(57)【要約】  本発明は、新規のスクリーニングパラダイムを使用した癌性疾患改変抗体の産生方法に関する。エンドポイントとしての癌細胞の細胞傷害性を使用した抗癌抗体の分離により、このプロセスによって治療および診断目的の抗癌抗体の産生が可能になる。抗体を、癌の病期分類および診断を補助するために使用することができ、これを使用して、原発性腫瘍および腫瘍転移を治療することができる。抗癌抗体を、毒素、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、および造血系細胞に抱合することができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体または該ヒト化抗体から産生された抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体または該キメラ抗体から産生された抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託された単離ハイブリドーマ細胞株。
【請求項５】
ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍から選択される組織サンプル中の癌性細胞の抗体誘導細胞傷害性を開始する方法であって、
該ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍由来の組織サンプルを準備する工程、
ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体、またはそのＣＤＭＡＢを準備する工程であって、該ＣＤＭＡＢが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、準備する工程、および
該単離モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそのＣＤＭＡＢを該組織サンプルと接触させる工程、
を含み、
該単離モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそのＣＤＭＡＢの該組織サンプルとの結合により、細胞傷害性が誘導される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項７】
請求項２に記載のヒト化抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項８】
請求項３に記載のキメラ抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項９】
細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的、またはレポーター部分、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーと抱合した、請求項１、請求項２、請求項３、請求項６、請求項７、または請求項８のいずれか１項に記載の単離抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項１０】
ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、哺乳動物における抗体誘導細胞傷害性に感受性を示すヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を軽減する方法であって、該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを、該哺乳動物の膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有用な量で該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項１８】
ヒト腫瘍がＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させる方法であって、該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを、該哺乳動物の膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有用な量で該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍がＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させる方法であって、該哺乳動物の膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の少なくとも１つの化学療法薬と併せて該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２６】
前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体、またはＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体によって特異的に結合するヒト腫瘍から選択される組織サンプル中の癌性細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
該ヒト腫瘍由来の組織サンプルを準備する工程、
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同一のエピトープを認識する該単離モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそのＣＤＭＡＢの少なくとも１つを準備する工程、
少なくとも１つの準備した該抗体またはそのＣＤＭＡＢを該組織サンプルと接触させる工程、および
少なくとも１つの準備した該抗体またはそのＣＤＭＡＢの該組織サンプルとの結合を決定する工程、
を含み、
該組織サンプル中の該癌性細胞の存在が示される、結合アッセイ。
【請求項３３】
ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍がＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるためのモノクローナル抗体の使用であって、該哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを該哺乳動物に投与する工程を含む、使用。
【請求項３４】
前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍がＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるためのモノクローナル抗体の使用であって、該哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の少なくとも１つの化学療法薬と併せて該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記単離モノクローナル抗体が、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項６、請求項７、請求項８、請求項１７、請求項４９、請求項５０、請求項５４、請求項５５、または請求項５６のいずれか１項に記載の抗体またはＣＤＭＡＢ、
抗体またはその抗原結合部分と細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーとの抱合体、および
必要量の薬学的に許容可能なキャリアを組み合わせて含むヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効な組成物であって、前記組成物が、該ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効である、組成物。
【請求項４８】
ヒト癌性腫瘍がＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、該ＣＤＭＡＢが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、ヒト癌性腫瘍の存在を検出するためのアッセイキットであって、該キットがＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢおよびモノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢがポリペプチドに結合するかどうかを検出するための手段、特定のカットオフレベルでの該ポリペプチドの損座剤によって該ヒト癌性腫瘍が存在すると診断される、アッセイキット。
【請求項４９】
ヒトＴＲＯＰ−２に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢであって、該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体と同一のヒトＴＲＯＰ−２のエピトープと反応し、該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが、該単離モノクローナル抗体のその標的ヒトＴＲＯＰ−２抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項５０】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同一のエピトープを認識する単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢであって、該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが、単離モノクローナル抗体のその標的エピトープへの結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項５１】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトＴＲＯＰ−２抗原の少なくとも１つのエピトープを発現するヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させるプロセスであって、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを該ヒト腫瘍を罹患している個体に投与する工程を含み、該エピトープの結合により、膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量が減少する、プロセス。
【請求項５２】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトＴＲＯＰ−２抗原の少なくとも１つのエピトープを発現するヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させるプロセスであって、少なくとも１つの化学療法薬と併せてＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを該ヒト腫瘍を罹患している個体に投与する工程を含み、該投与により腫瘍の全身腫瘍組織量が減少する、プロセス。
【請求項５３】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生された抗原結合フラグメントによって特異的に認識されるＴＲＯＰ−２を発現する細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
細胞サンプルを準備する工程、
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生された抗原結合フラグメントを準備する工程、
該単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを該細胞サンプルと接触させる工程、および
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの該細胞サンプルとの結合を決定する工程、とを含み、
該単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントによって特異的に結合されるＴＲＯＰ−２の抗原を発現する細胞の存在を決定するが決定される、結合アッセイ。
【請求項５４】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２によって産生された単離モノクローナル抗体と同一のヒトＴＲＯＰ−２のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号１、配列番号２、および配列番号３の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号４、配列番号５、および配列番号６の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域またはそのヒトＴＲＯＰ−２結合フラグメントを含む、モノクローナル抗体。
【請求項５５】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２によって産生された単離モノクローナル抗体と同一のヒトＴＲＯＰ−２のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号１、配列番号２、および配列番号３の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号４、配列番号５、および配列番号６の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ならびにヒト抗体の重鎖および軽鎖由来の可変ドメインフレームワーク領域またはヒト抗体コンセンサスフレームワークまたはそのヒトＴＲＯＰ−２結合フラグメントを含む、モノクローナル抗体。
【請求項５６】
ヒトＴＲＯＰ−２に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列またはそのヒトＴＲＯＰ−２結合フラグメントを含む、モノクローナル抗体。
【請求項５７】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生された抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗原を発現する、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療によって生存を延長し、疾患の進行を遅延させる方法であって、哺乳動物の腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の該モノクローナル抗体を該哺乳動物に投与し、それにより、疾患の進行が遅延し、生存が延長される工程を含む、方法。
【請求項５８】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生されたＴＲＯＰ−２結合フラグメントに特異的に結合するＴＲＯＰ−２を発現する、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療によって生存を延長し、疾患の進行を遅延させる方法であって、哺乳動物の腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の該モノクローナル抗体を該哺乳動物に投与し、それにより、疾患の進行が遅延し、生存が延長される工程を含む、方法。
【請求項５９】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項６、請求項７、請求項８、請求項１７、請求項４９、請求項５０、請求項５４、請求項５５、または請求項５６のいずれか１項に記載の抗体またはＣＤＭＡＢおよび
必要量の薬学的に許容可能なキャリア
を併せて含むヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効な組成物であって、該組成物が、該ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効である、組成物。
【請求項６０】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項６、請求項７、請求項８、請求項１７、請求項４９、請求項５０、請求項５４、請求項５５、または請求項５６のいずれか１項に記載の抗体またはＣＤＭＡＢと細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーとの抱合体、および
必要量の薬学的に許容可能なキャリア
を組み合わせて含むヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効な組成物であって、
該組成物がヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌性疾患改変抗体（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ＣＤＭＡＢ）の単離および産生ならびに任意選択的に１つまたは複数の化学療法薬と組み合わせた治療および診断プロセスにおけるＣＤＭＡＢの使用に関する。本発明は、さらに、本発明のＣＤＭＡＢを使用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＯＰ−２は、ほとんどの癌腫およびいくつかの正常なヒト組織上に発現する細胞表面糖タンパク質である。これは、ヒト栄養胚葉細胞上の抗原を認識したヒト絨毛癌細胞株ＢｅＷｏに対して惹起した２つのマウスモノクローナル抗体によって認識される分子として最初に定義された（Ｆａｕｌｋ  １９７８）。この分子は、他の研究者らによって独立して発見されており、この抗原を記載するのに多数の名称が与えられている。したがって、ＴＲＯＰ−２は、ＧＡ７３３−１および上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−Ｉ）とも呼ばれていた（Ｂａｓｕ  １９９５，Ｆｏｒｎａｒｏ  １９９５）。
【０００３】
ＴＲＯＰ−２遺伝子は、ＲＮＡ中間体を介した相同遺伝子ＧＡ７３３−２（上皮糖タンパク質−２、ＥｐＣＡＭ、およびＴｒｏｐ−１としても公知）の後位によって形成されたと考えられる無イントロン遺伝子である。ＴＲＯＰ−２遺伝子は、染色体Ｉｐ３２にマッピングされている（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ２００１）。ＴＲＯＰ−２のタンパク質成分の分子量は、約３５キロダルトンである。その分子量は、細胞外ドメインの不均一なＮ結合型グリコシル化によって１１〜１３キロダルトン増加し得る。細胞外ドメイン中に多数のシステイン残基が存在し、これにより、ジスルフィド架橋部位を形成することができる。ＴＲＯＰ−２は、タンパク質キナーゼＣ（Ｃａ２＋依存性タンパク質キナーゼ）の基質であり、細胞内セリン３０３残基をリン酸化することが示されている（Ｂａｓｕ  １９９５）。細胞質Ｃａ２＋の上昇によって認められるように、ＴＲＯＰ−２の抗ＴＲＯＰ−２抗体との架橋によってカルシウムシグナルを伝達することも示されている（Ｒｉｐａｎｉ  １９９８）。これらのデータはＴＲＯＰ−２の生理学的機能としてのシグナル伝達を支持するにもかかわらず、今日まで、生理学的リガンドは同定されていない。ｃＤＮＡマイクロアレイテクノロジーを使用した大規模遺伝子発現分析において、ＴＲＯＰ−２が卵巣上皮と比較して漿液卵巣乳頭状癌で最も高く過剰発現することが報告された遺伝子群のメンバーとして同定されたので、最近、ＴＲＯＰ−２発現と癌との間の関連が示されている（Ｓａｎｔｉｎ  ２００４）。
【０００４】
ＴＲＯＰ−２の発現プロフィールは、多数の異なるＴＲＯＰ−２抗体を使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）およびフローサイトメトリー研究によって解明されている。抗ＴＲＯＰ−２抗体１６２−２５．３および１６２−４６．２は、ヒト絨毛癌細胞株ＢｅＷｏでのマウスの免疫化によって産生され、一連の腫瘍およびリンパ細胞株および末梢血単核球に対するその反応性について調査された。この研究では、両抗体は栄養胚葉特異的なようである一方で（試験した４つの絨毛癌細胞株のうちで３つが染色した）、他のリンパ細胞株または腫瘍細胞株（線維肉腫、頸部肉腫、結腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、赤白血病に相当する）は、直接免疫蛍光ＦＡＣＳアッセイで染色されなかった。さらに、正常な末梢血細胞は染色されなかった。抗体を、ホルマリン固定パラフィン包埋胎盤組織切片および肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、およびリンパ節組織の正常な凍結切片の染色について試験した。胎盤組織切片が両抗体で染色される一方で、他の正常組織は染色されなかった（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  １９８１）。これら２つの抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断研究での使用について厳格に報告されている。
【０００５】
抗ＴＲＯＰ−２抗体ＭＯｖ１６を、不十分に分化した卵巣癌ＯｖＣａ４３４３／８３の粗膜調製物でのマウスの免疫化によって生成した。ＭＯｖ１６を、良性および悪性卵巣腫瘍の凍結組織切片に対する反応について試験した。ＭＯｖ１６は、５４個の悪性卵巣腫瘍のうちの３１個および１６個の良性卵巣腫瘍のうちの２個と反応した。試験した５個の粘液性卵巣腫瘍のうち、ＭＯｖ１６は完全に非反応性を示した。ＭＯｖ１６を、一連の凍結非卵巣悪性腫瘍に対する反応性についても試験し、１８９個の乳癌切片のうちの１１７個および１８個の肺癌切片のうちの１２個に結合することが見出された。ＭＯｖ１６は、試験した１６個の非上皮腫瘍（脂肪肉縮、軟骨肉腫、内皮腫、組織球腫、および未分化胚細胞腫が含まれる）で完全に非反応性を示した。凍結正常組織切片に対して試験した場合、ＭＯｖ−１６は、乳房、膵臓、腎臓、および前立腺の切片と反応した。使用した組織切片数は報告されていないが、ＭＯｖ１６反応性は、肺、脾臓、皮膚、卵巣、胸腺、耳下腺、胃、喉頭、子宮、および結腸の切片に対して陰性であると報告されている。著者は、ＭＯｖ１６がパラフィン包埋組織に非反応性を示したので、凍結組織切片を使用したと言及していた（Ｍｉｏｔｔｉ  １９８７）。この抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断研究での使用についてしか報告されていなかった。
【０００６】
抗ＴＲＯＰ−２抗体Ｒｓ７−３Ｇ１１（ＲＳ７）を、外科的に摘出した肺のヒト原発性扁平上皮癌由来の粗膜調製物でのマウスの免疫化によって生成した。ＩＨＣを使用して、ヒトの腫瘍組織および正常組織の凍結切片に対するＲＳ７染色を試験した。ＲＳ７は、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、および扁平上皮癌に相当する４０個の切片のうちの３３個に結合した。正常組織のうち、ＲＳ７は、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、および前立腺の２０個の組織切片のうち１６個に結合した一方で、５個の脾臓組織切片は染色されなかった。この研究では、著者は、腫瘍中の抗原密度は正常な上皮組織よりも高いようであると言及していた（Ｓｔｅｉｎ  １９９０）。
【０００７】
腫瘍組織および正常組織の両方に対してさらなるＲＳ７の組織特異性研究を行った。ＲＳ７を、凍結腫瘍切片のパネルに対して試験し、肺、胃、腎臓、膀胱、結腸、乳房、卵巣、子宮、および前立腺に相当する７７個の切片の６５個に結合した。試験した５つのリンパ腫に結合しなかった。ＲＳ７を、全部で２４の組織型から構成される８５個の凍結ヒト正常組織切片のパネルに対して試験した。１３種の正常組織（肺、気管支、気管、食道、結腸、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、皮膚、甲状腺、乳房、および前立腺）の３９個の切片は、ＲＳ７によって染色された。この研究の著者は、陽性染色が認められた組織おいて、反応性は、一般に、上皮細胞、特に管および腺に制限されると言及していた。ＲＳ７がホルマリン固定パラフィン包埋切片に反応性を示さなかったので、この研究が凍結切片に制限されるとも言及していた（Ｓｔｅｉｎ  １９９３）。
【０００８】
ポリクローナルＴＲＯＰ−２抗体を、ヒトＴＲＯＰ−２の細胞質ドメインの１６９と１８２との間のアミノ酸位置に対応する合成ペプチドでのマウスの免疫化によって調製した。ポリクローナル抗体を、ホルマリン固定ヒト食道過形成および癌腫組織を含んだ組織アレイスライドに対して試験した。５５個の癌腫検体のうちの１０個は、ポリクローナル抗体での強い染色を示した一方で、軽度過形成組織は非常に弱く染色され、発現レベルが悪性形質転換に関連し得ることを示している（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ２００４）。
【０００９】
概して、異なる抗ＴＲＯＰ−２抗体を使用して得たＩＨＣ反応パターンは一貫していた。癌における発現は主に癌腫で見出され、ほとんどの癌腫が反応性を示した。正常組織では、発現は上皮起源の細胞に限定されるようであり、癌腫の染色が対応する正常な上皮組織の染色よりも強いといういくつかの証拠が存在した。
【００１０】
ＩＨＣ研究での使用に加えて、抗体ＲＳ７を、ヌードマウス異種移植片モデルにおける腫瘍標的化研究からなる最初の実験のｉｎｖｉｖｏモデルで試験した。ｉ．ｖ．注射した放射性標識ＲＳ７は、Ｃａｌｕ−３（肺腺癌）またはＧＷ−３９（結腸癌）腫瘍のいずれかを保有するマウスの腫瘍中に特異的に蓄積することが示された（Ｓｔｅｉｎ  １９９０）。異種移植片系における放射性標識ＲＳ７の生体分布を調査し、免疫抱合体としてのＲＳ７の治療可能性を研究するためにさらなる研究を行った。この研究では、Ｃａｌｕ−３ヒト肺腺癌異種移植片を保有するヌードマウスにおける１３１Ｉ標識ＲＳ７Ｆ（ａｂ’）２の治療有効性を調査した。Ｃａｌｕ−３細胞とのマウスの３週間のインキュベーション後、腫瘍サイズが約０．３〜０．９グラムに到達した場合、６〜７匹のマウスからなる群を、１．０ｍＣｉの１３１Ｉ−ＲＳ７−Ｆ（ａｂ’）２または１．５ｍＣｉの１３１Ｉ−ＲＳ７−Ｆ（ａｂ’）２のいずれかのｉ．ｖ．での単回投与で処置し、類似の非処置コントロールマウス群と比較した。１．０ｍＣｉの１３１Ｉ−ＲＳ７−Ｆ（ａｂ’）２の単回投与により、約５週間にわたって腫瘍成長が抑制された一方で、１．５ｍＣｉの１３１Ｉ−ＲＳ７−Ｆ（ａｂ’）２の単回投与によって腫瘍成長が抑制され、平均腫瘍サイズは、放射性抗体の注射から８週間まで処置前のサイズを超えなかった。１．５ｍＣｉの１３１Ｉ−ＲＳ７−Ｆ（ａｂ’）２を投与したマウスは平均１８．７％の体重減少を経験し、これは、処置に関連する毒性の存在を示していた。この研究では、裸のＲＳ７またはＲＳ７のＦ（ａｂ’）２フラグメントでの処置の影響は試験していなかった（Ｓｔｅｉｎ  １９９４ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌異種移植片モデルにおける１３１Ｉ−ＲＳ７の影響を試験するために別の研究を行った。約０．１ｃｍ３のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を保有する１０匹のマウスからなる群を、２５０μＣｉの１３１Ｉ−ＲＳ７または２５０マイクロＣｉの１３１Ｉ−Ａｇ８（アイソタイプ適合コントロール抗体）のいずれかの単回ｉ．ｖ．投与を使用して処置した。６匹の群を、３０μｍの非標識ＲＳ７またはＡｇ８のいずれかの単回ｉ．ｖ．投与を使用して処置した。１３１Ｉ−ＲＳ７で処置した動物で腫瘍の完全な退行が認められ（腫瘍が一過性に再発した１匹の動物を除く）、この退行が１１週間の観察期間にわたって持続した。腫瘍退行は、１３１Ｉ−Ａｇ８処置マウスでも認められたが、２週間と５週間との間のみで認められ、残りの研究期間は腫瘍成長の継続または持続のいずれかが認められた。非標識ＲＳ７またはＡｇ８を投与したマウスの腫瘍成長は阻害されず、Ａｇ８処置マウスと比較してＲＳ７処置マウスの平均腫瘍体積にいかなる相違も認められなかった。約０．２〜０．３ｃｍ３のより大きなＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を保有する１０匹のマウスからなる２つのさらなる群を、わずかにより多い用量の２７５μＣｉの１３１Ｉ−Ｒｓ７または２７５μＣｉの１３１Ｉ  Ａｇ８のいずれかで処置し、類似の非処置マウス群と比較した。腫瘍体積を、毎週１５週間測定した。この場合に非処置マウスと比較して１３１Ｉ−ＲＳ７処置マウスの間で腫瘍成長の有意差が存在したにもかかわらず、１３���Ｉ−ＲＳ７処置マウスの腫瘍成長は１３１Ｉ−Ａｇ８処置マウスと比較して有意差はなかった。これは、有効性の一部が、照射の非特異的影響に起因し得ることを示していた。０．２〜０．３ｃｍ３の腫瘍を含むマウスにおいて非標識抗体は試験されなかった（Ｓｈｉｈ  １９９５）。
【００１１】
放射免疫療法に最適な放射性標識を選択するための免疫抱合体としてのＲＳ７の有効性を試験するさらなる多数の研究が存在している（Ｓｔｅｉｎ  ２００１ａ，Ｓｔｅｉｎ  ２００１ｂ，Ｓｔｅｉｎ  ２００３）。ＲＳ７のヒト化バージョンも生成されているが、前臨床異種移植片モデルにおいて放射性抱合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）として試験されているだけである（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ２００４）。これらの研究は、ＲＳ７を使用した前に記載の研究と類似の好ましい効果を示すが、ある研究では、放射性標識ＲＳ７を前に決定した最大耐量で送達させた場合でさえ、毒性を生じ、死至るマウスもあった（Ｓｔｅｉｎ  ２００１ａ）。これらの研究においてマウスにおける異種移植片腫瘍の有効な処置を放射性標識ＲＳ７を使用して達成されたにもかかわらず、裸のＲＳ７は評価されていなかった。
【００１２】
