(57)【要約】  本発明は、ビオチン標識またはこの類似体との少なくとも１つの共有結合をさらに含む、式：オリゴ糖−スペーサー−（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト）（式中、オリゴ糖は、４から２５個の単糖類単位を含む負に帯電したオリゴ糖残基であり、電荷は正に帯電した対イオンによって相殺され、オリゴ糖残基がそれ自体（ＡＴ−ＩＩＩ媒体）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖から誘導され；スペーサーは、結合であり、または本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、互いに１０〜２０Å離れて残基内に位置するカルボキシレート部分および塩基部分を含むフィブリノゲンのＲＧＤおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤ断片を模倣した残基である。）の化合物または薬学的に許容されるこの塩もしくはプロドラッグもしくはこの溶媒和物に関する。本発明の化合物は、抗血栓活性を有し、血栓症の治療または予防に使用することができる。本発明の化合物の抗血栓活性は、アビジン、ストレプトアビジンおよび高いビオチン親和性を有するこの類似体の投与に関する緊急の場合に中和することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物（この式（Ｉ）の化合物は、ビオチン標識またはこの類似体との少なくとも１つの共有結合をさらに含む。）
オリゴ糖−スペーサー−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト    （Ｉ）
（式中、オリゴ糖は、４から２５個の単糖類単位を含む負に帯電したオリゴ糖残基であり、電荷は正に帯電した対イオンによって相殺されており、前記オリゴ糖残基はそれ自体が（ＡＴ−ＩＩＩ媒介）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖から誘導されており；
スペーサーは、結合であり、または本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、互いに１０〜２０Å離れて残基内に位置するカルボキシレート部分および塩基部分を含むフィブリノゲンのＲＧＤおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤ断片を模倣した残基である。）
または薬学的に許容されるこの塩もしくはプロドラッグもしくはこの溶媒和物。
【請求項２】
スペーサーが本質的に薬理学的不活性な結合残基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
スペーサーが１から５０個原子の長さを有する、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
スペーサーが少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
オリゴ糖が４から１６個の単糖類単位を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
オリゴ糖が硫酸化五糖類残基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
五糖類残基が構造Ａを有する、請求項６に記載の化合物
【化１】
2009511543.tif 000024
（式中、Ｒ１は、独立に、ビオチン標識もしくはこの類似体、ＯＳＯ３−または（１〜８Ｃ）アルコキシである。）。
【請求項８】
五糖類残基が構造Ｂを有する、請求項７に記載の化合物
【化２】
2009511543.tif 000025
（式中、Ｒ１は、ＯＣＨ３またはＯＳＯ３−である。）。
【請求項９】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基が、Ｒｏ４３５０５４、ＳＣ５４７０１（ゼミロフィバン）、ＲＷＪ５００４２、シブラフィバン（Ｒｏ４４３８８８）、ラミフィバン（Ｒｏ４４９８８３）、ＧＰＩ５６２、ＦＫ６３３、チロフィバン（ＭＫ３８３）、オルボフィバン（ＳＣ５７１０１）、エプチフィバチド（Ｃ６８２２）、ロキシフィバン（ＸＶ４５９）、エラロフィバン（ＲＷＪ５３３０８）、ＳＲ１２１５６６（ＳＲ１２１７８７の活性型）、レフラダフィバン（ＢＩＢＵ５２）、ロトラフィバン（ＳＢ２１４８５７）、ガントフィバン（ＹＭ０２８）、Ｔ−２５０、ＥＦ５０７７、ＺＤ２４８６、ＴＡＫ０２９、ＴＰ９２０１、Ｌ７０３０１４およびＵＲ−３２１６から誘導された残基から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
ビオチン標識またはこの類似体との１つの共有結合を含む、請求項１から９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
式Ｉの化合物のオリゴ糖残基がビオチン標識またはこの類似体との共有結合を含む、請求項１から７、９および１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
式Ｉの化合物のオリゴ糖残基が、式−（ＮＨ−ＣＯ）ｎ−（ＣＨ２）ｐ−Ｘ−ＢＴ（式中、ｎは、０または１であり、ｐは、４または５であり、Ｘは、ＮＨ、Ｎ（１〜４Ｃ）アルキル、ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ、ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ、ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨまたはＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨであり、ＢＴは、以下の標識
【化３】
2009511543.tif 000026
である。）のビオチン類似体との１つの共有結合を含む、ビオチン類似体との１つの共有結合を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
【化４】
2009511543.tif 000027
である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
式Ｉの化合物のスペーサーがビオチン標識またはこの類似体との共有結合を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
式Ｉの化合物のスペーサーが、式
−（ＣＨ２）４−Ｘ−ＢＴ
（式中、ＸおよびＢＴは、請求項１２の定義の通りである。）のビオチン類似体との１つの共有結合を含む、ビオチン類似体との１つの共有結合を含む、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
【化５】
2009511543.tif 000028
である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
このナトリウム塩の形態である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
【化６】
2009511543.tif 000029
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
式Ｉの化合物のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基がビオチン標識またはこの類似体との共有結合を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
式Ｉの化合物のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基がビオチン標識またはこの類似体との共有結合を含む、ビオチン標識またはこの類似体との１つの共有結合を含む、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に適切な助剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
治療に使用するための請求項１から２０のいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチン標識またはビオチン誘導体を含む新規な抗血栓二重阻害剤、これらの調製のための方法、活性成分として本化合物を含む医薬組成物、ならびに薬物製造のための前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
予測可能な抗血栓作用、好ましくは、より長い半減期を（血小板凝集の一貫した抑制を達成するために）有するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの探索における最近の進展は、複合的な薬理学的プロファイルを有する新規な抗血栓二重阻害剤をもたらしている。これら新規な化合物は、凝固カスケード（Ｘａ因子）および血小板凝集経路（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）（ＥＰ１５７４５１６に記載）の両方の鍵となる標的を阻害する。
【０００３】
抗凝固および抗アテローム血栓治療の分野の範囲内で、予防措置として、使用される抗凝固剤または抗アテローム血栓剤の活性を中和または最小化できる解毒剤の必要性が存在する。これは、出血が不測の原因により治療下の患者において誘発される可能性があることが周知であるためである。さらに、抗アテローム血栓または抗凝固治療下の患者において、手術により介入する必要がある可能性がある。さらに、一部の外科手術中に、抗凝固剤を、血液凝固を防ぐために高用量で使用する可能性があり、手術終了時にこれを中和させる必要がある。さらに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤が使用される抗血小板治療において、臨床的に有効な解毒剤は、まだ利用可能でない。したがって、いつでも抗アテローム血栓および／または抗凝固活性を停止させるために、中和することができる利用可能な抗アテローム血栓および／または抗凝固剤を有することは有益である。
【０００４】
ＵＳ２００４／００２４１９７（ＷＯ０２／２４７５４）において、緊急の場合、特定の多糖類の抗凝固活性は、これらの多糖類が少なくともビオチンまたはビオチン誘導体との共有結合を含むならば、アビジンを使用して部分的に減少させ得ることを開示している。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５０（２００２）２７３−２７８において、Ｏ．Ｒｏｇｅｒらは、ビオチン化剤を含む還元的アミノ化（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ａｍｉｎａｔｉｏｎ）による炭水化物誘導について述べている。本開示は、多分散天然多糖類の非選択的修飾に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＥＰ１５７４５１６に記載の二重阻害剤から誘導される新規な中和可能な二重阻害剤に関する。
【０００６】
【化７】
2009511543.tif 000002
である基、［本明細書では「ＢＴ」とも呼ばれる特定のビオチン「標識」（ヘキサヒドロ−２−オキサ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−ペンタン酸、好ましくはＤ（＋）−異性体より誘導される。）］またはこの類似体を、ＥＰ１５７４５１６に記載の化合物の構造に結合させまたは導入し、この結果、中和可能な二重阻害剤を得ることができることが発見されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、ビオチン標識またはこの類似体との少なくとも１つの共有結合をさらに含む、式（Ｉ）の化合物
オリゴ糖−スペーサー−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト    （Ｉ）
（式中、オリゴ糖は、４から２５個の単糖類単位を含む負に帯電したオリゴ糖残基であり、電荷は正に帯電した対イオンによって相殺され、オリゴ糖残基がそれ自体（ＡＴ−ＩＩＩ媒介）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖から誘導され；
スペーサーは、結合でありまたは本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、互いに１０〜２０Å離れて残基内に位置するカルボキシレート部分および塩基部分を含むフィブリノゲンのＲＧＤおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤ断片を模倣した残基である。）
