(57)【要約】  血清半減期または血清安定性が増大した、トランスフェリンおよびナトリウム利尿ペプチドの融合タンパク質が開示されている。好ましい融合タンパク質は、トランスフェリン部分がグリコシル化、鉄との結合および／またはトランスフェリン受容体との結合がないことまたは減少を示すよう修飾されたものを含む。    【図１】2009511060.tif 000033
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウム利尿ペプチドと、天然トランスフェリン分子と比較してグリコシル化の減少を示す修飾されたトランスフェリン（ｍＴｆ）分子とを含んでなる融合タンパク質。
【請求項２】
リンカーペプチドが、前記ペプチドとｍＴｆを分けている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ｍＴｆ分子が、天然トランスフェリン分子と比較して金属結合の減少またはトランスフェリン受容体結合の減少を示す、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ナトリウム利尿ペプチドが融合タンパク質のＮ末端にある、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ナトリウム利尿ペプチドが融合タンパク質のＣ末端にある、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ナトリウム利尿ペプチドが融合タンパク質内に挿入されている、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
少なくとも２種のナトリウム利尿ペプチドを含んでなる、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
融合タンパク質のＮ末端が、分泌シグナル配列を含んでなる、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
シグナル配列が、血清トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノトランスフェリンまたはそれらの変異体に由来するシグナル配列である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
シグナル配列が、ＨＳＡシグナル配列、ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列またはＴｆシグナル配列である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
シグナル配列が、配列番号２のアミノ酸１〜１９を含んでなるＴｆシグナル配列である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ナトリウム利尿ペプチドが修飾されている、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ナトリウム利尿ペプチドがアミノ酸置換、付加または欠失によって修飾されている、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ｍＴｆ分子のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する親和性が低下している、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ｍＴｆ分子がＴｆＲと結合しない、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
ｍＴｆ分子が、修飾されたラクトフェリンまたは修飾されたメラノトランスフェリンである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
ｍＴｆタンパク質の鉄に対する親和性が低下している、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
ｍＴｆタンパク質が鉄と結合しない、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
ｍＴｆタンパク質がＮ結合型グリコシル化を示さない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ｍＴｆタンパク質がグリコシル化を示さない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ｍＴｆタンパク質が、少なくとも１つのグリコシル化を妨げる突然変異を含んでなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ナトリウム利尿ペプチドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、長時間作用型ナトリウム利尿ペプチド（ＬＡＮＰ）、Ｖｅｓｓｅｌ  Ｄｉｌａｔｏｒ、カリウム利尿ペプチドまたはキメラナトリウム利尿ペプチドである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２３に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項２７】
コードされる融合タンパク質を発現する条件下で、請求項２５に記載の宿主細胞を培養するステップを含んでなる、融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項２８】
コードされる融合タンパク質を発現する条件下で、請求項２６に記載の宿主細胞を培養するステップを含んでなる、融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項２９】
原核生物のものまたは真核生物のものである、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
原核生物のものまたは真核生物のものである、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
酵母細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
酵母細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸と機能し得る形で連結している、Ｔｆシグナルペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸分子。
【請求項３４】
Ｔｆシグナルペプチドが哺乳類Ｔｆシグナルペプチドである、請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項３５】
哺乳類ＴｆシグナルペプチドがヒトＴｆシグナルペプチドである、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
ヒトＴｆシグナルペプチドが配列番号２のアミノ酸１〜１９に示される配列を有する、請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項３７】
請求項３３から３６のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項３８】
請求項３３から３６のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項３９】
請求項３７に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４０】
融合タンパク質を発現および分泌する条件下で、請求項３８に記載の宿主細胞を培養するステップを含んでなる、分泌型融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項４１】
融合タンパク質を発現および分泌する条件下で、請求項３８に記載の宿主細胞を培養するステップを含んでなる、分泌型融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項４２】
宿主細胞が酵母である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｔｆ分子のシグナルペプチドをコードする核酸を、請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸と機能し得る形で連結するステップと、機能し得る形で連結している核酸を宿主細胞に導入するステップと、融合タンパク質を発現および分泌する条件下で宿主細胞を培養するステップとを含んでなる、分泌型融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項４４】
Ｔｆシグナルペプチドが哺乳類Ｔｆシグナルペプチドである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳類ＴｆシグナルペプチドがヒトＴｆシグナルペプチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ヒトＴｆシグナルペプチドが、配列番号２のアミノ酸１〜１９に示される配列を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
宿主細胞が酵母である、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
請求項２３に記載の核酸分子を含んでなるトランスジェニック動物。
【請求項４９】
融合タンパク質を製造する方法であって、請求項４８に記載のトランスジェニック動物から融合タンパク質を単離するステップを含んでなる方法。
【請求項５０】
ｍＴｆ融合タンパク質が、ラクトフェリンを含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
融合タンパク質を、トランスジェニック動物から得た生体液から単離する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記体液が血清または乳である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項１に記載の融合タンパク質と担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項５４】
対象において血圧を低下させる方法であって、対象に、治療上有効な量の、請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項５５】
対象においてナトリウムと水のバランスを調節する方法であって、対象に、治療上有効な量の、請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項５６】
対象において心血管疾患を治療する方法であって、対象に、治療上有効な量の、請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項５７】
対象において鬱血性心不全を治療する方法であって、対象に、治療上有効な量の請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項５８】
リンカーが、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１４１）、（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号１４２）、ＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたＰＥＡＰＴＤ（配列番号１４９および１５２）およびＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせた（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号１９８および１９９）からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
精製されている、請求項１から２２または５８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２００５年１０月１４日に出願された米国特許仮出願第６０／７２６，１９８号の利益を主張する。
【０００２】
本願は、２００５年３月４日に出願された米国特許仮出願第６０／６５８，１４０号、２００５年３月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／６６３，７５７号および２００３年３月４日に出願された米国特許出願第１０／３７８，０９４号の利益を主張する２００３年８月２８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２６８１８ならびに２００１年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／３１５，７４５号および２００１年１１月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／３３４，０５９号の利益を主張する２００２年８月３０日に出願された米国特許出願第１０／２３１，４９４号と関連するが、これらの利益は主張しない。なお、これらのすべては参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。本願はまた、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２００２年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／４０６，９７７号と関連する。
【０００３】
本発明は、グリコシル化、鉄結合および／またはトランスフェリン受容体結合を減少させるか、または阻害するよう修飾されたトランスフェリン分子と融合しているか、その分子中に挿入されている、血清安定性またはｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期が延長された治療用タンパク質またはペプチドに関する。具体的には、本発明は、トランスフェリン分子または修飾されたトランスフェリン分子と融合しているか、その分子中に挿入されているナトリウム利尿ペプチドを含む。
【背景技術】
【０００４】
治療用タンパク質またはペプチドは、その天然状態で、または組換えによって製造される場合に、通常、短期間の血清安定性または短いｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を示す不安定な分子である。さらに、これらの分子は、診断および治療目的で、製剤される場合に、特に、水溶液中に製剤される場合に、極端に不安定であることが多い。
【０００５】
タンパク質性治療分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性を延長または促進する現実的な解決案はわずかしか存在しない。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、タンパク質と結合させ、タンパク質のより長時間作用する、持続的活性をもたらすことができる物質である。ＰＥＧとの結合によってタンパク質の活性が延長される場合には、タンパク質を投与しなければならない頻度を減少させることができる。しかし、ＰＥＧ結合はタンパク質の治療活性を低下させるか、または破壊することも多い。いくつかの例では、ＰＥＧ結合はタンパク質の免疫原性を低下させることができるが、その他の例では、免疫原性を実質的に増大させることもある。
【０００６】
治療用タンパク質またはペプチドは、治療用タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を延長できるタンパク質との融合によっても安定化されている。例えば、アルブミンと、または抗体フラグメントと融合している治療用タンパク質は、融合していない状態の治療用タンパク質と比較した場合にｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期の延長を示すことがある。米国特許第５，８７６，９６９号および同５，７６６，８８３号参照のこと。
【０００７】
別の血清タンパク質グリコシル化ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）も、細胞の内部に標的送達するために、または血液脳関門を通過して薬剤を運ぶために治療用タンパク質との融合物を作製するために用いられている。グリコシル化ヒトＴｆを含んでなるこれらの融合タンパク質は、全長Ｔｆを薬剤と融合することによって、血液脳関門を通過して神経成長因子（ＮＧＦ）または繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を標的に向けるために用いられている。米国特許第５，６７２，６８３号および同５，９７７，３０７号参照のこと。これらの融合タンパク質では、分子のＴｆ部分はグリコシル化され、２個の鉄原子と結合しており、これは、細胞上の受容体とのＴｆの結合にとって、またこれらの特許の発明者によれば、血液脳関門を通過してＮＧＦまたはＣＮＴＦ部分を標的送達するために必要である。トランスフェリン融合タンパク質はまた、Ｔｆ受容体による細胞の内側へ標的送達するための別の形のＴｆ融合物を製造する能力を調べるために、グリコシル化トランスフェリンの表面に露出されたループ中にＨＩＶ−１プロテアーゼ標的配列を挿入することによって製造されている（ＡＩｉら（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３頁）。
【０００８】
血清トランスフェリン（Ｔｆ）は、８０，０００ダルトンの分子量を有する単量体糖タンパク質であり、循環中で鉄と結合し、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）によってそれを種々の組織へ輸送する（Ａｉｓｅｎら（１９８０年）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：３５７〜３９３頁；ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら（１９８１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：３５４３〜３５５３頁、米国特許第５，０２６，６５１号）。Ｔｆは、最もよく見られる血清分子の１種であり、全血清タンパク質の最大約５〜１０％を構成する。アルコール依存症の個体の血液では、糖鎖不全トランスフェリンが高レベルで生じ、グリコシル化トランスフェリンの半減期（およそ７〜１０日）よりも、より長い半減期（およそ１４〜１７日）を示す。ｖａｎ  Ｅｉｊｋら（１９８３年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １３２：１６７〜１７１頁、Ｓｔｉｂｌｅｒ（１９９１年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：２０２９〜２０３７頁（１９９１年）、Ａｒｎｄｔ（２００１年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７（１）：１３〜２７頁および「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、（Ｎｏｒｄｍａｎｎら編）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、１９８８年、第７１巻、３５３〜３５７頁中、Ｓｔｉｂｌｅｒら）参照のこと。
【０００９】
Ｔｆの構造は十分に特性決定されており、受容体結合、鉄結合および放出の、ならびに炭酸イオン結合の機序が解明されている（米国特許第５，０２６，６５１号、同５，９８６，０６７号およびＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら（１９８３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（６）：３５４３〜３５４６頁）。
【００１０】
トランスフェリンおよびトランスフェリン受容体と結合する抗体はまた、癌療法として腫瘍細胞に毒物を送達または保持するために用いられており（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９９４年）、またトランスフェリンは、ＤＮＡを細胞に送達するための非ウイルス性遺伝子療法ベクターとしても用いられている（Ｆｒａｎｋら、１９９４年；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２年）。トランスフェリン受容体を入り口点として用いてタンパク質を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する能力は、数種のタンパク質およびペプチド、例えば、ＣＤ４（Ｗａｌｕｓら、１９９６年）、脳由来神経栄養因子（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９４年）、グリア由来神経栄養因子（Ａｌｂｅｃｋら）、血管作用性小腸ペプチド（ｖａｓｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）類似体（Ｂｉｃｋｅｌら、１９９３年）、β−アミロイドペプチド（Ｓａｉｔｏら、１９９５年）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５年）について実証されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、トランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質もしくはペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を延長するよう、またはＴｆ部分のグリコシル化を減少させるか、もしくは阻害することによってバイオアベイラビリティを増大させるよう、または鉄および／もしくはＴｆ受容体結合を減少させるか、もしくは妨げるようには修飾または操作されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下により詳細に記載されるように、本発明は、少なくとも１種のナトリウム利尿タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド実体を含んでなる修飾されたＴｆ融合タンパク質を含み、Ｔｆ部分は、分子のｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期またはバイオアベイラビリティを延長するよう操作されている。本発明はまた、融合タンパク質を含んでなる医薬製剤および組成物、修飾されたトランスフェリンとの融合による治療用タンパク質の血清安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期およびバイオアベイラビリティを延長する方法、修飾されたＴｆ融合タンパク質をコードする核酸分子などを含む。本発明のもう１つの態様は、修飾されたＴｆ融合タンパク質を用いて患者を治療する方法に関する。修飾されたＴｆ融合タンパク質は、グリコシル化ならびに／または鉄および受容体結合を減少させるか、または妨げるよう修飾されているヒトトランスフェリンＴｆ部分を含んでなることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
一般的説明
本発明は、１つには、本発明者らによる、治療用タンパク質を、トランスフェリン、修飾されたトランスフェリンまたは血清における治療用タンパク質の半減期を延長するのに十分なトランスフェリンもしくは修飾されたトランスフェリンの一部と遺伝子融合することによって、治療用タンパク質を安定化し、血清半減期および／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を延長することができるという発見に基づいている。修飾されたトランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質もしくはペプチドと共有結合しているトランスフェリンタンパク質またはドメインを含み、トランスフェリン部分は、野生型トランスフェリン配列に対して１個または複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を含有するよう修飾されている。一実施形態では、Ｔｆ融合タンパク質は、完全にグリコシル化されたＴｆ、例えば、完全にＮ結合型グリコシル化されたＴｆと比較して、ＴｆまたはＴｆドメイン内のグリコシル化を減少させるか、または妨げるよう操作されている。その他の実施形態では、Ｔｆタンパク質またはＴｆドメインは、鉄または炭酸イオンとの結合を減少させるか、もしくは結合がないことを示すよう、またはＴｆ受容体（ＴｆＲ）に対して減少した親和性を有するか、もしくは結合しないよう修飾されている。
【００１４】
本発明によって企図される治療用タンパク質として、それだけには限らないが、ポリペプチド、抗体、ペプチドまたはその断片または変異体が挙げられる。本発明の治療用タンパク質は、ナトリウム利尿ペプチドおよびその類似体、誘導体、キメラナトリウム利尿ペプチドならびにナトリウム利尿受容体アゴニストまたはアンタゴニストとして働くペプチドまたはタンパク質を含むことが好ましい。
【００１５】
したがって、本発明は、トランスフェリン融合タンパク質、融合タンパク質を含んでなる治療用組成物および融合タンパク質を投与することによって疾患または障害を治療、予防または改善する方法を含む。本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、好ましくは、遺伝子融合（すなわち、治療用タンパク質のすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドが修飾されたトランスフェリンのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドとインフレームで連結している核酸の翻訳によって、トランスフェリン融合タンパク質が作製されている）または互いの化学的結合によって互いに結合している、治療用タンパク質の少なくとも断片または変異体と、修飾されたトランスフェリンの少なくとも断片または変異体を含む。治療用タンパク質およびトランスフェリンタンパク質は、トランスフェリン融合タンパク質の一部となると、トランスフェリン融合タンパク質の「一部」、「領域」または「部分」（例えば、「治療用タンパク質部分」または「トランスフェリンタンパク質部分」）と呼ばれ得る。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と、修飾された血清トランスフェリンタンパク質とを含んでなるか、または、それらからなるトランスフェリン融合タンパク質を提供する。その他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質および修飾されたトランスフェリンタンパク質の生物学的に活性な、かつ／または治療上活性な断片を含んでなるか、または、それらからなるトランスフェリン融合タンパク質を提供する。その他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質および修飾されたトランスフェリンタンパク質の生物学的に活性な、かつ／または治療上活性な変異体を含んでなるか、または、それらからなるトランスフェリン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と、修飾されたトランスフェリンの生物学的に活性な、かつ／または治療上活性な断片とを含んでなるトランスフェリン融合タンパク質を提供する。もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の活性形である。
【００１７】
特に断りのない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料はいずれも、本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料は記載されている。
【００１８】
定義
本明細書において、トランスフェリン配列中の「に対応するアミノ酸」または「同等なアミノ酸」は、第１のトランスフェリン配列と少なくとも第２のトランスフェリン配列間の同一性または類似性を最大にするアラインメントによって同定される。第２のトランスフェリン配列中の同等なアミノ酸を同定するために用いられる数は、第１のトランスフェリン配列中の対応するアミノ酸を同定するために用いられる数に基づく。特定の場合には、これらの語句を、ウサギ血清トランスフェリン中の特定の残基と比較して、ヒトトランスフェリン中のアミノ酸残基を記載するために用いることもある。
【００１９】
本明細書において、用語「生物活性」とは、生物学的状況において（すなわち、生物において、またはそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製において）治療用分子、タンパク質またはペプチドによって発揮される機能または活性のセットを指す。生物学的活性としては、それだけには限らないが、特許請求される融合タンパク質の治療用分子部分の機能、例えば、それだけには限らないが、応答性細胞株からの細胞外マトリックス分泌の誘導、ホルモン分泌の誘導、走化性の誘導、有糸分裂誘発の誘導、分化の誘導または応答性細胞の細胞分裂の阻害が挙げ得る。本発明の融合タンパク質またはペプチドは、その治療用タンパク質の天然の対応物の１種または複数の生物活性を示す場合に、生物学的に活性であると考えられる。
【００２０】
本明細書において、「結合剤」とは、粉末物質に結合性を付与するために用いられる薬剤である。結合剤または「造粒剤」は、知られているように、錠剤製剤に結束性を付与し、これによって打錠後に錠剤が無傷で残ること、ならびに、所望の硬度および大きさの顆粒剤の製剤による自由流動性の改良が確実となる。結合剤としてよく用いられる物質として、デンプン、ゼラチン、糖、例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、糖蜜およびラクトース、天然および合成ゴム、例えば、アラビアガム、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワールゴム、ガッティゴム、イサポールハスクスの粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ビーガム、微晶質セルロース、微晶質デキストロース、アミロースおよびカラマツアラボガラクタンなどが挙げられる。
【００２１】
本明細書において、用語「担体」とは、それとともに組成物が投与される、希釈液、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、滅菌液体、例えば、水および油、例えば、石油、動物、植物または合成起源の油、例えば、ピーナッツオイル、ダイズオイル、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。
【００２２】
本明細書において、「着色剤」とは、錠剤によりよい外観を与え、さらに製造業者がその調製の際に製品を制御する助けとなり、ユーザが製品を識別する助けとなる薬剤である。承認され認定された水溶性ＦＤ＆Ｃ色素、それらの混合物またはそれらの対応するレーキはいずれも、錠剤を着色するために使用してよい。カラーレーキは、重金属の水和酸化物への水溶性色素の吸着によって組み合わせたものであり、不溶性型の色素をもたらす。
【００２３】
本明細書において「希釈剤」とは、打錠にとって実用的な大きさの錠剤を作製するために製剤の体積を増大するよう加えられる不活性物質である。よく用いられる希釈剤として、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、粉末糖、シリカなどが挙げられる。
【００２４】
本明細書において「崩壊薬」または「崩壊剤」とは、投与後の錠剤の分解または崩壊を促進する物質である。崩壊剤として働く物質は、デンプン、クレー、セルロース、アルギンまたはゴムに化学的に分類されている。その他の崩壊薬として、ビーガムＨＶ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然スポンジ、陽イオン交換樹脂、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、架橋ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
【００２５】
用語「分散性」または「分散可能」とは、約１０重量％（％ｗ）水未満、通常、約５％ｗより低い、好ましくは、約３％ｗ未満の含水率、約１．０〜５．０μｍ質量中位径（ＭＭＤ）、通常、１．０〜４．０μｍ  ＭＭＤおよび好ましくは、１．０〜３．０μｍ  ＭＭＤの粒径、約＞３０％、通常、＞４０％、好ましくは、＞５０％、最も好ましくは、＞６０％の送達される用量および１．０〜５．０μｍ空気動力学的質量中位径（ＭＭＡＤ）、通常、１．５〜４．５μｍ  ＭＭＡＤ、好ましくは、１．５〜４．０μｍ  ＭＭＡＤのエアゾール粒径分布を有する乾燥粉末を意味する。
【００２６】
用語「乾燥」とは、粒子が吸入装置において容易に分散可能であり、エアゾールを形成するような含水率を有する組成物を意味する。この含水率は、一般に、約１０重量％（％ｗ）水より低く、通常、約５％ｗより低く、好ましくは、約３％ｗ未満である。
【００２７】
本明細書において「有効量」とは、任意の医療に伴う適当な便益／リスク比で、所望の局所または全身効果および性能を提供するのに十分な薬物または薬理学的に活性な作用剤の量を意味する。
【００２８】
本明細書において「矯味剤」は、その化学構造が、単純なエステル、アルコールおよびアルデヒドから炭水化物および複合揮発性油にわたり大きく異なる。現在、ほとんどの所望の種類の合成フレーバーが利用可能である。
【００２９】
本明細書において、用語「Ｔｆタンパク質の断片」または「Ｔｆタンパク質」または「Ｔｆタンパク質の一部」とは、天然に存在するＴｆタンパク質またはその突然変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含んでなるアミノ酸配列を指す。
【００３０】
本明細書において、用語「遺伝子」とは、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子は、それだけには限らないが、コード配列および／またはその発現に必要な調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、その他のタンパク質の認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントも含む。遺伝子は、注目する供給源からのクローニングまたは既知もしくは推定配列情報からの合成をはじめ、種々の供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するよう設計された配列も含み得る。
【００３１】
本明細書において「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」または「異種遺伝子」または「異種配列」または「外因性ＤＮＡセグメント」とは、特定の宿主細胞にとって外来性の供給源に起因するか、同一供給源に由来する場合は、その元の形から修飾されている、ポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを指す。宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内因性であるが、修飾されている遺伝子を含む。したがって、この用語は、細胞にとって外来性であるか、異種である、または細胞にとって同種であるが、その要素が元々は見られない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントを指す。例として、酵母細胞にとって天然であるが、ヒトＴｆ配列と結合しているシグナル配列は異種である。
