(57)【要約】  本発明の目的は、嚢胞性線維症、及び特に嚢胞性線維症における粘液の分泌増加の予防的及び/又は治癒的対症療法を意図した医薬の製造における少なくとも１の細胞質ホスホリパーゼＡ２(ｃＰＬＡ２)の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
嚢胞性線維症の対症療法を意図した医薬の製造における少なくとも１の細胞質ホスホリパーゼＡ２(ｃＰＬＡ２)阻害剤の使用。
【請求項２】
前記ｃＰＬＡ２阻害剤が、任意の天然又は合成化学又は生物学的分子であるか、又は投与後に、ｃＰＬＡ２の活性若しくはｃＰＬＡ２をコードする遺伝子の発現の低下又はさらに完全な阻害を引き起こす任意の組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ｃＰＬＡ２阻害剤が、ＡＴＫ、ピロリジン-１、ＭＡＦＰ、ＭＬ３１９６、ＢＭＳ-２２９７２４、３,３-ジメチル-６-(３-ラウロイルウレイド)-７-オキソ-４-チア-１-アザビシクロ[３,２,０]ヘプタン-２-カルボン酸、ｓｉＲＮＡ又はインドール類から選ばれることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ｃＰＬＡ２阻害剤がＡＴＫであることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ｃＰＬＡ２阻害剤が、前記医薬の中で０.０１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１ｇ、かなり好ましくは１０ｍｇ〜５００ｍｇの量で使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
予防的及び/又は治癒的対症療法における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬が、液体又は粉末若しくは錠剤などの固体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬が、経口経路により、エアロゾル経路により、又は注射により、特に腹腔内経路、静脈内経路、動脈内経路、又は筋肉内経路により投与されることを意図されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
嚢胞性線維症粘液の分泌増加の対症療法を意図した医薬の製造における少なくとも１の細胞質ホスホリパーゼＡ２阻害剤の使用であって、当該医薬が、嚢胞性線維症の遺伝子治療を補完するために投与されることを意図する、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嚢胞性線維症の対症療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症(ＣＦ)は、ＣＦＴＲ遺伝子、つまりＣＦＴＲ(嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子)タンパク質と呼ばれる１４８０個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする２５０ｋｂの遺伝子、の突然変異により引き起こされる。このタンパク質は、塩素チャネルのファミリーの一部である。今日までに、疾患に関与する１０００を超える突然変異が記載されてきたが、ΔＦ５０８と呼ばれる最も頻繁に生じる変異(１９８９年に発見された)は、約７０％の患者においてみられる。この突然変異は、遺伝子の第１０エキソンに関する変異のため、アミノ酸、つまり５０８位のフェニルアラニン、の欠失からなる。集合における突然変異の発生率は、約３０００の出生児に１人であるが、ホモ接合体のみが病気となる。平均寿命は、先進国でおよそ３５歳である。表現形として通常であるヘテロ接合体又は健常なキャリアは、一般集合のおよそ４％を占める。
【０００３】
