(57)【要約】  バイロンが、タンパク質補充物を発現系に添加しない限り複製することができないようにウイルスDNAまたはRNAが改変されている条件付きで生存するバイロン及びその作製方法。発現系は、ウイルス粒子の自己組織化に適した従来の細胞培養または無細胞発現系のいずれかである。両発現系は、複製不能バイロンの複製または会合のいずれかのためにウイルスタンパク質の添加を必要とする。次に、条件付きで生存するバイロンは、1）全成分無傷複製不能ウイルス；2）タンパク質補充物の添加により一時的に蘇生する条件付きで生存するバイロン；及び3）それ自体サブユニットワクチンとして作用するタンパク質補充物；により誘発される3相の免疫特性を有するワクチンの作製のために使われる。
2009518046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子を提供する段階と、
b.前記ウイルスDNAまたはRNAを増幅する段階と、
c.前記ウイルスDNAまたはRNAを、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAにおいて改変する段階と、
d.増幅され改変されたウイルスDNAまたはRNAを回収する段階と、
e.前記回収したウイルスDNAまたはRNAを、ウイルス粒子が条件付きで生存するビリオンとして自己組織化することに適した無細胞発現系に再パッケージする段階と、
f.少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンを回収する段階と
を含む、少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンの作製方法。
【請求項２】
前記条件付きで生存するビリオンが、ウイルスDNAまたはRNAの改変を欠く対応するビリオンに比べて複製能力を欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスゲノムがHIVウイルスゲノムである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを配合する段階と、前記ウイルスワクチンに、前記少なくとも1種の改変した複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する所定量の外因性複製タンパク質を添加し、それによって前記少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンの限定された複製を可能にする段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、前記ウイルスワクチンに、前記改変した複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当し、前記少なくとも1種の改変した複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAの生物活性のあるフラグメントまたは誘導体である、所定量の外因性複製タンパク質を添加し、それによって前記少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンの限定された複製が可能となる段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、薬学的に許容可能な担体を添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドを添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類、タイコ酸、ザイモサン、クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜、プロタミン、ヘパリナーゼ、C3bの産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子、dCVFの形のコブラ毒因子、C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケル、硫酸化ポリアニオン、ヒートショックタンパク質、フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインA、ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖、硫酸ヘパリンの多糖類フラグメント、フィブリノーゲン、リポ多糖類、ホスホリルコリン、尿酸、IgGI及びIgGIII抗体、補体タンパク質、並びにその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドを添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドを添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、無傷の宿主のHIV感染組織から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
a.少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、ウイルスDNAまたはRNA複製を不能にするように改変されている、ウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNA；
を含み、
b.前記ウイルスDNAまたはRNAが、無細胞発現系において自己組織化するウイルスタンパク質によって被包されて、条件付きで生存するバイロンを形成する；
免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記条件付きで生存するバイロンが、ウイルスDNAまたはRNAの改変を欠く対応するバイロンに比べて複製能力を欠損している、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスゲノムがHIVウイルスゲノムである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
ワクチンとして配合される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも1種の改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する所定量の外因性複製タンパク質と組み合わせてワクチンとして配合され、それによって、複製に適した条件の系に投与すると、条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも1種の改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当し、前記改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAの生物活性のあるフラグメントまたは誘導体である、所定量の外因性複製タンパク質と組み合わせてワクチンとして配合され、それによって、複製に適した条件の系に投与すると、条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
薬学的に許容可能な担体と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
タイコ酸と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
ザイモサンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
プロタミンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
ヘパリナーゼと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
C3の産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
dCVFの形のコブラ毒因子と組み合わせた請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケルと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
硫酸化ポリアニオンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
ヒートショックタンパク質と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインAと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
硫酸ヘパリンの多糖類フラグメントと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
フィブリノーゲンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
リポ多糖類と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
ホスホリルコリンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
尿酸と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
IgGI及びIgGIII抗体と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
補体タンパク質と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記ウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染組織から単離される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記ウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記ウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
前記改変された少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
経口的に、経頬的に、経粘膜的に、舌下に、経鼻的に、直腸に、膣内に、眼内に、筋肉内に、リンパ管内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、皮内に、腫瘍内に、局所的に、経肺的に、吸入により、注射により、または移植により投与される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
a.ウイルス複製に適した条件下で、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子に改変を有する少なくとも1種のHIVバイロンの存在下で細胞を培養して、条件付きで生存するバイロンを形成する段階と、
b.前記改変を有する前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する外因性複製タンパク質を添加し、前記培養における前記バイロンの複製を促進して、薬学的に許容可能な量の複製不能なバイロンを作製する段階と、
c.前記複製不能なバイロンを精製し回収する段階と、
d.前記改変を有する前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子に相当する所定量の複製タンパク質で前記複製不能なバイロンを配合し、それによって、複製に適した条件の系に投与すると、前記条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする段階と
を含む、ウイルスワクチンの作製方法。
【請求項５０】
前記条件付きで生存するバイロンが、ウイルスDNAまたはRNAの改変を欠く対応するバイロンに対して複製能力を欠損している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する前記所定量の外因性複製タンパク質が、前記改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAの生物活性のあるフラグメントまたは誘導体であり、それによって、少なくとも1種の条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスワクチンが、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルスワクチンが、少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルスワクチンが、少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類、タイコ酸、ザイモサン、クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜、プロタミン、ヘパリナーゼ、C3bの産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子、dCVFの形のコブラ毒因子、C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケル、硫酸化ポリアニオン、ヒートショックタンパク質、フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインA、ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖、硫酸ヘパリンの多糖類フラグメント、フィブリノーゲン、リポ多糖類、ホスホリルコリン、尿酸、IgGI及びIgGIII抗体、補体タンパク質、並びにその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ウイルスワクチンが、薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも1種のHIVバイロンが、無傷の宿主のHIV感染組織から単離される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも1種のHIVバイロンが、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも1種のHIVバイロンが、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
a.少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに改変を有し、条件付きで生存するバイロンを形成し、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAにおける前記改変に相当する外因的に添加されたタンパク質を含むウイルス複製に適した条件下で培養されるHIVバイロンと、
b.改変を有する前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当し、完全タンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、及びその組合せからなる群から選択される生物活性のあるタンパク質と
を含む、免疫原性組成物。
【請求項６１】
前記条件付きで生存するバイロンが、対応する無改変HIVバイロンと比べて複製を欠損している、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
前記HIVバイロンが、HIV感染組織から単離される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
前記HIVバイロンが、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
前記HIVバイロンが、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
前記改変された少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
ワクチンとして配合される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
薬学的に許容可能な担体と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
タイコ酸と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
ザイモサンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
プロタミンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
ヘパリナーゼと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
C3の産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
dCVFの形のコブラ毒因子と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケルと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
硫酸化ポリアニオンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
ヒートショックタンパク質と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインAと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
硫酸ヘパリンの多糖類フラグメントと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
フィブリノーゲンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
リポ多糖類と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
ホスホリルコリンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
尿酸と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
IgGI及びIgGIII抗体と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８８】
補体タンパク質と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８９】
薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項９０】
経口的に、経頬的に、経粘膜的に、舌下に、経鼻的に、直腸に、膣内に、眼内に、筋肉内に、リンパ管内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、皮内に、腫瘍内に、局所的に、経肺的に、吸入により、注射により、または移植により投与される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真摯な努力が重ねられているが、HIVの安全な治療ワクチンはない。HIV生活環の種々の段階が発明者たちにより標的にされてきた。現在までのところ、研究では、免疫抑制レトロウイルスHIV-1及びHIV-2に対する効果的な免疫応答を促進すると考えられる組成物は見つかっていない。大半のHIVワクチンは、前記ウイルスのエンベロープスパイクに対する中和抗体の産生を誘導するために、前記ウイルスの表面糖タンパク質（gp160、gp120及びgp41）のエンベロープの一部を使っている。一部のワクチンは、高力価の中和抗体の産生に成功している。このアプローチの背景にある見解は、これらの糖タンパク質に結合する抗体は前記ウイルスを中和し感染を妨げると考えられることである。次に、機能する免疫系は補体系を活性化することができ、これにより溶解へとカスケードが起き、前記ウイルスを破壊すると考えられる。しかし、前記ウイルスは機敏且つ容易に免疫系を逃れることができる。現在までのところ、AIDSに罹り、適切な免疫応答を開始して、前記ウイルスを除去した個体の症例研究は1件も記録されていない。従って、HIV疾患に関する免疫マーカーはない。
【０００３】
いくつかの薬剤または組成物（例えば、AZT、ddI、ddC、d4T及び3TC）は逆転写を阻害する。これらの2',3'-ジデオキシヌクレオシド類似物は、ある種の株に対して有効でありうるが、HIVのゲノム変異性に対して脆弱である（Deeks、第6章）。これらの薬物は、毒性、価格、複雑な治療計画、薬物間相互作用の他に薬物耐性の問題にも直面している。
【０００４】
病原体に対するワクチンは、抗菌治療よりも対象範囲が限定されている。抗生物質は、様々な源由来の種々の細菌感染に対する複数の承認された用途を有することがある。しかし、ワクチンは、効果があるにしても、個体を特定の疾患に罹ることから守るのみである。しかし、ワクチンが、関連する感染性エレメント由来の病原体からなる場合、その限界が不鮮明になることがある。この古典的な例は、天然痘ワクチンであり、このワクチンはワクシニアである。このウイルスは水牛痘に類似しており、病原媒介動物による牛痘及び/または天然痘の継代に由来していた可能性がある（Flint、2004年、6頁）。19世紀、エドワードジェンナーは、牛痘に接触した患者が天然痘に対して免疫性があることに注目した。この観察に続いて、彼は天然痘予防のために牛痘由来ワクチンを開発した。ジェンナー型ワクチンは1種の病原体を利用して、第2の病原体に対する免疫応答を誘発する（Wagnerら、102〜108頁）。
【０００５】
現在入手可能なワクチンは8種の広い範疇、すなわち（1）弱毒性生（セービンポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、黄熱病、水痘帯状疱疹（水痘）、BCG（結核）、腸チフス（サルモネラチフィ）、狂犬病（イヌなどの動物用）；（2）不活化全成分ウイルスまたは細菌性狂犬病（ヒト用）、インフルエンザ、A型肝炎、百日咳（百日咳菌）、パラチフス（パラチフス菌）、発疹チフス（発疹チフスリケッチア）、ペスト（ペスト菌）；（3）サブユニット（A型肝炎またはB型肝炎）；（4）不活化毒素またはトキソイド（破傷風、ジフテリア）；（5）ジェンナー型（天然痘）；（6）組換え生（ワクシニアベクターを利用する動物用の狂犬病）；（7）コンジュゲート（髄膜炎）、並びに（8）精製莢膜多糖類（髄膜炎（インフルエンザ菌）及び連鎖球菌肺炎）、のうちの1種に分類される。
【０００６】
