(57)【要約】【課題】表皮成長因子を短く処理するとＣａ２＋流入とＰＬＤ２依存性機序を通じてグルコース−非依存的インシュリン分泌が促進されることを明らかにする。また、本発明は表皮成長因子が正常なまたは糖尿病のあるマウスで血しょうグルコース数値を減少させる新規の分泌促進剤であることを明らかにし、糖尿病で表皮成長因子による治療の可能性を提供すること。【解決手段】本発明者らは短時間に表皮成長因子を処理した場合、Ｃａ２＋の流入とＰＬＤ２−依存的機序を通じてインシュリン分泌をグルコース−非依存的に促進することを明らかにした。さらに本発明者らは表皮成長因子が正常及び糖尿病のあるマウスで血しょうグルコース数値をさげる新規な分泌促進剤であることを明らかにした。【選択図】図６Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮成長因子及び薬学的に許容可能な担体を含有する糖尿病の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記表皮成長因子はグルコース−非依存的に膵臓ベータ−細胞でインシュリン分泌を促進することを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記表皮成長因子は膵臓ベータ−細胞でＣａ２＋の流入とＰＬＰ２活性を通じてインシュリン分泌を促進することを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記表皮成長因子はヒト表皮成長因子であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記表皮成長因子は個体の重量に対して５μｇ/ｋｇ乃至１００μｇ/ｋｇの量で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記表皮成長因子は個体の重量に対して１０μｇ/ｋｇ乃至６０μｇ/ｋｇの量で投与されることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
表皮成長因子を血糖数値調節を必要とする個体に有効量で投与することを含む血糖数値を調節する方法。
【請求項８】
表皮成長因子を血中インシュリン数値調節を必要とする個体に有効量で投与することを含む血中インシュリン数値を調節する方法。
【請求項９】
前記血糖数値調節はグルコース−非依存的に血中インシュリン数値を調節することによって行われることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有効量は個体の重量に対して５μｇ/ｋｇ乃至１００μｇ/ｋｇであることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記有効量は個体の重量に対して１０μｇ/ｋｇ乃至６０μｇ/ｋｇであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記表皮成長因子はヒト表皮成長因子であることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記表皮成長因子は経口、皮下、静脈内または筋肉内に投与されることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１４】
前記個体は糖尿病患者であるか正常的な個体であることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００６年７月１４日付で出願された米国特許出願第６０/８０７，３７４号の全文を優先権主張し、参照として含む。
本発明は、糖尿病の予防または治療剤及び糖尿病の予防または治療法に関する。また、本発明は、血糖数値を調節する製剤及び血糖数値を調節する方法及びほ乳動物でグルコース−非依存的インシュリン分泌を誘導する製剤を確認する方法及び糖尿病または低血糖数値を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓ベータ−細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ β−ｃｅｌｌｓ）の主な機能は血糖変動を制限するために適切な比率でインシュリンを合成して分泌することである。インシュリンが過剰に分泌されると低血糖症（ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）が発生し、分泌が不充分であると糖尿病が発生する。したがって、体内でグルコース−恒常性を確保するために、インシュリン分泌が非常に厳格に統制されることは当然である。インシュリンは膵臓ベータ−細胞の分泌顆粒（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｇｒａｎｕｌｅｓ）で保存され、分泌促進剤（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ）の刺激を受けて細胞外に分泌される。ベータ細胞の活性程度はグルコース、アミノ酸、脂肪酸、神経伝達物質及びホルモンを含む様々な他の刺激剤によって決められる。綿密な研究にもかかわらず、前記刺激対分泌の関係に関する、そしてインシュリン分泌の絶妙の調節を維持する過程は未だに完全に明らかにはなっていない。
【０００３】
糖尿病はすべての世代と集団に渡って最も一般的な内分泌疾患のうちの１つである。糖尿病には２種類の主要形態がある：すべての場合で５〜１０％を占めるインシュリン依存性糖尿病（第１型糖尿病、ＩＤＤＭ）及びほぼ９０％を占めるインシュリン非依存性糖尿病（第２型糖尿病、ＮＩＤＤＭ）である。仮に若年者がいわゆるＭＯＤＹ（若年者糖尿病の成熟発現：ｍａｔｕｒｉｔｙ ｏｎｓｅｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｏｕｎｇ）と呼ばれる第２型糖尿病と診断される場合が増加している傾向にもかかわらず、前記第２型糖尿病は年令の増加と関係がある。前記第１型糖尿病及び第２型糖尿病ともで膵臓ベータ−細胞の破壊や不完全なインシュリン生産及び分泌を通じてインシュリン分泌が減少する。第２型糖尿病患者は典型的に適切な食事療法、体重減量及び運動を通じて治療を始める。
【０００４】
前記第２型糖尿病はインシュリン抵抗及びインシュリン分泌減少が特徴である。前記インシュリン分泌制御は主にグルコースそれ自体で調節されるが、また一連の物質代謝、神経、ホルモン、そして時には薬理的要因が関与する。開始因子（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）は他の刺激が不足する場合にインシュリン分泌を増加させることができるが、増強剤（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）は開始因子、多くの場合、グルコースが存在しなければならない（非特許文献１）。糖尿病治療で引き起こされた低血糖症は深刻な問題を招くとの報告が多い。
【０００５】
表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）は多様な形態の細胞、特に、繊維母細胞及び上皮細胞の増殖のための重要な成長因子である。前記表皮成長因子は、また、先体細胞外分泌（ａｃｒｏｓｏｍａｌｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）及び多様なホルモンの分泌のような分泌症状を誘導することがある。前記一部表皮成長因子は膵臓の発達に所定の役割を果たすと知られている。体外で表皮成長因子及び白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）を処理すると、インシュリンを生産するベータ−細胞群が発生する（非特許文献２）。表皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）はヒト胎児膵臓で発現され、表皮成長因子受容体が欠乏したマウスは非正常的膵臓島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓ）を示す（非特許文献３）。前記表皮成長因子はまた、マウスの膵臓ベータ−細胞のインシュリン量と再生に関係があると見られる（非特許文献４）。また、前記表皮成長因子は膵臓で生産され、糖尿病のある動物では表皮成長因子の循環水準及び表皮成長因子受容体が減少する（非特許文献５）。しかし、インシュリン分泌のような膵臓機能の調整によるグルコース調節と関する表皮成長因子の役割はまだ研究されたことがない。
【０００６】
