(57)【要約】  本発明は、インターロイキン２部分、及びフィブロネクチンの特別ドメインBを特異的に認識する抗体部分を含んで成る融合タンパク質の特定形の癌の処理のためへの使用に関する。さらに、本発明は、（i）前記融合タンパク質、及び（ii）小分子、すなわちゲムシタビンの組合せにも関する。前記融合タンパク質又は組合せは、癌、特に膵臓癌の処理のために使用され得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌の処理のための薬剤の製造のためへの、
ED−B−フィブロネクチンドメインを特異的に認識する抗体部分、及び
インターロイキン−２部分を含んで成る融合タンパク質の使用。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、N−末端抗体部分、及びC−末端インターロイキン２部分を有するか、又は
前記融合タンパク質が、N−末端インターロイキン２部分及びC−末端抗体部分を有する請求項１記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、前記抗体部分及びインターロイキン２部分を連結する融合タンパク質リンカーを有する請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
前記抗体部分が、ナノモル以下の親和性を伴って、EDb腫瘍胎児性フィブロネクチンドメインに対して特異的に結合する請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
前記抗体部分が、L19抗体の少なくとも１つのCDR配列を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記抗体部分が、配列番号６〜11の配列を含んで成る請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
前記抗体部分が、配列番号01の少なくとも１つのVH鎖、又は配列番号02の少なくとも１つのVL鎖を含んで成る請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
前記抗体部分が、配列番号01の１つのVH鎖、及び配列番号02の１つのVL鎖を含んで成る請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
前記H及びL鎖が、抗体リンカーにより連結される請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体リンカーが、配列番号03の配列、又は配列番号03の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んで成る請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
前記インターロイキン２部分が、ヒトインターロイキン２又はその機能的変異体である請求項１〜10のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
前記インターロイキン２部分が、配列番号04の配列を含んで成る請求項１〜11のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
融合タンパク質リンカーが、前記抗体部分及びインターロイキン２部分を連結している請求項１〜12のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
前記融合タンパク質リンカーが、１〜30個の長さのアミノ酸を有する請求項13記載の使用。
【請求項１５】
前記融合タンパク質リンカーが、配列番号05の配列を含んで成る請求項13又は14記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも（i）融合タンパク質、及び（ii）ゲムシタビン（gemcitabine）を含んで成る組合せであって、
前記融合タンパク質が、EDb−フィブロネクチンドメインを特異的に認識する抗体部分、及び
インターロイキン−２部分を含んで成ることを特徴とする組合せ。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が、N−末端抗体部分、及びC−末端インターロイキン２部分を有するか、又は
前記融合タンパク質が、N−末端インターロイキン２部分及びC−末端抗体部分を有する請求項16記載の組合せ。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、前記抗体部分及びインターロイキン２部分を連結する融合タンパク質リンカーを有する請求項16又は17記載の組合せ。
【請求項１９】
前記抗体部分が、ナノモル以下の親和性を伴って、EDb腫瘍胎児性フィブロネクチンドメインに対して特異的に結合する請求項16〜18のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２０】
前記抗体部分が、L19抗体の少なくとも１つのCDR配列を含む請求項16〜19のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２１】
前記抗体部分が、配列番号６〜11の配列を含んで成る請求項16〜20のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２２】
前記抗体部分が、配列番号01の少なくとも１つのVH鎖、又は配列番号02の少なくとも１つのVL鎖を含んで成る請求項16〜21のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２３】
前記抗体部分が、配列番号01の１つのVH鎖、又は配列番号02の１つのVL鎖を含んで成る請求項16〜22のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２４】
前記H及びL鎖が、抗体リンカーにより連結される請求項16〜23のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２５】
前記抗体リンカーが、配列番号03の配列、又は配列番号03の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んで成る請求項16〜24のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２６】
前記インターロイキン２部分が、ヒトインターロイキン２又はその機能的変異体である請求項16〜25のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２７】
前記インターロイキン２部分が、配列番号04の配列を含んで成る請求項16〜26のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２８】
融合タンパク質リンカーが、前記抗体部分及びインターロイキン２部分を連結している請求項16〜27のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項２９】
前記融合タンパク質リンカーが、１〜30個の長さのアミノ酸を有する請求項16〜28のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項３０】
前記融合タンパク質リンカーが、配列番号05の配列を含んで成る請求項16〜29のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項３１】
ゲムシタビンがゲムシタビン塩酸塩である請求項16〜30のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項３２】
薬剤として使用するための請求項16〜30のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項３３】
癌の処理のための薬剤として使用するための請求項16〜30のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項３４】
前記癌が、非小細胞肺癌、頭及び首癌、卵巣癌及び乳癌から選択される請求項33記載の組合せ。
【請求項３５】
前記癌が、膵臓癌である請求項33記載の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（i）インターロイキン２部分、及びフィブロネクチンのエキストラドメインB（ED−B−フィブロネクチン）を特異的に認識する抗体部分を含んで成る融合タンパク質、及び（ii）ゲムシタビン（Gemcitabine）の組合せ、及び癌、特に膵臓癌の処理のためへのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術状態：
膵臓の腺癌は、産業化された西洋国における癌関連死亡の中の５番目の原因を表す（Parker SL, Tong T, Bolden S, Wingo PA. Cancer statistics, 1997. CA Cancer J Clin 1997;47:5-27）。膵臓癌として診断された患者の予後は、わずか１〜４％の推定される全体的な5年生存率を有するので、非常に不良である。手術による切除は、わずかな可能性ある治療処理を提供するが、局部的に拡大されたか又は転移された疾病は、ほとんどの場合、手術処理を不可能にする（Rosewicz S, Wiedenmann B. Pancreatic carcinoma. Lancet 1997;349:485-489; Cohen SJ, Pinover WH, Watson JC, Meropol NJ. Pancreatic cancer. Curr Treat Options Oncol 2000; 1:375-386）。
【０００３】
さらに最近入手できる緩和手段は、この新生成物の攻撃路に対してはほとんど影響を有さず、4〜6ヶ月の憂鬱なメジアン生存率を伴って、20％以下の客観的応答率に達する（Burris HA, III, Moore MJ, Andersen J, Green MR, Rothenberg ML, Modiano MR, Cripps MC, Portenoy RK, Storniolo AM, Tarassoff P, Nelson R, Dorr FA, Stephens CD, Von Hoff DD. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol 1997;15:2403-2413）。
【０００４】
現在の化学療法剤及び放射線処理は、腫瘍細胞の急速に分裂する性質に依存し、それにより、不良な選択性を有する。増殖性非悪性細胞に対する許容できない毒性が用量の段階的拡大を制限し、そして治療用量の投与を妨げる。さらに、ほとんどの化学療法剤は、腫瘍部位で選択的に蓄積しない（Bosslet K, Straub R, Blumrich M, Czech J, Gerken M, Sperker B, Kroemer HK, Gesson JP, Koch M, Monneret C. Elucidation of the mecha- nism enabling tumor selective prodrug monotherapy. Cancer Res 1998;58:1195-1201）。
【０００５】
高い間隙圧力及び不規則な腫瘍脈管構造のために、化学療法剤は、腫瘍内で適切なレベルに達することはできない（Folli S, Pelegrin A, Chalandon Y, Yao X, Buchegger F, Lienard D, Lejeune F, Mach JP. Tumor-necrosis factor can enhance radio-antibody uptake in human colon carcinoma xenografts by increasing vascular permeability. Int J Cancer 1993;53:829-836; Jain RK. Transport of molecules in the tumor interstitium: a review. Cancer Res 1987;47:3039-3051）。
【０００６】
しかしながら、抗癌効能のために必要である用量は許容できない毒性に関係しているので、全身性TNFαの臨床学的開発は失敗した（Jones AL, Selby P. Tumor necrosis factor: clinical relevance. Cancer surveys 1989;8:817-836）。それらの障害を回避するための１つの有望な達成方法は、抗体特異的リガンド、例えば腫瘍関連マーカーに対して特異的な抗体を通して腫瘍微小環境への治療剤の標的化された供給から成る。
【０００７】
特に、腫瘍脈管形成に関連するマーカーの標的化は、多くの理由のために興味ある治療手段を提供する。最初に、腫瘍新生脈管構造の周囲に及び腫瘍支質において選択的に発現される標的物は、静脈内投与される抗体誘導体に容易に接近できる。第２に、新生脈管構造のマーカーが典型的には、腫瘍細胞よりも遺伝的により安定している、内皮細胞及び/又は繊維芽細胞により生成される。第３に、脈管形成は腫瘍増殖及び転移の必要条件であるので、新規形成する血管への毒性剤の選択的供給が治療的有益性を提供する。
【０００８】
最終的に、脈管形成、すなわち先に存在する血管からの新規毛管の増殖がすべての攻撃的固体腫瘍の特徴であるので、それらの標的物は、全−腫瘍（pan-tumoral）抗原として見なされ得る（Halin C, Zardi L, Neri D. Antibody-based targeting of angiogenesis. News Physiol Sci 2001;16:191- 194; Alessi P, Ebbinghaus C, Neri D. Molecular targeting of angiogenesis. Biochim Biophys Acta 2004; 1654:39-49）。
【０００９】
これまで知られている新生脈管形成及び組織再造形に関連する、最も選択的な腫瘍性胎児マーカーの１つは、フィブロネクチン（FN）のエストラドメインB（ED-B）を提供する（Castellani P, Viale G, Dorcaratto A, Nicolo G, Kaczmarek J, Querze G, Zardi L. The fibronectin isoform containing the ED - B oncofetal domain: a marker of angiogenesis Int J Cancer. 1994 Dec l ;59(5):612-8. Erratum in: Int J Cancer 1995 JuI 4;62(1):118）。FNは、広範囲の健康な組織及び体液において多量に発現される高分子量細胞外マトリックス（ECM）成分である。種々の異なったFNイソフォームが、一次転写体での選択的スプライシングのために生成され得る。
【００１０】
マウス及びヒトにおける配列において同一である、91個のアミノ酸の小ドメインED−Bは、血管及び組織フィブロネクチンの両者において通常不在であるが、但し再生する子宮内膜及び卵巣のいくらかの血管に関しては除く（Alessi P, Ebbinghaus C, Neri D. Molecular targeting of angiogenesis. Biochim Biophys Acta 2004;1654:39-49; Viti F, Tarli L, Giovannoni L, Zardi L, Neri D. Increased binding affinity and valence of recombinant antibody fragments lead to improved targeting of tumoral angiogenesis. Cancer Res 1999;59:347-352）。
【００１１】
しかしながら、それは、新生脈管形成に関連する活性組織再造形の間、フィブロネクチン分子に挿入されるようになり、新生脈管構造の周囲に、及び悪性腫瘍の支質及び再構造形及び脈管形成を受ける他の組織に蓄積する。最近、フィブロネクチンのED−Bドメインに対して特異的な多くの良好な品質の抗体が生成されている。
【００１２】
特に、ED−Bに対してピコモルでの結合親和性を示すヒト一本鎖Fv抗体フラグメントscFv（L19）が、実験腫瘍モデル（Viti F, Tarli L, Giovannoni L, Zardi L, Neri D. Increased binding affinity and valence of recombinant antibody fragments lead to improved targeting of tumoral angiogenesis. Cancer Res 1999;59:347-352）及び癌を有する患者（Santi- maria M, Moscatelli G, Viale GL, Giovannoni L, Neri G, Viti F, Leprini A, Borsi L, Castellani P, Zardi L, Neri D, Riva P. Immunoscintigraphic detection of the ED - B domain of fibronectin, a marker of angiogenesis, in patients with cancer. Clin Cancer Res 2003;9:571-579）において、標的腫瘍新生脈管構造を選択的に標的化することが確かめられており、従って腫瘍新生脈管への治療剤の選択的供給のための手段を提供する。
【００１３】
