(57)【要約】  本出願は、被検体の例えば皮膚におけるVEGF-Aのレベル又は活性を減少させることにより、皮膚損傷を処置する（例えば低減、緩和又は予防する）方法を特徴とする。【選択図】図５
2009523807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
UVBにより誘発される皮膚損傷を低減させる方法であって、皮膚におけるVEGF-Aの活性又はレベルを減少させることを含んで成る方法。
【請求項２】
皮膚におけるリンパ管形成因子の活性又はレベルを増加させることを更に含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リンパ管形成因子がVEGF-C又はVEGF-Dである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
浮腫を減らす方法であって、VEGF-Aの活性又はレベルを減少させることを含んで成る方法。
【請求項５】
皮膚におけるリンパ管形成因子の活性又はレベルを増加させることを更に含んで成る、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記リンパ管形成因子がVEGF-C又はVEGF-Dである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
VEGF-A活性の阻害剤をスクリーニングする方法であって、
VEGF-Aを結合しそしてVEGF-Aに応答することができる膜貫通受容体を細胞に提供し；
試験化合物の存在下で、前記細胞とVEGF-A又はその断片を含んで成るポリペプチドとを接触せしめ；そして
前記細胞への前記ポリペプチドの結合を評価する
ことを含んで成り、ここで前記細胞への前記ポリペプチドの結合を阻害する試験化合物がVEGF-A活性の阻害剤である方法。
【請求項８】
前記膜貫通受容体がVEGF-2のVEGF-A結合部分を含んで成る、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記試験化合物が天然産物又は抽出物である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
VEGF-A活性の阻害剤についてのスクリーニング方法であって、
VEGF-Aに結合することができる膜貫通受容体の部分を含んで成る第一ポリペプチドを提供し；
前記ポリペプチドを、試験化合物の存在下で、VEGF-A又はその断片を含んで成る第二ポリペプチドと接触せしめ；そして
前記第二ポリペプチドへの前記第一ポリペプチドの結合を評価する
ことを含んで成り、ここで前記第二ポリペプチドへの前記第一ポリペプチドの結合を阻害する試験化合物が、VEGF-A活性の阻害剤である方法。
【請求項１１】
前記膜貫通受容体がVEGFR-2のVEGF-A結合性部分を含んで成る、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記試験化合物が天然産物又は抽出物である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
VEGF-A発現の阻害剤についてのスクリーニング方法であって、
(a) VEGF-Aプロモーター領域を有する細胞を提供し；
(b) 該細胞をUVB照射に暴露し；
(c) (b)の前、最中又は後に、前記細胞を試験化合物と接触せしめ；そして
(d) 前記プロモーター領域により指令される発現を測定する
ことを含んで成り、ここで発現を減少させる試験化合物が、VEGF-A発現の阻害剤である方法。
【請求項１４】
前記膜貫通受容体がVEGFR-2のVEGF-A結合部分を含んで成る、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記試験化合物が天然産物又は抽出物である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
VEGF-Aの発現、活性又はレベルを減少させる剤の使用であって、慢性又は急性UVBにより誘発される皮膚損傷を減少させる医薬の調製のための使用。
【請求項１７】
前記医薬がリンパ管形成因子の発現、活性又はレベルを増加させる剤を更に含んで成る、請求項１６の使用。
【請求項１８】
前記リンパ管形成因子がVEGF-C，VEGF-D又はVEGFR-3である、請求項17の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
本出願は、2006年１月18日出願の米国特許出願第60/760,328号の優先権を主張し、該出願は参考としてその全内容が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
背景技術
リンパ管系は、細胞外間隙からタンパク質に富むリンパ液を排出させる薄壁毛細管の緻密なネットワークから構成される。その主な役割としては、組織液恒常性の維持と、求心性免疫応答の媒介が挙げられる〔Oliver他 (2002) Genes Dev. 16:773-83 ; Witte他 (2001) Microsc. Res. Tech. 55:122-45〕。既知のリンパ管の機能の１つは、正常組織と炎症組織からの組織液の排出である〔Kunstfeld他 (2004) Blood 104:1048-57〕。
【０００３】
発明の要約
本発明者らは、マウス皮膚における急性及び慢性UVB照射がリンパ管の著しい拡大を引き起こすことを報告する。驚くべきことに、そのような拡大したリンパ管は、生体内リンパ管造影法により検出すると、機能的に損傷されており且つ高透過性である。血管内皮増殖因子（VEGF）-Aの発現レベルはUVB照射した表皮で増加したが、既知のリンパ管形成因子VEGF-C又は-Dの発現レベルは増加しなかった。トランスジェニックマウスの表皮におけるVEGF-Aの標的過剰発現は、急性UVB照射後にリンパ管の拡大と漏洩の増加を引き起こし、その一方でVEGF-Aシグナル伝達の全身的遮蔽は、UVBにより誘導されるリンパ管異常と光損傷を大幅に防止した。総合すると、それらの知見は、リンパ管がUVBにより誘導される皮膚光損傷の標的であること、そしてVEGF-Aがリンパ管機能の障害を媒介し、それによって皮膚に対するUVB照射の悪影響の一因となることを指摘する。
【０００４】
一態様では、本開示は、皮膚、例えば顔、胸、首、手又は体の他の部分のVEGF-Aの活性又はレベルを減少させることにより、UVBで誘発される皮膚損傷を減らす方法を特徴とする。該方法は更に、皮膚中のリンパ管形成因子、例えばVEGF-C又はVEGF-Dの活性又はレベルを増加させることを含む。
【０００５】
別の態様では、本開示は、VEGF-Aの活性又はレベルを減少させることにより浮腫を減らす方法を特徴とする。
更に別の態様では、本開示は、リンパ機能を促進することにより、例えば顔、胸、首、手又は体の他の部分における、UVBで誘発される皮膚損傷を減らす方法を特徴とする。
【０００６】
更に別の態様では、本開示は、VEGF-A活性の阻害剤についてスクリーニングする方法であって、VEGF-Aに結合し且つ応答することができる膜貫通受容体を細胞に提供し；該細胞を、試験化合物、例えば天然産物又は抽出物の存在下でVEGF-A又はその断片を含有するポリペプチドと接触せしめ；そして前記細胞への前記ポリペプチドの結合を評価することを含んで成り、ここで前記細胞への前記ポリペプチドの結合を阻害する試験化合物が、VEGF-A活性の阻害剤であるという方法を特徴とする。
【０００７】
更に別の態様では、本開示は、VEGF-A活性の阻害剤についてスクリーニングする方法であって、VEGF-Aに結合することができる膜貫通受容体の一部を含有する第一のポリペプチドを提供し；前記第一のポリペプチドを試験化合物、例えば天然産物又は抽出物の存在下で、VEGF-A又はその断片を含有する第二のポリペプチドと接触せしめ；そして前記第二のポリペプチドへの前記第一のポリペプチドの結合を評価することを含んで成り、ここで前記第二のポリペプチドへの前記第一のポリペプチドの結合を阻害する試験化合物が、VEGF-A活性の阻害剤であるという方法を特徴とする。
【０００８】
更に別の態様では、VEGF-A発現の阻害剤についてスクリーニングする方法であって、該方法は(a) VEGF-Aプロモーター領域を有する細胞を提供し；(b) 該細胞をUVB放射線に暴露し；(c) (b)の前、最中又は後で、前記細胞を試験化合物、例えば天然産物又は抽出物と接触せしめ；そして(d) 前記プロモーター領域により指令される発現を測定することを含んで成り、ここで発現を減少させる試験化合物が、VEGF-A発現の阻害剤であるという方法を特徴とする。
【０００９】
一態様では、本開示は、例えば顔、胸、首、手又は体の他の部分に、UVB誘発皮膚損傷を有する被検体を処置する方法を特徴とする。該方法は、被検体に、治療上有効な量のVEGF/VEGFRモジュレーターを投与することを含んで成る。
【００１０】
一態様では、該モジュレーターは、VEGF-A/VEGFR（例えばVEGFR-2）アンタゴニストである。VEGF-A/VEGFRアンタゴニストは、細胞又は被検体におけるVEGF-A/VEGFR活性を直接又は間接的に減少させる物質（剤）である。該アンタゴニストとしては、核酸及びタンパク質、例えば抗体又は可溶性VEGF-A受容体断片が挙げられる。例えば、該アンタゴニストは、VEGF-Aと相互作用しそして、例えば細胞表面VEGFR（例えばVEGFR-2）へのVEGF-A結合親和力を減少させるタンパク質であることができる。例えば、該タンパク質は(i) VEGF-AもしくはVEGFR（例えばVEGFR-2）を認識する抗体、又は(ii) VEGFRの細胞外領域を含むタンパク質、例えば可溶性VEGF-A受容体（例えばFcドメインに融合した）であることができる。アンタゴニストの例としては、VEGF-A mRNAを結合するか又は他の方法で阻害する、例えばmRNA産生、プロセシング又は翻訳を阻害することができる核酸分子が挙げられる。更に別のアンタゴニストとしては、優性陰性VEGF-Aタンパク質もしくはその断片、及びVEGF-A核酸発現を減少させる物質（例えば、人工転写因子又は人工転写因子をコードする核酸）が挙げられる。他の適当なVEGF-A/VEGFR（例えばVEGFR-2）アンタゴニストとしては、小分子、天然産物及び抽出物が挙げられる。
【００１１】
或る実施態様では、該モジュレーターはVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）の内因性レベルを減少させる。
一態様では、該モジュレーターはVEGF-C/D/VEGFR(例えばVEGFR-3)アゴニストである。VEGF-C/D/VEGFRアゴニストは、被検体におけるVEGF-C/D/VEGFR活性を直接又は間接的に増加させる物質である。
【００１２】
多くのVEGF-C/D/VEGFR（例えばVEGFR-3）アゴニストは、VEGFRシグナル伝達活性を増加させる。VEGF-C/D/VEGFRアゴニストの例としては、VEGF-C/Dポリペプチドを含むタンパク質（例えば、それの成熟異種二量体形に変形されるような）又はそれの生物学的活性断片もしくは類似体、VEGF-C/Dをコードする核酸又はそれの生物学的活性断片もしくは類似体が挙げられる。別のタンパク質及び分子、例えば抗体及び小分子も、VEGFR活性を増加させるのに用いることができる。例えば、VEGFR（例えばVEGFR-3）を結合し、そして場合により架橋する（例えば二量体化する）抗体を、VEGFR（例えばVEGFR-3）活性の増加に使用することができる。別の適当なVEGF-C/D/VEGFR（例えばVEGFR-3）アゴニストとしては、小分子、天然産物及び抽出物が挙げられる。
【００１３】
モジュレーターは、増加されたリンパ管機能が所望される状態を処置するために用いることができる。そのような状態としては、浮腫、例えばUVB照射による浮腫が挙げられる。増加されたリンパ管機能が所望される他の状態としては、老化皮膚又は損傷した皮膚、例えばUVBにより損傷した皮膚が挙げられる。更に別の状態としては、一部は遺伝的又は環境的要因により、例えば紫外線照射により、引き起こされるものが挙げられる。例えば、該状態は、皮膚細胞外マトリックス損傷、例えば加齢により又は紫外光への過剰暴露により引き起こされるものである。
【００１４】
別の態様では、本開示は、リンパ機能を活性調節する化合物を同定する方法を特徴とする。該方法は、VEGF-A/VEGFR（例えばVEGFR-2）活性をモニタリングすることができる細胞又は生物体を提供し；該細胞又は生物体を試験化合物、例えば天然産物又は抽出物と接触せしめ；そして該細胞又は生物体中のVEGF-A/VEGFR（例えばVEGFR-2）活性を評価することを含んで成る。例えば、細胞はVEGF-A/VEGFR（例えばVEGFR-2）活性のレポーター、又はそのような細胞を含む生物体である。レポーター活性の変化又は他の関連パラメーターの変化は、例えばVEGF-A/VEGFR活性の変化を示す。該方法は更に、細胞増殖又は細胞遊走、例えばリンパ内皮細胞増殖又は遊走に対する試験化合物の効果を評価することを含んで成る。
【００１５】
一態様では、レポーターは、検出可能タンパク質をコードする配列と、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子のプロモーターの領域、例えば転写開始部位から少なくとも100，200，300，500，800，1000，2000もしくは5000塩基上流の位置までの領域、開始METコドンから少なくとも100，200，300，500，800，1000，2000もしくは5000塩基上流までの領域、又はTATAボックスから少なくとも100，200，300，500，800，1000，2000もしくは5000塩基上流までの領域を含む、作用可能に連結されたプロモーターとを含んで成る遺伝子である。
【００１６】
該細胞又は生物体は一般に哺乳動物、例えばヒト又は非ヒト、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、サルなどである。
【００１７】
更に別の態様では、本開示は、試験化合物を評価する方法であって、例えば試験生物、例えばVEGF-A/VEGFR（例えばVEGFR-2）経路活性のレポーターを含んで成るトランスジェニック生物、に局所投与される化合物（例えば天然産物又は抽出物）を評価するための方法を特徴とする。該方法は、試験化合物を試験生成物と接触せしめ、そしてVEGF-A/VEGFR経路活性を評価することを含んで成る。例えば、この評価は、VEGF-A、VEGFR（例えばVEGFR-2）又はVEGFRにより調節される遺伝子もしくは遺伝子産物、からのタンパク質発現又はｍRNA発現を評価することを含む。該方法はまた、別のVEGF-A/VEGFR経路モジュレーターの存在下で、例えば可溶性VEGFを含むタンパク質、VEGFRの可溶性細胞外ドメインを含むタンパク質、又はVEGF-AもしくはVEGFRに対する抗体の存在下で、試験化合物を評価することを含む。
