(57)【要約】  本発明は、タンパク質結合基を含有し、且つ活性物質又は低分子活性物質誘導体を放出するように、体内で酵素的に切断することができるメトトレキサート誘導体に関する。メトトレキサート誘導体を製造する方法、その使用、及びメトトレキサート誘導体を含む薬剤も開示する。【選択図】なし
2009544638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉ：
【化１】
2009544638.tif 000014
（式中、
Ｒ１＝Ｈ又はＣＨ３、
Ｒ２＝Ｈ又はＣＯＯＨ、
Ｐ１＝リシン、メチオニン、アラニン、プロリン又はグリシン、
Ｐ２＝ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、プロリン又はチロシン、
Ｐ３＝Ｄ−アラニン、アラニン、Ｄ−バリン、バリン、ロイシン又はフェニルアラニン、
Ｘａａ＝アルカリ側鎖を有するアミノ酸、
ｍ＝０〜６、
ｎ＝０〜５、
ｏ＝０〜２、
ｐ＝１〜１０、
ＰＭはタンパク質結合基である）
のメトトレキサート誘導体。
【請求項２】
ＰＭが、マレインイミド基、２−ジチオピリジル基、ハロゲンアセトアミド基、ハロゲンアセテート基、ジスルフィド基、アクリル酸エステル基、モノアルキルマレイン酸エステル基、モノアルキルマレアミン酸アミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、イソチオシアネート基及びアジリジン基（必要に応じて置換されてもよい）から成る群から選択される、請求項１に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項３】
ＰＭが、マレインイミド基（必要に応じて置換されてもよい）である、請求項２に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項４】
ｍ＝０及びｎ＝４である、請求項３に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項５】
ｍ＝３及びｎ＝１である、請求項３に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項６】
Ｒ１＝ＣＨ３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項７】
Ｒ２＝ＣＯＯＨ及びｐ＝４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項８】
Ｐ１＝リシン、アラニン又はメチオニンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項９】
Ｐ２＝フェニルアラニン、メチオニン、アラニン又はチロシンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１０】
Ｐ３＝Ｄ−アラニン、アラニン、Ｄ−バリン、バリン又はフェニルアラニンである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１１】
Ｐ１＝リシン、Ｐ２＝ロイシン又はフェニルアラニン、及びＰ３＝アラニン、Ｄ−アラニン、バリン又はＤ−バリンである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１２】
Ｐ２＝ロイシン及びＰ３＝Ｄ−バリンである、請求項１１に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１３】
Ｐ２＝ロイシン及びＰ３＝バリンである、請求項１１に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１４】
Ｐ２＝フェニルアラニン及びＰ３＝Ｄ−アラニンである、請求項１１に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１５】
Ｐ２＝フェニルアラニン及びＰ３＝アラニンである、請求項１１に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１６】
Ｐ１＝メチオニン、Ｐ２＝メチオニン、アラニン又はフェニルアラニン、及びＰ３＝アラニン又はフェニルアラニンである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１７】
Ｐ２＝アラニン及びＰ３＝フェニルアラニンである、請求項１６に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１８】
Ｐ２＝フェニルアラニン及びＰ３＝アラニンである、請求項１６に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項１９】
Ｐ２＝メチオニン及びＰ３＝アラニンである、請求項１６に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項２０】
Ｐ２＝メチオニン及びＰ３＝フェニルアラニンである、請求項１６に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項２１】
ｏ＝０である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項２２】
Ｘａａ＝アルギニン、リシン又はヒスチジンである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項２３】
