(57)【要約】  本明細書は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲットドメインを含む改変クロストリジウム毒素; かかる改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子; およびかかる改変クロストリジウム毒素の生産方法を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む改変クロストリジウム毒素:
a)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素酵素ドメイン;
b)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素転位置ドメイン; 
c)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することが出来る転位置促進ドメイン; 
d) クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合でき、かつクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することが出来る変化したターゲティングドメイン; および、
e)プロテアーゼ切断部位;
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は、改変クロストリジウム毒素の一本鎖形態を二本鎖形態へと変換する。
【請求項２】
改変クロストリジウム毒素が、一本のポリペプチドのアミノからカルボキシへ直線状の順序において、1)クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、2)クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン、3) 変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメイン、4)変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン、5)クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、または6) クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む、請求項１の改変クロストリジウム毒素。
【請求項３】
転位置促進ドメインがクロストリジウム毒素転位置促進ドメインである、請求項１の改変クロストリジウム毒素。
【請求項４】
転位置促進ドメインがエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインである、請求項１の改変クロストリジウム毒素。
【請求項５】
変化したターゲティングドメインが、グルカゴン様ホルモン、神経ホルモン、神経調節サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合タンパク質、ニューレキシンに選択的に結合するリガンド、ニューレキシン-2αに対するリガンド、ニューレキシン-2βに対するリガンド、ニューレキシン-3αに対するリガンド、ニューレキシン-3βに対するリガンド、WNT、Ng-CAM(L1)、NCAM、N-カドヘリン、アグリン-MUSK、基底膜ポリペプチド、およびそのターゲティングドメインがクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行可能な前記ポリペプチドのいずれかの変異体からなる群から選択される、請求項１の改変クロストリジウム毒素。
【請求項６】
変化したターゲティングドメインが、セクレチン、グレリン (GHS)、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、グルカゴン様ペプチド-2 (GLP-2)、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド (PACAP)、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド (GRPP)、オキシントモジュリン (OXY)、血管作用性小腸ペプチド-1 (VIP-1)、血管作用性小腸ペプチド-2 (VIP-2)、胃抑制ポリペプチド (GIP)、ガラニン (Gal) 、またはカルシトニン関連ペプチド、内臓腸管ペプチドからなる群から選択されるグルカゴン様ホルモンを含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項７】
変化したターゲティングドメインが、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CCRH) および副甲状腺ホルモン (PTH)からなる群から選択される神経ホルモンを含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項８】
変化したターゲティングドメインが、毛様体神経栄養因子 (CNTF)、グリコホリン-A (GPA)、白血病抑制因子 (LIF)、インターロイキン (IL)、オンコスタチン M (OSM)、カルディオトロフィン-1 (CT-1)、カルディオトロフィン様サイトカイン (CLC)、ニューロロイキン (NL)、VEGF、インシュリン様成長因子-1 (IGF-1)、インシュリン様成長因子-2 (IGF-2) および上皮成長因子 (EGF)からなる群から選択される神経調節サイトカインを含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項９】
変化したターゲティングドメインが、神経成長因子 (NGF)、脳由来成長因子 (BDNF)、ニューロトロフィン-3 (NT-3) およびニューロトロフィン-4/5 (NT-4/5)からなる群から選択されるニューロトロフィンを含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１０】
変化したターゲティングドメインが、グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF)、ニュールツリン (NRTN)、パーセフリン (PSPN) およびアルテミン (ARTN)からなる群から選択される成長因子を含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１１】
変化したターゲティングドメインが、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP10、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF10、GDF11、GDF15、アクチビン A、アクチビン B、アクチビン C、アクチビン E およびインヒビン Aからなる群から選択されるTGFβ スーパーファミリーメンバーを含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１２】
変化したターゲティングドメインが、血清アミロイド P、β-グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、cry1A、殺虫性デルタ-エンドトキシン、アグルチニン 、アブリンおよびリシンからなる群から選択される糖結合タンパク質を含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１３】
変化したターゲティングドメインが、ニューレキシン-1α、ニューレキシン-1β、ニューレキシン-2α、ニューレキシン -2β、ニューレキシン-3α およびニューレキシン-3βからなる群から選択されるポリペプチドに結合するリガンドを含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１４】
変化したターゲティングドメインがラミニン β-2を含む、請求項５の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１５】
プロテアーゼ切断部位が内因性クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位または外来性切断部位である、請求項１の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１６】
請求項１の改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド分子が発現ベクターを含む、請求項１６のポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】
請求項１の改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞において発現させる工程を含む、改変クロストリジウム毒素を生産する方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、改変クロストリジウム毒素を生産する方法:
a) 請求項１の改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入する；および
b) 前記ポリヌクレオチド分子にコードされる改変クロストリジウム毒素を発現させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本非仮出願は、35 U.S.C. §119(e)に従って2006年7月11日出願の米国仮出願第60/807,062号からの優先権を主張し、これはその内容全体を引用により本明細書に含める。
【０００２】
本出願において引用するすべての特許および刊行物はその内容全体を引用により本明細書に含める。
【背景技術】
【０００３】
クロストリジウム毒素、例えば、ボツリヌス神経毒(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/G、ならびに破傷風(Tetanus)神経毒 (TeNT)が神経伝達を阻害する能力は、多種多様な治療および美容用途に用いられており、例えば、William J. Lipham、COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack、Inc.、2004)を参照されたい。医薬組成物として市販されているクロストリジウム毒素としては、BoNT/A 調製物、例えば、BOTOX（登録商標）(Allergan、Inc.、Irvine、CA)、Dysport（登録商標）/Reloxin（登録商標）、(Beaufour Ipsen、Porton Down、England)、Linurase（登録商標） (Prollenium、Inc.、Ontario、Canada)、Neuronox（登録商標） (Medy-Tox、 Inc.、Ochang-myeon、South Korea) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products、China)およびXeomin（登録商標） (Merz Pharmaceuticals、GmbH.、Frankfurt、Germany);ならびにBoNT/B 調製物、例えば、MyoBloc（商標）/NeuroBloc（商標） (Elan Pharmaceuticals、San Francisco、CA)が挙げられる。一例として、BOTOX（登録商標） は以下の適応症のために１以上の国で現在認可されている: アカラシア、成人性痙縮、裂肛、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、痙性斜頚、本態性振戦、眉間のしわまたは運動過多の顔のしわ、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の運動亢進、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス性障害、鼻から唇へのしわ、攣縮性発声障害、斜視および VII 神経障害。
【０００４】
クロストリジウム毒素治療法は多くの適応症への使用が成功している。一般に、クロストリジウム毒素治療の投与は良好に耐用される。しかし、いくつかの用途における毒素投与は、有益な効果を達成するためにより多い用量が必要とされるために挑戦的でありうる。第一に、より多い用量は、毒素が身体の間質液および循環系、例えば、心血管系およびリンパ系を介して移動する可能性を上昇させ得、その結果、毒素治療の標的ではない領域への望ましくない毒素の分散が起こりうる。かかる分散は、望ましくない副作用、例えば、治療標的ではない神経細胞における神経伝達物質放出の阻害または治療標的ではない筋肉の麻痺を導きうる。例えば、治療的に有効量のBoNT/A 治療を斜頸のために頚の筋肉に投与された患者は、中咽頭への毒素の分散のために嚥下障害を起こしうる。したがって、治療部位において有効であるが、毒素治療の標的ではない領域においては無視できるか最小の効果しか有さない改善されたクロストリジウム毒素に対する要求がいまだに存在する。
【０００５】
第二に、より多い用量でのクロストリジウム毒素治療は、毒素に対する抗体応答を誘発しうる。強力かつ有効な治療ではあるが、神経伝達物質放出の阻害およびその結果としてのクロストリジウム毒素治療によって誘発される神経筋麻痺は永続的なものではない。かかる麻痺効果の可逆性により、この毒素からの治療利益を維持するためには定期的な治療が必要である。この反復曝露の結果として、患者によってはクロストリジウム毒素に対する免疫応答が起こり得、これによりさらなる治療に対する個体の応答性が低下または完全に阻止される。例えば、Joseph Jankovic、Botulinum toxin: Clinical Implications of Antigenicity and Immunoresistance、(SCIENTIFIC AND THERAPEUTIC ASPECTS OF BOTULINUM TOXIN、409-415、Mitchell F. Brin et al.、eds.、Lippincott Williams & Wilkins、2002); Dirk Dressler、Clinical Presentation and Management of Antibody -induced Failure of Botulinum Toxin Therapy、19(Suppl. 8) MOV. DISORD. S92-S100 (2004); M. Zouhair Atassi、Basic Immunological Aspects of Botulinum Toxin Therapy、19(Suppl. 8) MOV. DISORD. S68-S84、(2004)を参照されたい。したがって、有効な治療利益を維持しつつ、それ自体に対する免疫原性応答を誘発する能力が低下した、改良されたクロストリジウム毒素に対する要求がいまだに存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
より多い用量を必要とする治療法における臨床的、治療的および美容上のクロストリジウム毒素の使用が増えているため、適用の標的部位において有効であるが、望ましくない一または複数の位置への毒素の分散による望ましくない副作用を低減または阻止する改変クロストリジウム毒素の開発が医薬産業において必要である。一つのアプローチは、改変毒素がクロストリジウム毒素標的細胞に対する変化した細胞結合能力を有するようクロストリジウム毒素を改変することを含む。この変化した結合能力は、天然クロストリジウム毒素の内因性ターゲティングドメインを、天然クロストリジウム毒素標的細胞の表面に存在する異なる受容体に選択的に結合する別の分子のターゲティングドメインによって置換することにより達成される。ターゲティングドメインに対するかかる改変の結果、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体（標的受容体）に対し選択的に結合し得る改変毒素が得られる。変化したターゲティングドメインがヒトターゲティングドメインポリペプチド由来である場合さらなる利点が達成される。というのはかかるポリペプチドは患者において免疫原性応答を誘発しにくいからである。クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化した細胞結合能力を有する改変クロストリジウム毒素は、標的受容体に結合し、細胞質へと転位置し、そしてクロストリジウム毒素標的細胞のSNARE 複合体に対するそのタンパク分解作用を発揮しうる。
【０００７】
クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化した細胞結合能力を有する改変クロストリジウム毒素の非限定的な例は、例えば、Lance E. Steward、et al.、Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells、国際特許出願第2006/009831号(Mar. 14、2005)；およびLance E. Steward et al.、 Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use、米国特許出願第11/376,696号 (Mar. 15、 2006)に記載されている。天然クロストリジウム毒素標的細胞に対するこの変化した結合能力は、個体に投与すべき改変クロストリジウム毒素のより低い有効用量を可能とする。というのはより多くの毒素が標的細胞へと送達されるからである。したがって、クロストリジウム毒素標的細胞への細胞結合能力が変化した改変クロストリジウム毒素は、治療標的ではない領域への毒素の望ましくない分散を低下させ、それにより、望ましくない位置へのクロストリジウム毒素の拡散に付随する望ましくない副作用が低減または予防される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、非標的化領域への毒素分散に付随する望ましくない副作用を低減または予防する新規なクロストリジウム毒素を提供する。これら改変クロストリジウム毒素は、部分的には、改変毒素からの軽鎖が標的細胞の細胞質に転位置し、その標的SNARE基質を酵素的に改変するプロセスを増強する転位置促進ドメインを含む。したがって、例えば本明細書に開示する転位置促進ドメインを含むクロストリジウム毒素標的細胞に対する細胞結合能力が変化した、改変クロストリジウム毒素、例えば、Steward、前掲、(Mar. 14、 2006)および Steward、前掲、(Mar. 15、 2006)に開示のものは、クロストリジウム毒素標的細胞における強度の上昇および、非標的化領域への毒素分散に付随する望ましくない副作用の随伴する低下を示す。これらおよび関連する利点は様々な臨床、治療および美容用途、例えば、神経筋障害、神経障害、眼障害、疼痛、筋肉損傷、頭痛、心血管疾患、精神神経障害、内分泌障害、癌、耳障害および運動過多による顔のしわ、ならびに、クロストリジウム毒素標的細胞に対する細胞結合能力が変化した改変クロストリジウム毒素の個体への投与が有益な効果を与えうるその他の障害の治療にとって有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1は、中枢および末梢神経細胞における神経伝達物質放出およびクロストリジウム毒素中毒の現在のパラダイムの模式図を示す。図1Aは、中枢および末梢神経細胞の神経伝達物質放出機構の模式図を示す。放出プロセスは２工程を含むものとして記載できる: 1)小胞ドッキング、神経伝達物質分子を含む小胞の小胞に結合したSNARE タンパク質が、細胞膜に位置する膜に結合した SNARE タンパク質と結合する;および、2) 神経伝達物質放出、ここで、小胞が細胞膜と融合し、神経伝達物質分子がエキソサイトーシスされる。図1Bは、中枢および末梢神経細胞における破傷風およびボツリヌス毒素活性についての中毒機構の模式図を示す。この中毒プロセスは、４工程を含むものとして記載できる: 1) 受容体結合、ここで、クロストリジウム毒素がクロストリジウム受容体に結合し、中毒プロセスを開始する; 2) 複合体インターナリゼーション、ここで毒素結合の後毒素受容体複合体を含む小胞が細胞内にエンドサイトーシスされる; 3) 軽鎖転位置、ここで複数の事象の結果、活性軽鎖の細胞質への放出が起こる; および 4) 酵素による標的改変、ここで、クロストリジウム毒素の活性軽鎖が、その標的SNARE基質、例えば、SNAP-25、VAMPまたはシンタキシンをタンパク分解により切断し、それにより小胞ドッキングおよび神経伝達物質放出が阻止される。
【図２】図2は、天然クロストリジウム毒素のドメイン編成を示す。一本鎖形態は、酵素ドメイン、転位置ドメイン、HCN 転位置促進ドメインおよびHCC ターゲティングドメインを含むアミノからカルボキシルへの直鎖状編成を示す。転位置および酵素ドメインの間に位置する二本鎖ループ領域を二重SSブラケットによって示す。この領域は、天然プロテアーゼ、例えば、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼまたは環境中にて生じた天然プロテアーゼによるタンパク分解切断時に、一本鎖形態の毒素を二本鎖形態に変換する内因性二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。上記のように、一本鎖形態、HCC ターゲティングドメインはβ-三葉型ドメインを含み、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にてα-フォールド、β4/β5 ヘアピンターン、β-フォールド、β8/β9 ヘアピンターンおよびγ-フォールドを含む。
【図３】図3は、酵素ドメインを含む軽鎖 (LC)、転位置ドメインを含む重鎖 HN ドメイン、転位置促進ドメインを含む重鎖 HCN ドメインおよびターゲティングドメインを含む重鎖 HCC ドメインのモジュールの三次元構造を示すBoNT/Aのリボン模式図を示す。
【図４】図4は、改変毒素のアミノ末端に位置する増強した転位置能力および変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素を示す。図4Aは、アミノからカルボキシル直鎖状編成にて、変化したターゲティングドメイン、転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび酵素ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は、転位置促進および酵素ドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態に変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、ターゲティングおよび転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進および酵素ドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。図4Bは、アミノからカルボキシル直鎖状編成にて変化したターゲティングドメイン、酵素ドメイン、転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は酵素および転位置ドメインの間に位置している。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態に変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、ターゲティングおよび酵素ドメイン、酵素および転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。
【図５】図5は、その他の２つのドメインの間に位置する増強した転位置能力および変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素を示す。図5Aは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて、酵素ドメイン、変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は、酵素およびターゲティングドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位でありうる。スペーサーが、酵素およびターゲティングドメイン、ターゲティングおよび転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。図5Bは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示される。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は転位置促進およびターゲティングドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位はクロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位でありうる。スペーサーが、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進およびターゲティングドメイン、ターゲティングおよび酵素ドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。
【図６】図6は、改変毒素のカルボキシル末端に位置する増強した転位置能力および変化したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素を示す。図6Aは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて酵素ドメイン、転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示す。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は酵素および転位置ドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、酵素および転位置ドメイン、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進およびターゲティングドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。図6Bは、アミノからカルボキシルへの直鎖状編成にて転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を示し、二本鎖ループ領域は二重SSブラケットにより示す。二本鎖ループ領域内のタンパク分解切断部位 (P)は転位置促進および酵素ドメインの間に位置する。P プロテアーゼによりタンパク分解切断されると、一本鎖形態の毒素は二本鎖形態へと変換される。P プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素内因性プロテアーゼ切断部位または非クロストリジウム毒素外来性プロテアーゼ切断部位であり得る。スペーサーが、転位置および転位置促進ドメイン、転位置促進および酵素ドメイン、酵素およびターゲティングドメインの間またはそれらの組合せに位置していてもよい。
【図７】図7は、転位置促進ドメインを含むHCN ドメインの境界領域を示すBoNT/Aのリボン模式図を示す。図7Aは、アミノ-末端境界領域を示す。 図7Bは、カルボキシル-末端境界領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・テタニ（破傷風菌）、クロストリジウム・ブラチイおよびクロストリジウム・ブチリクムにより生産されるクロストリジウム毒素は、ヒトおよびその他の哺乳類の治療および美容処置に非常に広く用いられている。クロストリジウム・ボツリヌスの株は、抗原的に異なるタイプの７種のボツリヌス毒素 (BoNT)を生産し、それらはヒト(BoNT/A、/B、/Eおよび/F)、動物(BoNT/C1および/D)におけるボツリヌス中毒大流行の調査によって同定されたか、あるいは土壌から単離された(BoNT/G)。７つのすべてのボツリヌス毒素(BoNT) 血清型は類似の構造および薬理特性を有するが、それぞれはまた異質な細菌学的特徴を示す。一方、破傷風毒素 (TeNT)は、クロストリジウム・テタニ（破傷風菌）の均一な群により生産される。２つの別の種のクロストリジウムである、クロストリジウム・ ブラチイおよびクロストリジウム・ブチリクムもそれぞれ、BoNT/FおよびBoNT/Eと類似の毒素を生産する。
【００１１】
表1.  クロストリジウム毒素参照配列および領域
【表１】
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【００１２】
クロストリジウム毒素は、互いにおよそ 35%のアミノ酸同一性を有し、同じ機能的ドメイン編成および全体構造を共有する。クロストリジウム毒素はそれぞれおよそ 150 kDaの一本鎖ポリペプチドとして翻訳され、それは次いで天然プロテアーゼ、例えば、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼまたは環境中に生じた天然プロテアーゼによりジスルフィドループ内でタンパク分解切断により切断される(図2 参照)。この翻訳後プロセシングにより、およそ 50 kDaの軽鎖 (LC)およびおよそ 100 kDaの重鎖 (HC)が一つのジスルフィド結合および非共有相互作用によって一緒になって含まれる二本鎖分子が生じる。成熟二本鎖分子は３つの機能的に異なるドメインを含むと広く考えられている: 1)神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的化する亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含むLC に位置する酵素ドメイン(表1); 2)細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのLCの放出を促進する重鎖のアミノ-末端半分(HN ドメイン)に含まれる転位置ドメイン(表1);および 3)標的細胞の表面に位置する受容体複合体への毒素の結合活性および結合特異性を決定する重鎖のカルボキシル-末端半分 (HC ドメイン) 内にある結合ドメイン(表1)、例えば、Kathryn Turton et al.、Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure、Function and Therapeutic Utility、27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); John A. Chaddock and P. M. H. Marks、Clostridial Neurotoxins:  Structure -Function Led Design of New Therapeutics、63(5) Cell. Mol. Life Sci. 540-551 (2006);および Keith Foster et al.、Re-engineering the Target Specificity of Clostridial Neurotoxins - A Route To Novel Therapeutics、9(2-3) Neurotox Res. 101-107 (2006)を参照されたい。
【００１３】
クロストリジウム毒素の結合、転位置および酵素活性はすべて、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する、全体としての細胞中毒機構を行うために必要であり、かかる機構は血清型またはサブタイプにかかわらず類似である。現在のパラダイムでは、中毒機構は少なくとも４工程を含むとして説明される: 1) 受容体結合、2) 複合体インターナリゼーション、3) 軽鎖転位置、および、4) 酵素による標的改変 (図1参照)。このプロセスは、クロストリジウム毒素のHC ドメインが、標的細胞の細胞膜表面に位置する毒素-特異的受容体に結合すると開始する。受容体複合体の結合特異性は、部分的には、それぞれのクロストリジウム毒素受容体複合体を異なるように構成すると考えられるガングリオシドおよびタンパク質受容体の特定の組合せによって達成されると考えられている。いったん結合すると、毒素受容体複合体はエンドサイトーシスによりインターナライズされ、インターナライズされた小胞は特定の細胞内経路へと選別される。HN ドメインにより媒介され、さらにHCN ドメインにより促進されると現在では考えられている転位置工程は、小胞区画の酸性化によりトリガーされるようである。このプロセスは、疎水性を上昇させ、毒素の重鎖からの軽鎖の分離を促進する２つの重要な pH-依存的構造再編成を開始させるようである。いったん活性化されると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが細胞内小胞から細胞質ゾルへと放出され、ここでそれは特異的に神経伝達物質放出装置の３つの既知のコア成分の１つを標的化するようである。これらのコアタンパク質、小胞-結合膜タンパク質 (VAMP)/シナプトブレビン、25 kDaのシナプトソーム関連タンパク質 (SNAP-25)およびシンタキシンは、シナプス小胞ドッキングおよび神経終末での融合に必要であり、可溶性 N-エチルマレイミド-感受性 因子-付着タンパク質-受容体 (SNARE) ファミリーのメンバーを構成する。BoNT/AおよびBoNT/EはSNAP-25をカルボキシル末端領域にて切断し、それぞれ９または２６のアミノ酸セグメントを放出し、BoNT/C1もSNAP 25をカルボキシル末端付近で切断する。ボツリヌス血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F およびBoNT/G、および破傷風毒素は、VAMPの保存された中央部分に対して作用し、VAMPのアミノ末端部分を細胞質ゾルへと放出する。 BoNT/C1はシンタキシンを細胞質ゾル膜表面の近くの単一の部位にて切断する。シナプスの SNAREの選択的タンパク分解は、インビボでクロストリジウム毒素により起こる神経伝達物質放出の遮断の原因である。クロストリジウム毒素のSNARE タンパク質標的は様々な非神経細胞タイプにおけるエキソサイトーシスに共通である; これら細胞において、神経細胞におけるように、軽鎖ペプチダーゼ活性がエキソサイトーシスを阻害する、例えば、Yann Humeau et al.、How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release、82(5) Biochimie. 427-446 (2000); および Giovanna Lalli et al.、The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons、11(9) Trends Microbiol. 431-437、(2003)を参照されたい。
【００１４】
BoNT/A、BoNT/BおよびTeNTのHC ドメインの三次元結晶構造は、クロストリジウム神経毒の３つの機能的ドメインが構造的に異なることを示す。軽鎖のHEXXH コンセンサスモチーフが、チャンネルによって接近可能なタンパク質表面上の深い裂に位置する触媒部位の四面体亜鉛結合ポケットを形成する。HNおよびHC ドメインの構造は主にβ-シートトポロジーからなり、それらは１つのα-ヘリックスによって連結されている。円柱状形状のHN ドメインは２つの長い両親媒性 α-ヘリックスを含み、それらはいくつかのウイルスタンパク質にみられるコイルドコイルモチーフと類似している。HN ドメインはまた、「転位置ベルト」と称される構造化されていない長いループを形成し、それは活性部位の触媒-結合ポケットへの亜鉛原子の接近を妨げる軽鎖の大きく負に荷電した裂のまわりを包んでいる。HC ドメインは機能を示すほぼ同じサイズの２つの異なる構造特徴を含む。一方はHCN ドメインと称され、HC ドメインのアミノ半分に位置する。HCN ドメインはβ-バレル、ジェリー・ロール(jelly-roll)フォールドを形成する。HCC ドメインはHC ドメインを構成するもう一方のドメインである。このカルボキシル-末端ドメインは、多くの糖結合タンパク質、例えば、血清アミロイド P、シアリダーゼ、cryia、殺虫性 ∂-内毒素およびレクチンにみられる炭水化物結合部分に類似した３つの異なる炭水化物結合領域を形成する改変されたβ-三葉型ドメインを含む。生化学研究により HCC ドメインのβ-三葉型ドメイン構造は、細胞表面上のクロストリジウム毒素受容体の特定の炭水化物を含有する成分への結合を媒介するようであることが示されており、例えば、Krzysztof Ginalski et al.、Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site、482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000)を参照されたい。HC ドメインはHN ドメインから離れるよう傾いており、表面ループを露出しており、結合のためにそれらを接近可能としている。軽鎖とHC ドメインとの間には接触は起こらない。
【００１５】
本発明者らはHCC ドメインのみが受容体結合に寄与していることを知っている。というのは、β-三葉型ドメインはこのドメインに制限されているからである。構造的β-三葉型ドメインを含むタンパク質は、サイトカイン、MIR ドメインタンパク質、リシン B-様レクチン、アグルチニン、ダイズ トリプシンインヒビター様タンパク質、アクチン-架橋タンパク質、LAG-1 タンパク質およびAbfB ドメインタンパク質を含む少なくとも８つのスーパーファミリーへと組織化される多様な群のタンパク質を表し、例えば、C. A. Orengo et al.、Protein Superfamilies and Domain Superfolds、372 Nature 631-634 (1994);およびAlexey G. Murzin et al.、SCOP: A Structural Classification of Proteins Database for the Investigation of Sequences and Structures、247(4) J. Mol. Biol. 536-540 (1995)を参照されたい。多様な細胞での役割を有する一方、これらスーパーファミリーのメンバーは、機構的にβ-三葉型ドメインを介したタンパク質-タンパク質結合を介して機能する。特に興味深いのは、これらのメンバーの多くが受容体相互作用に特異的に関与しているという事実であり、例えば、サイトカインスーパーファミリーメンバーである、線維芽細胞増殖因子(FGF)およびインターロイキン-1 (IL-1);リシン B-様レクチン;アグルチニン; およびSTI-様メンバーである Kunitz インヒビターおよびクロストリジウム神経毒が含まれる。 HCC ドメインのみが、中毒の細胞結合工程を媒介するということは、クロストリジウム毒素の受容体結合活性を破壊する突然変異がHCC ドメインに限られているという知見によってさらに支持され、例えば、Andreas Rummel et al.、The HCC- Domain of Botulinum Neurotoxins A and B Exhibits a Singular Ganglioside Binding Site Displaying Serotype Specific Carbohydrate Interaction、51(3) Mol. Microbiol. 631-643 (2004)を参照されたい。
【００１６】
HCC ドメインは、クロストリジウム毒素のその受容体との選択的結合に必要であるだけでなく、十分でもあるため、本発明者らは、クロストリジウム毒素のHCN ドメインの主な機能は、中毒プロセスの細胞結合工程ではなく転位置工程に関与していると推定した。というのは、HCN ドメインの欠損は、中毒効率を低下させるようであるからである。例えば、サブスタンスPターゲティングドメインを含む改変BoNT/Aは、その対応する標的細胞を中毒させることにおいて非効率的であった。この改変毒素において、BoNT/A HCC ドメインとBoNT/A HCN ドメインとの両方を含む完全なBoNT/A HC ドメインを、サブスタンスPターゲティングドメインで置換した。同様に、本発明者らは、完全なBoNT/A HC ドメインが外来性ターゲティングドメインで置換されたその他のいくつかの改変クロストリジウム毒素が中毒能力の低下を示すことを決定した。したがって、HCN ドメインは以下の理由から転位置促進機能を有する：1) HCC ドメインは主に、中毒プロセスの受容体結合工程を媒介する; 2) HCN ドメインを欠損する改変クロストリジウム毒素は、かかる改変毒素がそのSNARE 基質のタンパク分解の低下を示すことから明らかなように、細胞質への転位置能力の低下を示す; および、3) LC ドメインは毒素の酵素活性を媒介する。HCN ドメインの正確な転位置促進機構は現在理解されていないが、HCN ドメインは、1)エンドソームの孔の形成に関与している可能性があり; 2)孔の小胞膜への挿入を媒介している可能性があり; 3)エンドソーム膜を横切るLCの送達を補助している可能性があり、および/または 4)転位置ドメインとの関係においてターゲティングドメインの適当な配向を促進する構造的足場またはスペーサーとして働いている可能性がある。この最後の点において、HCN ドメインは、リガンドの受容体による結合に続いて膜への挿入のために転位置ドメインを適切に提示することを促進するために転位置ドメインを配向させる役割をしているのであろう。転位置工程におけるHCN ドメインのこの新規な役割は、クロストリジウム毒素 HCN ドメインは中毒プロセスの細胞結合工程に必須の役割を果たしているという広く受け入れられていた概念に反するものである。
【００１７】
したがって、本発明は、1)増強した転位置能力; および2)天然クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化したターゲティング能力を示す、改変クロストリジウム毒素を開示する。増強した転位置能力は、例えば、クロストリジウム毒素のHCN 領域を含む転位置促進ドメインによって媒介される。HCN ドメインは、転位置工程におけるインターナライズされた細胞内小胞から標的細胞の細胞質への軽鎖の放出をHN ドメインが 媒介するプロセスを増強する。増強した転位置能力は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素においてクロストリジウム毒素 HCN ドメインを含めるまたは維持することによって得られる。天然クロストリジウム毒素標的細胞に対する変化したターゲティング能力は、クロストリジウム毒素の改変HCC ターゲティングドメインを含む変化したターゲティングドメインによって媒介される。HCC ドメインは主に、標的細胞表面に位置する受容体複合体への毒素の結合活性および結合特異性を決定する。変化したターゲティング活性は、クロストリジウム毒素の天然 HCC ターゲティングドメインを、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合ドメインにより置換することにより達成される。
【００１８】
増強した転位置および変化したターゲティング活性の両方は、個体に投与すべき改変クロストリジウム毒素のより低い有効用量を可能とするはずである。というのはより多くの毒素が標的細胞に送達されるからである。したがって増強した転位置および結合能力を有する改変クロストリジウム毒素は、治療標的ではない領域への毒素の望ましくない分散を低減し、それにより、クロストリジウム毒素の望ましくない位置への拡散に伴う望ましくない副作用を低減または予防するであろう。
【００１９】
したがって、本発明の側面は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素を提供し、ここで、改変クロストリジウム毒素は、天然クロストリジウム毒素と比較して、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合活性を示す。軽鎖が細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来るあらゆる転位置促進ドメインが、本発明の側面に実施に有用であると考えられ、これらに限定されないが、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよびエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが挙げられる。同様に、多数の変化したターゲティングドメインが想定され、これらに限定されないが、以下が挙げられる：シナプス前膜に存在する受容体に結合する変化したターゲティングドメイン、例えば、グルカゴン様ホルモン、神経ホルモン、神経調節性サイトカイン（neuroregulatory cytokines）、ニューロトロフィン、成長因子、軸索誘導シグナル分子、糖結合タンパク、ニューレキシンおよび WNT に選択的に結合するリガンド；およびシナプス後膜に存在する受容体に結合する変化したターゲティングドメイン、例えば、Ng-CAM(L1), NCAM, N-カドヘリン, アグリン-MUSK, 基底膜ポリペプチド。本明細書の改変クロストリジウム毒素における変化したターゲティングドメインの位置は、毒素のアミノ末端、酵素および転位置ドメインの間または毒素のカルボキシル末端に位置してもよいことも想定される。したがって、本明細書に開示される改変クロストリジウム毒素は、アミノからカルボキシルへのドメイン編成として例えば以下を含みうる：変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメイン;変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン;クロストリジウム毒素酵素ドメイン、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメイン;クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメイン;クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメイン;ならびにクロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン。
【００２０】
本発明の別の側面は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を提供し、ここで、改変クロストリジウム毒素は、天然クロストリジウム毒素と比較して、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対して結合活性を示す。本明細書のポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素の変化したターゲティングドメインの位置は、毒素のアミノ末端、酵素および転位置ドメインの間、または毒素のカルボキシル末端に位置しうると想定される。
【００２１】
本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、該方法は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞中で発現させる工程を含み、ここで改変クロストリジウム毒素は、天然クロストリジウム毒素と比較して、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合活性を示す。本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、該方法は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトを細胞に導入する工程、ここで改変クロストリジウム毒素は天然クロストリジウム毒素と比較して、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合活性を示し、および発現コンストラクトを細胞中で発現させる工程を含む。
【００２２】
本発明の側面は部分的には改変クロストリジウム毒素を提供する。本明細書において用いる場合、「改変クロストリジウム毒素」という用語は、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する全細胞機構を実行することが出来るあらゆるポリペプチドを意味し、低または高親和性受容体複合体へのクロストリジウム毒素の結合、毒素のインターナリゼーション、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質への転位置およびクロストリジウム毒素基質の酵素的改変が含まれる。本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、改変クロストリジウム毒素が、軽鎖が改変毒素から標的細胞の細胞質へと転位置するプロセスを増強する転位置促進ドメインを含み、改変クロストリジウム毒素がクロストリジウム毒素にみられる天然結合ドメインの細胞結合活性を欠いているという事実によって、天然クロストリジウム毒素から区別される。そうではなく、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、標的細胞の表面に位置する内因性クロストリジウム毒素受容体に対する改変クロストリジウム毒素の結合活性を決定する変化したターゲティングドメインを含む。定義によると、天然クロストリジウム毒素は変化したターゲティングドメインを欠いている。改変クロストリジウム毒素の例は、例えば、Lance E. Steward et al.、 Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells、国際特許出願第2006/009831号 (Mar. 14、 2005); および Lance E. Steward et al.、 Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use、米国特許出願第11/376,696号 (Mar. 15、 2006)に記載されている。例えば、Steward、前掲、(Mar. 14、2006)および Steward、前掲、(Mar. 15、 2006)に記載のあらゆる改変クロストリジウム毒素をさらに改変して、本明細書に開示のように転位置促進ドメインを含めることができる。
【００２３】
本発明の側面は、部分的には、クロストリジウム毒素酵素ドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素酵素ドメイン」という用語は、中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来るあらゆるクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。したがって、クロストリジウム毒素酵素ドメインは特異的に、クロストリジウム毒素基質を標的化し、クロストリジウム毒素基質、例えば、SNARE タンパク質、例えば、SNAP-25 基質、VAMP 基質およびシンタキシン基質のタンパク分解切断が含まれる。クロストリジウム毒素酵素ドメインの非限定的な例としては、例えば、クロストリジウム毒素軽鎖領域、例えば、BoNT/A 軽鎖領域、BoNT/B 軽鎖領域、BoNT/C1 軽鎖領域、BoNT/D 軽鎖領域、BoNT/E 軽鎖領域、BoNT/F 軽鎖領域、BoNT/G 軽鎖領域、およびTeNT 軽鎖領域が挙げられる。
【００２４】
クロストリジウム毒素酵素ドメインとしては、これらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームおよびクロストリジウム毒素軽鎖サブタイプ; 非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素軽鎖キメラ、その活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【００２５】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列(表1参照)の対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素軽鎖を意味し、参照配列の対応する領域に対してパーセント同一性にて記載できるものをいう。明示的に示さない限り、本明細書に開示するすべてのクロストリジウム毒素軽鎖変異体は、中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来る。非限定的な例として、配列番号1 のアミノ酸1-448を含むBoNT/A 軽鎖変異体は、配列番号1のアミノ酸領域 1-448と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号2のアミノ酸1-441を含むBoNT/B 軽鎖変異体は、配列番号2のアミノ酸領域 1-441と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号3のアミノ酸1-449を含むBoNT/C1 軽鎖変異体は、配列番号3のアミノ酸領域 1-449と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号4 のアミノ酸1-445を含むBoNT/D 軽鎖変異体は、配列番号4のアミノ酸 領域 1-445と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号5のアミノ酸1-422を含むBoNT/E 軽鎖変異体は、配列番号5のアミノ酸 領域 1-422と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号6のアミノ酸1-439を含むBoNT/F 軽鎖変異体は、配列番号6のアミノ酸 領域 1-439と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号7のアミノ酸 1-446を含むBoNT/G 軽鎖変異体は、配列番号7のアミノ酸領域 1-446と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;および、配列番号8のアミノ酸1-457を含むTeNT 軽鎖変異体は、配列番号8のアミノ酸 領域 1-457と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【００２６】
クロストリジウム毒素の各血清型において、そのアミノ酸配列、そしてかかるタンパク質をコードする核酸においていくらか相違する天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体が存在し得ることが当業者に認識されている。例えば、現在４つのBoNT/A サブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 および BoNT/A4が存在し、特定の軽鎖 サブタイプは別のBoNT/A 軽鎖 サブタイプと比較した場合におよそ 95%のアミノ酸同一性を示す。本明細書において用いる場合、「天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、天然プロセスにより生産されるあらゆるクロストリジウム毒素軽鎖を意味し、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されたクロストリジウム毒素軽鎖アイソフォーム、自然突然変異により生産されたクロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームおよび、クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプが挙げられる。天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同じようにして機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖の代わりとなりうる。天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸または１００以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から、少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体がそれに基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【００２７】
天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例は、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォーム、例えば、BoNT/A 軽鎖アイソフォーム、BoNT/B 軽鎖アイソフォーム、BoNT/C1 軽鎖アイソフォーム、BoNT/D 軽鎖アイソフォーム、BoNT/E 軽鎖アイソフォーム、BoNT/F 軽鎖アイソフォーム、BoNT/G 軽鎖アイソフォーム、およびTeNT 軽鎖アイソフォームである。クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームは、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームが基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わることができる。
【００２８】
天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体の別の非限定的な例は、クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプ、例えば、サブタイプ BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 および BoNT/A4からの軽鎖;サブタイプ BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B 二価(bivalent)およびBoNT/B タンパク非分解性(nonproteolytic)からの軽鎖;サブタイプ BoNT/C1-1およびBoNT/C1-2からの軽鎖;サブタイプ BoNT/E1、BoNT/E2 および BoNT/E3からの軽鎖;およびサブタイプ BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3 およびBoNT/F4からの軽鎖である。クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプは、クロストリジウム毒素軽鎖 サブタイプが基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わることができる。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、ヒトの操作の助けを借りて生産されたあらゆるクロストリジウム毒素軽鎖を意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作によって生産されたクロストリジウム毒素軽鎖、および化学合成によって生産されたクロストリジウム毒素軽鎖が挙げられる。非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素軽鎖 キメラ変異体および活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片が挙げられる。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素軽鎖配列 (表1)からの元のアミノ酸のものと類似の少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸 アナログによって少なくとも１つの アミノ酸が置換されたクロストリジウム毒素軽鎖を意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わることが出来る。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸、または５００以上のアミノ酸が、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から置換している可能性がある。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体はまた、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から、少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、および保存的 TeNT 軽鎖変異体が挙げられる。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体」という用語は、1) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から欠失している; 2) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖 が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に付加している; または 3) 少なくとも１つの アミノ酸が参照クロストリジウム毒素軽鎖配列からの元のアミノ酸のものと類似の性質を共有していないアミノ酸またはアミノ酸アナログによって置換されている(表1)、クロストリジウム毒素軽鎖を意味する。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体 が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖と実質的に同様に機能し得、本発明のあらゆる側面において、参照クロストリジウム毒素軽鎖と代わりうる。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から欠失している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に付加している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体は、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸、または５００以上のアミノ酸が、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から置換している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体はまた、少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖から置換している可能性があり、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体が基づく参照クロストリジウム毒素軽鎖に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または 95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、および非保存的 TeNT 軽鎖変異体が挙げられる。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素軽鎖 キメラ」という用語は、少なくともクロストリジウム毒素軽鎖の一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表1の参照クロストリジウム毒素軽鎖とは異なる少なくとも１つの 性質を有する毒素軽鎖を形成しているポリペプチドを意味し、ただし、このクロストリジウム毒素軽鎖 キメラは依然として神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的化することができるものであり、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構全体を実行することに寄与することができるものである。かかるクロストリジウム毒素軽鎖 キメラは例えば、Lance E. Steward et al.、Leucine-based Motif and Clostridial Toxins、米国特許出願公開 2003/0027752 (Feb. 6、2003); Lance E. Steward et al.、Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins、米国特許出願公開 2003/0219462 (Nov. 27、2003); およびLance E. Steward et al.、Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins、米国特許出願公開 2004/0220386 (Nov. 4、2004)に記載されている。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片」という用語は、本発明の側面において有用であり得る軽鎖を含むあらゆる様々なクロストリジウム毒素断片を意味するが、ただし、かかる軽鎖断片は、神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的化できるものであり、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体を実行することに寄与できるものである。クロストリジウム毒素の軽鎖はおよそ 420-460 アミノ酸の長さであり、酵素ドメインを含む(表1)。研究により、クロストリジウム毒素軽鎖の全長は、酵素ドメインの酵素活性に必要ではないことが示された。非限定的な例として、BoNT/A 軽鎖の最初の８のアミノ酸(配列番号1の残基1-8)は、酵素活性に必要ではない。別の非限定的な例として、TeNT 軽鎖の最初の８の アミノ酸(配列番号8の残基1-8)は、酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は活性に必要ではない。非限定的な例として、BoNT/A 軽鎖の最後の 32 アミノ酸 (配列番号1の残基 417-448)は酵素活性に必要ではない。別の非限定的な例として、TeNT 軽鎖の最後の 31 アミノ酸 (配列番号8の残基427-457)は酵素活性に必要ではない。したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 350 アミノ酸、少なくとも 375 アミノ酸、少なくとも 400 アミノ酸、少なくとも 425 アミノ酸および少なくとも 450 アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 350 アミノ酸、多くとも 375 アミノ酸、多くとも 400 アミノ酸、多くとも 425 アミノ酸および多くとも 450 アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。
【００３４】
様々な配列アラインメント方法のいずれを用いて天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体および非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル(global)方法、ローカル(local)方法およびハイブリッド方法、例えば、セグメントアプローチ方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。
【００３５】
グローバル方法では、分子の最初から最後まで配列をアラインし、個々の残基対のスコアを足すことにより、およびギャップペナルティを課すことにより最良のアラインメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、CLUSTAL W、例えば、Julie D. Thompson et al.、CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting、Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice、22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)参照;および反復リファインメント(iterative refinement)が挙げられ、例えば、Osamu Gotoh、Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments、264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照されたい。
【００３６】