この疾患の主な結果のうちの１つは、呼吸器及び消化器の粘膜の分泌上皮細胞により主に分泌される粘液(粘液の粘度は通常よりも高い)の組成の変化である。ＣＦＴＲチャネルの変化は、粘液の粘性をより高くしかつ厚くし、そうして嚢胞性線維症の患者において粘液の声門への移動を妨げる上皮を介したイオン流入の変化を引き起こす。この粘液が過剰であること及び粘液の線毛除去が欠如していることは、日和見感染細菌(例えば、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ヘモフィラス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae))による慢性感染を引き起こし、これは大量の好中球の流入により特徴付けられる気道における悪化した炎症応答を引き起こしうる。これらの病原体は、気管支感染の多くの発作に寄与する。この感染プロセスの制御を失うことは、気管支閉塞としばしば関連して、肺組織の破壊を引き起こし、そうして患者の死亡をもたらす呼吸器機能の進行性の消失を引き起こす。
【０００４】
この疾患は、９０％の患者に存在する不十分な膵液分泌のため本質的に生じる消化器障害によっても特徴付けられる。これらの呼吸器及び消化器症状は、臨床像を決定付けるが、呼吸器症状は、患者の生命予後を決定する。
【０００５】
Ｐ.アエルギノーサ(P. aeruginosa)の慢性感染は、主な感染問題を構成し、そして通常、疾患の進行における分岐点となる。いわゆるある「ムコイド型」の菌は、エキソ多糖マトリクス中に閉じ込められたマイクロコロニーの形態で粘液中で増殖する。
【０００６】
このムコイド性質は、実質上感染に特異的である。ムコイド型菌の出現は、年齢と供に、そして呼吸器疾患の進行と供に増加する。
【０００７】
気管支肺症状は、数ヶ月又は数十年にわたる慢性呼吸器不全をもたらす周期的な発病を発達させる。気胸又は喀血などの合併症は、生命予後に悪影響を与え得る。
【０００８】
一般的なものさしとして、およそ３分の１のケースでは右又は両心室の心不全を伴なう進行性感染の呼吸器症状の悪化に続いて死が起こる。現在、嚢胞性線維症は、対症療法でのみ治療することができる。治療は、基本的に、呼吸器運動療法や、抗生物質治療による抗感染治療から構成される。煩わしいことはもちろんのこと、この治療は、一生を通じて行なわれなければならない。
【０００９】
抗生物質治療は、いくらかの一般的な制限原則：抗生物質の適切な選択、気管支感染の慢性化及び長期間(最低２週間)の治療における高用量により引き起こされる抵抗性の予防、抗緑膿菌肺炎抗生物質の非経口経路のみによる投与、に従わなければならない。
【００１０】
幾つかの分子、特に粘液の粘度を低減することができる細胞外ＤＮＡの加水分解についての触媒酵素であるｒｈＤＮａｓｅ、は粘液を流動化することを可能にし、運動療法により取り除くことを容易にする。慢性の進行性呼吸不全の場合、夜間の酸素治療が必須となる。しかしながら、肺移植が最後の手段として残っている。
【発明の開示】
【００１１】
その結果、現在の治療(移植は言うまでもなく)ほど煩わしいものではなく、かつ患者の命を改善する症状の予防的及び/又は治療的処置についての必要性は常に存在する。
【００１２】
これは本発明の目的のうちの一つである。
【００１３】
シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)などの病原体による感染は、細胞質ホスホリパーゼＡ２(ｃＰＬＡ２)などの炎症性タンパク質の活性化を誘導する。細胞質ホスホリパーゼＡ２は、リン脂質を加水分解し、そしてアラキドン酸(ＡＡ)を放出するために、原形質膜へと移動する。
【００１４】
次にＡＡは、炎症に係わる２の区別される酵素経路：プロスタグランジン、特にプロスタグランジンＥ２(ＰＧＥ２)の産生に繋がるシクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ)経路；及びロイコトリエン、特にロイコトリエンＢ４(ＬＴＢ４)の産生を導くリポオキシゲナーゼ経路により代謝される。
【００１５】
従来の研究により、嚢胞性線維症を患う患者(ＣＦ患者)の気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)においてロイコトリエンＢ４(ＬＴＢ４)及びプロスタグランジンＥ２(ＰＧＥ２)の量の増加が存在することが示された。この増加は、ＣＦＴＲをコードする遺伝子が欠失され、その結果ＣＦＴＲタンパク質を産生しないＫＯ(ノックアウト)マウス(ＣＦＴＲ-/-と呼ばれる突然変異マウス)の嚢胞性線維症の動物モデルにおいて発見された。さらに、ＬＴＢ４及びＰＧＥ２が、粘液の分泌を誘導する事ができるということが確立された。
【００１６】
