(57)【要約】【課題】硝子体出血がヒアルロニダーゼ注射治療のみで解消するか、硝子体切除手術が必要であるかを予測し、無用な手術を回避する。【解決手段】この発明は、眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを加速する酵素を硝子体内に注射した後の治療成果を予測する方法に関し、その方法は、硝子体内に注射する前に被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）の基準線を測定し、硝子体内に注射した後の予め定められた第一の期間の時点で被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を測定し、基準線と前記予め定められた第一の期間の時点との間のＴＨＰＳの減少値（ΔＴＨＰＳ）を計算し、そのΔＴＨＰＳを閾値と比較し、そして硝子体内に注射した後の予め定められた第二の期間の時点で、前記閾値と前記ΔＴＨＰＳの比較から、硝子体内注射に対して好ましい反応をする蓋然性のある被検者を分類することを含んでなる。この発明は、さらに、関連の医療キットに関する。【選択図】図４
2009518072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを加速する酵素を硝子体内に注射した後の治療成果を予測する方法であって、
ａ．硝子体内に注射する前に被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）の基準線を測定するステップと、
ｂ．硝子体内に注射した後の予め定められた第一の期間の時点における被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を測定するステップと、
ｃ．基準線と前記予め定められた第一の期間の時点との間のＴＨＰＳの減少値（ΔＴＨＰＳ）を計算するステップと、
ｄ．そのΔＴＨＰＳを閾値と比較するステップと、
ｅ．硝子体内に注射した後の予め定められた第二の期間の時点において、前記閾値と前記ΔＴＨＰＳの比較に基づいて、硝子体内注射に対して好ましい反応をする蓋然性のある被検者を分類するステップと、
を含んでなる治療成果予測方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記ΔＴＨＰＳが前記閾値より大きいときは、その被検者を、好ましい反応をする蓋然性があると分類する
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記ΔＴＨＰＳが前記閾値以下であるときは、その被検者を、好ましい反応をする蓋然性がないと分類する
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
時計文字盤の複数の区分に相当させて、角度で画定した網膜眼底の複数区画の各々において、被検者の眼球内の硝子体出血を採点することによって、前記ＴＨＰＳを測定する
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
時計文字盤の１２の区分に相当させて、角度で画定した網膜眼底の１２区画の各々において、被検者の眼球内の硝子体出血を採点することによって、前記ＴＨＰＳを測定する
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、
前記眼底の各区画に、０（出血なし）から最大値（最も重篤な出血）までの範囲にわたる硝子体出血の格付け得点を割り当てる
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、
前記眼底の各区画に、０（出血なし）から４（最も重篤な出血）までの範囲にわたる硝子体出血の格付け得点を割り当てる
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
前記酵素がヒアルロニダーゼである
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記酵素がヒツジのヒアルロニダーゼである
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
前記酵素がＶｉｔｒａｓｅ（登録商標）である
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、
前記予め定められた第一の期間が１か月である
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
前記予め定められた第二の期間が３か月である
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、
前記閾値が、受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）分析法によって選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、
前記閾値が５である
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを加速する酵素を硝子体内に注射した後の治療成果を予測するキットであって、
ａ．硝子体内に注射する前に被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）の基準線を測定する手段と、
ｂ．硝子体内に注射した後の予め定められた第一の期間の時点における被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を測定する手段と、
ｃ．基準線と前記予め定められた第一の期間の時点との間のＴＨＰＳの減少値（ΔＴＨＰＳ）を計算する手段と、
ｄ．そのΔＴＨＰＳを閾値と比較する手段と、
ｅ．硝子体内に注射した後の予め定められた第二の期間の時点において、前記閾値と前記ΔＴＨＰＳの比較に基づいて、硝子体内注射に対して好ましい反応をする蓋然性のある被検者を分類する手段と、
を備えてなる治療成果予測キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記ΔＴＨＰＳが前記閾値より大きいときは、その被検者を、好ましい反応をする蓋然性があると分類する
ことを特徴とするキット。
【請求項１７】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記ΔＴＨＰＳが前記閾値以下であるときは、その被検者を、好ましい反応をする蓋然性がないと分類する
ことを特徴とするキット。
【請求項１８】
請求項１５に記載のキットにおいて、
時計文字盤の複数の区分に相当させて、角度で画定した網膜眼底の複数区画の各々において、被検者の眼球内の硝子体出血を採点することによって、前記ＴＨＰＳを測定する
ことを特徴とするキット。
【請求項１９】
請求項１５に記載のキットにおいて、
時計文字盤の１２の区分に相当させて、角度で画定した網膜眼底の１２区画の各々において、被検者の眼球内の硝子体出血を採点することによって、前記ＴＨＰＳを測定する
ことを特徴とするキット。
【請求項２０】
請求項１８に記載のキットにおいて、
前記眼底の各区画に、０（出血なし）から最大値（最も重篤な出血）までの範囲にわたる硝子体出血の格付け得点を割り当てる
ことを特徴とするキット。
【請求項２１】
請求項１９に記載のキットにおいて、
前記眼底の各区画に、０（出血なし）から４（最も重篤な出血）までの範囲にわたる硝子体出血の格付け得点を割り当てる
ことを特徴とするキット。
【請求項２２】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記酵素がヒアルロニダーゼである
ことを特徴とするキット。
【請求項２３】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記酵素がヒツジのヒアルロニダーゼである
ことを特徴とするキット。
【請求項２４】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記酵素がＶｉｔｒａｓｅ（登録商標）である
ことを特徴とするキット。
【請求項２５】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記予め定められた第一の期間が１か月である
ことを特徴とするキット。
【請求項２６】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記予め定められた第二の期間が３か月である
ことを特徴とするキット。
【請求項２７】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記閾値が、受診者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）分析法によって選択される
ことを特徴とするキット。
【請求項２８】
請求項１５に記載のキットにおいて、
前記閾値が５である
ことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、概して、ヒアルロニダーゼによる治療の成功を予測するツールに関する。
【０００２】
この出願は、２００５年１２月２日出願の米国仮特許出願第６０／７４１，７６３号、２００６年５月３１日出願の米国仮特許出願第６０／８０９，４８０号および２００６年１０月１６日出願の米国仮特許出願第６０／８５２，０５０号の利益を主張するものである。なお、それら特許出願は、その全体をここに援用するものである。
【背景技術】
【０００３】
硝子体出血は、糖尿病（Frank RN 2004 N Engl J Med 350:48-58）や他の臨床状態（Spraul CW and Grossniklaus HE 1997 Surv Ophthalmol 42:3-39）の合併症で、視力を脅かす病症であり、アメリカ合衆国では１年間に２０，０００名もの多数の個体が冒されている（Lindgren G et al. 1995 Am J Ophthalmol 119:458-465; Vitale S et al. 2006 JAMA 295:2158-2163）。持続性硝子体出血は、直接の視力障害に加えて、網膜硝子体牽引および維管の網膜前膜の発生を隠蔽してしまうことがある。この隠蔽は、治療せずに放置すると、進行性の血管新生およびより破壊的な網膜疾病を覆い隠してしまうことがある。したがって、硝子体出血は、減少させねばならず、かつ可能であれば、それを取り除いて、視力を回復させ、および硝子体網膜の原因疾病を治療できるようにしなければならない。増殖性糖尿病網膜症の患者の場合、治療は、全網膜レーザ光凝固法(panretinal laser photocoagulation)（ＰＲＰ）を用いて行われることが最も多い（The Diabetic Retinopathy Study Research Group 1976 Am J Ophthalmol 81:383-396）。
【０００４】
歴史的に見ると、硝子体出血の初期の管理法は、一般に、３か月〜６か月間の観察（「監視待機」）に続いて出血が自然に消失しなかった患者に硝子体切除を行う方法であった。観察期間中、視力の障害は、毎日の生活の活動の妨げになり、かつ高齢の患者集団には転倒の危険が増大する（Coleman AL et al. 2004 Ophthalmology 111:857-862）。
【０００５】
現在、高密度の硝子体出血は、観察、硝子体切除手術またはヒアルロニダーゼの硝子体内注射で何とか対処されている。可能な限り早期に、硝子体出血の原因疾病を治療することが好ましい。しかし、数か月以内に出血が自然に消失する患者もあるので、観察は、典型的な初期の対処法である。したがって、患者は、必要でないかもしれない外科手術（硝子体切除術）を、最初は控えている。出血が自然に消失した場合は、原因疾病、典型的には増殖性糖尿病網膜症の治療が、医院で行われ、網膜のレーザ（全網膜光凝固）治療が、数月にわたって２〜３回行われる。出血が消失しない場合の観察に固有の潜在的危険は、上記のとおりである。
【０００６】
硝子体切除手術は、局所または全身の麻酔、外来患者または入院患者の入院および数日間〜数週間、時には数か月間の回復期間を必要とする網膜と硝子体の大手術である。その外科手術自体には、結膜と強膜の外科切開、ならびにこれに続く硝子体、硝子体出血部および網膜表面または硝子体内の維管膜の除去が含まれている。続いて、網膜にレーザを当て、次いで、存在し得る医原性または既存の網膜の裂孔または円孔にタンポンを挿入するための空気流または気体交換を行う可能性もある。硝子体切除手術は、２０ゲージ、２３ゲージまたは２５ゲージの器具によって実施する。後者の２種の器具は、典型的には強膜または結膜の縫合を必要としない。手術後数週間にわたって、眼球が治癒するにつれて、ステロイド剤、毛様体筋麻酔薬および抗生物質の局所点眼薬を投与することがある。結膜下の出血、刺激、裂傷およびびらんは、典型的には、数日間ないし数週間以内に解決する。視力の回復も、典型的には、数日間ないし数週間で起きる。硝子体切除手術の重大な危険性としては、眼内炎（感染症）、網膜剥離、網膜裂孔、緑内障、痛み、出血、視力の喪失および白内障発生の高い危険性がある（Pado-Munoz A et al. 2006 Eur J Ophthalmol 16:52-59）。手術へ進むことを決断することは、重大な決定であり、勤務からの欠席、手術後の家族の介護の必要性および手術の費用を含む社会的面と経済的面の両方で問題が派生する。
【０００７】
酵素によって硝子体を溶解して硝子体出血を消失させる方法は、硝子体出血の、侵襲性が最小限で保存的かつ経済的な治療法として研究されてきた（Bhisitkul RB 2001 Br J Ophthalmol 2001 85:1-2、 Vitrase(登録商標) Package Insert, ISTA Pharmaceuticals(登録商標), Inc. Irvine, CA 2005）。硝子体内のヒアルロニダーゼは，硝子体の液化を誘発することによって、出血の消失を促進できるが、赤血球の崩壊と捕食が見込まれる。ヒアルロニダーゼを硝子体内に一回注射することの効力と安全性は、多数の国家にわたる無作為二重盲検プラセボ対照で大規模な二つの第３相臨床試験で実証されている（Kuppermann BD et al. 2005 Am J Ophthalmol 140:573-584; Kuppermann BD et al. 2005 Am J Ophthalmol 140:585-598）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
