(57)【要約】  本発明は関節及び椎間板疾患の治療の方法を提供し、複数の細胞の少なくとも一部による少なくとも一つの軟骨形成マーカーの増加した量の発現を引き起こすことができる少なくとも一つの生物活性因子で増強された、実質的に精製された複数の細胞を含んでなる新規組成物を、それらを必要とする対象に投与することを含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、複数の細胞の少なくとも一部による少なくとも一つの軟骨形成マーカーの改変された量の発現を引き起こすことができる少なくとも一つの生物活性因子で増強された、実質的に精製された複数の細胞を含んでなる、前記組成物。
【請求項２】
該実質的に精製された複数の細胞が少なくとも一つの多分化能細胞を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該少なくとも一つの多分化能細胞が骨髄細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
骨髄細胞が、全骨髄、濃縮された骨髄、濾過された骨髄、分離された骨髄及び骨髄から単離され及び培養増殖された細胞集団から成る群より選択される供給源から抽出される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも一つの多分化能細胞が間葉細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
該実質的に精製された複数の細胞のメンバーがヒト細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
該ヒト細胞が同種移植片源から採取される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
該ヒト細胞が自家移植片源から採取される、請求項６に記載の組成物
【請求項９】
該実質的に精製された複数の細胞のメンバーが異種源から誘導される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
該少なくとも一つの軟骨形成マーカーが、コラーゲンタイプＩＩ、グリカン、バーシカン又はフィブロモジュリンのようなプロテオグリカン、ルミカン、ＳＯＸ−９、硫酸化グリコサミノグリカン、軟骨細胞増殖、細胞凝縮、アルカリホスファターゼ、コラーゲンタイプＸ及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
該少なくとも一つの生物活性因子が、ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＭＩＡ／ＣＤ−ＲＡＰ、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＩＧＦ、デキサメタゾン及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
該少なくとも一つの生物活性因子がＬＭＰ−１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
該複数の細胞が培養される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
該複数の細胞が前もって設計された形状に増殖される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
該複数の細胞のメンバーが軟骨又は軟骨様組織を形成する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該軟骨が、人体内の関節窩、椎間板組織及び軟骨性組織から成る群より選択される人体中の部位で形成される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
該椎間板組織が終板、髄核及び線維輪から成る群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
潤滑剤、抗炎症剤、抗生物質、鎮痛剤及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される少なくとも一つの添加剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
組成物であって、複数の細胞の少なくとも一部の軟骨形成又は軟骨形成様細胞への分化を引き起こすことができる少なくとも一つの生物活性因子で増強された、実質的に精製された複数の細胞を含んでなる、前記組成物。
【請求項２０】
該実質的に精製された複数の細胞が少なくとも一つの多分化能細胞を含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
該少なくとも一つの多分化能細胞が骨髄細胞である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
骨髄細胞が、全骨髄、濃縮された骨髄、濾過された骨髄、分離された骨髄及び骨髄から単離され及び培養増殖された細胞集団から成る群より選択される供給源から抽出される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも一つの多分化能細胞が間葉細胞である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
該実質的に精製された複数の細胞のメンバーがヒト細胞である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
該ヒト細胞が同種移植片源から採取される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
該ヒト細胞が自家移植片源から採取される、請求項２５に記載の組成物
【請求項２７】
該実質的に精製された複数の細胞のメンバーが異種源から採取される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２８】
該少なくとも一つの生物活性因子が、ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＧＤＦ−５、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＭＩＡ／ＣＤ−ＲＡＰ、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＩＧＦ、デキサメタゾン及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２９】
該少なくとも一つの生物活性因子がＬＭＰ−１である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３０】
該複数の細胞が培養される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３１】
該複数の細胞が前もって設計された形状に増殖される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３２】
該複数の細胞のメンバーが軟骨又は軟骨様組織を形成する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
該軟骨が、人体内の関節窩、椎間板組織及び軟骨性組織から成る群より選択される人体中の部位で形成される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
該椎間板組織が終板、髄核及び線維輪から成る群より選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
潤滑剤、抗炎症剤、抗生物質、鎮痛剤及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される少なくとも一つの添加剤をさらに含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３６】
製剤であって、薬学的に許容できる坦体又は希釈剤とともに請求項１又は１９に記載の組成物を含んでなる製剤。
【請求項３７】
該薬学的に許容できる坦体又は希釈剤が液体又は半固体である、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
筋肉内、静脈内、髄内又は関節内注射に適した、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３９】
軟骨細胞由来組織の治療の方法であって、請求項１の組成物の有効量を、それらを必要とする対象に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４０】
軟骨細胞由来組織の治療の方法であって、請求項１８の組成物の有効量を、それらを必要とする対象に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４１】
請求項１又は請求項１８の組成物が、少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなるベクターで形質転換された複数の細胞の少なくとも一部を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該少なくとも一つの生物活性因子がＬＭＰ−１である、請求項４１に記載の方法。  
【請求項４３】
請求項１の組成物が少なくとも一つの間葉細胞を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