ローカル方法では、入力配列のすべてによって共有される１以上の保存モチーフを同定することによって配列をアラインする。非限定的な方法としては、例えば、Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans、Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences、8(5) CABIOS 501-509 (1992)参照; Gibbs sampling、例えば、C. E. Lawrence et al.、Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment、262(5131) Science 208-214 (1993)参照; Align-M、例えば、Ivo Van Walle et al.、Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences、20(9) Bioinformatics,:1428-1435 (2004)参照、が挙げられる。
【００３７】
ハイブリッド方法は、グローバルおよびローカルアラインメント方法の両方の機能的側面を組み合わせたものである。非限定的な方法としては、例えば、セグメント-対-セグメント比較、例えば、Burkhard Morgenstern et al.、Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based 0n Segment-To-Segment Comparison、93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996)参照; T-Coffee、例えば、Cedric Notredame et al.、T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment、302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000)参照; MUSCLE、例えば、Robert C. Edgar、MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput、32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004)参照; および DIALIGN-T、例えば、Amarendran R Subramanian et al.、DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment、6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005)参照、が挙げられる。
【００３８】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、クロストリジウム毒素軽鎖アイソフォームまたはクロストリジウム毒素軽鎖サブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、非天然クロストリジウム毒素軽鎖変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、非保存的クロストリジウム毒素軽鎖変異体、クロストリジウム毒素 キメラ 軽鎖、活性のクロストリジウム毒素軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００３９】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは BoNT/A 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/A 軽鎖は配列番号1のアミノ酸 1-448を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、天然 BoNT/A 軽鎖変異体、例えば、BoNT/A アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/A サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1の天然 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、例えば、配列番号1のBoNT/A アイソフォームのアミノ酸1-448または配列番号1のBoNT/A サブタイプのアミノ酸1-448を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、非天然 BoNT/A 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/A 軽鎖変異体、BoNT/A キメラ 軽鎖、活性のBoNT/A 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1の非天然 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、例えば、配列番号1の保存的 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、配列番号1の非保存的 BoNT/A 軽鎖変異体のアミノ酸1-448、配列番号1の活性のBoNT/A 軽鎖断片のアミノ酸1-448、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００４０】
この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、例えば、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸1-448と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、例えば、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸1-448と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４１】
この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、 BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば 少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４２】
この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A 軽鎖は、配列番号1のアミノ酸1-448に対して例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４３】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/B 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/B 軽鎖は配列番号2のアミノ酸1-441を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、天然 BoNT/B 軽鎖変異体、例えば、BoNT/B アイソフォームからの軽鎖または BoNT/B サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2の天然 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、例えば、配列番号2のBoNT/B アイソフォームのアミノ酸1-441 または配列番号2のBoNT/B サブタイプのアミノ酸1-441を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、非天然 BoNT/B 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/B 軽鎖変異体、BoNT/B キメラ 軽鎖、活性のBoNT/B 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、 BoNT/B 軽鎖は、配列番号2の非天然 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、例えば、配列番号2の保存的 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、配列番号2の非保存的 BoNT/B 軽鎖変異体のアミノ酸1-441、配列番号2の活性のBoNT/B 軽鎖断片のアミノ酸1-441、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００４４】
この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、例えば、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸1-441と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、例えば、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸1-441と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド を含む。
【００４５】
この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４６】
この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B 軽鎖は、配列番号2のアミノ酸1-441に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４７】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/C1 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/C1 軽鎖は配列番号3のアミノ酸1-449を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、天然 BoNT/C1 軽鎖変異体、例えば、BoNT/C1 アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/C1 サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3の天然 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、例えば、配列番号3のBoNT/C1 アイソフォームのアミノ酸1-449または配列番号3のBoNT/C1 サブタイプのアミノ酸1-449を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、非天然 BoNT/C1 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体、BoNT/C1 キメラ 軽鎖、活性のBoNT/C1 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3の非天然 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、例えば、配列番号3の保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、配列番号3の非保存的 BoNT/C1 軽鎖変異体のアミノ酸1-449、配列番号3の活性のBoNT/C1 軽鎖断片のアミノ酸1-449、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００４８】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、例えば、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449 と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸1-449と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、例えば、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸1-449 と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸1-449と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４９】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチド を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチド を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５０】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 軽鎖は、配列番号3のアミノ酸1-449に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５１】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/D 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/D 軽鎖は配列番号4のアミノ酸1-445を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、天然 BoNT/D 軽鎖変異体、例えば、BoNT/D アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/D サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4の天然 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、例えば、配列番号4のBoNT/D アイソフォームのアミノ酸1-445または配列番号4のBoNT/D サブタイプのアミノ酸1-445を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、非天然 BoNT/D 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/D 軽鎖変異体、BoNT/D キメラ 軽鎖、活性のBoNT/D 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4の非天然 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、例えば、配列番号4の保存的 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、配列番号4の非保存的 BoNT/D 軽鎖変異体のアミノ酸1-445、配列番号4の活性のBoNT/D 軽鎖断片のアミノ酸1-445、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００５２】
この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、例えば、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸1-445と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、例えば、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸1-445と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５４】
この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D 軽鎖は、配列番号4のアミノ酸1-445に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５５】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは BoNT/E 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/E 軽鎖は配列番号5のアミノ酸1-422を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、天然 BoNT/E 軽鎖変異体、例えば BoNT/E アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/E サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5の天然 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、例えば、配列番号5のBoNT/E アイソフォームのアミノ酸1-422または配列番号5のBoNT/E サブタイプのアミノ酸1-422を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、非天然 BoNT/E 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/E 軽鎖変異体、BoNT/E キメラ 軽鎖、活性のBoNT/E 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5の非天然 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、例えば、配列番号5の保存的 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、配列番号5の非保存的 BoNT/E 軽鎖変異体のアミノ酸1-422、配列番号5の活性のBoNT/E 軽鎖断片のアミノ酸1-422、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００５６】
この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、例えば、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸1-422と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、例えば、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸1-422と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５７】
この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５８】
この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E 軽鎖は、配列番号5のアミノ酸1-422に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５９】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/F 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/F 軽鎖は配列番号6のアミノ酸1-439を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、天然 BoNT/F 軽鎖変異体、例えば、BoNT/F アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/F サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6の天然 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、例えば、配列番号6のBoNT/F アイソフォームのアミノ酸1-439 または配列番号6のBoNT/F サブタイプのアミノ酸1-439を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、非天然 BoNT/F 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/F 軽鎖変異体、BoNT/F キメラ 軽鎖、活性のBoNT/F 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6の非天然 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、例えば、配列番号6の保存的 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、配列番号6の非保存的 BoNT/F 軽鎖変異体のアミノ酸1-439、配列番号6の活性のBoNT/F 軽鎖断片のアミノ酸1-439またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００６０】
この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、例えば、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸1-439と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、例えば、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸1-439と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６１】
この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６２】
この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F 軽鎖は、配列番号6のアミノ酸1-439に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６３】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはBoNT/G 軽鎖を含む。この態様の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、天然 BoNT/G 軽鎖変異体、例えば、BoNT/G アイソフォームからの軽鎖またはBoNT/G サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7の天然 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、例えば、配列番号7のBoNT/G アイソフォームのアミノ酸1-446または配列番号7のBoNT/G サブタイプのアミノ酸1-446を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、非天然 BoNT/G 軽鎖変異体、例えば、保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、非保存的 BoNT/G 軽鎖変異体、BoNT/G キメラ 軽鎖、活性のBoNT/G 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7の非天然 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、例えば、配列番号7の保存的 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、配列番号7の非保存的 BoNT/G 軽鎖変異体のアミノ酸1-446、配列番号7の活性のBoNT/G 軽鎖断片のアミノ酸1-446、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００６４】
この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、例えば、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸1-446と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、例えば、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸1-446と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６５】
この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６６】
この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G 軽鎖は、配列番号7のアミノ酸1-446に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６７】
別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはTeNT 軽鎖を含む。この態様の側面において、TeNT 軽鎖は配列番号8のアミノ酸1-457を含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、天然 TeNT 軽鎖変異体、例えば、TeNT アイソフォームからの軽鎖またはTeNT サブタイプからの軽鎖を含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8の天然 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、例えば、配列番号8のTeNT アイソフォームのアミノ酸1-457または配列番号8のTeNT サブタイプのアミノ酸1-457を含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、非天然 TeNT 軽鎖変異体、例えば、保存的 TeNT 軽鎖変異体、非保存的 TeNT 軽鎖変異体、TeNT キメラ 軽鎖、活性のTeNT 軽鎖断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8の非天然 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、例えば、配列番号8の保存的 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、配列番号8の非保存的 TeNT 軽鎖変異体のアミノ酸1-457、配列番号8の活性のTeNT 軽鎖断片のアミノ酸1-457、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００６８】
この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、例えば、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 85％のアミノ酸同一性 、配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸1-457と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、例えば、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸1-457と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６９】
この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００７０】
この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT 軽鎖は、配列番号8のアミノ酸1-457に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００７１】
本発明の側面は、部分的には、クロストリジウム毒素転位置ドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素転位置ドメイン」という用語は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来るあらゆるクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。したがって、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、クロストリジウム毒素軽鎖の膜を横切る運動を促進し、クロストリジウム毒素軽鎖の膜を介する細胞内小胞から細胞の細胞質への運動を包含する。クロストリジウム毒素転位置ドメインの非限定的な例としては、例えば、クロストリジウム毒素 HN 領域 例えば、BoNT/A HN 領域、BoNT/B HN 領域、BoNT/C1 HN 領域、BoNT/D HN 領域、BoNT/E HN 領域、BoNT/F HN 領域、BoNT/G HN 領域、およびTeNT HN 領域が挙げられる。
【００７２】
クロストリジウム毒素転位置ドメインとしては、これらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプ; 非天然クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体、クロストリジウム毒素 HN 領域キメラ、その活性のクロストリジウム毒素 HN 領域 断片、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【００７３】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HN 領域 変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列 (表1参照)の対応する領域から少なくとも１つの アミノ酸変化を有し、その参照配列の対応する領域に対してパーセント同一性において記載できるクロストリジウム毒素 HN 領域を意味する。明示的に示さない限り、本明細書に開示されるすべてのクロストリジウム毒素 HN 領域 変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来る。非限定的な例として、配列番号1のアミノ酸449-873を含むBoNT/A HN 領域 変異体は、配列番号1のアミノ酸領域449-873と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号2のアミノ酸442-860を含むBoNT/B HN 領域 変異体は、配列番号2のアミノ酸 領域 442-860と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号3のアミノ酸450-868を含むBoNT/C1 HN 領域 変異体は、配列番号3のアミノ酸 領域 450-868と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号4のアミノ酸446-864を含むBoNT/D HN 領域 変異体は、配列番号4のアミノ酸 領域 446-864と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号5のアミノ酸423-847を含むBoNT/E HN 領域変異体は、配列番号5のアミノ酸領域 423-847と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号6のアミノ酸440-866を含むBoNT/F HN 領域変異体は、配列番号6のアミノ酸領域 440-866と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号7のアミノ酸447-865を含むBoNT/G HN 領域変異体は、配列番号7の アミノ酸領域 447-865と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; および配列番号8のアミノ酸458-881を含むTeNT HN 領域変異体は、配列番号8のアミノ酸領域 458-881と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【００７４】
クロストリジウム毒素の各血清型のなかに、アミノ酸配列において、およびかかるタンパク質をコードする核酸においてもなんらか相違する天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が存在しうることが当業者に認識されている。例えば、現在では４つのBoNT/A サブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3およびBoNT/A4が存在し、これらは別のBoNT/A HN 領域サブタイプと比較しておよそ 87％のアミノ酸同一性を示す特定の HN 領域サブタイプを有する。本明細書において用いる場合、「天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、天然プロセスによって生産されたあらゆるクロストリジウム毒素 HN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォーム、自然突然変異によって生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプが挙げられる。天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることができる。天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸 または １００以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【００７５】
天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォーム、例えば、BoNT/A HN 領域アイソフォーム、BoNT/B HN 領域アイソフォーム、BoNT/C1 HN 領域アイソフォーム、BoNT/D HN 領域アイソフォーム、BoNT/E HN 領域アイソフォーム、BoNT/F HN 領域アイソフォーム、BoNT/G HN 領域アイソフォーム、およびTeNT HN 領域アイソフォームである。クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォーム は、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームが基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。
【００７６】
天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の別の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプ、例えば、サブタイプ BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 およびBoNT/A4からのHN 領域サブタイプ； BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B 二価およびBoNT/B タンパク非分解性からのHN 領域サブタイプ； BoNT/C1-1 およびBoNT/C1-2からのHN 領域サブタイプ； BoNT/E1、BoNT/E2およびBoNT/E3からのHN 領域;および、サブタイプ BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3およびBoNT/F4からのHN 領域である。クロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプ は、クロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプが基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。
【００７７】
本明細書において用いる場合、「非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、ヒト操作の助けによって生産されたあらゆるクロストリジウム毒素 HN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域および化学合成により生産されたクロストリジウム毒素 HN 領域が挙げられる。非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、クロストリジウム毒素 HN 領域キメラ変異体 および活性のクロストリジウム毒素 HN 領域断片が挙げられる。
【００７８】
本明細書において用いる場合、「保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素 HN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸と類似の少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸 アナログによって少なくとも１つの アミノ酸が置換されたクロストリジウム毒素 HN 領域を意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体 は、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸または５００以上のアミノ酸が置換している可能性がある。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 BoNT/A HN 領域変異体、保存的 BoNT/B HN 領域変異体、保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、保存的 BoNT/D HN 領域変異体、保存的 BoNT/E HN 領域変異体、保存的 BoNT/F HN 領域変異体、保存的 BoNT/G HN 領域変異体、および保存的 TeNT HN 領域変異体が挙げられる。
【００７９】
本明細書において用いる場合、「非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体」という用語は、1)非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも１つの アミノ酸が欠失している; 2)非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも１つの アミノ酸が付加している; または3) 少なくとも１つの アミノ酸が参照クロストリジウム毒素 HN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸と類似のいかなる性質も共有しない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログによって置換されている、クロストリジウム毒素 HN 領域を意味する。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体 は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HN 領域に取って代わることが出来る。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体 は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸欠失している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸付加している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸、１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、３００以上のアミノ酸、４００以上のアミノ酸または５００以上のアミノ酸が置換している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能背があり、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 BoNT/A HN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HN 領域変異体、および非保存的 TeNT HN 領域変異体が挙げられる。
【００８０】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HN 領域キメラ」という用語は、少なくとも クロストリジウム毒素 HN 領域の一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表1の参照クロストリジウム毒素 HN 領域とは異なる少なくとも１つの 性質を有する毒素 HN 領域を形成するポリペプチドを意味し、ただしこのクロストリジウム毒素 HN 領域キメラは、LCの細胞内小胞から標的細胞の細胞質への放出を依然として促進することが出来、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体を実施することに寄与できるものである。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「活性のクロストリジウム毒素 HN 領域断片」という用語は、本発明の側面に有用であり得るHN 領域を含むあらゆる様々なクロストリジウム毒素断片を意味し、ただしこれらの活性の断片は、LC の細胞内小胞から標的細胞の細胞質への放出を促進することができ、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行に寄与することができるものである。クロストリジウム毒素の重鎖からのHN 領域はおよそ 410-430 アミノ酸の長さであり、転位置ドメインを含む(表1)。研究によりクロストリジウム毒素 重鎖からのHN 領域の全長が、転位置ドメインの転位置活性に必要であるわけではないことが示された。したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 350 アミノ酸、少なくとも 375 アミノ酸、少なくとも 400 アミノ酸および少なくとも 425 アミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム毒素 HN 領域を含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 350 アミノ酸、多くとも 375 アミノ酸、多くとも 400 アミノ酸および多くとも 425 アミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム毒素 HN 領域を含みうる。
【００８２】
様々な 配列 アラインメント 方法のいずれを用いて天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体および非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル 方法、ローカル 方法およびハイブリッド 方法、例えば、セグメント アプローチ 方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは、当業者の範囲内で本教示から常套の手順である。
【００８３】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素転位置ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HN 領域アイソフォームまたはクロストリジウム毒素 HN 領域サブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、非天然クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HN 領域変異体、クロストリジウム毒素 キメラ HN 領域、活性のクロストリジウム毒素 HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００８４】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは BoNT/A HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、天然 BoNT/A HN 領域変異体、例えば、BoNT/A アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/A サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1の天然 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、例えば、配列番号1のBoNT/A アイソフォームのアミノ酸449-873または配列番号1のBoNT/A サブタイプのアミノ酸449-873を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、非天然 BoNT/A HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/A HN 領域変異体、非保存的 BoNT/A HN 領域変異体、BoNT/A キメラ HN 領域、活性のBoNT/A HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1の非天然 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、例えば、配列番号1の保存的 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、配列番号1の非保存的 BoNT/A HN 領域変異体のアミノ酸449-873、配列番号1の活性のBoNT/A HN 領域断片のアミノ酸449-873、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００８５】
この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸449-873と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸449-873と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８６】
この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸449-873に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873 に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００８７】
この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HN 領域は、配列番号1のアミノ酸449-873に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００８８】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、BoNT/B HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/B HN 領域は配列番号2のアミノ酸442-860を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、天然 BoNT/B HN 領域変異体、例えば、BoNT/B アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/B サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2の天然 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、例えば、配列番号2のBoNT/B アイソフォームのアミノ酸442-860または配列番号2のBoNT/B サブタイプのアミノ酸442-860を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、非天然 BoNT/B HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/B HN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HN 領域変異体、BoNT/B キメラ HN 領域、活性のBoNT/B HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2の非天然 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、例えば、配列番号2の保存的 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、配列番号2の非保存的 BoNT/B HN 領域変異体のアミノ酸442-860、配列番号2の活性のBoNT/B HN 領域断片のアミノ酸442-860、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００８９】
この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸442-860と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸442-860 と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸442-860と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９０】
この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９１】
この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860 に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HN 領域は、配列番号2のアミノ酸442-860に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９２】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/C1 HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、天然 BoNT/C1 HN 領域変異体、例えば、BoNT/C1 アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/C1 サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3の天然 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868、例えば、配列番号3のBoNT/C1 アイソフォームのアミノ酸450-868または配列番号3のBoNT/C1 サブタイプのアミノ酸450-868を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、非天然 BoNT/C1 HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体、BoNT/C1 キメラ HN 領域、活性のBoNT/C1 HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は配列番号3の非天然 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868 、例えば、配列番号3の保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868、配列番号3の非保存的 BoNT/C1 HN 領域変異体のアミノ酸450-868、配列番号3の活性のBoNT/C1 HN 領域断片のアミノ酸450-868、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００９３】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸450-868と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸450-868と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９４】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９５】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HN 領域は、配列番号3のアミノ酸450-868に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９６】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは BoNT/D HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/D HN 領域は配列番号4のアミノ酸446-864を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、天然 BoNT/D HN 領域変異体、例えば、BoNT/D アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/D サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は配列番号4の天然 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、例えば、配列番号4のBoNT/D アイソフォームのアミノ酸446-864または配列番号4のBoNT/D サブタイプのアミノ酸446-864を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、非天然 BoNT/D HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/D HN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HN 領域変異体、BoNT/D キメラ HN 領域、活性のBoNT/D HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4の非天然 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、例えば、配列番号4の保存的 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、配列番号4の非保存的 BoNT/D HN 領域変異体のアミノ酸446-864、配列番号4の活性のBoNT/D HN 領域断片のアミノ酸446-864、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００９７】
この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸446-864と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸446-864と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９８】
この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸446-864に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００９９】
この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HN 領域は、配列番号4のアミノ酸446-864に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１００】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/E HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5のアミノ酸423-847を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、天然 BoNT/E HN 領域変異体、例えば、BoNT/E アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/E サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5の天然 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、例えば、配列番号5のBoNT/E アイソフォームのアミノ酸423-847 または配列番号5のBoNT/E サブタイプのアミノ酸423-847を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、非天然 BoNT/E HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/E HN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HN 領域変異体、BoNT/E キメラ HN 領域、活性のBoNT/E HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5の非天然 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、例えば、配列番号5の保存的 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、配列番号5の非保存的 BoNT/E HN 領域変異体のアミノ酸423-847、配列番号5の活性のBoNT/E HN 領域断片のアミノ酸423-847、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１０１】
この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸423-847と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸423-847と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０２】
この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸423-847に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０３】
この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HN 領域は配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HN 領域は、配列番号5のアミノ酸423-847に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０４】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/F HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/F HN 領域は配列番号6のアミノ酸440-866を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、天然 BoNT/F HN 領域変異体、例えば、BoNT/F アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/F サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6の天然 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、例えば、配列番号6のBoNT/F アイソフォームのアミノ酸440-866または配列番号6のBoNT/F サブタイプのアミノ酸440-866を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、非天然 BoNT/F HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/F HN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HN 領域変異体、BoNT/F キメラ HN 領域、活性のBoNT/F HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6の非天然 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、例えば、配列番号6の保存的 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、配列番号6の非保存的 BoNT/F HN 領域変異体のアミノ酸440-866、配列番号6の活性のBoNT/F HN 領域断片のアミノ酸440-866、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１０５】
この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸440-866と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸440-866と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０６】
この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０７】
この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HN 領域は、配列番号6のアミノ酸440-866に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１０８】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/G HN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/G HN 領域は配列番号7のアミノ酸447-865を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、天然 BoNT/G HN 領域変異体、例えば、BoNT/G アイソフォームからのHN 領域またはBoNT/G サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7の天然 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、例えば、配列番号7のBoNT/G アイソフォームのアミノ酸447-865または配列番号7のBoNT/G サブタイプのアミノ酸447-865を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、非天然 BoNT/G HN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/G HN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HN 領域変異体、BoNT/G キメラ HN 領域、活性のBoNT/G HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7の非天然 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、例えば、配列番号7の保存的 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、配列番号7の非保存的 BoNT/G HN 領域変異体のアミノ酸447-865、配列番号7の活性のBoNT/G HN 領域断片のアミノ酸447-865、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１０９】
この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸447-865と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸447-865と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。 
【０１１０】
この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１１】
この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HN 領域は、配列番号7のアミノ酸447-865に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１２】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはTeNT HN 領域を含む。この態様の側面において、TeNT HN 領域は配列番号8のアミノ酸458-881を含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、天然 TeNT HN 領域変異体、例えば、TeNT アイソフォームからのHN 領域またはTeNT サブタイプからのHN 領域を含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8の天然 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、例えば、配列番号8のTeNT アイソフォームのアミノ酸458-881または配列番号8のTeNT サブタイプのアミノ酸458-881を含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、非天然 TeNT HN 領域変異体、例えば、保存的 TeNT HN 領域変異体、非保存的 TeNT HN 領域変異体、TeNT キメラ HN 領域、活性のTeNT HN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8の非天然 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、例えば、配列番号8の保存的 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、配列番号8の非保存的 TeNT HN 領域変異体のアミノ酸458-881、配列番号8の活性のTeNT HN 領域断片のアミノ酸458-881、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１１３】
この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸458-881と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸458-881と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１１４】
この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１５】