インシュリン分泌は主に細胞内Ｃａ２＋の上昇によって誘導されるが、多様な蛋白質キナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ）及びホスホリパーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｓ）のような細胞内信号によって調節され得る。例えば、哺乳類のＰＬＤ（ホスホリパーゼＤ）は成長因子を含む多様な信号に対応して多機能性脂質（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｉｐｉｄ）、ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を生産するためにホスファチジルコリンを加水分解する細胞膜結合型酵素（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅ）である（非特許文献６）。前記ホスファチジン酸は多様な生理的症状に関与する細胞内脂質二次伝令（ｓｅｃｏｎｄｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）である。このような発見は作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）に誘導されたＰＬＤ活性が多様な信号症状でどのような役割を担当することも有り得ることを示唆する（非特許文献７）。今まで、２種類の形態の哺乳類ＰＬＤ（ＰＬＤ１及びＰＬＤ２）が複製された。前記ＰＬＤ１及びＰＬＤ２は約５０％の序列相同性を有し、類似の調節性ドメインを含んでいるが、局所化及び調節蛋白質相互作用で差を示す（非特許文献８）。ＰＬＤ活性は多様なトラフィッキング過程（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、特に、細胞外分泌の調節に関与することができる（非特許文献９）。前記ＰＬＤ１及びＰＬＤ２は２段階過程によって肥満細胞で異なる様相の細胞外分泌を調節する（非特許文献１０）。また、ホスファチジン酸はインシュリン細胞外分泌の重要な媒介体である（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＨｅｄｅｓｋｏｖＣＪ ｅｔａｌ．， ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ ６０:４４２−５０９、１９８０
【非特許文献２】Ｂａｅｙｅｎｓ Ｌ ｅｔａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ４８:４９−５７、２００５
【非特許文献３】Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２７:２６１７−２６２７，２０００
【非特許文献４】Ｌｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ５３:６０８−６１５， ２００４;Ｂｒａｎｄ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，ＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ ９１:４１４−４２０， ２００２;Ｓｕａｒｅｚ−ＰｉｎｚｏｎＷＬ ｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４:２５９６−２６０１，２００５
【非特許文献５】Ｂｕｒｇｅｓｓ ＡＷ，Ｂｒ ＭｅｄＢｕｌｌ ４５:４０１−４２４，１９８９;Ｋａｓａｙａｍａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６:７６４４−７６４８，１９８９;Ｋａｓｈｉｍａｔａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ９２３:４９６−５００， １９８７
【非特許文献６】Ｅｘｔｏｎ ＪＨ，Ｂｉｏｃｈｉｍ ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ １４３９:１２１−１３３，１９９９
【非特許文献７】Ｊｏｎｅｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ １４３９:２２９−２４４， １９９９;ＨｏｎｄａＡ， ｅｔａｌ．， Ｃｅｌｌ９９:５２１−５３２， １９９９
【非特許文献８】Ｆｒｏｈｍａｎ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ １４３９:１７５−１８６， １９９９
【非特許文献９】Ｊｏｎｅｓ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ １４３９:２２９−２４４， １９９９
【非特許文献１０】Ｃｈｏｉ ＷＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６８:５６８２−５６８９，２００２
【非特許文献１１】ＭｅｔｚＳＡ， ＢｉｏｃｈｅｍＪ ２７０:４２７−４３５， １９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、インシュリン分泌のような膵臓機能の調整によるグルコース調節に関する表皮成長因子の役割は未だに研究されたことがなく、分泌促進剤（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ）によるＰＬＤの特異な調節は依然として不確実であるという問題があった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、表皮成長因子を短く処理するとＣａ２＋流入とＰＬＤ２依存性機序を通じてグルコース−非依存的インシュリン分泌が促進されることを明らかにした。また、本発明は表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）が正常なまたは糖尿病のあるマウスで血しょうグルコース数値を減少させる新規の分泌促進剤（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ）であることを明らかにし、糖尿病で表皮成長因子による治療の可能性を提示した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一具体例において、表皮成長因子を有効性分として含有する糖尿病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。本発明は表皮成長因子を含有するインシュリン−分泌製剤を提供し、より好ましくは表皮成長因子を含有するグルコース−非依存的インシュリン−分泌製剤を提供する。前記表皮成長因子はグルコース−非依存的に膵臓ベータ−細胞のインシュリン分泌を促進する。また、本発明は個体に表皮成長因子を有効量だけ投与することを含む糖尿病の治療法を提供する。前記表皮成長因子の有効量はインシュリン分泌を開始することができる量である。
【００１１】
本発明の他の一具体例において、本発明は表皮成長因子を含有する血糖数値を調節する製剤及び表皮成長因子を血糖数値調節を必要とする哺乳類個体に有効量だけ投与することを含む血糖数値を調節する方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の一具体例において、本発明は表皮成長因子を含有する糖尿病の診断キット及び表皮成長因子を利用するほ乳動物の糖尿病の診断方法を提供する。より具体的に、前記糖尿病の診断方法は個体の血液サンプルを準備し、抗原−抗体反応で前記血液サンプル内の表皮成長因子の濃度を測定することで行うことができる。
【００１３】
本発明の他の一具体例において、本発明はほ乳動物でグルコース−非依存的インシュリン分泌を誘導する製剤を確認する方法を提供する。前記方法は表皮成長因子を使用することを含む。
【発明の効果】
【００１４】
糖尿病の新しい予防と治療を提供するもので、多くの患者の幸福に繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
下記図面と共に本発明の詳細な説明を参照すると、本発明をさらによく理解することができ、同時に本発明のより完全な理解とそれに伴われる多くの利点が明確になる。
【図１】図１Ａ乃至図１Ｃは、表皮成長因子が速くてグルコース−非依存的にＭＩＮ６細胞でインシュリン分泌を促進することを示す。前記表皮成長因子はグルコースよりさらに速い反応速度で時間及び投与量に応じてＭＩＮ６細胞からインシュリン分泌を促進することを示した（図１Ａ及び１Ｂ）。また、前記表皮成長因子は基本的なグルコース濃度（２．７ｍＭ）でインシュリン数値を増加させ、それだけでなく高いグルコース濃度（１１ｍＭ）でもグルコースに誘導されたインシュリン分泌を増加させた（図１Ｃ）。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、ＭＩＮ６細胞でＣａ２+流入が表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌を媒介することを示す。図２Ａは表皮成長因子が細胞外のＣａ２+流入を促進したことを示し、前記細胞外のＣａ２+流入はＥＧＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を処理すれば減少する。また、図２ＢはＭＩＮ６細胞で表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌がＣａ２+キレート剤によって減少したことを示す。
【図３】図３Ｃ乃至図３Ｄは、ＰＬＤ２が特に表皮成長因子−依存性インシュリン分泌に関与することを示す。ＰＬＤは表皮成長因子の刺激によって迅速に（２分内）活性化される（図３Ａ）。表皮成長因子−依存性インシュリン分泌は１−ブタノール、ＰＬＤ阻害剤を処理した場合に抑制されるが、対照群のｔ−ブタノールを処理した場合には抑制されなかった（図３Ｂ）。また、ＰＬＤ２は排他的に表皮成長因子−依存性インシュリン分泌を媒介し、ＰＬＤ１の過発現は制限された効果を示した（図３Ｃの上段部分）。また、ＰＬＤ２の不活性化は表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌を無くし（図３Ｄの上段部分）、ＰＢｔ形成で測定された表皮成長因子−依存性ＰＬＤ活性がＰＬＤ２過発現または不活性によって排他的に調節される（図３Ｃ、図３Ｄの下段部分）。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、Ｃａ２+流入が表皮成長因子で誘導されたＰＬＤ活性に重要であることを示す。図４はＥＧＴＡまたはＢＡＰＴＡ/ＡＭを使用してＣａ２+流入を遮断することで大部分のＰＬＤ活性が抑制されることを示す。また、図４ＢはＰＬＤアイソザイムを不活性化させることによってＰＬＤ活性を抑制することが表皮成長因子−依存性Ｃａ２+流入にほとんど効果がなかったことを示す。この時、ＰＬＤｓの不活性か否かはウェスタンプロットを通じて確認した。
