(57)【要約】  本発明は、癌化学療法剤および抗増殖剤と併用して、そのような薬剤の有効性の改良するためおよび／または比較的低い治療活性を有効な化合物を与えるために使用できる化合物の同定についてのアッセイの改良に関する。乾癬などの異常な宿主細胞増殖に関連する癌および他の疾患を治療するために、現行薬剤と新規薬剤との組合せ療法において使用できる、該アッセイによって同定される化合物のクラスもまた提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療法で使用される医薬品の製造のための、Ｎｒｆ２遺伝子活性をダウンレギュレートできる薬剤の使用。
【請求項２】
前記薬剤が、Ｎｒｆ２による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートする、請求項１に記載の薬剤の使用。
【請求項３】
１つまたは複数の前記遺伝子がＡＲＥ遺伝子経路に関連する遺伝子であり、その発現がＮｒｆ２によるトランス活性化の減少によってダウンレギュレートされる、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬品が異常な細胞増殖に関連する疾患を治療するためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤が単独で投与されることが意図される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記医薬品が、細胞毒性剤、アルキル化剤、酸化還元サイクル剤、チオール活性化薬、ＧＳＨ合成の阻害剤、またはアポトーシス誘導剤からなる群から選択される他の薬剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
治療される被験体が、ＵＶ電離放射線または光力学療法によって治療される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
治療される前記疾患が癌または乾癬である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
レチノイドが、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現のダウンレギュレートを経由して宿主において異常に増殖する細胞の感受性を高める、異常な細胞増殖に関連する疾患の治療で使用される医薬品の製造のためのレチノイドまたは式（Ｉ）に記載の化合物：
【化１】
2009544679.tif 000015
（式中、Ｘは、Ｃ、ＯまたはＮまたはＳであり；Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4（ＯＨ）、ＣＯＯＨ、Ｃ（＝ＣＨ2）ＣＨ3、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3であり；およびＲ2は、各々の利用可能な位置で、Ｈ、ハロ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＨまたはＮＨ2から独立して選択される）の使用。
【請求項１０】
レチノイドがＮｒｆ２遺伝子活性をダウンレギュレートし、それによってＮｒｆ２が防御程度を高める抗増殖剤の感受性を増加させる、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬品が、レチノイドによって感受性を高められた細胞の細胞死を誘導できるさらなる薬剤をさらに含む、請求項９または１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記さらなる薬剤が、アルキル化剤または酸化還元サイクル剤などの化学療法剤である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
レチノイドが、Ｎｒｆ２による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
レチノイドが、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、レチナールまたはレチノールである、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
レチノイドが、
【化２】
2009544679.tif 000016
【化３】
2009544679.tif 000017
である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
レチノイドおよび化学療法剤などのＮｒｆ２活性をダウンレギュレートできる薬剤を活性成分として含むか、またはそれらから本質的にはなる、医薬組成物。
【請求項１７】
前記化学療法剤がアルキル化剤または酸化還元サイクル化合物である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記化学療法剤が、シスプラチン、メルファラン、クロラムブチル、ミトロザントロン（ｍｉｔｒｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、ＢＣＮＵ、チステパ（ｔｈｉｓｔｅｐａ）、ドキソルビシンまたはブレオマイシンである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＧＳＨ産生またはチオレドキシン産生を阻害する、ＢＳＯなどの酸化還元制御剤をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
細胞毒性またはアポトーシスに対して細胞の感受性を高めることに使用される、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現の誘導を直接的または間接的にダウンレギュレートする薬剤についてスクリーニングする方法であって、
ａ）抗酸化応答を行なうことができる細胞であり、下流に位置するレポーター遺伝子を含み複数の連結されたＡＲＥ配列によって制御されるＡＲＥレポーター遺伝子コンストラクトを含む細胞、をインビトロで提供する工程と；
ｂ）該細胞とスクリーニングされる被検薬剤を接触させる工程と；
ｃ）該薬剤が、被検薬剤が加えられていない細胞に比較して、レポーター遺伝子の誘導を低下できるか、または発現を低下できるかどうかを検出する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項２１】
異常な細胞増殖に関連する疾患の治療で使用する薬剤の同定のための請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が癌または乾癬である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被検薬剤がＮｒｆ２活性を阻害する能力についてもまた検査される、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
使用される前記ＡＲＥ配列がラットＧＳＴＡ２遺伝子および／またはマウスｇｓｔａｌ遺伝子からである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が抗酸化応答を行なうことができる哺乳類の細胞である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞がＭＣＦ７細胞である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記レポーター遺伝子の誘導が活性化剤の追加によって促進される、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記活性化剤が、ｔＢＨＱなどのキノン、およびスルフォラファンなどのイソチオシアメート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｍａｔｅ）、マレイン酸ジエチルなどのα，β−不飽和カルボニル、またはβ−ナフトフラボンなどのフラボノイド、または１−シアノ−２，３−エピチオプロパンなどのエピチオアルカン、またはリポ酸などのジ−メルカプタンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｎｒｆ２が、アンチセンスまたはＲＮＡｉの技術を使用してＫｅａｐｌの発現をダウンレギュレートすることによって、または変異Ｋｅａｐｌ遺伝子を含む細胞内で、活性化される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
Ｎｒｆ２が、Ｂａｃｈ１、Ｂａｃｈ２、ｃＦｏｓおよび小Ｍａｆなどの負に作用する競合転写因子の発現をダウンレギュレートすることによって活性化される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
レポーター遺伝子が、ＧＦＰおよび関連した蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホソファターゼ（ｐｈｏｓｏｐｈａｔａｓｅ）または任意のアッセイ可能なホルモンもしくは酵素である、請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記レポーター遺伝子の産物の検出が、比色アッセイ、蛍光アッセイ、発光アッセイ、放射免疫アッセイまたは免疫学的アッセイによって実行される、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
レポーター活性のレベルまたは程度を確認するために、被検薬剤の不在下で比較実験または対照実験が実行される、請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、ラットＧＳＴＡ２および／またはマウスｇｓｔａｌ遺伝子からのＡＲＥ配列の複数の連結したコピーの下流にレポーター遺伝子を含むＡＲＥレポーターコンストラクトを含むヒト乳腺ＭＣＦ７細胞である、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現に対する効果についてのスクリーニング薬剤で使用される細胞。
【請求項３６】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法または細胞。
【請求項３７】
複数の連結した前記ＡＲＥ配列が、レポーター遺伝子の上流に頭−尾で連続して位置する、請求項２０〜３６のいずれか一項に記載の方法または細胞。
【請求項３８】
コピー数が６〜８である、請求項３６に記載の方法または細胞。
【請求項３９】
被験体へＮｒｆ２による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートできる薬剤の有効量を投与する工程を含む、異常な細胞増殖に関連する疾患に罹患する患者を治療する方法。
【請求項４０】
細胞死を引き起こすかもたらすことができるさらなる薬剤を投与することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
異常な細胞増殖に関連する疾患に罹患する患者を治療する方法であって、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現を減少させることができる量のレチノイド、および異常な細胞増殖を減少させることができる量のさらなる薬剤を被験体へ投与する工程を含み、レチノイドが異常な増殖細胞のさらなる薬剤に対する感受性を増加させる役目をする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌化学療法剤および／または抗増殖剤と併用して、そのような薬剤の有効性を改良するためおよび／または比較的低い治療活性を有効な化合物に与えるために使用できる化合物を同定するための改良アッセイに関する。また、乾癬などの異常な宿主細胞増殖に関連する癌および他の疾患を治療するための、現行薬剤と新規薬剤との組合せ療法において使用できる、該アッセイによって同定される化合物のクラスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
序論
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素１（ＮＱＯ１）、アルド−ケト還元酵素（ＡＫＲ）ミクロソームエポキシド加水分解酵素、ＵＤＰ−グルクロノシル転移酵素、ならびに還元グルタチオン（ＧＳＨ）と共に反応するグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびＧＳＨの生合成酵素（グルタミン酸システインリガーゼ（ＧＣＬ；ＧＣＬＣおよびＧＣＬＭサブユニットを含む）ならびにＧＳＨシンターゼ）などの薬物代謝酵素は、活性酸素種（ＲＯＳ）だけでなく発癌性親電子性物質からも細胞を保護する(Hayes & Wolf, 1990; Nioi & Hayes, 2004)。この防御は酸化還元ストレッサーに応答してアップレギュレートでき、その結果として細胞が適応し、酸化促進物質および親電子性物質の存在への耐性の獲得を可能にする。その防御は特定の腫瘍においてもまた過剰発現される。これらの遺伝子の誘導は、主としてＮｒｆ２（McMahon et al., 2001; Lee et al., 2003)（キャップ・アンド・カラー（ｃａｐ  ’ｎ’  ｃｏｌｌａｒ）（ＣＮＣ）塩基性領域ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）タンパク質のファミリーに属する転写因子）によって制御される(Hayes & McMahon, 2001; Motohashi et al., 2002; Kobayashi et al., 2005)。Ｎｒｆ２は、遺伝子のプロモーター中に抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ、５’−（Ａ／Ｇ）ＴＧＡＣＮＮＮＧＣ（Ａ／Ｇ）−３’）を含む解毒遺伝子および抗酸化遺伝子の誘導を仲介し(Rushmore et al., 1991; Friling et al., 1992; Nguyen et al., 1994; Wasserman & Fahl, 1997; Sasaki et al.,, 2002; Mulcahy et al., 1997; Erickson et al., 2002; Ikeda et al., 2002; Kepa et al., 2003; Nioi, et al., 2003; Jowsey et al., 2003)；ＡＲＥは文献中で時々親電子性物質応答エレメント（ＥｐＲＥ）とも呼ばれている。細胞が有害な環境要因に抵抗する能力の制御におけるＮｒｆ２についての重要な役割は、Ｎｒｆ２ノックアウトマウス(Itoh et al., 1997)が、高酸素誘導性肺損傷(Cho et al., 2002)たばこ煙誘導性肺気腫に感受性を示すこと、および発癌物質を含む毒性生体異物に対して罹病性が増加することを示した研究によって実証された(Aoki et al., 2001; Chan et al., 1999; Enomoto et al., 2001; Iida et al., 2004; Ramos-Gomez et al., 2001)。
【０００３】
Ｎｒｆ２の活性は、抑制因子（細胞質におけるｂＺＩＰタンパク質を連結するケルヒ（Ｋｅｌｃｈ）様ＥＣＨ関連タンパク質１（Ｋｅａｐ１））に結合することによって抑制される(Itoh et al., 1999; Kang et al., 2004)。あるいは、Ｋｅａｐ１がカリン（ｃｕｌｌｉｎ）−３基質アダプターとして作用するので、Ｋｅａｐ１はＮｒｆ２の分解を促進し、それによってｂＺＩＰタンパク質のユビキチン化およびプロテアソーム分解を促進する。(McMahon et al., 2003; Kobayashi et al., 2004; Cullinan et al., 2004; Zhang et al., 2004; Furukawa et al, 2005)。親電子剤および酸化ストレッサーはＫｅａｐ１を修飾し、Ｋｅａｐ１が分解のためにＮｒｆ２を標的とすることを防止する(Zhang et al., 2005; Hong et al., 2005)。Ｋｅａｐ１のそのような不活性化は、Ｎｒｆ２が核中で他のｂＺＩＰタンパク質と共にヘテロ二量体を形成して蓄積することを可能にし、ＮＱＯ１、ＡＫＲ、ＧＳＴ、ＧＣＬＣおよびＧＣＬＭを含む標的遺伝子をトランス活性化する(Hayes & McMahon, 2001; Motohashi et al., 2002; Kobayashi et al., 2005)。Ｋｅａｐ１の遺伝学的ノックダウンもまた、ＡＲＥ遺伝子一連の発現を増加させる(Wakabayashi et al., 2003; Devling et al., 2005)。
【０００４】