本発明者は、ｃＰＬＡ２の活性の増加を通して、ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異の存在と、嚢胞性線維症のカジュアル薬（casual agent）と、肺の粘液の分泌増加との間の関係の仮説を立てた。
【００１７】
次に本発明者は、気道の炎症を引き起こすシュードモナス・アエルギノーサのリポ多糖(ＬＰＳ)を注入することにより刺激されたＣＦＴＲ-/-マウスが、野生型マウスよりも多くの粘液を分泌するということを明らかにした。
【００１８】
注入とは、気道を通して、より正確に記載すると気管内経路により投与することを意味する。
【００１９】
粘液の分泌が、アスピリン、ＣＯＸ阻害剤により阻害されるということも発明者により示された。
【００２０】
同様に、本発明者によるｃＰＬＡ２をコードする遺伝子が欠失されたＫＯマウス(ｃＰＬＡ２-/-)の気道における粘液の分泌の研究により、粘液が完全になくなっているということが示された。その結果、ｃＰＬＡ２は、気道における粘液分泌の調節において一役を担う。
【００２１】
粘液は、ムチン(糖タンパク質)から本質的に構成され、そしてＭＵＣ５ＡＣは、嚢胞性線維症を患う患者の肺において最も豊富なムチンのうちの一つである。
【００２２】
この関係では、本発明者は、免疫組織化学染色によって、ＭＵＣ５ＡＣが気道における粘液の量の増加を示すＣＦＴＲ-/-マウスにおいて発現されることを示すことができる。
【００２３】
その結果、嚢胞性線維症に関与するＣＦＴＲ遺伝子の少なくとも１の突然変異と、ｃＰＬＡ２の過活性に関連した粘液の分泌との間のおそらく直接的な関係をＣＦＴＲ-/-マウスにおいて初めて示すことにより、本発明者が立てた仮説が確認された。
【００２４】
ＡＴＫを受けたか又は受けていないＣＦ患者の肺移植片の気管支ホモジェネートにおけるｃＰＬＡ２活性のレベルは、この可能性を確認した。
【００２５】
最後に、本発明者は、ｃＰＬＡ２の特異的阻害剤の腹腔内経路による投与が、気道における粘液の分泌、つまりＣＦＴＲ+/+マウスよりも高いレベルでｃＰＬＡ２を発現するＣＦＴＲ-/-マウスにおいて、シュードモナス・アエルギノーサ由来のＬＰＳの注入によりおそらく引き起こされる分泌、を除去するということを示すことができる。
【００２６】
これらの結果により初めて、嚢胞性線維症の対症療法においてｃＰＬＡ２阻害剤の使用を予測することが可能となる。
【００２７】
これらの驚くべきかつ予測できない結果により、粘液の分泌増加を導く気道の疾患、例えば嚢胞性線維症、また、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＬＤ)、例えば、喉頭炎及び咽頭炎、肺炎、インフルエンザ、塵肺、慢性気管支炎、及び肺気腫、又はアレルギー性アスペルギルス症の治療におけるｃＰＬＡ２阻害剤の治療、予防、及び/又は治癒的役割を考えつくことを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
こうして、本発明の対象は、嚢胞性線維症、特に呼吸器及び消化器粘膜の分泌上皮による粘液の分泌の増加の予防及び/又は治癒的対症療法を意図する医薬の製造における少なくとも１の細胞質ホスホリパーゼＡ２阻害剤(ｃＰＬＡ２)の使用である。
【００２９】
ｃＰＬＡ２阻害剤は、任意の化学分子、生物分子、天然分子、又は合成分子を意味し、メカニズムがどのようなものであれ、投与後にｃＰＬＡ２の活性又はｃＰＬＡ２遺伝子の発現の低下、又は完全な阻害を引き起こす任意の組成物を意味する。ｃＰＬＡ２阻害剤の一例として、ＡＴＫ(アラキドニル・トリフルオロメチルケトン；Ackermannら、J. Biol. Chem., 1995; 270: 455-50)、ピロリジン-１(Senoら、J. Med. Chem. 2000; 43: 1041-44)、ＭＡＦＰ(メチルアラキドニルフルオロホスホナート：Lioら、Biochim. Biophys. Acta; 1996; 1302: 55-60)、ＭＬ３１９６(Lehr, J. Med. Chem., 1997, 40: 2694-2705)、４-[４-[２-[２-ビス(４-クロロフェニル)メトキシ]エチル-スルホニル]エトキシ]フェニル]-１,１,１-トリフルオロ-２-ブタノン、ＢＭＳ-２２９７２４(Ｂｕｒｋｅら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001, 298: 376-85)、国際出願ＷＯ０３/０４８１２２に記載される３,３-ジメチル-６-(３-ラウロイルウレイド)-７-オキソ-４-チア-１-アザビシクロ[３,２,０]ヘプタン-２-カルボン酸又はインドール類、並びにＵＳ６,６３０,４９６又はＵＳ６,３５０,８９２に記載される化合物が挙げられる。
