(57)【要約】  使用が容易で、信頼性の高い結果が一貫して得られ、検出方法の一環として色の変化を必要としないバイオセンサを提供する。本発明にかかるバイオセンサは、生化学検体を含む基質と、酵素系と、低分子グリコールエーテルと、検出手段とを備える。このうち、前記生化学検体は低密度リポタンパク質である。また、前記酵素系は、コレステロールエステラーゼ、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素等のコレステロール酵素を含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学検体を含む基質と、
酵素系と、
低分子グリコールエーテルと、
検出手段と、
を備えることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記基質は血液、血清または血漿等の生体液であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記生体液から判定される生化学検体はリポタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記リポタンパク質は低密度リポタンパク質であることを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記酵素系は、コレステロールエステラーゼ、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素等のコレステロール酵素を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記低分子グリコールエーテルは、１−４繰り返し直鎖または分岐アルキレン基を有する基から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記アルキレン基は、エチレン、プロピレンおよびその異性体、ブチレンおよびその異性体、ペンチレンおよびその異性体、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項６に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記グリコールエーテルは、１以上のアルコキシ基によって随意に置換されたアルキル基によって置換されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記アルキル基はＣ１−Ｃ５アルキルであることを特徴とする請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記アルキレン基またはアルキル基は、１−４アルコキシ基によって置換されることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記１−４アルコキシ基は１−４エトキシ基であることを特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記低分子グリコールエーテルは、２−メトキシエタノール、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールプロピルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジエチレングリコールペンチルエーテル、１−メトキシ−２−プロパノール、ジプロピレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールブチルエーテル、グリセロールエトキシレート−ｃｏ−プロポキシレートトリオール、ネオペンチルグリコールエトキシレート、プロポキシエタノール、トリエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールプロピルエーテル、１−ｔ−ブトキシ−２−プロパノール、ジプロピレングリコールプロピルエーテル、トリプロピレングリコールプロピルエーテルまたはジプロピレングリコール−t−ブチルエーテルであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
水性緩衝液をさらに備えることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記緩衝液は通常、アルカリ性であることを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
溶液のイオン強度が低密度リポタンパク質に対する選択性が向上するように増加することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記溶液のイオン強度は、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ヘキサミンルテニウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ランタン、硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウムからなる群から選択された塩を加えることにより増加することを特徴とする請求項１５に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記検出手段は電気化学セルであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
試料中の生化学検体の量を測定する検出方式であって、
ａ）低分子グリコールエーテルと混合酵素の混合溶液を用意する工程と、
ｂ）検査対象の試料溶液を加える工程と、
ｃ）結果として測定可能信号への変化となる状況下で、結果として得られた混合物を培養する工程と、
ｄ）結果として生じた変化を測定する工程と、
ｅ）較正曲線を用いて元の試料中のＨＤＬとＬＤＬとの間を識別するか、または検体の量を確認する工程を含むことを特徴とする検出方式。
【請求項１９】
前記検体は低密度リポタンパク質であることを特徴とする請求項１８に記載の検出方式。
【請求項２０】
前記測定可能信号は、電気化学信号、比色信号、温度信号、圧電信号、またはスペクトル信号であることを特徴とする請求項１８または１９に記載の検出方式。
【請求項２１】
前記低分子グリコールエーテルは請求項６〜１２のいずれか１項に定義される低分子グリコールエーテルであることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の検出方式。
【請求項２２】
前記生物学的検体および試薬を使用前に乾燥することを特徴とする請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の検出方式。
【請求項２３】
生物学的検体の可溶化に低分子グリコールエーテルを使用することを特徴とする低分子グリコールエーテルの使用。
【請求項２４】
前記低分子グリコールエーテルは請求項６〜１２のいずれか１項に定義される低分子グリコールエーテルであることを特徴とする請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記グリコールエーテルは、低密度リポタンパク質コレステロール等のリポタンパク質の可溶化に用いられることを特徴とする請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項２６】
低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、およびグリコールエーテルを含む溶液のイオン強度増加に塩を使用し、前記溶液のイオン強度増加が低密度リポタンパク質および高密度リポタンパク質の相対的溶解性を調節することを特徴とする塩の使用。
