(57)【要約】  本発明によって、真核生物細胞に対して、有効な終止−コドン突然変異抑制活性と、低い毒性と選択性とを示すパロモマイシン由来アミノグリコシド類（式Ｉ）の新規なクラスが提供される。また、本発明によって、これらのパロモマイシン由来アミノグリコシド類およびその中間体を製造する方法、ならびにそれを含む医薬組成物、嚢胞性線維症などの遺伝子疾患の治療におけるその使用が提供される。パロモマイシンの構造的特徴の操作は、潜在的な毒性を減らし、突然変異リードスルー活性を改善するために慎重に選択される。【選択図】  なし
2009532461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
2009532461.tif 000135
（式中：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、単糖類部分、ハライド、ヒドロキシル、アミンまたはオリゴ糖類部分であり、
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；但し、化合物は、
2009532461.tif 000136
アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンからなる群から選択されない）
を有する化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
一般式Ｉ：
2009532461.tif 000137
（式中：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、単糖類部分、ハライド、ヒドロキシル、アミンまたはオリゴ糖類部分であり、
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；但し、化合物は、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンからなる群から選択されない）
を有する化合物またはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３】
包装材で包装されて、遺伝子疾患の治療で使用するために、前記包装材料中にまたは前記包装材料上に印刷されて識別される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
遺伝子疾患を治療する方法であって、一般式Ｉ：
2009532461.tif 000138
（式中：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、単糖類部分、ハライド、ヒドロキシル、アミンまたはオリゴ糖類部分であり、
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；但し、化合物は、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンからなる群から選択されない）
を有する治療上有効量の化合物またはその医薬的に許容される塩を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５】
遺伝子疾患を治療するための医薬の製造における、一般式Ｉ：
2009532461.tif 000139
（式中：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、単糖類部分、ハライド、ヒドロキシル、アミンまたはオリゴ糖類部分であり、
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；但し、化合物は、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンからなる群から選択されない）
を有する化合物またはその医薬的に許容される塩の使用。
【請求項６】
Ｘは酸素である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項７】
Ｒ５はヒドロキシルである、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項８】
Ｙは水素である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、単糖類部分である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１０】
Ｒ１は前記単糖類部分である、請求項９に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１１】
Ｒ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである、請求項１０に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１２】
Ｒ２は前記単糖類部分である、請求項９に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである、請求項１２に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１４】
Ｒ３は前記単糖類部分である、請求項９に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１５】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれヒドロキシルである、請求項１４に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１６】
前記単糖類部分は、一般式ＩＩ：
2009532461.tif 000140
を有し、式中、
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；および
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の各々は、独立して、ヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１７】
Ｒ７およびＲ８はそれぞれヒドロキシルである、請求項１６に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１８】
Ｒ６はアミンである、請求項１６に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項１９】
Ｒ６はヒドロキシルである、請求項１６に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２０】
Ｒ１はアミンである、請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２１】
Ｒ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである、請求項２０に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、オリゴ糖類部分である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２３】
Ｒ１は前記オリゴ糖類部分である、請求項２２に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２４】
Ｒ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである、請求項２３に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２５】
Ｒ２は前記オリゴ糖類部分である、請求項２２に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２６】
Ｒ１およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである、請求項２５に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２７】
Ｒ３は前記オリゴ糖類部分である、請求項２０に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２８】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれヒドロキシルである、請求項２７に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項２９】
前記オリゴ糖類部分は二糖類部分である、請求項２２〜２８のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３０】
前記二糖類部分は、一般式Ｉ＊：
2009532461.tif 000141
を有し、式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｒ＊１、Ｒ＊２およびＲ＊３の各々は、独立して、ハライド、ヒドロキシル、アミンであり、または一般式Ｉを有する化合物に結合しており、但し、Ｒ＊１、Ｒ＊２およびＲ＊３の少なくとも１つは、上記一般式Ｉを有する化合物に結合しており；
Ｘ＊は、酸素または硫黄であり；
Ｒ＊４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）部分であり；
Ｒ＊５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；および
Ｙ＊は、水素、アルキルまたはアリールである、請求項２９に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３１】
前記オリゴ糖類部分はリンカーをさらに含む、請求項２２〜２９のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３２】
Ｒ４およびＹはそれぞれ水素である、請求項１〜３１のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３３】
Ｒ５はヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択され、Ｙはアルキルである、請求項１〜３１のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３４】
Ｒ４はＡＨＢである、請求項１〜３１のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３５】
Ｒ５はヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択され、Ｙはアルキルである、請求項３４に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３６】
化合物は、原核細胞よりも真核細胞に選択的な活性を有する、請求項１〜３１のいずれかに記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３７】
化合物は抗菌活性を有さない、請求項３６に記載の化合物、組成物、方法または使用。
【請求項３８】
前記遺伝子疾患は、末端切断の突然変異を有するタンパク質を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の組成物、方法または使用。
【請求項３９】
前記遺伝子疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、毛細血管拡張性運動失調、ハーラー症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、アッシャー症候群およびテイ−サックス病からなる群から選択される、請求項３〜５のいずれかに記載の組成物、方法または使用。
【請求項４０】
前記遺伝子疾患は嚢胞性線維症である、請求項３９に記載の組成物、方法または使用。
【請求項４１】
経口投与のために製剤化される、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項４２】
前記投与は経口的に行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、Ｒ１は前記単糖類部分であり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、
（ａ）一般式ＩＩＩ：
2009532461.tif 000142
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、前記ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）
を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）前記ヒドロキシル保護基および前記アミン保護基の各々を除去し、それにより化合物を得ること
を含む、方法。
【請求項４４】
Ｔ１−Ｔ２の各々は、シクロヘキサノンジメチルケタ−ルである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、Ｒ２は前記単糖類部分であり、Ｒ１およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、
（ａ）一般式ＩＶ：
2009532461.tif 000143
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ４の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、前記ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）
を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）前記ヒドロキシル保護基および前記アミン保護基の各々を除去し、それにより化合物を得ること
を含む、方法。
【請求項４６】
Ｔ１−Ｔ４の各々は、Ｏ−アセチルである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、Ｒ３は前記単糖類部分であり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれヒドロキシルであり、
（ａ）一般式Ｖ：
2009532461.tif 000144
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、前記ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）
を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）前記ヒドロキシル保護基および前記アミン保護基の各々を除去し、それにより化合物を得ること
を含む、方法。
【請求項４８】
Ｔ１は４−メトキシ−１−メチルベンゼンであり、Ｔ２はＯ−ベンゾイルである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記保護された単糖類は、一般式ＶＩ：
2009532461.tif 000145
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３の各々は、独立して、前記ヒドロキシル保護基および前記アミン保護基からなる群から選択され；および
Ｌは前記脱離基である）
を有する、請求項４３〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
Ｌは、ｐ−トリルスルフィド（ｐ−チオトルエン）、チオエチルおよびトリクロロアセチミデートからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｚ１−Ｚ３の各々は、ヒドロキシル保護基である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、Ｒ１はアミンであり、ならびにＲ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、
（ａ）一般式ＩＩＩ：
2009532461.tif 000146
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、前記ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）
を有する化合物をトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させ、それによりその３’位にトリフルオロ−メタンスルホネート基を得ること：
（ｂ）その３’位に前記トリフルオロ−メタンスルホネート基を有する前記化合物をナトリウムアジドと反応させること；ならびに
（ｃ）前記ヒドロキシル保護基および前記アミン保護基の各々を除去し、それにより化合物を得ること
を含む、方法。
【請求項５３】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、Ｒ１は前記一般式Ｉ部分を有する前記二糖類部分であり、ならびにＲ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、
（ａ）一般式ＩＩＩ：
2009532461.tif 000147
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、前記ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）
を有する化合物を、一般式ＩＩＩ＊：
2009532461.tif 000148
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙ＊は、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ＊１−Ｔ＊２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ＊１およびＱ＊２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ＊３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、前記ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘ＊は、酸素または硫黄である）
を有する化合物とカップリングさせること；ならびに
（ｂ）前記ヒドロキシル保護基および前記アミン保護基の各々を除去し、それにより化合物を得ること
を含む、方法。
【請求項５４】
前記カップリングはリンカーを介して行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記リンカーはアルキルである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記アミン保護基の各々は、アジド基およびＮ−フタルイミド基からなる群から選択される、請求項４３〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒドロキシル保護基は、Ｏ−アセチル、Ｏ−クロロアセチルおよびＯ−ベンゾイルからなる群から選択される、請求項４３〜５５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノグリコシド類の新規なクラスおよび遺伝子疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのヒトの遺伝子疾患はナンセンス突然変異に起因し、そこでは３種類の終止コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡ）の１つがアミノ酸をコードするコドンと置換し、翻訳の中途終了をもたらし、結局、末端切断された不活性タンパク質に至る。現在、何百ものそのようなナンセンス突然変異が知られており、そして、いくつかは嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、毛細血管拡張性運動失調、ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、テイ−サックス（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）病および多くの疾患を含む致命的疾患の特定の症例を説明することが示された［１、２］。それらの疾病の多くについては、有効な治療は現在のところなく、そして、遺伝子治療が遺伝子疾患の可能な解決法のように見えるが、この技術がヒトで使用されることができる前に、まだ多くの重大な障害を解決する必要がある。
【０００３】
この数年の間に、アミノグリコシド類は、リボソームをリードスルー（読み過ごし）終止コドンの突然変異に誘導し、ｍＲＮＡ分子の一部から全長タンパク質を生成するそれらの能力のために、いくつかの遺伝子疾患の治療で治療的価値を有することが示されている［３−６］。
【０００４】
アミノグリコシド類は、致命的な感染症の治療のために一般に使われている非常に強力な広範囲スペクトルを有する抗生物質である［７、８］。２−デオキシストレプタミン（２−ＤＯＳ）アミノグリコシド抗生物質（背景技術の図１に示される）［９］は、選択的に原核生物のリボソームを標的として、１６ＳリボソームＲＮＡの解読Ａ−領域と結合することによって、タンパク質翻訳阻害および翻訳の正確性への妨害をもたらす［７、１０−１２］。最も研究されたアミノグリコシド類の１つは、パロモマイシン（その硫酸塩は、Ｈｕｍａｔｉｎの商品名で知られている）であり、それは腸アメーバ症に対して使われる抗菌性の薬物である。それはインドでの内臓リーシュマニア症（カラアザール）に対する薬物としてインド医薬品管理局により承認されて、米国では２００５年に「希少疾病用医薬品」の地位を与えられた。パロモマイシンは、１６ＳサブユニットのリボソームＲＮＡと結合することによってタンパク質合成を阻害することが知られている。
【０００５】
細菌のリボソーム構造の決定［１３−１７］のいくつかの業績は、細菌のＡ−部位のオリゴヌクレオチドモデルの結晶およびＮＭＲ構造とともに［１８−２２］、原核生物細胞での解読メカニズムを理解するために、およびアミノグリコシド類がどのようにして遺伝暗号の有害な読み誤りをもたらすかについて理解するために役立つ情報を提供した。解読の間、アミノアシル−ｔＲＮＡ選択における重要な工程は、ｍＲＮＡのコドンと同系統のアミノアシル−ｔＲＮＡのアンチコドンとの間でのミニヘリックス形成に基づく。このプロセスでは、Ａ−部位の形態は、「オフ」状態（２つの保存されたアデニンＡ１４９２とＡ１４９３とがヘリックス内で折り返されている）から「オン」状態（Ａ１４９２とＡ１４９３とは、Ａ−部位からフリップアウトされて、同系統のコドン−アンチコドンのミニヘリックスと相互作用する）に変化する［１１、１５］。この構造的な変化は、非可逆的な方法で翻訳の継続を決める分子スイッチである。パロモマイシンおよびゲンタマイシンなどのアミノグリコシド類の細菌のＡ−部位への結合は、同系統のｔＲＮＡ−ｍＲＮＡ複合体がない状態でさえ「オン」構造を安定化する。したがって、非同系統のｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ複合体に対するＡ−部位の親和性は、アミノグリコシド結合により増大し、リボソームが非系統および同系統の複合体を効率的に区別するのを妨げている。
【０００６】
タンパク質合成の終了は、ｍＲＮＡ中の終止コドンの存在によってシグナル化されて、放出因子タンパク質によって媒介される。翻訳終了の効率は、通常非常に高く、完全な細胞では、終止コドン（抑制）でのアミノ酸の誤編入が、通常約１０−４の低い頻度で生じる。真核生物でのアミノグリコシド類による停止抑制の強化は、タンパク質合成中に翻訳の正確性を妨害する際に、アミノグリコシドの活性に類似したメカニズムで起こると考えられる。すなわち、ある特定のアミノグリコシド類のリボソームＡ−部位への結合は、恐らく放出因子を挿入する代わりに、ほぼ同系統のｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ複合体を安定させる細胞構造変化を引き起こす。アミノグリコシド類は、顕著に異なる効率でいろいろな終止コドンを抑制（ＵＧＡ＞ＵＡＧ＞ＵＡＡ）し、その抑制効果は、終止コドンのすぐ下流の４番目のヌクレオチドの同一性のみならず、終止コドン付近のローカル配列コンテキストにさらに依存する（Ｃ＞Ｕ＞Ａ≧Ｇ）［６、２３］。
【０００７】
アミノグリコシド類が哺乳動物細胞の中途ナンセンス突然変異を抑制することができたという事実は、１９８５年にＢｕｒｋｅおよびＭｏｇｇによって最初に実証され、彼らはまた、これらの薬物の遺伝子疾患治療における治療の可能性に注目した［３］。研究された最初の遺伝子疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）であり、コーカサス人集団で最も優勢な常染色体劣性疾患であり、それは２，５００人の新生児あたり１人に影響を及ぼす。ＣＦは、嚢胞性線維性膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質における突然変異に起因する。現在では、ＣＦＴＲ遺伝子に１，０００を超えるＣＦをもたらす異なる突然変異が確認されたが、その突然変異の５〜１０％は、中途終止コドンである。中部・東部ヨーロッパのユダヤ人において、Ｗ１２８２Ｘ突然変異および他のナンセンス突然変異は、すべてのＣＦＴＲ変異体対立遺伝子の６４％を占める［５］。
【０００８】
ＣＦＴＲ終止突然変異のアミノグリコシド媒介抑制についての最初の実験は、ＣＦＴＲ遺伝子で見られる中途終止突然変異がＧ−４１８およびゲンタマイシン（背景技術の図１参照）によって、気管支の上皮細胞株で全長の機能性ＣＦＴＲの出現により測定されるように抑制されることができることを証明した［２４、２５］。ヒトＣＦＴＲ−Ｇ５４２Ｘ組み換え遺伝子を保有するＣＦＴＲ−／−トランスジェニックマウス変異体からの腸組織の抑制実験は、ゲンタマイシンおよびより効果の少ないトブラマイシンでの処置マウスの腺にヒトＣＦＴＲタンパク質が出現したことを証明した［２６］。最も重要なことに、二重盲検・偽薬対照・交差試験を使用する臨床研究は、ゲンタマイシンが罹患患者で終止突然変異を抑制することができることを示し、そしてゲンタマイシン治療は、ＣＦＴＲ終止突然変異を保有する１９人の患者の群で鼻粘膜を通過する膜コンダクタンスを改善した［２７］。インビトロの系の培養細胞株または動物モデルで試験されたアミノグリコシド類の治療可能性についての他の遺伝子疾患は、ＤＭＤ［２８］、Ｈｕｒｌｅｒ症候群［２９］、尿崩症［３０］、腎症性シスチン蓄積症［３１］、色素性網膜炎［３２］、および毛細血管拡張性運動失調［３３］を含む。