【００３０】
本発明の特定の実施では、ｃＰＬＡ２阻害剤は、ｃＰＬＡ２遺伝子の発現と緩衝するｓｉＲＮＡである。
【００３１】
好ましくは、本発明に従って使用されるｃＰＬＡ２阻害剤はＡＴＫである。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、粘液の分泌増加を導く気道疾患の治療、特に嚢胞性線維症の対症療法、を意図する医薬の製造におけるｃＰＬＡ２阻害剤(２以上)の組み合わせを使用することも可能である。
【００３３】
本発明では、嚢胞性線維症の治療を意図する医薬の製造において、ｃＰＬＡ２が使用される。喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＬＤ)、例えば喉頭炎及び咽頭炎、肺炎、インフルエンザ、塵肺、慢性気管支炎、及び肺気腫、又はアレルギー性アスペルギルス症における粘液分泌増加の対症療法を意図した医薬の製造においてｃＰＬＡ２阻害剤を使用することを予測することもできる。
【００３４】
本発明では、ｃＰＬＡ２阻害剤は、０.０１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１ｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜５００ｍｇの量を含む医薬において使用することができる。
【００３５】
より具体的に、ｃＰＬＡ２阻害剤、例えばＡＴＫは、特に、０.１ｍｇ/ｋｇ〜５００ｍｇ/ｋｇ、好ましくは１ｍｇ/ｋｇ〜１００ｍｇ/ｋｇ、かなり好ましくは１０ｍｇ/ｋｇ〜５０ｍｇ/ｋｇを含む量で投与することができる。
【００３６】
本発明の文脈では、対症療法という語句は、疾患に付随する症状の予防的及び/又は治癒的処置を指す。この処置は、患者のケアも改善する(苦痛の低下、平均余命の改善、疾患進行の遅延など)。さらに、当該処置は、他の成分又は処置、例えば特に本出願において特定された病原体又は外傷の治療のための他の活性化合物と組み合わせて行なうことができる。
【００３７】
例えば、嚢胞性線維症において気道を介した遺伝子治療に関する試行が、平均的な結果しかもたらさなかったこと、つまり、期待するところの希望にはかなり足りていないということ、が知られている。突然変異されておらずかつ機能的なＣＦＴＲ遺伝子を有する核酸型のベクターを(例えば、エアロゾルを用いて)肺に注入し、その結果肺の表面の上皮細胞に達しさせることに関する気道を介した遺伝子治療による治療において、ベクターは当該細胞をカバーする粘液層に衝突する。こうして、粘液は、処置前に粘液バリアの肺胞表面をきれいにするために意図された粘液流動化薬を用いるにも関わらず、ベクターがその標的に少なくとも十分な量で達することを妨げる。気道を介して遺伝子治療を補完するために投与されうる粘液分泌の阻害薬を提供する点について全ての関心は、こうして理解される。こうして、別の観点では、本発明の対象は、嚢胞性線維症における粘膜の分泌の増加についての対症療法のために意図された医薬の製造における少なくとも１の細胞質ホスホリパーゼＡ２(ｃＰＬＡ２)阻害剤の使用であり、当該医薬は、嚢胞性線維症の遺伝子治療を補完するために投与されなければならない。
【００３８】
本発明の医薬は、考えられる全ての投与形態をとることができる。例えば、当該医薬は、筋肉内又は静脈内注射用のシロップ又は溶液などの液体でありうるし、又は例えば粉末又は錠剤などの固体であってもよい。
【００３９】
投与は、当業者に知られている任意の方法、好ましくは経口経路、エアロゾル経路、又は注射、通常腹腔内、大脳内、髄空内、静脈内、動脈内、又は筋肉内経路注射により行うことができる。経口経路による投与が好ましい。長期間の治療の場合、好ましい投与経路は、舌下、経口、又は経皮経路である。
【００４０】
一般的に、本発明に従って使用されるｃＰＬＡ２阻害剤の一日用量は、求められる治療効果を得るために必要とされる最小用量である。この用量は、治療対象の重量などの異なる因子に依存するであろう。
【００４１】
必要であれば、一日用量は、１日あたり２、３、４、５、６、又はそれ以上の用量で投与することができるし、又は複数のサブ用量は当該日の間の適切な間隔で投与されうる。