生ワクチンは宿主内で実際の感染を引き起こす。従って、免疫系の液性及び細胞媒介性アームが、協調した律動的な形で応答し感染を根絶する。その結果、一生ではないにしても長期の免疫が可能になる。ベクターが免疫化された宿主によって排泄される場合には、生ワクチンのもう1つの利点を実現することができる。未免疫の患者は感染に罹り、従って免疫になることができる。未免疫の患者が適切な候補でなければ、これによる不慮の致命的になることが多い結果が生じるおそれがある。にもかかわらず、「集団免疫」という概念は、生ベクターにより最もよく実現することができる（Levinson、247〜243頁）。1回のみのワクチン接種が求められる場合が多い。生ワクチンは通常、弱毒化された、非病原性または相対的に非病原性のベクターからなる。このワクチン接種法の不利は、逆突然変異が起こり生物を病原性にする可能性である。さらに、一部の個体は、多くの場合内在性の免疫疾患、合併症、または既存の症状のために、相対的非病原性ベクターに屈することになる。この古典的例が、湿疹または乾癬に罹っているが他の点では健康な患者への天然痘ワクチンの投与であろう。これらの患者は、播種性劇症疾患に罹り、ワクチンに屈することが多かった。
【０００７】
不活化全成分ウイルスまたは細菌由来ワクチンは、大きな安全域に特徴付けられる。ウイルスが複製能力を失っている場合には、感染症がワクチンから生じることはない。従って、「集団免疫」の効果は、セービンワクチンの場合と同じ方法ではソークワクチンには適用できない。不活化全成分ウイルスワクチンの不利は、通常、たとえあっても生じる免疫応答が弱いことである。病原体複製がなければ、免疫学的認識は起こらないことが多い。追加の不利は、不活化または複製不能ベクターに対する全身性応答の欠如である。工学的に改変された不活化ワクチンであるポリオ用ソークワクチンは粘膜免疫を生じない。言い換えると、IgA応答が実現されない。さらに、不活化ベクターでの細胞内複製の欠如のために、細胞傷害性T細胞応答は起きない、または多くの場合無効である。生ベクターワクチンで見られるように、細胞内複製がなければ、ウイルスタンパク質は、ウイルスエピトープとMHC-Iタンパク質の会合に不可欠な細胞質プロテアソーム、TAP、小胞体、ゴルジ経路に進入しない。MHC-Iタンパク質を背景に提示される病原体エピトープはCD8（またはTh-1）応答を誘発する。
【０００８】
不活化ワクチンは、病原体エピトープに対する代替免疫応答を起こす。不活化ワクチンの内部移行は、エンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスいずれかの結果として起こる。どちらの取込み機構が使用されても、細胞内小胞またはファゴソームとして知られる細胞内オルガネラが生じる。前記小胞の膜は細胞膜由来であり、内腔の内容物は細胞質及び細胞外由来物質を含有する。小胞膜上のプロトンポンプの作用を通じて、水素原子が小胞内に活発に運び込まれ、内容物を酸性化する。次に、これらの小胞は、酸性環境で活性な種々の酵素を含有するリソソームと融合する。そのために、ファゴリソソームが小胞内容物を分解し、種々のペプチド及び糖タンパク質を産生する。この構造物内では、病原体由来フラグメントがMHC-IIタンパク質に接触する。これらのタンパク質は、小胞体内で合成され、ゴルジ体を介してファゴリソソームに運ばれる。MHC-IIタンパク質は、主にCD4+細胞と相互作用し、それに遭遇する免疫領域に範囲が限定されるTh-2偏向免疫応答を誘発する。従って、不活化ベクターは、主に液性または抗体応答を誘発し、ベクターが粘膜的に投与されない限り、粘膜免疫は実現されない。さらに、不活化ベクターは通常、ワクチンの多数回投与が必要であり、注目される免疫記憶応答は多くの場合、生ベクターで見られるよりも持続時間が短い（Parham、2005年、67〜96頁；Levinson、393〜412頁；Kaufmann、1997年、37〜45頁）。
【０００９】
サブユニットワクチンは、免疫応答を侵入生物の決定的な構造成分に導く。複製が起こらないので、大きな安全域が存在する。安全は高くつく。すなわち、主にTh-2偏向した弱く狭く限定された免疫応答である。
【００１０】
これは、ウイルスを含むあらゆる細胞内複製病原体には好ましいTh-1偏向免疫応答と対照的である。T細胞は抗原提示細胞（B細胞、マクロファージ及び樹状細胞）上のMHC分子を背景にした場合のみ抗原に応答する（Peter Parham、2005年、第3章、67頁）。さらに具体的には、Th-1応答はMHC-Iタンパク質に結合している抗原の提示に依存している。細胞内で複製する生物はTAP-プロテアソーム経路により分解される（Peter Parham、2005年、第3章、67〜96頁）。細胞は、階層的な一連の酵素（E1、E2及びE3）を通じて、タンパク質を多数のユビキチン残基にコンジュゲートすることにより、この経路にタンパク質分解を導く（Krauss、101〜113頁；Parham、2005年、81頁）。
【特許文献１】米国特許第7,132,271号
【特許文献２】米国特許出願公開第20050112139号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ヌクレオチドベースのワクチン（DNAまたはRNA）はHIV遺伝子を使う。宿主細胞転写及び翻訳機構はHIVタンパク質を産生する。これらのタンパク質に対する免疫応答が予測される。核酸それ自体は提案されている免疫応答の焦点ではないが、核酸を破壊することを目的とする細胞エフェクター機構を誘発し、多くの場合ワクチンを無効にする。ウイルス核酸は自然免疫応答の種々の成分により「異物」として認識される。ウイルス核酸の転写及び翻訳が開始する前に、宿主はその核酸を排除してしまう。適切に投与すれば、HIV疾患は生じない。潜在的に効果を有するためには、ヌクレオチドベースのワクチンはいくつかの段階を達成しなければならない。これらの段階には以下のものがあるが、これらに限定されない。すなわち、第1段階は、無傷で改変されていないウイルス核酸の細胞による取込みである。第2段階は、病原体由来核酸の破壊に向けられる複数の宿主細胞質酵素の回避である。自然免疫応答の多くの成分がそのように向けられている。ウイルス核酸に対する自然応答は免疫を誘発しない。従って、ウイルス核酸が細胞の細胞質または核細胞質内で破壊されなければ、保護的なワクチン接種効果を実現することはできない。第3段階は、ウイルス核酸の核への同化作用である。これは、高度に調節された過程である核膜孔の通過により、または、潜在的に正常な細胞機能を乱し、提案されている免疫応答を妨げることができる核膜の突き抜けにより実現されうる。第4段階は、ウイルス核酸の宿主DNAへの取込みである。第5段階は、ウイルス遺伝子の転写である。第6段階は、宿主細胞質におけるウイルス遺伝子の翻訳である。これらの段階はすべて、細胞応答が起こることが可能になる前に、適切な免疫領域内で実現されなければならない。しかし、これらの段階が実現されたからといって、効果的な免疫応答と同一視することはできない。ヌクレオチドワクチンは市販されてはいない。従って、高度なレベルの安全性及び有効性を有するHIVワクチンの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、免疫原性組成物またはワクチンであり、及び、サブユニットワクチンの高い安全性を、Th-1偏向免疫応答を誘発することができる生ワクチンの有効性と組み合わせた免疫原性組成物を作製する方法である。従来のアプローチの代替物である本発明は、条件付きで生存するウイルスに基づいている。すなわち、さもなければ複製不能なウイルスは、ウイルスゲノムの中でそのタンパク質をコードする対応する遺伝子配列の改変または欠失のために利用できないタンパク質の代わりをする外因性タンパク質が添加されると、限られた時間複製可能となり得る（つまり、「条件付きで生存する」）。本発明の一実施形態は、1種または複数の特定のウイルスタンパク質を標的にするノックアウトバイロンを使う。本発明の各実施形態では、「ノックアウト」標的遺伝子配列に対応するタンパク質欠損は外因的に添加してよい。所定量の外因的に添加される標的タンパク質は、さもなければ複製能力のないバイロンを所望の時間的に及び量的に定義または限定されたレベルの複製を実現することができるようにするために必要であることが企図されている。条件付きで生存するウイルスと混合して提供される外因的に添加されるタンパク質の量、半減期、細胞内濃度、細胞内での位置、及び立体構造が免疫原性組成物またはワクチンの複製動態を制御する。
【００１３】
本発明の範囲を理解する上で、本明細書で使用するように、用語「含む（comprising）」及びその派生語は、述べられた特徴、要素、成分、及び/または段階の存在を明確に述べるが、他の述べられていない特徴、要素、成分、及び/または段階の存在を排除するものではない制約のない用語であることを意図している。前述したことは、用語「含む（including）」、「有する（having）」及びその派生語などの類似する意味の言葉にも当てはまる。
【００１４】
本発明の一態様は、宿主が、免疫系には正常だと思われる感染を背景に、病原体を含む完全なまたはほぼ完全なレパートリーの免疫原に曝露されることである。このアプローチは、生ウイルスベクターの免疫応答の有効性、幅、及び長期記憶を包含する。投与された組成物またはワクチンの背景次第で、集団免疫も実現される可能性がある。さらに、本発明は不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンの安全性を実現する。なぜなら、こうして得られるバイロンは、改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する外因性タンパク質の非存在下では複製不能であるためである。
【００１５】
本発明は、それぞれが免疫原性である2種の成分を有すると見なしてよい。第1の成分は、1種または複数のタンパク質をコードする遺伝子またはmRNAの一部またはすべてを欠く欠損配列になるようにウイルスDNAまたはmRNAが改変された無傷のバイロンである。あるいは、標的タンパク質をコードする遺伝子を翻訳不可能な核酸で置換してもよい。第2の成分は、ウイルスDNAまたはRNA配列にコードされていないタンパク質に相当する1種または複数の外因性タンパク質の添加である。第1の成分の免疫原性は二相性である。補完する欠損タンパク質なしで投与すると、全成分ウイルス複製不能バイロンベースの免疫原性組成物またはワクチンが実現される。補完する外因性タンパク質と共に投与すると、複製が時間的に制御され限定された条件付きで生存するバイロンが実現されて、安全性を改善するであろう。複製が終わると、複製不能な非感染性のバイロンが残る。従って、この組成物の出発点及び終点は同じである。すなわち、免疫原性組成物として機能することができる複製不能全成分バイロンである。
【００１６】
本発明の一実施形態では、Th-1応答は、誘発されて無傷のバイロンの1種または複数の成分に向けられるであろう。無傷の宿主の免疫応答という概念内で投与または添加されるタンパク質は、サブユニットワクチンである。第1の成分が二相性なので、免疫原性組成物は、実際には、同時に投与される3種のワクチン概念である。すなわち、（1）全成分無傷複製不能ウイルス、（2）（条件付きで）生存するバイロン（時または日で測定される半減期で時間的に制御される）、及び（3）サブユニットワクチンである。概念的には、ワクチンの各成分は、他の2種類の成分にはアジュバンドとして働き、ワクチン製剤全体の免疫原性を増強する。MMR及びDPTなどの複数のベクターワクチンは、各成分に対する陽性応答を示している。三価ワクチンの各ベクターは、他の2種類のベクターの免疫原性を増強する。
【００１７】
本発明の一実施形態は、組織培養と組み合わせずに条件付きで生存するワクチンを作製するための迅速なシステムを提供する。組織培養由来抗原は、予測しない免疫応答が起きワクチンの有効性を制限するおそれのある組織由来抗原の同化作用により損なわれる。さらに、組織培養のウイルスは、宿主細胞環境に応じて突然変異し続けるであろう。組織培養物は、無傷宿主免疫系を正確に再現しない。組織培養由来ウイルスは、野生分離株も臨床分離株も反映しない。組織培養の連続するウイルス突然変異は、予測不可能であり、再現性の欠如をもたらし、ワクチン作製のためのバイロン複製における品質管理及び回収を損なう。従って、組織由来ウイルスはワクチン投与には不十分である。
【００１８】
本発明は生組換え担体に依存しない。組換えベクターに対する初期免疫応答は、担体ベクターそれ自体に部分的にまたは全体的に制限されていて、有効性を損なう。生組換え担体のその後のワクチン負荷（challenge）は、担体ベクターに対する急速な適応免疫応答を誘発し、ベクター及び遺伝子工学的に改変された抗原物質を除去する。「抗原原罪」の概念は、より広範囲な免疫応答とその後のワクチン負荷を可能にしない。繰り返しワクチン負荷は、特異性及び頑強性の点で獲得免疫応答を増強するが、その応答は、免疫応答が最初に向けられた抗原に対してのみである。従って、組換えベクターは、免疫認識において抗原的に限定的であり、1つの適用に限定される。言い換えると、組換えベクター系は個体当たり1回しか使用できない。なぜならば、最初の曝露後、個体はベクターそれ自体に対して免疫を獲得するからである。さらに、組換えベクター系は、免疫系に、免疫応答が望ましくない多種多様の抗原物質を提示する。ベクターそれ自体がこの抗原デコイの供給源である。担体ベクターそれ自体を含む抗原の潜在数は、免疫応答が望まれる遺伝的に導入された物質の数を大幅に上回る。さらに、組換えベクターの外部タンパク質は、免疫系が曝露される最初の抗原である。組換えベクターの「追加抗原投与量」は有益ではない。本発明は、組換えベクター系に導入されるワクチンが現在直面しているこれらの不利を回避する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
序論
本発明は、条件付きで生存するバイロンに基づいている。すなわち、他の方法では複製不能であるように改変されたバイロンは、ウイルスゲノムの中でそのタンパク質をコードする対応する遺伝子配列の改変（または欠失）のために利用できないタンパク質の代わりをする外因性タンパク質が添加されると、限られた時間複製可能となり得る。定義によるウイルスは、生きた構造物でも死んだ構造物でもない。定義によるウイルスは、複製可能であるまたは複製不能であるとして最もよく特徴付けられる。本発明では、生きたウイルスとは複製可能なベクターのことである。本発明の一態様は、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、ウイルスDNAまたはRNAを複製不能にするように改変されており、次に、この改変されたウイルスDNAまたはRNAが、無細胞発現系において自己組織化するウイルスタンパク質に被包されて、条件付きで生存するバイロンを形成する、完全なウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNAを含む免疫原性組成物である。この条件付きで生存するバイロンを作製するための方法は、完全なゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子を提供する段階と、前記ウイルスDNAまたはRNAを増幅する段階と、前記ウイルスDNAまたはRNAを、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAにおいて改変する段階と、増幅され改変されたウイルスDNAまたはRNAを回収する段階と、前記回収したDNAまたはRNAを、ウイルス粒子の自己組織化に適した無細胞発現系に再パッケージングする段階と、こうして得られる条件付きで生存するビリオンの所望する量を回収する段階とを含む。この条件付きで生存するバイロンを作製するための代替方法は、従来の細胞培養系を使うことである。この方法では、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが改変されたバイロンは、前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する外因性タンパク質を添加して、ウイルス複製に適した条件下で培養してもよい。従って、本発明の第4の態様は、全成分ウイルスタンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、またはその組合せと組み合わせて、複製不能なバイロンを使ってワクチンを配合することである。いずれの方法で作製したワクチンも、1）全成分無傷複製不能ウイルス；2）タンパク質補充物の添加により一時的に蘇生される条件付きで生存するバイロン；及び3）サブユニットワクチンとして作用するタンパク質補充物それ自体；により誘発される3相の免疫特性を有することになる。無細胞系で作製される条件付きで生存するバイロンで配合されるワクチンの追加の特徴は、投与されるとワクチンの誘発された免疫原性応答に寄与するベクターは存在しないことである。
【００２０】
好ましい標的ヌクレオチド配列複製タンパク質遺伝子または対応するmRNA
好ましくは、HIVに向けられる実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、HIVゲノムの中央部内に位置し、ウイルス複製に必要である。本発明に従った他の核酸配列は、欠失の標的にされてもよいし、翻訳不能な遺伝子情報で置換されてもよい。全体的改変により複製不能なバイロンが生じる限り、これらには、エンベロープ糖タンパク質、gp120及びgp41、レトロウイルスコード化酵素（プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ及びリボヌクレアーゼH）、Nef並びに末端反復配列があるが、これらに限定されない。しかし、通常は、この適用のために、複製タンパク質遺伝子は、無傷の宿主内にある場合にはバイロン複製を不能にするように改変してもまたは欠失してもよい遺伝子である。従って、この適用のための複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAは、前記タンパク質をコードする核酸配列を意味する。しかし、ウイルスゲノムの転写で欠けているタンパク質は、外因的に添加することができる。これにより、無傷の宿主において活発で「正常」なウイルス複製が起こるであろう。この発明のために、複製タンパク質遺伝子を改変すること（または改変）は、さらに本明細書に記載するように、例えば、バイロンが外因性複製タンパク質の非存在下では複製不能になると考えられる限り、欠失または突然変異を含むように、広く解釈されるべきである。本発明の一HIV実施形態では、例えば、標的ウイルスタンパク質はVif、Vpr、Vpu（HIV-1）、Tatエキソン1、及びVpx（HIV-2）である。比較的サイズが小さいので、これらのタンパク質は、一部、非重複セグメントにもコードされており、すべてがウイルス複製に不可欠なタンパク質である。これらの非重複ゲノムセグメントの1種または複数を除去すれば、外因性供給源の欠損または欠乏タンパク質が供給されない限り、in vivo繁殖ができないウイルスを産生する。
【００２１】
vifヌクレオチド配列は、polヌクレオチド配列の3'側、及びvprヌクレオチド配列の5'側に位置している。一部のウイルス分離体では、polの3'末端とvifの5'末端のヌクレオチド配列間に小さな重複部分が存在する。vifの3'末端ヌクレオチド配列はvprの5'末端と重複している。vifタンパク質は1種のエキソンにコードされている。polとvpr間のvif非重複セグメントを選択的に切除して、pol及びvprの転写及び翻訳産物に悪影響を与えることなく、ウイルスをvif欠損にすることができる。
【００２２】
Vifタンパク質（ウイルス感染因子）は、ウイルスRNA及び核タンパク質複合体との相互作用を通じてHIV-1バイロンにもHIV-2バイロンにも組み込まれる。Vifは約216アミノ酸長である。Vifは構造タンパク質ではなく、Rev依存性であり、従って、ウイルス生活環の後期に産生される。in vitroでのVif欠損バイロンは、機能的vif遺伝子をもつ無傷のウイルスより103倍感染性が低い。in vivoでのVif欠損バイロンは、複製不能である。Vifは、
1.ウイルス感染性を増加させること、
2.バイロン会合を増強すること、
3.逆転写酵素によるDNA合成を促進すること、
4.細胞タンパク質CEM15/APOBEC3G（アポリポタンパク質B RNA編集酵素またはアポリポタンパク質B RNA触媒酵素）に拮抗すること（APOBEC3G、すなわち自然免疫系の成分は、シチジンデアミナーゼである）、
5.細胞質へのウイルスRNAの未熟核酸搬出を妨げる阻害配列（INS）を含有すること、
6.細胞膜の構造変化を誘発すること、
7.サイトカイン調節障害に寄与し、ファゴサイトーシスを阻害し、細胞伸長を制限すること、
8.ウイルスRNAを細胞内リボヌクレアーゼ分解から保護すること、
9.プロテアーゼ酵素の活性を時間的に調節すること
を含むが、これらの機能に限定されない多数の機能を有する。
【００２３】
vifの非重複ヌクレオチド配列が切除されている条件付きで生存するウイルスは、ウイルス複製も感染もできない。Vifタンパク質は、感染細胞内で必要とされるよりも過剰に産生される。過剰なVifタンパク質の多くは、非感染細胞に同化され、そこで、そのサイトカイン調節障害、ゆえに免疫抑制効果の大部分ではないにしても多くを発揮する。Vifタンパク質の外因的供給は、細胞内複製を制限するのみならず、vif免疫抑制も制限する。
【００２４】
vprヌクレオチド配列は、vifヌクレオチド配列の3'側及びTatエキソン1ヌクレオチド配列の5'側に位置している。大半のウイルス分離体では、vprの5'末端はvifと重複し、3'末端はtatエキソン1と重複している。重複セグメントの5'と3'間は、選択的に切除できる非重複セグメントである。vpr欠損突然変異体は、無傷の宿主において活発な複製ができない。vif及びtatエキソン1ヌクレオチド配列は、介在する非重複セグメントの選択的切除でも無傷のままである。
【００２５】
Vprタンパク質（ウイルスタンパク質r）は、HIV-1及びHIV-2両方の後期遺伝子産物である。Vprはrev依存性である。Vprは、比較的大きなGagポリペプチドから切断されるウイルスタンパク質p6との相互作用を通じてバイロンに組み込まれる。
【００２６】
Vprは、
1.核局在化シグナル、
2.Tatタンパク質と共にHIVゲノム発現を調節すること、
3.感染T細胞の細胞分裂を細胞周期のG2期で遮断すること、
4.非感染T細胞のG1期で細胞周期を遮断すること、
5.可溶性Vprは、HIV抗原に特異的な非感染細胞傷害性CD8 T細胞を、細胞周期のG2期で停止させること、
6.抗体受容体親和性成熟に必要なB細胞体細胞高頻度突然変異を制限すること、
7.ウイルス突然変異を増加させることによりウイルス集団不均一性を増大させること、
8.遺伝子転写を調節するヒストンアセチラーゼ活性のあるコアクチベータであるp300の活性を増強すること、
9.転写因子NF-IL-6及びNF-κBを活性化すること、
10.細胞内グルココルチコイド受容体と相互作用し、同時活性化すること、
11.Sp1、p53、Rb（過剰リン酸化）、TFIIB、核輸送因子のインポーチンα及びヌクレオポリンPom21、並びにMOV34のヒト相同体を含むがこれに限定されない種々の他の細胞タンパク質と相互作用し、その発現を制御する。Vprタンパク質と細胞タンパク質のp53及びSp1の協調的相互作用は、HIV-1遺伝子転写に対し正の効果を及ぼすこと、
12.細胞の細胞骨格変化を誘発すること、
13.おそらく核局在化に寄与する核膜ヘルニア形成を誘発すること、
14.ミトコンドリア膜透過性機能障害を誘発すること、