【０００９】
しかしながら、アミノグリコシドの医薬としての使用における主な限界のうちの１つは、典型的には腎臓（腎毒性）および耳に関連する（内耳神経毒性）病気で発現する哺乳動物に対するそれらの高い毒性である。この毒性の原因は、異なる要因とメカニズム（例えばリン脂質に対する相互作用、ホスホリパーゼの阻害およびフリーラジカルの形成）との組み合わせに起因すると推定される［３４、３５］。細菌のリボソームに対しては選択的であると考えられたが、大部分のアミノグリコシド類は、また、真核生物のＡ−部位とも結合するが、それは細菌のＡ−部位に対するよりも低い親和性である［３６］。哺乳動物細胞での翻訳の阻害は、また、これらの薬物の高い毒性に関して可能性のある原因のうちの１つでもある。それらの細胞毒性を増している別の因子は、ミトコンドリア１２ＳのｒＲＮＡのＡ−部位へのそれらの結合であり、その配列は細菌のＡ−部位に非常に類似している［３７］。
【００１０】
多くの研究が、アミノグリコシド類と関連した毒性を理解し軽減する方法を提供するために試みられたが［３８］、それはフリーラジカル濃度を低下させるために抗酸化剤［３９、４０］を使用すること、同様にアミノグリコシド類がリン脂質と相互作用する能力を低下させるためのポリ−Ｌ−アスパラギン酸塩［４１、４２］およびダプトマイシン［４３、４４］を使用することを含む。アミノグリコシド類の取り込みの際のメガリン（特に腎臓近位尿細管および内耳で豊富であるマルチリガンドのエンドサイトーシス受容体）の役割が、最近、証明された［３５］。メガリンへのアミノグリコシドの結合と競合するアゴニストの投与はまた、アミノグリコシドの取り込みおよび毒性の減少をもたらした［４５］。さらに、アミノグリコシドが投与される投与計画および／または方法を変えることが、毒性を減らす手段として検討されてきた［４６、４７］。
【００１１】
アミノグリコシドの毒性を減らす広範囲な努力にもかかわらず、投与計画の変更以外に、殆どの結果は、終止突然変異を抑制するためのアミノグリコシド類の投与に関する標準的な臨床実務および手順へと成熟していなかった。例えば、臨床試験でのゲンタマイシンの弱毒性用量の使用が、インビトロ系と比較してインビボ系実験で得られた減少したリードスルー効率を恐らく引き起こした［４８］。アミノグリコシドであるｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ−４１８硫酸塩、背景技術の図１参照）は、インビトロでの翻訳−転写系［６］において最良の終止抑制活性を示したが、それが非常に低い濃度でさえ致命的であるので、治療剤としてのその使用が可能でないことを明らかにした。例えば、ヒト繊維芽細胞に対するＧ−４１８のＬＤ５０は、ゲンタマイシン、ネオマイシンおよびカナマイシンの２．５〜５．０ｍｇ／ｍｌと比較して、０．０４ｍｇ／ｍｌである［４９］。
【００１２】
若干のアミノグリコシド系薬物（例えばＧ−４１８およびゲンタマイシンなど）への真核生物リボソームの増加した感受性は魅力的であるが、真核生物リボソームとのそれらの相互作用に関する十分な構造データの不足のために、今日まで合理的に説明することができなかった。Ｇ−４１８は、非常に低い濃度でさえ非常に有毒であるので、現在、ゲンタマイシンは様々な動物モデルおよび臨床試験で試験される唯一のアミノグリコシドである。培養細胞のそれらの比較的より低い毒性により、アミカシン［５０］およびパロモマイシン［５１］が、終止突然変異抑制治療用ゲンタマイシンの代替品を代表することができることをいくつかの研究は示したが、これらのアミノグリコシド類による臨床試験はまだ報告されていない。
【００１３】
現在まで、ほとんど全ての抑制実験は、臨床的に、市販品のアミノグリコシド類［６］を用いて実施されており、終止コドンリードスルー誘因としてそれらの活性を最適化させる努力は何もされてこなかった。現在では、限られた数のアミノグリコシド類（ゲンタマイシン、アミカシンおよびトブラマイシンを含む）のみが、ヒトの体内投与用の抗生物質として臨床的に使用されている。これらのうち、トブラマイシンは終止突然変異抑制活性を持たず、ゲンタマイシンが動物モデルおよび臨床試験で終止突然変異抑制活性に関して試験された唯一のアミノグリコシドである。近年、ネアミン誘導体の１群が脊髄筋萎縮症（ＳＰＡ）患者に由来する線維芽細胞でＳＭＮタンパク質のリードスルーを促進することが示された；しかしながら、これらの化合物は抗生物質として当初設計され、これらの誘導体のリードスルー活性のさらなる改善のためには、何らの結論も引き出されなかった［５２］。
【００１４】
本出願譲受人による米国特許出願番号第１１／０７３６４９号（それは引用により本明細書に完全に記載されたように組み込まれる）は、一連のアミノグリコシド類（これらのアミノグリコシド類が非常に強力かつ効果的な抗生物質であるようにしうる共通した骨格構造の特徴を有し、一方で、それに対する抗生物質耐性を減らすか、または妨げる）を教示している。米国特許出願番号第１１／０７３６４９号で教示されるアミノグリコシド誘導体は、炭疽菌などの細菌性感染症に対する有効な抗生物質として、また遺伝子疾患（例えば嚢胞性線維症）の治療のための治療剤としても示されている。
【００１５】
より詳しくは、米国特許出願番号第１１／０７３６４９号で教示された化合物は、細菌のｒＲＮＡの１６Ｓサブユニット上での解読Ａ−部位を選択的に認識し、結合することによりこれらの抗菌活性を発揮する既知のアミノグリコシド抗生物質に基づいて設計された。このように、これらの化合物は、現在利用できるアミノグリコシド類の半合成類似体であり、アミノグリコシドの所定の位置は、ｒＲＮＡのリン酸ジエステル結合およびそれと平行して致死因子（ＬＦ）の活性部位におけるＡｓｐ／ＧｌｕおよびＡｓｎ／Ｇｌｎクラスタの認識を強化するために修飾されてきており、それによって高められた抗菌性能を発揮する。これらの修飾は、さらに化合物に酵素触媒に対する耐性を提供して、このようにそれらの生物学的利用能とそれゆえに抗菌性能とを向上させる。さらにまた、アミノグリコシドの化学的修飾を通して設計された構造に導入された立体障害は、最も広く見受けられる耐性の原因である酵素（ＡＰＨ（３’）−ＩＩＩａ）に対して、これらの化合物に劣った基質を付与し、したがってそれに対する耐性の進行を妨げる。
【００１６】
これらの構造の設計および二機能性の活性については、Ｍａｒｉａｎａ  Ｈａｉｎｒｉｃｈｓｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３（２００５）５７９７−５８０７にも記載されている。
【００１７】
米国特許出願番号第１１／０７３６４９号で教示された化合物は、中途終止コドンをブロックし、したがって遺伝子疾患を治療することに効果的であることがさらに判明した。しかしながら、以下に詳述されるように、これらの化合物の強化された抗菌活性は、遺伝子疾患を治療するのに用いられるとき、好ましくない場合がある。他の修飾アミノグリコシド類および構造的に関連した抗生物質が提案され製造されたが［５３−６１］、それでも、その終止コドンリードスルー治療活性については、記載されなかったし、示唆も試験もされなかった。
【００１８】
効果的なリードスルー薬物の望ましい特徴は経口投与であること、および細菌に対してはほとんど効果がないか、全く効果を有しないことである。リードスルー薬物の抗菌活性は、特に胃腸（ＧＩ）生物相に関して、ＧＩ生物相平衡の逆転に起因する副作用および耐性の発現により、抗生物質の不必要な使用として望ましくない。この点で、上述の制限に加えて、臨床アミノグリコシド類の大多数は、細菌のリボソームに対して非常に選択的であり、ヒト細胞の細胞質リボソームに対しては著しい影響を及ぼさない。
【００１９】
上述の制限を回避する努力において、生物薬物会社のＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＮＹ、ＵＳＡ）は、現在、ナンセンスリードスルー活性のための大きな化学ライブラリーをスクリーニングすることによって新しい終止突然変異抑制薬物を発見しようと試みている。このアプローチを使って、新規な非アミノグリコシド化合物であるＰＴＣ１２４が発見された［６２］。この薬物の正確な化学構造は、今まで公表されなかったが、それが抗菌活性と報告された毒性とを有しないという事実は、リボソームに及ぼすその作用メカニズムがアミノグリコシド類のそれとは異なることを示唆する。ＦＤＡは、ナンセンス突然変異によって引き起こされたＣＦおよびＤＭＤの両方の治療のためにＰＴＣ１２４に早期承認および希少薬の指定を与え、そして、ＣＦおよびＤＭＤ患者の第ＩＩ相臨床試験の予備結果は、有望のように思われる［６３］。
【００２０】
要約すると、上で提示された総体的なデータは、改善された終止突然変異抑制活性、哺乳動物細胞への低い毒性、および限られた抗菌活性また非抗菌活性を有する新規なアミノグリコシド誘導体に関する組織的探索は、それらが臨床的に使用されうる点にまでアミノグリコシド誘導体の研究の手段を開発するために必要であることを示唆している。
【００２１】
したがって、上記の制限がない、遺伝子疾患の治療において有用なアミノグリコシド誘導体に対して広く認識された必要性があり、それを有することは非常に有益となるであろう。
【発明の開示】
【００２２】
本発明は、パロモマイシン由来アミノグリコシド類の新規なクラスに関し、それらは高い中途終止−コドン突然変異のリードスルー活性を示す一方で、哺乳動物細胞での低毒性と低い抗菌性とを発揮することにより、遺伝子疾患（例えば嚢胞性線維症）の治療において有益に使用することができる。
【００２３】
したがって、本発明の一態様によれば、一般式Ｉ：
2009532461.tif 000003
（式中：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、単糖類部分、ハライド、ヒドロキシル、アミンまたはオリゴ糖類部分であり、
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；但し、化合物は、
2009532461.tif 000004
アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンからなる群から選択されない）
を有する化合物またはその医薬的に許容される塩が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、ここに記載される化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００２５】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、医薬組成物は包装材で包装されて、遺伝子疾患の治療で使用するために、包装材料中にまたは包装材料上に印刷されて識別される。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬組成物は経口投与のために製剤化される。
【００２７】
本発明のなお別の態様によれば、遺伝子疾患を治療する方法が提供され、その方法は、一般式Ｉを有する治療上有効量の化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。但し、その化合物は、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンからなる群から選択されない。
【００２８】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、該化合物は経口投与される。
【００２９】
本発明のさらに別の態様によれば、遺伝子疾患を治療するための医薬の製造において、一般式Ｉを有する化合物の使用を提供し、但し、該化合物は、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンからなる群から選択されない。
【００３０】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、遺伝子疾患は、末端切断の突然変異を有するタンパク質を含む。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、遺伝子疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、毛細血管拡張性運動失調、ハーラー症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、アッシャー症候群（Ｕｓｈｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）およびテイ−サックス病からなる群から選択される。好ましくは、遺伝子疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびハーラー症候群からなる群から選択される。
【００３２】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態における特徴によれば、式Ｉ中のＸは、酸素である。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、式Ｉ中のＲ５は、ヒドロキシルである。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、式Ｉ中のＹは、水素である。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、式Ｉ中のＲ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、単糖類部分である。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ１は単糖類部分である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ２およびＲ３は、それぞれヒドロキシルである。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ２は単糖類部分である。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ１およびＲ３は、それぞれヒドロキシルである。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ３は単糖類部分である。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ１およびＲ２は、それぞれヒドロキシルである。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、単糖類部分は、一般式ＩＩ：
2009532461.tif 000005
を有し、式中、
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；および
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の各々は、独立して、ヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択される。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、式ＩＩ中のＲ７およびＲ８は、それぞれヒドロキシルである。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、式ＩＩ中のＲ６は、アミンである。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、式ＩＩ中のＲ６は、ヒドロキシルである。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ１は、アミンであり、Ｒ２およびＲ３は、それぞれヒドロキシルである。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、オリゴ糖類部分である。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ１は、オリゴ糖類部分である。好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、それぞれヒドロキシルである。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ２は、オリゴ糖類部分である。好ましくは、Ｒ１およびＲ３は、それぞれヒドロキシルである。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ３は、オリゴ糖類部分である。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、それぞれヒドロキシルである。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、オリゴ糖類部分は、二糖類部分である。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、二糖類部分は、一般式Ｉ＊：
2009532461.tif 000006
であり、式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｒ＊１、Ｒ＊２およびＲ＊３の各々は、独立して、ハライド、ヒドロキシル、アミンであり、または一般式Ｉを有する化合物に結合しており、但し、Ｒ＊１、Ｒ＊２およびＲ＊３の少なくとも１つは、上記一般式Ｉを有する化合物に結合しており；
Ｘ＊は、酸素または硫黄であり；
Ｒ＊４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）部分であり；
Ｒ＊５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；および
Ｙ＊は、水素、アルキルまたはアリールである。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、オリゴ糖類部分は、リンカーをさらに含む。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ４およびＹは、それぞれ水素である。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ４はＡＨＢである。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、Ｒ５はヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択され、Ｙはアルキルである。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本明細書に示される化合物の各々は、原核細胞よりも真核細胞に選択的な活性を有する。記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本明細書に示される化合物の各々は、抗菌活性を有さない。
【００５８】
本発明のなお別の態様によれば、本明細書に記載される一般式Ｉを有する化合物を製造する方法が提供され、式Ｉ中のＲ１は単糖類部分であり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、該方法は、
（ａ）一般式ＩＩＩ：
2009532461.tif 000007
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより該化合物を得ること
を含む。
【００５９】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｔ１−Ｔ２の各々は、シクロヘキサノンジメチルケタ−ルである。
【００６０】
本発明のなお別の態様によれば、本明細書に記載される一般式Ｉを有する化合物を製造する方法が提供され、式Ｉ中のＲ２は単糖類部分であり、Ｒ１およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、該方法は、
（ａ）一般式ＩＶ：
2009532461.tif 000008
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ４の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより該化合物を得ること
を含む。
【００６１】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｔ１−Ｔ４の各々は、Ｏ−アセチルである。
【００６２】
本発明のなお別の態様によれば、本明細書に記載される一般式Ｉを有する化合物を製造する方法が提供され、式Ｉ中のＲ３は単糖類部分であり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれヒドロキシルであり、該方法は、
（ａ）一般式Ｖ：
2009532461.tif 000009
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより該化合物を得ること
を含む。
【００６３】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、Ｔ１は４−メトキシ−１−メチルベンゼンであり、Ｔ２はＯ−ベンゾイルである。
【００６４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、保護された単糖類は、一般式ＶＩ：
2009532461.tif 000010
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基からなる群から選択され；および
Ｌは脱離基である）を有する。
【００６５】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、式ＶＩ中のＬは、ｐ−トリルスルフィド（ｐ−チオトルエン）、チオエチルおよびトリクロロアセチミデートからなる群から選択される。
【００６６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、式ＶＩ中のＺ１−Ｚ３の各々は、ヒドロキシル保護基である。
【００６７】
本発明のなお別の態様によれば、本明細書に記載される一般式Ｉを有する化合物を製造する方法が提供され、Ｒ１はアミンであり、ならびにＲ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、該方法は、
（ａ）一般式ＩＩＩを有する化合物をトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させ、それによりその３’位にトリフルオロ−メタンスルホネート基を得ること：
（ｂ）その３’位にトリフルオロ−メタンスルホネート基を有する化合物をナトリウムアジドと反応させること；ならびに
（ｃ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより該化合物を得ること
を含む。
【００６８】
本発明のなお別の態様によれば、本明細書に記載される一般式Ｉを有する化合物を製造する方法が提供され、Ｒ１は一般式Ｉ＊を有する二糖類部分であり、ならびにＲ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、該方法は、
（ａ）一般式ＩＩＩを有する化合物を、一般式ＩＩＩ＊：
2009532461.tif 000011
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙ＊は、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ＊１−Ｔ＊２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ＊１およびＱ＊２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ＊３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘ＊は、酸素または硫黄である）の化合物とカップリングさせること；ならびに
（ｂ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより該化合物を得ること
を含む。
【００６９】
以下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、カップリングはリンカーを介して行われ、リンカーはアルキルが好ましい。
【００７０】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、アミン保護基の各々は、アジド基およびＮ−フタルイミド基からなる群から選択される。
【００７１】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ヒドロキシル保護基は、Ｏ−アセチル、Ｏ−クロロアセチルおよびＯ−ベンゾイルからなる群から選択される。
【００７２】
本発明は、嚢胞性繊維症および他の遺伝子疾患を治療するための治療剤として、終止コドン突然変異抑制、低い細胞毒性および低い抗菌活性など（これらすべては化合物を当該分野で公知の他のアミノグリコシド化合物よりはるかに優れたものとする）の有益な特徴を有するアミノグリコシド化合物を提供することにより、現在知られている配置の欠点に成功裡に対処している。
【００７３】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、最終結果に影響しない他の工程および成分が加えられ得ることを意味する。この用語は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【００７５】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【００７６】
