(57)【要約】各インフルエンザウイルス株の抗原を組み合わせて多価インフルエンザウイルスワクチンを製造するまで、冷蔵を行わない。さらに、インフルエンザワクチンの包装から投与までの間にも冷蔵を行わない。こうして冷蔵に対する必要性を最小限に抑えるため、ワクチンの製造から投与に到るまでコールドチェーンを維持する必要がない。本発明の一実施形態においては、インフルエンザワクチンのＨＡ含量は、少なくとも６ヶ月間室温で保管しても許容範囲内にとどまり得る。
2009534303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性インフルエンザワクチンを保管するためのプロセスであって、該ワクチンは、１０℃超で１０週間を超えて保管される工程を含む、プロセス。
【請求項２】
前記ワクチンは、バルクワクチンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記バルクからワクチンの１単位用量を取り出し、該１単位用量を容器内に配置する工程をさらに含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記ワクチンは、包装されたワクチンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
複数の包装された水性インフルエンザワクチンを分配するためのプロセスであって、該ワクチンは、非冷蔵状態で第１の場所から第２の場所に輸送される工程を含む、プロセス。
【請求項６】
バルク水性インフルエンザワクチンを分配するためのプロセスであって、該ワクチンは、非冷蔵状態で第１の場所から第２の場所に移動される工程を含む、プロセス。
【請求項７】
前記バルクからワクチンの１単位用量を取り出し、該１単位用量を容器内に配置する工程をさらに含む、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記バルクは、一価バルクである、請求項６または請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記バルクは、多価バルクである、請求項６または請求項７に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記第１および第２の場所は、１キロメートル超離れている、請求項１〜９のいずれかに記載のプロセス。
【請求項１１】
複数の包装された水性インフルエンザワクチンを分配するためのプロセスであって、該ワクチンは、第１の場所から第２の場所に輸送され、かつ、該第２の場所に非冷蔵状態で少なくとも１００時間保管される工程を含む、プロセス。
【請求項１２】
包装される水性ワクチンをワクチンバルクから調製するためのプロセスであって、ワクチンの１単位用量が、該バルクから取り出され、非冷蔵状態で容器に入れられる工程を含む、プロセス。
【請求項１３】
濃縮されたインフルエンザ抗原バルクを希釈するためのプロセスであって、該濃縮バルクは、水性媒体により非冷蔵状態で希釈される工程を含む、プロセス。
【請求項１４】
前記バルクは、一価バルクである、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記希釈された抗原と１種または複数種の別のインフルエンザウイルス株由来の抗原とを組み合わせて、多価組成物を得る工程をさらに含む、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記バルクは、多価バルクである、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１７】
多価インフルエンザワクチンを調製するためのプロセスであって、第１のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含む水性調製物が、非冷蔵状態で第２のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含む水性調製物と混合される工程を含む、プロセス。
【請求項１８】
３種類の株に由来する抗原が混合され、三価インフルエンザワクチンを得る、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
インフルエンザウイルスを含む組成物を不活化するためのプロセスであって、該組成物は、非冷蔵状態で不活化剤と混合される工程を含む、プロセス。
【請求項２０】
アジュバントインフルエンザウイルスワクチンを調製するためのプロセスであって、インフルエンザウイルス抗原が、非冷蔵状態でアジュバントと組み合わされる工程を含む、プロセス。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載のプロセスにより取得可能なまたは得られた、ワクチン。
【請求項２２】
（ａ）少なくとも１種のインフルエンザウイルス株由来の赤血球凝集素を含む水性ワクチンおよび（ｂ）該ワクチンが（ｉ）非冷蔵状態で保管されてもよいか、および／または（ｉｉ）室温で保管されてもよいことを示す資料を含む、キット。
【請求項２３】
非冷蔵状態で少なくとも１００時間保管されている水性インフルエンザウイルスワクチンであって、ただし、該ワクチンは（ｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株およびＡ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８株を含む三価ワクチンでも；（ｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株およびＡ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株およびＢ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１２０／００株を含む三価ワクチンでも；（ｉｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株およびＡ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株およびＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７株を含む三価ワクチンでもない、ワクチン。
【請求項２４】
非冷蔵状態で少なくとも１００時間保管されている水性インフルエンザウイルスワクチンであって、細胞培養で増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、ワクチン。
【請求項２５】
非冷蔵状態で少なくとも１００時間保管されている水性インフルエンザウイルスワクチンであって、ニワトリのＤＮＡ、オボアルブミンおよびオボムコイドを含まない、ワクチン。
【請求項２６】
非冷蔵状態で少なくとも１００時間保管されている水性インフルエンザウイルスワクチンであって、水銀を含まない、ワクチン。
【請求項２７】
非冷蔵状態で少なくとも１００時間保管されている水性インフルエンザウイルスワクチンであって、スプリットビリオンワクチン、全ビリオンワクチン、生ウイルスワクチンまたはビロゾームワクチンである、ワクチン。
【請求項２８】
少なくとも１種のインフルエンザウイルス株由来の赤血球凝集素を含む水性ワクチンであって、該ワクチンが２５℃で保管される場合、該赤血球凝集素の分解率が１株当たり年間３３％未満である、ワクチン。
【請求項２９】
開業医が患者に投与する薬品の製造におけるインフルエンザウイルス抗原の使用であって、該薬品は、該薬品の製造から該薬品が開業医により受領されるまでの間冷蔵されない、使用。
【請求項３０】
開業医が患者に投与する薬品の製造におけるインフルエンザウイルス抗原の使用であって、該薬品は、該開業医により受領されてから該患者に投与されるまでの間冷蔵されない、使用。
【請求項３１】
インフルエンザウイルスワクチンを患者に投与するためのプロセスであって、該投与前の２４時間において、該ワクチンは、非冷蔵状態で少なくとも１２時間保管されている、プロセス。
【請求項３２】
インフルエンザウイルスワクチンを患者に投与するためのプロセスであって、該ワクチンは、非冷蔵状態で少なくとも１２時間保管されてから該患者に投与される、プロセス。
【請求項３３】
前記ワクチンは、細胞培養で増殖されたウイルスから調製される、請求項１〜３２のいずれかに記載のプロセス、ワクチンまたは使用。
【請求項３４】
前記細胞培養は、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；またはＷＩ−３８から選択される細胞株によるものである、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記ワクチンは、洗浄剤を含む、請求項１〜３４のいずれかに記載のプロセス、ワクチンまたは使用。
【請求項３６】
前記ワクチンは、不活化ウイルスから調製される、請求項１〜３５のいずれかに記載のプロセス、ワクチンまたは使用。
【請求項３７】
前記ワクチンは、スプリットウイルスから調製される、請求項３６に記載のプロセス、ワクチンまたは使用。
【請求項３８】
前記ワクチンは、精製表面糖タンパク質ワクチンである、請求項３６に記載のプロセス、ワクチンまたは使用。
【請求項３９】
前記ワクチンは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種または複数種から防御する、請求項１〜３８のいずれかに記載のプロセス、ワクチンまたは使用。
【請求項４０】
前記ワクチンは、アジュバントを含む、請求項１〜３９のいずれかに記載のプロセス、ワクチンまたは使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に引用する文書についてはすべて、参照によってその全体を援用する。
【０００２】
本発明は、インフルエンザウイルス感染症の予防ワクチン、特に、冷蔵を要さずに有効性を維持するワクチンの分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
現在、様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが入手可能である（参考文献１の１７章および１８章などを参照のこと）。一般に、ワクチンは、生ウイルスまたは不活化ウイルスのどちらかをベースにしている。不活化ワクチンのベースとなるのは、全ビリオン、ウイルス「スプリット」粒子あるいは精製表面抗原である場合がある。
【０００４】
通常のインフルエンザワクチンに求められる有効期間は、５２週間である。この要件を満たすため、現在のインフルエンザワクチンに共通する特徴の１つは、インフルエンザワクチンが投与の時点まで冷蔵状態で保存されることにある。こうした状態であれば、赤血球凝集素（ＨＡ：ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）などの感染防御抗原の安定性が保たれる。
【０００５】
参考文献２（非特許文献１）には、様々なワクチン調製物を対象としたＨＡ分解に関する解析が含まれており、ＨＡ含量は、５℃で保存されれば、７８週間許容範囲にとどまるが、保存温度が２５℃（すなわち室温）まで上昇すると、分解率が少なくとも６倍（最悪の観察例では２４倍まで）上昇することが報告されている。被検ワクチンの１つでは、有効期間は、５℃で保存した場合、１０４週間と推定されたが、２５℃で保存した場合、１６週間に短縮し、さらに５．３週間を超えて２５℃で保管される場合、このワクチンは使用不能になることが推定された。
【０００６】
こうした温度感受性のため、現在のインフルエンザワクチンの製造、包装および分配のシステムでは、コールドチェーンを維持する必要がある。
【０００７】
コールドチェーンを不要にするために、ワクチン接種の様々な代替戦略が提示されてきた。たとえば、参考文献３および４（非特許文献２および３）では、インフルエンザワクチンを乾燥粉末として製剤化することが報告されている。タンパク質ベースのワクチンの代わりにＤＮＡワクチンを用いることも提案されている。
【０００８】
本発明は、コールドチェーンを維持する必要がない、特に分配の過程および／または最終の医療機関の施設内においてコールドチェーンを維持する必要がない、一段と改良されたインフルエンザワクチンおよびその製造プロセスを提供することを目的としている。
【非特許文献１】Ｃｏｅｎｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００６）２４：５２５−３１
【非特許文献２】Ｈｕａｎｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２３：７９４−８０１
【非特許文献３】Ｇａｒｍｉｓｅら、ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ（２００６）７（１）：Ａｒｔｉｃｌｅ１９．ＤＯＩ：１０．１２０８/ｐｔ０７０１１９．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、包装から投与までの間にインフルエンザワクチンを冷蔵する必要がない。従来技術の考えに反して、インフルエンザワクチンのＨＡ含量は、少なくとも６ヶ月間室温で保管しても許容範囲内にとどまり得る。
【００１０】
また、本発明は、ウイルス増殖後のバルク抗原の製造過程（抗原の精製過程など）において冷蔵状態を必要としないが、既承認の製造方法を変更せずに済むように、冷蔵状態のままでこうした工程を実施し、バルク後の工程（様々な株の抗原の混合、用量充填、保管、分配など）を冷蔵せずに行うこともできる。本発明の重要な利点の１つは、分配者および／または医師などが包装されたワクチンを冷蔵せずに保管できることである。さらに、本発明では、ワクチンが体温により近い温度で投与されるため、患者の快適性が増すことになる。
【００１１】
したがって、本発明は、複数の包装された水性インフルエンザワクチンを分配するためのプロセスであって、ワクチンを第１の場所から第２の場所に非冷蔵状態下で輸送する工程を含む、プロセスを提供する。第１と第２の場所は、好ましくは１キロメートル超離れている。
【００１２】
また、本発明は、バルク水性インフルエンザワクチンを分配するためのプロセスであって、ワクチンを第１の場所から第２の場所に非冷蔵状態で移動する工程を含む、プロセスも提供する。第１および第２の場所は、好ましくは１キロメートル超離れている。バルクは、一価バルクでも、多価バルクでもよい。このプロセスは、バルクからワクチンの１単位用量を取り出し、この１単位用量を容器内に配置する工程をさらに含むものである。
【００１３】
したがって、本発明は、複数の包装された水性インフルエンザワクチンを分配するためのプロセスであって、ワクチンを第１の場所から第２の場所に輸送し、かつ、ワクチンを第２の場所に非冷蔵状態で少なくともｈ時間保管する工程を含む、プロセスを提供する。ｈの値は、１２、１８、２４、３６、４８、６０、７２、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、５０００あるいはそれ以上から選択される。第２の場所は、好ましくは、たとえば、クリニック、医院など、ワクチンを患者に投与する場所である。
【００１４】
また、本発明は、インフルエンザワクチンを分配するためのプロセスであって、ワクチンを第１の場所から第２の場所に非冷蔵状態で移動し、第２の場所は、患者が（好ましくは）ワクチンの予防接種を受けることができる場所である、プロセスも提供する。第２の場所は、たとえば、クリニック、保健所、ショッピングモール、患者の自宅、患者の職場などであっても構わない。
【００１５】
また、本発明は、水性インフルエンザワクチンを保管するためのプロセスであって、ワクチンを１０℃超で１０週間を超えて保管する工程を含む、プロセスも提供する。保管ワクチンは、バルクワクチン（一価または多価）でも、包装されたワクチンでもよい。ワクチンがバルクワクチンである場合、このプロセスは、バルクからワクチンの１単位用量を取り出し、この１単位用量を容器内に配置する工程をさらに含んでもよい。バルクが一価バルクである場合、このプロセスは、一価バルクを（希釈する場合はその前、そのさなかまたはその後に）別の一価バルクと組み合わせる工程をさらに含んでもよい。ワクチンが包装されたワクチンである場合、ワクチンは、好ましくは（ｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株と、Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株と、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８株とを含む三価ワクチン；（ｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株と、Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株と、Ｂ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１２０／００株とを含む三価ワクチン；または（ｉｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株と、Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６−ｒｅａｓｓ．株と、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７株とを含む三価ワクチンではない。
【００１６】
また、本発明は、包装される水性ワクチンをワクチンバルクから調製するためのプロセスであって、ワクチンの１単位用量をバルクから取り出し、非冷蔵状態で容器に入れる工程を含む、プロセスも提供する。
【００１７】
また、本発明は、濃縮されたインフルエンザ抗原バルクを希釈するためのプロセスであって、濃縮バルクを水性媒体により非冷蔵状態で希釈する工程を含む、プロセスも提供する。このプロセスを行えば、抗原調製物は所望の最終濃度に調製される。バルクは、複数のインフルエンザウイルスの抗原を含んでも構わない。代替の方法として、バルクは、単一のインフルエンザウイルス株の抗原を含む一価バルクであってもよく、この場合、プロセスは、希釈抗原と１種または複数種の別のインフルエンザウイルス株の抗原とを組み合わせて、多価組成物を得る工程をさらに含んでも構わない。
【００１８】
また、本発明は、多価インフルエンザワクチンを調製するためのプロセスであって、第１のインフルエンザウイルス株の抗原を含む水性調製物を、非冷蔵状態において第２のインフルエンザウイルス株の抗原を含む水性調製物と混合する工程を含む、プロセスも提供する。このプロセスを用いてバルクワクチンを調製してもよいし、包装ワクチンを調製してもよい。好ましくは、このプロセスを用いて３種類のインフルエンザウイルス株の抗原を混合することで、三価インフルエンザワクチンを調製する。このプロセスを用いてバルクワクチン調製する場合、プロセスは、バルクからワクチンの１単位用量を取り出し、この１単位用量を容器内に配置する工程をさらに含んでもよい。
【００１９】
また、本発明は、インフルエンザウイルスを含む組成物を不活化するためのプロセスであって、組成物を不活化剤（ホルムアルデヒドなど；より詳細には以下を参照のこと）と非冷蔵状態で混合する工程を含む、プロセスも提供する。