15.HIV-2において、VprはVpxのバイロンへの組込みを促進すること（Vpxは、完全なウイルス活性に必要な、HIV-2においてのみ存在するアクセサリータンパク質である）
を含むが、これらの機能に限定されない多数の機能を有する。
【００２７】
vprヌクレオチド配列の非重複セグメントが除去されている条件付きで生存するバイロンは、無傷の宿主において活発な複製及び感染ができない。HIV感染細胞では、Vprタンパク質は活発な複製に必要とされるよりも過剰な量産生される。過剰なVprタンパク質は非感染免疫細胞に同化され、一部細胞機能を抑制するように機能する。vpr欠損条件付きで生存するウイルスワクチンでは、Vprタンパク質の外因的供給は、ウイルス複製もウイルス誘発免疫抑制も制限する。
【００２８】
vpuヌクレオチド配列は、tatエキソン1ヌクレオチド配列の3'末端とenvヌクレオチド配列の5'末端の間に位置している。大半のウイルス分離体では、tatとvpuのヌクレオチド配列には重複がない。これとは対照的に、vpuとenvの重複セグメントは、大半のウイルス株に存在する。vpuの非重複セグメントは、選択的に切除されて、envの転写及び翻訳産物に悪影響を与えることなく、ウイルスをvpu欠損にすることができる。
【００２９】
Vpuタンパク質は、HIV-1及びSIVの4株にのみ存在する。Vpuの一次アミノ酸配列は、HIVゲノムにコードされるタンパク質の中で最小であり、長さが77〜86アミノ酸で変動がある。Vpuは主にRER/ゴルジ装置内にある。Vpuタンパク質は成熟バイロンには組み込まれない。HIV-2のVpuタンパク質の、少なくとも一部の機能的等価物は、Env糖タンパク質に属すると見なされてきた。Vpuタンパク質産生はRev依存性であり、従って、ウイルス複製周期の後期に注目される。Vpuタンパク質をコードするメッセンジャーRNAは、バイシストロン性である。大半のウイルス分離体では、Vpu開始コドンは、適切なコザック配列にはなく、すなわち、メチオニン以外のアミノ酸をコードしている。大部分ではないにしても多くのウイルス分離体では、Vpuタンパク質mRNAの開始配列は、A/GCCAATGGである（宿主リボソーム装置により最も簡単に認識されるコザック配列は、5'-ACCAUGG-3'である）。Env糖タンパク質の開始コドンは、適切なコザック配列中のメチオニン残基である。リーキースキャニングのために、ウイルスは宿主転写装置を適切な割合（1/10）のVpu/Envタンパク質の産生に導くことができる。
【００３０】
HIV-2はVpuタンパク質をコードしていないが、gp36 TMサブユニット内ではVpu様活性が見られる。機能の選択及び分割が進化と相関し、成熟のマーカーであるならば、HIV-2はHIV-1ほど分化してはいない。系統樹では、複雑な生物ほど生命の進化の後期に発達し、よく適応している。進化的に言えば、HIV-2の方が「古い」ウイルスである。従って、HIV-2はHIV-1よりも簡単な標的のはずである。実際、HIV-2はHIV-1ほど感染性ではなく、病原性がないことが分かっている。従って、Vpuタンパク質は、時代を通してHIVを追跡する遺伝子マーカーである可能性がある。
【００３１】
Vpuタンパク質（ウイルスタンパク質U）は、
1.HIV複製を時間的に制御すること、
2.免疫抑制、
3.Vpu発現は、宿主においてウイルス発現、突然変異及び伝播を増強すること、
4.宿主細胞CD4発現を減少させること、
5.サイトカイン調節障害及び免疫機能障害に寄与すること、
6.HIVにおける悪性形質転換を促進すること、
7.バイロン放出を増強すること、
8.MHC-I細胞発現を減少させること
を含むが、これらに限定されない多数の機能を有する。
【００３２】
vpuヌクレオチド配列の非重複セグメントが切除された条件付きで生存するバイロンは無傷の宿主内では活発な複製も感染もできない。HIV感染細胞におけるVpuタンパク質の産生は、ウイルス複製のための細胞の需要を上回る。過剰なVpuタンパク質の多くは他の非感染免疫細胞に同化される。Vpuタンパク質に起因すると考えられる免疫抑制は、Vpuタンパク質を獲得している非感染細胞に主に向けられる。vpu欠損条件付きで生存するウイルスベクターでは、外因性Vpuタンパク質はウイルス複製における制御因子である。さらに、Vpuタンパク質の免疫抑制は、供給されるVpuタンパク質の量及び半減期により同様に制御されることになる。
【００３３】
vpxのヌクレオチド配列は、vifのヌクレオチド配列の3'側及びvprのヌクレオチド配列の5'側にある。vifとvpxのヌクレオチド配列間の重複ゲノム配列は、大半のHIV-2株に存在する。これとは対照的に、大半の分離体中のvpx及びvprヌクレオチド配列は非重複である。vpxの非重複ヌクレオチド配列を切除すると、Vif及びVprタンパク質の転写及び翻訳産物に悪影響を与えることなく、ウイルスはvpx欠損になる。
【００３４】
Vpxタンパク質（ウイルスタンパク質x）は、Gagのp6ドメインと相互作用することによりバイロンにパッケージされる。Vpxは、HIV-2及び4株のSIVにのみ存在する。Vpxの無傷のバイロン内への組込みは、p6のN末端ドメインのジロイシンモチーフに媒介される。ほぼ等モル量のGagとVpxがHIV-2バイロンに組み込まれる。Vpxは、3両親媒性αヘリックスを含むほぼ100アミノ酸長の小さな疎水性タンパク質である。Vpxは構造的にはVprタンパク質と関連しているが、機能的には異なる。Vpxは核外移行シグナルを欠き、細胞周期停止とは関係していない。
【００３５】
Vpxは、
1.核局在化シグナル（NLS）、
2.非分割細胞でのHIV-2感染を促進すること、
3.マクロファージでHIV複製を促進すること、
4.細胞膜の細胞質側でのバイロン会合を促進すること、
5.MHC-II抗原提示を妨害すること、
6.逆転写酵素活性を増強すること
を含むが、これらに限定されない多数の機能を有する。
【００３６】
vpxのヌクレオチド配列を欠損する条件付きで生存するバイロンは、無傷の宿主では生存不能である。HIV-2に感染した細胞は、細胞の要求よりも過剰にVpxを産生する。過剰なVpxタンパク質の多くは、非感染免疫細胞に同化される。Vpxに関連する免疫抑制は、大部分、Vpxタンパク質を細胞質に取り込んでいる非感染細胞で起きる。そのような条件付きで生存するバイロン組成物におけるVpxタンパク質の外因的供給により、感染細胞でのウイルスの限定された細胞内複製だけではなく、非感染細胞でのVpxにより発揮される限定された免疫抑制も可能になる。
【００３７】
tat（転写因子のトランス活性化因子）エキソン1ヌクレオチド配列は、vprヌクレオチド配列の3'側及びvpuヌクレオチド配列の5'プライム側に位置する。vprとtatエキソン1間の重複セグメントは、大半のウイルス分離体において注目される。非重複セグメントは、残りのtatエキソン1ヌクレオチド配列を包含する。大半の分離体では、そのtatエキソン1ヌクレオチド配列は、HIV-1ではvpuと重複していない。Vpuヌクレオチド配列は、HIV-2ゲノムには取り込まれない。tat欠損バイロン（エキソン1）は、無傷の宿主では複製不能である。
【００３８】
完全HIV-1 Tatタンパク質は、2種の別々のエキソンにコードされている。選択的スプライシングにより、HIV感染細胞では、2種類のTatタンパク質が産生される。Tatタンパク質の第1の72アミノ酸（NH2ドメイン）はウイルス複製に不可欠であり、1種のエキソン転写物によりコードされている。第2のエキソンは、アミノ酸73〜101を包含するCOOH末端ドメインをコードしている。従って、1種類のTatタンパク質は、NH2ドメインをコードするわずか1種のエキソンのヌクレオチド配列を反映しており、72アミノ酸長である。もう1種類は両エキソンの産物であり、101アミノ酸長である（HIV疾患の1株は、86アミノ酸Tatタンパク質を有する）。COOH末端ドメインは、Tatタンパク質が多くの免疫調整効果を発揮するに必要である。従って、代替ワクチンは、Tatエキソン1ヌクレオチド配列にコードされたTatタンパク質のアミノ末端エキソンのみをコードし得る。
【００３９】
Tatタンパク質は、ウイルス複製周期の初期に発現され、rev非依存性である。Tatタンパク質は、無傷のバイロンに組み込まれない。
【００４０】
Tatタンパク質は、
1.NF-κB活性化を誘発すること、
2.細胞（宿主）のmRNA翻訳を阻害するが、ウイルスのmRNA翻訳は阻害しないこと、
3.感染T細胞においても非感染T細胞においても、細胞内サイクリンTを枯渇させること、
4.bcl-2を下方調節し、非感染造血細胞においてアポトーシスを誘発すること、
5.前記アポトーシスを妨害するHIV感染マクロファージにおいてbcl-2を上方調節すること、
6.中枢及び末梢神経系において神経細胞死を誘発すること、
7.T細胞集団を組織するアクセサリー細胞の能力を低下させること、
8.B細胞を活性化し、B細胞リンパ腫を誘発すること、
9.IL-6放出を刺激することにより免疫グロブリン合成を誘発すること、
10.T細胞膜上のCD26またはジペプチジルアミノペプチダーゼIV活性を阻害して、T細胞のリコール活性化を阻止すること、
11.単球においてファゴリソソーム融合を阻止すること、
12.CD4細胞においてIL-2及びIL2R発現を阻害すること、
13.炎症性酸化還元状態（酸化ストレス）を増幅すること、
14.腫瘍壊死因子（TNF）活性を増幅すること、
15.TGF-ベータ放出を刺激すること（追加の免疫抑制）、
16.MHC I遺伝子の転写を抑制すること、
17.非感染CD4細胞においてJNK及びERK/MAPK経路を活性化すること、
18.単球走化を刺激すること、
19.ベータ2ミクログロブリンプロモーターを抑制すること、
20.IL-12合成を阻害すること、
21.非感染だがTatトランスフェクト細胞において、HIV-1共受容体合成（CCR5及びCXCR4）を誘発し、HIVウイルスに対する非感染マクロファージ及びT細胞の感受性を増強すること（両マクロファージ及びT細胞トロピックウイルス株の感染性を促進する）、
22.CD28経路を介してT細胞を過剰活性化すること、
23.カポジ肉腫の増殖を増強すること、
24.特異抗原に応答した非感染リンパ球の増殖を阻害すること、
25.HIV感染T細胞を活性化誘発アポトーシスから保護すること、
26.非感染T細胞においてアポトーシスを誘発すること、
27.ナチュラルキラー（NK）細胞細胞傷害性を阻害すること、
28.マクロファージにおいてTRAIL産生を上方調節すること、
29.非感染単球においてTRAILの発現を増加させること、
30.HIV感染単球をTRAIL媒介アポトーシスから保護すること、
31.B細胞上のIL-4受容体を上方調節すること、
32.HIV認知症を誘発すること、
33.樹状細胞機能を損なうこと、
34.感染細胞及び非感染細胞上のマンノース受容体を減少させること、
35.タンパク質がHIV mRNAの5'末端のトランス活性化応答エレメント（TAR）に結合することにより、HIVウイルスの転写を少なくとも1000倍増強すること（具体的には、TARエレメント基部のバルジ領域と相互作用する）、
36.ウイルス転写において細胞由来RNAポリメラーゼII複合体の活性を増強すること
を含むが、これらに限定されない多数の機能を有する。
【００４１】
条件付きで生存するバイロンに基づく免疫原性組成物及びその作製方法の具体的実施例は、この時点でTatタンパク質を使って以下に説明する。しかし、多くの改変または代替実施形態が可能であり、具体的実施例は説明のみを目的に提供するものであり、限定すると明確に述べるのでない限り、本発明を限定するものではないことは、当業者には明らかであろう。
【００４２】
例えば、tatエキソン1の非重複ヌクレオチド配列が切除されている条件付きで生存するバイロンは、ウイルス複製も感染もできない。以下の実施形態の一態様は、条件付きで生存するバイロンの限定された複製だけではなく、免疫原としての及びウイルストランス活性化における、Tatタンパク質の限定された免疫抑制機能でもある。Tatタンパク質はHIV株間で高度に保存されている。さらに、Tatタンパク質は高度に免疫抑制性であり、その多種の効果は実証されてきた。HIVウイルスが感染し活発に複製する細胞は、無傷のバイロンに同化されずウイルス複製のために使われない多くのウイルス成分を産生する。そのような細胞のTatタンパク質は、複製に必要とされる量よりも過剰に産生される。過剰なTatタンパク質の機能は、宿主の免疫系を抑制することである。tat欠損条件付きで生存するバイロンにTatタンパク質を外因的に供給すると、HIVウイルスの限定された複製、及び限定されたTat媒介免疫抑制が可能になると考えられる（例えば、Rubartelliらを参照されたい）。
【００４３】
HIV Tatタンパク質は、それぞれが特定の物理的、立体的、及び静電気的特性を有する数個の異なる領域に細分することができる。Tatの「コア」ドメインからなる短い20アミノ酸配列、具体的には、アミノ酸21〜40は、HIVをin vitroで増殖させるに十分である。Tatタンパク質は、HIV内で2種の離れたエキソンによりコードされている。従って、全成分無傷複製不能ウイルスは、スプライスすることにより獲得できる。例えば、第1エキソンを改変または除去しても、第2エキソンを改変または除去しても、両エキソンを改変または除去してもよい。Tatタンパク質の第1の72アミノ酸（NH2ドメイン）は、HIVのウイルス複製に不可欠であり、1種のエキソン転写物によりコードされている。第2エキソンは、アミノ酸73〜101を包含するCOOH末端ドメインをコードしている。従って、本発明の実施形態は、NH2ドメインをコードするわずか1種のエキソンを有するHIVのヌクレオチド配列に基づいてよく、72アミノ酸長である。COOH末端ドメインは、Tatタンパク質が多くの免疫調節効果を発揮するのに必要である。従って、本発明の別の態様は、Tatタンパク質のカルボキシル末端エキソンのみをコードするHIVのヌクレオチド配列を含んでいてよい。本発明の追加の態様は、突然変異ヌクレオチド配列を1種または両方のエキソンでスプライスしてよい。Tatタンパク質の第2のエキソンは、全体がenv遺伝子に重複している。revエキソン2のヌクレオチド配列は、tatエキソン2ヌクレオチド配列内に完全に含まれている。env及びrevエキソン2遺伝子の機能を保存するためには、特別な配慮を払う必要がある。一実施形態では、tatエキソン2ヌクレオチド配列のスプライシング部位（5'、3'、または3'と5'スプライシング部位両方のいずれかを機能的でなくしてtatエキソン2転写を停止させることができる）は、これらの部位でのスプライシングは不可能であるが、envまたはrevエキソン2遺伝子のアミノ酸配列に、たとえあっても重大な変化は起こらないような形で突然変異させることができる。
【００４４】
あるいは、tatのある種の特定のミスセンスまたはナンセンスヌクレオチド配列は、ウイルスを複製不能にする。他の点では無傷のHIV RNA配列中にコードされたこれらの配列は、無傷のウイルス構造物内で使用することができる。Tatタンパク質のアミノ酸位置番号22（C22G）または30（C30G）でシステイン残基をグリシンで置換すると、HIVのLTRのTat媒介トランス活性化が抑制される。システイン残基番号31をグリシンで置換すると、HIV Tatウイルストランス活性化を損なうが、完全に阻害はしない。これは、ウイルス複製が、ペースは比較的遅いが、細胞内で進行する点で、前記のシステイン置換（C31G）をもつエキソンIのみをコードするバイロンにおいて特に魅力的と考えられる。エキソンIIがなければ、Tatタンパク質の免疫抑制効果の大部分はなくなるであろう（Wangら）。
【００４５】
Tat欠損バイロンは、Lauの米国特許第7,132,271号において一般的に取り上げられている種々の方法のうちいずれによっても獲得することができる。この特許文献は、参照により本明細書に組み込まれているものとする。安定なTat欠損突然変異体を作製するための技術には、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発（例えば、Dengら、Busbyら）、標的遺伝子欠失（「遺伝子ノックアウト」）（例えば、Camperら、Aguzziら）、tatアンチセンスポリヌクレオチドでのトランスフェクション（例えば、Leeら）、及びtatドミナントネガティブ突然変異遺伝子でのトランスフェクションがあるが、これらに限定されるものではなく、これらの技術は参照により本明細書に組み込まれているものとする。従って、Tatタンパク質は無傷のバイロンには含まれないため、Tat媒介免疫応答は、無傷のバイロンの構造を変えることなく、生理活性のTatタンパク質をコードするヌクレオチド配列の欠失及び/または突然変異により除くことができる。
【００４６】
tatエキソン1によりコードされたTatタンパク質の非重複ヌクレオチド配列を完全に欠く、または突然変異、切断型、もしくは他の点では無効なTatタンパク質をコードする免疫原性組成物において、所定量のTatタンパク質を、ワクチン自体と共に外因的に添加または投与してもよい。これにより、外因性Tatタンパク質がウイルス複製に使い尽され、細胞外環境に同化され、または細胞酵素により分解されるまで、所望の期間（例えば、数時間）細胞内ウイルス複製が可能になる。外因性Tatタンパク質は、ウイルスをトランス活性化するその能力を維持するために、天然の非酸化型である必要があると考えられる。供給されるTatタンパク質は、独立して、同時に、または経時的に使用できるいくつかの型：すなわち、
1.完全101アミノ酸配列；
2.比較的短いがそれでも効果的な86アミノ酸配列；
3.エキソンIにコードされる切断型NH2 72アミノ酸配列；
4.Tatタンパク質のコアドメインと、前述のトランス活性化能力を有するエキソンIによりコードされる他の切断型アミノ酸配列；
5.複製能力を実証している前記の番号1、2、3または4の突然変異配列；または
6.適用の相対的もしくは絶対的濃度、または時間枠が限定されていない前記の組合せ、
7.Tatタンパク質をコードするメッセンジャーRNAまたは転写的に生物活性のあるフラグメント、
のうちの1つの型を包含することができるであろう。
【００４７】
条件付きで生存する（すなわち、Tatタンパク質自体を産生する能力に欠ける）バイロンと共に、限定量の外因性Tatタンパク質を含むことにより、添加したTatタンパク質は、ウイルス複製を制御するサブユニットワクチンとして作用する。Tatタンパク質に対する免疫応答は、液性も細胞媒介性も、HIV患者でこれまで注目されており、疾患進行と逆相関している。DPTなどの他の多価ワクチンとの類似性により、百日咳成分は、おそらく局所的非特異的炎症を増強することにより、ジフテリア及び破傷風成分のアジュバンドの機能を果たしている。同様に、条件付きで生存するバイロンは、サブユニットワクチンの形で外因性Tatタンパク質の免疫刺激剤として作用する可能性があり、または逆もまた同じである。
【００４８】
限定量の外因性添加Tatタンパク質が使い尽されると、不活化された細胞内及び細胞外HIV複製不能バイロンが残る。このバイロンは、感染性複製可能HIVバイロンの構造成分を有している。失われたTatタンパク質は、ウイルス複製及び免疫抑制に関与する調節タンパク質であり、Tatタンパク質はHIVウイルスの成分ではない。従って、本発明は、最終的複製不能ウイルスの細胞内複製を実現する。
【００４９】
要約すると、本発明のこの実施例は、Tatタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部またはすべてが改変されている（すなわち、欠失または特異的突然変異を含む）免疫原性組成物である。適用に応じて、この免疫原性組成物は、Tatタンパク質をコードするエキソンの一方または両方を含んでいてよい。Tatタンパク質はワクチン接種計画の範囲に含まれ、細胞内HIV複製を進行させる。この複製は、短命であり、Tatタンパク質が使い尽されると停止することになる。前記の本発明のこの実施形態は、例となるだけであって、限定を意図するものではない。
【００５０】
HIVウイルスの原材料及び株の選択
古典的に、1つの病原体に対するワクチンは、1種、2種またはおそらく3種の別個であるが関連するベクターで構成されている。例えば、ソーク及びセービンワクチンは三価である。このアプローチは、その特徴的な個体群統計学（疑似種）、並びにウイルスの実証された株及び循環組換え型の多血症を有するHIVなどの疾患には当てはまらないと考えられる。一般に、免疫原性組成物でワクチンを配合することは、当技術分野では公知である。
【００５１】
本発明の2つのアームは別々に調製してよい。以下は、複製不能バイロンを作製するための本発明の態様であり、いくつかの段階、すなわち（1）対象のウイルス株の完全なウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNA分子の提供または選択；（2）必要な場合には、ウイルス核酸の単離；（3）核酸の改変；（4）核酸増幅；（5）複製不能全成分バイロンの会合、すなわち、ウイルス粒子の自己組織化に適した発現系における集められた核酸の再パッケージング；（6）自己組織化した条件付きで生存するバイロンの回収；及び（7）改変した遺伝子または対応するmRNAに相当する外因的複製タンパク質の任意的な添加；を包含する。
【００５２】
HIV生ベクターは、米国国立衛生研究所（NIH）から購入し、ワクチンの原材料として使用してよい。しかし、これらのウイルス分離体は、in vitroで数多くの細胞株を通じて継代されてきたために、活発な感染に罹った患者で注目される特徴の多くを欠いている。かなり典型的には、連続細胞株（すなわち、可能な有糸分裂回数に有限限界がない細胞）は、その普遍的有効性、低価格、詳細に明らかにされた栄養素要求、及び全体的予測性のために、培地として使用されている。連続する細胞培養物の予測性は、3種のパラメータ、すなわち（1）無限回数の有糸分裂；（2）数時間内でまたは数分内でも細胞分裂させる細胞周期の短いG1期；及び（3）絶え間ない突然変異；で定義されている。しかし、ウイルスは宿主環境に迅速に適応する。SupT1、H9、ジャーカットまたはA3.01などの連続するヒトT細胞株も、NIHエイズ研究及び標準試薬計画またはアメリカンタイプカルチャーコレクション、いずれもロックビル、MD研究所、から入手することができる。適応HIVウイルスは、これらの連続細胞株において増殖することができるが、ヒト起源のウイルス分離体の大半は増殖しない（Michaelら）。
【００５３】
古典的ウイルス学は、「野生型」ウイルスと突然変異またはその他の方法で改変されたウイルス物質を区別する。実際には、「野生型」ウイルスは、無傷の宿主から単離されるウイルスと同義ではないことがあり、多くの場合、同義ではない。従って、通常、連続する細胞培養を通じての継代により作製される実験室由来「野生型」と、無傷の自然宿主由来のウイルス分離株は区別する必要がある。後者は、野生または臨床分離株と呼ばれるのが最もよく、ワクチンに求められる構造上または遺伝上の特質を示す。従って、無傷の宿主由来の野生または臨床分離株として描かれるウイルスは、細胞培養由来のウイルスとは対照をなす。
【００５４】