本明細書中で使用される、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１種の化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【００７７】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【００７８】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲にある／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【００７９】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００８０】
図１は、背景技術で記載された抗菌性アミノグリコシド類の化学構造を示す。
【００８１】
図２は、本実施形態による例示的な化合物を得るための化学構造および一般的な合成経路を示し、それらはパロマミンの骨格に基づき、他の既知のアミノグリコシドと比較して、終止−コドン突然変異のリードスルー活性および低下した毒性を発揮するように設計した。
【００８２】
図３Ａ−Ｄは、試験化合物および［３５Ｓ］−メチオニンの存在下、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする２５−ｋＤａのポリペプチドとＯＲＦをコードする１０−ｋＤａのポリペプチドとの間のＴＧＡ  Ｃナンセンス終止突然変異を含むプラスミド系レポーター構築物の発現により、例示的な化合物３およびパロモマイシンに関して測定されたインビトロでの突然変異抑制および翻訳比較アッセイの結果を示し、化合物３（図３Ａ）およびパロモマイシン（図３Ｃ）に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｅｒを用いて定量化された反応生成物、および比較プロットを示し、そこでは変異抑制値（黒い点で示される）と翻訳値（白い点で示される）とをその不在下で発現される全タンパク質からの試験化合物の各濃度における全タンパク質の相対的な割合として算出し、化合物３（図３Ｂ）およびパロモマイシン（図３Ｄ）に関しては３通り測定した。
【００８３】
図４は、ＣＯＳ−７細胞で発現されたウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子とホタルルシフェラーゼ遺伝子との間のポリリンカー中でのＴＧＡ  Ｃナンセンス突然変異を含むｐ２Ｌｕｃプラスミドを使用して、パロモマイシンとゲンタマイシンと比較した、本実施形態による例示化合物、すなわち化合物３によって発現されるナンセンス変異のエクスビボでの抑制を示し、それは異なる濃度の各試験化合物に対して３以上の独立した実験の平均として算出された抑制レベルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
本発明は、アミノグリコシド類の新規なクラスに関し、それは、例えば、遺伝子疾患の治療において有益に使用されうる。具体的には、本発明は、パロモマイシン由来の化合物の新規なクラスに関し、それらは高い中途終止−コドン突然変異のリードスルー活性を示し、一方で哺乳動物細胞において低毒性を発揮する。したがって、本発明はこれらの化合物を含む医薬組成物および嚢胞性線維症などの遺伝子疾患の治療におけるそれらの使用に関する。本発明は、さらにこれらの化合物を製造する方法に関する。
【００８５】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００８６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００８７】
上で議論したように、過去１０年にわたって、天然アミノグリコシド類の多くの類似体が、病原性細菌でこれらの薬物に対する抗菌性の耐性の急速な広がりを克服するために設計、合成されており、それによって抗生物質アミノグリコシド類のうちのいくつかは、終止コドン突然変異抑制活性を有することが示された。しかし、ヒト遺伝子疾患の治療でのこれらのアミノグリコシド類の可能性のある用途に関して、ほとんど全ての終止コドン突然変異抑制実験は、市販のアミノグリコシド類で行われており、そして、終止コドンリードスルー誘因としてこれらのアミノグリコシド類の活性を最適化させるための努力は殆どされてこなかった。
【００８８】
現在まで、あるアミノグリコシド類が終止抑制を誘導するのに対して、他のものがそうしない理由についての疑問に対する明瞭な答えはまだない。哺乳類系でのいくつかの市販のアミノグリコシド類のインビトロでの抑制活性は、環Ｉ上にＣ６’ヒドロキシル基を有するＧ−４１８およびパロモマイシン（参照：図１）などのアミノグリコシド類が通常、同じ位置にアミンを有するものよりも一般的により効果的であることを明らかにした［６、５１］。
【００８９】
終止−コドン突然変異抑制に関してアミノグリコシド類の効果をさらに探索している間に、減少した毒性と同様に改善された終止−コドンリードスルー活性を示すであろうアミノグリコシド類似体を見出す目的で、本発明者らは、抗菌活性および／または終止−コドン突然変異抑制活性のために必要であるものから毒性を誘発するアミノグリコシド構造の要素を切り離すことがこの効果に有益であろうと予想した。臨床的に使用されたアミノグリコシド類および若干の設計された構造（参照：図１）に関して利用できる毒性データから、アミノグリコシド類の毒性に大きく影響する２つの主な因子は、アミノ基の数の減少（脱アミノ化）および／または環上ヒドロキシル基の欠失（脱酸素化）であると仮定された。
【００９０】
脱アミノ化（アミノ基の除去）の結果としてのアミノグリコシドの低減された毒性が、例えば、パロモマイシン（ネオマイシンよりアミノ基が１つ少なく、より毒性が小さいという点で、ネオマイシンと異なる）（ネオマイシンのＬＤ５０＝２４、パロモマイシン＝１６０）で観察された。したがって、１個の電荷（生理的ｐＨでの正に帯電したアミン基による）のこの違いは、２つの化合物の毒性に大きな違いを生じる。同様に、カナマイシンＢ（ＬＤ５０＝１３２）とカナマイシンＡ（ＬＤ５０＝２８０）およびカナマイシンＣ（ＬＤ５０＝２２５）との１個の電荷の違いは、後者の２つをカナマイシンＢより低毒性とした。いかなる特定の理論にも束縛されないが、帯電したアミノ基の減少によるアミノグリコシド類の毒性のそのような減少は、他の細胞成分との非特異的な相互作用の減少により、およびフリーラジカルの減少した生成により説明することができると推測されてきた。アミノグリコシド類の毒性に影響を及ぼすことが注目されたさらなる因子は、２−ＤＯＳ環のＮ１−アミンの（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）基によるアシル化であるが、この効果の範囲はアミノグリコシド構造（例えば、ネアミンのＬＤ５０＝１２５対Ｎ１−ＡＨＢ−ネアミンのＬＤ５０＝２６０；およびカナマイシンＡのＬＤ５０＝２８０対アミカシンのＬＤ５０＝３００）に依存することが示された。
【００９１】
脱酸素化（ヒドロキシル基の除去）の結果としてのアミノグリコシド類の増加した毒性は、例えば、トブラマイシン（ＬＤ５０＝７９）を与える、カナマイシンＢ（ＬＤ５０＝１３２）中の３’−ＯＨの除去において観察されたが、それは親のカナマイシンＢよりも非常に有毒である。どんな特定の理論によっても束縛されないが、この現象は、３’−ＯＨに隣接した２’−ＮＨ２の塩基性の減少によって説明することができる。確証的な結果は、カナマイシンＢおよびいくつかのその臨床的誘導体における５−ＯＨを５−フッ素で置換することによって提供された［６４−６６］。このように、トブラマイシン（３’−デオキシ）、ゲンタマイシン（３’，４’−ジデオキシ）、ジベカシン（３’，４’−ジデオキシ）およびアルベカシン（３’，４’−ジデオキシ）などの臨床的薬物の非常に高い毒性は、主としてＣ３’−酸素原子またはＣ３’，Ｃ４’−酸素原子の欠失により生じるこれらの薬物における２−ＮＨ２基（環Ｉ）の増加した塩基性に帰することができた。
【００９２】
米国特許出願番号第１１／０７３６４９号で示されるアミノグリコシド類似体に導入された構造操作は、特にリジッド糖環の付加を含む。アミノグリコシド骨格へのリジッド糖環の付加は、耐性を引き起こす酵素との相互作用に影響を及ぼし、したがって酵素の触媒作用および引き続く耐性の出現のために必要な３次元複合体の形成の抑制に貢献した。
【００９３】
本発明を実施する間、本発明者らは効果的な突然変異抑制活性および低減された毒性を示す新規な化合物を設計し、成功裡に製造および使用した。これらの化合物は、パロマミン骨格（パロモマイシンから、その２つの単糖類部分を除いて得られた）に基づき、それに対して新しい構造的特徴が導入された。パロモマイシンの構造的特徴の操作は、潜在的な毒性を減らし、突然変異リードスルー活性を改善するために慎重に選択された。
【００９４】
したがって、本発明の一態様によれば、一般式Ｉ：
2009532461.tif 000012
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は、独立して、単糖類部分、ハライド、ヒドロキシル、アミンまたはオリゴ糖類部分であり、
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）部分であり；
Ｒ５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；そして
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールである）
を有する化合物が提供される。
【００９５】
本明細書中で使用される用語「単糖類」は、当該分野で周知であり、加水分解によってさらに分解することができない単一の糖質分子からなる糖の単純な形態を指す。単糖類の最も一般的な例は、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ガラクトース、およびリボースを含む。単糖類は、炭水化物の炭素原子の数によって分類することができる：つまり、３個の炭素原子を有するトリオース（例えば、グリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトン）；４個の炭素原子を有するテトロース（例えば、エリトロース、トレオースおよびエリトルロース）；５個の炭素原子を有するペントース（例えば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロースおよびキシルロース）；６個の炭素原子を有するヘキソース（例えば、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボースおよびタガトース）；７個の炭素原子を有するヘプトース（例えば、マンノヘプチュロース、およびセドヘプチュロース）；８個の炭素原子を有するオクトース（例えば、２−ケト−３−デオキシ−マンノ−オクトネート）；９個の炭素原子を有するノノース（例えば、シアロース）；および１０個の炭素原子を有するデコースである。単糖類は、蔗糖（一般の砂糖）および他の多糖類（例えば、セルロースおよび澱粉）のようなオリゴ糖類の構築ブロックである。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、用語「部分」は、化学物質の一部および好ましくは主要部を言うのであって、それは化学反応を経て、今度は別の分子実体に共有結合で結合されている分子または基である。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、用語「ハライド」（本明細書において「ハロ」とも呼ばれる）は、フッ素、塩素、臭素、または沃素の原子を記載し、本明細書においてフッ化物、塩化物、臭化物および沃化物とも呼ばれる。
【００９８】
本明細書中で使用される用語「ヒドロキシル」は−ＯＨ基を示す。
【００９９】
本明細書中で使用される用語「アミン」は−ＮＲ’Ｒ’’基を記載し、ここでＲ’およびＲ’’のそれぞれは独立して水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ脂環式環、アリール、またはヘテロアリールであり、これらの用語は本明細書中で定義される。
【０１００】
本明細書中で使用される用語「アルキル」は、直鎖基および分枝鎖基を含む脂肪族炭化水素を記載する。好ましくは、アルキル基は１個〜２０個の炭素原子、より好ましくは１個〜１０個の炭素原子を有する。数値範囲、例えば「１個〜１０個」が本明細書で述べられる場合は常に、それは基（この場合はアルキル基）が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などの１０個までの炭素原子を含むということを意味する。アルキルは置換または非置換でありうる。置換されている場合、置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハライド、ヒドロキシ、アルコキシ、およびヒドロキシアルキルであることができ、これらの用語は本明細書中下記で定義される。本明細書中で使用される用語「アルキル」はまた、飽和または不飽和の炭化水素を包含するので、この用語はアルケニルおよびアルキニルをさらに包含する。
【０１０１】
用語「アルケニル」は、本明細書中に定義されるように、少なくとも２つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和なアルキルを記載する。アルケニルは、本明細書において上記に記載されるような１つ以上の置換基によって置換されていても置換されていなくてもよい。
【０１０２】
用語「アルキニル」は、本明細書中に定義されるように、少なくとも２つの炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素三重結合からなる不飽和アルキルを示す。アルキニルは、本明細書において上記に記載されるような１つ以上の置換基によって置換されていても置換されていなくてもよい。
【０１０３】
用語「アリール」は、完全共役のπ電子系を有する、すべてが炭素の単環基または縮合多環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を示す。アリール基は、本明細書において上記に記載されるような１つ以上の置換基によって置換されていても置換されていなくてもよい。
【０１０４】
用語「ヘテロアリール」は、例えば、窒素、酸素およびイオウなどの１個または複数個の原子を環（１つまたは複数）に有し、さらには完全共役のπ電子系を有する単環基または縮合環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を記載する。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。ヘテロアリール基は、本明細書において上記に記載されるような１つ以上の置換基によって置換されていても置換されていなくてもよい。代表的な例は、チアジアゾール、ピリジン、ピロール、オキサゾール、インドール、プリンなどである。
【０１０５】
上記の式Ｉで示される二環式構造は、ここではパロマミン骨格として言及される。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｘは酸素である。
【０１０７】
さらに好ましくは、Ｒ５はヒドロキシルである。
【０１０８】
さらに好ましくは、Ｙは水素またはアルキルであり、より好ましくは、Ｙはメチルである。
【０１０９】
本発明の一実施形態では、上記の式Ｉで示されるパロマミン骨格は、それに結合した１つ以上のさらなる単糖類部分を含む。
【０１１０】
上記の式Ｉで理解できるように、単糖類部分がパロマミン骨格に結合できるいくつかの位置がある。好ましい実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３として示される３つの位置があり、それは単糖類部分をパロマミン骨格に導入するために好ましい。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、単糖類部分である。
【０１１２】
好ましくは、１つの単糖類のみが、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の任意の１つに導入される。そのような場合、好ましくは、他の位置は、ヒドロキシルである。
【０１１３】
より好ましくは、単糖類部分はＲ１の位置に導入され、Ｒ２およびＲ３は好ましくは、それぞれヒドロキシルである。
【０１１４】
同様に、単糖類部分がＲ２の位置に導入される場合、Ｒ１およびＲ３は好ましくは、それぞれヒドロキシルであり、そして単糖類部分がＲ３の位置に導入される場合、Ｒ１およびＲ２は好ましくは、それぞれヒドロキシルである。
【０１１５】
好ましい実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、単糖類部分である。好ましくは、単糖類はペントース（例えば、フラノースなど）、またはヘキソース（例えば、ピラノースなど）である。本実施形態による好ましい単糖類部分は、一般式ＩＩ：
2009532461.tif 000013
によって総称的に表すことができ、式中、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の各々は、ヒドロキシルおよびアミンからなる群から独立して選択され、破線はＲ配置またはＳ配置を示す。曲線は、パロマミン骨格に結合している単糖類部分の位置を示す。
【０１１６】
好ましくは、Ｒ７およびＲ８は、それぞれヒドロキシルである。
【０１１７】
後続の実施例の部分（参照：表１８）で示され、証明されるように、Ｒ６の位置の置換基は、生成する化合物の切断変異リードスルー活性および抗菌活性に影響を及ぼすことが分かった。したがって、上記の式ＩＩによって表わされる単糖類部分を有する好ましい化合物は、Ｒ６の位置にアミン基またはヒドロキシル基、より好ましくはアミン基を有している。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、上記の式Ｉで示されるパロマミン骨格は、好ましくはＲ１、Ｒ２とＲ３の位置で、それに結合した１つ以上のさらなるオリゴ糖類部分を含む。したがって、好ましい実施形態によれば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、オリゴ糖類部分である。好ましくは、１つのオリゴ糖類部分のみが、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３のいずれか１つに導入される。そのような場合、好ましくは、他の位置は、ヒドロキシルである。
【０１１９】
好ましくは、オリゴ糖類部分はＲ１の位置に結合し、一方、他の２つの位置、Ｒ２およびＲ３は好ましくは、それぞれヒドロキシルである。あるいはまた、オリゴ糖類部分はＲ２の位置に結合し、好ましくは、Ｒ１およびＲ３はそれぞれヒドロキシルであり、またはオリゴ糖類部分はＲ３の位置に結合し、そして好ましくはＲ１およびＲ２はそれぞれヒドロキシルである。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴ糖類」は、２つ以上の単糖類単位（これらは本明細書で定義されている）を含む化合物を指す。好ましくは、オリゴ糖類は、２〜６個の単糖類を含み、より好ましくは、オリゴ糖類は２〜４個の単糖類を含み、そして最も好ましくは、オリゴ糖類は２つの単糖類単位を有する二糖類部分である。
【０１２１】
好ましい実施形態によれば、一般式Ｉを有する化合物に結合した二糖類は、以下のような一般式Ｉ＊：
2009532461.tif 000014
であり、式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｒ＊１、Ｒ＊２およびＲ＊３の各々は、独立して、ハライド、ヒドロキシル、アミンであり、または一般式Ｉを有する化合物に結合しており、但し、Ｒ＊１、Ｒ＊２およびＲ＊３の少なくとも１つは、上記一般式Ｉを有する化合物に結合しており；
Ｘ＊は、酸素または硫黄であり；
Ｒ＊４は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）部分であり；
Ｒ＊５は、ヒドロキシルまたはアミンであり；および
Ｙ＊は、水素、アルキルまたはアリールである。
【０１２２】
したがって、そのような「二量体」は、それらの対応するＲ１、Ｒ＊１、Ｒ２、Ｒ＊２、Ｒ３またはＲ＊３の位置でそれらの任意の組み合わせにより互いに結合した２つの化合物を含み、例えば、Ｒ１−Ｒ＊２もしくはＲ２−Ｒ＊１結合二量体、Ｒ１−Ｒ＊３もしくはＲ３−Ｒ＊１結合二量体、Ｒ３−Ｒ＊２もしくはＲ２−Ｒ＊３結合二量体、Ｒ１−Ｒ＊１結合二量体、Ｒ２−Ｒ＊２結合二量体またはＲ３−Ｒ＊３結合二量体が挙げられる。好ましくは、それはＲ１−Ｒ＊１結合二量体である。
【０１２３】
２つの部分の間の結合は、リンカーまたは結合部分を介することができる。本明細書中で使用される用語「リンカー」は、少なくとも２つの他の化学部分に結合している化学部分を指し、したがって、それらの間を結合する。本実施形態では、リンカーは好ましくは、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであり、より好ましくはメチレンである。
【０１２４】
先に議論したように、パロマミン骨格上のアミン基の数を増加させることは、毒性に関して否定的な効果を有する場合があるが、元の置換されたヒドロキシルと比較して、逆の立体化学でＲ１の位置にアミン基を有するパロマミン類似体は、逆の配置で付加されるアミンの影響を調べる試みにおいて後続の実施例の部分に示されるように製造された。
【０１２５】
後続の実施例の部分で証明されるように、ヒドロキシルを置換し逆の配置を有するＲ１の位置にアミンを有する本実施形態による例示的な化合物、つまり化合物８が製造されて、パロモマイシンと比較して６〜１６倍の低い抗菌活性を示した（参照：下記の表１８）。
【０１２６】
したがって、本発明の別の実施形態においては、Ｒ１はアミンである。好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、それぞれヒドロキシルである。
【０１２７】
上記の化合物は、Ｒ４、Ｒ５およびＹの位置における置換基にしたがって、いくつかの部分集合にさらに分類することができる。上記で定義されるように、Ｒ４は水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）部分であり、Ｒ５はヒドロキシルまたはアミンであり、そしてＹは水素またはアルキル（好ましくは、メチル）であることができ、Ｒ４、Ｒ５およびＹに関して化合物の６つの好ましい部分集合をともに与える。
【０１２８】
Ｒ４、Ｒ５およびＹに関して、１つの部分集合では、Ｒ４およびＹの各々は水素であり、そしてＲ５はヒドロキシルであり、図２に示される化合物を与える。この点での他の２つの部分集合において、Ｒ４は水素かＡＨＢのいずれかであり、Ｒ５の位置のアミンおよびＹの位置のメチルが存在し、これらの化合物の各々において、Ｒ５の位置はＲかＳの立体配置であると推測することができる。
【０１２９】
上記の部分集合の各々は、そのＲ４置換基（水素またはＡＨＢ部分のいずれかである）によって、さらに分けることができる。あるいはまた、ＡＨＢ部分は、α−ヒドロキシ−β−アミノプロピオニル（ＡＨＰ）部分により置換することができる。
【０１３０】
本実施形態による現在最も好ましい化合物は、上記の一般式ＩおよびＲ１、Ｒ２またはＲ３の１つとして単糖類部分（例えばリボフラノース）を有する。
【０１３１】
上記の一般式Ｉを有する化合物（式中、Ｙが水素であり、Ｒ４が水素またはＡＨＢ部分であり、そしてＲ１−Ｒ３の１つが、リボフラノースまたはピラノース部分である）はまた、ここでは化合物３および３７〜４１を指す（参照：下記のスキーム７）；上記の一般式Ｉを有する化合物（式中、Ｒ５がヒドロキシルであり、Ｒ４が水素またはＡＨＢ部分であり、Ｒ１−Ｒ３の１つが、リボフラノースまたはピラノース部分であり、そしてＹがメチルである）はまた、ここでは化合物４２〜４７を指す（参照：下記のスキーム８）；および上記の一般式Ｉを有する化合物（式中、Ｒ５がアミンであり、Ｒ４が水素またはＡＨＢ部分であり、Ｙがメチルであり、そしてＲ１−Ｒ３のうちの１つが、リボフラノースまたはピラノース部分である）はまた、ここでは化合物４８〜５３を指す（参照：下記のスキーム８）。
【０１３２】
本実施形態によれば、（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−アミノ−６−（（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ）−４，６−ジアミノ−２−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イルオキシ）−３−ヒドロキシシクロヘキシルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジオール（以下、化合物２と称す）、（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−アミノ−６−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４，６−ジアミノ−３−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−２−イルオキシ）−２−ヒドロキシシクロヘキシルオキシ）−２−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジオール（以下、化合物４と称す）、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシンおよびそれらの名前に加えた接尾辞を有するそれらの任意の変形体（例えば、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１Ａ、ゲンタマイシンＣ２、ゲンタマイシンＤ、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ブチロシンＡ、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシンＢ、他）は、上記されており、したがって、本発明のこの態様の範囲から除外される。これらもまた、２つ以上の単糖類単位を有する任意の他のアミノグリコシド類似体を含み、それらは上記されている。
2009532461.tif 000015
【０１３３】
