(57)【要約】本発明は、核酸を等温増幅する方法、及び核酸と増幅産物検出用信号プローブを同時に増幅することを特徴とする核酸の検出方法に関するもので、より詳細には、外部プライマーセット及びRNA/DNAハイブリッドのプライマーセットを利用して標的核酸を等温増幅する方法、並びに外部プライマーセット、RNA/DNAハイブリッドのプライマーセット及びDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブを用いて標的核酸と信号プローブを同時に増幅して増幅産物を検出する方法に関する。  本発明によれば、従来方法のPCR方法などに比べて簡便で、汚染の危険がなく、迅速・正確に標的核酸を増幅することができ、信号プローブを同時に増幅することができるので、病原菌の検出及び確認、規定された表現型をもたらす遺伝子変更の検出、遺伝疾患や疾患に対する感受性の診断、遺伝子発現の評価及び様々なゲノムプロジェクトに応用されて、分子生物学的研究及び疾病診断に有用である。【選択図】図２
2009511042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）（i）標的核酸、（ii）前記標的核酸と相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（iii）前記標的核酸と３'末端部分が相補的で、５'末端部分は非相補的な塩基配列を有する内部RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と、及び
（b）前記（a）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なDNA重合酵素とRNA分解酵素を含む酵素反応混合液を加えた後、前記標的核酸を等温で増幅する段階とを含む核酸の等温増幅方法。
【請求項２】
前記外部プライマーセットは、オリゴDNA、オリゴRNA及びハイブリッドオリゴRNA/DNAで構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の核酸の等温増幅方法。
【請求項３】
前記RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットは、RNA部分が標的核酸配列と非相補的な塩基配列を有し、DNA部分が標的核酸と相補的な塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸の等温増幅方法。
【請求項４】
前記DNA重合酵素は、耐熱性DNA重合酵素であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の等温増幅方法。
【請求項５】
前記耐熱性DNA重合酵素は、Bst
DNA重合酵素、exo（-）vent DNA重合酵素、exo（-）Deep vent DNA重合酵素、exo（-）Pfu DNA重合酵素、及びBca DNA重合酵素で構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項４に記載の核酸の等温増幅方法。
【請求項６】
前記RNA分解酵素はRNaseHであることを特徴とする請求項１に記載の核酸の等温増幅方法。
【請求項７】
前記等温増幅は、５０〜６５℃で行うことを特徴とする請求項１に記載の核酸の等温増幅方法。
【請求項８】
（a）（i）標的核酸検出用核酸サンプル、（ii）前記標的核酸と相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（iii）前記標的核酸と３'末端部分が相補的で、５'末端部分は非相補的な塩基配列を有する内部RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と、及び
（b）前記（a）段階で変性された反応混合物に鎖の置換が可能なDNA重合酵素とRNA分解酵素、及び前記外部プライマーセットと内部プライマーセットにより生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブを含む酵素反応混合液を加えた後、前記標的核酸と前記プローブ信号を等温で同時に増幅させる段階と、
（c）前記増幅されたプローブ信号を用いて標的核酸を検出する段階を含む核酸の検出方法。
【請求項９】
前記外部プライマーは、オリゴDNA、オリゴRNA及びハイブリッドオリゴRNA/DNAで構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーは、RNA部分が標的核酸配列と非相補的な塩基配列を有し、DNA部分が標的核酸と相補的な塩基配列を有することを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、２５〜４５塩基からなることを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、外部DNA部分の長さがそれぞれ１０〜２０塩基からなり、内部ＲＮＡ部分は長さが４〜６塩基からなることを特徴とする請求項１１に記載の核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、末端が標識物質で標識されていることを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記標識物質は、ビオチン、フルオレセント、digoxygenin、２,４-ジニトロフェニルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは３'末端に燐酸基を有することを特徴とする請求項１３に記載の核酸の検出方法。
【請求項１６】
前記DNA重合酵素は、耐熱性DNA重合酵素であることを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１７】
前記耐熱性DNA重合酵素は、Bst
DNA重合酵素、exo（-）vent DNA重合酵素及びBca DNA重合酵素で構成される群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１６に記載の核酸の検出方法。
【請求項１８】
前記RNA分解酵素はRNaseHであることを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１９】
前記標的核酸の増幅とプローブ信号の増幅は、５０〜６５℃で行うことを特徴とする請求項８に記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を等温増幅する方法、及び核酸と増幅産物検出用信号プローブを同時に増幅することを特徴とする核酸の検出方法に関するもので、より詳細には、外部プライマーセット及びRNA/DNAハイブリッドのプライマーセットを利用して標的核酸を等温増幅する方法、並びに外部プライマーセット、RNA/DNAハイブリッドのプライマーセット及びDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブを利用して標的核酸と信号プローブを同時に増幅して増幅産物を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術は、少量の核酸を検出し、分析する有用な技術である。標的核酸に対する核酸増幅技術の高性能は、感染性疾患及び遺伝性疾患を診断・分析するための遺伝子の分離技術、及び法医学的面での特定核酸を検出する技術の発展をもたらし、このような核酸検出方法に基づいて非常にセンシティブな診断・分析を行うことができる方法が提案されてきた（非特許文献１）。