該複数の細胞が、治療に先だって対象から採取される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
該複数の細胞が同種源から採取される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
該複数の細胞が異種源から採取される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
該軟骨細胞由来組織が軟骨又は軟骨様組織である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
該軟骨細胞由来組織が椎間板組織である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
プロテオグリカン上方制御因子を投与することをさらに含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
細胞外マトリックスの分解を防止する少なくとも一つの試薬を投与することをさらに含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
該少なくとも一つの試薬がマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）下方制御剤である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
該少なくとも一つの試薬が、ＯＮＯ−４８１７、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、ＣＭＴ−３、マトリックスメタロプロテイナーゼの５−アミノ−２−メルカプト−１、３、４−チアジアゾールに基づいた阻害剤、ドセタキセル、ケルセチン、緑茶抽出物、ＴＮＦ−α阻害剤、ＩＬ−１β阻害剤、ｐ３８阻害剤、プリノマスタット、Ｐ１６、イソフラボン、ＰＣＫ３１４５及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
該細胞外マトリックスが軟骨組織中又は椎間領域中である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
該対象が変性椎間板疾患を患っている、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
該複数の細胞のメンバーを、インビボで生物活性因子と接触させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
該複数の細胞のメンバーを、レシピエント内への導入に先立って、培養において生物活性因子と接触させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５７】
該組成物が静水圧下で対象物に投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５８】
該複数の細胞のメンバーが、対象への導入に先立って、静水圧下で培養される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
該静水圧が日常生活の正常活動度の物理的刺激を模倣する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該静水圧が約１〜約１０ＭＰａの範囲である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１の組成物が、低酸素圧を有する部位で対象に投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１の組成物が部位に投与され、ここで該部位での圧縮力は、該複数の細胞が軟骨細胞又は軟骨細胞様細胞へ分化し、及びそれにより該対象中の軟骨を修復する又は形成するような圧縮力である、請求項４０に記載の方法。
【請求項６３】
さらに、潤滑剤、抗炎症剤、抗生物質、鎮痛剤及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される少なくとも一つの添加剤を対象に投与することを含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項６４】
対象中の腱又は靱帯を修復する又は形成する方法であって、該対象中の腱又は靱帯損傷の部位で対象に請求項１の組成物を投与することを含んでなり、ここで該部位での剪断応力及び引張力は、前記工学処理骨髄細胞が軟骨細胞又は軟骨細胞様細胞へ分化し、及びそれにより該対象中の腱又は靱帯を修復する又は形成するような力である、前記方法。
【請求項６５】
対象中の腱又は靱帯を修復する又は形成する方法であって、該対象中の腱又は靱帯損傷の部位で対象に請求項１８の組成物を投与することを含んでなり、ここで該部位での剪断応力及び引張力は、前記工学処理骨髄細胞が軟骨細胞又は軟骨細胞様細胞へ分化し、及びそれにより該対象中の腱又は靱帯を修復する又は形成するような力である、前記方法。
【請求項６６】
軟骨細胞由来組織の治療の方法であって、複数の多分化能細胞の有効量及び少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列の有効量を、それらを必要とする対象に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項６７】
該少なくとも一つの生物活性因子がＬＭＰ−１である、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
本出願は、本明細書において援用される、２００５年５月２７日に出願された仮出願番号６０／６８５,２２４の優先権を主張する。
【０００２】
背景技術
本発明は、椎間板（ｄｉｓｃ）のさらなる変性を防止するため、マトリックス産生を上方制御するように、比較的容易に得られる軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）様細胞を椎間板に提供する組成物及び方法に関する。
【０００３】
背景技術
年齢に伴う椎間板の進行性変性は、細胞密度の減少及び軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）特異的マトリックス成分、特にプロテオグリカンの合成の減少を付随すると信じられている。例えば., S.J. Lipson & H. Muir H.,Volvo award in basic science: Proteoglycans in Experimental Intervertebral Disc Degeneration, 6 SPINE 194-210 (1981); A. G. Nerlich et al., Volvo Award winner in basic science studies: Immunohistologic Markers for Age-related Changes of Human  Lumbar Intervertebral Discs,22 SPINE 2781-95 (1997); R. H. Pearce et al., Degeneration and the Chemical Composition of the Human  Lumbar Intervertebral Disc, 5 J. ORTHOP. RES. 198-205 (1987) 、を参照されたい。プロテオグリカンのこれらの減少に取り組む一つのアプローチは、変性椎間板内に自己椎間板細胞を移植することである。これらの移植された細胞は、マトリックス産生を上方制御することにより椎間板を刺激するであろうと考えられる。自己椎間板細胞の移植は試されてきており、技術的には容易であり、及び生物学的には椎間板傷害を修復すること及び椎間板変性を遅延させることに関係していることが示されている。T. Ganey et al., Disc Chondrocyte Transplantation in a Canine Model: A treatment for Degenerated or Damaged Intervertebral disc, 28 SPINE 2609-20 (2003) を参照されたい。しかしながら、自己細胞採取のドナー側の罹患及び免疫学的影響が臨床診療でのこれらのアプローチを制限している。
【０００４】
発明の要旨
それ故、椎間板のさらなる変性を防止するために、マトリックス産生を上方制御するように、比較的容易に得られる軟骨細胞様細胞を椎間板に提供するのが本発明の目的である。
【０００５】
一つの側面において、本発明は、複数の細胞の少なくとも一部による少なくとも一つの軟骨形成（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）マーカーの改変された量の発現を引き起こすことができる少なくとも一つの生物活性因子で増強された、実質的に精製された複数の細胞含んでなる組成物を提供する。本発明の異なった態様において、複数の細胞のメンバーは、骨髄細胞、脂肪細胞及び筋肉細胞から成る群より選択される。さらに、本発明の一つの態様において、少なくとも一つの生物活性因子はＬＭＰ−１である。
【０００６】
別の側面において、本発明は、適した担体又は希釈剤と組み合わされた上記の組成物を含んでなる製剤である。本発明の異なった態様において、本発明の組成物は、筋肉内、静脈内、髄内又は関節内注射に適した液体又は半固体担体である。
【０００７】
別の側面において、本発明は軟骨細胞由来組織の治療の方法を提供し、上記のいずれかの態様に従った有効量の組成物を、それらを必要とする対象へ投与することを含んでなる。本発明の異なった態様において、複数の細胞のメンバーは、軟骨形成細胞へのそれらの分化を促進する条件下で培養される。
