(57)【要約】  本発明は、胎盤幹細胞からグリア細胞及びオリゴデンドロサイトを産生するための方法及び組成物を提供する。本発明は、例えば中枢神経系（CNS）の外傷、虚血及び変性障害の治療及び介入における、特に多発性硬化症などの脱髄疾患の治療における、これらのグリア細胞及びオリゴデンドロサイトの使用を更に提供する。【選択図】図１
2009511058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴデンドロサイトを産生する方法であって、胎盤由来幹細胞を、前記幹細胞がオリゴデンドロサイトの特徴を示すのに十分な条件下及び時間で培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記特徴が、ミエリンオリゴデンドロサイト特異的タンパク質の産生又はミエリンオリゴデンドロサイト特異的タンパク質をコードする遺伝子の発現である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記培養が、前記幹細胞をイソブチルメチルキサンチン（IBMX）と接触させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
請求項1記載の方法によって産生されるオリゴデンドロサイト。
【請求項５】
異常な髄鞘形成と関連する疾患、障害又は状態を有する対象を治療する方法であって、請求項4記載のオリゴデンドロサイトを前記対象に導入することを含む、前記方法。
【請求項６】
前記疾患、障害又は状態が多発性硬化症である、請求項5記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1.技術分野）
本発明は、胎盤由来幹細胞（以下PDSCという）からグリア細胞及びオリゴデンドロサイトを産生するための方法並びに組成物を提供する。本発明は、例えば中枢神経系（CNS）の外傷、虚血及び変性障害の治療及び介入における、これらのグリア細胞及びオリゴデンドロサイトの使用を更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
（2. 発明の背景）
CNSグリアを産生することができる胚性幹細胞は、脊髄に対する外傷後の機能回復を促進することができ、多発性硬化症などの脱髄性及び異常髄鞘形成疾患を修復する可能性を有する。しかし、臨床療法のための胚幹細胞の使用は、容易に対処できない倫理的懸念を提起する。
また、体細胞幹細胞も、治療適用のために提唱されてきた。例えば 細胞補充療法の動物モデルにおいて、移植された幹細胞の治療可能性は、倫理的に許容し得る自己幹細胞の供与源が利用できる場合、並びに幹細胞の特定の細胞タイプへの成熟をプログラムする自己更新及び運命決定の制御が達成される場合に、臨床用途につなげることができるだけである 。
【０００３】
神経変性障害は、ますます有意な罹患率及び死亡率の原因となっている。ミエリンの破壊は、若年成人において、最も一般的な神経疾患の多発性硬化症の根底をなし、ミエリンは、外傷性脊椎損傷後の修復に影響を及ぼして、ダメージを受けたニューロンの軸索の再生を防げ、また近位の損傷を受けていない軸索における電気伝導に影響を及ぼす。従って、オリゴデンドロサイトの置換は、有意な臨床目標である。オリゴデンドロサイトは、神経幹細胞から得られるが、このような幹細胞は、得るのが難しい 。
【０００４】
（3．本発明の要旨）
本発明は、胎盤由来幹細胞からオリゴデンドロサイトを産生するための方法及び組成物、並びにこのようなオリゴデンドロサイトを、中枢神経系の外傷、虚血若しくは全身性障害を含むものなどの疾患、障害又は状態を治療するために使用する方法を提供する。例えば、一つの態様において、本発明は、異常な髄鞘形成と関連した疾患、障害又は状態の治療における胎盤由来幹細胞から産生されるオリゴデンドロサイトの使用に関する。一つの実施態様において、本発明は、 オリゴデンドロサイトを産生する方法であって、胎盤由来幹細胞を、前記幹細胞がオリゴデンドロサイトの特徴を示す条件下及び十分な時間で培養することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記特徴は、ミエリンオリゴデンドロサイト特異的タンパク質の産生又はミエリンオリゴデンドロサイト特異的タンパク質をコードする遺伝子の発現である。別の特定の実施態様において、前記培養は、前記幹細胞をイソブチルメチルキサンチン（IBMX）と接触させることを含む。別の実施態様において、本発明は、胎盤由来幹細胞の分化によって産生されるオリゴデンドロサイトを提供する。また、本発明は、異常な髄鞘形成と関連する疾患、障害又は状態を有する対象を治療する方法であって、前記対象内にこのようなオリゴデンドロサイトを導入することを含む、前記方法を提供する 。より具体的実施態様において、疾患、障害又は状態は、多発性硬化症である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（5．発明の詳細な記述）
（5.1オリゴデンドロサイトの産生）
本発明は、胎盤由来細胞、特に胎盤幹細胞（胎盤由来幹細胞（PDSC）という）からオリゴデンドロサイトを産生するための方法及び組成物を提供する。幹細胞は、灌流によって哺乳動物胎盤から得てもよい（例えば、Haririの文献、米国出願公開第2002/0123141号及び第2003/0032179号を参照されたく、これらは、その全体が本明細書に組み込まれている）。また、幹細胞は、胎盤又はその一部の破壊（例えば、解離）によって胎盤から得てもよい（例えば、第6.2節を参照されたい）。オリゴデンドロサイトの特徴を示す細胞は、胎盤由来幹細胞から得てもよい。これらの細胞は、例えば多発性硬化症などの脱髄又は髄鞘発育不全と関連した疾患治療、障害又は状態に有用である。
【０００６】
一つの実施態様において、幹細胞などの分化可能な細胞は、以下の通りに胎盤から得てもよい。単核細胞（MNC）の初代培養を胎盤、例えばヒト胎盤灌流液から単離する。胎盤は、ドナーのインフォームドコンセントの下で、正期産児の出生後に得られる。簡単には、臍血管をカニューレ処置し、次いで 流速制御された回路につなぎ、胎盤を、例えば高グルコース、1%ヘパリン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ修正イーグル培地（DMEM、Gibco／BRL社）で1mL/分（室温、24時間まで）にて灌流する。次いで、胎盤灌流液（750mL）をプールし、遠心し、そして細胞ペレットを1%ウシ胎児血清（FBS）を含むPBSに再懸濁し、次いでLymphoprep(商標)（Gibco／BRL社）を介して差動的勾配密度遠心分離によって分離する。接着性PDSCを含む 単核細胞を含有するバフィーコート界面を回収して、DMEM/10% FBSに再懸濁し、フィブロネクチンコート（Sigma社）ファルコンプレートにまいて、5%の加湿したCO2を用いて37℃でインキュベートする。24時間のインキュベーション後、非接着性細胞を廃棄し、接着細胞を新鮮な培地にて維持して、増殖させ；個々の細胞コロニーが10〜18日の間に発生して、該コロニーをPDSC株として増殖させる。
【０００７】
ヒト胎盤由来幹細胞（PDSC）は、培養において線維芽細胞様の形態を示し（図2a）、かつHLA-クラスI陽性である。FACS解析を使用すると、これらの細胞は、造血マーカーCD34又はCD45のいずれをも発現しない。しかし、これらは、多分化能表面マーカーCD10（CALLA）、CD29（β1インテグリン）、CD54（ICAM-1）、CD90（Thy-1）並びにSH2及びSH3を発現する。標準的な増殖条件下で、PDSCについての倍加時間は、18〜36時間であり、細胞は、インビトロでの40回を超える集団倍加の間、この表現型を維持する。
【０００８】
多数の研究が、胚性、造血性及び骨髄間質細胞を含むインビトロ及びインビボでの幹細胞の神経分化を記述してきた（Glaserらの論文、FASEB J. 2005 19（1）：112-4 (2005);Rogisterらの論文、Cellular Neuroscience 14:287-300 (1999);Rao及びMayerProschelの論文、, Dev. Biol. 188：48-63（1997）;Andersonの論文、Neuron 30：19-35（2001）;Raoの論文、Stem Cells and Development 13:452-455 (2004);
Hermansonらの論文、Nature 419：934-939(2002);Joheらの論文、Genes Dev. 10：
3129-3140(1996))。
【０００９】
インビトロにおける神経分化は、細胞内cAMPを上昇させる薬剤を使用して促進させることができる。ヒト胎盤に由来する細胞が神経系統を産生することができるかどうかを決定するために、該細胞を同様のインビトロ条件下で調べた。単層PDSCを収集し（0.25%トリプシン、1mM EDTA）、次いで0.5mM IBMX（Sigma社）を含む培地に再びまいて（5×103/mL）、24〜72時間後に位相差顕微鏡観察、免疫蛍光法及びフローサイトメトリーによって形態の変化をモニターした。培養の3日後、細胞のおよそ50%が長い突起及び明白な球面細胞細胞体をもつ神経様の形態を有したが、一方、対照培養は、未分化を維持した。また、IBMX処理した培養物は、神経前駆体マーカー（ネスチン、ビメンチン、GFAP）、ニューロンマーカー（エノラーゼ、神経フィラメント）を含む多数の神経上皮系統マーカー及びグリアマーカー（MOSP）を示した細胞に対して免疫反応性を示した（図2）。神経抗原発現の一過性プロフィールを決定するために、フローサイトメトリーを処置PDSC及び無処置PDSCの両方で行った。抗原発現の明白な変化は、1日後にIBMXで試験したすべてのマーカーについて明らかであったが、無処置細胞では変化なかった。従って、これらの誘導条件下で観察される変化は、選択的濃縮又は生存よりむしろ、神経分化と一致して、抗原マーカーの迅速獲得を反映する。
【００１０】
胎盤由来幹細胞は、IBMX、神経幹細胞成熟因子（例えば、EGF、FGF）及び／又はオリゴデンドロサイト前駆体細胞分裂促進因子（例えば、FGF、PDGF）を含む培地中で培養することによってオリゴデンドロサイトに分化し得る。オリゴデンドロサイトは、上記の通りに胎盤由来幹細胞から産生すること、並びに第6.1節に記載されているように維持され、又は培養することができる。オリゴデンドロサイト分化は、第6.3節に記載されているような免疫組織化学及びPCR、並びに第6.5節に記載されているようなフローサイトメトリーを使用して評価することができる。オリゴデンドロサイト増殖、遊走及び生存は、第6.4節に記載されているように評価することができる。
【００１１】
（5.2 胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団）
本発明の免疫抑制の方法では、（1）組織培養基体に付着し；（2）非胎盤細胞型に分化する能力を有し；及び（3）十分な数において、検出可能に免疫機能、例えば混合リンパ球反応アッセイ法におけるCD4+及び／又はCD8+幹細胞の増殖を抑制する能力を有する胎盤幹細胞、すなわち胎盤又はその一部から得られる幹細胞を使用する。胎盤幹細胞は、血液、例えば胎盤血又は臍帯血に由来しない。本発明の方法及び組成物に使用される胎盤幹細胞は、個体の免疫系を抑制する能力を有し、かつ個体の免疫系を抑制するそれらの能力について選択される。
【００１２】
胎盤幹細胞は、胎児又は母性起源のいずれかであることができる（すなわち、母又は胎児の遺伝子型を有することができる）。胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、起源が胎児のみ若しくは母性のみである胎盤幹細胞を含むことができ、又は胎児及び母性起源の両方の混合された胎盤幹細胞の集団を含むことができる。胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、形態、マーカー、及び下記で論議する培養特性によって同定及び選択することができる。
【００１３】
（5.2.1 物理的及び形態学的な特徴）
本発明に使用される胎盤幹細胞は、初代培養において、又は細胞培養において培養されたときに、組織培養基体、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に付着する。培養における胎盤幹細胞は、一般に、多数の細胞質プロセスを有する、線維芽細胞様、すなわち星状の外見であることが想定され、中心細胞体から増殖する。しかし、胎盤幹細胞は、線維芽細胞が示すよりも多数のこのようなプロセスを示すので、胎盤幹細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞から形態的に区別可能である。また、形態的に、胎盤幹細胞は、造血幹細胞から区別可能であり、これは、一般に培養においてより丸いか、又は丸石の形態であることが想定される。
【００１４】
（5.2.2 細胞表面、分子、及び遺伝子マーカー）
本発明の方法及び組成物に有用な胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞の集団は、幹細胞若しくは幹細胞を含む細胞の集団を、同定及び／又は単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。本発明の胎盤幹細胞及び幹細胞集団（すなわち2つ以上の胎盤幹細胞）は、胎盤又はその任意の部分（例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤子葉、その他）から直接得られた幹細胞及び幹細胞含有細胞集団を含む。また、胎盤幹細胞集団には、培養における胎盤幹細胞の集団（すなわち2つ以上）及び容器、例えばバッグにおける集団を含む。しかし、胎盤幹細胞は、栄養膜ではない。
【００１５】
胎盤幹細胞は、一般にマーカーCD73、CD105、CD200、HLA-G及び／又はOCT-4を発現し、かつCD34、CD38又はCD45のいずれをも発現しない。また、胎盤幹細胞は、HLA-ABC（MHC-1）及びHLA-DRを発現し得る。これらのマーカーは、胎盤幹細胞を同定し、その他の幹細胞タイプから胎盤幹細胞を区別するために使用することができる。胎盤幹細胞は、CD73及びCD105を発現し得るので、これらは、間充織幹細胞様の特徴を有し得る。しかし、胎盤幹細胞は、胎児特異的マーカーのCD200及びHLA-Gを発現し得るので、これらは、CD200もHLA-Gも発現しない間充織幹細胞、例えば骨髄由来間充織幹細胞から区別することができる。同様に、CD34、CD38及び／又はCD45の発現の欠如により、非造血幹細胞として胎盤幹細胞を同定する。
【００１６】
一つの実施態様において、本発明は、CD200+、HLA-G+である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。単離された集団の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD73+及びCD105+である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-又はCD45-である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別の実施態様において、前記単離された集団は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに、1つ以上の胚様体様体を産生する。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、CD73+、CD105+、CD200+である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。前記集団の具体的実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-及びHLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記細胞集団は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに、1つ以上の胚様体様体を産生する。
【００１８】
また、本発明は、CD200+、OCT-4+である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-及びCD45-である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である。別の具体的実施態様において、集団は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに、1つ以上の胚様体様体を産生する。
【００１９】
また、本発明は、CD73+、CD105+及びHLA-G+である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。上記の複数の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またOCT-4+である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD200+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である。
【００２０】