【０００３】
核酸の検出は、DNA鎖の相補性とin vitroで一本鎖の核酸が二本鎖のハイブリッド分子を形成する能力に起因するもので、このような能力により試料から特定核酸を検出することができる（非特許文献２）。
【０００４】
核酸検出に使用されるプローブは、核酸試料に存在する標的配列と混合化することができる特定配列で構成される。前記プローブは、化学物質、免疫化学物質、螢光または放射性同位元素によって読まれる。通常、プローブは、標的核酸に対する相補的配列を有する短い断片の核酸と、DNAハイブリダイゼーションを読むことができる螢光物質や、ビオチン及びdigoxygeninのような標識又はリポーター分子を含む構成を有する。
【０００５】
しかし、上記のような核酸検出方法では、特に、染色体DNA上の短い配列を検出することができず、コピー数が低く、野生型遺伝子に対する変形した対立遺伝子の制限されたコピー数を解決するのに限界があった。核酸検出方法の他の問題点は、標的配列、化学物質及びプローブと、他の分子あるいは構造との物理的相互作用を制限するin vitroまたはin situの環境条件と関連がある。
【０００６】
標的核酸を検出するための方法は、３つのカテゴリーに分けることができる。標的核酸を増幅させる方法である目標配列の増幅と、プローブ分子自体を増幅させるプローブ増幅と、各プローブが示す信号を複合プローブや連結プローブ技術により増加させる信号増幅がある。
【０００７】
In
vitro核酸増幅技術は、少量の核酸を検出及び分析する主な方法として利用されてきた。特に、PCR（polymerase
chain reaction）は最も広く利用される核酸増幅方法であって、相補的配列の各ストランド（strand）を鋳型として使用し、プライマーにより核酸の合成が反復して行われることで相補的配列の各ストランドの複製が合成される。PCR過程を行うためには、予めプログラムされた熱循環装備（thermal
cycling instrument）が必要である。このため、多くの費用がかかり、特異性が比較的低く、また、結果を再現するためには実行段階を標準化しなければならないという短所がある。
【０００８】
さらに、他の核酸増幅方法であるLCR（ligase chain reaction）は、２つの隣接したオリゴヌクレオチドが標的核酸と混合化され、リガーゼ（ligase）によりライゲーションされる。これによって形成されたプローブ（probe）は、相補的なヌクレオチドとともに温度サイクリング（temperature cycling）により増幅される。
【０００９】
LCRは、プライマーを用いた核酸の伸長（primer extension）より高い識別力（discriminatory power）を有するので、遺伝子の点突然変異（genotyping point mutation）においては、PCRより高い対立遺伝子特異性（allele specificity）を示す。LCRはこれまで開発された核酸増幅技術の中で最も高い特異性を有し、すべての識別メカニズムが最適化されている最も簡単な方法であるが、反応速度が最も遅く、多数の変形プローブを必要とするという短所がある。
【００１０】
LCRのようにライゲーションを利用する方法は、LCR又はRCA（rolling circle replication）過程で発生するDNA接合によって第１に円形化されるパドロックプローブ（padlock probe）を利用してRCA方法で増幅させることにより、標的増幅PCRを行わなくても遺伝子型を分析（genotyping）することができる（非特許文献３）。
【００１１】
SDA（strand displacement amplification）は、エンドヌクレアーゼによってストランドを置換（strand displacement）することにより、サンプル内の標的核酸配列及びこれの相補的ストランドを増幅させる方法である。この方法は、核酸重合酵素（nucleic acid polymerase）、少なくとも１つの置換されたdNTP（deoxynucleoside triphosphate）を含むdNTPs、及び標的断片（target fragment）の３'末端に対して相補的なプライマーを少なくとも１つ以上含有する混合物を使用する。各プライマーは、５'末端に制限エンドヌクレアーゼ（restriction endonuclease）が認知することができる配列を有しいる（非特許文献４）。
【００１２】
SDA方法と類似する方法としては、RNA/DNAハイブリッドのプライマーまたはRNAプライマーを利用してプライマーを伸長させた後、鋳型DNAと混合化をなしているRNAプライマーを切断するRNaseH酵素を用いてプライマーと鋳型DNAを切断した後、鎖置換により新たなプライマーを伸長させる方法であって、５'-RNA/DNA-３'プライマーを使用するSPIA法（single primer isothermal amplification）（特許文献１）、５'-DNA/ＲＮＡ-３'プライマーを使用するICAN法（isothermal chimeric primer-initiated amplification of
nucleic acid）（特許文献２）、RNAプライマーを使用するRiboprimer法（特許文献３）等がある。
【００１３】
TMA法（transcription Mediated amplification）は、一定の温度、一定のイオン強度（ionic strength）及び一定のpHで１つのプロモータープライマーのみを使用して標的核酸を増幅させる方法である（非特許文献５）。TMA法は、実質的に標的核酸で構成された混合物と標的核酸の３'末端部位あるいはこれと隣接した部位と混合化するための標的配列の３'末端部位と相補的なオリゴヌクレオチドであるプロモータープライマー（promoter-primer）を結合させることを特徴とする。前記プロモータープライマーは、コンプレックシング配列（complexing sequence）の５'末端部位に位置したRNA重合酵素に対するプロモータ部位の配列も含む。前記プロモータープライマー及び標的配列は、プロモータープライマー/標的配列ハイブリッドを形成してDNAが伸長するようになる。
【００１４】
前記TMA法のDNA伸長（extension）過程において、標的配列の３'末端はコンプレックシング配列と標的配列の間でプロモータープライマーが混合化された複合体（complex）に近接した位置から伸長するものと推測される。プロモーター配列は、第１のDNA伸長生成物を生成して二本鎖プロモーター配列を形成する前記伸長過程に対する鋳型として作用する。プロモータープライマーの３'末端は、第２のDNA伸長過程に対するプライマーとしても使用できる。前記伸長過程では、鋳型として標的配列を用いて二本鎖核酸複合体が形成される。前記複合体は、ＲＮＡ標的配列が使用される場合はDNA/RNA複合体であり、DNA標的配列が使用される場合はDNA/DNA複合体になる。次いで、標的配列の様々なRNA複製を生産するために、プロモータープライマーのプロモーターを認知するRNA重合酵素が前記第１のDNA伸長生成物を用いてRNAを合成する。