【０００８】
さらに別の側面において、本発明は軟骨細胞由来組織の治療の方法を提供し、少なくとも一つの生物活性因子をコードするベクターの有効量を、それらを必要とする対象へ投与することを含んでなる。一つの態様において、少なくとも一つの生物活性因子はＬＭＰ−１である。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の目的のため、以下の非制限的定義が提供される：
本明細書で使用される用語「軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）」は、人体内の関節窩、椎間板及びすべての軟骨組織を指す。
【００１０】
用語「同種移植片」及び「同種の」とは、二人の人の間の組織移植片のような、レシピエントと同一種、しかし異なった遺伝子組立形態のドナーから得られた組織の移植片を指す。
【００１１】
用語「自家移植片」及び「自家の」とは、同一個体の体から誘導され又は移されていることを指す。
用語「異種移植片」及び「異種の」とは、レシピエントと異なった種のドナーから誘導されていることを指す。
【００１２】
用語「椎間板」及び「椎間板組織」は、終板、髄核及び／又は線維輪を含む。
用語「ベクター」とは、標的細胞に遺伝子配列を導入することができる核酸アセンブリー（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を指す（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子性キャリアー及びリポソーム）。用語「発現ベクター」とは、細胞において目的の配列又は遺伝子の発現を方向付けることができるプロモーターを含有する核酸アセンブリーを指す。ベクターは典型的には、ベクターによりトランスフェクトされた細胞の選択のための選択可能マーカーをコードする核酸配列を含む。一般に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」及び遺伝子導入ベクター」とは、目的の核酸配列の発現を方向付け、及び標的細胞へ遺伝子配列を導入できるいずれかの核酸配列を指す。それ故、本用語はクローニング及び発現ベヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００１３】
用語、疾患を「治療すること」又は「治療」とは、疾患の徴候又は症状を緩和することを目指して、一つ又はそれより多くの薬剤を患者（ヒト又はその他）に投与することを含むことができるプロトコールを実行することを指す。緩和は、疾患の徴候又は症状の出現に先だって、ならびにそれらの出現の後に生じ得る。それ故、「治療すること」又は「治療」は疾患を「予防すること」又は「予防」を含む。加えて、「治療すること」又は「治療」は徴候又は症状の完全な緩和、完全な治癒を必要とせず、そして特定的には、患者に最低限の効果のみを有するプロトコールを含む。
【００１４】
用語「実行者」とは、患者に本発明の方法及び組成物を使用する人を指す。本用語は、限定ではなく、医師、看護士、科学者、及び他の医学又は科学従事者を含む。
用語「多分化能細胞」とは、一つより多くの細胞型へ分化できる細胞を指す。本明細書で使用される多分化能性細胞には、限定されるわけではないが、間葉細胞が含まれる。
【００１５】
本明細書で使用する用語「ＬＭＰ−１」は、複数の細胞のメンバーによる少なくとも一つの軟骨形成マーカーの発現を引き起こすことができる生物活性断片、誘導体及びそれら類似体を含む。ＬＭＰ−１は、米国特許第米国特許２００３０１２５２４８号(Hair) で使用されているＬＭＰ、及び限定されるわけではないが、ＷＯ００／６６１７８（ＰＣＴ／ＵＳ００／１１６６４出願から）に開示されているものを含むＬＭＰスプライス変異体、も含む。本明細書で使用されるＬＭＰは、米国特許第２００３０１８０２６６(McKay) に開示されているＬＩＭミネラリゼーションプロテインも含む。すべての上記出版物の全教示は本明細書において援用される。
【００１６】
本発明の方法は、分子生物学における日常的な技術を利用する。一般分子生物学を開示している基礎的教科書には、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001) 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994) が含まれる。
【００１７】
一つの態様において、本発明は複数の細胞の少なくとも一部が軟骨形成又は軟骨形成様細胞へ分化することを引き起こすことができる、少なくとも一つの生物活性因子で増強された、実質的に精製された複数の細胞を含んでなる組成物を提供する。
【００１８】
本発明の複数の細胞は、少なくとも一つの生物活性因子により、少なくとも一つの軟骨形成マーカーを産生するように刺激することができる。該少なくとも一つの生物活性因子は、複数の細胞のメンバーによる少なくとも一つの軟骨形成マーカーの発現を、直接的にか又は間接的に引き起こすことができる分子を含んでなる。例えば、骨形態形成タンパク質２、７及び９（それぞれＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ−９）は、プロテオグリカンの発現を誘導する。それ故、もし分子がこれら及び他のＢＭＰの発現を誘導すれば、順に、プロテオグリカンの発現を誘導し、こうした分子は該少なくとも一つの生物活性因子と考えられる。該少なくとも一つの生物活性因子は、いくつかの態様において、アミノ酸配列、生物活性断片、誘導体及びそれら類似体を指す。他の態様において、該少なくとも一つの生物活性因子は、複数の細胞のメンバーによる少なくとも一つの軟骨形成マーカーの発現を、直接的にか又は間接的に引き起こすことができる分子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列を含んでなる。それ故、複数の細胞のメンバーによる少なくとも一つの軟骨形成マーカーの発現を、直接的にか又は間接的に引き起こすことができるＬＭＰ−１又はそれらの断片を含んでなるベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、用語「少なくとも一つの生物活性因子」の意味の範囲内である。
【００１９】
文献において、プロテオグリカン合成を刺激する一つのアプローチはサイトカインの使用である。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−βｌ）、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のようないくつかの候補サイトカインによる予備的仕事は、それらが椎間板細胞においてアグリカン合成速度を刺激し得ることを示した。S. T. Yoon, The Potential of Gene Therapy for the treatment of Disc Degeneration, 35 ORTHOP. CLIN. N. AM. 95-100 (2004); Y. Zhang et al., Growth Factor Osterogenic Protein-1: Differing Effects on Cell from Three Distinct Zones in the BovineIntervertebral Disc, 83 AM. J. PHYS. MED. REHABIL. 515-21 (2004); J. Yung Lee et al., New Use of a Three-dimensional Pellet Culture System for Human Intervertebral Disc Cell: Initial Characterization and Potential Use for Tissue Engineering, 26 SPINE 2316-22 (2001) を参照されたい。
【００２０】
当業者は、アグリカンを含むプロテオグリカンが唯一の適した軟骨形成マーカーではないことを認識するであろう。本発明の異なった態様において、該少なくとも一つの軟骨形成マーカーは、コラーゲンタイプＩＩ、アグリカン、バーシカン又はフィブロモジュリンのようなプロテオグリカン、ルミカン、ＳＯＸ−９、硫酸化グリコサミノグリカン、軟骨細胞増殖 、細胞凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）、アルカリホスファターゼ、コラーゲンタイプＸ及びそれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択される。
【００２１】
本発明の一つの態様において、該少なくとも一つの生物活性因子はＬＩＭミネラリゼーションプロテイン−１（ＬＭＰ−１）を含んでなる。ＬＭＰ−１は新規の高度に保存された細胞内調節タンパク質であり、出願者により複数のＢＭＰを上方制御することによりプロテオグリカン産生は増加することが示されている。S. T. Yoon et al., ISSLS Prize Winner: ＬＭＰ−１Upregulates Intervertebral Disc Cell Production of Proteoglycans and BMPs In Vitro and In Vivo, 29 SPINE 2603-11 (2004) を参照されたい。ＬＭＰ−１は、プロテオグリカン又は他の関連細胞外マトリックス分子を上方制御することによる、変性椎間板の治療の良い候補であることができる。
【００２２】