【００２０】
また、本発明は、アジュバントインフルエンザウイルスワクチンを調製するためのプロセスであって、インフルエンザウイルス抗原をアジュバントと非冷蔵状態で組み合わせる工程を含む、プロセスも提供する。このプロセスを用いてバルクワクチンを得てもよく、したがって、このプロセスは、アジュバントワクチンの１単位用量をバルクから取り出し、この１単位用量を容器内に配置する工程をさらに含んでもよい。アジュバントと組み合わせるインフルエンザウイルス抗原は、好ましくは多価である。
【００２１】
また、本発明は、これらのプロセスにより取得可能なまたは得られたワクチンも提供する。
【００２２】
また、本発明は、非冷蔵状態で少なくともｈ時間保管されている水性インフルエンザウイルスワクチンであって：（ａ）ｈが１２、１８、２４、３６、４８、６０、７２、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、５０００あるいはそれ以上から選択され、（ｂ）ワクチンが、（ｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株と、Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株と、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８株とを含む三価ワクチン；（ｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株と、Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株と、Ｂ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１２０／００株とを含む三価ワクチン；または（ｉｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株と、Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株と、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７株とを含む三価ワクチンではない、インフルエンザウイルスワクチンも提供する。
【００２３】
また、本発明は、非冷蔵状態で少なくともｈ時間保管されている水性インフルエンザウイルスワクチンであって：（ａ）ｈは、１２、１８、２４、３６、４８、６０、７２、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、５０００あるいはそれ以上から選択され、（ｂ）ワクチンを、細胞培養で増殖させたインフルエンザウイルスから調製する、ワクチンも提供する。したがって、このワクチンは、鶏卵から調製されるワクチンと異なり、ニワトリのＤＮＡおよび卵タンパク質（オボアルブミンおよびオボムコイドなど）を含まないため、アレルゲン性を低下させることができる。
【００２４】
また、本発明は、（ａ）水性インフルエンザワクチンと、（ｂ）ワクチンを（ｉ）非冷蔵状態および／または（ｉｉ）室温で保管できることを示す資料とを含むキットも提供する。
【００２５】
また、本発明は、少なくとも１種のインフルエンザウイルス株の赤血球凝集素を含む水性ワクチンであって、ワクチンを２５℃で保管する場合、赤血球凝集素の分解率が１株当たり年間３３％未満である、ワクチンも提供する。たとえば、抗原濃度が１株当たり３０μｇ／ｍｌの場合、分解率は、１株当たり年間１０μｇ／ｍｌ未満である。
【００２６】
また、本発明は、少なくとも１種のインフルエンザウイルス株のノイラミニダーゼを含む水性ワクチンであって、ワクチンを２５℃で保管する場合、ノイラミニダーゼの分解率が１株当たりの年間３３％未満である、ワクチンも提供する。
【００２７】
また、本発明は、少なくとも１種のインフルエンザウイルス株の赤血球凝集素とノイラミニダーゼとの両方を含む水性ワクチンであって、ワクチンを２５℃で保管する場合、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼの分解率がともに、１株当たりの年間３３％未満である、ワクチンも提供する。
【００２８】
また、本発明は、開業医が患者に投与する薬品を製造するにおけるインフルエンザウイルス抗原の使用であって、薬品の製造から開業医が薬品を受領するまでの間に薬物を冷蔵しない、使用も提供する。
【００２９】
また、本発明は、開業医が患者に投与する薬品を製造するにおけるインフルエンザウイルス抗原の使用であって、開業医が受領してから患者に投与するまでの間に薬品を冷蔵しない、使用も提供する。
【００３０】
また、本発明は、インフルエンザウイルスワクチンを患者に投与するためのプロセスであって、投与の前の２４時間において（注射の前など）、ワクチンを非冷蔵状態で少なくとも１２時間（好ましくは少なくとも１８時間、一層好ましくは少なくとも２３時間、たとえば、投与前の２４時間の全時間）保管しておく、プロセスも提供する。
【００３１】
また、本発明は、インフルエンザウイルスワクチンを患者に投与するためのプロセスであって、ワクチンを非冷蔵状態で少なくともｈ時間保管した後に患者に投与し、ｈは、１２、１８、２４、３６、４８、６０、７２、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、５０００あるいはそれ以上から選択される、プロセスも提供する。
【００３２】
本発明のプロセス、使用およびワクチンにおける抗原については、好ましくは卵で増殖させたウイルスではなく細胞培養で増殖させたウイルスから調製する。これらの抗原が、特に安定であることが確認されているためである。理論に拘泥するわけではないが、現状では、本発明者らは、卵で増殖させた抗原に対するこのような安定性の向上には：（ａ）現行ワクチンにおいては卵由来の残留成分（たとえば、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼなどの酵素）がＨＡ分解に関与している可能性があるため、ウイルス増殖基質としての卵を回避することで、ワクチンの熱安定性が向上する；および／または（ｂ）細胞培養、特に哺乳動物細胞培養で得られるインフルエンザウイルスの糖タンパク質のグリコフォームは、卵において得られるグリコフォームよりも安定であるという２つの理由があり得ると考える。
【００３３】
本発明のワクチンは、特にスプリット抗原ワクチンまたは表面抗原ワクチンを対象に、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）」と呼ばれる）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」：ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）またはデオキシコール酸ナトリウムなどの洗浄剤を含んでもよい。トウィーン８０は、ＨＡ１μｇ当たり５〜２５μｇなど、たとえば、１０〜１５μｇ／μｇのようにＨＡよりも大きな質量（すなわちＨＡ１μｇ当たり１μｇ超）で存在してもよい。ＣＴＡＢは、たとえば、１．０〜１．５μｇ／μｇなど、ＨＡ１μｇ当たり０．５〜２．５μｇで存在してもよい。トウィーン８０およびＣＴＡＢは、同時に存在しても構わない。洗浄剤（単数または複数）は、インフルエンザウイルス抗原（ＨＡなど）を安定化し、熱による分解を防止することが可能である。以下の実施例で見られる熱安定性を、特にトウィーン８０（ポリソルベート８０）の存在で説明することができる。
【００３４】
抗原成分
本発明は、インフルエンザウイルス抗原を用いる。抗原については一般に、インフルエンザビリオンから調製するが、代替方法として、抗原を組換え宿主で発現させて、精製した形で用いてもよい。たとえば、組換え赤血球凝集素に関しては、たとえば、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞株で発現させ［５、６］、抗原として使用されており、組換えノイラミニダーゼの場合も同様である［７］。しかしながら、抗原は、ビリオン由来であるのが一般的である。
【００３５】
抗原は、生ウイルスの形をとってもよいし、一層好ましくは、不活化ウイルスの形をとってもよい。ウイルスを不活化する化学的手段には、洗浄剤、ホルムアルデヒド（ホルマリンなど）、β−プロピオラクトンといった薬剤の１種または複数種による有効量での処理または紫外線による処理がある。不活性化のさらなる化学的手段として、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）またはこれらの任意の組み合わせによる処理が挙げられる。ウイルス不活化の他の方法については、たとえば、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミンまたはγ線照射など、当該技術分野において公知である。ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品は、不活化全ビリオンワクチンである。
【００３６】
ビリオンについては、様々な方法によりウイルス含有液から採取することができる。たとえば、精製プロセスとして、ビリオンを壊す洗浄剤を含むショ糖直線密度勾配液によるゾーン遠心分離を挙げることができる。次いで、任意に希釈後、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製することができる。
【００３７】
スプリットビリオンについては、「トウィーン−エーテル」スプリットプロセスなど、精製ビリオンを洗浄剤（たとえば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコラート、トリ−Ｎ−ブチルホスファート、トリトンＸ−１００、トリトンＮ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）ＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を製造する。インフルエンザウイルスをスプリットする方法に関しては、当該技術分野において周知であり、たとえば、参考文献８−１３などを参照されたい。一般に、ウイルスのスプリットは、感染性か非感染性かを問わず、ウイルスを破壊する濃度でスプリット剤を用いて全ウイルスを破壊または断片化することで行われる。破壊の結果、ウイルスタンパク質の全部または一部が可溶化され、ウイルスの完全性が変化する。好ましいスプリット剤は、非イオンおよびイオン（陽イオンなど）界面活性剤、たとえば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ホベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ヘカメグ（Ｈｅｃａｍｅｇ）、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスファート、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（たとえば、トリトンＸ−１００またはトリトンＮ１０１などのトリトン界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（トウィーン界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエトレンエステルなどである。有用なスプリット手順の１つは、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの持続的作用を用いるもので、最初のビリオン精製の過程（ショ糖密度勾配液など）でスプリットを行うことができる。スプリットビリオンを、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁できると有用である。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）といった製品は、スプリットワクチンである。
【００３８】
精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原である赤血球凝集素を含み、さらに、ノイラミニダーゼも含むのが一般的である。これらのタンパク質を精製された形に調製するためのプロセスは、当該技術分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＥ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）といった製品は、サブユニットワクチンである。
【００３９】
また、インフルエンザ抗原は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  Ｖ（商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）といった製品と同様に、ビロゾームの形［１４］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）をとることがあるが、ビロゾームを本発明と一緒に用いないことが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、ビロゾームの形ではない。
【００４０】
インフルエンザウイルスについては、弱毒化することができる。インフルエンザウイルスは、温度感受性であっても構わない。インフルエンザウイルスは、低温順応型であってもよい。これら３つの特徴は、生ウイルスを抗原として用いる場合、特に有用である。
【００４１】
ワクチンに使われるインフルエンザウイルス株は季節により異なるが、現在の汎流行の中間期では、ワクチンは一般に、２種類のインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）と、１種類のインフルエンザＢ株とを含み、三価ワクチンが一般的である。また、本発明は、（特にインフルエンザＡウイルスの）Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株など、汎流行株（すなわち、ワクチン接種者および一般のヒト集団が免疫学的に感受性である株）のＨＡも用いるが、汎流行株のインフルエンザワクチンは、一価のものでもよいし、汎流行株を添加した通常の三価ワクチンベースのものでもよい。一方、季節およびワクチンに含まれる抗原の性質に応じて、本発明は、ＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６（インフルエンザＡウイルス）の１種または複数種から防御することがある。Ｈ１抗原の場合、参考文献２と比較して、ＨＡ分解率の大幅な低下が認められた。分解率の低下は、Ｈ３抗原、さらにはインフルエンザＢウイルス抗原でも認められた。
【００４２】
本発明は、インフルエンザＡウイルスのＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）サブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９を防御することがある。
【００４３】
本発明の組成物は、汎流行の中間期の株に対する免疫性を与えるのに好適であるばかりでなく、汎流行株に対する免疫性を与えるのに特に有用である。汎流行の発生の原因となり得るインフルエンザ株の特徴として：（ａ）現在循環しているヒト株の血球凝集素よりも新しい血球凝集素、すなわち、１０年以上にわたりヒト集団において認められていない血球凝集素（Ｈ２など）、あるいは、ヒト集団において以前にまったく確認されたことがない血球凝集素（通常、鳥集団だけに確認されるＨ５、Ｈ６またはＨ９など）を含んでいる、および／または現在循環しているヒト株のノイラミニダーゼよりも新しいノイラミニダーゼを含んでいるため、ヒト集団は株の血球凝集素および／またはノイラミニダーゼに対して免疫学的に感受性であること；（ｂ）ヒト集団に水平感染する能力があること；および（ｃ）ヒトに対して病原性を持つことが挙げられる。Ｈ５Ｎ１株などの汎流行インフルエンザに対する免疫性を与えるには、Ｈ５型赤血球凝集素を持つウイルスが好ましい。他に考えられる株として、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびこれ以外の出現する可能性がある任意の汎流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプ内のウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類できる［１５］が、クレード１および３が特に重要である。
【００４４】
その抗原を組成物に含ませると有用であり得る他の株には、耐性汎流行株［１７］など、抗ウイルス性治療に抵抗性（オセルタミビル［１６］および／またはザナミビルに対する抵抗性など）を示す株がある。
【００４５】
本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスなど、インフルエンザウイルス株の１種または複数種（１種、２種、３種、４種あるいはそれ以上など）の抗原（単数または複数）を含んでもよい。一価ワクチンを調製してもよく、２価、３価、４価なども同様である。ワクチンがインフルエンザ株を２種以上含む場合、一般に、ウイルスを採取し、抗原を調製した後、異なる株を別々に増殖させて混合する。したがって、本発明のプロセスは、２種以上のインフルエンザ株の抗原を混合する工程を含んでもよいが、このプロセスについては、非冷蔵状態で実施することができる。２種のインフルエンザＡウイルス株と１種のインフルエンザＢウイルス株との抗原など、三価ワクチンは好ましいものである。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は、単一のインフルエンザＡ株の抗原を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、２種のインフルエンザＡ株の抗原を含んでもよいが、これら２種の株は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２でないことを条件とする。いくつかの実施形態では、組成物は、３種以上のインフルエンザＡ株の抗原を含んでも構わない。
【００４７】
