(57)【要約】  炭疽菌芽胞糖タンパク質複合体ワクチンの調製方法が開示される。また、活性剤として芽胞糖タンパク質複合体を含む、炭疽菌ワクチン組成物類が開示される。ある実施形態において、本ワクチン類は、肺炭疽病などの感染症を起こす炭疽菌及び数種類のバシラス・セレウスによる感染から保護するのに十分である。
2009511018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭疽菌又は炭疽菌様細菌の外膜から糖タンパク質複合体を単離する方法であって、炭疽菌芽胞の外膜の抽出物から、該抽出物の糖結合剤への吸収によって、少なくとも１つの糖タンパク質を単離するステップを含む方法。
【請求項２】
糖結合剤がレクチン、抗体、タンパク質又は脂質の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖タンパク質が少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離されるステップをさらに含み、前記少なくとも１つの他の分子が、タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複合体がサイズ排除クロマトグラフィー又は電気溶出の少なくとも１つを用いて外膜から単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
複合体の、他の分子が少なくとも特定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２６に示すアミノ酸配列の少なくとも１つに対し、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
炭疽菌芽胞の外膜から単離された少なくとも１つのレクチン結合糖タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
【請求項８】
糖タンパク質が少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離され、前記少なくとも１つの他の分子はタンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
糖タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２６に示すアミノ酸配列の少なくとも１つに対し、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組成物がアジュバントをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
炭疽菌感染を予防又は治療する方法であって、炭疽菌芽胞の外膜から単離された少なくとも１つのレクチン結合糖タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む組成物を、対象に投与することを含む方法。
【請求項１２】
組成物が、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）及び浮腫因子（ＥＦ）からなる群から選択される追加の炭疽菌抗原をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
糖タンパク質が炭疽菌内膜内に複合体として存在し、ワクチンが複合体の少なくとも１つの追加の成分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
複合体の追加の成分が他のタンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質の少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法
【請求項１５】
組成物が炭疽菌の全ての株及びバシラス・セレウスＧ９２４１を含む他の炭疽様感染に対して防御的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
糖タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２６に示すアミノ酸配列の少なくとも１つに対し、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
治療が細胞性免疫応答又は液性免疫応答の少なくとも１つをもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
対象が哺乳動物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がマウス、霊長類、ウシ、ヒツジ、有蹄動物、ウマ、ウサギ、モルモット又はヒトである、請求項１８に記載の方法
【請求項２０】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５に示す核酸配列を含む、炭疽菌芽胞の外膜から単離されたレクチン結合糖タンパク質をコードする単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の記載）
本出願は、２００５年１０月６日に出願の、米国特許仮出願第６０／７２４３０６号「新規炭疽菌芽胞ワクチン」の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ワクチンとしての炭疽菌芽胞糖タンパク質（anthrax spore glycoproteins）に関する方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト感染が、感染した動物又は皮若しくはウールなどの畜産物との接触から通常生じたので、炭疽菌は羊毛選別人の疾患として以前は知られていた。２００１年９月１１日の事件及び以降の炭疽病発生は、近年この細菌が生物戦争及びテロリズムを目的として使用されていることを鮮明にした。ルイ・パスツールは、熱弱毒株を用いて１８８１年に最初の炭疽菌ワクチンを作製した。現在の米国の認可ヒト炭疽菌ワクチンである、BioPort Corporation（Lansing, MI）社製のBIOTHRAX（商標）又はAnthrax Vaccine Adsorbed（ＡＶＡ）は、炭疽菌（B. anthracis）の毒素産生性、非被包性株の発酵槽培養物からの水酸化アルミニウム吸着上清物質からなる。
【０００４】
これまで、毒素成分だけが炭疽菌に対して防御免疫を与えることが示されている（Mahlandt, B. G., et al. 1966. J Immunol 96:727-33）。例えば、防御抗原（ＰＡ、protective antigen）は、炭疽菌ワクチンの必須成分である（Grabenstein, J. D. 2003, Immunol. Allergy Clin. North Am., 23(4): 713-30）。抗ＰＡ抗体特異免疫は抗芽胞活性を含むことができ、したがって、炭疽菌芽胞による初期ステップの感染を阻止する役割を果たすことができる（Welkos, S. et al., 2001, Microbiology 147:1677-85）。現在の米国の認可ヒト炭疽菌ワクチンは、主に、炭疽菌の毒素産生性、非被包性株の発酵槽培養物からの、感染防御抗原（ＰＡ）と未定義量の致死因子（ＬＦ、Lethal Factor）及び浮腫因子（ＥＦ、Edema Factor）からなる。BIOTHRAX（商標）によるヒトワクチン接種は、６回の免疫接種と以降の年１回の追加抗原刺激を必要とするであろう（２００２、Anthrax Vaccine Adsorbed（BioThrax（商標））製品挿入紙、BioPort Corporation；Friedlander, A. M., et al., 1999, Jama 282:2104-6）。このワクチンを用いて、ヒトで、全身の有害事象が約１％で及び局所の有害事象が３．６％で報告されている（Pittman, P. R. et al., 2001, Vaccine 20:972-8）。
【０００５】
抗原としてＰＡを用いる炭疽菌ワクチンの安全性プロフィール及び免疫原性を改善する多くの試みがあり、その例としては、ＰＡをアジュバントに製剤化（Ivins, B. E. et al., 1992, Infect. Immun., 60:662-8；Kenney, R. T., et al., 2004. J. Infect. Dis., 190:774-82, Epub 2004 Jul 13）（Matyas, G. R., et al., 2004, Infect. Immun., 72:1181-3）、カプセル状のポリ−γ−ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ、poly-gamma-d-glutamic acid）をＰＡにコンジュゲートすること（Rhie, G. E. et al., 2003. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 100:10925-30）、精製ＰＡ（Singh, Y. et al., 1998. Infect. Immun., 66:3447-8）及びＰＡのＣドメイン４（ＰＡ−Ｄ４）（Flick-Smith, H. C. et al., 2002, Infect. Immun., 70:1653-6）の使用、ＰＡベースのＤＮＡワクチンの開発（Gu, M. L. et al., 1999, Vaccine 17:340-4; Riemenschneider, J. et al., 2003, Vaccine 21:4071-80）、並びに、アデノウイルス、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ワクシニアウイルスベクター及びベネズエラウマ脳炎ウイルスにおけるＰＡの発現（Coulson, N. M. et al., 1994, Vaccine, 12:1395-401；Garmory, H. S. et al., 2003, Infect. Immun., 71:3831-6；Iacono-Connors, L. C. et al., 1991, Infect. Immun., 59:1961-5；Ivins, B. E., and S. L. Welkos, 1986, Infect. Immun., 54:537-42；Lee, J. S. et al., 2003., Infect. Immun., 71:1491-6；Tan, Y. et al. 2003, Hum. Gene Ther., 14:1673-82）が含まれる。炭疽防御抗原（ＰＡ）は、現在の認可炭疽菌ワクチンBIOTHRAX（商標）の主要な抗原である。ＰＡのＣ末端ドメイン４（ＰＡ−Ｄ４、残基５９６〜７３５）は、細胞受容体、炭疽毒素受容体（ＡＴＲ）を結合する役割を担うとみられ、ＰＡの支配的な防御エピトープを含む可能性がある（Flick-Smith, H. C. et al., 2002, Infect. Immun. 70:1653-6；Little, S. F. et al. 1996, Microbiology 142:707-15）。以前の研究は、ＰＡ及びＮ末端領域トランケーションＬＦ（成熟タンパク質の残基１０〜２５４）を組み合わせたプラスミド発現ベクターによる免疫接種が、ＰＡ単独よりも良い防御を提供することができることを示した（Galloway, D., et al. 2004, Vaccine, 22:1604-8; Price, B. M. et al., 2001, Infect. Immun., 69:4509-15）。
【０００６】
肺炭疽の非常に致命的な性質、炭疽菌芽胞の生産及び保管の容易さ、並びに攻撃後の環境中で生存する芽胞の能力は、細菌戦及びバイオテロリズムにおける病原体として炭疽菌を魅力的なものにする。有効な抗生物質療法の機会を得る手段が非常に少ないので、ワクチン接種は肺炭疽に対する最高の防御手段であろう。炭疽病に対する現在のワクチンは、栄養細胞によって生成される防御抗原（ＰＡ）を含む、炭疽菌の非被包性株からの未精製培養液上清である。このワクチンはアカゲザル及びウサギで肺型炭疽に対して防御を提供することができるが、モルモットでの防御は様々である（Fellows et al., 2001）。さらに、ＰＡを利用する現在のワクチンは、天然の病原体に対する防御を提供することが予想されるだけであり、その人工の生物体に対する防御を提供することは予想されないであろう。生物兵器として炭疽菌を選択するのは、その細菌の毒性の特性だけによるものではなく、それが、容易に生産され、安定して維持、送達される媒体を提供するからである。ボツリヌス中毒毒素又は志賀毒素などの、他の毒素をこの細菌に導入することが可能である。そのような処理された炭疽菌芽胞は、次に、炭疽毒素だけでなく、芽胞に導入された追加の毒素も送達することができよう。現在の（ＰＡを利用する）ワクチンは、外来の毒素に対する防御を提供しないので、そのような処理された生物体に対して有効ではなかろう。これらの理由から、抗毒素免疫単独では、長期の解決法にはならないであろう。
【０００７】
今日利用できるワクチンは熱弱毒化炭疽株の使用よりも改善されたものであるが、改善されたワクチンの必要性がまだ存在する。例えば、今日利用できるワクチンは、標準化の欠如及び比較的高い生産費を特徴とする。さらに、BIOTHRAX（商標）によるヒトワクチン接種は、６回の免疫接種とその後の年１回の追加抗原刺激を必要とする（例えば、Anthrax Vaccine Adsorbed BIOTHRAX（商標）製品挿入紙、BioPort Corporation社製、2002；Friedlander, A. M., et al., 1999, JAMA 282:2104-6、を参照）。新しい、改善された炭疽菌ワクチンの開発の必要性をさらに鮮明に示しているのは、ヒトで１％の全身有害事象及び３．６％の局所有害事象が報告されていることである（Pittman, P. R. et al., 2001, Vaccine 20:972-8）。
【非特許文献１】Mahlandt, B. G., et al. 1966. J Immunol 96:727-33
【非特許文献２】Grabenstein, J. D. 2003, Immunol. Allergy Clin. North Am., 23(4): 713-30
【非特許文献３】Welkos, S. et al., 2001, Microbiology 147:1677-85
【非特許文献４】Friedlander, A. M., et al., 1999, Jama 282:2104-6
【非特許文献５】Pittman, P. R. et al., 2001, Vaccine 20:972-8
【非特許文献６】Ivins, B. E. et al., 1992, Infect. Immun., 60:662-8
【非特許文献７】Kenney, R. T., et al., 2004. J. Infect. Dis., 190:774-82, Epub 2004 Jul 13
【非特許文献８】Matyas, G. R., et al., 2004, Infect. Immun., 72:1181-3
【非特許文献９】Rhie, G. E. et al., 2003. Proc. Natl. Acad. Sci., USA100:10925-30
【非特許文献１０】Singh, Y. et al., 1998. Infect. Immun., 66:3447-8
【非特許文献１１】Flick-Smith, H. C. et al., 2002, Infect. Immun., 70:1653-6
【非特許文献１２】Gu, M. L. et al., 1999, Vaccine 17:340-4
【非特許文献１３】Riemenschneider, J. et al., 2003, Vaccine 21:4071-80
【非特許文献１４】Coulson, N. M. et al., 1994, Vaccine, 12:1395-401
【非特許文献１５】Garmory, H. S. et al., 2003, Infect. Immun., 71:3831-6
【非特許文献１６】Iacono-Connors, L. C. et al., 1991, Infect. Immun., 59:1961-5
【非特許文献１７】Ivins, B. E., and S. L. Welkos, 1986, Infect. Immun., 54:537-42
【非特許文献１８】Lee, J. S. et al., 2003., Infect. Immun., 71:1491-6
【非特許文献１９】Tan, Y. et al. 2003, Hum. Gene Ther., 14:1673-82
【非特許文献２０】Little, S. F. et al. 1996, Microbiology 142:707-15
【非特許文献２１】Galloway, D., et al. 2004, Vaccine, 22:1604-8
【非特許文献２２】Price, B. M. et al., 2001, Infect. Immun., 69:4509-15
【非特許文献２３】Fellows et al., 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、微生物の表面から、抗原性であることができるタンパク質複合体を単離するための方法及びシステムを提供する必要性がある。様々な細菌戦病原体、並びにＨＩＶなどの他の疾患病原体に対して防御するために用いることができるワクチンを開発する必要性もある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態は、ワクチンとして使用するための、炭疽及び他の微生物物質からの糖タンパク複合体の単離に関する方法及び組成物を含む。本発明は、様々な方法で実施することができる。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、ワクチンにおいて用いることができる、微生物の外膜又は表面の糖タンパク質の単離のための方法を含む。一実施形態において、微生物は炭疽菌又は炭疽菌様細菌（an anthrax-like bacterium）であることができる。一実施形態において、前記方法は、抽出物の糖結合剤（a sugar-binding agent）への吸収によって、細菌外膜の抽出物から少なくとも１つの糖タンパク質を単離するステップを含むことができる。一実施形態において、糖結合剤はレクチンである。或いは、糖と結合することができ、また、糖タンパク質で見られる特定の糖と相互作用することが知られているタンパク質、脂質、糖及び他の抗体などの他の作用物質を、タンパク質及び他の糖タンパク質複合体を捕捉するのに用いることができる。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、微生物の外膜又は表面から単離される、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質を含む組成物を含む。一実施形態において、外膜は炭疽菌芽胞からのものである。一実施形態において、前記組成物は医薬担体を含むことができる。ある実施形態において、糖タンパク質はオリゴ糖、脂質又はリン脂質の少なくとも１つを含む複合体として単離される。
【００１２】
ある実施形態において、本発明の組成物は、全ての炭疽菌株又は関連疾患、及び他の炭疽様感染、例えば、それには限定されないが、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）Ｇ９２４１に対して防御的である炭疽菌ワクチンを提供する。
【００１３】
本発明は、以下のそれには限定されない図を参考に、よりよく理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義
以下の定義は、本明細書の記載を理解するために用いることができる。特に定義されていない場合は、本明細書で用いられる全ての技術用語及び専門用語は、当分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書で用いる用語「ａ」又は「ａｎ」は、文脈から特に明示されていない限り、複数の対象を指すことができる。用語「又は」は、文脈から特に明示されていない限り、用語「及び／又は」と同じ意味で使用される。
【００１６】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、部分的な又は完全長のタンパク質を含むことができるタンパク質分子を記載するために、本明細書で互換的に用いられる。本明細書で用いるように、「ポリペプチドドメイン」は、独立した単位を含む、ポリペプチドに沿った領域を含む。ドメインは、構造、配列及び／又は生物的活性に関して定義することができる。一実施形態において、ポリペプチドドメインは、残りのタンパク質から実質的に独立する方法で折り畳まれるタンパク質領域を含むことができる。ドメインは、ドメインデータベース、例えば、それらに限定されないが、PFAM、PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、SBASE、ISREC PROFILES、SAMRT及びPROCLASSを用いて特定することができる。本明細書で用いるように、用語「糖タンパク質」は、グリコシル化された任意のタンパク質を指す。
【００１７】
「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドである。この用語は、一本鎖核酸、二本鎖核酸並びにヌクレオチド又はヌクレオシド類似体から作製されるＲＮＡ及びＤＮＡを含むものとして用いる。ＤＮＡ分子は、（コード鎖として）５’から３’の方向で一般に提示されるそれらの核酸配列によって特定することができ、５’及び３’は、１ヌクレオチドの５’末端のヒドロキシル基及び次のヌクレオチドの３’末端のヒドロキシル基の間で形成される結合を示す。５’−３’方向で提示されるコード鎖については、その補体（又は、非コード鎖）は、ワトソン−クリック型塩基対形成に従ってその配列にハイブリダイズするＤＮＡ鎖である。ゆえに、本明細書で用いるように、核酸の補体は「逆補体」と同じであり、その自然形では問題の核酸と対になった塩基であろう核酸を記載する。
【００１８】
本明細書で用いるように、「プライマー」は、そのプライマーを少なくとも一部基質として用いる酵素反応が生じることができるように、標的の核酸とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドのサブセットである。プライマーは、当技術分野で利用できる、酵素操作を妨害しないヌクレオチド又はヌクレオチドの誘導体若しくは類似体の、任意の組合せから作製することができる。「プローブ」は、一般的に配列特異的な方法で、例えばハイブリダイゼーションを通して、標的の核酸と相互作用することができるオリゴヌクレオチド分子である。一般的に、プローブは、当技術分野で利用できるヌクレオチド又はヌクレオチドの誘導体若しくは類似体の、任意の組合せから作製することができる。
【００１９】
用語「ベクター」は、細胞内に第２の核酸分子を輸送するために用いることができる核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは、ベクターに挿入されたＤＮＡ配列の複製を可能にする。ベクターは、少なくとも一部の宿主細胞での核酸分子の発現を強化するための、プロモーターを含むことができる。ベクターは自律的に複製する（染色体外）ことができるか、又は、宿主細胞染色体に組み込むことができる。一実施形態において、ベクターは、ベクターに挿入された核酸配列の少なくとも一部に由来するタンパク質を生産することができる、発現ベクターを含むことができる。
【００２０】
用語「〜％同一である」又は「同一割合」は、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の間の配列同一性を指す。同一割合は２つの配列を一列に並べることで測定することができ、比較する配列が共有する位置での同一残基（すなわちアミノ酸又はヌクレオチド）の数を指す。配列アラインメント及び比較は、当技術分野で標準のアルゴリズムを用いて（例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 1981, 2:482；Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48:443）；Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444）、又は、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡとして公的に利用できるこれらのアルゴリズムのコンピュータ化バージョン（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI）によって実行することができる。また、National Institutes of Health, Bethesda MD、を通して利用できるＥＮＴＲＥＺを、配列比較のために用いることができる。一実施形態において、２つの配列の同一割合は、各アミノ酸ギャップが２つの配列の間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドのミスマッチであるかのように重み付けされるように、１のギャップウエイトでＧＣＧを用いて測定することができる。
【００２１】
本明細書で用いる「有効量」は、所期の効果を生むために有効な剤の量を意味する。剤が殺虫効果を達成するために用いられる場合、有効量を含む実際の用量は、投与経路及び使用製剤に依存してよい。
【００２２】
本明細書で用いられる「免疫応答」は、抗体の生成、免疫の生成、抗原に対する過敏症の生成、及び寛容性の形成を含む、抗原の存在に対しての体全体の反応を指す。したがって、抗原への免疫応答は、対象における関心の抗原に対する液性及び／又は細胞性免疫応答の生成も含む。「液性免疫応答」は、形質細胞によって生産される抗体によって媒介される。「細胞免疫応答」は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球によって媒介されるものである。芽胞はマクロファージ内で発芽することができるので、芽胞に対しての免疫接種は、オプソニン化抗体の生成を引き起こすことができる。細胞性免疫は、マクロファージ活性化及び芽胞の死の増加を引き起こすことによって補償することができる。芽胞成分に対する液性免疫も免疫を引き起こすことができ、この作用は細胞性免疫によって増強されうる。本明細書で用いるように、「抗体価」は、各対象について免疫前試料の同等の吸光度値をもたらした、免疫後血清の最大希釈と定義される。
【００２３】
本明細書で用いるように、用語「抗原」は、抗体によって認識され、及び／又は個体で免疫応答を導き出すことができる任意の剤（例えば、任意の物質、化合物、分子、タンパク質又は他の部分）を指す。本明細書で用いるように、用語「アジュバント」は、抗原の免疫応答を増加させることができる任意の剤（例えば、任意の物質、化合物、分子、タンパク質又は他の部分）を指す。
【００２４】
本明細書で用いるように、用語「抗体」は、それらには限定されないが任意の類の完全体免疫グロブリン（すなわち無傷の抗体）を含む。天然の抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、へテロ四量体糖タンパク質である。一般的に、各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結するが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則正しく間隔のあいた鎖内部のジスルフィド架橋を有することもできる。各重鎖は、一方の端に、いくつかの定常領域が続く可変領域ＶＨを有することができる。各軽鎖は、一方の端に可変領域ＶＬを、及びその他方の端に定常領域を有することができる。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と並ぶことができ、軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と並ぶことができる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変領域の間で境界を形成すると考えられる。任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の１つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従い、免疫グロブリンを異なる種類に割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンには５つの主要な種類、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２にさらに分割することができる。他の種（例えばマウス）には、類似した種類がある。異なる種類の免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる。
【００２５】
用語「可変」は、本明細書において、抗体間で配列が異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性で用いられる、可変抗体領域の一定の部分を記載するために用いられる。しかし、可変性は、通常、抗体の可変領域全体に均一に分布せず、一般的に、軽鎖及び重鎖の可変領域において相補性決定部（ＣＤＲ）又は超可変部と呼ばれる３つの部分に集中する。可変領域のより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。未変性の重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、このＦＲ領域は主にβシート構造を採用し、３つのＣＤＲを介して連結し、このＣＤＲはｂシート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成することができる。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接して一緒に保持することができ、他の鎖からのＣＤＲと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与することができる（Kabat E. A. et al., 1987, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md.、を参照）。定常領域は抗体を抗原に結合することに直接関与することはないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性における抗体の関与を示すことができる。
【００２６】
本明細書で用いるように、用語「抗体又はそのフラグメント」は、二重又は多重の抗原又はエピトープ特異性を有するキメラ抗体及びハイブリッド抗体、並びにハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどのフラグメントを含む。ゆえに、それらの特異抗原に結合する能力を保持する抗体フラグメントは、この定義に含まれる。例えば、ＥＦｎ結合活性を維持する抗体フラグメントは、用語「抗体又はそのフラグメント」の意味の範囲に含まれる。そのような抗体及びフラグメントは、当技術分野で周知の技術によって作製することができ、実施例及び抗体生産並びに特異性及び活性についての抗体スクリーニングのための一般方法で示す方法に従って、特異性及び活性についてスクリーニングすることができる（Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)を参照）。また、例えば、その内容が本明細書で参照により組み込まれている米国特許第４，７０４，６９２号に記載されているような、抗体フラグメント及び抗原結合タンパク質（一本鎖抗体）のコンジュゲート体も、「抗体又はそのフラグメント」の意味の範囲に含まれる。
【００２７】
また、本明細書で用いるように、「ヒト化型抗体」は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、若しくは他の抗原結合性抗体部分配列）である。
【００２８】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同質の抗体集団から得た抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、より少ない量で存在するであろう自然に起こりうる突然変異を除いて同一である。本明細書でモノクローナル抗体は、具体的には、一部の重鎖及び／又は軽鎖が特定の種に由来するか又は特定のクラス若しくはサブクラスの抗体に属する抗体の対応配列と同一であるか又は相同であるが、その鎖の残りの部分は、別の種に由来するか又は別のクラス若しくはサブクラスの抗体に属する抗体の対応配列、並びに、それらが所望の活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントと同一であるか又は相同である「キメラ」抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)、を参照）。
【００２９】
本明細書で用いるように、用語「炭疽菌」は、栄養体又は芽胞状の任意の炭疽菌株を指す。本明細書で用いるように、用語「炭疽菌様」又は「炭疽様感染」又は「炭疽様疾患」は、任意のバシラス・セレウス菌株又は他の関連バシラス菌株、及び、肺、胃腸又は皮膚の炭疽のそれに類似した疾患を指す。本明細書で用いるように、用語「芽胞表面」は、外膜、芽胞殻及び皮質外層を指す。具体的には、最近の研究において、Ｂ．セレウス菌ＡＴＣＣ１０９８７、Ｂ．セレウス菌ＡＴＣＣ１０９８７、Ｂ．セレウス菌Ｇ９２４１が炭疽様応答を引き起こすことが分かった。（Rask et al., 2004, Nucleic Acids Res. 32(3): 977-88；Han et al., 2006; J. Bacteriology, 188 (9): 3382-90；Hoffmaster et al., 2006, J Clin. Microbiol., 44: 3352-60）
【００３０】
本明細書で用いるように、用語「複合型」、「複合体」又は「複数の複合体」は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用によって互いに結合するいかなるものも意味する。例えば、糖タンパク質ＢｃｌＡ複合体は、ＢｃｌＡ及び、ＢｃｌＡに結合した他の任意のタンパク質、脂質、リン脂質、多糖類又は糖タンパク質である。
【００３１】
ワクチンとしての炭疽菌芽胞糖タンパク質に関する方法及び組成物
本発明の実施形態は、ワクチンとしての炭疽菌芽胞糖タンパク質及び糖タンパク質複合体の単離に関する方法及び組成物を含む。本発明は、様々な方法で具体化することができる。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、ワクチンにおいて用いることができる、微生物の外膜の糖タンパク質の単離方法を含む。一実施形態において、微生物は細菌でよい。一実施形態において、細菌は炭疽菌又は炭疽菌様細菌であることができる。一実施形態において、前記方法は、抽出物の糖結合剤への吸収によって、細菌外膜の抽出物から少なくとも１つの糖タンパク質を単離するステップを含むことができる。一実施形態において、糖結合剤はレクチンである。或いは、糖タンパク質で見られる特定の糖と相互作用することが知られているタンパク質、脂質、糖及び他の抗体などの他の剤を、糖タンパク質又は糖タンパク質複合体を捕捉するのに用いることができる。
【００３３】
一実施形態において、前記方法は、糖タンパク質が、少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離されるステップを含み、前記少なくとも１つの他の分子は、タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質を含む。例えば、複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー又は電気泳動溶出の少なくとも１つを用いて、外膜から単離することができる。或いは、他のサイズ選択法を用いることができる。また、一実施形態において、複合体の少なくとも１つの他の分子が特定される。一実施形態において、糖タンパク質及び／又は他の分子を特定するために用いる方法には、ＭＳ−ＴＯＦ、タンパク質シークエンシング又は他の類似した方法、例えば、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化法（ＭＡＬＤＩ、Matrix-assisted laser desorption/ionization）、飛行時間型（ＴＯＦ、Time-of-flight）質量分析（ＭＳ、mass spectrometry）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ、Electrospray-ionization）イオントラップ（ＩＴ、Ion Trap）ＭＳ、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ、Fourier transform ion cyclotron resonance）ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴ＭＳを含めることができる。
