(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドと、それを含む組成物と、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８受容体を発現する細胞を刺激するためにオリゴヌクレオチドおよび組成物を使用する方法とを提供する。オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７を刺激するためにウラシルが豊富な領域を含む。ＴＬＲ８を刺激するためのオリゴヌクレオチドは、グアニンが豊富な領域を含む。本発明の方法および組成物は、感染症および癌などの状態を治療または予防するために特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜５０個の間のヌクレオチドからなり、ＵＵＵｒ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵｒ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹから選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであって、
Ｕが、それぞれ独立して、ウラシル含有ヌクレオチドから選択され、
Ｙが、それぞれ独立して、非ウラシル含有ヌクレオチドから選択され、
Ｘが、それぞれ独立して、任意のヌクレオチドから選択され、
ｒが１〜３の整数であり、
ｎが１〜４の整数であり、
ｐが４よりも大きい整数であり、そして
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ウラシル含有ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然結合を含む一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、１０〜１９個の間のヌクレオチドからなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、１９〜５０個の間のヌクレオチドからなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０個の間のヌクレオチドからなる、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、２１〜３０個の間のヌクレオチドからなる、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、１５〜２１個の間のヌクレオチドからなる、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、１５ヌクレオチドまたは２１ヌクレオチドからなる、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが配列ＵＵＵｒ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵｒを含み、ｒが２であり、そしてｎが１である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが配列（ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ）ｍを含み、ｎが１〜４の整数であり、そしてｍが２よりも大きい整数である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ｎが１である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ｍが３または４である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが配列Ｙ（Ｕ）ｐＹを含み、ｐが９よりも大きい整数である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｕがそれぞれウリジンであり、前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの非天然結合を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
１つ以上のホスホロチオエート結合を含むと共に完全にウリジンからなる２１−ｍｅｒと、少なくとも１０の連続したウリジンを含む２１−ｍｅｒと、配列ＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵ（Ｕはそれぞれウリジンであり、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択される）を含む２１−ｍｅｒとから選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも５０％のウラシル含有ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、５０％未満のグアニン含有ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、ｐｏｌｙＵｏ−２１、ｐｏｌｙＵｏ−１５、ｐｏｌｙＵｏ−１０、ｐｏｌｙＵｓ−２１、ｐｏｌｙＵｓ−１５、ｐｏｌｙｄＵｏ−２１、ｐｏｌｙｄＵｓ−２１、ＳＳＤ８、ＳＳＤ９、ＳＳＤ１０、ＳＳＤ１３、ＳＳＤ１４、ＳＳＤ１５、ＳＳＤ２１、ＳＳＤ２２、ＳＳＤ２３、ＳＳＤ２４、ＳＳＤ２８またはＳＳＤ２９から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
１１〜５０個の間のヌクレオチドからなり、ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺから選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであって、
Ｇが、それぞれ独立して、グアニン含有ヌクレオチドから選択され、
Ｘが、それぞれ独立して、任意のヌクレオチドから選択され、
Ｚが、それぞれ独立して、非グアニンヌクレオチドから選択され、
ｎが、１〜４の整数であり、
ｐが、４よりも大きい整数であり、そして
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非グアニン含有ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然結合を含む一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが配列ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧを含み、ｎが１である、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが配列（ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ）ｍを含み、
ｎが１〜４の整数であり、
ｍが２よりも大きい整数である、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
ｎが１である、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
ｍが３または４である、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが配列Ｚ（Ｇ）ｐＺを含み、ｐが９よりも大きい整数である、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
Ｇがそれぞれグアノシンである、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹから選択される配列をさらに含み、
Ｕが、それぞれ独立して、ウラシル含有ヌクレオチドから選択され、
Ｙが、それぞれ独立して、非ウラシル含有ヌクレオチドから選択され、
ｎがそれぞれ独立して選択され、そして
ｐがそれぞれ独立して選択される、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドをさらに含む、請求項１または１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
ａ．１０〜５０個の間のヌクレオチドからなり、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹ（式中、
Ｕはそれぞれ独立してウラシル含有ヌクレオチドから選択され、
Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、
ｎは１〜４の整数であり、そして
ｐは４よりも大きい整数である）
から選択される配列を含む有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
ｂ．薬学的に許容可能なキャリアと、
を含む医薬品組成物。
【請求項２８】
ａ．１１〜５０個の間のヌクレオチドからなり、ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、
Ｇはそれぞれ独立してグアニン含有ヌクレオチドから選択され、
Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、
Ｚはそれぞれ独立して非グアニンヌクレオチドから選択され、
ｎは１〜４の整数であり、そして
ｐは４よりも大きい整数である）
から選択される配列を含む有効量の一本鎖オリゴヌクレオチドと、
ｂ．薬学的に許容可能なキャリアと、
を含む医薬品組成物。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、緻密化剤またはリポソームと複合体を形成する、請求項２７または２８に記載の医薬品組成物。
【請求項３０】
前記緻密化剤がポリエチレンイミンである、請求項２９に記載の医薬品組成物。
【請求項３１】
抗原をさらに含む、請求項２７または２８に記載の医薬品組成物。
【請求項３２】
前記抗原が、ウィルス抗原、癌抗原またはアレルゲンから選択される、請求項３１に記載の医薬品組成物。
【請求項３３】
第２の治療薬をさらに含む、請求項２７または２８に記載の医薬品組成物。
【請求項３４】
前記第２の治療薬が、化学療法薬、放射線治療薬、細胞毒、抗血管新生薬、癌抗原に対するモノクローナル抗体、免疫調節剤、サイトカイン、細胞表面受容体またはギャップ結合の上方制御に影響を与える薬剤、細胞分裂阻害剤または分化剤、あるいは細胞接着阻害薬、あるいは抗ウィルス剤から選択される、請求項３３に記載の医薬品組成物。
【請求項３５】
ＴＬＲ７を発現する細胞においてＴＬＲ７活性を刺激する方法であって、前記細胞を請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項３６】
前記細胞が形質細胞様樹状細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＴＬＲ８を発現する細胞においてＴＬＲ８活性を刺激する方法であって、前記細胞を請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項３８】
前記細胞が、骨髄樹状細胞、単球、またはＣＤ４＋調節性Ｔ細胞から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験者の免疫応答を刺激する方法であって、前記患者に請求項２７に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
被験者の免疫応答を刺激する方法であって、前記患者に請求項２８に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
前記方法が、癌、感染症、アレルギー、喘息、または自己免疫疾患を治療または予防するために使用されるか、あるいは、疾患、手術、または免疫抑制薬の投与に起因する患者の免疫機能を高めるために使用される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、癌を治療するため、あるいはウィルス性疾患を治療または予防するために使用される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
組成物の投与後に、被験者の免疫細胞活性を検出するさらなるステップを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌が、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚（扁平上皮癌を含む）の癌腫を含む癌腫と、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリーセルリンパ腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血系腫瘍と、急性および慢性の骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血系腫瘍と、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍と、メラノーマ、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍と、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および抹消神経系の腫瘍と、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含む間葉由来の腫瘍と、メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌を含む他の腫瘍とから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
化学療法薬、放射線治療薬、抗血管新生薬、標的免疫毒素、標的凝固リガンド、サイトカイン、ホルモン療法薬、または治療抗体から選択される薬剤を被験者に投与するさらなるステップを含み、前記薬剤が別個の剤形として、あるいは前記組成物の一部として投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウィルス性疾患が、エンテロウィルス（ポリオウィルス、コクサッキーウィルス、エコーウィルスなどのピコルナウィルス科のウィルスを含むがこれらに限定されない）、ロタウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルスから選択されるウィルスによって生じる疾患から選択され、ヒトにおいて見られるウィルスの特定の例として、レトロウィルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）などのヒト免疫不全ウィルスおよびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離体）、ピコルナウィルス科（例えば、ポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、エンテロウィルス、ヒトコクサッキーウィルス、ライノウィルス、エコーウィルス）、カリシウィルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）、トガウィルス科（例えば、馬脳炎ウィルス、風疹ウィルス）、フラビウィルス科（例えば、デング熱ウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）、コロナウィルス科（例えば、コロナウィルス）、ラブドウィルス科（例えば、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス）、フィロウィルス科（例えば、エボラウィルス）、パラミクソウィルス科（例えば、パラインフルエンザウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス）、オルトミクソウィルス科（例えば、インフルエンザウィルス）またはトリインフルエンザウィルス（例えば、Ｈ５Ｎ１または関連ウィルス）、ブニヤウィルス科（例えば、ハンタンウィルス、ブニヤウィルス、フレボウィルスおよびナイロウィルス）、アレナウィルス科（出血熱ウィルス）、レオウィルス科（例えば、レオウィルス、オルビウィルスおよびロタウィルス）、ビルナウィルス科、ヘパドナウィルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）、パルボウィルス科（パルボウィルス）、パポバウィルス科（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）、アデノウィルス科（ほとんどのアデノウィルス）、ヘルペスウィルス科（単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ））、ポックスウィルス科（痘瘡ウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス）、イリドウィルス科（例えば、アフリカブタ熱ウィルス）、または未分類ウィルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体、非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体、ノーウォークおよび関連のウィルス、またはアストロウィルス）があげられるがこれらに限定されない、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
ヌクレオシド類似体、非ヌクレオチド逆転写酵素阻害薬、ウィルスプロテアーゼ阻害薬、ウィルスタンパク質に対する抗体、ウィルスアンコーティング剤、またはサイトカインから選択される薬剤を被験者に投与するさらなるステップを含み、前記薬剤が別個の剤形として、あるいは前記組成物の一部として投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物中の前記オリゴヌクレオチドがデバイスから放出されて治療的に有効であるように、請求項２７または２８に記載の組成物が含浸されるか、あるいは請求項２７または２８に記載の組成物を含有する植込み型薬物放出デバイス。
【請求項４９】
植込み型薬物放出デバイスを含浸または充填する方法であって、前記薬物放出デバイスを請求項２７または２８に記載の組成物と接触させるステップを含む方法。
【請求項５０】
ａ．請求項２７または２８に記載の組成物と、
ｂ．癌の治療において有用な治療薬、感染症の治療において有用な治療薬、癌抗原、ウィルス抗原またはアレルゲンから選択される第２の薬剤と、
を含み、前記組成物および前記第２の薬剤が別々の剤形中に存在するが互いに関連している組成物。
【請求項５１】
ａ．請求項２７または２８に記載の組成物と、
ｂ．癌の治療において有用な治療薬、感染症の治療において有用な治療薬、癌抗原、ウィルス抗原またはアレルゲンから選択される第２の薬剤と、
を別々の容器内に含むキット。
【請求項５２】
ａ．請求項１または１８に記載のオリゴヌクレオチドと、
ｂ．検出可能なマーカーと、
を含む結合体。
【請求項５３】
試験オリゴヌクレオチドのＴＬＲ７またはＴＬＲ８への結合を検出する方法であって、
ａ．請求項５２に記載の結合体をＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質と接触させるステップであって、前記結合体の前記オリゴヌクレオチド部分は、前記試験オリゴヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列およびヌクレオチド間結合を有するステップと、
ｂ．前記検出可能なマーカーを検出するステップと、
を含む方法。
【請求項５４】
試験分子がＴＬＲ７またはＴＬＲ８に結合するかどうかを決定する方法であって、
ａ．前記試験分子が存在しない場合に、請求項５２に記載の結合体をＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質と接触させるステップと、
ｂ．前記ＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質に結合した検出可能なマーカーの量を定量するステップと、
ｃ．前記試験分子の存在下で、請求項５２に記載の結合体をＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質と接触させるステップと、
ｄ．前記試験分子の存在が、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質に結合した検出可能なマーカーの量を低下させるかどうかを決定するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、特に形質細胞様樹状細胞などの細胞の膜内に存在するＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）およびＴｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）などの受容体を刺激することによって免疫機能を変化させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザおよび他のウィルスに対する最も早い応答の１つは、抗ウィルス状態を確立して自然免疫系および適応免疫系の橋渡しをする重要なサイトカインであるＩ型ＩＦＮの産生である（非特許文献１）。哺乳類の自然免疫系は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーに属する受容体ファミリーによって侵入する病原体の存在を認識する。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９（全て、ウィルス病原体関連の分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識に関与する）などのＴＬＲは細胞内で発現され、これらの細胞が取り込んだ細胞外物質の中のウィルスＰＡＭＰの存在についてエンドソームの内容物をサンプリングする。アポトーシス細胞からの物質を取り込むＣＤ８ａ＋樹状細胞（ＤＣ）の場合、これらのＴＬＲは感染細胞中に存在するウィルスＰＡＭＰを感知するが、形質細胞様ＤＣは、細胞物質ではなくウィルス粒子を取り込み、取り込み時にウィルス粒子内部のゲノム核酸を認識するようである。
【０００３】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および高ＣｐＧ含量などのウィルスゲノムのいくつかの特徴は、宿主によって非自己であると識別され得る分子のサインとしての機能を果たすことができる。宿主−ウィルスの相互作用は感染細胞によるＩ型ＩＦＮの分泌をもたらし、おそらくＴＬＲによるパターン認識を伴う。ほとんどの型の細胞はウィルス感染の際にＩＦＮαおよびＩＦＮβを産生することができるが、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、特に、特定のウィルスに応答して非常に高レベルのＩ型ＩＦＮをうまく分泌する。
【０００４】
炎症誘発性のインターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）ファミリーのメンバーとして、ＴＬＲは、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒ相同（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれるその細胞質ドメインにおいて相同性を共有する（例えば、ＰＣＴ公開出願、特許文献１および特許文献２（これらの全体の開示は参照によって本明細書中に援用される）を参照）。ＴＬＲによって仲介される細胞内シグナル伝達機構は通常類似していると思われ、ＭｙＤ８８および腫瘍壊死因子受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）は重要な役割を果たすと考えられる（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、これらの全体の開示は参照によって本明細書中に援用される）。ＭｙＤ８８とＴＲＡＦ６の間のシグナル伝達は、セリン−スレオニンキナーゼＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）ファミリーのメンバー（少なくともＩＲＡＫ−１およびＩＲＡＫ−２を含む）を必要とすることが知られている（非特許文献８）。
【０００５】
ＴＬＲの活性化において、ＭｙＤ８８のＴｏｌｌ相同ドメインはＴＬＲのＴＩＲドメインと結合し、ＭｙＤ８８のデスドメインはセリンキナーゼＩＲＡＫのデスドメインと結合する。ＩＲＡＫはＴＲＡＦ６と相互作用を起こし、これは少なくとも２つの経路への通路の役割を果たし、一方は転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化をもたらし、そして他方は、活性化剤タンパク質−１（ＡＰ−１）転写因子ファミリーのメンバーであるＪｕｎおよびＦｏｓの活性化をもたらす。ＮＦ−ｋＢの活性化は、ＭＡＰ３キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーのメンバーであるＴＡＫ−１およびＩｋＢキナーゼの活性化を伴う。ＩｋＢキナーゼはＩｋＢをリン酸化し、その分解およびＮＦ−ｋＢの核への転位をもたらす。ＪｕｎおよびＦｏｓの活性化は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）およびＭＡＰキナーゼＥＲＫ、ｐ３８、ならびにＪＮＫ／ＳＡＰＫを必要とすると考えられる。ＮＦ−ｋＢおよびＡＰ−１はいずれも、様々なサイトカインおよび共刺激分子の遺伝子を含む多数の重要な免疫応答遺伝子の転写の制御に関与する（例えば、非特許文献９、非特許文献１０を参照）。
【０００６】
全てではないが多数のＴＬＲに対するリガンドが記載されている。例えば、ＴＬＲ２はペプチドグリカンおよびリポペプチドに応答して信号を送ることが報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。ＴＬＲ４は、リポ多糖（ＬＰＳ）に応答して信号を送ることが報告されている（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。細菌フラゲリンはＴＬＲ５に対する天然リガンドであると報告されている（非特許文献１９）。ＴＬＲ６は、ＴＬＲ２と共に、プロテオグリカンに応答して信号を送ると報告されている（非特許文献２０、非特許文献２１）。
【０００７】
ＴＬＲ７は、ゲノムウィルスＲＮＡの検出のためのパターン認識受容体である。形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）におけるＴＬＲ７仲介のＩＦＮαの誘発は、ＲＮＡ配列に関係なく、ウィルスＲＮＡ、哺乳類ｍＲＮＡおよびインビトロ転写されたＧＦＰのＲＮＡによって引き起こすことができる。長鎖の可変長のｐｏｌｙＵ（非特許文献２２）と、高い割合のＧＵヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド（非特許文献２３、特許文献３）と、特定の特異的ｓｉＲＮＡ配列（非特許文献２４）と、グアニンヌクレオチド類似体（非特許文献２５）とを含む様々な配列は、ＰＤＣにおいてＴＬＲ７をある程度まで刺激できることが既に示されている。イミキモドおよびレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ８４８）などの特定の抗ウィルスイミダゾキノリン化合物は、ＴＬＲ７を活性化できることが報告されている（非特許文献２６、非特許文献２７）。
【０００８】
ＴＬＲ８は、一本鎖ＲＮＡの検出のためのパターン認識受容体である。これは、ヒト樹状細胞、特に骨髄樹状細胞において機能的であるが、マウス樹状細胞においては機能的でないようである（非特許文献２７）。ＴＬＲ８は、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞においても機能的である。ＴＬＲ７を刺激するＧＵが豊富なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド、グアニンヌクレオチド類似体、ならびにイミキモドおよびレシキモド（Ｒ８４８）などのイミダゾキノリン化合物は、ヒトＴＬＲ８も刺激することが示されている。マウスにおけるＴＬＲ８の欠如の重要性と、何故ＴＬＲ７およびＴＬＲ８がヒト免疫細胞においていくらか冗長な認識機能を有するように見えるかは分かっていない。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ９８／０８９７９号明細書
【特許文献２】ＰＣＴ／ＵＳ０１／１６７６６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０２３２０７４号明細書
【非特許文献１】ル・ボン（Ｌｅ  Ｂｏｎ）ら、（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：４３２頁
【非特許文献２】ウェチェ（Ｗｅｓｃｈｅ）Ｈら、（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８３７−４７頁
【非特許文献３】メディトフ（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ）Ｒら、（１９９８年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ２：２５３−８頁
【非特許文献４】アダチ（Ａｄａｃｈｉ）Ｏら、（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：１４３−５０頁
【非特許文献５】カワイ（Ｋａｗａｉ）Ｔら、（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：１１５−２２頁
【非特許文献６】カオ（Ｃａｏ）Ｚら、（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：４４３−６頁
【非特許文献７】ロメガ（Ｌｏｍａｇａ）ＭＡら（１９９９年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：１０１５−２４頁
【非特許文献８】ムツィオ（Ｍｕｚｉｏ）Ｍら、（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１６１２−５頁
【非特許文献９】アデレム（Ａｄｅｒｅｍ）Ａら、（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７８２−７頁
【非特許文献１０】ヘイカー（Ｈａｉｃｋｅｒ）Ｈら、（１９９９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：６９７３−８２頁
【非特許文献１１】ヨシムラ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ）Ａら、（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：１−５頁
【非特許文献１２】ブライトビル（Ｂｒｉｇｈｔｂｉｌｌ）ＨＤら、（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７３２−６頁
【非特許文献１３】アリプランティス（Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓ）ＡＯら、（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７３６−９頁
【非特許文献１４】タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ）ら、（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：４４３−５１頁
【非特許文献１５】アンダーヒル（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ）ＤＭら、（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：８１１−５頁