いくらかの被検者は、ヒアルロニダーゼによる治療に比較的速く反応して、硝子体出血が４週間以内に実質的に消失した。残りの被検者には、３か月以内に消失した被検者と、ヒアルロニダーゼによる治療に反応しないように見受けられた被検者が含まれている。この反応する被検者と反応しない被検者を識別する明確な予測法がなければ、これらの患者を処置することは骨の折れることである。臨床医は、視力が損なわれおよび網膜の病状が悪化する危険がある場合、３か月間の観察を続けるか、または特に高い危険性がある外科手術の候補もしくは未保険の患者について有意な危険性と費用が生じうる場合、硝子体切除手術を実施するか、というジレンマに直面する。
【０００９】
患者がヒアルロニダーゼで治療される場合、目標は、硝子体出血の消失を達成することである。その出血が消失すれば、直ちに原因疾病を治療することができる。この治療は、典型的には、先に述べたように、増殖性糖尿病網膜症のためにレーザを網膜に当てる治療である。当該出血が消失しない場合、臨床医は、ある期間観察を続けるかまたは硝子体切除手術を入れるか決断しなければならない。臨床医を導くのに役立つ予測モデルがあれば、そのような状況下で有用である。これにより、患者は、ヒアルロニダーゼで治療してもらうことができ、次いで出血が１か月以内に消失しない場合は、予測モデルがあれば、出血が３か月までに消失するであろうか否かを予測するのに役立てることができる。そのモデルが、出血消失の可能性が比較的高いと予測したならば、患者は継続して観察を受けることになるであろう。このことによって、患者は不必要な手術を受けなくてよいことになる可能性があるであろう。そのモデルが、出血消失の可能性が比較的低いと予測したならば、硝子体切除手術が実施されることになるであろう。その結果、患者は、さらに２か月間も、視力障害が継続することから免れ、および原因疾病が潜在的に進行することから免れることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
続いてこの発明の説明に移ると、最初の第３相臨床試験由来の眼底検査データを事後分析することによって、ヒアルロニダーゼを硝子体内に一回注射してから１か月後に、反応被検者と非反応被検者を区別するための簡単で信頼性の高い採点法を設計した。この方法、および糖尿病と硝子体出血に冒されている患者の処置に対する潜在的な関わり合いを以下に説明する。
【００１１】
この発明は、眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを加速する酵素を硝子体内に注射した後の治療成果を予測する方法に関し、その方法は、硝子体内に注射する前に被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）の基準線を測定し、硝子体内に注射した後の予め定められた第一の期間の時点で被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を測定し、基準線と前記予め定められた第一の期間の時点との間のＴＨＰＳの減少値（ΔＴＨＰＳ）を計算し、そのΔＴＨＰＳを閾値と比較し、そして硝子体内に注射した後の予め定められた第二の期間の時点で、前記閾値と前記ΔＴＨＰＳの比較から、硝子体内注射に対して好ましい反応をする蓋然性のある被検者を分類することを含んでなる。さらに、この発明は、関連の医療キットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明は、眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを加速する酵素を硝子体内に投与したことに対する硝子体出血の反応を予測する新しい採点方法を発見したことに基づいている。
【００１３】
したがって、この発明の一つの側面は、眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを加速する酵素を硝子体内に注射した後の治療成果を予測する方法を提供する。その方法は、
ａ．硝子体内に注射する前に被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）の基準線を測定するステップと、
ｂ．硝子体内に注射した後の予め定められた第一の期間の時点における被検者の出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を測定するステップと、
ｃ．基準線と硝子体内に注射した後の前記予め定められた第一の期間の時点との間のＴＨＰＳの減少値（ΔＴＨＰＳ）を計算するステップと、
ｄ．そのΔＴＨＰＳを閾値と比較するステップと、
ｅ．硝子体内に注射した後の予め定められた第二の期間の時点において、前記閾値と前記ΔＴＨＰＳの比較に基づいて、硝子体内注射に対して好ましい反応をする蓋然性のある被検者を分類するステップと、
を含んでなる。
【００１４】
この好ましい実施態様の諸目的のため、眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを加速する酵素について、以下に考察する。
【００１５】
この好ましい実施態様の諸目的のため、出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を以下のようにして測定する。時計文字盤の複数の区分に相当させて、角度で画定した網膜眼底の複数区画の各々において、被検者の眼球内の硝子体出血を各評価で採点する。眼底の各区画に、０（出血なし）から最大値（最も重篤な出血）までの範囲にわたる明確に定義した硝子体出血の格付け得点を割り当てる。その複数の得点を合計して、各評価での出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を得る。
【００１６】
一実施態様では、出血の合計得点（ＴＨＰＳ）の測定は、以下のようにして実施する。時計文字盤の１２の区分に相当させて、角度で画定した網膜眼底の１２区画の各々において、被検者の眼球内での各査定時点で、硝子体出血を採点する。眼底の各区画に、０（出血なし）から４（最も重篤な出血）までの範囲にわたる明確に定義した硝子体出血の格付け得点を割り当てる。その１２の得点を合計して、各査定での出血の合計得点（ＴＨＰＳ）を得る。
【００１７】
この好ましい実施態様の諸目的のため、予め定められた第一の期間は、ΔＴＨＰＳが硝子体出血の成果の予測変数である期間である。そのような期間は、硝子体内注射による治療に反応して眼球の硝子体液から出血血液がいかに速く消失するかによって変わる。この期間は、硝子体内注射の後、１日、１週間、１か月、そして２か月、さらには６か月までであり得る。好ましくは、特定のヒアルロニダーゼによる治療に対しては、ＴＨＰＳは１か月時点で測定される。他の時点も価値があると解すべきであり、当業者は、この明細書の開示から見て、過度の実験をしないでＴＨＰＳを測定するための期間を容易に決定することができる。
【００１８】
この好ましい実施態様の諸目的のため、予め定められた第二の期間は、治療を受けている眼球の硝子体液から出血血液が消失するのを確認できような、硝子体内注射に対する反応が十分に有意となる期間である。例えば、硝子体内注射をしてから３か月、４か月、５か月または６か月の時点で硝子体切除なしに出血が消失することを使って、患者が治療に対して反応する被検者（反応者）であるかどうかを示すことができる。出血消失がないことを使って、患者が反応しない被検者（非反応者）であることを示すことができる。異なる時点も価値があると解され、当業者は、この明細書の開示から見て、過度の実験をしないで硝子体出血の消失を測定するための期間を容易に決定することができる。
【００１９】
この好ましい実施態様の諸目的のため、基準線と、硝子体内注射に続く予め定められた第一の期間の時点との間のＴＨＰＳの減少（ΔＴＨＰＳ）の計算は、「減少量」（基準線におけるＴＨＰＳ−注射後の予め定められた第一の期間の時点におけるＴＨＰＳ）として計算される。
【００２０】
この好ましい実施態様の諸目的のため、与えられた患者についてΔＴＨＰＳを閾値と比較する。
【００２１】
この好ましい実施態様の諸目的のため、与えられた患者についてΔＴＨＰＳが閾値を超える場合、これは、「陽性」（＝有望）であるとされ、硝子体内治療に対して好ましい反応を予測している。ΔＴＨＰＳが閾値以下である場合、これは、「陰性」（＝望み薄）であるとされ、好ましくない反応を予測している。
【００２２】
この好ましい実施態様の諸目的のため、硝子体内治療に対する好ましい反応は、出血の消失であり、そして好ましくない反応は、出血の消失が起こらないことまたは硝子体の外科手術である。
【００２３】
この好ましい実施態様の諸目的のため、反応者を非反応者から最良に区別するΔＴＨＰＳの閾値が選択される。経験を積んだ臨床医に、臨床データが提供される。そのデータは、閾値の種々の値について、真陽性（真の有望）、真陰性（真の望み薄），偽陽性（偽の有望）および偽陰性（偽の望み薄）の数を表す。臨床医は、各臨床結果が与えられると、各自の判断で、偽陽性と偽陰性との間の最良の兼合いを表す閾値を選択する（DeNeef, P. and Kent, D.L. 1993 Medical Decision Making 13:126-132、Noe, D.A. 1983 Clin Chem 29:571-572、Schafer, H., 1989 Statistics in Medicine 8:1381-1391、および Somoza, E. and Mossman, D. 1991 Biological Psychiatry 29:811-826）。
【００２４】
我々は、Coste, J and Pouchot, 2003 Int J Epidemiology 32:304-313 に記載されている線に沿って、我々の予測モデルについて「グレイゾーン」を実施することは、この発明の範囲内に入ると考える。
【００２５】
定義
特に断らない限り、この明細書で使用される技術用語と科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Singleton P and Sainsbury D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J, Wiley & Sons, Chichester, New York, 2001 および Dorlands Illustrated Medical Dictionary 30th ed., 2003, Saunders Philadelphia PA. を参照。
【００２６】
移行語(transitional term)の「備えてなる(comprising)」は、「含んでなる(including)」、「包含してなる(containing)」、または「特徴とする(characterized by)」と同義であり、内包的または非制限的であり、そして追加の、非列挙の要素や方法ステップを除外しない。
【００２７】
移行句(transitional phrase)の「からなる(consisting of)」は、その請求項に明記されていないいかなる要素、ステップまたは成分を除外するが、通常付随する不純物などの、この発明に無関係の追加の構成要素またはステップは除外しない。
【００２８】
移行句の「本質的に…からなる(consisting essentially of)」は、請求項の範囲を、明記されている材料またはステップ、および請求されている発明の基本的で新規な特徴事項（一または複数）に著しく影響しないものに限定する。
【００２９】
硝子体液
硝子体ゲルは、事実上無細胞の高度に水和された（含水量＞９８％）細胞外マトリックスである。そのゲル構造は、コラーゲンＩＩ型、Ｖ／ＸＩ型およびＩＸ型を含む、組成中に混合されている（異形の）細い分枝していないコラーゲンフィブリルの希薄な網目構造で維持されている。哺乳類の硝子体中では、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヒアルロナンが、これらコラーゲンフィブリルの間の空間を満たす主な構成要素である。
【００３０】
この硝子体ゲルは、水晶体の代謝に必要な管路を提供すること、および透明性を維持するため硝子体腔から細胞や大きい高分子を取り除くことを含む、特定の生理的機能を有している。硝子体が、眼球の成長を調整するのに重要な役割を演じること、機械的外傷のあるときの眼球を保護すること、および血管新生を阻止することも示唆されている。しかし、硝子体ゲルは、眼球に著しい傷害を与えることなく（ときに高齢の患者に核硬化白内障(nuclear sclerotic cataract)を起こすことがあるのは別として）、殆ど完全に取り除く（硝子体切除手術により）ことができる。さらに、硝子体ゲルは、一度取り除かれると、いかなる有意な程度にも再生しない。
【００３１】
グリコサミノグリカン類
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）類は、Ｎ−アセチルヘキソサミンおよびヘキソースまたはヘキスロン酸を含有する二糖の反復単位を有する幾種類もの高分子量の線状複合多糖類であり、これらの残基の一方または両者が硫酸化されていることもある。このクラスの化合物としては、コンドロイチン硫酸類、デルマタン硫酸類、ヘパリン硫酸、ヘパリン、ケラチン硫酸類およびヒアルロン酸がある。ヘパリン以外は、全て、プロテオグリカン中に存在する。一種または複数種のグリコサミノグリカン類は、各種のムコ多糖類中に異常に蓄積されているので、以前はムコ多糖類と称されていた。
【００３２】
グリコサミノグリカン類は、細胞外マトリックスの多糖類である。ヒアルロナンを除いて、全てのＧＡＧ類は、タンパク質のコアに結合させて合成される。生成した巨大分子はプロテオグリカンと称され、そしてそのタンパク質コアには、一または複数のＧＡＧ連鎖を結合させることができる。ヒアルロナンではないが、プロテオグリカンのＧＡＧ連鎖が最初に合成された後、その連鎖は、細胞から分泌される前に、硫酸化、エピマー化および脱アセチル化を含む変形を受けることもある。
【００３３】
１．ヒアルロナン