Ｎｒｆ２によって調節される多数の遺伝子は薬物耐性と関連づけられてきた。例えば、主としてＧＣＬ（ＧＣＬＣおよびＧＣＬＭサブユニットを含む）によって調節される抗酸化ＧＳＨは、シスプラチンを含むいくつかの化学療法剤およびアルキル化剤メルファランに対する腫瘍細胞の耐性に関わる(Tew, 1994; McLellan & Wolf, 1999; Townsend et al., 2003; Townsend & Tew, 2003; Waxman, 1990)。時々、高レベルのＧＣＬＣは薬物耐性と関連づけられてきた(Mulcahy et al., 1995; Ogretmen et al., 1998; Yao et al., 1995)。同様に、様々な親電子性化合物とＧＳＨのコンジュゲーションを触媒するＧＳＴイソ酵素の過剰発現(Hayes & Pulford, 1995)が、多数の腫瘍タイプにおいて報告され(Hayes & Wolf, 1990; Tew, 1994)、これらの酵素は化学療法剤への耐性の発達に関係していた(Tew, 1994; Townsend et al., 2003)。ＮＱＯ１活性の増加もまた特定のヒト肺腫瘍において示されている(Kepa et al., 2003; Schlager et al., 1990; Malkinson et al., 1992; Smitskamp-Wilms et al., 1995)。さらに、高レベルのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）(Wong et al., 1995; Kizaki et al., 1993)は、化学療法剤の毒性効果から癌細胞を保護することが示された。
【０００５】
薬物代謝酵素は抗癌剤に対する腫瘍細胞の感受性の決定に主要な貢献をするので、かかる遺伝子がどのように調節されるのか、およびそれらの調節の変化が癌治療法の改良をもたらすことができるのかを理解することは重要である。
【０００６】
ＷＯ２００６／１２８０４１は、Ｎｒｆ２の発現レベルを減少させて抗癌剤に対するＮＳＣＬＣ細胞の感受性を高めるために、Ｎｒｆ２に対するＲＮＡｉ分子の使用を教示する。しかしながら、ＲＮＡｉ技術を使用するタンパク質の発現の減少は効率的な送達の問題から影響を受けうる。
【０００７】
ＷＯ０１／５７１８９は、Ｆａｓ誘導性プログラム細胞死を増加させるために、Ｎｒｆ２に対するアンチセンスＲＮＡｉおよびＮｒｆ２のドミナントネガティブ変異体の使用を教示する。ディルマロール（ｄｉｒｕｍａｒｏｌ）およびスルフィンピラゾンもまた、Ｆａｓ誘導性死滅に対するＮｒｆ２によって付与された防御をアンタゴナイズすることが示される。しかしながら、これらの分子の実際の標的は同定されてない。
【０００８】
本発明は、他の化学薬剤に対する細胞の感受性を高めることに使用するための、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現の誘導を減少できる薬剤の同定を可能にするアッセイを提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、癌および乾癬などの異常な細胞増殖に関連する疾患の治療法を改良する手段としてＡＲＥ駆動性遺伝子発現の誘導を減少させる薬剤を提供することをさらなる目的とする。
【００１０】
本発明は、ラットＧＳＴＡ２（Rushmore et al., 1991）およびマウスｇｓｔａ１（Friling et al., 1992)の両方（後者の遺伝子ではエレメントはもともとＥｐＲＥと呼ばれた）において見出された最小のシスエレメントの複数の連結したコピーを含む、感受性があり安定したＡＲＥレポーター細胞株の作製に部分的に基づく。以前にZhu & Fahl (2000)により、安定したＡＲＥ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターＨｅｐＧ２細胞株が作製された。彼らが用いたレポーターコンストラクトは、ＧＦＰを駆動するチミジンキナーゼプロモーターにライゲーションしたマウスｇｓｔａ１からの４１−ｂｐのＡＲＥ含有プロモーター配列の４つの連結したコピーを含んでいた。しかしながら、９０μＭのｔｅｒｔブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）による、安定したＨｅｐＧ２／ＧＦＰ−Ｂレポーター細胞株の処理は、３倍だけの最大増加（特に高くない誘導レベル）をもたらした(Zhu & Fahl, 2000)。最も重要なことには、ＨｅｐＧ２／ＧＦＰ−Ｂ細胞株は、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現を阻害して治療法を改良できるアンタゴニストを同定するよりもむしろ、アゴニスト（すなわち化学予防的誘導剤）を同定するために使用された。さらに、ｔＢＨＱに応答してＨｅｐＧ２／ＧＦＰＢ細胞株において観察される誘導が比較的低レベルであることは、細胞株がアンタゴニストの同定においてほとんど役に立たないことを示唆する。
【発明の概要】
【００１１】
毒性薬物および抗増殖性薬物の効果に対して細胞の感受性を高めることができる化合物をスクリーニングする方法およびその産物が提供される。そのような化合物は、それら自体が細胞死／アポトーシスの誘導に影響するか、または例えば薬剤解毒、薬剤隔離、細胞からの薬剤除去もしくは単に薬剤作用に対する内在的耐性に起因して効果がなくなってしまうこともある他の薬剤による効果的な治療の提供をもたらすことができる。本方法は、ＡＲＥ応答エレメントおよびプロモーターの転写調節下のレポーター遺伝子を備えたＡＲＥ応答エレメントを含む遺伝子コンストラクトを安定的に導入したＡＲＥ応答性細胞に対して、適切な培地中の化合物を加えることを含む。
【００１２】
第１の態様では、治療法で使用される医薬品の製造のためのＮｒｆ２活性をダウンレギュレートできる薬剤が提供される。
【００１３】
薬剤は、好ましくは、Ｎｒｆ２による遺伝子発現のトランス活性化、および特にプロモーター中に抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）を含む遺伝子のトランス活性化をダウンレギュレートする。
【００１４】
薬剤は、癌および乾癬などの異常な細胞増殖に関連する疾患の治療において適用を見出すことができる。
【００１５】
本発明者は、Ｎｒｆ２のトランス活性化活性のダウンレギュレーションによって、細胞死をもたらすように細胞の感受性を高めることが可能であることを確認した。例えば、いくつかの細胞毒性剤の効果は、Ｎｒｆ２がＡＲＥを有する遺伝子をトランス活性化する能力によって減少させられる。Ｎｒｆ２活性のダウンレギュレートによって、治療の期間がより短いおよび／または必要とされる細胞毒性薬がより少ないという可能な利点で、そのような細胞毒性薬の有効性は増加できる。
【００１６】
いくつかの先行技術の教示とは異なり、本発明はＮｒｆ２活性の低分子化学物質アンタゴニストに関する。アンタゴニストは、一般にＮｒｆ２の発現またはｍＲＮＡのレベルには効果がないが、むしろＮｒｆ２の活性自体に効果がある。これは、ＲＮＡｉまたはアンチセンス技術の使用によるようなＮｒｆ２発現の減少をデザインした遺伝学的技術とはかなり異なる。したがって本発明は、Ｎｒｆ２の核酸ベースの阻害剤の使用に関する。
【００１７】
本発明の薬剤は、典型的には約１０００〜２０００Ｍｎより少ない（７５０ｍＷより少ないなどの）分子量を有する。
【００１８】
本発明者は、低分子のスクリーニングを実行し、他の化学薬剤に加えてレチノイン酸およびその特定の誘導体もまたＡＲＥ駆動性遺伝子発現の誘導を低下させることができる強力な薬剤であることを観察した。
【００１９】
したがって、さらなる態様において、異常な細胞増殖に関連する疾患の治療に使用される医薬品の製造のためのレチノイドであり、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現のダウンレギュレートを経由して宿主において異常に増殖する細胞の感受性を高めるレチノイドの使用が提供される。
【００２０】
典型的には、レチノイドは、Ｎｒｆ２による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートする。
【００２１】
レチノイドとは、様々な立体異性体のレチノイン酸を意味し、これにはオールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸および１３−シスレチノイン酸、並びにアシトレーション（ａｃｉｔｒａｔｉｏｎ）レチナールおよびレチノール、更に酢酸塩などの塩を含む。本発明において適切である多数の可能性のあるレチノイドを表す一般的な構造は、以下に示される：
【化１】
2009544679.tif 000003
【化２】
2009544679.tif 000004
【００２２】
市販で入手可能な化学的ライブラリー（メイブリッジ・ケミカル（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社）のスクリーニングにおいて、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現のダウンレギュレートに対して有意な活性を有するものとして、さらなる化合物が同定された。したがって、本発明は、異常な細胞増殖に関連する疾患の治療で使用される医薬品の製造のための式（Ｉ）に記載の化合物の使用にも及び、式（Ｉ）の化合物はＡＲＥ駆動性遺伝子の発現をダウンレギュレートすることにより、宿主において異常に増殖する細胞の感受性を高める。
【化３】
2009544679.tif 000005
式中、ＸはＣ、Ｏ、ＮまたはＳであり；Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4（ＯＨ）、ＣＯＯＨ、Ｃ（＝ＣＨ2）ＣＨ3、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3、ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ（ＣＨ3）3であり；およびＲ2は、各々の存在可能な位置で、Ｈ、ハロ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＨまたはＮＨ2から独立して選択される。
【００２３】
好ましくは、ＸはＯである。好ましくは、Ｒ1はＣ（＝Ｏ）ＣＨ3である。好ましくは、Ｒ2はハロおよびｈ、より好ましくは位置３および４でハロ、特に塩素である。
【００２４】
特に好ましい化合物は、ＸはＯであり、Ｒ1はＣ（＝））ＣＨ3であり、Ｒ2は位置２、５および６でＨ、および位置３および４でＣ１である。
【００２５】
さらなる態様において、Ｎｒｆ２活性をダウンレギュレートできる薬剤（レチノイドおよび化学療法剤）を活性成分として含むか、またはそれらから本質的にはなる医薬組成物が提供される。
【００２６】
レチノイドは、ＡＲＥ駆動性発現をダウンレギュレートする役目をし、その結果として、アポトーシス、またはアルキル化剤もしくは酸化還元サイクル化合物などの他の薬剤による治療に対する細胞の感受性を高め、それによって例えば癌を治療する場合の化学療法剤の有効性を改良することが理解される。したがって、治療は他の薬剤との組合せにおけるレチノイドの使用によってより有効になりえるか、および／または被験体に対して投与される他の薬剤のより少なくすることを可能にする。
【００２７】
癌の治療のための適切な化学療法剤は、アルキル化剤シスプラチン、メルファラン、クロラムブチル、ミトロザントロン（ｍｉｔｒｏｚａｎｔｒｏｎｅ）およびＢＣＮＵ；ならびにエトプシド（ｅｔｏｐｓｉｄｅ）などの酸化還元サイクル剤を含んでいる。感受性を高める薬剤との組合せにおいて使用される他の薬剤は上文に記述されている。
【００２８】
酸化還元反応制御剤は化学療法剤の有効性を改良することもできるので、医薬組成物は細胞の酸化還元状態を制御するＢＳＯなどの酸化還元制御剤をさらに含むことができる。
【００２９】
本発明に記載の使用のために、本明細書において記載される化合物または生理学的に許容される塩、エステルまたは他の生理学的に機能性のあるその誘導体は、したがって、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、ならびに任意で他の治療的および／または予防的な成分と共に、化合物または生理学的に許容される塩、エステルまたは他の生理学的に機能性のあるその誘導体を含む医薬製剤として提供できる。１つまたは複数の担体は、製剤の他の成分と適合しそのレシピエントに対して有害でないという意味で許容できるものでなくてはならない。
【００３０】
医薬製剤は、経口投与、局所投与（経皮投与、口腔投与および舌下投与を含む）、直腸投与または非経口投与（皮下投与、皮内投与、筋肉内投与および静脈内投与を含む）、鼻腔投与および経肺投与（例えば吸入による）のために適切なものを含む。製剤は、適切な場合、個別の投与量単位において都合よく提供され、製薬の当技術分野で周知の方法のいずれかによっても調製できる。すべての方法は、液体担体もしくは微粉固体担体または両方と活性化合物を組合わせ、次に必要なならば産物を所望される製剤へと形成する工程を含む。
【００３１】
担体が固体である経口投与のために適切な医薬製剤は、最も好ましくは、各々が所定の量の活性化合物を含むボーラス、カプセルまたは錠剤などの単位用量製剤として提供される。錠剤は圧縮または成型によって任意で１つまたは複数の副成分と共に作製されてもよい。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、平滑剤、界面活性剤または分散剤と任意で混合される粉末または顆粒などの流動性のある形態で適切な機械において活性化合物を圧縮することによって調製できる。成型錠剤は不活性液体希釈剤と活性化合物の成型によって作製できる。錠剤は任意で被覆され、被覆されないならば任意で刻み目を付けることができる。カプセルは、活性化合物をカプセル殻の中に満たすことによって、単独または１つまたは複数の副成分との混合において調製でき、次に通常の様式でそれらを密封できる。カシェ剤は、１つまたは複数の任意の副成分と共に活性化合物がライスペーパーエンベロープ中に密封されるカプセルに類似する。活性化合物も分散可能な顆粒として製剤化でき、それは例えば投与前に水中に懸濁できるか、または食品にふりかけることができる。顆粒は、例えば小袋中にパッケージ化できる。担体が液体である経口投与のために適切な製剤は、溶液または水性もしくは非水性の液体における懸濁物、または水中油滴型液体エマルジョンとして提供できる。
【００３２】
経口投与のための製剤は、制御放出剤形（例えば活性化合物が適切な放出を制御するマトリックス中に製剤化されるか、または適切な放出を制御するフィルムにより被覆される錠剤）を含む。そのような製剤は予防的な使用のために特に好都合かもしれない。
【００３３】
担体が固体である直腸投与のために適切な医薬製剤は、最も好ましくは、単位用量坐剤として提供される。適切な担体は、カカオバター、および当技術分野において一般に使用される他の材料を含む。坐剤は、軟化または融解された担体との活性化合物の混合、続いて冷却および鋳型中での形成によって都合よく形成できる。
【００３４】
非経口投与のために適切な医薬製剤は、水性または油性の媒質中の活性化合物の滅菌済み溶液または懸濁物を含む。
【００３５】
注射可能な調製物は、ボーラス注射または継続的な点滴に適合できる。そのような調製物は、使用のために必要とされるまで、製剤の導入後に密封される単位用量またはマルチ用量容器中で都合よく提供される。あるいは、活性化合物は、使用前に滅菌済みの発熱物質不含有水などの適切な媒質により構成される粉末形態でありうる。
【００３６】
活性化合物は長時間作用性デポー調製物としても製剤化でき、それは筋肉注射によって、または移植によって、例えば皮下または筋肉内に投与できる。デポー調製物は、例えば適切なポリマー材料または疎水性材料、またはイオン交換樹脂を含むことができる。そのような長時間作用性製剤は、予防的な使用のために特に好都合である。
【００３７】
口腔を介する肺内投与のために適切な製剤は、活性化合物を含み、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲内の直径を有する粒子が、レシピエントの気管支樹中に送達されるように提供される。
【００３８】
１つの可能性として、そのような製剤は、微細に粉砕された粉末の形態であり、それは例えばゼラチンの適切な貫通可能なカプセル中に、吸入装置における使用のために、またはあるいは活性化合物、適切な液体またはガスの噴霧剤、ならびに任意で界面活性剤および／または固体希釈剤などの他の成分を含む自動推進製剤としてのいずれかで都合よく提供できる。適切な液体噴霧剤はプロパンおよびクロロフルオロカーボンを含み、適切なガス噴霧剤は二酸化炭素を含む。活性化合物が溶液または懸濁物の液滴の形態で分注される自動推進製剤もまた用いることができる。
【００３９】
そのような自動推進の製剤は当技術分野で公知のものに類似しており、確立された手順によって調製できる。適切には、それらは、所望されるスプレー特性を有するマニュアル作動可能弁または自動機能弁のいずれかと共に提供される容器中で提供され；有利には、弁は、その各々の操作に際して、固定体積（例えば２５〜１００マイクロリットル）を送達する従量型である。
【００４０】
