(57)【要約】本発明は、とりわけ、癌を治療する方法、癌治療のための組成物、ならびに癌の診断および／または検出のための方法および組成物を提供する。特に、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２過剰発現に関連する癌の治療、診断、および検出のための組成物および方法を提供する。本発明の１つの態様では、ＡＭＩＧＯ−２インヒビターおよび１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物が提供され、このＡＭＩＧＯ−２インヒビターは、単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などである。
2009544287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者における癌または癌の症状を治療する方法であって、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターを該患者に投与する工程を含み、該ＡＭＩＧＯ−２インヒビターは、
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターがコントロールと比較してＡＭＩＧＯ−２発現を少なくとも２０％阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターがコントロールと比較して少なくとも２０％の癌細胞の細胞死を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＥＣＤ中の１つまたは複数のエピトープに結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体またはＦａｂフラグメントが、本質的に配列番号２または配列番号３からなる配列中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲＮＴドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ１ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３０および配列番号５７からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ２ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３２、配列番号３９、および配列番号６１からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ３ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５６、および配列番号５８からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ４ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２６、配列番号３５、および配列番号４５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ５ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２５、配列番号２７、配列番号３６、および配列番号５３からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ６ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号６２からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲＣＴドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２８、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６２からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＩｇ  Ｖ−ｓｅｔドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＩｇドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＥＣＤ中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体またはＦａｂフラグメントが配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または膵臓癌を罹患しているか罹患しやすい、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が肺癌または結腸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体またはＦａｂフラグメントが、染色体安定性、腫瘍形成能、細胞増殖、細胞周期制御、癌細胞運動性、細胞接着、腫瘍形成、転移、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達、癌細胞生存、サイクリン産生、キナーゼ活性、基質リン酸化、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、腫瘍と間質組織との間の相互作用、および血管形成からなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２活性を阻害する、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体を標識する、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記標識が酵素、放射性同位体、毒素、またはフルオロフォアである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２以外のポリペプチドに対して約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、配列番号１７〜２４に記載の配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む第１のヌクレオチド鎖、および該第１の鎖と実質的に相補的な配列を含む第２のヌクレオチド鎖を含むｄｓＲＮＡ分子であり、該ｄｓＲＮＡ分子が３７６９ヌクレオチド長未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、配列番号７〜１６に記載の配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数の化学療法、放射線療法、または手術での前記患者の治療をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌の症状が、慢性咳、息切れの悪化、体重減少、過度の疲労、疼痛、喀血、血尿、無食欲、重度の発汗（ｈｅａｖｙ  ｓｗｅａｔｉｎｇ）、発熱、高血圧、貧血、下痢、便秘、血便、黄疸、めまい、脱力、悪寒、筋痙攣、深静脈血栓症、腹部膨隆、膨満感（ｂｌｏａｔｉｎｇ）、月経不順、結腸転移、肺転移、膀胱転移、腎臓転移、乳房転移、子宮転移、卵巣転移、および膵臓転移からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
患者のＡＭＩＧＯ−２活性を調整する方法であって、該ＡＭＩＧＯ−２活性を調整するのに有効な量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターを該患者に投与する工程を含み、該ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択される、方法。
【請求項３０】
前記ＡＭＩＧＯ−２活性が、染色体安定性、腫瘍形成能、細胞増殖、細胞周期制御、癌細胞運動性、細胞接着、腫瘍形成、転移、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達、ＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーの調整、癌細胞生存、サイクリン産生、キナーゼ活性、基質リン酸化、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、腫瘍と間質組織との間の相互作用、および血管形成からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示す患者を同定する方法であって、
（ａ）サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現の証拠の存在または非存在を検出する工程であって、該サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現の証拠の存在が、ＡＭＩＧＯ−２療法の候補である患者を示し、該サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現の証拠の非存在がＡＭＩＧＯ−２療法の候補ではない患者を示す、工程、
（ｂ）該患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補である場合、治療有効量の以下、すなわち
（１）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択される、ＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（２）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（３）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（４）小分子、
（５）模倣物、
（６）可溶性受容体、ならびに
（７）デコイ
からなる群より選択されるインヒビターを該患者に投与する工程、
（ｃ）該患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補でない場合、該患者に伝統的な癌療法薬を投与する工程
を含む、方法。
【請求項３３】
前記ＡＭＩＧＯ−２発現がコントロールと比較して少なくとも２０％増加する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＡＭＩＧＯ−２発現の証拠をＡＭＩＧＯ−２ＲＮＡレベルの測定によって検出する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ＡＭＩＧＯ−２発現の証拠をＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドレベルの測定によって検出する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が、１つまたは複数の肺癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または膵臓癌を罹患しているか罹患しやすい、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
癌細胞の成長を阻害する方法であって、該癌細胞を、コントロールと比較して少なくとも２０％該細胞の成長を阻害するのに有効な量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程を含み、該インヒビターが、
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択される、方法。
【請求項３８】
前記癌細胞が癌患者中に存在するか該癌患者に由来する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
阻害する必要のある患者における癌細胞表現型を阻害する方法であって、該方法は、治療有効量の以下、すなわち
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２インヒビターを該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
前記癌細胞表現型が、１つまたは複数の、コラーゲン中の細胞運動性、腫瘍形成能、足場非依存性様式で成長する能力、細胞生存、または細胞接着である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌細胞が、肺癌細胞、膀胱癌細胞、腎臓癌細胞、結腸癌細胞、乳癌細胞、子宮癌細胞、卵巣癌細胞、および膵臓癌細胞からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
癌細胞の成長を阻害する方法であって、ＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞を含む癌を有する患者に１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーを調整する化合物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４４】
前記１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーが、ｃ−ＭＹＣ、ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＬ１、および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＥＲＫがリン酸化ＥＲＫである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
患者中の腫瘍を検出するための方法であって、画像化剤に連結したＡＭＩＧＯ−２インヒビターを含む組成物を該患者に投与する工程、および該患者中の該画像化剤の局在化を検出する工程を含み、該インヒビターが、
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択される、方法。
【請求項４７】
前記組成物が、画像化剤に抱合したＡＭＩＧＯ−２抗体を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記画像化剤が、１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、または２０６Ｂｉである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
癌インヒビターを同定する方法であって、該癌はコントロールと比較したＡＭＩＧＯ−２の過剰発現によって特徴づけられ、該方法は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、およびＡＭＩＧＯ−２活性が調整されるかどうかを決定する工程を含み、該ＡＭＩＧＯ−２活性の調整が癌インヒビターを示す、方法。
【請求項５０】
前記候補化合物が、癌細胞中のＡＭＩＧＯ−２活性を調整するが、非癌細胞中では調整しない、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
癌インヒビターを同定する方法であって、該癌はコントロールと比較したＡＭＩＧＯ−２の過剰発現によって特徴づけられ、該方法は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を候補化合物およびＡＭＩＧＯ−２リガンドと接触させる工程、およびＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーの活性が調整されるかどうかを決定する工程を含み、該下流マーカーの調整が癌インヒビターを示す、方法。
【請求項５２】
前記下流マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＬ１、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）の発現の減少からなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記下流マーカーの活性が、ＥＲＫリン酸化の減少またはＥＲＫ発現の減少である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記下流マーカーの活性がＰＡＲＰ１切断の増加である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記候補化合物およびＡＭＩＧＯ−２リガンドが、癌細胞中のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーの調整を誘導するが、非癌細胞では誘導しない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
細胞毒性薬剤または診断薬剤を、ＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞に送達させる方法であって、該方法は、
（ａ）ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する精製抗体に抱合した該細胞毒性薬剤または該診断薬剤を提供する工程であって、該エピトープがシグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるドメイン中に存在する、工程、および
（ｂ）該細胞を該抗体-薬剤抱合体または該フラグメント-薬剤抱合体に曝露する工程を含む、方法。
【請求項５７】
癌患者を治療する方法であって、該方法は、
該患者由来の癌サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現をコントロールサンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現と比較する工程、
（１）ＡＭＩＧＯ−２発現が該コントロールサンプルと比較して該癌サンプル中で上方制御される場合、該患者を以下、すなわち
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択されるインヒビターを含む組成物で処置する工程、および
（２）ＡＭＩＧＯ−２発現が該コントロールサンプルと比較して該癌サンプル中で不変であるか下方制御される場合、二次アッセイを行う工程、
を含む、方法。
【請求項５８】
前記二次アッセイが、インヒビターの存在下および非存在下での前記癌サンプル中のＡＭＩＧＯ−２下流マーカーのレベルまたは活性を比較する工程を含み、
（１）ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの存在下での該癌サンプル中の該ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーのレベルまたは活性が該ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの非存在下での該癌サンプル中の該ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーのレベルまたは活性と比較して減少する場合、該患者を、以下、すなわち
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択されるインヒビターを含む組成物で処置するか、
（２）ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの存在下での該癌サンプル中の該ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーのレベルまたは活性が該ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの非存在下での該癌サンプル中の該ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーのレベルまたは活性と比較して不変であるか減少する場合、該患者を伝統的な癌療法薬で処置する工程
を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＬ１、ＶＥＧＦ、ウロキナーゼ、およびＥＲＫからなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記下流マーカーの活性が、ＥＲＫリン酸化またはＥＲＫ発現である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記下流ＡＭＩＧＯ−２マーカーの活性が減少する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記二次アッセイが、インヒビターの存在下および非存在下での前記癌サンプル中のＰＡＲＰ１切断を比較する工程を含み、
（ａ）ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの存在下での該癌サンプル中のＰＡＲＰ１切断が、該ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの非存在下での該癌サンプル中のＰＡＲＰ１切断と比較して増加する場合、前記患者を、以下、すなわち
（１）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体；
（２）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（３）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（４）小分子、
（５）模倣物、
（６）可溶性受容体、ならびに
（７）デコイ
からなる群より選択されるインヒビターを含む組成物で処置するか、
（ｂ）ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの存在下での該癌サンプル中のＰＡＲＰ１切断が、該ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの非存在下での該癌サンプル中のＰＡＲＰ１切断と比較して増加するか不変である場合、該患者を伝統的な癌療法薬で処置する工程
を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
患者の癌を診断する方法であって、候補癌細胞中のＡＭＩＧＯ−２局在化をアッセイする工程を含み、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の、細胞膜を含まない該癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２に対する比が少なくとも２：１である場合、該患者はＡＭＩＧＯ−２関連癌を有すると診断する、方法。
【請求項６４】
前記細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の、細胞膜を含まない前記癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２に対する比が少なくとも３：１である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を有すると診断される場合、
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択されるインヒビターを含む組成物を該患者に投与する工程をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを同定する方法であって、候補化合物の存在下および非存在下でＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞を含むサンプルにおいてＡＭＩＧＯ−２のリン酸化を比較する工程を含み、該候補化合物の非存在下での該サンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化と比較した該候補化合物の存在下での該サンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化の調整が、該候補化合物がＡＭＩＧＯ−２モジュレーターであることを示す、方法。
【請求項６７】
ＡＭＩＧＯ−２を、免疫沈降抗体を使用して前記サンプルから単離する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫沈降抗体はＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体であり、該エピトープが、シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるドメイン中に存在する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＡＭＩＧＯ−２リン酸化がセリン／トレオニンリン酸化である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＡＭＩＧＯ−２リン酸化を、ホスホセリン／トレオニン抗体を使用して決定する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫沈降抗体がホスホセリン／トレオニン抗体である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
ＡＭＩＧＯ−２インヒビターおよび１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物であって、該ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、
（ａ）シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、
（ｂ）配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、
（ｃ）単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、
（ｄ）小分子、
（ｅ）模倣物、
（ｆ）可溶性受容体、ならびに
（ｇ）デコイ
からなる群より選択される、組成物。
【請求項７３】
前記組成物が、染色体安定性、腫瘍形成能、細胞増殖、細胞周期制御、癌細胞運動性、細胞接着、腫瘍形成、転移、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達、癌細胞生存、サイクリン産生、キナーゼ活性、基質リン酸化、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、腫瘍と間質組織との間の相互作用、および血管形成からなる群より選択される少なくとも１つのＡＭＩＧＯ−２活性を阻害する、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記組成物が、癌細胞中の少なくとも１つの細胞表現型を誘導するが、非癌細胞では誘導しない、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７５】
前記組成物が癌細胞生存を阻害するか、該組成物がＡＭＩＧＯ−２の細胞質リン酸化を阻害するか、血管形成または細胞増殖、セリン／トレオニンキナーゼ活性を阻害するか、Ｅｒｋリン酸化を阻害するか、ｃＪｕｎ、ｃＭｙｃ、またはＦｏｓＬ１発現を阻害するか、細胞周期のＧ２／Ｍ期への細胞分裂の進行を阻害する、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７６】
前記組成物が滅菌注射液である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターがＡＭＩＧＯ−２翻訳を阻害するか、ＡＭＩＧＯ−２  ｍＲＮＡ分解を誘導する、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７９】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲＮＴドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ１ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３０および配列番号５７からなる群より選択される、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８１】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ２ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３２、配列番号３９、および配列番号６１からなる群より選択される、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８２】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ３ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５６、および配列番号５８からなる群より選択される、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８３】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ４ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２６、配列番号３５、および配列番号４５からなる群より選択される、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８４】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ５ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２５、配列番号２７、配列番号３６、および配列番号５３からなる群より選択される、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８５】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ６ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号６２からなる群より選択される、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８６】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ−ＣＴドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２８、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６２からなる群より選択される、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８７】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＩｇ  Ｖ−ｓｅｔドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８８】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２のＩｇドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８９】
前記抗体またはＦａｂフラグメントがＡＭＩＧＯ−２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記抗体またはＦａｂフラグメントが、本質的に配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される配列からなる配列中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記抗体またはＦａｂフラグメントが、本質的に配列番号２または配列番号３からなる配列中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９２】
前記抗体またはＦａｂフラグメントが、少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＡＭＩＧＯ−２に結合する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項９３】
前記ＡＭＩＧＯ−２活性が、染色体安定性、腫瘍形成能、細胞増殖、細胞周期制御、癌細胞運動性、細胞接着、腫瘍形成、転移、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達、癌細胞生存、サイクリン産生、キナーゼ活性、基質リン酸化、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、腫瘍と間質組織との間の相互作用、および血管形成からなる群より選択される、請求項７２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記抗体またはＦａｂフラグメントが、癌細胞生存、ＡＭＩＧＯ−２の細胞質リン酸化、またはＥｒｋリン酸化を阻害する、請求項７２に記載の組成物。
【請求項９５】
前記組成物が、ｃＪｕｎ、ｃＭｙｃ、またはＦｏｓＬ１の発現を阻害する、請求項７２に記載の組成物。
【請求項９６】
前記組成物が、細胞周期のＧ２／Ｍ期への細胞分裂の進行を阻害する、請求項７２に記載の組成物。
【請求項９７】
前記ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、配列番号１７〜２４からなる群より選択される配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む第１のヌクレオチド鎖および該第１の鎖と実質的に相補的な配列を含む第２のヌクレオチド鎖を含むｄｓＲＮＡ分子であり、該ｄｓＲＮＡ分子が３７６９ヌクレオチド長未満である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項９８】
前記ｄｓＲＮＡがコントロールと比較してＡＭＩＧＯ−２翻訳を少なくとも２０％阻害する、請求項９７に記載の組成物。
【請求項９９】
ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する精製抗体であって、該エピトープが、シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるドメイン中に存在する、精製抗体。
【請求項１００】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ１ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３０および配列番号５７からなる群より選択される、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０１】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ２ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３２、配列番号３９、および配列番号６１からなる群より選択される、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０２】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ３ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５６、および配列番号５８からなる群より選択される、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０３】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ４ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２６、配列番号３５、および配列番号４５からなる群より選択される、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０４】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ５ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２５、配列番号２７、配列番号３６、および配列番号５３からなる群より選択される、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０５】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ６ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号６２からなる群より選択される、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０６】
前記抗体が、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲＣＴドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号２８、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６２からなる群より選択される、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０７】
前記抗体が、配列番号２５〜６２からなる群より選択される１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１０８】
前記抗体が、本質的に配列番号２または配列番号３からなる配列中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する、請求項１１９に記載の精製抗体。
【請求項１０９】
前記抗体が、染色体安定性、腫瘍形成能、細胞増殖、細胞周期制御、癌細胞運動性、細胞接着、腫瘍形成、転移、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達、癌細胞生存、サイクリン産生、キナーゼ活性、基質リン酸化、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、腫瘍と間質組織との間の相互作用、および血管形成からなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２活性を阻害する、請求項９９に記載の精製抗体。
【請求項１１０】
ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する精製抗体であって、該エピトープが配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される配列を含む、精製抗体。
【請求項１１１】
請求項９９に記載の抗体を産生する単離細胞。
【請求項１１２】
請求項９９に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１１３】
請求項９９に記載の抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１４】
配列番号２のポリペプチドの単離エピトープ保有フラグメントであって、該フラグメントが、配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される１つまたは複数のエピトープを含む、フラグメント。
【請求項１１５】
配列番号２の約６個と約２０個との間の連続するアミノ酸を含む、請求項１１４に記載のエピトープ保有フラグメント。
【請求項１１６】
配列番号２の少なくとも２１個の連続するアミノ酸および配列番号２の５２２個未満の連続するアミノ酸を含む、請求項１１４に記載のエピトープ保有フラグメント。
【請求項１１７】
請求項１１４に記載の単離エピトープ保有フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
請求項１１４に記載のエピトープ保有フラグメントでの被験体の免疫化によって得られる精製ＡＭＩＧＯ−２抗体。
【請求項１１９】
配列番号１７〜２４に記載の配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む第１のヌクレオチド鎖および該第１の鎖と実質的に相補的な配列を含む第２のヌクレオチド鎖を含む単離ｄｓＲＮＡ分子であって、該ｄｓＲＮＡ分子が３７６９ヌクレオチド長未満である、単離ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１２０】
前記第２のヌクレオチド鎖が前記第１の鎖に完全に相補的な配列を含み、前記ｄｓＲＮＡ分子が３７６９ヌクレオチド長未満である、請求項１１９に記載の単離ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１２１】
配列番号７〜１６に記載の配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、腫瘍学分野に関する。より具体的には、本発明は、癌の治療方法、癌治療のための組成物、ならびに癌の診断および／または検出のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、合衆国における死亡原因の第２位である。「癌」を使用して、多数の異なる癌型（すなわち、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌）を説明するが、各癌型は表現型レベルおよび遺伝子レベルの両方において異なる。癌に特徴的な無秩序な成長は、１つまたは複数の遺伝子の発現が変異によって無調節になる場合に起こり、細胞成長をもはや制御することができない。
【０００３】
遺伝子は、しばしば、２つのクラス（癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子）に分類される。癌遺伝子は、その通常の機能は細胞成長を促進することであるが、特定の条件下のみでこれが起こる遺伝子である。癌遺伝子が変異を獲得し、その後制御されなくなる場合、癌遺伝子は全ての条件下で成長を促進する。しかし、癌が真に成立するためには癌が腫瘍抑制遺伝子の変異も獲得しなければならないことが見出されている。腫瘍抑制因子の通常の機能は、細胞成長を停止させることである。腫瘍抑制因子の例には、ｐ５３，ｐｌ６，ｐ２１，およびＡＰＣが含まれ、その全てが正常に作用する場合、細胞が分裂して無秩序に成長するのを停止させる。腫瘍抑制因子が変異するか喪失し、細胞成長の抑制も喪失する場合、細胞は直ちに無制限に成長する。