哺乳動物の硝子体の主なＧＡＧは、（硫酸化されていない）ヒアルロナンであり、一方、コンドロイチン硫酸およびヘパリン硫酸を含む硫酸ＧＡＧ類は、少ない成分である。対照的に、ヒナドリの硝子体では、主なＧＡＧはコンドロイチン硫酸である。ヒアルロナンは、交互にβ（１→３）結合とβ（１→４）結合で連結されているＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−グルコサミンの二糖の反復単位で構成されている。この初期の生合成産物は、細胞外の環境中に分泌される前に修飾されることはない。ヒアルロナンは、空間を満たす網目構造を形成し、また浸透緩衝剤として、大きい分子や細胞を取り除く分子ふるいとしておよび潤滑剤としても働くことができる、高度に水和された多価陰イオンである。
【００３４】
成人のヒトの硝子体内ヒアルロナンの全濃度は、６５〜４００μｇ／ｍｌの間であると推定されており、成熟したウシの硝子体では、５７０μｇ／ｍｌと推定されている。ヒアルロナンは、硝子体全体では不均一に分布しており、後部硝子体中には高濃度で存在し、前部硝子体中には比較的低濃度で存在している。さらに、ヒアルロナンの濃度は、年齢によって変化するようであり、若い動物は、成熟動物より濃度が低い。ヒトの硝子体でも同様な年齢に関連した変化があり、ヒアルロナンの濃度は、約２０歳までは増大し、約７０歳までほぼ一定のままであり、約７０歳になると再び増大する。硝子体のヒアルロナンは、分子量が多分散性であるが、いく人かの研究者が平均値を得ている。ヒトのヒアルロナンの分子量は、２〜４百万と報告されている。ウシの硝子体については、非常に変化の大きい値が得られている。研究者らは、重量平均分子量が、新生子ウシの場合、３百万であり、高年齢のウシの場合、８０，０００〜５００，０００まで低下すると報告した。しかし、別の研究者らは、成熟ウシの硝子体について、６３，０００という重量平均分子量を得た。動的レーザ光分散法(dynamic laser scattering technique)を使用して、成熟ウシの硝子体ヒアルロナンについて、１７０，０００という重量平均分子量が最近得られている。
【００３５】
生物物理学的データと分子モデリングの実験によって、溶解しているヒアルロナンは、一般に、硬いコイルの構造をとっているが、短い範囲にわたってその構造に折畳み、ループまたは湾曲を導入する性質がある。高濃度では、ヒアルロナン連鎖が絡まり流体力学的相互作用によって網目構造が形成されるようであり、これらのプロセスは、ヒアルロナンの多くの粘弾性特性を説明している。さらに、現在、ヒアルロナンの連鎖が、生理的諸条件の下で、溶液中で凝集体を形成することがあるかについて、論争中である。しかし、ヒアルロナンは、分子量または濃度とは無関係に、常に、真の「ゲル」とは対照的に流動する粘弾性溶液を形成する。このような挙動は、ヒアルロナンの連鎖が、強力で安定な分子間会合を形成しないことを示している。このことは、生理的条件下では連鎖と連鎖の会合の証拠を提供できなかった光漂白法の後、共焦点蛍光回収法(confocal fluorescence recovery)によって得た最近のデータによって支持されている。ヒトとウシの硝子体を回転射影電子顕微鏡法(rotary shadowing electron microscopy)で試験した結果は、延びた三次元格子状吻合網目構造およびそのヒアルロナン網目構造の交点の球状タンパク質を形成するヒアルロナンの側方凝集体が存在することを示唆した。これらの球状タンパク質は、ヒアルロナンのこれら側方凝集体が硝子体中で形成されるのを仲介する可能性がある。
【００３６】
２．コンドロイチン硫酸プロテオグリカン類
コンドロイチン硫酸は、β（１→３）結合とβ（１→４）結合で交互に連結されたＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの二糖の反復単位で構成されたＧＡＧ連鎖である。この初期の生合成産物は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基の４−硫酸化と６−硫酸化によって、および頻度は少ないがＤ−グルクロン酸の２−硫酸化によって、種々の程度に修飾される。硝子体は、２種類のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、すなわちＩＸ型コラーゲンとバーシカンを含有していることが知られている。硝子体中のコンドロイチン硫酸の大部分は、大きいプロテオグリカンのバーシカン中に存在している。バーシカンのコアタンパク質は、中心のコンドロイチン硫酸保有ドメイン、多数のモジュラードメイン（ＥＦＧ様ドメイン、レクチン様ドメインおよびＣＲＰ様ドメインを含む）を有するＣ−末端領域、ならびに球状Ｎ−末端ヒアルロナン結合ドメインを含んでなる。バーシカンとヒアルロナンの結合は、硝子体中でも確認されているリンクタンパク質と称される４５ｋＤａの糖タンパク質で安定化されている。これは、硝子体中のヒアルロナン結合タンパク質類のうち、最初に実証されたものであったが、リンクタンパク質とバーシカンは、モル比がほぼ１：１であったので、硝子体のヒアルロナンと複合体を形成するようである。しかし、ウシの硝子体中ではヒアルロナンは１５０：１モル比で過剰であり、そしてバーシカン−リンクタンパク質−ヒアルロナン複合体は、ヒアルロナン連鎖と連結するとは考えられないので、これらの複合体は、恐らくヒアルロナンの網目構造を安定化しないであろう。しかし、バーシカンは、おそらく多種類の巨大分子と相互に作用できるそのＣ−末端領域を介して、ヒアルロナンの網目構造を他の構成要素に連結することによって、硝子体の構造に寄与できる。バーシカンが、細胞外マトリックスのミクロフィブリルタンパク質のフィブリン−１とフィブリン−２と相互に作用することが、最近明らかになっており、フィブリン−１とフィブリン−２の両者は、ペプチド配列決定法によってウシの硝子体中で確認されている。
【００３７】
３．ヘパラン硫酸プロテオグリカン類
最初に、ヘパラン硫酸を、α（１→４）結合で連結されているＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖を反復することによって製造する。次いで、この炭水化物の連鎖を、合成中、Ｄ−グルクロン酸を種々の程度にエピマー化し、硫酸化し、次にアセチル化する。ヘパラン硫酸のプロテオグリカン類は、通常、しかし専らというわけではないが、基底膜内および細胞表面に見られる。ヘパラン硫酸は、ウシの硝子体内で確認されており、そしてヘパラン硫酸のプロテオグリカンアグリンは、ヒナドリの硝子体、網膜の内境界層とシナプス含有細胞層中に確認されている。しかし、アグリン(agrin)が哺乳類の硝子体中にも存在しているかどうかは、分かっていない。硝子体ゲルは、基底膜中に通常見られる、ニドゲン−１(nidogen-1)、フィブリン類およびフィブロネクチンを含む多くの他の成分を含有し、およびこれら巨大分子がゲルの真の構造成分を表しているのかまたは硝子体腔を囲む基底膜から由来するのかどうか、不明のままである。
【００３８】
コラーゲン類
コラーゲン類は、身体タンパク質全体の３０％を構成する、遺伝および構造の面で類縁の一群の細胞外マトリックスタンパク質である。コラーゲン分子は、組み合わさって、ロープ状構造および織物シートを含む、引張り強さの高い多種の構造体を形成する。３０種を超える遺伝子でコードされる１９の異種のコラーゲンが同定されている。個々のコラーゲン分子は、三つのポリペプチド連鎖（α鎖）で構成されている。これらのα鎖は、第三残基ごとにグリシンを有する特徴的なアミノ酸配列を有する膠原性領域を含んでおり、一方、他の二つの残基は、プロリンまたはヒドロキシプロリンを含んでなることが多い。これら３連鎖は、互いにその周りに巻きついて膠原性三重らせんを形成している。また、全てのコラーゲン分子は、その分子の両末端に存在しているがさらに膠原性領域の間に散在していることもある非膠原性領域も有している（例えばＩＸ型コラーゲン）。ＶＩ型コラーゲンの場合、その三重らせん領域の両末端の非膠原性領域は、その分子の分子量の半分以上を占めている。繊維状コラーゲン（例えば、ＩＩ型コラーゲン）の場合、短い非膠原性「テロペプチド類」が、プロセシング（非膠原性領域の大部分を酵素で除くプロセシング）を行った後、前記三重らせん領域の両末端に残ったままであり、これらテロペプチドは、架橋結合を形成するのに重要である。
【００３９】
個々のコラーゲンモノマーが、細胞外マトリックス中に集合して繊維状集合体を形成する。硝子体の主要コラーゲンフィブリルは、３種の異なる型のコラーゲン（ＩＩ型、Ｖ／ＸＩ型およびＩＸ型）で構成されたロープ状構造であり、すなわち異種型(heterotypic)（混合型）フィブリルである。軟骨および核髄質(nucleus pulposus)のコラーゲンフィブリルは、同様に、ＩＩ型、Ｖ／ＸＩ型およびＩＸ型のコラーゲンを含有しているが、Ｖ／ＸＩ型コラーゲンは、異なるα鎖の組成を有している。ＩＩ型およびＶ／ＸＩ型のコラーゲンは、ねじれ配列(staggered array)に整列している繊維状コラーゲンであり、ともに架橋されて細長いフィブリルを形成している。ＩＸ型コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲンに架橋されていて、これらフィブリルの表面に沿って規則的に整列している。
【００４０】
硝子体の異種型コラーゲンフィブリルは、均一な直径（種によって、１０−２０ｎｍの間の直径）を有する、細い分枝していないフィブリルである。硝子体のゲルは、低濃度のコラーゲンを含有し、濃度は、ウシの眼球の場合、約６０μｇ／ｍｌ、そしてヒトの眼球の場合、約３００μｇ／ｍｌと推定されている。このコラーゲンの濃度は、硝子体全体を通して均一ではなく、濃度が最も高いのは、硝子体基底部の所である。そこから、濃度は、硝子体の中心部および後部に向かって低下するが、硝子体の周辺皮質層では増大している。
【００４１】
１．ＩＩ型コラーゲン
硝子体において支配的なコラーゲンは、ＩＩ型コラーゲンであり、全コラーゲンの約７５％を占めている。そのコラーゲンモノマーは、三つの同一のα鎖[α１（ＩＩ）]3で構成されている。ＩＩ型コラーゲン分子は、「四分の一ねじれ配列(quarter staggered array)」で共に共有架橋結合して、異種型コラーゲンフィブリルの主要バルクを形成している。ＩＩ型コラーゲン分子は、細胞外の環境に分泌されるとき、可溶性前駆体型のプロコラーゲンであり、これは、Ｎ−プロペプチドおよびＣ−プロペプチドと称される末端延長部分を有している。これらの延長部分は、一旦、細胞外環境に入ると、Ｎ−プロテイナーゼおよびＣ−プロテイナーゼと称される特異的酵素によって除かれるかまたは「プロセシング」されて、各末端に、主三重らせん領域と短い非膠原性テロペプチドが残る。プロセシングによって、コラーゲンの溶解性は低下し、沈殿してフィブリルを形成させる。
【００４２】
ＩＩ型プロコラーゲンのＮ−プロペプチド領域は、エキソン２が発現されるか（ＩＩＡ型プロコラーゲン）または発現されない（ＩＩＢ型プロコラーゲン）ｍＲＮＡレベルで選択的スプライシングを受ける。上記ＩＩＡ型プロコラーゲンは、そのＮ−プロペプチド中に追加の６９アミノ酸のシステインリッチのドメインを含有している。成熟軟骨中には、ＩＩＢ型プロコラーゲンが発現されるが、プレコンドロジェニック(prechondrogenic)組織中および多くの他の胚芽組織中には、ＩＩＡ型が発現される。胎児および成人の硝子体中には、両方のスプライス変異体が発現されるが、ＩＩＡ型が支配的である。ＩＩＡ型のＮ−プロペプチド中の前記追加のドメインの機能は、十分に解明されていないが、興味深いことには、このドメインは、ＴＧＦ−β１およびＢＭＰ−２に特異的に結合することが分かっている。ＩＩＡ型プロコラーゲンのＮ−プロペプチドは、成熟ウシの硝子体コラーゲンフィブリルの表面に非共有結合で保持されていることが最近明らかになった。これらの保持されているＮ−プロペプチドは、硝子体のゲル構造に寄与する事ができ、加えて、成長因子を結合できるので、硝子体腔中で増殖プロセスを調節できると思われる。
【００４３】
２．Ｖ／ＸＩ型コラーゲン
Ｖ／ＸＩ型コラーゲンは、硝子体の異種型フィブリル中のコラーゲンの約１０％を占めるフィブリルコラーゲンである。ウシ硝子体中では、このコラーゲンは、α１（ＸＩ）鎖とα２（Ｖ）鎖を含むことが分かったが、それらの化学量論は、分かっていない。すなわち、これらα連のうちの一方は、従来からＸＩ型コラーゲンと会合した遺伝子産物であり、他方はＶ型コラーゲンと会合している。ＸＩ型コラーゲンは、軟骨中にＩＩ型コラーゲンと会合して見られ、３種の別個のα鎖、すなわちα１（ＸＩ）、α２（ＸＩ）およびα３（ＸＩ）で構成され、そのα３（ＸＩ）は、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子から由来する。α１（Ｖ）、α２（Ｖ）およびα３（Ｖ）の各種組合せで構成され得るＶ型コラーゲンは、例えば皮膚および角膜中で、Ｉ型コラーゲンを含む異種型フィブリルの中に見られる。しかし、Ｖ型とＸＩ型のコラーゲンは、構造と機能が非常に類似しており、これらのコラーゲンから由来のα鎖の混合物を含有する、他の例の組織がある。したがって、これら２種のコラーゲンは、もはや別のコラーゲンと見るべきではなく、全てＶ／ＸＩ型コラーゲンのファミリーの一員と見るべきであると提唱されている。
【００４４】
α１（ＸＩ）プロコラーゲン連鎖のＮ−プロペプチド領域の多くの異なるスプライス変異体が、存在して、異なる機能特性を有し得ることが分かっている。加えて、少なくとも軟骨の場合、僅かにそのＮ−プロペプチドの一部だけが、通常、プロセシング中に除去されるようである。その結果、Ｎ−プロペプチドの一部は、硝子体コラーゲンフィブリルの表面から突出して、そのＮ−プロペプチドはフィブリルの直径の制御またはそのコラーゲンフィブリルと他の成分の相互作用の決定に関与する。しかし、どのようなスプライス変異体が硝子体中に存在するか、および、硝子体の場合、Ｎ−プロペプチドがコラーゲンフィブリルの表面に保持されているかどうかは、分かっていない。
【００４５】
３．ＩＸ型コラーゲン