さらなる可能性として、活性化合物は霧吹き器または噴霧器中で使用される溶液または懸濁物の形態でありえ、それによって加速された気流または超音波の撹拌は吸入のための微細な液滴霧を生ずるために用いられる。
【００４１】
鼻腔投与のために適切な製剤は、肺内投与のために上述されたものに一般に類似する調製物を含む。分注されたとき、鼻腔における保持を可能にするために、そのような製剤は望ましくは１０〜２００ミクロン範囲内の粒子直径を有するべきであり；これは必要に応じて適切な粒子サイズの粉末の使用または適切な弁の選択によって達成されてもよい。他の適切な製剤は、鼻近くまで保持された容器からの鼻通路を通した迅速な吸入による投与のための、２０〜５００ミクロンの範囲内の粒子直径を有する粗粉、および水性もしくは油性の溶液、または懸濁物中に０．２〜５％ｗ／ｖの活性化合物を含む点鼻液を含む。
【００４２】
前述の担体成分に加えて、上述された医薬製剤は、希釈剤、緩衝剤、着香剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、防腐剤（抗酸化剤を含む）および同種のもの、ならびに予定されたレシピエントの血液と製剤を等張にする目的のために含まれる物質などの適切な１つまたは複数の付加的な担体成分を含むことができることが理解されているべきである。
【００４３】
薬学的に許容される担体は当業者に周知であり、０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％生理食塩水を含むがこれらに限定されない。加えて、そのような薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルジョンでありえる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは生理食塩水および緩衝培地を含む懸濁物を含んでいる。非経口媒質は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定油を含んでいる。防腐剤および他の添加剤には、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスおよび同種のものなどもまた存在できる。
【００４４】
局所製剤のために適切な製剤は、例えばゲル、クリームまたは軟膏として提供できる。そのような調製物は、例えば創傷もしくは潰瘍の表面上に直接塗るか、または治療領域へおよびその上に適用できる包帯、ガーゼ、メッシュもしくは同種のものなどの適切な支持体上に保つかのいずれかで、創傷または潰瘍に適用できる。
【００４５】
治療される部位（例えば創傷または潰瘍）上に直接スプレーできるか、またはふりかけることができる液体または粉末の製剤もまた提供できる。あるいは、包帯、ガーゼ、メッシュまたは同種のものなどのキャリアーは、製剤をスプレーできるか、またはふりかけることができ、次に治療部位へ適用できる。
【００４６】
さらなる態様において、Ｎｒｆ２による遺伝子発現のトランス活性化をダウンレギュレートできる薬剤の有効量を被験体へ投与する工程を含む、異常な細胞増殖に関連する疾患に罹患する患者を治療する方法が提供される。
【００４７】
さらなる態様において、ＡＲＥ駆動性遺伝子の発現を減少させることができる量のレチノイドまたは式Ｉに記載の化合物と薬剤を被験体へ投与する工程を含み、レチノイドまたは式Ｉに記載の化合物と薬剤が組合せで細胞死誘導などによって細胞増殖を改善する役目をする、異常な細胞増殖に関連する疾患に罹患する患者を治療する方法が提供される。
【００４８】
レチノイドまたは式Ｉに記載の化合物と他の薬剤は、同時にまたは別々に投与されてもよいことが理解されている。もし別々に投与される場合には、レチノイドまたは式Ｉに記載の化合物は他の薬剤の前に投与されることが一般的である。
【００４９】
さらなる態様において、細胞の感受性を高めることに使用される、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現の誘導をダウンレギュレートする薬剤についてスクリーニングする方法であって、
ａ）抗酸化応答を行なうことができる細胞であり、複数の連結したＡＲＥ配列の下流に位置するレポーター遺伝子を含むＡＲＥレポーター遺伝子コンストラクトを含む細胞、をインビトロで提供する工程と；
ｂ）該細胞とスクリーニングされる被検薬剤を接触させる工程と；
ｃ）該薬剤が、被検薬剤が加えられていない細胞に比較して、レポーター遺伝子の誘導を低下できるか、または発現を低下できるかどうかを検出する工程と、を含むスクリーニング方法が提供される。
【００５０】
本スクリーニングは、細胞の感受性を高めることができ、癌および乾癬などの異常な細胞増殖に関連する疾患の治療に役に立つ薬剤の同定における適用を見出す。
【００５１】
細胞の感受性を高めることそれ自体は、細胞が酸化還元バランスの変化に起因するアポトーシスへの自発的感受性を増加できるので、治療効果を有することができるが、感受性を高めることは、しばしば他の薬剤が望ましくなく増殖する細胞を治療する能力をもたらすか、またはその能力を高めるだろう。そのような薬剤は、感受性を高めることがそれらの作用の効率を改良または促進することが意図される場合には、例えば癌を治療するために慣習的に使用される化学療法剤を含むことができる。
【００５２】
しかしながら、Ｎｒｆ２経路に対するそのような感受性を高める薬剤の効果を考慮すれば、一旦増殖細胞が感受性を高められたならば、他の薬剤も異常な細胞増殖に関連する疾患の治療において有用でありうる。例えば、Ｎｒｆ２のアンタゴナイズ作用の後に治療上効果的になりうる薬剤は、通常はＮｒｆ２によって調節される酵素によって解毒される化合物を含み；酸化ストレスを誘導する化合物、ＭＲＰ２（または関連する排出ポンプ）を介して細胞の中へ／から外へ輸送される、シスプラチン、クロラムブチル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンクリスチンなどの化合物（Wawabe et al., 1999; Smitherman et al., 2004; Vlaming et al., 2006）がこのカテゴリーへと分類されることが意図される。本発明は、さらにＮｒｆ２依存性遺伝子を介して通常は解毒される新規抗腫瘍剤が開発されることを可能にする。この場合において新規薬剤はＮｒｆ２アンタゴニストと共に適用されるか、または抗癌特性に加えてＮｒｆ２阻害活性の両方を持つ二機能性の分子を合成することができるかもしれない。
【００５３】
便利には、使用されるＡＲＥ配列は、ラットＧＳＴＡ２（５’−ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＣＡ−３’）および／またはマウスｇｓｔａ１遺伝子中の配列からである。
【００５４】
任意の哺乳類細胞が適切であるが、望ましくは細胞は腫瘍細胞であり、抗酸化応答を行なうことができる。適切な細胞は、ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２、ＣＨＯおよびＨｅｐａ１およびＨａＣａＴを含み、感受性の理由のためにＭＣＦ７が好まれる。
【００５５】
細胞と被検薬剤の接触は、細胞を増殖させる培養液へ被検薬剤を加えることなどの任意の適切な手段によって行なうことができる。
【００５６】
レポーター遺伝子の誘導は、ＡＲＥ駆動性レポーター遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、または低下させることができる薬剤をより容易に同定するために、または細胞株において寄与する活性が本質的に低い場合に、ｔＢＨＱ、スルフォラファン、マレイン酸ジエチルまたはβ−ナフトフラボンなどの活性化剤の追加によって促進されてもよい。活性化剤は、一般に、被検薬剤の前に細胞へ加えられる。
【００５７】
アンチセンスまたはＲＮＡｉ；技術を使用して、Ｋｅａｐ１の発現をダウンレギュレートすることによってＮｒｆ２を活性化することも可能かもしれない。次に活性化されたＮｒｆ２は、レポーター遺伝子発現の誘導を引き起こすＡＲＥ配列に作用するだろう。Ｂａｃｈ１、Ｂａｃｈ２、ｃＦｏｓおよび小Ｍａｆなどの負に作用する競合する転写因子の発現のダウンレギュレートによって、Ｎｒｆ２の活性を増加させることは同様に可能かもしれない。
【００５８】
被検薬剤が有するＡＲＥ駆動性レポーター遺伝子の誘導に対する効果の検出は、用いられているレポーター遺伝子に依存するが、適切な技術は当業者に周知である。典型的なレポーター遺伝子は、ＧＦＰおよび関連する蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼならびに同種のものを含む。レポーター遺伝子の産物を検出する任意のアッセイは、レポーター遺伝子によりコードされたタンパク質を直接検出することによって、またはレポーター遺伝子にコードされた酵素の酵素産物の検出によってのいずれかで、本発明における使用のために適切である。アッセイは比色アッセイ、蛍光アッセイもしくは発光アッセイ、またはさらにタンパク質タグの場合においては、放射免疫アッセイもしくは他の免疫学的アッセイを含んでいる。これらのアッセイの多くは市販で入手可能である。
【００５９】
典型的には、比較または対照の実験はレポーター活性のレベルまたは程度を確認するために被検薬剤の不在下で使用され、そのため被検薬剤の効果は容易に検出できる。観察されるシグナルレベルに対する候補化合物の効果を基礎レベルと比較して測定することにより、癌の治療で使用される感受性を高める薬剤としての化合物の可能性を評価できる。
【００６０】
便利には、本方法はマルチウェル形式で実行され、多くのそのような検定方法が、任意で自動手段または半自動手段を使用して、複数の化合物について同時に実行されることを可能にするために、例えば２４、４８、９６ウェルプレートを使用できる。
【００６１】
さらなる態様において、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現に対する効果についてのスクリーニング薬剤で使用される細胞が提供される。そこでは細胞は、ラットＧＳＴＡ２遺伝子およびマウスｇｓｔａ１遺伝子からのＡＲＥ配列の複数の連結したコピーの下流にレポーター遺伝子を含むＡＲＥレポーターコンストラクトを含むヒト乳腺ＭＣＦ７細胞である。
【００６２】
好ましくは、レポーター遺伝子は、ホタルまたはウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ遺伝子などのルシフェラーゼ遺伝子である。レポーター遺伝子はさらに、レポーター遺伝子のすぐ上流であるが、ＡＲＥ配列の下流である最小プロモーターの制御下であってもよい。典型的な最小プロモーターはＳＶ４０プロモーターおよびチミジンキナーゼプロモーターを含んでおり、ＡＲＥ配列は、プロモーター配列にじかに隣接できるか、またはそれから最大１０ｋｂの間隔で配置できる。
【００６３】
複数の連結したＡＲＥ配列は、レポーター遺伝子の上流に、連続して頭−尾で位置する。便利には、コピー数は４、５、６、７もしくは８、またはさらに多く、その各々は、５’−ＣＣＣ−３’などの短いリンカー配列で分離される（リンカーのサイズは重要ではない）。好ましくは、コピー数は６〜８以上である。好ましい配列は、特に６つおよび８つのコピーについて表１において示される。
【００６４】
コンストラクトは従来の方法（好都合な制限部位を用いることによってプラスミドの中へコンストラクトの構成要素の各々を導入すること、制限部位の提供を含む末端で特異的配列を導入するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、および同種のもの）に従って調製できる。
【００６５】
レポーターコンストラクトは、調製された後に任意の適切な手段で細胞の中へ導入できる。細胞または細胞株の中へＡＲＥ駆動性レポーターコンストラクトを導入する方法は、トランスフェクション、カチオン性化合物と共に複合体を形成すること、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび同種のものを含む。細胞を増殖させ、次にレポーターコンストラクトの連続的な存在についてスクリーニングする。抗生物質耐性遺伝子がレポーターコンストラクトと共に導入された場合には、細胞を抗生物質耐性について選択し、次に抗生物質耐性細胞を適切な条件下の発光についてスクリーニングする。抗生物質耐性の非存在下では、細胞を発光について直接スクリーニングできる。便利には、発光のためのアッセイは従来の試薬を使用して溶解物で実行される。
【００６６】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼであるならば、従来の市販キットに従って発光を測定できる。細胞は、照度計に適合させることができるマルチウェルプレート中に播種できる。既知数の細胞を適切な培地（候補化合物を加えた）の各ウェルの１つの中へ導入し、培養は少なくとも１２時間、より通常には少なくとも約２４時間、および約６０時間以下、特に約４８時間維持される。候補化合物と併用して、誘導化合物（例えばｔＢＨＱ、スルフォラファン、マレイン酸ジエチルまたはβ−ナフトフラボン）もまた加えることができる。次に培養を、非イオン性界面活性剤（例えば１％トリトンＸ−１００）を使用して、適切な緩衝液中で溶解する。次に細胞を速やかにアッセイする。誘導剤の濃度は薬剤の性質に依存して変化するだろうが、発現を誘導するのに十分である。ｔＢＨＱの濃度は、一般に例えば約１〜１００μＭの範囲内、好ましくは約５０μＭであるだろう。
【００６７】
発光レベルの検出のために他の技術を使用できる。発光を測定する特定の様式は、本発明に重要ではない。
【００６８】
被検薬剤のタイプは低分子化学物質およびペプチド分子を含む。
【００６９】
本発明は、本発明に関連するデータを示す、以下に提供される図１〜１３に関してここでさらに記述される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＡＲＥ駆動性レポータープラスミド地図を示した図である。イラストはｐＧＬ−８×ＡＲＥベクターを示す。ラットＧＳＴＡ２遺伝子およびマウスｇｓｔａ１遺伝子のプロモーターからの単一のＡＲＥは、下線で示された「コア」配列によりプラスミドの上方に提供される。レポータープラスミドが５’−ＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡ−３’配列の８つのタンデム配置されたコピーを含み、各々が５’−ＣＣＣ−３’リンカーにより連結される（表１において示されるように）ことに注目。リンカーのサイズは変更できる。
【図２】ＡＲＥコピー数とＭＣＦ７細胞におけるｔＢＨＱによるレポーター遺伝子活性誘導との間の相関性を示した図である。（Ａ）ＤＭＳＯまたは１０μＭのｔＢＨＱを含む抗生物質添加ＤＭＥＭ中で、ＭＣＦ７細胞を２４時間培養した。その後細胞を採取した。全細胞の抽出物（Ｃｒｕ）の一部（６０μｇのタンパク質）および核抽出物（Ｎｕｃｌｅａｒ）の一部（２０μｇのタンパク質）を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｎｒｆ２タンパク質の発現をウェスタンブロッティングで測定した。スタンダード、１ｎｇの組換えｈｉｓ−ｍＮｒｆ２。示されたブロットは、少なくとも３つの独立した実験からの結果を表わす。（Ｂ）ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレート中に２×１０5細胞／ウェルで播種し、ｐＧＬ３−ｎ×ＡＲＥコンストラクトをトランスフェクションし、５０μＭのｔＢＨＱにより処理した。ルシフェラーゼレポーター活性を１８時間後に測定した。データは、３つの独立した実験の結果を表わす。各実験における各処理には少なくとも３つの重複測定がある。