ノイラミニダーゼ前処置Ｈ３９２２ヒト乳癌細胞でのマウスの免疫化により、抗ＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体ＢＲ１１０が産生された（米国特許第５，８５０，８５４号に開示されており、その先行特許の項を参照のこと）。免疫組織学により、ヒト凍結組織検体を使用して、ＢＲ１１０は、広範なヒト癌腫検体（肺、結腸、乳房、卵巣、腎臓、食道、膵臓、皮膚、肺、および扁桃腺の癌腫検体が含まれる）に反応することが示された。ヒト組織切片を試験していなかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、ＢＲ１１０がヒト癌腫細胞株Ｈ３３９６またはＨ３９２２に対してＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を持たないことが証明された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、ヒト癌細胞株Ｈ３６１９、Ｈ２９８７、ＭＣＦ−７、Ｈ３３９６、およびＨ２９８１に対するＢＲ１１０−免疫毒素の細胞傷害性を分析した。試験した細胞株のＥＣ５０は、それぞれ、０．０６、０．００１、０．０５、０．０９、および＞５μｇ／ｍＬであった。裸のＢＲ１１０抗体についての細胞傷害性データは開示されていなかった。裸のＢＲ１１０または免疫抱合ＢＲ１１０についてのｉｎ  ｖｉｖｏデータは開示されていなかった。
【００１３】
卵巣癌細胞化物Ｃｏｌｏ３１６でのマウスの免疫化から生成されたＴＲＯＰ−２を標的にする多数のさらなる抗体（ＭＲ５４、ＭＲ６、およびＭＲ２３など）（Ｓｔｅｉｎ  １９９４ｂ）およびＴ２４膀胱癌細胞株でのマウスの免疫化によって生成された抗体Ｔ１６（Ｆｒａｄｅｔ  １９８４）が生成されている。これらの抗体の使用は、ＴＲＯＰ−２抗原の生化学的特徴づけおよび組織発現研究に制限されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの抗体の抗癌有効性についての報告は存在していない。ＲＳ７は、前臨床癌モデルにおける治療有効性について試験された唯一の抗体であり、その使用は放射性同位体のキャリアに制限されていた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける前臨床癌モデルにおいて治療有効性を示すいかなる裸のＴＲＯＰ−２抗体も報告されていない。
【００１４】
癌療法としてのモノクローナル抗体：癌を示す各個体は固有のものであり、人によって異なる癌を有する。このことにもかかわらず、現在の治療法は、同一の病期の同一の癌型を有する全ての患者を同一の方法で治療している。これらの患者の少なくとも３０％は、一次治療に失敗し、それによってさらなる一連の治療を行い、治療失敗、転移、最終的には死亡の確率が増加するであろう。優れた治療法は、特定の個体のための個別化療法（ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ）であろう。個別化に順応できる現在唯一の治療法は、手術である。化学療法および放射線治療は、患者に合わせることができず、多くの場合、手術のみでは治癒には不十分である。
【００１５】
モノクローナル抗体の出現で、各抗体を１つのエピトープに指向することができるので、個別化療法のための方法を開発できる可能性がより現実的になった。さらに、特定の個体の腫瘍を独自に定義する種々のエピトープに指向する抗体の組み合わせを産生することが可能である。
【００１６】
癌性細胞が形質転換細胞に特異的な抗原を含むことが癌性細胞と正常細胞との間の有意差であると認識されているので、これらの癌抗原への特異的結合によって形質転換細胞を特異的に標的にするようにモノクローナル抗体をデザインすることができると科学界で長きにわたって考えられれおり、それ故に、モノクローナル抗体が癌細胞を排除するための「特効薬」としての役立つと信じられている。しかし、現在、単一のモノクローナル抗体が全ての癌の症例で役立つことはできず、モノクローナル抗体を、クラスとして（標的癌治療として）位置づけることができると広く認識されている。ここに開示の発明の教示にしたがって単離したモノクローナル抗体は、例えば、腫瘍の全身腫瘍組織量の減少によって患者に有利な様式で癌性疾患過程を改変することが示されており、これを、本明細書中で、癌性疾患改変抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌抗体」と様々にいう。
【００１７】
現在のところ、癌患者は、通常、治療の選択肢はほとんどない。癌療法への厳格に管理されたアプローチにより、総生存率および総罹患率を改善している。しかし、特定の個体に対しては、この改善された統計値は、必ずしもその個別の状況の改善と相関しない。
【００１８】
したがって、同一コホートの他の患者とは無関係に各腫瘍を施術者が治療することができた方法を考え出した場合、これにより、個別化療法の固有のアプローチを一人一人の患者に合わせられるであろう。かかる一連の治療法は、理想的には、治癒率を増大させ、より良い結果が得られ、それによって長い間の切実な要求が満たされるであろう。
【００１９】
組織学的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌治療における成果は限定的である。リンパ腫および白血病はヒト血漿を使用して治療されているが、緩和または応答はほとんど延長されなかった。さらに、再現性を欠き、化学療法と比較してさらなる利点は得られなかった。乳癌、黒色腫、および腎細胞癌などの固形腫瘍は、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、およびウマ血清でも治療されており、同様に、予想不可能であり、且つ無益な結果が得られている。
【００２０】
固形腫瘍についてのモノクローナル抗体の臨床試験が多数行われている。１９８０年代に、ヒト乳癌についての少なくとも４つの臨床試験が行われ、この試験により、特異的抗原に対する抗体を使用するか、組織選択性に基づいて、少なくとも４７人の患者からたった１人しか反応者が得られなかった。１９９８年になって初めて、シスプラチンと組み合わせたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ハーセプチン（登録商標））を使用して首尾よく臨床試験が行われた。この試験では、３７人の患者を反応について評価し、その約１／４が部分的な反応率を有し、さらなる１／４がわずかまたは安定に疾患が進行した。反応者の進行時間の中央値は、８．４ヶ月であり、反応持続時時間の中央値は５．３ヶ月であった。
【００２１】
ハーセプチン（登録商標）は、タキソール（登録商標）と組み合わせた初回使用について１９９８年に承認された。臨床試験の結果は、タキソール（登録商標）のみを投与した群（３．０ヶ月）と比較した抗体療法＋タキソール（登録商標）を投与した患者の疾患進行期間の中央値の増加（６．９ヶ月）を示した。生存期間の中央値もわずかに増大した：タキソール（登録商標）治療のみの治療群の１８ヶ月に対して、ハーセプチン（登録商標）＋タキソール（登録商標）治療を行った治療群の２２ヶ月。さらに、タキソール（登録商標）のみと比較した抗体＋タキソール（登録商標）の組み合わせ群において完全な反応者（２人に対して８人）および部分的反応者（１５人に対して３４人）の両方の数が増加した。しかし、ハーセプチン（登録商標）およびタキソール（登録商標）を使用した治療は、タキソール（治療）治療のみと比較して、心臓毒性の発生率がより高くなった（ぞれぞれ、１％に対して１３％）。また、ハーセプチン（登録商標）療法は、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）（現在、機能的または生物学的に重要なリガンドか知られていない受容体）を過剰発現する（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によって決定した場合）患者（転移性乳癌患者の約２５％）にのみ有効であった。したがって、乳癌患者の要求の多くは依然として満たされていない。ハーセプチン（登録商標）治療から恩恵を受けることができる患者でさえ、依然として化学療法が必要であり、その結果、少なくともいくらかの程度で、この種の治療の副作用に対処しなければならないであろう。
【００２２】
結腸直腸癌を調査する臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質標的に対する抗体を含む。腺癌に対していくらかの特異性を有する１７−１Ａなどの抗体に対して６０人超における第二相臨床試験を行い、たった１人しか部分的反応を示さなかった。他の試験では、１７−１Ａの使用により、さらなるシクロホスファミドを使用したプロトコールにおいて、５２人の患者のうちでわずかに１人が完全に反応し、２人で小さな反応が認められた。今まで、１７−１Ａの第ＩＩＩ相臨床試験では、第ＩＩＩ期結腸癌のアジュバント療法として有効性を改善しなかった。画像化について最初に承認されたヒト化マウスモノクローナル抗体も、腫瘍を退行しなかった。
【００２３】
ごく最近になって、モノクローナル抗体を使用した結腸直腸癌臨床研究から任意の肯定的な結果が得られた。２００４年に、エルビタックス（登録商標）は、イリノテカンベースの化学療法が無効なＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌患者の二次治療として承認された。２治療群を使用した第ＩＩ相臨床研究および単一治療群を使用した研究の両方由来の結果は、イリノテカンと組み合わせたエルビタックス（登録商標）の反応率がそれぞれ２３％および１５％であり、疾患進行の中央値がそれぞれ４．１ヶ月および６．５ヶ月であることを示した。同一の２治療群を使用した第ＩＩ相臨床研究および別の単一治療群を使用した研究由来の結果は、エルビタックス（登録商標）のみでの治療によって反応率がそれぞれ１１％および９％であり、疾患進行の中央値がそれぞれ１．５ヶ月および４．２ヶ月であることを示した。
【００２４】
その結果として、スイスおよび米国の両方におけるイリノテカンと組み合わせたエルビタックス（登録商標）治療ならびに米国におけるエルビタックス（登録商標）のみの治療は、初回イリノテカン両方を失敗した結腸癌患者の二次治療として承認されている。したがって、ハーセプチン（登録商標）のように、スイスにおける治療は、モノクローナル抗体と化学療法との組み合わせとしてのみ承認されている。さらに、スイスおよび米国での治療は、患者の二次治療としてのみ承認されている。また、２００４年に、アバスチン（登録商標）は、転移性結腸直腸癌の初回治療として静脈内５−フルオロウラシルベースの化学療法と組み合わせた使用について承認された。第ＩＩＩ相臨床試験の結果は、５−フルオロウラシルのみで治療した患者と比較して、アバスチン（登録商標）＋５−フルオロウラシルで治療した患者の生存の中央値が延長（ぞれそれ、１６ヶ月に対して２０ヶ月）されたことを証明した。しかし、ハーセプチン（登録商標）およびエルビタックス（登録商標）のように、治療は、モノクローナル抗体と化学療法との組み合わせとしてのみ承認されている。
【００２５】
肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および胃癌についての結果も依然として芳しくない。非小細胞肺癌についての最も有望な最近の結果は第ＩＩ相臨床試験に由来し、この治療は化学療法薬であるタキソテール（登録商標）と組み合わせた細胞死滅薬であるドキソルビシンに抱合したモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ）を含む。タキソテール（登録商標）は、肺癌の二次治療のための唯一のＦＤＡ承認化学療法薬である。初期データは、タキソテール（登録商標）のみと比較した全生存率の改善を示す。本研究のために採用した６２人の患者のうち、２／３にタキソテール（登録商標）と組み合わせたＳＧＮ−１５を投与する一方で、残りの１／３にタキソテール（登録商標）のみを投与した。タキソテール（登録商標）のみを投与した患者の５．９ヶ月と比較して、タキソテール（登録商標）と組み合わせたＳＧＮ−１５を投与した患者について、全生存の中央値は７．３ヶ月であった。１年および１８ヶ月での全生存は、タキソテール（登録商標）のみを投与した患者についてのそれぞれ２４％および８％と比較して、ＳＮＧ−１５＋タキソテール（登録商標）を投与した患者についてはそれぞれ２９％および１８％であった。さらなる臨床試験を計画している。
【００２６】
前臨床的に、黒色腫に対するモノクローナル抗体の使用である程度の成果がいくつかあげられている。これらの抗体で臨床試験に到達したものはほとんどなく、今日まで、第ＩＩＩ相臨床試験で好ましい結果が承認も証明もされていない。
【００２７】
疾患を治療する新規の薬物は、疾患の病理発生に寄与し得る３０，０００種の公知の遺伝子産物のうちで関連標的の同定不足によってその発見が妨げられている。腫瘍学研究では、潜在的な薬物標的は、腫瘍細胞中に過剰発現されるという事実のために、しばしば簡潔に選択される。このようにして同定された標的を、多数の化合物との相互作用についてスクリーニングする。潜在的な抗体療法の場合、これらの候補化合物は、通常、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって定められた原理に従ったモノクローナル抗体の伝統的生成方法に由来する（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）。脾臓細胞を、抗原（例えば、全血、細胞画分、精製抗原）で免疫化したマウスから回収し、免疫化したハイブリドーマパートナーと融合する。得られたハイブリドーマをスクリーニングし、標的に最も強く結合する抗体の分泌について選択する。癌細胞に指向する多数の治療および診断抗体（ハーセプチン（登録商標）およびリツキシマブが含まれる）を、これらの方法を使用して産生し、その親和性に基づいて選択されている。このストラテジーの欠点は、２つある。第１に、治療抗体または診断抗体の結合のための適切な標的の選択が、組織特異的発癌過程周辺の知識不足およびこの知識不足によるこれらの標的を同定する過度に単純化した方法（過剰発現による選択など）のために制限される。第２に、最も高い親和性で受容体に結合する薬物分子が、通常は、シグナルを開始または阻害する可能性が最も高いという仮定は、常に正しいというわけではないかもしれない。
【００２８】
乳癌および結腸癌の治療がいくらか進歩しているにもかかわらず、単剤両方または同時治療のいずれかとしての有効な抗体療法の同定および開発は、全ての癌型に不適切であった。
【００２９】
先行特許：特許文献１は、患者の腫瘍由来の細胞をＭＨＣ遺伝子でトランスフェクションし、これを患者の細胞または組織からクローニングすることができる過程を開示する。次いで、これらのトランスフェクションされた細胞を使用して、患者にワクチン接種する。
【００３０】
特許文献２は、哺乳動物の新生物細胞および星状細胞の内部細胞成分に特異的であるが、外部成分には特異的ではないモノクローナル抗体を得る工程、モノクローナル抗体を標識する工程、標識された抗体を新生物細胞を死滅させる治療を受けた哺乳動物の組織と接触させる工程、および新生物細胞を分解する内部細胞成分への標識抗体の結合の測定によって治療法の有効性を決定する工程を含む過程を開示する。ヒト細胞内抗原に指向する抗体の調製では、特許権者は、悪性細胞がかかる抗原の都合の良い供給源であることを認識している。
【００３１】
特許文献３は、新規の抗体およびその産生方法を提供している。具体的には、本特許は、ヒト腫瘍（例えば、結腸および肺の腫瘍）に関連するタンパク質抗原に強く結合する一方で、正常な細胞にははるかに弱く結合する性質を有するモノクローナル抗体の形成を教示している。
【００３２】
特許文献４は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に取り出す工程、癌組織を処置して腫瘍組織を得る工程、腫瘍細胞を照射して、生存可能であるが非腫瘍化する工程、およびこれらの細胞を使用して原発性腫瘍の再発を阻害すると同時に転移を阻害することができる患者用のワクチンを調製する工程を含む癌の治療方法を提供する。本特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応性を示すモノクローナル抗体の開発を教示している。第４段落４５行目（以下を参照のこと）に記載のように、特許権者は、ヒト新形成における有効な特異的免疫療法薬を発現するモノクローナル抗体の開発において原発性腫瘍細胞を使用している。
【００３３】
特許文献５は、ヒト癌腫に特徴的であるが、起源となる上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示している。
【００３４】
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞中でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体、この抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、この抗体を使用した癌の治療方法、およびこの抗体を含む薬学的組成物を示す。
【００３５】
特許文献７は、腫瘍または非腫瘍組織供給源から精製したムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生のための新規のハイブリドーマ細胞株を記載している。
【００３６】
特許文献８は、所望の抗原に特異的な抗体を産生する非とリンパ球の生成方法、モノクローナル抗体の産生方法、およびこの方法によって産生されたモノクローナル抗体を示す。本特許は、特に、癌の診断および治療に有用な抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生を示す。
【００３７】
特許文献９は、ヒト癌腫細胞と反応性を示す抗体、抗体フラグメント、抗体抱合体、および短鎖免疫毒素に関する。分子がヒト癌腫表面上に存在する細胞膜抗原と反応性を示し、さらに、抗体が癌腫細胞内で内在化し、抗体−薬物抱合体および抗体−毒素抱合体を形成させる能力を有するという点で、これらの抗体が機能する機構は二要素からなる。その非修飾形態では、抗体はまた、特定の濃度で細胞傷害性を示す。
【００３８】
特許文献１０は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、高齢の哺乳動物由来の抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見出される１つの天然抗体型であると言われる。自己抗体が「高齢哺乳動物」に由来するので、自己抗体が実際に治療を受ける患者に由来する必要はない。さらに、本特許は、高齢哺乳動物由来の天然およびモノクローナル抗核自己抗体およびモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示する。
【００３９】
特許文献１１は、ＧＡ７３３−１に指向する特異的抗体ＢＲ１１０を開示している。この特許は、免疫毒素抱合体としてのＢＲ１１０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を開示している。裸の抗体としてのこの抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能は開示していなかった。この抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ機能も開示していなかった。
【００４０】
特許文献１２は、抗原（ＥＧＰ−Ｉが含まれるが、これらに限定されない）の宿主に指向する免疫毒素抱合抗体（ＲＳ７が含まれるが、これらに限定されない）を特許請求の範囲に記載している。免疫毒素は、リボ核酸分解活性を有する免疫毒素に制限される。しかし、実施例は、ＣＤ２２に指向する特異的免疫毒素抱合抗体ＬＬ２のみを開示している。この出願では、ＲＳ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能またはｉｎ  ｖｉｖｏ機能を開示していなかった。
【００４１】
特許文献１３は、ＥＧＰ−Ｉに対して指向する特異的抗体ＲＳ７を開示している。この出願は、放射性標識抱合体としてのＲＳ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を開示している。裸の抗体としてのこの抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能は開示していなかった。この出願は、放射性標識抱合体および非標識抱合体の連続投与に起因するＲＳ７のｉｎ  ｖｉｖｏ機能を開示している。しかし、この研究は、１人の患者に制限され、任意の認められた機能が非標識抗体に起因するかどうかは知られていない。裸の抗体の投与に起因するＲＳ７のｉｎ  ｖｉｖｏ機能は存在しなかった。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号
【特許文献１１】米国特許第５，８５０，８５４号
【特許文献１２】米国特許第６，６５３，１０４号
【特許文献１３】米国特許出願番号２００４０００１８２５Ａ１号
【発明の開示】
【００４２】
本願は、癌性疾患改変モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための米国特許第６，１８０，３５７号に教示の患者特異的抗癌抗体の産生方法を使用する。これらの抗体を、１つの腫瘍のために特異的に作製することができ、それにより、癌療法の個別化が可能となる。本願の文脈内で、細胞死滅（細胞傷害性）または細胞成長阻害（細胞増殖抑制性）特性のいずれかを有する抗癌抗体を、以後、細胞毒性という。これらの抗体を、癌の病期分類および診断を補助するために使用することができ、これを使用して、腫瘍転移を治療することができる。これらの抗体を、予防治療による癌防止のために使用する個ともできる。伝統的な創薬パラダイムにしたがって生成した抗体と異なり、この方法で生成した抗体は、悪性組織の成長および／または生存に不可欠であることが以前に示されていない分子および経路を標的にすることができる。さらに、これらの抗体の結合親和性は、より強い親和性の相互作用に従い得る細胞傷害事象の開始要件に合わせられる。また、標準的な化学治療様式（例えば、放射性核種）を本発明のＣＤＭＡＢと抱合し、それにより、前述の化学療法の使用を集中させることは、本発明の範囲内である。ＣＤＭＡＢを、毒素、細胞傷害性部分、酵素（例えば、ビオチン抱合酵素）、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、または造血系細胞に抱合し、それにより、抗体抱合体を形成することもできる。ＣＤＭＡＢを、単独で使用するか、１つまたは複数のＣＤＭＡＢ／化学療法薬と組み合わせて使用することができる。
【００４３】
個別化抗癌治療が見込まれると、患者の管理方法が変化する。有望な臨床的シナリオは、腫瘍サンプルを提示時に得て、保存することである。このサンプルから、腫瘍を、既存の癌性疾患改変抗体のパネルから分類することができる。患者を慣習的に病期分類するが、利用可能な抗体を、患者のさらなる病期分類に利用することができる。患者を即座に既存の抗体で処置し、腫瘍に特異的な抗体のパネルを、本明細書中で概説した方法を使用するか本明細書中に開示したスクリーニング方法と併せたファージディスプレイライブラリーの使用して産生することができる。他の腫瘍が処置されるエピトープと同一のいくつかのエピトープを保有し得る可能性があるので、生成された全ての抗体を、抗癌抗体のライブラリーに添加する。本方法によって産生された抗体を使用して、これらの抗体に結合する癌を有する多数の患者の癌性疾患を治療するのに有用であり得る。
【００４４】
抗癌抗体に加えて、多様な治療計画の一部として現在推奨されている治療法を受けるために患者を選択することができる。本発明の方法によって単離した抗体が非癌性細胞に対して比較して非毒性を示すという事実により、高用量で使用される抗体と組み合わせるか、単独か、従来の治療法と併せて使用することが可能である。治療指数が高いことにより、短い時間的尺度で再治療することも可能であり、それにより、治療耐性細胞が出現する可能性が減少するはずである。
【００４５】
患者が初期治療では効果がないか、転移している場合、再治療のために腫瘍に対する特異的抗体の生成過程を繰り返すことができる。さらに、抗癌抗体を、患者から得た赤血球に抱合し、転移治療のために再注入することができる。転移性癌の有効な治療はほとんどなく、通常、転移は死に至る悪い結果の前兆となる。しかし、転移性癌は、通常、十分に脈管形成されており、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位に抗体を濃縮する効果があり得る。転移前でさえも、ほとんどの癌細胞は、その生存のために宿主の血液の供給に依存しており、赤血球に抱合した抗癌抗体はｉｎ  ｓｉｔｕ腫瘍に対しても有効であり得る。あるいは、抗体を、他の造血細胞（リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞など）に抱合することができる。
【００４６】
５つの抗体クラスが存在し、それぞれ、その重鎖によって授与される機能に関連する。一般に、裸の抗体による癌細胞の死滅は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のいずれかによって媒介される。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分の結合およびそれによる古典的補体活性化経路の活性化によってヒト補体を活性化し、それにより、腫瘍を溶解することができる。ヒト抗体について、最も有効な補体活性化抗体は、一般に、ＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、Ｆｃ受容体を有する細胞傷害性細胞を動員し、それにより、単球、マクロファージ、顆粒球、および一定のリンパ球によって細胞を死滅させるのに有効である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプの両方のヒト抗体は、ＡＤＣＣを媒介する。
【００４７】
Ｆｃ領域によって媒介される細胞傷害性には、エフェクター細胞、その対応する受容体、またはタンパク質（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、および補体）が存在することが必要である。これらのエフェクター機構の非存在下では、抗体のＦｃ部分は不活性である。抗体のＦｃ部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の薬物動態学に影響を与える性質を付与することができるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではこれを作動しない。
【００４８】
抗体を試験する細胞傷害性アッセイには、いかなるエフェクター機構も存在せず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。これらのアッセイには、エフェクター細胞（ＮＫ、マクロファージ、またはＴ細胞）または補体が存在しない。これらのアッセイが、共に何を付加するかによって完全に定義されるので、各成分を特徴づけることができる。本明細書中で使用したアッセイは、標的細胞、培地、および血清のみを含む。標的細胞は、癌細胞または線維芽細胞であるので、エフェクター機能を持たない。エフェクター機能特性を持つ外因性細胞を使用しないので、この機能を有する細胞要素が存在しない。培地は、補体やいかなる細胞も含まない。標的細胞の成長を支持するために使用した血清は、補体活性を持たないことが供給元によって開示されている。さらに、本発明者らの研究室では、使用した血清中に補体活性が存在しないことを立証している。したがって、本発明者らの研究は、抗体の影響がＦａｂによって媒介される抗原結合の影響に完全に起因すると言う事実を証明する。有効に、標的細胞は、Ｆｃの受容体を持たないので、Ｆａｂのみと遭遇し、相互作用する。ハイブリドーマは標的細胞を使用して試験した完全な免疫グロブリンを分泌するにもかかわらず、細胞と相互作用する免疫グロブリンの一部のみがＦａｂであり、これが抗原結合フラグメントとして作用する。
【００４９】
特許請求の範囲に記載の抗体および抗原結合フラグメントに関して、本願は、出願時に、図１中のデータによって証明するように、細胞傷害性を証明している。上記に指摘し、且つ客観的証拠によって確認するように、この影響は、腫瘍細胞へのＦａｂの結合に完全に起因する。
【００５０】
Ｆｃによって採用されるエフェクター機構と無関係な標的抗原への抗体の直接的結合による抗体媒介細胞傷害性の十分な証拠が技術的に存在する。これについての最良の証拠は、補足的細胞または補体（これらの機構を正式に排除するため）を使用しないｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験である。これらの実験型を、完全な免疫グロブリンまたはＦ（ａｂ）’２フラグメントなどの抗原結合フラグメントを使用して行った。これらの実験型では、抗体または抗原結合フラグメントは、抗Ｈｅｒ２抗体および抗ＥＧＦＲ抗体（共に癌療法における販売について米国ＦＤＡによって承認されている）の場合などで標的細胞のアポトーシスを直接誘導することができる。
【００５１】
抗体媒介癌死滅の別の可能な機構は、細胞膜中の種々の化学結合の加水分解を触媒するように機能する抗体およびその関連する糖タンパク質または糖脂質（いわゆる、触媒抗体）の使用を介し得る。
【００５２】
３つのさらなる抗体媒介癌細胞死滅機構が存在する。１つ目は、癌細胞上に存在する推定抗原に対して免疫応答を起こすように身体を誘導するためのワクチンとしての抗体の使用である。２つ目は、成長受容体を標的にしてその機能を妨害するか、その機能が効率的に喪失するように受容体を下方制御するための抗体の使用である。３つ目は、細胞死を指示し得る細胞表面部分の直接ライゲーション（ＴＲＡＩＬ  Ｒ１またはＴＲＡＩＬ  Ｒ２などの死滅受容体またはαＶβ３などのインテグリン分子のライゲーション）に及ぼすかかる抗体の影響である。
【００５３】
