(57)【要約】  本発明は２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質に関する。本発明は更に、２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質をコードする核酸配列、これらのタンパク質または該タンパク質をコードする核酸配列を含むワクチン、そのような核酸配列を含むＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体（ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）および宿主細胞、そのようなＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体を含むワクチン、そのような核酸配列を含む宿主細胞、そのようなワクチンの製造方法、ならびにサケ科魚におけるウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチンにおける及び該ワクチンの製造のための、そのようなタンパク質またはそのようなタンパク質をコードする核酸配列の使用に関する。
2009511005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、２００ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の２００ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項３】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号１に示す核酸配列によりコードされる、請求項１または２記載の２００ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項４】
１８０ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、１８０ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項５】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、請求項１記載の１８０ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項６】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号３に示す核酸配列によりコードされる、請求項１または２記載の１８０ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項７】
１００／８５ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、１００／８５ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項８】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、請求項１記載の１００／８５ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項９】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号５に示す核酸配列によりコードされる、請求項１または２記載の１００／８５ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１０】
７９ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、７９ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１１】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、請求項１記載の７９ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１２】
該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号７に示す核酸配列によりコードされる、請求項１または２記載の７９ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１３】
請求項１から３のいずれか１項に記載の２００ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項１４】
請求項４から６のいずれか１項に記載の１８０ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項１５】
請求項７から９のいずれか１項に記載の１００／８５ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項１６】
請求項１０から１２のいずれか１項に記載の７９ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項１７】
請求項１から３のいずれか１項に記載の２００ｋＤタンパク質に対する又は該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項１８】
請求項４から６のいずれか１項に記載の１８０ｋＤタンパク質に対する又は該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項１９】
請求項７から９のいずれか１項に記載の１００／８５ｋＤタンパク質に対する又は該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項２０】
請求項１０から１２のいずれか１項に記載の７９ｋＤタンパク質に対する又は該タンパク質の免疫原性断片に対する抗体と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項２１】
アジュバントを含む、請求項１３から２０のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２２】
２００ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、該核酸配列が、配列番号１に示す核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、核酸配列。
【請求項２３】
核酸配列が、配列番号１に示す核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する、請求項２２記載の核酸配列。
【請求項２４】
１８０ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、該核酸配列が、配列番号３に示す核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、核酸配列。
【請求項２５】
核酸配列が、配列番号３に示す核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する、請求項２４記載の核酸配列。
【請求項２６】
１００／８５ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、該核酸配列が、配列番号５に示す核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、核酸配列。
【請求項２７】
核酸配列が、配列番号５に示す核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する、請求項２６記載の核酸配列。
【請求項２８】
７９ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、該核酸配列が、配列番号７に示す核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、核酸配列。
【請求項２９】
核酸配列が、配列番号７に示す核酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する、請求項２８記載の核酸配列。
【請求項３０】
請求項２２から２９のいずれか１項に記載の核酸配列を含んでなるＤＮＡ断片。
【請求項３１】
機能的に連結されたプロモーターの制御下で、請求項２２〜２９のいずれか１項記載の核酸配列または請求項３０記載のＤＮＡ断片を含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項３２】
請求項２２から２９のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項３０記載のＤＮＡ断片または請求項３１記載の組換えＤＮＡ分子を含んでなる生組換え担体（ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）。
【請求項３３】
請求項２２から２９のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項３０記載のＤＮＡ断片、請求項３１記載の組換えＤＮＡ分子または請求項３２記載の生組換え担体を含んでなる宿主細胞。
【請求項３４】
請求項２２から２９のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項３０記載のＤＮＡ断片、請求項３１記載の組換えＤＮＡ分子、請求項３２記載の生組換え担体または請求項３３記載の宿主細胞と医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチン。
【請求項３５】
魚類に対して病原性であるウイルス、生物もしくは微生物に由来する追加的な抗原、該抗原に対する抗体、または該抗原をコードする遺伝情報を含む、請求項１３から２１または３４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３６】
魚類に対して病原性であるウイルス、生物または微生物が、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、ストライプドジャック神経壊死症ウイルス（ｓｔｒｉｐｅｄ  ｊａｃｋ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＪＮＮＶ）、伝染性サケ貧血ウイルスウミシラミ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ｖｉｒａｌ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＨＳＶ）、膵疾患ウイルス（Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、伝染性サケ貧血ウイルス、フレキシバクター・コルムナリス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）、エドワージエラ・イクタルリ（Ｅｄｗａｒｄｓｉａｌｌａ  ｉｃｔａｌｕｒｉ）、エドワージエラ・タルダ（Ｅ．ｔａｒｄａ）、エルシニア・ラッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ）、パスツレラ・ピスシシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）、ビブリオ・アンギララム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、エロモナス・サルサニサイダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）およびレニバクテリウム・サルモニナルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）の群から選ばれる、請求項３５記載のワクチン。
【請求項３７】
アジュバントを含む、請求項３４から３６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３８】
ワクチンにおいて使用するための、請求項１から３のいずれか１項に記載の２００ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項３９】
ワクチンにおいて使用するための、請求項４から６のいずれか１項に記載の１８０ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項４０】
ワクチンにおいて使用するための、請求項７から９のいずれか１項に記載の１００／８５ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項４１】
ワクチンにおいて使用するための、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の７９ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項４２】
ワクチンにおいて使用するための、請求項２２から２９のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項３０記載のＤＮＡ断片、請求項３１記載の組換えＤＮＡ分子、請求項３２記載の生組換え担体または請求項３３記載の宿主細胞。
【請求項４３】
ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｏｕｓｅ）感染に対するワクチンの製造のための、請求項１から３のいずれか１項に記載の２００ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項４４】
ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｏｕｓｅ）感染に対するワクチンの製造のための、請求項４から６のいずれか１項に記載の１８０ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項４５】
ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｏｕｓｅ）感染に対するワクチンの製造のための、請求項７から９のいずれか１項に記載の１００／８５ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項４６】
ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｏｕｓｅ）感染に対するワクチンの製造のための、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の７９ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片。
【請求項４７】
ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｏｕｓｅ）感染に対するワクチンの製造のための、請求項２２から２９のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項３０記載のＤＮＡ断片、請求項３１記載の組換えＤＮＡ分子、請求項３２記載の生組換え担体または請求項３３記載の宿主細胞の使用。
【請求項４８】
請求項１から３のいずれか１項に記載の２００ｋＤタンパク質もしくは該２００ｋＤタンパク質に対する抗体、請求項４から６のいずれか１項に記載の１８０ｋＤタンパク質もしくは該１８０ｋＤタンパク質に対する抗体、請求項７から９のいずれか１項に記載の１００／８５ｋＤタンパク質もしくは該１００／８５ｋＤタンパク質に対する抗体、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の７９ｋＤタンパク質もしくは該７９ｋＤタンパク質に対する抗体、請求項２２から２９のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項３０記載のＤＮＡ断片、請求項３１記載の組換えＤＮＡ分子、請求項３２記載の生組換え担体または請求項３３記載の宿主細胞と医薬上許容される担体とを混合することを含んでなる、請求項１３から２１または３４から３６のいずれか１項に記載のワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質に関する。本発明は更に、２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質をコードする核酸配列、これらのタンパク質または該タンパク質をコードする核酸配列を含むワクチン、そのような核酸配列を含むＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体（ｌｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）および宿主細胞、そのようなＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体を含むワクチン、そのような核酸配列を含む宿主細胞、そのようなワクチンの製造方法、ならびにサケ科魚におけるウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）感染に対するワクチンにおける及び該ワクチンの製造のための、そのようなタンパク質またはそのようなタンパク質をコードする核酸配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウミシラミ（ｓｅａ  ｌｉｃｅ）は、海洋魚類を宿主とする外部寄生生物の一群を構成する。それは場合によっては宿主特異的である。単なる一例として挙げると、サケシラミ（レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）（Ｋｒｏｙｅｒ））は、それがサケ科魚にのみ感染する点で宿主特異的である。しかし、ほとんどのウミシラミは様々な度合で宿主特異的ではなく、サケ科魚およびタラ科魚を含む種々の海洋魚類に感染する。カリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）は大抵はサケ科魚の表面上で見出されるが、カリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）は大抵は非サケ科魚の表面上で見出される。最も宿主特異的でないウミシラミの１つであるカリグス・エロンガツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）は８０を超える異なる種の魚類から分離されている。
【０００３】
サケシラミであるレペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）は、サケ科魚宿主の皮膚、粘液および血液を食する海洋外部寄生性カイアシ類である。該シラミは１０の発達段階を有し、そのうちの２つの段階は水中での自由生活性であり、１つの段階は感染性であり、７つの段階は寄生性である（Ｐｉｋｅ，Ａ．Ｗ．およびＷａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｓ．Ｌ．，Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．４４：２３３−３３７（１９９９）に概説されている）。自然条件下では、どちらの種も通常は少数でしか見出されないが、レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）は野生の大西洋サケ（サルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ））およびブラウントラウト（サルモ・トルッタ（Ｓａｌｍｏ  ｔｒｕｔｔａ））の両方に甚大な損害を与えうる。サルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）は水産養殖で益々頻繁に飼養されるようになってきており、これはウミシラミの宿主の高い局所密度化を招く。その結果、水産養殖におけるサケへのウミシラミ感染が明らかに増加している。
【０００４】
タラ科魚におけるコリグス（Ｃｏｌｉｇｕｓ）感染についても、タラ科魚の養殖の重要性の増大により、予測可能な将来、同じことが起こるであろう。新たに開始されたタラ科魚の生産は僅か６０５トンに達したに過ぎなかった。しかし、英国のみにおいても、タラ科魚の消費量は年間１７０，０００トンであり、欧州の漁獲限度量の急激な削減を考慮すると、タラ科魚の養殖が商業的に益々魅力的なものとなることは明らかである。
【０００５】
ウミシラミは主として粘液および皮膚を常食することから、シラミ感染自体が疾患および死亡の直接原因となることはめったにない。しかし、これは粘液および皮膚に損傷を与えて、宿主を、日和見感染をより受けやすいものにする。したがって、これらの日和見感染が、益々重大になりつつある経済的損失の直接原因となる。ネブゴン（Ｎｅｖｕｇｏｎ）およびアクアガード（Ａｑｕａｇａｒｄ）のような有機リン系殺虫剤での古典的治療は、もはや選択肢ではない。これは、シラミがそのような殺虫剤に対する耐性を益々発達させてきていること、およびそのような殺虫剤が環境の観点から、もはや許容されないことによる。したがって、ウミシラミに対するワクチンが非常に望ましい。しかし、現在までに、そのようなワクチンは市販されていない。適当なワクチン候補の探索は既に長年にわたって続けられている。しかし、このアプローチは現在のところ、ウミシラミ感染に対するワクチンを生み出すには至っていない。
【０００６】
本発明の目的は、感受性魚類、例えばとりわけ、サルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）、サルモ・トルッタ（Ｓａｌｍｏ  ｔｒｕｔｔａ）およびタラ科魚においてウミシラミ感染および該感染の影響に対する或る程度の防御を誘導しうる新規ワクチンを提供することである。
【発明の開示】
【０００７】
驚くべきことに、成体産卵性ウミシラミ、より詳しくは、レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）、カリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）、カリグス・エロンガツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）およびカリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）の卵から、サルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）、サルモ・トルッタ（Ｓａｌｍｏ  ｔｒｕｔｔａ）およびタラ科魚において抗体を誘導しうる幾つかのタンパク質が単離可能であり、該抗体誘導は、これらのタンパク質でワクチン接種された魚類がウミシラミ感染およびその影響に対して効率的に防御される程度のものであることが、本発明において見出された。
【０００８】
より一層驚くべきことに、１つの種のそれぞれ２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質に対する抗体と他の種における相同２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質との間の強力な交差反応性が存在するようであった。例えばレペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）からのこの２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質に対して産生された抗体は、カリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）からの相同タンパク質に対してもウエスタンブロットにおいて強力に反応するようであった。
【０００９】
後記において更に明らかにされるとおり、本発明の第１の実施形態はこの２００ｋＤタンパク質に関する。本発明の第２の実施形態はこの１８０ｋＤタンパク質に関する。本発明の第３の実施形態はこの１００／８５ｋＤタンパク質に関する。本発明の第４の実施形態はこの７９ｋＤタンパク質に関する。
【００１０】
多数の異なる核酸配列が１つの同じタンパク質をコードしうることが当技術分野においてよく知られている。この現象は、アミノ酸をコードする各トリプレットの第２および特に第３の塩基におけるゆらぎとして一般に知られている。この現象は、同じタンパク質を尚もコードする２つの核酸配列に関する約３０％の非相同性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｙ）をもたらしうる。したがって、わずか７０％の全配列同一性を有する２つの核酸配列は尚も１つの同じタンパク質をコードしうる。
【００１１】
本発明に含まれる特定のタンパク質に関して、個々のウミシラミ株間で自然変異が存在しうると理解されるであろう。これらの変異は、配列全体におけるアミノ酸の相違により又は該配列におけるアミノ酸の欠失、挿入、逆位もしくは付加により示されうる。生物学的または免疫学的活性を実質的に変化させないアミノ酸置換が例えばＮｅｕｒａｔｈらにより“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換または進化において頻繁に生じている置換としては、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３を参照されたい）が挙げられる。他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感度なタンパク質比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）および同一タンパク質間の機能的類似性の決定のための方法を開発した。本発明の典型的な実施形態のそのようなアミノ酸置換ならびに欠失および／または挿入を有する変異体は、生じるタンパク質がそれらの免疫反応性を保有している限り、本発明の範囲内である。これは、異なる野外分離体から単離された本発明のウミシラミタンパク質が、同じ免疫学的特性を有する同じタンパク質を尚も表すにもかかわらずなぜ約７０％の同一性レベルを有しうるのかを説明するものである。ウミシラミ感染に対する又は少なくとも該感染の臨床的徴候に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質を尚も与える、本発明の或るタンパク質のアミノ酸配列におけるそれらの変異は、「免疫学的特性に実質的に影響を及ぼさない」とみなされる。
【００１２】
したがって、本発明のタンパク質は、配列番号２に示す２００ｋＤタンパク質、配列番号４に示す１８０ｋＤタンパク質、配列番号６に示す１００／８５ｋＤタンパク質または配列番号８に示す７９ｋＤタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質およびその免疫原性断片を含む。
【００１３】
したがって、本発明の１つの実施形態は、２００ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するものに関する。
【００１４】
免疫原性断片は、少なくとも５０アミノ酸の長さを有する断片である。免疫原性断片の概念は後記で定義される。
【００１５】
好ましくは、該２００ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは８０％の同一性を有する。より一層好ましいのは、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の同一性レベルである。
【００１６】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、本発明の２００ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の配列同一性を有するものに関する。
【００１７】