当業者は、以下に記載した本発明に適した細胞が、少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列により形質転換されてもよいことを疑いの余地なく認識するであろう。少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列は、複数の方法により細胞内へ導入することができる。外因性核酸配列を導入する適した方法は、Sambrook and Russel、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition) , Cold Spring Harbor Press, NY, 2000 、に記載されている。これらの方法には、限定ではなく、例えば、マイクロインジェクション又はエレクトロポレーションのような物理的導入技術；例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションのようなトランスフェクション；例えば、リポソームを使用する膜融合導入；及び、例えば、ＤＮＡ又はレトロウイルスベクターを使用する導入のようなウイルス導入が含まれる。例えば、エレクトロポレーション (例えば、Iversen et al., Electroporation  by nucleofector is the best nonviral transfection technique in human endothelial and smooth muscle cell , GENETIC VACCINES AND THER. 3:2-14 (2005) を参照されたい) のような、適した細胞内へ本発明の核酸配列を導入するための他の方法が、当業者には明らかであろう。すべてのこうした方法は本発明の範囲内である。
【００２３】
一つの態様において、該少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸はウイルスベクターである。本発明に適したベクターには、限定ではないが、プラスミドベクター及びウイルスベクターが含まれる。ウイルス発現ベクター、特に心臓細胞に効率的に形質導入するもの（例えば、アルファウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））は、例えば、Williams and Koch, Annu. Rev. Physiol. 66:49 (2004); del Monte and Hajjar, J. Physiol. 546.1:49 (2003) 、に記載されているように有用である。
【００２４】
一つの態様において、該ベクターは、パルボウイルスファミリーからのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含んでなる。これらのベクターは１９番染色体上の特異的部位に遺伝子材料を挿入し得る。当業者は、ＡＡＶの利点の中で、ＡＡＶは病原性ではなく、及びＡＡＶで治療されたほとんどの人が、該ウイルスを除去するための免疫応答を生じないという事実を認識するであろう。
【００２５】
アデノウイルス及びＡＡＶベクターの両方が、衰えかけている心筋細胞を含む心臓細胞内へ導入遺伝子（望まれたように指示された導入遺伝子を含む）を送達することにおいて効果的であることが示された（例えば、Iwanaga et al., J. Clin. Invest. 113:727（2004); Seth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:16683 (2004); Champion et al.,Circulation 108:2790 (2003); Li et al., Gene Ther. 10:1807（2003); Vassalli et al., Int. J. Cardiol. 90:229 (2003); del Monte et al., Circulation 105:904 (2002); Hoshijima et al., Nat. Med. 8:864 (2002); Eizema et al.,Circulation 101:2193 (2000); Miyamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:793 (2000); He et al., Circulation 100:974 (1999) を参照されたい）。最近の報告は、マウス及びハムスター心筋及び動脈における、１年以上に及ぶ持続性遺伝子発現のためのＡＡＶベクターの使用を示している(Li et al., Gene Ther. 10:1807（2003); Vassalli et al., Int. J. Cardiol. 90:229 (2003)) 。特に、ＡＡＶ血清型６に基づいた発現ベクターが、骨格筋及び心筋の両方に効率的に形質導入することが示されている(例えば、Blankinship et al., Mol. Ther. 10:671 (2004)) 。
【００２６】
該少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列は、当業者には一般に公知の、及び、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed.2001) 及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1994) に記載されている方法により構築することができる。さらに、本発明の少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列は、特にウイルスベクターを含んでなる一つの態様において、複数の方法により、最も特別には、例えば、J. M. Coffin, S. H. Hughes & H. E. Varmus (eds.), Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press 、のようなパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞株を使用することにより産生することができる。
【００２７】
レトロウイルスを産生するための、及びインビトロ又はインビボで細胞を感染させるための他の方法は、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989),Sections 9.10-9.14 に記載されている。本発明の少なくともいくつかの態様において、形質転換の効率を増加させる様式で核酸配列を製剤することが有利であろうことを当業者は疑いの余地なく認めるであろう。ほんの一例として及び何らかの限定ではなく、該核酸配列はリポソーム中に入れることができる。リポソームは、例えば、Epstein et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 米国特許第４，４８５，０４５号及び米国特許第４，５４４，５４５号、に記載されているような当該技術分野では公知の方法により製造することができる。増強された循環時間を有するリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００２８】
プロテオグリカン及びＢＭＰ上方制御を刺激するためのＬＭＰ−１の研究は、以前は椎間板細胞又は骨髄細胞にのみ焦点を当てていた。しかしながら、本発明はこれらの細胞タイプのみに限定されない。例えば、異なったタイプの多分化能性細胞のような、複数の細胞タイプが本発明に有用である。多分化能性細胞は体内の多様な組織源から誘導し得る。異なった態様において、細胞集団は生きているドナー又は死体組織源から単離することができる。こうした組織源には、限定されるわけではないが、脂肪組織、筋組織、末梢血、臍帯血、血管、骨格筋、皮膚、肝臓及び心臓が含まれる。本発明の実施において、細胞源は、全細胞濃縮された細胞、濾過された細胞、分離された細胞及び組織源から単離された及び培養増殖された細胞集団を含むことができる。
【００２９】
一つの態様において、該複数の細胞のメンバーは骨髄細胞である。これらの細胞は利用できる供給源から容易に入手可能であり、及び最少の罹患率でヒトドナーから採取し得る。もし骨髄細胞が本発明の実施に使用されるならば、細胞源は全骨髄、濃縮された骨髄、濾過された骨髄、分離された骨髄細胞及び骨髄源から単離された及び培養増殖された細胞集団を含むことができる。とりわけ、骨髄は間葉細胞の集団を含有する。軟骨内へ移植されたヒト間葉系幹細胞は軟骨細胞への部位特異的分化を起こすことができることが報告されている。K. W. Liechty et al., Human Mesenchymal Stem Cells Engraft and Demonstrate Site-specific Differentiation After In Utero Transplantation in Sheep, 6 NAT. MED. 1282-6 (2000) 、を参照されたい。重要なことは、ヒト骨髄細胞を使用することは、自己又は同種間椎間板細胞採取の実際的な問題を取り除き、臨床的移植手順における細胞調製に必要とされる時間を非常に短縮する。
【００３０】