それにもかかわらず、化合物２および化合物４は、それらの治療活性について一般的に、いうまでもなく遺伝子疾患の治療に関連しては、また特に終止−コドン突然変異抑制に関連しては、記載も試験もされなかったので、したがって、本発明の他の態様からは除外されない。
【０１３４】
本実施形態は、さらに本明細書に記載された化合物の任意のエナンチオマー、プロドラッグ、溶媒和物、水和物、および／または医薬的に許容される塩類を包含する。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、用語「エナンチオマー」は、互いの完全な反転／反射（鏡像）によるのみでその対応物に関して重ね合わせられる化合物の立体異性体を指す。エナンチオマーは、それらが右手および左手のように互いを指すので、「掌性」を持つと言われている。エナンチオマーは、全生物系などの、掌性を単独で有する環境に存在する場合を除き、同一の化学的および物理的性質を有する。
【０１３６】
用語「プロドラッグ」は、インビボで活性化合物（活性な親薬物）に変換される薬物を指す。プロドラッグは、親薬物の投与を促進するのに典型的に役立つ。それらは、例えば、経口投与によって生物学的に利用可能であるが、親薬物はそうではない。プロドラッグは、医薬組成物で親薬物と比較して改善された溶解度を有することができる。プロドラッグはまた、インビボで活性化合物の徐放を達成するためにもしばしば用いられる。制限されることなく、プロドラッグの例としては、１つ以上のカルボン酸部分を有し、エステル（「プロドラッグ」）として投与される本発明の化合物が挙げられるであろう。そのようなプロドラッグは、インビボで加水分解され、それによって遊離した化合物（親薬物）を提供する。選択されたエステルは、プロドラッグの溶解度特性および加水分解率の両方に影響を及ぼす可能性がある。
【０１３７】
用語「溶媒和物」は、可変化学量論（例えば、ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサなど）の複合体を指し、それは溶質（本発明の化合物）および溶媒によって形成され、それによって溶媒は溶質の生物学的活性を妨げない。適切な溶媒は、例えば、エタノール、酢酸などを含む。
【０１３８】
用語「水和物」は、上記で定義されたように、溶媒和物を指し、溶媒は水である。
【０１３９】
用語「医薬的に許容される塩」は、親化合物およびその対イオンの荷電種を指し、それは親化合物の溶解度特性を改変するために、および／または親化合物による生物体への任意の大きな刺激を減少させるために典型的に用いられ、一方で、投与された化合物の生物学的活性および特性を維持する。非限定的な医薬的に許容される塩の例としては、カルボキシレートアニオンおよびカチオン（非制限的に例えばアンモニウム、ナトリウム、カリウムなど）が挙げられる。
【０１４０】
さらに本発明によれば、本明細書に記載される化合物を製造する方法が提供される。
【０１４１】
本明細書で記載される合成経路は、受容体と供与体との間の反応を含み、それにより用語「受容体」は、本明細書ではパロマミンに由来する骨格の構造を記載するために使われ、それはＣ５、Ｃ６およびＣ３’などの位置で少なくとも１個の、好ましくは選択的に選ばれた利用可能な（保護されていない）ヒドロキシル基を有し、それはグリコシド化反応の間は反応性であって、グリコシルを受け入れることができ、そして、用語「供与体」は、本明細書ではグリコシルを記載するために使用される。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、用語「グリコシル」は、単糖類のヘミアセタール官能基からヒドロキシル基を除去することによって、および低級オリゴ糖類の拡張によって得られる化学基を指す。
【０１４３】
供与体および受容体は、望ましい化合物を形成するために設計される。以下は、本発明のこの態様の好ましい実施形態を記載し、本明細書に記載される化合物の例示的な部分集合を製造する例示的な方法を提示する。
【０１４４】
本実施形態の化合物の合成は、一般に、（ｉ）パロマミン骨格に存在する選択された位置で１個以上のヒドロキシルおよびアミンの選択的な保護によって受容体化合物を製造し、そして、１つまたは２つの位置を未保護のままとし、したがって上記で定義したように供与体（グリコシル）化合物を自由に受け入れることができるようにすること；（ｉｉ）例えば、受容体上の保護されていない位置への適切に保護された供与体化合物とのカップリング反応により、または水酸基をアミン基と置換し、場合によりアミンの配置を反転することにより、所望の位置での受容体の構造的特徴を操作すること；および（ｉｉｉ）全ての保護基を除去することを含む。
【０１４５】
本明細書中で使用される場合、用語「保護基」は、特定の官能性をブロックまたは保護し、一方で化合物上の他の官能基を反応させる一般的に使用される置換基を指す。例えば、「アミノ保護基」は、化合物中のアミン官能性をブロックまたは保護する、アミノ基に結合した置換基を指す。適切なアミノ保護基は、アジ化物（アジド）、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−アセチル、Ｎ−トリフルオロアセチル、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚ）およびＮ−９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含む。同様に、「ヒドロキシル保護基」は、ヒドロキシル官能基をブロックまたは保護するヒドロキシル基の置換基を指す。適切な保護基は、シクロヘキサノンジメチルケタール（２つの隣接したヒドロキシル基との１，３−ジオキサンを形成する）、４−メトキシ−１−メチルベンゼン（２つの隣接したヒドロキシル基との１，３−ジオキサンを形成する）、Ｏ−アセチル、Ｏ−クロロアセチル、Ｏ−ベンゾイルおよびＯ−シリルを含む。保護基の一般的な記載およびそれらの使用については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。
【０１４６】
以下に示される好ましい実施形態によれば、アミン保護基は、アジド基および／またはＮ−フタルイミド基を含み、そしてヒドロキシル−保護基は、Ｏ−アセチル、Ｏ−クロロアセチルおよび／またはＯ−ベンゾイルを含む。
【０１４７】
一実施形態において、本明細書で示される一般式Ｉを有する化合物の例示的な部分集合を製造する方法が提供され、単糖類はＲ１の位置に結合し、Ｒ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである。本実施形態によれば、該方法は、適切に保護された受容体化合物と適切に保護された供与体化合物とを製造して、これらの２つの化合物を互いにカップリングさせて、その後、生成する化合物からすべての保護基を除去することにより実施される。
【０１４８】
この実施形態によれば、受容体は、特定の位置に保護基を有するパロマミンの１つの型である一般式ＩＩＩ：
2009532461.tif 000016
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）を有する。
【０１４９】
保護基は、それらが容易に結合し、適切な条件下で除去されるように選択され、そしてパロマミンの種々のアミンおよび水酸基の異なる反応性にしたがって、Ｒ１の位置の水酸基は未保護のままとし、カップリング反応のために遊離であるように選択される。
【０１５０】
好ましい実施形態によると、Ｔ１−Ｔ２の各々は、シクロヘキサノンジメチルケタール保護基であり、Ｔ１の場合、２つの隣接した水酸基によって１，３−ジオキサンを形成し、Ｔ２の場合、１，３−ジオキソランを形成する。
【０１５１】
供与体化合物は、その１”の位置に脱離基を有する保護された単糖類である。そのような保護された単糖類は、一般式ＶＩ：
2009532461.tif 000017
によって総称的に表すことができ、式中、
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３の各々は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基から独立して選択され、Ｌは脱離基であり、破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示す。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、用語「脱離基」は、化学反応の間、有機分子からの脱離を容易に受ける不安定な原子、基または化学的部分を言い、一方で脱離はその上で脱離する原子、基または部分の相対的な安定性によって促進される。典型的には、強酸の共役塩基である任意の基は、脱離基として作用することができる。したがって、本実施形態に従う適切な脱離基の代表例は、非制限的にハライド、アセテート、トシレート、トリフレート、スルホネート、アジド、ヒドロキシ、チオヒドロキシ、アルコキシ、シアネート、チオシアネート、ニトロ、およびシアノを含む。
【０１５３】
用語「アセテート」は、酢酸アニオンを指す。
【０１５４】
用語「トシレート」は、トルエン−４−スルホン酸アニオンを指す。
【０１５５】
用語「トリフレート」は、トリフルオロ−メタンスルホン酸アニオンを指す。
【０１５６】
用語「アジド」は、Ｎ３−を指す。
【０１５７】
用語「ヒドロキシ」および「チオヒドロキシ」は、ＯＨ−およびＳＨ−アニオンをそれぞれ指す。
【０１５８】
用語「シアネート」および「チオシアネート」は、［Ｏ＝Ｃ＝Ｎ］−および［Ｓ＝Ｃ＝Ｎ］−アニオンをそれぞれ指す。
【０１５９】
用語「ニトロ」は、ＮＯ２−を指す。
【０１６０】
用語「シアノ」は、［Ｃ≡Ｎ］−を指す。
【０１６１】
好ましくは、Ｌはｐ−トリルスルフィド（ｐ−チオトルエン）、チオエチルおよびトリクロロアセチミデートであり、さらに好ましくは、Ｚ１−Ｚ３の各々は、ヒドロキシル保護基である。
【０１６２】
したがって、該方法は、
（ａ）上記の受容体化合物を上記の供与体化合物とカップリングさせること；および、
（ｂ）続いて保護基の各々を除去すること
により実施される。
【０１６３】
本実施形態によって製造された例示的な化合物は、後続の実施例の部分で示されるように、化合物６および化合物７を含む。
【０１６４】
この基本的な方法は、所望の位置で供与体と相互作用するように設計された受容体を利用して、本実施形態による化合物の他の例示的な部分集合を製造するために使用される。
【０１６５】
したがって、本発明の別の実施形態によれば、本明細書に記載される一般式Ｉを有する化合物の例示的部分集合を製造する方法が提供され、単糖類はＲ２の位置に結合され、Ｒ１およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである。このような方法は、
（ａ）一般式ＩＶ：
2009532461.tif 000018
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ４の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより該化合物を得ること
によって行われる。
【０１６６】
好ましくは、Ｔ１−Ｔ４の各々は、Ｏ−アセチルである。
【０１６７】
既に示された実施形態におけるように、単糖類の誘導体は保護された単糖類であり、それは本明細書において上記で示されたような一般式ＶＩを有する。
【０１６８】
本実施形態によって製造された例示的な化合物は、後続の実施例の部分に示されるように、化合物２および化合物３を含む。
【０１６９】
本発明のなお別の実施形態によれば、本明細書に示される一般式Ｉを有する化合物の例示的部分集合を製造する方法が提供され、単糖類はＲ３の位置に結合され、Ｒ１およびＲ２はそれぞれヒドロキシルである。このような方法は、
（ａ）一般式Ｖ：
2009532461.tif 000019
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）を有する化合物を、１”位に結合した脱離基ならびにヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを有する単糖類の誘導体とカップリングさせること、ならびに
（ｂ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより該化合物を得ること
によって行われる。
【０１７０】
好ましくは、Ｔ１は４−メトキシ−１−メチルベンゼンであり、Ｔ２はＯ−ベンゾイルである。
【０１７１】
本実施形態によって製造された例示的な化合物は、後続の実施例の部分に示されるように、化合物４および化合物５を含む。
【０１７２】
他の実施形態において、本明細書において上記に示される受容体は、一般式Ｉを有する化合物の他の部分集合の製造において利用される。
【０１７３】
従って、なお別の実施形態において、本明細書において上記に示される一般式Ｉを有する化合物を製造する方法が提供され、Ｒ１は親のパロマミン化合物における対応するヒドロキシル基と比べて反転された立体配置を示すアミンであり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである。このような方法は、
（ａ）一般式ＩＩＩ：
2009532461.tif 000020
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙは、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ１−Ｔ２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ１およびＱ２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘは、酸素または硫黄である）
を有する化合物をトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させ、それによりその３’位にトリフルオロ−メタンスルホネート基を得ること：
（ｂ）その３’位にトリフルオロ−メタンスルホネート基を有する化合物をナトリウムアジドと反応させること；ならびに
（ｃ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それによりＲ１の位置にアミンを有する化合物を得ること
によって行われる。
【０１７４】
本実施形態によって製造された例示的な化合物は、後続の実施例の部分に示されるように、化合物８を含む。
【０１７５】
さらなる実施形態によれば、本明細書において上記に示される一般式Ｉを有する二量体化合物を製造する方法が提供され、Ｒ１は本明細書において上記に示される一般式Ｉ＊を有する二糖類部分であり、ならびにＲ２およびＲ３はそれぞれヒドロキシルである。このような方法は、
（ａ）一般式ＩＩＩを有する化合物を、一般式ＩＩＩ＊：
2009532461.tif 000021
（式中：
破線は、Ｒ配置またはＳ配置を示し；
Ｙ＊は、水素、アルキルまたはアリールであり；
Ｔ＊１−Ｔ＊２の各々は、独立して、ヒドロキシル保護基であり；
Ｑ＊１およびＱ＊２の各々は、独立して、アミン保護基であり；
Ｑ＊３は、アミン保護基およびＡＨＢ部分からなる群から選択され、ＡＨＢ部分は、ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の少なくとも１つを含み；および
Ｘ＊は、酸素または硫黄である）を有する別の化合物とカップリングさせること；ならびに
（ｂ）ヒドロキシル保護基およびアミン保護基の各々を除去し、それにより二量体化合物を得ること
によって行われる。
【０１７６】
二量体化合物は、ホモ二量体化合物であってよく、２つの二糖類が互いに同一である（すなわち、Ｙ、Ｘ、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｔ１およびＴ２ならびにＹ＊、Ｘ＊、Ｑ＊１、Ｑ＊２、Ｑ＊３、Ｔ＊１およびＴ＊２は、それぞれ同一である）か、またはヘテロ二量体であり、２つの二糖類がその中で１つ以上の特徴において異なる。
【０１７７】
本態様の他の好ましい実施形態によると、カップリングは、リンカー（該用語は先に定義されている）を介して実施される。好ましくは、リンカーはアルキルであり、より好ましくは、低級アルキルであり、そして最も好ましくは、リンカーはメチレン基である。
【０１７８】
このように、カップリングは二官能性化合物、好ましくは、二官能性アルキル（例えばメチレン）の存在下で実施され、それは２個の遊離（未保護の）ヒドロキシル基と反応し、それによりその間のカップリングに影響を及ぼす。本明細書で定義されるように、そのような二官能性化合物は、好ましくは２個の脱離基を有する。
【０１７９】
本実施形態によって製造された例示的な化合物は、後続の実施例の部分に示されるように、化合物９を含む。
【０１８０】
後続の実施例の部分で証明されるように、本明細書で示される化合物は、切断変異抑制活性、すなわち終止−コドン突然変異のリードスルーを誘発する能力を有するように設計され、そして実際にそれが示された。そのような活性は、これらの化合物を遺伝子疾患、特に切断変異により特徴づけられる疾患の治療のための治療的に活性な薬物としての使用に適した化合物とする。
【０１８１】
このように、本発明の別の態様によれば、遺伝子疾患を治療する方法が提供される。その方法は、本発明のこの態様にしたがって、それを必要とする被験体に、一般式Ｉを有する治療上有効量の１つ以上の本明細書で示される化合物を投与することにより実施される。
【０１８２】
本発明の本態様の範囲から除外されるのは、本明細書で上記のように、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、フォーチミシン、Ｇ−４１８、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ハベカシン、ネチルマイシン、イスタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、リビドマイシン、ネアミン、ネオマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシンおよび上記された類似体または変形体である。
【０１８３】
本明細書中で使用される場合、用語「治療すること」および「治療」は、病態の進行を止めるか、実質的に阻害するか、遅らせるか、または後退させるか、病態の臨床的または感覚的な徴候を実質的に改善するか、または病態の臨床的または感覚的な徴候の出現を実質的に防止することを含む。
【０１８４】
本明細書中で使用される場合、用語「治療上有効量」は、治療されている病態の徴候の１つ以上をある程度まで取り除いてくれる、投与された高分子の量を言う。
【０１８５】
用語「遺伝子疾患」は、本明細書中で使用される場合、両親からしばしば継承される１つ以上の欠陥遺伝子に起因し、欠陥のある劣性遺伝子の２人の健康なキャリアが子供をつくる場合あるいは欠陥遺伝子が優性である場合に予想外に出現しうる慢性疾患を指す。遺伝子疾患は、異なる遺伝様式で現れ、それは遺伝子の１つの変異したコピーだけが子孫が影響を受けるのに必要である常染色体優性様式、および遺伝子の２つのコピーが子孫が影響を受けるのに変異される必要がある常染色体劣性様式を含むことができる。
【０１８６】
好ましい実施形態によれば、遺伝子疾患は、その不適切な翻訳をもたらす切断変異を有する遺伝子を含む。不適切な翻訳は、必須タンパク質の合成の減少または中止を引き起こす。
【０１８７】
そのような遺伝子疾患の例示として、非制限的には、嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、毛細血管拡張性運動失調、ハーラー症候群、血友病Ａ、血友病Ｂ、アッシャー症候群およびテイ−サックス病が挙げられる。
【０１８８】
したがって、遺伝子疾患を治療するための医薬の製造において、本明細書で示される一般式Ｉを有する化合物の使用が提供される。
【０１８９】
本明細書で記載された方法および使用のいずれにおいても、本明細書に記載される化合物は、それ自身で利用されうるし、または医薬組成物の一部を形成することができ、さらに医薬的に許容される担体を含む。
【０１９０】
このように、さらに本発明によれば、活性成分としての本明細書で記載の新規化合物のいずれかおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【０１９１】
遺伝子疾患（定義により慢性である）の治療に主として向けられているので、本明細書で示される化合物またはそれを含む医薬組成物は、治療される被験体の一生の間、投与されることが予想される。したがって、その化合物を含む医薬組成物の投与様式は、投与のために容易かつ快適であること、好ましくは自己投与による必要があり、それに患者の幸福および生涯のためにできるだけ少額の料金を取るようになっている必要がある。
【０１９２】
本明細書で示された化合物およびそれを含む医薬組成物の反復投与および定期的投与は、例えば、１日単位で、つまり、１日に１度で達成することができ、より好ましくは、投与は週単位で、つまり、週に１度で達成され、より好ましくは、投与は月単位で、つまり、月に１度で達成され、最も好ましくは、投与は数か月に１度（例えば１．５か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、またはさらに６か月毎）に達成される。
【０１９３】
上記で議論したように、切断突然変異リードスルー薬物としての現在公知のアミノグリコシド類の使用に関するいくつかの限界は、それらが主に抗菌性（抗生物質薬物として使われる）であるという事実と関係している。任意の抗菌剤の慢性的な使用は非常に容認され難く、生命さえ脅かされる。それというのもそれが腸内細菌叢を変えて、炎症性腸疾患の紅班などの他の病状を引き起す場合があり、または悪化させる場合があり［６７］、また微生物の若干の病理学的な菌株の耐性の出現を引き起こす場合がある［６８−７１］からである。
【０１９４】
本明細書で示された化合物は、好ましくは、抗菌活性を有しない。「非抗菌活性」により、特定の細菌株に関するその最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、この菌株に関して抗生物質と考えられる化合物の濃度より非常に高いことを意味する。さらに好ましくは、これらの化合物のＭＩＣは、切断変異抑制活性を発揮するために必要な濃度よりかなり高い。
【０１９５】
好ましくは非抗菌性であるので、本明細書で示される化合物は、前記の制限に悩まされず、したがって吸収経路を経由して投与することができ、該経路は、標的とされず、したがってそれらの維持さえ必要である場合がある良性および／または有益な微生物を含むことができる。本明細書で示される化合物の重要な特徴は、慢性病状に対してこれらの化合物を特に効果的な薬物とする。それというのも、それらは繰り返して、生涯の間、いかなる副作用、蓄積作用をもたらすことなく投与することができ、さらに経口的または経腸的に、つまり消化管を通して投与することができ、それは慢性疾患を治療することに向けられた薬物のための非常に役に立つ、重要な特性であるからである。
【０１９６】
好ましい実施形態によれば、本明細書で示される化合物は、真核生物細胞対原核生物細胞に対して選択的であり、すなわち、該化合物は原核生物細胞（例えば、細菌などの細胞）における活性に比べて、真核生物細胞（例えば、哺乳類（ヒト）などの細胞）でより高い活性を示す。どんな特定の理論にも束縛されることなく、本明細書で示される化合物（１６ＳリボソームＲＮＡのＡ−部位と結合することによって作用し、一方でリボソームは、遺伝子を翻訳することに関与することが知られている）は、真核生物のリボソームＡ−部位へのより高い親和性を有するか、さもなければ真核生物のリボソームＡ−部位対原核生物のリボソームＡ−部位に対して選択的であると推定される。
【０１９７】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に示される化合物と、他の化学的成分（例えば、医薬的に許容されかつ好適な担体および賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物体に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１９８】
以降、用語「医薬的に許容される担体」は、生物体に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しない担体または希釈剤を示す。担体の非限定的な例には、プロピレングリコール、生理食塩水、エマルジョン、および有機溶媒と水の混合物、ならびに固体の担体（例えば、粉末状の担体）およびガス状の担体がある。
【０１９９】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０２００】
薬物の配合および投与のための様々な技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０２０１】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々な方法によって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来の方法によって製造することができる。
【０２０２】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、本明細書中に示される化合物を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む一つ以上の医薬的に許容される担体を使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０２０３】
好ましい実施形態によれば、最も好ましい投与経路は経口的に達成される。経口投与の場合、本明細書中に示される化合物は、化合物を、この分野で十分に知られている薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に配合することができる。そのような担体により、本明細書中に示される化合物は、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０２０４】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された活性成分を含有し得る。軟カプセルでは、本明細書中に示される化合物を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０２０５】