【００３２】
本明細書において「単離された」核酸配列とは、その他の核酸配列を本質的に含まない、アガロースゲル電気泳動によって調べると、少なくとも約２０％純粋、好ましくは、少なくとも約４０％純粋、より好ましくは、約６０％純粋、さらにより好ましくは、約８０％純粋、最も好ましくは、約９０％純粋、さらに最も好ましくは、約９５％純粋である核酸配列を指す。例えば、単離核酸配列は、核酸配列をその天然の位置から異なる部位に再配置し、そこで再生されるよう遺伝子工学において用いられる標準的なクローニング手順によって得ることができる。クローニング手順は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる所望の核酸断片を切り出すことおよび単離することと、この断片をベクター分子に挿入することと、組換えベクターを宿主細胞に組み込み、そこで核酸配列のマルチプルコピーまたはクローンが複製されることとにかかわり得る。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源のものまたはそれらの任意の組合せであり得る。
【００３３】
本明細書において、２種以上のＤＮＡコード配列は、ＤＮＡコード配列間のインフレーム融合の結果として、ＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドに翻訳される場合に、「連結」または「融合」しているといわれる。Ｔｆ融合に関連して用語「融合」とは、それだけには限らないが、少なくとも１種の治療用タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのＴｆのＮ末端との結合、ＴｆのＣ末端との結合および／またはＴｆ内の任意の２種のアミノ酸間の挿入を含む。本明細書において、「連結された」または「融合された」はまた、２種以上の部分をコードするＤＮＡ配列がイントロンによって分けられており、その的確なスプライシング（ｍＲＮＡレベルで）が融合タンパク質をもたらす構築物を含む。
【００３４】
本明細書において「滑沢剤」とは、錠剤製造においていくつかの機能、例えば、錠剤造粒のフロー速度を改良すること、錠剤物質の金型およびパンチの表面への付着を防ぐこと、粒子間摩擦を減らすことおよび金型キャビティからの錠剤の放出を容易にすることを果たす物質である。よく用いられる滑沢剤として、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸および硬化植物油が挙げられる。滑沢剤の通常量は、約０．１重量％〜約５重量％にわたる。
【００３５】
本明細書において「修飾されたトランスフェリン」（ｍＴｆ）は、野生型トランスフェリンと比較して、そのアミノ酸配列の少なくとも１つの修飾を示すトランスフェリン分子を含む。このような修飾として、それだけには限らないが、完全にグリコシル化されたＴｆタンパク質と比較してグリコシル化を減少させる修飾が挙げ得る。修飾されたＴｆはまた、炭水化物残基の酵素による除去によってグリコシル化が減少されたＴｆを含み得る。
【００３６】
本明細書において「修飾されたトランスフェリン融合タンパク質」とは、少なくとも１分子の修飾されたトランスフェリン（またはその断片または変異体）の少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはその断片または変異体）との融合によって形成されたタンパク質を指す。
【００３７】
本明細書において、用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖いずれかの形のその重合体を指す。具体的に制限のない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸を包含する。特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列ならびに明確に示される配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成できる（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１頁；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８頁；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８頁）。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと同義的に用いられる。
【００３８】
本明細書において、ＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントと機能的な関係におかれている場合に「機能し得る形で連結された」といわれる。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、融合タンパク質の分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡと機能し得る形で連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写を刺激する場合に、コード配列と機能し得る形で連結している。通常、機能し得る形で連結しているＤＮＡ配列は隣接しており、シグナル配列または融合タンパク質の場合は、双方とも隣接しており、リーディング相にある。しかし、エンハンサーは、転写を制御するコード配列と連続である必要はない。代わりに、機能し得る形で連結しているＤＮＡ配列は、１個または複数のイントロン配列によって分けられており、イントロン配列のスプライシングが、得られる成熟ｍＲＮＡにおいて連続である配列をもたらしてもよい。これに関連して、連結は、好都合な制限部位での、または代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって達成される。
【００３９】
本明細書において「薬学的に許容される」とは、ヒトに投与した場合に、生理学的に忍容され、通常、アレルギー性等の有害な反応、例えば、胃の不調、めまいなどを生じない物質および組成物を指す。通常、本明細書において、用語「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制当局によって承認見込みであるか、米国薬局方またはその他の一般に認識される薬局方に動物、より特に、ヒトの使用について収載されていることを意味する。
【００４０】
本明細書において「生理学的に有効な量」とは、対象に送達され、所望の緩和効果または治療効果を与える量である。この量は各薬物に特有であり、最高の承認される投与レベルである。
【００４１】
本明細書において、用語「散剤」とは、自由流動し、吸入装置中で容易に分散可能であり、続いて、対象によって吸入され、その結果、粒子が肺に到達し、肺胞中への浸透が可能となる微細分散した固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、散剤は「吸入用」であるといわれる。平均粒径は、直径約１０ミクロン（μｍ）未満であり、相対的に均一な球状の形状分布を有することが好ましい。直径は約７．５μｍ未満であることがより好ましく、約５．０μｍ未満であることが最も好ましい。通常、粒径分布は、直径約０．１μｍ〜約５μｍ、特に、約０．３μｍ〜約５μｍの間である。
【００４２】
本明細書において、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始することに関与するＤＮＡの領域を指す。
【００４３】
本明細書において、用語「組換え体」とは、遺伝子またはＤＮＡの新規組合せを用いた形質転換を受けた細胞、組織または生物を指す。
【００４４】
本明細書において、用語「対象」はヒト、哺乳類または動物であり得る。治療されている対象は、治療を必要とする患者である。
【００４５】
本明細書において、ターゲッティング実体、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとは、特定の細胞種（正常（例えば、リンパ球）または異常（例えば、癌細胞））と特異的に結合し、したがってＴｆ融合タンパク質または化合物をその細胞種に特異的にターゲッティングするために使用できる分子を指す。
【００４６】
本明細書において「錠剤」とは、適した希釈剤を伴ってか、伴わずに薬物物質を含有する固体の医薬投与形であり、当技術分野で周知の打錠または成形法のいずれかによって調製される。錠剤は、１９世紀の後半から広範に使用されており、その人気は続いている。錠剤は、製造業者（例えば、調製の簡便さおよび経済性、安定性ならびに包装、輸送および調剤における利便性）および患者（例えば、投与量の的確性、緻密性、携帯性、味の個性のなさおよび投与の容易性）の双方に与えられる利点のために依然として投与形として人気がある。錠剤は最も頻繁には円盤状の形であるが、円形、楕円形、矩形、円筒状または三角形であってもよい。大きさおよび重量は、存在する薬物物質の量および意図される投与方法に応じて大きく異なり得る。２つの一般的クラス（１）打錠錠剤および（２）成形錠剤または粉薬錠剤に分類される。錠剤は、有効成分または治療成分または複数の成分に加え、いくつかの不活性物質または添加剤を含有する。このような添加剤の第１群として、製剤に十分な打錠特性を付与するのに役立つ物質、例えば、希釈剤、結合剤および滑沢剤が挙げられる。このような添加剤の第２群は、完成した錠剤にさらなる所望の物理的特性を与えるのに役立ち、例えば、崩壊薬、着色剤、矯味剤および甘味剤がある。
【００４７】
本明細書において、用語「治療上有効な量」とは、それを必要とする対象に投与されると、治療を達成するのに十分である、治療用分子を含んでなるトランスフェリン融合タンパク質の量を指す。「治療上有効な量」を構成するトランスフェリン融合タンパク質の量は、用いられる治療用タンパク質、状態または疾患の重篤度ならびに治療される対象の年齢および体重に応じて変わるが、当業者ならば自身の知識および本開示内容を考慮して日常的に決定できる。
【００４８】
本明細書において「治療用タンパク質」とは、１種または複数の治療活性、予防活性および／または生物活性を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはその断片または変異体を指す。本発明に包含される治療用タンパク質として、それだけには限らないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体および生物製剤が挙げられる。用語ペプチド、タンパク質およびポリペプチドは、本明細書において同義的に用いられる。さらに、用語「治療用ペプチド」は、治療用タンパク質の内因性または天然に存在する相互関連物を指す場合もある。「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療上活性な」タンパク質とは、治療用タンパク質、例えば、１種または複数の本明細書に記載されるかそうでなければ当技術分野で公知の治療用タンパク質と関連している、１種または複数の既知生物活性および／または治療活性を有するポリペプチドを意味する。限定されない例として、「治療用タンパク質」として、疾患、状態または障害を治療、予防または改善するのに有用であるタンパク質がある。このような疾患、状態または障害は、ヒトにおけるものであってもよいし、非ヒト動物におけるもの、例えば、家畜への使用であってもよい。
【００４９】
本明細書において、用語「形質転換」とは、核酸（すなわち、ヌクレオチドポリマー）を細胞中に移すことを指す。本明細書において、用語「遺伝子形質転換」とは、ＤＮＡ、特に、組換えＤＮＡを、細胞中に移し、組み込むことを指す。
【００５０】
本明細書において、用語「形質転換体」とは、形質転換を受けた細胞、組織または生物を指す。
【００５１】
本明細書において、用語「導入遺伝子」とは、その機能を確保する方法で、生物、宿主細胞またはベクター中に挿入される核酸を指す。
【００５２】
本明細書において、用語「トランスジェニック」とは、種々の形質転換法のうち１種によって、外来遺伝子または修飾遺伝子、特に、修飾されたＴｆ融合タンパク質をコードする遺伝子を受け取った、細胞、細胞培養物、生物、細菌、真菌、動物、植物および前述のものいずれかの後代を指し、ここで、外来遺伝子または修飾遺伝子は、外来遺伝子または修飾遺伝子を受け取る生物種と同一または異なる種に由来する。
【００５３】
「変異体（複数）または変異体」とは、参照核酸またはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性は保持しているポリヌクレオチドまたは核酸を指す。通常、変異体は、参照核酸またはポリペプチドと全体的に密接に類似しており、多くの領域において、同一である。本明細書において、「変異体」とは、配列において天然治療用タンパク質と異なっているが、本明細書において別の場所に記載されるか、そうでなければ当技術分野において公知の、少なくとも１つのその機能および／または治療特性は保持している、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分を指す。
【００５４】
本明細書において、用語「ベクター」とは、広範に、外因性核酸をコードする任意のプラスミド、ファージミドまたはウイルスを指す。この用語はまた、核酸をウイルス粒子または細胞中に移すのを促進する非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物などを含むと解釈される。ベクターは、核酸またはその突然変異体の細胞への送達のための送達媒体として適しているウイルスベクターであってもよいし、またはベクターは同一目的に適している非ウイルスベクターであってもよい。細胞および組織へのＤＮＡの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は、当技術分野では周知であり、例えば、Ｍａら（１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４〜１２７４６頁）に記載されている。ウイルスベクターの例としては、それだけには限らないが、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換え鳥類ポックスウイルスなどが挙げられる（Ｃｒａｎａｇｅら、１９８６年、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３０５７〜３０６３頁；１９９４年８月１８日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／１７８１０；１９９４年１０月２７日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／２３７４４）。非ウイルスベクターの例としては、それだけには限らないが、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが挙げられる。
【００５５】
本明細書において、用語「野生型」とは、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。
【００５６】
トランスフェリンおよびトランスフェリン修飾
本発明は、治療用タンパク質と、トランスフェリンまたは修飾されたトランスフェリンとを含んでなる融合タンパク質を提供する。本発明によって提供される治療用タンパク質は、ナトリウム利尿ペプチド、類似体、誘導体またはキメラナトリウム利尿分子であることが好ましい。
【００５７】
任意のトランスフェリンを用いて、本発明の修飾されたＴｆ融合タンパク質を作製できる。例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、約７５ｋＤａ（グリコシル化を計上せずに）の６７９個のアミノ酸のタンパク質であり、遺伝子重複に起因すると思われる２つの主要なドメイン（またはローブ）、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を含む。すべて参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０６３、ＸＭ＿００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ＿０３９８４５、ＸＭ＿０３９８４７およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ならびに配列番号１、２および３参照のこと。２つのドメインは長い間に分岐したが、大きな程度の同一性／類似性を保持している（図１）。
【００５８】
ＮおよびＣドメインの各々は、さらに、２つのサブドメイン、ＮｌおよびＮ２、ＣｌおよびＣ２に分かれる。Ｔｆの機能は、鉄を身体の細胞に輸送することである。この過程は、すべての細胞で、特に、増殖中の細胞で活発に発現される、Ｔｆ受容体（ＴｆＲ）によって媒介される。ＴｆＲは、鉄が結合している形のＴｆを認識し（受容体あたり、その２分子が結合される）、次いで、エンドサイトーシスが起こり、それによって、ＴｆＲ／Ｔｆ複合体がエンドソームに輸送され、そこでのｐＨの局所的落ち込みが、結合している鉄の放出および細胞表面へのＴｆＲ／Ｔｆ複合体の再循環およびＴｆの放出（その鉄と結合していない形のアポＴｆとして知られる）をもたらす。受容体結合は、ＴｆのＣドメインを介する。グリコシル化されていない鉄が結合しているＴｆが受容体と結合するので、Ｃドメイン中の２つのグリコシル化部位は、受容体結合に関与しないと思われる。
【００５９】
各Ｔｆ分子は２個の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を運ぶことができる。これらはＮ１とＮ２、Ｃ１とＣ２サブドメインの間の空間で複合体形成し、分子のコンホメーション変化をもたらす。Ｔｆは、Ｔｆ受容体によって血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。
【００６０】
ヒトトランスフェリンでは、鉄結合部位は、配列番号３の少なくともアミノ酸Ａｓｐ６３（天然Ｔｆシグナル配列を含む配列番号２のＡｓｐ８２）、Ａｓｐ３９２（配列番号２のＡｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２のＴｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２のＴｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２のＴｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４または５１７（配列番号２のＴｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２のＨｉｓ２６８）およびＨｉｓ５８５（配列番号２のＨｉｓ６０４）を含んでなる。ヒンジ領域は、配列番号３の少なくともＮドメインアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８ならびにＣドメインアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８を含んでなる。カーボネート結合部位は、配列番号３の少なくともアミノ酸Ｔｈｒ１２０（配列番号２のＴｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２のＴｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２のＡｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２のＡｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２のＡｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２のＡｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２のＧｌｙ１４６）およびＧｌｙ４５９（配列番号２のＧＩｙ４７８）を含んでなる。
【００６１】
本発明の一実施形態では、修飾されたトランスフェリン融合タンパク質は、修飾されたヒトトランスフェリンを含むが、任意の動物Ｔｆ分子、例えば、ヒトＴｆ変異体、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サル、ならびにその他のウシ、イヌおよび鳥類種を用いて、本発明の融合タンパク質を製造してもよい。これらのＴｆ配列のすべてが、ＧｅｎＢａｎｋおよびその他の公開データベースにおいて容易に入手可能である。ヒトＴｆヌクレオチド配列は入手可能であり（配列番号１、２および３および上記で記載される受託番号を参照のこと、また、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で入手可能である）、これを用いて、ＴｆまたはＴｆのドメインと選択した治療用分子間の遺伝子融合物を作製できる。融合物はまた、関連分子、例えば、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３４３）またはメラノトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３９００、ネズミメラノトランスフェリン）から作製できる。
【００６２】
メラノトランスフェリンは、悪性黒色腫細胞において高レベルで見られるグリコシル化タンパク質であり、最初はヒト黒色腫抗原ｐ９７と名づけられた（Ｂｒｏｗｎら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３頁）。ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリンおよびニワトリトランスフェリンと高度の配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３頁；Ｒｏｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８６年、８３：１２６１〜１２６５頁）。しかし、これらの受容体とは異なり、メラノトランスフェリンの細胞受容体は同定されていない。メラノトランスフェリンは、鉄と可逆的に結合し、２つの形で存在し、その一方はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞膜と結合しており、もう一方の形は可溶性であり、かつ、活発に分泌される（Ｂａｋｅｒら、１９９２年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２９８：２１５〜２１８頁；Ａｌｅｍａｎｙら、１９９３年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１０４：１１５５〜１１６２頁；Ｆｏｏｄら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７０１１〜７０１７頁）。
【００６３】
ラクトフェリン（Ｌｆ）、自然防御鉄結合性タンパク質は、抗菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性および抗炎症活性を有するとわかっている。このタンパク質は、常在菌叢に通常さらされている外分泌液：乳、涙、鼻の浸出液、唾液、気管支粘液、胃腸液、頸膣部粘液および精液中に存在する。さらに、Ｌｆは、循環多形核好中球（ＰＭＮ）の二次特異的顆粒の主要な構成要素である。アポタンパク質は、敗血症領域においてＰＭＮの脱顆粒で放出される。Ｌｆの主要な機能は、遊離ラジカル媒介性損傷を抑制するため、および侵入する微生物細胞および腫瘍細胞の金属の利用可能性を低下させるために、液体および炎症を起こした領域中の遊離鉄を除去することである。成体において１２５Ｉ  Ｌｆのターンオーバー速度を調べた研究では、Ｌｆは肝臓および脾臓によって迅速に取り込まれ、放射能は肝臓および脾臓において数週間持続するということがわかった（Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９７９年）、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）５７：４５３〜４６０頁）。
【００６４】
一実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンスプライス変異体を含む。一実施例では、トランスフェリンスプライス変異体は、ヒトトランスフェリンのスプライス変異体であり得る。特定の一実施形態では、ヒトトランスフェリンスプライス変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ６１１４０のものであり得る。
【００６５】
もう１つの実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ラクトフェリンスプライス変異体を含む。一実施例では、ヒト血清ラクトフェリンスプライス変異体は、好中球ラクトフェリンの新規スプライス変異体であり得る。特定の一実施形態では、好中球ラクトフェリンスプライス変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ５９４７９のものであり得る。もう１つの特定の実施形態では、好中球ラクトフェリンスプライス変異体は、以下の、スプライス変異体の新規領域を含むアミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号１２９）を含んでなり得る。
【００６６】
もう１つの実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、メラノトランスフェリン変異体を含む。
【００６７】
修飾されたＴｆ融合物は、任意のＴｆタンパク質、断片、ドメインまたは操作されたドメインを用いて作製できる。例えば、融合タンパク質は、天然Ｔｆシグナル配列を含むか含まない全長Ｔｆ配列を用いて製造できる。Ｔｆ融合タンパク質はまた、単一のＴｆドメイン、例えば、個々のＮまたはＣドメインまたは２Ｎまたは２Ｃドメインを含んでなる修飾された形のＴｆを用いて作製できる（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００２年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／４０６，９７７号参照のこと）。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質と、グリコシル化を減少、阻害または防止するよう変更されている単一のＣドメインとの融合物を製造できる。その他の実施形態では、ＣドメインにはＴｆグリコシル化部位が存在するので、単一のＮドメインの使用が有利である。好ましい実施形態は、高レベルで発現される単一のＮドメインを有するＴｆ融合タンパク質である。
【００６８】
本明細書において、Ｎ様ドメインとして機能するよう修飾されるＣ末端ドメインまたはローブは、天然または野生型Ｎドメインまたはローブのものと実質的に同様のグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すよう修飾される。好ましい実施形態では、Ｃドメインまたはローブは、関連Ｃドメイン領域またはアミノ酸の、天然または野生型Ｎドメインの対応する領域または部位に存在するものへの置換によってグリコシル化されず、鉄と結合しないよう修飾される。
【００６９】
本明細書において、「２つのＮドメインまたはローブ」を含んでなるＴｆ部分は、天然Ｃドメインまたはローブを天然または野生型Ｎドメインもしくはローブまたは修飾されたＮドメインもしくはローブで置換するよう修飾されているか、または野生型もしくは修飾されたＮドメインと実質的に同様に機能するよう修飾されているＣドメインを含有するＴｆ分子を含む。
【００７０】
２つのドメイン（Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ  ３．７ｂ２、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｆｉｔ）を重ね合わせることによる、また直接アミノ酸アラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアラインメント）による２つのドメインの分析により、２つのドメインが長い間に分岐したことが示される。アミノ酸アラインメントは２つのドメイン間に４２％の同一性と５９％の類似性を示す。しかし、Ｎドメインの約８０％が、構造同値のＣドメインとマッチする。Ｃドメインはまた、Ｎドメインと比較して、いくつかの余分のジスルフィド結合を有する。
【００７１】
ＮおよびＣドメインの分子モデルのアラインメントは、以下の構造同値を示す。
【００７２】
【表１】
2009511060.tif 000003
【００７３】
２つのドメインのジスルフィド結合は以下のように並ぶ。
【００７４】
【表２】
2009511060.tif 000004
【００７５】
一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む。さらなる実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリン由来のトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む。
【００７６】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒｌ８８およびＨｉｓ２４９からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む、含んでなる、またはからなる。
【００７７】
もう１つの実施形態では、修飾されたトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリンＮ末端ローブ突然変異体を含む。
【００７８】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含む、含んでなる、またはからなる。さらなる実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリン由来のトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含む。
【００７９】
さらなる一実施形態では、Ｃ末端ローブ突然変異体は、グリコシル化を可能にしない、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうち少なくとも１個に対応する１個のアミノ酸の突然変異をさらに含む。
【００８０】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、突然変異体は金属と結合する能力を保持する。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、突然変異体は金属と結合する能力が低下している。もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、突然変異体は金属と結合する能力を保持せず、Ｎドメインと実質的に同様に機能する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＴｆまたはＴｆ部分は、治療用タンパク質またはペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期、血清安定性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶液安定性またはバイオアベイラビリティを、融合していない状態の治療用タンパク質またはペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期、血清安定性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶液安定性またはバイオアベイラビリティと比較して増大させるのに十分な長さである。このような安定性、血清半減期またはバイオアベイラビリティの増大は、融合していない治療用タンパク質を超える約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多い増大であり得る。いくつかの場合では、修飾されたトランスフェリンを含んでなるトランスフェリン融合タンパク質は、約１０〜２０またはそれより長い日数、約１２〜１８日または約１４〜１７日という血清半減期を示す。
【００８２】
ＴｆのＣドメインが融合タンパクの一部である場合は、２つのＮ結合型グリコシル化部位、配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に対応するアミノ酸残基は、酵母系における発現のために、グリコシル化または過度のマンノシル化を防ぐよう、また、融合タンパク質および／または治療用タンパク質の血清半減期を延長するよう（アシアロ−またはいくつかの場合には、モノシアロ−Ｔｆまたはジシアロ−Ｔｆを製造するよう）突然変異させてもよい。突然変異は、Ｎ４１３およびＮ６１１に対応するＴｆアミノ酸に加え、グリコシル化を防ぐまたは実質的に減少させるための、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接する残基のものでもあり得る。Ｆｕｎｋらの米国特許第５，９８６，０６７号を参照のこと。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現されるＴｆのＮドメインは、Ｓ３２で単一のヘキソースでＯ結合型グリコシル化となり、これもこのようなグリコシル化を防ぐよう突然変異または修飾されてもよいということも報告されている。
【００８３】
したがって、本発明の一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、修飾されたトランスフェリン分子を含み、トランスフェリンはグリコシル化の減少、例えば、それだけには限らないが、アシアロ型、モノシアロ型およびジシアロ型のＴｆを示す。もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぐよう突然変異されている組換えトランスフェリン突然変異体を含む。もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化された組換えトランスフェリン突然変異体を含む。さらなる一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぐまたは減少させるよう突然変異されている組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうち少なくとも１個が、グリコシル化を可能にしないか、または完全にグリコシル化されたＴｆと比較して減少させるアミノ酸に突然変異されている。もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぐか、実質的に減少させるよう突然変異されている組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、突然変異はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接する残基のものであり得る。さらに、グリコシル化は、セリンまたはトレオニン残基を突然変異させることによって減少させるか、または防ぐことができる。一実施形態では、修飾されたトランスフェリンタンパク質は、配列番号３のＳ４１５およびＴ６１３での突然変異を含有する。例えば、本発明は、突然変異Ｓ４１５ＡおよびＴ６１３Ａで修飾されたＴｆタンパク質を含んでなる融合タンパク質を含む。さらに、Ｘをプロリンに変更することは、グリコシル化を阻害することがわかっている。