【請求項２７】
前記イオン強度増加は高密度リポタンパク質に対して低密度リポタンパク質の溶解性を向上させることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記塩は、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ヘキサミンルテニウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ランタン、硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウムからなる群から選択されることを特徴とする請求項２６または２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記塩の濃度は０．１Ｍ〜１Ｍの範囲にあることを特徴とする請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記溶液のイオン強度は０．５Ｍから１．５Ｍの範囲にあることを特徴とする請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコールエーテルを用いたセンサに関し、特に、高密度リポタンパク質コレステロールとの最小限の相互作用で低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）を選択的に可溶化してＬＤＬの検出を可能とするグリコールエーテルを用いたバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは通常の身体機能において重要な役割を果たす。コレステロールは、細胞組織の発達、細胞膜、ホルモンの再生に関与し、また、その他の機能を果たす。しかし、血中コレステロール値が高い状態では冠状動脈性心疾患の危険性が増し、心臓発作を引き起こす恐れがある。さらに、高血中コレステロール値は脳卒中発症リスクの増加に関連していることも知られている。血中コレステロール値が高い患者は高コレステロール血症を患っていると考えられる。
【０００３】
体内のコレステロールには２つの主要供給源がある。つまり、体内で合成されるコレステロールと、肉、家禽、魚、乳製品等の食事由来のコレステロールとがある。飽和脂肪の多い食事は体内でのコレステロール生成を促進する。
【０００４】
コレステロールはリポタンパク質として知られる特別な運搬体によって細胞組織へまたは細胞組織から運ばれる。これは、コレステロールが血液に溶けないためである。リポタンパク質には大きく分けて低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の２種類がある。ＬＤＬが運ぶコレステロールは悪玉コレステロールと呼ばれ、一方、ＨＤＬが運ぶコレステロールは善玉コレステロールと呼ばれる。ＬＤＬコレステロールは動脈の内壁に付着しやすく、結果として血小板が凝集し動脈血栓が形成され、心臓発作または脳卒中のリスクが上昇する。血中ＬＤＬコレステロール値は約１００ｍｇ／ｄｌが望ましく、それを超える（１６０ｍｇ／ｄｌを超える）場合、心疾患のリスクが増大する。
【０００５】
ＨＤＬコレステロールはそうした心疾患リスク増大から人体を保護するとされている。ＨＤＬは動脈からコレステロールを回収し、肝臓へ戻すと考えられている。また、ＨＤＬは動脈内にすでに凝集した血小板から余分なコレステロールを取り除くとも言われている。
【０００６】
そのため、血液中のＬＤＬコレステロール量とＨＤＬコレステロール量を識別するセンサの開発に多大な努力が注がれてきた。
【０００７】
従来、低密度リポタンパク質中のコレステロール量は超遠心分離法を用いて決定されてきた。しかし、この方法は特別な器具を必要とし、必要な測定値を得るために時間がかかる。
【０００８】
近年、より簡単な操作で信頼性の高い測定結果が得られるセンサが開発されている。そのようなセンサは一般的にバイオセンサとして知られている。
【０００９】
バイオセンサは、生化学的認識要素または検出要素と物理的変換器を組み合わせた解析ツールである。バイオセンサは、個人健康管理、環境スクリーニングならびにモニタリング、バイオプロセスモニタリング等の多様な分野、および飲食料品業界で広く利用されている。
【００１０】
生物学的感知要素としては、酵素、抗体、ＤＮＡ配列、または微生物をも用いることができる。生化学的要素は、選択的に反応または結合を促進する。生化学的認識における選択性は、複素試料マトリクス内、すなわち体液内でのバイオセンサの動作を可能にする。変換器は、生化学的事象を測定可能信号に変換しこれによってその検出を可能としている。測定可能事象は酵素反応生成物／酵素反応基質の生成または消費によるスペクトル変化から生化学的錯体形成における質量変化に及ぶ。一般的に変換器はさまざまな形態をとり、測定対象となる物理化学パラメータを決定する。変換器は、光吸収、蛍光性、または屈折率等の変化を測定する光学変換器であっても良いし、生物学的に誘導された結合反応に付随する質量の変化を測定する質量変換器であっても良い。また、変換器は、検体／生物学的認識層相互作用に伴うインピーダンス変換器（電気特性の変化を測定）または熱変換器（エンタルピー（熱）の変化を測定）であっても良いし、電気化学変換器であっても良い。
【００１１】
バイオセンサは分散計測の利便性および簡易性、すなわち、関心部位または治療部位に対する分析評価を得る潜在能力を提供する。適切に設計され製造されれば、バイオセンサ装置は大量生産も可能である。しかし、バイオセンサの使用にはいくつかの制限がある。一例としては、汚れや衝突に対する変換器の脆弱性が挙げられる。
【００１２】
酵素バイオセンサは、臨床的、環境的、農業的、および生物工学的用途において検体の検出に広く用いられている。人体体液の臨床分析において測定可能な検体としては、例えば、グルコース、乳酸塩、コレステロール、ビリルビン、アミノ酸がある。血液等の生体液中の検体のレベルは疾病の診断およびモニタリングに重要である。
【００１３】
一般的に酵素系で使用されるセンサは、治療部位または市販の装置に備えられる。センサを用いて指先から採取した新鮮な未処理血液試料を検査して、試料を装置に加えてから例えば１〜２分以内に（時間は固定ではなく大幅な変更もあり得る）総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬおよびＬＤＬの濃度を判断することができる。これら４つのパラメータの組み合わせは、成人の心疾患の危険性を効果的に示唆することが臨床的に証明されている。例えば、良く知られているように高コレステロールは無症状であるため、すべての成人が自身のリスクを検査することが推奨される。リスクが高いことが分かれば、食事制限のみ、または治療薬剤との組み合わせによって、そのリスクを大きく軽減することができる。
【００１４】
そうした酵素バイオセンサの中には、当該検体を検出するために電気化学的分析を用いるものがある。判定される検体と反応した酵素と相互作用するメディエータ（媒介物質）の酸化状態の変化を利用する。メディエータの酸化状態は、基質投入時に酵素と相互作用する状態のみになるように選択される。検体は酵素を介してメディエータと反応する。これにより、メディエータが酸化または還元し（酵素反応による）、このメディエータのレベルの変化は、所定の電位に生成された電流例の電気化学信号を判定することにより測定できる。
【００１５】