また、本発明は、CD73+、CD105+幹細胞である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、前記複数は、胚様体様体の形成が可能な条件下で1つ以上の胚様体様体を形成し、かつ前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する、前記細胞集団を提供する。具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またCD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、またOCT-4+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、またOCT-4+、CD34-、CD38-及びCD45-である。
【００２１】
また、本発明は、OCT4+幹細胞である複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団であって、前記集団は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに、1つ以上の胚様体様体を形成し、かつ前記複数は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する前記細胞集団を提供する。種々の実施態様において、前記単離された胎盤細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95% OCT4+幹細胞である。上記集団の具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD73+及びCD105+である。別の特定の実施態様において、前記幹細胞は、CD34-、CD38-又はCD45-である。別の具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD200+である。より具体的実施態様において、前記幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である。別の具体的実施態様において、前記集団は、増殖され、例えば少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回又は少なくとも20回継代されている。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-及びCD133-である、複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を含む単離された細胞集団を提供する。
【００２３】
上述の胎盤幹細胞の具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、IL-6、IL-8及び単球化学誘引物質タンパク質（MCP-1）を恒常的に分泌する。
上述した複数の胎盤幹細胞のそれぞれは、哺乳動物胎盤から直接得られて単離された胎盤幹細胞、若しくは培養されて少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30回以上継代された胎盤幹細胞、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
上記の免疫抑制性の複数の胎盤幹細胞には、約、少なくとも、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれ以下、若しくはそれより多い胎盤幹細胞を含むことができる。
【００２４】
（5.2.3 胎盤幹細胞集団の選択及び産生）
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD200+、HLA-G+胎盤幹細胞であり、かつ前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤細胞の集団を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、またCD73+及びCD105+である幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択することは、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに、1つ以上の胚様体様体を形成する複数の胎盤幹細胞を選択することも含む。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD73+、CD105+、CD200+胎盤幹細胞であり、かつ前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する複数の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、またHLA-G+である幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-及びHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、加えて、胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに1つ以上の胚様体様体を産生する胎盤細胞の集団を選択することを含む。
【００２６】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD200+、OCT-4+胎盤幹細胞であり、かつ前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する複数の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、またCD73+及びCD105+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の特定の実施態様において、前記選択は、またHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００２７】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD73+、CD 105+及びHLA-G+胎盤幹細胞であり、かつ前記胎盤幹細胞は、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ法においてT細胞増殖を検出可能に抑制する複数の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD200+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００２８】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%がCD73+、CD105+胎盤幹細胞であり、かつ前記複数は、胚様体様体の形成が可能な条件下で1つ以上の胚様体様体を形成する複数の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またOCT-4+である胎盤幹細胞を選択することを含む。より具体的実施態様において、前記選択は、またOCT-4+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００２９】
別の実施態様において、本発明は、また、複数の胎盤細胞から複数の免疫抑制性胎盤幹細胞を選択する方法であって、前記単離胎盤細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%がOCT4+幹細胞であり、かつ前記複数は、胚様体様体の形成が可能な条件下で1つ以上の胚様体様体を形成する複数の胎盤細胞を選択することを含む、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記選択は、またCD73+及びCD105+である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD34-、CD38-又はCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。別の具体的実施態様において、前記選択は、またCD200+である胎盤幹細胞を選択することを含む。より具体的実施態様において、前記選択は、またCD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤幹細胞を選択することを含む。
【００３０】
また、本発明は、免疫抑制性集団又は複数の胎盤幹細胞を産生する方法を提供する。例えば、本発明は、任意の上記複数の胎盤幹細胞を選択すること、及びその他の細胞、例えばその他の胎盤細胞から複数の胎盤幹細胞を単離することを含む、細胞集団を産生する前記方法を提供する。具体的実施態様において、本発明は、前記胎盤細胞が（a）基体に付着し、（b）CD200及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105及びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか、又はCD73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し；並びに（c）MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団産生方法を提供する。
【００３１】
より具体的実施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD200及びHLA-Gを発現し、及び（c）MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団産生方法を提供する。別の具体的実施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びCD200を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団産生方法を提供する。別の具体的実施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD200及びOCT-4を発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団産生方法を提供する。別の具体的実施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD73及びCD105を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに胚様体様体を形成し、並びに（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団産生方法を提供する。別の具体的実施態様において、本発明は、（a）基体に付着し、（b）CD73、CD105及びHLA-Gを発現し、及び（c）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団産生方法を提供する。（a）基体に付着し、（b）OCT-4を発現し、（c）胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されたときに胚様体様体を形成し、並びに（d）MLRにおいてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制する胎盤幹細胞を選択すること；並びに、その他の細胞から前記胎盤幹細胞を単離して細胞集団を形成することを含む細胞集団を産生する方法。
【００３２】
免疫抑制性胎盤幹細胞集団を産生する方法の具体的実施態様において、前記T細胞及び前記胎盤細胞は、前記MLRにおいて約5：1の比で存在する。本方法に使用される胎盤細胞は、胎盤全体に、又は主に羊膜に、又は羊膜及び絨毛膜に由来することができる。別の具体的実施態様において、胎盤細胞は、前記胎盤細胞の非存在下での前記MLRにおけるT細胞増殖の量と比較して、前記MLRにおいて少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%又は少なくとも95%までCD4+又はCD8+T細胞増殖を抑制する。加えて、本方法は、免疫調節、例えばその他の免疫細胞の活性、例えばナチュラルキラー（NK）細胞の活性の抑制ができる胎盤幹細胞集団の選択及び／又は産生を含むことができる。
【００３３】
（5.2.4 培養における増殖）
本明細書に記述した胎盤幹細胞の増殖は、任意の哺乳動物細胞についてと同様に、部分的には増殖のために選択される特定の培地に依存する。最適条件下において、胎盤幹細胞は、典型的には3〜5日で数が二倍になる。培養の間に、本発明の胎盤幹細胞は、培養における基体、例えば組培養織容器の表層、（例えば、組織培養ディッシュプラスチック、フィブロネクチンコートしたプラスチック、その他）に付着して、単層を形成する。
【００３４】
本発明の胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養されたときに、胚様体様体を形成し、すなわち細胞の三次元クラスターが接着性幹細胞層の上に成長する。胚様体様体内の細胞は、最初期幹細胞と関連するマーカー、例えばOCT-4、Nanog、SSEA3及びSSEA4を発現する。胚様体様体内の細胞は、典型的には培養基体に接着性ではなく、本明細書に記述した胎盤幹細胞も同様であるが、培養の間に接着細胞に付着されたままである。胚様体様体は、接着性幹細胞の非存在下で形成されないので、胚様体様体細胞は、生存性に関して接着性胎盤幹細胞に依存的である。従って、接着性胎盤幹細胞は、接着性胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の増殖を促進させる。理論によって拘束されることは望まないが、胚幹細胞が細胞の支持細胞層上で増殖するのと同じだけ、胚様体様体の細胞も、接着性胎盤幹細胞上で増殖することが考えられる。間充織幹細胞、例えば骨髄に由来する間充織幹細胞は、培養において胚様体様体を発生しない。
【００３５】
（5.2.5 分化）
本発明の方法に有用な胎盤幹細胞は、異なる委任細胞系統に分化可能である。例えば、胎盤幹細胞は、脂肪生成、軟骨形成、神経原性又は骨原性の系統の細胞に分化することができる。このような分化は、例えば骨髄由来間充織幹細胞を同様の細胞系統に分化するための当該技術分野において公知の任意の方法によって達成することができる。
【００３６】
（5.3 胎盤幹細胞を得る方法）
（5.3.1 幹細胞収集組成物）
本発明は、胎盤幹細胞を収集及び単離する方法を更に提供する。一般に、幹細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば幹細胞収集組成物を使用して、哺乳動物胎盤から得られる。幹細胞収集組成物は、2005年12月29日に出願された「胎盤幹細胞を収集し、及び保存するための改善された組成物、並びに該組成物を使用する方法（"Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"）」の表題の関連した米国仮出願第60/754,969号に詳述されている。
幹細胞収集組成物は、幹細胞の収集及び／又は培養のために適した任意の生理的に許容し得る溶液、例えば生理食塩水（例えば、リン酸塩緩衝食塩水、クレブス（Kreb's）溶液、修正クレブス溶液、イーグル溶液、0.9% NaClなど）、培地（例えば、DMEM、H.DMEMなど）などを含むことができる。
【００３７】
幹細胞収集組成物は、胎盤幹細胞を保存する、すなわち収集時から培養時において、胎盤幹細胞が死滅するのを防げる、又は胎盤幹細胞の死滅を遅延させる、又は死滅する細胞の集団における胎盤幹細胞の数を減少させるなど他の傾向がある、1つ以上の成分を含むことができる。このような成分は、例えば以下であることができる：アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤）；血管拡張薬（例えば、硫酸マグネシウム、降圧剤、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸エステル、アデノシン、インドメタシン又は硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば、2-（1Hインドール-3-イル）-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバマート又はクロナゼパム）；TNF-α阻害剤；及び／又は酸素含有パーフルオロカーボン（例えば、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデシルブロミドなど）。
【００３８】
幹細胞収集組成物は、1つ以上の組織分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNase若しくはDNase又はその他を含むことができる。このような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、ヒストリチクス菌由来コラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベラーゼ（LIBERASE）、ヒアルロニダーゼ、その他を含むが、限定されない。
【００３９】