【００１５】
NASBA法（nucleic acid sequence-based amplification）には、一本鎖RNAの合成、一本鎖DNAの合成及び二本鎖DNAの合成が含まれる（非特許文献６）。前記一本鎖RNAは、第１のプライマーに対する第１の鋳型となり、前記一本鎖DNAは、第２のプライマーに対する第２の鋳型となり、前記二本鎖DNAは、前記第１の鋳型に対する複製を合成するにおいて第３の鋳型となる。
【００１６】
PCR等の熱循環過程を利用する増幅方法は、各サイクルの「標的」温度に達するため熱循環ブロックを必要とし、熱ブロックが標的温度に達するまで遅延時間が必要であるので、増幅反応が完了するまで長時間がかかるという短所がある。
【００１７】
SDA、NASBA及びTMA等の等温標的核酸増幅方法は、一定の温度で核酸増幅が行われるため、別途の熱循環装置が不要で、操作が簡単であるという長所がある。
【００１８】
しかし、上記の等温標的核酸増幅方法には、幾つかの問題点がある。SDA方法による核酸増幅は、規定された制限酵素のための部位が存在する必要があるため応用性に制限があり、NASBA及びTMAのような転写ベースの増幅方法は、プライマーによる重合酵素プロモーター配列と増幅生成物との結合が必要であり、この過程は非特異的増幅をもたらす傾向がある。このため、これら転写ベースの増幅方法によるDNA標的の増幅メカニズムは確立されていない。
【００１９】
また、現在使用されている増幅方法にはさらに別の問題点がある。先行増幅反応の増幅生成物によりテストサンプルが汚染するおそれがあり、このため、サンプルの非標的特異的増幅をもたらす。これを防止するために、増幅反応の最後、あるいは標的核酸の増幅開始前にテストサンプルの汚染を除去する様々な手段及び物理的手段を採用したテスト溶液の汚染検出方法が提案されているが、これらのほとんどは核酸増幅操作を複雑にする。
【００２０】
核酸検出のための他の方法であるプローブを増幅させる方法としては、前記核酸増幅方法で使用されるLCR方法がある。
【００２１】
核酸検出のためのまた他の方法としては、目的核酸やプローブを増幅させるのではなく、信号を増幅させる方法がある。これらの方法としては、標的核酸をキャプチャーするために４種のセットのプローブを使用するbDNA（branched DNA）増幅法がある（非特許文献７）。信号増幅を利用するハイブリッドキャプチャー方法は、標的核酸を直接検出し、標的核酸を増幅する方法と同様の敏感性を有し、信号検出のために抗体や化学発光物質を使用する（非特許文献８）。
【００２２】
また、信号プローブを増幅する方法として、CPT（cycling probe
technology）増幅法がある（非特許文献９）。前記方法は、標的核酸と相補的な塩基配列を有するDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブを使用し、標的核酸と前記プローブが混合される場合、ハイブリッドプローブのRNA部分がRNaseH酵素により切断され、切断されたハイブリッドプローブは、標的核酸と分離され、また他のDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブが標的核酸と混合されて再び切断されたプローブが生成される。このように循環的に信号プローブを増幅させる方法である。
【００２３】
しかし、前記CPT方法は、増幅効率が１０３〜１０６と比較的低く、独立的に診断に利用することは難しく、PCR方法等、従来の核酸増幅により一次的に標的核酸の特定部位の量を増加させた後、別途に信号プローブを増幅することになるので、使用が複雑で、高費用と長時間がかかるという問題点がある。
【００２４】
そこで、本発明の発明者らは、上記のような問題点を解決し、標的核酸を迅速かつ正確に増幅する方法及び標的核酸の増幅と同時に前記増幅産物を検出する方法を開発するために努力した結果、標的核酸と相補的な塩基配列を有する外部プライマーセットと標的核酸と部分的に相補的な塩基配列を有する内部RNA/DNAハイブリッドのプライマーセットを用いることにより、等温で標的核酸を速かに増幅させることができることを確認した。前記方法により増幅された増幅産物と相補的な塩基配列を有するDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブを利用すれば、等温で標的核酸とプローブ信号を同時に増幅できるこことを見出し、本発明を完成するに至った。
【特許文献１】米国特許６,２５１,６３９号
【特許文献２】米国特許出願２００５/０１２３９５０号
【特許文献３】米国特許出願２００４/０１８０３６１号
【非特許文献１】Belkum, Current Opinion InPharmacology, 3：497, 2003
【非特許文献２】Barry et al., Current Opinionin Biotechnology, 12：21, 2001
【非特許文献３】Qi et al., Nucleic Acids Research,29:e116, 2001
【非特許文献４】Walker et al., Nucleic AcidsRes.,20：1691, 1992
【非特許文献５】Kwoh et al., Proc. Nat. Aca.Sci.USA, 86：1173, 1989
【非特許文献６】Compton, Nature, 350：91, 1991
【非特許文献７】Ross et al., J. Virol. Method.,101：159, 2002
【非特許文献８】Van Der Pol et al., J. ClinicalMicrobiol., 40：3564, 2002; Nelson et al., Nucleic AcidsResearch, 24：4998, 1996
【非特許文献９】Duck et al., BioTechniques9：142, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、標的核酸を等温で迅速かつ正確に増幅させる方法を提供することである。
【００２６】
本発明の他の目的は、等温で標的核酸及びプローブ信号の増幅を同時に行うことを特徴とする核酸の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
上記目的を達成するために本発明は、（a）（i）標的核酸、（ii）前記標的核酸と相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（iii）前記標的核酸と部分的に相補的な塩基配列を有する内部RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と；（b）前記（a）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なDNA重合酵素とRNA分解酵素を含む酵素反応混合液を添加した後、前記標的核酸を等温で増幅させる段階を含む核酸の等温増幅方法を提供する。
【００２８】