成人骨髄細胞はインビトロ及びインビボで、軟骨細胞へ分化することが示されている。D.J. Prockop, Marrow Stromal Cells as Stem Cells for Nonhematopoietic Tissues、 276 SCIENCE 71-4 (1997); M. F. Pittenger et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cell, 284 SCIENCE 143-7（1999); P. Bianco et al., Bone Marrow Stromal Stem Cells: Nature, Biology, and Potential Applications, 19 STEM CELLS 180-92 (2001) を参照されたい。軟骨形成遺伝子を発現させる成人骨髄細胞の工学処理は報告されており、生体内原位置でそれらの分化を軟骨に方向付けし、それ故に軟骨を修復する。N. Adachi et al., Muscle Derived, Cell Based Ex Vivo Gene Therapy for Treatment of Full Thickness Articular Cartilage Defects, 29 J. RHEUMATOL. 1920-30 (2002); Y. Gafni et al., Stem Cell as Vehicles for Orthopedic Gene Therapy, 11 GENE THER. 417-26 (2004) 、を参照されたい。ＢＭＰは間葉系幹細胞の骨形成分化を促進することができるが、椎間板内の無血管性及び低酸素圧環境のため、間葉系幹細胞は軟骨細胞へより分化しやすいようである。D.A. Puleo, Dependence of Mesenchymal cell Responses on Duration of Exposure to Bone Morphogenetic Protein-2 In vitro , 173 J. CELL. PHYSIOL. 93-101(1997); O. Fromigue et al., Bone Morphogenetic Protein-2 and Transforming Growth Factor-beta2 Interact to Modulate Humans Bone Marrow Stromal Cell Proliferation and Differentiation, 68 J. CELL. BIOCHEM. 411-26 (1998); A. H. Reddi, Bone Morphogenetic Proteins, Bone Marrow Stromal Cell, and Mesenchymal Stem cell : Maureen Owen Revisited, 1995 CLIN. ORTHOP. 115-9; M. K. Majumdar et al., BMP-2 and BMP-9 Promotes Chondrogenic Differentiation of Human  Multipotential  Mesenchymal cells and Overcomes the Inhibitory Effect of IL-1, 189 J. CELL. PHYSIOL. 275-84 (2001) を参照されたい 。
【００３１】
要約すると、ヒト骨髄細胞は、ＬＭＰ−１により誘導される可能性を有し、複数のＢＭＰを上方制御することによりプロテオグリカン及び他の軟骨形成マーカーの合成を増加させる。それ故、これらの細胞は、椎間板変性についての、生体外遺伝子療法のよい候補である。
【００３２】
従って、関節又は椎間板内へ移植された場合か又は生体外で維持される場合に、もし骨髄、特にヒト骨髄を軟骨細胞を選択的に分化させるように刺激することができたら、それは有効な療法剤として使用することができる。
【００３３】
本発明の複数の細胞のメンバーは、自家源のみからならず、同種源から、又は異種源からさえも誘導することができる。しかしながら、複数の細胞のメンバーの自家源を使用することが、本発明の組成物に対する免疫応答及び他の歓迎されない副作用の機会を最少にするであろうことを当業者は理解するであろう。
【００３４】
椎間板内に移植された場合、ＬＭＰ−１増強骨髄細胞は椎間板変性を休止及び／又は逆行させることができる。出願者は、ＬＭＰ−１で骨髄を増強することにより、療法的軟骨形成マトリックスが形成されることを決定した。一つの特定の態様において、もし傷害を受けた椎間板内へ移植されたら、椎間板を修復することが可能である。
【００３５】
本発明の一つの態様において、上記のようにＬＭＰ−１で形質転換された骨髄細胞及び間葉細胞を、傷害を受けた椎間板内へ入れた場合、生体内原位置で軟骨への間葉系幹細胞の分化を方向付ける遺伝子を発現することができ、それ故に衰えかけている椎間板の軟骨を修復する。さらに、プロテオグリカン、特にアグリカンの上方制御は、さらなるタンパク質分解から椎間板を保護するであろう。
【００３６】
当業者は、本発明に従った複数の細胞を作製するため、細胞を採取するいくつかの方法が存在することを疑う余地なく理解するであろう。例えば、間葉細胞富化分画を含む骨髄細胞は、以下の「実施例」の節に記載されているように採取することができる。別の態様において、該細胞は脂肪組織から誘導することができる。もしこの態様が選択されたら、細胞は米国特許第２００５０２８２２７５号(Katz) に記載されている条件下で精製する及び培養することができる。簡単には、軟骨形成分化のためには、好ましくは、細胞を高密度（例えば、約数百万細胞／ｍｌ、又はマイクロマス培養技術を使用して）で、及び少量の血清存在下（例えば、約１％〜約５％）で培養する。さらに、細胞を所望の形に増殖させるため、スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）上で培養することも可能である。半月板修復の治療のために有用なこうした方法の適した非制限例は、例えば、米国特許第２００５０２３４５４９ 号(Kladakis) に記載されている。さらに、該細胞をバイオリアクター、例えば、米国特許第６，８７５，６０５号に開示されているバイオリアクターで培養することができる。
【００３７】
上で議論したように、本発明の複数の細胞のメンバーの軟骨形成細胞への分化のために培養条件は重要である。高密度、例えば、約１０５〜約１０７細胞／ｍＬでの播種及び低酸素圧下、例えば、約１％〜約５％の間のＯ２で培養することは、複数の細胞の培養されたメンバーが軟骨形成系列へ入るのを刺激することにおいて役割を果たしている。さらに、当業者は、対象への導入に先立って静水圧下で複数の細胞を培養することが有利であるのを発見するであろう；ここで静水圧は日常生活の正常活動度の物理的刺激を模倣する。一つの態様において、静水圧は約１〜約１０ＭＰａの範囲である。
【００３８】
さらに、当業者は、完全に分化していない複数の細胞のメンバーを、それらを必要とする対象に投与することができることを理解するであろう。対象体内の配置領域の特定の物理的及び化学的特性は、完全に分化していない複数の細胞のメンバーを軟骨細胞又は軟骨細胞様細胞に分化させ、及びそれにより対象の軟骨を修復する、又は形成させる。これらの物理的及び化学的特性は、圧縮力、せん断力、低酸素圧（約１％〜約５％の間）、比較的に高い圧力である。こうした条件の組み合わせの適した非制限例には、１,８００サイクル／日又は７,２００サイクル／日の、５ＭＰａへの正弦波静水圧縮が含まれる。Elder et al., Cyclic hydroststic compression stimulates chondroinduction of C3H/10T1/2 cells. BIOMECH MODEL MECHANOBIOL . 3(3):141-6 (2005). Epub Jan 25, 2005 。関節及び椎間板はこうした特性を有し、そしてそれ故、対象に投与された時点で、もし複数の細胞のメンバーが完全に分化していなければ、複数の細胞のメンバーを刺激して軟骨細胞又は軟骨細胞様細胞へ分化させるであろう。
【００３９】
当業者は、本発明の組成物が少なくとも一つの添加物をさらに含んでなることができることを認識するであろう。該少なくとも一つの添加物の適した例には、限定ではなく、潤滑剤、抗炎症剤、抗生物質、鎮痛剤及びそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００４０】
適した潤滑剤の例には、限定ではなく、ヒアルロン酸、ヒアルロナン、ラブリシン、ポリエチレングリコール及びそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。適した抗炎症性化合物には、ステロイド系及び非ステロイド系構造両方の化合物が含まれる。ステロイド系抗炎症性化合物の適した非制限例は、ヒドロコルチゾン、コルチゾール、ヒドロキシトリアムシノロン、アルファメチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロゾン、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロソン、フルオシノロン、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステルのバランス、クロロプレドニゾン、酢酸クロルプレドニゾン、クロコルテロン、クレスシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ハイドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロンのような副腎皮質ステロイドが含まれる。上記ステロイド系抗炎症性化合物の混合物も使用し得る。
【００４１】