注射の場合、本明細書中に示される化合物は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る、緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩水緩衝液など）であって、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールの如き有機溶媒を含むまたは含まない緩衝液において配合することができる。
【０２０６】
経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０２０７】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性なアミノグリコシド化合物の量を明らかにするために、または活性なアミノグリコシド化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０２０８】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０２０９】
吸入による投与の場合、本明細書中に示される化合物は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物（典型的には、粉末状の担体、液状の担体、および／またはガス状の担体を含む）の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器で使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、本明細書中に示される化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０２１０】
本明細書中に示される化合物は非経口投与、例えばボーラス注射または連続点滴のために配合されることができる。注射のための配合は、単位用量形態（例えばアンプルまたは多用量コンテナ）で提供されることができ、これらには所望により保存剤が添加されている。組成物は懸濁物、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルジョンであることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤の如き配合剤を含むことができる。
【０２１１】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態における化合物調製物の水溶液が含まれる。さらに、本明細書中に示される化合物の懸濁物を、適切なオイル状の注射用懸濁物およびエマルジョン（例えば、油中水型、水中油型、または油エマルジョン中の油中水型）として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有し得る。場合により、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために本明細書中に示される化合物の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。
【０２１２】
あるいは、本明細書中に示される化合物は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にする。
【０２１３】
本明細書中に示される化合物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０２１４】
本明細書中に記載される医薬組成物はまた、固相またはゲル相の好適な担体または賦形剤を含むことができる。そのような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー（例えば、ポリエチレングリコールなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１５】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、活性成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果がある量は、処置されている被験体の疾患の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは、処置されている被験体の生存を延ばすために効果的な本明細書中に示される化合物の量を意味する。
【０２１６】
治療効果がある量の決定は十分に当業者の範囲内であり、特に本願明細書で与えられる詳細な開示に鑑みればそうである。
【０２１７】
本実施形態の方法に使用される本明細書中に示される化合物に対して、治療的に有効な量または用量は最初に動物における活性アッセイから推定されることができる。例えば、活性アッセイによって測定されるような変異抑制レベルを含む循環濃度範囲（例えば切断変異の実質的なリードスルーを達成する試験化合物の濃度）を達成するために、用量は動物モデルで配合されることができ、かかる情報は人間に有用な用量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２１８】
本明細書中に示される化合物の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば対象化合物についてＥＣ５０（最大効果の５０％が観察される化合物の濃度）およびＬＤ５０（試験された動物の５０％の死を生ずる致死量）を測定することによって明らかにすることができる。これらの活性アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。
【０２１９】
投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」（第１章、１頁）を参照のこと）。
【０２２０】
投薬量および投薬間隔を、望ましい効果を維持するために十分である本明細書中に示される化合物の血漿中レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータ（例えば、切断変異、すなわち変異コドンのリードスルーを有する遺伝子全体の発現の５０％〜９０％を達成するために必要な化合物の濃度）から推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
【０２２１】
投薬間隔もまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、時間の１０％〜９０％について、好ましくは３０％〜９０％の間、最も好ましくは５０％〜９０％の間、ＭＥＣを越える血漿中レベルを維持する治療法を使用して投与されなければならない。
【０２２２】
処置される慢性状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は上述の徐放性組成物の単回投与であることも可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、定期的な処置の間に十分な改善が達成されるまで、または、定期的な処置の間に疾患状態の実質的な縮小が達成されるまで続く。
【０２２３】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている被験体、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。
【０２２４】
本発明の組成物は、所望される場合には、活性成分を含有する１つまたは複数の単位用量形態を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ（食品医薬品局）承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックまたは（吸入用の）加圧容器などである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴うことがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本実施形態による化合物を含む組成物はまた、本明細書において上記に詳述されるように、適応される状態の処置または診断をするために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０２２５】
従って、好ましい実施形態において、医薬組成物は、本明細書で規定されたように、包装材で包装されて、遺伝子疾患の治療で使用するために、包装材料中にまたは包装材料上に印刷されて識別される。
【０２２６】
本明細書において記載される組成物、方法および使用のいずれにおいても、化合物は遺伝子疾患の治療に有用な他の薬剤と組み合わせて利用されることができる。
【０２２７】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０２２８】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０２２９】
実施例１
化学合成
材料および方法：
１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、分極移動による無歪感度増大法（１Ｄ  ＤＥＰＴ）、全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、異種核多量子相関法（ＨＭＱＣ）および異核種間遠隔相関分光法（ＨＭＢＣ）のスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ（商標）５００分光計で記録した。ｐｐｍで報告される化学シフトは、溶媒としてＣＤＣｌ３を用いた内部標準Ｍｅ４Ｓｉ（δ＝０．０）および溶媒としてＤ２Ｏを用いたＨＯＤ（水素オンデマンド、δ＝４．６３）に相対的である。
【０２３０】
質量分光分析を、電気噴霧電離質量測定（ＥＳＩＭＳ）条件のためのＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｘ  Ａｐｅｘ  ３の質量分析計で、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ条件下、ＴＳＱ−７０Ｂ質量分光計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｍａｔ）ＭＡＬＤＩ微細質量分光計で、α−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸マトリックスを使用して行った。
【０２３１】
反応をシリカゲル（ゲル６０  Ｆ２５４、０．２５ｍｍ、メルク）上でＴＬＣによってモニタリングし、スポットを１０％Ｈ２ＳＯ４（８００ｍｌ）中（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ（１２０グラム）と（ＮＨ４）２Ｃｅ（ＮＯ３）６（５グラム）とを含む黄色溶液で炭化することによって視覚化した。
【０２３２】
フラッシュカラムクロマトグラフィを、シリカゲル「ゲル６０」（７０〜２３０メッシュ）で実施した。
【０２３３】
反応を全てアルゴン雰囲気下で実施し、特に明記しない限り、無水溶媒を使用した。
【０２３４】
化学薬品は全て、特に明記しない限り、一般の販売業者から得た。
【０２３５】
一般的な合成概要：
一連の新規化合物を、中途終止突然変異に起因するヒトの遺伝子疾患の治療のために、本実施形態にしたがって設計した。全ての化合物を、パロモマイシンに由来するパロマミンから誘導した。
【０２３６】
化合物２〜９を、図２に示す経路に従って合成した。図２で分かるように、基本的な合成は、二糖類パロマミン（ここでは、化合物１と称される）へのルイス酸で促進されたパロモマイシンの直接的な切断を含み、したがって、設計された化合物の製造に共通の出発原料として使用される。下記の合成で使用される保護基を、結合および除去のそれらの容易性、ならびに反応条件下でのそれらの安定性に基づいて選択した。Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）［７２］を用いるチオグリコシドのグリコシド化方法およびＢＦ３［７３］を用いるトリクロロアセチミデートのグリコシド化方法は、迅速かつ効率的の両方であることが分かった。リボフラノシド供与体である化合物１４ａ、１４ｂ、１５ａおよび１５ｂ（下記スキーム１参照）のＣ−２位でのベンゾアートエステルによる保護は、化合物２〜７における隣接基関与により、環ＩＩＩとパロマミン部分との間での選択的なβ−グリコシド結合形成が可能となるように特別に設計した。
2009532461.tif 000022
【０２３７】
上記のスキーム１で見られる試薬および条件は以下を含む：（ａ）ＴｆＮ３、Ｅｔ３Ｎ、ＣｕＳＯ４（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中、３：１０：３）；（ｂ）Ａｃ２Ｏ（４．２当量）、ピリジン、−６℃；（ｃ）シクロヘキサノンジメチルケタール、ＣＳＡ、ＤＭＦ、１１０℃；（ｄ）ＢｚＣｌ、ピリジン；（ｅ）ＴＦＡ／Ｈ２Ｏの５：３、ＴＨＦ、４０℃；（ｆ）アニスアルデヒド−ジメチルアセタール、ＣＳＡ、ＤＭＦ、５０℃；および略語は以下の通りである：Ｔｆ＝トリフルオロメタンスルホニル、ＣＳＡ＝カンファースルホン酸、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、Ｂｚ＝ベンゾイル、ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、ＰＭＰ＝ｐ−メトキシフェニル。
【０２３８】
化合物２〜７の製造は、３つの適切に保護された異なるパロマミン受容体、すなわち、化合物１１〜１３を使い、それらはＣ５、Ｃ６、およびＣ３’位でパロマミン部分のヒドロキシル基をグリコシド化反応に対して選択的に露出し、Ｃ５ヒドロキシル基を反応に対して最も感受性とし、Ｃ３’ヒドロキシル基を最も弱い感受性とした。これらの受容体分子は、上記のスキーム１中で示されるようにパロマミン（化合物１）から容易に入手できた。
【０２３９】
化合物１０の無水酢酸による低温での位置選択的アシル化は、受容体化合物１１を６５％の収率で与えた［７４］。別の経路では、シクロヘキサノンジメチルケタールによる化合物１０の処理は、第２の受容体である化合物１２を与え、Ｃ３’位のヒドロキシル基を除いて、すべての官能基を保護した。化合物１２のベンゾイル化の後に酸加水分解およびベンジリデンアセタール形成工程が続いて、第３の受容体である化合物１３を全３工程に対して８６％の単離収率で得た。
【０２４０】
次いで、パロマミン受容体化合物１１〜１３を、２組のグリコシル供与体、すなわち化合物１４ａ〜１４ｂと化合物１５ａ〜１５ｂとを用いてグリコシル化反応に別々に付して、下記のスキーム２で示されるように、設計された保護誘導体化合物１６〜１８を６８〜９５％の全収率で提供した。以下に示されるように、化合物１６〜１８の構造を、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、２Ｄ−ＣＯＳＹ、および１Ｄ  ＴＯＣＳＹ  ＮＭＲ分光法を含むいろいろな分光技術の組合せによって確認した。次いで、これらの保護された化合物を、２段階または３段階のいずれかの脱離反応に付した：メチルアミン（ＥｔＯＨ中３３％溶液）処理によるすべてのエステルの除去、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応によるすべてのアジド基の還元反応、ならびにトリフルオロ酢酸水溶液でのＯ−ベンジリデンアセタールおよびシクロヘキシリデンケタールの加水分解は、下記のスキーム２で見られるように、最終的な化合物２〜７を優れた純度および単離収率で与えた。
2009532461.tif 000023
【０２４１】
上記スキーム２で見られる試薬および条件は、以下を含む：（ａ）化合物１５ａまたは化合物１５ｂ、ＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（触媒量）、ＣＨ２Ｃｌ２、４Åのモレキュラーシ−ブ、化合物１１→化合物１６ａ（８５％）、化合物１１→化合物１６ｂ（７１％）、化合物１２→化合物１８ａ（９５％）、化合物１２→化合物１８ｂ（９３％）；（ｂ）（ｉ）ＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液）、（ｉｉ）ＰＭｅ３（ＴＨＦ中１Ｍ）、ＮａＯＨ  ０．１Ｍ、ＴＨＦ、室温；化合物１６ａ→化合物２（８４％）、化合物１６ｂ→化合物３（９１％）、化合物１７ａ→化合物４（２工程に対して７５％）、化合物１７ｂ→化合物５（４４％）、化合物１８ａ→化合物６（８４％）、化合物１８ｂ→化合物７（７５％）；（ｃ）化合物１４ａまたは化合物１４ｂ  ＮＩＳ、ＴｆＯＨ（触媒量）、ＣＨ２Ｃｌ２、４Åのモレキュラーシ−ブ、化合物１３→化合物１７ａ（６８％）、化合物１３→化合物１７ｂ（７６％）；（ｄ）化合物１７ａに関してＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ  ６：１、ＴＨＦ  ５０℃、化合物１７ｂ（５２％）に関してＴＦＡ／Ｈ２Ｏ  ３：２、ＴＨＦ、６０℃°、化合物１８ａ（７５％）に関してＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ  １０：３、１，４−ジオキサン、化合物１８ｂ（８２％）に関してＴＦＡ／Ｈ２Ｏ  ５：１、ＴＨＦ、５０℃；および略語は次のとおりである：ＰＭＰ＝ｐ−メトキシフェニル、ＮＩＳ＝Ｎ−ヨードスクシンイミド、Ｔｆ＝トリフルオロメタンスルホニル、ＣＳＡ＝カンファースルホン酸、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、Ｂｚ＝ベンゾイル，ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸。
【０２４２】
下記のスキーム３は、化合物８〜９の製造を示す。Ｄ−アロ配置を有する化合物８中の環Ｉを、Ｃ３’位で選択的に配置を反転することによって、化合物１から製造した。化合物１２におけるＣ３’位のヒドロキシル基のトリフルオロメタンスルホニル化の後に、アジドによる求核的置換により対応するシス−ジアジド化合物１９を２工程に対して８２％の収率で得た。シクロヘキシリデンケタールの酢酸水溶液による加水分解、次いで上記したような２段階脱保護により、設計された化合物８を６８％の収率で提供した。同じ受容体化合物１２をＮａＨの存在下、ＣＨ２Ｂｒ２で処理して、保護された二量体化合物２０を８２％の収率で得て、化合物１９の場合のように同様の３段階脱保護により、所望の二量体化合物９を８６％の収率で得た。
2009532461.tif 000024
【０２４３】
上記スキーム２で見られる試薬および条件は次を含む：（ａ）Ｔｆ２Ｏ、ピリジン、（９２％）；（ｂ）ＮａＮ３、ＤＭＦ、ＨＭＰＡ、（７２％）、（ｃ）化合物１９に対してはＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ  ８：１、１、４−ジオキサン、７５℃、（６０％）、化合物２０に対しては、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ  ５：６、ＴＨＦ、６０℃、（９０％）；（ｄ）（ｉ）ＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液）、（ｉｉ）ＰＭｅ３（ＴＨＦ中１Ｍ）、ＮａＯＨ  ０．１Ｍ、ＴＨＦ、室温；化合物１９→化合物８（７６％）、化合物２０→化合物９（８１％）、（ｅ）ＣＨ２Ｂｒ２、ＮａＨ、ＤＭＦ／ＨＭＰＡ  ２：１、４Åモレキュラーシ−ブ、（８２％）、および略語は次のとおりである：ＨＭＰＡ＝ヘキサメチルホスホルアミド。
【０２４４】
化合物１０に基づいて、中間体化合物１０−ＡＨＢ（参照：下記のスキーム４）は、パロマミン核を有しているが、さらに、それはＮ１位での（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）置換を含む。Ｎ１−ＡＨＢ置換は、リードスルー活性および毒性の両方をさらに改善することが期待される。この期待は、アミカシンがＣＦＴＲタンパク質の修復に対してゲンタマイシンより良好に機能するという最近の観察［７５］により支持される。カナマイシンＡ（Ｎ１位でのＡＨＢ置換の不在のみがアミカシンと異なる）は、何らのリードスルー活性も示さない［６］。
【０２４５】
中間体化合物２１および２３（参照：下記のスキーム４）は、それぞれＧ−４１８およびゲンタマイシンに対応する。化合物２１および２３は、より良好な腎毒性および細胞毒性を達成するためにＣ６’−ジアステレオマーの混合物と分離されたＣ６’−ジアステレオマーとを製造するのに用いる。この立体化学の問題は、ゲンタマイシンＣ２で試験［６４］したが、Ｇ−４１８のＣ６’−ジアステレオマーは文献に見当たらない。３’−ＯＨ基および４’−ＯＨ基を、ゲンタマイシンＣ２に関して観察されるようにさらに毒性を減らす試みにおいて、化合物２３に付加する。構造−活性研究のために、中間体化合物２１および２３の環ＩＩをさらに修飾するための試みにおいて、中間体化合物２２および２４は、Ｇ−４１８およびアミカシン（化合物２２に対応する）またはゲンタマイシンおよびアミカシン（化合物２４に対応する）の官能基を１つの分子中で組み合わせている。
2009532461.tif 000025
【０２４６】
５つの全ての化合物１０−ＡＨＢ、２１、２２、２３および２４の製造は、共通の出発原料としてパロモマイシンから容易に入手できるパロマミン（化合物１）を用いて開始する［７６］：ＣｂｚによるＮ２’およびＮ３における化合物１の選択的保護、続いて公開された手順［７７−８０］にしたがって、化合物１の対応するＮ１−ＡＨＢ誘導体を得るために、ＡＨＢ（ＮＯＳ−ＡＨＢ−Ｃｂｚ）の活性エステルで処理し、この中間体をＰｄ／Ｈ２で処理して化合物１０−ＡＨＢを得る。
【０２４７】
パロマミン１へのＡＨＢの導入のための類似した工程、引き続く選択的なアセチル化によりＣ５−受容体化合物２５を与え、化合物２５と５”−アジドリボース［７６］のトリクロロアセタミデ−ト供与体とのカップリング、続いての脱保護工程により、下記のスキーム５に示すように設計された擬似三糖類化合物２６を与える。Ｇ−４１８へのＡＨＢの導入のための類似した工程およびその後の脱保護工程は、そのＮ１−ＡＨＢ類似体化合物２７を与える（参照：スキーム５）。
2009532461.tif 000026
【０２４８】
上記スキーム５で見られる試薬および条件は次を含む：（ａ）（ｉ）Ｃｕ（ＯＡｃ）２、Ｎｉ（ＯＡｃ）２、Ｃｂｚ−ＮＯＳ；（ｉｉ）ＮＯＳ−ＡＨＢ−Ｃｂｚ、ＤＣＣ、ＨＯＢＴ；（ｉｉｉ）４．２当量のＡｃ２Ｏ、Ｐｙ、−７℃；（ｂ）（ｉ）ＢＦ３−ＯＥｔ２、ＤＣＭ／ＭｅＣＮ；（ｉｉ）ＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液）；（ｉｉｉ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ジオキサン、ＡｃＯＨ；（ｃ）（ｉ）Ｚｎ（ＯＡｃ）２、Ｃｂｚ−ＮＯＳ；（ｉｉ）ＮＯＳ−ＡＨＢ−Ｃｂｚ、ＤＣＣ、ＨＯＢＴ；および（ｄ）Ｐｄ／Ｃ、Ｈ２、ジオキサン、ＡｃＯＨ。
【０２４９】
化合物２１の製造のために、下記のスキーム６で示されるように、パロマミンを一連の７つの工程に付して化合物２８をＣ６’−ジアステレオマー混合物として得る。これらのジアステレオマー混合物の絶対立体化学を決定するために、各々をベンズアルデヒドジメチルアセタールで処理して対応するベンジリデンアセタールの化合物２９（エクアトリアルまたはアキシアルのＣ６’−メチル基を有する）を与える。各々のジアステレオマー中のＣ６’−プロトンのカップリング定数とともに、Ｃ５’−プロトンを有するこれらのメチレン基のＮＯＥスペクトルは、Ｃ６’−中心での絶対配置の決定を可能にする。同様に、ゲンタマイシン誘導体化合物２３のＣ６’位における絶対配置を決定する。この趣旨で、化合物２８を最初に対応するアミン化合物３０に変換して、Ｔｒｏｃによる保護およびＮａＨによる処理の後に、対応する環状のオキサゾリジノン化合物３１を与える。化合物２８および化合物３０の各々のジアステレオマーを、その後、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応に付し、上記スキーム５で示されているように、同様の一連の反応により対応するＮ１−ＡＨＢ誘導体化合物２２および化合物２４を与える。
2009532461.tif 000027
【０２５０】
上記スキーム６で見られる試薬および条件は次を含む：（ａ）（ｉ）ＴｆＮ３、Ｃｕ（ＩＩ）；（ｉｉ）ＴＩＰＳＣｌ、Ｐｙ；（ｉｉｉ）ＰＭＢＣｌ、ＮａＨ、ＤＭＦ；（ｉｖ）ＨＦ／Ｐｙ；（ｖ）Ｓｗｅｒｎ酸化；（ｖｉ）ＭｅＭｇＢｒ、Ｅｔ２Ｏ；（ｖｉｉ）ＴＦＡ；（ｂ）Ｐｈ（ＯＭｅ）２、ＣＳＡ；（ｃ）（ｉ）シクロヘキサノンジメチルケタール、ＣＳＡ；（ｉｉ）Ｓｗｅｒｎ酸化；（ｉｉｉ）ＮＨ３、ＮａＢＣＮＨ３、ＭｅＯＨ；（ｉｖ）ＡｃＯＨ、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ；および（ｄ）（ｉ）ＴｒｏｃＣｌ、ＤＣＭ、Ｅｔ３Ｎ；（ｉｉ）ＮａＨ、ＤＭＦ。
【０２５１】
類似した合成経路を用いて、下記スキーム７およびスキーム８で示される３系列の化合物を、化合物の各系列に対する対応する受容体化合物、すなわち第１系列に対する中間体化合物３２（スキーム７）、第２系列に対する中間体化合物３３および第３系列に対する中間体化合物３４（スキーム８）ならびに３つの異なる供与体化合物１４ｂ、３５および３６を用いて製造する。供与体化合物３５および３６を、所望の１，２−シス−グリコシド結合形成を可能にするために、Ｃ２−ＯＨの位置でのエーテル保護（化合物３５ではｐ−メトキシベンジルおよび化合物３６ではベンジル）により特別に設計する。
2009532461.tif 000028
【０２５２】
供与体化合物３５を、以下の工程でゲンタマイシンから良好な単離収率で得た：ＭｅＯＨ、ＡｃＣｌ、還流（９０％収率）；ＴｒｏｃＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＣＨＣ１３／Ｈ２Ｏ（９３％収率）；ＢｚＣｌ、Ｐｙ（７０％収率）；ＴｏｌＳＨ、ＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（５３％収率）；ＥｔＯＨ中ＭｅＮＨ２（９０％収率）；ＮａＨ、ＰＭＢＣｌ、ＴＢＡＩ（８２％収率）。化合物３５でのオキサゾリジノン保護は、標準的なグリコシル化反応の下では非常に効率的であることが分かった。このオキサゾリジノン環は、加熱しながらの塩基性（ＮａＯＨ）Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ条件下で、自発的な開環を受ける。このように、上記スキーム７で概して示すように、受容体３２の供与体１４ｂ、３５または３６のいずれかとのカップリング、続いての脱保護工程は、所望の化合物３、３７〜４１を与えた。