これに関しては、インターロイキン２（IL-2）が、最も有能な抗腫瘍サイトカインの１つとして特徴づけられている。それは、免疫調節効果、例えば種々の抗腫瘍エフェクター細胞の刺激を示す（Rosenberg SA. Progress in the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. J Intern Med 2001;250:462-475）。しかしながら、転移性腎細胞癌の臨床処理について立証されているにもかかわらず、全身適用されるIL-2は、所望するほど好結果をもたらすことが証明されていない。
【００１４】
全身適用されるIL-2の治療効果は、用量拡大を制限し、そして治療用量の投与を妨げる、その重大な潜在的に生命脅威の副作用（例えば、起立性低血圧、血管漏れ病症候群及び深い不調感）により妨げられる（Bubenik J, Den Otter W, Huland E. Local cytokine therapy of cancer: interleukin-2, interferons and related cytokines. Cancer Immu- nol Immunother 2000;49:l 16-122; Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Evidence for a structural motif in toxins and interleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and initiating vascular leak syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:3957-3962）。
【００１５】
さらに、全身的に供給されるIL-2の急速な分解又は排除がさらに、その有効性を低める。他方では、IL−2の局部投与は、より好結果をもたらし、そして悪性滲出の制御、及び確立された損傷の有意な緩解の生成をもたらしている（Bubenik J, Den Otter W, Huland E. Local cytokine therapy of cancer: interleukin-2, interferons and related cytokines. Cancer Immunol Immunother 2000;49: 116-122; Den Otter W, Do- browolski Z, Bugajski A, Papla B, Van Der Meijden AP, Koten JW, Boon TA, Siedlar M, Zembala M. Intravesical interleukin-2 in Tl papillary bladder carcinoma: regression of marker lesion in 8 of 10 patients. J Urol 1998;159:1183-1186; Baselmans AH, Koten JW, Battermann JJ, Van Dijk JE, Den Otter W. The mechanism of regression of solid SL2 lymphosarcoma after local IL-2 therapy. Cancer Immunol Immunother 2002;51:492-498; Krastev Z, Koltchakov V, Popov D, Alexiev A, Koten JW, Den Otter W. A case of hepatocellular carcinoma (HCC): treatment with local application of alcohol and interleukin 2 (IL-2). Hepatogastroenterology 2003;50:1647-1649）。
【００１６】
これに関して、サイトカインIL-2を、FNのED−Bに対して特異的なscFv L19に接合することによる、そのIL-2の腫瘍微小環境への標的化されたアップロードは、IL-2の治療指数を増強し、そして同時に、その毒性副作用を低めるために魅力ある概念であると思われる。これまで、腫瘍微小環境へのIL-2のL19−介在性供給が、奇形癌、小細胞肺癌及び結腸腺癌の皮下マウスモデルを用いて、このサイトカインの治療性能を増強することは確証されている（Carnemolla B, Borsi L, Balza E, Castellani P, Meazza R, Berndt A, Ferrini S, Kosmehl H, Neri D, Zardi L. Enhancement of the antitumor properties of interleukin-2 by its targeted delivery to the tumor blood vessel extracellular matrix. Blood 2002;99:1659- 1665）。
【００１７】
腫瘍は、新規血管の形成（脈管形成）を伴わないで一定質量以上に増殖することはできず、そして微小血管密度と腫瘍侵襲との間の相互関係は多くの腫瘍について報告されている（Folkmann (1995) Nat. Med., Vol. 1, p. 27）。脈管形成のマーカーを選択的に標的化できる分子は、腫瘍、及び血管増殖により特徴付けられる他の疾病、例えばリウマチ様関節炎、糖尿病網膜症及び年齢関連の黄斑性変性の診断及び治療のための臨床学的機会を創造する（O'Reilly など. (1996) Nat. Med. Vol.: 2 p. 689 et seqq; O'Reilly など. (1997) Cell, Vol.: 88, p. 277 et seqq; Friedlander など. (1995) Science Vol.: 270, p. 1500 et seqq; Pasqualini など. (1997) Nat. Biotechnol. Vol.: 15 p. 542 et seqq; Huang など. (1997) Science, Vol.: 275, p. 547 et seqq; Kim など. (1993) Nature, Vol.: 362, p. 841 et seqq; Schmidt - Erfurth など. (1997) Br. J. Cancer, Vol.: 75, p. 54 et seqq）。
【００１８】
EP01223707号はウィルスの処理のためのジフルオロ−炭水化物基を含むヌクレオシドを開示する。EP0184365号は、疑わしい新生体の処理のための薬物としてゲムシタビン（１−（４−アミノ−２−オキソ−1H−ピリミジン−１−イル）−２−デスオキシ−２，２−ジフルオロリボース又は2’−デオキシ−2’, 2’−ジフルオロシチジン）の使用を開示する。ゲムシタビンの合成は、EP 0 184 365号及びEP 727 433号に記載されている。用語“ゲムシタビン”とは、2’−デオキシ−2’, 2’−ジフルオロシチジン、及び生理学的に許容できるその塩、特にその塩酸塩として理解されるべきである。2’−デオキシ−2’, 2’−ジフルオロシチジンの塩酸塩は、商品名Gemzarとして市販されている。
【００１９】
膵臓癌は、化学療法抵抗性癌であり、そして膵臓癌のスタンダロン放射線療法は患者のための生存有益性をもたらさない。いくつかの臨床試験は、放射線療法及びゲムシタビンの組合せを記載する（Blackstock A.W. など. J. Clin. Oncol. 17:2208-2212, 1999; Mose S. など. Strahlenther Onkol. Vol.: 178, pages 59-70, 2002）。膵臓癌の処理のための抗体と組合して、放射線免疫療法において放射線感受性物質としてのゲムシタビンの使用が、いくつかの動物モデルにおいて調べられている。Gold DVなど.（Clin. Can. Res., Vol.: 9, 3929s-3937s,2003）は、ゲムシタビンと組合して、MUC1ムチンに対して向けられたY−90−及びI−131−ラベルされたモノクローナル抗体の使用を記載する。その組合わされた処理は、有意に改良された処理効力をもたらした。
【００２０】
インターロイキン２（IL-2）、すなわちTヘルパー１細胞により生成される４個のαへリックス束のサイトカインは、特定の及び天然の免疫応答の活性化相において必須の役割を演じる（Taniguchiなど. (1993) Cell, Vol.: 73, pages 5 - 8）。IL-2は、活性化されたT及びBリンパ球、及びナチュラルキラー（NK）細胞の増殖及び分化を促進し、そして細胞毒性T細胞（CTL）活性及びNK/リンホカイン活性化されたキラー（LAK）抗−腫瘍細胞毒性を誘発する。IL-2は、いくつかのヒト腫瘍の免疫療法アプローチに使用されて来た（Rosenberg (1992) J. Clin. Oncol. Vol.: 10, pages 180 - 199）。
【００２１】
組換えIL-2（rIL-2）のみ、又は養子移入されたリンパ細胞と組合してのその投与は、動物モデル及び患者の両方において、確立された腫瘍の緩解をもたらした。しかしながら、そのインビボ治療効力は、その急速なクリアランス、及び高い用量で、血管漏れ症候群に主に関連する重度の毒性により制限される（Siegel and Puri (1991) Interleukin-2 tox- icity in J. Clin. Oncol. Vol.: 9 pages 694 - 704）。細胞表面腫瘍マーカーに対して向けられた抗体による腫瘍部位へのIL-2の供給は、IL-2の活性局部濃度の達成、及び全身性投与に関連する毒性の低下を可能にすることができる（Lode etなど. (1998) Pharmacol. Ther. Vol.: 80, pages 277 - 292）。
【００２２】
腫瘍細胞表面で結合されるIL-2の存在は、免疫系のエフェクター細胞、すなわちCD8+細胞毒性T細胞又はナチュラルキラー（NK）細胞のいずれかの活性化及び/又は標的化、及び効果的な抗−腫瘍免疫応答の誘発をもたらす。T−又はNK−細胞は、腫瘍細胞表面での適切なリガンドを特異的に認識する受容体（例えば、T−細胞のためのT−細胞受容体）を通しての１つのシグナル、及び腫瘍細胞表面に位置するIL-2によるIL-2受容体鎖を通して第２シグナルを受ける（Lode et al., 1999, PNAS USA, 96: 8591-8596及びそこに引用される文献）。
【００２３】
フィブロネクチン分子への選択的スプライシングにより挿入される、マウス、ラット及びヒトにおいて同一の91個のアミノ酸の配列である、フィブロネクチンのED-Bドメインは、新生血管構造体の周囲に特異的に蓄積し、そして分子介在のための標的物を提供する（Zardi など. (1987) EMBO J. Vol.: 6, pages 2337 - 2342 ; Carnemolla など. (1989) J. Cell Biol. VoI: 108, pages 1139 - 1148, さらに Castellaniなど, (1994) Int. J. Cancer, Vol. 59, pages 612 - 618）。ED−Bドメインに対して向けられたヒト組換え抗体L19を用いて、インビボ新生血管標的化の可能性は、異なった腫瘍モデルにおいて示されている（Tarli など. (1999) Blood, Vol.: 94, pages 192 - 198; Viti など. (1999) Cancer Res. Vol.: 347）。
【００２４】
ED−B−フィブロネクチンドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体がWO97/45544号に記載されている。
モノクローナル抗体L19は、WO99/58570号に記載されている。
融合タンパク質L19IL2は、例えばWO01/62298号に記載されている。WO01/62298号（第８頁、12行）は、Pini など. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776に記載されているheL19VH及びL19VLドメイン配列を言及する。Piniなどは、第21772頁の表IIにL19の配列の一部を記載する。L19は、EMBL受託番号AJ006113号を有する。
【００２５】
膵臓癌を効果的に処理するための薬物についての強い医学的必要性がある。本発明は、膵臓癌の処理のために適切である新規で且つ効果的な薬物の入手を可能にする。
１つの態様においては、本発明は、膵臓癌の処理のための薬剤の製造のためへの、
ED−B−フィブロネクチンドメインを特異的に認識する抗体部分、及び
インターロイキン−２部分を含んで成る融合タンパク質の使用に関する。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、少なくとも融合タンパク質、及びゲムシタビンを含んで成る組合せに関し、ここで
前記融合タンパク質が、ED−B−フィブロネクチンドメインを特異的に認識する抗体部分、及び
インターロイキン−２部分を含んで成る。
用語“ゲムシタビン”とは、2’−デオキシ−2', 2'−ジフルオロシチジン、及び生理学的に許容できるその塩、特にその塩酸塩として理解されるべきである。2’−デオキシ−2', 2'−ジフルオロシチジンの塩酸塩は、商品名Gemzarとして市販されている。
【００２７】
その塩形でのゲムシタビンは、下記式を有する：
【化１】
2009532408.tif 000003
【００２８】
本発明者は、免疫組織化学により決定される場合、ヒト膵臓癌においてED-B FNの選択的過剰発現を観察し、ところがED−B FNはヒト非形質転換膵臓及び慢性膵炎組織においては検出できなかった。ヒト情況に類似して、定性的に及び定量に比較できるED-B FN発現パターンが一次膵臓腫瘍及びリンパ節において確かめられ、そして正常位マウスモデルの肝臓転移がこの研究において調べられた。
【００２９】
それらのマウスモデルを、臨床学的に代表的なインビボモデルとして用いて、本発明者は驚くべきことには、L19IL2の投与が、確立された一次膵臓腫瘍の増殖を効果的に阻害し、そしてリンパ節転移を低めるか又は排除し、ところが未標的化されたIL-2は少ししか又はまったく治療的効果を誘発しなかったことを示した。また、L19IL2の抗腫瘍活性は、scFv L19抗体フラグメントのみの適用により示されるように、IL-2により独占的に介在されるが、いずれの治療的有益性も達成しなかった。未標的化されたIL-2の適切な性能は、静脈内投与の後、多くの場合、１：20ほどの低い、１以下の腫瘍/器官比率の特徴を示す観察を考慮すれば、驚くべきことではない（Bosslet K, Straub R, Blumrich M, Czech J, Gerken M, Sperker B, Kroemer HK, Gesson JP, Koch M, Monneret C. Elucidation of the mechanism enabling tumor selective prodrug monotherapy. Cancer Res 1998;58:1195-1201）。
【００３０】
これは、膵臓癌の場合、L19IL2の治療効力を証明する最初の研究である。さらに、本発明者は、膵臓癌についての病理生理学的に適切な正常位マウスモデルを用いて、転移性疾病を制御するL19IL2の治療能力を最初に示した。L19IL2の増殖阻害効果は細胞型特異的ではないが、しかし膵臓癌の２種の異なったマウスモデルにおいて確立されており、但しそれらが異なった定量レベルのED-B発現を示すことは注目すべきである。
【００３１】
さらに、本発明者のデータは、L19IL2は単独で、ヒト膵臓癌の処理のために入手できる標準の最も重要な化学療法剤ゲムシタビンよりもかなりの程度まで膵臓癌増殖を阻害できることを示す。実際、L19IL2の２回の適用が、膵臓癌を担持するマウスの腫瘍負荷を、対照において観察される腫瘍負荷のわずか25％まで低めるのに十分であった。L19IL2治療の臨床学的有望性及び視野が、膵臓癌を担持する長期生存マウスの40％において、完全な緩解の誘発及び腫瘍再発の欠失により示された。
【００３２】
さらに、驚くべきことには、陽性治療結果が、L19IL2及びゲムシタビン塩酸塩の組合せ治療による、腫瘍担持マウスの処理により達成され、すなわち一次膵臓腫瘍増殖の97％の阻害（70％の完全な緩解を包含する）が観察された。
【００３３】
IL-2の抗腫瘍活性の基礎となる機構はまた十分には理解されていない。この論点と取り組むために、本発明者は組織学的調査を行った。L19IL2処理されたマウスの最も興味をそそる特徴の１つは、広範囲の腫瘍壊死であった。わずかな白血球のみが浸潤する腫瘍組織の中心部分における壊死の程度及びその位置が観察され、これは、マクロファージ又は他の免疫エフェクター細胞による直接的な細胞−細胞の接触により引起される個々の腫瘍細胞死よりもむしろ他の基礎をなす機構を示唆する。
【００３４】