制癌剤の臨床的有用性は、患者に体する許容可能なリスクプロフィール下での薬物の利点に基づく。癌療法では、一般に、生存が最も求められている利点であるが、延命に加えて多数の他の十分に認識される利点が存在する。治療によって生存に有害な影響を及ぼさないこれらの他の利点には、症状の緩和、有害事象からの防御、再発期間または無病生存期間の延長、および進行期間の延長が含まれる。これらの基準は一般に許容されており、米国食品医薬品局（Ｆ．Ｄ．Ａ．）などの規制機関は、これらの利点が得られる薬物を承認している（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２：１３７−１４３  ２００２）。これらの基準に加えて、これらの利点型を予測することができる他のエンドポイントが存在することが十分に認識されている。１つには、Ｕ．Ｓ．Ｆ．Ｄ．Ａ．によって許可された加速承認審査方式は、患者の利点を予想する可能性が高い代替審査であると認識されている。２００３年末現在、この審査方式によって１６種の薬物が承認されており、これらのうち、４つが完全承認（ｆｕｌｌ  ａｐｐｒｏｖａｌ）に移行している（すなわち、追跡研究によって、代用評価項目によって予想された患者の直接的利点が証明された）。固形腫瘍における薬物の影響を決定するための１つの重要なエンドポイントは、治療に対する反応の測値絵による腫瘍の全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２（３）：２０５−２１６  ２０００）。かかる評価のための臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（癌の国際的専門グループ）の反応評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって推奨されている。ＲＥＣＩＳＴ基準にしたがって適切なコントロール群と比較した客観的反応として示される腫瘍の全身腫瘍組織量に及ぼす影響が証明されている薬物は、最終的に、患者に直接的な利点が得られる。前臨床場面では、腫瘍の全身腫瘍組織量は、一般に、評価および文書化がより容易である。前臨床研究を臨床場面に変換することができる点において、前臨床モデルで生存期間が延長される薬物は、最も臨床での利用が期待される。臨床治療に対する肯定的反応と類似して、前臨床場面で腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させる薬物も、疾患に対して有意に直接的影響を及ぼし得る。生存の延長が最も求められている制癌剤治療による臨床結果であるにもかかわらず、臨床的に有用な他の利点が存在し、疾患進行の遅延、生存の延長、またはその両方と相関し得る腫瘍の全身腫瘍組織量の減少によっても直接的な利点が得られ、臨床的に影響を及ぼし得ることが明確である（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｉｌｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，３９ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００３，ｐａｇｅｓ  ２０９−２１９）。
【００５４】
本発明は、細胞傷害性アッセイ、動物モデルにおける確立されていない腫瘍の成長および確立された腫瘍の成長ならびに癌性疾患を罹患した動物モデルにおける生存期間の延長におけるその影響によって同定されたＡＲ５２Ａ３０１.５の開発および使用を説明する。本発明は、標的分子（ＴＲＯＰ−２）上に存在するエピトープに特異的に結合し、裸の抗体として悪性腫瘍細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示すが、正常な細胞には示さず、裸の抗体としてヒト癌のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて腫瘍成長の阻害および生存の延長も直接媒介する試薬を最初に記載しているという点で癌治療分野において進歩している。類似の性質を持つことが示されていないので、これは任意の他の前に記載の抗ＴＲＯＰ−２抗体に関して進歩している。また、一定の腫瘍型の成長および発達に関連する事象におけるＴＲＯＰ−２の直接的関与を最初に明確に証明しているので、この分野を進歩させている。また、ヒト患者において類似の抗癌性を示す可能性があるので、癌療法を進歩させている。さらなる進歩は、抗癌抗体ライブラリー中にこれらの抗体を含めることにより、異なる抗癌抗体の適切な組み合わせを決定し、それにより、腫瘍の成長および発達を最も有効に標的化および阻害することによって異なる抗原マーカーを発現する腫瘍を標的化する可能性を増大させることである。
【００５５】
まとめると、本発明は、投与した場合に哺乳動物中で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させることができる治療薬の標的としてのＡＲ５２Ａ３０１．５抗原の使用を教示する。本発明はまた、ＣＤＭＡＢ（ＡＲ５２Ａ３０１．５）ならびにその誘導体および抗原結合フラグメントの使用、ならびにその抗原を標的化して哺乳動物中で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させ、それにより、処置した哺乳動物の生存を延長するためのそのリガンドを誘導する細胞傷害性を教示する。さらに、本発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を保有する哺乳動物の診断、治療法の予想、および予後診断に有用であり得る癌性細胞中のＡＲ５２Ａ３０１．５抗原の検出の使用を教示する。
【００５６】
したがって、本発明の目的は、特定の個体に由来する癌性細胞または１つまたは複数の特定の癌細胞株に対して惹起した癌性疾患改変抗体（ＣＤＭＡＢ）であって、ＣＤＭＡＢは癌細胞に対して細胞傷害性を示すと同時に非癌性細胞に対して比較的非毒性を示す、ＣＤＭＡＢを産生し、それにより、ハイブリドーマ細胞株およびハイブリドーマ細胞株がコードされる対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離する方法を使用することである。
【００５７】
本発明のさらなる目的は、癌性疾患改変抗体、そのリガンド、および抗原結合フラグメントを教示することである。
【００５８】
本発明のさらなる目的は、その細胞傷害性が抗体依存性細胞傷害性によって媒介される癌性疾患改変抗体を産生することである。
【００５９】
本発明のなおさらなる目的は、その細胞傷害性が補体依存性細胞傷害性によって媒介される癌性疾患改変抗体を産生することである。
【００６０】
本発明のなおさらなる目的は、その細胞傷害性が細胞化学結合での加水分解を触媒する能力の関数である癌性疾患改変抗体を産生することである。
【００６１】
本発明のなおさらなる目的は、癌の診断、予後診断、およびモニタリングのための結合アッセイで有用である癌性疾患改変抗体を産生することである。
【００６２】
本発明の他の目的および利点は、以下の記載から明らかになるであろう。以下の記載は、説明および例示を目的として、本発明の一定の実施形態を記載する。
【００６３】
（図面の簡単な説明）
図１は、細胞株細胞株ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３、およびＣＣＤ−２７ｓｋに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害率および結合レベルを比較する。
図２は、癌および正常細胞株に対するＡＲ５２Ａ３０１．５および抗ＥＧＦＲ抗体コントロールの結合を表にしている。データを、平均蛍光強度のアイソタイプコントロールに対する増加倍数として示す。
図３は、いくつかの癌細胞株および非癌細胞株に指向するＡＲ５２Ａ３０１．５および抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む。
図４は、予防ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルにおける腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図５は、予防ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図６は、確立ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図７は、確立ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図８は、予防ＰＬ４５膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図９は、予防ＰＬ４５膵臓癌モデルの生存率に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。
図１０は、予防ＰＬ４５膵臓癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図１１は、予防ＰＣ−３前立腺癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図１２は、予防ＰＣ−３前立腺癌モデルの生存率に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。
図１３は、予防ＰＣ−３前立腺癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図１４は、予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図１５は、予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
図１６は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（レーン１）の全膜画分由来のサンプルならびにＰＣ−３（レーン２）およびＣＣＤ−２７ｓｋ（レーン３）細胞株由来の全細胞溶解物由来のサンプルのウェスタンブロット。ブロットを、ＡＲ４７Ａ６．４．２およびＡＲ５２Ａ３０１．５を使用して探索した。分子量マーカーを左側に示す。
図１７は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分由来のＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）およびアイソタイプコントロール（レーン２）での免疫沈降によって調製した免疫複合体のウェスタンブロット。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の全膜フラクションとインキュベーションしていない抗体抱合タンパク質Ｇ−セファロースビーズも、ネガティブコントロールとして使用した（レーン３および４）。複製ブロットを、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２、ＡＲ５２Ａ３０１．５（ハイブリドーマ上清）、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールを使用するか、一次抗体を使用しないで探索した。サンプルを、還元条件下および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。分子量マーカーを左側に示す。
図１８は、組換えヒトＴＲＯＰ−２のウェスタンブロット。各レーンを、ＡＲ５２Ａ３０１．５（レーン１）およびＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン３）ならびにアイソタイプコントロール抗体（レーン２および４）で探索した。
図１９は、ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）および脱グリコシル化（Ｄ）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）および組換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）。
図２０は、抗ヒトＴＲＯＰ−２で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）および脱グリコシル化（Ｄ）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）および組換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）。
図２１は、１Ｂ７．１１  ＩｇＧ１アイソタイプコントロールで探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）および脱グリコシル化（Ｄ）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）および組換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）。
図２２は、異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトＴＲＯＰ−２のウェスタンブロット。レーン３〜７を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した。レーン９〜１３を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した。レーン１５〜１９を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化８Ａ３Ｂ．６とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した。レーン８および１４をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン８を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン１、２、および２０を、ＴＢＳＴのみとインキュベーションした。
図２３は、異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトＴＲＯＰ−２のウェスタンブロット。レーン３〜７を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２で探索した。レーン９〜１３を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２で探索した。レーン１５〜１９を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化１Ｂ７．１１とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２で探索した。レーン８および１４をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン８を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン１、２、および２０を、ＴＢＳＴのみとインキュベーションした。
図２４は、正常なヒト組織マイクロアレイにおけるＡＲ５２Ａ３０１．５対ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのＩＨＣ比較を表にしている。
図２５は、正常なヒト組織マイクロアレイ由来のＡＲ５２Ａ３０１．５（Ａ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た脾臓ならびにＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｃ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｄ）を使用して得た脳組織の結合パターンを示す代表的顕微鏡写真。倍率は２００倍である。
図２６は、異なる正常なヒト組織マイクロアレイ由来の種々のヒト腫瘍および正常な組織切片におけるＡＲ５２Ａ３０１．５のＩＨＣ比較を表にしている。
図２７は、種々のヒト腫瘍組織マイクロアレイ由来のＡＲ５２Ａ３０１．５（Ａ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た乳房腫瘍組織、ＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｃ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｄ）を使用して得た前立腺腫瘍組織、ＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｅ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｆ）を使用して得た膵臓腫瘍組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は２００倍である。
図２８は、異なる正常な種の組織マイクロアレイ由来の種々のヒトおよび他の種の正常な組織切片におけるＡＲ５２Ａ３０１．５のＩＨＣ比較を表にしている。
図２９は、種々の複数の種の組織マイクロアレイ由来のＡＲ５２Ａ３０１．５（Ａ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た正常なヒト腎臓組織、ＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｃ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｄ）を使用して得た正常なカニクイザル腎臓組織、およびＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｅ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｆ）を使用して得た正常なアカゲザル組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は２００倍である。
図３０は、ＡＲ５２Ａ３０１．５のマウス配列決定で使用した全オリゴヌクレオチドプライマーの配列（配列番号９〜４６）。
図３１は、ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＨ領域およびＶＬ領域のＲＴ／ＰＣＲ増幅のアガロースゲル。
図３２は、ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＨ−Ｂ、ＶＨ−Ｅ、およびＶＬ−ＧのＰＣＲコロニースクリーンのアガロースゲル。
図３３は、ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＬアミノ酸配列（配列番号８）。
図３４は、ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＨアミノ酸配列（配列番号７）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
一般に、概要、説明、実施例、および特許請求の範囲で使用した場合、以下の用語または句は、示した定義を有する。
【００６５】
用語「抗体」を、最も広い意味で使用し、具体的には、例えば、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体が含まれる）、多エピトープ特異性を有する中和抗体、単鎖抗体、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、免疫抱合体、および抗体フラグメント（以下を参照のこと）を対象とする。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得た抗体をいう（すなわち、この集団を含む各抗体は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である）。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向する。その特異性に加えて、他の抗体によって汚染されることなく合成することができるという点で、モノクローナル抗体は有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法によって抗体を産生する必要があると解釈される。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ（マウスまたはヒト）法によって作製することができるか、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」を、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００６７】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくは、抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、全長未満の抗体（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、
Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、二特異性抗体、単鎖抗体分子、単鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質、抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれる。
【００６８】
「インタクトな」抗体は、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む抗体である。定常ドメインは、未変性配列の定常ドメイン（例えば、ヒト未変性配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異型であり得る。好ましくは、インスタントな抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００６９】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体を、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には５つの主なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）が存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）にさらに分類することができる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
【００７０】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（未変性配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因し得る生物活性をいう。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞誘導細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。
【００７１】
「抗体依存性細胞誘導細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞を溶解する細胞媒介反応をいう。ＡＤＣＣの媒介のための初代細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイ（米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のアッセイなど）を行うことができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、動物モデル（Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）などに記載の動物モデルなど）で）評価することができる。
【００７２】
「エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、その未変性供給源（例えば、本明細書中に記載の血液またはＰＢＭＣ）から単離することができる。
【００７３】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」を、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用する。好ましいＦｃＲは、未変性配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するＦｃＲであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（対立遺伝子変異形（ｖａｒｉａｎｔ）およびこれらの受容体の選択的スプライシング形態が含まれる）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）の概説を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。他のＦｃＲ（将来的に同定されるＦｃＲが含まれる）は、本明細書中の用語「ＦｃＲ」に含まれる。この用語には、母親のＩｇＧの胎児への輸送を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１  １７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４２９（１９９４））。
【００７４】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で分子が標的を溶解する能力をいう。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への補体系（Ｃ１ｑ）の第１成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００７５】
用語「可変」は、可変ドメインの一定の部分の配列が抗体間で非常に異なるという事実をいい、その特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性で使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。可変性は、軽鎖および重鎖の両可変ドメイン中に超可変領域と呼ばれる３つのセグメント中に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分を、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ぶ。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、４つのＦＲを含み、これらは主にβシート立体配置を取り、３つの超可変領域によって結合してループ結合を形成し、いくつかの場合、βシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって他の鎖由来の超可変領域と極めて接近してつなぎ合わされ、これが、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す（抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など）。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」ドメインと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント（それぞれ、単一の抗原結合部位を有する）および残りの「Ｆｃ」フラグメント（その名称は容易に結晶化する能力を反映している）が産生される。ペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる。
【００７７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインが強固に非共有結合した二量体からなる。この立体配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つの超可変領域が、抗体に抗原結合親和性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的に３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）は、全結合部位よりも低い親和性にもかかわらず、抗原を認識して結合する能力を有する。Ｆａｂ領域は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数のシステイン（抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインが含まれる）が付加されている点がＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中で、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を保有するＦａｂ’についての表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、当初は、このフラグメント間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
【００７８】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確な型の１つに割り当てることができる。
【００７９】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｖｂｏｄｙ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００８０】
用語「二特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいう。このフラグメントは、同一のポリペプチド鎖中の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。短すぎて同一鎖上で２つのドメインが対合できないリンカーの使用により、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと強制的に対合し、２つの抗原結合部位が作製される。二特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。
【００８１】
用語「三特異性抗体」または「三価抗体」は、３つの単鎖抗体の組み合わせをいう。三特異性抗体を、ＶＬまたはＶＨドメインのアミノ酸末端を使用して（すなわち、いかなるリンカー配列も使用しない）構築する。三特異性抗体は、環状のヘッドトゥーテール様式で整列されたポリペプチドを有する３つ７のＦｖヘッドを有する。三特異性抗体の可能な高次構造は、互いに平面に対して１２０°の角度で存在する３つの結合部位を有する平面である。三特異性抗体は、単一特異性、二重特異性、または三重特異性であり得る。
【００８２】
「単離」抗体は、同定され、その自然環境成分から単離および／または回収された抗体である。その自然環境の夾雑成分は、抗体の診断または治療での使用を妨害する可能性のある材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性の溶質が含まれ得る。単離抗体には、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれる。これは、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離抗体を、少なくとも１つの精製工程によって調製するであろう。
【００８３】