Ｘａａ＝アルギニン及びｏ＝２である、請求項２２に記載のメトトレキサート誘導体。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体を製造する方法であって、一般構造式ＩＩ：
【化２】
2009544638.tif 000015
（式中、
Ｒ１＝ＣＨ３、Ｈ又はＣＯＣＦ３、
Ｒ２＝Ｃ（ＣＨ３）３、アルコキシ置換ベンジル基又はトリアルキルシリル基である）を有するメトトレキサート誘導体を、カルボン酸活性化試薬の存在下で、触媒／補助塩基を添加しながら、一般構造式ＩＩＩ：
【化３】
2009544638.tif 000016
（式中、
Ｒ３＝Ｈ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯｔＢｕ、
Ｐ１＝リシン、メチオニン、アラニン、プロリン又はグリシン、
Ｐ２＝ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、プロリン又はチロシン、
Ｐ３＝Ｄ−アラニン、アラニン、Ｄ−バリン、バリン、ロイシン又はフェニルアラニン、
Ｘａａ＝アルカリ側鎖を有するアミノ酸、
ｍ＝０〜６、
ｎ＝０〜５、
ｏ＝０〜２、
ｐ＝１〜１０、
ＰＭはタンパク質結合基であり、潜在的な求核基が存在し、必要に応じてＰ１、Ｐ２及びＸａａで保護基によって保護され、第２の工程で必要に応じてカチオン捕捉試薬を添加しながら酸で処理される）
の架橋剤−ペプチド単位と反応させる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体を製造する方法。
【請求項２５】
前記カルボン酸活性化試薬が、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨウ化物及びＯ−（アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記触媒／補助塩基が、トリアルキルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）又はそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｎ−エチルジイソプロピルアミンと関連してＯ−（アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートがカルボン酸活性化試薬として使用される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
塩化水素が、前記第２の工程における酸として使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
トリフルオロ酢酸が、前記第２の工程における酸として使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の工程において、前記カチオン捕捉試薬が、水、フェノール、チオアニゾール、ジイソプロピルシラン及び１，２−エタンジチオール、又はそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
メトトレキサート−α−ｔｅｒｔ−ブチルエステルが、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンと関連してＯ−（アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを使用して、（（（（６−マレインイミドヘキサノイル）Ｄ−アラニル）フェニルアラニル）ｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニルリシル）リシン−トリフルオロアセテートと反応し、第２の工程でトリフルオロ酢酸で処理される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
必要に応じて１つ又は複数の薬学的に許容される補助剤と共に、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体を含む薬剤。
【請求項３３】
癌疾患の治療用の請求項１〜２３のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体の使用。
【請求項３４】
リウマチ疾患の治療用の請求項１〜２３のいずれか一項に記載のメトトレキサート誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メトトレキサート誘導体及びメトトレキサートペプチド誘導体（タンパク質結合基を含有し、且つ活性物質又は低分子活性物質誘導体を放出するように、体内で酵素的に切断することができる）、メトトレキサート誘導体を製造する方法、その使用、並びにメトトレキサート誘導体を含有する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メトトレキサート（ＭＴＸ）は、腫瘍及び関節リウマチの治療に使用される葉酸拮抗薬である。この使用は、多くの副作用（例えば眩暈、脱毛、口内炎、胃腸症状、感染感受性の増大）によって制限される。ＭＴＸ及びＭＴＸ誘導体の副作用プロファイル及び有効性を改善するために、高分子輸送形態のＭＴＸが、活性物質を合成ポリマー（例えばポリ（エチレングリコール））（非特許文献１）、ＨＰＭＡコポリマー（非特許文献２）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（非特許文献３、非特許文献４）に結合させることによって提供されている。しかし、未だに副作用プロファイルが低く、且つ遊離ＭＴＸに比べて有効性が本質的に改善されたＭＴＸ又はＭＴＸ誘導体を含有する新規のシステムに対する要求がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Riebeseel, K.; Biedermann, E.; Loeser, R.; Breiter, N.; Hanselmann, R. et al., BioconjugateChem. 2002, 13, 773-785