この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HN 領域は、配列番号8のアミノ酸458-881に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１１６】
本発明の側面は、部分的には、転位置促進ドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「転位置促進ドメイン」という用語は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来るあらゆるポリペプチドを意味する。したがって、転位置促進ドメインは、クロストリジウム毒素軽鎖が膜を横切る運動においてクロストリジウム毒素転位置ドメインを補助し、細胞内小胞の膜を介する細胞の細胞質へのクロストリジウム毒素軽鎖の運動を包含する。転位置促進ドメインの非限定的な例は、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、例えば、クロストリジウム毒素 HCN 領域、例えば、BoNT/A HCN 領域、BoNT/B HCN 領域、BoNT/C1 HCN 領域、BoNT/D HCN 領域、BoNT/E HCN 領域、BoNT/F HCN 領域、BoNT/G HCN 領域、およびTeNT HCN 領域である。転位置促進ドメインの別の非限定的な例は、エンベロープを持ったウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、アルファウイルス、ベシクロウイルス、レスピロウイルス、モルビリウイルス、アブラウイルス、ヘニパウイルス、メタニューモウイルスおよび泡沫状ウイルスにみられるウイルス融合ペプチドドメインである。
【０１１７】
したがって、一つの態様において、転位置促進ドメインは、クロストリジウム毒素軽鎖が膜を横切る運動においてクロストリジウム毒素転位置ドメインを促進する。この態様の側面において、転位置促進ドメインは、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、少なくとも 10％、少なくとも 20％、少なくとも 30％、少なくとも 40％、少なくとも 50％、少なくとも 60％、少なくとも 70％、少なくとも 80％、少なくとも 90％ または少なくとも 100％上昇させることにより、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において、クロストリジウム毒素転位置ドメインを促進する。この態様の別の側面において、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、少なくとも ２倍、少なくとも ３倍、少なくとも ４倍、少なくとも ５倍、少なくとも １０倍または少なくとも ２０倍上昇させることによって、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置ドメインを促進する。この態様のさらに別の側面において、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、多くとも 10％、多くとも 20％、多くとも 30％、多くとも 40％、多くとも 50％、多くとも 60％、多くとも 70％、多くとも 80％、多くとも 90％または多くとも 100％上昇させることによって、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置ドメインを促進する。この態様の別の側面において、細胞質におけるクロストリジウム毒素軽鎖の量を、例えば、多くとも ２倍、多くとも ３倍、多くとも ４倍、多くとも ５倍、多くとも １０倍または多くとも ２０倍上昇させることによって、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の運動において、転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置ドメインを促進する。
【０１１８】
クロストリジウム毒素「転位置促進ドメイン」には、これらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプ; 非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、クロストリジウム毒素 HCN 領域キメラ、その活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せが含まれる。
【０１１９】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列(表1参照)の対応する領域から少なくとも１つの アミノ酸変化を有し、参照配列の対応する領域に対してパーセント同一性にて記載することが出来るクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味する。明示的に示さない限り、本明細書に開示されるすべてのクロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することができる。非限定的な例として、配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A HCN 領域変異体は、配列番号1のアミノ酸領域 874-1110と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号2のアミノ酸861-1097を含むBoNT/B HCN 領域変異体は、配列番号2のアミノ酸領域 861-1097と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号3のアミノ酸869-1111を含むBoNT/C1 HCN 領域変異体は、配列番号3のアミノ酸領域 869-1111と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号4のアミノ酸865-1098を含む BoNT/D HCN 領域変異体は、配列番号4のアミノ酸領域 865-1098と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号5のアミノ酸848-1085を含む BoNT/E HCN 領域変異体は、配列番号5のアミノ酸領域 848-1085 と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号6のアミノ酸867-1105を含むBoNT/F HCN 領域変異体は、配列番号6のアミノ酸領域 867-1105と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号7のアミノ酸866-1105 を含むBoNT/G HCN 領域変異体は、配列番号7のアミノ酸領域 866-1105と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; および配列番号8のアミノ酸882-1127を含むTeNT HCN 領域変異体は、配列番号8のアミノ酸領域 882-1127と比較して、少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【０１２０】
クロストリジウム毒素の各血清型のなかで、そのアミノ酸配列およびかかるタンパク質をコードする核酸においていくらか相違する天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が存在しうることが当業者に認識されている。例えば、現在４つのBoNT/A サブタイプ、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 および BoNT/A4が存在し、別のBoNT/A HCN 領域サブタイプと比較した場合およそ 87％のアミノ酸同一性を示す特異的 HCN 領域サブタイプを有する。本明細書において用いる場合、「天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、天然プロセスにより生産されるあらゆるクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されるクロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォーム、自然突然変異により生産されるクロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームおよびクロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプが挙げられる。天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸または５０以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【０１２１】
天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォーム、例えば、BoNT/A HCN 領域アイソフォーム、BoNT/B HCN 領域アイソフォーム、BoNT/C1 HCN 領域アイソフォーム、BoNT/D HCN 領域アイソフォーム、BoNT/E HCN 領域アイソフォーム、BoNT/F HCN 領域アイソフォーム、BoNT/G HCN 領域アイソフォーム、およびTeNT HCN 領域アイソフォームである。クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームは、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームが基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。
【０１２２】
天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の別の非限定的な例は、クロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプ、例えば、サブタイプ BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3 およびBoNT/A4からのHCN 領域;サブタイプ BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B 二価 および BoNT/B タンパク非分解性からのHCN 領域;サブタイプ BoNT/C1-1 およびBoNT/C1-2からのHCN 領域;サブタイプ BoNT/E1、BoNT/E2 およびBoNT/E3 HCN 領域; およびサブタイプ BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3およびBoNT/F4からのHCN 領域である。クロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプは、クロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプが基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。
【０１２３】
本明細書において用いる場合、「非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、ヒト 操作の助けにより生産されたあらゆるクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されたクロストリジウム毒素 HCN 領域および化学合成により生産されたクロストリジウム毒素 HCN 領域が挙げられる。非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、クロストリジウム毒素 HCN 領域キメラ変異体および活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片が挙げられる。
【０１２４】
本明細書において用いる場合、「保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素 HCN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸のものと類似する少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸アナログによって少なくとも１つの アミノ酸が置換されたクロストリジウム毒素 HCN 領域を意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域 と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸または１００以上のアミノ酸置換している可能性がある。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、および保存的 TeNT HCN 領域変異体が挙げられる。
【０１２５】
本明細書において用いる場合、「非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体」という用語は、 1) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から欠失している; 2) 少なくとも１つの アミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に付加されている;または 3) 少なくとも１つの アミノ酸が参照クロストリジウム毒素 HCN 領域 配列 (表1)からの元のアミノ酸のものと類似のいかなる性質も共有していない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより置換されている、クロストリジウム毒素 HCN 領域を意味する。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体 は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域と実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に取って代わることが出来る。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸欠失している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、および１０以上のアミノ酸付加されている可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、２０以上のアミノ酸、３０以上のアミノ酸、４０以上のアミノ酸、５０以上のアミノ酸または１００以上のアミノ酸置換している可能性がある。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体はまた、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域から少なくとも 10 の連続するアミノ酸、少なくとも 15 の連続するアミノ酸、少なくとも 20 の連続するアミノ酸、または少なくとも 25 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体が基づく参照クロストリジウム毒素 HCN 領域に対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、および非保存的 TeNT HCN 領域変異体が挙げられる。
【０１２６】
本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素 HCN 領域キメラ」という用語は、少なくともクロストリジウム毒素 HCN 領域の一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、表1の参照クロストリジウム毒素 HCN 領域とは異なる少なくとも１つの性質を有する毒素 HCN 領域を形成するポリペプチドを意味し、ただしこのクロストリジウム毒素 HCN 領域キメラは依然としてLCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程を促進することが出来、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行において寄与しうるものである。
【０１２７】
本明細書において用いる場合、「活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片」という用語は、本発明の側面に有用であり得るHCN 領域を含むあらゆる様々なクロストリジウム毒素断片を意味し、ただし、これらの活性の断片はLCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することができ、したがってクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行において寄与することができるものである。クロストリジウム毒素の重鎖からのHCN ドメインはおよそ 230-250 アミノ酸の長さであり、転位置ドメインを含む(表1)。さらに、クロストリジウム毒素 HCN 領域の境界を規定する特定のアミノ酸位置が同定されているが(表1)、機能的境界は決定的ではないということが当該技術分野において周知である。例えば、すべての天然クロストリジウム毒素についてのHCN ドメインのアミノ末端はHN ドメイン (転位置ドメイン)である。BoNT/Aの構造の調査において、ランダムコイルリンカー領域が HN および HCN ドメインの間の境界を形成している(図7A参照)。BoNT/A HN ドメインはアミノ酸 N859からI873を含むα-ヘリックスにて終わっているようである。α-ヘリックスに続いて、HCN ドメインへと導くランダムコイル (I873からI878)が存在し、ここでβ-シートが位置I878にて開始している。上記残基は決定された二次構造の最初または最後において境界を規定するが、ランダムコイル 領域およびそれがつなげるドメインの一方または両方における残基の間に有意な相互作用(即ち、疎水性、H-結合など)がないことを意味するものではない。したがって、最小限、BoNT/A HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 Y869 から L879に存在するいずれかのアミノ酸を含みうる。同様の分析が、BoNT/B HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は最小限、アミノ酸領域 Y856からL866に存在するいずれかのアミノ酸でありうることを示している; BoNT/C1 HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸はアミノ酸領域 Y864から L874に存在するいずれかのアミノ酸でありうる; BoNT/D HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 Y860から L870に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/E HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 F843からL853に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/F HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 L862からL872に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/G HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸はアミノ酸領域 Y861から L871に存在するいずれかのアミノ酸でありうる;そして、TeNT HCN ドメインのアミノ-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 I877から L887に存在するいずれかのアミノ酸であり得る。
【０１２８】
同様に、すべての天然クロストリジウム毒素のHCN ドメインのカルボキシル-末端部分(即ち、HCNおよび HCC ドメインの間の融合点)はある範囲のアミノ酸を含む。秩序だった二次構造の最初または最後としてのBoNT/A HCN ドメインの境界の規定において、HCN ドメインはα-ヘリックスのQ1091にて終わっている可能性があり、HCC ドメインはβ-鎖のK1109から開始している可能性がある(図7B参照)。これら２つのドメインに介在するアミノ酸配列は、より長いランダムコイルを含むが、これはランダムコイルが構造的に重要ではないことを意味するわけではない。実際、このランダムコイルは、HCN および HCC ドメインの両方と大きな相互作用を有する (即ち、疎水性およびH-結合)。したがって、最小限、BoNT/A HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 D1089からY1111に存在するいずれかのアミノ酸を含みうる。同様の分析が、最小限、BoNT/B HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸はアミノ酸領域 K1076からY1098に存在するいずれかのアミノ酸であることを示している; BoNT/C1 HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 N1090から Y1112に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/D HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 E1077から Y1099に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/E HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 S1064からY1086に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/F HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 S1084から Y1106に存在するいずれかのアミノ酸であり得る; BoNT/G HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 W1084から Y1106に存在するいずれかのアミノ酸であり得る;および、TeNT HCN ドメインのカルボキシル-末端境界を規定するアミノ酸は、アミノ酸領域 T1106から Y1128に存在するいずれかのアミノ酸であり得る。
【０１２９】
したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 200 アミノ酸、少なくとも 225 アミノ酸、少なくとも 250 アミノ酸および少なくとも 275 アミノ酸の長さを有する転位置促進ドメインを含むクロストリジウム毒素 HCN 領域を含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 200 アミノ酸、多くとも 225 アミノ酸、多くとも 250 アミノ酸および多くとも 275 アミノ酸の長さを有する転位置促進ドメインを含むクロストリジウム毒素 HCN 領域を含みうる。
【０１３０】
様々な配列アラインメント方法のいずれを用いて天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体および非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル 方法、ローカル 方法およびハイブリッド 方法、例えば、セグメント アプローチ 方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは、当業者の範囲内で、本教示から常套の手順である。
【０１３１】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はクロストリジウム毒素転位置ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、クロストリジウム毒素 HCN 領域アイソフォームまたはクロストリジウム毒素 HCN 領域サブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、非天然クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、非保存的クロストリジウム毒素 HCN 領域変異体、クロストリジウム毒素 キメラ HCN 領域、活性のクロストリジウム毒素 HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１３２】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、BoNT/A HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、天然 BoNT/A HCN 領域変異体、例えば、BoNT/A アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/A サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1の天然 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、例えば、配列番号1のBoNT/A アイソフォームのアミノ酸874-1110または配列番号1のBoNT/A サブタイプのアミノ酸874-1110 を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、非天然 BoNT/A HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/A HCN 領域変異体、BoNT/A キメラ HCN 領域、活性のBoNT/A HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1の非天然 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、例えば、配列番号1の保存的 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、配列番号1の非保存的 BoNT/A HCN 領域変異体のアミノ酸874-1110、配列番号1の活性のBoNT/A HCN 領域断片のアミノ酸874-1110、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１３３】
この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸874-1110と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、例えば、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号1のアミノ酸874-1110と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３４】
この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１３５】
この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/A HCN 領域は、配列番号1のアミノ酸874-1110に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１３６】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/B HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/B HCN 領域は配列番号2のアミノ酸861-1097を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、天然 BoNT/B HCN 領域変異体、例えば、BoNT/B アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/B サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2の天然 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、例えば、配列番号2のBoNT/B アイソフォームのアミノ酸861-1097または配列番号2のBoNT/B サブタイプのアミノ酸861-1097を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、非天然 BoNT/B HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/B HCN 領域変異体、BoNT/B キメラ HCN 領域、活性のBoNT/B HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2の非天然 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、例えば、配列番号2の保存的 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、配列番号2の非保存的 BoNT/B HCN 領域変異体のアミノ酸861-1097、配列番号2の活性のBoNT/B HCN 領域断片のアミノ酸861-1097、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１３７】
この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸861-1097と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、例えば、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号2のアミノ酸861-1097と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３８】
この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１３９】
この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/B HCN 領域は、配列番号2のアミノ酸861-1097に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４０】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/C1 HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は配列番号3のアミノ酸869-1111を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体、例えば、BoNT/C1 アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/C1 サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3の天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、例えば、配列番号3のBoNT/C1 アイソフォームのアミノ酸869-1111または配列番号3のBoNT/C1 サブタイプのアミノ酸869-1111を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、非天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体、BoNT/C1 キメラ HCN 領域、活性のBoNT/C1 HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3の非天然 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、例えば、配列番号3の保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、配列番号3の非保存的 BoNT/C1 HCN 領域変異体のアミノ酸869-1111、配列番号3の活性のBoNT/C1 HCN 領域断片のアミノ酸869-1111、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１４１】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸869-1111と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号3のアミノ酸869-1111と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４２】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４３】
この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して、例えば、多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/C1 HCN 領域は、例えば、配列番号3のアミノ酸869-1111に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４４】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/D HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/D HCN 領域は配列番号4のアミノ酸865-1098を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は天然 BoNT/D HCN 領域変異体、例えば、BoNT/D アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/D サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、配列番号4の天然 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、例えば、配列番号4のBoNT/D アイソフォームのアミノ酸865-1098または配列番号4のBoNT/D サブタイプのアミノ酸865-1098 を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は非天然 BoNT/D HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/D HCN 領域変異体、BoNT/D キメラ HCN 領域、活性のBoNT/D HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、配列番号4の非天然 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、例えば、配列番号4の保存的 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、配列番号4の非保存的 BoNT/D HCN 領域変異体のアミノ酸865-1098、配列番号4の活性のBoNT/D HCN 領域断片のアミノ酸865-1098、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１４５】
この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸865-1098と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号4のアミノ酸865-1098と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４６】
この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４７】
この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/D HCN 領域は、例えば、配列番号4のアミノ酸865-1098に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１４８】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/E HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/E HCN 領域は配列番号5のアミノ酸848-1085を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、天然 BoNT/E HCN 領域変異体、例えば、BoNT/E アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/E サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、配列番号5の天然 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、例えば、配列番号5のBoNT/E アイソフォームのアミノ酸848-1085 または配列番号5のBoNT/E サブタイプのアミノ酸848-1085を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、非天然 BoNT/E HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/E HCN 領域変異体、BoNT/E キメラ HCN 領域、活性のBoNT/E HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は配列番号5の非天然 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、例えば、配列番号5の保存的 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、配列番号5の非保存的 BoNT/E HCN 領域変異体のアミノ酸848-1085、配列番号5の活性のBoNT/E HCN 領域断片のアミノ酸848-1085、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１４９】
この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸848-1085と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号5のアミノ酸848-1085と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５０】
この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５１】
この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/E HCN 領域は、例えば、配列番号5のアミノ酸848-1085に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５２】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはBoNT/F HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/F HCN 領域は配列番号6のアミノ酸867-1105を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、天然 BoNT/F HCN 領域変異体、例えば、BoNT/F アイソフォーム からの HCN 領域またはBoNT/F サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、配列番号6の天然 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、例えば、配列番号6のBoNT/F アイソフォームのアミノ酸867-1105または配列番号6のBoNT/F サブタイプのアミノ酸867-1105を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、非天然 BoNT/F HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/F HCN 領域変異体、BoNT/F キメラ HCN 領域、活性のBoNT/F HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、配列番号6の非天然 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、例えば、配列番号6の保存的 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、配列番号6の非保存的 BoNT/F HCN 領域変異体のアミノ酸867-1105、配列番号6の活性のBoNT/F HCN 領域断片のアミノ酸867-1105、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１５３】
この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸867-1105と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号6のアミノ酸867-1105と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５４】
この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５５】
この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、BoNT/F HCN 領域は、例えば、配列番号6のアミノ酸867-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５６】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは BoNT/G HCN 領域を含む。この態様の側面において、BoNT/G HCN 領域は配列番号7のアミノ酸866-1105を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は天然 BoNT/G HCN 領域変異体、例えば、BoNT/G アイソフォームからのHCN 領域またはBoNT/G サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、配列番号7の天然 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、例えば、配列番号7のBoNT/G アイソフォームのアミノ酸866-1105または配列番号7のBoNT/G サブタイプのアミノ酸866-1105を含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、非天然 BoNT/G HCN 領域変異体、例えば、保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、非保存的 BoNT/G HCN 領域変異体、BoNT/G キメラ HCN 領域、活性のBoNT/G HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、配列番号7の非天然 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、例えば、配列番号7の保存的 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、配列番号7の非保存的 BoNT/G HCN 領域変異体のアミノ酸866-1105、配列番号7の活性のBoNT/G HCN 領域断片のアミノ酸866-1105、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１５７】
この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸866-1105と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号7のアミノ酸866-1105と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５８】
この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１５９】
この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、BoNT/G HCN 領域は、例えば、配列番号7のアミノ酸866-1105に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１６０】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置ドメインはTeNT HCN 領域を含む。この態様の側面において、TeNT HCN 領域は配列番号8のアミノ酸882-1127を含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、天然 TeNT HCN 領域変異体、例えば、TeNT アイソフォームからの HCN 領域またはTeNT サブタイプからのHCN 領域を含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、配列番号8の天然 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、例えば、配列番号8のTeNT アイソフォームのアミノ酸882-1127 または配列番号8のTeNT サブタイプのアミノ酸882-1127を含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、非天然 TeNT HCN 領域変異体、例えば、保存的 TeNT HCN 領域変異体、非保存的 TeNT HCN 領域変異体、TeNT キメラ HCN 領域、活性のTeNT HCN 領域断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、配列番号8の非天然 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、例えば、配列番号8の保存的 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、配列番号8の非保存的 TeNT HCN 領域変異体のアミノ酸882-1127、配列番号8の活性のTeNT HCN 領域断片のアミノ酸882-1127、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１６１】
この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸882-1127と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号8のアミノ酸882-1127と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６２】
この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100または200 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１６３】
この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、TeNT HCN 領域は、例えば、配列番号8のアミノ酸882-1127に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50または100 の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１６４】
エンベロープを持ったウイルスの膜の細胞膜への融合は、宿主細胞の細胞質へのウイルスカプセルの放出において必須の工程である。この融合事象は、ウイルス膜に位置するウイルス糖タンパク質に存在する融合ペプチド セグメントによって媒介され、pH-依存的またはpH-非依存的プロセスのいずれかを伴い、例えば、Frederick M. Hughson、Structural Characterization of Viral Fusion Proteins、5(3) Curr. Biol. 189-274 (1159); Trudy G. Morrison、Structure and Function of a Paramyxovirus Fusion Protein、1614 (1) Biochim. Biophys. Acta. 73-84; David J. Schibli and Winfried Weissenhorn、Class I and Class II Viral Fusion Protein Structures Reveal Similar Principles in Membrane Fusion、21(6) Mol. Membr. Biol. 361-371 (1168)を参照されたい。融合ペプチドドメインは、ウイルスカプセルの細胞膜への挿入において補助する疎水性のおよそ 20-30 アミノ酸のグリシンリッチペプチドを含む。したがって、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインは転位置促進ドメインとして有用であり得る。
【０１６５】
エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインとしては、これらに限定されないが、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームおよびエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプ; 非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン キメラ、その活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン 断片、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【０１６６】
本明細書において用いる場合、「エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、天然または非天然を問わず、開示された参照配列の対応する領域から少なくとも１つの アミノ酸変化を有し、その参照配列の対応する領域に対するパーセント同一性において記載できるエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味する。明示的に示さない限り、本明細書に開示するすべてのクロストリジウム毒素 HCN 領域変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖の転位置を媒介する中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来る。非限定的な例として、配列番号118を含むインフルエンザウイルス A 融合ペプチドドメイン変異体は、配列番号118と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号123を含むセムリキ森林ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号123と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号125を含む東部ウマ脳炎ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号125と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号133を含むベネズエラウマ脳炎ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は、配列番号133と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号150を含む水疱性口内炎ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号150と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号161を含むセンダイウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号161と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号168を含むイヌジステンパーウイルス融合ペプチドドメイン変異体は、配列番号168と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号178を含むニューカッスル病ウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号178と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;そして配列番号191を含むヘンドラウイルス融合ペプチドドメイン変異体は配列番号191と比較して少なくとも１つの アミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【０１６７】
各エンベロープを持ったウイルスについて、そのアミノ酸配列およびかかるタンパク質をコードする核酸においていくらか異なる天然 融合ペプチドドメイン変異体が存在しうることが当業者に認識されている。例えば、インフルエンザAウイルス 赤血球凝集素に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも５の 天然変異体が知られている(配列番号118 から配列番号122);東部ウマ脳炎ウイルス E1 タンパク質に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも６の 天然変異体が知られている(配列番号125から配列番号130); ベネズエラウマ脳炎ウイルス E1 タンパク質に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも８の 天然変異体が知られている(配列番号133から 配列番号140);水疱性口内炎ウイルス (VSV) 糖タンパク質 Gに存在する融合ペプチドドメインの少なくとも７の 天然変異体が知られている(配列番号150から配列番号156); および、ニューカッスル病ウイルス F タンパク質 に存在する融合ペプチドドメインの少なくとも１１の 天然変異体が知られている(配列番号178から配列番号188)。本明細書において用いる場合、「エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、天然プロセスによって生産されるあらゆるエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味し、例えば、これらに限定されないが、選択的スプライシングされた転写産物から生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォーム、自然突然変異により生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームおよびエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプが挙げられる。天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体 は、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において、参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸または１０以上のアミノ酸置換している可能性がある。天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体はまた、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも 2 の連続するアミノ酸、少なくとも 3 の連続するアミノ酸、少なくとも 4 の連続するアミノ酸、または少なくとも 5 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。
【０１６８】
天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォーム、例えば、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、アルファウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、レスピロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、モルビリウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、アブラウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインアイソフォーム、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームおよび泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームである。エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォーム は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。
【０１６９】
天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプ、例えば、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、アルファウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、レスピロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、モルビリウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、アブラウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインサブタイプ および泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインサブタイプである。エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプ は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。
【０１７０】
本明細書において用いる場合、「非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、ヒト操作の助けにより生産されたあらゆるエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味し、例えば、これらに限定されないが、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインおよび化学合成により生産されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが挙げられる。非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例としては、 例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラ変異体および活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片が挙げられる。
【０１７１】
本明細書において用いる場合、「保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、参照エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン配列からの元のアミノ酸と類似の少なくとも１つの 性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより少なくとも１つのアミノ酸が置換されたエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味する。性質の例としては、これらに限定されないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的 性質など、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸または１０以上のアミノ酸置換している可能性がある。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体はまた、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも 2 の連続するアミノ酸、少なくとも 3 の連続するアミノ酸、少なくとも 4 の連続するアミノ酸、または少なくとも 5 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例としては、例えば、保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体および保存的 泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン変異体が挙げられる。
【０１７２】
本明細書において用いる場合、「非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体」という用語は、1)非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも１つの アミノ酸が欠失している; 2)非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインが基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも１つの アミノ酸が付加されている; または、 3)参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン配列からの元のアミノ酸のものと類似のいかなる性質も共有しない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより少なくとも１つの アミノ酸 が置換されている、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを意味する。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体 は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインと実質的に同様に機能することが出来、本発明のあらゆる側面において参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに取って代わることが出来る。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸または５以上のアミノ酸が欠失している可能性がある。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン に対して１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸または５以上のアミノ酸が付加されている可能性がある。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体は、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸または１０以上のアミノ酸が置換している可能性がある。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体 はまた、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインから少なくとも 2 の連続するアミノ酸、少なくとも 3 の連続するアミノ酸、少なくとも 4 の連続するアミノ酸、または少なくとも 5 の連続するアミノ酸置換している可能性があり、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体が基づく参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインに対して少なくとも 50％のアミノ酸同一性、65％のアミノ酸同一性、75％のアミノ酸同一性、85％のアミノ酸同一性または95％のアミノ酸同一性を有する。非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体の非限定的な例としては、例えば、非保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体および非保存的 泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン変異体が挙げられる。
【０１７３】
本明細書において用いる場合、「エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラ」という用語は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインの少なくとも一部および少なくとも１つのその他のポリペプチドの少なくとも一部を含み、参照 エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインとは異なる少なくとも１つの 性質を有するエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを形成する、ポリペプチドを意味し、ただし、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラは依然としてLCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行に寄与することが出来るものである。
【０１７４】
本明細書において用いる場合、「活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片」という用語は、LCが細胞内小胞から標的細胞の細胞質へと放出される中毒プロセスの転位置工程をさらに促進することが出来、したがって、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解により切断する細胞機構の全体の実行に寄与することが出来るあらゆる様々な エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片を意味する。エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインはおよそ 15-30 アミノ酸の長さである。したがって、この態様の側面は、例えば、少なくとも 10 アミノ酸、少なくとも 15 アミノ酸、少なくとも 20 アミノ酸および少なくとも 25 アミノ酸の長さを有する活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片を含む転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面は、例えば、多くとも 10 アミノ酸、多くとも 15 アミノ酸、多くとも 20 アミノ酸および多くとも 25 アミノ酸の長さを有する活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片を含む転位置促進ドメインを含みうる。