インフルエンザウイルスは、リアソータント株であってもよく、逆遺伝学技術で得られたものでもよい。逆遺伝学技術［たとえば、１８−２２］を用いれば、所望のゲノムセグメントを持つインフルエンザウイルスを、プラスミドによりインビトロで調製することができる。一般に、逆遺伝学技術は、（ａ）所望のウイルスＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ分子をポル（ｐｏｌ）Ｉプロモーターなどから、および（ｂ）ウイルスタンパク質をコードしているＤＮＡ分子をポルＩＩプロモーターなどから発現させるもので、細胞に２つのタイプのＤＮＡが発現するため、完全にインタクトな感染性ビリオンが構築される。このＤＮＡは、好ましくは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質をすべて与えるものであるが、ヘルパーウイルスを用いてＲＮＡおよびタンパク質の一部を与えることも可能である。プラスミドベースの方法は、各ウイルスＲＮＡを製造するために別々のプラスミドを用いたものが好ましく［２３−２５］、これらの方法は、ウイルスタンパク質の全部または一部（たとえば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰといったタンパク質だけ）を発現させるプラスミドも使用するもので、最大１２種のプラスミドを使用する方法もある。必要とするプラスミドの数を減らすため、最近のアプローチ［２６］では、同じプラスミドの（ウイルスＲＮＡ合成用の）複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（たとえば、インフルエンザＡのｖＲＮＡセグメントのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべてをコードしている配列）と、別のプラスミドのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの複数のタンパク質コード領域（たとえば、インフルエンザＡのｍＲＮＡ転写物のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべてをコードしている配列）とを組み合わせている。参考文献２６の方法の好ましい態様は：（ａ）単一のプラスミドにＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡのｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一のプラスミドに８つすべてのｖＲＮＡコードセグメントを含むものである。一方のプラスミドにＮＡセグメントとＨＡセグメントを含み、他方のプラスミドに他の６つのセグメントを含む場合も都合がよい。
【００４８】
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするポルＩプロモーターの使用に代わる方法として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーター［２７］を用いることもできる。たとえば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターを手軽に用いることができる。ポルＩプロモーターには種特異性があるため、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの方が、多くの細胞型（ＭＤＣＫ：Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙなど）にとり一層好都合であるかもしれない。ただ、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの場合、外来性のポリメラーゼ酵素をコードしているプラスミドも細胞にトランフェクトしなければならない。
【００４９】
他の技法では、単一の鋳型からウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするポルＩとポルＩＩの二重プロモーターを用いることができる［２８、２９］。
【００５０】
したがって、ウイルス、特にインフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスの１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでもよい（一般にＡ／ＰＲ／８／３４の６つのセグメントとワクチン株に由来するＨＡおよびＮセグメント、すなわち、６：２のリアソータント）。インフルエンザＡウイルスはさらに、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスまたはワクチン調製物用のリアソータントウイルスの製造に有用なこれ以外の任意のウイルス株の１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでも構わない。一般に、本発明は、ヒトからヒトに感染する能力がある株を防御するものであり、このため、その株のゲノムは、ほとんどの場合、哺乳類（ヒトなど）のインフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。この株のゲノムは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含んでも構わない。
【００５１】
上記のように、抗原の供給源としてのウイルスを、細胞培養で増殖させるのが一般的であるが、いくつかの実施形態では、卵で増殖させる場合もある。現在のインフルエンザウイルス増殖の標準的な方法では、特定病原体未感染（ＳＰＦ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）の孵化鶏卵を用いて、卵内容物（尿膜腔液）からウイルスを精製する。卵ベースのウイルス増殖を用いる場合、ウイルスと一緒に１種または複数種のアミノ酸を卵の尿膜腔液（ａｌｌａｎｔｏｉｄ  ｆｌｕｉｄ）に導入してもよい［１２］。
【００５２】
細胞基質は一般に、哺乳動物起源の細胞株である。好適な哺乳動物由来の細胞には、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサル）およびイヌの細胞があるが、これに限定されるものではない。たとえば、腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など、様々な細胞型を用いてもよい。好適なハムスター細胞の例として、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）２１またはＨＫＣＣ（ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）と呼ばれる細胞株が挙げられる。好適なサル細胞には、たとえば、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞株と同様の腎細胞として、アフリカミドリザル細胞などがある。好適なイヌ細胞は、たとえば、ＭＤＣＫ細胞株などの腎細胞である。したがって、好適な細胞株には：ＭＤＣＫ；ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ベロ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８等があるが、これに限定されるものではない。哺乳動物細胞を用いることは、ワクチンに、ニワトリのＤＮＡばかりでなく卵タンパク質（オボアルブミンおよびオボムコイドなど）が含まれない可能性があり、それによりアレルゲン性が低下することを意味する。
【００５３】
インフルエンザウイルスを増殖させる好ましい哺乳動物細胞株には：マディンダービー（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［３０−３３］；アフリカミドリザル（サバンナモンキー）腎臓由来のベロ細胞［３４−３６］；またはヒト網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［３７］がある。これらの細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）［３８］、コーリエルセルレポジトリーズ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）［３９］またはヨーロピアンコレクションオブセルカルチャーズ（ＥＣＡＣＣ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）などから一般に入手することができる。たとえば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で種々様々なベロ細胞を、カタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を提供している。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０でＥＣＡＣＣから入手可能である。哺乳動物細胞株に代わる方法として、ウイルスを、鳥胚性幹細胞［４０、４３］およびアヒル（アヒル網膜など）または雌鶏由来の細胞株など、鳥細胞株で増殖させてもよい［たとえば、参考文献４０−４２］。好適な鳥胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞であるＥＢ４５、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４由来のＥＢｘ細胞株がある［４４］。また、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ：ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）などを用いてもよい。
【００５４】
インフルエンザウイルスを増殖させる最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。ＭＤＣＫの起源細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手できるが、この細胞株の誘導体を用いても構わない。たとえば、参考文献３０は、懸濁培養液での増殖に適合されたＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託されている「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）を開示している。参考文献４５も同様に、無血清培養液に加えた懸濁液中で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託されている「Ｂ−７０２」）を開示している。参考文献４６は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）など、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞を開示している。参考文献４７は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）などの感染に対して高感受性を有するＭＤＣＫ細胞株を開示している。こうしたＭＤＣＫ細胞株のどれを使用しても構わない。
【００５５】
細胞増殖用の培養液ならびに培養の開始に用いるウイルス接種物は、好ましくは単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルスおよび／またはパルボウイルスを含まない（すなわち、これらのウイルスについて混入試験を行ってもその結果が陰性になる）［４８］。単純ヘルペスウイルスが存在しないことは特に好ましい。
【００５６】
ウイルスを、懸濁液［３０、４９、５０］または接着培養液中の細胞で増殖させてもよい。一実施形態では、細胞を懸濁液中の増殖に適応させてもよい。懸濁培養液中の増殖に適応する好適なＭＤＣＫ細胞株の１つは、ＭＤＣＫ３３０１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託）である。代替方法として、マイクロキャリア培養を用いることもできる。
【００５７】
インフルエンザウイルスの複製を支持する細胞株については、好ましくは無血清培地および／または無タンパク質培地で増殖させる。本発明において、培地とは、ヒトまたは動物由来の血清から得られる添加物を含まない無血清培地をいう。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物および無血清タンパク質がなくても細胞の分裂増殖が起こる培養液という意味で解釈されるものであるが、任意にトリプシンまたはウイルス増殖に必要な場合がある他のプロテアーゼなどのタンパク質を含んでもよい。当然のことながら、こうした培養液中で増殖する細胞は、それ自体タンパク質を含むものである。
【００５８】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞株については、ウイルス複製の過程で好ましくは３７℃未満（３０〜３６℃など）で増殖させる［５１］。
【００５９】
培養細胞でウイルスを増殖させる方法は通常、培養細胞に培養したい株を接種する工程と、その感染細胞を、たとえば、ウイルス力価または抗原発現などを基準に望ましいと判定したウイルス増殖期間（接種後２４〜１６８時間など）培養する工程と、増殖したウイルスを回収する工程とを含むものである。培養細胞には、（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０で測定して）ウイルス対細胞の比が１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、一層好ましくは１：５０〜１：１０になるように接種する。ウイルスを細胞の懸濁液に加えるか、細胞の単層に付着させ、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で少なくとも６０分間、ただし、ほとんどの場合、３００分間未満、好ましくは９０〜２４０分間ウイルスを細胞で吸収させる。この感染細胞培養物（単層など）を、凍結融解あるいは酵素作用により除去して、回収する培養上清のウイルス含量を増加させてもよい。次いで、この回収した液体を不活化、あるいは、凍結保存する。培養細胞については、感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」）約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、一層好ましくは０．００１〜２で感染させてもよい。さらに一層好ましくは、細胞をｍ．ｏ．ｉ．約０．０１で感染させても構わない。感染細胞を、感染から３０〜６０時間後に回収することができる。好ましくは、感染から３４〜４８時間後に細胞を回収する。さらに一層好ましくは、感染から３８〜４０時間後に細胞を回収する。ウイルス放出を可能にするため、細胞培養の過程でプロテアーゼ（一般にトリプシン）を加えるのが一般的で、プロテアーゼについては、培養の過程で任意の好適な段階で加えて構わない。
【００６０】
現在、インフルエンザワクチンは通常、ＳＲＩＤ（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）で測定されるＨＡレベルを参照して標準化される。既存のワクチンは一般に、１株当たり約１５μｇのＨＡを含むが、投与量を減らして用いてもよい（アジュバントを用いる場合など）。投与量が多くなる場合（投与量が３倍または９倍など［５２、５３］）、１／２（すなわち、１株当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８といった分割投与が用いられている［６５、６６］。したがって、ワクチンは、インフルエンザ１株当たり０．１〜１５０μｇのＨＡ、たとえば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど、好ましくは０．１〜５０μｇのＨＡを含んでもよい。具体的な投与量として、たとえば、１株当たり約９０、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などが挙げられる。本発明のワクチン、キットおよびプロセスの成分（の量および濃度など）については、最終製品においてこうした抗原投与量が得られるように選択すればよい。濃縮バルクを所望の最終ＨＡ濃度に希釈する場合、非冷蔵状態で行ってもよい。
【００６１】
生ワクチンについては、ＨＡ含量ではなく５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０：ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ）で投与量を測定し、１株当たり１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）ＴＣＩＤ５０が一般的である。
【００６２】
本発明と一緒に用いるＨＡは、ウイルスに見られる天然のＨＡでもよいし、変性されていてもよい。たとえば、ＨＡを変性して、ウイルスが鳥種で高い病原性を示す原因となる決定因子（たとえば、ＨＡ１とＨＡ２に開裂する部位の周辺など、高塩基性領域）を除去することが知られている。除去しないと、この決定因子により、卵におけるウイルスの増殖が妨げられるためである。
【００６３】
本発明の組成物は、赤血球凝集素を含むばかりでなく、インフルエンザウイルスタンパク質をさらに含んでもよい。たとえば、本発明の組成物は一般に、ノイラミニダーゼ糖タンパク質を含む。本発明の組成物は、Ｍ１および／またはＭ２（またはこれらのフラグメント）および／または核タンパク質など、マトリックスタンパク質をさらに含んでも構わない。
【００６４】
いくつかの実施形態、特に（ａ）卵で増殖させたワクチンから抗原を調製する場合、（ｂ）ワクチンが不活化表面抗原ワクチンである場合、および／または（ｃ）ワクチンがチオメルサールを含む場合、本発明は、参考文献２に開示されている以下の３種類のワクチンと関連性がない：（ｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株およびＡ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８株を含む三価ワクチン；（ｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株およびＡ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株およびＢ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１２０／００株を含む三価ワクチン；または（ｉｉｉ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９  ＲＥＳＶＩＲ−１７  ｒｅａｓｓ．株およびＡ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  ＩＶＲ−１１６  ｒｅａｓｓ．株およびＢ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７株を含む三価ワクチン。
【００６５】
宿主細胞ＤＮＡ
細胞株でウイルスを増殖させる場合、ＤＮＡの任意の発癌活性を最小限にとどめるため、最終ワクチンの残留細胞株ＤＮＡの量を最小限に抑えるのが一般的である。したがって、この組成物が含む残留宿主細胞ＤＮＡは、１用量当たり好ましくは１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、一層好ましくは１００ｐｇ未満）であるが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在しても構わない。一般に、本発明の組成物から除外することが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。
【００６６】