また、本発明は、（a）（i）標的核酸検出用核酸サンプル、（ii）前記標的核酸と相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（iii）前記標的核酸と部分的に相補的な塩基配列を有するRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と；（b）前記（a）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なDNA重合酵素、RNA分解酵素及び前記外部プライマーセットと内部プライマーセットにより生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブを含む酵素反応混合液を添加した後、前記標的核酸と前記プローブ信号を等温で同時に増幅させる段階と；（c）前記増幅されたプローブ信号を利用して標的核酸を検出する段階を含む核酸の検出方法を提供する。
【００２９】
本発明において、前記外部プライマーは、オリゴDNA、オリゴRNA及びハイブリッドオリゴRNA/DNAで構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする。前記RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーは、RNA部分が標的核酸配列と非相補的塩基配列を有し、DNA部分が標的核酸と相補的な塩基配列を有することを特徴とする。
【００３０】
本発明において、前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、２５〜４５塩基からなることを特徴とする。外部DNA部分の長さはそれぞれ１０〜２０塩基からなり、内部ＲＮＡ部分は、長さが４〜６塩基からなることを特徴とする。
【００３１】
本発明において、前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、末端が標識物質で標識されていることを特徴とする。前記標識物質は、ビオチン、フルオレセント、digoxygenin、２,４-ジニトロフェニル等、特定抗体と選択的に結合する物質であることを特徴とする。
【００３２】
本発明において、前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、３'末端がフォスフェート物質で標識されており、増幅反応中にプローブの伸長反応が発声するのを防止できることを特徴とする。
【００３３】
本発明において、前記DNA重合酵素は、耐熱性DNA重合酵素であることを特徴とする。前記耐熱性DNA重合酵素は、Bst
DNA重合酵素、exo（-）vent DNA重合酵素及びBca DNA重合酵素で構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする。
【００３４】
本発明において、前記RNA分解酵素はRNaseHであることを特徴とする。
【００３５】
本発明において、前記標的核酸の増幅とプローブ信号の増幅は、５０〜６５℃で行うことを特徴とする。
【００３６】
以下、本発明の内容の特定部分を詳細に開示および記述するが、この分野における通常の知識を有するものであれば、以下の説明は単なる実施例を示したものにすぎず、本発明の範囲がそれらによって限定されるべきではないことが理解できるであろう。本発明の真の範囲は特許請求の範囲の各請求項及びそれらの等価物によってのみ定義されるものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、１つの観点により核酸を等温増幅する方法を開示する。
【００３８】
本発明の核酸等温増幅は、図１に示すように、以下の過程により行われる。
【００３９】
まず、増幅を行う鋳型となる標的核酸、外部プライマーセット及びRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットの混合物を変性させて各々一本鎖DNAを調剤する。変性させた混合物を等温増幅温度で冷却し、前記混合物にDNA重合酵素とRNA分解酵素が含有された酵素反応溶液を加える。このとき、増幅温度に冷却された反応液内で標的核酸に前記外部プライマーセットと前記RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットがアニールする。
【００４０】
前記外部プライマーセットは、内部プライマーセットより標的核酸の両末端側に近い配列と、相補的な配列を含むことが好ましい。また、内部プライマーセットは、外部プライマーより標的核酸の中心に近い配列を含むことが好ましい。この場合、内部プライマーは外部プライマーよりDNA鎖伸長方向の前側にアニールする。アニールされた内部プライマーと外部プライマーは、鎖置換能力のあるDNA重合酵素によって伸長され、外部プライマーが鋳型（標的核酸）に沿って伸長することにより、伸長方向の前側に位置する内部プライマー及び内部プライマーで伸長したDNA鎖が鋳型（標的核酸）から離れていき鎖置換が生じる。最終的には、内部プライマーで伸長された一本鎖のDNA増幅産物と外部プライマーで伸長された一本鎖のDNA増幅産物が得られる。
【００４１】
前記増幅産物である一本鎖DNAを鋳型にして外部プライマーが伸長して二本鎖DNAが形成され、伸長されたRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーは鎖置換によって一本鎖DNAが分離され、前記二本鎖DNAのRNA部分はRNaseHによって分離され、RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーがアニールし鎖置換によりプライマーが伸長する過程が繰り返されることが標的DNAが増幅される（図２）。
【００４２】
本発明は、他の観点により、核酸と増幅産物検出用信号プローブを同時に増幅することを特徴とする核酸の検出方法を開示する。
【００４３】
まず、標的核酸検出用核酸のサンプル、外部プライマーセット及びRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットの混合物を変性させて、各々一本鎖DNAを調剤する。変性された混合物を等温増幅温度で冷却し、前記混合物にDNA重合酵素、RNA分解酵素及びDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブが含有された酵素反応溶液を加える。このとき、増幅温度で冷却した反応液内で標的核酸に前記外部プライマーセットと前記RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーセットがアニールする。
【００４４】
前記外部プライマーセットは、内部プライマーセットより標的核酸の両末端側に近い配列と、相補的な配列を含むことが好ましい。内部プライマーセットは、外部プライマーより標的核酸の中心に近い配列を含むことが好ましい。この場合、内部プライマーは外部プライマーよりDNA鎖伸長方向の前側にアニールされる。アニールされた内部プライマーと外部プライマーは、鎖置換能力のあるDNA重合酵素によって伸長し、外部プライマーが鋳型（標的核酸）に沿って伸長することにより、伸長方向の前側に位置する内部プライマー及び内部プライマーで伸長したDNA鎖が鋳型（標的核酸）から離れていき鎖置換が生じ、最終的には、内部プライマーで伸長した一本鎖のDNA増幅産物と外部プライマーで伸長した一本鎖のDNA増幅産物が得られる。