ＩＸ型コラーゲンは、フィブリルコラーゲンではなく、ＸＩＩ型、ＸＩＶ型、ＸＶＩ型およびＸＩＸ型のコラーゲンも含むコラーゲンのＦＡＣＩＴ（分断三重らせんを有するフィブリル会合コラーゲン）グループに属している。ＩＸ型コラーゲンは、３種のα鎖、すなわちα１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）およびα３（ＩＸ）で構成されている。このコラーゲンは、４種の非膠原性領域（ＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３およびＮＣ４）の間に散在している３種の膠原性領域（ＣＯＬ１、ＣＯＬ２およびＣＯＬ３）を有しているので、前記フィブリルコラーゲンより一層複雑な構造を有している。ＩＸ型コラーゲンは、フィブリル表面に沿って規則的に分布しフィブリル表面に架橋されている異種型コラーゲンフィブリル中に組み込まれる前にプロセシングを受けない。ＣＯＬ１とＣＯＬ２は、コラーゲンフィブリルの表面に対して逆平行に整列されていると考えられ、そしてＣＯＬ２は、ＩＩ型コラーゲン分子に架橋結合するための部位を提供する。ＮＣ３領域は、ＣＯＬ３を前記フィブリルの表面から支柱様の方式で延出させることができて、その支柱の末端にＮＣ４ドメインが連結されている、ヒンジとして働く。軟骨では、球形ＮＣ４ドメインが、回転射影電子顕微鏡法で、この支柱の末端に見ることができるが、硝子体の中にはこのドメインは見られない。軟骨のＩＸ型コラーゲンの球形ＮＣ４ドメインは、殆ど全体が、延出されたα１（ＩＸ）鎖で構成されているが、硝子体中では、そのα１（ＩＸ）鎖は、選択的スプライシングと転写開始部位を使用する結果、短くなっている。軟骨のＩＸ型コラーゲンの球形ＮＣ４ドメインは、高い塩基性である（ヒトＩＸ型コラーゲンの場合、ｐＩ  １０．４である）ので、ＧＡＧと相互に作用し合うこともある。さらに、軟骨のＮＣ４領域は、ＩＸ型コラーゲン分子と連結しながら、そしてもしかするとコラーゲンフィブリルと一緒に、自己会合することができる、ということが分かっている。しかし、ＮＣ４ドメインは、硝子体中に事実上存在しないので、そのような相互作用は、おそらく起こらない。
【００４６】
ＩＸ型コラーゲンは、時には、そのＮＣ３ドメインのα２（ＩＸ）鎖に連結されたコンドロイチン硫酸ＧＡＧ連鎖を有するプロテオグリカンである。成熟軟骨では、このプロテオグリカンの形は、一般に、少ない形であり、硝子体ではＧＡＧ連鎖が常に可溶性のＩＸ型コラーゲン上に存在している。ヒナドリの硝子体では、ＩＸ型コラーゲン分子に連結されている大きな３５０ｋＤａのコンドロイチン６−硫酸連鎖が、支配的なＧＡＧである。哺乳類の硝子体中では、ＩＸ型コラーゲンＧＡＧ連鎖は、６−硫酸化コンドロイチン硫酸とは異なり、短く（１５〜６０ｋＤａ）そして主として４−硫酸化型からなっている。
【００４７】
４．ＶＩ型コラーゲン
硝子体は、少量のＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルを含有している。これらのフィブリルは、ＶＩ型コラーゲンのモノマーだけで構成され、そのモノマーが末端対末端の様式でジスルフィド結合で結合されたテトラマーになっている。この分子構成は、約１００ｎｍの軸方向周期性を有するダブルビードのミクロフィブリル(double-beaded microfibril)を作る。ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルが、ＩＩ型コラーゲンとヒアルロナンを結合できるということを示唆する証拠がある。それ故に、これらのミクロフィブリルは、前記異種型フィブリルに比べて少ない成分であるが、前記異種型コラーゲンフィブリル同士を連結するか、または前記異種型フィブリルをヒアルロナン網目構造に結合させるかするによって、硝子体のゲル構造に寄与し得ると思われる。
【００４８】
非膠原性構造のタンパク質類
１．フィブリリンおよびフィブリリン含有ミクロフィブリル
硝子体は、異種型コラーゲンフィブリルとＶＩ型コラーゲンミクロフィブリルを含有していることと併せて、第三型のフィブリル構造、すなわちフィブリリン含有ミクロフィブリルを含有している。これらは、おそらく、硝子体中に、前記異種型コラーゲンほどには豊富でないが、ＶＩ型コラーゲンのミクロフィブリルよりは豊富である。この眼球の小帯は、硝子体ゲル中に分離されたミクロフィブリルとして存在していることに加えて、全体で、フィブリリン含有ミクロフィブリルの束を構成している。多くの組織内で、フィブリリン含有ミクロフィブリルは、エラスチンと会合しているが、硝子体および眼球小帯ではそうではないようである。フィブリリン含有ミクロフィブリルは、回転射影電子顕微鏡法で調べると、直径が１０〜１２ｎｍで、特徴的なビード型である。これらミクロフィブリルは、５６ｎｍの基本的な軸方向周期性を有しているが、この周期性はその弾性のために変化する。
【００４９】
眼球中のこれらミクロフィブフィルの主要成分は、フィブリリン−１である。これは、非常に多数のカルシウム結合上皮増殖因子様ドメインを含有する３５０ｋＤａの糖タンパク質である。加えて、この眼球のフィブリリン含有ミクロフィブリルは、ミクロフィブリル会合糖タンパク質−１（ＭＡＧＰ−１）を含む他のより少ない成分を含有している。
【００５０】
フィブリリン−１をコードする遺伝子（ヒトの染色体１５ｑ２１上のＦＢＮ１）の欠陥は、水晶体転位症のみ、またはより頻繁に、マルファン症候群を起こす。この症候群は、眼球、心臓血管および骨格の奇形が特徴である。その眼球の表現型としては、水晶体の転位、近視および裂孔原性網膜剥離を発症する傾向がある。このような網膜剥離の起こる危険性が増大するのが、硝子体内の異常なフィブリリン含有ミクロフィブリルによる硝子体ゲルの構造異常が直接原因であるのかどうか、または水晶体の不安定性および／または近視に派生するのかどうか、不明である。
【００５１】
２．オプティシン(opticin)
組織中では、一般に、異種型コラーゲンフィブリルは、その表面に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のロイシンに富んだ反復単位(leucine-rich repeat)（ＬＲＲ）のタンパク質のファミリーの一種または複数種のメンバーが非共有結合されている。硝子体の異種型コラーゲンフィブリルに結合している、オプティシンと称されるＥＣＭ−ＬＲＲファミリーの新規なメンバーが、最近同定された。オプティシン（以前は、ビトリカン(vitrican)と呼称されていた）は、硝子体中でコラーゲンフィブリルに結合するこのファミリーの、唯一ではないとしても、支配的なメンバーのようである。コラーゲンに結合するＥＣＭ−ＬＲＲタンパク質ファミリーの諸メンバーが、コラーゲンフィブリルの集成に、そしてコラーゲンフィブリルの側方会合または側方融合を防ぐのに、重要であることが分かっている。これらの機能は、デコリン、ルミカンおよびフィブロモジュリンを含むＥＣＭ−ＬＲＲタンパク質ファミリーの他のメンバーをコードする遺伝子のないノックアウトマウスを分析することによって実証されている。
【００５２】
オプティシンは、システインクラスター（会合体）が隣接している６個のＬＲＲを含有する中央領域を有している。ＥＣＭ−ＬＲＲタンパク質のデコリンから類推して、この領域はコラーゲンを捕捉する領域のようである。そのＣ末端領域は、ジスルフィド結合で結合されたループ内に含有されている追加のＬＲＲ反復単位を含有している。そのＮ末端領域は、潜在Ｏ−グリコシル化部位のクラスターを含有し、そして硝子体のオプティシンは、シリル化Ｏ結合オリゴ糖で重度に置換されているが、ＧＡＧ連鎖（一または複数）で置換されていない点で、ＥＣＭ−ＬＲＲタンパク質の中で、独特なものであり、一般に、ＥＣＭ−ＬＲＲタンパク質は、コンドロイチン硫酸またはケラタン硫酸のＧＡＧ連鎖で置換されている。
【００５３】
３．ＶＩＴ１
硝子体中で同定されている別の新規のコラーゲン結合巨大分子は、ＶＩＴ１と称されている。この巨大分子は、ウシの硝子体コラーゲンフィブリルと弱く会合した巨大分子のプールの中で発見され、次いでそのｃＤＮＡをクローン化し、配列を決定した。それは、二つのフォンビルブランドＡドメインを有する塩基性の高いタンパク質（ｐＩ  ９．２９）である。ＶＩＴ１は、硝子体ゲルの重要な構造成分であると思われる。
【００５４】
４．他の巨大分子
軟骨のオリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）に類似の巨大分子が、ウエスタンブロッティング法によって、硝子体内で同定されている。ＣＯＭＰは、軟骨や腱に見られる特徴的な５個のアーム構造を有する酸性糖タンパク質である。ＣＯＭＰをコードする遺伝子が突然変異して、骨格異形成偽性軟骨無形成症および多発性骨端骨異形成症（ＥＤＭ１）を起こすことがある。これら患者において、眼球異常の報告はない。また、硝子体は、汎存の糖タンパク質フィブロネクチンを含有し、そしてこのフィブロネクチンのいくらかは、異種型コラーゲンフィブリルと会合していることも分かっている。その全濃度は、約６μｇ／ｍｌであると分かった。
【００５５】
眼球の硝子体液から出血血液の酵素による除去
グリコサミノグリカナーゼ類（例えば、ヘパリナーゼ類、コンドロイチナーゼ類、ヒアルロニダーゼ類）、コラゲナーゼ類、ケラチナーゼ類、リアーゼ、プラスミンおよびディスパーゼを含む多種類の酵素を使って、硝子体の構造を調整することできる。
【００５６】
ヘパリナーゼ類
ヘパリンまたはヘパラン硫酸を切断する６種類の酵素が、４種類の細菌：フラボバクテリウム・ヘパリナム(Flavobacterium heparinum)、バシラス属の細菌(Bacillus sp.)、バクテロイデス・ヘパリノリティカス(Bacteroides heparinolyticus)および未分類の土壌細菌から単離されている。少なくとも２９種類の他の細菌が、ヘパリナーゼ活性を発現することが定性プレート検定法で確認されているが、これらの酵素は、単離も特性決定もされていない。前記諸酵素は、主としてヘパリンに作用するヘパリナーゼＩ、ヘパリンとヘパラン硫酸の両者に作用するヘパリナーゼＩＩ、および専らヘパラン硫酸に作用するヘパリナーゼＩＩＩに分類されている。
【００５７】
コンドロイチナーゼ類
コンドロイチナーゼ類は、コンドロイチン硫酸、すなわち眼球の網膜と硝子体の結合を仲介するプロテオグリカン類の一成分、に作用する細菌起源の酵素である。コンドロイチナーゼ類の命名法は、コンドロイチン４硫酸がコンドロイチンＡと称され、デルマタン硫酸がコンドロイチンＢと称され、およびコンドロイチン６硫酸がコンドロイチンＣと称されたことに由来している。したがって、例えば、コンドロイチナーゼＡＣは、コンドロイチン４硫酸とコンドロイチン６硫酸を分解するが、デルマタン硫酸は分解しない。
【００５８】
コンドロイチナーゼ酵素は、アルスロバクター(Arthrobacter)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、エロモナス(Aeromonas)属、バシラス(Bacillus)属、バクテロイデス(Bacteroides)属、プロテウス(Proteus)属、および未分類の菌株（おそらくアウレバクテリウム(Aurebacterium)属）の細菌から単離されて特性が決定されている。コンドロイチナーゼの活性は、さらに、幾つかの他の微生物中にも検出されている。コンドロイチナーゼは、土壌細菌および腸管細菌中に産生されて、酸性多糖が上皮細胞に沿って腸管腔中に放出され、腸内細菌に専用の栄養源を提供する。これら菌株の大部分は、培地中のコンドロイチン硫酸またはデルマタン硫酸（２〜５ｍｇ／ｌ）によって誘発されるに違いなく、少なくとも２種の細菌：バシラス属およびエフ・ヘパリナム(F.heparinum)属の細菌が、唯一の炭素源としてのコンドロイチン硫酸上で増殖できる。フラボバクテリウム・ヘパリウム(Flavobacterium heparium)は、不飽和の二糖類を、デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸から製造する４種のコンドロイチナーゼ、すなわちコンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、およびコンドロイチナーゼＡＢＣを産生する。
【００５９】
コンドロイチナーゼＡＣ
コンドロイチナーゼＡＣは、４−デオキシ−β−Ｄ−グルク−４−エヌロノシル基(4-deoxy-β-D-gluc-4-enuronosyl groups)を含有する二糖類に対して１，４−β−Ｄ−ヘキソサミニル結合および１，３−β−Ｄ−グルクロノシル結合を含有する多糖類の除去分解反応を触媒する。この触媒の他の名称としては、コンドロイチナーゼ、コンドロイチン硫酸リアーゼ、コンドロイチンＡＣエリミナーゼ、コンドロイチンＡＣリアーゼ、コンドロイチナーゼＡＣおよびＣｈｎＡＣがある。この酵素は、コンドロイチン４硫酸とコンドロイチン６硫酸に作用するが、ヒアルロン酸塩には余り作用しない。
【００６０】
コンドロイチナーゼＢ
コンドロイチナーゼＢは、４−デオキシ−β−Ｄ−グルク−４−エヌロノシル基を含有する二糖類に対して１，４−β−Ｄ−ヘキソサミニル結合および１，３−β−Ｄ−グルクロノシル結合または１，３−α−Ｌ−イズロノシル結合を含有するデルマタン硫酸を除去分解して、４，５−不飽和デルマタン硫酸の二糖（δＵＡ−ＧａｌＮＡＣ−４Ｓ）を生成する反応を触媒する。これは、基質としてのデルマタン硫酸に対して特異的であることが知られている唯一のリアーゼである。触媒作用に必要な最小の基質長は、四糖である。
【００６１】
コンドロイチナーゼＡＢＣ
コンドロイチナーゼＡＢＣは、ポリマーのコンドロイチン硫酸類およびそのオリゴ糖フラグメント類の両者の非還元性末端由来の二糖残基のエキソ分解反応(exolytic cleavage)を触媒する。この酵素の別名としては、コンドロイチンＡＢＣエリミナーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣリアーゼ、ＣｈＳ−ＡＢＣリアーゼ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソエリミナーゼ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、およびＣｈＳ−ＡＢＣリアーゼＩＩがある。この酵素は、コンドロイチン硫酸型およびデルマタン硫酸型の各種グリコサミノグリカン類を分解する。コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよびデルマタン硫酸が最良の基質であるが、この酵素は、はるかに低い速度でヒアルロナンにも作用できる。ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンは、基質ではない。
【００６２】