一般的に作用微小電極および参照電極を備えた従来の微小電極を使用しても良い。作用電極は一般的に、パラジウム、白金、金、または炭素からなる。対向電極は通常、炭素、Ａｇ/ＡｇＣｌ、Ａｇ/Ａｇ２ＳＯ４、パラジウム、金、白金、Ｃｕ/ＣｕＳＯ４、Ｈｇ/ＨｇＯ、Ｈｇ/ＨｇＣｌ２、Ｈｇ/ＨｇＳＯ４またはＺｎ/ＺｎＳＯ４からなる。
【００１６】
作用電極は前記微小電極を形成するソケットの内部にあっても良い。特許文献１は使用可能な微小電極の例を開示しており、その全内容が参照によって本明細書に編入される。
【００１７】
この従来技術は、血液、血清、血漿等の試料中のＬＤＬコレステロールを検出する方法をいくつか教示している。コレステロール濃度を決定する従来の方法の多くは、色の変化等各種特性の評価に基づいている。
【００１８】
特許文献２〜４はポリエチレングリコールエーテルを用いたバイオセンサを開示している。特許文献５は低密度リポタンパク質中のコレステロールの判定方法を開示している。この方法は、試料中の総コレステロール値および非ＬＤＬ成分（ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびカイロミクロン）中のコレステロール値の測定に基づいている。この方法によれば、一方の量からもう一方を引くだけでＬＤＬコレステロール量を算出できる。特許文献６および７は電気化学セルを用いたＬＤＬ検出方式を開示している。
【００１９】
【特許文献１】国際公開第０３/０９７８６０号パンフレット
【特許文献２】欧州特許第１４３４０５４号明細書
【特許文献３】国際公開第０３/１０２５９６号明細書
【特許文献４】特開２００４−３５４２８４号
【特許文献５】米国特許第６７６２０６２号明細書
【特許文献６】米国特許第６３４２３６４号明細書
【特許文献７】特開２００１−３４３３４８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、使用が容易で、信頼性の高い結果が一貫して得られ、検出方法の一環として色の変化を必要としない検出方式は有用であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、バイオセンサは、生化学検体を含む基質と、酵素系と、低分子グリコールエーテルと、検出手段とを備えるバイオセンサを提供する。
【００２２】
概して、前記基質は血液または血漿等の生体液であり、前記生体液から判定される生化学検体はリポタンパク質であっても良く、通常、低密度リポタンパク質である。
【００２３】
前記酵素系は、コレステロールエステラーゼ、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素等のコレステロール酵素を含んでも良い。
【００２４】
前記低分子グリコールエーテルは、１−４繰り返し直鎖または分岐アルキレングリコール基を有する基から選択されても良い。通常、前記アルキレン基は、エチレン、プロピレンおよびその異性体、ブチレンおよびその異性体、ペンチレンおよびその異性体、またはその組み合わせである。グリコールエーテルはＣ１−Ｃ５アルキル等のアルキル基によって置換されても良い。前記低分子グリコールエーテルは、２−メトキシエタノール（2-methoxyethanol）、トリプロピレングリコールメチルエーテル（tripropylene glycol methyl ether）、ジエチレングリコールプロピルエーテル（diethylene glycol propyl ether）、ジエチレングリコールブチルエーテル（diethylene glycol butyl ether）、ジエチレングリコールペンチルエーテル（diethylene glycol pentyl ether）、１−メトキシ−２−プロパノール（1-methoxy-2-propanol）、ジプロピレングリコールブチルエーテル（dipropylene glycol butyl ether）、トリプロピレングリコールブチルエーテル（tripropylene glycol butyl ether）、グリセロールエトキシレート−ｃｏ−プロポキシレートトリオール（glycerol ethoxylate-co-propoxylate triol）、ネオペンチルグリコールエトキシレート（neopentyl glycol ethoxylate）、プロポキシエタノール（propxyethanol）、トリエチレングリコールメチルエーテル（triethylene glycol methyl ether）、プロピレングリコールプロピルエーテル（propylene glycol propyl ether）、１−ｔ−ブトキシ−２−プロパノール（1-tert-butoxy-2-propanol）、ジプロピレングリコールプロピルエーテル（dipropylene glycol propyl ether）、トリプロピレングリコールプロピルエーテル（tripropylene glycol propyl ether）またはジプロピレングリコール−t−ブチルエーテル（dipropylene glycol tert-butyl ether）から選択されても良い。
【００２５】
バイオセンサはさらに水性緩衝液を備えていても良い。緩衝液の水素イオン濃度（ｐＨ）は通常５から１０であり、特に好ましくは７から１０である。
【００２６】
バイオセンサの溶液のイオン強度または塩強度は、低密度リポタンパク質に対する選択性が向上するように増加しても良い。イオン強度は、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ヘキサミンルテニウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ランタン、硫酸ナトリウムおよび硫酸マグネシウムからなる群から選択された塩を加えることにより増加しても良い。
【００２７】
前記検出手段は電気化学セルであっても良い。
【００２８】
本発明の第２の態様によれば、試料中の生化学検体の量を測定する検出方式は、
ａ）低分子グリコールエーテルと酵素混合物との混合溶液を用意する工程と、
ｂ）検査対象の試料溶液を加える工程と、
ｃ）結果として測定可能信号に変化する状況下で、結果として得られた混合物を培養する工程と、
ｄ）結果として生じた変化を測定する工程と、
ｅ）較正曲線を用いて元の試料中のＨＤＬとＬＤＬとを識別する、または検体の量を確認する工程を備えることを特徴とする。
【００２９】
前記検体は低密度リポタンパク質であっても良い。
【００３０】
前記測定可能信号は、通常、電気化学信号、比色信号、温度信号、圧電信号、またはスペクトル信号である。
【００３１】
生物学的検体および試薬は使用前に乾燥しても良い。検体および試薬は凍結乾燥しても良い。
【００３２】
本発明の第３の態様によれば、生物学的検体の可溶化に低分子グリコールエーテルを用いることを特徴とする。
【００３３】
前記低分子グリコールエーテルは、１−４繰り返し直鎖または分岐アルキレングリコール基を有する基から選択されても良い。通常、前記アルキレン基は、エチレン、プロピレンおよびその異性体、ブチレンおよびその異性体、ペンチレンおよびその異性体、またはその組み合わせである。グリコールエーテルはＣ１−Ｃ５アルキル等のアルキル基によって置換されても良い。前記低分子グリコールエーテルは、２−メトキシエタノール、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールプロピルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジエチレングリコールペンチルエーテル、１−メトキシ−２−プロパノール、ジプロピレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールブチルエーテル、グリセロールエトキシレート−ｃｏ−プロポキシレートトリオール、ネオペンチルグリコールエトキシレート、プロポキシエタノール、トリエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールプロピルエーテル、１−ｔ−ブトキシ−２−プロパノール、ジプロピレングリコールプロピルエーテル、トリプロピレングリコールプロピルエーテルまたはジプロピレングリコール−t−ブチルエーテルから選択されても良い。