【非特許文献１６】ホシノ（Ｈｏｓｈｉｎｏ）Ｋら（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：３７４９−５２頁
【非特許文献１７】ポルトラク（Ｐｏｌｔｏｒａｋ）Ａら、（１９９８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８５−８頁
【非特許文献１８】メディトフ（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ）Ｒら、（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：３９４−７頁
【非特許文献１９】ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）Ｆら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１０９９−１１０３頁
【非特許文献２０】オジンスキ（Ｏｚｉｎｓｋｙ）ら、（２０００年）ＰＮＡＳ  ９７：１３７６６−７１頁
【非特許文献２１】タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ）ら、（２００１年）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：９３３−４０頁
【非特許文献２２】ディーボルド（Ｄｉｅｂｏｌｄ）ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２９頁
【非特許文献２３】ハイル（Ｈｅｉｌ）ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２６頁
【非特許文献２４】ホーナング（Ｈｏｒｎｕｎｇ）ら、（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：２６３頁
【非特許文献２５】リー（Ｌｅｅ）ら、（２００３年）ＰＮＡＳ  １００：６６４６−６６５１頁
【非特許文献２６】ヘンミ（Ｈｅｍｍｉ）Ｈら、（２００２年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：１９６−２００頁
【非特許文献２７】ジューク（Ｊｕｒｋ）Ｍら、（２００２年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：４９９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ウィルスおよび他の感染病原体に対する防御のための自然免疫応答のＴＬＲ７およびＴＬＲ８仲介の刺激の重要性を考慮して、そして一般に、癌などの状態の治療および防止を助ける免疫応答を刺激するために、当該技術分野ではインビトロおよびインビボでＴＬＲ７およびＴＬＲ８を互いに独立して有効および確実に活性化することのできる新規の化合物が非常に必要とされている。本発明は、この必要性およびその他の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの態様では、本発明は、単離した一本鎖オリゴヌクレオチドと、それを含む組成物と、特にＴＬＲ７受容体によるＴＬＲ仲介のシグナル伝達を最適に刺激するための方法とを提供する。本明細書において記載されるオリゴヌクレオチド、組成物および方法は、ＴＬＲ７発現細胞、例えば形質細胞様樹状細胞などの樹状細胞、および調節性Ｔ細胞の特定のサブセットの活性化をインビトロおよびインビボで増強するために有用である。このようなオリゴヌクレオチド、組成物および方法は、癌または感染症、特にウィルス感染症などの状態を治療または予防するための医薬品および方法を含む多数の臨床用途において有用である。また本発明のオリゴヌクレオチドおよび組成物は、ＴＬＲ７活性に対する他の化合物の効果を評価するための方法、例えば、ＴＬＲ７またはＴＬＲ７発現細胞の他の候補調節物質を同定または特徴付けるためのアッセイにおいて使用することもできる。オリゴヌクレオチドおよび組成物は、特に樹状細胞によってＩＦＮαの産生および／または放出を誘発する方法においても有用である。
【００１１】
現在記載されているオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７刺激のために最も重要なものを決定するために様々な構造パラメータを変化させた、本明細書中で提供される研究に基づいている。意外なことに、ヌクレオチドウリジンは、ＴＬＲ７受容体による認識およびＴＬＲ７受容体の活性化を決定する本質的な特徴であることが発見された。従って、１つの実施形態では、本発明は、１０〜５０個の間のヌクレオチドからなり、ＵＵＵｒ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵｒ、またはＵＵｒ−Ｘ−ＵＵｒ−Ｘ−ＵＵｒ（式中、Ｕはそれぞれ独立してウラシル含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立してヌクレオチド、任意で非ウラシルヌクレオチドまたはウラシルから選択され、ｒは１〜２０の整数、好ましくは１〜１０の整数、好ましくは１、２、３、４または５であり、ｎは１〜４の整数である）から選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非ウラシル含有ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然結合を含む。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド（例えば、非ウラシルヌクレオチド、誘導体）は、生物サンプル、好ましくは樹状細胞を含むサンプル（例えば、ｐＤＣまたは他のＴＬＲ７発現ＤＣが存在する）と接触されたときにかなりの量のＩＬ−６を誘発する能力をオリゴヌクレオチドに付与しない。好ましくは、本発明に従うＴＬＲ７アゴニストは、ＩＬ−６とは対照的にＩＦＮ−αを誘発するその能力のために選択され、特に、例えば感染症の治療のためにＩＦＮ−α：ＩＬ−６の誘発の比が最も高いオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００１３】
例えば、完全にウリジンまたはデオキシウリジンヌクレオチドからなる規定長さを有する短いオリゴヌクレオチドは、強力なＴＬＲ７刺激能力を有することが発見された。従って、１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドのそれぞれはウラシル含有オリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非天然骨格結合を含む。より好ましくは、各ヌクレオチドはウリジンである。また、特にダブレットまたはトリプレットが少数、好ましくは１つの介在ヌクレオチドによって分離される場合には、２つ以上のウリジンのトリプレットまたは５つ以上のウリジンのダブレットを含有するオリゴヌクレオチドも強力な活性化剤であることが発見された。従って、もう１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、配列（ＵＵＵｒ−（Ｘ）ｎ）ｍまたは（ＵＵＵＵ−（Ｘ）ｎ）ｍ（式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは２よりも大きい整数である）を含む。任意でＸは非ウラシルヌクレオチドであり、任意でＸはウリジンであり、ｒは１〜２０の整数、好ましくは１〜１０の整数、そして好ましくは、１、２、３、４または５である。好ましくは、ｍは３または４である。より好ましくは、各Ｕはウリジンを有する。さらにより好ましくは、各ｎは１である。また、オリゴヌクレオチド内の５よりも多い、好ましくは１０の連続した一続きのウリジンは、強力なＴＬＲ７活性化能力を付与するのに十分であることも分かった。従って、もう１つの実施形態では、本発明は、１０〜５０個の間のヌクレオチドからなり、配列：Ｙ（Ｕ）ｐＹ（式中、Ｕはそれぞれ独立してウラシル含有ヌクレオチドから選択され、Ｙはそれぞれ独立して非ウラシル含有ヌクレオチドから選択され、そしてｐは４よりも大きい整数である）を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。より好ましいのは、ｐが５、６、７、８、９、１０、１１または１２よりも大きい整数の場合である。これらの記載される実施形態のそれぞれにおいて、各Ｕはウリジンであることが好ましい。
【００１４】
また、単一の非ウリジンヌクレオチドによってそれぞれが分離された５つのウリジンダブレットを含むオリゴヌクレオチド、および１０の連続ウリジンを有する同様のサイズのオリゴヌクレオチドはいずれも、ＴＬＲ７を刺激するその能力が、完全にウリジンからなる同じサイズのオリゴヌクレオチドと等しいことも分かった。従って、もう１つの好ましい実施形態によると、オリゴヌクレオチドは、配列：ＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵ（配列番号１）を含む。
【００１５】
また、これらの配列特徴はオリゴヌクレオチドの骨格と無関係に保持されることも分かった。例えば、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドのいずれかで構成され得る。また、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合を含むものと同じくらい有効に作用する。ホスホロチオエートおよび他の非天然結合は、このような結合を含むオリゴヌクレオチドに安定性の増強を与える。従って、１つ以上のこのような非天然結合の存在は、上記のオリゴヌクレオチドのいずれにおいても好ましい。好ましい実施形態では、少なくとも１つの非天然結合はホスホロチオエート結合である。
【００１６】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの全てがリボヌクレオチドである。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの全てがデオキシリボヌクレオチドである。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは１０〜３０ヌクレオチドの間である。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜３０ヌクレオチドの間である。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが１５〜２１ヌクレオチドの間である。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが２１〜３０ヌクレオチドの間である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは長さが１５、または２１ヌクレオチドである。さらにより好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが２１ヌクレオチドである。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド内のウラシル含有ヌクレオチドの大部分は、少なくとも１つの他のウラシル含有ヌクレオチドに隣接する。
【００１７】
もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＳＤ８（配列番号１２）、ＳＳＤ９（配列番号１３）、ＳＳＤ１０（配列番号１４）、ＳＳＤ２１（配列番号１８）、ＳＳＤ２２（配列番号１９）、ＳＳＤ２３（配列番号２０）、ＳＳＤ２４（配列番号２１）、ＳＳＤ２８（配列番号２４）、ＳＳＤ２９（配列番号２５）、ｐｏｌｙＵｓ−２１（配列番号５）、ｐｏｌｙＵｓ−１５（配列番号６）またはｐｏｌｙＵｓ−１０（配列番号７）からなる群から選択される配列を含む。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ＳＳＤ８、ＳＳＤ９、ＳＳＤ１０、ＳＳＤ２１、ＳＳＤ２２、ＳＳＤ２３、ＳＳＤ２４、ＳＳＤ２８、ＳＳＤ２９、ｐｏｌｙＵｓ−２１、ｐｏｌｙｄＵｓ２１（配列番号９）、ｐｏｌｙＵｓ−１５またはｐｏｌｙＵｓ−１０（配列番号４）からなる群から選択される配列からなる。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｐｏｌｙＵｏ１５、ｐｏｌｙＵｏ２１（配列番号８）、またはｐｏｌｙｄＵｓ２１（配列番号９）から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非ウラシル含有塩基または少なくとも非天然結合を含む。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドはさらに少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、ここでＣは非メチル化シトシン含有ヌクレオチドであり、Ｇはグアニン含有ヌクレオチドである。ＣＧダブレットは、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、ＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹから選択される配列の一部として存在してもよく、あるいはこれらの配列の外側に存在してもよい。このような配列はＴＬＲ９受容体をアゴナイズすることが分かっており、これは、本発明のオリゴヌクレオチドの特定の治療的使用およびその他の使用において望ましいであろう。代替の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＧダブレットを特異的に排除する。このようなオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９受容体をアゴナイズしない。ＴＬＲ９受容体のアゴニズムを回避することは、本発明のオリゴヌクレオチドの特定の治療的使用およびその他の使用において望ましいであろう。
【００１８】
１つの例では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的細胞におけるアポトーシスを誘発するＴＬＲ７アゴニストである。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のアゴニストならびにＴＬＲ３アゴニストである化合物イミキモドは、アポトーシスを誘発すると報告されている（マイヤー（Ｍｅｙｅｒ）Ｔ、ニンドル（Ｎｉｎｄｌ）Ｉ、シュモック（Ｓｃｈｍｏｏｋ）Ｔ、ウーリッヒ（Ｕｌｒｉｃｈ）Ｃ、ステリー（Ｓｔｅｒｒｙ）Ｗ、ストックフレス（Ｓｔｏｃｋｆｌｅｔｈ）Ｅ、組織培養におけるＴｏｌｌ様受容体−７アゴニストによるアポトーシスの誘発（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−７  ａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３年１１月、１４９、Ｓｕｐｐｌ６６：９−１４頁、シェーン（Ｓｃｈｏｎ）ら、（２００４年）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２２：１２６６−１２７６頁、および国際公開第２００６０５４１７７号パンフレット（アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら））。１つの実施形態では、本発明者らは、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的細胞（１つの好ましい実施形態ではＴＬＲ７ポリペプチドを発現する細胞を含む）のアポトーシスを誘発するために使用することができると規定している。細胞は、好ましくは腫瘍細胞である。従って、１つの態様では、本発明は、細胞、好ましくは腫瘍細胞がＴＬＲ７ポリペプチドを発現するかどうかを決定し、前記腫瘍細胞がＴＬＲ７ポリペプチドを発現する場合には、細胞のアポトーシスを誘発するのに有効な量で本発明のオリゴヌクレオチドを前記細胞と接触させることを提供する。もう１つの実施形態では、本発明は個体の細胞、好ましくは腫瘍細胞がＴＬＲ７ポリペプチドを発現するかどうかを決定し、前記腫瘍細胞がＴＬＲ７ポリペプチドを発現する場合には、細胞のアポトーシスを誘発するのに有効な量で本発明の前記オリゴヌクレオチドを前記個体に投与することを提供する。
【００１９】
またさらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、ここでＣは非メチル化シトシン含有ヌクレオチドであり、Ｇはグアニン含有ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、ＵＵＵＵ、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、ＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹを含む本明細書中に記載されるウリジン含有配列のいずれも含有しない。このようなオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７受容体をアゴナイズすることなく、ＴＬＲ９受容体をアゴナイズするであろう。
【００２０】
また本発明は、長さが１０〜５０ヌクレオチドの間であり、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、ＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹ（式中、Ｕはそれぞれ独立してウラシル含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、Ｙはそれぞれ独立して非ウラシル含有ヌクレオチドから選択され、ｎは１〜４の整数であり、そしてｐは４よりも大きい整数である）から選択される配列を含む単離した一本鎖オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む組成物も提供する。上記の好ましいウラシル含有オリゴヌクレオチドのそれぞれは、本発明の組成物中に存在し得る。本発明の組成物中に存在し得るその他の好ましいオリゴヌクレオチドは、ｐｏｌｙＵｏ１５、ｐｏｌｙＵｏ２１、またはｐｏｌｙｄＵｏ２１から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドと、ｐｏｌｙＵｏ１５、ｐｏｌｙＵｏ２１、またはｐｏｌｙｄＵｏ２１から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとである。
【００２１】
また、本発明のオリゴヌクレオチド組成物の効力は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドの安定性または細胞に進入する能力を増強することができる第２の化合物との複合体を形成することによって増強できることも分かった。従って、好ましい実施形態では、組成物は、ＰＥＩなどのカチオン性化合物またはカチオン性リポソームと複合体が形成されたオリゴヌクレオチドを含む。特に好ましい実施形態では、カチオン性化合物はＰＥＩである。
【００２２】
もう１つの態様では、本発明は、細胞におけるＴＬＲ７仲介のシグナル伝達を増強する方法を提供し、本方法は、前記細胞と、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物とを接触させることを含む。好ましい実施形態では、本方法は、被験者におけるＴＬＲ７仲介のシグナル伝達を増強するためにインビボで使用され、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物が患者に投与される。もう１つの実施形態では、ＴＬＲ７仲介のシグナル伝達が増強される細胞は免疫細胞である。もう１つの実施形態では、細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞または単球であり、これらのそれぞれはＴＬＲ７を発現する。もう１つの実施形態では、樹状細胞は形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）である。もう１つの実施形態では、ＴＬＲ７受容体の刺激は細胞の活性化をもたらす。もう１つの実施形態では、細胞はマウス細胞である。もう１つの実施形態では、細胞はヒト細胞である。もう１つの実施形態では、細胞は、癌または感染症の患者から単離される。もう１つの実施形態では、細胞は、ＴＬＲ７を自然に発現する。もう１つの実施形態では、細胞は発現ベクターを含み、その存在が細胞中でＴＬＲ７の発現をもたらす。
【００２３】
もう１つの実施形態では、方法は、前記接触ステップの後に、細胞の活性化が検出されるステップをさらに含む。もう１つの実施形態では、活性化は、Ｉ型インターフェロン、例えばＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ４０からなる群から選択されるサイトカインの細胞による産生のレベルを調査することによって検出される。もう１つの実施形態では、調査ステップはＥＬＩＳＡを用いて実行される。１つの実施形態では、候補ＴＬＲ７アゴニストを同定するまたは特徴付ける方法において、ＩＬ−６に対するＩＦＮ−αの比率が検出され、ＩＦＮ−α：ＩＬ−６の比率が最も大きいオリゴヌクレオチドが候補ＴＬＲ７アゴニストとして選択される。
【００２４】
もう１つの態様では、本発明は、患者の免疫応答を刺激する方法を提供し、本方法は、本明細書中で記載されるオリゴヌクレオチドのいずれかと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬品組成物を患者に投与することを含む。
【００２５】
１つの実施形態では、患者は、癌または感染症を有する。もう１つの実施形態では、感染症はウィルス感染症である。もう１つの実施形態では、組成物の投与は、患者の形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）、Ｂ細胞または単球の刺激をもたらす。
【００２６】
もう１つの実施形態では、方法はさらに、投与ステップに続いて患者における免疫細胞活性が検出されるステップを含み、増大した免疫細胞活性の検出は、投与が効果的であることを示す。もう１つの実施形態では、活性は、前記患者において形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）、Ｂ細胞または単球の活性を調査することによって検出される。もう１つの実施形態では、細胞の活性は、Ｉ型インターフェロン、例えばＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ４０からなる群から選択されるサイトカインの発現のレベルを調査することによって検出される。もう１つの実施形態では、調査ステップはＥＬＩＳＡを用いて実行される。好ましい実施形態では、本発明のＴＬＲ７アゴニストオリゴヌクレオチドはＩＦＮαの発現または分泌を誘発するが、ＩＬ−６の発現は実質的に誘発しない。
【００２７】
もう１つの態様では、本発明は、単離した一本鎖オリゴヌクレオチドと、それを含む組成物と、ＴＬＲ８受容体によるＴＬＲ仲介のシグナル伝達を最適に刺激するための方法とを提供する。本明細書中に記載されるこれらのオリゴヌクレオチド、組成物および方法は、ＴＬＲ８発現細胞、例えば骨髄樹状細胞などのヒト樹状細胞、および調節性Ｔ細胞の特定のサブセットの活性化をインビトロおよびインビボで増強するために有用である。このようなオリゴヌクレオチド、組成物および方法は、癌または感染症、特にウィルス感染症などの状態を治療または予防するための医薬品および方法を含む多数の臨床用途において有用である。これらの本発明のオリゴヌクレオチドおよび組成物は、ＴＬＲ８活性に対する他の化合物の効果を評価するための方法、例えば、ＴＬＲ８またはＴＬＲ８発現細胞の他の候補調節物質を同定または特徴付けるためのアッセイにおいて使用することもできる。オリゴヌクレオチドおよび組成物は、特に樹状細胞によってＩＦＮαの産生および／または放出を誘発する方法においても有用であり、そしてＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の免疫抑制活性の遮断においても有用である。
【００２８】
ＴＬＲ８アゴニストオリゴヌクレオチドは本明細書で与えられるＴＬＲ７アゴニストに関する研究に基づいており、Ｇ、Ｕが豊富なＲＮＡオリゴヌクレオチドのＴＬＲ７およびＴＬＲ８アゴニスト活性（米国特許出願公開第００３０２３２０７４号明細書、およびハイル（Ｈｅｉｌ）Ｆ．ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３、１５２６−２９頁）と、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞においてＴＬＲ８をアゴナイズする様々なホスホロチオエート結合デオキシグアノシン含有オリゴヌクレオチドの能力（ペン（Ｐｅｎｇ）Ｇ．ら（２００５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９、１３８０−１３８４頁）とは他で実証されている。従って、１つの実施形態では、本発明は、１１〜５０個の間のヌクレオチドからなり、ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、Ｇはそれぞれ独立してグアニン含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、Ｚはそれぞれ独立して非グアニンヌクレオチドから選択され、ｎは１〜４の整数であり、ｐは４よりも大きい整数である）から選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非グアニン含有ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然結合を含む。
【００２９】
１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドのそれぞれはグアニン含有オリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの非天然骨格結合を含む。より好ましくは、各ヌクレオチドはグアノシンまたはデオキシグアノシンである。
【００３０】
もう１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＧ（Ｘ）ｎ）ｍ（式中、ｍは２よりも大きい整数である）から選択される配列を含む。好ましくは、ｍは３または４である。より好ましくは、各Ｇはグアノシンを有する。さらにより好ましくは、各ｎは１である。
【００３１】
もう１つの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列Ｚ（Ｇ）ｐＺを含み、ｐは９よりも大きい整数である。各Ｇがグアノシンであるか、あるいは各Ｇがデオキシグアノシンである場合がさらにより好ましい。
【００３２】
もう１つの好ましい実施形態によると、オリゴヌクレオチドは、配列：ＧＧＸＧＧＸＧＧＸＧＧＸＧＧを含む。
【００３３】
また、１つ以上の非天然結合の存在は、上記のオリゴヌクレオチドのいずれにおいても好ましい。好ましい実施形態では、少なくとも１つの非天然結合はホスホロチオエート結合である。
【００３４】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドは全てリボヌクレオチドである。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドは全てデオキシリボヌクレオチドである。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、１１〜３０ヌクレオチドの間である。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが２１〜３０ヌクレオチドの間である。さらにもう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１５〜２１ヌクレオチドの間である。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド内のグアニン含有ヌクレオチドの大部分は、少なくとも１つの他のグアニン含有オリゴヌクレオチドに隣接する。
【００３５】
さらにもう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドはさらに少なくとも１つのＣＧダブレットを含み、ここでＣは非メチル化シトシン含有ヌクレオチドであり、Ｇはグアニン含有ヌクレオチドである。ＣＧダブレットは、ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺから選択される配列の一部として存在してもよく、あるいはオリゴヌクレオチド内のこれらの配列の外側に存在してもよい。代替の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＧダブレットを特異的に排除する。
【００３６】
もう１つの実施形態では、ＴＬＲ８アゴニストオリゴヌクレオチドはさらに、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、ＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹから選択される配列を含む。オリゴヌクレオチド内で、このようなウラシル含有配列はグアニン含有配列と重複してもよく、あるいは完全に別個であってもよい。このようなオリゴヌクレオチドはＴＬＲ７およびＴＬＲ８をアゴナイズすることができ、これは、特定のヒトの治療的使用および他の使用において有用である。
【００３７】
また本発明は、長さが１１〜５０ヌクレオチドの間であり、ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、Ｇはそれぞれ独立してグアニン含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、Ｚはそれぞれ独立して非グアニンヌクレオチドから選択され、ｎは１〜４の整数であり、そしてｐは４よりも大きい整数である）から選択される配列を含む単離した一本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物も提供する。上記の好ましいグアニンヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドのそれぞれは、本発明の組成物中に存在し得る。本発明の組成物中に存在し得るその他の好ましいオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合によって互いに結合されたグアニン含有ヌクレオチドから完全になるオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
好ましい実施形態では、組成物は、ＰＥＩなどのカチオン性化合物またはカチオン性リポソームと複合体が形成されたオリゴヌクレオチドを含む。特に好ましい実施形態では、カチオン性化合物はＰＥＩである。
【００３９】
もう１つの態様では、本発明は、細胞におけるＴＬＲ８仲介のシグナル伝達を増強する方法を提供し、本方法は、前記細胞を本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物と接触させることを含む。好ましい実施形態では、方法は、被験者におけるＴＬＲ８仲介のシグナル伝達を増強するためにインビボで使用され、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物が患者に投与される。もう１つの実施形態では、ＴＬＲ８仲介のシグナル伝達が増強される細胞は免疫細胞である。もう１つの実施形態では、細胞は樹状細胞である。もう１つの実施形態では、細胞はＣＤ４＋調節性Ｔ細胞である。もう１つの実施形態では、ＴＬＲ８受容体の刺激は、細胞の活性化をもたらす。もう１つの実施形態では、ＴＬＲ８受容体の刺激は、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の非活性化をもたらす。もう１つの実施形態では、細胞はマウス細胞である。もう１つの実施形態では、細胞はヒト細胞である。もう１つの実施形態では、細胞は、癌または感染症の患者から単離される。もう１つの実施形態では、細胞はＴＬＲ８を自然に発現する。もう１つの実施形態では、細胞は発現ベクターを含み、その存在が細胞内でのＴＬＲ８の発現を導く。