【００４２】
選択された量は、複数の因子、特に投与経路、投与期間、投与時間、化合物の排出率、当該化合物と組み合わせて使用される他の製品、患者の年齢、体重及び身体的状態、並びに病歴、及び薬において知られている他の全ての情報に左右される。
【００４３】
さらに、本発明に従った医薬は、同時に、別々に、又は時間に渡って、特に上に定義される病気を患う対象の治療の間に使用するための少なくとも１の他の治療活性成分を含むことができる。
【００４４】
本発明に従った医薬は、１以上の賦形剤又は不活性な(つまり、医薬として不活性でありかつ非毒性の)ビヒクルを含む。医薬用途と適合し、かつ当業者に知られている溶液、例えば、生理食塩水、生理的等張緩衝溶液などについて言及がされてもよい。医薬は、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、保存剤から選ばれる１以上の薬剤又はビヒクルを含むことができる。(液体及び/又は注射用及び/又は固体)製剤中に使用できる薬剤又はビヒクルは、特にメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油若しくは動物油、アカシアなどである。組成物は、場合により、持続性及び/又は徐放性放出を保証する医薬形態又は装置を用いて、注射用懸濁物、ゲル、オイル、錠剤、座剤、粉末、ゼラチン、カプセルの形態に剤形することができる。このタイプの製剤では、例えばセルロース、カルボネート、又はスターチなどの薬剤が、うまく使用される。
【００４５】
下記の実施例は、本発明をいかようにも制限することなく本発明を例示する。
【実施例】
【００４６】
材料と方法
動物モデル
"Centre de Distribution, de Typage et d'Archivage Animal" UPS44 CNRS in Orleanによって、混合遺伝子プールに維持されたＣ５７ＢＬ/６Ｊマウス(ＣｆｔｒtmUNCマウス)に樹立された嚢胞性線維症モデルについて実験を行なった。野生型ＣＦＴＲ+/+と変異型ＣＦＴＲ-/-マウスを３〜４週で離乳させ、そして市販の下剤、Ｍｏｖｉｃｏｌ（登録商標）を添加した食餌を与えた。下剤を伴なわないＣＦＴＲ-/-マウスは、消化管における液体の分泌の変化から生じる腸閉塞症のため離乳後直ぐに死亡した。
【００４７】
各カテゴリーの処置について５〜７週齢の少なくとも５匹のマウスの群について、実験を行なった。
【００４８】
同一の遺伝子プール由来の変異体ｃＰＬＡ２-/-マウスとその野生型ｃＰＬＡ２+/+ホモログを、"Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Tokyo"(Uozumiら、Nature, 1997)から得た。これらのマウスは実験の際に６〜８週齢であった。
【００４９】
使用される製品及び試薬
キシラジン(Ｒｏｍｐｕｍ、Bayer-France)
ケタミン(Ｉｍａｌｇｅｎｅ１０００Merial, Lyons, France)
Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳ、セロタイプ１０(Sigma, St. Louis, MO)
ＥＤＴＡ、フェニルメチルスフホキシド及びジチオスレイトール(Sigma, St.Louis, MO)
抗-ＭＵＣ５ＡＣ抗体(クローン４５Ｍ１、Neomarkers, Fermont, CA,USA)
抗マウスＩｇＧ抗体(Dako Cytomation Envision System)
アミノエチルカルバゾール(Sigma, St.Louis, MO)
【００５０】
実験プロトコル
使用される生成物を、注射可能な塩類溶液(又は生理的食塩水)に溶解し、そして気管内(ｉ.ｔ.)又は腹腔内(ｉ.ｐ.)経路により注射した。
【００５１】
使用プロトコルは以下の通りである：
１)アスピリン(５０ｍｇ/ｋｇ、ｉ.ｐ.)、ＬＰＳ前３０分、次に毎日、１日おき；
２)ＡＴＫ(２０ｍｇ/ｋｇ、ｉ.ｐ.)、ＬＰＳ前３０分及び２４時間後。
【００５２】
ＬＰＳ(３３０μｇ/ｋｇ、ｉ.ｔ.)の注入前にマウスを２％キシラジン(８ｍｇ/ｋｇ)及びケタミン１０００(４０ｍｇ/ｋｇ)で麻酔した。
気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)及び肺のサンプリングを、ＬＰＳの注入後４日目に以下に記載されるように行なった。
