(57)【要約】有効量のＶＥＧＦ受容体アゴニスト、例えばＦｌｔ１アゴニスト、を投与することによる対象における腎臓疾患を治療する方法が提供される。そのアゴニストは、Ｆｌｔ１の活性化のための使用において薬学的に許容される担体中のＶＥＧＦ受容体アゴニスト、例えばＶＥＧＦ、Ｆｌｔ１に対する抗体、Ｆｌｔ１リガンド、Ｆｌｔ１小分子活性化剤、又はＦｌｔ１選択的薬剤、を含む組成物から成る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓疾患を有する対象に、有効量のＶＥＧＦ受容体調製薬を投与することを含む腎臓疾患を治療する方法であって、前記ＶＥＧＦ受容体調整剤がＦｌｔ１アゴニストを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｆｌｔ１アゴニストが、Ｆｌｔ１アゴニスト抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｆｌｔ１アゴニストが、ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆｌｔ１選択的薬剤である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｆｌｔ１アゴニストが、ＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｂである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｆｌｔ１アゴニストが、Ｆｌｔ１の小分子アゴニストである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腎臓疾患が、ＶＥＧＦレベルの低下により特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腎臓疾患が、炎症性腎臓疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症性腎臓疾患が、炎症細胞の変化、免疫複合体の堆積、又は糸球体の補体活性化によって特徴づけられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫複合体の堆積が、ＩｇＭの堆積である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記補体活性化が、Ｃ１ｑ、Ｃ３及びＣ４の活性化を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記腎臓疾患が、糸球体腎炎（腎不全）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記糸球体腎炎が、タンパク尿症、糸球体硬化症、又は高血圧により測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糸球体腎炎が、減少した腎臓メサンギウム細胞の生存性、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）合成の遺伝子発現の増加、又はマトリックス分解の低下により測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記糸球体腎炎が、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに有効量の第二薬剤を投与することを含む請求項１に記載の方法であって、前記第二薬剤が血管新生剤である、方法。
【請求項１６】
さらに有効量の第二薬剤を投与することを含む請求項１に記載の方法であって、前記第二薬剤が第二のＦｌｔ１アゴニストである、方法。
【請求項１７】
前記血管新生剤が、ＶＥＧＦである請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が腎臓疾患を引き起こす感染を起こしている、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００６年３月２７日提出の米国仮特許出願第６０／７８６，２４６号の優先権を主張するものであり、その明細書の全文がここに援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、腎臓疾患（腎機能異常）を治療するためのＶＥＧＦＲアゴニストを利用する方法を含む、ＶＥＧＦＲ調節剤の治療的使用に関する。
【０００３】
（発明の背景）
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞で発現する二つのチロシンキナーゼ受容体であるＦｌｔ１（ＶＥＧＦＲ−１）及びＦｌｋ１（ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ−２）の活性化を介して、内皮細胞の分化及び生存を含む様々な血管機能を調節する（例えば、Ferrara, N., et al.. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 9:669-676 (2003)参照）。最近の研究により、造血幹細胞含む様々な非内皮細胞において、ＶＥＧＦ受容体が発現していることが明らかとなっており、ＶＥＧＦのリガンド／受容体システムの血管以外への調節機能が示唆される。例えば、Autiero, M., et al. Placental growth factor and its receptor, vascular endothelial growth factor receptor-1: novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatory disorders. J Thromb Haemost 1: 1356-1370 (2003)参照。腎臓において、ＶＥＧＦ受容体は、主に前糸球体、糸球体、後糸球体で発見されており（例えばThomas, S., et. al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-12433 (2000)参照）、傍尿細管内皮細胞及び糸球体メサンギウム細胞においても発見されているが、足細胞では見られていない。例えば、Gruden, G., et al., 1997. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A 94:12112-12116 (1997); Harper, S.J., et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-446 (2001);及びTakahashi, T., et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226 (4-6) (1995)参照。正常な成人の腎臓において、ＶＥＧＦ−Ａの発現は、糸球体足細胞及び尿細管上皮細胞で最も顕著であって、メサンギウム細胞でより低い発現であり、内皮細胞では検出できない。例えば、Noguchi, K., et al.. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-1825 (1998);及びSimon, M., et al.. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268:F240-250 issn: 0002-9513 (1995)参照。発現の局在に基づき、ＶＥＧＦ−Ａは、糸球体及び傍尿細管内皮細胞を標的として、主に傍分泌（paracrine）又は接触分泌（juxtacrine）のエフェクター機能を介して腎臓のホメオスタシス及び糸球体濾過を調節する役割を担っていると考えられる。様々な研究から、腎臓の発達及び腎障害モデルにおけるＶＥＧＦ−Ａの役割が解析されている。例えば、de Vriese, A.S. et al. Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes. J Am Soc Nephrol 12: 993-1000 (2001); Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16 (2003); Kang, D.H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J Am Soc Nephrol 12:1448-57 (2001); Masuda, Y. et al. Vascular endothelial growth factor enhances glomerular capillary repair and accelerates resolution of experimentally induced glomerulonephritis. Am J Pathol 159, 599-608 (2001);及びOstendorf, T. et al. VEGF(165) mediates glomerular endothelial repair. J Clin Invest 104:913-23 (1999)参照。
【０００４】
ＶＥＧＦ−Ａの調節異常は、腫瘍、糖尿病及び糸球体腎炎を含む腎障害の実験モデルに共通する特徴である（例えば、Khamaisi, M., et al. The emerging role of VEGF in diabetic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 18:1427-1430 (2003);及びSchrijvers, B. F., et al.. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65:2003-2017 (2004)参照）。ＶＥＧＦ−Ａ及びその受容体は、１型及び２型糖尿病を患う実験動物やヒトにおいて、少なくとも一定期間上方制御されるが、様々な進行性腎臓疾患の残存腎臓における糸球体腎炎及び尿細管間質性線維症の発生とＶＥＧＦ−Ａレベルの減少は関連している。例えば、Honkanen, E., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor in idiopathic membranous glomerulonephritis: relationships to clinical course. Am J Kidney Dis 42:1139-1148 (2003).; Korbet, S.M., et al. The racial prevalence of glomerular lesions in nephrotic adults. Am J Kidney Dis 27:647-51 (1996); Sivridis, E., et al. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and angiogenic factor expression in idiopathic membranous nephropathy. Am J Kidney Dis 41:360-365 (2003);及びSrivastava, T., et al. High incidence of focal segmental glomerulosclerosis in nephrotic syndrome of childhood. Pediatr Nephrol 13:13-8 (1999)参照。主なＦＳＧＳの組織病理学的特徴の一つとして、沈着した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）又は糸球体硬化の蓄積が挙げられる。糸球体硬化の発症機序は解明されておらず、糸球体に存在する３種類の細胞（足細胞、内皮細胞又はメサンギウム細胞）のどの細胞が線維形成過程に関与しているかも解明されていない。
【０００５】
メサンギウム細胞は、糸球体腎炎又は糖尿病性ネフロパシーなど、損傷の種類にかかわらず、腎損傷に対する糸球体の反応の一つとして細胞外マトリックスの増加を伴って複製する。この過程は、糸球体の限外濾過能を減少させ、結果として糸球体硬化症及び末期の腎不全に至る。例えば、Buschhausen, L., et al.  Kidney fibrosis impairs glomerular ultrafiltration and results in glomerular sclerosis and end-stage renal failure.  Regulation of mesangial cell function by vasodilatory signaling molecules. Cardiovasc Res 51:463-469 (2001)参照。糸球体硬化症のトランスジェニックモジュール（例えば、Shih, N. Y., et al. Congenital nephrotic syndrome in mice lacking CD2-associated protein Science 286:312-315 (1999)参照）及びヒト患者（Srivastava, T., et al. Synaptopodin expression in idiopathic nephrotic syndrome of childhood. Kidney Int 59:118-125 (2001)参照）において足細胞の異常が同定されたことにより、これらの細胞が糸球体の瘢痕化の開始において役割を担っているであろうことが示唆される。他のモデル内皮細胞又はメサンギウム細胞が線維形成過程に関与していることを示している（例えば、Schnaper, H. W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-252 (2003)参照）。多数の糸球体硬化症モデル（及び臨床におけるＦＳＧＳ）において、ＥＣＭの蓄積が、多くの場合、メサンギウム細胞から始まっている。腎臓の糸球体に存在する３種類の全ての細胞型が、疾患の進行に関与している、もしくは何らかの形で原因となっているのかもしれない。
【０００６】
ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦの刺激に対して、一次ヒトメサンギウム細胞増殖の増大（Onozaki, A., et al.. Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF: inhibitory effects of thiazolidinedione. Biochem Biophys Res Commun 317:24-29 (2004)）、コラーゲン産生の誘導（Amemiya, T., et al. Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells. Kidney Int 56:2055-2063 (1999)）及び一酸化窒素の産生増加（Trachtman, H., et al. Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide production by cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 245:443-446 (1998)）を示す研究に基づいて、メサンギウム細胞に対する機能的な役割を担っていると考えられている。しかしながら、インビトロにおけるＶＥＧＦ−Ａの刺激に対するメサンギウム細胞の反応性にもかかわらず、腎臓の発達中のメサンギウム細胞における、関連するＶＥＧＦ受容体の性質及びＶＥＧＦ−Ａ産生の変化の影響は解明されていない。
【０００７】
腎臓及び腎臓の細胞型におけるＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体の生物学的機能の発見及び理解が必要とされている。それらの分子の生物学的機能の解明は、腎臓疾患の治療に導き得る。本発明はこれら及び他の要求に対処するものであり、そのことは以下の開示の概要により明らかである。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、対象において腎臓疾患を治療するための方法を提供する。例えば、本発明の方法は、腎臓病を有する対象に、有効量のＶＥＧＦＲ調製剤を投与することを含む。本発明に有用なＶＥＧＦＲ調製剤には、例えば、少なくとも一つ以上のＶＥＧＦレセプタに特異的なアゴニスト（例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）アゴニスト、選択的にＦｌｔ−１と結合するＦｌｔ−１選択的ＶＥＧＦ変異体（Ｆｌｔ−自己）、Ｆｌｔ−１に結合して活性化する増殖因子（例えばＰＩＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｂ）、抗ＶＥＧＦＲ−１アゴニスト抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、抗体フラグメント、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体）、小分子Ｆｌｔ１アゴニスト、など）が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明のある態様において、ＶＥＧＦＲモジュレータは、Ｆｌｔ１アゴニストである。ある態様において、ＶＥＧＦＲ−１アゴニストは、例えば、ＶＥＧＦ、付加的なＶＥＧＦＲ１リガンド又はアゴニスト、ＶＥＧＦＲ２リガンド、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）選択的な変異体、抗ＶＥＧＦＲ−２アゴニスト抗体、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２に結合して、活性化させる増殖因子などの血管新生剤と組み合わせて投与される。本発明により治療できる腎臓疾患は、炎症性じん臓病（例えば、炎症細胞、免疫複合体沈着（例えばＩｇＭ沈着）、補体活性化（例えばＣ１ｑ、Ｃ３及びＣ４の活性化）又はそれらの組合せの変更によって特徴づけられる）、腎炎、糸球体硬化症、糸球体腎炎（腎不全）（例えば、タンパク尿症、糸球体硬化症、高血圧、腎臓メサンギウム細胞の減少した生存、ＥＣＭ合成の遺伝子発現の増加、マトリックス分解の減少及び／又はこれらの因子を組み合わせることにより測定することができる）、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、などを含むが、これに限定されるものではない。本発明の特定の態様において、対象は、腎臓疾患を引き起こす感染症がある。
【０００９】
ある態様において、腎臓疾患は、ＶＥＧＦレベルの減少によって特徴づけられる。本発明のある態様においては、疾患は、腎臓の細胞型の変性（例えばメサンギウム細胞、足細胞及び／又は内皮細胞）を含む。    
【００１０】
本発明の特定の態様において、対象に送達される本発明の剤は、タンパク質又はポリペチドである。本発明の特定の態様において、本発明の剤は、全身性デリバリーシステムにより対象に投与することができる。全身性デリバリーシステムは、剤（例えば、精製された剤及び高分子マトリックス）を含む徐放製剤を含み得る。ある態様では、剤の組換え型を発現している哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）を含む細胞製剤が投与される。あるいは、本発明の剤は、剤をコード化している核酸から成る腎臓を標的とした遺伝子送達ベクターを介して投与することができる。遺伝子治療のための確立されたウィルス性又は非ウイルス性ベクター（例えば、腎臓を標的とした遺伝子送達ベクター）を用いることができる。
【００１１】
ＶＥＧＦＲ調整剤を含む製品及びキット、さらに診断キット及び方法も提供される。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の組成物または生物システムに限られたものではなく、言うまでもなく変化しうることは理解されるところである。また、ここで用いられる用語は、特定の態様を記載するためのみにあって、限定することを目的としないこともまた理解されるところである。この明細書および添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、明確に示されない限り、複数の対象を含む。したがって、例えば、「分子」という記載は、任意に2それ以上の分子などの組合せを含む。 
【００１３】
腎炎は、腎臓の炎症である。腎炎の証拠、例えば、尿中の血液及び／又はタンパク質、及び減少した腎臓機能等は、免疫応答、糸球体に影響を及ぼしている炎症、尿細管、尿細管周囲の組織または血管のタイプ、位置および強度に依存する。「腎炎関連の疾患」は、例えば、初期の糸球体症（急性びまん性増殖性糸球体腎炎、連鎖球菌感染後糸球体症、非連鎖球菌感染後糸球体症、半月体形成性糸球体腎炎、膜性糸球体症、リポイド変性ネフローゼ、巣状分節状糸球体硬化症、膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎炎、巣状増殖性糸球体腎炎、そして、慢性糸球体腎炎）、全身性疾患（全身性エリテマト−デス、糖尿病、アミロイドーシス、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎、Ｗｅｌｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑病および細菌性心内膜炎）および遺伝性疾患（アルポート症候群、膜菲薄化症およびファブリー病）を含むが、これに限定されるものではない。
【００１４】
「ネフローゼ症候群」は、腎臓に影響を及ぼす多くの疾患によって生じる症状の一群である。そして、結果として長期にわたる尿へのタンパク質の損失、減少した血中タンパク質（特にアルブミン）濃度、体の過剰な塩および水の保持および増加した血中脂肪（脂質）レベルが引き起こされる。ネフローゼ症候群は、糸球体症またはありとあらゆる疾患のいずれかによって生じ得る。一般的に、この症候群は、３または４ヵ月の間に完全な腎不全へと進行する。
【００１５】
「急性腎炎症候群」または「急性糸球体腎炎」は、しばしば赤血球（キャスト）の凝集塊および尿中のタンパク質の可変的な量を伴って、尿中ヘの血液の突然の出現を引き起こす糸球体の炎症に関連する。急性腎炎症候群は、連鎖菌感染症（例えば敗血性咽頭炎）に続いて起こることがある。糸球体は、凝集する死んだ連鎖球菌からの抗原と共に、それらを中和する抗体の蓄積によって損傷を受ける。これらの凝集塊（免疫複合体）は、糸球体の膜を被覆して、それらの濾過機能を妨げる。急性腎炎症候群は、また、他の感染症（例えば人工身体部分（人工器官）の感染、細菌性心内膜炎、肺炎、腹部臓器の膿瘍、水痘、感染性肝炎、梅毒およびマラリア）に対する反応によって生じる場合がある。最後の３つの感染症によって、急性腎炎症候群よりむしろネフローゼ症候群が生じる場合がある。「慢性腎炎症候群」または「慢性糸球体腎炎」は、糸球体が損傷を受け、数年の期間にわたって腎臓機能が悪化するいくつかの障害を引き起こす疾患に関連する。
【００１６】
糸球体症は糸球体疾患である。そして、それは毛細血管叢の病気である。腎糸球体疾患において、各々の尿細管の始点におけるループ状毛細血管の形状を成す房の疾患である。糸球体症のタイプは、例えば、（１）急性腎炎症候群；（２）急速進行性腎炎症候群；（３）ネフローゼ症候群；そして、（４）慢性腎炎症候群を含むが、これに限定されるものではない。糸球体が損害を受けているので、例えばタンパク質、血液、白血球および破片などの通常血流からもれない物質が、糸球体を通過し、尿に入ることができる。糸球体に供給する毛細血管において、小さい血餅（マイクロ血栓）が形成される場合がある。
【００１７】
糸球体硬化症は、しばしば腎臓動脈硬化または糖尿病と関連している腎糸球体中において、ヒアリンの堆積又は瘢痕化が引き起こされる腎変性疾患である。一般的に、循環炎症細胞の浸潤、間質の繊維化及び尿細管萎縮がある。いくつかの要因によって生じる糸球体障害は、可溶性IgA（sIgA）、sIgGおよびsIgMとタンパク質が結合するタンパク尿症をもたらし、基底膜の上に免疫複合体が形成される。これらの免疫複合体は、炎症性リンパ球に対しての化学走性因子として機能し、患部の過剰な免疫応答が生じる（Bohle A et al., Kidney Int 67 (Suppl.):186S-188S(1998)）。尿細管が炎症細胞によって損害を受けている場合、糸球体とつながっている血管もまた、損傷し、閉塞する。結果として、糸球体は、悪影響を受けて、悪化する。これらの糸球体の変化は、組織の繊維化を伴い、最終的な腎不全へと進行する（例えば、Ratscchek M et al., Clin Nephrol 25: 221-226 (1986); Bohle A et al, Clin Nephrol 29: 28-34 (1998); Bohle A et al., Kidney Blood Press Res 19:191-195 (1996)参照）。