現在、残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、生物学的製剤に関する一般的な規制要件であり、当業者の通常の技術の範囲内である。ＤＮＡの測定に用いるアッセイは一般に、検証済みアッセイである［５４、５５］。検証済みアッセイの性能特性については、数学的および定量的に記載することが可能であり、誤差が生じても原因が特定されることになる。アッセイについては通常、正確度、精度、特異性などの特性を検査する。アッセイのキャリブレーションを（宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量などを基準に）行い、アッセイの検査を行ったら、ＤＮＡの定量的測定を日常的に行うことができる。ＤＮＡの定量化には、サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［５６］；スレッシュホールド（商標）システム（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）などのイムノアッセイ法［５７］；および定量ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）［５８］という主に３つの技法を用いることができる。これらの方法はすべて、当業者にはよく知られているものだが、各方法の詳細な特性は、たとえば、ハイブリダイゼーション用のプローブの選択、増幅用のプライマーおよび／またはプローブの選択など、該当する宿主細胞によって異なることがある。モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製のスレッシュホールド（商標）システムは、全ＤＮＡをピコグラムレベルで定量するアッセイであり、生物学的製剤に混入したＤＮＡレベルのモニタリングに用いられている［５７］。通常のアッセイでは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）結合タンパク質、ウレアーゼコンジュゲート抗ｓｓＤＮＡ抗体とＤＮＡとの反応複合体が配列非特異的に形成される。アッセイの構成成分はすべて、製造者から入手することができるコンプリート総ＤＮＡアッセイキットに含まれている。残留宿主細胞ＤＮＡを検出する定量ＰＣＲアッセイについては、たとえば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）ラボラトリーサービスイズ（ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、バイオリライアンス（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ）（商標）、アルセアテクノロジー（Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）など、様々なメーカーが提供している。ヒトウイルスワクチンにおける宿主細胞ＤＮＡ混入の測定に関する化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと総ＤＮＡスレッシュホールド（商標）システムとの比較については、参考文献５９で確認することができる。
【００６７】
混入ＤＮＡについては、たとえば、クロマトグラフィーなどの標準的な精製手続きを用いてワクチンの調製中に除去することができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去を、たとえば、デオキシリボヌクレアーゼを用いたヌクレアーゼ処理により促進させてもよい。宿主細胞ＤＮＡの混入を抑える簡便な方法については、参考文献６０および６１に開示されており、最初にウイルス増殖の過程で使用してもよいデオキシリボヌクレアーゼ（ベンゾナーゼなど）、次いでビリオン破壊の過程で使用してもよい陽イオン界面活性剤（ＣＴＡＢなど）を用いる２工程処理などがある。β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤による処理に関しても、宿主細胞ＤＮＡの除去に用いてよく、さらに、ビリオンの不活化に用いても都合がよい場合がある［６２］。
【００６８】
ワクチンに含まれる宿主細胞ＤＮＡは、赤血球凝集素１５μｇ当たり＜１０ｎｇ（＜１ｎｇ、＜１００ｐｇなど）であり、容量０．２５ｍｌ当たりでは、＜１０ｎｇ（＜１ｎｇ、＜１００ｐｇなど）で宿主細胞ＤＮＡを含むことが好ましい。ワクチンに含まれる宿主細胞ＤＮＡは、赤血球凝集素５０μｇ当たり＜１０ｎｇ（＜１ｎｇ、＜１００ｐｇなど）であり、容量０．５ｍｌ当たりでは、＜１０ｎｇ（＜１ｎｇ、＜１００ｐｇなど）で宿主細胞ＤＮＡを含むことが一層好ましい。
【００６９】
保管状態および輸送
ワクチンまたは抗原組成物を冷蔵されていない（または、同様の表現）という場合、ワクチンまたは抗原組成物が≦８℃の温度になるような条件下で保管されていないことをいう。したがって、組成物を一時的に冷蔵庫に入れても、全体の温度が８℃以下まで低下するほど時間が十分に長くない場合、この組成物は、冷蔵されていないものである。しかしながら、好ましい実施形態では、短い期間でも、本発明を任意の冷蔵状態に付さなくてもよい。
【００７０】
本発明が２つの場所間の輸送を含む場合、２つの場所は、好ましくはｎキロメートル超離れており、ｎは、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、１００あるいはそれ以上から選択される。
【００７１】
組成物を１０℃超で保管する場合、≧１１℃、≧１２℃、≧１３℃、≧１４℃、≧１５℃、≧１６℃、≧１７℃、≧１８℃、≧１９℃、≧２０℃、≧２１℃、≧２２℃、≧２３℃、≧２４℃で保管してもよい。組成物は一般に、４０℃未満、たとえば、≦３９℃、≦３８℃、≦３７℃、≦３６℃、≦３５℃、≦３４℃、≦３３℃、≦３２℃、≦３１℃、≦３０℃、≦２９℃、≦２８℃、≦２７℃、≦２６℃で保管する。標準的な保管温度は、室温、たとえば１８℃〜２３℃、２０±１℃などである。
【００７２】
組成物を１０週間を超えて非冷蔵状態で保管する場合、≧１１週間、≧１２週間、≧１３週間、≧１４週間、≧１５週間、≧１６週間、≧１７週間、≧１８週間、≧１９週間、≧２０週間、≧２５週間、≧２６週間、≧３０週間、≧３５週間、≧４０週間保管してもよい。保管は、１年間未満が通例である。
【００７３】
直接の光を避けて、たとえば暗所でワクチンを保管してもよい。
【００７４】
ワクチンの赤血球凝集素の分解率が１株当たり年間３３％未満である場合、分解率は、好ましくは≦３２％、≦３１％、≦３０％、≦２９％、≦２８％、≦２７％、≦２６％、≦２５％、≦２４％、≦２３％、≦２２％、≦２１％、≦２０％、≦１９％、≦１８％、≦１７％、≦１６％、≦１５％、≦１４％、≦１３％、≦１２％、≦１１％、≦１０％、≦９％、≦８％、≦７％、≦６％、≦５％あるいはそれよりも低いことが好ましい。分解率については、好ましくは「安定性試験ガイドライン（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」というＩＣＨ（日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ））のガイドラインＱ１Ａ（Ｒ２）により、関連する統計解析を含めて測定する。
【００７５】
アジュバント
本発明の組成物は、組成物を投与される患者に起こる免疫反応（体液性および／または細胞性）を増強する働きをするアジュバントを含むと都合がよいことがある。インフルエンザワクチンと一緒にアジュバントを用いることは、すでに記載されている。参考文献６３および６４では、水酸化アルミニウムが使用され、参考文献６５では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの混合物が使用された。参考文献６６にも、アルミニウム塩アジュバントの使用が記載された。カイロンワクチンズ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）社製のＦＬＵＡＤ（商標）は、水中油型エマルジョンを含むものである。
【００７６】
本発明に用いることができるアジュバントは、以下を含むが、これに限定されるものではない：
・  カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはこれらの混合物）などのミネラル含有組成物。カルシウム塩は、リン酸カルシウム（参考文献６７に開示されている「ＣＡＰ（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」粒子など）を含む。アルミニウム塩は、任意の好適な形態（たとえば、ゲル、結晶、非結晶など）をとっている水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などの塩を含む。こうした塩への吸着は、好ましいものである。ミネラル含有組成物は、金属塩の粒子として調製されても構わない［６８］。アルミニウム塩アジュバントに関しては、以下に詳細に記載する。
【００７７】
・  サイトカイン誘導剤（より詳細には以下を参照のこと）。
【００７８】
・  サポニン［参考文献１０４の第２２章］。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根および花でも確認されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。バラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から得られるサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、スミラックスオルナタ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、ギプソフィラパニクラタ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブリデスベイル（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））およびサポナリアオフィシアナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（ソープルート（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））由来の市販品も入手できる。サポニンアジュバント製剤は、ＱＳ２１などの精製製剤ならびにＩＳＣＯＭ（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）などの脂質製剤を含むものである。ＱＳ２１は、スティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（商標）として販売されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｈａｓｅ−ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製されている。こうした技法を用いて精製された特定の画分として、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃなどが確認されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の製造方法は、参考文献６９に開示されている。Ｑｕｉｌ  Ａの画分Ａに関しては、他の少なくとも１種のアジュバントと一緒に用いることができる［７０］。サポニン製剤は、コレステロールなどのステロールをさらに含んでもよい［７１］。サポニンとコレステロールの組み合わせを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成してもよい［参考文献１０４の第２３章］。また、ＩＳＣＯＭは一般に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含むものである。ＩＳＣＯＭには、任意の既知のサポニンを用いることができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種または複数種を含むものである。ＩＳＣＯＭは、参考文献７１−７３に詳細に記載されている。任意に、ＩＳＣＯＭは、さらなる洗浄剤を有していなくてもよい［７４］。各複合体が本質的に１種のサポニン画分を含む、少なくとも２種類のＩＳＣＯＭ複合体の混合物を用いてもよく、この複合体は、ＩＳＣＯＭ複合体またはＩＳＣＯＭマトリックス複合体である［７５］。サポニンベースのアジュバント開発に関する概説については、参考文献７６および７７で確認することができる。
【００７９】
・  脂肪性アジュバント（より詳細には以下を参照のこと）。
【００８０】
・  細菌性ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）リボシル化毒素（大腸菌易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」または百日咳毒素「ＰＴ」など）およびその解毒化誘導体である、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２と呼ばれる変異体毒素など［７８］。解毒化ＡＤＰリボシル化毒素を粘膜アジュバントとして用いることは、参考文献７９に、非経口アジュバントとして用いることは、参考文献８０に記載されている。
【００８１】
・  エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［８１］またはキトサンおよびその誘導体［８２］などの生体接着剤および粘膜接着剤。
【００８２】
・  生体内分解性かつ無毒性の材料（たとえば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微小粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、一層好ましくは直径が約２００ｎｍ〜約３０μｍまたは直径が約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）。任意に、表面が（ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅなどにより）負に、または（たとえば、陽イオン界面活性剤、ＣＴＡＢなどにより）正に帯電するように処理されたポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい。
【００８３】
・  リポソーム（参考文献１０４の第１３章および第１４章）。アジュバントとして使用するのに好適なリポソーム製剤の例は、参考文献８３−８５に記載されている。
【００８４】
・  水中油型エマルジョン（より詳細には以下を参照のこと）。
【００８５】
・  ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［８６］。こうした製剤は、オクトキシノールとの併用でポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［８７］、さらにはオクトキシノールなどの少なくとも１種の別の非イオン界面活性剤との併用でポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤をさらに含むものである［８８］。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレト９（ｌａｕｒｅｔｈ  ９））、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシテイレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルからなる群から選択される。
【００８６】
・  Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」すなわち「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ」（商標））、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）などのムラミルペプチド。
【００８７】
・  第１のグラム陰性菌から調製される外膜タンパク質プロテオソーム調製物と第２のグラム陰性菌由来のリポサッカリド調製物との組み合わせ。この外膜タンパク質プロテオソーム調製物とリポサッカリド調製物は、安定な共有結合アジュバント複合体を形成する。こうした複合体として、髄膜炎菌外膜タンパク質およびリポポリサッカリドからなる複合体「ＴＶＸ−９０８」がある。これらの複合体は、インフルエンザワクチンのアジュバントとして用いられている［８９］。
【００８８】
・  メチルイノシン  ５’−モノホスファート（「ＭＩＭＰ」）［９０］。
【００８９】
・  以下の式を持つ化合物のようなポリヒドロキスル化ピロリジジン化合物［９１］：
【００９０】
【化１】
2009534303.tif 000003
式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝、非置換または置換、飽和または不飽和のアシル基、アルキル基（シクロアルキル基など）、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基またはこれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む群からから選択される。例として、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどがあるが、これに限定されるものではない。
【００９１】
・  γイヌリン［９２］またはアルガンムリンなどのその誘導体。
【００９２】
・  α−グリコシルセラミド、たとえばα−ガラクトシルセラミドなどのＣＤ１ｄリガンド。
【００９３】
これらおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献１０４および１０５に詳細に記載されている。
【００９４】
組成物は、２種以上の該アジュバントを含んでも構わない。たとえば、組成物は、水中油型エマルジョンとサイトカイン誘導剤との両方を含むと都合がよいことがある。これは、その組み合わせが、インフルエンザワクチンにより引き起こされるインターフェロンγ反応などのサイトカイン反応を高めるためであり、改善の程度は、水中油型エマルジョンまたはサイトカイン誘導剤を単独で使用する場合に比べてはるかに大きい。
【００９５】
組成物中の抗原およびアジュバントは一般に、混合状態にある。
【００９６】