【００５３】
気管支肺胞洗浄液(ＢＡＬ)
マウスを２００ｍｇ/ｋｇのペントバルビタール(ｉ.ｐ.)で麻酔し、そしてその気管を切断し、そしてカニューレを挿入した。５ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤(フェニルメチルスルホキシド：５ｍＭ、ジチオスレイトール５ｍＭ)を含む注射用生理食塩水１ｍｌを用いた一連の洗浄によりＢＡＬを行なった。
【００５４】
細胞を自動カウンター、Counter ZM(Coultronic Margency, France)により計数した。これは、肺の炎症状態を明らかにすることができる。
【００５５】
細胞型の同定を、細胞遠心(Hettich-Universal)の後に、Ｄｉｆｆ-Ｑｕｉｃｋ着色(Baxter Dade AG, Dudingen, Germany)により行なった。これは、炎症を反映する好中球多核細胞の比率を計数することを可能にする。
結果は、ＢＡＬ１ｍｌあたりの細胞数で表される。
【００５６】
ＥＬＩＳＡによるＭＵＣ５ＡＣの検出
９６ウェルプレート(Ｎｕｎｃ)のウェル中で、５０μｌの核洗浄液(ＢＡＬ)サンプルを１時間５０μｌの炭酸水素塩-炭酸塩混合物(５０/５０)と４０℃でインキュベートした。
【００５７】
乾燥後、ウェルを３回ＰＢＳで洗浄し、次にＢＳＡ２％で飽和し、ｆｒａｃｔｉｏｎＶ(Ｓｉｇｍａ)で１時間室温でインキュベートした。
【００５８】
ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ/Ｔｗｅｅｎ２０(０.０５％)中に１/１００に希釈したＭＵ５ＡＣ(クローン４５Ｍ１)に対する一次抗体(５０μｌ)を、各ウェルに配置し、そして室温で１時間インキュベートを続けた。
【００５９】
ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼと組合わされた１００μｌの二次抗マウスＩｇＧ抗体(１：１００００)を次に各ウェルに配置し、そして室温で１時間インキュベートを続けた。
【００６０】
ウェルをＰＢＳで３回洗浄後に、タンパク質の存在は、３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼを用いて示された。次に反応を１ＭのＨ2ＳＯ4で停止した。吸光度を４５０ｎｍで計測した。結果をＢａｌ１ｍｌあたりのタンパク質の重さ(ｍｇ)で表す。
【００６１】
肺の固定と組織学的分析
肺に４％ホルムアルデヒドを注いで、血液を取り除き、そして４％ホルムアルデヒド中に４８時間４℃で浸漬して、次にパラフィンに入れた。 
【００６２】
標準方法に従って、５μｍの厚さの切片を、ヘマトキシリン／エオシン、過ヨウ素酸シッフ試薬(ＰＡＳ)及びアルシアンブルー(ＡＢ；ｐＨ２.４)で染色した(Histologie Normale et Pathologique. P. GANTER & G. Jolies, Gauthier-Villars)。
【００６３】
粘液を染めるアルシアンブルーで染色された切片の顕微鏡検査の後に、陽性の気管支及び細胞を計数した。「陽性気管支数／陽性細胞数」の比は、粘液産生試験の結果を評価するために役立つスコアを確立することを可能にする(以下を参照のこと)。
【００６４】
免疫組織化学
パラフィン切片を、ＰＢＳ１×中に８μｇ／ｍｌの濃度のＭＬＪ５ＡＣに対する抗体(クローン４５Ｍ１)で室温にて２時間処理した。
次にこれらの切片をＰＢＳで洗浄し、そして３０分間抗-マウスＩｇＧ抗体でインキュベートし、ペルオキシダーゼと組み合わせた。
アミノエチルカルバゾールで可視化を行なった。
【００６５】
ウェスタンブロット
マウス肺を溶解緩衝液でホモジェナイズした(ＲＬＴ緩衝液、Quiagen)。ホモジェネートを遠心し、そして等量のタンパク質(１０〜５０μｇ)を７.５％電気泳動ゲル(トリス／グリシン／ＳＤＳポリアクリルアミド)に配置した。
【００６６】
次に５％ミルクＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ１％oで前もって処理されたニトロセルロース膜(Millipore)にタンパク質を転写した。
次に膜を１時間室温で一次抗体の存在下でインキュベートし、次にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ１％oで３回洗浄した。