【００１８】
あるタイプは、肥厚した基底膜および増加した糸球体間質マトリックスを伴う糸球体毛細血管の分節状の虚脱である巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）で、しばしばタンパク尿症および腎不全を引き起こす。例えば、Kamanna et al., Histol. Histopathol. 13: 169-179(1998); Wehrmann et al., Clin. Nephrol. 33:115-122 (1990); Mackensen-Haen, et al., Clin. Nephrol. 37:70-77 (1992)参照。それによって、永続的な腎不全が生じることがある。
【００１９】
「メサンギウム」なる用語は、腎臓の糸球体の毛細血管ループを支持している組織のことであり、メサンギウム細胞及び糸球体間質マトリックスからなっている。メサンギウム細胞が、糸球体のループ構造を維持すること及び糸球体血流を調整する食細胞の機能または能力を有することは公知である。糸球体間質細胞は、アンギオテンシンII受容器を有しており、血小板活性化因子、プロスタグランジン、タイプIVコラーゲン、フィブロネクチン、などを産生する。メサンギウムマトリックスは、メサンギウム細胞を囲む細胞外マトリックス成分である。
【００２０】
本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ受容体」又は「ＶＥＧＦＲ」なる用語は、ＶＥＧＦの細胞受容体、通常血管内皮細胞で見つかる細胞表面受容体、及びＶＥＧＦへの結合能を保持するその断片及び変異体（例えば、細胞外ドメインの断片または切断型）のことである。ＶＥＧＦＲのいくつかの例は、文献においてＦｌｔ−１（ここではＶＥＧＦＲ−１と交換可能に用いられる）及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（ここではＶＥＧＦＲ−２と交換可能に用いられる）として称されるプロテインキナーゼ受容体を含む。例えば、DeVries et al. Science, 255:989 (1992); Shibuya et al. Oncogene, 5:519 (1990); Matthews et al. Proc. Nat. Acad. Sci., 88:9026 (1991); Terman et al. Oncogene, 6:1677 (1991);及びTerman et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 187:1579 (1992)参照。Ｆｌｔ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ、fms-like tyrosine kinase-1）及びＫＤＲ（キナーゼドメイン領域、kinase domain region）受容体は、高い親和性でＶＥＧＦに結合する。ＫＤＲのマウスホモログであるＦｌｋ−１（胎児肝臓キナーゼ、fetal liver kinase-1）は、ヒトのＫＤＲと８５％の配列同一性を有する。Ferrara Kidney Intl. 56:794-814 (1999)。Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）−様ドメイン、一つの膜貫通領域及びキナーゼ挿入領域によって分断されているコンセンサス・チロシンキナーゼ（ＴＫ）配列を有する。およそ１０〜２０ｐＭの解離定数で、Ｆｌｔ−１は、ｒｈＶＥＧＦ１６５に対して最も高い親和性有する。およそ７５〜１２５ｐＭの解離定数で、ＫＤＲは、ＶＥＧＦに対して低い親和性を有する。ＶＥＧＦＲの核酸配列及びアミノ酸配列は、当業者によって容易に利用及び入手できる。
【００２１】
他のＶＥＧＦ受容体として、ＶＥＧＦをクロス・リンク標識できるもの、もしくは、ＫＤＲ又はＦｌｔ−１によって共免疫沈降させることができるものが含まれる。ＶＥＧＦ１２１でなくＶＥＧＦ１６５と結合する更なるＶＥＧＦ受容体が同定された。それがｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １である。Soker et al Cell 92:735-45 (1998)。アイソフォーム特異的VEGF結合受容体は、神経細胞誘導を媒介するコラプシン（collapsin）／セマフォリン（semaphorin）ファミリーに対する受容体でもある。
【００２２】
Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ受容体は、主に血管内皮細胞の表面に結合した受容体として存在する。但し、それらは、内皮細胞以外にも存在し得る。いくつかの可溶型VEGFRもまた、見つかっている。例えば、第７のＩｇ様ドメイン、膜貫通配列及び細胞質ドメインを欠く、選択的にスプライスされた可溶型Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）をコード化しているｃＤＮＡが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）において同定された。Kendall et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 226:324-328 (1996)。
【００２３】
「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung et al. Science, 246:1306 (1989)、Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)及びRobinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5):853-865 (2001)によって記載されているように、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１８９-、及び２０６-アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を意味する。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含み、生物学的活性を保持するポリペプチド断片をも意味する。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表す。「断片の」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。天然ＶＥＧＦ断片は、天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及び／又はＦｌｔ−１受容体結合親和性を有する。
【００２４】
「血管新生因子又は作用剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、内皮細胞増殖、血管の安定化及び／又は脈管形成などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子には、限定するものではないが、例としてＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリーのメンバー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンギオポイエチン)、エフリンなどが含まれる。また、創傷治癒を促進する因子、例として成長ホルモン、インスリン様増殖因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ、及び、そのファミリーメンバー及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。例えば、Klagsbrun and D’Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999);  Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (例えば、公知の血管形成因子を挙げている表１);及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)参照。
【００２５】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは任意の哺乳動物からの天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
【００２６】
「単離された」ポリペプチドとは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、ポリペプチドの診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。一実施態様では、ポリペプチドは、(１)ローリー法で測定した場合９５％を越える、又は９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツでのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２７】
ポリペプチド「変異体」は対応する天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチド又はその断片を意味する。そのような変異体には、例えば一又は複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加され、又は欠失されたポリペプチドが含まれる。通常は、変異体は天然配列ポリペプチドないしはその断片と少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２８】
本明細書中で用いる「変異体」なる用語は、ここに記載される変異体及び／又は一又は複数のアミノ酸変異を天然タンパク質の配列に含むタンパク質変異体を指す。場合によって、一又は複数のアミノ酸突然変異にはアミノ酸置換(一又は複数)が含まれる。本発明での使用のための変異体は当分野で公知の様々な方法によって調製されうる。本発明の一実施態様では、本発明の方法で用いられるＶＥＧＦは、組換えＶＥＧＦを含む。ＶＥＧＦのアミノ酸配列変異体はＶＥＧＦ ＤＮＡの突然変異によって調製されうる。アミノ酸配列変異体は、例えばＶＥＧＦのＤＮＡ又はＶＥＧＦＲのＤＮＡの変異により調製し得る。このような変異体には、例えばＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲのアミノ酸配列内の残基の例えば欠失、挿入又は置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の何かを組み合わせて、所望の活性を有する最終コンストラクトに達成してもよい。変異体をコードするＤＮＡ中に作製される突然変異は、リーディングフレーム外の配列におくべきでなく、好ましくは二次的ｍＲＮＡ構造を生産しうる相補的な領域を作製しないであろう。欧州特許第７５４４４号Ａ。
【００２９】
場合によって、変異体は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド部位特異的突然変異誘発又はファージディスプレイ技術によって、変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現することによって調整する。
【００３０】
アミノ酸配列変化を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異自体は予め決定する必要はない。例えば、ある部位での突然変異のパフォーマンスを最適化するために、ランダムな突然変異誘発を標的コドン又は標的領域で行い、発現された変異体を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位に置換突然変異を作製する技術は、周知の、例えば部位特異的突然変異誘発である。本明細書中に記述される変異体の調製は、ＰＣＴ出願国際公開第００／６３３８０号に記載のものなどのファージディスプレイ技術によって達成されうる。
【００３１】
このようなクローンが選択されたあと、変異したタンパク質領域は取り除かれ、タンパク質産生のために好適なベクター、一般に好適な宿主の形質転換に用いられうる種類の発現ベクターに組み込まれてもよい。
【００３２】
アミノ酸配列欠失は、一般に１〜３０の残基、場合によって１〜１０の残基、場合によって１〜５以下に変動し、一般的に隣接する。
【００３３】
アミノ酸配列の挿入には、１残基から基本的に制限しない長さのポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入(すなわち天然のタンパク質配列内の挿入)は、一般的におよそ１〜１０の残基、場合によって１〜５、又は場合によって１〜３に変動しうる。末端挿入の例は、組換え宿主からの分泌を促すためのＮ末端への、宿主細胞に異種性であるか相同的であるかにかかわらないシグナル配列の融合などである。
【００３４】
更なる変異体は、天然のタンパク質内の少なくとも一のアミノ酸残基が取り除かれているもの及び、異なる残基がその位置に挿入されているものである。このような置換は、表１に示すものを考慮してなされうる。また、本明細書において記述されるように、変異体は非天然のアミノ酸を含んでなってもよい。
【００３５】
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
(1) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
【００３６】
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づいてグループに分類してもよい。
(1) 疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(2) 中性の親水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(3) 酸性：asp、glu；
(4) 塩基性：his、lys、arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：gly、pro；
(6) 芳香族：trp、tyr、phe。
【００３７】
表１
2009541207.tif 000002
【００３８】
「天然に生じるアミノ酸残基」(すなわち遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基)は、アラニン(Ａｌａ)；アルギニン(Ａｒｇ)；アスパラギン(Ａｓｎ)；アスパラギン酸(Ａｓｐ)；システイン(Ｃｙｓ)；グルタミン(Ｇｌｎ)；グルタミン酸(Ｇｌｕ)；グリシン(Ｇｌｙ)；ヒスチジン(Ｈｉｓ)；イソロイシン(Ｉｌｅ)：ロイシン(Ｌｅｕ)；リジン(Ｌｙｓ)；メチオニン(Ｍｅｔ)；フェニルアラニン(Ｐｈｅ)；プロリン(Ｐｒｏ)；セリン(Ｓｅｒ)；スレオニン(Ｔｈｒ)；トリプトファン(Ｔｒｐ)；チロシン(Ｔｙｒ)；及び、バリン(Ｖａｌ)からなる群から選択されうる。「非天然に生じるアミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができる残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)及び米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が含まれる。簡単に言うと、これらの手順は、ＲＮＡのインビトロ又はインビボの転写及び翻訳が続く非天然に生じるアミノ酸残基によるサプレッサーｔＲＮＡの活性化を伴う。例として、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号；Noren et al. Science 244:182 (1989)；及び、上掲のEllman et al.を参照。
【００３９】
置換、欠失又は挿入による効果は、当業者により常套的なスクリーニングアッセイを用いて容易に評価することができる。例えば、ファージディスプレーにより選択されたＶＥＧＦ変異体は、組換え細胞培養において発現させ、場合によって細胞培養物から精製してもよい。ＶＥＧＦ変異体は、その時点でＫＤＲ又はＦｌｔ−１受容体への結合親和性、及びその技術分野において知られている、もしくは本明細書において開示されている他の生物学的活性を評価してもよい。細胞溶解物又は精製されたＶＥＧＦ変異体の結合特性及び活性は、適切なスクリーニングアッセイにおいて、所望の特性をスクリーニングすることができる。例えば、抗体に対する親和性など、天然のＶＥＧＦと比較してのＶＥＧＦ変異体の免疫学的特性の変化が望ましい。そのような変化は、競合型アッセイにより測定することができ、その分野における技術に従って実施することができる。それぞれのＶＥＧＦ変異体の受容体結合親和性は、その分野において周知であり、後述する実施例に記載されているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び／又はＢＬＡｃｏｒｅアッセイにより測定することができる。発明の一実施態様では、本発明のＶＥＧＦ変異体は、ＫＤＲ受容体のリン酸化誘導能を反映するＫＩＲＡアッセイにおいても活性を示すであろう。発明の一実施態様では、本発明のＶＥＧＦ変異体は、内皮細胞増殖（ＨＵＶＥＣ増殖アッセイなどの周知の方法により測定可能）を付加的又は選択的に誘導するであろう。ここに開示される特殊なＶＥＧＦ変異体に加えて、Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:5638-5646 (1996)に記載されるＶＥＧＦ変異体も、本発明において用い得る。
【００４０】
本明細書中の「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとして、選択した配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGIN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって以下に記載のように得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作製され、米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録され、ジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、例えばデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００４１】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００４２】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体(完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
【００４３】
特に断らない限りは、「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は典型的には３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【００４４】
「抗体断片」は、一般には無傷の抗体の抗原結合を含み、よって抗原に結合する能力を保持している無傷の抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体断片の例には、(i)ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；(ii)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ'断片；(iii)ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；(iv)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ'断片；(v)抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；(vi)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward等, Nature 341, 544-546 (1989))；(vii)単離されたＣＤＲ領域；(viii)ヒンジ領域がジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ'断片を含む二価断片であるＦ(ａｂ')２断片；(ix)単鎖抗体分子(例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ)(Bird等, Science 242:423-426 (1988)；及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；(x)同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー(diabodies)」(例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号)が含まれる。
【００４５】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾語句は、抗体が何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)又はMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４６】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
【００４７】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００４８】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。暴露時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【００４９】
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって均一には分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性のより短い領域により分離される１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる相対的にインバリアントな伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、これは主にβシート配置をとり、３つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、βシート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲ領域の直ぐ近傍に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害(ＡＤＣＣ)への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００５０】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、ＶＬのおおよそ残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及びＶＨのおおよそ３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、ＶＬの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及びＶＨの残基２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)(Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。