【００３４】
低密度リポタンパク質コレステロール等のリポタンパク質の可溶化にグリコールエーテルを用いても良い。
【００３５】
本発明の第４の態様によれば、溶液のイオン強度がＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールの識別に関与することを特徴とする。液体のイオン強度または塩濃度の変化は、前記２つのコレステロールに対する相対的反応度に影響を及ぼすことが知られている。したがって、低密度リポタンパク質および高密度リポタンパク質の相対的溶解性の増分を調節することによって、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、およびグリコールエーテルを含む溶液のイオン強度または塩濃度を高めるための塩の使用を提供する。
【００３６】
イオン強度または塩濃度を高めるための塩の使用によって、概して、高密度リポタンパク質に対して低密度リポタンパク質の溶解性を向上させる。
【００３７】
溶液のイオン強度または塩濃度は塩を加えることにより調整できる。例えば、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、または塩化ヘキサミンルテニウムが、溶液のイオン強度または塩濃度を変更するために用いられていた。しかし、その他の塩、例えば、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ヘキサミンルテニウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ランタン、硫酸ナトリウムまたは硫酸マグネシウムを用いても良い。
【００３８】
ここで使用する用語の定義は以下の通りとする。
【００３９】
「グリコール」は二価アルコールを示す。「グリコールエーテル」は二価アルコールまたは三価アルコールのモノアルキルエーテルを示す。
【００４０】
「アルキル」は、直鎖または分岐飽和脂肪族炭化水素を含む。アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。特に明記しない限り、「アルキル」はアルキル基およびシクロアルキル基の両者を含む。
【００４１】
「生体液」は検体を測定することのできる任意の体液または体液派生物である。例としては、血液、尿、間質液、血漿、皮膚液、汗、涙等が挙げられる。
【００４２】
「電気化学センサ」は、電気化学的酸化または還元反応によって、試料中の検体の存在を検出する、または検体の濃度もしくは量を測定するように構成された装置である。
【００４３】
「酸化還元メディエータ」は、検体または検体還元酵素もしくは検体酸化酵素、共同因子、その他の酸化還元活性種と電極の間で電子を運ぶ電子移動物質である。「酸化還元メディエータ」は、直接または１以上の付加的な電子移動物質を介して電子を運ぶ。
【００４４】
「参照電極」は、特に明記しない限り、ａ）参照電極およびｂ）対向電極として兼用できる参照電極（すなわち、対向／参照電極）を含む。
【００４５】
「対向電極」は、特に明記しない限り、ａ）対向電極およびｂ）参照電極として兼用できる対向電極（すなわち、対向／参照電極）を含む。
【００４６】
「測定可能信号」は、電流、電極電位、蛍光性、吸収分光、発光、光散乱、ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、熱変化、または圧電変化等を容易に測定できる信号を示す。
【００４７】
「生化学検体」は、生体液中に存在するであろういかなる測定可能な化学物質または生化学物質を含み、また、酵素、抗体、ＤＮＡ配列、または微生物のいずれをも含む。
【００４８】
本発明において使用可能な周知のバイオセンサは、例えば、それぞれが管状マイクロバンド電極等のマイクロバンド作用電極を持つ４つの試薬ウェルを有するストリップと、共通の参照片とからなっていても良い。ストリップの検出要素は、異なる特別に処方された試薬を乾燥することにより得ることができる。試薬は、少なくとも各ウェル内の検査試料中の特定の検体と相互作用するメディエータおよび酵素からなる。異なる試薬を各ウェルに加えて乾燥することができるため、複数の検体の検査を単一の検査試料によって達成できることは明らかである。ウェルの数は変更できるため、特定の検査の数も変更できる。例えば、１から６のウェルを有するセンサを使用しても良い。
【００４９】
通常、作用微小電極および参照電極を備えた従来の微小電極を使用しても良い。作用電極は一般的に、パラジウム、白金、金、または炭素からなる。対向電極は通常、炭素、Ａｇ／ＡｇＣｌ、Ａｇ／Ａｇ２ＳＯ４、パラジウム、金、白金、Ｃｕ／ＣｕＳＯ４、Ｈｇ／ＨｇＯ、Ｈｇ／ＨｇＣｌ２、Ｈｇ／ＨｇＳＯ４またはＺｎ／ＺｎＳＯ４からなる。
【００５０】
好ましい微小電極においては、作用電極は前記微小電極を形成するソケットの内部にある。特許文献１は本発明で使用可能な微小電極の例を開示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、添付図面を参照して本発明の好適な実施形態の例を説明する。
【００５２】
実施例１
ＬＤＬ緩衝液＃１（トリス緩衝液：５％のグリシン、ｐＨ９．０）
Ｔｒｉｚｍａ  Ｐｒｅ-Ｓｅｔ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ−１４４４）ｐＨ９．０を９５０ｍｌのｄＨ２Ｏ（ｄＨ２Ｏ＝脱イオン水）に溶解し、水素イオン濃度（ｐＨ)を記録した。次に、５０ｇのグリシン（Ｓｉｇｍａ社、Ｇ-７４０３）をトリス溶液に加え、水素イオン濃度（ｐＨ)を記録した。水素イオン濃度（ｐＨ)を１０Ｍの水酸化カリウム（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ-５９５８）を用いて８．８〜９．２以内に調整して１０００ｍｌのｄＨ２Ｏ溶液を生成し、最終的に水素イオン濃度（ｐＨ９．１)を記録した。生成した溶液を４℃で保存した。
【００５３】
グリコールエーテル溶液
ＬＤＬ緩衝液＃１を用いて濃度が２倍のグリコールエーテル溶液を生成した。
ジエチレングリコールモノペンチルエーテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、３２２８５）
約２．５％（８７２μｌのＬＤＬ緩衝液＃１中０．０２１８ｇ）
ジエチレングリコールモノブチルエーテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、５３７６４０）
約１０％（６４０μｌのＬＤＬ緩衝液＃１中０．０６４ｇ）
【００５４】
Ｓｃｉｐａｃ ＬＤＬ、ＨＤＬ試料
脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｓ１３９）を用いて、ＬＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｐ２３２−８）およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｐ２３３−８）を必要濃度の１０倍の濃度で生成した（最終的な検査混合物で１：１０に希釈するため）。その後、試料をＳｐａｃｅ臨床分析機器（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ製）を用いて分析した。