【非特許文献２】Subr, V.; Strohalm, J. et al. Controlled Release 1997, 49, 123-132
【非特許文献３】Wunder, A.; Muller-Ladner et al., J Immunol2003, 170, 4793-4801
【非特許文献４】Wunder, A.; Stehle, G. et al., Int. J. Oncol. 1997, 11, 497-507
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の基礎を成す技術的課題は、腫瘍組織又はリウマチ組織においてＭＴＸ又はＭＴＸ誘導体を放出するメトトレキサートのプロドラッグを提供することである。
【０００５】
この技術的課題は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特に、一般構造式：
【０００７】
【化１】
2009544638.tif 000003
【０００８】
（式中、Ｒ１＝Ｈ又はＣＨ３、Ｒ２＝Ｈ又はＣＯＯＨ、Ｐ１〜Ｐ３＝Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸であり、Ｘａａは溶解度調節アミノ酸であり、ｍ＝０〜６、ｎ＝０〜５、ｏ＝０〜２、ｐ＝１〜１０であり、ＰＭはタンパク質結合基である）のメトトレキサート誘導体が提供される。
【０００９】
本発明によれば、本発明のメトトレキサート誘導体がプロドラッグを構成するように、加水分解で又は酵素的に切断可能な統合された既定の切断点によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性物質又はスペーサー−活性物質誘導体が制御様式で放出される。
【００１０】
本発明のＭＴＸ誘導体は、抗腫瘍又は抗リウマチのメトトレキサート成分、スペーサー分子、ペプチド鎖及びヘテロ二官能性架橋剤から成る。この構造的構成は、以下で詳細に説明する。
【００１１】
本発明の抗腫瘍ＭＴＸ成分は、一般構造式：
【００１２】
【化２】
2009544638.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒ１＝ＣＨ３又はＨである）の活性物質である。
【００１４】
好ましい活性物質は、メトトレキサートである。
【００１５】
本発明のスペーサー分子は、一般構造式：
【００１６】
【化３】
2009544638.tif 000005
【００１７】
（式中、Ｒ２＝Ｈ又はＣＯＯＨ、ｐ＝１〜１０である）のジアミンである。
【００１８】
好ましいスペーサーは、エチレンジアミン（Ｒ２＝Ｈ、ｐ＝１）及びｐ＝４又は５のスペーサーである。特に好ましいスペーサーは、Ｌ−リシン（Ｒ２＝ＣＯＯＨ、ｐ＝４）である。
【００１９】
本発明において、ペプチドは、酵素的に切断可能な配列及びＮ末端溶解度調節成分から構成され、一般構造式：
【００２０】
【化４】
2009544638.tif 000006
【００２１】
（式中、Ｐ１〜Ｐ３＝Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸、Ｘａａ＝アルカリ側鎖を有するアミノ酸、ｏ＝０〜２である）を有する。
【００２２】
本発明において、アミノ酸Ｐ１は、アミノ酸のリシン、メチオニン、アラニン、プロリン及びグリシンから選択される。アミノ酸Ｐ２は、アミノ酸のロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、プロリン及びチロシンから選択される。アミノ酸Ｐ３は、アミノ酸のＤ−アラニン、アラニン、Ｄ−バリン、バリン、ロイシン及びフェニルアラニンから選択される。Ｐ１位の好ましいアミノ酸は、リシン、アラニン及びメチオニンである。Ｐ２位の好ましいアミノ酸は、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン及びチロシンである。Ｐ３位の好ましいアミノ酸は、Ｄ−アラニン、アラニン、Ｄ−バリン、バリン及びフェニルアラニンである。
【００２３】
特に好ましいペプチド配列が以下の表に列挙される。
【００２４】
【表１】
2009544638.tif 000007
【００２５】
本発明によれば、溶解度調節基Ｘａａは、アミノ酸のアルギニン、リシン及びヒスチジンから選択されるのが好ましい。特に好ましい基はアルギニンである。
【００２６】
本発明において、ヘテロ二官能性架橋剤は、一般構造式：
【００２７】
【化５】
2009544638.tif 000008
【００２８】
（式中、ｍ＝０〜６、ｎ＝０〜５、ＰＭ＝タンパク質結合基である）のタンパク質結合基を有するカルボン酸である。
【００２９】
タンパク質結合基（ＰＭ）は、２−ジチオピリジル基、ハロゲンアセトアミド基、ハロゲンアセテート基、ジスルフィド基、アクリル酸エステル基、モノアルキルマレイン酸エステル基、モノアルキルマレアミン酸アミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基、イソチオシアネート基、アジリジン基又はマレインイミド基から選択されるのが好ましい。特に好ましいタンパク質結合基はマレインイミド基である。
【００３０】