または薬学的に許容されるこの塩もしくはプロドラッグもしくはこの溶媒和物に関する。
【０００８】
本発明の化合物は、Ｘａ凝固因子のＡＴＩＩＩ媒介による阻害とおよびフィブリノゲンの受容体への結合に拮抗することによる血小板凝集の抑制との両方により有効な抗血栓症薬である。これらは、血栓症を治療および（場合によって）予防するために有用である。血栓症は凝固カスケードが活性化される多くの血栓および血栓形成前（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）の状態を含み、これらには深部静脈血栓、肺塞栓症、血栓静脈炎、血栓症または塞栓症による動脈閉塞、血管形成中または後の動脈再閉塞、動脈損傷または侵襲的心臓病学的手技後の再狭窄、術後の静脈血栓症または塞栓症、脳卒中および心筋梗塞を含むが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
本発明の化合物におけるビオチン標識（またはこの類似体）は、アビジン（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｔｗｅｌｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６，Ｍ．Ｎ．９２０，ｐａｇｅｓ  １５１−１５２）またはストレプトアビジン（ビオチンと非常に高い親和性を有するそれぞれ約６６，０００および６０，０００Ｄａに等しい質量を有する２種の四量体タンパク質）である特定の解毒剤により速やかに認識され、これら解毒剤に結合する。したがって、緊急状態では、本発明の二重阻害剤の作用を、アビジンまたはストレプトアビジンを用いて（例えば、これらを含む薬剤溶液の注射によって）、速やかに中和することができる。高いビオチン親和性を有するアビジンおよびストレプトアビジンの類似体を、同様に使用することができる。生じた不活性の解毒剤−阻害剤複合体は、血液循環から除去される。
【００１０】
対応する非ビオチン化化合物との比較試験において、二重阻害剤へのビオチン標識の導入は、二重阻害剤の血小板凝集抑制活性またはこれらの抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）媒介の抗Ｘａ効力を妨げないことが認められている。さらに、アビジンまたはストレプトアビジンの投与は、式Ｉの化合物の抗血栓活性の迅速および定量的中和をもたらす。
【００１１】
本発明により標識として使用することができるビオチン類似体は、Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔａｌｏｇｕｅ，１９９９−２０００，６２−８１頁に見られるビオチン類似体、例えば、６−ビオチンアミドヘキサノエート、６−（６−ビオチンアミドヘキサンアミド）ヘキサノエートおよび２−ビオチンアミドエタンチオールなどから選択することができるが、これらに限定されるものではない。このような類似体において、上記の定義のように、ビオチン標識ＢＴは、構造の特徴的部分である。その他の類似体は、例えば、ビオチニダーゼによる切断に対し安定である、ビオチンアミド結合（アルキルが（１〜４Ｃ）アルキル、好ましくはメチルである。）においてアルキル化されているビオチン類似体または例えばヒドロキシメチレン、カルボキシレートもしくは酢酸塩をビオチンアミド結合に対しアルファ位に有する他のビオチン類似体である。
【００１２】
好ましいビオチン類似体は、式
−（ＮＨ−ＣＯ）ｎ−（ＣＨ２）ｐ−Ｘ−ＢＴ
（式中、ｎは、０または１であり、ｐは、４または５であり、ＸはＮＨ、Ｎ（１〜４Ｃ）アルキル、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり、ＢＴは、上記の定義の通りである。）を有する。
【００１３】
４から２５個の単糖類単位のいずれかの負に帯電したオリゴ糖残基は、本発明の化合物において使用可能である。本発明の適切な化合物は、オリゴ糖が硫酸化オリゴ糖残基である化合物である。好ましくは、オリゴ糖残基は、ＥＰ０４５４２２０、ＥＰ０５２９７１５、ＷＯ９７／４７６５９、ＷＯ９８／０３５５４およびＷＯ９９／３６４４３で開示されたオリゴ糖などの、それ自体が（ＡＴ−ＩＩＩ媒介）抗Ｘａ活性を有するオリゴ糖から誘導される。さらに好ましいものは、４から１６個の単糖類単位を有するオリゴ糖残基である。最も好ましくオリゴ糖は、硫酸化五糖類残基である。好ましい五糖類残基は、構造Ａを有する
【００１４】
【化８】
2009511543.tif 000003
（式中、Ｒ１は、独立に、ビオチン標識もしくはこの類似体、ＯＳＯ３−または（１〜８Ｃ）アルコキシである。）。
【００１５】
特に好ましい五糖類残基は、構造Ｂを有する
【００１６】
【化９】
2009511543.tif 000004
（式中、Ｒ１は、ＯＣＨ３またはＯＳＯ３−である。）。構造Ｂの最も好ましい五糖類において、Ｒ１は、ＯＳＯ３−である。
【００１７】
スペーサーは、結合であり、または本質的に薬理学的に不活性な、柔軟な結合残基である。ここで用いられる「本質的に薬理学的不活性な」という用語は、本発明の化合物が治療的に有効である用量で、スペーサーが、それ自体が薬理学的活性を示す原子または基を含まないことを意味する。したがって、本発明の化合物が抗トロンビン剤として使用される用量で、スペーサーの性質は、実証可能な薬理学的副作用をもたらすことはない。好ましい実施形態において、スペーサーは、オリゴ糖残基の酸素を含まないスペーサーの「バックボーン」に沿って数えられる１〜５０個の原子を好ましくは有する、本質的に薬理学的不活性な結合残基である。スペーサーは、環式構造および不飽和結合などの（いくぶん）固定された要素を含んでよい。本発明の化合物のスペーサーは、好ましくは柔軟である。適切なスペーサーは、当業者により容易に設計されることができる。より好ましいスペーサーの長さは、１０〜３５個の原子、特に１０〜２８個である。しかし、合成の理由のためには、より長いスペーサーは適さないと考えられるが、より長いスペーサーが依然として本発明の化合物にうまく適用し得る。非常に適したスペーサーは、少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。より好ましいスペーサーは、より好ましくは６つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。
【００１８】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基へのスペーサー付着部位は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト活性が消失しなければ、本質的に任意に選択することができる。したがって、（場合によってエステル化された）カルボン酸部分および塩基部分は、無変化のままでなければならない。
【００１９】
本発明による好ましい化合物において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基は、Ｒｏ４３５０５４、ＳＣ５４７０１（ゼミロフィバン）、ＲＷＪ５００４２、シブラフィバン（Ｒｏ４４３８８８）、ラミフィバン（Ｒｏ４４９８８３）、ＧＰＩ５６２、ＦＫ６３３、チロフィバン（ＭＫ３８３）、オルボフィバン（ＳＣ５７１０１）、エプチフィバチド（Ｃ６８２２）、ロキシフィバン（ＸＶ４５９）、エラロフィバン（ＲＷＪ５３３０８）、ＳＲ１２１７８７、レフラダフィバン（ＢＩＢＵ５２）、ロトラフィバン（ＳＢ２１４８５７）、ガントフィバン（ＹＭ０２８）、Ｔ−２５０、ＥＦ５０７７、ＺＤ２４８６、ＴＡＫ０２９、ＴＰ９２０１、Ｌ７０３０１４、ＳＲ１２１５６６（ＳＲ１２１７８７の活性型）およびＵＲ−３２１６から誘導された残基から選択される。また、前記残基の誘導体も、（場合によってエステル化された）カルボン酸部分および塩基部分（または保護塩基部分）を含む部が保持されている化学修飾残基を含む。好ましい実施形態において、ＳＲ１２１５６６（ＳＲ１２１７８７の活性型）が選択される。最も好ましいのは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基がチロフィバンから誘導された化合物である。
【００２０】
本発明による好ましい化合物は、ビオチン標識またはこの類似体との１つの共有結合を含む。
【００２１】
ビオチン（またはこの類似体）標識は、化合物式Ｉのすべての部分において存在することができる。したがって、本発明の実施形態は、（ａ）式Ｉの化合物のオリゴ糖残基がビオチン標識またはこの類似体との共有結合を含み、（ｂ）式Ｉの化合物のスペーサーがビオチン標識またはこの類似体との共有結合を含み、（ｃ）式Ｉの化合物のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基がビオチン標識またはこの類似体との共有結合を含む、化合物である。
【００２２】
好ましいのは、式Ｉの化合物のオリゴ糖残基が式
−（ＮＨ−ＣＯ）ｎ−（ＣＨ２）ｐ−Ｘ−ＢＴ
［式中、ｎは、０または１であり（これらの化合物において、好ましくはｎ＝１）、ｐは、４または５であり（これらの化合物において、好ましくはｐ＝５）、ＸおよびＢＴは、上記の定義の通りである。］のビオチン類似体との１つの共有結合を含む、ビオチン類似体との１つの共有結合を含む化合物である。
【００２３】
本発明の他の好ましい化合物は、ビオチン類似体との１つの共有結合を含み、この場合、式Ｉの化合物のスペーサーが式
−（ＣＨ２）４−Ｘ−ＢＴ
（式中、ＸおよびＢＴは、上記の定義の通りである。）のビオチン類似体との１つの共有結合を含む。
【００２４】
本発明のビオチン化二重阻害剤の代表例は、式Ｉの化合物の他に、以下の構造を有する、
【００２５】
【化１０】
2009511543.tif 000005
2009511543.tif 000006
スペーサーが別の位置でオリゴ糖に結合しているおよび／またはビオチン（類似体）標識がこの分子の別の位置に存在する化合物である。式ＩＩの化合物は、本発明の好ましい例である。
【００２６】
正に帯電した対イオンは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋などを意味する。好ましくは、式Ｉの化合物は、これらのナトリウム塩の形態である。
【００２７】
塩基部分という用語は、アミン、アミジン、グアニジン、ピペリジンなどのいずれかの周知の塩基部分を意味する。
【００２８】
「互いに１０〜２０Å離れて」という句により、結合に沿って測定するだけではなく、他の１つに対する２つの基の空間的配向を意味する。距離の測定のために、周知のモデリング技術が当業者に利用可能である。（例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，２５３７−２５５１を参照のこと）。
【００２９】
（１〜８Ｃ）アルキルという用語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第二ブチル、第三ブチル、ヘキシルおよびオクチルなどの１〜８個の炭素原子を有する分枝鎖または非分枝鎖のアルキル基を意味する。メチルおよびエチルは、好ましいアルキル基である。
【００３０】
（１〜８Ｃ）アルコキシという用語において、アルキル残基は、前記の定義の通りである。
【００３１】
「プロドラッグ」という用語は、例えば、式Ｉの化合物のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基における塩基部分（例えば、アミノまたはベンズアミジノ基）が、（例えば、ヒドロキシ、（１〜６Ｃ）アルコキシまたは（１〜６Ｃ）アルコキシカルボニル基により）保護されている化合物などの活性化合物へ体内で代謝される化合物を意味する。また、プロドラッグの例は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基におけるカルボキシレート基がエステル化されている式Ｉの化合物である。
【００３２】
本発明による溶媒和物は、水和物を含む。
【００３３】