【図５】図５Ａ乃至図５Ｃは、インシュリン分泌がマウス膵臓島でＣａ２+流入とＰＬＤ活性を通じて表皮成長因子によって増加することを示す。図５Ａは表皮成長因子がインシュリン分泌を迅速に増加させたことを示す。図５Ｂ及び５ＣはＣａ２+流入またはＰＬＤ活性を抑制すると表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌が完全に遮断されることを示す。
【図６】図６Ａ乃至図６Ｅは、表皮成長因子が血しょうグルコース数値を下げて血しょうインシュリン数値を増加させることを示す。図６Ａは表皮成長因子（５０ｇ/ｋｇ）のグルコース−降下効果がインシュリンにも類似の効能があり、投与量に依存的であることを示す。また、図６Ｂは表皮成長因子とグルコース（０．５ｇ/ｋｇ）とも血しょうインシュリン数値を増加させることを示す。図６Ｃはグルコースを経口投入した場合、食塩水を処理した場合に比べて血しょう表皮成長因子数値が上昇することを示す。また、図６Ｄ及び６Ｅは表皮成長因子がまた肥満のｄｂ/ｄｂ型マウスで血しょうグルコースを減少させ、血しょうインシュリン数値を増加させる可能性があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
下記本発明の詳細な説明と添付した図面を参照すると本発明をさらによく理解することができ、同時に本発明のより完全な理解とそれに伴われる多くの利点が明確になる。
【００１７】
表皮成長因子（ＥＧＦ）は膵臓で合成され、糖尿病のある動物は低い水準の表皮成長因子を有している。それにもかかわらず、グルコース恒常性のような膵臓の主な機能を調節することにおいて表皮成長因子の役割は未だに研究されたことがない。これに本発明は表皮成長因子が膵臓ベータ細胞株だけでなく、マウス膵臓島でもインシュリン分泌を迅速に増加させることを開示している。このような事実はＣａ２＋流入とＰＬＤ活性、特にＰＬＤ２によるものである。これはｓｉＲＮＡとＰＬＤアイソザイム（ｉｓｏｚｙｍｅｓ）の過発現のような分子的操作（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ）と薬理的遮断剤を使用して決められた。また、表皮成長因子は血しょうインシュリン数値を増加させ、正常または糖尿病のあるマウスでグルコース降下を媒介した。これに、まず、本発明は表皮成長因子が血しょうグルコース数値を調節する新規の分泌促進剤で、糖尿病の予防または治療用製剤という端緒を提供する。
【００１８】
本発明の一具体例において、本発明は表皮成長因子及び薬学的に許容可能な担体を含有する糖尿病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。より具体的に、前記表皮成長因子はヒト表皮成長因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であり得る。前記表皮成長因子はグルコース−非依存的に膵臓ベータ−細胞からインシュリン分泌を促進する。前記表皮成長因子は膵臓ベータ−細胞または膵臓島でＣａ２＋流入とＰＬＰ２活性を通じてインシュリン分泌を促進する。
【００１９】
前記表皮成長因子は個体の重量に対して５μｇ/ｋｇ乃至１００μｇ/ｋｇの量だけ投与され、より好ましくは個体の重量に対して１０μｇ/ｋｇ乃至６０μｇ/ｋｇの量だけ投与される。
【００２０】
本発明の他の一具体例において、本発明は表皮成長因子を血糖数値調節を必要とする個体に有効量だけ投与することを含む血糖数値を調節する方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の一具体例において、本発明は表皮成長因子を血中インシュリン数値調節を必要とする個体に有効量だけ投与することを含む血中インシュリン数値を調節する方法を提供する。
【００２２】
前記個体に血糖数値を調節したり血中インシュリン数値を調節する方法において、前記血糖数値を調節することはグルコース−非依存的に血中インシュリン数値を調節することによって行われる。前記表皮成長因子はヒト表皮成長因子であってもよい。前記有効量は個体の重量に対して５μｇ/ｋｇ乃至１００μｇ/ｋｇだけであり、より好ましくは個体の重量に対して１０μｇ/ｋｇ乃至６０μｇ/ｋｇだけである。前記表皮成長因子は経口、皮下、静脈内または筋肉内に投与される。前記個体は糖尿病患者であるか正常個体である。
【００２３】
本発明の薬学的組成物またはそのそれぞれの活性成分の服用形態は精製、カプセル（軟質カプセル、マイクロカプセル）、パウダー、顆粒、シロップなどのような経口投与形態;及び注射（皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射など）、外部塗布形態（鼻腔噴霧製剤、経皮製剤、軟膏など）、座薬（直腸座薬、膣内座薬）、ペレット、点滴注入などのような非経口投与形態を含む。
【００２４】
本発明の薬学的組成物の投与量はそれぞれの薬品毎に提案された投与量を参照して適切に決められ、個体、年令、個体の体重、現在の臨床状態、投与時間、投与形態、投与方法、薬品の組み合わせなどに応じて適切に選択される。インシュリン増減剤（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）及び抑制剤（ａｎｏｒｅｃｔｉｃ）の服用量は臨床的に使用される投与量に基づいて適切に選択される。例えば、成人糖尿病患者（体重:５０ｋｇ）のインシュリン増減剤投与のために一日投与量は普通０．０１乃至１０００ｍｇ、好ましくは０．１乃至５００ｍｇである。前記投与量は一日に１回乃至複数回投与することができる。
【００２５】
前記表皮成長因子の瞬間的投与（１分）でインシュリン分泌を促進することが可能であり（図１Ａ）、投与された群でのみＣａ２＋数値を増加させることができ（図２Ａ）、これは表皮成長因子が開始因子として機能する可能性があることを示す。また、表皮成長因子はグルコース−依存的インシュリン分泌を促進し（図１Ｃ）、これは表皮成長因子の効果がグルコース−非依存的であることを意味する。グルコースによるインシュリン分泌は５分程度で最高点に、１０分程度で最低点に至り、その後時間が経過することによって徐々に増加する二重的様相を持っている。前記最初様相がグルコース恒常性を確保するインシュリン−依存性過程で重要である（ＣａｕｍｏＡ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ ＪＰｈｙｓｉｏｌ ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ ２８７:Ｅ３７１−３８５， ２００４）。表皮成長因子受容体として媒介されるインシュリン分泌の時間推移は神経細胞で神経伝達物質の分泌と類似し、膵臓ベータ細胞からのグルコース−依存的インシュリン分泌の最初様相に比べて非常に迅速である。表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌はグルコースと比較すると迅速なＣａ２＋流入が必要であり、つまり、グルコース代謝時間によるＣａ２＋流入のために主に３〜４分が必要であり、ＡＴＰ/ＡＤＰ比率変化が遅延された（データ未記載）。インシュリン分泌は、時には細胞膜受容体（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、三量体型Ｇ−蛋白質及び二次伝令物質（ｓｅｃｏｎｄｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）を含む従来信号伝達機序（ｓｉｇｎａｌｉｎｇｃａｓｃａｄｅｓ）を通じて調節することができる（ＲｏｓｅｎｂａｕｍＴ， ｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０:１７５５−１７６２，２００１;Ｉｔｏｈ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２２:１７３−１７６， ２００３;ＭｅａｒｓＤ， ＪＭｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ２００:５７−６６， ２００４）。したがって、表皮成長因子受容体として媒介されるインシュリン分泌調節が合理的でないことではない。これに、表皮成長因子の新たな役割が体内及び体外でインシュリン分泌の開始因子として定義され、これは糖尿病で表皮成長因子の治療の可能性を示唆する。
【００２６】