【００６７】
次に、二次抗体の存在下で膜を１時間室温でインキュベートし、次にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ１％oで洗浄した。
【００６８】
次に膜上に存在するタンパク質の存在を、製造元の推奨に従ってペルオキシダーゼを伴なって化学発光をもたらすＥＣＬシステム(Ａｍｅｒｓｈａｍ２１０６)を用いて検出した。次に膜を放射線用フィルムと接触させて露光し、そして当該フィルムを現像した。
【００６９】
アクチン対照は、ＭＵ５ＡＣタンパク質の発現割合を標準化することを可能にした。バンドの強度を、画像分析器を用いて計測した。
【００７０】
ＣＦ患者の肺移植片の気管支ホモジェネートにおけるｃＰＬＡ２活性の計測
Kramerら(Biochem. J. et al. 248: 779-785(1987))に従い、Hidiら(J.Immunol.151: 5613-5623(1993))により与えられた変更を伴なって計測を行なった。
【００７１】
Filgueriasら(Lipids 22: 731-735)に従って肺ホモジェネートを調製した。
５０〜１００μｌの肺ホモジェネートを、１ｍMのカルシウム及び１０００００ｃｐｍ／ｍｌの放射活性ホスファチジルコリン(１-パルミトイル２１４C-アラキドノイル-ｓｎ-グリセロホスホリルコリン、５２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Amersham)を含むＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液中でインキュベートした。
【００７２】
３０分のインキュベートの後に、クロロホルム／メタノール溶液(１：１)の添加により反応を止めた。
脂質をBligh及びDyer法(Can. J. Biochem (1959) 37:911-918)により抽出し、次に乾燥するまで蒸発させて、そして、クロロホルム／メタノール／酢酸／水(６５：４３：１：３)を移動溶液として用いて、薄層クロマトグラフィー(Merck)にかけた。
【００７３】
次にホスファチジルコリン(ＰＣ)に対応するスポットを回収し、そして標準シンチレーション液を用いて放射活性を計測した。ｃＰＬＡ２活性をカウント／分(ｃｐｍ)で表した。
【００７４】
結果
Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳによる刺激又は刺激なしから４日目のＣＦＴＲ+/+及びＣＦＴＲ-/-マウスの気道における粘液の産生
対照マウスは、ある用量の生理食塩水を受けた。
【表１】
2009532445.tif 000002
【００７５】
これらの結果により、気管支上皮細胞による粘液の産生におけるＣＦＴＲ遺伝子及びＣＦＴＲタンパク質の関与が示される。
【００７６】
Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳによる刺激又は刺激なしのＣＦ(ＣＦＴＲ-/-)及び野生型(ＣＦＴＲ+/+)の肺における分泌されたＭＵＣ５ＡＣタンパク質の量の計測
【表２】
2009532445.tif 000003
【００７７】
ＣＦマウスは、基礎条件下、及びＬＰＳで処理された後の両方において、ＷＴマウスと比べてより多くのＭＵＣ５ＡＣを分泌する。
＊Ｐ＜０.００１、ＷＴに比べたＣＦマウス。
＃Ｐ＜０.００１、対照に比べたＬＰＳ。
【００７８】
Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳでの刺激又は刺激なし、及びアスピリンを投与した(Ａｓｐ)４日目のＣＦＴＲ+/+及びＣＦＴＲ-/-マウスの気道における粘液の産生
「対照」マウスは、ある用量の生理食塩水及びある用量のアスピリンを受けた。
【表３】
2009532445.tif 000004
【００７９】
これらの結果により、ＣＯＸ阻害剤が、気管支上皮細胞による粘液の産生の阻害を引き起こし、そしてこの産生におけるＣＯＸの関与を確認した。
【００８０】
Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳでの刺激又は刺激なし、及びＡＴＫを投与したＣＦＴＲ+/+マウス及びＣＦＴＲ-/-マウスの気道における粘液の産生
「対照」マウスは、ある量の生理食塩水及びある量のＡＴＫを受けた。
【表４】
2009532445.tif 000005