【０００４】
ＡＭＩＧＯ−２（Ａｌｉｖｍ１およびＤＥＧＡとしても公知）は、ＡＭＩＧＯ（アンフォテリン誘導性遺伝子およびＯＲＦ）ファミリーのメンバーである（非特許文献１）。ＡＭＩＧＯファミリーは細胞運動性に関与し、ファミリーメンバーは同種親和性相互作用およびヘテロ親和性相互作用の両方を有する。ＡＭＩＧＯ−２はまた、アポトーシスを阻害し、ニューロンの生存を促進する（非特許文献２）。ＡＭＩＧＯ−２は、胃癌で上方制御され（非特許文献３）、ＡＭＩＧＯ−２の安定な阻害により、腫瘍細胞の染色体安定性、移動、および成長を阻害することができる。
【０００５】
しかし、今日まで、癌ならびに他の疾患および障害におけるＡＭＩＧＯ−２の役割は完全に解明されていなかった。したがって、ＡＭＩＧＯ−２を調整する組成物および方法を同定する必要がある。本発明は、これらおよび他の重要なニーズに関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｕｊａ−Ｐａｎｕｌａら、ＪＣＢ（２００３）１６０  ９６３
【非特許文献２】Ｏｎｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００３）２３  ５８８７
【非特許文献３】Ｒａｂｅｎａｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３  ５０５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
いくつかの態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターおよび１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【０００８】
１つの態様では、ＡＭＩＧＯ−２インヒビターおよび１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物であって、ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが、単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲｌドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、またはデコイである、組成物を特徴とする。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する精製抗体であって、エピトープが、シグナルペプチドドメイン、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲｌドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、またはＩｇドメイン中に存在する、精製抗体を特徴とする。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体を産生する単離細胞であって、エピトープが、シグナルペプチドドメイン、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲｌドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、またはＩｇドメイン中に存在する、単離細胞を特徴とする。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマであって、エピトープが、シグナルペプチドドメイン、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲｌドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、またはＩｇドメイン中に存在する、ハイブリドーマを特徴とする。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物であって、エピトープが、シグナルペプチドドメイン、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、またはＩｇドメイン中に存在する、非ヒトトランスジェニック動物を特徴とする。
【００１３】
別の態様では、本発明は、配列番号２のポリペプチドの単離エピトープ保有フラグメントであって、フラグメントが、配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される１つまたは複数のエピトープを含む、フラグメントを特徴とする。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、配列番号２のポリペプチドの単離エピトープ保有フラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、フラグメントが、配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される１つまたは複数のエピトープを含む、ポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１５】
さらに別の態様では、配列番号２のポリペプチドのエピトープ保有フラグメントでの被験体の免疫化によって得られる精製ＡＭＩＧＯ−２抗体であって、フラグメントが、配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される１つまたは複数のエピトープを含む、精製ＡＭＩＧＯ−２抗体を特徴とする。
【００１６】
別の態様では、本発明は、配列番号１７〜２４に記載の配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む第１のヌクレオチド鎖および第１の鎖と実質的に相補的な配列を含む第２のヌクレオチド鎖を含む単離ｄｓＲＮＡ分子であって、ｄｓＲＮＡ分子が３７６９ヌクレオチド長未満である、単離ｄｓＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、配列番号１７〜２４に記載の配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む第１のヌクレオチド鎖および第１の鎖と完全に相補的な配列を含む第２のヌクレオチド鎖を含む単離ｄｓＲＮＡ分子であって、ｄｓＲＮＡ分子が３７６９ヌクレオチド長未満である、単離ｄｓＲＮＡ分子を特徴とする。
【００１８】
別の態様では、本発明は、配列番号７〜１６に記載の配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離核酸を特徴とする。
【００１９】
別の態様では、本発明は、治療を必要とする患者における癌または癌の症状を治療する方法であって、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターを患者に投与する工程を含み、インヒビターは、単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド、シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲ１ドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、およびデコイである、方法を特徴とする。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、患者のＡＭＩＧＯ−２活性を調整する方法であって、ＡＭＩＧＯ−２活性を調整するのに有効な量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターを患者に投与する工程を含む、方法を特徴とする。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示す患者を同定する方法であって、（ａ）サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現の証拠の存在または非存在を検出する工程であって、サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現の証拠の存在が、ＡＭＩＧＯ−２療法の候補である患者を示し、サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現の証拠の非存在がＡＭＩＧＯ−２療法の候補ではない患者を示す、検出する工程、（ｂ）患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補である場合、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターを含む組成物を患者に投与する工程、（ｃ）患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補でない場合、患者に伝統的な癌療法薬を投与する工程を含む、方法を特徴とする。
【００２２】
別の態様では、本発明は、癌細胞をコントロールと比較して少なくとも２０％細胞の成長を阻害するのに有効な量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程を含む、癌細胞の成長を阻害する方法を特徴とする。
【００２３】
別の態様では、本発明は、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターを患者に投与する工程を含む、阻害する必要のある患者において癌細胞表現型を阻害する方法を特徴とする。
【００２４】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞を含む癌を有する患者に１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーを調整する化合物を投与する工程を含む癌細胞の成長を阻害する方法を特徴とする。１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーは、ｃ−ＭＹＣ、ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＬ１、および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）であり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の下流マーカーの調整が、１つまたは複数の下流マーカーの発現の阻害（例えば、タンパク質またはｍＲＮＡ発現の阻害）であり得る。いくつかの実施形態では、調整には、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーの活性阻害も含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＥＲＫの調整には、ＥＲＫのリン酸化の調整が含まれる。いくつかの実施形態では、ＥＲＫの調整には、１つまたは複数のＥＲＫ基質に対するＥＲＫキナーゼ活性の調整が含まれる。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、画像化剤に連結したＡＭＩＧＯ−２インヒビターを含む組成物を患者に投与する工程、および該患者中の該画像化剤の局在化を検出する工程を含む、患者中の腫瘍を検出する方法を特徴とする。
【００２６】
別の態様では、本発明は、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２インヒビターを患者に投与する工程を含む、患者の２つまたはそれを超える細胞の相互作用を阻害する方法を特徴とする。
【００２７】
別の態様では、本発明は、細胞中でＡＭＩＧＯ−２抗体を発現させる方法であって、ＡＭＩＧＯ−２抗体が、配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択される配列を含むエピトープに特異的に結合する、方法を特徴とする。本方法は、細胞中でＡＭＩＧＯ−２抗体をコードする核酸を発現する工程を含む。
【００２８】
別の態様では、本発明は、癌インヒビターを同定する方法であって、癌がコントロールと比較してＡＭＩＧＯ−２の過剰発現によって特徴づけられる、方法を特徴とする。本方法は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、およびＡＭＩＧＯ−２活性が調整されるかどうかを決定する工程を含み、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整が癌インヒビターを示す。
【００２９】
別の態様では、本発明は、癌インヒビターを同定する方法であって、癌がコントロールと比較したＡＭＩＧＯ−２の過剰発現によって特徴づけられる、方法を特徴とする。本方法は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を候補化合物およびＡＭＩＧＯ−２リガンドと接触させる工程、およびＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーの活性が調整されるかどうかを決定する工程を含み、下流マーカーの調整が癌インヒビターを示す。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２インヒビターに対する患者の感受性を決定する方法であって、患者の癌サンプル中のＡＭＩＧＯ−２の差分発現の証拠を検出する工程を含み、ＡＭＩＧＯ−２の差分発現の証拠がＡＭＩＧＯ−２インヒビターに対する患者の感受性を示す、方法を特徴とする。
【００３１】
別の態様では、本発明は、サンプルからＡＭＩＧＯ−２タンパク質を精製する方法であって、（ａ）固体支持体に結合した抗ＡＭＩＧＯ−２抗体を含むアフィニティマトリックスを準備する工程、（ｂ）サンプルをアフィニティマトリックスと接触させて、アフィニティマトリックス−ＡＭＩＧＯ−２タンパク質複合体を形成する工程、（ｃ）アフィニティマトリックスＡＭＩＧＯ−２タンパク質複合体をサンプルの残りから分離する工程、および（ｄ）アフィニティマトリックスからＡＭＩＧＯ−２タンパク質を放出させる工程を含む、方法を特徴とする。
【００３２】
別の態様では、本発明は、細胞毒性薬剤または診断薬剤を、ＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞に送達させる方法を特徴とする。本方法は、（ａ）抗ＡＭＩＧＯ−２抗体またはそのフラグメントに抱合した細胞毒性薬剤または診断薬剤を提供する工程、および（ｂ）細胞を抗体-薬剤抱合体またはフラグメント-薬剤抱合体に曝露する工程を含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、候補ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの有効性を決定する方法であって、ＡＭＩＧＯ−２発現細胞を候補ＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させて、下流ＡＭＩＧＯ−２マーカーのレベルまたは活性が減少するかどうかを決定する工程を含み、下流マーカーのレベルまたは活性の減少が、候補ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが有効な抗癌薬であることを示す、方法を特徴とする。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、候補ＡＭＩＧＯ−２インヒビターの有効性を決定する方法であって、ＡＭＩＧＯ−２発現細胞を候補ＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させて、ＰＡＲＰ１切断が増加するかどうかを決定する工程を含み、ＰＡＲＰ１切断の増加は、候補ＡＭＩＧＯ−２インヒビターが有効な抗癌薬であることを示す、方法を特徴とする。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、癌がＡＭＩＧＯ−２関連癌であるかどうかを決定する方法であって、癌中のＡＭＩＧＯ−２発現をコントロール細胞中のＡＭＩＧＯ−２発現と比較する方法を含み、コントロール細胞と比較した癌細胞中の上方制御されたＡＭＩＧＯ−２発現は癌がＡＭＩＧＯ−２関連癌であることを示す、方法を特徴とする。
【００３６】
別の態様では、本発明は、癌がＡＭＩＧＯ−２関連癌であるかどうかを決定する方法であって、癌サンプルおよびコントロールサンプルをＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程および癌サンプルおよびコントロールサンプル中のＡＭＩＧＯ−２下流マーカーのレベルまたは活性を比較する工程を含み、コントロールサンプルと比較した癌サンプル中のＡＭＩＧＯ−２下流マーカーのレベルまたは活性の減少は癌がＡＭＩＧＯ−２関連癌であることを示す、方法を特徴とする。
【００３７】
別の態様では、本発明は、癌がＡＭＩＧＯ−２関連癌であるかどうかを決定する方法であって、癌サンプルおよびコントロールサンプルをＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程および癌サンプルおよびコントロールサンプル中のＰＡＲＰ１切断を比較する工程を含み、コントロールサンプルと比較した癌サンプル中のＰＡＲＰ１切断の増加は癌がＡＭＩＧＯ−２関連癌であることを示す、方法を特徴とする。
【００３８】
さらに別の態様では、本発明は、癌患者を治療する方法であって、癌がＡＭＩＧＯ−２関連癌であるかどうかを決定する工程、患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を有する場合にＡＭＩＧＯ−２インヒビターを含む組成物を患者に投与する工程、および患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を持たない場合に伝統的な癌治療薬を患者に投与する工程を含む、方法を特徴とする。
【００３９】
別の態様では、本発明は、癌患者を治療する方法であって、患者由来の癌サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現をコントロールサンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現と比較し、（１）癌サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現がコントロールサンプルと比較して上方制御される場合にＡＭＩＧＯ−２インヒビターを含む組成物で患者を処置し、（２）癌サンプル中のＡＭＩＧＯ−２発現がコントロールサンプルと比較して不変であるか下方制御される場合に二次アッセイを行う工程を含む、方法を特徴とする。
【００４０】
別の態様では、本発明は、患者の癌を診断する方法であって、候補癌細胞中のＡＭＩＧＯ−２局在化をアッセイする工程を含み、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の、細胞膜を含まない癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２に対する比が少なくとも２：１である場合、ＡＭＩＧＯ−２関連癌を有する患者であると診断する、方法を特徴とする。
【００４１】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を含むサンプル中のＡＭＩＧＯ−２活性の調整を検出する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）サンプルを、ＡＭＩＧＯ−２活性を調整するのに十分な時間ＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程、（ｂ）抗ＡＭＩＧＯ−２抗体でＡＭＩＧＯ−２を免疫沈降する工程、および（ｃ）ホスホ−セリン／トレオニン抗体を使用してサンプル中のＡＭＩＧＯ−２セリン／トレオニンリン酸化をコントロールと比較する工程を含む、方法を特徴とする。コントロールと比較したサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のセリン／トレオニンリン酸化の変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。
【００４２】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を含むサンプル中のＡＭＩＧＯ−２活性の調整を検出する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）サンプル中のＡＭＩＧＯ−２を、ＡＭＩＧＯ−２活性を調整するのに十分な時間過剰発現する工程、（ｂ）抗ＡＭＩＧＯ−２抗体でＡＭＩＧＯ−２を免疫沈降する工程、および（ｃ）ホスホ−セリン／トレオニン抗体を使用してサンプル中のＡＭＩＧＯ−２セリン／トレオニンリン酸化をコントロールと比較する工程を含む。コントロールと比較したサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のセリン／トレオニンリン酸化の変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。
【００４３】
さらに別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を含むサンプル中のＡＭＩＧＯ−２活性の調整を検出する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）サンプルを、ＡＭＩＧＯ−２活性を調整するのに十分な時間ＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程、（ｂ）抗ホスホ−セリン／トレオニン抗体でＡＭＩＧＯ−２を免疫沈降する工程、および（ｃ）抗ＡＭＩＧＯ−２抗体を使用してサンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルをコントロールと比較する工程を含む、方法を特徴とする。コントロールと比較したサンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルの変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。
【００４４】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を含むサンプル中のＡＭＩＧＯ−２活性の調整を検出する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）ＡＭＩＧＯ−２活性を調整するのに十分な時間サンプル中のＡＭＩＧＯ−２を過剰発現する工程、（ｂ）抗ホスホ−セリン／トレオニン抗体でＡＭＩＧＯ−２を免疫沈降する工程、および（ｃ）抗ＡＭＩＧＯ−２抗体を使用してサンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルをコントロールと比較する工程を含む。コントロールと比較したサンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルの変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。
【００４５】
別の態様では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを同定する方法であって、候補化合物の存在下および非存在下でＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞を含むサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化を比較する工程を含み、候補化合物の非存在下でのサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化と比較した候補化合物の存在下でのサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化の調整は、候補化合物がＡＭＩＧＯ−２モジュレーターであることを示す、方法。
【００４６】
本発明のこれらおよび他の態様は、発明の詳細な説明中で解明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ））オリゴヌクレオチドアレイから作成した遺伝子発現データ（図１Ａ）および組織内で合成したｃＤＮＡマイクロアレイ（図１Ｂ）を示す。
【図２】正常組織ならびに結腸、乳房、および前立腺の組織サンプル中の相対ＡＭＩＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルのグラフを示す。
【図３】癌組織および正常組織から単離したＡＭＩＧＯ−２  ｍＲＮＡ由来のオリゴヌクレオチドアレイデータ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２  ０  Ａｒｒａｙ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）のグラフを示す。正常組織型および癌組織型をｘ軸に沿って記載する。縦軸上の各スポットは１人の患者由来の組織サンプルを示し、縦軸上の各スポットの高さ（線形）はプローブ組の相対発現レベルを示す。黒丸は線形検出範囲内における発現レベルを有するサンプルを示す。白丸は、遺伝子がプローブ組の検出限度未満である場合のサンプルにおける遺伝子発現の上限を示す。白四角は、プローブ組が飽和した場合のサンプル中の遺伝子発現の下限を示す。
【図４】ｙ軸がｌｏｇ２ベースであること以外は、図３に示すグラフを示す。正常組織型および癌組織型を横軸に沿って記載する。癌組織名を「ｃ＿」の後に示し、正常組織名を「ｎ＿」の後に示す。「ｎｓ」は不特定の組織サブタイプを示す。
【図５】６つの異なる細胞株から単離したＡＭＩＧＯ−２タンパク質を示すウェスタンブロット分析を示す。相対半定量ＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｔレベルを４つの細胞株の名称の隣に括弧書きする。
【図６】ｓｉＲＮＡ投与後のＳＷ６２０細胞中のＡＭＩＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルのグラフを示す。ｙ軸は相対的スケールであり、数字は任意である。ＵＴ＝非トランスフェクション；Ｅｇ５＝ｓｉＲＮＡターゲティングＥｇ５（無関係の遺伝子）；ネガティブコントロール＝任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列；Ｃ３１５−１．２からＣ３１５−４．３はＡＭＩＧＯ−２  ｓｉＲＮＡのパネルである。
【図７Ａ】ｓｉＲＮＡ投与後のＣｏｌｏ３２０細胞中のＡＭＩＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルのグラフを示す。ｙ軸は相対スケールであり、数字は任意である。Ｅｇ５＝ｓｉＲＮＡターゲティングＥｇ５（無関係の遺伝子）；ネガティブコントロール＝任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列；Ｃ３１５−１．２およびＣ３１５−４．３はＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡである。
【図７Ｂ】ｓｉＲＮＡ投与後のＨＣＴ１１６細胞中のＡＭＩＧＯ−２  ｍＲＮＡレベルのグラフを示す。ｙ軸は相対スケールであり、数字は任意である。Ｅｇ５＝ｓｉＲＮＡターゲティングＥｇ５（無関係の遺伝子）；ネガティブコントロール＝任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列；Ｃ３１５−１．２およびＣ３１５−４．３はＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡである。
【図８Ａ】ＳＷ６２０細胞の細胞死に及ぼすＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡの影響のグラフを示す。「Ｐｏｓ．コントロール」は、Ｅｇ５  ｓｉＲＮＡターゲティングＥｇ５である。「Ｎｅｇ．コントロール」は、任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列である。ｙ軸は、発光レベルを示し、このレベルは死細胞数と比例する。
【図８Ｂ】ＭＲＣ９細胞の細胞死に及ぼすＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡの影響のグラフを示す。「Ｐｏｓ．コントロール」は、Ｅｇ５  ｓｉＲＮＡターゲティングＥｇ５である。「Ｎｅｇ．コントロール」は、任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列である。ｙ軸は、発光レベルを示し、このレベルは死細胞数と比例する。
【図９】ＡＧＳ細胞中のＡＭＩＧＯ−２、ＰＡＲＰ、Ｍ３０、およびチューブリンタンパク質の発現およびプロセシングに及ぼすＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡの影響を示すウェスタンブロットのパネルを示す。「Ｐｏｓ．コントロール」は、Ｅｇ５  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来の溶解物を示す。「Ｎｅｇ．コントロール」は、任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列でトランスフェクトした細胞由来の溶解物を示す。
【図１０Ａ】ＳＷ６２０細胞中のＡＭＩＧＯ−２、ＥＲＫ、ｃ−Ｍｙｃ、およびチューブリンタンパク質の発現およびプロセシングに及ぼすＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡの影響を示すウェスタンブロットのパネルを示す。ｐＥＲＫはリン酸化ＥＲＫタンパク質である。「Ｎｅｇ．コントロール」は、図９中に記載のものと同様である。
【図１０Ｂ】ＳＷ６２０細胞中ｃ−ＭＹＣ  ｍＲＮＡレベルに及ぼすＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡの影響のグラフを示す。「Ｐｏｓ．コントロール」は、Ｅｇ５  ｓｉＲＮＡターゲティングＥｇ５である。「Ｎｅｇ．コントロール」は、任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列である。ｙ軸は、ｑＰＣＲによって決定したｍＲＮＡの相対発現レベルを示す。
【図１１】ＡＧＳ細胞中のＡＭＩＧＯ−２、ＥＲＫ、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、およびチューブリンタンパク質の発現およびプロセシングに及ぼすＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡの影響を示すウェスタンブロットのパネルを示す。ｐＥＲＫはリン酸化ＥＲＫタンパク質である。「抗有糸分裂遺伝子」と呼ばれるレーンは、Ｅｇ５  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞由来の溶解物を示す。「Ｎｅｇ．コントロール」は、任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列でトランスフェクトした細胞由来の溶解物である。
【図１２】ｃＪｕｎ発現に及ぼすＡＭＩＧＯ−２調整の影響を示す。図１２Ａは、ｃＪｕｎがＡＭＩＧＯ−２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞中で下方制御されることを示すウェスタンブロットのパネルである。「ＵＴ」は非トランスフェクションコントロールサンプルを示し、「ＤｈａｒｍＮｅｇ」は任意の公知の遺伝子と相同でないネガティブコントロールｓｉＲＮＡ配列であり、Ｃ３１５−１．３ｓｉはＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡである。図１２Ｂは、ＡＭＩＧＯ−２で安定にトランスフェクトした細胞株中でｃＪｕｎ発現が上方制御されることを示すウェスタンブロットのパネルである。図１２Ｃは、アゴニスト抗ＡＭＩＧＯ−２抗体ＭＡＢ２０８０へのＡＧＳ細胞の曝露後のｃＪｕｎの上方制御を示すウェスタンブロットである。「ＩＳＯ」はアイソタイプコントロールを示す。
【図１３】ＡＧＳ細胞およびＳＷ６２０細胞におけるサイクリンＢ１およびｃＦｏｓＬ１発現に及ぼすＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの影響を示すウェスタンブロットのパネルを示す。「ＵＴ」は非トランスフェクションコントロールサンプルを示し、「ＤｈａｒｍＮｅｇ」は任意の公知の遺伝子と相同でないネガティブコントロールｓｉＲＮＡ配列であり、Ｃ３１５−１．３ｓｉおよびＣ３１５−４．３ｓｉはＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡである。
【図１４】ｃ−Ｍｙｃ発現に及ぼすＡＭＩＧＯ−２調整の影響を示す。図１４Ａおよび１４Ｂは、ＡＭＩＧＯ−２  ｓｉＲＮＡ  Ｃ３１５−１．３ｓｉおよびＣ３１５−４．３ｓｉへのＳＷ６２０細胞（図１４Ａ）およびＡＧＳ細胞（図１４Ｂ）の曝露後のｃ−Ｍｙｃの下方制御を示すウェスタンブロットのパネルである。「ＵＴ」は非トランスフェクション細胞培養物である。「Ｎｅｇ．」は、任意の公知の遺伝子と相同でないｓｉＲＮＡ配列でトランスフェクトしたサンプルを示す。「Ｅｇ５」は、ｓｉＲＮＡターゲティングＥｇ５でトランスフェクトしたサンプルを示す。図１４Ｃは、抗ＡＭＩＧＯ−２抗体  ＭＡＢ２０８０への細胞の曝露後のＳＷ６２０細胞およびＡＧＳ細胞の上方制御を示すウェスタンブロットを示す。
【図１５Ａ】ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターにより一致させて下方制御した遺伝子を示す。
【図１５Ｂ】ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターにより一致させて上方制御（図１５Ｂ）した遺伝子を示す。
【図１６】ＳＷ６２０細胞由来のホールセル溶解物中のｃＪＵＮ、ｃＦｏｓＬ１、およびチューブリンタンパク質に及ぼすＡＭＩＧＯ−２特異的抗体ＭＡＢ２０８０（Ａ）の影響を示すウェスタンブロットのパネルを示す（上の２つのパネル）。下のパネル中の一連のウェスタンブロットは、細胞中の総ＥＲＫと比較したＥＲＫのリン酸化（ｐＥＲＫ）に及ぼすＭＡＢ２０８０（Ａ）の影響を示す。「Ｉ」または「アイソタイプコントロール」は、非特異的マウスＩｇＧでのＳＷ６２０細胞の処置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
本願の発明者らは、とりわけ、ＡＭＩＧＯ−２がいくつかの癌（肺癌および結腸癌が含まれる）で過剰発現され、正常組織では発現が制限されることを発見した。驚いたことに、ＡＭＩＧＯ−２の阻害によって癌細胞生存が阻害される。さらに、ＡＭＩＧＯ−２の阻害によって下流マーカーレベル（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ｃ−Ｍｙｃ、ｃＪｕｎ、ＦｏｓＬ１、ＶＥＧＦ、ウロキナーゼ、またはＥＲＫ）が調整されることが見出された。したがって、本発明は、癌の治療、診断、および画像化、特に、ＡＭＩＧＯ−２関連癌の治療、診断、および画像化、ならびに異常なＡＭＩＧＯ−２発現に関連する他の疾患および障害の治療のための方法および組成物を提供する。本発明のこれらおよび他の態様を、本出願で提供する。
【００４９】
定義
本書類を通して種々の定義を使用する。ほとんどの用語は、当業者による用語に起因する意味を有する。本書類中の以下または他の場所のいずれかで具体的に定義された用語は、全体として本発明の文脈で提供された意味を有し、当業者によって典型的に理解される通りである。
【００５０】
本発明の実施には、他に示されない限り、当業者の範囲内の従来の化学的方法、生化学的方法、分子生物学的方法、免疫学的方法、および薬理学的方法を使用するであろう。かかる技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ  Ｍ  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）を参照のこと。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、他で明確に示さない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば、「抗体」の言及には、２つまたはそれを超えるかかる抗体の混合物が含まれる。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、値の＋／−３０％、＋／−２０％、＋／−１０％、または＋／−５％をいう。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、アリビン１（Ａｌｉｖｉｎ１）（ＡＬＩ１）およびＤＥＧＡとしても公知の用語「ＡＭＩＧＯ−２」は、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子をいう。ＡＭＩＧＯ−２のヌクレオチド配列を配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿１８１８４７）として示し、ＡＭＩＧＯ−２のアミノ酸配列を配列番号２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿１８１８４７）として示す。用語「ＡＭＩＧＯ−２」には、ホモログ（核酸およびアミノ酸の両方）も含まれる。いくつかの実施形態では、かかるＡＭＩＧＯ−２核酸およびアミノ酸は、未変性のＡＭＩＧＯ−２核酸またはアミノ酸の１つまたは複数の活性を保持する。
【００５４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合形態をいい、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されたか誘導体化されたアミノ酸、および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。この用語には、融合タンパク質が含まれ、非相同アミノ酸配列を有する融合タンパク質、非相同および相同なリーダー配列を有する融合物（Ｎ末端メチオニン残基を含むか含まない）、免疫学的にタグ化されたタンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
用語「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は交換可能に使用され、診断、治療、または療法を受けることが望まれる任意の被験体、特にヒトをいう。他の被験体には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、およびウマなどが含まれ得る。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「癌」は、原発性または転移性の癌をいう。用語「癌細胞」は、形質転換された細胞をいう。これらの細胞は癌患者から単離することができ、あるいはこれらの細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌性となるように形質転換された細胞であり得る。癌細胞は、多数のサンプル型（任意の組織または細胞培養株が含まれる）に由来し得る。いくつかの実施形態では、癌細胞は、過形成、腫瘍細胞、または新生物である。いくつかの実施形態では、癌細胞を、肺組織、膀胱組織、腎臓組織、結腸組織、乳房組織、子宮組織、卵巣組織、または膵臓組織から単離する。いくつかの実施形態では、癌細胞を、公的に利用可能な確立された細胞株から採取する。いくつかの実施形態では、癌細胞を、既存の患者サンプルまたは癌細胞を含むライブラリーから単離する。いくつかの実施形態では、癌細胞を単離し、次いで、異なる宿主（例えば、異種移植片）中に移植する。いくつかの実施形態では、癌細胞を移植し、ＳＣＩＤマウスモデル中で使用する。いくつかの実施形態では、癌細胞は、肺癌または結腸癌である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、胃癌以外の癌である。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換された」は、その子孫によって安定に遺伝する細胞の性質の任意の変化をいう。いくつかの実施形態では、「形質転換された」は、正常な細胞の癌性細胞（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｃｅｌｌ）（腫瘍を生じることができる細胞）への変化をいう。いくつかの実施形態では、形質転換細胞は不死化される。形質転換は、多数の要因（受容体リン酸化の非存在下での受容体の過剰発現、ウイルス感染、癌遺伝子および／もしくは腫瘍抑制遺伝子の変異、ならびに／または細胞の成長および／もしくは不死化特性を変化させる任意の他の技術が含まれる）に起因し得る。
【００５８】