【００５５】
酵素混合物
ＬＤＬ緩衝液＃１を用いて濃度が２倍の酵素混合物を生成した。
１６０ｍＭの塩化ヘキサミンルテニウム（ＩＩＩ）（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社、１０５１１）
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ社）
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）
６．７ｍｇ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ（Ｓｏｒａｃｈｉｍ／東洋紡社、ＣＯＥ−３１１）
４４．４ｍｇ／ｍｌのゼラチンフリーのコレステロール脱水素酵素（天野エンザイム株式会社、ＣＨＤＨ−６）
【００５６】
検査プロトコル
濃度が２倍の９μｌのグリコール溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。
Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（１０倍濃縮ＬＤＬまたはＨＤＬ、もしくは脱脂血清）を結果として得られたグリコールエーテル：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を電極上に滴下した。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで５つの時点（１０，３２，６３，９０，１１０秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料の検査は２回行った。
【００５７】
分析
Ｓｐａｃｅ臨床分析機器からの脱脂血清およびＬＤＬ、ＨＤＬ濃度とともにデータを分析した。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に、各時点におけるＬＤＬおよびＨＤＬに対する反応の勾配を用いた。
【００５８】
図１および図２は、ジエチレングリコールモノペンチルエーテルを用いて、ＨＤＬに対してＬＤＬを選択的に可溶化した場合の結果を示すグラフである。
【００５９】
図３および図４は、ジエチレングリコールモノブチルエーテルを用いて、ＨＤＬに対してＬＤＬを選択的に可溶化した場合の結果を示す表である。
【００６０】
結論
ジエチレングリコールモノブチルエーテル（５％）はＬＤＬに対する３５％以上の選択的識別性を示し、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル（１．２５％）もまたＬＤＬに対する選択的識別性を示したがその度合いは小さくなり２０％以上であった。
【００６１】
実施例２：コレステロールエステラーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）対リパーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）
【００６２】
溶液
ＲｕＡｃＡｃ＝［ＲｕIII（ａｃａｃ）２（ｐｙ−３−ＣＯＯＨ）（ｐｙ−３−ＣＯＯ）］
０．１ＭのＫＣＩ、ｐＨ９．０のトリス、５％のグリシンを含む緩衝液を用いて３０ｍＭのＲｕａｃａｃ溶液を生成した。
ジエチレングリコールブチルエーテル溶液：Ｒｕａｃａｃ溶液を用いて１０％グリコールエーテル溶液を生成した。
Ｒｕａｃａｃ溶液を用いて酵素混合物を生成した。
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素
６．７ｍｇ／ｍｌのコレステロールエステラーゼまたは６．７ｍｇ／ｍｌのリパーゼ
４４．４ｍｇ／ｍｌのゼラチンフリーのコレステロール脱水素酵素
脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｓ１３９）を用いて、ＬＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｐ２３２−８）およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｐ２３３−８）を生成した。その後、試料をＳｐａｃｅ臨床分析機器（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ製）を用いて分析した。
【００６３】
検査プロトコル
濃度が２倍の９μｌのグリコールエーテル溶液（またはグリコールエーテルを含まないＲｕａｃａｃ溶液）を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（ＬＤＬまたはＨＤＬ、もしくは脱脂血清）を結果として得られたグリコールエーテル：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を国際公開第２００３／０５６３１９号に記載されているような電極上に滴下した。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで７つの時点（０，２８，５６，８４，１１２，１４０，１６８秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料の検査は２回行った。
【００６４】
結果
Ｅ２Ｃ４はジエチレングリコールブチルエーテルである。
ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。その勾配を、図５に示す。
【００６５】
結論
５％のジエチレングリコールブチルエーテル存在下でコレステロールエステラーゼを用いた場合の方がＬＤＬに対する識別性が高かったが、コレステロールエステラーゼまたはリパーゼのどちらを用いても酵素混合物はＬＤＬ識別性を示した。
これらのデータは、リパーゼによる識別は、ジエチレングリコールブチルエーテルを加えることによりＨＤＬ識別からＬＤＬ識別に切り替わることを示唆している。
これは、ジエチレングリコールブチルエーテルがコレステロールエステル加水分解酵素という種類よりもＬＤＬ識別に強い影響を持つことを示している。
【００６６】
実施例３：ＬＤＬを選択的に可溶化するためのジエチレングリコールブチルエーテルの最適濃度の特定
ＨＤＬとの最小限の相互作用でＬＤＬを検出するために、ジエチレングリコールモノブチルエーテルを滴定しＬＤＬを選択的に可溶化するための最適濃度を滴定することを目的としてこの実験を行った。
【００６７】
溶液
ＲｕＡｃＡｃ溶液：０．１ＭのＫＣＩ、ｐＨ９．０のトリス、１０％のスクロースを含む緩衝液を用いて３０ｍＭのＲｕＡｃａｃ溶液を生成した。
上記のＲｕａｃａｃ溶液中に１２％、１０％、８％、６％、４％、２％のジエチレングリコールブチルエーテルを含むグリコールエーテル溶液を生成した。
酵素混合物（コレステロールエステラーゼを含む）、ＬＤＬ試料およびＨＤＬ試料を実施例２と同様の処方で生成した。
【００６８】
方法
実験および分析は実施例２で説明した方法と同様に行われた。図６にその結果を示す。
【００６９】
結論
ＬＤＬに対する反応の勾配はジエチレングリコールブチルエーテルの濃度の上昇に伴って増加した。結果として、ＬＤＬに対する識別性は６％のジエチレングリコールブチルエーテルで最も高かった。
【００７０】
実施例４：ＬＤＬを選択的に可溶化するためのジプロピレングリコールブチルエーテルの最適濃度の特定
ＨＤＬとの最小限の相互作用でＬＤＬを検出するために、ジプロピレングリコールブチルエーテルの濃度を変えてＬＤＬを選択的に可溶化するための最適濃度を特定することを目的としてこの実験を行った。
