(57)【要約】  消化器多核体ウイルス（ＲＳＶ）を標的とする新規ポリクローナル抗体、およびＲＳＶと反応する新規な高親和性抗体が開示される。前記ポリクローナル抗体は、ＲＳＶタンパク質ＲおよびＲＳＶタンパク質Ｇの両方と反応する抗体分子を含んでもよく、好ましくは、前記ポリクローナル抗体は、これらのタンパク質の様々なエピトープを標的とする。本発明の単一の抗体分子は、ピコモル範囲で低い解離定数を提供する親和性を示すことが示される。本発明の抗体を産生する方法ならびにＲＳＶ感染のためのそれらの使用方法もまた開示される。
2009528828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳＶサブタイプＡおよびＢを中和することができる抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体であって、前記ポリクローナル抗体が、少なくとも１種のＲＳＶ外被タンパク質における少なくとも３種の異なるエピトープに一緒に特異的に結合する別個の抗体メンバーを含む、抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項２】
前記ポリクローナル抗体が、少なくとも２種のＲＳＶ外被タンパク質に対する特異的な反応性を一緒に提供する別個の抗体メンバーを含む、請求項１記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項３】
ＲＳＶ外被タンパク質が、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  ＳＨタンパク質から選択される、請求項１または２記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項４】
抗−外被タンパク質の反応性が抗−Ｇおよび抗−Ｆ反応性であり、前記反応性が少なくとも２種の別個の抗−Ｇ抗体および少なくとも１種の別個の抗−Ｆ抗体により提供される、請求項１から３のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項５】
第１の抗−Ｇ抗体が、Ｇ−タンパク質における保存されたエピトープに特異的に結合でき、第２の抗−Ｇ抗体が、Ｇ−タンパク質システインリッチドメイン（ＧＣＲＲ）に特異的に結合でき、ならびにＦ−反応性が、抗原部位Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、Ｃ、またはＦ１のうちの少なくとも１つに対して指向性である、請求項４記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項６】
少なくとも抗−Ｇ反応性の一部がＣＸ３Ｃモチーフに対して指向性である、請求項４または５記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項７】
抗−Ｇ反応性が、さらに少なくとも１種の株特異的なエピトープに対して指向性である、請求項４から６のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項８】
抗−Ｆ反応性が、少なくとも抗原部位ＩＩおよび抗原部位ＩＶに対して指向性である、請求項４から７のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項９】
抗−外被タンパク質の反応性が、請求項４から８に対して、または関して指向性であって、さらにＳＨタンパク質に対して指向性である、請求項１から８のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項１０】
別個の抗体メンバーの組成物が、ドナーにおけるＲＳＶ外被抗原に対する多様性、親和性および特異性に関する液性免疫応答を反映する、請求項１から９のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１から１０のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体であって、別個の抗体が、ＲＳＶに対する液性免疫応答を上げた一人またはそれ以上のヒトドナーから得られた核酸配列によりコードされ、前記ポリクローナル抗体が、十分にヒト抗体であるポリクローナル抗体。
【請求項１２】
別個の抗体メンバーが、ドナーに元々存在するＶＨおよびＶＬのペアーから構成される、請求項１０または１１記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項１３】
別個のメンバーが各々、表５に示されるＶＨおよびＶＬのペアーの群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、請求項１から１２のうちのいずれか記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体および医薬上許容される賦形剤を活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項１５】
哺乳動物においてＲＳＶ感染に関連する１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善する方法であって、前記哺乳動物に請求項１から１３のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体または請求項１４記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１６】
有効量が、体重ｋｇあたり抗体１００ｍｇまたはそれ以下であり、例えば、体重ｋｇあたり抗体９０ｍｇまたはそれ以下、８０ｍｇまたはそれ以下、７０ｍｇまたはそれ以下、６０ｍｇまたはそれ以下、５０ｍｇまたはそれ以下、４０ｍｇまたはそれ以下、３０ｍｇまたはそれ以下、２０ｍｇまたはそれ以下、１０ｍｇまたはそれ以下、９ｍｇまたはそれ以下、８ｍｇまたはそれ以下、７ｍｇまたはそれ以下、６ｍｇまたはそれ以下、５ｍｇまたはそれ以下、４ｍｇまたはそれ以下、３ｍｇまたはそれ以下、２ｍｇまたはそれ以下、１ｍｇまたはそれ以下、０．９ｍｇまたはそれ以下、０．８ｍｇまたはそれ以下、０．７ｍｇまたはそれ以下、０．６ｍｇまたはそれ以下、０．５ｍｇまたはそれ以下、０．４ｍｇまたはそれ以下、０．３ｍｇまたはそれ以下、０．２ｍｇまたはそれ以下および０．１ｍｇまたはそれ以下である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
有効量が、少なくとも体重ｋｇあたり抗体０．０１ｍｇであり、例えば、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ｍｇである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
有効量が、体重ｋｇあたり抗体０．１〜２０ｍｇの間である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
抗体が、年間あたり少なくとも１回投与され、例えば、年間あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９回で投与される、請求項１５〜１８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
抗体が、ＲＳＶ感染を誘引するリスクの高い年の間に一定間隔で投与される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
一定間隔が、１週間、２週間、１ヶ月間、または２ヶ月間である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物におけるＲＳＶ感染に関連した１つまたはそれ以上の症状の治療、改善または予防のための組成物の調製のための請求項１から１３のうちのいずれか１項記載の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体または請求項１４記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
ＶＨおよびＶＬをコードするペアー（ｐａｉｒｓ）のレパートリーを作成する方法であって、メンバーが、ＲＳＶ感染から生じる液性免疫応答に関連する遺伝子のペアーを反映するものであって、
ａ．ＲＳＶに感染したドナーまたはＲＳＶ感染から回復したドナーからリンパ球を含む細胞画分を提供し；
ｂ．任意選択的に、前記細胞画分からＢ細胞または血漿細胞を濃縮し；
ｃ．前記細胞画分由来の細胞を複数の容器に個々に分配することを含む、単離された単一細胞の集団を得て；次いで
ｄ．前記単離された単一細胞に由来する鋳型を用いて、重複伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＲＴ−ＰＣＲ法において、増幅させ、ＶＨおよびＶＬをコードするペアーの連結を生じさせ；
ｅ．任意選択的に、連結したＶＨおよびＶＬをコードするペアーのネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを実施すること：
を含む方法。
【請求項２４】
請求項１から１３のうちのいずれか１項記載の組み換えポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体を発現することができる、ポリクローナル細胞株。
【請求項２５】
個々の細胞が各々、単一のＶＨおよびＶＬをコードするペアーを発現することができ、全体としてポリクローナル細胞株がＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションを発現することができ、各ＶＨおよびＶＬをコードするペアーが、抗−ＲＳＶ抗体をコードする、ポリクローナル細胞株。
【請求項２６】
前記ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションが、請求項２３の方法により作成される、請求項２５記載のポリクローナル細胞株。
【請求項２７】
本明細書の表５に記載される抗体分子、あるいは前記抗体分子の特異的に結合するフラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログから選択される単離ヒト抗ＲＳＶ−抗体分子であって、前記結合するフラグメントまたはアナログが、少なくとも前記単離抗体分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む単離ヒト抗ＲＳＶ−抗体分子。
【請求項２８】
表８に記載された抗体に由来するか、あるいは配列番号：１〜４４のうちの１つに含まれる重鎖ＣＤＲアミノ酸配列および配列番号：１〜４４から選択されるアミノ酸配列より８８高い配列番号を有する付随の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の抗体分子、フラグメントまたはアナログ。
【請求項２９】
ヒト抗体由来のＦａｂにおけるＣＤＲと同一であるＣＤＲを含み、前記Ｆａｂは、物質輸送時の制限を避けるために非常に低い密度でセンサー表面上に固定された組み換えＲＳＶ  Ｇタンパク質を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００において表面プラズモン共鳴分析を実施して測定する場合、５００ｎＭまたはそれ以下のＲＳＶ  Ｇタンパク質に対する解離定数ＫＤを示す、単離された抗体分子、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログ。
【請求項３０】
ＫＤが、４００ｎＭまたはそれ以下であり、例えば、３００ｎＭまたはそれ以下、２００ｎＭまたはそれ以下、１００ｎＭまたはそれ以下、１ｎＭまたはそれ以下であり、９００ｐＭまたはそれ以下、８００ｐＭまたはそれ以下、７００ｐＭまたはそれ以下、６００ｐＭまたはそれ以下、５００ｐＭまたはそれ以下、４００ｐＭまたはそれ以下、３００ｐＭまたはそれ以下、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、９０ｐＭまたはそれ以下、および８０ｐＭまたはそれ以下である、請求項２９記載の単離された抗体分子、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログ。
【請求項３１】
ヒト抗体由来のＦａｂにおける抗原結合部位に同一である抗原結合部位を含み、前記Ｆａｂは、物質輸送時の制限を避けるために非常に低い密度でセンサー表面上に固定された組み換えＲＳＶ  Ｇタンパク質を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００において表面プラズモン共鳴分析を実施して測定する場合、５００ｎＭまたはそれ以下のＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する解離定数ＫＤを示す、単離された抗体分子、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログ。
【請求項３２】
ＫＤが、４００ｎＭまたはそれ以下であり、例えば、３００ｎＭまたはそれ以下、２００ｎＭまたはそれ以下、１００ｎＭまたはそれ以下、１ｎＭまたはそれ以下であり、９００ｐＭまたはそれ以下、８００ｐＭまたはそれ以下、７００ｐＭまたはそれ以下、６００ｐＭまたはそれ以下、５００ｐＭまたはそれ以下、４００ｐＭまたはそれ以下、３００ｐＭまたはそれ以下、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、９０ｐＭまたはそれ以下、８０ｐＭまたはそれ以下、７０ｐＭまたはそれ以下、６０ｐＭまたはそれ以下、５０ｐＭまたはそれ以下、４０ｐＭまたはそれ以下、３０ｐＭまたはそれ以下、２５ｐＭまたはそれ以下、２０ｐＭまたはそれ以下、１５ｐＭまたはそれ以下、１０ｐＭまたはそれ以下、９ｐＭまたはそれ以下、８ｐＭまたはそれ以下、７ｐＭまたはそれ以下、６ｐＭまたはそれ以下、および５ｐＭまたはそれ以下である、請求項３１記載の単離された抗体分子、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログ。
【請求項３３】
クローン番号８１０、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８５８または８９４で産生されるヒト抗体のＣＤＲを含む、請求項２７〜３２のうちのいずれか１項記載の抗体分子あるいは特異的に結合するフラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログ。
【請求項３４】
医薬上許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたは希釈液との混合において、請求項２７〜３３のうちのいずれか１項記載の抗体分子あるいは特異的に結合するフラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログを含む抗体組成物。
【請求項３５】
請求項２７〜３３のうちのいずれか１項記載の２種の別個の抗体分子および／または特異的に結合するフラグメントおよび／または合成もしくは半合成抗体アナログを含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
請求項２７〜３３のうちのいずれか１項記載の少なくとも３種の別個の抗体分子および／または特異的に結合するフラグメントおよび／または合成もしくは半合成抗体アナログを含み、かかる組成物が、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０種の別個の抗体分子および／またはフラグメントおよび／または合成もしくは半合成抗体アナログを含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する少なくとも１種の抗体分子、フラグメントまたはアナログを含み、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に結合する少なくとも１種の抗体分子、フラグメントまたはアナログを含む、請求項３４〜３６のうちのいずれか１項記載の組成物。
【請求項３８】
請求項２７〜３３のうちのいずれか１項で定義される少なくとも１種のＣＤＲのアミノ酸配列をコードする、単離核酸フラグメント。
【請求項３９】
少なくとも表５に記載されたクローンのうちの１つにより産生される抗体のＣＤＲをコードする、単離核酸フラグメント。
【請求項４０】
配列番号：１〜４４のうちのいずれか１つに記載される重鎖アミノ酸配列のＣＤＲ配列をコードする、単離核酸フラグメント。
【請求項４１】
配列番号：８９〜１３２のうちのいずれか１つに記載される軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ配列をコードする、単離核酸フラグメント。
【請求項４２】
配列番号：１〜４４のうちのいずれか１つに記載される重鎖アミノ酸配列のＣＤＲ配列および配列番号：１〜４４から選択されるアミノ酸配列より８８高い配列番号を有する付随の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列をコードする、単離核酸フラグメント。
【請求項４３】
配列番号：４５〜８８および／または１３３〜１７６に含まれるコーディング配列を含む、請求項３８〜４２のうちのいずれか１項記載の核酸フラグメント。
【請求項４４】
請求項３８〜４３のうちのいずれか１項に記載の核酸フラグメントを含む、ベクター。
【請求項４５】
自律的に複製することができる、請求項４４記載のベクター。
【請求項４６】
プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、およびウイルスからなる群から選択される、請求項４４または４５記載のベクター。
【請求項４７】
５’→３’方向および作動可能な連結において、請求項３８〜４３のうちのいずれか１項に記載の第１の核酸フラグメントの発現を促進するための少なくとも１つのプロモーターであって、必須なフレームワーク領域、任意選択でリーダーペプチドをコードする核酸配列、前記第１の核酸フラグメント、任意選択で定常領域をコードする核酸配列、および任意選択で第１の転写終結領域をコードする核酸配列と一緒に少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲをコードし、ならびに／あるいは
５’→３’方向および作動可能な連結において、請求項３８〜４３のうちのいずれか１項に記載の第２の核酸フラグメントの発現を促進するための少なくとも１つのプロモーターであって、必須なフレームワーク領域、任意選択でリーダーペプチドをコードする核酸配列、前記第２の核酸フラグメント、任意選択で定常領域をコードする核酸配列、および任意選択で第２の転写終結領域をコードする核酸配列と一緒に少なくとも１つの重鎖ＣＤＲをコードするもの
を含む、請求項４４〜４６のうちのいずれか１項記載のベクター。
【請求項４８】
宿主細胞に導入される時に宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項４４〜４７のうちのいずれか１項記載のベクター。
【請求項４９】
請求項４４〜４８のうちのいずれか１項のベクターを有する、形質転換細胞。
【請求項５０】
請求項４４〜４８のうちのいずれか１項記載のベクターを有し、請求項３８〜４３のうちのいずれか１項記載の核酸フラグメントを発現し、ならびに任意選択的にその表面上でその組み換え発現産物を分泌または保有する安定な細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化器多核体ウイルス感染症に関連した１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善のための組み換えポリクローナル抗体に関する。本発明はまた、抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体（抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ）を産生するポリクローナル発現細胞株に関する。さらに、本出願は、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂを含む診断上および薬理学的組成物ならびにＲＳＶ感染に関連する１つまたはそれ以上の症状の予防、治療または改善における使用を記載する。
【背景技術】
【０００２】
消化器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、幼児および小さな子供における下部呼吸器疾患の主な要因である。慢性肺疾患または先天性心臓疾患のごとく根本的な健康問題を抱える未成熟な幼児および子供は、ＲＳＶ感染後の細気管支炎および肺炎などの重篤な病気に対して最も高いリスクを有する。最近、ＲＳＶはまた、免疫不全の成人、特に骨髄移植被提供者、高齢者および肺疾患にかかっている人などの一定のリスクの高い成人において重要な病変として認識されてきた。
【０００３】
ヒトＲＳＶは、パラミクソウイルス科ニューモウイルス属サブファミリーのメンバーであり、ＡおよびＢサブタイプとして存在する。ＲＳＶは、外被性非分割型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、少なくとも１１種のタンパク質をコードし、そのうちの３種が外被関連タンパク質、Ｆ（融合糖たんぱく質）、Ｇ（受容体−結合糖タンパク質）、およびＳＨ（小疎水性タンパク質）である。外被タンパク質は、ウイルス表面上に存在し、ある程度まで感染した細胞の表面上にも存在する。Ｆタンパク質は、ウイルスと細胞膜の融合を促進し、それによりウイルスＲＮＡの細胞質への侵入を可能にする。Ｆタンパク質は、２つのジスルフィド結合サブユニット、Ｆ１とＦ２からなり、５７４個のアミノ酸の不活性型Ｎ−グルコシル化前駆体のタンパク質分解性切断により産生される。Ｇタンパク質は、（ウイルス株に依存する）２８９〜２９９個のアミノ酸のＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。前駆形態は３２ｋＤａであり、Ｎ−およびＯ−連結オリゴ糖の付加により８０〜９０ｋＤａのタンパク質に成熟する。ＲＳＶ  Ｇタンパク質は、ビリオンの標的細胞への結合に関連する。Ｇタンパク質の膜−結合形態に加えて、短縮型の可溶性形態もまた産生される。この機能はウイルスと感染細胞から離れている免疫応答を再指令することが示唆される。さらに、Ｇタンパク質は、リンパ球の取り込みと同様に、ケモカインの修飾やサイトカインの発現のごとく多くの炎症性効果に関連することが示されている。ＳＨタンパク質は６４〜６５個のアミノ酸のタンパク質であり、精製されたＲＳＶ粒子の表面上に極めて低い量で存在するが、ＲＳＶ感染細胞の表面上で豊富に発現される。ＳＨタンパク質の機能は解明されていないが、ゴルジ複合体を介するウイルスタンパク質の輸送を補助しうる可能性がある（Rixon et al 2004, J.Gen.Virol.85:1153-1165）。ＧおよびＦタンパク質の機能を阻害することは、ＲＳＶ感染の予防に関係すると考えられている。
【０００４】
ＲＳＶ感染の予防と治療はこの数十年間大きく注目を浴びており、ワクチンの開発、抗ウイルス化合物（治療用に承認されたリバビリン）、アンチセンス薬物、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術および免疫グロブリンやモノクローナル抗体のごとき抗体産物を含む（Maggon and Barik, 2004, Rev.med.Virol.14:149-168で全て総説される）。これらの方法のなかで、静脈注射用免疫グロブリン、ＲＳＶ−ＩＶＩＧ、およびモノクローナル抗体、パリビズマブはリスクの高い子供のＲＳＶ予防用に承認されている。
【０００５】
しかしながら、ＲＳＶ−ＩＶＩＧ（ＲｅｓｐｉＧａｍ）のごとき免疫グロブリン産物は、大量の注射を必要とする低い特異的活性のごとくいくつかの欠点を有することが知られ、前もっての集中的な治療のため静脈投与が限られる子供には困難である。さらに、バッチ間の変動が伴う問題とともに、血清由来の免疫グロブリン産物からのウイルス疾患の伝染のリスクもまた存在する。したがって、正常なドナーの約８％のみがＲＳＶを中和するのに十分高い抗体力価を示すことから、高力価ＲＳＶ免疫グロブリン産生の要請に見合う十分なドナーを得ることは困難である。
【０００６】
Ｆタンパク質またはＧタンパク質に対するモノクローナル抗体は、インビトロにおける中和効果およびインビボにおける予防効果を有することが示されてきた（例えば、Beeler and Coelingh 1989.J.Viro l63:2941-50; Garcia-Barreno et al 1989.J.Virol 63:925-32; Taylor et al 1984.Immunology 52: 137-142; Walsh et al 1984, Infection and Immunity 43:756-758; US 5,842,307およびUS 6,818,216）。今日、モノクローナル抗体パリビズマブはＲＳＶ−ＩＶＩＧの使用から完全に取って代わった。中和アッセイは、パリビズマブおよびＲＳＶ−ＩＶＩＧが、ＲＳＶサブタイプＢに対して対等に作用する一方、パリビズマブがサブタイプＡに対してより有効に作用することを示す（Johnson et al 1997.J.Infect.Dis1 76:1215-24）。しかしながら、パリビズマブおよびＮｕｍａｘのごとく産物により示されるようなモノクローナル抗体の優れた中和および予防効果にもかかわらず、これらにはまた、ＲＳＶウイルスの性質による一定の欠点が付随しうる。
【０００７】
ＲＳＶには、２つの別個の抗原グループまたはサブタイプ、ＡおよびＢが存在する。ほとんどのＲＳＶタンパク質は、２つのサブグループ間で高度に保存され、Ｆタンパク質は９１％のアミノ酸相同性を示す。しかしながら、Ｇタンパク質は、ＡおよびＢサブグループ間で５３％のみのアミノ酸相同性を有する広範な配列可変性を示す（Sullender 2000. Clin.Microbiol.Rev 13:1-15）。ほとんどのタンパク質はまた、Ｇタンパク質を除いて、アミノ酸レベルにおいて、サブグループＡ内で２０％およびサブグループＢ内で９％まで相違するサブグループ内で限られた変動を示す。ＡおよびＢのウイルスサブタイプは、異なる年の間で変化する相対頻度を伴って、多くのＲＳＶ伝染病で共循環する。それゆえ、モノクローナル抗体は、両方のサブタイプならびにサブタイプ内の変化を中和することができるように慎重に選択されなければならない。
【０００８】
２つのＲＳＶサブタイプとサブタイプ内の多様性の問題点に加えて、ヒトＲＳＶは、ほとんどのＲＮＡウイルスと同様に、選択圧の下で急速な変異を行う能力を有する。ｍＡｂを用いるインビトロにおけるＲＳＶエスケープ変異体の選択がよく知られている（例えば、Garcia-Barreno et al 1989.J.Virol 63:925-32）。重要なことに、最近、パリビズマブはインビボと同様にインビトロでもエスケープ変異体を選択し、その単離された変異体のいくつかはコットンラットにおけるパリビズマブ予防に完全に耐性であることが知見された（Zhao and Sullender 2005 J.Virol 79:3962-8およびZhao et al 2004.J.Infect.Dis 190:1941-6）。さらに、内在的にパリビズマブに耐性である野生型ＲＳＶ株も存在し得、それは、パリビズマブの起源であるマウス抗体がある臨床分離株を中和することに失敗することにより示された（Beeler and Coelingh 1989.J.Virol 63:2941-50）。その上、１つの明らかに耐性なウイルスもまた、免疫応答性コットンラットにおけるパリビズマブ予防後に同定された（Johnson et al 1997.J.Infect.Dis 176:1215-24）。それゆえ、一定条件下において、エスケープ変異体が存在するか、または治療の結果として時間とともに発生しうることから、単独の単一特異性の抗体の使用は、ＲＳＶ疾患の治療に適切または十分であり得ない。
【０００９】
ＲＳＶ−ＩＶＩＧおよびパリビズマブの有用性に関するさらなる検討事項は、有効な治療に必要とされる用量である。ＲＳＶ感染症のコットンラットモデルにおいて、肺のＲＳＶ複製を１００倍まで減少させるのに３０μｇ／ｍｌ以上の血清濃度が必要であることが示されている。ＲＳＶ−ＩＶＩＧにおいては、静脈に投与される月に７５０ｍｇ総タンパク質／ｋｇの用量が、リスクの高い子供におけるＲＳＶ入院の頻度を減少させるのに有効である一方、パリビズマブにおいては、月に１５ｍｇ／ｋｇの筋肉内用量が有効であることが証明された。しかしながら、複数回にわたる静脈内または筋肉内の大用量の投与は、患者にとって不便であり、ＲＳＶ感染症に対するリスクのある成人の広範なグループの予防および治療のためのこれらの産物の幅広い使用を妨げる。
【００１０】
したがって、ドナーの利用可能性に依存せず、サブタイプＡおよびＢを網羅する１種またはそれ以上のＲＳＶ抗原ならびにウイルス変異により生じるいずれかのエスケープ変異体に対して免疫特異的に結合し、高度に強力であり、改善された薬物動態学的プロファイルを有し、それゆえに総体として改善された治療プロファイルを示し、それによりより低頻度の投与および／またはより低用量の投与で足りる、抗体産物が必要である。
【００１１】
（貢献の開示）
それゆえ、本発明の目的は、極めて強力な代替的な抗−ＲＳＶ免疫グロブリン産物であって、組み換えで産生され、消化器多核体ウイルスのサブタイプＡおよびＢに対して、ならびにエスケープ変異体の可能性を制限する主要な表面抗原のうちの少なくとも１つにおける複数のエピトープに対して、反応性を示す抗−ＲＳＶ免疫グロブリン産物を提供することである。
【００１２】
本発明はまた、新規のヒト抗−ＲＳＶ抗体分子ならびにそれらの誘導体を提供することを目的とし、この抗体分子または誘導体は、既存のモノクローナル抗−ＲＳＶ抗体および抗体誘導体を超えた改善された性質を示す。
【００１３】
（本発明の説明）
ＲＳＶにおける複数のエピトープを標的とするポリクローナル抗体組成物の使用は、エスケープ変異体の発生を最小限にすることが期待され、多様性をもって自然界で循環するウイルスに対する保護をも提供することができる。血清由来のＲＳＶ−ＩＶＩＧとは対照に、本発明のポリクローナル抗体は、非ＲＳＶ抗原に結合する抗体分子を含まない。
【００１４】
本発明は、ポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体を提供する。好ましくは、ポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体は、自然には抗体を産生しない細胞から得られる。かかる抗体は、組み換えポリクローナル抗体（ｒｐＡｂ）と呼ばれる。本発明の抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂは、ＦまたはＧタンパク質における複数のエピトープに対して指向性がある。特に、ＧおよびＦタンパク質の両方における複数のエピトープにして指向性がある抗−ＲＳＶｒｐＡｂが好ましい。好ましくは、保存されたグループ、潜在的にサブタイプ−特異的グループおよび株−特異的グループに属するＧタンパク質エピトープは、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂにより網羅される。さらに、第３の外被タンパク質、小分子疎水性（ＳＨ）タンパク質に対して反応性を有する抗体は、本発明の抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂの望ましい構成要素である。
【００１５】
さらに、本発明は、活性成分が抗−ＲＳＶポリクローナル抗体である医薬組成物、ならびにＲＳＶ感染症の予防、改善または治療のためのかかる組成物の使用を提供する。
【００１６】
本発明は、ＲＳＶによる感染によって上昇された液性免疫応答を反映するための方法であって、かかる誘発した個体から元々のＶＨおよびＶＬ遺伝子のペアーを単離し、次いでこの元々のペアーを維持する抗体を産生することによる方法をさらに提供する。
【００１７】
（定義）