【００８４】
以下により詳細に論じるように、本発明の修飾されたＴｆ融合タンパク質はまた、鉄と結合しないよう、かつ／またはＴｆ受容体と結合しないよう操作することができる。本発明のその他の実施形態では、鉄結合は保持され、Ｔｆの鉄結合能力を用いて、上皮細胞または内皮細胞膜を通過して、かつ／またはＢＢＢを通過して、治療用タンパク質またはペプチド（類）を細胞の内側に送達することができる。鉄および／またはＴｆ受容体と結合するこれらの実施形態は、グリコシル化を減少させるか、防ぎ、治療用タンパク質の血清半減期を延長するよう操作されることが多い。Ｎドメインは、鉄とともに負荷される場合に、単独ではＴｆＲと結合せず、鉄結合型ＣドメインはＴｆＲと結合するが、分子全体と同じ親和性でではない。
【００８５】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、金属イオンと結合する能力を保持しない突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、金属イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも、より弱い結合親和性を有する突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、金属イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも、より強い結合親和性を有する突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。
【００８６】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン受容体と結合する能力を保持しない突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン受容体に対して、野生型血清トランスフェリンよりも、より弱い結合親和性を有する突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン受容体に対して、野生型血清トランスフェリンよりも、より強い結合親和性を有する突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。
【００８７】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、炭酸イオンと結合する能力を保持しない突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、炭酸イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも、より弱い結合親和性を有する突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、炭酸イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも、より強い結合親和性を有する突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含む。
【００８８】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒｌ８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基に突然変異を有し、金属イオンと結合する能力を保持する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含む。代替実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒｌ８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基に突然変異を有し、金属イオンと結合する能力が低下している組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体。もう１つの実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒｌ８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基に突然変異を有し、金属イオンと結合する能力を保持しない組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体。
【００８９】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有し、金属イオンに対して、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも、より強い結合親和性を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含む（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９８６，０６７号参照のこと）。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有し、金属イオンに対して、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも、より弱い結合親和性を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含む。さらなる一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有し、金属イオンと結合しない組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含む。
【００９０】
任意の利用可能な技術、例えば、それだけには限らないが、一般に利用可能な分子技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に開示されるものを用いて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を製造できる。当技術分野では周知である部位特異的変異を達成するための技術を用いてヌクレオチド置換を実施する場合には、コードされるアミノ酸変更は軽度のもの、すなわち、保存的アミノ酸置換であることが好ましいが、その他の非保存的置換も、特に、Ｔｆ融合タンパク質の修飾されたトランスフェリン部分、例えば、グリコシル化の減少、イオン結合の減少などを示す修飾されたＴｆタンパク質を製造する場合には、同様に企図される。通常、１〜約３０アミノ酸のアミノ酸置換、小さな欠失または挿入；トランスフェリンドメイン間の挿入；小さなアミノまたはカルボキシル末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基またはトランスフェリンドメイン間の、もしくはトランスフェリンタンパク質と治療用タンパク質もしくはペプチドを連結する５０、４０、３０、２０または１０個未満の残基の小さなリンカーペプチドまたは精製を容易にする小さな伸長、例えば、ポリヒスチジントラクト、抗原エピトープもしくは結合ドメインが具体的に企図される。
【００９１】
保存的アミノ酸置換の例として、同一群内、例えば、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）および小さなアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の群内で行われる置換がある。
【００９２】
非保存的置換は、ある群のアミノ酸の別の群のアミノ酸との置換を包含する。例えば、非保存的置換は、極性アミノ酸の疎水性アミノ酸との置換を含む。ヌクレオチド置換の概要については、Ｆｏｒｄら（１９９１年）、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．２：９５〜１０７頁参照のこと。非保存的置換、欠失および挿入は、鉄の結合がないか、または結合が減少している、融合タンパク質のＴｆ受容体との結合がないか、または結合が減少している、かつ／またはグリコシル化がないか、または減少している、本発明のＴｆ融合タンパク質を製造するのに特に有用である。
【００９３】
鉄結合および／または受容体結合は、Ｔｆ  Ｎドメイン残基、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒｌ８８、Ｈｉｓ２４９および／またはＣドメイン残基Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４および／またはＨｉｓ５８５のうち１個または複数に対応するアミノ酸残基の突然変異、例えば、欠失、置換または挿入によって減少させるか、混乱させることができる。鉄結合はまた、アミノ酸、配列番号３のＬｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７またはＡｒｇ６３２の突然変異によって影響を受け得る。カーボネート結合は、Ｔｆ  Ｎドメイン残基、配列番号３のＴｈｒｌ２０、Ａｒｇｌ２４、Ａｌａｌ２６、ＧＩｙ１２７および／またはＣドメイン残基Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８および／またはＧｌｙ４５９のうち１個または複数に対応するアミノ酸残基の突然変異、例えば、欠失、置換または挿入によって減少させるか、混乱させることができる。カーボネート結合の減少または混乱は、鉄および／または受容体結合に悪影響を及ぼし得る。
【００９４】
Ｔｆ受容体の結合は、鉄結合について上記で記載されるＴｆＮドメイン残基のうち１個または複数に対応するアミノ酸残基の突然変異、例えば、欠失、置換または挿入によって減少させるか、混乱させることができる。
【００９５】
上記で論じられるように、グリコシル化も、Ｃドメイン残基、Ｎ４１３および／またはＮ６１１に対応するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位周辺のＴｆＣドメイン残基のうち１個または複数に対応するアミノ酸残基の突然変異、例えば、欠失、置換または挿入によって減少させるか、防ぐことができる（米国特許第５，９８６，０６７号参照のこと）。例えば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１を、Ｇｌｕ残基に突然変異させることができる。
【００９６】
本発明のＴｆ融合タンパク質が、グリコシル化、鉄結合、カーボネート結合および／または受容体結合を防ぐよう修飾されていない場合には、グリコシル化、鉄および／または炭酸イオンを、融合タンパク質から奪うか、切断し取り除いてもよい。例えば、利用可能なデグリコシラーゼを用いて、融合タンパク質からグリコシル化残基、特に、Ｔｆ部分と結合している糖残基を切断してもよいし、グリコシル化酵素が欠損した酵母を用いて、グリコシル化を防いでもよいし、かつ／またはグリコシル化を防ぐ薬剤、例えば、ツニカマイシンの存在下で組換え細胞を増殖させてもよい。
【００９７】
融合タンパク質上の糖質は、融合タンパク質をデグリコシラーゼを用いて処理することによって、酵素的に減少させるか、完全に除去できる。デグリコシラーゼは、当技術分野では周知である。デグリコシラーゼの例として、それだけには限らないが、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧアーゼＡ、ＰＮＧアーゼＦ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼおよびエンドＨデグリコシラーゼが挙げられる。
【００９８】
それにもかかわらず、特定の状況では、融合タンパク質のＴｆ部分が完全にグリコシル化された経口送達に好ましいものがあり得る。
【００９９】
Ｔｆの三次元構造を変更するため、例えば、鉄結合およびＴｆ受容体認識に必要なコンホメーションの変化を妨げるためのヒンジ領域の修飾のために、さらなる突然変異をＴｆを用いて行ってもよい。例えば、突然変異は、Ｎドメインアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８ならびにＣドメインアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８において、またはその周辺で行ってもよい。さらに、突然変異は、Ｔｆ構造および機能を変更するためにこれらの部位のフランキング領域において、またはその周辺で行ってもよい。
【０１００】
本発明の一態様では、トランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質の半減期またはバイオアベイラビリティを延長するための、ならびに、いくつかの例では、治療用タンパク質を細胞の内側へ、かつ／または血液脳関門を通過して送達する担体タンパク質として機能し得る。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、血液脳関門を通過する能力を保持しない修飾されたトランスフェリン分子を含む。
【０１０１】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン受容体と結合し、治療用ペプチドを細胞の内側へ輸送する能力を保持する修飾されたトランスフェリン分子を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン受容体と結合し、治療用ペプチドを細胞の内側へ輸送する能力を保持しない修飾されたトランスフェリン分子を含む。
【０１０２】
さらなる実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン受容体と結合し、治療用ペプチドを細胞の内側へ輸送する能力を保持し、血液脳関門を通過する能力を保持する修飾されたトランスフェリン分子を含む。代替実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、血液脳関門を通過する能力を保持するが、トランスフェリン受容体と結合し、治療用ペプチドを細胞の内側へ輸送する能力は保持しない修飾されたトランスフェリン分子を含む。
【０１０３】
修飾されたトランスフェリン融合タンパク質
本発明のタンパク質の融合物は、Ｔｆタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端と結合している１つまたは複数のコピーの治療用タンパク質またはポリペプチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドは、Ｔｆタンパク質のＮおよびＣ末端両方と結合しており、融合タンパク質は、Ｔｆのいずれかの末端もしくは両末端に、１個または複数の治療用タンパク質もしくはポリペプチドの等価物または１個または複数の異なる治療用タンパク質もしくはポリペプチドを含有し得る。その他の実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドは、Ｔｆタンパク質の既知ドメインに、例えば、１個または複数のＴｆの表面ループに挿入される（Ａｌｉら（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３頁参照のこと）。挿入をトランスフェリンのマルチプルループ中に行い、治療用タンパク質が結合する、抗原、受容体またはターゲッティング分子に対する親和性の増大した五価分子を作製してもよい。その他の実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドを、ＴｆのＮおよびＣドメインの間に挿入する。あるいは、治療用タンパク質またはポリペプチドをトランスフェリン分子中のどこかに挿入する。
【０１０４】
通常、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、１つの修飾されたトランスフェリンに由来する領域と、１つの治療用タンパク質領域とを有し得る。しかし、各タンパク質の複数の領域を用いて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製してもよい。同様に、２種以上の治療用タンパク質を用いて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製し、それによって多機能性の修飾されたＴｆ融合タンパク質を製造できる。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子またはその一部と融合している治療用タンパク質またはポリペプチドまたはその一部を含有する。もう１つの実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＮ末端と融合している治療用タンパク質またはポリペプチドを含有する。代替実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＣ末端と融合している治療用タンパク質またはポリペプチドを含有する。さらなる一実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質またはポリペプチドのＮ末端と融合しているトランスフェリン分子を含有する。代替実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質またはポリペプチドのＣ末端と融合しているトランスフェリン分子を含有する。
【０１０６】
その他の実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、修飾されたトランスフェリンのＮ末端およびＣ末端の両方と融合している治療用タンパク質を含有する。もう１つの実施形態では、ＮおよびＣ末端で融合している治療用タンパク質は、同一治療用タンパク質と結合する。代替実施形態では、ＮおよびＣ末端で融合している治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。もう１つの代替実施形態では、ＮおよびＣ末端で融合している治療用タンパク質は、同一の疾患、障害または状態を治療または予防するために使用できる異なる治療用タンパク質と結合する。もう１つの実施形態では、ＮおよびＣ末端で融合している治療用タンパク質は、患者において同時によく生じることが当技術分野で知られている疾患または障害を治療または予防するために使用できる異なる治療用タンパク質である。
【０１０７】
修飾されたトランスフェリン部分が治療用タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端と融合している本発明の修飾されたトランスフェリン融合タンパク質に加え、本発明のトランスフェリン融合タンパク質はまた、注目する治療用タンパク質またはペプチド（例えば、本明細書に開示される治療用タンパク質またはペプチドまたはその断片または変異体）を、修飾されたトランスフェリンの内部領域に挿入することによっても製造できる。修飾されたトランスフェリンの内部領域としては、それだけには限らないが、鉄結合部位、ヒンジ領域、ビカーボネート結合部位または受容体結合ドメインが挙げられる。
【０１０８】
修飾されたトランスフェリン分子のタンパク質配列内には、いくつかのループまたはターンが存在し、これはジスルフィド結合によって安定化されている。これらのループは、治療上活性なペプチド、特に、機能的であるために二次構造を必要とするものまたは特定の生物活性を有する修飾されたトランスフェリン分子を生じる治療用タンパク質の挿入または内部融合にとって有用である。
【０１０９】
治療用タンパク質がＴｆ分子の少なくとも１つのループ中に挿入されるか、それを置換する場合には、挿入は、Ｔｆのその他の領域の他に、任意の表面に露出されたループ領域内で行うことができる。例えば、挿入は、Ｔｆアミノ酸３２〜３３、７４〜７５、２５６〜２５７、２７９〜２８０および２８８〜２８９を含んでなるループ内で行うことができる（Ａｌｉら、前掲）（図３参照のこと）。これまでに記載されているように、挿入はまた、以下のより詳細に記載される、Ｔｆのその他の領域内、例えば、鉄およびビカーボネート結合のための部位、ヒンジ領域および受容体結合ドメインで行うことができる。タンパク質またはペプチドの挿入のための修飾／置換を受け入れられるＴｆタンパク質配列中のループはまた、ランダムペプチドインサートのスクリーニング可能なライブラリーの開発にも使用できる。任意の手順を用いて、Ｔｆドメインへのクローニングおよび／またはＴｆの末端との融合に先立って、ペプチドライブラリー、例えば、利用可能なファージおよび細菌ディスプレイシステムを作製するための核酸インサートを製造できる。
【０１１０】
ＴｆのＮ末端は遊離しており、分子の本体から離れて向いている。したがって、Ｎ末端でのタンパク質またはペプチドの融合は、好ましい実施形態であり得る。このような融合物は、治療用タンパク質とＴｆを分離するためのリンカー領域、例えば、それだけには限らないが、ポリグリシンストレッチを含み得る。コドン操作／最適化（リボソーム進行を阻害する大きなステムロープがないこと）によって、リーダー配列間の接合部、リーダー配列の選択およびｍＲＮＡの構造へ注意することで分泌が増大し、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて容易に達成できる。
【０１１１】
ＴｆのＣ末端はより埋まっており、Ｃ末端由来のジスルフィド結合６アミノ酸によって固定されていると思われる。ヒトＴｆでは、Ｃ末端アミノ酸は、配向される方法によって変わるが、プロリンであり、これは融合物を分子本体から離れて向けるか、分子本体中に向けるのいずれかである。本発明のいくつかの実施形態では、Ｃ末端のリンカーまたはスペーサー部分を使用できる。Ｎ末端近傍のプロリンも存在する。本発明の一態様では、Ｎおよび／またはＣ末端のプロリンを変更できる。本発明のもう１つの態様では、Ｃ末端ジスルフィド結合を排除して、Ｃ末端を繋ぎ止めていることを解くことができる。
【０１１２】
さらにその他の実施形態では、小分子治療薬を、細胞の内側に送達し、ＢＢＢを通過するために鉄と複合体を形成させ、修飾されたＴｆタンパク質融合物に負荷することができる。ターゲッティングペプチドの添加または、例えば、一本鎖抗体（ＳＣＡ）を用いて特定の細胞種、例えば、癌細胞にペイロードをターゲッティングできる。
【０１１３】
修飾されたトランスフェリンタンパク質は、任意の融合タンパク質、本発明の方法および種々のその他の態様とともに用いることができる。一実施形態では、修飾されたトランスフェリンタンパク質は、１つまたは２つのＮ結合型グリコシル化部位（例えば、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）内またはそれに隣接する修飾を含有する。例えば、本発明は、Ｔｆ部分が、Ｎ結合型グリコシル化部位内のセリンおよび／またはトレオニンアミノ酸に突然変異を含有する融合タンパク質を含む。一実施形態では、修飾されたトランスフェリンタンパク質は、Ｓ４１５およびＴ６１３（配列番号３）に突然変異を含有する。例えば、本発明は、突然変異Ｓ４１５ＡおよびＴ６１３Ａを含む修飾されたＴｆタンパク質を含んでなる融合タンパク質を含む。
【０１１４】
治療用タンパク質およびペプチド
本発明の方法および組成物に従って、任意の治療用分子を、Ｔｆの融合パートナーとして使用できる。本明細書において、治療用分子とは、通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで有益な生物学的効果を発揮できるタンパク質またはペプチドであり、正常なホメオスタシス、生理学または疾患状態に対して有益な効果を発揮するタンパク質またはペプチドを含む。治療用分子は、マーカーまたはタンパク質精製助剤としてよく用いられる融合パートナー、例えば、細菌ガラクトシダーゼを含まない（例えば、米国特許第５，９８６，０６７号およびＡｌｄｒｅｄら（１９８４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２２：９６０〜９６５頁参照のこと）。例えば、病状と関連している細菌効果として、治療される対象にとって有利である任意の効果、例えば、疾患予防、疾患の安定化、疾患症状の軽減もしくは緩和または治療される対象にとって有益な効果を生み出す根底にある欠陥の調節、緩和または治癒が挙げられる。
【０１１５】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、好ましくは、遺伝子融合によって互いに結合している、治療用タンパク質の少なくとも断片または変異体と、血清トランスフェリン、例えば、修飾された血清トランスフェリンの少なくとも断片または変異体を含む。
【０１１６】
一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、ナトリウム利尿ペプチドと連結している修飾されたトランスフェリン分子を含む。もう１つの実施形態では、修飾されたトランスフェリン融合タンパク質は、アミノ末端のナトリウム利尿ペプチドと連結しているカルボキシル末端のトランスフェリンを含む。代替実施形態では、修飾されたトランスフェリン融合タンパク質は、カルボキシ末端のナトリウム利尿ペプチドと連結しているアミノ末端のトランスフェリンを含む。
【０１１７】
さらなる実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくとも断片または変異体、例えば、ナトリウム利尿ペプチドの断片または変異体を含有し得る。さらなる一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質は、少なくとも１つの生物活性または治療活性を保持する、ナトリウム利尿ペプチドのペプチド断片またはペプチド変異体を含有し得る。トランスフェリン融合タンパク質は、少なくとも約３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０または少なくとも約７０以上のアミノ酸長の、トランスフェリンもしくは修飾されたトランスフェリンのＮおよび／もしくはＣ末端と融合しているか、またはトランスフェリンもしくは修飾されたトランスフェリンのループ内に挿入されているか、ループ中に挿入されているペプチド断片またはペプチド変異体であり得る治療用タンパク質を含有し得る。
【０１１８】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、１種または複数のペプチドを含有し得る。ペプチドの数が増えるにつれ、トランスフェリンと融合しているペプチドの機能およびトランスフェリン融合タンパク質全体の機能が増強される。ペプチドを用いて、複数の機能を有するペプチドまたはタンパク質ドメインを含むことによって二機能または多機能融合タンパク質を作製できる。例えば、多機能融合タンパク質は、治療用タンパク質および融合タンパク質を特定の標的にターゲッティングするための第２のタンパク質を用いて作製できる。その他のペプチドを用いて、細胞系の免疫応答を誘導するか、または抗ウイルス、抗菌もしくは抗病原体反応を誘導できる。
【０１１９】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合分子は、全長タンパク質ならびにアミノ酸配列のアミノ末端から１個または複数の残基が欠失しているポリペプチドを含む治療用タンパク質の断片であり得る治療用タンパク質部分を含有する。
【０１２０】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合分子は、全長タンパク質ならびにアミノ酸配列のカルボキシ末端から１個または複数の残基が欠失しているポリペプチドを含む治療用タンパク質の断片であり得る治療用タンパク質部分を含有する。
【０１２１】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合分子は、アミノおよびカルボキシ両末端から１個または複数のアミノ酸が欠失している可能性がある治療用タンパク質部分を含有する。
【０１２２】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合分子は、本明細書に示される参照治療用タンパク質と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である治療用タンパク質部分、またはその断片を含有する。さらなる実施形態では、トランスフェリン融合分子は、上記のようにＮ末端およびＣ末端が欠失しているアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である治療用タンパク質部分を含有する。
【０１２３】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合分子は、例えば、治療用タンパク質の天然または野生型アミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である治療用タンパク質部分を含有する。これらのポリペプチドの断片も提供する。
【０１２４】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質、例えば、細胞表面および分泌タンパク質は、１個または複数のオリゴサッカライド基を結合することによって修飾することができる。グリコシル化と呼ばれる修飾は、タンパク質の物理特性に大きく影響を及ぼすことができ、タンパク質安定性、分泌および局在性において重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿って特定の位置で起こる。通常、２つの主要な種類のグリコシル化：セリンまたはトレオニン残基と結合している、Ｏ結合型オリゴサッカライドを特徴とするグリコシル化、およびＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（ここで、Ｘはプロリンを除くアミノ酸であり得る）中のアスパラギン残基と結合しているＮ結合型オリゴサッカライドを特徴とするグリコシル化がある。
【０１２５】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質ならびにその類似体および変異体は、それらが発現される宿主細胞によって、またはそれらの発現のその他の条件によって、その核酸配列の操作の結果として１つまたは複数の部位でのグリコシル化が変更されるよう修飾できる。例えば、アミノ酸残基の置換または欠失、例えば、グルタミンのアスパラギンとの置換によって、グリコシル化部位を無効にするか導入することによってグリコシル化異性体を製造でき、またはグリコシル化しない宿主細胞において、例えば、グリコシル化欠損酵母において、タンパク質を発現させることによってグリコシル化されていない組換えタンパク質を製造することができる。これらのアプローチは、当技術分野で公知である。
【０１２６】
治療用タンパク質およびその核酸配列は、当技術分野では周知であり、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ登録簿）、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑなどの公開データベースから入手可能である。本明細書において参照される受託番号および配列は、参照によりその全文が組み込まれる。
【０１２７】
その他の実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、本願において別の場所に記載される治療用タンパク質の治療活性および／または生物活性に相当する治療活性および／または生物活性を有し得る。さらなる実施形態では、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療上活性なタンパク質部分は、本明細書に記載される参照配列の断片または変異体である。
【０１２８】
本発明はさらに、本明細書に記載される治療用タンパク質の断片を含んでなるＴｆ融合タンパク質を対象とする。たとえ、タンパク質のＮ末端からの１個または複数のアミノ酸の欠失が、治療用タンパク質部分の１つまたは複数の生物学的機能の修飾または喪失をもたらしても、その他の治療活性および／または機能活性（例えば、生物活性、多量体を形成する能力、リガンドと結合する能力）は依然として保持され得る。例えば、Ｎ末端が欠失しているポリペプチドの、ポリペプチドの完全または成熟型を認識する抗体を誘導および／またはこれと結合する能力は、Ｎ末端から完全ポリペプチドの大部分に満たない残基が除去される場合は、通常、保持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するかどうかは、当技術分野で公知の本明細書およびその他の場所に記載される日常的な方法によってアッセイできる。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失している突然変異体が、いくつかの生物活性または免疫学的活性を保持し得ると思われる。実際、わずか６個のアミノ酸残基からなるペプチドが、免疫応答を誘発し得ることは多い。
【０１２９】
また、上記に記載されるように、たとえ、治療用タンパク質のＮ末端またはＣ末端から１個または複数のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つまたは複数の生物機能の修飾または喪失をもたらしても、その他の機能活性（例えば、生物活性、多量体を形成する能力、リガンドと結合する能力）および／または治療活性は、依然として保持され得る。例えば、Ｃ末端が欠失しているポリペプチドの、ポリペプチドの完全または成熟型を認識する抗体を誘導および／またはこれと結合する能力は、Ｃ末端から完全または成熟ポリペプチドの大部分に満たない残基が除去されている場合、通常、保持される。参照ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、治療活性を保持するかどうかは、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知の日常的な方法によって容易に調べることができる。
【０１３０】
治療用タンパク質のペプチド断片は、その断片である治療用タンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／または機能活性（例えば、生物活性）を示すアミノ酸配列を含んでなる、または、からなる断片であり得る。
【０１３１】
治療用タンパク質のペプチド断片は、タンパク質のＮおよびＣ末端のみを含んでなる、すなわち、治療用タンパク質の中心部分が欠失している場合もある。あるいは、ペプチド断片は、治療用タンパク質の中心部分の隣接していないおよび／または隣接する部分を含んでなる場合もある。
【０１３２】
その他のポリペプチド断片は、生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片とは、本発明に用いられる治療用タンパク質の活性と同様であるが、必ずしも同一ではない活性を示すものである。断片の生物活性として、改善された所望の活性または減少した望ましくない活性が挙げられる。
【０１３３】
通常、タンパク質の変異体は、全体的に極めて類似しており、多数の領域で、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質のアミノ酸配列と同一である。これらの変異体をコードする核酸も本発明に包含される。
【０１３４】
本発明に使用できるさらなる治療用ポリペプチドとして、治療用タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体と、当業者に公知であるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドがある（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ参照のこと）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。
【０１３５】