【００５１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全な抗体は異なる「クラス」に分類できる。完全な抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００５２】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化により生成される免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列のＦｃ領域又は変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界はまちまちであるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、約Ｃｙｓ２２６又は約Ｐｒｏ２３０に位置するアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで延びていると定義される(ここではKabat等, 上掲による番号付けシステムを使用した)。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメイン及び１つのＣＨ３ドメインを含み、状況に応じてＣＨ４ドメインを含む。
【００５３】
ここで使用する「Ｆｃ領域鎖」という表現は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００５４】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Cγ２」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
【００５５】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲(つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸)を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン(例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：米国特許第5,821,333号参照)とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。
【００５６】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域はは、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【００５７】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００５８】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に由来するＦｃ領域と同じアミノ酸配列を有する。「変異体ポリペプチドを含む。「変異体Ｆｃ領域」には、最低１つのアミノ酸修飾だけが天然配列のＦｃ領域と異なるアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域、又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合に、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここに開示する突然変異Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。
【００５９】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異性の毒性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞に境界抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する一次細胞はＦｃγＲIIIのみを発現し、一方単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII、及びＦｃγＲIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch及びKinetによる、Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)の、464ページの表3にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビボＡＤＣＣアッセイ(例えば米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載)を行うことができる。そのようなアッセイに有用な作動体細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又はそれに加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばClynesらによる PNAS(アメリカ合衆国)、 95:652-656(1998)に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【００６０】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
【００６１】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００６２】
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
【００６３】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００６４】
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００６５】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。更に、ここでの多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。ここでの多量体抗体に対して、機能的抗原結合部位の数は以下の実施例２に記載したような超遠心分離分析法を使用して評価することができる。この分析法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比を組み合わせ、複合体の平均分子量を、機能的結合部位の異なった数を仮定して算定する。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実験値と比較する。
【００６６】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
【００６７】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編 (1988)に記載されたもののような常套的な交差ブロックアッセイ法を実施することができる。
【００６８】
「ポリペプチド鎖」はそのドメインのそれぞれが他のドメインに、非共有的相互作用又はジスルフィド結合とは異なり、ペプチド結合によって結合したポリペプチドである。
【００６９】
ここでの「可動リンカー」とはペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味し、それによって結合された（例えば２つのＦｄ領域のような）２つのポリペプチドに対してより大なる回転自由度を提供する。そのような回転自由度により、可動リンカーによって結合された２又はそれ以上の抗原結合部位がそれぞれより効率的に標的抗原（群）に接近できるようになる。適切な可動リンカーペプチド配列の例には、gly-ser、gly-ser-gly-ser（配列番号：１０）、ala-ser、及びgly-gly-gly-ser（配列番号：１１）が含まれる。好ましくは、可動リンカーは２から約１０のアミノ酸残基、最も好ましくは４以下の残基を含む。
【００７０】
「二量体化ドメイン」は少なくとも２つのアミノ酸残基（一般にはシステイン残基）又は少なくとも２つのペプチド又はポリペプチド（これは同じか異なったアミノ酸配列を持ちうる）の結合（association）によって形成される。ペプチド又はポリペプチドは共有的及び／又は非共有的結合によって互いに相互作用しうる。ここでの二量体化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１-ＣＬ対；出典明示によりここに取り込まれる米国特許第５８２１３３３号に記載されたような、遺伝子操作された「ノブ（knob）」及び／又は「隆起(protruberance)」を持つ「インターフェース」；ロイシンジッパー（例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Kostelney等, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照；又は酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー）；イソロイシンジッパー；レセプター二量体対（例えばインターロイキン-８レセプター（ＩＬ-８Ｒ）；及びインテグリンヘテロ二量体、例えばＬＦＡ-１及びＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）、又はその二量体化領域；二量体リガンドポリペプチド（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン-３（ＮＴ-３）、インターロイキン-８（ＩＬ-８）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；Arakawa等, J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)及びRadziejewski等 Biochem. 32(48): 1350 (1993)を参照)、又はその二量体化領域；ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基対；ペプチド又はポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成可能なようにそれぞれが少なくとも一つのシステイン残基（例えば約１、２又は３から約１０のシステイン残基）を有するペプチド又はポリペプチドの対（以下、「合成ヒンジ」）；及び抗体可変ドメインが含まれる。ここでの最も好適な二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域である。
【００７１】
「形質移入」とはあらゆるコード配列が実際に発現されるかされないにかからわず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを意味する。数多くの形質移入法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。成功裏の形質移入はこのベクターの作用の任意の指標が宿主細胞内で生じる場合に一般に認められる。
【００７２】
「形質転換」とは、ＤＮＡが、染色体外成分としてであれ染色体統合によってであれ、複製可能であるように生物体にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的な方法を使用してなされる。Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972)及びMandel等, J. Mol. Biol., 53: 154 (1970)に記載されているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、実質的な細胞壁障壁を含む原核生物又は他の細胞に対して一般的に使用される。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は１９８３年８月１６日に発行されたAxelの米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核注入又はプロトプラスト融合もまた用いることもできる。
【００７３】
Ａ．抗ＧＤＭ抗体
一実施態様では、本発明は、ここで、神経膠腫の疾病の経過の重症度の決定及び／又は予後の予測において治療、診断及び／又は予後薬としての用途が見出され得る抗ＧＤＭ抗体の使用法を提供する。このような目的に使用できる例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【００７４】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
【００７５】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００７６】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
【００７７】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
【００７８】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００７９】
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００８０】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００８１】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
【００８２】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
【００８３】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
【００８４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【００８５】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００８６】
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００８７】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の実施に有用な抗-ＧＤＭ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)）。
【００８８】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００８９】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００９０】
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００９１】
ヒト化抗ＧＤＭ抗体抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞障害性剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【００９２】
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【００９３】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
【００９４】
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【００９５】
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片は、対応する完全長分子が有する抗原結合特異性に類似の特異性を維持しながら迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
【００９６】
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００９７】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＧＤＭタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＧＤＭ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＧＤＭアームは、ＧＤＭ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＧＤＭを発現する細胞に細胞障害性剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＧＤＭ結合アーム及び細胞障害性剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【００９８】
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。
【００９９】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１００】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１０１】
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１０２】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１０３】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１０４】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１０５】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１０６】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１０７】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１０８】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１０９】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０１１０】
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０１１１】
共有結合的修飾の他の型は、種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることをを含む。また、ＧＤＭポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Oslo編(1980)に開示されている。
【０１１２】
１０．免疫リポソーム
ここで開示されている抗ＧＤＭ抗体又はＧＤＭ結合抗体断片は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
【０１１３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０１１４】
９．抗ＰＲＯ８４２抗体の用途
本発明の抗ＰＲＯ８４２抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ＰＲＯ８４２抗体は、ＰＲＯ８４２の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、滑液、血漿／血清又は尿における発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.(1987)pp.147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら,Nature144:945(1962)；Davidら,Biochemistry,13:1014(1974)；Painら,J.Immunol.Meth.,40:219(1981)；及びNygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407(1982)に記載された方法が含まれる。
【０１１５】
また、抗ＰＲＯ８４２抗体は、組換え細胞培地又は天然の供給源からのＰＲＯ８４２の親和性精製に利用できる。この方法において、ＰＲＯ８４２に対する抗体を、当分野でよく知られた方法を用いてSephadex樹脂又は濾紙等の適した支持体に固定化する。次いで、固定化した抗体をＰＲＯ８４２を含む試料と接触させて精製し、その後、固定化した抗体と結合したPRO21074以外の試料中の実質的には全ての物質を取り除きうる適した溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からＰＲＯ８４２を引き離しうる他の適した溶媒で洗浄する。
【０１１６】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗ＮＲＰ１抗体は技術とすぐに入手可能な材料を用いて組み換えて生成することができる。
【０１１７】
抗ＮＲＰ１抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離されるか合成されて、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【０１１８】
(i)  シグナル配列成分
この発明の抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
【０１１９】
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【０１２０】
(ii)  複製起点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【０１２１】
(iii)  選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１２２】
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１２３】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
【０１２４】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【０１２５】
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１２６】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０１２７】
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【０１２８】
(iv)  プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
【０１２９】
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０１３０】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１３１】
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【０１３２】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【０１３３】
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１３４】
(v)  エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１３５】
(vi)  転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１３６】
(vii)  宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０１３７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【０１３８】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【０１３９】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
【０１４０】
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１４１】