用語「抗体」は、血清の機能的な構成要素を記載し、多くの場合、分子のコレクション（抗体または免疫グロブリン）としてまたは１分子（抗体分子または免疫グロブリン分子）としてのどちらかで呼ばれる。抗体分子は、特異的な抗原性決定基（抗原または抗原性エピトープ）に結合または反応することができ、順に免疫学的なエフェクター機構の誘導を導きうる。個々の抗体分子は通常、単一特異性とされ、抗体分子の組成物は、モノクローナル（すなわち、同一の抗体分子からなる）またはポリクローナル（すなわち、同一の抗原におけるか、または別個の異なる抗原における同一または異なるエピトープと反応する異なる抗体分子からなる）であってもよい。各抗体分子は、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にする固有の構造を有し、全ての自然の抗体分子は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖の同一の全体基本構造を有する。抗体はまた、免疫グロブリンとして総称される。本明細書で用いられるような用語、抗体は、最も広い意味で用いられ、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）な抗体、キメラ化、ヒト化、完全なヒトのおよび単一鎖の抗体、ならびにＦａｂ、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントのごとき抗体の結合フラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＧのごとき多量体型を網羅する。いくつかの例では、本出願は、用語「合成もしくは半合成抗体アナログ」を用い、それは、特に（ＲＳＶ抗原への特異的な結合を示すことより）抗体の性質を示す天然に存在しない分子を意味し、天然に存在する抗体に由来するＣＤＲを含み、−かかるアナログは、例えば、ｓｃＦｖフラグメント、二重特異性抗体などにより表されるが、例えば、本明細書で開示される抗−ＲＳＶ抗体分子に由来するＣＤＲ（例、当該技術分野で周知の移植技術による）を含むように改良される表面上天然に存在する抗体−例えば、かかる抗体アナログは、別の動物種の抗体分子に取り込まれている、あるいは同一種由来の異なる抗体アイソタイプもしくはクラスに取り込まれている、本明細書に開示されるＣＤＲを含みうる。
【００１８】
用語「抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体」または「抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ」は、組み換えで産生される多様な抗体分子の組成物であって、各メンバーが消化器多核体ウイルスにおける少なくとも１つのエピトープに結合することができ、全体としてのポリクローナル抗体がＲＳＶを中和することができる抗体分子の組成物を記載する。好ましいのは、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ組成物は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢの両方を中和する。さらにより好ましいのは、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂは、ＧおよびＦタンパク質に対する結合反応性をさらに含む。好ましいのは、組成物は、単一のポリクローナルを生成する細胞株から産生される。
【００１９】
用語「同種ＶＨおよびＶＬをコードするペアー（ｐａｉｒｓ）」は、同一細胞内に含まれるか、または由来するＶＨおよびＶＬをコードする配列の元々のペアーを記載する。したがって、同種ＶＨおよびＶＬのペアーは、かかる細胞が由来するドナーに元々存在するＶＨおよびＶＬのペアーを表す。用語「ＶＨおよびＶＬをコードするペアーから発現される抗体」は、抗体または抗体フラグメントが、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を含むベクター、プラスミドまたは類似物から産生されることを示す。同種のＶＨおよびＶＬをコードするペアーが、完全な抗体として、またはそれらの安定なフラグメントとして発現される場合、それらは、それらが由来する細胞で元々発現される抗体の結合親和性および特異性を維持する。同種ペアーのライブラリーはまた、同種ペアーのレパートリーまたはコレクションとも称され、個別に保存されるか、またはプールされうる。
【００２０】
用語「組み換えポリクローナル抗体の別個のメンバー」は、可変領域内の１つまたはそれ以上の鎖を含む組み換えポリクローナル抗体組成物の個々の抗体分子を表し、他のポリクローナルタンパク質の個々のメンバーと比較してアミノ酸配列の相違により特徴付けられる。これらの鎖は、特に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に局在される。
【００２１】
用語「エピトープ」は、一般に、動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトにおける抗原性または免疫原性活性を有する大型分子の一部または大型分子の部分（例、抗原または抗原部位）を記載するのに用いられる。免疫原性活性を有するエピトープは、動物における抗体応答を誘導する大型分子の一部である。抗原性活性を有するエピトープは、当該技術分野でよく知られる方法のいずれかにより、例えば、本明細書に記載される免疫アッセイにより調べられるように、抗体が免疫特異的に結合する大型分子の一部である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原は、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する物質、例えば、毒素、ウイルス、細菌、タンパク質またはＤＮＡである。抗原または抗原部位は、それらが非常に小さくない限り、多くの場合、１つより多くのエピトープを有し、免疫応答を活性化することができる。同一の抗原における異なるエピトープに結合する抗体は、それらがエピトープの局在に依存して、結合する抗原の活性を変化させる効果を示すことができる。抗原の活性部位におけるエピトープに結合する抗体は、抗原の機能を完全に妨害しうる一方、異なるエピトープに結合する別の抗体は、単独で抗原の活性に全くまたはほとんど効果を示し得ない。しかしながら、かかる抗体は、さらに補体を活性化し、それにより抗原の排除が起き、次いで同一の抗原の異なるエピトープに結合する１つまたはそれ以上の抗体と結合される場合に相乗効果を生じうる。本発明では、大型分子のエピトープの一部は、好ましくはＲＳＶポリペプチドの一部である。本発明の抗原は、好ましくは、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する、ＲＳＶ関連タンパク質、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントである。ＲＳＶ関連抗原はまた、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する、ＲＳＶポリペプチドまたはそのフラグメントのアナログまたは誘導体であってもよい。
【００２２】
例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の配列に関連して用いられる用語「完全なヒト」は、９８から１００％のヒト配列を記載する。
【００２３】
用語「免疫グロブリン」は、一般に、血液または血清中で見出される抗体の混合物の総称として用いられるが、他の起源に由来する抗体の混合物を表すのに用いられてもよい。
【００２４】
用語「液性免疫応答を反映する」は、ポリクローナル抗体に関して用いられる場合、個々の抗体メンバーをコードする核酸配列が、抗−ＲＳＶ特異的抗体を産生する血漿細胞の発生頻度の上昇を伴うドナーに由来する抗体組成物を意味する。かかるドナーは、ＲＳＶ感染から回復したものであるか、ＲＳＶに感染した個体と密接な関係を示すものであるか、あるいはＲＳＶワクチン接種を受けたもののいずれかであってもよい（ＲＳＶワクチンの例は、例えば、Maggon and Barik, 2004, Rev.med.Virol.14:149-168を参照）。感染または誘発によってドナー内で上昇した抗体の親和性および特異性を反映させるために、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードする配列は、それらが単離される時に、ドナー内に元々存在する遺伝子のペアーまたは組合せ（同種のペアー）で維持されるべきである。ドナーにおける液性免疫応答の多様性を反映するため、ＲＳＶに結合する抗体をコードする全ての配列は、スクリーニング手順に基づいて選択される。単離された配列は、可変領域、特に、ＣＤＲ領域の多様性に関して、またはＶＨおよびＶＬファミリーに関しても解析される。これらの解析に基づいて、ＲＳＶに結合する抗体の全体の多様性を表す同種ペアーの集団が選択される。かかるポリクローナル抗体は、典型的に、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００または１０４個の別個のメンバーを有する。
【００２５】
組成物は、その投与が受容する患者により耐性化されうる場合、「薬理学的に許容される」と言われる−同じことを、組成物の一部である賦形剤、ビヒクル、担体および希釈剤に適用する。
【００２６】
用語「ポリクローナル抗体」は、同一または異なる抗原における数種の特異的な抗原性決定基／エピトープと結合するか、または反応することができる異なる（多様な）抗体分子の組成物であって、組成物中のそれぞれ個々の抗体が特定のエピトープと反応することができる組成物を記載する。通常、ポリクローナル抗体の可変性は、いわゆるポリクローナル抗体の可変領域、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に位置される。本発明では、ポリクローナル抗体は、ポリクローナル細胞株からワンポットで産生されるか、または異なるポリクローナル抗体の混合物のどちらかであってもよい。モノクローナル抗体の混合物は、それらが個々のバッチ内で産生され、必ずしも、例えば、翻訳後修飾の相違を生じる同一の細胞株に由来しないことから、ほとんどポリクローナル抗体とは考えられていない。しかしながら、モノクローナル抗体の混合物が、本発明のポリクローナル抗体として同一の抗原／エピトープの範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を提供する場合、ポリクローナル抗体の等価物として考えられる。ポリクローナル抗体のメンバーが抗原／抗原部位／エピトープに対して特異的に結合するか、または特異的な反応性を有すると記載する場合、本明細書では、結合定数が１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１ｎＭ以下であることを意味する。
【００２７】
用語「組み換え抗体」は、発現ベクターでトランスフェクトされた細胞または細胞株から発現される抗体分子または数種類の分子を記載するのに用いられ、この発現ベクターは、自然界ではその細胞に付随していない抗体のコーディング配列を含む。組み換え抗体組成物中の抗体分子が多様であるか、または相違する場合、用語「組み換えポリクローナル抗体」または「ｒｐＡｂ」は、ポリクローナル抗体の定義に従って適用する。
【００２８】
用語「組み換えポリクローナル細胞株」または「ポリクローナル細胞株」は、変異型の核酸配列のレパートリー（例、抗体をコードする核酸配列のレパートリー）でトランスフェクトされるタンパク質の混合物／集団を発現する細胞を意味し、変異型の核酸配列は、自然界ではトランスフェクトされた細胞に付随していない。好ましいのは、トランスフェクションは、組み換えポリクローナル細胞株を一緒に構成する個々の細胞が各々、目的の単一で別個の核酸配列の転写活性コピーを保持し、目的の組み換えポリクローナル抗体の１つのメンバーをコードするように行われる。さらにより好ましいのは、別個の核酸配列の単一コピーのみがゲノム中の特異的な部位に組み込まれる。組み換えポリクローナル細胞株を構成する細胞は、目的の別個の核酸配列の組み込まれるコピーを保持する能力について、例えば、抗生物質選択により選択される。かかるポリクローナル細胞株を構成することができる細胞は、例えば、細菌、真菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞のごとき真核細胞、特に、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０）、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＹＢ２／０のごとき不死化哺乳動物細胞株、ならびに、Ｈｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のごとき不死化ヒト細胞でありうる。
【００２９】
用語「ＶＨおよびＶＬのペアーをコードする配列」または「ＶＨおよびＶＬをコードする配列のペアー」は、各分子が、可変重鎖および可変軽鎖の発現をコードする配列を含む核酸分子を示し、これらは、適切なプロモーターおよび／またはＩＲＥＳ領域が存在し、配列に作動可能に連結される場合、核酸分子に由来する一組として発現されうる。核酸分子はまた、重鎖および／または軽鎖の定常領域の一部または完全な定常領域をコードし、適切なプロモーターおよび／またはＩＲＥＳ領域が存在し、配列に作動可能に連結される場合に、Ｆａｂフラグメント、全長抗体または他の抗体フラグメントが発現されてもよい。
【００３０】
組み換えポリクローナル抗体は、投与される量が生理学的に有意である、例えば、動物またはヒトにおけるＲＳＶ感染を予防するか、または弱毒化する場合に、「治療上有効な量」で投与されることとされる。
【００３１】
（図面の説明）
図１：（Ａ）プロトタイプ株、Ｌｏｎｇ（サブタイプＡ）および１８５３７（サブタイプＢ）由来の全体のＧタンパク質のアミノ酸配列の並列比較。シグナル／膜貫通領域を点線で囲う。Cane et al1991 J.Gen.Virol. 72:2091-2096により同定されるようなアミノ酸１０１〜１３３および２０８〜２９９の間の２つの可変領域を下線で特定する。Ｇタンパク質の中心フラグメントはＥ．ｃｏｌｉで融合タンパク質として発現され、黒色で囲う。２つのアミノ酸配列を、配列番号：７１１（サブタイプＡ）および配列番号：７１２（サブタイプＢ）に記載する。（Ｂ）（Ａ）に示される中心フラグメントの並列比較。１３−ａａ保存領域およびＧタンパク質システインリッチドメイン（ＧＣＲＲ）の局在を角括弧で示す。（両サブタイプ間で同一の）ＧＣＲＲにおけるジスルフィド架橋を四角角括弧で示す。２つのアミノ酸配列を配列番号：７１３（サブタイプＡ）および配列番号：７１４（サブタイプＢ）に記載する。
【００３２】
図２：多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）およびクローン化工程（Ｂ）の模式的概要。（Ａ）ＶＨおよびＶＫ遺伝子ファミリー各々に特異的な２組のプライマー、ＣＨ＋ＶＨ１−８およびＶＫ１−６＋ＣＫ１を第一のＰＣＲ工程に用いた。ＶＨまたはＶＫプライマー間の相同領域は重複するＰＣＲ産物を生じる。第２工程において、この産物をネスティドＰＣＲで増幅させる。プライマーはまた、クローン化を容易にする制限酵素の認識部位を含む。（Ｂ）作成した同種の連結ＶＨおよびＶＫをコードするペアーをプールし、隣接するＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位の使用により哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターに挿入した。次いで、全長抗体の発現を促進するために、二方向性プロモーターを連結ＶＨおよびＶＫをコードする配列間のＡｓｃＩ−ＮｈｅＩ制限酵素部位に挿入する。用いられるＰＣＲプライマーを平行矢印により示す。ＣＨ１：重鎖定常領域１、ＣＬ：定常領域、ＬＣ：軽鎖；Ａｂ：抗体；Ｐ１−Ｐ２：二方向性プロモーター。
【００３３】
図３：哺乳動物全長抗体発現ベクター００−ＶＰ−５３０の模式図。ベクターは以下の構成要素を含む：ＡｍｐおよびＡｍｐ  ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子およびそのプロモーター。ｐＵＣ開始点＝ｐＵＣ複製開始点。Ｐ１＝軽鎖の発現を促進する哺乳動物プロモーター。Ｐ２＝重鎖の発現を促進する哺乳動物プロモーター。リーダーＩＧＨＶ＝ゲノムヒト重鎖リーダー。ＶＨ＝重鎖可変領域をコードする配列。ＩｇＧ１＝ゲノム免疫グロブリンアイソタイプＧ１重鎖定常領域をコードする配列。ウサギβ−グロブリンＡ＝ウサギベータ−グロブリンポリＡ配列。カッパリーダー＝マウスカッパリーダーをコードする配列。ＬＣ＝軽鎖をコードする配列の配列。ＳＶ４０  ｔｅｒｍ＝サルウイルス４０転写終結配列。ＦＲＴ＝Ｆｌｐ認識標的部位。Ｎｅｏ＝ネオマイシン耐性遺伝子。ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ＝サルウイルス４０ポリＡシグナル配列。
【００３４】
図４：ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）解析を用いてクローン８０１から得られた抗体（Ａｂ８０１）のエピトープ特異性の特徴付け。抗体８０１結合を、３つの抗体、９ｃ５（２）、１３３−ｈ（３）およびパリビズマブ（４）であって、各々、抗原部位Ｆ１、ＣおよびＩＩに結合する抗体を用いて、タンパク質Ｆへの結合に関する対競合（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）でテストした。対照の細胞は、競合しないＡｂ８０１（１）のタンパク質Ｆへの結合を示す。４つの抗体の注入時間を矢印により示す。応答を相対的共鳴単位（ＲＵ）で示す。長い両方向矢印は競合しない応答の大きさを示し、短い両方向矢印は９ｃ５で阻害された応答の大きさを示す。
【００３５】
図５：図は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢ株のインビトロ中和の結果である。抗−Ｆ抗体混合物の希釈物を、ＲＳＶ  ｌｏｎｇ（グラフＡ）およびＲＳＶ  Ｂ１（グラフＢ）株を中和する能力についてテストした。クローン８１０、８１８、８１９、８２５および８２７から得られた抗体混合物、抗−Ｆ（Ｉ）を三角形（▲）として示し、クローン７３５、８００、８１０、８１８、８１９、８２５、８２７、８６３、８８０、８８４および８９４から得られた抗体混合物、抗−Ｆ（ＩＩ）を四角形（■）として示す。パリビズマブをダイヤモンンド（◆）として示し、アイソタイプに適合する陰性コントロール（抗−アカゲザルＤ）抗体を円（●）として示す。吸光度を４９０ｎｍで測定し、ＲＳＶ複製と相関関係にある。
【００３６】
図６：図は、インビトロＲＳＶ融合阻害アッセイの結果である。抗体混合物の希釈物を、ＲＳＶ  Ｂ１株を中和する能力についてテストした。クローン８１０、８１８、８１９、８２５、８２７、７９６、８３８８４１、８５６および８８８から得られる抗体混合物、抗−Ｆ（Ｉ）Ｇを白抜きの四角形（□）として示し、７３５、８００、８１０、８１８、８１９、８２５、８２７、８６３、８８０、８８４、８９４、７９３、７９６、８３８、８４１、８５６および８８８から得られる抗体混合物、抗−Ｆ（ＩＩ）Ｇを、白抜きの三角形（△）として示す。パリビズマブをダイアモンド（◆）として示す。吸光度を４９０ｎｍで測定し、ＲＳＶ複製と相関関係にある。
【００３７】
図７：図は、活性な補体の存在下でＰＲＮＴにより測定されるごとく抗−Ｇ抗体クローンの組み合わせによるＲＳＶのインビトロ中和からの結果である。（表８に記載される）個々の抗体組成物の希釈物を、ウサギ補体の存在下におけるＲＳＶ株Ｌｏｎｇとインキュベートし、その後、ＨＥｐ−２細胞を感染させた。インキュベーション２４時間後、感染の程度を、ＲＳＶ特異的血小板の免疫検出を用いて検出した。抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ１３を白抜き三角形（△）として、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ３５を三角形（▲）として、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ３６を四角形（■）として、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ４１を円（●）として、ならびに抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ４５を白抜き四角形（□）として示す。データをコントロール±ＳＤと比較して％感染として表す。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
標的抗原およびポリクローナル抗体組成物
本発明のポリクローナル抗体は、同一の組成物中に多くの別個の抗体分子を含む。各分子は、ＲＳＶ関連抗原に結合する能力に基づいて選択される。本発明のポリクローナル抗体は、ポリクローナル抗体組成物を構成する別個の抗体分子の集められた（ｃｏｍｐｉｌｅｄ）結合反応性に相当する結合反応性を含む。
【００３９】
本発明の抗−ＲＳＶポリクローナル抗体は、好ましくは、ＧおよびＦタンパク質の両方に対する収集された結合反応性、より好ましくは、エスケープ変異体の発生のリスクを最小限にし、最も高い可能性のある中和能力を達成する複数のエピトープに対する集められた結合反応性を含む。中和抗体により認識される少なくとも５つの主要な抗原部位は、Ｆタンパク質において同定されている（Lopez et al 1998.J.Virol 72:6922-8）。全ての抗原部位はＦ１鎖にマップされ、部位Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩを含み、部位ＩおよびＩＩは各々、ＢおよびＡとも呼ばれうる。部位ＩＩは、Ｎ−末端分節のプロテアーゼ耐性領域に位置し、ならびに部位ＩＶ、ＶおよびＶＩは、タンパク質のシステインリッチ領域のＣ末端に位置する。部位Ｉは、このシステインクラスターの中央に位置する。Ｆタンパク質上のさらなる抗原部位は、アミノ酸位置２４１および２４２を含むエピトープＦ２が位置する部位Ｃである。さらに、Ｆ１と呼ばれる抗原部位に結合するモノクローナル抗体が存在し、Ｆ１はＦ１ａ、Ｆ１ｂおよびＦ１ｃと呼ばれるエピトープを含む。現在、この抗原部位は、Ｆタンパク質上の特定の部位にマップされていない。これらの部位／エピトープの大半は、広く中和抗体を生じるが、抗原部位Ｉに特異的ないくつかの抗体は、サブタイプＡ特異的であることが示されている。部位Ｉに結合する抗体はまた、ウイルス中和における限界効果を示す。パリビズマブにより認識されるエピトープは、アミノ酸位置２７２における選択されたエスケープ変異体の局在により判断されるような抗原部位ＩＩに位置する（Zhao et al 2004 J.Infect.Dis190:1941-6）。さらに、エピトープの３種のタイプがＧタンパク質上で同定された：ｉ）全てのＲＳＶ株に存在する保存されたエピトープ、ｉｉ）同一のサブタイプに属する全てのウイルスに存在するグループ特異的なエピトープ、ならびにｉｉｉ）同一のサブタイプに属する株のサブセットのみに存在する株特異的または可変性エピトープ。保存されたおよびグループ特異的なエピトープは、４つのシステイン（アミノ酸残基１７３、１７６、１８２および１８６）のクラスターならびに全てのヒトＲＳＶ単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）間で同一配列の短いアミノ酸断片（残基１６４−１７６）を含むＧタンパク質の中央部分にマップされている。システインクラスターは、位置１７３−１８３および１７６−１８２の間のジスルフィド結合により保持され、アミノ酸残基１７１−１８７の範囲であるＧタンパク質システインリッチ領域（ＧＣＲＲ）の中央部を構成し、それによりＧＣＲＲは、１３個のアミノ酸保存領域と重複する。Ｇ糖タンパク質は、保護的免疫と疾病病因の両方の誘導に役割を果たすようである。例えば、マウスにおける研究は、Ｇ糖タンパク質が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および肺好酸球の産生により特徴付けられるＴｈ２  ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を調節することを示した。好酸球の補充と活性は、ＩＬ−４およびＩＬ−５のごとき数種の因子により促進される。さらに、マウスの急性感染期間におけるＲＳＶ  Ｇタンパク質の発現は、Ｔｈ１サイトカイン発現の減少（例、ＩＬ−２およびガンマインターフェロン）、ケモカインｍＲＮＡ発現の変化（例、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＰ−２、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１）、ならびに感染した肺へのＮＫ細胞輸送の減少により特徴付けられる改善された自然免疫応答に関連していた。特に、ＧＣＲＲは、自然炎症反応を調節し、それにより可能性としてＲＳＶクリアランスを遅延させることに重要な役割を果たすことが示された（Polack et al.,2005 PNAS 102:8996-9001）。ＧＣＲＲは、アミノ酸位置１８２から１８６にＣＸ３Ｃモチーフを含む。ＲＳＶに感染されたマウスにおける呼吸速度の減少は、ＣＸ３Ｃモチーフに対する抗体が呼吸速度の減少を無効にすることから、このモチーフに関連することが示された（Tripp et al.2003.J.Virol.77:6580-6584およびUS 2004/0009177 (appl.no.10/420,387)）。株特異的エピトープは、Ｇタンパク質の外部ドメインにおけるシステインクラスターの可変領域Ｎ末端にマップされるが、好ましいのは、Ｇポリペプチドの可変Ｃ末端の３番目に位置される（Martinez et al.1997.J.Gen.Virol.78:2419-29）。図１は、Ｌｏｎｇ株（サブタイプＡ）および１８５３７株（サブタイプＢ）由来のＧタンパク質の並列比較を表し、これはＧタンパク質の多様な領域を示す。一般的に、モノクローナル抗−Ｇタンパク質抗体は、ＲＳＶ中和における限界的効果を有する。しかしながら、モノクローナル抗−Ｇ抗体の混合物がインビトロならびにインビボにおけるＲＳＶの中和を高めることが報告されてきた（Walsh et al 1989.J.Gen.Virol 70:2953-61およびMartinez and Melero 1998 J.Gen.Virol.79:2215-20）。モノクローナル抗−Ｇ抗体を結合する最も大きな効果は、ウイルスの画分がまだ中和に耐性であっても、抗体が異なるエピトープに結合する時に明確に発揮される。さらに、異なるエピトープ特異性を有する２つの異なる抗−Ｆ抗体の組合せならびに１つの抗−Ｆと１つの抗−Ｇ特異的抗体の組合せは、ＲＳＶにおけるインビトロ中和効果の上昇を示した（Anderson et al 1988 J.Virol.62: 4232-4238）。モノクローナル抗体を混合することにより得られるいくつかの有利な点は、例えば、活性部位の阻害によるアンタゴニスト効果のごときモノクローナル抗体の個々の特性のためと考えられる。その他の効果は、今のところ理解されていない理由による相乗作用が考えられる。
【００４０】
ＲＳＶ中和のメカニズムは複雑であり、完全に理解されていない。多くの異なるエピトープ、ＦおよびＧタンパク質のみで同定された、保存されたサブタイプ特異的ならびに株特異的エピトープ、ならびにエスケープ変異体の潜在的な作成は、ＲＳＶ感染の予防に役割を果たしうる全ての中和メカニズムを定めるのに広範囲な抗体特異性が必要であることを示唆する。それゆえ、合理的な方法において、サブタイプＡおよびＢの両方のＲＳＶ株、ならびにエスケープ変異体および今日知られるＲＳＶ株から生じる新しい株によるＲＳＶ感染を予防することができるモノクローナル抗体の混合物を選択することは非常に困難である。
【００４１】
本発明の態様は、多くの多様性および広範な抗−ＲＳＶ特異性を有するポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体を提供する。本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体は、産生時における利用可能なドナーに依存せず、バッチ間の変動は、ドナー由来の抗−ＲＳＶ免疫グロブリン産物（例、ＲＳＶ  ＩＶＩＧ）で観察されるものよりかなり小さい。本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体では、全ての個々の抗体メンバーは、ＲＳＶ関連抗原に結合することができ、前記ポリクローナル抗体はＲＳＶサブタイプＡおよびＢを中和することができる。ポリクローナル抗体の各々別個の抗体は、ポリクローナル抗体の他のメンバーのいずれかによっても結合されないエピトープに結合することが好ましい。本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶは、多価の手段でＲＳＶ抗原に結合し、それは通常、結果として、相乗的な中和、マクロファージによる感染細胞の食作用の改善および感染細胞に対する抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）の改良ならびに補体活性の上昇を生じる。さらに、本発明のポリクローナル抗体は、ＲＳＶ  ＩＶＩＧの場合である非結合タンパク質により「希釈」されず、この場合、有効であるために７５０ｍｇの合計タンパク質／ｋｇの用量が必要とされる。７５０ｍｇの合計タンパク質内におけるＲＳＶ特異的抗体の割合は知られていないが、最大で１％より大きくなることはなく、恐らく１％より小さいと考えられる。したがって、パリビズマブのインビトロにおける効力がＲＳＶ  ＩＶＩＧの効力より２５−３０倍高いとされた場合（Johnson et al 1997 J.Infect.Dis.176:1215-24）、これはＲＳＶ  ＩＶＩＧの特異的活性の減少により相殺される。それゆえ、ＲＳＶ−ＩＶＩＧに含まれる免疫グロブリン分子のわずか１％がＲＳＶに特異的である場合、ＲＳＶ−ＩＶＩＧポリクローナル抗体の活性のある用量は、モノクローナル抗体パリビズマブの活性のある用量より低い、わずか７．５ｍｇ／ｋｇである。
【００４２】
これらの理由により、本発明の組み換えポリクローナルＲＳＶ−特異的抗体は、モノクローナル抗体より有意に高い能力であることが期待され、それゆえに、パリビズマブおよびＲＳＶ  ＩＶＩＧの有効な用量と比較して、より少ない用量の本発明のポリクローナル抗体で投与することが可能である。したがって、本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体はまた、リスクの高い患者、特に骨髄移植の被提供者、高齢者および慢性肺疾患にかかっている個体の予防および治療に適すると考えられる。本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体のさらなる有利な点は、個々の抗体メンバーの濃度がモノクローナル抗体の濃度より有意に低く（用いられる濃度が同一であったとしても）、したがって個々の抗体が治療上、個々の免疫系により外部物質として認識される可能性が低くなり、１つの個々の抗体が患者内の免疫応答により排除されるとしても、残存する抗体メンバーが無傷であることから、ポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体の中和能力またはクリアランス速度に影響することはないようである。
【００４３】
本発明の具体例は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢを中和することができる組み換えポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体であり、前記ポリクローナル抗体は、少なくとも１つのＲＳＶ外被タンパク質における少なくとも３つの異なるエピトープに一緒に特異的に結合する別個の抗体メンバーを含む。好ましいのは、Ｆタンパク質は、少なくとも３つの別個の抗体メンバーにより特異的に結合され、前記エピトープは、好ましくは異なる抗原部位に位置する。
【００４４】
本発明のさらなる具体例は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢを中和することができる組み換えポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体であり、前記ポリクローナル抗体は、少なくとも２つのＲＳＶ外被タンパク質に対する特異的反応性を一緒に提供する別個の抗体メンバーを含む。２つの外被タンパク質は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、すなわち、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  ＳＨタンパク質から選択することができる。好ましくは、本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体は、抗−Ｇおよび抗−Ｆ反応性を含む。かかるポリクローナル抗体の抗−Ｇおよび抗−Ｆ反応性は、好ましくは、少なくとも２つの別個の抗−Ｇ抗体および少なくとも１つの別個の抗−Ｆ抗体からなる。好ましいのは、少なくとも３つの別個の抗体は、異なるエピトープに結合し、それにより少なくとも３つの異なるエピトープを網羅し、同時に抗体は、同様にＲＳＶサブタイプＡおよびサブタイプＢ株を中和することができる。より好ましい本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体の抗−Ｇおよび抗−Ｆ反応性は、以下に記載される抗−Ｇおよび抗−Ｆ反応性のいずれかの組合せからなる。最も好ましい本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体は、以下で言及される全ての抗原部位／エピトープに対する抗−Ｇおよび抗−Ｆ反応性からなる。本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体に可能な最も広い特異性を得るために、１つまたはそれ以上の好ましい全ての抗原部位は、１つより多くの別個の抗体により網羅されることが望ましい。したがって、同一抗原または抗原部位における数種のエピトープが、本発明のポリクローナル抗体の別個のメンバーにより結合されることが好ましい。