実際、最近の証拠は、局部IL-2投与に続く広範囲に及ぶ腫瘍壊死のIL-2−依存性誘発が、IL-2活性化された免疫エフェクター細胞（De Mik HJ, Koten JW, Maas RA, Dullens HF, Den Otter W. Tumour regression by IL-2 mediated stagnation of blood flow. In Vivo 1991;5:679-684; Sakkoula E, Pipili-Synetos E, Maragoudakis ME. Involvement of nitric oxide in the inhibition of angiogenesis by interleukin-2. Br J Pharmacol 1997;122:793- 795）により生成されるリンパ球及び酸化窒素により、及び/又はIL-2（Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Evidence for a structural motif in toxins and interleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and initiating vascular leak syndrome. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:3957-3962）及び内皮上の活性化されたNK細胞（Al- bertsson PA, Basse PH, Hokland M, Goldfarb RH, Nagelkerke JF, Nannmark U, Kup- pen PJ. NK cells and the tumour microenvironment: implications for NK-cell function and anti-tumour activity. Trends Immunol 2003;24:603-609; Di Carlo E, Meazza R, Basso S, Rosso O, Comes A, Gaggero A, Musiani P, Santi L, Ferrini S. Dissimilar anti-tumour reactions induced by tumour cells engineered with the interleukin-2 or inter- leukin-15 gene in nude mice. J Pathol 2000;191 :193-201）の直接的な細胞毒性効果により誘発され得る局部血管漏れ症候群によるためであることを示唆する。
【００３５】
内皮細胞がED-B FN含有ECM構造体に沿って移動し（Tarli L, Balza E, Viti F, Borsi L, Castellani P, Berndorff D, Dinkelborg L, Neri D, Zardi L. A high-affinity hu- man antibody that targets tumoral blood vessels. Blood 1999;94:192-198) and that IL-2 is selectively delivered to the ECM by linking it to scFv Ll 9）、そしてIL-2がそれをscFv L19に結合することによりECMに選択的に供給されることを考慮して、IL-2依存性腫瘍壊死及び緩解への、内皮細胞に対するIL-2の直接的な細胞毒性効果の寄与が非常に魅力的な仮説を提供する。
【００３６】
IL-2は内皮細胞に対して細胞毒性を発揮することが報告されているが、このサイトカインは、興味あることには、高濃度のIL-2においてインビトロで妨害を受けないで増殖することができる、癌細胞に対して直接的な影響を有さない（Rosenberg SA. Progress in the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. J Intern Med 2001 ;250:462-475）。それにもかかわらず、L19IL2により処理されたマウスの腫瘍サンプルは、Ki67発現についての免疫組織化学分析により示されるように、増殖細胞の数の相当な上昇を示した。
【００３７】
L19IL2誘発された腫瘍緩解を仲介する可能性ある免疫エフェクター細胞に関して、本発明者は、L19IL2が、免疫組織化学を通して、腫瘍浸潤性マクロファージの数の４倍の上昇を誘発したことを観察した。この観察は、マクロファージが殺腫瘍活性、及びサイトカイン及び成長因子生成によるIL-2刺激に応答する概念と一致する。さらに、マクロファージの消耗がIL-2の治療効力を弱めることが確立されている（Masztalerz A, Van Rooijen N, Den Otter W, Everse LA. Mechanisms of macrophage cytotoxicity in IL-2 and IL- 12 mediated tumour regression. Cancer Immunol Immunother 2003 ;52:235-242）。しかしながら、マクロファージ消耗は、IL-2の抗腫瘍活性を完全には排除することができず、このことは、さらなる機構の寄与を示唆している。
【００３８】
この概念によれば、NK細胞の強く（70倍）増強された存在が、この研究においてL19IL2処理された腫瘍に観察された。IL-2誘発された抗腫瘍応答について、腫瘍組織へのNK細胞浸潤の機能的有意性が、NK細胞消耗が膵臓癌に対するL19IL2の治療効果を完全に破壊する観察により確立された。さらに、本発明者のデータは、次の証拠により指示される：（i）NK細胞による腫瘍組織の管外滲出及び浸潤の他に有望な抗腫瘍効果がインビトロ及びインビボで示されており、（ii）NK細胞は、前臨床及び臨床設定における組換えIL-2による、優先的に刺激されたリンパ球特定集団として見出されてきた（Basse PH, Whiteside TL, Herberman RB. Use of activated natural killer cells for tumor immunotherapy in mouse and human. Methods MoI Biol 2000;121 :81-9;: Janssen RA, Sleijfer DT, Heijn AA, Mulder NH, The TH, de Leij L. Peripheral blood lymphocyte number and phenotype prior to therapy correlate with response in subcutaneously applied rIL-2 therapy of renal cell carcinoma. Br J Cancer 1992;66:1177-1179）。
【発明の開示】
【００３９】
従って、本発明者は、正常位ヌードマウスにおいて膵臓癌の処理のための新規で、非常に効果的な特異的抗癌剤として組換え融合タンパク質L19IL2を確立し、そしてその基礎をなす免疫及び非免疫介在性機構を特徴づけている。
さらに、本発明者の前臨床データは、膵臓癌における免疫サイトカインL19IL2を用いての臨床研究の開始を強く支持する。
【００４０】
好ましい態様においては、前記融合タンパク質は、N−末端抗体部分、及びC−末端インターロイキン２部分を有するか、又は
前記融合タンパク質は、N−末端インターロイキン２部分及びC−末端抗体部分を有する。
もう１つの好ましい態様においては、融合タンパク質は、抗体部分及びインターロイキン２部分を連結するリンカーを含んで成る。
【００４１】
好ましくは、抗体部分はヒトである。
好ましい態様においては、フィブロネクチンのED-Bドメインを特異的に認識する抗体部分は、ナノモル以下の親和性を伴って結合する。抗体−抗原親和性の定義及び測定についての再考については、Ned など. (1996). Trends in Biotechnol. 14, 465-470を参照のこと。
【００４２】
好ましい態様においては、抗体部分は、L19抗体のCDRの少なくとも１つを含み、好ましくはそれはL19抗体のすべてのCDR配列を含む。
好ましい態様においては、抗体部分は、配列番号６〜11の少なくとも１つを含んで成る。好ましくは、抗体は、配列番号６〜11の配列を含んで成る。
【００４３】
もう１つの好ましい態様においては、前記抗体部分は、配列番01の少なくとも１つのVH鎖、又は配列番号02の少なくとも１つのVL鎖を含んで成る。より好ましい態様においては、前記抗体部分は、配列番号01の少なくとも１つのVH鎖、及び配列番号02の少なくとも１つのVL鎖を含んで成る。さらにより好ましい態様においては、前記抗体部分は、配列番号01の１つのVH鎖、及び配列番号02の１つのVL鎖を含んで成る。
【００４４】
前記H及びL鎖が、抗体リンカーにより連結される、抗体部分が好ましい。
好ましい態様においては、前記抗体リンカーは、配列番号03の配列、又は配列番号03の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んで成る。より好ましい態様においては、抗体リンカーは、配列番号03の配列を有する。
好ましい態様においては、前記インターロイキン２部分は、ヒトインターロイキン２又はその機能的変異体である。
【００４５】
より好ましい態様においては、前記インターロイキン２部分は、配列番号04の配列を含んで成る。
インターロイキン２部分は、グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良い。グリコシル化されていないインターロイキン２の場合、グリコシル化パターンは、生来のヒトインターロイキン２と同一であっても又は異なっていても良い。
本発明の融合タンパク質の使用が好ましく、ここで前記融合タンパク質リンカーは配列番号05の配列を含んで成り、好ましくは前記融合タンパク質リンカーは配列番号05の配列を有する。
【００４６】
好ましい態様においては、融合タンパク質リンカーは、１〜30個、より好ましくは４〜25個、さらにより好ましくは６〜20個の長さのアミノ酸を有する。
抗体部分がscFv又はジアボディー（diabody）フォーマットで存在する場合、抗体リンカーは、１〜20個、より好ましくは４〜15個、さらにより好ましくは６〜15個の長さのアミノ酸を有する。
１つの態様においては、本発明の融合タンパク質は、膵臓癌の処理のための薬剤として使用される。
【００４７】
融合タンパク質は、水溶液においてモノマー、又はマルチマー、例えばホモダイマー形、又はそれらの混合物の形で存在することができる。好ましい態様においては、融合タンパク質は、モノマー又はホモダイマー、又はそれらの混合物である。
もう１つの態様においては、抗癌療法は、本発明の融合タンパク質及びゲムシタビンの組合せに関する。この組合せは特に、癌療法のために有用である。
【００４８】
本発明の組合せが好ましい。
好ましい態様においては、前記融合タンパク質は、N−末端抗体部分、及びC−末端インターロイキン２部分を有するか、又は
前記融合タンパク質は、N−末端インターロイキン２部分及びC−末端抗体部分を有する。
もう１つの好ましい態様においては、融合タンパク質は、抗体部分及びインターロイキン２を連結するリンカーを含んで成る。
【００４９】
好ましくは、抗体部分は、ヒト、キメラ又はヒト適合化された、特にヒトが好ましい。
好ましい態様のいては、フィブロネクチンのED-Bドメインを特異的に認識する抗体部分は、ナノモル以下の親和性を伴って結合する。抗体−抗原親和性の定義及び測定についての再考は、Ned など. (1996). Trends in Biotechnol. 14, 465-470を参照のこと。
好ましい態様においては、抗体部分は、L19抗体のCDRの少なくとも１つを含み、好ましくはそれはL19抗体のすべてのCDR配列を含む。
【００５０】
好ましい態様においては、抗体部分は、配列番号６〜11の少なくとも１つを含んで成る。好ましくは、抗体は、配列番号６〜11の配列を含んで成る。
もう１つの好ましい態様においては、前記抗体部分は、配列番号01の少なくとも１つのVH鎖、又は配列番号02の少なくとも１つのVL鎖を含んで成る。より好ましい態様においては、前記抗体部分は、配列番号01の少なくとも１つのVH鎖、及び配列番号02の少なくとも１つのVL鎖を含んで成る。さらにより好ましい態様においては、前記抗体部分は、配列番号01の１つのVH鎖、及び配列番号02の１つのVL鎖を含んで成る。
【００５１】
前記H及びL鎖が、抗体リンカーにより連結される、抗体部分が好ましい。
好ましい態様においては、前記抗体リンカーは、配列番号03の配列、又は配列番号03の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んで成る。より好ましい態様においては、抗体リンカーは、配列番号03の配列を有する。
好ましい態様においては、前記インターロイキン２部分は、ヒトインターロイキン２又はその機能的変異体である。
【００５２】
より好ましい態様においては、前記インターロイキン２部分は、配列番号04の配列を含んで成る。
インターロイキン２部分は、グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良い。グリコシル化されていないインターロイキン２の場合、グリコシル化パターンは、生来のヒトインターロイキン２と同一であっても又は異なっていても良い。
本発明の融合タンパク質の使用が好ましく、ここで前記融合タンパク質リンカーは配列番号５の配列を含んで成り、好ましくは前記融合タンパク質リンカーは配列番号05の配列を有する。
【００５３】
好ましい態様においては、融合タンパク質リンカーは、１〜30個、より好ましくは４〜25個、さらにより好ましくは６〜20個の長さのアミノ酸を有する。
抗体部分がscFv又はジアボディー（diabody）フォーマットで存在する場合、抗体リンカーは、１〜20個、より好ましくは４〜15個、さらにより好ましくは６〜15個の長さのアミノ酸を有する。
【００５４】
１つの態様においては、本名発明の融合タンパク質は、膵臓癌、特に膵臓癌腫の処理のための薬物として使用される。
本発明の組合せが、薬物として使用するために好ましい。
本発明の組合せは、癌の処理のための薬物として使用するために、より好ましい。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明の組合せに関し、ここで非小細胞肺癌、頭及び首癌、卵巣癌及び乳癌、特に膵臓癌から選択される。
癌療法に使用するための追加の物質との組合せが好ましい。
【００５５】
組合せは、少なくとも２種の医薬的活性化合物を含んで成る医薬組成物である。それらの化合物は、同時に、又は１分〜数日の間隔をおいて別々に投与され得る。化合物は、同じ経路を通して又は異なって投与され得；例えば１つの活性化合物の経口投与及びもう１つの非経口投与が可能である。また、活性化合物は、１つの薬物、例えば１つの注入溶液に、又は別々に配合される両化合物を含んで成るキットとして配合され得る。また、両化合物は複数のパッケージに存在することも可能である。
【００５６】
組成物は、医薬的に許容できる希釈剤及び/又はキャリヤーと共に少なくとも１つの医薬的活性化合物を含んで成る。
本発明の“特異的に認識する”とは、予定された抗原に結合する抗体を言及する。典型的には、抗体は、少なくとも約1×10-7M-1の親和性を伴って結合し、そして予定された抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）への結合のために、その親和性によりも少なくとも２倍高い親和性を伴って予定された抗原に結合する。前記抗原は、フィブロネクチンのED-Bドメインである。
【００５７】
抗原リンカーは、Vh及びVIドメインを結合するために適切であるいずれかのリンカー、好ましくはペプチドリンカーである。適切なリンカーは例えば、Bird など, Science, 242, 423-426, 1988; Huston など, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988, EP 0 573 551号; EP 0 623679 号及び EP 0 318554号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。
【００５８】
融合タンパク質リンカーは、抗体又は抗体フラグメント及び第２の生物学的活性タンパク質を連結するために適切なリンカーであり、好ましくはリンカーはペプチドである。適切なリンカーは、EP 0 573 551号; EP 0 623679号及びEP 0 318554号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。特に、適切なリンカーは、EP0623679号に記載されている。
【００５９】
本発明のインターロイキン２とは、哺乳類インターロイキン２、好ましくはヒトインターロイキン２及びその機能的変異体を言及する。インターロイキン２の機能的変異体は、生来のヒトインターロイキン２の少なくとも10％、より好ましくは50％以上、及びさらにより好ましくは90以上の活性を示すヒトインターロイキン２の変異体である。インターロイキン２活性は、生化学アッセイにおいての又はインビボでのインターロイキン２の活性であり、特にインターロイキン２活性は、活性化されたT及びBリンパ球及び天然のナチュラルキラー細胞の増殖及び/又は分化、及び/又は細胞毒性T細胞活性及び/又はNK/リンホカイン活性化されたキラー（LAK）抗腫瘍活性の誘発に対する効果により測定される（Meazza R, Marciano S, Sforzini S, など. Analysis of IL-2 receptor expression and of the biological effects of IL-2 gene transfection in small-cell lung cancer. BrJ. Cancer. 1996; 74:788-795）。
【００６０】
特に、機能的変異体は、EP0109748号に記載されるようなインターロイキン２のシステイン２のシステイン−125ムテイン、及び他のムテイン、例えばEP136489号に記載されるようなシステインムテイン、特にセリン125−インターロイキン２である。また、hIL2変異体のN−末端は、活性に有意に影響を及ぼさないで変更され得、特にN−末端の１〜５個のアミノ酸、特に好ましくはN−末端アラニンが欠失されるか又は変更され得、好ましくは欠失され得る。
【００６１】
さらに、インターロイキン２は変更された又は欠失された後−翻訳修飾を含むことができ、特にグリコシル化パターンは変更されるか又は不在であり得る。異なった又は不在のグリコシル化が、配列を突然変異誘発することにより、又は適切な宿主における融合タンパク質の発現により得られる。例えば、転移性RCCのために許容されるアルデスレウキン（Aldesleukin）は、E.コリにおいて生成される、グリコシル化されていないデス−アラニル−１、セリン−125ヒトインターロイキン２である。
【００６２】