幹細胞収集組成物は、抗生物質の殺菌的又は細菌静的に有効な量を含むことができる。ある非限定的な実施態様において、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル（cefprozil）、セファクロル、セフィキシム又はセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンV）又はキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン又はノルフロキサシン（norfloxacin））、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、その他である。具体的実施態様において、抗生物質は、グラム（+）及び／又はグラム（-）細菌、例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）その他に対して活性である。
【００４０】
また、幹細胞収集組成物は、以下の化合物の1つ以上を含むことができる：アデノシン（約1mM〜約50mM）；D-グルコース（約20mM〜約100mM）；マグネシウムイオン（約1mM〜約50mM）；一つの実施態様において、内皮完全性及び細胞生存能を維持するために十分な量で存在する20,000ダルトンよりも大きな分子量の巨大分子（例えば、25g/l〜約100g/l又は約40g/l〜約60g/lで存在する、合成又は天然に存在するコロイド、デキストラン又はポリエチレングリコールなどの多糖体）；抗酸化剤（例えば、約25μM〜約100μMで存在する、ブチルヒドロキシアニゾール、ブチルヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC又はビタミンE）；還元剤（例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン）；細胞内へのカルシウム流入防止薬（例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L）；一つの実施態様において、残留する血液の凝固を防止するのを補助するために十分な量で存在する、抗凝固薬（例えば、約1000単位/l〜約100,000単位/lの濃度で存在するヘパリン又はヒルジン）；又はアミロライド含有化合物（例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピル、アミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブチルアミロライド）。
【００４１】
（5.3.2 胎盤の収集及び取扱い）
一般に、ヒト胎盤は、出生後にその娩出直後に回収される。好ましい実施態様において、胎盤は、インフォームドコンセント後に、及び患者の完全な病歴を得て胎盤と関連させた後に、患者から回収される。好ましくは、病歴は、分娩後も続ける。このような病歴を使用して、その後の胎盤又はそこから収集される幹細胞の使用を調整することができる。例えば、病歴を考慮して、胎盤と関連する乳児のための個人化された医薬のために、又は乳児の親、同胞若しくはその他の親類のために、ヒト胎盤幹細胞を使用することができる。
【００４２】
胎盤幹細胞の回復の前に、臍帯血及び胎盤血が除去される。ある実施態様において、分娩後に、胎盤の臍帯血が回収される。胎盤は、従来の臍帯血回収過程に供することができる。典型的には、針又はカニューレが使用され、重力を用いて、胎盤を失血させる（例えば、Andersonの文献、米国特許第5,372,581号；Hesselらの文献、米国特許第5,415,665号を参照されたい）。針又はカニューレは、通常臍静脈に置かれ、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤から臍帯血を排出するのを補助することができる。このような臍帯血回収は、商業的に、例えばLifeBank社、Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry and Cryocellで行ってもよい。好ましくは、胎盤は、臍帯血回復の間の組織破壊を最小化するために、更なる操作を伴わずに重力で排出される。
【００４３】
典型的には、胎盤は、例えば灌流又は組織解離による臍帯血の回収及び幹細胞の収集のために、分娩又は出産室から別の場所、例えば研究室まで輸送される。胎盤は、好ましくは、例えば胎盤を無菌の熱的に絶縁された輸送装置（20〜28℃の間に胎盤の温度を維持する）に、無菌のジップ-ロックプラスチック袋内にクランプした近位臍帯と共に置き、次いでこれを断熱された容器に置くことによって輸送される。別の実施態様において、胎盤は、実質的に2005年9月19日に出願された係属中の米国特許出願第11/230,760号に記載されているような臍帯血収集キットで輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩の4〜24時間後に研究室に送達される。ある実施態様において、近位臍帯は、臍帯血回収の前に胎盤の盤への挿入の好ましくは4〜5cm（センチメートル）以内に固定される。その他の実施態様において、近位臍帯は、臍帯血回収後に、しかし更に胎盤の処理前に固定される。
【００４４】
胎盤は、幹細胞収集の前に、無菌条件下で、及び室温又は5〜25℃（摂氏）の温度のいずれかにて貯蔵することができる。胎盤は、48時間より長い期間の間、及び好ましくは任意の残留する臍帯血を除去するために胎盤を灌流する前の4〜24時間の間、貯蔵してもよい。胎盤は、好ましくは抗凝血溶液中に5℃〜25℃（摂氏）の温度にて貯蔵される。適切な抗凝血溶液は、当該技術分野において周知である。例えば、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。好ましい実施態様において、抗凝血溶液は、ヘパリンの溶液（例えば、1%w/wの1：1000溶液）を含む。失血させた胎盤は、胎盤幹細胞を収集する前に、好ましくは36時間だけの間貯蔵される。
例えば、哺乳動物胎盤又はその部分は、一旦上記の通りに一般に収集及び調製されると、任意の当該技術分野において公知の様式、例えば灌流又は崩壊、例えば1つ以上の組織崩壊酵素で消化して処理することができ、幹細胞を得ることができる。
【００４５】
（5.3.3 胎盤組織の物理的破壊及び酵素消化）
一つの実施態様において、幹細胞は、器官の物理的破壊、例えば酵素消化によって哺乳動物胎盤から収集される。例えば、胎盤又はその一部は、例えば粉砕し、剪断し、刻み、さいの目に切り、細断し、侵して柔らかくするなどしてもよいが、その一方で、本発明の幹細胞収集組成物と接触させて、その後に組織を1つ以上の酵素で消化させる。また、胎盤又はその一部は、物理的に崩壊させ、及び1つ以上の酵素で消化し、次いで生じる材料を本発明の幹細胞収集組成物に浸漬又は混合してもよい。任意の物理的破壊方法を使用することができるが、本破壊方法は、例えばトリパンブルー排除によって決定すると、生存可能な前記器官の細胞の複数、より好ましくは大部分及びより好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%又は99%を残すことを条件とする。
【００４６】
胎盤は、物理的破壊及び／又は酵素消化、並びに幹細胞回収の前に成分に解剖することができる。例えば、胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、胎盤子葉又は任意のこれらの組み合わせから得ることができる。好ましくは、胎盤幹細胞は、羊膜及び絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。典型的には、胎盤幹細胞は、胎盤組織の小さなブロック、例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000立方ミリメートルの体積である胎盤組織のブロックの破壊によって得ることができる。
【００４７】
好ましい幹細胞収集組成物は、1つ以上の組織破壊的酵素（類）を含む。好ましくは、酵素消化には、酵素の組み合わせ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせ、例えばコラゲナーゼとディスパーゼとの組み合わせを使用する。一つの実施態様において、胎盤組織の酵素消化は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼの組み合わせ又はリベラーセ（LIBERASE）（Boehringer Mannheim社、Indianapolis, Ind.）及びヒアルロニダーゼの組み合わせなどの、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ及びヒアルロン酸の消化のための粘液溶解酵素の組み合わせを使用する。胎盤組織を崩壊させるために使用することができるその他の酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼや、トリプシン、キモトリプシン又はエラスターゼなどのセリンプロテアーゼを含む。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンによって阻害され得るので、従って、消化のために使用する培地は、通常無血清である。EDTA及びDNaseは、一般に細胞回収の効率を上昇させるための酵素消化手順に使用される。消化産物は、好ましくは、粘稠性消化産物内に幹細胞が補足されるのを回避するために、希釈される。
【００４８】
任意の組織消化酵素の組み合わせを使用することができる。組織消化酵素のための典型的な濃度は、例えばコラゲナーゼ I及びコラゲナーゼIVについて50〜200U/ml、ディスパーゼについて1〜10U/ml、並びにエラスターゼについて10〜100U/mlを含む。プロテアーゼは、組み合わせて、すなわち同じ消化反応において2つ以上プロテアーゼを使用すること、又は胎盤幹細胞を遊離するために連続して使用することができる。例えば、一つの実施態様おいて、胎盤又はその一部は、最初に適切な量のコラゲナーゼIで2mg/mlにて30分間消化し、続いてトリプシン、0.25%で37℃にて10分間消化する。セリンプロテアーゼは、好ましくはその他の酵素の使用に続いて連続して使用される。
【００４９】
別の実施態様において、組織は、幹細胞の単離の前に、幹細胞を含む幹細胞収集組成物に、又は組織を崩壊させる及び／若しくは消化する溶液に、幹細胞収集組成物と共に、キレート剤、例えばエチレングリコールビス（2-アミノエチルエーテル）-N,N,N'N'-4酢酸（EGTA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加することによって更に崩壊させることができる。
胎盤全体又は胎盤の一部が胎児及び母性の両方の細胞を含む場合（例えば、胎盤の一部が絨毛膜又は子葉を含む場合）、収集される胎盤幹細胞には、胎児及び母性の供与源に由来する胎盤幹細胞の混合物を含むであろうことが認識されるであろう。母性細胞（例えば、羊膜）を全く含まないか、又はごくわずかな数含む胎盤の一部の場合、収集される胎盤幹細胞には、ほぼ胎児の胎盤幹細胞だけを含むであろう。
【００５０】
（5.3.4 胎盤灌流）
また、胎盤幹細胞は、哺乳動物胎盤の灌流によって得ることができる。幹細胞を得るために哺乳動物胎盤を灌流する方法は、例えばHaririの文献、米国出願公開第2002/0123 141号に、及び2005年12月29日に出願された「胎盤幹細胞を収集及び保存するための改善された組成物、並びに該組成物を使用する方法（"Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"）」の表題の関連した米国仮出願第60/754,969号に開示されている。
【００５１】
胎盤幹細胞は、灌流、例えば灌流溶液として幹細胞収集組成物を使用して、例えば胎盤脈管構造を通すことによって収集することができる。一つの実施態様において、哺乳動物胎盤は、臍帯動脈及び臍静脈の一方又は両方を通して灌流溶液を通すことによって灌流される。胎盤を通る灌流溶液の流れは、例えば胎盤内への重力流を使用して達成してもよい。好ましくは、灌流溶液は、ポンプ、例えばペリスタル型ポンプを使用して強制的に胎盤を通す。臍静脈は、例えば、無菌の管などの無菌の連結装置に接続されているカニューレ、例えばテフロン（登録商標）又はプラスチックカニューレでカニューレ処置することができる。無菌の連結装置は、灌流マニホルドに接続される。
【００５２】
灌流の準備において、胎盤は、好ましくは、臍帯動脈及び臍静脈が胎盤の最も高い位置に位置するように向ける（例えば、懸濁する）。胎盤は、胎盤の脈管構造を通して、又は胎盤の脈管構造及び周囲組織を通して、灌流液体、例えば本発明の幹細胞収集組成物を通すことによって灌流することができる。一つの実施態様において、臍帯動脈及び臍静脈は、柔軟なコネクタを介して灌流溶液の貯蔵所に接続されたピペットに同時に接続される。灌流溶液を臍静脈及び動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から胎盤の周囲組織に滲出させ、及び／又は血管壁を通過させ、妊娠の間に母の子宮に付着させた胎盤の表面から適切な開放容器に収集する。また、灌流溶液は、臍帯開口部を介して導入して、母性の子宮壁との界面である胎盤壁の開口部から流出又は浸出させてもよい。別の実施態様において、灌流溶液は、臍静脈を通過させ臍帯動脈から収集されるか、又は臍帯動脈を通過させて臍静脈から収集される。
【００５３】
一つの実施態様において、近位臍帯を灌流の間に固定し、より好ましくは胎盤の盤への臍帯の挿入の4〜5cm（センチメートル）以内に固定される。
失血処理の間の哺乳動物胎盤からの灌流液体の最初の収集では、一般に臍帯血及び／又は胎盤血の残留赤血球に着色している。灌流が進行するにつれて、灌流液体は無色になり、残留臍帯血細胞が胎盤から洗い流される。一般に、最初に胎盤を失血させるためには、30〜100ml（ミリリットル）の灌流液が適切であるが、観察される結果に応じて、より多くの、又はより少ない灌流液体を使用してもよい。
胎盤幹細胞を収集するために使用される灌流液体の体積は、収集される幹細胞の数、胎盤のサイズ、単一の胎盤から行われる収集の数などに応じて変化させてもよい。種々の実施態様において、灌流液体の体積は、50ml〜5000ml、50ml〜4000ml、50ml〜3000ml、100mL〜2000ml、250ml〜2000ml、500ml〜2000ml又は750ml〜2000mlであってもよい。典型的には、胎盤は、失血に続いて700〜800mlの灌流液体で灌流される。
【００５４】
胎盤は、数時間又は数日の期間にわたって複数回灌流することができる。胎盤が複数回灌流される場合、これを無菌条件下で入れ物又はその他の適切な容器内で維持又は培養して、幹細胞収集組成物又は標準的な灌流溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水（「PBS」）などの通常の生理食塩溶液）で、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）の有無において、及び／又は抗菌剤（例えば、β-メルカプトエタノール（0.1mM）；ストレプトマイシン（例えば、40〜100μg/mlで）、ペニシリン（例えば、40U/mlで）、アンフォテリシンB（例えば、0.5μg/mlにて）などの抗生物質）の有無において灌流してもよい。一つの実施態様において、単離された胎盤は、胎盤が灌流及び灌流液の収集の前に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24時間、又は2若しくは3日以上維持され、又は培養されるように、灌流液を収集することなくしばらくの間維持又は培養される。灌流された胎盤は、1以上の更なる時間、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間以上の間維持して、例えば700〜800mlの灌流液体で二度目に灌流することができる。胎盤は、例えば1、2、3、4、5又は6時間毎に一回、1、2、3、4、5回以上の回数灌流することができる。好ましい実施態様において、胎盤の灌流及び灌流溶液、例えば幹細胞収集組成物の収集は、回収された有核細胞の数が100細胞/mlを下回るまで繰り返される。異なる時点の灌流液を更に個々に処理して、細胞、例えば幹細胞の時間依存的な集団を回収することができる。また、異なる時点からの灌流液をプールすることができる。
【００５５】
任意の理論によって拘束されることも望まないが、失血及び胎盤の灌流に十分な時間の後、胎盤幹細胞は、失血及び灌流された胎盤の微小循環に移動すると考えられ、そこで、本発明の方法に従って、好ましくは灌流によって収集容器内を洗浄することによって該細胞は収集される。単離された胎盤の灌流は、残留臍帯血を除去するだけでなく、酸素を含む適切な栄養素を胎盤に提供するのにも役に立つ。胎盤は、好ましくは抗血液凝固剤を添加することなく、残留臍帯血細胞を除去するために使用される同様の溶液で培養し、及び灌流してもよい。
【００５６】
本発明の方法に従った灌流により、前記溶液で灌流されていない、及びさもなければ幹細胞を得るための処理（例えば、組織破壊、例えば酵素消化による）がされていない哺乳動物胎盤から得られる数よりも有意に多くの胎盤幹細胞の収集となる。この状況において、「有意に多い」とは、少なくとも10%多いことを意味する。例えば、本発明の方法に従った灌流により、胎盤又はその一部が培養された培地から得られる胎盤幹細胞の数よりも有意に多い胎盤幹細胞を生じる。
【００５７】
幹細胞は、1つ以上のプロテアーゼ又はその他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によって胎盤から単離することができる。具体的実施態様において、胎盤又はその一部（例えば、羊膜、羊膜及び絨毛膜、胎盤小葉若しくは子葉、又は前述の任意の組み合わせ）を25〜37℃にして、200mlの培地中で1つ以上の組織破壊酵素と共に30分間インキュベートする。灌流液からの細胞を収集し、4℃にして、5mM EDTA、2mM ジチオスレイトール及び2mM β-メルカプトエタノールを含む冷却阻害剤混合物で洗浄する。幹細胞を数分後に本発明の冷却（例えば、4℃）幹細胞収集組成物で洗浄する。