「癌表現型」は、一般に、癌性細胞に特徴的な種々の生物学的現象のいずれかをいい、この現象は癌型によって変化し得る。癌表現型を、一般に、例えば、細胞の成長または増殖（例えば、無秩序な成長または増殖）、細胞周期の調節、細胞運動、細胞間相互作用、または転移などの異常によって同定する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「転移」は、癌の起源（例えば、原発性腫瘍）から離れた部位に広がった癌をいう。転移部位には、骨、リンパ節、肺、肝臓、および脳が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「血管形成」は、患者の血管の発達をいう。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「臨床エンドポイント」は、癌を示す測定可能な事象をいう。臨床エンドポイントには、最初の転移時期、その後の転移時期、転移物のサイズおよび／または数、腫瘍のサイズおよび／または数、腫瘍の位置、腫瘍の侵襲性、生活の質、および痛みなどが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、臨床エンドポイントを決定および測定する能力を有すると考えられる。臨床エンドポイントの測定方法は、当業者に公知である。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、患者由来の生体物質をいう。本発明によってアッセイされるサンプルは、任意の特定の型に制限されない。サンプルには、制限されない例として、単一の細胞、複数の細胞、組織、腫瘍、体液、生体分子、または任意の上記の上清もしくは抽出物が含まれる。例には、生検のために取り出した組織、切除中に取り出した組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜、および糞便のサンプルが含まれる。使用サンプルは、アッセイ形式、検出方法、およびアッセイされる組織、細胞、または抽出物の腫瘍の性質に基づいて変化するであろう。サンプルの調製方法は当該分野で周知であり、使用する方法に適合するサンプルが得られるように容易に適合することができる。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「生体分子」には、ポリペプチド、核酸、および糖類が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「調整」は、細胞の内部、外部、または表面上に存在する遺伝子、タンパク質、または任意の分子の質または量の変化をいう。変化は、分子の発現またはレベルの増加または減少であり得る。用語「調整する」には、生物学的機能／活性（細胞シグナル伝達活性、細胞周期の調節、キナーゼ活性、セリン／トレオニンキナーゼ活性、細胞間相互作用活性、倍数性に影響を及ぼす活性、染色体安定性、腫瘍形成能、細胞運動性、転移、癌細胞生存、癌細胞の成長、増殖、細胞周期を介した進行、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、細胞間相互作用（ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号  ＮＭ＿０２０７０３、配列番号６３に記載のアミノ酸）またはＡＭＩＧＯ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号  ＮＭ＿１９８７２２、配列番号６４に記載のアミノ酸配列）の一方または両方との間の相互作用が含まれる）、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、血管形成、神経の伸長、または細胞死が含まれるが、これらに限定されない）の質または量の変化も含まれる。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「モジュレーター」は、癌に関連する１つまたは複数の生理学的事象または生化学的事象を調整する組成物をいう。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、癌に関連する１つまたは複数の生物活性を阻害する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、小分子、抗体、模倣物、デコイ、またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、リガンド結合の遮断またはリガンド結合部位の競合によって作用する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、リガンド結合と無関係に作用する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、リガンド結合部位を競合しない。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、癌に関与する遺伝子産物の発現を遮断する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、癌に関与する２つまたはそれを超える生体分子の物理的相互作用を遮断する。いくつかの実施形態では、本発明のモジュレーターは、細胞シグナル伝達活性、細胞周期制御、キナーゼ活性、セリン／トレオニンキナーゼ活性、細胞間相互作用活性、倍数性に影響を及ぼす活性、染色体安定性、腫瘍形成能、細胞運動性、転移、癌細胞生存、癌細胞の成長、増殖、細胞周期を介した進行、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、細胞間相互作用（ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用が含まれる）、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、血管形成、または神経の伸長からなる群より選択される１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターはＡＭＩＧＯ−２発現を阻害する。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、細胞周期のＧ２／Ｍ期への分裂細胞の進行を阻害する。
【００６６】
「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現または産生された生体高分子産物である。遺伝子産物は、例えば、非スプライシングＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾ポリペプチド、スプライスバリアントポリペプチドなどであり得る。テンプレートとしてＲＮＡ遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡのｃＤＮＡ）を使用して作製される生体高分子産物もこの用語に含まれる。遺伝子産物を、酵素的、組換え的、化学的、または遺伝子が未変性である細胞内で作製することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物がタンパク質性である場合、遺伝子産物は生物活性を示す。いくつかの実施形態では、遺伝子産物が核酸である場合、遺伝子産物を、生物活性を示すタンパク質性遺伝子産物に翻訳することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「ＡＭＩＧＯ−２活性の調整」は、例えば、作用因子（ａｇｅｎｔ）のＡＭＩＧＯ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの相互作用、ＡＭＩＧＯ−２転写および／または翻訳の阻害（例えば、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子またはＡＭＩＧＯ−２遺伝子発現産物とのアンチセンスまたはｓｉＲＮＡの相互作用、ＡＭＩＧＯ−２発現を容易にする転写因子の調整による）などの結果であり得るＡＭＩＧＯ−２活性の増加または減少をいう。例えば、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整は、生物活性の増加または生物活性の減少をいう。ＡＭＩＧＯ−２活性の調整はまた、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２表現型の増加または減少をいう。ＡＭＩＧＯ−２活性を、手段（ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドレベルの評価またはＡＭＩＧＯ−２転写レベルの評価が含まれるが、これらに限定されない）によって評価することができる。ＡＭＩＧＯ−２活性の比較を、特に、ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーレベルの測定、染色体安定性の測定、キナーゼ活性の測定、腫瘍形成能の測定、転移の測定、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達の測定、ＡＭＩＧＯ−２媒介細胞接着の測定、ＡＭＩＧＯ−２媒介癌細胞アポトーシスの測定、ＥＲＫリン酸化の測定、癌細胞の成長の測定、腫瘍形成の測定、サイクリン産生の測定、細胞増殖の測定、癌細胞の成長の測定、足場非依存性増殖の測定、細胞周期制御の測定、神経ガイダンス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ）の測定、癌細胞運動性の測定、  ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化の測定、細胞間相互作用（ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用が含まれる）の測定、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベルの測定、血管形成の測定、および細胞死の測定によって行うこともできる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２活性の阻害は特に興味深い。本明細書中で使用される場合、用語「阻害する」は、活性または量の低減、減少、不活化、または下方制御をいう。例えば、本発明の文脈では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、１つまたは複数の腫瘍形成能、癌細胞運動性、細胞接着、転移、癌細胞生存、キナーゼ活性、増殖、足場非依存性増殖、癌細胞運動性、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、神経ガイダンス、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、リン酸化ＥＲＫレベル、および血管形成を阻害することができる。かかる活性の阻害は、コントロールと比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であり得る。当業者は、ＡＭＩＧＯ−２調整を測定する能力を有すると考えられる。例示的アッセイの非限定的な例を以下に示す。
【００６９】
したがって、本明細書中で使用される場合、用語「ＡＭＩＧＯ−２の阻害」は、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２媒介性生物活性の低減、減少、不活化、または下方制御をいう。「ＡＭＩＧＯ−２生物活性」の阻害は、例えば、腫瘍形成能、癌細胞運動性、細胞接着、転移、癌細胞生存、キナーゼ活性、増殖、足場非依存性増殖、癌細胞運動性、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、神経ガイダンス、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、リン酸化ＥＲＫレベル、または血管形成の低減、減少、不活化、または下方制御をいう。かかる活性の阻害は、コントロールと比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、活性化されてＡＭＩＧＯ−２活性が増加するＡＭＩＧＯ−２活性の調整は特に興味深い。ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、１つまたは複数の倍数性および細胞死を阻害することができる。ＡＭＩＧＯ−２活性の活性化、上方制御、または増加は、コントロールと比較して、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも５００％であり得る。例えば、細胞死を２００％増加させるＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを欠くコントロールと比較して、細胞死を２倍に増加させる。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「癌細胞における差分発現」および「癌細胞で差分発現されたポリヌクレオチド」は、本明細書中で交換可能に使用され、癌性でない同一細胞型の細胞と比較した場合に癌性細胞中で差分発現される遺伝子に相当するか対応するポリヌクレオチドをいう（例えば、ｍＲＮＡは、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％〜約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍またはそれを超えて異なる（例えば、より高いかより低い）レベルで見出される）。比較は、例えば、組織中の細胞型をある程度識別しうるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成または別のアッセイ方法を使用する場合、可能である。その組織供給源から取り出した細胞間またはｉｎ  ｓｉｔｕでの第１の細胞とその組織供給源から取り出した第２の細胞との間の比較も行うことができるか、別法として行うことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、正常細胞と比較して癌遺伝子中で上方制御される。
【００７２】
癌の少なくとも１つの症状が緩和、終結、遅延、または防止される場合、ＡＭＩＧＯ−２関連癌は、「阻害される」。本明細書中で使用される場合、癌の再発または転移が低減、遅延、遅滞、または防止される場合もまた、ＡＭＩＧＯ−２関連癌は「阻害される」。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、句「ＡＭＩＧＯ−２媒介性細胞接着を阻害する」は、少なくとも１つの細胞がＡＭＩＧＯ−２を差分発現する、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの存在下での細胞間接着の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２媒介性細胞接着を、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターによって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのＡＭＩＧＯ−２媒介性細胞接着と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。ＡＭＩＧＯ−２媒介性細胞接着を、例えば、目的の細胞の標識、これらの基質に接着する非標識細胞集団とのインキュベーション、および非接着集団から接着集団を分離するための洗浄によって比較することができる。この様式では、細胞接着を、基質上に保持された標識量の測定によって決定する。アッセイ系の例には、蛍光プローブ（カルセインＡＭ、ＣＦＭＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセタート）、５（６）−ＣＦＤＡ−ＳＥ  ［５−（および−６）−カルボキシフルオレセインジアセタート、スクシニミジルエステル］）での標識および蛍光プレートリーダーまたはフローサイトメトリーによる蛍光の測定が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、句「癌細胞の成長を阻害する」は、癌細胞がＡＭＩＧＯ−２を発現する、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの存在下での癌細胞の成長の減少、軽減、または根絶をいう。いくつかの実施形態では、細胞は、他の正常な細胞および／または他の癌細胞と比較して、ＡＭＩＧＯ−２を差分発現する。この文脈では、細胞の成長を、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターによって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下での癌細胞成長と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。癌細胞成長の比較を、例えば、ＭＴＴアッセイ（例えば、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＭＴＴ  細胞増殖アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ＢｒｄＵ組み込み（例えば、Ａｂｓｏｌｕｔｅ−Ｓ  ＳＢＩＰアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、細胞内ＡＴＰレベルの測定（例えば、ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）−Ｍ、１，０００アッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）またはＡＴＰ細胞生存アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）の使用）、ＤｉＯｃｌ８アッセイ、膜透過性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイ（例えば、Ｖｉｂｒａｎｔ細胞毒性アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、または細胞ＬＤＨ活性の測定を使用して行うことができる。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、句「腫瘍形成を阻害する」は、腫瘍がＡＭＩＧＯ−２を差分発現する細胞を含む、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの存在下での腫瘍形成の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、腫瘍形成を、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターによって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下での腫瘍形成と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、および１００％まで減少させることができる。腫瘍形成の比較を、例えば、細胞ベースのアッセイ（例えば、軟寒天中のコロニー形成）、典型的には目的の細胞の動物（例えば、胸腺欠損マウスまたはラット、照射したマウスまたはラット；免疫学的に特権を与えられた部位（脳、頬袋、または眼など）への接種、同系動物の接種）への注射に依存した腫瘍形成のｉｎ  ｖｉｖｏモデル、および定義した期間後の塊のサイズのモニタリングを使用して行うことができる。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、句「サイクリンＤ１を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性サイクリン産生の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２媒介性サイクリン産生を、阻害剤によって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのＡＭＩＧＯ−２媒介性サイクリン産生と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。サイクリン産生の比較を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングによるサイクリンｍＲＮＡレベルの測定、免疫ブロッティング、免疫沈降、またはＥＬＩＳＡによるサイクリンポリペプチドレベルの測定、機能アッセイ（例えば、ＣＤＫ、ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ２７  ＫＩＰ−１をターゲティングする抗体を使用したサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）などのサイクリン制御因子と複合体化したサイクリンレベルを測定するための同時免疫沈降アッセイが含まれる）の使用によって行うことができ、ＣＤＫによるサイクリンのリン酸化の測定を、放射性標識および免疫沈降分析またはＦＲＥＴベースの方法（例えば、ＣＤＫ／サイクリンＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））によってアッセイすることができる。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、句「サイクリンＢ１を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性サイクリン産生の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２媒介性サイクリン産生を、阻害剤によって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのＡＭＩＧＯ−２媒介性サイクリン産生と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。サイクリン産生の比較を、サイクリンＤ１についての上記の方法にしたがって行うことができる。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「ＦｏｓＬ１の阻害」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ＦｏｓＬ１産生の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ＦｏｓＬ１産生を、阻害剤によって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのＡＭＩＧＯ−２媒介性ＦｏｓＬ１産生と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。ＦｏｓＬ１産生の比較を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングによるＦｏｓＬ１  ｍＲＮＡレベルの測定、免疫ブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、または免疫組織化学によるＦｏｓＬ１ポリペプチドレベルの測定によって行うことができる。ＦｏｓＬ１発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）の適切な測定方法の例は、本発明の実施例中に示され、例えば、Ｍａｔｓｕｏら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２４  １８４−１８７およびＳａｈｉｎら、（２００５）Ｐａｎｃｒｅａｓ  ３０（２）１５８−１６７にも記載されている。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、「ｃ−Ｍｙｃの阻害」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ｃ−Ｍｙｃ産生の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ｃ−Ｍｙｃ産生を、阻害剤によって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのＡＭＩＧＯ−２媒介性ｃ−Ｍｙｃ産生と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。ｃ−Ｍｙｃ産生の比較を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングによるｃ−Ｍｙｃ  ｍＲＮＡレベルの測定、または免疫ブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、もしくは免疫組織化学によるｃ−Ｍｙｃポリペプチドレベルの測定によって行うことができる。あるいは、またはさらに、ｃ−Ｍｙｃを、例えば、ｃ−Ｍｙｃ転写因子が標的遺伝子の転写を促進する能力によって「機能的に」測定することができる。標的遺伝子は内因性遺伝子であり得るか、外因性導入遺伝子（すなわち、レポーター遺伝子）であり得る。標的遺伝子ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の測定を、本明細書に記載の任意の方法を使用して行うことができる。いくつかの例では、レポーター遺伝子は、測定可能な活性を有する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）または検出可能なタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）であり得る。ｃ−Ｍｙｃ発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）の適切な測定方法の例は、共に当該分野で公知であり、本発明の実施例に十分に記載されている。レポーター遺伝子発現（特に、上記の酵素または検出可能なレポーター遺伝子）のモニタリング方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｃｚｉｅｐｌｕｃｈら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８（１０）２８３３−８に記載されている。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「ｃ−Ｊｕｎの阻害」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ｃ−Ｊｕｎ産生の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ｃ−Ｊｕｎ産生を、阻害剤によって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのＡＭＩＧＯ−２媒介性ｃ−Ｊｕｎ産生と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。ｃ−Ｊｕｎ産生の比較を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングによるｃ−Ｊｕｎ  ｍＲＮＡレベルの測定、または免疫ブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、もしくは免疫組織化学によるｃ−Ｊｕｎポリペプチドレベルの測定によって行うことができる。あるいは、またはさらに、ｃ−Ｊｕｎを、例えば、ｃ−Ｊｕｎ転写因子が標的遺伝子の転写を促進する能力によって「機能的に」測定することができる。標的遺伝子は内因性遺伝子であり得るか、外因性導入遺伝子（すなわち、レポーター遺伝子）であり得る。標的遺伝子ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の測定を、本明細書に記載の任意の方法を使用して行うことができる。ｃ−Ｊｕｎ発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）の適切な測定方法の例は、共に当該分野で公知であり、本発明の実施例に十分に記載されており、例えば、Ｋｈａｒｂａｎｄａら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０  ７９４７−７９５２  ａｎｄ  Ｋａｙａｈａｒａら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５（９）３７８４−３７９２にさらに記載されている。レポーター遺伝子発現（特に、上記の酵素または検出可能なレポーター遺伝子）のモニタリング方法は、当該分野で周知であり、上に記載されている。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、句「ＥＲＫリン酸化を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ＥＲＫリン酸化の減少、低減、または根絶をいう。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２媒介性ＥＲＫリン酸化を、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターによって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのＡＭＩＧＯ−２媒介性ＥＲＫリン酸化と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。ＥＲＫリン酸化の比較を、当業者に公知のリン酸化アッセイを使用して評価することができる。
【００８２】
いかなる特定の理論または作用機構にも制限されないが、ＥＲＫのリン酸化が一般にその活性化を誘導するので、句「ＥＲＫリン酸化を阻害する」は、いくつかの実施形態では、リン酸化ＥＲＫによる１つまたは複数のＥＲＫ基質のＡＭＩＧＯ−２媒介性リン酸化の減少、低減、または根絶をもいうことができる。ＥＲＫ基質には、ＩＥＸ−Ｉ、ＥＬＫｌ、パキシリン、Ｂｃｌ−２、ＳＯＳ、またはＳＰ１が含まれるが、これらに決して制限されない。ＥＲＫのその基質上のキナーゼ活性のモニタリング方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｍｅｃｈａｎｔら、（１９９９）ＢＢＲＣ  ２５４  ４５４−４６１；Ｃｈｅｍｉａｃｋら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９  ４７１７−４７２０；Ｃａｎｏら、（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０８  ３５９９−３６０９；Ｇａｒｃｉａら、（２００４）ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：５１５１−５１６３；およびＴａｍｕｒａら、（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５６９  ２４９−２５５に記載されている。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、句「癌細胞生存を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する癌細胞の生存の減少または低減をいう。いくつかの実施形態では、用語「癌細胞生存を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する癌細胞のアポトーシスへの影響をいう。いくつかの実施形態では、癌細胞は、他の正常細胞および／または他の癌細胞と比較してＡＭＩＧＯ−２を差分発現する。この文脈では、ＡＭＩＧＯ−２発現癌細胞の生存を、阻害剤によって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下でのおよび／または正常細胞での癌細胞生存と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで減少させることができる。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、句「ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流メンバーに及ぼすＡＭＩＧＯ−２の影響の減少、軽減、または根絶をいう。ＡＭＩＧＯ−２を含む細胞シグナルカスケードは、細胞の成長および生存を媒介する経路を含む。いくつかの実施形態では、細胞の成長および生存を媒介する経路は、活性化された成長因子経路（ＥＧＦＲ経路またはβ−カテニン経路など）の下流である。いくつかの実施形態では、経路は、とりわけ、β−カテニンを安定化させる変異β−カテニン経路である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達の阻害により、１つまたは複数の下流マーカーが上方制御される。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達の阻害により、１つまたは複数の下流マーカーが下方制御される。
【００８５】
ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達の阻害を、細胞シグナル伝達経路の下流メンバーのポリペプチドレベルまたはポリヌクレオチドレベルの測定によって決定することができる。当業者は、ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドレベルを測定する能力を有すると考えられる。当業者は、ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーレベルも測定することができる。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、句「細胞間相互作用を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する２つまたはそれを超える細胞の間の相互作用の低減または消失をいう。いくつかの実施形態では、細胞間の相互作用によって細胞シグナルが得られる。細胞間相互作用を、当業者に公知の多数の方法（同時培養し、例えば、異なる蛍光膜色素（ＰＫＨ２６およびＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）が含まれる）で事前に標識した細胞の間の膜交換の観察が含まれるが、これらに限定されない）によって検出することができる。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、句「増殖を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性増殖の低減または消失をいい、当業者に公知の多数の方法によって測定することができる。細胞増殖アッセイには、ＭＴＴアッセイ（例えば、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ＢｒｄＵ組み込みアッセイ（例えば、Ａｂｓｏｌｕｔｅ−Ｓ  ＳＢＩＰアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、細胞内ＡＴＰレベルの測定（アッセイの市販品には、ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）−Ｍ、１，０００アッセイキット（ＰｅｒｋｍＥｌｍｅｒ）およびＡＴＰ細胞生存アッセイキット（Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ））、ＤｉＯｃ１８アッセイ、膜透過性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイ（例えば、Ｖｉｂｒａｎｔ細胞毒性アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、細胞ＬＤＨ活性の測定、ならびに３Ｈ−チミジン組み込みおよび細胞力価Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、句「血管形成を阻害する」は、ＡＭＩＧＯ−２媒介性血管形成の低減または消失をいう。血管形成を、当業者に公知の多数の方法（細胞増殖アッセイ、細胞遊走アッセイ、細胞分化アッセイ、器官培養（ｅｘ  ｖｉｖｏ）アッセイ、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、角膜血管形成アッセイ、マトリゲルプラグアッセイ、およびＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、またはＣ５７ＢＬマウスにおける腫瘍容積アッセイが含まれるが、これらに限定されない）によって検出することができる。
【００８９】
細胞遊走アッセイには、ブラインドウェル走化性チャンバー（例えば、修飾ボイデンチャンバーアッセイ）およびファゴカイネティックトラックアッセイ（Ｐｈａｇｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｒａｃｋ  ａｓｓａｙ）が含まれるが、これらに限定されない。細胞分化アッセイには、コラーゲン、フィブリン凝塊、またはマトリゲル中での管形成およびその後の電子顕微鏡法が含まれるが、これらに限定されない。器官培養（ｅｘ  ｖｉｖｏ）アッセイには、ラット大動脈輪アッセイおよびニワトリ大動脈弓アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、句「細胞周期を介した進行を阻害する」は、細胞分裂の遅延または失速をいう。細胞周期の進行を、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）組み込みによってアッセイすることができる。かかるアッセイは、新規に合成されたＤＮＡへのＢＲＤＵの組み込みによってＤＮＡ合成を受けた細胞集団を同定する。次いで、新規に合成されたＤＮＡを、抗ＢＲＤＵ抗体（Ｈｏｓｈｉｎｏら、，１９８６，ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３８，３６９；Ｃａｍｐａｎａら、，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０７，７９）または他の手段を使用して検出することができる。細胞増殖を、ホスホ−ヒストンＨ３染色（ヒストンＨ３のリン酸化によって有糸分裂を受けた細胞集団を同定する）によってアッセイすることもできる。セリン１０でのヒストンＨ３のリン酸化を、ヒストンＨ３のセリン１０残基のリン酸化形態に特異的な抗体を使用して検出する（Ｃｈａｄｌｅｅ，Ｄ．Ｎ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７０  ２００９８−１０５）。細胞増殖を、［３Ｈ］−チミジン組み込みを使用して試験することもできる（Ｃｈｅｎ，Ｊ．，１９９６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：１３９５  ４０３；Ｊｅｏｕｎｇ，Ｊ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８３６７−７３）。このアッセイにより、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的特徴づけが可能になる。このアッセイでは、ＤＮＡを合成する細胞は、新規に合成されたＤＮＡに［３Ｈ］−チミジンを組み込みであろう。次いで、組み込みを、標準的な技術（シンチレーションカウンター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ  Ｓ  ３８００液体シンチレーションカウンター）中での放射性同位体の計数など）によって測定することができる。別の増殖アッセイは、色素アラマーブルー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）を使用する。この色素は生細胞中で還元された場合に蛍光を発し、細胞数が間接的に測定される（Ｖｏｙｔｉｋ−Ｈａｒｂｉｎ  ＳＬら、，１９９８，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ  ３４  ２３９−４６）。さらに別の増殖アッセイ（ＭＴＳアッセイ）は、工業用化学薬品のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性評価に基づき、可溶性テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）を使用する。ＭＴＳアッセイは市販されており、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ（カタログ番号Ｇ５４２１）が含まれる。細胞増殖を、軟寒天中のコロニー形成によってアッセイすることもできる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。細胞増殖を、代謝活性細胞の指標としてのＡＴＰレベルの測定によってアッセイすることもできる。かかるアッセイは、市販されており、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。細胞周期増殖を、フローサイトメトリーによってアッセイすることもできる（Ｇｒａｙ  Ｊ  Ｗら、（１９８６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｌａｔ  Ｓｔｕｄ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｍｅｄ  ４９  ２３７−５５）。細胞を、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで評価して細胞周期の異なる段階での細胞蓄積を測定することができる。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、「ＡＭＩＧＯ−２下流マーカー」は、正常または健常な組織におけるその発現レベルと比較した癌組織または癌細胞中の発現レベルの変化を示すか、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの存在下で適切に変化する遺伝子または活性である。いくつかの実施形態では、下流マーカーは、ＡＭＩＧＯ−２を本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターと撹乱した場合の発現レベルの変化を示す。ＡＭＩＧＯ−２下流マーカーには、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ｃ−Ｍｙｃ、ＶＥＧＦ、ウロキナーゼ、ｃｊｕｎ、ＦｏｓＬ１、またはＥＲＫが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＰ１の切断が、ＡＭＩＧＯ−２活性の下流マーカーである。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、句「癌細胞アポトーシスの増加」は、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの存在下でのＡＭＩＧＯ−２を発現する癌細胞のアポトーシスの増加をいう。この文脈では、癌細胞アポトーシスを、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターによって、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの非存在下での癌細胞アポトーシスと比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで増加させることができる。いくつかの実施形態では、癌細胞は、正常細胞および／または他の癌細胞と比較してＡＭＩＧＯ−２を差分発現する。癌細胞アポトーシスの比較を、例えば、ＤＮＡ断片化、カスパーゼ活性、ミトコンドリア膜電位の喪失、活性酸素種（ＲＯＳ）産生の増加、細胞内酸性化、クロマチン凝縮、細胞表面上のホスファチジルセリン（ＰＳ）レベル、および細胞膜透過性の増加の測定によって行うことができる。
【００９３】