この実施形態の最も好ましい形態は、配列番号１に記載の核酸配列によりコードされる本発明の２００ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００１８】
タンパク質の同一性のレベルは、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで見出されうるコンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して、サブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することにより決定されうる。このプログラムに関する参考文献としてはＴａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）が挙げられる。私用するマトリックスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」である。使用するパラメーターはデフォルトパラメーターである。オープン・ギャップ：１１。伸長ギャップ：１。ギャップｘ ドロップオフ：５０。
【００１９】
本発明の配列の縦列を含むアミノ酸配列も本発明の範囲内である。
【００２０】
本発明の第２の実施形態は、１８０ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するものに関する。
【００２１】
好ましくは、該１８０ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片のアミノ酸配列は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは８０％の同一性を有する。より一層好ましいのは、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の同一性レベルである。
【００２２】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、本発明の１８０ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の配列同一性を有するものに関する。
【００２３】
この実施形態の最も好ましい形態は、配列番号３に記載の核酸配列によりコードされる本発明の１８０ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００２４】
本発明の第３の実施形態は、１００／８５ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するものに関する。
【００２５】
好ましくは、該１００／８５ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片のアミノ酸配列は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは８０％の同一性を有する。より一層好ましいのは、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の同一性レベルである。
【００２６】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、本発明の１００／８５ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の配列同一性を有するものに関する。
【００２７】
この実施形態の最も好ましい形態は、配列番号５に記載の核酸配列によりコードされる本発明の１００／８５ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００２８】
本発明の第４の実施形態は、７９ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するものに関する。
【００２９】
好ましくは、該７９ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片のアミノ酸配列は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、より好ましくは８０％の同一性を有する。より一層好ましいのは、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の同一性レベルである。
【００３０】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、本発明の７９ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片であって、該タンパク質またはその免疫原性断片が、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で好ましくなる）の配列同一性を有するものに関する。
【００３１】
この実施形態の最も好ましい形態は、配列番号７に記載の核酸配列によりコードされる本発明の７９ｋＤタンパク質または該タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００３２】
実施例から容易に理解されるとおり、例えばレペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）から単離された２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質に対して産生させた抗体は、ウエスタンブロットにおいて、例えばカリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）またはカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）の相同タンパク質と強力に反応する。これは、該抗体に対するエピトープが該カイアシ類外部寄生生物において良く保存されていることを既に示している。したがって、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質に対して産生させた抗血清とウエスタンブロットにおいて反応する成体産卵性ウミシラミの卵からのカイアシ類外部寄生生物タンパク質も本発明の範囲内に含まれるとみなされる。前記のとおり、そのような外部寄生生物カイアシ類の具体例としては、もちろん、レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）、カリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）、カリグス・エロンガツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）種が挙げられる。
【００３３】
本発明の新規２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質および７９ｋＤタンパク質をコードする核酸配列が本明細書に開示されているため、このタンパク質を十分な量で入手することが今や可能である。これは、例えば、該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質をコードする遺伝子の全部または一部を発現させるための発現系を使用することにより行われうる。該核酸配列の発現のための必須要件は、適当なプロモーターが該核酸配列に機能的に連結されていて、該核酸配列が該プロモーターの制御下に置かれていることである。プロモーターの選択は、タンパク質発現のための宿主細胞として使用される細胞において遺伝子転写を指令しうる任意の真核生物、原核生物またはウイルスプロモーターに及ぶことが当業者に明らかである。
【００３４】
機能的に連結されたプロモーターは、それが連結されている核酸配列の転写を制御しうるプロモーターである。機能的に連結されたプロモーターの制御下に本発明の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質をコードする核酸配列を含む構築物を更に、組換えＤＮＡ分子と称することとする。そのようなプロモーターは、発現のために使用される細胞においてそのプロモーターが機能的であるならば、該タンパク質遺伝子の天然プロモーターまたは別のプロモーターでありうる。また、それは異種プロモーターでありうる。宿主細胞が細菌である場合、使用されうる有用な発現制御配列には、Ｔｒｐプロモーターおよびオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーターおよびオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．およびＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージラムダプロモーターおよびオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーターおよびオペレーター、終結配列ならびに選択される宿主細胞に和合性である他の発現増強および制御配列が含まれる。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御配列には、例えばα接合因子が含まれる。昆虫細胞の場合、バキュロウイルスのポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターが使用されうる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が脊椎動物由来である場合、例示される有用な発現制御配列には、（ヒト）サイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ら，ＰＮＡＳ  ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＲＳＶ，Ｇｏｒｍａｎ，ＣＭ．ら，ＰＮＡＳ  ７９，６７７７−６７８１，１９８２；Ｆｙｎａｎら，前掲；Ｕｌｍｅｒら，前掲）、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５０，７２５−７３２，１９８４）、ＳＶ４０最初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，７７３，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーターおよびβアクチンプロモーター（Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２−１５４，１９９２）が含まれる。該調節配列には、ターミネーターおよびポリアデニル化配列も含まれうる。使用されうる配列としては、よく知られたウシ成長ホルモンポリアデニル化���列、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーターおよびポリアデニル化配列が挙げられる。
【００３５】
細菌、酵母、真菌、昆虫および脊椎動物細胞発現系は、非常に頻繁に使用される系である。そのような系は当技術分野でよく知られており、一般に入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡから商業的に入手可能である。これらの発現系に次ぐものとしては、寄生生物に基づく発現系が魅力的な発現系である。そのような系は、例えばフランス国特許出願公開番号２  ７１４  ０７４、およびＵＳ  ＮＴＩＳ公開番号ＵＳ  ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，ＳおよびＲｏｇｅｒｓ，Ｗ．：１９９３年１２月１日付け公開）に記載されている。
【００３６】
これを考慮して、本発明のもう１つの実施形態は、該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性部分をコードする核酸配列を含む生組換え担体（Ｌｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  （ＬＲＣ））に関する。好ましくは、該ＬＲＣは、今度は本発明の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質またはその免疫原性部分をコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片を含む。より好ましくは、該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性部分をコードする核酸配列は、機能的に連結されたプロモーターの制御下に置かれる。これらのＬＲＣは、追加的な遺伝的情報（この場合は、前記のとおりの２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性部分をコードする核酸配列）がクローニングされている微生物またはウイルスである、そのようなＬＲＣに感染した魚類は、該担体の免疫原に対してだけでなく、該遺伝暗号が該ＬＲＣ内に追加的にクローニングされているタンパク質（例えば、本発明に記載の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質）の免疫原性部分に対しても免疫応答をも引き起こすであろう。細菌ＬＲＣの一例として、当技術分野で公知のビブリオ・アンギララム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）のような細菌が魅力的に使用されうる（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐ．３０３−３０６，Ｌｅ  ＧａｌおよびＨａｌｖｏｒｓｏｎ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）。
【００３７】