“抗体−依存性細胞−介在性細胞毒性”及び“ADCC”とは、Fc受容体（FcRs）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合された抗体を認識し、そして続いて標的細胞の溶解を引起す細胞−介在性反応を言及する。ADCC、NK細胞を仲介するための一次細胞はFcγRIII のみを発現し、ところが単球はFcγRI、FcγRII及びFcγIII を発現する。造血細胞上でのFeR発現は、表３、第465頁、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)に要約される。
【００６３】
興味ある分子のADCC活性を評価するために、インビトロADCCアッセイ、例えばアメリカ特許第5,500,362号又は第5,821,337号に記載されるアッセイが実施され得る。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（PBMC）及びナテュラルキラー（NK）細胞を包含する。他方では、又はさらに、興味ある分子のADCC活性は、インビボで、例えば動物モデル、例えばClynes など. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるモデルにおいて評価され得る。
【００６４】
“ヒトエフェクター細胞”とは、１又は複数のFcRsを発現し、そしてエフェクター機能は実施する白血球である。好ましくは、その細胞は、少なくともFcγRIII を発現し、そしてADCCエフェクター機能を実施する。ADCCを仲介するヒト白血球の例は、末梢血液単核細胞（PBMC）、ナテュラルキラー（NK）細胞、単球、細胞毒性T細胞及び好中球を包含し；PBMC及びNK細胞が好ましい。
【００６５】
用語“Fc受容体”又は“FcR”とは、抗体のFc領域に結合する受容体を記載するために使用される。好ましいFcRは、天然の配列のヒトFcRである。さらに、好ましいRcRは、IgG抗体（γ受容体）を結合する１つであり、そしてFcγRI、FcγRII及びFcγRIII サブクラス、例えば、対立遺伝子変異体の受容体、及びそれらの受容体の選択的にスプライシングされた形を包含する。FcγRII受容体は、主にその細胞質ドメインにおいて異なる、類似するアミノ酸配列を有する、FcγRIIA（“活性化受容体”）及びFcγRIIB（“阻害受容体”）を包含する。
【００６６】
活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン−基礎の活性化モチーフ（ITAM）を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン−基礎の阻害モチーフ（ITIM）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs are reviewed in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immu- nol9:457-92 (1991); Capel など, Immunomethods 4:25-34 ( 1 994); 及び de Haas など, J. Lab. CHn. Med. 126:330-41 (1995)を参照のこと）。他のFcRs、例えば未来において同定されるそれらは、本明細書において用語“FcR”により包含される。その用語はまた、母親のIgGの胎児へのトランスファーを担当する新生児受容体FcRnを包含する（Guyer など., J. Immunol. 1 1 7587 (1976) 及び Kim など., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００６７】
抗体部分は、下記に定義されるような抗体を含んで成る。
用語“抗体”は、本明細書において、最も広い態様で使用され、そして損なわれていないモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、及び抗体フラグメント（それらが生物学的活性を示す限り）を包含する。好ましくは、抗体はヒト、キメラ又はヒト型化抗体であり、特に好ましくはヒト抗体である。
【００６８】
“抗体フラグメント”は、損なわれていない抗体の一部を含んで成り、好ましくはその抗原−結合又は可変領域を含んで成る。抗体フラグメントの例は次のものを包含する：Fab, Fab’, F(ab’)2及びFvフラグメント、一本鎖Fvフラグメント；ジアボディー（diabodies）;ミニボディー（minibodies）；ナノボディー（nanobodies）;線状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成される多特異的抗体。好ましくは、抗体フラグメントは、ヒト、キメラ又はヒト型化フラグメントであり、特にヒトフラグメントが好ましい。
【００６９】
“生来の抗体”とは通常、２種の同一のL鎖及び２種の同一のH鎖から構成される。約150,000ドルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。個々のL鎖は１つのジスルフィド共有結合によりH鎖に結合され、そしてジスルフィド連鎖の数は、異なった免疫グロブリンイソタイプのH鎖間で変化する。個々のH及びL鎖はまた、規則的に一定の間隔で開けられた鎖内ジスルフィド架橋を有する。個々のH鎖は、一端で可変ドメイン（VH）、続いて多くの不変ドメインを有する。個々のL鎖は一端で可変ドメイン（VL）及びその他の端で不変ドメインを有し；L鎖の不変ドメインは、H鎖の最初の不変ドメインと一列整列され、そしてL鎖の可変ドメインはH鎖の可変ドメインと一列整列される。特定のアミノ酸残基が、L鎖及びH鎖可変ドメイン間でインターフェースを形成すると思われる。
【００７０】
用語“可変”とは、可変ドメインの一定の部分が抗体間で配列において広範囲に異なり、そしてその特定の抗原に対する個々の特定の抗体の結合及び特異性に使用される事実を言及する。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均等に分布されていない。それは、L鎖及びL鎖可変ドメインの両者において超可変領域と呼ばれる３個のセグメントにおいて濃縮されている。可変ドメインのより高く保存される部分は、骨格領域（FR）と呼ばれる。生来のH及びL鎖の可変ドメインは、連結し、そして多くの場合、β−シート構造の一部を形成するループを形成する、３種の超可変領域により連結される、β−シート配列を大部分採用する４種のFRを個々に含んで成る。
【００７１】
個々の鎖における超可変領域は、FRにより密接に接近して一緒に維持され、そして他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat など, Sequences of Proteins Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと）。不変ドメインは、抗原への抗体の結合において直接的に関与しないが、しかし種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性（ADCC）における抗体の関与を示す。
【００７２】
抗体のパパイン消化は、“Fabフラグメント”と呼ばれる２種の同一の抗原結合フラグメント（個々は単一の抗原結合部位を有し）、及び残留“Fc”フラグメント（この名称は容易に結晶化するその能力に影響を及ぼす）を生成する。ペプシン処理は、２種の抗原結合部位を有し、そして抗原を架橋できるF(ab’)2フラグメントを生成する。
【００７３】
“Fv”は、完全な抗原−認識及び抗原−結合部位を含む最少の抗体フラグメントである。この領域は、強い非共有結合下での１つのH鎖及び１つのL鎖可変ドメインのダイマーから成る。それは、個々の可変ドメインの３種の超可変領域がVH-VLダイマーの表面上に抗原−結合部位を規定するために相互作用する配置で存在する。集合的には、６種の超可変領域が、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的なわずか３種の超可変領域を含んで成るFvの半分）が、抗原を認識し、そして結合する能力を有する。
【００７４】
Fabフラグメントはまた、L鎖の不変ドメイン、及びH鎖の第１不変ドメイン（CH1）を含む。Fab’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１又は複数のシステインを含むH鎖CH1ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によりFabフラグメントとは異なる。Fab’−SHは、不変ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を担持するFab’についての本明細書における名称である。F(ab’)抗体フラグメントは本来、それらの間にヒンジシステインを有するFab’2−フラグメント対として生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングがまた知られている。
【００７５】
いずれかの脊椎動物からの抗体（医務のグロブリン）の“L鎖”は、それらの不変ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２種の明確なタイプの１つに割り当てられ得る。
【００７６】
それらのH鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に依存し、抗体は異なったクラスに割り当てられ得る。次の５種の主要クラスの損なわれていない抗体が存在し：IgA, IgD, IgE, IgG及びIgM、そしてそれらのいくつかはさらに、次のサブタイプ（イソタイプ）に分割され得る：IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA及び IgA2。異なったクラスの抗体に対応するH鎖不変ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なったクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は良く知られている。
【００７７】
“一本鎖Fv”又は“scFv”抗体フラグメントは、抗体のVH及びVLドメインを含んで成り、ここでそれらのドメインは一本鎖ポリペプチドに存在する。好ましくは、Fvポリペプチドはさらに、抗原結合のための所望する構造体のscFvによる形成を可能にする、VH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを含んで成る。scFvの再考に関しては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-3 15 (1994)を参照のこと。
【００７８】
さらなる態様においては、抗体又は抗体フラグメントは、McCafferty など, Nature, 348552-554 (1990)に記載される技法を用いて生成された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Clackson など, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks など, J. MoI. Biol, 222581-597 (1991)は、ファージライブラリーを用いてのそれぞれのネズミ及びヒト抗体の単離を記載する。続く出版物は、シャフリングによる高親和性（mM範囲）ヒト抗体の生成（Marks など, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）、及び非常に大きなファージライブラリーを構成するための手段としての組合せ感染及びインビボ組換え（Waterhouse など, Nuc. Acids. Res., 21 :2265-2266 (1993)）を記載する。従って、それらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に代わる種々の技法である。
【００７９】
DNAはまた、例えばヒトH鎖及びL鎖不変ドメインのためのコード配列を、その相同ネズミ配列の代わりに置換することにより（アメリカ特許第4,8 16,567号; Morrison, など, Proc. Nat. Acad. ScL USA, 8 1 .685 1 (1984)）、又は非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列のすべて又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより修飾され得る。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の不変ドメインにより置換され、又はそれらの抗体の１つの抗原−組合せ部位の可変ドメインにより置換され、１つの抗原に対する特異性を有する１つの抗原−組合せ部位、及び異なった抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原−組合せ部位を含んで成るキメラ性二価抗原が創造される。
【００８０】
用語“ジアボディー（diabodies）”とは、２つの抗原−結合部位を有する小さな抗体フラグメントを言及する。そのようなフラグメントは、同じポリペプチド鎖（VH-VL）におけるL鎖可変ドメイン（VL）に連結されるH鎖可変ドメイン（VH）を含んで成る。同じ鎖上の２種のドメイン間の対合を可能にするには短過ぎるリンカーを用いることにより、ドメインは、もう１つの鎖の相補的ドメインとの対合、及び２つの抗原−結合部位の創造を強要される。ジアボディーは、例えばEP 0 404 097号; WO 93/11161 号; 及びHollinger など, Proc. Natl. Acad ScL USA, 905444-6448 (1993)に、より詳細に記載される。
【００８１】
用語“モノクローナル抗体”とは、本明細書において使用される場合、実質的に相同の抗体の集団から得られる抗体を言及し、すなわち前記集団を含んで成る個々の抗体は同一であるが、但し少量で存在することができる可能性ある天然に存在する突然変異を除く。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。さらに、異なった決定因子（エピトープ）に対して向けられた異なった抗体を典型的には包含する従来（ポリクローナル）の抗体調製物に比較して、個々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して向けられる。
【００８２】
それらの特異性の他に、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養物により合成されることにおいて好都合である。モディファイアー“モノクローナル”は、実質的に相同の抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、そしていずれかの特別な方法による抗体の生成を要求するものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用するべきモノクローナル抗体は、最初に、Kohlerなど, Nature, 256: 495 (1975)により記載されるハイブリドーマ方法により製造され得、又は組換えDNA方法により製造され得る（例えば、アメリカ特許第4,816,5671号を参照のこと）。
【００８３】
“モノクローナル抗体”はまた、例えばClackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al, J. MoI. Biol, 222581-597 (1991)に記載される技法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００８４】
モノクローナル抗体は、本明細書においては、H及び/又はL鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか又は相同であり、ところが鎖の残りは、もう１つの種に由来するか、又はもう１つの抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか又は相同である、“キメラ”抗体（免疫グロブリン）、及びそれらが所望する生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを特に包含する（アメリカ特許第4,816,567号；Morrison など, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 8 1 :685 1-6855 (1984)）。
興味あるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列、及びヒト不変領域配列を含んで成る“霊長類適合された”抗体を包含する（アメリカ特許第5,693,780号）。
【００８５】
ヒト型化抗体：非ヒト抗体をヒト適合するための方法は、当業界において記載されている。好ましくは、ヒト型化抗体は、非ヒトである源からの抗体中に導入される１又は複数のアミノ酸残基を有する。それらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、“移入”可変ドメインから典型的には取られる“移入”残基として言及される。ヒト適合化は、ヒト抗体のその対応する配列により超可変領域を置換することにより、Winter及び共同研究者の方法（Jones et al, Nature, 321522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen など, Science, 239: 1534-1536 (1988)）に従って、実質的に実施され得る。
【００８６】