(viii)  宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４２】
(ix)  抗体精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１４３】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０１４４】
本発明のポリペプチドに対する共有的修飾
本発明のポリペプチド、例えばＶＥＧＦやＶＥＧＦと組み合わせる他の付加的な治療用ポリペプチド薬剤の共有結合による修飾は本発明の範囲内に包含される。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又はポリペプチドの化学的切断によりなされうる。他の種類のポリペプチドの共有的修飾は、選択される側鎖又はＮ末端ないしはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を反応させることによって、又は、修飾アミノ酸ないしは非天然のアミノ酸を発達するポリペプチド鎖に組み込むことによって、分子内に導入される。例えばEllman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)；Noren等 Science 244:182 (1989)；及び、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号。
【０１４５】
最も一般的には、システイニル残基は、α-ハロアセタート(及び対応するアミン)、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイン残基もまたブロモトリフルオロアセトン；α-ブロモ-β-(５-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート；Ｎ-アルキルマレイミド類；３-ニトロ-２-ピリジルジスルフィド；メチル-２-ピリジルジスルフィド；ｐ-クロロ水銀安息香酸；２-クロロ水銀-４-ニトロフェノール；又はクロロ-７-ニトロベンゾ-２-オキサ-１,３-ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【０１４６】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応によって誘導体化されるが、この薬剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的である。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、典型的にはｐＨ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０１４７】
リジニル及びアミノ末端残基はコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α-アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬には、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ-メチルイソ尿素、２,４-ペンタンジオン、及びグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応である。
【０１４８】
アルギニル残基は一あるいは幾つかの従来の試薬との反応によって修飾され、とりわけ、フェニルグリオキサール、２,３-ブタンジオン、１,２-シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンがある。アルジニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。更に、これらの試薬はリジンの基並びにアルギニンε-アミノ基と反応しうる。
【０１４９】
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入に特に興味をもって、なされる。最も一般的には、Ｎ-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使用して、それぞれがＯ-アセチルチロシル種と３-ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基はラジオイムノアッセイでの使用のための標識化タンパク質を調製するために１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてヨウ素化される。
【０１５０】
カルボキシル側基(アスパルチル又はグルタミル)がカルボジイミド(Ｒ-Ｎ=Ｃ=Ｎ-Ｒ')(ここで、ＲとＲ'は異なったアルキル基である)、例えば、１-シクロヘキシル-３-(２-モルホリニル-４-エチル)カルボジイミド又は１-エチル-３-(４-アゾニア-４,４-ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基へ変換される。
【０１５１】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へしばしば脱アミド化される。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に入る。
【０１５２】
その他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86頁 (1983))、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１５３】
他のタイプの共有的修飾は本発明のポリペプチドに対してグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手順は、それらがＮ-又はＯ-結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中でのポリペプチドの生産を必要としない点で有利である。用いられるカップリング態様に応じて、糖(類)は、(a)アルギニンとヒスチジンに、(b)遊離のカルボキシル基に、(c)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(d)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(e)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(f)グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号並びにAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306頁 (1981)に記載されている。
【０１５４】
本発明のポリペプチドに存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になすことができる。化学的脱グリコシル化には、ポリペプチドを化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物に暴露することを必要とする。この処理により、ポリペプチドをインタクトなままにしながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆どの又は全ての糖の切断が生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。例えば抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成できる。
【０１５５】
本発明のポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【０１５６】
薬剤的製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５７】
また活性成分は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Oslo,A.編(1980)に開示されている。また、Johnson等, Nat. Med., 2:795-799 (1996)；Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993)；Hora等, Bio/Technology, 8:755-758 (1990)；Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462；国際公開第９７／０３６９２号、国際公開第９６／４００７２号、国際公開第９６／０７３９９号；及び、米国特許第５６５４０１０号を参照。
【０１５８】
ある実施態様では、インビボ投与のために使用される製剤は無菌である。これは滅菌濾過膜による濾過によって達成される。ＶＥＧＦは、凍結乾燥された形態、又は、水溶液又はゲル形態で保存されうる。より高い又はより低いｐＨ値でも好適な場合があるが、ＶＥＧＦ調製物のｐＨはおよそ５〜９まででありうる。賦形剤、担体、又は安定剤の使用によりＶＥＧＦの塩類が形成されうることは理解されるであろう。
【０１５９】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、本発明のポリペプチドを含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。封入された抗体は体内に長い間残る場合、３７℃での水分に暴露される結果、変性し又は凝集して、生物活性を消失させ、免疫原性を変化させる可能性がある。関与する機構に応じて安定化のための合理的な方策を案出することができる。例えば、関連するメカニズムに応じて安定性を得るための合理的な処置が案出できる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが分かったら、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリックス組成物を開発することで、安定化を達成することができる。
【０１６０】
また、ＶＥＧＦ及び／又は付加的な薬剤は、遺伝子治療によって創傷に投与されてもよい。遺伝子治療は、被検体への核酸の投与によって行われる治療を指す。遺伝子治療適用において、例えば欠損した遺伝子の置換のために、遺伝子を細胞に導入して、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」には、永続的な効果が単一の治療によって達成される従来の遺伝子治療と遺伝子治療薬の投与の両方が含まれ、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回の投与又は繰り返し投与を伴う。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電するホスホジエステル基を非荷電基に置換することによって修飾して、それらの取り込みを上げることができる。遺伝子治療の方法の一般的な概念については、例として、Goldspiel等 Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)；Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan Science 260:926-932 (1993)；Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；及び、May TIBTECH 11:155-215 (1993)を参照。用いられうる組換えＤＮＡ技術の当分野で公知の共通の方法は、Ausubel等 eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記述される。
【０１６１】
核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。技術は、核酸がインビトロ又はインビボで意図した宿主の細胞の培養細胞にトランスファーされるかどうかによって異なる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸のトランスファーに好適な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが含まれる。一般に好適なインビボ遺伝子導入技術には、ウイルス(一般的にレトロウイルス)ベクターによる形質移入及び、ウイルスコートタンパク質-リポソーム媒介性形質移入が含まれる(Dzau等, Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993))。例えば、インビボ核酸導入技術には、ウイルスベクター(例えばアデノウイルス、単純ヘルペスIウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス又は、アデノ関連ウイルス)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質媒介トランスファーに有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)が含まれる。遺伝子治療にウイルスベクターを使用する例は、Clowes等 J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)；Kiem等 Blood 83:1467-1473 (1994)；Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)；Grossman and Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)；Bout等 Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994)；Rosenfeld等 Science 252:431-434 (1991)；Rosenfeld等 Cell 68:143-155 (1992)；Mastrangeli等 J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)；及び、Walsh等 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993)に見られる。
【０１６２】
ある場合では、創傷の細胞を標的とする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなどを核酸供給源に供給することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質は、例えばある種類の細胞に向性があるキャプシドタンパク質又はその断片、細胞周期への内部移行を行うタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を亢進するタンパク質のターゲティングのため及び／又はこれらの取り込みを容易にするために用いられうる。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)；及び、Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)に記載される。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概要については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１６３】
用量及び投与
本発明の医薬組成物の用量と所望の薬剤濃度は、想定する特定の使用によって変化しうる。適切な用量の決定又は投与の手段は、十分に、通常の医師の技術の範囲内である。動物実験は、ヒトの治療のための有効量の決定について信頼性のある手引きとなる。有効量の異種間スケーリングは、Mordenti, J. and Chappell, W. The use of interspecies scaling in toxicokinetics In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96によって主張される原則に従って実施されうる。ＶＥＧＦを投与された動物の創傷モデルについての用量-反応曲線の例を図２に示す。これはウサギの虚血性耳創傷に投与されるＶＥＧＦについての用量-反応曲線である。図３は、糖尿病マウス創傷に投与されるＶＥＧＦについての用量-反応曲線である。創傷の種類又は疾患の予防ないしは治療のために、ＶＥＧＦの適切な用量は、治療する疾患の種類、上記に定義するように、疾患の重症度及び経過、該薬剤を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、従来の治療法、患者の病歴及び薬剤への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。ＶＥＧＦは、治療される特定の疾患、個々の患者の状態、ＶＥＧＦの運搬部位、投与の方法及び専門家に知られている他の因子を考慮して、良好な医療行為と一致した様式で製剤化され、投与されるであろう。
【０１６４】
使用される用量は本明細書において記述される因子に依存する。本発明のある実施態様では、疾患の種類と重症度に応じて、およそ１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ(例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＶＥＧＦ及び／又は薬剤が、例えば一又は複数の別々の投与であろうと、あるいは連続注入によるものであろうと、患者への候補投与量である。特定の用量及び運搬の方法に関する手引きは文献に示される。一実施態様では、投与されるＶＥＧＦの有効量は、およそ２０μｇ／ｃｍ２からおよそ２５０μｇ／ｃｍ２である。ある実施形態では、投与される有効量は、およそ２４μｇ／ｃｍ２又は２４μｇ／ｃｍ２である。ある実施形態では、投与される有効量は、およそ７２μｇ／ｃｍ２又は７２μｇ／ｃｍ２である。ある実施形態では、投与される有効量は、およそ２１６μｇ／ｃｍ２又は２１６μｇ／ｃｍ２である。一実施態様では、投与されるＶＥＧＦの有効量は、２０μｇ／ｃｍ２から２５０μｇ／ｃｍ２である。ある実施態様では、投与される有効量は、およそ２４μｇ／ｃｍ２からおよそ２１６μｇ／ｃｍ２、又は２４μｇ／ｃｍ２から２１６μｇ／ｃｍ２である。ある実施態様では、投与される有効量は、およそ２４μｇ／ｃｍ２からおよそ７２μｇ／ｃｍ２、又は２４μｇ／ｃｍ２から７２μｇ／ｃｍ２である。ある実施態様では、投与される有効量は、およそ７２μｇ／ｃｍ２からおよそ２１６μｇ／ｃｍ２、又は７２μｇ／ｃｍ２から２１６μｇ／ｃｍ２である。ある実施態様では、投与される有効量は、およそ２１６μｇ／ｃｍ２からおよそ２５０μｇ／ｃｍ２、又は２１６μｇ／ｃｍ２から２５０μｇ／ｃｍ２である。薬剤は一連の治療又は一時的に被検体に好適に投与される。
【０１６５】
数日又はそれ以上にわたって繰り返し投与するために、状態に応じて、疾患の症状が望ましく抑制されるまで、例えば創傷の完全な閉鎖又は創傷領域の減少が起こるまで、治療は維持される。しかしながら、他の投与計画が有用でもよい。典型的に、臨床医は、必要な生体作用が示される用量(一又は複数)に達するまで、本発明の分子(一又は複数)を投与するであろう。有効量のＶＥＧＦの投与は、毎日、又は場合によっては週に２、３回、例えば、週に少なくとも２回、又は週に少なくとも３回、又は週に少なくとも４回、又は週に少なくとも５回、又は週に少なくとも６回であってもよい。一実施態様では、ＶＥＧＦは、少なくとも６週間、又は少なくともおよそ１２週間、又は完全に創傷が閉鎖するまで(例えば、排液又は包帯の必要がない皮膚閉鎖により決定されうる)まで投与される。本発明のある態様では、ＶＥＧＦは、２０週間未満の間、投与される。本発明の治療の経過は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１６６】
本発明の治療組成物は、典型的に被検体に局所的に投与される。本発明の一実施態様では、ＶＥＧＦは、例えば、予め充填された注射器又は容器の、局所用ゲルの製剤である。ある実施態様では、更なる治療薬もまた、局所的に投与される。また、場合によって、ＶＥＧＦ及び／又は更なる治療的薬剤の投与の他の手段を、例えば任意の適切な手段、例えば、限定するものではないが、非経口、皮下、腹膜内、肺内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄膜下、経口、及び鼻腔内の投与によって投与されうる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下投与が含まれる。
【０１６７】
本明細書において記述されるように、ＶＥＧＦは一又は複数の更なる治療薬ないしは手順と組み合わされてもよい。併用投与には、同時投与、異なる製剤又は単一の製薬的製剤を用いたもの及び何れかの順序での連続的な投与が含まれる。複数の薬剤の使用もまた、本発明に包含される。例えば、ＶＥＧＦは、付加的な治療剤の投与の前、後、又は替えて投与されうるか、又は、これらと同時に投与されてもよい。一実施態様では、両方(又は、すべて)の活性薬剤が同時にそれらの生物活性を発揮する期間がある。併用療法投薬計画において、本発明の組成物は、治療的に有効な量又は治療的に相乗的な量で投与される。本明細書中で用いるように、治療的有効量は、ＶＥＧＦ及び一又は複数の他の治療薬の同時投与、ないしは手順の投与により標的の疾患又は症状が低減ないしは抑制される量である。例えば、治療的に相乗的な量は、ＶＥＧＦ及び一又は複数の他の治療薬、例えば本明細書中に記載のものの、相乗的又は有意に創傷治癒を促進及び／又は改善させるために必要な量である。
【０１６８】
疾患の予防又は治療のために、本抗体の好適な用量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。
【０１６９】
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器とラベルを具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、試験管等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の活性剤は本抗体である。容器のラベル又は付属物は、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示が明記されるパッケージ挿入物を含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１７０】
（実施例）
本明細書に記載される実施例及び実施態様は、単に例示を目的とするものであって、様々な改良や変更が当業者に示唆され、本出願の精神と権限内及び添付の特許請求の範囲に包含されることは理解されるところである。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、全ての目的のためのそれらの全てが本明細書に援用される。
【０１７１】
（実施例１）
Ｆｌｔ１／ＶＥＧＦＲ−１を介した腎臓メサンギウム細胞でのＶＥＧＦ−Ａによる新規自己分泌制御ループの同定
我々は、ＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ１／ＶＥＧＦＲ−１）を発現する細胞においてＶＥＧＦ遺伝子が除去されたトランスジェニックマウスを作製した。我々は、腎臓メサンギウム細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の除去により、１−３ヵ月歳のマウスにおいて、タンパク尿症、糸球体硬化症、高血圧及び死によって特徴づけられる進行性腎不全になることを発見した。影響を受けた糸球体は、足細胞における減少したＶＥＧＦ−Ａ発現、及び炎症細胞、免疫複合体の堆積及び補体活性化の増加を示した。メサンギウム細胞における自己分泌ループの障害は、減少した腎臓ＶＥＧＦレベルと関連しているヒトの腎臓の病変の一部に類似した明瞭な腎臓の変化を誘発する。インビトロにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ欠損メサンギウム細胞及びＦｌｔ−１欠損メサンギウム細胞は、減少した細胞生存、及びＥＣＭ合成及びマトリックス分解が減少する方向への遺伝子発現の変化を示した。これらの所見は、足細胞におけるECM生産及びVEGF発現を調整するVEGF-A及びVEGFR-1間の新規な自己分泌シグナリングループを同定する。腎臓細胞（例えばメサンギウム細胞）におけるVEGFR1の刺激は、減少したVEGF-Aレベルと関連した進行性の糸球体硬化症の治療の治療方針となり得る。