また、ＬＲＣウイルスは、該核酸配列を標的細胞内に運搬する手段として使用されうる。この目的に適したウイルスとしては、例えばアルファウイルス−ベクターが挙げられる。アルファウイルス−ベクターに関する総説はＳｏｎｄｒａ  ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＴｈｏｍａｓ  Ｗ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  Ｊｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４３４−４３９（１９９９）に記載されている。好ましいウイルスＬＲＣは、ノビルハブド（Ｎｏｖｉｒｈａｂｄｏ）ウイルス属、特にウイルス性出血敗血症ウイルス種、および伝染性造血組織壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）種のウイルスである。例えば、ＩＨＮＶは魚類病原体であり、それに関する、サケ科魚において使用するための弱毒化ウイルス発現および運搬系が既に記載されている（ＷＯ  ０３／０９７０９０；Ｂｉａｃｃｈｅｓｉら，２０００，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ，ｖｏｌ．７４，ｐ．１１２４７−１１２５３）。ウイルスＮＶタンパク質の欠失は該ウイルスを弱毒化し、外来遺伝子の挿入のための空間を作る。好ましい構築物は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質をコードしうる核酸構築物を含有する組換えＩＨＶである。ついで、そのようなＬＲＣは、例えば浸漬（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）ワクチン接種により、標的魚類に投与される。
【００３８】
宿主動物において本発明の挿入核酸配列の発現を誘導しうる、選択された細菌、寄生生物またはウイルスのゲノム内に組換え核酸配列を導入するためには、当技術分野でよく知られているインビボ相同組換えの技術が用いられる。
【００３９】
最後に、本発明のこの実施形態のもう１つの形態は、前記の組換えＤＮＡ分子または生組換え担体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌に基づくプラスミドまたはｐＧＥＸのような細菌発現ベクターまたはバクテリオファージと組合された、細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来する細胞でありうる。また、該宿主細胞は真核生物由来であることが可能であり、例えば、酵母特異的ベクター分子と組合された酵母細胞、あるいはベクターまたは組換えバキュロウイルスと組合された昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８））、例えばＴｉ−プラスミドに基づくベクターまたは植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら；Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））と組合された植物細胞、同様に適当なベクターまたは組換えウイルスと組合されたＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはクランデルネコ腎細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌ  Ｆｅｌｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ−ｃｅｌｌｓ）などの哺乳類細胞のような高等真核細胞でありうる。
【００４０】
前記のとおり、該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質のそれぞれがウミシラミ種に対する或る程度の防御を誘導することが見出されたことが本発明の利点の１つである。したがって、該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質のそれぞれは魚類ウミシラミ種に対する魚類の防御のためのワクチンの主要化合物を構成する。したがって、もう１つの実施形態は、これらのタンパク質の少なくとも１つ又は好ましくはそれ以上を含む、ウミシラミ感染に対するワクチンに関する。ワクチン接種の目的または抗体の産生のためにタンパク質を使用する場合には、全タンパク質を使用する必要はない。単独で又は例えばＫＬＨのような担体と組合されてそのタンパク質に対する免疫応答を誘導しうるそのタンパク質の断片（いわゆる、免疫原性断片）を使用することも可能である。「免疫原性断片」は、脊椎動物宿主において免疫応答を誘導する該完全長タンパク質の能力を尚も有する、すなわち、ＢまたはＴ細胞エピトープを有する、該完全長タンパク質の断片であると理解される。要するに、免疫原性断片は、該完全長タンパク質、すなわち、本発明の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質と反応する抗体を誘導しうる断片である。この場合、免疫原性断片（決定基）をコードするＤＮＡ断片を容易に特定するために、種々の技術が利用可能である。Ｇｅｙｓｅｎら（特許出願ＷＯ  ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ  ８６／０６４８７、米国特許第４，８３３，０９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７）により記載されている方法（いわゆる、ＰＥＰＳＣＡＮ法）は、実施が容易であり、迅速であり、十分に確立された、エピトープ（タンパク質の免疫学的に重要な領域）の検出のための方法である。該方法は全世界で用いられており、そのようなものとして当業者によく知られている。この（経験的）方法はＢ細胞エピトープの検出に特に適している。また、いずれかのタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられたら、現在知られているエピトープとのそれらの配列上および／または構造上の一致に基づいて、コンピュータープログラムが、特定のタンパク質断片を、免疫学的に重要なエピトープとして特定する。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））による親水性基準とＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７：４５−１４８（１９８７）および米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造態様との組合せに基づく。同様に、Ｔ細胞エピトープは、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）および米国特許出願ＮＴＩＳ  ＵＳ  ０７／００５，８８５）の補助により、コンピューターにより該配列から予測されうる。一般的原理に関してはＳｈａｎ  Ｌｕ，Ｔｉｂｔｅｃｈ  ９：２３８−２４２（１９９１）��、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）に、総説としてはＬｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：３−７（１９９２）に、ＨＩＶエピトープに関してはＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５：２４１２−２４１８（１９９１）に、要約された概説が記載されている。
【００４１】
したがって、本発明のこの実施形態の１つの形態は、前記の本発明の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性断片と医薬上許容される担体とを含む、ウミシラミ感染に対するワクチンに関する。
【００４２】
さらにもう１つの実施形態は、ウミシラミ感染に対するワクチンの製造のための、本発明の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性断片の使用に関する。
【００４３】
該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性断片に基づくワクチンは、該タンパク質またはその免疫原性断片を後記の医薬上許容される担体と混合することにより容易に製造されうる。
【００４４】
そのようなワクチンのもう１つの可能性は、前記の宿主細胞と医薬上許容される担体とを含むワクチンである。
【００４５】
あるいは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片を発現しうる、前記の生組換え担体を含みうる。そのようなワクチン、例えばビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）担体に基づくワクチン、またはウイルス担体、例えばアルファウイルスベクターに基づくワクチンは、それらがウミシラミの感染の天然様態をより良く模擬するという点で、サブユニットワクチンより優れている。さらに、それらの自己増殖は利点となる。なぜなら、免疫のために少量の組換え担体が必要となるに過ぎないからである。
【００４６】
前記の全てのワクチンは能動ワクチン接種に寄与する。すなわち、それらは宿主の防御系を惹起する。あるいは、抗体を例えばウサギにおいて産生させることが可能であり、あるいは後記の抗体産生細胞系から得ることが可能である。ついでそのような抗体を魚類に投与することが可能である。このワクチン接種方法、すなわち受身ワクチン接種は、動物が既に感染しており自然免疫応答を惹起させる時間が無い場合に選択されるワクチン接種である。また、それは、急な高い感染の圧力を受ける傾向にある動物をワクチン接種するための好ましい方法である。本発明の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片に対する投与された抗体は、これらの場合、ウミシラミのタンパク質に直接的に結合しうる。これは、それがウミシラミ感染の負荷を軽減するという利点を有する。したがって、本発明のこの実施形態の１つの他の形態は、該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性断片に対する抗体と医薬上許容される担体とを含む、ウミシラミ感染に対するワクチンに関する。
【００４７】
該タンパク質またはその免疫原性断片（例えば、前記のとおりに発現されるもの）は、ポリクローナル、単一特異性またはモノクローナル抗体（またはそれらの誘導体）でありうる抗体を製造するために使用されうる。ポリクローナル抗体が望まれる場合には、ポリクローナル血清を製造し加工するための技術が当技術分野でよく知られている（例えば、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｔｅｒ編，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。本発明のタンパク質または本発明のその免疫原性断片に対して反応性であるモノクローナル抗体は、同様に当技術分野で公知の技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により近交系マウスを免疫することにより製造されうる。本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明において記載されているウミシラミタンパク質に対する又はそのタンパク質の免疫原性断片に対する抗体に関する。
【００４８】
本発明の抗体の大規模製造のための方法も当技術分野で公知である。そのような方法は、ファージディスプレイのための線維状ファージにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝情報の（断片の）クローニングに基づく。そのような技術は、とりわけ、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．における“ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”の“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｇｅ”、およびＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら，（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９４），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５、およびＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら，（１９９４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５の総説に記載されている。ついで該ファージを使用して、ラクダ科動物重鎖抗体を発現するラクダ科動物発現ライブラリーをスクリーニングする（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．およびＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：１３１−１４０（１９９９）ならびにＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望の抗体を発現するライブラリーからの細胞を増殖させ、ついで抗体の大規模発現に使用することが可能である。
【００４９】
さらにもう１つの実施形態は、本発明の抗体と医薬上許容される担体とを混合することを含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【００５０】
ワクチン接種のための代替的な効率的方法は、関連抗原をコードするＤＮＡでの直接的ワクチン接種である。タンパク質をコードするＤＮＡでの直接的ワクチン接種は多種多様なタンパク質において成功している（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：２０−２６（１９９３）において概説されている）。このワクチン接種方法は、ウミシラミ感染に対する魚類のワクチン接種にも魅力的なものである。したがって、本発明のこの実施形態の更に他の形態は、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸配列を含むワクチン、そのような核酸配列を含むＤＮＡ断片を含むワクチン、およびそのような核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【００５１】