好ましい架橋剤は、ｍ＝３及びｎ＝１、並びにｍ＝０及びｎ＝４を特徴とする。
【００３１】
本発明によれば、活性物質及びスペーサー分子は、活性物質のγ−カルボキシル基と、スペーサー分子の第１アミノ基とのアミド結合によって連結する。スペーサー分子と架橋剤−ペプチド単位との結合は、スペーサー分子の第２アミノ基と、架橋剤−ペプチド単位のＣ末端カルボキシル基とのアミド結合から成る。架橋剤とペプチド鎖との結合は、ペプチド鎖のＮ末端と、架橋剤のカルボキシル基とのアミド結合から成る。
【００３２】
本発明のＭＴＸ誘導体の本質的な特性は、スペーサー分子と架橋剤との結合が酵素的に切断することができ、それにより腫瘍組織又はリウマチ組織における活性物質又はスペーサー−活性物質誘導体の制御放出が可能になることである。プロテアーゼ（例えばカテプシン又はプラスミン）が多くのヒトの腫瘍及びリウマチ組織で過剰発現し、したがってプロドラッグの標的指向性の酵素活性化に対する適用の理想点が示される（Yan, S. et al., Biol. Chem. 1998, 2, 113-123; Leto, G. et al., Clin. Exp. Metastasis 2004, 91-106; Sloane, B. .F.; Yan, S. et al., Seminars in Cancer Biology, 2005, 15, 149-157; Dano, K.; Behrendt, N. et al., Thrombosis & Haemostasis 2005, 93, 676-681; Hashimoto, Y.; Kakegawa, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, 283, 334-339; Ikeda, Y.; Ikata, T. et al., J. Med. Invest. 2000, 47, 61-75）。さらに、本発明のＭＴＸ誘導体は、関節リウマチを患う患者の実験用腫瘍ホモジネート及び滑液において迅速な切断を示す（実施例４及び実施例５を参照されたい）。
【００３３】
本発明のＭＴＸ誘導体は、一般構造式：
【００３４】
【化６】
2009544638.tif 000009
【００３５】
（式中、
Ｒ１＝ＣＨ３、Ｈ又はＣＯＣＦ３、
Ｒ２＝Ｃ（ＣＨ３）３、アルコキシ置換ベンジル基又はトリアルキルシリル基である）のメトトレキサート誘導体と、一般構造式：
【００３６】
【化７】
2009544638.tif 000010
【００３７】
（式中、
Ｒ３＝Ｈ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯｔＢｕ、
Ｐ１＝リシン、メチオニン、アラニン、プロリン又はグリシン、
Ｐ２＝ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、プロリン又はチロシン、
Ｐ３＝Ｄ−アラニン、アラニン、Ｄ−バリン、バリン、ロイシン又はフェニルアラニン、
Ｘａａ＝アルカリ側鎖を有するアミノ酸、
ｍ＝０〜６、
ｎ＝０〜５、
ｏ＝０〜２、
ｐ＝１〜１０、
ＰＭはタンパク質結合基であり、潜在的な求核基が存在し、必要に応じてＰ１、Ｐ２及びＸａａで当業者に既知の保護基によって保護される）の架橋剤−ペプチド単位との縮合によって生成されるのが好ましい。
【００３８】
本発明によれば、架橋剤−ペプチド単位のカルボキシル基の活性化用の試薬として、好ましくはＯ−（アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨウ化物が、一般的な触媒又は補助塩基（例えばＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ）、トリアルキルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）又はヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））を添加しながら使用される。例えば、極性有機溶媒、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で反応を行う。例えば、−１０℃〜室温の温度で反応を行い、その反応時間は、例えば３０分〜４８時間である。例えば、非極性溶媒、好ましくはジエチルエーテルからの析出によって、中間生成物の単離が達成される。
【００３９】
続く第２の合成工程では、本発明によれば、Ｐ１、Ｐ２、Ｘａａでの求核基に対する潜在的な保護基と共に保護基Ｒ２が取り除かれる。酸、好ましくはトリフルオロ酢酸又は塩酸で処理することによって、典型的にこの切断が達成される。本発明の好ましい実施形態では、第１の合成工程の生成物を、１：１の比のトリフルオロ酢酸とジクロロメタンとの混合物で約３０分間処理する。非極性溶媒、好ましくはジエチルエーテルからの析出によって、粗生成物を単離する。
【００４０】
本発明によれば、例えば、結晶化又はカラムクロマトグラフィによって、好ましくは逆相シリカゲル上で、粗生成物を精製する。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態によれば、カップリング試薬としてＨＡＴＵを使用し、その後トリフルオロ酢酸で処理して、メトトレキサート−γ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを
ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−ＯＨ（ＥＭＣ＝６−マレインイミドカプロン酸）と縮合させる（実施例１を参照されたい）。
【００４２】