ＰＬＤは表皮成長因子の刺激によって活性化され、前記活性化はグルコースなどのような他のＰＬＤ−調節分子によるものより非常に迅速な過程である。前記表皮成長因子として媒介されるＰＬＤ活性の根本的な機序は論争の余地がある。そのうち、表皮成長因子−依存的Ｃａ２＋の増加はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化させ、ＰＬＤ活性を誘導する（ＹｅｏＥＪ，ｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７０:３９８０−３９８８， １９９５）。また、他の研究はＣａ２＋流入がＰＬＤ活性と関連があり、ＰＫＣはこのような過程に関与すると示唆した（ＳｕｎＳＨ，ｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ７３:３３４−３４３， １９９９）。しかし、特定アイソザイムのＣａ２＋として媒介されたＰＬＤ活性については限定された研究のみある。本研究で本発明者らは表皮成長因子を処理して膵臓ベータ細胞でＣａ２＋−依存的アイソザイムとしてＰＬＤ２を確認した（図３Ｃ及び３Ｄ）。仮に、ＰＬＤ１及びＰＬＤ２が約５０％の序列相同性を持っていて、類似の調節性ドメインを含んでいても（ＦｒｏｈｍａｎＭＡ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１４３９:１７５−１８６， １９９９）、局所化及び調節蛋白質相互作用で差を示す（Ｍｉｎ ＤＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌｓ １１:３６９−３７８， ２００１;Ｈｉｒｏｙａｍａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９５:１４９−１６４， ２００５）。従来研究ではＰＬＤ１及びＰＬＤ２が２段階過程によって肥満細胞で異なる様相の細胞外分泌を調節するということを示唆する（ＣｈｏｉＷＳ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６８:５６８２−５６８９， ２００２）:微粒子と関連したＰＬＤ１によって調節される細胞周辺への微粒子電位及び形質膜（ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ）と関連したＰＬＤ２によって調節される形質膜と微粒子のＣａ２＋依存性融合。ＰＬＤ１がグルコースで促進されるインシュリン分泌の媒介体と示唆する従来研究とは異なって（ＨｕｇｈｅｓＷＥ，ｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７９:２７５３４−２７５４１， ２００４）、本研究では表皮成長因子刺激がＰＬＤ２活性に必要であった。グルコースによるＰＬＤ１と表皮成長因子によるＰＬＤ２の特異の活性は異なる反応速度を有し、その機序のためにより多くの説明を必要とする。本発明者らはＰＬＤ２−特異抗体を利用したウェスタンブロット（図３Ｃ及び３Ｄ）とＲＴ−ＰＣＲ（データ未記載）を通じてＭＩＮ６細胞からＰＬＤ２を検出した。さらに、本発明者らはＰＬＤ１でないＰＬＤ２が表皮成長因子−依存的インシュリン分泌を媒介するということを決めるために過発現及び不活性（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）戦略を使用した（図３Ｃ及び３Ｄ）。このような結果はグルコースが比較的に遅延された時間推移でＰＬＤ１を通じてインシュリン分泌を促進する反面、表皮成長因子は形質膜に位置したＰＬＤ２を活性化させて形質膜にインシュリン微粒子を嵌め込む（ｐｒｅｄｏｃｋ）迅速な融合を誘導するということを仮定する。本研究はＰＬＤ１及びＰＬＤ２がインシュリン分泌を調節するために異なる経路で媒介することを証明する。ＰＬＤｓが細胞外分泌過程で重要な分子であるので、ＰＬＤｓを研究するとインシュリン分泌���調節機序に関する重要な見解を提供することができる。インシュリン分泌でＰＬＤ１及びＰＬＤ２の異なる調節機序についてはより多くの研究が必要である。
【００２７】
グルコース代謝はＡＴＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅＫ+ チャンネルの閉鎖を招き、その後、形質膜の脱分極によってｖｏｌｔａｇｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅＣａ２＋チャンネルを開放する（ＨｅｎｑｕｉｎＪＣ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ４９:１７５１−１７６０， ２０００）。その結果、細胞質に遊離されたＣａ２＋濃度上昇が初期インシュリン分泌を促進するために必要で、十分になる。前記初期インシュリン分泌は形質膜にインシュリン微粒子を嵌め込む融合によって媒介される（ＭｅａｒｓＤ，ＪＭｅｍｂｒＢｉｏｌ２００:５７−６６， ２００４）。本結果は表皮成長因子で刺激されたＣａ２＋の流入がインシュリン分泌を媒介することを示す（図２Ｂ）。本発明で本発明者らは表皮成長因子で促進されたインシュリン分泌のためにＣａ２＋の流入とＰＬＤ活性が全て必要であることを確認した（図２Ｂ及び３Ｂ）。本発見はＣａ２＋流入がＰＬＤ活性のための上位信号（ｕｐｓｔｒｅａｍｓｉｇｎａｌ）であることを示唆する（図４）。本発明は膵臓ベータ−細胞によるインシュリン分泌において促進剤で誘導されたＣａ２＋流入とＰＬＤ活性の間の密接な関係を示す。
【００２８】
表皮成長因子は膵臓機能を調節し、膵臓及び膵液で生産される（ＨｕｏｔａｒｉＭＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９:１４９４−１４９９，１９９８）。表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）はヒト胎児膵臓（ｈｕｍａｎｆｅｔａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ）で全般的に発現され、表皮成長因子受容体が欠乏したマウスは非正常的膵臓島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔ）の形成を示す。表皮成長因子に属する一部は膵臓発達にある役割を果たす。表皮成長因子はマウスの膵臓ベータ−細胞の再生だけでなくインシュリン量を調節する。さらに、表皮成長因子の欠乏は糖尿病と関連がある：糖尿病のある動物では表皮成長因子または表皮成長因子受容体の数値が肝臓、顎下腺、血しょう、ミルクのような多様な器官または液で減少する（ＴｈｕｌｅｓｅｎＪ， ｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｇｕｌ ２７:１３９−１４４， １９９３）。興味深いことに、前記蛋白質の数値が時々インシュリン治療剤を処理した後に回復し、糖尿病治療中に表皮成長因子及びインシュリンがさらに大きく作用する（ＨｅｎｎｅｓｓｅｙＰＪ， ｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ １２５:９２６−９２９， １９９０）。仮に表皮成長因子がインシュリン分泌を誘導するＧＬＰ−１−依存的信号伝達と混線を示しても（ＭａｃＤｏｎａｌｄＰＥ， ｅｔａｌ．，Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ２７８:５２４４６−５２４５３， ２００３）、表皮成長因子が正確にインシュリン分泌を調節するということを示す研究はない。ＭＩＮ６細胞株（図１）ＲＩＮｍ５Ｆ細胞株（データ未記載）及びマウス膵臓島（図５）から表皮成長因子がインシュリン分泌を促進するという研究結果と一致するように、本発明者らは表皮成長因子が正常、さらに糖尿病のあるマウスで血しょうインシュリン数値を増加させて血しょうグルコース数値を減少させたことを明らかにした（図６）。さらに、本発明者らはグルコースを注入すると生理的表皮成長因子数値が上昇することを知った。このような結果から本発明者らは生理的な表皮成長因子が速かにインシュリン分泌を上昇させ、前記過程が血しょうグルコース数値を短期間に調節するのに重要であると考える。表皮成長因子−依存的インシュリン分泌は体内グルコース恒常性でのグルコースと類似な機能をするようである。ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）、抗体またはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を利用した表皮成長因子の内部（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）数値を減少させることはグルコース及びインシュリン恒常性に関する表皮成長因子の生理的な機能を指示するようになる。ベータ−細胞再生だけでなく、インシュリン分泌に関する表皮成長因子の役割を総合すると、本研究結果は血清表皮成長因子数値が減少する糖尿病の病態生理（ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）をさらによく理解するのに寄与する。また、糖尿病のあるマウスで表皮成長因子が示した効果を通じて表皮成長因子が可能な糖尿病治療剤として利用されることが分かる。
【実施例】
【００２９】
下記の実施例を参照して本発明をさらに詳しく説明する。しかし、下記の実施例はどのような方式でも本発明の範囲を制限すると解釈されてはいけない。
【００３０】
［実験材料］