【００４０】
もう１つの実施形態では、方法はさらに、前記接触ステップに続いて細胞の活性化が検出されるステップを含む。もう１つの実施形態では、活性化は、Ｉ型インターフェロン、例えばＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ４０からなる群から選択されるサイトカインの細胞による産生のレベルを調査することによって検出される。もう１つの実施形態では、調査ステップはＥＬＩＳＡを用いて実行される。
【００４１】
もう１つの実施形態では、方法はさらに、前記接触ステップに続いてＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の非活性化が検出されるステップを含む。もう１つの実施形態では、非活性化は、未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の能力を決定することによって検出される。もう１つの実施形態では、調査ステップは、ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞と共にインキュベートされた未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞への［３Ｈ］チミジンの取り込みを検出することによって実行される。
【００４２】
もう１つの態様では、本発明は患者の免疫応答を刺激する方法を提供し、本方法は、本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドのいずれかと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬品組成物を患者に投与することを含む。
【００４３】
１つの実施形態では、患者は、癌または感染症を有する。もう１つの実施形態では、感染症はウィルス感染症である。もう１つの実施形態では、組成物の投与は、患者において樹状細胞の刺激をもたらす。
【００４４】
もう１つの実施形態では、方法はさらに、投与ステップに続いて、患者において免疫細胞活性が検出されるステップを含み、増大した免疫細胞活性の検出は、投与が効果的であることを示す。もう１つの実施形態では、活性は、前記患者の樹状細胞の活性を調査することによって検出される。もう１つの実施形態では、細胞の活性は、Ｉ型インターフェロン、例えばＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ４０からなる群から選択されるサイトカインの発現のレベルを調査することによって検出される。もう１つの実施形態では、調査ステップは、ＥＬＩＳＡを用いて実行される。もう１つの実施形態では、活性は、前記患者においてＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の活性を調査することによって検出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
定義
他に定義されない限りは、本明細書で使用される全ての化学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、Ｔ細胞抗原受容体またはＢ細胞抗原受容体によって認識されることが可能な任意の分子を指す。この用語は、宿主の免疫系によって外来性であると認識される任意のタイプの分子を広く含む。抗原は通常、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類結合体、多糖類および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、多糖類、炭水化物、ウィルスおよびウィルス抽出物、および寄生虫などの多細胞生物、ならびにアレルゲンを含むが、これらに限定されない。タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである抗原に関しては、抗原は、抗原をコードする核酸分子を含むことができる。より具体的には、抗原は、癌細胞および癌細胞の中または上で発現される分子を含む癌抗原と、完全および弱毒化されたウィルスならびにウィルスの中または上で発現される分子を含むウィルス抗原と、アレルゲンとを含むがこれらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「Ｔｏｌｌ様受容体」および同等に「ＴＬＲ」という用語は、病原体関連の分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識して、自然免疫における重要なシグナル伝達要素の役割を果たす、少なくとも１１の高度に保存された哺乳類パターン認識受容体タンパク質（ＴＬＲ１−ＴＬＲ１１）のファミリーの任意のメンバーを指す。ＴＬＲポリペプチドは、ロイシンが豊富な反復を有する細胞外（細胞質外）ドメインと、膜貫通ドメインと、ＴＬＲシグナル伝達に関与する細胞内（細胞質内）ドメインとを含む特徴的な構造を共有する。ＴＬＲはヒトＴＬＲを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書で言及される場合、「Ｔｏｌｌ様受容体−７」または「ＴＬＲ７」は、公に入手可能なＴＬＲ７配列、例えば、ヒトＴＬＲ７に関してはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２４０４６７またはＡＡＦ６０１８８、あるいはマウスＴＬＲ７に関してはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ０３５８８９またはＡＡＫ６２６７６に対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を共有する核酸またはポリペプチドを指す。このような配列のいずれかの誘導体および断片も包含される。ヒトＴＬＲ７のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＡＦ２４０４６７（配列番号３１）およびＡＡＦ６０１８８（配列番号３２）が与えられる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ＴＬＲシグナル伝達」は、本明細書ではＴＬＲシグナル伝達経路とも呼ばれるＴｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路を活性化するＴＬＲポリペプチド、特にＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の能力を指す。ＴＬＲ活性の変化は、例えば、ＮＦ−ｋＢ感受性プロモーターおよびエンハンサーの制御下で遺伝子の発現を測定するように設計されたアッセイによって測定することができる。このような遺伝子は天然に存在する遺伝子でもよく、あるいはこれらは細胞内に人工的に導入された遺伝子でもよい。天然に存在するレポーター遺伝子は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）、ならびに共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードする遺伝子を含む。その他の遺伝子は、このような調節要素の制御下におくことができ、従って、ＴＬＲシグナル伝達のレベルを報告する働きをする。
【００５０】
本明細書で使用される場合、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８に対する本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドの効果に関する「刺激する」または「活性化する」という用語は、細胞の表面上または細胞質区画内、例えばエンドソーム表面に存在するＴＬＲ７またはＴＬＲ８に直接または間接的に結合し、ＴＬＲシグナル伝達を誘発するオリゴヌクレオチドの能力を指す。ＴＬＲシグナル伝達の検出可能な差異は、オリゴヌクレオチドが、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８受容体を刺激または活性化することを示し得る。標的遺伝子の発現、シグナル伝達成分のリン酸化、ＮＫ−ｋＢなどの下流要素の細胞内局在化、特定の成分（ＩＲＡＫなど）と他のタンパク質または細胞内構造との関連、あるいはキナーゼ（ＭＡＰＫなど）などの成分の生化学的活性における変化を含むシグナル伝達の差異は多数の方法のいずれにおいても明示することができる。使用されるアッセイにかかわらず、ＴＬＲシグナル伝達のいずれかの態様における５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、またはそれ以上の変化は、刺激または活性化を示す。
【００５１】
「細胞を活性化する」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞に、ＩＦＮα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ４０からなる群から選択される１つ以上のサイトカインの発現を増大させることを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、所望の結果を達成または促進するために必要な量または十分な量を指す。場合によっては、有効量は治療的に有効な量である。治療的に有効な量は、被験者において所望の生物学的応答を促進または達成するために必要な量または十分な量である。特定の用途のための有効量は、治療される疾患または状態、投与される特定の薬剤、被験者の寸法、もしくは疾患または状態の重症度などの因子に応じて変わる。当業者は、過度の実験を必要とすることなく特定の薬剤の有効量を経験的に決定することができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は免疫系に属する細胞を指す。免疫細胞は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、好中球、マクロファージ、単球、樹状細胞、ならびに上記のいずれかの特別な形態、例えば、形質細胞様樹状細胞、血漿細胞、ＮＫＴ、ヘルパーＴ、調節性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「癌」および同等に「腫瘍」という用語は、宿主由来の細胞の異常な複製が被験者において検出可能な量で存在する状態を指す。癌は、悪性または非悪性の癌であり得る。癌または腫瘍には、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃（腹部）癌、上皮内腫瘍、白血病、リンパ腫、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）、メラノーマ、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、すい臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎（腎臓）癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、ならびに他の癌腫および肉腫が含まれるが、これらに限定されない。癌は、原発性または転移性であり得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「感染」および同等に「感染症」という用語は、被験者の血液、または通常は無菌の組織または通常は無菌の区画内中に、感染生物体または病原体が検出可能な量で存在する状態を指す。感染生物体および病原体は、ウィルス、細菌、真菌、および寄生虫を含む。この用語は、急性および慢性の両方の感染症および敗血症を包含する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「自然免疫応答」という用語は、特定の病原体関連の分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する任意のタイプの免疫応答を指す。当該技術分野では天然または生来の免疫としても知られている自然免疫は、主に、好中球、顆粒球、単核食細胞、樹状細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫ細胞を伴う。自然免疫応答は、Ｉ型インターフェロンの産生（例えば、ＩＦＮ−α）、好中球の活性化、マクロファージの活性化、ファゴサイトーシス、オプソニン化、補体の活性化、およびこれらの組み合わせを含むことができるが限定されない。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」は、特異的な受容体によって免疫細胞に作用して、免疫細胞の活性化および機能の状態に影響を及ぼす多数の可溶性タンパク質または糖タンパク質のいずれかを指す。サイトカインには、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、トランスフォーミング成長因子β、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ケモカインなどが含まれる。種々のサイトカインは、自然免疫、獲得免疫、またはその両方に影響を与える。サイトカインには、特に、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。ケモカインには、特に、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、およびＭＣＰ−３が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、障害、疾患、または状態に関連して使用される「治療する」、「治療」または「治療的な」という用語は、障害、疾患、または状態の発生を防止または遅延する、障害、疾患、または状態の進行を防止、遅延または停止する、あるいは障害、疾患、または状態を排除することが意図される方法でこのような障害、疾患、または状態に介入することを意味する。障害、疾患、または状態が、処置または治療と考えられる方法に対して実際に停止または排除されなくてもよいことは認識されるであろう。障害、疾患、または状態に関連する「予防する」および「予防的な」という用語は治療に関連するが、障害、疾患、または状態を発生する危険があるが、投与の時点で兆候または症候を示していない個体と共に使用される。
【００５９】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用されて、互いに結合された多数のヌクレオチドの鎖を意味する。「ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、リン酸基および交換可能な有機塩基に結合された糖を含む分子を意味する。本発明のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドは、糖部分、リン酸部分および／または塩基部分において修飾することができる。糖部分はリボース、デオキシリボースまたはアラビノースでよく、好ましくはリボースまたはデオキシリボース、そしてより好ましくはリボースである。また糖は、これらのヌクレオチドにおいて、２’位における他の修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾、２’−アミノ修飾、２’−デオキシ修飾、２’−フルオロなどの２’−ハロ修飾、そして２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾などの上記の組み合わせ）を含んでもよい。しかしながら、このような他の２’糖修飾は、ＴＬＲアゴニズムにとって重要でないヌクレオチドに制限される。従って、２’糖修飾は、本発明のオリゴヌクレオチドのＵが豊富な領域のウラシル含有ヌクレオチドまたはＧが豊富な領域のグアニン含有ヌクレオチドには存在しない。さらに好ましくは、２’糖修飾は、オリゴヌクレオチドのＵが豊富またはＧが豊富な領域のヌクレオチドには存在しない。核酸分子は現存する核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成である（例えば、核酸合成によって生成される）。
【００６０】
ヌクレオチドの塩基部分は、プリンまたはピリミジンである。プリンおよびピリミジンは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンおよびウラシルなどの天然に存在する塩基と、イノシン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アルキルアデニン、２−アルキルイノシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−ハロプリン、２−チオピリミジン（ｔｈｉｏｃｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、４−チオウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルピリミジン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルピリミジン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルピリミジン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノピリミジン、５−ハロピリミジン、５−ヒドロキシピリミジン、５−ヒドロキシメチルピリミジン、６−アゾピリミジン、６−メチルプリン、７−デアザプリン、７−メチルプリン、８−アザプリン、他の８−置換プリン、ジヒドロウラシル、ヒポキサンチン、Ｎ２−ジメチルプリン、プソイドウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、置換７−デアザプリン、およびキサンチンなどの化学修飾された塩基とを含むが、これらに限定されない。このリストは例示的であることを意味し、限定的であると解釈されてはならない。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオチドのリン酸基は、別のヌクレオチドと結合することができる別のリン含有部分によって修飾され得る。このような修飾された基としては、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートがあげられる。リン酸ジエステル結合以外の結合によって本発明のオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間に形成される結合は「非天然結合」と呼ばれる。
【００６２】
その他の修飾は、本発明のオリゴヌクレオチドの３’または５’末端ヌクレオチドに存在し得るものであり、３’−および／または５’−末端キャップ、末端３’−５’結合、および５’−末端のリン酸基または修飾されたリン酸基を含む。
【００６３】
５’−キャップの例としては、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位脱塩基部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分、３’−２’−逆位脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくは架橋または非架橋メチルホスホネート部分があげられるが、これらに限定されない。
【００６４】
３’−キャップの非限定的な例としては、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄエリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１，２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４ジヒドロキシブチル（ｄｉｂｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｌ）ヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分、５’−５’−逆位脱塩基部分、５’−ホスホロアミデート、５’−ホスホロチオエート、１，４ブタンジオールホスフェート、５’−アミノ、架橋および／または非架橋５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分があげられるが、これらに限定されない（さらに詳細には、参照によって本明細書中に援用されるビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびアイヤー（Ｉｙｅｒ）、１９９３年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９、１９２５頁が参照される）。
【００６５】
「ウラシル含有ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ウラシルおよびデオキシウラシル、および修飾ウラシルを含有するヌクレオチドを包含する。「非ウラシル含有ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ウラシルまたは修飾ウラシルを塩基として含まないヌクレオチドを意味する。「非グアニン含有ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、グアニンまたは修飾グアニンを塩基として含まないヌクレオチドを意味する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、コード配列および遺伝子発現配列は、コード配列の発現または転写および／または翻訳が遺伝子発現配列の影響または制御下におかれるような形で共有結合される場合に操作可能に結合されるといわれる。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘発がコード配列の転写をもたらす場合、そして２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨げないか、あるいは（３）タンパク質に翻訳される対応のＲＮＡ転写物の能力を妨げない場合に、操作可能に結合されるといわれる。従って、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように遺伝子発現配列がそのコード配列の転写を達成することができれば、遺伝子発現配列はコード配列に操作可能に結合されるであろう。
【００６７】
本発明は、免疫応答を刺激するための新規のオリゴヌクレオチド、組成物および方法を提供する。本発明は、特に形質細胞様樹状細胞などの樹状細胞、具体的にはＴＬＲ７受容体によるＴＬＲ仲介のシグナル伝達を刺激するその能力に関する様々なオリゴヌクレオチドの系統的な分析を含む研究に基づく。
【００６８】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、組成物および方法は、インビトロおよびインビボで免疫刺激を増強するために有用である。従って、このようなオリゴヌクレオチド、組成物および方法は、癌または感染症などの状態、特にウィルス感染症を治療または予防するための医薬品および方法を含む多数の臨床用途において用途を見出すであろう。また本発明のオリゴヌクレオチドおよび組成物は、このような状態の治療において使用するための薬剤を調製するための方法において使用することもできる。本発明の組成物は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣによるＩＦＮαの誘発において、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を介して同様に作用することが報告されている低分子量の抗ウィルス化合物Ｒ８４８およびロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）よりも最高約３０倍まで強力であった。本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドが、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の調節物質、例えば、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８のシグナル伝達、もしくはＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現細胞の活性化剤または阻害薬を同定するためのアッセイにおいても使用可能であることは認識されるであろう。
【００６９】
本発明は、オリゴヌクレオチドがＴＬＲ７を活性化できるかどうかの決定において、ヌクレオチドウリジンまたはデオキシウリジンが必須の制御要素であるという驚くべき発見に基づく。従って、ウリジンの絶対数あるいはオリゴヌクレオチド内でのウリジンのグルーピングのいずれかの観点から十分なウラシル含有オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは短くてもインビボまたはインビトロでＴＬＲ７受容体を有効に刺激するために使用することができる。
【００７０】
本発明のオリゴヌクレオチド
１つの一般的な実施形態では、本発明は、１０〜５０個の間のヌクレオチド（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドを含み、好ましくは長さが１０〜１９ヌクレオチドの間、長さが１５〜３０ヌクレオチドの間、長さが１９〜５０ヌクレオチドの間、長さが１５〜２１ヌクレオチドの間、または長さが２１〜３０ヌクレオチドの間、より好ましくは長さが１５または２１ヌクレオチドのヌクレオチド、そして最も好ましくは長さが２１ヌクレオチドのヌクレオチドである）からなり、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹ（式中、Ｕはそれぞれ独立してウラシル含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、ｎは１〜４の整数であり、そしてｐは４よりも大きい整数である）から選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非ウラシル含有ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然結合を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７を刺激する能力の増強を実証するであろう。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、一続きの少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続したウリジンを含む。
【００７１】
１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは配列ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵを含み、ｎは１である。もう１つの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列（ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ）ｍを含み、ｎは１〜４の整数、より好ましくは１であり、そしてｍは２よりも大きい整数、好ましくは３または４である。もう１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは配列Ｙ（Ｕ）ｐＹを含み、ｐは９よりも大きい整数である。これらの記載した実施形態のそれぞれにおいて、各Ｕはウリジンであるのが好ましい。
【００７２】
特に好ましいのは、完全にウリジンからなる１つ以上のホスホロチオエート結合を有する２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（例えば、ｐｏｌｙＵｓ２１）と、一続きの少なくとも１０の連続したウリジンを含む２１−ｍｅｒ（例えば、ＳＳＤ３０）と、配列ＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵ（式中、Ｕはそれぞれ独立してウリジンであり、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択される）を含む２１−ｍｅｒ（例えば、ＳＳＤ２８）とである。
【００７３】
通常、オリゴヌクレオチド内に存在するウラシル含有ヌクレオチドの割合が高いほど、ＴＬＲ７を刺激するその能力も高い。従って、１つの好ましい実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のウラシル含有ヌクレオチドを含む。好ましくは、ウラシル含有ヌクレオチドのそれぞれはウリジンである。１つの特に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは完全にウリジンから構成され、少なくとも１つの非天然結合を含む。
【００７４】
その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、任意で１つ以上のホスホロチオエート結合を有し、長さが１０〜５０ヌクレオチドの間であり、一続きの少なくとも１０の連続したウリジンを含むオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅ）と、配列ＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵＸＵＵ（式中、Ｕはそれぞれ独立してウリジンであり、Ｘはそれぞれ独立してＧ（グアニン）以外、Ｃ以外、またはＧおよびＣ以外のヌクレオチドから選択される）を含むオリゴヌクレオチドとを含む。
【００７５】
また、オリゴヌクレオチドのグアニン含量は通常ＴＬＲ７活性にとって重要でないことも発見された。従って、１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満のグアニン含有ヌクレオチドを含有することができる。
【００７６】
本発明の教示に従い、従ってＴＬＲ７を刺激することができる多数のオリゴヌクレオチド、特に、ｐｏｌｙＵｏ−２１、ｐｏｌｙＵｏ−１５、ｐｏｌｙＵｏ−１０、ｐｏｌｙＵｓ−２１、ｐｏｌｙＵｓ−１５、ｐｏｌｙｄＵｏ−２１、ｐｏｌｙｄＵｓ−２１、ＳＳＤ８、ＳＳＤ９、ＳＳＤ１０、ＳＳＤ１３、ＳＳＤ１４、ＳＳＤ１５、ＳＳＤ２１、ＳＳＤ２２、ＳＳＤ２３、ＳＳＤ２４、ＳＳＤ２８、ＳＳＤ２９、およびＳＳＤ３０は表１に示される。これらのオリゴヌクレオチド、または変異体、誘導体、もしくはこれらのオリゴヌクレオチドのいずれかを含むより長いオリゴヌクレオチドはどれも使用することができる。
【００７７】
もう１つの一般的な実施形態では、本発明は、１１〜５０個の間のヌクレオチド（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドを含み、好ましくは長さが１０〜１９ヌクレオチドの間、長さが１５〜３０ヌクレオチドの間、長さが１９〜５０ヌクレオチドの間、長さが１５〜２１ヌクレオチドの間、または長さが２１〜３０ヌクレオチドの間であり、より好ましくは長さが１５または２１ヌクレオチドのヌクレオチドであり、最も好ましくは長さが２１ヌクレオチドのヌクレオチドである）からなり、ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、Ｇはそれぞれ独立してグアニン含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、Ｚはそれぞれ独立して非グアニンヌクレオチドから選択され、ｎは１〜４の整数であり、そしてｐは４よりも大きい整数である）から選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非グアニン含有ヌクレオチドまたは少なくとも１つの非天然結合を含む。これらのＧが豊富なオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ８をアゴナイズする能力の増強を示すであろう。
【００７８】