本発明のＤＮＡワクチンにおける使用に適したＤＮＡプラスミドの例としては、細菌、真核生物および酵母宿主細胞のための通常のクローニングまたは発現プラスミドが挙げられ、該プラスミドの多くは商業的に入手可能である。そのようなプラスミドのよく知られた例としては、ｐＢＲ３２２およびｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。該ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は、該核酸配列のタンパク質発現を誘導することが可能であるべきである。該ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は１以上のタンパク質コード化核酸配列を含みうる。また、該ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は、他の核酸配列、例えば、非メチル化ＣｐＧジ−ヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド、または他の抗原タンパク質もしくはアジュバント性サイトカインをコードする核酸配列を含みうる。
【００５２】
したがって、発現系におけるそれらの使用およびＤＮＡワクチン接種におけるそれらの使用の両方を考慮して、本発明のもう１つの実施形態は、配列番号１に示す核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で同一性が好ましくなる）の同一性を有する核酸配列を含む、２００ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。
【００５３】
任意の核酸と本発明の核酸との間の同一性（％）は、インターネットアドレスｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．において見出されうるサブプログラム「ＢｌａｓｔＮ」（Ｔ．Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＆  Ｔ．Ｍａｄｄｅｎ，１９９９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７４，ｐ．２４７−２５０）を選択することにより、コンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定される。使用するパラメーターはデフォルトパラメーター：マッチに関するリウォード：＋１；ミスマッチに関するペナルティ：−２；オープンギャップペナルティ：５；伸長ギャップペナルティ：２；およびギャップｘ ドロップオフ：５０である。
【００５４】
前記のＢｌａｓｔＰプログラムの出力とは異なり、ＢｌａｘｔＮプログラムは類似性を一覧せず、同一性のみを一覧し、同一であるヌクレオチドの％が「同一性」として示される。
【００５５】
任意の核酸と本発明の核酸との間の同一性／ミスマッチのレベルを決定するためのコンピューターアルゴリズムの使用と並んで、特に、制御されたストリンジェンシーの条件下のハイブリダイゼーションによる、実験的技術も用いられうる。
【００５６】
２つのヌクレオチド配列間の同一性の関数としてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の定義は、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３８，ｐ．２６７−２８４）の融解温度Ｔｍに関する式：
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ
から導かれる。
【００５７】
この式において、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合（％）であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さであり、ミスマッチは同一マッチの欠如である。
【００５８】
ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、より高い又はより低いストリンジェンシーのものとされることも可能であり、それにより、それぞれより高い又はより低い割合（％）の同一性が選択される。
【００５９】
一般に、より高いストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることにより及びインキュベーション温度を増加させることにより得られる。コンピューター解析により決定された或る％レベルの同一性に合致するハイブリダイゼーション条件を選択することは、当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。
【００６０】
単なる一例として示し、そしてもちろん、該断片のＧ／Ｃ含量および長さに左右されるものではあるが、「ストリンジェント」な洗浄条件は６５℃の温度での１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの条件である。高いストリンジェンシーの条件は、ＳＳＣ濃度が０．３×ＳＳＣに向かって減少した条件を意味する。
【００６１】
本発明のもう１つの実施形態は、配列番号３に示す核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で同一性が好ましくなる）の同一性を有する核酸配列を含む、１８０ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。
【００６２】
本発明のもう１つの実施形態は、配列番号５に示す核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で同一性が好ましくなる）の同一性を有する核酸配列を含む、１００／８５ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。
【００６３】
本発明のもう１つの実施形態は、配列番号７に示す核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは７５％、より好ましくは８０％または更には８５％、９０％、９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より一層好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％（その順序で同一性が好ましくなる）の同一性を有する核酸配列を含む、７９ｋＤタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関する。
【００６４】
本発明の目的においては、ストリンジェントな条件は、核酸が３０％のミスマッチを有する場合、すなわち、それが、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示すヌクレオチド配列（の関連部分）に対して７０％同一である場合に、該核酸が尚もハイブリダイズする条件である。
【００６５】
したがって、ある核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示すヌクレオチド配列を有する核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする場合、それは本発明の核酸とみなされる。
【００６６】
これらの実施形態の好ましい形態においては、本発明は、該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性部分をコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片に関する。ＤＮＡ断片は、本発明の核酸配列の担体として機能するヌクレオチドの伸長である。そのようなＤＮＡ断片は、例えば、本発明の核酸配列がクローニングされたプラスミドでありうる。後記のとおり、そのようなＤＮＡ断片は、例えば、プライマーとして使用するためにＤＮＡの量を増加させるのに、および本発明の核酸配列の発現に有用である。
【００６７】
本発明のワクチンにおいて使用する、本発明の核酸配列、または本発明の核酸配列を含むＤＮＡプラスミド（好ましくは、転写調節配列に機能的に連結されているもの）は、裸形態であることが可能であり、あるいは運搬系に組込まれていることが可能である。適当な運搬系は、脂質小胞、イスコム（ｉｓｃｏｍｓ）、デンドロマー（ｄｅｎｄｒｏｍｅｒ）、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、多糖マトリックスなど（後記を参照されたい）であり、これらは全て、当技術分野でよく知られている。また、運搬系として非常に適しているのは、弱毒化生細菌、例えばビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種、および弱毒化生ウイルス、例えばアルファウイルスベクター（前記のとおり）である。
【００６８】
本発明のこの実施形態のより好ましい形態は、２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性部分をコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、該核酸配列が、機能的に連結されたプロモーターの制御下に配置されているものに関する。そのような組換え体は、例えば標準的な分子生物学的技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）の手段により入手されうる。
【００６９】
この実施形態の更に他の形態は、ワクチンにおいて使用するための、前記の核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子、生組換え担体および宿主細胞に関する。
【００７０】
本発明のもう１つの実施形態は、前記の核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子、生組換え担体および宿主細胞を含むワクチンに関する。
【００７１】
本発明の更にもう１つの実施形態は、ウミシラミ感染に対するワクチンの製造のための、前記の核酸配列、ＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体または宿主細胞の使用に関する。
【００７２】
ＤＮＡワクチンは、皮内適用により、例えば無針注射器を使用することにより容易に投与されうる。この投与方法は、ワクチン接種すべき動物の細胞内に該ＤＮＡを直接的に運搬する。１０ｐｇ〜１０００μｇの範囲のＤＮＡ量が良好な結果を与える。好ましくは、１〜１００μｇのマイクログラム範囲の量を用いる。あるいは、例えば、投与すべきＤＮＡの１０ｐｇ〜１０００ｐｇ／ｍｌを含む溶液に動物を浸すことが可能である。
【００７３】
もう１つの実施形態においては、本発明のワクチンは更に、魚類病原性生物、例えばウミシラミ、微生物およびウイルスに由来する１以上の抗原、それらの抗原に対する抗体、またはそのような抗原をコードする遺伝情報を含む。もちろん、そのような抗原は、例えば他のウミシラミ抗原でありうる。そのような抗原はまた、他の魚類病原性生物、微生物およびウイルスから選ばれる抗原でありうる。そのような生物およびウイルスは、好ましくは、水生ビルナウイルス、例えば伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、水生ノダウイルス、例えばストライプドジャック神経壊死症ウイルス（ｓｔｒｉｐｅｄ  ｊａｃｋ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＪＮＮＶ）、水生ラブドウイルス、例えば伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）およびウイルス性出血性敗血症ウイルス（ｖｉｒａｌ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＨＳＶ）、膵疾患ウイルス（Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、および水生オルトミクソウイルス、例えば伝染性サケ貧血ウイルスの群、ならびに魚類病原性細菌、例えばフレキシバクター・コルムナリス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）、エドワージエラ・イクタルリ（Ｅｄｗａｒｄｓｉａｌｌａ  ｉｃｔａｌｕｒｉ）、エドワージエラ・タルダ（Ｅ．ｔａｒｄａ）、エルシニア・ラッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ）、パスツレラ・ピスシシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）、ビブリオ・アンギララム（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、エロモナス・サルサニサイダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）およびレニバクテリウム・サルモニナルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）の群から選ばれる。
【００７４】
本発明の全てのワクチンは、医薬上許容される担体を含む。医薬上許容される担体は、例えば無菌水または無菌生理食塩水でありうる。より複雑な形態においては、該担体は、例えばバッファーでありうる。
【００７５】