ＥＣＬ（高感度ケミルミネッセンス法：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）キットをＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）で購入した;デュポンＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で[３Ｈ]ミチスチン酸;ＭＥＲＣＫ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）でシリカゲル６０ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｌａｔｅｓ;インビトロジェン（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）社でＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０及びＬｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ;ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）社でウシ胎仔血清;大熊製薬（ソウル、韓国）社で表皮成長因子;Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）でＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−結合された山羊由来抗ウサギＩｇＧ（ｇｏａｔａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ）及び抗−マウスＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭ;及びモレキュラー・プローブ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）社でＦｌｕｏ−３ＡＭを購入した。ＰＬＤ１とＰＬＤ２ともが識別できる多クローン抗体（ｍＳＴＰ４）は従来方法によって製造した（Ｌｅｅｅｔ ａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ１３４７:１９９−２０４， １９９７）。ＰＬＤ２−特異的抗体は従来方法によって製造した（Ｋｉｍｅｔ ａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ ８５:１２２８−１２３６，２００３）。その他のすべての化合物はＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）社で購入した。
【００３１】
［実施例１：ＭＩＮ６細胞でインシュリン分泌を促進する表皮成長因子］
表皮成長因子は膵臓で生産され、膵臓に効能があり、その循環水準が糖尿病がある場合に変更される（ＢｕｒｇｅｓｓＡＷ， ＢｒＭｅｄ Ｂｕｌｌ４５:４０１−４２４， １９８９;Ｋａｓａｙａｍａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６:７６４４−７６４８， １９８９）。本実施例は表皮成長因子がインシュリン分泌を促進することができるかどうか及び表皮成長因子によるインシュリン分泌がグルコース処理によって増加するかどうかを確認するために行われた。
【００３２】
１．１実験方法
細胞培養：インシュリンを生産するマウス細胞ＭＩＮ６ｍ９を清野進博士（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＫｏｂｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｋｏｂｅ， Ｊａｐａｎ）から提供を受けて、１９から２５継代を使用して３７℃の細胞培養器（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄＣＯ２を５％に調節）でＤＭＥＭ（２５ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％（ｖ/ｖ）ウシ胎仔血清、５０ＩＵ/ｍｌのペニシリン及び５０μｇ/ｍｌのストレプトマイシン含有）培地で培養した。ＭＩＮ６細胞を従来公知の方法によってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥを使用して形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させた。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥを使用することによって形質感染の効率は約３０〜４０％であった。
【００３３】
インシュリン分泌測定：１０〜１５の分離された膵臓島バッチ（ｂａｔｃｈｅｓ）または孔−プレート（１２または２４）で培養した１×１０６ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌを０．２％の牛血清アルブミンが追加されたＫＲＢで２回洗浄した。その後、ＫＲＢ溶液で３７℃、６０分間培養した。本発明者らは同一な実験セットで同一な数の膵臓島を使用した。培養が終わる時、前記溶液をテスト試薬が含まれた新たなＫＲＢに交替し、前記指示された時間培養した。前記培養培地をサンプリングして細胞を除去するために遠心分離した後、上澄み液をＲＩＡ（放射免疫測：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ）キット（Ｌｉｎｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を利用してインシュリン分析に使用した。
【００３４】
統計的分析：実験結果を平均±ＳＥまたは平均±ＳＤで示した（ＰＬＤ活性分析及びインシュリン分泌分析）。平均差の統計的有意性はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔで評価した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意することを示す。
【００３５】
１−２．マウスＭＩＮ６インシュリン種細胞で表皮成長因子のインシュリン分泌テスト
表皮成長因子がインシュリン分泌を促進するかどうかを確認するために、本発明者らはマウスＭＩＮ６インシュリン種（ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ）細胞に表皮成長因子を処理した。表皮成長因子を１分処理した場合、有意的にインシュリン分泌が増加した。表皮成長因子はグルコースよりさらに速い速度でＭＩＮ６細胞から時間及び投与量に応じるインシュリン分泌を促進した（図１Ａ及び図１Ｂ）。特に、表皮成長因子を１〜２分、１．５〜１５ｎＭで処理した場合に効果的であった（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【００３６】
前記ＭＩＮ６細胞を２４孔プレートに移して２４時間培養した。前記細胞を０．２％の牛血清アルブミンが追加されたＫＲＢで２回洗浄した。その後、ＫＲＢ溶液で３７℃、６０分間の培養した。
【００３７】
前記培養が終わる時、前記溶液を無添加（ＮＴ）、１５ｎＭの表皮成長因子（ヒトＥＧＦ、ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＣＡＡ３４９０２）または１１ｍＭのグルコースが含まれた新たなＫＲＢで交替した。そして、０、１、２、５、または１０分間培養した。前記培養培地をサンプリングして細胞を除去するために遠心分離した後、上澄み液をインシュリン数値分析に使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した（図１Ａ）。
＊：無処理された細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合
【００３８】
前記培養が終わる時、前記溶液を表皮成長因子が０、１．５、１５、または１５０ｎＭ含まれた新たなＫＲＢに変えて１分間追加培養した。前記培養培地をサンプリングして細胞を除去するために遠心分離した後、上澄み液をインシュリン数値分析に使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した（図１Ｂ）。
＊：無処理された細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合
【００３９】
１−３．表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌細胞に対するグルコース処理
表皮成長因子によるインシュリン分泌がグルコース処理による付加的なものであるかどうかを確認するために、本発明者らは表皮成長因子によって誘導されたインシュリン分泌に及ぼす高濃度（１１ｍＭ）のグルコース効果を実験した。
【００４０】
表皮成長因子は基本濃度（２．７ｍＭ）のグルコースでインシュリン数値を増加させただけでなく、高濃度（１１ｍＭ）のグルコースでもグルコースによって誘導されたインシュリン分泌を増加させた（図１Ｃ）。
【００４１】
総合すると、前記データを通じてグルコースと同様に表皮成長因子は膵臓ベータ−細胞でのインシュリン分泌開始因子であり、インシュリン分泌に与える表皮成長因子の効果はグルコース−非依存的であることが分かった。
【００４２】
前記培養が終わる時、前記溶液を２．７または１１ｍＭのグルコースを含有して０、１５、または３０ｎＭの表皮成長因子が含まれた新たなＫＲＢに変えて５分間追加培養した。
【００４３】
前記培養培地をサンプリングして細胞を除去するために遠心分離した後、上澄み液をインシュリン数値分析に使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した（図１Ｃ）。