【００８１】
得られたスコアは、表１の対応するスコアと比べられる。
これらの結果により、ｃＰＬＡ２阻害剤が、気管支上皮細胞による粘液の産生の阻害を引き起こすということが示される。
【００８２】
Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳで刺激又は刺激なしから４日目のｃＰＬＡ２+/+及びｃＰＬＡ２-/-マウスの気道における粘液の生産 
「対照」マウスは、生理食塩水の用量を受ける。
【表５】
2009532445.tif 000006
【００８３】
これらの結果により、気管支上皮細胞による粘液産生についてのｃＰＬＡ２の関与が示される。
【００８４】
ウエスタンブロットによる、Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳで刺激又は刺激なしでのＣＦＴＲ+/+及びＣＦＴＲ-/-の気管支ホモジェネートにおけるＭＵＣ５ＡＣメッセンジャーＲＮＡの量の計測
使用される一次抗体は、抗-ＭＵＣ５ＡＣモノクローナル抗体(クローン４５Ｍ１、Neomarkers, Fermont, CA, USA)である。
使用される二次抗体は、抗マウスＩｇＧ抗体(Dako Cytomation Envision System)である。
【００８５】
各サンプルについて、量の計測は、標準化のための同一サンプルにおいて計測されたアクチンメッセンジャーＲＮＡの量の計測に関連する(ＭＵＣ５ＡＣｍＲＮＡ／アクチンｍＲＮＡ)。
【表６】
2009532445.tif 000007
【００８６】
これらの結果により、刺激されていようがいまいが、ＣＦマウスにおけるＭＵＣ５ＡＣｍＲＮＡの増加を確認した。
＊Ｐ＜０.００１、ＷＴに比べたＣＦ
【００８７】
ウエスタンブロットによる、Ｐ.アエルギノーサ由来のＬＰＳで刺激、又は刺激なしで、かつＡＴＫの投与有り又は無しのＣＦＴＲ+/+マウスの気管支ホモジェネートにおけるＭＵＣ５ＡＣメッセンジャーＲＮＡの量の計測
上記実験に同一の条件下では、この結果により、ＭＵＣ５ＡＣｍＲＮＡ発現が、完全に非刺激ＣＦＴＲ+/+マウスにおいて完全に阻害され、そして刺激されたＣＦＴＲ+/+マウスにおいて、かなり少量のＭＵＣ５ＡＣｍＲＮＡしか存在しないということが示される。
【００８８】
マウスの気管支ホモジェネートにおけるｃＰＬＡ２メッセンジャーＲＮＡの量の計測
使用される一次抗体は、抗ｃＰＬＡ２モノクローナル抗体(Cell Signaling or Santa-Cruz)である。
使用される二次抗体は、抗マウス抗体(Dako Cytomation Envision System)である。
【００８９】
各サンプルについて、量の計測は、標準化のため同一のサンプルにおいて計測されるアクチンメッセンジャーＲＮＡの量の計測に関連する(ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡ／アクチンｍＲＮＡ)。
【００９０】
【表７】
2009532445.tif 000008
【００９１】
これらの結果により、刺激されていようがいまいが、ＣＦマウスにおけるＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの増加が確認された。
＊Ｐ＜０.００１、ＷＴと比べたＣＦ
【００９２】
ＣＦ患者の肺移植片の気管支ホモジェネートにおけるｃＰＬＡ２活性の計測
【表８】
2009532445.tif 000009
これらの結果により、ｃＰＬＡ２阻害剤の使用が、ＣＦ患者における粘液分泌を非ＣＦ患者の分泌量まで回復するということが示された。組織学的及び免疫組織学的研究。
組織学又は免疫組織化学的分析は、マウス肺の切片で行なわれて、気管支上皮細胞による粘液の産生の計測において得られた結果が確認された。
【国際調査報告】
2009532445.tif 000010
2009532445.tif 000011
2009532445.tif 000012
2009532445.tif 000013
2009532445.tif 000014
2009532445.tif 000015
2009532445.tif 000016
2009532445.tif 000017
2009532445.tif 000018
2009532445.tif 000019
2009532445.tif 000020
2009532445.tif 000021