無傷の宿主内では、HIVウイルスは複数の領域、臓器系、及び/または組織学的組織に存在し、多様な細胞液に排泄される。実際のHIVウイルスの他に無傷のRNA及びDNA配列も、疾患スペクトラムのすべての段階の感染者から、急性レトロウイルス症候群（すなわち、感染の30日以内に大半の患者で起きる）の前でも、回収することができる。具体的には、前記ウイルスはその宿主環境に適応し、6時間の半減期で、典型的なHIVウイルスは、それが最終的に再感染するのと同一組織の細胞により産生され、分泌される。従って、同一患者の別々の臓器系でのウイルス培養物は多くの場合、わずかではあるが重要な遺伝子型及び表現型の相違を示しており、その相違はウイルスが感染する組織におけるウイルス複製に必要である。
【００５５】
これは、生物はその環境に適応する、さもなければ消滅するという基本的ダーウィン原理に基づく推定である。ヒト宿主の免疫学的環境は、腸管関連リンパ系組織（GALT）、気管支関連リンパ系組織（BALT）、皮膚関連リンパ系組織（SALT）、乳房関連リンパ系組織（MALT）、及び結膜関連リンパ系組織（CALT）を含むが、これらに限定されないいくつかの別々の生物圏または区画（そのすべてがHIVに感染する）に分割される。免疫系のリンパ球などの細胞成分も他の分子成分も、体細胞組織全体に均等に分布しているわけではない（Parrishら）。従って、HIVウイルスに対する免疫圧力は、起源となる特定の組織または臓器によって異なる。ウイルスの遺伝子型及び表現型発現は、ウイルスが増殖する免疫環境を反映することになる。
【００５６】
HIV感染の主な方法は性的なものである。従って、無傷の宿主の精液、膣液、及び直腸液が、ワクチン作製のためのウイルスの野生分離株または臨床分離株の論理的供給源である。頚膣部洗浄液による検体収集方法は、詳細に明らかにされている。子宮頚部分泌液の手による収集も描かれている。これは、全成分複製可能バイロン、ウイルスRNA、またはDNAのいずれかを獲得する代替方法である。精液からのウイルスの単離も、日常的に実施されている（Michaelら、1999年、第17章）。ヒト精液でのHIV-1の培養方法は、産業界では標準的である（Michaelら、1999年、第8章）。最後に、直腸分泌物の収集及び処理方法は文献に定義されている（Michaelら、1999年、第35章）。
【００５７】
HIVウイルスの検出、単離、及び増殖は、ヒト単球/マクロファージ、T細胞、及び中枢神経系組織を含むが、これらに限定されない種々の感染組織上で実施することができる（Michaelら、1999年、第9章及び第10章）。HIV培養及び増殖は、マイトジェン、すなわち「正常な」非感染健常提供者由来の刺激された末梢血単核球（PBMC）を使って実現することができる（Michaelら、1999年、第1章）。この方法は、多くのHIVワクチン及び薬剤努力の礎石ではあるが、危険が多い。ウイルスは細胞培養中で突然変異をし続け、ウイルスを元の組織分離株と区別する遺伝子型及び表現型の特徴付け（遺伝的浮動）を迅速に帯びることになる。培養物も信頼できず、多くの場合、ウイルス複製が検出可能になるまでに30日を要することもある。
【００５８】
ウイルス核酸の単離のための出発物質は、2種類の広い範疇、すなわち（1）細胞豊富；及び（2）細胞不足；に分けることができる。これらの範疇において、一部重複が存在する。細胞不足分離株は、はじめの細胞豊富培養物から得られる。細胞豊富出発物質には、以下の、（1）全血または血液画分；（2）骨髄；（3）新鮮な、凍結した、パラフィン包埋下、または他の方法で調製した組織標本；（4）in vitro培養細胞；（5）組織由来液体及び細胞で含浸したスワブ；並びに（6）気管支洗浄液があるが、これらに限定されない。細胞不足出発物質には、以下の、（1）血漿；（2）血清；（3）尿；（4）唾液；（5）細胞培養上澄み；及び（6）便があるが、これらに限定されない（Botho Bowienら）。
【００５９】
HIVを含むウイルスは、任意の範疇の開始物質から単離してもよい。しかし、細胞豊富物質からのウイルスDNAの単離は、宿主とウイルスDNAの同時精製により複雑になるであろう。以下に議論するPCRベース技術は、細胞豊富培養液からウイルス核酸を検出し、単離し、及び増幅することができるが、これには鋳型として大量の核酸が必要であり、この要求がPCRを阻害する可能性がある（Bowienら、第5章）。細胞豊富培養液中のウイルスDNA/RNAは、細胞関連（cell associated）でもあり、無細胞でもある。細胞内区画では、ウイルス核酸は、宿主ゲノムに組み込まれてもよいし、細胞質と核両方の区画において宿主及び/またはウイルスタンパク質に結合してもよい。最後に、部分的または全成分ウイルス核酸は、無タンパク質の細胞外環境において細胞豊富系に見出すことができる。従って、細胞豊富培養液では、ウイルス核酸DNAの供給源及び含有量は均一ではない。
【００６０】
無細胞体液は、宿主DNA混入物を制限するが、完全に排除することはない。多くの細胞不足分離株中のウイルスDNA含有物は、特徴的に低力価であり、単離及び増殖の前に核酸を濃縮する必要がある。
【００６１】
哺乳動物由来赤血球は、循環に入った直後に徐核され、従って、DNAがほとんどない。ミトコンドリアDNAはそれでもミトコンドリア内に存在するが、核を含有する無傷の細胞内では、ミトコンドリアDNAは全細胞DNAのごくわずかな割合である。ヒト血液は、核を有する白血球のほぼ1000倍の赤血球を含有する。従って、血液をウイルス単離及び増殖のための選択培養液として使う場合、赤血球がまず取り除かれるはずである。
【００６２】
赤血球は、低浸透圧性培養液では、白血球よりも迅速に破裂するために、これは低浸透圧性ショックにより実現することができる。あるいは、フィコール密度勾配遠心分離は、単核細胞（リンパ球及び単球）を赤血球から分離することができる。第3の方法は、全血液を室温で10分間3300gで遠心分離することからなる。これにより、血液は3種の容易に識別可能な画分、すなわち、（1）バフィーコートとして知られる白血球豊富な画分；（2）血漿；及び（3）赤血球；に分離される（Bowienら、第2章）。バフィーコートは、ウイルス核酸分離に適した細胞豊富供給源となると考えられ、血漿画分は、やはりウイルス核酸分離に適した細胞不足培養液として働くと考えられる。
【００６３】
ウイルス株の選択は、論理的には集団に固有の株のものに匹敵する。前述のように、単一クローンのウイルスは、HIV禍を代表するものではないであろう。検討すべき他の要因には、個々のHIV株の免疫原性及び病原性があるが、これらに限定されない。最適ワクチンは、好ましくは、実際の感染粒子またはその一部を最も厳密に反映する要素を含むべきである。これは、無傷の宿主で注目される疑似種遺伝子型及び表現型ワクチンを反映するはずである。ワクチン製造に使用されるバイロンは、任意の組織供給源に由来し得るが、精液、膣、及び/または直腸組織が好まれるであろう。
【００６４】
ウイルス核酸の単離
感染組織からのウイルス核酸RNAまたはDNAの単離は、種々の詳細に明らかにされた実験方法により実現することができる。最初の段階は、ウイルスDNAを単離すべき場合には、細胞壁物質の酵素的または機械的分解、並びに存在するのであれば細胞膜の界面活性剤溶解からなる。細胞破壊後、タンパク質は、ウイルス由来でも宿主由来でも、核酸から分離される。
【００６５】
新たに収集した組織及び細胞が、核酸の単離のためには理想的である。組織及び細胞を貯蔵しておくと、核酸の完全性を損なう。長期貯蔵が必要な場合には、濾紙またはpH8のTE緩衝液中で-20℃でDNAを凍結することが推奨される。DNA貯蔵培養液は、水分及び混入物質が存在しないようにすべきである。尿及び精液などの生体液の長期貯蔵は、好ましくはないが、-20℃〜-80℃で実施可能である（Bowienら、第2章）。
【００６６】
DNAを細胞から単離する2種類の非常に簡単な技術、すなわち（1）細胞溶解物の高温（例えば、20分間90℃）でのインキュベーション；及び（2）プロテイナーゼK消化；が記載されている。両技術は、適用が制限されており、数多くの混入物質により損なわれることが多い（Bowienら、第2章）。
【００６７】
生物組織は、核酸分離に先立って、ロータ、すなわち固定子ホモジナイザーを使って均一組成物にしてもよい。あるいは、混合物粉砕機で、核酸分離に先立って、細胞及び組織を破壊しホモジナイズすることが可能である（Bowienら、第2章）。
【００６８】
RNA及びDNAの分子構造、静電気的特性、及び拡散係数は、かなり類似している。従って、多くのDNA単離法はRNA不純物により損なわれることになる。リボヌクレアーゼAで処理すれば、RNAは取り除かれる。リボヌクレアーゼA溶液は、これを使ってデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する混入した任意の物質を取り除く前に、加熱処理をすべきである。デオキシリボヌクレアーゼのないリボヌクレアーゼも市販されている。リボヌクレアーゼHは、開始培地及び/または最終産物を含む様々な時点でDNA単離法に組み込むことができる（Bowienら、第2章）。
【００６９】
フェノールまたはフェノール/クロロホルム混合液からなる有機抽出法は、文献に定義されている（Bowienら、第2章）。サザンブロットの方法は、HIV核酸を検出するために使われる追加の精製法であり、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1の割合）抽出培養液からなり、文献にも記載されている。リボヌクレアーゼ（RNase）を添加して、調製物中のRNAを消化し、ウイルスDNAを単離することができる。ウイルスDNAフラグメント及び宿主DNAから無傷のウイルスDNAをさらに単離することは、勾配遠心分離によって実現され得る（Michaelら、第9章及び第10章）。
【００７０】
ウイルス核酸の「塩析」法はもう1つの選択肢である。細胞溶解物を、タンパク質などの混入物質の沈澱を促進する高浸透圧培養液に曝露する。遠心分離により沈澱物を取り除き、ウイルスDNAを第2段階アルコール沈澱により回収する。DNA純度及び収量は、この方法では予測不可能な場合もある（Bowienら、第2章）。
【００７１】
塩化セシウム密度/臭化エチジウム勾配による遠心分離で、アルコール沈澱により形成される細胞溶解物に含まれるウイルスDNAを分離することができる。遠心分離には数時間必要であり、DNAバンドをイソプロパノールで抽出して、臭化エチジウムを取り除く。次に、DNAをアルコールで沈澱させる。この方法では高品質のDNAが得られるが、自動化されておらず、従って、時間がかかり、比較的高価であり、ヒト可変性のために大規模使用には適用できない可能性がある（Bowienら、第2章）。しかし、単離し、ワクチン製剤に理想的だと分かれば、核酸改変を進めて、標的配列を欠失させることができる。
【００７２】
もう1つの単離法は、高濃度カオトロピック塩の存在下での核酸のシリカへの選択的吸収によるものである。これらのカオトロピック塩には、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、及び過塩素酸ナトリウムがあるが、これらに限定されない。この方法であれば、DNAはRNAから効率的に分離されるが、高純度及び高品質のDNAを低塩分緩衝液でシリカ粒子から溶出させることが可能になる前に、他の細胞混入物質を洗い流す必要がある。シリカベースの方法は数社からキットとして提供されている（Bowienら、第2章）。
【００７３】
核酸の負電荷を帯びたリン酸と基質上の正電荷を帯びた表面分子の間の静電気的相互作用に基づく陰イオン交換法が、ウイルスDNA単離のために使われている。固相陰イオン交換クロマトグラフィーを使えば、ウイルスDNAは低塩分条件下で基質に結合するであろう。RNA及びタンパク質などの混入物質は、中間塩分緩衝液を使って分離する。次に、DNAは高塩分緩衝液で溶出され、不純物が比較的ない高品質である。次に、溶出したDNAをアルコール沈澱により回収すると、ゲノム改変及び増殖に適したものになる（Bowienら、第2章）。
【００７４】
DNA安定化及び単離機能で知られている化合物を含浸したフィルターペーパーを使って、改変及び増幅までDNAを貯蔵することができる。細胞を溶解し、殺菌能力があり、酸化などのDNA分解を阻害し、且つ核酸に結合する化合物が、フィルターペーパー上にある。DNAは、溶出されるまでフィルターペーパーに結合したままである。この方法により、重大なDNA損傷または劣化なしで、数年間、室温でのDNA貯蔵が可能になる（Bowienら、第2章）。
【００７５】
前述したように、血液はゲノム核酸の供給源になりうる。ヘパリン及びEDTAなどの一般の抗凝固薬は、DNA単離操作を妨害し得、従って、血液を貯蔵すべきでない場合には回避すべきである。QIAGEN（商標）は、全血からDNAを単離するためのQIAamp（商標）DNA血液キットを製造している。全血画分の遠心分離及び分離は、この方法には必要でない。代替法では、DNeasy（商標）ティシューキットが市販されており、シリカゲル膜技術に基づいている。QIAGEN（商標）は、DNAを単離するための陰イオン交換技術も、血液及び細胞培養DNAキットとして製造している。最後に、QIAGEN（商標）社製のQIAamp（商標）UltraSens（商標）ウイルスキットは、HIV DNAを血漿及び血清から単離することができる（Botho Bowienら、第5章）。
【００７６】
ウイルスRNAは、ある種の実施形態においてはDNAよりも好ましいことがある。RNA固有の不安定性のために、いずれも適用可能な場合には、DNAが好ましい。血液を利用する場合は、RNA単離に先立って、宿主赤血球及び血小板をウイルス供給源から取り除くべきである。前述の赤血球は核酸をほとんど含有しておらず、ウイルス核酸単離には乏しい供給源である。赤血球を除けば、rbcs/wbcsの割合は1000/1なので、RNA単離が簡略化される。上でDNA単離に関して議論したこの方法を実現するのと同じ方法が適用される。しかし、この方法には、（1）低浸透圧性ショックに続く遠心分離；及び（2）フィコール密度勾配遠心分離；があるが、これらに限定されない。
【００７７】
従って、一般に、ウイルスRNA単離が目標である場合には、細胞不足物質の方が細胞豊富物質よりも好ましい。標的ウイルスRNAが細胞外であれば、これは実験方法を制限すると考えられる。DNAに関して上で議論したように、細胞外核酸は、非感染性の複製不能である可能性がある。ウイルスRNAの理想的供給源は、ウイルスDNAの供給源、すなわち、今日HIV感染の主要な方法となっている性交でウイルスを感染させる体液を反映している。そのような細胞不足体液からの細胞由来RNAの方が、複製可能感染性バイロンをより表しているであろうし、本出願人の意見では好ましいと考えられる。細胞不足培養液由来のウイルスRNAは、細胞関連、無細胞、またはその2つの組合せであることが可能である。こうして得られるウイルスRNA濃度は、供給源を問わず、低く、超遠心、限外濾過、または沈澱を必要とすると予測される（Bowienら、第6章）。
【００７８】
非HIV感染組織由来細胞RNAは、3種の別々のプール、すなわち、（1）リボソームRNA；（2）トランスファーRNA；及び（3）mRNA；からなる。mRNAはDNAに存在する遺伝情報を運ぶ。mRNA画分は3種のうち最も小さいが、RNAベース免疫原性組成物またはワクチン開発には必要な成分である。典型的な哺乳動物細胞中の全RNAのうち、わずか1〜5%がmRNAである（Bowienら、第6章）。細胞内のRNA発現はかなり可変的である。HIV感染細胞では、ウイルスRNAの異種混合物からなる細胞由来RNAの4分の1プールを単離することができる。そのような細胞株内のウイルスRNAは、一本鎖、二倍体（5'末端近傍の特定の配列のみで結合している）であるか、RNA/DNA二本鎖で相補的DNAに結合しているのが見られるかのいずれかである。ワトソンクリックの二重らせんに多少は類似しているらせん構造を帯びた二本鎖RNA分子にも遭遇する。一本鎖RNA分子には、未スプライスの、単一回スプライスされた、または複数回スプライスされた核酸配列がある。未スプライスRNAは、細胞由来5'キャップ及び3'ポリアデニル化された（ポリA配列）テイルを有することも有さないこともある。特にHIVウイルスに感染した細胞では、mRNA含有量は時間的に変動し、Revタンパク質の発現に依存している。ウイルスRNAの抽出後、mRNA画分の濃縮は、オリゴ（dT）セルロースの添加により実現することができる。これを使って、真核生物mRNAのポリ（A）テイルに結合して分離させてもよい。これにより、mRNAのDNA、rRNA、及びtRNAからの分離が促進される。
【００７９】
試料回収及び処理の方法は、数秒内のmRNA産生に影響する可能性がある。理想的には、ワクチン作製のために単離されたmRNAは、in vivoで産生されるmRNAを反映するはずである。しかし、細胞死並びに、細胞及びウイルス由来リボヌクレアーゼ酵素によるRNAの酵素的分解は、mRNA画分を迅速に破壊しうる。同様に、試料加工及び処理は、ある種のウイルス遺伝子の発現を誘発するまたは下方調節することがある。従って、mRNAを、任意の核酸単離法にも先立って、安定化するべきである。液体窒素内での、またはエタノール及びドライアイスを使った急速凍結が、mRNAを安定化するのに使われてきたが、結果は信頼に足るものではない。
【００８０】
RNA単離の実験室過程の初期に、細胞またはウイルス由来リボヌクレアーゼを不活化することが好ましい。リボヌクレアーゼ酵素は細胞内に広範に分布し機能するために、一般に補助因子を必要とせず、比較的安定であり、高効率で、不活化するのが困難であることが多い。ウイルス核酸を得るために細胞を溶解すると、それに続いて細胞内リボヌクレアーゼを放出する。イソチオシアン酸グアニジン及び塩酸グアニジンを含むカオトロピック試薬は、直ちにリボヌクレアーゼを不活化する。そのうえ、混入DNAの消化は、デオキシリボヌクレアーゼIで実現することができる（Bowienら、第6章）。デオキシリボヌクレアーゼI処理は、RNA単離を伴う任意の実験プロトコルの開始時、中間時、または終了時に実施することができるが、通常、リボヌクレアーゼ不活化化合物での処理の後に続くべきである。
【００８１】
これまで、メルカプトエタノール、サルコシル、及びチオシアン酸グアニジンの混合物を使って、リボヌクレアーゼを不活化し、pH7.0で組織標本からウイルスRNAを精製してきた。次に、pH4.0の酢酸ナトリウム及び酸性フェノールを添加して、RNAをアルコールで沈澱させる。
【００８２】
RNAlater（商標）RNA安定化試薬などのRNA保存化合物が市販されている。これにより、mRNA単離前の組織試料の長期間の貯蔵が可能になる。もう1つの例は、RNA安定化及び精製のためのPAXgene（商標）血液RNAシステムである。この産物は、遺伝子転写を妨げる（Bowienら、第2章）。
【００８３】
細胞豊富培養液をRNA単離に使う場合には、リボヌクレアーゼ阻害剤のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する媒体中での、プロテイナーゼKによる細胞溶解が比較的容易な方法である。DNAはデオキシリボヌクレアーゼIで取り除くことができる。有機抽出とそれの続くアルコール沈澱、または詳細に明らかにされたシリカベースもしくは陰イオン交換法により、任意の過剰な混入デオキシリボヌクレアーゼも取り除かれる。ゲノムRNAを得るためのウイルスRNAの分離は、遠心分離またはゲル電気泳動により実現することができる（Bownienら、第6章）。
【００８４】
あるいは、上述のカオトロピック剤は、リボヌクレアーゼを不活化するだけではなく、細胞も破壊する。有機抽出は、カオトロピック抽出に続き、以下の定義された技術、すなわち（1）アルコール沈澱；（2）LiCl沈澱；（3）CsCl密度勾配；（4）シリカベース法；（5）陰イオン交換法；及び（6）ハイブリッド選択；のうちの1つまたは複数を伴う（Bowienら、第6章）。
【００８５】
HIVヌクレオカプシドタンパク質にコンジュゲートしたHIV RNAは、ほぼ2〜3時間の間安定である。HIV RNAの定量化及び増幅は技術的に困難であるが、Chiron（商標）社製の分岐DNAアッセイ、Roche（商標）社製のAmplicor（商標）RT-PCRアッセイ、及びOrganon-Teknika（商標）社によるNASBA増幅システムなどの市販のアッセイで実現することができる。NASBAは、DNAが混入した組成物中でRNAを選択的に増幅することができる。NASBAは、DNAからウイルスRNAを分離する少なくとも1精製段階を不必要にすることができる。実施される段階が少なくなるほど、実験方法が合理化され、正確なゲノム増幅の割合が高くなる（Nelson Michaelら、1999年、第16章）。
【００８６】
HIV RNA核酸を、ノーザンブロットの方法を用いて、種々の組織及びin vitro細胞株から検出し単離することができる。この技術に関しては、DNAまたはRNAプローブのいずれも用いることができるが、DNAを用いてより多くの成功が示されてきた（Michaelら、1999年、第10章）。
【００８７】
Trizol（商標）などの市販の試薬が、組織標本からのRNA抽出に利用可能である。QlAamp（商標）キットなどのシリカベース技術が、RNA分離及び精製のために、細胞溶解物または無細胞試料で使用することができる（Bowienら、第5章）。
【００８８】
ウイルスRNAは、QlAamp（商標）ウイルスRNAミニキットなどのミクロ濃縮機により、便標本から単離し、濃縮することもできる（Bowienら、第5章）。
【００８９】
HIV RNAの単離及び安定化のための他の限定された方法が、これまで定義付けられている。これらの方法には、全血試料に使用されるCatrimox（商標）、及び室温で数カ月間貯蔵した後の血液からウイルスRNAを単離するために使うことのできるRNeasy（商標）ミニキットなどの陽イオン界面活性剤があるが、これらに限定されない。
【００９０】
ウイルスRNAは典型的に折りたたまれて特有の二次構造を帯びる。HIVにおいて、ウイルスRNA二本鎖は、5'末端の保存領域での分子結合により達成される（Flintら、2004年、第7章）。これらの二次、並びにHIVの場合は、三次及び四次構造による逆転写は困難になることがある。Omniscript（商標）及びSensiscript（商標）などの市販の逆転写酵素がこの目的に利用可能である（Bowienら、第6章）。
【００９１】
ウイルスの遺伝子型及び表現型の特徴は、一部、ウイルスが侵入しそこで複製する宿主細胞型によって決定されると考えるのが妥当であろう。HIVの主な複製保有宿主には、マクロファージ及び主にリンパ系組織に存在するT細胞がある。in situハイブリダイゼーション（ISH）により、DNA及びmRNAを含む特定の核酸の他にも細胞内タンパク質の同定、濃度推定、並びに細胞内局在化が可能になる。DNA、mRNA及びタンパク質は、個々の細胞内で同時に検出可能であり、研究者は細胞内レベルでゲノム含有量とゲノム発現を協調させることができる。
【００９２】
ISHは、以下に記載するin situ PCRの方法と比べると比較的感度が低い。ISHは、当業者によって細胞当たりわずか20コピーのmRNA濃度まで検出することができる。ISHを実施している大半の実験室が、細胞当たり100コピー以上と定義されているmRNA同定閾値に関してより制限されている。in situハイブリダイゼーションの方法はすでに定義付けられているが、HIVを有するあらゆる細胞型への統一されたアプローチはない。それでも、その方法は一般に知られている。
【００９３】