【０２５３】
供与体化合物３５を、以下の工程でゲンタマイシンから良好な単離収率で得た：ＭｅＯＨ、ＡｃＣｌ、還流（９０％収率）；ＴｒｏｃＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＣＨＣ１３／Ｈ２Ｏ（９３％収率）；ＢｚＣｌ、Ｐｙ（７０％収率）；ＴｏｌＳＨ、ＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（５３％収率）；ＥｔＯＨ中ＭｅＮＨ２（９０％収率）；ＮａＨ、ＰＭＢＣｌ、ＴＢＡＩ（８２％収率）。化合物３５でのオキサゾリジノン保護は、標準的なグリコシル化反応の下では非常に効率的であることが分かった。このオキサゾリジノン環は、加熱しながらの塩基性（ＮａＯＨ）Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ条件下で、自発的な開環を受ける。このように、上記スキーム７で示すように、受容体３２と供与体、すなわち化合物１４ｂ、３５または３６のいずれかとのカップリング、続いての脱保護工程は、所望の化合物３、３７〜４１を与える。
【０２５４】
同様に、これらの供与体（化合物１４ｂ、３５および３６）と適切な受容体、すなわち化合物３３または３４とのカップリング（ＮＩＳ、ＡｇＯＴｆ、Ｅｔ２Ｏ／ＣＨ２Ｃｌ２）は、対応する保護された化合物を提供し、これらは標準的な脱保護工程の後で、下記のスキーム８で示すように、化合物４２〜５３の所望のＣ５−およびＣ６−結合誘導体を与える。
2009532461.tif 000029
【０２５５】
次の例は、スキーム１〜３で先に概説されるように、化合物２〜９に至る化合物を製造するための詳細な合成手順を示す。
【０２５６】
パロマミン（化合物１）の製造：
2009532461.tif 000030
化合物１を、Ｓｗａｙｚｅおよび共同研究者らの発表された手順［７４］をいくらか改変して、ルイス酸促進によるパロモマイシンの直接的切断により製造した。
【０２５７】
塩化アセチル（３５ｍｌ）を、０℃で１０分間かけて無水メタノール（２１５ｍｌ）の攪拌溶液に添加した。さらに約１５分間攪拌した後、市販のパロモマイシン硫酸塩サンプル（２５グラム、３１．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応は７０℃で加熱還流した。反応の進行は、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を用いてＴＬＣによってモニタリングし、４時間後に反応の完了を示した。反応混合物を冷凍庫で約２時間冷却し、濾過し、残渣を最小量の水に溶解させた。この濃縮水溶液を冷エタノール（５００ｍｌ、０℃）に滴下して加え、生成したエマルジョンを冷凍庫に約２時間置いた。混合物を濾過し、残渣を真空乾燥して化合物１を白色固体（１２．５ｇ、９４％収率）として得た。
【０２５８】
化合物１の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐＨ＝３．５）データは、下記の表１に要約される。
2009532461.tif 000031
【０２５９】
2009532461.tif 000032
Ｃ１２Ｈ２５Ｎ３Ｏ７  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：３４７．２；実測値  ｍ／ｅ：３４７．２。
【０２６０】
化合物１０の製造：
2009532461.tif 000033
化合物１０を、化合物１の全てのアミン基をＴｆＮ３で処理して対応するアジド基に同時変換して化合物１０を９０％の収率で得る発表された手順［８１］に従って、化合物１（パロマミン）から製造した。
【０２６１】
化合物１１の製造：
2009532461.tif 000034
化合物１１を、Ｓｗａｙｚｅｓおよび共同研究者らの発表された手順［７４］に以下の改変をおこなって、過アジド誘導体である化合物１０から無水酢酸による位置選択的アセチル化により低温で製造した。
【０２６２】
発表された手順［８１］によって製造された化合物１０（２グラム、５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（５ｍｌ）に溶解し、得られた混合物を−６℃に冷却し、その後、無水酢酸（４．２当量、２．６５ｍｌ）をそれへ添加した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）によってモニタリングし、８時間後に反応の終了を示した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈して、ＨＣｌ（２％）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液とおよび塩水で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して化合物１１（１．８４グラム、６５％収率）を得た。
【０２６３】
Ｃ２０Ｈ２７Ｎ９Ｏ１１  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：５９２．２；実測値  ｍ／ｅ：５９２．２。
【０２６４】
化合物１２の製造：
2009532461.tif 000035
シクロヘキサノンジメチルケタール（３０ｍｌ、２００ｍｍｏｌ）および触媒量のカンファースルホン酸（ＣＳＡ）を、化合物１０（８．９グラム、２２．２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（３０ｍｌ）溶液に加えた。反応系を５０℃で１時間攪拌し、反応の進行をＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ）によってモニタリングし、出発原料の完全な消費を示した。その後、反応系を油浴中で１１０℃まで加熱し、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）によってモニタリングし、４時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１２（８．５グラム、６７％収率）を得た。
【０２６５】
2009532461.tif 000036
【０２６６】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝（そうでないことを示さない場合、２２．４〜３７．８の範囲はシクロヘキサノン炭素原子に関する）２２．５，２２．８，２３．７（２Ｃ），２４．９，２５．５，２７．８，３３．９，３６．０，３６．３，３７．８，５７．２，６０．４，６１．５（Ｃ−６’），６１．９，６４．０，６８．７，７３．７，７６．８，７９．３，７９．４，９７．０（Ｃ−１’），９９．１（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール），１１３．７（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール）。
【０２６７】
Ｃ２４Ｈ３５Ｎ９Ｏ７  Ｎａに対するＥＳＩＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：５８４．３；実測値  ｍ／ｅ：５８４．３。
【０２６８】
化合物１３ｅの製造：
2009532461.tif 000037
化合物１２（２．５グラム、４．４５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２０ｍｌ）に溶解し、４−ジメチルアミノピリジン（０．５グラム、４．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で５分間攪拌し、その後、塩化ベンゾイル（１．３ｍｌ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）によってモニタリングし、約８時間後に反応の終了を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ＨＣｌ（２％）、Ｈ２Ｏおよび塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。
【０２６９】
粗生成物をＴＦＡ（５ｍｌ）と水（３ｍｌ）とを加えたＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解した。反応混合物を４０℃で８時間攪拌し、その間、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、７：３）によってモニタリングした。反応混合物をさらに処理することなくフラッシュクロマトグラフィ（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって直接精製して化合物１３ｅ（２グラム、８９％の全収率）を得た。
【０２７０】
2009532461.tif 000038
【０２７１】
2009532461.tif 000039
【０２７２】
Ｃ１９Ｈ２３Ｎ９Ｏ８  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：５２８．２；実測値  ｍ／ｅ：５２８．２。
【０２７３】
化合物１３の製造：
2009532461.tif 000040
１−（ジメトキシメチル）−４−メトキシベンゼン（１．３ｍｌ、７．６ｍｍｏｌ）および触媒量のＣＳＡを、乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解された化合物１３ｅ（１．９３グラム、３．８２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を５０℃で攪拌し、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）によってモニタリングし、８時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１３（２グラム、８４％収率）を得た。
【０２７４】
2009532461.tif 000041
【０２７５】
2009532461.tif 000042
【０２７６】
Ｃ２７Ｈ２９Ｎ９Ｏ９  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：６２３．２；実測値  ｍ／ｅ：６２３．２。
【０２７７】
ｐ−メチルフェニル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−１−チオ−Ｄ−リボフラノース（化合物１４ａ）の製造：
2009532461.tif 000043
４−メチルベンゼンチオール（０．６グラム、４．８３ｍｍｏｌ）およびＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１．５ｍｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍｌ）に溶解された１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノース（２．０グラム、３．９６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。得られた混合物をアルゴン雰囲気下、室温で攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）によってモニタリングし、８時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で中和し、塩水で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して化合物１４ａ（２．０グラム、８９％収率）をアノマー混合物（α／β  ３：５）として得た。
【０２７８】
αアノマーのスペクトル分析：
2009532461.tif 000044
【０２７９】
βアノマーのスペクトル分析：
2009532461.tif 000045
【０２８０】
Ｃ３３Ｈ２８Ｏ７Ｓ  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：５９１．２；実測値  ｍ／ｅ：５９１．３。
【０２８１】
５−デオキシ−５−アジド−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−１−Ｏ−トリクロロアセチミド−Ｄ−リボフラノース（化合物１５ｂ）の製造：
2009532461.tif 000046
Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ、０．８ｇ、４．４１ｍｍｏｌ）を化合物１４ｂ（１．８グラム、３．６７ｍｍｏｌ）（発表された手順［８２］に従って製造された）の−１０℃に冷却されたアセトン（３０ｍｌ）溶液に加え、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）によってモニタリングし、２時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、ＮＨ４Ｃｌおよび塩水で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して所望のアノマーアルコールを得た。
【０２８２】
該中間体アルコールを乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）に溶解し、ＣＣｌ３ＣＮ（１．７ｍｌ、１１．８ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（２００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）をそれに加えた。混合物を室温で攪拌し、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）によってモニタリングし、８時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトで濾過した。セライトをＣＨ２Ｃｌ２で十分に洗浄し、蒸発乾固して化合物１５ｂ（１．８９グラム、９７％の合計収率）をアノマー混合物（α／β  １：９）として得た。
【０２８３】
αアノマーのスペクトル分析：
2009532461.tif 000047
【０２８４】
Ｃ１９Ｈ１７Ｎ３Ｏ６  Ｎａに対するＥＳＩＭＳ（［Ｍ−Ｃ２ＮＣｌ３＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：４０６．１；実測値  ｍ／ｅ：４０６．１。
【０２８５】
化合物１６ａの製造：
2009532461.tif 000048
無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を粉末状の火炎乾燥した４Åモレキュラーシーブ（５００ｍｇ）に加え、受容体化合物１１（３００ｍｇ、０．５２７  ｍｍｏｌ）（上記に示されるように製造された）および供与体化合物１５ａ（１．１５グラム、１．８９６ｍｍｏｌ）（公表された手順［８２］に従って製造された）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次に、−４０℃まで冷却した。その後、触媒量のＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１０μｌ）を反応混合物に加え、−１５℃で攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）によってモニタリングし、１．５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトで濾過した。セライトをＣＨ２Ｃｌ２で十分に洗浄後、洗液を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１６ａ（４５２ｍｇ、８５％の収率）を得た。
【０２８６】
化合物１６ａの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表２に要約される。
2009532461.tif 000049
【０２８７】
2009532461.tif 000050
【０２８８】
2009532461.tif 000051
【０２８９】
Ｃ４６Ｈ４７Ｎ９Ｏ１８  Ｋに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｋ］＋）ｍ／ｅの計算値：１０５２．３；実測値  ｍ／ｅ：１０５２．４。
【０２９０】
化合物１６ｂの製造：
2009532461.tif 000052
【０２９１】
無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を粉末状の火炎乾燥した４Åモレキュラーシーブ（５００ｍｇ）に加え、受容体化合物１１（３００ｍｇ、０．５２７ｍｍｏｌ）および供与体化合物１５ｂ（１グラム、１．８９６ｍｍｏｌ）（ともに上記に示されるように製造された）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次に、−４０℃まで冷却した。その後、触媒量のＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１０μｌ）を反応混合物に加え、−１５℃で攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）によってモニタリングし、１．５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトで濾過した。セライトをＣＨ２Ｃｌ２で十分に洗浄後、洗液を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１６ｂ（３５０ｍｇ、７１％の収率）を得た。
【０２９２】
化合物１６ｂの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表３に要約される。
2009532461.tif 000053
【０２９３】
2009532461.tif 000054
【０２９４】
2009532461.tif 000055
Ｃ３９Ｈ４２Ｎ１２Ｏ１６  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：９５７．３；実測値  ｍ／ｅ：９５７．５。
【０２９５】
化合物１７ａの製造：
2009532461.tif 000056
無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を粉末状の火炎乾燥した４Åモレキュラーシーブ（８００ｍｇ）に加え、受容体化合物１３（４２０ｍｇ、０．６７４ｍｍｏｌ）および供与体化合物１４ａ（３３４ｍｇ、０．８０８ｍｍｏｌ）（ともに上記に示されるように製造された）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次に、Ｎ−ヨードスクシニミド（ＮＩＳ、２９０ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、室温で５分間攪拌した。その後、反応混合物を−４０℃まで冷却し、触媒量のＴｆＯＨ（１０μｌ）を反応混合物に加えた。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）によってモニタリングし、２時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトで濾過した。セライトをＥｔＯＡｃで十分に洗浄後、洗液を合わせ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１７ａ（４９０ｍｇ、６８％の収率）を得た。
【０２９６】
化合物１７ａの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表４に要約される。
2009532461.tif 000057
【０２９７】
2009532461.tif 000058
【０２９８】
2009532461.tif 000059
【０２９９】
Ｃ５３Ｈ４９Ｎ９Ｏ１６  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：１０９０．３；実測値  ｍ／ｅ：１０９０．３。
【０３００】
化合物１７ｂの製造：
2009532461.tif 000060
無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を粉末状の火炎乾燥した４Åモレキュラーシーブ（５００ｍｇ）に加え、受容体化合物１３（３５０ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）および供与体化合物１４ｂ（３３４ｍｇ、０．６８２ｍｍｏｌ）（ともに上記に示されるように製造された）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次に、ＮＩＳ（２９０ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、室温で５分間攪拌した。その後、反応混合物を−４０℃まで冷却し、触媒量のＴｆＯＨ（１０μｌ）を反応混合物に加えた。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）によってモニタリングし、２時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトで濾過した。セライトをＥｔＯＡｃで十分に洗浄後、洗液を合わせ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１７ｂ（４２０ｍｇ、７６％の収率）をアノマー混合物（α／β  １：５）として得た。
【０３０１】
化合物１７ｂの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表５に要約される。
2009532461.tif 000061
【０３０２】
2009532461.tif 000062
【０３０３】
2009532461.tif 000063
【０３０４】
Ｃ４６Ｈ４４Ｎ１２Ｏ１４  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：１０１１．３；実測値  ｍ／ｅ：１０１１．６。
【０３０５】
化合物１８ａの製造：
2009532461.tif 000064
無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を粉末状の火炎乾燥した４Åモレキュラーシーブ（５００ｍｇ）に加え、受容体化合物１２（２００ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）および供与体化合物１５ａ（３００ｍｇ、０．４９４ｍｍｏｌ）（ともに上記に示されるように製造された）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次に、−４０℃まで冷却した。その後、触媒量のＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１０μｌ）を反応混合物に加え、−２０℃で攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１５：８５）によってモニタリングし、３時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトで濾過した。セライトをＣＨ２Ｃｌ２で十分に洗浄後、洗液を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１８ａ（３４０ｍｇ、９５％の収率）を得た。
【０３０６】
化合物１８ａの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表６に要約される。
2009532461.tif 000065
【０３０７】
2009532461.tif 000066
【０３０８】
2009532461.tif 000067
【０３０９】
Ｃ５０Ｈ５５Ｎ９Ｏ１４  Ｎａに対するＥＳＩＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：１０４４．４；実測値  ｍ／ｅ：１０４４．４。
【０３１０】
化合物１８ｂの製造：
2009532461.tif 000068
無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）を粉末状の火炎乾燥した４Åモレキュラーシーブ（５００ｍｇ）に加え、受容体化合物１２（３４０ｍｇ、０．６０５ｍｍｏｌ）および供与体化合物１５ｂ（６００ｍｇ、１．１０７ｍｍｏｌ）（ともに上記に示されるように製造された）を加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次に、−２０℃まで冷却した。その後、触媒量のＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１０μｌ）を反応混合物に加え、−２０℃で攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１５：８５）によってモニタリングし、３時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトで濾過した。セライトをＣＨ２Ｃｌ２で十分に洗浄後、洗液を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して化合物１８ｂ（５２０ｍｇ、９３％の収率）を得た。
【０３１１】
化合物１８ｂの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表７に要約される。
2009532461.tif 000069
【０３１２】
2009532461.tif 000070
【０３１３】
2009532461.tif 000071
【０３１４】
Ｃ４３Ｈ５０Ｎ１２Ｏ１２  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：９４９．４；実測値  ｍ／ｅ：９４９．３。