【０１７５】
様々な 配列 アラインメント 方法のいずれを用いて、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体および非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体のパーセント同一性を決定してもよく、例えば、これらに限定されないが、グローバル方法、ローカル方法およびハイブリッド 方法、例えば、セグメント アプローチ 方法が挙げられる。パーセント同一性を決定するプロトコールは当業者の範囲内であり、本教示から常套の手順である。
【０１７６】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素は、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインを含むクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームまたはエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインキメラ、活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１７７】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122の天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122のインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122のインフルエンザウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122の非天然 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122の保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122の非保存的 インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122の活性の インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１７８】
この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１７９】
この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８０】
この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121 または配列番号122に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８１】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはアルファウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、天然 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、アルファウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはアルファウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149の天然 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149のアルファウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149のアルファウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、アルファウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の アルファウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149の非天然 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149の保存的 ��ルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149の非保存的 アルファウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149の活性の アルファウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１８２】
この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と少なくとも 90％のアミノ酸同一性 または配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８３】
この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149 に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８４】
この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、アルファウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148 または配列番号149に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８５】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはベシクロウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはベシクロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160の天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160のベシクロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160のベシクロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160の非天然 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160の保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160の非保存的 ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160の活性の ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１８６】
この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８７】
この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８８】
この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159 または配列番号160に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１８９】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはレスピロウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、レスピロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはレスピロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167の天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167のレスピロウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167のレスピロウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、レスピロウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の レスピロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167の非天然 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167の保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167の非保存的 レスピロウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167の活性の レスピロウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１９０】
この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９１】
この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９２】
この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166 または配列番号167に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９３】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、モルビリウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、モルビリウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはモルビリウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177の天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177のモルビリウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177のモルビリウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、モルビリウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の モルビリウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177の非天然 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177の保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177の非保存的 モルビリウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177の活性の モルビリウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１９４】
この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９５】
この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９６】
この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176 または配列番号177に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０１９７】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、アブラウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、アブラウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはアブラウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190の天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190のアブラウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190のアブラウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、アブラウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の アブラウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190の非天然 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190の保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190の非保存的 アブラウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190の活性の アブラウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０１９８】
この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９９】
この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２００】
この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、アブラウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189 または配列番号190に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２０１】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインはヘニパウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはヘニパウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号191 または配列番号192の天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号191 または配列番号192のヘニパウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号191 または配列番号192のヘニパウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、非天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号191 または配列番号192の非天然 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号191 または配列番号192の保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号191 または配列番号192の非保存的 ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号191 または配列番号192の活性の ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０２０２】
この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号191または配列番号192と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号191または配列番号192と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号191または配列番号192と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２０３】
この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。 
【０２０４】
この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号191または配列番号192に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２０５】
別の態様において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたはメタニューモウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、配列番号193の天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、配列番号193のメタニューモウイルス融合ペプチドドメインアイソフォームまたは配列番号193のメタニューモウイルス融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、非天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、非保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインキメラ、活性の メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメインは、配列番号193の非天然 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体のアミノ酸、例えば、配列番号193の保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号193の非保存的 メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン変異体、配列番号193の活性の メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【０２０６】
この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号193と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号193と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号193と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号193と少なくとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号193と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193と多くとも 70％のアミノ酸同一性、配列番号193と多くとも 75％のアミノ酸同一性、配列番号193と多くとも 80％のアミノ酸同一性、配列番号193と多くとも 85％のアミノ酸同一性、配列番号193と多くとも 90％のアミノ酸同一性または配列番号193と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２０７】
この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続しないアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２０８】
この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。 この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。 この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、メタニューモイルス融合ペプチドドメイン は、例えば、配列番号193に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または10の連続するアミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０２０９】
本発明の側面は、部分的には変化したターゲティングドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「変化したターゲティングドメイン」という用語は、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することが出来、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒させる全体のインターナリゼーション 機構を開始することが出来るあらゆるポリペプチドを意味する。本明細書において用いる場合、「選択的に」という用語は、高度に好ましい活性または作用を有することを意味する。本明細書において用いる場合、「選択的に結合する」という用語は、分子が生理条件下で、または生理条件下に実質的に近いインビトロ条件で、その他の非標的受容体と比較して統計的に有意に大きい程度でその標的受容体に結合することが出来ることを意味する。したがって、本明細書の変化したターゲティングドメインに対する言及において、非クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する変化したターゲティングドメインの差別的な結合が存在する。
【０２１０】
本発明の側面は、部分的には変化したターゲティングドメインを提供する。本明細書において用いる場合、「変化したターゲティングドメイン」という用語は、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することが出来、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒させる全体のインターナリゼーション 機構を開始させることが出来るあらゆるポリペプチドを意味する。本明細書において用いる場合、「選択的に」という用語は、高度に好ましい活性または作用を有することを意味する。本明細書において用いる場合、「選択的に結合する」という用語は、分子が生理条件下で、または生理条件下に実質的に近いインビトロ条件で、その他の非標的受容体と比較して統計的に有意に大きい程度でその標的受容体に結合することが出来ることを意味する。したがって、本明細書の変化したターゲティングドメインに対する言及において、クロストリジウム毒素標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する変化したターゲティングドメインの差別的な結合が存在する。
【０２１１】
本明細書に開示する変化したターゲティングドメインは、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の、クロストリジウム毒素標的細胞の表面に位置する非クロストリジウム毒素受容体に対する結合活性を促進する。 本明細書において用いる場合、「結合活性」という用語は、１つの分子が、少なくとも１つの分子間または分子内力、例えば、これらに限定されないが、共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用等、またはそれらのあらゆる組合せを介して別の分子と直接的または間接的に接触することを意味する。「結合した」および「結合する」は、結合について考えられる用語である。
【０２１２】
本明細書において用いる場合、「結合親和性」という用語は、特定の受容体に対して分子の結合活性がいかに強いかを意味する。一般に、高い結合親和性は、結合ドメインとその受容体とのより大きい分子間力に起因し、一方低い結合親和性は、リガンドとその受容体とのより小さい分子間力を伴う。高い結合親和性は、低い結合親和性の場合よりもその受容体結合部位における結合ドメインについてのより長い滞留時間を伴う。したがって、高い結合親和性を有する分子は、受容体の結合部位を最大に占有し、生理応答を引き起こすのに必要な分子の濃度がより低いことを意味する。逆に、低い結合親和性は、受容体の受容体結合部位が最大に占有され、最大の生理応答が達成される前に必要な分子の濃度が比較的高いことを意味する。したがって、高い結合親和性に起因する上昇した結合活性を有する改変クロストリジウム毒素は、毒素のより低用量の投与を可能にし、それにより、毒素の非標的化領域への分散に伴う望ましくない 副作用を低下または予防する。
【０２１３】
本明細書において用いる場合、「結合特異性」という用語は、１つの特定の受容体に対して分子の結合活性がどの程度特異的であるかを意味する。一般に、高い結合特異性は１つの特定の受容体または受容体の亜群とのより独占的な相互作用をもたらし、一方低い結合特異性は、より大きい群の受容体とのより乱れた相互作用をもたらす。したがって、高い結合特異性を有する分子は、分子が特定の受容体の結合部位を占有し、生理応答を惹起することを意味する。逆に、低い結合特異性は、分子が多くの受容体の結合部位を占有し多数の生理応答を惹起することを意味する。したがって、高い結合特異性に起因する上昇した結合活性を有する改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素標的細胞のある亜群に存在する非クロストリジウム毒素受容体のみを標的化し、それによりすべてのクロストリジウム毒素標的細胞の標的化に伴う副作用が低減される。
【０２１４】
その変化したターゲィング活性に加えて、本明細書の開示される天然のターゲティングドメインの変化したターゲットドメインとの置換は、改変毒素が免疫原性応答を誘発する可能性を減少するというさらなる利点を有する。HCC ターゲティングドメインにみられる領域には、抗BoNT/A中和抗体が結合する（例えば、M. Zouhair Atassi et al.、Mapping of the Antibody-binding Regions on Botulinum Neurotoxin H-chain Domain 855-1296 with Anti-toxin Antibodies from Three Host Species、15 J. PROT. CHEM. 691-700、(1996); M. Zouhair Atassi & Behzod Z. Dolimbek、Mapping of the Antibody-binding Profile on Botulinum Neurotoxin A HN-domain (residues 449-859) with Anti-toxin Antibodies from Four Host Species. Antigenic Profile of the Entire H-chain of Botulinum Neurotoxin A、23(1) PROTEIN J. 39-52、(2004)を参照）。それゆえ、1) クロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインが不在; 2) ヒト由来の変化したターゲティングドメインはそれがヒトポリペプチドであるためおそらく患者において免疫原性応答を誘発しない、との理由から、このターゲティングドメインの除去により免疫原性応答の可能性が減少する。
【０２１５】
本明細書において用いる場合、用語「クロストリジウム毒素標的細胞」は、天然クロストリジウム毒素により中毒がおこりうる天然の細胞を意味し、限定はされないが、以下が含まれる：運動神経; 感覚神経; 自律神経;例えば、交感神経および副交感神経; 非ペプチド作動性神経、例えば、コリン作動性神経、アドレナリン作動性神経、ノルアドレナリン作動性神経、セロトニン作動性神経、GABA作動性神経; およびペプチド作動性神経、例えば、サブスタンスP 神経、カルシトニン遺伝子関連ペプチド神経、血管作用性小腸ペプチド神経、ニューロペプチド Y神経、コレシストキニン神経。
【０２１６】
天然クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対して結合活性を示す変化したターゲティングドメインはいずれも本発明の側面の実施に使用可能であると想定され、それには、限定はされないが、シナプス前膜に存在する受容体に選択的に結合するポリペプチドおよびシナプス後膜に存在する受容体に選択的に結合するポリペプチドが含まれる。シナプス前膜に存在する受容体に結合すると考えられるポリペプチドには、限定はされないが、以下が含まれる：グルカゴン様ホルモン、例えば、セクレチン、グレリン (GHS)、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、グルカゴン様ペプチド-2 (GLP-2)、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド (PACAP)、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド (GRPP)、オキシントモジュリン (OXY)、血管作用性小腸ペプチド-1 (VIP-1)、血管作用性小腸ペプチド-2 (VIP-2)、胃抑制ポリペプチド (GIP)、ガラニン (Gal) 、またはカルシトニン関連ペプチド、内臓腸管ペプチド（visceral gut peptide）; 神経ホルモン、例えば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CCRH) および副甲状腺ホルモン (PTH); 神経調節サイトカイン、例えば、毛様体神経栄養因子 (CNTF)、グリコホリン-A (GPA)、白血病抑制因子 (LIF)、インターロイキン (IL)、オンコスタチン M (OSM)、カルディオトロフィン-1 (CT-1)、カルディオトロフィン様サイトカイン (CLC)、ニューロロイキン (NL)、VEGF、インシュリン様成長因子-1 (IGF-1)、インシュリン様成長因子-2 (IGF-2) および上皮成長因子  (EGF); ニューロトロフィン、例えば、神経成長因子 (NGF)、脳由来成長因子 (BDNF)、ニューロトロフィン-3 (NT-3) およびニューロトロフィン-4/5 (NT-4/5); 成長因子、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF)、ニュールツリン  (NRTN)、パーセフリン (PSPN)、アルテミン (ARTN); トランスフォーミング成長因子β (TGFβ)、骨形成タンパク質 (BMP)、増殖分化因子 (GDF)、アクチビン; 軸索ガイダンスシグナル伝達分子、例えば、ネトリン、セマフォリン およびエフリン; 糖結合タンパク質、例えば、血清アミロイド P、β-グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、cry1A、殺虫性デルタ-エンドトキシン、アグルチニン、アブリン およびリシン;ニューレキシンに選択的に結合するリガンド、例えば、ニューレキシン-1α およびニューレキシン-1βに対するリガンド;ニューレキシン-2αおよびニューレキシン-2βに対するリガンド;ニューレキシン-3αおよびニューレキシン-3βに対するリガンド; およびWNT。シナプス後膜に存在する受容体に結合すると考えられるリガンドには、限定はされないが、以下が含まれる：Ng-CAM(L1)、NCAM、N-カドヘリン、アグリン-MUSK、基底膜ポリペプチド、例えば、ラミニン β-2。
【０２１７】
変化したターゲティングドメインには、限定はされないが、天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、変化したターゲティングドメインのアイソフォーム; 非天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、キメラの変化したターゲティングドメイン、活性なそれらの変化したターゲティングドメインの断片、またはそれらいずれかの組合せ、が含まれる。
【０２１８】
本明細書において用いる場合、用語「変異体」は、変化したターゲティングドメインの変異体の説明に使用する場合、天然であっても非天然であっても、開示される参照配列の対応領域からの少なくとも1のアミノ酸変化を有し、かつその参照配列の対応領域との同一性の割合で説明可能な、変化したターゲティングドメインを意味する。特記なき限り、本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの変異体はいずれも、クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合可能であり、全内部移行機構を開始させ、それにより本明細書に開示される改変クロストリジウム毒素による標的細胞の中毒がおこる。非限定的な例として、配列番号9のアミノ酸 21-50由来のグリコーゲン由来ペプチド変異体は、配列番号9アミノ酸領域 21-50と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号10のアミノ酸 132-158由来のPACAP変異体は、配列番号10のアミノ酸領域 132-158と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号19のアミノ酸 159-193由来のCCRH変異体は、配列番号19のアミノ酸領域 159-193と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号20のアミノ酸 35-70由来のPTH変異体は、配列番号20のアミノ酸領域 35-70と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号28のアミノ酸 57-210由来のIL-6 変異体は、配列番号28のアミノ酸領域 57-210と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号31のアミノ酸 54-546由来のニューロロイキン変異体は、配列番号31のアミノ酸領域 54-546と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号33のアミノ酸 52-109由来のIGF-1変異体は、配列番号33のアミノ酸領域 52-109と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; および配列番号38のアミノ酸 144-249由来のNT-3 変異体は、配列番号38のアミノ酸領域 144-249と比較して、少なくとも1のアミノ酸の相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【０２１９】
当業者であれば、そのアミノ酸配列が、またそのタンパク質をコードする核酸がある程度相違する、天然の変化したターゲティングドメインの変異体が存在しうることを認識する。本明細書において用いる場合、用語「天然の変化したターゲティングドメインの変異体」は、天然のプロセスにより産生されるあらゆる変化したターゲティングドメインを意味し、限定はされないが、選択的にスプライシングされた転写物から産生される変化したターゲティングドメインのアイソフォーム、自然突然変異により産生される変化したターゲティングドメインのアイソフォーム、および変化したターゲティングドメインのサブタイプが含まれる。天然の変化したターゲティングドメインの変異体は、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。天然の変化したターゲティングドメインの変異体は、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸、20以上のアミノ酸、30以上のアミノ酸、40以上のアミノ酸、50以上のアミノ酸または100以上のアミノ酸が置換されうる。天然の変化したターゲティングドメインの変異体はまた、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、少なくとも5の連続するアミノ酸、少なくとも10の連続するアミノ酸、少なくとも15の連続するアミノ酸、少なくとも20の連続するアミノ酸、または少なくとも25の連続するアミノ酸が置換され、その天然の変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに対して、少なくとも50%のアミノ酸同一性、65%のアミノ酸同一性、75%のアミノ酸同一性、85%のアミノ酸同一性、または95%のアミノ酸同一性を有しうる。
【０２２０】
天然の変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例は、変化したターゲティングドメインのアイソフォーム、例えば、グルカゴン様ペプチドアイソフォーム、PACAP アイソフォーム、CCRH アイソフォーム、PTH アイソフォーム、IL-6 アイソフォーム、ニューロロイキンアイソフォーム、IGF-1 アイソフォーム、およびNT-3 アイソフォームである。変化したターゲティングドメインのアイソフォームは、その変化したターゲティングドメインのアイソフォームの基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。
【０２２１】
本明細書において用いる場合、用語「非天然の変化したターゲティングドメインの変異体」は、人為的操作により産生される変化したターゲティングドメインを意味し、限定はされないが、ランダム変異誘発または合理的設計を用いて遺伝子操作により産生される変化したターゲティングドメイン、および化学合成により産生される変化したターゲティングドメインが含まれる。非天然の変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例には、例えば、保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、変化したターゲティングドメインのキメラ変異体および活性な変化したターゲティングドメインの断片が含まれる。
【０２２２】
本明細書において用いる場合、用語「保存的な変化したターゲティングドメインの変異体」は、参照の変化したターゲティングドメインの配列のもとのアミノ酸と類似する少なくとも1の性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより置換された少なくとも1のアミノ酸を有する変化したターゲティングドメインを意味する。性質の例には、限定はされないが、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらのあらゆる組合せが含まれる。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、例えば、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸、20以上のアミノ酸、30以上のアミノ酸、40以上のアミノ酸、50以上のアミノ酸、100以上のアミノ酸、200以上のアミノ酸、300以上のアミノ酸、400以上の、または500以上のアミノ酸が置換されていてよい。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体はまた、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、少なくとも5の連続するアミノ酸、少なくとも10の連続するアミノ酸、少なくとも15の連続するアミノ酸、少なくとも20の連続するアミノ酸、または少なくとも25の連続するアミノ酸が置換され、その保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに対して、少なくとも50%のアミノ酸同一性、65%のアミノ酸同一性、75%のアミノ酸同一性、85%のアミノ酸同一性または95%のアミノ酸同一性を有しうる。保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例には、例えば、保存的グルカゴン様ペプチド変異体、保存的PACAP領域変異体、保存的CCRH領域変異体、保存的PTH変異体、保存的IL-6変異体、保存的ニューロロイキン変異体、保存的IGF-1変異体、および保存的NT-3領域変異体が含まれる。
【０２２３】
本明細書において用いる場合、用語「非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体」は、1)その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから少なくとも1のアミノ酸が欠失している; 2) その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに少なくとも1のアミノ酸が付加されている; または3) 少なくとも1のアミノ酸が参照の変化したターゲティングドメインの配列のもとのアミノ酸と類似する性質を共有しない別のアミノ酸またはアミノ酸アナログにより置換されている、変化したターゲティングドメインを意味する。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明のあらゆる側面において参照の変化したターゲティングドメインと置換可能である。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、および10以上のアミノ酸が欠失されうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、および10以上のアミノ酸が付加されうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体は、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、1以上のアミノ酸、2以上のアミノ酸、3以上のアミノ酸、4以上のアミノ酸、5以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸、20以上のアミノ酸、30以上のアミノ酸、40以上のアミノ酸、50以上のアミノ酸、100以上のアミノ酸、200以上のアミノ酸、300以上のアミノ酸、400以上の、または500以上のアミノ酸が置換されうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体はまた、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインから、例えば、少なくとも5の連続するアミノ酸、少なくとも10の連続するアミノ酸、少なくとも15の連続するアミノ酸、少なくとも20の連続するアミノ酸、または少なくとも25の連続するアミノ酸が置換され、その非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の基となった参照の変化したターゲティングドメインに対して少なくとも50%のアミノ酸同一性、65%のアミノ酸同一性、75%のアミノ酸同一性、85%のアミノ酸同一性または95%のアミノ酸同一性を有しうる。非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体の非限定的な例には、例えば、非保存的グルカゴン様ペプチド変異体、非保存的PACAP領域変異体、非保存的CCRH領域変異体、非保存的PTH変異体、非保存的IL-6変異体、非保存的ニューロロイキン変異体、非保存的IGF-1変異体、および非保存的NT-3領域変異体が含まれる。
【０２２４】
本明細書において用いる場合、用語「キメラの変化したターゲティングドメイン」は、ある変化したターゲティングドメインの少なくとも一部と、少なくとも1の他のポリペプチドの少なくとも一部とを含み、参照の変化したターゲティングドメインと少なくとも1の性質が異なる変化したターゲティングドメインを形成するポリペプチドを意味し、但しこのキメラの変化したターゲティングドメインがやはりクロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合可能であり、全内部移行機構を開始し、それにより改変クロストリジウム毒素による標的細胞の中毒がおこることを条件とする。
【０２２５】
本明細書において用いる場合、用語「活性な変化したターゲティングドメインの断片」は、本発明の側面において有用でありうる様々な変化したターゲティングドメインの断片を意味し、但しこれらの活性な断片がやはりクロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合可能であり、全内部移行機構を開始し、それにより改変クロストリジウム毒素による標的細胞の中毒がおこることを条件とする。すなわち、この態様の側面は、例えば、少なくとも5のアミノ酸、少なくとも10のアミノ酸、少なくとも20のアミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも350アミノ酸、少なくとも400アミノ酸および少なくとも450アミノ酸の長さを含む変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面は、例えば、最大5アミノ酸、最大10アミノ酸、最大20アミノ酸、最大30アミノ酸、最大40アミノ酸、最大50アミノ酸、最大100アミノ酸、最大150アミノ酸、最大200アミノ酸、最大250アミノ酸、最大300アミノ酸、最大350アミノ酸、最大400アミノ酸および最大450アミノ酸の長さを含む変化したターゲティングドメインを含みうる。
【０２２６】
様々な配列比較方法はいずれも天然の変化したターゲティングドメインの変異体および非天然の変化したターゲティングドメインの変異体の同一性の割合の決定に使用可能であり、限定はされないが、グローバル方法、ローカル方法、ハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法が含まれる。同一性の割合を決定するプロトコールは、当業者にとって、また本明細書の教示から、ルーチンな作業である。
【０２２７】
すなわち、ある態様において、本明細書に開示される改変クロストリジウム毒素は、変化したターゲティングドメインを含む。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは、天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、変化したターゲティングドメインのアイソフォームまたは変化したターゲティングドメインのサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素の変化したターゲティングドメインは、非天然の変化したターゲティングドメインの変異体、例えば、保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、非保存的な変化したターゲティングドメインの変異体、キメラの変化したターゲティングドメイン、活性な変化したターゲティングドメインの断片、またはそれらのいずれかの組合せを含む。
【０２２８】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの例は、例えば、グルカゴン様ホルモン、例えば、セクレチン、グルカゴン様ペプチド、GLP-1およびGLP-2など、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド (PACAP)、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド (GRPP)、オキシントモジュリン (OXY)、成長ホルモン放出ホルモン (GHRH)、血管作用性小腸ペプチド (VIP)、胃抑制ポリペプチド (GIP)、およびカルシトニン関連ペプチド、内臓腸管ペプチド（visceral gut peptide）、例えば、ガストリン、ガストリン放出ペプチド (GRP、ボンベシン) またはコレシストキニン (CCK)である。
【０２２９】
すなわち、ある態様において、変化したターゲティングドメインはグリコーゲン由来ペプチドに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号9のグリコーゲン由来ペプチドに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは、GRPP、GLP-1、GLP-2、グルカゴンまたはオキシントモジュリンを含むグリコーゲン由来ペプチドに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178を含むグリコーゲン由来ペプチドに由来する。
【０２３０】
この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２３１】
この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。 この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２３２】
この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、グリコーゲン由来ペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸 21-50、アミノ酸 53-81、アミノ酸 53-89、アミノ酸 98-124、またはアミノ酸 146-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２３３】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはPACAPに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号10のPACAPに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号10のアミノ酸 132-158を含むPACAPに由来する。
【０２３４】
この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号10のアミノ酸 132-158と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号10のアミノ酸 132-158と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号10のアミノ酸 132-158と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２３５】
この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２３６】
この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PACAPは、例えば、配列番号10のアミノ酸 132-158に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２３７】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGHRHに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号11のGHRHに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75を含むGHRHに由来する。
【０２３８】
この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。  この態様のさらに他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２３９】
この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２４０】
この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GHRHは、例えば、配列番号11のアミノ酸 32-58またはアミノ酸 32-75に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２４１】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはVIP1に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号12のVIP1に由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151を含むVIP1に由来する。
【０２４２】
この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２４３】
この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２４４】
この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP1は、例えば、配列番号12のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 125-151に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２４５】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはVIP2に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号13のVIP2に由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150を含むVIP2に由来する。
【０２４６】
この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２４７】
この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２４８】
この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VIP2は、例えば、配列番号13のアミノ酸 81-107またはアミノ酸 124-150に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２４９】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGIPに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号14のGIPに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93を含むGIPに由来する。
【０２５０】
この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２５１】
この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２５２】
この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GIPは、例えば、配列番号14のアミノ酸 52-78またはアミノ酸 52-93に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２５３】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはセクレチンに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号15のセクレチンに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号15のアミノ酸 28-54を含むセクレチンに由来する。
【０２５４】
この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号15のアミノ酸 28-54と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号15のアミノ酸 28-54と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号15のアミノ酸 28-54と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２５５】
この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２５６】
この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、セクレチンは、例えば、配列番号15のアミノ酸 28-54に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２５７】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはガストリンに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号16のガストリンに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92を含むガストリンに由来する。
【０２５８】
この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２５９】
この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２６０】
この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ガストリンは、例えば、配列番号16のアミノ酸 76-92またはアミノ酸 59-92に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２６１】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGRPに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号17のGRPに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50を含むGRPに由来する。
【０２６２】
この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２６３】
この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２６４】
この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GRPは、例えば、配列番号17のアミノ酸 41-50またはアミノ酸 24-50に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２６５】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはCCKに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号18のCCKに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号18のアミノ酸 99-112を含むCCKに由来する。
【０２６６】
この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と  のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号18のアミノ酸 99-112と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号18のアミノ酸 99-112と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号18のアミノ酸 99-112と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２６７】
この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２６８】
この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCKは、例えば、配列番号18のアミノ酸 99-112に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCKは、例えば、  に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２６９】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CCRH) または副甲状腺ホルモン (PTH)などの神経ホルモンである。
【０２７０】
すなわち、ある態様において、変化したターゲティングドメインはCCRHに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号19のCCRHに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194を含むCCRHに由来する。
【０２７１】
この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２７２】
この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２７３】
この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CCRHは、例えば、配列番号19のアミノ酸 159-193またはアミノ酸 154-194に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２７４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはPTHに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号20のPTHに由来する。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177を含むPTHに由来する。
【０２７５】
この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２７６】
この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２７７】
この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、PTHは、例えば、配列番号20のアミノ酸 35-70またはアミノ酸 145-177に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２７８】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、神経調節サイトカインであり、例えば、毛様体神経栄養因子 (CNTF)、グリコホリン-A (GPA)、白血病抑制因子 (LIF)（コリン作動性分化因子 (CDF)としても知られる）、インターロイキン (IL)、例えばIL1、IL2、IL6、IL8およびIL10、オンコスタチン M、カルディオトロフィン-1 (CT-1)、カルディオトロフィン様サイトカイン (CLC)、またはニューロロイキン （グルコースリン酸イソメラーゼ (GPI)、自己分泌型細胞運動刺激因子 (AMF)、成熟分化因子 (MF)とも呼ばれる）である。
【０２７９】
すなわち、ある態様において、変化したターゲティングドメインはCNTFに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号21のCNTFに由来する。この態様の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号21のアミノ酸配列と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号21のアミノ酸配列と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２８０】
この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２８１】
この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CNTFは、例えば、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２８２】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGPAに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号22のGPAに由来する。この態様の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号22のアミノ酸配列と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号22のアミノ酸配列と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２８３】
この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２８４】
この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GPAは、例えば、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２８５】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはLIFに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号23のLIFに由来する。この態様の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号23のアミノ酸配列と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号23のアミノ酸配列と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２８６】
この態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、LIFは、例えば、。配列番号23のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含むこの態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２８７】
この態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、LIFは、例えば、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２８８】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはCT-1に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号24のCT-1に由来する。この態様の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも75%のアミノ酸同一性配列番号24のアミノ酸配列と、少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号24のアミノ酸配列と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号24のアミノ酸配列と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号24のアミノ酸配列と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号24のアミノ酸配列と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号24のアミノ酸配列と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２８９】