【図３】ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性はＮｒｆ２によって仲介されることを示した図である。（Ａ）ＡＲＥｃ３２細胞におけるＮｒｆ２の過剰発現は、基底ルシフェラーゼレポーター活性および誘導性ルシフェラーゼレポーター活性の両方を増加させた。ＡＲＥｃ３２細胞は１．５×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種して、２５、５０または１００ｎｇ／ウェルのいずれかのｐＨｙｇ−ＥＦ−ｈＮｒｆ２でトランスフェクションした。同量のｐＥＧＦＰ−Ｎ１を陰性対照としてトランスフェクションした。トランスフェクション後に（２４時間）、細胞をＤＭＳＯ単独または１０μＭのｔＢＨＱ（ＤＭＳＯ中）のいずれかで処理した。ルシフェラーゼ活性をアッセイした。対照、ＤＮＡなしでトランスフェクション試薬のみ細胞に加え、２４時間ＤＭＳＯで処理した。（Ｂ）ＡＲＥｃ３２細胞株におけるＲＮＡｉベクターによるＮｒｆ２のノックダウン。ＡＲＥｃ３２細胞を、増殖培地において８×１０6細胞／ディッシュで１００ｍｍディッシュ中に播種した。２４時間後に、細胞は１枚のプレートあたり２４μｇのｐＲＳ−ｈＮｒｆ２またはｐＲＳ−ＧＦＰでトランスフェクションした。さらに２４時間が経過した後全ＲＮＡを細胞から抽出し、Ｎｒｆ２およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのレベルをタックマン（ＴａｑＭａｎ）ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。１８Ｓ  ｒＲＮＡレベルは内部スタンダードとして使用した。モックトランスフェクションした細胞（対照）からのｍＲＮＡのレベルを１００％に設定した。（Ｃ）ＡＲＥｃ３２細胞におけるＮｒｆ２発現の抑制は、基底ルシフェラーゼレポーター活性および誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を減少させる。パネル（Ｂ）において示される実験に並列の実験において、ＡＲＥｃ３２細胞を１．５×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種し、２５、５０および１００ｎｇ／ウェルのｐＲＳ−ｈＮｒｆ２でトランスフェクションした。同量のｐＲＳ−ＧＦＰを陰性対照としてトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をＤＭＳＯまたは１０μＭのｔＢＨＱで処理した。ルシフェラーゼ活性をアッセイした。対照、ＤＮＡなしでトランスフェクション試薬のみ細胞に加え、２４時間ＤＭＳＯで処理した。ヒストグラフは三重サンプルからの平均±標準偏差としてルシフェラーゼ活性を示す。各実験における各処理には少なくとも３つの重複測定がある。ｐＲＳ−ｈＮｒｆ２またはｐＥＧＦ−Ｎｒｆ２と対照によりトランスフェクションされた培養からのルシフェラーゼ活性の間の差の有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定によって評価された。（＊）ｐ＜０．０５；（＊＊）ｐ＜０．００５。
【図４】ＭＣＦ７細胞における、時間依存的および用量依存的様式でのＡＲＥ駆動性レポーター遺伝子活性のｔＢＨＱによる誘導を示した図である。細胞を、増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を１〜２０μＭのｔＢＨＱを含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換した。次に細胞を４〜２４時間の間でインキュベートし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ＤＭＳＯ（０．１％ｖ／ｖ）で処理した細胞のルシフェラーゼ活性の値を１に設定した。パネル（Ａ）はｔＢＨＱの様々な濃度によるＡＲＥｃ３２細胞の２４時間の処理後のルシフェラーゼ誘導の用量応答を示す。パネル（Ｂ）は１０μＭのｔＢＨＱによるＡＲＥｃ３２細胞の処理後のルシフェラーゼ誘導の時間経過を示す。示されたデータは、３つの独立した実験の結果を表わす。各実験における各処理には少なくとも３つの重複測定がある。
【図５】抗癌剤によるＡＲＥｃ３２細胞におけるレポーター遺伝子活性およびＡＫＲ１Ｃの誘導が酸化還元依存性であることを示した図である。（Ａ）ＢＳＯは、ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼ活性の抗癌剤による誘導を促進した。ＡＲＥｃ３２細胞を０．４×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を５０μＭのＢＳＯを含む増殖培地で置換し；ＢＳＯで前処理されない細胞に等容積のＰＢＳを加えた。さらに２４時間後に（その時間の間にＢＳＯはＧＳＨを枯渇できた）、培養液を、ＤＭＳＯ（対照）または１０μＭシスプラチン、または２０μＭメルファラン、または１００μＭ  ＢＣＮＵ、または１００μＭクロラムブチルのいずれかを含み、すべて５ｍＭのＮＡＣありまたはなしの、抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換し、２４時間インキュベートした。細胞はルシフェラーゼ活性についてアッセイされた。ＤＭＳＯで処理された対照細胞の値を１に設定した。レポーター遺伝子活性データは三重サンプルからの平均±標準偏差を示す。ＮＡＣと共に抗癌剤へ暴露された培養と抗癌剤単独で処理された培養からのルシフェラーゼ活性の間の差の有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定によって評価された。これは３つの独立した実験の結果を表わす。（＊）ｐ＜０．０５；（＊＊）ｐ＜０．００５。（Ｂ）ＡＫＲ１Ｃ  ｍＲＮＡは酸化還元依存的様式で抗癌剤によって誘導された。ＡＲＥｃ３２細胞を、増殖培地において２×１０6細胞／ディッシュで１００ｍｍディッシュ中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を５０μＭのＢＳＯを含む増殖培地で置換した。２４時間後に、培養液を、ＤＭＳＯ、１０μＭ  ｔＢＨＱ、２０μＭメルファラン、１０μＭシスプラチン、１００μＭのＢＣＮＵ、または１００μＭクロラムブチルのいずれかを含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換し、細胞を採取する前にさらに２４時間インキュベートした。ＡＫＲ１Ｃ  ｍＲＮＡの発現をタックマン分析によって測定した。ＤＭＳＯ（対照）で処理された細胞のＡＫＲ１ＣのｍＲＮＡのレベルを１に設定した。抗癌剤へ暴露された培養からのＡＫＲ１Ｃ  ｍＲＮＡのレベルとＤＭＳＯへ暴露された培養からのＡＫＲ１Ｃ  ｍＲＮＡのレベルの間の差の有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定によって評価された。データは、２つの独立した実験の平均を表わし、各実験における各処理には３つの重複測定がある。（＊）ｐ＜０．０５；（＊＊）ｐ＜０．００５。（Ｃ）パネル（Ｂ）中に示された実験に並列の実験において、全細胞の溶解物からの３０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。ＡＫＲ１Ｃの発現を、ウェスタンブロッティングによってＡＫＲ１Ｃに対して特異的抗体で測定した。示されたブロットは、３つの独立した実験からの結果を表わす。
【図６】オールトランスレチノイン酸がＡＲＥ駆動性ルシフェラーゼ活性の誘導を抑制することを示した図である。ＡＲＥｃ３２細胞を、増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を、１０μＭ  ｔＢＨＱ、１０μＭ  ＳＵＬ、１０μＭアクロレインまたは１０μＭβ−ナフトフラボン（ＮＦ）を含む抗生物質添加済み新しいＤＭＥＭで置換し、１μＭオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を誘導剤と共に培地へ併用して加えた。細胞を採取する２４時間前に、細胞をＡＴＲＡありおよびＡＴＲＡなしで様々な誘導剤と共にインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＤＭＳＯ（０．１％ｖ／ｖ）で処理された細胞のルシフェラーゼ活性の値を任意に１に設定し、提供されたデータは三重サンプルからの平均±標準偏差を示す。ＡＴＲＡが存在して誘導因子へ暴露された培養とＡＴＲＡの存在なしで誘導因子へ暴露された培養からのルシフェラーゼ活性の間の差の有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定によって評価された。これは３つの独立した実験の結果を表わす。（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．００５；
【図７】ＡＲＥｃ３２細胞におけるｔＢＨＱによるＡＲＥレポーター活性の誘導に対するＡＴＲＡによる濃度依存的および時間依存的阻害を示した図である。（Ａ）誘導可能なＡＲＥ駆動性遺伝子発現のレチノイン酸による阻害の用量応答を測定するために、ＡＲＥｃ３２細胞を増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を、ＡＴＲＡ、９−シスＲＡまたは１３−シスＲＡのいずれかの様々な濃度（１０-9Ｍ〜１０-6Ｍ）と共に１０μＭのｔＢＨＱを含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換した。その後細胞を採取する前にさらに２４時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を測定した。１０μＭのｔＢＨＱ単独、レチノイン酸なし（対照）により処理された細胞のルシフェラーゼ活性の値を１００％に設定した。（Ｂ）誘導可能なＡＲＥ駆動性遺伝子発現のオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）による阻害の時間経過を立証するために、ＡＲＥｃ３２細胞を増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を、１０μＭのｔＢＨＱ、または１μＭのＡＴＲＡ、または１０μＭのｔＢＨＱにプラスして１μＭのＡＴＲＡを含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換し、さらに４〜２４時間インキュベートした。各タイムポイントでＤＭＳＯ（０．１％ｖ／ｖ）（対照）により処理された細胞のルシフェラーゼ活性の値を任意に１に設定した。示されたデータは３つの独立した実験の結果を表わす。各実験における各処理には少なくとも３つの重複測定がある。
【図８】ｔＢＨＱによる内在性ＡＫＲ１Ｃの誘導がＡＲＥｃ３２細胞においてＡＴＲＡにより阻害されることを示した図である。ＡＲＥｃ３２細胞を、増殖培地において２×１０6細胞／ディッシュで１００ｍｍディッシュ中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を、ＤＭＳＯ、１０μＭ  ｔＢＨＱ、１μＭ  ＡＴＲＡ、または１０μＭ  ｔＢＨＱのいずれかにプラスして１μＭ  ＡＴＲＡを含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換し、さらに２４時間インキュベートした。（Ａ）２４時間の処理後に全ＲＮＡを抽出した。ＡＫＲ１ＣのｍＲＮＡのレベルをタックマン分析により測定した。１８Ｓ  ｒＲＮＡのレベルを内部スタンダードとして使用した。対照、細胞をＤＭＳＯのみで処理した。タックマンデータは三重サンプルからの平均±標準偏差を示し、３つの独立した実験の結果を表わす。異なる処理による培養と対照培養からのｍＲＮＡレベルの間の差の有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定によって評価された。（＊）ｐ＜０．０５。（Ｂ）全細胞の抽出物を異なる薬剤で処理した細胞から調製した。ＡＫＲ１Ｃおよびアクチンの発現をウェスタンブロッティングによって測定した。示されたブロットは３つの独立した実験からの結果を表わす。
【図９】オールトランスレチノイン酸がＮｒｆ２（＋／＋）マウスの小腸において、ＧＳＴ、ＧＣＬＣおよびＮＱＯ１の発現を抑制することを示した図である。「材料および方法ＩＩ」中で記載されているように、野生型（ｎｒｆ２+/+）マウスおよびノックアウト（ＫＯ、ｎｒｆ２-/-）マウス（８週令）を、対照飼料またはビタミンＡ欠損（ＶＡＤ）飼料で６週間飼育した。野生型マウスおよびＫＯマウスの小腸からの粗抽出液の一部（５μｇタンパク質）で、ＮＱＯ１、ＧｓｔＭ５、ＧｓｔＡ１／２およびＧＣＬＣに対する特異的抗体によるウェスタンブロッティングを行なった。各レーンは個別のマウスからのサンプルを含む。一連の実験において、オールトランスレチノイン酸を、実験の最後の２週間ＶＡＤ飼料の野生型動物へ投与した（１０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内）。これらの動物を屠殺し、前述のように、ＧＳＴ、ＧＣＬＣおよびＮＱＯ１についてのイムノブロットを実行した。
【図１０】ＡＴＲＡがＡＲＥｃ３２細胞において抗癌剤によるルシフェラーゼレポーター活性の誘導を抑制することを示した図である。（Ａ）ＡＲＥｃ３２細胞を、１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を、ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭシスプラチン、２０μＭメルファラン、１００μＭ  ＢＣＮＵ、または１００μＭクロラムブチルのいずれかを、１μＭ  ＡＴＲＡありまたはなしで含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換し、２４時間インキュベートした。細胞は、材料および方法中で詳しく述べられるようなルシフェラーゼ活性についてアッセイされた。ＤＭＳＯ処理のＡＲＥｃ３２細胞から得られたルシフェラーゼ値を１に設定した。（Ｂ）ＡＲＥｃ３２細胞を、０．４×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を５０μＭのＢＳＯを含む増殖培地で置換し；等容積のＰＢＳをＢＳＯ前処理なしで細胞へ加えた。５０μＭのＢＳＯとの２４時間のインキュベーションに続いて（細胞内ＧＳＨを枯渇させる）、培地を、ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭシスプラチン、２０μＭメルファラン、１００μＭカルムシチン（ｃａｒｍｕｓｉｔｉｎｅ）または１００μＭクロラムブチルのいずれかを、１μＭのＡＴＲＡありまたはなしで含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換し、２４時間インキュベートした。細胞は、材料および方法中で詳しく述べられるようなルシフェラーゼ活性についてアッセイされた。ＤＭＳＯで処理された対照細胞の値を１に設定した。データは三重サンプルからの平均±標準偏差を示す。ＡＴＲＡと共に抗癌剤へ暴露された培養と抗癌剤単独で処理された培養からのルシフェラーゼ活性の間の差の有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定によって評価された。これは３つの独立した実験の結果を表わす。（＊）ｐ＜０．０５；（＊＊）ｐ＜０．００５）。
【図１１】ＡＴＲＡがＮｒｆ２の核移行をブロックしないことを示した図である。核抽出物を、１０μＭ  ｔＢＨＱ、１μＭ  ＡＴＲＡ、または１０μＭ  ｔＢＨＱのいずれかに１μＭ  ＡＴＲＡをプラスしたものより２４時間処理したＡＲＥｃ３２細胞から調製した。核抽出物からの一部（２０μｇのタンパク質）を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ニトロセルロース転写膜上にブロットし、マウスタンパク質に対する抗体を使用してＮｒｆ２の存在を検出した。パネルＡにおいて、示されたブロットは少なくとも３つの独立した実験の典型的な結果を表わす。パネルＢにおいて、Ａにおいて示されたブロットをデンシトメトリーによってスキャンした。
【図１２】ＡＴＲＡがＡＲＥ配列へのタンパク質複合体の結合を減少させることを示した図である。１０μＭのｔＢＨＱで２４時間インキュベートしたＡＲＥｃ３２細胞からの核抽出物（１０μｇのタンパク質）を、１μＭのＡＴＲＡの非存在下または存在下でＡＲＥを結合する能力についてＥＭＳＡによって分析した。２００倍過剰の未標識ＡＲＥを結合の特異性をモニタリングするために使用した。矢印は、ＤＮＡタンパク質複合体の特異的なバンドを示す。結果は３つの独立した実験を表わす。
【図１３】ＡＴＲＡがＮｒｆ２のＡＲＥ配列への結合を妨害することを示した図である。核抽出物を、１μＭのＡＴＲＡの非存在下または存在下で１０μＭのｔＢＨＱと共に２４時間インキュベートしたＡＲＥｃ３２細胞から調製した。核抽出物の一部（１００μｇタンパク質）をビオチン化ＡＲＥオリゴヌクレオチドと共にインキュベートし、材料および方法中で詳しく述べられるようにプルダウンアッセイを実行した。プルダウンしたビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥへかけ、特異的な抗Ｎｒｆ２抗体によりイムノブロットした。モックオリゴヌクレオチドを陰性対照として含んだ。
【図１４】ＢＴＢ０９４６３およびレチノイン酸がＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ３２中のルシフェラーゼのｔＢＨＱ誘導性発現をアンタゴナイズできることを示した図である。
【図１５】ｔＢＨＱの追加前に最大４８時間のＢＴＢ０９４６３によるＡＲＥｃ３２細胞の前処理が、併用投与として、ルシフェラーゼ発現に対して同一の抑制効果を有することを示した図である。
【図１６】いくつかのレチノイドが、ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ３２におけるルシフェラーゼのｔＢＨＱ誘導性発現をアンタゴナイズすることを示した図である。
【図１７】ＢＴＢ０９４６３およびレチノイン酸が、２つの独立した細胞株においてタンパク質レベルでＡＲＥ駆動性遺伝子ＡＫＲ１Ｃ（およびＮＱＯ１）のスルフォラファンに誘導される発現をアンタゴナイズできることを示した図である。