本発明の化合物は、チロフィバン、ＳＲ１２１５６６、Ｒｏ４３５０５４、ＲＷＪ５００４２もしくはＳＣ５４７０１（ゼミロフィバンの薬理学的活性型）、ラミフィバンまたはこの類似体から誘導される前記のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストを、当技術分野で一般に公知の方法を使用して、アミノ酸、ペプチド模倣物または追加の官能基（例えば、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−Ｎ３、末端アルキンなど）を用いて、場合によって修飾することにより調製することができる。このような修飾ＲＧＤ類似体の合成の例は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，３５７−３７９（２００１）に記載されており、ここでは化合物は、標的薬物送達のための可能性あるベクターとして示唆されている。本発明によれば、場合によって修飾されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト部分は、（ａ）オリゴ糖に直接結合している、（ｂ）オリゴ糖−スペーサー残基に結合している、または（ｃ）引き続いてオリゴ糖−スペーサー−残基に結合しているスペーサーに結合している（例えば、ＷＯ９９／６５９３４；ＷＯ０１／４２２６２より公知の方法による。）。例えば、文献（例えば、ＥＰ０４５４２２０、ＥＰ０５２９７１５、しかしこれらの供給源に限定されるものではない。）により公知のオリゴ糖または市販のオリゴ糖など、いかなる適切なオリゴ糖も、この目的のために使用することができる。オリゴ糖を、例えば、Ｂｕｉｊｓｍａｎ，Ｒ．ら（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９９，９，２０１３−２０１８）に記載の当技術分野で公知の方法により、適切な時点でリン酸化することができる。オリゴ類へのスペーサーの結合は、例えば、ＥＰ０６４９８５４またはＥＰ０４００５３４３．１に記載の方法を用いて実施することができる。
【００３４】
ビオチン標識を式Ｉの化合物に結合させる方法に関して、化学文献が、利用することができ、当業者に周知の保護基の異なるセットを使用することができるいくつかの可能性を提供している。例えば、活性化エステル、マレイミド、ヨードアセチルまたは一級アミン型などの反応基を含むビオチン標識は、アミノ官能基、チオール官能基、カルボン酸官能基、またはアルデヒド官能基と好ましくは反応させ得、この反応は文献（参照、Ｓａｖａｇｅら、Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）に記載の条件に従って生じる。
【００３５】
ビオチン標識は、例えば、（負に帯電した）オリゴ糖残基に直接結合させるか、またはオリゴ糖−スペーサー残基の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ官能基を通して、もしくは場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ酸残基を通して、式Ｉの化合物のオリゴ糖残基の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミン官能基に結合させることができる。
【００３６】
本発明の別の態様において、ビオチン標識を、例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基に直接結合させるか、または結合残基の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ官能基を通してもしくは場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ酸残基を通して、式Ｉの化合物のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミン官能基に結合させることができる。
【００３７】
さらに本発明の別の態様において、ビオチン標識を、例えば、段階的に、最初はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基に直接結合させ、または式Ｉのスペーサーの一部の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ官能基を通してもしくは場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ酸残基を通して、式Ｉの化合物のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ官能基に結合させ、二番目にオリゴ糖に直接結合させる、または式Ｉのスペーサーの一部の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ官能基を通して、もしくは場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミノ酸残基を通して、式Ｉの化合物の（負に帯電した）オリゴ糖残基の場合によってＮ−（１〜４Ｃ）アルキル化されたアミン官能基に結合させる（あるいはその逆）ことにより導入することができる。
【００３８】
本発明の別の態様において、場合によってＮ−アルキル化されたアミノ酸残基またはα−Ｎ−置換（β−）アミノ酸類似体を、当技術分野で公知の方法を使用したペプチド結合により導入することができる。アジド基は、その後のビオチン標識の導入のために、式Ｉの化合物の前駆体において使用することができる適切な潜在的アミノ官能基である。
【００３９】
また、公知のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの他の例は、本発明の化合物のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの部分（のためのベース）を利用することができる（しかしこれらの例に限定されるものではない。）。これらの化合物は、ＥＰ０５２９８５８、ＷＯ９６／２０１７２、ＥＰ０４９６３７８、ＥＰ０５３０５０５、Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３，５３９（１９９５）、ＷＯ９３／０８１７４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，８８６１（１９９３）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３，３４５３（２０００）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３，３３７（１９９５）、ＵＳ５２３９１１３、ＵＳ５３４４９５７、ＵＳ５９７３００３、ＵＳ５７０３１２５、ＷＯ９６／３７４６４、ＷＯ９３／０７８６７、ＵＳ５３７８７１２、ＥＰ４４５７９６、ＵＳ５２７３９８２、ＵＳ５７７０５７５、ＷＯ０１／６０２８１３、ＥＰ６５６３４８、ＵＳ５７２６１８５、ＥＰ５０５８６８、ＥＰ５６０７３０、ＵＳ５５６１１１２、ＥＰ５１３６７５、ＵＳ５５７４０１６、ＷＯ９４／０９０３０、ＥＰ４７８３６３、ＵＳ５２９２７５６、ＵＳ５２０６３７３、ＷＯ９３／１６９９４、ＵＳ５３１２９２３、ＥＰ７４３３０２、ＵＳ５６５８９２９、ＵＳ５８８０１３６、ＵＳ５８１４６４３、ＵＳ６０４０３１７、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ  １３（８），１１７３−１１８８（２００３）およびＣｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ  １４，１５６７−１６０９（２００４）に記載のＲｏ４３８８５７、Ｒｏ４８３６５７、ＢＩＢＬ１２、ＦＫ６３３、ＧＲ１４４０５３、ＥＭＤ７６３３４、ＳＲ１２１５６６、ＳＢ２０８６５１、ＳＣ５４６８４、ＳＣ５２０１２、ＤＭＰ７５４、ＦＲ１５８９９９、ＧＲ２００９７６、ＸＶ７８８、ＭＫ３８３（チロフィバン）、ＲＷＪ５３３０８、ＺＤ２４８６、Ｌ７０９７８０、ＲＧＤ８９１、Ｔ２５０、Ｃ６８２２、ＢＩＢＵ１０４、ＳＢ２１４８５７、ＳＣ５７１０１、Ｇ７４５３、ＴＡＫ０２９、ＸＶ４５４、ＸＶ４５９、Ｌ７３４２１７、ＤＭＰ８０２、ＳＲ１２１７８７、ＴＰ９２０１、ＤＭＰ７５７、ＳＣ５２０１２、ＲＰＲ１０９８９１、ＹＭ６８１２８、ＭＥ３２２９、ＭＥ３２３０、ＣＴ５０３５２、ＭＫ８５２、Ｓ１１９７、ＤＭＰ７２８、ＳＣ５７３４５、Ｌ７３８１６７、ＧＲ２３３５４８、Ｒｏ４３８８５７、ＴＡ９９３、ＹＭ３３７、ＢＩＢＷ１９４、ＢＩＢＵ１２９、ＢＩＢＷ９８、テトラフィブリシン、Ｌ７０３０１４、ＢＩＢＵ２５１、ＧＲ９１６６９、ＲＧ１３９６５、Ｇ７４４６、ＰＳ０２８、ＸＲ３００、ＮＳＬ９４０３、Ｌ７５６５６８、Ｓ１７６２、Ｌ７４６２２３、Ｌ７６７６８５、ＮＳＬ９５３０１、Ｇ４１２０、ＳＢ２０７０４３、ＧＲ８３８９５、Ｐ２４６、Ｌ７３９７５８、ＸＲ２９９、ＳＶ８７３、ＲＷＪ５０２２８、ＸＱ８７０、ＥＦ５１５４、ＡＲ０５１０、Ｇ７５７０、Ｇ７４４２、Ｇ７４６４、ＲＷＪ５２６５６、ＴＡＫ０２４、ＭＳ１８０、ＭＳ２８１６８、ＸＵ０６３、ＸＵ０６５、Ｌ７３４１１５、ＳＭ２０３０２、ＴＳ９４３、ＮＳＬ９６１８４、ＵＲ１２９４７、ＸＵ０５７、Ｌ７５００３４、ＵＲ３２１６、ＵＲ２９２２、ＣＰ４６３２、ＡＲ���５９８、ＳＣ７９９９２、ＳＣ４９９２、ＲＧＤ０３９、ＭＥ３２７７、Ｔ２５０、ＳＣ５７０９９Ｂ、ＳＫＦ１０６７６０、ＳＫＦ１０７２６０、ＲＷＪ５２６５４、ＰＳＡ０６１３、ＣＧＨ４００、ＮＳＬ９５３１７、ＸＴ１１１、ＲＷＪ２７７５５、Ｌ７３６６２２、ＳＣ４６７４９、ＳＭ２０３０２、ＹＭ５７００２９、ＣＹ３１１１７６およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストなどである。
【００４０】
さらに、本発明に含まれるものは、互いに１０〜２０Å離れて残基内に位置する（場合によってエステル化された）カルボキシレート部分および塩基部分を通常含むフィブリノゲンのＲＧＤおよび／またはＫ（ＱＡ）ＧＤ断片を模倣した、新規に設計されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基を含む化合物である。
【００４１】
本発明の化合物を調製するための上記の方法における手順のステップであるペプチド結合は、ペプチド断片の結合（または縮合）のための当技術分野で一般に公知の方法、例えば、アジド法、混合酸無水物法、活性化エステル法、カルボジイミド法（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｍｅｔｈｏｄ）により、または好ましくはＴＢＴＵなどのアンモニウム／ウロニウム塩の影響下、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび７−アザ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの触媒およびラセミ化抑制化合物の添加によって実施することができる。概要は、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ３，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ  ａｎｄ  Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００２）に示されている。
【００４２】
本化合物に存在するアミン官能基を、Ｎ−保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基もしくはフタロイル（Ｐｈｔｈ）基など、αアミノ基の保護のためにペプチド化学において一般に使用される基を意味する。）によって、合成処理の間に保護できる、またはアジド部分のデマスキングによって導入できる。アミノ保護基およびこの除去に関する概要は、上記のＴｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ３およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて示されている。
【００４３】
アミジン官能基は、存在する場合、結合のステップにおいて非保護のままにしておくことができ、またはアリルオキシカルボニルもしくはベンジルオキシカルボニルなどのカルバミン酸塩を用いて保護することができる。アミジン官能基は、前駆体として１，２，４−オキサジアゾリン−５−オン部分を用いて穏やかな条件下で導入するのが好ましい。
【００４４】
カルボン酸基を、ｔｅｒｔ−ブチルエステルなどのαカルボン酸基の保護のために、ペプチド化学において一般に使用される基によって保護することができる。修飾されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのカルボン酸基を、ブチルエステルとして好ましくは保護する。保護基の除去は、これら保護基の性質によって異なる方法で行うことができる。通常、脱保護は、酸性条件下およびスカベンジャーの存在下に、または接触水素化などの還元条件下に行う。
【００４５】
オリゴ糖へのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの連結の必要条件は、カルボキシレート基などの直交性反応型（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ）の固定基が存在することで、これらはオリゴ糖残基もしくはオリゴ糖−スペーサー誘導体に直接結合させる、またはスペーサーを通してオリゴ糖−スペーサー誘導体に結合させることができる。そのような連結を可能にするために、殆どの場合、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの追加的な修飾が必要である。
【００４６】