１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは配列ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧを含み、ｎは１である。もう１つの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列（ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ）ｍを含み、ｎは１〜４の整数、より好ましくは１であり、そしてｍは２よりも大きい整数、好ましくは３または４である。もう１つの好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは配列Ｚ（Ｇ）ｐＺを含み、ｐは９よりも大きい整数である。これらの記載される実施形態のそれぞれにおいて、各Ｇはグアノシンであることが好ましい。
【００７９】
本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドが、ＴＬＲ７またはＴＬＲ−８刺激能力を与えるもの以外のヌクレオチドを含有できることは認識されるであろう。例えば、ＴＬＲ７活性化配列（例えば、表１に示される配列）またはＴＬＲ−８活性化配列は、安定性を増強するため、特異的な細胞または細胞内区画へのターゲティングを指示するため、様々なタンパク質による結合を増強するためなどの目的で設計された他の配列要素、例えば短配列と一緒にオリゴヌクレオチド中に存在することができる。１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、さらに、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含み、ＴＬＲ９と、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８のいずれかとをアゴナイズすることができるであろう。もう１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ−７およびＴＬＲ−８の両方の活性化配列（すなわち、ａ）ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹから選択される配列と、ｂ）ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺから選択される配列とであり、Ｘ、ｎおよびｐはそれぞれ独立して選択される）を含み得る。
【００８０】
本明細書で記載される配列特徴が満たされる限りは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを一緒に結合させる骨格に関して比較的柔軟性がある。オリゴヌクレオチドのリン酸骨格の修飾は、例えば、ＴＬＲ７刺激および／またはＴＬＲ−８刺激活性を保持しながらインビトロでのその安定性を増強することができる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。特に好ましい実施形態では、結合は全てホスホロチオエートである。他の修飾核酸は、とりわけ、アルキルホスホネート（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｏｎａｔｅ）、アリールホスホネート、アルキルホスホロチオエート、アリールホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、モルホリノ、およびこれらの組み合わせを含む。
【００８１】
もう１つの例では、オリゴヌクレオチドは任意で、配列（Ｇ）ｐ（式中、ｐは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、任意で各Ｇはデオキシリボヌクレオチドである）を特異的に排除してもよい。もう１つの例では、オリゴヌクレオチドは、任意で、配列（Ｕ）ｐ（式中、ｐは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、任意で各Ｕはリボヌクレオチドである）を特異的に排除してもよい。もう１つの例では、オリゴヌクレオチドは、任意で、ＣＵＧＵ、ＵＵＧＵ、ＣＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＧＵＵＧＵＵＵＵ、およびＧＵＵＧＵからなる群から選択される配列を特異的に排除してもよく、任意で各ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
【００８２】
多数の実施形態において、オリゴヌクレオチドは他の成分と共に処方され得る。例えば、１つの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＰＥＩなどのカチオン性物質と複合体が形成される。このような化合物は、オリゴヌクレオチドを分解に対して保護する助けをすることができ、インビトロまたはインビボで細胞内へのオリゴヌクレオチドの取り込みも容易にする。他の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、臨床設定において使用するための調製物において医薬品キャリアと共に処方され得る。
【００８３】
特異的な配列を有し、骨格および／または塩基修飾を含むオリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野においてよく知られており、容易に実行される。例えば、所望の配列を含み、多数の骨格または塩基修飾のいずれかを含むオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を用いて調製することができ、あるいは商業的な供給業者から注文することもできる。通常、本発明の核酸は、β−シアノエチルホスホルアミダイト法（ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ＳＬら、（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９頁）、またはヌクレオシドＨ−ホスホネート法（ガレッグ（Ｇａｒｅｇｇ）ら、（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５１−４頁、フローラー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ）ら、（１９８６年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４：５３９９−４０７頁、ガレッグら、（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５５−８頁、ギャフニー（Ｇａｆｆｎｅｙ）ら、（１９８８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９：２６１９−２２頁）を用いて新規に合成することができる。
【００８４】
ホスホロチオエートなどの修飾骨格は、ホスホロアミデート化学またはＨ−ホスホネート化学のいずれかを用いる自動化技術を用いて合成され得る。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載されるように作ることができ、アルキルホスホトリエステル（チャージされた酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号明細書および欧州特許第０９２，５７４号明細書において記載されるようにアルキル化される）は、市販の試薬を用いる自動化固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ骨格修飾および置換を行うための方法は、ウールマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）Ｅら、（１９９０年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４頁、グッドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）Ｊ、（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５頁に記載されている。
【００８５】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を刺激するオリゴヌクレオチドの能力のアッセイ
本発明のオリゴヌクレオチドは、様々なアッセイのいずれかを用いて、ｐＤＣまたは他の細胞型においてＴＬＲ７を刺激するその能力についてインビトロで評価することができる。このようなアッセイは、とりわけ、本明細書で提供される配列の誘導体を試験するため、あるいは本明細書の教示に従って設計された新規の配列を、ＴＬＲ７を刺激するその能力について評価するために使用することができる。このようなアッセイは、例えば本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを標準物またはコントロールとして用いて、ＴＬＲ７発現細胞の他の調節物質を同定するためにも使用することができる。また、ｐＤＣのインビトロ刺激は、例えば、個体からのｐＤＣまたは他のＴＬＲ７発現細胞を評価するために有用である。例えば、ｐＤＣは、癌または感染症の患者から取り出すことができ、ｐＤＣを刺激する能力は本発明のオリゴヌクレオチドを用いて評価される。このようなアッセイにおいてｐＤＣが刺激され得ることの検出は、患者が、本発明のオリゴヌクレオチドの投与を伴う治療または予防方法のために適切な候補であることを示す。
【００８６】
オリゴヌクレオチドは、同様の様々なアッセイを用いて、骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）、単球、またはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋調節性Ｔ（「Ｔｒｅｇ」）細胞、もしくは他の細胞型においてＴＬＲ８を刺激するその能力についてインビトロで評価することができる。これらの細胞型のインビトロ刺激は、本発明のオリゴヌクレオチドにより患者が免疫刺激される能力を評価するためにも有用である。
【００８７】
本発明のインビトロアッセイは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を自然に発現する単離細胞か、あるいは必要なＴＬＲを通常は発現しないが、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８をコードする発現構築物が導入されている細胞のいずれかを用いて実施することができる。
【００８８】
１つの実施形態では、細胞は機能性ＴＬＲを自然に発現し、例えば、ＴＬＲ７の場合にはＢ細胞、単球、ｐＤＣまたは他の樹状細胞タイプであり、ＴＬＲ８の場合にはｍＤＣ、単球またはＴｒｅｇ細胞である。ｐＤＣは、例えば骨髄、血液または脾臓から、標準的な方法を用いて単離することができる（例えば、ディーボルド（Ｄｉｅｂｏｌｄ）ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２９頁、ハイル（Ｈｅｉｌ）ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３／１５２６頁、トライアンタフィロウ（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕ）ら、（２００５年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：２４１６頁、リー（Ｌｅｅ）ら、（２００３年）ＰＮＡＳ  １００：６６４６頁、ホーナング（Ｈｏｒｎｕｎｇ）ら、（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １１：２６３頁、米国特許出願公開第２００３／０２３２０７４号明細書が参照され、これらのそれぞれの開示はその全体が本明細書中に援用される）。また、ＴＬＲ７を発現する適切なマウス細胞としては、例えばチャールズ・リバーＵＫ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫ）から入手できるような、例えばＣ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＢＡ、１２９または他のマウスから単離した骨髄前駆細胞から単離したＦｌｔ３Ｌ−ＤＣがある。ヒトでは、ＴＬＲ７を発現する適切な細胞型には、ＰＢＭＣから新たに単離した形質細胞様ＤＣも含まれる。この細胞株は、多発性骨髄腫（ＩｇＧλ型）の診断時に６１歳の老人の末梢血から確立した（マツオカ（Ｍａｔｓｕｏｋａ）Ｙら、（１９６７年）Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １２５：１２４６−５０頁、その開示全体は参照によって本明細書中に援用される）。ＲＰＭＩ８２２６細胞は、免疫賦活性核酸に応答して、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＰ−１０を含む多数の他のケモカインおよびサイトカインを分泌することが知られている。ＲＰＭＩ８２２６細胞株は、イミダゾキノリン化合物を含む特定の小分子に応答することが分かっている。例えば、イミダゾキノリン化合物Ｒ８４８（レシキモド）を用いたＲＰＭＩ８２２６細胞のインキュベーションにより、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、およびＩＰ−１０の産生が誘発される。近年、Ｒ８４８は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を介するその免疫賦活性効果を仲介することが報告された。
【００８９】
また、ＴＬＲ８をアッセイするための骨髄樹状細胞および単球は、骨髄、末梢血、または胎児組織から単離され得る。Ｔｒｅｇ細胞は通常、末梢血から単離される（ペン（Ｐｅｎｇ）Ｇ．ら、（２００５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９、１３８０−８４頁を参照）。ＴＬＲ８はマウスにおいて非機能性なので、ヒト細胞株のみが機能性ＴＬＲ８の供給源である。このような細胞株は、ＴＩＬ１０２、ＴＩＬ１６４、およびＴＨＰ−１を含む。
【００９０】
多種類の細胞型はいずれも本発明のアッセイのためにＴＬＲ７またはＴＬＲ８を発現するように作ることができる。例えば、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を発現しないヒト２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）を使用することができる。このような細胞は、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を発現する細胞をもたらすように、一時的または安定的に適切な発現ベクターを形質移入することができる。このような安定的に形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞は市販されている（カリフォルニア州サンディエゴのインビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））。１つの実施形態では、対応する発現構築物が存在する場合よりも著しく低いレベルではあるが、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を普通に発現する細胞を使用することができる。ＴＬＲ７またはＴＬＲ−８コード発現構築物は標準的な分子生物学法を用いて作ることができ、通常は、操作可能に結合されたコード配列、およびＴＬＲ７またはＴＬＲ８の全てまたは一部をコードするコード配列の発現を恒常的に駆動することができる制御配列を含む。このようなベクターは当該技術分野において標準的であり、例えば、分子クローニング：実験室マニュアル（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、第３版（２００１年１月１５日）、または分子生物学におけるショートプロトコール（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、最新プロトコール、第５版（２００２年１０月１８日）に記載されており、そのそれぞれは参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【００９１】
ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の発現を駆動するために使用することができる恒常的な哺乳類プロモーターとしては、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼのためのプロモーター、β−アクチンプロモーターおよび他の恒常的なプロモーターがあげられるが、これらに限定されない。真核生物細胞において恒常的に機能する典型的なウィルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、サルウィルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウィルス、アデノウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウィルス、モロニー白血病ウィルスおよび他のレトロウィルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）からのプロモーター、ならびに単純疱疹ウィルスのチミジンキナーゼプロモーターがある。他の恒常的なプロモーターは当業者には知られている。
【００９２】
本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘発性プロモーターも含む。誘発性プロモーターは、誘発剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するために誘発される。その他の誘発性プロモーターは当業者には知られている。
【００９３】
ヒトおよび他の種からのＴＬＲ７およびＴＬＲ８のための核酸およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースから入手可能である。例えば、ヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）の核酸およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２４０４６７（ヌクレオチド１３５〜３２８５にわたるコード領域）およびＡＡＦ６０１８８としてそれぞれ見出すことができる。マウスＴＬＲ７（ｍＴＬＲ７）の核酸およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ０３５８８９（ヌクレオチド４９〜３２０１にわたるコード領域）およびＡＡＫ６２６７６としてそれぞれ見出すことができる。
【００９４】
通常、ＴＬＲ発現細胞は、オリゴヌクレオチドおよび適切な培地と一緒に適切な容器、例えば９６ウェルプレート内に導入され得る。通常、候補オリゴヌクレオチドは、様々な濃度に対する異なる応答を得るために異なる濃度で並行して試験され得る。通常、これらの濃度のうちの１つはネガティブコントロールとしての役割を果たし、すなわちゼロの薬剤濃度またはアッセイの検出限界よりも低い薬剤濃度である。
【００９５】
成分の添加の順序、インキュベーション温度、インキュベーションの時間、およびアッセイの他のパラメータは、容易に決定することができる。このような実験は、単にアッセイのパラメータの最適化を必要とするだけで、アッセイの基本構成ではない。インキュベーション温度は通常４℃〜４０℃の間であり、より一般的には約３７℃である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速な高処理スクリーニングを容易にするために最小限にされ、通常は１分〜４８時間の間である。
【００９６】
混合物中には様々な他の試薬も含まれ得る。これらには、最適なタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸の結合を容易にするために使用され得る、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、洗剤などの試薬が含まれる。このような試薬は反応成分の非特異的または背景の相互作用を低減することもできる。プロテアーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ阻害薬、抗菌剤などのアッセイの効率を改善する他の試薬が使用されてもよい。
【００９７】
インキュベーション（例えば１８〜２０時間）の後、細胞の活性化（またはその欠如）は、数多くの可能性のある方法のいずれかを用いて評価することができる。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の活性化を検出するためのアッセイは、とりわけ、ディーボルド（Ｄｉｅｂｏｌｄ）ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２９頁、ハイル（Ｈｅｉｌ）ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３／１５２６頁、トライアンタフィロウ（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕ）ら、（２００５年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：２４１６頁、リー（Ｌｅｅ）ら、（２００３年）ＰＮＡＳ  １００：６６４６頁、ホーナング（Ｈｏｒｎｕｎｇ）ら、（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １１：２６３頁、米国特許出願公開第２００３／０２３２０７４号明細書において記載されており、これらのそれぞれの開示は、その全体が本明細書中に援用される。
【００９８】
好ましい実施形態では、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８応答性のサイトカインのレベルは、オリゴヌクレオチドを用いる細胞のインキュベーションの後の培地中で測定される。例えば、上澄みはインキュベーションの後に単離することができ、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ＩＦＮα、ＩＬ−６、またはＩＬ−１２ｐ４０（あるいはＴＬＲ７またはＴＬＲ８シグナル伝達の結果として誘発されることが知られている任意の他の適切なサイトカイン）などのサイトカインのレベルを決定することができる。
【００９９】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の刺激は、多数の可能性のある読み取りシステムのいずれかを用いて評価することができ、そのほとんどは、例えばＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ、ＩＲＡＫ４、ｐ３８、および／またはＥＲＫを伴うＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路に基づく（ハッカー（Ｈｃｋｅｒ）Ｈら、（１９９９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：６９７３−８２頁）。これらの経路は、ＫＢキナーゼ複合体およびｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼを含むキナーゼを活性化する。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の活性化は、ＴＬＲシグナル伝達の様相を調査することによって評価することができる。例えば、ＴＬＲシグナル伝達の活性化は、タンパク質−タンパク質の会合（例えば、ＩＲＡＫと、ＭｙＤ８８および／またはＴＲＡＦ６）の変化、タンパク質の活性（例えば、ＴＡＫ−１などのタンパク質のキナーゼ活性）の変化、タンパク質の細胞内局在化（ＮＫ−ｋＢの核内への移動など）の変化、そして遺伝子発現（例えば、ＮＫ−ｋＢ感受性遺伝子の発現）およびサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮα、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２ｐ４０の産生および分泌）の変化を引き起こす。このような変化はどれも検出可能であり、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の活性化を検出するために使用することができる。特に好ましい実施形態では、ＴＬＲ７の刺激は、培養の１８〜２０時間後に上澄みを採取し、サンドイッチＥＬＩＳＡによりＩＦＮα、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２ｐ４０のレベルを測定することによって検出される。もう１つの好ましい実施形態では、ＴＬＲ８の刺激は、培養の１８〜２０時間後に上澄みを採取し、サンドイッチＥＬＩＳＡによりＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１２ｐ４０のレベルを測定することによって検出される。
【０１００】
もう１つの実施形態では、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の刺激、およびその結果生じるシグナル伝達経路の活性化において、検出可能な遺伝子産物の発現を引き起こすレポーター構築物を含有する細胞が使用される。アッセイのために特に有用なレポーター遺伝子およびレポーター遺伝子構築物としては、例えば、ＮＦ−ｋＢに感受性のプロモーターに作用的に結合したレポーター遺伝子があげられる。このようなプロモーターの例には、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＴＮＦ−αのためのものが含まれるが、これらに限定されない。ＴＬＲ感受性プロモーターに作用的に結合されたレポーター遺伝子は、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）、バイオルミネセンスマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、例えば米国特許第５，４９１，０８４号明細書）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、例えば米国特許第６，４８６，３８２号明細書）など）、表面発現分子（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、および分泌分子（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α）を含むことができるが、これらに限定されない。例えば、ハッカー（Ｈｃｋｅｒ）Ｈら、（１９９９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：６９７３−８２頁、マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）ＴＬら、（１９９５年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：５２５８−６７頁が参照され、これらの開示は参照によって本明細書中に援用される。ＴＬＲシグナル伝達レポータープラスミドは市販されている（カリフォルニア州サンディエゴのインビボジェン）。
【０１０１】
酵素活性の読み取りに頼ったアッセイにおいて、基質はアッセイの一部として供給され、検出は、化学発光、蛍光、着色、放射性標識の取り込み、薬物耐性、光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｓｉｔｙ）、または酵素活性の他のマーカーの測定を伴うことができる。分子の表面発現に頼ったアッセイについては、検出は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析または機能アッセイを用いて達成することができる。分泌分子は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）またはバイオアッセイを用いてアッセイすることができる。これらおよび他の適切な読み取りシステムの多くは当該技術分野においてよく知られており、市販されている。好ましくは、レポーター系はどれが使用されても定量化可能である。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８仲介の活性を評価するために使用されるマーカーに検出可能な変化を誘発すれば刺激性であるといわれる。例えば、オリゴヌクレオチドは、マーカーの発現、活性、リン酸化、分泌などにおいて、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、またはそれ以上の変化を引き起こすことができる。
【０１０３】
本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ７発現細胞の新規の調節物質を同定するためにこのようなアッセイにおいて使用することができる。通常、スクリーニング方法は、ＴＬＲ７を介するシグナル伝達を阻害または増強する化合物についてアッセイすることを含む。本方法では、ＴＬＲ７、ＴＬＲのために適切な基準リガンド（例えば、ｐｏｌｙＵｓ−２１などの本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドのうちの１つ）、および候補調節化合物が用いられる。通常、ＴＬＲ７は基準オリゴヌクレオチドと接触され、ＴＬＲ仲介の基準シグナルが測定される。選択されるＴＬＲは候補化合物とも接触され、ＴＬＲ仲介の試験シグナルが測定される。次に、試験シグナルおよび基準シグナルが比較される。有利な候補化合物は、次に、アッセイにおいて基準化合物として使用することができる。このような方法は、候補配列およびオリゴヌクレオチド修飾の自動化された高処理スクリーニングに適応可能である。このような高処理スクリーニング方法の例は、米国特許第６，１０３，４７９号明細書、米国特許第６，０５１，３８０号明細書、米国特許第６，０５１，３７３号明細書、米国特許第５，９９８，１５２号明細書、米国特許第５，８７６，９４６号明細書、米国特許第５，７０８，１５８号明細書、米国特許第５，４４３，７９１号明細書、米国特許第５，４２９，９２１号明細書、および米国特許第５，１４３，８５４号明細書に記載されている。同じようにして、本発明のＴＬＲ−８活性化オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ８発現細胞の調節物質を同定するために使用することができる。
【０１０４】
組成物
本発明は、１つ以上の本発明のオリゴヌクレオチドおよび許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。好ましくは、本発明の組成物は、有効量のａ）ｉ）１０〜５０の間のヌクレオチドからなり、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹ（式中、Ｕはそれぞれ独立してウラシル含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、ｎは１〜４の整数であり、そしてｐは４よりも大きい整数である）から選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドか、あるいはｉｉ）１１〜５０の間のヌクレオチドからなり、ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、Ｇはそれぞれ独立してグアニン含有ヌクレオチドから選択され、Ｘはそれぞれ独立して任意のヌクレオチドから選択され、Ｚはそれぞれ独立して非グアニンヌクレオチドから選択され、ｎは１〜４の整数であり、そしてｐは４よりも大きい整数である）から選択される配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドと、ｂ）薬学的に許容可能なキャリア（「医薬品組成物」）とを含む。
【０１０５】