従って、そのような“ヒト型化”抗体は、キメラ抗体であり（アメリカ特許第4,816,567号）、ここで実質的に損なわれていない可変ドメインが、非ヒト種からその対応する配列により置換されている。実際、ヒト型化抗体は典型的には、いくつかの超可変領域残基及びたぶんいくつかのFR残基が齧歯動物抗体における類似部位からの残基により置換されているヒト抗体である。ヒト型化抗体の製造に使用されるヒト可変ドメイン（L及びH鎖の両者）の選択が、抗原性を低めるために非常に重要である。
【００８７】
いわゆる“最良の適合”方法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列が既知ヒトの可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーンされる。次に、齧歯動物の配列に最も近いヒト配列が、ヒト型化抗体のためのヒト骨格領域（FR）として許容される（Sims など., J. Immunol., 151 :2296 (1993); Chothiaなど., J. MoI. Biol, 196:901 (1987)）。
【００８８】
もう１つの方法は、L又はH鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定の骨格領域を使用する。同じ骨格がいくつかの異なったヒト型化抗体のために使用され得る（Carter など, Proc. Natl Acad. Sci. USA,89:4285 (1992); Presta など, J. Immunol, 151 :2623 (1993)）。抗体は、抗原及び他の好ましい生物学的性質のために高い親和性の保持下でヒト型化することはさらに重要である。好ましい方法に従ってこの目的を達成するために、ヒト劇合された抗体は、親及びヒト型化配列の三次元モデルを用いての親配列及び種々の構想のヒト型化生成物の分析方法により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは通常入手でき、そして当業者に良く知られている。選択された候補体免疫グロブリン配列の有望な三次元高次構造を例示し、そし表すコンピュータープログラムが入手できる。
【００８９】
この表示の調査は、候補体免疫グロブリン配列の機能における残基の有望な役割の分析、すなわち候補体免疫グロブリンのその抗原を結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。この手段で、FR残基が受容体から選択され、そして組合わされ、そして所望する抗体特徴、例えば標的抗原のための高められた親和性が達成されるよう配列を移入することができる。一般的に、超可変領域残基は直接的であり、そして最も実質的には、抗原結合に影響を与えることに包含される。
【００９０】
ヒト抗体：ヒト適合化に代わるものとして、ヒト抗体が生成され得る。例えば、免疫化に基づいて、内因性免疫グロブリン生成の不在下で十分な範囲のヒト抗体を生成できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生成することが現在可能である。例えば、キメラ及び生殖系変異体マウスにおける抗体H鎖連結領域（JH）遺伝子のホモ接合性欠失が内因性抗体生成の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系変異体マウスへのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーが、抗原攻撃に基づいてヒト抗体の生成をもたらすであろう。例えば、Jakobovits など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Ja- kobovits など, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 及びアメリカ特許第5,591,669号、第5,589,369 合、及び第5,545,807号を参照のこと。
【００９１】
他方では、ファージ表示技法（McCaffertyなど, Nature 348:552-553 (1990)）が、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（V）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体フラグメントをインビトロで生成するために使用され得る。この技法によれば、抗体Vドメイン遺伝子が、線状バクテリオファージの主要又はマイナーなコートタンパク質遺伝子、例えばM13又はfdのいずれか中に読み取り枠を整合してクローン化され、そしてファージ粒子の表面上で機能的抗体フラグメントとして表示される。線状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能的性質に基づく選択がまた、それらの性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。
【００９２】
従って、ファージは、B細胞の性質のいくらかを模倣する。ファージ表示は、種々の形で実施され得る；それらの再考のためには、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)を参照のこと。V−遺伝子セグメントのいくつかの源がファージ表示のために使用され得る。Clacksonなど., Nature, 352-624-628 (1991)は、免疫化されたマウスの膵臓に由来するV遺伝子の小さなランダム組合せライブラリーから種々の抗−オキサゾロン抗体を単離した。
【００９３】
免疫化されていないヒトドナーからの広範囲のV遺伝子が構成され、そして種々の抗原（自己−抗原を包含する）に対する抗体が、Marks など., J MoI. Biol. 222581-597 (1991),、又はGriffith など, EMBO J 12:725-734 (1993)により記載される技法に実質的に従って単離され得る。また、アメリカ特許第5,565,332号及び第5,573,905号も参照のこと。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化されたB細胞によって生成され得る（アメリカ特許第5,567,610号及び第5,299,275号を参照のこと）。
【００９４】
用語“超可変領域”とは、本明細書において使用される場合、抗原結合を担当できる、抗体のアミノ酸残基を言及する。超可変領域は、“相補的決定領域”又は“CDR”からのアミノ酸残基（例えば、L鎖可変ドメインにおける残基24−34（L1）、50−56（L2）及び89−97（L3）及びH鎖可変ドメインにおける31−35（H1）、50−65（H2）及び95−102（H3）；（Kabat など, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）、及び/又は“超可変ループ”からのそれらの残基（例えば、L鎖可変ドメインにおける残基26−32（L1）、50−52（L2）及び91−96（L3）及びH鎖可変ドメインにおける26−32（H1）、53−55（H2）及び96−101（H3）；Chothia and Lesk J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)）を含んで成る。“骨格”又は“FR”残基は、本明細書に定義されるように、超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【００９５】
抗体フラグメント：種々の技法が、抗体フラグメントの生成のために開発されて来た。従来、それらのフラグメントは、損なわれていない抗体のタンパク質加水分化酵素により誘導される（例えば、Morimotoなど, Journal of Biochemical und Biophysical Methods 24: 107-1 17 (1992) 及び Brennan など, Science, 229:81 (1985)を参照のこと）。しかしながら、それらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞により直接的に生成され得る。例えば、抗体フラグメントは、上記に論じられる抗体ファージライブラリーから単離され得る。
【００９６】
他方では、Fab’−SHフラグメントはE.コリから直接的に回収され、そしてF(ab’)2フラグメントを形成するために化学的にカップリングされ得る（Carter など., Biotechnology 10: 163- 167 (1992)）。もう１つのアプローチによれば、F(ab’)2フラグメントは組換え宿主培養物から直接的に単離され得る。抗体フラグメントの生成のための他の技法は、当業者に明らかであろう。他の態様においては、選択の抗体は一本鎖Fvフラグメントである。WO 93/16185号; アメリカ特許第5,571,894号;及びアメリカ特許第5,587,458号を参照のこと。抗体フラグメントはまた、例えばアメリカ特許第5,641,870号に記載のように、“線状抗体”でもあり得る。そのような線状フラグメントは単一特異性又は二特異性であり得る。
【００９７】
用語“特異的に認識する”とは、予定された抗体に結合する抗体を言及する。典型的には、抗体は、少なくとも１×10-7Mの親和性で結合し、そしてフィブロネクチンのED-Bドメイン以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）に結合するための親和性よりも少なくとも２倍、高いフィブロネクチンのED-Bドメインに結合する。
【００９８】
本明細書に記載される、タンパク質又はペプチドアンタゴニスト又は抗体部分のアミノ酸配列修飾が企画される。例えば、アンタゴニストの結合親和性及び/又は他の生物学的性質を改良することが所望される。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変更をアンタゴニスト核酸中に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又はそれら中への挿入、及び/又はそれらの置換を包含する。欠失、挿入及び置換のいずれかの組合せが、最終構造体に達するために製造され、但し最終構造体は所望する特徴を有する。
【００９９】
従って、H又はL鎖の場合、1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18;19 又は20個のアミノ酸の変動が実施され得る。インターロイキン２の場合、1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 又は 33個のアミノ酸の変動が実施され得る。リンカーの場合、1; 2; 3; 4; 5; 6;又は7個の変動が実施され得る。リンカーの場合、その変動は、機能的アミノ酸配列間に十分な空間が容易に創造されるので、柔軟である。
【０１００】
変動は、欠失、挿入及び/又は置換として定義される。アミノ酸変更はまた、アンタゴニストの後−翻訳工程を変え、例えばグリコシル化部位の数又は位置を変更する。突然変異誘発のための好ましい位置であるアンタゴニストの一定残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and WeIk Science, 244: 108 1-1085 (1989)により記載されるように、“アラニン走査突然変異誘発”と呼ばれる。ここで、標的残基類中の１つの残基又はグループ（例えば、荷電された残基、例えば、Arg, Asp, His, Lis及びGln）が同定され、そして中性又は負に荷電されたアミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）により置換され、アミノ酸と抗原との相互作用が影響される。
【０１０１】
次に、置換に対して機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換の部位で又はその部位のために、追加の又は他の変異体を導入することにより改良される。従って、アミノ酸配列変動を導入するための部位はあらかじめ決定されるが、突然変異自体の性質はあらかじめ決定される必要はない。例えば所定の部位で突然変異の性能を分析するために、Ala走査又はランダム突然変異誘発が標的コドン又は領域で行われ、そして発現されたアンタゴニスト変異体が所望する活性についてスクリーンされる。アミノ酸配列挿入は、１つの残基〜100又はそれ以上の残基を含むポリペプチドのアミノ−及び/又はカルボキシル−末端融合、及び単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を包含する。
【０１０２】
末端挿入の例は、N−末端メチオニル残基を有するアンタゴニスト又は細胞毒性ポリペプチドに融合されるアンタゴニストを包含する。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、酵素のアンタゴニストのN−又はC−末端への融合、又はアンタゴニストの血清半減期を高めるポリペプチドを包含する。もう１つのタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。それらの変異体は、異なった残基により置換されるアンタゴニスト分子に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。抗体アンタゴニストの置換性突然変異のための最大興味の部位は、超可変領域を包含するが、しかしFR変更がまた企画される。保存性置換は、表１の“好ましい置換”の表題下に示されている。
【０１０３】
【表１】
2009532408.tif 000004
【０１０４】
そのような置換が生物学的活性の変更をもたらす場合、表１に“典型的な置換”として示されるか、又はアミノ酸種類に関して下記にさらに記載されるような、より実質的な変更が導入され得、そして生成物がスクリーンされ得る。
【０１０５】
アンタゴニストの生物学的性質における実質的な修飾は、（a）シート又はへリックスコンホメーションとしての置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性度、又は（ｃ）大部分の側鎖の維持に対するそれらの効果において有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖性質に基づいて次ぎのグループに分けられる：
(1) 疎水性: ノルロイシン, Met, Ala, VaI, Leu, Ile;
(2) 中性親水性: Cys, Ser, Thr;
(3) 酸性：Asp, Glu; 
(4)塩基性：Asn, GIn, His, Lys, Arg;
(5) 鎖配向に影響を及ぼす残基: GIy, Pro; 及び
(6) 芳香性: Tip, Tyr, Phe。
【０１０６】
非保存性置換は、それらの種類の１つのメンバーのもう１つの種類のメンバーによる交換を必然的に伴うであろう。アンタゴニストの適切なコンホメーションの維持に関与されないいずれかのシステイン残基はまた、分子の酸化安定性を改良し、そして異常架橋を妨げるために、一般的にセリンにより置換され得る。逆に言えば、システイン結合がその安定性を改良するためにアンタゴニストに追加され得る（特に、ここでアンタゴニストは抗体フラグメント、例えばFvフラグメントである）。
【０１０７】
特に好ましいタイプの置換変異体は、親抗体の１又は複数の超可変領域残基の置換を包含する。一般的に、さらなる進行のために選択される、得られる変異体は、それらが生成される親抗体に対して改良された生物学的性質を有するであろう。そのような置換変異体を生成するための従来の手段は、ファージ表示を用いての親和性突然変異である。手短には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）が突然変異誘発され、個々の部位でのすべての可能なアミノ置換を生成する。このようにして生成される抗体変異体は、個々の粒子内にパッケージされるM13の遺伝子III 生成物への融合体として線状ファージ粒子から一価態様で表示される。
【０１０８】
次に、ファージ表示された変異体が、本明細書に開示されるように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーンされる。修飾のための候補体超可変領域部位を同定するために、アラニン走査突然変異誘発が実施され得、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基が同定され得る。他方では又はさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することは有益である。そのような接触残基及び隣接する残基は、本明細書に詳細される技法の置換のための候補体である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルが本明細書に記載のようにしてスクリーニングにゆだねられ、そして１又は複数の適切なアッセイにおいて卓越した性質を有する抗体がさらなる進行のために選択され得る。
【０１０９】
アンタゴニストのもう１つのタイプのアミノ酸変異体がアンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。それを変更するとは、アンタゴニストに見出される１又は複数の炭水化物成分の欠失、及び/又はアンタゴニストに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０１１０】