in situポリメラーゼ連鎖反応により、細胞内DNA及びRNAの同定及び増幅が可能である。これはワクチン作製においては好ましいと判明するであろう。なぜならば、核酸単離の多くの段階が不必要になり（実験方法を合理化し、核酸純度を促進し、回収可能核酸量を増強する）、同定される核酸配列は、感染する複製可能バイロンの核酸配列に類似するからである。作製される大半のHIVバイロンは、非感染性であり複製不能である。任意の系でも、in vitroでもin vivoでも、非感染性不能バイロンによる感染性複製可能バイロンの混入が必然的に生じる。非感染性複製不能バイロンに向けられる免疫応答は、なんら利益はなく、最悪の場合のシナリオでは、宿主に悪影響を与える可能性がある。
【００９４】
「抗原原罪」という概念が、オルソミクソウイルス族の分割型マイナス鎖RNAウイルスであるインフルエンザAに関して詳細に明らかにされてきた。病原生物に対する宿主の一次応答が、抗原的に完全に異なる株が宿主に感染するまでは、その生物に対する追加の免疫応答を遮断する（Parham、2005年、第8章）。「抗原原罪」という概念は、HIVを含む他の病原体に非常によく当てはまるようである。最適には、最初のワクチン（サブユニット、生、条件付きで複製可能、組み換え、またはその他の方法で）は、実際の感染生物に密接に類似していて、欠損バイロンには類似していないはずであり、欠損バイロンは宿主による適切な免疫応答を邪魔する免疫性デコイとして働き、その後の類似する病原体に対する免疫応答を遮断する可能性がある。
【００９５】
HIV核酸単離、改変及び増幅を提供するために、1つまたは複数の前記の供給源を利用すれば、組成物またはワクチン開発が可能になるであろう。本発明の一実施形態は、核酸の単離前の、感染性複製可能バイロンの非感染性複製不能バイロンからの分離をさらに包含するであろう。これは、細胞不足培養液の感染細胞をHIV核酸の供給源として単離することにより実現することができると考えられる。そのような単離は体液の遠心分離により実現され得る。次に、in situハイブリダイゼーション及びin situ PCRにより、好ましい核酸の同定及び増幅が可能になる。逆転写in situ PCRを実現することもできる。1.5キロ塩基未満のmRNAフラグメントは、今日利用できる技術でRT-in situ PCRを受けることができる。これでは、10キロ塩基長の全HIVゲノムのRTは可能ではないと考えられる。しかし、in situ RT PCR後の重複または連続mRNAフラグメントを、DNAリガーゼで連結し、改変及び増幅に適した無傷のHIV DNAゲノムを作製することができる（Michaelら、1999年、第18章）。
【００９６】
Superscript II（商標）などの逆転写酵素が市販されており、これはリボヌクレアーゼH活性（逆転写されたRNA/DNAヘテロ二本鎖中の一本鎖RNAを分解する）を欠き、従って、DNA増幅ではより効率がよい。この酵素は、比較的長いmRNA分子を逆転写することができ、通常のRT増幅に使うことができる。
【００９７】
逆転写及びDNA増幅のためのアニーリング温度は、in situハイブリダイゼーション及びin situ PCRのために数学的に規定されてきた。再アニーリング温度パラメータも、アニーリング温度ブロックの迅速な経験的決定またはタッチダウンPCRのために、温度勾配ブロックで設計されたサーモサイクラーを使って規定することができる（Michaelら、1999年、第18章）。
【００９８】
in situ PCR及びISHで同定され増幅される核酸の量は、特徴的に、以下で議論する溶液ベースPCR法の核酸量よりもはるかに少ない。当分野の研究者たちは、ISH及びin situ PCRに関する律速因子は、プライマーが細胞膜を通過する困難さであると結論している。これは、例として、（1）細胞に適用されるヒートショック、これにより細胞は巨大分子に対する膜透過性を一時的に増加させる；（2）細胞貫通ペプチド（CPP）へのプライマーの結合；及び/または（3）（1）と（2）の組合せを含む数種の方法により克服される可能性がある。
【００９９】
DNA及びRNAの定量化法、並びに純度の評価法
RNA及びDNA濃度並びに純度を評価する実験方法は標準化されており、かなり類似している。RNAの濃度は、紫外光を最小限の歪み及び吸収で分光光度計中を通過させる水晶キュベットを使って、260nm（A260）で吸収度を測定することによって決定することができる。この方法を実施する間ずっとpHを7.0に保てば、妥当性及び再現性が確保できる。260及び280nmでの吸収値の比により、RNAの純度の推定値が得られる。Oligotex（商標）mRNAキットなどのキットが、mRNAの定量用に市販されている（Bowienら、2003年、第5章；Nicholl、第3章）。
【０１００】
DNA濃度及び純度の定量も、分光光度計により実施して、水晶キュベット中260nmでの吸収度の測定を行ってよい。DNA定量化にアガロースゲル分析も用いることができる。RNAの場合と同様に、DNAの純度は、A260/A280比を測定することにより決定することができる（Bowienら、第7章；Nicholl、2002年、第3章）。
【０１０１】
ポリメラーゼ連鎖反応は、DNA及び/またはRNA配列を増幅するためだけではなく、プライマー、酵素、塩、緩衝液、ヌクレオチドなどの混入物質を除去するためにも使うことができる。QIAquick（商標）96PCR精製キットなどのキットは、DNAのPCR精製を可能にし、シリカゲル膜ベース技術である。DNA精製の代替法は、MinElute（商標）反応クリーンアップキット法である。この方法も、シリカゲル膜技術に基づいている（Bowienら、第7章）。
【０１０２】
RNAの精製は、リボヌクレアーゼのないデオキシリボヌクレアーゼIを使って実現することができ、RNA精製用のRNeasy（商標）キット及びQIAamp（商標）RNA血液ミニキットなどが市販されている。これはシリカ膜スピンカラム技術に基づいており、デオキシリボヌクレアーゼ処理の必要性を取り除く（Bowienら、第6章）。
【０１０３】
DNA分子の実際の配列決定は、文献に詳細に明らかにされている2つの方法により実施することができる。マクサムギルバート配列決定法は、一組の入れ子フラグメントに基づいており、各鎖の5'末端でDNAを32Pで放射線標識する。サンガークールソン（ジデオキシまたは酵素的）配列決定法は、DNAポリメラーゼのクレノーフラグメント及びプライマーを利用して、DNAポリメラーゼに3'末端を提供する（Nicholl、第3章）。
【０１０４】
前記の方法のいずれも、無傷のウイルス核酸、複製依存バイロンで使用する改変された核酸の他にも切断フラグメントの核酸配列の配列決定のために使うことができる。さらに、ワクチンベクターのサブユニット成分をコードする核酸配列を決定することができる。
【０１０５】
核酸改変
選択されたウイルス核酸が単離されると、配列改変を開始できる。前記のように、本明細書で使用の改変には、欠失及び突然変異もあってよい。RNAでもDNAでも利用することができるが、DNAの方が好ましいと考えられる。DNAの方が安定しており、ex vivo増幅が容易であり、DNAの突然変異の方が効率的に実現できる可能性がある。ウイルスゲノムのRNA鋳型も使うことができる。逆転写酵素、すなわちRNA依存性DNAポリメラーゼは、RNAからDNAの相補鎖を産生する。あるいは、RNAは、重複及び/または非重複セグメントの欠失により改変することができる。PCRそれ自体は、DNAに点突然変異、欠失または挿入を導入できる（Flintら、2004年、第2章）。
【０１０６】
条件付きで生存するバイロンの作製は、細菌またはその他に由来する制限酵素を使用して、無傷のウイルスゲノムから所望の配列を切断することにより着手してよい。標的タンパク質の遺伝子配列を切り取るためには、制限酵素の相補体を使うことができる。この方法で、標的タンパク質のコドンを囲む遺伝子配列が同定されることになる。
【０１０７】
制限酵素は、ウイルスによる感染に対する防御として細菌によって産生される。200種以上の制限酵素が同定されており、市販されている。これらの酵素のうち約100種が研究者により広く使用されている。制限酵素はそれぞれDNAに結合し、認識配列と呼ばれる特異的なヌクレオチド配列を認識する。酵素は、DNAの両方の鎖を認識配列内で特定の切断パターンで切断する。この後に、改変された核酸配列の精製段階が続く。
【０１０８】
制限酵素の使用により生成するフラグメントは、平滑末端、3'突出末端、または5'突出末端を有する場合がある。切断DNAの改変は、末端同士を再アニールする前に実施することができる。例えば、酵素の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（TdT）は、繰り返し及び無作為にヌクレオチドを、利用できる3'末端ならどこにでも無鋳型の形で添加する（Nicholl、2002年、第4章）。これには、突出、平滑末端、及び陥凹3'末端がある。DNA配列の2つの末端が互いに連結し戻されると（例えば、リガーゼを添加することによって）、ノックアウトHIVバイロンが作製される可能性があり、これが本発明の基礎としての働きをする。DNAの5'及び/または3'末端を分解するエキソヌクレアーゼなどの他のDNA改変酵素も、この目的に用いてよい。
【０１０９】
4種の追加の有用なヌクレアーゼ（Bal 31、エキソヌクレアーゼIII、デオキシリボヌクレアーゼI［DNaseI］、及びS1-ヌクレアーゼ）は文献に詳細に明らかにされており、それぞれは活性の位置及び様式が異なり、分子生物学者に当分野の細刻み道具を与える。リン酸基を付加する、またはDNA分子の末端から除去することができる。酵素のアルカリホスファターゼは、DNAの末端リン酸分子を切断し、酵素のポリヌクレオチドキナーゼはリン酸基をDNA末端に付加する。
【０１１０】
別の酵素、末端トランスフェラーゼ（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ）は、ヌクレオチドを開放3'DNA末端ならどれにでも繰り返し付加する。これには、突出、平滑末端、及び陥凹3'末端がある。標的核酸配列がウイルスゲノムから欠失された後、残りのDNAフラグメントを、酵素のDNAリガーゼにより結合させて機能分子にすることができる。アクセサリータンパク質（及び/または構造タンパク質及び/または酵素タンパク質）産生に必要な配列が欠失したこのウイルスゲノムは、PCRまたはその他の配列増幅法を利用して増幅させることができる。
【０１１１】
改変された核酸の純度を保証し増強するために、数段階が続いてよい。これらの段階には、遠心分離、ゲル電気泳動、核酸塩基配列決定、及びゲノム配列の逆転写と転写翻訳されたタンパク質すべての同定があるが、これらに限定されない。後者の方法は、無細胞栄養ブロス、または多形核血液細胞などのin vitro細胞培養、またはHeLa細胞などの連続する細胞株において実現することができる。
【０１１２】
標的タンパク質の非重複セグメントの除去により、切断型非機能タンパク質が転写される。切除されたセグメントそれぞれが1つのタンパク質の一部のみをコードしているので、その標的タンパク質のみが悪影響を受けるであろう。にもかかわらず、これにより、HIVバイロンは無能にされ不活化されることになる。こうして得られたバイロンは、それ自体複製不能及び非感染性になる。他所で議論したように、複製には欠損タンパク質の外因的供給源が必要になるであろう。重複セグメントを除去すれば、前記重複セグメントに部分的にコードされたタンパク質すべてが悪影響を受けることになる。
【０１１３】
一般に利用できる分子生物学の技術を使って、DNAは、vif、vpr、vpu、tatエキソン1、及びvpxコドンの非重複部分をコードする配列などの正確な標的領域で切断することができる。1種または複数の構造、酵素、またはアクセサリータンパク質に悪影響を与える1種または複数の突然変異があれば、バイロンは不能になる（Flintら、2004年、第20章）。これらの突然変異は、1種または複数の塩基置換、塩基欠失（近接でも非近接でも）、またはヌクレオチド配列の欠失でありうる。条件付きで生存するバイロンという文脈では、標的タンパク質の非重複及び/または重複遺伝子セグメントの切除が利用されることになる。点変異それ自体は、逆突然変異が起きてウイルスを複製可能にならせる性質のために、十分な安全性評価基準を許さない。
【０１１４】
核酸増幅
主に、下で議論する核酸増幅法である溶液ベースPCR技術は、ウイルス核酸の供給源を区別しない。さらに、この技術は核酸の供給源に依存していない。大半の適用では、PCRは核酸同定、精製または単離の機構ではない。例外は、細胞内核酸同定、精製及び単離を可能にするin situ PCR（上で議論した）である。
【０１１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のおかげで、研究者は任意の生物のDNA配列も100万倍以上選択的に増幅することができる。その方法は、ウイルスゲノムの2つの保存された領域からのプライマーの選択に頼っている。大半の過程が、5'LTR及びgagヌクレオチド配列の近位に位置しているtRNAプライマー結合部位、並びに3'LTRのR/U5接合部のmRNAポリアデニル化シグナル部位を利用する。これは、構造、酵素及びアクセサリータンパク質のコード領域すべて、並びに3'LTRのU3及びR領域を包含する9kbのウイルスDNAを増幅する。感染性プロバイロンは、無傷の5'及び3'LTRがなければ実現できない。PCR反応に含まれないLTR領域の別々の増幅は、別々の増幅により再生することができ、DNAライゲーションを利用して、両LTRをもつ無傷のゲノム配列を作製することができる（Michaelら、1999年、第12章；Nicholl、2002年、第7章；Specterら）。
【０１１６】
PCR以外の他の核酸増幅法が定義されたおり、これには核酸配列ベース増幅（NASBA）及び転写媒介増幅（TMA）があるが、これらに限定されない。さらに、鎖置換増幅（SDA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、サイクリングプローブ技術（CPT）、及びクリーベースインベーダーアッセイが核酸増幅のために使われている。ウイルス核酸の欠失は、これらの方法によっても実現することが可能である。核酸配列の数を増やさずに、シグナル増幅のみに向けられた他の実験方法が定義されており、これには酵素免疫アッセイ技術（EIA）、分岐鎖DNA（bDNA）、及びハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）、並びに蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）法があるが、これらに限定されない（Specterら）。シグナル増幅法による核酸同定は核酸増幅に先行することができる。これにより実験方法が合理化できる。
【０１１７】
増幅方法はすべて、手順とは無関係に、好ましくは、細胞酵素のウラシルNグリコシラーゼ（UNG）で実施される。これにより、PCR持ち越し混入が減少する。PCR反応混合物をUNGで室温で10分間前処理すると、DNA分子からウラシル残基が切断、切除される。次に、熱不活化によりいずれの残留UNGも取り除かれる。この過程によりゲノム純度が確保される（Michaelら、1999年、第15章）。
【０１１８】
古典的に、PCR方法は、温泉に生息する好熱性細菌のサーマスアウアチクスに由来するTaqポリメラーゼを利用する（Nicholl、2002年、第7章）。ゲノム複製の速度及び正確さを増強した他の類似の機能をするポリメラーゼが、今や利用できるようになりつつある（Michaelら、1999年、第15章）。他のDNAポリメラーゼ酵素には、Pwo、Tth、及びHotTub DNAポリメラーゼがあり、これらの酵素は混入物質が存在する場合に用いられてきたし、多くの場合使うことができる。
【０１１９】
プローブ及び配列欠失システムなどのリアルタイムPCR技術により、実験室混入の危険を最小限にして、PCR単離及び増幅法を行うことが可能になる（Bowienら、第8章）。
【０１２０】
核酸増幅は、核酸改変及び改変された核酸配列の精製の前または後で実施することができる。
【０１２１】
条件付きで生存するバイロンの会合
改変後のウイルスDNAまたはRNA（例えば、指定された配列の切除、他の突然変異など）は、再パッケージされなければならない。これは、無細胞発現系/培養液または細胞培養物で実現することができる。in vitro及びin vivoの無傷のバイロン内で、細胞膜とのウイルス融合の前に、逆転写の過程が起こり始める。サブウイルス粒子内で、ウイルスRNAが、カプシドコア領域に含まれる逆転写酵素により逆転写される。従って、DNA、RNAまたは両方は、ウイルス粒子会合のための開始点になりうる（Flintら、2004年、第4章及びApp.A）。
【０１２２】
ウイルス構造は、自己組織化の整然とした予測可能な配列を指示する。ヌクレオカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質の基盤である。同様に、カプシドタンパク質は、マトリックスタンパク質の足場である。マトリックスタンパク質は、gp120/gp41三量体の足場である。ウイルス会合の部位では、ほぼ10%のgagポリタンパク質（gag-pol）が、レトロウイルス酵素の翻訳産物、すなわちプロテアーゼ（PR）、逆転写酵素（RT）、及びインテグラーゼ（IN）をgag-polタンパク質の3'またはCOOH末端に坦持している。
【０１２３】
最初に、2本のRNA鎖が、ウイルスの5'LTRにある特定の配列（二量体化開始部位及び二量体連結構造）により連結される。この過程はin vitroで起こり、ウイルス会合を開始させる。2本のRNA鎖の連結は、次の段階を起こさせるRNAの立体構造変化を促進する。次に、NCタンパク質（p7）がウイルスRNAを覆う。アクセサリータンパク質のVif及びNefは、ウイルスRNAヌクレオカプシド複合体と会合し、無傷のバイロンに組み込まれる。無傷のバイロンのウイルスゲノムの表面にほぼ2000分子のp7が存在する。NCセグメント（p7）と二倍体のウイルスRNAの会合により、Vpr（HIV-1及びHIV-2）及びVpx（HIV-2）アクセサリータンパク質を結合させているp6タンパク質との会合の引き金が引かれる。ほぼ2000のp6タンパク質は各バイロンに同化される。
【０１２４】
次に、ウイルスコード化酵素、すなわちRT、IN、リボヌクレアーゼH及びプロテアーゼは、二倍体ウイルスRNA/p7/p6/Vpr/Vpx（HIV-2）複合体と共有結合していない。前記酵素のそれぞれのほぼ10コピーが各バイロンに含まれている。ウイルスカプシドタンパク質は、シス-トランスペプチジル-プロリルイソメラーゼ活性を示す広範に分布する細胞タンパク質サイクロフィリンA（CypA）に結合する。CypAのp24への結合は、カプシド配列87 His-Ala-Gly-Pro-Ile-Ala 92で起きる。カプシドタンパク質の立体構造変化が起き、次の段階を促進する。
【０１２５】
二倍体ウイルスRNA/p7/p6/Vpr/Vpx（HIV-2）複合体は、カプシド（p17またはCA）タンパク質とCypA分子との会合のための基盤である。次の段階を完了するためにはほぼ2000分子のp17/バイロンが必要とされる。200CypA分子のみが各HIVバイロンに組み込まれる。理想的には、会合したウイルス及び細胞由来タンパク質の割合は、無傷のバイロンの最終構成を反映しなければならない。HIV-2バイロンは、CypA分子を同化せず、従って、この段階はHIV-2の会合には必要ではない。会合したカプシドタンパク質/CypA複合体は管状形を帯び、マトリックスタンパク質（p24）の会合のための基盤となる。
【０１２６】
マトリックスタンパク質は、カプシドシリンダーの周囲に正十二面体を形成する。ほぼ2000のマトリックスタンパク質単量体が自己会合して、正十二面体を形成する。この構造は、gp41分子の同化のための基盤である。MAの結晶構造は三量体であり、MA構造タンパク質の三量体化は、レンチウイルスの保存された特性であると思われる（A.Cimarelliら）。gp41分子は、マトリックスタンパク質正十二面体の外部表面上で自己組織化して、ホモ三量体になる。gp120分子はバイロンの最外部タンパク質であり、最後にウイルスに会合されるタンパク質である。gp41三量体は三次元構造を帯び、gp120分子と対応する静電気的特性を示す。gp41/gp120相互作用は、樹木（gp41）の上に置かれているゴルフボール（gp120）にたとえられる。72のgp41/gp120三量体は、ウイルスの外部タンパク質外被を形成する。
【０１２７】
ウイルスRNA/タンパク質相互作用の他にウイルスタンパク質/ウイルスタンパク質相互作用及びウイルスタンパク質/宿主細胞タンパク質も、ファンデルワールス力、水素結合、及び双極子-双極子モーメントなどの非共有結合に媒介される。これらの分子間力は、バイロン会合の順序及びバイロンの最終三次元構造を決定する。
【０１２８】
HIV感染細胞の細胞膜の細胞質側には、Gagポリタンパク質及びGag-Polポリタンパク質が10対1の割合で蓄積している。プロテアーゼ酵素がこれらのポリタンパク質を切断するのは、ウイルス発芽の過程中及びその後であり、この過程の前ではない。プロテアーゼ活性は、プロバイロンが細胞由来エンベロープを獲得する後で生じる。各HIVバイロンでは、ほぼ2000コピーのp7及びp24タンパク質が同化していることが実証されている。ほぼ90%のp7及びp24タンパク質がGagポリタンパク質由来であり、ほぼ10%がGag-Polポリタンパク質由来である。これらのポリタンパク質の切断は、出芽中に無傷の細胞由来エンベロープ内で起こり、従って、個々の由来タンパク質はすべて無傷のバイロンに同化しなければならない。
【０１２９】
推論によれば、2000コピーのp7及びp24、並びにほぼ1800はGagポリタンパク質由来であり、200はGag-Polポリタンパク質由来である。バイロン会合のこの時点で、個々のタンパク質単量体の喪失が、エンベロープのある出芽ウイルス内でのポリタンパク質の切断、及びバイロン会合の全体的な高効率のためにある可能性はない。従って、2000コピーのp6及びp17は各HIVバイロンに含まれていると考えるのが妥当である。Gag及びGag-Polポリタンパク質は、5'から3'方向に、1コピーのp17、p24、p7、p6をコードしており、Gag-Polでは、ウイルス酵素それぞれを1コピーコードしている。従って、ウイルス酵素それぞれの最大200コピーが各バイロンに組み込まれている可能性がある。ウイルス粒子の自己組織化のための無細胞発現系では、酵素を含むウイルスタンパク質の割合は適度に一貫していると考えられる。
【０１３０】
マトリックスタンパク質は、プレインテグレーション複合体の核ターゲティングも新たに転写されたgagポリタンパク質の細胞膜ターゲティングも促進する。gagポリタンパク質内のマトリックスタンパク質は、細胞由来ミリストイル部分と結合する。これにより、マトリックスタンパク質において方向変化が可能になる。Nefタンパク質もウイルス会合の過程でミリストイル化され、細胞膜の細胞質側に極性化される。上の方法では、ミリストイル部分のマトリックス及びNefタンパク質への取込みは回避すべきである。ミリストイル部分は、ウイルスの標的細胞への侵入後に付加されるが、無傷のバイロンの成分ではない。無傷のバイロン内のミリストイル部分は、PICの核局在化を可能にしないと考えられる。従って、HIVバイロン作製のために使われる無細胞培養液は、あらゆるミリストイル部分または類似の脂肪酸物質を欠いていなければならない。ミリストイル化を触媒する酵素も取り除くべきである。
【０１３１】