ケラチナーゼ類
ケラチナーゼ類は、一般に知られているタンパク質分解酵素のトリプシン、ペプシンおよびパパインに耐性の剛性が高くかつ強力に架橋された構造のポリペプチドの「ケラチン」の加水分解反応を目的とする。ケラチナーゼ類は、温度範囲とｐＨ活性範囲が広い強固な酵素であり、主なものはセリンまたはメタロプロテアーゼ類である。ケラチナーゼ類の配列相同性が、ケラチナーゼ類がセリンプロテアーゼ類のスブチリシンファミリーと関連していることを示している。微生物のケラチナーゼ類は、ケラチン性基質上で増殖するとき、圧倒的に細胞外であるが、細胞に結合したケラチナーゼ類および細胞内ケラチナーゼ類もいくつか報告されている。
【００６３】
コラゲナーゼ類
コラゲナーゼ類は、コラーゲンの三重らせん領域のペプチド結合を切断する酵素である。コラーゲン分子は、この酵素以外では、酵素の攻撃に対する耐性が非常に高い。２種類のコラゲナーゼが知られている。クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)は、２００を超える部位で、コラーゲンの各ポリペプチド連鎖を切断する一連のコラゲナーゼ類を分泌する。これらのコラゲナーゼ類は、宿主の結合組織のバリアを破壊することにより、病原性の高いクロストリジウムが侵入することに寄与している。もう一方の型である組織コラゲナーゼ類は、増殖または再造形する、両生類の組織および哺乳類の組織の中に発見されている。１９種類もの多くの型のコラーゲンが存在するように、多種の亜型のコラゲナーゼがある。哺乳類のコラゲナーゼ類は、細胞外メタロプロテイナーゼ類（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１９およびＭＭＰ−２６）のファミリーに属している。これらは、生理的なｐＨと温度において、コラーゲンを分解する。この真核コラゲナーゼ類は、前駆体の形態で存在していることが分かっている。
【００６４】
天然のコラーゲンに作用する六つの種のメタロエンドペプチダーゼが、クロストリジウム・ヒストリチカムの培地から単離することができる。クラスＩは、α型（６８ｋＤａ）、β型（１１５ｋＤａ）およびγ型（７９ｋＤａ）を形成し、クラスＩＩは、δ型（１００ｋＤａ）、ε型（１１０ｋＤａ）およびζ型（１２５ｋＤａ）を形成している。これら２つのクラスは、免疫学的に交差反応性であるが、有意に異なる配列および異なる特異度を有し、例えばコラーゲンに対するそれらの作用は、相補的である。また、これら酵素は、ペプチジル−トリペプチダーゼとしても作用する。前記酵素の変異体は、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)、エンペドバクター・コラゲノリチカム(Empedobacter collagenolyticum)、シュードモナス・マリノグルチノサ(Pseudomonas marinoglutinosa)、ならびにビブリオ(Vibrio)の種、ビブリオＢ−３０(Vibrio B-30)の種、ヴィ・アルジノリチカス(V.alginolyticus)およびストレプトマイセス(Streptomyses)の種から精製されている。
【００６５】
血栓崩壊剤
ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）および組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）は、血栓崩壊剤である。これら３種の薬剤は、全て、血漿タンパク質プラスミノーゲンを、プラスミンに、直接またくは間接的に変換する。次いで、そのプラスミンは、フィブリンを迅速に分解して、血塊分解(clot lysis)を起こす。プラスミノーゲンの全身性活性化は、これらの薬剤全てによって起こすことができるが、フィブリノーゲンならびにＩＩ因子、Ｖ因子およびＶＩＩＩ因子を分解して不活性化することによって血液凝固も阻害する。
【００６６】
ＳＫは、グループＣのβ−溶血性連鎖状球菌から単離される精製細菌タンパク質である。これは、プラスミノーゲンに非共有結合で結合して、アクチベータの複合体を形成し、その複合体は、他のプラスミノーゲン分子をプラスミンに変換する。ＳＫは、抗原性なので、循環抗体が前記薬剤を不活性化するとともに重篤なアレルギー反応をも起こすことがあるから、少なくとも６か月間は再投与できない。
【００６７】
ＵＫは、ヒトの尿からまたは培養されたヒトの胎児腎細胞から単離され、かつ高分子量および低分子量の両形態で存在する。ＳＫと異なり、ＵＫは、抗原性ではないので、プラスミノーゲンをプラスミンに直接変換することによって溶解状態を起こす。
【００６８】
ｔ−ＰＡは、血栓崩壊剤として最新のものであるが、各種の細胞系を使って組換えＤＮＡ法で製造される。ＵＫと同様に、ｔ−ＰＡは、非抗原性なので、プラスミノーゲンをプラスミンに直接変換するが、ＳＫやＵＫよりは、フィブリン特異度が高い（すなわち、プラスミノーゲンの全身性活性化の程度が低い）。しかしながら、フィブリン特異度は、相対的であり、ｔ−ＰＡを投与した後、全身性フィブリノーゲン分解反応が起こることがある。
【００６９】
ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼは、基質のヒアルロナート（ヒアルロン酸、ヒアルロナン）を分解することができる酵素を指すのに使用される一般用語であるが、これらの酵素の幾つかは、低速度ではあるが、コンドロイチン硫酸も分解できる（Kreil,G. 1995 Protein Sci, 4:1666-1669）。
【００７０】
ヒアルロナート（ＨＡ）は、線状の硫酸化されていないグリコサミノグリカンのポリマーであり、平均分子量が１０，０００より大きい。このポリマーは、グリコシド結合によって交互に連結されたＮ−アセチルグリコサミンとグルクロン酸の残基で形成されているが、他のグリコサミノグリカン類と異なり、共有結合したペプチドを欠いている。高レベルのＨＡが、通常、関節包、眼球の硝子体、臍帯のワルトンゼリー、羊水と胎児組織、および迅速に増殖または修復する全ての組織の中に存在しており、身体中のヒアルロナートの５０％は、皮膚の中に見られる。ＨＡのレベルは、炎症、浮腫、臓器移植後の腫脹、卒中、または心筋梗塞、敗血症、創傷修復および発癌の際に増大する。各種の起源から単離されたヒアルロナートは、同じ化学構造を有している（Hynes, W.L. et al. 2000 FEMS Microbiol. Lett. 183:201-207）。
【００７１】
これらヒアルロニダーゼは、ＨＡの分解反応を触媒する三つの型、すなわちＩ型−ヒアルロナート−４−グリカノヒドロラーゼ類（ＥＣ  ３．２．１．３５、ヒアルロノグルコサミナーゼ）、ＩＩ型−ヒアルロナート−３−グリカノヒドロラーゼ類（ＥＣ  ３．２．１．３６、ヒアルロノグルクロニダーゼ）、およびＩＩＩ型−ヒアルロナートリアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．１）に細別できる（Pessini, A.C. et al. 2001 Toxicon 39:1495-1504）。ヒアルロナート−４−グリカノヒドロラーゼ類は、哺乳類の精子、リソソーム類および各種の昆虫とヘビの毒液中に見られる精巣型ヒアルロニダーゼ類である。前記第二グループのヒアルロナート−３−グリカノヒドロラーゼ類は、ヒル類、幾種類かの十二指腸虫とオキアミが産生する（Karlstam, B. et al. 1991 Polar Biol. 11:501-507）。これら両グループのヒアロルニダーゼ類は、ヒアルロナートを分解して、最終産物として四糖類を生成する。前記第三グループのヒアルロナートリアーゼ類は、各種の細菌によって産生され、β−１−４結合に跨る除去によって、エンド−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ類として作用する。他のヒアルロニダーゼ類と異なり、ヒアルロナートリアーゼ類の産物は、不飽和二糖類である（Hynes, W.L. et al. 2000 FEMS Microbiol Lett. 183:201-207）。さらに、ヒアルロナート−４−グリカノヒドロラーゼ類およびヒアルロナートリアーゼ類は、エンドグルコサミニルニル基を遊離させることによってヒアルロナートを分解し、すなわちエンドヘキソサミニダーゼ類であり、一方、ヒルのヒアルロニダーゼは、エンドグルクロニル基を遊離させ、すなわちエンド−β−グルクロニダーゼのように作用する（Karlstam, B. et al. 1991 Polar Biol. 11:501-507）。
【００７２】
Ｉ．ヒアルロナート−４−グリカノヒドロラーゼ類
脊椎動物では、これらの酵素は、２つのクラスに区分される。すなわち、中性で活性のヒアルロニダーゼ類、例えば、精子関連のＰＨ−２０、および酸性ｐＨが最適条件であるヒアルロニダーゼ類、例えば、ヒトの腎臓および血漿に見られるもの、に区分される（Frost, G.I. et al. 1997 Biochem. Biophys. Res. Commun. 236:10-15）。ヒトのゲノムは、互いに約４０％が同一のヒアルロニダーゼ様パラロガス配列を６つ含有している。これら配列は、ヒト染色体に密着結合した二つのトリプレット、すなわち３ｐ２１．３（ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２およびＨＹＡＬ３）ならびに７ｑ３１．３（ＨＹＡＬ４、ＰＨ２０／ＳＰＡＭ１およびＨＹＡＬＰ１）に区分される。染色体３中の三つのヒアルロニダーゼ配列は、類似のゲノム構造を有している。ＨＹＡＬ１は、他のヒアルロニダーゼ配列中には存在しないエクソン１内に保持されている追加のイントロンを有している。染色体７に密集した三つのヒアルロニダーゼ遺伝子は、染色体３上の遺伝子よりもはるかに大きいイントロンを有し、かつ追加のエキソンを含有している。
【００７３】
マウスのオルソログ遺伝子(orthologous gene)は、マウス染色体９Ｆ１〜Ｆ２および６Ａ２上のシンテニック領域に見られる。ヒトおよびマウスのオルソログ(orthologs)の対の間の相同性の程度は、ヒトの６種のパラログ(paralogs)の間の相同性の程度より、はるかに大きい（Csoka, A.B. et al. 2001 Matrix Biol. 20:49-508）。
【００７４】
Ｈｙａｌ−１、血漿ヒアルロニダーゼ
血清中の酸性活性ヒアルロニダーゼは、哺乳類の身体組織から精製され、クローン化され、配列を決定され、そして発現された最初のヒアルロニダーゼである（Frost, G.I. et al. 1997 Biochem Biophys Res Commun 236:10-15）。その５７ｋＤａのタンパク質は、翻訳グリコシル化後の約８ｋＤａを含む４９ｋＤａの単一ポリペプチド連鎖である。それは、精子に見られる酵素ＰＨ−２０と約４０％同一でかつ約６０％相同性である。最高レベルの、ＨＹＡＬ１のｍＲＮＡが、主要な実質器官、例えば、肝臓、腎臓、脾臓および心臓に見られる。マウスのオルソログもクローン化されて発現され（Csoka, T.B. et al. 1997 FEBS Lett 417:307-310）、ヒトの配列と７３％同一であることが観察された。
【００７５】
高レベルのヒアルロニダーゼ活性を有していることが長年にわたって知られている尿が、血漿に見られるヒアルロニダーゼ活性の１００倍の比活性のＨｙａｌ−１を含有することが観察された。４５ｋＤａの分子量を有する追加の第二活性が、尿中に見られ、そしてそのカルボキシ領域から約１００個のアミノ酸が欠失して（図１）、ジスルフィド結合で結合された二つのポリペプチド連鎖になっているＨｙａｌ−１であることが、アミノ酸配列決定法で確認された（Csoka, T.B. et al. 1998 Genomics 48:63-70）。前記酵素の二つの形態は、類似の比活性を有しているので、上記のことは、酵素原（チモーゲン）とプロセスド酵素(processed enzyme)の関係を示してはいない。また、Ｈｙａｌ−１の二種のイソ酵素が培養細胞中に見られ、培地中では、高分子量のイソ酵素が支配的であり、そして細胞層中ではそれより短いプロセスドイソ酵素が支配的である。二つの型のＰＨ−２０も存在し（Cherr, G.N. et al. 1996 Dev. Biol. 175:142-153、Meyer, M.F. et al. 1997 FEBS Lett. 413:385-388）、高分子量の方の型は、形質膜に結合されたグリコシルホスファチジル−イノシトール−（ＧＰＩ−）連結のタンパク質である。
【００７６】
Ｈｙａｌ−２
別の広く発現されかつ重要なヒトの酸性活性ヒアルロニダーゼのＨｙａｌ−２は、Ｈｙａｌ−１の遺伝子に隣接した染色体部位の遺伝子によってコードされている。Ｈｙａｌ−２は、高分子量のＨＡポリマーを分解して、約２０ｋＤａの中位の大きさのフラグメントにする特異な基質特異度を有している。肺の繊維芽細胞は、ＨＡに対してＨｙａｌ−２と類似の大きさの比活性を有する原形質膜抽出物中に、酸性活性ヒアルロニダーゼを有している。
【００７７】
Ｈｙａｌ−３
Ｈｙａｌ−３、すなわち３ｐ２１．３遺伝子座にコードされている第三の酵素については、殆ど分かっていない。強いハイブリッド形成発現パターンが哺乳類の睾丸と骨髄に見られる。これら二つの組織は、その動物の一生の間、胎児細胞様および幹細胞様の状態を保持しており、Ｈｙａｌ−３が幹細胞を制御するのに重要であろうことを示唆している。マウスのＨｙａｌ−３は、クローン化したところ、ヒトの配列に対してアミノ酸同一性が約８０％であった（Csoka, A.B. et al. 2001 Matrix Biol. 20:499-508）。この同一性の程度は、ヒトとマウスのＨｙａｌ−１オルソログの間の同一性（７３％）より高く（図２）、このことは、Ｈｙａｌ−３が、生体内で重要な機能を有していることを示唆しているが、今までのところ、生体外でヒアルロニダーゼ活性を有していることは、終局的には分かっていない。
【００７８】
ＰＨ−２０／ＳＰＡＭ１、精巣ヒアルロニダーゼ
