(57)【要約】  本発明は、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ相互作用に対する阻害活性を有し、抗腫瘍療法あるいはＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路、転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路、またはＰＣＮＡもしくはＲＡＤ６を含む経路に関連する疾病の治療および／または予防を目的とする医薬組成物の製造において使用することができる化合物（Ｉ）［式中、Ｒはヘテロシクリル基であり；Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈまたはアルキルであり；Ｒ３はＨ、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり；Ｒ４およびＲ５は、独立に、Ｈまたはアルキルであり；ｑは０および１から選択される数である］；およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体に関する。  Ｒ−（ＣＲ１Ｒ２）ｑ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３）−Ｃ（Ｒ４Ｒ５）−ＣＯ−ＮＨ２                                      （Ｉ）【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体：
Ｒ−（ＣＲ１Ｒ２）ｑ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３）−Ｃ（Ｒ４Ｒ５）−ＣＯ−ＮＨ２
［式中、
Ｒは基：
【化１】
2009544600.tif 000039
であり、ここで、
Ｒ６は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり；
Ａは、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され；
ｏは、０、１、２、３および４から選択される数であり；
ｎは、０および１から選択される数であり；
直線−は、Ｒ基と式（Ｉ）の分子の残りの部分との結合部位を示し；
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され；
Ｒ３は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され；
ｑは、０および１から選択される数である］。
【請求項２】
Ｒ６がＨ、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり、Ｒ３がＨ、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基である、請求項１に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項３】
Ｒ６が、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチルおよび置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基であり；Ｒ３が、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチル、および置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基である、請求項２に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項４】
Ｒ６が、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレート、およびカルボキサミドから選択される１以上の基で置換されている基である、請求項３に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項５】
Ｒ３が、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレート、およびカルボキサミドから選択される１以上の基で置換されている基である、請求項３に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項６】
Ｒ６が、ｐ−フルオロフェニルエチルまたは２，４−ジクロロフェニルエチル基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項７】
Ａが、塩素、フッ素および／または臭素で置換されているフェニルであり、ｏが１、２および３から選択される数である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項８】
Ｒ７およびＲ８が双方ともＨであり、ｏが２であり、Ａがｐ−フルオロフェニルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項９】
Ｒ３が２−ピリミジニルエチル、２，４−ジクロロフェニルエチルまたは４−メトキシフェニルエチルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１０】
ｎが１である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１１】
ｎが０である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１２】
ｑが０である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１３】
ｑが１である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１４】
式Ｉａ（Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド）：
【化２】
2009544600.tif 000040
を有する、請求項１に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１５】
式Ｉｂ（１，４−ビス［２’−（４’’フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）−カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン）：
【化３】
2009544600.tif 000041
を有する、請求項１に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１６】
下式：
【化４】
2009544600.tif 000042
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’−ピリジル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化５】
2009544600.tif 000043
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化６】
2009544600.tif 000044
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化７】
2009544600.tif 000045
１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
【化８】
2009544600.tif 000046
１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
【化９】
2009544600.tif 000047
１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
【化１０】
2009544600.tif 000048
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−［２’−｛２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化１１】
2009544600.tif 000049
［１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
の１つを有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
医学的使用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
【請求項１８】
ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防を目的とする医薬品の製造のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用。
【請求項１９】
ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病が、炎症性および自己免疫疾患である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記炎症性および自己免疫病態または疾病が、炎症性腸疾患、炎症性関節病態、アトピー性皮膚炎および他の炎症性皮膚科病態、神経炎、脳炎、脳脊髄炎および中枢神経系または末梢神経系に影響を及ぼす炎症性病態、筋炎、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、炎症を呈する感染性疾患、宿主対移植片拒絶反応、結膜炎および炎症性眼症、耳炎または口腔粘膜炎である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病が、癌または新生物である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
前記癌または新生物が、前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮および子宮頸癌；骨肉腫、軟組織肉腫および血管肉腫；白血病およびリンパ腫を含む造血器腫瘍；神経芽腫、膠芽腫および星状細胞腫；黒色腫、皮膚の基底細胞癌または扁平上皮癌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防を目的とする医薬品の製造のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用。
【請求項２４】
前記病態または疾病が炎症プロセスまたは新生物プロセスである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
抗腫瘍療法を目的とする医薬品を製造するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用であって、前記医薬品が、化学または放射線感作作用をもたらすＰＣＮＡおよびＲＡＤ６によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路のアンタゴニストであるか、あるいは該遺伝毒性障害耐性経路を阻害するものである、使用。
【請求項２６】
抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２７】
前記抗腫瘍薬がドキソルビシンまたはエトポシドである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
治療上有効な量の請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなる、医薬組成物。
【請求項２９】
治療上有効な量の少なくとも１種の第二の治療薬をさらに含んでなる、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
第二の治療薬が、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は医化学の分野であり、より具体的には、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ相互作用に対する阻害活性を有する治療化合物の開発、ならびに抗腫瘍療法を目的とするあるいはＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路、転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路、またはＰＣＮＡもしくはＲＡＤ６を含む経路に関連する疾病の治療および／または予防を目的とする医薬組成物の製造または使用に関する。
【０００２】
背景技術
ユビキチン化として知られるタンパク質の翻訳後修飾は、基質タンパク質のリジンとユビキチンペプチドのカルボキシ末端のグリシンとのイソペプチド結合の形成からなる［１］。ユビキチン（Ｕｂ）分子は、サイトゾル中や細胞核中に豊富に含まれている７６個のアミノ酸を有するポリペプチドである。Ｕｂ分子は、ＡＴＰを必要とする反応においてＵｂ分子を活性化するＥ１酵素（Ｕｂ活性化酵素）とチオエステル結合を形成し、結果としてＥ１酵素は、Ｅ２またはユビキチン結合酵素と呼ばれる第二のクラスの酵素の触媒システインとのチオエステル結合の形成を促進する状態となる。ヒトでは単一種のＥ1酵素が存在するが、一方、Ｅ２タイプの酵素は３０種近く存在する可能性がある。Ｅ２酵素は、Ｕｂのカルボキシ末端のグリシンと基質タンパク質のリジンとのイソペプチド結合の形成により、Ｕｂ分子を基質タンパク質へ転移することができる。ユビキチンユニットの共有結合付加による基質タンパク質の修飾は、モノユビキチン化と呼ばれている。同じＥ２酵素は、ユビキチン間でのイソペプチド結合の形成により、基質タンパク質と先に結合した別のＵｂ分子へのＵｂ分子の転移を触媒することができる。この反応は何度も繰り返すことができ、ポリユビキチン鎖の形成を引き起こす。このプロセスはポリユビキチン化として知られている。ユビキチン分子は７個のリジンを有し、ユビキチン間でイソペプチド結合を形成するのにそれらのうちのいずれもを使用することができる。異なるタイプのポリユビキチン鎖の存在量を決定する試験により、ポリユビキチン鎖の形成に最もよく使用されるユビキチン分子のリジンは、ユビキチンの２９位、４８位および６３位に存在するものであることが示されている［２，３］。ポリユビキチン鎖の基質タンパク質における４８位のリジン（Ｋ４８）とのイソペプチド結合を通じての４以上のＵｂユニットの形成は、プロテアソーム調節粒子のサブユニットにより認識されるシグナルであり［４］、それによってそのように修飾されたタンパク質はプロセシングを受け、プロテアソームによって分解される。それに対して、ユビキチンの６３位のリジン（Ｋ６３）を通じてのイソペプチド結合によって形成されるポリユビキチン鎖はプロテアソームにより認識されないようであり［５］、そのためこのタイプのポリユビキチン化は修飾されたタンパク質のプロテアソームによるプロセシングおよび分解のシグナルではない。他の形式のポリユビキチン化の機能、または基質タンパク質において前記修飾によってもたらされる結果についてはほとんど分かっていない。ユビキチンのリジン４８（Ｋ４８）によるポリユビキチン化は「標準」ポリユビキチン化と呼ばれており、一方、他のリジンのいずれかを使用したポリユビキチン化は「非標準」または「変形」ポリユビキチン化と呼ばれている［６］。多くのＥ２はＵｂの転移を触媒して、Ｋ４８またはＫ２９タイプのポリユビキチン鎖を形成することができるが、一方、Ｋ６３タイプのポリユビキチン鎖の形成には、ヘテロ二量体ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１またはＵＢＣ１３−ＵＥＶ２が特異的に必要であると思われる［６］。ポリユビキチン鎖の形成は、結合のタイプ（Ｋ４８またはＫ６３）に特異的なヒドロラーゼ（イソ��プチダーゼ）の活性によって妨げられる。
【０００３】
ヘテロ二量体ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１およびＫ６３タイプのポリユビキチン化を媒介するためのその活性を必要とする２つの生化学プロセスは、ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）によって媒介されるＤＮＡ修復［７］およびＴＮＦαまたはＩＬ−１などのサイトカインによって開始されるシグナル伝達［８］である。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母では、ヘテロ二量体Ｕｂｃ１３ｐ−Ｍｍｓ２ｐ（Ｍｍｓ２ｐはＵＥＶ１およびＵＥＶ２のオーソロガスＳ．セレビシエタンパク質である）は、ＰＣＮＡの変形（Ｋ６３  タイプ）ポリユビキチン化による修飾に不可欠であり［７−１１］、エラーフリー」として知られるＲＡＤ６（ユビキチン結合酵素）依存性損傷乗り越えＤＮＡ修復経路に関与している［１２−１６］。このタンパク質ＰＣＮＡは、Ｓ期開始時にＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯ分子の共有結合）により修飾され、それによりＰＣＮＡは安定し、細胞周期のこのＳ期の間、ＤＮＡ複製において作用することができる［７，９］。Ｓ期以外では、ＰＣＮＡは、ユビキチンリガーゼＲａｄ１８ｐと関連しているＲａｄ６ｐ結合酵素による標準ポリユビキチン化により修飾される。しかしながら、遺伝毒性障害を受けて、ヘテロ二量体Ｕｂｃ１３ｐ−Ｍｍｓ２ｐの核侵入が起こり、そのヘテロ二量体Ｕｂｃ１３ｐ−Ｍｍｓ２ｐは、Ｒａｄ６ｐによって媒介される標準ポリユビキチン化による修飾と競合して、ユビキチンリガーゼＲａｄ５ｐと関連して、ＰＣＮＡのＫ６３タイプのポリユビキチン化を触媒し、そのためＰＣＮＡの分解を防ぐ。このようにして、ヘテロ二量体Ｕｂｃ１３ｐ−Ｍｍｓ２ｐは、ＤＮＡにおけるニックの損傷乗り越え修復に使用することができる［７−１１，１７］。哺乳類では、ＰＣＮＡは、ＵＢＣ１３ＵＥＶ１（またはＵＢＣ１３−ＵＥＶ２）により媒介される変形ポリユビキチン化により修飾されることがはっきりと証明されていないため、Ｓ．セレビシエ酵母とは異なり、ＰＣＮＡ依存性ＤＮＡ修復におけるこのタイプの基質修飾の役割は明らかでない。
【０００４】
哺乳類細胞では、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１により触媒されるポリユビキチン化活性は、ＴＮＦαとその受容体との結合の後のＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ６アダプタータンパク質のヘテロ二量体化［１８−２０］、またはＩＬ−１によって誘導されるＴＲＡＦ６のヘテロ二量体化［２１］に不可欠であることが証明されている。このヘテロ二量体化は、ＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ６のユビキチンリガーゼ活性を刺激し、それによりＫ６３タイプの鎖自己ポリユビキチン化のためのＵＢＣ１３−ＵＥＶ１を補充する。これらのＫ６３ポリユビキチン鎖は、ＴＡＢ２またはＴＡＢ３タンパク質により認識され、ＴＡＫ１プロテインキナーゼと複合体を形成し、それを活性化し［２２］、次に別のキナーゼ、ＩＫＫαをリン酸化し、活性化し、それにより細胞質ＮＦκＢ阻害剤であるＩκＢのリン酸化および分解を導くシグナル伝達カスケードを開始する。このようにして、ＩκＢは核に転座し、その転写調節作用を発揮することができる［１８−２２］。
【０００５】