この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２９０】
この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CT-1は、例えば、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２９１】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはCLCに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号25のCLCに由来する。この態様の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号25のアミノ酸配列と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号25のアミノ酸配列と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２９２】
この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２９３】
この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、CLCは、例えば、配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２９４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはIL-1に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号26のIL-1に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号26のアミノ酸 123-265を含むIL-1に由来する。
【０２９５】
この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号26のアミノ酸 123-265と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号26のアミノ酸 123-265と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号26のアミノ酸 123-265と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２９６】
この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２９７】
この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-1は、例えば、配列番号26のアミノ酸 123-265に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０２９８】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはIL-2に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号27のIL-2に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号27のアミノ酸 21-153を含むIL-2に由来する。
【０２９９】
この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号27のアミノ酸 21-153と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号27のアミノ酸 21-153と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号27のアミノ酸 21-153と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３００】
この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３０１】
この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-2は、例えば、配列番号27のアミノ酸 21-153に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３０２】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはIL-6に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号28のIL-6に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号28のアミノ酸 57-210を含むIL-6に由来する。
【０３０３】
この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号28のアミノ酸 57-210と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号28のアミノ酸 57-210と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号28のアミノ酸 57-210と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３０４】
この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３０５】
この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-6は、例えば、配列番号28のアミノ酸 57-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３０６】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはIL-8に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号29のIL-8に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94を含むIL-8に由来する。 
【０３０７】
この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３０８】
この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３０９】
この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-8は、例えば、配列番号29のアミノ酸 21-99またはアミノ酸 31-94に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３１０】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはIL-10に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号30のIL-10に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178を含むIL-10に由来する。
【０３１１】
この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３１２】
この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３１３】
この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IL-10は、例えば、配列番号30のアミノ酸 37-173またはアミノ酸 19-178に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３１４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはニューロロイキンに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号31のニューロロイキンに由来する。この態様の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性 を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号31のアミノ酸配列と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号31のアミノ酸配列と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３１５】
この態様の他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニューロロイキン は、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３１６】
この態様の他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニューロロイキンは、例えば、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３１７】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはVEGFに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号32のVEGFに由来する。この態様の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号32のアミノ酸配列と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号32のアミノ酸配列と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３１８】
この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３１９】
この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、VEGFは、例えば、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３２０】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはIGF-1に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号33のIGF-1に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118を含むIGF-1に由来する。
【０３２１】
この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３２２】
この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３２３】
この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-1は、例えば、配列番号33のアミノ酸 52-109またはアミノ酸 49-118に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３２４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはIGF-2に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号34のIGF-2に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180を含むIGF-2に由来する。
【０３２５】
この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と  のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３２６】
この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３２７】
この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、IGF-2は、例えば、配列番号34のアミノ酸 31-84またはアミノ酸 25-180に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３２８】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはEGFに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号35のEGFに由来する。この態様の側面において、EGFは、例えば、少なくとも70%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、少なくとも75%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、少なくとも80%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、少なくとも85%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、少なくとも90%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性 or 少なくとも95%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、EGFは、例えば、最大70%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、最大75%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、最大80%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、最大85%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性、最大90%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性 or 最大95%配列番号35のアミノ酸配列と  のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３２９】
この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３３０】
この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、EGFは、例えば、配列番号35のアミノ酸配列に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３３１】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、NGF、BDNF、NT-3、またはNT-5などのニューロトロフィンである。
【０３３２】
すなわち、ある態様において、変化したターゲティングドメインはNGFに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号36のNGFに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号36のアミノ酸 139-257を含むNGFに由来する。
【０３３３】
この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と少なくとも90%のアミノ酸同一性、または配列番号36のアミノ酸 139-257と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号36のアミノ酸 139-257と最大90%のアミノ酸同一性、または配列番号36のアミノ酸 139-257と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３３４】
この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３３５】
この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NGFは、例えば、配列番号36のアミノ酸 139-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３３６】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBDGFに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号37のBDGFに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247を含むBDGFに由来する。
【０３３７】
この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３３８】
この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。。
【０３３９】
この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BDGFは、例えば配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BDGFは、例えば、配列番号37のアミノ酸 133-240またはアミノ酸 129-247に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。。
【０３４０】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはNT-3に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号38のNT-3に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257を含むNT-3に由来する。 
【０３４１】
この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３４２】
この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３４３】
この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-3は、例えば、配列番号38のアミノ酸 144-249またはアミノ酸 19-257に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３４４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはNT-4/5に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号39のNT-4/5に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210を含むNT-4/5に由来する。
【０３４５】
この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３４６】
この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３４７】
この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、NT-4/5は、例えば、配列番号39のアミノ酸 89-202またはアミノ酸 81-210に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３４８】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、GDNF、ニュールツリン、パーセフリン（persephrin）またはアルテミン（artemin）である。
【０３４９】
すなわち、ある態様において、変化したターゲティングドメインはGDNFに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号40のGDNFに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号40のアミノ酸 118-211を含むGDNFに由来する。
【０３５０】
この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号40のアミノ酸 118-211と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号40のアミノ酸 118-211と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号40のアミノ酸 118-211と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３５１】
この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３５２】
この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDNFは、例えば、配列番号40のアミノ酸 118-211に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３５３】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはニュールツリンに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号41のニュールツリンに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197を含むニュールツリンに由来する。
【０３５４】
この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197と最大90%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３５５】
この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニュールツリン は、例えば、列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。配この態様のさらに他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３５６】
この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、ニュールツリンは、例えば、配列番号41のアミノ酸 107-196またはアミノ酸 96-197に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３５７】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはパーセフリンに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号42のパーセフリンに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号42のアミノ酸 66-155を含むパーセフリンに由来する。
【０３５８】
この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号42のアミノ酸 66-155と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号42のアミノ酸 66-155と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号42のアミノ酸 66-155と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３５９】
この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３６０】
この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、パーセフリンは、例えば、配列番号42のアミノ酸 66-155に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３６１】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはアルテミンに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号43のアルテミンに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号43のアミノ酸 123-218を含むアルテミンに由来する。
【０３６２】
この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号43のアミノ酸 123-218と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号43のアミノ酸 123-218と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号43のアミノ酸 123-218と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３６３】
この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３６４】
この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アルテミンは、例えば、配列番号43のアミノ酸 123-218に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３６５】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3またはTGFβ4などのTGFβである。
【０３６６】
ある態様において、変化したターゲティングドメインはTGFβ1に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号44のTGFβに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号44のアミノ酸 293-390を含むTGFβ1に由来する。 
【０３６７】
この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号44のアミノ酸 293-390と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号44のアミノ酸 293-390と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号44のアミノ酸 293-390と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３６８】
この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３６９】
この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ1は、例えば、配列番号44のアミノ酸 293-390に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３７０】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはTGFβ2に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号44のTGFβ2に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号45のアミノ酸 317-414を含むTGFβ2に由来する。
【０３７１】
この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号45のアミノ酸 317-414と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号45のアミノ酸 317-414と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号45のアミノ酸 317-414と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３７２】
この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３７３】
この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ2は、例えば、配列番号45のアミノ酸 317-414に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３７４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはTGFβ3に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号44のTGFβ3に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号46のアミノ酸 315-412を含むTGFβ3に由来する。
【０３７５】
この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号46のアミノ酸 315-412と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号46のアミノ酸 315-412と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号46のアミノ酸 315-412と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３７６】
この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３７７】
この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ3は、例えば、配列番号46のアミノ酸 315-412に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３７８】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはTGFβ4に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号44のTGFβ4に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号47のアミノ酸 276-373を含むTGFβ4に由来する。
【０３７９】
この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号47のアミノ酸 276-373と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号47のアミノ酸 276-373と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号47のアミノ酸 276-373と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３８０】
この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３８１】
この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、TGFβ4は、例えば、配列番号47のアミノ酸 276-373に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３８２】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8またはBMP10などのBMPである。
【０３８３】
すなわち、ある態様において、変化したターゲティングドメインはBMP2に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号48のBMP2に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号48のアミノ酸 296-396を含むBMP2に由来する。
【０３８４】
この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号48のアミノ酸 296-396と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号48のアミノ酸 296-396と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号48のアミノ酸 296-396と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３８５】
この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３８６】
この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP2は、例えば、配列番号48のアミノ酸 296-396に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３８７】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBMP3に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号49のBMP3に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号49のアミノ酸 370-472を含むBMP3に由来する。
【０３８８】
この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号49のアミノ酸 370-472と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号49のアミノ酸 370-472と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号49のアミノ酸 370-472と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３８９】
この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３９０】
この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP3は、例えば、配列番号49のアミノ酸 370-472に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３９１】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBMP4に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号50のBMP4に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号50のアミノ酸 309-409を含むBMP4に由来する。
【０３９２】
この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号50のアミノ酸 309-409と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号50のアミノ酸 309-409と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号50のアミノ酸 309-409と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３９３】
この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３９４】
この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP4は、例えば、配列番号50のアミノ酸 309-409に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３９５】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBMP5に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号51のBMP5に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454を含むBMP5に由来する。
【０３９６】
この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０３９７】
この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３９８】
この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP5は、例えば、配列番号51のアミノ酸 353-454またはアミノ酸 323-454に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０３９９】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBMP6に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号52のBMP6に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513を含むBMP6に由来する。
【０４００】
この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４０１】
この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４０２】
この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP6は、例えば、配列番号52のアミノ酸 412-513またはアミノ酸 374-513に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４０３】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBMP7に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号53のBMP7に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431を含むBMP7に由来する。
【０４０４】
この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４０５】
この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４０６】
この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP7は、例えば、配列番号53のアミノ酸 330-431またはアミノ酸 293-431に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４０７】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBMP8に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号54のBMP8に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号54のアミノ酸 301-402を含むBMP8に由来する。
【０４０８】
この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号54のアミノ酸 301-402と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号54のアミノ酸 301-402と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号54のアミノ酸 301-402と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４０９】
この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４１０】
この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP8は、例えば、配列番号54のアミノ酸 301-402に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４１１】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはBMP10に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号55のBMP10に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号55のアミノ酸 323-424を含むBMP10に由来する。
【０４１２】
この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号55のアミノ酸 323-424と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号55のアミノ酸 323-424と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号55のアミノ酸 323-424と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４１３】
この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４１４】
この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、BMP10は、例えば、配列番号55のアミノ酸 323-424に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４１５】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF10、GDF11またはGDF15のようなGFPである。
【０４１６】
すなわち、ある態様において、変化したターゲティングドメインはGDF1に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号56のGDF1に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号56のアミノ酸 267-372を含むGDF1に由来する。
【０４１７】
この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号56のアミノ酸 267-372と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号56のアミノ酸 267-372と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号56のアミノ酸 267-372と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４１８】
この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４１９】
この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF1は、例えば、配列番号56のアミノ酸 267-372に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４２０】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF2に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号57のGDF2に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号57のアミノ酸 327-429を含むGDF2に由来する。
【０４２１】
この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号57のアミノ酸 327-429と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号57のアミノ酸 327-429と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号57のアミノ酸 327-429と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４２２】
この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４２３】
この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF2は、例えば、配列番号57のアミノ酸 327-429に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４２４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF3に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号58のGDF3に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号58のアミノ酸 264-364を含むGDF3に由来する。
【０４２５】
この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号58のアミノ酸 264-364と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号58のアミノ酸 264-364と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号58のアミノ酸 264-364と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４２６】
この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４２７】
この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF3は、例えば、配列番号58のアミノ酸 264-364に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４２８】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF5に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号59のGDF5に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号59のアミノ酸 400-501を含むGDF5に由来する。
【０４２９】
この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号59のアミノ酸 400-501と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号59のアミノ酸 400-501と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号59のアミノ酸 400-501と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４３０】
この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４３１】
この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF5は、例えば、配列番号59のアミノ酸 400-501に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４３２】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF6に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号60のGDF6に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号60のアミノ酸 354-455を含むGDF6に由来する。
【０４３３】
この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号60のアミノ酸 354-455と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号60のアミノ酸 354-455と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号60のアミノ酸 354-455と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４３４】
この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４３５】
この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF6は、例えば、配列番号60のアミノ酸 354-455に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４３６】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF7に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号61のGDF7に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号61のアミノ酸 352-450を含むGDF7に由来する。
【０４３７】
この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号61のアミノ酸 352-450と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号61のアミノ酸 352-450と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号61のアミノ酸 352-450と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４３８】
この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４３９】
この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF7は、例えば、配列番号61のアミノ酸 352-450に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４４０】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF8に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号62のGDF8に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号62のアミノ酸 281-375を含むGDF8に由来する。
【０４４１】
この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号62のアミノ酸 281-375と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号62のアミノ酸 281-375と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号62のアミノ酸 281-375と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４４２】
この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４４３】
この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF8は、例えば、配列番号62のアミノ酸 281-375に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４４４】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF10に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号63のGDF10に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号63のアミノ酸 376-478を含むGDF10に由来する。
【０４４５】
この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号63のアミノ酸 376-478と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号63のアミノ酸 376-478と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号63のアミノ酸 376-478と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４４６】
この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４４７】
この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF10は、例えば、配列番号63のアミノ酸 376-478に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４４８】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF11に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号64のGDF11に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号64のアミノ酸 313-407を含むGDF11に由来する。
【０４４９】
この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号64のアミノ酸 313-407と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号64のアミノ酸 313-407と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号64のアミノ酸 313-407と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４５０】
この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４５１】
この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF11は、例えば、配列番号64のアミノ酸 313-407に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４５２】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはGDF15に由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号65のGDF15に由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号65のアミノ酸 211-308を含むGDF15に由来する。
【０４５３】
この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号65のアミノ酸 211-308と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号65のアミノ酸 211-308と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号65のアミノ酸 211-308と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４５４】
この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４５５】
この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、GDF15は、例えば、配列番号65のアミノ酸 211-308に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４５６】
本明細書に開示される変化したターゲティングドメインの別の例は、例えば、アクチビン A、アクチビン B、アクチビン C、アクチビン E またはインヒビン Aである。
【０４５７】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはアクチビン Aに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号66のアクチビン Aに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号66のアミノ酸 321-426を含むアクチビン Aに由来する。
【０４５８】
この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号66のアミノ酸 321-426と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号66のアミノ酸 321-426と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号66のアミノ酸 321-426と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４５９】
この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４６０】
この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Aは、例えば、配列番号66のアミノ酸 321-426に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４６１】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはアクチビン Bに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号67のアクチビン Bに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号67のアミノ酸 303-406を含むアクチビン Bに由来する。
【０４６２】
この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号67のアミノ酸 303-406と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号67のアミノ酸 303-406と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号67のアミノ酸 303-406と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４６３】
この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４６４】
この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Bは、例えば、配列番号67のアミノ酸 303-406に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４６５】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはアクチビン Cに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号68のアクチビン Cに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352を含むアクチビン Cに由来する。
【０４６６】
この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４６７】
この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４６８】
この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Cは、例えば、配列番号68のアミノ酸 247-352またはアミノ酸 237-352に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４６９】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはアクチビン Eに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号69のアクチビン Eに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号69のアミノ酸 247-350を含むアクチビン Eに由来する。
【０４７０】
この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号69のアミノ酸 247-350と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号69のアミノ酸 247-350と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号69のアミノ酸 247-350と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４７１】
この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４７２】
この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、アクチビン Eは、例えば、配列番号69のアミノ酸 247-350に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４７３】
別の態様において、変化したターゲティングドメインはインヒビン Aに由来する。別の態様において、変化したターゲティングドメインは配列番号70のインヒビン Aに由来する。この態様のある側面において、変化したターゲティングドメインは配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366を含むインヒビン Aに由来する。
【０４７４】
この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と少なくとも70%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と少なくとも75%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と少なくとも80%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と少なくとも85%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と少なくとも90%のアミノ酸同一性または配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と最大70%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と最大75%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と最大80%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と最大85%のアミノ酸同一性、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と最大90%のアミノ酸同一性または配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366と最大95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４７５】
この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の非連続アミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４７６】
この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。この態様の他の側面において、インヒビン Aは、例えば、配列番号70のアミノ酸 262-366またはアミノ酸 233-366に対して少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20の連続するアミノ酸の付加を有するポリペプチドを含む。
【０４７７】
本明細書において開示する変化したターゲティングドメインは、天然クロストリジウム毒素にみられるクロストリジウム毒素ターゲティングドメインの結合活性を置換する。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素ターゲティングドメイン」という用語は、「クロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域」または「クロストリジウム毒素 HCC 領域」と同義であり、中毒プロセスの細胞結合工程、例えば、クロストリジウム毒素の標的細胞の細胞膜表面に位置するクロストリジウム毒素-特異的受容体への結合を実行することができるあらゆる天然クロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。結合活性の置換は、例えば、完全なクロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインの変化したターゲティングドメインによる置換;クロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインの部分の変化したターゲティングドメインによる置換、ただし、残っているクロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインの部分はそのクロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することが出来ない; および変化したターゲティングドメインとクロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインを含むクロストリジウム毒素との作動可能な連結、ただし、クロストリジウム毒素 HCC ターゲティングドメインはそのクロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することが出来ないように変化されている、によって達成することが出来ると考えられる。