ワクチンの製造方法は、本発明の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性部分、および／またはそのタンパク質もしくはその免疫原性断片に対する抗体、および／または核酸配列、および／またはＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換え担体もしくは宿主細胞と、医薬上許容される担体とを混合することを含む。
【００７６】
本発明のワクチンは、好ましい形態においては、免疫刺激性物質、いわゆるアジュバントを含有しうる。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質を含む。多種多様なアジュバントが当技術分野で公知である。魚類および甲殻類動物の養殖において頻繁に使用されるアジュバントの具体例としては、ムラミルジペプチド、リポ多糖、いくつかのグルカンおよびグリカンならびにカルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））（ホモポリマー）が挙げられる。魚類および甲殻類動物のワクチンに適したアジュバントの詳細な概説はＪａｎ  Ｒａａによる総説論文（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４（３）：２２９−２８８（１９９６））に記載されている。該ワクチンはまた、いわゆる「ビヒクル」を含みうる。ビヒクルは、該タンパク質が、それに共有結合することなく付着している化合物である。そのようなビヒクルとしては、とりわけ、バイオマイクロカプセル（ｂｉｏ−ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅ）、マイクロアルギナート（ｍｉｃｒｏ−ａｌｇｉｎａｔｅ）、リポソームおよびマクロゾル（ｍａｃｒｏｓｏｌ）が挙げられ、これらの全ては当技術分野で公知である。該抗原がビヒクル内に部分的に包埋されている、そのようなビヒクルの特別な形態が、いわゆる、ＩＳＣＯＭ（ＥＰ  １０９．９４２、ＥＰ  １８０．５６４、ＥＰ  ２４２．３８０）である。また、該ワクチンは、１以上の適当な界面活性化合物または乳化剤、例えばスパン（Ｓｐａｎ）もしくはトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）を含みうる。
【００７７】
しばしば、例えば易分解性タンパク質の分解を防ぎ、該ワクチンの貯蔵寿命を増加させ、あるいは凍結乾燥効率を改善するために、該ワクチンを安定剤と混合する。有用な安定剤としては、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼインまたはそれらの分解産物、およびバッファー、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。好ましくは、本発明のワクチンは凍結乾燥形態である。凍結乾燥されたタンパク質およびＤＮＡは、特に室温で、それらが液体形態である場合より遥かに長い貯蔵寿命を有する。凍結乾燥法自体は当技術分野でよく知られている。また、該ワクチンは、生理的に許容される希釈剤に懸濁されうる。言うまでもなく、アジュバント化、ビヒクル化合物または希釈剤の添加、タンパク質の乳化または安定化のための他の方法も本発明に包含される。
【００７８】
該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００／８５ｋＤタンパク質もしくは７９ｋＤタンパク質または該タンパク質のいずれかの免疫原性部分に基づく本発明のワクチンは、非常に適切には、動物当たりタンパク質１〜１００マイクログラムの量で投与されうるが、原理上はそれより少量を用いることも可能である。１００マイクログラムを超える用量は、免疫学的には非常に適しているが、商業的理由からはそれほど魅力的ではないであろう。
【００７９】
前記のＬＲＣ−ウイルスおよび細菌のような生弱毒化組換え担体に基づくワクチンは、遥かに低い用量で投与されうる。なぜなら、それらは感染中に増殖するからである。したがって、非常に適した量は、細菌およびウイルスに関して、１０３および１０９  ＣＦＵ／ＰＦＵの間の範囲であろう。
【００８０】
当技術分野で全て公知である多数の投与方法が適用されうる。タンパク質に基づく本発明のワクチンは、好ましくは、注射、浸漬、液浸、または経口経路により魚類に投与される。投与プロトコールは、標準的なワクチン接種の慣例に従い最適化されうる。好ましくは、該ワクチンは、特に商業的水産養殖の場合には、浸漬または経口経路により投与される。経口投与の場合、該ワクチンは、好ましくは、経口投与用の適当な担体、すなわち、セルロース、食事または代謝可能な物質、例えばアルファ−セルロースまたは植物もしくは動物由来の種々の油と混合される。また、魅力的な投与方法は、高濃度の常食生物への該ワクチンの投与、およびそれに続く、標的動物（例えば、魚類）への該常食生物の給餌である。本発明のワクチンの経口運搬のための特に好ましい食品担体は、該ワクチンを被包（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）しうる常食生物である。適当な常食生物には、プランクトン様非選択的濾過摂食生物、好ましくは、輪形動物のメンバー、アルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）などが含まれる。非常に好ましいのは、ブラインシュリンプであるアルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）種である。非常に優れた投与方法は以下のものであろう。本発明のタンパク質を体内で合成している細菌、酵母細胞または任意の他の細胞をプランクトン様非選択的濾過摂食生物、好ましくは、輪形動物のメンバー、アルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ）などに直接的に給餌する。ついで、プランクトン様非選択的濾過摂食生物により摂取されたそれらの細菌、酵母細胞または任意の他の細胞を含む、そのようにして得られた医薬組成物を、ウイルス感染に対して防御すべき甲殻類動物に経口投与することが可能である。
【００８１】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８２】
実施例
【実施例１】
【００８３】
１．ワクチン接種およびチャレンジ
ワクチン製剤
サケシラミ卵を、流動する海水（３４，５‰、２０μＭ濾過）を含有するインキュベーター内で孵化させた。シラミを、感染性コペポディッド段階まで成長させた後、大西洋サケ（Ｓ．ｓａｌａｒ）を含有するタンクに加え、自然成長にゆだねた。成体産卵性レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）（Ｌｓ）の雌を、麻酔された魚から鉗子で集め、生殖巣部分に穿刺することにより卵母細胞を集めた。５０個のシラミからの卵母細胞を２．５ｍｌの冷超音波処理バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させることにより、水溶性タンパク質を抽出し、小型超音波細胞破壊装置を使用する超音波処理により卵を破壊した。その超音波処理された抽出物を遠心分離（１３０００ｇ、４℃で２０分間）により清澄化し、ペレットおよび脂質を廃棄し、上清を−２０℃で保存した。
【００８４】
上清全タンパク質含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により分析し、既知量のＢＳＡとの対比において定量した。Ｌｓタンパク質抽出物をｄｄＨ２０で約５ｍｇ／ｍｌ（ＢＳＡ当量）まで希釈し、０、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の３７％  ホルムアルデヒドを加えた。同時に５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ対照抗原を調製した。６７％  ＩＳＡ７６３油（Ｓｅｐｐｉｃ）中での２７％（ｗ／ｗ）の抗原の乳化によりワクチンを製剤化した。
【００８５】
ワクチンおよびチャレンジ実験
５０匹の大西洋サケのプレスモルト（ｐｒｅ−ｓｍｏｌｔ）（約４０ｇ）に、１５０μｌのワクチン（タンパク質約２００μｇ）を個々に腹腔内注射することによりワクチン接種した。対照群（ｎ＝５０）には、ＢＳＡ（２００μｇ／用量）を含有する対照ワクチンでワクチン接種した。１個の環状１２００Ｌタンク内で全ての魚を１０℃で維持した。脂びれの切断により、それらの２つの群を識別した。魚は自然光で維持し、ワクチン接種後の９〜１１週にわたって塩水に馴化させた。水の体積および流動を低下させた後、約２，６００個の感染性コペポディッドを該タンクに加えることにより、それらの群を１つの集団として（ワクチン接種の１５週間後に）チャレンジした。不動性の物理的に付着したチャリムス（Ｃｈａｌｉｍｕｓ）段階まで寄生生物を成長させるために、該魚を該タンク内に２週間維持し、ついで３つの異なる２５０Ｌタンクに移した。タンク１および２はそれぞれ対照およびワクチン接種魚を含有し（ｎ＝２５）、タンク３はワクチン接種魚と対照ワクチン接種魚との混合群を含有していた（ｎ＝２５＋２５）。成体雌シラミにおいて最初の卵連糸（ｅｇｇ  ｓｔｒｉｎｇ）が観察されてから３週間後、チャレンジの１１週間後に実験を終了した。罹患率（感染した魚の割合）および存在量（魚当たりのシラミの数）を比較することにより、ワクチンの効果を評価した。さらに、タンク１（対照）とタンク２（ワクチン）のみの間で魚の病状（外部創傷）を比較した。取り扱いの前に全ての魚を麻酔し、動物のサンプリングを行った（国内法に従い行った）。
【００８６】
２．該ワクチンにおけるタンパク質をコードする遺伝子の特定
該ワクチン抗原のタンパク質含量を、１０〜２０％  Ｌｉｎｅａｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌ  （ＢｉｏＲａｄ）および商業的に製造された泳動バッファーを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により分析した。タンパク質バンドＡを該ゲルから切り出し、内部アミノ酸配列分析を、実質的にＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（Ａｎｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：１７３−１７９（１９９２））の記載のとおりにＥｕｒｏＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｖにより行った。これはタンパク質バンドのｉｎ  ｓｉｔｕトリプシン消化、該ペプチドの抽出および生じた断片のＲＰ−ＨＰＬＣ分離を含む。精製された断片上で、逐次的に遊離されたＰＴＨアミノ酸（Ｈｅｗｉｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７９９０−７９９７（１９８１））断片の特定を、ＲＰ−ＨＰＬＣユニットにオンライン接続されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４９４  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステムを使用して行った。内部ペプチド配列を逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅ）し、それを使用して、該ペプチド配列をコードする遺伝子転写産物に関してサケシラミＥＳＴの内部データベースを検索した。この後、重複ＥＳＴクローンを特定し、ＲＡＣＥクローンにより補足し、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ９．１．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して完全長ｃＤＮＡ配列を構築した。タンパク質ドメインを特定し遺伝子機能を示すために、Ｂｌａｓｔ検索を行った。
【００８７】
３．タンパク質の抗原性の評価
精製タンパク質でのウサギの免疫化
該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００および８５ｋＤタンパク質ならびに７９ｋＤタンパク質を、Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌモデル４９１（ＢｉｏＲａｄ）を該製造業者の説明に従い使用する分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により分析し、ＢＳＡとの対比において定量した（前記のとおり）。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃにより、その施設において、その免疫化プロトコール（第１４日、２８日および５６日に追加免疫化）を用いて、１頭のウサギが該精製２００ｋＤタンパク質で免疫化され、１頭が該精製１８０ｋＤタンパク質で免疫化され、１頭が該精製１００ｋＤタンパク質で免疫化され、１頭が該精製８５ｋＤタンパク質で免疫化され、１頭が該精製７９ｋＤタンパク質で免疫化された。
【００８８】
全ワクチン抗原での大西洋サケの免疫化
レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）からのワクチン抗原を前記のとおりに調製し（５ｍｇ／ｍｌ）、フロイント完全アジュバントと１：１で混合し、均一になるまでボルテックスした。５匹の大西洋サケ（約２５０ｇ）を１５０μｌ（約３７５μｇのタンパク質）の腹腔内注射により免疫化した。血液を免疫化の９週間後に採取し、４℃で一晩放置して凝固させた。抗血清をアリコート化し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００８９】
ウサギ抗血清の分析