【０３１５】
化合物１９ａの製造：
2009532461.tif 000072
化合物１２（３００ｍｇ、０．５３４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）に溶解し、乾燥ピリジン（５ｍｌ）に加えた。反応混合物を室温で５分間攪拌し、氷浴中で−１５℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ２Ｏ、３００ｍｇ、１．０６７ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下して加えた。１５分後氷浴を除き、反応混合物を室温まで加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １：４）によってモニタリングし、１．５時間後に反応の終了を示した。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、ＨＣｌ（２％）および塩水で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製して化合物１９ａ（３４０ｍｇ、９２％の収率）を得た。
【０３１６】
2009532461.tif 000073
【０３１７】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝（そうでないことを示さない場合、２２．４〜３７．６の範囲はシクロヘキサノン環炭素原子に関する）２２．１，２２．２，２３．７（２Ｃ），２４．８，２５．５，２７．７，３３．７（Ｃ−２），３６．０，３６．３，３７．６，５７．２，６０．２，６１．０，６１．３（Ｃ−６’），６４．４，７０．９，７７．７，７８．１，７８．３，７９．２，８３．２（Ｃ−３’），９７．７（Ｃ−１’），１００．７（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール），１１４．０（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール）。
【０３１８】
Ｃ２５Ｈ３４Ｆ３Ｎ９Ｏ９Ｓ  Ｎａに対するＥＳＩＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：７１６．２；実測値  ｍ／ｅ：７１６．２。
【０３１９】
化合物１９の製造：
2009532461.tif 000074
上記で示したように製造された化合物１９ａ（３３０ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）およびヘキサメチルホスホルトリアミド（ＨＭＰＡ、１ｍｌ）に溶解し、ＮａＮ３（３１０ｍｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃で攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  １５：８５）によってモニタリングし、２時間後に反応の完了を示した。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製して化合物１９（２００ｍｇ、７２％の収率）を得た。
【０３２０】
化合物１９の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表８に要約される。
2009532461.tif 000075
【０３２１】
化合物１９に対するさらなる１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは：δ＝１．２６−１．９３（ｍ，２０Ｈ，シクロヘキサン環）を含んでいた。
【０３２２】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝（そうでないことを示さない場合、２２．６〜３７．６の範囲はシクロヘキサン環炭素原子に関する）２２．６（２Ｃ），２３．７（２Ｃ），２４．９，２５．５，２７．８，３４．２（Ｃ−２），３５．９，３６．３，３７．６，５６．９，５７．３，５９．８，６０．４，６０．８，６１．４（Ｃ−６’），７０．９，７７．１，７９．３（２Ｃ），９６．５（Ｃ−１’），１００．０（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール），１１３．６（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール）。
【０３２３】
Ｃ２４Ｈ３４Ｎ１２Ｏ６  Ｎａに対するＥＳＩＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：６０９．３；実測値  ｍ／ｅ：６０９．３。
【０３２４】
化合物１９ｃの製造：
2009532461.tif 000076
上記で示したように製造された化合物１９（２００ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ）をジオキサン（３ｍｌ）に溶解し、酢酸（８ｍｌ）および水（１ｍｌ）に加え、反応混合物を７５℃で攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン  ７：３）によってモニタリングし、３時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して化合物１９ｃ（９０ｍｇ、６０％の収率）を得た。
【０３２５】
2009532461.tif 000077
【０３２６】
2009532461.tif 000078
【０３２７】
Ｃ１２Ｈ１９Ｎ１２Ｏ６に対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｅの計算値：４２７．３；実測値  ｍ／ｅ：４２７．３。
【０３２８】
化合物２０の製造：
2009532461.tif 000079
ＤＭＦ／ＨＭＰＡ（２：１、３ｍｌ）の乾燥混合物を粉状の火炎乾燥した４Åモレキュラーシーブ（５００ｍｇ）に加え、ジブロモメタン（１９μｌ、０．２６ｍｍｏｌ）と上記で示したように製造された受容体化合物１２（２９０ｍｇ、０．５１６ｍｍｏｌ）とを添加した。反応混合物を室温で１０分間攪拌し、−１０℃に冷却し、次いでＮａＨ（１９ｍｇ、０．７９２ｍｍｏｌ）をそれに加えた。１５分間攪拌後に、反応混合物を４０℃に加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１５：８５）によってモニタリングし、２時間後に反応の完了を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、セライトで濾過した。セライトをＥｔＯＡｃで十分に洗浄後、洗液を合わせ、塩水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗製物をフラッシュクロマトグラフィにより精製して化合物２０（２４０ｍｇ、８２％の収率）を得た。
【０３２９】
化合物２０の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは、下記の表９に要約される。
2009532461.tif 000080
【０３３０】
化合物２０に対するさらなる１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）データは：δ＝１．２３−１．７０（ｍ，４０Ｈ，シクロヘキサン環），５．２１（ｓ，２Ｈ，Ｈ−１”）を含んでいた。
【０３３１】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝（そうでないことを示さない場合、２２．４〜３７．６の範囲はシクロヘキサン環炭素原子に関する）２２．４，２３．５（２Ｃ），２４．７，２５．４，２７．５（Ｃ−２），３３．７，３５．８，３６．１，３７．６，５７．０，６０．４，６１．５（Ｃ−６’），６２．１，６３．９，７３．６，７４．１，７８．０，７８．２，９６．６（Ｃ−１”  他の半分），９７．０（Ｃ−１’），９９．６（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール），１１５．４（ＯＣＯ  シクロヘキサノンケタール）。
【０３３２】
Ｃ４９Ｈ７０Ｎ１８Ｏ１４  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：１１５７．５；実測値  ｍ／ｅ：１１５７．４。
【０３３３】
化合物２０ｃの製造：
2009532461.tif 000081
【０３３４】
化合物２０（２４０ｍｇ）（上記で示したように製造された）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（１ｍｌ）と水（１．２ｍｌ）との混合物に加えた。反応混合物を６０℃で２時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、９：１）によってモニタリングした。反応混合物をフラッシュクロマトグラフィ（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して化合物２０ｃ（１５５ｍｇ、９０％の収率）を得た。
【０３３５】
2009532461.tif 000082
【０３３６】
2009532461.tif 000083
【０３３７】
Ｃ２５Ｈ３８Ｎ１８Ｏ１４  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：８３７．３；実測値  ｍ／ｅ：８３７．２。
【０３３８】
化合物２の製造：
2009532461.tif 000084
【０３３９】
化合物２を下記のスキーム９で示すチャートに従って製造した。化合物１０から出発し、化合物１１に変換して、化合物１５ａとカップリングして上記で示した化合物１６ａを得た。
2009532461.tif 000085
【０３４０】
上記で示されるように製造された化合物１６ａ（４５０ｍｇ、０．４４４ｍｍｏｌ）をＭｅＮＨ２（３０ｍｌのＥｔＯＨ中、３３％溶液）の溶液で処理し、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、７：３）によってモニタリングし、８時間後に反応の完了を示した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固し、残渣をＴＨＦ（５ｍｌ）とＮａＯＨ水溶液（０．１Ｍ、３．５ｍｌ）との混合物に溶解した。この混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中１Ｍ溶液、２．６６ｍｌのＴＨＦ、２．６６ｍｍｏｌ）をそれに加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。
【０３４１】
反応混合物をシリカゲルの短いカラム上でフラッシュクロマトグラフィにより精製した。カラムを以下の溶媒で洗浄した：ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、およびＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）。生成物をＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液）とＭｅＯＨとの１：４の比率の混合物により溶出した。生成物を含む画分を合わせ、減圧下で蒸発し、少量の水に再溶解し、減圧下で再び蒸発した。この手順を２〜３回繰り返して、化合物２（１７０ｍｇ、８４％の収率）の遊離アミン形態を得た。この生成物を水に溶解し、ｐＨをＨ２ＳＯ４（０．０１Ｍ）で６．５に調整し、凍結乾燥して化合物２の硫酸塩を得た。
【０３４２】
化合物２の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．５）データは、下記の表１０に要約される。
2009532461.tif 000086
【０３４３】
2009532461.tif 000087
Ｃ１７Ｈ３３Ｎ３Ｏ１１  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：４７８．２；実測値  ｍ／ｅ：４７８．２。
【０３４４】
化合物３の製造：
2009532461.tif 000088
化合物３を下記のスキーム１０で示すチャートに従って製造した。化合物１０および化合物１４ｂから出発し、化合物１１および化合物１５ｂにそれぞれ変換して、互いにカップリングして上記で示した化合物１６ｂを得た。
2009532461.tif 000089
【０３４５】
上記で示されるように製造された化合物１６ｂ（３２０ｍｇ、０．３４２ｍｍｏｌ）をＭｅＮＨ２（３０ｍｌのＥｔＯＨ中、３３％溶液）の溶液で処理し、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ、７：３）によってモニタリングし、８時間後に反応の完了を示した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固し、残渣をＴＨＦ（３．７ｍｌ）とＮａＯＨ水溶液（０．１Ｍ、２．５ｍｌ）との混合物に溶解した。この混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中１Ｍ溶液、２．７４ｍｌのＴＨＦ、２．７４ｍｍｏｌ）をそれに加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。
【０３４６】
生成物を化合物２について上記に示されるように精製し、遊離アミンとして化合物３（１４２ｍｇ、９１％の収率）を得た。
【０３４７】
化合物３の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．５）データは、下記の表１１に要約される。
2009532461.tif 000090
【０３４８】
2009532461.tif 000091
【０３４９】
Ｃ１７Ｈ３３Ｎ４Ｏ１０  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：４７７．２；実測値  ｍ／ｅ：４７７．５。
【０３５０】
化合物４の製造：
2009532461.tif 000092
化合物４を下記のスキーム１１で示すチャートに従って製造した。化合物１０から出発し、化合物１３に変換して、化合物１４ａとカップリングさせて上記で示した化合物１７ａを得た。
2009532461.tif 000093
【０３５１】
化合物１７ａ（４６０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解し、酢酸（４．５ｍｌ）および水（０．７５ｍｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で３時間攪拌し、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：２）によってモニタリングした。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、混合物を減圧下で蒸発乾固した。
【０３５２】
残渣をＴＨＦ（４ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＨ（０．１Ｍ、３ｍｌ）の溶液を加えた。混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中１Ｍ溶液、２．８５ｍｌ、２．８５ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をシリカゲルの短いカラム上でフラッシュクロマトグラフィにより精製した。カラムを以下の溶媒で洗浄した：ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、およびＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）。生成物をＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液）とＭｅＯＨとの１：４の比率の混合物で溶出した。生成物を含む画分を減圧下で蒸発し、水に再溶解し、減圧下で再び蒸発させた。この手順を２〜３回繰り返して、化合物４（１４７ｍｇ、７５％の全収率）の遊離アミン形態を得た。該生成物を水に溶解し、ｐＨをＨ２ＳＯ４（０．０１Ｍ）で６．６５に調整し、凍結乾燥して化合物４の硫酸塩を黄色泡状固体として得た。
【０３５３】
化合物４の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．０，Ｈ２ＳＯ４  ０．０１Ｍによって調整された）データは、下記の表１２に要約される。
2009532461.tif 000094
【０３５４】
2009532461.tif 000095
【０３５５】
Ｃ１７Ｈ３３Ｎ４Ｏ１０  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：４７８．２；実測値  ｍ／ｅ：４７８．２。
【０３５６】
化合物５ｄの製造：
2009532461.tif 000096
化合物１７ｂ（４００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解し、ＴＦＡ（１．５ｍｌ）と水（１ｍｌ）との混合物に添加した。反応混合物を５０℃で２時間攪拌し、その間、反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）によってモニタリングした。反応混合物を直接シリカゲルカラムに適用し、フラッシュクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して化合物５ｄ（１８０ｍｇ、５１．６％の収率）を得た。
【０３５７】
2009532461.tif 000097
【０３５８】
2009532461.tif 000098
【０３５９】
Ｃ３８Ｈ３８Ｎ１２Ｏ１３  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：８９３．３；実測値  ｍ／ｅ：８９３．２。
【０３６０】
化合物５の製造：
2009532461.tif 000099
化合物５を下記のスキーム１２で示すチャートに従って製造した。化合物１０から出発し、化合物１３に変換して、化合物１４ｂとカップリングして化合物１７ｂを得、上記に示される化合物５ｄに変換した。
2009532461.tif 000100
【０３６１】
化合物５ｄ（１４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解して、ＮａＯＨ（０．１Ｍ、２ｍｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中、１Ｍ溶液、１．６５ｍｌ、１．６５ｍｍｏｌ）をそれに加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をシリカゲルの短いカラム上でフラッシュクロマトグラフィにより精製した。カラムを以下の溶媒で洗浄した：ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、およびＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）。生成物をＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液）とＭｅＯＨとの１：４の比率の混合物で溶出した。生成物を含む画分を減圧下で蒸発し、水に再溶解し、減圧下で蒸発した。この手順を２〜３回繰り返して、化合物５の遊離アミン形態（３２ｍｇ、４４％の収率）を得た。このアミンを水に溶解し、ｐＨをＨ２ＳＯ４（０．０１Ｍ）で６．５に調整し、凍結乾燥して化合物５の硫酸塩を黄色泡状固体として得た。
【０３６２】
化合物５の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．０）データは、下記の表１３に要約される。
2009532461.tif 000101
【０３６３】
2009532461.tif 000102
Ｃ１７Ｈ３４Ｎ４Ｏ１０に対するＴＯＦ  ＡＰＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｅの計算値：４５５．２；実測値  ｍ／ｅ：４５５．２。
【０３６４】
化合物６ａの製造：
2009532461.tif 000103
【０３６５】
化合物１８ａ（２４０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をジオキサン（６ｍｌ）に溶解して、酢酸（１０ｍｌ）と水（３ｍｌ）との混合物に加えた。反応混合物を７０℃で５時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、７：３）によってモニタリングした。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で蒸発し、フラッシュクロマトグラフィ（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して化合物６ａ（２１５ｍｇ、７５％の収率）を得た。
【０３６６】
2009532461.tif 000104
【０３６７】
2009532461.tif 000105
【０３６８】
Ｃ３８Ｈ３９Ｎ９Ｏ１４  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：８６８．３；実測値  ｍ／ｅ：８６８．４。
【０３６９】
化合物６の製造：
2009532461.tif 000106
化合物６を下記のスキーム１３で示すチャートに従って製造した。化合物１０から出発し、化合物１２に変換して、化合物１５ａとカップリングして化合物１８ａを得、上記に示される化合物６ａに変換した。
2009532461.tif 000107
【０３７０】
化合物６ａ（２００ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解して、ＮａＯＨ（０．１Ｍ、１．５ｍｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中、１Ｍ溶液、１．４ｍｌ、１．４ｍｍｏｌ）をそれに加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をシリカゲルの短いカラム上でフラッシュクロマトグラフィにより精製した。カラムを以下の溶媒で洗浄した：ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、およびＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）。生成物をＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液）とＭｅＯＨとの１：４の比率の混合物で溶出した。生成物を含む画分を減圧下で蒸発し、水に再溶解し、減圧下で蒸発した。この手順を２〜３回繰り返して、化合物６の遊離アミン形態（９０ｍｇ、８４％の収率）を得た。このアミンを水に溶解し、ｐＨをＨ２ＳＯ４（０．０１Ｍ）で６．５に調整し、凍結乾燥して化合物６の硫酸塩を白色泡状固体として得た。
【０３７１】
化合物６の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．５）データは、下記の表１４に要約される。
2009532461.tif 000108
【０３７２】
2009532461.tif 000109
【０３７３】
Ｃ１７Ｈ３３Ｎ４Ｏ１０  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：４７８．２；実測値  ｍ／ｅ：４７８．４。
【０３７４】
化合物７ａの製造：
2009532461.tif 000110
化合物１８ｂ（５００ｍｇ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解して、ＴＦＡ（１ｍｌ）と水（１ｍｌ）との混合物に加えた。反応混合物を５０℃で２時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、７：３）によってモニタリングした。反応混合物を、フラッシュクロマトグラフィ（シリカ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して化合物７ａ（３４０ｍｇ、８２％の収率）を得た。
【０３７５】
2009532461.tif 000111
【０３７６】
2009532461.tif 000112
【０３７７】
Ｃ３１Ｈ３４Ｎ１２Ｏ１２  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：７８９．２；実測値  ｍ／ｅ：７８９．２。
【０３７８】
化合物７の製造：
2009532461.tif 000113
化合物７を下記のスキーム１４で示すチャートに従って製造した。化合物１０および化合物１４ｂから出発し、化合物１２および化合物１５ｂにそれぞれ変換して、それらを互いにカップリングして化合物１８ｂを得、上記に示される化合物７ａに変換した。
2009532461.tif 000114
【０３７９】
化合物７ａ（３００ｍｇ、０．３９１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解して、ＮａＯＨ（０．１Ｍ、２ｍｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中、１Ｍ溶液、３．３ｍｌ、３．３ｍｍｏｌ）をそれに加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をシリカゲルの短いカラム上でフラッシュクロマトグラフィにより精製した。カラムを以下の溶媒で洗浄した：ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、およびＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）。生成物をＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液，４０ｍｌ）とＭｅＯＨとの１：４の比率の混合物で溶出した。生成物を含む画分を減圧下で蒸発し、水に再溶解し、減圧下で蒸発した。この手順を２〜３回繰り返して、化合物７の遊離アミン形態（１３４ｍｇ、７５％の収率）を得た。このアミンを水に溶解し、ｐＨをＨ２ＳＯ４（０．０１Ｍ）で６．６に調整し、凍結乾燥して化合物７の硫酸塩を白色泡状固体として得た。