よって、ヘテロ二量体ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１（またはＵＢＣ１３−ＵＥＶ２）は、サイトカイン（ＴＮＦα）によって媒介される炎症、および、少なくとも酵母における、遺伝毒性障害を受けての複製後修復と同じぐらい重要な２つのプロセスの不可欠なレギュレーターである。ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１（またはＵＢＣ１３−ＵＥＶ２）よって媒介されるＫ６３タイプのポリユビキチン化を必要とする他の生物学的プロセス、例えば運動性［２３］、リガンド依存性エンドサイトーシス［２４］、または抗原Ｔ細胞活性化［２５］がある。それゆえ、この翻訳後修飾よって媒介される可能性がある多くの生物学的プロセスがあり、それらの研究はほとんど始められていない新規分野の調査である。
【０００６】
ＵＢＣ１３およびＵＥＶタンパク質によって形成されるヘテロ二量体の構造［２６、２７］は、最も際立った特徴が、ＵＢＣ１３における、上にＵＥＶタンパク質（Ｍｍｓ２ｐ、ＵＥＶ１またはＵＥＶ２）の疎水性残基、とりわけ８位のフェニルアラニン、５位のプロリンおよび３６位のイソロイシンもドッキングする２つの非常に区切られた疎水性ポケットの関与であるという相互作用界面を示す。これらの相互作用は、疎水性相互作用の両側に存在する極性残基を含む静電相互作用により安定化される。この配置はユビキチン結合酵素間で独特であるため、ＵＢＣ１３とＵＥＶタンパク質のいずれか（Ｍｍｓ２ｐ、ＵＥＶ１およびＵＥＶ２）との相互作用に高度に特異的である［２６−２８］。ＵＥＶタンパク質との相互作用に関与するＵＢＣ１３の疎水性ポケットによって区切られていることに加えて、この事実から、この界面はその相互作用を妨害するペプチドミメティック化合物を設計するための興味深い標的となる。このヘテロ二量体の形成の阻害は、その触媒活性、それゆえ関連基質のＫ６３タイプのポリユビキチン化に影響を及ぼすはずであり、この翻訳後修飾が関与するプロセスの遮断を意味する。このような趣旨で、低分子ＩＳＧ１５タンパク質の共有結合によるＵＢＣ１３の翻訳後修飾はその触媒活性を阻害することが証明されたことを指摘すべきである［２９、３０］。異なる生体系におけるＵＢＣ１３の阻害の効果を研究するために、この観察結果は非常に興味深いが、ＩＳＧ１５修飾が多くの他のタンパク質に影響を及ぼすことを指摘しなければならない。
【０００７】
タンパク質表面の認識を目的とする、生物学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を変調する能力を有する分子の設計は、化学と生物学との合流点におけるバイオテクノロジーの最大の課題の１つと考えられており、治療学において膨大な可能性を有する。しかしながら、多数のプロテアソーム阻害剤［３１，３２］、またはユビキチン化に関連する酵素活性の特異的阻害剤［３３，３４］が開発され、報告されているが、Ｋ６３タイプのポリユビキチン鎖の形成についての阻害剤も、他のタイプのポリユビキチン鎖（Ｋ４８、Ｋ２９、Ｋ６など）の形成についての特異的阻害剤も一切、現在まで報告されていない。同様に、ＵＢＣ１３ユビキチン結合酵素の他の薬理学的阻害剤はいずれも分かっていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ相互作用に対する阻害活性またはＵＢＣ１３の酵素活性に対する阻害活性を有する式（Ｉ）の新規ファミリーの化合物に関し、それゆえ、該化合物は、抗腫瘍療法においてあるいはＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路または転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防において有用である。
【０００９】
本発明において、表現「ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路または転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路に関連する病態または疾病」には、ＵＣＢ１３またはＮＦ−κＢは該疾病／病態において直接の因果的役割を有していないが、ＵＣＢ１３またはＮＦ−κＢが該疾病／病態の発症にある程度関与しているという疾病が含まれ、それゆえに、本発明の式（Ｉ）の化合物は、抗腫瘍療法においてあるいはＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路または転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防において有用である。
【００１０】
よって、本発明の第一の態様は、式（Ｉ）の化合物、ならびに下記に記載するその塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体（本発明の化合物）に関する。
【００１１】
本発明の第二の態様は、前記式（Ｉ）の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体を合成するための方法に関する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、医学的使用のための式（Ｉ）の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体に関する。
【００１３】
本発明の別のさらなる態様は、ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防を目的とする医薬品を製造するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体の使用に関する。
【００１４】
本発明の別のさらなる態様は、転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防を目的とする医薬品を製造するための、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用に関する。
【００１５】
別のさらなる態様では、本発明は、抗腫瘍療法を目的とする医薬品を製造するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関し、該医薬品は、化学または放射線感作作用をもたらすＰＣＮＡおよびＲＡＤ６によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路のアンタゴニストであるか、あるいは化学または放射線感作作用をもたらすＰＣＮＡおよびＲＡＤ６によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路を阻害する。
【００１６】
同様に、本発明の別のさらなる態様は、抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００１７】
最後に、本発明の別の態様は、治療上有効な量の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物もしくは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなる医薬組成物に関する。
【発明の具体的説明】
【００１８】
タンパク質表面の認識を目的とする、生物学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を変調する能力を有する分子の設計は、化学と生物学との合流点におけるバイオテクノロジーの最大の課題の１つと考えられており、治療学において膨大な可能性を有する。
【００１９】
この意味において、ＵＢＣ１３酵素は、新規治療化合物を設計するための有望な治療標的である。結果として、ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用を競合的に妨害することができる小分子の同定を可能にする方法を設計し、その出発仮説は、この相互作用を阻害することによりＫ６３タイプのポリユビキチン鎖を形成するＵＢＣ１３の能力を阻害するというものであった。この薬理学的開発に適用される方法論は、一方で、阻害化合物のバイオアベイラビリティ（すなわちそれらの細胞内局在および侵入能力）を、他方で、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用の妨害の特異性を、そして、最後に、ＵＥＶ１と相互作用するためにＵＢＣ１３によって使用される表面に対するこれらの小分子の空間および電荷調整を優先する。本発明において行われる方法は、以下を連続的に組み合わせている：
【００２０】
（１）酵母２−ハイブリッドアッセイにより判定される、この相互作用を特異的に阻害する能力を有するものを選抜するための、Ｎ−アルキルグリシン（ペプトイド）のコンビナトリアルケミカルライブラリーの試験的スクリーニング。関連するタンパク質−タンパク質相互作用の制御を利用することから、用いるスクリーニング法では、小分子のバイオアベイラビリティと、ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用の阻害の特異性の両方にアプローチすると同時に解決することが可能である。
【００２１】
（２）前工程において選択されたペプトイドのＵＢＣ１３の表面における分子ドッキングを判定するためのコンピューターによる最適化。
【００２２】
（３）ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用に対する阻害活性を有する薬効のある小分子の合成。前工程において得られた仮想最適化データをこの合成のガイドラインとして用いた。
【００２３】
（４）前工程において合成された化合物のin vitroおよびin vivo機能効果の特性評価。この特性評価には、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１のユビキチン結合活性を阻害し、さらにこの酵素によって調節されることが分かっている細胞プロセスのいくつかを妨害するこれらの化合物の能力の判定が含まれた。図１は、この薬理学的開発のために従う工程および方法図式的に示す。このスクリーニングに用いたコンビナトリアルモジュールケミカルライブラリーの一般構造（ＩＩ）を以下に示す：
【化１】
2009544600.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、前記ケミカルライブラリーの構築に用いられた化学的多様性を表す）［３５］。
【００２４】
このようにして、本発明の発明者らは、ＵＢＣ１３タンパク質とＵＥＶタンパク質（Ｍｍｓ２ｐ、ＵＥＶ１およびＵＥＶ２、実施例４参照）との相互作用を阻害することができ、この酵素のタイプＫ６３ポリユビキチン化活性を競合的に阻害し、薬理学上有効な濃度において生物学的効果をもたらすことができる一般式Ｉを有する新規ファミリーの化合物を同定した。これらの化合物は、ＵＢＣ１３タンパク質とＵＥＶ１タンパク質との正確な相互作用を競合的に阻害するため、「Ｋ６３タイプのポリユビキチン化」として知られるモードでポリユビキチン鎖を形成するそれらの酵素活性を阻止し、後者はこれらの化合物が活性を発揮する機構である（実施例５）ため、次にはこのＫ６３タイプポリユビキチン化によって変調される総ての生化学的経路および生物学的プロセスも変調する。
【００２５】
本発明の薬物対象の生物活性は、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ２およびＵｂｃ１３ｐ−Ｍｍｓ２ｐによって媒介される変形ポリユビキチン化(variant polyubiquitylation variant)によって通常調節される生化学的経路を反映する。特に、このヘテロ二量体酵素によって媒介されるポリユビキチン化は、一方で、ＲＡＤ６依存性「エラーフリー」経路として知られる経路によるＤＮＡ修復を（実施例６）、他方で、サイトカインおよび他の刺激により誘導される転写因子ＮＦ−κＢの活性化を調節する。この活性の結果として、これらの薬物は、サッカロミセス・セレビシエ酵母細胞と哺乳類細胞（子宮頸癌および前立腺癌それぞれに由来するＨｅＬａおよびＰＣ−３）の両方を、物理的または化学的作用因子（紫外線、メタンスルホン酸メチルまたはドキソルビシンなど）の細胞傷害作用に対して感作する（実施例８）。これらの薬物の活性についての別の生物学的結果は、薬理学上有効な濃度においての、サイトカイン（ＴＮＦαなど）による転写因子ＮＦ−κＢ活性化の阻害であり（実施例７）、これらの薬物は従来の抗悪性腫瘍薬の細胞傷害効果を高める。これらの活性から、本発明の薬物対象には、少なくとも２つのタイプの医学的用途がある：
【００２６】
（１）ＤＮＡを損傷または修飾する細胞傷害活性を有する化学的または物理的作用因子（遺伝毒性薬）に対する腫瘍細胞の感作。この感作によりかかる遺伝毒性薬の治療上有効な用量を低減しなければならず、そのためかかる作用因子の望ましくない副作用のいくつかが軽減される。
【００２７】
（２）炎症性サイトカインおよびケモカインの活性化を提示する病態における抗炎症効果。
これらの新規薬物は、さらに、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１（ＵＢＣ１３−ＵＥＶ２）の活性および種々の形式のユビキチン化およびポリユビキチン化により調節される他の活性を調査するためのツールである。
【００２８】
手短に言えば、新規治療標的となるこのＵＢＣ１３酵素の薬理学的阻害剤の前例がないことから、これらの化合物は、新規クラスの薬物にさらに相当し、抗新生物、抗炎症用途に関して、さらにＵＢＣ１３酵素およびＫ６３タイプの非標準ポリユビキチン化を含む代謝経路に関連する他の複数の病理学的プロセスにおいて、独自の新規薬理学的アプローチに相当する。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物
本発明の第一の態様は、式（Ｉ）：
Ｒ−（ＣＲ１Ｒ２）ｑ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３）−Ｃ（Ｒ４Ｒ５）−ＣＯ−ＮＨ２
［式中、
Ｒは基：
【化２】
2009544600.tif 000003
であり、ここで、
Ｒ６は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり；
Ａは、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ７およびＲ８は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され；
ｏは、０、１、２、３および４から選択される数であり；
ｎは、０および１から選択される数であり；
直線−は、Ｒ基と式（Ｉ）の分子の残りの部分との結合部位を示し；
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され；
Ｒ３は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され；
ｑは、０および１から選択される数である］
の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体に関する。
【００３０】
本発明はまた、本発明の化合物の塩も提供する。例えば、本明細書において提供される化合物の薬学上許容される塩は、酸付加塩、塩基付加塩または金属塩であり得、従来の化学的方法によって塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。かかる塩は、例えば、水中でまたは有機溶媒中でまたはそれら２つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を化学量論量の好適な塩基または酸と反応させることにより一般に調製される。エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリロ(acetonitrilo)などの非水性媒質が一般に好ましい。酸付加塩の例としては、無機酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩など）、有機酸付加塩（例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩など）が挙げられる。アルカリ付加塩としては、無機塩（例えば、アンモニウム塩など）および有機アルカリ塩（例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、グルタミンおよび塩基性アミノ酸塩など）が挙げられる。金属塩の例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩およびリチウム塩が挙げられる。
【００３１】
用語「薬学上許容される」とは、生理学的に許容され、かつヒトに投与したときに。アレルギー反応または類似の有害反応（胃の不快感、めまいなど）を通常引き起こさない分子実体および組成物に関する。好ましくは、本明細書において、用語「薬学上許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって認可されているか、または動物、より詳しくはヒトにおけるその使用について米国薬局方(the US pharmacopoeia)または別の一般に有名な薬局方に記載されていることを意味する。
【００３２】
当業者には、薬学上許容される塩を得るための可能な手段として薬学上許容されない塩も本発明の範囲に含まれることは明らかであろう。
【００３３】
本発明の化合物は、遊離化合物としてまたは溶媒和物として結晶形態であり得、両方の形態は本発明の範囲内であることが意図される。この意味において、本明細書における用語「溶媒和物」には、両方の薬学上許容される溶媒和物、すなわち医薬品の製造において使用することができる式（Ｉ）の化合物の溶媒和物と、薬学上許容される溶媒和物または塩の調製において有用であり得る薬学上許容されない溶媒和物が含まれる。薬学上許容されるならば、薬学上許容される溶媒和物の性質は重大ではない。溶媒和物は、当業者に周知の従来の溶媒和法によって得ることができる。溶媒和物の例としては、水和物およびアルコラート、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルコラート、例えば、メタノラートが挙げられる。
【００３４】
本明細書における用語「プロドラッグ」には、個体に投与すると、該個体内で該式（Ｉ）の化合物を直接または間接的に提供することができる、式（Ｉ）の化合物の任意の誘導体化合物、例えば、エステル（カルボン酸エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属塩スルホン酸エステルなどを含む）、カルバメート、アミドなどが含まれる。有利には、前記誘導体は、個体に投与すると、式（Ｉ）の化合物のバイオアベイラビリティを増加するか、または生物学的コンパートメント内での式（Ｉ）の化合物の放出を促進する化合物である。個体に投与することができ、式（Ｉ）の化合物が個体の生物学的コンパートメント内で供給されるならば、前記誘導体の性質は重大ではない。前記プロドラッグは、当業者に公知の従来の方法によって調製することができる。
【００３５】
本発明に、本明細書に記載される化合物の考えられるあらゆる異性体が含まれるということは当業者には直ちに明らかであろう。従って、多重結合の存在に応じて、本発明の化合物にＺおよびＥ異性体が含まれ得る。キラル中心の存在に応じて、光学異性体または鏡像異性体も含まれる。個々の異性体、鏡像異性体またはジアステレオ異性体およびその混合物は、本発明の範囲内である。個々の鏡像異性体またはジアステレオ異性体、ならびにその混合物は、従来の技術によって分離することができる。
【００３６】
立体異性体は、当業者には、同じ一連の結合によって結合している同じ原子から形成された、代替不可能な異なる三次元構造を有する化合物として理解される。
【００３７】
療法に適用する場合には、式（Ｉ）の化合物、その異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物は、好ましくは薬学上許容されるまたは実質的に純粋な形態であり、すなわち希釈剤および担体などの通常の医薬品添加物を除いて、通常の投与量レベルにおいて有毒であると考えられる材料を含まない薬学上許容される純度レベルを有する。有効成分の純度レベルは、好ましくは５０％より高く、より好ましくは７０％より高く、より好ましくは９０％より高い。好ましい実施態様では、有効成分の純度レベルは、式（Ｉ）の化合物またはその塩、溶媒和物もしくはプロドラッグのの９５％より高い。