【００３４】
例えば、一実施形態において、本発明は、ワクチンにおいて用いることができる、炭疽菌芽胞の外膜の糖タンパク質の単離方法を含む。一実施形態において、前記方法は、抽出物中のタンパク質のレクチンへの吸収によって、炭疽菌芽胞の外膜の抽出物から少なくとも１つの糖タンパク質を単離するステップを含むことができる。ある実施形態において、糖タンパク質はオリゴ糖、脂質又はリン脂質の少なくとも１つを含む複合体として単離される。
【００３５】
一実施形態において、糖タンパク質は少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離され、前記少なくとも１つの他の分子は、タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質を含む。例えば、複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー又は電気泳動溶出の少なくとも１つを用いて、外膜から単離することができる。或いは、他のサイズ選択法を用いることができる。また、一実施形態において、複合体の少なくとも１つの他の分子が特定される。一実施形態において、糖タンパク質及び／又は他の分子を特定するために用いる方法には、ＭＳ−ＴＯＦ、タンパク質シークエンシング又は他の類似した方法、例えば、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオントラップ（ＩＴ）ＭＳ、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化（ＭＡＬＤＩ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳを含めることができる。
【００３６】
一実施形態において、複合体は、炭疽菌由来の以下のタンパク質、ＣｏｔＳ、ＣｏｔＪＡ、ＣｏｔＪＢ、ＣｏｔＪＣ、ＣｏｔＭ、ＣｏｔＨ、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＡｌｐｈａ、ＣｏｔＦ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＺ、Ｃｏｔ（推定上の１、２、３、４）、ＣｏｔＨｙｐｏＡｌｐｈａ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＦ（関連）、ＢｃｌＡ、ＥＡ１、ＥＡ２、ｓｒｔＡ（ＳｏｒｔａｓｅＡ）、ＳＳＰＨ１、ＳＳＰＨ２、ＳＳＰＩ、ＳＳＰＫ、ＳＳＰＮ、ＳＳＰＯ、ＴＬＰ、ＳＳＰＢ、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ１、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ２、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ３、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ４、ＳＡＳＰ−２、ＳＳＰＦ、ＳＡＳＰ−１、ＳＳＰＥ（ＳＳＰｇａｍｍａ）、ＥｘｓＢ、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ−１、ｃｓｐＢ−２、ｃｓｐＣ、ｃｓｐＤ、ｃｓｐＥ、ＮＤＫ、ＮｕｐＣ−１、ＮｕｐＣ−２、ＮｕｐＣ−３、ＮｕｐＣ−４、ＮｕｐＣ−５、ＮｕｐＣ−６、ＮｕｐＣ−７、ＰｎｕＣ、アラニンラセマーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ヌクレオシドヒドロラーゼ、ＢｘｐＢ、ＥｘｓＦＡ又はＥｘｓＦＢの少なくとも１つを含む。
【００３７】
他の実施形態において、複合体は枯草菌芽胞から単離される。ゆえに、一実施形態において、複合体は枯草菌由来の以下のタンパク質、ＣｏｔＡ、ＣｏｔＢ、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＦ、ＣｏｔＧ、ＣｏｔＨ、ＣｏｔＪＡ、ＣｏｔＪＢ、ＣｏｔＪＣ、ＣｏｔＭ、ＣｏｔＲ、ＣｏｔＳＡ、ＣｏｔＳ、ＣｏｔＴ、ＣｏｔＶ、ＣｏｔＷ、ＣｏｔＹ、ＣｏｔＺ、ＧｅｒＰＡ、ＧｅｒＰＢ、ＧｅｒＰＣ、ＧｅｒＰＤ、ＧｅｒＰＥ、ＧｅｒＰＦ、ＹａａＨ、ＹａｂＧ、ＹｒｂＡ（ＳａｆＡ）、ＣｏｔＱ（ＹｖｄＰ）、ＣｏｔＵ（ＹｎｚＨ）、ＣｏｔＩ（ＹｔａＡ）、ＹｃｋＫ、ＹｄｈＤ、ＹｈｄＡ、ＹｈｄＥ、ＹｉｒＹ、ＹｉｓＹ、ＹｏｄＩ、ＹｏｐＱ、ＹｄｅＰ／ＹｐｅＢ、ＹｐｚＡ、ＹｕｓＡ、ＹｗｑＨ、ＹｘｅＦ、ＣｓｐＤ、Ｈｓｂ、ＰｈｏＡ、ＳｌｅＢ、ＳｓｐＡ、ＳｓｐＥ、ＹｈｃＮ、ＹｒｂＢ、ＣｇｇＲ、ＣｏｘＡ、ＣｗｌＪ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＭ、ＳｐｏＶＩＤ、ＹｈｂＡ、ＣＳＩ５、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ＤＨＢＡ、ＦＡＢＩ、ＲＬ１０、ＳＲＦＡＤ、ＳＡＳ１、ＳＡＳ２、ＳＡＳＧ、ＳＳＰＡ、ＳＳＰＢ、ＳＳＰＣ、ＳＳＰＤ、ＳＳＰＥ、ＳＳＰＦ、ＳＳＰＧ、ＳＳＰＨ、ＳＳＰＩ、ＳＳＰＪ、ＳＳＰＫ、ＳＳＰＬ、ＳＳＰＭ、ＳＳＰＮ、ＳＳＰＯ、ＳＳＰＰ、ＴＬＰ、ＳＳＰＧ−１又はＳＳＰＧ−２の少なくとも１つを含む。
【００３８】
他の実施形態において、複合体はバシラス・セレウス菌芽胞から単離される。ゆえに、一実施形態において、複合体はバシラス・セレウス菌由来の以下のタンパク質、ＥｘｓＡ、ＥｘｓＢ、ＥｘｓＣ、ＥｘｓＤ、ＥｘｓＥ、ＥｘｓＧ、ＥｘｓＨ、ＥｘｓＹ、ＥｘｓＪ、ＥｘｓＦ、ＹｒｂＢ又はＮａｄＡの少なくとも１つを含む。
【００３９】
他の実施形態において、本発明は、炭疽菌芽胞の外膜由来の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質を含む組成物を含む。ある実施形態において、糖タンパク質はオリゴ糖、脂質又はリン脂質の少なくとも１つを含む複合体として単離される。一実施形態において、前記組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。
【００４０】
薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知の標準の薬学的に許容される担体のいずれかを含むことができる。一実施形態において、医薬担体は液体でよく、本発明のタンパク質又は核酸構築物は溶液状であることができる。他の実施形態において、薬学的に許容される担体は、粉末、凍結乾燥粉末又は錠剤の形の、固体であることができる。或いは、医薬担体は、ゲル、坐薬又はクリームであることができる。代わりの実施形態において、担体は、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマー封入セル又はウイルスを含むことができる。ゆえに、薬学的に許容される担体という用語は、水、アルコール、リン酸緩衝生理食塩溶液、糖（例えば、ショ糖若しくはマンニトール）、油又はエマルション、例えば油／水エマルション若しくはトリグリセリドエマルション、各種の湿展剤、錠剤、コーティング錠及びカプセルなどの標準の薬学的に許容される担体のいずれかを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
一実施形態において、複合体は、炭疽菌由来の以下のタンパク質、ＣｏｔＳ、ＣｏｔＪＡ、ＣｏｔＪＢ、ＣｏｔＪＣ、ＣｏｔＭ、ＣｏｔＨ、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＡｌｐｈａ、ＣｏｔＦ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＺ、Ｃｏｔ（推定上の１、２、３、４）、ＣｏｔＨｙｐｏＡｌｐｈａ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＦ（関連）、ＢｃｌＡ、ＥＡ１、ＥＡ２、ｓｒｔＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ  Ａ）、ＳＳＰＨ１、ＳＳＰＨ２、ＳＳＰＩ、ＳＳＰＫ、ＳＳＰＮ、ＳＳＰＯ、ＴＬＰ、ＳＳＰＢ、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ１、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ２、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ３、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ４、ＳＡＳＰ−２、ＳＳＰＦ、ＳＡＳＰ−１、ＳＳＰＥ（ＳＳＰｇａｍｍａ）、ＥｘｓＢ、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ−１、ｃｓｐＢ−２、ｃｓｐＣ、ｃｓｐＤ、ｃｓｐＥ、ＮＤＫ、ＮｕｐＣ−１、ＮｕｐＣ−２、ＮｕｐＣ−３、ＮｕｐＣ−４、ＮｕｐＣ−５、ＮｕｐＣ−６、ＮｕｐＣ−７、ＰｎｕＣ、アラニンラセマーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ヌクレオシドヒドロラーゼ、ＢｘｐＢ、ＥｘｓＦＡ又はＥｘｓＦＢの少なくとも１つを含む。
【００４２】
他の実施形態において、複合体は枯草菌芽胞から単離される。ゆえに、一実施形態において、複合体は枯草菌由来の以下のタンパク質、ＣｏｔＡ、ＣｏｔＢ、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＦ、ＣｏｔＧ、ＣｏｔＨ、ＣｏｔＪＡ、ＣｏｔＪＢ、ＣｏｔＪＣ、ＣｏｔＭ、ＣｏｔＲ、ＣｏｔＳＡ、ＣｏｔＳ、ＣｏｔＴ、ＣｏｔＶ、ＣｏｔＷ、ＣｏｔＹ、ＣｏｔＺ、ＧｅｒＰＡ、ＧｅｒＰＢ、ＧｅｒＰＣ、ＧｅｒＰＤ、ＧｅｒＰＥ、ＧｅｒＰＦ、ＹａａＨ、ＹａｂＧ、ＹｒｂＡ（ＳａｆＡ）、ＣｏｔＱ（ＹｖｄＰ）、ＣｏｔＵ（ＹｎｚＨ）、ＣｏｔＩ（ＹｔａＡ）、ＹｃｋＫ、ＹｄｈＤ、ＹｈｄＡ、ＹｈｄＥ、ＹｉｒＹ、ＹｉｓＹ、ＹｏｄＩ、ＹｏｐＱ、ＹｄｅＰ／ＹｐｅＢ、ＹｐｚＡ、ＹｕｓＡ、ＹｗｑＨ、ＹｘｅＦ、ＣｓｐＤ、Ｈｓｂ、ＰｈｏＡ、ＳｌｅＢ、ＳｓｐＡ、ＳｓｐＥ、ＹｈｃＮ、ＹｒｂＢ、ＣｇｇＲ、ＣｏｘＡ、ＣｗｌＪ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＭ、ＳｐｏＶＩＤ、ＹｈｂＡ、ＣＳＩ５、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ＤＨＢＡ、ＦＡＢＩ、ＲＬ１０、ＳＲＦＡＤ、ＳＡＳ１、ＳＡＳ２、ＳＡＳＧ、ＳＳＰＡ、ＳＳＰＢ、ＳＳＰＣ、ＳＳＰＤ、ＳＳＰＥ、ＳＳＰＦ、ＳＳＰＧ、ＳＳＰＨ、ＳＳＰＩ、ＳＳＰＪ、ＳＳＰＫ、ＳＳＰＬ、ＳＳＰＭ、ＳＳＰＮ、ＳＳＰＯ、ＳＳＰＰ、ＴＬＰ、ＳＳＰＧ−１又はＳＳＰＧ−２の少なくとも１つを含む。
【００４３】
他の実施形態において、複合体はバシラス・セレウス菌芽胞から単離される。ゆえに、一実施形態において、複合体はバシラス・セレウス菌由来の以下のタンパク質、ＥｘｓＡ、ＥｘｓＢ、ＥｘｓＣ、ＥｘｓＤ、ＥｘｓＥ、ＥｘｓＧ、ＥｘｓＨ、ＥｘｓＹ、ＥｘｓＪ、ＥｘｓＦ、ＹｒｂＢ又はＮａｄＡの少なくとも１つを含む。
【００４４】
一実施形態において、前記方法は、糖タンパク質が、少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離されるステップを含み、前記少なくとも１つの他の分子は、タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質を含む。例えば、複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー又は電気泳動溶出の少なくとも１つを用いて、外膜から単離することができる。或いは、他のサイズ選択法を用いることができる。また、一実施形態において、複合体の少なくとも１つの他の分子が特定される。一実施形態において、糖タンパク質及び／又は他の分子を特定するために用いる方法には、ＭＳ−ＴＯＦ、タンパク質シークエンシング又は他の類似した方法、例えば、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオントラップ（ＩＴ）ＭＳ、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化（ＭＡＬＤＩ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳを含めることができる。
【００４５】
他の実施形態において、本発明は、ポリペプチド、糖タンパク質、脂質、リン脂質又はオリゴ糖の少なくとも１つを含む、炭疽菌芽胞の外膜から単離された複合体を含む組成物を含み、前記ポリペプチド、糖タンパク質、脂質、リン脂質又はオリゴ糖は抗原を含み、及び／又は、前記少なくとも１つのポリペプチド、糖タンパク質、脂質、リン脂質又はオリゴ糖は、細胞性又は液性の免疫応答を引き起こすことができる。一実施形態において、前記組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。
【００４６】
一実施形態において、複合体は、炭疽菌由来の以下のタンパク質、ＣｏｔＳ、ＣｏｔＪＡ、ＣｏｔＪＢ、ＣｏｔＪＣ、ＣｏｔＭ、ＣｏｔＨ、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＡｌｐｈａ、ＣｏｔＦ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＺ、Ｃｏｔ（推定上の１、２、３、４）、ＣｏｔＨｙｐｏＡｌｐｈａ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＦ（関連）、ＢｃｌＡ、ＥＡ１、ＥＡ２、ｓｒｔＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ  Ａ）、ＳＳＰＨ１、ＳＳＰＨ２、ＳＳＰＩ、ＳＳＰＫ、ＳＳＰＮ、ＳＳＰＯ、ＴＬＰ、ＳＳＰＢ、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ１、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ２、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ３、ＳＳＰａｌｐｈａ／ｂｅｔａ４、ＳＡＳＰ−２、ＳＳＰＦ、ＳＡＳＰ−１、ＳＳＰＥ（ＳＳＰｇａｍｍａ）、ＥｘｓＢ、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ−１、ｃｓｐＢ−２、ｃｓｐＣ、ｃｓｐＤ、ｃｓｐＥ、ＮＤＫ、ＮｕｐＣ−１、ＮｕｐＣ−２、ＮｕｐＣ−３、ＮｕｐＣ−４、ＮｕｐＣ−５、ＮｕｐＣ−６、ＮｕｐＣ−７、ＰｎｕＣ、アラニンラセマーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ヌクレオシドヒドロラーゼ、ＢｘｐＢ、ＥｘｓＦＡ又はＥｘｓＦＢの少なくとも１つを含む。
【００４７】
他の実施形態において、複合体は枯草菌芽胞から単離される。ゆえに、一実施形態において、複合体は枯草菌由来の以下のタンパク質、ＣｏｔＡ、ＣｏｔＢ、ＣｏｔＣ、ＣｏｔＤ、ＣｏｔＥ、ＣｏｔＦ、ＣｏｔＧ、ＣｏｔＨ、ＣｏｔＪＡ、ＣｏｔＪＢ、ＣｏｔＪＣ、ＣｏｔＭ、ＣｏｔＲ、ＣｏｔＳＡ、ＣｏｔＳ、ＣｏｔＴ、ＣｏｔＶ、ＣｏｔＷ、ＣｏｔＹ、ＣｏｔＺ、ＧｅｒＰＡ、ＧｅｒＰＢ、ＧｅｒＰＣ、ＧｅｒＰＤ、ＧｅｒＰＥ、ＧｅｒＰＦ、ＹａａＨ、ＹａｂＧ、ＹｒｂＡ（ＳａｆＡ）、ＣｏｔＱ（ＹｖｄＰ）、ＣｏｔＵ（ＹｎｚＨ）、ＣｏｔＩ（ＹｔａＡ）、ＹｃｋＫ、ＹｄｈＤ、ＹｈｄＡ、ＹｈｄＥ、ＹｉｒＹ、ＹｉｓＹ、ＹｏｄＩ、ＹｏｐＱ、ＹｄｅＰ／ＹｐｅＢ、ＹｐｚＡ、ＹｕｓＡ、ＹｗｑＨ、ＹｘｅＦ、ＣｓｐＤ、Ｈｓｂ、ＰｈｏＡ、ＳｌｅＢ、ＳｓｐＡ、ＳｓｐＥ、ＹｈｃＮ、ＹｒｂＢ、ＣｇｇＲ、ＣｏｘＡ、ＣｗｌＪ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＭ、ＳｐｏＶＩＤ、ＹｈｂＡ、ＣＳＩ５、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ＤＨＢＡ、ＦＡＢＩ、ＲＬ１０、ＳＲＦＡＤ、ＳＡＳ１、ＳＡＳ２、ＳＡＳＧ、ＳＳＰＡ、ＳＳＰＢ、ＳＳＰＣ、ＳＳＰＤ、ＳＳＰＥ、ＳＳＰＦ、ＳＳＰＧ、ＳＳＰＨ、ＳＳＰＩ、ＳＳＰＪ、ＳＳＰＫ、ＳＳＰＬ、ＳＳＰＭ、ＳＳＰＮ、ＳＳＰＯ、ＳＳＰＰ、ＴＬＰ、ＳＳＰＧ−１又はＳＳＰＧ−２の少なくとも１つを含む。
【００４８】
他の実施形態において、複合体はバシラス・セレウス菌芽胞から単離される。ゆえに、一実施形態において、複合体はバシラス・セレウス菌からの以下のタンパク質、ＥｘｓＡ、ＥｘｓＢ、ＥｘｓＣ、ＥｘｓＤ、ＥｘｓＥ、ＥｘｓＧ、ＥｘｓＨ、ＥｘｓＹ、ＥｘｓＪ、ＥｘｓＦ、ＹｒｂＢ又はＮａｄＡの少なくとも１つを含む。
【００４９】
一実施形態において、糖タンパク質は少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離され、前記少なくとも１つの他の分子は、タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質を含む。例えば、複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー又は電気泳動溶出の少なくとも１つを用いて、外膜から単離することができる。或いは、他のサイズ選択法を用いることができる。また、一実施形態において、複合体の少なくとも１つの他の分子が特定される。一実施形態において、糖タンパク質及び／又は他の分子を特定するために用いる方法には、ＭＳ−ＴＯＦ、タンパク質シークエンシング又は他の類似した方法、例えば、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオントラップ（ＩＴ）ＭＳ、マトリックス介助レーザーデソープション／イオン化（ＭＡＬＤＩ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳを含めることができる。
【００５０】
一実施形態において、糖タンパク質又は糖タンパク質複合体が単離される微生物は、炭疽細菌を含むことができる。或いは、他の微生物として、表１に記載する微生物のいずれか１つを含むことができる。
【００５１】
【表１】
2009511018.tif 000003
2009511018.tif 000004
2009511018.tif 000005
2009511018.tif 000006
2009511018.tif 000007
2009511018.tif 000008
2009511018.tif 000009
【００５２】
一実施形態において、本組成物はワクチンを含むことができる。ある実施形態において、本発明の組成物は、全ての炭疽菌株及び他の炭疽様感染、例えば、それには限定されないが、バシラス・セレウスG9241に対して防御的な炭疽菌ワクチンを提供する。ワクチンは精製された抗原を含むことができ、その抗原は、本明細書で開示されるポリペプチドのいずれか１つを含む。一実施形態において、抗原は、炭疽菌芽胞の外膜から単離された少なくとも１つの糖タンパク質の複合体を含むことができる。ある実施形態において、ワクチンは、炭疽菌芽胞の外膜から単離された精製抗原、及び、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）タンパク質、浮腫因子（ＥＦ）、などの他の炭疽菌抗原を含む、複合ワクチンを含むことができる。
【００５３】
本発明の方法又は組成物のある実施形態において、複合体は、配列番号１〜２６に示す核酸配列の少なくとも１つ又はアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、単離された分子を含む。或いは、複合体は、配列番号１〜２６に示す核酸配列と９５％〜９９％の同一性を有する核酸分子、又は、アミノ酸配列と９５％〜９９％の同一性を有するタンパク質若しくはポリペプチドを含むことができる。他の実施形態において、複合体は、配列番号１〜２６に示す核酸配列と９０％〜９９％の同一性を有する核酸分子、又は、アミノ酸配列と９０％〜９９％の同一性を有するタンパク質若しくはポリペプチドを含むことができる。他の実施形態において、複合体は、配列番号１〜２６に示す核酸配列と８５％〜９９％の同一性を有する核酸分子、又は、アミノ酸配列と８５％〜９９％の同一性を有するタンパク質若しくはポリペプチドを含むことができる。他の実施形態において、複合体は、配列番号１〜２６に示す核酸配列と８０％〜９９％の同一性を有する核酸分子、又は、アミノ酸配列と８０％〜９９％の同一性を有するタンパク質若しくはポリペプチドを含むことができる。例えば、複合体は、配列番号１〜２６に示す核酸配列及び／又はアミノ酸配列の少なくとも１つによってコードされるタンパク質の断片及び／又は相同体を含むことができ、その相同体は保存的なアミノ酸置換を含み、その断片は抗原性であるポリペプチドの部分を含む。本発明は、配列番号１〜２６に示す配列に含まれる核酸配列の少なくとも１５個の連続的な核酸配列を含む核酸配列の断片も含む。他の実施形態において、本発明は、配列番号１〜２６に示す配列に含まれる核酸配列の相補体の少なくとも１５個の連続的な核酸配列を含む核酸配列の断片も含む。一実施形態において、糖タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６に示すアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、一実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５に示す核酸配列を含む、炭疽菌芽胞の外膜から単離したレクチン結合糖タンパク質をコードする単離核酸分子を含む。
【００５４】
一実施形態において、本発明は、本明細書で開示される核酸のいずれかを含む組換えＤＮＡ構築物を含むベクターも含む。また、一実施形態において、本発明は、本明細書で開示される核酸のいずれかを含む組換えＤＮＡ構築物を含むベクターを含む細胞を含むことができる。
【００５５】
他の実施形態において、本発明は、バシラス・セレウス菌G9241などの炭疽菌感染及び炭疽様感染に対するワクチン接種のためにこれらの組成物を用いる方法を含む。例えば、一実施形態において、本発明の組成物は、単独で又は組み合わせて、炭疽に対して防御免疫を誘導するための抗原として用いることができる。一実施形態において、組成物は免疫応答の誘導を助けるアジュバントと一緒に用いることができる。
【００５６】
本発明は、炭疽菌感染を予防又は治療する方法も提供する。他の実施形態において、本発明は、対象で炭疽菌感染、炭疽様疾患又は他の関心の疾患を治療又は予防する方法であって、炭疽菌芽胞の外膜からの少なくとも１つの糖タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含む方法を含む。ゆえに、一実施形態において、本発明は、対象で炭疽菌に対する免疫応答を起こさせる方法であって、炭疽菌芽胞の外膜上の少なくとも１つの糖タンパク質を含む組成物を含む組成物を対象に投与することを含み、その糖タンパク質は少なくとも１つのレクチン結合糖を含む方法を含む。一実施形態において、免疫応答は細胞免疫応答である。あるいは、又は追加的に、免疫応答は液性免疫応答である。他の実施形態において、本発明は、対象で炭疽菌に対する免疫応答を起こさせる方法であって、本明細書で開示される核酸のいずれかを対象に投与することを含み、それにより、例えば組成物の核酸を発現させることができ、免疫応答は細胞性又は液性の免疫応答である方法を含む。
【００５７】
本発明のワクチン及び組成物で治療する対象は、任意の哺乳動物、例えばマウス、霊長類、ヒト、ウシ、ヒツジ、有蹄動物又はウマであることができる。本発明の組成物及び／又はワクチンは、任意の標準的なワクチン投与方法で投与することができる。一実施形態において、投与は注射による。他の実施形態において、投与は経鼻吸入によることができる。
【００５８】
本明細書で開示される組成物及びワクチンは、個々に、又は、炭疽菌若しくは炭疽菌様細菌からの芽胞の他の成分と組み合わせて用いることができる。或いは、本組成物及びワクチンは、防御抗原（ＰＡ）、ＬＦ又はＥＦ（Pezard, C. et al. 1995, Infect. Immun., 63:1369-72）ワクチンを含むワクチンなどの、炭疽菌感染を治療するために用いられるワクチンと組み合わせて用いることができる。さらに、本明細書で開示されるワクチンは、アジュバントの使用を含むことができる。また、他の炭疽菌抗原を用いることができる（Brossier, F., and M. Mock, 2001, Toxicol., 39:1747-55；Cohen, S et al., 2000, Infect Immun 68:4549-58）。
【００５９】
炭疽病及び他の炭疽様感染
炭疽病は、グラム陽性、内生芽胞生産性の桿状細菌炭疽菌に起因する、主にウシ、ヒツジ及びヤギの非常に致命的な疾患である。炭疽菌は、バシラス属の他のメンバーと同様に、増殖条件が好ましくない場合は、発達上の経路、芽胞形成に移行することができる。芽胞形成過程の結果、乾燥及び熱を含む多数の環境攻撃に耐える、代謝的に不活性な細胞形態である内生芽胞が生産される。バシラス種によって生産される芽胞は、長期間土壌中で残存することができ、世界中で見られる。
【００６０】
ヒトも、炭疽菌に感染しやすい。感染は、３つの型の１つで起こることができる。皮膚の擦過を通しての芽胞の侵入は、皮膚型炭疽の特質である悪性膿疱と呼ばれる病変をもたらす。この型は最も一般的な「自然」なヒト炭疽病であり、死亡率は低く、抗生物質療法によく応答する。炭疽菌で汚染された肉の摂取は、その胃腸型疾患を引き起こす。この種の疾患は米国で稀であるが、２０００年に複数の症例がミネソタで報告された（Morbid. Mortal. Weekly Report, 2000, 49:813-816）。この型の疾患はより高い死亡率を有し、未処置症例では約４０％である。ヒト炭疽の最も致死性の高い型は、肺型である。吸入された芽胞は肺に蓄積し、肺胞マクロファージによって呑食される（Ross, J. M. , 1957, J. Pathol. Bacteriol, 73:485-494）。次に、芽胞は所属リンパ節へ送られ、途中でマクロファージの中で発芽する（Ross, 1957; Guidi-Rontani, C., M., et al., 1999, Mol. Microbiol. 31:9-17）。肺炭疽の初期症状は、特徴のないインフルエンザ様の症状である。患者の状態は症状発現の後急速に悪化し、２、３日以内にしばしば死亡する。死亡率は高く、抗生物質療法によっても９８％以上である。したがって、肺炭疽はバイオテロリズム攻撃における第１の懸念である。近年では、バシラス・セレウスG9241菌株は、肺炭疽に類似した疾患を引き起こすことが示された（Hoffmaster, A.R., et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101: 8449-8454）。マウスでは、Ｂ．セレウスG9241は１００％致死的である（Hoffmaster et al., 2004）。セレウス菌の他の株は、Ｂ．セレウスATCC 10987などの炭疽菌の病原性因子のいくつかを示した（Rask et al., 2004; Han et al., 2006, and Hoffmaster et al., 2006）。炭疽病及び炭疽様疾患による感染に対し、単一のワクチンで対処することは可能でありうる。
【００６１】
芽胞は、炭疽菌の感染型である。芽胞の外側は、毛様突起の外部毛羽立ちによって囲まれた基底層からなる、外部外膜の存在を特徴とする（Hoffmaster et al., 2004；Hachisuka, Y., et al., 1966, J. Bacteriol. 91:2382-2384；Kramer, M. J., and I. L. Roth, 1968, Can J. Microbiol. 14:1297-1299）。肺への芽胞の侵入後、芽胞はマクロファージによって速やかに取り込まれ、そこでそれらは発芽する。栄養型（増殖型）では、芽胞外膜及び外皮層はポリＤ−グルタミン酸莢膜及びＳ（表面）層によって置換される。
【００６２】
マクロファージによって呑食された芽胞の消長を調査した（Dixon, T. C., et al., 2000, Cell. Microbiol., 2:453-463；Guidi-Rontani, C., et al., 1999, Mol. Microbiol. 31:9-17；Guidi-Rontani, C., et al., 2001, Molec. Microbiol. 42:931-938）。炭疽菌の芽胞がマクロファージの表面に付着すると、それらは迅速に貪食されるであろう。外膜及びファゴリソソーム膜の間には、密接な相互作用が存在する可能性がある。しかし、新規の栄養形桿菌は、培養マクロファージのファゴソームから脱出すること、及び細胞の細胞質中で増殖することができる。マクロファージからの細菌の放出は、芽胞の食作用の４〜６時間後に起こる。炭疽菌の主要な病原性因子は、プラスミド上にコードされている。１つのプラスミド（pXO1）が毒素遺伝子を運び、第２のプラスミド（pXO2）がポリグルタミン酸莢膜生合成装置をコードする。
【００６３】
ある実施形態において、本発明の方法及び組成物は、関心の他の炭疽菌様細菌又は微生物のためのワクチンを開発するために用いることもできる。炭疽様感染の芽胞は、炭疽菌芽胞のそれらに類似する。例えば、バシラス・セレウスは、糖タンパク質、オリゴ糖及び他の糖を含む外膜を有することが示された。また、両方とも莢膜を含むので、Ｂ．セレウスG9241の栄養細胞は炭疽菌の栄養細胞に似ることができるが、Ｂ．セレウスG9241の莢膜は炭疽菌のｐＸＯ２プラスミドによってコードされず、ｐＢＣ２１８クラスターによってコードされるようである（Hoffmaster et al., 2004）。ｐＸＯ１プラスミドでコードされる炭疽毒素のいくつかは、Ｂ．セレウスG9241内で、ＡｔｘＡ（毒素調節因子）、致死因子及び防御抗原（ＰＡ）を含む、ｐＢＣ２１８上でコードされる類似した対応物を有する可能性がある。ＰＡの機能にとって重要な３３個のアミノ酸のうち２７個は炭疽菌エームズ株及びＢ．セレウスG9241で同一であるので、Ｂ．セレウスG9241で見られるＰＡが機能的である可能性を示す証拠がある。
【００６４】
炭疽菌芽胞の芽胞表面と反応性である抗体は、芽胞と宿主細胞及び／又は環境との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。例えば、芽胞表面と反応性である抗体は、マウス腹腔マクロファージによる芽胞食作用を強化すること、及び、インビトロで芽胞発芽を抑制することができる。ＢｃｌＡ（バシラスの、コラーゲン様タンパク質）と呼ばれる第１の芽胞表面タンパク質が、最近、炭疽菌において発見された。ポリＤ−グルタミン酸莢膜は芽胞に存在せず、したがって、ＢｃｌＡを含む表面タンパク質が表層を構成する。炭疽菌の他の芽胞特異的構成要素を探すために、質量分析が利用された。
【００６５】
芽胞は、３−Ｏ−メチルラムノース、ラムノース及びガラクトサミンの存在を特徴とする。この炭水化物は芽胞だけで見られ、栄養生長する細胞によっては合成されない。バシラス・チューリンジエンシス及びＢ．セレウスは炭疽菌と遺伝的に緊密に関係し、両方の外膜は、その主要な炭水化物要素がラムノースである糖タンパク質を含むが、バシラス・チューリンジエンシスタンパク質はガラクトサミンをさらに含む。他の糖モノマーはバシラス・チューリンジエンシス外膜に存在し、それは、前に芽胞糖として同定された３−Ｏ−メチルラムノース又は２−Ｏ−メチルラムノースである可能性がある。
【００６６】
１．組成物の調製
一実施形態において、炭疽菌芽胞の外膜上の糖タンパク質は、他のタンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質と複合体を形成することができる。外膜４によって囲まれた炭疽細菌（又は、他の微生物）２の図を、図１で示す。ゆえに、芽胞は、糖又はオリゴ糖６、ペプチド８、脂質１２などの他の生体分子と複合体を形成した、様々な糖タンパク質又はリポポリサッカライド５を含むことができることが分かる。また、一実施形態において、これらの複合体１４、１６の少なくとも一部は抗原性であるので、抗炭疽ワクチンを作製するために、抗原エピトープの単離を利用することができる。ゆえに、本明細書で述べるように、実際の細菌から単離された毒素タンパク質７、９（例えば、ＰＡ；ＬＦ）だけを含むワクチンは、肺炭疽に対して完全には有効でないことが分かった。芽胞に基づく抗原をワクチンに加えることによって、本発明の組成物の実施形態は、炭疽及び炭疽に基づく疾患（又は、関心の他の疾患）に対する改善された免疫を提供することができる。
【００６７】
図２は、本発明の方法の略図を提供する。この方法は、図２に示す２つの部分を含むことができ、これらの部分は個別に、又は組み合わせて実施することができる。図２で示すように、一実施形態において、本発明は炭疽菌芽胞から糖タンパク質及び他の分子を精製する方法を提供する。一実施形態において、本方法は炭疽菌又は他の炭疽菌様細菌（又は、関心の微生物）から芽胞を単離する、第１のステップ２２を含むことができる。芽胞の単離は、本明細書の実施例１１に記載の遠心分離、又は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの当技術分野で周知の他の方法で実施することができる。２Ｄゲル電気泳動によって単離された単離炭疽菌芽胞の例を、図４（矢印は、白色芽胞を指す）に示す。次に、本方法は、尿素、超音波処理、ビーズ打撃、フレンチプレス又は他のなんらかの手段を用いて芽胞を溶解すること２４を含むことができる。芽胞の溶解は、純粋な（約９５〜１００％の純度）芽胞溶液（炭疽菌芽胞とＰＢＳ又は水）をとり、尿素抽出、又は他のなんらかの溶解手法、例えば、本明細書中の超音波処理を実施することにより、又は、当技術分野で周知の方法を用いることにより実施することができる。
【００６８】
この時点で、サイズ排除クロマトグラフィー又はＨＰＬＣによって芽胞から複合体を精製する、任意選択のステップ２６を実施することができる。
【００６９】
次に、複合体に含まれる糖タンパク質を精製するために、溶解した芽胞又はサイズで選択した分画をカラムに加えることができる。一実施形態において、芽胞混合物から糖タンパク質複合体を精製するために、レクチンを用いる２８。レクチンは、糖タンパク質の炭水化物部分を認識してそれと結合することができる、糖結合タンパク質である。次に、炭疽菌糖タンパク質よりもレクチンに強い親和性を有する他の糖でレクチンを洗浄することによって、レクチンを糖タンパク質から放出することができる３０。レクチン結合によって精製した炭疽菌タンパク質のサブセットを示す例を、図３に示す。ゆえに、レクチンによる抽出直後に、尿素抽出した芽胞で見られるタンパク質のサブセット（例えば、ＥＡ１及び新しいタンパク質１、２、３、４、５、６及び７）が単離されることが分かる。この時点で、溶出した糖タンパク質は、飛行時間型質量分析（ＭＳ−ＴＯＦ）、タンパク質シークエンシング又は他の類似の方法によって特定することができる３２。例えば、図５は、図３のゲル上で見られるＥＡ１バンドのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳの結果を示す。本明細書で記載するように、糖タンパク質複合体は、炭疽感染若しくは任意の炭疽様疾患に対する免疫のためのワクチンとして、又は、炭疽菌、他の任意の炭疽様芽胞若しくは他の関心の微生物の検出のための診断手段として使用することができる。
【００７０】
一実施形態において、レクチンで精製した複合体から特定のタンパク質を除去するために、電気泳動溶出を用いることができる。代わりに、タンパク質をレクチン複合混合物に加えるために、尿素抽出した芽胞又は他の溶解した芽胞の電気泳動溶出を用いることができる３４（図２）。電気泳動溶出については、単離された芽胞タンパク質の一次元若しくは二次元のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、sodium dodecyl sulfate）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ、polyacrylamide gel electrophoresis）、又は本来のゲル電気泳動を実施することができる。次に、ゲルを染色し、関心のスポットを切り出し、脱色することができる。次に、関心のタンパク質を含むゲルの単離された部分に電荷を通し、ゲルからタンパク質を溶出させる。関心の分子量から外れるタンパク質、糖タンパク質、脂質、リン脂質又はオリゴ糖を除去するために、他の技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィー又はＨＰＬＣを用いることができる。溶出したタンパク質をフィルター上に、又はチューブ若しくはフィルターチューブなどの容器内に捕捉し、ＭＳ−ＴＯＦ、タンパク質シークエンシング又は、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−ＩＴ、ＭＡＤＬＩＦＴ−ＩＣＲ若しくはＥＳＩ  ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳなどの他の類似した方法によって分析することができる３６。