目的の抗原（例えば、ＴＲＯＰ−２抗原）「に結合する」抗体は、抗体が抗原を発現する細胞の標的化における治療薬または診断薬として有用であるような十分な親和性で抗原に結合することができる抗体である。抗体がＴＲＯＰ−２に結合する抗体である場合、通常、他の受容体とは対照的にＴＲＯＰ−２に優先的に結合し、非特異的Ｆｃ接触または他の抗原と共通の翻訳後修飾などの偶発的な結合は含まれず、他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体であり得る。目的の抗原に結合する抗体の検出方法は当該分野で周知であり、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンブロットなどのアッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、表現「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」は、相互交換可能に使用され、全てのかかる表示には、子孫が含まれる。意図的または非意図的な変異により、全ての子孫はＤＮＡ含有量が正確に同一でなくて良い。最初に形質転換した細胞についてスクリーニングした場合に同一の機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。異なる表示が意図される場合、文脈から明らかであろう。
【００８５】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、標的化した病態または障害を防止または遅延（減少）することを目的とする治療上の処置および予防または防止手段の両方をいう。処置を必要とする者には、既に障害を有する者および障害を有する傾向のある者または障害を防止すべき者が含まれる。したがって、本明細書中の処置すべき哺乳動物は、障害を有するか障害に罹りやすいか影響を受けやすいと診断され得る。
【００８６】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には、無秩序な細胞の成長または死滅によって特徴づけられる哺乳動物の生理学的容態をいうか説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。かかる癌のより詳細な例には、扁平上皮癌（例えば、扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ））、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺の扁平上皮癌が含まれる）、腹膜癌、肝細胞癌、消化管の癌または胃癌（消化管癌が含まれる）、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌が含まれる。
【００８７】
「化学療法薬」は、癌治療に有用な化合物である。化学療法薬の例には、以下が含まれる：アルキル化剤（チオテパおよびシクロスホスファミド（サイトキサン（商標））など）；アルキルスルホナート（ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど）；アジリジン（ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など）；エチレンイミンおよびメチリアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）が含まれる）；ナイトロジェンマスタード（クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、エンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）（カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど）；抗生物質（アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルノマイシン（ｃａｒｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど）；代謝拮抗物質（メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）；葉酸アナログ（デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトトレキサートなど）；プリンアナログ（フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど）；ピリミジンアナログ（アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵなど）；アンドロゲン（カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど）；抗副腎物質（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給物質（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エデトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エフロールニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセタート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダニン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２"−ｔｒｉクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（タキソテール（登録商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシン  Ｃ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体。腫瘍のホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン薬（抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）が含まれる）；抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど））、および上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体も本定義に含まれる。
【００８８】
治療するための「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物（ヒト、マウス、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、またはマウス系統、家畜、動物園の動物、競技用動物（ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシなど）が含まれる）をいう。好ましくは、本明細書中の哺乳動物は、ヒトである。
【００８９】
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法（固相技術を使用したホスホトリエステル、亜リン酸塩、またはホスホルアミダイト化学（１９８８年３月４日公開の欧州特許第２６６，０３２号に記載の技術など）またはＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｈ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７，１９８６に記載のデオキシヌクレオシドＨホスホン酸中間体を介した技術など）によって化学合成される短い一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。次いで、オリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲルで精製する。
【００９０】
本発明によれば、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンの「ヒト化」および／または「キメラ」形態は、元の抗体と比較してヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、またはヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）の応答を減少させる特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど）を含み、所望の影響の再現に必要な非ヒト免疫グロブリン由来の必要な部分（例えば、ＣＤＲ、抗原結合領域、および可変領域など）を含むと同時に非ヒト免疫グロブリンに匹敵する結合特性を保持する抗体をいう。大部分で、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基を所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（マウス、ラット、またはウサギなど）のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）に置換するヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒトＦＲ残基に置換する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体や移入されるＣＤＲまたはＦＲ配列のいずれでも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾により、抗体の能力がさらに洗練および至適化される。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、全てまたは実質的に全てのＦＲ残基はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃ少なくとも一部）を含むであろう。
【００９１】
「脱免疫化」抗体は、所与の種に体して非免疫原性を示すかより小さな免疫原性を示す免疫グロブリンである。抗体の構造代替物によって脱免疫化を行うことができる。当業者に公知の任意の脱免疫化技術を使用することができる。１つの適切な抗体の脱免疫化技術は、例えば、２０００年６月１５日に公開のＷＯ  ００／３４３１７号に記載されている。
【００９２】
「アポトーシス」を誘導する抗体は、アネキシンＶの結合、カスパーゼ活性、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の膨張、細胞の断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成（これらに限定されない）によって例示される任意の手段によってプログラム細胞死を誘導する抗体である。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、「抗体誘導細胞傷害性」は、ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生されたハイブリドーマ上清または抗体由来の細胞傷害効果を意味すると理解される。この効果は、必ずしも結合の程度に関連するわけではない。
【００９４】
本明細書を通して、ハイブリドーマ細胞株およびこれらによって産生される単離モノクローナル抗体を、二者択一的に、内部表示（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｓｉｇｕｎａｔｉｏｎ）（ＡＲ５２Ａ３０１．５）または寄託番号（Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）（ＩＤＡＣ１４１２０５−０３）という。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、「抗体−リガンド」は、標的抗原の少なくとも１つのエピトープに対して結合親和性を示し、インタクトな抗体分子、抗体フラグメント、および少なくとも抗原結合領域またはその一部（すなわち、抗体分子の可変部分）を有する任意の分子（例えば、ＩＤＡＣ１４１２０５−０３と指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合される抗原（ＩＤＡＣ１４１２０５−０３抗原）の少なくとも１つのエピトープを特異的に認識して結合するＦｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、または任意の遺伝子操作された分子）であり得る部分を含む。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、「癌性疾患改変抗体」（ＣＤＭＡＢ）は、患者に有利な様式（例えば、腫瘍保有個体の全身腫瘍組織量の減少または生存の延長）で癌性脂環過程を改変するモノクローナル抗体およびその抗体−リガンドをいう。
【００９７】
「ＣＤＭＡＢ関連結合薬」は、その最も広い意味で、少なくとも１つのＣＤＭＡＢ標的エピトープに競合的に結合する任意の形態のヒトまたは非ヒト抗体、抗体フラグメント、または抗体リガンドなどが含まれるが、これらに限定されないと理解される。
【００９８】
「競合結合剤」は、少なくとも１つのＣＤＭＡＢ標的エピトープに対する結合親和性を有する任意の形態のヒトまたは非ヒト抗体、抗体フラグメント、または抗体リガンドなどが含まれると理解される。
【００９９】
処置すべき腫瘍には、原発性腫瘍および転移性腫瘍ならびに難治性腫瘍が含まれる。難治性腫瘍には、化学療法薬のみ、抗体のみ、照射のみ、またはその組み合わせを使用した治療に応答できないか耐性を示す腫瘍が含まれる。難治性腫瘍はまた、かかる薬剤での治療によって阻害される用であるが、治療中断から５年以内、時折１０年まで、またはそれを超えて再発する腫瘍を含む。
【０１００】
治療することができる腫瘍には、非脈管形成腫瘍、実質的に依然として脈管形成腫瘍しない腫瘍、および脈管形成腫瘍が含まれる。適宜に治療することができる固形腫瘍の例には、乳癌、肺癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膠腫、およびリンパ腫が含まれる。かかる腫瘍のいくつかの例には、類上皮腫、扁平細胞腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ）（頭頸部腫瘍など）、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍（小細胞肺癌および非小細胞肺癌が含まれる）、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、および肝臓腫瘍が含まれる。他の例には、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫、大脳転移、黒色腫、消化管癌、腎癌、肉腫、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫、好ましくは、多形性膠芽細胞腫および平滑筋肉腫が含まれる。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する分子の一部を意味する。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、「競合的に阻害する」は、従来の相互抗体競合アッセイを使用してＩＤＡＣ１４１２０５−０３と指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体（ＩＤＡＣ  １４１２０５−０３抗体）が指向する決定部位を認識して結合することができることを意味する（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  Ｃ．ａｎｄ  Ｄｕｆｏｕｒ  Ｄ．（１９７３），Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ  ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８，１５）。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、「標的抗原」は、ＩＤＡＣ１４１２０５−０３抗原またはその一部である。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、「免疫抱合体」は、任意の分子またはＣＤＭＡＢ（細胞毒素、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍薬、または治療薬に化学的または生物学的に結合した抗体など）を意味する。抗体またはＣＤＭＡＢを、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、細胞毒素、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍薬、または治療薬に結合することができる。免疫抱合体の例には、抗体毒素化学抱合体および抗体−毒素融合タンパク質が含まれる。
【０１０５】
抗腫瘍薬としての使用に適切な放射性物質は、当業者に公知である。例えば、１３１Ｉまたは２１１Ａｔを使用する。これらの同位体を、従来の技術を使用して抗体に結合する（例えば、Ｐｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８，６９−７３（１９９３））。あるいは、抗体に結合する抗腫瘍薬は、プロドラッグを活性化させる酵素である。一旦抗体複合体が投与されると腫瘍部位に到達するまで不活性形態を維持し、腫瘍部位でその細胞毒形態に変換されるプロドラッグを投与することができる。実際には、抗体−酵素抱合体を患者に投与し、治療すべき組織領域に局在させる。次いで、治療すべき組織領域で細胞傷害薬に変換するようにプロドラッグを患者に投与する。あるいは、抗体に抱合した抗腫瘍薬は、サイトカイン（インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）など）である。サイトカインが他の組織に影響を及ぼすことなく腫瘍の損傷または破壊を媒介するように、抗体によってサイトカインが腫瘍を標的にする。従来の組換えＤＮＡ技術を使用して、サイトカインをＤＮＡレベルで抗体に融合する。インターフェロンを使用することもできる。
【０１０６】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、抗原結合領域が生物学的に活性な分子（例えば、毒素、酵素、蛍光タンパク質、発光マーカー、ポリペプチドタグ、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、またはタンパク質薬）に連結された任意のキメラタンパク質を意味する。
【０１０７】
本発明は、さらに、標的またはレポーター部分が結合してイル本発明のＣＤＭＡＢを意図する。標的部分は、結合対の第１のメンバーである。抗腫瘍薬を、例えば、かかる対の第２のメンバーに抱合し、それにより、抗原結合タンパク質が結合する部位に指向する。かかる結合対の一般例は、アビジンおよびビオチンである。好ましい実施形態では、ビオチンを、本発明のＣＤＭＡＢの標的抗原に抱合し、それにより、アビジンまたはストレプトアビジンが抱合する抗腫瘍薬または他の部分の標的が得られる。あるいは、ビオチンまたは別のかかる部分を、本発明のＣＤＭＡＢの標的抗原に連結し、例えば、検出可能なシグナル発生物質をアビジンまたはストレプトアビジンに抱合する診断系でレポーターとして使用する。
【０１０８】
検出可能なシグナル発生物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断で有用である。シグナル発生物質は、外部手段（通常、電磁波放射線の測定）によって検出可能な測定シグナルを発生する。大部分で、シグナル発生物質は、酵素または発色団であるか、蛍光、リン光、または化学発光によって発光する。発色団には、紫外領域もしくは可視領域で光を吸収する色素が含まれ、酵素触媒反応の基質または分解産物であり得る。
【０１０９】
さらに、当業者に周知の調査方法または診断方法のためのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの本発明のＣＤＭＡＢの使用が本発明の範囲内に含まれる。本明細書中で意図するように診断方法を実施するために、本発明は、さらに、本発明のＣＤＭＡＢを含むキットを含み得る。かかるキットは、かかる個体の細胞上のＣＤＭＡＢの標的抗原の過剰発現の検出による一定の癌型のリスクのある個体の同定に有用であろう。
【０１１０】
診断アッセイキット
腫瘍の存在の決定のために、診断アッセイキットの形態で本発明のＣＤＭＡＢを使用することが意図される。患者中の腫瘍を、一般に、１つまたは複数の腫瘍特異的抗原（例えば、患者から得た生体サンプル（血液、血清、尿、および／または腫瘍生検など）中のタンパク質および／またはかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド）の存在に基づいて検出する。
【０１１１】
タンパク質は、特定の腫瘍（例えば、結腸腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、または前立腺腫瘍）の有無を示すマーカーとして機能する。抗原が他の癌性腫瘍の検出のために使用されることがさらに意図される。本発明のＣＤＭＡＢから構成される結合薬またはＣＤＭＡＢ関連結合薬を診断アッセイキット中に含めることにより、生体サンプル中の結合薬に結合する抗原のレベルを検出することができる。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを使用して、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出することができ、このレベルは、癌の有無も示す。結合アッセイで診断するために、正常な組織中に存在する抗原レベルに関して、統計的に有意な抗原レベルと相関するデータを作製し、それにより、癌性腫瘍の存在を明確に診断する結合を認識する。当業者に公知のように、サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するための結合薬を使用するための本発明の診断アッセイに複数の形式が有用であることが意図される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に例示されている。上記診断アッセイ形質の任意および全ての組み合わせ、並べ替え、または修正形態がさらに意図される。
【０１１２】
患者中の癌の有無を、典型的には、（ａ）患者から得た生体サンプルを結合薬と接触させること、（ｂ）サンプル中の結合薬に結合するポリペプチドレベルを検出すること、および（ｃ）ポリペプチドレベルと所定のカットオフ値を比較することによって決定する。
【０１１３】
例示的実施形態では、アッセイがサンプルの残存物由来のポリペプチドに結合してこれを除去するための固体支持体上に固定したＣＤＭＡＢベースの結合薬の使用を含むことが意図される。次いで、結合したポリペプチドを、レポーター基を含み、結合薬／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出することができる。例示的検出試薬には、ポリペプチドもしくは抗体に特異的に結合するＣＤＭＡＢベースの結合薬または結合薬に特異的に結合する他の薬剤（抗免疫グロブリン、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ、またはレクチンなど）が含まれ得る。別の実施形態では、ポリペプチドをレポーター基で標識し、結合薬のサンプルとのインキュベーション後に固定した結合薬と結合させる競合アッセイを使用することができることが意図される。サンプルと固定した結合薬が示す反応性は、サンプル成分が結合薬への標識ポリペプチドの結合を阻害する範囲である。かかるアッセイでの使用に適切なポリペプチドには、結合薬が結合親和性を有する全長腫瘍特異的タンパク質および／またはその部分が含まれる。
【０１１４】
タンパク質を結合することができる当業者に公知の任意の材料の形態であり得る固体支持体を有する診断キットを提供する。適切な例には、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜が含まれ得る。あるは、支持体は、ビーズまたはディスク（ガラス、グラスファイバー、ラテックス、またはプラスチック材料（ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなど）など）であり得る。支持体は、磁性粒子または光ファイバーセンサ（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示のものなど）であり得る。
【０１１５】
特許および科学文献に十分に記載されている当業者に公知の種々の技術を使用して、結合剤を固体支持体上に固定すると認識される。用語「固定」は、吸着などの非共有結合および共有結合の両方をいい、本発明の文脈では、支持体上の作用因子（ａｇｅｎｔ）と官能基との直接結合であり得るか、架橋剤による連結であり得る。好ましいが非限定的な実施形態では、吸着によるマイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への固定が好ましい。適切な緩衝液中での結合薬の固体支持体との適切な時間の接触によって吸着することができる。接触時間は温度に伴って変化することができ、一般に、約１時間と約１日との間の範囲内であろう。
【０１１６】
支持体と結合薬の官能基（ヒドロキシル基またはアミノ基など）との両方と反応する二官能性試薬との支持体の第１の反応によって、結合薬を抗体支持体に共有結合する。例えば、ベンゾキノンを使用した適切なポリマーコーティングまたは支持体上のアルデヒド基の結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合によって、結合剤を支持体に共有結合することができる。（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９１  ，ａｔ  Ａ１２  Ａ１３を参照のこと）。
【０１１７】
診断アッセイキットは２抗体サンドイッチアッセイの形態を取るとさらに認識される。サンプル内のポリペプチドが固定した抗体に結合するように抗体（例えば、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定した本発明に開示のＣＤＭＡＢ）をサンプルと接触させることによってこのアッセイを行うことができる。次いで、非結合サンプルを固定したポリペプチド−抗体複合体から除去し、レポーター基を含む検出試薬（好ましくは、ポリペプチド上の異なる部位に結合することができる第２の抗体）を添加する。次いで、固体支持体に結合したままの検出試薬の量を、特異的レポーター基に適切な方法を使用して決定する。
【０１１８】
特定の実施形態では、上記のように一旦抗体が支持体上に固定されると、支持体上の残りのタンパク質結合部分が当業者に公知の任意の適切な遮断薬（ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）など）の使用によって遮断されることが意図される。次いで、固定化抗体をサンプルと共にインキュベーションし、ポリペプチドを抗体と結合させる。インキュベーション前に、サンプルを、適切な希釈剤（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）など）で希釈することができる。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）を、具体的に選択した腫瘍を有する個体から得たサンプル内のポリペプチドの存在の検出に十分なに相当するように選択する。好ましくは、接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡を達成するレベル少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡を達成するのに必要な時間を、ある期間にわたる結合レベルのアッセイによって容易に決定することができることを認識するであろう。
【０１１９】
非結合サンプルを適切な緩衝液での固体支持体の洗浄によって除去することがさらに意図される。次いで、レポーター基を含む二次抗体を、固体支持体に添加する。結合ポリペプチドを検出するのに十分な時間、固定化した抗体−ポリペプチド複合体との検出試薬のインキュベーションを行う。その後、非結合検出試薬を除去し、結合検出試薬をレポーター基を使用して検出する。レポーター基の検出に使用した方法は、選択したレポーター基の型（例えば、放射性基）に特異的である必要があり、シンチレーションカウンティングまたはオートラジオグラフィ法が一般に適切である。分光法を使用して、色素、発光基、および蛍光基を検出することができる。異なるレポーター基（一般に、放射性基、蛍光基、または酵素）にカップリングしたアビジンを使用して検出することができる。酵素レポーター基を、一般に、基質の添加（一般に、特定の期間）およびその後の反応産物の分光分析または他の分析によって検出することができる。
【０１２０】
癌（前立腺癌など）の有無を決定するために本発明の診断アッセイキットを使用するために、固体支持体に結合したままであるレポーター基から検出されたシグナルを、一般に、所定のカットオフ値に相当するシグナルと比較する。例えば、癌検出のための例示的カットオフ値は、固定化抗体を癌を罹患していない患者由来のサンプルとインキュベーションした場合に得られる平均シグナルであり得る。一般に、所定のカットオフ値より約３標準偏差高いシグナルを生成するサンプルを、癌陽性と見なす。別の実施形態では、カットオフ値を、Ｓａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，ｐ．１０６−７．による受診者動作特性曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅ）を使用して決定することができる。かかる実施形態では、カットオフ値を、診断試験の結果についてのそれぞれの起こり得るカットオフ値に相当する真の陽性率（すなわち、有病正診率）と偽陽性率（１００％特異性）との対のプロットから決定することができる。左上の隅に最も近いプロットのカットオフ値（すなわち、最も広い領域を囲む値）は、最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定したカットオフよりも高いシグナルを生成するサンプルを陽性と見なすことができる。あるいは、カットオフ値を、プロットに沿って左にシフトして、偽陽性率を最小にするか、右にシフトして議員正率を最小にすることができる。一般に、この方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルを、癌陽性と見なす。