＊または＊＊：２．７または１１ｍＭのグルコースを処理した細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合
【００４４】
［実施例２：ＭＩＮ６細胞で表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌のＣａ２＋流入依存性］
インシュリン分泌のためには細胞内Ｃａ２＋の濃度（[Ｃａ２＋]ｉ）の増加を必要とする（ＢａｒｇＳ ｅｔａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ５１（Ｓｕｐｐｌ１）:Ｓ７４−８２， ２００２）。本実施例は表皮成長因子によって誘導されたインシュリン分泌に対するＣａ２＋流入の効果を確認するために行われた。
【００４５】
２．１[Ｃａ２＋]ｉ測定方法
細胞内Ｃａ２＋数値変化を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を通じてＣａ２＋−敏感性染料（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｙｅ）を利用して測定した。細胞を４０分間常温で２μｌのＦｌｕｏ−３ＡＭでロードした。クレブスーリンゲル重炭酸塩緩衝溶液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ;ＫＲＢ;１２９ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、４．８ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、２．７ｍＭのグルコース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で洗浄した後、細胞を１５分間Ｆｌｕｏ−３ＡＭのない状態で追加培養して、染料を脱エステル化（ｄｅ−ｅｓｔｅｒｉｆｙ）した。染料ローディングによる可能な影響を排除するために、本発明者らは実験の最後にサポニンで数値を標準化した。標準化するために本発明者らは実験が仕上がると残留蛍光（Ｆｏ）数値を測定し、実験条件の蛍光数値（Ｆ）からこれを減算した。アルゴンレーザーを利用してＦｌｕｏ−３ＡＭの励起（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）波長を４８８−ｎｍにし、放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）波長を５１５−ｎｍにした。イメージを２０Ｘ対物レンズが備えられた倒立共焦点顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ;Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）で撮影した。
【００４６】
２．２．表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌でＣａ２＋流入効果
前記ＭＩＮ６細胞をガラス板（ｇｌａｓｓ ｄｉｓｈｅｓ）または２４孔プレートに２４時間平板培養した。前記細胞をＫＲＢ（０．２％のＢＳＡが添加される）で２回洗浄し、ＫＲＢ溶液で３７℃、６０分間の培養した。
【００４７】
前記培養が終わる時、前記溶液をＤＭＳＯに溶かしたＦｌｕｏ−３ＡＭ（１ｍｇ/ｍｌ）が含まれた新たなＫＲＢに変えて１時間追加培養した。前記培養が終わると、前記細胞を無処理したり３０分間のＥＧＴＡを処理し、１５ｎＭの表皮成長因子を処理して培養した。イメージを２０Ｘの対物レンズが備えられた倒立共焦点顕微鏡（ＺｅｉｓｓＬＳＭ ５１０Ｍｅｔａ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ドイツ）で撮影した。標準化するために本発明者らは実験が仕上げされると残留蛍光（Ｆｏ）数値を測定し、実験条件の蛍光数値（Ｆ）からこれを減算した。前記データを平均±Ｓ．Ｅで示し、この時、ｎ=７にした（図２Ａ）。
【００４８】
前記図２Ａで表皮成長因子は細胞外Ｃａ２＋流入を刺激し、これはＥＧＴＡを処理すれば減少し得る。表皮成長因子によって誘導されたインシュリン分泌に対するＣａ２＋流入を説明するために、本発明者らは細胞外Ｃａ２＋流入を遮断するために前記細胞にＥＧＴＡを処理したり、細胞外Ｃａ２＋流入及び細胞内Ｃａ２＋分泌を遮断するために１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ'−テトラ酢酸テトラキス（アセト−オキシメチルエステル）（ＢＡＰＴＡ/ＡＭ）を処理した。
【００４９】
前記培養が終わる時、前記溶液を無処理、ＥＧＴＡまたはＢＡＰＴＡ/ＡＭが含まれた新たなＫＲＢに変えて３０分間の追加培養した後、０または１分間１５ｎＭの表皮成長因子を処理した。前記培養培地をサンプリングして細胞を除去するために遠心分離した後、上澄み液をインシュリン数値分析に使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した（図２Ｂ）。
＊：表皮成長因子を処理した細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合
【００５０】
前記図２Ｂで表皮成長因子によって誘導されたインシュリン分泌がＣａ２＋キレート剤によって減少した。また、前記と同一な結果をＲＩＮｍ５Ｆ細胞でも観察することができた（データ未記載）。総合すると、前記結果を通じて表皮成長因子によって誘導されたインシュリン分泌のためにはＣａ２＋流入が必要であることが分かった。
【００５１】
［実施例３：ＭＩＮ６細胞でＰＬＤ２の表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌媒介］
従来研究はＰＬＤが多様な細胞外分泌を媒介する重要な分子であることを示唆した（Ｊｏｎｅｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ１４３９:２２９−２４４， １９９９;ＣｈｏｉＷＳ ｅｔａｌ．， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １６８:５６８２−５６８９， ２００２;ＭｅｔｚＳＡ ｅｔａｌ．， ＢｉｏｃｈｅｍＪ ２７０:４２７−４３５， １９９０）。
本発明者らは最初にＭＩＮ６細胞でのＰＬＤ活性をテストした。表皮成長因子の刺激によってＰＬＤは迅速に（２分内）活性化された（図３Ａ）。表皮成長因子−依存的インシュリン分泌が１−ブタノール、ＰＬＤ阻害剤を処理した場合は抑制されるが、対照群としてｔ−ブタノールを処理した場合には抑制されなかった（図３Ｂ）。このような結果を通じて表皮成長因子によって誘導されるインシュリン分泌のためにはＰＬＤ活性が必要であることが分かった。また、前記と同一な結果がＲＩＮｍ５Ｆ細胞でも観察された（データ未記載）。
【００５２】
ＰＬＤ構造体：マウスＰＬＤ１またはヒトのＰＬＤ２の全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ｃＤＮＡｓを細胞に形質感染させるためにｐｃＤＮＡ３．１ベクターに連結した。
【００５３】
ＳｉＲＮＡ序列：マウスＰＬＤ１（（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １０９９ｔｏ １１１９、ＡＡＣＡＣＧＵＵＡＧＣＵＡＡＧＵＧＧＵＡＵ、ＳＥＱ ＩＤＮＯ:１）またはＰＬＤ２（（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ２５３９ｔｏ ２５５９、ＡＡＣＵＣＣＡＵＣＣＡＧＧＣＵＡＵＵＣＵＧ、ＳＥＱＩＤ ＮＯ:２）に対応する２１−ｍｅｒ ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎ ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， ＣＯ）で購入した。全てのｓｉＲＮＡ序列のＢＬＡＳＴ検索結果を通じてデータベースである他の序列と有意の相同性はなかった。
【００５４】
細胞でＰＬＤ活性分析：６孔プレートで培養した細胞をＫＲＢで２回洗浄し、ＫＲＢ溶液で３７℃、４時間[３Ｈ]ミチスチン酸で標識した。ＰＢｔ（フォスファチジルブタノール）の形成を測定することによってＰＬＤ活性を評価した（ＫｉｍＪＨ ｅｔａｌ．， ＪＩｍｍｕｎｏｌ １６３:５４６２−５４７０， １９９９）。０．４％の１−ブタノールがある場合、ＰＢｔ斑点の大きさを測定して、１−ブタノールのない場合のＰＢｔ斑点の大きさを減算することでＰＬＤ活性を測定した。
【００５５】
インシュリン分泌を促進するＰＬＤアイソザイムを確認するために、本発明者らはＰＬＤアイソザイムの過発現及び不活性による効果を調査した。本発明者らは空ベクター、ＰＬＤ１またはＰＬＤ２でＭＩＮ６細胞を形質感染させ、表皮成長因子でそれを刺激した。ＰＬＤ１は従来知らされたようにグルコース−依存的インシュリン分泌を媒介した（データ未記載、ＨｕｇｈｅｓＷＥ ｅｔａｌ．，Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ ２７９:２７５３４−２７５４１，２００４）。反対に、ＰＬＤ２は排他的に表皮成長因子−依存的インシュリン分泌を媒介し、ＰＬＤ１の過発現は制限された効果のみを示した（図３Ｃの上段部分）。さらに、ＰＬＤ１でないＰＬＤ２を不活性化させた場合、表皮成長因子によって誘導されるインシュリン分泌が起こらなかった（図３Ｄの上段部分）。また、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞でも同一な結果を観察することができた（データ未記載）。最後に、ＰＢｔ形成によって測定された表皮成長因子に依存的ＰＬＤ活性はＰＬＤ２過発現または不活性によって排他的に調節された（図３Ｃ及び３Ｄの下段部分）。このような結果から、前記細胞で表皮成長因子によって誘導されるインシュリン分泌のためにはＰＬＤ２が必要であるということが分かった。