【００７１】
一実施形態において、レクチンカラムから単離され、一次元若しくは二次元のＳＤＳ又は本来のゲル上の関心のスポットと相関する特定の糖タンパク質だけを用いて、本発明の組成物（例えばワクチン）を作製する３３、４０（図２）。代わりに、芽胞複合体から単離されたタンパク質を精製糖タンパク複合体へ戻し、本発明の組成物を作製することができる。３３、３８、４０（図２）。
【００７２】
図３のパネルＡ及びＢは、レクチン処理によって炭疽菌芽胞タンパク質を単離した後に得ることができる種類の結果の概念を示す。ゆえに、一実施形態において、試料中のタンパク質のプロフィールは、一次元又は二次元（２Ｄ）のゲル電気泳動によって特徴づけることができる。一実施形態において、試料は、１つの次元においては２Ｄゲル電気泳動の場合のように上昇するｐＨの勾配に沿った電荷に基づいて分離され、他の次元においてはサイズに基づいて分離される。炭疽菌芽胞から単離されたタンパク質のプロフィールは、レクチン処理前（図３Ａ）よりもレクチン処理後（図３Ｂ）に実質的に少ないタンパク質を含むことが分かる。
【００７３】
２．ワクチン
一実施形態において、本発明の組成物はワクチンを含む。ウイルス及び細菌の感染に対するワクチンを作製するために、いくつかの基本戦略を用いることができる。炭疽及び炭疽様感染に対するワクチンを開示している米国特許出願は、２００３０１１８５９１、２００４／０００９１７８、２００４／０００９９４５、２００２／０１４２００２である。これらの特許出願は、炭疽菌ワクチンに関連する物質及び炭疽菌ワクチンの作製で使用される物質に関して、本明細書で参照により組み込まれる。三者構成の炭疽毒素（ＡＶＡ）の防御抗原（ＰＡ）成分を含む炭疽菌ワクチンは、動物試験で完全には防御できない。実際、栄養細胞を囲んで補体媒介性の殺滅による殺滅から保護する（Rhie et al., 2003；Schneerson et al., 2003）ポリＤ−グルタミン酸莢膜（ＰＧＡ）をさらに標的にする、コンジュゲートワクチンが求められた。しかし、そのようなワクチンは、マクロファージと芽胞との最初の相互作用ではなく、栄養細胞及び致死毒素を標的にする。
【００７４】
本明細書で開示されるワクチンは、炭疽菌芽胞から単離されたレクチン精製糖タンパク質複合体で構成することができる。一実施形態において、ワクチンは、防御抗原又はＬＦ抗原などの炭疽細菌及び／又は芽胞から単離された他の成分と併用される。又は、莢膜成分を含めることができる。さらに、ワクチンは、糖タンパク質複合体の脱グリコシル化された形態、融合タンパク質又は欠落しているか若しくは削除されたサブユニットを含むことができる複合体を含めて、炭疽菌芽胞から単離されたレクチン精製糖タンパク質複合体の全体を、又は、部分的に、用いることができる。一実施形態において、炭疽菌のレクチン結合糖タンパク質の断片を、ＰＡ断片と組み合わせることができる。例えば、炭疽菌のレクチン結合糖タンパク質複合体の断片を、ＰＡ断片と組み合わせることができる。又は、炭疽菌のレクチン結合糖タンパク質の断片を、抽出可能な抗原１（ＥＡ１）、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ、Serum Amyloid P Component）又はカプセル状のポリγ−ｄ−グルタミン酸（ＰＧＡ、poly-gamma-d-glutamic acid）などの他の芽胞関連抗原と組み合わせることができる。他の実施形態において、本発明は、１つ又は複数の炭疽菌タンパク質又はポリペプチドをコードする１つ又は複数のレプリコンに由来する１つ又は複数のレプリコン粒子を含む炭疽菌ワクチンに関する。
【００７５】
一実施形態において、本発明のワクチンは、液性及び／又は細胞性の免疫応答を増進させるために、アジュバントを含む。一実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムなどの、Food and Drug Administrationによって承認されるものである。或いは、Ribiアジュバントを使用することができる。
【００７６】
３．ワクチン投与
本明細書で開示されるペプチド、組成物、ワクチン又は抗体は、所望の生物効果のために所望の場所に所望の投薬量を送達することができる、当業者に周知のいかなる投与様式によっても投与することができる。経路又は様式には、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内注射、筋肉内注射）、又は皮下投与が含まれる。一実施形態において、ワクチンは、皮下又は筋肉内の注射のために調製される。ワクチンは、全身又は粘膜の免疫を提供する前にペプチドが分解されずに、それが、例えば、経口、吸入、鼻腔内又は直腸経由で粘膜に送達可能にするように製剤化することができる。投与される活性化合物の量は、当然、例えば、治療対象、対象の体重、投与方法及び担当医師の判断によって決まる。免疫原性量は、標準手順で決定することができる。「免疫原性量」は、ワクチンを投与する対象で免疫応答を呼び起こすのに十分なタンパク質の量である。キログラムにつき約１０２〜１０７マイクログラムの量の用量が適当であり、治療する対象の年齢及び種によって、それよりも多くの量又は少ない量が用いられる。
【００７７】
意図する投与様式に従い、組成物又はワクチンは、好ましくは正確な投薬量の単独投与のために適する単位用量剤形である、例えば錠剤、坐薬、ピル、カプセル、粉末、液剤、懸濁液、その他などの固体、半固体又は液体剤形の形態であることができる。組成物又はワクチンは、上記したように、選択した免疫原の有効量を薬学的に許容される担体と組み合わせて含むことができ、さらに、他の薬剤、医薬用薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、その他を含むことができる。例示的な薬用担体には、発熱性物質を含まない滅菌水、及び発熱性物質を含まない滅菌生理食塩水が含まれる。
【００７８】
一定レベルの投薬量が維持されるように、非経口的投与は、緩放出性又は徐放性のシステムの使用を含むことができる。本明細書で参照により組み込まれている米国特許第３，７１０，７９５号を参照。緩放出性又は徐放性を用いるシステムは、経口投与でも用いることができる。ワクチン又は組成物は、より遅い放出又は持続的放出のために、リポソーム形態で投与するか、カプセル化するか、又は他の方法で保護若しくは製剤化することができる。一次抗体応答と呼ばれるワクチン抗原への最初の曝露後の抗体レベルは、主にＩｇＭからなる可能性があり、持続時間が短く程度も低い可能性があるので、効果的な防御には不十分である。第２の及び以降の抗原チャレンジ後の抗体レベル、すなわち二次抗体応答は、より速やかに出現してより長い期間持続し、より高い力価を達成し、主にＩｇＧからなる。より短い潜伏期は、一般に、記憶細胞と呼ばれる、繰返し曝露の時点で既に存在する抗原感受性細胞による。
【００７９】
一実施形態において、ワクチンはアデノウイルスベクターとして提供される。一実施形態において、アデノウイルスに基づくワクチンは、免疫化を達成するために、筋肉内注射（非経口）、鼻腔内投与又は経口投与などの、異なる経路によって投与することができる。病原体、この場合炭疽菌芽胞に対してより強い粘膜免疫を引き出すために、この種のワクチンによる鼻腔内免疫接種が好ましい可能性がある。一実施形態において、バイオテロリズム攻撃によって拡散されたエアゾール分散炭疽菌芽胞に起因する肺炭疽に対する防御のために、鼻腔内投与を提供することができる。
【００８０】
現在投与されている炭疽菌ワクチンは、１８カ月にわたる６回の免疫接種と、その後の年１回の追加抗原刺激により機能することができる。一実施形態において、本発明のワクチンは、任意選択の追加抗原刺激で防御免疫を提供するために、１、２、３、４又は５回の免疫接種で提供することができる。適当な免疫接種スケジュールの例としては、それらに限定されないが、（ｉ）０カ月、１カ月及び６カ月、（ｉｉ）０日、７日及び１カ月、（ｉｉｉ）０カ月及び１カ月、（ｉｖ）０カ月及び６カ月、又は、防御免疫を与えるか、又は病気の症状を緩和するか、又は疾患の程度を弱めることが予想される所望の免疫応答を引き出すのに十分な他のスケジュールがある。
【００８１】
一実施形態において、本発明のワクチンは、抗糖タンパク質複合体ＩｇＧ抗体価、抗糖タンパク質複合体ＩｇＧ１抗体価、抗糖タンパク質複合体ＩｇＧ２ａ抗体価の少なくとも１つを提供することができる。代わりの実施形態において、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１０５００、１１０００、１１５００及び１２０００の抗体価が、１、２、３、４、５回又はそれより多くの免疫接種後２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０週までに達成される。一実施形態において、有効な免疫接種を維持するために、追加抗原刺激接種が用いられる。追加抗原刺激は、例えば、先行接種の後１、２、３、４、６、８、１２年ごとに与えることができる。
【００８２】
一実施形態において、ワクチンは、本発明の方法によって単離された免疫原性炭疽タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。例えば、一実施形態において、配列番号１〜２６で示す配列に含まれる核酸配列を含む核酸を、本発明のワクチンで用いることができる。
【００８３】
ＤＮＡ（又は、ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ）をワクチンとして用いる場合、当技術分野で周知の方法のなかでもとりわけ金のビーズによる送達（遺伝子銃）、リポソームによる送達又は直接注入などの技術を用いて、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）を直接的に投与することができる。任意の１つ又は複数の構築物又はＤＮＡ若しくはＲＮＡを、対象で免疫原性応答を引き出すのに有効な任意の組合せで使用することができる。一般に、投与する核酸ワクチンは、１用量につき核酸が約１〜５μｇの量であることができ、治療対象、所望の免疫応答を起こす対象の免疫系の能力及び所望の防御度によって決まる。投与するワクチンの正確な量は開業医の判断によって決まり、個々の対象及び抗原に特有であってよい。
【００８４】
４．免疫応答を評価するためのアッセイ
本発明の実施形態は、炭疽菌の内膜から単離された成分への免疫応答を評価するためのアッセイも提供する。
【００８５】
アッセイは、抗体応答及び遅延型過敏症応答を測定するアッセイなどの、インビボアッセイを含むことができる。一実施形態において、抗体応答を測定するアッセイは、主にＢ細胞機能、並びにＢ細胞／Ｔ細胞相互作用を測定することができる。他の実施形態において、遅延型過敏症応答アッセイは、Ｔ細胞免疫を測定することができる。抗体応答アッセイについては、抗原チャレンジ後に血液中の抗体価を比較することができる。これらのレベルは、抗体の型、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭ又はＩｇＤ別に数量化することができる。また、抗原刺激なしで血液中の抗体及びリンパ球のレベルを測定することによって、免疫系の発達を調査することができる。炭疽菌芽胞又は炭疽の他の任意の株と依然として結合することができる抗体の最大希釈を検査する、凝集アッセイを用いることができる。
【００８６】
アッセイは、インビトロアッセイを含むこともできる。インビトロアッセイは、細胞の分割する能力若しくは他の細胞が分割するのを助ける能力、又は、リンフォカイン及び他の因子を放出する能力、活性化のマーカーを発現する能力、並びに標的細胞を溶解する能力を判定することを含むことができる。マウス及びヒトのリンパ球を、インビトロアッセイで比較することができる。一実施形態において、末梢血細胞、脾細胞又はリンパ節細胞などの類似したソースからのリンパ球が比較される。しかし、ヒト末梢血細胞及びマウス脾細胞のそれには限定されない例の場合のように、異なるソースからのリンパ球を比較することが可能である。インビトロアッセイについては、細胞は、精製すること（例えばＢ細胞、Ｔ細胞及びマクロファージ）、又はそれらの天然の状態のままにすること（例えば脾細胞若しくはリンパ節細胞）ができる。精製は、所望の結果を与える任意の方法によることができる。細胞は、マイトジェン又は特異抗原を用いて、それらの増殖能力についてインビトロで試験することができる。マイトジェンは、限定されないコンカナバリンＡ及びＴ細胞受容体抗体の例の場合のようにＴ細胞の分割能力を、又は、限定されない植物性凝集素の例の場合のようにＢ細胞の分割能力を特異的に試験することができる。特異抗原の存在下で分割する細胞の能力は、混合リンパ球反応、ＭＬＲ、アッセイを用いて判定することができる。特定のリンフォカインを分泌する細胞の能力を数量化するために、培養細胞からの上清を試験することができる。細胞を培養物から取り出して、活性化抗原を発現するそれらの能力について試験することができる。これは、限定されない活性化抗原と結合する抗体又はリガンド並びに活性化抗原をコードするＲＮＡと結合するプローブを用いる例の場合のように、任意の適当な方法によって実施することができる。
【００８７】
また、一実施形態において、ある細胞型の頻度を測定するために、表現型細胞アッセイを実施することができる。血液中のリンパ球又はマクロファージを計数するために、末梢血球数計数を実施することができる。限定されないＣＤ４細胞数及びＣＤ４／ＣＤ８比を測定する例の場合のように、ある抗原を発現する細胞の割合を判定するために末梢血リンパ球をスクリーニングするために、抗体を用いることができる。
【００８８】
ある実施形態において、炭疽又は炭疽菌タンパク質、例えば宿主タンパク質、又は化学的誘導剤、又は、本発明の炭疽菌タンパク質と相互作用してその機能を抑制することができる他のタンパク質を抑制する薬剤及び剤の効果を分析するために、形質転換宿主細胞を用いることができる。抗炭疽薬剤又は抗炭疽様疾患薬若しくは剤の効果を試験する方法は、例えば、ラット炭疽毒素アッセイ（Ivins et al. 1986, Infec. Immun. 52, 454-458；Ezzell et al., Infect. Immun., 1984, 45:761-767）、或いは、炭疽毒素に対する抗血清を検定するためのウサギの皮膚試験でよい（Belton and Henderson, 1956, Br.J. Exp. Path. 37, 156-160）。
【００８９】
５．抗体の生成
本発明の他の実施形態は、炭疽菌芽胞内膜単独から、又は、他の炭疽菌成分と一緒のものから単離された、レクチン結合糖タンパク質を特異的に認識する抗体の生成を含む。一実施形態において、ポリクローナルの、モノクローナルの、キメラの、ヒトの、ヒト化された、又はヒト以外のものであれ、本抗体調製物は、炭疽菌芽胞単独から、又は、他の炭疽菌成分と一緒のものから単離された、レクチン結合糖タンパク質複合体の変異体及び断片を認識し、標的にすることができる。炭疽菌芽胞内膜単独から、又は、他の炭疽菌成分と一緒のものから単離されたレクチン結合糖タンパク質複合体のいずれかの、本来のものでない変異体又は断片を特異的に認識する抗体は、例えば、炭疽菌芽胞の内膜から単離されたレクチン結合糖タンパク質複合体の組換え断片、及びそのようなタンパク質の変異体を精製するために用いることができた。そのような抗体は、インビボでの炭疽菌の直接的免疫療法ターゲッティングのための、「受動ワクチン」として用いることもできた。また、研究又は診断で使用するための、炭疽菌芽胞又は芽胞断片をインビトロ又はインビボで検出するために前記抗体を用いる方法が開示される。
【００９０】
一実施形態において、本明細書で提供される抗体は、炭疽菌芽胞及び炭疽と緊密に関連する他の種の芽胞を中和することができる。提供される抗体は、炭疽又は炭疽様感染を治療するために、例えば、針注射を通して、直接的に送達することができる。提供される抗体は、肺炭疽又は炭疽様疾患を治療するために、非観血的に、例えば鼻腔内に送達することができる。
【００９１】
一実施形態において、治療効率を最大にするために、細胞送達の向上のために、例えば、リポソーム、マイクロスフェア又は他のトランスフェクション強化剤に、抗体を封入することができる。一実施形態において、提供される抗体又はＦａｂフラグメントなどのそれらのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を、プラスミド又はウイルスベクターなどの遺伝子ベクターにクローニングし、炭疽又は炭疽様疾患の治療のために、抗体の内因性発現のために宿主に送達することができる。
【００９２】
一実施形態において、抗体は他の種で生成され、ヒトでの投与のために「ヒト化される。」ヒト以外（例えばマウス）の抗体のヒト化形態は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、若しくは他の抗原結合性抗体部分配列）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、ヒト以外の種、例えば、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのＣＤＲからの残基（ドナー抗体）によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト以外の残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもインポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。一般には、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト以外の免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１つ、一般的には２つの可変領域の実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含む（Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525；Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596。
【００９３】
当技術分野で知られているヒト以外の抗体をヒト化する方法を、本発明の抗体をヒト化するために用いることができる。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外のソースからそれに導入された１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらのヒト以外のアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と呼ばれ、それらは一般的に「インポート」可変領域から取り出される。ヒト化は、基本的に、ヒト抗体の対応配列を齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列で置換することによって実施することができる（Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525；Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327；Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536を参照。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に無傷のヒト可変領域未満がヒト以外の種からの対応配列によって置換された、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、一般的に、一部のＣＤＲ残基、おそらく一部のＦＲ残基が、齧歯動物の抗体の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【００９４】
ヒト化抗体を作製する際に用いる、軽鎖及び重鎖を含めたヒト可変領域の選択は、抗原性を減少させるために非常に重要であろう。「最良適合」法によると、齧歯動物の抗体の可変領域の配列を、周知のヒト可変領域配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングする。次に、齧歯動物のそれに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al., 1993, J. Immunol., 151:2296；Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901。他の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体のために、同じフレームワークを用いることができる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:4285; Presta et al., J. Immunol., 1993, 151:2623）。
【００９５】
一実施形態において、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物的性質を保持してヒト化される。この目標を達成するために、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化生成物を分析することによって調製することができる。これらの表示と公開されている三次元の免疫グロブリンモデルとのコンピュータによる比較は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち、抗原と結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、所望の抗体特性、例えば標的抗原への親和性の増強が達成されるように、ヒトフレームワーク（ＦＲ）残基は、コンセンサス配列及びインポート配列から選択して組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に対する影響に直接的に、及び、最も実質的に関与する（例えば、国際公開９４／０４６７９を参照）。
【００９６】
一実施形態において、内因性の免疫グロブリンが生成されない場合に、免疫接種の後に、ヒト抗体の完全なレパートリーを生じさせる能力があるトランスジェニック動物（例えばマウス）を、使用することができる。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスの抗体重鎖Ｊ領域のＪＨ遺伝子のホモ接合欠失は、内因性の抗体産生の完全な抑制をきたすことが記載された。そのような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジ後にヒト抗体の生成をもたらすことができる（例えば、Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555；Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258；Bruggemann et al., 1993, Year in Immunology, 7:33を参照）。
【００９７】
他の実施形態において、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーで生成することもできる（Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol., 227:381；Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581。他の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。（例えば、Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77；Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147(1): 86-95を参照。例えば、本発明は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含むことができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる（例えば、Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495; or Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照）。ハイブリドーマ法では、免疫接種剤と特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することができるリンパ球を誘導するために、一般的に、マウス又は他の適当な宿主動物を免疫接種剤で免疫接種する。代わりに、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。好ましくは、免疫接種剤は、炭疽菌芽胞の外膜上の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質を含む組成物を含む。伝統的に、モノクローナル抗体の生成は、免疫原用としての精製されたタンパク質又はペプチドの入手可能性に依存している。最近では、ＤＮＡに基づく免疫接種が、強い免疫応答を誘導し、モノクローナル抗体を生成する方法としての可能性を示している。この方法では、ＤＮＡに基づく免疫接種を用いることができ、その場合、当技術分野で周知の方法（例えば、Kilpatrick KE, et al., 1998, Hybridoma, Dec. 17(6): 569-76；Kilpatrick KE et al., 2000, Hybridoma, Aug., 19(4): 297-302）に従い、及び、実施例で記載するように、ヒトＩｇＧ１との融合タンパク質として発現される炭疽菌芽胞の一部をコードするＤＮＡを宿主動物に注入する。
【００９８】
他の実施形態において、抗原をバキュロウイルスで発現させることができる。バキュロウイルス系の利点には、生成の容易さ、高レベルの発現、及び、哺乳動物系で見られるものに非常に類似する翻訳後修飾が含まれる。抗原は、抗原がビリオンの表面に提示されるように、シグナル配列に作動可能的に連結されるように、炭疽菌抗原タンパク質をコードする遺伝子を挿入することによって生成される。この方法は完全体ウイルスによる免疫化を可能にし、標的抗原の精製を不要にする。
【００９９】
一実施形態において、ヒト起源の細胞が所望の場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、モノクローナル抗体を生産する方法で用いられる。代わりの実施形態において、ヒト以外の哺乳動物のソースが所望の場合、脾細胞又はリンパ節細胞を用いることができる。次に、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞系は、齧歯動物、ウシ、ウマ、及びヒト起源の骨髄腫細胞を含む、形質転換された哺乳動物細胞であることができる。一実施形態において、ラット又はマウス骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の増殖又は生存を抑制する１つ又は複数の物質を含有する、適当な培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止するヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを一般的に含む（「ＨＡＴ培地」）。好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に高感度であるものである。より好ましい不死化細胞系はマウス骨髄腫系であり、それらは、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center、San Diego、Calif.及びAmerican Type Culture Collection、Rockville、Mdから得ることができる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の生産について記載されている（Kozbor, 1984, J. Immunol., 133:3001；Brodeur et al., 1987, "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications" Marcel Dekker, Inc., New   York, pp. 51-63）。次に、ハイブリドーマ細胞を培養した培地を、炭疽菌抗原に対するモノクローナル抗体の存在について検査することができる。
【０１００】
一実施形態において、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降反応によって、又は、インビトロの結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ、radioimmunoassay）若しくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ、enzyme-linked immunoabsorbent assay）によって測定することができる。そのような技術及びアッセイは当技術分野で公知であり、下の実施例又はHarlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)でさらに記載されている。
【０１０１】
所望のハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンを限界希釈又はＦＡＣＳ選別法によってサブクローニングし、標準の方法によって増殖させることができる。このために適当な培地には、例えば、ダルベッコの修正イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物の腹水として、インビボで増殖させることができる。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、タンパク質Ｇ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培地又は腹水液から単離又は精製することができる。
【０１０２】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号で記載されるものなどの、組換えＤＮＡ方法によって作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離、配列決定をすることができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましいソースの役目を果たす。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、次に、それらをサルのコス細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ、Chinese hamster ovary）細胞、形質細胞腫細胞又は骨髄腫細胞などの、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成する。ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域のコード配列を相同マウス配列の代わりに置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、又は、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合で結合させることによって修飾することもできる。任意選択で、炭疽菌芽胞及び炭疽様他種に特異性を有する１つの抗原結合部を含むキメラ二価抗体を作製するために、そのような非免疫グロブリンポリペプチドで抗体の定常領域を置換するか、又は、抗体の１つの抗原結合部の可変領域を置換する。
【０１０３】
インビトロの方法は、一価抗体を調製するためにも適当である。フラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを生成するための抗体の消化は、当技術分野で周知の常用技術を用いて達成することができる。例えば、消化はパパインを用いて実施することができる。パパイン消化の例は、国際公開９４／２９３４８、米国特許第４，３４２，５６６号、及びHarlow and Lane, Antibodies, 1988, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York、で記載されている。抗体のパパイン消化は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる同一な２つの抗原結合フラグメントを一般的に生成し、それぞれは、単一の抗原結合部位及び残りのＦｃフラグメントを有する。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれるフラグメントをもたらし、それは、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋させる能力を保持する。抗体消化において生成するＦａｂフラグメントは、軽鎖の定常領域及び重鎖の第１の定常領域も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ部からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖領域のカルボキシ末端で、２、３の残基が付加されることによって、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ部でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ’フラグメントを含む、二価のフラグメントである。本明細書で、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’の名称である。抗体フラグメントは、当初、それらの間でヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学結合も公知である。
【０１０４】
他の実施形態において、抗体の単離された免疫原性的に特異的なパラトープ又はフラグメントも提供される。抗体の特異的な免疫原性エピトープは、分子の化学的又は物理的な崩壊によって完全体抗体から単離することができる。このように得られる精製フラグメントは、次に、本明細書で記載される方法で、それらの免疫原性及び特異性を判定するために試験することができる。抗体の免疫活性パラトープは、直接的に合成してもよい。免疫活性フラグメントは、抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも約２〜５個の連続的なアミノ酸のアミノ酸配列と定義される。
【０１０５】
他の実施形態において、本発明の抗体は、タンパク質化学技術によって、２つ以上のペプチド又はポリペプチドを一緒に結合することによって作製することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学を用いて、今日利用できる実験室用機器を用いて化学的に合成することができる。（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）。当業者は、例えば、抗体に対応するペプチド又はポリペプチドが、標準の化学反応によって合成することができることを容易に理解することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断しないことが可能であるが、抗体の他のフラグメントを合成し、その後樹脂から切断し、それによって、他のフラグメント上では機能的にブロックされる末端基を曝露させることができる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それぞれそれらのカルボキシル及びアミノ末端のペプチド結合を通して共有結合的に結合し、抗体又はそのフラグメントを形成することができる。（Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992)；Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY。或いは、先に述べたように、ペプチド又はポリペプチドをインビボで独立して合成することができる。単離されると、類似したペプチド縮合反応を通して、これらの独立したペプチド又はポリペプチドを結合して抗体又はそのフラグメントを形成することができる。