Ｆｌｔ−１：ｆｍｓ様チロシンキナーゼ；ＧＢＭ：糸球体基底膜；ＶＥＧＦ：血管内皮細胞増殖因子；ＶＥＧＦＲ：ＶＥＧＦ受容体；ＶＥＧＦＲ−１：ＶＥＧＦ受容体−１；Ｆｌｔ−１：ｆｍｓ様チロシンキナーゼ；ＶＥＧＦＲ−２：ＶＥＧＦ受容体−２（ＫＤＲ（またはＦｌｋ１））；ＷＴ：野生型；ＷＴ−１：ウィルム腫瘍核タンパク質−１；ＥＣＭ：細胞間マトリックス
【０１７２】
（材料と方法）
ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰ及びＦｌｔ１−Ｃｒｅマウスの作製及びＲＯＳＡ２６リポーター系統までの繁殖：
前述したように、ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスが作製された（例えば、Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159(1999a)を参照）。簡潔に述べると、ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスでは、ＶＥＧＦのエキソン３の近傍にｌｏｘＰサイトが存在しており、それによりｌｏｘＰ遺伝子組換えを受けた細胞においてＶＥＧＦアレルの無効化が起こる。ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスを、Ｆｌｔ１プロモータの３．１ｋｂの断片がＣｒｅ−レコンビナーゼの発現を駆動しているＦｌｔ１−Ｃｒｅマウスと交配させた（例えば、Gerber, H. P., et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667 (1997)を参照）。前述したように、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅマウスは、Ｃｒｅ−レコンビナーゼの発現を駆動しているＦｌｔ１プロモータの３．１ｋｂの断片を含むコンストラクトをマウス卵子前核に顕微注入することにより作製された。Hogan, B., et al. (eds.)参照。
【０１７３】
マウス胚の操作（Cold Spring Harbor Laborator Press, 1994）
Ｃｒｅ−レコンビナーゼの発現をモニタするために、Ｆｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）またはＦｌｔ−Ｃｒｅ＋マウスＲＯＳＡ２６リポーター系統と交配され（例えば、Mao, X., et al. Improved reporter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5037-5042(1999)を参照）、それによって、β−ガラクトシダーゼの遍在性の発現が、転写/翻訳終止シグナルによって阻害される。この「ストッパー-フラグメント」は、ｌｏｘＰサイトの近傍に存在しており、Ｃｒｅ媒介性の切除を起こし、Ｃｒｅ−レコンビナーゼを発現する細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現する。
【０１７４】
Ｆｌｔ１−ｌｏｘＰマウスの作製：
マウスのＦｌｔ１遺伝子座のエキソン１を含む１６ｋｂのゲノムＦｌｔ−１ＤＮＡクローンは、以下のプライマーを用いて、バクテリアの人工染色体ライブラリのスクリーニングにより単離された：
Ｆｌｔ１翻訳開始コドンの上流３．０〜１．６ｋｂに及んでいる１．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩゲノムＤＮＡフラグメントは切除され、ＴＮＬＯＸ１−３ターゲッティングベクターのＮｏｔＩサイトにブラントエンドクローニングされた。その後、２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｔＸＩゲノムＤＮＡフラグメントは、ブラントエンド・ライゲーションによって、ＰＧＫ−ｎｅｏＲカセットの下流で、ＬｏｘＰ３の５’側であるＴＮＬＯＸ１−３の固有のＡｓｃＩサイトにクローニングされた。この２．０ｋｂのフラグメントは、Ｆｌｔ１遺伝子プロモータ、転写開始点及びＦｌｔ１遺伝子のエキソン１の領域を含んでいる。最後に、２．０ｋｂのＢｓｔＸＩ／ＢｓｍＩゲノムＤＮＡは、ＴＫＮｅｏＦｌｔ１−１で表されるターゲティングベクターを作製するために、第３のｌｏｘＰサイトの３’側にあるＰｍｅＩにブラントエンドクローニングされた。ＴＫＮｅｏＦｌｔ１−１は、ｌｏｘＰの配列及び位置及びゲノムＤＮＡへの挿入を確認するために、配列決定され、制限エンドヌクレアーゼ消化を受けた。ターゲッティングベクターは、ＳａｌＩ消化によって直線化され、１２９Ｓｖ系統に由来するＴＣＬ１及びＲ１ＥＳ細胞に２０μｇエレクトロポレーションされた。ＥＳ細胞及びマウス胚繊維芽細胞は、前述したように、マウス白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で培養下で維持された（Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice.  Development 126:1149-1159 (1999a)を参照）。ＥＳ細胞は、エレクトロポレーションの２４時間後にＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を用いたポジティブセレクションにかけられ、このセレクションの９日間後に、個々のコロニーは採取、栽培され、サザンブロット分析により組換え陽性のものがスクリーニングされた。耐性クローンのゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ（ターゲッティング・イベントの５’末端の解析のため）もしくはＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（標的ゲノム領域の３’末端の解析のため）によって消化された。標的領域の５’及び３’末端をスクリーニングするために用いたプローブは、以下のプライマー対を用いたＰＣＲによって作製した：５’プローブ（６３９塩基）：Ｆｌｔ−ＬＯＸ．１１２３Ｆ（ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＡＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ（配列番号：１））及びＦｌｔ−ＬＯＸ．１７６２Ｒ（ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ（配列番号：２））；３’プローブ（８３４塩基）：Ｆｌｔ−ＬＯＸ．９７３３Ｆ（ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ（配列番号：３））及びＦｌｔ−ＬＯＸ．１０５６７Ｒ（ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ（配列番号：４））。＃１５及び＃Ｆ７として指定された２つの独立したＥＳ細胞クローンは、相同組み換え体として同定され、Ｃｒｅ−リコンビナーゼ（ｐＭＣ−Ｃｒｅ）をコード化している発現ベクターで一過性にトランスフェクションされた（Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice.  Development 126:1149-1159 (1999a)を参照）。トランスフェクトされたＥＳクローンは、個々のコロニーを得るために採取され、ＰＧＫ−ｎｅｏＲカセットの削除及びＬｏｘＰ１及びＬｏｘＰ２間の遺伝子組換えのためにサザンブロット及びＰＣＲによってスクリーニングされた。サザンブロット分析に加えて、選択されたコロニーも、プライマーＦｌｔ−ＬＯＸ．２３６Ｆ  （ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＡＣＴ（配列番号：５））及びＦｌｔ−ＬＯＸ．２６２９Ｒ  （ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＣＡＡ（配列番号：６））を用いたＰＣＲによって分析された。Ｆｌｔ−ＬＯＸ．２３６Ｆは、ＤＮＡの５’に直ちにアニールし、ＬｏｘＰ３の最初の６つのヌクレオチドとオーバーラップする。さらに、Ｆｌｔ−ＬＯＸ．２６２９Ｒ（３’ホモロジーアームの下流ＤＮＡに相同である）と共に用いられる。ＬｏｘＰ３を含むＤＮＡからＰＣＲ産物が生成される。これらのプライマーは、第３のｌｏｘＰサイトが遺伝子組換えを受けなかったことを更に確認するために用いた。
【０１７５】
＃１５及び＃Ｆ７に由来する１つのＥＳ細胞クローン（ＰＧＫ−ｎｅｏＲカセットが取り外されており、それぞれ＃１５．Ｃ１．Ｈ１及び＃Ｆ７．Ａ．Ｅ１１を意味する）は、３．５日のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ胚盤胞の胞胚腔への注入された（例えば、Hogan et al., et al. (eds.). Manipulating the mouse embryo, (Cold Spring Harbor Laborator Press) (1994)を参照）。キメラの雄は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雌のマウスと交配し、ＬｏｘＰ１／２及びＬｏｘＰ３を検出するためのＰＣＲ分析による生殖系列伝達のスクリーニングがその産仔により行われた。ＬｏｘＰ１／２の存在のスクリーニングに用いられるＰＣＲプライマーは、Ｆｌｔ−ＬＯＸ．１３３５Ｆ（ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ（配列番号：７））及びＦｌｔ−ＬＯＸ．３２０７Ｒ（ＧＣＣ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＣＧＧ（配列番号：８））であった。ＬｏｘＰ３の存在のスクリーニング用いられるＰＣＲプライマーは、Ｆｌｔ−ＬＯＸ．２３６Ｆ及びＦｌｔ−ＬＯＸ．２６２９Ｒであった。ＬｏｘＰに挟まれたＦｌｔ１アレルを有さないＦｌｔ１−ＬｏｘＰ（−／−）、ＬｏｘＰに挟まれた一つのＦｌｔ１アレルを有するＦｌｔ１−ＬｏｘＰ（＋／−）、及びＦｌｔ１の両方のアレルがｌｏｘＰサイトを含むＦｌｔ１−ＬｏｘＰ（＋／＋）マウスを作製するために、Ｆｌｔ１−ＬｏｘＰ（＋／−）マウスを交配させた。Ｆｌｔ１−ｌｏｘＰマウスは、一般的に、Ｆｌｔ−ＬＯＸ．１３３５Ｆ及びＦｌｔ−ＬＯＸ．３２０７Ｒオリゴヌクレオチドを用いているＰＣＲによって遺伝子型が判別された。
【０１７６】
インサイチュハイブリダイゼーション：
ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−ｂのインサイチュハイブリダイゼーションは、マウスのＴＧＦ−β（Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴ（配列番号：９）；Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＧＧＧＴＴＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＴ（配列番号：１０）；プローブ・サイズ：６０９ｎｔ）及び、ラットＶＥＧＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＡＣＧＴＣＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＧＣＧ（配列番号：１１）；Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡ（配列番号：１２）；プローブ・サイズ：３４８ｎｔ）に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって作製されたアンチセンス及びセンスプローブを用いて実施された。腎臓組織は、７．５週齢のマウスから摘出され、４％ホルマリンで固定され、パラフィン包埋された。５μｍ厚の切片は、脱パラフィンされ、３７℃で３０分間、４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で脱タンパク質化され、さらに前述したようにインサイチュハイブリダイゼーションのための処理が行われた（例えば、Gerber, H. P., et al. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nat Med 5:623-628(1999b)参照）。３３Ｐ−ＵＴＰ標識センス及びアンチセンス・プローブは、５５℃、オーバーナイトで切片にハイブリダイズされた。ハイブリダイズしていないプローブは、３７℃で３０分間２０μｇ／ｍｌ  のＲＮアーゼＡのインキュベーションによって取り除かれた後、５５℃の０．１  Ｘ標準食塩‐クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）で２時間、高いストリンジェンシーでの洗浄及び段階的なエチルアルコールによる脱水が行われた。スライドは、ＮＢＴ２ニュークリアトラックエマルジョン（イーストマン・コダック）に浸漬され、乾燥剤を含む密封されたプラスチックスライドボックスにおいて４℃で４−６週間露光され、現像した後にヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色した。
【０１７７】
電子顕微鏡：
４〜５週齢ＶＥＧＦｌｏｘＰ，Ｆｌｔ１−Ｃｒｅマウスの腎臓皮質組織片は、２％のホルムアルデヒド、２．５％のグルタールアルデヒドの０．１Ｍのカコジラート・バッファー中で、４℃、オーバーナイトで固定した。洗浄後、サンプルは、２時間１％水性オスミウムで後固定され、さらに水で洗浄された後、段階的なエチルアルコール及びプロピレンオキサイドで脱水され、ＥＰＯＮＡＴＥ  １２（Ted Pella, Inc. Redding, Ca）に包埋された。超薄切片は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  ＵＣＴミクロトームで切られて、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で対比染色された後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２透過型電子顕微鏡において８０ｋＶで観察された。画像は、ＧＡＴＡＮ  Ｒｅｔｒａｃｔａｂｌｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎデジタル・カメラで撮られた。
【０１７８】
ＬａｃＺ染色；
胚性日９．５胚または１週齢マウスからの組織をＬａｃＺ染色するために、組織は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において切開され、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）ＰＢＳによって４℃で１時間固定した。リンス・バッファー（５ｍＭエチレン・グリコールビス（アミノエチルエーテル）−四酢酸（ＥＧＴＡ）、０．０１％のデオキシコレート、０．０２％のＮＰ−４０、２ｍＭ塩化マグネシウムを含むＰＢＳ）中で３０分、３回の洗浄の後、胚は染色溶液（５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６、１ｍｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）を含むリンス・バッファー）中で３７℃、オーバーナイトでインキュベートされた。組織は４℃で３０分間、４％ＰＦＡを含むＰＢＳにおいて後固定された。そして、７０％のエチルアルコールへ移され、ライカＭＺＦＬＩＩＩ解剖顕微鏡、ＳＰＯＴデジタル・カメラ及びＳＰＯＴ  Ａｄｖａｎｃｅｄ光学ソフトウェアを用いて撮影されるか又はパラフィン包埋及び切片化のために処理された。
【０１７９】
組織学的分析及び免疫細胞化学：組織学的分析のために、組織は１２〜１６時間、１０％中性緩衝ホルマリンにおいて固定された後、７０％のエチルアルコールに移され、パラフィン包埋された。５μｍ切片は、ミクロトーム（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を用いて切られ、ヘマトキシリン‐エオジン（Ｈ＆Ｅ）によって染色された。パラフィン埋め込み切片は、Ｃｒｅ−リコンビナーゼに対する抗体（EMD Biosciences.Novagen, San Diego, California）、全ての内皮細胞を検出するＣＤ３１に対する抗体（MEC 13.3, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, California）、主に動脈ではない血管内皮にラベルをつけるＶＥＧＦＲ−２／Ｆｌｋ−１に対する抗体（MALK-1, Genentech, Inc. South San Francisco, California）及び発達及び活性化したメサンギウム細胞及び平滑筋細胞を検出するα平滑筋アクチンに対する抗体（DakoCytomation California, Inc., Carpinteria, CA）を使用した免疫組織化学によって分析された。細胞外基質成分を検出するために、ＩＶ型コラーゲンに対する抗体（Chemicon Internation, Temecula, California）及びラミニンに対する抗体（Chemicon）が用いられた。染色は、基本的に前述されるように行われた（例えば、Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a)を参照）。
【０１８０】
免疫蛍光法による研究のために、摘出された腎臓は縦に切開され、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Tissue Tek, Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA）に包埋された後、５〜１０μｍで切片化された。マウスVEGFを発現する糸球体細胞型を同定するために、凍結切片は、アフィニティー精製したインテグリンα8ウサギ抗血清（1/200でメサンギウム細胞を検出する、Ulrich Muller, The Scripps Research Institute, La Jolla, CAからの親切な寄贈）、ラット抗マウスCD31抗体（BD Pharmingen）（内皮細胞を検出する）、又は、ウサギ抗マウスウィルムの腫瘍核タンパク質抗体（WT-1; Santa Cruz Biotechnology Inc.（2μg/ml））（足細胞を検出する）の何れかと共に、20μg/mlの濃度のマウスＶＥＧＦを認識するヒト化モノクローナル抗体（a-VEGF、Genentech Inc.）と共にインキュベートされた。切片は、洗浄され、AlexaFluor-594結合ヤギ抗ヒトIgG及びAlexaFluor-488が結合したヤギ抗ラットもしくはヤギ抗ウサギのIgG二次抗体（4μg/ml、Invitrogen）とインキューベートされた。Flt1-Cre導入遺伝子を発現している糸球体細胞型を同定するために、凍結切片は、抗β‐ガラクトシダーゼ（Rockland Immunochemicals Inc.; 200μg/ml）、続いてAlexaFluor-594結合ヤギ抗ウサギIgGとインキューベートされた。WT-1抗体及び抗インテグリンα8は、ウサギIgGに対するゼノン標識化技術を用いて、製造業者によってAlexaFluor-488で標識化された（Invitrogen）。CD31抗体、又はAlexaFluor-488で標識化された抗WT-1抗体もしくは抗インテグリンα8抗体が洗浄された切片に適用された。この研究において、抗beta-Gal染色は、Cre-リコンビナーゼが媒介する切除が他の偏在的に発現し、これらのマウスにおける抗beta-Galの発現を駆動するＲＯＳＡ２６遺伝子プロモーターの抑制を不可逆的に取り除くように、いずれか、又は全ての発達の段階におけるFlt1-Cre導入遺伝子の発現を反映している（Mao et.al., Improved reporter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 96:5037-42 (1999)）。
【０１８１】
免疫グロブリンの堆積を検出するために、マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）の各クラス及びアイソタイプに特異的なフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合ラット・モノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA）は、4μg/mlの濃度で、ブロッキングされた凍結切片に4μg/mlの濃度で１．５時間インキューベートされた。Ｉｇ堆積は特異的なクラス及びアイソタイプのマウスＩｇに対するアフィニティ精製されたフルオレッセインイソチオシアネート結合ポリクローナル抗体を用いて確認された（Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL）。マウス補体系のC1q、C3及びC4コンポーネントは、5μg/mlのラット・モノクローナル抗体（HyCult Biotechnology b.v., Uden, The Netherlands）及び第２の試薬としてのAlexaFluor-594結合goat-anti-rat-IgG（Invitrogen）を用いて検出された。
【０１８２】
Ｔ細胞及び単球マクロファージ系統の細胞は、ＣＤ４に対する抗体（BD Biosciences, Pharmingen, San Jose, California）及びF4/80（Serotec Inc., Raleigh, NC）のそれぞれ、及び標準的な染色プロトコルを用いて検出された。全ての免疫細胞化学的研究において、一次抗体を濃度、種及びアイソタイプを合わせた精製Ｉｇに置換することは、ネガティブコントロールを包含する。 
【０１８３】
マウス腎臓の低酸素状態を検出するために4週齢Flt1-Cre-及びFlt1-Cre+; VEGF（loxP/loxP）マウスは、腹腔内に塩酸ピモニダゾール（Hypoxyprobe -1, Chemicon International, Temecula, California（60mg/kg））を注射された。1時間注射後の、マウスは頚椎脱臼によって安楽死した。そして、腎臓が摘出され、10%ホルマリンにオーバーナイトで固定し、それから脱水されて、パラフィンに包埋された。Hypoxyprobe-1キット製造業者Chemicon International）によって記載されているように、5μmのパラフィン包埋された切片は、Hypoxyprobe-1Mab1で処理及び染色され、蛍光を検出するための、ストレプトアビジン-AlexaFluor594（Invitrogen）で置換されたストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ・インキュベーションを除いた。Hypoxyprobe-Mab1で用いられた濃度に合わせたマウスIgG1は、一次抗体の非特異的染色のためのアイソタイプコントロールとして用いられた。更なるネガティブコントロールとして、Hypoxyprobe-1を注射されなかったマウスから単離された腎臓切片は、Hypoxyprobe-Mab1と共にインキューベートされた。
【０１８４】
リアルタイム定量的RT-PCR分析;RNAは、5〜7.5週齢マウスの組織からSTAT 60メソッド（TEL-TEST "B", Friendswood, TX）を用いて単離され、Rneasy クイック・スピン・カラム（Qiagen, Valencia, CA）で精製した。リアルタイム定量的RT-PCR分析は、前述したように100ngのトータルRNA、アプライドバイオシステムRT-PCR試薬及び96穴フォーマットのModel 7700 シークエンス・ディテクター（Applied Biosystems）を用いて行われた（例えば、Gerber, H. P., et al. Complete inhibition of rhabdomyosarcoma xenograft growth and neovascularization requires blockade of both tumor and host vascular endothelial growth factor. Cancer Res 60:6253-6258 (2000)を参照）。RT-PCRのコンディションは、48℃で30分、95℃で10分及び95℃で30秒及び60℃で90秒の40サイクルであった。結果は、Sequence Detection Software（Applied Biosystems）を用いて分析され、ANOVAによる統計解析は、StatViewソフトウェア（SAS Institute Inc., Cary,. North Carolina）を用いて行われた。各サンプルの相対RNA当量は、glyceraldehydes-3-dehydrogenase（GAPDH）レベルで標準化することにより得られた。