【０３８０】
化合物７の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．５）データは、下記の表１５に要約される。
2009532461.tif 000115
【０３８１】
2009532461.tif 000116
【０３８２】
Ｃ１７Ｈ３３Ｎ４Ｏ１０  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：４７７．２；実測値  ｍ／ｅ：４７７．２。
【０３８３】
化合物８の製造：
2009532461.tif 000117
化合物８を下記のスキーム１５で示すチャートに従って製造した。化合物１０から出発し、上記で示した化合物１９ｃに変換した。
2009532461.tif 000118
【０３８４】
化合物１９ｃ（９０ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解して、ＮａＯＨ（０．１Ｍ、２ｍｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中、１Ｍ溶液、１．６９ｍｌ、１．６９ｍｍｏｌ）をそれに加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をシリカゲルの短いカラム上でフラッシュクロマトグラフィにより精製した。カラムを以下の溶媒で洗浄した：ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、およびＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）。生成物をＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液，３０ｍｌ）とＭｅＯＨとの１：４の比率の混合物で溶出した。生成物を含む画分を減圧下で蒸発し、水に再溶解し、減圧下で蒸発した。この手順を２〜３回繰り返して、化合物８の遊離アミン形態（５２．０ｍｇ、７６．５％の収率）を得た。この生成物を水に溶解し、ｐＨをＨ２ＳＯ４（０．０１Ｍ）で６．６に調整し、凍結乾燥して化合物８の硫酸塩を得た。
【０３８５】
化合物８の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．５）データは、下記の表１６に要約される。
2009532461.tif 000119
【０３８６】
2009532461.tif 000120
【０３８７】
Ｃ１２Ｈ２６Ｎ４Ｏ６  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：３４５．２；実測値  ｍ／ｅ：３４５．２。
【０３８８】
化合物９の製造：
2009532461.tif 000121
化合物９を下記のスキーム１６で示すチャートに従って製造した。化合物１０から出発し、上記で示した化合物２０ｃに変換した。
2009532461.tif 000122
【０３８９】
化合物２０ｃ（１５５ｍｇ、０．２０８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解して、ＮａＯＨ（０．１Ｍ、２ｍｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１０分間攪拌し、その後、ＰＭｅ３（ＴＨＦ中、１Ｍ溶液、２．２８ｍｌ、２．２８ｍｍｏｌ）をそれに加えた。反応の進行を、溶離剤としてエタノール中３３％溶液に希釈された１０：１５：６：１５の相対的な比率のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＭｅＮＨ２混合物を使用して、ＴＬＣによってモニタリングし、５時間後に反応の完了を示した。反応混合物をシリカゲルの短いカラム上でフラッシュクロマトグラフィにより精製した。カラムを以下の溶媒で洗浄した：ＴＨＦ（１００ｍｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）、およびＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）。生成物をＭｅＮＨ２（ＥｔＯＨ中３３％溶液，３０ｍｌ）とＭｅＯＨとの１：４の比率の混合物で溶出した。生成物を含む画分を減圧下で蒸発し、水に再溶解し、減圧下で蒸発した。この手順を２〜３回繰り返して、化合物９の遊離アミン形態（１０２ｍｇ、８１．４％の収率）を得た。このアミンを水に溶解し、ｐＨをＨ２ＳＯ４（０．０１Ｍ）で６．５に調整し、凍結乾燥して化合物９の硫酸塩を黄色泡状固体として得た。
【０３９０】
化合物９の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．７５）データは、下記の表１７に要約される。
2009532461.tif 000123
【０３９１】
化合物９に対するさらなる１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ，ｐＨ＝３．７５）データは：δ＝５．１２（ｓ，１Ｈ）を含んでいた。
【０３９２】
2009532461.tif 000124
【０３９３】
Ｃ２５Ｈ５０Ｎ６Ｏ１４  Ｎａに対するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦＭＳ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）ｍ／ｅの計算値：６８１．３；実測値  ｍ／ｅ：６８１．６。
【０３９４】
実施例２
生物学的活性のアッセイ
本明細書で提示された化合物、すなわち、化合物２〜９のリードスルー終止コドン突然変異に対する能力を、哺乳動物の培養細胞においてインビボおよびエクスビボで検討した。
【０３９５】
化学薬品および試薬はすべて、特に明記しない限り一般の市販品から得た。市販抗生物質であるパロモマイシンおよびゲンタマイシンは、Ｓｉｇｍａから入手した。
【０３９６】
インビトロでの翻訳反応ならびに抑制および翻訳の定量化：
突然変異抑制活性のアッセイを「ＵＧＡ  Ｃ」突然変異に関して行なった。この突然変異は、アミノグリコシド媒介抑制に対して最も感受性であることが示されている。最初に、化合物１〜９について、インビトロでこのナンセンス突然変異を抑制するそれらの能力について、ＰＣＤＨ１５遺伝子のＲ３Ｘナンセンス突然変異（中途ＵＧＡ  Ｃ終止コドン）を保持するレポーター構築物を使って試験した。プロトカドヘリン１５をコードするＰＣＤＨ１５遺伝子の突然変異は、１型アッシャー症候群（ＵＳＨ１）の原因となり、それは言語習得前の深刻な難聴、前庭反射消失、および色素性網膜炎の思春期前の発症（ＲＰ）［８３］によって特徴づけられる。４つの異なるＰＣＤＨ１５  ＵＳＨ１起因ナンセンス突然変異（Ｒ３Ｘ、Ｒ２４５Ｘ、Ｒ６４３Ｘ、およびＲ９２９Ｘ）は、ヒトで報告されている。興味深いことに、ＰＣＤＨ１５の上記のナンセンス突然変異はＵＳＨ１を引き起こすが、一方で同じ遺伝子中の特定のミスセンス突然変異は非症候性難聴のみをもたらし、ＲＰを伴わない。そのような観察は、この遺伝子によってコードされたタンパク質の部分的な、または低レベルの活性が通常の網膜機能に十分である場合があることを示唆しており、本明細書で提示される化合物のいずれをもリードスルー治療の適切な候補にする。
【０３９７】
化合物１〜９によるナンセンス突然変異の抑制について、ＰＣＤＨ１５遺伝子のＲ３Ｘ突然変異［８４］を保持しているレポータープラスミドを使って、インビトロで試験した。このプラスミドを作るために、オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡおよびＡＧＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧを互いにアニーリングし、プラスミドｐＤＢ６５０［６］のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位内に挿入した。
【０３９８】
得られたレポータープラスミドｐＤＢ６５０−Ｒ３Ｘは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする２５−ｋＤａのポリペプチドとＯＲＦをコードする１０−ｋＤａのポリペプチドとの間のＴＧＡ  Ｃナンセンス終止突然変異を含んでいた。したがって、終止コドンでの効率的な翻訳終了は、２５−ｋＤａのポリペプチドの産生をもたらし、一方、ここで試験された化合物によるナンセンス突然変異の抑制は、より長い３５−ｋＤａタンパク質の合成を可能にした。
【０３９９】
プラスミドを、［３５Ｓ］−メチオニンの存在下、ウサギ網状赤血球溶解液結合転写／翻訳システム（プロメガ）で転写、翻訳して、反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析を用いて定量した。突然変異抑制レベルを全タンパク質（３５−ｋＤａおよび２５−ｋＤａの合計）からの３５−ｋＤａ生成物の相対的な割合として算出し、翻訳レベルを、試験化合物の不在下、全タンパク質からの各試験化合物濃度における全タンパク質の相対的な割合として算出した。
【０４００】
パロモマイシンおよびゲンタマイシンの突然変異抑制活性を測定し、本明細書で提示される化合物の活性に対する標準として使用した。パロモマイシンの試験濃度は、０、５、１０、２０、３０および４０μｇ／ｍｌであり、ゲンタマイシンの試験濃度は、０、５、１０、２０および３０μｇ／ｍｌであり、化合物１〜９の試験濃度は、０〜１６０μｇ／ｍｌの範囲であった。最大限の抑制レベルを観察した濃度は、下記の表１８に示される。
【０４０１】
試験および分析に関して類似した方法を使用して、上記で示されたＮ１−ＡＨＢ基を示す化合物について、突然変異抑制活性に関して試験する。
【０４０２】
表１８は、Ｒ３Ｘ突然変異の最大インビトロ突然変異抑制および翻訳レベルを、化合物１〜９に対して測定されたＭＩＣ値とともに示す。表１８中の結果は、少なくとも３つの独立した実験の平均として報告される。
2009532461.tif 000125
【０４０３】
表１８において理解できるように、パロモマイシン中に存在する１つの環（すなわち、化合物２の場合のように環ＩＶ）、またはパロモマイシン中に存在する２つの環（すなわち、化合物１の場合のように環ＩＩＩおよびＩＶ）のいずれかの除去は、インビトロでのリードスルー活性を４９％抑制から１．６％（化合物２）および６．２％（化合物１）まで劇的に減少させる。これらのデータのみから、パロモマイシンの環ＩＶは、哺乳類のＡ−部位のその適切な認識のために、およびその後のリードスルー活性のために非常に重要であることを示している。化合物２（１．６％）の抑制レベルと比較して、化合物１（６．２％）の実質的により高い抑制レベルは、化合物１（パロマミン）が、哺乳類のリボソームによって優先して認識され且つ著しい抑制活性を有するパロモマイシンの最小構造モチーフを表すことを意味している。
【０４０４】
表１８からさらに結論づけることができるように、化合物８のように１個の余分のアミンの付加、または化合物９のようにパロマミン二量体化に伴った、化合物４のようにＣ６位での、または化合物６のようにＣ３位でのパロマミン骨格へのプレーンリボースの結合は、パロマミン自体のそれより低い抑制レベルを与えた。
【０４０５】
しかしながら、最も重要な結果は、プレーンリボースの代わりに５−アミノリボース（リボサミン）が異なる位置でパロマミン部分に結合されている場合に観察された。さらに表１８で理解することができるように、化合物３、５および７の観察された突然変異抑制レベルは、同じ位置でプレーンリボース環を含んでいる対応する化合物（すなわち、化合物２、４、および６）よりもそれぞれ高いものであった。さらに、化合物３、５、および７のシリーズでは、パロマミン骨格上のリボサミンの位置の特定の影響がＣ５（化合物３）＞＞Ｃ６（化合物５）＞Ｃ３’（化合物７）であることが観察され、これは、化合物３での親のパロモマイシン（環Ｉ−ＩＩＩ）の擬似三糖類コア構造の保存が効率的なリードスルー活性にとって重要であることを示唆している。
【０４０６】
化合物１〜９の突然変異抑制データは、化合物２〜７のシリーズにおいて、各ペア中のアミノ基の増加した数は改善されたリードスルー活性に結びつくが、化合物８および化合物９で得られたデータは、たとえ原核生物および真核生物のｒＲＮＡの両方へのこれらの類似体の結合親和性が増加しているようであっても［３６および８５］、パロマミン骨格上のアミノ基の数の単なる増加がリードスルー活性の増加に必ずしも至らないことを示している。それにもかかわらず、対応するリボース化合物２のそれと比較して化合物３の観察された１３倍高い抑制レベル、および化合物１のそれと比較して３倍超の高い抑制レベルは、化合物３でのＣ５”−ＮＨ２基の存在がその高いリードスルー活性の原因であることを示唆する。
【０４０７】
図３Ａ−Ｄは、試験化合物および［３５Ｓ］−メチオニンの存在下、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする２５−ｋＤａのポリペプチドとＯＲＦをコードする１０−ｋＤａのポリペプチドとの間のＴＧＡ  Ｃナンセンス終止突然変異を含むプラスミド系レポーター構築物の発現により、例示的な化合物３およびパロモマイシンに関して測定されたインビトロでの変異抑制および翻訳比較アッセイの結果を示し、化合物３（図３Ａ）およびパロモマイシン（図３Ｃ）に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され且つｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｅｒで定量化された反応生成物、ならびに比較プロットを示し、そこでは変異抑制値（黒い点で示される）および翻訳値（白い点で示される）をその不在下で発現される全タンパク質からの試験化合物の各濃度における全タンパク質の相対的な割合として算出し、化合物３（図３Ｂ）およびパロモマイシン（図３Ｄ）に関して３組測定した。
【０４０８】
表１８および図３Ａ−Ｄで分かるように、その非常に重要なリードスルー活性の他に、化合物３はまた、各試験化合物が最大限の抑制率に達した濃度で、パロモマイシン（約４０％）またはゲンタマイシン（約４０％）のいずれかよりも約２倍高い翻訳レベル（約８０％、参照：表１８）を保持した。化合物３による翻訳阻害のそのような減少は、親のパロモマイシンまたはゲンタマイシン化合物のそれと比較して、化合物３の減少した毒性と解釈することができた。このように、上記の濃度でパロモマイシンによって誘発された抑制は化合物３のそれより高いが、化合物３の場合に生産される全タンパク質の量はより大きい。
【０４０９】
アミノグリコシド抗生物質によって誘導されるエクスビボでの突然変異抑制：
本発明をさらに実施化する際、化合物３によって示されるタンパク質生産の向上は、観察された抑制率においてでさえ、ナンセンスコドンを含有する遺伝子から産生される機能的タンパク質の総量を増やすことによって、哺乳動物の細胞系での薬物誘発ナンセンス抑制の効率を原則として増やすことができると結論された。プロモーター活性化剤によるナンセンスコドンを含有する遺伝子からの機能的タンパク質産生の向上についての最近の研究は、この推定を支持する［３３］。この可能性を試験するために、化合物３を、パロモマイシンおよびゲンタマイシンとともに、二重ルシフェラ−ゼリポーター系を用いた培養細胞においてＵＧＡ  Ｃ終止コドンのリードスルー活性に関して評価した。
【０４１０】
化合物１〜９によるナンセンス突然変異の抑制を、二重ルシフェラーゼレポータープラスミド［８６］を用いてエクスビボで試験した。ＵＧＡＣ突然変異を保持するｐ２ＬＵＣプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、試験化合物の添加を１５時間後に実施した。ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて培養２４時間後に測定し、終止コドンリードスルーを上記のように算出した。
【０４１１】
試験および分析するための同様の方法を用いて、先に示されたＮ１−ＡＨＢ基を示す化合物についてエクスビボでの突然変異抑制活性を試験する。
【０４１２】
図４は、ＣＯＳ−７細胞で発現されたウミシイタケルシフェラーゼおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子の間のポリリンカーにＴＧＡ  Ｃナンセンス変異を含むｐ２Ｌｕｃプラスミドを用い、例示的な化合物３、パロモマイシンおよびゲンタマイシンよって発現されるナンセンス突然変異のエクスビボでの抑制を示し、これは、異なる濃度の各試験化合物に対して３以上の独立した実験の平均として算出された抑制レベルを示す。
【０４１３】
図４で理解できるように、化合物３の活性は、すべての試験された濃度においてパロモマイシンおよびゲンタマイシンのそれより優れている。試験化合物では、誘導されたリードスルー活性は、試験化合物の増加した濃度とともに増加したが、この増加は、化合物３の場合において他の２つの臨床的に使われた薬物よりもより有意であった。図４でさらに理解できるように、ゲンタマイシン（患者においてナンセンス突然変異を抑制する能力があることが示される現在唯一の臨床的に関連したアミノグリコシドである）は、パロモマイシンまたは化合物３のいずれよりも有効ではなかった。パロモマイシンおよびゲンタマイシンに対する化合物３のそのような増加したリードスルー効果は、培養細胞に関してその低い毒性のためである可能性が高い。
【０４１４】
抗菌活性：
その抗菌活性に対する哺乳動物細胞で観察されたアミノグリコシド誘発終止コドンリードスルー活性を比較するために、化合物１〜９をグラム陰性細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））およびグラム陽性細菌（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））の両方に対する抗菌剤としてさらに検討し、最小阻止濃度（ＭＩＣ）値を、対照としてパロモマイシンおよびゲンタマイシンを用いる微量液体希釈法により決定し、結果を上記の表１８に示す。
【０４１５】
使用された細菌株は、エシェリキア・コリＡＴＣＣ  ２５９２２およびバチルス・サブチリスＡＴＣＣ  ６６３３であった。ＭＩＣ値を、米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）［８７］に準拠した２倍微量希釈法により、３８４μｇ／ｍｌおよび５１２μｇ／ｍｌの２つの異なる出発濃度で測定した。すべての実験を３通り実施し、類似した結果が２〜４つの異なる実験で得られた。
【０４１６】
試験および分析に関して同様の方法を使用して、先に示したＮ１−ＡＨＢ基を示す化合物を抗菌活性について試験する。
【０４１７】
表１８で示されるＭＩＣ値から推論できるように、ここに示されるすべての化合物の抗菌活性は、親化合物のパロモマイシンのそれより、大腸菌で８〜４３およびバチルス・サブチリスで６〜６４の範囲の遺伝因子により著しく低いのに対して、ゲンタマイシンおよびパロモマイシンは両方の細菌株に対して優れた抗菌活性を示した。
【０４１８】
最も重要なことに、パロモマイシンの抗菌性と比較して、化合物３のかなり低い抗菌活性は、化合物３の真核生物細胞に対する選択性が、親のパロモマイシンのそれより非常に高いことを示す。したがって、化合物３が有意な抗菌活性を示すことができないという観察された能力は、ＧＩ生物相平衡を逆転したり、抗生物質耐性の出現を増やしたりすることなく、選択的に哺乳類のリボソームに作用することができて、効果的な終止コドン抑制を引き起こすことができるアミノグリコシド類の新規な変形体の設計のために本明細書で概説される戦略の一般的な適用性という意味において陽性の結果として解釈される必要がある。
【０４１９】
哺乳類系における細胞毒性：
市販され、臨床的に使用されたアミノグリコシド類に関して、化合物３の減少した毒性をさらに確かめるために、一連の細胞毒性アッセイが３つの腎臓由来細胞株、すなわちＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓）、ＣＯＳ−７（サルの腎臓）およびＭＤＣＫ（イヌの腎臓）を用いて、下記のように実施した。
【０４２０】
ＨＥＫ−２９３、ＣＯＳ−７またはＭＤＣＫは、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２で、９６−ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）で一晩成長させた。１日後に、培地を、ストレプトマイシンを含まない培地に変えて、異なる濃度の試験化合物を加えた。４８時間後、メーカーの指示に従って５時間のインキュベーションプロトコルを使用して、細胞増殖アッセイ（ＸＴＴに基づく比色分析、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を実施した。光学密度（ＯＤ）を、Ｅｉｉｓａプレートリーダを利用して記録された。細胞生存率を、試験化合物の存在下で成長させた培養物中の生細胞数対試験化合物なしで成長させた対応する細胞培養物の間の比率として算出した。細胞に対する半数最大致死濃度（ＬＣ５０）は、Ｇｒａｆｉｔ５ソフトウェアを使用して、濃度−応答曲線を少なくとも２つの独立した実験データに適合させることから得られた［Ｒ．Ｊ．Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ，Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，Ｈｏｒｌｅｙ、Ｕ．Ｋ．２００１］（参照：下記の表１９）。
【０４２１】
試験および分析に関する同様の方法を用いて、先に示したＮ１−ＡＨＢ基を示す化合物を細胞毒性について試験する。
2009532461.tif 000126
【０４２２】
表１９で理解できるように、化合物３に対して得られたＬＣ５０値は、３つの全ての細胞株で試験した場合、ＬＣ５０値が臨床的に使われるアミノグリコシドであるゲンタマイシンおよびパロモマイシンに対して得られたＬＣ５０値よりも６倍〜１５倍高かった。
【０４２３】
要約すると、本発明者らによって合成、試験されたパロマミン誘導体である化合物２〜９は、インビトロおよびエクスビボの両方での哺乳類翻訳システムにおける中途終止コドン抑制に対する合成アミノグリコシド類の組織的研究を提供する。パロマミン（化合物１）は、臨床的に重要な薬物パロモマイシンの最小構造モチーフとして同定され、潜在的な終止コドンリードスルー誘発剤として多様な構造の構築のための骨格として使用した。これらの化合物は、培養細胞中で親パロモマイシンと比較して、有意に高い終止コドンリードスルー活性およびより低い毒性を示した。ＣＯＳ−７細胞では、これらの化合物の活性はまた、ゲンタマイシン（これまでに患者においてナンセンス突然変異を抑制する能力があることが示された唯一のアミノグリコシド）のそれよりも高かった。グラム陰性細菌株およびグラム陽性細菌株に対する抗菌性試験は、これらの化合物が真核生物細胞でそれらの作用において非常に選択的なことを示す。
【０４２４】
先に示した実験結果に基づいて、本実施形態による化合物の突然変異リードスルー誘発活性は、哺乳動物細胞においてエクスビボで測定されるとき、また商業的に入手でき、臨床的に使用されたアミノグリコシド類のリードスルー活性と比較して、顕著に改善されることが理解できる。さらに、ここに示される化合物の減少した毒性は、それらのナンセンス突然変異抑制活性と組み合わされて、商業的に入手でき、臨床的に使用されるアミノグリコシド類と比較して、それはより少ない、より小さな副作用を伴うことが期待されるのでそれらの使用を非常に有益にしている。これらの観察は、本明細書で示される化合物を、切断変異に起因する遺伝子疾患の治療のための可能性がある新規治療剤と見なすことができることを明らかに証明している。
【０４２５】
総合すると、これらの結果は、本明細書に示される化合物が突然変異抑制療法に関してゲンタマイシンおよびパロモマイシンの代替物を表すことができたことを示唆し、したがって、中途終止突然変異のアミノグリコシド誘発抑制の効率を最適化することによって選択的に哺乳動物細胞を標的とする新規なアミノグリコシドに基づく小分子の開発をするための新しい方向を提供する。
【０４２６】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０４２７】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０４２８】
2009532461.tif 000127
2009532461.tif 000128
2009532461.tif 000129
2009532461.tif 000130
2009532461.tif 000131
2009532461.tif 000132
2009532461.tif 000133
2009532461.tif 000134
【図面の簡単な説明】
【０４２９】
【図１】背景技術で記載された抗菌性アミノグリコシド類の化学構造を示す。
【図２】本実施形態による例示的な化合物を得るための化学構造および一般的な合成経路を示す。
【図３】試験化合物および［３５Ｓ］−メチオニンの存在下、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする２５−ｋＤａのポリペプチドとＯＲＦをコードする１０−ｋＤａのポリペプチドとの間のＴＧＡ  Ｃナンセンス終止突然変異を含むプラスミド系レポーター構築物の発現により、例示的な化合物３およびパロモマイシンに関して測定されたインビトロでの突然変異抑制および翻訳比較アッセイの結果を示す。
【図４】ＣＯＳ−７細胞で発現されたウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子とホタルルシフェラーゼ遺伝子との間のポリリンカー中でのＴＧＡ  Ｃナンセンス突然変異を含むｐ２Ｌｕｃプラスミドを使用して、パロモマイシンとゲンタマイシンと比較した、本実施形態による例示化合物、すなわち化合物３によって発現されるナンセンス変異のエクスビボでの抑制を示し、それは異なる濃度の各試験化合物に対して３以上の独立した実験の平均として算出された抑制レベルを示す。
【図１】
2009532461.tif 000149
【図２】
2009532461.tif 000150
【図３】
2009532461.tif 000151
【図４】
2009532461.tif 000152
【国際調査報告】
2009532461.tif 000153
2009532461.tif 000154
2009532461.tif 000155