【図１８】ＢＴＢ０９４６３が、ｍＲＮＡのレベルでＡＲＥ駆動性遺伝子ＡＫＲ１Ｃ１のスルフォラファンに誘導される発現にアンタゴナイズできることを示した図である。
【図１９】いくつかのレチノイドが、ＭＣＦ７細胞においてタンパク質レベルでＡＲＥ駆動性遺伝子ＡＫＲ１Ｃのスルフォラファンに誘導される発現をアンタゴナイズできることを示した図である。
【図２０ａ】一般に処方される抗癌薬物が、ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ２３におけるルシフェラーゼ活性を誘導することができることを示した図である。
【図２０ｂ】ＢＴＢ０９４６３およびレチノイン酸が、ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ３２におけるカルムスチン誘導のルシフェラーゼ活性をアンタゴナイズすることを示した図である。
【図２０ｃ】ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ３２における化学療法剤に誘導されるルシフェラーゼ活性のレチノイン酸のアンタゴナイズ作用のさらなる特性解析を示した図である。
【図２０ｄ】カルムスチンはＣａｃｏ−２細胞においてタンパク質レベルでＡＲＥ遺伝子ＡＫＲ１Ｃを誘導することができ、この誘導はＢＴＢ０９４６３との併用処理によって抑制できることを示した図である。
【図２０ｅ】ＢＴＢ０９４６３が、ＭＣＦ７細胞におけるＡＲＥ駆動性遺伝子のカルムスチンで誘導される発現をタンパク質レベルでアンタゴナイズするという支持へのさらなる証拠を示した図である。
【図２１】ＢＴＢ０９４６３が相乗的方式でＭＣＦ７細胞におけるカルムスチン毒性を増加させることを示した図である。
【図２２】細胞毒性抗生物質ブレオマイシン（Ａ〜Ｃ）またはカルムスチン（Ｄ）を投与したＭＣＦ７細胞が、レチノイン酸（Ａ）、酢酸レチニル（ＢおよびＤ）またはアシトレチン（Ｃ）により共処理されたとき、細胞死滅が大きく相乗的に増加することを示した図である。
【図２３】ＢＴＢ０９４６３およびレチノイドが、Ａ５４９細胞における内在性ＡＫＲ１Ｃ１  ｍＲＮＡの構成的レベルを抑制することを示した図である。
【図２４】ＢＴＢ０９４６３およびレチノイドが、Ａ５４９細胞におけるＡＲＥ遺伝子の一連メンバーであるタンパク質のレベルを抑制することを示した図である。
【図２５】ＢＴＢ０９４６３が、Ａ５４９細胞においてＡＲＥ駆動性遺伝子についてのｍＲＮＡの構成的レベルを阻害することを示した図である。
【００７１】
材料および方法Ｉ
化学物質および細胞培養
特別の指示の無い限り、化学物質はすべてシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）  社、ドーセット、イギリスから購入した。Ｄ．Ｌ−スルフォラファンは、ＬＫＴラボラトリーズ（ＬＫＴ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（セント・ポール、ミネソタ、アメリカ）から入手した。ＯＴＯ０９６４６３は、メイブリッジ・ケミカル社の化合物ライブラリーの化学的スクリーニングから同定され、ＡＣＤコードＭＦＣＤ００１７３６６９下でそれらから利用可能である。ＨｅｐＧ２（ヒト肝芽腫）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）、Ｈｅｐａ１（マウス肝臓癌）およびＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣癌）細胞株は、英国癌研究所（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ−ＵＫ）（ロンドン、イギリス）の細胞サービスから入手した。ＭＣＦ７細胞のための増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質を添加したグルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）含有ダルベッコＭＥＭであった。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％のＦＢＳおよび抗生物質を添加したグルタマックス含有ダルベッコＭＥＭ中で維持した。Ｈｅｐａ１細胞を、１０％ＦＢＳ、抗生物質、１％非必須アミノ酸および２．５μｇ／ｍｌウシインスリンを添加したグルタマックス含有ダルベッコＭＥＭ中で維持した。ＣＨＯ細胞を、１０％ＦＢＳ、抗生物質、１％チミジンおよび１％ヒポキサンチンを添加したグルタマックス含有ダルベッコＭＥＭ中で維持した。すべての細胞を９５％空気および５％ＣＯ２中３７℃で培養し、３〜４日ごとに継代した。すべての細胞培養のための培地添加物はライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、ペーズリー、イギリスから購入した。
【００７２】
レポータープラスミドおよび発現コンストラクト
ＡＲＥ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＳＶ４０プロモーターを含むｐＧＬ３−プロモーターベクター（プロメガＵＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＫ）、サザンプトン、イギリス）を使用して作製した。それらを表１中に要約する。これらのプラスミドは、プロモーター−ｌｕｃ＋転写ユニットの上流のＮｈｅ１およびＸｈｏ１の制限部位を介して頭−尾方向で挿入されたＡＲＥ配列のコピー数が、異なる。ラットＧＳＴＡ２およびマウスｇｓｔａ１中に存在するＡＲＥ（５’−ＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡ−３’、下線部の最小の機能性配列を有する）の１、２、４、６または８個のいずれかのコピーを含む５つのプラスミドを作製し；これらはｐＧＬ−ｎ×ＡＲＥと呼ばれた。向かい合った鎖上に５’−ＣＣＣ３−’および５’−ＧＧＧ３−’の配列を有するリンカーを、個々のシスエレメントの間に置いた。さらに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動するラットＧＳＴＡ２遺伝子プロモーターのヌクレオチド−６８２〜−７２２の４１ｂｐ（５’−ＧＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧ−３’、最小の機能性エンハンサーは下線で示される）を表わす、ｐＧＬ−ＧＳＴＡ２ＡＲＥと命名されたプラスミドを作製した。マウスｇｓｔａ１において、この配列は５’−ＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＧ−３’である（Hayes & Pulford, 1995）。オリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ−バイオテック（ＢＩＯＴＥＣＨ）社（エバーセルク（Ｅｂｅｒｓｅｒｇ）、ドイツ）によって合成された。プラスミドを作製した後、インサートのＤＮＡ配列を検査した。
【００７３】
ｐＨｙｇ−ＥＦ−ｈＮｒｆ２（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−タグ付加ヒトＮｒｆ２発現ベクター）は、Ｍａｓａｙｕｋｉ  Ｙａｍａｍｏｔｏ教授（筑波大学、基礎医学系、日本）からの寄贈であった。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（陰性対照として用いられるＧＦＰ発現ベクター）は、ＢＤクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＵＫ社（ハンプシャー、イギリス）から入手した。
【００７４】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の一時的なトランスフェクションおよび分析
デュアルルシフェラーゼのレポーターアッセイ系（プロメガ社）を一過性にトランスフェクションした細胞におけるレポーター遺伝子活性を検査するために使用した。簡潔には、細胞を２４ウェルプレートにおいて２×１０5細胞／ウェルの密度で播種し、適切な培地中で増殖させた。一晩のインキュベーション後に、細胞に、様々なＡＲＥ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを一過性にトランスフェクションした。プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケ属ルシフェラーゼをコードする）を、トランスフェクション効率に対する対照に使用した。トランスフェクションは、製造者の使用説明書に従って、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００試薬（リファー・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、コベントリー、イギリス）を使用して実行した。トランスフェクションに続いて、培養液を、各実験の直前に調製された５０μＭのｔＢＨＱ（最終濃度０．１％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を与える溶液において）を含む新しい増殖培地で２４時間後に置換した。対照実験のために、媒質単独（０．１％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ）を増殖培地へ加えた。細胞を採取前に生体異物へ応答するように２４時間放置し、細胞溶解物中のホタルおよびウミシイタケ属のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（プロメガ社）の追加後に、照度計（ターナー・デザインズ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）、モデルＴＤ−２０／２０、プロメガ社）を使用して測定した。反応のクエンチング後に、ストップアンドグロー（Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ）試薬（プロメガ）を加えることによってウミシイタケ属ルシフェラーゼ反応を開始した。ウミシイタケ属ルシフェラーゼ活性に対してホタルルシフェラーゼ活性を正規化することによって、相対的なルシフェラーゼ活性を計算した。
【００７５】
安定したＡＲＥ駆動性レポーター系の作製
ｐＧＬ−８×ＡＲＥを、ネオマイシンにより選択可能なマーカーを含むｐＣＤＮＡ３．１プラスミドと一緒に、リン酸カルシウム法を使用して、ＭＣＦ７細胞の中へ安定的にトランスフェクションした（Moffat et al., 1997）。トランスフェクションされた細胞を、３〜４週間培地中の０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を使用して選択した。Ｇ４１８耐性クローンは、基底ルシフェラーゼ活性、および誘導性ルシフェラーゼ活性（５０μＭのｔＢＨＱによって）の測定によって分離およびスクリーニングした。上述されるように、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。陽性のクローン（それらは低いバックグラウンドおよび高い誘導性ルシフェラーゼ活性を示す）を継代し、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む増殖培地中で維持した。
【００７６】
安定したＡＲＥ−ルシフェラーゼレポーター細胞の生体異物処理
ＢＣＮＵおよびメルファランを１０００×濃縮溶液として酸性化エタノール中に溶解した。ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサートおよびパクリタキソールを、リン酸緩衝生理食塩水中に溶解した。他の抗癌剤をＤＭＳＯ中の１０００×濃縮ストック溶液として調製し、使用まで−２０℃で保存した。抗癌剤による処理のために、細胞を、増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルの密度で９６ウェルマイクロタイタープレート中に播種した。一晩の回復後に、培養液を、対象となる抗癌剤と共に抗生物質添加済みの新しいダルベッコＭＥＭで置換した。等容積の媒質を対照ウェルへ加えた。２４時間の処理後に、上述されるように、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７７】
安定したＡＲＥ−ルシフェラーゼレポーター細胞におけるｈＮｒｆ２の過剰発現
トランスフェクションのために、ＡＲＥｃ３２細胞を、１００μｌ増殖培地において１．５×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。一晩の回復後に、リポフェクタミン２０００試薬を使用して、２５〜１００ｎｇ／ウェルのｐＨｙｇ−ＥＦ−ｈＮｒｆ２ベクターまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターを、細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後の４時間の回復期間に続いて、培養液を、グルタマックスおよび１０μＭのｔＢＨＱ（またはＤＭＳＯ単独）を含む抗生物質添加済みの新しいダルベッコＭＥＭで置換した。等容積のＤＭＳＯを対照ウェルへ加えた。最終的に、ｔＢＨＱによる２４時間の処理後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７８】
Ｎｒｆ２  ｓｉＲＮＡベクターの調製およびトランスフェクション
ｐＲＳ  ｈＮｒｆ２（ヒトＮｒｆ２を標的とするｐＳＵＰＥＲ  ＲＮＡｉベクター）を、スーパー（ＳＵＰＥＲ）ＲＮＡｉ（商標）ライブラリー（オランダ癌研究所（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、アムステルダム、オランダ）のグリセロールストックから回収した。この研究において使用されるｐＲＳ−ｈＮｒｆ２中のオリゴインサートの配列は、ｈＮｒｆ２  ｃＤＮＡの２０８３〜２１０１（ナンバリングはＡＴＧ開始コドン中のＡからである）の領域に対応する、５’−ＧＣＡＴＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＴＧ−３’であった。ＧＦＰを標的とするｐＳＵＰＥＲ  ＲＮＡｉベクター（ｐＲＳ−ＧＦＰ）も、スーパーＲＮＡｉ（商標）ライブラリーから得て、陰性対照として使用した。
【００７９】
ｐＳＵＰＥＲ  ＲＮＡｉによるトランスフェクションのために、ＡＲＥｃ３２細胞を１００μｌ増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。一晩のインキュベーション後に、２５〜１００ｎｇ／ウェルのｐＲＳ−ｈＮｒｆ２またはｐＲＳ−ＧＦＰのｐＳＵＰＥＲベクターをリポフェクタミン２０００試薬を使用して、細胞の中にトランスフェクションした。トランスフェクションからの回復に続いて（２４時間）、培養液を、グルタマックスおよび１０μＭのｔＢＨＱ（またはＤＭＳＯ単独）を含む抗生物質添加済みの新しいダルベッコＭＥＭで置換した。２４時間の処理後に、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＮＡｉの特異性をタックマン分析によって確認した。
【００８０】
統計分析
統計比較を対応のないスチューデントのｔ検定によって実行した。ｐ＜０．０５の値が有意であると統計的に判断された。
【００８１】
結果
機能的なＡＲＥ駆動性レポータートランス遺伝子を発現する安定した細胞株の作製
この研究において、ラットＧＳＴＡ２遺伝子およびマウスｇｓｔａ１遺伝子のプロモーターに共通のシスエレメントの１、２、４、６または８個のいずれかのコピーを含む一連のＡＲＥ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを作製した。ＡＲＥ配列を表１中にリストする。これらのレポーターコンストラクトを、ＭＣＦ７細胞およびＨｅｐＧ２細胞における一過性トランスフェクションによって検査した。図２中に示されるように、ｐＧＬ３のプロモーター中のＡＲＥのコピー数を増加させることは、通常の恒常的条件下で観察されるルシフェラーゼ活性の基底レベルに対して有意な効果はなかった。しかしながら、ＭＣＦ７細胞におけるｐＧＬ３プロモーターベクター中のＡＲＥコピーの数とｔＢＨＱによるルシフェラーゼ活性の誘導のレベルとの間には十分な相関性があった。これらの結果から、ラットＧＳＴＡ２−ＡＲＥの複数のコピーのトランスフェクションが、ｔＢＨＱ処理に対するレポーター遺伝子活性（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の感受性を増加させたことを実証したNguyen et al., 1994）の結果が確認される。
【００８２】