図３を参照すれば、精巣ヒアルロニダーゼのＰＨ−２０／ＳＰＡＭ１は、精子による卵子の受精中に重要である（Cherr, G.N. et al. 1996 Dev. Biol. 175:142-153）。各種の種において睾丸の中でＳＰＡＭ１が発現することが、一致して報告されている。ヒトＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ、GenBank Accession No. ＮＭ＿１５３１８９（配列番号：３）、ウシＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ、GenBank Accession No. ＢＣ１１０１８３（配列番号：１３）、ブタ精子接着分子１のＳＰＡＭ１、GenBank Accession No. ＮＰ＿９９９１７６（配列番号：１４）、およびヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼ（配列番号：１５）。ヒトの精巣上体、精管、前立腺および胎盤、ならびにネズミの精巣上体、腎臓、子宮、膣および卵管の中での発現も検出されている。ＳＰＡＭ１の発現は、ヒトの女性の生殖管路中には検出されていない。触媒ドメインがヒアルロン酸を分解することが分かっている。この分子は、卵子を囲んでいる小丘細胞層の細胞外マトリックスの主要成分であり、そしてＳＰＡＭ１は、生体外でこの小丘層を除くことが分かっている。ＳＰＡＭ１は、その触媒領域とは別個の、ヒアルロン酸結合領域と透明帯結合領域を有し、その透明体に結合した際の精子細胞中の細胞内信号伝達経路にも関わっている（Dunn, C.A. et al. 2005 BMC Genomics 6:47）。
【００７９】
Ｈｙａｌ−４
Ｈｙａｌ−４と称される新規なヒアルロニダーゼパラログは、染色体７ｑ３１．３の所で同定される。ヒトＨＹＡＬ４のｃＤＮＡは、長さが２４１４ヌクレオチドと計算されている。ＨＹＡＬ４の発現は、胎盤と骨格筋に限定されている。予備的証拠では、Ｈｙａｌ−４が、ＨＡに対して活性を有していないコンドロイチナーゼであることを示している。ヒトとマウスのＨｙａｌ−４は、アミノ酸同一性が７７％である（Csoka, A.B. et al. 2001 Matrix Biol.20:499-508）。
【００８０】
ＨＹＡＬＰ１
ＨＹＡＬＰ１は、早期終始コドンを生じる二つの欠失部分が存在しているので、ヒトの偽遺伝子である。マウスおよびおそらく他の哺乳類においても、ＨＹＡＬＰ１は、哺乳類の活性ヒアルロニダーゼ酵素をコードしていると思われる。
【００８１】
非哺乳類のヒアルロナート−４−グリカノヒドロダーゼ類
ヘビ、ミツバチおよびサソリの毒液は、生体外でのｐＨ範囲４．０〜６．０において活性である３３〜１１０ｋＤａのヒアルロニダーゼ類を含有している（Pessini, A.C. et al. 2001 Toxicon 39:1495-1504）。
【００８２】
ＩＩ．ヒアルロナート−３−グリカノヒドロラーゼ類
ヒアルロナート−３−グリカノヒドロラーゼ類は、ＨＡのエンドグルクロニル基を放出し、すなわちエンド−β−グルクロニダーゼと同様に作用する。南極オキアミから精製されたヒアルロニダーゼは、最適ｐＨが５．３で、最適温度が３７℃で、分子量が８０，０００ダルトン（８０ｋＤａ）である。
【００８３】
ＩＩＩ．ヒアルロナートリアーゼ類
広範囲の微生物が、ヒアルロナートを分解できる酵素を産生する。ヒアルロニダーゼを産生できるグラム陽性微生物としては、連鎖球菌属(Streptococcus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)およびクロストリジウム属(Clostridium)の様々な種の微生物がある。連鎖球菌の二つの種のストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)とストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)は、ヒアルロニダーゼをコードしている。８種の完全細菌ヒアルロニダーゼの遺伝子および２種のバクテリオファージの遺伝子は、その分子配列が確認されている。この細菌ヒアルロニダーゼを産生する細菌とその受託番号は、Ｓ．アウレウス(S.aureus)（Ｕ２１２２１）、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)（Ｙ１５９０３）、Ｓ．ヒューモニエ(S.pheumoniae)（Ｌ２０６７０）、Ｓ．グリセウス(S.griseus)（ＡＢ０２８２１０）、Ｓ．コエリコロル(S.coelicolor)（ＡＬ０３１１２４）、Ｐ．アクネス(P.acnes)（Ｕ１５９２７）、Ｃ．ペルフリンゲンス(C.perfringens)（Ｐ２６８３１）、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)（１０９５４５４）であり、リアーゼの配列の一部が分かっているのがバクテロイデス・テータイイオタオミクロン(Bacteroides thetaiiotaomicron)（Ｌ４２３６７）である。二つの配列が決定されたバクテリオファージのヒアルロニダーゼは、共に、グループＡの連鎖球菌（Ｍ１９３４８およびＵ２８１４４）を感染させるテンペレートファージ由来である（Hynes, W.L. et al. 2000 FEMS Lett. 183:201-207）。アミノ酸配列が推定されて分かっているヒアルロニダーゼは、分子量が極めて様々である。連鎖球菌バクテリオファージの酵素が、最も小さく、膠原性モチーフの存否に応じて３６〜４０ｋＤａの範囲内である（Hynes, W.L. et al. 1995 Infect. Immun. 63:3015-3020）。他のヒアルロニダーゼ類の推定タンパク質は、はるかに大きく、ストレプトコッカス・アガラクティエ由来のものは１２１ｋＤａであり、Ｓ．ヒューモニエ由来のものは１０７ｋＤａであり、Ｃ．ペルフリンゲンス由来のものは１１４ｋＤａであり、Ｓ．アウレウス由来のものは９２ｋＤａであり、Ｐ．アクネス由来のものは８２ｋＤａであり、そして２種のストレプトマイセスの種由来のものは７７ｋＤａと８４ｋＤａである（Hynes, W.L. et al. 2000 FEMS Lett. 183:201-207）。他の（配列が決定されていない）ヒアルロニダーゼ類の分子量もかなり変化し、５０〜１６０ｋＤａの範囲内である（Linhardt, R.J. et al. 1986 Appl. Microbiol. Biotechnol. 12:135-176）。上記同定されている細菌ヒアルロニダーゼは、大部分が酸性ｐＨでより活性であり（Benchetrit, L.C. et al. 1978 J. Bacteriol. 134:221-228、Brunish, R. et al. 1958 J. Biol. Chem. 231:291-301、Hill, J. 1976 Infect. Immun. 14:726-735、Linder, L. et al. 1971 Scand. J. Dent. Res. 79:528-532、Nord, C.E. 1971 Odontol. Rev. 22:125-136、Rautela, G.S. et al. 1973 Arch. Biochem. Biophys. 158:687-694）  、一方、ペプトストレプトコッカス属のヒアルロニダーゼ（推定分子量１６０，０００）は、活性になる最適ｐＨが中性近傍である（Tam, Y.-C. et al. 1985 Infect. Immun. 47:508-513）。
【００８４】
ヒアルロニダーゼ類は、長年にわたって治療に利用されている。ヒアルロニダーゼ類は、組織の膜の透過性を増大し、粘度を低下させて、組織を、注射流体がより容易に透過できるようにする（拡散効果）。ヒアルロニダーゼ類は、多くの医療分野、すなわち整形外科、外科、眼科、内科、腫瘍科、皮膚科、婦人科などに広く使用されている（Menzel and Farr 1998 Cancer Lett. 131:3-11）。
【００８５】
患者の硝子体出血を消失させる酵素を硝子体内に注射した後の、硝子体出血の反応を予測する採点方法
目的：酵素を注射した後、３か月までに、硝子体が透明になる可能性が最も高い患者を続けて観察する指針を提供する予測モデルを開発することである。
【００８６】
計画：硝子体出血の治療処置のために、酵素を硝子体内に注射する無作為二重盲検プラセボ対照臨床試験から、事後データ分析を被検者について実施する。
【００８７】
成果の主要尺度：上記臨床試験中、硝子体出血の密度を、眼底の１２個の放射状区画（「時計の時間」）の各々について、明確に定義した０〜４の硝子体出血格付けスケールを使って採点する。基準線と予め定められた注射後の第一の期間との間での合計出血得点の減少値（ΔＴＨＰＳ）を分析して、予め定められた注射後の第二の期間の時点における硝子体出血の結果の予測変数として分析する。
【００８８】
所見：受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析により強力な予測モデルを実地に示し、その場合、その曲線下面積（ＡＵＣ）が敏感度と特異度の尺度を提供する。
【００８９】
結論：そのΔＴＨＰＳは、硝子体に出血が見られる患者の硝子体に酵素を注射することによる成果を予測するための定量的指針を提供する。
【００９０】
訓練組と妥当性確認組：前記遡及的分析(retrospective analysis)で得た結果の適用性を確認するために、利用可能な被検者のデータの組（集合）を二分する。一方の部分は、訓練組（集合）であるが、予測モデルの研究と開発のために使用する。もう一方の部分は、妥当性確認組（集合）であるが、最終モデルが定義されるまで保留されて、判定用の閾値が選択される。次いで、妥当性確認組は、予測アルゴリズムに通す。
【００９１】
これら二つのデータの組は、硝子体の出血を消失させるために酵素を注射する臨床試験に参加している被検者の１つのグループから得た。硝子体が出血している患者を、コンピュータ作成の無作為化リストに従って、順次１つの治療グループに割り当てる。治療グループには、零を含む範囲の複数の酵素投与量が含まれ、その場合、零は食塩水投与または観察のみであってもよい。
【００９２】
眼科検査を、硝子体内に注射する前に基準線および硝子体内に注射した後の予め定められた第一の期間後の時点（例えば、１日目、１週間目、１、２および３月目）に実施する。時計文字盤の１２の区分に相当させて、眼底網膜の１２個の角度で画定した各区画において、被検眼球を評価するごとに、硝子体の出血を採点する。眼底の各区画に、０（出血なし）から４（最も重篤な出血）までの範囲内の明確に定義した硝子体出血の格付け得点を割り当てる。その１２の得点を各来診ごとに合計して、出血の合計点数（ＴＨＰＳ）を得る。基準線と硝子体内注射後の予め定められた第１の期間の時点との間のＴＨＰＳの減少得点値（ΔＴＨＰＳ）を調べる。この得点は、大部分の被検者について正の数になるように、「変化値」（［予め定められた第一期間の時点におけるＴＨＰＳ］引く［基準線におけるＴＨＰＳ］）ではなくて、「減少値」（［基準線におけるＴＨＰＳ］引く［予め定められた第一期間の時点におけるＴＨＰＳ］）として計算することに留意されたい。
【００９３】
一次効果の終点は、予め定められた第二期間までの硝子体出血の消失と定義する。被検眼球の硝子体出血が予め定められた期間窓内に十分消失した場合、被検者を治療成功に分類する。硝子体出血の消失を測定する基準の一つは、原因疾患の治療の完了である。症例報告用紙（ＣＲＦ）には、治療が開始されたか、進行中であるか、または成功裡に完了したかついて、記載してもよい。
【００９４】
予め定められた第一期間の評価から得たデータを使って、予め定められた第二期間の終わりの時点での各被検者の成果を予測する。そのような予測をすることが無関係と思われる被検者は、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析から除く。したがって、以下の事象、すなわち、重篤な有害事象、硝子体切除術その他の眼の外科的処置、および治療の開始または成功裡の完了が、その被検者の予め定められた第一期間での来診より前に起これば、その被検者は除外する。ΔＴＨＰＳまたは成果を決められない被検者は、除外する。残った被検者の組を無作為に二つの部分に分け、訓練組と妥当性確認組とする。
【００９５】
統計的分析：予め定められた第二期間の来診時点またはその前に硝子体切除なしで治療が成功裡に完了している被検者（反応者）を意味する「１」、および予め定められた第二期間の来診時点またはその前に治療が成功裡に完了していない被検者（非反応者）を意味する「０」を使って二元成果(binary outcome)を研究する。ΔＴＨＰＳを、この二元成果の予測変数として評価する。線形分類法として知られているアルゴリズムを採用する（Duda RO et al.in Pattern Classification, 2nd ed. New York、John Wiley & Sons, Inc. 2001 p.37）。与えられた被検者についてΔＴＨＰＳが閾値を超えた場合、それは、「陽性」であると判断し、硝子体内酵素治療に対する好ましい反応を予測している。ΔＴＨＰＳが前記閾値以下であった場合、それは、「陰性」であると判断し、好ましくない反応を予測している。適切な閾値を選択することについて、以下に考察する。
【００９６】
前記成果のためのΔＴＨＰＳの予測値は、ＲＯＣ曲線を使って決定する（Agresti A in Categorical Data Analysis, 2nd ed. Hoboken, New Jersey、John Wiley & Sons, Inc. 2002 pp. 228-230）。前記曲線の下の面積（ＡＵＣ）を計算し、Ｚ−得点を使って、予測値を有しない無作為分類のそれに対してΔＴＨＰＳの予測値を比較する（帰無仮説）（Hanley JA and McNeil BJ 1982 Radiology 143:29-36）。
【００９７】
被検者を分類するためのΔＴＨＰＳの使用を評価するため、反応者を非反応者から最良に区別するΔＴＨＰＳのための閾値を選択する。訓練組のデータに基づいて、０〜４８の各種閾値について真陽性、真陰性、偽陽性および偽陰性の数を列挙した表を、経験をつんだ複数の臨床医に見てもらう。臨床医らは、各々の場合の臨床結果を与えられて、偽陽性と偽陰性の間の最良の兼ね合いを表すと彼らが考える一つの閾値に合意に達することを求められる（DeNeef, P. and Kent, D.L. 1993 Medical Decision Making 13:126-132、Noe, D,A. 1983 Clin Chem 29:571-572、Schafer, H. 1989 Statistics in Medicine 8:1381-1391、および Somoza, E. and Mossman, D. 1991 Biological Psychiatry 29:811-826）。次いで、その同じ閾値を妥当性確認組からのデータに適用する。この閾値より上および下の被検者について、成果を照合する。