本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸につき、最大５個のアミノ酸の変更を含み得るということを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であることを意図する。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対象配列中の最大５％のアミノ酸残基を、別のアミノ酸で挿入、欠失または置換してもよい。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、または参照配列中の残基間に個別に、もしくは参照配列内の１個または複数の隣接する基に散在する、これらの末端位置の間の任意の場所で起こり得る。
【０１３６】
実際に、任意の個々のポリペプチドは、例えば、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のアミノ酸配列またはそのフラグメント（例えば、トランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラムを用いて従来的に調べることができる。クエリー配列（本発明の配列）と対象配列間の最良の全体的なマッチを調べるための好ましい方法は、グローバル配列アラインメントとも呼ばれ、Ｂｒｕｆｉａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ  ２４５（１９９０年））に基づいてＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて調べることができる。
【０１３７】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域または両方における変更を含有し得る。サイレントな置換、付加または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変更しない変更を含有するポリヌクレオチド変異体を用いて、修飾されたＴｆ融合タンパク質を製造することができる。遺伝子コードの縮重によるサイレントな置換によって生じるヌクレオチド変異体を利用できる。さらに、約５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５または１〜２個のアミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失または付加されているポリペプチド変異体も利用できる。ポリヌクレオチド変異体は、種々の理由で、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンの、上記のような宿主、例えば、酵母または大腸菌による好ましいものへの変更）ために製造できる。
【０１３８】
その他の実施形態では、治療用タンパク質部分は、野生型配列と比較して保存的置換を有する。「保存的置換」とは、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換、芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換ならびに小さなアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換などの群内の交換を意味する。表現上サイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）に提供されている。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載される治療用タンパク質および／または血清トランスフェリンおよび／本発明の修飾されたトランスフェリンタンパク質のアミノ酸配列の断片または変異体を含んでなる、または、からなり、断片または変異体は、参照アミノ酸配列と比較して、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０または５０〜１５０個のアミノ酸残基付加、置換および／または欠失を有する。さらなる実施形態では、アミノ酸置換は保存的である。これらのポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明に包含される。
【０１３９】
本発明の融合タンパク質は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに連結しているアミノ酸から構成されたものであり得、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、自然過程、例えば、翻訳後プロセッシングによって、または当技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾され得る。このような修飾は、基本的な教本に、およびより詳細な研究論文に、ならびに膨大な研究文献に十分に記載されている。
【０１４０】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端をはじめ、ポリペプチド中のどこでも起こり得る。当然のことではあるが、同種の修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同程度または様々な程度で存在し得る。また、所与のポリペプチドは、多数の種類の修飾を含有し得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐している場合もあるし、分岐を有するか有さない環状である場合もある。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然過程に起因する場合もあるし、合成法によって作製される場合もある。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介性付加、例えば、アルギニル化、およびユビキチン化を含む（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１〜１２頁（１９８３年）；Ｓｅｉｆｔｅｒら（１９９０年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６頁；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２頁を参照のこと）。
【０１４１】
本発明の治療用タンパク質は、それだけには限らないが、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはその断片および変異体を含む。本発明の治療用タンパク質は、ナトリウム利尿ペプチドおよびその類似体、誘導体およびキメラ分子を含むことが好ましい。心血管疾患の治療のためのその他の治療用ペプチド融合物として、アドレノメデュリンとの融合物Ｓｈｉｍｏｓａｗａ，Ｔ．ら（２００２年）Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ，ａｎ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄａｍａｇｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５、１０６〜１１１頁）およびウロコルチンとの融合物（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．ら（１９９６年）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｒｏｃｏｒｔｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７、２１６７〜２１７０頁）が挙げられる。
【０１４２】
ナトリウム利尿ペプチド
本発明は、１つまたは複数のコピーの、トランスフェリン分子と融合しているナトリウム利尿ペプチドを含んでなる融合タンパク質を提供する。トランスフェリン分子は、天然トランスフェリン分子と比較して、グリコシル化の減少を示す修飾されたトランスフェリン分子であることが好ましい。ナトリウム利尿ペプチドは、内因性ナトリウム利尿ペプチドまたは外因性ペプチド、例えば内因性ナトリウム利尿ペプチドの類似体もしくは誘導体、キメラナトリウム利尿ペプチドまたはナトリウム利尿ペプチド受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用できるペプチドであり得る。融合タンパク質は、１種のみのナトリウム利尿ペプチドを含有してもよいし、種々の種類のナトリウム利尿ペプチドの組合せを含有してもよい。
【０１４３】
ナトリウム利尿ペプチドは、体液および電解質の恒常性の調節に関与しているホルモンである。３つの主要な種類の哺乳類ナトリウム利尿因子がある。第１の種類、心房性ナトリウム利尿ペプチドまたは因子（ＡＮＰまたはＡＮＦ）は、顆粒が豊富な心房抽出物は、ナトリウム利尿および血管拡張を引き起こす物質を含有しているということを見出した１９８１年にＤｅＢｏｌｄおよび共同研究者によって発見された（ＤｅＢｏｌｄら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（１９８１年）２８：８９〜９４頁）。２年後、Ｆｌｙｎｎらが、哺乳類心房からＡＮＰを精製し、配列決定した（Ｆｌｙｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３年）１１７：８５９〜８６５頁）。それから程なく、第２の種類、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）および第３の種類、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）が発見された。ＢＮＰは最初ブタ脳において発見された（Ｓｕｄｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ（１９８８年）１５５：７２６〜７３２頁）が、ＢＮＰの主要な供給源は心室である。ＣＮＰは、神経系において最初同定された（Ｓｕｄｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９０年）１６８（２）：８６３〜８７０頁）が、後に、内皮細胞によって産生されることがわかった（Ｓｕｇａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９９２年）９０（３）：１１４５〜１１４９頁）。これらの哺乳類ナトリウム利尿ペプチドに加え、２種のその他のペプチドが単離されている。Ｔｅｒｖｏｎｅｎ（１９９８年）は、同様の構造および特性を有するサケナトリウム利尿因子（サケ心臓ペプチド）の単離を報告し（Ｔｅｒｖｏｎｅｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９８８年）１３９：４０２１〜４０２５頁）、Ｓｃｈｗｅｉｔｚらは、グリーンマンバの毒中にマンバ属（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）を発見した（Ｓｃｈｗｅｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９９２年）２６７：１３９２８〜１３９３２頁）。
【０１４４】
ナトリウム利尿ペプチドは、３つの異なる遺伝子によって合成され、次いで、３種の異なるプロホルモン（すなわち、１２６個のアミノ酸の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、１０８ａ．ａ．の脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）および１２６個のアミノ酸のＣ−ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）プロホルモン）として保存される。構造的には、ナトリウム利尿ペプチドは、相同ペプチドホルモンである。それらは種々の長さのペプチドであるが、ジスルフィド結合を提供する２個のシステインを含有する同一の１７アミノ酸環を共有している。
【０１４５】
また、多数の非内因性または外因性ナトリウム利尿ペプチド、例えば、別のペプチドと融合している１種または複数のナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列を含有するキメラナトリウム利尿ペプチド、および内因性または野生型ナトリウム利尿ペプチドに由来する突然変異体ナトリウム利尿ペプチドが存在する。突然変異体ナトリウム利尿ペプチドは、野生型ペプチドからの１個または複数のアミノ酸の置換および／または欠失によって得ることができる。突然変異体ナトリウム利尿ペプチドは、対応する内因性ナトリウム利尿ペプチドと同一のアミノ酸配列を有さないが、対応する内因性ペプチドと類似の結合特異性を共有している。キメラナトリウム利尿ペプチドは、別のナトリウム利尿ペプチドの一部の付加またはナトリウム利尿ペプチドの一部の、別のナトリウム利尿ペプチドもしくは治療用ペプチドでの置換によって得ることができる。
【０１４６】
ナトリウム利尿ペプチドは、共通受容体を共有し、セカンドメッセンジャーとしてのｃＧＭＰの細胞内産生を刺激する。哺乳類ナトリウム利尿ペプチドの機能活性は、ナトリウム利尿ペプチドの、３種の別個の哺乳類受容体、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、ＢおよびＣ（ＮＰＲＡ、ＮＰＲＢおよびＮＰＲＣ）との結合によって媒介される。ＮＰＲＡおよびＮＰＲＢは、グアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）と関係している。したがって、細胞外ドメインとのリガンド結合が、細胞質ＧＣドメインを活性化する。他方、ＮＰＲＣは、ｃＧＭＰ産生とは結びついておらず、ＡＮＰのクリアランスにおいて機能し得る。
【０１４７】
哺乳類膜上にこれらの特異的受容体が存在することは、種々の腎臓、副腎皮質および血管組織において実証されている（Ｓｃｈｅｎｋら、（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１４８８７〜１４８９０頁；Ｖａｎｄｌｅｎら、（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０８８９〜１０８９２頁；Ｍｉｓｏｎｏら、（１９８５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３０：９９４〜１００１頁；Ｈｉｒｏｓｅら、（１９８５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３０：５７４〜５７９頁；Ｙｉｐら、（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８２２９〜８２３２頁；Ｓｃｈｅｎｋら、（ＩＩ）（１９８５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２７：４３３〜４４２頁；Ｈｉｒａｔａら、（１９８５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２８：５３８〜５４６頁；Ｗｉｎｑｕｉｓｔら、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７６６１〜７６６４頁；Ｎａｐｉｅｒら、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５９４６〜５９５０頁；Ｈｉｒａｔａら、（１９８４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２５：５６２〜５６８頁；Ｄｅ  Ｌｅａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１５：１６３６〜１６３８頁；Ｄｅ  Ｌｅａｎら、（１９８４年）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３５：２３１１〜２３１８頁）。
【０１４８】
ナトリウム利尿ペプチドは、すべてのペプチドと同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達後、極めて短い半減期を有する。したがって、血清安定性またはｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期の延長した、また機能活性が増強されたナトリウム利尿ペプチドを得ることには関心がある。
【０１４９】
心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）
ＡＮＰには、ＡＮＦ、カルディオナトリン、アトリオナトリウレティック因子、プロナトリオジラチン（ＰＮＤ）、心房性ペプチンをはじめ種々の名称が与えられているが、現在ではまとめてＡＮＰとして知られている。ＡＮＰの主要な供給源は、心房であるが、その合成等価物がα−Ｈ−ＡＮＰの形で市販されている。
【０１５０】
ＡＮＰは、心房でプレホルモンとして合成され、切断されてプロホルモンとなる。ＡＮＰは、１種の遺伝子が４種のペプチドホルモンを合成するホルモン系の一部である。ＡＮＰ遺伝子は、１５１アミノ酸のプレプロホルモン（配列番号４）を合成し、これが小胞体内でプロセシングされて、そのＮ末端から２５アミノ酸のシグナルペプチドを除去した後に１２６アミノ酸のプロホルモンを形成する（すなわち、以下のペプチドホルモンの保存型）。
【０１５１】
【表３】
2009511060.tif 000005
１２６アミノ酸ＡＮＰプロホルモン（配列番号５、２５アミノ酸のシグナルペプチドを除去した後）内のこれら４種のペプチドホルモンは、以下からなる：（１）第１の、プロホルモンのＮ末端からの３０アミノ酸（すなわち、プロＡＮＰ配列番号５の１〜３０、長時間作用型ナトリウム利尿ペプチド、ＬＡＮＰ）、（２）配列番号５のアミノ酸３１〜６７（すなわち、プロＡＮＰ３１〜６７、Ｖｅｓｓｅｌ  Ｄｉｌａｔｏｒ）、（３）配列番号５のアミノ酸７９〜９８（プロＡＮＰ７９〜９８、カリウム利尿ペプチド）および（４）このプロホルモンの配列番号５のアミノ酸９９〜１２６（ＡＮＰ：ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ）。
【０１５２】
これらの４種のペプチドホルモンの各々は、血流内を循環し、ＬＡＮＰおよびＶｅｓｓｅｌ  Ｄｉｌａｔｏｒの血漿中濃度は、ＡＮＰよりも１５〜２０倍高い。これらのペプチドホルモンの各々は、動物およびヒトの双方において生物学的効果、例えば、血圧低下、ナトリウム利尿および／または利尿効果を有する。ＡＮＰ（配列番号５のアミノ酸９９〜１２６）は、ペプチドの主要な循環型である。
【０１５３】
本明細書において、用語「心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）」は、種々の種に由来する任意のＡＮＰ、その類似体および誘導体およびキメラＡＮＰペプチドを意味する。この用語はまた、内因性ＡＮＰペプチドと同様のアミノ酸配列を有する合成によって製造されたＡＮＰも指す。例えば、用語「ＡＮＰ」は、哺乳類、例えば、それだけには限らないが、ヒト、ラット、マウス、ウマまたはブタ供給源に由来する配列を有するＡＮＰを含み得る。
【０１５４】
ＡＮＰは、強力なナトリウム利尿および血管弛緩性ポリペプチドである。その主要な生物学的機能の１つは、ナトリウム排泄（ナトリウム利尿）を増強することである。ＡＮＰは、血圧恒常性、細胞外液量の調節において、およびレニン−アンジオテンシン系ならびにその他のホルモンおよび神経伝達物質系の昇圧効果に対するアンタゴニストとして大きな役割を果たすことがわかっている。ＡＮＰは、ラジオイムノアッセイによって血中で検出されている（Ｇｕｔｋｏｗｓｋａら、（１９８４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．１２５：３１５〜３２３頁；Ｔａｎａｋａら、（１９８４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４：６６３〜６６８頁）。
【０１５５】
ＡＮＰの強力な生物活性のために、その血中レベルの調節は、高血圧症、ショックなどの障害の治療のための治療アプローチとなる。現在天然および合成ＡＮＰならびにその類似体は、ＡＮＰレベルを増大させることによって液量および血管機能の調節を可能にするが、有効な療法はまた、所望の細胞外液量および電解質恒常性を達成するためにＡＮＰレベルが低下することを必要とする場合がある。
【０１５６】
ＡＮＰは、高血圧症、心疾患、急性腎不全および浮腫の治療において静脈内に注入される。ＡＮＰは、静脈内に注入されると、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）および濾過率を増大させることがわかっている。ＡＮＰはまた、近位尿細管ナトリウムイオン濃度および水再吸収を減少させることもわかっている。さらに、ＡＮＰは、集合管において正味のナトリウムイオン再吸収および水再吸収を阻害し、血漿レニン濃度を低下させ、アルドステロン分泌を阻害することもわかっている。ＡＮＰを静脈内に使用することはまた、平均動脈圧低下をもたらし、また、ナトリウム利尿および利尿を導いた。
【０１５７】
Ｖｅｓｓｅｌ  Ｄｉｌａｔｏｒは、鬱血性心不全を患うヒトにおいて、大きな、有益な利尿、ナトリウム利尿および血行動態特性を有することがわかっている（Ｖｅｓｅｌｙ，Ｄ．Ｌ．ら（１９９８年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９８：３２３〜３２９頁）。
【０１５８】
透析は、特定の患者において腎機能を補完し、またはそれに取って代わる方法を提供する。主に、血液透析と腹膜透析が、現在用いられている２つの方法である。
【０１５９】
血液透析では、患者の血液は、人工腎臓透析機を通過する。機械中のメンブレンが、血液を清浄化するための人工腎臓として作用する。血液透析は、特殊機械を必要とする体外治療であるために、ある種の固有の不利点、例えば、透析機械を利用できる度合い、感染および汚染の可能性を伴う。
【０１６０】
血液透析と関連している不利点を克服するために、腹膜透析が開発された。腹膜透析は、患者自身の腹膜を半透膜として利用する。腹膜は、身体の腹部骨盤壁の膜性の内張りである。腹膜は、その多数の血管および毛細血管のために、天然の半透膜として作用し得る。
【０１６１】
実施中は、腹膜透析溶液がカテーテルを利用して腹膜腔に導入される。十分な期間の後、透析液と血液の間の溶質の交換が達成される。液体除去は、血液からの水の流出を可能にする透析液から血液への適した浸透勾配を提供することによって達成される。これによって、血液において、適切な酸−塩基、電解質および液体バランスが達成されることが可能となる。適当な休止期間の後、透析溶液または透析物をカテーテルを通して身体から排出する。
【０１６２】
腹膜透析は、血液透析に優るいくつかの利点を提供するものの、腹膜透析の主な不利点として、不十分な正味の限外濾過および尿素窒素およびナトリウムの不十分なクリアランスが挙げられる。結果として、腹膜透析の全体的な適切性は不十分であり得る。したがって、より大きな正味の限外濾過および尿素窒素などの成分のクリアランスの増大を提供する改善された腹膜透析溶液が必要である。
【０１６３】
米国特許第５，９６５，５３３号は、腹膜透析患者において経験される正味の限外濾過の増大およびナトリウムクリアランスの増大をもたらす、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ＡＮＰの誘導体、ＡＮＰの類似体、ＡＮＰクリアランス受容体と結合する物質またはＡＮＰ合成を促進する物質を含有する腹膜透析溶液を提供している。
【０１６４】
血清安定性またはｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期が延長したＡＮＰを得るための手段として、ＡＮＰをトランスフェリンまたは修飾されたトランスフェリンと融合することがある。ＡＮＰを修飾されたトランスフェリンと融合することによって、送達の間のＡＮＰの安定性が改善され、標的部位での治療効果が増大される。本発明は、天然トランスフェリンと比較して、グリコシル化の減少を示す修飾されたトランスフェリンと融合しているＡＮＰを含んでなる融合タンパク質を提供する。融合タンパク質中のＡＮＰは、内因性ペプチドまたは外因性ペプチド、すなわち、類似体、誘導体およびキメラ分子であり得る。外因性ＡＮＰは、増強されていない場合でも、少なくとも内因性ＡＮＰと同様の機能活性および安定性を有する。ＡＮＰ配列は、ＴｆのＮ末端と、ＴｆのＣ末端と、ＮおよびＣ末端両方と融合していてもよく、または１つまたは複数のＴｆの表面に露出されたループ中に挿入されていてもよい。
【０１６５】
脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）
脳ナトリウム利尿ペプチドは最初ブタ脳において発見されたが（Ｓｕｄｏｈ，Ｐ．（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：７８〜８１頁）、ＢＮＰは心室に局在していた。本明細書において、用語「脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）」とは、種々の種に由来する任意の天然に存在するＢＮＰ、その類似体および誘導体およびキメラＢＮＰを指す。この用語はまた、内因性ＢＮＰと同様のアミノ酸配列を有する合成によって製造されたＢＮＰも指す。例えば、用語「ＢＮＰ」は、哺乳類、例えば、それだけには限らないが、ヒト、ラット、マウス、ウマまたはブタ供給源に由来する配列を有するＢＮＰを含む。
【０１６６】
上記に記載されるように、Ｓｕｄｏｈ，Ｐ．（Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）３３２：７８〜８１頁）が、最初に、ＢＮＰを単離し、配列決定した。ＢＮＰは、ブタ脳および心房組織において、分析される心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）活性の約１／１００の濃度で合成される２６アミノ酸のペプチドである。このブタ脳ナトリウム利尿ペプチド、すなわちｐＢＮＰの活性のスペクトルは、ブタＡＮＰのものと同様である。
【０１６７】
ＢＮＰは、ＡＮＰと同様に、大きな前駆体分子から導かれる。Ｓｕｄｏｈらからのその後の論文で、これらのタンパク質がさらに特徴決定された。Ｓｕｄｏｈら、（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ（１９８８年）１５５：７２６〜７３２頁）は、Ｃ末端に上記のブタＢＮＰの２６アミノ酸および配列Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−（配列番号６）のさらなるＮ末端６アミノ酸の延長部分を含有する、ブタ脳からの３２アミノ酸のナトリウム利尿ペプチド（「ＢＮＰ−３２」）の単離を報告した。その後の頁に続く論文で、組織中の種々のナトリウム利尿ペプチドのレベルが報告された。Ｕｅｄａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ（１９８８年）１５５：７３３〜７３９頁）は、ラジオイムノアッセイを利用して、脳および脊髄にブタＢＮＰおよびブタＢＮＰ−３２の位置を特定し、そのレベルを測定した。結果は、ＢＮＰおよびＢＮＰ−３２の両方が、ブタ脳における免疫反応性ＢＮＰの主要な形であること、ならびに髄質矯−脳橋、線条体および脊髄において最高濃度が見出されることを示した。ブタ脳では、ブタ型の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｐＡＮＰ）のブタ型も見出されたが、ＢＮＰに特徴的なものより約１３倍低いレベルでであった。Ｍｉｎａｍｉｎｏら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ（１９８８年）１５５：７４０〜７４６頁）は、末梢組織におけるブタＢＮＰおよびＡＮＰのラジオイムノアッセイの結果を報告した。ＢＮＰの濃度は、アッセイされた組織のうち心房で最高であった。このタンパク質の免疫反応型は、ほとんどは１２ｋＤａの高分子量型を特徴としており、心房組織中の全免疫反応性ＢＮＰの１５％未満がより小さい分子量型ｐＢＮＰまたはｐＢＮＰ−３２であった。
【０１６８】
その後の開示で、Ｍｉｎａｍｉｎｏら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ（１９８８年）１５７：４０２〜４０９）は、このより高分子量型のＢＮＰのブタ心臓からの単離および特性決定を報告した。このタンパク質の完全アミノ酸配列が得られ、そのカルボキシ末端に２６アミノ酸のｐＢＮＰ（および３２アミノ酸ｐＢＮＰ−３２）を含有することがわかった。全長タンパク質は、１０６個のアミノ酸を含有する。最後に、Ｍａｅｋａｗａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ（１９８８年）１５５：４１０〜４１６頁）が、ブタＢＮＰの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび配列分析を報告している。ｃＤＮＡライブラリーはブタ心房から得、関連するＢＮＰをコードする遺伝子を単離し、配列決定した。遺伝子は、Ｎ末端に２５残基の推定シグナルペプチド、続いて、報告されたタンパク質の１０６個のアミノ酸に対応するコドンを含むことがわかった。これらの結果は、通常、より長い前駆体と結合している心房由来のナトリウム利尿ペプチドの研究から得られる情報と一致する。
【０１６９】
Ｋａｍｂａｙａｓｈｉら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９９０年）２５９（２）：３４１〜５頁）は、ヒト心房からヒト脳ナトリウム利尿ペプチド（ヒトＢＮＰ）を単離した。配列番号７は、そのシグナルペプチドを含むヒトＢＮＰ配列を開示する。配列番号７中の最初の２６個のアミノ酸はシグナルペプチドである。
【０１７０】
【表４】
2009511060.tif 000006
【０１７１】
配列分析により、ｃＤＮＡ配列から推定されるヒトＢＮＰ前駆体のＣ末端配列（配列番号８の１０３〜１３４）と同一である、配列Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｍ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｃ−Ｆ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｒ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｈを有する３２アミノ酸のペプチドであるということが示された。ヒトＢＮＰ前駆体では、ヒトＢＮＰの配列（１０３〜１３４）に、Ｐｒｏｌ０１−Ａｒｇｌ０２が先行し、これは心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ、配列番号４）の前駆体のＰｒｏ９７−Ａｒｇ９８と同一のプロセシングシグナルである。ＢＮＰ前駆体のプロセシングは、心筋細胞において起こるが、心筋細胞におけるＡＮＰ前駆体のプロセシングは現在のところ明らかではない。
【０１７２】
米国特許第５，９４８，７６１号には、高レベルの細胞外液を特徴とする状態を治療するのに有用な組換えイヌＢＮＰが開示されている。この特許は、種々のペプチド、例えば、Ｒ１−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−  Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｒ２［ここで、Ｒｌは（Ｈ）、Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−  Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙからなる群から選択され、Ｒ２は（ＯＨ）、ＮＨ２またはＮＲ２（ここで、各Ｒは独立にＨまたは低級アルキル（１−４Ｃ）である）であるか、またはＡｓｎ、Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号１３０）である］を開示している。
【０１７３】
ＢＮＰは、ＡＮＰと同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達後、短い半減期を有する。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達後のＢＮＰの血清安定性またはｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を延長する１つの方法として、それらをトランスフェリンまたは修飾されたトランスフェリンと融合することがある。本発明は、天然トランスフェリンと比較して、グリコシル化の減少を示す修飾されたトランスフェリンと融合しているＢＮＰを含んでなる融合タンパク質を提供する。融合タンパク質中のＢＮＰは、内因性ペプチドまたは外因性ペプチド、すなわち、類似体、誘導体およびキメラ分子であり得る。外因性ＢＮＰは、増強されていない場合でも、少なくとも内因性ＢＮＰと同様の機能活性および安定性を有する。ＢＮＰ配列は、ＴｆのＮ末端と、ＴｆのＣ末端と、ＮおよびＣ末端両方と融合していてもよく、または１つもしくは複数のＴｆの表面に露出されたループ中に挿入されていてもよい。
【０１７４】
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）
ＢＮＰ同様、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）は、ニワトリ直腸に対する強力な弛緩作用に基づいてブタ脳抽出物から単離された（Ｓｕｄｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９９０年）１６８（２）：８６３〜８７０頁）；Ｓｕｄｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９９０年）１６８（２）：８６３〜８７０頁）。ＣＮＰは内皮細胞起源のものであり、血管拡張性および増殖阻害性ペプチドとして機能する（Ｓｕｇａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９９２年）９０（３）：１１４５〜１１４９頁）。
【０１７５】
本明細書において、用語「Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）」とは、種々の種由来の任意の天然に存在するＣＮＰ、その類似体および誘導体およびキメラＣＮＰを指す。この用語はまた、内因性ＣＮＰと同様のアミノ酸配列を有する合成によって製造されたＣＮＰも指す。例えば、用語「ＣＮＰ」は、哺乳類、例えば、それだけには限らないが、ヒト、ラクダ、ラット、マウス、ウマまたはブタ供給源に由来する配列を有するＣＮＰを含む。
【０１７６】
ＡＮＰおよびＢＮＰと同様に、ＣＮＰは大きな前駆体タンパク質から合成され、成熟した、活性ペプチドは、分子内ジスルフィド結合によって形成される１７アミノ酸のループを有する。ヒトペプチドでは、これらのアミノ酸のうち１１個が、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰにおいて同一であるが、Ｃ末端テールは、長さおよび組成の両方において異なる（Ｋａｍｂａｙａｓｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９９０年）２５９（２）：３４１〜５頁）。しかし、ＣＮＰはＣ末端テールを有さず、ＣＮＰの遺伝子の構造についての研究により、翻訳はｍＲＮＡ中の最後のシステインコドンの直後の停止コドンによって終結されるということが実証された。ＣＮＰ前駆体のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１７７】
【表５】
2009511060.tif 000007
【０１７８】