ポリペプチドのグリコシル化は典型的には、N−結合されか又はO−結合される。N−結合されるとは、アスパラニン残基の側鎖への炭水化物成分の結合を言及する。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリン及びアスパラギン−X−トレオニン（Xはプロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物成分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるそれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、有能なグリコシル化部位を創造する。O−結合されたグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も通常にはセリン又はトレオニン（但し、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンもまた使用され得る）への糖N−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つへの結合を言及する。
【０１１１】
アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は従来、アミノ酸配列が１又は複数の上記トリペプチド配列（N−結合されるグリコシル化部位のための）を含むようその配列を変更することにより達成される。変更はまた、元のアンタゴニストの配列（O−結合されるグリコシル化部位のための）への１又は複数のセリン又はトレオニン残基の付加又はそれによる置換により行われ得る。
【０１１２】
アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸は、当業界において知られている種々の方法により調製される。それらの方法は、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、又はオリゴヌクレオチド−介在性（又は特定部位）突然変異誘発による調製、PCR突然変異誘発、及びアンタゴニストの初期に調製された変異体又は非変異体バージョンのカセット突然変異誘発を包含するが、但しそれらだけには制限されない。
【０１１３】
例えば、アンタゴニストの抗原−依存性細胞介在性細胞毒性（ADCC）及び/又は補体依存性細胞毒性（CDC）を増強するためには、エフェクター機能に関して本発明のアゴニストを変性することが所望される。これは、抗体アンタゴニストのFc領域に１又は複数のアミノ酸置換を導入することにより達成され得る。他方では又はさらに、システイン残基がFc領域に導入され、この領域における鎖間ジスルフィド結合が可能にされる。このようにして生成されたホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーション能力及び/又は高められた補体介在性細胞殺害及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ADCC）を有する。
【０１１４】
Caron など, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Wolff など. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載のようにして、ヘテロ二価性架橋剤を用いて調製され得る。他方では、二重Fc領域を有し、そしてそれにより、増強された補体溶解及びADCC能力を有する抗体が構築され得る。Stevenson など. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照のこと。
【０１１５】
本発明の好ましい態様においては、配列番号４の配列を含んで成る本発明のL19IL2が使用される。
本発明の好ましい態様においては、配列番号６〜11の配列を含んで成るL19IL2が本発明に従って使用される。
本発明の好ましい態様においては、配列番号1, 2, 3, 4及び5の配列を含んで成るL19IL2が本発明に従って使用される。
【０１１６】
本発明のもう１つの態様においては、L19IL2融合タンパク質、配列番号１，２，３、４及び５の配列に比較して、変動を含む。融合タンパク質L19IL2の変動は、前に言及されたような変動により定義される。特に、L19IL2分子におけるアミノ酸が、表２におけるように、配列番号１，２，３，４及び５により定義されるそれらのアミノ酸に比較して、アミノ酸欠失、挿入及び/又は置換により修飾され得る。
【０１１７】
【表２】
2009532408.tif 000005
【０１１８】
さらなる修飾は、Pini など. (1998) J Biol. Chem., Vol.: 273, pages 21769 - 21776, WO 02 / 20563号, WO 2005/37312号、及びWO 99 / 58570号に言及されている。
【０１１９】
治療介在のために適切な薬物としての使用：
本発明の組合せは、薬理学的活性を示す。特に、組合せは、癌、特に膵臓癌に関して、多くの病理学的又は疾病状態において薬理学的活性を示す。
従って、本発明の組合せは、非小細胞肺癌、頭及び首癌、結腸癌、卵巣癌及び乳癌、特に膵臓癌の処理への使用のために指摘され得る。融合タンパク質及びゲムシタビンは、同時に、又は異なった時間で別々に投与され得る。
【０１２０】
そのような状態の処理に関しては、もちろん適切な用量は、例えば宿主、投与の状態、及び処理される病態の性質及び重症度に、非常に依存する。
一般的に、ヒトにおける融合タンパク質L19IL2の指摘される反復用量は、１回の適用当たり、固定された用語としてのIUに等しい約１〜100Mio IL-2、好ましくは５〜30Mio IL-2の範囲である。抗体は、身体における最も敏感な器官（用量制限器官）の毒性を引起さない用量で与えられるべきである。抗体に関しては、腎臓は用量制限器官であり、そして心血管系に対する衝撃は、L19IL2に関して用量制限性である。
【０１２１】
本発明の特異的結合メンバー、例えば抗体抗原−結合ドメインを含んで成るそれらのメンバーが、いずれか適切な経路を通して、通常、血流中への注入により、及び/又は処理されるべき部位、例えば腫瘍中に直接的に、処理の必要な患者に投与され得る。正確な用量は、多くの要因、処理の経路、処理されるべき領域（例えば、腫瘍）のサイズ及び位置、抗体（例えば、完全な抗体、scFv分子）の正確な性質、及び抗体に結合されるいずれかの検出できるラベル又は他の分子の性質に依存するであろう。処理は、医者の決定で、毎日、１週２度、毎週、又は毎月、反復され得る。
【０１２２】
投与されるゲムシタビンの用量は、使用の態様及び使用経路、及び患者の必要条件に従って変化するであろう。一般的に、毎週の適用が、成人の患者の分身性治療に関しては、毎日の投与よりも好ましい。最も通常適用される週１度のスケジュールに関しては、ゲムシタビンの標準用量は、15〜30分にわたって静脈内注入として100〜1250mg/m2である。
【０１２３】
本発明は、態様において次のものを開示する：
（α）癌、特に非小細胞肺癌、頭及び首癌、結腸癌、卵巣癌及び乳癌、特に膵臓癌の処理のための薬物の製造のためへのL19IL2又はゲムシタビンとのその組合せの使用；
（β）非小細胞肺癌、頭及び首癌、結腸癌、卵巣癌及び乳癌、特に膵臓癌の処理方法、ここで前記方法は、ゲムシタビンと組合せてのL19IL2の医薬組成物の投与を含んで成り、前記組合せの量が疾病を抑制し、そして前記組合せの医薬組成物が、その必要な患者に与えられ；
（γ）L19IL2及びゲムシタビンを含んで成る医薬組成物。
好ましい投与方法は、非経口、特に静脈内注入である。
【実施例】
【０１２４】
IL-2は、最も有能な既知の抗腫瘍サイトカインの１つである。しかしながら、全身的に適用されるIL-2の効力は、細胞毒性を付随することにより補充されて来た（Bubenik J, Den Otter W, Huland E. Local cytokine therapy of cancer: interleukin-2, interferons and related cytokines. Cancer Immunol Immunother 2000;49:l16-122; Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Evidence for a structural motif in toxins and interleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and initiating vascular leak syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:3957-3962）。結果として、可能性ある努力が、移動局部IL-2処理プロトコールの開発に払われてきた。
【０１２５】
最近、多−化学療法と組合しての動脈又は門静脈カテーテルを通して進行した膵臓癌を有する患者の局部IL-2処理が、応答速度の上昇、腫瘍負荷の低下、及び生存時間の延長をもたらす有望な結果を示した（Abdel-Wahab M, El Shennawy F, Agha S, Ragab E, Fathi O, Sultan A, Elghawalby N, Ezzat F. Evaluation of cell mediated immunity in advanced pancreatic carcinoma before and after treatment with interleukin-2 (IL-2). Hepatogastroenterology 1999;46 Suppl 1 :1293-1296; Lygidakis NJ, Vlachos L, Raptis S, Sgourakis G, Mourikis D, Kehagias D. Consecutive re-explorations for final resection of initially unresectable pancreatic head carcinoma. Hepatogastroenterology 1999;46:2229-2239）。
【０１２６】
これに関しては、膵臓癌へのIL-2の選択的抗体に基づく供給が興味あるアプローチを提供する。なぜならば、それは全身性毒性を制限しながら、一次及び転移性腫瘍を同様に制御する、IL-2の腫瘍への特異的蓄積の目的を達成するからである。この研究においては、本発明者は、膵臓癌における組換え融合タンパク質L19IL2の治療効力を調査する。
【０１２７】
材料及び方法：
材料：
次のものを購入した：ヒト膵臓癌細胞形MiaPaca (American Type Culture Collection) 及び DanG及びネズミリンパ腫細胞系YAC-1 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Braun- schweig, Germany)；ダルベッコイーグル培地（DMEM）、RPMI1640倍地、PBS、ハンクス液（HBSS）、抗生物質/抗カビ溶液、グルタミン及びヒグロマイシンB（Invitrogen, Berlin, Germany）；ウシ胎児血清(FCS)、 トリプシン/EDTA、 ペニシリン、 及びストレプトマイシン(Biochrom, Berlin, Germany);
【０１２８】
ヒト融合タンパク質 L19IL2 及びヒトホモダイマーscFv 抗体フラグメントL19 (Schering AG, Berlin, Germany); Ficoll-Paque Plus (Amersham, Braunschweig, Germany); コラゲナーゼタイプ3 (Worthington, NJ, USA); AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ(Applied Biosystems, CA, USA); PCR ヌクレオチド混合物(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA); TumorTACS 現場アポプトシス検出キット(R&D Systems GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany);
【０１２９】
モノクローナルマウス抗‐ヒト-パンサイトケラチン (C11) Ab (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); モノクローナルマウス抗‐ヒトKi67 Ab (Dianova, Hamburg, Germany); ビオチン接合されたモノクローナルマウス抗‐マウスNK 1.1 (PK136) Ab (Serotec, Duesseldorf Germany)、 モノクローナル抗‐マウス CD11b (M 1/70) Ab 及び R-PE 接合されたモノクローナルラット抗‐マウスCD49b (DX5) Ab (BDBiosciences, Heidelberg, Germany); ウサギ抗‐アシアロGMl 抗血清 (ASGMl) (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germany);
【０１３０】
モノクローナルマウス抗‐ヒト CD31 (JC/70A) Ab、モノクローナルマウス抗‐ヒトCA 19-9 (1116-NS-19-9) Ab 及びAEC-基質-クロモゲン (Dako, Hamburg, Germany); Vectastain ABCキット(Vector Laboratories, Wertheim-Bettingen, Germany); Alamar Blue (BioSource, CA, USA); QIAamp DNA Mini キット (Qiagen, Hilden, Germany); ゲムシタビン (Lilly, Giessen, Germany)、 Rompun 2% (Bayer GmbH, Leverkusen, Germany); Ketavet (Pharmacia GmbH, Erlangen, Germany).すべての他の化学製品及び試薬は、Sigma Chemical Co. (Deisenhofen, Germany)から購入された。
【０１３１】
ヒト組織サンプル：
21の膵臓癌、17の慢性膵炎及び13の正常膵臓組織サンプルを、Department of Surgery at Charite University Hospitalでの手術切除を受けた個人から入手した。この研究は、地元の論理委員会により許可され、そしてすべての患者は、手術の前、インフォームドコンセントを受けた。
【０１３２】
細胞培養物：
ヒト膵臓癌細胞系DAN-G及びMiaPaca、及びネズミリンパ腫細胞系YAC-1を、上記のようにして培養した（Wagner K, Scholz A,Wiedenmann Bertram and Menrad Andreas, The targeted immunocytokine L19IL2 efficiently inhibits the growth of orthotopic cancer in nude mice, paper submitted to Cancer Research）。Angiopoetin2 DNA構造体により安定してトランスフェクトされたMiaPaca細胞を、MiaPaca野生型細胞として維持し、但し300μg/mlの濃度でヒグロマイシンBの添加を除く。
【０１３３】
動物：
雌のNMRIヌードマウス（生後約10週：21〜25gの体重）を、Bomholtgard（Ry, Denmark）から購入した。動物保護は、協会のガイドラインに従い、そしてすべての実験は、地元の動物研究機関により許可された。
【０１３４】
腫瘍移植及びインビボ処理：
膵臓癌の３匹の正常位異種移植マウスモデル（２匹の非転移性モデルを包含する）を、ヒト膵臓癌細胞系DanG及びMiaPacaの野生型細胞の注入により確立し、そして１匹の転移性モデルを、Angiopoetin2 DNA構造体により安定してトランスフェクトされたMiaPaca細胞（MiaPaca-A2）の移植により確立した（A. Scholzにより確立された；公開されていないデータ）。正常位移植を記載のようにして実施した（Alves F, Contag S, Missbach M, Kaspareit J, Nebendahl K, Borchers U, Heidrick B, Streich R, Hiddemann W, An orthotopic model of ductal adenocarcinoma of the pancreas in severe combined immunodeficient mice representing all steps of the metastatic cascade. Pancreas 2001; 23:227-235）。
【０１３５】
手短には、マウスを、ケタミン（100mg/kg）及びキシラジン（10mg/kg）の混合物を腹腔内投与（i.p.）することにより麻酔をした。中央の側腹切開のあと、腹膜を開き、そして膵臓を露出した。10μlのPBS中、１×106個の腫瘍細胞のアリコートを、インスリン注射を用いて、膵臓の腹部に注射し、膵臓組織に可視的に浸潤せしめた。膵臓をその元の位置の後方に置き、そして腹壁を、腹膜に関してはVicryl6-0を用いて、及び皮膚に関しては縫合クリップを用いて、２つの層を閉じた。治療の開始の前、10匹のマウスを殺害し、腫瘍病巣の存在を確かめた。
【０１３６】
マウスをランダムにし、そして10〜12匹のマウスのグループを、ビークル（0.9％塩溶液）、標的化されていないIL-2、ホモダイマーscFv L19又はL19-IL-2（ホモダイマーscFv L19に接合されるIL-2から成る）により静脈内（i.v）処理するか、又は結果のセクションに記載されるようにして、異なったプロトコールに従ってゲムシタビンと共にi.p.投与した。すべての治療剤を、0.9％塩溶液に希釈し、そして１μl/g BWの体積で適用した。治療の終結のあと、マウスを殺害し、血液サンプルを集め、そして腫瘍体積を、長さ×幅×深さ×π/6の式を用いて計算した。
【０１３７】
転移性MiaPac-A2腫瘍モデルのリンパ節の面積を、最大の直径及びその垂直の直径を決定し、そして２つの測定値を測定することにより計算した。１つの実験においては、長期のデータを得るために、治療の完結の後、マウスを生かし続けた。治療の終りに及びその後、週２度、マウスの血液サンプルを、ヘパリン処理された血液採集毛細管による後眼窩放血により採取し、血清CA19-9レベルを調べた。マウスの生存時間は、治療の停止の100日後まで続いた（腫瘍細胞移植の121日後）。マウスは、100日目、検出できる腫瘍細胞が存在しない場合、治療されたものとして見なされた。