【００５８】
パン（pan）法を使用する灌流（これにより、灌流液が胎盤の母側から滲出した後に収集される）により、胎児及び母性の細胞の混合物を生じることが、認識されるであろう。その結果、本方法によって収集された細胞には、胎児及び母性の両方の起源の胎盤幹細胞の混合された集団を含む。対照的に、単に胎盤の脈管構造だけを通す灌流（これにより、灌流液体が1つ又は2つの胎盤の血管を通過し、単に残りの血管を通って収集される）では、ほとんど胎児起源の胎盤幹細胞の集団のみの収集となる。
【００５９】
（5.3.5 胎盤幹細胞の単離、分取及び特性付け）
哺乳動物胎盤からの幹細胞は、灌流又は酵素消化によって得られるかどうかにかかわらず、最初にフィコール勾配遠心分離によってその他の細胞から精製すること（すなわち、から単離すること）ができる。このような遠心分離では、遠心分離速度などに関して、任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一つの実施態様において、例えば、胎盤から収集される細胞は、5000×gにて室温で15分間の遠心分離によって灌流液から回収され、これにより、例えば細胞を混入する細片及び血小板から分離する。別の実施態様において、胎盤灌流液を約200mlまで濃縮し、穏やかにフィコール上に層にして、約1100×gで22℃にて20分間遠心分離し、細胞の低密度界面層を更なる処理のために収集する。
【００６０】
細胞ペレットを新鮮な幹細胞収集組成物又は幹細胞維持のために適した培地、例えば2U/mlヘパリン及び2mM EDTA（GibcoBRL社、NY）を含むIMDM無血清培地に再懸濁することができる。総単核細胞分画は、例えば製造業者の推奨された手順に従ってLymphoprep（Nycomed Pharma社、Oslo、Norway）を使用して単離することができる。
本明細書に使用される、胎盤幹細胞を「単離すること」とは、幹細胞が通常無処置の哺乳動物胎盤において付随する細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%を除去することを意味する。器官からの幹細胞は、幹細胞が通常無処置の器官において付随している細胞の50%未満を含む細胞の集団に該幹細胞が存在するときに、「単離されて」いる。
【００６１】
灌流又は消化によって得られた胎盤細胞は、例えば、更に又は最初に、例えば0.2%のEDTA（Sigma社, St. Louis MO）を含む0.05%のトリプシンの溶液を使用する差動的トリプシン処理によって単離することができる。胎盤幹細胞は、典型的には約5分以内にプラスチック表面から剥離するが、その他の接着集団は、典型的には20〜30分以上のインキュベーションが必要であるので、差動的トリプシン処理が可能性である。剥離された胎盤幹細胞は、トリプシン処理及び例えばトリプシン中和溶液（TNS、Cambrex社）を使用して、トリプシン中和後に収集することができる。接着細胞の単離の一つの実施態様において例えば、約5〜10×106細胞の一定分量をいくつかのT-75フラスコ、好ましくはフィブロネクチンコートしたT75フラスコのそれぞれに置く。このような実施態様において、細胞を市販の間充織幹細胞増殖培地（MSCGM）（Cambrex社）と共に培養して、組織培養インキュベーター（37℃、5% CO2）に置くことができる。10〜15日後、非接着細胞をPBSで洗浄することによってフラスコから除去する。次いで、PBSをMSCGMによって置き換える。フラスコは、好ましくは種々の接着細胞タイプの存在について、及び特に線維芽細胞様細胞のクラスターの同定及び増殖について、毎日調べる。
【００６２】
哺乳動物胎盤から収集される細胞の数及びタイプは、例えばフローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的な又は細胞-マーカー特異的抗体での染色）蛍光標示式細胞分取器（FACS）、磁気標示式細胞分取器（MACS）などの標準的な細胞検出技術を使用して、形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することによって、光学顕微鏡観察又は共焦点顕微鏡観察を使用する細胞の形態の検査によって、並びに／又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野における周知技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって、モニターすることができる。これらの技術を使用して、1つ以上の特定のマーカーについて陽性である細胞を同定することもできる。例えばCD34に対する抗体を使用して、上記の技術を使用し、細胞がCD34の検出可能な量を含むかどうかを決定することができ；その場合は、細胞はCD34+である。同様に、細胞がRT-PCRによって検出可能なほど十分なOCT-4 RNAを産生するか、又は成人細胞よりも有意に多いOCT-4RNAの場合、細胞はOCT-4+である。細胞表面マーカー（例えば、CD34などのCDマーカー）及びOCT-4などの幹細胞特異的遺伝子の配列に対する抗体も、当該技術分野において周知である。
【００６３】
胎盤細胞、特にフィコール分離、差動的接着又は両方の組み合わせによって単離された細胞は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）を使用して分取してもよい。蛍光標示式細胞分取（FACS）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離するための周知の方法である（Kamarchの論文, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165）。個々の粒子における蛍光部分のレーザー励起により、わずかな電荷が生じ、混合物から正及び負の粒子の電磁分離が可能となる。一つの実施態様において、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドを異なる蛍光標識で標識する。細胞を、細胞選別機を通して処理し、使用した抗体に対してこれらが結合する能力に基づいて細胞を分離することができる。FACS分取された粒子は、分離及びクローニングを促進するために、96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェルに直接入れてもよい。
【００６４】
一つの分取スキームにおいて、胎盤からの幹細胞は、マーカーCD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4及び／又はHLA-Gの発現に基づいて分取される。これは、培養におけるこれらの接着特性に基づいて幹細胞を選択するための手順と合わせて達成することができる。例えば、接着選択幹は、マーカー発現に基づいて分取の前又は後に達成することができる。一つの実施態様において、例えば、細胞を最初にこれらのCD34の発現に基づいて分取し；CD34-細胞を保持して、CD200+HLA-G+細胞を他の全てのCD34-細胞から分離する。別の実施態様において、胎盤からの細胞は、これらのマーカーCD200及び／又はHLA-Gの発現に基づいており；例えば、これらのマーカーのいずれかを示す細胞を更に使用するために単離する。例えば、CD200及び／又はHLA-Gを発現する細胞を、具体的実施態様において、これらのCD73及び／若しくはCD105の発現、抗体SH2、SH3若しくはSH4によって認識されるエピトープ、又はCD34、CD38若しくはCD45の発現の欠如に基づいて更に分取することができる。例えば、一つの実施態様において、胎盤細胞をCD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38及びCD45の発現又はその欠如によって分取して、CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-及びCD45-である胎盤細胞を更に使用するためにその他の胎盤細胞から単離する。
【００６５】
別の実施態様において、細胞を分離するために磁気ビーズを使用することができる。
細胞は、磁気標示式細胞分取（MACS）技術（粒子を、これらが磁気ビーズ（直径0.5〜100μm）に結合する能力に基づいて分離するための方法）を使用して分取してもよい。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合性付加を含む種々の有用な修飾を磁気微粒子に対して行うことができる。次いで、ビーズを細胞と混合して結合させる。次いで、細胞を、磁場を通過させ、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一つの実施態様において、次いでこれらの細胞を単離して、更なる細胞表面マーカーに対する抗体に結合させた磁気ビーズと再び混合することができる。細胞を再び磁場を通過させ、両抗体に結合した細胞を単離する。次いで、このような細胞をクローン単離のためのマイクロタイターディッシュなどの別々のディッシュに希釈することができる。
【００６６】
また、胎盤幹細胞は、細胞形態及び増殖特性に基づいて特徴づけること、及び／又は分取することができる。例えば、胎盤幹細胞は、例えば培養において線維芽細胞様外見を有するとして特徴づけること、及び／又は例えば線維芽細胞様外見に基づいて選択することができる。また、胎盤幹細胞は、これらが胚様体様体を形成する能力を有するとして特徴づけること、及び／又はこれらが胚様体様体を形成する能力に基づいて選択することができる。一つの実施態様において、例えば、形状が線維芽細胞様であり、CD73及びCD105を発現し、培養において1つ以上の胚様体様体を産生する胎盤細胞を、その他の胎盤細胞から単離する。別の実施態様において、培養において1つ以上の胚様体様体を産生するOCT-4+胎盤細胞をその他の胎盤細胞から単離する。
【００６７】
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、コロニー形成単位アッセイ法によって同定すること、及び特徴づけることができる。Mesen Cult（商標）培地（Stem Cell Technologies社、Vancouver British Columbia）などのコロニー形成単位アッセイ法は、当該技術分野において一般に公知である。
【００６８】
胎盤幹細胞は、トリパンブルー排除アッセイ法、フルオレセイン二酢酸摂取アッセイ法、ヨウ化プロピジウム摂取アッセイ法（生存度を評価するため）；及びチミジン摂取アッセイ法、MTT細胞増殖アッセイ法（増殖を評価するため）などの当該技術分野において公知の標準的な技術を使用して、生存度、増殖能及び寿命を評価することができる。寿命は、増殖させた培養における集団倍加の最大数を決定することによるなど、当該技術分野において周知方法によって決定してもよい。
【００６９】
また、胎盤幹細胞は、当該技術分野において公知のその他の技術、例えば所望の細胞選択的増殖（ポジティブ選択）、望まれない細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）；混合集団における差動的細胞被凝集性に基づいた、例えばダイズ凝集素での分離；凍結融解法；濾過；従来遠心分離及びゾーン遠心分離；遠心溶出法（カウンタ-ストリーミング遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動法；その他を使用して他の胎盤細胞からまた分離することができる。
【００７０】
（5.4 胎盤幹細胞の培養）
（5.4.1培地）
単離された胎盤幹細胞、若しくは胎盤幹細胞集団、又は胎盤幹細胞が生じる細胞若しくは胎盤組織を使用して、細胞培養を開始するか、又は播種することができる。細胞は、一般にコーティングしてない無菌の組織培養容器へ移すか、又はラミニン、コラーゲン（例えば、天然又は変性型）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜タンパク質（例えば、マトリゲル（Matrigel）（BD Discovery Labware, Bedford, Mass.））などの細胞外基質又はリガンドでコートされている無菌の組織培養容器へ移す。
【００７１】
胎盤幹細胞は、幹細胞の培養のために許容し得るものとして当該技術分野において認識される任意の培地において、及び任意の条件下で培養することができる。好ましくは、培地には、血清を含む。胎盤幹細胞は、例えばITS（インスリン-トランスフェリン-セレン）、LA+BSA（リノール酸-ウシ血清アルブミン）、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG（ダルベッコ修正基本培地、低グルコース）／MCDB 201（ヒヨコ線維芽細胞基礎培地）；10%ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM-HG（高グルコース）；15% FBSを含むDMEM-HG；10% FBS、10% ウマ血清及びヒドロコルチゾンを含むIMDM（イサコフ修正ダルベッコ培地）；10% FBS、EGF及びヘパリンを含むM199；10% FBS、GlutaMAX（商標）及びゲンタマイシンを含むα-MEM（最小基本培地）；10% FBS、GlutaMAX（商標）及びゲンタマイシンを含むDMEMなどにおいて培養することができる。好ましい培地は、2%のFBS、ITS、LA+BSA、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG/MCDB-201である。
【００７２】
胎盤幹細胞を培養するために使用することができるその他の培地には、DMEM（高又は低グルコース）、イーグル基本培地、ハム（Ham's）F10培地（F10）、ハムF-12培地（F12）イサコフ修正ダルベッコ培地、間充織幹細胞増殖培地（MSCGM）、リーボビッツ（Liebovitz's）L-15培地、MCDB、DMIEM/F12、RPMI 1640、アドバンスドDMEM（Gibco）、DMEM/MCDB2O1（Sigma社）及びCELL-GRO FREEを含む。
【００７３】
培地は、例えば、以下を含む1つ以上の成分と組み合わせて補充することができる：血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、好ましくは約2〜15%（v/v）；ウマ科（ウマ）血清（ES）；ヒト血清（HS））；β-メルカプトエタノール（BME）、好ましくは約0.001%（v/v）；1つ以上の成長因子、例えば血小板由来成長因子（PDGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、インスリン様成長因子-1（IGF-1）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮成長因子（VEGF）及びエリスロポエチン（EPO）；L-バリンを含むアミノ酸；並びに、例えばペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンB、ゲンタマイシン及びニスタチンなどの微生物汚染を制御するための1つ以上の抗生物質の及び／又は抗真菌薬を単独又は組み合わせのいずれかで。
【００７４】
（5.4.2 胎盤幹細胞の伸展及び増殖）
一旦、単離された胎盤幹細胞又は幹細胞の単離された集団（例えば、幹細胞又は幹細胞の集団がインビボにおいて通常付随する胎盤細胞の少なくとも50%から分離された幹細胞又は幹細胞の集団）が単離されたら、幹細胞又は幹細胞の集団をインビトロで増殖及び伸展させることができる。例えば、胎盤幹細胞の集団は、組織培養容器、例えばディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート又はその他において、幹細胞が70〜90%コンフルエンスに増殖するのに十分な時間、すなわち幹細胞及びそれらの子孫が組織培養容器の培養表面領域の70〜90%を占めるまで、培養することができる。
【００７５】
胎盤幹細胞は、細胞増殖が可能な密度で培養容器に播種することができる。例えば、細胞は、低密度（例えば、約1,000〜約5,000細胞／cm2）から高密度（例えば、約50,000以上の細胞／cm2）で播種してもよい。好ましい実施態様において、細胞は、空気中の約0〜約5容量パーセントのCO2にて培養される。一部の好ましい実施態様において、細胞は、空気中の約2〜約25パーセントのO2にて、好ましくは空気中約5〜約20パーセントのO2にて培養される。細胞は、好ましくは約25℃〜約40℃、好ましくは37℃にて培養される。細胞は、好ましくはインキュベーターにおいて培養される。培地は、静置か、又は例えばバイオリアクターを使用して撹拌されてもよい。胎盤幹細胞は、好ましくは低酸化ストレス下で培養される（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステイン、又はその他の添加を伴う）。
【００７６】
一旦70%〜90%のコンフルエンスが得られたら、細胞を継代してもよい。例えば、細胞は、当該技術分野において周知の技術を使用して、酵素処理して、例えばトリプシン処理して、組織培養表面からこれらを分離することができる。ピペット操作によって細胞を除去して細胞を計数後、約20,000〜100,000個の幹細胞、好ましくは約50,000個の幹細胞を新鮮な培地を含む新たな培養容器に継代する。典型的には、新たな培地は、幹細胞が除去された培地と同じタイプである。本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18又は20回以上継代された胎盤幹細胞の集団を包含する。