ワクチンがアジュバントを含む場合、ワクチンの分配時に即座に調製してもよい。したがって、本発明は、すぐに混合できるように抗原およびアジュバントの成分を含むキットを提供する。キットを用いれば、アジュバントおよび抗原を使用時まで別々に保管することができる。キット内の成分は、互いに物理的に切り離されているため、様々な方法で分けておくことができる。たとえば、この２つの成分をバイアルなど、２つの容器に入れておいてもよい。その後、２つのバイアルの内容物については、たとえば、一方のバイアルの内容物を取り出してこれを他方のバイアルに加えて、あるいは、２つのバイアルの内容物を別々に取り出して第３の容器で混合することで、混合しても構わない。好ましい構成では、キット成分の一方をシリンジに入れておき、他方をバイアルなどの容器に入れておく。シリンジを用いて（針などにより）内容物を第２の容器に挿入して混合し、次いでこの混合物をシリンジに移してもよい。その後、この混合したシリンジの内容物を、一般には新しい無菌の注射針で患者に投与してもよい。１成分を１本のシリンジに充填すれば、患者への投与に際し別のシリンジを使用する必要がなくなる。別の好ましい構成は、キットの２つの成分を一緒に保管するものだが、たとえば、参考文献９３−１００等で開示されているようなデュアルチャンバーシリンジなど、同じシリンジ中で別々になっている。シリンジを操作する際（患者に投与する間など）に、２つのチャンバーの内容物を混合する。このように構成すれば、使用時に別の混合工程を行う必要がなくなる。
【００９７】
水中油型エマルジョンアジュバント
水中油型エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンのアジュバントとして用いるのに特に好適であることが明らかにされている。様々な水中油型エマルジョンが知られており、これらは一般に、少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤を含み、油（類）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は通常、直径が５μｍ未満であり、サブミクロンであることもあるが、こうした小さなサイズはマイクロフルイダイザーにより実現され、安定なエマルジョンが得られる。濾過滅菌に付すことができるため、液滴のサイズは、２２０ｎｍ未満であることが好ましい。
【００９８】
本発明を、動物（魚など）性油または植物性油などの油と一緒に用いてもよい。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀物が挙げられる。最も一般的に入手可能な堅果油として、落花生油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が挙げられる。たとえば、ホホバ豆から得られるホホバ油を用いてもよい。種油には、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油および同種ものがある。穀物群では、コーン油が最も入手しやすいが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、米、テフ、ライコムギおよび同種ものなど、他の穀物油を用いてもよい。炭素数６〜１０個の、グリセリンおよび１，２−プロパンジオールの脂肪酸エステルについては、種油においては天然に存在しないものだが、堅果油および種油を出発物質として適切な材料を加水分解、分離およびエステル化することで調製することができる。哺乳類の乳の脂肪および油は、代謝可能であるため、本発明の実施に際して用いてもよい。動物供給源から純粋な油を得るうえで必要な分離、精製、鹸化および他の手段の手順については、当該技術分野において周知である。大部分の魚は、容易に回収できる代謝可能な油を含む。本明細書で使用可能な魚油の一部として、たとえば、タラ肝油、サメ肝油および鯨蝋などの鯨油が挙げられる。分枝鎖油の多くは、炭素数５個のイソプレンを単位として生化学的に合成され、通常、テルペノイドと呼ばれている。サメ肝油は、本明細書に特に好ましいスクアレンと呼ばれる分枝鎖不飽和テルペノイドである２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含む。スクアレンの飽和アナログであるスクアランも、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランなどの魚油については、商業的供給源から容易に入手できるか、当該技術分野において公知の方法により得ることができる。これ以外の好ましい油として、トコフェロールがある（以下を参照のこと）。油の混合物を用いてもよい。
【００９９】
界面活性剤については、「ＨＬＢ」（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ：親水性親油性バランス）で分類することもできる。本発明の好ましい界面活性剤は、ＨＬＢが少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、一層好ましくは少なくとも１６である。本発明を、以下の界面活性剤と一緒に用いてもよいが、これに限定されるものではない：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にトウィーンと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＥＯ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）／ＰＯ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）線状ブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸ（商標）という商品名で販売されている酸化エチレン（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ：ｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）のコポリマー；反復基であるエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）の数が異なってもよいオクトキシノール（特にオクトキシノール−９（トリトンＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が注目される）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ブリジ３０）など、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコール（ブリジ（Ｂｒｉｊ）界面活性剤と呼ばれる）から得られるポリオキシエチレン脂肪エーテル；ソルビタントリオレアート（スパン８５（Ｓｐａｎ  ８５））およびソルビタンモノラウラートなどのソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮと呼ばれる）。エマルジョンに加える好ましい界面活性剤は、トウィーン８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、スパン８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびトリトンＸ−１００である。上記のように、トウィーン８０などの洗浄剤は、以下の実施例に見られる熱安定性に寄与する可能性がある。
【０１００】
トウィーン８０／スパン８５の混合物など、界面活性剤の混合物を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（トウィーン８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルとｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）などのオクトキシノールとの組み合わせも、好適なものである。別の有用な組み合わせには、ラウレト９にポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを加えたものがある。
【０１０１】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（トウィーン８０など）０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（トリトンＸ−１００またはトリトンシリーズの他の洗浄剤など）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレト９など）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。
【０１０２】
本発明に有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、以下を含むが、これに限定されるものではない：
・  スクアレンと、トウィーン８０と、スパン８５とのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの体積組成は、スクアレンが約５％、ポリソルベート８０が約０．５％およびスパン８５が約０．５％であってもよい。これら比率を、重量で見ると、スクアレンが４．３％、ポリソルベート８０が０．５％およびスパン８５が０．４８％になる。このアジュバントは、参考文献１０４の第１０章および参考文献１０５の第１２章に詳細に記載されているように「ＭＦ５９」［１０１−１０３］と呼ばれている。ＭＦ５９エマルジョンは、シトラートイオン、たとえば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含んでいると都合がよい。
【０１０３】
・  スクアレンと、トコフェロールと、トウィーン８０のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含んでもよい。さらに、スパン８５（１％など）および／またはレシチンを含んでも構わない。これらのエマルジョンは、スクアレンを２〜１０％、トコフェロールを２〜１０％、トウィーン８０を０．３〜３％で含んでいてもよいが、エマルジョンがより安定するため、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは≦１である。スクアレンおよびトウィーン８０は、体積比約５：２で存在してもよい。こうしたエマルジョンの１つを、トウィーン８０をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）に溶解して２％溶液を得て、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレンの）混合物と混合し、その後、この混合物をマイクロフルイダイズすることで製造することができる。得られたエマルジョンは、たとえば、平均直径が１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍであるサブミクロンの油滴を含んでもよい。
【０１０４】
・  スクアレンと、トコフェロールと、トリトン洗浄剤（トリトンＸ−１００など）とのエマルジョン。このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）（以下を参照のこと）を含んでもよい。このエマルジョンは、リン酸緩衝液を含んでも構わない。
【０１０５】
・  ポリソルベート（ポリソルベート８０など）と、トリトン洗浄剤（トリトンＸ−１００など）と、トコフェロール（α−トコフェロールスクシナートなど）とを含むエマルジョン。このエマルジョンは、これら３つの成分を質量比約７５：１１：１０（７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌトリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌα−トコフェロールスクシナートなど）で含んでもよいが、これらの成分で抗原由来のものがあれば、その分もこの濃度に含めるべきである。このエマルジョンは、スクアレンを含んでもよい。このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（以下を参照のこと）を含んでも構わない。この水相は、リン酸緩衝液を含んでもよい。
【０１０６】
・  スクアランと、ポリソルベート８０と、ポロキサマー４０１とのエマルジョン（「プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（商標）Ｌ１２１」）。このエマルジョンについては、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で製剤化してもよい。このエマルジョンは、ムラミルペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントに加えたトレオニル−ＭＤＰと一緒に用いられている［１０６］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％プルロニックＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。また、このエマルジョンを、「ＡＦ」アジュバントの場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを使用せずに用いてもよい［１０７］（５％スクアラン、１．２５％プルロニックＬ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。マイクロフルイダイズすることが好ましい。
【０１０７】
・  油を０．５〜５０％、リン脂質を０．１〜１０％、非イオン界面活性剤を０．０５〜５％で含むエマルジョン。参考文献１０８に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。液滴の大きさはサブミクロンであると都合がよい。
【０１０８】
・  代謝不可能な油（ライトミネラルオイルなど）と少なくとも１種の界面活性剤（レシチン、トウィーン８０またはスパン８０など）とのサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−リポフィルコンジュゲート（グルクロン酸のカルボキシル基を介して脂肪族アミンをデサシルサポニンに加えて製造する、参考文献１０９に記載のＧＰＩ−０１００など）、ジメチイジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなど、添加物を含んでもよい。
【０１０９】
・  鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン性親水性界面活性剤（エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど）を含むエマルジョン［１１０］。
【０１１０】
・  鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン性親油性界面活性剤（エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど）を含むエマルジョン［１１０］。
【０１１１】
・  サポニン（ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１など）とステロール（コレステロールなど）とが、らせん状ミセルとして存在しているエマルジョン［１１１］。
【０１１２】
エマルジョンについては、分配時に即座に抗原と混合してもよい。したがって、包装されたワクチンまたは分配されたワクチンでは、使用時にすぐに最終製剤にしやすいようにして、アジュバントおよび抗原を別々に保管してもよい。抗原は通常、液状であるため、２種類の液体を混合して、ワクチンの最終的な調製を行う。混合する２種類の液体の体積比は、異なってもよい（５：１および１：５など）が、通常は約１：１である。
【０１１３】
抗原とアジュバントの混合後、赤血球凝集素抗原は通常、水溶液の状態のままであるが、油／水界面の周辺に移動することがある。一般に、赤血球凝集素がエマルジョンの油相に入り込むことがあっても、わずかである。
【０１１４】
組成物がトコフェロールを含む場合、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、ε−トコフェロールまたはξ−トコフェロールのうちどれを用いてもよいが、α−トコフェロールが好ましいものである。トコフェロールは、様々な塩および／または異性体など、複数の形態をとることができる。塩としては、スクシナート、アセタート、ニコチナートなどの有機塩がある。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールについては、どちらも用いることができる。高齢患者（６０歳以上など）に用いる場合、ビタミンＥがこの患者群の免疫反応を促進すると報告されているため、ワクチンにトコフェロールを加えると都合がよい［１１２］。また、トコフェロールには、エマルジョンの安定化に役立つ可能性がある酸化防止剤特性もある［１１３］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、スクシナートである。スクシナート塩は、インビボでＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）関連リガンドと協同的に作用することが確認されている。加えて、α−トコフェロールスクシナートは、インフルエンザワクチンとの適合性があり、水銀化合物の代替として有用な保存剤であることも知られている［１１］。
【０１１５】
サイトカイン誘導剤
本発明の組成物に加えるサイトカイン誘導剤は、患者に投与する際に、免疫系にインターフェロンおよびインターロイキンなどのサイトカインの放出を誘発する作用がある。サイトカイン反応は、インフルエンザ感染に対する宿主防御の初期段階および決定的な段階に関与していることが分かっている［１１４］。好ましい薬剤は：インターフェロンγ；インターロイキン−１；インターロイキン−２；インターロイキン−１２；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；およびＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のうち１つまたは複数の放出を誘発する作用がある。好ましい薬剤は、インターフェロンγ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−２など、Ｔｈ１型免疫反応と関係するサイトカインの放出を誘発する。インターフェロンγとインターロイキン−２をともに刺激することが好ましい。
【０１１６】
したがって、本発明の組成物の投与の結果、患者のＴ細胞は、インフルエンザ抗原により刺激を受けると、抗原特異的に所望のサイトカイン（類）を放出する。たとえば、患者の血液から精製されたＴ細胞は、インビトロでインフルエンザウイルス赤血球凝集素に曝露されると、γ−インターフェロンを放出する。末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）においてこうした反応を測定する方法は、当該技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＰＯＴ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）、フローサイトメトリーおよびリアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）が挙げられる。たとえば、参考文献１１５では１つの研究が報告されている。その中で、破傷風トキソイドに対するＴ細胞による抗原特異的免疫反応、特にγ−インターフェロン反応をモニターし、ＴＴ（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）による抗原特異的反応と自然反応とを識別するには、ＥＬＩＳＰＯＴが最も高感度な方法である一方、再刺激の作用を検出には、フローサイトメトリーによる細胞質内サイトカインの検出が、最も効果的な方法であることが分かった。