マトリックスタンパク質は、gp41の内部細胞質ドメインに特異的に結合する。gp41糖タンパク質は、gp120に非共有結合的に結合する。出芽バイロン表面への細胞質の融合により、最初に、未成熟非感染性ウイルス粒子が放出される。次に、ウイルスプロテアーゼ酵素はgag及びgag-polポリタンパク質を切断し続け、感染性粒子が生じる。
【０１３２】
さらに、自己組織化過程は、以下の、
pH
重量オスモル濃度
温度
ウイルスタンパク質の相対比
ウイルスタンパク質の添加順
促進性または阻害性非ウイルス物質の包含
光線、特に紫外線領域の光線の強度、周波数、及び持続時間
を調節することにより、制御してよい。
【０１３３】
好ましくは、pH、重量オスモル濃度、及び温度は、細胞内環境（pH=7）、重量オスモル濃度（=280mosm）、温度=37℃を反映するのがよい。特に260nm帯の紫外線は回避すべきである。この波長では、RNA及びDNA両方の立体構造変化が観察される。特に、260nmの紫外線に曝露された結果として、DNA内にチミンダイマーが生じる。ウイルスタンパク質の相対比は、無傷のバイロン内のタンパク質単量体の比を反映すべきである。ウイルスタンパク質の添加順は、所望の最終産物に依存するが、通常は、システムの秩序性を維持するために、内部構造タンパク質は典型的には開始点であり、終点は最外部構造タンパク質である。通常、3'から5'方向のEnv遺伝子及びGag遺伝子の配列は、この内部配置を外部配置に正確に映し出すウイルスタンパク質をコードしている。ウイルスにコードされた酵素の他に、ある種のアクセサリータンパク質（HIV-1及びHIV-2中のVpr、並びにHIV-2中のVpx）も、カプシドコア内に含まれるが、構造的ではない。条件付きで生存する複製可能バイロンを企図しているので、これらのタンパク質の包含はこの組成物またはワクチンに必要である。複製可能組成物では、これらのウイルスコード化酵素及び前記のアクセサリータンパク質も必要である。
【０１３４】
バイロンの産生は、バイロンコード化プロテアーゼ酵素が触媒することができ、この酵素は、Gagポリタンパク質及びGag-Polポリタンパク質を切断して、細胞内ウイルス産生を最適に促進する時間的に限定された配列内の個々のタンパク質成分にする。Nefタンパク質も、出芽中及び後でプロテアーゼにより切断される。従って、Gagポリタンパク質（または、10対1の割合のGagポリタンパク質及びGag-Polポリタンパク質）と共にこの酵素を包含することが、ウイルス作製の代替法（対各タンパク質を経時的に添加すること）である。
【０１３５】
ウイルス自己組織化はATPまたはGTP消費過程ではない。従って、各段階は先行段階から続いて論理的に起こり、より低いエントロピー状態になる。エントロピーとは、任意の系でも、要素の可能な配置数である。エントロピーは、乱数度またはばらつきの尺度である。エネルギーが消費されなければ、物質はエントロピーが低い構造体になる。可変性を維持するためには、エネルギーが消費されなければならないし、生細胞は、このばらつき/非ばらつき比を維持する方に、そのエネルギー資源の多くを転用する。ウイルスは生きた構造体ではない。ウイルスは、ATPまたはGTPを生成も消費もしないが、宿主細胞転写及び翻訳機構に全面的に頼っている。
【０１３６】
一般に考えられているエントロピーはウイルスには当てはまらない。ウイルスと細菌の橋渡しを表す可能性のあるあらゆるウイルスの中で最も複雑なものを除いて、ウイルス構造体は2種類の可能な低エントロピー状態、すなわち正十二面体またはらせん状、のうちの1つを帯びている。HIV外部構造は、20個の三角形面と12個の頂点に特徴付けられる正十二面体構造であり、2つ折り、3つ折り、または5つ折りの対称回転軸から見ることができる。gp120及びgp41糖タンパク質はHIVウイルスの外部または表面タンパク質であるが、根底にあるマトリックスタンパク質が正十二面体構造を規定している。
【０１３７】
正十二面体対称構造体は、三角形成数、T、すなわち面当たりの構造単位の数に基づいている。正十二面体に自己組織化するための最小サブユニット数は60である。60サブユニットのみでは、それぞれのサブユニットは正十二面体を生み出すためには同一でなければならない。このモデルでは、T=1である。ウイルス構造タンパク質内に60を超えるユニットが存在する場合、それぞれのユニットまたはサブユニットは、サブユニットの非共有結合特性に規定されている準等価の位置に存在する。構造環境が異なればより大きな正十二面体を規定することもあるが、サブユニットの非共有結合特性は類似している（しかし、必ずしも最も単純な60サブユニット構造に見られるような同一ではない）。任意の構造でも、分子の規則性及び最密性が、強い分子間構造、水素結合、双極子引力、及びファンデルワールス力を可能にする。
【０１３８】
外部または内部構造体を構成するサブユニットタンパク質の柔軟性が、ウイルスカプシド自己組織化に別の次元を与える。近接カプシド単量体間の構造的相補性の他に、協調的な電気的相互作用も、形成される最終多サブユニットタンパク質構造を規定する。従って、各サブユニットが、それぞれが独自の三次元構造を有する複数のドメインを有することができ、各ドメインは残りのドメインに対して特定の配向を帯びている。
【０１３９】
従って、一部のウイルスの場合の三角形成数の規則は当てはまらないと思われる。別々の柔軟性のあるタンパク質ドメイン、及びそれぞれが別個の構造体と見なされることを考慮すると、三角形成数規則が当てはまる。エネルギー消費がないので、ウイルス会合は、最低エントロピーの構造に到達するためには秩序だった配列に従わなければならない。MAの結晶構造は三量体であり、MA構造タンパク質の三量体化は、レンチウイルスの保存された特性であると思われる（Cimarelliら）。
【０１４０】
バイロン会合に必要な構造、酵素、及びアクセサリー遺伝子の産物は、in vitroで作製することができる。一般的なレトロウイルスベクター（RV）を使う遺伝子導入は、遺伝子形質導入の十分に裏付けされた方法である。5'及び3'LTRの両方、パッケージングシグナル部位（ψ部位）、及びポリプリン経路を使って、遺伝子ベクターを酵母、大腸菌などの細胞培養物またはHeLaなどの連続細胞株に導入することができる（Michael、1998年、第24章）。1種または複数のマーカータンパク質をコードする遺伝子配列を、外来遺伝子としてレトロウイルスベクターに含むことができる。ヌクレオカプシド（p7）、p6、カプシド、マトリックス、gp41及びgp120構造タンパク質は、遺伝子導入によって細胞培養物で産生し、分割することができる。同様に、無傷のバイロン中に含まれるレトロウイルス酵素及びアクセサリータンパク質のゲノム配列を細胞培養物に導入し、分割することができる。
【０１４１】
Tat及びRevタンパク質はウイルス会合には必要ではなく、出芽後は構造タンパク質ではないので、従って、これらのタンパク質をコードしている遺伝子配列は、無傷のバイロンを産生するために組織培養にスプライスする必要がない。Nefタンパク質はHIVバイロンにパッケージされ、そこでウイルスプロテアーゼにより切断される。HIVプロウイルスDNA合成はNefタンパク質がなければ効率が低くなる。しかし、Nefタンパク質は、ウイルス複製、成熟、及び出芽には必要ではない。好ましくは、パッケージング株内に遺伝的にコードされたウイルスのタンパク質成分は、正常なウイルス会合に匹敵する連続する形で添加され、Nepタンパク質を含むことになる。
【０１４２】
最も内部の構造から始まり最も外部の構造で終わる整然とした順序のHIVバイロン会合は、条件付きで生存する無傷のバイロンを会合するのに従うべきタンパク質及びRNAの順序を指示する。適切な割合のウイルス成分は、一実施形態では、自然の自己組織化過程を反映して連続する形で添加される。過剰なタンパク質は、次の段階の前に、遠心分離または他の過程により除去される。バイロンは、無傷の宿主内での複製に必要な1種または複数のタンパク質をコードするゲノム情報が欠失しているために、技術的に複製不能である。
【０１４３】
前記の実施形態では、無細胞系を利用することができる。従って、エンベロープはウイルス構造の一部にはならない。エンベロープは、バイロン会合の後、及び細胞膜の細胞質側での出芽前に獲得される。
【０１４４】
B型肝炎ワクチンは、バイロン会合、構造、及び安定性をエンベロープに依存していない正常なエンベロープを有するウイルスという前記の概念に一部類似している。B型肝炎ワクチンは、酵母培養液中で産生され、1つのウイルス構造タンパク質、すなわちB型肝炎ウイルス表面抗原を含有している。この構造タンパク質は、自然に自己組織化して、粒子のような安定したウイルスになる。これらの粒子はエンベロープを欠くが、安定で免疫原性である。興味深いことに、B型肝炎はHIVに類似した逆転写酵素をコードしている。B型肝炎はDNAウイルスであり、HIVはRNAウイルスである。
【０１４５】
あるいは、ワクチンは、連続している、していないにかかわらず、細胞株で作製することができる。前記の条件付きで生存するバイロンのゲノムは、細胞株（連続的でも非連続的でも）にスプライスすることができる。これは、上で議論したように、本発明のサブユニット成分の作製において、制限酵素により実現することができる。核酸配列にコードされていない外因性タンパク質を供給して、複製を促進し制御することができる。あるいは、外因的に添加された改変された複製タンパク質を有する無傷の条件付きで生存するバイロンは、in vivo組織培養液に入れることができる。これにより、前記のワクチン法は組織培養で再現される。ウイルスの複製は、外因的に添加されたタンパク質の量及び半減期によって一部制御されることになる。あるいは、改変された遺伝子配列の生物活性タンパク質またはタンパク質フラグメントは、条件付きで生存するバイロンが感染したin vitro組織培養液に添加することができる。
【０１４６】
HIVを培養するためのin vitro細胞株または培養液の使用により、自然環境または宿主（例えば、ヒト）で産生されたHIVバイロンとの遺伝子型及び表現型の相違点を有することになるウイルス構造物の会合がもたらされる。これは、適応において考慮すべき第2の方法の可能な態様である。しかし、第2の方法は必要な段階が少なく、適切な栄養分が供給され全体の細胞培養液が連続細胞複製を助長するのであれば、連続細胞培養液で無限に進行することができる。
【０１４７】
外因性タンパク質（サブユニット）の作製
条件付きで生存するウイルスバイロンは、複製のために欠損複製タンパク質の外因的な供給を必要とするであろう。この複製タンパク質は、遺伝子導入により細胞培養で産生することができる。タンパク質の宿主細胞及びウイルス粒子への取込みは、タンパク質を細胞貫通性ペプチドに結合させることにより実現することができる。細胞貫通性ペプチド（CPP）は、細胞の細胞膜を通過して種々のコンジュゲート生理活性物質を細胞内に送達することができる5〜40アミノ酸で構成されたオリゴマーである。エンドサイトーシスを含む種々の機構が、CPPの作用機構を説明するために文献に記載されてきた。送達されたカーゴはCPPに共有結合もできるし、非共有結合もできる（Gellissen、Langel）。
【０１４８】
理想的には、条件付きで生存するバイロン中で欠損している1種または複数のタンパク質をコードする核酸配列は、同一ウイルス供給源の無傷の核酸から得られる。一実施形態では、2種以上の近接タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、無傷の核酸配列から切り出される。重複及び非重複セグメントは取り除かれ、従って、in vitro発現ベクターに使用して、これらのタンパク質の完全なアミノ酸配列を産生することができる。ウイルスベクターで1種のタンパク質のみが改変されているまたは欠損している場合、そのタンパク質の非重複読取りセグメントのみが取り除かれる。この非重複核酸配列は、遺伝子導入には十分ではないであろう。しかし、1種のタンパク質をコードする重複及び非重複配列を切り出せば、遺伝子導入は可能になるであろう。この例における遺伝物質の供給源は、条件付きで生存するウイルスベクターに適切であることも適切ではないこともある。重複及び非重複セグメントの両方によりコードされるタンパク質を組織培養液中に供給することにより、ウイルスの複製及び会合が生じる。特定のバイロン中で欠損した核酸にコードされた1種または複数のタンパク質が、同一細胞または同一細胞培養液中の別のバイロンによるタンパク質産生により補完されるin vitro細胞株では、欠損タンパク質のバイロン中への同化がトランスの形で起こり、ウイルス複製及び会合を促進することになる。
【０１４９】
1種または複数の改変タンパク質をコードする単離した核酸に関しては、適切な発現ベクターを選択しなければならない。古典的には、プラスミド、すなわち細胞の細胞質内の染色体外の部位に維持された環状二本鎖DNA分子を使用する。プラスミドは、DNAをコピーさせる複製起点、ベクターを可視化する選択可能マーカー、及び大規模製造のために標的DNAの挿入を可能にする1種または複数の独自の制限エンドヌクレアーゼ制限部位を含有する小分子である。プラスミドは通常は、細胞生存に必要ではないが、多くの場合、理想的とはいえない条件下で生物を生存させる選択的特徴を与える。数種の天然に存在するプラスミドが定義されており、遺伝子導入実験法に利用することができる。他の市販のプラスミドは遺伝子導入法の産物であり、実験室外では存在しない。
【０１５０】
プラスミドは環境内の核膜を欠く原核生物にのみ存在する。従って、転写と翻訳は同時に起きる。転写後修飾は原核生物では起こることはできない。転写後及び翻訳後修飾がなく、HIVなどの哺乳動物に感染するウイルスがコードするタンパク質配列は、原核生物では、正常な宿主で見られる構造とは著しく異なる構造を帯びていることがある。従って、プラスミド及び大腸菌などの原核生物により産生されるこれらのタンパク質は、正常な真核宿主細胞に同化されると、機能的ではないことがある。原核生物発現系内のプラスミド由来ウイルスタンパク質は、無傷のバイロンに組み込まれる前に追加の修飾段階を必要とする場合がある（Desmond S.T.Nicholl、第5章）。
【０１５１】
遺伝子工学で最も広く使われている真核生物は、出芽酵母（サッカロマイセスセレビシエ）である。出芽酵母は、現在、ウイルスの1種の構造タンパク質、すなわちB型肝炎表面抗原で構成されたB型肝炎ワクチンの大量生産に使われている（Nicholl、第5章）。タンパク質の出芽酵母の転写後及び翻訳後修飾は、哺乳動物細胞中のタンパク質の転写後修飾に密接に類似している。
【０１５２】
バクテリオファージはDNAを大腸菌に導入するために使われてきた。バクテリオファージは、細菌に感染するウイルスである。遺伝子導入のための他のベクターは、バクテリオファージ核酸に結合されたプラスミド配列からなり、コスミドとして知られている。この技術は文献に詳細に明らかにされている（Nicholl、第5章）。
【０１５３】
真核細胞はタンパク質の転写後及び翻訳後修飾を可能にする。従って、真核生物は、哺乳動物に感染するウイルスタンパク質の好ましい発現系である。酵母では、酵母エピソームプラスミド、酵母組込みプラスミド、酵母複製プラスミド、酵母セントロメアプラスミド、及び酵母人工染色体を含むが、これらに限定されない種々の遺伝子工学的に改変されたベクターは、文献に記載されており、in vitroでHIVウイルスタンパク質を産生するために使うことができる。さらに、細菌人工染色体（bac）も定義されている。しかし、bacは転写後及び翻訳後修飾装置の両方を欠いている（Nicholl、第5章）。
【０１５４】
プラスミドは染色体外タンパク質産生の理想的な機構を代表するが、大部分、原核生物のみに制限される。染色体外の位置の他に、1種の細胞が複数の同一プラスミドを同化する能力も、連続タンパク質産生を可能にする。染色体外の位置により、標的核酸配列は生物の染色体の制御範囲外に置かれる。細菌染色体の転写はプロモーターの制御の下にある。しかし、プロモーターは遺伝子配列をシスで制御するのみである。従って、プロモーターはプラスミド転写を制御しない。
【０１５５】
プラスミドDNAを哺乳動物細胞培養物に導入すると、通常、プラスミドは分解消失するか、またはプラスミドは宿主染色体に組み込まれ、従って、宿主染色体の制御の下にある。宿主染色体の大部分は、細胞性転写では不活性である（異質クロマチン）。異質クロマチンへまたは近傍へプラスミドを挿入すると、プラスミド遺伝子発現は喪失することになる（Klugら）。
【０１５６】
哺乳動物細胞におけるプラスミド組込みに対する一例外が定義されている。エプスタインバーウイルスの複製起点、エプスタインバーウイルスのウイルス的にコード化された核内抗原（EBNA-1）、EBNA-1の結合部位、及び選択可能マーカーを含有するプラスミドが、そのようなプラスミドの構築基盤を提供する。プラスミドの複製起点を取り除き、それをヒトゲノムの無作為断片で置き換えると、in vitro哺乳動物細胞培養物に侵入すると、位置が染色体外のままであり自律的に複製するプラスミドベクターを作製することができる。1種または複数のHIVタンパク質のヌクレオチド配列をこのプラスミドにスプライスすることができる。真核細胞培養物に置かれたプラスミドは、細胞質に同化されることになる。プラスミドの核標的は起こらないであろう。ウイルス遺伝子の転写、翻訳及び翻訳後修飾は、核制御なしで、従って、外因的に供給されるEBNA-1の存在下で連続する形で起こるであろう（RLP Adams）。これは、細胞関連培地が予測される場合は、HIVウイルスタンパク質のin vitro産生のための適切な機構である。
【０１５７】
市販されていないプラスミドベクターの単離も探求してよい。プラスミド単離のための細菌細胞培養物を生育するのに適切な培地は、LB培地である。急速抽出アルカリ法（R.E.A.L.）Prep 96キットなどの市販のキットを使えば、プラスミド、コスミド、bac、及びファージ人工染色体の急速単離が可能になる。シリカベース法も、プラスミドDNA単離の信頼できる方法である（Bowienら、第3章）。プラスミド単離から始まり、in vitroプラスミド構築、精製及び商品化へと至る過程は文献に概要が述べられている（Botho Bowienら、第4章）。
【０１５８】
HIVバイロンの個々のタンパク質成分を単離する代替法を使うことが可能である。HIVが感染したHeLa細胞などのin vitro細胞培養液の上澄みを細胞培養液から分離し、個々のウイルスタンパク質をゲル電気泳動、遠心分離または他の方法により同定することができる。あるいは、全細胞培養液を、個々のHIVタンパク質の分離前にホモジナイズすることができる。両方法とも、もっともらしいが、混入物質並びに野生分離株とin vitro HIV細胞培養物間の前記の遺伝子型及び表現型の相違点のために、好ましくはない。
【０１５９】
そのうえ、タンパク質の化学合成は、種々のアミノ酸配列で実現することができる。
【０１６０】
ベクターの構築方法は当業者には周知である（例えば、米国特許第7,132,271号に例証されている）。例には、化学的にもしくは酵素的に合成されたDNA、ウイルスcDNAのフラグメント、または標的遺伝子を使うことがある。そのうえ、細胞培養物のトランスフェクションは、標準方法により、例えば、DEAEデキストラン法（McCutchen及びPagano）、リン酸カルシウム法（Grahamら）、または、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の他のあらゆる方法により実施される（Sambrookら）。不十分な複製または他の活性を有するトランスフェクタントが選択される。選択を容易にするために、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII、アンピシリン耐性またはG418耐性などのマーカー遺伝子が、アンチセンスまたは突然変異遺伝子を坦持するベクターに含まれていてもよい。マーカー遺伝子が含まれる場合、トランスフェクタントをマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性）の発現のために選択し、培養し、次に標的活性をアッセイしてよい。
【０１６１】
2種類以上のHIV株に同時感染した宿主では、異なるウイルスのヌクレオチドセグメントからなる循環組換え型が進化することが注目されてきた。それぞれがコードしている欠損タンパク質を補完して、1種または複数のその他の方法では生育不能バイロンを複製及び増殖させるタンパク質をコードする生育不能バイロンの共依存性も注目されている（Flintら、2004年、第20章）。二倍体である真核生物とHIVバイロン間には類似点が存在する。真核生物は核膜を有し、典型的には二倍数の染色体を有している。従って、1つの染色体にコードされている欠損タンパク質は、その相補的染色体が非欠損タンパク質をコードしていれば、生物の生存能に影響を与えないであろう。
【０１６２】
HIVは二倍体バイロン（一倍体である大半のウイルスとは異なる）であり、真核生物のように、RNA鎖のヌクレオチド配列は同一である必要はなく、多くの場合同一ではない。2種以上のHIV株が感染した細胞では、1つの株が、1種または複数の他の株がコードする欠損タンパク質を回避する複数の機会が存在する。細胞に感染する異なる株の数が増えるに従って、生育不能株の増殖する機会も増える。これにより、ウイルス変異がウイルス生存を保証することが一部説明される。
【０１６３】
本発明は、HIVウイルス進化の特徴である前記の現象に基づいている。1種または複数のタンパク質が欠損しているウイルスゲノムは、その欠損タンパク質が別の供給源から提供されると、生育可能になる。本発明の一実施形態では、複数のウイルス株が、前記のように、同一標的核酸配列が取り除かれることになる。
【０１６４】
条件付きで生存するバイロン作製の代替in vitro法は、組織培養物に、第1の条件付きで生存するバイロン及び、第1の条件付きで生存するバイロンからスプライスされた核酸配列を含む第2のバイロン（条件付きで生存しているまたはそうではない）を同時感染させる。これにより、ウイルス複製が可能になると考えられる。しかし、そのような培養物では組換え事象が起こり、潜在的に複製可能ベクターを出現させる可能性がある。
【０１６５】
Vpr、Vif、並びにVpx（及びHIV-2中のVpx）を含むいくつかのアクセサリーウイルスタンパク質が、無傷のバイロン内に存在する。これらのタンパク質は、1回または複数回のウイルス複製を維持することがあり、Vpr、Vif、Vpxまたはその組合せの核酸配列を欠損する条件付きで生存するバイロンにおける免疫記憶及びそれによる必然的な免疫を伴う適切なTh-1応答を生じるのに十分な量である可能性がある。欠損タンパク質の供給を使い果たすと、複製は休止する。従って、Vpr、Vif、Vpxまたはその組合せの核酸配列を欠損する条件付きで生存するバイロンは、一部の状況では外因性タンパク質の補充を必要とすることも必要としないこともある。ウイルスの複製サイクルの数は、最終的にはまだ欠損タンパク質の量及び半減期により調節され制御されるが、この方法では、外因的に添加されるタンパク質はどれも関与していない可能性がある。
【０１６６】
本発明の一実施形態では、vpr配列のノックアウトバイロンが、前記のように標的にされ取り除かれる。しかし、HIVウイルス粒子はそれぞれ約100コピーのVprタンパク質を同化するために、外因的に添加されるVprタンパク質は必要なことも必要でないこともある（Cohenら、第16章）。Vprタンパク質の供給を使い果たすと、ウイルス感染性、病原性、及び複製は重大に損なわれるであろう。健常宿主の無傷の免疫環境は、適切な応答を開始し、細胞内で複製するウイルスを根絶することになる。