【０１０６】
例えば、一実施形態において、クローン化又は合成のペプチド断片の酵素連結は、比較的短いペプチド断片を結合して、より大きなペプチド断片、ポリペプチド又は完全体タンパク領域を生成することを可能にする（Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)）。或いは、合成ペプチドの本来の化学的連結は、より短いペプチド断片から大きなペプチド又はポリペプチドを合成的に構築するために利用することができる。この方法は、２ステップ化学反応からなる（Dawson et al., 1994, Science, 266:776-779）。第１ステップは、最初の共有結合生成物としてチオエステル結合中間体を与える、保護されていない合成ペプチド−α−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む他の保護されていないペプチド断片との化学選択的反応である。反応条件を変化させることなく、この中間体は自発的で、急速な分子内反応を経て、連結部位で本来のペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成へのこの本来の化学的連結法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製で例示される（Baggiolini M et al., 1992, FEBS Lett. 307:97-101；Clark-Lewis I et al.,1994, J.Biol.Chem., 269:16075)；Clark-Lewis I. et al., 1991, Biochemistry, 30:3128；Rajarathnam K et al., 1994, Biochemistry 33:6623-30）。
【０１０７】
或いは、保護されていないペプチド断片を化学的に連結することができるが、化学的連結の結果としてペプチド断片の間で形成される結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer, M et al., 1992, Science, 256:221）。この技術は、タンパク質領域の類似体、並びに、完全な生物的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられた（deLisle Milton RC et al., 1992, Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267）。
【０１０８】
また、生物活性を有する抗体フラグメントも開示される。そのポリペプチド断片は、炭疽菌芽胞ポリペプチドの糖タンパク質をコードする核酸を、そのポリペプチド断片を生成することができる発現系、例えばアデノウイルス又はバキュロウイルス発現系でクローニングして得た組換えタンパク質でよい。例えば、抗体と炭疽菌芽胞又は他の緊密に関連する種の芽胞との相互作用と関連する生物効果を引き起こすことができる特異的ハイブリドーマから、その抗体の活性領域を決定することができる。抗体の活性、結合特異性及び親和性に寄与しないことが分かったアミノ酸は、それぞれの活性を失わずに削除することができる。例えば、様々な実施形態において、アミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸を未変性の又は修飾された非免疫グロブリン分子又は免疫グロブリン分子から順次除去し、それぞれの活性を多くの利用できるアッセイの１つで試験する。他の例では、抗体フラグメントは修飾された抗体を含み、その抗体では、少なくとも１つのアミノ酸で特定の位置の天然アミノ酸を置換し、アミノ末端若しくはカルボキシ末端のアミノ酸の一部、又は抗体の内部領域の一部でさえ、ポリペプチド断片又は他の部分、例えば、修飾された抗体の精製を容易にすることができるビオチンで置換した。例えば、コード領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生成するように、ペプチド化学により、又は、２つのポリペプチド断片をコードするそれぞれの核酸を発現ベクターにクローニングすることにより、修飾された抗体をマルトース結合タンパク質に融合することができる。ハイブリッドポリペプチドは、アミロースアフィニティーカラム上を通過させることによってアフィニティー精製することができ、次に、特異的プロテアーゼ因子Ｘａでハイブリッドポリペプチドを切断することによって、修飾された抗体受容体をマルトース結合領域から分離することができる。（例えば、New England Biolabs Product Catalog, 1996, pg. 164.を参照）。ハイブリッドタンパク質を真核細胞からも単離するために、類似した精製法が利用できる。
【０１０９】
他の配列に結合しているかどうかに関係なく、炭疽菌芽胞ポリペプチドの断片は、特定の領域又は特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換又は他の選択された修飾を含むが、断片の活性は、修飾されていない抗体又は抗体フラグメントと比較してあまり変化していないし、損なわれていない。これらの修飾は、なんらかの追加の特性を、例えばジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去又は付加すること、その生物学的寿命を延ばすこと、その分泌特性を変化させること、その他を提供することができる。いずれの場合も、断片は、結合活性、結合領域での結合の調節、その他などの生体活性特性を有していなければならない。抗体の機能的領域又は活性領域は、タンパク質の特定の領域の突然変異と、以降の発現及び発現ポリペプチドの試験によって特定することができる。そのような方法は当分野の熟練者には容易に明らかになるものであり、例としては、抗原をコードする核酸の部位特異的突然変異を含めることができる。（Zoller MJ et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10: 6487-500）。特定のタンパク質、変異体又は断片と選択的に結合する抗体を選択するために、様々なイムノアッセイ方式を用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質、タンパク質変異体又はその断片と選択的に免疫活性である抗体を選択するために常用される（Harlow and Lane, 1988）。
【０１１０】
他の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのレクチン結合糖又はその断片を含む炭疽菌芽胞の糖複合成分の少なくとも１つに対するモノクローナル抗体、及び、炭疽菌芽胞上の糖複合成分の少なくとも１つに対する抗体又はそのフラグメントの結合を検出するための１つ又は複数の試薬の容器を含む抗体試薬キットを含み、糖タンパク質は少なくとも１つのレクチン結合糖を含む。試薬には、例えば、蛍光タグ、酵素タグ又は他のタグを含めることができる。試薬は酵素反応のために二次又は三次の抗体又は試薬を含むこともでき、酵素反応は視覚化することができる生成物を生成する。
【０１１１】
６．機能的核酸
一実施形態において、本発明の組成物は、炭疽、炭疽様感染又は他の関心の疾患の治療又は予防のための治療剤としての機能的核酸を含む。機能的核酸は、標的分子と結合すること又は特異反応を触媒することなどの、特定の機能を有する核酸分子である。例えば、機能的核酸には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、トリプレックス形成分子及び外部ガイド配列が含まれる。機能的核酸分子は、標的分子が有する特定の活性の影響因子、阻害剤、モジュレーター及び刺激因子として作用することができ、又は、機能的核酸分子は、他のいかなる分子とは独立にデノボ活性を有することができる。
【０１１２】
機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は炭水化物鎖などの、いかなる巨大分子とも相互作用することができる。一実施形態において、本発明の機能的核酸は、炭疽菌芽胞の外膜上の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質をコードするｍＲＮＡと相互作用することができる。他の実施形態において、本発明の機能的核酸は、炭疽菌芽胞の外膜上の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質と相互作用することができる。或いは、本発明の機能的核酸は、炭疽菌芽胞の外膜上の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質をコードするゲノムＤＮＡと相互作用することができる。機能的核酸は、標的分子と機能的核酸分子との間の配列相同性に基づいて、他の炭疽菌核酸と相互作用するように設計することができる。他の実施形態において、機能的核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能的核酸分子と標的分子との間の配列相同性ではなく、特異的認識を起こさせる三次構造の形成に基づく。
【０１１３】
一実施形態において、機能的核酸は、アンチセンス核酸を含むことができる。アンチセンス分子は、正規又は非正規の塩基対形成を通して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子及び標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮアーゼＨ媒介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を通して標的分子の破壊を促進するように設計される。或いは、アンチセンス分子は、転写又は複製などの標的分子上で通常起こるプロセシング機能を妨害するように設計することができる。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子で最もアクセスしやすい領域を発見することによるアンチセンス効率の最適化のための多数の方法が、存在する。例示的な方法には、インビトロの選択実験並びにＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いるＤＮＡ修飾研究を含めることができる。代わりの実施形態において、アンチセンス分子は、解離定数（ｋｄ）が１０-６、１０-８、１０-１０又は１０-１２Ｍ以下で標的分子と結合する。アンチセンス分子の設計及び使用の助けとなる方法及び技術の代表例は、次の米国特許第５，１３５，９１７号、５，２９４，５３３号、５，６２７，１５８号、５，６４１，７５４号、５，６９１，３１７号、５，７８０，６０７号、５，７８６，１３８号、５，８４９，９０３号、５，８５６，１０３号、５，９１９，７７２号、５，９５５，５９０号、５，９９０，０８８号、５，９９４，３２０号、５，９９８，６０２号、６，００５，０９５号、６，００７，９９５号、６，０１３，５２２号、６，０１７，８９８号、６，０１８，０４２号、６，０２５，１９８号、６，０３３，９１０号、６，０４０，２９６号、６，０４６，００４号、６，０４６，３１９号及び６，０５７，４３７号で見られる。
【０１１４】
他の実施形態において、機能的核酸は、アプタマーを含むことができる。アプタマーは、標的分子と好ましくは特異的に相互作用する分子である。一般的に、アプタマーは、ステムループ又はＧクオーターなどの既定の二次又は三次構造に折り畳まれる、長さ１５〜５０塩基の小さな核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小分子、並びに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの大きな分子と結合することができる。一実施形態において、本発明のアプタマーは、解離定数（ｋｄ）が１０-１２Ｍ未満で標的分子と非常に強固に結合することができる。代わりの実施形態において、アプタマーは、ｋｄが１０-６、１０-８、１０-１０又は１０-１２Ｍ未満で標的分子と結合することができる。本発明のアプタマーは、非常に高度の特異性で、標的分子と結合することができる。例えば、分子上の単一の位置だけが異なる標的分子と他の分子との間の結合親和性において１０，０００倍を超える差を有するアプタマーが単離された（米国特許第５，５４３，２９３号）。代わりの実施形態において、アプタマーと標的分子とのｋｄは、血清アルブミン等のバックグラウンド結合分子とのｋｄの少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００又は１００，０００分の１であり得る。様々な異なる標的分子と結合するアプタマーを作製して使用する方法の代表例は、以下に記す米国特許第５，４７６，７６６号、５，５０３，９７８号、５，６３１，１４６号、５，７３１，４２４号、５，７８０，２２８号、５，７９２，６１３号、５，７９５，７２１号、５，８４６，７１３号、５，８５８，６６０号、５，８６１，２５４号、５，８６４，０２６号、５，８６９，６４１号、５，９５８，６９１号、６，００１，９８８号、６，０１１，０２０号、６，０１３，４４３号、６，０２０，１３０号、６，０２８，１８６号、６，０３０，７７６号及び６，０５１，６９８号で見ることができるが、これらに限定されない。
【０１１５】
他の実施形態において、組成物はリボザイムを含むことができる。リボザイムは、分子内又は分子間で、化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、したがって触媒性の核酸である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。自然系で見られるリボザイムに基づく、ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒するいくつかの異なる種類のリボザイム、例えばハンマーヘッドリボザイム（例えば、米国特許第５，３３４，７１１号、５，４３６，３３０号、５，６１６，４６６号、５，６３３，１３３号、５，６４６，０２０号、５，６５２，０９４号、５，７１２，３８４号、５，７７０，７１５号、５，８５６，４６３号、５，８６１，２８８号、５，８９１，６８３号、５，８９１，６８４号、５，９８５，６２１号、５，９８９，９０８号、５，９９８，１９３号、５，９９８，２０３号、及び国際特許出願の国際公開９８５８０５８、国際公開９８５８０５７及び国際公開９７１８３１２）、ヘアピンリボザイム（例えば、米国特許第５，６３１，１１５号、５，６４６，０３１号、５，６８３，９０２号、５，７１２，３８４号、５，８５６，１８８号、５，８６６，７０１号、５，８６９，３３９号及び６，０２２，９６２号）及びテトラヒメナリボザイム（例えば、米国特許第５，５９５，８７３号及び５，６５２，１０７号）がある。自然系で見ることのできないいくつかのリボザイムもあるが、それらは、デノボで特異反応を触媒するように設計された（例えば、米国特許第５，５８０，９６７号、５，６８８，６７０号、５，８０７，７１８号及び５，９１０，４０８号）。一実施形態において、リボザイムはＲＮＡ基質を切断することができる。リボザイムは、一般的に、標的基質の認識及び結合と以降の切断を通して、核酸基質を切断する。しばしば、この認識は、大部分は標準的又は非標準的な塩基対相互作用に基づく。標的基質の認識は標的基質配列に基づくので、この特性は、リボザイムを核酸の標的特異的切断のための特に良い候補にする。様々な異なる反応を触媒するリボザイムを作製、使用する方法の代表例は、以下に記す米国特許第５，６４６，０４２号、５，６９３，５３５号、５，７３１，２９５号、５，８１１，３００号、５，８３７，８５５号、５，８６９，２５３号、５，８７７，０２１号、５，８７７，０２２号、５，９７２，６９９号、５，９７２，７０４号、５，９８９，９０６号及び６，０１７，７５６号で見ることができるが、これらには限定されない。
【０１１６】
他の実施形態において、組成物はトリプレックス形成核酸を含むことができる。トリプレックスを形成する機能的核酸分子は、二本鎖又は一本鎖の核酸と相互作用することができる分子である。トリプレックス分子が標的領域と相互作用する場合、トリプレックスと呼ばれる構造が形成され、その場合、ワトソン・クリック及びフーグスティーン塩基対合に依存する複合体を形成する、３本のＤＮＡ鎖が存在する。トリプレックス分子は高い親和性及び特異性で標的領域と結合することができるので好ましい。代わりの実施形態において、トリプレックス形成分子は、ｋｄが１０-６、１０-８、１０-１０又は１０-１２Ｍ未満で標的分子と結合する。様々な異なる標的分子と結合するトリプレックス形成分子を作製して使用する方法の代表例は、以下に記す米国特許第５，１７６，９９６号、５，６４５，９８５号、５，６５０，３１６号、５，６８３，８７４号、５，６９３，７７３号、５，８３４，１８５号、５，８６９，２４６号、５，８７４，５６６号及び５，９６２，４２６号で見ることができるが、これらに限定されない。
【０１１７】
他の実施形態において、組成物は外部ガイド配列（ＥＧＳ、external guide sequence）を含むことができる。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子と結合して複合体を形成する分子であり、この複合体は、標的分子を切断するＲＮアーゼＰによって認識される。ＥＧＳは、選択されたＲＮＡ分子を特異的に標的にするように設計することができる。ＲＮアーゼＰは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを助ける。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを用いて実質的にあらゆるＲＮＡ配列を切断するために、細菌のＲＮアーゼＰを補充することができる。（Yale, and Forster and Altman, Science 238:407-409 (1990)による国際公開９２／０３５６６）。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮアーゼＰによって指示されるＲＮＡの切断は、真核細胞内で所望の標的を切断するために利用することができる。（Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:8006-8010；国際公開９３／２２４３４；国際公開９５／２４４８９；Yuan and Altman, EMBO J., 1995, 14:159-168及びCarrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1995, 92:2627-2631。様々な異なる標的分子の切断を促進するＥＧＳ分子を作製して使用する方法の代表例は、以下に記す米国特許第５，１６８，０５３号、５，６２４，８２４号、５，６８３，８７３号、５，７２８，５２１号、５，８６９，２４８号及び５，８７７，１６２号で見ることができるが、これらに限定されない。
【０１１８】
７．ペプチド
一実施形態において、本発明の組成物及び／又はワクチンは、炭疽菌芽胞の外膜上の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質のポリペプチド断片を含むことができる。ペプチドは、抗原、又は担体と結合した抗原、又は結合若しくは未結合の抗原の混合物であることができる。次に、炭疽菌感染又は炭疽様感染を予防する方法において、そのペプチドを用いることができる。例えば、一実施形態において、ペプチドはワクチンとして役立つことができる。
【０１１９】
抗原の免疫原性量は、標準手順で決定することができる。簡潔には、様々な濃度の推定上の特定の免疫活性ペプチド又はポリペプチドを調製し、ヒトなどの動物に投与し、各濃度に対する動物の免疫学的応答（例えば、抗体生成又は細胞性応答）を測定することができる。ワクチン中の薬学的に許容される担体には、生理食塩水又は他の適当な担体を含めることができる（Arnon, R. (Ed.), 1987, Synthetic Vaccines I: 83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida）。アジュバントもワクチンの担体の一部であることができるが、その場合、それは用いる抗原、投与様式及び対象に基づく標準の基準によって選択することができる（Arnon, 1987）。投与方法は、用いる個々のワクチン及びそれを投与する対象によって、経口若しくは舌下の手段に、又は、注射によることができる。
【０１２０】
一実施形態において、炭疽菌芽胞の外膜上の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む少なくとも１つの糖タンパク質を含むタンパク質は、変異体を含むことができる。関連する生物体で見られる芽胞糖とは異なる、炭疽菌の栄養細胞で見られない芽胞特異糖（ラムノース、３−Ｏ−メチルラムノース及びガラクトサミン）が発見された（Fox et al., 1993; Wunschel et al., 1994）。炭疽菌芽胞は炭水化物によって囲まれていることが、直接的に証明された。
【０１２１】
一実施形態において、ペプチドは、Ｂｃｌ様ペプチドを含むことができる。例えば、約９０％の炭水化物からなるコラーゲン（炭疽菌、コラーゲン様タンパク質）で見られるように、糖タンパク質ＢｃｌＡはタンデムリピートの領域を有する（Sylvester et al., 2002）。モノクローナル抗体標識によって証明されているように、ＢｃｌＡは外膜短柔毛に局在化される（Sylvester et al, 2002）。芽胞特異糖は、糖タンパク質ＢｃｌＡの成分であることがその後証明された（Daubenspeck et al., 2004）。ＢｃｌＡ合成をコードするオペロンが発見され、タンデムリピートを有する第２の糖タンパク質ＥｘｓＨが、Ｂ．セレウス及びＢ．チューリンジエンシスに存在することが証明された（Garcia Patronne, and Tandecarz, 1995; Todd et al., 2003）。
【０１２２】
ＢｃｌＡのペプチド骨格は約３９ｋＤａの予測分子量（ＭＷ）を有するが、スターン株については、無傷のタンパク質は＞２５０ｋＤａの見掛け質量で移動し、それは、かなりグリコシル化されているタンパク質と合致する。タンパク質中のGPTリピート及び[GPT]5GDTGTTリピートの数が異なるために、ＢｃｌＡタンパク質の間にかなりのサイズ不均一性がある。後の２１個のアミノ酸リピートは、「ＢｃｌＡリピート」と名づけられた。これらのリピートは、ＢｃｌＡ中のラムノース−オリゴ糖のための、主要なアンカーポイントである（Sylvestre et al., 2003）。
【０１２３】
炭疽菌芽胞の外膜上の、少なくとも１つのレクチン結合糖を含む既知の糖タンパク質に加えて、開示されている方法及び組成物において機能することもできるタンパク質変異体が存在する。ある実施形態において、変異体は置換型、挿入型、トランケーション型又は欠失型の変異体である。
【０１２４】
タンパク質変異体及び誘導体は当分野の技術者にはよく理解されており、アミノ酸配列の修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列の修飾は、一般的に、置換型、挿入型、トランケーション型又は欠失型の変異体の４クラスの１つ又は複数に該当する。挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端での融合、並びに１個又は複数個のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は通常、アミノ末端又はカルボキシル末端での融合のそれらより小さな挿入であり、例えば、約１〜４残基である。免疫原性融合タンパク質誘導体は、免疫原性を与えるために十分に大きなポリペプチドをインビトロ架橋によって標的配列に融合することによって、又は、融合をコードするＤＮＡで形質転換した組換え細胞培養によって作製される。トランケーションは、完全長タンパク質のＣ末端又はＮ末端からのアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質配列からの１つ又は複数のアミノ酸残基の除去を特徴とする。一般的に、タンパク質分子内の任意の１部位で、約２〜６個以下の残基が削除される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的突然変異によって調製され、それによって変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後、組換え細胞培養でそのＤＮＡを発現させる。既知の配列を有するＤＮＡの所定部位で置換突然変異を起こさせる技術は公知であり、例としては、Ｍ１３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発がある。アミノ酸置換は一般的に単一残基のものであるが、同時にいくつかの異なる場所で起こることができる。挿入は、通常約１〜１０個のアミノ酸残基である。欠失は約１〜３０個の残基である。欠失又は挿入は、好ましくは隣接した対で、すなわち２残基の欠失又は２残基の挿入で作製される。最終構築物に到達するために、置換、トランケーション、欠失、挿入又はそれらの任意の組合せを組み合わせることができる。突然変異は読み枠から外れて配列を置いてはならず、好ましくは、二次的ｍＲＮＡ構造を生成することができる相補領域を形成しない。置換型変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されるものである。そのような置換は、一般に表２に示す置換型に従って作製され、保存的置換と呼ばれる。
【０１２５】
【表２】
2009511018.tif 000010
【０１２６】
機能又は免疫学的同一性の実質的な変更は、表２のそれらよりも保存的でない置換を選択することによって、すなわち、（ａ）置換領域におけるシート若しくはらせんの高次構造としてのポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさの維持に及ぼすそれらの影響においてより大きく異なる残基を選択することによって達成される。タンパク質特性の最も大きな変化を起こさせると一般に予想される置換は、（ａ）親水性残基，例えばセリル又はスレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルの代わりに（又は、それによって）置換されるもの、（ｂ）システイン又はプロリンが、他の任意の残基の代わりに（又は、それによって）置換されるもの、（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えばリジル、アルギニル又はヒスチジルが、電気陰性の残基、例えばグルタミル又はアスパルチルの代わりに（又は、それによって）置換されるもの、或いは、（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有していないもの、例えば、この場合はグリシンの代わりに（又は、それによって）置換されるもの、（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化のための部位の数を増加させることによるものである。
【０１２７】
例えば、生物学的及び／又は化学的に類似する他のものによる１アミノ酸残基の置換は、保存的置換として当分野の技術者に知られている。例えば、保存的置換は、１疎水性残基を他の残基で、又は１極性残基を他の残基で置換することであろう。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及び、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを含む。明示的に開示された各配列のそのような保存的に置換された変形形態は、本明細書で提供されるモザイクポリペプチドに含まれる。置換型又は欠失型の突然変異は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）のための部位を挿入するために使用することができる。システイン又は他の不安定な残基の欠失も、望ましいことがある。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失又は置換は、例えば塩基性残基の１つを削除することによって、又は、１つをグルタミニル若しくはヒスチジル残基によって置換することによって達成される。
【０１２８】
本発明のポリペプチドは、翻訳後修飾を含むことができる。一実施形態において、特定の翻訳後の誘導体化は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、翻訳後に、対応するグルタミル及びアスパルチル残基にしばしば脱アミド化される。或いは、これらの残基は、やや酸性条件で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Franciscopp 79-86 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに、場合によっては、Ｃ末端のカルボキシルのアミド化が含まれる。
【０１２９】
一実施形態において、開示されているタンパク質の変異体及び誘導体は、特定の既知の配列との相同性／同一性に関して変異体及び誘導体を定義することに基づく。当分野の技術者は、２つのタンパク質の相同性及び／又は同一割合を測定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルになるように２つの配列を一列に並べた後に、計算することができる。相同性を計算する他の方法は、公表されているアルゴリズムによって実施することができる。比較のために最適な配列の整列は、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch（1970, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85: 2444 (1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA）のコンピュータによる実行、又は、目視検査によって行うことができる。同じ種類の相同性が核酸について得ることができ（Zuker, M., 1989, Science 244:48-52; Jaeger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7706-7710; Jaeger et al., 1989, Methods Enzymol., 183:281-306）、これらは、少なくとも核酸整列に関連する物質については本明細書で参照により組み込まれる。一実施形態において、特定の配列と少なくとも８０％の相同性を有する実施形態などの任意の組合せで、保存的な突然変異及び相同性の記載を一緒に組み合わせることができ、変異体は保存的突然変異体である。
【０１３０】
この明細書は様々なタンパク質及びタンパク質配列について述べるので、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸も開示されることは理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての変性配列を、すなわち、特定の１タンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、並びに、変性核酸を含む、タンパク質配列の開示されている変異体及び誘導体をコードする全ての核酸を含む。ゆえに、各特定の核酸配列を本明細書で書き出すことはできないが、各及びあらゆる配列が、開示されているタンパク質配列を通して本明細書で実際に開示、記載されることが理解される。例えば、配列番号１〜２６の核酸配列のあるものは、配列番号１〜２６の配列で示す特定のタンパク質配列をコードすることができる。
【０１３１】
一実施形態において、アミノ酸及びペプチド類似体を、開示されている組成物に組み込むことができる。例えば、表１に示すアミノ酸と異なる機能的置換基を有する、多数のＤアミノ酸又はアミノ酸が存在する。一実施形態において、ペプチドは天然のペプチドの反対側の立体異性体、並びにペプチド類似体の立体異性体を含むことができる。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸を加え、類似体アミノ酸を部位特異的にペプチド鎖に挿入するためにアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を設計することによって、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（Thorson et al., 1991, Methods in Molec. Biol. 77:43-73；Zoller, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354；Ibba, 1995, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216；Cahill et al., 1989, TIBS, 14(10): 400-403；Benner, 1994, TIBS Tech, 12:158-163；Ibba and Hennecke, 1994, Bio/technology, 12:678-682。これらの全ては、少なくともアミノ酸アナログに関連する物質について、本明細書で参照により組み込まれる）。
【０１３２】
一実施形態において、本発明の化合物は、ペプチドに類似するが、天然のペプチド結合を通して連結されない分子を含むことができる。例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体の結合は、［（ＣＨ２ＮＨ）−−］、［−−（ＣＨ２Ｓ）−−］、［−−（ＣＨ２−−ＣＨ２）−−］、［−−（ＣＨ＝ＣＨ）−−］、［（シス及びトランス）］、［−−（ＣＯＣＨ２）−−］、［−−（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）−−］及び［−−（ＣＨＨ２ＳＯ）−−］を含むことができる（Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)；Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review)；Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468；Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979)［（−−ＣＨ２ＮＨ）−−、（ＣＨ２ＣＨ２）−−］；Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986)［−−（ＣＨＨ２）−−（Ｓ）］；Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982)［−−（ＣＨ−ＣＨ）−−、シス及びトランス］；Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)［−−（ＣＯＣＨ２）−−］；Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982)［−−（ＣＯＣＨ２）−−］；Szelke et al.欧州特許出願ＥＰ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）［−−（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）−−］；Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983)［−−（Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２）−−］；並びに、Hruby Life Sci 31:189-199 (1982)［−−（ＣＨ２）−−（Ｓ）−−］；それらのそれぞれは本明細書で参照により組み込まれる。特に好ましい非ペプチド結合は、−［−−（ＣＨ２ＮＨ）−−］である。ペプチド類似体が、結合原子の間でｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸、などの複数の原子を有しうることが理解される。アミノ酸類似体及び類似体及びペプチド類似体は、強化されたか又は望ましい特性、例えばより経済的な生成、より大きな化学安定性、強化された薬理特性（半減期、吸収、効力、効能、その他）、変化した特異性（例えば広範囲の生物的活性）、減少した抗原性、その他を有する。Ｄアミノ酸はペプチダーゼその他によって認識されないので、Ｄアミノ酸はより安定したペプチドを生成するために用いることができる。同じ種類のＤアミノ酸（例えばＬリジンの代わりにＤリジン）によるコンセンサス配列の１つ又は複数のアミノ酸の計画的置換は、より安定したペプチドを生成するために用いることができる。システイン残基は、２つ以上のペプチドを環化又は結合するために用いることができる。このことは、ペプチドが特定の立体構造をとるようにするのに有用である。（Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387）。