【００４５】
本発明によるプローブ信号の増幅は、上記核酸等温増幅と同時に行われ、前記核酸の等温増幅を介して増幅された標的DNAは、DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブとアニールされてRNA/DNAハイブリッド二本鎖が形成されると、RNaseHの活性によってDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブのRNA部分が切断され、切断されたプローブは信号が活性化されて標的DNAから分離されていき、新しいDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブが結合され、RNaseHにより切断、分離されるサイクルが繰り返されることでプローブ信号が増幅される（図３）。
【００４６】
本発明の外部プライマーは、標的核酸配列に相補的（complementary）で１５〜３０塩基を有することが好ましい。外部プライマーと相補的な標的核酸配列は、内部プライマーと相補的な標的核酸配列に隣接した配列（１〜６Obpの差）であることが好ましい。外部プライマーと相補的な標的核酸配列は、内部プライマーと相補的な核酸配列より標的核酸配列の３'末端側に近い配列であることが好ましい。
【００４７】
本発明のＲＮＡ/DNAハイブリッドの内部プライマーは、オリゴRNAとオリゴDNAが結合したプライマーであって、５'末端部分は標的核酸の塩基配列と非相補的で、３'末端部分は標的核酸の塩基配列と相補的であることが好ましい。RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーは２０〜４５塩基で構成されることが好ましい。このとき、オリゴRNAは１５〜２５塩基であることが好ましく、オリゴDNAは５〜２０塩基であることが好ましい。
【００４８】
より好ましくは、RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーでオリゴRNAは標的核酸の塩基配列と非相補的であり、オリゴDNAは標的核酸の塩基配列と相補的であることが好ましい。
【００４９】
本発明におけるRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーと相補的な標的核酸の配列は、外部プライマーと相補的な標的核酸の配列より５'末端側に位置した配列を含むことが好ましい。内部プライマーと相補的な標的核酸配列は、外部プライマーと相補的な標的核酸配列に隣接した配列（１〜６Obpの差）であることが好ましい。
【００５０】
本発明で使用されるDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、前記外部プライマー又はRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーにより増幅される核酸増幅産物と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましく、DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブの５'末端と３'末端はオリゴDNAで構成され、中間部分はオリゴRNAで構成されることが好ましい。
【００５１】
前記DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、２５〜４５塩基で構成されることが好ましく、５'末端及び３'末端のオリゴDNA部分は各々１０〜２０塩基で構成されることが好ましい。中間に位置したオリゴRNA部分は４〜６塩基で構成されることが好ましい。
【００５２】
本発明の方法により増幅された信号プローブは、金ナノオリゴプローブのハイブリダイゼーションによるcross linking凝集方法を利用して、溶液の吸光度の変異により検出することができる（Mirkin et al. Nature 382：607-609, 1996）。この場合、DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブがDNAポリメラーゼにより伸長することを防止するため、３'末端のタグ（tagged）プローブを使用することが好ましく、より好ましくは、フォスフェートでタグされたプローブを使用することが好ましい。
【００５３】
３'末端及び５'末端が金ナノパーティクルにコンジュゲート（conjugated）された金ナノオリゴプローブは、水溶液相の吸光度５３０ｎｍで最大吸光度を示すが、前記金ナノオリゴプローブと相補的塩基配列を有する信号プローブが存在する場合は、金ナノプローブがハイブリダイゼーションによりクロスリンク（cross-linking）して、金ナノプローブの凝集が誘導されて最大吸光度が変異することが分かる。これにより、５３０ｎｍと７００ｎｍでの吸光度の変位比率を測定することでプローブの存在を確認することができる。
【００５４】
本発明の方法により増幅された信号プローブは、マイクロプレートでhorse radish peroxidaseを利用して検出することができる（Bekkaoui et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 34：83-93, 1999）。この場合、DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブは、末端は螢光物質とビオチンで標識することが好ましく、信号プローブが増幅された反応は、ビオチンと選択的に結合するstreptavidineが表面処理されたマイクロウェルと螢光物質と選択的に結合するアンチ-螢光物質がコンジュゲートされたHRP（hores radish peroxidase）を利用して結合し、洗浄した後、HRPの基質であるTMB（tetranitrobenzidine）反応により４６５ｎｍでの吸光度の変異比率を測定すれば、プローブの存在を確認することができるが、これに限定されるものではない。さらに、螢光物質とビオチン以外に２,４-ジニトロフェニル又はdigoxygeninを使用して前記物質と選択的結合をする抗体（antibody）がコンジュゲートされた標識を使用することも可能である。
【００５５】
本発明で使用されるDNA重合酵素は、DNA鋳型に沿って核酸プライマーを拡張することができる酵素であって、置換されたストランドが結合するポリヌクレオチドから核酸ストランドを置換できなければならない。本発明で使用できるDNA重合酵素の例としては、鎖置換が可能であると知られるBst
DNA重合酵素、Bca DNA重合酵素、exo（-）vent DNA重合酵素、exo（-）Deep vent DNA重合酵素、exo（-）Pfu DNA重合酵素、及びパイ２９ DNA重合酵素が好ましく、反応の迅速性及び効率性のためには耐熱性DNA重合酵素が好ましい。
【００５６】
本発明で使用されるＲＮＡ分解酵素は、一般的に５'RNA部分を切断し、RNA/DNAハイブリッド体のRNAストランドを切断する特徴を有し、一本鎖RNAは分解しないことが良く、好ましくは、RNaseHを使用することが好ましい。
【００５７】