【０１６７】
ワクチンまたは組成物を、純粋なもしくは実質的に純粋なバイロンと外因的に添加されるタンパク質として、または随意にアジュバンドもしくは他の組成物と共に製剤もしくは調製物として投与することが可能である。
【０１６８】
家畜使用でもヒト使用でも、本発明の実施において使用される製剤は、1種または複数の薬学的に許容可能な担体及び随意に他の治療成分と一緒に、前記のようなノックアウトバイロンと外因的に添加される複製タンパク質を含む。タンパク質担体は、製剤の他の成分と適合し、その受容者に有害ではないという意味で「薬学的に許容可能」でなければならない。タンパク質担体（例えば、補体タンパク質）のカップリングは薬理学内で公知である。
【０１６９】
望ましくは、製剤は、HIVバイロンが適合しないと知られている他の物質を含むべきではない。現在の薬理学標準に従って、方法は、条件付きで生存するバイロン及び外因的に添加される複製タンパク質を、1種または複数のアクセサリー成分を構成してもよい担体と共に会合させる段階を含む。注射による投与に適した製剤は、都合よくワクチンの無菌水溶液を含み、その溶液は好ましくは受容者の血液と等張である。そのような製剤は、薬学的に許容可能な無菌水溶液を生成するように調製してよい。
【０１７０】
本発明の一実施形態では、欠損タンパク質は、ペネトラチン、Tatタンパク質のフラグメント（アミノ酸48〜60）トランスポータント、シグナル配列ベースペプチド、アルギニンポリペプチド、pVEC及び/または両親媒性モデルペプチドなどの細胞貫通ペプチドに連結することになる。このようなカップリングは当業者には公知であり、標的欠損タンパク質の宿主細胞内への細胞膜通過を促進するであろう（Ulo Langel）。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明は、ユビキチン化タンパク質は、抗原のプロセッシング及びT細胞への提示を含むがこれらに限定されない種々の細胞機能と相関関係があるという知見に基づいている（Krauss）。外因的に添加されるタンパク質は、ポリユビキチン化することができる。プロテアソーム経路侵入を促進するために、無傷のバイロンもポリユビキチン化してよい。従って、外因的に供給されるウイルスタンパク質及び/または条件付きで生存するバイロンをユビキチンとコンジュゲートすると、外因的に添加されるタンパク質及び/または条件付きで生存するバイロンはプロテアソーム経路に導かれ、そのタンパク質及び/またはウイルスベクター上の1種または複数のエピトープに対するMCH-1ベースTh-1免疫応答が起きる。外因性タンパク質の一部がユビキチン化される実施形態は本発明の範囲内であり、例えば、外因性タンパク質の半分をユビキチン化してよい。
【０１７２】
切断された核酸配列に基づく代替実施形態
条件付きで生存するバイロンが作製される限り、配列切除及び連結のあらゆる可能な組合せが予測される。配列切除により損なわれるあらゆるアクセサリーまたは調節タンパク質を、外因的に提供して、ウイルス複製を細胞内で「正常な」しかし限定された形で進行させることができる。現在、HIV-1では15種の条件付きで生存するバイロン、HIV-2では15種の条件付きで生存するバイロンが記載されているが、これは純粋に例であって、この発明の範囲を限定するために利用されることを意図していない。
【０１７３】
例の目的で及び最も簡単な実施形態では、vif、vpr、tat（エキソン1）、vpu（HIV-1）、及びvpx（HIV-2）をコードする重複及び非重複ゲノム配列は、制限酵素を使って、個々にまたは別の配列と組み合わせて切除することができる。vifのpolとの重複セグメント、及びvpuのenvとの重複セグメントは取り除かれることはなく、これらの遺伝子及びその遺伝子がコードするタンパク質は無傷のままであると考えられる。このノックアウトシステムを利用して、無傷のバイロンカプセルに含まれていることも含まれないこともある5種の別々のタンパク質（Vif、Vpr、Tat（エキソン1）、Revエキソン1及びHIV-1中のVpuまたはHIV-2中のVpx）を外因的に適用することができる。
【０１７４】
代替の実施形態では、vprとの非重複tatエキソン1ゲノム配列を欠く免疫原性組成物が使われる。次に、エキソン1及び2にコードされる全Tatタンパク質は、免疫原性組成物またはワクチンの一部として外因的に供給される。tatエキソン1ヌクレオチド配列が取り除かれる任意の配合も、revエキソン1ヌクレオチド配列を取り除くことになる。大半のウイルス分離株では、Revエキソン1はtatエキソン1と完全に重複している。従って、2種のタンパク質、すなわちTat及びRevをウイルス組成物に添加する必要があると思われる。好ましくは、2種の別々のエキソンにコードされる全Tat及びRevタンパク質が添加されることになる。Tatエキソン2はrevエキソン2と完全に重複しており、両方がenvに完全に重複している。さらに別の実施形態では、revエキソン1ゲノム配列を欠く免疫原性組成物が切除され、エキソン1及び2にコードされた全Revタンパク質の他に全Tatタンパク質も外因的に供給することができるであろう。
【０１７５】
tatまたはrevエキソン1の3'末端とvpuタンパク質の5'末端間に位置するイントロン配列は、好ましくは、前記または下記のワクチンのいずれからでもスプライスされないと考えられる。HIV RNAゲノムの逆転写において重要なポリプリン経路は、このイントロン配列内に存在する。HIV-2では、類似の配列がvpxヌクレオチド配列の3'末端とvprヌクレオチド配列の5'末端の間に存在する。同様の形で、この配列を切り出すのは好ましくはないと考えられる。
【０１７６】
非重複遺伝子セグメントを1つだけ切除することにより、HIV-1の4種の別々の条件付きで生存するバイロン、及びHIV-2では4種の別々の条件付きで生存するバイロンを開発することができる。切断型損傷遺伝子にコードされたタンパク質は外因的に投与することができる。
【０１７７】
2種の非重複遺伝子セグメントを切除すれば、6種の可能な条件付きで生存するバイロンが可能になる。切除されたゲノムにコードされた複製タンパク質は外因的に供給することができる。2種の連続的タンパク質のゲノムを切除すれば、2種の重複セグメントも切除される可能性がある。これによって、ウイルス核酸配列の4回ではなく2回の「切断」が必要になるだけであり、さらに2回ではなく1回の再アニーリング過程が必要になるだけなので、設計及び製造の安全性並びに簡素さが増大すると考えられる。すなわち、非連続非重複遺伝子セグメントの切除であれば、通常、「切断」も再アニーリングもさらに多くの回数必要となるであろう。
【０１７８】
3種の非重複遺伝子セグメントを切除すれば、4種の可能な条件付きで生存するバイロンが生じる。切除されたゲノムにコードされたタンパク質は外因的に供給することができる。
【０１７９】
4種の非重複ゲノムセグメントすべてを切除することによって、1種の生バイロンが生じる。従って、HIV-1に関して15種の別々の条件付きで生存するバイロンを作製してよく、HIV-2に関して15種の別々の条件付きで生存するバイロンを作製してよい。以下の一覧表は、潜在的な組成物の部分的に及び/または完全に切除されたゲノム配列を描いている。
HIV-1：
vif
vpr
tatエキソン1
vpu
vif及びvpr
vif及びtatエキソン1
vif及びvpu
vpr及びtatエキソン1
vpr及びvpu
tatエキソン1及びvpu
vif、vpr及びtatエキソン1
vif、vpr及びvpu
vif、tatエキソン1及びvpu
vpr、tatエキソン1及びvpu
vif、vpr、tatエキソン1及びvpu
HIV-2
vif
vpr
tatエキソン1
vpx
vif及びvpr
vif及びtatエキソン1
vif及びvpx
vpr及びtatエキソン1
vpr及びvpx
tatエキソン1及びvpx
vif、vpr及びtatエキソン1
vif、vpr及びvpx
vif、tatエキソン1及びvpx
vpr、tatエキソン1及びvpx
vif、vpr、tatエキソン1及びvpx
【０１８０】
投与及びアジュバンド
免疫原性組成物またはワクチンは、赤血球媒介マイクロインジェクションを介して投与してよい。赤血球はin vitroでは低浸透圧溶液中で溶解する。ワクチンを前記溶液に添加する。赤血球細胞膜は、低浸透圧溶液中では非常に多孔質であり、細胞外環境由来の大きなタンパク質を細胞に入らせる（Dohertyら）。次に、赤血球を正常浸透圧の溶液（9%NaCl）に入れる。損傷した赤血球は隔離され、脾臓及び肝臓で分解される。両臓器中の抗原提示細胞、特に肝洞様毛細血管を裏打ちしているクッパー細胞は、異物を取り込み、それを適切なT細胞に提示する。
【０１８１】
ワクチン投与のための別の実施形態では、身体中免疫活性が最小である器官である無傷の表皮は、その障壁が破られたら、免疫系のエフェクター器官になりうる。ワクチン接種の2〜3日前に、ワクチンを受ける領域は機械的に剪毛され、表層擦過傷をつくる。これにより、負傷部位で隔離する自然免疫応答並びに獲得免疫応答の両方のエフェクター細胞及びタンパク質が始動し、ワクチンのために免疫応答を準備することになる。免疫抑制を誘発する紫外線への曝露は回避すべきである。ワクチンは、皮内経路により擦過表皮内に投与される。これにより、リンパ節構造に密接に類似する解剖学的に定義された階層的免疫応答が生じることになる。これは、本発明者による好ましいワクチン投与法である。
【０１８２】
ワクチン接種の好ましい領域は、大腿上内側部だと考えられる。この領域からのリンパ排液は、直接鼠径リンパ節に向かう。鼠径リンパ節の数は12から20まで変動があり、下肢からのリンパ液をろ過するだけではなく、外生殖器、会陰、殿部及び下部肛門管からのリンパ液もろ過する（Ben Pansky）。これらは、この疾患の性感染の最初のHIV感染及び伝播部位である。
【０１８３】
本発明は、ワクチンに対する免疫応答を促進することを目的とするアジュバンドまたは他の組成物を上のワクチン混合物すべてに添加してよいことをさらに企図している。そのようなアジュバンドは、好ましくは、前記混合物に結合する形である。そのような組成物には、少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類、タイコ酸、ザイモサン、クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜、プロタミン、ヘパリナーゼ、C3bの産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子、dCVFの形のコブラ毒因子、C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケル、または硫酸化ポリアニオンがあるが、これらに限定されない。これらのアジュバンドの運用は米国特許出願公開第20050112139号に以前記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれているものとする。例となる追加のアジュバンドは、
追加のアジュバンド
（a）ヒートショックタンパク質（HSP）：HSP90はいくつかの異なる細胞内タンパク質シャペロンと会合し、多量体タンパク質を形成する。HSP90の阻害剤は、細胞内病原体またはそのサブユニットを含む関連タンパク質の急速なユビキチン化及びプロテアソーム分解をもたらす（Hoffman、Ronald）。HSP60及びHSP70：マクロファージ及び樹状細胞などの免疫細胞を活性化する（Kaufmann、2004年、第13章）。
（b）フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインA：TLR4を介した認識により免疫細胞を活性化する。
（c）ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖：TLR4にも媒介された樹状細胞の活性化因子（Kaufmann、2004年、第13章）。
（d）ヘパリン硫酸塩の多糖類フラグメント：TLR4を介して樹状細胞の成熟を誘発する（Kaufmann、2004年、第13章）。
（e）フィブリノーゲン：TLR4を通じてマクロファージ内でのケモカイン産生を誘発する（Kaufmann、2004年、第13章）。
（f）リポ多糖類（LPS）：微生物成分中最も強力な免疫賦活剤（Kaufmann、2004年、第13章）。
（g）ホスホリルコリン（PC）：グラム陽性菌に存在する主要抗原構造。PCは自然IgM抗体の他にもCRP（C反応性タンパク質）が結合する。従って、PCは、補体系を活性化し、自然免疫応答を増強することができる。CRPのPCへの結合はカルシウム依存性である。PCの自然IgM抗体への結合はカルシウム依存性ではない。
（h）尿酸（UA）：アポトーシス、ネクローシス、または他の形の細胞死を受けているヒト細胞は、種々の非特異的危険シグナルを放出し、そのうちの1つは尿酸である。尿酸は樹状細胞成熟を刺激し、抗原に対するCD8 T細胞の応答性を増強する。UAは自然に存在する外因性アジュバンドである。ワクチンと合わせたUAの投与は、ワクチンの有効性を増強することになる。
（i）ワクチンのどちらかの成分に特異的なIgGI抗体及びIgGIII抗体（どちらかの成分）：ナチュラルキラー（NK）細胞は、IgGI及びIgGIIIに特異的なCD16またはFcγRIIIとして知られるFc受容体に特徴付けられる。ワクチンをこれらの抗体にコンジュゲートすることにより、NK細胞の抗体依存性細胞性細胞障害（ADCC）が増強されることになる（Parham、2003年、第7章）。これらの受容体も樹状細胞（DC）上に存在する。NK及びDC細胞は相互プライミングの過程を受け、樹状細胞の場合は、成熟はこの「掛け合い応答」の結果として起きる。DC細胞は自然及び獲得または適応免疫系間の架け橋である。従って、ワクチンに装着されたIgGI及びIgGIII抗体は、NK細胞及びDC細胞の応答を増強する他にも、潜在的病原体またはワクチンを処理する際にその協同作用を促進することにより、ワクチンをオプソニン化することになる（Ferlazzoら、Cooperら、Chiesaら）。
（j）補体タンパク質：種々の補体タンパク質、特にC3bは、それが結合している免疫原をオプソニン化する。これにより、自然及び適応免疫応答の両方は増強されることになる（Hoffmanら）。
【０１８４】
結論
免疫原性組成物の分析及び開発は、広範囲用量の不活化粒子を評価のために組み込むべきである。動物試験は、大きさ、種、及び、免疫学的特徴の相違点を考慮すべきであり、ヒトと動物の間には免疫学的相違点があるために、動物試験は毒性分析に委ねられることが予想されている。臨床試験では、少なくとも、小集団での安全性及び投与量から、数百人のボランティアの第2相での安全性及び免疫原性、大規模有効性相におよぶ標準的3相モデルを伴うことになる。臨床試験は、他の免疫抑制条件、妊娠、劇薬使用等の排除など慣例的な適切な排除基準を含むべきである。
【０１８５】
上に詳細に記載した投与経路に加えて、投与は、例えば、経口的に、経頬的に、経粘膜的に、舌下に、経鼻的に、直腸的に、膣的に、眼内に、筋肉内に、リンパ管内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、皮内に、腫瘍内に、局所的に、経肺的に、吸入により、注射により、または移植により等、種々の経路で実施してよい。多様な形の組成物には、制限なく、カプセル、ジェルキャップ、錠剤、腸溶カプセル、被包性粒子、粉末、坐薬、注射薬、軟膏、クリーム、移植物、パッチ、液体、吸入薬、または噴霧薬、全身性、局所的な、または他の経口媒体、溶液、懸濁液、点滴薬等があり得る。HIV感染の第1標的の一部は、皮膚、直腸、及び膣粘膜における上皮細胞並びにランゲルハンス細胞であるために、送達の好ましい実施形態は、直腸及び/または膣坐薬と組み合わせた皮膚送達である。HIVには、主に直腸及び膣性交により罹る。従って、ワクチンの直腸及び/または膣坐薬投与が、好ましい投与方法である。さらに、本発明は、自然の、組換えの、及び突然変異形、フラグメント、融合タンパク質、並びに他のサイトカインの類似物及び誘導体、混合物を含むサイトカインなどの他の治療薬、他の生理活性物質、及び製剤補助剤等と組み合わせてもよい。当業者は、注射のためには、リンゲル液または生理食塩水緩衝液などの水溶液製剤が適切であることを認識するであろう。リポソーム、乳濁液、及び溶剤は送達手段の別の例である。経口投与には、カプセル、錠剤、液体、丸薬等に適した、ショ糖、セルロース等などの担体が必要と考えられる。
【０１８６】
従って、結論として、本発明は、条件付きで生存するバイロンに基づいている。すなわち、他の方法では複製不能であるように改変されたバイロンを、ウイルスゲノム中のタンパク質をコードする対応するゲノム配列の改変（または欠失）のために利用できないそのタンパク質の代わりをする外因性タンパク質を添加すると、限られた時間複製可能にすることができる。ウイルスは、定義によれば、生きている構造体でも死んでいる構造体でもない。ウイルスは、複製可能であるか複製不能であるとして、最もよく特徴付けられる。本発明では、生きたウイルスとは複製可能ベクターのことである。本発明の一態様は、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、ウイルスDNAまたはRNAを複製不能にするように改変されている、完全なウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNAを含む免疫原性組成物である。次に、この改変されたウイルスDNAまたはRNAは無細胞発現系で自己組織化するウイルスタンパク質に被包され、条件付きで生存するバイロンを形成する。この条件付きで生存するバイロンの作製方法は、完全なゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子を提供する段階、前記ウイルスDNAまたはRNAを増幅する段階、前記ウイルスDNAまたはRNAの、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAを改変する段階、増幅され改変されたウイルスDNAまたはRNAを回収する段階、回収したDNAまたはRNAを、ウイルス粒子の自己組織化に適した無細胞発現系において再パッケージする段階、及びこうして得られた条件付きで生存するバイロンの所望の量を回収する段階を含む。この条件付きで生存するバイロンの代替作製方法は、従来の細胞培養系を使うことである。この方法では、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAを改変されたバイロンは、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する外因性タンパク質の添加と共に、ウイルス複製に適した条件下で培養してよい。従って、本発明の第4の態様は、複製不能バイロンを、全成分ウイルスタンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、またはその組合せと組み合わせて使ってワクチンを配合することである。いずれかの方法で作製されたワクチンは、1）全成分無傷複製不能ウイルス；2）タンパク質補充物の添加により一時的に蘇生する条件付きで生存するバイロン；及び3）それ自体サブユニットワクチンとして作用するタンパク質補充物；により誘発される3相の免疫特性を有することになる。無細胞系で作製された条件付きで生存するバイロンで配合されたワクチンの追加の特徴は、投与された時に、ワクチンの誘発された免疫原性応答に寄与するベクターが存在しないことである。
【０１８７】
前記の例は、見本となる実施形態と見なすべきであり、決して本発明を限定するものではない。従って、上の記載は特定の実施形態に言及してはいるが、その精神から逸脱することなく多くの改変を加えてよいことは理解されるであろう。
【０１８８】
（参考文献）
2009518046.tif 000003
2009518046.tif 000004
2009518046.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】HIV遺伝子のコード配列を白い長方形として描いたHIV-1の線形ゲノムの概略図である。
【図２】HIV遺伝子のコード配列を白い長方形として描いたHIV-2の線形ゲノムの概略図である。
【図１】
2009518046.tif 000006
【図２】
2009518046.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月25日(2008.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子を提供する段階と、
b.前記ウイルスDNAまたはRNAを増幅する段階と、
c.前記ウイルスDNAまたはRNAを、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAにおいて改変する段階と、
d.増幅され改変されたウイルスDNAまたはRNAを回収する段階と、
e.前記回収したウイルスDNAまたはRNA及びウイルス成分を無細胞培養液に添加して、ウイルス粒子の条件付きで生存するビリオンとしての自己組織化に適した細胞及びベクターを用いない発現系を形成する段階と、
f.少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンを回収する段階と
を含む、少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンの作製方法。
【請求項２】