【０１１７】
好適なサイトカイン誘導剤には、以下があるが、これに限定されるものではない：
・  ＣｐＧモチーフ（グアノシンに結合したリン酸に連結している非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡまたはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドなど、免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【０１１８】
・  ３−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「ＭＰＬ（商標）」とも呼ばれる「３ｄＭＰＬ」）［１１６−１１９］。
【０１１９】
・  イミキモド（「Ｒ−８３７」）、レシキモド（「Ｒ−８４８」）［１２２］およびこれらのアナログなどのイミダゾキノリン化合物［１２０、１２１］；およびその塩（ヒドロクロリド塩など）。免疫刺激イミダゾキノリンに関する詳細については、参考文献１２３−１２７で確認できる。
【０１２０】
・  参考文献１２８に開示されているようなチオセミカルバゾン化合物。この活性化合物を製剤化、製造およびスクリーニングする方法に関しても、参考文献１２８に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生するヒト末梢血単核球の刺激には特に効果的である。
【０１２１】
・  参考文献１２９に開示されているようなトリプタントリン化合物。この活性化合物を製剤化、製造およびスクリーニングする方法に関しても、参考文献１２９に記載されている。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血単核球を刺激してＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生するには特に効果的である。
【０１２２】
・  以下のようなヌクレオシドアナログ：（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１２３】
【化２】
2009534303.tif 000004
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１３０−１３２に開示されている化合物；（ｆ）以下の式を持つ化合物であって：
【０１２４】
【化３】
2009534303.tif 000005
式中：
Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルキルまたは置換Ｃ１〜６アルキルであり；
Ｒ３は、存在しないか、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は各々独立に、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキルであるか、あるいは結合してＲ４〜５のような５員環を形成し：
【０１２５】
【化４】
2009534303.tif 000006
この結合は
【０１２６】
【化５】
2009534303.tif 000007
で示す結合で行われ
Ｘ１およびＸ２は各々独立に、Ｎ、Ｃ、ＯまたはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ９ａであり、
式中、Ｒ９ａは：
【０１２７】
【化６】
2009534303.tif 000008
この結合は
【０１２８】
【化７】
2009534303.tif 000009
で示す結合で行われ
Ｒ１０およびＲ１１は各々独立に、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＲａＲｂまたは−ＯＨであり；
各ＲａおよびＲｂは独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６〜１０アリールであり；
各ＲＣは独立に、Ｈ、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、Ｃ１〜６アルキルまたは置換Ｃ１〜６アルキルであり；
各Ｒｄは独立に、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ６〜１０アリールまたはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリルまたは置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、リン酸塩、二リン酸塩または三リン酸塩であり；
各ｎは独立に、０、１、２または３であり；
各ｐは独立に、０、１または２である、化合物；
または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体または互変異性体の薬学的に許容される塩。
【０１２９】
・  ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１３３］。
【０１３０】
・  以下のような参考文献１３４に開示されている化合物：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ：ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ：ａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｏｎｅ）化合物［１３５、１３６］、ヒドラプタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１３７］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物およびベンゾアゾール化合物［１３８］。
【０１３１】
・  ポリオキシドニウムポリマー［１３９、１４０］または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【０１３２】
・  参考文献１４１に開示されている化合物。
【０１３３】
・  ＲＣ−５２９などのアミノアルキルグルコサミニドホスファート誘導体［１４２、１４３］。
【０１３４】
・  α−グリコシルセラミド（α−ガラクトシルセラミドなど）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなどのＣＤ１ｄリガンド［１４４−１５１］。
【０１３５】
・  たとえば、参考文献１５２および１５３に記載されているようなポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ：ｐｏｌｙ［ｄｉ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ］」）などのホスファゼン。
【０１３６】
・  以下のような小分子免疫賦活剤（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセタート
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【０１３７】
本発明に用いるサイトカイン誘導剤は、トール様受容体（ＴＬＲ：Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストであってもよい。たとえば、このサイトカイン誘導剤は、ヒトＴＬＲ１タンパク質、ヒトＴＬＲ２タンパク質、ヒトＴＬＲ３タンパク質、ヒトＴＬＲ４タンパク質、ヒトＴＬＲ７タンパク質、ヒトＴＬＲ８タンパク質および／またはヒトＴＬＲ９タンパク質の１つまたは複数のアゴニストでも構わない。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７（イミダゾキノリンなど）および／またはＴＬＲ９（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）のアゴニストである。これらの薬剤は、先天性免疫経路を活性化するうえで有用である。
【０１３８】
サイトカイン誘導剤については、組成物の製造における様々な段階で組成物に加えることができる。たとえば、サイトカイン誘導剤は、抗原組成物中に存在してもよく、その後、この混合物を水中油型エマルジョンに加えてもよい。代替方法として、サイトカイン誘導剤は、水中油型エマルジョン中に存在してもよく、この場合、この薬剤を乳化前にエマルジョン成分に加えてもよいし、あるいは、乳化後にエマルジョンに加えても構わない。同様に、この薬剤を、エマルジョン液滴中でコアセルベート化してもよい。最終組成物中のサイトカイン誘導剤の位置および分布は、その親水性／親油性特性によって異なり、たとえば、この薬剤は、水相、油相および／または油−水界面に位置することがある。
【０１３９】
サイトカイン誘導剤を、抗原（たとえば、ＣＲＭ１９７）など、別の薬剤にコンジュゲートしてもよい。小分子のコンジュゲーション技法に関する一般的な概説は、参考文献１５４に記載されている。代替方法として、このアジュバントを、疎水性相互作用またはイオン相互作用などにより、追加の薬剤に非共有結合させることもできる。
【０１４０】
好ましいサイトカイン誘導剤は、（ａ）免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）３ｄＭＰＬの２種類である。
【０１４１】
免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオネート修飾体などのヌクレオチド修飾体／アナログを含んでもよく、二本鎖または（ＲＮＡを除く）一本鎖であってもよい。参考文献１５５、１５６および１５７は、あり得べきアナログ置換、たとえば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント作用については、参考文献１５８−１６３にさらに記載されている。ＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴモチーフなどのＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９を指向してもよい［１６４］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：オリゴデオキシヌクレオチド）など、Ｔｈ１免疫反応の誘導に特異的であってもよいし、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど、Ｂ細胞反応の誘導に一層特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１６５−１６７で論じられている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体に認識されやすいように構築される。任意に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を３’末端で結合して「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成してもよい。たとえば、参考文献１６４および１６８−１７０を参照されたい。有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ７９０９であり、プロミューン（ＰｒｏＭｕｎｅ）（商標）（コリーファーマシューティカルグループインク（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．））とも呼ばれている。
【０１４２】
ＣｐＧ配列の使用に代わる方法として、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列を用いてもよい［１７１］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくても構わない。
【０１４３】
免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであってもよい。たとえば、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、２つ以上の連続したチミジンヌクレオチド（参考文献１７１に開示されているようなＴＴＴＴなど）を含んでもよく、および／またはチミジンが＞２５％（たとえば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成物を含んでもよい。たとえば、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、２つ以上の連続したシトシンヌクレオチド（たとえば、参考文献１７１に開示されているようなＣＣＣＣなど）を含んでもよく、および／またはシトシンが＞２５％（たとえば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成物を含んでもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくても構わない。
【０１４４】
免疫刺激オリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも２０ヌクレオチドを含むものである。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１００個未満のヌクレオチドを含んでもよい。
【０１４５】
３ｄＭＰＬ（３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デサシル−４’−モノホスホリル脂質Ａとも呼ばれる）は、モノホスホリル脂質Ａの還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されているアジュバントである。３ｄＭＰＬは、サルモネラミネソタのヘプトースを含まない変異体から調製されており、化学的には脂質Ａと類似しているが、酸不安定ホスホリル基および塩基不安定アシル基を欠いている。３ｄＭＰＬは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦなど、複数のサイトカインの放出を刺激する作用がある（参考文献１７２も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製に関しては、参考文献１７３に最初に記載された。
【０１４６】
３ｄＭＰＬは、関連分子の混合物の形をとるものであり、アシル化により変化しても構わない（たとえば、長さが異なってもよい３、４、５または６つのアシル鎖を持つ）。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとも呼ばれる）単糖が、２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、さらに、３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を持つ。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を持つ。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を持つ。代表的な構造は、以下である：
【０１４７】
【化８】
2009534303.tif 000010
基Ｒ１、基Ｒ２および基Ｒ３は各々独立に、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは８〜１６、一層好ましくは９〜１２、最も好ましくは１０である。
【０１４８】
基Ｒ１’、基Ｒ２’および基Ｒ３’は各々独立に：（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であってもよく、式中、Ｒ４は、−Ｈあるいは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、式中、ｍの値は、好ましくは８〜１６、一層好ましくは１０、１２または１４である。ｍは、２位では、好ましくは１４である。ｍは、２’位では、好ましくは１０である。ｍは、３’位では、好ましくは１２である。したがって、基Ｒ１’、基Ｒ２’および基Ｒ３’は、好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【０１４９】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬのアシル鎖は、３つだけになる（２位、２’位および３’位に各々１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つだけが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬのアシル鎖は、４つであってもよい。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つだけが−Ｈである場合、３ｄＭＰＬのアシル鎖は、５つであってもよい。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈでない場合、３ｄＭＰＬのアシル鎖は、６つであってもよい。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を持つこれらの形態の混合物であってもよいが、混合物は、６つのアシル鎖を持つ３ｄＭＰＬを含み、特にヘキサアシル鎖形が３ｄＭＰＬ全体の少なくとも１０重量％、たとえば、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％あるいはそれ以上を占めるようにすると好ましい。６つのアシル鎖を持つ３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性のある形態であることが明らかになっている。
【０１５０】
したがって、本発明の組成物に加える３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、以下である：
【０１５１】
【化９】
2009534303.tif 000011
３ｄＭＰＬを混合物形態で用いる場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に関しては、混合物中の３ｄＭＰＬ種を合わせたものをいう。
【０１５２】