種の間で、ＡＮＰおよびＣＮＰ両方のアミノ酸配列は高度に保存されているが、ＢＮＰの構造は大きく異なっている。例えば、成熟２８アミノ酸のヒトおよびブタＡＮＰは同一であり、ラットペプチドにおいても１つの置換しかない。この構造変動の存在は、ナトリウム利尿ペプチドに特異的な少なくとも３種の受容体の存在と相まって、体液恒常性の生理学的制御が複雑であることを示唆する。ＡＮＰおよびＣＮＰは両方とも心前負荷を減少させる。しかし、ＡＮＰとは異なり、ＣＮＰはナトリウム利尿性ではない（Ｓｔｉｎｇｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９２年）２６２（１Ｐｔ２）：Ｈ３０８−１２）。
【０１７９】
本発明は、血清安定性およびｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期が延長したＣＮＰを提供する。本発明は、トランスフェリンまたは修飾されたトランスフェリンと融合しているＣＮＰを含んでなる融合タンパク質を提供する。トランスフェリン分子は、野生型トランスフェリンと比較してグリコシル化の減少を示すよう修飾されていることが好ましい。ＣＮＰは、内因性ペプチドまたは外因性ペプチド、例えば、類似体、誘導体またはキメラペプチドであり得る。類似体、誘導体またはキメラペプチドは、増強されていない場合でも、少なくとも内因性ＣＮＰと同様の機能活性および安定性を有する。さらに、融合タンパク質は、内因性および外因性ＣＮＰペプチドの組合せを含有し得る。ＣＮＰ配列は、ＴｆのＮ末端と、ＴｆのＣ末端と、ＮおよびＣ末端両方と融合していてもよく、または１つまたは複数のＴｆの表面に露出されたループ中に挿入されていてもよい。
【０１８０】
ナトリウム利尿ペプチドの変異体
本発明はまた、アゴニスト、ミメティクスまたはアンタゴニストとして機能する内因性ナトリウム利尿ペプチドの変異体を提供する。内因性ナトリウム利尿ペプチドの変異体として、突然変異誘発、例えば、別個の点突然変異、アミノ酸付加、置換または欠失によって生じ得る類似体、誘導体およびキメラペプチドが挙げられる。親ナトリウム利尿ペプチドの変異体は、親ペプチドの天然に存在する形の生物活性と実質的に同様のものまたはその一部を保持し得る。したがって、機能の制限された変異体を用いる治療によって、特異的な生物学的効果が引き起こされ得る。一実施形態では、天然に存在する形のペプチドの生物活性の一部を有する変異体での対象の治療は、親ペプチドの天然に存在する形を用いる治療と比較して、対象における副作用が少ない。
【０１８１】
変異体ナトリウム利尿ペプチドは機能的に活性である。本明細書において、用語「機能的に活性」とは、全長ペプチドの１つまたは複数の既知機能的属性を示す種を指す。「変異体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。通常、変異体は、内因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、全体的に密接に類似しており、多数の領域では、同一である。
【０１８２】
アゴニストまたはミメティクスのいずれかとして機能するナトリウム利尿ペプチドの変異体は、ペプチドアゴニストについて内因性ペプチドの突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。一実施形態では、変異体のライブラリーを、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製し、これは遺伝子ライブラリーによってコードされる。変異体のライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、可能性ある配列の縮重セットが個々のペプチドとして、または、配列のセットを含有する、より大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージまたはｍＴｆディスプレイのための）発現可能であるよう遺伝子配列に、酵素によってライゲーションすることによって作製できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性ある変異体のライブラリーを作製するために使用できる種々の方法がある。
【０１８３】
本発明はまた、ナトリウム利尿受容体のアゴニストおよびアンタゴニストのペプチドを含んでなるライブラリーを包含する。これらのペプチドは、既知ナトリウム利尿ペプチドと配列では関連のないものを含む。
【０１８４】
内因性ナトリウム利尿ペプチドの変異体は、少なくとも６個の（連続する）核酸または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸の配列、それぞれ、核酸の場合における特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに、またはアミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さを含む。変異体は、全長であってもよいし、前記変異体が修飾された核酸またはアミノ酸を含有する場合には全長以外であってもよい。変異体として、それだけには限らないが、（ｉ）同一の大きさのアミノ酸配列と比較した場合に、（ｉｉ）アラインメントが当技術分野で公知のコンピュータホモロジープログラム（例えば、ウィスコンシンＧＣＧソフトウェア）によって行われている整列された配列と比較した場合にまたは（ｉｉｉ）コードする核酸が、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、またはストリンジェントでない条件下で（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９３年）、前記のペプチドをコードする配列とハイブリダイズ可能である場合に、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または好ましくは９５％のアミノ酸同一性の種々の実施形態において実質的に相同な領域を含んでなる分子が挙げられる。
【０１８５】
変異体は、機能的に同等な分子をもたらす置換、付加または欠失によるその配列の変更によって製造できる。したがって、本発明は、実質的に同様のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む。もう１つの実施形態では、注目する配列内の１個または複数のアミノ酸残基を、類似の極性および正味電荷の、したがって、サイレントな変更をもたらす別のアミノ酸と置換できる。配列内のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスのその他のメンバーから選択できる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正の電荷を有する（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負の電荷を有する（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【０１８６】
特定の実施形態では、変異体は、動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ、サル、カエル）またはヒトナトリウム利尿物質と関連している。相同体（すなわち、ヒト以外の種に由来するペプチドをコードする核酸）またはその他の関連配列（例えば、パラログ）もまた、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングの技術分野で周知の方法を用い、特定のヒト配列のすべてまたは一部をプローブとして用いる、低、中または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによって得ることができる（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）。
【０１８７】
変異体ＮＰ（ナトリウム利尿ペプチド）配列は、ＴｆのＮ末端と、ＴｆのＣ末端と、ＮおよびＣ末端両方と融合していてもよく、または１つまたは複数のＴｆの表面に露出されたループ中に挿入されていてもよい。
【０１８８】
キメラナトリウム利尿ペプチド
本発明はまた、１つまたは複数のコピーの、ＴｆまたはｍＴｆ分子と融合しているキメラナトリウム利尿ペプチドを含んでなる融合タンパク質を提供する。キメラナトリウム利尿ペプチドは、２種以上の異なるナトリウム利尿ペプチドまたはナトリウム利尿ペプチドと別のペプチドに由来する配列を含有し得る。
【０１８９】
米国特許第６，８１８，６１９号（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）は、単離および精製された、哺乳類においてナトリウム利尿、レニン抑制、利尿および／または血管拡張活性を有するペプチド化合物を提供している。このペプチドは次式（Ｉ）の化合物を含んでなる。
【０１９０】
【表６】
2009511060.tif 000008
［式中、ＡｌはＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ａ３はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ａ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ａ５はＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａＩ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ノルロイシンまたはＩｌｅであり、Ｘ０は不在であるか、またはＣ末端にＣｙｓ残基、より好ましくは、ＢＮＰまたはＣＮＰのＮ末端由来の残基を有する、１〜３５のアミノ酸残基の、好ましくは、１〜２５アミノ酸残基のペプチドであり、Ｘ１はＳｅｒまたはＴｈｒである］。あるいは、このペプチドは次式（ＩＩ）の化合物を含んでなる。
【０１９１】
【表７】
2009511060.tif 000009
［式中、ＡｌはＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ａ３はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ａ４はＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ａ５はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ノルロイシンまたはＩｌｅであり、Ｘ２は不在であるか、または１〜３５のアミノ酸残基の、好ましくは、１〜２５アミノ酸残基のペプチドであり、Ｘ０は不在であるか、またはＣ末端にＣｙｓ残基、より好ましくは、ＢＮＰまたはＣＮＰのＮ末端由来の残基を有する、１〜３５のアミノ酸残基の、好ましくは、１〜２５アミノ酸残基のペプチドであり、ＸｌはＳｅｒまたはＴｈｒである］。
【０１９２】
米国特許第６，８１８，６１９号の好ましいペプチドとして、ＤＮＰ（マンバ属（ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端とともにＢＮＰのコア環構造を含んでなる４１アミノ酸のペプチドであるキメラペプチドが挙げられる。したがって、式（Ｉ）の好ましい化合物として、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ（配列番号１１）を含んでなるキメラペプチドまたはその生物学的に活性な変異体または断片がある。キメラペプチドはＣｙｓ１０とＣｙｓ２６の間にジスルフィド橋を有することが好ましい。本発明のその他の好ましいペプチドとして、ＤＮＰのＣ末端とともにＣＮＰのコア環構造を含んでなる３７アミノ酸のペプチドが挙げられる。したがって、式（Ｉ）のもう１つの好ましい化合物として、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ（配列番号１２）を含んでなるキメラペプチドまたはその生物学的に活性な変異体または断片がある。キメラペプチドは、Ｃｙｓ６とＣｙｓ２２の間にジスルフィド橋を有することが好ましい。したがって、Ｘ０は、存在する場合には、ヒトＢＮＰのＮ末端、すなわち、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１３）、またはヒトＣＮＰのＮ末端、すなわち、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１４）であることが好ましい。さらにもう１つの好ましいペプチドとして、好ましくは、カルボキシ末端の１５アミノ酸またはその生物学的に活性な変異体または断片を含むＤＮＰのカルボキシ末端の一部が挙げられる。
【０１９３】
本明細書において、用語「生物学的に活性な」とは、ペプチドが天然ナトリウム利尿ペプチドの活性のうち少なくとも１つを有することを意味する。
【０１９４】
本発明の融合タンパク質は、野生型トランスフェリン融合タンパク質と比較してグリコシル化の減少を示す、修飾されたトランスフェリンと融合しているキメラナトリウム利尿ペプチドを含んでなることが好ましい。
【０１９５】
ナトリウム利尿ペプチド／ｍＴｆ融合タンパク質を用いる方法
心房性ナトリウム利尿ペプチドは、心房膨満、アンジオテンシンＩＩ刺激、エンドセリンおよび交感神経刺激（β−アドレナリン受容体によって媒介される）に応じて心房筋細胞によって合成、保存および放出される。循環中にあると、その作用は主に、腎臓、血管組織および副腎に対してであり、その作用は、腎臓によるナトリウムおよび水の排泄および血管内容積の減少および血圧の低下をもたらす。ＡＮＰレベルの上昇は、多血状態（血液容積の上昇）および鬱血性心不全の際に見られる。
【０１９６】
ＡＮＰは、ナトリウムと水のバランス、血液容積および動脈圧の長期の調節に関与している。このホルモンは、副腎皮質によるアルドステロン放出を減少させ、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）を増大させ、ナトリウム利尿および利尿（カリウム保持性）を生じさせ、レニン放出を減少させ、それによってアンジオテンシンＩＩを減少させる。これらの作用は、血液容積、ひいては、中心静脈圧（ＣＶＰ）、心拍出量および動脈圧の低減の一因となる。ＡＮＰの慢性上昇は、主に全身の血管抵抗を低下させることによって、動脈圧を低下させると思われる。全身の血管拡張の機序は、血管平滑筋ｃＧＭＰのＡＮＰ受容体媒介性上昇と関与している可能性があり、ならびに交感神経性血管緊張を減弱することによる可能性がある。この後者の機序は、中枢神経系内の部位に対するＡＮＰ作用に関与している可能性があり、ならびに交感神経末端によるノルエピネフリン放出の阻害による可能性がある。
【０１９７】
したがって、ＡＮＰは、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン系の対抗制御系である。中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤である薬物のクラスは、心不全の動物モデルにおいて有効であることがわかっている。これらの薬物は、中性エンドペプチダーゼ、ＡＮＰの分解に関与する酵素を阻害し、それによってＡＮＰの血漿レベルを上昇させる。ＮＥＰ阻害は、薬物がＡＣＥ阻害剤と組み合わされる場合に、心不全において特に有効である。
【０１９８】
ＢＮＰは、心筋細胞起源であり、ＡＮＰ同様、ヒト血漿中を循環する（ｄｅ  Ｂｏｌｄら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、２８、８９（１９８１年）；Ｂｕｒｎｅｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８４年）２４７、Ｆ８６３）。ＢＮＰは、ナトリウム利尿性、レニン阻害性、血管拡張性および変弛緩性である（Ｍｕｋｏｙａｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９１年）８７、１４０２；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６年）２７１、Ｒ１５２９；Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓａｍｓｏｎ  Ｗ．Ｋ．、Ｌｅｖｉｎ  Ｅ．Ｒ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、３０９〜３２６頁（１９９７年）中、Ｇｒａｎｔｈａｍら）。
【０１９９】
ヒトでは鬱血性心不全（ＣＨＦ）の際、ＡＮＰおよびＢＮＰが血漿および心臓中で増大し、それらは、心室機能不全の血清マーカーとして働くのに加え、重要な心腎臓保護作用を発揮する。
【０２００】
心血管系および腎臓の両方に対する、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰの様々な作用ならびに病態生理学的状態、例えば、心不全、高血圧症および腎疾患におけるそれらの役割のために、天然ペプチドおよびその類似体分子が治療薬として臨床および基礎科学者にとって重要なものとなった。例えば、Ｌｅｗｉｃｋｉら（米国特許第５，１１４，９２３号、同４，８０４，６５０号および同４，７５７，０４８号）、Ｊｏｈｎｓｏｎら（米国特許第５，０４７，３９７号）およびＪｏｈｎｓｏｎら（米国特許第４，９３５，４９２号）およびＷｅｉら（米国特許第５，５８３，１０８号）参照のこと。米国特許第５，５８３，１０８号は、バソナトリンペプチド（ＶＮＰ）と呼ばれるＡＮＰとＣＮＰのキメラに関する。ＶＮＰは、ＣＮＰの２２個のアミノ酸とＡＮＰのカルボキシ末端の５個のアミノ酸を含み、動静脈拡張効果およびナトリウム利尿効果を有する。
【０２０１】
本発明は、治療上有効な投与量の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、血圧の低下、心肥大の抑制、鬱血性心不全および非代償性心不全などの心血管疾患の治療、ＣＶＤの術後修復の増強、アルドステロン産生および放出の抑制、利尿、塩排泄の調節、慢性腎臓疾患などの腎肥大を引き起こす種々の腎疾患の治療、肺高血圧症などの肺疾患の抑制および肺疾患に伴う合併症の減少、血管細胞増殖の抑制および糖尿病性網膜症および緑内障などの種々の疾患の眼における血管緊張の調節、脂肪細胞における脂肪分解速度の増大ならびに炎症および炎症性メディエーターの減少のためにナトリウム利尿ペプチド／ＴｆまたはｍＴｆ融合タンパク質を用いる方法を提供する。投与量は、所望の結果をもたらす時間枠に対して、単回投与であってもよいし、複数回の投与を含んでなってもよい。本発明は、種々のその他の疾患および状態を治療するために、開示されたナトリウム利尿ペプチド／ｍＴｆ融合タンパク質を用いる方法をさらに提供する。
【０２０２】
本発明のさらなる一実施形態では、ナトリウム利尿ペプチド／ＴｆまたはｍＴｆ融合物を、ナトリウム利尿ペプチドを不活化し得るプロテアーゼまたはペプチダーゼの阻害剤、例えば、ＮＥＰ阻害剤とともに投与する。阻害薬は、本発明の融合タンパク質と同時に、または適切な阻害を提供するのに適当な用量および頻度で投与できる。例えば、融合タンパク質は、１週間に１回投与してもよく、阻害剤は毎日投与してもよい。
【０２０３】
核酸
本発明はまた、治療用タンパク質、好ましくは、治療用タンパク質と共有結合または連結している、トランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部を含んでなるトランスフェリン融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。以下により詳細に論じられるように、任意の治療用タンパク質を使用してよい。融合タンパク質は、リンカー領域、例えば、約５０、４０、３０、２０または１０アミノ酸残基未満のリンカーをさらに含んでなり得る。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部と共有結合している場合もあるし、トランスフェリンタンパク質またはその一部と治療用タンパク質、好ましくは、治療用タンパク質の間にある場合もある。本発明の核酸分子は、精製されていても、されていなくてもよい。
【０２０４】
核酸分子を複製するためおよびコードされる融合タンパク質を発現させるための宿主細胞およびベクターも提供する。原核生物または真核生物にかかわらず任意のベクターまたは宿主細胞を使用してよいが、真核生物発現系、特に、酵母発現系が好ましいものであり得る。このような目的のための多数のベクターおよび宿主細胞が、当技術分野では公知である。所望の適用に適当なセットを選択することは十分に当業者の範囲内である。
【０２０５】
トランスフェリン、トランスフェリンの一部および注目する治療用タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当技術分野で公知の種々のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからクローニングできる。プローブに基づく方法を用いてこのようなＤＮＡ配列を単離する技術は、従来技術であり、当業者には周知である。このようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、公開されたＤＮＡまたはタンパク質配列に基づくものであり得る（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９３年）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６Ｂ／ｌ：２０３〜２１８頁およびそれに引用されるすべての参照文献を参照のこと）。あるいは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）によって開示されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法も使用できる。このようなＤＮＡ配列を単離するためのライブラリーの選択およびプローブの選択は、当業者のレベルの範囲内である。
【０２０６】
当技術分野で公知であるように、２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の「類似性」は、一方のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列およびその保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸置換基を、第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定する。このような配列の２種のストリングス間のマッチの同一性によって決定される２種のポリペプチドまたは２種のポリヌクレオチド配列間の配列関係の程度を意味する「同一性」も同様に当技術分野で公知である。同一性および類似性の双方とも容易に算出できる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年）。
【０２０７】
２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性および類似性を判定するにはいくつかの方法が存在するが、用語「同一性」および「類似性」は当業者には周知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，ＭおよびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８年）。２種の配列間の同一性または類似性を調べるためによく用いられる方法として、それだけには限らないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９４年およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８年）に開示されるものが挙げられる。
【０２０８】
同一性を調べるのに好ましい方法は、調べられる２種の配列間に最大のマッチを生じるよう設計される。同一性および類似性を調べる方法は、コンピュータプログラムに体系化されている。２種の配列間の同一性および類似性を調べるのに好ましいコンピュータプログラム法として、それだけには限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０年））が挙げられる。前記の類似性または同一性の程度は、２種の配列間の同一性の程度として決定され、第１の配列の第２のものからの導出を示すことが多い。２種の核酸配列間の同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ中に提供されるＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁（１９７０年））などの当技術分野で公知のコンピュータプログラムによって調べることができる。本発明の２種の核酸配列間の同一性の程度を調べる目的には、ＧＡＰを、以下の設定に従って用いる：５．０というＧＡＰ作製ペナルティーおよび０．３というＧＡＰ伸長ペナルティー。
【０２０９】
コドン最適化
遺伝暗号の縮重により、天然ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドと同一アミノ酸配列を有するポリペプチドを依然として生じながら、トランスフェリンタンパク質および／または注目する治療用タンパク質のヌクレオチド配列の変動が可能となる。「コドン最適化」として知られる（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５４７，８７１号に記載される）手順は、このような変更されたＤＮＡ配列を設計する手段を含むものを提供する。コドン最適化遺伝子の設計は、種々の因子、例えば、生物におけるコドン使用の頻度、隣接頻度、ＲＮＡ安定性、二次構造形成の可能性、合成経路およびその遺伝子の意図される将来のＤＮＡ操作を考慮しなければならない。特に、酵母発現系を用いる場合には、利用可能な方法を用いて、酵母によって最も容易に認識されるものを用いて所与の融合タンパク質をコードするコドンを変更してよい。
【０２１０】
遺伝暗号の縮重によって、同一のアミノ酸配列が多数の異なる方法でコードされ、翻訳されることが可能となる。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンは、各々、６種の異なるコドンによってコードされるが、バリン、プロリン、トレオニン、アラニンおよびグリシンは、各々、４種の異なるコドンによってコードされる。しかし、このような同義語コドンの使用頻度は、真核生物および原核生物の間でゲノム毎に異なる。例えば、哺乳類間の同義語コドン選択パターンは、極めて類似しているが、進化的に遠位の生物、例えば、酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、細菌（例えば、大腸菌）および昆虫（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））は、明確に異なるパターンのゲノムコドン使用頻度を示す（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、８、４９〜６２頁（１９８０年）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、９、４３〜７４頁（１９８１年）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１４、１５１〜１９７頁（１９８６年）；Ａｏｔａ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１６、３１５〜４０２頁（１９８８年）；Ｗａｄａ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９付録、１９８１〜１９８５頁（１９９１年）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２８５、１６５〜１６９頁（１９９１年））。これらのコドン選択パターンの相違が、ペプチド伸長速度を調節することによる個々の遺伝子の全体的な発現レベルの原因であると思われる。（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９頁（１９９１年）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３、２８９５〜２８９８頁（１９８４年）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０７、３６５〜３７７頁（１９８９年）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７、３７５〜３７９頁（１９８０年）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．、およびＹａｒｕｓ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０９、６５〜７７頁（１９８９年）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６頁（１９８４年）、Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６頁（１９８４年）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．Ｐ．、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、４３、２１１〜２２５頁（１９７４年）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４６、１〜２１頁（１９８１年）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５１、３８９〜４０９頁（１９８１年））。
【０２１１】
合成遺伝子にとって好ましいコドン使用頻度は、組換えタンパク質発現に使用することを意図される、特に、酵母種のものである細胞／生物の正確な（またはできる限り密接に関連している）ゲノムに由来する核遺伝子のコドン使用を反映するはずである。上記で論じたように、好ましい一実施形態では、ヒトＴｆ配列は、治療用タンパク質ヌクレオチド配列が酵母発現のために本明細書に記載されるように修飾の前後にコドン最適化される。
【０２１２】
ベクター
本発明において使用するための発現単位は、通常、５’から３’方向に機能し得る形で連結している以下のエレメントを含んでなる：転写プロモーター、分泌シグナル配列、注目する治療用タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列と連結しているトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部を含んでなる修飾されたＴｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列および転写ターミネーターを含んでなる。上記で論じたように、Ｔｆ部分と融合しているか、Ｔｆ部分内にある治療用タンパク質またはペプチドの任意の配置を本発明のベクターにおいて使用できる。適したプロモーター、シグナル配列およびターミネーターの選択は、選択された宿主細胞によって決まり、当業者には明らかであり、以下でより具体的に論じる。
【０２１３】
本発明において使用するための適した酵母ベクターは、米国特許第６，２９１，２１２号に記載されており、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５〜１０３９頁、１９７８年）、ＹＥｐｌ３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ  ８：１２１〜１３３頁、１９７９年）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４〜１０８頁、１９７８年）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４およびそれらの誘導体が挙げられる。有用な酵母プラスミドベクターとしてまた、ｐＲＳ４０３−４０６、ｐＲＳ４１３−４１６およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７、ＵＳＡから入手可能なピキアベクターも挙げられる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰｌ、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１．６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。
【０２１４】
このようなベクターは、通常、選択可能マーカーを含み、これは形質転換体が選択されるのを可能にするためのそれについての表現型アッセイが存在する優性表現型を示す任意の数の遺伝子のものであり得る。好ましい選択可能マーカーとして、宿主細胞栄養要求性を補完するもの、抗生物質耐性を提供するものまたは細胞が特定の炭素供給源を利用するのを可能にするものがあり、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈら、同書）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ８：１７、１９７９年）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同書）またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ、ＥＰ１７１，１４２）が挙げられる。その他の適した選択可能マーカーとして、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子が挙げられる。酵母において使用するのに好ましいプロモーターとして、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５：１２０７３〜１２０８０頁、１９８０年；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９〜４３４頁、１９８２年；Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎ．Ｙ．、１９８２年中、Ｙｏｕｎｇら；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２〜２０１頁、１９８３年）が挙げられる。この関連で、特に好ましいプロモーターとして、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）およびＡＤＨ２−４Ｃ（米国特許第６，２９１，２１２号参照のことプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ３０４：６５２〜６５４頁、１９８３年）がある。発現単位はまた、転写ターミネーターを含み得る。好ましい転写ターミネーターとして、ＴＰＩｌターミネーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、同書）がある。酵母発現系のその他の好ましいベクターならびに好ましい構成要素、例えば、プロモーターおよびターミネーターは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、欧州特許ＥＰ０２５８０６７、ＥＰ０２８６４２４、ＥＰ０３１７２５４、ＥＰ０３８７３１９、ＥＰ０３８６２２２、ＥＰ０４２４１１７、ＥＰ０４３１８８０およびＥＰ１００２０９５；欧州特許公報ＥＰ０８２８７５９、ＥＰ０７６４２０９、ＥＰ０７４９４７８およびＥＰ０８８９９４９；ＰＣＴ国際公開ＷＯ００／４４７７２およびＷＯ９４／０４６８７ならびに米国特許第５，７３９，００７号、同５，６３７，５０４号、同５，３０２，６９７号、同５，２６０，２０２号、同５，６６７，９８６号、同５，７２８，５５３号、同５，７８３，４２３号、同５，９６５，３８６号、同６１５０，１３３号、同６，３７９，９２４号および同５，７１４，３７７号に開示されている。