【０１３８】
ナチュラルキラー（NK）細胞の消耗：
NK細胞消耗を、前記のようにして実施した（Peron JM, Couderc B, Rochaix P, Douin-Echinard V, Asnacious A, Souque A, Voigt JJ, Buscail L, Vinel JP, Favre G, Treatment of murine hepatocellular carcinoma using genetically modified cells to express interleukin-12. J Gastroenterol Hepatol 2004; 19:388-396）。手短には、マウスを、腫瘍細胞注入の３日前、50μlの抗アシアロ-GM-1（ASGM1）Abにより、４日ごとに合計６回、i.p. 注射した。NK細胞消耗の品質を、流動細胞計測法及び細胞毒性アッセイによりモニターした。
【０１３９】
脾臓単核細胞（MNC）の調製：
単核細胞を、特にことわらない限り、NK細胞について消耗されたマウスの脾臓から調製した。手短には、脾臓を深い一般的な麻酔で除去し、そして37℃で１時間、コラゲナーゼにより消化した。続いて、内容物を、100μmの細胞ストレーナーを通して引き出し、そしてHBSSにより２度、洗浄した。単核細胞を、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心法を行うことにより細胞懸濁液から分離した。
【０１４０】
Alamar Blue細胞毒性アッセイ：
YAC-1細胞に対する単離されたネズミ脾臓MNCの細胞毒性活性を、前に詳細に記載されるようにして、24時間のalamarBlue細胞毒性アッセイを用いて試験した。
【０１４１】
流動細胞計測法：
NK細胞について消耗されているか、又は消耗されていないマウスから単離された１×106個の脾臓MNCを、１μgのPEラベルされた抗NK1.1抗体と共に４℃で15分間インキュベートした。PBSによる洗浄の後、蛍光陽性細胞の存在を、Cellquestソフトウェア（BectonDickensen; Heidelberg, Germany）を用いて、FACScanにより分析した。
【０１４２】
免疫組織化学分析：
手術的に切開されたヒト及びネズミ組織サンプルを、液体窒素において急速に凍結し、そしてPFA ４％、pH７に20分間、固定した後、凍結された組織の４μmの低温槽切片を、前に記載のようにして、アビジン−ビオチン−技法を用いて免疫組織化学的に分析した。スライドを次の一次抗体と共に１時間インキュベートした：ビオチニル化されたL19IL2（30μg/ml）、１：100の希釈度でのモノクローナルマウス抗−ヒトCD31、１:50の希釈度でのラット抗−マウスCD11b、１：50の希釈度でのビオチニル化されたマウス抗−マウスCD161ｂ/c/NK1.1及び1：50の希釈度でのビオチニル化されたマウス抗−ヒトパンサイトケラチン。一次抗体の代わりにPBSにより染色された切片を負の対照として使用した。
【０１４３】
増殖性細胞を、Animal Research Kitの適用により、モノクローナルマウス抗−ヒトKi67Abにより検出した。正常位細胞を、TumorTACS 現場アポトーシス検出キットを用いて、末端デオキシヌクレオチジルトランスファーゼ介在dUTPニック末端ラベリング（TUNEL）により試験した。両方法を製造業者の説明書に従って実施したが、但し３−アミノ−９−エチルカルバゾール（AEC）を、基質−クロモゲンとして使用した。負の対照は、一次抗体（Animal Research kit）又は末端デオキシヌクレオチジルトランスファラーゼ（TUNEL）の削除により包含された。生存（非壊死）腫瘍組織の領域についての定量的免疫組織化学分析を、Axiovison4.2ソフトウェア（Zeiss, Jena, Germany）を用いて、コンピューター助力のイメージング分析により実施した。
【０１４４】
増殖する正常位及び炎症性細胞の定量化のために、個々の腫瘍検体の20のランダムに選択された測定領域（680×510μm、倍率20倍）を分析し、そしてED-B FN発現の評価のために、10の領域（1390×1000μm、倍率10倍）を走査した。その結果は、測定領域の百分率（炎症細胞、ED-B FN）又は合計腫瘍細胞（Ki67, TUNEL）の百分率として正の染色を表す。壊死性腫瘍領域の定量的分析のために、H＆E切片を、低倍率（2.5倍）で走査した。合計及び壊死性腫瘍領域をスクリーン上に記録し、そして領域をイメージ分析システムにより計算し、そして腫瘍壊死領域/合計の腫瘍領域の比率を％で与えた。
【０１４５】
DNAの抽出及びDNAポリメラーゼ鎖反応（PCR）：
マウスリンパ節のゲノムDNAを、QIAamp DNA Miniキットを用いて、その製造業者の推薦するプロトコールに従って抽出した。ヒト特異的DNAの存在を、前方向プライマー5’- gggataatttcagctgactaacacg-3’及び逆方向プライマー5’-ttccgtttagttaggtgcagttatc-3’を用いて、Beckerなど. (Becker M, Nitsche A, Neumann C, Aumann J, Junghahn I, fichtner I, Sensitive PCR method for the detection and real time quantification of human cells in xenotransplantation systems. Br J Cancer 2002;87:1328- 1335)により報告されるプロトコールに従って、ヒト染色体17のα−サテライト領域の850bpフラグメントを増幅するポリメラーゼ鎖反応（PCR）により証明した。
【０１４６】
血清パラメーター：
マウス血液サンプルを、後眼窩放血又は断頭により得た。サンプルを遠心分離し、そして上清液を-20℃で貯蔵した。血清CA 19-9レベルを、ADVIA Centaur (Bayer, Leverkusen, Germany)上で、十分に自動化された化学ルミネセンスイムノアッセイにより測定し、そしてエイパーゼ（eipase）レベルを、ADVIA 2400 (Bayer, Leverkusen, Germany)上で、動的比色アッセイを用いて決定した。
【０１４７】
統計学的分析：
統計学的差異を、両側Mann-Whitney U−検定及びFishers厳正試験により評価し、そして相互関係を、GraphPad統計学ソフトウェアー（GraphPad Software Inc., San Diego, CA）を用いて、線状回帰により評価した。差異は、ｐ＜0.05で統計学的に有意であると思われた。
【０１４８】
結果：
ED-B FNはヒト膵臓癌において選択的に過剰発現される：
膵臓癌へのIL-2の選択的供給のための適切な標的物としてのED-B FNの仮定される役割を評価するために、本発明者は最初に、形質転換されていないヒト膵臓組織、慢性膵炎及び管腺癌におけるED-B FNの発現パターンを研究した。同時に、同じ組織からの一連の切片を、内皮細胞特異的抗原CD31に対するモノクローナル抗体により染色した。分析された（ｎ＝19）、すべてではないが、しかし１つの癌サンプルが、腫瘍血管の内部部位で及び腫瘍支質においてED-B FNの蓄積を表した。
【０１４９】
膵臓癌におけるED-B FN発現の定量化は、7.35％±1.60％のメジアンED-B FNレベルを表した（図１B）。対照的に、形質転換されていない膵臓組織（ｎ＝11）及び慢性膵炎（ｎ＝15）の血管及び支質は、それぞれ0.1％以下のED-B FN比率に対応する、無視できるか又は無のED-B FN発現を示した（図１B）。従って、それらのデータは、膵臓癌におけるED-B FNの選択的過剰発現を示し、それにより、膵臓癌のためのED-B FNに基づく標的化された治療のための基本原理を提供する。
【０１５０】
膵臓癌におけるL19IL2の治療効力に取り組むために、本発明者は、適切なマウスモデルを確立し、そしてヌードマウスの膵臓中に、ヒト膵臓癌細胞系DanG及びMiaPacaを正常位的に注入した。ED-B FNの発現パターンについての得られる正常位膵臓腫瘍の免疫組織化学分析は、腫瘍血管の周囲に及び支質区画において強い免疫染色を一貫して示した。ヒト情況に比較して、ED-B FNの定量レベルは、DanG腫瘍において有意に高く（22.33％±0.65％）、しかし他方では、MiaPaca腫瘍においては類似した（7.96％±1.32％）（図1B）。定性的及び定量的ED-B FN発現はインビボ情況を模倣することが確証され、そして膵臓癌に対するL19IL2の治療影響の評価を可能にした。
【０１５１】
L19IL2は確立された膵臓癌に対して有意な抗腫瘍活性を発揮する：
膵臓癌情況におけるL19IL2処理の効力を決定するために、無胸腺ヌードマウスに、ヒト膵臓癌細胞系DanGを正常位的に注入した。固形腫瘍の確立の後、マウスはランダムにされ、0.9％塩溶液、又はL19IL2又は標的化されていないIL-2のいずれかの1.43MIU/kg BW又は4.29MIU/kg BW IL-2同等物を10日間、受けた。治療の最後で、すべてのマウスを殺害し、そして腫瘍体積を計算した。
【０１５２】
IL-2処理は低い用量で腫瘍増殖に対して効果を有さず、そして高い用量においても少々の効果のみを有し、L19IL2の投与は対照マウスに観察される腫瘍体積の21.4％（1.43MIU/kg BW）及び2.7％（4.29MIU/kg BW）への腫瘍体積の統計学的に有意な低下をもたらし、従って標的化されていないIL-2よりも有意に卓越している（図2A、左側パネル）。別の実験においては、本発明者は、scFv L19抗体フラグメント自体のIL-2無関係抗腫瘍活性を除外した。このためには、マウスを、4.29MIU/kg BW L19IL2又は等モル量のscFv L19のみのいずれかにより、10日間、処理した。最初の実験においては、L19IL2の投与は、対照マウスに比較して、腫瘍負荷の統計学的に有意な低下を再現的に誘導した。
【０１５３】
対照的に、scFv L19は、いずれの阻害効果の達成も失敗し、治療的活性のエフェクター成分としてのIL-2の役割を強調する（図2A, 右側パネル）。カリパス測定による腫瘍サイズの連続した評価は正常位的に注入された腫瘍に対して適切でないので、本発明者は、腫瘍の進行及び腫瘍増殖に対する治療効果をモニターするための適切な血清マーカーの確立を意図し、そして腫瘍体積とCA19-9の血清濃度との間の有意な相互関係を示すことができた（ｎ＝56：ｐ＜0.001）（図2B、左側パネル）。従って及び上記腫瘍負荷のL19IL2誘発された低下に一致して、L19IL2の投与は、腫瘍担持マウスにおける血清CA19-9レベルの有意な低下をもたらし、ところがIL2は血清腫瘍マーカーに対して影響を与えなかった（データは示されていない）。
【０１５４】
この観察に基づいて、本発明者は、ビークル及びL19IL2処理されたマウスの血液サンプルを反復して集めることによりL19IL2処理された増殖遅延の時間―応答関係を評価した。興味あることには、対照に比較される場合、２倍低い血清CA19-9レベルに関して、L19IL2依存性腫瘍増殖遅延が、処理の開始の後、３日ほどで観察され、そしてこの差異は、実験の最後まで、上昇し続けた。実際、この時点で、血清CA19-9レベルの15倍以上の上昇が対照グループにおいて検出され、ところがL19IL2を得るマウスの血清腫瘍マーカーは、治療の開始で、基線とは有意に異ならなかった（図2B、右側パネル）。
【０１５５】
L19IL2の治療効果を証明するために、次に本発明者は、IL-2活性及び続く炎症応答が、形質転換されてない膵臓組織に隣接して急性膵炎を誘発しない腫瘍に制限されることを確証した。このためには、塩溶液、又は標的化されたか又は標的化されていないIL-2のいずれかにより処理されたマウスを、膵炎の代用マーカーとしての血清リパーゼレベルについてアッセイした。しかしながら、対照に比較して、L19IL2も標的化されていないIL-2のいずれも、血清リパーゼ濃度を妨げなかった（図2C）。
【０１５６】
この発見は、従来のHE染色、及びNK1.1（ナチュラルキラー（NK）細胞）及びCD11ｂ（主にマクロファージ）に対して向けられた抗体による免疫染色を用いて、膵臓腫瘍及びL19IL2により処理された動物の形質転換されていない残留膵臓組織の組織学的分析により、さらに確証された。注釈の中で、急性膵炎の症状は検出できず、そして炎症性細胞は腫瘍において選択的に蓄積し、隣接する形質転換されていない膵臓組織を軽く攻撃し、それにより、L19IL2処理の悪影響として膵炎を除外した（データは示されていない）。
【０１５７】
腫瘍増殖のL19IL2誘発された低下が細胞型特異的であるか否かを調べるために、マウスに、ヒト膵臓癌細胞系MiaPacaを正常位的に注入した。固形腫瘍の確立の後、マウスはランダムにされ、0.9％塩溶液、又はL19IL2又はIL-2のいずれかの1.43MIU/kg BW又は4.29MIU/kg BW IL-2同等物を10日間、受けた。標的化されていないIL-2は低用量で治療効果を有さないが、等モル量のL19IL2は対照の10.4％（p＝0.0003）への腫瘍負荷の有意な低下を再現的に導き、それにより、標的化されていないIL-2（p＝0.0003）よりも有意に（８倍）卓越していた。高い用量で、標的化されていないIL-2は対照の47.3％（p＝0.0205）への腫瘍体積の有意な低下をもたらした。しかしながら、等モル量のL19IL2の適用は、対照の16.8％（p＝0.0007）までの腫瘍増殖の阻害を達成し、従って、標的化されていないIL-2よりも３倍以上、効果的であるが、但しこの差異は統計学的有意に達しなかった（p＝0.0513）（図2D）。
【０１５８】
L19IL2は膵臓癌の確立された転移を有意に低めるか又は排除する：
一次膵臓腫瘍の処理のためのL19IL2の効力を証明するために、次に本発明者は、転移性疾病におけるその効能を調べた。従って、マウスを、Ang2 DNA構造体（MiaPaca-A2）により安定してトランスフェクトされたMiaPaca細胞によって正常位的に移植し、腹部内リンパ節及び肝臓への膵臓癌の転移性広がりをもたらす。転移を、ヒトパンサイトケラチンについての免疫組織化学的染色により確かめ、そして続いて、ED-B FN発現について調べた。確実に、すべてのリンパ節は、新生細胞により浸潤され、そしてすべての肝臓転移はED-B FNについての免疫反応性を示し、ところが浸潤されていないリンパ節及び肝臓は免疫反応性を示さなかった。
【０１５９】
この観察に基づけば、前もって確立されたリンパ節転移を有する正常位MiaPaca-A2膵臓腫瘍を担持するマウスを、ビークル又はL19IL2により、4.29MIU/kg BWで10日間ランダムに処理した（60〜64及び67〜71日目）。治療の最後で、すべてのマウスを殺害し、そして一次腫瘍体積及びリンパ節を計算した。一次腫瘍体積の有意な低下の他に、L19IL2は、ビークル処理された対照に観察される腫瘍の20％以下に、メジアンリンパ節領域の相当な低下をもたらした（p＝0.0120）（図３、薄いバー）。パンサイトケラチンについての免疫染色によるリンパ節転移の確証は、L19IL2処理されたマウスの20％に比較して、対照マウスの80％のリンパ節におけるサイトケラチンについての強い免疫反応性を有する大きな多形核細胞を示した。
【０１６０】
しかしながら、L19IL2処理されたマウスのほとんどでのリンパ節は、サイトケラチンに対して陽性の小さな顆粒球のような細胞を示し、このことは、以前に報告されている、顆粒球における顆粒結合されたエピトープと抗−サイトケラチン抗体との交差反応を示唆する（Streicher J, Fabian B, Herkner K, Pointner H, Bayer PM. Anticytokeratins are a potential source of false-positive indirect immunofluo- rescence assays for C-ANCA. J Clin Lab Anal 1998;12:54-59）。
【０１６１】
それらの顆粒球のようであるが、しかしサイトケラチン陽性細胞が新生又は炎症性細胞を表すかどうかをさらに明確にするために、リンパ節を、ヒト染色体17上のα−サテライトDNA上のヒト特異的な850bpのフラグメントの検出のためにDNA-PCRを行うことによりヒト癌細胞の浸潤についてスクリーンした。予測されたサイズのPCR増幅を、すべての陽性対照マウスのリンパ節において検出できたが、しかしL19IL2処理されたマウスのわずか33％において検出できた。従って、L19IL2処理は、リンパ節転移の有意な低下をもたらした（p＝0.0275）（図3D、ダーク  バー）。
【０１６２】
L19-IL2のスケジュール依存性抗腫瘍効果：
L19-IL12のスケジュール依存性抗腫瘍効果の評価のために、DanG細胞により正常位に注入されたマウスを、対照グループ、又は次のプロトコールに従っての4.29MIU/kg BW L19IL2による処理にランダムに割り当てた：（ａ）週１度、7, 14日目；（ｂ）週３度、7, 9, 11, 14, 16, 18日目；（ｃ）週５度、７〜11及び14〜18日目（図4、左側パネル）。対照に比較して、すべてのレジメは、有意な腫瘍増殖の遅延をもたらした。しかしながら、７〜11日目、14〜18日目、L19IL2の適用は、最良の腫瘍応答をもたらし、対照に観察される腫瘍負荷の12％までの腫瘍負荷の低下をもたらし、ところがL19IL2注入の回数の低下は腫瘍応答の低下に関連し、但しそれらの差異は統計学的有意性に達しなかった（図４、右側パネル）。
【０１６３】
L19IL2処理は相当な長期効果をもたらす：
