCP45834 -197000064927549
公開タンパク質受託番号:         NP_056219
遺伝子記号:                                   DFNB31
タンパク質名:                                 難聴, 常染色体の劣性31
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32W1V9(1289841..1413275)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   607928
OMIM情報:                         難聴, 常染色体の劣性 31,607084 (3)
転写産物の配列 (配列番号5):
タンパク質の配列 (配列番号10):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号15):
CTCTCCCAGCTCTCGGACAGCGGGCAGACTCTAAGCGAGGACAGTGGTGTGGATGCTGGCGAGGCAGAGGCCAGCGCCCCAGGCCGAGGAAGGCAGTCGG
Y
GTCCACCAAGAGCAGGAGTAGCAAGGAGCTGCCTCGGAACGAGAGGCCCACAGATGGGGCCAACAAACCGCCTGGACTTCTGGAGCCCACGTCCACTCTG
Celera SNP ID:                              hCV1920609
公開SNP ID:                               rs2274159
転写産物の配列中のSNP       配列番号5
転写産物におけるSNPの位置:           3047
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(T,58|C,62)
SNPの型:                                         ミスセンス突然変異
タンパク質コード領域:                             配列番号10,783位,(V,GTG) (A,GCG)
。
【０４２４】
［表２］
表２．ゲノムのSNP情報および関連する遺伝子情報
遺伝子番号:                                   1
Celera遺伝子:                                   hCG29235 - 83000099300842
遺伝子記号:                                   POMT1
タンパク質名:                                 タンパク質-O-マンノシルトランスフェラーゼ1
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32W1V9(18396310..18438527)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   607423
OMIM情報:                         Walker-Warburg症候群,236670 (3); 筋ジストロフィー, 肢帯/2K型, 609308 (3)
ゲノム配列(配列番号16):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号20):
CTGGGCAGCCTCGCCTCTTGGCCTCTGCAGGTGCCTCTGTATGGGAGGCCAGAGTTTCTGTCACTAACTTTTTCTAAGCTCACAATGTCTAGAGGTGGGT
R
CGCTTTTCCACGCAGTGGAACATGACTTTTCTTTGAATCTCTGGCAGGTCTGTGTGTTCTGTCACTTGCTCGCCCGAGCAGTGGCTTTGCTGGTCATCCC
Celera SNP ID:                              hCV8715115
公開SNP ID:                               rs2018621
ゲノム配列中のSNP:           配列番号16
ゲノムにおけるSNPの位置:                 17298
SNPの供給源:                                     dbSNP;HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(A,9|G,111)
SNPの型:                                         転写因子結合部位;UTR5;イントロン
遺伝子番号:                                   2
Celera遺伝子:                                   hCG32519 - 84000314391801
遺伝子記号:                                   DFNB31
タンパク質名:                                 難聴, 常染色体の劣性31
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32W1V9(1289841..1413275)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   607928
OMIM情報:                         難聴, 常染色体の劣性 31,607084 (3)
ゲノム配列(配列番号17):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号21):
GCCCTCTGCATCCTCCTCCTCCTGGCTCACCGGTTTGTTGGCCCCATCTGTGGGCCTCTCGTTCCGAGGCAGCTCCTTGCTACTCCTGCTCTTGGTGGAC
R
CCGACTGCCTTCCTCGGCCTGGGGCGCTGGCCTCTGCCTCGCCAGCATCCACACCACTGTCCTCGCTTAGAGTCTGCCCGCTGTCCGAGAGCTGGGAGAG
Celera SNP ID:                              hCV1920609