【００４５】
本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体の抗−Ｇ反応性に関して、この反応性は、好ましくは、保存されたエピトープに対する指向性である。より好ましい抗−Ｇ反応性は、Ｇ−タンパク質上の保存されたエピトープに特異的に結合することができる第１の抗−Ｇ抗体、およびＧタンパク質システインリッチ領域（ＧＣＲＲ）に特異的に結合することができる第２の抗−Ｇ抗体からなる。ポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体は、好ましくは、少なくとも２つの別個の抗−Ｇタンパク質を含み、少なくとも１つの第１の抗体は、Ｇタンパク質上の保存されたエピトープに特異的に結合することができ、少なくとも１つの第２の抗体は、サブタイプＡまたはＢのどちらかを認識する異なる保存されたエピトープまたはグループ特異的エピトープに特異的に結合することができる。好ましくは、ポリクローナル抗体は、少なくとも３つの別個の抗−Ｇ抗体を含み、第１の抗体は、Ｇ−タンパク質上の保存されたエピトープに特異的に結合することができ、第２の抗体は、サブタイプＡのＧタンパク質に特異的に結合することができ、第３の抗体は、サブタイプＢのＧタンパク質に特異的に結合することができる。Ｇタンパク質システインリッチ領域（ＧＣＲＲ）は、保存されたエピトープが位置する上流１３アミノ酸領域およびグループ特異的エピトープが位置する領域と一部重複する。それゆえ、保存されたエピトープに特異的に結合することができる抗体ならびにグループ特異的な抗体は、それらが認識するエピトープがＧＣＲＲに位置する場合にＧＣＲＲに結合してもよい。好ましくは、保存されたエピトープまたは株特異的なエピトープへの結合により特徴付けられる別個の抗体のうちの少なくとも１つもまた、ＧＣＲＲを認識する。ＧＣＲＲのＣＸ３Ｃモチーフに結合する抗体は、ウイルス中和の観点から特に好ましい。しかしながら、ＣＸ３ＸＣモチーフに結合する抗体はまた、フラクタルカインおよび他のヒトＣＸ３Ｃケモカインのごとく多くの他の関連しないヒト抗原に結合し、それゆえ、望ましくない副作用を産生することから、交差反応（例、実施例における一定の抗体について示されるように）についてかかる抗体をテストし、次いで適するモデル系で同一の抗体をテストする合理的方法が存在する。いずれにしても、副作用が存在しないか、ごく軽微であるか、または少なくとも許容されるかが確実性の程度で立証されうる前に、臨床試験において、本発明の抗体のごとき所定の医薬品をテストすることが必ず必要である。保存されたおよびグループ特異的な抗−Ｇ反応性に加えて、株特異的なエピトープに対して指向性のあるさらなる抗−Ｇ反応性もまた、本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体に含まれてもよい。ほとんどの多くの株特異的エピトープに対して指向性のある株特異的抗−Ｇ反応性は、５年以内にＲＳＶ感染を生じるウイルス株に存在することが好ましい。本発明では、株特異的エピトープは、限られた数のＲＳＶ株に存在するのみのエピトープとして理解される。グループ特異的および／または株特異的抗−Ｇ抗体の添加は、本発明の抗−ＲＳＶ抗体に対してさらなる多様性を提供することができ、Ｇタンパク質の保存領域に対する反応性を有する抗体と結合される時に相乗作用を誘導しうる。好ましくは、本発明の抗−Ｇ抗体は、直接ＲＳＶを中和し、ウイルスの細胞への進入を阻害し、細胞移動を防止し、炎症反応を抑制し、および／または多核体形成を予防する。
【００４６】
本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体の抗−Ｆ反応性に関して、この反応性は、好ましくは、１つまたはそれ以上の抗原部位Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＣまたはＦ１における少なくとも１つのエピトープに対して指向性がある。本発明のさらなる具体例では、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは全てのこれらの抗原部位／エピトープは、本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体における別個の抗体により網羅される。好ましくは、本発明の抗−Ｆ抗体は、直接ＲＳＶを中和し、および／またはウイルスの細胞への進入を阻害し、および／または多核体形成を予防する。
【００４７】
本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体組成物では、組成物は、Ｆタンパク質における全ての抗原部位を対して指向性のある結合反応性を含まず、抗原部位ＩＩのエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの別個の抗−Ｆ抗体が存在することが好ましい。より好ましいのは、部位ＩＩ特異的な抗−Ｆ抗体は、抗体パリビズマブとして同一のエピトープまたは抗原部位に結合する。部位ＩＩ−特異的な抗体に加えて、１つまたはそれ以上の別個の部位ＩＶ−特異的な抗−Ｆ抗体が望ましく、かかる抗体は、好ましくはＲＳＶＦ２−５として同一のエピトープに結合する。
【００４８】
サブタイプ−特異的な抗−Ｆ抗体はまた、当該技術分野で知られている。しかし、Ｆタンパク質が２つのサブタイプＡおよびＢ間で９１％のアミノ酸相同性を示すことから、サブタイプ−特異的な抗−Ｆ抗体は、抗−Ｇ抗体におけるよりもより少ない。しかしながら、かかる株−特異的な抗−Ｆ抗体は、可能な限り広範な特異性を得ることを付与し、それゆえに本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体の望ましい構成要素である。
【００４９】
上で言及されたＲＳＶ  ＧおよびＦタンパク質抗原に加えて、ＲＳウイルスは、第３の外被タンパク質である小分子疎水性（ＳＨ）タンパク質を発現する。ＳＨタンパク質由来のペプチドに対して上昇した過免疫血清は、インビトロでＲＳＶを中和することができないことが示されてきた（Akerlind-Stopner et al 1993 J.Med.Virol.40:112-120）。しかしながら、タンパク質は主に感染した細胞で発現されることから、ＳＨタンパク質に対する抗体は、融合の阻害における効果を示し、ＲＳＶ感染に対するインビボにおける保護に関連する可能性が考えられる。このことは、ＳＨ遺伝子を欠失するＲＳＶ株が上気道において１０倍低い効率で複製するという事実により支持される（Bukreyev et al 1997 J.Virol.71:8973-82）。
【００５０】
本発明のさらなる具体例は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢを中和し、抗−ＳＨ反応性、および抗−Ｇもしくは抗−Ｆ反応性を含むことができるポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体である。ＳＨタンパク質のアミノ酸４１から６４／６５（サブタイプＡ／Ｂ）までの範囲のＣ−末端は、細胞表面上に露出される。したがって、この領域に局在するエピトープに対する抗−ＳＨ反応性が望ましい。ＳＨタンパク質のＣ末端は、サブタイプＡおよびＢと異なり、それゆえに本発明のポリクローナル抗体におけるサブタイプＡおよびＢの両方に対する抗−ＳＨ反応性を含むことが望ましい。このＳＨ反応性は、少なくとも２つの別個の抗−ＳＨ抗体により提供することができ、第１の抗体は、ＳＨサブタイプＡに特異的に結合することができ、第２の抗体は、ＳＨサブタイプＢに特異的に結合することができる。
【００５１】
本発明の一の具体例では、ポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体は、ＳＨサブタイプＡおよび／またはＢに対する特異的反応性ならびにＧタンパク質に対する特異的反応性を含む。Ｇタンパク質に対する反応性は、上に記載の反応性のいずれかからなりうる。
【００５２】
代替的な具体例では、ＳＨサブタイプＡおよび／またはＢに対する特異的な反応性は、上に記載される抗−Ｆ反応性のいずれかと組み合わされてポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体が構成されうる。
【００５３】
本発明の好ましい具体例では、ポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体は、外被タンパク質、Ｆ、ＧおよびＳＨの３つ全てに対する反応性を含む。
【００５４】
本発明のポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体に含まれる反応性は、組合せがＲＳＶサブタイプＡおよびＢを中和することができる限り、表１に記載される抗原／抗原部位および／またはエピトープに対する特異的な結合反応性を有する別個の抗体のいずれか可能な組合せを構成してもよい。好ましくは、組合せは、少なくとも２つのＲＳＶ外被タンパク質に対する反応性を含む。
【００５５】
好ましくは、本発明によるポリクローナル抗体の個々の別個な抗体メンバーは、それら自身で中和および／または抗−炎症特性を有する。しかしながら、これらの特定の特性を持たない抗体もまた、例えば、補体活性を介して、ＲＳＶクリアランスに役割を果たしうる。
表１：ＲＳＶ関連抗原、抗原部位およびエピトープのまとめ
【表１】
2009528828.tif 000003
【００５６】
好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、抗体分子を自然に発現しないポリクローナル細胞株（組み換えポリクローナル抗体発現とも呼ばれる）由来の単一のバッチまたは数個のバッチとして産生される。モノクローナル抗体を混合することと比較して、組み換えポリクローナル抗体を産生することの有利な点の１つは、（単一のモノクローナル抗体を産生するのと同様のコストで）同時に無制限数の別個の抗体分子を産生する能力である。それゆえ、有意に最終産物のコストを増加させることなく、大量のＲＳＶ関連の抗原に対する反応性を有する抗体を含むことが可能である。特に、生物学では完全に理解されていないＲＳＶと同様に複雑な標的に関しては、ＲＳＶ単独に対して中和または保護することが示されていない個々の抗体は、他の抗体と結合される時に相乗作用を誘導しうる。それゆえ、ポリクローナル抗体組成物中に上に記載されるものに加えて、別個の抗体を含むことは有利な点であり得、わずかな判断基準は、個々の抗体がＲＳＶ関連抗原に結合する（例えば、ＲＳＶ感染細胞への結合により評価される）ことである。好ましくは、上に記載される全てのポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体組成物は、組み換えポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体（抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ）組成物である。
【００５７】
関連抗原として実証されていないが、その可能性のあるＲＳＶ標的抗原に結合する潜在的に関連のある抗原を獲得するための１つの方法は、ＲＳＶに感染されたドナーの免疫応答（完全な免疫応答）により上昇した個々の抗体からなるポリクローナル抗体組成物を作成することである。ＲＳＶに対して完全な免疫応答を示す抗体を得ることに加えて、ＲＳＶ感染の保護、中和、および／または排除に特に関連する可能性のある抗原に結合する抗体に対する陽性選択が行われうる。さらに、ＲＳＶの保護、中和および／または排除に関連すると考えられる特定の抗原、抗原部位またはエピトープに対する抗体がドナーの完全な免疫応答において同定されない場合、かかる抗体は、特定の抗原（選択された免疫応答）を有するドナーの免疫付与／ワクチン接種により上昇されてもよい。一般的に、中和は、血小板の減少、マイクロ中和試験または融合阻害アッセイのごときインビトロ中和アッセイにより評価される（例、Johnson et al 1997 J.Infect.Dis 176:1215-24）。したがって、これらのアッセイのうちの１つにおいて有意な効果を示す抗体または抗体組成物は、陰性コントロールと比較した時に中和すると考えられる。保護は、一般的に、例えばコットンラットモデル（例、Johnson et al 1997 J.Infect.Dis 176:1215-24）またはマウスモデル（例、Taylor et al 1984 Immunology 52, 137-142およびMejias, et al 2005 Antimicrob Agents Chemother 49: 4700-4707）におけるインビトロ誘発実験により測定される。インビボ誘発実験は、抗体がウイルス誘発前に投与される予防様式において、または抗体がウイルス誘発後に投与される治療として実施するか、あるいは両方の組合せとして実施することができる。
【００５８】
本発明のポリクローナル抗体組成物は、ＲＳＶ抗原に結合することができる抗体からなり得、このＲＳＶ抗原は必ずしも知られていないか、または必ずしも外被タンパク質ではない（抗体は感染細胞に結合するが、選択された抗原または抗原部位には結合しない）が、抗体は、例えば、ＲＳＶ感染にかかっているか、またはＲＳＶ感染から回復する１つまたはそれ以上のドナーに由来する別個の抗体をコードする核酸配列を得ることにより、ＲＳＶ感染後の完全な免疫応答から獲得される。第二に、同一の完全な免疫応答に由来する抗体は、特定の抗原、抗原部位および／またはエピトープに結合する能力に基づいて選択され、本発明のポリクローナル抗体に含まれうる。第三に、特定のＲＳＶ関連抗原で免疫付与／ワクチン接種され、それによりこれらのドナーで「選択された」免疫応答が上昇された１つまたはそれ以上のドナーから獲得されたＶＨおよびＶＬペアーからコードされる別個の抗体は、本発明のポリクローナル抗体組成物に含まれうる。したがって、本発明で言及される技術のいずれかに由来する抗体は、単一のポリクローナル抗体に結合されてもよい。好ましくは、本発明の抗体をコードする核酸は、ヒトドナーから得られ、産生された抗体は、完全なヒト抗体である。
【００５９】
本発明のポリクローナル抗体組成物の背景にある動機は：仮に、ＲＳＶに感染したドナーが抗原に対する液性免疫応答を上げる場合、これらの抗体は、少なくともある程度まで、ウイルスのクリアランスに貢献し、それによりポリクローナル抗体産物中の包含にふさわしいようである。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂを産生することであって、別個の抗体メンバーの組成物は、ＲＳＶ外被抗原に対する多様性、親和性および特異性に関して液性免疫応答を反映する。好ましくは、液性応答の反映は以下のうちの１つまたはそれ以上が満たされることを確認することにより立証される。ｉ）かかる抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ中の個々の抗体メンバーのＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列が、例えばＲＳＶ感染後にＲＳＶに対する液性免疫応答を上げたドナーに由来すること；ｉｉ）ＶＨおよびＶＬをコードする配列が、ドナーに存在するＶＨおよびＶＬをコードする配列の元々のペアーが維持されるようなドナーから単離されること；ｉｉｉ）ｒｐＡｂの個々のメンバーをコードするＶＨおよびＶＬのペアーが、ＣＤＲ領域が可能な限り多様であるように選択されること；あるいはｉｖ）抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂの個々のメンバーの特異性が、抗体組成物が哺乳動物における有意な抗体応答を導く抗原に一緒に結合するように選択されること。好ましくは、抗体組成物は、前記ドナーに由来する血清サンプル中で有意な抗体力価を生じる抗原、抗原部位および／またはエピトープに一緒に結合する。かかる抗原、抗原部位および／またはエピトープは、上記表１にまとめられるが、上に記載されるような未知の抗原、抗原部位および／またはエピトープならびに非外被抗原を構成してもよい。好ましくは、ドナーはヒトであり、ポリクローナル抗体は完全なヒト抗体である。
【００６１】
本発明は、ＲＳＶ関連抗原に対して結合特異性を有する全長の抗体、Ｆａｂフラグメントまたはその他の抗体フラグメントとして表すことができる一連のＶＨおよびＶＬペアーを同定した。特異的なＶＨおよびＶＬペアーは、実施例２における表５のクローン数により同定される。表５で同定されるようなＶＨおよびＶＬペアーを含む抗体は、好ましくは完全なヒト抗体である。しかしながら、望ましくは、キメラ化抗体もまた産生されてもよい。
【００６２】
本発明の好ましい抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体は、表５に記載されるＶＨおよびＶＬペアーのグループから選択される重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む別個のメンバーからなる。好ましくは、ＣＤＲ領域は、表５に示されるペアーで維持され、望ましいフレームワークに組み込まれる。
【００６３】
代替的に、第１クローンの重鎖由来のＣＤＲ領域（ＣＤＲＨ）は、第２クローンの軽鎖由来のＣＤＲ領域（ＣＤＲＬ）と結合される（ＶＨおよびＶＬペアーの組み換え（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ））。ＣＤＲ領域はまた、例えば、第１クローン由来のＣＤＲＬ１領域を第２クローン由来のＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３領域と結合することにより、軽鎖または重鎖内で組み換えられてもよい。かかる組み換えは、好ましくは同一抗原に結合するクローン間で行われる。本発明のＣＤＲ領域はまた、例えば、点変異による親和性成熟を受けてもよい。
【００６４】
可変重鎖および可変軽鎖をコードするペアーの単離および選択
抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体組成物を作成するプロセスは、適する起源に由来する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードし、それによりＶＨおよびＶＬをコードするペアーのレパートリーを作成する配列の単離に関する。一般的に、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を得るための適する起源は、ＲＳＶに感染されたか、またはＲＳＶ感染から回復した動物またはヒトに由来するか、あるいはＲＳＶ株またはかかる株に由来するタンパク質もしくはＤＮＡで免疫付与／ワクチン接種された動物またはヒトに由来する血液、脾臓または骨髄サンプルのごとき細胞画分を含むリンパ球である。好ましくは、画分を含むリンパ球は、ヒトまたはヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物から採集される。細胞画分を含む採集されたリンパ球は、さらに特定のリンパ球集団、例えば、Ｂリンパ球系列に由来する細胞を得るために濃縮されてもよい。好ましくは、濃縮は、例えばＢ細胞、形質芽細胞および／または血漿細胞に対して系列特異的細胞表面マーカータンパク質の特性を利用する、磁気ビーズ細胞分離装置（ＭＡＣＳ）および／または蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて行われる。好ましくは、細胞画分を含むリンパ球は、Ｂ細胞、形質芽細胞および／または血漿細胞に関して濃縮される。さらにより好ましくは、高いＣＤ３８発現および中間体ＣＤ１９および／またはＣＤ４５発現を有する細胞が血液から単離される。これらの細胞は時々、循環血漿細胞、初期血漿細胞または形質芽細胞と呼ばれる。簡潔にするため、本発明では、それらは他の用語が同じ意味で用いられるとしても単に血漿細胞と呼ぶ。
【００６５】
ＶＨおよびＶＬをコードする配列の単離は、ＶＨおよびＶＬをコードする配列がランダムにベクターに結合してＶＨおよびＶＬをコードする配列ペアーの組合せライブラリーを作成する従来の方法において行うことができる。しかしながら、本発明では、ＲＳＶ感染による液性免疫応答で産生される抗体の多様性、親和性および特異性を反映することが好ましい。このことは、ドナーに元々存在するＶＨおよびＶＬペアーの維持に関連し、それにより配列が単離されるドナーから産生された抗体に元々存在するＶＨおよびＶＬペアーに相当する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードする各配列ペアーのレパートリーを生じる。これはＶＨおよびＶＬをコードする配列の同種ペアーとも呼ばれ、この抗体は同種抗体と称される。好ましくは、本発明のＶＨおよびＶＬをコードするペアー、組合せまたは同種は、ヒトドナーから得られ、それゆえ配列は完全にヒトのものである。
【００６６】
ＶＨおよびＶＬをコードする配列の同種ペアーを作成するためのいくつかの異なる方法が存在する。１つの方法は、リンパ球含有細胞画分から分離される単一細胞に由来するＶＨおよびＶＬをコードする配列の増幅と単離に関する。ＶＨおよびＶＬをコードする配列は、別々に増幅され、第二工程で組み合わされてもよく、あるいは、それらは増幅中に組み合わされてもよい（Coronella et al 2000 Nucleic Acids Res 28: E85; Babcook et al 1996 PNAS 93: 7843-7848およびWO 05/042774）。第２の方法は、細胞内（ｉｎ−ｃｅｌｌ）増幅ならびにＶＨおよびＶＬをコードする配列の組合せに関する（Embleton et al 1992 Nucleic Acids Res 20: 3831-3837; Chapal et al 1997. BioTechniques 23: 518-524）。第３の方法は、溶血プラークアッセイをＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡクローニングと組み合わせる選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）である（Babcook et al 1996 PNAS 93:7843-7848）。ドナーにおけるＶＨおよびＶＬ配列ペアーの多様性を擬似するＶＨおよびＶＬをコードする配列のペアーのレパートリーを得るために、ＶＨおよびＶＬペアーの組み換え（ランダムな組合せ）ができる限り生じないハイスループット法が好ましく、例えば（本明細書に援用される）WO 05/042774に記載される。
【００６７】
本発明の好ましい具体例では、ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのレパートリーは、メンバーのペアーがＲＳＶ感染から生じる液性免疫応答に関連する遺伝子のペアーを反映し、工程ｉ）ＲＳＶに感染したか、またはＲＳＶ感染から回復したドナーに由来するリンパ球含有細胞画分を提供し；ｉｉ）任意選択的に、前記細胞画分からＢ細胞または血漿細胞を濃縮し、；ｉｉｉ）前記細胞画分各々に由来する細胞を複数の容器に分配することを含む、単離された単一細胞の集団を得；ｉｖ）前記単離された単一細胞に由来する鋳型を用いて、多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ法において増幅し、ＶＨおよびＶＬをコードするペアーの連結を生じさせ、次いでｖ）任意選択的に、連結されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーのネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを行うことを含む方法にしたがって作成される。好ましくは、単離された同種ＶＨおよびＶＬをコードするペアーは、以下に記載されるようにスクリーニングの手法にかけられる。
【００６８】
一度ＶＨおよびＶＬ配列のペアーが作成されると、ＲＳＶ関連抗原に対する結合反応性を有するＶＨおよびＶＬペアーをコードする配列を同定するスクリーニング手法が行われる。好ましくは、ＲＳＶ関連抗原はＲＳＶ外被タンパク質、特にＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  ＳＨタンパク質である。ＶＨおよびＶＬ配列のペアーが組み合わされる場合、スクリーニングの前に、ＲＳＶに結合する抗体フラグメントをコードするＶＨおよびＶＬペアーを濃縮するためにファージディスプレイ法を適用することができる。
【００６９】
ＲＳＶによる感染により液性免疫応答時に産生される抗体の多様性、親和性および特異性を反映するために、本発明は、出来る限り最も広範な多様性を得るため、同種ペアーのためのスクリーニング手法を発展させた。スクリーニングのために、同種ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのレパートリーは、適する宿主細胞にトランスフェクトされる細菌または哺乳動物のどちらかのスクリーニングベクターを用いて、抗体フラグメント（例、ｓｃＦｖもしくはＦａｂ）または全長抗体としてのどちらかで個々に発現される。Ｆａｂ／抗体のレパートリーは、１つまたはそれ以上のＲＳＶ株のウイルス粒子に対する反応性について選択される。好ましくは、少なくとも２つの株、サブタイプＡのうちの１つおよびサブタイプＢのうちの１つが用いられる。サブタイプＡ株は、例えば、Ｌｏｎｇ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６）、Ａ２（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４０）または最近のＬｏｎｇ様サブタイプＡ分離株である。サブタイプＢ株は、例えば、１８５３７（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５８０）、Ｂ１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１４００）、９３２０（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９５５）または最近の１８５３７様分離株である。同時に、Ｆａｂ／抗体のレパートリーは、組み換えＧタンパク質、組み換えＦタンパク質およびＲＳＶ抗原に由来するペプチドのごとく選択された抗原に対して選択される。抗原ペプチドは、例えば、Ｇタンパク質保存領域（アミノ酸１６４−１７６）およびＧタンパク質のシステインコア領域（サブタイプＡならびにサブタイプＢ株のアミノ酸１７１−１８７）、ならびにＳＨタンパク質の細胞外領域（サブタイプＡのアミノ酸４２−６４およびサブタイプＢの４２−６５）から選択されうる。好ましくは、スクリーニング中のビーズまたはプレートにおける固定を容易にするために、ペプチドがビオチン化される。代替的な固定の方法が用いられてもよい。抗原は、ＲＳＶの生物学の知見および期待される中和および／または保護効果に基づいて選択され、これらの抗原に結合することができる可能性のある抗体が提供できる。このスクリーニング手法は、同様にして組み合わせファージディスプレイライブラリーに適用されうる。スクリーニングに用いられる組み換えＧおよび／またはＦタンパク質は、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞または別の適切な発現系において発現されうる。Ｇおよび／またはＦタンパク質は、（膜貫通領域のない）可溶性タンパク質として発現されるか、または３番目のタンパク質に融合されるかのどちらかで安定性が上昇されてもよい。Ｇおよび／またはＦタンパク質が融合タグと一緒に発現される場合、融合の相手方は、スクリーニング前に切り離されてもよい。好ましくは、サブタイプＡおよびサブタイプＢの両方の典型例であるＧおよび／またはＦタンパク質は、スクリーニングのために発現され、用いられる。加えて、株特異的Ｇタンパク質もスクリーニングのために発現され、用いられる。上に記載される一次スクリーニングに加えて、選択された配列が擬陽性をコードしていないことを確実にするため、二次スクリーニングが実施されてもよい。二次スクリーニングでは、一次スクリーニングで同定したＶＨおよびＶＬペアーに結合する全てのＲＳＶ／抗原が、ウイルス株および選択された��原の両方に対して再度選択される。一般的に、免疫学的アッセイは、本発明で実施されるスクリーニングに適する。かかるアッセイは当該技術分野においてよく知られ、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴＳ、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡ、膜アッセイ（例、ウェスタンブロット）、フィルターを用いる解析、およびＦＡＣＳを構成する。前記アッセイは、前の濃縮工程がなくてもＶＨおよびＶＬペアーをコードする配列から産生されるポリペプチドを利用して行うことができる。ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのレパートリーが同種ペアーである事象では、例えば、ファージディスプレイによる濃縮は、スクリーニングの前には必要とされない。しかしながら、組み合わせライブラリーのスクリーニングでは、免疫アッセイは、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌表面ディスプレイ、酵母ディスプレイ、真核生物ウイルスディスプレイ、ＲＮＡディスプレイまたはコバレント（ｃｏｖａｌｅｎｔ）ディスプレイのごとき濃縮方法と組み合わせてまたは濃縮方法の後に行われる（Fitz Gerald, K.,2000. Drug Discov.Today 5, 253-258にて総説される）。
【００７０】
スクリーニングで選択された配列をコードするＶＨおよびＶＬペアーは、一般的に、配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）にかけられ、可変領域の多様性に関して解析される。特に、ＣＤＲ領域における多様性が興味深いが、ＶＨおよびＶＬファミリーの発現もまた興味深い。これらの解析に基づいて、１つまたはそれ以上のドナーから単離されたＲＳＶ結合抗体の全体の多様性を表すＶＨおよびＶＬペアーをコードする配列が選択される。好ましくは、全てのＣＤＲ領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）に相違を持つ配列が選択される。異なるＶＨおよびＶＬファミリーに属する１つまたはそれ以上の同一または非常に類似したＣＤＲ領域を持つ配列が存在する場合、これらも選択される。好ましくは、少なくとも可変重鎖のＣＤＲ３領域（ＣＤＲＨ３）は、選択された配列のペアー間で異なる。潜在的に、ＶＨおよびＶＬ配列ペアーの選択は、単にＣＤＲＨ３領域の可変性に基づくことができる。プライミングおよび配列の増幅中に、可変領域のフレームワーク領域、特に最初のフレームワーク領域において変異が生じうる。好ましくは、最初のフレームワーク領域で起きるエラーは、例えば、配列が完全なヒトであるようなドナーの配列に完全にまたは少なくとも９８％対応することを確実にするために修復される。
【００７１】
ＶＨおよびＶＬペアーをコードする選択された配列のコレクションの全体の多様性が、ＲＳＶ感染に対する液性反応における遺伝子レベルで見られる多様性をよく表すことが確実である場合、選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションから発現される抗体の全体の特異性もまた、ＲＳＶ感染ドナーで産生される抗体の特異性を表すことが期待される。選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションから発現される抗体の特異性が、感染したドナーで上昇された抗体の特異性を表すかどうかの指標は、ウイルス株ならびにドナー血液のうちの選択された抗原に対する抗体力価を、選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションから発現される抗体の特異性と比較することにより得ることができる。加えて、選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションから発現される抗体の特異性がさらに解析されうる。特異性の程度は、検出することができる結合反応性に対する異なる抗原の数に相関する。本発明のさらなる具体例では、選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションから発現される個々の抗体の特異性は、エピトープマッピングにより解析される。
【００７２】
エピトープマッピングは、多くの方法により行われてもよく、それらは必ずしも相互に排斥しない。抗体クローンのエピトープ特異性をマップする１つの方法は、標的抗原の一次構造に由来する各種大きさのペプチドへの結合性を評価することである。かかるペプチドは、直鎖状および立体構造の両方であってもよく、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）を含む多くのアッセイ形式で用いられてもよい。
【００７３】