【００１８】
一態様では、レポーターは、検出可能タンパク質をコードする配列と、VEGF又はVEGFR遺伝子のプロモーターの領域、例えば転写開始部位から少なくとも100，200，300，500，800，1000，2000もしくは5000塩基上流の位置までの領域、開始METコドンから少なくとも100，200，300，500，800，1000，2000もしくは5000塩基上流までの領域、又はTATAボックスから少なくとも100，200，300，500，800，1000，2000もしくは5000塩基上流までの領域を含む、作用可能に連結されたプロモーターとを含んで成る遺伝子である。
【００１９】
該方法は、試験化合物がVEGF/VEGFR経路活性を変化させる（例えば増加させるか減少させる）かどうか、試験化合物を（例えば試験化合物のライブラリー、例えば天然産物又は抽出物のライブラリーから）選択することを含んで成ることができる。選択された試験化合物は、例えば医薬組成物として、例えば局所投与に又は別の投与経路に適当な医薬組成物として、製剤化することができる。該方法は更に、その医薬組成物を被検体に、例えば本明細書に記載の疾患を有するか又はその恐れのある被検体に投与することを含み得る。
【００２０】
一態様では、本発明は、皮膚損傷、例えば慢性もしくは急性UVBにより誘発される皮膚損傷といった放射線誘発皮膚損傷をモジュレートする物質、例えば減少させる物質（例えば天然産物又は抽出物）を同定することを含んで成る。該方法は、VEGF-Aシグナル伝達をモジュレートする物質、例えば減少させる物質〔例えば、VEGF-Aの発現、活性もしくはレベル、又はVEGFレセプター（VEGFR、例えばVEGFR-2）の発現、活性もしくはレベルを減少させる物質〕を同定し、そしてVEGF-Aシグナル伝達、活性又はレベルをモジュレートする該物質の能力を、皮膚損傷、例えば慢性もしくは急性UVB誘発皮膚損傷のような放射線誘発皮膚損傷をモジュレートする能力と関連付けることを含んで成る。該方法は更に、同定された物質、例えば皮膚損傷をモジュレートする物質を選択することを含むことができる。
【００２１】
一態様では、該物質は、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）と相互作用する能力、例えばそれを結合する試験物質の能力を評価することにより同定される。別の態様では、該物質は、VEGF-A又はVEGFR調節領域、例えばプロモーター、例えばVEGF-A又はVEGFRプロモーターと相互作用する試験物質の効果を評価することにより同定される。別の態様では、該物質は、皮膚細胞、例えば角化細胞中のVEGF-A生産に対する試験物質の効果を評価することにより同定される。別の態様では、該物質は完全動物モデル、例えばVEGF-Aトランスジェニック動物、例えばVEGF-A過剰発現動物において、急性VEGF-Aシグナル伝達をモジュレートする試験物質の能力を評価すること、例えば定量的に又は定性的に評価することにより同定される。
【００２２】
試験物質は、例えば、核酸（例えばアンチセンス、リボザイム）、ポリペプチド（例えば抗体又はそれの抗原結合性断片）、ペプチド断片、ペプチド模倣物、又は小分子（例えば2000ダルトン未満の分子量を有する小型有機分子）であることができる。試験物質は、精製された形態、例えば少なくとも純度10，50，70，80，90又は99％で、例えば別の試験物質を含まない均一組成で、評価することができる。別の好ましい態様では、試験物質は組み合わせライブラリー、例えばペプチドもしくは有機分子組み合わせライブラリー、又は天然産物もしくは抽出物ライブラリーの構成員である。好ましい態様では、複数の試験物質、例えばライブラリー構成員が試験される。好ましくは、複数の試験物質、例えば構造又は機能的特性を共有する試験物質は、粗製又は半精製抽出物、例えば草花抽出物又は藻類抽出物といった植物抽出物であることもできる。
【００２３】
本発明方法は、例えば、前記物質又はそれの用途に関連した資料、販売材料又は教材、例えば印刷物又はコンピューター可読材料（例えばラベル、ｅメール）を、（例えば政府、医療施設、保険会社又は患者に）提供することにより、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）発現、レベル又は活性に対する前記物質の効果を、哺乳動物（例えばヒト）に対する前記物質の推定効果と比較し、相関関係を示し又は関連づけ、前記物質の効果を哺乳動物（例えばヒト）に対する効果として同定することを含み得る。例えば、該方法は、前記物質が基準物質に比較して、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）発現、レベル又は活性を減少させるならば、前記物質を急性UVB誘発皮膚損傷を減少させる物質として同定することを含むことができる。その同定は、例えば本明細書に記載のように、資料、販売材料又は教材の形であることができる。一態様では、該方法は、前記物質の効果を表す値を、皮膚損傷を減少させる能力と関連付けること、例えば前記物質の効果を表す値を皮膚損傷を減少させる能力と関連付けるデータベースを作製すること、を含んで成る。
【００２４】
一態様では、該方法は少なくとも２つの評価段階、例えば該方法は、第一の系、例えば無細胞系、細胞系、組織系又は動物モデルにおいて試験物質を評価する第一段階、並びに第二の系、例えば第二の細胞系もしくは組織系又は非ヒト動物において、前記試験物質を評価する第二段階を含む。一態様では、前記評価段階の１つが、被検体の皮膚又は皮膚外植片に対する前記物質の効果を評価すること、例えば、好ましくは急性UVB暴露の前後の、皮膚における皮膚損傷の存否、範囲又は型を評価することを含む。被検体は実験動物又はヒトであることができる。一態様では、第一の評価が、レポーター遺伝子のような異種配列に連結されたVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）プロモーターに対する試験物質の効果を試験することを含み、そして第二の評価が、前記試験物質を系、例えば細胞系又は動物系に投与し、そして皮膚損傷及び／又はVEGF生産に対する前記試験物質の効果を評価することを含む。或る態様では、該方法は同型の系における２つの評価段階を含み、例えば前記試験物質を同一又は異なる非ヒト動物における第一の評価の後、非ヒト動物において再評価する。この２つの評価は、或る時間の長さ、例えば数日、数週間、数か月又は数年おいて実施することができる。
【００２５】
好ましい態様では、同定段階は(a) ゲノムが、異種配列、例えばレポーターポリペプチド〔例えば比色分析（例えばLacZ）、発光分析（例えばルシフェラーゼ）又は蛍光検出可能なレポーターポリペプチド、例えばGFP, EGFP, BFP, RFP〕をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結された、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子の調節領域〔例えばVEGF-Aプロモーターについては、Gille他、EMBO J. 1997第16(4)巻:750-9を参照のこと；そしてVEGFR-2(flk1)プロモーターについては、Giraudo他、J. Biol. Chem. 1998 第273(34)巻:22128-35を参照のこと〕を含む外来核酸を含んで成る細胞、組織又は非ヒト動物に、試験物質を提供し；(b)前記細胞、組織又は非ヒト動物における前記レポーターポリペプチドの発現をモジュレートする試験物質の能力を評価し；そして(c) 前記レポーターポリペプチドの発現をモジュレートする試験物質を、急性UVB誘発皮膚損傷をモジュレートする物質として選択することを含んで成る。
【００２６】
一態様では、前記動物は実験用げっ歯類である。該動物は野生型又はトランスジェニック実験動物、例えばVEGF-Aトランスジェニックげっ歯類、例えばVEGFトランスジェニックマウスであることができる。被検体はヒトであってもよい。好ましい態様では、評価段階が、前記物質を被検体に投与しそして皮膚損傷（例えばUVBへの急性暴露により引き起こされる皮膚損傷）を評価すること含んで成る。別の態様では、前記細胞又は組織が皮膚細胞、例えば角化細胞；又は組織、例えば皮膚外植片である。更に別の態様では、細胞、例えば皮膚細胞、例えば角化細胞、又は組織、例えば皮膚外植片が、トランスジェニック動物に由来する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、被検体、例えばヒト被検体を治療する方法を特徴とする。該方法は、(a)例えば放射線暴露、例えば慢性もしくは急性UVB暴露のため、浮腫もしくは皮膚損傷を有するか又はその恐れがある被検体を同定し；(b)被検体に、該被検体のVEGF-Aシグナル伝達をモジュレートする物質（例えば天然産物又は抽出物）を投与し、例えば該被検体にVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）の活性、レベル又は発現を減少させる物質、例えば本明細書中に記載の物質、の有効量を投与することを含んで成る。好ましくは、前記物質は被検体の皮膚に例えば局所的に投与される。好ましい態様では、前記物質は慢性又は急性UVBにより誘発される皮膚の発赤、炎症、浮腫、水疱形成、腫れ及び／又は日焼けが予防又は低減される。急性UVB暴露とは、少なくとも１ MEDのUVB光、好ましくは少なくとも２，３又は５ MEDSのUVB光への暴露を意味する。一態様では、被検体は３〜８ MEDS、例えば３〜５、５〜７、又は７〜８ MEDSに暴露される。ある態様では、UV指数が中度〜極度である場合、被検体は、例えば日焼けを引き起こすのに十分な時間、太陽に暴露される予定か、暴露されているか又は暴露された経験がある。被検体は急性UVB暴露の１又は複数の症候、例えば皮膚の炎症、発赤、腫れ、水疱形成、圧痛又は浮腫を示すことがある。典型的には、被検体は少なくとも５歳の年齢である。好ましくは、被検体は少なくとも10，15，20，25，30，35，40，45，50又はそれ以上の年齢である。
【００２８】
好ましい態様では、該物質はリポソーム担体、例えばレシチンリポソーム又はアルキルリン脂質リポソームを介して投与される。該物質は、顔、胸、首、手及び体の他の部分に投与することができる。治療は該物質の１回以上の投与、例えば少なくとも２回、３回又は４回の投与を含むことができる。治療は該物質の毎日投与を含むこともできる。
【００２９】
一態様では、本発明方法は、該物質を第二の治療剤、例えば第二の皮膚治療剤、例えば日焼け止め、抗生物質、保湿剤、レチノイン酸、レチノイド誘導体又はα−ヒドロキシ酸と組み合わせて投与することを含んで成る。ある態様では、該物質が徐放性装置、例えば生体適合性ポリマー、ミクロ粒子、又はメッシュと組み合わせて被検体に投与される。そのような装置は薬剤の分解を減らし且つ薬剤の放出を制御することができる。
【００３０】
ある態様では、当該方法は、被検体を皮膚損傷について評価することを含む。この評価は、薬剤の投与の前、最中及び／又は後に実施することができる。例えば、評価は、投与の少なくとも４時間、８時間、12時間、１日、２日、４，７，14日又はそれ以上前に及び／又は後に実施することができる。
【００３１】
皮膚損傷を改善する必要のある被検体の同定は、例えば被検体自身により、医療業者により、皮膚損傷治療業者により、又は他の団体により実施される。薬剤は例えば被検体により、医療業者により、皮膚損傷治療業者により、又は他の団体により投与され得る。同様に、皮膚損傷に対する薬剤の効果の評価も、被検者自身により、医療業者により、皮膚損傷治療業者により、又は他の団体により実施することができる。
【００３２】
VEGF-Aシグナル伝達を減少させる物質は、例えば、VEGF-A結合タンパク質又はVEGFR-2結合タンパク質であることができる。例えば、そのような結合タンパク質は、VEGF-Aを結合し且つ阻害することができるか、又はVEGFR-2活性を結合し且つ阻害することができる。そのような結合タンパク質は、互いと又は別の結合相手と相互作用するVEGF-A又はVEGFR-2の能力を阻害しうる。一態様では、結合タンパク質はVEGF-A又はVEGFR-2に特異的に結合する抗体、例えば結合相手又は互いと結合するVEGF又はVEGFR-2の能力を分断する抗体である。別の典型的な物質は、VEGF-A又はVEGFR-2に結合するがVEGFシグナル伝達を破壊する変異型不活性VEGF-Aである。更に別の典型的な物質は、VEGF-A又はVEGFR-2に結合するがVEGF-Aシグナル伝達を破壊するVEGFR-2（例えば非シグナル伝達変異体）又はその断片（例えばVEGFR-2の細胞外ドメイン）である。追加の典型的な物質としては、細胞VEGF-A又はVEGFR-2核酸配列、例えばmRNAに結合することができ且つタンパク質、例えばアンチセンス分子、siRNA分子又はリボザイムの発現を阻害することができる、VEGF-A又はVEGFR-2核酸分子；及びVEGF-A又はVEGFR-2遺伝子発現を減少させる物質、例えばVEGF-A又はVEGFR-2のプロモーターを結合する小分子；又は組成もしくは半精製抽出物、例えば植物抽出物、例えば草花抽出物又は藻類抽出物が挙げられる。
【００３３】
例えば、被検体はVEGFアンタゴニスト、例えば抗VEGF抗体、例えばbevacizumab；又はVEGF受容体アンタゴニスト、例えば抗VEGF受容体抗体、又は1500ダルトン未満の分子量を有する化合物である小分子阻害剤で処理することができる。
【００３４】
代表的な阻害剤及びVEGF受容体アンタゴニストとしては、VEGF受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤が挙げられる。４−〔４−（１−アミノ−１−メチルエチル）フェニル〕−２−〔４−（２−モルホリン−４−イルエチル）フェニルアミノ〕ピリミジン−５−カルボニトリル（JNJ-17029259）は、血管内皮増殖因子受容体−２の経口投与可能な選択的ナノモル阻害剤である５−シアノピリミジンの構造分類の１つである。追加の例としては、PTK-787／ZK222584（Astra-Zeneca）, SU5416, SU11248（Pfizer）及びZD6474（〔N-（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−〔（１−メチルピペリジン−４−イル）メトキシ〕キナゾリン−４−アミン〕）が挙げられる。使用することができる更に別の剤は、広域特異性チロシンキナーゼ阻害剤、例えばSU6668である。例えば、Bergers, B.他(2003) J. Clin. Invest. 111, 1287-1295を参照のこと。