【０１２１】
キットによって可能な診断アッセイを、結合薬を膜（ニトロセルロース膜など）に固定した流入（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）形態またはストリップ試験形態のいずれかで行うと認識される。流入試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜と通過するにつれて、固定結合薬に結合する。第２に、標識した結合薬は、第２の結合薬を含む溶液が膜を流れるのにつれて、結合薬−ポリペプチド複合体に結合する。結合した第２の結合薬を、上記のように検出することができる。ストリップ試験形式では、結合薬が結合した膜の一方の末端を、サンプルを含む溶液に浸漬する。サンプルは、第２の結合薬を含む領域を介して膜に沿って固定化結合薬領域に移動する。固定化抗体領域での第２の結合薬の濃度は、癌の存在を示す。視覚的に読み取ることができる結合部位でのパターン（線）の存在は、肯定的試験を示す。かかるパターンの非存在は、否定的結果を示す。一般に、結合薬の膜固定量を、生体サンプルが上記考察の形式で２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生成するのに十分なポリペプチドレベルを含む場合、視覚的に認識可能なパターンが生成されるように選択する。本発明の診断アッセイでの使用に好ましい結合薬は、本発明に開示の抗体、その抗原結合フラグメント、および本明細書中に記載の任意のＣＤＭＡＢ関連結合薬である。抗体の膜固定量は、診断アッセイを行うのに有効な任意の量であり、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり得る。典型的には、かかる試験を、非常に少量の生体サンプルを使用して行うことができる。
【０１２２】
さらに、本発明のＣＤＭＡＢを、その標的抗原を同定する能力の研究で使用することができる。
【０１２３】
本明細書中に記載の発明をより完全に理解するために、以下の説明を記載する。
【０１２４】
本発明は、ＩＤＡＣ１４１２０５−０３抗原を特異的に認識して結合するＣＤＭＡＢ（すなわち、ＩＤＡＣ１４１２０５−０３  ＣＤＭＡＢ）を提供する。
【０１２５】
ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢは、ハイブリドーマＩＤＡＣ１４１２０５−０３によって産生されたその標的抗原に対する単離モノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限り、任意の形態であり得る。したがって、ＩＤＡＣ１４１２０５−０３抗体と同一の結合特異性を有する任意の組換えタンパク質（例えば、抗体を第２のタンパク質（リンホカインまたは腫瘍阻害成長因子など）と組み合わせた融合タンパク質）は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態では、ＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ１４１２０５−０３抗体である。
【０１２７】
他の実施形態では、ＣＤＭＡＢは抗原結合フラグメントであり、Ｆｖ分子（単鎖Ｆｖ分子など）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、異種抗体、またはＩＤＡＣ１４１２０５−０３抗体の抗原結合領域を有する任意の組換え分子であり得る。本発明のＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ１４１２０５−０３モノクローナル抗体が指向するエピトープに指向する。
【０１２８】
本発明のＣＤＭＡＢを、修飾して誘導体分子を産生することができる（すなわち、分子内のアミノ酸修飾による）。化学修飾も可能である。直接変異、親和成熟法（ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）、ファージディスプレイ、または鎖シャフリングによる修飾も可能である。
【０１２９】
親和性および特異性を、ＣＤＲおよび／またはフェニルアラニントリプトファン（ＦＷ）残基の変異ならびに所望の特徴を有する抗原結合部位のスクリーニングによって修飾または改変することができる（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９５）２５４：３９２−４０３）。１つの方法は、別の同一の抗原結合部位集団中の２〜２０個のアミノ酸のサブセットが特定の位置で見出される容易、各残基または残基の組み合わせを無作為化することである。あるいは、誤りがちなＰＣＲ法によって残基の範囲にわたって変異を誘導することができる（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９２）２２６：８８９−９６）。別の例では、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターを、大腸菌変異株中で増殖させることができる（例えば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９６）２５０：３５９−６８）。これらの変異誘発方法は、当業者に公知の多数の方法の例である。
【０１３０】
本発明の抗体の親和性の別の増加様式は、鎖シャフリングを行うことである。この鎖シャフリングは、重鎖または軽鎖を他の重鎖または軽鎖と無作為に対合して、より高い親和性を有する抗体を調製する。抗体の種々のＣＤＲを、他の抗体中の対応するＣＤＲとシャフリングすることもできる。
【０１３１】
誘導体分子は、ポリペプチドの機能的性質を保持しているであろう。すなわち、かかる置換を行った分子は、依然としてＩＤＡＣ１４１２０５−０３抗原またはその一部にポリペプチドが結合するであろう。
【０１３２】
これらのアミノ酸置換には、当該分野で「保存的」置換として公知のアミノ酸置換が含まれるが、必ずしもこれに限定されない。
【０１３３】
例えば、タンパク質化学の十分に確立された原理は、タンパク質の高次構造または機能のいずれも変化させることなく、タンパク質を「保存的アミノ酸置換」と表題をつけた一定のアミノ酸置換を行うことができることである。
【０１３４】
かかる変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）と任意の他のこれらの疎水性アミノ酸との置換；アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）との置換およびその逆；グルタミン酸（Ｑ）とアスパラギン（Ｎ）との置換およびその逆；ならびにセリン（Ｓ）とトレオニン（Ｔ）との置換およびその逆のいずれかが含まれる。タンパク質の三次元構造に置ける特定のアミノ酸の環境およびその役割に応じて、他の置換も保存的置換と見なすことができる。例えば、アラニンとバリン（Ｖ）との交換が可能であるので、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、高い頻度で交換可能である。比較的疎水性を示すメチオニン（Ｍ）を、高い頻度でロイシンおよびイソロイシンと交換することができ、時折バリンと交換することができる。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）を、アミノ酸残基の有意な特徴がその電荷であり、且つこれら２つのアミノ酸残基のｐＫの相違は有意ではない位置で高い頻度で交換可能である。さらなる他の変化を、特定の条件下で「保存的」と見なすことができる。
【０１３５】
実施例１
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５
ハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５を、ブダペスト条約に従って、２００５年１２月１４日に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ（ＩＤＡＣ），Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ，１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，Ｃａｎａｄａ，Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２に受入番号１４１２０５−０３で寄託した。３７  ＣＦＲ  １．８０８にしたがって、寄託されている材料の公衆への提供可能性に関して寄託者によって課せられている制限の全てが、特許が付与されたとき、取り消し不能の条件で撤回される。寄託機関が生育能力のあるサンプルを分譲することができない場合、寄託物を置換する。
【０１３６】
抗癌抗体  ＡＲ５２Ａ３０１．５を産生するハイブリドーマを産生するために、凍結ヒト卵巣腫瘍組織（類内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の単一細胞上清を、ＰＢＳ．ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で調製し、アジュバントを、穏やかな混合によって調製した。５〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、２００万個の細胞を含む５０μｌの抗原−アジュバントの腹腔内注射によって免疫化した。最近調製された抗原−アジュバントを使用して、最初の免疫化から２週間後および５週間後に、約２００万個の細胞を含む５０〜６０μｌで腹腔内にて両方のＡＲ５２Ａ３０１．５免疫化マウスを追加免疫した。脾臓を、最後の免疫化から３日後に融合のために使用した。単離非細胞のＮＳＯ−１骨髄腫パートナーとの融合によってハイブリドーマを調製した。融合物由来の上清を、ハイブリドーマのサブクローンから試験した。
【０１３７】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体がＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。４℃の１００μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を２．４μｇ／ｍＬ含むコーティング緩衝液（０．１  Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ  ９．２〜９．６）を、ＥＬＩＳＡプレートに一晩添加した。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（５％ミルクを含む洗浄緩衝液）を、プレートに室温で１時間添加し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清を添加し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体の１００，０００  倍希釈物（１％のミルクを含むＰＢＳで希釈）のいずれかを１００μｌ／ウェルで添加した。室温で１時間のプレートのインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ溶液を、室温で１〜３分間インキュベーションした。５０μｌ／ウェルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって呈色反応を停止させ、プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレートリーダーで４５０ｎｍを読み取った。図１に示すように、ＡＲ５２Ａ３０１．５ハイブリドーマは、ＩｇＧアイソタイプの一次抗体を分泌した。
【０１３８】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体のサブクラスを決定するために、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ分類キット（ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｏｎｔｓｔｒａａｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してアイソタイプ分類実験を行った。５００μｌの緩衝液を、ラット抗マウスサブクラス特異的抗体を含む試験ストリップに添加した。５００μｌのハイブリドーマ上清を試験管に添加し、穏やかな撹拌によって浸漬させた。捕捉マウス免疫グロブリンを、コロイド粒子にカップリングした第２のラットモノクローナル抗体によって直接検出した。これらの２つのタンパク質の組み合わせにより、アイソタイプを分析するための視覚シグナルを得る。抗癌抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５は、ＩｇＧ１由来のκアイソタイプである。
【０１３９】
１ラウンドの限界希釈後、ハイブリドーマ上清を、細胞ＥＬＩＳＡアッセイ中の標的細胞に結合した抗体について試験した。以下の２つのヒト卵巣癌細胞株および１つのヒト正常皮膚細胞株を試験した：ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３、およびＣＣＤ−２７ｓｋ。ＯＣＣ−１を除く全ての細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＯＣＣ−１卵巣癌細胞株を、Ｏｔｔａｗａ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）から入手した。
【０１４０】
使用前にプレーした細胞を固定した。プレートを、室温のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含むＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した１００μｌの２％パラホルムアルデヒドを、各ウェルに室温で１０分間添加し、その後に破棄した。プレートを、室温のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含むＰＢＳで再度３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの５％ミルクを含む洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用して、室温で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ハイブリドーマ上清を、７５μｌ／ウェルにて室温で１時間添加した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の２５，０００倍希釈物（１％ミルクを含むＰＢＳ中で希釈）を添加した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００  μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を、室温で１〜３分間インキュベーションした。５０μｌ／ウェルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレートリーダーで４５０ｎｍを読み取った。図１で表にした結果を、前に試験した細胞株に結合しないことが示されている自家ＩｇＧアイソタイプコントロールと比較したバックグラウンドの倍数として示した。ハイブリドーマＡＲ５２Ａ３０１．５由来の抗体は、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３への結合を示した。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、正常皮膚細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋへの検出可能な結合レベルを示さなかった。
【０１４１】
抗体結合試験と併せて、以下の細胞株におけるハイブリドーマ上清の細胞傷害効果を試験した：ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３、およびＣＣＤ−２７ｓｋ。カルセインＡＭを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。以下に概説のように変更して、製造者の説明書にしたがってアッセイを行った。細胞を、所定の適切な密度でアッセイ前にプレートした。２日後、７５μｌハイブリドーママイクロタイタープレート由来の上清を細胞プレートに移し、５％ＣＯ２インクベーターで５日間インキュベーションした。ポジティブコントロールの役割を果たすウェルを空になるまで吸引し、１００μｌのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）またはシクロヘキシミドを添加した。処置５日後、プレートを逆にしてブロットを乾燥させることによってプレートを空にした。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む室温のＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水）を、マルチチャネルスクイーズボトルから各ウェルに分注し、３回軽く叩き、逆にしてブロットを乾燥させることによって空にした。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含むＤＰＢＳ中で希釈した５０μｌの蛍光カルセイン色素を各ウェルに添加し、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌでデータを分析した。結果を、図１に表で示す。ＡＲ５２Ａ３０１．５  ハイブリドーマ由来の上清は、ＯＶＣＡＲ−３細胞に対して２４％の特異的細胞傷害性を示した。これは、ポジティブコントロールであるシクロヘキシミドを使用して得た細胞傷害性の５３％であった。図１由来の結果は、ＡＲ５２Ａ３０１．５の細胞傷害効果が癌細胞型に対する結合レベルと比例することを証明する。ＯＣＣ−１細胞と比較してＯＶＣＡＲ−３細胞で得られた細胞傷害性レベルはより高く、ＯＶＣＡＲ−３細胞のより高い結合レベルと一致した。図１に表で示すように、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、ＣＣＤ−２７ｓｋ正常細胞株で細胞傷害性を示さなかった。公知の非特異的細胞傷害薬であるシクロヘキシミドおよびアジ化ナトリウムは、一般に、予想通りの細胞傷害性を示した。
【０１４２】
実施例２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合
ＡＲ５２Ａ３０１．５モノクローナル抗体を、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）中でハイブリドーマを培養し、１週間に２回の回収および再播種を行うことによって産生した。ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ，ＱＣ）を使用した標準的な抗体精製手順に従った。脱免疫化抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体をい使用することは、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４３】
膵臓（ＢｘＰＣ−３、ＡｓＰＣ−１、およびＰＬ４５）、結腸（ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ、ＳＷ１１１６、ＨＴ−２９、およびＣｏｌｏ−２０５）、乳房（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７）、前立腺（ＰＣ−３およびＤＵ−１４５）、肺（ＮＣＩ−Ｈ５２０およびＡ５４９）、食道（Ｔ．Ｔｎ）、甲状腺（ＳＷ５７９）、頭頸部（ＦａＤｕ）、および卵巣（ＯＣＣ−１、Ｃ−１３、ＯＶＣＡ−４２９、Ｓｋ−ＯＶ−３、ＯＶ２００８、Ｈｅｙ、Ａ２７８０−ｃｐ、Ａ２７８０−Ｓ、およびＯＶＣＡＲ−３）の癌細胞株ならびに皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）および肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）由来の非細胞株へのＡＲ５２Ａ３０１．２の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。卵巣癌細胞株の大部分を除く全細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｃ−１３、ＯＶ２００８、Ｈｅｙ、Ａ２７８０−ｃｐ、Ａ２７８０−Ｓ、ＯＣＣ−１、およびＯＶＣＡ−４２９卵巣癌細胞株を、Ｏｔｔａｗａ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）から入手した。
【０１４４】
ＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない）で単層を最初に洗浄することによって、ＦＡＣＳ用の細胞を調製した。次いで、３７℃で、細胞分離緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して、その細胞培養プレートから細胞を取り除いた。遠心分離および回収後、細胞を、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、および２％ウシ胎児血清を含む４℃のＤＰＢＳ（染色培地）に再懸濁し、計数し、適切な細胞密度に等分し、スピンダウンによって細胞をペレットにし、２０μｇ／ｍＬの試験抗体（ＡＲ５２Ａ３０１．５）またはコントロール抗体（アイソタイプコントロール、抗ＥＧＦＲ）の存在下で４℃の染色培地中に氷上で３０分間再懸濁した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６抱合二次抗体の添加前に、細胞を染色培地で１回洗浄した。次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６抱合抗体を含む染色培地を、４℃で３０分間添加した。次いで、最後に細胞を洗浄し、固定培地（１．５％パラホルムアルデヒドを含む染色培地）に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリー捕捉を、ＦＡＣＳａｒｒａｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を使用したＦＡＣＳａｒｒａｙ（商標）でのサンプルの流れによって評価した。ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器の電圧および振幅の増加の調整によって、細胞の前方向（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を設定した。細胞が約１〜５単位の中程度の蛍光強度を有する一定のピークを有するように、蛍光（Ａｌｅｘａ−５４６）チャネルのための検出器を非染色細胞の流れによって調整した。各サンプルのために、約１０，０００のゲーティング事象（染色された固定細胞）を分析のために獲得し、結果を図３に示す。
【０１４５】
図２は、平均蛍光強度のアイソタイプコントロールに対する増加倍数として示す。ＡＲ５２Ａ３０１．５抗体の代表的ヒストグラムを、図３にまとめた。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３（２９．４倍）、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（２２．７倍）、頭頸部癌細胞株ＦａＤｕ（５９．８倍）、卵巣癌細胞株  ＯＶ２００８、ＯＶＡＲ−３、およびＣ−１３（３２．７倍、２２．１倍、および３８．７倍）、および結腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０５およびＤＬＤ−１（３８．６倍および８２．８倍）への強い結合を示した。結合は、卵巣癌細胞株Ｈｅｙ、ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡ−４２９、およびＯＶＣＡＲ−３（それぞれ、５．９倍、１７．８倍、３．４倍、および２２．１倍）、乳癌細胞株ＭＣＦ−７（１６．０倍）、前立腺癌細胞株ＰＣ−３およびＤＵ−１４５（５．０倍および３．９倍）、食道癌細胞株Ｔ．Ｔｎ（１８．６倍）、結腸癌細胞株ＨＴ−２９（６．７倍）、および膵臓細胞株ＰＬ４５（１２．９倍）でも認められ、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０（２．１倍）および非癌肺細胞株Ｈｓ８８８．Ｌｕ（２．６倍）でより弱い結合が認められた。皮膚由来の非癌細胞株（ＣＣＤ−２７ｓｋ）は、これらの条件下で検出できなかった。これらのデータは、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、種々の癌細胞株に明確に結合するが、試験したいくつかの株としか細胞傷害性に関連しなかったという点で、機能的特異性を示すことを証明する。
【０１４６】
実施例３
ＢｘＰＣ−３細胞を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍予防実験
実施例１および２は、いくつかの異なる癌適応症にわたる検出可能な結合によってＡＲ５２Ａ３０１．５がヒト癌細胞株に対して抗癌性を示すことを証明した。図４および５を参照して、６〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、５００万個のヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）を含む１００μｌの生理食塩水を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、５匹からなる３つの治療群に無作為に分けた。移植１日後、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ５２Ａ３０１．５試験抗体または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に３００μｌの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、同一の様式で、１週間に１回、７週間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって７日毎に８週間にわたって測定するか、各動物がＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）エンドポイントに到達するまで測定した。動物の体重を、１週間に１回、研究期間にわたって記録した。研究終了時に、ＣＣＡＣガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
【０１４７】
ＡＲ５２Ａ３０１．５はまた、ヒト膵臓癌のｉｎ  ｖｉｖｏ予防モデルで、腫瘍成長を防止し、全身腫瘍組織量を減少させた。移植５５日後（最後の投与の６日後）に、ＡＲ５２Ａ３０１．５処置群の平均腫瘍体積は、緩衝液コントロール処置群より７０％減少した（ｐ＜０．００２；図４）。
【０１４８】
研究を通して、毒性の臨床的徴候は認められなかった。図５に示す体重を、健康および成長障害の代替物として使用した。群内で、研究期間にわたって、コントロール群で有意でない１０％の体重増加が認められた。その上、ＡＲ５２Ａ３０１．５処置群で有意でない体重増加（平均１９．６  ｇ〜２１．２ｇの８％の増加）が認められた。
【０１４９】
まとめると、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、このヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて十分に耐性を示し、全身腫瘍組織量を減少させた。
【０１５０】
実施例４
ＢｘＰＣ−３細胞を使用したｉｎ  ｖｉｖｏでの確立腫瘍の実験
ヒト膵臓癌のＢｘＰＣ−３モデルに対するＡＲ５２Ａ３０１．５の有効性をさらに決定するために、抗体を、確立されたＢｘＰＣ−３異種移植片モデルに対して試験した。図６および７を参照して、６〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、５００万個のヒト膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）を含む１００μｌの生理食塩水を、首筋への皮下注射によって移植した。腫瘍成長を、カリパスによって毎週測定した。コホートの大部分が移植３３日後に平均腫瘍体積が８５ｍｍ３（５６〜１１１の範囲）に到達した場合、９匹のマウスを、２つの治療群にそれぞれ無作為に割り当てた。ＡＲ５２Ａ３０１．５試験抗体または緩衝液コントロールを、２０ｍｇ／ｋｇの抗体用量で、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に３００μｌの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体を、同一の様式で、移植５３日後まで１週間に３回、全部で１０回投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約７日毎に移植６３日後までか、各動物がＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）エンドポイントに到達するまで測定した。動物の体重を、１週間に１回、研究期間にわたって記録した。研究終了時に、ＣＣＡＣガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
【０１５１】
ＡＲ５２Ａ３０１．５は、確立ヒト膵臓癌モデルにおいて全身腫瘍組織量を有意に減少させた。５４日目に、ＡＲ５２Ａ３０１．５治療動物の平均腫瘍体積は、コントロール動物治療動物の平均腫瘍体積の５８％であった（ｐ＜０．００２；図６）。これらの結果は、ＡＲ５２Ａ３０１．５の５１％のＴ／Ｃに相当する。
【０１５２】
１週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代替物として使用した。図７に認められるように、研究終了時の２つの抗体処置群およびコントロールの間で平均体重に有意差は認められなかった。さらに、全群の体重は、研究を通して有意に変化しなかった。
【０１５３】