ウサギ抗２００ｋＤタンパク質抗血清、抗１８０ｋＤタンパク質抗血清、抗１００ｋＤタンパク質抗血清、抗８５ｋＤタンパク質抗血清および抗７９ｋＤタンパク質抗血清をウエスタンブロット法（全卵タンパク質を含むブロットを使用するもの）により、および単一の精製タンパク質を抗原として使用するＥＬＩＳＡにより分析した。簡潔に説明すると、前記のとおりのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続く、ニトロセルロース上へのブロッティング（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  グリシン、２０％  メタノールを使用して１５０Ｖで４５分間および冷却）によりウエスタンブロット法を行い、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｅｎ中の３％脱脂乾燥乳（Ｎｅｓｔｌｅ）を使用してそれを室温で１時間ブロッキングした。ニトロセルロースをウサギ抗血清および前血清対照（１：１０００）と共に室温で２時間インキュベートし、ついでＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。二次ニトロセルロースをホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（１：２０００，ＢｉｏＲａｄ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの３回の洗浄およびＴＢＳでの１回の洗浄の後、予め混合されたＨＲＰ−４ＣＮ基質を製造業者（ＢｉｏＲａｄ）の説明に従い使用して比色検出を行った。
【００９０】
簡潔に説明すると、（卵３５ｋＤタンパク質を対照として使用して）コーティングバッファー（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３，３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中で約２μｇ／ｍｌに希釈され４℃で一晩インキュベートされた卵から精製された１００μｌの該２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００ｋＤタンパク質、８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質でＮｕｎｃ免疫吸着プレートウェルをコートすることにより、ＥＬＩＳＡを行った。ついでウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２００μｌ／ウェル）中の５％脱脂乾燥乳（Ｎｅｓｔｌｅ）で室温で１時間ブロッキングし、再び洗浄した。２倍希釈のウサギ抗血清（１：２０００から）を室温で２時間インキュベートし（１００μｌ／ウェル）、ついでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（１：３０００，ＢｉｏＲａｄ）を加え（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回の洗浄およびＰＢＳで１回の洗浄の後、１５０μｌのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（新鮮なＨ２Ｏ２が０．０１２％まで加えられたリン酸−クエン酸バッファー（ｐＨ５）中、０．４ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えて使用して、２０分間発色させた。５０μｌの２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止させた後、吸光度を４９２ｎｍで測定した。
【００９１】
サケ抗血清分析
該ワクチン抗原で免疫化された５匹の大西洋サケからの抗血清を、精製卵２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００ｋＤタンパク質、８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質を抗原として使用するＥＬＩＳＡにより分析した。簡潔に説明すると、これは、該抗血清を１：２５から希釈し４℃で一晩インキュベートすること以外はウサギ抗血清分析に関して記載されているとおりに行った。さらに、該サケ抗血清と該ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体との間のウサギ抗サケＩｇφ２０６（１：６０００）の存在下のインキュベーション工程（室温で１時間）を追加した。
【００９２】
４．他のカイアシ類外部寄生生物におけるホモログ抗原の特定
他のカイアシ類外部寄生生物におけるホモログ抗原の比較
レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）（実験用系統）、カリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）（タラ科魚上で維持された第４世代の実験用系統）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）（チリにおけるサケ・オングロウイング（ｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ）養殖から集められたもの）の外部卵群のタンパク質含量を比較した。ワクチン製造に関して記載されている超音波処理を用いて、水溶性卵タンパク質を卵連糸（１５μｌバッファー／ｃｍ卵連糸）から抽出した。上清全タンパク質含量を、前記のとおりに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにそれに続くクーマシー染色、およびウサギ抗レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）卵２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００ｋＤタンパク質、８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質抗血清を使用するウエスタンブロット法（前記のとおり）により分析した。
【００９３】
結果
１．ワクチン実験
実験群（タンク１〜３）間で魚の体重、体長および条件因子における相違は観察されなかった。このことはそれらのタンク間の等しい条件を示している。
【００９４】
タンク２（ワクチン）においては、タンク１（対照）と比較して、成体雌シラミの罹患率および存在量の両方が低かった。雄シラミの罹患率および存在量はそれらの２つのタンクの間で有意には異なっておらず、このことは、ワクチン接種群における雌シラミの死亡率の増加を示している（図１）。さらに、ワクチン接種された魚（タンク２）の８０％は病状を示さず、一方、対照魚（タンク１）の８０％はびらん又は創傷を有していた（図２）。タンク３（混合群）においては、罹患率および存在量はワクチン接種魚と対照魚との間でそれほど有意には異ならなかった（図１）。しかし、タンク１において見られる典型的な１：１の性比とは異なり、ワクチン接種魚および対照魚の両方において、非対称な性比が観察され、雌の数当たりの雄の数が増加した（表１）。シラミの非対称な性比は、魚の密度と無関係には該研究所においてこれまでに観察されたことはない。非対称な性比はタンク２においても観察されたが、これはワクチンの効果を示すものである。これは、タンク３におけるシラミが宿主間で移動し、したがって、タンク３における全てのシラミがワクチン接種魚を部分的に食した可能性がある。
【００９５】
【表１】
2009511005.tif 000003
【００９６】
２．ワクチン製剤中のタンパク質をコードする遺伝子の特定
レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）からの未受精卵のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、それぞれ卵バンドＡ〜Ｅと称される、２００ｋＤ、１６０ｋＤ、１００ｋＤ、８５ｋＤおよび３５ｋＤのおおよその分子量を有する５つの主要バンドを示した（図３）。
【００９７】
本発明の２００ｋＤタンパク質である卵タンパク質Ａから３つのペプチド配列を得（表２）、これらのペプチド配列をコードするＥＳＴを社内サケシラミＥＳＴデータベースにおいて特定した。重複ＥＳＴおよびＲＡＣＥクローンに基づいて完全長ｃＤＮＡ配列を成功裏に構築した。卵バンドＡをコードするｃＤＮＡ配列Ｖ６ｘ（配列番号１）のイン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）分析は、それが、ビテロゲニンの主要特徴を有するタンパク質であることを示した（表２）。該卵母細胞におけるバンドＡは約２００ｋＤであり、これはＶ６Ｘ  ＯＲＦおよびノーザンブロット転写産物分析と良く相関する（データ非表示）。
【００９８】
【表２】
2009511005.tif 000004
【００９９】
本発明の１８０ｋＤタンパク質である卵タンパク質Ｂから３つのペプチド配列を得（表３）、これらのペプチド配列をコードするＥＳＴを社内サケシラミＥＳＴデータベースにおいて特定した。重複ＥＳＴおよびＲＡＣＥクローンに基づいて完全長ｃＤＮＡ配列を成功裏に構築した。卵バンドＢをコードするｃＤＮＡ配列Ｖ１ｘ（配列番号３）のイン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）分析は、それが、ビテロゲニンの主要特徴を有するタンパク質であることを示した（表２）。該卵母細胞におけるバンドＢは約１８０ｋＤであり、これはＶ６Ｘ  ＯＲＦおよびノーザンブロット転写産物分析と良く相関する（データ非表示）。
【０１００】
【表３】
2009511005.tif 000005
【０１０１】
卵タンパク質Ｃから１つのペプチド配列を得、卵タンパク質Ｄから１つのペプチド配列を得（表４）、これらのペプチド配列をコードするＥＳＴを社内サケシラミＥＳＴデータベースにおいて特定した。重複ＥＳＴおよびＲＡＣＥクローンに基づいて完全長ｃＤＮＡ配列を成功裏に構築し、該完全長ｃＤＮＡ配列は、卵タンパク質ＣおよびＤが同一遺伝子によりコードされていることを示した。イン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）分析によれば、この遺伝子配列は、ビテロゲニンの主要特徴を有するタンパク質をコードしている。卵タンパク質ＣおよびＤの分子量は合わせて約１８３ｋＤであり、これは該遺伝子のオープンリーディングフレームおよびノーザンブロット転写産物分析と良く相関する。しかし、レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）卵母細胞においては、この遺伝子によりコードされるタンパク質は１つのＮ末端部分（バンドＤ）および１つのＣ末端部分（バンドＣ）へとプロセシングされるらしい。
【０１０２】
【表４】
2009511005.tif 000006
【０１０３】
卵タンパク質Ｅから１つのペプチド配列を得、該ペプチド配列をコードするＥＳＴを社内サケシラミＥＳＴデータベースにおいて特定した。重複ＥＳＴおよびＲＡＣＥクローンに基づいて完全長ｃＤＮＡ配列を成功裏に構築した。イン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）分析によれば、卵バンドＥ  ｃＤＮＡ配列（配列番号７）は、７９ｋＤａの分子量を有する未知機能のタンパク質をコードしている。これはノーザンブロット転写産物分析と良く相関し（データ非表示）、このことは、卵バンドＥ（７９ｋＤ）がプロセシングされていることを示している。該ＯＲＦコード化タンパク質はシグナルペプチド、ならびに植物および動物に共通の古来（ａｎｃｉｅｎｔ）の細胞接着ドメインを表すと示唆される細胞外ドメインである３つのファスシクリン（ｆａｓｃｉｃｌｉｎ）（ＦＡＳ１）ドメインを有する。
【０１０４】
【表５】
2009511005.tif 000007
【０１０５】
３．タンパク質抗原性の評価
図８〜１１から認められうるとおり、ウサギの免疫化に使用した精製卵タンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ（図４〜７）のそれぞれは高レベルの特異的抗体を誘導した。これらの抗体は、抗原としての全タンパク質を含むゲルのウエスタンブロット上で、２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００ｋＤタンパク質、８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質のいずれかのみに特異的に結合する（図１２〜１５）。
【０１０６】
図１６〜１９から明らかに認められうるとおり、該ワクチン抗原（全卵タンパク質Ａ〜Ｅ）は、大西洋サケの免疫化のために一緒に使用された場合に、該精製２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００ｋＤタンパク質、８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質卵バンドに対する抗体の産生を誘導した。
【０１０７】
結論：前記実験から、本発明のタンパク質、すなわち、該卵タンパク質調製物の２００ｋＤタンパク質、１８０ｋＤタンパク質、１００ｋＤタンパク質、８５ｋＤタンパク質または７９ｋＤタンパク質のそれぞれは、ウミシラミに対する防御を誘導することが可能であり、高度に免疫原性であり、ウサギにおいてそれらに対して産生させた抗体および魚類において産生させた抗体の両方により認識されると結論づけられる。
【０１０８】
４．他のカイアシ類外部寄生生物におけるホモログ抗原の特定
レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）、カリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）からの卵タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー全タンパク質染色は、全３種が、類似した卵タンパク質パターンを有することを示した（図２０ａ〜２３ａ）。同じ卵タンパク質のウエスタンブロット法は、該２００ｋＤ、１８０ｋＤ、１００ｋＤ、８５ｋＤおよび７９ｋＤタンパク質に対応するウサギ抗レペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）卵バンドＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのそれぞれが両方のカリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）種におけるホモログタンパク質に特異的に結合することを示した（図２０ｂ、２１ｂ、２２ｂ、２２ｃ、２３ｂ）。結論：本発明の２００ｋＤ、１８０ｋＤ、１００ｋＤ、８５ｋＤおよび７９ｋＤタンパク質に基づく防御はレペオフテイルス・サルモニス（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓ）に対してだけではなく、カリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）種に対しても同等に実施可能であると結論づけられうる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】チャレンジの１１週間後（ワクチン接種の２６週間後）の、ワクチン接種された大西洋サケスモルトにおける成体サケシラミの罹患率。
【図１Ｂ】チャレンジの１１週間後（ワクチン接種の２６週間後）の、ワクチン接種された大西洋サケスモルトにおける成体サケシラミの存在量。
【図２】サケシラミでのチャレンジの１１週間後の、ワクチン接種（タンク２）および対照ワクチン接種（タンク１）大西洋サケにおける、サケシラミにより誘発された外部病状の度数およびレベル。
【図３】ワクチン抗原調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー（全タンパク質染色）分析。
【図４】精製卵バンドＡ（レーン２）および粗製ワクチン抗原調製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー（全タンパク質染色）分析。分子量標準が左側に示されている（レーン１）。
【図５】精製卵バンドＢ（レーン２）および粗製ワクチン抗原調製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー（全タンパク質染色）分析。分子量標準が左側に示されている（レーン１）。
【図６】精製卵バンドＣ（レーン２）、Ｄ（レーン５）および粗製ワクチン抗原調製物（レーン３および６において重複）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー（全タンパク質染色）分析。分子量標準が左側に示されている（レーン１）。
【図７】精製卵バンドＥ（レーン１）および粗製ワクチン抗原調製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー（全タンパク質染色）分析。分子量標準がレーン２に示されている。
【図８】ＥＬＩＳＡにより分析された、卵バンドＡまたは卵バンドＥ（対照血清）で免疫化されたウサギからの抗血清における、卵バンドＡタンパク質に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＡタンパク質でコートした。
【図９】ＥＬＩＳＡにより分析された、卵バンドＢまたは卵バンドＥ（対照血清）で免疫化されたウサギからの抗血清における、卵バンドＢタンパク質に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＡタンパク質でコートした。
【図１０Ａ】卵バンドＣ、Ｄまたは卵バンドＥ（対照血清）で免疫化されたウサギからの抗血清における、卵タンパク質ＣおよびＤ（それぞれ図ＡおよびＢ）に対する抗体のレベル。精製卵バンドＣまたはＤ（それぞれ図ＡおよびＢ）でコートされたプレートを使用するＥＬＩＳＡにより血清を分析した。
【図１０Ｂ】卵バンドＣ、Ｄまたは卵バンドＥ（対照血清）で免疫化されたウサギからの抗血清における、卵タンパク質ＣおよびＤ（それぞれ図ＡおよびＢ）に対する抗体のレベル。精製卵バンドＣまたはＤ（それぞれ図ＡおよびＢ）でコートされたプレートを使用するＥＬＩＳＡにより血清を分析した。
【図１１】ＥＬＩＳＡにより分析された、卵バンドＥまたは卵バンドＤ（対照血清）で免疫化されたウサギからの抗血清における、卵バンドＥタンパク質に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＥタンパク質でコートした。
【図１２】全ワクチンタンパク質を抗原として使用するウエスタンブロット法により分析されたウサギ抗卵バンドＡ抗血清（Ａ２）の抗原特異性。Ａ３を前血清と共にインキュベートした。該ウエスタンブロット法において使用したワクチン抗原（卵バンドＡ〜Ｅ）がレーンＢ２（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの全タンパク質染色）に示されている。同じ分子量標準がレーンＡ１およびＢ１に示されている。
【図１３】全ワクチンタンパク質を抗原として使用するウエスタンブロット法により分析されたウサギ抗卵バンドＢ抗血清（Ａ２）の抗原特異性。Ａ３を前血清と共にインキュベートした。該ウエスタンブロット法において使用したワクチン抗原（卵バンドＡ〜Ｅ）がレーンＢ２（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの全タンパク質染色）に示されている。同じ分子量標準がレーンＡ１およびＢ１に示されている。
【図１４】全ワクチンタンパク質を抗原として使用するウエスタンブロット法により分析されたウサギ抗卵バンドＣおよび抗卵バンドＤ抗血清（それぞれＡ２およびＡ３）の抗原特異性。Ａ４を前血清と共にインキュベートした。該ウエスタンブロット法において使用したワクチン抗原（卵バンドＡ〜Ｅ）がレーンＢ２（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの全タンパク質染色）に示されている。同じ分子量標準がレーンＡ１およびＢ１に示されている。
【図１５】全ワクチンタンパク質を抗原として使用するウエスタンブロット法により分析されたウサギ抗卵バンドＥ抗血清（Ａ２）の抗原特異性。Ａ３を前血清と共にインキュベートした。該ウエスタンブロット法において使用したワクチン抗原（卵バンドＡ〜Ｅ）がレーンＢ２（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの全タンパク質染色）に示されている。同じ分子量標準がレーンＡ１およびＢ１に示されている。
【図１６】該ワクチン抗原で免疫化された５匹の大西洋サケからの抗血清における、卵バンドＡタンパク質に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＡタンパク質でコートした。対照血清は未免疫化サケからのものである。
【図１７】該ワクチン抗原で免疫化された５匹の大西洋サケからの抗血清における、卵バンドＢタンパク質に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＢタンパク質でコートした。対照血清は未免疫化サケからのものである。
【図１８Ａ】該ワクチン抗原で免疫化された５匹の大西洋サケからの抗血清における、卵バンドＣタンパク質（ａ）および卵バンドＤタンパク質（ｂ）に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＣタンパク質（ａ）および精製卵バンドＤタンパク質（ｂ）でコートした。対照血清は未免疫化サケからのものである。
【図１８Ｂ】該ワクチン抗原で免疫化された５匹の大西洋サケからの抗血清における、卵バンドＣタンパク質（ａ）および卵バンドＤタンパク質（ｂ）に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＣタンパク質（ａ）および精製卵バンドＤタンパク質（ｂ）でコートした。対照血清は未免疫化サケからのものである。
【図１９】該ワクチン抗原で免疫化された５匹の大西洋サケからの抗血清における、卵バンドＥタンパク質に対する抗体のレベル。ＥＬＩＳＡプレートを精製卵バンドＥタンパク質でコートした。対照血清は未免疫化サケからのものである。
【図２０】レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）（Ｌ．ｓ）と比較した場合のカリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）（Ｃ．ｃ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）（Ｃ．ｒ）における卵タンパク質Ａの分析。（ａ）全ての卵タンパク質の全タンパク質分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を行った。（ｂ）カリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）におけるホモログ遺伝子産物への交差結合に関して分析するために、ウサギ抗Ｌ．ｓ卵タンパク質Ａを使用してウエスタンブロット法を行った。（ｃ）陰性ウエスタンブロット対照としてウサギ前血清を使用した。Ｓｔｄと表示されているレーンは同じ分子量標準を含有する。
【図２１】レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）（Ｌ．ｓ）と比較した場合のカリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）（Ｃ．ｃ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）（Ｃ．ｒ）における卵タンパク質（Ａ〜Ｅ）の分析。（ａ）全ての卵タンパク質の全タンパク質分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を行った。（ｂ）カリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）におけるホモログ遺伝子産物への交差結合に関して分析するために、ウサギ抗Ｌ．ｓ卵タンパク質Ｂを使用してウエスタンブロット法を行った。（ｃ）陰性ウエスタンブロット対照としてウサギ前血清を使用した。Ｓｔｄと表示されているレーンは同じ分子量標準を含有する。
【図２２】レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）（Ｌ．ｓ）と比較した場合のカリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）（Ｃ．ｃ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）（Ｃ．ｒ）における卵タンパク質ＣおよびＤの分析。（ａ）全ての卵タンパク質の全タンパク質分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を行った。カリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）におけるホモログ遺伝子産物への交差結合に関して分析するために、ウサギ抗Ｌ．ｓ卵タンパク質Ｃ（ｂ）およびＤ（ｃ）を使用してウエスタンブロット法を行った。（ｄ）陰性ウエスタンブロット対照としてウサギ前血清を使用した。Ｓｔｄと表示されているレーンは同じ分子量標準を含有する。
【図２３】レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）（Ｌ．ｓ）と比較した場合のカリグス・クルツス（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）（Ｃ．ｃ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）（Ｃ．ｒ）における卵タンパク質Ｅの分析。（ａ）全ての卵タンパク質の全タンパク質分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を行った。（ｂ）カリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）におけるホモログ遺伝子産物への交差結合に関して分析するために、ウサギ抗Ｌ．ｓ卵タンパク質Ｅを使用してウエスタンブロット法を行った。（ｃ）陰性ウエスタンブロット対照としてウサギ前血清を使用した。Ｓｔｄと表示されているレーンは同じ分子量標準を含有する。
【図１Ａ】
2009511005.tif 000008
【図１Ｂ】
2009511005.tif 000009
【図２】
2009511005.tif 000010
【図３】
2009511005.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009511005.tif 000015
【図８】
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【図９】
2009511005.tif 000017
【図１０Ａ】
2009511005.tif 000018
【図１０Ｂ】
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【図１１】
2009511005.tif 000020
【図１２】
2009511005.tif 000021
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2009511005.tif 000026
【図１８Ａ】
2009511005.tif 000027
【図１８Ｂ】
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【図１９】
2009511005.tif 000029
【図２０】
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【図２１】
2009511005.tif 000031
【図２２】
2009511005.tif 000032
【図２３】
2009511005.tif 000033
【配列表】
2009511005000001.app
【国際調査報告】
2009511005.tif 000034
2009511005.tif 000035
2009511005.tif 000036