【００３５】
別の好ましい態様では、VEGF-A又はVEGFR-2は、内因性VEGF-A又はVEGFR-2遺伝子の発現のレベルを減少させることにより、例えばVEGF-A又はVEGFR-2遺伝子の転写を減少させることにより、阻害される。好ましい態様では、VEGF-A又はVEGFR-2遺伝子の転写は、例えば転写抑制遺伝子のためのDNA結合部位などの負の調節配列の付加によって、又はエンハンサーや転写活性因子のためのDNA結合部位などの正の調節配列の付加によって、内因性VEGF-A又はVEGFR-2遺伝子の調節配列を変更することにより、減少させることができる。別の好ましい態様では、VEGF-A又はVEGFR-2を結合する抗体がモノクローナル抗体、例えばヒト化キメラ抗体又はヒトモノクローナル抗体である。
【００３６】
一態様では、VEGF発現を減少させる物質は、細胞性VEGF-A又はVEGFR-2核酸配列、例えばmRNAに結合することができ、且つ、タンパク質、例えばアンチセンス分子、siRNA分子又はリボザイムの発現を阻害することができる、VEGF-A又はVEGFR-2核酸分子；VEGF-A又はVEGFR-2遺伝子発現を減少させる物質、例えばVEGF-A又はVEGFR-2のプロモーターを結合する小分子；又は粗製もしくは半精製抽出物、例えば植物抽出物、例えば草花抽出物もしくは藻類抽出物、例えばザクロ種子油又はブドウ種子油である。
【００３７】
当該方法は、１又は複数のリンパ管形成因子の活性を増大させること、例えば被検体における天然リンパ管形成タンパク質、例えばVEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）の活性を増加させることを更に含んで成ることができる。VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）活性は、例えば、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）活性を増加させる物質を投与することにより、増加させることが可能である。好ましい態様では、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）活性を増加させる物質は、次のもののうちの１つ又は複数であることができる：VEGF-Cもしくは-Dポリペプチド、又はそれの生物活性断片もしくは類似体、例えばVEGF-Cもしくは-D由来ポリペプチド又はそれの逆（retro-inverso）ポリペプチド；VEGF-Cもしくは-Dポリペプチドをコードする核酸、又はそれの生物活性断片もしくは類似体；VEGF-Cもしくは-Dのアゴニスト、例えばVEGF-Cもしくは-D活性を有するか又は増加させる抗体又は小分子；VEGF-Cもしくは-D核酸発現を増加させる物質、例えばVEGF-Cもしくは-Dのプロモーター領域に結合し且つ発現を増加させる小分子。
【００３８】
好ましい態様では、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）は、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）発現を誘導する物質、例えば小分子により増加される。好ましい態様では、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）発現を誘導する物質は局所投与される。好ましい態様では、該剤はUVB暴露、例えば太陽暴露より充分に前に、リンパ管形成効果がUVB暴露の時点で被検体皮膚に存在するように、被検体に投与される。
【００３９】
VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）活性は、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）核酸、あるいはVEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）タンパク質、断片又は類似体を被検体に徐放投与することにより増加させることも可能である。VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）核酸、タンパク質、断片又は類似体は、徐放系、例えば生体適合性ポリマー、ミクロ粒子、又はメッシュと組み合わせて被検体に投与できる。該系は、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）核酸の分解を減らし且つその放出を制御することができる。そのようなVEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）生体適合性徐放系は、例えば注射又は移植（注入）により、筋肉内に、皮下に、静脈内に、又は臓器、関節腔又は病巣に、投与することができる。
【００４０】
VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）のレベルは、内因性VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）活性を増加させることにより高めることもできる。該遺伝子の発現レベルを増加させることにより、例えばVEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）遺伝子の転写を増加させること；VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）mRNAの安定性を向上させること、例えば該mRNAの二次もしくは三次構造を変更することによって；VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）mRNAの翻訳を増加させること、例えばVEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）mRNAの配列を変更することによって；そして／又は、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）タンパク質の安定性を増加させることにより、活性を増加させることができる。VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）遺伝子の転写は、例えば、内因性VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）遺伝子の調節配列を変更することにより、増加させることができる。一態様では、調節配列は次の方法により変更することができる：正の調節要素（例えばエンハンサー又は転写活性化因子のためのDNA結合部位）の付加；負の調節要素（例えば転写抑制因子のためのDNA結合部位）の削除；及び／又は内因性調節配列もしくはその中の要素の別遺伝子のものによる置換。それによりVEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）遺伝子をより効率的に転写できるようにする。
【００４１】
一態様では、該物質は、VEGF-Cもしくは-D又はVEGFR（例えばVEGFR-3）を含有する組成物、例えば小分子又は粗製もしくは半精製抽出物、例えば植物抽出物例えば草花抽出物である。
【００４２】
別の態様では、本発明は、慢性もしくは急性UVB誘発皮膚損傷を減少させるための組成物であって、VEGF-AもしくはVEGFR（例えばVEGFR-2）の発現、活性又はレベルを減少させる物質、例えば本明細書に記載の物質、例えば本明細書に記載のスクリーニング法により同定された物質を含有する組成物を特徴とする。好ましい態様では、該組成物は化粧用組成物、例えば局所投与用に処方された組成物である。好ましい態様では、該組成物は香料、保存剤又は他の化粧品成分、例えば保湿剤又は日焼け止め剤、例えばオクチルメトキシシンナメート、アミノ安息香酸、オキシベンゾン、パジメートＯ、ホモサレート又は二酸化チタンを含んでもよい。該組成物はシャンプー、オイル、クリーム、ローション、石鹸、フォーム、ゲル又は他の化粧品製剤において提供することができる。好ましい態様では、該組成物は化粧品成分、例えば香料又は保湿剤も含有する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、慢性又は急性UVBにより誘発される皮膚損傷を減少させるための医薬の調製のための、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）の発現、活性又はレベルを減少させる物質、例えば本明細書中に記載の物質、例えば本明細書に記載のスクリーニング法により同定された剤の使用を特徴とする。或る態様では、該医薬はVEGF-C, VEGF-D又はVEGFR-3の発現、活性又はレベルを増加させる物質を更に含んで成る。
【００４４】
別の態様では、本発明は被検体における皮膚損傷をモジュレートする方法を特徴とする。該方法は、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）の成分の発現、活性又はレベルに影響を及ぼす物質、例えば本明細書に記載の物質、例えば本明細書に記載のスクリーニング法により同定された物質、を含有する組成物を被検体に提供し；そしてUVB誘発皮膚損傷のような皮膚損傷該を治療するための、該剤の適用指針を被検体に提供することを含んで成る。
【００４５】
別の態様では、本発明は被検体の皮膚損傷をモジュレートするためのキットであって、本明細書に記載の組成物、例えばVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）の一成分の発現、活性又はレベルに影響を及ぼす物質を含有する組成物；及び急性UVBにより誘発される皮膚損傷、例えば発赤、腫れ、日焼け及び／又は炎症の治療を必要とする体の部位に該組成物を適用するための指針、を含んで成るキットを特徴とする。好ましい態様では、該組成物は化粧品成分、例えば香料又は保湿剤も含有する。
【００４６】
本発明の物質の有効量は、被検体（例えばヒト）への投与時に、該被検体の皮膚損傷を低減する組成物の量として定義される。被検体に投与するべき有効量は、典型的には年齢、性別、表面積、体重及び皮膚の状態をはじめとする様々な要因に基づく。体表面積は、患者の伸長と体重から概算的に決定することができる。例えば、Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537を参照のこと。有効量は、当業者により認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、別の処置、例えば別の皮膚損傷低減化合物の使用との併用の可能性に依存して、変化するだろう。
【００４７】
別の面では、本発明は、ヒト被検体の皮膚領域（例えば前腕、足、背中、胴、頭、顔、頭皮）に、保護量のVEGFシグナル伝達阻害剤を適用し；そして前記被検体を放射線、例えば日光、例えば直接日光もしくは強烈な日光、又はUV光（例えば日焼けサロンでのような）に暴露することを含んで成る方法を特徴とする。保護量は、皮膚損傷を検出可能なレベル又は統計学上有意なレベルに減少させるのに十分な量である。
【００４８】
別の態様では、本発明は、被検体又は被検体からの細胞、例えば皮膚細胞をモニタリングする方法を特徴とする。該方法は、VEGF-A，-C及び-Dのうちの１つ又は複数の発現を評価することを含んで成る。基準（例えば対照細胞又は未照射の細胞）に比較した、VEGF-Aレベルの増加又はVEGF-Cもしくは-Dレベルの減少は、被検体又は被検体からの細胞が、皮膚損傷状態、例えば放射線、例えばUVB放射線に暴露される恐れがあるか又は暴露されたことを示すことができる。
【００４９】
本明細書中で用いる場合、UVB放射線への暴露とは、少なくとも１ MEDの自然光又は人工UVB放射線（例えばUVBランプ、例えば日焼け用、又は光線療法用、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎もしくは白斑の治療用）への暴露を意味する。
本発明の１又は複数の態様の詳細は、添付図面及び下記説明に与えられる。本発明の別の特徴、目的及び利点は、下記記載及び添付図面並びに特許請求の範囲から明白であろう。
【００５０】
具体的説明
皮膚への紫外線Ｂ波（UVB）照射は、紅斑、細胞外マトリックス分子の分解及び皮膚の皺を誘発する。リンパ管は正常な皮膚において体液平衡を維持するのに重要な役割を果たす。マウス皮膚の急性UVB照射と慢性UVB照射の両方がリンパ管の顕著な拡大を引き起こすことを発見した。驚くべきことに、それらの拡大したリンパ管は、リンパ管造影法により検出すると、機能的に損傷を受けており且つ高浸透性であった。UVB照射した表皮において血管内皮増殖因子（VEGF）-Aの発現レベルは増強されたが、VEGF-C又は-Dのそれは増強されなかった。トランスジェニックマウスの表皮におけるVEGF-Aの標的過剰発現は、急性UVB照射後のリンパ管の著しい拡大と、驚くべきことにリンパ管の漏出も引き起こし、その一方でVEGF-Aシグナル伝達の全身的遮蔽が、リンパ管異常を大幅に防止し、且つUVBにより誘発される光損傷も防止した。総合すると、それらの知見は、リンパ管がUVBにより誘発される皮膚光損傷を防止するための新規標的であることを示し、そしてリンパ機能の促進、例えばVEGF-Cのようなリンパ管形成因子による促進が、皮膚に対するVEGF-Aにより一部媒介されるUVB照射の損傷を軽減しうることも示唆する。従って、本出願は、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）のレベル又は活性を減少させることにより、被検体の例えば皮膚における、皮膚損傷（例えばUVBにより誘発される）を治療する（例えば減少させる、軽減する、又は予防する）方法を特徴とする。
【００５１】
VEGF及びVEGF受容体は、例えばShibuya & Claesson-Welsh (2006) Exp. Cell Res. 312:549-60 ; Byrne他(2005) J. Cell. Mol. Med. 9:777-94 ;及びCoultas他 (2005) Nature 438:937-45において概説されている。
【００５２】
UVB損傷