【０１３３】
８.核酸
ワクチンは核酸からなることができるので、炭疽菌芽胞の外膜の抽出物からの、抽出物のレクチンへの吸収による少なくとも１つの糖タンパク質、並びに、本明細書で開示される他の任意のタンパク質並びにそのようなポリペプチド及び／又はタンパク質の変異体及び断片をコードする核酸を含む、本明細書で開示される様々な核酸ベースの分子がある。一実施形態において、本発明のワクチンで用いる核酸は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド代替物を含むことができる。これら及び他の分子のそれには限定されない例は、本明細書で述べられる。
【０１３４】
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を形成するそれらのリン酸部分及び糖部分を通して連結することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）及びチミン−１−イル（Ｔ）でよい。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドのそれには限定されない例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）又は５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）であろう。例えば、ベクターが細胞で発現される場合、発現されたｍＲＮＡは一般的にＡ、Ｃ、Ｇ及びＵで構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外来性送達を通して細胞又は細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境内でアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチド類似体からなることが有利であることが、理解される。
【０１３５】
ある実施形態において、本発明のヌクレオチドワクチンは、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド代替物又はコンジュゲート体ヌクレオチドの少なくとも１つを含むことができる。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖又はリン酸部分へのある種類の修飾を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は当技術分野で公知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン及び２−アミノアデニン、並びに糖又はリン酸部分での修飾を含む。ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドに類似した機能特性を有するが、リン酸部分を含有しないペプチド核酸（ＰＮＡ）などの分子である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン・クリック又はフーグスティーンの方式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通して連結する分子である。適当な標的核酸と相互作用する場合、ヌクレオチド代替物は二重らせん型の構造に従うことができる。他の型の分子を核酸分子に連結して、コンジュゲート体を形成することができる。コンジュゲート体は、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に化学的に連結することができる。そのようなコンジュゲート体は、それに限定されないが、コレステロール部分などの脂質部分を含む。（Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 6553-6556）。ワトソン・クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド代替物のワトソン・クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド代替物のワトソン・クリック面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１及びＣ６位置、並びに、ピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位置を含む。フーグスティーン相互作用は、二本鎖ＤＮＡの主溝に露出する、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のフーグスティーン面で起こる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位置及びＣ６位置の反応基（ＮＨ２又はＯ）を含む。
【０１３６】
本発明の実施形態は、本明細書で記載する炭疽菌芽胞で見られる複合体の糖タンパク質及び糖タンパク質と関連するポリペプチドをコードする遺伝子と、プライマー又はプローブとして相互作用することができるオリゴヌクレオチドも含む。ある実施形態において、プライマーはＤＮＡ増幅反応を補助するために用いられる。一般的に、プライマーは配列特異的に伸長させることができる。配列特異的なプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズするかさもなければ結合する核酸分子の配列及び／又は組成物が、プライマーの伸長によって生成される生成物の組成物又は配列に対して指示又は影響する任意の方法を含む。したがって、配列特異的なプライマーの伸長は、ＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写又は逆転写を含むが、これらに限定されるものではない。配列特異的な方法でプライマーを増幅する技術及び条件が好ましい。ある実施形態において、ＤＮＡ増幅反応、例えばＰＣＲ又は直接のシークエンシングのためにプライマーを用いる。ある実施形態において、例えば、プライマーを伸長させるために用いられるヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが、それらが化学的に反応してプライマーを配列特異的に伸長させるように修飾される、非酵素的技術を用いてプライマーを伸長させることもできることが理解される。一般的に、開示されるプライマーは核酸若しくは核酸の領域とハイブリダイズするか、又は、それらは核酸の補体若しくは核酸の領域の補体とハイブリダイズする。
【０１３７】
一実施形態において、組成物は、インビボ又はインビトロで細胞に送達するために製剤化される。核酸をインビトロ又はインビボで細胞に送達するために用いることができる、いくつかの組成物及び方法がある。これらの方法及び組成物は、大きく２つのクラス、すなわち、ウイルスに基づく送達系及びウイルスに基づかない送達系に分けることができる。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどのいくつかの直接送達系によって、又は、細胞若しくはカチオン性リポソームなどの担体内の遺伝物質の移動により送達することができる。トランスフェクションのための適当な手段、例えばウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、又はエレクトロポレーション及びＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法（Wolff, J. A., et al., 1990, Science, 247, 1465-1468; Wolff, J. A., 1991, Nature, 352, 815-818）。そのような方法は当技術分野で公知であり、本明細書で記載される組成物及び方法での使用に容易に適応させることが可能である。ある場合には、これらの方法は、大きなＤＮＡ分子で特に機能するように修飾される。さらに、これらの方法は、担体のターゲッティング特性を用いて、ある疾患及び細胞集団を対象とするために用いることができる。
【０１３８】
一実施形態において、本発明は、細胞に遺伝子を送達するためのトランスファーベクターの使用（例えばプラスミド）、又は、例えば組換えレトロウイルス若しくはアデノウイルスの一部として遺伝子を送達する一般戦略の一部として、トランスファーベクターの使用を含むことができる（Ram et al., 1993, Cancer Res. 53:83-88）。本明細書で用いるように、プラスミド又はウイルスのベクターは、分解せずに関心の核酸を細胞に輸送する因子である。トランスファーベクターは、それが送達される細胞内で関心の遺伝子の発現を起こさせるプロモーターを含むことができる。一部の実施形態において、ベクターはウイルス又はレトロウイルスに由来する。本発明のＤＮＡ構築物を細胞に送達するために用いることができるウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビス及び他のＲＮＡウイルス、並びにＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含めることができる。また、それらをベクターとして適当にさせるこれらのウイルスの特性を共有する、任意のウイルスファミリーも含まれる。例えば、マウスマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、を含むレトロウイルス、及び、ベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスは、本発明のＤＮＡ構築物を細胞に送達するために用いることができる。レトロウイルスベクターは他のウイルスベクターより大きな遺伝的ペイロード、すなわち導入遺伝子又はマーカー遺伝子を運ぶことができ、この理由のために、一般的に用いられるベクターである。しかし、それらは非増殖細胞ではそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは比較的安定し、扱いが容易で、高力価を有し、エアゾール製剤で送達することができ、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。水痘ウイルスのベクターは大きく、遺伝子挿入のためにいくつかの部位を有し、それらは耐熱性であり、室温で保存することができる。一実施形態において、インターロイキン８又は１０のコード領域を運ぶベクターなどの、ウイルス抗原によって引き出された宿主生物の免疫応答を抑制するように設計されたウイルスベクターを用いることができる。
【０１３９】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入する化学的又は物理的方法よりも高い処理（遺伝子を導入する能力）能力を有することができる。一般的に、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写産物、複製及びキャプシド形成のために必要な逆方向末端反復、並びに、転写及びウイルスゲノムの複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして設計される場合、ウイルスは一般的に初期遺伝子の１つ又は複数が除去され、遺伝子又は遺伝子／プロモーターカセットが、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入される。この型の構築物は、最高約８ｋｂの外来遺伝物質を運ぶことができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、一般的に、トランスの初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように工作された細胞系によって供給される。
【０１４０】
ｉ．レトロウイルスベクター
一実施形態において、レトロウイルスは本発明の核酸分子を細胞に送達するために用いられる。レトロウイルスは、レトロウイルスのウイルスファミリーに属する動物ウイルスであり、任意の型、サブファミリー、属又は指向性を含む。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを用いる方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号及び４，９８０，２８６号、国際出願国際公開９０／０２８０６及び国際公開８９／０７１３６、並びにMulligan（Science 260:926-932 (1993)）で記載され、それらの教示は本明細書で参照により組み込まれる。
【０１４１】
レトロウイルスは、基本的に、核酸カーゴを詰め込んだパッケージである。核酸カーゴとともに、複製された娘分子がパッケージ外皮内に効率的に詰め込まれることを確実にする、パッケージシグナルが運ばれる。パッケージシグナルに加えて、複製されたウイルスの複製及び詰込みのためにシスで必要な、いくつかの分子が存在する。一般的に、レトロウイルスゲノムは、タンパク質外皮の作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含有する。外来性ＤＮＡによって典型的に置換されるのは、そのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子であるため、これは標的細胞へと運搬される。レトロウイルスベクターは、一般的に、パッケージ外皮への組込みのためのパッケージシグナル、ｇａｇ転写単位の開始を合図する配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するプライマー結合部位を含む逆転写のために必要なエレメント、ＤＮＡ合成の間のＲＮＡ鎖のスイッチを誘導する末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２の鎖の合成のための初回抗原刺激部位の役目を果たすプリンに富む配列５’〜３’ＬＴＲ、及び、ゲノムを宿主ゲノムへ挿入するためのレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲ末端近くの特定の配列を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来配列のウイルスゲノムへの挿入、逆転写、及び複製後の新しいレトロウイルス粒子への詰込みを可能にする。この量の核酸は、各転写産物のサイズにより、１つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入断片に他の遺伝子とともに、陽性又は陰性の選択マーカーを含むことが好ましい。
【０１４２】
ほとんどのレトロウイルスベクターの複製機構及びパッケージタンパク質が除去された（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）ので、ベクターは一般的に、それらをパッケージ細胞系に配置することによって生成される。パッケージ細胞系は、複製及びパッケージ機構を有するがパッケージシグナルを欠くレトロウイルスでトランスフェクト又は形質転換された細胞系である。選択されたＤＮＡを運ぶベクターがこれらの細胞系にトランスフェクトされる場合、関心の遺伝子を含有するベクターは、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって複製され、新しいレトロウイルス粒子にパッケージされる。その機構のためのゲノムは、必要なシグナルを欠くので詰め込まれない。
【０１４３】
ii．アデノウイルスベクター
一実施形態において、アデノウイルスベクターは、本発明の核酸分子を細胞に送達するために用いられる。複製不能なアデノウイルスは、インビトロ及びインビボ送達のために今日利用できる、効率的な遺伝子導入媒体である（Lukashok, S. A., and M. S. Horwitz. 1998. Current Clinical Topics in Infectious Diseases 18:286-305）。広範囲の抗原を発現するアデノウイルス媒介性の組換えワクチンが構築され、異なる病原体に対する防御免疫が動物モデルで証明された（Lubeck, M. D., et al. 1997. Nat Med 3:651-8）（Shi, Z., et al., 2001, J Virol 75:11474-82；Shiver, J. W., et al., 2002, Nature 415:331-5；Tan, Y., et al., 2003, Hum Gene Ther 14:1673-82）。
【０１４４】
複製不全のアデノウイルスの構築が記載されている（Berkner et al., J. Virology, 1987, 61:1213-1220；Massie et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883；Haj-Ahmad et al., 1986, J. Virology 57:267-274；Davidson et al., 1987, J. Virology 61:1226-1239；Zhang, 1993, BioTechniques 15:868-872）。これらのウイルスをベクターとして用いることの利点は、それらは初期感染細胞内で複製することができるが新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないので、それらが他の細胞型に広がることのできる範囲が限定されることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質及びいくつかの他の組織部位への直接の、インビボ送達の後、高効率の遺伝子導入を達成することが示された（Morsy, 1993, J. Clin. Invest. 92:1580-1586；Kirshenbaum, 1993, J. Clin. Invest. 92:381-387；Roessler, 1993, J. Clin. Invest. 92:1085-1092；Moullier, 1993, Nature Genetics 4:154-159；La Salle, Science, 1993, 259:988-990；Gomez-Foix, 1992, J. Biol. Chem. 267:25129-25134；Rich, 1993, Human Gene Therapy 4:461-476；Zabner, 1994, Nature Genetics 6:75-83；Guzman, 1993, Circulation Research 73:1201-1207；Bout, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10；Zabner, 1993, Cell 75:207-216；Caillaud, 1993, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291；及びRagot, 1993, J. Gen. Virology 74:501-507）。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体に結合することによって遺伝形質導入を達成し、その後、野生型又は複製不全アデノウイルスと同じように、ウイルスは受容体依存性エンドサイトーシスによって内在化される（Chardonnet and Dales, 1970, Virology 40:462-477）；Brown and Burlingham, 1973, J. Virology 12:386-396）；Svensson and Persson, 1985, J. Virology 55:442-449）；Seth, et al., 1984, J. Virol. 51:650-655）；Seth, et al., 1984, Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533）；Varga et al., 1991, J. Virology 65:6061-6070）；Wickham et al., 1993, Cell 73:309-319）。
【０１４５】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子を除去したアデノウイルスに基づくものであることができる。Ｅ１遺伝子は、ウイルスの複製及び発現のために必要である。しかし、Ｅ１を削除したウイルスは、２９３細胞などのＥ１をトランスで提供する細胞系で増殖させることができる（Graham and Prevec, 1995, Mol. Biotechnol. 3:207-220）。他の実施形態において、Ｅ１及びＥ３遺伝子は、アデノウイルスゲノムから除去される。Ｅ３領域は、感染細胞に対する免疫応答のブロックに関与する。
【０１４６】
他の実施形態において、ヒトＡｄ３５又はＡｄ７などの、大多数のヒト集団が非常に弱い既存の免疫を有する代替の血清型アデノウイルスベクターを用いることができた（３１、４６）。また、ヒツジ及びチンパンジーのアデノウイルスなどの、動物に由来するアデノウイルスベクターも、代替のワクチン送達ベクターとして用いることができた（Farina, S. F. et al. J Virol 75:11603-13; Hofmann, C. et al. 1999. J Virol 73:6930-6）。
【０１４７】
iii．アデノ随伴ウイルスのベクター
一実施形態において、アデノ随伴ウイルスベクターは、本発明の核酸分子を細胞に送達するために用いられる。ウイルスベクターの他の型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠陥パルボウイルスは多くの細胞型を感染させることができ、ヒトに非病原性であるので、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは約４〜５ｋｂを運搬することができ、野生型ＡＡＶは染色体１９に安定して挿入されることが知られている。この部位特異組込み特性を有するベクターが、好ましい。この種のベクターの特に好ましい実施形態は、Avigen社、San Francisco、CA、によって生産されるＰ４．１Ｃベクターであり、それは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ及び／又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含有することができる。ＡＡＶウイルスの他の型では、ＡＡＶは、異種遺伝子に作動可能的に連結した細胞特異発現を指示するプロモーターを含有する少なくとも１つのカセットに連なる、一対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含有する。この関係において異種とは、ＡＡＶ及びＢ１９パルボウイルスに固有でない、任意のヌクレオチド配列又は遺伝子を指す。一般的に、ＡＡＶ及びＢ１９のコード領域が削除され、その結果、安全で非細胞毒性のベクターが生成する。ＡＡＶ  ＩＴＲ又はその修飾体は感染性及び部位特異的組込みを与えるが、細胞傷害性でなく、プロモーターは細胞特異発現を指示する。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する物質に関して、本明細書で参照により組み込まれる。ある実施形態において、ウイルス及びレトロウイルスベクター内の挿入遺伝子は、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるプロモーター及び／又はエンハンサーを含む。
【０１４８】
iv．大きなペイロードのウイルスベクター
他の実施形態において、ヘルペスウイルスベクターなどの大きなペイロードのウイルスベクターを、本発明の核酸分子を細胞に送達するために用いる。大きなヒトヘルペスウイルスによる分子遺伝的実験は、大きな異種ＤＮＡ断片をクローニングし、増殖させ、ヘルペスウイルスによる感染を許容する細胞で確立することが可能になる手段を提供した（Sun et al., 1994, Nature genetics 8: 33-41；Cotter and Robertson, 1999, Curr. Opin. Mol. Ther., 5: 633-644）。これらの大きなＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びＥＢウイルス（ＥＢＶ）は、特定の細胞に＞１５０ｋｂのヒト異種ＤＮＡの断片を送達する能力を有する。ＥＢＶ組換体は、感染Ｂ細胞内でＤＮＡの大きな断片をエピソームＤＮＡとして維持することができる。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入断片を運ぶ個々のクローンは、遺伝的に安定しているようであった。これらのエピソームの維持には、ＥＢＶによる感染の間構成的に発現される、特定のＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１を必要とする。さらに、これらのベクターをトランスフェクションのために用いることができ、その場合、大量のタンパク質をインビトロで一時的に生成することができる。ヘルペスウイルスアンプリコン系も、＞２２０ｋｂのＤＮＡ断片を詰め込み、ＤＮＡをエピソームとして安定的に維持することができる細胞を感染させるために用いられている。他の実施形態において、複製するもの、及び宿主に制限され複製しないワクシニアウイルスベクターを用いることもできる。
【０１４９】
ｖ．非核酸ベースの系
本発明の核酸分子は、様々な方法で標的細胞に送達することができる。例えば、ある実施形態において、組成物はエレクトロポレーションを通して、又はリポフェクション、又はリン酸カルシウム沈殿を通して送達することができる。選択される送達機構は、一部、標的細胞の型に、及び送達がインビボ又はインビトロで起こるかによって決まる。
【０１５０】
ゆえに、組成物は、例えば開示されたウイルス又はベクターに加えて、リポソーム、例えばカチオン性リポソーム（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）又はアニオン性リポソームなどの脂質を含むことができる。リポソームは、所望により、特定の細胞を標的にすることを容易にするタンパク質をさらに含むことができる。化合物及びカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に導かれる血液に投与するか、又は、呼吸器官に吸入させて呼吸器官の標的細胞に投与することができる（例えば、Brigham et al., 1989, Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100)；Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417)；米国特許第４，８９７，３５５号を参照）。さらに、化合物は、マクロファージなどの特定の細胞型を標的にすることができるマイクロカプセルの成分として投与するか、又は、化合物の拡散若しくはマイクロカプセルからの化合物の送達が特定の速度若しくは投薬量のために設計される場合、投与することができる。
【０１５１】
対象の細胞への外来性ＤＮＡの投与及び取込み（すなわち遺伝子形質導入又はトランスフェクション）を含む上記方法では、細胞への組成物の送達は、様々な機構によることができる。一例として、送達は、LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE（GIBCO-BRL社、Gaithersburg、MD）、SUPERFECT（Qiagen社、Hilden、Germany）及びTRANSFECTAM（Promega Biotec社、Madison、WI）などの市販のリポソーム製剤、並びに当技術分野の標準方法に従い開発された他のリポソームを用いて、リポソームを通して達成することができる。さらに、開示された核酸又はベクターは、エレクトロポレーションによってインビボで送達することができ、その技術はGenetronics社、（San Diego、CA）から、並びにSONOPORATION machine（ImaRx Pharmaceutical社、Tucson、AZ）の手段で利用することができる。
【０１５２】
材料は、溶液、懸濁液の状態である（例えば、微小粒子、リポソーム又は細胞に組み込まれる）ことができる。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを通して、特定の細胞型を標的にすることができる。以下の参考文献は、腫瘍組織を特定のタンパク質の標的にするこの技術の使用例である。（Senter, et al., 1991, Bioconjugate Chem., 2:447-451；Bagshawe、K.D., 1989, Br. J. Cancer, 60:275-281；Bagshawe, et al., 1988, Br. J. Cancer, 58:700-703；Senter, et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:3-9；Battelli, et al.,1992, Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425；Pietersz and McKenzie, 1992, Immunolog. Reviews, 129:57-80）；及び、Roffler, et al., 1991, Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065）。これらの技術は、様々な他の特定の細胞型で用いることができる。「ステルス」及び他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌腫に対する脂質媒介薬物ターゲティングを含む）などの媒体、細胞特異リガンドを通したＤＮＡの受容体媒介ターゲティング、リンパ球誘導腫瘍ターゲティング、及びマウスグリオーマ細胞のインビボの高特異性治療的レトロウイルスターゲティングも用いることができる（Hughes et al., 1989, Cancer Research, 49:6214-6220及びLitzinger and Huang, 1992, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187）。一般に、受容体は、構成的に又はリガンド誘導的に、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体はクラスリンコートピットに集合し、クラスリンコートの小胞を通して細胞に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次に細胞表面へリサイクルするか、細胞内で保存されるか、又はリソソームで分解される。内在化経路は、養分吸収、活性化タンパク質の除去、巨大分子の一掃、ウイルス及び毒素の日和見主義的な侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの型、リガンド結合価及びリガンド濃度により、複数の細胞内経路に従う。受容体媒介エンドサイトーシスの分子及び細胞機構がレビューされている（Brown and Greene, 1991, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409）。
【０１５３】
細胞に送達される、宿主細胞ゲノムに組み込む予定の核酸は、一般的に組込み配列を含有する。これらの配列は、特にウイルスベースの系を用いる場合は、しばしばウイルス関連の配列である。これらのウイルス組込み系は、リポソームなどの非核酸ベースの送達系を用いて送達することができる核酸に組み込み、送達系に含まれる核酸が宿主ゲノムに組み込まれるようにすることもできる。
【０１５４】
宿主ゲノムへの組込みのための他の一般技術には、例えば、宿主ゲノムとの相同組換えを促進するように設計された系が含まれる。これらの系は一般的に、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えが起こる宿主細胞ゲノム内で標的配列と十分な相同性を有し、送達された核酸が宿主ゲノムに組み込まれるようにする、発現させる核酸に連なる配列に依存する。相同組換えの促進に必要なこれらの系及び方法は、当分野の技術者に周知である。
【０１５５】
一実施形態において、核酸分子は薬学的に許容される担体で投与することができ、当技術分野で周知の様々な機構（例えば裸のＤＮＡの取込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋内注射、エンドサイトーシスなど）によって、インビボ及び／又はエキソビボで対象の細胞に送達することができる。エキソビボの方法を使用する場合は、細胞又は組織を取り出して、当技術分野で周知の標準プロトコルに従って体外で維持することができる。組成物は、任意の遺伝子導入機構、例えばリン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション又はタンパクリポソームを通して、細胞に導入することができる。形質導入した細胞は、次に細胞型又は組織型に標準の方法により、対象へ注入（例えば、薬学的に許容される担体で）又は同位置への移植により戻すことができる。対象への様々な細胞の移植又は注入のために、標準の方法が知られている。
【０１５６】
（ｅ）発現系
一実施形態において、細胞に送達される核酸は、発現を制御する系を含むことができる。例えば、ウイルス及びレトロウイルス系内の挿入遺伝子は、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるプロモーター及び／又はエンハンサーを通常含む。プロモーターは、一般に、転写開始点との関係で比較的固定された場所にある場合に機能する配列又はＤＮＡ配列である。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的相互作用に必要なコアエレメントを有し、上流エレメント及び応答エレメントを含むことができる。
【０１５７】
ある実施形態において、哺乳動物の宿主細胞でのベクターからの転写を制御するプロモーターは、様々なソース、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、又は、βアクチンプロモーターなどの異種哺乳動物のプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として、都合よく得られる（Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの極初期プロモーターは、HindIII E制限断片として都合よく得られる（Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)）。当然、宿主細胞又は近縁種からのプロモーターもここで役立つ。
【０１５８】
本明細書で用いるように、エンハンサーは、転写起点からの距離が固定されずに機能するＤＮＡ配列を一般に指し、転写単位に対し５’（Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)）又は３’（Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)）であることができる。さらに、エンハンサーはイントロン（Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)）並びにコード配列自体（Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)）の中にあることができる。それらは、長さが通常１０〜３００ｂｐであり、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させる働きをする。エンハンサーは、転写の調節を媒介する応答エレメントもしばしば含有する。プロモーターは、転写の調節を媒介する応答エレメントも含有することができる。エンハンサーは、遺伝子の発現調節をしばしば決定する。現在では多くのエンハンサー配列が哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、−フェトプロテイン及びインスリン）から知られているが、一般的に、一般発現のためには真核細胞ウイルスからのエンハンサーが用いられる。好ましい例は、複製起点の後ろ側のＳＶ４０エンハンサー（塩基対１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーである。