さらに、ペプチドは、例えば、標的抗原の細胞外領域または保存領域を表す利用可能な配列および構造データを用いて合理的に選択されてもよく、あるいは、ペプチドは、抗原の選択された部分または全てを表す重複するペプチドのパネルとして設計されてもよい（Meloen RH, Puijk WC, Schaaper WMM. Epitope mapping by PEPSCAN. In: Immunology Methods Manual. Ed Iwan Lefkovits 1997, Academic Press, pp 982-988）。
【００７４】
１つまたはそれ以上のかかるペプチドを有する抗体クローンの特異的な反応性は、一般的にエピトープ特異性の指標である。しかしながら、ペプチドは、多くの場合、立体構造の欠如のため、および抗体とタンパク質で比較されるような抗体とタンパク質抗原間の相互作用の一般的に大きな埋もれた表面積のため、タンパク質性抗原に対して高まった抗体により認識されるエピトープの模倣性に乏しい。エピトープマッピングの第２の方法は、タンパク質抗原において直接的に特異性を定めることが可能であり、従来のよく定められた抗体を用いてマスクする選択的エピトープによるものである。ブロッキング後に抗原に対して２番目に結合する抗体の結合性の減少は、共有または重複エピトープの一般的な指標である。選択的なマスクによるエピトープマッピングは、多くの免疫アッセイにより行われてもよく、当該技術分野でよく知られるＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅを含むが、これらだけに限定されない（例、Ditzel et al. 1997 J.Mol.Biol. 267:684-695; Aldaz-Carroll et al.2005.J.Virol. 79: 6260-6271）。抗−ウイルス抗体のエピトープ特異性を調べるためのさらに別の可能な方法は、抗体の存在下におけるウイルスエスケープ変異体の選択である。かかるエスケープ変異体からの目的遺伝子の配列決定は、一般に、抗体による認識に重要であって、エピトープ（の一部）を構成する抗原におけるアミノ酸を明らかにする。
【００７５】
好ましくは、本発明の抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂに含まれる個々のメンバーは、抗体組成物の特異性が共同で、ＲＳＶサブタイプＡとＢの両方、およびＲＳＶ関連抗原タンパク質ＦとＧ、ならびに好ましくはＧを網羅するように選択される。
【００７６】
選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーに由来する組み換えポリクローナル抗体の産生
本発明のポリクローナル抗体は、１また数個のバイオリアクターまたはそれらの等価物中でポリクローナル発現細胞株から産生される。この方法の後に、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂは、そのプロセスの間に抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂを構成する個々のメンバーを分離することなく、単一の調製物としてリアクターから精製することができる。ポリクローナル抗体が１つ以上のバイオリアクターで産生される場合、各バイオリアクターからの上澄み液は、精製前にプールされうるか、あるいは精製された抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂは、各バイオリアクターから各々精製された上澄み液から得られた抗体をプールすることにより得られうる。
【００７７】
組み換えポリクローナル抗体を産生する１つの方法は、WO 2004/061104およびWO 2006/007850 (PCT/DK2005/000501)に記載される（これらの文献は出典明示により本明細書に援用する）。本明細書に記載される方法は、抗体をコードする配列の各宿主細胞のゲノムへの部位特異的な組み込みを基にし、ＶＨおよびＶＬタンパク質鎖が、生成期間に元々のペアーで維持されることを確実にする。さらに、部位特異的な組み込みは、位置効果を最小限にし、それゆえ、ポリクローナル細胞株における個々の細胞の増殖と発現の特性がきわめて類似することが期待される。一般に、前記方法は以下に関する：ｉ）１つまたはそれ以上のリコンビナーゼ認識部位を有する宿主細胞；ｉｉ）宿主細胞に適合する少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を有する発現ベクター；ｉｉｉ）全長抗体または抗体フラグメントがベクターから発現されうるように、選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーをスクリーニングベクターから発現ベクターに移すことによる発現ベクターコレクションの作成（かかる移行は、必ずしもスクリーニングベクターが発現ベクターと同一である必要はない）；ｉｖ）発現ベクターおよび宿主細胞のゲノム中のリコンビナーゼ認識部位をベクター中の認識部位と結合させることが可能なリコンビナーゼをコードするベクターのコレクションによる宿主細胞のトランスフェクション；ｖ）トランスフェクトされた宿主細胞かららポリクローナル細胞株を得ること／作成すること、次いでｖｉ）前記ポリクローナル細胞株からポリクローナル抗体を発現させ、収集すること。
【００７８】
好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例、Ｓｐ２／０またはＮＳ０細胞）のごとき哺乳動物細胞、ＮＩＨ３Ｔ３のごとき線維芽細胞、ならびにＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のごとき不死化ヒト細胞が用いられる。しかしながら、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、Ｅ．ｃｏｌｉなどのごとく非哺乳動物の真核または原核細胞もまた用いられうる。適する宿主細胞は、そのゲノム中に１つまたはそれ以上の適するリコンビナーゼ認識部位を含む。宿主細胞はまた、組み込み体を選択することができるために、組み込み部位に作動可能に連結される選択様式を含むべきである（すなわち、組み込み部位中に抗−ＲＳＶ  Ａｂ発現ベクターまたは発現ベクターフラグメントの組み込まれたコピーを有している細胞）。ゲノム中の予定された位置にＦＲＴ部位を有する細胞の調製物は、例えば、US 5,677,177に記載された。好ましくは、宿主細胞は単一の組み込み部位のみを有し、その部位は組み込み体の高発現を可能にする部位（いわゆるホットスポット）に位置される。
【００７９】
適する発現ベクターは、宿主細胞のリコンビナーゼ認識部位に適合する組み換え認識部位を含む。好ましくは、リコンビナーゼ認識部位は、宿主細胞の構築に用いられる選択遺伝子とは異なる適切な選択遺伝子に連結される。選択遺伝子は、当該技術分野においてよく知られ、グルタミン合成酵素遺伝子（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、およびネオマイシンを含み、ＧＳまたはＤＨＦＲは、挿入されたＶＨおよびＶＬ配列の遺伝子増幅に用いられてもよい。ベクターはまた、ベクターの完全な組み込みの代わりに、抗体をコードする配列のリコンビナーゼ介在カセット交換（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｓｓｅｔｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ；ＲＭＣＥ）を可能にする２つの異なるリコンビナーゼ認識部位を含んでもよい。ＲＭＣＥは、Langer et al 2002. Nucleic Acids Res. 30, 3067-3077; Schlake and Bode 1994. Biochemistry 33, 12746-12751およびBelteki et al 2003. Nat.biotech. 21, 321-324に記載される。適するリコンビナーゼ認識部位は当該技術分野でよく知られ、ＦＲＴ、ｌｏｘおよびａｔｔＰ／ａｔｔＢ部位を含む。好ましくは、組み込みベクターは、アイソタイプをコードするベクターであり、定常領域（好ましくはイントロンを含む）は、スクリーニングベクターからのＶＨおよびＶＬをコードするペアーの移行前のベクターに存在する（あるいは、スクリーニングが全長抗体において行われる場合、定常領域はスクリーニングベクター中にすでに存在する）。ベクターに存在する定常領域は、全体の重鎖定常領域（ＣＨ１からＣＨ３またはＣＨ４まで）であるか、抗体のＦｃ部分をコードする定常領域（ＣＨ２からＣＨ３またはＣＨ４まで）のどちらかであり得る。軽鎖カッパまたはラムダ定常領域はまた、移行前に存在してもよい。定常領域数の選択は、存在するとしても用いられるスクリーニングおよび移行システムに依存する。重鎖の定常領域は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥから選択することができる。好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３である。さらに、抗−ＲＳＶ抗体をコードする核酸の部位特異的な組み込みのための発現ベクターは、ＶＨおよびＶＬ鎖の各々の高レベル発現を指示する適切なプロモーターまたはその等価な配列を含む。図３は、発現ベクターを設計するための１つの可能な方法を示すが、他の多くの設計も可能である。
【００８０】
スクリーニングベクターからの選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーの移行は、各発現ベクター分子が１つのＶＨおよびＶＬをコードするペアーを含むように、慣用的な制限酵素切断およびライゲーションにより行うことができる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬをコードするペアーは各々移行されるが、任意選択的に、まとめて移行されてもよい。全ての選択されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーが発現ベクターに移行されると、発現ベクターのコレクションまたはライブラリーが得られる。移行の代替的な方法は、任意選択で用いられてもよい。スクリーニングベクターが発現ベクターと同一である場合、発現ベクターのライブラリーは、スクリーニング中に選択されたＶＨおよびＶＬ配列ペアーからなり、それらはスクリーニング／発現ベクター中に配置される。
【００８１】
核酸配列を宿主細胞にトランスフェクトする方法は当該技術分野において周知である。部位特異的な組み込みを確実にするために、適切なリコンビナーゼが宿主細胞にも提供されるべきである。これは、好ましくはリコンビナーゼをコードするプラスミドの共トランスフェクションにより達成される。適切なリコンビナーゼは、例えば、Ｆｌｐ、ＣｒｅまたはファージΦＣ３１インテグラーゼであり、対応するリコンビナーゼ認識部位を有する宿主細胞／ベクターシステムと一緒に用いられる。宿主細胞は、まとめてトランスフェクトされ得、それは、発現ベクターのライブラリーが１回の単一反応で細胞株にトランスフェクトされ、それによりポリクローナル細胞株を得ることを意味する。代替的に、発現ベクターのコレクションは、宿主細胞に個別にトランスフェクトされ、それにより個々の細胞株のコレクションを作成することができる（各細胞株は特定の特異性を有する抗体を産生する）。次いで、トランスフェクションにより作成された細胞株（各々またはポリクローナル）は、トランスフェクション前にまだこれらの特性を示さなかった場合、部位特異的な組み込み体について選択され、懸濁液および血清を含まない培地で増殖させるのに用いられる。トランスフェクションが個別に実施された場合、個々の細胞株は、それらの増殖特性および抗体産生に関してさらに解析される。好ましくは、同様の増殖速度および抗体発現レベルを有する細胞株は、ポリクローナル細胞株の作成について選択される。次に、ポリクローナル細胞株は、個々の細胞株を所定の割合で混合することにより作成される。一般に、ポリクローナルマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）、ポリクローナルリサーチ細胞バンク（ｐＲＣＢ）および／またはポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）がポリクローナル細胞株から構築される。ポリクローナル細胞株は、個々の細胞株を所定の割合で混合することにより作成される。ポリクローナル細胞株は、アンプルに分配され、それによりポリクローナルリサーチ細胞バンク（ｐＲＣＢ）またはマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）を作成し、ポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）は、リサーチまたはマスター細胞バンクから細胞を増殖させることにより作成することができる。リサーチ細胞バンクは、主として概念研究の証拠のためのものであり、ポリクローナル細胞株は、マスター細胞バンクにおけるポリクローナル細胞株ほど多くの個々の抗体を含み得ない。通常、ｐＭＣＢは、産生のためにｐＷＣＢを構築するためにさらに増殖させられる。ｐＷＣＢが使い果たされると、ｐＭＣＢからのアンプルが増殖させられて新しいｐＷＣＢを構築することができる。
【００８２】
本発明の一の具体例は、本発明の組み換えポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体を発現することができるポリクローナル細胞株である。
【００８３】
本発明のさらなる具体例は、各々個別の細胞が単一のＶＨおよびＶＬをコードするペアーを発現することができるポリクローナル細胞株であって、前記ポリクローナル細胞株が、全体としてＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションを発現することができ、各ＶＨおよびＶＬのペアーが抗−ＲＳＶ抗体をコードする。好ましくは、ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのコレクションは、本発明の方法により作成される同種ペアーである。
【００８４】
本発明の組み換えポリクローナル抗体は、抗体の十分な発現が可能な期間、適切な培地中でｐＷＣＢからの１つのアンプルを培養することにより発現され、このポリクローナル細胞株は安定した状態を保つ（期間（ｗｉｎｄｏｗ）はおよそ１５日と５０日の間である）。流加または灌流のごとき培養方法が用いられてもよい。組み換えポリクローナル抗体は、培地から得られ、慣用的な精製技術により精製される。イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用およびゲルろ過のごとく後の精製工程と一緒にしたアフィニティークロマトグラフィーがＩｇＧの精製によく用いられる。精製後、ポリクローナル抗体組成物中の全ての個々のメンバーの存在が、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより試験される。ポリクローナル抗体組成物の特徴付けは、WO 2006/007853（PCT/DK2005/000504）（出典明示により本明細書に援用する）に詳細に記載される。
【００８５】
組み換え宿主において抗体の混合物を発現させる代替的な方法は、WO 04/009618に記載される。この方法は、単一の細胞株に由来する同一の軽鎖に結合した異なる重鎖を有する抗体を生成する。この方法は、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂが組み合わせライブリーから産生される場合に適用してもよい。
【００８６】
治療用組成物
本発明の別の態様は、活性成分として抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂもしくは抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナルＦａｂまたは別の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体フラグメントを含む医薬組成物である。好ましくは、かかる組成物の活性成分は、本発明に記載されるような抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体である。かかる組成物は、ＲＳＶ感染の予防および／または治療を目的とされる。好ましくは、医薬組成物は、ヒト、家畜、またはペットに投与される。
【００８７】
医薬組成物は、医薬上許容される賦形剤をさらに含む。
【００８８】
抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂまたはそのポリクローナルフラグメントは、単一用量形態において、医薬上許容される希釈剤、担体、または賦形剤内で投与されてもよい。慣用的な医薬上の実施が用いられることにより、ＲＳＶに感染した患者、またはＲＳＶに感染するリスクの高いであろう患者に投与するのに適切な製剤または組成物が提供されてもよい。好ましい具体例では、投与は予防である。別の好ましい具体例では、投与は治療であり、ＲＳＶ感染に関連する症状の発症後に投与されることを意味する。適切な投与経路が用いられてもよく、例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、座剤、または経口投与であってもよい。例えば、医薬製剤は、液状溶液または懸濁液の形態であってもよく、経口投与用には、製剤は、錠剤、カプセル、チューインガムまたはペースト状の形態であってもよく、鼻腔内用には、粉末、点鼻剤、またはエアロゾルの形態であってもよい。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の溶解、凍結乾燥、混合、顆粒化または調合プロセスを用いて、それ自体周知な手法で調製される。医薬組成物は、慣用的な製薬の実施に従って製剤化されてもよい（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R.Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PAおよびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NYを参照。）。
【００９０】
好ましくは、活性成分の溶液もしくは懸濁液、特に等張水溶液もしくは懸濁液は、本発明の医薬組成物を調製するのに用いられる。活性成分のみまたは担体、例えば、マンニトールと一緒になった活性成分を含む凍結乾燥された組成物の場合、かかる溶液もしくは懸濁液は、可能であるならば、使用前に産生されてもよい。医薬組成物は、滅菌されていてもよく、ならびに／あるいは賦形剤、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩および／または緩衝液を含んでいてもよく、例えば、慣用的な溶解または凍結乾燥プロセスを用いて、それ自身よく知られる手法で調製される。前記溶液もしくは懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのごとき粘度増加物質を含んでもよい。
【００９１】
注入組成物は、滅菌状態下で慣用的な手法において調製される；同じく、組成物をアンプルまたはバイアルに導入し、容器を密閉することに適用する。
【００９２】
経口投与のための医薬組成物は、活性成分を液体担体と一緒にすることにより、望ましくは生じた混合物を顆粒化し、次いで、所望または必要であるならば、適切な賦形剤を錠剤、ピル、またはカプセルへ添加した後、混合物を処理することにより得ることができ、セラック、糖またはその両方でコートされていてもよい。それらはまた、活性成分を一定量で拡散し、または解離されうるプラスティック担体に取り込まれることも可能である。
【００９３】
医薬組成物は、約１％から約９５％まで、好ましくは約２０％から約９０％までの活性成分を含む。本発明による医薬組成物は、例えば、アンプル、バイアル、座薬、錠剤、ピル、またはカプセルの形態のごとき単一用量の形態であってもよい。製剤は、治療上または予防上有効量（例、病態を予防、排除、または軽減する量）でヒトの個体に投与されることにより、病気または状態に対する治療が提供されうる。投与される治療剤の好ましい用量は、ＲＳＶ感染の重症度、各患者の総体的な健康状態、化合物賦形剤の剤形、およびその投与経路のごとき変動するものに依存すると考えられる。
【００９４】
本発明による組成物の治療上の使用
本発明による医薬組成物は、哺乳動物における病気の治療、改善または予防に用いられてもよい。本願の医薬組成物で治療または予防することができる状態は、ＲＳＶに感染した患者の治療、またはＲＳＶに感染するリスクのある患者、特にＲＳＶに感染する高いリスクを有する患者の予防、および治療を含む。高いリスクの患者は、例えば、幼児および小さい子供である。特に、慢性肺疾患または先天性心疾患のごとき問題を抱える未熟な幼児および子供は、ＲＳＶ感染後に細気管支炎および肺炎のごとき深刻な病気に対して最も高いリスクを有する。また、免疫不全の成人、特に骨髄移植被提供者、高齢者および慢性肺疾患にかかっている患者のごとき高いリスクの成人は、好ましくは、本発明による医薬組成物による予防または治療上の処置を受けることができる。
【００９５】
本発明の一の具体例は、哺乳動物におけるＲＳＶ感染に関連した１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善する方法であって、前記哺乳動物に本発明の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体の有効量を投与することを含む。
【００９６】
本発明のさらなる具体例は、哺乳動物におけるＲＳＶ感染に関連した１つまたはそれ以上の症状の治療、改善または予防のための組成物の調製のための本発明の抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体の使用である。
【００９７】
好ましくは、上記具体例における哺乳動物は、ヒト、家畜またはペットである。
【００９８】
さらなる具体例では、ＲＳＶ感染に関連した１つまたはそれ以上の症状を予防、治療または改善する方法を受けさせる哺乳動物は、好ましくは４０ｋｇを超える体重を有する。
【００９９】
対象がヒトである具体例では、好ましくは、未成熟な幼児、慢性肺疾患または先天性心疾患にかかっている子供である。代替的な具体例では、ヒトは、免疫不全の成人、特に骨髄移植被提供者、高齢者または慢性肺疾患にかかっている個体である。
【０１００】
診断上の使用
本発明の別の具体例は、診断用キットを目的とする。本発明によるキットは、本発明に従って調製される抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂを含み、このタンパク質は、検出可能な標識で標識されていてもよく、または非標識検出用に標識されていなくてもよい。キットは、ＲＳＶで感染された個体を同定するのに用いられてもよい。
【０１０１】
本発明の抗体分子およびそれに関連した態様
本明細書で開示される新規な抗体分子がそれら自体の権利において技術常識に貢献すると信じられることは特筆されるべきである。したがって、本発明はまた、本明細書で開示される抗体分子のいずれか１つならびにこれらの抗体のフラグメントおよびアナログに関連し、前記フラグメントまたはアナログは、少なくとも本明細書で開示される抗体のＣＤＲを含む。
【０１０２】
例えば、ヒトのドナーから単離された完全なヒト抗体分子のいずれかは、抗原結合部位としては、公知の従来技術のモノクローナル抗体を超えた極めて高い改善された動力学的特性を示す結合部位を含むことが本発明者らにより見出された。それゆえ、本願の開示におけるポリクローナル抗体組成物に多くの着目がなされたとしても、本明細書で説明されるポリクローナル抗体の利用に関する全ての対象物はまた、本明細書で開示される単一の抗体分子のうちのいずれか１つに関連する。−すなわち、本発明のポリクローナル抗体組成物に関連する製剤化、用量、投与などに関する全ての開示は、本明細書で開示される個々の抗体分子、抗体フラグメントおよび抗体アナログ、好ましくはフレームワーク配列に準用する。
【０１０３】
したがって、本発明はまた、本明細書中の表５に記載される抗体分子から選択される単離ヒトＲＳＶ−抗体分子、あるいは前記単離抗体分子に特異的に結合するフラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログであって、前記結合するフラグメントまたはアナログは、少なくとも前記単離抗体分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものに関連する。多くの場合、元々のヒト抗体の可変領域に由来するフレームワーク領域は、抗体の抗原特異性がＣＤＲおよびフレームワーク領域の３Ｄ構成によることが知られることから、フラグメントまたはアナログにも含まれる。
【０１０４】
用語「単離された抗体分子」は、天然の夾雑物から単離され、同一のアミノ酸配列（すなわち、同一の可変領域および定常領域）を示す別個の抗体コレクションを表すことが意図される。
【０１０５】
典型的に、抗体分子、フラグメントまたはアナログは、表８に記載される抗体に由来するか、あるいは、配列番号：１−４４のうちの１つに含まれる重鎖ＣＤＲアミノ酸配列および配列番号：１−４４から選択されるアミノ酸配列より８８高い配列番号：を有する付随の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。このことは、抗体分子、フラグメントまたはアナログが上に記載される４４個のクローン以外の同一物から見出される可変領域の同種のペアーを含むことを意味する。
【０１０６】
上に記載されるように、多くの本抗体分子は、非常に高い親和性を示し、本発明はまた、ヒト抗体に由来するＦａｂ中のＣＤＲに同一のＣＤＲを含む、単離された抗体分子、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログに関連し、前記Ｆａｂは、物質輸送時の制限を避けるために極めて低い密度でセンサー表面上に固定された組み換えＲＳＶ  Ｇタンパク質を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００において表面プラズモン共鳴分析を実施して測定した場合、５００ｎＭまたはそれ以下のＲＳＶ  Ｇタンパク質の解離定数ＫＤを示す。単離された抗体分子、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体は、典型的に、４００ｎＭまたはそれ以下、例えば、３００ｎＭまたはそれ以下、２００ｎＭまたはそれ以下、１００ｎＭまたはそれ以下、１ｎＭまたはそれ以下、９００ｐＭまたはそれ以下、８００ｐＭまたはそれ以下、７００ｐＭまたはそれ以下、６００ｐＭまたはそれ以下、５００ｐＭまたはそれ以下、４００ｐＭまたはそれ以下、３００ｐＭまたはそれ以下、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、９０ｐＭまたはそれ以下、および８０ｐＭまたはそれ以下のごときより低いＫＤを示す。
【０１０７】
本発明の別の具体例は、ヒト抗体に由来するＦａｂ中の抗原結合部位に同一の抗原結合部位を含む、単離された抗体分子、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体アナログに関連し、前記Ｆａｂは、物質輸送時の制限を避けるために極めて低い密度でセンサー表面上に固定された組み換えＲＳＶ  Ｇタンパク質を用いて、Ｂｉｏｃｏｒｅ３０００において表面プラズモン共鳴分析を実施して測定した場合、５００ｎＭまたはそれ以下のＲＳＶ  Ｆタンパク質の解離定数ＫＤを示す。この単離された抗体、抗体フラグメントまたは合成もしくは半合成抗体は、典型的に、４００ｎＭまたはそれ以下、例えば、３００ｎＭまたはそれ以下、２００ｎＭまたはそれ以下、１００ｎＭまたはそれ以下、１ｎＭまたはそれ以下、９００ｐＭまたはそれ以下、８００ｐＭまたはそれ以下、７００ｐＭまたはそれ以下、６００ｐＭまたはそれ以下、５００ｐＭまたはそれ以下、４００ｐＭまたはそれ以下、３００ｐＭまたはそれ以下、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、９０ｐＭまたはそれ以下、８０ｐＭまたはそれ以下、７０ｐＭまたはそれ以下、６０ｐＭまたはそれ以下、５０ｐＭまたはそれ以下、４０ｐＭまたはそれ以下、３０ｐＭまたはそれ以下、２５ｐＭまたはそれ以下、２０ｐＭまたはそれ以下、１５ｐＭまたはそれ以下、１０ｐＭまたはそれ以下、９ｐＭまたはそれ以下、８ｐＭまたはそれ以下、７ｐＭまたはそれ以下、６ｐＭまたはそれ以下、および５ｐＭまたはそれ以下のごときＫＤを示す。
【０１０８】
特に有用な抗体分子または特異的に結合するフラグメントまたは合成もしくは半合成の抗体アナログは、クローン番号８１０、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８５８または８９４で産生されるヒト抗体のＣＤＲを含む。
【０１０９】
上に記載されるように、本発明のこれらの有用な抗体分子は、本発明のポリクローナル製剤と同一の方法および同一の適用で製剤化されてもよい。したがって、本発明は、医薬上許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたは希釈剤と混合した、このセクションで記載される抗体分子、特異的に結合するフラグメントまたは合成もしくは半合成の抗体アナログを含む抗体組成物に関する。組成物は、１つ以上の結合特異性を含んでもよく、例えば、２つの本発明の別個の抗体分子ならびに／あるいは本発明の特異的に結合するフラグメントおよび／または合成もしくは半合成の抗体アナログを含んでもよい。組成物は、少なくとも３つの別個の抗体分子および／または抗体フラグメントおよび／または合成もしくは半合成抗体アナログ、特に本発明の結合フラグメントまたは合成もしくは半合成の抗体アナログを含んでもよく、それゆえに４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の別個の抗体分子および／またはフラグメントおよび／または合成もしくは半合成抗体アナログを含む組成物を構成してもよい。
【０１１０】
特に目的とする組成物は、少なくとも１つのＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する本発明の抗体分子、フラグメントまたはアナログ、ならびに少なくとも１つのＲＳＶ  Ｇタンパク質に結合する本発明の抗体分子、フラグメントまたはアナログを含む。
【０１１１】
本発明の一部はまた、核酸フラグメントのごとく、本発明の抗体分子のうちの少なくとも１つの定義されたＣＤＲのアミノ酸をコードする単離された核酸フラグメントであって、それは、少なくとも表５に記載されるクローンのうちの１つにより産生される抗体のＣＤＲをコードする。核酸フラグメントは、典型的にはＤＮＡであるが、ＲＮＡでもありうる。
【０１１２】
別の具体例は、配列番号：１−４４のうちのいずれか１つに記載される重鎖アミノ酸配列のＣＤＲ配列をコードする、単離された核酸フラグメントであるか、あるいは、配列番号：８９−１３２のうちのいずれか１つに記載される軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ配列をコードする、単離された核酸フラグメントである。本発明の好ましい核酸フラグメントは、配列番号：１−４４のうちのいずれか１つに記載される重鎖アミノ酸配列のＣＤＲ配列をコードし、配列番号：１−４４から選択されるアミノ酸配列より８８高い配列番号：を有する付随する軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列に記載される。このことは当然、核酸フラグメントが上で記載される４４個のクローン由来の同一物中に見出される可変領域の同種のペアーをコードすることを意味する。それゆえ、核酸フラグメントは、配列番号：４５−８８および／または１３３−１７６に含まれるコーディング配列を含んでもよい。
【０１１３】
利便的に、核酸フラグメントがベクターに導入されても、本発明の一部となる。かかるベクターは、自律的に複製することができてもよく、典型的には、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、およびウイルスからなる群から選択される。
【０１１４】
本発明のベクターが発現ベクターである場合では、それは、好ましくは以下に概略を示す（参考．図３の典型的なベクター）：
−５’→３’方向および作動可能な連結において、上記に示される第１の核酸フラグメントの発現を促進するための少なくとも１つのプロモーターであって、それは、いずれかの必須なフレームワーク領域、任意選択でリーダーペプチドをコードする核酸配列、前記第１の核酸フラグメント、任意選択で抗体の定常領域をコードする核酸配列、ならびに任意選択で第１の転写終結領域をコードする核酸配列と一緒に少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲをコードし、ならびに／あるいは