【００９８】
結果：それら被検者を訓練組と妥当性確認組に区分けする。訓練組は、予測モデルの評価と閾値の選択のために使用する。複数の臨床医が一つの閾値を選択し、次いで、その閾値を使って妥当性確認組の中の患者を、予測される反応者と非反応者に分類する。次いで、その予測の成果を報告する。
【００９９】
ΔＴＨＰＳと成功する治療：ΔＴＨＰＳの種々の閾値レベルについて、成功する治療をΔＴＨＰＳで予測できることを示すＲＯＣ曲線を作成する。そのｙ軸は、治療を成功裡に完了する被検者の中でΔＴＨＰＳが当該閾値より上である被検者の割合である、敏感度(sensitivity)を示す。そのｘ軸は、
硝子体切除なしの治療を完了できない被検者の中で
ΔＴＨＰＳが当該
閾値より上である被検者の割合である、（１ − 特異度）（訳者注：この「１ − 特異度」は「偽陽性率」とも呼ばれる）を示す。そのＡＵＣは、適当なＰ値で予測可能性が全くないという帰無仮説を否定する曲線である。
【０１００】
適切な敏感度と適切な特異度をもたらす一つのΔＴＨＰＳの閾値が選択される。その選択されたΔＴＨＰＳの閾値は、適切な百分率の陽性（閾値より上のΔＴＨＰＳ）の予測値および適切な百分率の陰性（閾値より下のΔＴＨＰＳ）の予測値をもたらす。この閾値を使って被検者の成果が分類される。
【０１０１】
糖尿病の患者にヒアルロニダーゼを硝子体内注射した後の硝子体出血の反応を予測する採点方法
硝子体出血は、現在、観察、硝子体切除、または硝子体内ヒアルロニダーゼによる酵素での硝子体溶解によって治療処置されている。ヒアルロニダーゼで治療された患者は、迅速に反応して出血が消失するか、反応が遅くて出血の消失が遅延するか、または３か月を超えて出血が持続するかする。
【０１０２】
目的：ヒアルロニダーゼを注射した後、３か月までに、硝子体が透明になる可能性が最も高い患者を続けて観察する指針を提供する予測モデルを開発することである。
【０１０３】
計画：重篤な硝子体出血の治療処置のためぬ、ヒアルロニダーゼを硝子体内に一回注射する二つの無作為二重盲検プラセボ対照第３相臨床試験から、事後データ分析を糖尿病の被検者について実施した。
【０１０４】
成果の主要尺度：上記臨床試験中、硝子体出血の密度を、眼底の１２個の放射状区画（「時計の時間」）の各々について、明確に定義した０〜４の硝子体出血格付けスケールを使って採点した。基準線と注射後１か月との間での合計出血得点の減少値（ΔＴＨＰＳ）を分析して、３か月後における硝子体出血の結果の予測変数として分析した。
【０１０５】
所見：受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析により強力な予測モデルを実地に示したが、その場合、その曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．８４５であった（Ｐ＜０．０００１）。そのΔＴＨＰＳは、ヒアルロニダーゼで治療した被検者の方が食塩水で治療した対照被検者より高かった。ΔＴＨＰＳの中央値は、食塩水で治療した対照被検者では２．０であったのに対して、５５ＩＵ（６８ＵＳＰ）のヒアルロニダーゼで治療した被検者では８．０であり、７５ＩＵ（９３ＵＳＰ）のヒアルロニダーゼで治療した被検者では６．０であった（Ｐ＜０．０００１、クラスカル・ワリス検定）。
【０１０６】
結論：１か月後のΔＴＨＰＳは、糖尿病でかつ重篤な硝子体出血が見られる患者の硝子体にヒアルロニダーゼを一回注射することによる成果を予測するための定量的指針を提供する。
【０１０７】
訓練組と妥当性確認組：前記遡及的分析で得た結果の適用性を確認するために、利用可能な被検者のデータの組を半分に区分する。一方の半分は、訓練組で、予測モデルの研究と開発のために使用した。もう一方の半分のは、妥当性確認組で、最終モデルが定義され決断閾値が選択されるまで保留した。次いで、妥当性確認組を予測アルゴリズムにかけた。ここに報告する結果は、その妥当性確認組から得たものである。
【０１０８】
これら二つのデータの組は、重篤な硝子体出血を消失させるためヒツジのヒアルロニダーゼ（Vitrase（登録商標）、ISTA Pharmaceuticals, Inc.）を硝子体内に１回注射した二つの第３相臨床試験に参加した、糖尿病の被検者８５６名から得た（臨床試験 NCT 00198510 および NCT 00198497）（Vitrase（登録商標）Package Insert. ISTA Pharmaceuticals（登録商標）Inc. Irvine, CA 2005、Kuppermann BD et al. 2005 Am J Ophthalmol 140:573-584）。国際公開ＷＯ２００４／０９２３６１号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１６９２号を参照。硝子体が出血している被検者を、コンピュータ作成無作為化リストに従って、治療グループに逐次割り当てた。その治療グループとしては、７．５ＩＵ（９．３ＵＳＰ）、５５ＩＵ（６８ＵＳＰ）および７５ＩＵ（９３ＵＳＰ）（ISTA Pharmaceuticals(登録商標), Inc.）があった。ＦＤＡと協議して、７．５ＩＵのグループは、この投与量が次善の投与量であることが確認されたので、このグループの登録は、１８１名の患者で中止した。このグループは、この分析には含まれていない。
【０１０９】
硝子体内注射前の基準線で、および１日目、１週間目、１か月目、２か月目および３か月目に、眼科の検査を実施した。被検眼球の図４に示したような時計文字盤の１２の区分に相当させて、角度で画定した眼底網膜の１２区画の各々における被検眼球の各評価で、硝子体出血を採点した。その眼底の各区画に、０（出血なし）から４（最も重篤な出血）までの範囲の明確な硝子体出血格付けの得点を割り当てた。これら１２の得点を合計して、各来診時の出血合計得点（ＴＨＰＳ）を得た。基準線と硝子体内注射から１か月後との間のＴＨＰＳの減少値（ΔＴＨＰＳ）を調べた。この得点は、大部分の被検者について正の数になるように、「変化値」（［１か月後のＴＨＰＳ］引く［基準線におけるＴＨＰＳ］）ではなくて、「減少値」（［基準線におけるＴＨＰＳ］引く［１か月後のＴＨＰＳ］）として計算してあることに留意されたい。
【０１１０】
一次効果の終点は、原因疾患を確認して、指示されれば３か月目の来診までに治療を完了するのに十分なほど、硝子体出血が消失することと定義した。被検眼球の硝子体出血が、原因疾患を診断するのに十分消失した場合、および先に定義した３基準が３か月目来診の期間窓内に満たされた場合、被検者を治療成功に分類した。前記基準の内の一つは、各臨床試験における原因疾患に対するＰＲＰの完了であった。症例報告用紙（ＣＲＦ）には、ＰＲＰが開始されたか、進行中であるか、または成功裡に完了したかについて、記載した。
【０１１１】
１か月目の評価から得たデータを使って、３か月目の終わりの時点での各被検者について成果を予測した。そのような予測をすることが無関係と思われる被検者は、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析から除いた。したがって、以下の事象、すなわち、重篤な有害事象、硝子体切除術その他の眼の外科的処置、およびＰＲＰの開始または成功裡の完了が、１か月目の来診より前に起こった場合は、その被検者は除外した。ΔＴＨＰＳまたは成果を決められなかった少数の被検者は、除外した。被検者の残りの組を無作為に半分ずつにに分け、訓練組と妥当性確認組とした。
【０１１２】
統計的分析：３か月目の来診時またはその前に硝子体切除なしでＰＲＰが成功裡に完了していた被検者（反応者）を意味する「１」、および３か月目の来診時またはその前にＰＲＰが成功裡に完了していなかった被検者（非反応者）を意味する「０」を使って二元成果(binary outcome)を検討した。ΔＴＨＰＳを、この二元成果の予測変数として評価した。線形分類法として知られているアルゴリズムを採用した（Duda RO et al. in Pattern Classification, 2nd ed. New York、John Wiley & Sons, Inc. 2001 p.37）。与えられた被検者についてΔＴＨＰＳが閾値を超えた場合、それは、「陽性」であると判断し、硝子体内酵素治療に対する好ましい反応を予測していた。ΔＴＨＰＳが前記閾値以下であった場合、それは、「陰性」であると判断し、好ましくない反応を予測していた。適切な閾値を選択することについて、以下に考察する。
【０１１３】
前記成果のためのΔＴＨＰＳの予測値は、ＲＯＣ曲線を使って決定した（Agresti A in Categorical Data Analysis, 2nd ed. Hoboken, New Jersey、John Wiley & Sons, Inc. 2002 pp. 228-230）。前記曲線の下の面積（ＡＵＣ）を計算し、Ｚ−得点を使って、予測値を有しない無作為分類のそれに対してΔＴＨＰＳの予測値を比較した（帰無仮説）（Hanley JA and McNeil BJ 1982 Radiology 143:29-36）。非母数密度推定法(nonparametric density estimation)（Venables WN and Ripley BD in Modern Applied Statistics with S. 4th ed. New York、Springer-Verlag 2002, pp.126-132）を利用して、治療グループの被検者についてΔＴＨＰＳ値の分布をプロットし、治療グループをクラスカル・ワリス検定法で比較し、そしてウイルコクソン順位和検定法で対による比較を実施した。
【０１１４】
被検者を分類するためのΔＴＨＰＳの使用を評価するため、反応者を非反応者から最良に区別するΔＴＨＰＳのための閾値を選択した。訓練組のデータに基づいて、０〜４８の各種閾値について真陽性、真陰性、偽陽性および偽陰性の数を列挙した表を、経験を積んだ複数の臨床医に見てもらった。臨床医らは、各々の場合の臨床結果を与えられて、偽陽性と偽陰性の間の最良の兼ね合いを表すと彼らが考える一つの閾値に合意に達することを求められた（DeNeef, P. and Kent, D.L. 1993 Medical Decision Making 13:126-132、Noe, D,A. 1983 Clin Chem 29:571-572、Schafer, H. 1989 Statistics in Medicine 8:1381-1391、および Somoza, E. and Mossman, D. 1991 Biological Psychiatry 29:811-826）。次いで、その同じ閾値を妥当性確認組からのデータに適用した。この閾値より上および下の被検者について、成果を照合した。統計的分析は、全て、S-Plus Version 7.0（Insightful Corp., Seattle, WA）ソフトウェアで行なった。
【０１１５】
結果：分析された糖尿病患者８５６名のうち、４３名（５．０％）は、ΔＴＨＰＳを計算するためのデータを欠いているため、または１か月目の来診をしていないかもしくは継続管理をしていないので成果のデータを欠いているため除外した。残りの被検者８１３名のうち１３名（１．５％）は、１か月目の来診時またはその前に、硝子体切除術または他の外科手術（例えば、冷凍網膜固定法および強膜内陥術）の治療を実施できなかったため、除外した。これら被検者のうち２名（０．２％）は、重篤な有害事象、具体的に述べると網膜剥離を経験した。レーザ治療の成果については、１００名の被検者（１１．７％）を、１か月目の来診の前にＰＲＰが開始されたため、除外して、７００名の被検者を残した。次いで、被検者を各３５０名の訓練組と妥当性確認組に区分した。その訓練組は、予測モデルの評価と閾値の選択に使った。閾値５．０が臨床医らによって選択され、妥当性確認組の中の患者を予測される反応者と非反応者に分類するのに使用された。その予測成果を以下に報告する。
【０１１６】
ΔＴＨＰＳおよび成功裡のレーザ治療
図５に示すＲＯＣ曲線は、ΔＴＨＰＳが、ΔＴＨＰＳの種々の閾値レベルについてレーザ治療の成功を予測することができることを示す。そのｙ軸は、成功裡にレーザ治療を完了した被検者の中でΔＴＨＰＳが閾値より上である被検者の割合を意味する敏感度を示す。そのｘ軸は、硝子体切除なしでレーザ治療を完了できなかった被検者の中でΔＴＨＰＳが閾値より上である被検者の割合を意味する「１ − 特異度」を示す。このＡＵＣは、０．８４５であり、Ｐ＜０．０００１で予測可能性が全くないという帰無仮説を、否定している。
【０１１７】
選択されたΔＴＨＰＳの閾値５．０によって、敏感度８４％、特異度７２％、陽性（閾値より上のΔＴＨＰＳ）の予測値５７％、および陰性（閾値より下のΔＴＨＰＳ）の予測値９１％が得られた。ΔＴＨＰＳの閾値＞５．０を使った、被検者の成果のツリー図を、図６に示す。
【０１１８】
治療グループによるΔＴＨＰＳ
図７は、前記３治療グループのΔＴＨＰＳ値の非母数密度の推定値を示し、非対称の分布を示している。食塩水治療グループ、５５ＩＵ治療グループおよび７５ＩＵ治療グループのΔＴＨＰＳ中央値は、それぞれ２．０、８．０および６．０である。ヒアルロニダーゼ５５ＩＵの反応が食塩水対照の反応より大きいという仮説の片側ウイルコクソン順位和検定法によって、Ｚ得点（Ｚスコア）４．３６６４（Ｐ＜０．０００１）が得られている。食塩水対照に対するヒアルロニダーゼ７５ＩＵの反応の同様の検定によって、Ｚ得点３．４５７７（Ｐ＝０．０００３）が得られている。５５ＩＵグループと７５ＩＵグループの間に統計的には有意差がない（ｐ＝０．８４７）。前記３治療グループについてΔＴＨＰＳが等価であるかに関するクラスカル・ワリス検定によって、χ2 値２０．９６２６（自由度：２、Ｐ＜０．０００１）が得られている。
【０１１９】
考察
硝子体出血に対して実行可能な治療法として、ヒアルロニダーゼを使用する酵素による硝子体溶解法(enzymatic vitreolysis)がある。治療と症状解消の間に３か月までの遅れを伴う、治療に対する種々の反応が、現行の治療アルゴリズム下での患者の治療処置について挑戦課題を与えている。硝子体内へのヒアルロニダーゼの注射に対して迅速に（つまり、１か月以内に）反応しない患者に対しては、患者を観察するかまたは硝子体切手術に進むかについて、客観的な指針は全くない。