【０１８５】
血清化学及び血液学的パラメーター：7.5週齢マウスを二酸化炭素吸入によって安楽死させ、血液をエチレンジアミン四酢酸（EDTA）コーティングチューブ（Microtainer, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey）に心臓穿刺によって採取した。血液細胞数はCell Dyn 3700（Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois）を用いて計数した。血清はserum-separatorチューブ（Microtainer, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey）への採取により得られ、血清パラメーターは、ロシュ・コバス・インテグラ400計測器（Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana）を用いることを測定した。
【０１８６】
尿検査：尿は、４から５週齢のマウスから受動的に集められた。各遺伝子型のマウスからの代表的な尿サンプルは、尿テストストリップ（Chemstrip 10 with SG, Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, Indiana, USA）を用いて、タンパク質、血液、ブドウ糖及びケトンの存在が検査された。タンパク尿症は4-20%勾配トリス/グリシン・ゲル（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）上に1ulの尿をロードし、SDS-PAGEにかけることに続いて、銀染色法又はアフィニティー精製されたヤギ抗血清200μg/ml（Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX）を用いたマウス・アルブミンのウェスタンブロッティングによりさらに確認された。
【０１８７】
平均動脈圧の測定：マウスは、イソフルラン吸入によって麻酔された（Aerrane, Baxter Caribe Inc.）腹部の正中切開で、カテーテル（ポリエチレン管、PE10、Becton-Dickinson）が右の総頚動脈に配置され、絹糸縫合を用いて固定された。血圧測定はAcqKnowledgeハードウェアおよびソフトウェア（Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, CA）を用いてデジタルに15分間集められた。 
【０１８８】
統計解析：相補ＤＮＡマイクロアレイデータ（別のセクションを参照）の分析を除いて、全ての統計は、特に明記しない限りStatViewソフトウェア（SAS Institute Inc., U.S.A.）を用いた分散分析解析（ANOVA）によって行った。
【０１８９】
糸球体の単離及びメサンギウム細胞培養：マウス糸球体は、（Takemoto et al., A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. Am J Pathol 161:799-805 (2002)）の方法に従って単離され、20μg/mLフィブロネクチン（Sigma Corp, St Louis, Missouri）でコーティングされたディッシュ上の、メサンギウム細胞メディウム（ダルベッコのModifiedイーグルMedium（DMEM）、20%ウシ胎仔血清（FCS）、2mMのグルタミン、100のU/mLペニシリン、100のμg/mLストレプトマイシン）中で培養した。糸球体は、糸球体がプレートに付着し、コンフルエントな単層の細胞がディッシュを覆うまでの6-7日間、37℃、5%二酸化炭素、95%空気の加湿された空気においてインキューベートされた。この技術を用いて、糸球体メサンギウム細胞の均一な培養が行われ、少なくとも５回継代され得る。糸球体メサンギウム細胞の形態学は、光学顕微鏡を用いたメサンギウム細胞の発表された報告と一致しているようだった（Mene et al., Phospholipids in signal transduction of mesangial cells. Am J Physiol 256: F375-386(1989)）。糸球体メサンギウム細胞は、抗ビメンチン抗体（DakoCytomation）及び抗ミオシン抗体（Zymed Laboratories, Inc, South San Francisco, California）の免疫染色に対してポジティブであり、CD31（BD Biosciences Pharmingen, San Jose, California）及びアセチル化された低密度リポタンパク質取り込み（Biomedical Technologies, Inc, Stoughton, Massachusetts）についてはネガティブであった。加えて、全てのメサンギウム細胞は、インビトロで繊維芽細胞の成長を妨げる少なくとも3日間のD-バリンが置換された最小必須培地で培養された（Gilbert and Migeon, (1975). D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture. Cell 5:11-17）。
【０１９０】
糸球体メサンギウム細胞培養は、VEGF（loxP/loxP）及びFlt1（loxP/loxP）マウス、及びゲノムloxPサイトを有さない同じコロニーのWTマウスから確立された。メサンギウム細胞生存研究のために、メサンギウム細胞は、105細胞/ウェルの密度で６−ウェル・ディッシュに平板培養されて、20% FCSを含むメサンギウム細胞メディウムにおいて、オーバーナイトでインキューベートされた。メディウムは、吸引され、コントロールとしてLacZを発現しているアデノウィルス（Ad-LacZ）、又はloxP間の遺伝子組換えを誘発するCre-リコンビナーゼを発現しているアデノウィルス（Ad-Cre）のいずれかを含む無血清培地と交換された。それにより、それぞれVEGF（loxP/loxP）及びFlt1（loxP/loxP）細胞におけるVEGF又はFlt1遺伝子が除去された。アデノウィルスは、生存研究において、感染の多重度（MOI）１０００で用いられた。中和抗マウスVEGF抗体（a-VEGF、G6-23-IgG）（Genentech, Inc. South San Francisco, California）または、コントロール・アイソタイプを合わせた抗体（Control IgG）は、10μg/mLの濃度でＭＯＩ＝１０００のメディウムに添加された。アデノウィルス添加の４日後、残留付着細胞は、PBSで洗浄され、トリプシン処理して、Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer（Beckman Coulter, Inc. Fullerton, California）を用いて計数した。メサンギウム細胞は、各遺伝子型のマウスから単離された（遺伝子型につきn=5から7匹のマウス）。2から5のウェルは、細胞が誘導された各マウスの各ウイルスについて計数された。Ad-LacZ及びAd-Cre処理間の細胞数比は算出され、コントロールで得られた値の割合のように、標準化された。  
【０１９１】
相補ＤＮＡマイクロアレイ：メサンギウム細胞は、4匹のWTマウス及び4匹のVEGF（loxP/loxP）マウスから用意をされた。継代培養数2または3で、メサンギウム細胞は、MOI＝１００でAd-LacZまたはAd-Creを含む無血清培地で５日間培養された。RNAは、『リアルタイム定量的RT-PCR』のセクションにて説明したように、STAT60方法及びRneasy Quick Spin Columnsを用いて単離された。相補的なRNA（cRNA）を用意するための方法及びアレイのハイブリダイゼーション/スキャンのための方法は、Affymetrixによって提供された（Affymetrix, Inc. Santa Clara, California）。5μgのトータルRNAは、cDNA合成キット（SuperScript Choice（GIBCO/BRL, Grand Island, New York））及びT7-（dT）24オリゴマー・プライマー（Biosearch Technologies, Inc, Novato, California, Custom Synthesis）を用いて二本鎖cDNAに変えられた。二本鎖cDNAはアフィニティ樹脂（Sample Cleanup Module Kit、Affymetrix, Inc. Santa Clara, California）及びエタノール沈殿によって精製された。第二鎖合成の後、標識化されたcRNAは、T7 ＲＮＡポリメラーゼ及びビオチン標識化されたヌクレオチドを用いてcDNAサンプルからインビトロ転写反応で作製された（Enzo Biochem, Inc. Farmingdale, New York）。標識化されたcRNAはアフィニティ樹脂（sample cleanup module kit, Affymetrix）で精製された。標識化されたcRNAの量は、260ナノメートルで吸光度を測定して、260ナノメートルでの1 ODがRNA40μg/mlに対応する在来技法を用いることによって決定された。ｃＤＮＡ20μgは、40mMトリス-酢酸塩（pH 8.1）、100mM酢酸カリウム及び30mM酢酸マグネシウムに30分間94℃でインキューベートすることにより断片化された。サンプルは、炙り器オーブンで60回転数／分、４５℃で19時間、Mouse Genome 430 2.0アレイにハイブリダイズされた。アレイは、洗浄され、染色されてAffymetrix Fluidics Station及びスキャナーにおいてスキャンされた。データ解析は、Affymetrix GeneChip Analysisソフトウェアを用いて行われた。遺伝子発現はAffymetrix MAS 5.0 signal valuesによって要約され、対数目盛で分析された。分散分析はウィルス効果（Ad-LacZまたはAd-Cre）、遺伝子型効果（WTまたはVEGF（loxP/loxP））及び各プローブセットのVEGF遺伝子切除の効果を考慮することによって適用された。VEGF（loxP/loxP）細胞のAd-CreとAd-LacZからの遺伝子発現の平均倍率変化に対する対応WT細胞の倍率変化、遺伝子発現の差（ｔ検定からのp値）の証拠の強さ及び遺伝子発現の最小限の絶対信号機は、遺伝子切除効果によって有意に影響を受けるプローブ・セットをスクリーニングするための基準の組み合わせのように、用いられた。これらの基準は、2-倍の最小限の倍変更、p値が0.05以下、及び５０以上の絶対的な信号でセットされた。WT及びVEGF欠損メサンギウム細胞間の遺伝子発現の変化が、比較された。
【０１９２】
Affymetrixによって提供される遺伝子オントロジー分類に従って、有意に調節不全の遺伝子を分類するために、我々は2004年8月9日のバージョンの遺伝子オントロジー（ＧＯ）階層を得た。NetAffyデータベースは、各Affymetrixプローブ・セットをLocusLink遺伝子識別と関連させるために用いられた。loc2goファイルは、遺伝子及びGO概念を結びつけるために用いられるNCBI LocusLinkウェブサイト（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/LocusLink/のインターネットに利用できる）からダウンロードされた。遺伝子関連の分布は、GO注釈と共に遺伝子の全てのセット及びVEGF遺伝子切除に影響を受ける遺伝子のセットを用いてGO階層に算出された。各GO概念のために、遺伝子切除効果の有無とGO概念の有無を表した2×2の分割表が作製された。関連のカイ自乗分析は、統計的有意差を決定するために行われた。オッズ比は、予想される数によってGO概念に対する観察されたノックアウトが影響を及ぼしている遺伝子数を割ることによって算出された。オッズ比に対する95%の信頼区間は、1000のブートストラップサンプルから得られた。
【０１９３】
マイクロ・アレイ・データはまた、Ingenuity Pathways Analysis（IPA; IngenuityR Systems, www.ingenuity.com）を用いて分析された。発現が有意に特異に制御された（4e-3以下のｐ値）プローブの識別子は、遺伝子がマップされたアプリケーションにロードされた。これらのプローブが位置した遺伝子は、Ingenuity Pathways Knowledge Base（IPKB）に含まれる情報を用いて分子ネットワークを作製するために用いられた。機能解析のために、これらの同じ遺伝子は、IPKBを用いて生物学的機能及び／又は疾患と関連していた。フィッシャーの正確確率検定は、データ・セットに割り当てられた各生物学的機能及び／又は疾患が偶然のみに起因する可能性を決定するp値を算出するために用いられた。 
【０１９４】
（結果）
発生におけるＦｌｔ１−Ｃｒｅ導入遺伝子の発現は、内因性Ｆｌｔ１の発現を反復する  
Flt1遺伝子の3.1kbのプロモーター断片は、一過性にトランスフェクションされた内皮細胞又は酸素圧低下状態に暴露されたＨｅｐ３Ｂ細胞におけるレポータ遺伝子発現の増加を媒介するのに十分であることが既に同定され、特性が明らかにされている（例えば、Gerber, H. P., et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667(1997)を参照）。Ｃｒｅ−リコンビナーゼ遺伝子の上流に挿入された同じ３．１ｋｂのＦｌｔ−１プロモータ断片からなる構成要素は、トランスジェニック・マウスを作製するために用いられた。成人腎臓において最も高いＬａｃＺ発現を有する系統は、詳細な導入遺伝子発現分析のために選抜された。９．５日のトランスジェニック胚のホールマウント染色は、内因性のＦｌｔ１遺伝子発現によって一致した血管発現パターンを明らかにした。また、例えば、Fong, G.H., et al. Regulation of flt-1 expression during mouse embryogenesis suggests a role in the establishment of vascular endothelium. Developmental Dynamics 207:1-10 (1996)を参照。新生児マウスにおいて、LacZ陽性細胞は、心臓、脾臓、肺、精巣及び皮膚を含む種々の組織に存在した。腎臓内皮細胞及びメサンギウム細胞におけるＦｌｔ−１発現について記載している依然の報告に一致して（Takahashi, T., et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226(1995)を参照）、LacZ陽性細胞は、管周囲内皮細胞及び腎糸球体の中央域の範囲内の細胞で見つかった。また、５日齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；  ＲＯＳＡ＋マウスにおいては内皮細胞及びメサンギウム細胞に典型的に局在した。
【０１９５】
Ｆｌｔ−ＣＲＥ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスは、糸球体腎炎を呈して及び、−１２週、４歳で末期腎不全に屈する。  
Ｆｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスは予想されるメンデル比で生まれた（図１、ａ）が、減少した生存は、４週間目から明白であり、９５％以上のＦｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスが１２週までに死亡した（図１、ｂ）。精密検査により、Flt-CRE+; VEGF（loxP/loxP）マウスが脾臓を欠いており、腎臓質量は有意に減少していたことが明らかとなった。図１（ｃ）を参照。嚢胞腎病変の減少した腎臓脈管形成及び嚢胞性腎疾患の出現が見られ、両側の腎臓における疾患を示していた。図１（ｄ）参照。肺、肝臓、心臓、脳及び骨格筋等のＬａｃＺポジティブ脈管系を有する他の器官は、形態学、重量または血管系のいかなる有意な変化を示さなかった。
【０１９６】
検尿で、4〜5週齢Flt-CRE+; VEGF（loxP/loxP）マウスにおいて、500mg/dLを上回るタンパク尿症がみられた。銀染色法及びウェスタンブロット分析で、莫大な量のアルブミンが検出され、Flt-CRE+; VEGF（loxP/-）またはFlt1-Cre-マウスではなくFlt-CRE+; VEGF（loxP/loxP）マウスの尿において、不完全な糸球体ろ過バリア機能を示している。図１（ｅ）参照。血液化学分析により、コントロールマウスと比較してＦｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおいて血中尿素窒素（Ｂ．Ｕ．Ｎ．）レベル及び、血清クレアチニンの４倍の増加が見られたが（図１、ｆ及びｇを参照）、ナトリウム、カリウム、塩化物及びカルシウムの血清レベルは影響を受けなかった。腎不全と関連している病理学と一致して、Flt-CRE+; VEGF（loxP/loxP）トランスジェニック・マウスの血圧は、Flt-CRE-コントロール同腹仔と比較して有意に上昇していた。図1（h）参照。合わせると、これらは、Flt-CRE+; VEGF（loxP/loxP）マウスが次第に、タンパク尿症及び高血圧と関連した腎臓機能不全が進行し、末期腎不全に至ることを示している。
【０１９７】
腎臓メサンギウム細胞におけるＦｌｔ１−Ｃｒｅ導入遺伝子発現及びＶＥＧＦ−Ａ遺伝子切除
免疫組織化学的手法を用いる、我々は4週齢Flt1-Cre+; VEGF（loxP/loxP）マウスの糸球体におけるVEGF-A発現及びa-Wilms腫瘍核タンパク質を発現している足細胞を特定し（Haas, C., et al. MHC antigens in interferon gamma (IFN gamma) receptor deficient mice: IFN gamma-dependent up-regulation of MHC class II in renal tubules. Kidney-Int 48:1721-7 issn: 0085-2538(1995)を参照）、大多数のVEGF-A発現が足細胞に限定されていることを明らかにした。ＶＥＧＦ−Ａを発現する糸球体細胞型を同定するための抗ＶＥＧＦ抗体での共染色と共に、４週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）；ＲＯＳＡ２６＋マウスの腎臓の凍結切片をメサンギウム細胞（抗インテグリンα８）、内皮細胞（抗ＣＤ３１）及び足細胞（抗ＷＴ−１）を検出する抗体で染色し、ＶＥＧＦ−Ａが糸球体足細胞及びメサンギウム細胞において検出された。マージ画像は、VEGF-A発現がWT-1-positiveな足細胞において検出され、有意であるが、より低VEGF-A発現が糸球体メサンギウム細胞において検出されることを示した。７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−マウスの糸球体の周辺の多量な銀粒子に示されるように、ＶＥＧＦ−Ａのインサイチュハイブリダイゼーションにより、足細胞における高いレベルのＶＥＧＦ−Ａ発現が確認された。図２（ａ）参照。インテグリンα８陽性メサンギウム細胞（例えば、Hartner, A., et al., Alpha8 integrin in glomerular mesangial cells and in experimental glomerulonephritis. Kidney Int 56:1468-80(1999)を参照）及びＶＥＧＦ−Ａの共染色によって、４週間齢マウスのメサンギウム細胞におけるより弱いが、有意な発現が示された。図２（ａ）参照。しかしながら、我々は、分析された腎臓切片において、ＶＥＧＦ−Ａ／ＣＤ３１二重陽性内皮細胞を検出することはできず、このことは以前に記載されている糸球体内皮細胞のＶＥＧＦ−Ａの欠如と一致していた。例えば、Simon, M. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268: F240-50 issn: 0002-9513(1995)及び、Noguchi, K. et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-25 (1998)参照。  
【０１９８】
胚性及び出産後の発達においてＣｒｅ−リコンビナーゼを発現している糸球体細胞型を決定するために、免疫蛍光組織化学はβ−ガラクトシダーゼを検出する抗体（抗ｂｅｔａ−Ｇａｌ）を用いて実施された。４週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓切片の分析により、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋）同腹仔と比較してＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおいてβ−Ｇａｌ／インテグリンα８二重陽性メサンギウム細胞数及び染色が増加したことが明らかとなった。しかしながら、β−Ｇａｌ、及び足細胞マーカーであるＷＴ−１もしくは内皮細胞マーカーであるＣＤ３１の二重陽性細胞は検出されなかった。免疫組織化学はFlt1-Cre導入遺伝子がメサンギウム細胞において検出ことを明らかにした、免疫組織化学により、Flt1-Cre導入遺伝子はメサンギウム細胞において検出されたが、糸球体内皮細胞で検出された。ところが、Ｆｌｔ−１を発現することが公知である管状内皮細胞は陽性であった。図２（ｂ）参照。ゲノムPCRにより、胚発生（E17.5及びE18.5）における腎臓及び1週齢Flt1-Cre+; VEGF（loxP/wt）マウスの腎臓のメサンギウム細胞組織片において有意なレベルのVEGF切除が明らかとなった。これらの所見は前の報告と一致しており（例えば、Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26(1995)を参照）、腎糸球体内のメサンギウム細胞がＶＥＧＦ−Ａ及びＦｌｔ１の両方を発現することができ、更にＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの糸球体におけるＶＥＧＦ−遺伝子切除が少なくともメサンギウム細胞で起こっているという考えのサポートを示唆している。ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子切除は他の糸球体細胞又は糸球体区画の外側の細胞において起こる場合があるが、我々の分析では検出されず、観察された糸球体の変化に間接的に関与する可能性がある。ＲＮＡの定量的遺伝子発現分析により、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓での組織障害及び進行する修復プロセスが、Ｃｒｅ−リコンビナーゼの著しい上方制御を引き起こすことを確認した（図２（ｃ）参照）。ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子切除及び糸球体血管分布の減少（図３、Ｐａｎｅｌ  ｇ及びｈ）と一致して、同時、Ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ−２）及びＶＥＧＦ−Ａの下方制御が検出された（図２（ｃ））。その一方で、Ｆｌｔ−１レベルは変わらなかった。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓を用いたインサイチュハイブリダイゼーションの実験により、７週齢までに全ての糸球体細胞型におけるＶＥＧＦ−Ａ発現の著明な減少が明らかとなった。１週齢の腎臓についてのＶＥＧＦ及びＢ−Ｇａｌ発現の免疫組織化学的分析は、糸球体の３つの主要な分類を同定した：１．）β−Ｇａｌ染色の非存在下において、正常レベルのＶＥＧＦ発現をしている糸球体。２．）減少したＶＥＧＦ及び斑点状のβ−Ｇａｌ発現を示している糸球体、及び３．）高いβ−Ｇａｌ染色が見られるが、検知されないＶＥＧＦレベルの糸球体。腎臓メサンギウム細胞におけるVEGF遺伝子切除は、生後発育を通して起こり、減少した足細胞VEGF発現及び／���は足細胞細胞死と関連している場合がある。これらの実験において、その所見により、腎臓メサンギウム細胞のVEGFによる自己分泌調節ループの下流の標的として、足細胞によるVEGF発現が同定される。
【０１９９】