ＤＮＡ断片化を、例えば、ＴＵＮＥＬアッセイ（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）を使用して測定することができる。市販のアッセイバージョンは、広範に利用可能な、例えば、ＡＰＯ−ＢｒｄＵ（商標）ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴ（商標）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｍｇｅｎ）、およびＡｐｏＡｌｅｒｔ（商標）ＤＮＡ断片化アッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ａ  Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ）である。
【００９４】
カスパーゼ活性を、特定のカスパーゼに特異的な蛍光発生基質、発色基質、および発光基質を介してモニタリングすることができる。市販のアッセイキットは、少なくとも１、２、３、６、７、８、および９について利用可能である（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎを参照のこと）。
【００９５】
ミトコンドリア膜電位の喪失を、健常に活動的なミトコンドリア中に差分的に蓄積される蛍光色素を使用して測定することができる。１つの非限定的な例は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄシステムである。
【００９６】
活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を、蛍光色素（例えば、Ｈ２ＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる）を使用して測定することができる。
【００９７】
細胞内酸性化を、蛍光色素または発色色素を使用して測定することができる。
【００９８】
クロマチン凝縮を、蛍光色素（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２が含まれる）を使用して測定することができる。
【００９９】
細胞表面上のホスファチジルセリン（ＰＳ）レベルを測定することができる。例えば、アネキシンＶは、ＰＳに対する親和性が高い。多数の市販のアッセイは、細胞表面への標識アネキシンの結合のモニタリングに適切である。
【０１００】
細胞膜透過性を、色素（アポトーシス細胞に侵入することができるが、壊死細胞に侵入できない蛍光色素ＹＯ−ＰＲＯ−Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）を使用して測定することができる。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「上方制御する」は、活性または量の増加、活性化、または刺激をいう。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ末端」は、タンパク質の最初の１０アミノ酸をいう。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｃ末端」は、タンパク質の最後の１０アミノ酸をいう。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「ドメイン」は、生体分子の既知のもしくは想定される機能に寄与する生体分子の構造部分をいう。ドメインは、その領域または一部と共存することができ、その領域の全部または一部に加えて、特定の領域と異なる生体分子の一部を組み込むこともできる。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞外ドメイン」は、細胞の外側または外部である分子の一部をいう。本発明の文脈では、Ｎ末端細胞外ドメインは、第１の膜貫通ドメインの直前の分子のＮ末端に存在する細胞外ドメインをいう。２つの膜貫通（ＴＭ）ドメインの間（例えば、ＴＭ２との３との間）の細胞外ドメインの文脈では、細胞外ドメインは、ＡＭＩＧＯ−２の第２の膜貫通ドメインと第３の膜貫通ドメインとの間の細胞膜の外部のＡＭＩＧＯ−２の一部をいう。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、用語「リガンド結合ドメイン」は、ＡＭＩＧＯ−２の対応する未変性配列の少なくとも１つの定量的結合活性を保持する受容体の任意の部分または領域をいう。
【０１０７】
用語「領域」は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分をいう。タンパク質の場合、領域を、タンパク質のアミノ酸配列の連続部分によって定義される。いくつかの実施形態では、「領域」は、生体分子の機能に関連する。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分をいう。タンパク質の場合、この部分を、タンパク質のアミノ酸配列の連続部分と定義し、少なくとも３〜５アミノ酸、少なくとも８〜１０アミノ酸、少なくとも１１〜１５アミノ酸、少なくとも１７〜２４アミノ酸、少なくとも２５〜３０アミノ酸、および少なくとも３０〜４５アミノ酸をいう。オリゴヌクレオチドの場合、この部分を、オリゴヌクレオチドの核酸配列の連続する部分と定義し、少なくとも９〜１５ヌクレオチド、少なくとも１８〜３０ヌクレオチド、少なくとも３３〜４５ヌクレオチド、少なくとも４８〜７２ヌクレオチド、少なくとも７５〜９０ヌクレオチド、および少なくとも９０〜１３０ヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態では、生体分子のフラグメントは生物活性を有する。本発明の文脈では、ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドフラグメントは、配列番号２に示す全ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２フラグメントは、未変性ＡＭＩＧＯ−２の１つまたは複数の活性を保持する。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、句「ＡＭＩＧＯ−２関連細胞／腫瘍／サンプル」などは、非癌性および／または非転移性の細胞、サンプル、腫瘍、または他の病変と比較したＡＭＩＧＯ−２の差分発現によって特徴づけられる細胞、サンプル、腫瘍、または他の病変をいう。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２関連細胞、サンプル、腫瘍、または他の病変は、非転移性細胞、サンプル、腫瘍、または他の病変と比較したＡＭＩＧＯ−２発現の増加によって特徴づけられる。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、標的タンパク質またはフラグメントに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティング抗体をいい、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、キャメルボディ（ｃａｍｅｌｂｏｄｙ）、またはミクロ抗体（ｍｉｃｒｏａｎｔｉｂｏｄｙ）が含まれる）も含まれる。用語「抗体」には、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療抗体遺伝子移入がさらに含まれる。
【０１１１】
本明細書中で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得た抗体をいう。すなわち、集団を含む各抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって夾雑することなく合成することができるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法によって抗体が産生される必要があると解釈されるべきではない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」を、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０１１２】
本明細書中のモノクローナル抗体には、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか相同する一方で、残りの鎖が別の種に由来するか別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか相同する、「キメラ」抗体およびかかる抗体のフラグメント（所望の生物活性を示す限り）が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書中の目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。
【０１１３】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部（いくつかの実施形態では、その抗原結合領域または可変領域を含む）を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、二特異性抗体、線状抗体（Ｚａｐａｔａら、，Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ  ８（１０）：１０５７−１０６２  ［１９９５］）、単鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体が含まれる。
【０１１４】
「インタクトな」抗体は、抗原結合可変領域、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む抗体である。定常ドメインは、未変性配列定常ドメイン（例えば、ヒト未変性配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異型であり得る。いくつかの実施形態では、インタクトな抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【０１１５】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（未変性配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因する生物活性をいう。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。
【０１１６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、一定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞，好中球，およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌Ｉｇによってこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、その後に細胞毒で標細胞を死滅させることができる細胞傷害性形態をいう。抗体は、細胞傷害性細胞を「装備し」、かかる死滅に絶対に必要である。ＡＤＣＣの媒介のための初代細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３中にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号などに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、（ＵＳＡ）９５  ６５２−６５６（１９９８）などに開示の動物モデル）で評価することができる。
【０１１７】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれる。エフェクター細胞を、その未変性供給源（例えば、本明細書中に記載の血液またはＰＢＭＣ）から単離することができる。
【０１１８】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」を、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、未変性配列のヒトＦｃＲである。さらに、いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するＦｃＲであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（対立遺伝子変異形（ｖａｒｉａｎｔ）およびこれらの受容体の選択的スプライシング形態が含まれる）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）の概説を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。他のＦｃＲ（将来的に同定されるＦｃＲが含まれる）は、本明細書中の用語「ＦｃＲ」に含まれる。この用語には、母親のＩｇＧの胎児への輸送を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１  １７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４２９（１９９４））。
【０１１９】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で分子が標的を溶解する能力をいう。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイを行うことができる。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基をいう。いくつかの実施形態では、エピトープは、エピトープに固有の空間的配置で３つまたはそれを超えるアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、線状または高次構造のエピトープである。一般に、エピトープは、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、および少なくとも１２個のかかるアミノ酸からなり、より通常には、少なくとも８〜１０個のかかるアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的配置の決定方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。
【０１２１】
句「相補性決定領域」は、未変性の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔら、，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）を参照のこと。句「定常領域」は、エフェクター機能を付与する抗体分子の一部をいう。本発明では、マウス定常領域を、ヒト定常領域と置換する。本発明のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域を、以下の５つのアイソタイプから選択することができる：α、δ、ε、γ、またはμ。抗体のヒト化の１つの方法は、非ヒト重鎖および軽鎖配列をヒト重鎖および軽鎖配列とアラインメントする工程と、かかるアラインメントに基づいて非ヒトフレームワークとヒトフレームワークとを選択し、置換する工程と、ヒト化配列の高次構造を予想するために分子モデリングを行う工程と、親抗体の高次構造と比較する工程とを含む。この過程の後に、ヒト化配列モデルの推定高次構造が親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの高次構造に非常に類似するまで、ＣＤＲの構造を破壊するＣＤＲ領域中の残基を繰り返し逆変異する。かかるヒト化抗体を、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌ受容体によって、取り込みおよびクリアランスを容易にするためにさらに誘導体化することができる。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１２２】
得られたポリペプチドが標的タンパク質に特異的な少なくとも１つの結合領域を含む限り、広範な種々の抗体／免疫グロブリンフレームワークまたは足場を使用することができる。かかるフレームワークまたは足場には、５つの主なヒト免疫グロブリンのイディオタイプまたはそのフラグメント（本明細書中の他の場所に開示のもの）が含まれ、好ましくはヒト化態様を有する他の動物種の免疫グロブリンが含まれる。ラクダにおいて同定された重鎖抗体などの単一の重鎖抗体は、これに関して特に興味深い。新規のフレームワーク、足場、およびフラグメントが当業者によって発見および開発され続けている。
【０１２３】
本発明のＣＤＲをグラフティングすることができる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を生成することができる。標的に特異的な結合領域を含む限り、既知または未知の非免疫グロブリンフレームワークおよび足場を使用することができる。かかる化合物は、本明細書中で、「標的特異的結合領域を含むポリペプチド」として公知である。公知の非免疫グロブリンフレームワークまたは足場には、アドネクチン（フィブロネクチン）（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ），アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、アブリンクスｎｖ（Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））、リポカリン（アンチカリン）（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｍｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、小モジュラー免疫医薬品（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｒｍｍｕｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｉｅｓ）（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）），プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ，Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（γ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
（ｉｉｉ）マキシボディ／アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）−Ａｖｉｄｉａ
アビマーは、ＬＲＰ−１などのタンパク質を含む天然のＡ−ドメインに由来する。これらのドメインは、タンパク質間相互作用の性質によって使用され、ヒトにおいて、２５０種を超えるタンパク質が構造的にＡ−ドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーによって連結した多数の異なる「Ａ−ドメイン」単量体（２−１０）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、同第２００５００５３９７３号、同第２００５００４８５１２号、および同第２００６０００８８４４号に記載の方法論を使用して、標的抗原に結合することができるアビマーを作製することができる。
【０１２５】
用語「アンタゴニスト」を、最も広い意味で使用し、本明細書中に開示の腫瘍細胞抗原の生物活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子が含まれる。類似の様式では、用語「アゴニスト」を、最も広い意味で使用し、本明細書中に開示の腫瘍細胞抗原の生物活性を模倣する任意の分子が含まれる。適切なアゴニストまたはアンタゴニスト分子には、具体的には、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、腫瘍細胞抗原のフラグメントもしくはアミノ酸配列、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子などが含まれる。腫瘍細胞抗原のアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法は、目的の抗原を発現する腫瘍細胞を候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させる工程および腫瘍細胞抗原に通常関連する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定する工程を含むことができる。アンタゴニストは、合理的デザインまたはファージディスプレイによって生成されたペプチドでもあり得る（例えば、１９９８年８月１３日公開のＷ０９８／３５０３６号を参照のこと）。１つの実施形態では、選択される分子は、抗体のＣＤＲに基づいてデザインされた「ＣＤＲ模倣物」または抗体アナログであり得る。かかるペプチドのみで拮抗性を示し得るが、ペプチドを任意選択的に細胞毒性薬剤に融合してペプチドの拮抗性を付加または増強することができる。
【０１２６】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいう。オリゴヌクレオチドには、アンチセンスおよびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列の一部を含み、少なくとも約１０ヌクレオチド且つ約５００ヌクレオチドまでを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、および約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、化学合成することができ、プローブとして使用することもできる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である部分を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド（ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）である。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、アンチセンスポリヌクレオチドがＡＭＩＧＯ−２ポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる場合、ＡＭＩＧＯ−２ポリヌクレオチド配列（ＡＭＩＧＯ−２の転写または翻訳に関連するポリヌクレオチド配列（例えば、ＡＭＩＧＯ−２ポリヌクレオチドのプロモーター）が含まれる）に相補的なヌクレオチド配列を有する非修飾または修飾核酸をいう。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドコードポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を阻害することができるアンチセンスポリヌクレオチドが特に興味深い。
【０１２８】
本明細書中で使用される場合、用語「ｓｉＲＮＡ  オリゴヌクレオチド」、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」、「短い干渉ＲＮＡ」、または「ｓｉＲＮＡ」は交換可能に使用され、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としても公知の、転写後遺伝子サイレンシングを介して作用するオリゴヌクレオチドをいう。この用語は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」を行うことができる二本鎖核酸分子をいう（Ｋｒｅｕｔｚｅｒら、，ＷＯ００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、ＷＯ０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ，ＷＯ９９／３２６１９号；Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，ＷＯ０１／２９０５８号を参照のこと）。ｓｉＲＮＡ分子は、一般にＲＮＡ分子であるが、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに含む。細胞への一過性ｓｉＲＮＡ移入によってｓｉＲＮＡ遺伝子ターゲティング実験が行われている（リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、または微量注入などの古典的方法によって行われる）。ｓｉＲＮＡ分子は、２１〜２３ヌクレオチドＲＮＡであり、通常ＲＮＡｉを開始する長い二本酸ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のＲＮアーゼＩＩＩプロセシング産物に類似する２〜３ヌクレオチドの３’−オーバーハング末端を特徴とする。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、用語「デコイ受容体」は、ＡＭＩＧＯ−２リガンドに結合することができるポリペプチド、模倣物、または他の高分子の、少なくとも一部を含む受容体をいう。本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、治療有効量の薬物を個体に投与する場合、個体内の癌細胞または癌細胞の転移の、１つまたは複数の臨床エンドポイント、成長、および／または生存の減少または逆転として認められる薬効が得られる薬物の量をいうことを意味する。治療有効量を、典型的には、有効成分を含まない組成物を同様の状況の個体に投与する場合に認められる効果と比較した効果によって決定する。被験体のための正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康状態、条件の性質および範囲、投与のために選択される治療薬または治療薬の組み合わせに依存するであろう。しかし、所与の状況のための有効量は日常的な実験によって決定され、この決定は、臨床家の判断の範囲内である。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、用語「〜との組み合わせ」または「〜との併用」は、他の治療計画と共に本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを投与することをいう。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、用語「感受性」は、ＡＭＩＧＯ−２療法が許容可能な治療方法である患者（すなわち、陽性に応答する可能性が高い患者）をいう。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示す癌患者は、ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示さない患者と比較して高レベルのＡＭＩＧＯ−２を発現する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２療法の良好な候補ではない癌患者には、その癌細胞中または癌細胞上のＡＭＩＧＯ−２を欠くかより低いレベルで有する腫瘍サンプルを有する癌患者が含まれる。いくつかの実施形態では、癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２と比較して細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の比率がより高い患者は、かかる患者が非細胞膜局在化ＡＭＩＧＯ−２と比較して細胞膜局在化ＡＭＩＧＯ−２の比率がより低い患者よりもＡＭＩＧＯ−２療法に対する感受性がより高いことを示す。いくつかの実施形態では、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の、細胞膜を含まない癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２と比較した比率が少なくとも２：１であれば、患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を有し、ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示すことを示す。いくつかの実施形態では、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の、細胞膜を含まない癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２と比較した比率が少なくとも３：１であれば、患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を有し、ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示すことを示す。
【０１３２】
本明細書中で使用される場合、用語「検出」は、活性（例えば、遺伝子発現）または生体分子（例えば、ポリペプチド）の証拠を確立、発見、または確認することを意味する。
【０１３３】
「未変性配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。かかる未変性配列ポリペプチドを、天然から単離することができるか、組換え手段または合成手段によって産生することができる。したがって、未変性配列ポリペプチドは、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。
【０１３４】
用語「アミノ酸配列変異形」は、未変性配列ポリペプチドといくらか異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。通常、アミノ酸配列変異形は、未変性リガンドの少なくとも１つの受容体結合ドメインまたは未変性受容体の少なくとも１つのリガンド結合ドメインまたはそのリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％相同、または少なくとも約９０％相同であろう。アミノ酸配列変異形は、未変性アミノ酸配列のアミノ酸配列内の一定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有する。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、句「相同ヌクレオチド配列」または「相同アミノ酸配列」またはその変異形は、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの少なくとも特定の比率の相同性によって特徴づけられる配列をいい、「配列同一性」と交換可能に使用される。相同ヌクレオチド配列には、タンパク質のイソ型をコードする配列が含まれる。かかるイソ型を、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同一生物の異なる組織中に発現することができる。あるいは、イソ型を、異なる遺伝子によってコードすることができる。相同ヌクレオチド配列には、ヒト以外の種（哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない）のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。相同ヌクレオチド配列には、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子異形（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）および変異体も含まれるが、これらに限定されない。相同アミノ酸配列には、せいぜい５０個（例えば、せいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０）の保存的アミノ酸置換を含み、ポリペプチドが、未変性ポリペプチドの結合能力および／または活性の少なくとも２５％（例えば、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％またはそれを超える）を保持するアミノ酸配列が含まれる。保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる。すなわち、グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニン；リジン、ヒスチジン、およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン、である。
【０１３６】
相同アミノ酸配列には、（２つまたはそれを超えるアミノ酸の）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸セグメントまたは不連続の単一アミノ酸を欠くアミノ酸配列の欠失変異形が含まれ得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、相同アミノ酸配列は、１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２０超）アミノ酸の挿入を含むことができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、相同アミノ酸配列は、保存的な置換、挿入、および／または欠失を含むことができる。
【０１３９】
相同率または同一率を、例えば、デフォルト設定を使用し、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）のアルゴリズムを使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  ＵＮＩＸ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって決定することができる。いくつかの実施形態では、プローブと標的との間の相同性は、約５０％〜約６０％である。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１またはその一部と約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、および約１００％相同なヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ホモログは、配列番号１と同一の活性を有する。いくつかの実施形態では、ホモログは、配列番号１と同一の発現プロフィールを共有する。
【０１４０】
相同性は、ポリペプチドレベルでもあり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２またはその一部と約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、および約１００％相同である。いくつかの実施形態では、ホモログは、配列番号２と同一の活性を有する。いくつかの実施形態では、ホモログは、配列番号２と同一の発現プロフィールを共有する。
【０１４１】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、種々の長さの核酸配列をいう。いくつかの実施形態では、プローブは、少なくとも約１０ヌクレオチドであり且つ約６，０００ヌクレオチドまでの長さを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、または少なくとも７５個の連続ヌクレオチドを含む。プローブは、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出で使用する。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から得られるが、これは標的配列に対する特異性が高く、オリゴマーよりもはるかにゆっくり標的とハイブリッド形成する。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、ハイブリッド形成膜ベースのＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインする。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、用語「混合」は、同一領域中に１つまたは複数の化合物、細胞、および分子などを共に組み合わせる過程をいう。この過程は例えば、１つまたは複数の化合物、細胞、または分子を混合することが可能な試験管、ペトリ皿、または任意の容器中で行いうる。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、用語「単離」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体が天然に存在する環境と異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞をいう。細胞の単離方法は、当業者に周知である。単離されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を、一般的に、実質的に精製する。
【０１４４】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」は、その天然の環境から取り出され、天然に会合する他の化合物を少なくとも６０％、少なくとも７５％、および少なくとも９０％含まない化合物（ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体のいずれか）をいう。
【０１４５】
本明細書中で使用される場合、用語「結合」は、２つまたはそれを超える生体分子または化合物の間の物理的または化学的な相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス、疎水性相互作用などが含まれる。結合は直接または間接のいずれかであり得る。間接的結合は、別の生体分子または化合物を介するか、その影響に起因する。直接結合は、別の分子または化合物を介するかその影響に起因しては起こらないが、その代わりに他の実質的な化学的中間体を持たない相互作用をいう。
【０１４６】
本明細書中で使用される場合、用語「接触」は、第１の分子を第２の分子に物理的に接近させて直接または間接的に１つにすることを意味する。分子は、多数の緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。「接触」には、例えば、ポリヌクレオチドを、核酸分子を含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、またはマイクロアレイなどに入れることが含まれる。接触には、例えば、抗体を、ポリペプチドを含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、またはマイクロアレイなどに入れることが含まれる。接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こり得る。
【０１４７】
本明細書中で使用される場合、句「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」または「ストリンジェントな条件」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリッド形成するが他の配列とのハイブリッド形成は最小である条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境によって異なる。より長い配列は、その適切な相補物とより高い温度で特異的にハイブリッド形成する。一般に、ストリンジェントな条件を、定義したイオン強度およびｐＨで特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリッド形成する（定義したイオン強度、ｐＨ、および核濃度下での）温度である。一般にＴｍで標的配列が過剰に存在するので、平衡状態でプローブの５０％がその相補物とハイブリッド形成する。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃である条件であろう。ホルムアミドなどの不安定化剤を添加してストリンジェントな条件を達成することもできる。
【０１４８】
本明細書中で使用される場合、用語「中程度のストリンジェンシー条件」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリッド形成するが、限定された数の他の配列とハイブリッド形成する条件をいう。中程度の条件は配列依存性であり、環境によって異なる。中程度の条件当業者に周知であり、とりわけ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９８９））に記載されている。
【０１４９】
本明細書中に記載の核酸組成物を使用して、例えば、生体サンプル（例えば、ヒト細胞の抽出物）中のｍＲＮＡまたはかかるサンプルから産生したｃＤＮＡの検出のためのプローブとしてのポリペプチドを産生し、ポリヌクレオチドのさらなるコピーを生成し、リボザイムまたはオリゴヌクレオチド（一本鎖および二本鎖）および一本鎖ＤＮＡプローブまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドを生成することができる。本明細書中に記載のプローブを使用して、例えば、サンプル中の本明細書中に提供したポリヌクレオチドの有無を決定することができる。ポリペプチドを使用して、癌に関連するポリペプチドに特異的な抗体を生成することができ、言い換えると、この抗体は、本明細書中により詳細に考察されるように、診断方法および予後診断方法で有用である。ポリペプチドは、本明細書中により詳細に考察されるように、治療介入のための標的としても有用である。本発明の抗体を使用して、例えば、本発明のポリペプチドを精製、検出、およびターゲティングすることもできる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ診断方法および治療方法の両方が含まれる）。例えば、抗体は、生体サンプル中の本発明のポリペプチドレベルを定量的および定性的に測定するための免疫アッセイで有用である。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。これらおよび他の用途を、以下により詳細に記載する。
【０１５０】
本明細書中で使用される場合、用語「画像化剤」は、本発明の抗体、小分子、またはプローブに連結し、当業者に公知の技術を使用して検出することができる組成物をいう。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子発現の証拠」は、遺伝子が発現した任意の測定可能な指標をいう。