【０２１５】
酵母の他に、本発明の修飾された融合タンパク質は、糸状菌、例えば、真菌アスペルギルス属の株において発現させることができる。有用なプロモーターの例として、アスペルギルスニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）解糖系遺伝子に由来するもの、例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９頁、１９８５年）およびｔｐｉＡプロモーターが挙げられる。適したターミネーターの例として、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同書）がある。このような構成要素を利用する発現単位を、例えば、アスペルギルス属の染色体ＤＮＡに挿入できるベクターにクローニングすることができる。
【０２１６】
本発明を実施するのに使用するための哺乳類発現ベクターは、修飾されたＴｆ融合タンパク質の転写を導くことができるプロモーターを含む。好ましいプロモーターとして、ウイルスプロモーターおよび細胞性プロモーターが挙げられる。好ましいウイルスプロモーターとして、アデノウイルス２由来の主要後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４〜１３１９９頁、１９８２年）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４頁、１９８１年）が挙げられる。好ましい細胞性プロモーターとして、マウスメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９〜８１４頁、１９８３年）およびマウスＶ６（米国特許第６，２９１，２１２号参照のこと）プロモーター（Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５４９６、１９８７年）が挙げられる。特に好ましいプロモーターとして、マウスＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号参照のこと）プロモーター（Ｌｏｈら、同書）がある。このような発現ベクターはまた、プロモーターの下流およびトランスフェリン融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に位置するＲＮＡスプライス部位のセットを含有し得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
【０２１７】
発現ベクター中には、注目するコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルも含有される。ポリアデニル化シグナルとして、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス５ＥｌＢ領域に由来するポリアデニル化シグナルおよびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：３７１９〜３７３０頁、１９８１年）が挙げられる。特に好ましいポリアデニル化シグナルとして、ＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号参照のこと）遺伝子ターミネーター（Ｌｏｈら、同書）がある。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位の間に位置する非コードウイルスリーダー配列、例えば、アデノウイルス２三分節リーダーを含み得る。好ましいベクターとしてまた、エンハンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサーおよびマウス（米国特許第６，２９１，２１２号参照のこと）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅｌｌ  ３３：７１７〜７２８頁、１９８３年）が挙げ得る。発現ベクターとしてまた、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする配列も挙げ得る。
【０２１８】
形質転換
真菌を形質転換する技術は、文献においてよく知られており、例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９〜１９３３頁、１９７８年）、Ｙｅｌｔｏｎら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１７４０〜１７４７頁、１９８４年）およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３０１：１６７〜１６９頁、１９８３年）によって記載されている。クローニングされたＤＮＡ配列を真菌細胞に導入するためのその他の技術、例えば、エレクトロポレーション（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２〜１８７頁、１９９１年）を使用できる。宿主細胞の遺伝子型は、通常、発現ベクターに存在する選択可能マーカーによって補完される遺伝子の欠陥を含有する。個々の宿主および選択可能マーカーの選定は、当業者のレベルの範囲内である。
【０２１９】
本発明の修飾されたＴｆ融合タンパク質を含んでなるクローニングされたＤＮＡ配列は、例えば、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １４：７２５、１９７８年；Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３、１９８１年；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６、１９７３年）によって哺乳類培養細胞に導入することができる。クローニングされたＤＮＡ配列を、哺乳類細胞に導入するためのその他の技術、例えば、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１〜８４５頁、１９８２年）またはリポフェクションも使用できる。クローニングされたＤＮＡを組み込んでいる細胞を同定するために、通常、注目する遺伝子またはｃＤＮＡとともに選択可能マーカーを細胞に導入する。哺乳類培養細胞に用いるのに好ましい選択可能マーカーとして、薬物、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択可能マーカーは、増幅可能な選択可能マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択可能マーカーとして、ＤＨＦＲ遺伝子がある。特に好ましい増幅可能なマーカーとして、ＤＨＦＲ１（米国特許第６，２９１，２１２号参照のこと）ｃＤＮＡ（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２４９５〜２４９９頁、１９８３年）がある。選択可能マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓｓ．）によって概説されており、選択可能マーカーの選定は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
【０２２０】
宿主細胞
本発明はまた、本発明の修飾されたトランスフェリン融合タンパク質を発現するよう形質転換された細胞、好ましくは、酵母細胞を含む。本発明はまた、形質転換された宿主細胞自体に加え、栄養培地中の、それらの細胞の培養物、好ましくは、モノクローナル（クローン的に均一な）培養物またはモノクローナル培養に由来する培養物も含む。ポリペプチドが分泌される場合は、培地は細胞とともに、または細胞が濾過または遠心分離により除去されている場合はそれらを伴わずにポリペプチドを含有する。
【０２２１】
本発明の実施において使用するための宿主細胞として、外因性ＤＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクトされ、培養において増殖され得る、真核細胞、場合により、原核細胞、例えば、培養哺乳類、昆虫、真菌、植物および細菌細胞が挙げられる。
【０２２２】
真菌細胞、例えば、酵母種（例えば、サッカロミセス種、シゾサッカロミセス種、ピキア種）を、本発明内の宿主細胞として使用できる。本発明のトランスフェリン融合タンパク質を発現するための宿主として、本発明の実施において有用であると考えられる酵母を含む真菌の例として、ピキア（そのうちいくつかの種はハンゼヌラとして以前は分類された）、サッカロミセス、クリベロマイセス、アスペルギルス、カンジダ、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、シゾサッカロミセス、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ザイゴサッカロミセス、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ、セファロスポリウム、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール、ニューロスポラ、ヤロウィア、メトシュニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、フォドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドマイコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）などがある。サッカロミセス種の例として、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．イタリカス（ｉｔａｌｉｃｕｓ）およびＳ．ルクシー（ｒｏｕｘｉｉ）がある。クリベロマイセス種の例として、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）およびＫ．マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）がある。適したトルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）種として、Ｔ．デルブリュッキ（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）がある。ピキア種の例として、Ｐ．アングスタ（ａｎｇｕｓｔａ）（以前はＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、Ｐ．アノマラ（ａｎｏｍａｌａ）（以前はＨ．アノマラ（ａｎｏｍａｌａ））およびＰ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）がある。
【０２２３】
本発明のＴｆ融合タンパク質を産生するのに特に有用な宿主細胞として、メチロトローフのピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）がある（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら、（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．６：６１９〜６２４頁）。ピキアパストリスは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離およびクローニングされ、その形質転換が１９８５年に最初に報告されたので、外来タンパク質の産生に関して卓越した宿主であるよう開発された。Ｐ．パストリスは、グルコースの不在下でメタノールを炭素供給源として利用できる。Ｐ．パストリス発現系は、アルコールオキシダーゼ、メタノールの代謝における第１のステップを触媒する酵素の発現をコードする遺伝子を制御する、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸｌ）プロモーターを使用できる。このプロモーターは特性決定されており、一連のＰ．パストリス発現ベクターに組み込まれている。Ｐ．パストリスにおいて産生されるタンパク質は、通常、正しく折り畳まれており、培地中に分泌されるので、遺伝子操作されたＰ．パストリスの発酵が、大腸菌発現系の優れた代替物を提供する。この系を用いて、破傷風菌毒素断片、百日咳菌パータクチン、ヒト血清アルブミンおよびリゾチームをはじめいくつかのタンパク質が製造されている。
【０２２４】
酵母サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株は、もう１つの好ましい宿主である。好ましい実施形態では、糖タンパク質のアスパラギン結合型グリコシル化に必要である遺伝子に遺伝子の欠陥を含有する、酵母細胞、より詳しくは、サッカロミセスセレビシエ宿主細胞を用いる。このような欠陥を有するＳ．セレビシエ宿主細胞は、突然変異および選択の標準技術を用いて調製できるが、多数の利用可能な酵母株がグリコシル化または過剰なマンノシル化を防ぐまたは減少させるよう修飾されている。Ｂａｌｌｏｕら、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：５９８６〜５９９１頁、１９８０年）は、アスパラギン結合型グリコシル化に影響を及ぼす遺伝子に欠陥があるマンノプロテイン生合成突然変異体の単離を記載している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４８１〜４８６頁、１９９７年）は、酵母におけるタンパク質のＯ−グリコシル化における第１のステップに関与する酵素をコードする少なくとも６種の遺伝子のファミリー（ＰＭＴ１〜６）を記載している。これらの遺伝子のうち１種または複数に欠陥のある突然変異体は、Ｏ結合型グリコシル化の減少および／またはＯ−グリコシル化の特異性の変更を示す。
【０２２５】
異種タンパク質の産生を最適化するために、宿主株が、タンパク質分解活性の低下をもたらすＳ．セレビシエｐｅｐ４突然変異などの突然変異を保持することも好ましい（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：２３〜３３頁、１９７７年）。領域をコードするその他のプロテアーゼに突然変異を含有する宿主株は、多量の本発明のＴｆ融合タンパク質を産生するのに特に有用である。
【０２２６】
本発明のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞は、適当な増殖培地中で増殖させる。本明細書において、用語「適当な増殖培地」とは、細胞の増殖に必要な栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要な栄養素として、炭素供給源、窒素供給源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび増殖因子が挙げ得る。通常、増殖培地は、例えば、ＤＮＡ構築物上のまたはＤＮＡ構築物とともに同時トランスフェクトされた選択可能マーカーによって補完される薬物選抜または必須栄養素の欠乏によって、ＤＮＡ構築物を含有する細胞を選択する。酵母細胞は、例えば、炭素供給源、例えば、スクロース、非アミノ酸窒素供給源、無機塩、ビタミンおよび必須アミノ酸サプリメントを含んでなる既知組成培地において増殖することが好ましい。培地のｐＨは、２を超え、かつ、８未満で、好ましくは、ｐＨ５．５〜６．５で維持されることが好ましい。安定なｐＨを維持する方法として、緩衝作用および一定のｐＨ制御が挙げられる。好ましい緩衝剤として、コハク酸およびＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）が挙げられる。アスパラギン結合型グリコシル化に必要な遺伝子に欠陥を有する酵母細胞は、浸透圧安定剤を含有する培地で増殖させることが好ましい。好ましい浸透圧安定剤として、培地中に０．１Ｍと１．５Ｍの間の濃度で、好ましくは、０．５Ｍまたは１．０Ｍでソルビトールを補給したものがある。
【０２２７】
哺乳類培養細胞は、通常、市販の血清含有または血清不含培地で増殖させる。用いる個々の細胞株に適当な培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。トランスフェクトされた哺乳類細胞は、一定期間、通常、１〜２日間増殖させ、注目するＤＮＡ配列を発現し始めるのを可能にする。次いで、薬物選択を、選択可能マーカーを安定な様式で発現する細胞の増殖を選択するよう適用する。クローニングされた配列のコピー数の増大、それによる発現レベルの増大を選択するよう、増幅可能な選択可能マーカーを用いてトランスフェクトされている細胞について、薬物濃度を段階的に増加させてもよい。
【０２２８】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いても、本発明の修飾されたＴｆ融合タンパク質を製造できる。ＢａｃＰＡＫ（商標）バキュロウイルス発現系（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））は、昆虫宿主細胞において組換えタンパク質を高レベルで発現する。標的遺伝子はトランスファーベクター中に挿入され、これが昆虫宿主細胞中に、線状化ＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡとともに同時トランスフェクトされる。ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡはバキュロウイルスゲノムの必須部分が失われている。ＤＮＡをベクターを用いて組み換えると、必須エレメントが回復され、標的遺伝子がバキュロウイルスゲノムに移される。組換え後、いくつかのウイルスプラークを選別および精製し、組換え表現型を確認する。次いで、新規に単離された組換えウイルスを増幅させ、昆虫細胞培養物に感染させ、多量の所望のタンパク質を産生させるために使用できる。
【０２２９】
本発明のＴｆ融合タンパク質はまた、トランスジェニック植物および動物を用いて製造できる。例えば、ヒツジおよびヤギは、その乳中に治療用タンパク質を作製できる。またはタバコ植物は、その葉にタンパク質を含み得る。タンパク質のトランスジェニック植物および動物産生は双方とも、融合タンパク質をコードする新規遺伝子を生物のゲノム中に付与することを含んでなる。トランスジェニック生物は新規タンパク質を産生できるだけでなく、この能力を子孫に伝えることもできる。
【０２３０】
分泌シグナル配列
用語「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」また「分泌リーダー配列」は、同義的に用いられ、例えば、双方とも参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２９１，２１２号および同５，５４７，８７１号に記載されている。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、分泌ペプチドをコードする。分泌ペプチドとは、細胞からの成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌に導くよう作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、通常、疎水性アミノ酸のコアを特徴とし、一般に（それに限らないが）、新規に合成されたタンパク質のアミノ末端に見られる。分泌ペプチドは、分泌の際に成熟タンパク質から切断されることが極めて多い。分泌ペプチドは、分泌経路を通過する時に、成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能にするプロセシング部位を含有し得る。プロセシング部位は、シグナルペプチド内にコードされる場合もあり、または、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によってシグナルペプチドに付加される場合もある。
【０２３１】
分泌ペプチドを用いて、本発明の修飾されたＴｆ融合タンパク質の分泌を導くことができる。その他の分泌ペプチドと併用できる１種のこのような分泌ペプチドとして、α接合因子リーダー配列がある。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳後プロセシングステップにとって必要である。無傷のシグナル配列が存在する場合には、発現されているタンパク質は、粗面小胞体の内腔に入り、次いで、ゴルジ体によって分泌小胞に輸送され、最後に、細胞外に輸送される。通常、シグナル配列は、開始コドンの直後に続き、分泌されるタンパク質のアミノ末端でシグナルペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的プロテアーゼによって切断除去される。好ましいシグナル配列は、ウイルス、哺乳類または酵母発現ベクターを用いる組換えタンパク質発現のプロセシングおよび排出効率を改善する。
【０２３２】
一実施形態では、天然Ｔｆシグナル配列を用いて、本発明の融合タンパク質を発現および分泌させることができる。トランスフェリン分子は、血液、涙および乳など、種々の種類の分泌物中に存在するので、多数の異なるトランスフェリンシグナルペプチドがある。例えば、トランスフェリンシグナルペプチドは、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリンまたはメラノトランスフェリン由来のものであり得る。天然トランスフェリンシグナルペプチドはまた、昆虫、哺乳類、魚、カエル、アヒル、ニワトリまたはその他の種など、種々の種由来のものであり得る。シグナルペプチドは、哺乳類トランスフェリン分子由来であることが好ましい。シグナルペプチドは、ヒト血清トランスフェリン由来であることがより好ましい。以下の表は、種々の哺乳類トランスフェリン分子に由来するシグナルペプチド配列を要約するものである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈａｔｈａｍ．ｅｄｕ／ｕｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅ／ｂｉｏ／ｌａｍｂｅｒｔ／ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ／ｓｉｇｎａｌ．ｈｔｍ）。
【０２３３】
【表８】
2009511060.tif 000010
【０２３４】
もう１つの実施形態では、シグナルペプチドは、機能的に活性なシグナルペプチドを有する、変異体または修飾されたトランスフェリン分子に由来する。さらに、シグナルペプチドは、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を細胞膜を通過して輸送する能力と、次いで、融合タンパク質をプロセシングする能力を保持するトランスフェリンシグナルペプチドの変異体または修飾された形である。
【０２３５】
もう１つの実施形態では、トランスフェリン由来シグナル配列を用いて、異種タンパク質を分泌させることができる。例えば、Ｔｆシグナル配列にとって異種である注目する任意のタンパク質を、Ｔｆシグナルを用いて発現および分泌させることができる。特に、Ｔｆシグナル配列を用いて、組換え酵母からタンパク質を分泌させることができる。シグナルペプチドは、ヒト血清トランスフェリン由来であることが好ましい（ｎＬ、配列番号２のアミノ酸１〜１９）。
【０２３６】
シグナル配列の効率的な除去を確実にするよう、いくつかの場合には、シグナル配列と成熟タンパク質の間に短いプロペプチド配列を含み、プロペプチドのＣ末端部分が酵母Ｋｅｘ２ｐプロテアーゼなどのプロテアーゼの認識部位を含んでなることが好ましい場合がある。プロペプチド配列は約２〜１２個のアミノ酸長であることが好ましく、約４〜８個のアミノ酸長がより好ましい。このようなプロペプチドの例として、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１２５、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１２６）、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１２７）およびＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１２８）がある。
【０２３７】
リンカー
本発明の修飾されたトランスフェリン融合タンパク質のＴｆ部分と治療用タンパク質は直接融合してもよいし、またはより大きな物理的分離を提供し、融合されるタンパク質間により大きな空間的な可動性を可能にし、ひいては、治療用タンパク質の、例えば、その同族受容体との結合について到達性を最大化するために種々の長さのリンカーペプチドを用いて融合してもよい。リンカーペプチドは、可動性であるアミノ酸からなるものであってもよいし、より剛性であるアミノ酸からなるものであってもよい。例えば、それだけには限らないが、ポリ−グリシンストレッチなどのリンカーを使用できる。リンカーは、約５０、４０、３０、２０、１０または５個未満のアミノ酸残基であり得る。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部と、およびトランスフェリンタンパク質またはその一部と治療用タンパク質、例えば、ナトリウム利尿ペプチドの間に共有結合させることができる。
【０２３８】
本発明は、長い可動性のリンカー、短い可動性のリンカーおよび剛性のリンカーを提供する。長い可動性のリンカーの例として、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、（ＳＧＧＧ）２（配列番号１３１）、（ＳＧＧＧ）３（配列番号１３２）および（ＳＧＧＧ）ｎ（配列番号１３３）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号１３４）、（ＧＧＧＳ）３（配列番号１３５）および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３６）、（ＳＳＳＧ）２（配列番号１３７）（ＳＳＳＧ）３（配列番号１３８）および（ＳＳＳＧ）ｎ（配列番号１３９）（ここで、ｎは３を超える整数である）が挙げられる。短い可動性のリンカーとして、Ｓ、ＳＳおよびＳＳＧが挙げられる。短いリンカーの例として、１個のＳｅｒ残基、２個のＳｅｒ残基もしくはペプチドＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙまたは１個のＧｌｙ残基、２個のＧｌｙ残基、３個のＧｌｙ残基もしくはペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１４０）が挙げられる。剛性のリンカーの例として、ＰＥ、ＰＥＡ、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１４１）、（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号１４２）、（ＰＥＡＰＴＤ）３（配列番号１４３）または（ＰＥＡＰＴＤ）ｎ（配列番号１４４）（ここで、ｎは整数である）が挙げられる。本発明はまた、ＩｇＧヒンジリンカー（配列番号１４５〜１４７）、ＣＥｘリンカー（ＳＳＧＡＰＰＰＳ（エキセンディン−４へのＣ末端伸長）（配列番号１４８））、ＰＥＡＰＴＤリンカー（配列番号１４９〜１５８）ととものＩｇＧヒンジリンカーおよびＣＥｘリンカー（配列番号１５９〜１６４）ととものＩｇＧヒンジリンカーも提供する。
【０２３９】
Ｔｆ融合タンパク質の検出
生物学的に活性な修飾されたトランスフェリン融合タンパク質を検出するためのアッセイは、トランスフェリンおよび治療用タンパク質を含んでなる融合タンパク質を検出するウェスタントランスファー、タンパク質ブロットまたはコロニーフィルターならびに活性に基づくアッセイを含み得る。ウェスタントランスファーフィルターは、Ｔｏｗｂｉｎら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７６：４３５０〜４３５４頁、１９７９年）によって記載される方法を用いて調製できる。手短には、サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動する。ゲル中のタンパク質を、電気泳動によってニトロセルロースペーパーに移す。タンパク質ブロットフィルターは、上清サンプルまたは濃縮物を、例えば、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、Ｎ．Ｈ．）を用いてニトロセルロースフィルターを通して濾過することによって調製できる。コロニーフィルターは、適当な増殖培地をはさんで置かれたニトロセルロースフィルター上でコロニーを増殖させることによって調製できる。この方法では、固体培地が好ましい。細胞をフィルター上で少なくとも１２時間増殖させる。フィルターと結合しているタンパク質を回収しない適当なバッファーで洗浄することによって細胞をフィルターから回収する。好ましいバッファーは、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１９ｍＭグリシン、ｐＨ８．３、２０％メタノールを含んでなる。
【０２４０】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、放射性同位元素またはその他の造影剤を用いて標識し、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断目的で使用できる。好ましい放射性同位元素造影剤として、ヨウ素−１２５およびテクネチウム−９９が挙げられ、テクネチウム−９９が特に好ましい。タンパク質−同位元素コンジュゲートを製造する方法は、当技術分野では周知であり、例えば、Ｅｃｋｅｌｍａｎら、（米国特許第４，６５２，４４０号）、Ｐａｒｋｅｒら、（ＷＯ８７／０５０３０）およびＷｉｌｂｅｒら、（ＥＰ２０３，７６４）によって記載されている。あるいは、トランスフェリン融合タンパク質は、スピン標識エンハンサーと結合させ、磁気共鳴（ＭＲ）イメージングに用いることができる。適したスピン標識エンハンサーとして、安定な、立体障害のある、フリーラジカル化合物、例えば、窒素酸化物が挙げられる。ＭＲイメージングのためにリガンドを標識する方法は、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎら、（米国特許第４，６５６，０２６号）に開示されている。
【０２４１】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質の検出は、治療用タンパク質を、検出可能な物質と共役させる（すなわち、物理的に連結する）ことによって容易になり得る。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例として、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、適した放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２４２】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質の、抗体と結合する能力または抗体との結合について抗原と競合する能力をアッセイしている一実施形態では、当技術分野で公知の種々のイムノアッセイ、例えば、それだけには限らないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いる競合および非競合アッセイ系を使用できる。一実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質上の標識を検出することによって、トランスフェリン融合タンパク質の結合を検出する。もう１つの実施形態では、トランスフェリン融合タンパク質と相互作用する二次抗体または試薬の結合を検出することによって、トランスフェリン融合タンパク質を検出する。さらなる実施形態では、二次抗体または試薬を標識する。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多数の手段が当技術分野では公知であり、本発明の範囲内である。
【０２４３】
本発明の融合タンパク質はまた、治療用タンパク質部分の活性をアッセイすることによって検出できる。具体的には、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を、当業者に公知のアッセイを用いて、機能活性（例えば、生物活性または治療活性）についてアッセイできる。さらに、当業者は、周知のアッセイを用いて、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の断片を、活性について日常的にアッセイできる。さらに、当業者は、当技術分野で公知のアッセイを用いて、修飾されたトランスフェリンタンパク質の断片を活性について日常的にアッセイできる。
【０２４４】
例えば、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の、抗治療用ポリペプチド抗体および／または抗トランスフェリン抗体と結合するか、または抗治療用ポリペプチド抗体および／または抗トランスフェリン抗体との結合について治療用タンパク質と競合する能力をアッセイしている一実施形態では、当技術分野で公知の種々のイムノアッセイ、例えば、それだけには限らないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いる競合および非競合アッセイ系を使用できる。一実施形態では、一次抗体上の標識を検出することによって抗体結合を検出する。もう１つの実施形態では、一次抗体との二次抗体または試薬の結合を検出することによって一次抗体を検出する。さらなる一実施形態では、二次抗体を標識する。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多数の手段が当技術分野では公知であり、本発明の範囲内である。
【０２４５】
治療用タンパク質の結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）が同定されるさらなる一実施形態では、例えば、当技術分野で周知の手段、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーおよびアフィニティーブロッティングによって、融合物の治療用タンパク質部分としてその治療用タンパク質を含有するトランスフェリン融合タンパク質によってその結合パートナーとの結合をアッセイできる。その他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【０２４６】
融合タンパク質の製造
本発明は、本明細書に記載される核酸分子を用いて、本発明の修飾された融合タンパク質を製造する方法をさらに提供する。大まかに言えば、タンパク質の組換え型の製造は、通常、以下のステップを含む。
【０２４７】
まず、本発明のトランスフェリン融合タンパク質をコードする核酸分子を得る。次いで、核酸分子を、上記の適した制御配列と機能し得る関係に置き、タンパク質オープンリーディングフレームを含有する発現単位を形成することが好ましい。発現単位を用いて適した宿主を形質転換し、形質転換された宿主を組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養する。場合により、組換えタンパク質を培地からまたは細胞から単離するが、幾分かの不純物が許容され得るいくつかの場合にはタンパク質の回収および精製は必要でないこともある。
【０２４８】