【００５６】
図３ＡでＭＩＮ６細胞を６孔プレートに２４時間平板培養した。前記細胞をＫＲＢで２回洗浄し、[３Ｈ]ミチスチン酸が含まれたＫＲＢ溶液で３７℃、４時間培養した。前記培養が終わる時、指定された時間の間に１５ｎＭの表皮成長因子を処理した。１−ブタノール及び表皮成長因子が含まれた場合、０、１、２、５または１０分が経過してＰＢｔ斑点の大きさを測定し、その結果を１−ブタノールが存在しない場合には収得した斑点の大きさで減算した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した（図３Ａ）。
【００５７】
図３ＢでＭＩＮ６細胞を２４孔プレートで２４時間平板培養した。前記細胞を０．２％のＢＳＡが含まれたＫＲＢで２回洗浄し、ＫＲＢ溶液で３７℃、６０分間培養した。前記培養が終わる時、前記溶液を０．４％のｔ−ブタノールまたは１−ブタノールが含まれた新たなＫＲＢに変えて１０分間培養した後、ＭＩＮ６細胞に０または１分間１５ｎＭの表皮成長因子を処理した。前記培養培地をサンプリングして細胞を除去するために遠心分離した後、その上澄み液をインシュリン数値分析に使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
＊：表皮成長因子を処理した細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合。
【００５８】
図３Ｃ及び３Ｄで、前記ＭＩＮ６細胞を２４孔プレート（インシュリン数値を測定するため）または６孔プレート（ＰＬＤ活性を測定するため）に平板培養し、指定されたプラスミド（図３Ｃでベクター、ＰＬＤ１またはＰＬＤ２）またはｓｉＲＮＡｓ（図３Ｄで対照群(luciferase)、マウスＰＬＤ１またはマウスＰＬＤ２）で形質感染し、２４時間または７２時間培養した。形質感染の効率は約３０〜４０％であった。インシュリン分泌を（上段部分）を測定するために前記細胞を０．２％のＢＳＡが含まれたＫＲＢで２回洗浄し、ＫＲＢ溶液で３７℃、６０分間培養した。前記培養が終わる時、前記溶液を０または１分間の１５ｎＭの表皮成長因子が含まれた新たなＫＲＢに変えた。前記培養培地をサンプリングして細胞を除去するために遠心分離した後、その上澄み液をインシュリン数値分析に使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
＊：表皮成長因子を処理した細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合。
一方、ＰＬＤ活性（下段部分）を測定するために、前記細胞をＫＲＢで２回洗浄し、[３Ｈ]ミチスチン酸が含まれたＫＲＢ溶液で３７℃、４時間培養した。前記培養が終わる時、０または１分間１５ｎＭの表皮成長因子を処理した。１−ブタノール及び表皮成長因子が含まれた場合、１分が経過してＰＢｔ斑点の大きさを測定し、その結果を１−ブタノールが存在しない場合には収得した斑点の大きさで減算した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
＊：表皮成長因子を処理した細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合。
前記細胞を０．１％のトリトンＸ−１００が含まれたＫＲＢで溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに移した後、抗−ＰＬＤｓ抗体（図３Ｃの内部ボックス及び図３ＤのＰＬＤ１−内部ボックス）、ＰＬＤ２−特異の抗体（図３ＤのＰＬＤ２−内部ボックス）またはアクチン抗体（図３Ｃまたは図３Ｄのアクチン内部ボックス）を使用して免疫ブロットした（図３Ｃの内部ボックス及び図３ＤのＰＬＤ１−内部ボックス）。
【００５９】
［実施例４：ＭＩＮ６細胞でＣａ２＋流入に依存的ＰＬＤ活性］
Ｃａ２＋流入とＰＬＤ活性が表皮成長因子−依存的インシュリン分泌に必要であるので、本実施例はＰＬＤ活性に対するＣａ２＋流入の効果及びＣａ２＋流入に対するＰＬＤ活性の効果をテストして、前記Ｃａ２＋流入とＰＬＤ活性の関係を分析した。ＥＧＴＡまたはＢＡＰＴＡ/ＡＭを使用してＣａ２＋流入を遮断することによって大部分のＰＬＤ活性が抑制された（図４Ａ）。これは表皮成長因子−依存的インシュリン分泌と互いに関係があった（図２Ｂ）。しかし、ＰＬＤアイソザイムを不活性化（ＰＬＤｓの不活性如何はウェスタンブロットを通じて確認）させてＰＬＤ活性を抑制した場合には、表皮成長因子−依存的Ｃａ２＋流入にほとんど影響がなかった（図４Ｂ）。前記結果から表皮成長因子−依存的インシュリン分泌においてＣａ２＋流入がＰＬＤ活性に影響を与えること（ｕｐｓｔｒｅａｍ）が分かった。
【００６０】
図４ＡでＭＩＮ６細胞を６孔プレートに２４時間平板培養した。前記細胞をＫＲＢで２回洗浄した後、３７℃、４時間の間に[３Ｈ]ミチスチン酸が含まれたＫＲＢ溶液で培養した。前記培養が終わる時、前記溶液を無処理、ＥＧＴＡまたはＢＡＰＴＡ/ＡＭが含まれた新たなＫＲＢに変えて３０分間の培養した後、０または１分間の１５ｎＭの表皮成長因子を処理した。１−ブタノールが存在する状態で１分が経過してＰＢｔ斑点の大きさを測定し、その結果を１−ブタノールの存在しない状態での斑点の大きさで減算した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
＊：表皮成長因子を処理した細胞と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合。
【００６１】
図４ＢでＭＩＮ６細胞をガラス板で平板培養し、ｓｉＲＮＡｓ（対照群（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、マウスＰＬＤ１またはマウスＰＬＤ２）で形質感染した後、２４時間培養した。前記細胞を０．２％のＢＳＡが含まれたＫＲＢで２回洗浄し、ＫＲＢ溶液で３７℃、６０分間培養した。前記培養が終わる時、前記溶液をＤＭＳＯに溶かしたＦｌｕｏ−３ＡＭ（１ｍｇ/ｍｌ）が含まれた新たなＫＲＢに変えて１時間追加培養した。前記培養が終わると、前記細胞に１５ｎＭ表皮成長因子を処理した。イメージを２０Ｘの対物レンズが備えられた倒立共焦点顕微鏡（ＺｅｉｓｓＬＳＭ ５１０Ｍｅｔａ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ドイツ）で撮影した。標準化するために本発明者らは実験が仕上がると残留蛍光（Ｆｏ）数値を測定し、実験条件の蛍光数値（Ｆ）からこれを減算した。前記データをピークタイムの平均±Ｓ．Ｅで示し、この時、ｎ=７にした。前記細胞を０．１％のトリトンＸ−１００が含まれたＫＲＢで溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに移して抗−ＰＬＤｓ抗体（図４ＢのＰＬＤ１−内部ボックス）、ＰＬＤ２−特異な抗体（図４ＢのＰＬＤ２−内部ボックス）またはアクチン抗体（図４Ｂのアクチン−内部ボックス）で免疫ブロットした。
【００６２】
免疫ブロット分析：蛋白質をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７:６８０−６８５，１９７０）で９５℃、５分間加熱して変成させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して従来知られた方法（ＫｉｍＪＨ ｅｔａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３:５４６２−５４７０， １９９９）によって免疫ブロットした。
【００６３】
［実施例５：マウス膵臓島において表皮成長因子で誘導されたインシュリン分泌のＣａ２＋流入及びＰＬＤ活性必要性］
インシュリン分泌で表皮成長因子、Ｃａ２＋、ＰＬＤの生理的重要性を確認するために、本発明者らはマウス膵臓島の一次培養物を製造した。期待したように、表皮成長因子は迅速にインシュリン分泌を増加させ（図５Ａ）、このような結果は多様な成長因子（データ未記載）を１分処理した場合、成長因子の間に特異であった。Ｃａ２＋流入またはＰＬＤ活性を完全に抑制した場合、表皮成長因子によって誘導されるインシュリン分泌が遮断された（図５Ｂ及び５Ｃ）。これは表皮成長因子によって促進されるインシュリン分泌のためにはＣａ２＋流入及びＰＬＤが必要であることを示唆する。
【００６４】
マウス膵臓島を準備するために、従来公知の方法（Ｊｏｎａｓ ＪＣ，ｅｔａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ４７:１２６６−１２７３， １９９８）によって７乃至８週齢の雄ＢＡＬＢ/ｃマウス（Ｈｙｏｃｈａｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）から膵臓島を分離した。分離された膵臓島を孔当り１０〜１５膵臓島が含まれるように１２孔プレートに移した。本発明者らは各実験セット上同数の膵臓島を使用した。膵臓島は５ｍＭのグルコース及び１０％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）が含まれたＲＰＭＩ１６４０に２日間保存し、１００ｇ/ｍｌのストレプトマイシン及び１００Ｕ/ｍｌのペニシリンを補充した。