薬学的に許容可能な溶液は通常、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性キャリア、アジュバント、および任意で他の治療成分を含有する。本発明において有用な医薬品組成物において使用され得る薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントおよび媒体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、ホスフェートなどの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩または電解質、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂があげられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
治療において使用するために、適切な標的細胞、例えばｐＤＣ、単球、ｍＤＣ、Ｔｒｅｇ細胞による化合物の取り込みを可能にする任意のモードで、有効量の化合物を被験者に投与することができる。本発明の医薬品組成物の「投与」は、当業者に既知の手段によって達成することができる。本発明の組成物は、経口的、非経口的、吸入スプレーによって、局所的、経皮的、経直腸的、経鼻的、経頬的、舌下、経膣的または埋め込みレザバー（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を介して投与され得る。「非経口的」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内および頭蓋内の注射または点滴技術を含む。好ましくは、組成物は、経口的、腹腔内または静脈内に投与される。注射はボーラス投与でも連続点滴でもよい。治療薬の調製および投与の様々な方法は当該技術分野においてよく知られており、例えばレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１５版において教示されており、その開示の全体は参照によって本明細書中に援用される。
【０１０７】
医薬品組成物は、好ましくは、用量単位で調製および投与される。このような調製方法は、投与すべき分子と、１つ以上の副成分を構成するキャリアなどの成分とを関連させるステップを含む。一般に、組成物は、活性成分と、液体キャリア、リポソームまたは微粉化した固体キャリアまたはその両方とを均一および密接に関連させ、そして必要であれば次に製品を成形することによって調製される。
【０１０８】
液体の用量単位は、注射または他の非経口投与ためのバイアルまたはアンプルである。固体用量単位は、錠剤、カプセル、粉末、および坐薬である。患者の治療のために、化合物の活性、投与の仕方、投与の目的（すなわち、予防的または治療的）、障害の性質および重症度、患者の年齢および体重に応じて、異なる用量が必要とされ得る。所与の用量の投与は、個々の用量単位の形で単回投与により行うこともできるし、あるいはより小さい用量単位を数回で行うこともできる。数日、数週間、または数ヶ月隔てた特定の間隔で繰り返される多数回の用量の投与も本発明によって意図される。本発明の方法において使用される組成物中に含まれる化合物の濃度は、約１ｎＭ〜約１００μＭの範囲であり得る。有効な用量は、約１０ピコモル／ｋｇ〜約１００マイクロモル／ｋｇの範囲であると考えられる。
【０１０９】
経口投与に適切な本発明の組成物は、所定の量の活性成分をそれぞれが含有するカプセル、小袋または錠剤などの別個の単位として、粉末または顆粒として、水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油液体エマルジョンまたは油中水液体エマルジョンとして、リポソーム内に充填されて、およびボーラスとしてなどで提供され得る。ソフトゼラチンカプセルは、化合物の吸収速度を有利に増大し得るこのような懸濁液を含有するために有用であり得る。
【０１１０】
錠剤は、任意で１つ以上の副成分と共に圧縮または成形することによって製造することができる。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と任意で混合された粉末または顆粒などの自由に流動する形態の活性成分を適切な機械で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤に浸した粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、任意で、被覆されたり刻み目がつけられたりしてもよく、その中の活性成分の遅延または制御放出を提供するように処方され得る。本明細書における化合物および当該技術分野において既知の他の化合物のような薬学的に活性な成分のこのような遅延または制御放出組成物を処方する方法は当該技術分野において知られており、いくつかの発行された米国特許において記載されている。そのいくつかは米国特許第４，３６９，１７２号明細書、および米国特許第４，８４２，８６６号明細書、ならびにこれらの中で引用される参考文献を含むがこれらに限定されない。コーティングは、化合物の腸への送達のために使用することができる（例えば、米国特許第６，６３８，５３４号明細書、米国特許第５，２１７，７２０号明細書、および米国特許第６，５６９，４５７号明細書、米国特許第６，４６１，６３１号明細書、米国特許第６，５２８，０８０号明細書、米国特許第６，８００，６６３号明細書、ならびにこれらの中で引用される参考文献を参照）。
【０１１１】
経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアは、ラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も通常添加される。カプセル形態における経口投与のためには、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性の懸濁液が経口的に投与される場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と混ぜ合わせられる。所望される場合には、特定の甘味料および／または香味料および／または着色剤が添加されてもよい。ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤も溶解および吸収を高めるために有用であり得る。
【０１１２】
経口投与に適切な組成物には、フレーバーベースの成分、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）と、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性ベースの活性成分を含む香錠とが含まれる。
【０１１３】
非経口投与に適切な組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および意図されるレシピエントの血液と製剤とを等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の無菌注射溶液と、懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液とを含む。製剤は単位用量または多用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中で提供され、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され、使用の直前に注射のための無菌液体キャリア、たとえば水の添加が必要なだけである。即座の注射溶液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【０１１４】
このような注射溶液は、例えば無菌の注入可能な水性または油性懸濁液の形態でもよい。この懸濁液は、当該技術分野において既知の技術に従って、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０など）および懸濁化剤を用いて処方することができる。無菌の注入可能な調製物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のように、非経口的に許容可能な非毒性の希釈剤または溶媒中の無菌の注入可能な溶液または懸濁液であってもよい。使用され得る許容可能な媒体および溶媒の中には、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は溶媒または懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意のブランドの固定油を用いることができる。オリーブ油またはヒマシ油（特に、そのポリオキシエチル化バージョン）などの薬学的に許容可能な天然油のように、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は注入物質の調製において有用である。これらの油溶液または懸濁液は、Ｐｈ．ヘルブ（Ｈｅｌｖ）または同様のアルコールなどの長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含有してもよい。
【０１１５】
本発明の医薬品組成物は、直腸または膣投与のために座薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、本発明の化合物と、室温で固体であるが直腸温度では液体であり、従って直腸内で溶融して活性成分を放出し得る適切な非刺激性の賦形剤とを混合することによって調製することができる。このような物質には、ココアバター、ビーズワックスおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明の医薬品組成物の局所投与は、所望の治療が、局所適用によって容易に到達できる領域または器官を含む場合に特に有用である。皮膚に局所的に適用する場合、医薬品組成物は、キャリア中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切な軟膏と共に処方され得る。本発明の化合物の局所投与のためのキャリアには、鉱油、液体石油、白色石油（ｗｈｉｔｅ  ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、医薬品組成物は、キャリア中に懸濁または溶解された活性化合物を含有する適切なローションまたはクリームと共に処方することができる。適切なキャリアには、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれるが、これらに限定されない。また、本発明の医薬品組成物は、直腸坐薬製剤あるいは適切な浣腸製剤によって下部腸管に局所的に適用されてもよい。局所経皮パッチおよびイオン泳動投与も本発明に含まれる。
【０１１７】
本発明の医薬品組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。このような組成物は、医薬品製剤の技術分野においてよく知られている技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収プロモーター、フルオロカーボン、および／または当該技術分野において既知の他の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。本発明の方法において用いることができるエアロゾル製剤には、米国特許第６，８１１，７６７号明細書に記載されるものも含まれ、その開示は参照によって本明細書中に援用される。
【０１１８】
組成物は、それ自体（そのまま）あるいは薬学的に許容可能な塩の形態で投与することができる。医薬において使用される場合、塩は薬学的に許容可能でなければならないが、非薬学的に許容可能な塩を便利に用いて、その薬学的に許容可能な塩を調製することもできる。このような塩としては、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されるものがあげられるが、これらに限定されない。また、このような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として調製することもできる。
【０１１９】
適切な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）、クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）、ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）、ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）があげられる。適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）があげられる。
【０１２０】
他の送達系は、時間放出、遅延放出または持続放出送達系（本明細書では集合的に「植込み型薬物放出デバイス」と呼ばれる）を含むことができる。このような系は化合物の繰り返しの投与を回避することができ、被験者および医師に対する便利性を増大させる。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者には知られている。これらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ酸無水物などのポリマーベースの系が含まれる。薬物を含有する上記ポリマーのマイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号明細書に記載されている。また送達系は、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、ならびにモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどの脂肪酸または中性脂肪を含む脂質、ヒドロゲル放出系、シラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）系、ペプチドベースの系、ワックスコーティング、従来のバインダーおよび賦形剤を用いる圧縮錠剤、部分的に融合した植込錠などである非ポリマー系も含む。特定の例としては、（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号明細書、米国特許第４，６７５，１８９号明細書、および米国特許第５，７３６，１５２号明細書に記載されるものなどの本発明の薬剤がマトリックス内の形で含有される浸食系と、（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号明細書、米国特許第５，１３３，９７４号明細書および米国特許第５，４０７，６８６号明細書に記載されるように、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系とがあげられるが、これらに限定されない。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系を使用することができ、そのいくつかは移植に適している。
【０１２１】
従って、もう１つの実施形態によると、本発明は植込み型薬物放出デバイスを含浸または充填する方法を提供し、前記薬物放出デバイスと、本発明のＴＬＲアゴニストオリゴヌクレオチドまたはＴＬＲアゴニストオリゴヌクレオチドを含む組成物とを接触させるステップを含む。
【０１２２】
もう１つの実施形態によると、本発明は、本発明のＴＬＲアゴニストオリゴヌクレオチドまたはＴＬＲアゴニストオリゴヌクレオチドを含む組成物が含浸されるかあるいはこれらを含有する植込み型薬物放出デバイスを提供し、前記ＴＬＲアゴニストは前記デバイスから放出されて治療的に活性である。
【０１２３】
また本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞に到達または進入するため、そのインビボの安定性を増大するため、あるいはその他の目的のためにその能力を増大するように設計された他の化合物と共に投与する（またはインビトロで使用する）こともできる。好ましいこのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸と結合して緻密化するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性化合物と複合体を形成し、分解から保護されると共に、その細胞内への取り込みが容易になる（例えば、ボイシフ（Ｂｏｕｓｓｉｆ）ら、（１９９５年）ＰＮＡＳ  ９２：７２９７頁、ゴッドベイ（Ｇｏｄｂｅｙ）、（１９９９年）ＰＮＡＳ  ９６：５１７７頁を参照）。ＰＥＩが好ましいが、他の緻密化剤（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）またはカチオン性物質も使用可能であることは認識されるであろう。
【０１２４】
また緻密化剤は単独で使用することもできるし、生物学的または化学的／物理的ベクターと組み合わせて使用することもできる。「緻密化剤」は、本明細書で使用される場合には、核酸の負電荷を中和し、それにより細かい顆粒への核酸の緻密化を可能にするヒストンなどの薬剤を指す。核酸の緻密化は、標的細胞による核酸の取り込みを容易にする。緻密化剤は単独で使用することができ、すなわち細胞によってより効率的に取り込まれる形で核酸を送達する。あるいは、より好ましくは、上記のベクターの１つ以上と組み合わせて使用することができる。
【０１２５】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドはリポソームと複合体が形成される。リポソームは、とりわけ、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質などの特定のリガンドと結合することによって特定の組織の標的とすることができるという点で有用である。リポソームを免疫細胞の標的とするために有用であり得るリガンドとしては、免疫細胞の細胞表面マーカーと相互作用をする抗体など、免疫細胞特異的受容体および分子と相互作用をする無処置の分子または分子の断片があげられるが、これらに限定されない。このようなリガンドは、当業者にはよく知られた結合アッセイによって容易に同定され得る。
【０１２６】
リポソームは２つの広い種類に分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電したｓｓＲＮＡ分子と相互作用をして安定な複合体を形成する正に帯電したリポソームである。正に帯電したｓｓＲＮＡ／リポソーム複合体は負に帯電した細胞表面と結合し、エンドソーム内へ取り込まれる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂し、その内容物が細胞の細胞質内に放出される（ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８７年、１４７、９８０−９８５頁）。
【０１２７】
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、複合体を形成するのではなく、ｓｓＲＮＡを捕捉する。ｓｓＲＮＡおよび脂質はいずれも同様に帯電されるので、複合体形成ではなく反発が生じる。従って、ｓｓＲＮＡはこれらのリポソームの水性内部に補足される。ｐＨ感受性リポソームは、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするｓｓＲＮＡを培養中の細胞の単層に送達するために使用されている（チョウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９２年、１９、２６９−２７４頁）。
【０１２８】
リポソーム組成物の１つの主要なタイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は通常ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性の融合性リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソームの組成物のもう１つのタイプは、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。もう１つのタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１２９】
核酸を含むリポソームは、例えば、チエリー（Ｔｈｉｅｒｒｙ）ら、国際公開第９６／４００６２号パンフレット（高分子量核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法（ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ））、タガワ（Ｔａｇａｗａ）ら、米国特許第５，２６４，２２１号明細書（ＲＮＡを含有するタンパク質結合リポソーム（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｎｄｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＲＮＡ））、ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）ら、米国特許第５，６６５，７１０号明細書（オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する方法（ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ））、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら、国際公開第９７／０４７８７号パンフレット（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ））において記載されている。
【０１３０】
リポソームのもう１つのタイプ、トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、薬物送達媒体のために魅力的であり、高度に変形可能な脂質凝集体である（ケベク（Ｃｅｖｃ）ら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１３６８（２）：２０１−１５頁）。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能なので液滴よりも小さい孔を貫通できる脂肪滴であるということができる。トランスファーソームはそれらが使用される環境に適応可能であり、例えば、それらは形状に適応可能であり、自己修復性であり、断片化することなく標的に到達することが多く、そして自己負荷することが多い。トランスファーソームは、例えば、表面エッジ活性化剤、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作成することができる。
【０１３１】
形質移入のための脂質製剤は、例えば、エフェクテン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥＴＭ）（特別なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム脂質）およびスーパーフェクト（ＳＵＰＥＲＦＥＣＴＴＭ）（新規の作用性デンドリマー技術）としてキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）から市販されている。リポソームは、例えば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＴＡＰおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）などのカチオン性脂質から形成されるリポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ）およびリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥＴＭ）として、ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から市販されている。リポソームの製造方法は当該技術分野においてよく知られており、多くの刊行物で記載されている。またリポソームは、とりわけ、グレゴリアディス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）、（１９８５年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：２３５−２４１頁によって概説されている。
【０１３２】
本発明の組成物は、関連の状態、例えば、癌またはウィルス感染症などの感染症の治療または予防に有用な他の薬剤を含んでもよい。
【０１３３】
１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、抗原と一緒に組成物中に処方される。抗原は別個の成分として組成物中に存在してもよく、あるいはオリゴヌクレオチドと結合して複合体を形成してもよい。複合体中で２つの薬剤は互いに直接共有結合または共役されてもよく、あるいはリンカーまたはテザー部分を介して付着されてもよい。好ましい実施形態では、抗原はウィルス抗原、癌抗原またはアレルゲンである。このような組成物は、その抗原によって特徴付けられる疾患または状態に対する抗原特異的応答を刺激するために使用される。
【０１３４】
本明細書における使用では、「ウィルス抗原」という用語は、無処置、弱毒または死滅させた全ウィルス、任意の構造または機能性ウィルスタンパク質、または抗原性であるのに十分な長さ（通常、約８アミノ酸またはそれより長い）のウィルスタンパク質のペプチド部分を含むがこれらに限定されない。ウィルス抗原の源としては、レトロウィルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）などのヒト免疫不全ウィルスおよびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離体）、ピコルナウィルス科（例えば、ポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、エンテロウィルス、ヒトコクサッキーウィルス、ライノウィルス、エコーウィルス）、カリシウィルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）、トガウィルス科（例えば、馬脳炎ウィルス、風疹ウィルス）、フラビウィルス科（例えば、デング熱ウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）、コロナウィルス科（例えば、コロナウィルス）、ラブドウィルス科（例えば、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス）、フィロウィルス科（例えば、エボラウィルス）、パラミクソウィルス科（例えば、パラインフルエンザウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス）、オルトミクソウィルス科（例えば、インフルエンザウィルス）、ブニヤウィルス科（例えば、ハンタンウィルス、ブニヤウィルス、フレボウィルスおよびナイロウィルス）、アレナウィルス科（出血熱ウィルス）、レオウィルス科（例えば、レオウィルス、オルビウィルスおよびロタウィルス）、ボルナウィルス科、ヘパドナウィルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）、パルボウィルス科（パルボウィルス）、パポバウィルス科（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）、アデノウィルス科（ほとんどのアデノウィルス）、ヘルペスウィルス科（単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウィルス）、ポックスウィルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス）、およびイリドウィルス科（例えば、アフリカブタ熱ウィルス）、ならびに未分類ウィルス（例えば、デルタ肝炎（Ｂ型肝炎ウィルスの欠損サテライトであると考えられる）、Ｃ型肝炎の因子、ノーウォークおよび関連のウィルス、およびアストロウィルス）からのウィルスがあげられるが、これらに限定されない。あるいは、ウィルス抗原は、組換えで産生されてもよい。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「癌抗原」および「腫瘍抗原」という用語は交換可能に使用され、癌細胞によって差別的に発現されることにより、癌細胞を標的とするために利用することができる抗原を指す。癌抗原は、腫瘍特異的免疫応答を潜在的に明白に刺激することができる抗原である。これらの抗原のうちのいくつかは正常細胞によってコードされるが、必ずしも発現されない。これらの抗原は、正常細胞において通常は無変化である（すなわち、発現されない）抗原、分化の特定の段階にだけ発現される抗原、および胚性および胎児性抗原などの時間的に発現される抗原と特徴付けることができる。他の癌抗原は、癌遺伝子などの変異細胞遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、変異体ｐ５３）、内部欠失または染色体転位から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウィルスに保有されるものなどのウィルス遺伝子によってコードされ得る。
【０１３６】
癌抗原は、本明細書で使用される場合、腫瘍または癌細胞表面と関連されて、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子との関係では抗原提示細胞の表面で発現される場合に免疫応答を誘発することができるペプチド、タンパク質、または糖タンパク質などの化合物である。癌抗原は、例えばコーエン（Ｃｏｈｅｎ）ＰＡら、（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：１０５５−８頁に記載されるように癌細胞の粗抽出物の調製によって、抗原の部分的な精製によって、組換え技術によって、あるいは既知の抗原の新規の合成によって、癌細胞から調製することができる。癌抗原は、組換えで発現される抗原、腫瘍または癌の免疫原性部分または全体もしくはそれらの細胞を含むが、これらに限定されない。このような抗原は、組換えで、あるいは当該技術分野において既知の他の手段によって単離または調製することができる。
【０１３７】
腫瘍抗原の例としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、Ｒａｆ−１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えばＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、または少なくとも１つのＨＥＲサブユニットで構成されるヘテロダイマー受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３−インテグリン、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＰＤＧＦベータ受容体、Ｓｒｃ、ＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８、ｈＣＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１５、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００．ｓｕｐ．Ｐｍｅ１１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒト乳頭腫ウィルスタンパク質などのウィルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ−コード核内抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、およびｃ−ｅｒｂＢ−２、またはｈｔｔｐ：／／ｏｎｃｏｌｏｇｙｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｏｋｓｉｔｅ／ＴａｒｇｅｔｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＴＴＯＥｘｈｉｂｉｔ２．ｐｄｆおよびｈｔｔｐ：／／ｏｎｃｏｌｏｇｙｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｏｋｓｉｔｅ／Ｔａｒｇｅｔｅｄ��ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＴＴＯＥｘｈｉｂｉｔ３．ｐｄｆ（これらの開示は、参照によって本明細書中に援用される）に示される追加のタンパク質標的があげられる。このリストは限定を意味しない。