−５’→３’方向および作動可能な連結において、本発明の第２の核酸フラグメントの発現を促進するための少なくとも１つのプロモーターであって、それは、いずれかの必須なフレームワーク領域、任意選択でリーダーペプチドをコードする核酸配列、前記第２の核酸フラグメント、任意選択で抗体の定常領域をコードする核酸配列、ならびに任意選択で第２の転写終結領域をコードする核酸配列と一緒に少なくとも１つの重鎖ＣＤＲをコードする。
【０１１５】
かかるベクターは、安定に宿主細胞を形質転換することに用いることができ、次いで組み換え発現産物を得るために培養されうる場合に特に有用である。したがって、好ましいベクターは、宿主細胞に導入される時に、宿主細胞ゲノムに組み込まれるものである。
【０１１６】
したがって、本発明はまた、このセクションに記載される発明のベクターを保有する形質転換された細胞、ならびにこのベクターを保有し、このセクションに記載される本発明の核酸フラグメントを発現する安定な細胞株に関連する。形質転換された細胞および細胞株の両方は、必要に応じて、その表面上の組み換え発現産物（すなわち、本発明の抗体分子、抗体フラグメントまたはアナログ）を分泌するか、または保有する。
【実施例１】
【０１１７】
この実施例は、本発明を例示するために適用された方法を集めたものである。
【０１１８】
ａ．ドナー血液由来のラムダ−陰性の形質芽細胞の分別
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の説明書に従ってＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ）および勾配遠心分離を用いて、ドナーから採集した血液から単離した。単離したＰＢＭＣを、−１５０℃でＦＣＳ；１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存するか、または直接使用した。Ｂ細胞画分を抗−ＣＤ１９抗体で標識し、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いてＰＢＭＣ画分から単離した。ＰＢＭＣ（１×１０６細胞）を抗−ＣＤ１９−ＦＩＴＣ抱合抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で２回洗浄し、再懸濁させた。抗−ＦＩＴＣ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を、標識した細胞と混合し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞−ビーズ懸濁液をＬＳ  ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）にアプライする前に洗浄の手順を繰り返した。ＣＤ１９陽性細胞画分を、製造業者の説明書に従ってカラムから溶離し、ＦＣＳ−１０％  ＤＭＳＯ中で保存するか、または直接単一細胞を分別した。
【０１１９】
形質芽細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ３８、およびＣＤ４５細胞表面タンパク質の発現プロファイルに基づいた蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により、ＣＤ１９＋Ｂ細胞画分から選択した。ＣＤ１９は、血漿細胞前駆体上でも発現されるＢ−細胞マーカーである一方、ＣＤ３８は、形質芽細胞および血漿細胞上で強く発現される。形質芽細胞は、明らかに残りのＣＤ１９＋細胞よりいくらか低いＣＤ１９およびＣＤ４５の発現を示し、このことは別々の集団への分離を可能にする。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ；１％ＢＳＡ）で洗浄し、抗−ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ３８−ＡＰＣ、抗−ラムダ−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で２０分間染色した。ＰＣＲの鋳型として供給できない細胞を排除させるためにラムダ軽鎖染色を含めた（セクションｃを参照）。染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、再懸濁させた。
【０１２０】
ＦＡＣＳ中の細胞の流速を約２００イベント／秒に設定し、細胞濃度を５×１０５／ｍｌにして高い血漿細胞レスキューを得た。以下のゲート設定を用いた。各ゲートは作成者の設定（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍｅｒ）である。
【０１２１】
ゲート１：ＦＳＣ／ＳＳＣゲート。最も高いＦＳＣを示すリンパ球集団を選択し、それにより生存細胞の分別を確実にした。
【０１２２】
ゲート２：ＳＳＣｈ／ＳＳＣｗ。このゲートは単一細胞の分別を確実にした。
【０１２３】
ゲート３：形質芽細胞を表すイベントをＣＤ３８高／ＣＤ１９中間としてＣＤ３８／ＣＤ１９ドットプロットで表した。
【０１２４】
ゲート４：セクションｃで記載されるＰＣＲ法のみがカッパ軽鎖を増幅するため、ラムダ−陰性イベントをラムダ／ＣＤ１９ドットプロットで表した。
【０１２５】
ゲート３の代替としてまたはゲート３に加えて、形質芽細胞をＣＤ４５／ＣＤ３８ドットプロット中のＣＤ３８高およびＣＤ４５中間として同定した。これは、抗−ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰによる細胞の染色を必要とする。
【０１２６】
これらの４つの基準を満たした得られた集団を、分別緩衝液を含む９６−ウェルＰＣＲプレートに単一細胞に分別した（セクションｃを参照）。前記細胞を含むプレートを−８０℃で保存した。
【０１２７】
ｂ．ＥＬＩＳｐｏｔ
ＥＬＩＳｏｔを用いることにより、得られた細胞サンプル、すなわち、ＰＢＭＣ、ＭＡＣＳ−精製ＣＤ１９＋細胞、またはＦＡＣＳで分別した形質芽細胞の集団において、抗−ＲＳＶ抗体を発現する形質芽細胞の割合を評価した。ニトロセルロース表面を伴う９６−ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を２５μｇ／ｍｌの不活性化ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ粒子（ＨｙＴｅｓｔ）溶液でコートした。ウェルをＲＰＭＩ、２％  粉乳とのインキュベーションによりブロックし、４℃で約５時間静置し、続いて３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、細胞サンプルをＲＰＭＩ培地中で各ウェルに添加し、続いて一般的な組織培養条件で２４時間インキュベートした。分泌されたＲＳＶ−特異的な抗体は、抗体産生細胞周辺の固定化されたウイルス粒子に結合する。細胞をＰＢＳ；０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回およびＰＢＳで３回洗浄することにより取り除いた。ＨＲＰ−抱合抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＣａｌＴａｑ）およびＨＲＰ−抱合抗−ヒトＩｇＡ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を加え、固定化された抗体と３７℃で１時間反応させた。洗浄の手順を繰り返し、発色基質（Ｎ，Ｎ−ＤＭＦ（ジ−メチルホルムアミド）中に可溶化された３−アミノ−９−エチルカルバゾール）を添加した。発色をＨ２Ｏの添加により４分後に停止させた。赤色スポットを抗原−特異的抗体−分泌細胞が局在する部位として同定した。
【０１２８】
ｃ．同種ＶＨおよびＶＬペアーの連結
ＶＨおよびＶＬをコードする配列の連結を、セクションａに記載されるように得られた単一細胞上で行い、ＶＨおよびＶＬをコードする配列の同種のペアーを容易にした。手法は、一工程（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）の多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲに続いてネスティドＰＣＲに基づく二工程（ｔｗｏ  ｓｔｅｐ）ＰＣＲ法を利用した。本実施例で用いられるプライマーミックスは、カッパ軽鎖のみを増幅する。しかしながら、ラムダ軽鎖を増幅することができるプライマーを任意選択で多重プライマーミックスおよびネスティドＰＣＲプライマーミックスに添加することができた。ラムダプライマーを添加する場合、セクションａにおける分取の手法は、ラムダ陽性細胞が排除されないように用いられるべきである。同種ＶＨおよびＶＬ配列の連結のための原理を図２に示す。
【０１２９】
セクションａで産生された９６−ウェルＰＣＲプレートを融解させ、分取した細胞を多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲの鋳型として供給した。単一細胞分取前に各ウェルに添加した分取緩衝液は、反応緩衝液（ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液；Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（表２を参照）およびＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有した。これにＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス（２５×希釈率；Ｑｉａｇｅｎ）およびｄＮＴＰ（各２００μＭ）を補充して２０μｌの反応体積で所定の最終濃度を得た。
【０１３０】
プレートを５５℃で３０分間インキュベートして各細胞からのＲＮＡ逆転写を可能にした。ＲＴ後、プレートを以下のＰＣＲサイクルにかけた：９４℃で１０分、３５×（９４℃で４０秒、６０℃で４０秒、７２℃で５分）、７２℃で１０分。
【０１３１】
２４個の９６−ウェルプレート用のＰｅｅｌ  Ｓｅａｌ  Ｂａｋｅｔを備えるＨ２０ＢＩＴサーマルサイクラー（ＡＢｇｅｎｅ）でＰＣＲ反応を実施してハイスループットを容易にした。ＰＣＲプレートをサイクリング後に−２０℃で保存した。
【０１３２】
表２：ＲＴ−ＰＣＲ多重重複伸長プライマーミックス
【表２】
2009528828.tif 000004
Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ
【０１３３】
ネスティドＰＣＲ工程では、９６−ウェルプレートの各ウェル（２０−μｌ反応物）に以下の混合物を調製して所定の最終濃度を得た：１×ＦａｓｔＳｔａｒｔ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、ｄＮＴＰミックス（各２００μＭ）、ネスティドプライマーミックス（表３を参照）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０８Ｕ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｌｅｎｄ（０．８Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）。ネスティドＰＣＲの鋳型として、１μｌを多重重複伸長ＰＣＲ反応物から移した。ネスティドＰＣＲプレートを以下のＰＣＲサイクルにかけた：３５×（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒）、７２℃で１０分。
【０１３４】
無作為に選択した反応物を１％アガロースゲル上で解析して約１０７０ｂｐの重複伸長フラグメントの存在を確認した。
【０１３５】
さらにＰＣＲフラグメントを処理するまでプレートを−２０℃で保存した。
【０１３６】
表３：ネスティドプライマーのセット
【表３】
2009528828.tif 000005
【０１３７】
ｄ．同種ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのスクリーニングベクターへの挿入
ＲＳＶ粒子または抗原に対して結合特異性を有する抗体を同定するために、セクションｃに記載されるように得られたＶＨおよびＶＬをコードする配列を全長抗体として発現させた。このことは、ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのレパートリーの発現ベクターへの挿入および宿主細胞への形質転換に関連した。
【０１３８】
連結されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーを含む発現ベクターのレパートリーを作成するために、二工程クローニング法を採用した。統計的に、発現ベクターのレパートリーがスクリーニングレパートリーの作成に用いられる同種ペアーのＶＨおよびＶＬＰＣＲ産物の数より１０倍多い組み換えプラスミドを含む場合、全てユニークな遺伝子ペアーが表される可能性は９９％である。それゆえ、４００個の重複伸長Ｖ−遺伝子フラグメントがセクションｃで得られた場合、少なくとも４０００個のクローンのレパートリーがスクリーニングにより作成された。
【０１３９】
簡単に説明すると、セクションｃにおけるネスティドＰＣＲからの連結されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーのレパートリーを、（他のドナーに由来するペアーを混合することなく）プールした。ＰＣＲフラグメントを、ＰＣＲ産物の末端に導入された認識部位においてＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ  ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いて切断した。一般的なライゲーションの方法により、切断および精製されたフラグメントをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化した哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター（図３）に結合させた。ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉにエレクトロポレートし、適切な抗生物質を含む２×ＹＴプレートに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。増幅されたベクターのレパートリーを、一般的なＤＮＡ精製方法（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、プレートから回収した細胞から精製した。プロモーター−リーダーフラグメントの挿入のために、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩエンドヌクレアーゼを用いる切断によりプラスミドを調製した。これらの酵素の制限部位は、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子のペアー間に局在した。ベクターの精製後に、ＡｓｃＩ−ＮｈｅＩで消化された二方向性哺乳動物プロモーター−リーダーフラグメントを、一般的なライゲーション法によりＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位に挿入した。結合されたベクターをＥ．ｃｏｌｉ中で増幅させ、一般的な方法を用いてプラスミドを精製した。作成されたスクリーニングベクターのレパートリーを慣用的な手法によりＥ．ｃｏｌｉに形質転換させた。得られたコロニーを３８４−ウェルマスタープレートに集め、保存した。アレイしたコロニー数は、インプットしたＰＣＲ産物の数を少なくとも３倍超え、それによりセクションｃで得られた全てのユニークなＶ−遺伝子ペアーの存在について９５％の可能性が与えられた。
【０１４０】
ｅ．スクリーニング
セクションｄで集められた細菌コロニーを、同様の３８４−ウェルプレート中の培地に播種し、一晩培養した。トランスフェクション用のＤＮＡを細胞培養プレートの各ウェルから調製した。トランスフェクション前日に、３８４−ウェルプレートに２０μｌ培地中で３０００細胞／ウェルにおいてＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を播種した。細胞を、製造業者の説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＤＮＡとともにトランスフェクトさせた。２−３日間の培養後、スクリーニングに用いるため、全長抗体を含む上澄み液を収集し、保存した。
【０１４１】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００  ＦＭＡＴ（登録商標）システム、ホモジニアス（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）ビーズに基づいた可溶化キャプチャーＦＬＩＳＡ（蛍光連結免疫吸着アッセイ）を用いてスクリーニングを行った（Swartzman et al1999, AnalBiochem271:143-151）。ＲＳＶ抗原に由来するウイルス粒子、組み換えＧタンパク質およびビオチン化ペプチドを含む多くの抗原をスクリーニングに使用した。ペプチドは、Ｇタンパク質の保存領域（アミノ酸１６４−１７６）とシステインコア領域（アミノ酸１７１−１８７、株Ｌｏｎｇおよび１８５３７）およびＳＨ−タンパク質の細胞外領域（Ａ２株のアミノ酸４２−６４および１８５３７株の４２−６５）に由来した。不活性化されたＲＳＶ株Ｌｏｎｇのウイルス粒子（ＨｙＴｅｓｔ）を、３００μｌのウイルスストック（タンパク質濃度：２００μｇ／ｍｌ）と一緒に３００μｌの５％  ｗ／ｖビーズ（直径６．７９μｍ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）をインキュベートすることによりポリスチレンビーズ上に固定化させた。可溶性組み換えＧタンパク質（１８５３７株の配列のアミノ酸６６−２９２）を同様に直接ポリスチレンビーズ上に固定化させた一方、ビオチン化されたペプチドを、前コートされたストレプトアビジンポリスチレンビーズ（直径６．０−８．０μｍ、Ｇｅｒｌｉｎｄｅ  Ｋｉｓｋｅｒ）上で飽和濃度において補促させた。コート混合物を一晩インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ビーズを、１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）および５μｌヤギ−抗−ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ６４７抱合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）を含む５０ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。再懸濁したコート混合物の１０μｌに、ＦＭＡＴ適合性の３８４−ウェルプレート中で２０μｌの抗体を含む上澄み液を添加し、約１２時間インキュベートし、その後、各ウェル中のビーズ表面における蛍光を測定した。蛍光の強度がバックグラウンド基準を超えた少なくとも６つの標準偏差である場合、蛍光イベント（ｅｖｅｎｔ）が陽性であると判断した。
【０１４２】
最初の当たりで生じたクローンを元々のマスタープレートから取り出し、新しいプレートに収集した。これらのクローンからＤＮＡを単離し、Ｖ−遺伝子のＤＮＡ配列決定を行った。この配列を並列比較し、全てのユニークなクローンを選択した。
【０１４３】
選択されたクローンをさらに検証した。簡単に説明すると、２×１０６個のフリースタイル（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ）２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の説明書に従って、２ｍｌのフリースタイル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中において、選択されたクローン由来の１．７μｇ  ＤＮＡおよび０．３μｇのｐＡｄＶＡｎｔａｇｅプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェクトした。２日後、上澄み液を、ＩｇＧ発現について、ならびに一次スクリーニングに用いられる異なる抗原および組み換え精製Ｆタンパク質とＥ．ｃｏｌｉ産生のＧタンパク質フラグメント（１８５３７株配列のアミノ酸１２７−２０３）との反応性について、ＦＬＩＳＡおよび／またはＥＬＩＳＡによりテストした。抗体上澄み液を連続希釈でテストすることにより、抗原反応性によるクローンのランキングを可能にした。
【０１４４】
ｆ．クローン修復
セクションｃに記載されるような多重ＰＣＲ法を用いると、高い相同性により、一定頻度のＶ−遺伝子ファミリー内および間のクロスプライミングが予想される。クロスプライミングは、免疫グロブリンフレームワーク中に天然に存在しないアミノ酸を導入し、いくつかの潜在的な結果、例えば、構造変化および免疫原性の増加をもたらし、それらは全て治療活性の減少を招く。
【０１４５】
これらの欠点を解消し、選択されたクローンが自然の液性免疫応答を反映することを確実にするために、かかるクロスプライミング変異をクローン修復（ｃｌｏｎｅ  ｒｅｐａｉｒ）と呼ばれるプロセスで修復した。
【０１４６】
クローン修復手順の第一工程では、ＶＨ配列を、目的クローンの起源であるＶＨ−遺伝子に対応する配列を含むプライマーセットでＰＣＲ増幅し、それによりクロスプライミングにより導入された変異のいずれかを修正した。ＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＡｓｃＩで消化し、慣用的なライゲーション手法を用いて、ＸｈｏＩ／ＡｓｃＩで消化された哺乳動物発現ベクター（図３）に結合させた。結合したベクターをＥ．ｃｏｌｉ中で増幅させ、一般的な方法によりプラスミドを精製した。ＶＨ配列の配列を決定して修正を確認し、ベクターをＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化して軽鎖の挿入用に調製した。
【０１４７】
第二工程では、完全な軽鎖を、目的クローンの起源であるＶＬ−遺伝子に対応する配列を含むプライマーセットでＰＣＲ増幅し、それによりクロスプライミングにより導入された変異のいずれかを修正した。ＰＣＲフラグメントをＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化し、上記で調製されたベクターを含むＶＨに結合させた。ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉで増幅させ、一般的な方法により精製した。次いで、軽鎖の配列を決定して修正を確認した。
【０１４８】
選択されたクローンのカッパ定常領域が、セクションｃに記載の遺伝子増幅中に導入された変異を含んだ場合、未変異の定常領域により置換された。これは、（定常領域を除いて増幅された）修復ＶＬ−遺伝子を、（別々のＰＣＲで得られた）修正配列を伴う定常領域に繋ぐ重複ＰＣＲにおいて行った。全体の配列を増幅し、上に記載されるごときベクターを含むＶＨにクローン化し、修復された軽鎖の配列を決定して修正を確認した。
【０１４９】
ｇ．ポリクローナル細胞株の作成
組み換えポリクローナル抗体を産生するポリクローナル発現細胞株の作成は、単一のＶＨおよびＶＬ遺伝子配列に由来するユニークな抗体を各々発現する個々の発現細胞株の作成に関する複数−工程手順である。ポリクローナル細胞株は、個々の細胞株を混合し、混合物をアンプルに分配し、それによりポリクローナルリサーチ細胞バンク（ｐＲＣＢ）またはマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）を作成することにより得られ、ポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）は、リサーチまたはマスター細胞バンクから細胞を増殖させることにより作成されうる。一般的に、ｐＲＣＢ由来のポリクローナル細胞株は、ｐＷＣＢを作成することなく直接用いられる。
【０１５０】
ポリクローナル細胞株を作成するプロセスにおける各工程を以下に記載する。
【０１５１】
ｇ−１  哺乳動物細胞株のトランスフェクションおよび選択
Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を開始細胞株として用いた。より均一な細胞株を得るために、親のＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞株を、希釈を制限してサブクローン化し、いくつかのクローンを選択し、増殖させた。増殖の具合に基づいて、１つのクローン、ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）を開始細胞株として選択した。ＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＨＡＭ−Ｆ１２中で接着細胞として培養した。
【０１５２】
セクションｆで得た選択および修復されたＶＨおよびＶＬをコードするペアーを各々含む各プラスミド調製物を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、Ｔ１７５フラスコ中の〜１９×１０６個のＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（０１９）細胞（より詳細については、WO 04/061104を参照）に、Ｆｌｐリコンビナーゼをコードするプラスミドで共トランスフェクトした。細胞を２４時間後にトリプシン処理し、２−ｌａｙｅｒ（１２６０ｃｍ２）ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）に移した。トランスフェクション４８時間後に添加した５００μｇ／ｍｌのジェネティシンの存在下で培養することにより、組み換え細胞株を選択した。約２週間後にクローンが現れた。クローンを数え、細胞をトリプシン処理し、その後、ＲＳＶ特異的な抗体のうちの１つを発現するクローンのプールとして培養した。
【０１５３】
ｇ−２  血清を含まない懸濁培養への適応
接着した抗−ＲＳＶ抗体を発現する細胞培養物各々をトリプシン処理し、遠心分離し、適切な無血清培地（Ｅｘｃｅｌｌ３０２、JRH Biosciences；５００μｇ／ｍｌ  ジェネティシン、抗凝集剤（１：２５０）および４ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中に１．１５×１０６細胞／ｍｌの入った別々の振蘯フラスコ（２５０ｍｌ）に移した。増殖と細胞形態を数週間にわたって経過観察した。４−６週間後、細胞株は通常、３０時間より少ない倍加時間を有する良好かつ安定な増殖状態を示し、次いで用いた各細胞株を複数のアンプルに凍結保存した。
【０１５４】
適応中に発現された各抗体を、セクションｉ）に記載される方法を用いて上澄み液から精製した。精製された抗体を以下に記載されるごとく抗原特異性および生化学的特性の特徴付けに用いた。
【０１５５】
ｇ−３  細胞株の特徴付け
全ての各細胞株を抗体産生および増殖に関して特徴付けを行った。これを以下のアッセイで行った：
【０１５６】
産生：
各発現細胞株の組み換え抗体の産生を、カッパ特異的ＥＬＩＳＡによる適応期間後に続けた。ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中のヤギ−抗−ヒトＦｃ精製抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）で一晩コートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ；０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で６回洗浄し、２％  スキムミルクを含む洗浄緩衝液中で１時間のインキュベーションによりブロックした。細胞培地の上澄み液を添加し、さらに１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、二次抗体（ヤギ−抗−ヒトカッパＨＲＰ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）を添加し、インキュベーションを繰り返した。激しい洗浄後、ＥＬＩＳＡをＴＭＢ基質液で発色させ、Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を止めた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０１５７】
さらに、細胞内染色を用いることにより、一般的な発現レベルならびに組み換え抗体の発現に関する細胞集団の均一性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を調べた。５×１０５個の細胞を、ＣｅｌｌＦｉｘ（BD-Biosciences）中で２０分間のインキュベーションによる固定の前に、冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ；２％  ＦＣＳ）で洗浄した。細胞をペレット状にし、氷冷メタノールで１０分間透過処理し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。懸濁液に、蛍光タグをつけた抗体（ヤギＦ（ａｂ’）２フラグメント、抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加した。２０分後、氷上で細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、次いでＦＡＣＳ解析を行った。
【０１５８】
増殖：
細胞懸濁液のアリコットを１週間に２から３回取り、細胞数、細胞の大きさおよび生存率をＶｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）解析により調べた。細胞培養の倍加時間をＶｉ−Ｃｅｌｌ測定からの細胞数を用いて算出した。
【０１５９】
ｇ−４  各抗体の抗原特異性の特徴付け
よく特徴付けられた特性を有する抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂの作成を行うために、各々発現される抗体の抗原およびエピトープ特異性を測定した。すでにセクションｅに記載されるように、スクリーニング中に同定された抗体を、単一のＲＳＶ抗原（組み換えＧタンパク質、組み換えまたは精製Ｆタンパク質）またはそのペプチドフラグメント（タンパク質Ｇ、サブタイプＡおよびＢの保存領域およびシステインコアモチーフ、ならびにＳＨタンパク質、サブタイプＡおよびＢの細胞外ドメイン）に対するそれらの結合特性をＦＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定することで確認した。エピトープ特異性を、よく特徴付けられた市販の抗体であって、そのうちのいくつかが表４に示される抗体との競合によるＥＬＩＳＡにおいて調べた。必ずしも表４に示された全ての抗体を、本発明の各々の抗体の特徴付けに用いておらず、それらが結合する抗原、抗原部位および／またはエピトープに関して特徴付けられた潜在的な他の抗体または抗体フラグメントもまた用いられてもよい。簡単に説明すると、エピトープのブロッキングに用いられる抗体または抗体フラグメントを、過剰量、すなわち、実験的に調べられたように７５％の最大結合を与える濃度の１００倍（Ditzel et al., J.Mol.Biol.1997, 267:684-695）の固定化抗体（ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ粒子、ＨｙＴｅｓｔ）とインキュベートした。洗浄後、各抗体クローンを、様々な濃度でブロックした抗原とインキュベートし、いずれかの結合したヒトＩｇＧを、一般的なＥＬＩＳＡプロトコルに従ってヤギ−抗−ヒトＨＲＰ抱合体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて検出した。エピトープ特異性を、ブロッキングおよびプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）の両方の（実験的に調べられた）飽和濃度を用いるＢｉａｃｏｒｅにおいて、異なる抗体クローン間の対（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）競合によりさらに特徴付けした。直接アミンカップリング（Ｂｉａｃｏｒｅ）により固定化された精製ＦまたはＧタンパク質を抗原として用いた。ＥＬＩＳＡ−およびＢｉａｃｏｒｅ−の両方に基づいたエピトープマッピングでは、エピトープブロッキング後の減少した結合を競合させていない結合と比較した。
【０１６０】
表４：抗−Ｆおよび抗−Ｇ抗体のエピトープマッピングのモノクローナル抗体
【表４】
2009528828.tif 000006
【０１６１】
欄「抗原」は、Ｍａｂ／Ｆａｂにより結合されるＲＳＶ関連抗原を示し、サブタイプ特異性が知られている場合、これは（）で示される。欄「エピトープ（ａａ）」は、ＭＡｂ／Ｆａｂにより認識されるエピトープ名を示し、さらに、（）では、ＲＳＶエスケープ変異体を生じるアミノ酸の位置、または結合が示されたペプチド／タンパク質が示される。表４に示す参考文献（Ｒｅｆ．）の番号は、