【０４７８】
BoNT/A、BoNT/BおよびTeNTのHC ドメインの三次元結晶構造は、クロストリジウム神経毒の３つの機能的ドメインが構造的に異なることを示す。軽鎖のHEXXH コンセンサスモチーフは、チャンネルによって接近可能なタンパク質表面上の深い裂(deep cleft)に位置する触媒部位の四面体亜鉛結合ポケットを形成する。HNおよびHC ドメインの構造は１つのα-ヘリックスによって連結しているβ-シートトポロジーから主に構成される。円柱形状の HN ドメインはいくつかのウイルスタンパク質にみられるコイルドコイルモチーフに類似する２つの長い両親媒性 α-ヘリックスを含む。HN ドメインはまた、活性部位の触媒結合ポケットへの亜鉛原子の接近を阻止する軽鎖の大きく負に荷電した裂を包む、「転位置ベルト」と称される長い構造化されていないループを形成する。HC ドメインは、機能を示すおおむね同じサイズの２つの異なる構造的特徴を含む。HCN ドメインと称される第一の構造は、HC ドメインのアミノ側半分に位置している。HCN ドメインはβ-バレル、ジェリー・ロール(jelly-roll) フォールドを形成する。HCC ドメインは、 HC ドメインを構成する第２のドメインである。このカルボキシル末端ドメインは、多くの糖結合タンパク質、例えば、血清アミロイド P、シアリダーゼ、cryia、殺虫性 ∂-内毒素およびレクチンにおいてみられる炭水化物結合部分に類似する３つの異なる炭水化物結合領域を形成する改変されたβ-三葉型ドメインを含む。生化学的研究により、HCC ドメインのβ-三葉型ドメイン構造は、細胞表面上のクロストリジウム毒素受容体の特定の炭水化物含有成分への結合を媒介するようであるということが示されており、例えば、Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000)を参照されたい。HC ドメインはHN ドメインから離れるよう傾いており、表面ループを露出させ、それらを結合のために接近可能にしている。軽鎖とHC ドメインとの接触は起こらない。
【０４７９】
構造的β-三葉型ドメインを含むタンパク質は多様な群のタンパク質を表し、例えば、C. A. Orengo et al., Protein Superfamilies and Domain Superfolds, 372 Nature 631-634 (1994)を参照されたい。β-三葉型ドメインは、特徴的な偽-三回軸対称を示す３つのβ-ヘアピン構造によって一端にて閉じた６本鎖β-バレルを含む。この三回対称の単量体構造的単位は、逆平行β-シートの対として構築される４つのβ-シートを含むβ-三葉型フォールドと称される。これらβ-三葉型フォールドのそれぞれをβ-ヘアピンターンが分かつ。それゆえ、直線状の様式で、β-三葉型ドメインは、第１のβ-三葉型フォールドの４つのβ-シート、β-ヘアピンターン、第２のβ-三葉型フォールドの４つのβ-シート、第２のβ-ヘアピンターン、第２のβ-三葉型フォールドの４つのβ-シートを含む。第１のヘアピンターンはβ-三葉型ドメインの第４および第５のβ-シートの間に位置しているので、それはβ4/β5 β-ヘアピンターンと称される。同様に、第２のヘアピンターンはβ-三葉型ドメインの第８および第９のβ-シートの間に位置しているので、それはβ8/β9 β-ヘアピンターンと称される。
【０４８０】
β-三葉型フォールドを含むタンパク質に典型的であるように、クロストリジウム毒素の間のHCC ドメインの全体的なアミノ酸配列同一性は低い。しかし、結合活性に必須の鍵となる残基は構造分析および突然変異誘発実験により同定されており、例えば、Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124 (2000); およびAndreas Rummel et al., The HCC-Domain of Botulinum Neurotoxins A and B Exhibits a Singular Ganglioside Binding Site Displaying Serotype Specific Carbohydrate Interaction, 51(3) Mol. Microbiol. 631-643 (2004)を参照されたい。さらに、研究により、β4/β5およびβ8/β9 β-ヘアピンターンがβ-三葉型ドメインにおいて観察される正しい偽-三回軸対称を付与することにおいて重要であること、およびこれらターンはβ-三葉型ドメインの安定性に重要であることが解明されており、例えば、Stephen R. Brych et al., Structure and Stability Effects of Mutations Designed to Increase the Primary Sequence Symmetry Within the Core Region of a β−trefoil, 10 Protein Sci. 2587-2599 (2001); Jaewon Kim et al., Alternative Type I and I’ Turn Conformations in the β8/β9 β-hairpin of Human Acidic Fibroblast Growth Factor, 11 Protein Sci. 459-466 (2002); Jaewon Kim et al., Sequence swapping Does Not Result in Conformation Swapping for the β4/β5 and β8/β9 β-hairpin Turns in Human Acidic Fibroblast Growth Factor, 14 Protein Sci. 351-359 (2005)を参照されたい。様々なクロストリジウム毒素にみられるβ-三葉型ドメインを構成するアミノ酸配列を表2に示す。
【０４８１】
表2.クロストリジウム毒素のβ-三葉型ドメイン
【表２】
2009543557.tif 000004
【０４８２】
したがって、ある態様において、HCC 領域を含むクロストリジウム毒素ターゲティングドメインは本明細書に開示される増強した結合ドメインにより置換されうる。この態様の側面において、BoNT/A HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/B HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/C1 HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/D HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/E HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/F HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/G HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、TeNT HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよい。
【０４８３】
この態様の側面において、BoNT/A HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/B HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/C1 HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/D HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/E HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/F HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、BoNT/G HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、TeNT HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよい。この態様の別の側面において、配列番号1のアミノ酸 1092-1296を含むBoNT/A HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号2のアミノ酸 1079-1291を含むBoNT/B HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号3のアミノ酸 1093-1291を含むBoNT/C1 HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号4のアミノ酸 1080-1276を含むBoNT/D HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号5のアミノ酸 1067-1252を含むBoNT/E HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号6のアミノ酸 1087-1274を含むBoNT/F HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号7のアミノ酸 1087-1297を含むBoNT/G HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよく、配列番号8のアミノ酸 1109-1315を含むTeNT HCC 領域は変化したターゲティングドメインにより置換されていてもよい。
【０４８４】
別の態様において、本明細書において開示する変化した結合ドメインは、クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合できなくなるよう変化したクロストリジウム毒素ターゲティングドメインを含むクロストリジウム毒素に作動可能に連結している。本明細書において用いる場合、クロストリジウム毒素ターゲティングドメインに言及する場合の「変化した」という用語は、ドメインがそのクロストリジウム毒素受容体にもはや選択的に結合することが出来ないようにクロストリジウム毒素ターゲティングドメインの結合活性を排除または低減するように改変された天然クロストリジウム毒素ターゲティングドメインを意味する。定義によると、変化したクロストリジウム毒素ターゲティングドメインは、開示された参照配列 (表1参照)の対応する領域から少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、その参照配列の対応する領域に対するパーセント同一性において記載することが出来る。非限定的な例として、配列番号1のアミノ酸 1111-1296を含む改変された BoNT/A HCC 領域は、配列番号1のアミノ酸領域 1111-1296と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;配列番号2のアミノ酸 1098-1291を含む改変された BoNT/B HCC 領域は、配列番号2のアミノ酸領域 1098-1291と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号3のアミノ酸 1112-1291を含む改変された BoNT/C1 HCC 領域は、配列番号3のアミノ酸領域 1112-1291と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号4のアミノ酸 1099-1276を含む改変された BoNT/D HCC 領域は、配列番号4のアミノ酸領域 1099-1276と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号5のアミノ酸 1086-1252を含む改変された BoNT/E HCC 領域は、配列番号5のアミノ酸領域 1086-1252と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号6のアミノ酸 1106-1274を含む改変された BoNT/F HCC 領域は、配列番号6のアミノ酸領域 1106-1274と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する; 配列番号7のアミノ酸 1106-1297を含む改変された BoNT/G HCC 領域は、配列番号7のアミノ酸領域 1106-1297と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する;および、配列番号8のアミノ酸 1128-1315を含む改変された TeNT HCC 領域は、配列番号8のアミノ酸領域 1128-1315と比較して少なくとも１つのアミノ酸相違、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加を有する。
【０４８５】
この態様の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列と少なくとも 70％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 75％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 80％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 85％のアミノ酸同一性、その参照配列と少なくとも 90％のアミノ酸同一性またはその参照配列と少なくとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列と多くとも 70％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 75％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 80％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 85％のアミノ酸同一性、その参照配列と多くとも 90％のアミノ酸同一性またはその参照配列と多くとも 95％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０４８６】
この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100、または200の非連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の非連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０４８７】
この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。この態様のさらに別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して多くとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この態様の別の側面において、変化したクロストリジウム毒素 HCC ターゲティング領域は、例えば、その参照配列に対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、20、30、40 、50、100 または200の連続アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【０４８８】
本発明の別の側面において、変化した結合活性を有する改変クロストリジウム毒素は、部分的には、二本鎖ループ領域内に位置するプロテアーゼ切断部位を含む。本明細書において用いる場合、「二本鎖ループ領域」という用語は、一本鎖形態のクロストリジウム毒素を二本鎖形態へと変換するのに用いられるプロテアーゼ切断部位を含むクロストリジウム毒素のアミノ酸配列を意味する。クロストリジウム毒素 二本鎖ループ領域の非限定的な例としては、配列番号1のアミノ酸430-454を含むBoNT/Aの二本鎖ループ領域;配列番号2のアミノ酸437-446を含むBoNT/Bの二本鎖ループ領域;配列番号3のアミノ酸437-453を含むBoNT/C1の二本鎖ループ領域;配列番号4のアミノ酸437-450を含むBoNT/Dの二本鎖ループ領域;配列番号5のアミノ酸412-426を含むBoNT/Eの二本鎖ループ領域;配列番号6のアミノ酸429-445を含むBoNT/Fの二本鎖ループ領域;配列番号7のアミノ酸436-450を含むBoNT/Gの二本鎖ループ領域;および配列番号8のアミノ酸439-467 を含むTeNT の二本鎖ループ領域が挙げられる(表3)。
【０４８９】
表3. クロストリジウム毒素の二本鎖ループ領域
【表３】
2009543557.tif 000005
示したアミノ酸配列は以下の通り:BoNT/A、配列番号1の残基325-462; BoNT/B、配列番号2の残基332-454; BoNT/C1、配列番号3の残基334-463; BoNT/D、配列番号4の残基334-458; BoNT/E、配列番号5の残基311-434; BoNT/F、配列番号6の残基328-453; BoNT/G、配列番号7の残基331-458;およびTeNT、配列番号8の残基334-474。星印(*)は、クロストリジウム毒素プロテアーゼによって切断されるペプチド結合を示す。
【０４９０】
あらゆるすべての プロテアーゼ切断部位を、クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態から二本鎖形態へ変換するために利用することが出来ると考えられ、例えば、これらに限定されないが、内因性二本鎖ループプロテアーゼ切断部位および外来性プロテアーゼ切断部位が挙げられる。プロテアーゼ切断部位の位置および種類は、特定のターゲティングドメインが遊離のアミノ-末端またはカルボキシル-末端アミノ酸を必要とするために重要であり得る。例えば、ターゲティングドメインが２つのその他のドメインの間に位置する場合、例えば、図5参照、プロテアーゼ切断部位の選択のための基準は、その部位を切断するプロテアーゼにより平滑切断(flush cut)が生じて、ターゲティングドメインのその受容体への選択的結合に必要な変化したターゲティングドメインの遊離のアミノ-末端またはカルボキシル-末端に曝露されるか否かであり得る。プロテアーゼ切断部位の選択および配置は当該技術分野において周知である。
【０４９１】
本明細書において用いる場合、「内因性二本鎖ループプロテアーゼ切断部位」という用語は、「天然二本鎖ループプロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然クロストリジウム毒素の二本鎖ループ領域内にみられる天然プロテアーゼ切断部位を意味し、例えばこれらに限定されないが、天然クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位変異体、例えば、クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位アイソフォームおよびクロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位サブタイプが挙げられる。内因性プロテアーゼ切断部位の非限定的な例としては、例えば、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位およびTeNT二本鎖ループプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【０４９２】
上記のように、クロストリジウムは毒素およそ 150 kDaの一本鎖ポリペプチドとして翻訳され、次いで天然プロテアーゼによりジスルフィドループ内にてタンパク分解切断により切断される。この翻訳後プロセシングにより、およそ 50 kDaの軽鎖 (LC)およびおよそ 100 kDaの重鎖 (HC)が一つのジスルフィド結合および非共有相互作用によって一緒になって含まれる二本鎖分子が生じる。プロテアーゼの同一性は現在知られていないが、多くのクロストリジウム毒素についての二本鎖ループプロテアーゼ切断部位が提案されている。BoNTにおいて、K448-A449での切断はBoNT/Aの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K441-A442での切断はBoNT/Bの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K449-T450での切断はBoNT/C1の一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; R445-D446 での切断はBoNT/Dの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; R422-K423での切断はBoNT/Eの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K439-A440 での切断はBoNT/Fの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する;および、 K446-S447での切断はBoNT/Gの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する。TeNTの一本鎖ポリペプチド形態のA457-S458でのタンパク分解切断の結果、二本鎖形態が得られる。かかる二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は改変クロストリジウム毒素にインフレームに作動可能に連結されて融合タンパク質とされる。
【０４９３】
しかし、二本鎖ループ内の付加的な切断部位も切断されるようであり、失われる小さいペプチド断片の生成をもたらすことに注意されたい。非限定的な例として、BoNT/A 一本鎖ポリペプチドの切断は、最終的には二本鎖ループ内の１０アミノ酸断片の欠失をもたらす。したがってBoNTにおいて、S441-L442での切断はBoNT/Aの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; G444-I445での切断はBoNT/Bの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; S445-L446 での切断はBoNT/C1の一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K442-N443 での切断はBoNT/Dの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K419-G420での切断は BoNT/Eの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K423-S424 での切断はBoNT/Eの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; K436-G437での切断はBoNT/Fの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; T444-G445での切断はBoNT/Gの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する; および、E448-Q449での切断はBoNT/Gの一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換する。
【０４９４】
したがって、一つの態様において、内因性クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含むプロテアーゼ切断部位は、一本鎖毒素を二本鎖形態へと変換するのに用いられる。この態様の側面において、タンパク分解切断による二本鎖形態への変換は、例えば、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位 またはTeNT 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む部位から起こる。
【０４９５】
この態様の別の側面において、タンパク分解切断による二本鎖形態への変換は、例えば、配列番号1のアミノ酸430-454を含むBoNT/Aの二本鎖ループ領域;配列番号2のアミノ酸437-446を含むBoNT/Bの二本鎖ループ領域;配列番号3のアミノ酸437-453を含むBoNT/C1の二本鎖ループ領域;配列番号4のアミノ酸437-450を含むBoNT/Dの二本鎖ループ領域;配列番号5のアミノ酸412-426を含むBoNT/Eの二本鎖ループ領域;配列番号6のアミノ酸429-445を含むBoNT/Fの二本鎖ループ領域;配列番号7のアミノ酸436-450を含むBoNT/Gの二本鎖ループ領域;または、配列番号8のアミノ酸439-467を含むTeNTの二本鎖ループ領域を含む部位から起こる。
【０４９６】
外来性プロテアーゼ切断部位もまた、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の一本鎖ポリペプチド形態を二本鎖形態へと変換するのに利用できると考えられる。本明細書において用いる場合、「外来性プロテアーゼ切断部位」という用語は、「非天然プロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然クロストリジウム毒素からの二本鎖ループ領域に通常は存在しないプロテアーゼ切断部位を意味する。外来性プロテアーゼ切断部位の非限定的な例としては、例えば、エンテロキナーゼ切断部位 (表4);トロンビン切断部位 (表4);因子 Xa 切断部位 (表4); ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位 (表4);タバコエッチウイルス (TEV) プロテアーゼ切断部位 (表4);ジペプチジル アミノペプチダーゼ 切断部位;低分子ユビキチン様修飾因子 (SUMO)/ユビキチン様 タンパク質-1(ULP-1) プロテアーゼ切断部位、例えば、MADSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGK EMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG (配列番号57);およびクロストリジウム毒素基質切断部位が挙げられる。
【０４９７】
表4.  外来性プロテアーゼ切断部位
【表４】
2009543557.tif 000006
星印(*)は、示されたプロテアーゼによって切断されるペプチド結合を示す。
【０４９８】
上記のように、クロストリジウム毒素はタンパク分解切断によって一本鎖ポリペプチド形態から二本鎖分子へと変換される。天然プロテアーゼは現在知られていないが、切断は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基の間の二本鎖ループ領域内で起こる(表3参照)。内因性プロテアーゼ切断部位の外来性プロテアーゼ切断部位による置換により、毒素の二本鎖ループ領域を切断するのに用いられる天然プロテアーゼを生産しない生物において発現された場合の、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の切断が可能となる。同様に、二本鎖ループ領域内への外来性プロテアーゼ切断部位の付加はまた、毒素の二本鎖ループ領域を切断するに使用される天然プロテアーゼを生産しない生物において発現された場合の、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の切断を可能とする。
【０４９９】
あらゆるすべての長さの外来性プロテアーゼ切断部位が本発明の側面に有用であり得ると考えられるが、ただし、かかる外来性プロテアーゼ切断部位はそのそれぞれの プロテアーゼによって切断されうるものである。したがって、この態様の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、少なくとも 6 アミノ酸の長さ、少なくとも 7 アミノ酸の長さ、少なくとも 8 アミノ酸の長さ、少なくとも 9 アミノ酸の長さ、少なくとも 10 アミノ酸の長さ、少なくとも 15 アミノ酸の長さ、少なくとも 20 アミノ酸の長さ、少なくとも 25 アミノ酸の長さ、少なくとも 30 アミノ酸の長さ、少なくとも 40 アミノ酸の長さ、少なくとも 50 アミノ酸の長さ または少なくとも 60 アミノ酸の長さであり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、多くとも 6 アミノ酸の長さ、多くとも 7 アミノ酸の長さ、多くとも 8 アミノ酸の長さ、多くとも 9 アミノ酸の長さ、多くとも 10 アミノ酸の長さ、多くとも 15 アミノ酸の長さ、多くとも 20 アミノ酸の長さ、多くとも 25 アミノ酸の長さ、多くとも 30 アミノ酸の長さ、多くとも 40 アミノ酸の長さ、多くとも 50 アミノ酸の長さ または多くとも 60 アミノ酸の長さであり得る。
【０５００】
この態様の側面において、二本鎖ループ領域を改変して、天然プロテアーゼ切断部位を外来性プロテアーゼ切断部位に置換することができる。このタイプの改変において、天然プロテアーゼ切断部位は作動不能とされ、したがってそのプロテアーゼによって切断することができない。外来性プロテアーゼ切断部位のみがその対応する外来性プロテアーゼによって切断されうる。このタイプの改変において、外来性プロテアーゼ部位は改変クロストリジウム毒素に作動可能にインフレームに融合タンパク質として連結され、部位はそのそれぞれの 外来性プロテアーゼによって切断することができる。非限定的な例として、二本鎖ループ領域において外来性プロテアーゼ切断部位を含む一本鎖改変BoNT/Aはそのそれぞれの 外来性プロテアーゼによって切断されて毒素の二本鎖形態を生じることが出来る。
【０５０１】
この態様の別の側面において、二本鎖ループ領域を改変して天然プロテアーゼ切断部位に加えて外来性プロテアーゼ切断部位を含めることも出来る。このタイプの改変において、両方の切断部位が改変クロストリジウム毒素に作動可能に融合タンパク質としてインフレームに連結され両方の部位がそれらそれぞれの プロテアーゼによって切断されうる。非限定的な例として、天然 BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位および外来性プロテアーゼ切断部位の両方を含む二本鎖ループを含む一本鎖改変BoNT/Aは、天然二本鎖ループプロテアーゼ、または適当な 外来性プロテアーゼのいずれかによって切断されて毒素の二本鎖形態を生じることが出来る。
【０５０２】
天然プロテアーゼ切断部位は、天然二本鎖ループプロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する少なくとも２つのアミノ酸の変化によって作動不能にされうる。より徹底的な変化もなすことができるが、ただし、二本鎖ループ領域の２つのシステイン残基をインタクトに維持し、依然としてジスルフィド架橋を形成できるようにする。アミノ酸変化の非限定的な例としては、アミノ酸の欠失または元のアミノ酸の異なるアミノ酸による置換が挙げられる。したがって、一つの態様において、天然プロテアーゼ切断部位は天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸の変化によって作動不能にされる。この態様の別の側面において、天然プロテアーゼ切断部位は、例えば、天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも３つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも４つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも５つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも６つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも７つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも８つのアミノ酸; 天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも９つのアミノ酸; 天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも１０のアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも 15のアミノ酸; または天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む少なくとも 20のアミノ酸の変化によって作動不能にされる。
【０５０３】
この態様のさらに別の側面において、天然二本鎖プロテアーゼ切断部位は、例えば、天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも３つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも４つのアミノ酸; 天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも５つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも６つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも７つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも８つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも９つのアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも１０のアミノ酸;天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも 15のアミノ酸; または天然プロテアーゼによって切断されるペプチド結合に隣接する２つのアミノ酸を含む多くとも 20のアミノ酸の変化によって作動不能にされる。
【０５０４】
一つの態様において、外来性プロテアーゼ切断部位は改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置する。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は外来性プロテアーゼ切断部位を含み、それは、例えば、ウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位、ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位、SUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位、トロンビン プロテアーゼ切断部位 または因子 Xa プロテアーゼ切断部位を含む。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０５０５】
この態様の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するウシ エンテロキナーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号71を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、ウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０５０６】
この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するタバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80 または配列番号81を含む 改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するタバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、タバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０５０７】
この態様のさらに別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86 または配列番号87を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０５０８】
この態様のさらに別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するSUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号88を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するSUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、SUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０５０９】
この態様のさらなる側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するトロンビン プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102 または配列番号103を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置するトロンビン プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、トロンビン プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０５１０】
この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置する凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、外来性プロテアーゼ切断部位 は、例えば、配列番号104 または配列番号105を含む改変クロストリジウム毒素の二本鎖ループ内に位置する凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位であり得る。この態様のさらに別の側面において、凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTの二本鎖ループ内に位置する。
【０５１１】
別の態様において、外来性プロテアーゼ部位は、クロストリジウム毒素基質切断部位を含む。本明細書において用いる場合、「クロストリジウム毒素基質切断部位」という用語は、隣接または非隣接認識要素またはその両方とともに、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に好適な条件下でクロストリジウム毒素によるその裂けやすい結合での検出可能な タンパク分解に十分な裂けやすい結合を意味する。定義によると、クロストリジウム毒素基質切断部位は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に好適な条件下で少なくとも１つの クロストリジウム毒素による切断に感受性である。クロストリジウム毒素基質切断部位の非限定的な例は、例えば、Lance E. Steward et al., Self-Activating Clostridial Toxins,米国特許出願 60/718,616 (Sep、19、2005) に開示されている。 
【０５１２】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに任意に１以上の付加的な成分を含んでいてもよいと理解される。任意の成分の非限定的な例として、改変クロストリジウム毒素はさらに、可動性スペーサーを含む可動性領域を含みうる。可動性スペーサーの非限定的な例としては、例えば、G-スペーサー GGGGS (配列番号106) またはA-スペーサー EAAAK (配列番号107) が挙げられる。可動性スペーサーを含む可動性領域は、ポリペプチドの特徴、特質または性質を最適化するためにポリペプチド 領域の長さを調節するために用いることが出来る。かかる可動性領域は融合タンパク質として改変クロストリジウム毒素にインフレームに作動可能に連結している。非限定的な例として、１以上の 可動性スペーサーをタンデムに含むポリペプチド 領域 を、プロテアーゼ切断部位をより良好に曝露するために用いることが出来、それにより、プロテアーゼによるその部位の切断が促進される。別の非限定的な例として、１以上の 可動性スペーサーをタンデムに含むポリペプチド 領域は、変化したターゲティングドメインをよりよく提示するために用いることが出来、それにより、変化したターゲティングドメインのその受容体との結合が促進される。
【０５１３】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに、可動性スペーサーを含む可動性領域を含みうる。別の態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに、複数の 可動性スペーサーをタンデムに含む可動性領域を含みうる。この態様の側面において、可動性領域は、タンデムに、例えば、少なくとも 1 のG-スペーサー、少なくとも 2のG-スペーサー、少なくとも 3のG-スペーサー、少なくとも 4のG-スペーサー または少なくとも 5のG-スペーサーを含みうる。この態様の別の側面において、可動性領域はタンデムに、例えば、多くとも 1の G-スペーサー、多くとも 2のG-スペーサー、多くとも 3のG-スペーサー、多くとも 4のG-スペーサー または多くとも 5のG-スペーサーを含みうる。この態様のさらに別の側面において、可動性領域はタンデムに、例えば、少なくとも 1のA-スペーサー、少なくとも 2のA-スペーサー、少なくとも 3のA-スペーサー、少なくとも 4のA-スペーサー または少なくとも 5のA-スペーサーを含みうる。この態様のさらに別の側面において、可動性領域はタンデムに、例えば、多くとも 1のA-スペーサー、多くとも 2のA-スペーサー、多くとも 3のA-スペーサー、多くとも 4のA-スペーサー または多くとも 5のA-スペーサーを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は１コピー以上の同じ可動性スペーサー、１コピー以上の異なる可動性スペーサー領域、またはそれらのあらゆる組合せを含む可動性領域を含みうる。
【０５１４】
この態様の側面において、可動性スペーサーを含む改変クロストリジウム毒素は、例えば、改変BoNT/A、改変BoNT/B、改変BoNT/C1、改変BoNT/D、改変BoNT/E、改変BoNT/F、改変BoNT/G または改変TeNTであり得る。
【０５１５】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はあらゆるすべての位置にて可動性スペーサーを含みうると考えられるが、ただし、改変クロストリジウム毒素は中毒プロセスを実行することができるものである。この態様の側面において、可動性スペーサーは、例えば、酵素ドメインおよび転位置ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、酵素ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、G-スペーサーは、例えば、酵素ドメインおよび転位置ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、酵素ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、A-スペーサーは、例えば、酵素ドメインおよび転位置ドメイン、酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、酵素ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【０５１６】
この態様の別の側面において、可動性スペーサーは、例えば、変化したターゲティングドメインおよび転位置ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、G-スペーサーは、例えば、変化したターゲティングドメインおよび転位置ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、A-スペーサーは、例えば、変化したターゲティングドメインおよび転位置ドメイン、変化したターゲティングドメインおよび酵素ドメイン、変化したターゲティングドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【０５１７】
この態様のさらに別の側面において、可動性スペーサーは、例えば、転位置ドメインおよび酵素ドメイン、転位置ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、G-スペーサーは、例えば、転位置ドメインおよび酵素ドメイン、転位置ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に位置する。この態様の別の側面において、A-スペーサーは、例えば、転位置ドメインおよび酵素ドメイン、転位置ドメインおよび変化したターゲティングドメイン、転位置ドメインおよびプロテアーゼ切断部位の間に 位置する。
【０５１８】
任意の成分の別の非限定的な例として、改変クロストリジウム毒素はさらにエピトープ結合領域を含みうる。エピトープ結合領域は多種多様な手順に利用でき、例えば、タンパク質 精製およびタンパク質 可視化が含まれる。かかるエピトープ結合領域は改変クロストリジウム毒素に融合タンパク質としてインフレームに作動可能に連結している。エピトープ結合領域の非限定的な例としては、例えば、FLAG,Express（商標） (配列番号108)、ヒト インフルエンザウイルス 赤血球凝集素 (HA) (配列番号109)、ヒト p62c-Myc タンパク質 (c MYC) (配列番号110)、水疱性口内炎ウイルス 糖タンパク質 (VSV-G) (配列番号111)、サブスタンスP  (配列番号112)、単純ヘルペスウイルス (HSV)の糖タンパク質-D 前駆体 (配列番号113)、V5 (配列番号114)、AU1 (配列番号115) およびAU5 (配列番号116); 親和性-結合、例えば、ポリヒスチジン (HIS) (配列番号117)、ストレプトアビジン 結合 ペプチド (strep)、およびビオチンまたはビオチン化 配列; ペプチド-結合領域、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼのグルタチオン 結合ドメイン、カルモジュリン 結合 タンパク質のカルモジュリン 結合ドメインおよびマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインが挙げられる。適当な結合ペプチドを選択、製造および使用するための特定のプロトコールの非限定的な例は、例えば、Epitope Tagging, pp. 17.90-17.93 (Sambrook and Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001); Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998); および Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998) に記載されている。さらに、結合 ペプチドならびによく特徴決定された 試薬、条件およびプロトコールの非限定的な例は市販の供給源から容易に入手可能であり、これらに限定されないが、BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA; BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA; Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA; QIAGEN、Inc.、Valencia、CA; およびStratagene、La Jolla、CAが挙げられる。これらのプロトコールは当業者の技術範囲内であって本教示から常套の手順である。
【０５１９】
したがって、一つの態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらにエピトープ結合領域を含みうる。別の態様において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はさらに複数の エピトープ結合領域を含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、少なくとも１つのエピトープ結合領域、少なくとも２つのエピトープ結合領域、少なくとも３つのエピトープ結合領域、少なくとも４つのエピトープ結合領域 または少なくとも５つのエピトープ結合領域を含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、多くとも１つのエピトープ結合領域、多くとも２つのエピトープ結合領域、多くとも３つのエピトープ結合領域、多くとも４つのエピトープ結合領域 または多くとも５つのエピトープ結合領域を含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、１コピー以上の同じエピトープ結合領域、１コピー以上の異なるエピトープ結合領域、またはそれらのあらゆる組合せを含みうる。
【０５２０】
エピトープ結合領域の位置は様々な位置であり得、例えば、これらに限定されないが、改変クロストリジウム毒素のアミノ末端、改変クロストリジウム毒素の内部、または改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端が挙げられる。したがって、一つの態様において、エピトープ結合領域は改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置する。かかる位置において、開始メチオニンをエピトープ結合領域の前に配置すべきである。さらに、開始メチオニンを含む別のポリペプチドの アミノ末端 に作動可能に連結したポリペプチドを付加すると、元のメチオニン 残基が欠失されうることが当該技術分野において知られている。これは付加されたポリペプチドが新しい開始メチオニンを含むことおよび元の開始メチオニンが融合タンパク質の最適の発現を低下させうることという事実に起因する。この態様の側面において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置するエピトープ結合領域は、例えば、FLAG,Express（商標） エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルス 赤血球凝集素 (HA) エピトープ結合領域、ヒト p62c-Myc タンパク質 (c MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス 糖タンパク質 (VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンスP  エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス (HSV) エピトープ結合領域の糖タンパク質-D 前駆体、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジン エピトープ結合領域、ストレプトアビジン 結合 ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン-S-トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン またはマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。 
【０５２１】
別の態様において、エピトープ結合領域は改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置する。この態様の側面において、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置するエピトープ結合領域は、例えば、FLAG,Express（商標） エピトープ結合領域、ヒトインフルエンザウイルス 赤血球凝集素 (HA) エピトープ結合領域、ヒト p62c-Myc タンパク質 (c MYC) エピトープ結合領域、水疱性口内炎ウイルス 糖タンパク質 (VSV-G) エピトープ結合領域、サブスタンスP  エピトープ結合領域、単純ヘルペスウイルス (HSV) エピトープ結合領域の糖タンパク質-D 前駆体、V5 エピトープ結合領域、AU1 エピトープ結合領域、AU5 エピトープ結合領域、ポリヒスチジン エピトープ結合領域、ストレプトアビジン 結合 ペプチド エピトープ結合領域、ビオチン エピトープ結合領域、ビオチン化 エピトープ結合領域、グルタチオン-S-トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメインまたはマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインであり得る。
【０５２２】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素はあらゆるすべての位置にて変化したターゲティングドメインを含みうると考えられ、 ただしその改変クロストリジウム毒素は中毒プロセスを実行することができるものである。非限定的な例として、改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に増強したターゲティングドメインを位置させること(図4参照);改変クロストリジウム毒素のクロストリジウム毒素酵素ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置ドメインの間に増強したターゲティングドメインを位置させること (図5参照); および改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に増強したターゲティングドメインを位置させること(図6参照)が挙げられる。天然クロストリジウム毒素の酵素ドメインは、ネイティブな開始メチオニンを含む。したがって、酵素ドメインがアミノ-末端位置にないドメイン編成においては、開始メチオニンを含むアミノ酸配列をアミノ-末端 ドメインの前に位置させるべきである。同様に、アミノ-末端 位置に変化したターゲティングドメインがある場合、開始メチオニン およびプロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列を、変化したターゲティングドメインが遊離のアミノ-末端を要求する状況においては、作動可能に連結させるとよく、例えば、Shengwen Li et al., Degradable Clostridial Toxins,国際特許出願公開 WO 2006/026780 (Mar. 9、2006) を参照されたい。さらに、開始メチオニンを含む別のポリペプチドのアミノ末端に作動可能に連結したポリペプチドを付加する場合、元のメチオニン 残基が欠失されうることが当該技術分野において知られている。
【０５２３】
したがって、一つの態様において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。
【０５２４】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素は、ひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にてクロストリジウム毒素酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。
【０５２５】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含みうる。
【０５２６】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよびクロストリジウム毒素転位置促進ドメインを含みうる。
【０５２７】
別の態様において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、内因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。この態様の別の側面において、改変クロストリジウム毒素はひとつのポリペプチドのアミノからカルボキシへの直線的順序にて、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン、外来性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含みうる。
【０５２８】
本発明の側面は部分的には、改変クロストリジウム毒素を提供する。本明細書に開示するクロストリジウム毒素改変の非限定的な例としては、例えば、変化したターゲティングドメインの付加、プロテアーゼ切断部位の付加、酵素、転位置および結合ドメインの再編成およびスペーサー 領域の付加が挙げられる。かかるすべての改変は、改変クロストリジウム毒素が細胞を中毒させる能力に実質的に影響を与えないことが理解される。本明細書において用いる場合、「実質的に影響を与えない」という用語は、改変クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素が神経細胞に入り、神経伝達物質放出を阻害する細胞機構の全体を実行することが出来ることを意味し、かかる細胞機構には、クロストリジウム毒素の低または高親和性 受容体複合体への結合、毒素受容体複合体のインターナリゼーション、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質への転位置およびクロストリジウム毒素基質の酵素的改変が含まれる。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 10％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 20％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 30％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 40％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 50％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 60％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 70％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 80％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の少なくとも 90％毒性であり または天然クロストリジウム毒素の少なくとも 95%毒性である。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素は、例えば、天然クロストリジウム毒素の多くとも 10％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 20％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 30％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 40％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 50％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 60％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 70％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 80％毒性であり、天然クロストリジウム毒素の多くとも 90％毒性であり または天然クロストリジウム毒素の多くとも 95%毒性である。
【０５２９】
本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書に開示するあらゆるすべての 改変クロストリジウム毒素はポリヌクレオチド分子によりコードされうると考えられる。
【０５３０】
本発明の側面は、部分的にはポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド分子」という用語は、「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのあらゆる長さのポリマー形態を意味する。本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードしうるあらゆるすべての ポリヌクレオチド分子が有用であり得ると考えられ、例えば、これらに限定されないが 天然および非天然 DNA 分子および天然および非天然 RNA 分子が挙げられる。天然および非天然 DNA 分子の非限定的な例としては、 一本鎖 DNA 分子、二本鎖 DNA 分子、ゲノム DNA 分子、cDNA 分子、ベクターコンストラクト、例えば、プラスミド コンストラクト、ファージミド コンストラクト、バクテリオファージ コンストラクト、レトロウイルス コンストラクトおよび人工染色体 コンストラクトが挙げられる。天然および非天然 RNA 分子の非限定的な例としては、一本鎖 RNA、二本鎖 RNAおよびmRNAが挙げられる。
【０５３１】
したがって、一つの態様において、ポリヌクレオチド分子は本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードする。
【０５３２】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示するクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、改変クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォームまたはクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体または活性のクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメイン、TeNT 酵素ドメイン、またはその活性の断片を含む。
【０５３３】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示するクロストリジウム毒素転位置ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素転位置ドメインアイソフォームまたはクロストリジウム毒素転位置ドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素転位置ドメイン変異体または活性のクロストリジウム毒素転位置ドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 転位置ドメイン、BoNT/B 転位置ドメイン、BoNT/C1 転位置ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置ドメイン、BoNT/F 転位置ドメイン、BoNT/G 転位置ドメイン、TeNT 転位置ドメイン、またはその活性の断片を含む。
【０５３４】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示する転位置促進ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインアイソフォームまたはクロストリジウム毒素転位置促進ドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン変異体または活性のクロストリジウム毒素転位置促進ドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 転位置促進ドメイン、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメイン、TeNT 転位置促進ドメイン、またはその活性の断片を含む。この態様のさらに別の側面において、転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインアイソフォームまたはエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインサブタイプを含む。この態様の別の側面において、転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、例えば、保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体、非保存的エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン変異体または活性のエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン断片、またはそれらのあらゆる組合せを含む。この態様の別の側面において、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン、アルファウイルス融合ペプチドドメイン、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン、アブラウイルス融合ペプチドドメイン、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン、メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン、泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン、またはその活性の断片を含む。
【０５３５】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、天然変異体、例えばアイソフォームまたはサブタイプなどを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然変異体、例えば保存的変異体、非保存的変異体または活性の断片、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス前膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、TGFβスーパーファミリーポリペプチド、例えばTGFβ、BMP、GDFおよびアクチビンなど;ニューロトロフィン、例えばNGF、BDNF、NT-3およびNT-4/5など; 軸索ガイダンスシグナル伝達分子、例えばネトリン、セマフォリンおよびエフリンなど;神経調節サイトカイン、例えばCNTF、GPA、LIF、インターロイキン、オンコスタチンM、CT-1およびCLCなど;糖結合タンパク質、例えば血清アミロイドP、β-グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、cryia、殺虫性デルタ-エンドトキシン、アグルチニン、アブリンおよびリシンなど;IGF、例えばIGF-1およびIGF-2など;ニューレキシン;ニューロロイキン/AMF/MF;TrkB;EGF;内蔵腸管ペプチド（visceral gut peptide）、例えばガストリン、VIP、ボンベシンなど;およびWNT、例えばFrizzledなどを含む。