本発明において、増幅反応は、本発明のプライマーと鋳型DNAとがアニールすることができ、使用される酵素の活性を実質的に抑制しない温度で行うことが好ましい。本発明で増幅反応を行う温度は、好ましくは３０〜７５℃、より好ましくは３７〜７０℃、５０〜６５℃が最も好ましい。
【００５８】
本発明による核酸の等温増幅方法によれば、追加外部プライマーを使用するので、単一のRNA/DNAハイブリッドのプライマーを使用する従来方法（米国特許６,２５１,６３９）に比べてその特異性が高く、外部プライマーにより置換された内部プライマーが新たな鋳型として作用して幾何級数的に増幅されるので、増幅効率を画期的に改善することが可能である。
【００５９】
また、従来の方法では、単一のRNA/DNAハイブリッドのプライマーを用いて標的塩基配列増幅時に一定の部位を増幅させるため、増幅を遮断する別途の遮断器（blocker）、あるいは鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（TSO）を使用するのに対して、本発明では、正方向プライマーと逆方向プライマーのペアーを用いて、別途の遮断器や鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用せずに、目的部位だけを増幅することができるという長所がある。
【００６０】
さらに、増幅されたDNAを鋳型としてDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブが結合及び分離するサイクルを繰り返して信号プローブを増幅させることができ、核酸増幅と信号プローブ増幅が同時にシングルチューブ（single-tube）で行われ、核酸増幅と核酸検出を同時に行うことができるという長所がある。
【００６１】
また、本発明は、使用されるRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーのうちRNA部分が鋳型と非相補的な塩基配列を有しており、単一のRNA/DNAハイブリッドのプライマーを使用する従来方法でRNA分解酵素の反応活性がDNA重合酵素のプライマー拡張活性より高いときに発生する不具合を考慮する必要がないという長所がある。
【００６２】
また、本発明の核酸の等温増幅方法は、最初のプライマー拡張と鎖置換反応後、新たに合成された増幅産物が新しい鋳型として使用される際に、鋳型と非相補的なRNA部位がプライマーと相補的な鋳型として作用してプライマーとの結合（annealing）温度を上昇させることによって増幅効率を増加させると同時に、プライマーダイマー（primer dimer）の形成を防止し、増幅産物の純度を高めることができる。
【００６３】
本発明の核酸の等温増幅方法及び核酸検出方法は、一定温度で反応を行うワンステップ（one-step）核酸及び信号プローブ等温増幅であって、特別の熱変換装置を必要としないので、迅速かつ簡単に標的核酸を増幅させることができる。また、増幅過程で２ペアのプライマーセットとプローブを使用することで、従来の方法に比べて、標的核酸だけを正確に増幅すると同時に、信号プローブも増幅することができる優れた特性を有する。
【００６４】
また、本発明の核酸の等温増幅方法及び核酸の検出方法は、等温で１つのチューブ（one-tube）内で行われるので、核酸の実時間検出のための大量処理が可能である。これにより、増幅技術の広い範囲の使用を制限した汚染による付加反応が発生するおそれを最小に抑えることができる。
【００６５】
本発明の核酸の等温増幅方法によれば、試料のDNA抽出から完全な増幅まで約１時間がかかり、試料DNAの抽出が済んでいれば約４０分がかかるので、極めて速かに増幅反応を行うことができる。
【００６６】
実施例を参照して以下に詳細に記述されるが、以下の実施例は単に例示のために提供され、本発明の範囲を制限するものではないことがこの分野における通常の知識を有する者であれば理解できるであろう。
【００６７】
（例１：核酸の等温増幅）
【００６８】
標的核酸としてlambda DNA（TaKaRa Bio Inc.；3010、0.3μg/ml）を使用し、外部プライマー及びRNA/DNAハイブリッドの内部プライマーは、lamda DNAの全体塩基配列（GenBank No. J02459）及び従来方法（Biochem. Biophy. Res. Comm., 289：150, 2001）を参照して作製した。
【００６９】
外部プライマーは、lambda DNAに相補的な配列を含むように設計し、配列番号１及び配列番号２に示す。
配列番号１：５'-GGACGTCAGAAAACCAGAA-３'
配列番号２：５'-GGCAGTGAAGCCCAGAT-３'
【００７０】
RNA/DNAハイブリッドの内部プライマーは、オリゴRNA部分はlamda
DNAに非相補的な配列を有し、オリゴDNA部分はlamda
DNAに相補的な配列を有するように設計し、配列番号３及び配列番号４に示す（オリゴRNA部分は下線表示）。
配列番号３：５'-UAAGAGAUCGCCCGUCAGCCGCTCCGATCACCCTCGCAAAC-３'
配列番号４：５'-CAACAUGACCGACGCUUGCCCGCGCCACGCTCCTTAATCTG-３'
【００７１】
前記外部プライマーセットと内部プライマーセットを用いて標的核酸を増幅するために、まず、前記外部プライマーセット、内部プライマーセット及び標的核酸を含有する反応混合物を用意する。前記反応混合物は、２０mM Tris-HCl（pH８．５）バッファに１０mM（NH４）２SO４、１０mM MgSO４、４mM KCl、０.５mM each dNTP（Fermentas）、０.５mM DTT、０.１μg BSA、０.１μM 外部プライマーセット、０.５μM 内部プライマーセット及び１０ng lambda DNAを添加して調剤した。前記反応混合物を９５℃で５分間変性（denaturation）させ、６３℃で５分間冷却した後、DNAを増幅するために酵素反応混合液を加えて、最終容量２０μｌとなるようにして６３℃で１時間間等温増幅を行った。
【００７２】
前記酵素反応混合液の成分は、０.３μg T４
Gene ３２Protein（USB）、６unit RNase inhibitor（Intron）、０.５unit RNaseH（Epicentre）及び３０unit Bst DNA polymerase（NEBM0275M）である。
【００７３】
一方、対照群として標的核酸（lambda DNA）が除外された酵素反応混合液と、外部プライマー及び/又は内部プライマーが除外された反応混合物を使用した。
【００７４】
増幅反応が終了した反応溶液６μｌをローディングバッファ（loading buffer）と混合し、エチジウムブロマイド（ethidium bromide）を含む１.８％のアガロースゲル（agarose gel）に電気泳動した後、UVトランスイルミネータで発色するバンドを通じて核酸増幅反応の効率を判断した。
【００７５】
その結果、図４に示すように、lambda DNAを添加しないサンプルと、内部プライマー及び/又は外部プライマーを添加しないサンプルに比べて、lambda DNA、内部プライマー及び外部プライマーを添加したサンプルで標的核酸の増幅産物が著しく増加することが確認できた。
【００７６】
（例２：大腸菌０１５７：H７での核酸分離）
【００７７】
Eascherichia