まとめると、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、この確立ヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて十分に耐性を示し、全身腫瘍組織量を減少させた。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、ヒト膵臓癌の防止モデル確立モデルにおける有効性を証明した。
【０１５４】
実施例５
ＰＬ４５細胞を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍予防実験
実施例３および４は、ＡＲ５２Ａ３０１．５がヒト膵臓癌細胞株に対して抗癌性を示すことを証明した。ヒト膵臓細胞株に対するＡＲ５２Ａ３０１．５の有効性を決定するために、抗体を、ＰＬ４５ヒト膵臓癌の異種移植片モデルに対して試験した。図８、９、および１０を参照して、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、５００万個のヒト膵臓癌細胞（ＰＬ４５）を含む１００μｌのＰＢＳ溶液を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、１０匹からなる２つの治療群に無作為に分けた。移植１日後、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ５２Ａ３０１．５試験抗体または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に３００μｌの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、１週間に１回、研究期間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約７日毎に測定した。９回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって１週間に１回記録した。研究終了時に、ＣＣＡＣガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
【０１５５】
ＡＲ５２Ａ３０１．５は、ヒト膵臓癌細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ予防モデルで、ＰＬ４５の腫瘍成長を有意に阻害した。コントロール群および抗体治療群のほとんど全てのマウスが依然として生存している場合、７７日目（最後の抗体投与の２０日後）に決定したところ、ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５での処置により、ＰＬ４５腫瘍の成長は、緩衝液処置群と比較して、４６．８％減少した（ｐ＝０．０００６８、ｔ検定）（図８）。研究を１２０日目（最後の投与の４５日後）まで継続し、その時点で、腫瘍体積のためにコントロール群を研究から排除した。しかし、ＡＲ５２Ａ３０１．５治療群の４０％が、この時点で依然として生存していた（図９）。
【０１５６】
研究を通して、毒性の臨床的徴候は認められなかった。１週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代わりにした。研究期間にわたって、全群で平均体重が増加した（図１０）。１３日目と７７日目との間の平均体重増加は、コントロール群で３．３９ｇ（１７．４％）およびＡＲ５２Ａ３０１．５治療群で２．８６ｇ（１４．５％）であった。治療期間または７７日目（最後の投与の２０日後）の各群の間で有意差は認められなかった。
【０１５７】
まとめると、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、７７日目にこのヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて十分に耐性を示し、全身腫瘍組織量を有意に減少させた。ＡＲ５２Ａ３０１．５治療はまた、緩衝液治療と比較して、生存率の増加も証明した。したがって、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、２つの異なるヒト膵臓癌モデルで有効性を証明した。
【０１５８】
実施例６
ＰＣ−３細胞を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍予防実験
実施例３、４、および５は、ＡＲ５２Ａ３０１．５が２つの異なるヒト膵臓癌異種移植片モデルに対して抗癌性を示すことを証明した。異なるヒト癌異種移植片モデルに対するＡＲ５２Ａ３０２．５の有効性を決定するために、抗体を、ＰＣ−３前立腺癌異種移植片モデルに対して試験した。図１１、１２、および１３を参照して、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、５００万個のヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を含む１００μｌのＰＢＳ溶液を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、１０匹からなる２つの治療群に無作為に分けた。移植１日後、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ５２Ａ３０１．５試験抗体または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に３００μｌの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、１週間に１回、研究期間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約７日毎に測定した。８回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって１週間に１回記録した。研究終了時に、エンドポイントに到達した場合のＣＣＡＣガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
【０１５９】
ＡＲ５２Ａ３０１．５は、ヒト前立腺癌のＰＣ−３ｉｎ  ｖｉｖｏ予防モデルで、腫瘍成長を阻害した。コントロール群および抗体治療群のほとんど全てのマウスが依然として生存している場合、５回投与後の３２日目に決定したところ、ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５での処置により、ＰＣ−３腫瘍の成長は、緩衝液処置群と比較して、３０．９％減少した（ｐ＝０．０１４４３、ｔ検定）（図１１）。研究を４７日目（最後の投与の３日前）まで継続し、その時点で、腫瘍体積／病変のためにコントロール群の全マウスを研究から排除した。しかし、ＡＲ５２Ａ３０１．５治療群のマウスの４０％が、この時点で依然として生存していた（図１２）。
【０１６０】
研究を通して、毒性の明らかな臨床的徴候は認められなかった。１週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代わりにした。平均体重は、比較的一定のままであった（図１３）。治療期間中および／または３２日目（５回投与後）の各群の間で有意差は認められなかった。
【０１６１】
まとめると、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、このヒト前立腺癌異種移植片モデルにおいて十分に耐性を示し、腫瘍成長を減少させた。抗体を使用した処置はまた、コントロール群と比較して生存に有利であることが証明された。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、２つの異なるヒト癌適応症（膵臓および前立腺）に対する有効性が証明された。
【０１６２】
実施例７
Ｃｏｌｏ２０５細胞を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍予防実験
実施例３、４、５、および６は、ＡＲ５２Ａ３０１．５が２つの異なるヒト膵臓癌および前立腺癌の異種移植片モデルに対して抗癌性を示すことを証明した。異なるヒト癌異種移植片モデルに対するＡＲ５２Ａ３０２．５の有効性を決定するために、抗体を、Ｃｏｌｏ２０５結腸癌異種移植片モデルに対して試験した。図１４および１５を参照して、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、５００万個の結腸癌細胞（Ｃｏｌｏ２０５）を含む１００μｌのＰＢＳ溶液を、各マウスの右脇腹への皮下注射によって移植した。マウスを、１０匹からなる２つの治療群に無作為に分けた。移植１日後、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ５２Ａ３０１．５試験抗体または緩衝液コントロールを、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に３００μｌの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、最初の２週間は１週間に１回、さらなる３週間は１週間に２回投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約３〜４日毎に測定した。８回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって腫瘍を測定した時に記録した。研究終了時に、エンドポイントに到達した場合のＣＣＡＣガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
【０１６３】
ＡＲ５２Ａ３０１．５は、ヒト結腸癌のＣｏｌｏ２０５ｉｎ  ｖｉｖｏ予防モデルで、腫瘍成長を有意に阻害した。２７日目（最後の投与の４日前）に決定したところ、ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５での処置により、Ｃｏｌｏ２０５結腸腫瘍の成長は、緩衝液処置群と比較して、３５．９％減少した（ｐ＝０．０１８７２、ｔ検定）（図１４）。
【０１６４】
研究を通して、毒性の明らかな臨床的徴候は認められなかった。１週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代わりにした。治療期間を通して、群間で平均体重の有意差は認められなかった（図１５）。
【０１６５】
まとめると、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、このヒト結腸癌異種移植片モデルにおいて十分に耐性を示し、腫瘍成長を有意に減少させた。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、３つの異なるヒト癌適応症（膵臓、前立腺、および結腸）に対する有効性が証明された。２つの異なる十分に認識されたヒト癌疾患モデルで治療上の利点が認められ、他の哺乳動物（ヒトが含まれる）における治療法についてのこの抗体の薬理学的利点および薬学的利点が示唆された。
【０１６６】
実施例８
抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５のヒトＴＲＯＰ−２との交差反応の同定
ウェスタンブロットの結果により、ＡＲ５２Ａ３０１．５が抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２（ヒトＴＲＯＰ−２に結合することが公知；図１６）によって認識される性質に類似の性質のバンドと交差作用することが示唆された。ＡＲ５２Ａ３０１．５によって認識される抗原をさらに特徴づけるために、この抗体を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）細胞の全膜画分由来のＡＲ４７Ａ６．４．２を使用して調製した免疫複合体のウェスタンブロットのプローブとして使用した。
【０１６７】
全細胞膜を、ＭＢ−２３１乳癌細胞のコンフルエントな培養物から調製した。細胞スタックから培地を除去し、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を、分離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して、プラットフォーム震盪機にて３７℃で２０分間分離した。細胞を回収し、９００ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁し、９００ｇにて４℃で１０分間遠心分離することによって洗浄した。次いで、ペレットを、必要になるまで−８０℃で保存した。膜を調製するために、細胞ペレットを解凍し、５０ｍＬの完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ；Ｌａｖａｌ  ＱＣ）あたり１錠を含む均質化緩衝液を、１ｇの細胞あたり３ｍＬの緩衝液の比率で再懸濁した。細胞懸濁液を、氷上のｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを使用した均質化に供して、細胞を溶解した。細胞ホモジネートを、１５，０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離して、核粒子を除去した。上清を採取し、管に分割し、７５，６００ｇにて４℃で９０分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、各膜ペレットを、約５ｍＬの均質化緩衝液に再懸濁した。全管由来の膜ペレットを合わせ、再度分割し、７５，６００ｇにて４℃で９０分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、ペレットを秤量した。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む可溶化緩衝液を、１ｇの膜ペレットあたり３ｍＬの緩衝液の比率でペレットに添加した。氷上のプラットフォーム震盪機での３００ｒｐｍで１時間の震盪によって膜を溶解した。膜上清を、７５，６００ｇで遠心分離して、可溶性物質をペレット化した。可溶化膜タンパク質を含む上清を管から慎重に取り出し、タンパク質濃度をアッセイし、−８０℃で保存した。
【０１６８】
ＭＢ−２３１の全膜画分を、１×ＲＩＰＡ緩衝液で１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に希釈した。このサンプルを、同一サイズの２つのアリコートに分割した。各アリコートを、ＡＲ４７Ａ６．４．２または８Ａ３Ｂ．６アイソタイプコントロール抗体のいずれかと抱合した抗体抱合タンパク質Ｇセファロースと４℃で２時間インキュベーションした。洗浄後、各抗体抱合ビーズサンプルを、２つの同一アリコートに分けた。ＩＰサンプル組の１つおよびそれぞれのＡＲ４７Ａ６．４．２および８Ａ３Ｂ．６抱合「偽ＩＰ」ビーズの１組を、１×非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で再懸濁し、第２の組を１×還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で再懸濁した。ボイル後、各サンプル由来の同一アリコートを、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）レーンにロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルをＰＶＤＦ膜に移し、後者を５％ミルクを含むＴＢＳＴで１時間ブロッキングし、その後に抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２、ＡＲ５２Ａ３０１．５、アイソタイプコントロール抗体８Ａ３Ｂ．６と共に、または一次抗体なしでブロッキング緩衝液中にて室温で２時間インキュベーションした。上記のようにブロットを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）とインキュベーションし、ブロッキング緩衝液で希釈し、室温で１時間インキュベーションした。上記のように洗浄後、製造者の説明書にしたがって、ブロットをＥＣＬ  Ｐｌｕｓ試薬で発色させた。この実験由来の結果（図１７）は、抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５はＡＲ４７Ａ６．４．２によって免疫沈降した抗原と特異的に交差反応し、後者の抗体によって認識される抗原と同一の見かけ上の分子量を有することを証明する。結果はまた、ウェスタンブロットのプローブとして使用した場合、ＡＲ４７Ａ６．４．２の交差反応性は、ＡＲ４７Ａ６．４．２免疫複合体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液とのボイルによって消失することを示す。しかし、還元条件下でのＡＲ５２Ａ３０１．５の同一の免疫複合体との交差反応性は検出可能な影響を受けず、両抗体が同一抗原上の異なるエピトープと交差反応し得ることが示唆された。ＡＲ４７Ａ６．４．２によって認識されるエピトープがジスルフィド結合依存性高次構造エピトープのようであり、ＡＲ５２Ａ３０１．５によって認識されるエピトープの場合ではないようである。
【０１６９】
抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５によって認識される抗原の性質をさらに確立するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で調製した組換えヒトＴＲＯＰ−２のウェスタンブロット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、ＡＲ５２Ａ３０１．５およびＡＲ４７Ａ６．４．２で探索した。この実験由来の結果（図１８）は、ＡＲ４７Ａ６．４．２およびＡＲ５２Ａ３０１．５の両方が組換えＴＲＯＰ−２と特異的に交差反応することを示す。したがって、本発明者らは、モノクローナル抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５によって認識されるエピトープもヒトＴＲＯＰ−２抗原内に含まれていたと結論づけることができる。
【０１７０】
実施例９
脱グリコシル化研究
ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合に及ぼすグリコシル化の影響を決定するために、製造者（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の説明書通りに変性条件下および非変性条件下で脱グリコシル化反応を設定した。変性反応のために、０．４μｇの組換えＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）または１００μｇのＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（上記のように単離）を、水で３０μｌに希釈した。１０μｌのインキュベーション緩衝液（５×、０．２５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）および２．５μｌの変性溶液（２％ＳＤＳ、１Ｍ  β−メルカプトエタノール）を添加し、反応物を５分間ボイルした。一旦反応物が室温に冷却すると、２．５μｌの界面活性剤溶液（１５％ＮＰ−４０）および１μｌの以下の各酵素を添加した：Ｎ−グリカナーゼ（登録商標）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（≧５Ｕ／ｍＬ）、シアリダーゼＡ（商標）（≧５Ｕ／ｍＬ）、Ｏ−グリカナーゼ（登録商標）（≧１．２５Ｕ／ｍＬ）、β（１−４）ガラクトシダーゼ（３Ｕ／ｍＬ）、およびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（４０Ｕ／ｍＬ）。脱グリコシル化酵素の代わりに５μｌの水を含むコントロール反応物を含めた。非変性反応のために、０．４μｇのｒｈＴＲＯＰ−２または１００μｇのＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質を、水で３５μｌに希釈した。上記列挙の１μｌの各酵素と共に１０μｌのインキュベーション緩衝液を添加した。脱グリコシル化酵素の代わりに５μｌの水を含むコントロール反応物を含めた。全反応物を、３７℃で２４時間インキュベーションした。
【０１７１】
脱グリコシル化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための反応物を調製した。１６．７μｌの還元または非還元サンプルロード緩衝液（４×）を、変性反応物および非変性反応物にそれぞれ添加した。サンプルを５分間ボイルし、室温に冷却した。１６．７μｌの各反応物を、四連の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。色素の前側がはみ出すまで、ゲルを１５０Ｖで泳動した。タンパク質を、４０Ｖで一晩ＰＶＤＦ膜に移した。膜を、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）を使用して調製した５％ミルクで１時間ブロッキングし、その後に一次抗体と２時間インキュベーションした。各一次抗体を、５％ミルクで５μｇ／ｍＬに希釈し、抗ヒトＴＲＯＰ−２以外は、２μｇ／ｍＬに希釈した。ブロットを、ＡＲ５２Ａ３０１．５、抗ヒトＴＲＯＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、または１Ｂ７．１１（所内で産生）ＩｇＧ１アイソタイプコントロールの１つとインキュベーションした。一次抗体のインキュベーション後、ブロットをＴＢＳＴで３回（それぞれ１０分間）洗浄した。ブロットを、５％ミルクで５０，０００倍希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ二次抗体と１時間インキュベーションし、次いで、ＴＢＳＴで３回洗浄した（各１０分間）。ブロットを、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｆｏｒｍｅｒｌｙ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＸ線現像液で現像した。
【０１７２】
図１９〜２１は、ＡＲ５２Ａ３０１．５、抗ヒトＴＲＯＰ−２、および１Ｂ７．１１  ＩｇＧ１アイソタイプコントロールでそれぞれ探索した３ブロットの結果を示す。図１９（ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索したブロット）は、レーン１に類似のサイズのバンドを示す。このバンドは、図２０（抗ヒトＴＲＯＰ−２で探索したブロット）で検出できない。レーン２由来のサンプルの反応性バンド（非変性および脱グリコシル化ＭＢ−２３１の全膜画分）は、約３７ｋＤａにシフトし、ＡＲ５２Ａ３０１．５（図１９）および市販の抗ＴＲＯＰ−２抗体（図２０）ブロットによって認識されるが、アイソタイプコントロール（図２１）によって認識されなかった。いかなるブロットにおいてもレーン５または６（変性、非脱グリコシル化、および脱グリコシル化したＭＢ−２３１の全膜画分）中にバンドは検出されず、抗体が還元条件下での全膜画分中の標的タンパク質に検出可能に結合しなかったことを示す。
【０１７３】
組換えヒトＴＲＯＰ−２は、図１９および２０（ＡＲ５２Ａ３０１．５および抗ヒトＴＲＯＰ−２でそれぞれ探索されたブロット）中のレーン３および４（それぞれ、非変性非脱グリコシル化および脱グリコシル化ｒｈＴＲＯＰ−２）に非常に強い非常に高分子量のバンド（見かけ上の分子量２２ＯｋＤａ超）として出現し、これは、ｒｈＴＲＯＰ−２のジスルフィド結合によって結合した多量体に相当する。図１９（ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索したブロット）中のレーン３（非変性非脱グリコシル化ｒｈＴＲＯＰ−２）中の約７０ｋＤａおよびレーン４（非変性および脱グリコシル化ｒｈＴＲＯＰ−２）中の約５５ｋＤａの強度の低いバンドが出現し、これは、ｒｈＴＲＯＰ−２の単量体形態に相当する。それぞれ２２０ｋＤａおよび７０ｋＤａを超える多量体バンドおよび単量体バンドの両方の見かけ上の分子量の２２０ｋＤａおよび５５ｋＤａ未満へのシフト（レーン３および４）は、脱グリコシル化による炭水化物基の喪失に起因する。還元条件下で（レーン７および８）、ｒｈＴＲＯＰ−２はより小さな単量体ポリペプチドとしてのみ検出され、グリコシダーゼ混合物での処理の際に見かけ上の分子量が約２０ｋＤａ減少する（図２０）。図２１（アイソタイプコントロール抗体１Ｂ７．１１で探索したブロット）は、いかなるレーンにおいても反応性を示さない。
【０１７４】
使用した全ての抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体（ＡＲ５２Ａ３０１．５および市販の抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体）は、グリコシダーゼ混合物での処理前および処理後にＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の全膜調製物中のヒトＴＲＯＰ−２抗原および精製組換えヒトＴＲＯＰ−２を認識した。この結果により、本実験で使用される特定のグリコシダーゼ混合物によって除去されなかった炭水化物基に結合することができるということを除外できないにもかかわらず、抗体が非炭水化物エピトープ（おそらく、ポリペプチドエピトープ）を認識することができることが示唆される。
【０１７５】
実施例１０
競合実験
ＡＲ４７Ａ６．４．２およびＡＲ５２Ａ３０１．５の結合特性をさらに特徴づけるために、ＡＲ４７Ａ６．４．２およびＡＲ５２Ａ３０１．５がＴＲＯＰ−２の類似のエピトープまたは異なるエピトープを認識するかどうかを決定するためのウェスタンブロットによって、抗体競合実験を行った。ヒトＴＲＯＰ−２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含み、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって発現される２μｇの組換え融合ポリペプチドを、２つの各１０％ポリアクリルアミドゲルの全長に及ぶ分離ウェルコームを使用した非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲル由来のタンパク質を、４０Ｖにて４℃で約１７時間、ＰＶＤＦ膜に移した。膜を、震盪プラットフォーム上で５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴにて室温で１時間ブロッキングした。膜を、約２０ｍＬのＴＢＳＴで２回洗浄し、２０の個別のチャネルを作製し、そこに異なる探索溶液を適用したウェスタンマルチスクリーン装置に入れた。事前にビオチン化したＡＲ４７Ａ６．４．２およびＡＲ５２Ａ３０１．５を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＯ固相ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して調製した。一次抗体溶液を、ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２またはビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５の種々の濃度の非ビオチン化抗体との混合によって調製した。具体的には、０．０５μｇ／ｍＬのビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５を含む３％脱脂粉乳のＴＢＳＴ溶液＋０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、または１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化抗体を含む溶液を調製した。使用した非ビオチン化抗体は、ＡＲ５２Ａ３０１．５、ＡＲ４７Ａ６．４．２、およびコントロール抗体８Ａ３Ｂ．６（抗ブルータングウイルス；ＩｇＧ２ａ、κ、所内で精製）であった。０．０５μｇ／ｍＬのビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２を含む溶液を、上記と同一濃度の非ビオチン化抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５、ＡＲ４７Ａ６．４．２、およびコントロール抗体１Ｂ７．１１（抗ＴＮＰ；ＩｇＧ１、κ、２０μｇ／ｍＬ、所内で精製）を使用して調製した。３％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴからなるネガティブコントロール溶液を、各膜上の２つのチャネルに添加した。
【０１７６】
一次抗体溶液を、膜上の個別のチャネル中にて震盪プラットフォーム上にて室温で２時間インキュベーションした。各チャネルを、震盪プラットフォーム上にてＴＢＳＴを使用して１０分間で３回洗浄した。３％ミルクを含むＴＢＳＴ溶液のみをネガティブコントロールとして適用した各膜上の１つのチャネルを除き、０．０１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）を含む３％脱脂粉乳のＴＢＳＴ溶液からなる二次溶液を、膜上の各チャネルに適用した。膜を、震盪プラットフォーム上にて室温で１時間二次溶液中でインキュベートした。各チャネルを、震盪プラットフォーム上にてＴＢＳＴを使用して１０分間で３回洗浄した。膜を、マルチスクリーン装置から取り出し、製造者の説明書に従って化学発光増強検出溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｆｏｒｍｅｒｌｙ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）とインキュベートした。次いで、膜を、フィルムに露光し、現像した。
【０１７７】