公開SNP ID:                               rs2274159
ゲノム配列中のSNP:           配列番号17
ゲノムにおけるSNPの位置:                 11890
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(A,58|G,62)
SNPの型:                                         ミスセンス突然変異;ヒト−マウスシンテニー領域
コンテキスト                         (配列番号22):
CTGTGGTCTTAAGAAAAGGACGTCAGTGGAAAGAGAGAGTGACCCAGAATCTCTAGAAGGTTAAGGCAAGCAGAGCCCTCAGGATAAGGCTGGAAACCAG
Y
GCTCCTGGGAGGGAATGCAGGCACCCGAGAACTTGGCTGGGGGAACTGTTACATCTTCATTTCCATTAACCTCTAACTGAAAGGCCACGTTTCCTTTCAT
Celera SNP ID:                              hCV939509
公開SNP ID:                               rs717916
ゲノム配列中のSNP:           配列番号17
ゲノムにおけるSNPの位置:                 21949
関連する問合せSNP:         hCV1920609(Power=.51)
SNPの供給源:                                     dbSNP;HapMap; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(T,58|C,62)
SNPの型:                                         イントロン
コンテキスト                         (配列番号23):
CCATTCCCAGTCTCTCTGGAAACCCCTATCCTAGCGCCTCTGGCAGAGTCTGCAGGACGGTGGGAGCTGATGAAATCCCCTTGCAACAAACAGCCCCAAT
S
ACATGTTTTAAATGCAAACCGGCTGGACTTTAGGAGGCAAAGGCCCCACGTGGACATCGCCTCCCTCCTGCAGAAGAACTGTGAGACGACTGCCCCAGGA
Celera SNP ID:                              hCV1920602
公開SNP ID:                               rs4979377
ゲノム配列中のSNP:           配列番号17
ゲノムにおけるSNPの位置:                 5016
関連する問合せSNP:         hCV1920609(Power=.51)
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(C,58|G,62)
SNPの型:                                         ヒト−マウスシンテニー領域;イントロン
コンテキスト                         (配列番号24):
AACCTAGGGTTTCAAACTCAGGGGCCCGGCTGTTATACACATAGTGAAGCAGCGTGGGTTGACTGGTGGGCTGGAGGGCATGTGCCCACCACTCAGCTCA
S
GCAGGGGCCATGCAGAGGTTCAGACCAGGTGTGGTGGAATTTCTCTTTTTCTCTTGGTAAGCTAGAAATTACTACTTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTT
Celera SNP ID:                              hCV32122697
公開SNP ID:                               rs4979380
ゲノム配列中のSNP:           配列番号17
ゲノムにおけるSNPの位置:                 12903
関連する問合せSNP:         hCV1920609(Power=.51)
SNPの供給源:                                     dbSNP;HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(G,58|C,62)
SNPの型:                                         イントロン
遺伝子番号:                                   3
Celera遺伝子:                                   hCG27735- 83000098893244
遺伝子記号:                                   DAPK1
タンパク質名:                                 細胞死に関連するプロテインキナーゼ1
Celeraゲノム軸:                  GA_x5YUV32VUMT(19054067..19283800)
染色体:                                     9
OMIM番号:                                   600831
OMIM情報:
ゲノム配列(配列番号18):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号25):
GAAATCAGTCTGCCAAGATAAATAATTATAACTGATAATAGGCTTATCAGTGTGACCACAGTAAATAATTCCATTATTATATACATCATACCACAGCGTA
R
TTGCTCACTTACCTGTCTCTTAAGGGAACCTGCATCTAATTATCTTTTAACTTTTAGGGCTGACATATACTTGACCTATAATTGTTGAATTAGCCAACTC
Celera SNP ID:                              hCV1386888