【００３８】
特に断りのない限り、本発明の化合物には、１以上の同位体濃縮原子の存在のみが異なる化合物も含まれる。例えば、重水素によるまたは三重水素による水素の置換、あるいは１３Ｃまたは１４Ｃ濃縮炭素または１５Ｎ濃縮窒素による炭素の置換を除き、前記構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明に記載される化合物、その薬学上許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物ならびにそれらを含む医薬組成物は、他の追加薬物とともに使用して、併用療法を提供することができる。前記追加薬物は、同じ医薬組成物の一部をなし得るし、あるいは、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容されるプロドラッグ、溶媒和物、誘導体もしくは塩を含んでなる医薬組成物の投与と同時であろうとなかろうとその投与のために別個の組成物として提供することができる。
【００４０】
本明細書に記載される化合物の定義において、次の用語は示されている意味を有する。
【００４１】
「アルキル」とは、炭素原子と水素原子によって構成され、不飽和を含まず、１〜６個、好ましくは１〜４個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合されている、直鎖または分枝鎖炭化水素基に関し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなどがある。
【００４２】
「アルケニル」とは、炭素原子と水素原子によって構成され、少なくとも１つの不飽和を含み、２〜６個、好ましくは２〜４個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合されている、直鎖または分枝鎖炭化水素基に関する。
【００４３】
「シクロアルキル」とは、３〜６個の間の炭素原子を有する飽和炭素環式環に関する。好適なシクロアルキル基としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルなどのシクロアルキル基が挙げられる。
【００４４】
「シクロアルキルアルキル」とは、アルキル基によって分子の残りの部分に結合されているシクロアルキル基に関し、例えば、シクロペンチルエチルがある。
【００４５】
「アルキニル」とは、炭素原子と水素原子によって構成され、少なくとも１つの共役または非共役炭素炭素三重結合を含み、２〜６個、好ましくは２〜４個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合されている、直鎖または分枝鎖炭化水素基に関し、例えば、−ＣＣＨ、−ＣＨ２ＣＣＨ、−ＣＣＣＨ３、−ＣＨ２ＣＣＣＨ３がある。
【００４６】
「アリール」とは、６個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基に関し、例えば、フェニルがある。
【００４７】
「アリールアルキル」とは、アルキル基によって分子の残りの部分に結合されているアリール基に関し、例えば、ベンジルおよびフェネチルがある。
【００４８】
「ヘテロシクリル」とは、炭素原子と、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜４個の間のヘテロ原子からなる３〜６員の安定な環、好ましくは、１、２、３または４個のヘテロ原子を有する４〜６員の環、より好ましくは、１、２または３個のヘテロ原子を有する５または６員の環に関する。本発明の目的では、複素環は単環式環系である。ヘテロシクリル基中の窒素、炭素または硫黄原子は場合によって酸化されていてもよく、窒素原子は場合によって第四級化されていてもよく、ヘテロシクリル基は部分的または完全に飽和されていてもよく、あるいは芳香族であってもよい。このような複素環の例としては、限定されるものではないが、アゼピン、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、フラン、イソチアゾール、イミダゾール、インドール、ピペリジン、ピペラジン、チアジアゾール、テトラヒドロフランが挙げられる。
【００４９】
「ヘテロシクリルアルキル」とは、アルキル基によって分子の残りの部分に結合されている複素環式基に関し、例えば、ピリミジニルエチルがある。
【００５０】
特に断りのない限り、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキル基は、場合によって、ハロ（フッ素、塩素または臭素）、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、スルホキシ、ｏ−ベンジル、ｏ−ベンゾイル、カルボキシ、シアノ、カルボニル、アシル、アルコキシカルボニル、スルホニル、スルホニルアミノ、アミノ、イミノおよびニトロなどの１、２または３個の置換基で置換されていてもよい。
【００５１】
「アルコキシカルボニル」とは、式−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（式中、Ｃ末端はその分子に結合され、Ｏ末端は炭素原子に結合されており、エステル官能基を形成している）を有する化合物に関する。前記炭素原子はアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アルキニル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリル基の一部であり得る。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物において、Ｒ６は、Ｈ、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり、Ｒ３は、Ｈ、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基である。
【００５３】
別のより好ましい実施態様によれば、Ｒ６は、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチルおよび置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基であり；Ｒ３は、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチル、および置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基である。
【００５４】
さらにより好ましい実施態様によれば、Ｒ６は、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレートおよびカルボキサミドから選択される１以上の基で置換されている基である。
【００５５】
本発明の別のさらなる実施態様によれば、Ｒ３は、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレートおよびカルボキサミドおよび塩から選択される１以上の基で置換されている基である。
【００５６】
本発明の他の異なる実施態様によれば、Ｒ６は、ｐ−フルオロフェニルエチルまたは２，４−ジクロロフェニルエチル基であり；置換基Ａは置換または非置換アリールであり；置換基Ａは塩素、フッ素および／または臭素で置換されているフェニルであり、ｏは１、２および３から選択される数であり；Ｒ７およびＲ８は双方ともＨであり、ｏは２であり、Ａはｐ−フルオロフェニルであり；Ｒ３は２−ピリミジニルエチル、２，４−ジクロロフェニルエチルまたは４−メトキシフェニルエチルであり；ｎは１であり；ｎは０であり；ｑは０であり；ｑは１である。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様は、式（Ｉａ）の化合物：バルビン(Varubin)と呼ばれる（Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロ−フェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド）：
【化３】
2009544600.tif 000004
、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体によって構成される。
【００５８】
本発明のもう１つの好ましい実施態様は、式（Ｉｂ）の化合物：（１，４−ビス［２’−（４’’フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’−ピリジル）エチル）−カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン）：
【化４】
2009544600.tif 000005
、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体によって構成される。
【００５９】
他の好ましい実施態様は、下記化合物：
【化５】
2009544600.tif 000006
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’−ピリジル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化６】
2009544600.tif 000007
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化７】
2009544600.tif 000008
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化８】
2009544600.tif 000009
１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
【化９】
2009544600.tif 000010
１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
【化１０】
2009544600.tif 000011
１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
【化１１】
2009544600.tif 000012
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−［２’−｛２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
【化１２】
2009544600.tif 000013
［１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
によって構成される。
【００６０】
その第二の態様では、本発明は、前記式（Ｉ）の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体を合成するための方法に関する。式（Ｉ）の本発明の化合物は、化学合成経路の手段によって入手または製造することができるか、あるいは種々の起源の天然材料から得ることができる。本願は、固相合成に基づく式Ｉの本発明の化合物の合成経路を記載する。本発明の２つの化合物式（Ｉａ）および（Ｉｂ）の固相合成スキームを以下に示す。当業者には、下記に示される２つのスキームおよび実施例３）によって示されるこの種の合成を式（Ｉ）に含まれる残りの化合物にも適用できることが明らかである。
【００６１】
スキームＩ：式Ｉａ化合物：（Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロ−フェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド）の合成
【化１３】
2009544600.tif 000014
【００６２】
スキームＩＩ：式Ｉｂの化合物：（１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’−ピリジル）エチル）−カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン）の合成
【化１４】
2009544600.tif 000015
【００６３】
本発明のもう１つのさらなる態様は、患者に投与するための、治療上有効な量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物、またはその薬学上許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物もしくは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなる医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物）によって構成される。
【００６４】
本発明のもう１つのさらなる態様は、式（Ｉ）の化合物が下記：Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド（Ｉａ）またはそのＲ、Ｓ鏡像異性体形態および／もしくはラセミ混合物のいずれかである、本発明の医薬組成物によってによって構成される。
【００６５】
本発明の別の特定の実施態様は、式（Ｉ）の化合物が下記：１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）カルボニル−メチル］ピペラジン−３，６−ジオン（Ｉｂ）、またはそのＲ、Ｓ鏡像異性体形態および／もしくはラセミ混合物のいずれかである、本発明の医薬組成物によってによって構成される。
【００６６】
本発明の別の特定の実施態様は、化合物（Ｉ）が
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’−ピリジル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；
１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン；
Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−［２’−｛２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド；および
［１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
から選択される本発明の医薬組成物によって構成される。
【００６７】
前記組成物に使用することができる薬学上許容されるアジュバントおよびビヒクルは、当業者に公知であり、治療組成物の製造において通常使用されるアジュバントおよびビヒクルである。
【００６８】
本記載において使用される意味において、表現「治療上有効な量」とは、所望の効果をもたらすように算出された、ＵＢＣ１３酵素の阻害を起こすことができる作用因子または化合物の量に関し、いくつかある要因の中で特に、該化合物の典型的な特徴（患者の年齢、状態、変化または障害の重篤度、ならびに(and on)投与の経路および頻度を含む）により一般に決定される。
【００６９】
別の特定の実施態様では、前記治療組成物は、固体形態または薬学上許容される希釈剤中の水性懸濁液として調製される。本発明によって提供される治療組成物は、任意の好適な投与経路により投与することができ、そのために、前記組成物は、選択される投与経路に好適な投与形の処方とされる。特定の実施態様では、本発明によって提供される治療組成物は、経口的に、局所的に、直腸にまたは非経口的に（皮下に、腹膜内に、皮内に、筋肉内に、静脈内になどを含む）投与される。医薬品の投与のための異なる投与形およびそれらを得るために必要な賦形剤についての概説は、例えば、E. W. Martinによる“Tratado de Farmacia Galenica”, C. Fauli i Trillo, 1993, Luzan 5, S. A. Ediciones, Madrid, in “Remington’s Pharmaceutical Sciences”またはスペインおよび米国薬局方の他の通常または類似のものにおいて見い出すことができる。
【００７０】
本発明において使用する化合物の有効な投与量は、選択した化合物の相対的有効性、処置を受ける障害の重症度、または年齢、体重もしくは投与方法によって一般に決まるであろう。それでもなお、前記活性化合物は、通常、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の典型的な１日総用量で１日１回以上、例えば１日１回、２回、３回、または４回投与される。
【００７１】
本発明において使用する化合物は、併用療法を提供するために他の薬物とともに投与することもできる。前記他の薬物は、同じ組成物の一部をなし得るし、あるいは、その投与のために別個の組成物として同時にまたは異なる時間に投与することができる。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、医学的使用のための、式（Ｉ）の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物に関する。
【００７３】
本発明の別のさらなる態様は、ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路の変化と関連している病態または疾病の治療および／または予防における、式（Ｉ）の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体、またはその混合物の使用に関する。
【００７４】
本発明の別のさらなる態様は、ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防を目的とする医薬品を製造するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関する。
【００７５】
特定の実施態様では、ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病は炎症性および自己免疫疾患である。好ましい実施態様では、前記炎症性および自己免疫病態または疾病は、炎症性腸疾患、炎症性関節病態、アトピー性皮膚炎および他の炎症性皮膚科病態、神経炎、脳炎、脳脊髄炎および中枢神経系または末梢神経系に影響を及ぼす炎症性病態、筋炎、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、炎症を呈する感染性疾患、宿主対移植片拒絶反応、結膜炎および炎症性眼症、耳炎または口腔粘膜炎：であり得る。
【００７６】
別の特定の実施態様では、ＵＢＣ１３酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病は癌または新生物であり、限定されるものではないが、いかなる組織起源のいかなるタイプの良性または悪性新生物も含まれ、中でも、限定されるものではないが、いかなるタイプの癌腫（前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮および子宮頸癌を含む）も、いかなるタイプの肉腫（骨肉腫、軟組織肉腫および血管肉腫を含む）も、いかなるタイプの造血器腫瘍（白血病およびリンパ腫を含む）も、いかなるタイプの神経系腫瘍（神経芽腫、膠芽腫および星状細胞腫を含む）も、いかなる皮膚科癌（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む）も含まれる。
【００７７】
本発明の別のさらなる態様は、転写因子ＮＦ−κＢを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および／または予防を目的とする医薬品を製造するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関する。特定の実施態様では、前記病態または疾病は炎症プロセスまたは新生物プロセスである。