水性状態では、３ｄＭＰＬは、直径が＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍなど、大きさの異なるミセル凝集体またはミセル粒子を形成してもよい。これらのいずれかまたは両方を、本発明と一緒に用いてもよいが、通常のアッセイにより、よりよい粒子を選択してもよい。本発明の使用では、活性に優れているため、比較的小さい粒子（たとえば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液を与えるのに十分に小さい）が好ましい［１７４］。好ましい粒子は、平均直径が２２０ｎｍ未満、一層好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満であり、平均直径が１００ｎｍでも構わない。しかしながら、ほとんどの場合、平均直径は、５０ｎｍ以上になる。これらの粒子は、十分に小さいため、濾過滅菌に好適である。粒子直径については、粒子の平均直径を明らかにする動的光散乱の一般的な手法で判定することができる。粒子の直径がχｎｍとされる場合、通常、この平均値の周りに粒子分布があるが、粒子数で少なくとも５０％（≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％あるいはそれ以上など）は、直径がχ±２５％の範囲内になるであろう。
【０１５３】
３ｄＭＰＬを水中油型エマルジョンと併用すると都合がよいことがある。３ｄＭＰＬは、実質的にすべてエマルジョンの水相に存在する場合がある。
【０１５４】
３ｄＭＰＬを単独で用いてもよいし、さらに１種または複数種の別の化合物と併用してもよい。たとえば、３ｄＭＰＬは、ＱＳ２１サポニン［１７５］との併用（水中油型エマルジョンに添加［１７６］）、免疫刺激オリゴヌクレオチドとの併用、ＱＳ２１および免疫刺激オリゴヌクレオチドの両方との併用、リン酸アルミニウム［１７７］との併用、水酸化アルミニウム［１７８］との併用あるいはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方との併用が知られている。
【０１５５】
脂肪性アジュバント
本発明と一緒に用いてもよい脂肪性アジュバントは、上記の水中油型エマルジョンに加えて、たとえば、以下も含むものである：
・  以下の式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物またはその塩であって：
【０１５６】
【化１０】
2009534303.tif 000012
たとえば、以下のような’ＥＲ８０３０５８’、’ＥＲ８０３７３２’、’ＥＲ８０４０５３’、ＥＲ８０４０５８’、’ＥＲ８０４０５９’、’ＥＲ８０４４４２’、’ＥＲ８０４６８０’、’ＥＲ８０４７６４’、ＥＲ８０３０２２または’ＥＲ８０４０５７’など、参考文献１７９に明らかにされているような化合物またはその塩：
【０１５７】
【化１１】
2009534303.tif 000013
・  ＯＭ−１７４などの大腸菌由来の脂質Ａの誘導体（参考文献１８０および１８１に記載）。
【０１５８】
・  アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパンアミニウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「バクスフェクチン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）（商標）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパンアミニウムブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）など、陽イオン性脂質および（ほとんどの場合中性の）共脂質の製剤。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩を含む製剤は、好ましいものである［１８２］。
【０１５９】
・  ３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（上記を参照のこと）。
【０１６０】
・  ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４など、リン酸含有非環式骨格に結合した脂質を含む化合物［１８３、１８４］：
【０１６１】
【化１２】
2009534303.tif 000014
アルミニウム塩アジュバント
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムと呼ばれるアジュバントを用いてもよい。こうした名称は、便宜上用いられているが、慣習的なものにすぎず、どちらの名称も、含まれている実際の化学物質を正確に説明するものではない（たとえば、参考文献１０４の第９章を参照のこと）。本発明では、アジュバントとして一般に用いられているのであれば、どのような「水酸化（ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）」アジュバントあるいは「リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」アジュバントも使用することができる。
【０１６２】
「水酸化アルミニウム」と呼ばれるアジュバントは、ほとんどの場合、少なくとも一部が結晶のオキシ水酸化アルミニウム塩であるのが一般的である。オキシ水酸化アルミニウムに関しては、式ＡｌＯ（ＯＨ）で表すことができ、赤外（ＩＲ：ｉｎｆｒａｒｅｄ）分光法、特に１０７０ｃｍ−１での吸収バンドの存在および３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いショルダーにより、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３など、他のアルミニウム化合物との識別が可能である［参考文献１０４の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、回折バンドの半価幅（ＷＨＨ：ｗｉｄｔｈ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）に反映され、結晶性が不十分な粒子では、結晶子サイズがより小さいため、線の広幅化が大きくなる。ＷＨＨの増大にともない表面積が拡大し、アジュバントのＷＨＨ値が大きくなれば、抗原吸着能が高まると見られている。水酸化アルミニウムアジュバントの場合、（たとえば、透過型電子顕微鏡写真で確認されるような）繊維形態が通常である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩ（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）は一般に、約１１であり、すなわち、アジュバント自体は、生理的ｐＨで正の表面電荷を帯びている。水酸化アルミニウムアジュバントの吸着能は、ｐＨ７．４でＡｌ＋＋＋１ｍｇ当たり１．８〜２．６ｍｇタンパク質であることが報告されている。
【０１６３】
「リン酸アルミニウム」と呼ばれるアジュバントは一般に、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、さらに、少量の硫酸塩（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスファートスルファート）を含むものである。リン酸アルミニウムアジュバントについては、沈殿によって得られ、沈殿過程での反応条件および濃度が、塩におけるヒドロキシルへのリン酸の置換の度合いに影響を与える。ヒドロキシホスファートは通常、ＰＯ４／Ａｌのモル比が０．３〜１．２である。ヒドロキシル基の存在により、ヒドロキシホスファートを厳密なＡｌＰＯ４と識別することができる。たとえば、３１６４ｃｍ−１でのＩＲスペクトルバンド（２００℃まで加熱した場合など）から、ヒドロキシル構造の存在が示される［参考文献１０４の第９章］
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は通常、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、一層好ましくは０．９５±０．１であろう。リン酸アルミニウムは通常、無定形で、特にヒドロキシリン酸塩ではこれが顕著になる。典型的なアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４〜０．９２の無定形ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、１ｍｌ当たり０．６ｍｇのＡｌ３＋が含まれる。リン酸アルミニウムは通常、粒状（たとえば、透過型電子顕微鏡写真で確認されるような板状形態）である。粒子の標準的な直径は、抗原吸着後であれば０．５〜２０μｍ（約５〜１０μｍなど）の範囲である。リン酸アルミニウムアジュバントの吸着能は、ｐＨ７．４でＡｌ＋＋＋１ｍｇ当たり０．７〜１．５ｍｇタンパク質であることが報告されている。
【０１６４】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ＰＺＣ：ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｚｅｒｏ  ｃｈａｒｇｅ）は、ヒドロキシルへのリン酸の置換の度合いと逆の関係にあり、この置換の度合いは、塩を沈殿により調製する際に用いる反応条件および反応物の濃度によって異なることがある。また、ＰＺＣについても、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変える（リン酸の増加＝ＰＺＣの酸性化）、あるいは、ヒスチジン緩衝液などの緩衝液を加える（ＰＺＣの塩基化）と変化する。本発明に従って用いられるリン酸塩アルミニウムは通常、ＰＺＣが４．０〜７．０、一層好ましくは５．０〜６．５、たとえば、約５．７である。
【０１６５】
本発明の組成物の調製に用いるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（リン酸またはヒスチジンまたはトリス緩衝液など）を含むものであるが、緩衝液は、必ずしも必要ではない。懸濁液は、好ましくは無菌、かつ、パイロジェンフリーである。懸濁液は、水性遊離リン酸イオンを含んでもよく、たとえば、濃度１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、一層好ましくは約１０ｍＭで含む。さらに、懸濁液は、塩化ナトリウムを含んでも構わない。
【０１６６】
本発明は、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムとの混合物を用いてもよい［６５］。この場合、リン酸アルミニウムが水酸化物（ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）よりも多く、重量比で少なくとも２：１など、たとえば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等で存在しても構わない。
【０１６７】
患者に投与する組成物のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、たとえば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇで投与することが好ましい。
【０１６８】
アジュバント成分は、１種または複数種のアルミニウム塩アジュバントを含むばかりでなく、さらに１種または複数種のアジュバントまたは免疫刺激剤を含んでもよい。こうした追加成分には、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）および／または水中油型エマルジョンがあるが、これに限定されるものではない。３ｄ−ＭＰＬは、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−デサシル−４’−モノホスホリル脂質Ａとも呼ばれている。この名称は、モノホスホリル脂質Ａの還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されていること示す。３ｄ−ＭＰＬは、サルモネラミネソタのヘプトースを含まない変異体から調製されており、化学的には脂質Ａと類似しているが、酸不安定ホスホリル基および塩基不安定アシル基を欠いている。３ｄＭＰＬは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦなど、複数のサイトカインの放出を刺激する作用がある。３ｄ−ＭＰＬの調製に関しては、参考文献１７３に最初に記載されたが、その産物は、コリキサコーポレーション（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）がＭＰＬ（商標）という商品名で製造および販売している。詳細については、参考文献１１６−１１９で確認できる。
【０１６９】
医薬組成物
本発明の組成物は、薬学的に許容されるものである。本発明の組成物は、ほとんどの場合、抗原以外の成分を含み、たとえば、１種または複数種の薬学的キャリア（単数または複数）および／または賦形剤（単数または複数）を含むものが一般的である。こうした成分の詳しい考察は、参考文献１８５に示されている。
【０１７０】
組成物は通常、水性形態である。
【０１７１】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでもよい。しかしながら、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、たとえば、チオメルサールを含まないことが好ましい［１１、１８６］。水銀をまったく含まないワクチンは、一層好ましいものである。保存剤を含まないワクチンは、特に好ましい。
【０１７２】
浸透圧を調節するため、ナトリウム塩などの生理的塩を含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は好ましいものであり、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在しても構わない他の塩として、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム脱水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１７３】
組成物は通常、重量オスモル濃度が２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、一層好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に収まる。重量オスモル濃度については、ワクチン接種による痛みに影響しないことが以前に報告されている［１８７］が、それでも、重量オスモル濃度をこの範囲に保つことが好ましい。
【０１７４】
組成物は、１種または複数種の緩衝液を含んでもよい。標準的な緩衝液として、リン酸緩衝、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液については一般に、５〜２０ｍＭの範囲で含ませる。緩衝液は、エマルジョンの水相に存在してもよい。
【０１７５】
組成物のｐＨは通常、５．０〜８．１、より一般的には６．０〜８．０、たとえば、６．５〜７．５または７．０〜７．８である。したがって、本発明のプロセスは、包装の前にバルクワクチンのｐＨを調製する工程を含んでもよい。
【０１７６】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくは発熱性物質を含まないものであり、たとえば、１用量当たり＜１ＥＵ（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｕｎｉｔ、標準測定値）、好ましくは１用量当たり＜０．１ＥＵで含む。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【０１７７】
ワクチンは、抗生物質（ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢなど）などの残留成分を微量で含んでも構わない。
【０１７８】
組成物は、１回のワクチン接種に見合った材料を含んでもよいし、複数回のワクチン接種に見合った材料（すなわち、「反復投与」組成物）を含んでもよい。反復投与の手配の際に保存剤を含めることは、好ましい。反復投与組成物に保存剤を含めるのに代わる方法として（あるいは、それに加えて）、組成物を、材料の除去用のアダプターを備えた容器に入れてもよい。
【０１７９】
インフルエンザワクチンについては、約０．５ｍｌの投与量で投与するのが一般的であるが、用量を半分（すなわち、約０．２５ｍｌ）にして小児に投与してもよく、たとえば、ある患者への投与の１単位用量を０．５ｍｌにするなど、適宜に各１単位用量を選択する。
【０１８０】
組成物またはキット成分の包装
本発明のプロセスは、ワクチンを容器に、特に医師が使用する分配用の容器に入れる工程を含んでもよい。こうした容器への充填後、容器を冷蔵しない。
【０１８１】
ワクチン用の好適な容器は、無菌にしておくべきバイアル、鼻スプレーおよびディスポーザブル注射筒を含む。
【０１８２】
組成物／成分がバイアル内にある場合、バイアルは、好ましくはガラスまたはプラスチック材料性である。組成物をバイアルに入れる前に、好ましくはバイアルを滅菌する。ラテックス感受性患者の問題を回避するため、バイアルは、好ましくはラテックスを含まない栓で密封し、すべての包装材料は、ラテックスを含まないことが好ましい。バイアルは、ワクチンの１回用量を含んでもよいし、２回以上の用量、たとえば、１０用量を含んでもよい（「反復投与」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。
【０１８３】
バイアルは、事前に充填されたプレフィルドシリンジを挿入できるように適合されたキャップ（ルアーロックなど）を備えていてもよく、シリンジの内容物については、バイアルに入れてもよく、バイアルの内容物については、再びシリンジに戻してもよい。バイアルからシリンジを取り出した後、針を装着して組成物を患者に投与してもよい。キャップは、好ましくはシールまたはカバーで覆われているため、キャップを使用する前にシールまたはカバーを取り去る必要がある。バイアルは、内容物を無菌的に取り出すことができるキャップを備えていてもよく、特に反復投与バイアルにはこれが当てはまる。
【０１８４】
組成物／成分をシリンジに充填する場合、シリンジには、針が装着されていてもよい。針が装着されていない場合、別の針をシリンジに付け、組み立てて使用しても構わない。こうした針を覆ってもよい。セーフティー針は好ましいものである。一般的な針は、２３ゲージの１インチ針、２５ゲージの１インチ針および２５ゲージの５／８インチ針である。シリンジは、記録を管理しやすくするロット番号、インフルエンザシーズンおよび内容物の有効期限が印刷されていることがある剥離式ラベルが付いていてもよい。シリンジのプランジャーには、吸引中に誤ってプランジャーを取り外さないように栓があることが好ましい。シリンジは、ラテックスゴムのキャップおよび／またはプランジャーを備えていても構わない。ディスポーザブル注射筒は、ワクチンの１回用量を含むものである。シリンジには通常、針の装着前の先端をシールする先端キャップが付いており、先端キャップは、好ましくはブチルゴム製である。シリンジおよび針が別々に収められている場合、針には、ブチルゴム製の保護物が装着されていることが好ましい。好ましいシリンジには、「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）という商品名で販売されているものがある。
【０１８５】