本発明のタンパク質結合メトトレキサート誘導体は、非経口、好ましくは静脈内投与してもよい。この目的のために、本発明のＭＴＸ誘導体は、必要に応じて一般的な薬学的に許容される補助剤（例えば担体、希釈剤又は溶媒）を使用して、溶液、固体又は凍結乾燥体（lyophilisate）として提供される。このような補助剤の例は、ポリソルベート、グルコース、ラクトース、マンニトール、デキストラン、クエン酸、トロメタモール（tromethamol）、トリエタノールアミン、アミノ酢酸若しくは合成ポリマー、又はそれらの混合物である。好ましくは、本発明のＭＴＸ誘導体は、等張緩衝液中に溶解して投与される。ＭＴＸ誘導体の溶解度は、薬学的に許容される溶媒（例えば１，２−プロパンジオール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、若しくは分子量が２００ｇ／ｍｏｌ〜６００ｇ／ｍｏｌのポリ（エチレングリコール）、又はそれらの混合物、好ましくは分子量が６００ｇ／ｍｏｌのポリ（エチレングリコール））、或いは溶解度調節剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ若しくはポリビニルピロリドン、又はそれらの混合物）によって必要に応じて改善されてもよい。
【００４３】
本発明のＭＴＸ誘導体の本質的な性質は、タンパク質結合基を介した血清タンパク質との迅速な共有結合であり、それにより高分子輸送形態の活性物質が生成される。血清タンパク質（例えばトランスフェリン、アルブミン及びＬＤＬ）は、腫瘍組織における取り込み及びリウマチ組織における集積を増大させることが知られており（Kratz F., Beyer U., Drug Delivery 1998, 5, 281-299; Adams, B. K., Al Attia, H. M. et al., Nuclear Med. Commun. 2001, 22, 315-318; Sahin, M., Bernay, I. et al., Ann. Nuclear Med. 1999, 13, 389-395; Liberatore, M., Clemente, M. et al., J. Nuclear Med. 1992, 19, 853-857）、本発明の範囲内で、細胞増殖抑制剤用の内因性担体として使用してもよい。特に好ましい血清タンパク質は、循環ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。このＨＳＡは、３０ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの平均濃度でヒト血液の主成分を構成し（Peters T., Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161-245）、タンパク質表面上に遊離システイン基（システイン−３４基）を示す。このＨＳＡは、マレインイミド又はジスルフィドのようなチオール結合基との結合に適するものである（国際公開第００／７６５５１号）。本発明のマレインイミド官能化ＭＴＸ誘導体がＨＳＡに迅速且つ選択的に結合したことは、実施例２で示される。新規のＭＴＸ誘導体と血清タンパク質との反応は、例えば注入のために準備された量のアルブミン、血液又は血清を用いて体外で行ってもよい。
【００４４】
担体システムとして合成ポリマーを有するメトトレキサート複合体と比較して、本発明のＭＴＸペプチド誘導体は、化学的に明確に規定される付加的利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ヒト血漿、ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（３）、及び３７℃でヒト血漿と２分間インキュベートした後のＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（３）のクロマトグラフィを示す図である（λ＝３００ｎｍで検出）。
【図２】３７℃でヒト血漿と２分間インキュベートした後、及びＥＭＣ（１０００μＭ）と３０分間プレインキュベートしたヒト血漿と５分間インキュベートした後のＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（Ｃ１６２）（２００μＭ）のクロマトグラフィを示す図である。
【図３】ヒトプラスミンと４時間インキュベートした後のＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨのＨＳＡ複合体のクロマトグラフィを示す図である（λ＝３７０ｎｍで検出）。
【図４】ヒトプラスミンと０時間、１時間、４時間及び２０時間インキュベートした後、並びに緩衝液中で２４時間後のＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（３）のＨＳＡ複合体のクロマトグラフィを示す図である（λ＝３００ｎｍで検出）。
【図５】カテプシンＢと４時間インキュベートした後のＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨのＨＳＡ複合体のクロマトグラフィを示す図である（λ＝３７０ｎｍで検出）。
【図６】カテプシンＢと０時間、１時間、４時間及び２４時間インキュベートした後、並びに緩衝液中で２４時間後のＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（３）のＨＳＡ複合体のクロマトグラフィを示す図である（λ＝３００ｎｍで検出）。