式Ｉの化合物を合成するためのスペーサー誘導構築物（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）の構築は、アミノ酸、これらの誘導体もしくはペプチド模倣物の段階的導入による直鎖状様式、または中間構築物のブロック結合による収束的様式のいずれかにおける当技術分野で公知の方法を用いる様々な方法において達成することができる。
【００４７】
遊離塩基の形態で生じる可能性のある本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で反応混合物から単離することができる。また、薬学的に許容される塩は、式（Ｉ）の遊離塩基を、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、アスコルビン酸などの有機または無機酸で処理することによっても得ることができる。
【００４８】
本発明の化合物またはその中間体は、キラル炭素原子を有することができ、したがって、純粋なエナンチオマー、またはエナンチオマーの混合物、またはジアステレオマーを含む混合物として得ることができる。純粋なエナンチオマーを得るための方法は、例えば、光学活性な酸およびラミセ混合物から得られる塩の結晶化、またはキラルカラムを用いたクロマトグラフィーなど、当技術分野において公知である。ジアステレオマーに対して、ストレート相（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｐｈａｓｅ）または逆相カラムを使用することができる。
【００４９】
本発明の化合物は、経腸的または非経口的に投与することができる。これら化合物およびこの組成物の正確な用量およびレジメンは、薬物を投与する個々の被験者の必要性、苦痛または必要性の程度および医療従事者（開業医）の判断に必然的に依存する。通常、非経口投与は、吸収により依存する他の投与方法より要求量が少ない。しかし、ヒトに対する１日投与量は、好ましくは０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５０】
また、本発明の化合物を用いて製造された薬物は、（救急）抗血栓療法におけるアジュバントとして使用することができる。そのような場合において、この薬物は、疾患状態を治療することにおいて有用なアスピリン、クロピドグレルまたはスタチンなどの他の化合物と共に投与する。例えば、標準的参考文献のＧｅｎｎａｒｏら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、特にＰａｒｔ  ８：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照）に記載のように、薬学的に適切な助剤と混合して、本化合物を、丸剤、錠剤などの固体用量単位に圧縮するか、またはカプセルもしくは坐剤に加工することができる。また、薬学的に適切な液体を用いて、本化合物を、例えば、注射製剤としての使用に、溶液、懸濁液、乳濁液の形態で適用することができる。
【００５１】
用量単位を製造するために、増量剤、着色剤、ポリマー結合剤などの従来の添加物の使用が考えられる。一般に、活性化合物の機能を妨げない薬学的に許容される添加剤を使用することができる。それと共に本組成物を投与することができる適切な担体には、適切な量において使用したラクトース、デンプン、セルロース誘導体など、またはその混合物がある。
【００５２】
本発明は、以下の実施例により、さらに例証される。
【００５３】
（実施例）
使用される略語
ＡＤＰ＝アデノシン５’−二リン酸
Ａｑ．＝水性
ＡＴＩＩＩ＝抗トロンビンＩＩＩ
Ｂｎ＝ベンジル
Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤｉＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド
ｆｍｏｃ＝カルバミン酸９−フルオレニルメチル
ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルホリン
Ｍｅ＝メチル
ｓａｔ．＝飽和
ＰＲＰ＝多血小板血漿
ＰＰＰ＝乏血小板血漿
ＲＴ＝室温
ＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＲＡＰ＝トロンビン受容体アゴニストペプチド
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル
【実施例１】
【００５４】
ｔｅｒｔ−ブチル１５−Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノエート（２）
ＥＰ１５７４５１６に記載のように調製したｔｅｒｔ−ブチル１５−アミノ−３，６，９，
１２−テトラオキサ−ペンタデカノエート（１）（０．５０ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（７．５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）に溶解した。４Ｎ  ＮａＯＨ溶液を、ｐＨが約９になるまで加えた。Ｎ−９−フルオレニルメチルカルバメートスクシンイミド（ＦｍｏｃＯＳｕ、０．５４ｇ、１．６０ｍｍｏｌ、１．１当量）を分割して加えた。１０分後、さらに４Ｎ  ＮａＯＨ溶液を加えて、ｐＨを約９に調整した。３時間後、反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ溶液を用いて、ｐＨ６〜７まで酸性化させた。Ｈ２Ｏを反応混合物に加え、次にＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過後、溶媒を減圧下（５０ｍｂａｒ、５０℃）で除去した。未精製油（ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１／０→９５／５、ｖ／ｖ）で精製し、帯黄色の油（０．６１ｇ、７９％）として化合物２を得た。Ｒｆ０．６４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９５／５、ｖ／ｖ）。
【実施例２】
【００５５】
１５−Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノエート（３）
化合物２をＤＣＭ（３．５ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（３．５ｍＬ）を窒素雰囲気下で加えた。１．５時間の撹拌後、反応混合液を減圧下で濃縮した。次に、過剰なＴＦＡをトルエン中で繰り返し濃縮することにより取り除いた。ＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ、１／２、ｖ／ｖ）を加え、溶液を１Ｎ  ＨＣｌで洗浄した。水層をＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ、１／２、ｖ／ｖ）で抽出した。混合した有機層を鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。ろ過後、溶媒を減圧下（５０℃）で除去した。未精製油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９９／０／１→８９／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）で精製し、化合物３を得た。残ったＡｃＯＨは、ＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ（１／２、ｖ／ｖ）に未精製の油性生成物を溶解し、Ｈ２Ｏ（３×）および鹹水ですすいだ後、ＭｇＳＯ４で乾燥させることにより除去する。ろ過後、溶媒を減圧下（５０℃）で除去し、帯黄色の油として化合物３を得た（０．３７ｇ、６７％）。Ｒｆ０３２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、８９／１０／１、ｖ／ｖ）。
【実施例３】
【００５６】
ｔｅｒｔ−ブチル１５−Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン（４）
化合物３（０．３７ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１８ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（０．４０μＬ、２．３１ｍｍｏｌ、３当量）およびＴＢＴＵ（０．２５ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で続いて加え、溶液を１０分間撹拌させた。次に、ε−（Ｚ）−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯｔＢｕ−ＨＣｌ（０．２９ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、Ｈ２Ｏ、０．１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液および鹹水ですすいだ。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、気圧下で濃縮した。精製をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１／０→９／１、ｖ／ｖ）により実施し、帯黄色の油として化合物４を得た（０．５１ｇ、８３％）。Ｒｆ０．８５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。ＥＳＩ−ＭＳ：７９２．６［Ｍ＋Ｈ］＋、８１４．６［Ｍ＋Ｎａ］＋、７３６．４［Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ］＋
【実施例４】
【００５７】
ｔｅｒｔ−ブチル１５−Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン（５）
化合物４（０．２６ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ２ＮＨ（１ｍＬ）を加え、溶液を２４時間撹拌させた。過剰なＥｔ２Ｎおよび溶媒を減圧下（５０℃）で除去した。トルエンを加え、減圧下（５０℃、６５ｍｂａｒ）で除去し、Ｎ−脱保護生成物を得た（０，２１ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）。Ｒｆ０．２３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。ＥＳＩ−ＭＳ：５７０．４［Ｍ＋Ｈ］＋、５１４．４［Ｍ−ｔＢｎ＋Ｈ］＋
粗生成物をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（０．１１ｍＬ）、続いてＮ２雰囲気下でジ−ｔ−ブチル重炭酸塩（７３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。５時間撹拌後、混合物を０．１Ｎ  ＨＣｌの冷（５℃）溶液に加え、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。ろ過後、溶媒を減圧下（１８０ｍｂａｒ、５０℃）で除去した。精製をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１／０→９５／５、ｖ／ｖ）により実施し、無色の油を得た（０．１７ｇ、８２％）。Ｒｆ０．５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。ＥＳＩ−ＭＳ：６７０．６［Ｍ＋Ｈ］＋、６９２．４［Ｍ＋Ｎａ］＋、５７０．４［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ］＋、５１４．１［Ｍ−Ｂｏｃ−ｔＢｕ＋Ｈ］＋
【実施例５】
【００５８】
１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−［Ｄ−（＋）−ビオチニル］−Ｌ−リシン（６）
化合物５（０．２３ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（８ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１．２ｍＬ）に溶解した。溶液を窒素で５分間フラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）後、Ｐｄ／Ｃ１０％（０．１１ｇ）を加えた。水素を溶液に４時間通した。窒素を溶液に通して１０分間フラッシュし、すべての水素を除去した。混合物をデカライトによりろ過し、減圧下（１７０ｍｂａｒ、５０℃）で濃縮して、無色の油としてＮ−Ｌ−リシン脱保護中間体を得た（０．１５ｇ、８１％）。Ｒｆ０．０２（ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ、９／１、ｖ／ｖ）。