coli ０１５７：H７菌株（KCCM 40406）を３７℃、好気性条件下で培養培地（Trypticase soy broth）で適切に培養した。前記培養条件で１時間ごとに細胞倍養液を取って吸光度及び細胞数を測定した。細胞数は、液体培地に細胞倍養液を連続的に希釈する方法でHelber cell counting chamberで測定して吸光度による細胞数を決定した。
【００７８】
前記大腸菌菌株からの核酸分離は、Intron社のG-spin Genomic DNA分離システム（Cat No.17121）を利用した。簡単に説明すると、対数増殖期の菌倍養液１.０mlを取って１０７細胞数/mlに濃度を調節した後、１３,０００g、２分間遠心分離して得られた細胞にG-buffer溶液３００mlを加えて再懸濁した後、６５℃で１５分間放置した。これに２５０mlのバインディングバッファを加えてスムーズに懸濁させた。前記バインディングバッファにはRNase溶液とProteinase K溶液が含まれている。この混合液をスピンカラム（spin column）に移して１３,０００gで１分間遠心分離を行った。５００ml washing buffer A洗浄液を再びスピンカラムに加えて１３,０００gで、１分間遠心分離して洗浄した。次いで、５００ml washing buffer B洗浄液を再びスピンカラムに加えて１３,０００gで１分間遠心分離を行った。カラムを新しいチューブに移した後、１００ml溶出バッファをカラムメンブレンに均等に浸して常温で３分間放置した後、１３,０００gで２分間遠心分離して核酸を得た。得られた核酸は−８０℃で保管して使用した。
【００７９】
（例３：金ナノパーティクルの製造（直径４２nm））
【００８０】
金ナノパーティクルの合成は、知られた既存の方法（Liu et. al, J. Am. Chem. Soc. 126：12299, 2004）を利用した。簡単に説明すると、２００mlの０.３mM HAuCl４（Aldrich, USA）をフラスコに入れて加熱して還流させた後、１.８mlの３８.８mM クエン酸ナトリウム（sodium citrate, Aldrich, USA）を速かに滴下して、薄い黄色から濃い紫色に変化した反応混合物を１０分間加熱する。薄い赤色になると常温で冷やしながら１５分間撹拌し、可視光線５２０nmで最上の吸光度を示す直径４２nmの金ナノパーティクル溶液を得た。
【００８１】
（例４信号プローブ（３'-and ５'-alkanethiol
oligonucleotide Modified Au nanoparticle）の製造）
【００８２】
信号プローブは、知られた既存の方法（Nucleic Acids Research33：e168, 2005, Journal of Biotechnology119：111,
2005）を参照して製造した。すなわち、前記実施例３であらかじめ製造された４２nm金ナノパーティクルに配列番号５及び配列番号６のＩＤＴ（alkanethiol oligonucleotide）を３mMになるように各々加えた後、ホイルで包んで１６時間常温で放置した。金ナノパーティクル溶液に０.１M、pH7.0の燐酸（KH２PO４/K２HPO４）を添加して燐酸１０mMを製造した。次いで、２M NaClを添加して０.０５M NaClを製造して２４時間が経過すると、最終的に０.３MのNaClを製造した。ここで、塩はゆっくり少量ずつ滴下して添加した。２４時間が経過した後、過量のチオールDNAを除去するために８,０００rpm、１５分間遠心分離して上澄液を除去した。１０mMの燐酸（pH７.０）、０.１MのNaClで２回洗浄した後、同じ１０mMの燐酸（pH７.０）、０.１MのNaClに最終的に溶解させて金ナノパーティクルで標識されたプローブを得た。
配列番号５：５'-HS-（CH２）６-AGTGACAAAACGCAG-３'
配列番号６：５'-AACTGCTCTGGATGC-（CH２）３-SH-３'
【００８３】
（例５：金ナノプローブの凝集反応検出のための標的核酸及び信号プローブの増幅）
【００８４】
E.coli 0157:H7（KCCM 40406）の全体塩基配列を参照して特定遺伝子部位（stx-２）を選択的に増幅するためのプライマー（配列番号７〜１０）及びプローブ（配列番号１１）を作製した。
配列番号７：５'-CGTTCCGGAATGCAAATC-３'
配列番号８：５'-CATCGTATACACAGGAGC-３'
配列番号９：５'-TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT-３'
配列番号１０：５'-CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATTCT-３'
配列番号１１：５'-TGCTGTGACAGTGACAAAACGCAGAACTGCTCTG-phasphate-３'
【００８５】
前記配列番号７及び配列番号８のプライマーは、Eascherichia
coli 0157：H7に相補的な配列を有する外部プライマーであり、配列番号９及び配列番号１０のプライマーは、Eascherichia coli 0157：H7に相補的な配列と非特異的な配列を含む内部プライマーである。配列番号１１は、信号プローブ増幅を行うためのプローブ（probe）で、DNA伸長反応を防止するため３'末端に燐酸基タグで標識されたDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブである。前記配列において下線部分はRNA塩基配列である。
【００８６】
前記プライマーを目的の核酸にアニールするために、前記外部プライマー（配列番号７及び配列番号８）、内部プライマー（配列番号９及び配列番号１０）を含む反応混合物を９５℃で５分間変性させた後、６３℃で５分間冷却した。
【００８７】
前記反応混合物の成分は、５mM Tris-HCl（pH8.5）、１０mM（NH４）２SO４、１０mM MgSO４、４mM KCl、０.５mM each dNTP（Fermentas）、２.９mM DTT、０.１Mg BSA、１０mM EGTA、５０mM spermine、０.０８mM外部プライマー、０.１２６mM内部プライマー、１ng Eascherichia coli 0157：H7DNAである。
【００８８】
次に、冷却した反応混合物に酵素反応混合液を加えて最終容量２０μｌとなるようにした後、DNA増幅が対数期に達するまで６３℃で４０分間等温増幅を行った。酵素反応混合液の成分は、０.３Mg T４ Gene３２
Protein（USB）、６unit
RNase inhibitor（Intron）、０.５unit RNaseH（Epicentre）、２０unit Bst DNA polymerase（NEBM0275M）、１nM DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブである。前記実験群の対照群としては目的の核酸を除いたものを使用した。
【００８９】
（例６：金ナノプローブの凝集反応検出）
【００９０】
実施例５で得られた増幅物１mlに実施例４で製造した金ナノパーティクルで標識されたプローブ（配列番号５及び配列番号６）と１０mMの燐酸を加えた後、０.５MのNaClを加えて最終反応液を５０mlにした。前記反応液を吸光度５３０nmと７００nm値を測定してOD５３０/OD７００の比率を計算して対照群と実験群を比較し、数値の差が大きいほど有効であると判断した（図５及び図６）。