図２２および２３は、抗体競合実験の結果を示す。ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合は、５０μｇ／ｍＬおよびそれを超える濃度の非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５で完全に阻害される一方で（１０００倍過剰；図２２のレーン３〜７）、ＡＲ４７Ａ６．４．２の結合は、５００μｇ／ｍＬおよびこれを超える濃度の非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２で完全に阻害される（１００００倍過剰；図２３のレーン９〜１３）。ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合は、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体を含むいかなるサンプル中でも阻害されず（図２２のレーン５〜１９）、ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２の結合は、ＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体を含むいかなるサンプル中でも阻害されなかった（図２３のレーン１５〜１９）。これは、同一の非ビオチン化抗体と混合したビオチン化抗体を用いて認められた結合の阻害が、過剰な抗体のみの非特異的相互作用ではなく、非ビオチン化抗体による抗原結合部位の占領に起因していたことを示す。ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合は、ＡＲ４７Ａ６．４．２を含む任意のサンプル中で完全に阻害されず、ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２の結合は、ＡＲ５２Ａ３０１．５を含む任意のサンプル中で完全に阻害されなかった。しかし、両ウェスタンブロットでは、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの他の非ビオチン化ＴＲＯＰ−２抗体での各ビオチン化ＴＲＯＰ−２抗体の反応性は、過剰なアイソタイプコントロール抗体の対応するレーンよりも強度が低かった。これらの結果は、ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合がＡＲ４７Ａ６．４．２のＴＲＯＰ−２への結合およびその逆を防止しないことを示す。まとめると、競合ウェスタンブロットの結果により、ＡＲ４７Ａ６．４．２およびＡＲ５２Ａ３０１．５によって認識されるＴＲＯＰ−２分子のエピトープは相互に異なるが、一方の抗体の結合が他方の結合に影響を及ぼすことが示唆される。
【０１７８】
実施例１１
ヒト正常組織の染色
ヒト正常組織中のＡＲ５２Ａ３０１．５抗原分布を特徴づけるためにＩＨＣ研究を行った。スライドを、冷（−２０℃）アセトン中で１０分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、４℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でそれぞれ２分間で３回リンスし、その後に、３％過酸化水素中で１０分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、ＰＢＳ中にて５分間で３回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）中にて室温で５分間インキュベーションした。ＡＲ５２Ａ３０１．５、抗ヒト筋肉アクチン（Ｃｌｏｎｅ  ＨＨＦ３５，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、抗ＴＲＯＰ−２クローン７７２２０．１１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．，ＭＮ，ＵＳＡ）、またはアイソタイプコントロール抗体（クロコウジカビグルコースオキシダーゼ（哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素）に指向する；Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を、抗体希釈緩衝液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）でその作業濃度（０．５μｇ／ｍＬであった抗アクチンおよび市販のＴＲＯＰ−２が１μｇ／ｍＬであったことを除き、各抗体について５μｇ／ｍＬ）に希釈し、室温で１時間（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｆｏｒ  １  ｈｏｕｒ）インキュベーションした。スライドを、ＰＢＳにて各２分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のＨＲＰ抱合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）にて室温で３０分間検出／視覚化した。この工程の後、スライドを、ＰＢＳにて各５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）色素原基質溶液の室温で１０分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Ｍｅｙｅｒヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）での対比染色後、スライドを段階的エタノール（７５〜１００％）で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｉｅｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して顕微鏡的に試験し、デジタル画像を撮り、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理組織学者によって解明した。
【０１７９】
１２種のヒト正常器官、卵巣、膵臓、甲状腺、脳（大脳、小脳）、肺、脾臓、子宮、子宮頸部、心臓、皮膚、および骨格筋への抗体の結合を、ヒト正常組織スクリーニングアレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。組織マイクロアレイは、２０種のヒト正常器官を含んでいたが、そのうちの８種は、剥離またはバックグラウンド染色のいずれかによって制限不可能であった。図２４は、ヒト正常組織アレイのＡＲ５２Ａ３０１．５染色の結果のまとめを示す。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、上皮組織（血管内皮、甲状腺の濾胞上皮、膵臓の腺房および導管上皮、肺胞上皮、皮膚の表皮角化細胞）の制限された結合を示した。抗体はまた、脾臓のリンパ組織への曖昧な結合および脳神経組織の負の結合を示した（図２５）。細胞局在化は、拡散した染色パターンで、細胞質および膜質で起こった。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、市販の抗ＴＲＯＰ−２抗体よりもヒト正常組織への結合が制限された。
【０１８０】
実施例１２
多腫瘍組織染色
ヒト癌中のＡＲ５２Ａ３０１．５抗原の蔓延（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を特徴づけるためにＩＨＣ研究を行った。スライドを、−８０℃から−２０℃に移した。１時間後、スライドを、冷（−２０℃）アセトン中で１０分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、４℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でそれぞれ２分間で３回リンスし、その後に、３％過酸化水素中で１０分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、ＰＢＳ中にて５分間で３回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）中にて室温で５分間インキュベーションした。ＡＲ５２Ａ３０１．１０、抗サイトケラチン７クローンＯＶ−ＴＬ  １２／３０（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、またはアイソタイプコントロール抗体（クロコウジカビグルコースオキシダーゼ（哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素）に指向する；Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を、抗体希釈緩衝液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）でその作業濃度（０．５μｇ／ｍＬであった抗アクチンおよび直ぐに使用できる抗サイトケラチン７を除き、各抗体について５μｇ／ｍＬ）に希釈し、室温で１時間インキュベーションした。スライドを、ＰＢＳにて各２分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のＨＲＰ抱合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）にて室温で３０分間検出／視覚化した。この工程の後、スライドを、ＰＢＳにて各５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）色素原基質溶液の室温で１０分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Ｍｅｙｅｒヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）での対比染色後、スライドを段階的エタノール（７５〜１００％）で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。膵臓アレイ（Ｔｒｉ  Ｓｔａｒ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のために、以下の修正を除いて、同一のプロトコールに従った。組織切片を最初に室温で２時間風乾し、アセトンでの固定後に３０分間再度風乾した。３％過酸化水素を含むメタノールを使用して、内因性過酸化水素を１５分間ブロッキングした。この工程を、一次抗体インキュベーション後に行った。
【０１８１】
スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｉｅｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して顕微鏡的に試験し、デジタル画像を撮り、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理組織学者によって解明した。
【０１８２】
図２６は、種々のヒト腫瘍およびその対応する正常組織切片（８結腸癌、９卵巣癌、および２正常卵巣、１０乳癌、および３正常乳房、９肺癌および２正常肺、１３前立腺癌および３正常前立腺、ならびに１３膵臓癌および４正常膵臓）のＡＲ５２Ａ３０１．５染色の結果のまとめを示す。組織は、３つの異なる組織マイクロアレイ（Ｔｒｉ  Ｓｔａｒ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）上に分布した。ＡＲ５２Ａ３０１．５抗体は、結腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、および膵臓癌に中等度から強い結合を示した（ぞれぞれ、４／８（５０％）、７／９（７８％）、７／１０（７０％）、６／９（６７％）、１２／１３（９２％）、および２／１３（１５％））（図２７）。さらに、結腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、および膵臓癌の切片に曖昧から弱い結合が認められた（それぞれ、３／８（３８％）、１／９（１１％）、３／１０（３０％）、３／９（３３％）、および１／１３（８％））。全ての試験した腫瘍では、結合は腫瘍細胞に特異的であった。対応する正常組織について、抗体は、２／２の卵巣組織および１／３の乳房組織に結合を示さなかった。１／２の肺および４／４の膵臓の正常組織で曖昧から弱い結合が認められ、２／３の乳房、１／２の肺、および３／３の前立腺の正常組織への中程度から強い結合も認められた。結合は、正常器官の上皮組織に制限された。ポジティブコントロール抗体である抗サイトケラチン７または抗アクチンは、上皮組織および筋肉組織にそれぞれ予想される正の結合を示した。負のＩｇＧアイソタイプコントロールは、いかなる試験組織にも検出可能な結合を示さなかった。
【０１８３】
実施例１３
多種組織染色
種々の種の凍結正常組織のＡＲ５２Ａ３０１．５抗原交差反応性を特徴づけて前臨床毒物学モデルを選択するために、ＩＨＣ研究を行った。ＳＣＩＤマウス正常組織（所内で採取）、ラット正常組織アレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、多種脳アレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および多種肝臓アレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）の切片を、−８０℃から−２０℃に移した。１時間後、スライドを、冷（−２０℃）アセトン中で１０分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、４℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でそれぞれ２分間で３回リンスし、その後に、３％過酸化水素中で１０分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、ＰＢＳ中にて５分間で３回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）中にて室温で５分間インキュベーションした。ＡＲ５２Ａ３０１．５、抗Ｇｒｐ９４（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）、抗ヒト筋肉アクチン（Ｃｌｏｎｅ  ＨＨＦ３５，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、またはアイソタイプコントロール抗体（クロコウジカビグルコースオキシダーゼ（哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素）に指向する；Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を、抗体希釈緩衝液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）でその作業濃度（０．５μｇ／ｍＬであった抗アクチンを除き、各抗体について５μｇ／ｍＬ）に希釈し、室温で１時間インキュベーションした。スライドを、ＰＢＳにて各２分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のＨＲＰ抱合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）にて室温で３０分間検出／視覚化した。この工程の後、スライドを、ＰＢＳにて各５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）色素原基質溶液の室温で１０分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Ｍｅｙｅｒヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）での対比染色後、スライドを段階的エタノール（７５〜１００％）で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。ヒト、カニクイザル、ウサギ、ハムスター、およびアカゲザルの各切片（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のために、以下の修正を用いて、同一のプロトコールに従った。最初の工程について、組織切片を室温で３０分間風乾し、アセトン固定を用いずに冷ＰＢＳで洗浄した（製造者由来の切片は、アセトン固定されていた）。３％過酸化水素を含むメタノールを使用して、内因性過酸化水素を２０分間ブロッキングした。この工程を、一次抗体インキュベーション後に行った。
【０１８４】
一次抗体の免疫反応性を、入手した状態の抗マウスＨＲＰ抱合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）にて室温で３０分間検出／視覚化した。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｉｅｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して顕微鏡的に試験し、デジタル画像を撮り、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理組織学者によって解明した。
【０１８５】
ＳＣＩＤマウス正常組織（所内で採取）、ラット、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウシ、ウマ、イヌ、およびブタの脳組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ラット、ヤギ、ニワトリ、およびウシ由来の肝臓組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ならびにヒト、カニクイザル、アカゲザル、ウサギ、ハムスター、およびモルモットの各組織切片（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のパネルへの抗体の結合を決定した。ポジティブコントロール抗体である抗体アクチン（クローンＨＨＦ３５，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）は、筋肉組織への予想される特異的結合を示した。ポジティブコントロール抗体である抗Ｇｒｐ９４（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ）は、主に上皮組織への予想される正の結合を示した。アイソタイプネガティブコントロール抗体（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）は、一般に、試験組織への検出可能な結合を示さなかった。ネガティブコントロール中に明らかなバックグラウンド染色を示した組織切片を、解釈から排除した。
【０１８６】
図２８は、ヒトおよび種々の正常組織のＡＲ５２Ａ３０１．５染色の結果を表にしている。ＡＲ５２Ａ３０１．５は、試験したウサギ、マウス、ラット、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、ニワトリ、ウマ、ウマ、またはブタの正常組織への結合を示さなかった。正常なイヌ組織について、対応するヒト組織で認められる結合と異なる結合が認められた。カニクイザル正常組織について、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、カニクイザルで結合が認められなかった卵巣を除く全ての試験器官について、対応するヒト組織に類似の組織特異性を示した（図２９）。アカゲザル正常組織について、ＡＲ５２Ａ３０１．５は、全ての試験器官の対応するヒト組織で認められる組織特異性と類似の組織特異性を示した（図２９）。アカゲザル正常組織パネルがカニクイザルについて試験したパネルより小さかったことに留意すべきである。染色プロフィールに基づいて、カニクイザルおよびアカゲザルの両方は、ＡＲ５２Ａ３０１．５に適切な毒物学モデルであると見なされる。
【０１８７】
実施例１４
ＡＲ５２Ａ３０１．５マウス配列
１．０  配列ベクターへの可変領域遺伝子のクローニング
抗体キメラの産生を容易にするために、重鎖および軽鎖の両方の可変領域をコードする遺伝子を、個別に市販の配列決定ベクターｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。
【０１８８】
１．１  ｍＲＮＡの単離
ＰｏｌｙＡ  Ｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０００  ｍＲＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）を、コンフルエントなＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＡＲ５２Ａ３０１．５）ハイブリドーマ細胞の培養物から単離した。ｍＲＮＡを、さらなる用途で必要になるまで−８０℃で保存した。
【０１８９】
１．２  可変領域遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅
軽鎖および重鎖の可変領域を増幅するために個別の反応を行った。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ｍＲＮＡテンプレートから相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を合成し、ターゲティングされた遺伝子を特異的に増幅した。
【０１９０】
軽鎖について、５．０μｌのｍＲＮＡを、１．０μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌのＭｕＩｇＧκＶＬ−３’プライマーＯＬ０４０および５．５μｌの無ヌクレアーゼ水（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合した。λ軽鎖について、５．０μｌのｍＲＮＡを、１．０μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌのＭｕＩｇＧλＶＬ−３’プライマーＯＬ０４２および５．５μｌの無ヌクレアーゼ水（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合した。γ重鎖について、５μｌのｍＲＮＡを、１．０μｌの２０ｐｍｏｌ／μｌのＭｕＩｇＧＶＨ−３’プライマーＯＬ０２３および５．５μｌの無ヌクレアーゼ水（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合した。３つ全ての反応混合物を、７０℃に設定したサーマルサイクラーの予熱ブロック中に５分間入れた。次いで、反応混合物を、氷上で５分間冷却し、その後、各４．０μｌのＩｍＰｒｏｍｍＩＩ  ５×反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．５μｌのＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．０μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１．０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、および１．０μｌのＩｍｐｒｏｍＩＩ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に添加した。これらの反応混合物を、室温で５分間インキュベーションし、その後、４２℃に設定した予熱ＰＣＲブロックに１時間移した。この後、逆転写酵素を、ＰＣＲブロック中での７０℃で１５分間のインキュベーションによって熱失活させた。
【０１９１】
次いで、重鎖および軽鎖の配列を、プライマープールを使用して特異的に増幅した（プライマー配列については、図３０を参照のこと；配列番号９〜４６）。プライマー作業溶液を、以下のように作製した。
１．５’単一プライマー（ＭｕＩｇＶＨ５’−ＡおよびＢ；ＭｕＩｇκＶＬｈ５’−Ａ、Ｂ、およびＣ；ＭｕＩｇλＶＬ５’−Ａ）は、２０μＭの濃度で各プライマーを含んでいた。
２．５’プライマープール（ＭｕＩｇＶＨ５’−Ｃ〜Ｆ；ＭｕＩｇκＶＬｈ５’−Ｄ〜Ｇ）は、５μＭの濃度で各構成性プライマーを含んでいた。
【０１９２】
重鎖および軽鎖の配列を、ｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲマスターミックスを、３７．５μｌの１０×Ｈｉ−Ｆｉ  Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、７．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、および３．７５μｌのＨｉ−Ｆｉ  Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２７３．７５μｌの無ヌクレアーゼ水に添加することによって調製した。このマスターミックスを、２１．５μｌアリコートで氷上の１５個の薄壁ＰＣＲ管に分注した。これらの６つの管に、２．５μｌのＭｕｌｇＶＨ−３’逆転写反応ミックスおよび１．０μｌの重鎖５’プライマーミックスＡ〜Ｆを添加した。別の７つの管に、２．５μｌのＭｕＩｇκＶＬ−３’逆転写反応物および１．０μｌの軽鎖５’プライマーミックスＡ〜Ｇを添加した。最後の管に、２．５μｌのＭｕＩｇλＶＬ−３’逆転写反応物および１．０μｌのλ軽鎖プライマーＭｕＩｇλＶＬ５’−Ａを添加した。反応物を、サーマルサイクラーのブロックに入れ、９５℃に２分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルで行った。最後に、ＰＣＲ産物を、７２℃で５分間加熱し、次いで、４℃で保存した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を使用して精製した。
【０１９３】
図３１は、ＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を示す。重鎖反応（レーン２〜７）は、ＭｕＩｇＶＨ５’−Ｂ（レーン３）およびＭｕＩｇＶＨ５’−Ｅ（レーン６）を使用して増幅した５００ｂｐの強いバンドを示す。軽鎖反応（レーン８〜１５）は、順方向プライマーＭｕＩｇκＶＬ５’−Ｇ（レーン１４）を使用して増幅した強い４５０ｂｐ産物のバンドを示す。これらの反応由来のＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を使用して精製した。
【０１９４】
１．３  配列決定ベクターへのクローニング
軽鎖Ｇおよび重鎖ＢおよびＥの精製ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターに個別にクローニングした。軽鎖および重鎖の両反応物を、５．０μｌの２×ライゲーション緩衝液、１．０μｌ  ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター、および１．０μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼへの３．０μｌの精製ＰＣＲ産物の添加によって調製した。製造者の説明書にしたがって、プラスミドを、サブクローニンググレードのＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント大腸菌（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。全形質転換のために、２．０μｌのライゲーション反応物を使用した。
【０１９５】
各反応由来の１００μｌの形質転換細胞を、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を含むＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）寒天（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）プレート上にプレートした。プレートを逆さにし、３７℃っでインキュベーションした。
【０１９６】
３つの各プレート由来の８つのクローンを選択し、これを使用して、２０μｌ滅菌水に接種した。３８５．２μｌ滅菌水、２５．５μｌジメチルスルホキシミド（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、５１μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、１０．２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、５．１μｌの５０ｐｍｏｌ／μｌプライマーＯＬ００１、５．１μｌの５０ｐｍｏｌ／μｌプライマーＯＬ００２、および２．５μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）の混合によってＰＣＲマスターミックスを調製した。このマスターミックスを、１９μｌアリコートで２４個のＰＣＲ反応管に分注した。これらの各反応管に、１．０μｌの接種したコロニー懸濁液を添加した。ＰＣＲ反応物を、サーマルサイクラーのブロックに入れ、９５℃に５分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間の２５サイクルで行った。最後に、ＰＣＲ産物を、７２℃で１０分間加熱した。次いで、各反応由来の５μｌを、１％アガロースゲルで泳動した。
【０１９７】
図３２は、ＡＲ５２Ａ３０１．５ＶＨ−Ｂの８コロニーおよびＡＲ５２Ａ３０１．５ＶＨ−Ｅの８コロニー由来のＰＣＲスクリーニング反応を示す。８個のＶＨＢコロニーのうちの７個（ＶＨＢ−２〜ＶＨＢ−８）（レーン２〜８）および８個のＶＨ−Ｅコロニーの１個（ＶＨＥ−２）（レーン１１）は、６５０ｂｐ産物バンドに陽性であり、５００ｂｐ産物のｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターへの首尾のよいクローニングを示す。残りのＶＨＢおよび７個のＶＨ−Ｅ反応物により、異なる分子量のバンドが得られ、５００ｂｐインサートの負の結果を示した。
【０１９８】
図３２はまた、ＡＲ５２Ａ３０１．５ＶＬ−Ｇの８コロニー由来のＰＣＲスクリーニング反応を示す。８個のＶＬＧコロニーのうちの４個（ＶＬＧ−２、ＶＬＧ−５、ＶＬＧ−６、およびＶＬＧ−７）（レーン１９、２２、２３、および２４）は、６００ｂｐ産物バンドに陽性であり、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターへの４５０ｂｐ産物の首尾のよいクローニングを示す。残りの４ＶＬ−Ｇ反応により、異なる分子量のバンドが産生され、４５０ｂｐインサートの負の結果を示した。
【０１９９】
各ライゲーション由来の最大で４個の正のコロニーを選択し、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を含む５ｍＬの２ＹＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）ブロスに接種した。培養物を、撹拌しながら３７℃で一晩インキュベーションした。Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を使用して、各培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２００】
１．４  ＤＮＡ配列決定