安定したレポーター細胞株の作製のための適切な細胞系を選ぶために、ｐＧＬ−ＧＳＴＡ２．４１ｂｐ−ＡＲＥをＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＣＨＯ、Ｈｅｐａ１細胞の中へトランスフェクションした。表２中に示されるように、このコンストラクトによる一過性トランスフェクション実験では、ＭＣＦ７細胞におけるルシフェラーゼ活性は５０μＭのｔＢＨＱによる一晩の処理後に５０倍まで誘導された。これとは対照的に、ＨｅｐＧ２、ＣＨＯまたはＨｅｐａ１細胞における同様のトランスフェクション実験後に、レポーター遺伝子は２〜４倍のみ誘導された。したがって、ＭＣＦ７細胞がＮｒｆ２を発現し、ＡＲＥ駆動性転写の測定のために感受性のある細胞系を提供できるということを我々の結果は示した。
【００８３】
このコンストラクトが、ｔＢＨＱによる処理後にかなり高レベルの誘導性ルシフェラーゼ産生を与えたので、レポーターが安定して存在する細胞株を産生するためのプラスミドとして、ｐＧＬ−８×ＡＲＥ（タンデム配置した８コピーの最小の機能性ＡＲＥを含む）を用いることに決定した。この目的を達成するために、ｐＧＬ−８×ＡＲＥおよびｐＣＤＮＡ３．１（ネオマイシンにより選択可能なマーカーを含む）を、ＭＣＦ７細胞の中へ安定的に共トランスフェクションし、Ｇ４１８の存在下で選択した。１５３個のＧ４１８耐性クローンが単離された。最初の継代後に、基底ルシフェラーゼ活性および誘導性ルシフェラーゼ活性に従って、３２個のクローンをさらなるモニタリングのために維持した。中でも、ＡＲＥｃ３２として定義された１つのクローンは、低い基底ルシフェラーゼ活性および高い誘導性ルシフェラーゼ活性を示し、２０代以上の継代後にも安定した表現型が実証された。残りのクローンは、１０μＭのｔＢＨＱによる低誘導レベル（２〜６倍）または多くの継代による不安定な表現型のいずれかを示したので廃棄した。したがってＡＲＥｃ３２細胞をさらなる研究のために保存した。
【００８４】
ＡＲＥｃ３２細胞におけるＡＲＥ駆動性ルシフェラーゼ活性の誘導はＮｒｆ２によって仲介される。
ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼ活性がＮｒｆ２に対して応答したものであることを確認するために、このＣＮＣ  ｂＺＩＰタンパク質を、発現コンストラクトｐＨｙｇ−ＥＦ−ｈＮｒｆ２の一過性トランスフェクションによってＡＲＥｃ３２細胞において過剰発現させた。図３中に示されるように、１０μＭのｔＢＨＱを処理したときにＤＮＡがトランスフェクションミックス中に含まれない対照細胞では、ルシフェラーゼ活性は１３倍誘導された。１ウェルあたり２５ｎｇのｐＨｙｇ−ＥＦ−ｈＮｒｆ２プラスミドＤＮＡを使用したときには、基底ルシフェラーゼ活性も誘導性ルシフェラーゼ活性も有意に影響されなかった。しかしながら１ウェルあたり５０ｎｇのｐＨｙｇ−ＥＦ−ｈＮｒｆ２によるトランスフェクション後には、ルシフェラーゼ活性の基底レベルは２．６倍に増加し、誘導性レベルは１９倍に増加した。１００ｎｇのｐＨｙｇ−ＥＦ−ｈＮｒｆ２によるトランスフェクション後には、レポーター遺伝子基底活性は４倍に、および誘導性レベルは２５倍に増加した。異なるウェルにおいて、同量のｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＥＧＦＰ発現ベクター）を、陰性対照としてＡＲＥｃ３２細胞の中へトランスフェクションした。基底のルシフェラーゼ活性も誘導性ルシフェラーゼ活性も、ＥＧＦＰの過剰発現によっては有意に影響されなかった。
【００８５】
Ｎｒｆ２がＡＲＥｃ３２細胞においてｔＢＨＱによるルシフェラーゼ活性の誘導を仲介するかどうかを決定するために、発現をノックダウンするためにＲＮＡｉベクターを使用した。図３Ｂは、ｐＲＳ−ｈＮｒｆ２ベクターまたはｐＲＳ−ＧＦＰベクターのいずれかによるＡＲＥｃ３２細胞のトランスフェクションがＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルに影響しないことを示す。しかしながら、ｐＲＳ−Ｎｒｆ２によるトランスフェクションの２４時間後に、Ｎｒｆ２についての内在性ｍＲＮＡのレベルは対照レベルの約４０％まで減少したが、その存在量はｐＲＳ−ＧＦＰベクターによるトランスフェクションによって影響されなかった（図３Ｂ）。この結果は、ｐＲＳ−ｈＮｒｆ２のトランスフェクションがｂＺＩＰ因子の発現を特異的に抑制したことを示す。
【００８６】
ｐＲＳ−ｈＮｒｆ２によるＡＲＥｃ３２細胞のトランスフェクションは、ルシフェラーゼ活性の基底レベルを対照レベルの６０％まで減少させた（図３Ｃ）。１ウェルあたり２５ｎｇのｐＲＳ−ｈＮｒｆ２  ＤＮＡを使用したときには、ルシフェラーゼ活性の誘導は、ＤＮＡがトランスフェクションミックス中に含まれてない対照細胞（１０倍の誘導）に比較して、有意に影響されなかった。５０ｎｇのｐＲＳ−ｈＮｒｆ２  ＤＮＡを使用したときには、１０μＭのｔＢＨＱによるルシフェラーゼ活性の誘導は８倍まで減少した。１ウェルあたり１００ｎｇのｐＲＳ−ｈＮｒｆ２  ＤＮＡを使用したときには、ｔＢＨＱによって６倍の誘導のみが検出された。異なるウェルにおいて、ＡＲＥｃ３２細胞を同量のｐＲＳ−ＧＦＰ  ＤＮＡ（ＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的とする）によりトランスフェクションしたときに、基底ルシフェラーゼ活性および誘導性ルシフェラーゼ活性は影響されなかった（図３Ｃ）。これらのデータは、ＡＲＥｃ３２細胞において基底ルシフェラーゼ活性および誘導性ルシフェラーゼ活性が、ＡＲＥを介してＮｒｆ２によって仲介されることを示す。
【００８７】
ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼの時間依存的および用量依存的な誘導
ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼ活性は時間依存的および用量依存的様式で誘導することができ；２４時間間処理後に、ルシフェラーゼ活性は１μＭのｔＢＨＱによって２倍および５μＭのｔＢＨＱによって５倍増加した（図４Ａおよび表３を参照）。最大ルシフェラーゼ活性（約１０倍の増加）は、１０μＭのｔＢＨＱによる処理後に観察された。ｔＢＨＱによるルシフェラーゼ活性の誘導は時間依存的でもあり；それは、１０μＭのｔＢＨＱによる８時間の処理後に４倍増加し、同一用量のｔＢＨＱによる処理の１８時間後に１０倍に達した。ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼ活性の誘導の同様の大きさは、１０μＭスルフォラファン（ＳＵＬ）（ＮＱＯ１およびＡＫＲ１Ｃの強力な酵素誘導因子）に対する２４時間の暴露後に観察された（Bonnesen et al., 2001）。
【００８８】
ＡＲＥレポーター遺伝子発現に対する抗癌剤の効果
癌化学療法剤がＮｒｆ２−ＡＲＥ系を修飾するかどうかを知るために、多数の抗癌剤をＡＲＥｃ３２細胞を使用してスクリーニングした。ＩＣ50の結果に基づいて（データ不掲載）、ＡＲＥｃ３２細胞を致死未満用量の複数の治療剤により２４時間処理した。ルシフェラーゼ活性に対するそれらの効果に従って、これらの薬物を３つの群へと表４中で分類した：有意な効果はないもの、中等度の活性化剤、および強力な活性化剤である。したがって、ドキソルビシン、エピルビシン、パクリタキソール（タキソール）、メトトレキサートおよびチオテパの処理は、ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼ活性レベルに対して効果がなかった。アルキル化剤シスプラチン、メファラン（ｍｅｐｈａｌａｎ）および酸化還元サイクル化合物エトプシドは、中等度にルシフェラーゼ活性を増加させた。アルキル化剤のクロラムブチル、ミトザントロンおよびＢＣＮＵによるＡＲＥｃ３２細胞の処理は、２〜４倍のルシフェラーゼ活性のより強力な誘導を誘発した。
【００８９】
ＡＲＥｃ３２細胞を使用して、シクロホスファミド処理がＡＲＥ−ルシフェラーゼ活性に対していかなる効果もないことが明らかになった。これとは対照的に、その主要な代謝物質アクロレインは、強力なＡＲＥ活性化剤であることが見出された；１０μＭアクロレインにより、ルシフェラーゼ活性が２７倍増加した。
【００９０】
抗癌剤によるＡＲＥ駆動性遺伝子発現の活性化は酸化還元反応依存的である。
細胞のＧＳＨレベルが、抗癌剤によるルシフェラーゼ活性の活性化能力に対する効果を有するかどうかを調べるために、我々は、化学療法剤を投与する前に、５０μＭのＢＳＯでＡＲＥｃ３２細胞を２４時間前処理した。図５Ａに示されるように、ＢＳＯによる前処理は、シスプラチンおよびメルファランによるルシフェラーゼ活性の誘導をそれぞれ３倍および５倍に増加させた。より顕著に、ＢＳＯは、クロラムブチルおよびＢＣＮＵによるルシフェラーゼ活性の誘導を＞１０倍に増加させた。そのような誘導は、約５ｍＭのＮＡＣの追加によって完全に抑制された（図５Ａ）。エトプシドおよびミトザントロンの処理については、ＢＳＯ前処理がルシフェラーゼ活性を有意に変化させないことが明らかにされた（データ不掲載）。
【００９１】
抗癌剤が内在性Ｎｒｆ２調節遺伝子の発現を同様に活性化するかどうかを知るために、ＡＲＥｃ３２細胞におけるＡＫＲ１Ｃの発現を検討した。ＢＳＯによる前処理なしでは、ＡＫＲ１ＣのｍＲＮＡレベルは、メルファラン、シスプラチン、クロラムブチルの処理によってわずかだけ増加した。しかしながら、細胞を５０μＭのＢＳＯにより２４時間前処理したときに、メルファランおよびシスプラチンはＡＫＲ１ＣのｍＲＮＡの発現をそれぞれ３倍および４倍まで増加させ、クロラムブチルはこのｍＲＮＡを３１倍増加させた（図５Ｂ）。ＢＣＮＵによる処理は、ＡＫＲ１ＣのｍＲＮＡの発現を３倍に誘導し、ＢＳＯ  ＢＣＮＵの前処理によりＡＫＲ１ＣのｍＲＮＡを４２倍に誘導した（図５Ｂ）。イムノブロットは、ＡＫＲ１Ｃタンパク質もまたこれらの抗癌剤によって増加することを明らかにした（図５Ｃ）。ＢＳＯ前処理は、ｔＢＨＱ処理によるＡＫＲ１Ｃタンパク質の発現をさらに促進しなかった。しかしながら、これは、恐らく１０μＭのｔＢＨＱ単独によるＡＫＲ１Ｃの誘導が既に最大レベルに達していたからであろう。
【００９２】
考察
ルシフェラーゼトランス遺伝子の発現を指令するために最小のエンハンサー配列のみが存在する、安定したＡＲＥレポーターヒト乳腺細胞株（ＭＣＦ７細胞に由来するＡＲＥｃ３２）を作製した。この目的のために用いられるＡＲＥは、ラットＧＳＴＡ２およびマウスｇｓｔａ１の両方のプロモーターで見出されるものの付近にデザインされた。ｇｓｔａ１の場合、その基底発現および誘導性発現はインビボのＮｒｆ２によって調節されることが示された（Chanas et al., 2002）。さらに、ヒトＮＱＯ１中のプロモーターとは異なり、ＧＳＴＡ２およびｇｓｔａ１のプロモーターは組み込まれているＡＰ１部位を含んでおらず、ＡＲＥ内にこの部位が存在しないことがレポーター遺伝子活性の誘導の実行を促進するので、ＧＳＴＡ２およびｇｓｔａ１のプロモーターからのＡＲＥを使用した。ＡＲＥｃ３２細胞において、ルシフェラーゼ活性の発現はＮｒｆ２によって仲介され、酸化還元状態に対して感受性のあることが示された。この細胞株は、１０μＭのｔＢＨＱによってレポーター活性が１０倍誘導され、したがってＮｒｆ２のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための化学的ライブラリーのスクリーニングに使用できる十分なモデル系を提供する。
【００９３】
抗癌薬剤に対するＡＲＥｃ３２細胞の応答
本研究において、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現を誘導する抗癌性アルキル化剤の能力を検討するために、ＡＲＥｃ３２細胞を使用した。シスプラチン、エトポシド（ＶＰ１６）、ミトザントロン、メルファラン、クロラムブチルおよびＢＣＮＵが、ルシフェラーゼを誘導できることが明らかになった。これらの化学療法剤によるＡＲＥ−ルシフェラーゼの誘導は、それがＢＳＯ前処理によって増大され、ＮＡＣによって抑制される場合、酸化還元感受性であることが見出された（図５Ａ）。興味深いことには、このことは、特定の抗癌剤による患者の準最適の治療は、Ｎｒｆ２によって制御される腫瘍において、細胞保護防衛を誘導することを示唆する。更に、腫瘍における細胞の酸化還元状態は、そのような防衛を活性化するそれらの能力に影響を及ぼすだろう。
【００９４】
材料および方法ＩＩ
化学物質
ＡＲＥｃ３２細胞の処理において使用されるレチノイドはＤＭＳＯ中に調製され、マウスに対して投与されるレチノイドはトウモロコシ油中に調製された。レチノイド溶液は小分けにして−７０℃で保存し、各々を解凍した後は１回だけ使用した。レチノイドの投与に関係する実験手順は、薄明かりで実行した。
【００９５】
動物
ホモ接合Ｎｒｆ２  ＫＯマウスおよびマウスの遺伝子型決定は、以前に記述した通りであった（Itoh et al., 1997）。２か月のＣ５７ＢＬ／６  ｎｒｆ２-/-およびｎｒｆ２+/+のオスマウスをこの研究で使用した。動物は餌および水を自由に摂取させて１２時間の明暗サイクルで飼育した。マウスは実験期間の間毎日体重測定した。すべての動物手順は、イギリス内務省のライセンス下で、および地方倫理委員会の承認取得後に行なわれた。
【００９６】
２つの摂食実験を実行した。実験１において、第一ステージ（４週間続いた）では、Ｎｒｆ２（＋／＋）マウスをレチノイン酸欠損のＶＡＤ飼料で飼育した（スペシャル・ダイエット・サービス（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）社、ウィザム、エセックス、イギリス）。第二ステージ（２週間続いた）では、マウスを３つの実験群へ分類し、それらの飼料および処理は：（ａ）１群、ＶＡＤ飼料；（ｂ）２群、ＶＡＤ飼料および１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で毎日ＡＴＲＡを投与した；（ｃ）３群、ＶＡＤ飼料およびトウモロコシ油を腹腔内で毎日投与した、である。実験２において、Ｎｒｆ２（／−）マウスを対照飼料またはＶＡＤ飼料で６週間飼育した。
【００９７】
６週間の終わりまでに、マウスを屠殺し、小腸を直ちに切除し、液体窒素中で凍結し、使用まで−７０℃で保存した。摂食実験は３回繰り返され、各実験群は２匹または３匹の動物を含んでいた。
【００９８】
細胞培養およびルシフェラーゼ活性の測定
上の材料および方法セクション中で記載されるようにＡＲＥｃ３２細胞を調製し、９５％空気および５％ＣＯ2において３７℃で０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む増殖培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質添加済みのグルタマックス含有ダルベッコＭＥＭ）で維持し、３〜４日ごとに継代した。細胞培養のための培地添加物はライフ・テクノロジーズ社（ペーズリー、イギリス）から購入した。
【００９９】
生体異物処理のために、ＡＲＥｃ３２細胞を増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を、生体異物（０．１％ｖ／ｖ）を含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換した。細胞を採取前に生体異物へ応答するように２４時間間放置し、細胞溶解物中のホタルルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社）の追加後に、照度計（ターナー・デザインズ、モデルＴＤ−２０／２０、プロメガ社）を使用して測定した。対照実験のために、媒質単独（０．１％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ）を培地へ加えた。
【０１００】
リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡをトリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）により単離し、製造者の使用説明書に従ってＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）  社）によりさらに精製した。使用される全ＲＮＡのＡ２６０／Ａ２８０比は典型的には≧１．９であった。ＲＮＡの質はアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザーを使用して評価した。以前に記述したようにＲＴ−ＰＣＲを実行した(Wang et al., 2005)。プライマーはＭＷＧ−バイオテック社によって合成された。プローブ（５’蛍光レポーター色素（６−カルボキシフルオレセイン）および３’クエンチング色素（６−カルボキシテトラメチルローダミン）で標識された）は、キアゲン社（ドイツ）によって合成された。各アッセイは三回行った。オリゴヌクレオチドプライマーの様々なセットからのＰＣＲ増幅の特異性を、アガロースゲル電気泳動によってルーチンに調べた。結果は７７００システムソフトウェアの使用によって分析した。１８Ｓ  ｒＲＮＡのレベルを内部スタンダードとして使用した。ヒトＡＫＲ１ＣのｍＲＮＡへ対応するｃＤＮＡの測定のためのプライマーおよびプローブに対する配列は以前に記述されている(Devling et al., 2005)。