【００７７】
（5.4.3 胎盤幹細胞集団）
本発明は、胎盤幹細胞の集団を提供する。胎盤幹細胞集団は、1つ以上の胎盤から直接に単離することができる；すなわち、胎盤幹細胞集団は、灌流液から得られ、若しくは灌流液内に含まれ、消化物（すなわち、胎盤又はその一部の酵素消化によって得られた細胞のコレクション）から得られ、若しくは消化物内に含まれる胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団であることができる。また、本発明の単離された胎盤幹細胞を培養及び増殖させて、胎盤幹細胞集団を産生することもできる。また、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を培養し、及び増殖させて、胎盤幹細胞集団を産生することができる。
【００７８】
本発明の胎盤幹細胞集団には、胎盤幹細胞、例えば本明細書に記述したような胎盤幹細胞を含む。種々の実施態様において、単離された胎盤幹細胞集団における細胞の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%が胎盤幹細胞である。すなわち、胎盤幹細胞集団は、例えば1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%程度の非幹細胞を含むことができる。
【００７９】
本発明は、例えば酵素消化又は灌流に由来するかどうかにかかわらず、特定のマーカー及び／又は特定の培養若しくは形態的特徴を発現する胎盤幹細胞を選択することによって単離された胎盤幹細胞集団を産生する方法を提供する。一つの実施態様において、例えば、本発明は、（a）基体に付着し、及び（b）CD200及びHLA-Gを発現する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を含む、細胞集団を産生する方法を提供する。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、（a）基体に付着し、及び（b）CD73、CD105及びCD200を発現する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を含む。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、（a）基体に付着し、及び（b）CD200及びOCT-4を発現する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を含む。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、（a）基体に付着し、（b）CD73及びCD105を発現し、及び（c）前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を含む。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、（a）基体に付着し、及び（b）CD73、CD105及びHLA-Gを発現する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。別の実施態様において、細胞集団を産生する方法は、（a）基体に付着し、（b）OCT-4を発現し、及び（c）前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進する胎盤細胞を選択すること；並びに前記細胞をその他の細胞から単離して細胞集団を形成すること；を含む。任意の上記の実施態様において、本方法は、加えて、ABC-p（胎盤特異的ABC輸送体タンパク質；例えばAllikmetsらの論文、Cancer Res. 58（23）：5337-9（1998）を参照されたい）を発現する胎盤細胞を選択すること；を含むことができる。また、本方法は、例えば間充織幹細胞に特異的な少なくとも１つの特徴、例えばCD29の発現、CD44の発現、CD90の発現又は前述の組み合わせの発現を示す細胞を選択することを含むことができる。
【００８０】
上記実施態様において、基体は、細胞、例えば胎盤幹細胞の培養及び／又は選択を達成することができる任意の表面であることができる。典型的には、基体は、プラスチック、例えば組織培養ディッシュ又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、生体分子、例えばラミニン又はフィブロネクチンでコートすることができる。
細胞、例えば胎盤幹細胞は、細胞選択の技術分野において公知の任意の手段によって胎盤幹細胞集団について選択することができる。例えば、細胞は、例えばフローサイトメトリー又はFACSで、1つ以上の細胞表面マーカーに対する抗体又は抗体群を使用して選択することができる。選択は、磁気ビーズと組み合わせて抗体を使用して達成することができる。特定の幹細胞関連マーカーに対して特異的である抗体は、当該技術分野において公知である。例えば、OCT-4（Abcam社、Cambridge、MA）、CD200（Abcam社）、HLA-G（Abcam社）、CD73（BD Biosciences Pharmingen社, San Diego Ca）、CD105（Abcam社；BioDesign International社, Saco, ME）、その他に対する抗体。また、その他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えばCD34、CD38及びCD45は、例えばStemCell Technologies社又はBioDesign International社から入手可能である。
【００８１】
単離された胎盤幹細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞又は胎盤細胞ではない細胞を含むことができる。
単離された胎盤幹細胞集団は、非幹細胞又は非胎盤細胞の1つ以上の集団と組み合わせることができる。例えば、胎盤幹細胞の単離された集団は、血液（例えば、胎盤血又は臍帯血）、血液由来幹細胞（例えば、胎盤血又は臍帯血に由来する幹細胞）、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来間葉細胞、骨由来幹細胞集団、未精製骨髄、成体（体細胞）幹細胞、組織内に含まれる幹細胞の集団、培養された幹細胞、完全に分化した細胞の集団（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊水細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞など）、その他と組み合わせることができる。単離された胎盤幹細胞集団における細胞は、それぞれの集団における総有核細胞の数に比較して、約100,000,000：1、 50,000,000：1、 20,000,000：1、 10,000, 000：1、 5,000,000：1、 2,000,000：1、 1,000,000：1、 500,000：1、 200,000：1、 100, 000：1、 50,000：1、 20,000：1、 10,000：1、 5,000：1、 2,000：1、 1,000：1、 500：1、 200：1、 100：1、 50：1、 20：1、 10：1、 5：1、 2：1、 1：1；1：2；1：5；1：10；1：100；1：200；1：500；1：1,000；1：2,000；1：5,000；1：10,000；1：20,000；1：50,000；1：100,000；1：500,000；1：1,000,000；1：2,000,000；1：5,000,000；1：10,000,000；1：20,000,000；1：50,000,000；又は約1：100,000,000の比で、別のタイプの複数の細胞と組み合わせることができる。単離された胎盤幹細胞集団における細胞は、同様に複数の細胞型の複数の細胞と組み合わせることができる。
【００８２】
一つにおいて、単離された胎盤幹細胞の集団は、複数の造血幹細胞と組み合わせられる。このような造血幹細胞は、例えば未処理の胎盤、臍帯血又は末梢血内に；胎盤血、臍帯血又は末梢血からの総有核細胞に；胎盤血、臍帯血又は末梢血からの単離されたCD34+細胞の集団に；未処理の骨髄に；骨髄からの総有核細胞に；骨髄からのCD34+細胞の単離された集団に、又はその他に含まれ得る。
【００８３】
（5.5 胎盤幹細胞の保存）
胎盤幹細胞は、保存すること、すなわち長期貯蔵を可能にする条件又は例えばアポトーシス若しくは壊死による細胞死を阻害する条件の下に置くことができる。
胎盤幹細胞は、2005年12月25日に出願された「胎盤幹細胞を収集及び保存するための改善された組成物、並びに該組成物を使用する方法（"Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"）」の表題の関連した米国仮出願第60/754,969号に記載されているように、例えばアポトーシス阻害剤、壊死阻害剤及び／又は酸素含有パーフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一つの実施態様において、本発明は、幹細胞の集団を保存する方法であって、前記幹細胞の集団を、アポトーシスの阻害剤及び酸素含有パーフルオロカーボンを含む幹細胞収集組成物と接触させることを含み、前記アポトーシスの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団におけるアポトーシスを低減又は防止するのに十分な量及び時間で存在する、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的実施態様において、前記アポトーシスの阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的実施態様において、前記JNK阻害剤は、前記幹細胞の分化又は増殖のいずれをも調整しない。別の実施態様において、前記幹細胞収集組成物は、前記アポトーシスの阻害剤及び前記酸素含有パーフルオロカーボンを別々の相に含む。別の実施態様において、前記幹細胞収集組成物は、前記アポトーシスの阻害剤及び前記酸素含有パーフルオロカーボンを乳剤中に含む。別の実施態様において、幹細胞収集組成物は、加えて、乳化剤、例えばレシチンを含む。別の実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは、幹細胞を接触させる時に、約0℃〜約25℃の間である。更に別の具体的実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記パーフルオロカーボンは、幹細胞を接触させる時に、約2℃〜10℃の間又は約2℃〜約5℃の間である。更に別の具体的実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団の輸送の間に行われる。更に別の具体的実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団の凍結融解の間に行われる。
【００８４】
別の実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の集団を保存する方法であって、前記幹細胞の集団をアポトーシスの阻害剤及び器官保存化合物と接触させることを含み、前記アポトーシスの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団におけるアポトーシスを低減、又は防止するのに十分な量及び時間で存在する、前記方法を提供する。具体的実施態様において、器官保存化合物は、UW溶液（米国特許第4,798,824に記述されており；ViaSpanとしても知られ；Southardらの論文、Transplantation 49（2）：251-257（1990）も参照されたい）又は米国特許第5,552,267号に記述された溶液である。別の実施態様において、前記器官保存化合物は、ヒドロキシエチル澱粉、ラクトビオ酸（lactobionic acid）、ラフィノース又はこれらの組み合わせである。別の実施態様において、幹細胞収集組成物は、加えて、酸素含有パーフルオロカーボンを二相で、又は乳剤としてのいずれかで含む。
【００８５】
本方法の別の実施態様において、胎盤幹細胞を、灌流の間にアポトーシス阻害剤及び酸素含有パーフルオロカーボン、器官保存化合物又はこれらの組み合わせを含む幹細胞収集組成物と接触させる。別の実施態様において、前記幹細胞を、組織破壊、例えば酵素消化の過程の間に接触させる。別の実施態様において、胎盤幹細胞を、灌流による収集後、又は組織破壊、例えば酵素消化による収集後に前記幹細胞収集化合物と接触させる。
【００８６】
典型的には、胎盤細胞の収集、濃縮及び単離の間に、低酸素及び機械的ストレスによる細胞ストレスを最小にするか、又は除去することが好ましい。従って、本方法の別の実施態様において、幹細胞又は幹細胞の集団は、収集、濃縮又は単離の間に、前記保存の間の6時間未満の間、正常な血液酸素濃度未満である酸素の濃度である酸素圧低下状態に曝露される。より具体的実施態様において、前記幹細胞の集団は、前記保存の間に、2時間未満の間、前記酸素圧低下状態に曝露される。更に別の具体的実施態様において、前記幹細胞の集団は、収集、濃縮又は単離の間に、1時間若しくは30分未満より少ない間、前記酸素圧低下状態に曝露され、又は酸素圧低下状態に曝露されない。別の具体的実施態様において、前記幹細胞の集団は、収集、濃縮又は単離の間にずり応力に曝露されない。
【００８７】
本発明の胎盤幹細胞は、例えば小さな容器、例えばアンプル内の凍結保存培地に凍結保存することができる。適切な凍結保存培地は、例えば増殖培地又は細胞凍結培地、例えば市販の細胞凍結培地、例えばC2695、C2639又はC6039（Sigma社）を含む培地を含むが、限定されない。凍結保存培地は、好ましくはDMSO（ジメチルスルホキシド）を、例えば約10%（v/v）の濃度にて含む。凍結保存培地は、更なる薬剤、例えばメチルセルロース及び／又はグリセロールを含んでいてもよい。胎盤幹細胞は好ましくは、凍結保存の間に約1℃／分にて冷却される。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125℃〜約-140℃である。凍結保存された細胞は、使用のために解凍する前に、液体窒素へ移すことができる。幾つかの実施態様において、例えば、一旦アンプルが約-90℃に到達したならば、これらを液体窒素貯槽領域に移す。凍結保存された細胞は、約25℃〜約40℃の温度にて、好ましくは約37℃の温度に解凍される。
【００８８】
（5.6胎盤幹細胞の使用）
（5.6.1胎盤幹細胞を含む組成物）
本発明の免疫抑制の方法には、胎盤幹細胞又は該細胞由来の生体分子を含む組成物を使用することができる。同様に、本発明の複数の胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞の集団は、例えば研究又は治療に使用するための任意の生理的に許容されるか、若しくは医学的に許容し得る化合物、組成物又は装置と組み合わせることができる。
【００８９】
（5.6.1.1 凍結保存された胎盤幹細胞）
本発明の免疫抑制性胎盤幹細胞集団は、保存すること、例えばあとで使用するために凍結保存することができる。細胞、例えば幹細胞の凍結保存のための方法は、当該技術分野において周知である。胎盤幹細胞集団は、個体に容易に投与可能な形態に調製することができる。例えば、本発明は、医療用に適した容器内に含まれる胎盤幹細胞集団を提供する。このような容器は、例えば無菌のプラスチック袋、フラスコ、ジャー又は胎盤幹細胞集団を容易に分配することができるその他の容器であってもよい。例えば、容器は、血液バッグ又はレシピエントに液体の静脈内投与をするのに適した医学的に許容し得るその他のプラスチックバッグであってもよい。容器は、好ましくは合わせた幹細胞集団を凍結保存できるものである。
凍結保存された免疫抑制性胎盤幹細胞集団は、単一のドナーに、又は複数のドナーに由来する胎盤幹細胞を含むことができる。胎盤幹細胞集団は、意図されたレシピエントに完全にHLA一致又は部分的若しくは完全にHLAミスマッチし得る。
【００９０】
従って、一つの実施態様において、本発明は、容器内に免疫抑制性胎盤幹細胞集団を含む組成物を提供する。具体的実施態様において、幹細胞集団は、凍結保存されている。別の具体的実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ又はジャーである。より具体的実施態様において、前記バッグは、無菌のプラスチック袋である。より具体的実施態様において、前記バッグは、前記胎盤幹細胞集団を静脈内投与を可能にする又は促進するのに適している。バッグは、例えば薬物の投与前又は投与の間に、相互接続されて胎盤幹細胞と1つ以上のその他の溶液の混合を可能にする複数の内膣又はコンパートメントを含むことができる。別の具体的実施態様において、組成物は、合わせた幹細胞集団の凍結保存を促進する1つ以上の化合物を含む。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞集団は、生理的に許容し得る水溶液内に含まれる。より具体的実施態様において、前記生理的に許容し得る水性溶液は、0.9% NaCl溶液である。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞集団は、前記幹細胞集団のレシピエントに対してHLA一致である胎盤細胞を含む。別の具体的実施態様において、前記合わせた幹細胞集団は、前記幹細胞集団のレシピエントに対して少なくとも部分的にHLAミスマッチである胎盤細胞を含む。別の具体的実施態様において、前記胎盤幹細胞は、複数のドナーに由来する。