【図７】ＯＶＣＡＲ−３腫瘍ホモジネートと４時間インキュベートした後のＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨのＨＳＡ複合体のクロマトグラフィを示す図である（λ＝３７０ｎｍで検出）。
【図８】ＲＡを患う患者の滑液と４時間インキュベートした後のＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（Ｃ１６２）のＨＳＡ複合体のクロマトグラフィを示す図である（λ＝３７０ｎｍで検出）。
【図９】ＯＶＣＡＲ−３モデルにおける腫瘍増殖の経過を示すグラフ図である。
【図１０】コラーゲン誘導性の関節炎モデルにおけるＲＡスコアの経過を示すグラフ図である。
【図１１】早期治療プロトコルによるコラーゲン誘導性の関節炎モデルにおける関節炎発症の経過を示すグラフ図である（免疫付与の１４日後を治療の開始とする）。
【図１２】早期治療プロトコルによるコラーゲン誘導性の関節炎モデルにおける関節炎スコアの経過を示すグラフ図である（免疫付与の１４日後を治療の開始とする）。
【図１３】晩期治療プロトコルによるコラーゲン誘導性の関節炎モデルにおける関節炎スコアの経過を示すグラフ図である（免疫付与の４２日後を治療の開始とする）。
【図１４】中期治療プロトコルによるコラーゲン誘導性の関節炎モデルにおける関節炎スコアの経過を示すグラフ図である（免疫付与の３０日後を治療の開始とする）。
【図１５】コラーゲン誘導性の関節炎モデルにおけるサイトカイン、ケモカイン及び酵素濃度の測定結果を示す図である。
【００４６】
以下の実施例は、本発明を限定することなくより詳細に説明する。
[実施例]
【実施例１】
【００４７】
ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの調製
ＤＩＥＡ（２７．２μＬ、１５９μｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１３．２９ｍｇ、３４．９６μｍｏｌ）を連続して、メトトレキサート−α−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＭＴＸ−α−ＯｔＢｕ）（１７．８５ｍｇ、３４．９６μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ  １５０μＬ溶液に添加する。超音波浴で２分間処理した後、反応混合物をＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ−ＯＨ（３１．７８μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ  １．５ｍＬ溶液に添加し、室温で１時間撹拌する。その後、反応混合物をジエチルエーテル１００ｍＬに添加し、遠心分離によって析出物を精製し、ジエチルエーテルで２回洗浄して、真空乾燥する。保護基を切断するために、粗生成物をジクロロメタン／ＴＦＡ（１：１）５ｍＬで１時間処理し、ジエチルエーテル１００ｍＬに添加し、遠心分離によって析出物を精製し、ジエチルエーテルで２回洗浄して、真空乾燥する。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８逆相、ＭｅＣＮ／水  ３０：７０、０．１％ＴＦＡ）及び凍結乾燥の後、ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨを淡黄色の固体物質として得る。
ＥＳＩ−ＭＳ（４．０ｋＶ、ＭｅＣＮ）：ｍ／ｚ（％）１１２２．３（［Ｍ＋Ｈ］＋、１００）、１１４４．４（［Ｍ＋Ｎａ］＋、７３）
【実施例２】
【００４８】
ヒト血漿におけるＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨとＨＳＡとの結合
３７℃で２分間、ヒト血漿サンプルをＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（２００μＭ）とインキュベートし、その後勾配溶離（流速：１．２ｍＬ／分、溶離液Ａ：３０％  ２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）、７０％  アセトニトリル；溶離液Ｂ：８５％  ２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）、１５％  アセトニトリル；勾配：２０分  無勾配の溶離液Ｂ、２５分  ０％〜１００％  直線的な溶離液Ａ、５分  無勾配の溶離液Ａ）によってＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（プレカラムフィルタを備えるＳｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）３００−５  ４．６×２５０ｍｍ（Waters））でクロマトグラフィを用いて分析する。ＭＴＸ誘導体で特徴的な波長３００ｎｍでの検出によって、プロドラッグピークのほぼ完全な低減、及びアルブミンの保持時間（ｔ＝約３２分）での吸収の増大が示される（図１を参照されたい）。
【００４９】
また、２４時間後のさらなる分析によって、対応するピーク面積に基づき、ＭＴＸの損失が１０％未満であることが示される。
【実施例３】
【００５０】
ヒト血漿におけるＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（Ｃ１６２）とＨＳＡとの結合