非ステロイド系抗炎症化合物の非制限例には、ナブメトン、セレコキシブ、エトドラク、ニメスリド、アパソン、金、ピロキシカム、イソキシカム、メロキシカム、テノキシカム、スドキシカム及びＣＰ−１４，３０４のようなオキシカム；アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリライセート、サファピリン、ソルプリン、ジフルニサル及びフェンドサルのようなサリチル酸；ジクロフェナク、フェンクロフェナック、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパク、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセメタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナク及びケトロラクのような酢酸誘導体；メフェナミック、メクロフェナミック、フルフェナミック、ニフルミック及びトルフェナミック酸のようなフェナム酸塩；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン及びチアプロフェニックのようなプロピオン酸誘導体；及びフェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン及びトリメサドンのようなピラゾールが含まれる。
【００４２】
このグループに包含される多様な化合物は当業者には公知である。非ステロイド系抗炎症性化合物の化学構造、合成、副作用その他の詳細な開示は、Anti-inflammatory and Anti-Rheumatic Drugs、K. D. Rainsford, Vol. I-III, CRC Press, Boca Raton, (1985), 及び Anti-inflammatory Agents, Chemistry and Pharmacology 1, R. A. Scherrer, et al., Academic Press, New York (1974) （各々が本明細書において援用される）を含む標準テキストを参照することができる。
【００４３】
これらの非ステロイド系抗炎症性化合物の混合物、ならびにこれらの化合物の薬学的に許容できる塩及びエステルも用いることができる。
加えて、いわゆる「天然の」抗炎症性化合物が開示された発明の方法において有用である。こうした化合物は、天然源（例えば、稙物、菌、微生物の副産物）から適した物理的及び／又は化学的単離により、抽出物として適切に得ることができる。こうした化合物の適した非制限例には、カンデリラろう、アルファビサボロール、アロエベラ、マンジスタ（アカネ属の植物、特定的にはクルマバアカネから抽出された）及びグッグル（コンミフォラ属の植物、特定的にはグッグルから抽出された）、コーラ抽出物、カモミール、ムチヤギ抽出物、グリシレチン酸、グリチルリチン酸及びそれらの誘導体（例えば、塩及びエステル）を含む甘草の化合物（稙物属／種グリシリザ・グラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ））のファミリーが含まれる。上記の化合物の適した塩には、金属及びアンモニウム塩が含まれる。適したエステルには、酸のＣ２〜Ｃ２４、好ましくはＣ１０〜Ｃ２４、より好ましくはＣ１６−Ｃ２４飽和又は不飽和エステルが含まれる。上記の具体的例には、油溶性甘草抽出物、グリチルリチン酸及びグリチルリチン酸それら自身、グリチルリチン酸一アンモニウム、グリチルリチン酸一カリウム、グリチルリチン酸二カリウム、１−ベータ−グリチルリチン酸、グリチルレチン酸ステアリル及び３−ステアリルオキシ−グリチルレチン酸及び３−スクシニルオキシ−ベータ−グリチルレチン酸二ナトリウムが含まれる。
【００４４】
一般に、抗炎症性非ステロイド系薬剤は、それらが疼痛の軽減を提供するので、「鎮痛薬」の定義に含まれる。しかしながら、本開示において、抗炎症性非ステロイド系薬剤は抗炎症化合物の定義に含まれる。従って、本開示の目的には、用語「鎮痛薬」の定義に抗炎症化合物は含まれない。それ故、適した鎮痛薬には、例えば、オピオイド（例えば、モルヒネ及びナロキソンのような）、局所的麻酔薬（例えば、リドカインのような）、グルタミン酸レセプターアンタゴニスト、α−アドレナリンレセプターアゴニスト、アデノシン、カナビノイド、コリン作動性及びＧＡＢＡレセプターアゴニスト及び異なる神経ペプチドのような他のタイプの化合物が含まれる。異なった鎮痛薬の詳細な議論は、その内容が本明細書において援用されるSawynok et al., (2003) Pharmacological Reviews, 55:1-20 、に提供されている。
【００４５】
適した抗生物質には、限定されるわけではないが、ニトロイミダゾール抗生物質、テトラサイクリン、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、アミノグリコシド、マクロライド抗生物質、リンコサミド抗生物質、４−キノロン、リファマイシン及びニトロフラントインが含まれる。適した具体的化合物には、限定されるわけではないが、アンピシリン、アモキシシリン、ベンジルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、バカンピシリン、ピバンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、オキサシリン、ピペラシリン、チカルシリン、フルクロキサシリン、セフロキシム、セフェタメト、セフェトラム、セフィキシン、セフォキシチン、セフタジジム、セフチゾキシム、ラタモキセフ、セフォペラゾン、セフトリアキソン、セフスロジン、セフォタキシム、セファレキシン、セファクロール、セファドロキシル、セファロチン、セファゾリン、セフポドキシム、セフチブテン、アズトレオナム、チゲモナム、エリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、パルジマイシン、リンコマイシン、バンコマイシン、スペクチノマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、オルニダゾール、アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ノルフロキサシン 、オフロキサシン、テマフロキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ロリテトラサイクリン、ニトロフラントイン、ナリジクス酸、ゲンタマイシン、リファンピシン、アミカシン、ネチルミシン、イミペネム、シラスタチン、クロラムフェニコール、フラゾリドン、ニフロキサジド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、次サリチル酸ビスマス、コロイド性次クエン酸ビスマス、グラミシジン、メシリナム、クロキシキン、クロルヘキシジン、ジクロロベンジルアルコール、メチル−２−ペンチルフェノール又はそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【００４６】
さらに、細胞外マトリックスの分解を防止する少なくとも一つの試薬を該組成物に加えるか、又は本発明の組成物の投与前又は後の短い時間（例えば、８時間以内、又は４時間以内、又は２時間以内、又は１時間以内）に該組成物と送達することができる。本発明の一つの態様において、該少なくとも一つの試薬はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）下方制御剤である。適したＭＭＰ下方制御剤は当該技術分野で公知であり、限定ではなく、ＯＮＯ−４８１７、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤１（ＴＩＭＰ−Ｉ）、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤２（ＴＩＭＰ−２）、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤３（ＴＩＭＰ−３）、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤４（ＴＩＭＰ−４）、化学修飾テトラサイクリン−３（ＣＭＴ−３）、５−アミノ−２−メルカプト−ｌ，３，４−チアジアゾールに基づいたマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害剤、ドセタキセル、ケルセチン、緑茶抽出物、ＴＮＦ−α阻害剤、ＩＬ−１β阻害剤、ｐ３８阻害剤、プリノマスタット、Ｐ１６、イソフラボン、ＰＣＫ３１４５及びそれらのいずれかの組み合わせが含まれる。これらの化合物のより詳細な記述、ならびに適した非制限的治療プロトコールは、例えば、Kim et al., Inhibition of Matrix  Metalloproteinase-9 Prevents  Neutrophilic Inflammation in Ventilator-Induced Lung Injury, AM. J. PHYSIOL. LUNG CELL MOL PHYSIOL, ２００６年５月１２日、印刷に先立った電子出版; Jamloki et al.,QSAR analysis of some 5-amino-2-mercapto-l,3,4-thiadiazole based inhibitors of matrix metalloproteinases and bacterial collagenase, BIOORG MED CHEM LETT. ２００６年５月６日、印刷に先立った電子出版; Li et al., Antitumor and antimetastatic activities of docetaxel are enhanced by genistin through regulation of osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANK) /RANK ligand/MMP-9 signaling in prostate cancer, CANCER RES.66 (9) : 4816-25 (2006); Vijayababu et al., Quercetin downregulates matrix metalloproteinase 2 and 9 protein expression in prostate cancer cells(PC-3),  MOL CELL BIOCHEM. ２００６年４月２８日、印刷に先立った電子出版; Roomi et al., In vivo and in vitro  antitumor  effect of ascorbic acid, lysine, proline, arginine, and green tea extract on human fibrosarcoma Cells HT-1080, MED ONCOL. 