公開SNP ID:                               rs4877365
ゲノム配列中のSNP:           配列番号18
ゲノムにおけるSNPの位置:                 52962
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE; CDX_Alzheimer
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(G,90|A,30)
SNPの型:                                         イントロン
コンテキスト                         (配列番号26):
TCTTTTGCCTTTGTGGATCAGCCAAGGCCACCTTTTAAGAGTTCTTTGTTCACTGGGGAGGATTCTGTCATGCCAAGGGCTGGGAATAAAAAAGTCACAA
R
TAGAAAGACTTGCTCAGCATTGGCAACTCCCATCCCTCAGTGGTTCTCTTGAGTTTTGGTAAATCTAGACTGATGAATATAGCAGCTAATGATCATAGTA
Celera SNP ID:                              hCV1386973
公開SNP ID:                               rs11141899
ゲノム配列中のSNP:           配列番号18
ゲノムにおけるSNPの位置:                 84240
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; CDX_Alzheimer
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(A,89|G,29)
SNPの型:                                         イントロン
コンテキスト                         (配列番号27):
AAAGGCAAGCTGAGCAGATGTTTTCCTGTAGTGAGTGTGTTACTTCATTATCTGTGCTAATAATTATAAGAATAAAAAGCAAAGCGCAGTGGACTCCTAT
R
TTTGCTCTTATGTTTTGTACTGTCATCTAAATCATGTCTCTTCAGGCGCGTGTTTGCTTCTGGGGATAGTTTTATCTTGTCAAGTGTGTTTGTTCTTGGA
Celera SNP ID:                              hCV1386978
公開SNP ID:                               rs3128521
ゲノム配列中のSNP:           配列番号18
ゲノムにおけるSNPの位置:                 88531
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE; CDX_Alzheimer
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(A,74|G,46)
SNPの型:                                         イントロン
コンテキスト                         (配列番号28):
AGGGATGAGGCGCGAGAAGCTACCCACAGGCCATAGAACATTTCCATTTCTTTTACCTCATTTGCTGGTGCTCTGATATTTTTCGGTGGCAGCCTTCTTC
Y
GATTTTAAATGTAACTCATGCTCATGTAGAAAGTTTGAAAACAACATAGAAAACTTTGAAAGAGAAAATAGGACTCTCTAGTAATCCCATCCCCCGAAAG
Celera SNP ID:                              hCV1386982
公開SNP ID:                               rs4878104
ゲノム配列中のSNP:           配列番号18
ゲノムにおけるSNPの位置:                 90260
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE; CDX_Alzheimer
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(C,82|T,38)
SNPの型:                                         イントロン;REPEATS
遺伝子番号:                                   4
Celera遺伝子:                                   hCG32521- 84000314391890
遺伝子記号:                                   AKNA
タンパク質名:                                 ATフック転写因子
Celeraゲノム軸:                   GA_x5YUV32W1V9(1223622..1306270)
染色体:                                     9
OMIM番号:
OMIM情報:
ゲノム配列(配列番号19):
SNP情報
コンテキスト                         (配列番号29):
GCCCTCTGCATCCTCCTCCTCCTGGCTCACCGGTTTGTTGGCCCCATCTGTGGGCCTCTCGTTCCGAGGCAGCTCCTTGCTACTCCTGCTCTTGGTGGAC
R
CCGACTGCCTTCCTCGGCCTGGGGCGCTGGCCTCTGCCTCGCCAGCATCCACACCACTGTCCTCGCTTAGAGTCTGCCCGCTGTCCGAGAGCTGGGAGAG
Celera SNP ID:                              hCV1920609
公開SNP ID:                               rs2274159
ゲノム配列中のSNP:           配列番号19
ゲノムにおけるSNPの位置:                 78109