【００７１】
溶液
３０ｍＭのＲｕａｃａｃ緩衝液、酵素溶液（コレステロールエステラーゼを含む）、ＬＤＬ試料およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社）を実施例２と同様に用意した。
上記のＲｕａｃａｃ溶液中に３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％のジプロピレングリコールブチルエーテルを含むグリコールエーテル溶液を生成した。
【００７２】
方法
実験および分析は実施例２で説明した方法と同様に行われた。図７にその結果を示す。
【００７３】
結論
ＬＤＬに対する反応の勾配はジプロピレングリコールブチルエーテルの濃度の上昇に伴って増加し、結果としてＬＤＬに対する識別性が向上した。ＬＤＬに対する識別性は１．５％および１．７５％のジプロピレングリコールブチルエーテルで最も高かった。
【００７４】
実施例５：ＬＤＬに対する高い選択性を示す薬剤の特定
ＨＤＬとの最小限の相互作用でＬＤＬを検出するために、ＬＤＬに対する選択性を示す薬剤を特定することを目的としてこの実験を行った。
【００７５】
溶液
グリコールエーテル溶液：ｐＨ９．０のトリス緩衝液、５％のグリシンを用いて各グリコールエーテル溶液を生成した。以下に記載した量では濃度が２倍のグリコールエーテル溶液となる。なお、計量に多少のばらつきがあるため、パーセンテージは近似値である。
２−メトキシエタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ社、１８５４６９）
１０％（４７７μｌの緩衝液中０．０４７７ｇ）
トリエチレングリコールメチルエーテル（Ｆｌｕｋａ社、９０４５０）
１０％（１００μｌ＋９００μｌの緩衝液）
ジエチレングリコールプロピルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社、５３７６６７）
１０％（９４７μｌの緩衝液中０．０９４７ｇ）
ジエチレングリコールブチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社、５３７６４０）
１０％（６４０μｌの緩衝液中０．０６４０ｇ）
ジエチレングリコールペンチルエーテル（Ｆｌｕｋａ社、３２２８５）
２．５％（８７２μｌの緩衝液中０．０２１８ｇ）
１−メトキシ−２−プロパノール（Ａｌｄｒｉｃｈ社、６５２８０）
１０％（４５９μｌの緩衝液中０．０４５９ｇ）
ジプロピレングリコールブチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社、３８８１３０）
２．５％（４８４μｌの緩衝液中０．０１２１ｇ）
トリプロピレングリコールメチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社、３０，２８６−４）
１０％（４６３μｌの緩衝液中０．０４６３ｇ）
トリプロピレングリコールブチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社、４８，４２２−９）
２．５％（７０４μｌの緩衝液中０．０１７６ｇ）
グリセロールエトキシレート−ｃｏ−プロポキシレートトリオール（Ａｌｄｒｉｃｈ社、４０，９１８−９）
５％（１．０６８ｍｌの緩衝液中０．０５３４ｇ）
ネオペンチルグリコールエトキシレート（Ａｌｄｒｉｃｈ社、４１０２７６）
１０％（６１９μｌの緩衝液中０．０６１９ｇ）
プロピレングリコールプロピルエーテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４２４９２７）
１０％（４４４μｌの緩衝液中０．０４４４ｇ）
１−ｔ−ブトキシ−２−プロパノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４３３８４５）
１０％（４７０μｌの緩衝液中０．０４７０ｇ）
ジプロピレングリコールプロピルエーテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４８４２１０）
１０％（４５８μｌの緩衝液中０．０４５８ｇ）
トリプロピレングリコールプロピルエーテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４６９９０４）
１０％（４３５μｌの緩衝液中０．０４３５ｇ）
ジプロピレングリコール−t−ブチルエーテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、５９３３４６）
１０％（４１７μｌの緩衝液中０．０４１７ｇ）
２−プロポキシエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、８２４００）
１０％（４４４μｌの緩衝液中０．０４４４ｇ）
ＬＤＬ試料およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社）：脱脂血清を用いてＬＤＬ試料およびＨＤＬ試料を生成した。
【００７６】
酵素混合物
ｐＨ９．０のトリス緩衝液、５％のグリシンを用いて、以下を含む酵素混合物を生成した
１６０ｍＭの塩化ヘキサミンルテニウム（ＩＩＩ）
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素
６．７ｍｇ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ
４４．４ｍｇ/ｍｌのゼラチンフリーのコレステロール脱水素酵素
【００７７】
検査プロトコル
９μｌのグリコール溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（ＬＤＬまたはＨＤＬ、もしくは脱脂血清）を結果として得られたグリコールエーテル：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を国際公開第２００３/０５６３１９号に記載されているような電極上に滴下した。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで５つの時点（１０，３２，６３，９０，１１０秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料の検査は２回行った。
【００７８】
結果
データを分析し、ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に第１時点における勾配を用いた。結果を図８に示す。
【００７９】
実施例６：５００〜１５００ｍＭのＫＣＩの滴定
ジエチレングリコールモノブチルエーテル存在下で、ＬＤＬ、ＨＤＬ反応に対するイオン強度増加効果を調べることを目的としてこの実験を行った。
【００８０】
溶液
３０ｍＭのＲｕａｃａｃ溶液：３０ｍＭのＲｕＡｃａｃ、ｐＨ９．０のトリス、５％のグリシン、５％のジエチレングリコールブチルエーテル
上記のＲｕａｃａｃ溶液中に３Ｍ，２Ｍ，１．５Ｍ，１ＭのＫＣＩを含むＫＣＩ溶液を生成した。
上記のＲｕａｃａｃ溶液中に以下を含む酵素混合物を生成した
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素
６．７ｍｇ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ
４４．４ｍｇ/ｍｌのコレステロール脱水素酵素
脱脂血清を用いてＬＤＬ試料およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社）を生成した。