３７℃で２分間、ヒト血漿サンプルをＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（２００μＭ）とインキュベートし、その後勾配溶離（流速：１．２ｍＬ／分、溶離液Ａ：３０％  ２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）、７０％  アセトニトリル；溶離液Ｂ：８５％  ２０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）、１５％  アセトニトリル；勾配：２０分  無勾配の溶離液Ｂ、２５分  ０％〜１００％  直線的な溶離液Ａ、５分  無勾配の溶離液Ａ）によってＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（プレカラムフィルタを備えるＳｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）３００−５  ４．６×２５０ｎｍ（Waters））でクロマトグラフィを用いて分析する。ＭＴＸ誘導体で特徴的な波長３７０ｎｍでの検出によって、プロドラッグピークのほぼ完全な低減、及びアルブミンの保持時間（ｔ＝４０分）での吸収の増大が示される（図２を参照されたい）。
【００５１】
前もって５分間ＥＭＣ（１０００μＭ）とインキュベートしたヒト血漿による反復試験（結果として、アルブミンのシステイン−３４基がブロッキングされる）は、その後のＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨとのインキュベート中にプロドラッグとアルブミンとの結合を示さない。クロマトグラフィでは、遊離プロドラッグだけを３７０ｎｍで検出することができる。
【実施例４】
【００５２】
カテプシンＢ及びプラスミンによるＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨからのアルブミン複合体の酵素切断
アルブミン複合体の調製：ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ  ４．００ｍｇを室温で５％ＨＳＡ溶液（Octopharm）８ｍＬ中に溶解し、３７℃で２時間振盪する。続いて、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）使い捨て濃縮器（disposable concentrators）を使用した濃縮によって、サンプルを７００μＭの濃度にする。
【００５３】
プラスミンによる切断：これより、アルブミン複合体溶液１００μＬを緩衝液（４ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４））５００μＬで希釈し、ヒト血漿プラスミン（３７０ｍＵ）２０μＬを添加し、混合物を３７℃でインキュベートする。実施例２に示されたＨＰＬＣ法で切断生成物の測定を行う（図３及び図４）。
【００５４】
カテプシンＢによる切断：これより、アルブミン複合体の溶液１８０μＬを緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ＊２  Ｎａ、８ｍＭのＬ−システイン（ｐＨ５．０））２７０μＬで希釈し、ヒトカテプシンＢ（２．１Ｕ）９０μＬを添加し、３７℃でインキュベートする。実施例２に示されたＨＰＬＣ法で切断生成物の測定を行う（図５及び図６）。
【００５５】
結果：酵素とのインキュベートの１時間後及び４時間後それぞれ、約４分での切断生成物としてのＨ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの形成を両方の場合で観察することができる。さらに、時間が経過するにつれて、アルブミン複合体の濃度が低減し、切断生成物の濃度が増大することが明らかである。したがって、切断生成物は、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ結合のタンパク質分解切断によって生じる。
【実施例５】
【００５６】
ヒト卵巣移植片（ＯＶＣＡＲ−３）のホモジネートにおけるＨＳＡ−ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの切断
腫瘍ホモジネートの調製：腫瘍材料を外科用メスで細片にし、その塊２００ｍｇを、３〜４個のガラスビーズを加えた緩衝液（トリス緩衝液（ｐＨ７．４））８００μＬで、振盪器において均質化する。続いて、４℃で遠心分離を行い、上清を２００μＬに等分する。
【００５７】
これより、実施例４に示されたアルブミン複合体ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの溶液１００μＬをホモジネート溶液（緩衝液で１：２に希釈したホモジネート溶液（４ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）））５００μＬで希釈し、３７℃でインキュベートする。実施例２に示されたＨＰＬＣ法で切断生成物の測定を行う（図７）。
【００５８】
結果：ＯＶＣＡＲ−３腫瘍ホモジネートとのインキュベートの４時間後、切断生成物としてのＨ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの形成を観察することができる。
【実施例６】
【００５９】
ＲＡを患う患者の滑液におけるＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（Ｃ１６２）の切断
アルブミン複合体の調製：ＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ  ４．００ｍｇを室温で５％  ＨＳＡ溶液（Octopharm）８ｍＬ中で溶解し、３７℃で２時間振盪する。続いて、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）使い捨て濃縮器を使用した濃縮によって、サンプルを７００μＭの濃度にする。