前記条件付きで生存するビリオンが、ウイルスDNAまたはRNAの改変を欠く対応するビリオンに比べて複製能力を欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスゲノムがHIVウイルスゲノムである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを配合する段階と、前記ウイルスワクチンに、前記少なくとも1種の改変した複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する所定量の外因性複製タンパク質を添加し、それによって前記少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンの限定された複製を可能にする段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、前記ウイルスワクチンに、前記改変した複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当し、前記少なくとも1種の改変した複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAの生物活性のあるフラグメントまたは誘導体である、所定量の外因性複製タンパク質を添加し、それによって前記少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンの限定された複製が可能となる段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、薬学的に許容可能な担体を添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドを添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類、タイコ酸、ザイモサン、クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜、プロタミン、ヘパリナーゼ、C3bの産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子、dCVFの形のコブラ毒因子、C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケル、硫酸化ポリアニオン、ヒートショックタンパク質、フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインA、ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖、硫酸ヘパリンの多糖類フラグメント、フィブリノーゲン、リポ多糖類、ホスホリルコリン、尿酸、IgGI及びIgGIII抗体、補体タンパク質、並びにその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドを添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記回収した少なくとも1種の条件付きで生存するビリオンからウイルスワクチンを調製する段階と、薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドを添加する段階とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、無傷の宿主のHIV感染組織から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記完全なウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
a.少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、ウイルスDNAまたはRNA複製を不能にするように改変されている、ウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNA；
を含み、
b.前記ウイルスDNAまたはRNAが、細胞及びベクターを用いない発現系において自己組織化するウイルスタンパク質によって被包されて、条件付きで生存するバイロンを形成する；
細胞及びベクターを含まない免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記条件付きで生存するバイロンが、ウイルスDNAまたはRNAの改変を欠く対応するバイロンに比べて複製能力を欠損している、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスゲノムがHIVウイルスゲノムである、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
ワクチンとして配合される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも1種の改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する所定量の外因性複製タンパク質と組み合わせてワクチンとして配合され、それによって、複製に適した条件の系に投与すると、条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも1種の改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当し、前記改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAの生物活性のあるフラグメントまたは誘導体である、所定量の外因性複製タンパク質と組み合わせてワクチンとして配合され、それによって、複製に適した条件の系に投与すると、条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
薬学的に許容可能な担体と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
タイコ酸と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
ザイモサンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
プロタミンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
ヘパリナーゼと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
C3の産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
dCVFの形のコブラ毒因子と組み合わせた請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケルと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
硫酸化ポリアニオンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
ヒートショックタンパク質と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインAと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
硫酸ヘパリンの多糖類フラグメントと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
フィブリノーゲンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
リポ多糖類と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
ホスホリルコリンと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
尿酸と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
IgGI及びIgGIII抗体と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
補体タンパク質と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
前記ウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染組織から単離される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
前記ウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
前記ウイルスゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子が、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
前記改変された少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
経口的に、経頬的に、経粘膜的に、舌下に、経鼻的に、直腸に、膣内に、眼内に、筋肉内に、リンパ管内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、皮内に、腫瘍内に、局所的に、経肺的に、吸入により、注射により、または移植により投与される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
a.ウイルス複製に適した条件下で、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子に改変を有する少なくとも1種のHIVバイロンの存在下で細胞を培養して、条件付きで生存するバイロンを形成する段階と、
b.前記改変を有する前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する外因性複製タンパク質を添加し、前記培養における前記バイロンの複製を促進して、薬学的に許容可能な量の複製不能なバイロンを作製する段階と、
c.前記複製不能なバイロンを精製し回収する段階と、
d.前記改変を有する前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子に相当する所定量の複製タンパク質で前記複製不能なバイロンを配合し、それによって、複製に適した条件の系に投与すると、前記条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする段階と
を含む、細胞及びベクターを含まないウイルスワクチンの作製方法。
【請求項５０】
前記条件付きで生存するバイロンが、ウイルスDNAまたはRNAの改変を欠く対応するバイロンに対して複製能力を欠損している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する前記所定量の外因性複製タンパク質が、前記改変された複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAの生物活性のあるフラグメントまたは誘導体であり、それによって、少なくとも1種の条件付きで生存するバイロンの限定された複製を可能にする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスワクチンが、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルスワクチンが、少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルスワクチンが、少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類、タイコ酸、ザイモサン、クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜、プロタミン、ヘパリナーゼ、C3bの産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子、dCVFの形のコブラ毒因子、C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケル、硫酸化ポリアニオン、ヒートショックタンパク質、フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインA、ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖、硫酸ヘパリンの多糖類フラグメント、フィブリノーゲン、リポ多糖類、ホスホリルコリン、尿酸、IgGI及びIgGIII抗体、補体タンパク質、並びにその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ウイルスワクチンが、薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせて配合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも1種のHIVバイロンが、無傷の宿主のHIV感染組織から単離される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも1種のHIVバイロンが、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも1種のHIVバイロンが、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
a.少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに改変を有し、条件付きで生存するバイロンを形成し、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAにおける前記改変に相当する外因的に添加されたタンパク質を含むウイルス複製に適した条件下で培養されるHIVバイロンと、
b.改変を有する前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当し、完全タンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、及びその組合せからなる群から選択される生物活性のあるタンパク質と
を含む、細胞及びベクターを含まない免疫原性組成物。
【請求項６１】
前記条件付きで生存するバイロンが、対応する無改変HIVバイロンと比べて複製を欠損している、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
前記HIVバイロンが、HIV感染組織から単離される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
前記HIVバイロンが、HIV感染精液組織、膣組織、及び直腸組織からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
前記HIVバイロンが、HIV感染精液、膣液、及び直腸液からなる群から選択され、無傷の宿主から単離される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
前記改変された少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、タンパク質Vif、Vpr、Vpu、Tatエクソン1、Vpx及びその組合せに相当する配列からなる配列から選択される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
ワクチンとして配合される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
薬学的に許容可能な担体と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
少なくとも1分子のマンノースで構成された多糖類と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
タイコ酸と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
ザイモサンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
クリプトコッカスネオフォルマンス血清型Cの多糖類莢膜と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
プロタミンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
ヘパリナーゼと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
C3の産生を増強するように適合させた形のコブラ毒因子と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
dCVFの形のコブラ毒因子と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
C3転換酵素活性を増強するように適合させた形のニッケルと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
硫酸化ポリアニオンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
ヒートショックタンパク質と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
フィブロネクチンのIII型反復エクストラドメインAと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
ヒアルロン酸の低分子量オリゴ糖と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
硫酸ヘパリンの多糖類フラグメントと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
フィブリノーゲンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
リポ多糖類と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
ホスホリルコリンと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
尿酸と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
IgGI及びIgGIII抗体と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８８】
補体タンパク質と組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８９】
薬学的に許容可能な担体及び少なくとも1種の薬学的に許容可能なアジュバンドと組み合わせた、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項９０】
経口的に、経頬的に、経粘膜的に、舌下に、経鼻的に、直腸に、膣内に、眼内に、筋肉内に、リンパ管内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、皮内に、腫瘍内に、局所的に、経肺的に、吸入により、注射により、または移植により投与される、請求項６０に記載の免疫原性組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
序論
本発明は、条件付きで生存するバイロンに基づいている。すなわち、他の方法では複製不能であるように改変されたバイロンは、ウイルスゲノムの中でそのタンパク質をコードする対応する遺伝子配列の改変（または欠失）のために利用できないタンパク質の代わりをする外因性タンパク質が添加されると、限られた時間複製可能となり得る。定義によるウイルスは、生きた構造物でも死んだ構造物でもない。定義によるウイルスは、複製可能であるまたは複製不能であるとして最もよく特徴付けられる。本発明では、生きたウイルスとは複製可能なベクターのことである。本発明の一態様は、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが、ウイルスDNAまたはRNAを複製不能にするように改変されており、次に、この改変されたウイルスDNAまたはRNAが、細胞及びベクターを用いない発現系において自己組織化するウイルスタンパク質に被包されて、条件付きで生存するバイロンを形成する、完全なウイルスゲノムを表すウイルスDNAまたはRNAを含む免疫原性組成物である。この条件付きで生存するバイロンを作製するための方法は、完全なゲノムを表す少なくとも1種のウイルスDNAまたはRNA分子を提供する段階と、前記ウイルスDNAまたはRNAを増幅する段階と、前記ウイルスDNAまたはRNAを、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAにおいて改変する段階と、増幅され改変されたウイルスDNAまたはRNAを回収する段階と、前記回収したDNAまたはRNA及びウイルス成分を無細胞培養液に添加して、ウイルス粒子の自己組織化に適した無細胞発現系を形成する段階と、こうして得られる条件付きで生存するビリオンの所望する量を回収する段階とを含む。この条件付きで生存するバイロンを作製するための代替方法は、従来の細胞培養系を使うことである。この方法では、少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAが改変されたバイロンは、前記少なくとも1種の複製タンパク質遺伝子または対応するmRNAに相当する外因性タンパク質を添加して、ウイルス複製に適した条件下で培養してもよい。従って、本発明の第4の態様は、全成分ウイルスタンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、またはその組合せと組み合わせて、複製不能なバイロンを使ってワクチンを配合することである。いずれの方法で作製したワクチンも、1）全成分無傷複製不能ウイルス；2）タンパク質補充物の添加により一時的に蘇生される条件付きで生存するバイロン；及び3）サブユニットワクチンとして作用するタンパク質補充物それ自体；により誘発される3相の免疫特性を有することになる。無細胞系で作製される条件付きで生存するバイロンで配合されるワクチンの追加の特徴は、投与されるとワクチンの誘発された免疫原性応答に寄与するベクターは存在しないことである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
条件付きで生存するバイロンの会合
改変後のウイルスDNAまたはRNA（例えば、指定された配列の切除、他の突然変異など）は、再パッケージされなければならない。これは、細胞及びベクターを用いない発現系/培養液または細胞培養物で実現することができる。in vitro及びin vivoの無傷のバイロン内で、細胞膜とのウイルス融合の前に、逆転写の過程が起こり始める。サブウイルス粒子内で、ウイルスRNAが、カプシドコア領域に含まれる逆転写酵素により逆転写される。従って、DNA、RNAまたは両方は、ウイルス粒子会合のための開始点になりうる（Flintら、2004年、第4章及びApp.A）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
バイロン会合に必要な一般的に「ウイルス成分」と呼ばれる構造、酵素、及びアクセサリー遺伝子の産物は、in vitroで作製することができる。一般的なレトロウイルスベクター（RV）を使う遺伝子導入は、遺伝子形質導入の十分に裏付けされた方法である。5'及び3'LTRの両方、パッケージングシグナル部位（ψ部位）、及びポリプリン経路を使って、遺伝子ベクターを酵母、大腸菌などの細胞培養物またはHeLaなどの連続細胞株に導入することができる（Michael、1998年、第24章）。1種または複数のマーカータンパク質をコードする遺伝子配列を、外来遺伝子としてレトロウイルスベクターに含むことができる。ヌクレオカプシド（p7）、p6、カプシド、マトリックス、gp41及びgp120構造タンパク質は、遺伝子導入によって細胞培養物で産生し、分割することができる。同様に、無傷のバイロン中に含まれるレトロウイルス酵素及びアクセサリータンパク質のゲノム配列を細胞培養物に導入し、分割することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
前記の実施形態では、細胞及びベクターを用いない系を利用することができる。従って、エンベロープはウイルス構造の一部にはならない。エンベロープは、バイロン会合の後、及び細胞膜の細胞質側での出芽前に獲得される。
【国際調査報告】
2009518046.tif 000008