前記のステップの各々は、種々の方法で達成できる。例えば、種々の宿主において機能し得る発現ベクターの構築は、上記に示される適当なレプリコンおよび制御配列を用いて達成される。制御配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を発現するために用いられる宿主細胞の種類に応じて変わり、先に詳細に論じられており、そうでなければ、当業者には公知である。通常使用不可な場合、これらのベクターに挿入するための切り出し可能な遺伝子を提供するためにコード配列の末端に適した制限部位を付加することができる。当業者ならば、所望の組換えタンパク質を製造するために本発明の核酸分子とともに使用するために、当技術分野で公知の任意の宿主／発現系を容易に適応させることができる。
【０２４９】
上記で論じたように、任意の発現系、例えば、酵母、細菌、動物、植物、真核生物および原核生物系を使用できる。いくつかの実施形態では、酵母、哺乳類細胞培養物およびトランスジェニック動物または植物産生系が好ましい。その他の実施形態では、天然酵母グリコシル化、過剰グリコシル化またはタンパク質分解活性を低減するよう修飾されている酵母系を使用できる。
【０２５０】
トランスフェリン融合タンパク質の単離／精製
分泌される、生物学的に活性なトランスフェリン融合タンパク質は、生物学的に活性な融合タンパク質の分泌を可能にする条件下で増殖させた宿主細胞の培地から単離できる。細胞物質を培養培地から回収し、当技術分野で公知の単離技術を用いて、生物学的に活性な融合タンパク質を単離する。適した単離技術として、種々のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによる沈降および分画が挙げられる。
【０２５１】
特に好ましい精製法として、鉄結合または金属キレート化カラムでのアフィニティークロマトグラフィーまたはポリペプチド融合物のトランスフェリンまたは治療用タンパク質に対する抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーがある。抗体は、固体支持体または基質に固定されるか、または結合していることが好ましい。特に好ましい基質として、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）がある。この方法によって、結合が生じるのを可能にする条件下で、培地を抗体／基質と組み合わせる。複合物を洗浄し、結合していない物質を除去することができ、複合物形成に不利な条件の使用によって、トランスフェリン融合タンパク質を放出させるか、溶出する。特に有用な溶出方法として、ｐＨの変更（ここでは、固定されていない抗体は、第１のｐＨではトランスフェリン融合タンパク質に対して高親和性を有するが、第２の（より高いまたはより低い）ｐＨでは低下した親和性を有する）、特定のカオトロピック剤の濃度の変更またはイミダゾールの使用が挙げられる。
【０２５２】
細胞の内側への、および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する、薬物または治療用タンパク質の送達
本発明の範囲内で、トランスフェリン融合タンパク質を、トランスフェリンの第二鉄イオンと複合体形成される分子または小分子治療薬を、細胞の内側または血液脳関門もしくはその他の関門を通過して、例えば、Ｔｆ受容体を天然に発現するか、または発現するよう操作された任意の細胞種の細胞膜を通過して送達するための担体として使用できる。これらの実施形態では、Ｔｆ融合タンパク質は、通常、グリコシル化を阻害、防止または除去して、融合タンパク質および／または治療用タンパク質部分の血清半減期を延長するよう操作されるか、修飾される。Ｔｆ融合タンパク質を特定の細胞種、例えば、癌細胞にさらにターゲッティングするためにターゲッティングペプチドの付加が具体的に企図される。
【０２５３】
一実施形態では、鉄を含有する、抗貧血薬、第二鉄−ソルビトール−シトレート複合体を、本発明の修飾されたＴｆ融合タンパク質に負荷した。第二鉄−ソルビトール−シトレート（ＦＳＣ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々のネズミ癌細胞の増殖を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍退縮を引き起こすが、非悪性細胞の増殖に対してはまったく効果がないことがわかっている（Ｐｏｌｊａｋ−Ｂｌａｚｉら（２０００年６月）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（米国）、１５／３：２８５〜２９３頁）。
【０２５４】
もう１つの実施形態では、双方とも第二鉄イオンと複合体を形成することがわかっている、抗悪性腫瘍薬Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）（ドキソルビシン）および／または化学療法薬ブレオマイシンを本発明のＴｆ融合タンパク質に負荷する。その他の実施形態では、薬物の塩、例えば、クエン酸塩または炭酸塩を調製し、第二鉄イオンと複合体形成させ、次いで、Ｔｆと結合させることができる。腫瘍細胞は、鉄について高いターンオーバー速度を示すことが多いので、少なくとも１種の抗腫瘍剤を保持するよう修飾されたトランスフェリンは、腫瘍細胞に対する薬剤曝露または薬剤負荷を増大するための手段を提供し得る（Ｄｅｍａｎｔ，Ｅ．Ｊ．、（１９８３年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７（１−２）：１１３〜１１８頁；Ｐａｄｂｕｒｙら（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：７８２０〜７８２３頁）。
【０２５５】
医薬製剤および治療法
トランスフェリン、例えば、修飾されたトランスフェリンを含んでなる本発明の融合タンパク質は、それを必要とする患者に、標準投与プロトコールを用いて投与できる。例えば、本発明のＴｆ融合タンパク質は、単独または、特定の病理過程を調節するその他の薬剤と組み合わせて、または逐次組み合わせて提供できる。本明細書において、２種の薬剤は、２種の薬剤が同時に投与されるか、薬剤が同時またはほぼ同時に作用する様式で独立に投与される場合に、併用投与されるといわれる。
【０２５６】
本発明の融合タンパク質は、非経口、皮下、静脈内の、筋肉内の、腹腔内、経皮および口内経路によって投与できる。例えば、薬剤は微量注入によって損傷部位に局所投与できる。あるいは、または同時に、投与は、経口、吸入、鼻腔または肺経路のいずれかによる非侵襲性であり得る。投与される投与量は、受容者の年齢、健康および体重、あるとすれば同時治療の種類、治療の頻度および所望の効果の性質に応じて変わる。
【０２５７】
任意の投与方法を用いて本発明のＴｆ融合タンパク質を送達できるが、経口投与または送達が、特定のクラスの融合タンパク質にとって、または特定の状態を治療するのに好ましい実施形態であり得る。
【０２５８】
本発明は、１種または複数の本発明の融合タンパク質を含有する組成物をさらに提供する。個々の必要性は様々であるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当業者の範囲内にある。通常の投与量は、約１ｐｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇを含んでなる。全身投与に好ましい投与量は、約１００ｎｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇを含んでなる。微量注入によって部位に直接投与するための好ましい投与量は、約１ｎｇ／体重ｋｇ〜約１ｍｇ／体重ｋｇを含んでなる。直接注入または微量注入により投与される場合には、１つには、限局性の鉄毒性を防ぐために、本発明の修飾された融合タンパク質を、鉄の結合の減少または結合がないことを示すよう操作してもよい。
【０２５９】
本発明の組成物は、薬理学的に活性な融合タンパク質に加え、活性化合物の、作用部位へ送達するために薬剤的に使用できる調製物への処理を容易にする賦形剤および補助剤を含んでなる適した薬学的に許容される担体も含有し得る。非経口投与に適した製剤として、水溶性の形、例えば、水溶性塩の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適当な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液も投与できる。適した親油性溶媒またはビヒクルとして、脂肪性オイル、例えば、ゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含有してもよく、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランが挙げられる。場合により、懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。リポソームもまた、細胞中への送達のために薬剤をカプセル化するために使用できる。
【０２６０】
本発明に従う全身投与のための医薬製剤は、経腸、非経口または局所投与用に製剤できる。実際、３種類の製剤すべてを同時に使用して、有効成分の全身投与を達成できる。経口投与に適した製剤として、ハードまたはソフトゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、コート錠、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤または吸入およびその制御放出型が挙げられる。
【０２６１】
本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤またはカプセル剤のような単位投与形であり得る。このような形では、組成物は、適当な量の有効成分を含有する単位用量に細分され、単位投与形は、包装された組成物、例えば、包装された散剤、バイアル、アンプル、充填済みシリンジまたは液体を含有するサシェ剤であり得る。単位投与形は、例えば、カプセル剤または錠剤自体である場合もあるし、または適当な数の包装された形の任意のこのような組成物である場合もある。治療に用いられる投与量は、医師によって主観的に決定されるはずである。
【０２６２】
本発明の方法の実施では、本発明の融合タンパク質は、単独または組み合わせて使用してもよいし、その他の治療薬または診断薬と併用してもよい。特定の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、一般に認められる医療業務に従ってこれらの状態のために通常処方されるその他の化合物とともに同時投与できる。本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、通常、哺乳類、例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用できる。
【０２６３】
経口医薬組成物および送達方法
本発明では、Ｔｆ融合タンパク質、例えば、それだけには限らないが、修飾されたＴｆ融合タンパク質を経口送達用に製剤できる。特に、特定の種類の疾患または病状を治療するために使用される本発明の特定の融合タンパク質は、経口製剤および送達に特に適している。このような種類の疾患または状態として、それだけには限らないが、急性、慢性および再発性疾患が挙げられる。慢性または再発性疾患として、それだけには限らないが、ウイルス性疾患または感染症、癌、代謝疾患、肥満症、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主病、全身微生物感染症、貧血、心血管疾患、精神病、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の障害、内分泌系または生殖器系の疾患、胃腸疾患が挙げられる。これらの種類の疾患の例として、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染、高血圧症、高コレステロール血症、動脈硬化症、関節炎およびアルツハイマー病が挙げられる。多数の慢性疾患では、本発明のＴｆ融合タンパク質の経口製剤および投与方法は、それらが、注射可能な治療または薬物プロトコールに対する確実性はないものの、家庭での経口投与による長期の患者のケアおよび療法を可能にするので特に有用である。
【０２６４】
本発明のＴｆ融合タンパク質を含んでなる経口製剤および送達方法は、１つには、胃腸（ＧＩ）上皮を通過するトランスフェリン受容体媒介性経細胞輸送をうまく利用している。Ｔｆ受容体は、ヒトＧＩ上皮では極めて高密度で見られ、トランスフェリンは、トリプシンおよびキモトリプシン消化に対して高度に耐性であり、タンパク質およびペプチドをＧＩ上皮を越えてうまく送達するためにＴｆキメラコンジュゲートが用いられている（すべて参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｘｉａら（２０００年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｐ．、２９５：５９４〜６００頁；Ｘｉａら（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．、１８（２）：１９１〜１９５頁およびＳｈａｈら、（１９９６年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．、８５（１２）：１３０６〜１３１１頁）。ＧＩ上皮を通過して輸送されると、本発明のＴｆ融合タンパク質は、血清中での半減期の延長を示す、すなわち、Ｔｆと結合しているか、Ｔｆ中に挿入されている治療用タンパク質またはペプチド（類）は、その非融合状態にあるタンパク質またはペプチドと比較して血清半減期の延長を示す。
【０２６５】
本発明のＴｆ融合タンパク質の経口製剤は、それらがＧＩ上皮への輸送および胃中でのＴｆ融合タンパク質成分およびその他の活性な化合物の保護にとって適しているように調製できる。このような製剤は、担体および分散剤成分を含んでもよく、任意の適した形、例えば、エアゾール剤（経口または肺送達用）、シロップ剤、エリキシル剤、錠剤、例えば、咀嚼錠、ハードまたはソフトカプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁液、エマルション剤、カシェ剤またはペレット顆粒剤および分散性散剤であり得る。Ｔｆ融合タンパク質製剤は、正確な投与量の簡単な、好ましくは、経口投与に適した固体投与形で用いられることが好ましい。経口投与のための固体投与形としては、錠剤、カプセル剤などが好ましい。
【０２６６】
錠剤またはカプセル剤の形での経口投与には、組成物が、有効な反応を生じさせるために十分な有効成分が宿主によって吸収されるのを確実に可能にするよう注意しなくてはならない。したがって、例えば、Ｔｆ融合タンパク質の量を、理論上必要とされるものを超えて増大させてもよいし、その他の既知手段、例えば、コーティングまたはカプセル化を用いて、ポリペプチドを胃における酵素作用から保護してもよい。
【０２６７】
従来、ペプチドおよびタンパク質薬は注射によって投与されてきたが、これはその他の手段によって、特に、経口によって投与された場合の低いバイオアベイラビリティのためである。これらの薬物は、化学的およびコンホメーション的に不安定である傾向があり、胃中の酸性条件によって、ならびに胃および消化管において酵素によって分解されることが多い。これらの送達問題に応えて、経口送達のための特定の技術、例えば、薬物担体としての、疎水性骨格と親水性分枝を有するポリマーから構成されるナノ粒子へのカプセル化、微小粒子へのカプセル化、エマルション中のリポソームへの挿入およびその他の分子とのコンジュゲーションが開発された。これらはすべて、本発明のＴｆ融合分子を用いて使用できる。
【０２６８】
ナノ粒子の例として、キトサンおよびカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）でコーティングされた粘膜付着性のナノ粒子（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４７（１）：３９〜５４頁、２００１年）および帯電した組合せポリエステル、ポリ（２−スルホブチル−ビニルアルコール）およびＤ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体を含有するナノ粒子（Ｊｕｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０（１）：１４７〜１６０頁、２０００年）が挙げられる。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド領域と陽イオン性ポリ−ビニルアミン基を含む表面ポリマーを含有するナノ粒子は、ラットに経口投与した場合に、サケカルシトニンの吸収の向上を示した。
【０２６９】
アルギン酸塩およびペクチンから構成され、ポリリジンで強化された薬物送達粒子は、比較的酸および塩基耐性であり、薬物の担体として使用できる。これらの粒子は、生体接着、吸収の増強および持続放出という利点を兼ね備える（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１（２）：１４１〜１４９頁、１９９９年）。
【０２７０】
さらに、両親媒性の界面活性剤を作製する、ペプチド、例えば、合成ソマトスタチンのＮおよびＣ末端にコンジュゲートされたリポアミノ酸基およびリポサッカライド基は、生物活性を保持する組成物を生じることがわかった（Ｔｏｔｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２（１９）：４０１０〜４０１３頁、１９９９年）。
【０２７１】
その他のペプチド送達技術の例として、注目するペプチドと、ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシルアミンおよびカルボルポールまたはタウロコール酸およびカルボポールのいずれかを含有するカルボポールコーティングした粘膜付着性エマルションが挙げられる。これらは、血清カルシウム濃度を低下させるためにラットに経口投与された場合に、有効であることがわかった（Ｏｇｉｓｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４（６）：６５６〜６６１頁、２００１年）。ホスファチジルコリン由来のホスファチジルエタノールを用いて、インスリンの担体としてホスファチジルエタノールを含有するリポソームを調製した。これらのリポソームは、ラットに経口投与された場合に、活性であることがわかった（Ｋｉｓｅｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２１６（１−２）：１０５〜１１４頁、２００１年）。
【０２７２】
インスリンは、インスリンと、プロテアーゼ阻害薬、例えば、アプロチニンまたはバシトラシンとを含有するポリ（ビニルアルコール）−ゲル球に製剤されている。これらのゲル球のグルコース低減特性は、インスリンが下部の腸で主に放出されるラットにおいて実証されている（Ｋｉｍｕｒａら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９（６）：８９７〜９００頁、１９９６年）。
【０２７３】
インスリンの経口送達はまた、油相に界面活性剤によって分散されるポリ（アルキルシアノアクリレート）で作られたナノ粒子を用いて（Ｄａｍｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（１２）：１４０３〜１４０９頁、１９９７年）、およびキトサンでコーティングされたアルギン酸カルシウムビーズを用いて研究されている（Ｏｎａｌら、Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（３）：２２９〜２３７頁、２００２年）。
【０２７４】
その他の方法では、ペプチドのＮおよびＣ末端が、ポリエチレングリコール、次いで、アリル鎖と連結しており、酵素分解に対する耐性が向上し、ＧＩ壁を通る拡散が向上したコンジュゲートを形成する（ｗｗｗ．ｎｏｂｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。
【０２７５】
ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）は陽イオン性脂質混合物であり、ペプチドと非共有結合によって相互作用し、保護コーティングまたは保護層を作製する。ペプチド−脂質複合体は、細胞の原形質膜と融合することができ、ペプチドが細胞中に内部移行される（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）。
【０２７６】
リポソームを開始物質として用いるプロセスでは、医薬ビヒクルとして渦巻き型の粒子が開発された。主に負に帯電した脂質を含有するリポソームの懸濁液にペプチドを加える。カルシウムの付加により、リポソームの、脂質二重層から構成される大きなシートへの崩壊および融合が引き起こされ、次いで、渦巻き型に自発的に巻き上がるか、積み重なる（米国特許第５，８４０，７０７号；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｌｉｖｅｒｙｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）。
【０２７７】
経口使用を対象とするＴｆ融合タンパク質を含んでなる組成物は、医薬組成物を製造するための当技術分野で公知の任意の方法に従って調製でき、このような組成物は、医薬上すばらしい、味のよい製剤を提供するために甘味剤からなる群から選択される１種または複数の薬剤を含有し得る。例えば、経口で送達可能な錠剤を調製するために、Ｔｆ融合タンパク質を少なくとも１種の医薬賦形剤と混合し、消化管に送達するための、公知の方法に従って固体製剤を打錠して錠剤を形成する。錠剤組成物は、通常、添加剤、例えば、糖類またはセルロース担体、デンプンペーストまたはメチルセルロースなどの結合剤、増量剤、崩壊剤または一般に、調合薬剤の製造において通常用いられるその他の添加剤とともに製剤する。経口により送達可能なカプセル剤を調製するには、ＤＨＥＡを、少なくとも１種の医薬賦形剤と混合し、固体製剤を、消化管への送達に適したカプセル容器中に入れる。Ｔｆ融合タンパク質を含んでなる組成物は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１８０４２）中、８９章に一般的に記載されるように調製できる。
【０２７８】
上記のように、本発明の経口製剤の多くは、胃環境からの保護と腸での生物学的に活性な物質の放出を可能にする不活性成分を含有し得る。このような製剤または腸溶コーティングは、当技術分野では周知である。例えば、錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中にＴｆ融合タンパク質を含有する錠剤を使用できる。これらの賦形剤は、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム、造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチンまたはアラビアガムおよび滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。
【０２７９】
錠剤はコーティングされていなくてもよいし、消化管における崩壊および吸収を遅延させ、それによって、長期間にわたる持続作用を提供するために公知の技術を用いてコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を単独でまたはワックスとともに使用できる。
【０２８０】
経口使用用製剤はまた、有効成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合されているハードゼラチンカプセル剤として、または有効成分が水性媒体もしくは油性媒体、例えば、ラッカセイ油、ピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブオイルと混合されているソフトゼラチンカプセル剤として調製できる。
【０２８１】
水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適した賦形剤との混合物中にＴｆ融合タンパク質を含有し得る。このような賦形剤として、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムがあり、分散剤または湿潤剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、レシチンまたはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレンまたはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデシルエチルオキシセタノールもしくはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートまたはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液はまた、１種または複数の保存料、例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種または複数の着色剤、１種または複数の矯味剤および１種または複数の甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンも含有し得る。
【０２８２】
油性懸濁液はまた、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブオイル、ゴマ油またはココナッツオイルに、または鉱油、例えば、流動パラフィンに、有効成分を懸濁することによって製剤できる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、ハードパラフィンまたはセチルアルコールを含有し得る。甘味剤、例えば、前記のものおよび矯味剤を付加して、味のよい経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化薬を付加することによって保存できる。
【０２８３】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性散剤および顆粒剤は、有効成分と、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１種または複数の保存料との混合物を提供する。適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、上記にすでに記載されているものによって例示されている。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、矯味剤および着色剤も存在し得る。
【０２８４】
Ｔｆ融合タンパク質を含有する医薬組成物はまた、水中油エマルションの形でもあり得る。油相は、植物油、例えば、オリーブオイルもしくはラッカセイ油または鉱油、例えば、アラビアゴムもしくはトラガカントゴム、天然に存在するホスホチド、例えば、ダイズレシチンおよび脂肪酸とヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエートおよび同部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。エマルションはまた、甘味剤および矯味剤も含有し得る。
【０２８５】
Ｔｆ融合タンパク質を含有するシロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトールまたはスクロースを用いて製剤できる。このような製剤はまた、鎮痛薬、防腐剤および矯味剤および着色剤も含有し得る。医薬組成物は、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液のような滅菌注射用製剤の形であり得る。この懸濁液は、上記に記載されている適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用い、公知の技術に従って製剤できる。滅菌注射用製剤はまた、例えば、１、３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容される希釈液または溶媒和物中の滅菌注射用溶液または懸濁液でもあり得る。使用できる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌、硬化油が、溶媒または懸濁媒として従来用いられている。この期間のために、合成モノまたはジグリセリドをはじめ、任意の無刺激性硬化油を使用できる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射用物質の調製に使用される。
【０２８６】
医薬組成物はまた、ポリエステルミクロスフェア、ゼインミクロスフェア、プロテイノイドミクロスフェア、ポリシアノアクリレートミクロスフェアおよび脂質ベースの系を用いて経口送達用に製剤できる（例えば、ＤｉＢａｓｅおよびＭｏｒｒｅｌ、Ｏｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳａｎｄｅｒｓおよびＨｅｎｄｒｅｎ（編）、２５５〜２８８頁（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７年）参照のこと）。
【０２８７】
薬剤的に活性なＴｆ融合タンパク質対担体および／またはその他の物質の割合は、約０．５〜約１００重量％（重量パーセント）で変わり得る。医薬製剤は、経口使用には、通常、約５〜約１００重量％の活性物質を含有する。その他の使用には、製剤は、通常、約０．５〜約５０重量％の活性物質を有する。
【０２８８】
本発明に用いられるＴｆ融合タンパク質製剤は、個体への投与の際に有効量のＴｆ融合タンパク質を提供する。これに関連して、Ｔｆ融合物の「有効量」とは、疾患の症状を寛解するのに有効である量である。
【０２８９】
本発明のＴｆ融合タンパク質組成物は、必ずしもそうではないが、症状を寛解するのに有効な量で毎日投与できる。通常、合計１日用量は、例えば、各々５０ｍｇのＴｆ融合タンパク質を含有する４個のカプセル剤または錠剤で経口投与される、１日あたり、少なくとも約５０ｍｇ、好ましくは、少なくとも約１００ｍｇ、より好ましくは、少なくとも約２００ｍｇ、好ましくは、最高５００ｍｇである。経口送達用のカプセル剤または錠剤は、最大全１日経口用量、例えば、２００ｍｇ以上を含有し得ることが好都合である。
【０２９０】
特に好ましい実施形態では、Ｔｆ融合タンパク質を含んでなる経口医薬組成物を緩衝液体形に製剤し、次いで、ソフトまたはハードコーティングゼラチンカプセル中にカプセル化し、次いで、これを適当な腸溶コーティングを用いてコーティングする。本発明の経口医薬組成物については、放出の位置は、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸をはじめ、ＧＩ系中のどこでもあり得る。
【０２９１】
その他の実施形態では、本発明の経口組成物を、公知の遅延放出製剤を用い、ＧＩ系において有効成分、例えば、本発明のＴｆ融合タンパク質をゆっくりと放出するよう製剤する。
【０２９２】
経口送達用の本発明のＴｆ融合タンパク質は、ＧＩ上皮中に見られるＴｆ受容体と結合できる。この結合および受容体媒介性輸送を容易にするために、通常、本発明のＴｆ融合タンパク質を、Ｔｆ部分と結合している、鉄を含めて、また、いくつかの場合には、カーボネートを含めて製造する。鉄およびカーボネートを含む本発明の融合タンパク質組成物のＴｆ部分を負荷するプロセスおよび方法は、当技術分野で公知である。
【０２９３】
本発明のいくつかの医薬製剤では、Ｔｆ融合タンパク質のＴｆ部分を、Ｔｆ部分の鉄に対する親和力または親和性を増大するよう修飾できる。このような方法は当技術分野では公知である。例えば、突然変異誘発を用いて、天然のトランスフェリンよりもより強い親和性で鉄と結合する突然変異トランスフェリン部分を製造できる。ヒト血清トランスフェリンでは、金属イオンキレート化のリガンドであるアミノ酸としては、それだけには限らないが、配列番号３のＮローブアミノ酸Ａｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒｌ８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７およびＨｉｓ２４９およびＣローブアミノ酸Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５（アミノ酸の横の数は、成熟タンパク質のバリンが位置１と指定された場合の、一次アミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置を示す）が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９８６，０６７号参照のこと。一実施形態では、Ｎローブ内のＬｙｓ２０６およびＨｉｓ２０７残基を、それぞれ、ＧｌｎおよびＧｌｕで置換する。
【０２９４】
本発明のいくつかの医薬製剤では、Ｔｆ融合タンパク質を、治療用タンパク質またはペプチドとＴｆ部分の間に切断部位を含有するよう操作する。このような切断可能な部位またはリンカーは、当技術分野で公知である。
【０２９５】
本発明の医薬組成物および本発明の方法は、融合タンパク質のＧＩ上皮を通過する輸送を容易にするための経細胞輸送エンハンサーの付加を含み得る。このようなエンハンサーは、当技術分野で公知である。Ｘｉａら、（２０００年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｐ．、２９５：５９４〜６００頁およびＸｉａら、（２００１年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．、１８（２）：１９１〜１９５頁参照のこと。
【０２９６】
本発明の好ましい実施形態では、経口医薬製剤は、上記のナトリウム利尿ペプチドのＮ末端で融合している、グリコシル化の減少またはグリコシル化がないことを示す修飾されたＴｆ部分を含んでなるＴｆ融合タンパク質を含む。このような医薬組成物を用い、有効用量の融合タンパク質を含んでなる医薬組成物の経口投与によって、グルコースインバランス障害、例えば、糖尿病を治療できる。
【０２９７】
患者において特定の病状と関連している症状、例えば、糖尿病の症状を緩和するよう算出された投与量を含む、有効用量の融合タンパク質は、いくつかの方法で判定できる。その他の製剤では、投与量は、患者において血糖レベルの検出可能な変化を誘導するのに有効な量の融合タンパク質を含んでなるよう算出する。血糖のこのような検出可能な変化として、約１％〜９０％の間の、または約５％〜約８０％の間の血糖レベルの低下が挙げ得る。これらの血糖レベルの低下は、治療される疾患状態および医薬組成物に応じて変わり、または投与方法を各患者の所望の結果を達成するよう改変してもよい。その他の例では、患者において治療用タンパク質またはペプチドの活性レベルの増大、例えば、ナトリウム利尿ペプチドの活性の検出可能な増大を検出するよう、医薬組成物を製剤し、投与方法を修飾する。このような製剤および方法は、約１ｐｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇの融合タンパク質、約１００ｎｇ〜約１００：ｇ／体重ｋｇの融合タンパク質、約１００：ｇ／〜約１００ｍｇ／体重ｋｇの融合タンパク質、約１：ｇ〜約１ｇの融合タンパク質、約１０：ｇ〜約１００ｍｇの融合タンパク質または約１０ｍｇ〜約５０ｍｇの融合タンパク質の間を送達できる。製剤はまた、例えば、約５〜約５００単位のヒトインスリンまたは約１０〜約１００単位のヒトインスリンなどの、治療用タンパク質活性の単位測定を用いて算出できる。重量または活性による測定は、Ｔｆと融合している各治療用タンパク質またはペプチドの既知標準を用いて算出できる。