【０１０１】
ウエスタンブロット分析
全細胞の抽出物は以前に記述したように培養細胞から調製した(Wang XJ 2006)。簡潔には、プロテアーゼ阻害剤混合物（ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社）を追加した０．１Ｍヘペス（ｐＨ  ７．４）、０．５Ｍ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロールを含む抽出緩衝液中で、細胞を溶解した。タンパク質サンプル（３０μｇ）を、標準的なプロトコールを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。以前に記述したように、ＡＫＲ１Ｃに対して作製された抗血清を使用してイムノブロットを実行した(O'Connor et al., 1999)。以前に記述したように、小腸サイトゾルを調製した(McMahon et al., 2001)。小腸サンプルからの５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってルーチンに分離した。ＮＱＯ１およびＧＳＴのタンパク質レベルを推定するために、ウェスタンイムモブロッティング（ｉｍｍｕｍｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を実行した。使用する一次抗体の供給源は以前に記述されている(Hayes et al., 2000; Kelly et al., 2000)。すべての場合において、等量のローディングを確認するために、アクチン（シグマ社）に対する抗体によるイムノブロットを実行した。
【０１０２】
電気泳動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡのために使用する核抽出物を別記された手順に従って調製した（Moffat et al., 1997）。［γ−32Ｐ］ＡＴＰおよびＴ4ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識した二本鎖ＤＮＡプローブ（ＡＲＥ、５’−ＧＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧ−３’［下線はコア配列］）を、以前に記述したように、ゲルシフト解析のために使用した（Moffat et al., 1997）。いくつかの分析において、結合の特異性を、標識プローブを加える前に、反応混合物へ２００倍モル過剰の未標識オリゴヌクレオチドを加えることによって実行される競合実験によって測定した。サンプルを４％ポリアクリルアミドゲルにおいて１００Ｖで分離した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーを行なった。
【０１０３】
ビオチン化ＡＲＥオリゴヌクレオチドのプルダウンアッセイ
以前に記述したように、プルダウンアッセイのために使用する核抽出物を調製した(Deng et al., 2003)。簡潔には、プロテアーゼ阻害剤混合物（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を追加した１０ｍＭヘペス（ｐＨ  ８．０）、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００ｍＭショ糖、０．５％ノニデットＰ−４０、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＧＴＡを含む、パック細胞２容積分の緩衝液Ａ中で５分間４℃にてＡＲＥｃ３２細胞を溶解した。粗製の核をミクロ遠心によって回収し、パック細胞３容積分の緩衝液Ｂ（ＰＢＳ（ｐＨ．７．４）、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０ｍＭジチオトレイトールに加えて緩衝液Ａ中のプロテアーゼ阻害剤および脱リン酸化酵素阻害剤）中に再懸濁した。次に核を４℃で超音波処理によって破壊し、続いて残屑を除去するためにミクロ遠心を行なった。核抽出物タンパク質を含む上清を回収し、−７０℃で保存した。
【０１０４】
５’でビオチン化した二本鎖ＡＲＥプローブ（ラットＧＳＴＡ２遺伝子プロモーター中のヌクレオチド−６８２〜−７２２の４２ｂｐを表わす）は、ＭＷＧ−バイオテック社によって合成された。その配列は５’−ＧＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧ−３’である。さらに、関連のないビオチン化プローブ（モック）（５’−ＡＧＡＧＴＧＧＴＣＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＣＴＧ−３’）もまた陰性のプローブ対照として供するために合成した。
【０１０５】
以前に記述したように、ＡＲＥプルダウンアッセイを実行した（Deng et al., 2003）。簡潔には、７２０ｎＭの５’でビオチン化されたＡＲＥプローブを、異なる化合物で処理されたＡＲＥｃ３２細胞からの５００μｇの核抽出物および１００μｌの４％ストレプトアビジンアガロースビーズ（シグマ社）と共に混合した。最終的な体積を、核抽出物緩衝液Ｂで５００μｌに調整した。混合物を１時間室温で揺り動かし、チューブを５０００ｇで３０秒間遠心した。沈殿を氷冷ＰＢＳで４回洗浄し、プルダウンした混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。Ｎｒｆ２タンパク質を、ウサギポリクローナルＮｒｆ２抗体を使用してイムノブロットによって同定した。
【０１０６】
統計分析
統計比較は対応のないスチューデントのｔ検定によって実行した。ｐの値＜０．０５は有意であると統計的に判断された。
【０１０７】
結果ＩＩ
オールトランスレチノイン酸によって誘導可能なＡＲＥ駆動性遺伝子発現のアンタゴナイズ作用
ＭＣＦ７−ＡＲＥレポーター細胞株は、ｔＢＨＱ、アクロレイン、β−ナフトフラボン（ＮＦ）およびスルフォラファンを含む、ＡＲＥを活性化することが公知である多数の化合物により処理された。期待されるように、これらすべての誘導剤はＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼ活性を増加させた（図６）。しかしながら１μＭのＡＴＲＡの存在下でｔＢＨＱ、アクロレイン、ＮＦおよびスルフォラファンによるＡＲＥｃ３２細胞の処理は、誘導剤によって影響を受けるＡＲＥ駆動性ルシフェラーゼ活性における増加を有意に弱めた。実際は、得られた値からＤＭＳＯ対照を引いた後は、ルシフェラーゼ活性はほとんど完全になくなった。続いて行なわれる実験において（図７Ａにおいて示される）、ＡＲＥ駆動性応答の阻害のレチノイン酸濃度に対する依存性、およびさらに他のレチノイド誘導体がＡＲＥ応答を阻害する能力を検討した。興味深いことには、すべての３つのレチノイドは、同様の用量依存的様式（ＩＣ50値はおよそ３×１０-7Ｍである）でＡＲＥ応答を阻害した。すべてのこれらの３つのレチノイド誘導体がほぼ等しい力価でレチノイン酸受容体に結合することが知られており、これが観察された応答を仲介することを示唆する。さらに、レチノイン酸によるルシフェラーゼ活性の阻害の時間依存性を測定した。図７Ｂにおいて示されるように、およそ３時間の遅滞期後に、ｔＢＨＱ処理した細胞におけるルシフェラーゼ活性は、２４時間の期間にわたりほとんど直線的に増加した。しかしながら、ＡＲＥｃ３２細胞をｔＢＨＱおよびＡＴＲＡにより同時に処理したときに、遅滞期は３時間から１６時間に増加し、その後ルシフェラーゼ活性は１６〜２４時間の間緩やかに増加したのみであった。
【０１０８】
オールトランスレチノイン酸はｔＢＨＱによる内在性遺伝子の誘導を阻害
レチノイン酸がＡＲＥを介して調節される内在性遺伝子の発現を阻害できるかどうかを立証するために、ｔＢＨＱによるＡＫＲ１Ｃ１遺伝子の誘導に対するＡＴＲＡの効果を研究した（図８Ａ）。この実験において、ｔＢＨＱはほぼ１５倍までＡＫＲ１Ｃ１のｍＲＮＡの発現を誘導し、この誘導はレチノイン酸との共インキュベーションによって著しく抑制された（たった３倍の誘導まで）。ＤＭＳＯ対照を引いた後に、阻害はおよそ８５％であると推測された。次にウエスタンブロット分析によってＡＫＲ１Ｃタンパク質の誘導に対するＡＴＲＡの効果を研究した。図８Ｂ中に図に示すように、このタンパク質のレベルもまた著しく減少した。ウエスタンブロットのスキャニングからこの減少がおよそ５０％であることが示され；タックマンとイムノブロットのデータとの間のこの見かけ上の相違は、ＡＫＲ１Ｃ１に対して作製された抗体がＡＫＲ１Ｃ２および恐らくＡＫＲ１Ｃ３と交差反応するので、恐らくこの抗体は特異性を欠くものであるためである。
【０１０９】
ＭＣＦ７細胞における観察から、インビボのＡＲＥ調節遺伝子を発現まで推定することができるかどうかを調べるために、レチノイン酸欠損（すなわちビタミンＡ欠損、ＶＡＤ）飼料をマウスに与える実験を実行した。興味深いことには、６週間のビタミンＡ欠損飼料で飼育された野生型マウスにおいて、ＡＲＥ調節遺伝子のＧｓｔＭ５  ＧＣＬＣ、ＮＱＯ１およびＧｓｔＡ１の充分な誘導が観察された（図９）。ｎｒｆ２-/-マウスにおいてＧｓｔＭ５  ＧＣＬＣ、ＮＱＯ１およびＧｓｔＡ１における増加が観察されなかったので、これらの遺伝子のＶＡＤ飼料による誘導はＮｒｆ２に依存的である。ＶＡＤ飼料で飼育される最後の２週間の間に野生型マウスに対して毎日ＡＴＲＡを投与することにより、ＡＲＥ駆動性遺伝子の誘導は、小腸においてほとんど完全に無くなった。この結果は、レチノイン酸の抑制作用が胃腸管におけるインビボの状況に関連することを実証する。
【０１１０】
オールトランスレチノイン酸は抗癌薬物によるＡＲＥ駆動性遺伝子発現の誘導を阻害
一連の抗癌剤によりレチノイン酸がＮｒｆ２調節遺伝子の誘導を阻害できるかどうかを決定するために、さらなる実験を実行した（図１０）。抗癌剤のうちで、シスプラチン、メルファランおよびクロラムブチルは、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現の弱い誘導因子であった（表４）。それに比べれば、ＢＣＮＵはより強力な誘導剤であった。これらの抗癌剤の各々によるＡＲＥ駆動性ルシフェラーゼ活性の誘導は、化学療法剤と共にＡＴＲＡが培地中に含有されることにより阻害された（図１０Ａ）。グルタチオン除去剤Ｌ−ブチオニン−Ｓ，Ｒ−スルホキシミン（ＢＳＯ）でＡＲＥｃ３２細胞を２４時間前処理することによって、これらの薬剤によるルシフェラーゼ活性の誘導を著しく促進でき、実際これらの条件下で使用される抗癌剤のすべてはＡＲＥレポーターの効率的な誘導因子であり；ＢＣＮＵおよびクロラムブチルは１０〜１５倍の間で誘導する。これらの実験のすべてにおいて、ＡＴＲＡはＡＲＥの誘導の強力な阻害剤であった。これは特に、細胞が５０μＭのＢＳＯにより前処理されたときに、ＤＭＳＯ対照値を引いた後のＡＲＥ応答がほとんどバックグラウンドレベルまで減少した実験のケースであった。これらのデータは、現在使用される抗腫瘍薬剤により誘導されたＡＲＥ応答を、レチノイン酸が減ずる能力を有することを実証する。
【０１１１】
オールトランスレチノイン酸は、Ｎｒｆ２の安定性に影響を及ぼさない
レチノイン酸がその抑制効果を発揮するメカニズムを確立するために、Ｎｒｆ２の核濃度がこの化合物の存在下で変化するかどうかを調べた。しかしながら、これはそうでないことが見出された（図１１）。したがって、ｂＺＩＰ因子を不安定にすること、またはその核移行を阻害することのどちらによっても、ＡＴＲＡが遺伝子発現のＮｒｆ２仲介性誘導をアンタゴナイズしないことが結論される。
【０１１２】
レチノイン酸がエンハンサーに対するＮｒｆ２の結合を阻害するかどうかを立証するために、コアＡＲＥ結合配列を使用する電気泳動度シフトアッセイを実行した。３つの複合体がこのエンハンサーと相互作用することが観察され（図１２）、それらの結合はｔＢＨＱおよびレチノイン酸の存在下で減少し、レチノイン酸はＡＲＥエンハンサーエレメントの活性化を妨害することを示す（トラック４対トラック２）。ＡＲＥエンハンサー上にＮｒｆ２をローディングするためのさらなる方法を使用して、ｔＢＨＱの存在下でレチノイン酸がＡＲＥに対するＮｒｆ２の結合を阻害することを確認できた（図１３）。したがってＡＴＲＡが遺伝子プロモーター中のＡＲＥ上へのＮｒｆ２の動員を妨害することによって、Ｎｒｆ２が遺伝子発現をトランス活性化する能力を阻害すると結論される。
【０１１３】
考察ＩＩ
上述されたデータは、レチノイン酸およびその各種誘導体がモデル誘導剤によるＡＲＥ駆動性遺伝子発現の誘導をアンタゴナイズすることを示す。更に、ＡＲＥ駆動性遺伝子発現のこのアンタゴナイズ作用は比較的低用量（すなわち１０-7Ｍ）のＡＴＲＡを必要とし、レチノイドはＮｒｆ２活性の強力な阻害剤であることが示唆される。抗癌剤によるＡＲＥ駆動性遺伝子の誘導もまたＡＴＲＡがブロックするという結果は、腫瘍が化学療法に応答して細胞保護遺伝子のスイッチを入れることを、レチノイドが阻害するということを示唆する。したがって、レチノイドは、それらが薬剤と共に共投与されるならば、抗癌剤が治療上より効果的であることを可能にする。
【０１１４】
さらなる実施例
さらなる実験を行ない、それらの結果を図１４〜２５中で示す。各実験のための方法および結果を以下に記述する。
【０１１５】
方法：ＡＲＥｃ３２細胞を９６ウェルプレート中に播種し、ＤＭＳＯ（対照）、ｔＢＨＱ（５０μＭ）、ｔＢＨＱ＋ＢＴＢ０９４６３（５μＭ）またはｔＢＨＱ＋レチノイン酸（１μＭ）により処理した。２４時間のインキュベーション後に、細胞をルシフェラーゼ活性の測定前に洗浄し溶解した。ＢＴＢ０９４６３は、１−｛４−［（３，４−ジクロロベンジル）オキシ］フェニル｝エタノ−１−オンである。
【０１１６】
結果：ルシフェラーゼ活性は、ＡＲＥｃ３２レポーター細胞株においてｔＢＨＱにより高誘導が可能であり、この実験においてＤＭＳＯ対照と比較して１４倍の発現誘導を示す。ＢＴＢ０９４６３またはレチノイン酸との共処理はそれぞれおよそ６５％および７５％でこの誘導を著しく抑制した。図１４を参照。
【０１１７】
方法：ＡＲＥｃ３２細胞を、９６ウェルプレート中に播種し、ｔＢＨＱ（５０μＭ）による処理前に、ＢＴＢ０９４６３（２．５、５または１０μＭ）を０、２４または４８時間与えた。ｔＢＨＱの追加の２４時間後に、細胞をルシフェラーゼ活性の測定前に洗浄し溶解した。
【０１１８】
結果：ルシフェラーゼ発現のｔＢＨＱ仲介性誘導の抑制は各投与計画下で同一だった。図１５を参照。
【０１１９】
方法：ＡＲＥｃ３２細胞を９６ウェルプレート中に播種し、ＤＭＳＯ（対照）、ｔＢＨＱ（５０μＭ）、ｔＢＨＱ＋レチノイド（０．２５、０．５および１μＭ）により処理した。２４時間のインキュベーション後に、細胞をルシフェラーゼ活性の測定前に洗浄し溶解した。
【０１２０】
結果：検査したレチノイドはすべて、ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ３２におけるｔＢＨＱ誘導性ルシフェラーゼ発現をダウンレギュレートできた。図１６を参照。
【０１２１】
方法：Ａ．Ｃａｃｏ−２細胞を、ＢＴＢ０９４６３（５μＭ）またはレチノイン酸（１μＭ）と共に公知のＡＲＥ遺伝子の誘導因子スルフォラファン（５μＭ）により、単独でまたは併用して処理した。２４時間後に細胞溶解物を調製し、ＡＫＲ１Ｃタンパク質のレベルを測定するためにウェスタンブロッティングを実行した。Ｂ．ＭＣＦ７細胞を、ＢＴＢ０９４６３（５μＭ）と共にスルフォラファン（５μＭ）により、単独でまたは併用して処理した。２４時間後に、細胞溶解物を調製し、ＡＫＲ１ＣおよびＮＱＯ１のレベルを検出するためにウエスタンブロットを実行し；ＭＣＦ７細胞におけるローディング対照としてＧＡＰＤＨを使用した。
【０１２２】
結果：Ａ．ＢＴＢ０９４６３およびレチノイン酸は、結腸癌細胞株（Ｃａｃｏ−２）においてスルフォラファンがＡＫＲ１Ｃを誘導する能力を劇的に低下させた。Ｂ．ＢＴＢ０９４６３は、乳癌細胞株ＭＣＦ７における、ＡＲＥ遺伝子ＮＱＯ１およびＡＫＲ１Ｃのスルフォラファンで駆動される誘導を強力に阻害した。図１７を参照。
【０１２３】
方法：Ｃａｃｏ−２細胞を、ＤＭＳＯ（対照）、ＢＴＢ０９４６３（５μＭ）、スルフォラファン（５μＭ）またはスルフォラファンプラスＢＴＢ０９４６３の組合せにより処理した。２４時間の処理後に細胞を採取し、ＲＮＡを単離した。各サンプルについてのｃＤＮＡを逆転写によって産生し、続いてＡＲＥ駆動性遺伝子のＡＫＲ１Ｃ１およびＮＱＯ１の遺伝子転写のリアルタイムＰＣＲ分析（タックマン分析）において使用した。データは、内部対照１８Ｓ  ＲＮＡ、および比較ＣＴ方法を使用して計算されたＡＫＲ１Ｃ１およびＮＱＯ１の相対的なレベルに対して正規化された。
【０１２４】
結果：スルフォラファンはＡＫＲ１Ｃ１のｍＲＮＡの１２倍の誘導を引き起こし、それはＢＴＢ０９４６３との共処理によって強く阻害された（５０％減少）。ＮＱＯ１は、スルフォラファンによってそれほど著しく誘導されなかったが、この場合ではＢＴＢ０９４６３により共処理されたときにｍＲＮＡ発現は減少した。図１８を参照。
【０１２５】