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(A,58|G,62)
SNPの型:                                         ミスセンス突然変異;ヒト−マウスシンテニー領域
コンテキスト                         (配列番号30):
CCATTCCCAGTCTCTCTGGAAACCCCTATCCTAGCGCCTCTGGCAGAGTCTGCAGGACGGTGGGAGCTGATGAAATCCCCTTGCAACAAACAGCCCCAAT
S
ACATGTTTTAAATGCAAACCGGCTGGACTTTAGGAGGCAAAGGCCCCACGTGGACATCGCCTCCCTCCTGCAGAAGAACTGTGAGACGACTGCCCCAGGA
Celera SNP ID:                              hCV1920602
公開SNP ID:                               rs4979377
ゲノム配列中のSNP:           配列番号19
ゲノムにおけるSNPの位置:                 71235
関連する問合せSNP:         hCV1920609(Power=.51)
SNPの供給源:                                     dbSNP;Celera; HapMap; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(C,58|G,62)
SNPの型:                                         ヒト−マウスシンテニー領域;イントロン
コンテキスト                         (配列番号31):
AACCTAGGGTTTCAAACTCAGGGGCCCGGCTGTTATACACATAGTGAAGCAGCGTGGGTTGACTGGTGGGCTGGAGGGCATGTGCCCACCACTCAGCTCA
S
GCAGGGGCCATGCAGAGGTTCAGACCAGGTGTGGTGGAATTTCTCTTTTTCTCTTGGTAAGCTAGAAATTACTACTTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTT
Celera SNP ID:                              hCV32122697
公開SNP ID:                               rs4979380
ゲノム配列中のSNP:           配列番号19
ゲノムにおけるSNPの位置:                 79122
関連する問合せSNP:         hCV1920609(Power=.51)
SNPの供給源:                                     dbSNP;HapMap; ABI_Val; HGBASE
母集団(対立遺伝子,数):         白色人種(G,58|C,62)
SNPの型:                                         イントロン
。
【０４２５】
【表３】
2009528023.tif 000021
【０４２６】
【表４】
2009528023.tif 000022
【０４２７】
【表５】
2009528023.tif 000023
【０４２８】
【表６】
2009528023.tif 000024
【０４２９】
【表７】
2009528023.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【０４３０】
【図１】図１は、コンピュータ読み取り可能な形態の本発明のＳＮＰ情報を含む、コンピュータをベースとした検出システムの線図による表示を提供する。
【図２】図２は、第９染色体上の探索用マーカーのＬＯＡＤとの関連性を示す。６７４個のＳＮＰのｐ値を、Ｃｅｌｅｒａのヒトゲノムアセンブリ、バージョンＲ２７に基づくその物理的な位置に対してプロットした。ｐ値＝０．０５における水平線は、有意でないマーカーから有意なマーカーを区別するために引いた。これまでに同定されている連鎖ピーク領域を、参照符と共に実線の水平線で示した。矢印は、ＤＡＰＫ１  ＳＮＰ  ｈＣＶ１３８６９８２を指す。
【図３】図３は、種々の遺伝子型と、そのＬＯＡＤの危険性との関連性を示す。小数の対立遺伝子のホモ接合体（ＴＴ）およびヘテロ接合体（ＴＣ）についてのオッズ比（ＯＲ）を、以下の研究セットによりグループ分けした：ＷＵ、ＳＤ、ＵＫ、および３セットの組み合わせ（全体）。
【図４】図４は、図４Ａおよび図４Ｂから構成される：ＬＯＡＤに関連するマーカーｈＣＶ１３８６９８２またはｈＣＶ１３８６８８８により層化したＤＡＰＫ１対立遺伝子特異的な遺伝子発現。（Ａ）一方とは異なる対立遺伝子特異的な転写産物の割合は、原因となる改変のヘテロ接合性（Ｘ，Ｙ）を必要とする。遺伝子型により層化されたときに対立遺伝子特異的な発現との関連性を示すマーカーは、原因となる改変と強いＬＤであるか、または、原因となる改変自体を表すと予想される。原因となる改変とＬＤではないマーカーが、対立遺伝子特異的な発現との関連性を示すことはほとんどない。Ａ１、Ａ２：対立遺伝子特異的な発現マーカー。原因となるＳＮＰが、発現マーカー（Ａ１／Ａ２）と完全にＬＤではない場合、原因となるＳＮＰの対立遺伝子（Ｘ／Ｙ）が、いずれかの対立遺伝子特異的な転写産物において生じ得ることに注意されたい。（Ｂ）ｃＤＮＡについての対立遺伝子特異的な遺伝子発現の割合を示す。２つのマーカーｈＣＶ２７０４９３１およびｈＣＶ２７０４８６１を解析して、対立遺伝子発現を測定した（Ｈｏｍ：ホモ接合体；Ｈｅｔ，ヘテロ接合体）。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を行い、関連性を評価した。相対的な発現を２＾ＤＣｔとして計算した（ＤＣｔは、一方の対立遺伝子のＰＣＲ反応の小さい方のＣｔ値を、別の対立遺伝子のＰＣＲ反応の大きい方のＣｔ値から引くことによって決定した）。
【図１】
2009528023.tif 000026
【図２】
2009528023.tif 000027
【図３】
2009528023.tif 000028
【図４】
2009528023.tif 000029
【配列表】
2009528023000001.app