L19IL2が持続できる長期緩解を達成できるかどうかを調べるために、正常位DanG膵臓癌担持のマウスを、4.29MIU/kg BW L19IL2により10日間、処理した（7〜11及び14〜18日目）。続いて、マウスを未処理のまま放置し、そして腫瘍再発を、血清CA19〜９レベルの週２回の評価によりモニターした。治療の終結の後、第４週〜第８週の間、10匹のマウスのうち６匹は、腫瘍再発に関係する血清腫瘍マーカーの著しい上昇を経験し、そして続いて、腫瘍負荷のために死亡した。１匹の動物は、血清CA19-9レベルのいずれの上昇も伴わないで、皮膚腫瘍を進行した。10匹のうち４匹は、治療の停止の後、３ヶ月間の観察期間を通して、血清CA19-9レベルの上昇を伴わないで生存した。この時点で行われる検死は、腫瘍再発の証拠を確実に示さず、そして動物は治療されたものとして見なされた（図５）。
【０１６４】
膵臓癌に対するL19-IL2、ゲムシタビン及びその組合せの治療効果：
ゲムシタビンは、膵臓癌を処理するための最良の現在入手できる細胞毒性薬剤と思われる。従って、本発明者は、ゲムシタビンに対するL19IL2の処理を比較し、そしてそれらの２種の剤の組合せ処理がいずれかの治療有益性を生成するかどうかを評価した。このためには、正常位DanG腫瘍を担持するマウスのゲムシタビンによる標準の膵臓癌処理（週１度、すなわち７及び14日目での250mg/kg BWのi.p.注入）は、対照マウスに比較して、膵臓腫瘍体積の28％までの有意な低下をもたらした。注釈の中で、L19IL2処理（８〜12及び15〜19日目、4.29MIU/kg BWのi.v.注入）は、単独で、ゲムシタビン治療よりも2.3倍、腫瘍体積を低めた（p＝0.0095）。
【０１６５】
さらに、L19IL2の処理及びゲムシタビンが組合わされる場合、腫瘍は非常に小さく、それぞれ、ゲムシタビン処理により観察される腫瘍負荷のわずか12.4％（p＝0.0004）、及びL19IL2処理により観察される腫瘍負荷の28.53％（p＝0.0435）への腫瘍負荷の低下に対応する（図６）。さらに、完全な緩解はゲムシタビンのみによる処理により達成されなかったが、L19IL2を投与されたマウスの37％、及びL19IL2及びゲムシタビンの組合せを受けたマウスの70％が完全な緩解を経験した。
【０１６６】
腫瘍壊死、アポプトシス及び増殖に対するL19IL2の効果：
L19IL2の誘発された腫瘍緩解を受ける機構を同定するために、本発明者は最初にビークル及びL19IL2処理されたマウスの腫瘍サンプルを、代表的なモデルとして正常位DanG膵臓癌モデルを用いて、従来のH＆E染色により分析した。L19IL2処理された腫瘍の最も興味をそそる特徴の１つは、広範な腫瘍壊死であった。実際、L19IL2を受けるマウスにおいては、壊死は腫瘍領域の42±10.86％を含み、そして未処理の対照においては、腫瘍領域のわずか2.5±2.177％が壊死であった（p＝0.0159）（図７A）。
【０１６７】
TUNELアッセイを通してのアポプトシスについての残留生存腫瘍組織の分析は、ビークル処理された対照に比較して、L19IL2処理されたマウスの腫瘍におけるアポプトシス細胞指標の適切な差異を示さなかった（図7B）。対照的に、Ki67免疫染色による増殖細胞についての分析は、分裂細胞の比較が、未処理の対照に比較して、L19IL2を投与されたマウスの腫瘍において実質的に（4.6倍）低められたことを示した（p＝0.0177）（図7C）。
【０１６８】
L19IL2誘発された抗腫瘍応答を介在する免疫エフェクター細胞の同定：
広範な腫瘍壊死の他に、L19IL2処理された腫瘍のH＆E染色は、未処理の対照において検出できない実質的な丸型細胞炎症浸潤を示した。L19IL2誘発された腫瘍増殖阻害を介在する免疫エフェクター細胞をさらに同定するために、腫瘍検体を、マクロファージを優先的に含むCD11ｂ+細胞及びNK細胞について免疫組織学的に評価した。実際、４倍以上の増加された数のCD11b+細胞が、未処理の対照に比較して、L19IL2処理された動物の腫瘍に検出でき（p＝0.0012）（図8A）、そしてさらに厳密には、NK細胞浸潤における70倍以上の上昇が示され(図8B)、このことは、NK細胞がL19IL2誘発された抗腫瘍応答の主要プレーヤーであることを示唆する。
【０１６９】
NK細胞の推定される役割をさらに実証するために、本発明者は抗ASGM-1抗体を通してのNK細胞消耗がL19IL2の治療効力を妨げるかどうかを試験した。このためには、DanG細胞を正常位で移植されたマウスを次の処理グループにランダムに割り当てた：NKコンピテント＋塩溶液処理、NK欠失＋塩溶液処理、NK欠失＋L19IL2処理（7〜11, 14〜18日目、4.29MIU/kg BW L19）及びNKコンピテント＋L19IL2処理（7〜11, 14〜18日目、4.29MIU/kg BW L19）。本発明者の免疫組織学液データに一致して、L19IL2処理は、NK欠失又はNKコンピテントビークル処理されたマウスに比較して、NK欠失マウスにおいていずれの有意な腫瘍再発も生成しなかった。さらに、L19IL2は、NK欠失マウスに比較して、NKコンピテントにおいて５倍以上効果的であった（図8C）。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、ヒト膵臓癌及び膵臓癌の2つの正常位ヌードマウスモデルにおけるED-B FNの発現を示す。ED-B FN発現は、コンピューター助力のイメージ分析により定量化された。与えられる値は、測定フレーム領域の％として免疫染色された領域を表し、そしてラインは個々のグループの平均ED-B FN量を示す。＊：p＜0.001（ヒト脾臓癌に対する）。
【０１７１】
【図２】図２は、ヌードマウスにおける正常位膵臓癌に対するL19IL2の治療効果を示す。A-Cヌードマウスは、ヒト膵臓癌細胞系DanGにより正常位的に注入された。固形腫瘍の確立の後、10〜12匹のマウスのグループを、10日間、示されるようにしてランダムに処理した（腫瘍細胞移植の後、７〜11、14〜18日目）。すべてのマウスは、21日目、殺害され、そして腫瘍体積が計算された（A, C）。
【０１７２】
（A）左側パネル：マウスは、0.9％塩溶液、又はL19IL2又は標的化されていないIL-2のいずれかとして、示される濃度のIL-2同等物のいずれかにより投与された。示されるデータは、個々の処理グループの平均腫瘍体積±SEMを表す。＊：p＜0.004（対照に対する）；＋：p＝0.0003（等モル量のIL-2に対する）。右側パネル：マウスは、塩溶液、4,29MIU/kg BW L19IL2、又は等モル量のホモダイマーscFvL19抗体フラグメントにより処理される。値は、ビークル処理された対照からの腫瘍体積の％として表される。＊：p≦0.004（対照及びL19に対する）。
【０１７３】
（B）左側パネル：血液サンプルが、８〜908mm3の体積範囲の腫瘍を担持するマウス及び負の対照として作用する腫瘍のないマウスから集められた。CA19-9の血清濃度が、化学ルミネセンスイムノアッセイにより決定され、そしてCA19-9レベル対腫瘍体積がそれぞれ個々の動物に関してプロットされた。N=56, r=0.7332, P＜0.0001。右側パネル：ビークル又はL19IL2により処理されたマウスからの血液サンプルが、示される時点で集められ、そして血清CA19-9レベルが決定された。個々の点は、対照又は処理のグループの平均±SEMを表す。＊：p＜0.05。
【０１７４】
（C）マウスは、示される処理グループにランダムに割り当てられた。処理の最後で、血液サンプルが集められ、そして血清リパーゼが動的比色アッセイにより分析された。示される値は、個々の処理グループの平均±SEMである。
【０１７５】
（D）ヌードマウスが、ヒト膵臓癌細胞系MiaPacaにより正常位的に移植された。固形腫瘍は、40日目までに確立されるようになり、そして続いてマウスは塩溶液、又は示される濃度のL19IL2又は標的化されていないIL2のいずれかにより、腫瘍細胞接種の後、40〜44、47〜51日目、処理された。すべてのマウスは54日目殺害され、そして腫瘍体積が計算された。示されるデータは、個々の処理グループの平均±SEMとして表される。＊：p≦0.0007（対照に対する）；＋、p＝0.0003（L19IL2 1.43 MIU/kg BW対等モル量のIL-2）：‡：p=0.0513（L19IL2 4.29 MIU/kg BW対等モル量のIL-2）。
【０１７６】
【図３】図３は、ヌードマウスにおける正常位膵臓癌異種移植体の確立された転移に対するL19IL2の治療効果を示す。ヌードマウス、Angiopoetin2 DNA構造体により安定してトランスフェクトされた、ヒト膵臓癌細胞系MiaPacaの細胞により正常位的に注入され、腹部内リンパ節及び肝臓への膵臓癌の転移性広がりをもたらした。リンパ節の領域は、最大の直径及びその垂直直径を測定し、そして２種の測定値の積を計算することにより計算された。得られる値は、対照及び処理グループのメジアンリンパ節±SEMを表す。リンパ節を、パンサイトケラチンに対する免疫染色により腫瘍浸潤について分析した。ヒト特異的DNA PCRの結果は図に要約されている。与えられるデータは、それぞれ、ビークル−又はL19IL2処理されたマウスの％としてPCR陽性リンパ節を有するマウスの数を表す。＊：p=0.0275。
【０１７７】
【図４】図４は、L19IL2のスケジュール依存性抗腫瘍効果を示す。正常位DanG膵臓腫瘍担持のヌードマウスは、左側パネル上に示される処理スケジュールに従って、ビークル（0.9％塩溶液）又は4.29MIU/kg BW L19IL2によりi.v. 投与された。すべてのマウスは21日目に殺害され、そして膵臓腫瘍体積が計算された（右側パネル）。示されるデータは、個々の処理グループの平均±SEMを表す。＊     ：p≦0.0001（塩溶液対照に対する）。
【０１７８】
【図５】図５は、L19IL2処理の長期効果を示す。正常位DanG膵臓癌担持の10匹のヌードマウスを、腫瘍細胞移植の後、７〜11、14〜18日目、4.29MIU/kg BW L19IL2により処理し、そして続いて、未処理のまま放置した。治療及び週２度の反復の最後で、マウス血液サンプルが集められ、そして血清CA19-9レベルが決定された。示されるデータは、それぞれ個々の動物の血清CA19-9レベルを表す。
【０１７９】
【図６】図６は、ヌードマウスにおける膵臓癌に対するL19IL2、ゲムシタビン及びその組合せによる処理の効力を示す。正常位DanG膵臓腫瘍担持のマウスを、週１度、250mg/kg BWゲムシタビンによるi.p. 処理（7、14日目）、８〜12、15〜19日目、4.29MIU/kg BW L19IL2のi.v. 注入、L19IL2及びゲムシタビンの組合せ処理又はビークル（0.9％塩溶液）処理にゆだねた。21日目で、すべてのマウスは安楽死され、そして腫瘍体積が計算された。結果は、個々の処理グループの平均±SEMとして表される。＊：p＜0.01（対照に対する）、x：p＜0.01（ゲムシタビンに対する）、＋：p＝0.0435（L19IL2に対する）。
【０１８０】
【図７】図７は、腫瘍壊死、アポプトシス及び増殖に対するL19IL2の効果を示す。正常位DanG腫瘍を担持するマウスを、0.9％塩溶液又は4.9MIU/kg BW L19IL2のいずれかによりi.v. 処理した。  左側パネル：治療の終結の後、腫瘍は、従来のH＆E染色により試験された（A）、アポプトシスはTUNELアッセイより評価され（B）、そして増殖細胞はKi67染色により可視化された（C）。ビークル処理された及びL19IL2処理された腫瘍の代表的サンプルが示されている。
【０１８１】
右側パネル：（A）壊死の定量化のために、壊死及び合計の腫瘍領域を定倍率（2.5倍）で記録した。領域はコンピューター助力のイメージ分析システムにより計算され、そして腫瘍壊死領域/合計腫瘍領域の比率は％で与えられる。示されるデータは、個々のグループの平均±SEMを表す。＊：p=0.0159。アポプトシス（B）及び増殖指標（C）の定量化のために、陽性腫瘍細胞/すべての腫瘍細胞の比率を計算した。結果は％で表され、そして個々のグループの平均±SEMを表す。＊：p=0.0177。（尺度バー500μm、B, C, 尺度バー100μm）。
【０１８２】
【図８】図８は、L19IL2誘発された腫瘍緩解を介在する免疫エフェクター細胞の同定を示す。（A, B）正常位DanG膵臓腫瘍担持のヌードマウスは、0.9％塩溶液又は4.29MIU/kg BW L19IL2をi.v. 投与された。治療の完結の後、腫瘍は、主にマクロファージを認識するCD11b抗体（A）及びNK細胞に対して特異的なNK1.1抗体（B）により染色された。左側パネル：ビークル処理（及びL19IL2処理）されたマウスの代表的な例が示されている（バー、100μm）。CD11b＋細胞（A）及びNK細胞（B）の浸潤を、コンピューター助力のイメージ分析により定量化した。得られる結果は、測定フレーム領域の％として免疫染色された領域を表し、そして個々のグループの平均±SEMとして表される。＊：p=0.0159(A), ＊：p=0.0012(B)。  （C）正常位DanG腫瘍担持のヌードマウスは、示される処理グループにランダムに割り当てられた。治療の停止の後、腫瘍体積が決定された。バーは、個々のグループの平均±SEMを表す。＊：p＜0.01（いずれか他のグループに対する）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月1日(2008.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも（i）融合タンパク質、及び（ii）ゲムシタビン（gemcitabine）を含んで成る組合せであって、
前記融合タンパク質が、EDb−フィブロネクチンドメインを特異的に認識する抗体部分、及び
インターロイキン−２部分を含んで成ることを特徴とする組合せ。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、N−末端抗体部分、及びC−末端インターロイキン２部分を有するか、又は
前記融合タンパク質が、N−末端インターロイキン２部分及びC−末端抗体部分を有する請求項１記載の組合せ。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、前記抗体部分及びインターロイキン２部分を連結する融合タンパク質リンカーを有する請求項１又は２記載の組合せ。
【請求項４】
前記抗体部分が、ナノモル以下の親和性を伴って、EDb腫瘍胎児性フィブロネクチンドメインに対して特異的に結合する請求項１〜３のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項５】
前記抗体部分が、L19抗体の少なくとも１つのCDR配列を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項６】
前記抗体部分が、配列番号６〜11の配列を含んで成る請求項１〜５のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項７】
前記抗体部分が、配列番号01の少なくとも１つのVH鎖、又は配列番号02の少なくとも１つのVL鎖を含んで成る請求項１〜６のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項８】
前記抗体部分が、配列番号01の１つのVH鎖、及び配列番号02の１つのVL鎖を含んで成る請求項１〜７のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項９】
前記H及びL鎖が、抗体リンカーにより連結される請求項１〜８のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１０】
前記抗体リンカーが、配列番号03の配列、又は配列番号03の配列に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含んで成る請求項１〜９のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１１】
前記インターロイキン２部分が、ヒトインターロイキン２又はその機能的変異体である請求項１〜10のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１２】
前記インターロイキン２部分が、配列番号04の配列を含んで成る請求項1〜11のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１３】
融合タンパク質リンカーが、前記抗体部分及びインターロイキン２部分を連結している請求項1〜12のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１４】
前記融合タンパク質リンカーが、１〜30個の長さのアミノ酸を有する請求項1〜13のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１５】
前記融合タンパク質リンカーが、配列番号05の配列を含んで成る請求項1〜14のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１６】
ゲムシタビンがゲムシタビン塩酸塩である請求項1〜15のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１７】
薬剤として使用するための請求項1〜16のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１８】
癌の処理のための薬剤として使用するための請求項1〜17のいずれか１項記載の組合せ。
【請求項１９】
前記癌が、非小細胞肺癌、頭及び首癌、卵巣癌及び乳癌から選択される請求項18記載の組合せ。
【請求項２０】
前記癌が、膵臓癌である請求項18記載の組合せ。
【国際調査報告】
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2009532408.tif 000017
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