９個のＡＲ５２Ａ３０１．５ＶＬおよびＶＨクローン（ＶＬＧ−２、ＶＬＧ−５、ＶＬＧ−６、ＶＬＧ−７、ＶＨＢ−２、ＶＨＢ−３、ＶＨＢ−４、ＶＨＢ−５、およびＶＨＥ−２）由来のプラスミドＤＮＡを、Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌｔｄ．ＤＮＡ配列決定装置（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で配列決定した。配列を図３３および３４に列挙し、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引いた。図３３は、配列番号８を示し、下線を引いたＣＤＲを配列番号４〜６と指定する。図３４は配列番号７を示し、下線を引いたＣＤＲを配列番号１〜３と指定する。ＣＤＲの定義およびアミノ酸配列のナンバリングを、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に従って行う。Ｋａｂａｔナンバリングは、図３３および３４中のアミノ酸配列の上に列挙している。Ｋａｂａｔナンバリングに適合するために、ＡＲ５２Ａ３０１．５軽鎖ＣＤＲ３中にハイフン（図３３）を挿入した。
【０２０１】
正確なＡＲ５２Ａ３０１．５ＶＬ配列は、５’プライマーＭｕＩｇκＶＬ−Ｇで増幅した４つの全クローン中で見出された。正確なＡＲ５２Ａ３０１．５ＶＨ配列は、５’プライマーＭｕＩｇＶＨ−Ｂで増幅した４つの全クローンで見出された。５’プライマーＭｕＩｇＶＨ−Ｅで増幅した産物の配列は、マウスＩｇＧ配列と整列しなかった。
【０２０２】
実施例１５
競合結合薬の単離
抗体をかんがみて、当業者は、競合阻害ＣＤＭＡＢ（例えば、同一エピトープを認識する抗体である競合抗体）を生成することができる（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８：１５−１８（１９７３））。１つの方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原での免疫化が必要である。サンプルには、組織、単離タンパク質、または細胞株が含まれ得るが、これらに限定されない。得られたハイブリドーマを、競合アッセイを使用してスクリーニングすることができ、このアッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、またはウェスタンブロッティングなどの試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するアッセイである。別の方法は、ファージディスプレイ抗体ライブラリーおよび抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体のパニングを使用することができる（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１４：２９４−３００（２００３））。いずれにしても、標的抗原の少なくとも１つのエピトープへの元の標識抗体の結合を示す能力に基づいて抗体を選択する。したがって、かかる抗体は、元の抗体として抗原の少なくとも１つのエピトープを認識するという特徴を有するであろう。
【０２０３】
実施例１６
ＡＲ５２Ａ３０１．５モノクローナル抗体の可変領域のクローニング
ＡＲ５２Ａ３０１．５ハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）由来の可変領域の配列を決定した（実施例１４）。キメラＩｇＧおよびヒト化ＩｇＧを生成するために、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを、適切な発現用ベクターにサブクローニングすることができる。
【０２０４】
別の実施形態では、ＡＲ５２Ａ３０１．５またはその脱免疫化、キメラ、またはヒト化バージョンを、抗体を発現し、回収することができるようなトランスジェニック動物中での抗体をコードする核酸の発現によって産生する。例えば、回収および精製を容易にする組織特異的様式で、抗体を発現することができる。１つのかかる実施形態では、本発明の抗体を、授乳時に分泌させるために乳腺中で発現する。トランスジェニック動物には、マウス、ヤギ、およびウサギが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０５】
（ｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ（実施例１に概説）を、従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を使用して容易に単離および配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることができるが、免疫グロブリンタンパク質を産生しない場合、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによってＤＮＡを修飾することもできる。キメラ抗体またはハイブリッド抗体を、合成タンパク質化学における公知の方法（架橋剤に関連する方法が含まれる）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することもできる。例えば、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって免疫毒素を構築することができる。この目的に適切な試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチリミダートが含まれる。
【０２０６】
（ｉｉ）ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来の抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基を、しばしば「移入」残基といい、この用語は、典型的には、「移入」可変ドメインから引き継いでいる。げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列との対応するヒト抗体配列の置換によるＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓの方法によってヒト化することができる。（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７−４０２（２０００）での概説）。
【０２０７】
ヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析過程によって、ヒト化抗体を調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、これは、当業者に良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の探索可能な三次元高次構造を例示および表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の起こり得る役割を分析可能である（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析）。このような方法で、所望の抗体特性（標的抗原に対する親和性の増加など）が達成されるように、ＦＲ残基を選択し、コンセンサス配列および移入配列と組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関連する。
【０２０８】
（ｉｉｉ）抗体フラグメント
抗体フラグメントの産生のための種々の技術が開発されている。これらのフラグメントを、組換え宿主細胞によって産生することができる（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８−５５７（１９９９）；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０（２０００）に概説）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施形態では、ロイシンジッパーＧＣＮ４を使用してＦ（ａｂ’）２を形成して、Ｆ（ａｂ’）２分子のアセンブリを促進する。別のアプローチに従って、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。
【０２０９】
実施例１７
本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体を、癌の予防／治療用組成物として使用することができる。本発明の抗体を含む癌の予防／治療用組成物は毒性が低く、液体調製物の形態または適切な調製物の薬学的組成物としてヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に、経口または非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮下など）で投与することができる。本発明の抗体自体を投与することができるか、適切な組成物として投与することができる。投与に使用される組成物は、本発明の抗体またはその塩と共に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。かかる組成物を、経口または非経口投与に適切な薬学的調製物の形態で提供する。
【０２１０】
非経口投与のための組成物の例は、注射用調製物、座剤などである。注射用調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射、点滴、関節内注射などの投薬形態が含まれ得る。これらの注射用調製物を、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物を、本発明の抗体またはその塩の慣習的に注射のために使用される滅菌水性溶剤または油性溶剤への溶解、懸濁、または乳化によって調製することができる。注射用水性溶剤として、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の助剤などを含む等張液が存在する。注射用水性溶剤を、適切な可溶化剤（アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物））など）と組み合わせて使用することができる。油性溶剤として、油性溶剤として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などを使用する。油性溶剤を、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの溶解補助剤と組み合わせて使用することができる。このようにして調製した注射剤を、適切なアンプルに充填する。直腸投与のために使用される座剤を、本発明の抗体またはその塩と従来の座剤の基剤とのブレンドによって調製することができる。経口投与用組成物には、固体または液体の調製物、具体的には、錠剤（ドラジェおよびフィルムコーティング錠が含まれる）、丸薬、顆粒、散剤調製物、カプセル（軟カプセルが含まれる）、シロップ、乳濁液、懸濁液などが含まれる。かかる組成物を公知の方法によって製造し、かかる組成物は、薬学的調製物分野で慣習的に使用されるビヒクル、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。錠剤のためのビヒクルまたは賦形剤の例は、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウムなどである。
【０２１１】
有利には、上記で使用される経口または非経口用の組成物を、有効成分の用量に適合させた単位用量を有する薬学的調製物に調製する。かかる単位用量調製物には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射剤（アンプル）、座剤などが含まれるが、これらに限定されない。上記化合物の含有量は、一般に、単位投薬形態あたり５〜５００ｍｇである。上記抗体は、特に注射形態では約５〜約１００ｍｇ含まれ、他の形態には１０〜２５０ｍｇ含まれることが好ましい。
【０２１２】
本発明の抗体を含む上記予防／治療薬または調整剤の用量は、投与される被験体、標的疾患、容態、投与経路などに応じて変化し得る。例えば、治療／防止のために使用する場合（例えば、成人の乳癌）、本発明の抗体を、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で約１〜５回／日、好ましくは約１〜３回／日の頻度で静脈内に投与することが有利である。他の非経口投与および経口投与では、薬剤を、上記用量に相当する用量で投与することができる。容態が特に重篤である場合、容態にしたがって用量を増大させることができる。
【０２１３】
本発明の抗体を、そのまままたは適切な組成物の形態で投与することができる。投与に使用される組成物は、上記抗体またはその塩と共に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。かかる組成物を、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内注射、皮下注射など）に適切な薬学的調製物の形態で提供する。上記の各組成物は、他の有効成分をさらに含むことができる。さらに、本発明の抗体を、他の薬物（例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミドなど）、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシルなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシンなど）、植物由来抗腫瘍薬（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールなど）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカンなど）と組み合わせて使用することができる。本発明の抗体および上記薬物を、同時または時間をずらして患者に投与することができる。
【０２１４】
特に癌のための本明細書中に記載の治療方法を、他の抗体または化学療法薬の投与によって実施することもできる。例えば、特に結腸癌治療の場合、ＥＧＦＲに対する抗体（エルビタックス（登録商標）（セツキシマブ）など）も投与することができる。エルビタックス（登録商標）は、乾癬治療にも有効であることが示されている。組み合わせ用の他の抗体には、特に乳癌治療の場合のハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、特に結腸癌治療の場合のアバスチン（登録商標）、および特に非小細胞肺癌治療の場合のＳＧＮ−１５が含まれる。本発明の抗体を、同一または他の経路を介して、他の抗体／化学療法薬と同時または個別に投与することができる。
【０２１５】
使用される化学療法薬／他の抗体投与計画には、患者の容態の治療に最適であると考えられる任意の投与計画が含まれる。異なる悪性疾患には、特異的抗腫瘍抗体および特異的化学療法薬を使用する必要があり得、これらを一人一人の患者に合わせて決定する。本発明の好ましい実施形態では、化学療法薬を、抗体療法と同時、より好ましくは抗体療法後に投与する。しかし、本発明は任意の特定の方法または投与経路に制限されないことを強調すべきである。
【０２１６】
多数の証拠により、ＡＲ５２Ａ３０１．５が、ＴＲＯＰ−２上に存在するエピトープのライゲーションによって抗癌効果を媒介し、生存を延長することが示される。実施例８および９では、ＡＲ５２Ａ３０１．５抗体を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などの発現細胞から同族抗原を免疫沈降することができることを示している。さらに、実施例１、２、および１１〜１３では、ＡＲ５２Ａ３０１．５抗体を、例示の技術（ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣが含まれるが、これらに限定されない）を使用して、この抗体に特異的に結合するＴＲＯＰ−２抗原部分を発現する細胞および／または組織の検出で使用することができることを示している。
【０２１７】
したがって、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイを使用して、免疫沈降したＡＲ５２Ａ３０１．５抗原がかかる細胞または組織へのＡＲ５２Ａ３０１．５の結合を阻害することができることを示し得る。さらに、ＡＲ５２Ａ３０１．５抗体と同様に、他の抗ＴＲＯＰ−２抗体を使用して、ＴＲＯＰ−２抗原の他の形態を免疫沈降および単離することができ、この抗原を使用して、同一アッセイ型を使用して抗原を発現する細胞または組織への抗体の結合を阻害することができる。
【０２１８】
本明細書中に言及した全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、各刊行物が具体的且つ個別に参考として援用されることを示すのと同一の範囲で、本明細書中で参考として援用される。
【０２１９】
本発明の一定の形態を例示しているが、本明細書中に記載され、示されている特定の形態またはその一部の配置に制限されないと理解すべきである。本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、本発明が明細書中に示し、そして記載した事項に制限されると見なすべきではないということが、当業者に明らかであろう。当業者は、目的を実施して記載の目的および利点ならびに特有の目的および利点が得られるように本発明を十分に適合させることを容易に認識するであろう。本明細書中に記載の任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順、および技術は、現在のところ好ましい実施形態の代表であり、これらは本発明の例示を意図し、本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者は、本発明を変更し、他で使用するが、これらは本発明の精神の範囲内に含まれ、添付の特許請求の範囲によって定義される。本発明は、特定の好ましい実施形態と併せて記載しているにもかかわらず、特許請求の範囲に記載の発明がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、当業者に自明の本発明の実施のための記載の様式の種々の修正形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】細胞株細胞株ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３、およびＣＣＤ−２７ｓｋに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害率および結合レベルを比較する。
【図２】癌および正常細胞株に対するＡＲ５２Ａ３０１．５および抗ＥＧＦＲ抗体コントロールの結合を表にしている。データを、平均蛍光強度のアイソタイプコントロールに対する増加倍数として示す。
【図３】いくつかの癌細胞株および非癌細胞株に指向するＡＲ５２Ａ３０１．５および抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む。
【図４】予防ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルにおける腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図５】予防ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図６】確立ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図７】確立ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図８】予防ＰＬ４５膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図９】予防ＰＬ４５膵臓癌モデルの生存率に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。
【図１０】予防ＰＬ４５膵臓癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図１１】予防ＰＣ−３前立腺癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図１２】予防ＰＣ−３前立腺癌モデルの生存率に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。
【図１３】予防ＰＣ−３前立腺癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図１４】予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルの腫瘍成長に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図１５】予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルの体重に及ぼすＡＲ５２Ａ３０１．５の影響を示す。データポイントは、平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図１６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（レーン１）の全膜画分由来のサンプルならびにＰＣ−３（レーン２）およびＣＣＤ−２７ｓｋ（レーン３）細胞株由来の全細胞溶解物由来のサンプルのウェスタンブロット。ブロットを、ＡＲ４７Ａ６．４．２およびＡＲ５２Ａ３０１．５を使用して探索した。分子量マーカーを左側に示す。
【図１７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分由来のＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）およびアイソタイプコントロール（レーン２）での免疫沈降によって調製した免疫複合体のウェスタンブロット。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の全膜フラクションとインキュベーションしていない抗体抱合タンパク質Ｇ−セファロースビーズも、ネガティブコントロールとして使用した（レーン３および４）。複製ブロットを、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２、ＡＲ５２Ａ３０１．５（ハイブリドーマ上清）、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールを使用するか、一次抗体を使用しないで探索した。サンプルを、還元条件下および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。分子量マーカーを左側に示す。
【図１８】組換えヒトＴＲＯＰ−２のウェスタンブロット。各レーンを、ＡＲ５２Ａ３０１．５（レーン１）およびＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン３）ならびにアイソタイプコントロール抗体（レーン２および４）で探索した。
【図１９】ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）および脱グリコシル化（Ｄ）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）および組換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）。
【図２０】抗ヒトＴＲＯＰ−２で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）および脱グリコシル化（Ｄ）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）および組換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）。
【図２１】１Ｂ７．１１  ＩｇＧ１アイソタイプコントロールで探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）および脱グリコシル化（Ｄ）したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）および組換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）。
【図２２】異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトＴＲＯＰ−２のウェスタンブロット。レーン３〜７を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した。レーン９〜１３を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した。レーン１５〜１９を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化８Ａ３Ｂ．６とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５で探索した。レーン８および１４をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン８を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン１、２、および２０を、ＴＢＳＴのみとインキュベーションした。
【図２３】異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトＴＲＯＰ−２のウェスタンブロット。レーン３〜７を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２で探索した。レーン９〜１３を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２で探索した。レーン１５〜１９を、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの非ビオチン化１Ｂ７．１１とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２で探索した。レーン８および１４をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン８を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン１、２、および２０を、ＴＢＳＴのみとインキュベーションした。
【図２４】正常なヒト組織マイクロアレイにおけるＡＲ５２Ａ３０１．５対ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのＩＨＣ比較を表にしている。
【図２５】正常なヒト組織マイクロアレイ由来のＡＲ５２Ａ３０１．５（Ａ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た脾臓ならびにＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｃ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｄ）を使用して得た脳組織の結合パターンを示す代表的顕微鏡写真。倍率は２００倍である。
【図２６】異なる正常なヒト組織マイクロアレイ由来の種々のヒト腫瘍および正常な組織切片におけるＡＲ５２Ａ３０１．５のＩＨＣ比較を表にしている。
【図２７】種々のヒト腫瘍組織マイクロアレイ由来のＡＲ５２Ａ３０１．５（Ａ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た乳房腫瘍組織、ＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｃ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｄ）を使用して得た前立腺腫瘍組織、ＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｅ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｆ）を使用して得た膵臓腫瘍組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は２００倍である。
【図２８】異なる正常な種の組織マイクロアレイ由来の種々のヒトおよび他の種の正常な組織切片におけるＡＲ５２Ａ３０１．５のＩＨＣ比較を表にしている。
【図２９】種々の複数の種の組織マイクロアレイ由来のＡＲ５２Ａ３０１．５（Ａ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｂ）を使用して得た正常なヒト腎臓組織、ＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｃ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｄ）を使用して得た正常なカニクイザル腎臓組織、およびＡＲ５２Ａ３０１．５（Ｅ）またはアイソタイプコントロール抗体（Ｆ）を使用して得た正常なアカゲザル組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は２００倍である。
【図３０】ＡＲ５２Ａ３０１．５のマウス配列決定で使用した全オリゴヌクレオチドプライマーの配列（配列番号９〜４６）。
【図３１】ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＨ領域およびＶＬ領域のＲＴ／ＰＣＲ増幅のアガロースゲル。
【図３２】ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＨ−Ｂ、ＶＨ−Ｅ、およびＶＬ−ＧのＰＣＲコロニースクリーンのアガロースゲル。
【図３３】ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＬアミノ酸配列（配列番号８）。
【図３４】ＡＲ５２Ａ３０１．５のＶＨアミノ酸配列（配列番号７）。
【図１】
2009527230.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009527230.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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2009527230.tif 000038
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