【０１５１】
用語「薬学的に許容可能なキャリア」は、治療薬（抗体またはポリペプチドなど）および他の治療薬の投与のためのキャリアをいう。この用語は、それ自体が組成物を投与した個体に有害な抗体の産生を誘導せず、過度な毒性を示さずに投与することができる任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、ゆっくり代謝する巨大な高分子（タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体、および不活性ウイルス粒子など）であり得る。かかるキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的に許容可能なキャリアには、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールが含まれ得る。湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝物質などの補助剤は、かかるビヒクル中にも存在することができる。
【０１５２】
本発明の方法および組成物によって治療することができる癌の特定の例には、ＡＭＩＧＯ−２関連癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、「ＡＭＩＧＯ−２関連癌」は、非癌性細胞と比較してＡＭＩＧＯ−２を差分発現する細胞によって特徴づけられる癌をいう。本発明は、ＡＭＩＧＯ−２が、とりわけ、染色体安定性、キナーゼ活性、腫瘍形成能、転移、シグナル伝達、細胞接着、アポトーシス、基質リン酸化、細胞成長、腫瘍形成、サイクリン産生、細胞増殖、細胞周期制御、癌細胞の成長、癌細胞生存、足場非依存性増殖、および血管形成、細胞遊走、細胞間相互作用において役割を果たす任意の腫瘍細胞型にも適用可能である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、癌は、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、もしくは膵臓癌または癌転移である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌または結腸癌である。いくつかの実施形態では、癌は、胃癌以外の癌である。いくつかの実施形態では、かかる癌は、コントロールと比較して少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％のＡＭＩＧＯ−２の差分発現を示す。
【０１５４】
本発明は、ＡＭＩＧＯ−２過剰発現に関連する疾患および障害を治療、阻害、および管理し、かかる疾患および障害の症状を治療、阻害、および管理する方法および組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態は、癌（癌転移、癌細胞生存、癌細胞増殖、癌細胞の成長、細胞周期制御、血管形成、および癌細胞侵襲が含まれるが、これらに限定されない）を治療、阻害、または管理する組成物を含む方法および組成物に関する。
【０１５５】
本発明は、さらに、本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターと組み合わせた他の有効成分を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、さらに、患者への１つまたは複数の従来の癌療法薬を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、１つまたは複数の化学療法、放射線療法、または手術を使用して患者を治療する工程を含む。
【０１５６】
本発明はまた、現在のまたは標準的な癌治療（手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および生物療法など）が部分的または完全に無効となった癌または他の過剰増殖細胞障害または疾患の治療、阻害、および管理のための方法および組成物を提供する。
【０１５７】
本発明はまた、癌を診断し、そして／または癌の進行を予想するための本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーター（特に、ＡＭＩＧＯ−２抗体）を使用した診断および／または画像化方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腫瘍および／または転移の画像化および局在化方法ならびに診断および予後診断方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＭＩＧＯ−２関連療法の適切性および／または有効性を評価する方法を提供する。
【０１５８】
ＡＭＩＧＯ−２モジュレーター
本発明は、とりわけ、癌の治療、診断、検出、または画像化のためのＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを提供する。ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターはまた、癌治療薬の調製に有用である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターはＡＭＩＧＯ−２インヒビターである。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ヌクレオチド、小分子、模倣物、デコイ、または抗体である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、単離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）；配列番号７〜１６からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチド；シグナルペプチド、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲｌドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＩｇドメインからなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２のドメイン中エピトープに結合する抗体；小分子；模倣物；可溶性受容体；またはデコイである。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２のドメイン中のエピトープに結合する抗体は、ＡＭＩＧＯ−２以外のポリペプチドに特異的に結合しない。例えば、いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、ＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３に特異的に結合しない。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、コントロールと比較して、ＡＭＩＧＯ−２活性を少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻害する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、コントロールと比較して、ＬＩＶ−１発現を少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻害する。
【０１６１】
抗体
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはＦａｂフラグメントである。抗体またはＦａｂフラグメントを、例えば、酵素、放射性同位体、またはフルオロフォアで標識することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはＦａｂフラグメントは、ＡＭＩＧＯ−２以外のポリペプチドに特異的に結合しない。例えば、いくつかの実施形態では、抗体またはＦａｂフラグメントは、ＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３に特異的に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体またはＦａｂフラグメントは、ＡＭＩＧＯ−２以外のポリペプチドに対して約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＡＭＩＧＯ−２に結合するモノクローナル抗体である。
【０１６２】
本発明はまた、競合的結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、免疫アッセイ）によって決定した場合に本発明のエピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、エピトープへの結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、種々の方法（例えば、（１）ヒトフレームワークおよび定常領域への非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフティング（当該分野で「ヒト化」と呼ばれる過程）、あるいは、（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面で「クローキング（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」すること（当該分野で「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれる過程）が含まれる）によって得られる。本発明では、ヒト化抗体には、「ヒト化」および「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体の両方が含まれるであろう。同様に、ヒト抗体を、トランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたマウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって作製することができる。攻撃誘発の際、ヒト抗体産生が認められ、これは遺伝子再編成、アセンブリ、抗体レパートリーを含むあらゆる点で、ヒトで認められる抗体と酷似する。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および以下の科学論文：Ｍａｒｋｓら、，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）；Ｊｏｎｅｓら、，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１  ６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４  ６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９  １５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１６４】
本発明の抗体は、異なる機構を介して機能することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）（抗体ターゲティング細胞への溶解攻撃）を誘発する。いくつかの実施形態では、抗体は、複数の治療機能（例えば、抗原結合、アポトーシスの誘導、および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が含まれる）を有する。いくつかの実施形態では、抗体を、毒素または放射性核種に抱合する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＭＩＧＯ−２アンタゴニストとして作用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを使用して受容体／リガンド相互作用を部分的または完全に破壊する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書中に開示のエピトープまたはその一部を結合する。いくつかの実施形態では、抗体の非存在下での活性と比較して、リガンド活性または受容体活性を少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％調整する抗体を提供する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本発明は、中和抗体を提供する。中和抗体は、感染因子（癌に関連するウイルスまたは細菌などのウイルスまたは細菌など）（例えば、ＪＣポリオーマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、またはピロリ菌）に結合する。いくつかの実施形態では、中和抗体は、受容体アンタゴニストとして有効に作用することができる（すなわち、リガンド媒介性受容体活性化の生物活性の全てまたはサブセットのいずれかの阻害）。いくつかの実施形態では、抗体を、本明細書中に開示の本発明のペプチドの特異的生物活性を含む生物活性についてのアゴニスト、アンタゴニスト、または逆アゴニストと特定することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、抗体は、とりわけ、染色体安定性、キナーゼ活性、腫瘍形成能、転移、シグナル伝達、細胞接着、細胞アポトーシス、基質リン酸化、癌細胞の成長、腫瘍形成、サイクリン産生、細胞増殖、細胞周期を介した進行（例えば、細胞周期のＧ２／Ｍ期への進行）、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、および血管形成からなる群より選択される１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２活性を阻害する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２抗体は、成長および生存経路（活性化ＥＧＦＲおよび変異β−カテニンによって媒介されるものなど）を阻害する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２抗体は、１つまたは複数のサイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＬ１、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）を阻害する（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害する）。ＶＥＧＦおよびウロキナーゼの調節は、血管形成におけるＡｍｉｇｏ−２の役割も示す。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２抗体は、癌細胞運動性を調整し、癌転移に影響を及ぼす。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２抗体は、最初期遺伝子および最初期遺伝子を含む経路を調節する。例えば、ＡＭＩＧＯ−２抗体は、１つまたは複数のｃＦｏｓＬ１、Ｅ２Ｆ１、ＥＬＫ１、ＪＮＫ、ＭＥＫＫ、ＳＡＰＫ１  ｐ３８、サイクリンＤ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＪＥ、ＫＣ、ｊｕｎＢ、およびＢＴＧ２ならびに関連経路を調節する。
【０１７０】
本発明の抗体」を、単独または他の組成物と組み合わせて使用することができる。抗体を、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種ポリペプチドと組換え的に融合するか、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に抱合する（共有結合的および非共有結合的抱合が含まれる）ことができる。例えば、本発明の抗体を、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素など）に組換え的に融合するか抱合することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５号、ＷＯ９１／１４４３８号、ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１７１】
キメラ抗体およびヒト化抗体に加えて、完全なヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウス（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１、および同第６，１１４，５９８号（その全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）またはヒト免疫グロブリン遺伝子のファージディスプレイライブラリー（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓら、，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）を参照のこと）に由来し得る。いくつかの実施形態では、抗体を産生し、ｓｃＦｖ−ファージライブラリーによって同定することができる。抗体ファージディスプレイテクノロジーは、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓなどの市販品を利用可能である。
【０１７２】
モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９６の方法またはその修正形態を使用して調製することができる。典型的には、マウスを、抗原を含む溶液で免疫化する。抗原含有溶液の生理食塩水（いくつかの実施形態では、フロント完全アジュバントなどのアジュバント）への混合または乳化、および混合物または乳濁液の非経口注射によって免疫化を行うことができる。当該分野で公知の任意の免疫化方法を使用して、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。動物の免疫化後、脾臓（および、任意選択的に、いくつかの巨大リンパ節）を取り出し、１つの細胞に分離する。脾臓細胞を、目的の抗原でコーティングしたプレートまたはウェルへの細胞懸濁液の適用によってスクリーニングすることができる。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、リンスで流されない。次いで、得られたＢ細胞または全ての分離脾臓細胞を、骨髄腫細胞との融合を誘導してハイブリドーマを形成させ、選択培地中で培養する。得られた細胞を、連続希釈および限界希釈によってプレートし、目的の抗原に特異的に結合する（そして無関係の抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分泌ハイブリドーマを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、培養ボトルまたは中空糸リアクター中）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（マウスの腹水として）のいずれかで培養する。
【０１７３】
米国特許第５，５４５，４０３号、同第５，５４５，４０５号および同第５，９９８，１４４号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に開示のように、発現のためのハイブリドーマの使用の代替法として、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞株などの細胞株中で抗体を産生することができる。簡潔に述べれば、細胞株を、軽鎖および重鎖をそれぞれ発現することができるベクターでトランスフェクトする。個別のベクターへの２つのタンパク質のトランスフェクションにより、キメラ抗体を産生することができる。Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ３：８；およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７０（全てが本明細書中で参考として援用される）。
【０１７４】
当該分野で公知の技術（ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））が含まれる）を使用して、ヒト抗体を産生することもできる。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒら、の技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅら、，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６  ９５（１９９１））。ヒト化抗体を、種々の方法（例えば、（１）ヒトフレームワークおよび定常領域への非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフティング（当該分野で「ヒト化」と呼ばれる過程）、あるいは、（２）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面での「クローキング」すること（当該分野で「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれる過程）が含まれる）によって行うことができる。本発明では、ヒト化抗体には、「ヒト化」および「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体の両方が含まれるであろう。同様に、ヒト抗体を、トランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたマウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって作製することができる。攻撃誘発の際、ヒト抗体産生が認められ、これは遺伝子再編成、アセンブリ、抗体レパートリーを含むあらゆる点で、ヒトで認められる抗体と酷似する。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および以下の科学論文：Ｍａｒｋｓら、，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９  ７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６  ８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２  １３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５  ９３（１９９５）；Ｊｏｎｅｓら、，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４  ６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９  １５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）（それぞれ��本明細書中で参考として援用される）に記載されている。完全にヒト化された抗体を、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などの供給者を使用したスクリーニングアッセイで同定することができる。
【０１７５】
ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作したトランスジェニック動物を使用して産生することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３号は、動物が内因性重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活化によって機能的な内因性免疫グロブリンを産生しない、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示している。ＷＯ９１／１０７４１号はまた、抗体が霊長類定常領域および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンコード遺伝子座が置換または不活化された、免疫原に対する免疫応答を備えうるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示する。ＷＯ９６／３０４９８号は、哺乳動物中の免疫グロブリン遺伝子座を修飾する（定常領域または可変領域の全部または一部を置換して、修飾抗体分子を形成するなど）ためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示している。ＷＯ９４／０２６０２号は、不活化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、マウスが内因性重鎖を欠き、１つまたは複数の外因性定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する、トランスジェニックマウスの作製方法を開示している。本発明の抗体を、米国特許第５，７６６，８８６号（本明細書中で参考として援用される）に考察されたヒト操作技術を使用して産生することもできる。
【０１７６】
上記のトランスジェニック動物を使用して、選択された抗原分子に対する免疫応答を生成することができる。抗体産生細胞を動物から取り出し、これを使用してヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。免疫化プロトコールおよびアジュバントなどは、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５号に記載のように、例えば、トランスジェニックマウスの免疫化で使用される。モノクローナル抗体を、対応するタンパク質の生物活性または生理学的影響を阻害または中和する能力について試験することができる。
【０１７７】
本発明の抗体を、Ｆａｎｇら、（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，５８４−５９０の考察のように、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療抗体遺伝子移入によって被験体に投与することができる。例えば、ＭＡｂ重鎖配列と軽鎖コード配列との間に配置されたポリペプチドの酵素非依存性同時翻訳自己切断を媒介するペプチドを含む多シストロン性発現カセットを送達するための組換えベクターを生成することができる。発現により、化学量論量の両ＭＡｂ鎖が得られる。いくつかの実施形態では、酵素非依存性同時翻訳自己切断を媒介するペプチドは、口蹄病由来２Ａペプチドである。
【０１７８】
抗体のフラグメントは、全長抗体の所望の親和性を保持する限り、本発明の方法での使用に適切である。したがって、抗ＡＭＩＧＯ−２抗体のフラグメントは、ＡＭＩＧＯ−２に結合する能力を保持する。かかるフラグメントを、対応する全長抗ＡＭＩＧＯ−２抗体に類似する性質によって特徴づける（すなわち、フラグメントは、ヒト細胞表面上に発現したヒトＡＭＩＧＯ−２抗原に特異的に結合するであろう）。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＭＩＧＯ−２の細胞外ドメイン中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２関連生物活性を調整する。いくつかの実施形態では、抗体は、とりわけ、１つまたは複数のキナーゼ活性、腫瘍形成能、転移、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達、ＡＭＩＧＯ−２媒介性細胞接着、癌細胞アポトーシス、ＥＲＫリン酸化  細胞成長、腫瘍形成、サイクリン産生、細胞増殖、細胞周期を介した進行、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、および血管形成を阻害する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、抗体は、シグナルペプチドドメイン、ＬＲＲＮＴドメイン、ＬＲＲｌドメイン、ＬＲＲ２ドメイン、ＬＲＲ３ドメイン、ＬＲＲ４ドメイン、ＬＲＲ５ドメイン、ＬＲＲ６ドメイン、ＬＲＲＣＴドメイン、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメイン、およびＡＭＩＧＯ−２のＩｇドメインからなる群より選択されるドメイン中の１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。シグナルペプチドドメインは配列番号２の約アミノ酸１〜３３であり、ＬＲＲ−Ｎ末端（ＬＲＲ−ＮＴ）ドメインは配列番号２の約アミノ酸４１〜６０であり、ＬＲＲ１ドメインは配列番号２の約アミノ酸６９〜９２であり、ＬＲＲ２ドメインは約アミノ酸９４〜１１６であり、ＬＲＲ３ドメインは約アミノ酸１１８〜１４０であり、ＬＲＲ４ドメインは約アミノ酸１４２〜１６４であり、ＬＲＲ５ドメインは約１６７〜１９１であり、ＬＲＲ６ドメインは約アミノ酸１９３〜２１６であり、ＬＲＲ−Ｃ末端（ＬＲＲ−ＣＴ）ドメインは約アミノ酸２２２〜２８２であり、Ｉｇ  Ｖ−ｓｅｔドメインは約２９３〜３８８であり、ＡＭＩＧＯ−２のＩｇドメインはＶ−ｓｅｔドメイン内に存在し、約アミノ酸３０３〜３６５である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＭＩＧＯ−２のシグナルペプチド中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体である。１つの実施形態では、抗体は、ＡＭＩＧＯ−２エピトープではないエピトープに特異的に結合しない。例えば、１つの実施形態では、抗体は、ＡＭＩＧＯ−エピトープまたはＡＭＩＧＯ−３エピトープに特異的に結合しない。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲＮＴドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ１ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＬＲＲ１エピトープは、配列番号３０および配列番号５７からなる群より選択される。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ２ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＬＲＲ２エピトープは、配列番号３２、配列番号３９、および配列番号６１からなる群より選択される。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ３ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＬＲＲ３エピトープは、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５６、および配列番号５８からなる群より選択される。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ４ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＬＲＲ４エピトープは、配列番号２６、配列番号３５、および配列番号４５からなる群より選択される。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ５ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＬＲＲ５エピトープは、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３６、および配列番号５３からなる群より選択される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲ６ドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＬＲＲ６エピトープは、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号６２からなる群より選択される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＬＲＲＣＴドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＬＲＲＣＴエピトープは、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６２からなる群より選択される。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＩｇ  Ｖ−ｓｅｔドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２のＩｇドメインの１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、本質的に配列番号３からなる配列中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。
【０１９２】
本発明の適切な抗体は、線状もしくは高次構造のエピトープまたはその組み合わせを認識することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３〜６および２５〜６２からなる群より選択されるＡＭＩＧＯ−２の抗原領域のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、本質的に配列番号３からなる配列中の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３からなる群より選択される配列を有するエピトープに特異的である。
【０１９３】
これらのペプチドは１つのエピトープを必ずしも正確にマッピングしなくてよいが、免疫原性を示さないＡＭＩＧＯ−２配列も含むことができると理解すべきである。
【０１９４】
本発明の抗体が結合することができる他の潜在的エピトープの予想方法は当業者に周知であり、以下が含まれるが、これらに限定されない。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析（Ｋｙｔｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２）、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ分析（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８；Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）２０：４８３−４８９；Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８６）８８：１−１８．）、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析（Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，Ｈ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９８８）４：１８１−１８６．）、およびＥｍｉｎｉ分析（Ｅｍｉｎｉ，Ｅ．Ａ．，Ｓｃｈｌｉｅｆ，Ｗ．Ａ．，Ｃｏｌｏｎｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ，Ｅ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４０：１３−２０．）。いくつかの実施形態では、潜在的なエピトープを、理論上の細胞外ドメインの決定によって同定する。ＴＭｐｒｅｄ（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ  ＆  Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ（１９９３）ＴＭｂａｓｅ−Ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７４，１６６を参照のこと）またはＴＭＨＭＭ（Ａ．Ｋｒｏｇｈ，Ｂ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，ａｎｄ  Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０５（３）５６７−５８０，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００１）などの分析アルゴリズムを使用して、かかる予想を行うことができる。ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０（Ｂｅｄｎｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４  ＪｕＩ  １６；３４０（４）：７８３−９５）などの他のアルゴリズムを使用して、シグナルペプチドの存在を予想し、これらのペプチドが全長タンパク質から切断される場所を予想することができる。細胞の外側のタンパク質の一部は、抗体相互作用の標的としての役割を果たすことができる。
【０１９５】
１）抗体が結合活性の閾値を示す場合、および／または２）抗体が既知の関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、抗体を、「特異的に結合する」と定義する。当業者は、抗体の結合親和性を、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９）によって容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、その標的エピトープまたは模倣デコイに、ＡＭＩＧＯ−２ファミリーの他の公知のメンバー（例えば、ＡＭＩＧＯ−１およびＡＭＩＧＯ−３）よりも標的癌関連ポリペプチドに対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、またはそれを超えて結合する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、抗体は、１０−４Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−９Ｍ以下の高親和性、またはナノモル以下の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭまたはさらに低い濃度）で結合する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２に対する抗体の結合親和性は、少なくとも１×１０６Ｋａである。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２に対する抗体の結合親和性は、少なくとも５×１０６Ｋａ、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａ、またはそれを超える。本発明の抗体を、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性に関して説明するか特定することもできる。いくつかの実施形態では、結合親和性には、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ、またはそれ未満のＫａを有する結合親和性が含まれる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えば、標準的なウェスタンブロット分析を使用して、抗体がＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドに結合するが、公知の関連ポリペプチドに結合しない場合、公知の関連ポリペプチドに結合しない（Ａｕｓｕｂｅｌら、，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４）。公知の関連ポリペプチドの例には、ＡＭＩＧＯファミリーの他のメンバー（例えば、ＡＭＩＧＯ−１およびＡＭＩＧＯ−３）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＭＩＧＯ−２のオルソログ、ホモログ、パラログ、もしくは変異形、またはその組み合わせおよびサブコンビネーション（ｓｕｂｃｏｍｂｍａｔｉｏｎ）に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＭＩＧＯ−２のオルソログに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＭＩＧＯ−２のホモログに結合する。ＡＭＩＧＯ−２のホモログは、公知のＡＭＩＧＯ−２関連タンパク質（ＡＭＩＧＯ−１およびＡＭＩＧＯ−３が含まれる）をいう。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＭＩＧＯ−２のパラログに結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＭＩＧＯ−２の変異形に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＡＭＩＧＯ−２のオルソログ、ホモログ、パラログ、もしくは変異形、またはその組み合わせおよびサブコンビネーションに結合しない。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドに特異的に結合する抗体集団を単離するために、抗体を公知の関連ポリペプチドに対してスクリーニングすることができる。例えば、ヒトＡＭＩＧＯ−２ポリペプチドに特異的な抗体は、適切な緩衝液条件下で不溶性マトリックスに接着したＡＭＩＧＯタンパク質（ＡＭＩＧＯ−２を除く）を含むカラムを通過するであろう。かかるスクリーニングにより、密接に関連するポリペプチドに交差反応性を示さないポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を単離可能である（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）。特異的抗体のスクリーニングおよび単離は、当該分野で周知である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ（ｅｄｓ．），Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３；Ｇｅｔｚｏｆｆら、，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１−９８，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，１９９６；Ｂｅｎｊａｍｉｎら、，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６７−１０１，１９８４を参照のこと）。かかるアッセイの代表例には以下が含まれる。同時免疫電気泳動（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットおよびウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６３（ＡＭＩＧＯ−１）および配列番号６４（ＡＭＩＧＯ−３）からなる群より選択される配列内のエピトープに特異的に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体またはＦａｂフラグメントは、ＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３と交差反応しない。