23:105-11 (2006); Sang et al., Matrix metalloproteinase  inhibitors as prospective agents for the prevention and treatment of cardiovascular and neoplastic diseases, CURR TOP MED CHEM. 6:289-316 (2006); Puli et al., Inhibition of matrix degrading enzymes and invasion in human glioblastoma (U87MG) Cells by isoflavones , J NEUROONGOL. ２００６年４月６日、印刷に先立った電子出版, Wang et al., P16 inhibits matrix  metalloproteinase-2 expression via suppression of Sp1-mediated gene transcription, J CELL PHYSIOL. 208:246-52 (2006); Annabi et al., Inhibition of MMP-9 secretion by the anti-metastatic PSP94-derived peptide PCK3145 requires cell surface laminin receptor signalling, ANTICANCER DRUGS, 17:429-438 (2006) を参照されたい。
【００４７】
別の側面において、本発明は、上記のいずれかの態様に従った組成物の有効量を、それらを必要とする対象に投与することを含んでなる、軟骨細胞由来組織を治療する方法を提供する。さらに、該組成物は、薬学的に許容できる坦体又は希釈剤とともに製剤することができる。一つの態様において、該薬学的に許容できる坦体又は希釈剤液体又は半固体である。さらに、該製剤は、筋肉内、静脈内、髄内又は関節内注射に適していることができる。
【００４８】
該組成物は、限定ではなく、対象の身体の所望の部分（例えば、関節又は椎間板）内への注射、外科的設置、筋肉内、静脈内、髄内又は関節内注射又はそれらのいずれかの組み合わせを含む、いくつかの手段により送達することができる。外科的設置は、スキャットホールド上で増殖させ、そしてそれ故、適した形状に形成された細胞について特に適している。
【００４９】
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列の有効量を、それらを必要とする対象に投与することを含んでなる、軟骨細胞由来組織の治療の方法を提供する。この態様において、該少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる核酸配列は、治療が必要とされる対象の体の部分内への直接注射により送達することができる。もしくは、該核酸配列は治療が必要とされる対象の体の部分に位置されたデポーから分配することができる。さらに、上記のように、該核酸配列は、少なくとも一つの生物活性因子をコードする核酸配列を含んでなる。
【実施例】
【００５０】
実施例１
単一の理論に縛られるのを望むわけではないが、もし移植された骨髄細胞をＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ−９のような他のＢＭＰ、あるいは椎間板マトリックスでさえも産生するようにＬＭＰ−１により誘導することが可能であれば、これらの細胞は、椎間板変性の生体外療法のための細胞の実際的供給源を意味することができる。以下に議論するように、出願者は、ヒトドナーからの骨髄細胞を、ＬＭＰ−１の過剰発現によりプロテオグリカン及びＢＭＰを産生するように刺激できるかどうかを試験するために実験を実施した。
【００５１】
ヒト骨髄細胞の調製
ヒト骨髄及び一致した末梢血を、Cambrex Bio Science Walkersville INC を介して３人の女性（年齢２１、２５及び３５歳）から集めた。本研究は、human subjects Institutional Review Board により承認された。骨髄は骨髄バイオプシー針により、後方腸骨稜から得られた。抗凝固剤としてのヘパリン中の骨髄液、３０ｃｍ３容量を吸引するため複数回通過させた。加えて、クエン酸を抗凝固剤として使用して、同一のドナーからおよそ６０ｃｍ３の末梢血を得た。採取２４時間以内に、Ｍａｇｅｌｌａｎシステム(Medtronic Sofamor Danek, Memphis, TN)において骨髄及び末梢血を混合し及び遠心分離した。細胞は標準装置プロトコールに従って遠心分離した。濃縮されたヒト骨髄細胞を回収すると、それは間葉細胞富化層を含んでいた。細胞数は、血球計数器及びＨｅｍａｖｉｔ  ｃｏｕｎｔ (CDC Tech INC, Oxford, CT) を使用して対照ウェルを計数することにより決定した。
【００５２】
細胞培養及びＡｄ−ｆ３５−ＬＭＰ１アデノウイルストランスフェクション
ＣＭＶプロモーターにより駆動されるヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡを運んでいる血清型３５ファイバー（Ｆ３５）を有する、複製欠損タイプ５アデノウイルスは、Medtronic Sofamor Inc. により提供された。このキメラアデノウイルスはＣＡＲレセプターとは独立した機構を介してヒト細胞に感染することが可能であり、及びより高い感染性を有していると考えられている。ウイルス量は、感染効率（ＭＯＩ）、細胞当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）として表現された。
【００５３】
濃縮骨髄細胞を、０．５ｍｌの無血清ＡＭＥＭ／Ｆ１２間葉幹細胞培地(Cambrex, Walkersville, MD) 中、３７℃で３０分の期間、Ａｄ−ｆ３５−ＬＭＰ１ウイルスの異なったＭＯＩ（３．３、１０、３３及び１００）で感染させた。対照として働いたウイルス群はなかった。各チューブに４００,０００細胞及び各処置群について６チューブ及び対照チューブを準備した。追加の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する１．５ｍｌの培地を有する６ウェルプレートに（ウェル当たり４００,０００細胞及び各処置群について６ウェル及び対照群）細胞を播種した。細胞は、加湿しながら６日間、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。第６日目、各処置群の３つのプレート及び対照群の細胞及び培地を合併した。遠心分離後、培地をプロテオグリカンアッセイ及び細胞をＲＮＡ抽出のために集めた。
【００５４】
プロテオグリカンアッセイ
培養培地のプロテオグリカン（ＰＧ）含量は、１,９ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイを使用してアッセイした。各ウェルからの培地の２０マイクロリットル（２０μｌ）を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で２００μｌのＤＭＭＢ色素溶液と穏やかに混合し、すぐに吸光度（ＯＤ）を５２０ｎｍの波長で検査した。検量線は硫酸コンドロイチン(Sigma Chemical, St. Louis, MO) の一連希釈液を使用して作成した。培地中のＰＧ含量は、対照に対するＡｄＯ  ５−ＬＭＰ１処置サンプルの増加倍量として定義された。
【００５５】
逆転写及びリアルタイムＰＣＲ
製造元(Ambion inc., Austin, TX, U.S.A.) により特定されているようにＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  Ｋｉｔを使用して、第６日目にＲＮＡを単離した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅ(Ambion, Inc., Austin, TX, U.S.A.) で処理して、サンプルのＤＮＡ夾雑を除去した。単離されたＲＮＡの濃度はＲＮＡ６０００  Ｎａｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ(Agilent  Technologies, Waldbronn, Germany) で決定した。逆転写は、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｔｉｏｎ試薬(Applied Biosystem,Foster city, CA) ：２．５μｌの５０Ｕ／μｌ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素；２μｌの２０Ｕ／μｌ  Ｒｎａｓｅ阻害剤；２２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣ１２溶液；５μｌの５０μＭ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ；１０μｌの１０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、及びｄＵＴＰと混合した１２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ；を使用し、５００ｎｇの全ＲＮＡを有する１００μｌ容量中で実施した。反応条件は、２５℃で１０分、４８℃で３０分及び９５℃で５分であった。ＤＮＡ夾雑がないことを確認するため、逆転写酵素で処理していないＲＮＡサンプルもＰＣＲにかけた：ＰＣＲ産物がないことでＤＮＡ夾雑がないことが確認される。