UV指数（米国環境保護庁により発表される）は、指定された日における太陽の紫外線の強度を示す。それには４つのカテゴリーがある―中程度（UV指数３未満）、高度（UV指数が３〜６）、非常に高度（UV指数が６〜10）及び極度（UV指数が10より高い）。中度UV指数は、ヒトの皮膚を日焼けさせるのに１時間以上要するだろうことを意味し；極度レベルは、15分未満を要するだろうことを意味する。該指数はしばしば天気情報に含められる。臨床的には、UVB暴露は最小紅斑量（MED）として測定される。１MEDは、敏感な皮膚に日焼けを生じさせるのに必要なUVBの量である。中度〜重度の急性UVB誘発皮膚損傷、例えば日焼けは、３〜８ MEDにて起こり得る。
【００５３】
スクリーニング法
ある物質がVEGF-Aシグナル伝達、例えばVEGF-AもしくはVEGFR遺伝子発現、活性又はレベルをモジュレートできるかどうかを評価する方法は多数存在する。一態様では、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーターからの発現を、例えば永久に又は一時的に、増加又は減少させることのできる試験物質の能力は、例えば汎用レポーター（例えばLacZ又はGEP又はルシフェラーゼ）転写アッセイにより評価される。例えば、ゲノムがVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）プロモーターに作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含んで成る細胞又はトランスジェニック動物を、試験物質と接触せしめることができ、ここでレポーター活性を増加又は減少させる試験物質の能力が、急性UVB皮膚損傷をモジュレートする能力の指標である。別の態様では、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子発現、或いはVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）活性又はレベルをモジュレートする試験物質の能力が、トランスジェニック動物、例えば本明細書に記載のトランスジェニック動物において評価される。
【００５４】
VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子発現或いはVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）活性又はレベルに対する試験物質の効果は、細胞、細胞溶解物、又は被検体、好ましくは非ヒト実験動物、より好ましくはげっ歯類（例えばラット、マウス又はウサギ）、又はその外植片（例えば皮膚）において評価することもできる。VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子発現を評価する方法は、当業界において周知であり、例えばノーザン分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）又はRNA in situハイブリッド形成（例えばSambrook他、Molecular Cloning: A raboratory Manual （第３版、2001）を参照のこと）が挙げられる。VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）のレベルは、例えばウエスタン分析、イムノアッセイ又はin situハイブリッド形成により、モニタリングすることができる。VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）活性、例えば変更したプロモーター結合及び／又は転写活性は、例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、DNAフットプリント法又はレポーター遺伝子アッセイにより、測定することができる。好ましくは、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子発現あるいはVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）活性又はレベルに対する試験物質の効果は、被検体における皮膚損傷の変化として観察される。より好ましくは、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子発現あるいはVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）活性又はレベルに対する試験物質の効果は、野生型細胞もしくは非ヒト動物、又は外植片もしくはそれから誘導された細胞に比較して、変更されたVEGFシグナル伝達を有するトランスジェニック細胞もしくは非ヒト動物、又は外植片もしくはそれから誘導された細胞において評価される。
【００５５】
試験物質は、LacZに融合したVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーターを含んで成るトランス遺伝子を発現する細胞、細胞抽出物、外植片又は被検体に投与することができる。VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーターあるいはVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーターからの転写を調節する因子に対する試験物質の効果の結果としての、トランス遺伝子（例えばレポーター、例えばLacZ又はGFP）転写の増強又は阻害は、色の変化として容易に観察することが可能である。レポーター転写レベル、及び結果としてVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーター活性は、確立された方法、例えばノーザン分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）又はRNA in situハイブリッド形成（例えばCuncliffe他(2002) Mamm. Genome 13;245を参照のこと）によりモニタリングすることができる。試験物質は、無細胞系、例えばVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーター−レポータートランス遺伝子〔例えばVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーター−LacZトランス遺伝子〕、VEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーターを結合する転写因子、粗製細胞溶解物又は核抽出物、並びに試験物質（例えば本明細書に記載の物質）を含んで成る環境を用いて評価することができ、ここでVEGF-A又はVEGFR（例えばVEGFR-2）遺伝子プロモーター活性に対する該試験物質の効果が、色の変化として検出される。
【００５６】
或る態様では、VEGF-A及びそれの生物学的活性断片は精製ポリペプチドとして提供される。精製ポリペプチドは、試験管内で生産されたポリペプチド（例えば試験管内翻訳により又は自動ポリペプチド合成装置の使用により）、及び細胞（例えば原核細胞、真核細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞）内で最初に発現されその後精製されたポリペプチドを包含する。精製ポリペプチドを発現する細胞としては、内因性遺伝子をコードする細胞、ポリペプチドをコードする発現ベクターにより形質導入された細胞、及び典型的にはその細胞型で発現されない内因性遺伝子の発現を誘導するように実験的に操作されている細胞（例えば遺伝子活性化技術）が挙げられる。或る態様では、ポリペプチドは融合タンパク質（例えばVEGFR−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合体）であって、該融合タンパク質を個々のポリペプチドに開裂・分離させるようなプロテアーゼ開裂部位を含有することがある融合タンパク質である。或る態様では、ポリペプチドは、該ポリペプチドの精製を容易にするアミノ酸配列（例えば多重ヒスチジン標識、FLAG標識等）を含むことができる。細胞からタンパク質を単離する又は細胞により発現されたポリペプチドを単離する方法としては、アフィニティー精製、サイズ排除クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、及び他のクロマトグラフィー精製法が挙げられる。該ポリペプチドは翻訳後修飾、例えばグリコシル化される場合がある。
【００５７】
別の態様では、本発明は、VEGF-AポリペプチドとVEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチドとの間のタンパク質−タンパク質相互作用をモジュレートする化合物を同定するために、試験化合物をスクリーニングする方法に関する。転写調節因子間のタンパク質−タンパク質相互作用をモジュレートできる化合物の高処理能力スクリーニングに有用な方法は、Lepourcelet他、Cancer Cell 5:91-102 (2004)に記載されており、その全内容が参考として本明細書に組み込まれる。典型的には、第一化合物を提供する。その第一化合物がVEGF-Aポリペプチド又はそれの生物学的活性断片であるか、或いは第一化合物がVEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチド又はそれの生物学的活性断片である。次いで第一化合物とは異なる化合物で、標識されている第二の化合物を提供する。この第二化合物はVEGF-Aポリペプチド又はそれの生物学的活性断片であるか、又は第二化合物がVEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチド又はそれの生物学的活性断片である。次いで試験化合物を提供する。第一化合物、第二化合物及び試験化合物を互いに接触せしめる。次いで第一化合物に結合した標識の量を測定する。結合した標識により評価されるような第一化合物と第二化合物との間のタンパク質−タンパク質相互作用の変化が、VEGF-AポリペプチドとVEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチドとの間のタンパク質−タンパク質相互作用をモジュレートすることにおける試験化合物の有効性の指標である。或る態様では、そのような変化は試験化合物を添加しない同一反応に比較して評価される。
【００５８】
或る態様では、提供される第一化合物が固体支持体に付着せしめられる。固体支持体としては、例えば、樹脂、例えばアガロース、ビーズ、及びマルチウエルプレートが挙げられる。一態様では、該方法が接触段階の後に、結合した標識と未結合の標識とを分離するための洗浄段階を含んで成る。
【００５９】
或る態様では、複数の試験化合物を第一化合物及び第二化合物と接触させる。異なる試験化合物をまとめて又は個別に他の化合物と接触させることができる。或る態様では、試験化合物の各々を、別々のウエルにおいて第一化合物と第二化合物の両方と接触せしめる。例えば、該方法は試験化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。試験化合物のライブラリーは上記に詳細に記述した。ライブラリーは、例えば、天然産物、有機化合物、ペプチド及び／又は修飾ペプチド、例えばＤ−アミノ酸、非自然アミノ酸及びＮ−置換アミノ酸といった修飾ペプチドを含むことができる。典型的には、該ライブラリーは、マルチウエルプレート、例えば96ウエルプレート中でのスクリーニングに適した形である。該アッセイは、多数の段階がコンピューター制御されそしてロボット装置により実施されるマルチウエル方式での自動化実行に特に有用である。ライブラリーは、他の方式、例えば、固体支持体に固定されそして微液滴中への放出に利用可能な合成化学物質ライブラリーの方式で利用することもできる。
【００６０】
或る態様では、第一化合物がVEGF-Aポリペプチド又はその断片であり、そして第二化合物がVEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチド又はその断片である。第一化合物を固定させることができる固体支持体は、例えばセファロースビーズ、SPAビーズ（シンチラントを内蔵する微小球）又はマルチウエルプレートであることができる。セファロースビーズは、洗浄段階を伴うアッセイを実施する場合に使用できる。第二化合物は、それの検出を可能にするような任意の標識、例えば放射能標識、蛍光剤、ビオチン、ペプチド標識、又は酵素断片により標識することができる。第二化合物は、例えば125Ｉ又は3Ｈで放射能標識することもできる。
【００６１】
或る態様では、第一又は第二化合物に化学的に接合されているか或いは第一又は第二化合物との融合タンパク質として発現される酵素の酵素活性は、結合タンパク質を検出するのに用いられる。結合タンパク質を検出するのに標準的な免疫学的方法を用いる結合アッセイも含まれる。或る態様では、VEGF-Aポリペプチド又はその断片とVEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチド又はその断片との相互作用は、VEGF-Aに共有結合された供与体（ドナー）蛍光色素分子〔例えばVEGF-Aに化学的に接合した蛍光基、又はVEGF-A−GFPキメラタンパク質として発現される緑色蛍光タンパク質（GFP）の変異体〕と、VEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチド又はその断片に共有結合した受容体蛍光色素分子との間の、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）により検出され、ここで、供与体発光スペクトルと受容体励起スペクトルには適当な重複（オーバーラップ）があり、そのためVEGF-AポリペプチドとVEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチドとのタンパク質−タンパク質相互作用を通して蛍光色素分子が近接近になると効率的な非放射性エネルギー転移を与える。
【００６２】
別の態様では、タンパク質−タンパク質相互作用は、酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼのドメインを再構成することにより検出される〔例えばRossi他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8405-8410 (1997) 参照〕。
【００６３】