【０１３８】
本発明の組成物（および方法）において使用され得るアレルゲンは記載するにはあまりにも膨大である。このようなアレルゲンの少しの例としては、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑粉、真菌胞子および薬物（例えば、ペニシリン）があげられるが、これらに限定されない。天然の動物性および植物性アレルゲンの例としては、以下の属：イヌ属（カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））、ヒョウヒダニ属（例えば、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ））、ネコ属（フェリス・ドメスチカス（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、ブタクサ属（アンブロシア・アルテミイスフォリア（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ））、ドクムギ属（例えば、ロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）およびロリウム・マルチフロラム（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））、スギ属（クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ））、アルタナリア属（アルタナリア・アルタナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ））、アルダー（Ａｌｄｅｒ）、ハンノキ属（アルナス・グルチノサ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ））、カバノキ属（ベツラ・ベルルコサ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ））、カシ属（クェルカス・アルバ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ））、オリーブ属（オレア・オイローパ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ））、ヨモギ属（アルテミシア・ブルガリス（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、オオバコ属（例えば、プランタゴ・ランセオラタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））、ヒカゲミズ属（例えば、パリエタリア・オフィシナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）およびパリエタリア・ジュダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ））、チャバネゴキブリ属（例えば、ブラッテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ））、ミツバチ属（例えば、アピス・マルチフローラム（Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））、イトスギ属（例えば、クプレッサス・センペルビレンス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、クプレッサス・アリゾニカ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ）およびクプレッサス・マクロカルパ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ））、ビャクシン属（例えば、ジュニペラス・サビノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、ジュニペラス・バージニアナ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ジュニペラス・コムニス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、およびジュニペラス・アシェイ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ））、クロベ属（例えば、ツーヤ・オリエンタリス（Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））、ヒノキ属（例えば、チャマエシパリス・オブツサ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ））、ゴキブリ属（例えば、ペリプラネタ・アメリカーナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））、カモジグサ属（例えば、アグロピロン・レペンス（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ））、ライムギ属（例えば、セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、コムギ属（例えば、トリチカム・アエスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、カモガヤ属（例えば、ダクチリス・グロメラータ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ））、ウシノケグサ属（例えば、フェスツカ・エラチオール（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ））、イチゴツナギ属（例えば、ポア・プラテンシス（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）およびポア・コンプレッサ（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））、カラスムギ属（例えば、アベナ・サチバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））、シラゲガヤ属（例えば、ホルカス・ラナタス（Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ））、ハルガヤ属（例えば、アントキサンタム・オドラタム（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ））、オオカニツリ属（例えば、アレナテラム・エラチウス（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ））、ヌカボ属（例えば、アグロスチス・アルバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ））、アワガエリ属（例えば、フレウム・プラテンス（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））、クサヨシ属（例えば、ファラリス・アルンジナセア（Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））、スズメノヒエ属（例えば、パスパルム・ノタータム（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ））、モロコシ属（例えば、ソルガム・ハレペンシス（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））およびスズメノチャヒキ属（例えば、ブロムス・イネルミス（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ））に特異的なタンパク質があげられる。
【０１３９】
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、および様々な潜在的な原因のいずれかに起因する任意のタイプの免疫系の低下など、増強したｐＤＣ活性によって、あるいはＴＬＲ７発現細胞またはＴＬＲ８発現細胞の増強した活性によって有利に影響され得る状態を治療または予防するために使用することができる。治療されている状態にかかわらず、関連の状態を治療するために使用することができる任意の他の薬剤が、本明細書に記載されるＴＬＲアゴニストオリゴヌクレオチドと一緒に本発明の組成物中に存在できることは認識されるであろう。
【０１４０】
もう１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、癌の治療において有用な別の治療薬と一緒に組成物中に処方される。このような薬剤としては、他のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９）のアゴニストと、オリゴヌクレオチドがアゴナイズするが異なる分子構造（すなわち、異なるヌクレオチド配列）を有する同じＴＬＲのアゴニストと、薬物、毒素、免疫調節物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害薬、治療的な放射性核種、血管新生阻害薬、化学療法薬、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、タキサン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２阻害薬、ＳＮ−３８、有糸分裂阻害薬、抗血管新生薬およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、窒素マスタード、ゲムシタビン、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウィルス薬タンパク質、ゲロニン、ジフテリン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ）毒素、シュードモナス属外毒素、シュードモナス属内毒素などの、放射性同位体、毒性タンパク質、毒性小分子を含むがこれらに限定されない細胞毒剤（例えばレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１９版（マーク・パブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）１９９５年）、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）の治療学の薬理学的基礎（マグロー・ヒル（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）、２００１年）、パスタン（Ｐａｓｔａｎ）ら、（１９８６年）Ｃｅｌｌ  ４７：６４１頁、ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）、（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３頁、米国特許第６，０７７，４９９号明細書、ｈｔｔｐ：／／ｏｎｃｏｌｏｇｙｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｏｋｓｉｔｅ／ＴａｒｇｅｔｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＴＴＯＥｘｈｉｂｉｔ４．ｐｄｆ、およびｈｔｔｐ：／／ｏｎｃｏｌｏｇｙｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｏｋｓｉｔｅ／ＴａｒｇｅｔｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＴＴＯＥｘｈｉｂｉｔ５．ｐｄｆ（これらの開示全体は参照によって本明細書中に援用される）を参照）と、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、Ｒａｆ−１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、または少なくとも１つのＨＥＲサブユニットで構成されるヘテロダイマー受容体、癌胎児性抗原、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３−インテグリン、Ｃ��ＬＡ−４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＰＤＧＦベータ受容体、Ｓｒｃ、ＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８、ｈＣＧ、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１５、あるいはｈｔｔｐ：／／ｏｎｃｏｌｏｇｙｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｏｋｓｉｔｅ／ＴａｒｇｅｔｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＴＴＯＥｘｈｉｂｉｔ２．ｐｄｆおよびｈｔｔｐ：／／ｏｎｃｏｌｏｇｙｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｏｋｓｉｔｅ／ＴａｒｇｅｔｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＴＴＯＥｘｈｉｂｉｔ３．ｐｄｆ（これらの開示は参照によって本明細書中に援用される）において示される追加のタンパク質標的をコードするｍＲＮＡを標的するｓｉＲＮＡなどの、腫瘍抗原または腫瘍増殖性タンパク質を標的とする薬剤と、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タルノキシフェン（ｔａｒｎｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ジェムシタブレン（ｇｅｍｃｉｔａｂｌｅｎ）、ナベルビン、ファメシル（ｆａｍｅｓｙｌ）−タンパク質トランスフェラーゼ（ｔａｎｓｆｅｒａｓｅ）阻害薬、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、または上記の類似体または誘導変異体を含むがこれらに限定されない化学療法薬と、乳癌（ドキソルビシン、エピルビシン、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド（ＡＣ）の組み合わせ、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび５−フルオロウラシル（ＣＡＦ）の組み合わせ、シクロホスファミド、エピルビシンおよび５−フルオロウラシル（ＣＥＦ）ハーセプチン（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）の組み合わせ、タモキシフェン、タモキシフェンおよび細胞毒の組み合わせ、ドセタキセルおよびパクリタキセルを含むタキサン、タキサンとドキソルビシンの組み合わせ、ならびにシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｐｈａｍｉｄｅ））、結腸癌（５−ＦＵおよびロイコボリンの組み合わせ、５ＦＵおよびレバミソールの組み合わせ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、またはイリノテカン、５−ＦＵおよびロイコボリン（ＩＦＬ）の組み合わせ、もしくはオキサリプラチン）、前立腺癌（放射性同位体（すなわち、パラジウム、ストロンチウム−８９およびイリジウム）、ロイプロリドまたは他のＬＨＲアゴニスト、非ステロイド性抗アンドロゲン薬（フルタミド、ニルタミド、およびビカルタミド）、ステロイド性抗アンドロゲン薬（酢酸シプロテロン）、ロイプロリドおよびフルタミド（ｆｌｕｔａｉｎｉｄｅ）の組み合わせ、エストロゲン（ＤＥＳ、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、結合エストロゲンＵ．Ｓ．Ｐ．、ＤＥＳ−ジホスフェートなど）、第二次ホルモン療法（アミノグルテチミド、ヒドロコルチ��ン、フルタミドの離脱、プロゲステロン、およびケトコナゾールなど）、低用量プレドニゾン、あるいは症候の主観的な改善およびＰＳＡレベルの低下を生じることが報告された他の化学療法薬または薬剤の組み合わせ（ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｃｌ）、パクリタキセル、エストラムスチン／ドセタキセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチン、およびエストラムスチン／パクリタキセルを含む））、メラノーマ（ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）など）、ビンカアルカロイド、白金化合物、およびタキサンを含む適度の単一の薬剤活性を有する薬剤、ダートマス（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ）療法（シスプラチン、ＢＣＮＵ、およびＤＴＩＣ）、インターフェロンα（ＩＦＮ−Ａ）、ならびにインターロイキン−２（ＩＬ−２））、卵巣癌（パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、オキサリプラチン、ヘキサメチルメラミン、タモキシフェン、イホスファミド、パクリタキセル（タキソール）またはドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ））およびシスプラチンまたはカルボプラチンの組み合わせ、シクロホスファミドおよびシスプラチンの組み合わせ、シクロホスファミドおよびカルボプラチンの組み合わせ、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）およびロイコボリン、エトポシド、リポソーマルドキソルビシン、ゲルシタビン（ｇｅｒｕｃｉｔａｂｉｎｅ）またはトポテカンの組み合わせ）、肺癌（シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、マイトマイシン、ドキソルビシン、およびエトポシドの単独または組み合わせ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン／エトポシド、およびシスプラチン（ＣＡＶ／ＥＰ）の組み合わせ、シスプラチンおよびビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはゲムシタビンの組み合わせ、ならびにカルボプラチンおよびパクリタキセルの組み合わせ）などの特定の癌を治療するための治療薬および治療薬の組み合わせとがあげられる。
【０１４１】
また本発明のオリゴヌクレオチド組成物は抗血管新生薬を含むこともできる。このような薬剤としては、ＶＥＧＦ関連遺伝子ファミリータンパク質に対する小分子阻害薬、中和抗体、アンチセンス戦略、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムと、拮抗特性を有するＶＥＧＦの変異体（すなわち、参照によって本明細書中に明確に援用される国際公開第９８／１６５５１号パンフレットに記載されるとおり）と、米国特許第６，５２４，５８３号明細書（その薬剤および適応症の開示は参照によって本明細書中に明確に援用される）の表Ｄに記載される薬剤と、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２，３ＰＤＧＦＲ−β、Ｆｌｔ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８αおよびＦＧＦＲ−１を含むがこれらに限定されない受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達を阻害する薬剤と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＣＯＸ−２、またはＨＩＦ−１αなどの、ＶＥＧＦ発現および産生の様々な調節剤の１つ以上を阻害する薬剤と、サリドマイドまたはその類似体ＣＣ−５０１３、ベバシツマブ（Ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（ｍＡｂ、ＶＥＧＦ−Ａを阻害、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ｍＡｂ、ＶＥＧＦＲ−２を阻害、イムクローン・システムズ（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））、ＣＤＰ−７９１（ペグ化されたＤｉＦａｂ、ＶＥＧＦＲ−２、セルテック（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ））、２Ｃ３（ｍＡｂ、ＶＥＧＦ−Ａ、ペレグリン・ファーマシューティカルズ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、ＰＴＫ−７８７（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−２およびＥＧＦＲ、ノバルティス）、ＺＤ６４７４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＥＧＦＲ  アストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））、ＡＺＤ２１７１（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、アストラゼネカ）、ＳＵ１１２４８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１，−２、ＰＤＧＦＲ  ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））、ＡＧ１３９２５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ファイザー）、ＡＧ０１３７３６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ファイザー）、ＣＥＰ−７０５５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、セファロン（Ｃｅｐｈａｌｏｎ））、ＣＰ−５４７，６３２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ファイザー）、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐ（可溶性ハイブリッド受容体ＶＥＧＦ−Ａ、ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）アベンティス（Ａｖｅｎｔｉｓ）／レジェネロン（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、ＧＷ７８６０２４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、グラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））、Ｂａｙ９３−４００６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＰＤＧＦＲ  バイエル（Ｂａｙｅｒ）／オニックス（Ｏｎｙｘ））、およびＡＭＧ７０６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、アムジェン（Ａｍｇｅｎ））があげられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
オリゴヌクレオチド組成物は、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＣｐＧ含有一本鎖ＤＮＡ、他のＴＬＲのアゴニスト、他のサイトカインおよび免疫抑制剤などの免疫調節剤と、Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似体と、またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−Ｉβ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインと、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を与える薬剤と、細胞分裂阻害剤および分化剤と、または細胞接着の阻害薬などの他の治療薬を含むこともできる。
【０１４３】
さらにもう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド組成物は、さらに、抗ウィルス剤を含むことができる。本発明の分子と組み合わせて使用することができる有用な抗ウィルス剤には、プロテアーゼ阻害薬、ヌクレオシド逆転写酵素阻害薬、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害薬およびヌクレオシド類似体が含まれるが、これらに限定されない。抗ウィルス剤の例としては、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル（ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリン、ならびにホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、α−インターフェロン、アデホビル、クレバジン（ｃｌｅｖａｄｉｎｅ）、エンテカビル、プレコナリルがあげられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
動物およびヒトに対する投与量（体表面１平方メートルあたりのミリグラムに基づく）の相互関係は、フライライヒ（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ）ら、（１９６６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  ５０：２１９頁に記載されている。体表面積は、患者の身長および体重からおおよそ決定され得る。例えば、サイエンティフィック・テーブル（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅ）、ニューヨーク州アードレイのガイギー・ファーマシューティカルズ（Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．）、１９７０年、５３７頁を参照されたい。本発明の化合物の有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲でよく、どの範囲においても、範囲の下端は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇの間の量であり、範囲の上端は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇの間の量である（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）。また有効な用量は、当業者により認識されるように、処置される疾患、投与経路、賦形剤の使用、およびの他の薬剤の使用などの他の治療的処置との併用の可能性に応じて変化し得る。
【０１４５】
追加の治療薬を含む医薬品組成物の場合、追加の治療薬の有効量は、ちょうどその追加の薬剤を用いる単独療法計画において通常用いられる投与量の約２０％〜１００％の間である。好ましくは、有効量は、通常の単独療法の用量の約７０％〜１００％の間である。これらの追加の治療薬の通常の単独療法の投与量は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら編、薬物療法ハンドブック第２版追補、アップルトン・アンド・ランゲ（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ）、コネチカット州スタンフォード（Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）（２０００年）と、ＰＤＲ薬局法方、タラスコンポケット薬局方（Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）２０００年、豪華版、タラスコン出版（Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、カリフォルニア州ローマリンダ（Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．）（２０００年）とが参照され、これらの参考文献のそれぞれは参照によって完全に本明細書中に援用される。
【０１４６】
上記の追加の治療薬のいくつかは、本発明の化合物と相乗的に作用し得ることが予期される。これが起こると、追加の治療薬および／または本発明の化合物の有効な投与量を単独療法で必要とされる量から低減することができる。これは、追加の治療薬または本発明の化合物のいずれかの毒性の副作用の最小限化、効力の相乗的な改善、投与または使用の容易さの改善、および／または複合調製物または製剤の全体的な費用の低減という利点を有する。
【０１４７】
上記の特定の治療薬が上記カテゴリーの中の２つ以上に分類されることは、当業者によって認識されるであろう。本発明の目的のために、このような治療薬は、これらの治療学カテゴリーのそれぞれのメンバーであると考えられ、特定の指定されたカテゴリー内にある任意の治療薬のキャラクタリゼーションが、別の指定されたカテゴリー内にあることも考えられることから、それを排除しない。
【０１４８】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８アゴニストと、癌の治療において有用な治療薬、感染症の治療において有用な治療薬、癌抗原、ウィルス抗原またはアレルゲンから選択されるもう１つの薬剤とを、別個の剤形において、しかし互いに関連して含む主題の組成物を提供する。「互いに関連する」という用語は、本明細書で使用される場合、別個の剤形が一緒にパッケージ化される、あるいは別個の剤形が同じ投与計画の一部として販売および投与される予定であることが容易に明らかであるように互いに付着されることを意味する。薬剤およびＴＬＲ７アゴニストは、好ましくは一緒にブリスターパックまたは他のマルチチャンバパッケージ内にパッケージ化されるか、ユーザーによって分離することができる（例えば、２つの容器の間の切り込み線で引き裂くことによって）連結されて別々に密封された容器（ホイルパウチなど）でパッケージ化される。
【０１４９】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、ａ）本発明のＴＬＲ７アゴニストまたはＴＬＲ８アゴニストと、ｂ）癌の治療において有用な治療薬、感染症の治療において有用な治療薬、癌抗原、ウィルス抗原またはアレルゲンから選択されるもう１つの薬剤とを、別個の容器に含むキットを提供する。
【０１５０】
治療方法