【００７８】
別のさらなる態様では、本発明は、抗腫瘍療法を目的とする医薬品を製造するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関し、該医薬品は、化学または放射線感作作用をもたらすＰＣＮＡおよびＲＡＤ６によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路のアンタゴニストであるか、あるいは該遺伝毒性障害耐性経路を阻害するものである。
【００７９】
本発明の別のさらなる態様は、抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造における式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００８０】
本発明において、「抗腫瘍薬」とは、腫瘍の成長、増殖および／または発生を阻害するために使用することができる抗増殖性、抗発癌性および／または制癌性を有する化学的、物理的または生物学的化合物または作用因子として理解される。
【００８１】
本発明において使用することができる抗腫瘍薬の例は、（ｉ）アルキル化剤（スルホン酸アルキルおよびエチレンイミン誘導体など）；（ｉｉ）代謝拮抗物質（葉酸拮抗薬およびプリン類似体など）；（ｉｉｉ）天然物（抗腫瘍抗生物質および分裂抑制因子など）；（ｉｖ）ホルモンおよびそのアンタゴニスト（アンドロゲンおよびコルチコステロイドなど）；（ｖ）生物学的作用因子（ウイルスベクターなど）；ならびに（ｖｉ）物理的作用因子（異なるタイプの照射源によって生成される電離放射線（放射線治療薬）など）である。抗腫瘍薬として使用することができる化合物のリストは、特許出願ＷＯ２００５／１１２９７３に記載されている。
【００８２】
本発明の特定の実施態様では、前記抗腫瘍薬はドキソルビシンまたはエトポシドである。
【００８３】
式（Ｉ）の化合物は、抗腫瘍薬による処置に対して哺乳類を感作することができるような量で該哺乳類に投与する必要がある。本発明において、「有効な感作量」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに投与したときに、抗腫瘍薬に対してまたは任意の他の抗腫瘍療法／処置に対して該哺乳類を感作するのに十分な式（Ｉ）の化合物の量として定義される。抗腫瘍薬に対して感作効果をもたらすのに必要な、腫瘍組織における式（Ｉ）の化合物の有効濃度は、０．０１ナノモル〜１００マイクロモルの間であり、、任意の経路によって前記被験体に投与しなければならない該化合物の用量は、該腫瘍内濃度に達するように調整しなければならない。哺乳類を「感作する」との用語には、
（ｉ）いかなる抗腫瘍薬または抗腫瘍処置もこれまでに受けたことのない哺乳類（「初回感作」）において抗腫瘍薬または抗腫瘍療法／処置の有効性を高めること
、ならびに／あるいは
（ｉｉ）抗腫瘍薬または抗腫瘍処置をすでに受けたことがあり、その抗腫瘍薬または抗腫瘍処置に対してこれまでに抵抗性を提示したかどうかはわからない哺乳類において抗腫瘍薬または抗腫瘍療法／処置の有効性を高めること
が含まれる。
【００８４】
本発明において検討することができる抗腫瘍処置は、例えば、白金化合物（カルボプラチンまたはシスプラチンなど）による、場合によって、ゲムシタビンまたはタキサン（ドセタキセルまたはパクリタキセルなど）と組み合わせての処置である。抗腫瘍処置のさらなる例は、特許出願ＷＯ２００５／１１２９７３において見い出すことができる。
【００８５】
前記抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造において式（Ｉ）の化合物を使用することによって効果的に治療することができる癌としては、哺乳類の癌、とりわけ癌または新生物が挙げられ、限定されるものではないが、いかなる組織起源のいかなるタイプの良性または悪性新生物も含まれ、中でも、限定されるものではないが、いかなるタイプの癌腫（前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮および子宮頸癌を含む）も、いかなるタイプの肉腫（骨肉腫、軟組織肉腫および血管肉腫を含む）も、いかなるタイプの造血器腫瘍（白血病およびリンパ腫を含む）も、いかなるタイプの神経系腫瘍（神経芽腫、膠芽腫および星状細胞腫を含む）も、いかなる皮膚科癌（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む）も含まれる。
【００８６】
最後に、本発明の別のさらなる態様は、治療上有効な量の式（Ｉ）の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなることを特徴とする医薬組成物に関する。特定の実施態様では、前記医薬組成物は、治療上有効な量の少なくとも１種の第二の治療薬をさらに含んでなり、本発明の別のさらに特定の実施態様では、該少なくとも１種の第二の治療薬は、式（Ｉ）の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体である。
【実施例】
【００８７】
実施例１．ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用を妨害することができるペプトイド（Ｎ−アルキルグリシン）を同定するための試験的スクリーニング
ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用を酵母２−ハイブリッドアッセイによって検出する。次の実施例において使用されるＵＢＣ１３およびＵＥＶ１のタンパク質型はヒト(Homo sapiens)のものである。ＵＢＣ１３タンパク質は、ＵＢＥ２Ｎ（ＨＵＧＯ命名法）とも呼ばれ、次の識別子を有する：ＮＣＢＩ−ＧＩ：４５０７７９３、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ６１０８８および［ＥＣ：６．３．２．１９］。ＵＥＶ１タンパク質は、ＵＢＥ２Ｖ１（ＨＵＧＯ命名法）とも呼ばれ、次の識別子を有する：ＮＣＢＩ−ＧＩ：７３７６５５４６およびＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１３４０４。このアッセイでは、ＵＢＣ１３を、プラスミドｐＢＤ−ＵＢＣ１３からＧａｌ４  ＤＮＡ−結合ドメイン（ＤＢＤ−ＵＢＣ１３）との融合タンパク質として発現させ、ＵＥＶ１を、プラスミドｐＡＣＴ２−ＵＥＶ１からＧａｌ４転写活性化ドメイン（ＡＤ−ＵＥＶ１）との融合タンパク質として発現させる。両方のプラスミドをサッカロミセス・セレビシエ株ＡＨ１０９において同時トランスフェクトし、ロイシンまたはトリプトファンを含まないＹＰＤ培地を入れたプレートで増殖させ、これら２つのアミノ酸に対するｔＲＮＡシンターゼ、すなわち２つの同時トランスフェクトしたプラスミドを含むものを発現しているコロニーだけを選抜する。株ＡＨ１０９には、そのゲノム内に２つの人工遺伝子座が組み込まれており：１つの遺伝子座は、ヒスチジル−ｔＲＮＡシンターゼの遺伝子の前にＧＡＬ１プロモーターに結合したＧａｌ４  ＤＢＤの認識配列を含み；別の遺伝子座は、ＡＤＥ２遺伝子の前にＧＡＬ２プロモーターに結合したＧａｌ４  ＤＢＤを含み、第三の遺伝子座は、β−ガラクトシダーゼ酵素のｌａｃＺ遺伝子の前にＭＥＬ１プロモーターに結合したＧａｌ４  ＤＢＤの認識配列を含む。一方で、Ｇａｌ４  ＤＢＤドメインを、他方で、転写活性化ドメインを含む転写因子を株ＡＨ１０９において発現させることで、Ｈｉｓ−ｔＲＮＡシンターゼの発現を誘導し、ヒスチジンフリー培地での増殖が可能になり、同時に、好適な基質を用いて酵素活性を比色定量により検出可能であるβ−ガラクトシダーゼの発現も誘導する。ＤＢＤ−ＵＢＣ１３およびＡＤ−ＵＥＶ１の発現および物理的相互作用は、Ｇａｌ４の結合部位と関連しているプロモータを活性化することができる転写因子を、これら２つの遺伝子座のプロモーター上に置く。そのため、プラスミドｐＢＤ−ＵＢＣ１３およびｐＡＣＴ２−ＵＥＶ１で同時トランスフェクトしたＡＨ１０９細胞のヒスチジンフリー培地での増殖は、ＵＢＣ１３タンパク質とＵＥＶ１タンパク質との物理的相互作用が存在することを示す。さらに、この相互作用の程度は、基質としてＯ−ニトロフェニル−ｐ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を使用した、β−ガラクトシダーゼ活性の比色定量によって良好な近似値で推測することができ、この酵素活性のレベルはＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用の強さに正比例する。
【００８８】
トリアルキルグリシン（ペプトイド）の基づくコンビナトリアル混合物および個別化合物の合成を以下のとおり行った：固相上での位置スキャニング形式による５２種の制御された混合物における５１２０種のペプトイドの最適化ケミカルライブラリー［３５］。このライブラリーは、５２種の制御された混合物および合計５１２０種の化合物からなる。混合物１〜２０（Ｏ１ＸＸ）には、定義された位置として、選択された、市販の２０種の第一級アミンのうちの１種を含め、一方、「Ｘ」位置（混合物位置）に１６種の第一級アミンの一群を使用した。混合物２１〜３６（ＸＯ２Ｘ）および３７〜５２（ＸＸＯ３）には、定義された位置に１６種のアミンの群だけを含めた［３６］。要約すれば、８つの合成工程による方法をＲｉｎｋアミド樹脂（０．７ｍ当量／ｇ、Rapp Polymere,Tubingen,Germany）のＦｍｏｃ保護基の解離で開始した。次いで、クロロ酢酸およびジイソプロピルカルボジイミドを用いてアシル化工程を行い、続いて個別アミンまたはアミンの混合物を用いてクロロメチル化中間体の対応するアミノ化を行った。その後、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水の混合物を用いて樹脂から生成物を切断し、溶媒を蒸発させ、その残渣を凍結乾燥し、１０％ジメチルスルホキシドに５ｍｇ／ｍＬの濃度に再び溶かした。上記合成順序を適用して、独立した固相合成によって個別ペプトイドを調製した。高速液体クロマトグラフィー、質量分析および１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲによって個別Ｎ−アルキルグリシンの純度を決定し、同定した。本明細書において示した一般構造（ＩＩ）は、本発明において使用するコンビナトリアルケミカルライブラリーを構成しているＮ−アルキルグリシン（ペプトイド）の一般化学構造を示す。
【００８９】
ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用を阻害することができるペプトイドを酵母２ハイブリッドアッセイによりスクリーニングするために使用される方法を以下に記載する。ＨｅｐＧ２細胞系統から逆転写(retrotranscription)およびＰＣＲによってＵＢＣ１３およびＵＥＶ１に対応する相補的ＤＮＡを作製した。ＵＢＣ１３を、Ｇａｌ４  ＤＮＡ−結合ドメインに従って、ベクターｐＢＤ(Stratagene, La Jolla, California, USA)にサブクローニングし、プラスミドｐＢＤ−ＵＢＣ１３を作製した。ＵＥＶ１を、Ｇａｌ４のトランス活性化ドメインに従って、ベクターｐＡＣＴ２(Clontech)にサブクローニングし、プラスミドｐＡＣＴ２−ＵＥＶ１を作製した。これらのプラスミドＰＢＤ−ＵＢＣ１３およびＰＡＣＴ２−ＵＥＶ１をサッカロミセス・セレビシエ株ＡＨ１０９中に同時トランスフェクトした。この目的に向けて、最近調製されたコンピテント酵母細胞を前記プラスミドのＤＮＡと、ポリエチレングリコール−酢酸リチウムの溶液（４０％ＰＥＧ、１００ｍＭ酢酸リチウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の担体としてのニシン精巣ＤＮＡとともに混合し、攪拌しながら３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、７％ジメチルスルホキシドを加え、前記細胞を水浴中で４２℃で３０秒間熱ショックに供し、直後に氷上で冷却を行った。それらの細胞を１０００ｇで遠心分離し、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣｌＨ、ｐＨ７．５ｍＭ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、最少培地プレートに播種して、ＨＩＳ３マーカー、ＡＤＥ２マーカーおよびＬａｃＺマーカーを発現している細胞の選抜を可能にする。増殖の３日後、増殖陽性の（それゆえ、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用陽性の）コロニーを選抜し、５ｍＬの最少培地で攪拌しながら３０℃で一晩増殖させた。さらに、それを、０．１ｍＭの混合物濃度で５２種のペプトイド混合物のうちの１種を含む新しい増殖培地に変更し、３０℃で一晩インキュベートした。その培養の吸光度（光学密度またはＯＤ）を６９５ｎｍで決定し、０．１ｍＭで同じペプトイド混合物を含むＹＰＤ培地で初期ＯＤ６９５  ０．２を有する新しい培養物を攪拌下３０℃で調製し、ＯＤ６９５  ０．８に達するまで３〜４時間増殖させた。その時点で、その培養物を遠心分離し、細胞ペレットをＺバッファー（１６ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５．５０ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．７５ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．２４６ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４  ｐＨ７．０）に再懸濁し、液体窒素（１分）−３７℃（１分）での凍結融解サイクルによって粉砕した分画した。１６０μＬのβ−ガラクトシダーゼ基質、Ｏ−ニトロフェニル−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｚバッファー中４ｍｇ／ｍＬ）をすぐに加え、目に見える基質（黄色）が形成するまで３０℃でインキュベートした。０．４ｍＬの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を加えることによって反応を停止させ、３０分間インキュベートし、続いて遠心分離を行った。この上清を４２０ｎｍで分光光度を測定するためのセルに移した。本明細書では、１単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を、１分当たり１細胞当たりに１μｍｏｌのＯＮＰＧをＯ−ニトロフェノールおよびＤ−ガラクトースに加水分解することができる量として記載している(Miller, 1972; Miller, 1992)。この比���定量アッセイにより、酵母２−ハイブリッド法による２タンパク質間の相互作用の強さの半定量的測定が提供される。
【００９０】
５２種のペプトイド混合物のそれぞれを、この方法によって３つの独立した試験において三連で解析した。これらの総てのアッセイにおいて、ペプトイドの不在下でのＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用およびｐ５３タンパク質とＳＶ４０ラージＴタンパク質との相互作用を陽性相互作用対照として使用した。ラミニンタンパク質およびｐ５３タンパク質を陰性対照として使用した。ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用に対するβ−ガラクトシダーゼ活性を、その対応する陽性対照（ｐ５３−ラージＴ）のβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。そのように標準化したβ−ガラクトシダーゼ活性(The activities β-galactosidase)を図２に示している。このグラフは、混合物番号１２、１６、３７、４２および４６の場合にＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用の最大阻害が繰り返し起こったことを示している。これらの混合物の、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用に対する阻害能力を、これらの５種の混合物だけを用いて、新規比色定量アッセイによって三連で確認し、混合物番号１２、４２および４６に最大阻害活性があることを確認した。
【００９１】
ケミカルライブラリーのモジュール性および組み合わせ性［３５、３６］により、この阻害活性に関与するペプトイドの好ましい多様性［すなわち構造（ＩＩ）のオリゴマーの位置Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の第一級アミン］を推測することが可能である。この場合、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用を阻害するペプトイドは、Ｎ３７−３７−９Ｃ、Ｎ３７−３７−１３Ｃ、Ｎ１５−３７−９ＣおよびＮ１５−３７−１３Ｃと呼ばれる１以上のペプトイドに一致しなければならず、それらの化学構造を以下に示す：
【化１５】
2009544600.tif 000016
【００９２】
位置Ｒ１では選択されるアミンは４’−フルオロフェニルエチル（ペプトイド  Ｎ３７−３７−９Ｃ）または２’−４’−ジクロロフェニルエチル（ペプトイド  Ｎ１５−３７−１３Ｃ）であり；位置Ｒ２ではアミンは、総ての場合において４’−フルオロフェニルエチルであり、位置Ｒ３ではアミン４’−メトキシフェニルエチル（ペプトイド  Ｎ３７−３７−９ＣおよびＮ１５−３７−１３Ｃ）および２−（２’−ピリジル）エチル（ペプトイド  Ｎ３７−３７−９ＣおよびＮ１５−３７−９Ｃ）が選択される。そのため、４つの選択されたペプトイドのＩＵＰＡＣ命名は、
Ｎ３７−３７−９Ｃ：［Ｎ−（２−（４’−フルオロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（４’−フルオロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（２’−ピリジン）エチル）グリシンアミド；
Ｎ３７−３７−１３Ｃ：［Ｎ−（２−（４’−フルオロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（４’フルオロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（４’−メトキシフェニルエチル）グリシンアミド；
Ｎ１５−３７−９Ｃ：［Ｎ−（２−（２’，４’−ジクロロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（４’−フルオロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（２’−ピリジン）エチル）グリシンアミド；
Ｎ１５−３７−１３Ｃ：［Ｎ−（２−（２’，４’−ジクロロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（４’−フルオロフェニル）エチル）グリシル］−［Ｎ−（２−（４’−メトキシフェニルエチル）グリシンアミド
である。
【００９３】
実施例２．実施例１において選抜したペプトイドから誘導される環式化合物の立体配座変形のＵＢＣ１３における分子ドッキングのコンピューターによる最適化。