更に別の態様では、タンパク質−タンパク質相互作用は、細胞におけるEspFuポリペプチドとTir又はN-WASPポリペプチドの適当なキメラ構成物の蛍光比イメージング（Bacskai他、Science 260:222-226 (1993)）により、或いはVEGF-AとVEGFR(例えばVEGFR-2)ポリペプチドの適当な構成物を使用し、VEGF-A/VEGFR相互作用を阻害する化合物を検出するための高処理能力アッセイに合うように調整された二ハイブリッド試験法〔Fearon他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7958-7962 (1992) ; Takacs他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10375-10379 (1993); Vidal他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10315-10320 (1996); Vidal他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10321-10326 (1996)〕により、評価される。それらの態様は、該アッセイにおいてモジュレーターとして働く化合物の細胞透過性が保証されるという利点を有する。
【００６４】
例えば、あるアッセイでは（唯一のアッセイではない）、VEGF-Aポリペプチド又はその断片をELISAプレートに吸着させる。次いでVEGF-Aポリペプチドを試験化合物に暴露し、続いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）−VEGFR（例えばVEGFR-2）ポリペプチド融合タンパク質に暴露する。結合したタンパク質を、ヤギ抗GST抗体、アルカリホスファターゼ（AP）結合抗ヤギIgＧ、及びAP基質を用いて検出する。タンパク質−タンパク質相互作用を妨害する化合物は、ELISAプレート上で減少したAPシグナルを生じる。
【００６５】
典型的な物質
様々な物質をVEGF（例えばVEGF-A，-C又は-D）又はVEGFR（例えばVEGFR-2又は-3）モジュレーターとして皮膚損傷を治療又は予防するために使用できる。該物質は、被検体に投与することができる任意の種類の化合物（例えば抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣物、薬理物質及びそれらの代謝産物、転写及び翻訳調節配列、天然産物及び抽出物等）であることができる。一態様では、VEGF/VEGFRモジュレーターは生体物質、例えば５〜300 kDaの分子量を有するタンパク質である。
【００６６】
例えば、VEGF/VEGFRモジュレーターは、VEGFRへのVEGFの結合を阻害することができるか、又は例えばVEGFRタンパク質、例えばVEGF-2により伝達されるような、VEGF媒介シグナル伝達を防止することができる。VEGFに結合するVEGF/VEGFRモジュレーターは、VEGFのコンホメーションを変更し、VEGFRへのVEGFの結合を阻害し、あるいは他の方法でVEGFRに対するVEGFの親和力を減少させ又はVEGFとVEGFRとの間の相互作用を防止する。あるいは、VEGF/VEGFRモジュレーターは、VEGFRへのVEGFの結合を刺激するか、又はVEGFの不在下でVEGFRを活性化することによりVEGFRシグナル伝達を誘導してもよい。
【００６７】
VEGF/VEGFRモジュレーター（例えば抗体）は、10-6，10-7，10-8，10-9又は10-10 Ｍ未満のＫd値でVEGFに又はVEGFRに結合することができる。一態様では、VEGF/VEGFRモジュレーターは、VEGFに結合する（即ち、非VEGF-Aタンパク質、例えばVEGF-C又はVEGF-Dに対するそれの親和力よりも少なくとも5，10，20，50，100，200，500又は1000倍の親和力でVEGF-Aに結合する）。好ましいVEGF/VEGFRモジュレーターはVEGF又はVEGFRに特異的に結合し、例えばVEGF又はVEGFR特異的抗体である。
【００６８】
代表的VEGF/VEGFRモジュレーターとしては、VEGF又はVEGFRに結合する抗体、及びVEGFへの結合を目当てに細胞表面VEGFRと競争するVEGFRの可溶性形態が挙げられる。VEGFRの可溶性形態の一例は、VEGFRの細胞外ドメインの少なくとも一部（例えば、VEGFR-2もしくはVEGFR-3の可溶性VEGF-結合性断片、例えばVEGFに結合する部分を含む断片）を含むタンパク質である。
【００６９】
VEGFRタンパク質の典型的可溶性形態は、VEGFに結合するVEGFRタンパク質の領域、例えば細胞外ドメイン、例えば細胞外領域の一ドメインを含んで成る。この領域は、そのＮ末端もしくはＣ末端の所で、別のアミノ酸配列、例えばFcドメインに、物理的に結合、例えば融合することができる。VEGFRからの該領域はリンカーにより異種アミノ酸配列から隔てられ得る。VEGFRの別の可溶性形態、例えばFcドメインを含まない形態も使用できる。
【００７０】
典型的VEGF/VEGFRモジュレーターとしては、VEGF及び／又はVEGFRに結合する抗体が挙げられる。一態様では、該抗体は、VEGFとVEGFRとの間の相互作用を物理的に妨害することにより、例えば対になる相手に対するVEGF及び／又はVEGFRの親和力を減少させることにより、VEGF複合体を破壊又は不安定化することにより、VEGF又はVEGFRを封鎖することにより、あるいはVEGF又はVEGFRを分解へと標的指向せしめることにより、VEGFとVEGFRとの間の相互作用を阻害する。一態様では、抗体は、VEGF/VEGFR結合に関与する１又は複数のアミノ酸残基を含むエピトープの所でVEGF又はVEGFRに結合することができる。そのようなアミノ酸残は、例えばアラニンスキャニングにより同定することができる。別の態様では、該抗体はVEGF/VEGFR結合に関与しない残基に結合することができる。例えば、抗体は、VEGF又はVEGFRのコンホメーションを変更することができ、それによって結合親和力を減少させるか、又は該抗体がVEGF/VEGFR結合を立体的に妨害してもよい。
【００７１】
VEGF及び／又はVEGFRに結合する抗体に加えて、別の抗体を使用できる。一態様では、該抗体がVEGF/VEGFR活性又はVEGF/VEGFR媒介現象の活性化を防止できる。
【００７２】
本明細書中で使用する時、用語「抗体」とは、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を提供するアミノ酸配列のことを言う。例えば、抗体は重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと省略する）及び軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと省略する）を含むことができる。別の態様では、例えば、抗体が２つの重（Ｈ）鎖可変領域と２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合性断片（例えば、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片及びdAb断片）、並びに完全抗体、例えばIgA, IgG（例えばIgG1, IgG2, IgG3, IgG4），IgE, IgD, IgM型（並びにそれらの亜型）の完全及び／又は全長免疫グロブリンを包含する。免疫グロブリンの軽鎖は、κ型又はλ型のいずれでもよい。一態様では、抗体はグリコシル化されている。抗体は抗体依存性細胞毒性及び／又は補体媒介細胞毒性について機能的であることができ、或いはそれらの活性の一方又は両方について非機能的であってもよい。
【００７３】
ＶＨ及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域（FR）」と称する高度に保存された領域が散在した、「相補性決定領域(“CDR”)」と称する高可変性領域に、更に小分割することができる。FRとCDRの範囲は正確に限定されている〔Kabat, E.A.他(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版，US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; 及びChothia, C.他 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照のこと〕。Kabat定義を本明細書では用いる。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順序で配置された３つのCDRと４つのFRから成る：FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。
【００７４】
「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変又は定常ドメインからのドメインのことを言う。免疫グロブリンドメインは、典型的には約７つのβ鎖から形成される２つのβシートと、保存された１つのジスルフィド結合を含有する（例えばA.F. Williams & A.N. Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. 6:381-405を参照のこと）。「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、抗原結合に適したコンホメーションでCDR配列を配置させるのに十分な構造を形成することができるアミノ酸配列のことを言う。例えば、該配列は、天然の可変ドメインのアミノ酸配列の全部又は一部を含んでもよい。例えば、該配列は、１個、２個又はそれ以上のＮもしくはＣ末端アミノ酸又は内部アミノ酸を省略してもよく、１もしくは複数の挿入又は追加の末端アミノ酸を含んでもよく、あるいは別の変形を含んでもよい。一態様では、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と会合して、標的結合性構造（又は「抗原結合部位」）、例えばVEGFと相互作用する構造、を形成する。
【００７５】
抗体のＶＨ鎖又はＶＬ鎖は、重鎖又は軽鎖定常領域の全部又は一部を更に含むことができ、それによりそれぞれ重鎖又は軽鎖免疫グロブリン鎖を構成する。一態様では、該抗体が２つの免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖から成る四量体である。免疫グロブリン重鎖と軽鎖はジスルフィド結合によって連結される。重鎖定常領域は、典型的には３つの定常ドメインCH1, CH2及びCH3を含んで成る。軽鎖定常領域は、典型的には１つのCLドメインを含む。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、典型的には宿主組織又は因子への抗体の結合、例えば免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）及び補体系の第一成分（Clq）への抗体の結合を媒介する。
【００７６】
抗体の１又は複数領域は、ヒト由来であるか、事実上ヒトであるか又はヒト化することができる。例えば、可変領域の１又は複数がヒトであるか又は事実上ヒトであることができる。例えば、CDRの１つ又は複数、例えばHC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3がヒトであることができる。軽鎖CDRの各々がヒトであることができる。HC CDR3がヒトであり得る。フレームワーク領域の１つ又は複数、例えばHC又はLCのFR1、FR2、FR3及びFR4がヒトであることができる。一態様では、全てのフレームワーク領域がヒトであり、例えばヒト体細胞由来であり、例えば免疫グロブリンを生産する造血細胞又は非造血細胞由来である。一態様では、ヒト配列は、例えば生殖細胞系列核酸によりコードされる、生殖細胞系列配列である。一態様では、定常領域のうちの１つ又は複数がヒトであるか、事実上ヒトであるか、又はヒト化することができる。別の態様では、フレームワーク領域（例えば集合的にFR1, FR2及びFR3、又は集合的にFR1, FR2, FR3及びFR4）の少なくとも70，75，80，85，90，92，95又は98％がヒトであるか、事実上ヒトであるか、又はヒト化することができ、或いは抗体全体がヒトであるか、事実上ヒトであるか、又はヒト化することができる。例えば、集合的にFR1，FR2及びFR3が、ヒト生殖細胞系列セグメントによりコードされるヒト配列と少なくとも70，75，80，85，90，92，95，98もしくは99％同一であるか、又は完全に同一であることができる。
【００７７】
「事実上ヒトの」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫応答を惹起しない位の十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含有する免疫グロブリン可変領域である。「事実上ヒトの」抗体は、正常なヒトにおいて免疫応答を惹起しない位の十分な数のヒトアミノ酸位置を含有する抗体である。
【００７８】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が、未修飾の形態が誘発するのよりも少ない免疫応答をヒトに誘発するように修飾されている免疫グロブリン可変領域、例えば、免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫応答を誘発しない位の十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように修飾されている免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの記載は、例えば米国特許第6,407,213号及び同第5,693,762号明細書にある。場合により、ヒト化免疫グロブリンは、１又は複数のフレームワークアミノ酸位置の所に非ヒトアミノ酸を含むことがある。
【００７９】
VEGF又はVEGFRに結合する抗体は、様々な手法により、例えば動物を使った免疫処置、又はファージ提示法のような試験管内法により、作製することができる。VEGF又はVEGFRの全部又は一部を免疫原として又は選択の標的として使用することができる。例えば、VEGF又はその断片、VEGFR又はその断片を免疫原として使用できる。一態様では、免疫処置動物は、本来の、ヒトの、又は部分的にヒトの免疫グロブリン遺伝子座を含む。一態様では、非ヒト動物はヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部分を含有する。例えば、ヒトＩg遺伝子座の大断片を用いてマウス抗体産生が欠如したマウス株を操作することが可能である。従って、ハイブリドーマ技術を用いることにより、少なくとも部分的にヒトの、所望の特異性を有する抗原特異的モノクローナル抗体を生産せしめそして選択することができる。例えばXENOMOUSETM、Green他（1994）Nat. Gen. 7:13-21；米国出願第2003-0070185号 ; 米国特許第5,789,650号；及び国際公開WO 96/34096号を参照のこと。