【０２９８】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を経口投与する方法も含む。このような方法は、それだけには限らないが、患者または介護士によって組成物を経口投与するステップを含み得る。このような投与ステップは、Ｔｆ融合タンパク質、疾患または患者の状態または個々の患者に応じて１日あたり１回または２回などの間隔での投与を含み得る。このような方法はまた、個々のＴｆ融合タンパク質の種々の投与量の投与も含む。例えば、医薬組成物の初期投与量は、所望の効果、例えば、血圧の低下を誘導するためにより高レベルであり得る。次いで、所望の効果が達成されると、その後の投与量は低減してもよい。投与プロトコールのこれらの変化および改変は、主治医または医療従事者によって行われ得る。患者が血圧をモニターしており、本発明のｍＴｆ−ナトリウム利尿ペプチド経口組成物を投与している場合など、いくつかの例では、投与プロトコールの変更は個々の患者によって行うことができる。
【０２９９】
本発明はまた、本発明のＴｆ融合タンパク質を経口投与可能な形に製剤することを含んでなる、本発明の経口組成物または医薬組成物を製造する方法を含む。その他の例では、本発明は、本発明のＴｆ融合タンパク質を経口投与に適した形に製剤することを含んでなる、本発明の組成物または医薬組成物を製造する方法を含む。
【０３００】
さらに、本発明は、Ｔｆ融合タンパク質製剤の肺送達を含む。肺送達は、その他の投与経路によって送達するのが困難である高分子の送達にとって特に有望である。このような肺送達は、肺に送達される薬物が肺胞領域を介して直接血液循環中に容易に吸収されるので、肺の疾患を治療するための全身送達および局所送達の両方にとって有効であり得る。
【０３０１】
本発明は、種々の状態または疾患を治療するための経口吸入（肺送達）のための薬物分散を形成するのに適した組成物を提供する。Ｔｆ融合タンパク質製剤は、液体ネブライザー、エアゾールベースの定量吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末分散装置など、種々のアプローチによって送達され得る。肺送達用の組成物の製剤では、通常、薬学的に許容される担体、例えば、界面活性剤またはサーファクタントおよびバルク担体を付加し、対象への組成物の均一な肺送達を増強するための安定性、分散性、一貫性および／または膨化特徴を提供する。
【０３０２】
界面活性剤またはサーファクタントは、粘膜または内張りを介したポリペプチドの吸収を促進する。有用な界面活性剤またはサーファクタントとして、脂肪酸およびその塩、胆汁酸塩、リン脂質またはアルキル糖類が挙げられる。脂肪酸およびその塩の例として、カプリル酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）およびミリスチン酸（Ｃ１４）のナトリウム、カリウムおよびリジン塩が挙げられる。胆汁酸塩の例として、コール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸およびウルソデオキシコール酸が挙げられる。リン脂質の例として、一本鎖リン脂質、例えば、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトールおよびリゾホスファチジルセリンまたは二本鎖リン脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルイノシトールおよびジアシルホスファチジルセリンが挙げられる。アルキルサッカライドの例として、アルキルグルコシドまたはアルキルマルトシド、例えば、デシルグルコシドおよびドデシルマルトシドが挙げられる。
【０３０３】
担体としてとして有用である医薬賦形剤として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの膨化剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤、塩化ナトリウムなどの塩等が挙げられる。これらの担体は、結晶または非晶質の形であってもよいし、これら２種の混合物であってもよい。
【０３０４】
膨化剤として使用するための炭水化物の例として、単糖、例えば、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど、二糖、例えば、ラクトース、トレハロースなど、シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび多糖、例えば、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど、アルジトール、例えば、マンニトール、キシリトールなどが挙げられる。膨化剤として使用するためのポリペプチドの例として、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニンおよびグリシンが挙げられるが、グリシンが好ましい。
【０３０５】
組成物の微量成分である添加物を、噴霧乾燥の間のコンホメーション的安定性のために、また散剤の分散性を向上させるために含めてもよい。これらの添加物として、疎水性アミノ酸、例えば、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなどが挙げられる。
【０３０６】
適したｐＨ調整剤または緩衝剤として、有機酸および塩基から調製された有機塩、例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム塩などが挙げられるが、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０３０７】
肺送達用のＴｆ融合組成物は、単位用量として包装することができ、これでは、治療上有効な量の組成物が単位用量容器、例えば、ブリスターパック、ゼラチンカプセルなど中に存在する。ブリスターパックまたはゼラチンカプセルの製造は、通常、包装の技術分野で一般によく知られている方法によって実施する。
【０３０８】
米国特許第６，５２４，５５７号は、（ａ）ＨＦＡ噴射剤と、（ｂ）噴射剤に分散可能な、医薬上活性なポリペプチドと、（ｃ）Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸またはその塩である界面活性剤、胆汁酸塩、リン脂質またはアルキルサッカライドとを含んでなり、界面活性剤が下気道におけるポリペプチドの全身吸収を増強する、薬剤エアゾール製剤を開示する。本発明はまた、このような製剤を製造する方法および患者の治療におけるこのような製剤の使用を提供する。
【０３０９】
乾燥散剤の肺送達のための１つのアプローチは、加圧ガスの供給源を提供するためのハンドポンプを備えた手持ち式の装置を利用する。加圧ガスは、散剤分散装置、例えば、ベンチュリノズルを介して急に放出され、分散された散剤は患者の吸入にとって利用可能になる。
【０３１０】
乾燥散剤分散装置は、いくつかの特許に記載されている。米国特許第３，９２１，６３７号には、粉末化医薬の単一のカプセルを貫くためのニードルを備えた手動のポンプが記載されている。医薬の複数の容器ディスクまたはストリップの使用が欧州特許出願ＥＰ０４６７１７２、国際特許公報ＷＯ９１／０２５５８および同ＷＯ９３／０９８３２、米国特許第４，６２７，４３２号、同４，８１１，７３１号、同５，０３５，２３７号、同５，０４８，５１４号、同４，４４６，８６２号、同５，０４８，５１４号および同４，４４６，８６２号に記載されている。
【０３１１】
タンパク質治療用物質のエアゾール化は、欧州特許出願ＥＰ０２８９３３６に開示されている。治療用エアゾール製剤は、国際特許公報ＷＯ９０／０９７８１に開示されている。
【０３１２】
本発明は、経口吸入用のＴｆ融合タンパク質を製剤することを提供する。この製剤は、Ｔｆ融合タンパク質と、肺送達に適した医薬賦形剤を含んでなる。本発明はまた、Ｔｆ融合タンパク質組成物を経口吸入によってそれを必要とする対象に投与することを提供する。
【０３１３】
トランスジェニック動物
本発明の一実施形態では、本発明の、血清半減期の増大した、血清安定性の増大した、またはバイオアベイラビリティの増大したトランスフェリン融合構築物を含有するトランスジェニック非ヒト動物の製造が企図される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＴｆ部分としてラクトフェリンを使用でき、その結果、融合タンパク質が製造され、乳中に分泌される。
【０３１４】
トランスジェニック、非ヒト動物の製造の成功は、例えば、その開示内容が参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２９１，７４０号（２００１年９月１８日に発行された）、米国特許第６，２８１，４０８号（２００１年８月２８日に発行された）および米国特許第６，２７１，４３６号（２００１年８月７日）など、いくつかの特許および刊行物に記載されている。
【０３１５】
動物、例えば、家畜化された哺乳類、例えば、乳牛、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシおよびヒツジの遺伝子の構成を変更する能力によって、いくつかの商業的適用が可能となる。これらの適用は、多量の外来タンパク質を、容易に回収できる形で発現する（例えば、乳または血液における発現）動物の製造、体重増加、飼料効率、屠体成分、乳産生または含量、疾患耐性および特定の微生物による感染に対する耐性の増大した動物の製造ならびに成長速度または繁殖成績の増強された動物の製造を含む。外因性ＤＮＡ配列を、そのゲノム中に含有する動物は、トランスジェニック動物と呼ばれる。
【０３１６】
トランスジェニック動物の製造のために最も広く用いられる方法として、受精胚の前核中へのＤＮＡのマイクロインジェクションがある（Ｗａｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３［１９９２年］）。トランスジェニック動物を製造するためのその他の方法として、レトロウイルスを用いる、またはレトロウイルスベクターを用いる胚の感染が挙げられる。野生型または組換えレトロウイルスのいずれかを用いる着床前および着床後両方のマウス胚の感染が、報告されている（Ｊａｎｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：１２６０（１９７６年）；Ｊａｎｅｎｉｃｈら、Ｃｅｌｌ  ２４：５１９（１９８１年）；Ｓｔｕｈｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７１５１（１９８４年）；Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６９２７（１９８５年）；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８〜６１５２頁（１９８５年）；Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３８３〜３８８頁（１９８７年））。
【０３１７】
レトロウイルスを用いて胚に感染させるための代替手段として、マウス胚の胞胚腔中へのウイルスまたはウイルス産生細胞の注入がある（Ｊａｈｎｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：６２３［１９８２年］）。妊娠中期マウス胚の子宮内レトロウイルス感染を用いる、マウスの生殖系列中へのトランスジーンの導入が報告されている（Ｊａｈｎｅｒら、前掲［１９８２年］）。トランスジェニック動物を作製するための、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いるウシおよびヒツジ胚の感染が報告されている。これらのプロトコールは、レトロウイルス粒子または受精卵または初期胚の囲卵腔中にレトロウイルス粒子を入れる、増殖の停止した（すなわち、マイトマイシンＣ処理した）細胞のマイクロインジェクションを含む（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９０／０８８３２［１９９０年］；ならびにＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、４０：３８６［１９９５年］。ＰＣＴ国際出願ＷＯ９０／０８８３２には、２〜８細胞期での、野生型ネコ白血病ウイルスＢのヒツジ胚の囲卵腔中への注入が記載されている。注射された胚に由来する胎児は、複数部位の組込みを含有することがわかった。
【０３１８】
米国特許第６，２９１，７４０号（２００１年９月１８日に発行された）には、分裂細胞を形質導入するレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）を用いる、成熟前卵母細胞および成熟した、不受精卵母細胞（すなわち、受精前卵母細胞）中への外因性ＤＮＡの導入によるトランスジェニック動物の製造が記載されている。この特許にはまた、種々の組換えタンパク質のサイトメガロウイルスプロモーター駆動性、ならびにマウス哺乳類腫瘍ＬＴＲ発現のための方法および組成物を記載されている。
【０３１９】
米国特許第６，２８１，４０８号（２００１年８月２８日に発行された）には、胚幹細胞を用いてトランスジェニック動物を製造する方法が記載されている。手短には、胚幹細胞を、桑実胚との混合細胞同時培養において用いて、トランスジェニック動物を作製する。例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス送達によって、外来遺伝物質を胚幹細胞中に導入し、その後、同時培養する。このようにしてトランスフェクトされたＥＳ細胞を、ネオマイシンなどの選択マーカーによって遺伝子の組込みについて選択する。
【０３２０】
米国特許第６，２７１，４３６号（２００１年８月７日に発行された）には、始原生殖細胞を単離することと、これらの細胞を培養して始原生殖細胞由来の細胞株を製造することと、始原生殖細胞および培養細胞株の双方を形質転換することと、これらの形質転換された細胞および細胞株を用いてトランスジェニック動物を作製することとを含む方法を用いる、トランスジェニック動物の製造が記載されている。トランスジェニック動物が作製される効率は大幅に増大され、それによってトランスジェニック非げっ歯類動物種の製造における相同組換えの使用が可能となる。
【０３２１】
遺伝子療法
本発明の一実施形態では、遺伝子療法のための、トランスフェリンまたは修飾されたトランスフェリンタンパク質またはドメインが、治療用タンパク質またはペプチドと連結しているトランスフェリン融合構築物の使用が企図される。本発明の血清半減期または血清安定性が増大された、修飾されたトランスフェリン融合構築物は、遺伝子療法治療に理想的に適している。
【０３２２】
可溶性融合タンパク質を発現する遺伝子療法の使用の成功が記載されている。手短には、細胞傷害性リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）およびヒト免疫グロブリンＧｌのＦｃ部分からなる可溶性融合タンパク質をコードする遺伝子を含有するアデノウイルスベクターの注射による遺伝子療法が、Ｉｊｉｍａら、（２００１年６月１０日）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（米国）１２／９：１０６３〜７７頁に最近示された。遺伝子療法のこの適用では、ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎のネズミモデルは、ベクターの関節内注入によってうまく治療された。
【０３２３】
遺伝子療法はまた、いくつかの米国特許、例えば、米国特許第６，２２５，２９０号（２００１年５月１日に発行された）、同６，１８７，３０５号（２００１年２月１３日に発行された）および同６，１４０，１１１号（２０００年１０月３１日に発行された）に記載されている。
【０３２４】
米国特許第６，２２５，２９０号は、哺乳類対象の腸上皮細胞が、所望の治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を機能し得る形で組み込むよう遺伝子改変される方法および構築物を提供している。腸細胞形質転換は、裸のＤＮＡから主に構成される製剤の投与によって達成され、ＤＮＡは経口投与できる。経口またはその他の胃腸内投与経路は、簡単な投与方法を提供し、その上、裸の核酸の使用により、遺伝子療法を達成するためのウイルスベクターの使用に伴う面倒な事態を避けられる。発現されたタンパク質は、消化管および／または血流中に直接分泌され、タンパク質の治療的血中濃度が得られ、それによってそのタンパク質を必要とする患者が治療される。形質転換された腸上皮細胞は、特定のタンパク質の欠乏と関連しているか、またはタンパク質の過剰発現による治療に適している疾患のための短期または長期の治療的療法を提供する。
【０３２５】
米国特許第６，１８７，３０５号は、脊椎動物、特に、哺乳類起源の細胞における遺伝子またはＤＮＡターゲッティングの方法を提供する。手短には、ＤＮＡを、ＤＮＡの相同組換えまたはターゲッティングによって脊椎動物起源の一次または二次細胞中に導入し、ＤＮＡは一次または二次細胞のゲノムＤＮＡ中に事前に選択された部位で導入される。
【０３２６】
米国特許第６，１４０，１１１号（２０００年１０月３１に発行された）には、レトロウイルス遺伝子療法ベクターが記載されている。開示されたレトロウイルスベクターは、注目する遺伝子の挿入部位を含み、広範なトランスフェクトされた細胞種において注目する遺伝子に由来する高レベルのタンパク質を発現可能である。また、選択可能マーカーを欠き、したがって、それらを、抗生物質などのマーカー産物の同時発現を伴わずに、種々の病状の治療においてヒト遺伝子療法にとって適したものにするレトロウイルスベクターも開示される。これらのレトロウイルスベクターは、特定のパッケージング細胞株における使用にとって特に適している。レトロウイルスベクターの、哺乳類細胞のゲノム中に挿入する能力のために、それらは、ヒトおよび動物における遺伝病の遺伝子療法における使用について特に有望な候補となってきた。遺伝子療法は、通常、（１）ｉｎ  ｖｉｖｏで患者細胞に新規遺伝物質を付加することまたは（２）患者細胞を身体から採取することと、その細胞に新規遺伝物質を付加することと、それらを身体に再導入すること、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子療法を含む。レトロウイルスベクターを用いた種々の細胞における遺伝子療法の実施方法についての議論は、例えば、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、１９８９年９月１９日に発行された米国特許第４，８６８，１１６号および１９９０年１２月２５日に発行された同４，９８０，２８６号（上皮細胞）、１９８９年８月１０日に公開されたＷＯ８９／０７１３６（肝細胞）、１９９０年７月２５日に公開されたＥＰ３７８，５７６（繊維芽細胞）および１９８９年６月１５日に公開されたＷＯ８９／０５３４５および１９９０年６月２８日に公開されたＷＯ／９０／０６９９７（内皮細胞）に見ることができる。
【０３２７】
トランスフェリン融合タンパク質を含有するキット
さらなる一実施形態では、本発明は、トランスフェリン融合タンパク質を含有するキットを提供し、これは例えば、治療適用または非治療適用のために使用できる。キットはラベルのついた容器を含んでなる。適した容器として、例えば、瓶、バイアルおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、種々の材料から形成され得る。容器には、例えば上記の、治療適用または非治療適用にとって有効であるトランスフェリン融合タンパク質を含む組成物を入れる。組成物中の活性物質は、治療用タンパク質である。容器上のラベルは、組成物が特定の療法または非治療適用に用いられることを示し、また、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用のいずれかの指示、例えば、上記に記載されるものを示す場合もある。
【０３２８】
本発明のキットは、通常、上記に記載される容器と、商業的およびユーザの観点から望ましい物質、例えば、バッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジおよび使用説明書を含む包装挿入物を含んでなる１種または複数のその他の容器を含んでなる。
【０３２９】
さらに記載をしなくても、当業者ならば、前記の説明および以下の例示的実施例を用いて、本発明の作製および利用し、特許請求される方法を実施できると考えられる。例えば、当業者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、本発明の融合タンパク質構築物の生物活性を、融合していない状態の治療部分の匹敵する活性と比較して容易に調べることができる。同様に、当業者ならば、本発明の構築物の血清半減期および血清安定性を容易に調べることができる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであって、決して、開示内容の残りの部分を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０３３０】
（実施例１）
ＢＮＰ／ｍＴｆ融合タンパク質
ナトリウム利尿ペプチドは、液体および電解質恒常性の調節に関与しているホルモンである。脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、最初ブタ脳において見出されたが（Ｓｕｄｏｈら（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １５５：７２６〜７３２頁）、ＢＮＰの主な供給源は心室である。その他のペプチドと同様に、ＢＮＰは、ヒトでは短い血漿半減期を有する。本発明は、血清安定性およびｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期が延長された、ｍＴｆ（Ｓ４１５Ａ、Ｔ６１３Ａ）と融合しているＢＮＰを含む融合タンパク質およびこのような融合タンパク質の、それを必要とする患者を治療するための医薬組成物を提供する。患者は、例えば、鬱血性心不全または腎疾患を患っているものであり得る。
【０３３１】
この実施例では、ＢＮＰ／ｍＴｆ融合タンパク質を製造するステップが記載されている。同じステップを用いて、その他のナトリウム利尿ペプチド、ＢＮＰ類似体または誘導体などを含むトランスフェリン融合タンパク質を作製できる。
【０３３２】
ヒトＢＮＰタンパク質配列を、ＰｕｂＭｅｄ（受託番号ＮＭ００２５２１）から得、酵母用に最適化したＤＮＡコドンに逆翻訳した。
【０３３３】
【表９】
2009511060.tif 000011
【０３３４】
Ｎ末端融合物：ｎＬ  ＢＮＰ（１−３２）（ＰＥＡＰＴＤ）２  ｍＴｆ（ｐＲＥＸ０７３０／７３１）
ヒトＢＮＰ配列（ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ）（配列番号１６６）を、隣接するｍＴｆ配列をコードする重複プライマー配列を用いてｍＴｆ（Ｓ４１５Ａ、Ｔ６１３Ａ）のＮ末端に挿入した。プライマーＰ１２２８（リバースプライマー）およびＰ１２２９（フォワードプライマー）は、ＢＮＰ配列および（ＰＥＡＰＴＤ）２リンカー（配列番号１４２）を、ｍＴｆ配列の５’およびｎＬリーダー配列の３’に導入するよう設計した。
【０３３５】
【表１０】
2009511060.tif 000012
【０３３６】
ＰＣＲの第１ラウンドで、Ｐ１２２８＋Ｐ００２５またはＰ１２２９＋Ｐ００１２を、ｐＲＥＸ０１９７とともに用いて２種の生成物を作製した。次いで、これらの反応から得た生成物を、外側プライマーＰ００１２およびＰ００２５を用いてＰＣＲの第２ラウンドに加えた。
【０３３７】
【表１１】
2009511060.tif 000013
この反応の生成物を、ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断し、ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＲＥＸ００５２にサブクローニングして、ｐＲＥＸ０７３０を作製した（図４）。
【０３３８】
プラスミドを制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩを用いて切断し、ＮｏｔＩを用いて切断したｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐら、（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１８３〜１８７頁）にライゲーションして酵母発現ベクターｐＲＥＸ０７３１を作製した（図５）。
【０３３９】
ＢＮＰのＣ末端融合物：ｎＬ  ｍＴｆ（ＰＥＡＰＴＤ）２ＢＮＰ（１−３２）（ｐＲＥＸ０７２２／７２３）
ＢＮＰタンパク質を、隣接するｍＴｆ配列をコードする重複プライマー配列を用いてｍＴｆのＣ末端に挿入した。プライマーＰ１２３０（リバースプライマー）およびＰ１２３１（フォワードプライマー）は、ＢＮＰ配列および（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号１４２）リンカーを、ｍＴｆ配列の３’に導入するよう設計した。
【０３４０】
【表１２】
2009511060.tif 000014
【０３４１】
ＰＣＲの第１ラウンドで、Ｐ１２３０＋Ｐ０００７またはＰ１２３１＋Ｐ００２６を、鋳型としてのｐＲＥＸ０１９７とともに用いて２種の生成物を作製した。
【０３４２】
【表１３】
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次いで、これらの反応から得た生成物を、外側プライマーＰ０００７およびＰ００２６を用いてＰＣＲの第２ラウンドに加えた。この反応の生成物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩを用いて切断し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩを用いて切断したｐＲＥＸ０１９７にサブクローニングして、ｐＲＥＸ０７２２を作製した（図６）。
【０３４３】
このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩを用いて切断し、ＮｏｔＩを用いて切断したｐＳＡＣ３５にライゲーションして酵母発現ベクターｐＲＥＸ０７２３を作製した（図７）。
【０３４４】
【表１４】
2009511060.tif 000016
【０３４５】
【表１５】
2009511060.tif 000017
【０３４６】
【表１６】
2009511060.tif 000018
【０３４７】
（実施例２）
ＡＮＰ／ｍＴｆ融合タンパク質
ＡＮＰは、１種の遺伝子が４種のペプチドホルモンを合成するホルモン系の一部である。ＡＮＰ血中レベルの調節は、高血圧症、ショックなどのような障害の治療のための治療アプローチである。現在天然および合成ＡＮＰならびにそれらの類似体は、ＡＮＰレベルを増大することによる液量および血管機能の調節を可能にするが、有効な療法はまた、所望の細胞外液量および電解質恒常性を達成するためにＡＮＰレベルが低下することを必要とする場合もある。
【０３４８】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を延長するための、ｍＴｆ（Ｓ４１５Ａ、Ｔ６１３Ａ）と融合しているＡＮＰを含む融合タンパク質を提供し、また、それを必要とする患者を治療するための医薬組成物も提供する。この実施例では、ＡＮＰ／ｍＴｆ融合タンパク質を製造するステップが記載される。同じステップを用いて、その他のナトリウム利尿ペプチド、例えば、ＡＮＰ類似体または誘導体などを含むトランスフェリン融合タンパク質を作製できる。
【０３４９】
ヒトＡＮＰタンパク質配列（ＳＬＲＲＳＳＣＦＧＧＲＭＤＲＩＧＡＱＳＧＬＧＣＮＳＦＲＹ）（配列番号１７９）を、ＰｕｂＭｅｄ（受託番号ＮＭ＿００６１７２）から得、酵母用に最適化したＤＮＡコドンに逆翻訳した。
【０３５０】
【表１７】
2009511060.tif 000019
【０３５１】
ＡＮＰのＮ末端融合物：ｎＬ  ＡＮＰ（１−２８）（ＰＥＡＰＴＤ）２ｍＴｆ（ｐＲＥＸ０８２６／８２７）
ＡＮＰタンパク質を、隣接するｍＴｆ配列をコードする重複プライマー配列を用いてｍＴｆのＮ末端に挿入した。プライマーＰ１５５２（リバースプライマー）およびＰ１５５３（フォワードプライマー）は、ＡＮＰ配列および（ＰＥＡＰＴＤ）２リンカーを、ｍＴｆ配列の５’、ｎＬ  リーダー配列の３’に導入するよう設計した。
【０３５２】
【表１８】
2009511060.tif 000020
【０３５３】
ＰＣＲの第１ラウンドで、Ｐ１５５２＋Ｐ００２５またはＰ１５５３＋Ｐ００１２を、鋳型としてのｐＲＥＸ０１９７とともに用いて２種の生成物を作製した。
【０３５４】
【表１９】
2009511060.tif 000021
次いで、これらの反応から得た生成物を、外側プライマーＰ００２５およびＰ００１２を用いてＰＣＲの第２ラウンドに加えた。この反応の生成物を、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断し、ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＲＥＸ００５２にサブクローニングして、ｐＲＥＸ０８２６を作製した（図１２）。
【０３５５】
このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩを用いて切断し、制限酵素ＮｏｔＩを用いて切断したｐＳＡＣ３５にライゲーションして酵母発現ベクターｐＲＥＸ０８２７を作製した（図１３）。
【０３５６】
ＡＮＰのＣ末端融合物：ｎＬ  ｍＴｆ（ＰＥＡＰＴＤ）２ＡＮＰ（１−２８）（ｐＲＥＸ０８２８／８２９）
ＡＮＰタンパク質を、隣接するｍＴｆ配列をコードする重複プライマー配列を用いてｍＴｆのＣ末端に挿入した。プライマーＰ１５５４（リバースプライマー）およびＰ１５５５（フォワードプライマー）は、ＡＮＰ配列および（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号１４２）リンカーを、ｍＴｆ配列の３’に導入するよう設計した。
【０３５７】
【表２０】
2009511060.tif 000022
【０３５８】
ＰＣＲの第１ラウンドで、Ｐ１５５４＋Ｐ０００７またはＰ１２３１＋Ｐ１６６８を、鋳型としてのｐＲＥＸ０１９７とともに用いて２種の生成物を作製した。次いで、これらの反応の生成物を、外側プライマーＰ０００７およびＰ１６６８を用いてＰＣＲの第２ラウンドに加えた。
【０３５９】
【表２１】
2009511060.tif 000023
【０３６０】
この反応の生成物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩを用いて切断し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩを用いて切断したｐＲＥＸ０１９７にクローニングして、ｐＲＥＸ０８２８を作製した（図１４）。
【０３６１】
このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩを用いて切断し、制限酵素ＮｏｔＩを用いて切断したｐＳＡＣ３５にライゲーションして酵母発現ベクターｐＲＥＸ０８２９を作製した（図１５）。
【０３６２】
【表２２】
2009511060.tif 000024
【０３６３】
【表２３】
2009511060.tif 000025
【０３６４】
【表２４】
2009511060.tif 000026
【０３６５】
（実施例３）
Ｖｅｓｓｅｌ  Ｄｉｌａｔｏｒ（１−４８）（ＰＥＡＰＴＤ）２  ｍＴｆ
ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｌａｔｏｒ配列の、ｍＴｆ（Ｓ４１５Ａ、Ｔ６１３Ａ）のＮ末端との融合は、３段階プロセスで達成した。まず、ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｌａｔｏｒ  ＤＮＡ配列の５’および３’末端を、それぞれ、リーダー配列およびリンカーペプチドの末端に付加するために２回のＰＣＲ反応を実施した。プライマーＰ０６６９およびＰ２２８０とともにプラスミドｐＲＥＸ０５４９（図８）を鋳型として用い、ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｌａｔｏｒの５’配列をリーダー配列に付加した（ＰＣＲｌ）。鋳型ｐＲＥＸ０５８４（図９）およびプライマーＰ２２７８およびＰ０４７８を用い、ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｌａｔｏｒの３’配列をリンカーペプチドに付加した（ＰＣＲ２）。
【０３６６】
次いで、これら２つの反応の生成物を、ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｌａｔｏｒの十分な配列を、Ｐ０６６９およびＰ２２８１を用いてＰＣＲ１に加えるよう（ＰＣＲ３）、またはＰ２２７９およびＰ０４７８を用いてＰＣＲ２に加えるよう（ＰＣＲ４）延長し、ＰＣＲ３の３’がＰＣＲ４の５’と重複した。最後の反応は、外側プライマーＰ０６６９およびＰ０４７８を用いてＰＣＲ３およびＰＣＲ４を一緒に連結するためであった。
【０３６７】
この最終反応の生成物を、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、同酵素を用いて切断したｐＲＥＸ０５４９にライゲーションし、ｐＲＥＸ１１４０を得た（図１０）。クローンは、制限消化およびＤＮＡ配列決定によって調べ、ＰＣＲ誘発性エラーをまったく含まない正しい挿入を確認した。
【０３６８】
発現カセットは、制限酵素ＮｏｔＩを用いる消化によってｐＲＥＸ１１４０から回収し、ベクター骨格を切断するためのＰｖｕＩを加えた。次いで、これを、ＮｏｔＩで切断し、南極ホスファターゼを用いてデホスファテイズドした酵母発現ベクターｐＳＡＣ３５中にライゲーションし、ｐＲＥＸ１１４６を得た（図１１）。
【０３６９】
【表２５】
2009511060.tif 000027
【０３７０】
【表２６】
2009511060.tif 000028
【０３７１】
【表２７】
2009511060.tif 000029
【０３７２】
【表２８】
2009511060.tif 000030
【０３７３】
【表２９】
2009511060.tif 000031
【０３７４】
【表３０】
2009511060.tif 000032
アミノ酸配列：配列番号１９２
ＤＮＡ配列：配列番号１９３
【０３７５】
本発明は、上記の実施例に関連して詳細に記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく種々の改変を行うことができるということは理解される。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。本願中に参照されたすべての引用された特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３７６】
【図１】ヒト（Ｈｕ）トランスフェリン（Ｔｆ）（配列番号３）のＮおよびＣドメインのアラインメントを示す図であり、類似性および同一性が範囲指定されている。
【図２Ａ−２Ｂ】種々の種に由来するトランスフェリン配列のアラインメントを示す図である。明るい陰：類似性；濃い陰：同一性。
【図３】治療用タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのための、いくつかのＴｆ表面に露出された挿入部位の位置を示す図である。
【図４】ベクターｐＲＥＸ０７３０を示す図である。
【図５】ベクターｐＲＥＸ０７３１を示す図である。
【図６】ベクターｐＲＥＸ０７２２を示す図である。
【図７】ベクターｐＲＥＸ０７２３を示す図である。
【図８】ベクターｐＲＥＸ０５４９を示す図である。
【図９】ベクターｐＲＥＸ０５８４を示す図である。
【図１０】ベクターｐＲＥＸ１１４０を示す図である。
【図１１】ベクターｐＲＥＸ１１４６を示す図である。
【図１２】ベクターｐＲＥＸ０８２６を示す図である。
【図１３】ベクターｐＲＥＸ０８２７を示す図である。
【図１４】ベクターｐＲＥＸ０８２８を示す図である。
【図１５】ベクターｐＲＥＸ０８２９を示す図である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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