【０１５９】
ある実施形態において、プロモーター及び／又はエンハンサーは、それらの機能を誘発する光又は特定の化学的事象によって、特異的に活性化することができる。系は、テトラサイクリン及びデキサメサゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ照射などの照射又はアルキル化化学療法剤への曝露によって、ウイルスベクター遺伝子の発現を強化する方法もある。
【０１６０】
また、ある実施形態において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、転写する転写単位の領域の発現を最大化する、構成的プロモーター及び／又はエンハンサーとして作用することができる。ある構築物では、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、それが特定の時間に特定の細胞型だけで発現されるとしても、全ての真核生物細胞型で活性であることができる。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）及びレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１６１】
全ての特異的調節エレメントをクローニングして、黒色腫細胞などの特定の細胞型で選択的に発現される発現ベクターを構築するために用いることができることが示された。グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞で遺伝子を選択的に発現させるのに用いられた。
【０１６２】
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）で用いられる発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる転写の終結のために必要な配列を含有することもできる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分の、ポリアデニル化断片として転写される。３’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位は、ポリアデニル化領域を含有することも好ましい。この領域の１利点は、転写された単位がｍＲＮＡのように処理、輸送される確率をそれが増加させることである。発現構築物内でのポリアデニル化シグナルの識別及び使用は、確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを、導入遺伝子構築物で用いることが好ましい。ある転写単位では、ポリアデニル化領域はＳＶ４０の初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。また、転写された単位が他の標準の配列を単独で、又は上記の配列と一緒に含有することが、構築物からの発現又はその安定性を改善するために好ましい。
【０１６３】
（ｆ）マーカー
ある実施形態において、ウイルスベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されたかどうか判断するために用いられ、送達されると発現される。好ましいマーカー遺伝子は、βガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、及び緑色蛍光タンパク質である。
【０１６４】
一部の実施形態において、マーカーは選択可能なマーカーであることができる。哺乳動物細胞に適当な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、dihydrofolate reductase）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイドロマイシン及びピューロマイシンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に無事導入されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧の下に置かれた場合でも生存することができる。広く使われる２つの異なるカテゴリーの選択体系が存在する。第１のカテゴリーは、細胞の代謝、及び、補足培地とは無関係に成長する能力を欠く突然変異細胞系の使用に基づく。２つの例はＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養素の添加なしで成長する能力を欠く。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路のために必要なある遺伝子を欠くので、欠落しているヌクレオチドが補足培地で提供されない限り、それらは生存することができない。培地へ補うことの代替形態は、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞に導入することによって、それらの成長要求性を変化させることである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地での生存が不可能である。
【０１６５】
第２のカテゴリーは、任意の細胞型で用いられる選択スキームを指し、突然変異細胞系の使用を必要としない、支配的な選択である。これらのスキームは、宿主細胞の生育を阻止する薬剤を一般に使用する。新規遺伝子を有する細胞は、薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き延びる。そのような支配的な選択の例では、薬剤のネオマイシン（Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)）、ミコフェノール酸、（Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)）又はハイグロマイシン（Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)）が用いられる。３例は、該当薬剤Ｇ４１８又はネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）若しくはハイグロマイシンそれぞれに対する耐性を伝達するために、真核生物による支配下の細菌遺伝子を用いる。他は、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューラマイシンを含む。
【０１６６】
１０．組成物の作製方法
特に記されない限り、本明細書で開示される組成物及び開示される方法を実施するのに必要な組成物は、当分野の技術者に公知である、その個別の試薬又は化合物のための任意の方法を用いて作製することができる。本明細書で開示される核酸及びタンパク質を生産するために、基本的な組換えバイオテクノロジー方法を用いることができることも理解される。
【０１６７】
１．核酸合成
例えば、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準の化学合成方法を用いて作製することができるか、又は、酵素法若しくは他の任意の周知の方法を用いて生産することができる。そのような方法には、標準の酵素消化と以降のヌクレオチド断片単離（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, Chapters 5, 6を参照）から、純粋に合成的な方法、例えば、Milligen又はBeckman System 1PlusＤＮＡ合成装置（例えば、Milligen-Biosearch社、Burlington、MA、のモデル８７００自動シンセサイザー、又は、ABIモデル３８０Ｂ；Ikuta et al., 1984, Ann. Rev. Biochem. 53:323-356、リン酸トリエステル及び亜リン酸トリエステル法を記載；及び、Narang et al., 1980, Methods Enzymol., 65:610-620；ホスホトリエステル法を記載）を用いるシアノエチルホスホラミダイト法が含まれる。タンパク質核酸分子は、周知の方法を用いて作製することができる（例えばNielsen et al., 1994, Bioconjug. Chem. 5:3-7）。
【０１６８】
２．ペプチド合成
炭疽菌ワクチンにおいて用いるためのタンパク質、例えば配列番号１〜２６の配列に含まれるものを生成する１方法は、タンパク質化学技術によって２つ以上のペプチド又はポリペプチドを連結することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学を用いて、今日利用できる実験室用機器を用いて化学的に合成することができる。（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）。当業者は、例えば、開示されるタンパク質に対応するペプチド又はポリペプチドが、標準の化学反応によって合成することができることを容易に理解することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断しないことが可能であるが、ペプチド又はタンパク質の他の断片を合成し、その後樹脂から切断し、それによって、他の断片上では機能的にブロックされる末端基を曝露させることができる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つの断片を、それぞれそれらのカルボキシル及びアミノ末端のペプチド結合を通して共有結合的に結合して、抗体又はそのフラグメントを形成することができる。（Grant GA, 1992, Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y., 1992；Bodansky M and Trost B., Ed., 1993, Principles of Peptide Synthesis. SpringerVerlag Inc., NY。或いは、本明細書で述べたように、ペプチド又はポリペプチドをインビボで独立して合成する。単離されると、類似したペプチド縮合反応を通して、これらの独立したペプチド又はポリペプチドを結合して、ペプチド又はその断片を形成することができる。
【０１６９】
例えば、クローン化又は合成のペプチド断片の酵素連結は、比較的短いペプチド断片を結合して、より大きなペプチド断片、ポリペプチド又は完全体タンパク領域を生成することを可能にする（Abrahmsen L et al., 1991, Biochemistry, 30:4151）。或いは、合成ペプチドの本来の化学的連結は、より短いペプチド断片から大きなペプチド又はポリペプチドを合成的に構築するために利用することができる。この方法は、２ステップ化学反応からなる（Dawson et al., 1994, Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779）。第１ステップは、最初の共有結合生成物としてチオエステル結合中間体を与える、保護されていない合成ペプチドチオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む他の保護されていないペプチド断片との化学選択的反応である。反応条件を変化させることなく、この中間体は自発的で、急速な分子内反応を経て、連結部位で本来のペプチド結合を形成する。（Baggiolini M et al., 1992, FEBS Lett. 307:97-101；Clark-Lewis I et al., 1994, J.Biol.Chem., 269:16075；Clark-Lewis I et al., 1991, Biochemistry, 30:3128；Rajarathnam K et al., 1994, Biochemistry 33:6623-30）。
【０１７０】
或いは、保護されていないペプチド断片を化学的に連結し、その場合、化学的連結の結果としてペプチド断片の間で形成される結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer, M et al. , 1992, Science, 256:221）。この技術は、タンパク質領域の類似体、並びに、完全な生物的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられてきた（deLisle Milton RC et al., 1992, Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267）。
【０１７１】
３．組成物の作製法
一実施形態において、芽胞表面の糖タンパク質複合体は、尿素抽出又は溶解の芽胞がレクチン精製された後に生成される。一実施形態において、調製物は、尿素抽出又は超音波処理などの他の溶解手段により芽胞を溶解することによって生成されるタンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質を含むが、上記の技術に限定されるものではない。一実施形態において、組成物は、芽胞を溶解した後の電気溶出又はサイズ排除クロマトグラフィーによって単離される、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、脂質又はリン脂質を含むことができる。
【０１７２】
本発明の実施形態は、組成物の作製方法並びに組成物に至る中間体の作製方法も含み、特定の配列へ言及する場合は、例示に過ぎないことが理解される。一実施形態において、ワクチンで用いるタンパク質は、配列１〜２６の核酸配列のいずれか１つで示す配列を有する核酸配列の１つによってコードされる配列を含む。合成化学的方法及び標準の分子生物学的方法など、これらの組成物を作製するために用いることのできる様々な方法がある。これら及び他の開示される組成物を作製する方法は、具体的に開示されることが理解される。例えば、一実施形態において、関心のタンパク質又はポリペプチドは、配列１〜２６の核酸配列のいずれか１つで示す配列を有する核酸配列の１つによってコードされる配列を、その核酸の発現を制御する配列と作動可能に連結することによって生成される。一実施形態において、核酸配列は、配列１〜２６の核酸配列のいずれか１つで示す配列を有する核酸配列の１つと、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を含むことができる。或いは、配列１〜２６の核酸配列のいずれか１つで示す配列を有する核酸配列の１つに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする配列を用いることができる。例えば、一実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５に示す核酸配列を含む、炭疽菌芽胞の外膜から単離したレクチン結合糖タンパク質をコードする単離核酸分子を含む。
【０１７３】
核酸構築物によってコードされるポリペプチドは、配列１〜２６のアミノ酸配列のいずれか１つで示す配列を有するポリペプチド配列の１つ、又はそのようなタンパク質の断片、又は保存的なアミノ酸置換を有するタンパク質を含むことができる。一実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６に示すアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０％の相同性を有する。他の実施形態において、本発明は、動物内の細胞を本明細書で開示される核酸分子のいずれかでトランスフェクトする方法によって作製される、遺伝子組換え動物を含む。動物は、哺乳動物でよい。代わりの実施形態において、哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ又は霊長類であることができる。或いは、遺伝子組換え動物は、本明細書で開示される細胞のいずれかを動物に加えることによって作製することができる。
【０１７４】
［実施例］
以下の実施例は、本明細書で請求する化合物、組成物、製品、装置及び／又は方法がどのように作製、評価されるかについての完全な開示及び記載を当分野の技術者に提供するために提示され、それらは単に例示的なものであり、開示を限定するものではない。数字(例えば、量、温度、その他）に関して正確を期する努力を払ったが、多少の誤差及び偏差は考慮されなければならない。別途示されない限り、部は重量による部であり、温度は摂氏温度又は周囲温度であり、圧力は大気圧又はその近くである。
【実施例１】
【０１７５】
外膜を囲む糖タンパク質短柔毛の超微形態的実証
緩衝液で洗浄した芽胞ペレット、１ミリリットル（ｍｌ）の２５％グルタルアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム溶液にルテニウム赤（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で１時間インキュベートする。各ペレットをリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、ルテニウム赤を含有する０．１Ｍカコジル酸ナトリウム溶液中の２％四酸化オスミウムで、室温で３時間固定する。これらの２つのステップからルテニウム赤を省略した以外は、陰性対照を同じように処理する。芽胞を緩衝液で洗浄し、３％寒天に包埋することができる。脱水は、２５％、５０％、７５％、９５％及び１００％エタノールによる逐次的処理を含む。その後、細胞を、プロピレンオキシド、プロピレンオキシド／ポリベッド８１２及び純粋なポリベッド８１２に、順番に入れることができる。重合は、６０℃で実施する。次に、切片を切り出し、２％酢酸ウラニル溶液で３７℃で４０分間、次にHanaichiクエン酸鉛で２分間染色する。芽胞を、透過型電子顕微鏡によって観察する。
【０１７６】
酢酸ウラニル及び四酸化オスミウムによる染色後の炭疽菌芽胞の超微形態的観察については、外膜の外部基底膜を下にある外皮層から容易に見分けることができる。さらなるルテニウム赤染色の後、外部短柔毛は容易に実証できる。免疫金標識を用いると、ＢｃｌＡのペプチド部分が、外膜表面で発現されることが証明される。さらに、外膜短柔毛はさらに炭水化物が豊富である。芽胞を精製する標準手順は、レノグラフィン（renografin）勾配を含む
【実施例２】
【０１７７】
ゲル電気泳動、糖タンパク質染色及びマトリックスアシスト飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いる、糖タンパク質、タンパク質、脂質及びリン脂質の分析
炭疽菌芽胞（５０ｍｇの含水重量）を、尿素緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ１０、８Ｍ尿素、２％２−メルカプトエタノール）で９０℃で１５分間抽出した。抽出した芽胞を室温で１０分間１３，０００ｇで遠心分離した。上清を取り出し、タンパク質分析のために保存した。芽胞タンパク抽出物を添加液と合わせ（３５:１）、multiphor II電気泳動システム又は他の適当な機器を用いてＩＰＧストリップ（ｐＨ３〜１０）へ加えた。次に、フォーカシングのために、ストリップを２３，０００Ｖｈで２４時間再水和する。次に、ＳＤＳ平衡緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ブロムフェノールブルー、微量）中で室温で１５分間、ストリップを直ちに平衡させた。その後、ＤＴＴ（１０ｍｇ／ｍＬ；６５ｍＭ）の第２の溶液中で室温で１５分間、ストリップを平衡させた。平衡化ストリップを４〜１５％勾配のポリアクリルアミドゲルに加え、トリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液中で電気泳動にかけた。タンパク質スポットを特定するために、ゲルをProtoBlue safeで染色する。
【０１７８】
電気溶出を実施するために、ゲルスポットをメスで切り出し、水又は他の適当な脱染緩衝液で脱染色する。次に、ゲル切片を試料チューブ（Millipore）に入れ、適当な分子量カットオフフィルター付きの電気溶出装置（Millipore）内に置く。例えば、ＥＡ１は約１００ｋＤａのゲル上を流れるので、タンパク質を捕捉してもなお脱気トリス−グリシン緩衝液を通過させるために、１００ｋＤａ分子量フィルターが用いられよう。タンパク質試料は、電気溶出する特定のタンパク質により１００Ｖｈで２２〜２４時間（より小さなタンパク質はより短い時間を必要とする）、電気溶出する。最後に、タンパク質試料をそれらのフィルター内でｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、所望の量に到達するまで、５，０００ｒｐｍで５分間隔で遠心分離する。
【０１７９】
次に、糖タンパク質溶液からＳＤＳ及びトリス−グリシンを除去するために、タンパク質をZipチップ（Michron BioResources社、Auburn、CA）で処理した。次に、糖タンパク質のタンパク質を分離するか又は炭水化物成分を破断するために、適当な酵素を適当な条件で用いる。例えば、ＥＡ１は、トリプシンを室温で３時間用いて消化することができる。次に、あらゆる塩又は界面活性剤の汚染を除去するために、再び試料をZipチップで処理する。ＳＤＳはＭＡＬＤＩイオン化及び結晶化を妨害するが、ＭＡＬＤＩ調製物中の高濃度のトリス及びグリシンは、マトリックスによるレーザーエネルギーの吸収を妨害する。精製試料を、ＭＡＬＤＩマトリックス（α−シアノヒドロキシケイ皮酸（７：３ｖ／ｖのアセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸に２０ｍｇ／ｍｌ）と２，５−ジヒドロキシ安息香酸（７：３ｖ／ｖのアセトニトリル：５％ギ酸に２０ｍｇ／ｍｌ）との１:１ｖ／ｖ溶液）と混合した（３１）。無傷のタンパク質の分子量（ＭＷ）は、２０Ｈｚの窒素レーザー及びリフレクトロンを備えたApplied Biosystems 4700 Protein Analyzer  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析計（Applied Biosystems社、Foster City、CA）を用いて測定する。
【０１８０】
例えば、ＥＡ１は、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ分析によって同定され、ゲル電気泳動上では濃く染色されたバンド、＜１００ｋＤａのバンドとして見ることができる、図３を参照。染色後に出現した少なくとも７つの他の可視タンパク質があり、それらは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって分析される。ＭＳ分析を用いて、＜１００ｋＤａバンドに対応するゲルバンドについて以下の質量、９８３．４３７３、１０１４．５７１、１０２９．５４７９、１１４０．５７５７、１１７９．５６９９、１２０６．５６８０、１２２３．５７８５、１２２８．７０７３、１２７７．６８３８、１３５６．８０６２、１３５９．７７８３、１４０５．７６４３、１４１４．８１３６、１４２４．７６１７、１５１５．８８４６、１５１７．７６７８、１５２６．８８２９、１５３３．７８４３、１６８４．８８２７、１７０９．８９２２、１７６５．９０１０、１７７１．８４８９、１８５７．８３２９、１８７８．９４２４、１９０１．８９２１、１９３４．９２８８、１９９６．９６４５、２０６３．０４１５、２２３０．１８６３及び２４９７．２００２を記録した。これらの値をProtein Prospectorにインプットし、全ての種についてSwiss-Protデータベースを検索すると、Ｐ９４２１７では７．３９×１０１４のＭＯＷＳＥスコアが得られ、それは炭疽菌のＳ層タンパク質ＥＡ１前駆体に対応する。
【０１８１】
これほど高いＭＯＷＳＥスコアでは、これが他のタンパク質であるという可能性は、ほぼ０である。さらに、わずか６．３の平均ｐｐｍ誤差で、４６．１％のタンパク質カバー率が達成された。さらに、分析した各ペプチドの配列をさらに裏付けるために、上の各質量のＭＳ／ＭＳスペクトルをとった。
【実施例３】
【０１８２】
溶解芽胞、ゲル電気泳動、及び単離された特定のタンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質への電気溶出
炭疽菌芽胞（５０ｍｇの含水重量）を、尿素緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ１０、８Ｍ尿素、２％２−メルカプトエタノール）で９０℃で１５分間抽出した。抽出した芽胞を室温で１０分間１３，０００ｇで遠心分離した。上清を取り出し、タンパク質分析のために保存した。３５:１芽胞タンパク抽出物を添加液と合わせ、multiphor II電気泳動システム又は他の適当な機器を用いてＩＰＧストリップ（ｐＨ３〜１０）へ加えた。次に、フォーカシングのために、ストリップを２３，０００Ｖｈで２４時間再水和する。次に、ＳＤＳ平衡緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ブロムフェノールブルー、微量）中で室温で１５分間、ストリップを直ちに平衡させた。その後、ＤＴＴ（１０ｍｇ／ｍＬ；６５ｍＭ）の第２の溶液中で室温で１５分間、ストリップを平衡させた。平衡化ストリップを４〜１５％勾配のポリアクリルアミドゲルに加え、トリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液中で電気泳動にかけた。タンパク質スポットを特定するために、ゲルをProtoBlue safeで染色する。
【０１８３】
電気溶出を実施するために、ゲルスポットをメスで切り出し、水又は他の適当な脱染緩衝液で脱染色する。次に、ゲル切片を試料チューブ（Millipore）に入れ、適当な分子量カットオフフィルター付きの電気溶出装置（Millipore）内に置く。例えば、ＥＡ１は約１００ｋＤａのゲル上を流れるので、タンパク質を捕捉してもなお脱気トリス−グリシン緩衝液を通過させるために、１００ｋＤａ分子量フィルターが用いられよう。タンパク質試料は、電気溶出する特定のタンパク質により１００Ｖｈで２２〜２４時間（より小さなタンパク質はより短い時間を必要とする）、電気溶出する。最後に、タンパク質試料をそれらのフィルター内でｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、所望の量に到達するまで、５，０００ｒｐｍで５分間隔で遠心分離する。成功した電気溶出の検証は、一次元ゲル電気泳動ミニゲルシステム上で、電気溶出試料を再試験することによって実施することができる。
【実施例４】
【０１８４】
炭疽菌芽胞を溶解した後の糖タンパク質複合体のレクチン精製
炭疽菌芽胞外膜上の糖タンパク質は、他のタンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質と複合体を形成し、それらは、尿素抽出緩衝液又は別の溶解方法によって先ず芽胞を溶解し、次にレクチンによって複合体を精製することによって単離することができる。レクチンは糖と結合することから、炭疽菌芽胞の外膜のＢｃｌＡと結合するはずである。ＢｃｌＡがレクチンと結合するときにはそれに結合した状態を維持するはずである、他の物質にもＢｃｌＡは結合する。次に、糖タンパク質複合体は、糖タンパク質よりも強く結合することができる糖でレクチンを洗浄することによってレクチンから離すことができ、よってレクチン上の空間との結合において糖が糖タンパク質に勝り、レクチンに結合しなかった糖タンパク質複合体と糖との混合物が残される。糖を低分子量のカットオフフィルターによって洗い流し、精製された糖タンパク質複合体を残すことができる。この方法のために用いることができた可能なレクチンには、ＳＢＡ（E-Y laboratories）、ＡＰＡ（E-Y laboratories）、ＧＳＡ−１（E-Y laboratories）、ＲＣＡ−Ｉ（E-Y laboratories）、ＲＣＡ−ＩＩ（E-Y laboratories）、Ｌ−ラムノース結合レクチンＳＴＬ１、ＳＴＬ２及びＳＴＬ３（Tateno et al., 1998）が含まれるが、それらに限定されない。これらのレクチンは、それらに限定されないが例えばゲル又はビーズなど、多くの形態をとることができる。新規の系として炭疽を用いると、レクチン技術を用いて精製することができる他の多くの微生物が存在する（表１）。
【実施例５】
【０１８５】
サイズ排除クロマトグラフィー
溶解した芽胞は、例えば、それには限定されないが、セファシル（sephacyl）カラムなどのサイズ排除カラムに通すことができる。この技術では、カラムの範囲内である分子量の物質がカラム内で捕捉されるが、質量の範囲外の物質はいずれもカラムを通り抜け、したがって物質はサイズによって選別される。
【実施例６】
【０１８６】
芽胞炭水化物複合体：抗原決定基は、モルモットモデルで感染に対する免疫を提供する。
炭疽菌芽胞は、その緊密に関係のある種のそれらと同様に、炭水化物成分を含有するようである。炭疽に対する完全な免疫は、防御抗原に加えてワクチンに芽胞成分を必要とすることも示された。
【０１８７】
（ａ）レクチン精製糖タンパク質複合体及びそれらの抗体応答による炭疽菌感染に対する防御
モルモット５匹（半分が雄で半分が雌）の群及びウサギ３匹（半分が雄で半分が雌）の群を、以下の、１）Colorado Serum社からのanimal current animalワクチン（陽性対照）、２）アジュバントだけをプラスしたＰＢＳ（陰性対照）、３）アジュバントとのレクチン精製糖タンパク質複合体の１００μｌ〜２ｍＬ量で筋肉内免疫接種する。追加免疫は、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週後に与える。動物は、２及び４週後に伏在静脈経由で又は他の放血方法を通して血を抜き取り、ＥＬＩＳＡ法により抗体応答を試験する。モルモットは、炭疽菌エームズ株又は他の株のＬＤ５０の１００倍で、２０週後に筋肉内抗原投与する。ウサギは、炭疽菌Ｖｏｌｌｕｍ株、エームズ株若しくは他の株、又は炭疽様感染を引き起こすことができるバシラス・セレウスＧ９２４１若しくは他の株のＬＤ５０の１００倍で、２０週後に吸入により抗原投与する。ＰＢＳで希釈した芽胞調製物を、Maxisorp ELISAプレートに塗布する。４℃で一晩インキュベーションの後、塗布したウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ［ｐＨ７．４］、０．１％ツイーン２０、０．００１％チメロサール）で洗浄する。次に、プレートをウサギ又はモルモットの抗血清の希釈溶液と反応させる。希釈溶液は、ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液（ＰＢＳ［ｐＨ７．４］、５％乾燥脱脂乳、０．００１％チメロサール）で作製する。二次抗体は、ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート体となる。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次に洗浄緩衝液で６回洗浄する。基質、２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）を加え、室温で１５分間のインキュベーションの後、プレートをマイクロタイタープレートリーダー（Dynex社製）により４０５ｎｍで読む。ＥＬＩＳＡ法は、炭疽からのΔＳｔｅｒｎｅ−１、Ｓｔｅｒｎｅ−３４Ｆ２又は他のいずれの適当な株の栄養細胞に対して、反応性が存在するかどうかを確認するためにも利用される。そのような活性が発見される場合、それは吸収法によって除去される。集団から芽胞を除去するために炭疽からのΔＳｔｅｒｎｅ−１、Ｓｔｅｒｎｅ３４Ｆ２又は他の適当な株の栄養細胞を繰り返し継代培養し、次に、中間対数期まで栄養ブイヨンで増殖させ、遠心分離によって収集し、ＰＢＳで洗浄し、ホルマリンで固定し、ＰＢＳで十分洗浄する。固定した細胞を抗血清の一定量に加え、栄養細胞抗原に対する抗体を、４℃で結合させる。次に、細菌及び結合抗体を遠心分離によって血清から除去する。栄養細胞反応性がＥＬＩＳＡによって検出されなくなるまで、これを繰り返す。抗血清からの抗体を、プロテインＡ−アガロースアフィニティーカラム（Pierce Chemical社製）を用いて精製する。外膜糖タンパク質複合体への抗体応答が起こるかどうか判定するために、ウェスタンブロット分析を実施し、抗原エピトープを確定する。
【０１８８】
このプロトコルは、レクチン精製糖タンパク質芽胞複合体が、炭疽菌のエームズ株（Ames strain）に対して経皮的に及び吸入により防御を提供することができるかどうかを判定する。さらに、この実験は、糖タンパク質複合体内の、免疫原性である個々の抗原を発現させ、どのような型の抗体がこれらの糖タンパク質複合体に対して形成されるかを表す。
【０１８９】
（ｂ）炭疽及び他の炭疽様感染の数株に対する防御
モルモット１０匹（半分が雄で半分が雌）の群及びウサギ６匹（半分が雄で半分が雌）の群を、以下の、１）Colorado Serum社製の現行の動物ワクチン（陽性対照）、２）アジュバントだけをプラスしたＰＢＳ（陰性対照）、３）アジュバントとのレクチン精製糖タンパク質複合体の１００μｌ〜２ｍＬ量で皮膚内免疫接種する。追加免疫は、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週後に与えることができる。動物は、２及び４週後に伏在静脈経由で又は他の放血方法を通して血を抜き取り、ＥＬＩＳＡ法により抗体応答を試験することができる。モルモットを上記の各群内で３つのサブグループに分け、２０週後に、炭疽菌１）Ｖｏｌｌｕｍ株若しくは他の炭疽株、２）エームズ株若しくは他の株、又は、炭疽様感染を引き起こすことができる３）バシラス・セレウスＧ９２４１若しくは他の株のＬＤ５０の１００倍で経皮的に抗原投与する。ウサギを各群内で３つのサブグループに分け、２０週後に、炭疽菌１）Ｖｏｌｌｕｍ株若しくは他の炭疽株、２）エームズ株若しくは他の株、又は、炭疽様感染を引き起こすことができる３）バシラス・セレウスＧ９２４１若しくは他の株のＬＤ５０の１００倍で吸入により抗原投与する。上のプロトコルは、レクチン精製糖タンパク質芽胞複合体が、炭疽菌及び炭疽様感染を引き起こす他の細菌に対して、経皮的に及び吸入により防御を提供することができるかどうかを判定する。
【実施例７】
【０１９０】
炭疽菌からのレクチン精製複合体の一次元ゲル
図３は尿素抽出芽胞及びレクチン精製複合体を含有する、一次元ＳＤＳゲルである。Ｓｔｅｒｎｅ  ３４Ｆ２芽胞は、Colorado Serum社から得た。大部分の細菌（＞９５％）で芽胞形成が完了したとき、芽胞を１週間栄養寒天プレート（Difco社、Detroit、MI）で増殖させた。芽胞は、１８．２ミリオームに設定したmilliQ水を用いて、プレートから収穫した。芽胞を、−８０℃で一晩冷凍した。翌日、残りのあらゆる栄養細胞を溶解するために、芽胞を室温で解凍させた（約３時間）。次に、芽胞を洗浄し、４℃で１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。芽胞の上の水を流し、芽胞を洗浄するために新しい水を上に加えた。加えた水量は、チューブ内の芽胞の量と同じであった。チューブを撹拌し、再び４℃で１０分間、１０，０００ｒｐｍで回転させた。芽胞の上の水が透明になるまで、上記した洗浄工程を３回繰り返した。加えた水の最終的な量は、チューブ内の遠心分離された芽胞の量と同じであった。位相差顕微鏡法を用いて芽胞を数え、純度を分析した。次に、芽胞を尿素で抽出した。尿素抽出した芽胞については、１０００μＬの濃縮炭疽菌懸濁液（９９．７６％純度の芽胞で１マイクロリットルにつき１．２７×１０７個の芽胞）を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上部の液体を流した。次に、３００マイクロリットルの尿素抽出緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ１０、８Ｍ尿素、２％２−メルカプトエタノール）（Fisher Scientific社製）を芽胞に加え、全ての芽胞が溶液に溶解するまで撹拌した。尿素溶液を、９０℃で１５分間加熱した。次に、尿素抽出芽胞を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を取り出し、底の粒子状物質を捨てた。上清の半分は、この図で示すゲルの尿素抽出レーンで用いた。上清の他の半分は、レクチン精製のために用いた。agroseビーズに結合した２ｍＬのＳＢＡレクチンを、重力カラム（Fisher Scientific社製）に入れた。ＳＢＡレクチンを、４ｍＬの水を用いて洗浄した。次に、１５０マイクロリットルの尿素抽出芽胞をカラム上に置き、１時間静置した。次に、過剰な未結合の物質は、廃棄物容器に流し込んだ。次に、０．１ＭのＤ−ガラクトース１．２ｍＬをカラムに加え、１時間静置した。次に、カラムを排水し、結合した物質の少量の試料を収集した（約３００マイクロリットル）。次に、結合した試料を、以下に記すＳＤＳページゲル上に流した。尿素抽出芽胞（上清）又はレクチン処理尿素抽出芽胞を、試料緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、０．０２％ブロムフェノールブルー）（Fisher Scientific社製）の２倍の量に加え、９５℃で４分間加熱した。１５マイクロリットルのカレードスコープPrestained Standard（BioRad社製）を、１つのレーンで用いた。prestained standardも、ゲルへ加える前に、９５℃で４分間加熱した。１５マイクロリットルの尿素抽出芽胞と試料緩衝液、又は１５マイクロリットルのレクチン処理尿素抽出芽胞と試料緩衝液を、４〜１５％ポリアクリルアミドミニゲルシステム（BioRad社製）に加えた。トリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（Fisher Scientific社製）を用いて、試料を電気泳動にかけた。ゲルを、１００Ｖで２時間���した。ゲルは、染色前に、１８．２ミリオームに設定したmilliQ水で１５分間３回洗浄した。ゲルは、ゲルコードブルーコマシー染色剤（comassee）（Pierce社、Rockford、IL）を用いて一晩染色した。最後に、あらゆる過剰な染色剤を除去するために、１５分間３回、ゲルを洗浄した。レーンＡ、Ｃ及びＥは、全て尿素抽出芽胞である。レーンＢは、レクチン単離尿素抽出芽胞である。このレーンには７つのバンドがある。１つのバンドは、ＥＡ１を含む。レーンＤは、カレードスコープprestained standardである。