【００９１】
図５及び図６に示したように、金ナノオリゴプローブと相補的な塩基配列を有する信号プローブが存在する実験群においては、金ナノプローブがハイブリダイゼーションによりクロスリンク（cross-linking）されて金ナノプローブの凝集が誘導され、最大吸光度が変化することを確認することができた。
【００９２】
（例７：HRP検出のための標的核酸及び信号プローブの増幅）
【００９３】
E.coli 0157：H7（KCCM
40406）の全体塩基配列を参照して特定遺伝子部位（stx-２）を選択的に増幅するためのプライマー（配列番号７〜１０）及びプローブ（配列番号１２）を製造した。
配列番号７：５'-CGTTCCGGAATGCAAATC-３'
配列番号８：５'-CATCGTATACACAGGAGC-３'
配列番号９：５'-TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT-３'
配列番号１０：５'-CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATTCT-３'
配列番号１２：５'-Fluorescein-TGTGACAGTGACAAAACGCAGAACT-GCT-Biotin-３'
【００９４】
前記配列番号７及び８のプライマーは、Eascherichia coli 0157：H7に相補的な配列の外部プライマーであり、配列番号９及び配列番号１０のプライマーは、Eascherichia coli 0157：H7に相補的な配列と非特異的な配列を含む内部プライマーである。配列番号１２は、信号プローブ増幅を行うためのDNA-RNA-DNAハイブリッドプローブで、５'末端はFluoresceinで、３'末端がビオチンで標識されており、下線部分はＲＮＡ塩基配列である。
【００９５】
前記プライマーを目的の核酸にアニールするために、前記外部プライマー（配列番号７及び配列番号８）、内部プライマー（配列番号９及び配列番号１０）を含む反応混合物を９５℃で５分間変性させた後、６３℃で５分間冷却した。
【００９６】
前記反応混合物の成分は、５mM Tris-HCl（pH8.5）、１０mM（NH４）２SO４、１０mM MgSO４、４mM KCl、０.５mM each dNTP（Fermentas）、２.９mM DTT、０.１Mg BSA、１０mM EGTA、５０mM spermine、０.０８mM外部プライマー、０.１２６mM内部プライマー、１ng Eascherichia coli 0157：H7 DNAである。
【００９７】
次に、冷却された反応混合物に酵素反応混合液を加えて最終容量２０μｌとなるようにした後、DNA増幅が対数期に達するまで６３℃で４０分間等温増幅を行った。酵素反応混合液の成分は、０.３Mg T４ Gene３２
Protein（USB）、６unit
RNase inhibitor（Intron）、０.５unit RNase H（Epicentre）、２０unit Bst DNA polymerase（NEBM0275M）、１nM DNA-RNA-DNAハイブリッドプローブである。前記実験群の対照群としては目的の核酸を除いたものを使用した。
【００９８】
（例８：HRPによる検出）
【００９９】
実施例７で得られた増幅物に１７０mlのPBSTバインディングバッファを加えて反応混合物を製造し、組成は次のとおりである。１３５mM NaCl、２.７mM KCl、８.１mM Na２HPO４、１.５mM KH２PO４、０.０５％ Tween ２０、１/１０００希釈されたanti-FHRP（Perkin Elmer、horseradish peroxidase conjugated anti-fluorescent antibody）。
【０１００】
前記混合物をstreptavidinコーティングマイクロプレートウェル（Roche）に移した後、３７℃で１０分間２００rpmで反応させた。ウェル内の上澄液を除去し、PBST washing buffer（前記バインディングバッファからantibodyを除去したこと以外はバインディングバッファと同じ組成）３００mlを添加して洗浄した。洗浄後のウェルに２００ml HRP基質、３,３'５,５'-tetramethylbenzidine（Bio-Rad、TMB）を加えて５分間暗いところで発色させた後、１００ml １N H２SO４を加えて反応を停止させた。
【０１０１】
実験群と対照群の有効性判断のためにELISAリーダー（Zenyth ３４０rt）を利用して４６５nmでの吸光度値を比較した。数値の差が大きいほど有効であると判断した。
【０１０２】
その結果、図７及び図８に示したように、核酸増幅産物が存在する実験群では、アンチ-fluoresceinがコンジュゲートされたHRP（hores radish peroxidase）により、プローブのfluoresceinの蛍光が発色しないことを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明は、標的核酸を等温で迅速かつ正確に増幅する方法、及び等温で標的核酸の増幅及びプローブ信号の増幅を同時に行う核酸の検出方法を提供する。本発明によれば、従来方法のPCR方法などに比べて簡便で、汚染の危険がなく、迅速・正確に標的核酸を増幅することができ、信号プローブを同時に増幅することができるので、病原菌の検出及び確認、規定された表現型をもたらす遺伝子変更の検出、遺伝疾患や疾患に対する感受性ーの診断、遺伝子発現の評価及び様々なゲノムプロジェクトに応用されて、分子生物学的研究及び疾病診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明による核酸の等温増幅方法を示した図式である。
【図２】本発明による核酸の等温増幅の順次形態を示した図式である。
【図３】本発明による核酸及び信号プローブの同時増幅を示した図式。
【図４】本発明による核酸等温増幅方法により生成された増幅産物を電気泳動により分析した結果を示した図式である。（M：Marker；レーン１：lambda DNAを添加しないサンプル；レーン２:内部及び外部プライマーを添加しないサンプル；レーン３：内部プライマーを添加しないサンプル；レーン４：外部プライマーを添加しないサンプル；レーン６：lambda DNA、内部プライマー及び外部プライマーを添加したサンプル）。
【図５】本発明による増幅方法により生成された信号プローブの金ナノプローブの凝集反応による検出を示した図式である。
【図６】本発明による増幅方法により生成された信号プローブを金ナノプローブの凝集反応により検出して分析した結果である。
【図７】本発明による増幅方法により生成された信号プローブのHRP（horse radish peroxidase）による検出を示した図式である。
【図８】本発明による増幅方法により生成された信号プローブをHRP（horse radish peroxidase）により検出して分析した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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