酵母２−ハイブリッドアッセイにおいてＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用を妨害するペプトイドは、ＵＥＶ１の第一の脂肪族ヘリックスと相互作用するＵＢＣ１３の表面で競合的に結合することによって貢献するため、この後者のタンパク質はＵＢＣ１３とのヘテロ二量体相互作用から外れると推測した。ＵＥＶ１と相互作用するＵＢＣ１３の表面は、ＵＥＶ１のフェニルアラニン８がドッキングする疎水性ポケットの中心が、ＵＢＣ１３の残基Ｅ５５、Ｌ５６、Ｙ５７およびＲ７０の側鎖との疎水性相互作用を受ける三尖頭星形疎水性溝である［２６、２７］。この仮説を研究するため、そしてこの活性を有する薬効のある化合物を作製する前の一段階として、活性ペプトイド、続いて、その誘導体環式化合物のＵＢＣ１３における興味深い表面での仮想分子ドッキングの研究を行った。これらの後者の化合物は、同定したＮ−アルキルグリシンから最も安定な立体配座を見つけるための化学的最適化に相当する。この情報に基づいて、実施例１において選抜したＮ−アルキルグリシンの立体配座制限類似体８構造のファミリーを設計した。前記８環状構造に一致する構造を示すために、選抜した各ペプトイドを仮想構成し、総ての形態をＵＢＣ１３タンパク質のモデルに関する分子ドッキング研究に供した。
【００９４】
これらの解析を、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１ヘテロ二量体複合体（Brookhavenタンパク質データバンク受託番号１ＪＡＴ）の原子構造において行った。最初に、目視検査および基本的なアクセシビリティの計算により、複合体の界面の記載した残基間に生じる相互作用は、この二元複合体の形成を効果的に防ぐことができる低分子量化合物の開発のガイドラインとすべきことが示唆された。
【００９５】
ＵＢＣ１３タンパク質（受容体）の調製。ＵＢＣ１３タンパク質の初期構造はＰＤＢデータベース登録１ＪＡＴに一致する［２６］。計算を行ったＵＢＣ１３タンパク質に相当するＡ鎖を、前記複合体中に存在するヘテロ二量体構造から分離した。ＡＭＢＥＲソフトウエアパッケージプロトネートユーティリティー(protonate utility)を用いて水素原子の位置を得た［３８］。次いで、ｐａｒｍ９９バージョンＡＭＢＥＲ力場に従い、原子半径および電荷をＵＢＣ１３タンパク質の総ての原子に割り当てた。さらに、ＵＢＣ１３タンパク質の活性中心を定義した。これを受けて、最初の目視検査後、二量体を形成している２タンパク質間の分離界面に位置するＵＢＣ１３タンパク質の残基Ｅ５５、Ｌ５６、Ｙ５７およびＲ７０を同定した。これらに残基は、主としてＵＥＶ１タンパク質の残基Ｆ８が挿入されるポケットを形成する。
【００９６】
実施例１において選抜したトリペプトイドの誘導体環式化合物（リガンド）の調製。これらの化合物の初期三次元構造（実施例１の各トリペプトイドの環状構造を有する８つの異なる構造ファミリー）をＣＯＲＩＮＡプログラム［３９］および内部プログラム（ＡＬＦＡ）によってそれらの２Ｄ構造から得た。この解析に基づいて両方の化合物の配座可動性に代表的な立体配座を選択した。次いで、電荷および半径を各原子に割り当てた。半径についてはｐａｒｍ９９バージョンＡＭＢＥＲ力場を用い、一方、電荷は、ＭＯＰＡＣソフトウエアパッケージ［４２］において実行される半経験的ハミルトニアンＭＮＤＯ法［４１］を用いて算出される静電電位（ＥＳＰ）［４０］を調整することにより算出した。
【００９７】
相互作用エネルギーの事前計算。前記リガンドを収容することができる空間領域、またはボックスを、前記タンパク質において予め選択された残基に基づいて定義した。前記リガンドに存在する原子に対応する、いくつかの化学的プローブの相互作用エネルギーを、所定のボックス内に作成した規則的な０．５Å格子で測定した。用いるエネルギー関数は、ＡＭＢＥＲプログラムにおいて用いられる分子力学関数の適用であり、［４３］において詳細に記載されている。
【００９８】
前記受容体の結合部位における前記リガンドのドッキング。並進空間０．５Åおよび回転間隔３０度を用いて、活性中心を形成している各格子点の各リガンドの考えられるあらゆる配向を「徹底的に」作成することによって活性中心内のリガンドの最確位置を得；それらの配向を、予め事前計算した格子により測定したそれらの最低相互作用エネルギーにより配列し、解析したリガンドにつき２０配向のリストを選択した。これらの計算は内部プログラム、ＣＤＯＣＫを用いて実行した［４３］。
【００９９】
前記リガンドの最終選抜。前記分子をより正確に識別するために、このリガンドリストの相互作用エネルギーに予め計算した補正を行った。これを受けて、溶媒和の寄与を組み込んだ。従って、リガンド−活性中心結合エネルギーは下式により決定される：
ΔＧｂｉｎｄｉｎｇ＝ＥｖｄＷ＋ΔＧｃｏｕｌ＋ΔＧＬｄｅｓｏｌｖ＋ΔＧＲｄｅｓｏｌｖ＋ΔＧｎｏｎ−ｐｏｌａｒ＋ΔＧＣＯＮＦ
【０１００】
ファンデルワールス相互作用（右辺の第一の項）は、前記ＣＤＯＣＫプログラムからのものである。静電成分（上式の右辺の成分２、３および４）については差分法によるポアソン方程式の数値解法（ＤｅｌＰｈｉプログラムにおいて実行されるものなど）によって、非静電成分（右辺の成分５）については比例定数０．００５４５を用いて接触可能表面に比例する項によって溶媒の効果を得た。間隔０．５Åを有し、該格子の寸法が任意の原子とボックスのエッジとの間隔が少なくとも１１Åあるようなものである立方体格子を、総ての静電気計算に用いた。前記分子の溶質内部を誘電率４で特徴づけ、一方、溶質外部には誘電率８０を用いた。用いた残りのラメーターはプログラムデフォルトパラメーターであった。
【０１０１】
見つけた最良の分子および寄与に分配されたそれらの相互作用エネルギーを表１〜表６に示す。最も高い理論親和性を有する化合物Ｎ３７−３７−９Ｃ、ファミリーＣ（化合物Ｉａ）およびＮ３７−３７−９Ｃ、ファミリーＤ（化合物Ｉｂ）について得られた結合モードの例を図３および図４に示す。
【０１０２】
【表１】
2009544600.tif 000017
【０１０３】
【表２】
2009544600.tif 000018
【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
【表４】
2009544600.tif 000020
【０１０６】
【表５】
2009544600.tif 000021
【０１０７】
【表６】
2009544600.tif 000022
【０１０８】
実施例３  ＵＥＶ１と相互作用するＵＢＣ１３の表面で良好な理論的ドッキングを示す環状化合物、化合物ＩａおよびＩｂの合成
３．１．−化合物Ｉａ（バルビン）：Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’−ピリジル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド
【化１６】
2009544600.tif 000023
【０１０９】
化合物Ｉａの合成は本特許出願に示されている。Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理した。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄した。この樹脂に３ｍＬのジメチルホルムアミド中、Ｎ−［２−２’−（ピリジン−２−イル）エチルアミン（１８０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。次に、この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で得られたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理した。この反応混合物を室温で３０分間、２回攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄した。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌した。この反応を同じ温度で１６時間繰り返した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理した。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄した。この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌した。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロ���ルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で１５分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３５ｍｇ、０．１当量）およびフェニルシラン（３７０μＬ、１０当量）で処理した。このプロセスを３回繰り返した。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（２３５ｍｇ、１．５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６１ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５４μＬ、３当量）で処理する手段によって環化を行った。この反応混合物を室温で３時間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄した。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理して、化合物Ｉａを含有する反応混合物を遊離させた。これを濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去した。残渣を、アセトニトリル−水勾配（２０％アセトニトリル→８０％アセトニトリル、３０分）を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製し、５２ｍｇの目的生成物を得た（収率３０％、純度９８％以上）。
ＨＲＭＳ−ＦＡＢ：Ｃ３１Ｈ３３Ｆ２Ｎ５Ｏ４  理論値［Ｍ＋Ｈ＋］５７８．２５７８８６；測定値５７８．２５７８４４
【０１１０】
３．２．−化合物Ｉｂ：［１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−［２’’ピリジル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
【化１７】
2009544600.tif 000024
【０１１１】
化合物Ｉｂの合成はスキームＩＩに示されている。固相における固相反応は全て２反復で行った。Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理した。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄した。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で製造されたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理した。この反応混合物を室温で３０分間攪拌した。これを濾過し、この樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄した。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌した。この反応物を同じ温度で１６時間攪拌した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄した。最後に、この樹脂を、室温で３０分間、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理した。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去した。次に環化を、還流条件下で３０分間、先の残渣を４ｍＬのジオキサンで処理する手段によって行った（ＨＰＬＣにより制御）。次に、４Ｎ水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール（１：２、１．５ｍＬ）の溶液を加え、この混合物を還流下で３０分間攪拌した（ＨＰＬＣにより制御）。この反応混合物を１Ｎ塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣を２×１０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮した。真空濃縮することによって���媒を除去すると、ジケトピペラジン中間体が無色固体の形態で得られた（９０ｍｇ、７２％）。この材料をさらに精製せずに次の工程で用いた。
【０１１２】
Ｎ−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成した。要するに、この断片は、樹脂（２９０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸（１５３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１７５μＬ、５当量）でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン（１５５μＬ、５当量）の存在下でＮ−［２−２’−（ピリジン−２−イル）エチルアミン（１３５μＬ、５当量）とカップリングさせることによって得た。次に、このジケトピペラジン中間体（９０．０ｍｇ、１当量）を、ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４５ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（５５μＬ、１．５当量）の存在下で樹脂とカップリングさせた。この反応混合物を室温で１時間攪拌した。乾燥樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄した。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水の６０：４０：２混合物で処理し、化合物Ｉｂを含有する反応混合物を得た。これを濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去した。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配（３０％アセトニトリル→４５％アセトニトリル、３０分）を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製し、５７ｍｇの目的生成物を得た（収率３３％、純度９８％以上）。
ＨＲＭＳ−ＦＡＢ：Ｃ３１Ｈ３３Ｆ２Ｎ５Ｏ４  理論値［Ｍ＋Ｈ＋］５７８．２５０１；測定値５７８．２５７３
【０１１３】
実施例３．３．化合物Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（２’’−ピリジル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド
【化１８】
2009544600.tif 000025
【０１１４】
Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に３ｍＬのジメチルホルムアミド中、Ｎ−［２−２’−（ピリジン−２−イル）エチルアミン（１８０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で得られたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間、２回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応を同じ温度で１６時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２４０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で１５分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３５ｍｇ、０．１当量）およびフェニルシラン（３７０μＬ、１０当量）で処理する。このプロセスを３回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（２３５ｍｇ、１．５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６１ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５４μＬ、３当量）で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で３時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。この混合物を濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製する。
【０１１５】
実施例３．４．化合物Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド
【化１９】
2009544600.tif 000026
【０１１６】
Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−メトキシフェニル）エチルアミン（２３０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で得られたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間、２回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、Ｎ−２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応を同じ温度で１６時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（２’，４’−ジクロロフェニル）エチルアミン（２４０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（��×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で１５分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３５ｍｇ、０．１当量）およびフェニルシラン（３７０μＬ、１０当量）で処理する。このプロセスを３回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（２３５ｍｇ、１．５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６１ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５４μＬ、３当量）で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で３時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。この混合物を濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製する。
【０１１７】
実施例３．５．化合物Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）−１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド
【化２０】
2009544600.tif 000027
【０１１８】
Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−メトキシフェニル）エチルアミン（２３５μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で得られたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間、２回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応を同じ温度で１６時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で１５分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３５ｍｇ、０．１当量）およびフェニルシラン（３７０μＬ、１０当量）で処理する。このプロセスを３回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（２３５ｍｇ、１．５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６１ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５４μＬ、３当量）で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で３時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。この混合物を濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製する。
【０１１９】
実施例３．６．化合物１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’  −（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’ピリジル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
【化２１】
2009544600.tif 000028
【０１２０】
固相反応は全て、２反復で行う。Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（２’，４’−ジクロロフェニル）エチルアミン（２４０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で製造）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間攪拌する。これを濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応物を同じ温度で１６時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で３０分間、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で３０分間、先の残渣を４ｍＬのジオキサンで処理する手段によって行う（ＨＰＬＣにより制御）。次に、４Ｎ水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール（１：２、１．５ｍＬ）の溶液を加え、この混合物を還流下で３０分間攪拌する（ＨＰＬＣにより制御）。この反応混合物を１Ｎ塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を２×１０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去し、ジケトピペラジン中間体が得られる。この材料をさらに精製せずに次の工程���用いる。
【０１２１】
Ｎ−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、この断片は、樹脂をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸（５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン（５当量）の存在下でＮ−［２−２’−（ピリジン−２−イル）エチルアミン（５当量）とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体（１当量）を、ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１．５当量）の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で１時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水の６０：４０：２混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。この化合物を濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製する。
【０１２２】
実施例３．７．化合物１−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−４−［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
【化２２】
2009544600.tif 000029
【０１２３】
固相反応は全て２反復で行う。Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（２’，４’−ジクロロフェニル）エチルアミン（２４０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で製造されたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間攪拌する。この混合物を濾過し、この樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応物を同じ温度で１６時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で３０分間、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で３０分間、先の残渣を４ｍＬのジオキサンで処理する手段によって行う（ＨＰＬＣにより制御）。次に、４Ｎ水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール（１：２、１．５ｍＬ）の溶液を加え、この混合物を還流下で３０分間攪拌する（ＨＰＬＣにより制御）。この反応混合物を１Ｎ塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を２×１０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去すると、ジケトピペラジン中間体が得られる���この材料をさらに精製せずに次の工程で用いる。
【０１２４】
Ｎ−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、この断片は、樹脂をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸（５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン（５当量）の存在下で２−（４’−メトキシフェニル）エチルアミン（５当量）とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体（１当量）を、ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１．５当量）の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で１時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水の６０：４０：２混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。この化合物を濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製する。
【０１２５】
実施例３．８．化合物１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（４’’−メトキシフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
【化２３】
2009544600.tif 000030
【０１２６】
固相反応は全て２反復で行う。Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で製造されたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間攪拌する。この混合物を濾過し、この樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応物を同じ温度で１６時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で３０分間、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で３０分間、先の残渣を４ｍＬのジオキサンで処理する手段によって行う（ＨＰＬＣにより制御）。次に、４Ｎ水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール（１：２、１．５ｍＬ）の溶液を加え、この混合物を還流下で３０分間攪拌する（ＨＰＬＣにより制御）。この反応混合物を１Ｎ塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を２×１０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去すると、ジケトピペラジン中間体が得られる。この���料をさらに精製せずに次の工程で用いる。
【０１２７】
Ｎ−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、この断片は、樹脂（２９０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸（１５３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１７５μＬ、５当量）でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン（１５５μＬ、５当量）の存在下で２−（４’−メトキシフェニル）エチルアミン（２３５μＬ、５当量）とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体（９０．０ｍｇ、１当量）を、ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４５ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（５５μＬ、１．５当量）の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で１時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水の６０：４０：２混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。この化合物を濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製する。
【０１２８】
実施例３．９．化合物Ｎ−アミノカルバモイルメチル−Ｎ−［２’−（２’’，４’’−ジクロロフェニル）エチル］−１，４−ビス［２’−４’’−フルオロフェニル）エチル］−３，７−ジオキソ−［１，４］ジアゼパン−５−カルボキサミド
【化２４】
2009544600.tif 000031
【０１２９】
Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（２’，４’−ジクロロフェニル）エチルアミン（２４０μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で得られたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間、２回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応を同じ温度で１６時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン��３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で１５分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３５ｍｇ、０．１当量）およびフェニルシラン（３７０μＬ、１０当量）で処理する。このプロセスを３回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（２３５ｍｇ、１．５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６１ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５４μＬ、３当量）で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で３時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。これを濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配（２０％アセトニトリル→５０％アセトニトリル、３０分）を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製し、７７．３ｍｇの目的生成物を得る（収率３８％、純度９８％以上）。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３２Ｈ３２Ｃｌ２Ｆ２Ｎ４Ｏ４  理論値［Ｍ＋Ｈ＋］６４５．２；測定値：［Ｍ＋Ｈ＋］６４５．２
【０１３０】
実施例３．１０．化合物［１，４−ビス［２’−（４’’−フルオロフェニル）エチル］−２−［Ｎ−アミノカルボニルメチル−Ｎ−（２’−（２’’、４’’−ジクロロフェニル）エチル）カルボニルメチル］ピペラジン−３，６−ジオン
【化２５】
2009544600.tif 000032
【０１３１】
固相反応は全て２反復で行う。Ｒｉｎｋアミド樹脂（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジン３ｍＬで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中、ブロモ酢酸（２０８ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて６０℃で２分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら９０℃で２分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、（Ｚ）−３−（アリルオキシカルボニル）アクリル酸（マイクロ波で活性化させながら６０℃で５０分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから８５％収率で製造されたもの）（２３４ｍｇ、５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２０３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２３５μＬ、５当量）の溶液で処理する。この反応混合物を室温で３０分間攪拌する。この混合物を濾過し、この樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。次に、この樹脂に、３ｍＬのジメチルホルムアミド中、２−（４’−フルオロフェニル）エチルアミン（２００μＬ、５当量）およびトリエチルアミン（２１０μＬ、５当量）の溶液を加え、この懸濁液を室温で３時間攪拌する。この反応物を同じ温度で１６時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジクロロメタン（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で３０分間、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水（６０：４０：２）の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で３０分間、先の残渣を４ｍＬのジオキサンで処理する手段によって行う（ＨＰＬＣにより制御）。次に、４Ｎ水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール（１：２、１．５ｍＬ）の溶液を加え、この混合物を還流下で３０分間攪拌する（ＨＰＬＣにより制御）。この反応混合物を１Ｎ塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を２×１０ｍＬの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去すると、中間体ジケトピペラジン（９０ｍｇ、７２���）が無色固体の形態で得られる。この材料をさらに精製せずに次の工程で用いる。
【０１３２】
Ｎ−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、これは、樹脂（２９０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド中２０％のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸（１５３ｍｇ、５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１７５μＬ、５当量）でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン（１５５μＬ、５当量）の存在下で２−（２’，４’−ジクロロフェニル）エチルアミン（１７０μＬ、５当量）とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体（９０．０ｍｇ、１当量）を、ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド（２：１、３ｍＬ）中、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４５ｍｇ、１．５当量）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（５５μＬ、１．５当量）の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で１時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン（３×３ｍＬ）、イソプロピルアルコール（３×３ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（３×３ｍＬ）で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／水の６０：４０：２混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。これを濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配（３０％アセトニトリル→４５％アセトニトリル、３０分）を適用する半分取スケールでのＲＰ−ＨＰＬＣの手段によって精製し、７１．７ｍｇの目的生成物を得る（収率３５％、純度９９％以上）。ＥＳＩＭＳ：Ｃ３２Ｈ３２Ｃｌ２Ｆ２Ｎ４Ｏ４  理論値［Ｍ＋Ｈ＋］６４５．２；側定値：［Ｍ＋Ｈ＋］６４５．１