【００８１】
検査プロトコル
９μｌのＫＣＩ溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料を結果として得られたＫＣＩ：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を電極上に滴下した。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで７つの時点（０，３２，６４，９６，１２８，１６０，１９２秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料の検査は２回行った。
【００８２】
データを分析し、ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。結果を図９に示す。
【００８３】
結論
ＬＤＬに対する反応の勾配を増加することにより、ＫＣＩ濃度が高濃度（１．５Ｍ）になり、ＬＤＬに対する識別性が低下した。結果として、ＬＤＬに対する識別性は５００、７５０、１ＭのＫＣＩで高かった。
【００８４】
実施例７：０〜５００ｍＭのＫＣＩの滴定
ジエチレングリコールブチルエーテル存在下で、ＬＤＬ、ＨＤＬ反応に対するイオン強度効果を調べることを目的としてこの実験を行った。
【００８５】
溶液
３０ｍＭのＲｕＡｃａｃを、ｐＨ９．０のトリス、５％のグリシン、５％のジエチレングリコールブチルエーテル溶液を含む緩衝液を用いて生成した。
上記のＲｕａｃａｃ緩衝液を用いて１Ｍ、５００ｍＭ、１００ｍＭ濃度のＫＣＩ溶液を生成した。
上記のＲｕａｃａｃ溶液を用いて濃度が２倍の酵素混合物を生成した
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ社）
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ社）
６．７ｍｇ/ｍｌのコレステロールエステラーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）
４４．４ｍｇ/ｍｌのゼラチンフリーのコレステロール脱水素酵素（天野エンザイム株式会社、ＣＨＤＨ−６）
脱脂血清を用いてＬＤＬ試料およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社）を生成した。
【００８６】
検査プロトコル
９μｌのＫＣＩ溶液またはＲｕａｃａｃ溶液（ブランク）を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（１０倍濃縮ＬＤＬもしくはＨＤＬ、または脱脂血清）を結果として得られたＫＣＩ：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を国際公開第２００３／０５６３１９号に記載されているような電極上に滴下した。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで７つの時点（０，３２，６４，９６，１２８，１６０，１９２秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料を重複して検査した。
【００８７】
結果
データを分析し、ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。結果を図１０に示す。
【００８８】
結論
０〜５００ｍＭの範囲内でＫＣＩ濃度を増すことにより、ＬＤＬに対する反応の勾配が増加し、ＫＣＩ濃度の上昇に伴いＬＤＬに対する識別性が高くなった。
【００８９】
実施例８：ＬＤＬの選択的可溶化におけるイオン強度の調査
ＨＤＬとの最小限の相互作用でＬＤＬを検出するために、塩化ヘキサミンルテニウムメディエータの濃度を変えてＬＤＬの選択的可溶化に対するイオン強度効果を調べることを目的としてこの実験を行った。
【００９０】
溶液
トリス緩衝液（ｐＨ９．０、５％のグリシン）を用いて、１２％のジエチレングリコールブチルエーテルを含むグリコールエーテル溶液を生成した。
脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ社）を用いて濃度の異なるＬＤＬ試料およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社）を生成した。
ｐＨ９．０のトリス緩衝液、５％のグリシンを用いて濃度が２倍の酵素混合物を生成した。
それぞれ８０、１６０、２４０または４８０ｍＭの塩化ヘキサミンルテニウムを含む４種の異なる酵素混合物を用意した。
８０、１６０、２４０または４８０ｍＭの塩化ヘキサミンルテニウム（ＩＩＩ）
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素
６．７ｍｇ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ
４４．４ｍｇ／ｍｌのゼラチンフリーのコレステロール脱水素酵素
【００９１】
検査プロトコル
濃度が２倍の９μｌのグリコールエーテル溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（１０倍濃縮ＬＤＬもしくはＨＤＬ、または脱脂血清）を結果として得られたグリコールエーテル：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を電極上に滴下した（国際公開第２００３／０５６３１９号に記載されているような電極）。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで５つの時点（０，２８，５６，８４，１１２秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料の検査は２回行った。
【００９２】
分析
データを分析し、ＬＤＬおよびＨＤＬの識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。第１時点０秒における結果を図１１（ａ）〜（ｄ）に示す。
【００９３】
結論
ＬＤＬに対する識別性は８０ｍＭの塩化ヘキサミンルテニウムで最も高かった。
【００９４】
特定の見解に縛られたくはないが、イオン強度またはイオン濃度が溶解度が制限されるレベルに達するまで、イオンの存在レベルの変化は共溶媒のコレステロールに対する相対的な溶解力を変化させると仮定できる。
【００９５】
実施例９：ジエチレングリコールブチルエーテルまたはジプロピレングリコールブチルエーテルによる血漿キャリブレーション
ジエチレングリコールモノブチルエーテル（Ｅ２Ｃ４）またはジプロピレングリコールモノブチルエーテル（Ｐ２Ｃ４）存在下における血漿ＬＤＬおよびＨＤＬに対する反応を調べることを目的としてこの実験を行った。
【００９６】
溶液
ＫＣＩ緩衝液：ｐＨ９．０のトリス緩衝液、５％のグリシン、０．２ＭのＫＣＩ
上記のＫＣＩ緩衝液を用いて４０ｍＭのＲｕａｃａｃを生成した。
上記のＲｕａｃａｃ溶液を用いて３ＭのＫＣＩ溶液を生成した。
酵素混合物：Ｒｕａｃａｃ溶液を用いて酵素混合物（共溶媒を含まない）を生成した。
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素
６．７ｍｇ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ
４４．４ｍｇ／ｍｌのゼラチンフリーのコレステロール脱水素酵素
１２％のＥ２Ｃ４を含む酵素混合物：２５３μＬの酵素混合物に０．０３０４ｇのＥ２Ｃ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を溶解した。