【実施例８】
【０１９１】
レクチン処理前の尿素抽出芽胞
図４は、レクチン処理前の尿素抽出芽胞を示す。Ｓｔｅｒｎｅ  ３４Ｆ２芽胞は、Colorado Serum社から得た。大部分の細菌（＞９５％）で芽胞形成が完了したとき、芽胞を１週間栄養寒天プレート（Difco社、Detroit、MI）で増殖させた。芽胞は、１８．２ミリオームに設定したmilliQ水を用いて、プレートから収穫した。芽胞を、−８０℃で一晩冷凍した。翌日、残りのあらゆる栄養細胞を溶解するために、芽胞を室温で解凍させた（約３時間）。次に、芽胞を洗浄し、４℃で１０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。芽胞の上の水を流し、芽胞を洗浄するために新しい水を上に加えた。加えた水量は、チューブ内の芽胞の量と同じであった。チューブを撹拌し、再び４℃で１０分間、１０，０００ｒｐｍで回転させた。芽胞の上の水が透明になるまで、上記した洗浄工程を３回繰り返した。加えた水の最終的な量は、チューブ内の遠心分離された芽胞の量と同じであった。位相差顕微鏡法を用いて芽胞を数え、純度を分析した。次に、芽胞を尿素で抽出した。尿素抽出した芽胞については、１０００μＬの濃縮炭疽菌懸濁液（９９．７６％純度の芽胞で１マイクロリットルにつき１．２７×１０７個の芽胞）を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上部の液体を流した。次に、３００マイクロリットルの尿素抽出緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐｈ１０、８Ｍ尿素、２％２−メルカプトエタノール）（Fisher Scientific社製）を芽胞に加え、全ての芽胞が溶液に溶解するまで撹拌した。尿素溶液を、９０℃に１５分間加熱した。次に、尿素抽出芽胞を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を取り出し、底の粒子状物質を捨てた。
【０１９２】
尿素抽出芽胞タンパク抽出物（上清）を添加液と合わせ、multiphor II電気泳動システム（Amersham社製）又は他の適当な機器を用いてＩＰＧストリップ（ｐＨ３〜１０）へ加えた。次に、フォーカシングのために、ストリップを２３，０００Ｖｈで２４時間再水和する。次に、ＳＤＳ平衡緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ブロムフェノールブルー、微量）中で室温で１５分間、ストリップを直ちに平衡させた。その後、ＤＴＴ（１０ｍｇ／ｍＬ；６５ｍＭ）の第２の溶液中で室温で１５分間、ストリップを平衡させた。平衡化ストリップを４〜１５％勾配のポリアクリルアミドゲルに加え、トリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液中で電気泳動にかけた。製造業者の説明に従い、ＥＣＬ糖タンパク質検出システム（Amersham Biosciences）で、ゲルを糖タンパク質について染色した。尿素抽出芽胞は、２つの糖タンパク質を明らかにする。
【実施例９】
【０１９３】
炭疽糖タンパク質のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳスペクトル
図５は、図３で示す一次元ゲルから得たゲル切片の、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化法（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）マススペクトルを示す。タンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース、Ｐ９４２１７、から、７．３９×１０＋１４のＭＯＷＳＥスコアを有する炭疽菌Ｓ層タンパク質ＥＡ１前駆体（ＥＡ１  ＩＤ）と同定された。このように高いスコアを有すると、これが他のタンパク質である可能性は、ほぼ０である。さらに、わずか６．３の平均ｐｐｍ誤差で、４６．１％のタンパク質カバー率が達成された。１０:１の信号対雑音閾値より上の質量の全てをデータ分析にかけ、上の同定が得られた。この実験で用いたＭＡＤＬＩ  ＴＯＦ  ＭＳは、Applied Biosystems 4700 Protein Identificationシステムであった。このスペクトルを生むために、以下のプロトコルを使用した。ゲルを染色した後、関心のいくつかのスポットをＭＳ分析のために選択した。洗浄し、加圧滅菌したかみそりの刃を用いてこれらのスポットを切り取り、１．５ｍＬ遠心管に加えた。次に、５０％アセトニトリルに溶かした１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液２００μＬで、ゲル切片を４５分間脱染色した。次に、それらが乾燥するまで、チューブを３７℃で真空乾燥する。次に、２５ｎＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶かした１００μＬの２ｍＭ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを加えることによって試料を還元し、軽く撹拌しながら３７℃で１５分間インキュベートさせる。上清を取り出し、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）中の２０ｍＭヨードアセトアミド１００μＬを加え、１５分間暗所に静置させる。次に、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム２００μＬでゲルを１５分間３回洗浄し、次に、真空遠心分離で乾燥させる。４０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）及び０．１％ｎ−オクチルグルコシドを含む１０％アセトニトリル中の、０．０２μｇ／μＬのシークエンシング等級の修飾トリプシン２０μＬで、室温で１時間ゲルを再水和する。次に、４０ｍＭ炭酸水素アンモニウム）ｐＨ８．０）を含む１０％アセトニトリル５０μＬをチューブに加え、５分間静置させる。上清を取り出し、新しい１．５ｍＬ遠心管に入れ、真空遠心分離して乾燥させる。次に、２００μＬの純水を加え、次に前と同じように回転させて乾燥させる。これを、３回繰り返す。最後に、第４回目の再懸濁後、１０μＬだけの試料が残るまで、溶液を乾燥させる。次に、この残りの溶液は、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ分析で使用可能である。ＭＳ分析については、１μＬの試料を１μＬのマトリックスと混合し、分析のためのステンレス鋼プローブまでスポットする。用いるマトリックスは、ＤＨＢ飽和溶液による８０／２０メタノール水溶媒系中の２、５ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）である。スポットが乾いた後、Applied Biosystems 4700 Protein Analyzer MSを標準条件で用いて、試料を流す。
【実施例１０】
【０１９４】
国際出願のためのタンパク質及び核酸配列
炭疽菌ＢｃｌＡ（４００４８）−（Ｑ５２ＮＹ８）
2. SQ   配列   322 AA;  30133 MW;  B036C1F1F4432E02 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGDTGT
TGPTGPTGPT GPTGPTGDTG TTGPTGPTGP TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGATGLTGP
TGPTGPSGLG LPAGLYAFNS GGISLDLGIN DPVPFNTVGS QFGTAISQLD ADTFVISETG
FYKITVIANT ATASVLGGLT IQVNGVPVPG TGSSLISLGA PIVIQAITQI TTTPSLVEVI
VTGLGLSLAL GTSASIIIEK VA
1. SQ   配列 969 BP; 265 A; 247 C; 231 G; 226 T; 0 他になし; 3713744812 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg   240
ccaactggac caactgggcc gactgggcca actggaccaa ctgggccgac tgggccaact   300
ggaccaactg ggccgactgg gccaactgga ccaactgggc caactggaga cactggtact   360
actggaccaa ctgggccaac tggaccaact ggaccaactg ggccaactgg agacactggt   420
actactggac caactgggcc aactggacca actggaccaa ctgggccgac tggaccgact   480
gggccgactg ggccaactgg gccaactggg ccaactggtg ctaccggact gactggaccg   540
actggaccga ctgggccatc cggactagga cttccagcag gactatatgc atttaactcc   600
ggtgggattt ctttagattt aggaattaat gatccagtac catttaatac tgttggatct   660
cagtttggta cagcaatttc tcaattagat gctgatactt tcgtaattag tgaaactgga   720
ttctataaaa ttactgttat cgctaatact gcaacagcaa gtgtattagg aggtcttaca   780
atccaagtga atggagtacc tgtaccaggt actggatcaa gtttgatttc actcggagca   840
cctatcgtta ttcaagcaat tacgcaaatt acgacaactc catcattagt tgaagtaatt   900
gttacagggc ttggactatc actagctctt ggcacgagtg catccattat tattgaaaaa   960
gttgcttaa                                                         969
炭疽菌ＢｃｌＡ（Ａ１６Ｒ）−（Ｑ５２ＮＺ０）
4. SQ   配列   388 AA;  35793 MW;  50767CAB307A5A7F CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP TGDTGTTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGDTGT TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP TGDTGTTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGA
TGLTGPTGPT GPSGLGLPAG LYAFNSGGIS LDLGINDPVP FNTVGSQFGT AISQLDADTF
VISETGFYKI TVIANTATAS VLGGLTIQVN GVPVPGTGSS LISLGAPIVI QAITQITTTP
SLVEVIVTGL GLSLALGTSA SIIIEKVA
3. SQ   配列 1167 BP; 321 A; 309 C; 285 G; 252 T; 0 他になし; 3217654551 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg   240
ccgactgggc caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact   300
gggccaactg gaccaactgg gccgactggg ccaactggac caactgggcc gactgggcca   360
actggaccaa ctgggccaac tggaccaact ggaccaactg ggccaactgg accaactgga   420
ccaactgggc caactggaga cactggtact actggaccaa ctgggccaac tggaccaact   480
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   540
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg   600
ccaactggac caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact   660
gggccaactg gaccaactgg accaactggg ccaactggac caactgggcc aactggtgct   720
accggactga ctggaccgac tggaccgact gggccatccg gactaggact tccagcagga   780
ctatatgcat ttaactccgg tgggatttct ttagatttag gaattaatga tccagtacca   840
tttaatactg ttggatctca gtttggtaca gcaatttctc aattagatgc tgatactttc   900
gtaattagtg aaactggatt ctataaaatt actgttatcg ctaatactgc aacagcaagt   960
gtattaggag gtcttacaat ccaagtgaat ggagtacctg taccaggtac tggatcaagt  1020
ttgatttcac tcggagcacc tatcgttatt caagcaatta cgcaaattac gacaactcca  1080
tcattagttg aagtaattgt tacagggctt ggactatcac tagctcttgg cacgagtgca  1140
tccattatta ttgaaaaagt tgcttaa                                     1167
炭疽菌ＢｃｌＡ（ＣＩＰＡ２）−（Ｑ８３ＴＬ０）
6. SQ   配列   262 AA;  25006 MW;  CB03E1E413646488 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP TGDTGTTGPT GPTGPTGPTG PTGATGLTGP
TGPTGPSGLG LPAGLYAFNS GGISLDLGIN DPVPFNTVGS QFGTAISQLD ADTFVISETG
FYKITVIANT ATASVLGGLT IQVNGVPVPG TGSSLISLGA PIVIQAITQI TTTPSLVEVI
VTGLGLSLAL GTSASIIIEK VA
5. SQ   配列 789 BP; 223 A; 189 C; 173 G; 204 T; 0 他になし; 668699339 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg   240
ccaactggac caactgggcc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact   300
gggccaactg gaccaactgg accaactggg ccaactggtg ctaccggact gactggaccg   360
actggaccga ctgggccatc cggactagga cttccagcag gactatatgc atttaactcc   420
ggtgggattt ctttagattt aggaattaat gatccagtac catttaatac tgttggatct   480
cagtttggta cagcaatttc tcaattagat gctgatactt tcgtaattag tgaaactgga   540
ttctataaaa ttactgttat cgctaatact gcaacagcaa gtgtattagg aggtcttaca   600
atccaagtga atggagtacc tgtaccaggt actggatcaa gtttgatttc actcggagca   660
cctatcgtta ttcaagcaat tacgcaaatt acgacaactc catcattagt tgaagtaatt   720
gttacagggc ttggactatc actagctctt ggcacgagtg catccattat tattgaaaaa   780
gttgcttaa                                                         789
炭疽菌ＢｃｌＡ（７６１１）−（Ｑ８３ＵＶ２）
8. SQ   配列   253 AA;  24218 MW;  10231F93AD9A1385 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGDTGTTGP TGPTGPTGPT GPTGATGLTG PTGPTGPSGL
GLPAGLYAFN SGGISLDLGI NDPVPFNTVG SQFGTAISQL DADTFVISET GFYKITVIAN
TATASVLGGL TIQVNGVPVP GTGSSLISLG APIVIQAITQ ITTTPSLVEV IVTGLGLSLA
LGTSASIIIE KVA
7. SQ   配列 762 BP; 216 A; 182 C; 165 G; 199 T; 0 他になし; 3124681291 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tggaccaact gggccaactg gaccaactgg gccaactggg   240
ccaactggag acactggtac tactggacca actgggccaa ctggaccaac tggaccaact   300
gggccaactg gtgctaccgg actgactgga ccgactggac cgactgggcc atccggacta   360
ggacttccag caggactata tgcatttaac tccggtggga tttctttaga tttaggaatt   420
aatgatccag taccatttaa tactgttgga tctcagtttg gtacagcaat ttctcaatta   480
gatgctgata ctttcgtaat tagtgaaact ggattctata aaattactgt tatcgctaat   540
actgcaacag caagtgtatt aggaggtctt acaatccaag tgaatggagt acctgtacca   600
ggtactggat caagtttgat ttcactcgga gcacctatcg ttattcaagc aattacgcaa   660
attacgacaa ctccatcatt agttgaagta attgttacag ggcttggact atcactagct   720
cttggcacga gtgcatccat tattattgaa aaagttgctt aa                     762
炭疽菌ＢｃｌＡ（ＡＴＣＣ４２２９）−（Ｑ８３ＷＡ５）
10. SQ   配列   223 AA;  21665 MW;  450F8ECB33FBC58E CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGDTGT
TGPTGPTGPT GPTGATGLTG PTGPTGPSGL GLPAGLYAFN SGGISLDLGI NDPVPFNTVG
SQFGTAISQL DADTFVISET GFYKITVIAN TATASVLGGL TIQVNGVPVP GTGSSLISLG
APIVIQAITQ ITTTPSLVEV IVTGLGLSLA LGTSASIIIE KVA
9. SQ   配列 672 BP; 195 A; 152 C; 136 G; 189 T; 0 他になし; 1857948650 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccaactgg accaactggg ccaactgggc caactggaga cactggtact   180
actggaccaa ctgggccaac tggaccaact gggccaactg gtgctaccgg actgactgga   240
ccgactggac cgactgggcc atccggacta ggacttccag caggactata tgcatttaac   300
tccggtggga tttctttaga tttaggaatt aatgatccag taccatttaa tactgttgga   360
tctcagtttg gtacagcaat ttctcaatta gatgctgata ctttcgtaat tagtgaaact   420
ggattctata aaattactgt tatcgctaat actgcaacag caagtgtatt aggaggtctt   480
acaatccaag tgaatggagt acctgtacca ggtactggat caagtttgat ttcactcgga   540
gcacctatcg ttattcaagc aattacgcaa attacgacaa ctccatcatt agttgaagta   600
attgttacag ggcttggact atcactagct cttggcacga gtgcatccat tattattgaa   660
aaagttgctt aa                                                     672
炭疽菌ＢｃｌＡ（ＣＩＰ５７２５）−（Ｑ８３ＷＡ６）
12. SQ   配列   244 AA;  23452 MW;  AC95F5F306ACD892 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGDTGTTG PTGPTGPTGP TGPTGATGLT GPTGPTGPSG LGLPAGLYAF
NSGGISLDLG INDPVPFNTV GSQFGTAISQ LDADTFVISE TGFYKITVIA NTATASVLGG
LTIQVNGVPV PGTGSSLISL GAPIVIQAIT QITTTPSLVE VIVTGLGLSL ALGTSASIII
EKVA
11. SQ   配列 735 BP; 210 A; 173 C; 156 G; 196 T; 0 他になし; 1433959005 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactggacca   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact gggccaactg gagacactgg tactactgga   240
ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggtgctac cggactgact   300
ggaccgactg gaccgactgg gccatccgga ctaggacttc cagcaggact atatgcattt   360
aactccggtg ggatttcttt agatttagga attaatgatc cagtaccatt taatactgtt   420
ggatctcagt ttggtacagc aatttctcaa ttagatgctg atactttcgt aattagtgaa   480
actggattct ataaaattac tgttatcgct aatactgcaa cagcaagtgt attaggaggt   540
cttacaatcc aagtgaatgg agtacctgta ccaggtactg gatcaagttt gatttcactc   600
ggagcaccta tcgttattca agcaattacg caaattacga caactccatc attagttgaa   660
gtaattgtta cagggcttgg actatcacta gctcttggca cgagtgcatc cattattatt   720
gaaaaagttg cttaa                                                  735
炭疽菌ＢｃｌＡ（ＡＴＣＣ６６０２）−（Ｑ８３ＷＡ７）
14. SQ   配列   253 AA;  24208 MW;  01293B56EDB92731 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGDTGTTG PTGPTGPTGP TGPTGPTGPT GPTGATGLTG PTGPTGPSGL
GLPAGLYAFN SGGISLDLGI NDPVPFNTVG SQFGTAISQL DADTFVISET GFYKITVIAN
TATASVLGGL TIQVNGVPVP GTGSSLISLG APIVIQAITQ ITTTSSLVEV IVTGLGLSLA
LGTSASIIIE KVA
13. SQ   配列 762 BP; 216 A; 182 C; 164 G; 200 T; 0 他になし; 645088734 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tggaccaact gggccaactg gagacactgg tactactgga   240
ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggaccaac tggaccaact   300
gggccaactg gtgctaccgg actgactgga ccgactggac cgactgggcc atccggacta   360
ggacttccag caggactata tgcatttaac tccggtggga tttctttaga tttaggaatt   420
aatgatccag taccatttaa tactgttgga tctcagtttg gtacagcaat ttctcaatta   480
gatgctgata ctttcgtaat tagtgaaact ggattctata aaattactgt tatcgctaat   540
actgcaacag caagtgtatt aggaggtctt acaatccaag tgaatggagt acctgtacca   600
ggtactggat caagtttgat ttcactcgga gcacctatcg ttattcaagc aattacgcaa   660
attacgacaa cttcctcatt agttgaagta attgttacag ggcttggact atcactagct   720
cttggcacga gtgcatccat tattattgaa aaagttgctt aa                     762
炭疽菌ＢｃｌＡ（ＣＩＰ５３１６９）−（Ｑ８３ＷＡ８）
16. SQ   配列   370 AA;  34262 MW;  064CEDCEF0EBB127 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP TGPTGPTGPT GPTGPTGDTG TTGPTGPTGP
TGPTGPTGDT GTTGPTGPTG PTGPTGPTGP TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGDTGTTGP
TGPTGPTGPT GPTGDTGTTG PTGPTGPTGP TGPTGPTGPT GATGLTGPTG PTGPSGLGLP
AGLYAFNSGG ISLDLGINDP VPFNTVGSQF GTAISQLDAD TFVISETGFY KITVIANTAT
ASVLGGLTIQ VNGVPVPGTG SSLISLGAPI VIQAITQITT TPSLVEVIVT GLGLSLALGT
SASIIIEKVA
15. SQ   配列 1113 BP; 307 A; 291 C; 269 G; 246 T; 0 他になし; 2173493146 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg   240
ccaactggac caactgggcc gactgggcca actggaccaa ctgggccgac tgggccaact   300
ggaccaactg ggccaactgg agacactggt actactggac caactgggcc aactggacca   360
actggaccaa ctgggccaac tggagacact ggtactactg gaccaactgg gccaactgga   420
ccaactggac caactgggcc gactggaccg actgggccga ctgggccaac tggaccaact   480
gggccgactg ggccaactgg accaactggg ccaactggag acactggtac tactggacca   540
actgggccaa ctggaccaac tggaccaact gggccaactg gagacactgg tactactgga   600
ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggaccaac tgggccaact   660
ggtgctaccg gactgactgg accgactgga ccgactgggc catccggact aggacttcca   720
gcaggactat atgcatttaa ctccggtggg atttctttag atttaggaat taatgatcca   780
gtaccattta atactgttgg atctcagttt ggtacagcaa tttctcaatt agatgctgat   840
actttcgtaa ttagtgaaac tggattctat aaaattactg ttatcgctaa tactgcaaca   900
gcaagtgtat taggaggtct tacaatccaa gtgaatggag tacctgtacc aggtactgga   960
tcaagtttga tttcactcgg agcacctatc gttattcaag caattacgca aattacgaca  1020
actccatcat tagttgaagt aattgttaca gggcttggac tatcactagc tcttggcacg  1080
agtgcatcca ttattattga aaaagttgct taa                              1113
炭疽菌ＢｃｌＡ（ＣＩＰ８１８９）−（Ｑ８３ＷＡ９）
18. SQ   配列   391 AA;  36071 MW;  E8B7B61480FD9DB9 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP TGDTGTTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGDT GTTGPTGPTG PTGPTGPTGD TGTTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGDTGTTG PTGPTGPTGP TGPTGDTGTT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGATGLTGPT GPTGPSGLGL PAGLYAFNSG GISLDLGIND PVPFNTVGSQ FGTAISQLDA
DTFVISETGF YKITVIANTA TASVLGGLTI QVNGVPVPGT GSSLISLGAP IVIQAITQIT
TTPSLVEVIV TGLGLSLALG TSASIIIEKV A
17. SQ   配列 1176 BP; 323 A; 310 C; 288 G; 255 T; 0 他になし; 1987561614 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg   240
ccgactgggc caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact   300
gggccaactg gaccaactgg gccgactggg ccaactggac caactgggcc gactgggcca   360
actggaccaa ctgggccaac tggagacact ggtactactg gaccaactgg gccaactgga   420
ccaactggac caactgggcc aactggagac actggtacta ctggaccaac tgggccaact   480
ggaccaactg gaccaactgg gccgactgga ccgactgggc cgactgggcc aactggacca   540
actgggccga ctgggccaac tggaccaact gggccaactg gagacactgg tactactgga   600
ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggagacac tggtactact   660
ggaccaactg ggccaactgg accaactgga ccaactgggc caactggacc aactgggcca   720
actggtgcta ccggactgac tggaccgact ggaccgactg ggccatccgg actaggactt   780
ccagcaggac tatatgcatt taactccggt gggatttctt tagatttagg aattaatgat   840
ccagtaccat ttaatactgt tggatctcag tttggtacag caatttctca attagatgct   900
gatactttcg taattagtga aactggattc tataaaatta ctgttatcgc taatactgca   960
acagcaagtg tattaggagg tcttacaatc caagtgaatg gagtacctgt accaggtact  1020
ggatcaagtt tgatttcact cggagcacct atcgttattc aagcaattac gcaaattacg  1080
acaactccat cattagttga agtaattgtt acagggcttg gactatcact agctcttggc  1140
acgagtgcat ccattattat tgaaaaagtt gcttaa                           1176
炭疽菌ＢｃｌＡ（Ｓｔｅｒｎｅ  ＣＩＰ７７０２）−（Ｑ８３ＷＢ０）
20. SQ   配列   445 AA;  40709 MW;  DAF461B2B6FFA247 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG DTGTTGPTGP TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGPTGDTG TTGPTGPTGP TGPTGPTGDT GTTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGDTGTTGP TGPTGPTGPT GPTGDTGTTG PTGPTGPTGP