【０２０１】
本発明はまた、標的タンパク質に特異的なＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体を提供する。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実施するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００号、米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号および米国特許出願公開第２００３０１１８５９２号を参照のこと。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は中和抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はターゲティング抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、標的結合の際に内在化される。いくつかの実施形態では、抗体は、標的結合の際に内在化されるようにならないが、その代わりに表面上に保持される。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、中和抗体は、いかなるエフェクター機能も持たないであろう。あるいは、中和抗体は、エフェクター機能を有することができる。
【０２０４】
本発明の抗体を、目的の腫瘍細胞抗原への結合の際に迅速に内在化される能力または結合後に細胞表面上に残存する能力についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、例えば、いくつかの免疫複合体型の構築では、毒素部分の放出に内在化が必要な場合、抗体が内在化できることが望ましいかもしれない。あるいは、抗体を使用してＡＤＣＣまたはＣＤＣを促進する場合、抗体が細胞表面上に残存することがより望ましいかもしれない。スクリーニング方法を使用して、これらの挙動型を識別することができる。例えば、細胞を、約１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩｇＧ１（コントロール抗体）または本発明の抗体の１つと氷上（内在化を遮断するための０．１％アジ化ナトリウムを含む）または３７℃（アジ化ナトリウムなし）で３時間インキュベートする場合、細胞を保有する腫瘍細胞抗原を使用することができる。次いで、細胞を、冷却染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム）で洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣにて氷上で３０分間染色する。相乗平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒによって記録する。アジ化ナトリウムの存在下にて氷上で本発明の抗体とインキュベートした細胞とアジ化ナトリウムの非存在下にて３７℃で観察した細胞との間でＭＦＩの相違が認められない場合、抗体は、内在化ではなく細胞表面上に結合したままである抗体であると考えられるであろう。しかし、アジ化ナトリウムの非存在下にて３７℃で細胞をインキュベート場合に表面染色可能抗体の減少が見出された場合、抗体は、内在化することができる抗体と考えられるであろう。
【０２０５】
抗体抱合体
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は抱合されている。いくつかの実施形態では、抱合抗体は、癌療法、癌診断、または癌性細胞の画像化に有用である。
【０２０６】
診断への適用のために、抗体を、典型的には、検出可能部分で標識するであろう。多数の標識が利用可能であり、一般に、以下のカテゴリーに分類することができる。
【０２０７】
（ａ）放射性核種（以下で考察したものなど）。抗体を、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，Ｃｏｌｉｇｅｎら、，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ  Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載の技術を使用して放射性同位体で標識することができる。例えば、シンチレーションカウンティングを使用して放射能を測定することができる。
【０２０８】
（ｂ）蛍光標識（希土類キレート（ユウロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッドなど）を利用可能である。蛍光標識を、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）に開示の技術を使用して抗体に抱合することができる。蛍光光度計を使用して蛍光を定量することができる。
【０２０９】
（ｃ）種々の酵素−基質標識を利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号は、これらのいくつかの概説を示す。酵素は、一般に、発色基質の化学変化を触媒し、これを種々の技術を使用して測定することができる。例えば、酵素は、基質の変色を触媒し、これを分光光度法で測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量する技術は、上に記載している。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、次いで、発色し、これを（化学発光分析計（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して）測定することができるか、蛍光受容体にエネルギーを供与することができる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ、米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）など）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｏｘｉｄａｓｅ）（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、およびマイクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体への酵素の抱合技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ  Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３  １４７−１６６（１９８１）に記載されている。
【０２１０】
抗体を、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイに使用することもできる。いくつかの実施形態では、免疫シンチオグラフィ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して局在化することができるように抗体を放射性核種で標識する。便宜上、本発明の抗体をキット中に提供することができる（すなわち、一定量の試薬の診断アッセイを実施するための説明書との組み合わせを包装する）。抗体を酵素で標識する場合、キットは、酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアが得られる基質前駆体）を含むことができる。さらに、安定剤および緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加物を含めることができる。種々の試薬の相対量を広範囲にわたって変化させて、アッセイの感受性を実質的に最適にする溶液中の試薬濃度を得ることができる。特に、試薬を、通常凍結乾燥された乾燥粉末（溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液が得られる賦形剤が含まれる）として提供することができる。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、抗体を、１つまたは複数のマイタンシン分子（例えば、約１〜約１０個のマイタンシン分子／抗体分子）に抱合する。マイタンシンを、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換することができ、これを、Ｍａｙ−ＳＨ３に還元し、修飾抗体と反応させて（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））、マイタンシノイド−抗体免疫複合体を生成することができる。いくつかの実施形態では、抱合体は、高度に強力なマイタンシン誘導体ＤＭ１（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン）（例えば、２００２年１２月１２日公開のＷＯ０２／０９８８８３号）（ＩＣ５０は約１０−１１Ｍである）（概説については、Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２を参照のこと）またはＤＭ４（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン）（例えば、２００４年１２月２日公開のＷＯ２００４／１０３２７２号）であり得る。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、抗体抱合体は、１つまたは複数のカリチアマイシン分子に抱合した抗腫瘍細胞抗原抗体を含む。抗生物質のカリチアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ分解物を産生することができる。使用することができるカリチアマイシンの構造アナログには、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１が含まれるが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）およびＬｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８））。米国特許第５，７１４，５８６号、同第５，７１２，３７４号、同第５，２６４，５８６号、および同第５，７７３，００１号（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、多数の癌中で過剰発現される酵素によって、抗体を、その活性形態で放出することができるプロドラッグと抱合する。例えば、活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）がプラスミンによって抱合体から放出される、ドキソルビシンのプロドラッグ形態を使用して、抗体抱合体を作製することができる。プラスミンは、多数の癌組織で過剰産生されることが公知である（Ｄｅｃｙ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １８（３）：５６５−５６７を参照のこと）。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、抗体を、酵素活性毒素およびそのフラグメントと抱合する。いくつかの実施形態では、毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、シュードモナス外毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖（ｍｏｄｅｃｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、α−サルシン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ）、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質、（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、リボヌクレアーゼ（Ｒｎａｓｅ）、デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ニガウリインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストレクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２号を参照のこと。いくつかの実施形態では、毒素は、本来備わっている免疫原性が低く、癌性細胞が毒素に耐性を示すようになる機会を減少させる作用機構（例えば、細胞増殖抑制機構に対する細胞障害機構）を備えている。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体と免疫調節薬との間で抱合体を作製する。例えば、いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用することができる。これらの分子は強力な免疫原であり、抗原特異的抗体応答を誘発することができる（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １００２：１０５−１１１を参照のこと）。さらなる免疫調節化合物には、幹細胞成長因子（「Ｓ１因子」など）、リンホトキシン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）、造血因子（インターロイキンなど）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、インターフェロン（ＩＦＮ）（インターフェロンα、β、またはγ）、エリスロポエチン，およびトロンボポエチンが含まれ得る。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、放射性抱合抗体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を提供する。いくつかの実施形態では、かかる抗体を、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｈ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、５８Ｃｏ、６７Ｇａ、８０ｍＢｒ、９９ｍＴｃ、１０３ｍＲｈ、１０９Ｐｔ、１６１Ｈｏ、１８９ｍＯｓ、１９２Ｉｒ、１５２Ｄｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２２３Ｒａ、２１９Ｒｎ、２１５Ｐｏ、２１１Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２１Ｆｒ、２１７Ａｔ、２１３Ｂｉ、２５５Ｆｍ、ならびにその組み合わせおよびサブコンビネーションを使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、ホウ素原子、ガドリニウム原子、またはウラニウム原子を、抗体に抱合する。いくつかの実施形態では、ホウ素原子は１０Ｂであり、ガドリニウム原子は１５７Ｇｄであり、ウラニウム原子は２３５Ｕである。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、放射性核種抱合体は、２０ｋｅＶと１０，０００ｋｅＶとの間のエネルギーを有する放射性核種を有する。放射性核種は、１０００ｋｅＶ未満のエネルギーを有するＡｕｇｅｒ放射体、２０ｋｅＶと５０００ｋｅＶとの間のエネルギーを有するＰ放射体、または２０００ｋｅＶと１０，０００ｋｅＶとの間のエネルギーを有するαまたは「ａ」放射体であり得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、γ線、β線、または陽電子放射同位体である放射性核種を含む診断放射性抱合体を提供する。いくつかの実施形態では、放射性核種は、２０ｋｅＶと１０，０００ｋｅＶとの間のエネルギーを有する。いくつかの実施形態では、放射性核種は、１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３Ｌｉ、および１９７Ｈｇからなる群より選択される。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を、感光剤または画像化剤である診断薬剤に抱合する。感光化合物は、色素源または色素などの化合物を含むことができる。画像化剤は、例えば、常磁性イオンであり得、このイオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）からなる群より選択される金属を含む。画像化剤は、Ｘ線技術またはコンピュータ断層撮影法で使用される放射線不透過化合物（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ヨウ素、イリジウム、バリウム、ガリウム、およびタリウム化合物など）でもあり得る。放射線不透過化合物を、バリウム、ジアトリゾアート、ヨード化ケシ油、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタム酸、ヨーダミド、イオジパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド（ｉｏｇｕｌａｍｉｄｅ）、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸（ｉｏｓｅｍｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾアート、プロピリオドン、および塩化第一タリウムからなる群より選択することができる。いくつかの実施形態では、診断免疫複合体は、本発明の抗体と抱合されるガス充填リポソームなどの超音波増強剤を含むことができる。診断免疫複合体を、種々の手順（術中、内視鏡的、または血管内の腫瘍または癌診断および検出方法が含まれるが、これらに限定されない）のために使用することができる。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピド酸ジメチル塩酸塩など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トリエン２，６−ジイソシアナートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）など）を使用して、抗体抱合体を作製する。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製することができる。１４Ｃ標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体へのラジオヌクレオチドの抱合のための例示的キレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞中の細胞傷害性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２））を使用することができる。薬剤を、炭水化物部分を介して、本発明の抗体とさらに連結することができる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体および細胞毒性薬剤を含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製することができる。いくつかの実施形態では、細胞毒性薬剤と抱合した抗腫瘍抗原抗体を含むかかる免疫複合体を、患者に投与する。いくつかの実施形態では、結合する免疫複合体および／または腫瘍細胞抗原タンパク質を細胞に内在化し、それにより結合した癌細胞の死滅における免疫複合体の治療有効性が増加する。いくつかの実施形態では、細胞毒性薬剤は、癌細胞中の核酸をターゲティングするか緩衝する。かかる細胞毒性薬剤の例には、メイタンシノイド、カリチアマイシン、リボヌクレアーゼ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、抗体を、腫瘍プレターゲティングで使用するために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）に抱合し、この抗体−受容体抱合体を患者に投与し、その後に透徹薬を使用して非結合抱合体を循環から除去し、次いで、細胞毒性薬剤（例えば、ラジオヌクレオチド）に抱合する「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、抗体を細胞傷害性分子と抱合し、これを標的細胞リソソーム（ｌｙｓｏｚｏｍｅ）内に放出する。例えば、薬物モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を、バリン−シトルリン結合を介して抱合することができ、これを、抗体抱合体の内在化後にタンパク質分解性リソソーム酵素カテプシンＢによって切断する（例えば、２００３年４月３日公開のＷＯ０３／０２６５７７号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、切断可能な部分としてのヒドラジン機能性を含む酸不安定性リンカーを使用して、ＭＭＡＥを抗体に結合することができる（例えば、２００２年１１月１１日公開のＷＯ０２／０８８１７２号を参照のこと）。
【０２２４】
抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
いくつかの実施形態では、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、ＷＯ８１／０１１４５号を参照のこと）を活性な抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素への抗体の抱合によって、本発明の抗体をＡＤＥＰＴで使用することができる。例えば、ＷＯ８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＡＤＥＰＴに有用な免疫複合体の酵素成分には、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するような方法でプロドラッグに作用することができる任意の酵素が含まれる。
【０２２６】
ＡＤＥＰＴに有用な酵素には、リン酸塩含有プロドラッグの遊離薬への変換に有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグの遊離薬への変換に有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンの抗癌薬（５−フルオロウラシル）への変換に有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグの遊離薬への変換に有用なセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグの遊離薬への変換に有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素；３−ラクタムで誘導体化した薬物の遊離薬への変換に有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにそのアミン窒素でフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基にてそれぞれ誘導体化された薬物の遊離薬への変換に有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、当該分野で「アブザイム」としても公知の酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。アブザイムの腫瘍細胞集団への送達のために、抗体−アブザイム抱合体を本明細書に記載のように調製することができる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＡＤＥＰＴ酵素を、当該分野で周知の技術（上記で考察のヘテロ二官能性架橋試薬の使用など）によって抗体に共有結合することができる。いくつかの実施形態では、本発明の酵素の少なくとも機能活性部分に連結した本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４））。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性様式よりもむしろ細胞増殖抑制性様式で作用する抗体の同定を、非処置コントロール培養物と比較した処置標的細胞培養物の生存率の測定によって行うことができる。生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号はそれぞれＧ８０８０およびＧ５７５０）などの当該分野で公知の方法を使用して検出することができる。いくつかの実施形態では、上記手段によって測定したところ、処置によって、いかなる細胞死の証拠もないコントロール培養物と比較して細胞数が減少する場合、潜在的に細胞増殖抑制性を示す抗体と見なす。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、当該分野で公知のアッセイを使用してＡＤＣＣを促進する抗体を同定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイを行うことができる。１つの例示的アッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイである。５１Ｃｒ標識標的細胞を調製するために、腫瘍細胞株を、組織培養プレート中で成長させ、滅菌１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを使用して回収した。剥離細胞を、細胞培養培地で２回洗浄する。細胞（５×１０６）を、２００μＣｉの５１Ｃｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ／ＤｕＰｏｎｔ）にて時折混合しながら３７℃で１時間標識する。標識細胞を、細胞培養培地で３回洗浄し、次いで、１×１０５細胞／ｍＬの濃度に再懸濁する。細胞を、オプソニン化しないで使用するか、アッセイ前にＰＢＭＣで１００ｎｇ／ｍＬおよび１．２５ｎｇ／ｍＬの試験抗体、またはＮＫアッセイで２０ｎｇ／ｍＬおよび１ｎｇ／ｍＬの試験抗体とのインキュベーションによってオプソニン化する。末梢血単核球を、正常な健常ドナーからのヘパリン上の血液回収によって調製し、同体積のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。次いで、血液を、ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＭＥＤＩＵＭ（登録商標）（ＬＳＭ：Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）上に重層し、製造者の説明書に従って遠心分離する。単核球を、ＬＳＭ−血漿界面から回収し、ＰＢＳで３回洗浄する。エフェクター細胞を、細胞培養培地中に最終濃度１×１０７細胞／ｍＬに懸濁する。ＬＳＭによる精製後、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、製造者の説明書にしたがってＮＫ細胞単離キットおよび磁性カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用したネガティブ選択によってＰＢＭＣから単離する。単離ＮＫ細胞を回収し、洗浄し、２×１０６細胞／ｍＬの濃度に細胞培養培地中に再懸濁した。ＮＫ細胞の同一性を、フローサイトメトリー分析によって確認する。マイクロタイタープレート（最終体積１００μＬ）の列に沿った細胞培養培地中でのエフェクター（ＰＢＭＣまたはＮＫ）細胞の２倍の連続希釈によって種々のエフェクター：標的比を調製する。エフェクター細胞の濃度は、ＰＢＭＣについては１．０×１０７／ｍＬ〜２．０×１０４／ｍＬの範囲であり、ＮＫについては２．０×１０６／ｍＬ〜３．９×１０３／ｍＬの範囲である。エフェクター細胞の滴定後、１００μＬの５１Ｃｒ標識した１×１０５細胞／ｍＬの標的細胞（オプソニン化または非オプソニン化）を、プレートの各ウェルに添加する。これにより、最初のエフェクター：標的比は、ＰＢＭＣについては１００：１となり、ＮＫ細胞については２０：１となる。全アッセイを二連で行い、各プレートは、自発的溶解（エフェクター細胞なし）および総溶解（標的細胞＋１００μＬ１％ドデシル硫酸ナトリウム、１Ｎ水酸化ナトリウム）の両方についてコントロールを含む。プレートを、３７℃で１８時間インキュベートし、その後に細胞培養上清を、上清回収システム（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を使用して回収し、Ｍｉｎａｘｉ  ａｕｔｏ−ｇａｍｍａ  ５０００  ｓｅｒｉｅｓガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１分間計数する。次いで、結果を、以下の式を使用して細胞傷害��として示す：細胞傷害率＝（サンプルｃｐｍ−自発的溶解）／（総溶解−自発的溶解）×１００。
【０２３０】
ＣＤＣを促進する抗体を同定するために、当業者は、当該分野で公知のアッセイを行うことができる。１つの例示的アッセイは、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＣＤＣアッセイである。異なる濃度の試験抗体の非存在下または存在下でのヒト（または別の供給源）補体含有血清との腫瘍細胞抗原発現細胞のインキュベーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＣ活性を測定することができる。次いで、細胞傷害性を、ＡＬＡＭＡＲ  ＢＬＵＥ（登録商標）を使用した生細胞の定量によって測定する（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２  １６３−１７１（１９９７））。コントロールアッセイを、抗体を使用しないで行い、抗体を使用するが熱失活血清を使用して行い、そして／または問題の腫瘍細胞抗原を発現しない細胞を使用して行う。あるいは、赤血球を、腫瘍抗原または腫瘍抗原由来のペプチドでコーティングし、次いで、赤血球溶解の観察によってＣＤＣをアッセイすることができる（例えば、  Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｔｙｊａｒｖｉ，Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ［Ｃ］．１９８１  Ｏｃｔ；８９（５）：３１５−９を参照のこと）。
【０２３１】
細胞死を誘導する抗体を選択するために、例えば、ＰＩ、トリパンブルー、または７ＡＡＤ取り込みによって示される膜完全性の喪失を、コントロールと比較して評価することができる。１つの例示的アッセイは、腫瘍抗原発現細胞を使用したＰＩ取り込みアッセイである。このアッセイにしたがって、腫瘍細胞抗原発現細胞を、１０％熱失活ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを捕捉したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）：ハムＦ−１２（５０：５０）中で培養する（したがって、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下でアッセイを行う）。腫瘍細胞を、３×１０６／皿の密度で１００×２０ｍｍ皿に播種し、一晩接着させる。次いで、培地を除去し、新鮮な培地のみまたは１０μｇ／ｍＬの適切なモノクローナル抗体を含む培地と置換する。細胞を、３日間インキュベートする。各処置後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理によって剥離する。次いで、細胞を、１２００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離し、ペレットを、３ｍＬの氷冷Ｃａ２＋結合緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）に再懸濁し、細胞クランプの除去のために３５ｍｍのストレイナーで覆った１２×７５チューブ（１ｍＬ／チューブ、３チューブ／処置群）に等分する。次いで、チューブに、ＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を入れる。サンプルを、ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析することができる。ＰＩ取り込みによって決定した、統計的に有意な細胞死レベルを誘導する抗体を、細胞死誘導抗体として選択することができる。
【０２３２】
ＰＥＴ画像化剤として１８Ｆ−アネキシンを使用して、アポトーシス活性について抗体をｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングすることもできる。この手順では、アネキシンＶを、１８Ｆで放射性標識し、観察しながら抗体投与後に試験動物に投与する。アポトーシス過程で起こる最も初期の事象の１つは、細胞膜の内側から外側の表面へのホスファチジルセリンの外転（ｅｖｅｒｓｉｏｎ）（アネキシンに接近可能である）である。次いで、動物を、ＰＥＴ画像化に供する（Ｙａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００５  Ａｐｒ；４６（４）：６５８−６６を参照のこと）。標準的なプロトコールにしたがって、動物を屠殺して各器官または組織を取り出し、アポトーシスマーカーについて分析することができる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、癌を遺伝子発現産物の過剰発現によって特徴づけることができる一方で、本出願は、腫瘍抗原過剰発現癌であると見なされない癌の治療方法をさらに提供する。癌中の腫瘍抗原発現を決定するために、種々の診断／予後診断アッセイが利用可能である。いくつかの実施形態では、遺伝子発現産物の過剰発現を、ＩＨＣによって分析することができる。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片を、ＩＨＣアッセイに供し、以下の腫瘍抗原タンパク質染色強度基準に従った。
【０２３４】
スコア０：染色が認められないか、１０％未満の腫瘍細胞で膜染色が認められる。
【０２３５】
スコア１＋：１０％を超える腫瘍細胞で、かすかに／わずかに認められる膜染色が検出される。細胞は、その膜の一部のみが染色される。
【０２３６】
スコア２＋：１０％を超える腫瘍細胞で、弱い〜中程度の完全な膜染色が認められる。
【０２３７】
スコア３＋：１０％を超える腫瘍細胞で、中程度から強い完全な膜染色が認められる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原過剰発現評価についてスコア０または１＋の腫瘍を、腫瘍抗原を過剰発現しないと特徴づけることができるのに対して、スコア２＋または３＋の腫瘍を、腫瘍抗原を過剰発現すると特徴づけることができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２は、正常細胞と比較して癌細胞中で有意に上方制御されないが、癌細胞と正常細胞でＡＭＩＧＯ−２発現に対する依存性が異なる。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２調整は、腫瘍−間質相互作用に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２の阻害は、腫瘍−間質相互作用を調整する。
【０２４０】
あるいは、またはさらに、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚ．から販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Ｖｙｓｉｓ，Ｉ１１）などのＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織に対して行って、腫瘍中の腫瘍抗原過剰発現の範囲（存在する場合）を決定することができる。
【０２４１】
さらに、ポリマーへの共有結合性抱合によって抗体を化学修飾して、例えば、その循環半減期を増加させることができる。各抗体分子を、１つまたは複数の（すなわち、１、２、３、４、５、またはそれを超える）ポリマー分子に付着させることができる。ポリマー分子を、いくつかの実施形態では、リンカー分子によって抗体に付着させる。ポリマーは、一般に、合成ポリマーまたは天然に存在するポリマー（例えば、任意選択的に置換された直鎖または分岐鎖のポリアルケン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐もしくは非分岐ポリサッカリド（例えば、ホモ−またはヘテロ−ポリサッカリド））であり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリオキシエチレンポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒ（式中、Ｒは水素または保護基（アルキル基またはアルカノール基）であり得る）を有する。いくつかの実施形態では、保護異は、１個と８個との間の炭素を有する。いくつかの実施形態では、保護基はメチルである。記号ｎは、１と１，０００との間または２と５００との間の整数である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの平均分子量は、１０００と４０，０００との間、２０００と２０，０００との間、または３，０００と１２，０００との間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシル基を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロキシは、末端ヒドロキシ基である。いくつかの実施形態では、このヒドロキシル基は、インヒビター上の遊離アミノ基と反応するように活性化される。しかし、反応基の型および量を変化させて本発明の共有結合的に抱合したＰＥＧ／抗体を得ることができると理解されるであろう。ポリマー、そのペプチドへの付着方法は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、および同第４，６０９，５４６号（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）に示されている。
【０２４２】
安全性の研究
本発明の抗体を、安全性および毒物学的特徴について試験することができる。これらの研究型のためのガイドラインを、ＵＳＤＡ  ＣＢＥＲ部門によって発行された文書「Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ」（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ  ９４Ｄ−０２５９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２８，１９９７）（本明細書中で参考として援用される）中に見出すことができる。一般に、候補抗体を、多数のヒト組織サンプルおよび／または単離ヒト細胞型を使用した前臨床研究でスクリーニングして、非標的組織結合および交差反応性を評価すべきである。これらのヒト組織研究から満足な結果が得られた後、種々の動物種由来の組織サンプルおよび単離細胞のパネルをスクリーニングして、一般的な毒物学研究での使用に適切な種を同定することができる。交差反応性動物種が同定されない場合、他のモデル型が適切であると見なすことができる。これらの他のモデルには、ヒト腫瘍細胞をげっ歯類宿主に移植する移植片モデルなどの研究または毒物学研究のために選択した動物種中の対応する腫瘍細胞抗原を認識する代理モノクローナル抗体の使用が含まれ得る。これらの代替モデル型由来のデータは第１の近似値であり、慎重に高等種に進行させるべきであると認識されるべきである。
【０２４３】
候補ネイキッド抗体（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）のために、簡潔な許容性を調査する研究を行うことができる。これらの研究では、候補分子の治療指数を、任意の用量依存性薬力学的効果の観察によって特徴づけることができる。広範な用量を使用すべきである（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍細胞抗原数の間の相違、交差反応性動物標的に対する候補抗体の親和性、および抗体結合後の細胞応答の相違を、治療指数の評価で考慮すべきである。候補抗体をヒトで試験する場合の初期用量群（ｇｕｉｌｄ）の考慮を補助するために、適切な動物モデルで薬力学研究および薬物動態学研究も行うべきである。
【０２４４】
候補免疫複合体のために、抱合体の安定性研究をｉｎ  ｖｉｖｏで行わなければならない。任意選択的に、免疫複合体の各成分に対して薬力学研究および薬物動態学研究を行い、候補免疫複合体由来の任意の分解産物の成り行きを決定するべきである。適切な動物モデルにおいても上記のように薬力学研究および薬物動態学研究を行い、初期用量群の考察を補助するべきである。薬物をネイキッド抗体での前処置と組み合わせて投与する場合、安全性研究デザインをさらに考慮しなければならない。ネイキッド抗体のみを使用して安全性研究を行わなければならず、且つ免疫複合体の最終用量がこの治療レジメンの型でより低いことに留意して、免疫複合体を使用して研究をデザインしなければならない。
【０２４５】
放射性免疫複合体について、動物の組織分布研究を行って生体分布データを決定するべきである。さらに、照射した放射能の総線量の代謝低下を、取得した初期および後期の時点の両方を使用して計算するべきである。放射性免疫複合体を、血清または血漿を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性について試験することができ、遊離放射性核種、放射性免疫複合体、および標識された非抗体化合物の比率を測定するための方法を開発すべきである。