【００６５】
前記マウス膵臓島を１２孔プレートで２４時間平板培養した。前記膵臓島を０．２％のＢＳＡが含まれたＫＲＢで２回洗浄し、ＫＲＢ溶液で３７℃、６０分間の培養した。
【００６６】
図５Ａで、前記培養が終わる時、前記溶液を新たなＫＲＢに変えて無処理、１５ｎＭの表皮成長因子または１１ｍＭのグルコースを処理して１または５分間培養した。前記培養培地をサンプリングし、膵臓島を除去するために遠心分離した後、上澄み液を取ってインシュリン数値測定に使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
＊または＊＊：１分または５分処理した膵臓島と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合。
【００６７】
図５Ｂで、前記培養が終わる時、前記溶液を無処理、ＥＧＴＡまたはＢＡＰＴＡ/ＡＭが含まれた新たなＫＲＢに変えて３０分間の培養した後、０または１分間１５ｎＭの表皮成長因子を処理した。前記培養培地をサンプリングして膵臓島を除去するために遠心分離した後、上澄み液をインシュリン数値を測定するために使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
＊：表皮成長因子を処理した膵臓島と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合。
【００６８】
図５Ｃで前記培養が終わる時、前記溶液を０．４％のｔ−ブタノール及び１−ブタノールが含まれた新たなＫＲＢに変え、１０分間培養した後、０または１分間の１５ｎＭの表皮成長因子を処理した。前記培養培地をサンプリングして膵臓島を除去するために遠心分離した後、上澄み液をインシュリン数値を測定するために使用した。２重で２回それぞれ分析したデータを平均±Ｓ．Ｄ．で示した。
＊：表皮成長因子を処理した膵臓島と比較する時、Ｐ＜０．０５である場合。
【００６９】
［実施例６：表皮成長因子の血しょうグルコース減少及び血しょうインシュリン数値増加効果］
体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で表皮成長因子がインシュリン分泌を促進することを確認するために、本実施例は表皮成長因子を静脈注射で注入することによって正常及び肥満ｄｂ/ｄｂマウスの血しょうグルコース及びインシュリン数値に対する表皮成長因子媒介反応特性を明らかにした。
【００７０】
血しょうグルコース及び血しょうインシュリン数値の測定：７または８週齢の雄ＩＣＲマウスをＨｙｏｃｈａｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ソウル、韓国）で購入し、Ｃ５７ＢＬＫＳＪ−ｄｂ/ｄｂマウスをＳＬＣ（日本）で購入した。前記マウスを６時間断食させた後、生理食塩水（本来の名称はサリーン）、表皮成長因子またはグルコースを尻尾静脈に静脈注射して血液サンプル（０．１ｍｌ）を収集した。携帯用グルコースメートル（Ｇｌｕｃｏ−Ｄｒ、韓国）を使用してグルコース酸化酵素法によって血しょうグルコースの濃度を測定した。血しょうは遠心分離を行って分離し、血しょうインシュリン分析はＲＩＡキットを利用して行った。本発明者らの所属機関指針に従い動物保護（ａｎｉｍａｌｃａｒｅ）を実施した。
【００７１】
血しょう表皮成長因子数値の測定：７乃至８週齢の雄ＩＣＲマウスをＨｙｏｃｈａｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ソウル、韓国）で購入した。前記マウスを６時間断食させた後、生理食塩水またはグルコースを経口投与して血液サンプル（０．１ｍｌ）をＥＧＴＡにコーティングされた試験管に収集した。血しょう表皮成長因子の濃度を表皮成長因子ＥＬＩＳＡキット（ＫＯＭＡｂｉｏｔｅｃｈ、韓国）で測定した。本発明者らの所属機関指針に従い動物保護を実施した。
【００７２】
予備実験で、表皮成長因子５０ｇ/ｋｇを７乃至８週齢の雄ＩＣＲマウスに静脈内注射した後、１０分後血しょうグルコースの減少効果が飽和に達した（データ未記載）。前記表皮成長因子（５０ｇ/ｋｇ）のグルコース減少効果はインシュリンと同様な効能があり、投与量に依存的であった（図６Ａ）。また、表皮成長因子及びグルコース（０．５ｇ/ｋｇ）は全て血しょうインシュリン数値を増加させ（図６Ｂ）、このような事実から前記グルコース減少効果が血しょうインシュリン数値の変化のためであることが分かった。インシュリン分泌及びグルコース変化の速度は互いに関係があった。さらに、グルコースを経口投与した場合、生理食塩水を投与した場合に比べて血しょう表皮成長因子数値を上昇させた（図６Ｃ）。前記結果から、表皮成長因子の生理的濃度は投与条件に応じて変化することがあり、分泌された表皮成長因子は結局インシュリン分泌を調節することができる。表皮成長因子はまた、肥満ｄｂ/ｄｂマウスで血しょうグルコースを減少させ、血しょうインシュリン数値を増加させた（図６Ｄ及び６Ｅ）。総合すると、本発明者らは正常または糖尿病のあるマウスモデルで表皮成長因子がインシュリン分泌を促進し、血しょうグルコースを減少させることができるという結論を出した。
【００７３】
図６Ａで７乃至８週齢の雄ＩＣＲマウス（１０マウス/グループ）に生理食塩水（二重希釈された水に０．９％のＮａＣｌ）、インシュリン（０．０６Ｕ/ｋｇ）または表皮成長因子（１８．５または５０ｇ/ｋｇ）を静脈注射して血しょうグルコース数値を測定した。前記データを平均±Ｓ．Ｅ．で示した。
†（インシュリン）、＊（表皮成長因子５０ｇ/ｋｇ）または＊＊（表皮成長因子１８．５．ｇ/ｋｇ）、特定時間に生理食塩水を投与したマウスと比較してＰ＜０．０５である場合
【００７４】
図６Ｂで、７乃至８週齢の雄ＩＣＲマウス（１０マウス/グループ）に生理食塩水、グルコース（０．５ｇ/ｋｇ）、または表皮成長因子（１８．５または５０ｇ/ｋｇ）を静脈注射して血しょうインシュリン数値を測定した。前記データを平均±Ｓ．Ｅ．で示した。
‡（グルコース）、＊（表皮成長因子５０ｇ/ｋｇ）または＊＊（表皮成長因子１８．５．ｇ/ｋｇ）、特定時間に生理食塩水を投与したマウスと比較してＰ＜０．０５である場合
【００７５】
図６Ｃで、７乃至８週齢の雄ＩＣＲマウス（１０マウス/グループ）に生理食塩水、グルコース（２ｇ/ｋｇ）を経口投与して血しょう表皮成長因子数値を測定した。前記データを平均±Ｓ．Ｅ．で示した。
＊：特定時間に生理食塩水を投与したマウスと比較してＰ＜０．０５である場合
【００７６】
図６Ｄで、肥満Ｃ５７ＢＬＫＳＪ−ｄｂ/ｄｂマウス（６マウス/グループ）に生理食塩水（二重希釈された水に０．９％のＮａＣｌ）、インシュリン（０．０６Ｕ/ｋｇ）または表皮成長因子（５０ｇ/ｋｇ）を静脈注射して血しょうグルコース数値を測定した。前記データを平均±Ｓ．Ｅ．で示した。
†（インシュリン）または＊（表皮成長因子５０ｇ/ｋｇ）、特定時間に生理食塩水を投与したマウスと比較してＰ＜０．０５である場合
【００７７】
図６Ｅで、肥満Ｃ５７ＢＬＫＳＪ−ｄｂ/ｄｂマウス（６マウス/グループ）に生理食塩水、グルコース（０．５ｇ/ｋｇ）または表皮成長因子（５０ｇ/ｋｇ）を静脈注射し血しょうインシュリン数値を測定した。注射前及び注射後１０分が経過して血しょうインシュリン数値を比較した。前記データを平均±Ｓ．Ｅ．で示した。
‡（グルコース）または＊（表皮成長因子５０ｇ/ｋｇ）、特定時間に生理食塩水を投与したマウスと比較してＰ＜０．０５である場合。すべての動物は水を自由に摂取するようにした。本発明者らの所属機関指針に従い動物保護を実施した。
【００７８】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得る事は明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2009543859.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2009543859.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2009543859.tif 000009
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2009543859.tif 000011
【図４Ａ】
2009543859.tif 000012
【図４Ｂ】
2009543859.tif 000013
【図５Ａ】
2009543859.tif 000014
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2009543859.tif 000017
【図６Ｂ】
2009543859.tif 000018
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2009543859.tif 000020
【図６Ｅ】
2009543859.tif 000021
【配列表】
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【国際調査報告】
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