1. Anderson et al., J.Clin.Microbiol.1986, 23:475-480.
2. Anderson et al., J.Virol.1988, 62:1232-4238.
3. Beeler & van Wyke Coelingh, J.Virol.1989, 63:2941-2950.
4. Cowe et al., JID 1998, 177:1073-1076.
5. Sominina et al., Vestn Ross Akad Med Nauk 1995, 9:49-54.
6. Collins et al., Fields Virology, p1313-1351.
7. Crowe et al., Virology 1998, 252:373-375.
8. Zhao & Sullender, J.Virol.2004, 79:3962-3968.
9. Sullender, Virology 1995, 209:70-79.
10. Morgan et al., J.Gen.Virol.1987, 68:2781-2788.
11. McGill et al., J.Immunol.Methods 2005, 297:143-152.
12. Arbiza et al., J.Gen.Virol.1992, 73:2225-2234.
13. Lopez et al., J.Virol.1998, 72:6922-6928.
14. Walsh et al., J.Gen.Virol.1989, 70:2953-2961.
15. Walsh et al., J.Gen.Virol.1998, 79:479-487.
に対応する。
【０１６２】
さらに、抗体クローンを、異なるＲＳＶ株（ＬｏｎｇおよびＢ１）で感染させた咽頭上皮ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬＬ−２３）への結合に関してもＦＡＣＳにより特徴付けした。簡単に説明すると、ＨＥｐ−２細胞を、無血清培地中で０．１ｐｆｕ／細胞の割合においてＲＳＶ  Ｌｏｎｇ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２６）株またはＲＳＶ  Ｂ１（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１４００）株のどちらかで２４時間（Ｌｏｎｇ株）または４８時間（Ｂ１株）感染させた。剥離および洗浄後、細胞を９６−ウェルプレートに分注し、各抗−ＲＳＶ抗体の希釈液（４ｐＭ−２００μＭ）において３７℃で１時間インキュベートした。細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、細胞表面結合抗体をヤギＦ（ａｂ）２抗−ヒトＩｇＧ−ＰＥ抱合体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）との４℃で３０分間のインキュベーションにより検出した。モック（ｍｏｃｋ）感染ＨＥｐ−２細胞に対する結合を同様に解析した。タンパク質Ｇ特異的として選択されたクローンもまた、組み換えヒトフラクタルキン（ＣＸ３ＣＬ１；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）との交差反応性についてＥＬＩＳＡによりテストした。抗−ヒトＣＸ３ＣＬ１／フラクタルキンモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性コントロールとして用いた。
【０１６３】
ｇ−５  各抗体の結合反応速度の特徴付け
本発明の抗体の動力学的解析を、物質移動の制限を避けるために極めて低い密度でセンサー表面上に固定された組み換え抗原を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（スウェーデン、ウプサラのＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）で表面プラズモン共鳴分析を用いて行った。ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｆａｂ調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて各抗体クローンから調製されたＦａｂフラグメントを用いて解析を行った。簡単に説明すると、合計２００共鳴単位（ＲＵ）の組み換えタンパク質Ｆまたは合計５０ＲＵの組み換えタンパク質Ｇを、製造業者の説明書に従ってアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いてＣＭ５チップ表面に抱合させた。Ｆａｂフラグメントを連続希釈でチップ表面上に注入し、固定化タンパク質を有するチップ上でテストされる時に２５を超えるＲＵ最大値を生じることのない最適化濃度で開始した。結合速度定数（ｋａ）および解離定数（ｋｄ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ）における所定の１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合および解離モデルを用いて全体的に評価した。
【０１６４】
Ｆａｂフラグメントにおける動力学的解析を行うことにより、実際に得られたデータがＲＳＶタンパク質に対する結合親和性を反映することを確認した。完全な抗体を用いた場合、データは結合親和性を反映し、容易に抗体の結合特性と抗原との正確な形の意味のある測定に置き換えることができないであろう。
【０１６５】
ｇ−６  各抗体の生化学的特性の特徴付け
不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、抗体および組み換えタンパク質における共通の現象である。抗体の修飾は、典型的には、例えば、Ｎ−糖鎖付加、タンパク質分解フラグメント化、およびＮ−とＣ−末端不均一性のごとき翻訳後修飾が発現中に起き、大きさまたは帯電の不均一性を生じる。加えて、メチオニン酸化および脱アミド化のごとき修飾は、後の短期または長期保存中に生じうる。これらのパラメーターは、治療抗体でよく定められていることが必要となるため、それらは、ポリクローナル細胞株の作成前に解析された。
【０１６６】
精製された各抗体の特徴付け（セクションｉを参照）に用いられる方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元と非還元状態）、弱陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、およびＲＰ−ＨＰＬＣ（還元と非還元状態）を含んだ。還元と非還元状態下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびＳＥＣは、精製された抗体が微量のフラグメント化および凝集化された形態を伴い、実質的に無傷であることを示した。精製された抗体のＩＥＸプロファイル解析は、単一のピークを示すプロファイルまたは複数のピークを示すクロマトグラフを結果として生じ、これらはこれらの特定の抗体における帯電の不均一性を示す。ＩＥＸ解析における複数のピークおよび／またはＳＤＳゲルにおける軽もしくは重鎖の異常な移動、あるいは異常なＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを生じる抗体調製物を、Ｎ−末端の配列決定により無傷なＮ−末端について、およびオリゴ糖プロファイルの相違により引き起こされる不均一性について詳細に解析した。さらに、選択された抗体を、酵素処理およびその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を用いて、可変鎖におけるＮ−糖鎖付加部位の存在について解析した。
【０１６７】
ｇ−７  抗−ＲＳＶ組み換えポリクローナル抗体産生のためのポリクローナル細胞株の樹立
樹立された発現細胞株のコレクションから、サブセットを選択して混合し、ポリクローナル細胞株およびポリクローナルリサーチ／マスター細胞バンク（ｐＲＣＢ／ｐＭＣＢ）を作成する。選択パラメーターを、ポリクローナル細胞株から産生されるポリクローナル抗体の使用、ならびに各細胞株の能力に従って定めることができる。一般的に以下のパラメーターを考慮する：
・細胞株の性質；ポリクローナル細胞株の安定性を最適化すること、２１〜３０時間の倍加時間を有する各細胞株および１ｐｇ／細胞／日を超える抗体産生が好ましい。
・反応性；抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂが反応性を示す抗原／抗原部位およびエピトープを慎重に考慮する。
・タンパク質化学；明確な生化学的性質を示す好ましい抗体が最終的な抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂに含まれる。
【０１６８】
組み換え抗−ＲＳＶ抗体を発現する選択された各細胞株を、振蘯フラスコにおける無血清培地中において３７℃で融解し、増殖させて２１−３４時間の倍加時間の集団を示す各クローンの少なくとも４×１０８個の細胞とした。生存率は、好ましくは９３％から９６％までの範囲である。ポリクローナル細胞株を、各細胞株から２×１０６個の細胞を混合することにより調製する。ポリクローナル細胞株を、５．６×１０７個の細胞を含有する凍結アンプルに分け、凍結保存する。ポリクローナル細胞株を有するこのバイアルのコレクションをポリクローナルリサーチ／マスター細胞バンク（ｐＲＣＢ／ｐＭＣＢ）と名付け、ポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）は、ｐＲＣＢ／ｐＭＣＢから１つのアンプルを増殖させることにより、ｐＲＣＢ／ｐＭＣＢのアンプルと同じ細胞密度を有する約２００個のアンプルのポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）を作出するために十分量の細胞とすることにより作成することができる。前記細胞バンクに由来する細胞をマイコプラズマおよび無菌性についてテストする。
【０１６９】
ｈ．組み換えポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体の発現
組み換えポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体のバッチを５リットルのバイオリアクター（ドイツ、メルズンゲンのB.Braun Biotech International）で産生する。簡単に説明すると、ｐＲＣＢまたはｐＷＣＢに由来するバイアルを融解し、振蘯フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で増殖させる。播種した列の細胞を、Ｇ４１８および抗凝集剤を含むＥｘＣｅｌｌ３０２培地中で３７℃、５％ＣＯ２で培養する。このバイオリアクターに、Ｇ４１８および抗凝集剤を含まない３ｌのＥｘＣｅｌｌ３０２培地中に懸濁させて０．６×１０６細胞／ｍｌで播種する。細胞数／生存細胞をＣＡＳＹまたはＶｉＣｅｌｌ計数により毎日モニターする。５０時間で２０００ｍｌのＥｘＣｅｌｌ３０２培地を補充し、９２時間後に３７℃から３２℃に温度を下げる。細胞培養上澄み液を１６４時間後に回収し、セクションｉに記載されるごとく精製にかける。
【０１７０】
ｉ．各抗−ＲＳＶ抗体およびポリクローナル抗−ＲＳＶ抗体の精製
セクションｇ．ｇ−２およびｈに記載されるように発現される抗体、全てのＩｇＧ１アイソタイプを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（プロテイン−Ａ）を用いてアフィニティー精製した。各抗体が固定化されたプロテイン−ＡにｐＨ７．４で相互作用し、一方で夾雑するタンパク質をカラムから洗浄した。次いで、結合した抗体を、ｐＨを２．７まで下げることによりカラムから溶出した。２８０ｎｍの吸光度測定から調べられた抗体を含む画分をプールし、Ｇ−２５カラムを用いて５ｍＭ  酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５で緩衝液交換し、−２０℃で保存した。
【０１７１】
ｊ．インビトロ中和アッセイ
ｊ−１  インビトロ使用のための活性なＲＳＶの調製
ヒト咽頭上皮ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬＬ−２３）を１×１０７細胞／フラスコで１７５ｃｍ２フラスコに播種した。細胞を、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−２６）、ＲＳＶ  Ｂ１（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−１４００）またはＲＳＶ  Ｂ  Ｗａｓｈ／１８５３７（Advanced Biotechnologies Inc.）のうちのいずれかで０．１ｐｆｕ／細胞の割合において３ｍｌ無血清培地中に感染させた。細胞を、３７℃；５％ＣＯ２で２時間感染させ、続いて３７ｍｌの完全ＭＥＭ培地を添加した。細胞変性効果が観察されるまで細胞をインキュベートした。細胞を掻き取ることにより剥がし、培地と細胞を２０秒間超音波処理し、一定分量にし、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０１７２】
ｊ−２  プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）
ＨＥｐ−２細胞を２×１０４細胞／ウェルで９６−ウェル培養プレート中に播種し、３７℃；５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。試験物質を無血清ＭＥＭ中に希釈させ、補体（ウサギに由来する補体血清、Ｓｉｇｍａ）の非存在または存在下において３７℃で３０分間前インキュベートした。この混合物をＨＥｐ−２細胞の単層にアプライし、３７℃；５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞を８０％アセトン；２０％ＰＢＳで２０分間固定した。洗浄後、ビオチン化されたヤギ抗−ＲＳＶ抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に添加し（１：２００）、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ−アビジンを添加し、３０分間インキュベートした。プラークを３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質との２５分間（ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ）および４５分間（ＲＳＶ  Ｂ１）のインキュベートにより発達させた。プラークをＢｉｏｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｓｙｓ  ＧｍｂＨ）でカウントした。力価の比較ができるように適用可能な場合には、ＥＣ５０値（プラーク数の５０％の減少を引き起こすのに必要とされる有効濃度）を算出した。
【０１７３】
ｊ−３  融合阻害アッセイ
融合阻害アッセイを、基本的に、ＲＳＶをテスト物質の添加前に感染させることを除いてプラーク減少中和アッセイと同様に行った。実際には、ウイルスを無血清培地中でＨＥｐ−２細胞の単層に１．５時間添加した。
【０１７４】
上澄み液を除去し、試験物質を補体（ウサギ由来の補体血清、Ｓｉｇｍａ）の存在するまたは存在しない完全ＭＥＭ培地に添加した。プレートを一晩インキュベートし、プラーク減少中和アッセイに関して上に記載されるように処理した。
【０１７５】
ｊ−４  マイクロ中和アッセイ
セクションｊ−２およびｊ−３に記載されるＰＲＮＴおよび融合阻害アッセイに加えて、ＲＳＶタンパク質の検出に基づくマイクロ中和アッセイをＲＳＶ中和および融合阻害の測定に用いた。
【０１７６】
中和テストでは、試験物質を無血清ＭＥＭで希釈し、ＲＳＶで９６ウェル培養プレート中において室温で３０分間前インキュベートした。トリプシン処理したＨＥｐ−２細胞を１．５×１０４細胞／ウェルで添加し、３７℃；５％ＣＯ２で２−３日間インキュベートした。細胞を洗浄し、８０％アセトン；２０％ＰＢＳにおいて４℃で１５分間固定し、乾燥させた。
【０１７７】
次いで、プレートを０．５％ゼラチン含有のＰＢＳ中において室温で３０分間ブロックし、０．５％ゼラチンおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＰＢＳ中で１：２００に希釈したＲＳＶタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（ＮＣＬ−ＲＳＶ３、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）のプールにおいて室温で２時間染色した。洗浄後、０．５％ゼラチンおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＰＢＳで１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗−マウス免疫グロブリンＨＲＰ−抱合体（Ｐ０２６０；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、オルト−フェニレンジアミンの添加により発色させた。Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を止め、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍを読み取った。
【０１７８】
融合阻害アッセイを、ウイルスが細胞に添加され、完全ＭＥＭで希釈された試験物質が添加される前に３７℃；５％ＣＯ２で１．５時間インキュベートすることを除いて、基本的にマイクロ中和試験と同様に行った。プレートを３７℃；５％ＣＯ２で２−３日間インキュベートし、上に記載のとおりに発色させた。
【０１７９】
ｋ．インビボ保護アッセイ
ｋ−１  マウス誘発モデル
７−８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．２ｍｌ抗体調製物を研究−１日目に腹腔内に接種した。プラセボ処理マウスを同様に０．１ｍｌＰＢＳ緩衝液で腹腔内に接種した。研究０日目に、マウスに吸入イソフルオランを用いて麻酔をかけ、５０μｌ中の１０−６〜１０−７ｐｆｕのＲＳＶ株Ａ２または細胞溶解物（偽の接種菌液）で鼻腔内に接種した。麻酔から完全に回復させて真っ直ぐに立たせると同時に、マウスに３０秒接種菌液を吸引させた。
【０１８０】
誘発５日後、マウスを過剰量のペントバルビタールナトリウムで屠殺した。屠殺後、血清を調製するために腋窩脈管からの放血により血液を得た。肺を取り除き、滅菌した砂を用いて２．５ｍｌ緩衝液中でホモジェナイズした。肺のホモジェナイズ物を遠心分離して砂と細胞破片を沈降させ、上澄み液を一定分量採取し、−７０℃で保存した。
【０１８１】
ウイルス負荷を、逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲを用いる肺サンプル中のＲＳＶ  ＲＮＡコピー数の定量化により調べた。製造業者の説明書に従って、抽出システムを自動化したＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、肺のホモジェナイズサンプルからＲＮＡを抽出した。Ｗｈｉｌｅｙら（J. Clinical Microbiol.2002, 40: 4418-22）により開示されるgごとくＲＳＶサブタイプＡのＮ遺伝子に特異的なプライマーおよびフルオロフォア標識プローブによるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅ機器および試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅリアル−タイムＲＴ−ＰＣＲにより、ＲＳＶ  ＲＮＡの検出を行った。公知のＲＳＶ  ＲＮＡコピー数を有するサンプルを同様に解析することにより標準曲線を作成した。
【０１８２】
肺組織サンプルにおける異なるサイトカインおよびケモカインのレベルを、齧歯類のｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ（ＭＡＰ）を用いるＲｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（テキサス州、オースティン）で市販される複数の免疫アッセイにより調べた。
【０１８３】
ｋ−２  コットンラット誘発モデル
６−８週齢の雌コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ）に、０．５ｍｌの抗体調製物またはプラセボ（ＰＢＳ）を研究−１日目に腹腔内に接種する。２４時間後、イソフルオランで早急に麻酔にかけ、１０−６−１０−７ｐｆｕのＲＳＶ株Ａ２またはコントロール培地（偽の接種菌液）の鼻腔内誘発を与える。総体積１００μｌの接種菌液を投与し、両方の鼻腔に均等に分布させる。鼻腔内誘発の完了後、各ラットを最低３０秒間真っ直ぐに立たせてから接種菌液を完全に吸気させる。誘発５日後、ペントバルビタールの致死性腹腔内注射により屠殺し、心臓穿刺により放血させる。血清サンプルを採取し、−８０℃で凍結し、各ラットを肺および鼻腔組織を除去するために無菌条件下で解剖する。組織サンプルをホモジェナイズし、上澄み液を−８０℃において一定分量で保存した。
【０１８４】
組織サンプルにおけるウイルス負荷を、Ｖａｍ  Ｅｌｄｅｎらの方法（J Clin Microbiol2003, 41(9):4378-4381）に基づくＴａｑ−Ｍａｎリアル−タイムアッセイによりＲＳＶ  ＲＮＡコピー数を定量化することで調べる。簡単に説明すると、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）法を用いて、肺のホモジェナイズしたサンプルからＲＮＡを抽出する。抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させ、次いで、ＲＳＶサブタイプＡのＮ遺伝子に特異的なプライマーおよび標識プローブとともにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲにより増幅する。公知のＲＳＶ濃度を有するサンプルを同様に解析して標準曲線を作成する。
【実施例２】
【０１８５】
本実施例では、抗−ＲＳＶ特異性を有する全長抗体として発現される同種ＶＨおよびＶＬペアーを含むクローンの単離、スクリーニング、選択および保存を例示した。
【０１８６】
ドナー
合計８９人のドナーを、ＲＳＶの季節に従業者およびビィドゥビェ病院（デンマーク）の小児科に入院した子供の両親の中から採用した。１８ｍｌの最初の血液サンプルを採血し、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を精製し（実施例１、セクションａ）、ＥＬＩＳｐｏｔを用いて抗−ＲＳＶ抗体の存在について検査し（実施例１、セクションｂ）、血漿細胞の発生頻度をＦＡＣＳ解析により調べた。
【０１８７】
最初の血液サンプルのスクリーニング時に１１人のドナーが陽性と見出され、これらのうちの１０人から４５０ｍｌの２回目の血液サンプルを採血した。形質芽細胞を実施例１のセクションａに従って単一細胞に分別した。ＥＬＩＳｐｏｔをＣＤ１９陽性Ｂ細胞の画分について行った。
【０１８８】
２回目の供血では、合計血漿細胞集団のうちの０．２および０．６％間のＲＳＶ特異的な血漿細胞（ＩｇＧ＋およびＩｇＡ＋）のＥＬＩＳｐｏｔ頻度を有する４人のドナーを同定した。これらの頻度を、同種ＶＨおよびＶＬペアーのレパートリーの連結を促進するのに十分高いと考えた。
【０１８９】
同種ＶＨおよびＶＬをコードするペアーの単離
抗体のレパートリーをコードする核酸を、５人のドナーに由来する単一細胞に分別された血漿細胞から多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ（実施例１、セクションｃ）により単離した。多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲは、重鎖可変領域遺伝子フラグメント（ＶＨ）および全長軽鎖（ＬＣ）の間に物理的連結を作出する。ＶＨ増幅用に１つおよびＬＣ増幅用に１つである２つのプライマーセットを用いることにより、全てのＶＨ−遺伝子ファミリーとカッパ軽鎖の抗体遺伝子を増幅するためにプロトコルを設計した。逆転写および多重重複伸長ＰＣＲに続いて、連結された配列をネスティドプライマーのセットによる２番目のＰＣＲ増幅にかけた。
【０１９０】
各々のドナーについて個別に処理し、多重重複ＲＴ−ＰＣＲにより１４８０から２４５０個の重複産物を作成した。各ドナーからの同種の連結したＶＨおよびＶＬをコードするペアーの作成したコレクションをプールし、実施例１のセクションｄ）に記載されるごとき哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター（図３）に組み込んだ。作成したレパートリーをＥ．ｃｏｌｉに形質転換させ、２０個の３８４−ウェルプレート中で一元管理し、保存した。レパートリーは、ドナーあたり１×１０６および３．６×１０６個の間のクローンで構成した。
【０１９１】
スクリーニング
ＩｇＧ抗体を含む上澄み液を、マスタープレートに由来する細菌クローンから調製したＤＮＡで一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から得た。上澄み液を実施例１、セクションｅに記載されるごとく選択した。約６００個の一次ヒット物を配列決定し、並列比較した。大部分は２つまたはそれ以上のメンバーのクラスターに収まったが、いわゆるシングルトンとして単離されたわずかなクローンも存在した。各クラスターおよびシングルトンに由来する代表的なクローンを、実施例１、セクションｅ）に記載されるごとき検証研究にかけた。多くの一次ヒット物を、不対システイン、潜在的なＰＣＲエラーである保存されていない変異、多重コドンの挿入および／または欠失、ならびに切断のごとき望まれていない配列の特徴のため、さらなる特徴付けから排斥した。
【０１９２】
合計８５個のユニークなクローンが検証を通過した。これらを表５にまとめる。各クローン番号は、特定のＶＨおよびＶＬペアーを特定する。ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶ遺伝子ファミリーは、各クローンについて示され、選択されたクローンのフレームワーク領域（ＦＲ）を特定する。各クローンから発現される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が示され、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３は、重鎖のＣＤＲ領域１、２および３を示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、軽鎖のＣＤＲ領域１、２および３を示す。
【０１９３】
完全な可変重鎖および軽鎖配列は、表５の情報から定めることができる。
【０１９４】
表５の各欄についてのさらなる詳細を以下に記載する。
【０１９５】
ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶ遺伝子ファミリー名を公式のＨＵＧＯ／ＩＭＧＴ命名法（IMGT; Lefranc & Lefranc, 2001, The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press）に従って割り当てた。番号付けと並列比較は、Ｃｈｏｔｈｉａ（Al-Lazikani et al.1997 J.Mol.Biol. 273:927-48）による。クローン８０９はＣＤＲＨ１の５’に対して２個のコドンの挿入を有し、伸長されたＣＤＲループに翻訳されうる。クローン８３１はＣＤＲＨ１の位置３１に１個のコドンの欠失を有する。
【０１９６】
欄「Ａｇ」は、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび／またはＢｉａｃｏｒｅにより調べられるごとく、命名されたクローンから産生される抗体により認識されるＲＳＶ関連抗原を示す。「＋」は、クローンがＲＳＶ粒子および／またはＲＳＶ感染細胞に結合するが、抗原が同定されていないことを示す。
【０１９７】
欄「エピトープ」は、命名されたクローンから産生される抗体により認識される抗原部位またはエピトープを示す（表４および下記を参照）。「Ｕ」は、エピトープが知られていないことを示す。ＵＣＩおよびＵＣＩＩは、未知のクラスターＩおよびＩＩを意味する。これらのクラスターに属する抗体は、類似の反応プロファイルを示すが、いまだ特定のエピトープに割り当てられていない。いくつかの抗体は、Ａ＆Ｃのごとく複合的なエピトープを認識する。（）に示されるエピトープはＥＬＩＳＡのみで同定されている。
【０１９８】
【表５】
2009528828.tif 000007
【０１９９】
【表６】
2009528828.tif 000008
【０２００】
ＣＤＲＨ１と名付けられた欄における上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：２０１−２８５と同じ順番で記載される。
【０２０１】
ＣＤＲＨ２と名付けられた欄における上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：２８６−３７０と同じ順番で記載される。
【０２０２】
ＣＤＲＨ３と名付けられた欄における上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：３７１−４５５と同じ順番で記載される。
【０２０３】
ＣＤＲＬ１と名付けられた欄における上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：４５６−５４０と同じ順番で記載される。
【０２０４】
ＣＤＲＬ２と名付けられた欄における上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：５４１−６２５と同じ順番で記載される。
【０２０５】
ＣＤＲＬ３と名付けられた欄における上段から下段までのアミノ酸配列は、配列番号：６２６−７１０と同じ順番で記載される。
【０２０６】
抗原特異性の特徴付け
検証期間に、クローンの抗原特異性を、ウイルス粒子、可溶性ＧおよびＦタンパク質ならびにＧタンパク質のフラグメントに対する結合性によりある程度まで調べた。
【０２０７】
抗−Ｆ反応性を有するクローンにおいては、さらに、抗原部位、可能ならば各クローンにより結合されるエピトープを調べるために、クローンから発現される各抗体の特異性を測定した（実施例１、セクションｇ−４を参照）。図４は、Ｂｉａｃｏｒｅ解析を用いて、クローン８０１から得られた抗体のエピトープ特異性の特徴付けを示す。解析は、タンパク質Ｆが、抗体８０１のＢｉａｃｏｒｅ細胞への注入前に１３３−１ｈまたはパリビズマブ（抗原部位ＣおよびＩＩ各々）により阻害される場合、高い抗体８０１結合性が検出できることを示す。競合した８０１抗体の結合性は、競合しない８０１抗体の結合性と比較してわずかに減少する。しかしながら、この減少は非常に低いため、結合部位の直接競合より立体構造の障害による可能性が高い。抗体８０１のＢｉａｃｏｒｅ細胞への注入前の９ｃ５抗体（抗原部位Ｆ１）を有するタンパク質Ｆの阻害は、Ｆタンパク質への抗体８０１結合性のほぼ完全な阻害を示す。それゆえ、抗体８０１はＦ１部位、またはそれに非常に近い部位でタンパク質Ｆに結合することとなる。
【０２０８】
抗−Ｇ反応性を有するクローンにおいては、さらに、各抗体がＧタンパク質の中心ドメイン、保存領域、またはＧＣＲＲに結合するかどうか、また、エピトープが保存またはサブタイプ特異的であるかを調べるために、クローンから発現される各抗体の特異性を測定した。このことは、以下のＧタンパク質フラグメントを用いるＥＬＩＳＡおよび／またはＦＬＩＳＡにより行った：
Ｇ（Ｂ）：（ＤＧ４４ＣＨＯ細胞で発現される）ＲＳＶ株１８５３７に由来する残基６６−２９２
Ｇ（Ｂ）フラグメント：（Ｅ．ｃｏｌｉで発現される）ＲＳＶ株１８５３７に由来する残基１２７−２０３
ＧＣＲＲ  Ａ：（選択的に形成されたシステイン架橋を伴って合成される）ＲＳＶ株Ｌｏｎｇに由来する残基１７１−１８７
ＧＣＲＲ  Ｂ：（選択的に形成されたシステイン架橋を伴って合成される）ＲＳＶ株１８５３７に由来する残基１７１−１８７
Ｇ保存：残基１６４−１７６
【０２０９】
さらなるエピトープ解析を、実施例１、セクションｇ−４に記載されるごとき競合アッセイにより抗−Ｇ反応性クローンにおいても行った。
【０２１０】
さらに、実施例１、セクションｅに記載されるごときスクリーニング手法で同定されたクローンのうちの１つは、ＳＨ特異的な抗体を産生する。加えて、多くのクローンは、１つまたはそれ以上の試験されたＲＳＶ株に結合するが、抗原は調べられなかった。
【０２１１】
全ての検証されたクローンにおける抗原特異性に関するデータを表５にまとめる。検証されたクローンはいずれもヒト咽頭上皮細胞に結合せず、試験されたＧ−特異的クローン（７９３、８１６、８３５、８４１、８５３、８５５、８５６、および８８８）のいずれもまたヒトフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＬ１）に結合しなかった。
【０２１２】
結合反応速度の特徴付け
組み換えＲＳＶ抗原に関する結合親和性を、番号付けした抗体クローンにおける表面プラズモン共鳴により調べた。全長抗体の酵素切断により調製されたＦａｂフラグメントで解析を行った。ピコモルからナノモル範囲におけるＫＤ値を有する多くの高親和性抗体クローンについてのデータを表６に表す。市販されているパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）から得たＦａｂフラグメントを対照として同様に解析した。
【０２１３】
表６：選択されたクローンの動力学的結合定数および親和性
【表７】
2009528828.tif 000009
【０２１４】
表５におけるクローン番号７３５、７３６、７４４、７９３、７９５、７９６、７９９、８００、８０１、８０４、８１０、８１１、８１２、８１４、８１６、８１７、８１８、８１９、８２４、８２５、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３５、８３８、８４１、８５３、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６１、８６３、８６８、８７０、８７１、８８０、８８１、８８４、８８５、８８６、８８８、８９４および９５５に対応する４７個のユニークな同種ＶＨおよびＶＬをコードするペアーのサブセットを、単一のＶＨおよびＶＬ遺伝子配列からユニークな抗体をそれぞれ発現する安定な個々の発現細胞株の作成のために選択した。４４個の選択されたクローン（上記に同定された８２８、８８５、および９５５を除く）の全配列（ＤＮＡおよび推定アミノ酸）を配列番号：１−１７６に示す。
【０２１５】
４４個のクローンを、配列番号：１−４４に記載される以下のＶＨ配列を産生することにより特徴付けする：
【０２１６】
クローン番号７３５：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSNGAIGDYDWSWIRQSPGKGLEWIGNINYRGNTNYNPSLKSRVTMSLRTSTMQFSLKLSSATAADTAVYYCARDVGYGGGQYFAMDVWSPGTTVTVSS
【０２１７】
クローン番号７３６：
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【０２１８】
クローン番号７４４：
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【０２１９】
クローン番号７９３：
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【０２２０】
クローン番号７９５：
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【０２２１】
クローン番号７９６：
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【０２２２】
クローン番号７９９：
QVQLVESGGGVVQPGRSLKLSCEASGFNFNNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGRNKYFADSVKGRFIISRDDSRNTVFLQMNSLRVEDTAVYYCARGSVQVWLHLGLFDNWGQGTLVTVSS
【０２２３】
クローン番号８００：
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【０２２４】
クローン番号８０１：
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【０２２５】
クローン番号８０４：
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【０２２６】
クローン番号８１０：
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【０２２７】
クローン番号８１１：
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【０２２８】
クローン番号８１２：
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【０２２９】
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【０２３０】
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【０２３１】
クローン番号８１７：
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【０２３２】
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【０２３３】
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【０２３４】
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【０２３５】
クローン番号８２５：
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【０２３７】
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【０２４０】
クローン番号８３５：
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クローン番号８５７：
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【０２４８】
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クローン番号８６１：
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【０２５０】
クローン番号８６３：
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【０２５２】
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【０２５３】
クローン番号８７１：
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【０２５４】
クローン番号８８０：
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【０２５５】
クローン番号８８１：
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【０２５６】
クローン番号８８４：
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【０２５７】
クローン番号８８６：
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【０２５８】
クローン番号８８８：
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【０２５９】
クローン番号８９４：
QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFRFSDYGMHWVRQAPSKGLEWVAVIWHDGSNIRYADSVRGRFSISRDNSKNTLYLQMNSMRADDTAFYYCARVPFQIWSGLYFDHWGQGTLVTVSS
【０２６０】
これらのＶＨアミノ酸配列は、以下の核酸配列によりコードされるクローンに存在し、それらはまた、配列番号：４５−８８として記載される：
【０２６１】
クローン番号７３５：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcactgtgtctaatggcgccatcggcgactacgactggagctggattcgtcagtccccagggaagggactggagtggattgggaacataaattacagagggaacaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatgtccctacgcacgtccacgatgcagttctccctgaagctgagctctgcgaccgctgcggacacggccgtctattactgtgcgagagatgtaggctacggtggcgggcagtatttcgcgatggacgtctggagcccagggaccacggtcaccgtctcgagt
【０２６２】
クローン番号７３６：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtacagcgtctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggctcccggcaaggggctggaatgggtggcatttatacggtatgatggaagtactcaagactatgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaatatggtgtatgtgcagatgaacagcctgagagttgaggacacggctgtctattactgtgcgaaagacatggattactatggttcgcggagttattctgtcacctactactacggaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt
【０２６３】
クローン番号７４４：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcagcggctattatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaacactagcagtggtggcacaaactatgcgcagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcccacatggaactgaggaggctgagatctgacgacacggccgtgtattattgtgcgagagaggacggcaccatgggtactaatagttggtatggctggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２６４】
クローン番号７９３：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcggcctctggattccccttcggtgactactacatgagctggatccgccaggctccagggaagggactggagtgggttgcatacattaatagaggtggcactaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagggacaacgccaagaactccctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccggggacacggccctctattactgtgcgagagggctaattctagcactaccgactgctacggttgagttaggagcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
【０２６５】
クローン番号７９５：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtgcctccatcagcagtggtgattattactggagttggatccgtcagtctccaaggaagggcctggagtggattgggtacatcttccacagtgggaccacgtactacaacccgtccctcaagagtcgagctgtcatctcactggacacgtccaagaaccaattctccctgaggctgacgtctgtgactgccgcagacacggccgtctattattgtgccagagatgtcgacgattttcccgtttggggtatgaatcgatatcttgccctctggggccggggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２６６】
クローン番号７９６：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcagcttcagtcactttggcatgcactgggtccgccaggttccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatcatatgatgggaataatgtacactatgccgactccgtaaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagatgacgacacgggtgtgtattactgtgcgaaggacgacgtggcgacagatttggctgcctactactacttcgatgtctggggccgtggcaccctggtcaccgtctcgagt
【０２６７】
クローン番号７９９：
caggtgcagctggtggagtctgggggcggcgtggtccagcctgggaggtccctgaaactctcttgtgaagcctctggattcaacttcaataattatggcatgcactgggtccgccaggcaccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatttcatatgacggaagaaataagtattttgctgactccgtgaagggccgattcatcatctccagagacgattccaggaacacagtgtttctgcaaatgaacagcctgcgagttgaagatacggccgtctattactgtgcgagaggcagcgtacaagtctggctacatttgggactttttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２６８】
クローン番号８００：
caggtgcagctggtggagtctgggggagccgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgaagtgtctggattcagtttcagtgactatggcatgaactgggtccgccagggtccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggcatgacggaagtaataaaaattatctagactccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattccaagaacacattgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacggctgtatattactgtgcgaggacgccttacgagttttggagtggctattactttgacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２６９】
クローン番号８０１:
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattccccttcaatagctatgccatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagtgatatattatgaagggagtaatgaatattatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacactctgtatttgcaaatggatagcctgagagccgaggacacggctgtctattactgtgcgaggaagtggctggggatggacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２７０】
クローン番号８０４：
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccggcctggggggtccctgagactctcctgttcagcctctggattcaccttcagtaactatgctatgcactgggtccgccaggctccagggaagagactggaatatgtttcagctactagtactgatggggggagcacatactacgcagactccctaaagggcacattcaccatctccagagacaattccaagaacacactgtatcttcaaatgagcagtctcagtactgaggacacggctatttattactgcgcccgccgattctggggatttggaaacttttttgactactggggccggggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２７１】
クローン番号８１０：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagtccgggtcctcggtgaaggtctcctgcagggcttctggaggcaccttcggcaattatgctatcaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgggtgggaaggatcatccctgtctttgatacaacaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacagatccacaaacacagccatcatgcaactgagcagtctgcgacctcaggacacggccatgtattattgtttgagaggttccacccgtggctgggatactgatggttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
【０２７２】
クローン番号８１１：
caggttcagctggtgcagtctggggctgtcgtggagacgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcatctggatacatcttcggcaactactatatccactgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatggcagttatcaatcccaatggtggtagcacaacttccgcacagaagttccaagacagaatcaccgtgaccagggacacgtccacgaccactgtctatttggaggttgacaacctgagatctgaggacacggccacatattattgtgcgagacagagatctgtaacagggggctttgacgcgtggcttttaatcccagatgcttctaatacctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt
【０２７３】