低酸素状態は、VEGF-A及びVEGFR-1の発現を上方制御することが見いだされ（例えば、Gerber, H.P., et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-67(1997)を参照）、増加した腎臓低酸素状態が、糸球体腎炎でも報告された。例えば、Nangaku, M. Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Intern Med 43:9-17(2004)を参照。4週齢Flt1-Cre+; VEGF（loxP/loxP）の腎臓糸球体の低酸素領域を、（Hypoxyprobe-Mab1）を用いて分析すると、増加した低酸素状態が野生型同腹仔と比較してノックアウト・マウスで一貫して見つかった。そのことは、低酸素状態がFlt-CREの上方制御を介してVEGF遺伝子切除を促進する場合があることが示された。個々の糸球体の疾患の進行度における変化と組み合わせた低酸素状態の領域によるバリエーションは、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ導入遺伝子の局所的な発現及び糸球体内皮細胞の導入遺伝子発現の欠如を説明する場合があり、それは基準気圧下の循環と密接に関連している。
【０２００】
Ｆｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）トランスジェニック・マウス糸球体の病態生理学変化
Ｆｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスで起こる組織病理学的変化は、腎不全に導く細胞における現象を理解するために分析された。異常な糸球体構造は、２、３及び７週で光学顕微鏡により検査されたＦｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおいて、明白だった。２週歳のマウスにおいて、嚢胞は腎皮質の全体にわたって存在し（図３、ａ）、それらの年齢を合わせたＷＴ同腹仔の糸球体とは外見上異なった２種類の糸球体構造が識別された（図３、ｂ）。２週間目のＦｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおいて、無細胞性領域を囲む足細胞からなる発達不十分な糸球体は、頻繁に観察された（図３、ａ及びｃ）。この外観を有する糸球体が、毛細血管ループの欠如により機能不全となる可能性があり、その上、７週歳のマウスの腎臓に類似した構造が見られないように（図３、ｅ及びｆ）、この段階を越えて発達することができない可能性がある。２−３週齢のＦｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓における多くの糸球体は、顕著に拡大され、糸球体全体にわたる多数の好酸球、タンパク性堆積、及び既存の毛細血管ループの欠如又は崩壊が観察された（図３、ｄ）。これらの糸球体は、典型的な７週齢Ｆｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの糸球体に類似した外観を有しており、それは、糸球体硬化症、繊維症及び巣状性間質性腎炎（図３、ｆ）を示す。それぞれの腎臓において、個々の糸球体は、軽度から重度の明白な変化を伴い、異なる程度に影響を受けている。加えて、移行上皮（図３、Ｐａｎｅｌ）により内側を覆われた大きな嚢胞及びタンパク性の物質で満たされ拡張された皮質尿細管が散在する群が観察された（図３、ｅ及びｆの比較）。ＷＴの腎臓と比較して、Ｆｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの糸球体全体にわたって、細胞質の減少が明白であり、その原因の一つには、減少した内皮細胞数があると考えられる（図３、ｇ及びｈの比較）。Ｆｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓における減少したＣＤ３１染色は、ＲＴ−ＰＣＲ（図６、ａ−ｄ）及び免疫組織化学的染色により測定されるように、多くの硬化性糸球体において広範囲なラミニン及び局所性のコラーゲンＩＶの堆積を伴っていた。例えば、７週間目のマウスのｋｉｄｎｅｔｙ切片で、ラミニン堆積は尿細管において検出され、病的な腎臓の糸球体の全体にわたって存在し、増加したコラーゲンＩＶ染色は野生型同腹仔と比較して患部組織において検出された。さらに、糸球体線維症及び組織障害のメディエーターであり、腎臓疾患においてたびたび上方制御されるトランスフォーミング成育因子−β（ｔｇｆ−β、図３、ｉ及びｊ）（Schnaper, H.W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284: F243-52(2003)によって論評される）、及び、活性化されたメサンギウム細胞のマーカーであるα平滑筋アクチン（図３、ｋ及びｌ）の両方が損傷を受けた腎臓において顕著に上昇した。
【０２０１】
透過電子顕微鏡法による腎臓切片の超微細構造の分析は、Ｆｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓において、足細胞足突起の融合及びメサンギウム細胞のマトリックスの拡張を含む巣状糸球体硬化症と一致したメサンギウム細胞及び他の特徴における欠陥を同定した（図３、ｍ）。内皮細胞がいくつかの糸球体において健常な見えるにもかかわらず、有窓化の喪失及び糸球体基底膜の広範囲に及ぶ拡張が、より進行した病変を伴った糸球体において観察される。加えて、メサンギウム細胞の損失及び電子密度の高い堆積物は、未発達な糸球体に存在した（図３、ｍ）。
【０２０２】
糸球体メサンギウム細胞のＶＥＧＦ遺伝子切除は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の堆積及び補体活性化と関連している。
Ｆｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓における高められた免疫応答の証拠は、循環リンパ球の上昇により示唆された。単核細胞／マクロファージ、Ｂ細胞及びＴ細胞系統（ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＣＤ４５Ｒ  ａｍｄ  Ｔｈｙ−１、それぞれ）のマーカーに対する腎臓ＲＮＡのリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｆｌｔ−ＣＲＥ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓において免疫浸潤が検出されたが、コントロール同腹仔においては検出されなかった（図４、ａ）。免疫組織化学的分析は、Ｆｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓におけるＦ４／８０及びＣＤ４（Ｔ細胞の一部のマーカー）発現細胞数の増加を明らかにした。図４（ｂ）を参照。これらの細胞系統マーカーがＦｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）トランスジェニック・マウスの肺又は心臓において上昇しなかったように、免疫細胞浸潤は腎臓組織に特異的に見えた。
【０２０３】
例えば、IgM及び各マウスのＩｇＧアイソタイプに特異的なモノクローナル抗体を用いた５週齢Flt1-Cre+;VEGF（loxP/loxP）マウスの腎臓皮質組織の免疫蛍光染色によって、分析された抗体のＩｇサブクラスの中で、IgG、IgA、IgDまたはIgE でなくIgMが病的な糸球体において堆積していることが明らかとなった。さらにまた、補体経路のＣ１ｑ、Ｃ３及びＣ４タンパク質の著しい増加は、（例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ３及びＣ４コンポーネントに対して特異的な抗体を使用した免疫蛍光法によって）特にＷＴの腎臓と比較してＦｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓の糸球体で検出された。増加したＣ１ｑ、Ｃ３及びＣ４が１週齢マウスにおいて検出され、Ｆｌｔ−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおいて補体媒介性細胞溶解が腎臓障害に有意に関与している可能性が示唆された。ハプロ不全（haplo-insufficient）の足細胞に選択的なＶＥＧＦ欠失を伴うマウスの腎臓における補体媒介性障害の証拠は、検出されなかった。
【０２０４】
ＶＥＧＦ遺伝子切除は、インビトロでメサンギウム細胞の生存に悪影響を与える：メサンギウム細胞における内部自己分泌ループを介して作用するＶＥＧＦの証拠。
インビトロでのメサンギウム細胞の成長に対するＶＥＧＦ−Ａ及びＦｌｔ１遺伝子切除の効果を調べるために、我々は、Ｆｌｔ１アレルに関して条件付きのアレルを有するマウス（Ｆｌｔ１−ｌｏｘ／ｌｏｘＰ）を作製した。図５（ａ）を参照。ｌｏｘＰサイトがマウスＦｌｔ１遺伝子のエキソン１の両側に位置しているターゲッティング・ベクターは、作製され、マウス胚性幹細胞の相同組み換えに用いられた。Ｆｌｔ１（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスは予想されるメンデルの頻度で生まれ、２つのｌｏｘＰサイトの存在がマウスの発生を妨げなかったことを示している。ＷＴ、ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）及びＦｌｔ１（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスからのメサンギウム細胞の均一な標本は、糸球体単離により得られ、ＬａｃＺを発現しているコントロール・アデノウィルス（Ａｄ−ＬａｃＺ）又はＣｒｅ−リコンビナーゼを発現しているアデノウィルス（Ａｄ−Ｃｒｅ）の何れかを感染させた。インビトロでのＦｌｔ１及びＶＥＧＦ−Ａ遺伝子切除頻度が、サザンブロット分析（図５、ｂ）及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（図５、ｃ及びｄ）によってモニタリングされ、９５％以上であることがわかった。メサンギウム細胞におけるＦｌｔ−１又はＶＥＧＦ−Ａ遺伝子切除は、細胞生存の有意な減少を引き起こし（図５、ｅ）、それによりＶＥＧＦがＦｌｔ１を介して細胞自律的な形でメサンギウム細胞生存を制御することが示された。中和ＶＥＧＦ抗体（ａ−ＶＥＧＦ、Ｇ６−２３）の添加は、メサンギウム細胞の生存に影響を与えなかった（図５、ｆ）。Ｇ６−２３が細胞内区画から排除されるように、ＶＥＧＦ−Ａ−またはＦｌｔ１欠損メサンギウム細胞において観察されるメサンギウム細胞の生存性の減少を反復する障害は、ＶＥＧＦ−Ａが内部自己分泌ループを介して作用する可能性を示している。Ｆｌｔ１欠損メサンギウム細胞の生存の減少は、ＶＥＧＦ−Ａのみの欠損によって生じる減少より大きく、他のＦｌｔ１のリガンド（例えばＰｌＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｂ）もまた、一因となる可能性を示唆している。
【０２０５】
メサンギウム細胞におけるVEGF遺伝子切除は、増加したECM生産と一致した遺伝子発現の変化を誘導する。
我々は、ＶＥＧＦ−Ａ欠損メサンギウム細胞において特異的に発現する遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った。２倍（絶対値）より大きい変化及び０．０５以下のｐ値（Ｓｔｕｄｅｎｔｓ’  ｔ−ｔｅｓｔ）により選抜したところ、分析した１１８１０の遺伝子のうち４８０の遺伝子がＷＴのメサンギウム細胞と比較してＶＥＧＦ−Ａ欠損メサンギウム細胞において有意に上方制御されることを見出した。走化性、構造的完全性又はＥＣＭ生産の制御、細胞移動及び体液性防衛機構に関連する遺伝子において有意差を示した全ての遺伝子のコントロール・セットと上方制御された遺伝子の分類間のＧＯ注釈の比較は、示されている（表２）。我々は、ＶＥＧＦ−Ａ欠損メサンギウム細胞において下方制御される遺伝子に対して同じ分析を行い、有意に示された６つのカテゴリーを同定した。６つのカテゴリのうちの３つはタンパク分解性遺伝子のスーパークラスに属し、一つは細胞情報伝達に関連する遺伝子を含んだ（表２）。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行われたシグナル経路分析は、細胞成長及び増殖、細胞集合、組織及び欠陥経路として定義されたサブクラスに属する遺伝子の発現がＶＥＧＦ欠損メサンギウム細胞（表２）において有意に変化したことを更に明らかにした。我々も、タンパク質合成、細胞死、細胞間シグナリング及び免疫応答に関与する分子ネットワークのカテゴリに属する遺伝子の４６％から５７％の発現がＶＥＧＦ欠損（表２）により有意に影響を受けていることを同定した。メサンギウムのマトリックス蓄積または糸球体疾患と関連している候補遺伝子は、ＶＥＧＦ−Ａ欠損メサンギウム細胞において有意に調節不全だった。それらの中で、ｔｇｆ−ｂ１（例えば、Schnaper, H. W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284: F243-252(2003)を参照）、アンジオポエチン−１（例えば、Satchell, S. C., and Mathieson, P. W. Angiopoietins: microvascular modulators with potential roles in glomerular pathophysiology. J Nephrol 16:168-178(2003)を参照）、及びＣＯＸ−２（Nasrallah, R. & Hebert, R.L. Prostacyclin signaling in the kidney: implications for health and disease. Am J Physiol Renal Physiol 289: F235-46 (2005)において論評）は上方制御されたが、血小板由来増殖因子受容体-β（Ｐｄｇｆｒ−β）及びＰｄｇｆ−ｃ（Betsholtz, C. et al. Role of platelet-derived growth factor in mesangium development and vasculopathies: lessons from platelet-derived growth factor and platelet-derived growth factor receptor mutations in mice. Curr Opin Nephrol Hypertens 13:45-52 (2004)において論評）は下方制御された。インビトロでのＶＥＧＦ−Ａ欠損メサンギウム細胞の遺伝子発現の変化は、細胞自律的に、のこれらの方法を制御するために、ＥＣＭメサンギウム・コンポーネントの蓄積を明らかにし、ＶＥＧＦ−Ａがこれらのプロセスを制御することを同定した。
【０２０６】
表２  メサンギウム細胞におけるＶＥＧＦ欠損に関連した遺伝子発現の変化
ＶＥＧＦ−Ａ欠損メサンギウム細胞において上方制御又は下方制御された遺伝子において有意に示された遺伝子オントロジー分類。
2009541207.tif 000003
2009541207.tif 000004
2009541207.tif 000005
【０２０７】
腎臓展開の間の減少したVEGF発現と関連している腎臓Pathologies
腎臓メサンギウム細胞（Flt-1時までに媒介となられる）のVEGF-Aの細胞自主的な機能は同定される及び、腎臓展開の間のこの調節機構の役割は記載されている。この調節機構を有する障害によって糸球体硬化症と関連しているいくつかの病態生理学の特徴が生じることができる証拠は、提供される。このモデルの進行性の腎不全は、発達上の損傷モデル（糸球体腎炎の成体開始モデルよりむしろ）を表す。いくつかの類似点が腎臓のより低VEGFレベルと関連しているこのモデル及び人間のじん臓病の腎臓病理学にある（Schrijvers, B.F., et al., The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65:2003-17(2004)を参照）、例えば、糸球体障害、硬化症及び炎症性堆積物及び補体活性化において。Isselbacher, K.J. et al. Harrison's Princip les of Internal Medicine, (1994)（McGraw-Hill Inc., New York）参照。Flt-Cre+;、VEGF（loxP/loxP）マウスは、IgM堆積物の遺伝モデルを示している蓄積及び病気にかかった腎臓のC1q、C3及びC4の活性化である。我々の所見は足細胞特異的VEGF-A haplo-deficiencyを有する9-12週歳のマウスの前の診察と異なる。そして、それは免疫複合体形成の非存在下で末期腎不全を呈した。Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16(2003)参照。  
【０２０８】
co-expressに最もたぶん両方の遺伝子としてのメサンギウム細胞を同定したVEGFR1を調査している報告および／または一次細胞の発現が単離するVEGF-Aの中で及び好ましい及び病気にかかった腎臓において大多数、（Thomas, S. et al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-43 (2000)参照; Gruden, G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A 94:12112-6 (1997); Harper, S.J. et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001); Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995); Simon, M. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268（1995）;及び、Noguchi, K. et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-25 (1998)）、むしろ足細胞より、VEGF-Aの最も高いレベルを表すことは公知である（Berse, B., et al. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors. Molecular Biology of the Cell 3:211-20 (1992)参照;及び、Brown, L.F. et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) by epidermal keratinocytes during wound healing. Journal of Experimental Medicine 176:1375-9 (1992)）、またはVEGFR-1（Thomas, S. et al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-43 (2000)を参照）を表している内皮細胞。Cre陽性の足細胞は、発現の間、さまざまな段階でFlt1-Cre+（VEGF（LoxP/LoxP））,ROSA26コンパウンド・トランスジェニック・マウスにおいて、検出でなかった。non-transformedされた足細胞のVEGFR-1/2発現の欠如は前の報告によって一致している（Gruden, G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A 94:12112-6 (1997); Harper, S.J. et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001)参照;及び、Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995)）及び自分自身の診察。しかしながら、SV40大きいT抗原を有する初期のマウスの足細胞の変換は、いくつかの変わる足細胞細胞系のVEGFR-1及びVEGF-A発現に結びついた。Chen, S. et al. Podocyte-derived vascular endothelial growth factor mediates the stimulation of alpha3(IV) collagen production by transforming growth factor-beta1 in mouse podocytes. Diabetes 53:2939-49 (2004)参照。
【０２０９】
証拠は、糸球体がVEGFによって制御した腎臓の発現の2つの調節機構の存在のために提供される：1.）足細胞及び糸球体毛細管内皮細胞の間でパラ分泌機構、誘導及び穿孔および／または糸球体濾過率の保守に関与していることを示唆された（Schrijvers, B.F., et al. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65:2003-17 (2004)においてチェックする）;及び、2。）、ECM生産を調整しているメサンギウム細胞及び足細胞の自己分泌ループは機能する。そして、VEGF発現を含む。モデル（足細胞のVEGF生産がメサンギウム細胞でのVEGFの自己分泌役割の下流の機能である）は、いずれの細胞型ものVEGF-不足をもつマウスのフェノタイプの重なりを占めていることができる。メサンギウムのVEGF-A欠乏も、足細胞特異的もので見つからない腎臓変化の更なる一組に導いた、VEGF-haplo-insufficientなマウス（浸潤の炎症細胞（図4 a-b）及び糸球体基底膜（図3m）の展開の存在を含む）。これらの所見は、影響を受ける細胞型が、VEGF-A発現の全体の減少に加えて、腎臓病理学のための鍵となる決定要素を表す場合があることを示唆する。VEGFシグナリングを刺激しているコンパウンドの管理は、特定のVEGFR-1において、糸球体硬化症と関連している部分集合じん臓病の処理のために有益である場合がある。
【０２１０】
メサンギウム細胞上のVEGFの遺伝子の及び生化学失活間の分別効果：Internal（メサンギウム細胞のVEGFの細胞自主的な機能の検出のRegulatory Mechanism A必要条件が傍またはjuxtacrineシグナリングを経てVEGF-A-deficientなメサンギウム細胞を救う足細胞から派生したVEGF-Aの見かけの失敗であったようにAutocrine VEGF-A Effector Functions）のための更なるEvidence。単一のモデルに限られていずに、メサンギウム細胞のVEGFの自己分泌ループの下流の機能である足細胞VEGF発現の識別は、VEGF-A不十分なメサンギウム細胞を救うために、合理的なものを足細胞の不能に提供する。造血幹細胞生存（HSCs）の調節のVEGF-Aのための細胞自主的な機能は、前に報告された。Gerber, H.P. et al. VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism. Nature 417, 954-8(2002)参照。類似において、VEGF-AまたはFlt1のために不十分な細胞とは対照的に、培養において栽培されるメサンギウム細胞に対する抗体を中和しているVEGF-A（G6-23）の管理は、メサンギウム細胞番号に衝撃を与えなかった。1つの理論に限られていずに、所見は自己分泌シグナリングがより一般の調節機構がnon-angiogenicなエフェクタ機能から血管形成を制御しているVEGFのパラ分泌機能を切り離すと述べる場合があることを示唆する（例えば中でチェックする、Gerber, H.P. & Ferrara, N. The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis. J Mol Med 81:20-31(2003)）多数の細胞型において。 
【０２１１】
実施例2：選択的に特異的VEGF受容体（例えばKDRまたはFlt-1）を結合して及び活性化するVEGF異型のVEGF Generation及び特徴づけのVEGFR Selective Variantsは、従来技術において公知で及び、例えば、Li et al. J. Biol. Chem. 275:29823 (2000)に記載されていた; Gille et al. J. Biol. Chem. 276:3222-3230 (2001);特許協力条約刊行物WO 00/63380及び97/08313;‖及び米国特許番号6,057,428（いずれがはっきりと本願明細書に引用したものとするかという開示）。 
【０２１２】