【０２４６】
オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、配列番号７〜２４からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスまたはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子または遺伝子発現産物の領域、ドメイン、部分、またはセグメントと相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１２〜約３５、および約１８〜約２５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子または遺伝子発現産物の領域、部分、ドメイン、またはセグメントと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子または遺伝子発現産物の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、または１００個の連続するヌクレオチドにわたって実質的に配列が相同する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子または遺伝子発現産物の全配列にわたって実質的に配列が相同する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子または遺伝子発現産物の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、または１００個の連続するヌクレオチドにわたって全配列が同一である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子またはその遺伝子産物の全長にわたって全配列が同一である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、中程度またはストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子に結合する。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を介して作用する。いくつかの実施形態では、１つのｄｓＲＮＡ鎖は、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子の領域、部分、ドメイン、またはセグメントと少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００個の連続するヌクレオチドにわたって実質的に配列が相同する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子の全長にわたって実質的に配列が相同する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を介して作用する）、ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖は、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子の領域、部分、ドメイン、またはセグメントと部分的に相補的である（例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方または両方は、ＡＭＩＧＯ−２遺伝子の領域、部分、ドメイン、またはセグメントと完全に相補的である。配列「相補性」は、その水素結合特性の結果としての特定の窒素含有塩基間の化学的親和性をいう（すなわち、アデニンおよびウラシル（または、ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡの場合、チミン）を相互に併置し、グアニンおよびシトシンを相互に併置する場合に逆平行二重鎖を形成することができるような塩基配列を有する２つの核酸鎖の性質）。したがって、完全に相補的な配列は、ヌクレオチド配列が逆平行二重鎖を形成する場合に塩基配列の完全な１対１の対応（すなわち、アデニン対ウラシルおよびグアニン対シトシン）を有する２つの配列であろう。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用する。この配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づく（またはこれからデザインする）ことができ、これを使用して特定の細胞または組織中の同一であるか、類似するか、相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認、または検出する。
【０２５１】
小分子
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは小分子である。本明細書中で使用される場合、用語「小分子」は、分子量が約１０キロダルトン未満である有機または無機非ポリマー化合物をいう。小分子の例には、ペプチド、オリゴヌクレオチド、有機化合物、および無機化合物などが含まれる。いくつかの実施形態では、小分子は、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１キロダルトン未満の分子量を有する。
【０２５２】
模倣物
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは模倣物である。本明細書中で使用される場合、用語「模倣物」は、ペプチド活性を模倣する化合物いうために使用される。模倣物は非ペプチドであるが、非ペプチド結合によって連結したアミノ酸を含むことができる。１９９７年６月１０日発行の米国特許第５，６３７，６７７号およびその特許出願（全てが、本明細書中で参考として援用される）は、模倣物の産生に関する詳細なガイダンスを含む。簡潔に述べれば、ＡＭＩＧＯ−２の三次元構造と特異的に相互作用するペプチドの三次元構造を、ペプチドではない分子によって再現する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２模倣物は、ＡＭＩＧＯ−２の模倣物またはＡＭＩＧＯ−２のリガンドの模倣物である。
【０２５３】
デコイ受容体
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＡＭＩＧＯ−２受容体の少なくとも一部を含むデコイ受容体である。いくつかの実施形態では、デコイ受容体は、天然のＡＭＩＧＯ−２受容体とＡＭＩＧＯ−２リガンドを競合する。いくつかの実施形態では、デコイ受容体を標識して、定量、定性決定（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および／または視覚化を容易にする。他の実施形態では、さらに、デコイ受容体および／またはデコイ受容体−ＡＭＩＧＯ−２複合体の単離および／または分離を容易にする部分を含む。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２受容体リガンドとの結合の際、デコイ受容体により、（未変性ＡＭＩＧＯ−２受容体と比較して）シグナルが増加する。いくつかの実施形態では、デコイ受容体は、ＡＭＩＧＯ−２リガンドの捕捉およびシグナル伝達ＡＭＩＧＯ−２受容体との相互作用の防止によって機能する非シグナル伝達分子である。いくつかの実施形態では、デコイ受容体は、抗体または抗体フラグメントと融合したＡＭＩＧＯ−２受容体の少なくとも一部を含む。
【０２５４】
癌の治療／防止方法
本発明は、治療有効量の１つまたは複数の本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを被験体に投与する工程を含む、被験体の癌または癌の症状を治療および／または防止する方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は、ＡＭＩＧＯ−２の過剰発現に関連する癌である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または膵臓癌である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌または結腸癌である。いくつかの実施形態では、被験体を、癌を有するか癌を罹患しやすいと診断した。いくつかの実施形態では、被験体を、胃癌以外の癌を有するか癌を罹患しやすいと診断した。
【０２５５】
癌の症状は当業者に周知であり、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、脱力、過度の疲労、摂食困難（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ  ｅａｔｉｎｇ）、無食欲、慢性咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、嘔気、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨隆、膨満感（ｂｌｏａｔｉｎｇ）、腹膜腔内の液体、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、痛み）、痛み、吐血、重度の発汗（ｈｅａｖｙ  ｓｗｅａｔｉｎｇ）、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移、および膵臓転移、および嚥下困難（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ  ｓｗａｌｌｏｗｉｎｇ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５６】
調整化合物の治療有効量は、医化学者に周知の手順に従って経験的に決定することができ、治療有効量は、とりわけ、患者の年齢、容態の重症度、および所望の最終的な薬学的処方物に依存するであろう。本発明のモジュレーターを、例えば、吸入または座剤によって投与するか、膣組織、直腸組織、尿道組織、口腔組織、および舌下組織の洗浄などによって粘膜組織に投与するか、経口、局所、鼻腔内、腹腔内、非経口、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間質、動脈内、皮下、眼内、滑液嚢内、経上皮、および経皮に投与することができる。いくつかの実施形態では、インヒビターを、洗浄、蛍光、または動脈内に投与する。他の適切な導入方法には、再充填可能なデバイスまたは生分解性デバイスおよび遅延放出または徐放性重合体デバイスも含まれ得る。上記で考察するように、本発明の治療組成物を、他の公知の抗癌薬または他の公知の抗骨疾患治療レジメンとの併用療法の一部として投与することもできる。
【０２５７】
本発明は、さらに、患者におけるＡＭＩＧＯ−２関連生物活性を調整する方法を提供する。本方法は、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２生物活性を調整するのに有効な量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む。ＡＭＩＧＯ−２生物活性の適切な測定アッセイは、上または以下に記載されている。
【０２５８】
本発明はまた、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、阻害を必要とする患者の癌細胞成長を阻害する方法を提供する。ＡＭＩＧＯ−２関連細胞成長の適切な測定アッセイは当業者に公知であり、上または以下に記載されている。
【０２５９】
本発明はまた、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーを調整する化合物を１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を含む癌を有する患者に投与することによる、（例えば、かかる方法を必要とする患者における）癌細胞成長を阻害する方法を提供する。１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２の下流マーカーを、ｃ−ＭＹＣ、ｃ−Ｊｕｎ、ＦｏｓＬ１、または細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）からなる群より選択することができる。ＥＲＫの調整は、ＥＲＫのリン酸化または１つまたは複数のその基質のＥＲＫによるリン酸化の調整であり得る（上記を参照のこと）。本方法は、任意選択的に、ＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞（例えば、ＡＭＩＧＯ−２  ｍＲＮＡまたはＡＭＩＧＯ−２タンパク質）を含む癌を有すると患者を同定する工程を含むことができる。
【０２６０】
本発明は、さらに、必要とする患者における癌を阻害する方法を提供する。本方法は、患者が本明細書中に記載のＡＭＩＧＯ−２療法の候補であるかどうかを決定する工程および患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補である場合に治療有効量の１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む。患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補でない場合、患者を、従来の癌治療法を使用して処置する。
【０２６１】
本発明は、さらに、癌を有すると診断されるか疑われる患者における癌を阻害する方法を提供する。本方法は、治療有効量の１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む。
【０２６２】
本発明はまた、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、患者の２つまたはそれを超える細胞の相互作用を阻害する方法を提供する。ＡＭＩＧＯ−２関連細胞相互作用の適切な測定アッセイは当業者に公知であり、上または以下に記載されている。
【０２６３】
本発明はまた、治療有効量の１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、患者の癌の１つまたは複数の症状を調整する方法を提供する。
【０２６４】
本発明は、さらに、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、阻害を必要とする患者の細胞成長を阻害する方法を提供する。細胞成長の適切な測定アッセイは当業者に公知であり、上または以下に記載されている。
【０２６５】
本発明はまた、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、癌細胞の遊走を阻害する必要がある患者の癌細胞の遊走を阻害する方法を提供する。ＡＭＩＧＯ−２関連細胞遊走の適切な測定アッセイは当業者に公知であり、上または以下に記載されている。
【０２６６】
本発明は、さらに、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、癌細胞の接着を阻害する必要がある患者の癌細胞の接着を阻害する方法を提供する。ＡＭＩＧＯ−２関連細胞接着の適切な測定アッセイは当業者に公知であり、上または以下に記載されている。
【０２６７】
本発明はまた、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、血管形成を阻害する必要必要がある患者の血管形成を阻害する方法を提供する。血管形成の適切な測定アッセイは当業者に公知であり、上または以下に記載されている。
【０２６８】
本発明はまた、癌を発症しやすいか、癌転移しているか、転移していたので、回帰または再発に感受性を示す患者を予防的に処置する方法を提供する。本方法は、特に、例えば、癌または転移腫瘍の家族歴を有するか、癌転移に対する遺伝的素因を示す高リスクの個体で有用である。いくつかの実施形態では、腫瘍はＡＭＩＧＯ−２関連腫瘍である。さらに、本方法は、外科的切除によって除去されたか、従来の癌治療を使用して処置されたＡＭＩＧＯ−２関連腫瘍を有していた患者のＡＭＩＧＯ−２関連腫瘍の再発を防止するのに有用である。
【０２６９】
本発明はまた、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、癌の進行および／または癌進行の原因を阻害する方法を提供する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、抗癌治療を必要とする患者を、化学療法および／または放射線療法と併せて本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターで処置する。例えば、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの投与後、患者を、治療有効量の抗癌照射で治療することもできる。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターと組み合わせて化学療法による治療を行う。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、化学療法および放射線療法と組み合わせて投与する。
【０２７１】
治療方法は、単一または複数の用量の１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて、滅菌され、無発熱物質であり、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを含む注射用薬学的組成物として投与する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、本発明の治療レジメンを、癌のための従来の治療レジメン（手術、放射線療法、ホルモン除去療法（ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ）、および／または化学療法が含まれるが、これらに限定されない）と共に使用する。本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、従来の癌治療の前、同時、または後に投与することができる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれを超える異なるＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、患者に投与する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの患者への投与量は、とりわけ、１つまたは複数の染色体不安定性、キナーゼ活性、腫瘍形成能、転移、ＡＭＩＧＯ−２シグナル伝達、細胞接着、癌細胞生存、ＥＲＫリン酸化、癌細胞の成長、腫瘍形成、サイクリン産生、細胞増殖、細胞周期を介した進行、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、細胞質リン酸化ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベル、および血管形成の阻害に有効である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの患者への投与量は、アポトーシスによる癌細胞死の増加に有効である。
神経系に関連する疾患および障害の治療方法
本発明はまた、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを患者に投与する工程を含む、治療を必要とする患者の神経系の疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、１つまたは複数のアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンチントン病、脊髄損傷、卒中、顔面神経損傷、糖尿病関連神経損傷、および網膜変性の治療方法を提供する。
【０２７４】
下流遺伝子発現の撹乱方法
いくつかの実施形態では、本発明は、１つまたは複数の遺伝子の撹乱方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＭＩＧＯ−２を過剰発現する細胞をＡＭＩＧＯ−２モジュレーターと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の発現を、治療有効量のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの患者への投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで撹乱する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＬＯＣ３３９９８８、ＳＡＴＢ１、Ｃ１１ｏｒｆ２１、ＦＡＭ３Ｂ、ＵＣＰ２、ＦＮＤＣ３Ａ、ＤＲＥ１、ＰＰＩＣ、ＡＳＳ、ＫＩＡＡ１７１８、ＡＬＤＨ６Ａ１、ＬＲ８、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＬＩＰＣ、ＦＺＤ１０、ＣＯＬ４Ａ２、ＴＰＰ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＡＤＣＹ９、ＡＺＧＰ１、ＵＳＨ１Ｃ、ＲＡＢ４０Ｂ、ＳＭＯＣ２、ＲＲＡＧＤ、ＮＵＤＴ２１、Ｃ１４ｏｒｆ１、ＴＰＰ１、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＫＩＡＡ０６５７、ＱＰＲＴ、ＲＦＫ、ＫＣＮＨ２、ＰＡＱＲ８、ＳＥＰＴ６、ＬＯＣ２８５７５８、ＥＦＮＡ１、ＬＧＡＬＳ８、ＡＴＰ１０Ｄ、ＥＲＢＢ３、ＣＨＳＴ１３、ＦＬＪ２５４７６、ＭＣＦ２Ｌ、ＦＬＪ１０１５９、ＲＡＢ１３、ＺＮＦ２６１、ＵＳＨ１Ｃ、ＯＳＴＭ１、ＢＭＰＲ２、ＩＰＯ９、ＺＮＦ２２６、ＨＲＡＳＬＳ３、ＥＲＢＢ３、ＰＲＯＳ１、ＡＬＤＨ６Ａ１、ＰＰＴ２、ＴＦＦ３、Ｃ２１ｏｒｆ８６、ＬＲＲＣ８Ｂ、ＢＡＺ２Ｂ、ＨＩＰ１、ＲＮＡＳＥ４、ＦＡＭ４６Ｃ、ＳＴＡＲＤ１０、ＫＬＦ１３、ＢＡＣＥ１、ＦＣＧＲＴ、ＱＰＣＴ、ＫＣＴＤ１４、ＦＲＡＳ１、ＦＡＭ６３Ｂ、ＳＰＯＮ２、ＩＱＷＤ１、ＢＭＰＲ２、ＴＸＮＩＰ、ＺＢＴＢ４、ＤＤＡＨ２、ＺＮＦ４２０、ＬＧＡＬＳ８、ＮＥＵ１、ＦＵＣＡ１、ＧＲＮ、Ｃ２０ｏｒｆ１９４、ＳＥＰＴ６、ＡＳＰＳＣＲ１、ＫＬＨＤＣ５、ＧＲＮ、ＳＴＡＲＤ１０、ＭＧＣ１２９８１、Ｃ１４ｏｒｆ１、ＥＰＢ４１、ＡＬＤＨ２、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＦＮＤＣ３Ａ、ＣＹＰ２Ｒ１、ＰＡＱＲ８、ＲＮＦ３８、ＫＩＡＡ１３２７、ＡＬＳ２ＣＲ３、ＥＰＳ８Ｌ３、ＢＡＣＥ１、ＳＥＰＴ６、ＩＬ２７ＲＡ、ＤＴＸ３Ｌ、ＣＢＰＩＮ、ＺＮＦ６２７、Ｃｌｏｒｆ８５、ＡＺＧＰ１、ＧＲＮ、ＳＵＯＸ、ＰＳＭＢ８、ＡＲＨＧＡＰ１、ＤＡＣＨ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＰＬＥＫＨＢ１、ＳＥＣ１４Ｌ１、Ｃ２ｏｒｆ７、ＴＰＤ５２Ｌ１、ＰＧＭ２、Ｃ１４ｏｒｆ４、ＺＮＦ２８６、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＰＳＭＥ１、ＺＮＦ２６８、ＴＲＡＦ５、ＳＥＰＴ６、ＭＧＣ４５４７４、ＷＩＰＩ−２、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＺＢＥＤ１、ＳＥＣ２４Ａ、ＧＧＴＬ３、ＴＲＩＭ４、ＰＰＭ１Ｈ、ＪＭＪＤ１Ａ、ＤＯＫ４、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＰＳＡＰ、ＥＸＯＣ７、Ｃ６ｏｒｆ８０、ＲＥＲＥ、ＺＮＦ６４１、ＭＸＲＡ７、ＲＡＣ１、ＮＤＳＴ１、ＪＡＧ２、ＺＮＦ３２９、ＳＥＰＴ６、ＫＬＨＤＣ５、ＳＴＸＢＰ１およびＵＢＥ２Ｌ３、ならびにその組み合わせおよびサブコンビネーションからなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の発現を阻害する。
【０２７５】
併用療法
いくつかの実施形態において、本発明は、癌に対する有効性をさらに改善するための２つまたはそれを超えるＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターはモノクローナル抗体である。２つまたはそれを超えるＡＭＩＧＯ−２抗体を含む組成物を、癌を罹患しているか癌にかかりやすいヒトまたは哺乳動物に投与することができる。１つまたは複数の抗体を、別の治療薬（細胞毒性薬剤または癌化学療法薬など）と共に投与することもできる。治療薬が治療効果を発揮する期間が重複する限り、２つまたはそれを超える治療薬を同時または同一経路で投与する同時投与は必要ない。異なる日または週に投与する場合、同時または連続投与が意図される。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、異なる抗体の組み合わせ投与（すなわち、「カクテル」）が意図される。かかる抗体カクテルは、異なるエフェクター機構を活用するか細胞傷害性抗体を免疫エフェクター機能性に依存する抗体と直接組み合わせた抗体を含むので、一定の利点を有し得る。組成物中のかかる抗体は、相乗的治療効果を示すことができる。
【０２７７】
細胞毒性薬剤は、細胞の機能を阻害または防止し、そして／または細胞を破壊する物質をいう。本用語は、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅ）、化学療法薬、および毒素（細菌、真菌、植物、または動物を起源とする酵素活性毒素または合成毒素など）、またはそのフラグメントを含むことが意図される。非細胞毒性薬剤は、細胞機能を阻害または防止せず、そして／または細胞破壊を起こさない物質をいう。非細胞毒性薬剤には、細胞傷害性となるように活性化することができる薬剤が含まれ得る。非細胞毒性薬剤には、ビーズ、リポソーム、マトリックス、または粒子（例えば、米国特許出願公開第２００３／００２８０７１号および同第２００３／００３２９９５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）が含まれ得る。かかる薬剤を、本発明の抗体と抱合、カップリング、連結、または会合することができる。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、従来の癌治療薬を、本発明の組成物と共に投与する。従来の癌治療薬には、以下が含まれる。
【０２７９】
ａ）癌化学療法薬、
ｂ）さらなる薬剤、
ｃ）プロドラッグ。
【０２８０】
癌化学療法薬には、アルキル化剤（カルボプラチンおよびシスプラチンなど）；ナイトロジェンマスタードアルキル化剤；ニトロソ尿素アルキル化剤（カルムスチン（ＢＣＮＵ）など）；代謝拮抗物質（メトトレキサートなど）；フォリン酸；プリンアナログ代謝拮抗物質；メルカプトプリン；ピリミジンアナログ代謝拮抗物質（フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））など）；ホルモン抗新生物薬（ゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェンなど）；天然抗新生物薬（アルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンα、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）など）；抗生物質天然抗新生物薬（ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣが含まれる）など）；およびビンカアルカロイド天然抗新生物薬（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンなど）；ヒドロキシ尿素；アセグラトン、アドリアマイシン、イフォスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍性多糖類、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミド（サイトトキシン（登録商標））、シゾフィラン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ドラスタチン、ドラスタチンアナログ（オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）など）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ミトザントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、エスペラミシン（例えば、米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、ネオカルチノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ぺプロマイシン、ベスタチン（ウベニメクス（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８１】
癌患者の治療薬として使用されるさらなる薬剤には、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；インターロイキン１〜１８（変異体およびアナログが含まれる）；インターフェロンまたはサイトカイン（インターフェロンα、βおよびγなど）；ホルモン（黄体形成ホルモン形成ホルモン（ＬＨＲＨ）およびアナログならびに性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）など）；成長因子（トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、およびインスリン成長因子（ＩＧＦ）など）；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）；浸潤阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１〜７（ＢＭＰ１〜７）；ソマトスタチン；サイモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管形成因子；抗原性物質；およびプロドラッグが含まれる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、１つまたは複数の従来の癌免疫療法薬と併せて投与することができる。免疫療法薬には、免疫系を刺激する（例えば、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および好中球の産生または活性を刺激する）ことを目的とする免疫療法薬（インターフェロンα、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１２、またはインターロイキン−２など）が含まれ得る。免疫療法薬には、癌治療に有用な１つまたは複数のワクチン薬も含まれ得る。例えば、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、所与の癌または癌抗原（例えば、ＭＡＧＥ抗原）のペプチド、ポリペプチド、またはウイルスベクターワクチンと共に（例えば、同時、ほぼ同時、または患者の全治療ストラテジーの１構成要素として）投与することができる。１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、特定の癌または癌抗原をターゲティングする１つまたは複数のモノクローナル抗体治療薬（例えば、薬剤）と共に投与することもできる。例えば、リツキシマブ（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８）−一定のＢ細胞悪性疾患中に存在するＣＤ２０抗原をターゲティングするキメラ抗体−は、免疫エフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞）上のＦｃ受容体に結合し、これらの免疫エフェクター細胞によって腫瘍細胞の破壊を促進する（抗体依存性細胞媒介性毒性とも呼ばれる、上記を参照のこと）。本明細書中に記載のように、特定の腫瘍細胞または腫瘍細胞抗原に結合する抗体を使用して、補体依存性細胞傷害性応答を誘発することもできる。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、１つまたは複数の癌のための細胞周期ターゲティング薬と併せて投与することができる。細胞周期ターゲティング薬には、細胞周期の特異的タンパク質メディエーター（例えば、サイクリン依存性キナーゼ）をターゲティングするもの（ロスコビチンまたはフラボピリドールなど）が含まれ得る。細胞周期ターゲティング薬（例えば、化合物）には、細胞周期の特定の時期に分裂細胞（例えば、癌細胞）を停止させる薬剤（タキソール、スタウロスポリン、ＵＣＮ−０１、ロスコビチン、またはビンブラスチンなどであるが、決してこれらに限定されない）も含まれ得る。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターおよび１つまたは複数のさらなる薬剤を、同時に投与する。他の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを最初に投与し、１つまたは複数のさらなる薬剤を２番目に投与する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のさらなる薬剤を最初に投与し、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを２番目に投与する。１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、以前施されたまたは現在施される療法と置き換えるか増強することができる。例えば、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターでの治療の際、１つまたは複数のさらなる薬剤の投与を停止するか減少させることができる（例えば、より低いレベルで投与することができる）。他の実施形態では、以前の療法の投与を維持する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターのレベルが治療効果を得るのに十分なレベルに到達するまで以前の療法を維持するであろう（例えば、所与の患者の至適投薬量を決定する場合）。２つの療法を組み合わせて施すことができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを被験体（例えば、ヒト患者）に投与して、同時投与される１つまたは複数の薬剤のレベルまたは投薬量を相殺することができる。例えば、第１の療法（例えば、タキソールなどの１つまたは複数のさらなる薬剤）の投薬量が患者に有毒であるか許容度が低い場合、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを投与する場合に投薬量を低下させることができる。１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの投与により、毒性または許容度の低い副作用を伴わずに第１の療法の治療効果と等価またはより高い治療効果が得られる。
【０２８６】
プロドラッグは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対して細胞傷害性が低いか細胞傷害性が無く、酵素的に活性化するか活性なまたはより活性の高い親形態に変換することができる薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体をいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａら、，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら、，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。プロドラッグには、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意選択的に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは任意選択的に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性の高い細胞傷害性遊離薬に変換することができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害薬の例には、上記の化学療法薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８７】
臨床的態様
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または膵臓癌、および癌転移に特に有用である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌または結腸癌である。
【０２８８】
薬学的組成物
本発明はまた、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物を、注射液（溶液または懸濁液）として調整し、注射前の溶液、懸濁液、または液体ビヒクルに溶かすのに適した固体形態を調製することもできる。リポソームは、薬学的に許容可能なキャリアの定義に含まれる。薬学的に許容可能な塩は、薬学的組成物中に存在することもできる（例えば、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩など）および有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩など））。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５）Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｍｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｍｓで得られる。
【０２８９】
ＡＭＩＧＯ−２の検出方法
本発明はまた、ＡＭＩＧＯ−２の検出方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２は、患者または患者サンプル中に存在する。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを含む組成物を患者に投与する工程および患者中の画像化剤の局在化を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、患者サンプルは癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、画像化剤に連結するか、検出可能に標識する。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターは、画像化剤と抱合したＡＭＩＧＯ−２抗体であり、これを患者に投与して、１つまたは複数の腫瘍を検出するか、ＡＭＩＧＯ−２療法に対する患者の感受性を決定する。標識抗体は、細胞上の高密度の受容体に結合し、それにより、腫瘍細胞上に蓄積されるであろう。標準的な画像化技術を使用して、腫瘍部位を検出することができる。
【０２９０】
本発明はまた、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを含む組成物をサンプルと接触させる工程およびサンプル中のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターの存在を検出する工程を含む、ＡＭＩＧＯ−２を発現または過剰発現する細胞または腫瘍を画像化／検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、サンプルは患者サンプルである。いくつかの実施形態では、患者サンプルは癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを、画像化剤に連結するか、検出可能に標識する。
【０２９１】
本発明はまた、患者、細胞、またはサンプル中に存在するＡＭＩＧＯ−２量を定量する方法を提供する。本方法は、１つまたは複数の抗体、プローブ、または小分子を患者またはサンプルに投与する工程およびサンプル中に存在するＡＭＩＧＯ−２量を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗体、プローブ、または小分子を、画像化剤に連結するか、検出可能に標識する。かかる情報は、例えば、腫瘍がＡＭＩＧＯ−２に関連するかどうか、したがって、特定の治療を使用または回避すべきかどうかを示す。いくつかの実施形態では、当業者に周知の標準的技術を使用して、腫瘍細胞を含むと考えられるサンプルを得、標識抗体、プローブ、オリゴヌクレオチド、および小分子と接触させる。任意の結合しない標識抗体、プローブ、オリゴヌクレオチド、または小分子の除去後、細胞に結合した標識抗体、プローブ、オリゴヌクレオチド、または模倣物の量、あるいは非結合物として除去された抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、または模倣物の量を決定する。この情報は、ＡＭＩＧＯ−２の存在量に直接関連する。
【０２９２】
当業者に周知の手順を使用して、画像化を行うことができる。例えば、ラジオシンチグラフィ、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴスキャン）によって画像化を行うことができる。画像化剤のために最も一般的に使用される放射性標識には、放射性要素およびインジウムが含まれる。ＣＴスキャンによる画像化は、鉄キレートなどの重金属を使用することができる。ＭＲＩスキャニングは、ガドリニウムまたはマンガンのキレートを使用することができる。さらに、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放射体を使用して、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）が可能であり得る。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターはＡＭＩＧＯ−２抗体である。いくつかの実施形態では、モジュレーターを、画像化剤に連結するか、検出可能に標識する。いくつかの実施形態では、画像化剤は、１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、または２０６Ｂｉである。
【０２９４】