方法：ＭＣＦ７細胞を、公知のＡＲＥ遺伝子の誘導因子スルフォラファン（５μＭ）により単独でまたは様々なレチノイド（０．５μＭ）により処理した。２４時間後に細胞溶解物を調製し、存在するＡＫＲ１Ｃタンパク質のレベルを検出するためにウエスタンブロットを実行した。
【０１２６】
結果：酢酸レチニル、アシトレチン、オールトランスレチナールおよびビタミンＡプロピオネートはすべて、ＭＣＦ７細胞におけるスルフォラファン誘導性ＡＫＲ１Ｃの発現を減少させた。図１９を参照。
【０１２７】
方法：ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ２３を９６ウェルプレート中に播種し、以前に決定されている非毒性濃度の細胞毒性薬により処理した。２４時間のインキュベーション後に、細胞をルシフェラーゼ活性の測定前に洗浄し溶解した。
【０１２８】
結果：検査された大多数の薬物は、典型的には１０〜６０％誘導にわたる、ＡＲＥ駆動性ルシフェラーゼ活性の中等度誘導を示した。化学療法薬の中で、アルキル化剤のブスルファン（３．１倍誘導）および最も強力なものであるカルムスチン（ＢｉＣＮＵ）（４．５倍誘導）は、ルシフェラーゼ活性の最も強力な誘導因子であることが証明された。図２０ａを参照。
【０１２９】
方法：ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ２３を９６ウェルプレート中に播種し、ＤＭＳＯ（対照）、カルムスチン（１００μＭ）、カルムスチン＋ＢＴＢ０９４６３（５μＭ）またはカルムスチン＋レチノイン酸（５μＭ）により処理した。２４時間のインキュベーション後に、細胞をルシフェラーゼ活性の測定前に洗浄し溶解した。
【０１３０】
結果：ＢＴＢ０９４６３およびレチノイン酸の両方は、ＡＲＥレポーター細胞株（ＡＲＥｃ３２）におけるルシフェラーゼ活性のカルムスチン仲介性誘導を完全に抑制できる。図２０ｂを参照。
【０１３１】
方法：Ａ．ＡＲＥレポーター細胞株ＡＲＥｃ２３を９６ウェルプレート中に播種し、ＤＭＳＯ（対照）、アルキル化剤単独、アルキル化剤＋レチノイン酸（ＡＴＲＡ）により処理した。２４時間のインキュベーション後に、細胞をルシフェラーゼ活性の測定前に洗浄し溶解した。Ｂ．Ｌ−ブチオニン−（ＳＲ）−スルホキシミン（ＢＳＯ）（グルタチオン合成経路における酵素の阻害剤）により前処理した細胞を用いて、実験Ａを修飾して繰り返す。２４時間のインキュベーション後に、細胞をルシフェラーゼ活性の測定前に洗浄し溶解した。
【０１３２】
結果：Ａ．レチノイン酸は、ＡＲＥレポーター細胞株（ＡＲＥｃ３２）におけるルシフェラーゼ活性の化学療法剤仲介性誘導を完全になくす。Ｂ．ＢＳＯによるＡＲＥｃ３２細胞の前処理は、化学療法剤仲介性ルシフェラーゼ活性のレベルにおいて著しい増加を引き起こした。レチノイン酸はこの増加反応をまだ有意にアンタゴナイズすることができた。図を２０ｃ参照。
【０１３３】
方法：Ｃａｃｏ−２細胞を、ＤＭＳＯ（対照）、カルムスチン（１００μＭ）、カルムスチン＋ＢＴＢ０９４６３（５μＭ）により２４時間処理した。２４時間後に細胞溶解物を調製し、ＡＫＲ１Ｃのレベルを検出するためにウエスタンブロットを行なう。
【０１３４】
結果：Ｃａｃｏ−２細胞のカルムスチン処理は、ＡＫＲ１Ｃタンパク質発現の大きな誘導を引き起こし、それはＢＴＢ０９４６３の共投与によって減少した。この結果はＬＳ１７４細胞においてもまた再現された（データ不掲載）。図２０ｄを参照。
【０１３５】
方法：ＭＣＦ７細胞を、ＤＭＳＯ（対照；レーン１）、スルフォラファン（５μＭ）（レーン２）、カルムスチン（１００μＭ）（レーン３）、カルムスチン＋ＢＴＢ０９４６３（５μＭ）（レーン５）により２４時間処理した。（レーン４は適用に無関係の実験条件を表わす）。２４時間後に細胞溶解物を調製し、Ｎｒｆ２、ＮＱＯ１およびＡＫＲ１Ｃタンパク質のレベルを検出するためにウエスタンブロットを行なった。
【０１３６】
結果：カルムスチン処理は、ＮＱＯ１およびＡＫＲ１Ｃタンパク質の過剰発現を引き起こした。ＡＣＲ１ＣおよびＮＱＯ１タンパク質の過剰発現はＢＴＢ０９４６３の共投与によって減少した。図２０ｅを参照。
【０１３７】
方法：アイソボログラム分析のために必要とされるデータを得るために、カルムスチン単独のＬＤ50、ＢＴＢ０９４６３単独のＬＤ50、および一定濃度の範囲のＢＴＢ０９４６３の存在下のカルムスチンのＬＤ50を決定する、ＭＣＦ７細胞を使用する細胞毒性アッセイを実行した。アッセイは、７２時間のインキュベーション時間で９６ウェルプレートにおいて実行した。細胞毒性はＡＴＰ化学発光アッセイを使用して決定した。
【０１３８】
結果：検査されている２つの個別の化合物のＬＤ50の間にプロットした線の下に存在するデータポイントは、相乗的な細胞毒性挙動を示す組合せを単独で示し、線から離れるほど、その関係はより相乗的である。この定義によってカルムスチンとＢＴＢ０９４６３の間には中等度の相乗作用がある。図２１を参照。
【０１３９】
方法：本質的には図２１の記述されるようにアッセイは実行された。
【０１４０】
結果：データから、ＭＣＦ７細胞がブレオマイシンおよびレチノイン酸（酢酸レチニルまたはアシトレチン）により共処理される場合、細胞死滅において非常に強力な相乗的増加があることが示された。相乗作用はカルムスチンおよび酢酸レチニルの特定の組合せについてもまた観察され、より低いカルムスチン濃度の力価における著しい増加であった。図２２を参照。
【０１４１】
方法：Ａ５４９細胞を、ＤＭＳＯ（対照）、ＢＴＢ０９４６３（１、５、２０、４０μｍｏｌ／ｌ）またはレチノイド（０．０５０、０．２０、０．５０、２．０μｍｏｌ／ｌ）により処理した。２４時間後に全ＲＮＡを調製し、タックマン分析をＡＫＲ１Ｃ１についてのｍＲＮＡレベルを検出するために実行した。
【０１４２】
結果：タックマンの結果は、ＢＴＢ０９４６３、オールトランスレチノイン酸、オールトランスレチナールおよび酢酸レチニルはすべて、濃度依存的様式でＡＫＲ１Ｃ１の構成的発現を阻害することを示した。図２３を参照。
【０１４３】
方法：Ａ５４９細胞を、ＤＭＳＯ（対照）、ＢＴＢ０９４６３（１、５μｍｏｌ／ｌ）またはレチノイン酸（０．０５０、０．２０、０．５０、２．０μｍｏｌ／ｌ）により処理した。２４時間後に細胞溶解物を調製し、ＡＲＥ駆動性遺伝子（ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ）のタンパク質レベルを検出するためにウエスタンブロットを実行した。
【０１４４】
結果：ウエスタンブロット分析の結果から、ＢＴＢ０９４６３およびオールトランスレチノイン酸は、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣおよびＧＣＬＭの構成的レベルを抑制することが示された。調べられたすべてのタンパク質において、ＢＴＢ０９４６３およびレチノイン酸による抑制は、対照において観察されたレベルと比較して少なくとも５０％であった。図２４を参照。
【０１４５】
方法：Ａ５４９細胞を、ＤＭＳＯ（対照）、ＢＴＢ０９４６３（１、５、２０、４０μｍｏｌ／ｌ）またはレチノイン酸（０．０５０、０．２０、０．５０、２．０μｍｏｌ／ｌ）により処理した。２４時間後に全ＲＮＡを調製し、内在性ＡＲＥ駆動性遺伝子ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭのｍＲＮＡのレベルを検出するために、タックマン分析を実行した。
【０１４６】
結果：タックマン分析の結果から、ＢＴＢ０９４６３およびオールトランスレチノイン酸は、濃度依存的様式でＮＱＯ１、ＧＣＬＣおよびＧＣＬＭの構成的ｍＲＮＡレベルを抑制することが示された。図２５を参照。
【０１４７】
方法：ＭＣＦ−７またはＡ５４９細胞を９６ウェルプレート中に播種した。２４時間後に、細胞を、カルムスチンもしくはブレオマイシンの単独で、またはＢＴＢ０９４６３の存在下（ＭＣＦ−７およびＡ５４９細胞についてそれぞれ５および２０μｍｏｌ／ｌ）のいずれかで７２時間処理した。細胞を洗浄し、次にそれらの生存度を決定するＡＴＰレベルを決定するために溶解した。
【０１４８】
結果：ＢＴＢ０９４６３またはレチノイン酸のいずれかとの細胞毒性制癌剤の組合せは、薬物療法単独よりも細胞毒性が高いことが見出された。このことは、カルムスチンおよびブレオマイシンについてのＩＣ50値の低下を５０％以上までもたらした。表５を参照。
【０１４９】
要約すると、Ｎｒｆ２転写因子が抗炎症性タンパク質に加えて、抗酸化酵素、薬物代謝酵素、薬物排出ポンプ、熱ショックタンパク質およびシャペロンをコードする一連の遺伝子の発現を制御するので、Ｎｒｆ２転写因子は、酸化ストレスを引き起こす薬剤、および親電子性物質である化学物質に対する防御を付与する。Ｎｒｆ２が制御する遺伝子はすべてそれらのプロモーター中に抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）を含んでいる。Ｎｒｆ２活性、およびそれが調節するタンパク質のレベルは前新生物、および多くの腫瘍において増加し、おそらく前悪性細胞および悪性細胞の生存に寄与する。本発明において、Ｎｒｆ２活性をアンタゴナイズし、癌化学療法剤の細胞毒性効果を増加させるレチノイドおよび他の低分子阻害剤（ＳＭＩ、例えばＢＴＢ０９４６３）について記述する。ヒト乳腺ＭＣＦ７由来の安定したレポーター細胞株において、レチノイドおよび他のＳＭＩは、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）およびスルフォラファン（Ｓｕｌ）（Ｋｅａｐ１に仲介される因子の分解を阻害することによってＮｒｆ２を活性化することが公知である化合物）によるＡＲＥ駆動性ルシフェラーゼレポーター遺伝子の誘導をアンタゴナイズする。レチノイドおよび他のＳＭＩは、ヒト乳腺ＭＣＦ７およびＭＤＡ１５７細胞、およびヒト結腸ＬＳ１７４およびＣａｃｏ２細胞を含む様々な株において、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で、アルド−ケト還元酵素（ＡＫＲ）１Ｃ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）、ならびにグルタミン酸システインリガーゼの触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットおよび修飾（ＧＣＬＭ）サブユニットなどの内在性のＡＲＥ駆動性遺伝子の誘導もまたアンタゴナイズする。特定の癌化学療法剤（例えばクロラムブチル、カルムスチン、メルファラン、ブスルファン、シスプラチン）はＡＲＥ駆動性遺伝子を誘導し、それらは薬物に対する耐性を誘導する適応反応を刺激することができ、ｔＢＨＱおよびＳｕｌによる場合のように、この誘導は同様にレチノイドおよび他のＳＭＩによってアンタゴナイズできることが示唆される。構成的に活性のあるＮｒｆ２（Ｋｅａｐ１による負の調節の欠損のために）を有するＡ５４９非小細胞肺癌細胞株において、レチノイン酸およびＳＭＩは、ＡＫＲ１Ｃ１、ＮＱＯ１およびＧＣＬＣが過剰発現される程度を減少させる。レチノイドがＮｒｆ２の活性を阻害する能力、およびしたがってそれが調節する遺伝子の発現は、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）によって仲介される。共免疫沈降実験により、レチノイン酸によるＡＲＥ駆動性遺伝子発現の阻害がＲＡＲαとＮｒｆ２との間の物理的相互作用（レチノイン酸によって非常に促進され、Ｎｒｆ２がＡＲＥに対して結合するのを阻害する組合わせ）を介して起こることが示された。レチノイドまたはＢＴＢ０９４６３によるＮｒｆ２のアンタゴナイズ作用は、Ａ５４９細胞［Ｋｅａｐ１によって制御されないＮｒｆ２を備えた］に加えて、ＭＣＦ７細胞［Ｋｅａｐ１によって負に制御されるＮｒｆ２を備えた］のブレオマイシンおよびカルムスチンの細胞毒性効果に対する感受性を増加させる。
【０１５０】
本発明は、ｔＢＨＱおよびＳｕｌに対して高応答性の合成連結ＡＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＡＲＥｃ３２と呼ばれるＭＣＦ７由来のレポーター細胞株の作製および妥当性検証もまた含む。ＡＲＥｃ３２細胞の利用は、ｔＢＨＱによるＡＲＥ−ルシフェラーゼ誘導の阻害剤としてＢＴＢ０９４６３が同定された、６０００の化学的ライブラリーをスクリーニングするために使用された。これとは別に、ＡＲＥｃ３２細胞はレチノイドを阻害剤として同定するために、またはｔＢＨＱによるＡＲＥ−ルシフェラーゼ誘導にもまた使用された。
【０１５１】
表１：ｐＧＬ３プロモーターベクター中のインサートの配列
最小のエンハンサー配列の５’− A／GＴＧＡＣｎｎｎＧＣA／G−３’（様々なレポーターコンストラクトについてインサート内で単一または複数のコピーとして存在する)を、下線で示す。
【０１５２】
【表１】
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【０１５３】
表２：ＡＲＥレポーター系の最適な利用のためのＭＣＦ７細胞の同定
ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２、ＣＨＯおよびＨｅｐａ１細胞を１×１０5細胞／ウェルで２４ウェルプレート中に播種し、ｐＧＬ−ＧＳＴＡ２．４１ｂｐ−ＡＲＥコンストラクトでトランスフェクションした。プラスミドｐＲＬ−ＴＫを各トランスフェクションにおいて内部対照として使用した。使用される細胞を５０μＭのｔＢＨＱで処理し、材料および方法中で詳しく述べられるように、ルシフェラーゼレポーター活性を決定した。対照実験のために、同一体積のＤＭＳＯを培地へ加えた。ＤＭＳＯで処理したＨｅｐＧ２細胞の相対的なルシフェラーゼ活性の値を１に設定した。これは３つの独立した実験の結果を表わす。各実験における各処理には少なくとも３つの重複測定がある。
【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
表３：ＡＲＥｃ３２細胞におけるルシフェラーゼ活性の誘導因子
細胞を増殖培地において１．２×１０4細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。２４時間の回復後に、培養液を以下に様々な濃度のリストされた化合物を含む抗生物質添加済みの新しいＤＭＥＭで置換した。次に細胞を２４時間インキュベートし、材料および方法中で詳しく述べられるようなルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ＤＭＳＯ（０．１％ｖ／ｖ）で処理した細胞のルシフェラーゼ活性の値を１に設定した。提供された結果は３つの独立した実験からの結果を表わす。各実験における各処理には少なくとも３つの重複測定がある。
【０１５６】
【表３】
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＊ＣＤ（ルシフェラーゼレポーター活性を２倍にするインダクティング剤（ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の濃度）。
【０１５７】
表４：抗癌剤およびそれらの代謝物質によるＡＲＥｃ３２細胞の処理の効果
材料および方法中で詳しく述べられるように、処理は２４時間であった。対照細胞については、同一体積の０．１％（ｖ／ｖ）の媒質を培地へ加えた。抗癌剤へ暴露した培養とＤＭＳＯで処理した培養からのルシフェラーゼ活性との間の差の有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定により評価した。これは３つの独立した実験の結果を表わす。（＊）ｐ＜０．０５。a対照値と比較した増加の平均（倍）±標準偏差として表現されたデータ。
【０１５８】
【表４】
2009544679.tif 000009
【０１５９】
表５：ＢＴ０９４６３またはレチノイドによって抗癌剤の細胞毒性効果に対する腫瘍細胞の感受性を高めること
【表５】
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【０１６０】
参考文献
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【０１６１】
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【０１６２】
2009544679.tif 000013
【０１６３】
2009544679.tif 000014
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2009544679.tif 000021
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2009544679.tif 000024
【図５Ｂ．Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２０ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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