【００５９】
Ｄ−（＋）−ビオチン（７５ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７ｍＬ）に懸濁した。ＤｉＰＥＡ（０．１１ｍＬ、０．６２ｍｍｏｌ、２当量）およびＴＢＴＵ（０．１０ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で続いて加え、溶液を１時間撹拌させた。上記のε−Ｎ−Ｌ−リシン脱保護中間体のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液を反応混合物に加えた。混合物を１６時間撹拌させた。Ｈ２Ｏを加え、ＤＣＭで抽出した（３×）。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、減圧下（８５０ｍｂａｒ、５０℃）で濃縮した。精製をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１／０→９／１、ｖ／ｖ）により実施し、油を得た（０．１３ｇ、６０％）。Ｒｆ０．４８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。ＥＳＩ−ＭＳ：７６２．６［Ｍ＋Ｈ］＋、７８４．６［Ｍ＋Ｎａ］＋、６６２．４［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ］＋、６０６．４［Ｍ−Ｂｏｃ−ｔＢｕ＋Ｈ］＋。この油を、乾燥４Ｎ  ＨＣｌのジオキサン（４ｍＬ）溶液に溶解し、撹拌した。１時間後、不溶性油が出現し、その後に溶媒を減圧下（１００ｍｂａｒ、５０℃）で除去し、定量的収率の化合物６を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：６０６．４［Ｍ＋Ｈ］＋、６２８．４［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【実施例６】
【００６０】
ベンジルＮ−＜３−｛［−ε−（Ｄ−（＋）−ビオチニル）−Ｌ−リシン−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシン（８）
ＥＰ１５７４５１６に記載のように調製した化合物７（０．１０ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（５６μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２当量）およびＴＢＴＵ（５１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で続いて加え、溶液を４５分間撹拌した。化合物６（０．１７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）、ＤｉＰＥＡ（２８μＬ、０．１６ｍｍｏｌ、１当量）に溶解し、反応混合物に加えた。混合物を１６時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ溶液で洗浄した。有機相をＨ２Ｏで洗浄し（３×）、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、減圧下（８５０ｍｂａｒ、５０℃）で濃縮した。精製をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９９／０／１→７９／２０／１  ｖ／ｖ）により実施し、化合物８を得た（５６ｍｇ、２７％）。Ｒｆ０．１５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９／１、ｖ／ｖ）。ＥＳＩ−ＭＳ：１３１６．６［Ｍ＋Ｈ］＋、１３３８．８［Ｍ＋Ｎａ］＋、１１８２。６［Ｍ−Ｚ＋Ｈ］＋、１２０４．６［Ｍ−Ｚ＋Ｎａ］＋、１３１４．８［Ｍ−Ｈ］＋
【実施例７】
【００６１】
化合物１０、１２、１７および２６の調製のための一般的手順：
カルボン酸誘導体（３３μｍｏｌ）（すなわち、化合物８、１１、１６または２５）を、乾燥ＤＭＦ（２×２ｍＬ）で繰り返し濃縮することにより乾燥し、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ２雰囲気下のＴＢＴＵ（１１ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（５．７μｌ、３３μｍｏｌ）の存在下で撹拌した。１時間後、五糖類９（３１μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、ＲＴで終夜撹拌し、イオン交換（Ｍｏｎｏ−Ｑ）および逆相（ＬｕｎａＣ１８）クロマトグラフィーによって分析した。反応混合物を濃縮した（＜５０℃、１５ｍｍＨｇ）。（粗）生成物（Ｈ２Ｏ／ｔ−ＢｕＯＨ中に１０ｍｇ／ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）を、１０％Ｐｄ／Ｃによる水素添加（Ｈ２）（当量（重量）を粗生成物に対して加えた。）により脱保護した。１６時間後に、溶液を脱気し、０．４５μＭ  ＨＰＬＣフィルターによってろ過し、減圧下（＜５０℃、１５ｍｍＨｇ）で濃縮した。抱合体を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、緩衝液：Ｈ２Ｏ→２Ｍ  ＮａＣｌ）により精製した後、セファデックスＧ２５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５−ｃｏｌｕｍｎ）（Ｈ２Ｏ）により脱塩し、凍結乾燥させた。
【実施例８】
【００６２】
メチルＯ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜＜１２−Ｎ−＜＜Ｎε−（Ｄ−（＋）−ビオニチル）−Ｎ−＜３−｛［１５−Ｎ−（１５−アザ−１−ケト−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデシル）］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシル＞−リシル−＞＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサ−ドデシル＞＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシドノナキスナトリウム塩（１０）
五糖類９（５１．７ｍｇ、２７．４μｍｏｌ）［ＷＯ０１／４２２６２に記載の誘導された単糖類５とＵＳ２００４／００２４１９７に記載の四糖類４８とを、脱保護および硫酸化を含むこれら特許出願に記載の方法と類似した方法を用いて結合させることにより得ることができる。］へのカルボン酸８（３７．８ｍｇ、２８．７μｍｏｌ）の抱合、続いて精製、および一般的手順に従って脱保護を実施した。抱合体１０を収量１３．６ｍｇ（１６％、２段階）の白色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ  ７．８５（ｄ，１Ｈ）、７．７８（ｄ，１Ｈ）、７．６３（ｄ，１Ｈ）、７．４２（ｔ，１Ｈ）、６．８５（ｄ，１Ｈ）、６．５０（ｄ，１Ｈ）、５．３９（ｄ，１Ｈ）、５．３３（ｄ，１Ｈ）、５．１３（ｂｓ，１Ｈ）、５．０８（ｄ，１Ｈ）、４．５８（ｍ，１Ｈ）、４．５８（ｄ，１Ｈ）、４．４９（ｍ，１Ｈ）、４．４８（ｍ，１Ｈ）、４．３３（ｍ，１Ｈ）、４．２９（ｍ，１Ｈ）、４．２８（ｄｄ，１Ｈ）、４．２２（ｄｄ，１Ｈ）、４．２１（ｍ，２Ｈ）、４．２０（ｍ，１Ｈ）、４．１７（ｍ，２Ｈ）、４．０９（ｍ，１Ｈ）、４．０７（ｍ，１Ｈ）、４．０５（ｄ，１Ｈ）、４．０２（ｍ，１Ｈ）、３．９６（ｓ，２Ｈ）、３．８９（ｍ，１Ｈ）、３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．８５（ｍ，２Ｈ）、３．７９（ｍ，２Ｈ）、３．７３（ｍ，１Ｈ）、３．６９（ｍ，１Ｈ）、３．６５（ｍ，１Ｈ）、３．６１〜３．５１（ｍ，２６Ｈ）、３．６０〜３．３８（８×ｓ，３４Ｈ）、３．４８（ｍ，２Ｈ）、３．４２（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｍ，１Ｈ）、３．３２（ｍ，１Ｈ）、３．１９（ｍ，３Ｈ）、２．９２〜２．２．８９（ｍ，１Ｈ）、２．６７（ｄ，１Ｈ）、２．４８（ｍ，１Ｈ）、２．１３（ｔ，２Ｈ）、１．９１（ｄ，１Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．６５〜１．３７（ｍ，５Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ：実測値：ｍ／ｚ  １３８１．３［Ｍ＋Ｈ］２−、１３９２．３［Ｍ＋Ｎａ］２−、１４０２．８［Ｍ＋２Ｎａ］２−、１４１３．８［Ｍ＋３Ｎａ］２−、９２０．２［Ｍ−３Ｈ］３−、９２７．５［Ｍ−３Ｈ＋Ｎａ］３−、９３４．５［Ｍ−３Ｈ＋２Ｎａ］３−、６９０．２［Ｍ−４Ｈ］４−、６９４．７［Ｍ−４Ｈ＋Ｎａ］４−
【実施例９】
【００６３】
メチルＯ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜１２−Ｎ−＜３−｛［１５−Ｎ−（１５−アザ−１−ケト−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデシル）］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシル＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサ−ドデシル＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシドノナキスナトリウム塩（１２）
化合物１２を、一般的手順に従った化合物９（１０１ｍｇ、５３．９μｍｏｌ）と化合物１１（６０．０ｍｇ、５６．６μｍｏｌ）（ＥＰ１５７４５１６に記載のように調製した。）との結合により得た。収量７２ｍｇ（５２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ  ７．８４（ｍ，１Ｈ）、７．７５（ｍ，１Ｈ）、７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．４２（ｔ，１Ｈ）、６．８３（ｄ，２Ｈ）、６．４８（ｄ，２Ｈ）、５．３８（ｄ，１Ｈ）、５．３３（ｍ，１Ｈ）、５．０８（ｄ，１Ｈ）、５．０２（ｂｓ，１Ｈ）、４．５８（ｄ，１Ｈ）、４．４６（ｂｓ，２Ｈ）、４．２８（ｍ，２Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．２２（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｍ，２Ｈ）、４．１１（ｍ，２Ｈ）、４．０４（ｄ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｍ，１Ｈ）、３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．８４（ｍ，２Ｈ）、３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｍ，１Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ）、３．６６（ｍ，２Ｈ）、３．６２〜３．３３（ｍ，５４Ｈ）、３．２０（ｄｄ，１Ｈ）、３．１８（ｍ，１Ｈ）、２．９２（ｍ，２Ｈ）、１．９２（ｍ，２Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．５８（ｍ，１Ｈ）、１．４４（ｍ，２Ｈ）、１．３３（ｍ，４Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １２２５．２［Ｍ＋５Ｈ＋２Ｎａ］２−、８２３．８［Ｍ＋３Ｎａ＋３Ｈ］３−、８１６．５［Ｍ＋２Ｎａ＋４Ｈ］３−、８０９．１［Ｍ＋Ｎａ＋５Ｈ］３−。
【実施例１０】
【００６４】
［Ｄ−（＋）ビオチニル］−Ｌ−アスパラギン酸塩−α−ベンジルエステル（１４）
Ｄ−ビオチン（２．０ｇ、８．１９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５２ｍＬ）懸濁液に、ペンタフルオロフェノール（１．６ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）、続いてＤＣＣ（２．５ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を、窒素雰囲気下のＲＴで終夜撹拌させた。反応混合物を懸濁液として残し、ろ過し、濃縮した。残渣をＥｔ２Ｏに溶解し、数分間撹拌し、その後、懸濁液を真空下でろ過し、白色の固体を得た（２．５８ｇ）ＥＳＩ−ＭＳ：４１１［Ｍ＋Ｈ］＋。固体をＤＭＦ（９０ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（１．２４ｍＬ、８．８２ｍｍｏｌ、１．４当量）を加えた。Ｈ−Ａｓｐ−ＯＢｎを固体として分割して加えた。約１５分後、反応混合物は透明になり、さらに２時間撹拌させた。反応混合物を減圧下で濃縮し、水、続いてＭｃＯＨ（３：１）を加えた。形成した固体をろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、真空下で乾燥させ、白色の固体として化合物１４を得た（２．９２ｇ、７７％）ＥＳＩ−ＭＳ：４５０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例１１】