【００５６】
ＬＭＰ−１、アグリカン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ−９のｍＲＮＡレベルは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Applied Biosystem, Foster City, CA） を使用するリアルタイムＰＣＲ法で決定した。２５マイクロリットル（２５μｌ）の反応容量は、５μｌの各サンプルのｃＤＮＡ、３．７５ピコモルのプライマー及び１２．５μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを含んでいた。リアルタイムＰＣＲはＧｅｎｅ  Ａｍｐ；５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム(Applied Biosystem, Foster City, CA) を使用し、以下の３工程プロトコールで実施した；工程１：５０℃で２分、工程２：９５℃で１０分、及び工程３：（９５℃で１５秒、６０℃で１分）ｘ４０サイクル。増幅特異性を確認するため、ＰＣＲ産物を解離曲線分析にかけた。各反応の閾値サイクル（Ｃｔ）を、以前に記述されている比較−ΔΔＣｔ法を使用する１８Ｓに従って規格化した。S. T. Yoon et al., ISSLS Prize Winner: ＬＭＰ−１Upregulates Intervertebral disc Cell Production of Proteoglycans and BMPs In vitro and In vivo , 29 SPINE 2603-11 (2004) を参照されたい 。すべての遺伝子のためのプライマーは、アガロースゲル上の生成物サイズを決定することにより、及びアンプリコンのＤＮＡ配列決定により確認した。
【００５７】
統計解析
全実験は３人の異なったヒトドナーで６回繰り返し、類似の結果を得た。すべてのデータは対照に対する比として表されている。両側スチューデント検定を、ｐ値を計算するために使用した。データは平均±ＳＥＭとして表されている。Ｐ＜０．０５を統計的有意差のためのカットオフポイントとして使用した。
【００５８】
ＤＭＭＢアッセイは、対照群と比較して、プロテオグリカン産生がＭＯＩ３．３、１０、３３及び１００でそれぞれ１．３５、１．５８、１．３９及び１．４６倍相加したことを示した（図１）。ＭＯＩ１０で有意な増加があった（Ｐ＜０．０５）。
【００５９】
リアルタイムＰＣＲデータは、対照群と比較して、ＬＭＰ−１のｍＲＮＡレベルが用量応答様式で増加した；ＭＯＩ３．３、１０、３３及び１００でそれぞれ３．２８、１２．７９、１８．９９及び１７．６５倍；ＭＯＩ１０、３３及び１００で有意な増加があった（Ｐ＜０．０５）（図２）。
【００６０】
対照群と比較して、アグリカンのｍＲＮＡレベルは、ＭＯＩ３．３、１０、３３及び１００でそれぞれ１．２１、２．６１、１．７８及び１．２６倍増加した；増加はＭＯＩ１０で有意であった（Ｐ＜０．０５）（図３）。
【００６１】
対照群と比較して、ＢＭＰ−２のｍＲＮＡレベルは、ＭＯＩ３．３、１０、３３及び１００でそれぞれ１．０５、２．０３、１．１５及び１．０２倍増加した；増加はＭＯＩ１０で有意であった（Ｐ＜０．０５）（図４）。
【００６２】
対照群と比較して、ＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルは、ＭＯＩ３．３、１０、３３及び１００でそれぞれ０．８８、１．７２、０．９５及び０．７８倍増加した；増加はＭＯＩ１０で有意であった（Ｐ＜０．０５）（図５）。
【００６３】
最後に、対照群と比較して、ＢＭＰ−９のｍＲＮＡレベルは、ＭＯＩ３．３、１０、３３及び１００でそれぞれ１．２３、２．９８、１．３６及び０．８７倍増加した；増加はＭＯＩ１０で有意であった（Ｐ＜０．０５）（図６）。
【００６４】
結論
ＬＭＰ−１の過剰発現は、ウサギ椎間板細胞においてＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７を上方制御することにより、プロテオグリカン産生を増加させることはすでに示されている。本明細書で示された研究は、非椎間板細胞で、特にヒト骨髄細胞を使用して非常に類似した結果を示した。
【００６５】
加えて、ＬＭＰ−１により上方制御されたＢＭＰ−９  ｍＲＮＡレベルはこの研究により最初に検出された。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−９はヒト多分化能間葉細胞の軟骨形成分化を促進し、及びＩＬ−１の阻害効果を克服することが報告されている。M. K. Majumdar et al., BMP-2 and BMP-9 Promotes Chondrogenic Differentiation of Human Multipotential Mesenchymal Cells and Overcomes the Inhibitory Effect of IL-1, 189 J. CELL. PHYSIOL. 275-84 (2001) を参照されたい。それ故、複数のＢＭＰの上方制御は、プロテオグリカンの合成において重要な役割を果たし、ヒト骨髄細胞の軟骨形成分化を導く。
【００６６】
要約すると、ヒト骨髄細胞はＬＭＰ−１により誘導される可能性を有し、複数のＢＭＰを上方制御することによりプロテオグリカンの合成を増加させる。それ故、これらの細胞は、限定されるわけではないが、生体外遺伝子療法を含む、椎間板変性の細胞療法及び遺伝子療法のためのよい候補である。
【００６７】
本明細書で参照された特許及び科学文献は、当業者が利用可能である知識を確立した。本明細書で引用されたすべての米国特許及び公開された又は未公開の米国特許出願は本明細書によって援用される。本明細書で引用されたすべての公開された外国特許及び特許出願は本明細書によって援用される。本明細書で引用されたすべての他の公表された参照文献、文書、原稿及び科学論文は、本明細書によって援用される。
【００６８】
本発明は、それらの好ましい態様に関して特定的に示されてきたが、形態及び詳細における多様な変更を、特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から離れることなく行うことができることを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、椎間板細胞による硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の産生に対するＡｄ−ｆ３５−ＬＭＰ１の効果を示している棒グラフである。データは対照群についてのｓＧＡＧ値に対して規格化されている（平均±ＳＥＭ、各ｎ＝６）。記号「＊」は対照群に対するＰ＜０．０５を示す。
【図２】図２、椎間板細胞によるＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルに対するＡｄ−ＬＭＰｌ−ＧＦＰの効果を示している棒グラフである。データは対照群についてのｍＲＮＡ発現に対して規格化されている（平均±ＳＥＭ、各ｎ＝６）。記号「＊」は対照群に対するＰ＜０．０５を示す。
【図３】図３は、椎間板細胞によるアグリカンｍＲＮＡレベルに対するＡｄ−ｆ３５−ＬＭＰ１の効果を示している棒グラフである。データは対照群についてのアグリカン値に対して規格化されている（平均±ＳＥＭ、各ｎ＝６）。記号「＊」は対照群に対するＰ＜０．０５を示す。
【図４】図４は、椎間板細胞によるＢＭＰ−２  ｍＲＮＡレベルに対するＡｄ−ＬＭＰｌ−ＬＭＰ１の効果を示している棒グラフである。データは対照群についてのＢＭＰ−２  ｍＲＮＡ発現に対して規格化されている（平均±ＳＥＭ、各ｎ＝６）。記号「＊」は対照群に対するＰ＜０．０５を示す。
【図５】図５は、椎間板細胞によるＢＭＰ−７  ｍＲＮＡレベルに対するＡｄ−ＬＭＰｌ−ＬＭＰ１の効果を示している棒グラフである。データは対照群についてのＢＭＰ−７  ｍＲＮＡ発現に対して規格化されている（平均±ＳＥＭ、各ｎ＝６）。記号「＊」は対照群に対するＰ＜０．０５を示す。
【図６】図６は、椎間板細胞によるＢＭＰ−９  ｍＲＮＡレベルに対するＡｄ−ＬＭＰｌ−ＬＭＰ１の効果を示している棒グラフである。データは対照群についてのＢＭＰ−９  ｍＲＮＡ発現に対して規格化されている（平均±ＳＥＭ、各ｎ＝６）。記号「＊」は対照群に対するＰ＜０．０５を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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