【０５３６】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドを含む。この態様の側面において、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、天然変異体、例えばアイソフォームまたはサブタイプなどを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、非天然変異体、例えば保存的変異体、非保存的変異体または活性の断片、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。この態様の別の側面において、クロストリジウム毒素標的細胞のシナプス後膜に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、Ng-CAM(L1)、N-CAM、N-カドヘリン、アグリン-MUSKおよび基底膜ポリペプチド、例えばラミニンβ-2などを含む。
【０５３７】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示するプロテアーゼ切断部位を含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位を含む。この態様の側面において、内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位 またはTeNT 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位であり得る。この態様の別の側面において、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子は外来性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位を含む。この態様の側面において、外来性クロストリジウム毒素プロテアーゼ部位をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、ウシ エンテロキナーゼ プロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位、ヒト ライノウイルス 3C プロテアーゼ切断部位、SUMO/ULP-1 プロテアーゼ切断部位、トロンビン プロテアーゼ切断部位、凝固因子 Xa プロテアーゼ切断部位またはクロストリジウム毒素基質切断部位、例えば、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位 またはTeNT 基質切断部位であり得る。
【０５３８】
別の態様において、ポリヌクレオチド分子は、部分的には、本明細書に開示する可動性スペーサーを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。この態様の側面において、可動性スペーサーをコードするポリヌクレオチド分子は、G-スペーサー、A-スペーサー またはそれらのあらゆる組合せを含みうる。
【０５３９】
本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作るために必要でありうるよく確立された分子生物学技術には、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、核酸ライゲーション、細菌形質転換、核酸精製、核酸配列決定および組換えに基づく技術を含む手順が含まれ、これらは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作るために必要な特定のプロトコールの非限定的な例は、例えば、MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 前掲, (2001);およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004) に記載されている。さらに、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作るのに有用な様々な市販品が広く入手可能である。これらのプロトコールは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。
【０５４０】
本発明の別の側面は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、かかる方法は、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞中で発現させる工程を含む。本発明の別の側面は本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を生産する方法を提供し、かかる方法は、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトを細胞に導入する工程および発現コンストラクトを細胞中で発現させる工程を含む。
【０５４１】
本明細書に開示する方法は、部分的には、改変クロストリジウム毒素を含む。本明細書に開示するあらゆるすべての改変クロストリジウム毒素は、本明細書に開示する方法を用いて生産することが出来ると考えられる。また、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードするあらゆるすべての ポリヌクレオチド分子は、本明細書に開示する方法を用いる本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の生産において有用であり得ると考えられる。
【０５４２】
本明細書に開示する方法は、部分的には、発現コンストラクトを含む。発現コンストラクトは、細胞または細胞非含有抽出物におけるポリヌクレオチド分子の発現に有用な発現ベクターに作動可能に連結した本明細書に開示するポリヌクレオチド分子を含む。多種多様な発現ベクターを改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の発現に利用でき、例えば、これらに限定されないが、ウイルス発現ベクター;原核発現ベクター; 真核発現ベクター、例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターおよび哺乳類発現ベクター; および細胞非含有抽出物発現ベクターが挙げられる。さらにこれら方法の側面の実行に有用な発現ベクターには、構成的、組織-特異的、細胞-特異的または誘導可能プロモーター要素、エンハンサー 要素またはその両方の制御下で改変クロストリジウム毒素を発現するものが含まれうることが理解される。発現ベクター、ならびにかかる発現ベクターからの発現コンストラクトの製造および使用のためによく確立された試薬および条件の非限定的な例は市販の供給源から容易に入手可能なものであり、例えば、これらに限定されないが、BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA; BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA; Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA; EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI; QIAGEN、Inc.、Valencia、CA;およびStratagene、La Jolla、CAが挙げられる。適当な発現ベクターの選択、製造および使用は当業者の技術範囲内であり本教示から常套の手順である。
【０５４３】
したがって、この態様の側面には、これらに限定されないが、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結したウイルス 発現ベクター;改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した原核 発現ベクター;改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した酵母発現ベクター;改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した昆虫発現ベクター; および改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した哺乳類発現ベクターが含まれる。この態様の別の側面には、これらに限定されないが、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結した細胞非含有抽出物発現ベクターを含む細胞非含有抽出物を用いて本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素を発現させるのに好適な発現コンストラクトが含まれる。
【０５４４】
本明細書に開示する方法は、部分的には細胞を含む。あらゆるすべての 細胞が利用できると考えられる。したがって、この態様の側面は、これらに限定されないが、原核細胞、例えば、これらに限定されないが、好気性、微好気性、カプノフィリック(capnophilic)、通性、嫌気性、グラム陰性およびグラム陽性細菌細胞の株、 例えば、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacteroides fragilis、Clostridia perfringens、Clostridia difficile、Caulobacter crescentus、Lactococcus lactis、Methylobacterium extorquens、Neisseria meningirulls、Neisseria meningitidis、Pseudomonas fluorescens および Salmonella typhimurium由来のもの; および真核細胞、例えば、これらに限定されないが、酵母株、例えば、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia angusta、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiaeおよびYarrowia lipolytica由来のもの; 昆虫細胞および昆虫由来の細胞株、例えば、Spodoptera frugiperda、Trichoplusia ni、Drosophila melanogaster および Manduca sexta由来のもの; および哺乳類細胞および哺乳類細胞由来の細胞株、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒト由来のものを含む。 細胞株はAmerican Type Culture Collection, European Collection of Cell Culturesおよび German Collection of Microorganisms and Cell Culturesから得ることが出来る。適当な細胞株の選択、製造および使用の特定のプロトコールの非限定的な例は、例えば、INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 前掲, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002); およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 前掲(2004) に記載されている。これらプロトコールは、当業者の技術範囲内であり、本教示から常套の手順である。
【０５４５】
本明細書に開示する方法は、部分的には、細胞にポリヌクレオチド分子を導入することを含む。細胞に導入されたポリヌクレオチド分子はその細胞によって一過性または安定に維持されうる。安定に維持されたポリヌクレオチド分子は染色体外にあって自律的に複製するものであってもよいし、細胞の染色体物質に組み込まれて非自律的に複製するものであってもよい。本明細書に開示するポリヌクレオチド分子を細胞に導入するためにあらゆるすべての方法を用いることが出来ると考えられる。核酸分子を細胞に導入するために有用な方法としては、これらに限定されないが、化学物質媒介トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム-媒介、ジエチル-アミノエチル (DEAE) デキストラン-媒介、脂質-媒介、ポリエチレンイミン (PEI)-媒介、ポリリシン-媒介およびポリブレン-媒介トランスフェクション; 物理的媒介トランスフェクション、例えば、遺伝子銃送達、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーション;およびウイルス-媒介トランスフェクション、例えば、レトロウイルス-媒介トランスフェクションが挙げられ、例えば、Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001)を参照されたい。当業者であれば、細胞に発現コンストラクトを導入する特定の方法の選択は、部分的には、細胞が一過性に発現コンストラクトを含むか否かあるいは細胞が安定に発現コンストラクトを含むか否かに依存することを理解している。これらプロトコールは当業者の技術範囲内であり本教示から常套の手順である。
【０５４６】
この態様の側面において、トランスフェクションと称される化学物質媒介法を用いて改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が細胞に導入される。トランスフェクションの化学物質媒介法において、化学物質は核酸と複合体を形成し、それが細胞へのその取り込みを促進する。かかる化学物質としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウム-媒介、例えば、Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004)を参照されたい; ジエチル-アミノエチル (DEAE) デキストラン-媒介、脂質-媒介、カチオン性ポリマー-媒介、例えばポリエチレンイミン (PEI)-媒介およびポリリシン-媒介およびポリブレン-媒介、例えば、Chun Zhang et al., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004)を参照されたい、が挙げられる。かかる化学物質媒介送達系は標準的方法を用いて調製することが出来るし、市販されており、例えば、CellPhect Transfection Kit (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran, (Stratagene、Inc.、La Jolla、CA); Lipofectamine（商標） ransfection Reagent (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA); ExGen 500 Transfection kit (Fermentas、Inc.、Hanover、MD)、および SuperFectおよびEffectene Transfection Kits (Qiagen、Inc.、Valencia、CA) を参照されたい。
【０５４７】
この態様の別の側面において、物理的媒介法を用いて改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が細胞に導入される。物理的技術としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、遺伝子銃およびマイクロインジェクションが挙げられる。遺伝子銃およびマイクロインジェクション技術は、核酸分子を細胞に導入するために細胞壁を穿孔するものであり、例えば、Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997);およびJohn O’Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004)を参照されたい。電気的透過法とも称されるエレクトロポレーションは、短い高電位の電気パルスを用いて膜に核酸分子が入る一過性の孔を作るものであり、すべての細胞タイプの安定および一過性のトランスフェクションに有効に利用でき、例えば、M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004);およびOliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004) を参照されたい。
【０５４８】
この態様の別の側面において、形質導入と称されるウイルス-媒介法を用いて改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が細胞に導入される。一過性の形質導入のウイルス-媒介法において、ウイルス 粒子が感染して宿主細胞中で複製するプロセスが操作されて、この機構が核酸分子を細胞に導入するために利用される。ウイルス-媒介法は多種多様なウイルスから開発されており、例えば、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴 ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルスおよびバキュロウイルスが挙げられ、例えば、Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); およびMaurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); および A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)を参照されたい。
【０５４９】
エンベロープを持たない二本鎖 DNA ウイルスであるアデノウイルスは、アデノウイルスが約 36 kbの比較的大きいポリヌクレオチド分子を扱い、高い力価で生産され、多種多様な分裂および非分裂細胞の両方に効率的に感染することができるため、しばしば哺乳類細胞 形質導入のために選択されており、例えば、Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); および Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001) を参照されたい。アデノウイルスに基づく系を用いる形質導入は、核酸分子が宿主細胞染色体へと組み込まれるのではなく、細胞核におけるエピソームから担持されるため長期のタンパク質発現を支持するものではない。アデノウイルスベクター系およびかかるベクターをどのように使用するかについての特定のプロトコールは、例えば、ViraPower（商標）Adenoviral Expression System (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) およびViraPower（商標）Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002);および AdEasy（商標）Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA)および AdEasy（商標）Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.に開示されている。
【０５５０】
核酸分子送達はまた、一本鎖 RNA レトロウイルス、例えば、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを使用することもできる。レトロウイルス-媒介形質導入はしばしば100％に近い形質導入効率をもたらし、感染効率 (MOI)を変化させることによってプロウイルス コピー数を容易に制御でき、一過性または安定に細胞を形質導入するために利用することが出来、例えば、Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004);および Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)を参照されたい。レトロウイルス 粒子はタンパク質キャプシドにパッケージされたRNA ゲノム、およびキャプシドの周囲の脂質エンベロープからなる。レトロウイルスは、そのRNAを細胞質に逆転写酵素とともに注入することによって宿主細胞に感染する。RNA テンプレートは次いで逆転写されて線状二本鎖 cDNAとなり、宿主細胞 ゲノムに組み込まれることによりそれ自身で複製する。ウイルス粒子は垂直 (親細胞から娘細胞へとプロウイルスを介して) および水平 (細胞から細胞へとウイルス粒子を介して)の両方にて伝播する。この複製戦略により、目的核酸分子が宿主細胞の染色体に安定に組み込まれるため長期の永続的な発現が可能となり、それによってタンパク質の長期の発現が可能となる。例えば、動物研究により、様々な組織へと注入されたレンチウイルス ベクターが、1年を超える持続的なタンパク質 発現をもたらしたことが示されており、例えば、Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996)を参照されたい。オンコレトロウイルス由来ベクター系、例えば、モロニーマウス白血病 (MoMLV)は広く使用されており、様々な種類の非分裂細胞に感染する。レンチウイルスは多くの種類の細胞タイプに感染することもでき、例えば分裂および非分裂細胞が挙げられ、そして高度に特異的な細胞の標的化を可能とする複雑なエンベロープタンパク質を有している。 
【０５５１】
レトロウイルス ベクターおよびかかるベクターをどのように使用するかについての特定のプロトコールは、例えば、米国特許 Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters,米国特許第5,464,758号(Nov. 7、1995)および Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression,米国特許第5,814,618号(Sep. 29、1998) David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same,米国特許第5,514,578号(May 7、1996) およびDavid S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor,米国特許 6,245,531 (Jun. 12、2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations,米国特許第5,364,791号(Nov. 15、1994)、Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy,米国特許第5,874,534号(Feb. 23、1999)および Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy,米国特許第5,935,934号(Aug. 10、1999) に開示されている。さらに、かかるウイルス送達系は標準的方法により調製することが出来、市販されており、例えば、BD（商標） Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) およびBD（商標） Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (Mar. 14, 2003), GeneSwitch（商標） System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) およびGeneSwitch（商標）System A Mifepristone-Regulated Expression System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov. 4, 2002); ViraPower（商標） Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)および ViraPower（商標） Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec. 8, 2003); および Complete Control（登録商標） Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) および Complete Control（登録商標） Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005eを参照されたい。
【０５５２】
本明細書に開示する方法は、部分的には、ポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素を発現させることを含む。様々な発現系のいずれも本明細書に開示するポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素を発現させるために有用であり得ると考えられ、例えば、これらに限定されないが、細胞に基づく系および無細胞発現系が挙げられる。細胞に基づく系としては、これらに限定されないが、ウイルス発現系、原核発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳類発現系が挙げられる。無細胞系としては、これらに限定されないが、コムギ胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物および大腸菌抽出物が挙げられ、一般に本明細書に開示する方法と同等である。発現系を用いるポリヌクレオチド分子の発現は、あらゆる様々な特性を含み得、例えば、これらに限定されないが、誘導可能発現、非誘導可能発現、構成的発現、ウイルス-媒介発現、安定に-組み込まれた発現、および一過性の発現が挙げられる。よく特徴決定されたベクター、試薬、条件および細胞を含む発現系はよく確立されており、市販の供給源から容易に入手可能であり、例えば、これらに限定されないが、Ambion、Inc. Austin、TX; BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA; BD Biosciences Pharmingen、San Diego、CA; Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA; QIAGEN、Inc.、Valencia、CA; Roche Applied Science、Indianapolis、IN; および Stratagene、La Jolla、CAが挙げられる。適当な異種発現系の選択および使用の非限定的な例は、例えば、PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); および Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001)に記載されている。これらのプロトコールは当業者の技術範囲内で本教示から常套の手順である。
【０５５３】
様々な細胞に基づく発現手順が、本明細書に開示するポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素の発現に有用である。例としては例えば、これらに限定されないが、ウイルス発現系、原核発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳類発現系が挙げられる。ウイルス発現系としては、これらに限定されないが、ViraPower（商標） Lentiviral (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、Adenoviral Expression Systems (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、AdEasy（商標）XL Adenoviral Vector System (Stratagene, La Jolla, CA)およびViraPort（登録商標） Retroviral Gene Expression System (Stratagene、La Jolla、CA)が挙げられる。原核発現系の非限定的な例としては、Champion（商標） pET Expression System (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)、TriEx（商標） Bacterial Expression System (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)、QIAexpress（登録商標） Expression System (QIAGEN、Inc.)、およびAffinity（登録商標） Protein Expression and Purification System (Stratagene、La Jolla、CA)が挙げられる。酵母発現系としては、これらに限定されないが、EasySelect（商標） Pichia Expression Kit (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、YES-Echo（商標） Expression Vector Kits (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA ) およびSpECTRA（商標）S. pombe Expression System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)が挙げられる。バキュロウイルス発現系の非限定的な例としては、BaculoDirect（商標） (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、Bac-to-Bac（登録商標） (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、および BD BaculoGold（商標） (BD Biosciences-Pharmigen、San Diego、CA)が挙げられる。昆虫発現系としては、これらに限定されないが、Drosophila Expression System (DES（登録商標）) (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、InsectSelect（商標） System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA) およびInsectDirec（商標）System (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)が挙げられる。哺乳類発現系の非限定的な例としては、例えば、T-REx（商標） (Tetracycline-Regulated Expression) System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、Flp-In（商標） T-REx（商標） System  (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、pcDNA（商標） system (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、pSecTag2 system (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)、 Exchanger（登録商標） System、InterPlay（商標） Mammalian TAP System (Stratagene、La Jolla、CA)、Complete Control（登録商標） Inducible Mammalian Expression System (Stratagene、La Jolla、CA) およびLacSwitch（登録商標） II Inducible Mammalian Expression System (Stratagene、La Jolla、CA)が挙げられる。
【０５５４】
本明細書に開示するポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素を発現させる別の手順は、無細胞発現系、例えば、これらに限定されないが、原核 抽出物および真核抽出物を用いる。原核細胞抽出物の非限定的な例としては、RTS 100 E. coli HY Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)、ActivePro In Vitro Translation Kit (Ambion, Inc., Austin, TX)、EcoPro（商標）System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)およびExpressway（商標） Plus Expression System (Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA)が挙げられる。真核細胞抽出物としては、これらに限定されないが、RTS 100 Wheat Germ CECF Kit (Roche Applied Science、Indianapolis、IN)、TnT（登録商標） Coupled Wheat Germ Extract Systems (Promega Corp.、Madison、WI)、Wheat Germ IVT（商標） Kit (Ambion、Inc.、Austin、TX)、Retic Lysate IVT（商標） Kit (Ambion、Inc.、Austin、TX)、PROTEINscript（登録商標） II System (Ambion、Inc.、Austin、TX)およびTnT（登録商標） Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega Corp.、Madison、WI)が挙げられる。
【０５５５】
本発明の他の側面は、以下のように記載可能である：
1.以下を含む改変クロストリジウム毒素:
a)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素酵素ドメイン;
b)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素転位置ドメイン; 
c)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することが出来る転位置促進ドメイン; 
d) クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合でき、かつクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することが出来る変化したターゲティングドメイン; および、
e)プロテアーゼ切断部位;
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は、改変クロストリジウム毒素の一本鎖形態を二本鎖形態へと変換する。
【０５５６】
2. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、改変クロストリジウム毒素は、一本のポリペプチドのアミノからカルボキシへ直線状の順序において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む。
【０５５７】
3. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、改変クロストリジウム毒素は、一本のポリペプチドのアミノからカルボキシへ直線状の順序において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む。
【０５５８】
4. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、改変クロストリジウム毒素は、一本のポリペプチドのアミノからカルボキシへ直線状の順序において、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位およびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。
【０５５９】
5. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、改変クロストリジウム毒素は、一本のポリペプチドのアミノからカルボキシへ直線状の順序において、変化したターゲティングドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転位置ドメインおよび転位置促進ドメインを含む。
【０５６０】
6. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、改変クロストリジウム毒素は、一本のポリペプチドのアミノからカルボキシへ直線状の順序において、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素酵素ドメインおよび変化したターゲティングドメインを含む。
【０５６１】
7. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、改変クロストリジウム毒素は、一本のポリペプチドのアミノからカルボキシへ直線状の順序において、クロストリジウム毒素転位置ドメイン、転位置促進ドメイン、プロテアーゼ切断部位、増強したターゲティングドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。
【０５６２】
8. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメインおよびTeNT 酵素ドメインからなる群から選択される。
【０５６３】
9. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、クロストリジウム毒素転位置ドメインは、BoNT/A 転位置ドメイン、BoNT/B 転位置ドメイン、BoNT/C1 転位置ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置ドメイン、BoNT/F 転位置ドメイン、BoNT/G 転位置ドメインおよびTeNT 転位置ドメインからなる群から選択される。
【０５６４】
10. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置促進ドメインである。
【０５６５】
11. 10による改変クロストリジウム毒素、ここで、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、BoNT/A 転位置促進ドメイン、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメインからなる群から選択される。
【０５６６】
12. 10による改変クロストリジウム毒素、ここで、クロストリジウム毒素転位置促進ドメインは、配列番号1のアミノ酸874-1110、配列番号2のアミノ酸861-1097、配列番号3のアミノ酸869-1111、配列番号4のアミノ酸865-1098、配列番号5のアミノ酸848-1085、配列番号6のアミノ酸867-1105、配列番号7のアミノ酸866-1105および配列番号8のアミノ酸882-1127からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０５６７】
13. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、転位置促進ドメインはエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインである。
【０５６８】
14. 13による改変クロストリジウム毒素、ここで、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインは、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン、アルファウイルス融合ペプチドドメイン、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン、アブラウイルス融合ペプチドドメイン、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインおよび泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインからなる群から選択される。
【０５６９】
15. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121および配列番号122からなる群から選択される。
【０５７０】
16. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、アルファウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148または配列番号149からなる群から選択される。
【０５７１】
17. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、ベシクロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159および配列番号160からなる群から選択される。
【０５７２】
18. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、レスピロウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166および配列番号167 からなる群から選択される。
【０５７３】
19. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、モルビリウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176または配列番号177 からなる群から選択される。
【０５７４】
20. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、アブラウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189または配列番号190からなる群から選択される。
【０５７５】
21. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、ヘニパウイルス融合ペプチドドメインは、配列番号191および配列番号192 からなる群から選択される。
【０５７６】
22. 14による改変クロストリジウム毒素、ここで、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインは配列番号193である。
【０５７７】
23. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、グルカゴン様ホルモン、神経ホルモン、神経調節サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合タンパク質、ニューレキシンに選択的に結合するリガンド、ニューレキシン-2αに対するリガンド、ニューレキシン-2βに対するリガンド、ニューレキシン-3αに対するリガンド、ニューレキシン-3βに対するリガンド、WNT、Ng-CAM(L1)、NCAM、N-カドヘリン、アグリン-MUSK、基底膜ポリペプチド、およびそのターゲティングドメインがクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行可能な前記ポリペプチドのいずれかの変異体からなる群から選択される。
【０５７８】
24. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、セクレチン、グレリン (GHS)、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、グルカゴン様ペプチド-2 (GLP-2)、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド (PACAP)、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド (GRPP)、オキシントモジュリン (OXY)、血管作用性小腸ペプチド-1 (VIP-1)、血管作用性小腸ペプチド-2 (VIP-2)、胃抑制ポリペプチド (GIP)、ガラニン (Gal) またはカルシトニン関連ペプチド、内臓腸管ペプチド（visceral gut peptide）からなる群から選択されるグルカゴン様ホルモンを含む。
【０５７９】
25. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、配列番号9のアミノ酸 21-50、配列番号9のアミノ酸 53-81、配列番号9のアミノ酸 53-89 、配列番号9のアミノ酸 98-124、配列番号9のアミノ酸 146-178、配列番号10のアミノ酸 132-158、配列番号11のアミノ酸 32-58、配列番号11のアミノ酸 32-75、配列番号12のアミノ酸 81-107、配列番号12のアミノ酸 125-151、配列番号13のアミノ酸 81-107、配列番号13のアミノ酸 124-150、配列番号14のアミノ酸 52-78、配列番号14のアミノ酸 52-93、配列番号15のアミノ酸 28-54、配列番号16のアミノ酸 76-92、配列番号16のアミノ酸 59-92、配列番号17のアミノ酸 41-50、配列番号17のアミノ酸 24-50および配列番号18のアミノ酸 99-112からなる群から選択されるグルカゴン様ホルモンを含む。
【０５８０】
26. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CCRH) および副甲状腺ホルモン (PTH)からなる群から選択される神経ホルモンを含む。
【０５８１】
27. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、配列番号19のアミノ酸 159-193、配列番号19のアミノ酸 154-194、配列番号20のアミノ酸 35-70および配列番号20のアミノ酸 145-177からなる群から選択される神経ホルモンを含む。
【０５８２】
28. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、毛様体神経栄養因子 (CNTF)、グリコホリン-A (GPA)、白血病抑制因子 (LIF)、インターロイキン (IL)、オンコスタチン M (OSM)、カルディオトロフィン-1 (CT-1)、カルディオトロフィン様サイトカイン (CLC)、ニューロロイキン  (NL)、VEGF、インシュリン様成長因子-1 (IGF-1)、インシュリン様成長因子-2 (IGF-2)および上皮成長因子 (EGF)からなる群から選択される神経調節サイトカインを含む。
【０５８３】
29. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26のアミノ酸 123-265、配列番号27のアミノ酸 21-153、配列番号28のアミノ酸 57-210、配列番号29のアミノ酸 21-99、配列番号29のアミノ酸 31-94、配列番号30のアミノ酸 37-173、配列番号30のアミノ酸 19-178、配列番号31、配列番号32、配列番号33のアミノ酸 52-109、配列番号33のアミノ酸 49-118、配列番号34のアミノ酸 31-84、配列番号34のアミノ酸 25-180および配列番号35からなる群から選択される神経ホルモンを含む。
【０５８４】
30. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、神経成長因子 (NGF)、脳由来成長因子 (BDNF)、ニューロトロフィン-3 (NT-3) およびニューロトロフィン-4/5 (NT-4/5)からなる群から選択されるニューロトロフィンを含む。
【０５８５】
31. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、配列番号36のアミノ酸 139-257、配列番号37のアミノ酸 133-240、配列番号37のアミノ酸 129-247、配列番号38のアミノ酸 144-249、配列番号38のアミノ酸 19-257、配列番号39のアミノ酸 89-202および配列番号39のアミノ酸 81-210からなる群から選択される神経ホルモンを含む。
【０５８６】
32. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF)、ニュールツリン (NRTN)、パーセフリン (PSPN) およびアルテミン (ARTN)からなる群から選択される成長因子を含む。
【０５８７】
33. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、配列番号40のアミノ酸 118-211、配列番号41のアミノ酸 107-196、配列番号41のアミノ酸 96-197、配列番号42のアミノ酸 66-155および配列番号43のアミノ酸 123-218からなる群から選択される神経ホルモンを含む。
【０５８８】
34. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP10、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF10、GDF11、GDF15、アクチビン A、アクチビン B、アクチビン C、アクチビン Eおよびインヒビン Aからなる群から選択されるTGFβ スーパーファミリーメンバーを含む。
【０５８９】
35. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、配列番号44のアミノ酸 293-390、配列番号45のアミノ酸 317-414、配列番号46のアミノ酸 315-412、配列番号47のアミノ酸 276-373、配列番号48のアミノ酸 296-396、配列番号49のアミノ酸 370-472、配列番号50のアミノ酸 309-409、配列番号51のアミノ酸 353-454、配列番号51のアミノ酸 323-454、配列番号52のアミノ酸 412-513、配列番号52のアミノ酸 374-513、配列番号53のアミノ酸 330-431、配列番号53のアミノ酸 293-431、配列番号54のアミノ酸 301-402、配列番号55のアミノ酸 323-424、配列番号56のアミノ酸 267-372、配列番号57のアミノ酸 327-429、配列番号58のアミノ酸 264-364、配列番号59のアミノ酸 400-501、配列番号60のアミノ酸 354-455、配列番号61のアミノ酸 352-450、配列番号62のアミノ酸 281-375、配列番号63のアミノ酸 376-478、配列番号64のアミノ酸 313-407、配列番号65のアミノ酸 211-308、配列番号66のアミノ酸 321-426、配列番号67のアミノ酸 303-406、配列番号68のアミノ酸 247-352、配列番号68のアミノ酸 237-352、配列番号69のアミノ酸 247-350、配列番号70のアミノ酸 262-366および配列番号70のアミノ酸 233-366からなる群から選択される神経ホルモンを含む。
【０５９０】
36. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、血清アミロイド P、β-グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、cry1A、殺虫性デルタ-エンドトキシン、アグルチニン、アブリンおよびリシンからなる群から選択される糖結合タンパク質を含む。
【０５９１】
37. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインは、ニューレキシン-1α、ニューレキシン-1β、ニューレキシン-2α、ニューレキシン -2β、ニューレキシン-3αおよびニューレキシン-3βからなる群から選択されるポリペプチドに結合するリガンドを含む。
【０５９２】
38. 23による改変クロストリジウム毒素、ここで、変化したターゲティングドメインはラミニン β-2を含む。
【０５９３】
39. 1による改変クロストリジウム毒素、ここで、プロテアーゼ切断部位は、内因性クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位または外来性切断部位である。
【０５９４】
40. 39による改変クロストリジウム毒素、ここで、内因性クロストリジウム毒素二本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、BoNT/A 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/B 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/C1 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/D 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/E 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/F 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位、BoNT/G 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位 およびTeNT 二本鎖ループプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される。
【０５９５】
41. 39による改変クロストリジウム毒素、ここで、外来性プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ切断部位、トロンビン切断部位、因子 Xa 切断部位、ヒトライノイルス 3C プロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス プロテアーゼ切断部位、ジペプチジルアミノペプチダーゼ 切断部位、低分子ユビキチン様修飾因子 (SUMO)/ユビキチン様 タンパク質-1(ULP-1) プロテアーゼ切断部位、およびクロストリジウム毒素基質切断部位からなる群から選択される。
【０５９６】
42. 41による改変クロストリジウム毒素、ここで、クロストリジウム毒素基質切断部位は、BoNT/A 基質切断部位、BoNT/B 基質切断部位、BoNT/C1 基質切断部位、BoNT/D 基質切断部位、BoNT/E 基質切断部位、BoNT/F 基質切断部位、BoNT/G 基質切断部位 およびTeNT 基質切断部位からなる群から選択される。
【０５９７】
43.以下を含む、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子:
a)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子;
b)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
c)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することが出来る転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
d) クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合でき、かつクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することが出来る変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子; および、
e)プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子、
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は改変クロストリジウム毒素の一本鎖形態を二本鎖形態へと変換する。
【０５９８】
44. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、ポリヌクレオチド分子は、請求項1-7のいずれかの改変クロストリジウム毒素をコードする。
【０５９９】
45. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 酵素ドメイン、BoNT/B 酵素ドメイン、BoNT/C1 酵素ドメイン、BoNT/D 酵素ドメイン、BoNT/E 酵素ドメイン、BoNT/F 酵素ドメイン、BoNT/G 酵素ドメインおよびTeNT 酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択される。
【０６００】
46. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、クロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、BoNT/A 転位置ドメイン、BoNT/B 転位置ドメイン、BoNT/C1 転位置ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置ドメイン、BoNT/F 転位置ドメイン、BoNT/G 転位置ドメインおよびTeNT 転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択される。
【０６０１】
47. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、転位置促進ドメインはクロストリジウム毒素転位置促進ドメインである。
【０６０２】
48. 47によるポリヌクレオチド分子、ここで、クロストリジウム毒素転位置促進ドメイン は、BoNT/A 転位置促進ドメイン、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメインからなる群から選択される。
【０６０３】
49. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、転位置促進ドメインはエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメインである。
【０６０４】
50. 49によるポリヌクレオチド分子、ここで、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン は、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン、アルファウイルス融合ペプチドドメイン、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン、アブラウイルス融合ペプチドドメイン、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン、メタニューモウイルス融合ペプチドドメインおよび泡沫状ウイルス融合ペプチドドメインからなる群から選択される。
【０６０５】
51. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、グルカゴン様ホルモン、神経ホルモン、神経調節サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合タンパク質、ニューレキシンに選択的に結合するリガンド、ニューレキシン-2αに対するリガンド、ニューレキシン-2βに対するリガンド、ニューレキシン-3αに対するリガンド、ニューレキシン-3βに対するリガンド、WNT、Ng-CAM(L1)、NCAM、N-カドヘリン、アグリン-MUSK、基底膜ポリペプチド、およびそのターゲティングドメインがクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行可能な前記ポリペプチドのいずれかの変異体をコードするポリヌクレオチド分子からなる群から選択される。
【０６０６】
52. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、セクレチン、グレリン (GHS)、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、グルカゴン様ペプチド-2 (GLP-2)、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド (PACAP)、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド (GRPP)、オキシントモジュリン (OXY)、血管作用性小腸ペプチド-1 (VIP-1)、血管作用性小腸ペプチド-2 (VIP-2)、胃抑制ポリペプチド (GIP)、ガラニン (Gal) またはカルシトニン関連ペプチド、内臓腸管ペプチド（visceral gut peptide）からなる群から選択されるグルカゴン様ホルモンをコードするポリヌクレオチド分子を含む
【０６０７】
53. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CCRH) および副甲状腺ホルモン (PTH)からなる群から選択される神経ホルモンをコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６０８】
54. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、毛様体神経栄養因子 (CNTF)、グリコホリン-A (GPA)、白血病抑制因子 (LIF)、インターロイキン (IL)、オンコスタチン M (OSM)、カルディオトロフィン-1 (CT-1)、カルディオトロフィン様サイトカイン (CLC)、ニューロロイキン  (NL)、VEGF、インシュリン様成長因子-1 (IGF-1)、インシュリン様成長因子-2 (IGF-2) および上皮成長因子  (EGF)からなる群から選択される神経調節サイトカインをコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６０９】
55. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、神経成長因子 (NGF)、脳由来成長因子 (BDNF)、ニューロトロフィン-3 (NT-3) およびニューロトロフィン-4/5 (NT-4/5)からなる群から選択されるニューロトロフィンをコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６１０】
56. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF)、ニュールツリン (NRTN)、パーセフリン (PSPN)、アルテミン (ARTN)からなる群から選択される成長因子をコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６１１】
57. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP10、GDF1、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF10、GDF11、GDF15、アクチビン A、アクチビン B、アクチビン C、アクチビン Eおよびインヒビン Aからなる群から選択されるTGFβ スーパーファミリーメンバーをコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６１２】
58. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、血清アミロイド P、β-グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、cry1A、殺虫性デルタ-エンドトキシン、アグルチニン、アブリンおよびリシンからなる群から選択される糖結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６１３】
59. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、ニューレキシン-1α、ニューレキシン-1β、ニューレキシン-2α、ニューレキシン -2β、ニューレキシン-3αおよびニューレキシン-3βからなる群から選択されるポリペプチドに結合するリガンドをコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６１４】
60. 43によるポリヌクレオチド分子、ここで、変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子は、ラミニン β-2をコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【０６１５】
61.改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞において発現させる工程を含む改変クロストリジウム毒素を生産する方法であって、ポリヌクレオチド分子は以下を含む:
a)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子;
b)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
c)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することが出来る転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
d) クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合でき、かつクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することが出来る変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子;および、
e)プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子、
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は改変クロストリジウム毒素の一本鎖形態を二本鎖形態へと変換する。
【０６１６】
62. 61による方法、ここで、ポリヌクレオチド分子は43のポリヌクレオチド分子のいずれかである。
【０６１７】
63. 以下の工程を含む改変クロストリジウム毒素を生産する方法:
a)細胞に改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を導入する工程、ポリヌクレオチド分子は以下を含む:
i)クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素による標的改変工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子;
ii)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を実行することが出来るクロストリジウム毒素転位置ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
iii)クロストリジウム毒素中毒プロセスの転位置工程を促進することが出来る転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子; 
iv) クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合でき、かつクロストリジウム毒素中毒プロセスの細胞結合工程を実行することが出来る変化したターゲティングドメインをコードするポリヌクレオチド分子;および、
v)プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子、
ここで、プロテアーゼ切断部位の切断は改変クロストリジウム毒素の一本鎖形態を二本鎖形態へと変換する、
b)ポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素を発現させる工程。
【０６１８】
64. 63による方法、ここで、ポリヌクレオチド分子は43のポリヌクレオチド分子のいずれかである。
【実施例】
【０６１９】
以下の非限定的な例は、単に開示された態様のより完全な理解を促すために例示的に提供されるものであり、本明細書に開示する態様のいずれも限定する意図ではない。
【０６２０】
実施例１