【０１３３】
実施例４．ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用に対する化合物ＩａおよびＩｂの効果
実施例２に記載したコンピュータ−解析により、化合物ＩａおよびＩｂは、ＵＥＶタンパク質（Ｍｍｓ２ｐ、ＵＥＶ１およびＵＥＶ２）の第一の脂肪族ヘリックスとのその特異的相互作用に通常使用されるＵＢＣ１３の表面の疎水性溝において良好な親和性でドッキングするという仮説が示唆される。これは、前記化合物がＵＢＣ１３とＵＥＶ１（またはＭｍｓ２ｐおよびＵＥＶ２）との相互作用を競合的に妨害することができるということを示唆する。それを試験によって証明するために、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用を阻害する化合物ＩａおよびＩｂの能力を２タイプのアッセイを用いて解析した：
（１）実施例１に記載した方法を適用しての、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用についての酵母２−ハイブリッドアッセイ；および
（２）大腸菌(Escherichia coli)において生産した組換えタンパク質を用いての、無細胞系におけるＵＢＣ１３タンパク質とＵＥＶ１タンパク質との相互作用。
【０１３４】
酵母２−ハイブリッドアッセイにおけるＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用に対する化合物ＩａおよびＩｂの効果を選択培地で増殖したサッカロミセス・セレビシエ株ＡＨ１０９の細胞を、１００μＭのいずれかの化合物とともにインキュベートすることにより行った。Ｓｖ４０ラージＴタンパク質とｐ５３タンパク質との相互作用を陽性相互作用対照として用いた。相互作用の強さは、基質としてＯ−ニトロフェニル−ｐ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を検出することによって比色定量により測定し、各測定を三連で行った。これらの条件において、図５（Ａ）では、化合物Ｉａは、１００μＭの濃度において、ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用をほぼ６０％阻害し、一方、化合物Ｉｂによるこの相互作用の阻害はほぼ４０％であることを示している。これら２つの化合物はいずれも、対照として用いた、ｐ５３とラージＴとの相互作用を阻害せず、これは両方の化合物がＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用を特異的に阻害することを示す。これらの結果は、化合物Ｉａが化合物Ｉｂより高い効率でこの相互作用を阻害することも示唆している。
【０１３５】
無細胞アッセイにおいてこれらの化合物の活性を決定するために、タンパク質−タンパク質相互作用試験を、大腸菌において生産した組換えタンパク質を用いて行った。ＵＢＣ１３およびＵＥＶ１を発現させるために、大腸菌株ＢＬ２１の細菌細胞をプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ１−ＵＢＣ１３またはＰＧＥＸ−４Ｔ３−ＵＥＶ１で形質転換し、形質転換されたコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を加えたプレートで増殖させることによって選抜した。個別コロニーを、抗生物質を加えない３ＬのＬＢ培地に移し、培養物が指数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ〜０．６）に達するまで攪拌しながら３７℃で増殖させ、その時点においてイソプロピルα−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Sigma社製Ｉ−６７５８）を１ｍＭの濃度で培養物に５時間加えることによって組換えタンパク質の発現を誘導した。これらの培養物を試験管に移し、遠心分離し、細胞ペレットをその２倍容量のｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、細胞破壊装置(Constant Systems)で破壊した。これらの細胞溶解物を４５μＭ孔のセルロースアセテートフィルター（Millipore社製ＳＬＨＡ０３３ＳＳ）で濾過し、ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム（Amersham Biosciences社製１７−５１３１−０１）に適用した。ＵＥＶ１の場合、カラムに特異的に結合したタンパク質を同じカラムで５０単位のトロンビン（Amersham Biosciences社製２７−０８４６−０１）を用いて酵素消化に２５℃で一晩供した。ＧＳＴユニットが第一のカラムに捕捉され、トロンビンが第二のカラムに捕捉されるように、ＨｉＴｒａｐＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ  ＦＦカラム（Amersham Biosciences社製２７−０８４６−０１）を前のカラムと連結した。次いで、ＧＳＴ部分のないＵＥＶＴタンパク質を溶出し、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって次の精製工程を行った。ＧＳＴ−ＵＢＣ１３組換えタンパク質を上述のとおり発現させ、ＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムでのアフィニティークロマトグラフィー、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５での濾過クロマトグラフィーによって精製した。精製タンパク質に相当する画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０カラム（Millipore社製４２０５）での遠心分離によって濃縮し、それらを使用するまで４℃で保存した。
【０１３６】
ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用に対する化合物ＩａおよびＩｂの効果を判定するために、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．６中４．０９μｍｇ／ｍＬの濃度のＧＳＴ−ＵＢＣ１３キメラ組換えタンパク質２μＬを、終濃度１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭまたは１００μＭの化合物バルビン、Ｉｂまたは環式対照化合物ＶＴＩＩ−Ｎ６−２−１Ｃとともに室温で３０分間プレインキュベートした。これらの混合物を、グルタチオンセファロース４Ｂマトリックス(Amersham Biosciences)とともに６０分間インキュベートすることによって固相に固定し、続いて、１０マトリックス容量の５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．６で洗浄を行った。次いで、これらのカラムを、同じバッファー中０．１５μｇ／ｍＬの濃度の１０μＬのＵＥＶ１タンパク質とともに４５分間インキュベートした。カラムと結合していないＵＥＶ１タンパク質（溶出画分、またはＥ）を１４，０００ｇでの遠心分離によって集めた後、これらのカラムを１０容量の前のバッファーで洗浄した。さらに、ＧＳＴ−ＵＢＣ１３およびＧＳＴ−ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１複合体を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中１０ｍＭの還元グルタチオンを含む溶出バッファーとともにインキュベートすることによって溶出した（残留画分、またはＢ）。画分Ｅおよび画分ＢをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０カラムでの遠心分離によって濃縮し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、５００ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、ｐＨ６．８）中で沸騰させることによって変性させ、電気泳動により１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで分離した。電気泳動後、これらのタンパク質を電気泳動的にＰＶＤＦ膜に転写し、これをブロッキングバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ  ｐＨ７．４中５％脱脂乳）とともに１時間プレインキュベートした後、ウサギ抗ＵＥＶ１抗体または抗ＵＢＣ１３抗体とともに１時間インキュベートした。これらの抗体は、ウサギを特異的ＵＥＶ１配列またはＵＢＣ１３配列それぞれに対応する合成ペプチドで免疫することによってこの研究室において予め作製し、免疫ペプチドが固定されるカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってこれらの抗体を免疫血清から精製した［３７］。これらの抗体とのインキュベーション後、前記膜を２０ｍＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ブロッキングバッファーで１：１０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体(Dako Cytomation)とともに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄後、前記上の反応物をＥＣＬシステム(Amersham)を用いた化学発光およびオートラジオグラフィーフィルムへの露光によって観察した。
【０１３７】
このアッセイの結果を図５（Ｂ）に示し、この図より、溶出され、ＧＳＴ−ＵＢＣ１３と結合しない画分中にＵＥＶ１の最大６０％（化合物Ｉａの場合）または４０％（化合物Ｉｂの場合）が見られることから、化合物ＩａおよびＩｂは、ＵＥＶ１とＧＳＴ−ＵＢＣ１３との結合を効果的に阻害するが、環式対照化合物ＶＩＩＩ−Ｎ６−２−１Ｃは阻害しないということが分かる。図５（Ｂ）は、１００μＭの環状化合物を用いて行ったアッセイの結果だけを示しているが、ずっと低い濃度、最大１０ｎＭの化合物ＩａおよびＩｂでのＵＥＶ１とＵＢＣ１３との相互作用の効果的な阻害も観察された。ＵＥＶ１タンパク質およびＵＢＣ１３タンパク質が高親和性（ＫＤ?５ｘ１０−１０Ｍ、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置により測定された定数）で互いに相互作用することを考慮すると、これらの結果は、化合物ＩａおよびＩｂによるＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用の阻害が、ＵＥＶ１の第一の脂肪族ヘリックスとのその相互作用に通常使用されるＵＢＣ１３の表面とのこれらの化合物の競合的相互作用によるものであることを示唆している。
【０１３８】
実施例５．ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１によって媒介されるポリユビキチン化に対する化合物Ｉａの効果
実施例４に記載した、化合物ＩａおよびＩｂによるＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用の阻害によれば、これらの化合物がＵＢＣ１３の酵素活性を阻害することができることが示される。背景に記載のとおり、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１によって触媒されるＫ６３タイプのポリユビキチン化には、ヘテロ二量体の両方のサブユニット間の相互作用が必要である。この酵素活性に影響を及ぼす化合物Ｉａ（ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用の阻害剤として２化合物のうちの最も活性なもの）の能力をin vitro遊離ポリユビキチン鎖形成アッセイによって解析した。このアッセイでは、０．１μＭのＥ1酵素(Boston Biochem)、０．２μＭのＵＢＣ１３、０．２μＭのＵＥＶ１（実施例４に記載のとおり作製したもの）、１１７μＭの野生型ユビキチン（Biomol社製ＵＷ８７９５）または６３位（ユビキチン  Ｋ６３）または４８位（ユビキチン  Ｋ４８；Boston Biochem）のリジン以外の総てのリジンが突然変異したものを含む反応物でのポリユビキチン鎖の形成を５０ｍＭのｐＨ７．６のＴｒｉｓ−ＨＣ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５ｍＭのジチオトレイトールを含む反応バッファー中で行う。化合物Ｉａ（バルビン）での処置のために、ＵＢＣ１３を１００μＭのこの化合物とともに室温で１０分間プレインキュベートした後、反応物に加えた。２ｍＭのＡＴＰを加えることによって反応を開始し、３７℃で異なる時間においてインキュベートすることによって行い、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ＳＤＳ、５００ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％ブロモフェノールブルーおよび５０％グリセロール  ｐＨ６．８）を加え、３分間沸騰させることによって停止させた。これらのサンプルを電気泳動によりポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで分離し、電気泳動的にＰＶＤＦ膜に転写した。実施例４に記載した免疫検出法に従って、これらのユビキチン分子をウサギ抗ユビキチン抗体（Biomol社製ＵＧ  ９５１０）を用いて検出し、化学発光により反応性を明示した。
【０１３９】
図６（Ａ）は、化合物Ｉａの不在下で、上記反応によりポリユビキチン鎖の形成が起こり、ユビキチンユニットが漸進的に付加されることにより経時的にサイズが増加することを示している。この対照反応では、反応の約３０分の時点においてトリユビキチン（Ｕｂ３）、６０分の時点においてテトラユビキチン（Ｕｂ４）、９０分の時点においてペンタユビキチン（Ｕｂ５）、その後の時間においてより大きなサイズ（または複雑性）の形態の出現を示す。図６（Ｂ）にて示されるように、異なる形態のポリユビキチンの生成についての定量分析では、ＵＢＣ１３と１００μＭの化合物バルビン（Ｉａ）とのプレインキュベーションにより、ポリユビキチン化形態の生成速度の低下が起こることが示される。対照反応の曲線の傾きと化合物Ｉａでの処置のものとの有意差から、この化合物によるＵＢＣ１３−ＵＥＶ１の酵素活性の阻害は競合的タイプのものであることも示される。このin vitroポリユビキチン化は、野生型ユビキチンを用いる場合と、前記反応においてユビキチンＫ６３を用いるときに起こり（図６（Ｃ））、その代わりにユビキチン４８を用いるときには起こらないことから、ユビキチン分子の６３位のリジンを特異的に用いる。さらに、ＵＢＣ１３と化合物Ｉａとのプレインキュベーションでは、基質が野生型ユビキチンである（図６（Ｃ））ときと同様の効率で基質としてユビキチンＫ６３を用いてポリユビキチン化を阻害する。よって、化合物Ｉａは、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１によりin vitroで触媒されるＫ６３タイプのポリユビキチン化を効果的に阻害するという結論に達する。
【０１４０】
実施例６．化合物ＩａおよびＩｂの生物活性
サッカロミセス・セレビシエ酵母における活性
Ｓ．セレビシエ酵母において、ＰＣＮＡタンパク質の、Ｕｂｃ１３ｐ−Ｍｍｓ２ｐによって媒介されるＫ６３タイプのポリユビキチン化は、「エラーフリー修復」と呼ばれるＲＡＤ６副経路における複製後ＤＮＡ修復に不可欠である［７−１７］。この経路では、ＵＢＣ１３およびＭＭＳ２の両方がＲＡＤ６に対して上位であるが、ＵＢＣ１３の欠失はｒａｄ６表現型を部分的に救済するが、ＭＭＳ２の欠失は救済しないという特異性を有する［１４］。両方の遺伝子は、ＲＡＤ６によって調節される第二の修復副経路、いわゆる「エラーを起こしやすい修復」、またはＲＥＶ３、ＲＥＶ７およびＲＥＶ１が関与する突然変異誘発副経路の変異株と相乗作用する。この相乗作用は、ＵＢＣ１３またはＭＭＳ２の欠失により遺伝毒性障害（紫外線放射またはメタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）への曝露など）に対するｒｅｖ３変異株のより高い感作が起こるという事実によって示される［１３−１５］。
【０１４１】
化合物ＩａおよびＩｂがＵｂｃ１３ｐ−Ｍｍｓ２ｐの機能を阻害するかどうかを判定するために、ｕｂｃ１３のヌル突然変異によって生じるＤＮＡ修復表現型をＳ．セレビシエにおいて再現するそれらの能力を評価した。従って、紫外線放射またはＭＭＳへの曝露後の生存能力アッセイにＲＡＤ６またはＲＥＶ３の変異株およびその親株（対照）を用いた。用いた株の遺伝子型は以下である：
１）親株（対照）ＢＹ４７４１：ｈｉｓ３ＡΔ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０におけるＭＡＴ
２）株Δｒａｄ６：ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  ｒａｄ６：：ｋａｎＭＸ４におけるＭＡＴ
３）株Δｒｅｖ３：ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  ｒｅｖ３：：ｋａｎＭＸ４におけるＭＡＴ
【０１４２】
細胞を、ＹＰＤ培地を加えた液体培養物に、対数増殖期に達するまで３０℃で一晩接種した。紫外線放射での処置では、１００μＭの化合物ＩａまたはＩｂの存在下または不在下で増殖させた細胞のアリコートにＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ装置(Stratagene)により図７および図８に示したエネルギーにおいて照射した。突然変異誘発物質ＭＭＳでの処置では、１００μＭの化合物ＩａまたはＩｂを加えた培地中で増殖させたまたは増殖していない細胞のアリコートをインキュベートし、０．０３％ＭＭＳを加え、その後、インキュベーションを図７および図８に示した時間の間行った。各処置の後、５００個の細胞をＹＰＤ培地を入れたプレートに播種し、２日後にコロニーを計数した。
【０１４３】
予想通り、これらのアッセイにおいてΔｒａｄ６変異株は紫外線照射に対してもＭＭＳに対してもより高い感受性を示し、突然変異誘発物質の用量を増加するにつれて生存が急激に減少している（図７）。しかしながら、１００μＭの化合物Ｉａまたは化合物Ｉｂの存在は、紫外線照射によって誘導されるｒａｄ６表現型を、それほどではないが、ＭＭＳでの処置によって生じた表現型も明らかに救済している（図７）。これはΔｕｂｃ１３変異株に特徴的な表現型であるため、化合物ＩａおよびＩｂはこの表現型を再現しており、このことはそれらの化合物がＵＢＣ１３の阻害と通じて作用することを示唆している。他方、Δｒｅｖ３変異株と化合物Ｉａ、それほどではないが、化合物Ｉｂとのインキュベーションにより、Δｕｂｃ１３突然変異のもののと同様の相乗作用で、紫外線放射またはＭＭＳへの曝露の効果に対する細胞のより高い感作が起こった（図８）。よって、解析した２つの表現型は、化合物ＩａおよびＩｂが、ＲＡＤ６によって調節されるＤＮＡ修復経路に影響を及ぼすこと、そしてそれらの化合物がＵｂｃ１３ｐの阻害によって貢献することを示している。
【０１４４】
実施例７．化合物ＩａおよびＩｂの生物活性
ＴＮＦαによる転写因子ＮＦ−κＢの刺激の阻害
背景に記載のとおり、Ｋ６３タイプのポリユビキチン化によって調節され、ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１（またはＵＢＣ１３−ＵＥＶ２）によって触媒される生化学的経路の１つは、サイトカイン、ＴＮＦαおよび他のポリペプチドによって誘導されるシグナルによる転写因子ＮＦ−κＢの活性化である。