具体的には、Flt-1受容体のための選択性を有するVEGF異型は、Flt-1でなく非常にKDRに影響を及ぼした4つの突然変異を結合することによって作製された結合する。イソロイシン43、イソロイシン46、グルタミン79および／またはイソロイシン83の突然変異は、これらの残りの側鎖がKDRに対する緊縛のために決定的であるが、Flt-1を結合するもののために重要でないことを示した。Liその他（2000）前掲の。Flt-自己異型は位置イソロイシン43、イソロイシン46、グルタミン79及びイソロイシン83でアラニン置換によって建設された。そして、Kunkel et al. Methods Enzymol. 204:125-139 (1991)によって記載されているサイト定方向突然変異方法を用いた。この特定のFlt-自己異型は、また、識別子（I43A/I46A/Q79A/I83A）によって表されることができる。それぞれ、位置43、46、79及び83のこれらの4つのアラニン置換のための対応するコードンは、GCC/GCC/GCG/GCCである。 
【０２１３】
さまざまな分析は、I43A/I46A/Q79A/I83A Flt-自己異型の特性及び生物学的活性度を検討するために実行された。Liその他（2000）前掲の。例えば、定量的結合している測定値は、可溶性radio-immuno受容体-結合実験（放射標識免疫定量）を用いて実施された。分析において、それぞれ、自国のVEGF（8-109）は、KDRのためのアフィニティ及び0.5nM及び0.4nMのうちのFlt-1つを有した。Flt1-自己が、この分析の少なくとも470-倍減少したKDR-結合能を有するとわかった。Flt-1の小さい減少-結合するELISAの個々の点変異体から観察した、Flt-1のためのFIt-自己異型のアフィニティは、天然タンパク質のそれと、基本的に同一だった。
【０２１４】
明細書は、当業者は本発明を実施することができるのに十分であると考慮される。本願明細書において記載されている実施例及び実施態様が図示する目的だけのためにあると理解される。実際、本願明細書において図と共に記載されるそれらに加えて本発明のさまざまな改変は、前述の説明から当業者にとって明らかになって及び添付の請求の範囲で落下する。本願明細書において引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、全ての目的のためのそれらの全部において本願明細書に引用したものとする。  
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】図１（ａ−ｈ）は、ＲＯＳＡ２６  ＬａｃＺレポーター系統を用いたＦｌｔ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウスの特徴及びＦｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスの作製を例示している。（ａ）Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋）マウス及びＦｌｔ１−Ｃｒｅ−；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの交配により生まれた産仔の遺伝子型頻度。結果として生じる全ての遺伝子型のマウスは、期待されるメンデル頻度で生まれる。（ｂ）Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの生存曲線。生存数の減少は、出生後４週間で明白となり、これらのマウスの９５％以上は、１２週間目までに死んだ。（ｃ）７．５週齢においてＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスと比較したＦｌｔ１−Ｃｒｅ−マウスの体重に対する腎臓重量比の割合。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓は、コントロールの腎臓より有意に軽い。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−、ｎ＝２５；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）、ｎ＝１０；＊ｐ＜０．０００１。（ｄ）（右）４週齢のＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスから摘出した腎臓を（左）のＷＴの表現型上正常な腎臓と比較した典型的な外観。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓は、高い頻度で外観上嚢状であり、薄い。（ｅ）（上部）４−５週間目のＦｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスの尿中に存在するタンパク質を検出する銀染色。パネルの上部に示される各遺伝子型の３匹のマウスから採取された尿１ｍＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色に供した。大量のタンパク質が、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋，ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの尿中において検出されたが、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋，ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋）マウス又はＦｌｔ１−Ｃｒｅ−マウスでは検出されなかった。このことは、ＶＥＧＦノックアウトマウスにおける重篤なタンパク尿症を示す。（ｆ）  ７．５週齢のＦｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスの血中尿素窒素（Ｂ．Ｕ．Ｎ．）レベル。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；  ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ），ｎ＝９；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋），ｎ＝８；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−，ｎ＝１６；＊＊ｐ値＜０．０００１。（ｇ）７．５週齢のＦｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスにおける血清クレアチニン・レベル。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ），ｎ＝９；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋），ｎ＝８；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−，ｎ＝１６；＊ｐ値＜０．０５。（ｈ）平均動脈圧（ＭＡＰ）及びＭＡＰ測定中の平均心拍数。（左軸及び柱）ＭＡＰ＋／−標準偏差は黒い柱として表される。ＭＡＰは、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−マウスと比較してＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおいて有意に上昇する。（右軸及び正方形）各マウスの心拍数はＭＡＰ測定の間記録され、平均測定値は黒い正方形＋／−標準偏差として示される。平均心拍数は、コントロールと比較してＶＥＧＦノックアウトマウスに有意差はなかった。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ），ｎ＝５；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−，ｎ＝１０；＊＊ｐ値＜０．００５。
【図２】図２、ａ−ｃは、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ  導入遺伝子及びＶＥＧＦ−Ａが腎糸球体のメサンギウム細胞において共発現していることを示す：（ａ）（左）ＶＥＧＦ−Ａアンチセンス・プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションに供された、７．５週齢マウスの腎臓切片のＨ＆Ｅ染色明視野像。（右）左パネルに示された画像の暗視野写真。ＶＥＧＦ−Ａの発現は、週齢を合わせたＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎糸球体において、著明に減少している。（ｂ）胎齢１８．５日のＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋）マウスの腎臓切片の、アフィニティー精製されたＣｒｅ−リコンビナーゼに対する抗血清を用いた免疫組織化学的染色。（上部）Ｆｌｔ１遺伝子プロモータによって発現するＣｒｅ−リコンビナーゼの発現（茶色）は、糸球体の内皮細胞及びメサンギウム細胞において検出される。（下部）Ｆｌｔ−Ｃｒｅの発現は、コントロールと同様に、管状−間質性／延髄の区画にわたる血管内皮細胞（ｅｎ）において観察された。（ｃ）７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスから単離された腎臓トータルＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｔ１、Ｆｌｋ１及びＶＥＧＦ−Ａのための相対ＲＮＡ単位（ＲＲＵ）は、ＧＡＰＤＨレベルにより標準化され、標準曲線から算出された（Gerber et al., 2000）。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ），ｎ＝６；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋），ｎ＝６；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−，ｎ＝６；＊ｐ値＜０．０５。
【図３】図３（ａ−ｍ）は、２−７週齢のＦｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ＬｏｘＰ  マウスの腎臓の組織学的分析及び５  週齢のＦｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ＬｏｘＰ  Ｍｉｃｅから単離した腎臓の透過型電子顕微鏡像を略図で例示している：（ａ）  Ｈ＆Ｅで染色され、低倍率で撮影されたＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓皮質。皮質の嚢胞の境界線はマークされ（点線）、周辺細胞からなる明らかに糸球体毛細血管ループを欠如した糸球体が明白である。（ｂ）  ２週齢ＷＴの腎糸球体のＨ＆Ｅ染色切片。（ｃ）２週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎糸球体のＨ＆Ｅ染色切片。（ｂ）の同腹仔ＷＴで観察されたような、密接した毛細血管ループは存在しないように見える。（ｄ）多量のＥＣＭ堆積により覆われた糸球体毛細血管と共に拡大された２週齢のＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウス腎糸球体のＨ＆Ｅ染色切片。（ｅ）Ｈ＆Ｅ染色された７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−マウスから採取された糸球体の典型的な外観。（ｆ）７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の糸球体のＨ＆Ｅ染色切片。この齢で、ＶＥＧＦノックアウトマウスの糸球体は、著明に拡大され、多量のＥＣＭ堆積は糸球体毛細血管及び泌尿器スペースに影響を与える。（ｇ及びｈ）ａ−ＣＤ３１を用いた７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−（ｇ）及びＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）（ｈ）の腎臓の免疫組織化学的染色。変異体の腎臓では、より少ないＣＤ３１陽性の内皮細胞が検出された。（ｉ及びｊ）インサイチュハイブリダイゼーションによって検出された７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−（ｉ）及びＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）（ｊ）の腎臓におけるＴＧＦ−ｂの発現。ＴＧＦ−ｂの著しい上方制御は、ＶＥＧＦ−Ａノックアウトマウスの腎臓において検出される。（ｋ及びｌ）７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−（ｋ）及びＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）（ｌ）の腎臓においてα平滑筋アクチン（ａ−ＳＭＡ）を検出するための免疫組織化学的染色。増加するａ−ＳＭＡ染色は、ＶＥＧＦノックアウトの糸球体にわたって検出可能であり、残存するメサンギウム細胞の活性化を反映する。（ｍ）（上部）透過型電子顕微鏡像は、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓において、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−の腎臓（下部）と比較して多数の欠陥を示す。（左）明瞭な足突起がコントロールに存在するのに対して、病気の腎臓には足細胞足突起（ｆｐ）が融合した領域（矢印）が存在する。（中）メサンギウム（ｍｅ）において、Ｆｌｔ−Ｃｒｅ−の腎臓には存在しない多数の高電子密度の堆積物（ｄｅ）が見られ、免疫介在性糸球体腎炎と一致している。（右）進展病巣を有する糸球体において、著明に肥厚し、退縮した糸球体基底膜が、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓において見られる。有窓性の内皮細胞（ｅｎ）は、コントロールにおいて見られるが、ＶＥＧＦノックアウトにおいて見つからない。
【図４】図４（ａ−ｂ）は、Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスにおける腎不全の進行がＩｇＭ堆積及び補体活性化と関連していることを略図で例示している：（ａ）Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−と比較したＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）の腎臓、肺及び心臓組織（黒線）、及びＦｌｔ１−Ｃｒｅ−と比較したＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋）Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）で対応する器官（灰色のバー）における単核細胞／マクロファージ（ＭＡＣ−１、Ｆ４／８０）、Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ）及びＴ細胞（Ｔｈｙ−１）系統の細胞で発現する遺伝子のＲＮＡレベルの変化。発現量は、マウスのＧＡＰＤＨに特異的なプローブ／プライマ・セットで標準化された。発現の統計学的に有意な変化は、アスタリスク（ｐ値＜０．００５）によって示される。Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ），ｎ＝６；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ＋；ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／＋），ｎ＝６；Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−，  ｎ  ＝  ６。（ｂ）それぞれａＦ４／８０及びａ−ＣＤ４抗体を用いた、５週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ−及びＦｌｔ１−Ｃｒｅ＋，ＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスの腎臓における（左）単核細胞／マクロファージ及び（右）Ｔ細胞系統の免疫組織化学的／蛍光性の染色。単核細胞／マクロファージ及びＴ細胞の一部は、ＶＥＧＦ−Ａノックアウトの腎臓組織に補充される。
【図５】図５（ａ−ｆ）は、ＶＥＧＦ−Ａ及びＦｌｔ１欠損メサンギウム細胞のインビトロ分析を例示する：（ａ）Ｆｌｔ１−ｌｏｘＰマウスを作製するジーンターゲッティングストラテジー。第一エキソンにターゲッティング・ベクターはＦｌｔ１遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含んでいる第一エキソンの上流で２つのｌｏｘＰサイト（ＬｏｘＰ１及びＬｏｘＰ２）が側面に位置されるＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを導入するため、及び第３のＬｏｘＰサイト（ＬｏｘＰ３）を第一エキソンの３’に導入するために設計された。Ｃｒｅ−リコンビナーゼ発現に続いて、ＬｏｘＰ１及びＬｏｘＰ２間で遺伝子組換えされた胚性幹（ＥＳ）細胞クローンが選択され、Ｆｌｔ１−ｌｏｘＰマウスを作製するのに用いられた。サザンブロッティングを用いたターゲティングイベント及び遺伝子組換えのスクリーニングに用いられた、ＰＣＲで増幅されたゲノムＤＮＡプローブの位置（５’Ｐｒ、３’  Ｐｒ）が示される。このスクリーニングにおいて用いられる制限酵素部位の位置及びターゲッティング・ベクターの領域のサイズ（キロベース）が示される。Ｅ：ＥｃｏＲＩ；  Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ；  Ｋ：ＫｐｎＩ；  ｋｂ：キロベース。（ｂ）ＷＴ、標的ＥＳ細胞クローン（Ｔａｒｇ．）、及びＬａｃＺ（ＬＺ）またはＣｒｅ−リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）遺伝子をコード化しているアデノウィルスを感染させたＦｌｔ１（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）メサンギウム細胞（Ｍｅｓ．）から抽出したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析。それぞれの細胞からのゲノムＤＮＡは、Ｆｌｔ１遺伝子の目標領域の５’末端又は３’末端のいずれかのターゲッティング・イベント及びｌｏｘＰ遺伝子組換えを分析するために、ＥｃｏＲＩもしくはＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩによって消化された。各レーンにおいて検出された、予測される断片サイズは、それぞれ各パネルの左右に示される（キロベース）。（ｃ）アデノウィルスに感染したメサンギウム細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ発現。メサンギウム細胞は、ＷＴ及びＶＥＧＦ（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスから単離され、ＬａｃＺ  （Ａｄ−ＬａｃＺ）又はＣｒｅ−リコンビナーゼ（Ａｄ−Ｃｒｅ）をコード化しているアデノウィルスに感染させた。トータルＲＮＡは単離され、ＶＥＧＦ−Ａ発現の分析のための定量的リアルタイムＰＣＲに供した。結果は、ＧＡＰＤＨに標準化後に相対ＲＮＡ単位（ＲＲＵ）で表され、各プライマ／プローブ・セットの標準曲線は、ＷＴマウスの腎臓トータルＲＮＡを用いて作成した。（ｄ）アデノウィルスに感染したメサンギウム細胞におけるＦｌｔ１発現。ＷＴ及びＦｌｔ１（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）マウスのメサンギウム細胞は、単離され、Ａｄ−ＬａｃＺ及びＡｄ−Ｃｒｅに感染した。ＲＮＡは単離され、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってＦｌｔ１の発現が分析された。結果は、Ｃにおいて説明したように、表される。（ｅ）インヴィトロにおける、ＶＥＧＦ−Ａ及びＦｌｔ１欠損メサンギウム細胞の生存。Ａｄ−ＬａｃＺ及びＡｄ−Ｃｒｅ処理間の細胞数比が算出され、ＷＴ細胞として得られた値の割合として正常化された。ＶＥＧＦ−Ａ及びＦｌｔ１欠損メサンギウム細胞は、ＷＴメサンギウム細胞と比較してインビトロで有意に減少した生存性を示した。ＷＴ��胞と比較した生存性の統計学的な有意差は、アスタリスクによって示される：＊ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．０１。Ｆｌｔ１欠損メサンギウム細胞及びＶＥＧＦ欠損メサンギウム細胞も、インビトロで有意に異なる生存性（ｐ＜０．０５）を示す。中和ＶＥＧＦ抗体（ａ−ＶＥＧＦ）又はコントロール抗体（コントロールＩｇＧ）の存在下で培養されたＡｄ−ＬａｃＺ感染メサンギウム細胞の生存。ＶＥＧＦ−Ａ又はＦｌｔ１が遺伝子的に切除された場合に明白なメサンギウム細胞の生存性の減少は、ａ−ＶＥＧＦ存在下のメサンギウム細胞培養では再現されなかった。
【図６】図６（ａ−ｄ）は、異なるコラーゲン型の発現を検出するための、７週齢Ｆｌｔ１−Ｃｒｅ；ＶＥＧＦ−ｌｏｘＰマウスから単離された腎臓トータルＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を例示する。Ｉ型コラーゲンα１（ａ）、ＩＩ型コラーゲンα２（ｂ）、ＩＶ型コラーゲンα２（ｃ）及びＸＶＩＩＩ型コラーゲンα１（ｄ）の相対ＲＮＡ単位（ＲＲＵ）は、グリセルアルデヒド−３リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）レベルで標準化し、標準曲線から算出された。
【図１ａ】
2009541207.tif 000006
【図１ｂ】
2009541207.tif 000007
【図１ｃ】
2009541207.tif 000008
【図１ｄ】
2009541207.tif 000009
【図１ｅ】
2009541207.tif 000010
【図１ｆ】
2009541207.tif 000011
【図１ｇ】
2009541207.tif 000012
【図１ｈ】
2009541207.tif 000013
【図２ａ】
2009541207.tif 000014
【図２ｂ】
2009541207.tif 000015
【図２ｃ】
2009541207.tif 000016
【図３ａ】
2009541207.tif 000017
【図３ｂ】
2009541207.tif 000018
【図３ｃ】
2009541207.tif 000019
【図３ｄ】
2009541207.tif 000020
【図３ｅ】
2009541207.tif 000021
【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
2009541207.tif 000024
【図３ｉ】
2009541207.tif 000025
【図３ｊ】
2009541207.tif 000026
【図３ｋ】
2009541207.tif 000027
【図３ｌ】
2009541207.tif 000028
【図３ｍ】
2009541207.tif 000029
【図４ａ】
2009541207.tif 000030
【図４ｂ】
2009541207.tif 000031
【図５ａ】
2009541207.tif 000032
【図５ｂ】
2009541207.tif 000033
【図５ｃ】
2009541207.tif 000034
【図５ｄ】
2009541207.tif 000035
【図５ｅ】
2009541207.tif 000036
【図５ｆ】
2009541207.tif 000037
【図６ａ】
2009541207.tif 000038
【図６ｂ】
2009541207.tif 000039
【図６ｃ】
2009541207.tif 000040
【図６ｄ】
2009541207.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月10日(2008.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009541207000001.app
【国際調査報告】
2009541207.tif 000042
2009541207.tif 000043
2009541207.tif 000044
2009541207.tif 000045