クローン番号８１２：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgagatgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggctccttcagcagctattctatcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtgggtgggaatgatcctgcctatctctggtacaacaaactacgcacagacatttcagggcagagtcatcattagcgcggacacatccacgagcacagcctacatggagctgaccagcctcacatctgaagacacggccgtgtatttctgtgcgagagtctttagagaatttagcacctcgacccttgacccctactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２７４】
クローン番号８１４：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaagtccgtgagactctcctgtgtaggctctggcttcaggctcatggactatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggactggattgggtggcagttatttcatatgatggagccaatgaatactacgcagagtccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattcagacaacactctgtatctacaaatgaagagcctgagagctgaggacacggctgtgtatttctgtgcgagagcgggccgttcctctatgaatgaagaagttattatgtactttgacaactggggcctgggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２７５】
クローン番号８１６：
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgtagcctccggattcacctttagtacctacgccatgacctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagtcattcgtgctagtggtgatagtgaaatctacgcagactccgtgaggggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctgcaaatggacagcctgagagtcgaggacacggccgtatatttctgtgcgaatataggccagcgtcggtattgtagtggtgatcactgctacggacactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２７６】
クローン番号８１７：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccaacctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcggcttcaacacccatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtggctgtcaattatctcacttgatgggattaagacccactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctacaattgagtggcctgagacctgaagacacggctgtatattactgtgcgaaagatcatattggggggacgaacgcatattttgaatggacagtcccgtttgacggctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２７７】
クローン番号８１８：
caggtcaccttgagggagtctggtccagcggtggtgaagcccacagaaacgctcactctgacctgcgccttctctgggttctcactcaacgccggtagagtgggtgtgagttggatccgtcagcccccagggcaggccccggaatggcttgcacgcattgattgggatgatgataaagcgttccgcacatctctgaagaccagactcagcatctccaaggactcctccaaaaaccaggtggtccttacactgagcaacatggaccctgcggacacagccacatattactgtgcccggacacaggtcttcgcaagtggaggctactacttgtactaccttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２７８】
クローン番号８１９：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctagtggcgccatcagtggtgctgattactactggagttggatccgccagcccccagggaagggcctggagtgggttgggttcatctatgacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaggagtcgagtgaccatatcaatagacacgtccaagaagcagttctccctgaagctgacctctgtgactgccgcagacacggccgtgtattactgtgccagagatctaggctacggtggtaactcttactcccactcctactactacggtttggacgtctggggccgagggaccacggtcaccgtctcgagt
【０２７９】
クローン番号８２４：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcggaaattactactggggctggatccggcagcccccagggaagggacttgagtggattgggcatatctacttcggtggcaacaccaactacaacccttccctccagagtcgagtcaccatttcagtcgacacgtccaggaaccagttctccctgaagttgaactctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgagggatagcagcaactggcccgcaggctatgaggactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２８０】
クローン番号８２５：
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttctggttacacctttaccagtaatggtctcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggtttgagtggctgggatggatcagcgctagtagtggaaacaaaaagtatgccccgaaattccagggaagagtcaccttgaccacagacatttccacgagcacagcctacatggaactgaggagtctgagatctgacgatacggccgtatattactgtgcgaaagatgggggcacctacgtgccctattctgatgcctttgatttctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt
【０２８１】
クローン番号８２７：
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcagggtttccggacacactttcactgcattatccaaacactggatgcgacagggtcctggaggagggcttgagtggatgggattttttgatcctgaagatggtgacacaggctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacagccacaggcacagcctacatggagctgagcagcctgacatctgacgacacggccgtatattattgtgcaacagtagcggcagctggaaactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２８２】
クローン番号８２９：
caggtcaccttgaaggagtctggtcctgcgctggtgaaagccacacagaccctgacactgacctgcaccttctctgggttttcactcagtaggaatagaatgagtgtgagctggatccgtcagcccccagggaaggccctggagtggcttgcacgcattgattgggatgatgataaattctacaacacatctctgcagaccaggctcaccatctccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacctattactgcgcacggactgggatatatgatagtagtggttattacctctactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２８３】
クローン番号８３０：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaaggtgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccacttacggtgtcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggttggatcagcgcttacaatggtaacacatactatctacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgcggggcctgaggtctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatcgtgttgggggcagctcgtccgaggttctatcgcgggccaaaaactacggtttggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt
【０２８４】
クローン番号８３１：
caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagttaaggtttcctgcaaggcttctgcaaacatcttcacttatgcaatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgttggcaatggtcagacaaaatattcacagaggttccagggcagagtcaccattaccagggacacgtccgcgactacagcctacatggagctgagcaccctgagatctgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggcgtgcgagccaatatggggaggtctatggcaactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２８５】
クローン番号８３５：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaggcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttcaggttacacctttatcagctatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggagcagcgtttacaatggtgacacaaactatgcacagaagttccacggcagagtcaacatgacgactgacacatcgacgaacacggcctacatggaactcaggggcctgagatctgacgacacggccgtgtatttctgtgcgagggatcgcaatgttgttctacttccagctgctccttttggaggtatggacgtctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
【０２８６】
クローン番号８３８：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagccggggacttccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtacgtttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaaataagaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaagtgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtgtattactgtgcggcccaaactccatatttcaatgagagcagtgggttagtgccggactggggccagggcaccctggtcaccgtctcgagt
【０２８７】
クローン番号８４１：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttatcagttttggcatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggacttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacagactatgcacagaggctccaggacagagtcaccatgactagagacacagccacgagcacagcctacttggagctgaggagcctgaaatctgacgacacggccgtgtactattgcactagagacgagtcgatgcttcggggagttactgaaggattcggacccattgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２８８】
クローン番号８５３：
gaagtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagccggggcagtctctgaagatctcctgtaagacttctggatacatctttaccaactactggatcggctgggtgcgccagaggcccgggaaaggcctggagtggatgggggtcatctttcctgctgactctgatgccagatacagcccgtcgttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcggtactgcctacctgcagtggagtagcctgaaggcctcggacaccgccatatattactgtgcgagaccgaaatattactttgatagtagtgggcaattctccgagatgtactactttgacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２８９】
クローン番号８５５：
caggttcagctggtgcagtctggacctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttatgtgttgaccaactatgccttcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggctgggatggatcagcggctccaatggtaacacatactatgcagagaagttccagggccgagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagtctgagatctgacgacacggccgtttatttctgtgcgagagatcttctgcggtccacttactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９０】
クローン番号８５６：
caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacaccttttccaactacggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacatactatgcacagaacctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgaccacagcctacatggtactgaggagcctgagatctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatggaaatacagcaggggttgatatgtggtcgcgtgatggttttgatatctggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt
【０２９１】
クローン番号８５７：
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggcccctgaggctctcctgtgtagcctctggattcagctttagcagctatgccatgaactggatccgcctggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggtattagtggtagcggtggtagcacttactacggagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagagccgtggatcgatatagtagtggcatctgttatatccccctactactacgacggaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt
【０２９２】
クローン番号８５８：
caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcctctggaggatccttcgacggctacactatcagctggctgcgacaggcccctggacaggggcttgagtggatgggaagggtcgtccctacacttggttttccaaactacgcacagaagttccaaggcagagtcaccgttaccgcggacagatccaccaacacagcctacttggaattgagcagactgacatctgaagacacggccgtatattactgtgcgaggatgaatctcggatcgcatagcgggcgccccgggttcgacatgtggggccaaggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９３】
クローン番号８５９：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccttgagactctcctgtgcagtgtctggatccagcttcagtaaatatggcatacactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcgtatgatggaagtaaaaagtatttcacagactccgtgaagggccgattcaccatcgccagagacaattcccagaacacggtttttctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtctattactgtgcgacaggagggggtgttaatgtcacctcgtggtccgacgtagagcactcgtcgtccttaggctactggggcctgggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９４】
クローン番号８６１：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcatttatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtattactgtgtgaaagatgaggtctatgatagtagtggttattacctgtactactttgactcttggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９５】
クローン番号８６３：
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacgtttagctcctataccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaagtattagtgctagtactgttctcacatactacgcagactccgtgaagggccgcttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgagtagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagattacgatttttggagtggctatcccgggggacagtactggttcttcgatctctggggccgtggcaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９６】
クローン番号８６８：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgacgccttcggagaccctgtccgtcacttgcactgtctctaattattccatcgacaatgcttactactggggctggatccggcagcccccagggaagggtctggagtggataggcagtatccatcatagtgggagcgcctactacaattcgtccctcaagagtcgagccaccatatctatagacacgtccaagaaccaattctcgttgaacctgaggtctgtgaccgccgcagacacggccgtatattactgtgcgcgcgataccatcctcacgttcggggagccccactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９７】
クローン番号８７０：
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccttgtccctcacctgcactgtctcaggtgactccatcagtaattactactggagttggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattggagaaatatctaacacttggagcaccaattacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatctctagacatgcccaagaaccagttgtccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtatattactgtgcgagagggcttttctatgacagtggtggttactacttgttttacttccaacactggggccagggcaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９８】
クローン番号８７１：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagagtctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatgacagtaataaacagtatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagagtacgctgtatctgcaaatggacagactgagagtcgaggacacggctgtgtattattgtgcgagagcctccgagtatagtatcagctggcgacacaggggggtccttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０２９９】
クローン番号８８０：
cagatcaccttgaaggagtctggtcctacgctggtgagacccacacagaccctcacactgacctgcaccttctctgggttctcactcagcactagtaaactgggtgtgggctggatccgtcagcccccaggaaaggccctggagtggcttgcactcgttgattgggatgatgataggcgctacaggccatctttgaagagcaggctcaccgtcaccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacatattactgtgcacacagtgcctactatactagtagtggttattaccttcaatacttccatcactggggcccgggcaccctggtcaccgtctcgagt
【０３００】
クローン番号８８１：
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtacagcctggaggctccctgagactctcctgtgaagtctccggattcaccttcaatagttatgaaatgacctgggtccgccaggccccagggaaggggctggagtgggtttcacacattggtaatagtggttctatgatatactacgctgactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactatatctgcaaatgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtttattactgtgcgaggtcagattactatgatagtagtggttattatctcctctacttagactcctggggccatggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０３０１】
クローン番号８８４：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaggaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcttctggacatactttcattaactttgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaggggcttgagtggatgggatacatcaacgctgtcaatggtaacacacagtattcacagaagttccagggcagagtcacctttacgagggacacatccgcgaacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaaacaatgggggctctgctatcattttttactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０３０２】
クローン番号８８６：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcagcttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcaaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaaaacgatgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtatttctgtgcgaagacaacagaccagcggctattagtggactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０３０３】
クローン番号８８８：
cagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccatcggagaccctgtccctcacctgcactgcctctggtggctccatcaacagtagtaatttctactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatcttttatagtgggaccacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagccctgtgaccgccgcagacacggctgtctatcactgtgcgagacatggcttccggtattgtaataatggtgtatgctctataaatctcgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt
【０３０４】
クローン番号８９４：
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtcgtccagcctggaaagtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcagattcagtgactacggcatgcactgggtccggcaggctccaagcaaggggctggagtgggtggcagttatctggcatgacggaagtaatataaggtatgcagactccgtgaggggccgattttccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatttgcaaatgaacagcatgagagccgacgacacggctttttattattgtgcgagagtcccgttccagatttggagtggtctttattttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt
【０３０５】
同一のクローンにおいて、軽鎖の完全なアミノ酸配列（すわなち、定常領域および可変領域を含む軽鎖）は以下のアミノ酸配列を有し、それらはまた、配列番号：８９−１３２として記載される：
【０３０６】
クローン番号７３５：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNSHLAWYQQKPGQAPRLLIYNTFNRVTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLATEDFGVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３０７】
クローン番号７３６：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQRISNHLNWYQQKPGKAPKLLIFGASTLQSGAPSRFSGSGSGTDFTLTITNVQPDDFATYYCQQSYRTPPINFGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３０８】
クローン番号７４４：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSLSTWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３０９】
クローン番号７９３：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITGYLNWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１０】
クローン番号７９５：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIHGASTGATGTPDRFSGSGSGTDFTLTISTLEPEDFAVYYCQQYGRTPYTFGQGTKLENKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１１】
クローン番号７９６：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLRSDGKTFLYWYLQKPGQSPQPLMYEVSSRFSGVPDRFSGSGSGADFTLNISRVETEDVGIYYCMQGLKIRRTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１２】
クローン番号７９９：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTFSCRASQSVSSWVAWYQQKPGKAPKLLISEASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSYSGYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１３】
クローン番号８００：
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGITDSLAWYQQKPGKAPKVLLYAASRLESGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKSPATFGPGTKVEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１４】
クローン番号８０１：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGFNYVDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALETPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１５】
クローン番号８０４：
EIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSVSSGYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASGRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYFGSPYTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１６】
クローン番号８１０：
NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLVWFQQKPGKVPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNISPYTFGQGTKLETKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１７】
クローン番号８１１：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSETVLYTSKNQSYLAWYQQKARQPPKLLLYWASTRESGVPARFSGSGSGTDFTLAISSLQAEDVAVYYCQQFFRSPFTFGPGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１８】
クローン番号８１２：
EIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQSVSSSYIAWYQQKPGQAPRLVIYAASRRATGVPDRFSGSGSATDFTLTISRLEPEDLAVYYCQHYGNSLFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３１９】
クローン番号８１４：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSRLAWYQQQPGKAPKFLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDLATYYCQQYNRDSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２０】
クローン番号８１６：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGRYYVDWYLQKPGQSPHLLIYLASNRASGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLHTPWTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２１】
クローン番号８１７：
EIVMTQSPATLSASPGERATLSCWASQTIGGNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGVPARFSGSGSGTEFTLAISSLQSEDFAVYYCQQYKNWYTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２２】
クローン番号８１８：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGRAPSLLIYAASNLQSGVPPRFSGSGSGTDFTLTISGLQPDDFATYYCQQSYSYRALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２３】
クローン番号８１９：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQTPGQAPRLLIYDASYRVTGIPARFSGSGSGIDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPGLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２４】
クローン番号８２４：
AIQLTQSPSSLSASVGDTVTVTCRPSQDISSALAWYQQKPGKPPKLLIYGASTLDYGVPLRFSGTASGTHFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNTYPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２５】
クローン番号８２５：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYNSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIHLASTREYGVPDRFSGSGSGTDFALIISSLQAEDVAVYYCQQYYQTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２６】
クローン番号８２７：
DIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQFISSYLHWYQQRPGKAPKLLMYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTNPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２７】
クローン番号８２９：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIASYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSYSTRFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２８】
クローン番号８３０：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVTSELAWYQQKPGKAPNFLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３２９】
クローン番号８３１：
DIQMTQSPSTLSASVGDRLTITCRASQNIYNWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSLSPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３０】
クローン番号８３５：
DIQLTQSPSFLSASLEDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLLDAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３１】
クローン番号８３８：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３２】
クローン番号８４１：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYWASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTLSSLQAEDVAVYYCQQFHSTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３３】
クローン番号８５３：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAAGMPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGNSPLTFGGGTEVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３４】
クローン番号８５５：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQAISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQADTFPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３５】
クローン番号８５６：
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSNDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTFSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３６】
クローン番号８５７：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNEYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYWGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３７】
クローン番号８５８：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDATKLETGVPTRFIGSGSGTDFTVTITSLQPEDVATYYCQHFANLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３８】
クローン番号８５９：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKVPKLLVFAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNSAPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３３９】
クローン番号８６１：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIIASYLNWYQQKPGRAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPIFTFGPGTKVNIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４０】
クローン番号８６３：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRTSQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４１】
クローン番号８６８：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIKNNLAWYQVKPGQAPRLLTSGASARATGIPGRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDIAVYYCQEYNNWPLLTFGGGTKVEIQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４２】
クローン番号８７０：
DIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCRASQRIASYLNWYQQKPGRAPKLLIFAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYATYYCQQSYSTPIYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４３】
クローン番号８７１：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLESEVPSRFSGRGSGTDFTFSISSLQPEDIATYFCQQYDNFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４４】
クローン番号８８０：
DIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQSYSFPYTFGQGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４５】
クローン番号８８１：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPRLTFGGGTKVDITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４６】
クローン番号８８４：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQTISVFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSAVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQESFSSSTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４７】
クローン番号８８６：
EIVMTQSPATLSVSPGETATLSCRASQSVSSNLAWYQHKPGQAPRLLIHSASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNMWPPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４８】
クローン番号８８８：
DIVMTQSPLSLPVTPGAPASISCRSSQSLLRTNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSIRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTSITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３４９】
クローン番号８９４：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPETFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０３５０】
これらのクローンにおいて核酸フラグメントをコードする軽鎖は、以下の核酸配列を有し、それらはまた、配列番号：１３３−１７６として提供される：
【０３５１】
クローン番号７３５：
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtccttgtctccaggagaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttaacagccacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctataatacattcaatagggtcactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagccttgcgactgaagattttggcgtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcccgccctcactttcggcggagggaccaaagtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５２】
クローン番号７３６：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggagacagagtcaccttcacttgccgggccagtcagaggattagcaaccatttaaattggtatcaacaaaagccagggaaagcccctaaactcctgatctttggtgcatccactcttcaaagtggggccccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaatgtacaacctgacgattttgcaacttactactgtcaacagagttacagaactcccccgatcaacttcggccaagggacacgcctggacattaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５３】
クローン番号７４４：
gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtatcagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatgatagctcactttctacgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５４】
クローン番号７９３：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattaccggctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaactcctgatctatgctacatccactttgcaaagtgaggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtcttcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttataataccctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５５】
クローン番号７９５：
gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtatcagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatacatggcgcatccaccggggccactggcaccccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagtacactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcaatatggtaggacaccgtacacttttggccaggggaccaagctggagaacaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５６】
クローン番号７９６：