検出方法は、当業者に周知である。例えば、ポリヌクレオチドの検出方法には、ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ＲＮＡ保護、およびＤＮＡハイブリッド形成（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドの検出方法には、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、スロットブロッティング、ペプチド質量フィンガープリンティング、電気泳動、免疫化学、および免疫組織化学が含まれるが、これらに限定されない。検出方法の他の例には、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、時間分解蛍光免疫アッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）、二色蛍光顕微鏡法、または免疫クロマトグラフィアッセイ（ＩＣＡ）（全て当業者に周知）が含まれるが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＣＲ法を使用してポリヌクレオチド発現を検出し、ＥＬＩＳＡテクノロジーを使用してポリペプチド産生を検出する。
【０２９５】
細胞毒性薬剤または診断薬剤の細胞への送達方法
本発明はまた、ＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞に細胞毒性薬剤または診断薬剤を送達する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞毒性薬剤または診断薬剤に抱合した本発明のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを細胞と接触させる工程を含む。
【０２９６】
癌患者の予後を決定する方法
本発明はまた、ＡＭＩＧＯ−２関連癌を有する患者の予後を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の癌細胞レベルの、癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２レベルに対する比を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２レベルが細胞膜を含まない癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２レベルよりも高い患者は、患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を有し、且つＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示すことを示す。いくつかの実施形態では、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の、細胞膜を含まない癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２と比較した比が少なくとも２：１であることは、患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を有し、且つＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示すことを示す。いくつかの実施形態では、細胞膜に局在化したＡＭＩＧＯ−２の、細胞膜を含まない癌細胞の他の領域に局在化したＡＭＩＧＯ−２に対する比が少なくとも３：１であることは、患者がＡＭＩＧＯ−２関連癌を有し、且つＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示すことを示す。
【０２９７】
ＡＭＩＧＯ−２療法に対する感受性を決定する方法
本発明はまた、ＡＭＩＧＯ−２療法に対する患者の感受性を決定する方法を提供する。本方法は、患者または患者サンプル中のＡＭＩＧＯ−２の差分発現の証拠の存在または非存在を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、患者またはサンプル中のＡＭＩＧＯ−２の差分発現の証拠の存在は、ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示す患者を示す。いくつかの実施形態では、患者またはサンプル中のＡＭＩＧＯ−２の差分発現の証拠の非存在は、ＡＭＩＧＯ−２療法の候補ではない患者を示す。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２は、正常細胞と比較して癌細胞中で有意に上方制御されないが、癌細胞と正常細胞でＡＭＩＧＯ−２発現に対する依存性が異なる。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２調整は、腫瘍−間質相互作用に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２の阻害は、腫瘍と間質組織との間の相互作用を阻害する。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、治療方法は、画像化剤に連結したＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを含む組成物を必要とする患者に投与し、患者中の遺伝子または遺伝子産物の証拠の存在または非存在を検出することを含む、ＡＭＩＧＯ−２療法に感受性を示す患者を最初に同定する工程を含む。いくつかの実施形態では、治療方法は、さらに、患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補である場合に患者に１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを投与する工程および患者がＡＭＩＧＯ−２療法の候補でない場合、患者を従来の癌治療で処置する工程を含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを単独で投与するか、患者が癌を有するか癌に感受性を示す場合に他の抗癌薬と組み合わせて投与する。
【０３００】
癌の進行を評価する方法
本発明はまた、第１の時点での生体サンプル中のＡＭＩＧＯ−２の発現産物レベルを第２の時点の同一の発現産物レベルと比較する工程を含む、患者の癌の進行を評価する方法を提供する。第１の時点と比較した第２の時点での発現産物レベルの変化は、癌の進行を示す。
【０３０１】
スクリーニング方法
本発明はまた、抗癌薬のスクリーニング方法を提供する。本方法は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を候補化合物と接触させる工程およびＡＭＩＧＯ−２関連生物活性が調整されたかどうかを決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の染色体不安定性、キナーゼ活性、腫瘍形成能、癌細胞の成長、癌細胞生存、腫瘍形成、癌細胞増殖、転移、細胞遊走、基質リン酸化、サイクリン産生、血管形成、細胞増殖、細胞周期制御、シグナル伝達、細胞間接着、細胞−細胞膜相互作用、細胞−細胞外基質相互作用、足場非依存性増殖、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質の細胞膜への局在化、ＡＭＩＧＯ−２とＡＭＩＧＯ−１またはＡＭＩＧＯ−３の一方または両方との間の相互作用、およびＡＭＩＧＯ−２発現の阻害は、抗癌薬であることを示す。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって同定された抗癌薬を、治療方法および／または診断方法において必要とする患者に投与する。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、下流マーカーの活性またはレベルを調整する能力について推定モジュレーターをスクリーニングすることによって抗癌薬（特に、抗転移癌薬）をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、サイクリンＤ１、サイクリンＢ１、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｊｕｎ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）のレベルを減少させる候補薬を、抗癌薬と同定する。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、候補化合物の存在下および非存在下でＡＭＩＧＯ−２を発現する１つまたは複数の細胞を含むサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化を比較する工程を含む。いくつかの実施形態では、候補化合物の非存在下でのサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化と比較した候補化合物の存在下でのサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のリン酸化の調整は、候補化合物がＡＭＩＧＯ−２モジュレーターであることを示す。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、免疫沈降抗体を使用して、ＡＭＩＧＯ−２をサンプルから単離する。いくつかの実施形態では、免疫沈降抗体は、本発明の抗ＡＭＩＧＯ−２抗体である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２リン酸化はセリン／トレオニンリン酸化である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２リン酸化を、ホスホセリン／トレオニン抗体を使用して検出および／または定量する。いくつかの実施形態では、免疫沈降抗体は、ホスホセリン／トレオニン抗体である。
【０３０５】
ＡＭＩＧＯ−２調整の検出方法
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞中のＡＭＩＧＯ−２活性の調整を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＭＩＧＯ−２を発現する細胞を含むサンプルをＡＭＩＧＯ−２活性の調整に十分な時間ＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程、およびホスホセリン／トレオニン抗体を使用してサンプル中のＡＭＩＧＯ−２セリン／トレオニンリン酸化をコントロールと比較する工程を含む。いくつかの実施形態では、コントロールと比較したサンプルの細胞中のＡＭＩＧＯ−２のセリン／トレオニンリン酸化の変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２リン酸化はセリン／トレオニンリン酸化である。いくつかの実施形態では、ＡＭＩＧＯ−２リン酸化を、ホスホセリン／トレオニン抗体を使用して検出および／または定量する。いくつかの実施形態では、免疫沈降抗体は、ホスホセリン／トレオニン抗体である。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２を過剰発現する細胞を含むサンプル中のＡＭＩＧＯ−２活性の調整を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整に十分な時間細胞中でＡＭＩＧＯ−２を過剰発現する工程、ＡＭＩＧＯ−２を本発明のＡＭＩＧＯ−２抗体で免疫沈降する工程、およびホスホセリン／トレオニン抗体を使用してサンプル中のＡＭＩＧＯ−２セリン／トレオニンリン酸化をコントロールと比較する工程を含む。いくつかの実施形態では、コントロールと比較したサンプル中のＡＭＩＧＯ−２のセリン／トレオニンリン酸化の変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調製に十分な時間サンプルをＡＭＩＧＯ−２インヒビターと接触させる工程、ＡＭＩＧＯ−２を抗ホスホセリン／トレオニン抗体で免疫沈降する工程、および本発明の抗体を使用して、サンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルをコントロールと比較する工程を含む。いくつかの実施形態では、コントロールと比較したサンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルの変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整に十分な時間サンプル中でＡＭＩＧＯ−２を過剰発現する工程、ＡＭＩＧＯ−２を抗ホスホセリン／トレオニン抗体で免疫沈降する工程、および本発明のＡＭＩＧＯ−２抗体を使用して、サンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルをコントロールと比較する工程を含む。いくつかの実施形態では、コントロールと比較したサンプル中のリン酸化ＡＭＩＧＯ−２レベルの変化は、ＡＭＩＧＯ−２活性の調整を示す。
【０３０９】
ＡＭＩＧＯ−２の精製方法
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２を含むサンプルからＡＭＩＧＯ−２タンパク質を精製する方法を提供する。本方法は、固体支持体に結合した本発明のＡＭＩＧＯ−２抗体を含むアフィニティマトリックスを準備する工程、サンプルをアフィニティマトリックスと接触させてアフィニティマトリックス−ＡＭＩＧＯ−２タンパク質複合体を形成する工程、サンプルの残存物からアフィニティマトリックス−ＡＭＩＧＯ−２タンパク質複合体を分離する工程、およびアフィニティマトリックスからＡＭＩＧＯ−２タンパク質を放出させる工程を含む。
【０３１０】
キット
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＭＩＧＯ−２の差分発現と相関する遺伝子または遺伝子産物の画像化および／または検出のためのキットを提供する。本発明のキットは、検出可能な抗体、小分子、オリゴヌクレオチド、デコイ、模倣物、またはプローブ、および本発明の方法の実施のための説明書を含む。任意選択的に、キットはまた、１つまたは複数の以下を含むことができる。コントロール（ポジティブおよび／またはネガティブ）、コントロール用の容器、正および／または負の結果の代表例の写真または描写。
【０３１１】
本明細書中に記載の各特許、特許出願、受入番号、および刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０３１２】
本明細書中に記載の修正形態に加えて、本発明の種々の修正形態は、上記説明を考慮して当業者に明らかであろう。かかる修正形態は、添付の実施形態の範囲内であることも意図される。本発明を、以下の実施例でさらに証明するが、これらは例示のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【０３１３】
（実施例１）ＡＭＩＧＯ−２発現はいくつかの癌組織で上方制御される
ｍＲＮＡを、レーザー捕捉顕微切断（ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）（ＬＣＭ）された結腸癌組織、乳癌組織、および前立腺癌組織から単離し、ｍＲＮＡを、各正常細胞のプール（図１Ａ；ＲＳＭ＝基準標準混合物（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｉｘ））または各組織サンプル内の癌細胞に隣接する正常細胞（図１Ｂ）と比較した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ  ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）（図１Ａ）または癌組織から作製したｃＤＮＡライブラリーを使用して組織内で生成したアレイ（図１Ｂ）のいずれかに対するオリゴヌクレオチドアレイ分析によってサンプルを試験した。図１Ａおよび１Ｂ中の各表について、患者の番号を示し、その後に癌と正常サンプルとの間の相対発現を示す。  （「％ＧＥ２Ｘ」および「＞＝２Ｘ」は２倍上方制御を示し、「％ＬＥ．５Ｘ」および「＜＝２ｘ」は２倍下方制御を示す）。両チップ組は、ＡＭＩＧＯ−２が結腸癌中で上方制御されることを証明した。組織内チップを使用して行った実験は、ＡＭＩＧＯ−２が乳癌および前立腺癌中でも上方制御されることを示した。これらの組織中での上方制御は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ実験では認められなかった。
【０３１４】
逆転写カップリングポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、正常組織サンプルおよび癌組織サンプル中の相対ＡＭＩＧＯ−２ｍＲＮＡレベルも試験した（図２）。正常組織のパネルならびに結腸、乳房、および前立腺ＬＣＭ（レーザー捕捉解剖）解剖したサンプルのプール（８人の患者／プール）を、半定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって比較した。２つのプライマー組を試験し、類似の結果（「ＡＢＴＰ  ５０８／５０９」と呼ばれるプライマー組由来のデータを図２に示す）を得た。試験した正常組織のうち、乳房および肺は、最も高い相対発現を示した。結腸癌は、正常結腸の５倍の上方制御および正常乳房の数倍の上方制御を示した。
【０３１５】
Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）を使用した癌組織および正常組織中のＡＭＩＧＯ−２ｍＲＮＡ発現のオリゴヌクレオチドアレイ分析のグラフを、図３および４に示す。正常組織型および癌組織型を、横軸に沿って示す。図４では、癌組織を、「ｃ＿」でラベルし（例えば、「ｃ＿ｂｒｅａｓｔ＿ｄｕｃｔ」は、乳癌組織サンプルを示す）正常組織を「ｎ＿」でラベルする。組織型を、既知である場合、組織の型およびサブタイプに関してさらにラベリングする。例えば、「ｃ＿ｂｒｅａｓｔ＿ｄｕｃｔ」は、乳房の管に局在化した乳癌由来の癌組織である。外科的除去の際にサブタイプが明確でなかったか未知であった場合、ラベルには、「非特定」を示す「ｎｓ」が含まれる。図３および４の縦軸上の各スポットは、１人の患者由来の組織サンプルを示し、縦軸上の最も高い各スポット（線形）は、プローブ組の相対発現レベルを示す。図３は線形分析を示す一方で、図４中のデータを、ｌｏｇ２スケールで示す。黒丸は線形検出範囲内における発現レベルを有するサンプルを示す。白丸は、遺伝子がプローブ組の検出限度未満である場合のサンプルにおける遺伝子発現の上限を示す。白四角は、プローブ組が飽和した場合のサンプル中の遺伝子発現の下限を示す。分析の実施前に、各プローブ組を、サンプルの巨大で多様な組にわたるその構成性プローブの挙動の分析によって較正した。この較正によって各プローブの相対感受性およびプローブ組応答がプローブ間で線形である強度の範囲を測定した。この範囲未満の強度を「非検出」と呼ぶ一方で、この範囲を超える強度を「飽和」と呼ぶ。サンプル間のハイブリッド形成および標識効率の変動により、較正の適用後に各アレイを規準化した。これにより、遺伝子発現に関する範囲の上限および下限が得られ、これはサンプルによっていくらか異なった。
【０３１６】
（実施例２）免疫組織化学により、ＡＭＩＧＯ−２が結腸癌および肺癌で発現することが明らかとなる
組織切片を脱パラフィン処理し、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  （Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）にて抗原回収（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を行った。標準的な細胞馴化を行い、次いで、細胞を一次抗体と６０分間インキュベートした。ウサギ抗ヒトＡＭＩＧＯ−２抗体（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）およびウサギＩｇＧプレブリードコントロール（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を、１０μｇ／ｍｌで使用した。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）およびその後にＶｅｎｔａｎａ  ＤＡＢ  Ｍａｐ  Ｋｉｔ  （Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を検出のために使用した。ＶｅｎｔａｎａヘマトキシリンおよびＢｌｕｉｎｇ試薬（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を対比染色のために使用し、切片をアルコールで段階的に脱水し、キシレン中で清浄化し、合成封入剤を使用してカバースリップをのせた。
【０３１７】
染色は、ＡＭＩＧＯ−２が腫瘍細胞および腫瘍間質で発現することを示す。腫瘍周辺の間質組織中のＡＭＩＧＯ−２発現は、腫瘍自体における発現と等価またはより高いことが認められた。これは、ＡＭＩＧＯ−２が腫瘍成長の支持に必要な脈管化に重要であり得ることを示す。
【０３１８】
（実施例３）ＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベルは異なる細胞株中で変化する
タンパク質溶解物を異なる細胞株の細胞ペレットから作製し、溶解物を、ＡＭＩＧＯ−２を特異的に認識するがＡＭＩＧＯ−１タンパク質やＡＭＩＧＯ−３タンパク質を認識しない市販のＡＭＩＧＯ−２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮのＭＡＢ２０８０）を使用した免疫沈降に供した。細胞株は、胃癌株（ＡＧＳ）、２つの結腸癌株（ＳＷ６２０およびＨＴ２９）、２つの結腸直腸株（Ｃｏｌｏ３２０およびＨＣＴ１１６）、および胚細胞株（２９３−ＣＭＶＩＩ）を含んでいた（図５）。免疫沈降によって捕捉されたタンパク質を、アクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、次いで、組織内で生成した抗ＡＭＩＧＯ−２抗体を使用したウェスタン分析に供した（図５）。結腸細胞株および胃細胞株において２つのバンド（約６３ｋＤおよび約９０ｋＤ）が認められた。より高い分子量の産物は、ＡＭＩＧＯ−２のグリコシル化形態、リン酸化形態、または多量体形態であり得る。相対半定量的ＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｔレベルを決定し、図５中の４つの細胞株の名称の隣に括弧書きで示す。Ｃｔ値は、一定サイクル数のＰＣＲ後の検出閾値を示す。より高いＣｔ値は、ｃＤＮＡの検出により多数のサイクルが必要であることを示し、したがって、より低いｍＲＮＡレベルであることを示す。試験した全ての細胞株は、ＡＭＩＧＯ−２ｍＲＮＡについて陽性であったが、タンパク質の検出能力はｍＲＮＡの減少に伴って低下した。図５は、ＡＭＩＧＯ−２が結腸癌細胞株において有意なレベルで発現することを示す。
【０３１９】
（実施例４）機能アッセイ
ｓｉＲＮＡのパネルを、ＳＷ６２０細胞（ＡＭＩＧＯ−２を発現する結腸癌細胞株）においてＡＭＩＧＯ−２ｍＲＮＡをノックダウンする能力について試験した（図６）。図６で試験したｓｉＲＮＡ配列を、表３に示す。図６に示すＡＭＩＧＯ−２ｓｉＲＮＡは全てＡＭＩＧＯ−２ｍＲＮＡレベルをいくらか低下させるが、ｓｉＲＮＡ薬であるＣ３１５−１．３およびＣ３１５−４．３はｍＲＮＡレベルの低下に最も有効なようであった。
【０３２０】
Ｃｏｌｏ３２０細胞およびＨＣＴ１１６細胞においてはウェスタンブロット分析によってＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベルは検出できなかったが（図５を参照のこと）、ＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡであるＣ３１５−１．３およびＣ３１５−４．３はこれらの細胞株においてＡＭＩＧＯ−２ｍＲＮＡレベルを低下させ（図７Ａおよび７Ｂ）、これは、Ｃｏｌｏ３２０細胞およびＨＣＴ１１６細胞における正のｍＲＮＡ発現と一致した。
【０３２１】
ＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの機能的結果を、いくつかの方法によって試験した。市販のキット（ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（登録商標），Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）を使用して、結腸細胞株  ＳＷ６２０におけるＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの際の細胞死の程度を評価した。非トランスフェクションサンプルおよびネガティブコントロールサンプルでは細胞死がほとんど認められなかった一方で、ポジティブコントロール遺伝子およびＡＭＩＧＯ−２のノックダウン（２つの異なるｓｉＲＮＡ試薬による）は、有意な毒性を示した（図８Ａ）。ＭＲＣ９細胞におけるＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの機能的結果も試験した。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡで処置した細胞においてより低い量の細胞死が認められたが、ＣＨＩＲ３１５−１．３ＳＩｓｉＲＮＡで処置したＭＲＣ９細胞で有意且つ再現可能な量の細胞死が認められた（図８Ｂ）。
【０３２２】
ＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの機能的結果を、胃癌細胞株ＡＧＳにおけるＰＡＲＰ切断およびＭ３０発現に及ぼすｓｉＲＮＡであるＣＨＩＲ３１５−１．３ＳＩおよびＣＨＩＲ３１５−４．３ＳＩの影響の試験によっても試験した。ＰＡＲＰ切断およびＭ３０産生は、アポトーシスのメディエーターであるカスパーゼ活性を示す。細胞を、ｓｉＲＮＡと４８時間インキュベートし、次いで、細胞溶解物を、ウェスタンブロットによって、ＡＭＩＧＯ−２、ＰＡＲＰ、Ｍ３０、およびチューブリンの発現およびプロセシングについて分析した。ポジティブコントロールおよびｓｉＲＮＡ処置サンプルにおいてＰＡＲＰ切断が増加し、Ｍ３０発現も増加した。これは、これらの細胞株のアポトーシスの増加を示す（図９）。予想通り、各ｓｉＲＮＡへの曝露後にＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベルは減少した（図９、上のパネル）。ＰＡＲＰ切断およびＭ３０発現に及ぼすｓｉＲＮＡであるＣＨＩＲ３１５−１．３ＳＩおよびＣＨＩＲ３１５−４．３ＳＩの影響も、結腸癌細胞株ＳＷ６２０において試験した。ＳＷ６２０細胞を、ＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡ（またはコントロールｓｉＲＮＡ）と７２時間インキュベートし、細胞溶解物を、上記のようにウェスタンブロットによって分析した。ＣＨＩＲ３１５−１．３ＳＩで処置したＳＷ６２０においてＰＡＲＰ切断が検出され、ｓｉＲＮＡ処置の結果としてこれらの細胞中でアポトーシスが起こることを示した。
【０３２３】
他のアッセイを使用して、種々の細胞株（ＡＧＳ、ＳＷ６２０、ＨＴ２９、Ａ５４９、およびＣｏｌｏ３２０癌細胞株；１８４Ｂ５およびＨＭＥＣ非発癌性乳房上皮細胞株；およびＭＲＣ９正常ヒト肺線維芽細胞株が含まれる）におけるＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの機能的結果も試験した。２つの異なるＡＭＩＧＯ−２ｓｉＲＮＡであるＣ３１５−１．３ｓｉおよびＣ３１５−４．３ｓｉを使用して実験を行った。ＡＭＩＧＯ−２ノックダウンも、全試験で確認した。これらの実験結果を以下に示す。
【０３２４】
Ｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡアッセイを使用して、フローサイトメトリーによって細胞死を測定した。ＡＧＳ、ＳＷ６２０、Ａ５４９、およびＣｏｌｏ３２０癌細胞においてＡＭＩＧＯ−２ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後に細胞死の増加が検出され、ＨＴ２９での増加は小さく、１８４Ｂ５またはＨＭＥＣ細胞では検出されなかった。ＭＲＣ９細胞についてはデータを報告しなかった。
【０３２５】
アポトーシスアッセイも使用して、ＰＡＲＰ切断および／またはＭ３０産生の検出によって細胞死を測定した。ＡＧＳおよびＳＷ６２０癌細胞においてＡＭＩＧＯ−２ｓｉＲＮＡであるＣ３１５−１ｓｉおよびＣ３１５−４ｓｉでのトランスフェクション後に死細胞の増加が検出されたが、Ａ５４９細胞では検出されなかった。ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ３２０、１８４Ｂ５、ＨＭＥＣ、、またはＭＲＣ９細胞株についてはデータを報告しなかった。
【０３２６】
製造者の説明書にしたがってＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（登録商標）アッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）も使用して、細胞死を測定した。
【０３２７】
細胞を、９６ウェル皿中で１日後に約８０〜９５％コンフルエントとなる密度でプレートした。オリゴヌクレオチドを、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）中で２μＭに希釈した。次いで、オリゴヌクレオチド−ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）を、アッセイで使用される特定の細胞型に対して最適となるように選択した送達ビヒクルに添加した。次いで、オリゴ／送達ビヒクル混合物を、細胞上で血清を含む培地でさらに希釈した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの最終濃度は、５０ｎＭであった。
【０３２８】
オリゴヌクレオチドを、上記のように調製した。細胞を、３７℃で約４時間から一晩トランスフェクトし、トランスフェクション混合物を、新鮮な培地と交換した。トランスフェクション細胞をトリプシン処理し、４８時間または７２時間後にプレートに結合したままの全細胞を計数した。
【０３２９】
ＳＷ６２０およびＡ５４９癌細胞株においてＡＭＩＧＯ−２ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後に細胞死の増加が検出されたが、ＭＲＣ９細胞では検出されなかった。ＡＧＳ、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ３２０、１８４Ｂ５、またはＨＭＥＣ細胞株についてはデータを報告しなかった。
【０３３０】
細胞力価グロー（ｇｌｏｗ）（ＡＴＰ測定、Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを使用して、足場依存性細胞成長を測定した。２４時間後、細胞を、３０００〜５０００細胞／ウェルにて９６ウェルプレートにプレートした。種々の時点（２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間のトランスフェクション後）で、細胞を溶解し、製造者の説明書にしたがって、細胞力価グローを使用してアッセイした。細胞力価グローアッセイの産生量（ｏｕｔｐｕｔ）により、相対細胞数に比例する蛍光が得られる。足場依存性細胞成長の減少は、ＡＧＳ、ＳＷ６２０、ＨＴ２９、Ｃｏｌｏ３２０、Ａ５４９、およびＭＲＣ９細胞で認められたが、１８４Ｂ５またはＨＭＥＣ細胞で認められなかった。
【０３３１】
軟寒天アッセイを使用して、足場依存性細胞成長を測定した。最初に非組織培養物処置プレートをポリ−ＨＥＭＡでコーティングして細胞のプレートへの付着を防止することによって軟寒天アッセイを行った。トリプシンおよび培地での２回の洗浄を使用して非トランスフェクション細胞を回収した。血球計を使用して細胞を計数し、１０４細胞／ｍｌ培地に再懸濁した。５０μｌのアリコートを、ポリＨＥＭＡコーティングした９６ウェルプレートに入れ、トランスフェクトした。
【０３３２】
トランスフェクションの翌日に、細胞をトリプシン処理し、再懸濁し、計数した。細胞を、約５００細胞／１００μｌ／ウェルに希釈し、深いウェルブロック（最大体積＝１ｍｌ／ウェル、三連、標準的配置）に移した。細胞を、以下の２つのプレート中に入れた。アッセイについてはＣｏｒｎｉｎｇ  ＃７００７  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｕ−ｐｌａｔｅ、プレーティング効率のチェックにはＣｏｒｎｉｎｇ＃３７９９）。Ｓｅａｐｌａｑｕｅ  ＧＴＧアガロース３％を電子レンジ中での１分間の加熱によって融解した。完全に融解した時点で、約１０ｍｌを予め加温した５０ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ＃３５−２０７０）に注ぎ、６０℃のヒートブロック中で少なくとも１０分間インキュベートした。約１８．６ｍｌの完全培地を、５０ｍｌポリプロピレンチューブに添加し、約３７℃の水浴中でインキュベートした。Ｍｕｌｔｉｍｅｋ（商標）ピペッターを使用して、アガロースを９６ウェルプレート中の細胞に分注した。約１８．６ｍｌの加温培地を１０ｍｌのアガロースに注ぎ、穏やかに反転させて十分に混合した。プレートを約４℃で２０〜３０分間インキュベートして、アガロースを迅速に固化させた。アガロースが固化した後、１００μｌ完全培地を細胞上に添加した。０日目のプレーティング効率を測定するために、約２５μｌ／ウェルＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを添加し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、１８〜２４時間後に、ＴＥＣＡＮプレートリーダーにて５３０ｅｘ／５９０ｅｍで読み取った。アッセイプレートを３７℃で７日間インキュベートし、その後にＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（２５μｌ／ウェル）で発色させた。
【０３３３】
ＳＷ６２０、Ａ５４９、およびＭＲＣ９細胞において足場依存性細胞成長の減少が認められた。ＡＧＳ、ＨＴ２９、およびＣｏｌｏ３２０細胞についてはデータを報告しなかった。このアッセイは、ＭＲＣ９、１８４Ｂ５、およびＨＭＥＣ細胞の試験に適切でない。なぜなら、この正常細胞型は典型的には足場依存様式で成長しないからである。ＡＭＩＧＯ−２モジュレーターを使用した癌細胞株におけるコロニー形成の阻害は、ＡＭＩＧＯ−２が転移表現型の産生および／または維持に重要であることを示す。
【０３３４】
機能的に関連する下流マーカーに及ぼすＣ３１５−１．３ｓｉおよびＣ３１５−４．３ｓｉ  ｓｉＲＮＡによるＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの影響を、ＳＷ６２０細胞およびＡＧＳ細胞において試験した。細胞を、ｓｉＲＮＡと２４時間インキュベートし、次いで、細胞溶解物をウェスタンブロットによって分析した。抗ＡＭＩＧＯ−２抗体ＲＢＡｄ７０（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を使用して、ＡＭＩＧＯ−２タンパク質を検出した。ローディングコントロールとしてチューブリンを使用した。両ｓｉＲＮＡにより、ＳＷ６２０細胞およびＡＧＳ細胞においてＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベルが減少した（図１０Ａおよび１１）。ＳＷ６２０細胞では、Ｃ３１５−１．３ｓｉは、Ｃ３１５−４．３ｓｉよりも有効にＡＭＩＧＯ−２タンパク質レベルを低下させるようであった（図１０Ａ）。ＳＷ６２０細胞におけるｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡに及ぼすＡＭＩＧＯ−２ノックダウンの影響も、Ｃ３１５−１．３ｓｉおよびＣ３１５−４．３ｓｉ  ｓｉＲＮＡを使用して試験した。細胞を、ｓｉＲＮＡと７２時間インキュベートし、次いで、ｍＲＮＡを単離し、分析のために調製した。ｃＭｙｃ  ｍＲＮＡは、ポジティブコントロールｓｉＲＮＡおよび両ＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡによって低下し、ＡＭＩＧＯ−２が転写レベルでｃ−ｍｙｃ発現に影響を及ぼすことを示した（図１０Ｂ）。両細胞株において両ｓｉＲＮＡによってリン酸化ＥＲＫも減少したが、ＳＷ６２０細胞では、Ｃ３１５−１．３ｓｉはＣ３１５−４．３ｓｉよりもリン酸化を減少させるようであった（それぞれ、図１０および１１）。両細胞株においてｃ−ｍｙｃ、ｃＦｏｓＬ１、およびｃＪｕｎも両ｓｉＲＮＡによって低下した（図１１、１２Ａ、１４Ａ、および１４Ｂ）。両ＡＭＩＧＯ−２特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＡＧＳ細胞においてサイクリンＤ１発現も減少した（図１１）。Ｃ３１５−１．３ｓｉでトランスフェクトしたＳＷ６２０細胞およびＡＧＳ細胞においてサイクリンＢ１およびｃＦｏｓＬ１レベルが減少した（図１３）。抗ＡＭＩＧＯ−２抗体であるＭＡＢ２０８０（ＡＭＩＧＯ−２のアゴニストとして作用する）に曝露したＳＷ６２０細胞は、ウェスタンブロットによって決定したところ、ｃＭｙｃ（図１４Ｃ）、ｃＪｕｎ（図１２Ｃ）、ＦｏｓＬ１、およびホスホ−ＥＲＫの上方制御が示された（図１６）。ＭＡＢ２０８０と接触したＡＧＳ細胞も、ｃＭｙｃ（図１４Ｃ）およびｃＪｕｎ（図１２Ｃ）の上方制御を示した。さらに、ＡＭＩＧＯ−２で安定にトランスフェクトしたＲａｔ１細胞は、ｃＪｕｎ発現の上方制御を示した（図１２Ｂ）。ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＢ１、ｃＦｏｓＬ１、およびｃＪｕｎ発現におけるＡＭＩＧＯ−２の見かけ上の役割により、ＡＭＩＧＯ−２が最初期遺伝子の調節に関与することが示唆される。これらの所見およびサイクリン遺伝子発現に及ぼすＡＭＩＧＯ−２下方制御の影響（上記を参照のこと）は、細胞周期制御におけるＡＭＩＧＯ−２の役割を支持する。
【０３３５】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ実験を実施して、遺伝子発現に及ぼすＡＭＩＧＯ−２ｓｉＲＮＡの影響を試験した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。これらの結果により、ＡＭＩＧＯ−２下方制御に関連するｃＦｏｓＬ１およびサイクリンＢ１の下方制御が確認され、これは、細胞の成長および生存におけるＡＭＩＧＯ−２の役割と一致した。
【０３３６】
（実施例５）ＡＭＩＧＯ−２は血管形成を阻害する
ＡＭＩＧＯ−２ノックダウンは、ウロキナーゼおよびＶＥＧＦ（共に血管形成に関与する）の発現を阻害する。ＡＭＩＧＯ−２発現は、正常な血管で認められており、これは、この遺伝子が血管形成で役割を果たすことを支持する（上記の実施例２を参照のこと）。また、ＡＭＩＧＯ−２のような神経のガイダンスおよび運動性に関与する多数の遺伝子も血管形成に関与する。
【０３３７】
（実施例６）ＡＭＩＧＯ−２抗体
【０３３８】
【表１】
2009544287.tif 000003
（実施例７）ＡＭＩＧＯ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド
【０３３９】
【表２】
2009544287.tif 000004
（実施例８）ＡＭＩＧＯ−２ｓｉＲＮＡ
【０３４０】
【表３】
2009544287.tif 000005
（実施例９）ＡＭＩＧＯ−２エピトープ
【０３４１】
【表４】
2009544287.tif 000006
（実施例１０）正常組織におけるＡＭＩＧＯ−２発現
上記のように、正常組織切片を調製し、ウサギ抗ＡＭＩＧＯ−２またはコントロールのプレブリード（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）抗体で染色した。染色は、ＡＭＩＧＯ−２が種々の正常なヒト組織（副腎、乳房、子宮頸管、肺、腎臓、肝臓、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脾臓、精巣、結腸、および子宮が含まれる）中、特に、肺、子宮頚管、心臓、および肝臓の間質細胞小集団（例えば、血管およびマクロファージ）中で発現することを示した。これらの組織におけるＡＭＩＧＯ−２タンパク質発現レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ実験（上記を参照のこと）によって決定したところ、対応するｍＲＮＡ発現レベルと相関し、ＡＭＩＧＯ−２が正常組織、特に、増殖性組織（例えば、精巣、皮膚、卵巣、脾臓、および結腸）中で広範に発現することを示した。
【０３４２】
本発明をその特定の実施形態に関して説明しているが、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更形態を実施することができ、等価物を構成することができると理解すべきである。さらに、特定の状況、材料、合成物、過程、工程段階、または工程に適合させるために、本発明の目的、精神、および範囲に対する多数の修正形態を実施することができる。かかる修正形態は全て、本発明の範囲内であることが意図される。
【図１】
2009544287.tif 000007
【図２】
2009544287.tif 000008
【図３】
2009544287.tif 000009
【図４】
2009544287.tif 000010
【図５】
2009544287.tif 000011
【図６】
2009544287.tif 000012
【図７Ａ】
2009544287.tif 000013
【図７Ｂ】
2009544287.tif 000014
【図８Ａ】
2009544287.tif 000015
【図８Ｂ】
2009544287.tif 000016
【図９】
2009544287.tif 000017
【図１０Ａ】
2009544287.tif 000018
【図１０Ｂ】
2009544287.tif 000019
【図１１】
2009544287.tif 000020
【図１２】
2009544287.tif 000021
【図１３】
2009544287.tif 000022
【図１４】
2009544287.tif 000023
【図１５Ａ】
2009544287.tif 000024
【図１５Ｂ】
2009544287.tif 000025
【図１６】
2009544287.tif 000026
【配列表】
2009544287000001.xml
【国際調査報告】
2009544287.tif 000043
2009544287.tif 000044
2009544287.tif 000045
2009544287.tif 000046
2009544287.tif 000047
2009544287.tif 000048