【００６０】
これより、ＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨのアルブミン複合体溶液７０μＬを滑液（蒸留水で１：１に希釈した関節リウマチを患う６人の患者の滑液）１４０μＬで希釈し、３７℃でインキュベートする。実施例２に示されたＨＰＬＣ法で切断生成物の測定を行う（図８）。
【００６１】
結果：関節リウマチを患う患者の滑液とのインキュベートの４時間後、切断生成物としてのＨ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの形成を観察することができる。
【実施例７】
【００６２】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ及びＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの有効性（腫瘍阻害特性）
下記及び図９で列挙された生物学的データは、遊離メトトレキサートと比較して、ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（ＡＷ０５４−ＥＭＣ）及びＥＭＣ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（Ｃ１７５）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の増大を示す。
動物：ヌードマウスＮＭＲＩ、腫瘍モデル：ＯＶＣＡＲ−３（皮下増殖する卵巣癌）
治療：７日、１４日、２１日、２８日の静脈注射（１０ｍＭのリン酸ナトリウム／５％  Ｄ−グルコース緩衝液（ｐＨ６．４））、用量はメトトレキサート当量に関連する。
【００６３】
【表２】
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【実施例８】
【００６４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨの有効性（抗リウマチ特性）
下記及び図１０で列挙された生物学的データは、遊離メトトレキサートと比較して、ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（ＡＷ０５４−ＥＭＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の増大を示す。
動物：マウス（ｍ、ＤＢＡ／１；モデル：コラーゲン誘導性関節炎モデル）
治療：３０日、３４日、３７日、４１日、４４日、４８日の静脈注射（１０ｍＭのリン酸ナトリウム／５％  Ｄ−グルコース緩衝液（ｐＨ６．４））、用量はメトトレキサート当量に関連する。
【００６５】
【表３】
2009544638.tif 000012
【００６６】
下記、図１１〜図１５、及び表１で列挙された生物学的データも、遊離メトトレキサートと比較して、ＥＭＣ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨ（ＡＷ０５４−ＥＭＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の増大を示す。
動物：マウス（ｍ、ＤＢＡ／１；モデル：コラーゲン誘導性関節炎モデル）
治療：１４日、４２日、及び３０日それぞれの１週間に２回の静脈注射（１０ｍＭのリン酸ナトリウム／５％  Ｄ−グルコース緩衝液（ｐＨ６．４））、用量はメトトレキサート当量に関連する。物質及び用量は、図１１〜図１５に示す。
【００６７】
６日の治療後の血清中のタンパク質濃度の測定は、製造業者のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡ（R&D Systems（Wiesbaden Germany）から市販されている）を用いて行う。
【００６８】
以下の表１は、早期治療プロトコルにおけるＮａＣｌ対照と比較して、ＭＴＸ又は様々な用量のＡＷ０５４による治療に対する反応を示す。ＡＷ０５４による治療によって、試験の終了時に関節炎の発症率が低減し、平均関節炎スコアが減少し、関節炎の最初の発症までの時間が延長され、改善を誘導するか、又はさらには関節炎の進行が軽減される。
【００６９】
【表４】
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【００７０】
実施例から、ヒト血漿とのインキュベート後、実質的に２分後には既に対応するアルブミン複合体が形成されることが明らかになる。複合体は十分な血漿安定性を示し、ヒトプラスミン及びカテプシンＢの両方の存在下で効果的な切断を観察することができる。切断によって、例えば低分子の切断生成物のみを構成するＨ−Ｌｙｓ（γ−ＭＴＸ）−ＯＨが形成される。しかし、その後この切断生成物は、これ以上ＭＴＸ及びリシンには切断されず、ｉｎ  ｖｉｖｏ対応試験によって、本発明のＭＴＸ−リシン誘導体自体の活性が高いことが示唆される。メトトレキサートと比較して、本発明のＭＴＸ−リシン誘導体は、かなり低い用量で効率の増大を示す。コラーゲン誘導性関節炎モデルの場合、この用量は、対応するメトトレキサート等価用量の約２０％である。また、誘導体は長期間活性があり、例えばＳＤＦ−１、ＯＰＧ及びＩＬ−１０の血清濃度が有意に低減する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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