３．５％のＰ２Ｃ４を含む酵素混合物：２５０μＬの酵素混合物に０．００７５ｇのＰ２Ｃ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を溶解した。
血漿試料：凍結血漿試料を少なくとも３０秒間解凍した後５分間遠心分離した。その後、試料をＳｐａｃｅ臨床分析機器（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ製）を用いて分析した。
【００９７】
検査プロトコル
Ｅ２Ｃ４を含む酵素混合物に関して、１．５μｌの３ＭのＫＣＩ溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、９μｌの試料（血漿もしくは脱脂血清）を結果として得られたＫＣＩ：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を電極上に滴下した。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで７つの時点（０，３２，６４，９６，１２８，１６０，１９２秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料の検査は２回行った。
Ｐ２Ｃ４を含む酵素混合物に関して、Ｔ＝−３０秒において、９μｌの酵素混合物を９μｌの試料（血漿もしくは脱脂血清）と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を電極上に滴下した。Ｔ＝０秒において、Ｅ２Ｃ４の場合と同様にクロノアンペロメトリー法による検査を開始した。
【００９８】
分析
データを分析し、ＬＤＬおよびＨＤＬの識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【００９９】
結果
Ｅ２Ｃ４を用いた場合、ｔ＝０秒において血漿ＬＤＬに対する識別性は１０３％であった（図１２参照、白丸はＨＤＬ、黒丸はＬＤＬを示す）。Ｐ２Ｃ４を用いた場合、ｔ＝９６秒において血漿ＬＤＬに対する識別性は９１％であった（図１３参照、白丸はＨＤＬ、黒丸はＬＤＬを示す）。
【０１００】
結論
Ｅ２Ｃ４またはＰ２Ｃ４ＬＤＬのどちらを用いても血漿ＬＤＬに対する識別性は高かった。
【０１０１】
実施例１０：ＨＤＬとの最小限の相互作用でＬＤＬを検出するために、ＬＤＬを選択的に可溶化する薬剤を特定するための実験
【０１０２】
溶液
０．１ＭのＫＣＩ緩衝液＝ｐＨ９．０のトリス緩衝液、５％のグリシン、０．１ＭのＫＣＩ
グリコールエーテル溶液：
０．１ＭのＫＣＩ緩衝液を用いて濃度が２倍のグリコールエーテル溶液を生成した。
ジエチレングリコールブチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社、５３７６４０）
１０％（９５８μｌのＫＣＩ緩衝液中０．０９５８ｇ）
酵素混合物：
０．１ＭのＫＣＩ緩衝液を用いて以下を含む酵素混合物を生成した。
４０ｍＭのＲｕＡｃａｃ
１７．７ｍＭのチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
８．４ｍｇ／ｍｌのプチダレドキシン還元酵素
６．７ｍｇ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ
４４．４ｍｇ／ｍｌのゼラチンフリーのコレステロール脱水素酵素
Ｓｃｉｐａｃ ＬＤＬ、ＨＤＬ試料：
脱脂血清（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｓ１３９）を用いて、ＬＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｐ２３２−８）およびＨＤＬ試料（Ｓｃｉｐａｃ社、Ｐ２３３−８）を必要濃度の１０倍の濃度で生成した。その後、試料をＳｐａｃｅ臨床分析機器（Ｓｃｈｉａｐｐａｎｅｌｌｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ製）を用いて分析した。
【０１０３】
検査プロトコル
９μｌのグリコールエーテル溶液を９μｌの酵素混合物と混合した。Ｔ＝−３０秒において、２μｌの試料（ＬＤＬもしくはＨＤＬ、または脱脂血清）を結果として得られたグリコールエーテル：酵素混合物と混合し、その結果得られた９μｌの溶液を電極上に滴下した（国際公開第２００３／０５６３１９号に記載されているような電極）。Ｔ＝０秒において、クロノアンペロメトリー法による検査を開始した。酸化電流を０．１５ｍＶで５つの時点（０，３５，６３，９０，１１８，１４５，１７２秒）において測定した。最終時点において還元電流を−０．４５ｍＶで測定した。各試料を重複して検査した。
【０１０４】
分析
Ｓｐａｃｅ臨床分析機器からの脱脂血清およびＬＤＬ、ＨＤＬ濃度とともにデータを分析した。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。結果を図１４に示す。
【０１０５】
結論
ジエチレングリコールブチルエーテルを用いたＬＤＬに対する識別性は高かった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ジエチレングリコールモノペンチルエーテルを用いて、ＨＤＬに対してＬＤＬを選択的に可溶化した場合の（実施例１）結果を示すグラフである。
【図２】ジエチレングリコールモノペンチルエーテルを用いて、ＨＤＬに対してＬＤＬを選択的に可溶化した場合の（実施例１）結果を示す表である。
【図３】ジエチレングリコールモノブチルエーテルを用いて、ＨＤＬに対してＬＤＬを選択的に可溶化した場合の（実施例１）結果を示す表である。
【図４】ジエチレングリコールモノブチルエーテルを用いて、ＨＤＬに対してＬＤＬを選択的に可溶化した場合の（実施例１）結果を示す表である。
【図５】実施例２の結果を示す表である（Ｅ２Ｃ４はジエチレングリコールブチルエーテル）。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【図６】実施例３の結果を示す表である。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【図７】実施例４の結果を示す表である。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【図８】実施例５のデータを示す表である。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【図９】実施例６の結果を示す表である。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【図１０】実施例７のデータを示す表である。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【図１１】実施例８の、第１時点０秒の結果を示す表である。ＬＤＬおよびＨＤＬの測定から得た識別性（％）の算出に各時点における勾配を用いた。
【図１２】Ｅ２Ｃ４を用いた場合の血漿ＬＤＬ（黒丸）および血漿ＨＤＬ（白丸）の識別性を示すグラフである（実施例９）。
【図１３】Ｐ２Ｃ４を用いた場合の血漿ＬＤＬ（黒丸）および血漿ＨＤＬ（白丸）の識別性示すグラフである（実施例９）。
【図１４】ＬＤＬおよびＨＤＬ間の識別性（％）の算出に用いられた各時点における勾配を示す表である（実施例１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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