TGPTGDTGTT GPTGPTGPTG PTGPTGDTGT TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGATGL
TGPTGPTGPS GLGLPAGLYA FNSGGISLDL GINDPVPFNT VGSQFGTAIS QLDADTFVIS
ETGFYKITVI ANTATASVLG GLTIQVNGVP VPGTGSSLIS LGAPIVIQAI TQITTTPSLV
EVIVTGLGLS LALGTSASII IEKVA
19. SQ   配列 1338 BP; 368 A; 360 C; 333 G; 277 T; 0 他になし; 688694428 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccgact gggccaactg gaccaactgg gccaactgga   240
gacactggta ctactggacc aactgggccg actgggccaa ctggaccaac tgggccaact   300
ggagacactg gtactactgg accaactggg ccaactggac caactgggcc gactgggcca   360
actggaccaa ctgggccgac tgggccaact ggaccaactg ggccaactgg agacactggt   420
actactggac caactgggcc aactggacca actggaccaa ctgggccaac tggagacact   480
ggtactactg gaccaactgg gccaactgga ccaactggac caactgggcc gactggaccg   540
actgggccga ctgggccaac tggaccaact gggccgactg ggccaactgg accaactggg   600
ccaactggag acactggtac tactggacca actgggccaa ctggaccaac tggaccaact   660
gggccaactg gagacactgg tactactgga ccaactgggc caactggacc aactggacca   720
actgggccaa ctggagacac tggtactact ggaccaactg ggccaactgg accaactgga   780
ccaactgggc caactggaga cactggtact actggaccaa ctgggccaac tggaccaact   840
ggaccaactg ggccaactgg accaactgga ccaactgggc caactggtgc taccggactg   900
actggaccga ctggaccgac tgggccatcc ggactaggac ttccagcagg actatatgca   960
tttaactccg gtgggatttc tttagattta ggaattaatg atccagtacc atttaatact  1020
gttggatctc agtttggtac agcaatttct caattagatg ctgatacttt cgtaattagt  1080
gaaactggat tctataaaat tactgttatc gctaatactg caacagcaag tgtattagga  1140
ggtcttacaa tccaagtgaa tggagtacct gtaccaggta ctggatcaag tttgatttca  1200
ctcggagcac ctatcgttat tcaagcaatt acgcaaatta cgacaactcc atcattagtt  1260
gaagtaattg ttacagggct tggactatca ctagctcttg gcacgagtgc atccattatt  1320
attgaaaaag ttgcttaa                                               1338
炭疽菌ＢｃｌＡ（Ａｍｅｓ）−（Ｑ８１ＪＤ７、Ｑ６ＫＶＳ０、Ｑ７ＢＹＡ５）
22. SQ   配列   382 AA;  35305 MW;  1DB4ED430DA07037 CRC64;
MSNNNYSNGL NPDESLSASA FDPNLVGPTL PPIPPFTLPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGPTGPT GDTGTTGPTG PTGPTGPTGP TGDTGTTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGD
TGTTGPTGPT GPTGPTGPTG DTGTTGPTGP TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGPTGPTGP
TGPTGDTGTT GPTGPTGPTG PTGPTGDTGT TGPTGPTGPT GPTGPTGPTG PTGATGLTGP
TGPTGPSGLG LPAGLYAFNS GGISLDLGIN DPVPFNTVGS QFGTAISQLD ADTFVISETG
FYKITVIANT ATASVLGGLT IQVNGVPVPG TGSSLISLGA PIVIQAITQI TTTPSLVEVI
VTGLGLSLAL GTSASIIIEK VA
21. SQ   配列 1149 BP; 317 A; 301 C; 279 G; 252 T; 0 他になし; 3918642356 CRC32;
atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca    60
tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc   120
ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg   180
actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg   240
ccgactgggc caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact   300
gggccaactg gaccaactgg gccgactggg ccaactggac caactgggcc aactggagac   360
actggtacta ctggaccaac tgggccaact ggaccaactg gaccaactgg gccaactgga   420
gacactggta ctactggacc aactgggcca actggaccaa ctggaccaac tgggccgact   480
ggaccgactg ggccgactgg gccaactgga ccaactgggc cgactgggcc aactggacca   540
actgggccaa ctggagacac tggtactact ggaccaactg ggccaactgg accaactgga   600
ccaactgggc caactggaga cactggtact actggaccaa ctgggccaac tggaccaact   660
ggaccaactg ggccaactgg accaactggg ccaactggtg ctaccggact gactggaccg   720
actggaccga ctgggccatc cggactagga cttccagcag gactatatgc atttaactcc   780
ggtgggattt ctttagattt aggaattaat gatccagtac catttaatac tgttggatct   840
cagtttggta cagcaatttc tcaattagat gctgatactt tcgtaattag tgaaactgga   900
ttctataaaa ttactgttat cgctaatact gcaacagcaa gtgtattagg aggtcttaca   960
atccaagtga atggagtacc tgtaccaggt actggatcaa gtttgatttc actcggagca  1020
cctatcgtta ttcaagcaat tacgcaaatt acgacaactc catcattagt tgaagtaatt  1080
gttacagggc ttggactatc actagctctt ggcacgagtg catccattat tattgaaaaa  1140
gttgcttaa                                                        1149
炭疽菌ＥＡ１−（Ｐ９４２１７、Ｑ６Ｉ２Ｒ２、Ｑ６ＫＷＪ３）
24. SQ   配列   862 AA;  91362 MW;  CB16B202F62CCCA0 CRC64;
MAKTNSYKKV IAGTMTAAMV AGIVSPVAAA GKSFPDVPAG HWAEGSINYL VDKGAITGKP
DGTYGPTESI DRASAAVIFT KILNLPVDEN AQPSFKDAKN IWSSKYIAAV EKAGVVKGDG
KENFYPEGKI DRASFASMLV SAYNLKDKVN GELVTTFEDL LDHWGEEKAN ILINLGISVG
TGGKWEPNKS VSRAEAAQFI ALTDKKYGKK DNAQAYVTDV KVSEPTKLTL TGTGLDKLSA
DDVTLEGDKA VAIEASTDGT SAVVTLGGKV APNKDLTVKV KNQSFVTKFV YEVKKLAVEK
LTFDDDRAGQ AIAFKLNDEK GNADVEYLNL ANHDVKFVAN NLDGSPANIF EGGEATSTTG
KLAVGIKQGD YKVEVQVTKR GGLTVSNTGI ITVKNLDTPA SAIKNVVFAL DADNDGVVNY
GSKLSGKDFA LNSQNLVVGE KASLNKLVAT IAGEDKVVDP GSISIKSSNH GIISVVNNYI
TAEAAGEATL TIKVGDVTKD VKFKVTTDSR KLVSVKANPD KLQVVQNKTL PVTFVTTDQY
GDPFGANTAA IKEVLPKTGV VAEGGLDVVT TDSGSIGTKT IGVTGNDVGE GTVHFQNGNG
ATLGSLYVNV TEGNVAFKNF ELVSKVGQYG QSPDTKLDLN VSTTVEYQLS KYTSDRVYSD
PENLEGYEVE SKNLAVADAK IVGNKVVVTG KTPGKVDIHL TKNGATAGKA TVEIVQETIA
IKSVNFKPVQ TENFVEKKIN IGTVLELEKS NLDDIVKGIN LTKETQHKVR VVKSGAEQGK
LYLDRNGDAV FNAGDVKLGD VTVSQTSDSA LPNFKADLYD TLTTKYTDKG TLVFKVLKDK
DVITSEIGSQ AVHVNVLNNP NL
23. SQ   配列 2589 BP; 926 A; 421 C; 515 G; 727 T; 0 他になし; 2474321808 CRC32;
atggcaaaga ctaactctta caaaaaagta atcgcaggta caatgacagc agcaatggta    60
gcaggtattg tatctccagt agcagcagca ggtaaatcat tcccagacgt tccagctgga   120
cattgggcag aaggttctat taattactta gtagataaag gtgcaattac aggtaagcca   180
gacggtacat atggtccaac cgaatcaatc gatcgtgctt ctgcagctgt aatcttcact   240
aaaattttaa atttaccagt tgatgaaaat gctcagcctt ctttcaaaga tgctaaaaat   300
atttggtctt caaaatatat tgcagcagtt gaaaaagctg gcgttgttaa aggtgatggc   360
aaagaaaact tctatccaga aggaaagatt gaccgtgctt catttgcttc tatgttagta   420
agtgcttata acttaaaaga taaagttaac ggcgagttag ttacgacatt tgaagattta   480
ttagatcatt ggggtgaaga gaaagcaaac atcctaatta accttggaat ctctgtaggt   540
actggtggta aatgggagcc aaataaatct gtatctcgtg cagaagcagc tcaatttatc   600
gcattaacag ataaaaaata tggaaaaaaa gataatgcac aagcgtatgt aactgatgtg   660
aaagtttctg agccaacgaa attaacatta acaggtactg gcttagacaa actttctgct   720
gatgatgtaa ctcttgaagg agacaaagca gttgcaatcg aagcaagtac tgatggtact   780
tctgcagttg taacacttgg tggcaaagta gctccaaata aagaccttac tgtaaaagtg   840
aaaaatcaat cattcgtaac gaaattcgta tacgaagtga aaaaattagc agtagaaaaa   900
cttacatttg atgatgatcg cgctggtcaa gcaattgctt tcaaattaaa cgatgaaaaa   960
ggtaacgctg atgttgagta cttaaactta gcaaaccatg acgtcaaatt tgtagcgaat  1020
aacttagacg gttcaccagc aaacatcttt gaaggtggag aagctacttc tactacaggt  1080
aaactagctg ttggcattaa gcagggtgac tacaaagtag aagtacaagt tacaaaacgc  1140
ggtggtttaa cagtttctaa cactggtatt attacagtga aaaaccttga tacaccagct  1200
tctgcaatta aaaatgttgt atttgcatta gatgctgata atgatggtgt tgtaaactat  1260
ggcagcaagc tttctggtaa agactttgct ttaaatagcc aaaacttagt tgttggtgaa  1320
aaagcatctc ttaataaatt agttgctaca attgctggag aagataaagt agttgatcca  1380
ggatcaatta gcattaaatc ttcaaaccac ggtattattt ctgtagtaaa taactacatt  1440
actgctgagg ctgctggtga agctacactt actattaaag taggtgacgt tacaaaagac  1500
gttaaattta aagtaacgac tgattctcgt aaattagtat cagtaaaagc taacccagat  1560
aaattacaag ttgttcaaaa taaaacatta cctgttacat tcgtaacaac tgaccaatat  1620
ggcgatccat ttggtgctaa cacagctgca attaaagaag ttcttccgaa aacaggtgta  1680
gttgcagaag gtggattaga tgtagtaacg actgactctg gttcaatcgg tacaaaaaca  1740
attggtgtta caggtaatga cgtaggcgaa ggtacagttc acttccaaaa cggtaatggt  1800
gctactttag gttcattata tgtgaacgta acagagggta acgttgcatt taaaaacttt  1860
gaacttgtat ctaaagtagg tcaatatggc caatcacctg atacaaaact tgacttaaat  1920
gtttcaacta ctgttgaata tcaattatct aagtacactt cagatcgcgt atactctgat  1980
cctgaaaact tagaaggtta tgaagttgaa tctaaaaatc tagctgtagc tgacgctaaa  2040
attgttggaa ataaagttgt tgttacaggt aaaactccag gtaaagttga tatccactta  2100
acgaaaaatg gtgcaactgc tggtaaagcg acagtcgaaa tcgttcaaga gacaattgct  2160
attaaatctg taaacttcaa accagttcaa acagaaaact ttgttgagaa gaaaatcaac  2220
atcggtactg tattagagct tgagaagagt aacctggatg atatcgtaaa aggtattaac  2280
ttaacgaaag aaacacaaca taaagtacgt gttgtgaaat ctggtgcaga gcaaggtaaa  2340
ctttacttag atagaaacgg tgatgctgta tttaacgctg gcgatgtaaa acttggcgat  2400
gtaacagtat ctcaaacaag tgattctgca cttccaaact tcaaggcaga tctttatgat  2460
actttaacta ctaagtacac tgacaaaggt acattagtat tcaaagtatt aaaagataaa  2520
gatgttatta caagcgaaat cggttcacaa gctgtacacg tgaacgttct taataaccca  2580
aatctataa                                                        2589
炭疽菌ＥＡ２−（Ｐ４９０５１、Ｑ６Ｉ２Ｒ３、Ｑ６ＫＷＪ４）
26. SQ   配列   814 AA;  86621 MW;  C1638D26A1C6B101 CRC64;
MAKTNSYKKV IAGTMTAAMV AGVVSPVAAA GKTFPDVPAD HWGIDSINYL VEKGAVKGND
KGMFEPGKEL TRAEAATMMA QILNLPIDKD AKPSFADSQG QWYTPFIAAV EKAGVIKGTG
NGFEPNGKID RVSMASLLVE AYKLDTKVNG TPATKFKDLE TLNWGKEKAN ILVELGISVG
TGDQWEPKKT VTKAEAAQFI AKTDKQFGTE AAKVESAKAV TTQKVEVKFS KAVEKLTKED
IKVTNKANND KVLVKEVTLS EDKKSATVEL YSNLAAKQTY TVDVNKVGKT EVAVGSLEAK
TIEMADQTVV ADEPTALQFT VKDENGTEVV SPEGIEFVTP AAEKINAKGE ITLAKGTSTT
VKAVYKKDGK VVAESKEVKV SAEGAAVASI SNWTVAEQNK ADFTSKDFKQ NNKVYEGDNA
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SKTVEIEAFA QKAMKEIKLE KTNVALSTKD VTDLKVKAPV LDQYGKEFTA PVTVKVLDKD
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EVRGLEKELD KYVTEENQKN AMTVSVLPVD ANGLVLKGAE AAELKVTTTN KEGKEVDATD
AQVTVQNNSV ITVGQGAKAG ETYKVTVVLD GKLITTHSFK VVDTAPTAKG LAVEFTSTSL
KEVAPNADLK AALLNILSVD GVPATTAKAT VSNVEFVSAD TNVVAENGTV GAKGATSIYV
KNLTVVKDGK EQKVEFDKAV QVAVSIKEAK PATK
25. SQ   配列 2445 BP; 974 A; 381 C; 479 G; 611 T; 0 他になし; 1260040913 CRC32;
atggcaaaga ctaactctta caaaaaagta atcgctggta caatgacagc agcaatggta    60
gcaggtgttg tttctccagt agcagcagca ggtaaaacat tcccagacgt tcctgctgat   120
cactggggaa ttgattctat taactactta gtagaaaaag gcgcagttaa aggtaacgac   180
aaaggaatgt tcgagcctgg aaaagaatta actcgtgcag aagcagctac aatgatggct   240
caaatcttaa acttaccaat cgataaagat gctaaaccat ctttcgctga ctctcaaggc   300
caatggtaca ctccattcat cgcagctgta gaaaaagctg gcgttattaa aggtacagga   360
aacggctttg agccaaacgg aaaaatcgac cgcgtttcta tggcatctct tcttgtagaa   420
gcttacaaat tagatactaa agtaaacggt actccagcaa ctaaattcaa agatttagaa   480
acattaaact ggggtaaaga aaaagctaac atcttagttg aattaggaat ctctgttggt   540
actggtgatc aatgggagcc taagaaaact gtaactaaag cagaagctgc tcaattcatt   600
gctaagactg acaagcagtt cggtacagaa gcagcaaaag ttgaatctgc aaaagctgtt   660
acaactcaaa aagtagaagt taaattcagc aaagctgttg aaaaattaac taaagaagat   720
atcaaagtaa ctaacaaagc taacaacgat aaagtactag ttaaagaggt aactttatca   780
gaagataaaa aatctgctac agttgaatta tatagtaact tagcagctaa acaaacttac   840
actgtagatg taaacaaagt tggtaaaaca gaagtagctg taggttcttt agaagcaaaa   900
acaatcgaaa tggctgacca aacagttgta gctgatgagc caacagcatt acaattcaca   960
gttaaagatg aaaacggtac tgaagttgtt tcaccagagg gtattgaatt tgtaacgcca  1020
gctgcagaaa aaattaatgc aaaaggtgaa atcactttag caaaaggtac ttcaactact  1080
gtaaaagctg tttataaaaa agacggtaaa gtagtagctg aaagtaaaga agtaaaagtt  1140
tctgctgaag gtgctgcagt agcttcaatc tctaactgga cagttgcaga acaaaataaa  1200
gctgacttta cttctaaaga tttcaaacaa aacaataaag tttacgaagg cgacaacgct  1260
tacgttcaag tagaattgaa agatcaattt aacgcagtaa caactggaaa agttgaatat  1320
gagtcgttaa acacagaagt tgctgtagta gataaagcta ctggtaaagt aactgtatta  1380
tctgcaggaa aagcaccagt aaaagtaact gtaaaagatt caaaaggtaa agaacttgtt  1440
tcaaaaacag ttgaaattga agctttcgct caaaaagcaa tgaaagaaat taaattagaa  1500
aaaactaacg tagcgctttc tacaaaagat gtaacagatt taaaagtaaa agctccagta  1560
ctagatcaat acggtaaaga gtttacagct cctgtaacag tgaaagtact tgataaagat  1620
ggtaaagaat taaaagaaca aaaattagaa gctaaatatg tgaacaaaga attagttctg  1680
aatgcagcag gtcaagaagc tggtaattat acagttgtat taactgcaaa atctggtgaa  1740
aaagaagcaa aagctacatt agctctagaa ttaaaagctc caggtgcatt ctctaaattt  1800
gaagttcgtg gtttagaaaa agaattagat aaatatgtta ctgaggaaaa ccaaaagaat  1860
gcaatgactg tttcagttct tcctgtagat gcaaatggat tagtattaaa aggtgcagaa  1920
gcagctgaac taaaagtaac aacaacaaac aaagaaggta aagaagtaga cgcaactgat  1980
gcacaagtta ctgtacaaaa taacagtgta attactgttg gtcaaggtgc aaaagctggt  2040
gaaacttata aagtaacagt tgtactagat ggtaaattaa tcacaactca ttcattcaaa  2100
gttgttgata cagcaccaac tgctaaagga ttagcagtag aatttacaag cacatctctt  2160
aaagaagtag ctccaaatgc tgatttaaaa gctgcacttt taaatatctt atctgttgat  2220
ggtgtacctg cgactacagc aaaagcaaca gtttctaatg tagaatttgt ttctgctgac  2280
acaaatgttg tagctgaaaa tggtacagtt ggtgcaaaag gtgcaacatc tatctatgtg  2340
aaaaacctga cagttgtaaa agatggaaaa gagcaaaaag tagaatttga taaagctgta  2400
caagttgcag tttctattaa agaagcaaaa cctgcaacaa aataa                 2445
【０１９５】
本発明は、本発明のある実施形態に関して記載、例示されているが、当業技術者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その中で様々な変更、修正及び置換を加えることができることを理解しよう。例えば、本明細書で示す投薬量以外の有効投薬量が、処理する昆虫集団の応答性の変化の結果として適用可能であろう。同様に、観察される具体的な生化学応答は、選択される個別の活性化合物又は薬用担体の存在の有無、並びに、製剤の型及び用いる投与様式に従い、及びそれらによって異なることができ、そのような予想される結果の変動又は差は、本発明の目的及び実施に従って企図される。本明細書で参照した全ての文献は、その全体において参照により組み込まれる。本明細書で参照する刊行物、特許又は特許出願は、本願明細書でその全体において参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】本発明の実施形態に従う炭疽菌芽胞の外膜の概略図。
【図２】本発明の実施形態に従う炭疽菌芽胞の外膜からの糖タンパク質の単離方法のフローチャート図。
【図３】本発明の実施形態に従う一次元のゲル電気泳動で実行されたレクチン処理の前後の炭疽菌芽胞のタンパク質分布の実施形態を示す図。
【図４】本発明の実施形態に従う二次元のゲル電気泳動で実行されたレクチン処理前の尿素抽出芽胞の糖タンパク質染色を示す図。
【図５】本発明の実施形態に従う、単一の糖タンパク質バンド（EA1 1D）（図３のゲルのバンド１）のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる特性評価を示す図。
【図１】
2009511018.tif 000011
【図２】
2009511018.tif 000012
【図３】
2009511018.tif 000013
【図４】
2009511018.tif 000014
【図５】
2009511018.tif 000015
【配列表】
2009511018000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月6日(2008.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的微生物の外膜又は表面から糖タンパク質複合体を単離する方法であって、前記微生物の外膜又は表面の抽出物から、前記抽出物の糖結合剤への吸収によって、少なくとも１つの糖タンパク質を単離するステップを含む方法。
【請求項２】
目的微生物が、表１に挙げる微生物のいずれか１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的微生物が炭疽菌であり、糖タンパク質複合体が前記炭疽菌の外膜から単離される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
目的微生物が炭疽菌様細菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
炭疽菌様細菌がバシラス・セレウスであり、糖タンパク質複合体が前記バシラス・セレウスの外膜から単離される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖結合剤がレクチン、抗体、タンパク質又は脂質の少なくとも１つを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
糖タンパク質が少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離されるステップをさらに含み、前記少なくとも１つの他の分子が、タンパク質、オリゴ糖、脂質又はリン脂質からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
複合体がサイズ排除クロマトグラフィー、電気溶出、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、high performance liquid chromatography）又はカラムクロマトグラフィーの少なくとも１つを用いて外膜から単離される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複合体の少なくとも１つの他の分子を特定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
糖タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２６に示すアミノ酸配列の少なくとも１つに対し、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
目的微生物の外膜又は表面から単離される少なくとも１つのレクチン結合糖タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
【請求項１２】
目的微生物が表１に挙げる微生物のいずれか１つから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
目的微生物が炭疽菌であり、糖タンパク質複合体が前記炭疽菌の外膜から単離される、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
目的微生物が炭疽菌様細菌である、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１５】
炭疽菌様細菌がバシラス・セレウスであり、糖タンパク質複合体が前記バシラス・セレウスの外膜から単離される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
糖タンパク質が少なくとも１つの他の分子を含む複合体の一部として単離され、前記糖タンパク質が組成物中に前記複合体の一部として存在し、前記少なくとも１つの他の分子はタンパク質、オリゴ糖、脂質及びリン脂質からなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
糖タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２６に示すアミノ酸配列の少なくとも１つに対し、少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
組成物が、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）及び浮腫因子（ＥＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの炭疽菌抗原をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１１〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
非ヒト動物に請求項１１〜１９のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、前記非ヒト動物における細菌又はウイルスの感染症の予防又は治療方法。
【請求項２１】
感染症が炭疽又は炭疽様感染である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
感染が炭素菌によって起こる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
感染が炭疽菌様細菌によって起こる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
炭疽菌様細菌がバシラス・セレウスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療が対象における細胞性免疫応答又は液性免疫応答の少なくとも１つをもたらす、請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。    
【請求項２６】
非ヒト動物が哺乳動物である、請求項２０〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物がマウス、霊長類、ウシ、ヒツジ、有蹄動物、ウマ、ウサギ、及びモルモットからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
レクチン結合糖タンパク質をコードする単離核酸分子であって、
ａ）  配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５に示すヌクレオチド配列、
ｂ）  配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５に示すヌクレオチド配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）  配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５に示すヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、並びに
ｄ）  配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５に示すヌクレオチド配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
からなる群から選択される核酸配列を含む核酸分子。
【国際調査報告】
2009511018.tif 000016
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2009511018.tif 000019
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