【００９１】
（5.6.1.2 医薬組成物）
免疫抑制性の胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、インビボでの使用のための医薬組成物に製剤することができる。このような医薬組成物には、医薬として許容し得る担体、例えば生理食塩水又はインビボでの投与のためのその他の承認された生理的に許容し得る溶液中に、胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団を含む。本発明の医薬組成物は、本明細書において他に記述した、任意の胎盤幹細胞集団又は胎盤幹細胞タイプを含むことができる。医薬組成物は、胎児、母性又は胎児及び母性の両方の胎盤幹細胞を含むことができる。本発明の医薬組成物は、単一の個体若しくは胎盤から、又は複数の個体若しくは胎盤から得られた胎盤幹細胞を更に含むことができる。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、任意の免疫抑制性の数の胎盤幹細胞を含むことができる。例えば、胎盤幹細胞の単一の単位投与量には、種々の実施態様において、約、少なくとも、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個、又はそれ以下、若しくはそれより多くの胎盤幹細胞を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、50%生細胞以上を含む（すなわち、集団における細胞の少なくとも50%は、機能的又は生きている）細胞の集団を含む。好ましくは、集団における細胞の少なくとも60%は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物における集団の細胞の少なくとも70%、80%、90%、95%又は99%は、生存可能である。
本発明の医薬組成物は、例えば移植を促進する1つ以上の化合物（例えば、抗T細胞受容体抗体、免疫抑制薬又はその他）；アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチル澱粉、その他などの安定剤；を含むことができる。
【００９３】
（5.6.1.3 胎盤幹細胞条件培地）
本発明の胎盤幹細胞は、免疫抑制性である条件培地、すなわち免疫細胞の1つ以上のタイプの複数に対して検出可能な免疫抑制効果を有する幹細胞によって分泌又は排出される1つ以上の生体分子を含む培地を産生するために使用することができる。種々の実施態様において、条件培地には、胎盤幹細胞を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日以上培養した培地を含む。その他の実施態様において、条件培地は、胎盤幹細胞を少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%コンフルエンス又は100%コンフルエンスまで培養した培地を含む。このような条件培地は、胎盤幹細胞の別の集団又は別の種類の幹細胞の培養を補助するために使用することができる。別の実施態様において、条件培地は、胎盤幹細胞を成体細胞タイプに分化した培地を含む。別の実施態様において、本発明の条件培地は、胎盤幹細胞及び非胎盤幹細胞を培養した培地を含む。
【００９４】
従って、一つの実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の培養液からの培地を含む組成物であって、前記胎盤幹細胞は、（a）基体に付着し；（b）CD200及びHLA-Gを発現するか、又はCD73、CD105及びCD200を発現するか、又はCD200及びOCT-4を発現するか、又はCD73、CD105及びHLA-Gを発現するか、又はCD73及びCD105を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進するか、又はOCT-4を発現し、かつ胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団における1つ以上の胚様体様体の形成を、前記集団が胚様体様体の形成が可能な条件下で培養されるときに促進し；並びに（c）MLR（混合リンパ球反応）においてCD4+又はCD8+T細胞増殖を検出可能に抑制し、前記胎盤幹細胞の培養は、前記培地において24時間以上培養されている、前記組成物を提供する。具体的実施態様において、組成物は、複数の前記胎盤幹細胞を更に含む。別の具体的実施態様において、組成物は、複数の非胎盤細胞を含む。より具体的実施態様において、前記非胎盤細胞は、CD34+細胞、例えば末梢血造血前駆細胞、臍帯血造血前駆細胞又は胎盤血造血前駆細胞などの造血前駆細胞を含む。また、非胎盤細胞は、間充織幹細胞、例えば骨髄由来間充織幹細胞などのその他の幹細胞を含むこともできる。非胎盤細胞は、成体細胞又は株化細胞の1つ以上のタイプであることができる。別の具体的実施態様において、組成物には、抗増殖薬、例えば抗-MIP-1α又は抗-MIP-1β抗体を含む。
【００９５】
（5.6.1.4 胎盤幹細胞を含むマトリックス）
本発明は、胎盤幹細胞の免疫抑制性集団を含むマトリックス、ヒドロゲル、足場及びその他を更に含む。
本発明の胎盤幹細胞は、天然のマトリックス、例えば羊膜材料などの胎盤生体材料上に播種することができる。このような羊膜材料は、例えば哺乳動物胎盤から直接解剖された羊膜；固定又は熱処理した羊膜、実質的に乾燥した（すなわち20%未満のH2O）羊膜、柔毛膜、実質的に乾燥した柔毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜、その他でであってもよい。胎盤幹細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、Haririの文献、米国出願公開番号2004/0048796に記述されている。
【００９６】
本発明の胎盤幹細胞は、例えば注射のために適したヒドロゲル溶液に懸濁することができる。このような組成物のために適したヒドロゲルには、RAD16などの自己集合ペプチドを含む。一つの実施態様において、細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば型において硬化させて、移植のためにその中に分散させた細胞を有するマトリックスを形成することができる。また、このようなマトリックスにおける胎盤幹細胞は、細胞が移植前に有糸分裂で増殖されるように培養することができる。ヒドロゲルは、例えば共有結合、イオン結合又は水素結合を介して架橋されて三次元開放格子構造を生成し、これが水分子を補足してゲルを形成する有機ポリマー（天然又は合成）である。ヒドロゲル形成材料は、アルギン酸及びその塩などの多糖体、ペプチド、ポリホスファジン及びポリアクリラート（これらはイオンによって架橋される）又はポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロック共重合体などのブロック重合体（それぞれ温度又はpHによって架橋される）を含む。一部の実施態様において、本発明のヒドロゲル又はマトリックスは、生体分解性である。
【００９７】
本発明の一部の実施態様において、製剤には、インサイチューで重合可能なゲル（例えば、米国特許出願刊行物2002/0022676；Ansethらの論文、J. Control Release, 78（1-3）:199-209 （2002）;Wangらの論文、Biornaterials, 24（22）:3969-80 （2003）を参照されたい）を含む。
【００９８】
幾つかの実施態様において、重合体は、水、緩衝塩溶液又は水性アルコール溶液などの水性溶液に少なくとも部分的に可溶性であって、荷電側鎖を有するか、若しくはその一価のイオン性塩である。陽イオンと反応することができる酸性側鎖を有する重合体の例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸との共重合体、ポリ（酢酸ビニル）及びスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化された重合体である。また、アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテル単量体又は重合体との反応によって生じた酸性側鎖を有する共重合体を使用することができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基及びハロゲン化された（好ましくは、フッ素化された）アルコール基、フェノール性OH基及び酸性OH基である。
【００９９】
本発明の胎盤幹細胞又はその共培養は、三次元フレームワーク又は足場上に播種すること、及びインビボ移植することができる。このようなフレームワークは、任意の1つ以上の成長因子、細胞、薬物、又は組織形成を刺激するか、若しくはさもなければ本発明の実施を増強、若しくは改善するその他の成分と組み合わせて移植することができる。
【０１００】
本発明に使用することができる足場の例には、不織マット、多孔性発泡体又は自己構築ペプチドを含む。不織マットは、グリコール酸及び乳酸の合成の吸収性共重合体で構成された線維を使用して形成することができる（例えば、PGA/PLA）（VICRYL, Ethicon社、Somerville, N.J.）。発砲体は、例えばポリ（ε-カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（PCL／PGA）共重合体で構成され、凍結乾燥(freeze-drying)又は凍結乾燥(lyophilization)（例えば、米国特許第6,355,699号を参照されたい）などの過程によって形成され、足場としても使用することができる。
【０１０１】
また、本発明の胎盤幹細胞は、モノリン酸、ジリン酸、トリリン酸、α-トリリン酸、β-トリリン酸及びテトラリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、マグネシウムリカルシウムホスフェート、バイオガラス（BIOGLASS）（登録商標）などの生物学的に活性なガラス及びこれらの混合物を含むが、限定されない生理的に許容し得るセラミック材料上に播種するか又はこれらと接触させることができる。現在市販の多孔性生体適合性セラミック材料には、サージボーン（SURGIBONE）（登録商標）（CanMedica 社, Canada）、エンドボン（ENDOBON）（登録商標）（Merck Biomaterial France社, France）、セロス（CEROS）（登録商標）（Mathys, AG社, Bettlach, Switzerland）及びヒーロス（HEALOS）（商標）（DePuy社, Raynham, MA）及びビトス（VITOSS）（登録商標）、ラコス（RHAKOSS）（商標）及びコルトス（CORTOSS）（登録商標）（Orthovita社, Malvern, Pa.）などのミネラル化コラーゲン骨移植製品を含む。フレームワークは、天然及び／又は合成材料の混合物、混合又は複合体であることができる。
別の実施態様において、胎盤幹細胞は、例えばPGA、PLA、PCL共重合体若しくは混合物などの生体吸収性材料又はヒアルロン酸から作製されるマルチフィラメント糸で構成することができるフェルト上へ播種するか又は接触させることができる。
【０１０２】
本発明の胎盤幹細胞は、別の実施態様において、複雑な構造であってもよい発泡体足場上へ播種することができる。このような発泡体足場は、修復、置換又は増大される本体の一部の特異的な構造のものなど、有用な形状に成形することができる。幾つかの実施態様において、フレームワークは、細胞接着性を増強するために、本発明の細胞の接種より前に、例えば0.1M 酢酸で処理し、続いてポリリジン、PBS及び／又はコラーゲン中でインキュベーションされる。マトリックスの外面は、マトリックスを血漿コーティングすることにより、又は1つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン-4-サルフェート、コンドロイチン-6-サルフェート、デルマタンサルフェート、ケラチンサルフェートなど）、細胞マトリックス及び／又はゼラチン、アルギナート、寒天、アガロース及び植物ゴム質、その他であるが、これらに限定されないその他の材料の添加などにより、細胞の接着又は成長及び分組織化を改善するために修飾してもよい。
【０１０３】
幾つかの実施態様において、足場は、該足場に非血栓形成性を与える材料を含むか、又は前記材料で処理される。また、これらの処理及び材料は、内皮増殖、遊走及び細胞外基質沈着を促進し、及び持続し得る。これらの材料及び処理の例には、ラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然の材料、EPTFEなどの合成材料、並びにパースパン（PURSPAN）（商標）（The Polymer Technology Group社、Berkeley, Calif.）などのセグメント型ポリウレタンウレアシリコーンを含むが、これらに限定されない。また、足場には、ヘパリンなどの抗血栓薬を含むことができ；また、足場は、胎盤幹細胞で播種する前に、表面電荷を変化させるために処理（例えば、血漿でのコーティング）することができる。
【０１０４】
（5.6.2 不死化された胎盤幹細胞系）
哺乳動物胎盤細胞は、成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を外部因子によって調節可能であるように、成長促進遺伝子、すなわち適切な条件下でトランスフェクト細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の適切なベクターでのトランスフェクションによって条件つきで不死化することができる。好ましい実施態様において、成長促進遺伝子は、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス又はヒト乳頭腫ウイルスのE7タンパク質などであるが、これらに限定されない発癌遺伝子である。
【０１０５】
成長促進タンパク質の外部制御は、外部から調節可能なプロモーター、例えばその活性を、例えばトランスフェクト細胞の温度又は細胞と接触する培地の組成を修飾することによって制御することができるプロモーターの制御下に成長促進遺伝子を置くことによって達成することができる。一つの実施態様において、テトラサイクリン（tet）で制御される遺伝子発現系を使用することができる（Gossenらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaruらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996を参照されたい）。tetの非存在下では、このベクター内のtetで制御されるトランス活性化因子（tTA）は、tetオペレーター配列に融合されたヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるphcmv*-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌（Escherichia coli）のトランスポゾン-10由来tet耐性オペロンのリプレッサー（tetR）と単純ヘルペスウイルスのVP16の酸性ドメインとの融合タンパク質である。tetの低く無毒な濃度（例えば、0.01〜1.0μg/ml）では、tTAによるトランス活性化をほぼ完全に消滅させる。
【０１０６】
一つの実施態様において、ベクターは、選択可能なマーカー、例えば薬物耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子を更に含む。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（neoR）は、本発明に使用してもよい１つのそのようなマーカーである。neoRを有する細胞は、例えば増殖培地に対する100〜200μg/mL G418の添加などの当業者に公知の手段によって選択してもよい。
【０１０７】
トランスフェクションは、レトロウイルスの感染を含むが、これに限定されない任意の当業者に公知の種々の手段によって達成することができる。一般に、細胞培養は、ベクターのための産生株化細胞から収集される条件培地とN2補充を含むDMEM／F12との混合物と共にインキュベーションすることによってトランスフェクトしてもよい。例えば、上記の通りに調製された胎盤細胞培養を、例えば、1体積の条件培地及び2体積のN2補充を含むDMEM／F12における約20時間のインキュベーションによって、インビトロにて5日後に感染させてもよい。次いで、選択可能なマーカーを有するトランスフェクト細胞を上記の通りに選択してもよい。
【０１０８】
トランスフェクション後、培養を、増殖可能な表面上で継代して、例えば24時間で少なくとも細胞の30%を二倍にさせる。好ましくは、基体は、ポリオルニチン（10μg/ml）及び／若しくはラミニン（10μg/mL）、ポリリジン／ラミニン基体又はフィブロネクチンで処理した表面でコートされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基体である。次いで、培養には、増殖培地を3〜4日毎に供給し、これには、1つ以上の増殖増強因子を補充しても、又はしなくてもよい。増殖増強因子は、培養が50%未満コンフルエントである場合、増殖培地に添加してもよい。