【００８０】
VEGF及びVEGFRに対する非ヒト抗体も例えばげっ歯類において生産せしめることができる。非ヒト抗体は、例えば、欧州特許第239 400号；米国特許第6,602,503号；同第5,693,761号；及び同第6,407,213号明細書に記載の通りにヒト化することができ、脱免疫することができ、又は他の方法でそれを事実上ヒトになるように修飾することができる。
【００８１】
欧州特許第239 400号（Winter他）は、ある種についての相補性決定領域(CDRs)を別の種からのものにより置換（与えられた可変領域内で）することにより抗体を変更することを記載している。典型的には、非ヒト（例えばマウス）抗体のCDRが、所望の置換された抗体をコードする配列を製造する組換え核酸技術を用いて、ヒト抗体の対応領域へと置換される。所望のイソタイプ（通常CHにはガンマＩ型、CLにはカッパ型）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加し、ヒト化重鎖及び軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞中で同時発現せしめ、可溶性ヒト化抗体を生産することができる。抗体をヒト化するための別の方法も使用できる。例えば、別の方法は抗体の三次元構造、三次元で結合決定基に近接しているフレームワーク位置、及び免疫原性ペプチド配列を説明することができる。例えば、WO 90/07861；米国特許第5,693,762号；同第5,693,761号；同第5,585,089号及び同第5,530,101号；Tempest他（1991）Biotechnology 9:266-271並びに米国特許第6,407,213号明細書を参照のこと。
【００８２】
VEGFとVEGFRに結合する完全にヒトのモノクローナル抗体は、例えば試験管内で感作されたヒト脾細胞を使って、Boerner他(1991) J. Immunol. 147:86-95により記載された通りに、生産せしめることができる。それらは、Persson他（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2432-2436により又はHuang & Stollar（1991）J. Immunol. Methods 141:227-236；更には米国特許第5,798,230号明細書により記載された、レパートリークローニング法により調製できる。大型非免疫ヒトファージ提示ライブラリーを使って高親和性抗体を単離し、それを標準ファージ技術を用いてヒト治療薬として開発することもできる〔例えばHoogenboom他（1998）Immunotechnology 4:1-20 ; Hoogenboom他（2000）Immunol Today 2:371-378；及び米国特許出願2003-0232333号を参照のこと〕。
【００８３】
本明細書に記載の抗体及び他のタンパク質は、原核細胞と真核細胞で生産せしめることができる。一態様では、抗体（例えばscFv）を酵母細胞、例えばPichia（Powers他(2001) J. Immunol. Methods 251:123-35参照）、Hanseula又はSaccharomyces中で発現させる。
【００８４】
抗体、特に全長抗体、例えばIgGを哺乳動物細胞中で生産させることができる。組換え発現用の代表的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞〔Urlaub & Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性CHO細胞を含み、例えばKaufman & Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載の通り、DHFR選択マーカーと共に使用される〕、リンパ球細胞系、例えばNS0骨髄腫細胞及びSP2細胞、COS細胞、K562細胞、並びにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、該細胞が哺乳動物上皮細胞である。
【００８５】
免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加の核酸配列、例えば宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製開始点）及び選択マーカー遺伝子を担持することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第4,399,216号；同第4,634,665号；同第5,179,017号明細書を参照のこと）。代表的な選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子〔メトトレキセート選択／増幅と共にdhfr-宿主細胞において使用される〕及びneo遺伝子（G418選択用）が挙げられる。
【００８６】
抗体（例えば全長抗体又はそれの抗原結合性部分）の組換え発現用の典型的系においては、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターがリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりdhfr- CHO細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖遺伝子と抗体軽鎖遺伝子は、該遺伝子の高レベル転写を稼働するエンハンサー／プロモーター調節要素（例えばSV40、CMV、アデノウイルス等に由来するもの、例えばCMVエンハンサー／AdMLPプロモーター調節要素又はSV40エンハンサー／AdMPLプロモーター調節要素）に各々作用可能に連結される。組換え発現ベクターはDHFR遺伝子も担持し、該ベクターによりトランスフェクトされたCHO細胞の、メトトレキセート選択／増幅を用いる選択に備える。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖と軽鎖の発現に備えて培養され、そして培地から完全な抗体が回収される。標準的分子生物学技術を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトせしめ、形質転換体について選択し、宿主細胞を培養し、そして培地から抗体を回収する。例えば、プロテインＡ又はプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、抗体を単離することができる。
【００８７】
抗体（及びFc融合体）は、修飾、例えばFc機能を変更する修飾、例えばFc受容体ともしくはClqとの又はその両方との相互作用を減少させるか又は除去するような修飾を含んでもよい。例えば、ヒトIgG1定常領域が、１もしくは複数の残基の所で、例えば米国特許第5,648,260号明細書の番号付け法に従って、残基234及び237の１又は複数において変更され得る。別の修飾の例としては米国特許第5,648,260号明細書に記載のものが挙げられる。
【００８８】
Fcドメインを含む幾つかのタンパク質のため、Fc領域がグリコシル化されている抗体又は他のタンパク質を合成するように抗体／タンパク質産生系を設計することができる。例えば、IgG分子のFcドメインは、CH2ドメインのアスパラギン297の所でグリコシル化される。Fcドメインは別の真核生物の翻訳後修飾を含むこともできる。別の場合、タンパク質はグリコシル化されない形態で生産される。
【００８９】
抗体及び他のタンパク質は、トランスジェニック動物により生産することもできる。例えば、米国特許第5,849,992号明細書は、トランスジェニック動物の乳腺において抗体を発現させる方法を記載している。乳特異的プロモーター、着目の抗体（例えば本明細書に記載の抗体）をコードする核酸配列、及び選択用のシグナル配列を含んで成るトランス遺伝子を構成する。そのようなトランスジェニック動物の雌により製造された乳は、着目のタンパク質、例えば抗体又はFc融合タンパク質を含有する。該タンパク質はその乳から精製することができ、又は或る用途では直接使用することができる。
【００９０】
抗体の範疇で記載される方法は、別のタンパク質、例えばFc融合体及び可溶性受容体断片にも適用可能である。
【００９１】
或る実施では、VEGF又はVEGFRをコードする内因性遺伝子の発現を減少させるために核酸アンタゴニストが用いられる。一態様では、核酸アンタゴニストがVEGF又はVEGFRをコードするmRNAを標的指向するsiRNAである。別の型の核酸アンタゴニストを使用してもよく、例えばdsRNA、リボザイム、三重ヘリックス形態、又はアンチセンス核酸を使用できる。或る態様では、核酸アンタゴニストをVEGFR活性化の下流エフェクター標識にDirectすることができる。
【００９２】
siRNAは場合によりオーバーハング（突出端）を含むことがある小型の二本鎖RNA（dsRNA）である。例えば、siRNAの二重鎖領域は、長さ約18〜25ヌクレオチド、例えば長さ約19，20，21，22，23又は24ヌクレオチドである。典型的には、siRNA配列は標的mRNAに正確に相補的である。特にdsRNAとsiRNAは哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）における遺伝子発現を静止させるのに用いることができる。siRNAsは29塩基対の基幹と２ヌクレオチドの3′突出端を有する短鎖ヘアピンRNAs（shRNAs）も含む。例えば、Clemens他（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6499-6503; Billy他(2001) Proc. Natl. Sci. USA 98:14428-14433; Elbashir他(2001) Nature 411:494-8; Yang他(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9942-9947; Siolas他（2005）, Nat. Biotechnol. 23(2):227-31; US 20040086884; US 20030166282; US 20030143204; US 20040038278; 及びUS 20030224432を参照のこと。
【００９３】
アンチセンス物質は、例えば、約８〜約80核酸塩基（即ち、約８〜約80ヌクレオチド）、例えば約８〜約50核酸塩基、又は約12〜約30核酸塩基を含むことができる。アンチセンス化合物としては、例えば、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、及び標的核酸にハイブリダイズしそしてその発現をモジュレートする他の短鎖触媒性RNA又は触媒性オリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンス化合物は、標的遺伝子中の配列に相補的である少なくとも8個の保存的核酸塩基の鎖を含む。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるのに、必ずしもその標的核酸配列に100％相補的でなくてもよい。オリゴヌクレオチドは、標的に該オリゴヌクレオチドが結合する時に特異的にハイブリダイズすることができ、標的分子の正常機能を妨害して利用能の低下を引き起こし、そして特異的結合が所望される条件下で、即ち生体内アッセイもしくは療法処置の場合、又は試験管内アッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、非標的配列への該オリゴヌクレオチドの非特異的結合が回避されるのに十分な程度の相補性を有する。
【００９４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとmRNA（例えばVEGF又はVEGFRをコードするmRNA）とのハイブリダイゼーションは、mRNAの１又は複数の正常機能を妨害し得る。妨害されるmRNAの機能としては、全ての重要機能、例えばタンパク質翻訳部位への該RNAの転座、RNAからのタンパク質の翻訳、１又は複数のmRNA種を与えるRNAのスプライシング、及び該RNAによって着手される触媒活性が挙げられる。RNAへの特異的タンパク質の結合も、該RNAへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより妨害される。
【００９５】
代表的なアンチセンス化合物としては、標的核酸、例えばVEGF又はVEGFRをコードするmRNAに、特異的にハイブリダイズするDNA又はRNA配列が挙げられる。相補的領域は約８〜約80核酸塩基に及ぶ。該化合物は１又は複数の修飾核酸塩基を含むことができる。修飾核酸塩基としては、例えば５−置換ピリミジン、例えば５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン及びＣ５−プロピニルピリミジン、例えばＣ５−プロピニルシトシン及びＣ５−プロピニルウラシルが挙げられる。別の適当な修飾核酸塩基としては、Ｎ4−（Ｃ1〜Ｃ12）アルキルアミノシトシン及びＮ4，Ｎ4−（Ｃ1〜Ｃ12）ジアルキルアミノシトシンが挙げられる。修飾核酸塩基は、７−置換−８−アザ−７−デアザプリン及び７−置換−７−デアザプリン、例えば７−ヨード−７−デアザプリン、７−シアノ−７−デアザプリン、７−アミノカルボニル−７−デアザプリンも包含する。それらの例としては、６−アミノ−７−ヨード−７−デアザプリン、６−アミノ−７−シアノ−７−デアザプリン、６−アミノ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−ヨード−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−シアノ−７−デアザプリン、及び２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリンが挙げられる。更に、Ｎ6−（Ｃ1〜Ｃ12）アルキルアミノプリン及びＮ6，Ｎ6−（Ｃ1〜Ｃ12）ジアルキルアミノプリン、例えばＮ6−メチルアミノアデニン及びＮ6，Ｎ6−ジメチルアミノアデニンも、適当な修飾核酸塩基である。同様に、別の６−置換プリン、例えば６−チオグアニンも、適当な修飾核酸塩基を構成し得る。別の適当な核酸塩基としては、２−チオウラシル、８−ブロモアデニン、８−ブロモグアニン、２−フルオロアデニン及び２−フルオログアニンが挙げられる。上述した修飾核酸塩基のいずれかの誘導体も適当である。上述の化合物のいずれかの置換基としては、Ｃ1〜Ｃ30アルキル、Ｃ2〜Ｃ30アルケニル、Ｃ2〜Ｃ30アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アミド、ニトロ、チオ、スルホニル、カルボキシル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル等が挙げられる。