【００６５】
Ｎ−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−＜Ｎ−［Ｄ−（＋）−ビオチニル］−Ｌ−アスパルチルα−ベンジルエステル＞−Ｌ−リシン（１５）
化合物１３（３．６０ｇ、６．７２ｍｍｏｌ、１．０７当量）（化合物６の合成のために前述したように得た。）および化合物１４（２．９２ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解した。ＤｉＰＥＡ（２．２ｍＬ、１２．６ｍｍｏｌ、２当量）を窒素雰囲気下で加え、続いてＴＢＴＵ（２．５３ｇ、７．８８ｍｍｏｌ、１．２５当量）を加えた。反応混合物を終夜撹拌させ、その後、溶媒を減圧下で除去した。精製を、ＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ）を用いて実施し、帯黄色の油を得た（２．３１ｇ）。ＥＳＩ−ＭＳ：９６７［Ｍ＋Ｈ］＋．脱保護は、ＲＴで２時間撹拌しながら、ＤＣＭ／ＴＦＡ（１：１、６０ｍＬ）において実施した。ＤＣＭを加え（１５０ｍＬ）、溶媒を加熱することにより除去した（４５℃、気圧）。この工程を繰り返し（３×）、続いてトルエンで濃縮を繰り返した（３×）。化合物１５を、帯黄色の固体として収集した（３．２９ｇ、３０％）。ＥＳＩ−ＭＳ：８１１［Ｍ＋Ｈ］＋
【実施例１２】
【００６６】
ε−Ｎ−（Ｄ−（＋）−ビオチニル−β−Ｌ−アスパルチル）−Ｎ−＜３−｛［１５−Ｎ−（１５−アザ−１−ケト−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデシル）］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシル＞−Ｌ−リシン（１６）
７（１．４１ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液に、ＤｉＰＥＡ（１．０ｍＬ、５．８ｍｍｏｌ、３当量）を窒素雰囲気下で加え、続いてＴＢＴＵ（６８５ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、１時間撹拌させた。次に１５のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を加え、３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗成生物をＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ）により精製し、帯黄色の固体を得た（７８３ｍｇ、２６％）。ＥＳＩ−ＭＳ：１５２２［Ｍ＋Ｈ］＋
【実施例１３】
【００６７】
メチル２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜＜１２−Ｎ−＜＜ε−Ｎ−（Ｄ−（＋）−ビオチニル−β−Ｌ−アスパルチル）−Ｎ−＜３−｛［１５−Ｎ−（１５−アザ−１−ケト−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデシル）］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシル＞−Ｌ−リシル−＞＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサ−ドデシル＞＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシドデカキスナトリウム塩（１７）
化合物１７の合成は、基本的に、一般的手順に従って実施した。したがって、１６（７６８ｍｇ、０．５０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液に、ＤｉＰＥＡ（１０６μＬ、０．６１ｍｍｏｌ、１．２当量）、続いて窒素下でＴＢＴＵ（１７８ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。溶液を１時間撹拌後、化合物９（９０６ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌を続けた。反応混合物を減圧下で濃縮し、Ｑ−セファロースで精製した（Ｈ２Ｏ→２Ｍ  ＮａＣｌ）。脱塩をセファデックス−Ｇ２５で実施し、透明な油を得た（１．５ｇ）。油をＨ２Ｏ（３７ｍＬ）およびｔ−ＢｕＯＨ（３７ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（６７０ｍｇ）を窒素雰囲気下で加えた。水素を溶液に１６時間通した。ろ過によりＰｄ／Ｃ触媒を除去した後、化合物をＱ−セファロースで再度精製し、セファデックス−Ｇ２５で脱塩して、収量４６５ｍｇ（３４％）の化合物１７を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ  ７．９４（ｍ，１Ｈ）、７．８６（ｔ，１Ｈ）、７．７１（ｍ，１Ｈ）、７．５２（ｔ，１Ｈ）、６．９３（ｄ，１Ｈ）、６．５８（ｄ，１Ｈ）、５．４５（ｄ，１Ｈ）、５．４２（ｄ，１Ｈ）、５．１８（ｂｓ，１Ｈ）、５．１５（ｄ，１Ｈ）、４．５６（ｍ，１Ｈ）、４．３３〜４．４１（ｍ，２Ｈ）、４．３０〜４．２１（ｍ，４Ｈ）、４．１３〜４．０５（ｍ，４Ｈ）、３．８９〜３．９６（ｍ，５Ｈ）、３．８７〜３．８２（ｍ，３Ｈ）、３．８１〜３．７０（ｍ，７Ｈ）、３．６９〜３．６０（ｍ，３９Ｈ）、３．５９〜３．４８（ｍ，１３Ｈ）、３．４７〜３．３５（ｍ，８Ｈ）、３．３０〜３．２４（ｍ，３Ｈ）、３．１１（ｔ，２Ｈ）、３．０６〜２．９３（ｍ，４Ｈ）、２．７９〜２．７３（ｍ，２Ｈ）、２．６０〜２．５２（ｍ，２Ｈ）、２．２６（ｔ，２Ｈ）、２．０１〜１．９６（ｍ，２Ｈ）、１．８１〜１．７４（ｍ，３Ｈ）、１．７１〜１．２５（ｍ，２０Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  １４８１．９［Ｍ＋４Ｎａ−４Ｈ］２−、１４７１．０［Ｍ＋３Ｎａ−３Ｈ］２−、９８０．７［Ｍ＋３Ｎａ−３Ｈ］３−Ｍ＋Ｎａ＋５Ｈ］３−
【実施例１４】
【００６８】
ε−Ｎ−メチル−ε−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン（１９）
化合物１８（１．２６ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（２．２ｇ、１６ｍｍｏｌ、５当量）、続いてヨウ化メチル（１．６ｍＬ、２５．６ｍｍｏｌ、８当量）を加えた。溶液を１００℃まで加熱し、密閉したフラスコにおいて２４時間撹拌した。反応混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈した。得られた固体をろ過し、鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９５／５）で精製し、油を得て（１．１８ｇ）、ＤＣＭ（５ｍＬ）とＴＦＡ（５ｍＬ）の混合物に溶解し、１時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をトルエン中で濃縮し（３×）、化合物１９を得た（１．５７ｇ、８７％）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２７１．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【実施例１５】
【００６９】
メチル１５−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−Ｎ−メチル−ε−Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシン（２１）
化合物１９（１．５７ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）と２０（０．６０ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）（ＥＰ１５７４５１６に記載の対応するｔｅｒｔ−ブチルエステル誘導体の脱保護により調製した。）を、化合物４の合成のために記載したように結合させ、収量８６％の化合物２１を得た（９８０ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ５３０．２［Ｍ＋Ｈ］＋、５５２．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
【実施例１６】
【００７０】
１５−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−Ｎ−メチル−Ｌ−リシン（２２）
化合物２１（０．９８ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、１Ｎ  ＬｉＯＨ（６ｍＬ）を加え、得られた溶液をＲＴで２時間撹拌した。反応混合液を１Ｎ  ＨＣｌの添加により中和し、続いて減圧下で濃縮し、脱保護した粗化合物２２を得て、これを更なる精製なしに次の反応に使用した。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４２０．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【実施例１７】
【００７１】
１５−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−Ｎ−［Ｄ−（＋）−ビオチニル］−εＮ−メチル−Ｌ−リシン（２３）
化合物２２（１．８５ｍｍｏｌ、粗）を、化合物６の調製のために前述したようにＤ−（＋）−ビオチン（０．５４ｇ、２．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）と結合し、ビオチン化リシン誘導体２３を得て、これを次のステップで精製なしに使用した。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６４６．４［Ｍ＋Ｈ］＋、６６８．６［Ｍ＋Ｎａ］＋
【実施例１８】
【００７２】
１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル−ε−Ｎ−［Ｄ−（＋）−ビオチニル］−εＮ−メチル−Ｌ−リシン（２４）
化合物２３（１．８５ｍｍｏｌ、粗）を、ｔ−ＢｕＯＨ（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解した。１０％Ｐｄ／Ｃ（７５０ｍｇ）を、窒素雰囲気下で加えた。水素を溶液に約４時間通した。Ｐｄ／Ｃをデカライトによるろ過により除去し、ＥｔＯＨで洗浄した。溶媒を減圧下（５０ｍｂａｒ、５０℃）で除去し、油として粗化合物２４を得た（＞１００％、残留溶媒）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６２０．４［Ｍ＋Ｈ］＋
【実施例１９】
【００７３】
ベンジルＮ−＜３−｛［−ε−（Ｄ−（＋）−ビオチニル−ε−Ｎ−メチル）−Ｌ−リシン−１５−アザ−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデカノイル］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞４−Ｏ−｛４−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシン（２５）
化合物７（０．５０ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）への化合物２４（０．５８ｇ、０．９３ｍｍｏｌ、粗）の結合を、合成化合物８のために前述したように実施した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよび分取ＨＰＬＣによる精製により、収量７７ｍｇでε−Ｎ−メチル化リシン誘導体２５を得た（化合物２１から開始される最後の４ステップにわたり８．５％）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１３３０．６［Ｍ＋Ｈ］＋
【実施例２０】
【００７４】