【０１０９】
条件つきで不死化した胎盤幹細胞株は、80〜95%コンフルエントのときに、トリプシン処理などにより、標準的な技術を使用して継代することができる。およそ第20継代まで、幾つかの実施態様において、（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞に対するG418の添加によって）選択を維持することが有益である。また、細胞は、長期貯蔵のために液体窒素中で凍結させていてもよい。
【０１１０】
クローン株化細胞は、上記の通りに調製した条件つきで不死化されたヒト胎盤幹細胞株から単離することができる。一般に、このようなクローン株化細胞は、限外希釈によるか、又はクローニング環を使用するなど、標準的技術を使用して単離して、増殖させてもよい。クローン株化細胞は、一般に上記の通りに供給して、継代してもよい。
【０１１１】
条件つきで不死化させたヒト胎盤幹細胞株は、クローンであってもよいが、必要ではなく、一般に分化を促進する培養条件下で、成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を抑制することによって、分化するように誘導してもよい。例えば、成長促進タンパク質をコードする遺伝子が、外部から調節可能なプロモーターの制御下である場合、条件、例えば培地の温度又は組成を修正して、成長促進遺伝子の転写を抑制してもよい。上で議論したテトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、テトラサイクリンを添加して成長促進遺伝子の転写を抑制することにより、分化を達成することができる。一般に、分化を開始するためには、4〜5日間で1μg/mlのテトラサイクリンで十分である。更に分化を促進するために、更なる薬剤を増殖培地に含めてもよい。
【０１１２】
（5.6.3 アッセイ法）
本発明のための胎盤幹細胞をアッセイ法に使用して、幹細胞増殖、増大及び／又は分化における培養条件、環境要因、分子（例えば、生体分子、小無機分子など）及びその他のものの影響を、このような条件に曝露されない胎盤幹細胞と比較して決定することができる。
好ましい実施態様において、本発明の胎盤幹細胞は、分子との接触による増殖、増大又は分化の変化についてアッセイされる。一つの実施態様において、例えば、本発明は、複数の胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物を同定する方法であって、前記複数の幹細胞を、増殖が可能な条件下で前記化合物と接触させることを含み、前記化合物が前記化合物と接触されない複数の幹細胞と比較して、前記複数の幹細胞の増殖の検出可能な変化を生じさせる場合、前記化合物は、胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物として同定される、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記化合物は、増殖の阻害剤として同定される。別の具体的実施態様において、前記化合物は、増殖のエンハンサーとして同定される。
【０１１３】
別の実施態様において、本発明は、複数の胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物を同定する方法であって、前記複数の幹細胞を、増殖が可能な条件下で前記化合物と接触させることを含み、前記化合物が前記化合物と接触しない複数の幹細胞と比較して、前記複数の幹細胞の増殖に検出可能な変化を生じさせる場合、前記化合物は、胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物として同定される、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記化合物は、増殖の阻害剤として同定される。別の具体的実施態様において、前記化合物は、増殖のエンハンサーとして同定される。
【０１１４】
別の実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞の分化を調整する化合物を同定する方法であって、前記幹細胞を、分化が可能な条件下で前記化合物と接触することを含み、前記化合物が前記化合物と接触しない幹細胞と比較して、前記幹細胞の分化に検出可能な変化を生じさせる場合、前記化合物は、胎盤幹細胞の増殖を調整する化合物として同定される、前記方法を提供する。具体的実施態様において、前記化合物は、分化の阻害剤として同定される。別の具体的実施態様において、前記化合物は、分化のエンハンサーとして同定される。
【０１１５】
（5.6.4 胎盤幹細胞バンク）
分娩後の胎盤からの幹細胞を多数の異なる方法で培養して、胎盤幹細胞のロットのセット、例えば個体に投与可能な用量のセットを作製することができる。このようなロットは、例えば胎盤の灌流液からの幹細胞から、又は酵素消化された胎盤の組織から得ることができる。複数の胎盤から得られる胎盤幹細胞のロットのセットは、例えば長期貯蔵のために胎盤幹細胞のバンクに置いておくことができる。一般に、接着性幹細胞を胎盤材料の初期培養から得て、種培養を形成し、これを一定条件下で増殖させて、およそ倍加と同等の数から細胞の集団を形成させる。ロットは、好ましくは単一の胎盤の組織に由来するが、複数の胎盤の組織に由来することもできる。
【０１１６】
一つの実施態様において、幹細胞ロットは、以下の通りに得られる。胎盤組織を最初に、例えば細かく切り刻むことによって崩壊させて、適切な酵素、例えばコラゲナーゼで消化する（上記第5.2.3節、を参照されたい）。胎盤の組織は、好ましくは単一の胎盤からの、例えば羊膜全体、絨毛膜全体又は両方を含むことができるが、羊膜又は漿膜の一部のみを含むこともできる。消化された組織を例えば約1〜3週間、好ましくは約2週間培養する。
非接着細胞の除去の後、形成する高密度コロニーを、例えばトリプシン処理によって収集する。これらの細胞を収集し、都合のよい培地の体積に再懸濁して、継代0の細胞として定義した。
【０１１７】
次いで、継代0の細胞を、増殖培養に播種するために使用する。増殖培養は、別々の細胞培養装置、例えばNUNC（商標）による細胞工場（Cell Factory）の任意の設備であることができる。継代0培養の細胞は、例えば1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、10×104個の幹細胞で、増殖培地を播種するように、任意の程度に細分することができる。好ましくは、約2×104〜約3×104個の継代0細胞が、それぞれの増殖培養に播種するために使用される。増殖培養の数は、継代0細胞の数に依存し得るし、幹細胞が得られる特定の胎盤に応じて、数がより多くても又はより少なくてもよい。
【０１１８】
増殖培養は、培養における細胞の密度が特定の値、例えば、約1×105細胞/cm2に到達するまで培養される。細胞は、この時点で収集及び凍結保存するか、又は上記の通りの新たな増殖培養において継代することができる。細胞は、使用前に、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、l9又は20回継代することができる。集団倍加の累積数の記録は、好ましくは増殖培養の間維持される。継代0培養からの細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38若しくは40回の倍加の間、又は60回までの倍加のために増殖させることができる。しかし、好ましくは、集団倍加の数は、細胞の集団を個々の用量に分ける前に、約15〜約30回の間、好ましくは約20回の倍加である。細胞は、増殖工程の全体にわたって連続して培養することができ、又は増殖の間の1つ以上の位置にて凍結することができる。
個々の用量のために使用される細胞は、あとで使用するために凍結させること、例えば凍結保存することができる。個々の用量は、例えば1mlあたり約1,000,000〜約100,000,000個の細胞を含むことができ、合計で約106〜約109個の間の細胞を含むことができる。
【０１１９】
本方法の具体的実施態様において、継代0細胞は、およそ4回の倍加の間培養され、次いで第1の細胞バンクに凍結させる。第1の細胞バンクからの細胞を凍結し、第2の細胞バンクを播種するために使用し、その細胞を更に約8回の倍加の間増殖させる。この段階で細胞を収集して、凍結し、新たな増殖培養を播種するために使用して、これを更に約8回の倍加の間進行させて、約20回の細胞倍加の累積数にする。継代の中間地点の細胞は、その後の増殖培養に使用するために、1mlあたり約100,000〜約10,000,000個の細胞、好ましくは1mlあたり約1,000,000個の細胞の単位で凍結される。約20回の倍加細胞は、幹細胞含有組成物を投与又は作製するのに使用するために、1mlあたり約1,000,000〜約100,000,000細胞の間の個々の用量で凍結させることができる。
【０１２０】
好ましい実施態様において、胎盤が得られるドナー（例えば、母）は、少なくとも１つの病原体について試験される。母が試験された病原体について陽性反応を示す場合、該胎盤からの全てのロットを廃棄する。このような試験は、継代0細胞の確立の前後又は増殖培養の間を含む胎盤幹細胞ロットの産生の間にいつでも行うことができる。存在が試験される病原体には、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、ヒト免疫不全症ウイルス（I型及びII型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、その他を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１２１】
（5.6.5 多発性硬化症の治療）
別の態様において、本発明は、多発性硬化症又は多発性硬化症に関連した症候を有する個体を治療する方法であって、個体に対して複数の胎盤幹細胞を、個体における免疫応答を検出可能に調節する、例えば抑制するのに十分な量で、及び十分な時間投与することを含む、前記方法を提供する。
【０１２２】
多発性硬化症（MS）は、中枢神経系の慢性の、再発性の炎症性疾患である。本疾患は、CNS及びPNS軸索を囲む髄鞘、オリゴデンドロサイト及び神経細胞それ自体に傷害を生じる。本疾患は、細胞の接着分子及び炎症誘発性サイトカインの影響の下で、増殖して、血液脳関門を越えて、CNSに入る自己反応性T細胞、特にCD4+T細胞によって媒介される。MSの症候には、肢の感覚障害、視覚神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸機能障害、性機能障害、運動失調及び複視が含まれる。
【０１２３】
4つの異なるタイプのMS又はMSの臨床経過が同定されている。最初に、再発性／鎮静性MS（RRMS）は、数日〜数週の期間にわたって急性的に現れる神経性の機能障害の自己制御発作、続いて、時には不完全な、数月にわたる回復段階によって特徴づけられる。第2のタイプの、二次進行性MS（SPMS）は、RRMSとして開始するが、臨床経過が急性発作とは無関係な機能で着実に悪化することによって特徴づけられるようになる。第3の一次進行性MS（PPMS）は、急性の発作を伴わずに発病から機能の着実な減退によって特徴づけられる。また、第4のタイプの進行性／再発性のMS（PRMS）も進行性の経過で開始し、進行性の機能の減退と重なった不定期の発作を伴う。
【０１２４】
MSを有する人は、一般に運動性技術評価を使用して、任意にMRIで評価される。例えば、１つの運動性評価技術である、拡大能力障害状態スケール（the expanded disability status scale）では、以下の通りに、罹患者の能力の段階的にスコアする：
0.0  正常な神経学的検査
1.0  障害なし、1つのFSの最小の徴候
1.5  障害なし、複数FSの最小の徴候
2.0  1つのFSの最小の障害
2.5  1つのFSの軽度の障害又は2つのFSの最小の障害
3.0  1つのFSの中等度の障害又は3つ若しくは4つのFSの軽度の障害。十分に移動できる。
3.5  十分に移動できるが、1つのFSの中等度障害及びいくつかのその他の最小の障害を伴う
4.0  補助を伴わずに十分に移動、自分のことは自分でできる、相対的に重篤な障害にもかかわらず、1日につき約12時間活動している；約500メートル補助なしに、又は休まずに歩くことができる
4.5  補助を伴わずに十分に移動、1日の多くは活動している、丸一日働くことができる、さもなければ完全な活動にいくらかの制限を有するか、最小限の介助を必要とするであろう；相対的に重篤な障害によって特徴づけられる；約300メートル補助なしに、又は休まずに歩くことができる
5.0  約200メートル補助なしに、又は休まずに移動；丸１日の活動（特別な準備がなくても丸１日働く）を障害するほどの重篤な障害
5.5  約100メートル補助なしに、又は休まずに移動；丸１日の活動を妨げるほど重篤な障害
6.0  休憩を伴い又は伴わずに約100メートル歩くために、断続的又は片側の一定の補助（杖、松葉杖、装具）が必要
6.5  休憩を伴い又は伴わずに約20メートル歩くために、一定の両側の補助（杖、松葉杖、装具）が必要
7.0  補助を伴ってもおよそ5メートルを越えて歩くことができない、本質的に車椅子に制限される；標準的な車椅子を自分で動かして、単独で移動する；1日につき約12時間車椅子で活動している
7.5  数歩以上進むことができない；車椅子に制限される；移動の際の補助が必要であろう；自分で動かすが、標準的な車椅子を丸一日続けることができない；動力付車椅子が必要であろう
8.0  本質的にベッド若しくは椅子に制限されるか、又は車椅子で巡回だが、1日の大半はベッド自体の外にいるであろう；多くのセルフケア機能を持つ；一般に、腕の使用は有効
8.5  本質的に1日の大半はベッドに制限される；腕の使用はいくらか有効で、いくらかのセルフケア機能を持つ
9.0  ベッドに制限される；なおもコミュニケーションをとり、食べることができる
9.5  全くどうすることもできないベッド患者；事実上コミュニケーションをとることや、食べて／嚥下することができない
10.0  MSによる死。
【０１２５】
上記評価法において、「FS」は、錐体、小脳、脳幹、感覚、腸及び膀胱、視覚、大脳及びその他の系を含む8つの測定される機能的な系をいう。
【０１２６】
Scripps神経評価スケール、移動インデックス及び多発性硬化症機能合成得点（MSFC）を含むその他の、同様の評価法が公知である。
また、MSの進行度は、罹患率の測定によっても評価した。
また、MSの進行度は、磁気共鳴映像法によっても評価し、これにより、MSと関連した神経病変（例えば、新たな病変、増強病変又は独特の活発な病変の組み合わせ）を検出することができる。
【０１２７】
従って、一つの実施態様において、本発明は、MSを有する個体、及び例えばMSと診断された個体を治療する方法であって、個体に複数の胎盤幹細胞を投与することを含み、前記胎盤幹細胞はオリゴデンドロサイトへ分化し得る、例えば該個体内でオリゴデンドロサイトへ分化する、前記方法を提供する。具体的実施態様において、投与することにより、個体におけるMSの1つ以上の症候を検出可能に改善する。より具体的実施態様において、症候は、例えば肢の感覚障害、視覚神経機能障害、錐体路機能障害、膀胱機能障害、腸機能障害、性的機能不全、運動失調又は複視の1つ以上である。別の具体的実施態様において、前記投与により、少なくとも半分の時点のEDSSスケールでの改善をもたらす。別の具体的実施態様において、前記投与により、少なくとも１つの時点のEDSSスケールでの改善をもたらす。別の具体的実施態様において、前記投与により、少なくとも2つの時点のEDSSスケールでの改善をもたらす。その他の具体的実施態様において、前記投与により、多発性硬化症評価スケールでの、又はMRIでの検出可能な改善をもたらす。
【０１２８】
MSは、その他の治療薬、例えば免疫調節薬又は免疫抑制薬、例えばIFNβ-1a及びIFN-1bを含むインターフェロンβ（IFNβ）；グリアトリアマー（gliatriamer）アセテート（コパキソン（Copaxone））；シクロホスファミド；メトトレキセート；アザチオプリン（イムラン（Imuran））；クラドリビン（ロイスタチン（Leustatin））；シクロスポリン；ミトキサントロン；その他で治療されてきた。また、MSは、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、メチルプレドニゾロン、デキサメサゾン、その他を含む糖質コルチコイドなどの抗炎症薬治療薬で治療されてきた。また、MSは、静脈免疫グロブリン、血漿交換法又はスルファサラジンなどのその他のタイプの治療薬で治療されてきた。
【０１２９】
従って、本発明は、MSを有する個体、例えばMSを有すると診断された個体の治療であって、該個体に複数の胎盤幹細胞及び1以上の治療剤を投与することを含み、前記投与は該個体におけるMSの1つ以上の症候を検出可能に改善し、並びに前記胎盤幹細胞はオリゴデンドロサイトへ分化し得る、例えば該個体内でオリゴデンドロサイトへ分化する、前記治療を更に提供する。一つの実施態様において、治療薬は、糖質コルチコイドである。具体的実施態様において、糖質コルチコイドは、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、メチルプレドニゾロン又はデキサメサゾンである。別の実施態様において、治療薬は、免疫調節薬又は免疫抑制薬である。種々の具体的実施態様において、免疫調節薬又は免疫抑制薬は、IFNβ-1a、IFN-1b、グリアトリアマーアセテート、シクロホスファミド、メトトレキセート、アザチオプリン、クラドリビン、シクロスポリン又はミトキサントロンである。その他の実施態様において、治療薬は、静脈免疫グロブリン、血漿交換又はスルファサラジンである。別の実施態様において、個体には、前述の治療薬の任意の組み合わせが投与される。