【００９６】
別の型の核酸物質の記載も入手できる。例えば、米国特許第4,987,071号；同第5,116,742号；同第5,093,246号；Woolf他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Antisense RNA and DNA, D.A. Melton編, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) 89:7305-9; Haselhoff & Gerlach (1988) Nature 334:585-59; Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; 及びMaher (1992) Bioassays 14:807-15を参照のこと。
【００９７】
VEGF又はVEGFRの発現を調節するのに人工転写因子も使用できる。そのような人工転写因子は設計することができ、或いはVEGF又はVEGFRをコードする内因性遺伝子中の、例えば調節領域中の一配列（例えばプロモーター）に結合する能力について、ライブラリーから選択することができる。例えば人工転写因子は、試験管内選択により（例えば、米国特許第6,534,261号記載のファージ提示法を使って）又は生体内選択により、或いは認識コードに基づいた設計により（例えばWO 00/42219と米国特許第6,511,808号明細書を参照）、調製することができる。例えば、特に、多様性亜鉛フィンガー領域のライブラリーを作製する方法については、Rebar他(1996) Methods Enzymol. 267:129; Greisman & Pabo (1997) Science 275: 657; Isalan他(2001) Nat. Biotechnol 19:656; 及びWu他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:344を参照のこと。
【００９８】
場合により、人工転写因子は、転写調節領域、例えば転写を活性化させる活性化領域に又は転写を抑制する抑制領域に融合せしめることができる。特に、抑制領域は、VEGF又はVEGFRをコードする内因性遺伝子の発現を減少させるために利用できる。人工転写因子それ自体を、細胞に輸送される異種核酸因子によりコードさせるか、又はタンパク質それ自体を細胞に輸送することができる（例えば米国特許第6,534,261号明細書参照）。人工転写因子をコードする配列を含む異種核酸は、例えば細胞（例えば内皮細胞）中の該人工転写因子のレベルを正確に制御できるようにするために、誘導性プロモーターに作用可能に連結せしめることができる。
【００９９】
投与
本明細書に記載の物質は、全身投与又は限局投与、例えば局所投与することができる。本明細書に記載の物質の局所投与が好ましい投与経路である。局所投与用には、本発明の組成物は細胞、外植片又は被検体と適合する溶媒を含有し得る。そのような局所用医薬組成物は、多数の形態、例えば溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー、石鹸又はエーロゾルの形で存在することができる。多種多様な担体材料を本発明組成物に使用でき、例えば、アルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油並びにポリエチレングリコールを使用できる。別の添加剤、例えば保存剤、香料、日焼け止め、又は他の化粧成分を、該組成物中に含めることができる。
【０１００】
局所送達に好ましい賦形剤はリポソームである。リポソームは、薬剤、例えば本明細書に記載の剤を細胞に運び送達せしめるのに使用できる。詳細な指針は例えば、Yarosh他 (2001) Lancet 357:926及びBouwstra他 (2002) Adv. Drug Deliv. Rev. 54 Suppl 1:S41に見つけることができる。
【０１０１】
全身投与の場合、該物質は経口経路により、又は非経口経路により、例えば皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内もしくはその他の経路により、投与することができる。限局投与の場合、それらは局所、経皮、経粘膜、鼻腔内又は他の経路により投与することができる。例えばマイクロインジェクション又はトランスフェクションにより、細胞を該物質と細胞外で又は細胞内で接触せしめることができる。該物質は、投与後に即座に除去され、投与後に除去されず、そして／又は、一定の、増加もしくは減少する頻度で及び／又は増加もしくは減少する用量もしくは濃度で、繰り返し投与可能である。複数の投与経路を同時に用いてもよく、例えば局所投与と経口投与を併用できる。非経口投与形態の例としては、等張食塩水、５％グルコース又は他の周知の製薬上許容できる賦形剤中の、活性物質の水溶液が挙げられる。シクロデキストリンのような可溶化剤、又は当業者に周知である他の可溶化剤を、本発明の色素変調組成物の送達のための医薬賦形剤として使用することができる。
【０１０２】
該組成物は、例えば、化粧品、医薬品又は皮膚ケア製品として提供することができる。該組成物は、常法を用いて別の投与経路用の剤形に製剤化することもできる。医薬組成物は、例えば、固体組成物を調製するのに適当な任意の医薬担体、例えば賦形剤（例えばデンプン、グルコース、果糖、ショ糖、ゼラチン等）、滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）、崩壊剤（例えばデンプン及び結晶セルロース）及び結合剤（例えば乳糖、マンニトール、デンプン及びアラビアガム）と共に、粉末もしくは顆粒として、又はカプセル、錠剤（各々遅延放出又は徐放性製剤を包含する）又はゲルシールとして、製剤化することができる。該組成物が注射液である時、例えば溶剤（例えば注射用蒸留水）、安定化剤（例えばエデト酸ナトリウム）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グリセリン及びマンニトール）、ｐＨ調整剤（例えば塩酸、クエン酸、及び水酸化ナトリウム）、懸濁化剤（例えばメチルセルロース）等を使用することができる。
【０１０３】
本発明の物質は、他の医薬成分、例えば第二の皮膚治療剤、例えば保湿剤、日焼け止めを含んでもよい。
【０１０４】
キット
本明細書に記載の物質（例えばVEGF抗体又はVEGFもしくはVEGFRをモジュレートする物質）はキットにおいて提供することができる。キットは、(a)本発明物質、例えば物質を含む組成物、及び(b)資料を含んで成る。資料は、本明細書に記載の方法及び／又は本明細書に記載の方法のためのVEGFもしくはVEGFRの使用に関する、説明、教材、販売又は他の材料であることができる。例えば、資料は急性UVB皮膚損傷、例えば日焼けに関する。
【０１０５】
一態様では、資料は、本明細書に記載の方法を適当なやり方で、例えば適当な用量、剤形、又は投与方法（例えば本明細書に記載の用量、剤形又は投与方法）で、本明細書に記載の物質を投与するための指示を含むことができる。好ましい用量、剤形又は投与方法は、局所及び経皮である。別の態様では、資料は、本明細書に記載の物質を適当な被検体、例えばヒト、例えば急性UVB損傷を有するか又はその恐れがあるヒトに投与するための指示を含むことができる。
【０１０６】
該キットの資料はその形に限定されない。多くの場合、資料、例えば指示は、印刷されたもの、例えば印刷されたテキスト、図面及び／又は写真、例えばラベル又は印刷紙で提供される。しかしながら、資料は他の方式、例えば点字、コンピューター可読材料、ビデオ録画、又はオーディオ記録等で提供することもできる。別の態様では、該キットの資料は、コンタクト情報、例えば住所録、ｅメールアドレス、ウエブサイト、又は電話番号であり、該キットの使用者は、VEGFもしくはVEGFR及び／又は本明細書に記載の方法におけるそれの使用についての実質的情報を得ることができる。もちろん、資料はいずれかの方式の組合せで提供することも可能である。
【０１０７】
本明細書に記載の物質に加えて、該キットの組成物は別の成分、例えば溶剤又は緩衝剤、安定剤、保存剤、香料又は他の化粧品成分、及び／又は本明細書に記載の状態もしくは障害を治療するための第二の剤を含んで成ることができる。あるいは、該キットの中に別の成分を含めることができるが、本明細書に記載の物質とは異なる組成物又は容器に別の成分を含めることができる。そのような態様では、該キットが本明細書に記載の物質と別の成分とを混合するための、又は本明細書に記載の物質を別の成分と一緒に使用するための、指示を含む。
【０１０８】
本明細書に記載の物質は、任意の形態で、例えば液体、乾燥形又は凍結乾燥形で提供することができる。本明細書に記載の物質は実質的に純粋及び／又は無菌であることが好ましい。本明細書に記載の物質が液体溶液において提供される場合、該溶液は好ましくは水溶液であり、無菌水溶液が好ましい。本明細書に記載の物質が乾燥形で提供される場合、一般に適当な溶剤の添加により再構成される。溶剤、例えば無菌水又は緩衝剤は、場合によりキットの中に提供される。
【０１０９】
該キットは、本明細書に記載の物質を含有する組成物のための１又は複数の容器を含むことができる。或る態様では、該キットは、組成物と資料のための別々の容器、分離材又は区画を含む。例えば、組成物がビン、バイアル又はシリンジの中に提供され、そして資料がプラスチックスリーブ又はパケットの中に含められる。別の態様では、該キットの個々の要素が１つの分離されない容器の中に含められる。例えば、組成物が、ラベルの形で資料が付着されているビン、バイアル又はシリンジの中に含められる。或る態様では、キットは、各々が本明細書に記載の物質の１もしくは複数の単位投与形態（例えば本明細書に記載の物質形）を含有する、複数の（例えば１パックの）個々の容器を含んで成る。例えば、該キットが複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット又はブリスターパックを含み、その各々が本明細書に記載の物質の１回量を含有する。該キットの容器は気密及び／又は防水であることができる。
【０１１０】
該キットは、組成物の投与に適当な装置、例えばシリンジ、吸入器、ピペット、計量スプーン、滴下器（例えば点眼器）、棒（例えば綿棒は木棒）、又は任意のそのような送達装置を含む。好ましい態様では、該装置が棒である。
【実施例】
【０１１１】
材料と方法
UVB照射処置計画
雌無毛マウスSkh1マウス（８週齢）を、記載の通りに〔Kochevar他(1993) J. Invest. Dermatol. 100:186-93〕、４個の等間隔に置かれた蛍光ランプ（Southern New England Ultraviolet, Bradford, CN）の壁を使って、UVB放射線に暴露した。マウス（グループ当たりｎ＝７）を偽照射するか、又は40 mJ/cm2の開始線量でそして4.5 MEDの最大線量まで0.5 MED（0.5最小紅斑量；MED）の増分で徐々に増加するUVB放射線に、10週間に渡り週３回、暴露した。UVBの全累積線量は5.46 J/cm2であった。急性日焼け反応は全く観察されなかった。追加の実験では、８週齢の雌Skh1マウス、K14プロモーターの調節下にマウスVEGF164の皮膚特異的過剰発現を有するFVBトランスジェニックマウス〔Detmar他（1998）J. Invest. Dermatol. 111:1-6〕又は野生型FVBマウス（グループ当たりｎ＝５）を、40 mJ/cm2（0.5 MED）又は80 mJ/cm2（１MED）の１回線量のUVB放射線で照射した。加えて、野生型マウス（ｎ＝５／グループ）を、50μｇの抗マウスVEGF中和抗体（R＆D Systems, Minneapolis, MN）又は50μｇの対照IgGで、記載の通りに（Hirakawa他（2005）Blood 105:2392-9）54 mJ/cm2のUVB照射への暴露の24時間前に、腹腔内注射により処置した。全ての動物実験はMassachusettus General Hospital Subcommittee on Research Animal Careにより承認された。
【０１１２】
生体内リンパ管撮影法
マウス（ｎ＝７／グループ）をアベルチン（0.4 g/kg, Sigma）により麻酔し、そしてリンパ管を可視化するために、10μlのハミルトン注射器を使って、耳介辺縁の内面の所に0.9％NaCl中１％エヴァンス青色素溶液１μlを皮内注射した。マウス耳を色素注射の１分、３分及び５分後に撮影した。
【０１１３】
定量的リアルタイムRT-PCR法
マウスの全背中皮膚から、最終UVB照射（ｎ＝７／グループ）の２日後に、TRIZOL試薬（登録商標、Invitrogen, Carsbad, CA）を使って全細胞RNAを単離し、続いてRQI RNアーゼ不含有DNアーゼ（Promega, Madison, WI）で処理した。全皮膚を、Tissue Lyser（Qiagen GmbH, ドイツ）を使ってホモジナイズした。VEGF-A, -C及び-D mRNAの発現レベルを、記載の通りに〔Hong他（2004）Nat. Genet. 36:683-5〕、ABI PRISM（登録商標）7000配列検出装置（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使った定量的実時間RT-PCR法により調べた。マウスVEGF-A, -C及び-Dのためのプライマーとプローブは既に記載されている〔Kunstfeld他（2004）Blood 104:1048-57〕。各反応は、内部標準としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）プライマー〔正プライマー：5’-TCACTGGCATGGCCTTCC-3’(配列番号１)、逆プライマー：5’-GGCGGGCACGTCAGATCCA-3’（配列番号２）〕、及びプローブ〔5’-JOE-TTCCTACCCCCAATGTGTCCGTCG-TAMRA-3’（配列番号３）〕を使って多重化した。
【０１１４】
免疫染色及びコンピューター支援血管分析法