容器については、たとえば、小児への投与を容易にするように用量の半分量を示す目印が付いていてもよい。たとえば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジに、０．２５ｍｌ容量を示す目印が付いても構わない。
【０１８６】
ガラス容器（シリンジまたはバイアルなど）を用いる場合、ソーダ石灰ガラス製よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いる方が好ましい。
【０１８７】
組成物に関しては、たとえば、投与の際の注意点、ワクチン内の抗原の詳細など、ワクチンの詳細を含む説明書を（同じ箱の中など）付けてもよい。また、注意点として、たとえば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合にすぐに利用できるアドレナリン溶液を保管しておくことなど、警告を含んでも構わない。
【０１８８】
ワクチンの処置および投与の方法
本発明の組成物は、ヒト患者の投与に好適なものであり、本発明は、患者に免疫反応を引き起こす方法であって、本発明の組成物を患者に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０１８９】
また、本発明は、薬品として用いられる本発明のキットまたは組成物も提供する。
【０１９０】
本発明の方法および使用により引き起こされる免疫反応は通常、抗体反応、好ましくは防御的抗体反応を含むものである。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体反応、中和能および保護作用を判定する方法については、当該技術分野において周知である。ヒトを対象とした試験から、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体価は、保護作用と相関する（血清サンプルの血球凝集抑制抗体価が約３０〜４０である場合、同種ウイルスによる感染に対する保護作用は約５０％である）ことが示されている［１８８］。抗体反応は一般に、血球凝集抑制、マイクロ中和、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ：ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）および／または一元放射溶血反応（ＳＲＨ：ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）で測定する。これらのアッセイ技法は、当該技術分野において周知である。
【０１９１】
本発明の組成物については、様々な方法で投与してもよい。最も好ましいワクチンの接種経路は、筋肉内注射（腕または脚など）であるが、これ以外の有効な経路として、皮下注射、鼻腔内［１８９−１９１］、経口［１９２］、皮内［１９３、１９４］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１９５］などが挙げられる。
【０１９２】
本発明に従って調製されるワクチンを用いて小児、成人をともに処置してもよい。インフルエンザワクチンに関しては現在、生後６ヶ月以上の小児および成人を対象として接種することが推奨されている。したがって、患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または５５歳以上であっても構わない。ワクチンを投与するのに好ましい患者は、高齢者（≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳など）、若年者（≦５歳など）、入院患者、医療従事者、軍関係者、妊婦、慢性疾患者、免疫不全患者、ワクチン投与の７日前に抗ウイルス性化合物（オセルタミビルまたはザナミビル化合物など；以下を参照のこと）を服用したことのある患者、卵アレルギーの人および海外旅行者である。ワクチンは、こうした群に好適であるばかりでなく、より一般的には１つの集団に用いてもよい。汎流行株の場合、すべての年齢群に投与することが好ましい。
【０１９３】
本発明の好ましい組成物は、有効性に関するＣＰＭＰ（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の基準の１、２または３を満たしている。成人（１８〜６０歳）に対するそれらの基準は：（１）セロプロテクション率≧７０％；（２）セロコンバージョン率≧４０％；および／または（３）ＧＭＴ（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ  ｔｉｔｅｒｓ）上昇率≧２．５倍である。高齢者（＞６０歳）に対するそれらの基準は：（１）セロプロテクション率≧６０％；（２）セロコンバージョン率≧３０％；および／または（３）ＧＭＴ上昇率≧２倍である。こうした基準は、少なくとも５０例のオープン試験に基づくものである。
【０１９４】
処置を行うには、単回投与スケジュールでも、反復投与スケジュールでもよい。初回ワクチン接種スケジュールおよび／または追加ワクチン接種スケジュールにおいて、反復投与を用いても構わない。反復投与スケジュールでは、たとえば、初回を非経口として追加を粘膜、初回を粘膜として追加を非経口とするなど、同一または異なる経路で様々な用量を投与しても構わない。２用量以上（一般に２用量）を投与すれば、たとえば、以前にインフルエンザワクチンを投与されたことがない人などの免疫学的に感受性の患者、または新しいＨＡサブタイプ（汎流行の発生の場合）のワクチン接種には、特に有用である。反復投与は一般に、少なくとも１週間（たとえば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔をおいて行う。
【０１９５】
本発明により製造されるワクチンを、他のワクチンと実質的に同時（同じ医師との相談中または同じ医療関係者もしくはワクチン接種センターへの訪問時などに）に患者に投与してもよい。たとえば、麻疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲ（ｍｅａｓｌｅｓ−ｍｕｍｐｓ−ｒｕｂｅｌｌａ）ワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶ（ｍｅａｓｌｅｓ−ｍｕｍｐｓ−ｒｕｂｅｌｌａ−ｖａｒｉｃｅｌｌａ）ワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ−ｔｅｔａｎｕｓ−ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン、インフルエンザ菌Ｂ型コンジュゲートワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン（四価Ａ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙワクチンなど）、呼吸器合胞体ウイルスワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチンなどと実質的に同時に患者に投与してもよい。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時に投与すると、高齢患者には特に有用である。
【０１９６】
同様に、本発明のワクチンを、抗ウイルス性化合物、特にインフルエンザウイルスに対して効果がある抗ウイルス性化合物（オセルタミビルおよび／またはザナミビルなど）と実質的に同時（同じ医師との相談中または同じ医療関係者への訪問時など）に患者に投与してもよい。こうした抗ウイルス薬には、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−エノン酸（そのエステル（エチルエステルなど）およびその塩（リン酸塩など）を含む）などのノイラミニダーゼ阻害剤がある。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））とも呼ばれる（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスファート（１：１）である。
【０１９７】
一般的な事項
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、たとえば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなってもよいし、他のもの、たとえば、Ｘ＋Ｙを含んでもよい。
【０１９８】
「実質的に」という語は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を排除するものではなく、たとえば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。「実質的に」という語については、必要に応じて本発明の定義から削除してもよい。
【０１９９】
数値χに対する「約（ａｂｏｕｔ）」は、たとえば、χ±１０％を意味する。
【０２００】
特に記載がない限り、２種以上の成分を混合する工程を含むプロセスでは、混合に任意の特定の順序を必要としない。したがって、成分を任意の順序で混合しても構わない。成分が３種類ある場合、２種類の成分を互いに混合して、次いで、この混合したものを第３の成分と混合するなどしてもよい。
【０２０１】
細胞培養の際に動物（特にウシ）の材料を用いる場合、その材料を、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃａｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）を含まない供給源から採取すべきである。全体として、動物由来の材料の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。
【０２０２】
組成物の一部として化合物を体内に投与する場合、その化合物の代わりに好適なプロドラッグを用いてもよい。
【０２０３】
遺伝子再集合または逆遺伝学の手順のために細胞基質を用いる場合、細胞基質は、たとえば、ヨーロッパ薬局方の一般条項５．２．３にあるような、ヒトワクチンの製造で使用が認められている基質であることが好ましい。
【０２０４】
ポリペプチド配列間の同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（オックスフォードモレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））において、パラメータであるギャップオープンペナルティを１２およびギャップエクステンションペナルティを１としてアファインギャップ検索を用いて実行されるように、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）ホモロジー検索アルゴリズムにより、測定することが好ましい。
【０２０５】
本発明を実施するモード
種々のインフルエンザウイルス株；Ａ／Ｐａｎａｍａ（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（Ｈ３Ｎ２）；Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ；Ｂ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ；およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕを、ＭＤＣＫ細胞基質で増殖させた［３０］。株を個々に増殖させ、各株から一価抗原バルクを調製した。株を選択し、組み合わせて臨床用の三価の最終ロットを得た。最終産物は、トウィーン８０（ポリソルベート８０）洗浄剤（ＨＡ１ｇ当たり＜２５μｇ）を含んでいたが、水銀を含んでいなかった。ウイルス破壊による残留ＣＴＡＢも存在した。
【０２０６】
一価バルクおよび最終の三価ロットを、冷蔵状態（２〜８℃）または非冷蔵状態（２３〜２７℃）下で保管し、ＳＲＩＤによりＨＡ含量を様々な時点で測定した。ＨＡ濃度は一価バルクでそれぞれ異なっていたが、最終の三価材料における所定のＨＡ開始レベル（ゼロ時）は、１用量につき１株当たり１５μｇであった。これは１株当たり３０μｇ／ｍｌである。
【０２０７】
図１〜図７は、異なる温度で保管した際に、経時的に測定した様々な一価または三価材料のＨＡレベルの例を示す。
【０２０８】
図１〜図７のワクチンは、２〜８℃では１２ヶ月、３７℃では４週間、優れた安定性を示した。さらに、データを示していないロットを含めすべてのロットにおいて、各測定時点で安定性要件を満たし、安定性規格に適合しないロットはなかった。したがって、すべての一価バルクを、２〜８℃で１２ヶ月または３７℃で４週間、保管することができており、これは、最終の三価産物でも同様である。このデータからは、２〜８℃で保管する場合、有効期間が３９ヶ月であることが示される。
【０２０９】
以下の表は、２３〜２７℃で最長１５ヶ月間保管した様々な一価ワクチンロットのＨＡレベルを示す。いずれの場合も、開始濃度の８０％を下回るＨＡレベルは認められなかった：
【０２１０】
【化１３】
2009534303.tif 000015
経時的なＨＡの測定値に基づき、ＨＡレベルを外挿することが可能である。そうすれば、予想有効期間、すなわち、ＨＡ濃度が２４μｇ／ｍｌまたは開始濃度の８０％を下回らない期間）を得ることができる。以下の表に、２〜８℃で保管され数ヶ月にわたり測定された様々な臨床三価材料の予想有効期間を示す。ウイルス株は、（Ｎ）Ａ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ；（Ｐ）Ａ／Ｐａｎａｍａ；（Ｇ）Ｂ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇであった：
【０２１１】
【化１４】
2009534303.tif 000016
すべての臨床材料に対して確認される予想有効期間は、少なくとも１５ヶ月である。１５ヶ月という有効期間は、前臨床毒性試験用に調製された材料に対しても推定された。
【０２１２】
ＨＡデータを参考文献２のデータと比較して、ＨＡ分解率および推定有効期間を得た。しかしながら、インフルエンザシーズンの違いから、すべての事例で、株間の直接比較ができたわけではなかった。
【０２１３】
図８は、参考文献２の試験と本発明との統計学的比較の１例を示す。
【０２１４】
２３〜２７℃で保管する場合、参考文献２のデータにおいては、ＨＡ分解が年間１１．３７μｇ／ｍｌ〜３３．７１μｇ／ｍｌで起きていることが示される。これに対して、被検ワクチンにおいては、ＨＡ分解が年間１．７１μｇ／ｍｌ〜４．５２μｇ／ｍｌという非常に低率で起きていることが示された。特にＡ／ＮＥＷ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ株の場合、観察対象の分解率が、参考文献２では年間１１．３７μｇ／ｍｌであったのに対し、被検ワクチンでは年間２．６７μｇ／ｍｌであった。４℃で保管されたワクチンにおいても、分解率はやはり被検ワクチンの方が低かった。
【０２１５】
【化１５】
2009534303.tif 000017
データからは、三価混合物は、２３〜２７℃でも最長１５ヶ月の有効期間を有し得ることが示されたが、これは、参考文献２の場合よりもかなり長いものである。４℃での有効期間は、最長４２〜４５ヶ月であり得た：
三価ワクチンを４０℃で保管した場合でも、Ｂ／江蘇成分の有効期間は、約６ヶ月であることが推定された。より低い保存温度（２５℃）での有効期間は、少なくとも９ヶ月まで拡大し、１８ヶ月以上になるかもしれない。
【０２１６】
参考文献２と比較して安定性が向上した理由としては：（ｉ）本ワクチンを卵からではなく哺乳動物細胞培養から調製したこと、および参考文献２で確認された分解の原因が、卵由来の残留成分（たとえば、プロテアーゼおよび／またはグリコシダーゼなどの酵素）および／またはグリコシル化の違いであった可能性があること；または（ｉｉ）本ワクチンではＨＡを安定させる可能性があるトウィーン８０が高レベルで存在することが考えられる。
【０２１７】
本発明について例示のみを目的として記載してきたが、本発明の範囲および主旨から逸脱せずに修正を施すことが可能であることが理解されるであろう。
【０２１８】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０２１９】
【化１６】
2009534303.tif 000018
【０２２０】
【化１７】
2009534303.tif 000019
【０２２１】
【化１８】
2009534303.tif 000020
【０２２２】
【化１９】
2009534303.tif 000021
【０２２３】
【化２０】
2009534303.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】以下の表の図１のサンプルに関して時間にわたって測定したＨＡレベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図２】以下の表の図２のサンプルに関して時間にわたって測定したＨＡレベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図３】以下の表の図３のサンプルに関して時間にわたって測定したＨＡレベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図４】以下の表の図４のサンプルに関して時間にわたって測定したＨＡレベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図５】以下の表の図５のサンプルに関して時間にわたって測定したＨＡレベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図６】以下の表の図６のサンプルに関して時間にわたって測定したＨＡレベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図７】以下の表の図７のサンプルに関して時間にわたって測定したＨＡレベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
【化２１】
2009534303.tif 000023
【図８】８０週間にわたり２３〜２７℃でのＢ／江蘇（Ｊｉａｎｇｓｕ）のＨＡ含量（μｇ／ｍｌ）を外挿する。データに関しては、異なるモデルまたは同種のモデルにより統計学的に評価した。図は、９５％信頼限界での回帰直線を示す。参考文献２のデータのインフルエンザＢウイルスデータとの比較から、本材料の有効期間の方が長いことが示される。
【図１】
2009534303.tif 000024
【図２】
2009534303.tif 000025
【図３】
2009534303.tif 000026
【図４】
2009534303.tif 000027
【図５】
2009534303.tif 000028
【図６】
2009534303.tif 000029
【図７】
2009534303.tif 000030
【図８】
2009534303.tif 000031
【国際調査報告】
2009534303.tif 000032
2009534303.tif 000033
2009534303.tif 000034
2009534303.tif 000035
2009534303.tif 000036