【０１４５】
ＴＮＦαによるＮＦκ−Ｂ活性の刺激に対する化合物ＩａおよびＩｂの活性を判定するために、３つのＮＦκ−Ｂ認識部位を含むプロモーターによって命令されるホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって生じるルシフェラーゼ活性を誘導するためのアッセイ（デュアル−ルシフェラーゼリポーターアッセイ合成システム、Promega、カタログ番号Ｅ１９１０を用いて判定する）を行った。この目的に向けて、ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションビヒクルとしてＦｕｇｅｎｅ(Roche)を使用して、ウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼをコードし、トランスフェクション効率対照であるプラスミドＰＲＬ−ＴＫ、およびプラスミドｐｒＬＵＣ（ＮＦκ−Ｂの転写活性の判定を可能にするプラスミド）で同時トランスフェクトした。１００，０００個の細胞を６ウェルプレート(Costar)に播種した。その翌日、０．５μｇの各プラスミドおよび３μｌのＦｕｇｅｎｅを用いて１５分間トランスフェクション複合体を作製した。この複合体をＯｐｔｉｍｅｍ培地(InVitrogen)中の細胞に加え、５時間後、その培地を完全培地（ペニシリンおよびストレプトマイシンを補給した、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミンを含むダルベッコの改変イーグル培地）に変更し、それに異なる濃度の化合物バルビン（Ｉａ）またはＩｂを加えたまたは加えなかった。その翌日、これらの細胞をＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍＬ）ともに４時間インキュベートし、その後、それらをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、製造業者(Promega)の指示に従って、２５０μＬの溶解バッファーで溶解した。この溶解物に１００μＬのルシフェラーゼ試薬（ＬＡＲＩＩ）を加えて、ホタルルシフェラーゼ活性を測定し、その後、反応を、１００μＬのウミシイタケルシフェラーゼ基質を含む停止バッファーを加えて停止させ、その時点においてこの第二の活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。トランスフェクトしたがＴＮＦαで刺激しなかった細胞に対応する値を、残りの試験値を標準化する対象として使用した。最後に、第三の標準化を行い、その総ての値は本発明の薬物対象を加えないＴＮＦαによるルシフェラーゼ活性の誘導の値（ＴＮＦα対照）に関連して反映される。
【０１４６】
図９は、ＨｅＬａ細胞と化合物Ｉａまたは化合物Ｉｂとのプレインキュベーションにより、ＴＮＦαによって誘導されるＮＦκ−Ｂの転写活性の刺激が用量依存的に阻害されることを示している。この阻害は、化合物Ｉｂを用いた場合よりも化合物Ｉａを用いた場合により顕著であり、ＨｅＬａ細胞を１００μＭ濃度のバルビン（Ｉａ）とともにプレインキュベートしたときのＴＮＦαによるＮＦ−κＢの活性化の５０％に近い阻害に達する。よって、化合物ＩａおよびＩｂはＮＦ−κＢの活性化の効果的な阻害剤であり、それによって、それらの化合物は、炎症プロセスまたは新生物プロセスを含む、この活性化が重要であるプロセスにおいて適用できるであろう。
【０１４７】
実施例８．化合物ＩａおよびＩｂの生物活性
ドキソルビシンおよびエトポシドの細胞傷害効果に対する腫瘍細胞の感作
転写因子ＮＦ−κＢの活性化は、正常細胞および腫瘍細胞が異なる形のストレスまたは損傷を受けたときのそれらの生存機構の１つである［４４−４７］。そのため、この転写因子の活性化の阻害によって生じた結果の１つは、遺伝毒性障害または別のタイプの細胞ストレスを引き起こす異なる物理的または化学的作用因子の細胞傷害効果に対してより高い感受性をもたらすことである。よって、細胞と化合物ＩａまたはＩｂとのインキュベーションでは、部分的にはＮＦ−κＢの活性化を阻害するそれらの能力によって、化学療法薬（ドキソルビシンまたはエトポシドなど）の効果に対する細胞感作が起こるかもしれない。言い換えれば、（ある特定の用量の）ドキソルビシンまたはエトポシドと化合物ＩａまたはＩｂとの組合せでは、ドキソルビシンまたはエトポシド単独よりも大きな細胞傷害効果およびより多くの用量のドキソルビシンまたはエトポシドそれぞれによって起こり得る細胞傷害効果と同様の細胞傷害効果が起こるはずである(should case)。
【０１４８】
この予測を試験によって証明するために、細胞計数試験をＣｙＱｕａｎｔ法（molecular probes、カタログ番号Ｃ−７０２６）によって行った。この細胞定量法は、核酸との結合後にその蛍光を定量的に刺激する化合物に基づく。９６ウェルプレートの各ウェルに１０，０００個の細胞を播種し、５％ＣＯ２および９０％湿度の雰囲気下でこれらのプレートの表面に３７℃で一晩それらを付着させ、その後、これらの細胞を異なる処置に供した。この試験処置が終了した時に、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、その後、ＣｙＱｕａｎｔアッセイを行う時間までプレートを−７０℃で冷凍した。定量のために、プレートを室温で解凍し、（製造業者の使用説明書に従って）各ウェルに２００μＬのＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ色素含有溶解バッファーを加えた。室温で２〜５分間インキュベートした後、４８０ｎｍおよび５２０ｎｍで放射された蛍光を定量した。蛍光分析による測定値に対応する細胞数を計算するために、既知数の細胞によって標準放射蛍光線を作成し、このデータを用いて、試験データを推定した。
【０１４９】
図１０にて示されるように、ＨｅＬａ細胞（子宮頸癌由来）またはＰＣ−３細胞（前立腺癌由来）を、１００μＭの化合物Ｉａを加えてまたは加えないで、０．０５μＭ〜５０μＭ間の濃度のエトポシドおよびドキソルビシンそれぞれで処置した。図１０のグラフから、ドキソルビシンのＩＣ５０はＰＣ−３細胞における処置の７２時間後０．５μＭに近く、エトポシドのＩＣ５０はＨｅＬａ細胞における処置の２４時間後およそ１．２５μＭであることを推測することができる。１００μＭのＩａの添加により、ドキソルビシンのＩＣ５０はＰＣ−３細胞で０．１μＭに低下し、エトポシドのＩＣ５０はＨｅＬａ細胞で０．０４μＭに低下した。よって、１００μＭの化合物Ｉａでの処置は、ドキソルビシンの細胞傷害効果に対する５倍の感作（ＰＣ−３細胞）、エトポシドの細胞傷害効果に対する３０倍の感作（ＨｅＬａ細胞）を引き起こす。
【０１５０】
実施例９．ヒト腫瘍細胞異種移殖片のネズミモデルにおける化学感作物質としての化合物Ｉａ（バルビン）の抗腫瘍活性
バルビンがin vivo抗腫瘍活性を有するかどうかを判定するために、ＰＣ−３細胞から形成された腫瘍を有するマウスにおけるその効果を解析した。試験腫瘍をＰＣ−３．Ｓｌｕｃ細胞の筋肉内接種によって行った［４８］。ＰＣ−３．Ｓｌｕｃ細胞は、哺乳類細胞ｑにおいてホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子を発現する、プラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ−ｌｕｃをトランスフェクトすることによって組み込んだＰＣ−３前立腺細胞である。ＰＣ−３．１ｕｃ細胞と、ルシフェラーゼ基質であるＤ−ルシフェリンとのインキュベーションでは発光し、この光を照度計によってまたはＣＣＤ（電荷結合素子）カメラでの検出によって絶対的に（光子数）定量することができる。後者の方法は、ルシフェリンの存在下での発光強度（光子数）がＰＣ−３．１ｕｃ細胞の数に正比例することから、さらに、接種した動物における腫瘍細胞の位置、ならびに腫瘍サイズの画像をリアルタイムで表すことができる。
【０１５１】
これらの研究では、２４匹の６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス(Charles River Laboratories)を使用した。これらの動物を常に無菌環境に維持し、動物を受け取ってから試験処置まで動物飼育設備に１週間維持した。６ｍｇ／Ｋｇのドロペリドール(Roche, Basel, Switzerland)および１２ｍｇ／Ｋｇのミダゾラム(Rovi S. A, Madrid, Spain)の等量混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって麻酔をかけた後、各動物の右足および左足の両方に１００μＬのウシ胎児血清フリー培養培地に懸濁した１ｘ１０６個のＰＣ−３．Ｓｌｕｃ細胞の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を行った。２週間、接種部位において腫瘍を発生させ、その後、放出光子の第一回目の測定を行い、Ｃ４７４２−９８−ＬＷＧ−ＭＯＤモデルＣＣＤカメラ（−８０℃に冷却）を備えたＯＲＣＡ−２ＢＴイメージングシステム装置(Hammamatsu Photonics)を用いて第一回目の画像の取り込みを解像度５１２ｘ５１２ピクセルで行った。腫瘍の発光レベルのin vivoトラッキングでは、上記のように動物に麻酔をかけ、そのすぐ後に１５０μｌのＤ−ルシフェリン(Promega)のＩ．ｐ．注射を１００ｍｇ／Ｋｇの用量で行った。４分後、光子を検出し、上記装置で５分間定量した。測定値は相対発光量（ＲＬＵ）で表される。総ての測定値において、腫瘍から遠い動物の領域（胸部）に対応するバックグラウンドシグナルを減じた。第一の画像を取得した直後に、同じ位置における同じ動物の画像を可視光で撮影した。光子の定量および解析を画像解析プログラムＷＡＳＡＢＩ(Hamamatsu Photonics)を用いて行った。定量的情報のイメージへの変換を疑似カラーでまたはグレースケールで行い、グレー／黒色の強度が定量データを忠実に表すように、総ての動物に対して同じパラメーターならびに強度および色の範囲を維持し、試験間および異なる動物間で同程度であるようにした。グラフ表示では、各腫瘍について、定量データ（ＲＬＵ）を処置第０日のＲＬＵに対して標準化した。
【０１５２】
両足に発光腫瘍を有する２４匹のマウスを４試験群に含めた：（１）１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）および５０μＬの腫瘍内（ｉ．ｔ．）ＰＢＳの静脈内（ｉ．ｖ．）注射を行った対照群。（２）ドキソルビシン(Sigma, Alcobendas, Madrid, Spain)（１００μＬのＰＢＳ中５ｍｇ／Ｋｇ）で週に１回、ｉ．ｖ．処置した群。（３）バルビン（５０μＬのＰＢＳ中１００μＭ）で週に２回、ｉ．ｔ．処置した群。（４）上記に示した投与用量および経路を用いた、ドキソルビシンで週に１回、ｉ．ｖ．とバルビンで週に２回の併用処置群。処置開始から５６日にわたって腫瘍の発光を解析した。これらの結果は、対照動物の腫瘍は、試験開始から１４日後の減少を除き、試験の間中一般に一定のペースで増殖したことを示している（図１１）。ＲＬＵ（ゆえに腫瘍サイズ）のこの減少は、各群の処置に関係なく、総ての群において観察されため、この試験の異種移殖片条件におけるこれらの細胞の固有の増殖パターンに相当する。対照マウスの腫瘍とは異なり、ドキソルビシン単独で処置したマウス（群２）の腫瘍は、試験中ほとんど増殖しなかった（図１１）。同様に、ドキソルビシンでｉ．ｖ．とバルビンでｉ．ｍ．の両方で処置したマウスも、この試験中にあまり増殖しなかった。最後に、バルビン単独でｉ．ｍ．処置した動物の腫瘍も、非常に限られた増殖を示し（ドキソルビシンで処置したものに対して有意な差はない）、いずれにせよ、対照マウスの腫瘍のものよりも有意に小さかった。
【０１５３】
よって、バルビンは、筋肉内注射により１００μＭの濃度において、ｎｕ／ｎｕマウスに移植したこの腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示す。
【０１５４】
参考文献
【表７】
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2009544600.tif 000035
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【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用の阻害剤を開発するための、本発明において従う工程および方法論のダイヤグラム。
【図２】酵母２−ハイブリッドアッセイにより判定される、ＵＢＣ１３とＵＥＶ１との相互作用を阻害する能力に関連した５２のペプトイド混合物のスクリーニングの結果。ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用について陽性細胞を５μＭの各ペプトイド混合物とともにインキュベートした。相互作用活性を、ペプトイドを加えない細胞に対して、さらに同じペプトイド混合物の存在下での陽性相互作用対照（ラージＴ−ｐ５３）のβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。黒色のバーは、相互作用に対してより高い阻害活性を有する混合物に相当する。
【図３】ドッキング結果。ＵＢＣ１３の表面における化合物バルビンすなわちＩａの分子ドッキングの構造モデル。説明図は、ＵＢＣ１３の表面のコナリー表示(a Connolly representation)であり、ＵＢＣ１３の表面においてＣＤＯＣＫによる最適ドッキング状態にある化合物バルビンの表示が隣接している。ＵＥＶタンパク質（Ｍｍｓ２ｐ、ＵＥＶ１およびＵＥＶ２）と相互作用するのに通常使用されるＵＢＣ１３の表面の疎水性ポケットにおける化合物バルビンのドッキングをよく観察するために、この表示を２つの異なる倍率で示している。
【図４】ドッキング結果。ＵＢＣ１３の表面における化合物Ｉｂの分子ドッキングの構造モデル。説明図は、ＵＥＶ１と相互作用するのに通常使用されるＵＢＣ１３の表面のコナリー表示であり、ＵＢＣ１３の表面においてＣＤＯＣＫによる最適ドッキング状態にある化合物Ｉｂのバー形態での表示が隣接している。ＵＥＶタンパク質（Ｍｍｓ２ｐ、ＵＥＶ１およびＵＥＶ２）と相互作用するのに通常使用されるＵＢＣ１３の表面の疎水性ポケットにおける化合物Ｉｂのドッキングをよく観察するために、この表示を２つの異なる倍率で示している。
【図５Ａ】化合物Ｉａ（バルビン）およびＩｂによる、ＵＢＣ１３タンパク質とＵＥＶ１タンパク質との相互作用の阻害。（Ａ）酵母２ハイブリッドアッセイ。ＵＢＣ１３−ＵＥＶ１相互作用について陽性細胞を１００μＭの化合物ＩａまたはＩｂとともにインキュベートした。相互作用活性を、環式化合物を加えない細胞に対して、さらに同じ濃度の前記２化合物の存在下での陽性相互作用対照（ラージＴ−ｐ５３）のβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。
【図５Ｂ】化合物Ｉａ（バルビン）およびＩｂによる、ＵＢＣ１３タンパク質とＵＥＶ１タンパク質との相互作用の阻害。（Ｂ）精製組換えタンパク質相互作用アッセイ。組換えＧＳＴ−ＵＢＣ−１３を１００μＭの化合物ＩａまたはＩｂとともにプレインキュベートし、グルタチオン−セファロースカラム上で複合体を結合した後のＧＳＴ−ＵＢＣ１３に相互作用するＵＥＶ１の能力を判定した。Ｅ、カラムから溶出した（ＧＳＴ−ＵＢＣ１３と結合していない）画分、Ｂ  カラム中に残留する（ＧＳＴ−ＵＢＣ１３と結合した、還元グルタチオン含有バッファーで溶出される）画分。
【図６Ａ】in vitroポリユビキチン化アッセイにおけるＵＢＣ１３−ＵＥＶ１の触媒活性の阻害。（Ａ）対照反応においてまたは１００μＭの化合物Ｉａの存在下での遊離ポリユビキチンの経時的蓄積。これらの反応において使用されるユビキチンは、野生型ユビキチン（イソペプチド結合を形成するために利用可能な７個のリジンを有する）である。モノユビキチン化（Ｕｂ）形態およびジユビキチン化（Ｕｂ２）形態は時間０において存在し、それらの存在量は動態を通して大きく変化しない。
【図６Ｂ】in vitroポリユビキチン化アッセイにおけるＵＢＣ１３−ＵＥＶ１の触媒活性の阻害。トリユビキチン化（Ｕｂ３）形態およびテトラユビキチン化（Ｕｂ４）形態は、（Ｂ）にて示されるように、三次速度式で蓄積する。前記反応は、（Ａ）において示したものと同じ条件で、１００μＭのＩａの存在下でまたは不在下（対照）で実施した。
【図６Ｃ】in vitroポリユビキチン化アッセイにおけるＵＢＣ１３−ＵＥＶ１の触媒活性の阻害。（Ｃ）では、前記反応はユビキチンＫ６３を用いて行われる（利用可能な７個のリジンのうち、６３位のものだけが利用可能であり；残りのリジンはアルギニンに突然変異したため、イソペプチド結合を形成するために利用できない）。前記反応は、（Ａ）において示したものと同じ条件で、１００μＭのＩａの存在下でまたは不在下（対照）で実施した。
【図７】Ｓ．セレビシエΔｒａｄ６突然変異株における化合物ＩａおよびＩｂによる、紫外線放射およびメタンスルホン酸メチルによる処置に対する感作。用量反応曲線。ＲＡＤ６欠失Ｓ．セレビシエ株を、１００μＭの化合物Ｉａもしくは化合物Ｉｂを使用せずに（ＹＰＤ）または使用して、異なる紫外線放射線量（上のグラフ）または異なる時間の０．０３％ＭＭＳへの曝露（下のグラフ）に供した。処置に供していない細胞と比べて生存を判定した。
【図８】Ｓ．セレビシエΔｒｅｖ３突然変異株における化合物ＩａおよびＩｂによる、紫外線放射およびメタンスルホン酸メチルによる処置に対する感作。用量反応曲線。ＲＥＶ３欠失Ｓ．セレビシエ株を、１００μＭの化合物Ｉａもしくは化合物Ｉｂを使用せずに（ＹＰＤ）または使用して、異なる紫外線放射線量（上のグラフ）または異なる時間の０．０３％ＭＭＳへの曝露（下のグラフ）に供した。処置に供していない細胞と比べて生存を判定した。
【図９】化合物ＩａおよびＩｂによる、ＮＦ−κＢのトランス活性化のＴＮＦαによる誘導の阻害。用量反応曲線。ＮＦ−κＢ転写活性を示すプラスミドでトランスフェクトし（ルシフェラーゼの活性化）、異なる濃度の化合物Ｉａまたは化合物ＩｂとともにプレインキュベートしたまたはプレインキュベートしていないＨｅＬａ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦκで２時間処置し、ＮＦ−κＢの活性化を定量した。ルシフェラーゼ活性単位を、化合物ＩａまたはＩｂの不在下でＴＮＦαにより誘導された活性に対して標準化した。
【図１０】化合物Ｉａによる、ＰＣ−３細胞におけるドキソルビシンの細胞傷害効果およびＨｅＬａ細胞におけるエトポシドの細胞傷害効果に対する感作。用量反応曲線。ＰＣ−３細胞およびＨｅＬａ細胞を、１００μＭの化合物Ｉａとともにプレインキュベートしまたはプレインキュベートせず、それぞれ、異なるドキソルビシンまたはエトポシド用量に曝露した。生存細胞の定量は、ＣｙＱｕａｎｔによって行い、処置に供していない細胞に対して標準化した。
【図１１】ドキソルビシン単独で（ｉ．ｖ．、５ｍｇ／Ｋｇ、週に１回）、バルビン単独で（１００μＭ、ｉ．ｍ．、週に２回）処置した、または両方の化合物で処置した対照マウスの腫瘍の相対的サイズ（各腫瘍の０日に対して標準化したＲＬＵ）のグラフ表示。各群６〜８個の腫瘍間の平均をそれらの対応する標準偏差バーとともに表示している。
【図１２】Hamamatsu Photonics社製の機器により記録した、明度の５２日にわたる連続トラッキングに関する、各処置群（対照、ドキソルビシン単独、バルビン単独、または併用処置）の代表的なマウス（平均に最も近いもの）の（疑似カラーからグレースケールに変換した）画像（使用した機器および特定のモデルの説明については本文を参照）。腫瘍は各動物の２本の足に存在する。各腫瘍内において、最も明瞭な領域は、最大ＲＬＵを有する領域、ゆえに最大腫瘍サイズを有する領域と相関する。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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