免疫蛍光分析法は、マウスLYVE-1〔Banerji他（1999）J. Cell Biol. 144:789-801〕、マウスCD31（BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA）に対するポリクローナル抗体、及びALEXA FLUOR（登録商標）488又はAKEXA FLUOR（登録商標）594（Molecular Probes, Eugene, OR）で標識された対応する第二抗体を使って、マウス組織の６μｍクリオスタット切片に対して実施した〔Kajiya他（2005）EMBO J. 24:2885-95〕。切片をNikon E-600顕微鏡（Nikon, Melville, NY）により検査し、そしてSPOTTMデジタルカメラ（Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI）により画像を取り込んだ。形態学的分析は、記載の通りに〔Hirakawa他（2005）Blood 105:2392-9〕IPLABTMソフトウエア（Scanalytics, Fairfax, VA）を使って実施した。各切片の３つの異なる領域を調査し、そして１平方マイクロメートル当たりの管の数、平均管サイズ、及びリンパ管により占有される相対組織面積を、表皮−真皮接点から200μｍ距離以内の領域にある皮膚において測定した。対応のないStudent ｔ−検定を使って、微小管密度及びサイズの相違を分析した。加えて、汎用ヘマトキシリン−エオシン染色を以前に記載された通りに実施した〔Prophet, Arrington & Sobin (1992) Laboratory Methods in Histotechnology〕。
【０１１５】
実施例１：慢性UVB照射は皮膚リンパ管の拡大を引き起こす
リンパ管構造に対するUVB照射の影響を調べるために、本発明者らはまず、10週間の期間に渡り、5.46 J/cm2の累積線量でSkh1無毛マウス〔Kligman (1996) Clin. Dermatol. 14:183-95〕の慢性UVB照射を実施した。慢性UVB照射は、以前に報告された通り〔Yano他（2002）J. Invest. Dermatol. 118:800-5〕顕著なシワ形成を引き起こしたが、一方で偽照射したマウスではそのような変化は検出されなかった。組織学的検査は、慢性UVB損傷の典型的徴候、例えば表皮増生、炎症細胞浸潤、及び浮腫形成を示した（図１Ａ及びＢ）。全血管（panvascular）マーカーCD31及びリンパ特異的ヒアルロナン受容体LYVE-1についての二重免疫蛍光染色は、以前の実験〔Yano他（2005）Br. J. Dermatol. 152:115-21〕と一致して、CD31＋/LYVE-1−血管の中程度の拡大を示した（図１Ｃ及びＤ）。驚くべきことに、LYVE-1陽性皮膚リンパ管はサイズが著しく増加し、不規則な形状と時折管壁の不完全な内皮細胞内壁を有し、一方で偽照射マウスでは正常なリンパ管だけが観察された（図１Ｃ及びＤ）。コンピューター支援形態学的分析は、リンパ管により占有される平均皮膚面積（偽照射マウスに対して2.5倍増加；Ｐ＜0.01）及び皮膚リンパ管の平均サイズ（2.1倍増加；Ｐ＜0.01）が、偽照射マウスに比較して、UVB照射皮膚において有意に増加した（図１Ｅ及びＦ）。対照的に、リンパ管の密度は両グループとも同等であった（図１Ｇ）。
【０１１６】
実施例２：慢性UVB照射後のリンパ管の機能の損傷及び漏出の増加
皮膚リンパ管の機能に対する慢性UVB照射の影響を更に調べるために、エヴァンス青色素をマウス耳介辺縁に皮内注射した。色素注射の１分後と３分後に、偽照射マウスに比較して、慢性UVB照射マウスの皮膚において著しく拡張したリンパ管が視覚化された（図２Ａ,Ｂ，Ｄ，Ｅ）。５分後、慢性UVB照射皮膚ではエヴァンス青色素がリンパ管から排出されたが、一方で偽照射マウスではそのような漏出は観察されなかった（図２Ｃ及びＦ）。これらの観察結果は、UVB照射後に拡大したリンパ管が脆弱で且つ機能的に損傷されていることを示す。
【０１１７】
実施例３：慢性UVB照射はVEGF-Aのアップレギュレーションを引き起こすが、VEGF-C又は-D発現のそれは引き起こさない
慢性UVB照射が、表皮角化細胞による既知のリンパ管形成因子VEGF-A〔Nagy他（2002）J. Exp. Med. 196:1497-506〕、VEGF-C又はVEGF-D〔Jussila他（2002）Physiol. Rev. 82:673-700〕のいずれかのアップレギュレーションを引き起こすかどうかを調べるために、本発明者らは耳皮膚の表皮から全RNAを単離し、次いでmRNA発現の定量的実時間TAQMANTM RT-PCR分析を行った。偽照射対照に比較して、UVB照射表皮においてVEGF-A mRNA発現の2.2倍アップレギュレーションが観察された（Ｐ＜0.01；図３Ａ）。対比して、VEGF-C及びVEGF-D mRNA発現レベルは両グループとも同等であった（図３Ｂ及びＣ）。表皮と真皮の両方を含む全皮膚溶解物から単離した全RNAを使って実験した時も同様な結果が得られた。
【０１１８】
実施例４：急性UVB照射は皮膚リンパ管の拡大と高透過性を誘導する
本発明者らは次に、急性UVB単回照射がリンパ管機能を損傷するのに十分であるかどうかを調べた。40 mJ/cm2の線量の単回UVB照射（0.5最小紅斑量；MED）の２日後、皮内エヴァンス青色素注射による皮膚リンパ管の可視化は、リンパ管が非照射皮膚におけるものと区別不可能であり、且つそれらは高透過性ではないことを示した（図４Ａ〜Ｆ）。対照的に、80 mJ/cm2の線量のUVB照射（１ MED）は、皮膚リンパ管の拡大を誘導し（図４Ｇ〜Ｈ）、そして顕著な漏出が観察された（図４Ｉ）。皮膚切片の示差免疫蛍光分析は、80 mJ/cm2でのUVB照射後にLYVE-1+リンパ管の著しい拡大を示したが、CD31+／LYVE-1-血管は中程度の拡大しか見られなかった（図４Ｌ）。しかしながら、非照射皮膚と40 mJ/cm2のUVB線量で照射した皮膚では、そのような変化は全く観察されなかった（図４Ｊ，Ｋ）。
【０１１９】
実施例５：UVB照射したVEGF-Aトランスジェニックマウスにおけるリンパ管の拡大の増加
本発明者らは、VEGF-AのmRNA発現がUVB照射後に表皮角化細胞によりアップレギュレートされることを発見したので、次に表皮由来VEGF-Aがリンパ管のUVB誘発拡大及び漏出を直接促進し得るかどうかを調べた。従って、ケラチン14プロモーターの調節下でマウスVEGF164を過剰発現するトランスジェニックFVBマウス〔Detmar他（1998）J. Invest. Dermatol. 111:1-6〕とFVB野生型マウスを、40 mJ/cm2 の単回UVB照射に暴露するか又は偽照射した。UVB照射後２日目の耳切片の示差免疫蛍光は、偽照射した野生型マウスとUVB照射した野生型マウスにおいてCD31+／LYVE-1-血管及びLYVE-1+リンパ管の数とサイズが同等であることを示した（図５Ａ及びＣ）。偽照射したVEGFトランスジェニックマウスは、野生型マウスに比較して、リンパ管サイズのわずかな増加を示した（図５Ｂ）。重要であるのは、VEGFトランスジェニックマウスのUVB照射後、耳の肥厚と浮腫形成の増加に伴って、リンパ管が著しく拡大した（図５Ｄ）。コンピューター介在形態学的分析は、野生型マウスに比較して、偽照射したVEGFトランスジェニックマウスにおいてリンパ管サイズの1.3倍増加（ｐ＜0.05）を示し、そして更にUVB照射後に有意な1.9倍拡大（ｐ＜0.01；図５Ｅ）を示した。リンパ管の密度は全てのグループにおいて同等であった（図５Ｆ）。
【０１２０】
実施例６：VEGF-Aの全身性阻止はリンパ管のUVB誘発拡大を阻害する
本発明者らは、次にVEGF-Aの全身性阻止がUVB誘発リンパ管拡大を防止するかどうかを調べた。野生型FVBマウスを、VEGF-Aに対する阻止抗体の又は同量の対照IgGの腹腔内注射の１日後に、54 mJ/cm2 のUVB単回照射に暴露した。UVB照射後２日目のCD31とLYVE-1についての二重免疫蛍光染色は、LYVE-1陽性リンパ管の顕著な拡大、並びに対照IgGで処置したマウスにおいてはCD31+／LYVE-1-血管の中程度の肥大を証明した（図６Ａ及びＣ）。対比して、VEGF-A阻止抗体による全身処置は、リンパ管と血管の拡大を完全に防止した（図６Ｂ及びＤ）。
【０１２１】
他の態様
本発明の多数の態様を記載してきた。それにも係わらず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多数の変更を行えることが分かるだろう。従って、他の態様も添付の請求の範囲内に含まれる。
すべての引用した特許、出願、及び参考文献は参考として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、慢性UVB照射後（図１Ｂ）のリンパ管の拡大と偽照射皮膚（図１Ａ）のリンパ管の非拡大を示す、ヘマトキシリン／エオシン染色皮膚組織試料の顕微鏡写真である。目盛：100μｍ。  図１Ｃ〜Ｄは、UVB照射（図１Ｄ）及び偽照射（図１Ｃ）した皮膚組織試料におけるCD31及びLYVE-1についての免疫蛍光顕微鏡写真である。UVB照射した皮膚試料は、UVB照射皮膚のCD31+／LYVE-1-血管の中程度の拡大を示した（図１Ｄ）。LYVE-1陽性皮膚リンパ管は、大きさが著しく増加し、不規則な形状を有し、時折不完全な内皮細胞ライニング（内壁）を有したのに対し、偽照射したマウスでは正常な虚脱性リンパ管のみが観察された（図１Ｄ）。目盛：100μｍ。
【０１２３】
図１Ｅ〜Ｇは、慢性UVB照射及び偽照射したマウスからの皮膚試料の形態学的分析を描写する棒グラフである。図１Ｅは、慢性UVB照射及び偽照射したマウスからの皮膚試料におけるリンパ管により占有された面積を表す。図１Ｆは、慢性UVB照射及び偽照射したマウスからの皮膚試料におけるリンパ管の平均サイズを表す。図１Ｇは、慢性UVB照射及び偽照射マウスからの皮膚試料におけるリンパ管の密度を表す。リンパ管により占有された面積（図１Ｅ）とリンパ管の平均サイズ（図１Ｆ）は、偽照射した皮膚に比較してUVB照射した皮膚において有意に増加した（**、ｐ＜0.01）。
【０１２４】
【図２】図２Ａ〜Ｆは、エバンス青色素を皮内に注射したマウス耳の写真である。図２Ａ〜Ｃは偽照射したマウスを表す。図２Ｄ〜Ｆは慢性的にUVB照射したマウスを表す。色素の広がりを、注射１分後（図２Ａと２Ｄ）、３分後（図２Ｂと２Ｅ）、及び５分後（図２Ｃと２Ｆ）に示す。インク注射から１分及び３分後に、偽照射したマウス（図２Ａ〜Ｂ）に比較して、慢性UVB照射したマウス皮膚（図２Ｄ〜Ｅ）において著しく膨張したリンパ管が可視化された。５分後、慢性UVB照射した皮膚（図２Ｆ）においてリンパ管からエバンス青色素が漏出されたのに対し、偽照射したマウス（図２Ｃ）ではそのような漏出は観察されなかった。
【０１２５】
【図３】図３Ａ〜Ｃは、慢性UVB照射後48時間目の耳皮の上皮から単離された全RNAの定量的実時間RT-PCR分析を描写する棒グラフである。偽照射した対照に比較して、UVB照射した表皮において、VEGF-A mRNA発現（図３Ａ）がアップレギュレートされた（***、ｐ＜0.01）。対照的に、VEGF-C（図３Ｂ）とVEGF-D（図３Ｃ）mRNA発現レベルは両グループにおいて同等であった。
【０１２６】
【図４】図４Ａ〜Ｉは、皮内注射したエバンス青色素によるマウス耳の写真である。図４Ａ〜Ｃは、偽照射したマウス（０ mJ/cm2）を表す。図４Ｄ〜Ｆは40 mJ/cm2 UVB（0.5 MED）の１回線量の２日後のマウスを表す。図４Ｇ〜Ｉは、80 mJ/cm2 UVB（1 MED）の１回線量の２日後のマウスを表す。色素の広がりが、注射の１分後（図２Ａ，２Ｄ及び２Ｇ）、３分後（図２Ｂ，２Ｅ及び２Ｈ）及び５分後（図２Ｃ，２Ｆ及び２Ｉ）に示される。80 mJ/cm2の線量による照射は、皮下リンパ管の拡大（図４Ｇ〜Ｈ）及び顕著な漏出（図４Ｉ）を引き起こした。
【０１２７】
図４Ｊ〜Ｌは、０ mJ/cm2（図４Ｊ），40 mJ/cm2（図４Ｋ）及び80 mJ/cm2（図４Ｌ）を照射した皮膚試料におけるCD31とLYVE-1についての免疫蛍光顕微鏡写真である。皮膚片のLYVE-1及びCD31についての示差免疫蛍光分析は、80 mJ/cm2のUVB照射後にLYVE-1+リンパ管の顕著な拡大を示した。未照射の皮膚（図４Ｊ）又は40 mJ/cm2で照射した皮膚（図４Ｋ）においては、そのような変化は全く観察されなかった。目盛：100μｍ。
【０１２８】
【図５】図５Ａ〜Ｄは、40 mJ/cm2のUVBの１回線量を照射した（図５Ｃ〜Ｄ）又は偽照射した（図５Ａ〜Ｂ）、野生型（図５Ａ及び５Ｃ）及びVEGFトランスジェニック（図５Ｂ及び５Ｄ）マウスの皮膚試料における、CD31及びLYVE-1についての免疫蛍光顕微鏡写真である。偽照射したVEGFトランスジェニックマウスは、野生型マウス（図５Ａ）に比較して、リンパ管サイズのわずかな増加を示した（図５Ｂ）。リンパ管は、UVB照射したVEGFトランスジェニックマウス（図５Ｄ）において浮腫形成を伴って大幅に膨張した。目盛：100μｍ。
【０１２９】
図５Ｅ〜Ｆは、慢性UVB照射した及び偽照射した野生型及びVEGFトランスジェニックマウス（図５Ｄ）からの皮膚試料の形態学的分析を描写する棒グラフである。図５Ｅは、慢性UVB照射した及び偽照射した野生型及びVEGFトランスジェニックマウスからの皮膚試料中のリンパ管の平均サイズを表す。図５Ｆは、慢性UVB照射した及び偽照射した野生型及びVEGFトランスジェニックマウスからの皮膚試料におけるリンパ管の密度を表す。形態学的分析は、野生型マウスに比較して偽照射したVEGFトランスジェニックマウスにおいてリンパ管サイズの1.3倍増加を示し（＊，ｐ＜0.05）、そしてUVB照射後には1.9倍増加を示した（**，ｐ＜0.01）（図５Ｅ）。リンパ管の密度は全グループで同等であった（図５Ｆ）。
【０１３０】
【図６】図６Ａ〜Ｄは、VEGF-Aに対する阻止抗体（図６Ｂ及び６Ｄ）又は対照IgG（図６Ａ及び６Ｃ）の腹腔内注射の１日後に、１回線量54 mJ/cm2のUVB照射により照射したマウスからの皮膚試料におけるCD31とHoechst染料（図６Ａ〜Ｂ）又はCD31とLYVE-1（図６Ｃ〜Ｄ）についての免疫蛍光顕微鏡写真である。UVB照射２日後のCD31とLYVE-1についての二重免疫蛍光染色は、対照IgGで処理したマウスにおいてLYVE-1陽性リンパ管の拡大（矢先）、並びにCD31+/LYVE-1血管の中程度の膨張（矢印）を示した（図６Ａ及び６Ｃ）。抗VEGF-A処理は、リンパ管と血管の拡張を防止した（図６Ｂ及び６Ｄ）。目盛：100μｍ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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