メチルＯ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜＜１２−Ｎ−＜＜Ｎε−（Ｄ−（＋）−ビオチニル−ε−Ｎ−メチル）−Ｎ−＜３−｛［１５−Ｎ−（１５−アザ−１−ケト−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデシル）］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシル＞−リシル−＞＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサ−ドデシル＞＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシドノナキスナトリウム塩（２６）
化合物２５（７７ｍｇ、５８μｍｏｌ）を、一般的手順に記載のように五糖類誘導体９（０．１０ｇ、５５μｍｏｌ）に結合させた。一般的手順に記載のように粗生成物を精製および脱塩し、続いて凍結乾燥させ、収量５０ｍｇ（２７％）の目標の抱合体２６を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２７６２．５［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７５】
【化１１】
2009511543.tif 000007
【００７６】
【化１２】
2009511543.tif 000008
【００７７】
【化１３】
2009511543.tif 000009
【００７８】
【化１４】
2009511543.tif 000010
【００７９】
【化１５】
2009511543.tif 000011
【００８０】
【化１６】
2009511543.tif 000012
【００８１】
【化１７】
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【００８２】
【化１８】
2009511543.tif 000014
【実施例２１】
【００８３】
薬理学
１．１  ＡＤＰにより誘発されたモルモット血小板凝集の抑制に関するインビトロ試験
インビトロにおけるヒトまたはモルモットの多血小板血漿（ＰＲＰ）に対するアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の添加は、血小板凝集を誘発する。この凝集は、ＰＲＰの光学濃度（ＯＤ）における変化を測定することにより評価することができる。以下のインビトロ試験は、モルモットのＡＤＰ誘発凝集への干渉について試験化合物を評価するために使用した。
【００８４】
材料
多血小板血漿（ＰＲＰ）：自由流（Ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）の血液を、健常ボランティアまたはモルモットから採取し、蒸留水Ｈ２Ｏ中０．１容量のクエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ、３．８％（ｗ／ｖ）に収集する。最終濃度は、０．３８％クエン酸ナトリウムである。クエン酸塩添加血を、室温でＨｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰにおいて１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ、すなわち９００ｒｐｍ）で遠心する。１５分後、遠心を、遠心機のブレーキをかけて中止し、上清（＝ＰＲＰ）を収集する。ＡＤＰ（分析用）の新しい溶液（０．９％ＮａＣｌのＭＱ水溶液中で５０μＭ）を直ちに使用する。
【００８５】
このアッセイにおいて、チロフィバン（静注用０．２５ｍｇ／ｍＬ濃縮液として購入したＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））は、３０〜６０ｎＭ（ＩＣ５０）の濃度で５μＭ  ＡＤＰにより誘発されたヒトの血小板凝集を５０％抑制する。
【００８６】
器具
１．シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血球計数器モデルＫＸ−２１。
２．６２０ｎｍフィルター付きのラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）ｉＥＭＳリーダーＭＦ、１，０００ｒｐｍおよび一定温度３７℃に設定されたオービタルシェイカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）。吸収を、ラボシステムズｉＥＭＳプログラムで測定する。
３．針付き血液採取システム６００ｍＬ、ａｒｔＰ４２０３（ＮＰＢＩ）。
４．９６ウェル平底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）。
【００８７】
手順
上清（ＰＲＰ）内の血小板を、シスメックス血球計数器を用いて計数し、上清をＰＰＰ（乏血小板血漿）で希釈し、約４００，０００±５０，０００ｐｌｔ／ｍＬを含むＰＲＰを得る。ＰＲＰは、室温で２０分以上、３時間未満で安定化するはずである。
【００８８】
１５０μＬのＰＲＰを、ピペットでマイクロプレートのウェルに移す。様々な濃度（化合物当たり７つの濃度）の３０μＬの試験化合物またはビヒクルを加え、マイクロプレートを、３７℃でラボシステムズｉＥＭＳリーダーＭＦにかける。次に光学濃度（ＯＤ６２０）を、６２０ｎｍで測定する。リーダー（１，０００ｒｐｍ）で２分間振盪後、ＯＤを再度測定する。これは血小板の安定性（自然発生の血小板凝集のないこと）について検証するためである。次に、５０μＭ  ＡＤＰ溶液２０μＬを加え、ＯＤを、６２０で１４分間、１分ごとに動力学的に測定する。２つの測定間に、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振盪させる。試験化合物ごとに、異なるボランティア由来のＰＲＰを用いて少なくとも２回の実験で調査する。
【００８９】
反応の評価
化合物の各濃度（溶媒を含む）での平均ＯＤを、ｔ＝０分およびｔ＝１０分で算出する。各濃度における抑制率を、以下の式を用いて算出する。
【００９０】
【数１】
2009511543.tif 000015
【００９１】
試験化合物のＩＣ５０は、ＡＤＰ誘発の血小板凝集が５０％減少する濃度である。このために、抑制率の値を、化合物の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ３．０を用いて（様々な傾きで）算出する。
【００９２】
１．２  ＴＲＡＰにより誘発されたヒト血小板凝集の抑制に関するインビトロ試験
インビトロにおける洗浄されたヒトまたはモルモットの血小板（ＷＰＬ）へのトロンビン受容体アゴニストペプチド（ＴＲＡＰ）の添加は、血小板凝集を誘発する。この凝集は、ＷＰＬの光学濃度を測定することにより判定することができる。ここに記載のインビトロ試験は、ヒト血小板のＴＲＡＰ誘発の凝集を抑制する試験化合物の活性について分析するために用いられる。マイクロプレートリーダーは、同時にいくつかの化合物の活性を測定するために用いられる。
【００９３】
材料
＊ワトソン緩衝液の組成：
Ｈ２Ｏ  １Ｌ当たり
ＮａＣｌ  ７．８３ｇ（１３４ｍｍｏｌ）
ＫＣｌ  ０．２２ｇ（２．９ｍｍｏｌ）
ＮａＨＣＯ３  １．０１ｇ（１２ｍｍｏｌ）
Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ  ０．０６ｇ（０．３４ｍｍｏｌ）
ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．２０ｇ（１ｍｍｏｌ）
グルコース０．９０ｇ（５ｍｍｏｌ）
ＨＥＰＥＳ  １．１９ｇ（５ｍｍｏｌ）
ｐＨは、ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）ＴＮＰ緩衝液で７．４に調整する。
【００９４】
＊ＴＮＰ緩衝液の組成：
Ｈ２Ｏ  １Ｌ当たり
トロメタミン（トリス）  ６．０５７ｇ（５０ｍｍｏｌ）
ＮａＣｌ  ５．８４４ｇ（１００ｍｍｏｌ）
ＰＥＧ６０００  ３．０ｇ
溶液のｐＨは、ＨＣｌ（１０ｍｏｌ／Ｌ）により３７℃で７．４に調整する。
【００９５】
＊ＰＧＩ２溶液：
ＫＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）中１ｍｇ／ｍＬのプロスタグランジンＩ２原液を−２０℃で保存する。使用直前に、氷冷ＮａＣｌ（９．０ｇ／Ｌ）中５μｇ／ｍＬの溶液を調製する。
【００９６】
＊多血小板血漿（ＰＲＰ）：
自由流の血液を、健常ボランティアまたはモルモットから採取し、ＭＱ水中０．１容量の３．８％クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ（ｗ／ｖ）に収集する。最終濃度は、０．３８％クエン酸ナトリウムである。クエン酸塩添加血を、室温でＨｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰにおいて１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ）で遠心する。１５分後、遠心を、遠心機のブレーキをかけて中止する。さらに上清（＝ＰＲＰ）を収集し、乏血小板血漿で希釈し、約４００，０００血小板／ｍＬを含む懸濁液を得る。
【００９７】
＊乏血小板血漿（ＰＰＰ）：
クエン酸塩添加血を、ＲＴで約２０，０００Ｎ／ｋｇで１０分間遠心し、ＰＰＰをサイホンで移す。
【００９８】
＊洗浄血小板（ＷＰＬ）：
一定分量の１μＬのＰＧＩ２溶液を、１ｍＬのＰＲＰに加え、その後、ＲＴで約２０，０００Ｎ／ｋｇで１０分間遠心する。血漿をサイホンで移し、５ｎｇ／ｍＬのＰＧＩ２を含むワトソン緩衝液を血小板ペレットに加え、血小板を、プラスチック棒で静かに撹拌しながら原容量に再懸濁する。血小板懸濁液を、２０，０００Ｎ／ｋｇで再度遠心する。血小板をワトソン緩衝液で再懸濁し、約４００，０００血小板／ｍＬを含む懸濁液を得る。
【００９９】
＊ＴＲＡＰ溶液：
ＴＲＡＰをＨ２Ｏに溶解し、５０μｍｏｌ／Ｌを含む溶液を得る。新しい溶液を毎日調製する必要がある。すべての水溶液に対して、超高純度のＨ２Ｏ（ミリＱの品質）を使用する。
【０１００】
＊ヒトフィブリノゲン（Ｋｏｒｄｉａ／ＥＲＬ、ａｒｔ  ｎｒ：ＦＩＢ２粉末）：０．５ｇのフィブリノゲン粉末を、真空下で５０ｍＬのＭＱ水に溶解する。この原液を、−２０℃で１００μＬの一定分量で保存する。使用直前に、０．５ｍｇ／ｍＬの生理食塩水溶液を調製する。
【０１０１】
このアッセイにおいて、チロフィバン（静注用０．２５ｍｇ／ｍＬ濃縮液として購入したＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））は、３０〜６０ｎＭ（ＩＣ５０）の最終濃度で５μＭ  ＴＲＡＰにより誘発されたヒトの血小板凝集を５０％抑制する。
【０１０２】
手順
ＷＰＬ濃度を、シスメックス血球計数器で計数し、懸濁液をワトソン緩衝剤で希釈し、約４００，０００ｐｌｔ／ｍＬの濃度を得る。使用前に、ＷＰＬを、室温で２０分以上、３〜４時間未満で安定化させる。
【０１０３】
１５０μＬのＷＰＬを、ピペットでマイクロプレートのウェルに移す。試験化合物または溶媒１５μＬおよび１５μＬのフィブリノゲン溶液を加え、マイクロプレートを、３７℃でマイクロプレートリーダーにかける。次に、光学密度（ＯＤ）を、４０５ｎｍで測定し、リーダーにおいて２分間振盪後、血小板の安定性（自然発生の血小板凝集のないこと）を検証するために、ＯＤ４０５を再度測定する。５０μＭ  ＴＲＡＰ溶液２０μＬを加え、ＯＤ４０５を４０５ｎｍで１４分間、１分ごとに動力学的に測定する。２つの測定間に、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振盪させる。試験化合物のＩＣ５０の測定のために、化合物ごとに、異なるボランティア由来のＷＰＬを用いて少なくとも２回の実験において調査する。
【０１０４】
反応の評価：
各濃度（溶媒を含む）の平均ＯＤを、ｔ＝０分およびｔ＝１０分で算出する。各濃度における抑制率を、以下の式によりマイクロソフトエクセルを用いて算出する。
【０１０５】
【数２】
2009511543.tif 000016
【０１０６】
化合物の濃度を、抑制率に対してプロットする。ＩＣ５０をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ３．０を用いて（様々な傾きで）算出する。試験化合物のＩＣ５０は、ＴＲＡＰ誘発の血小板凝集が５０％減少する濃度である。
【０１０７】
１．３  ヒト血漿における抗Ｘａ因子活性の判定のためのインビトロ試験
ヒト血漿における試験化合物の抗Ｘａ因子活性を、ＴｅｉｅｎおよびＬｉｅにより報告された方法を用いてＳ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓ  Ｌｔｄ、スウェーデン、ムルンダール（Ｍｏｌｎｄａｌ））によりアミド分解的（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）に測定した（Ｔｅｉｅｎ  ＡＮ，Ｌｉｅ  Ｍ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａｄｄｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９７７，１０：３９９−４１０）。抗Ｘａ活性を、アミド分解活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）と標準ペパリンの検量線との比較後にＵ／μｍｏｌで表す。