【０１２０】
上記分析で得た結果は、治療医師が、基準線時点と注射後１か月の時点での非侵襲性の網膜検査に基づいて、ヒアルロニダーゼによる治療の後で硝子体出血が消失する可能性を決める予測採点法を有していることを示している（Thomas E et al. in Proceedings Book of the 2006 Food and Drug Administration Science Forum Meeting, Washington, D.C., April 18-20, 2006, abstract）。この治療に反応する多くの患者は、早期に同定できるので、不必要な硝子体切除術を回避することができる。加えて、ΔＴＨＰＳの測定は、ヒアルロニダーゼによる治療に対して反応する可能性がないであろう患者を同定することができる。硝子体切除術を早期に行えば、それら患者の生活の質を改善するであろうし（Brown MM et al. 2003 Ophthalmology 110:1076-1081）、かつ彼らの原網膜疾患の悪化を防止できると思われる。
【０１２１】
閾値のΔＴＨＰＳ＞５．０という控えめの選択(conservative choice)は、さもなければヒアルロニダーゼによる治療に反応したであろう患者に硝子体切除手術を推薦することになるかもしれない「偽陰性」を避けることが最も必要であることに基づいている。もし、硝子体切除手術実施の決断がΔＴＨＰＳ値のみに基づいたら、患者の４．２％がこの「偽陰性」の範疇に入ってしまうと予想される。その偽陰性値は、判断資料データの中に入れておいて、予測の指針がない場合、硝子体切除手術をうけることになるかも知れない潜在的に非常に多数の潜在的反応者と比較しなければならない。
【０１２２】
定量的予測モデルと受信者操作特性曲線は、医療の多くの分野で一般的なものである（Muthukumar T et al. 2005 N Engl J Med 353:2342-2351、Mitchell SL et al. 2004 JAMA 291:2734-2740、Walter LC et al. 2001 JAMA 285:2987-2994、Newman TB et al. 2005 Arch Pediatr Adolesc Med 159:113-119）。例えば、ＣＤ４のカウントが、ＲＮＡヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を測定する代用マーカとして使用されており、そしてそのＡＵＣは、０．７６であった（Read JS et al. 2000 Pediatric Infect Dis J 19:544-541）。別の例は、前立腺癌の代用マーカとしての前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）試験であり、その場合、ＡＵＣは、０．７４〜０．７６であった（Etzioni R et al. 2004 Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 13:1640-1645）。眼科学では、ＲＯＣ曲線分析を使うことが増えてきている（Budenz DL et al. 2005 Ophthalmology 112:3-9、Burnstein Y et al. 2000 Am J Ophthalmol 129:328-333、Cullinane AB et al. 2002 Br J Ophthalmology 86:555-559）。我々は、ヒアルロニダーゼを硝子体内に注射した後の硝子体出血に関する我々の分析の過程と結果を明確に示す単純な二元決断モデルを提供し、その場合ＡＵＣは０．８４５であった。臨床診療の場合、我々は、ΔＴＨＰＳが、糖尿病でかつ重篤な硝子体出血を有する患者に対して臨床決断をする際に助けになると予想している（Landers MB et al. in Proceedings book of the Association for Research in Vision and Ophthalmology, Inc. Annual Meeting, Ft. Lauderdale, FL, April 30-May 5, 2006, abstract、および Bhaysar AR et al. in Proceedings book of the Association for Research in Vision and Ophthalmology, Inc. Annual Meeting, Ft. Lauderdale, FL, April 30-May 5, 2006, abstract）。ΔＴＨＰＳの「境界線」値を有する患者は、例えば、さらに１か月間観察され再び評価されてもよい。硝子体切除手術を実行しようと決断する場合、ΔＴＨＰＳに加えて、一般的な患者の健康、硝子体切除手術に対する候補立て、および職業上の要件を考慮すべきである。
【０１２３】
ＲＯＣ曲線の分析は、被検母集団の実態的人口統計と臨床特性に左右される。この母集団は、食塩水を注射された対照群を含んでいることに留意すべきである。食塩水の注射は、硝子体出血に対する治療として採用されないので、このグループは、臨床診療の場合には存在しないであろう。重要なことには、食塩水グループの患者の反応速度がヒアルロニダーゼグループの患者より低かったことである。したがって、ここに提供される結果は、控えめで、かつ治療の全利点は過小評価されている。臨床診療の場合、予測モデルは、代わりの治療が観察だけの場合、一層有用である。食塩水の対照グループは、ΔＴＨＰＳに基づいた予測が、零を含むヒアルロニダーゼ投与量の広い範囲にわたって有効であることを実証するために残した。
【０１２４】
上記モデルは、たとえ生理的事象がΔＴＨＰＳには僅かの変化しか生じない場合でも、ヒアルロニダーゼによる治療の長期間の成果は、最初の数週間の生理的事象によって殆ど決まってしまうことを示している。硝子体出血の消失の根底をなす機序は、完全には分かっておらず、赤血球の拡散、吸収および代謝に影響する硝子体の対流を含んでいるかも知れない。治療の失敗は、硝子体出血の再発、またはヘモグロビン、赤血球，および食菌作用に影響する細胞因子と生化学的因子の物理的輸送を妨げる可能性のある網膜前膜もしくは硝子体網膜の維管膜の生成、が原因であると思われる。ここに提供する成果は、硝子体出血の治療アルゴリズムの将来の臨床研究につながるであろうと思われる。さらなる研究としては、ＴＨＰＳの変化のより早期でより頻繁な測定と、併せて患者の年齢や出血の期間などの追加の変数を組み込んだ、より程度の高い予測モデルの開発と実証が挙げられるであろう。最後に、ΔＴＨＰＳを使って、二回目のヒアルロニダーゼの注射を行なう候補者を特定することができる。
【０１２５】
結論として、患者が硝子体の出血を起こすと、臨床医は、ヒアルロニダーゼを硝子体内へ注射する治療を選択すると思われる。このような状況下で、ΔＴＨＰＳを使った予測モデルを適用すると、意思決定とこれら患者のさらなる治療処置の指針を助けるツールが提供される。結局、これは、硝子体出血を治療するためにヒアルロニダーゼを投与される患者をより効果的に介護することにつながる。
【０１２６】
この発明を、明らかにし理解しやすくするためにある程度詳細に説明してきたが、当業者は、この発明の範囲から逸脱することなく、形状や細部の様々な変更ができることを理解するであろう。全ての図面、表および付属事項に、併せて上記に引用した特許、特許出願および刊行物は、この明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】Ｈｙａｌ−１の推定体内タンパク質分解プロセシングの線図である。プロセシングを受けていないＨｙａｌ−１を上側の図に示してある。Ｎ末端における最初の７個のアミノ酸を示してある（配列番号：１６）。体内タンパク質分解プロセシングの後、２個のフラグメントが生成して二つの別個のＮ末端が形成されている（配列番号：１６と配列番号：１７）。２２個のアミノ酸のフラグメントが、残りのタンパク質にジスルフィド結合で連結されていると推定される。
【図２Ａ】ＰＩＭＡプログラムを使用して２００１年までに同定されたヒトとマウスの全ヒアルロニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡの概念的翻訳の並びの一部（上段：最初の部分、下段：その続き）である。同一のアミノ酸を枠で囲ってある。保存されたブロック(conserved blocks)は、酵素活性にとって臨界的な領域であると推定されるが、全体にわたって見られる。Ｈｙａｌ２＿ｈ−（配列番号：１）、Ｈｙａｌ２＿ｍ−（配列番号：２）、ＰＨ２０＿ｈ−（配列番号：３）、ＰＨ２０＿ｍ−（配列番号：４）、Ｈｙａｌ１＿ｈ−（配列番号：５）、Ｈｙａｌ１＿ｍ−（配列番号：６）、Ｈｙａｌ４＿ｈ−（配列番号：７）、Ｈｙａｌ４＿ｍ−（配列番号：８）、Ｈｙａｌｐ１＿ｈ−（配列番号：９）、Ｈｙａｌｐ１＿ｍ−（配列番号：１０）、Ｈｙａｌ３＿ｈ−（配列番号：１１）、Ｈｙａｌ３＿ｍ−（配列番号：１２）。
【図２Ｂ】ＰＩＭＡプログラムを使用して２００１年までに同定されたヒトとマウスの全ヒアルロニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡの概念的翻訳の並びの一部（上段：図２Ａ下段の続き、下段：その続き）である。
【図２Ｃ】ＰＩＭＡプログラムを使用して２００１年までに同定されたヒトとマウスの全ヒアルロニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡの概念的翻訳の並びの一部（上段：図２Ｂ下段の続き、下段：その続き）である。
【図２Ｄ】ＰＩＭＡプログラムを使用して２００１年までに同定されたヒトとマウスの全ヒアルロニダーゼ遺伝子のｃＤＮＡの概念的翻訳の並びの一部（図２Ｃ下段の続き）である。
【図３Ａ】ヒトのＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号  ＮＭ＿１５３１８９）（配列番号：３）、に並べてウシのＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号  ＡＡＰ５５７１３）（配列番号：１３）、ブタの精子接着分子１すなわちＳＰＡＭ１（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号  ＮＰ＿９９９１７６）（配列番号：１４）、およびヒツジ精巣のヒアルロニダーゼ（配列番号：１５）の並びの一部（第１段から第７段まで順次前の段の続き）である。
【図３Ｂ】ヒトのＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号  ＮＭ＿１５３１８９）（配列番号：３）、に並べてウシのＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号  ＡＡＰ５５７１３）（配列番号：１３）、ブタの精子接着分子１すなわちＳＰＡＭ１（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号  ＮＰ＿９９９１７６）（配列番号：１４）、およびヒツジ精巣のヒアルロニダーゼ（配列番号：１５）の並びの一部（図３Ａ第７段の続き）である。
【図４】ΔＴＨＰＳの計算例を示す。この例では、基準線のＴＨＰＳは、４＋３＋４＋４＋４＋４＋４＋４＋４＋４＋４＋３＝４６である。１か月の時点でのＴＨＰＳは、２＋２＋３＋３＋３＋４＋４＋３＋３＋２＋２＋１＝３２である。したがって、ΔＴＨＰＳ＝４６−３２＝１４である。１４は、閾値の５より大きいので、この患者は「陽性」（＝有望）であり、好ましい成果が予測される。角度で画定した網膜眼底の１２個の区画の各々において、０（出血なし）から４（最も重篤な出血）までの範囲にわたる明確に定義された硝子体出血の格付け得点を割り当てた。すなわち、０は、網膜が目視可能で、容易に治療できる。１は、網膜の細部が目視可能で、出血がいくらか存在し、レーザによる治療が可能であろう。２は、網膜の大血管が目視可能であるが、中央網膜の細部は、水晶体赤道の後ろに全網膜光凝固法を適切に実施するのに十分なほど、目視可能でない。３は、赤色反射が目視できるが、水晶体赤道の後ろの中央網膜血管が全く見えない。４は、赤色反射が全くない。
【図５】全網膜レーザ光凝固（ＰＲＰ）治療が成功するというΔＴＨＰＳに基づいた予測を行なうための受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。敏感度（ｙ軸）および「１ − 特異度」（ｘ軸）を、ΔＴＨＰＳに対する閾値の関数として示す。敏感度および特異度の計算において、「陽性の結果」（＝有望な結果）とは、患者が、先に定義されている成功の基準（Kuppermann BD 他、2005 Am J Ophthalmol 140:573-584）を使って、全網膜レーザ光凝固術を成功裡に完了する、という予測をいう。選択された閾値、ΔＴＨＰＳ＞５の点を、その点における敏感度と特異度とともに、黒色で示してある。
【図６】被検者の成果を集計した表的図解である。このツリー図は、３か月後までに全網膜レーザ光凝固法の成功裡の完了と定義された「反応」について、および１か月後までに硝子体切除または他の手術が必要であると定義された「治療の失敗」について、被検者の成果を要約している。１か月後までの反応者の数と治療失敗者の数を２で割って、妥当性確認の組からの試験結果と直接比較した。この場合、妥当性確認の組には、予測モデルを適用された被検者の半数が含まれている。３か月後の時点で被検者の状態を予測するためにΔＴＨＰＳを使用する必要はないので、ΔＴＨＰＳの結果による分類は、１か月後の時点での治療の失敗または成功には適用できない。
【図７】治療グループによるΔＴＨＰＳ値に対する非母数密度の推定値を示す。このグラフは、３組の治療グループにおける被検者についてのΔＴＨＰＳ値のヒストグラムを平滑化したものである。５５ＩＵのグループと７５ＩＵのグループにおける被検者は、高いΔＴＨＰＳ値を有する、という蓋然性が高い。したがって、そのヒストグラムの右側テール部分は、これらのグループの方が高い。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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