【０１３０】
MSを有する個体、例えばMSと診断された個体は、疾患の進行の間の任意の時点で、複数の胎盤幹細胞及び任意に1つ以上の治療薬で治療することができる。例えば、個体は、診断の直後に、又は診断の1、2、3、4、5、6日以内に、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50週以上の内に、又は診断後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年以上の内に治療することができる。個体は、疾患の臨床経過の間に一回又は複数回治療することができる。個体は、必要に応じて、急性発作の間に、緩解の間に、又は慢性退行期の間に治療することができる。別の実施態様において、胎盤幹細胞は、分娩後、緩解の状態を維持し、又は妊娠中に経験した再発の発生を減少させるために、MSを有する女性に投与される。
【０１３１】
一つの実施態様において、個体には、約300,000,000個の胎盤幹細胞の用量が投与される。しかし、投薬量は、個体の身体特徴、例えば重量に応じて変更することができ、用量あたり1,000,000〜10,000,000,000個の胎盤幹細胞、好ましくは用量あたり10,000,000〜1,000,000,000個の間又は用量あたり100,000,000,000〜50,000,000個の胎盤幹細胞の範囲であり得る。投与は、好ましくは静脈内であるが、生細胞の投与のための任意の当該技術分野において承認された経路によることができる。一つの実施態様において、胎盤幹細胞は、細胞バンクからのものである。
【実施例】
【０１３２】
（6.実施例）
（6.1 実施例1：オリゴデンドロサイト維持培地）
オリゴデンドロサイトを維持するための代表的な培地は、以下の通りである 。好ましい培地は、齧歯類OL系統細胞の維持のために最適化された無血清製剤である。塩基培地（R1236）には、（Sigma社）、1mM ピルビン酸ナトリウム、抗生物質（ペニシリン-ストレプトマイシン）、0.05μg/mL インスリン（グルコース輸送物質を刺激するため）、100μg/mLのトランスフェリン（鉄の取り込み）、30nMセレン（代謝コファクター）、10μMフォルスコリン（cAMP）、60μg/mL N-アセチルシステイン（レドックス、生存）及び5μg/mL ウシ血清アルブミン（担体タンパク質）を補ったDMEM高グルコースを含む。齧歯類オリゴデンドロサイト前駆細胞を、増殖及び自己更新を促進するために、分裂促進因子を補ったR1236を使用して維持する（10ng/mL PDGF-AAプラス5ng/mL FGF2又は20% v：v B104条件培地）。オリゴデンドロサイト分化を促進するために、分裂促進因子を含む培地を10μg/mL ウシインスリン更に5μg/mL T3（トリヨードスレオニン）を含むR1236で置換して、これらの両方は、齧歯類オリゴデンドロサイトのための生存因子及び成熟因子である。培地に含まれるすべての成長因子は、組換え（ヒト）ポリペプチド（R&D 社）であり、B104-cmは、50%コンフルエンスにて培養し、次いでR1236に48時間曝露した神経芽腫細胞（ATCC社から入手可能）から調製される。次いで、この条件培地を濾過し、一定分量を使用まで-30℃にて貯蔵する。B104は、Salk InstituteのDave Schubert（Schubertらの論文、Nature 249：224-227（1974））によって確立された多数の神経細胞株の1つであり、齧歯類オリゴデンドロサイト前駆細胞の生存及び自己複製を補助する因子を分泌する。
【０１３３】
（6.2 実施例2：酵素消化によって胎盤から幹細胞を得る）
酵素消化によって胎盤組織から幹細胞を得るための例示的プロトコルは、以下の通りである 。凍結した胎盤組織（それぞれおよそ1×1×0.5cmまでの3片）を得る。組織は、臍帯、胎盤母体面又は羊膜である。使用する消化酵素には、トリプシン-EDTA（0.25%、GIBCO BRL社）；コラゲナーゼIA（Sigma社）、コラゲナーゼI（Worthington社）、コラゲナーゼ1A（Sigma社）+トリプシン-EDTA、コラゲナーゼ1（Worthington社）+ トリプシン-EDTA、又はエラスターゼ + コラゲナI + コラゲナIV + ダスパーゼ（Daspase）（Worthington社）を含む。胎盤組織の消化は、以下の通りである。組織を酵素（50mlのチューブ中、10mlに1g）の存在下において37℃にて、250rpm振盪、45°の角度のチューブ位置にて、1時間切り刻む（C25 Incubator Shaker、New Brunswick Scientific社、Edison、NJ、USA）。次いで、上清を廃棄する。ペレットを20ml Hank+ 5% FCS（3回）で洗浄し、12mlの培地に再懸濁する。生じる3mlの懸濁液を10mlの培地を含むT-75フラスコにそれぞれ分注する（消化あたり4フラスコ）。任意に、10mlのトリプシン/EDTAを、37℃にて30分間、 250rpmにて振盪しながら添加し、再遠心して、10ml Hank+ 5%のFCSで更に洗浄する。細胞をプレートにまいて培養し、接着細胞を選択する。
【０１３４】
（6.3 実施例3：オリゴデンドロサイト前駆体系統アッセイ法）
OPCの出現、成熟及び分化は、免疫化学及び転写物発現によって決定することができる。免疫化学用に、ガラスカバーガラス上で培養している細胞を、特定の濃度の成長因子を含む培地中でインキュベートする。1〜7日後にカバーガラスをはがし、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、次いで系統特異的抗体を使用して特徴づける（表1）。染色を、蛍光タグ（Alexa Fluor、Molecular Probes 社）に結合した二次抗体を使用して検出し、蛍光顕微鏡によって視覚化する。二次抗体単独をネガティブ対照として使用する。免疫反応性である細胞の比率は、カバーガラスあたり200までの細胞を計数することによって決定されるであろう。
【０１３５】
【表１】
2009511058.tif 000003
免疫組織化学的研究は、特異的培養条件下での転写物発現の解析にまで進展してきた。RNA解析には、ノーザンブロット（McKinnonらの論文、1990）及びRT-PCR（McKinnonらの論文、1993b）を使用する。60mmのプレート中で培養している細胞を回収して、RNAをTRIzol試薬（Gibco社）で収集する。RT-PCRについては、cDNAへと逆転写された1μｇのRNAを用いて解析を行う（MoMuLV逆転写酵素；1：1 cDNAの収率）。次いで、50〜100ng cDNAを、PCR増幅のための鋳型としてTaq ポリメラーゼ及び記述されたようなプライマー選択プログラムを使用して選択した合成プライマーと共に使用する （例えば、McKinnonらの論文、Glia 7：245-254 （1993）を参照されたい。）。 プライマーは、系統特異的オリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト前駆体タンパク質をコードする転写物に対してハイブリダイズするように構築する。新たなプライマー対については、勾配（±10℃）を使用して、最適な増幅パラメーターを確立する。PCR断片を電気泳動法によって分離して、臭化エチジウム染色によって視覚化し、これらの同一性を自動化されたDNA配列解析（DNAコア機能）によって確認する。
【０１３６】
（6.4 実施例4：増殖、遊走及び生存アッセイ法）
増殖アッセイ法：オリゴデンドロサイト前駆体が 特異的リガンドに対して分裂促進反応を生じる能力は、定量的3H-チミジン取り込みアッセイ法で測定される。最大半減反応を決定するために、細胞を、 FGF及びPDGFに対する最大応答の範囲の用量範囲で、成長因子に曝露する。反応は、500〜1000cpm（成長因子がない）〜10,000cpm（組換えPDGF-AA）のバックグランドの範囲に及び、本アッセイ法は、部分的な分裂促進反応を正確に検出するのに十分に感受性である。すべての細胞増殖アッセイ法は、少なくとも独立して3回、任意に行われる。定性的アッセイ法用に、細胞を分裂促進因子に対して、最後の4時間は50μM BrdU（Sigma社）の存在下で暴露して、DNA合成をBrdU（Osterhoutらの論文、J. Neurosci. 17：9122-9132 （1997））及び第2の系統マーカーについての二重免疫蛍光によってモニターする。
【０１３７】
増殖アッセイ法は、DNA合成のバックグランドレベルを減少させるために、組換え成長因子に対する曝露の24時間前に、分裂促進因子から除去した細胞で行う。本明細書に記述した増殖アッセイ法では、成長因子に対する曝露に依存したこのアッセイ法の最後の4時間の間の3H-チミジンの取り込みと共に、DNA合成の増加によって分裂促進因子に対する反応を測定する。96ウェルプレート（2,000個細胞／ウェル）の細胞を成長因子を欠いたR1236培地中で24時間、次いで因子の特定の濃度の存在下において24時間、最後の4時間は、0.5μCi/mlの3H-チミジン（Amersham社）の存在下でインキュベートする。核酸を、自動収集機（Brandel）使用して回収し、取り込まれた放射能をシンチレーション計数によって測定する。アッセイ法は、それぞれの成長因子濃度について、三通り（3ウェル）実行する。
【０１３８】
遊走アッセイ法：OPCが遊走する能力（走化性）及び成長因子に応答するこれらの方向反応を映画撮影技術によって測定する。定量的アッセイ法には、修正Boydenチャンバーアッセイ法（Armstrongらの論文、1990）を使用する。このアッセイ法では、走化性チャンバーの上下の両方のウェルに誘引剤を添加することによって（それは、走化性を無くすが、ケモキネシスでは無くさない）、PDGF-AAを媒介した走化性（4,000個の細胞/mm2）をバックグランド遊走（1,000個の細胞/mm2）から、及びケモキネシス（ランダムな運動性）から区別することができる（Armstrongらの論文、J. Neurosci. Res. 27:400-407 (1990)を参照されたい）。
【０１３９】
細胞を分裂促進因子を欠いた培地中で16時間培養し、次いで該細胞を、培地と更に誘引剤を含む下部チャンバーから分離するポリカーボネートフィルターを備える、特定培地における微小走化性チャンバーのウェル（20,000個の細胞/ウェル）の上部に移す。成長因子は、それぞれの濃度について三通りのウェルに与えて、細胞を37℃にて16時間インキュベートする。フィルターの下側に遊走したmm2あたりの細胞の数を、GFPタグを付けた細胞を計数することによって決定し、Dip-Quik（American Scientific社）で膜を染色後に総遊走を決定する。
【０１４０】
生存アッセイ法：個々のOPCの生存は、MTTアッセイ法（Mosmannの論文、1983）、及び（Yasudaらの論文、J. Neurosci. Res. 40：306-317 （1995））に記載されているように、修飾TUNELアッセイ法（Gavrieliらの論文、J. Cell. Biol. 119：493-501（1992））を使用するクロマチン断片化（ヌクレオソームラダー形成）を使用して測定される。細胞を、bFGF、PDGF-AAを含むか、又は成長因子なしの培地中で24時間の間培養し、MTTを取り込む細胞の数、又はニック末端標識のレベルを、突然変異体と野生型OL培養物との間で比較する。PI3K阻害剤ワートマニンを細胞死用のポジティブ対照として使用する（Ebnerらの論文、J. Neurosci. Res. 62：336-345 （2000））。
【０１４１】
MTTアッセイ法を、96ウェルプレートで培養している細胞で実施し、以前に記述されたように（Barresらの論文、Cell 70：31-46（1992））、染色された細胞を計数することによって標識された細胞の比率を決定する。 bFGF及びPDGF-AAがDNA断片化を妨げる能力は、これらの因子の有無において濃度を増加させて培養している細胞からのクロマチンDNAの解析によって決定する。定量分析については、96ウェルプレートで培養している細胞を4単位末端転移酵素（Promega Biotech社）、2μCi[α-32P])-ジデオキシATP（Amersham社）及び0.3%のTriton X-100を含むPBS中で37℃にて60分間インキュベートし、次いで、細胞可溶化物をWhatman GF/Cフィルター（Brandel Cell Harvester）で収集し、DNAの3'末端のへの32P取り込みを液体シンチレーション計数によって決定する。本アッセイ法は、酵素依存的であり、10,000cpmのバックグランド及び1μMスタウロスポリン（Ebner、2000）の存在下において72時間培養された細胞において100,000cpmの取り込みを示す。ヌクレオソームラダー形成の定性分析のためには、DNAを35mmディッシュで培養している細胞から単離し、末端転移酵素及び32P-ddATPでインビトロにて末端標識し、アガロースゲルでサイズ分離してヌクレオソームサイズ断片を分離し、放射能の取り込みを濃度測定によって決定する。
【０１４２】
（6.5実施例5：フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーのための細胞内染色を行うために、およそ5×105個のPDSCを、0.5mLのBeckman Coulter IntraPrep試薬で15分間透過化させる。PBSでリンス後、細胞を氷上で一次抗体（1g）と共に30分間インキュベートし、続いて 2回洗浄する。細胞を1：100の二次抗体中に再懸濁し、30分間インキュベートする。染色後に、細胞を2回洗浄し、直ちにBeckmanCoulter XL-MCLフローサイトメーターで解析する。未処置及びIBMX誘導した細胞におけるタンパク質発現を評価するために、 1.5× 10×104個の細胞をFL1（FITC）及びFL2（CY3）シグナルを使用して収集する。死細胞及び細片は、高い前方及び直交光散乱ウインドウ使用することにより、又はヨウ化プロピジウム（PI）排除によって除去する。
【０１４３】
マウス、ウサギ及びロバ一次抗体及び最終希釈は、以下の通りである：ウサギ抗ネスチン、1：100（BD PharMingen）；マウス抗ニューロン特異的エノラーゼ、1：100（Chemicon社）；マウス抗ミエリン／オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、1：100（DAKO）；マウス抗-神経フィラメント-L、1：100（DAKO社）；ウサギ抗グリア原線維酸性タンパク質、1：200（DAKO社）；マウス抗ビメンチン、1：100（BD PharMingen社）。
フローサイトメトリー実験に使用される以下の抗体は、Becton Dickinson社から入手可能であり、1：10希釈で使用する：抗CD45、抗CD34、抗CD29、抗CD10、抗HLA-1、抗CD54、抗CD90、抗SH2及び抗SH3。
【０１４４】
細胞をポリオルニチンコートしたガラスカバーガラス（Sigma社）上にて10% FCSを含むDMEM中でインキュベートする。細胞を4%のパラホルムアルデヒドのPBS溶液で10分間固定し、0.2%のTriton X-100のPBS溶液でRTにて10分間透過させる。次いで、細胞を一次抗体で37℃にて30分間インキュベートする。PBSで3回洗浄後、細胞をフルオレッセイン（FITC)-抱合ロバ抗マウスIgG（Jackson Laboratories社）又はCy3抱合ヤギ抗ウサギIgG（Jackson Laboratories社）のいずれかと共に、両方とも1：50希釈にて、37℃の暗下で30分間インキュベートする。標識された細胞を洗浄し、Vectashield封入剤（Vector Laboratories社）で包埋する。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】オリゴデンドロサイト前駆細胞成熟（McMorris & McKinnonの文献, Brain Pathology 6:313-329 (1996)）。抗原の一過性出現は、遊走性の「初期」（O2A）前駆体から非遊走性の「後期」（O4、プロ-オルブラスト（pro-OLblasts））及び有糸分裂後のOLへの進行を特徴づける。成熟は、示した因子により可逆的に阻害すること（ζ）又は逆転させること（7）ができる。モノクローナル抗体及び標的抗原が、表1に概説されている。
【図２】ヒト胎盤幹細胞。左：初代培養において形成された胎盤幹細胞コロニー。右：イソブチルメチルキサンチン（IBMX、アデノシン作動薬活性も有する、ホスホジエステラーゼの非特異的阻害剤）で処理した胎盤幹細胞；免疫染色は、神経幹細胞マーカー（ビメンチン、GFAP、ネスチン）、並びにニューロン（神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ）及びグリア（ミエリンオリゴデンドロサイト特異的タンパク質（MOSP））系統進行の両方のためのマーカーを含む、神経系統マーカーの存在を示す。
【図１】
2009511058.tif 000004
【図２】
2009511058.tif 000005
【国際調査報告】
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2009511058.tif 000007
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