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcgaagtgatggaaagacgtttttgtattggtatctgcagaagccaggccagtctccccaacccctaatgtatgaggtgtccagccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcaggggcagatttcacactgaacatcagccgggtggagactgaggatgttgggatctattactgcatgcaaggtttgaaaattcgtcggacgtttggcccagggaccaaggtcgaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５７】
クローン番号７９９：
gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccttctcttgccgggccagtcagagtgttagtagttgggtggcctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagctcctgatctctgaggcctccaatttggaaagtggggtcccatcccggttcagcggcagtggatccgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtatcatagttactctgggtacacttttggccaggggaccaagttggaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５８】
クローン番号８００：
gccatccagttgacccagtctccatcgtccctgtctgcatctgtaggcgacagagtcaccctcacttgccgggcgagtcagggcattaccgattctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaggtcctgctctatgctgcttccagattggaaagtggggtcccatccaggttcagtggccgtggatctgggacggatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagactttgcaacttattactgtcaacagtattctaagtcccctgcgacgttcggcccagggaccaaggtggaaatcagacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３５９】
クローン番号８０１：
gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctaaatagtaatggattcaactatgtggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacaactcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagctctagaaactccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６０】
クローン番号８０４：
gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccagggggaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcggctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccggcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtattttggctcaccgtacacttttggccaggggaccaagctggagctcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６１】
クローン番号８１０：
aacatccagatgacccagtctccatctgccatgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggcattagtaattatttagtctggtttcagcagaaaccagggaaagtccctaagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtctacagcataatatttccccttacacttttggccaggggaccaagctggagaccaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６２】
クローン番号８１１：
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaggtccagtgagactgttttatacacctctaaaaatcagagctacttagcttggtaccagcagaaagcacgacagcctcctaaactactcctttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgcccgattcagtggcagcggatctgggacagatttcactctcgccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaattttttaggagtcctttcactttcggccccgggaccagactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６３】
クローン番号８１２：
gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagttaccctctcttgcagggccagtcagagtgttagcagcagttacatagcctggtaccagcagaagcctggccaggctcccaggctcgtcatctatgctgcatcccgcagggccactggcgtcccagacaggttcagtggcagtgggtctgcgacagacttcactctcaccatcagtagactggagcctgaagatcttgcagtgtattactgtcagcactatggtaactcactattcactttcggccctgggaccaaggtggatgtcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６４】
クローン番号８１４：
gacatccagatgacccagtctccctccaccctgtctgcatctgtcggagacagagtcaccatcacttgccgggccagtcagagtattggtagccggttggcctggtatcagcagcaaccagggaaagcccctaaattcctgatctatgatgcctccagtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatcagggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagccggaggatcttgcaacttattactgccaacagtacaatagagattctccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６５】
クローン番号８１６：
gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcaccccaggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtgatggacgctactatgtggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacacctcctgatctatttggcttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcactggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggcgtttattactgcatgcaaggtctacacactccttggacgttcggccaggggaccaaggtggacatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６６】
クローン番号８１７：
gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgcgtccccaggggaaagagccaccctctcctgttgggccagtcagactattggaggcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtgtcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcgccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataaaaactggtacacttttggccaggggaccaagctggagctcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６７】
クローン番号８１８：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagaccattgccagttacgtaaattggtaccaacaaaaaccagggagagcccctagtctcctgatctatgctgcatctaacttgcagagtggggtcccaccaaggttcagtggcagtggatctgggacagacttcactctcaccatcagcggtctgcaacctgacgattttgcaacttattactgtcaacagagttacagttatcgagcgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６８】
クローン番号８１９：
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtcgttgtccccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctccttagcctggtaccaacagacacctggccaggctcccaggcttctcatctatgatgcgtcctacagggtcactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggatagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttactattgtcagcagcgtagcaactggcctccggggctcactttcggcggggggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３６９】
クローン番号８２４：
gccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgttggagacacagtcaccgtcacttgccggccaagtcaggacattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaacctcctaagctcctgatctatggtgcctccactttggattatggggtcccattaaggttcagcggcactgcatctgggacacatttcactctcaccatcagcagcctgcaacctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatacttacccattcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７０】
クローン番号８２５：
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacaactccaacaataagaactacttagcctggtatcagcagaaaccaggacagcctcctaagctcctcattcacttggcatctacccgggaatacggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcgctctcatcatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacaatattatcaaactcctctaacttttggccaggggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７１】
クローン番号８２７：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctggctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagttcattagcagctatttacattggtatcagcaaagaccaggcaaggcccctaaactcctgatgtatgctgcctccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacactaacccatacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７２】
クローン番号８２９：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctatctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattgccagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccccaaactcctgatctatgctgcatccagtttgcatagtggggtcccatcaagattcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacacagttacagtactcgattcactttcggccctgggaccaaagtggatgtcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７３】
クローン番号８３０：
gacatccagatgacccagtctccttcgaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggccagtcagagtgttactagtgagttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaacttcctgatctataaggcgtctagtttagaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtataatagttttccgtacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７４】
クローン番号８３１：
gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggcgacagactcaccatcacttgccgggccagtcagaatatttataactggttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaactcctgatctatgacgcctccactttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcgacttattactgccaacaatataatagtttgtctccgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７５】
クローン番号８３５：
gacatccagttgacccagtctccatccttcctgtctgcatctttagaagacagagtcactatcacttgccgggccagtcagggcattagcagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgctcgatgctgcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagcttaatagttaccctcggacgttcggccaagggaccaaggtggacatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７６】
クローン番号８３８：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcagcatcacttgccgggcgagtcagggcattagcaattatttagcctggtatcagcagaaaccagggaaggttcctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaggatgttgcaacttattactgtcaaaagtataacagtgcccctcaaacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７７】
クローン番号８４１：
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaggtccagccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagcttggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcgtttactgggcatcaacccgggcatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccctcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcagtttcatagtactcctcggacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７８】
クローン番号８５３：
gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaactacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccgctggcatgccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtaactcaccgctcactttcggcggagggaccgaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３７９】
クローン番号８５５：
gacatccagatgacccagtctccatcttctgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcaggctattagtaactggttagcctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaagattcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcactatcagcggcctgcagcctgaggattttgcaacttactattgtcaacaggctgacactttccctttcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８０】
クローン番号８５６：
gatattgtgatgacccagactccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcttggatagtaatgatggaaacacctatttggactggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatttatacattttcctatcgggcctctggagtcccagacaggttcagtggcagtgggtctggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggccgaggatgttggagtttattactgcatgcaacgtatcgagtttccgtacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８１】
クローン番号８５７：
gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagaaatgagtacaactatttggattggtacttgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctattggggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaaactctacaaactcctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８２】
クローン番号８５８：
gacatccagatgacccagtctccatcctccgtgtctgcatctgtgggagacagagtcaccatcacttgccaggcgagtcaagacattagcaactatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatcttcgatgcaaccaaattggagacaggggtcccaacaaggttcattggaagtggatctgggacagattttactgtcaccatcaccagcctgcagcctgaagatgttgcaacatattactgtcaacactttgctaatctcccatacacttttggccaggggaccaagctggagatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８３】
クローン番号８５９：
gacatccagatgacccagtctccatcttccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagggcattaggaattatttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagctcctggtctttgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaggatgttgcaacttattactgtcaaaggtataacagtgccccgctcactttcggcggagggacgaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８４】
クローン番号８６１：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagatcattgccagctatttaaattggtatcagcagaaaccaggcagagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccccatattcactttcggccctgggaccaaggtgaatatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８５】
クローン番号８６３：
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcaggaccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcttccaatagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagtgactggctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８６】
クローン番号８６８：
gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtattaaaaacaacttggcctggtaccaggtgaaacctggccaggctcccaggctcctcacctctggtgcatccgccagggccactggaattccaggcaggttcagtggcagtgggtctgggactgacttcactctcaccatcagcagcctccagtctgaagatattgcagtttattactgtcaggagtataataattggcccctgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatccaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８７】
クローン番号８７０：
gacatccagatgacccagtctcctccctccctgtctgcatctgtgggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagaggattgccagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggagagcccctaagctcctgatctttgctgcatccagtttacaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagacttcactctcaccatcagtagtctgcaacctgaagattatgcgacttactactgtcaacagagttacagtactcccatctacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８８】
クローン番号８７１：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggcgagtcagggcattagcaactatttaaattggtatcaacagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatcttcgatgcatccaatttggaatcagaggtcccatcaaggttcagtggacgtggatctgggacagattttactttctccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatatttctgtcaacagtatgataatttcccgtacacttttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３８９】
クローン番号８８０：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctggctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacctgccgggcaagtcagacgattgccagttatgtaaattggtatcaacagaaaccagggaaagcccctaatctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcatcttacttctgtcaacagagttacagtttcccgtacacttttggccaggggaccaagctggatatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３９０】
クローン番号８８１：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagaccattgccagctatgtaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccaatttgcaaagtggggtcccttcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtgtccctcggctcactttcggcggagggaccaaggtggacatcacacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３９１】
クローン番号８８４：
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggtcaagtcagaccattagcgtctttttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgccgcatccagtttgcacagtgcggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattctgcaacttactactgtcaagagagtttcagtagctcaactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３９２】
クローン番号８８６：
gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaacagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccaacataaacctggccaggctcccaggctcctcatccatagtgcatccaccagggccactgggatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccataagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataatatgtggcctccctggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３９３】
クローン番号８８８：
gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccctggagcgccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcgtactaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctattcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggctcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaatctctacaaacttcgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３９４】
クローン番号８９４：
gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctccgggggaaagagccaccctctcctgcagggctagtcagagtgttggcaacaacttagcctggtaccagcagagacctggccaggctcccagactcctcatctatggtgcgtccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaggattttgcagtttattactgtcagcagtatgataagtggcctgagacgttcggccaggggaccaaggtggacatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
【０３９５】
上記で考察された４４個のクローンの全てにおいて、コードされた抗体は、同一の定常ＩｇＧ重鎖を含み、それらは、以下のアミノ酸配列を有する（配列番号１７８）：
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０３９６】
この重鎖をコードするゲノム配列は、以下の核酸配列を有する（配列番号：１７７）：
【表８】
2009528828.tif 000010
【０３９７】
この配列において、エクソンは二重下線により示される。さらに、最初のＳｅｒをコードするヌクレオチドａｇｔ（ボルド体下線）は、ＩｇＧ発現ベクターにおいて、可変重鎖部位をコードするＸｈｏＩで消化されたＰＣＲ産物のＸｈｏＩで消化された発現ベクターへの導入の結果として作成される。
【０３９８】
上に記載されるＶＨおよびＶＬをコードするペアーは、ＥＬＩＳＡおよび／またはＦＬＩＳＡにおける様々な抗原およびペプチドに対する結合特異性、エピトープマッピング、抗原多様性、ならびに配列多様性により選択された。誤りが見つかった場合、選択された同種Ｖ−遺伝子ペアーをクローン修復（実施例１、セクションｆ）にかけた。各々の発現構築物を、ＣＨＯ−ＦｌｐＩｎ受容細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＦｌｐ−リコンビナーゼを発現するプラスミドを用いて共トランスフェクトし、次いで、組み込み体の抗生物質選択を行った。トランスフェクション、選択、および無血清培地への適応を、実施例１、セクションｇ−１およびｇ−２に記載されるごとく行った。
【０３９９】
各抗体を産生する細胞株の細胞バンクを作成するために、安定的にトランスフェクトされ、無血清の懸濁培地が適応された個々の発現細胞株を複数のアンプルで凍結保存した。
【実施例３】
【０４００】
インビトロ中和実験を、単一抗体クローンおよび精製された抗体の組み合わせの両方で行った。以下に記載される全ての抗体混合物は、本発明の各抗−ＲＳＶ抗体の多くからなり、それらを等量の異なる抗体を用いた混合物中に混合させた。
【０４０１】
単一抗体のテスト
最初に、各抗体の中和活性を、実施例１、セクションｊ−２で上に記載されるごとく、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢ株に対する補体の存在下におけるＰＲＮＴで調べた。多くの精製抗体のＥＣ５０値を表７に示す。興味深いことに、ほとんどの抗−Ｆ抗体が各々ウイルス中和活性を示した一方、ＥＣ５０は抗−ＲＳＶタンパク質Ｇ抗体の大半で測定されなかった。このことは、これらの抗体が各々、ウイルスを中和することができないことを示す。空欄は、まだ解析を行っていないことを示す。ＮＤは、ＥＣ５０値が非常に低いか、もしくは中和活性を欠失しているため、ＰＲＮＴで測定できなかったことを示す。
【０４０２】
表７：ＲＳＶサブタイプＡおよびＢに対する精製された抗−ＲＳＶタンパク質Ｆおよびタンパク質Ｇ抗体のＥＣ５０値
【表９】
2009528828.tif 000011
【０４０３】
抗−Ｆ抗体の混合物
サブタイプＡおよびＢのＲＳＶ株を中和する抗−ＲＳＶタンパク質Ｆ抗体の混合物の能力を、パリビズマブ（抗−Ｆ抗体についても）を用いて得られた中和効果と比較した。中和能力を、実施例１、セクションｊに記載されるごとくマイクロ中和試験またはＰＲＮＴを用いて測定した。最初の実験では、５個および１１個の異なる抗−Ｆ抗体を含む２つの抗体混合物、抗−Ｆ（Ｉ）および抗−Ｆ（ＩＩ）を各々、マイクロ中和試験を用いてパリビズマブと比較した。抗−Ｆ（Ｉ）は、クローン８１０、８１８、８１９、８２５および８２７から得られる抗体からなる。抗体８１０および８１９は、抗原部位Ａ／ＩＩに結合し、抗体８１８は、部位Ｂ／ＩまたはＦ１に、抗体８２５は、部位ＡおよびＣと重複する複合エピトープに結合し、ならびに抗体８２７は、別の複合エピトープに結合する（表５を参照）。抗−Ｆ（ＩＩ）は、クローン７３５、８００、８１０、８１８、８１９、８２５、８２７、８６３、８８０、８８４および８９４から得られる抗体からなる。抗−Ｆ（ＩＩ）は、所定の抗原部位のいずれかに対する複数の結合部位を含む：抗体８１０、８１９および８６３はＡ／ＩＩに結合し、抗体８００および８１８はＦ１（またはＢ／Ｉ）に結合し、抗体８２７および８２５は、上に記載される複合エピトープに、抗体７３５および８９４は、未知のクラスター（ＵＣ）Ｉに属し、抗体８８０は、ＵＣＩＩに、ならびに８８４は、別のいまだ未知のエピトープに結合する（表５を参照）。図５に示されるごとく、組成物抗−Ｆ（Ｉ）およびＦ（ＩＩ）の両方は、両サブタイプのＲＳＶ株の中和に関してパリビズマブよりより強力である。
【０４０４】
図５はまた、５個の抗体（抗−Ｆ（Ｉ））の組み合わせが１１個の抗体（抗−Ｆ（ＩＩ））の組み合わせより強力であることが示唆されることを示す。抗−Ｆ（Ｉ）混合物は、これまで明確にされてきた異なるエピトープ特異性のうちで最も強力な個々の中和抗体のいくつかを含む。抗−Ｆ（ＩＩ）混合物は、同一の５個の極めて強力な抗体を含むが、それはまた、所定のエピトープのいくつかに対するさらなる結合部位を含み、含まれた抗体はまた、それら自身におけるより広い範囲の中和活性を示す。それゆえ、極めて強力な抗体の活性は、Ｆタンパク質における中和エピトープへの結合による競合のため、抗−Ｆ（ＩＩ）組み合わせで希釈される可能性がある。しかしながら、各々の抗体に関連する中和効果以外の効果、例えば、食作用の増加、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）の上昇、抗炎症効果、補体活性、およびエスケープ変異体が作成される可能性の低下が可能性として存在することから、インビボを考慮に入れると、この結果は、５個の抗体混合物がインビボで用いられる際に１１個の抗体混合物よりも良好であるという指標として解釈されるべきではない。
【０４０５】
この最初の実験および補体の存在下で極めて強力であるＦ−特異的な抗体クローンの多くの組み合わせが同定されたことから、インビトロアッセイおよびクローンの組み合わせの両方が精査された。さらなる抗−Ｆ抗体組成物のＥＣ５０値（プラーク数の５０％減少を引き起こすのに必要とされる有効濃度）として表される中和能力を表８に記載する。組成物中のクローンの正確な数によらず、Ｆ−特異的抗体のテストされた組み合わせの大半は、ＲＳＶ株サブタイプＡの中和に関してパリビズマブよりも強力である。
【０４０６】
抗−Ｇ抗体の混合物
サブタイプＡのＲＳＶ株を中和する抗−Ｇ抗体混合物の能力を、実施例１、セクションｊ−２に記載されるように、ＰＲＮＴを用いてテストした。テストした抗−Ｇ抗体組成物からのＥＣ５０値を表８に記載する。２つの抗−Ｇ抗体の組成物のほとんどは、個々の抗−Ｇ抗体と比較してウイルスを中和する能力の顕著な上昇を示さなかった。２または３つの抗−Ｇ抗体のうちのいくつかの組み合わせは、濃度にかかわらず、決して１００％のウイルス中和率には到達しなかった。しかしながら、さらなる抗−Ｇ抗体を組成物に添加すると能力が上昇し、それは、可能性として抗−Ｇ抗体間における相乗的な中和効果を示唆する。図７は、複数のＧ−特異的なクローンを組み合わせた際の能力の上昇の一例を示す。
【０４０７】
抗−Ｆおよび抗−Ｇ抗体の混合物
ＲＳＶサブタイプＢ株を中和する抗−ＲＳＶタンパク質Ｆおよびタンパク質Ｇ抗体混合物の能力を、パリビズマブを用いて得られる中和効果と比較した。実施例１、セクションｊ−４に記載ごときマイクロ中和融合阻害アッセイまたはプラーク減少中和アッセイ（実施例１、セクションｊ−２）のどちらかを用いて中和能力を測定した。
【０４０８】
最初に、２つの抗体混合物、抗−Ｆ（Ｉ）Ｇおよび抗−Ｆ（ＩＩ）Ｇの中和活性をマイクロ中和融合阻害アッセイで測定した。これらの混合物の各々は、上に記載される組成物抗−Ｆ（Ｉ）および抗−Ｆ（ＩＩ）の抗−Ｆ抗体ならびにクローン７９３、７９６、８３８、８４１、８５６および８８８から得られる抗−Ｇ抗体を含み、ここで、抗体７９３、７９６、８３８はＧタンパク質の保存領域に結合し、８４１、９５６はＲＳＶサブタイプＡのＧＣＲＲに結合し、および８８８は両方のサブタイプのＧＣＲＲに結合する（表５を参照）。図６に示されるように、両組成物抗−Ｆ（Ｉ）ＧおよびＦ（ＩＩ）Ｇは、ＲＳＶ  Ｂ１株の中和に関してパリビズマブよりも強力である。さらに、２つの混合物の中和活性はおよそ同等である。それゆえ、抗−Ｆ抗体を多くのタンパク質Ｇ−特異的クローンと組み合わせると、２つの抗−Ｆ抗体混合物間で以前観察された能力の差異は減少するように思われる。このことは、ＲＳＶにおける広い範囲の抗原およびエピトープを認識する抗体を組み合わせると、一般的に中和活性が増加することを示唆しうる。
【０４０９】
その後、抗−Ｆおよび抗−Ｇ抗体の両方の多くの異なる組み合わせを、補体の存在または非存在下におけるＰＲＮＴを用いてテストした。活性な補体の存在下でこのアッセイにより得られるＥＣ５０値を表８に表す。抗−Ｆおよび抗−Ｇ抗体の両方を含む全てのテストされた組成物はＲＳＶサブタイプＡを中和し、これらの大半はパリビズマブよりより強力である。
【０４１０】
結果はまた、本発明の抗体クローニング技術を用いてヒトドナーから自然に高い親和性を有する抗体を繰り返し得られうることを示す。
【０４１１】
表８：ＲＳＶサブタイプＡおよびＢに対する抗−ＲＳＶ抗体の組み合わせのＥＣ５０値。空欄は、解析がまだ行われていないことを示す。ＮＤは、ＥＣ５０値が非常に低いか、もしくは中和活性を欠失しているため、ＰＲＮＴにおいて測定できなかったことを示す。
【表１０】
2009528828.tif 000012
【表１１】
2009528828.tif 000013
【表１２】
2009528828.tif 000014
【表１３】
2009528828.tif 000015
【実施例４】
【０４１２】
ＲＳＶ感染マウス肺におけるウイルス負荷の減少
ＲＳＶ感染に対する本発明の精製抗体の組み合わせのインビボ保護能力を、実施例１、セクションｋ−１に記載されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて示した（Taylor et al. 1984. Immunology 52, 137-142; Mejias, et al. 2005. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 4700-4707）。表９において、本発明の異なる抗体クローンの等量からなる３つの異なる抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂを用いる実験からのデータを、同一の実験の未感染コントロールマウスおよびプラセボ（ＰＢＳ）処理マウスからのデータと比較して表す。各処理群は５匹ずつのマウスを含み、このモデルにおいてウイルス複製のだいたいのピークである感染５日後にサンプルを得た。表９に示されるように、予防的に投与されると、ｒｐＡｂ組み合わせは、少なくとも投与量の順にウイルス負荷を有効に減少させる。コピー数を平均±標準偏差として表す。２つの処理群では、コピー数はこのアッセイの検出限界点またはそれ以下、すなわち、３．８ｌｏｇ１０ＲＮＡコピー／ｍｌであった。
【０４１３】
表９：マウス肺における予防およびＲＳＶ誘発後のウイルス負荷
【表１４】
2009528828.tif 000016
【０４１４】
ＲＳＶ感染マウスに由来する肺サンプルにおけるサイトカインおよびケモカインレベル
試験的なマウス予防研究に由来する肺サンプルを市販されている複合的な免疫アッセイを用いて解析することにより、実施例１、セクションｋ−１に記載されるように、ＲＳＶ感染およびｒｐＡｂ  １８による抗体予防後における異なるサイトカインおよびケモカインのレベルを調べた（表８）。未感染および未処理マウスからのサンプルについても、ＢＡＬＢ／ｃマウスの基準データを得るために解析した。感染５日後に全てのサンプルを得た。データを平均±標準偏差として表す。
【０４１５】
解析では、ヒトとマウスの両方において、ＲＳＶ感染、次いで炎症応答の重要なマーカーとして示される多くのサイトカインおよびケモカインは、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８（ＫＣ／ＧＲＯα）、ＩＬ−１０、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−１α、発現および分泌標準Ｔ細胞活性調整（ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ５）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを含み、それらサイトカインおよびケモカイン数のレベルがプラセボ処理マウスの肺で上昇する一方、約５０ｍｇ／ｋｇのｒｐＡｂで処理したマウスの肺は、未感染のコントロールマウスとほぼ同一のレベルであることが示された。同様の結果を他の抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂの組み合わせで得た。マウスはＩＬ−８の自明なホモログを有していないが、ＫＣと呼ばれるヒトＧＲＯαに機能的な相同性（ＩＬ−８と同様な機能）を有することは注目すべきである。
【０４１６】
炎症応答の動力学および抗体予防の用量応答効果は調査中である。
【０４１７】
表１０：ＲＳＶ感染マウスに由来する肺組織におけるサイトカインおよびケモカインのレベル
【表１５】
2009528828.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０４１８】
【図１】（Ａ）プロトタイプ株、Ｌｏｎｇ（サブタイプＡ）および１８５３７（サブタイプＢ）由来の全体のＧタンパク質のアミノ酸配列の並列比較。シグナル／膜貫通領域を点線で囲う。Cane et al 1991 J.Gen.Virol 72:2091-2096により同定されるようなアミノ酸１０１〜１３３および２０８〜２９９の間の２つの可変領域を下線で特定する。Ｇタンパク質の中心フラグメントはＥ．ｃｏｌｉで融合タンパク質として発現され、黒色で囲う。２つのアミノ酸配列を、配列番号：７１１（サブタイプＡ）および配列番号：７１２（サブタイプＢ）に記載する。（Ｂ）（Ａ）に示される中心フラグメントの並列比較。１３−ａａ保存領域およびＧタンパク質システインリッチドメイン（ＧＣＲＲ）の局在を角括弧で示す。（両サブタイプ間で同一の）ＧＣＲＲにおけるジスルフィド架橋を四角角括弧で示す。２つのアミノ酸配列を配列番号：７１３（サブタイプＡ）および配列番号：７１４（サブタイプＢ）に記載する。
【図２】多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）およびクローン化工程（Ｂ）の模式的概要。（Ａ）ＶＨおよびＶＫ遺伝子ファミリー各々に特異的な２組のプライマー、ＣＨ＋ＶＨ１−８およびＶＫ１−６＋ＣＫ１を第一のＰＣＲ工程に用いた。ＶＨまたはＶＫプライマー間の相同領域は重複するＰＣＲ産物を生じる。第２工程において、この産物をネスティドＰＣＲで増幅させる。プライマーはまた、クローン化を容易にする制限酵素の認識部位を含む。（Ｂ）作成した同種の連結ＶＨおよびＶＫをコードするペアーをプールし、隣接するＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位の使用により哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターに挿入した。次いで、全長抗体の発現を促進するために、二方向性プロモーターを連結ＶＨおよびＶＫをコードする配列間のＡｓｃＩ−ＮｈｅＩ制限酵素部位に挿入する。用いられるＰＣＲプライマーを平行矢印により示す。ＣＨ１：重鎖定常領域１、ＣＬ：定常領域、ＬＣ：軽鎖；Ａｂ：抗体；Ｐ１−Ｐ２：二方向性プロモーター。
【図３】哺乳動物全長抗体発現ベクター００−ＶＰ−５３０の模式図。ベクターは以下の構成要素を含む：ＡｍｐおよびＡｍｐ  ｐｒｏ＝アンピシリン耐性遺伝子およびそのプロモーター。ｐＵＣ開始点＝ｐＵＣ複製開始点。Ｐ１＝軽鎖の発現を促進する哺乳動物プロモーター。Ｐ２＝重鎖の発現を促進する哺乳動物プロモーター。リーダーＩＧＨＶ＝ゲノムヒト重鎖リーダー。ＶＨ＝重鎖可変領域をコードする配列。ＩｇＧ１＝ゲノム免疫グロブリンアイソタイプＧ１重鎖定常領域をコードする配列。ウサギβ−グロブリンＡ＝ウサギベータ−グロブリンポリＡ配列。カッパリーダー＝マウスカッパリーダーをコードする配列。ＬＣ＝軽鎖をコードする配列の配列。ＳＶ４０  ｔｅｒｍ＝サルウイルス４０転写終結配列。ＦＲＴ＝Ｆｌｐ認識標的部位。Ｎｅｏ＝ネオマイシン耐性遺伝子。ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ＝サルウイルス４０ポリＡシグナル配列。
【図４】ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）解析を用いてクローン８０１から得られた抗体（Ａｂ８０１）のエピトープ特異性の特徴付け。抗体８０１結合を、３つの抗体、９ｃ５（２）、１３３−ｈ（３）およびパリビズマブ（４）であって、各々、抗原部位Ｆ１、ＣおよびＩＩに結合する抗体を用いて、タンパク質Ｆへの結合に関する対競合（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）でテストした。対照の細胞は、競合しないＡｂ８０１（１）のタンパク質Ｆへの結合を示す。４つの抗体の注入時間を矢印により示す。応答を相対的共鳴単位（ＲＵ）で示す。長い両方向矢印は競合しない応答の大きさを示し、短い両方向矢印は９ｃ５で阻害された応答の大きさを示す。
【図５】図は、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢ株のインビトロ中和の結果である。抗−Ｆ抗体混合物の希釈物を、ＲＳＶ  ｌｏｎｇ（グラフＡ）およびＲＳＶ  Ｂ１（グラフＢ）株を中和する能力についてテストした。クローン８１０、８１８、８１９、８２５および８２７から得られた抗体混合物、抗−Ｆ（Ｉ）を三角形（▲）として示し、クローン７３５、８００、８１０、８１８、８１９、８２５、８２７、８６３、８８０、８８４および８９４から得られた抗体混合物、抗−Ｆ（ＩＩ）を四角形（■）として示す。パリビズマブをダイヤモンンド（◆）として示し、アイソタイプに適合する陰性コントロール（抗−アカゲザルＤ）抗体を円（●）として示す。吸光度を４９０ｎｍで測定し、ＲＳＶ複製と相関関係にある。
【図６】図は、インビトロＲＳＶ融合阻害アッセイの結果である。抗体混合物の希釈物を、ＲＳＶ  Ｂ１株を中和する能力についてテストした。クローン８１０、８１８、８１９、８２５、８２７、７９６、８３８８４１、８５６および８８８から得られる抗体混合物、抗−Ｆ（Ｉ）Ｇを白抜きの四角形（□）として示し、７３５、８００、８１０、８１８、８１９、８２５、８２７、８６３、８８０、８８４、８９４、７９３、７９６、８３８、８４１、８５６および８８８から得られる抗体混合物、抗−Ｆ（ＩＩ）Ｇを、白抜きの三角形（△）として示す。パリビズマブをダイアモンド（◆）として示す。吸光度を４９０ｎｍで測定し、ＲＳＶ複製と相関関係にある。
【図７】図は、活性な補体の存在下でＰＲＮＴにより測定されるごとく抗−Ｇ抗体クローンの組み合わせによるＲＳＶのインビトロ中和からの結果である。（表８に記載される）個々の抗体組成物の希釈物を、ウサギ補体の存在下におけるＲＳＶ株Ｌｏｎｇとインキュベートし、その後、ＨＥｐ−２細胞を感染させた。インキュベーション２４時間後、感染の程度を、ＲＳＶ特異的血小板の免疫検出を用いて検出した。抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ１３を白抜き三角形（△）として、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ３５を三角形（▲）として、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ３６を四角形（■）として、抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ４１を円（●）として、ならびに抗−ＲＳＶ  ｒｐＡｂ４５を白抜き四角形（□）として示す。データをコントロール±ＳＤと比較して％感染として表す。
【図１】
2009528828.tif 000018
【図２Ａ】
2009528828.tif 000019
【図２Ｂ】
2009528828.tif 000020
【図３】
2009528828.tif 000021
【図４】
2009528828.tif 000022
【図５Ａ】
2009528828.tif 000023
【図５Ｂ】
2009528828.tif 000024
【図６】
2009528828.tif 000025
【図７】
2009528828.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月10日(2008.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009528828000001.app
【国際調査報告】
2009528828.tif 000027
2009528828.tif 000028
2009528828.tif 000029
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