本発明の多数の実施形態において、本発明の一本鎖のウリジンが豊富またはグアニジンが豊富なオリゴヌクレオチドは、特異的な結果を達成するために治療的または予防的に有効な量で患者または個体に投与されるであろう。従って、本発明は、免疫応答の増強が有用でありそして／または必要とされる、癌または感染症、例えばウィルス感染症などの障害の治療または予防において有用な免疫刺激のために本明細書で記載されるオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。本方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを含む組成物を患者に投与するステップを含む。本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、ｐＤＣ活性の増強、単球活性の増強、ｍＤＣ活性の増強、Ｔｒｅｇ細胞活性の増強、もしくはＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現細胞の活性の増強によって有利に影響され得る状態を治療または予防できることは認識されるであろう。従って、本発明の方法および組成物を使用してアレルギー、喘息、自己免疫疾患などの状態を治療または予防し、そして疾患、手術、または免疫抑制薬（化学療法薬または他の薬物など）の投与または治療に起因して免疫系が弱まった患者の免疫機能を概して増強することができる。
【０１５１】
特定の実施形態では、本発明に従って被験者の免疫応答を刺激する方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを含む組成物の投与の後に、被験者の免疫細胞活性を検出する追加のステップを含む。活性の検出は、好ましくは、オリゴヌクレオチド組成物の投与の後の期間の後に、被験者から得られる樹状細胞、単球、またはＴｒｅｇ細胞において実施される。細胞は、被験者の末梢血、脾臓、骨髄またはリンパ節、好ましくは末梢血または骨髄から得ることができる。細胞は、投与組成物中のオリゴヌクレオチドが被験者の免疫細胞に影響を与えるのに十分な時間が経った後に得られるべきである。通常、これは、投与後１〜４８時間の間である。末梢血および／または髄は、好ましくは、既知の技術によってさらに精製される。通常、技術は、アッセイすべき細胞の型に特異的な適切な試薬を用いる蛍光活性化または磁気活性化細胞選別などの細胞選別技術である。
【０１５２】
得られる免疫細胞の活性は、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８のアゴニズムによって特定の細胞内で影響を受けることが分かっている活性を測定することによって決定され得る。ＴＬＲ７の活性化を決定するために、試験に好ましい細胞は、被験者からのｐＤＣである。単離したｐＤＣまたはｐＤＣの集団は、ＩＦＮα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ４０からなる群から選択されるサイトカインの発現のレベルを調べることによってアッセイされる。ＴＬＲ８の活性化を決定するために、試験に好ましい細胞は、ｍＤＣ、単球またはＴｒｅｇ細胞から選択される。ｍＤＣまたは単球をアッセイするために、ＴＮＦα、ＩＬ−６、またはＩＬ−１２ｐ４０の発現のレベルが測定される。Ｔｒｅｇ細胞のために、使用されるアッセイは、好ましくは、ＩＬ−１０またはトランスフォーミング成長因子βの発現のレベル、あるいはこのような細胞が同時培養において未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を調査する。
【０１５３】
多数のタイプの癌のいずれかを本発明のオリゴヌクレオチドを用いて治療または予防することができる。本質的に、ｐＤＣ、ｍＤＣ、単球、Ｔｒｅｇ細胞または他のＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現細胞の活性の増大によって治療、その進行を遅延、あるいは予防することができる癌（または他の状態）はどれでも治療することができる。治療することができる癌のタイプまたは増殖性疾患の例としては、膀胱、胸部、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚（扁平上皮癌を含む）の癌腫を含む癌腫と、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリーセルリンパ腫およびバーキット（Ｂｕｒｋｅｔｔｓ）リンパ腫を含むリンパ系の造血系腫瘍と、急性および慢性の骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血系腫瘍と、線維肉腫および横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｃｏｍａ）を含む間葉由来の腫瘍と、メラノーマ、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍と、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および抹消神経系の腫瘍と、線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）、および骨肉腫を含む間葉由来の腫瘍と、メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌を含む他の腫瘍とがあげられる。
【０１５４】
癌を治療するための１つの実施形態では、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現細胞のサンプルは、オリゴヌクレオチドの投与の前に患者から得られ、本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドが細胞を活性化する能力は、そのサンプルの一部において評価されるであろう。適切な活性オリゴヌクレオチドが同定されたらすぐにそれを使用して、患者のＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現細胞の残りの部分または別のサンプル（任意で、活性化の前に生体外で拡張される）を生体外で活性化することができ、この際、オリゴヌクレオチドは細胞にインビトロで適用され、次に活性化細胞が患者に戻される。あるいは、活性化能の評価に続いて患者の細胞をインビボで活性化することができ、この場合オリゴヌクレオチド（適切な医薬品製剤中の）は直接患者に投与される。１つの実施形態では、ｐＤＣもしくは他のＴＬＲ７−またはＴＬＲ−８発現細胞のサンプルが次に（オリゴヌクレオチド投与に続いて）患者から得られ、その活性をインビボで評価する。活性は、例えば、サイトカイン産生、ＴＬＲシグナル伝達に誘発される遺伝子発現、他の細胞の増殖への影響などの上記の方法のいずれかを用いて評価することができる。このような実施形態では、ｐＤＣまたは他のＴＬＲ発現細胞が活性である（あるいは、増殖の増大を受けた）ことの検出は、オリゴヌクレオチドが所望の効果を有していることの表示である。
【０１５５】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて癌が治療されている場合、もう１つの実施形態では、本発明の方法は、前記患者に別の抗癌化合物を投与するか、あるいは患者に別の治療的アプローチを受けさせる追加のステップを含む。固形腫瘍の治療の場合、例えば、本発明の組成物の投与は、手術、放射線療法、化学療法などの古典的なアプローチと組み合わせて使用され得る。従って、本発明は、手術または放射線治療と同時、その前または後に本発明のオリゴヌクレオチドが使用されるか、あるいは従来の化学療法薬、放射線治療薬または抗血管新生薬、もしくは標的免疫毒素または凝固リガンドと同時に、これらの前または後に本発明のオリゴヌクレオチドが患者に投与される併用療法を提供する。オリゴヌクレオチドが別の薬剤と共に患者に投与される場合、２つの成分は、別々に処方された組成物（すなわち、多剤形）として、あるいは単一の組成物（本発明のオリゴヌクレオチドおよび別の治療薬を含有する上記の併用単一剤形など）としてのいずれかで投与され得る。
【０１５６】
本発明のＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８刺激オリゴヌクレオチドと共に同時投与することができる他の抗癌化合物の例としては、サイトカインがある。本発明の組成物と組み合わせて有用である上記のサイトカインのいずれかを含むこのような併用アプローチにおいて様々なサイトカインを用いることができる。サイトカインの好ましい例としては、ＩＬ−１αＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γがあげられる。特に好ましいのは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１５などの、ＮＫ細胞の細胞毒活性を刺激するサイトカインである。サイトカインは、患者の状態およびサイトカインの相対毒性などの臨床的な兆候と一致する標準的な投与計画に従って投与される。
【０１５７】
その他の実施形態では、本発明のＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８刺激オリゴヌクレオチド組成物は、化学療法薬またはホルモン療法薬と組み合わせて投与され得る。様々なホルモン療法および化学療法薬は、本発明の組成物と組み合わせて有用である上記の薬剤のいずれかを含む本明細書に開示される併用治療法において使用することができる。典型的であると考えられる好ましい化学療法薬には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、細胞毒性抗生物質、ビンカアルカロイド、例えばアドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン、ならびにこれらの誘導体およびプロドラッグが含まれる。またキナーゼ阻害薬、そして特に血管新生阻害薬も考えられ、例えば、阻害薬またはＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ、Ｃ−ＫＩＴおよび／または１つ以上のｒａｆキナーゼ（例えば、Ｒａｆ−ａ、ｒａｆ−ｂおよび／またはｒａｆ−ｃ）が含まれる。好ましいホルモン剤は、例えば、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリンなどのＬＨＲＨアゴニストと、タモキシフェンおよびトレミフェンなどの抗エストロゲン剤と、フルタミド、ニルタミド、シプロテロンおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン剤と、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾールおよびファドロゾールなどのアロマターゼ阻害薬と、メドロキシ、クロルマジノンおよびメゲストロールなどのプロゲスターゲンとを含む。
【０１５８】
もう１つの実施形態では、本発明のＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８刺激オリゴヌクレオチド組成物は、治療抗体と組み合わせて投与され得る。１つの実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８刺激オリゴヌクレオチド組成物は標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を増強し、好ましくは、枯渇させることが目的とされる標的細胞の抗原に結合する抗体を前記患者に投与するステップと組み合わせて投与される。このような治療抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブタイプを有することが多いが、他のサブタイプおよび修飾バージョン（例えば、修飾されたＦｃ領域）も想定される。本発明に従って有利に使用することができる治療抗体の例は、イナート・ファルマ（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）に譲渡されたＰＣＴ公報、国際公開第２００５／００９４６５号パンフレットにおいて提供されており、その開示は参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０１５９】
また本発明は、被験者の感染症を治療または予防する方法、特にウィルス感染症を治療または予防する方法も提供し、本方法は、前記患者に本発明の組成物を投与するステップを含む。感染症を有する被験者は、感染性生物体に暴露されて、急性または慢性の検出可能なレベルの生物体を体内に有する被験者である。感染性生物体への暴露は、一般に、被験者外側表面、例えば皮膚または粘膜の膜で生じ、そして／または感染性生物体による被験者の外側表面の浸透を指す。ウィルス性疾患に加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、細菌、プリオン、真菌、および様々な寄生虫を含む他のタイプの感染病原体に対して防御するためにも使用することができる。例えば、Ｃ．Ｇ．Ａトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ベイリール・ティンデル（Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ）、英国、１９８３年、が参照され、その開示全体は参照によって本明細書中に援用される。
【０１６０】
ウィルス感染症の予防を必要とする被験者は、ウィルス性疾患に対するワクチン接種の候補者である被験者である。特定のウィルス性疾患のためには、このような被験者は新生児、乳児または青年である。その他のウィルス性疾患のためには、被験者は免疫無防備状態である。その他のウィルス性疾患のためには、被験者は任意のメンバーまたは集団である。
【０１６１】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて治療可能なウィルスとしては、エンテロウィルス（ポリオウィルス、コクサッキーウィルス、エコーウィルスなどのピコルナウィルス科のウィルスを含むがあるがこれらに限定されない）、ロタウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルスがあげられるが、これらに限定されない。ヒトにおいて見られるウィルスの特定の例としては、レトロウィルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）などのヒト免疫不全ウィルスおよびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離体）、ピコルナウィルス科（例えば、ポリオウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、エンテロウィルス、ヒトコクサッキーウィルス、ライノウィルス、エコーウィルス）、カリシウィルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）、トガウィルス科（例えば、馬脳炎ウィルス、風疹ウィルス）、フラビウィルス科（例えば、デング熱ウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）、コロナウィルス科（例えば、コロナウィルス）、ラブドウィルス科（例えば、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス）、フィロウィルス科（例えば、エボラウィルス）、パラミクソウィルス科（例えば、パラインフルエンザウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス）、オルトミクソウィルス科（例えば、インフルエンザウィルス）またはトリインフルエンザウィルス（例えば、Ｈ５Ｎ１または関連ウィルス）、ブニヤウィルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタンウィルス、ブニヤ（ｂｕｎｇａ）ウィルス、フレボウィルスおよびナイロウィルス）、アレナウィルス科（出血熱ウィルス）、レオウィルス科（例えば、レオウィルス、オルビウィルス（ｏｒｂｉｖｉｕｒｓ）およびロタウィルス）、ビルナウィルス科、ヘパドナウィルス科（Ｂ型肝炎ウィルス）、パルボウィルス科（パルボウィルス）、パポバウィルス科（パピローマウィルス、ポリオーマウィルス）、アデノウィルス科（ほとんどのアデノウィルス）、ヘルペスウィルス科（単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ））、ポックスウィルス科（痘瘡ウィルス、ワクシニアウィルス、ポックスウィルス）、イリドウィルス科（例えば、アフリカブタ熱ウィルス）、ならびに未分類ウィルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウィルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内在的に伝染、クラス２＝非経口的に伝染（すなわち、Ｃ型肝炎））、ノーウォークおよび関連のウィルス、およびアストロウィルス）があげられるがこれらに限定されない。
【０１６２】
癌と同様に、本発明の方法は、感染症の治療のために有用な別の薬剤を前記被験者に投与する追加のステップを含むことができる。感染症薬には、抗細菌剤、抗ウィルス剤、抗真菌剤および抗寄生虫剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
抗ウィルス剤は特に重要であり、ウィルスによる細胞の感染または細胞内のウィルスの複製を予防する化合物を含む。抗ウィルス剤により遮断または阻害することができるウィルス感染の過程にはいくつかの段階が存在する。これらの段階には、ウィルスの宿主細胞（免疫グロブリンまたは結合ペプチド）への付着、ウィルスのアンコーティング（例えば、アマンタジン）、ウィルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシド類似体）、新しいウィルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼ阻害薬）、ならびにウィルスの出芽および放出が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗ウィルス剤は、本発明のオリゴヌクレオチド／抗ウィルス剤の組み合わせ組成物の説明において上記で記載されている。
【０１６４】
好ましいヌクレオシド類似体としては、アシクロビル（単純疱疹ウィルスおよび水痘帯状疱疹ウィルスの治療のために使用される）、ガンシクロビル（サイトメガロウィルスの治療に有用）、イドクスウリジン、リバビリン（呼吸器多核体ウィルスの治療に有用）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、およびジドブジン（アジドチミジン）があげられるが、これらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドと共に投与され得るもう１つの種類の抗ウィルス剤は、インターフェロン（αおよびβ−インターフェロンなど）などのサイトカインを含む。また、通常の免疫グロブリン療法および高免疫グロブリン療法を含む免疫グロブリン療法も可能である。通常の免疫グロブリン療法は、正常な血液ドナーの血清から調製されて貯蔵される抗体産物を利用する。この貯蔵産物は、Ａ型肝炎、パルボウィルス、エンテロウィルス（特に、新生児において）などの広範囲のヒトウィルスに対して低力価の抗体を含有する。高免疫グロブリン療法は、特定のウィルスに対して高力価の抗体を有する個体の血清から調製される抗体を利用する。高免疫グロブリンの例としては、帯状疱疹免疫グロブリン（免疫無防備状態の子供および新生児において水痘の予防に有用）、ヒト狂犬病免疫グロブリン（狂犬病の動物にかまれた被験者の暴露後の予防において有用）、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（特にウィルスに暴露された被験者において、Ｂ型肝炎ウィルスの予防において有用）、およびＲＳＶ免疫グロブリン（呼吸器合胞体ウィルス感染症の治療において有用）がある。
【０１６５】
本発明の方法がウィルス感染症を予防するように設計される場合、本方法は通常、前記被験者にウィルス抗原を投与する追加のステップを含む。ウィルス抗原の選択は、本発明の組み合わせ組成物において有用であるものと同じ上記のウィルス抗原から行うことができる。
【０１６６】
１つ以上の薬剤が本発明のオリゴヌクレオチドに基づく療法と組み合わせて使用される場合、各治療が別々に実行される場合に観察される効果に相加的である複合的な結果は要求されない。少なくとも相加的な効果は通常望ましいが、単独療法の１つよりも増大した抗癌または抗感染症効果が有効であろう。また、これは確かに可能であり有利であるが、相乗効果を示すための併用治療は特に必要条件ではない。
【０１６７】
本発明の方法において有用な他の治療薬の有効量は当業者にはよく知られている。しかしながら、他の治療薬の最適な有効量の範囲を決定することは、十分に当業者の範囲内である。別の治療薬が動物に投与される本発明の１つの実施形態では、本発明の化合物の有効量は、他の治療薬が投与されない場合のその有効量よりも少ない。もう１つの実施形態では、従来の薬剤の有効量は、本発明の化合物が投与されない場合のその有効量よりも少ない。このようにして、高用量のいずれかの薬剤に関連する望ましくない副作用が最小限にされ得る。その他の潜在的な利点（投薬計画の改善および／または薬物費用の低下を含むが限定されない）は当業者には明らかであろう。
【０１６８】
もう１つの実施形態では、本発明は、検出可能なマーカーと結合した上記のオリゴヌクレオチドのいずれかを提供する。「検出可能なマーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、定量的または定性的に観察または測定することができる分子を指す。本発明の結合オリゴヌクレオチドにおいて有用な検出可能なマーカーの例としては、放射性同位体、蛍光染料、または相補的な結合対のメンバー（抗原／抗体、レクチン／炭水化物、アビジン／ビオチン、受容体／リガンド、または分子インプリントポリマー／プリント分子系のうちのどれか１つのメンバーなど）がある。
【０１６９】
このような検出可能なマーカーのオリゴヌクレオチドへの結合は、当該技術分野においてよく知られた方法によって達成することができる。オリゴヌクレオチド結合体の調製について記載している典型的な米国特許としては、例えば、米国特許第４，８２８，９７９号明細書、米国特許第４，９４８，８８２号明細書、米国特許第５，２１８，１０５号明細書、米国特許第５，５２５，４６５号明細書、米国特許第５，５４１，３１３号明細書、米国特許第５，５４５，７３０号明細書、米国特許第５，５５２，５３８号明細書、米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書、米国特許第５，５９１，５８４号明細書、米国特許第５，１０９，１２４号明細書、米国特許第５，１１８，８０２号明細書、米国特許第５，１３８，０４５号明細書、米国特許第５，４１４，０７７号明細書、米国特許第５，４８６，６０３号明細書、米国特許第５，５１２，４３９号明細書、米国特許第５，５７８，７１８号明細書、米国特許第５，５０８，０４６号明細書、米国特許第４，５８７，０４４号明細書、米国特許第４，６０５，７３５号明細書、米国特許第４，６６７，０２５号明細書、米国特許第４，７５２，７７９号明細書、米国特許第４，７８９，７３７号明細書、米国特許第４，８２４，９４１号明細書、米国特許第４，８３５，２６３号明細書、米国特許第４，８７６，３３５号明細書、米国特許第４，９０４，５８２号明細書、米国特許第４，９５８，０１３号明細書、米国特許第５，４８２，８３０号明細書、米国特許第５，１１２，９６３号明細書、米国特許第５，２１４，１３６号明細書、米国特許第５，０８２，８３０号明細書、米国特許第５，１１２，９６３号明細書、米国特許第５，２１４，１３６号明細書、米国特許第５，２４５，０２２号明細書、米国特許第５，２５４，４６９号明細書、米国特許第５，２５８，５０６号明細書、米国特許第５，２６２，５３６号明細書、米国特許第５，２７２，２５０号明細書、米国特許第５，２９２，８７３号明細書、米国特許第５，３１７，０９８号明細書、米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書、米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書、米国特許第５，５１０，４７５号明細書、米国特許第５，５１２，６６７号明細書、米国特許第５，５１４，７８５号明細書、米国特許第５，５６５，５５２号明細書、米国特許第５，５６７，８１０号明細書、米国特許第５，５７４，１４２号明細書、米国特許第５，５８５，４８１号明細書、米国特許第５，５８７，３７１号明細書、米国特許第５，５９５，７２６号明細書、米国特許第５，５９７，６９６号明細書、米国特許第５，５９９，９２３号明細書、米国特許第５，５９９，９２８号明細書、および米国特許第５，６８８，９４１号明細書があげられ、そのそれぞれは参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０１７０】
検出可能なマーカーに結合した本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、対応するＴＬＲへのオリゴヌクレオチドの結合を検出することができる。従ってもう１つの実施形態によると、本発明は、ａ）ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹ、もしくはｂ）ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、各Ｕ、Ｇ、Ｘ、ｎおよびｐは上記のように定義される）から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドのＴＬＲ７またはＴＬＲ８への結合を検出する方法を提供し、本方法は、検出可能なマーカーに結合された前記オリゴヌクレオチドを含む分子を、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質と接触させるステップと、前記検出可能なマーカーを検出するステップとを含む。ＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質は、単離したＴＬＲ７またはＴＬＲ８タンパク質、機能性オリゴヌクレオチド結合ドメインを含むＴＬＲ７またはＴＬＲ８タンパク質の断片、もしくはＴＬＲ７またはＴＬＲ８を発現する細胞でよい。任意で、本発明のＴＬＲ７アゴニストオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ８を介するシグナル伝達および／またはＴＬＲ８への結合を実質的に誘発せず、任意で、本発明のＴＬＲ８アゴニストオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７を介するシグナル伝達および／またはＴＬＲ７への結合を実質的に誘発しない。
【０１７１】
もう１つの実施形態によると、本発明は、試験分子がＴＬＲ７またはＴＬＲ８に結合するかどうかを決定する方法を提供しており、ａ）ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹ、もしくはｂ）ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、各Ｕ、Ｇ、Ｘ、ｎおよびｐは上記のように定義される）から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドと、検出可能なマーカーとを含む前記結合体を、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質と接触させるステップと、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質と関連された検出可能なマーカーを定量するステップと、前記試験分子の存在下で前記結合体を前記ＴＬＲ７またはＴＬＲ−８含有物質と接触させるステップと、前記試験分子の存在がＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質と関連された検出可能なマーカーの量を低下させたかどうかを決定するステップとを含む。試験分子の存在下におけるＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質に関連された検出可能なマーカーの量の低下は、試験分子がＴＬＲ７またはＴＬＲ８に結合することを示す。次に試験分子は、既に記載したアッセイのいずれかによって、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を活性化するその能力についてさらにアッセイされる。
【０１７２】
関連の実施形態では、本発明は、ＵＵＵ−（Ｘ）ｎ−ＵＵＵ、またはＵＵ−Ｘ−ＵＵ−Ｘ−ＵＵ、またはＹ（Ｕ）ｐＹ、もしくはｂ）ＧＧＧ−（Ｘ）ｎ−ＧＧＧ、ＧＧ−Ｘ−ＧＧ−Ｘ−ＧＧ、またはＺ（Ｇ）ｐＺ（式中、各Ｕ、Ｇ、Ｘ、ｎおよびｐは上記のように定義される）から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドと、検出可能なマーカーとを含む結合体、ならびにＴＬＲ７またはＴＬＲ８含有物質を別個の容器中に含むキットを提供する。
【実施例】
【０１７３】
本発明のさらなる態様および利点は以下の実験セクションにおいて開示されており、これは実例としてみなされるべきであって、本出願の範囲を限定してはならない。
【０１７４】
実験手順
試薬
ＰｏｌｙＩ：Ｃはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から、そしてｐｏｌｙＵはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（プール（Ｐｏｏｌｅ）、英国）から得た。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド１６６８は、ＣＲＵＫで作製するか、あるいはシグマ（プール、英国）から購入した。ＤＮＡ２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドはＣＲＵＫで合成し、そしてＲＮＡオリゴヌクレオチドはアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）またはサーモ・エレクトロン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）から入手した。ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｔｈｅｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（２ｋＤ）は、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。ｐｏｌｙＵを除く全ての試薬は内毒素を含まなかった。
【０１７５】
動物および細胞
Ｃ５７ＢＬ／６は、チャールズ・リバーＵＫ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫ）から入手した。ＴＬＲ７−／ｙおよびＴＬＲ７＋／ｙ同腹子コントロールマウスは、微生物病研究所（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）で繁殖させた。１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび５０ｎｇ／ｍｌのマウスＦｌｔ３Ｌ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中の骨髄細胞懸濁液からＦｌｔ３Ｌ−ＤＣを生成させ、培養の１０または１１日目に使用した。
【０１７６】
活性化アッセイ
オリゴヌクレオチドによる刺激のために、９６−ウェルプレートに、２×１０５Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣを３通り播種した。オリゴヌクレオチドを添加し、２００μｌの最終体積で細胞を一晩培養した。コントロールは培地のみ、０．５μｇ／ｍｌのＣｐＧ１６６８、１００ｍＭのロキソリビン、または１μＭＲ８４８を含有した。
【０１７７】
ＣｐＧ１６６８以外のオリゴヌクレオチドによる刺激のために、様々な用量の各試験オリゴヌクレオチドを１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中に希釈し、同体積の１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液＋／−ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｔｈｅｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（ＰＥＩ、ＲＮＡ用量に関係なく３μｌ／ｍｌのＰＥＩを用いた）と混合した。室温で１５分インキュベーションした後、オリゴヌクレオチド／ＰＥＩ複合体を細胞に添加した。培養の１８〜２０時間後に上澄みを採取し、サンドイッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮα、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０のレベルを決定した。