転位置促進ドメインおよびアミノ末端に存在する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の構築
本実施例は、本明細書に開示される、転位置促進ドメインを含み、かつ変化したターゲティングドメインがその改変毒素のアミノ末端に位置する改変クロストリジウム毒素の製造方法を説明する。
【０６２１】
1a.ターゲティング−転位置−転位置促進−酵素ドメインの構成
BoNT/A-AP4A-GRPP(配列番号194)に基づくポリヌクレオチド分子を、標準的手順を用いて合成する(BlueHeron（登録商標） Biotechnology、Bothell、WA)。本ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296を、GRPP ターゲティングドメインである配列番号9のアミノ酸 21-50と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図4Aの全体的ドメイン配置を有する。20〜50 塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的 ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、互いにライゲーションし、全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクターのSmaI 部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-AP4A-GRPPを作成する。合成したポリヌクレオチド分子を Big Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機 (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定により確証する。
【０６２２】
所望の場合、発現を最適化したBoNT/A-AP4A-GRPP (配列番号194)に基づくポリヌクレオチド分子を合成して大腸菌株における発現を向上させることが出来る。BoNT/A-AP4A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子は以下のように改変できる： 1)大腸菌株のネイティブなポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む; 2)大腸菌株にみられるネイティブなポリヌクレオチド分子の平均G+C含量により近く一致するG+C含量を含む; 3)ポリヌクレオチド分子内にみられるポリモノヌクレオチド領域を低減させる; および/または 4)ポリヌクレオチド分子内にみられる内部制御または構造部位を排除する、例えば、Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際公開 WO 2006/011966 (Feb. 2、2006) ; Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際公開 WO 2006/017749 (Feb. 16、2006) を参照されたい。いったん配列最適化が完了すると、20〜50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、これを互いにライゲーションして全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクター のSmaI 部位にクローニングしてpUCBHB1/BoNT/A-AP4A-GRPPを作成する。合成したポリヌクレオチド分子をBig Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いた配列決定により確証する。所望の場合、異なる生物、例えば、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０６２３】
類似のクローニング戦略を用いて、以下についてpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する： BoNT/B-AP4A-GRPP、配列番号2のアミノ酸 1098-1291が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/B; BoNT/C1-AP4A-GRPP、配列番号3のアミノ酸 1112-1291が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/C1; BoNT/D-AP4A-GRPP、配列番号4のアミノ酸 1099-1276が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/D; BoNT/E-AP4A-GRPP、配列番号5のアミノ酸 1086-1252が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/E; BoNT/F-AP4A-GRPP、配列番号6のアミノ酸 1106-1274が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/F; BoNT/G-AP4A-GRPP、配列番号7のアミノ酸 1106-1297が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/G; およびTeNT-AP4A-GRPP、配列番号8のアミノ酸 1128-1315が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変TeNT。
【０６２４】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、クロストリジウム毒素のHCC ターゲティングドメインを、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインと置換した、改変クロストリジウム毒素-AP4Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６２５】
pET29/BoNT/A-AP4A-GRPPを構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-AP4A-GRPP コンストラクトを、1) BoNT/A-AP4A-GRPPのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結可能とする、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手順を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化したpET29 ベクターにサブクローニングしてpET29/BoNT/A-AP4A-GRPPを得る。ライゲーション混合物を化学的コンピテント大腸菌 DH5α 細胞 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に熱ショック方法を用いて形質転換し、50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート(pH 7.0)に播き、37℃インキュベーターに入れて一晩培養する。発現コンストラクトを含む細菌をカナマイシン耐性コロニーとして同定する。候補コンストラクトをアルカリ法のプラスミド少量調製手順を用いて単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析してインサートの存在と配向を判定する。このクローニング戦略により、BoNT/A-AP4A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０６２６】
類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-AP4A-GRPP 毒素、例えば、BoNT/B-AP4A-GRPP、BoNT/C1-AP4A-GRPP、BoNT/D-AP4A-GRPP、BoNT/E-AP4A-GRPP、BoNT/F-AP4A-GRPP、BoNT/G-AP4A-GRPP、またはTeNT-AP4A-GRPPについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素-AP4Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６２７】
BoNT/A 転位置促進ドメインを別のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインで置換したBoNT/A-AP4A-GRPPを構築するために、BoNT/Bの転位置促進ドメインをBoNT/A-AP4A-GRPPにオーバーラップする末端によるスプライシング-ポリメラーゼ連鎖反応 (SOE-PCR) 手順を用いて導入し、例えば、R. M. Horton et al., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989);およびR. M. Horton, PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 (1995) を参照されたい。BoNT/B (配列番号2)のアミノ酸859-1097をコードする領域を含む核酸断片をSOE-PCRにより作動可能に連結し、BoNT/A-AP4A-GRPPの配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を置換し、pCR2.1 ベクターにTOPO（登録商標） TA クローニング方法 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いてサブクローニングする。これら反応に用いるフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、次のサブクローニング工程に有用な特有の制限酵素部位を含むよう設計する。その結果得られるコンストラクトを1)改変BoNT/A-AP4A-GRPPをコードする全オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結させることを可能にする制限酵素で消化する。その結果得られる制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、Inc.、Valencia、CA)により精製し、T4 DNA リガーゼ 手順を用いてpET29 ベクターにサブクローニングする。このクローニング戦略によりBoNT/B 転位置促進ドメインを含むBoNT/A-AP4A-GRPPをコードするpET29 発現コンストラクトが得られた。
【０６２８】
類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、例えば以下と置換した、BoNT/A-AP4A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する： 配列番号3のBoNT/C1のアミノ酸 869-1111を含む転位置促進ドメイン;  配列番号4のBoNT/Dのアミノ酸 865-1098を含む転位置促進ドメイン; 配列番号5のBoNT/Eのアミノ酸 846-1058を含む転位置促進ドメイン; 配列番号6のBoNT/Fのアミノ酸 867-1105を含む転位置促進ドメイン; 配列番号7のBoNT/Gのアミノ酸 866-1105を含む転位置促進ドメイン; または配列番号8のTeNTのアミノ酸 882-1127を含む転位置促進ドメイン。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン、例えば配列番号118−配列番号193、を含む転位置促進ドメインに置換したBoNT/A-AP4A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する。
【０６２９】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-AP4A-ノシセプチン、BoNT/C1-AP4A-GRPP、BoNT/D-AP4A-GRPP、BoNT/E-AP4A-GRPP、BoNT/F-AP4A-GRPP、BoNT/G-AP4A-GRPP、TeNT-AP4A-GRPP、および例えば以下を含む上記の改変クロストリジウム毒素-AP4Aをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６３０】
1b.ターゲティング-酵素-転位置-転位置促進ドメインの構成
実施例 1aに記載のように、BoNT/A-AP4B-GRPP (配列番号195)に基づくポリヌクレオチド分子を合成し、UCBHB1 ベクターにクローン化する。このポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296をGRPP ターゲティングドメインである配列番号9のアミノ酸 21-50と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図4Bの全体的ドメイン配置を有する。上記のように、所望の場合、異なる生物、例えば、細菌、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０６３１】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、クロストリジウム毒素のHCC ターゲティングドメインを、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインと置換した、改変クロストリジウム毒素-AP4Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６３２】
さらに、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを含む、改変クロストリジウム毒素-AP4B、例えばBoNT/B-AP4B、BoNT/C1-AP4B、BoNT/D-AP4B、BoNT/E-AP4B、BoNT/F-AP4B、BoNT/G-AP4B、またはTeNT-AP4Bを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６３３】
pET29/BoNT/A-AP4B-GRPPを構築するため、実施例 1aに記載のように、類似のクローニング戦略を用いる。このクローニング戦略により、BoNT/A-AP4B-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-AP4B-GRPP毒素、例えば、BoNT/B-AP4B-GRPP、BoNT/C1-AP4B-GRPP、BoNT/D-AP4B-GRPP、BoNT/E-AP4B-GRPP、BoNT/F-AP4B-GRPP、BoNT/G-AP4B-GRPP、またはTeNT-AP4B-GRPPについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素-AP4Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６３４】
BoNT/A 転位置促進ドメインが他のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインと置換されたBoNT/A-AP4B-GRPPを構築するため、実施例 1aに記載のように、SOE-PCRを用いる類似のクローニング戦略を使用する。このクローニング戦略により、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメイン、ならびにエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン、例えば配列番号118−配列番号193、を含む転位置促進ドメインを含むBoNT/A-AP4B-GRPPをコードするpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０６３５】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-AP4B-GRPP、BoNT/C1-AP4B-GRPP、BoNT/D-AP4B-GRPP、BoNT/E-AP4B-GRPP、BoNT/F-AP4B-GRPP、BoNT/G-AP4B-GRPP、TeNT-AP4B-GRPP、および例えば以下の変化したターゲティングドメインを含む上記の改変クロストリジウム毒素-AP4Bをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６３６】
実施例２
転位置促進ドメインおよび中央に存在する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の構築
本実施例は、本明細書に開示される、転位置促進ドメインを含み、かつ変化したターゲティングドメインがその改変毒素の２つの他のドメインの間に位置する改変クロストリジウム毒素の製造方法を説明する。
【０６３７】
2a.酵素-ターゲティング-転位置-転位置促進ドメインの構成
BoNT/A-CP5A-GRPP (配列番号196)に基づくポリヌクレオチド分子を、標準的手順を用いて合成する(BlueHeron（登録商標） Biotechnology、Bothell、WA)。本ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296を、GRPP ターゲティングドメインである配列番号9のアミノ酸 21-50と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図5Aの全体的ドメイン配置を有する。二本鎖毒素の形成に使用したエンテロキナーゼ切断部位の切断はまた、GRPP ターゲティングドメインの第１のアミノ酸を露出する。20〜50 塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的 ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、互いにライゲーションし、全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクターのSmaI 部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-CP5A-GRPPを作成する。合成したポリヌクレオチド分子を Big Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機 (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定により確証する。
【０６３８】
所望の場合、発現を最適化したBoNT/A-CP5A-GRPP (配列番号196)に基づくポリヌクレオチド分子を合成して大腸菌株における発現を向上させることが出来る。BoNT/A-CP5A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子は以下のように改変できる： 1)大腸菌株のネイティブなポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む; 2)大腸菌株にみられるネイティブなポリヌクレオチド分子の平均G+C含量により近く一致するG+C含量を含む; 3)ポリヌクレオチド分子内にみられるポリモノヌクレオチド領域を低減させる; および/または 4)ポリヌクレオチド分子内にみられる内部制御または構造部位を排除する、例えば、Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際公開 WO 2006/011966 (Feb. 2、2006) ; Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際公開 WO 2006/017749 (Feb. 16、2006) を参照されたい。いったん配列最適化が完了すると、20〜50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、これを互いにライゲーションして全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクター のSmaI 部位にクローニングしてpUCBHB1/BoNT/A-CP5A-GRPPを作成する。合成したポリヌクレオチド分子をBig Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (CP5Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機(CP5Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いた配列決定により確証する。所望の場合、異なる生物、例えば、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０６３９】
類似のクローニング戦略を用いて、以下についてpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：BoNT/B-CP5A-GRPP、配列番号2のアミノ酸 1098-1291が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/B; BoNT/C1-CP5A-GRPP、配列番号3のアミノ酸 1112-1291が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/C1; BoNT/D-CP5A-GRPP、配列番号4のアミノ酸 1099-1276が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/D; BoNT/E-CP5A-GRPP、配列番号5のアミノ酸 1086-1252が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/E; BoNT/F-CP5A-GRPP、配列番号6のアミノ酸 1106-1274が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/F; BoNT/G-CP5A-GRPP、配列番号7のアミノ酸 1106-1297が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/G; およびTeNT-CP5A-GRPP、配列番号8のアミノ酸 1128-1315が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変TeNT。
【０６４０】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、クロストリジウム毒素のHCC ターゲティングドメインを、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインと置換した、改変クロストリジウム毒素-CP5Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６４１】
pET29/BoNT/A-CP5A-GRPPを構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-CP5A-GRPP コンストラクトを、1) BoNT/A-CP5A-GRPPのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結可能とする、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手順を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化したpET29 ベクターにサブクローニングしてpET29/BoNT/A-CP5A-GRPPを得る。ライゲーション混合物を化学的コンピテント大腸菌 DH5α 細胞 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に熱ショック方法を用いて形質転換し、50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート(pH 7.0)に播き、37℃インキュベーターに入れて一晩培養する。発現コンストラクトを含む細菌をカナマイシン耐性コロニーとして同定する。候補コンストラクトをアルカリ法のプラスミド少量調製手順を用いて単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析してインサートの存在と配向を判定する。このクローニング戦略により、BoNT/A-CP5A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０６４２】
類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-CP5A-GRPP 毒素、例えばBoNT/B-CP5A-GRPP、BoNT/C1-CP5A-GRPP、BoNT/D-CP5A-GRPP、BoNT/E-CP5A-GRPP、BoNT/F-CP5A-GRPP、BoNT/G-CP5A-GRPP、またはTeNT-CP5A-GRPPについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下の変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素-CP5Aコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６４３】
BoNT/A 転位置促進ドメインを別のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインで置換したBoNT/A-CP5A-GRPPを構築するために、BoNT/Bの転位置促進ドメインをBoNT/A-CP5A-GRPPにオーバーラップする末端によるスプライシング-ポリメラーゼ連鎖反応 (SOE-PCR) 手順を用いて導入し、例えば、R. M. Horton et al., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989);およびR. M. Horton, PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 (1995) を参照されたい。BoNT/B (配列番号2)のアミノ酸859-1097をコードする領域を含む核酸断片をSOE-PCRにより作動可能に連結し、BoNT/A-CP5A-GRPPの配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を置換し、pCR2.1 ベクターにTOPO（登録商標） TA クローニング方法 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いてサブクローニングする。これら反応に用いるフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、次のサブクローニング工程に有用な特有の制限酵素部位を含むよう設計する。その結果得られるコンストラクトを1)改変BoNT/A-CP5A-GRPPをコードする全オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結させることを可能にする制限酵素で消化する。その結果得られる制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、Inc.、Valencia、CA)により精製し、T4 DNA リガーゼ 手順を用いてpET29 ベクターにサブクローニングする。このクローニング戦略によりBoNT/B 転位置促進ドメインを含むBoNT/A-CP5A-GRPPをコードするpET29 発現コンストラクトが得られた。
【０６４４】
類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、例えば以下と置換した、BoNT/A-CP5A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する： 配列番号3のBoNT/C1のアミノ酸 869-1111を含む転位置促進ドメイン;  配列番号4のBoNT/Dのアミノ酸 865-1098を含む転位置促進ドメイン; 配列番号5のBoNT/Eのアミノ酸 846-1058を含む転位置促進ドメイン; 配列番号6のBoNT/Fのアミノ酸 867-1105を含む転位置促進ドメイン; 配列番号7のBoNT/Gのアミノ酸 866-1105を含む転位置促進ドメイン; または配列番号8のTeNTのアミノ酸 882-1127を含む転位置促進ドメイン。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン、例えば配列番号118−配列番号193、を含む転位置促進ドメインに置換したBoNT/A-CP5A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する。
【０６４５】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-CP5A-GRPP、BoNT/C1-CP5A-GRPP、BoNT/D-CP5A-GRPP、BoNT/E-CP5A-GRPP、BoNT/F-CP5A-GRPP、BoNT/G-CP5A-GRPP、TeNT-CP5A-GRPP、および例えば以下の変化したターゲティングドメインを含む上記の改変クロストリジウム毒素-CP5Aをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６４６】
2b. 転位置-転位置促進-ターゲティング-酵素ドメインの構成
実施例 1aに記載のように、BoNT/A-CP5B-GRPP (配列番号197)に基づくポリヌクレオチド分子を合成し、UCBHB1 ベクターにクローン化する。このポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296をGRPP ターゲティングドメインである配列番号9のアミノ酸 21-50と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図5Bの全体的ドメイン配置を有する。二本鎖毒素の形成に使用したエンテロキナーゼ切断部位の切断はまた、GRPP ターゲティングドメインの第１のアミノ酸を露出する。上記のように、所望の場合、異なる生物、例えば、細菌、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０６４７】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、クロストリジウム毒素のHCC ターゲティングドメインを、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインと置換した、改変クロストリジウム毒素-CP5Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６４８】
さらに、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを含む、改変クロストリジウム毒素-CP5B、例えばBoNT/B-CP5B、BoNT/C1-CP5B、BoNT/D-CP5B、BoNT/E-CP5B、BoNT/F-CP5B、BoNT/G-CP5B、またはTeNT-CP5Bを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６４９】
pET29/BoNT/A-CP5B-GRPPを構築するため、実施例 1aに記載のように、類似のクローニング戦略を用いる。このクローニング戦略により、BoNT/A-CP5B-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-CP5B-GRPP毒素、例えば、BoNT/B-CP5B-GRPP、BoNT/C1-CP5B-GRPP、BoNT/D-CP5B-GRPP、BoNT/E-CP5B-GRPP、BoNT/F-CP5B-GRPP、BoNT/G-CP5B-GRPP、またはTeNT-CP5B-GRPPについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-CP5Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６５０】
BoNT/A 転位置促進ドメインが他のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインと置換されたBoNT/A-CP5B-GRPPを構築するため、実施例 1aに記載のように、SOE-PCRを用いる類似のクローニング戦略を使用する。このクローニング戦略により、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメイン、ならびにエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン、例えば配列番号118−配列番号193、を含む転位置促進ドメインを含むBoNT/A-CP5B-GRPPをコードするpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０６５１】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-CP5B-GRPP、BoNT/C1-CP5B-GRPP、BoNT/D-CP5B-GRPP、BoNT/E-CP5B-GRPP、BoNT/F-CP5B-GRPP、BoNT/G-CP5B-GRPP、TeNT-CP5B-GRPP、および例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを含む上記の改変クロストリジウム毒素-CP5Bをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６５２】
実施例３
転位置促進ドメインおよびカルボキシ末端に存在する変化したターゲティングドメインを含む改変クロストリジウム毒素の構築
本実施例は、本明細書に開示される、転位置促進ドメインを含み、かつ変化したターゲティングドメインがその改変毒素のカルボキシ末端に位置する改変クロストリジウム毒素の製造方法を説明する。
【０６５３】
3a.酵素-転位置-転位置促進-ターゲティングドメインの構成
BoNT/A-XP6A-GRPP (配列番号198)に基づくポリヌクレオチド分子を、標準的手順を用いて合成する(BlueHeron（登録商標） Biotechnology、Bothell、WA)。本ポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296を、GRPP ターゲティングドメインである配列番号9のアミノ酸 21-50と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図6Aの全体的ドメイン配置を有する。20〜50 塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的 ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、互いにライゲーションし、全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を、標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクターのSmaI 部位にクローニングし、pUCBHB1/BoNT/A-XP6A-GRPPを作成する。合成したポリヌクレオチド分子を Big Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機 (Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて配列決定により確証する。
【０６５４】
所望の場合、発現を最適化したBoNT/A-XP6A-GRPP (配列番号198)に基づくポリヌクレオチド分子を合成して大腸菌株における発現を向上させることが出来る。BoNT/A-XP6A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子は以下のように改変できる： 1)大腸菌株のネイティブなポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含む; 2)大腸菌株にみられるネイティブなポリヌクレオチド分子の平均G+C含量により近く一致するG+C含量を含む; 3)ポリヌクレオチド分子内にみられるポリモノヌクレオチド領域を低減させる; および/または 4)ポリヌクレオチド分子内にみられる内部制御または構造部位を排除する、例えば、Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 国際公開 WO 2006/011966 (Feb. 2、2006) ; Lance E. Steward et al. Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 国際公開 WO 2006/017749 (Feb. 16、2006) を参照されたい。いったん配列最適化が完了すると、20〜50塩基の長さのオリゴヌクレオチドを標準的ホスホラミダイト合成を用いて合成する。これらオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二本鎖とし、これを互いにライゲーションして全長ポリヌクレオチド分子をアセンブルする。このポリヌクレオチド分子を標準的分子生物学的方法を用いてpUCBHB1 ベクター のSmaI 部位にクローニングしてpUCBHB1/BoNT/A-XP6A-GRPPを作成する。合成したポリヌクレオチド分子をBig Dye Terminator（商標） Chemistry 3.1 (Applied Biosystems、Foster City、CA)およびABI 3100 配列決定機(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いた配列決定により確証する。所望の場合、異なる生物、例えば、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０６５５】
類似のクローニング戦略を用いて、以下についてpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：BoNT/B-XP6A-GRPP、配列番号2のアミノ酸 1098-1291が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/B; BoNT/C1-XP6A-GRPP、配列番号3のアミノ酸 1112-1291が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/C1; BoNT/D-XP6A-GRPP、配列番号4のアミノ酸 1099-1276が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/D; BoNT/E-XP6A-GRPP、配列番号5のアミノ酸 1086-1252が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/E; BoNT/F-XP6A-GRPP、配列番号6のアミノ酸 1106-1274が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/F; BoNT/G-XP6A-GRPP、配列番号7のアミノ酸 1106-1297が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変BoNT/G; およびTeNT-XP6A-GRPP、配列番号8のアミノ酸 1128-1315が配列番号9のアミノ酸 21-50と置換された改変TeNT。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-XP6Aをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68の��ミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６５６】
pET29/BoNT/A-XP6A-GRPPを構築するために、pUCBHB1/BoNT/A-XP6A-GRPP コンストラクトを、1) BoNT/A-XP6A-GRPPのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結可能とする、制限エンドヌクレアーゼで消化する。このインサートをT4 DNA リガーゼ手順を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化したpET29 ベクターにサブクローニングしてpET29/BoNT/A-XP6A-GRPPを得る。ライゲーション混合物を化学的コンピテント大腸菌 DH5α 細胞 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に熱ショック方法を用いて形質転換し、50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート(pH 7.0)に播き、37℃インキュベーターに入れて一晩培養する。発現コンストラクトを含む細菌をカナマイシン耐性コロニーとして同定する。候補コンストラクトをアルカリ法のプラスミド少量調製手順を用いて単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析してインサートの存在と配向を判定する。このクローニング戦略により、BoNT/A-XP6A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０６５７】
類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-XP6A-GRPP 毒素、例えばBoNT/B-XP6A-GRPP、BoNT/C1-XP6A-GRPP、BoNT/D-XP6A-GRPP、BoNT/E-XP6A-GRPP、BoNT/F-XP6A-GRPP、BoNT/G-XP6A-GRPP、またはTeNT-XP6A-GRPPについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-XP6Aコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６５８】
BoNT/A 転位置促進ドメインを別のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインで置換したBoNT/A-XP6A-GRPPを構築するために、上記のように、BoNT/Bの転位置促進ドメインをBoNT/A-XP6A-GRPPにオーバーラップする末端によるスプライシング-ポリメラーゼ連鎖反応 (SOE-PCR) 手順を用いて導入し、例えば、R. M. Horton et al., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlapping extension, 77(1) Gene 61-68 (1989);およびR. M. Horton, PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes, 3(2) Mol. Biotechnol. 93-99 (1995) を参照されたい。BoNT/B (配列番号2)のアミノ酸859-1097をコードする領域を含む核酸断片をSOE-PCRにより作動可能に連結し、BoNT/A-XP6A-GRPPの配列番号1のアミノ酸874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を置換し、pCR2.1 ベクターにTOPO（登録商標） TA クローニング方法 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いてサブクローニングする。これら反応に用いるフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、次のサブクローニング工程に有用な特有の制限酵素部位を含むよう設計する。その結果得られるコンストラクトを1)改変BoNT/A-XP6A-GRPPをコードする全オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド分子を切り出す;および2)このポリヌクレオチド分子をpET29 ベクター (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI)に作動可能に連結させることを可能にする制限酵素で消化する。その結果得られる制限断片をQIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN、Inc.、Valencia、CA)により精製し、T4 DNA リガーゼ 手順を用いてpET29 ベクターにサブクローニングする。このクローニング戦略によりBoNT/B 転位置促進ドメインを含むBoNT/A-XP6A-GRPPをコードするpET29 発現コンストラクトが得られた。
【０６５９】
類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、例えば以下と置換した、BoNT/A-XP6A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する： 配列番号3のBoNT/C1のアミノ酸 869-1111を含む転位置促進ドメイン;  配列番号4のBoNT/Dのアミノ酸 865-1098を含む転位置促進ドメイン; 配列番号5のBoNT/Eのアミノ酸 846-1058を含む転位置促進ドメイン; 配列番号6のBoNT/Fのアミノ酸 867-1105を含む転位置促進ドメイン; 配列番号7のBoNT/Gのアミノ酸 866-1105を含む転位置促進ドメイン; または配列番号8のTeNTのアミノ酸 882-1127を含む転位置促進ドメイン。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、配列番号1のアミノ酸 874-1110を含むBoNT/A 転位置促進ドメインに対応する領域を、エンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン、例えば配列番号118−配列番号193、を含む転位置促進ドメインに置換したBoNT/A-XP6A-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する。
【０６６０】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-XP6A-GRPP、BoNT/C1-XP6A-GRPP、BoNT/D-XP6A-GRPP、BoNT/E-XP6A-GRPP、BoNT/F-XP6A-GRPP、BoNT/G-XP6A-GRPP、TeNT-XP6A-GRPP、および例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを有する上記の改変クロストリジウム毒素-XP6Aをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６６１】
3b. 転位置-転位置促進-酵素-ターゲティングドメインの構成
実施例 1aに記載のように、BoNT/A-XP6B-GRPP (配列番号199)に基づくポリヌクレオチド分子を合成し、UCBHB1 ベクターにクローン化する。このポリヌクレオチド分子は、BoNT/A HCC ターゲティングドメインである配列番号1のアミノ酸 1111-1296をGRPP ターゲティングドメインである配列番号9のアミノ酸 21-50と置換するよう改変されたBoNT/Aをコードし、図6Bの全体的ドメイン配置を有する。上記のように、所望の場合、異なる生物、例えば、細菌、酵母株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株への発現最適化を行うことが出来、例えば、Steward、前掲、(Feb. 2、2006);およびSteward、前掲、(Feb. 16、2006) を参照されたい。
【０６６２】
同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを含む改変BoNT/A-XP6Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpUCBHB1 クローニングコンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６６３】
さらに、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを含む、改変クロストリジウム毒素-XP6B、例えばBoNT/B-XP6B、BoNT/C1-XP6B、BoNT/D-XP6B、BoNT/E-XP6B、BoNT/F-XP6B、BoNT/G-XP6B、またはTeNT-XP6Bを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６６４】
pET29/BoNT/A-XP6B-GRPPを構築するため、実施例 1aに記載のように、類似のクローニング戦略を用いる。このクローニング戦略により、BoNT/A-XP6B-GRPPをコードするポリヌクレオチド分子がカルボキシル末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに作動可能に連結して含まれるpET29 発現コンストラクトが得られる。類似のクローニング戦略を用いて、他の改変クロストリジウム毒素-XP6B-GRPP毒素、例えば、BoNT/B-XP6B-GRPP、BoNT/C1-XP6B-GRPP、BoNT/D-XP6B-GRPP、BoNT/E-XP6B-GRPP、BoNT/F-XP6B-GRPP、BoNT/G-XP6B-GRPP、またはTeNT-XP6B-GRPPについて、pET29 発現コンストラクトを作製する。同様に、類似のクローニング戦略を用いて、例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを有する改変クロストリジウム毒素-XP6Bをコードするポリヌクレオチド分子を含むpET29 発現コンストラクトを作製する：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６６５】
BoNT/A 転位置促進ドメインが他のクロストリジウム毒素転位置促進ドメインと置換されたBoNT/A-XP6B-GRPPを構築するため、実施例 1aに記載のように、SOE-PCRを用いる類似のクローニング戦略を使用する。このクローニング戦略により、BoNT/B 転位置促進ドメイン、BoNT/C1 転位置促進ドメイン、BoNT/D 転位置促進ドメイン、BoNT/E 転位置促進ドメイン、BoNT/F 転位置促進ドメイン、BoNT/G 転位置促進ドメインおよびTeNT 転位置促進ドメイン、ならびにエンベロープを持ったウイルスの融合ペプチドドメイン、例えば配列番号118−配列番号193、を含む転位置促進ドメインを含むBoNT/A-XP6B-GRPPをコードするpET29 発現コンストラクトが得られる。
【０６６６】
同様に、上記のクロストリジウム転位置促進ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を、BoNT/B-XP6B-GRPP、BoNT/C1-XP6B-GRPP、BoNT/D-XP6B-GRPP、BoNT/E-XP6B-GRPP、BoNT/F-XP6B-GRPP、BoNT/G-XP6B-GRPP、TeNT-XP6B-GRPP、および例えば以下を含む変化したターゲティングドメインを含む上記の改変クロストリジウム毒素-XP6Bをコードするポリヌクレオチド分子に導入することができる：配列番号9のアミノ酸 53-81;配列番号9のアミノ酸 53-89 ;配列番号9のアミノ酸 98-124;配列番号9のアミノ酸 146-178;配列番号10のアミノ酸 132-158;配列番号11のアミノ酸 32-58;配列番号11のアミノ酸 32-75;配列番号12のアミノ酸 81-107;配列番号12のアミノ酸 125-151;配列番号13のアミノ酸 81-107;配列番号13のアミノ酸 124-150;配列番号14のアミノ酸 52-78;配列番号14のアミノ酸 52-93;配列番号15のアミノ酸 28-54;配列番号16のアミノ酸 76-92;配列番号16のアミノ酸 59-92;配列番号17のアミノ酸 41-50;配列番号17のアミノ酸 24-50;配列番号18のアミノ酸 99-112;配列番号19のアミノ酸 159-193;配列番号19のアミノ酸 154-194;配列番号20のアミノ酸 35-70;配列番号20のアミノ酸 145-177;配列番号21のアミノ酸 1-200;配列番号22のアミノ酸 1-150;配列番号23のアミノ酸 1-202;配列番号24のアミノ酸 1-201;配列番号25のアミノ酸 1-225;配列番号26のアミノ酸 123-265;配列番号27のアミノ酸 21-153;配列番号28のアミノ酸 57-210;配列番号29のアミノ酸 21-99;配列番号29のアミノ酸 31-94;配列番号30のアミノ酸 19-178;配列番号31のアミノ酸 1-558;配列番号32のアミノ酸 1-371;配列番号33のアミノ酸 49-118;配列番号34のアミノ酸 25-180;配列番号35のアミノ酸 1-54;配列番号36のアミノ酸 139-257;配列番号37のアミノ酸 129-247;配列番号38のアミノ酸 19-257;配列番号39のアミノ酸 81-210;配列番号40のアミノ酸 118-211;配列番号41のアミノ酸 107-196;配列番号41のアミノ酸 96-197;配列番号42のアミノ酸 66-155;配列番号43のアミノ酸 123-218;配列番号44のアミノ酸 293-390;配列番号45のアミノ酸 317-414;配列番号46のアミノ酸 315-412;配列番号47のアミノ酸 276-373;配列番号48のアミノ酸 296-396;配列番号49のアミノ酸 370-472;配列番号50のアミノ酸 309-409;配列番号51のアミノ酸 323-454;配列番号52のアミノ酸 412-513;配列番号52のアミノ酸 374-513;配列番号53のアミノ酸 330-431;配列番号53のアミノ酸 293-431;配列番号54のアミノ酸 301-402;配列番号55のアミノ酸 323-424;配列番号56のアミノ酸 267-372;配列番号57のアミノ酸 327-429;配列番号58のアミノ酸 264-364;配列番号59のアミノ酸 400-501;配列番号60のアミノ酸 354-455;配列番号61のアミノ酸 352-450;配列番号62のアミノ酸 281-375;配列番号63のアミノ酸 376-478;配列番号64のアミノ酸 313-407;配列番号65のアミノ酸 211-308;配列番号66のアミノ酸 321-426;配列番号67のアミノ酸 303-406;配列番号68のアミノ酸 247-352;配列番号68のアミノ酸 237-352;配列番号69のアミノ酸 247-350;配列番号70のアミノ酸 262-366; または配列番号70のアミノ酸 233-366。
【０６６７】
実施例 4
細菌細胞における改変クロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素のいずれかの細菌細胞における発現に有用な手順を示す。
【０６６８】
発現コンストラクト、例えば、実施例1-5におけるいずれかの発現コンストラクトを、熱ショック形質転換プロトコールを用いて化学的コンピテント大腸菌 BL21 (DE3) 細胞(Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に導入する。熱ショック反応物を50 μg/mL のカナマイシンを含む1.5% LB寒天プレート (pH 7.0)に播き、37 ℃インキュベーターに入れ一晩培養する。発現コンストラクトを含む形質転換大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを用いて50 μg/mL のカナマイシンを含む3.0 mLのPA-0.5G 培地を含むバッフル付フラスコに接種し、これを37℃ インキュベーターに入れ、250 rpmで振盪しながら一晩培養する。その結果得られる一晩出発培養物を用いて50 μg/mL のカナマイシンを含むZYP-5052 自己誘導培地を含む3 L バッフル付フラスコに1:1000希釈にて接種する。培養体積は約 600 mL (20％ フラスコ体積)から約 750 mL (25% フラスコ体積)の範囲であった。これらの培養物を250 rpmで振盪する37 ℃ インキュベーターでおよそ 5.5時間培養し、次いで250 rpm で振盪する16 ℃インキュベーターに移し、一晩発現させる。細胞を遠心分離 (4,000 rpm、4 ℃、20-30分間)により収集し、すぐに用いるか、または必要時まで-80℃で乾燥保存する。
【０６６９】
実施例 5
改変クロストリジウム毒素の精製および定量
以下の実施例は、本明細書に開示するいずれかの改変クロストリジウム毒素の精製および定量に有用な方法を示す。
【０６７０】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー (IMAC) タンパク質精製のために、実施例 7に記載のように改変クロストリジウム毒素の発現に用いた大腸菌 BL21 (DE3) 細胞 ペレットを、カラム結合バッファー (25 mM N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 10 mM イミダゾール; 2x Protease Inhibitor Cocktail Set III (EMD Biosciences-Calbiochem、San Diego CA); 5 ユニット/mLのBenzonase (EMD Biosciences-Novagen、Madison、WI); 0.1% (v/v) Triton-X（登録商標） 100、4-オクチルフェノール ポリエトキシラート; 10％ (v/v) グリセロール)に再懸濁し、次いで冷却オークリッジ型遠心管に移す。細胞懸濁液を氷上で超音波処理して(10 秒の10-12 パルス、40％ 振幅、60 秒の冷却間隔、Branson Digital Sonifier)細胞を溶解し、次いで遠心分離して(16,000 rpm、4 ℃、20分間) 可溶化液を清澄にする。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムを2.5-5.0 mL のTALON（商標） SuperFlow Co2+ アフィニティー樹脂 (BD Biosciences-Clontech、Palo Alto、CA)を充填した20 mL Econo-Pac カラム支持体 (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いて調製し、これを5 カラム体積の脱イオン化蒸留水で、次いで5 カラム体積のカラム結合バッファーですすぐことにより平衡化する。清澄にした可溶化液をゆっくりと平衡化したカラムに重力流により(およそ 0.25-0.3 mL/分)アプライする。カラムを次いで 5 カラム体積のカラム洗浄バッファー (N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 10 mM イミダゾール; 0.1% (v/v) Triton-X（登録商標） 100、4-オクチルフェノール ポリエトキシラート; 10％ (v/v) グリセロール)により洗浄する。改変クロストリジウム毒素は 20-30 mL のカラム溶出バッファー(25 mM N-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸) (HEPES)、pH 7.8; 500 mM 塩化ナトリウム; 500 mM イミダゾール; 0.1% (v/v) Triton-X（登録商標） 100、4-オクチルフェノール ポリエトキシラート; 10％ (v/v) グリセロール) にて溶出され、およそ１２の1 mL フラクションに回収する。各溶出フラクションに含まれる改変クロストリジウム毒素の量をBradford 色素アッセイにより判定する。この手順において、各1.0 mL フラクションの20 μL アリコットを200 μLのBio-Rad Protein Reagent (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)と合わせ、脱イオン化蒸留水で1対4に希釈し、 次いで比色シグナルの強度を分光光度計を用いて測定する。最もシグナルが強い５つのフラクションを溶出ピークとみなし、一緒に合わせる。全タンパク質収量をプールしたピーク溶出フラクションの全タンパク質濃度をウシガンマグロブリンを標準(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)として用いて評価することによって判定する。  
【０６７１】
FPLC 脱塩 カラムを用いた改変クロストリジウム毒素の精製のために、HiPrep（商標） 26/10 サイズ排除 カラム (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ) を80 mLの4 ℃ カラム バッファー (50 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5)で前平衡化する。カラムを平衡化した後、改変クロストリジウム毒素サンプルを4 ℃ カラムバッファーの均一濃度移動相および流速10 mL/分のサイズ排除 カラムに BioLogic DuoFlow クロマトグラフィーシステム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いてアプライする。脱塩した改変クロストリジウム毒素サンプルをおよそ 7-12 mLの単一のフラクションとして回収する。
【０６７２】
FPLC イオン交換カラムを用いる改変クロストリジウム毒素の精製のために、IMAC カラムからの溶出後に脱塩された改変クロストリジウム毒素サンプルを1 mL Q1（商標） 陰イオン交換カラム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)にBioLogic DuoFlow クロマトグラフィーシステム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いてアプライする。サンプルを 4 ℃ カラムバッファー (50 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5)中でカラムにアプライし、4 ℃ 溶出バッファー (50 mM リン酸ナトリウム、1 M 塩化ナトリウム、pH 6.5)の以下の直線勾配にて溶出する: 工程 1、5.0 mLの5% 溶出バッファー、流速1 mL/分; 工程 2、20.0 mLの5-30％ 溶出バッファー、流速1 mL/分; 工程 3、2.0 mLの50％ 溶出バッファー、流速1.0 mL/分; 工程 4、4.0 mLの100％ 溶出バッファー、流速1.0 mL/分; および工程 5、5.0 mLの0％ 溶出バッファー、流速1.0 mL/分。カラムからの改変クロストリジウム毒素の溶出を280、260、および214 nmにてモニターし、280 nmにて最小閾値 (0.01 au)を上回る吸収を示すピークを回収する。ほとんどの改変クロストリジウム毒素は塩化ナトリウム 濃度およそ 100から200 mMにて溶出する。改変クロストリジウム毒素の平均総収量はBradford アッセイにより判定する。
【０６７３】
改変クロストリジウム毒素の発現をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。上記の手順を用いて精製したサンプルを2x LDS サンプルバッファー (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA) に添加し、NuPAGE（登録商標） Novex 4-12% Bis-Tris プレキャストポリアクリルアミドゲル (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA) を用いて変性還元条件にてMOPS ポリアクリルアミドゲル 電気泳動により分離する。ゲルをSYPRO（登録商標） Ruby (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA) で染色し、分離したポリペプチドを改変クロストリジウム毒素発現レベルの定量のためにFluor-S MAX MultiImager (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いて画像化する。改変クロストリジウム毒素のサイズおよび量をMagicMark（商標） タンパク質分子量標準(Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に対する比較により判定する。
【０６７４】
改変クロストリジウム毒素の発現はまた、ウェスタンブロット分析によっても分析する。上記の手順を用いて精製したタンパク質サンプルを 2x LDS サンプルバッファー (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)に添加し、NuPAGE（登録商標） Novex 4-12% Bis-Tris プレキャストポリアクリルアミドゲル(Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)を用いる変性還元条件でのMOPS ポリアクリルアミドゲル 電気泳動により分離する。分離したポリペプチドをTrans-Blot（登録商標） SD 半乾燥 電気泳動トランスファーセル装置 (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)を用いてゲルからポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Invitrogen、Inc、Carlsbad、CA)にウェスタンブロッティングによりトランスファーする。PVDF 膜を、25 mM Tris-緩衝食塩水 (25 mM 2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール塩酸 (Tris-HCl)(pH 7.4)、137 mM 塩化ナトリウム、2.7 mM 塩化カリウム)、0.1% TWEEN-20（登録商標）、ポリオキシエチレン (20) ソルビタンモノラウリエート、2% ウシ 血清アルブミン、5% 脱脂粉乳を含む溶液中で室温で2時間インキュベートすることによりブロッキングする。ブロッキングした膜を、適当な一次抗体をプローブとして含むTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）(25 mM Tris-緩衝食塩水、0.1% TWEEN-20（登録商標）、ポリオキシエチレン (20) ソルビタンモノラウリエート) 中で4 ℃で一晩インキュベートする。一次抗体によりプローブされたブロットをTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）で３回それぞれ15 分洗浄する。洗浄した膜を二次抗体としてセイヨウワサビペルオキシダーゼに接合した適当な免疫グロブリン G 抗体を含むTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）中で室温で2時間インキュベートする。二次抗体によりプローブされたブロットをTris-緩衝食塩水 TWEEN-20（登録商標）で３回それぞれ15 分洗浄する。標識された改変クロストリジウム毒素のシグナル検出はECL Plus（商標） Western Blot Detection System (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ) を用いて可視化し、Typhoon 9410 Variable Mode Imager (Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)により画像化して改変クロストリジウム毒素発現レベルを定量する。
【０６７５】
本発明の側面を開示された態様に言及して記載してきたが当業者であれば、開示された特定の実施例は単にこれらの側面を例示するものであり、本発明を限定するものではないことを容易に理解するであろう。様々な改変を本発明の精神を逸脱することなく行うことが出来る。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月11日(2009.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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