【０１０８】
【表１】
2009511543.tif 000017
【０１０９】
２．１  抗血栓活性のインビトロにおける中和
Ａ．血小板凝集抑制のインビトロにおける中和
（アビジンによる化合物の予備温置）
ＡＤＰ誘発の血小板凝集に関する前述のプロトコールにおいて実施したように、モルモットの最大の血小板凝集抑制が達成される濃度の２２５ｎＭの化合物１２または４５０ｎＭの化合物１０の存在下で、凝集を行った。ＡＤＰを加えることによってモルモットの血小板凝集を誘発する前に、化合物および異なる濃度のアビジン（卵白由来、Ｓｉｇｍａ）を室温で２分間温置した（図１および２）。
【０１１０】
Ｂ．血小板凝集抑制のインビトロにおける中和
（アビジンを遅らせて添加した後）
ＡＤＰ誘発の血小板凝集に関する前述のプロトコールにおいて実施したように、モルモットまたはヒトの最大の血小板凝集抑制が達成される濃度の２２５ｎＭの化合物１２または４５０ｎＭの化合物１０の存在下で、凝集を行った。７分後、血小板凝集が中断され、異なる濃度のアビジン（卵白由来、Ｓｉｇｍａ）をｔ＝９分で加えた。１分以内で、血小板凝集の検出が再開された（図３および４）。
【０１１１】
図５において、化合物１７によるヒトの血小板凝集抑制に対するアビジンの作用について示す（ＡＤＰ誘発の血小板凝集後の９分後、アビジンの添加）。
【０１１２】
結論：化合物１０を含むモルモットの血小板凝集アッセイに対するアビジンの投与は、血小板凝集を直ちに回復させるが（抗血栓薬の中和（抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ活性））、一方、非ビオチン化等価抗血栓化合物１２の抑制活性は回復させることができない。化合物１７へのアビジンの投与は、ヒトの血小板凝集の完全な回復をもたらす。
【０１１３】
３．１薬物動態
化合物１０、１２、１７および２７の薬物動態学的特性について、３００〜４００ｇｒのオスのウィスター系ラットにおいて検査した。ラットを、Ｏ２／Ｎ２Ｏ／イソフルランの混合物の吸入により麻酔し、その後に右側の頚動脈にカニューレを挿入した。翌日、ラットに１００または５００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を皮下投与した。皮下投与後、血液をいくつかの時間間隔で検体採取した。次に血液を遠心し、その後、血漿をサイホンで移し、使用するまで−２０℃で保存した。試験化合物自体の原液から作成した検量線に対する得られた血漿試料中の試験化合物の濃度を、Ｓ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓ  Ｌｔｄ、スウェーデン、ムルンダール（Ｍｏｌｎｄａｌ））を用いてＴｅｉｅｎおよびＬｉｅの方法を基にした抗Ｘａ活性の測定によりアミド分解的に測定した（Ｔｅｉｅｎ  ＡＮ，Ｌｉｅ  Ｍ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａｄｄｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９７７，１０：３９９−４１０）。試料中の濃度をｎｍｏｌ／ｍＬで表し、動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎのノンコンパートメントモデルで算出した。（図６および７）
【０１１４】
【表２】
2009511543.tif 000018
【０１１５】
【表３】
2009511543.tif 000019
【０１１６】
試験化合物１０、１２、１７および２７の変動内で、ラットにおいて同等な薬物動態学的作用を示すと結論される。
【０１１７】
３．２  薬物動態−中和実験
ラットを、１００ｎｍｏｌ／ｋｇｓ．ｃ．の用量の化合物１０、１２または２７で処理した。ｔ＝１時間で、血液試料を採取し、化合物１０または１２で処理したラットに、アビジン（卵白由来、Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。血液を、０．５、１、３、６および２３時間後に連続して検体採取した。血液を薬物動態学的実験に記載のように処理し、試料の濃度を（残留）抗Ｘａ活性を測定することにより判定した。（図８）
【０１１８】
【表４】
2009511543.tif 000020
【０１１９】
化合物１０（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の皮下投与後、（残留）抗Ｘａ活性を測定することにより判定した抗血栓活性を、アビジン１０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与により中和することができると結論される。アビジンによる化合物１０の中和は、化合物１２と比較した総Ｔ１／２ｅｌｉの著しい減少、総ＡＵＣ  ｉｎｆの著しい減少およびＣｌの著しい増加により反映されている。さらに、非ビオチン化等価化合物１２の薬物動態学的作用は、アビジンの添加により（また、同等のプロファイルを示す基準の五糖類２７と比較しても）影響されない。後者は、中和がビオチン標識の存在に関連し、これが二重阻害剤の薬物動態学的作用に影響を及ぼさないことを確認するものである。
【０１２０】
別々の実験において、化合物１０、１７または２６を５００ｎｍｏｌ／ｋｇ皮下の用量で投与し、その後、２４時間後に血液を収集した。次に１０ｍｇ／ｋｇのアビジンを静脈内投与し、血液を２５および２６時間後に収集した。（図９）
【０１２１】
【表５】
2009511543.tif 000021
【０１２２】
アビジン（１０ｍｇ／ｋｇ）投与の２時間後以内に、化合物１０、１７および２６の血漿濃度が、それぞれ７５、８３および６６％減少したと結論される。この実験は、ビオチン化化合物の皮下投与の２４時間後に実施された。このことは、ビオチン部分と抗血栓化合物の間のリンカーが、インビボにおいて安定していることを示している。
【０１２３】
４．抗血栓活性のインビボにおける中和
ラットにおいて、コラーゲン懸濁液の静脈内注入は血小板凝集を誘発し、一過性の血小板減少を引き起こす。本試験は、ラットにおいて、コラーゲンにより誘発された血小板減少の重症度に対する試験化合物の影響について評価するために使用する。
【０１２４】
第１の実験において、オスのモルモットに対して、コラーゲン注入の４時間前に、７５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量の化合物１０または溶媒を皮下投与した。第２の実験において、化合物１２および１７を、同じ時間に１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下投与した。オスのモルモットを、ケタミン＋セダマン（Ｓｅｄａｍｕｎ）（それぞれ９０＋１０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内投与により麻酔した。１５分後、総頚動脈の１つを分断し、ＰＥ５０カニューレ（Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ）でカニューレ処置した。０．５ｍＬの２つの血液試料を、２５μＬの０．２０Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ溶液を含むプラスチックバイアルに収集した。次にカニューレを、０．２５ｍｇ／ｍＬのコラーゲン懸濁液（Ｈｏｒｍｏｎ  Ｃｈｅｒｎｉｅ、西ドイツ、ミュンヘン、ｐＨ２．８の等張緩衝液で希釈）を含む注射器に接続した。この懸濁液を、３０秒間で２２５μＬの注入を通して投与した。次に注射器を取り外し、５ｍＬの２つの血液試料を、コラーゲン注入開始から８５および９５秒後に採取した。次に、動物をユーサセート（ｅｕｔｈａｓａｔｅ）で屠殺し、その後、試料ごとの血小板数をシスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血球計数器モデルＫＸ−２１で計数した。アビジンを使用した場合には、アビジン１０ｍｇ／ｋｇを、化合物１０、１２または１７の皮下投与後のｔ＝４ｈで静脈内投与し、その後、コラーゲンを５分以内に注入した。
【０１２５】
収集した血液試料における血小板数の計数後、ｔ＝８５および９５秒で得られた血液試料の平均血小板数を、ｔ＝０で得られた血液試料の平均値で割ることによって、血小板数の減少が算出された。本試験は、ｎ＝４で実施した。
【０１２６】
【表６】
2009511543.tif 000022
【０１２７】
【表７】
2009511543.tif 000023
【０１２８】
化合物１０の７５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは化合物１２もしくは１７の１００ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下投与後、化合物は、投与４時間後に６６％を上回るコラーゲン誘発血小板凝集を抑制した。コラーゲン注入直前の１０ｍｇ／ｋｇのアビジン投与は、化合物１０および１７の血小板抑制活性の迅速および定量的中和を引き起こしたが、ビオチン部分を欠く化合物１２では引き起こさなかった。これらの結果は、化合物１０および１７の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ媒介抗血小板活性の中和が、ビオチン標識単独で媒介され、アビジンへの特異的結合に基づくことを示している。さらに、化合物１０、１２および１７により生じた血小板数の相対的減少の比較は、ビオチン標識が二重阻害剤の固有の抗血小板活性を妨げないことを示している。
【０１２９】
更なる薬理学
化合物１７の投与後にモルモットにおいて誘発された用量依存的出血が、アビジン（静脈内１０ｍｇ／ｋｇ）の投与によって直ちに止まった。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、化合物１２による血小板凝集の抑制に対するアビジンの作用を示す図である。化合物およびアビジンの予備温置。
【図２】図２は、化合物１０による血小板凝集の抑制に対するアビジンの作用を示す。化合物およびアビジンの予備温置。
【図３】図３は、化合物１２によるモルモットの血小板凝集の抑制に対するアビジンの作用を示す（ＡＤＰ誘発血症凝集の９分後にアビジンの添加）。
【図４】図４は、化合物１０による血小板凝集の抑制に対するアビジンの作用を示す（ＡＤＰ誘発血症凝集の９分後にアビジンの添加）。
【図５】図５は、化合物１７によるヒトの血小板凝集の抑制に対するアビジンの作用を示す（ＡＤＰ誘発血症凝集の９分後にアビジンの添加）。
【図６】図６は、５００ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物の皮下投与後の平均データを示す。
【図７】図７は、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物の皮下投与後の平均データを示す。
【図８】図８は、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物の皮下投与後の平均データを示す。ｔ＝１時間で、アビジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を、化合物１０または１２で処理したこれらのラットに静脈内投与した。アビジン非存在下での化合物２７（五糖類部分）の薬物動態学的作用を比較のために示す。
【図９】図９は、化合物１０、１７または２６の５００ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下投与後の平均データを示す。Ｔ＝２４時間で、アビジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、その後血液試料をＴ＝２５および２６時間で収集した。比較のために、化合物１７の化合物１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（皮下）の値を、５００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量に正規化した。
【図１】
2009511543.tif 000030
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009511543.tif 000036
【図８】
2009511543.tif 000037
【図９】
2009511543.tif 000038
【国際調査報告】
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