【０１７８】
ヒトｐＤＣ活性化アッセイ
ＬｙｏＶｅｃと複合体が形成されたＲ８４８およびＲＮＡ９．２ＤＲは、インビボジェンから得た。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、シグマ・プロリゴ（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｌｉｇｏ）から購入した。ヒトＰＭＢＣは、フィコル−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）遠心分離によって正常なヒト末梢血から精製した。ＢＤＣＡ４＋形質細胞様ＤＣは、ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）からのＣＤ３０４＋ミクロビーズおよびミニマックス（ＭｉｎｉＭａｃｓ）を用いるポジティブ選択によって全ＰＢＭＣから精製した。上記のように調製したオリゴヌクレオチド／ＰＥＩ複合体を、９６ウェルプレートに２通りに播種した１〜２×１０５ｐＤＣに添加した。２００μｌの最終体積で細胞を一晩培養し、培養の１８〜２０時間後に上澄みを採取し、サンドイッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮαおよびＩＬ−６のレベルを決定した。
【０１７９】
結果
まず、ｐｏｌｙＵＲＮＡ、研究済みの未決定の長さのホモポリマーによるＩＦＮαの誘発と、天然ＲＮＡおよびｐｏｌｙＵホモポリマー中に存在するリン酸ジエステル結合を有する２１−ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙＵｏ−２１）、ならびにホスホロチオエート骨格修飾を有する２１−ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙＵｓ−２１）によるＩＦＮαの誘発とを比較した。骨格修飾にかかわりなく２１−ｍｅｒｐｏｌｙＵオリゴヌクレオチドは両方とも、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣによって用量依存的にＩＦＮαを誘発した（図１Ａ）。２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは両方とも、ＰＥＩとの複合体の形態でＦｌｔ３Ｌ培養物に与えられたときに同様のＩＦＮαを誘発し、等しい感受性であると認識されると思われる。ＰＥＩは、核酸と結合して凝縮させるポリカチオンであり、従って、ＲＮＡを分解から保護する能力を有する。この保護機能に加えて、ＰＥＩは、フリーＲＮＡの取り込みとは異なるメカニズムによる複合体の細胞内への取り込みを仲介する。
【０１８０】
本明細書に記載される実験全てに対して、より高いＰＥＩ濃度における細胞毒性を回避するためにＲＮＡの量に関係なく同一濃度のＰＥＩを使用した。しかしながら、ｐｏｌｙＵｓ−２１オリゴヌクレオチドはＰＥＩを用いずに培養物に与えられたときにＦｌｔ３Ｌ−ＤＣによってＩＦＮαを誘発した（図１Ｂ）ので、ＰＥＩは、核酸リガンドの取り込みおよびＴＬＲ７認識のために絶対的に重要なわけではない。対照的に、ｐｏｌｙＵｏ−２１オリゴヌクレオチドは同じ条件下でＩＦＮαを誘発することができず（図１Ｃ）、これは、おそらくヌクレアーゼ消化に対するリン酸ジエステル結合の感受性がより高い可能性が高いためである。次の実験では、ヌクレアーゼによる分解に対する感受性の違いに起因する刺激活性の違いを回避するために、フリーＲＮＡではなくＦｌｔ３Ｌ−ＤＣの刺激に対してＲＮＡ／ＰＥＩ複合体を用いた。
【０１８１】
ｐｏｌｙＵオリゴヌクレオチドの１１および６ヌクレオチドによる減少がその刺激活性にどのように影響するかを決定するために、１０−ｍｅｒおよび１５−ｍｅｒリン酸ジエステルおよびホスホロチオエートｐｏｌｙＵＲＮＡオリゴヌクレオチドと、ｐｏｌｙＵｏ−２１およびｐｏｌｙＵｓ−２１とを比較した。リン酸ジエステルｐｏｌｙＵＲＮＡについては、より短い１５−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、用量応答のシフトを示し、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣによるＩＦＮαの誘発のおける効力が約２０倍低かった（図２Ａ）。ホスホロチオエートｐｏｌｙＵＲＮＡについて、傾向は同じであるが、１５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドに関して見られるＩＦＮαの誘発の低下は、２１−ｍｅｒで得られる応答からは識別できず、１０−ｍｅｒは、試験用量では測定可能なレベルのＩＦＮαを誘発しなかった。従って、１０−ｍｅｒおよび１５−ｍｅｒは実際にＩＦＮαを誘発することができると結論付けられる。
【０１８２】
次に、ＴＬＲ７によるｓｓＲＮＡリガンドの認識に骨格修飾が影響を与えるかどうかを試験した。まず、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣによりｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドがＩＦＮαを誘発するかどうかを決定した。２１−ｍｅｒｐｏｌｙＵリン酸ジエステルＤＮＡオリゴヌクレオチドで刺激される場合、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣはＩＦＮαを産生した。興味深いことに、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙｄＵｏ−２１）は、より低い用量ではＩＦＮα応答の刺激において対応のＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙＵｏ−２１）よりも効力が低く、より高い用量ではＩＦＮαの誘発においてｐｏｌｙＵｏ−２１よりもさらにより強力であった（図３Ａ）。ホスホロチオエートｐｏｌｙＵ２１−ｍｅｒＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドを比較すると（それぞれ、ｐｏｌｙＵｓ−２１およびｐｏｌｙｄＵｓ−２１）、用量応答において同様のシフトが存在したが、試験した全ての用量において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドはより高いレベルのＩＦＮαを誘発した（図３Ｂ）。糖のＣ２位における骨格修飾はリガンド認識に影響を与えるが、それを廃止しないと結論付けられる。
【０１８３】
ｓｓＲＮＡにおけるＧＵが豊富なモチーフは、ＴＬＲ７の認識のために重要であることが報告されている。これに対処するために、ｐｏｌｙＵｓ−２１と、ＧＵが豊富なＲＮＡ４０オリゴヌクレオチドとを直接比較した（ハイル（Ｈｅｉｌ）ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２６頁）。Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣ活性化アッセイにおいて、ｐｏｌｙＵｓ−２１ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮαの誘発においてＲＮＡ４０よりもはるかに強力であった（図４Ａ）。これは、ＴＬＲ７がウリジン部分を排他的に認識し、他の全てのＲＮＡヌクレオチドを無視するという結論を支持する。
【０１８４】
ＴＬＲ７がウリジン部分を排他的に認識するという仮説をさらに試験するために、２１−ｍｅｒホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレオチドと、ウリジンおよびシトシン部分の種々の組成物とを比較した。ウリジンとアデノシン部分とを対にすることによるｄｓＲＮＡ構造の形成を回避するためにアデノシンに対してシトシン部分を選択し、ＧＵが豊富なモチーフを回避するためにグアノシン部分に対してシトシン部分を優遇した。様々なＲＮＡオリゴヌクレオチドの組成物については表１が参照される。最初に、ウリジンおよびシトシンヌクレオチドからなり、４、３または２つのいずれかのウリジンのトリプレットを含有する２１−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを比較した（それぞれ、オリゴヌクレオチドＳＳＤ８、ＳＳＤ９およびＳＳＤ１０）。オリゴヌクレオチドＳＳＤ８とＳＳＤ９との間の違いは辺縁部だけであるが、ＳＳＤ１０によるＩＦＮαの誘発はわずかに低下した（図４Ｂ）。ウリジンおよびシトシン部分の混合物を含有する３つのオリゴヌクレオチドは全て、完全にウリジンヌクレオチドからなる２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドよりも低いレベルのＩＦＮαをもたらした。
【０１８５】
２１−ｍｅｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのもう１つのセットでは、３つのウリジントリプレットにおいてウリジン部分の量を一定に保持したが、これらの３つのウリジントリプレットの１つのシトシン〜５つまでのシトシンからの距離を変化させた（オリゴヌクレオチドＳＳＤ２１−ＳＳＤ２５）。ウリジントリプレット間の距離が最も短いオリゴヌクレオチド（ＳＳＤ２１、トリプレット間に１つのシトシン）は、このオリゴヌクレオチドグループの中で最も高いレベルのＩＦＮαを誘発したが、予期されるように、ＩＦＮα誘発の効率は、完全にウリジンヌクレオチドからなるｐｏｌｙＵｓ−２１よりも低かった（図４Ｃ）。ＩＦＮαのレベルの低下は、ウリジントリプレット間の距離の増大と相互に関連した。ウリジントリプレット間の距離が一続きの５つのシトシンであるオリゴヌクレオチドＳＳＤ２５の場合には、測定可能なレベルのＩＦＮαはほとんど誘発されなかった（図４Ｃ）。別個のウリジン部分の間の距離がＩＦＮαの誘発に与える影響を明確にするために、１０のウリジンヌクレオチドを全てが含有するが、単一のシトシンヌクレオチドにより分離された１０個の単一のウリジンヌクレオチド（ＳＳＤ２７）、単一のシトシンヌクレオチドにより分離された５つのダブルウリジンヌクレオチド（ＳＳＤ２８）、または連続したシトシンヌクレオチドに隣接される一続きの１０のウリジンヌクレオチド（ＳＳＤ２９）のいずれかの形である２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの第２のセットを試験した。驚いたことに、一続きの１０のウリジン部分または５つのウリジンダブレットを含有するオリゴヌクレオチドはＩＦＮαの誘発において非常に強力であり、より高い濃度では、ｐｏｌｙＵｓ−２１オリゴヌクレオチドに匹敵するレベルのＩＦＮαがもたらされた（図４Ｄ）。これとは対照的に、交互のウリジンおよびシトシンヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド（ＳＳＤ２７）は、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣ培養物中のＩＦＮαの誘発において比較的不十分であった。
【０１８６】
オリゴヌクレオチド中のウリジンの位置もＩＦＮα誘発に影響を与えるかどうかを試験するために、同じ数のウリジンヌクレオチドを有し、ウリジン部分の間が同じ距離であるが、ウリジン部分がオリゴヌクレオチドの端部に位置するか（ＳＳＤ１３およびＳＳＤ１５）、あるいは端部にウリジン部分がない（ＳＳＤ８およびＳＳＤ１４）いずれかの２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを比較した。このようなオリゴヌクレオチドの２セットを比較し、いずれの場合も、端部にウリジン部分を持たないオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮαの誘発においてわずかにより強力であり、用量応答を対数尺度のほぼ半分シフトさせた（図４ＥおよびＦ）。
【０１８７】
要約すると、この一連の実験から、ウリジン部分の絶対数だけがＩＦＮα誘発のレベルを決定するのではなく、単一のウリジン部分の間の距離もＩＦＮαの誘発に影響を与えることが結論付けられる。さらに、データは、オリゴヌクレオチドの端部のウリジン部分が、オリゴヌクレオチドのさらに中央に対して位置するウリジン部分と同程度にはＩＦＮα誘発に関与しないことを示す。
【０１８８】
ＰｏｌｙＵＲＮＡは、低ｐＨにおいて二重らせん構造を形成することができないという点で、他のＲＮＡホモポリマーとは異なる。他のＲＮＡホモポリマーは、低ｐＨにおいて、古典的な核酸のワトソン−クリック塩基対合に基づかない、２本の一本鎖間の結合を形成することができるが、ｐｏｌｙＵＲＮＡは、その分子構造のためにそうすることができない。従って、ｐｏｌｙＵのみがＴＬＲ７によって認識されるという事実についての１つの可能な解釈は、ＴＬＲ７認識が生じるエンドソーム区画において見られるような低ｐＨでそれが一本鎖核酸として存続できることである。Ｆｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣを用いる活性化アッセイにおいてこの仮説を試験するために、合成２１−ｍｅｒホスホロチオエートｐｏｌｙＴＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙＴｓ−２１）がＦｌｔ３Ｌ−ＢＭＤＣによってＩＦＮαを誘発する能力を試験した。チミジンは、Ｃ５位の追加のメチル基だけがウリジンヌクレオチドとは異なり（図６ａおよびＢ）、従って、ホモポリマーｐｏｌｙＴＲＮＡは、ｐｏｌｙＵのように、低ｐＨで二本鎖構造を形成することができない。チミジンヌクレオチドはＤＮＡの一部を形成するだけであり、天然にはＲＮＡ分子中には存在しないので、チミジン含有ＲＮＡはこれまでＴＬＲ７活性化アッセイにおいて試験されたことがない。構造の類似性が高いにもかかわらず、ｐｏｌｙＴｓ−２１は、試験した濃度のいずれにおいても測定可能なレベルのＩＦＮαを誘発することができなかった（図５Ａ）。ｐｏｌｙＴｓ−２１オリゴヌクレオチドのように、ホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレオチドｐｏｌｙＡｓ−２１およびｐｏｌｙＣｓ−２１もＩＦＮαを誘発することができなかったが、以前の実験において、未決定の長さのｐｏｌｙＡおよびｐｏｌｙＣリン酸ジエステルＲＮＡはいずれもＩＦＮα産生を引き起こさないことが示されたので、このことは予測された。
【０１８９】
ｐｏｌｙＵＲＮＡの一本鎖の性質が、実際のｐｏｌｙＵ部分よりもＴＬＲ７活性化のために重要であるかどうかを試験するさらなる試みにおいて、糖／リン酸骨格のみからなるが、塩基が欠けているリボスペーサー（ｒｉｂｏｓｐａｃｅｒ）「ヌクレオチド」を使用した。ウリジンおよびリボスペーサー（ｐｏｌｙＵスペーサー）またはシチジンおよびリボスペーサーヌクレオチド（ｐｏｌｙＣスペーサー）の混合物からなるオリゴヌクレオチドを設計した。ウリジン部分のように、リボスペーサーヌクレオチドは、低ｐＨで２つの単一のＲＮＡ鎖間の結合（二重らせん構造の形成をもたらし得る）を形成することができない。ｐｏｌｙＵスペーサーがｐｏｌｙＵｓ−２１と同様、またはウリジン部分およびＴＬＲ７によって認識されない他のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド（ＳＳＤ１３）と同様のレベルのＩＦＮαを起こし得るかどうかを知りたかった。また、ｐｏｌｙＣスペーサーは、ウリジンおよびシトシン部分を含有するオリゴヌクレオチド（ＳＳＤ１３）と同様のレベルのＩＦＮαを誘発し得るかどうか、あるいはＩＦＮαをまったく誘発し得ないかどうかも試験した。
【０１９０】
両方のリボスペーサー含有オリゴヌクレオチドをｐｏｌｙＵｓ−２１およびＳＳＤ１３オリゴヌクレオチドと比較すると、ｐｏｌｙＣスペーサーは、試験されるどの濃度においても測定可能なＩＦＮαを誘発することができず、ｐｏｌｙＵスペーサーは、ｐｏｌｙＵｓ−２１またはＳＳＤ１３オリゴヌクレオチド刺激により得られるレベルをかなり下回るレベルを誘発した（図５Ｂ）。総合すると、チミジンおよびリボスペーサー「ヌクレオチド」がＴＬＲ７刺激に関してウリジン部分を置換できないことは、それが単にＴＬＲ７認識および刺激を導く低ｐＨにおいて保存されるｐｏｌｙＵＲＮＡの一本鎖の性質だけでなく、ＴＬＲ７の認識モチーフの一部を形成するウラシルの分子構造であることを示す。
【０１９１】
ウィルスｓｓＲＮＡがＴＬＲ７の天然リガンドとして同定される前に、イミダゾキノリンおよびヌクレオシド類似体などの低分子量の免疫応答修飾因子は、ＴＬＲ７依存性経路を介して自然免疫系を刺激することが示された。このような小さい抗ウィルス化合物の活性を、ウリジンが豊富な合成ＲＮＡリガンドと比較するために、ｐｏｌｙＵｓ−２１／ＰＥＩ複合体、イミダゾキノリンＲ８４８または置換グアノシンヌクレオシドロキソリビンの存在下で、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣを培養した。コントロールとして、ＴＬＲ９を刺激するＤＮＡオリゴヌクレオチドＣｐＧ１６６８で細胞を試験した。全てのＴＬＲリガンドは、以前の実験（データは示されない）で最大のサイトカイン誘発をもたらした濃度で使用した。意外なことに、核酸リガンドｐｏｌｙＵｓ−２１およびＣｐＧは、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣによるＩＦＮαの誘発において、低分子量抗ウィルス化合物Ｒ８４８およびロキソリビンよりも約３０倍強力であった（図７Ａ）。これと対照的に、イミダゾキノリンおよびヌクレオシド類似体は、ｐｏｌｙＵｓ−２１よりも良好なＩＬ−６の誘発物質であった（図７Ｂ）が、ＲＮＡリガンドと小さい抗ウィルス化合物との間のサイトカイン誘発の違いは、ＩＦＮαの誘発についてより著しかった。これらの結果は、様々なＴＬＲ７リガンドが特定のサイトカインの誘発を優先できることを示す。この現象について１つの可能性のある解釈は、ＴＬＲ／リガンド複合体に対する共受容体の補充であり、これは、ＩＦＮαなどのサイトカインの誘発を導く特定のシグナル伝達経路の刺激のためにより重要であり得る。もう１つの可能性のある解釈は、ＴＬＲ７の下流の様々なシグナル伝達経路の誘起が、リガンドの親和性によって影響を受けることであろう。サイトカイン誘発のこの差異についての解釈は不明確であるが、インビボ治療において誘発される免疫応答のタイプおよび強度のかなりの違いを導き、従って、治療結果に影響を与えるであろう。
【０１９２】
ウリジンベースの短いホモポリマーオリゴヌクレオチドも、ヒトｐＤＣを活性化するその能力について評価した。イミダゾキノリンおよびヌクレオシド類似体などの低分子量免疫応答修飾因子、ならびにＧＵが豊富なｓｓＲＮＡは、ヒト形質細胞様樹状細胞を活性化することが以前に報告されている。Ｕベースのオリゴヌクレオチドがヒト細胞を有効に活性化し得るかどうかを評価するために、ヒトＰＢＭＣから形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を精製し、最も強力なホスホロチオエート結合ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙＵｓ−２１）で活性化した。図ｘＡに示されるように、ｐｏｌｙＵｓ２１＋ＰＥＩは、ヒトｐＤＣによるＩＦＮ−αの産生を用量依存的に誘発した。しかしながら、ヒトｐＤＣに対するｓｓＲＮＡの最適用量は、マウスＦｌｔ３Ｌの場合よりも高かった（それぞれ、３μｇ／ｍｌおよび０．３μｇ／ｍｌ）。上記で示されるマウスの研究から予想されるように、ホスホロチオエート結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドｐｏｌｙＡｓ−２１は、ＩＦＮαを誘発することができなかった（図９Ａ）。
【０１９３】
ヒト細胞における様々なＴＬＲ７／８アゴニストの活性を比較するために、ｐｏｌｙＵｓ２１／ＰＥＩ複合体、コントロールｐｏｌｙＡｓ２１／ＰＥＩ複合体、イミダゾキノリンＲ８４８、ＲＮＡ９．２ＤＲオリゴヌクレオチド／ＬｙｏＶｅｃ複合体でｐＤＣを刺激した。顕著に、ｐｏｌｙＵｓ２１、Ｒ８４８およびＲＮＡ９．２ＤＲは、ヒトｐＤＣによって同等レベルのＩＦＮα産生を誘発した（図９Ｂ）。さらに、Ｒ８４８およびＲＮＡ９．２ＤＲは両方とも、ヒトｐＤＣによるＩＬ−６の良好な誘発物質であったが、ｐｏｌｙＵｓ２１はｐＤＣによるＩＬ−６分泌を誘発できなかった（図９Ｃ）。マウス細胞について上記で報告されたように、これらの結果は、さらに、異なるＴＬＲ７アゴニストは別個の細胞およびサイトカイン応答を誘発できることを示唆する。
【０１９４】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願がそれぞれ参照によって援用されると明確にそして個々に示されたかのように、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
【０１９５】
上記の本発明は、理解を明確にするために説明および実施例によっていくらか詳細に記載されたが、本発明の教示を考慮すれば、特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなくそこに特定の変形および変更がなされ得ることは当業者には容易に明らかであろう。
【０１９６】
表１は、試験したオリゴヌクレオチドのリストを提供する。リン酸ジエステル結合（Ｕｏ）、ホスホロチオエート結合（Ｕｓ、Ａｓ、Ｃｓ、Ｇｓ、Ｔｓ）、２’−Ｏ−メチル修飾（Ｕｍ）およびＤＮＡオリゴ（ｏｌｉｇｏ）（ｄＵｓ、ｄＵｏ）。
【０１９７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】ＰｏｌｙＵＲＮＡ２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドが、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合に関係なく、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣによりＩＦＮαを誘発することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣのバルク培養物を様々な用量のＲＮＡで刺激し、一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮαレベルを測定した（３通りのサンプル±１ＳＤ）。（Ａ）ＰＥＩと、未決定の長さのホモポリマーｐｏｌｙＵリン酸ジエステルＲＮＡとの複合体を、２１−ｍｅｒｐｏｌｙＵＲＮＡリン酸ジエステル（ｐｏｌｙＵｏ−２１）およびホスホロチオエート（ｐｏｌｙＵｓ−２１）オリゴヌクレオチドとのＰＥＩの複合体と比較した。ＰＥＩとの複合体（＋ＰＥＩ）の形態で、あるいはフリーのオリゴヌクレオチド（ＰＥＩなし）として、Ｆｌｔ３Ｌ由来のＢＭ−ＤＣの刺激のためにリン酸ジエステル（Ｂ）またはホスホロチオエート（Ｃ）ｐｏｌｙＵＲＮＡ２１−ｍｅｒを用いた。ｐｏｌｙＵ調製物の平均分子量がわからないので、ＲＮＡ濃度は、μモル濃度ではなくμｇ／ｍｌで示される。データは少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図２】ＰｏｌｙＵＲＮＡオリゴヌクレオチドにより仲介されるＦｌｔ３Ｌ−ＤＣ培養物中のＩＦＮαの誘発が、オリゴヌクレオチドのサイズと相互に関連があることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣのバルク培養物を様々な用量のＲＮＡオリゴヌクレオチドで刺激し、一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮαレベルを測定した（３通りのサンプル±１ＳＤ）。ＰＥＩと２１−ｍｅｒ、１５−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒｐｏｌｙＵリン酸ジエステル（Ａ）またはホスホロチオエート（Ｂ）ＲＮＡオリゴヌクレオチドとの複合体を細胞の刺激のために使用した。ＲＮＡの濃度は、異なるオリゴヌクレオチドの分子量を規格化するためにμモル濃度で示される。データは少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図３】骨格修飾が、ｐｏｌｙＵオリゴヌクレオチドのＩＦＮα刺激活性に影響を与えることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣのバルク培養物を様々な用量の２１−ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチド／ＰＥＩ複合体で刺激し、一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮαレベルを測定した（３通りのサンプル±１ＳＤ）。（Ａ）ｐｏｌｙＵリン酸ジエステルＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙＵｏ−２１）をｐｏｌｙＵリン酸ジエステルＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙｄＵｏ−２１）と比較した。（Ｂ）同様に、Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣの刺激のためにｐｏｌｙＵホスホロチオエートＲＮＡ（ｐｏｌｙＵｓ−２１）およびＤＮＡ（ｐｏｌｙｄＵｓ−２１）オリゴヌクレオチドを使用した。（Ｃ）ホスホロチオエート（ｐｏｌｙＵｓ−２１）または２’−Ｏ−メチル（ｐｏｌｙＵｍ−２１）骨格修飾を含有するｐｏｌｙＵＲＮＡオリゴヌクレオチドで細胞を処理した。データは少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図４】ＲＮＡオリゴヌクレオチドの刺激活性が、これらに含有されるウリジン部分の数と相互に関連があり、ダブルおよびトリプルのウリジン部分が単一のウリジン部分よりも刺激性であることを示す。（Ａ−Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣのバルク培養物を様々な用量の２１−ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチド／ＰＥＩ複合体で刺激し、一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮαレベルを測定した（３通りのサンプル±１ＳＤ）。ＰｏｌｙＵホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙＵｓ−２１）は、全ての実験において基準ＴＬＲ７リガンドの役割を果たした。様々な２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの組成物については表１が参照される。データは少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図５】ｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙＣ、ｐｏｌｙＴＲＮＡオリゴヌクレオチドもリボスペーサー部分もＦｌｔ３Ｌ−ＤＣにおけるＩＦＮα誘発を誘発しないことを示す。（Ａ、Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣのバルク培養物を様々な用量の２１−ｍｅｒＲＮＡオリゴヌクレオチド／ＰＥＩ複合体で刺激し、一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮαレベルを測定した（３通りのサンプル±１ＳＤ）。（Ａ）Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣの刺激のためにＰｏｌｙＵ（ｐｏｌｙＵｓ−２１）、ｐｏｌｙＡ（ｐｏｌｙＡｓ−２１）、ｐｏｌｙＣ（ｐｏｌｙＣｓ−２１）およびｐｏｌｙＴ（ｐｏｌｙＴｓ−２１）ホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。（Ｂ）ホモポリマーｐｏｌｙＵオリゴヌクレオチドによるＩＦＮαの誘発を、ウリジンおよびシチジン（ｃｙｓｔｉｄｉｎｅ）部分（ＳＳＤ１３）、ウリジンおよびリボスペーサー部分（ｐｏｌｙＵスペーサー）、またはシチジン（ｃｙｓｔｉｄｉｎｅ）およびリボスペーサー部分（ｐｏｌｙＣスペーサー）の混合物を含有する複合オリゴヌクレオチドによるＩＦＮαの誘発と比較した。様々な２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの組成物については表１が参照される。データは少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図６】ＲＮＡヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体ロキソリビンおよびＲ８４８の分子構造の略図を提供する。（Ａ）ウリジンＲＮＡヌクレオチドからなる二量体の描写である。試験された骨格修飾（ＤＮＡ対ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルおよびホスホロチオエート修飾）は青色で示され、有機塩基は灰色で強調される。（Ｂ）灰色で強調されたプリンシトシンおよびチミンの有機塩基構造の略図である。（Ｃ）Ｒ８４８、ロキソリビンおよびウリジンヌクレオチドの分子構造の描写である。これらの３つの分子の構造間で共有される部分、およびＴＬＲ７によるこれらのリガンドの認識に関与することが示される部分は灰色で強調される。
【図７】ｐｏｌｙＵＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＩＬ−６の誘発ではより優れているＴＬＲ７リガンドロキソリビンおよびＲ８４８とは違って、形質細胞様ＤＣからのＩＦＮαの強い誘発物質であることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｆｌｔ３Ｌ−ＤＣのバルク培養物を様々なＴＬＲ７リガンド、およびＴＬＲ９を刺激するＤＮＡオリゴヌクレオチドＣｐＧ１６６８（０．５μｇ／ｍｌ）で刺激した。使用したＴＬＲ７リガンドは、ＰＥＩと複合体が形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドｐｏｌｙＵｓ−２１（１μｇ／ｍｌ）およびイミダゾキノリンのロキソリビン（１００ｍＭ）およびＲ８４８（１０μｇ／ｍｌ）であった。全てのＴＬＲリガンドは、形質細胞様ＤＣによる最大レベルのサイトカイン産生を誘発する用量で使用した。一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮα（Ａ）およびＩＬ−６（Ｂ）レベルを測定した（３通りのサンプル±１ＳＤ）。データは少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図８】ＴＬＲ７リガンドが、ヒト形質細胞様ＤＣにおいてＩＦＮαおよびＩＬ−６を誘発することを示す。（Ａ）様々な用量（μモル濃度で表される）のｐｏｌｙＵｓ２１−ｍｅｒ対１μＭのｐｏｌｙＡｓ２１−ｍｅｒ（いずれも、ＰＥＩ複合体として）でヒトｐＤＣの培養物を刺激した。一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮαレベルを測定した。（Ｂ）ヒトｐＤＣの培養物をＰＥＩ複合体としてのｐｏｌｙＵｓ２１−ｍｅｒ（１０μＭ）対ＰＥＩ複合体としてのｐｏｌｙＡｓ２１−ｍｅｒ（１０μＭ）、ＬｙｏＶｅｃ複合体としてのＲＮＡ９．２ＤＲ（１μＭ）およびＲ８４８（１μＭ）で刺激した。一晩培養した後、ＥＬＩＳＡによって上澄み中のＩＦＮα（Ｂ）およびＩＬ−６（Ｃ）レベルを測定した。データは、３通りのサンプルの平均±１ＳＥＭであり、少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月18日(2008.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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