(57)【要約】本開示は、一般化された方法により多様な遺伝子領域と極めて頻度の低い突然変異の高感度検出の同時分析を可能にするハイスループット突然変異スクリーニングを教示する。方法は、リボヌクレアーゼによるＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖の処理、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼによる配列伸長、ブロッキング・アダプターとの連結、および特異的な配列補完実施後の一本鎖特異的ヌクレアーゼにより可能になる完全長配列伸長、および相補デオキシリボヌクレオチド三リン酸により補完された変異体のみのその後の標識レポーター・アダプターとの連結を含む。標識変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドまたは変異体‐三本鎖アダプターハイブリッドを形成することにより、変異体の検出および／または定量化は、供給源または関与する突然変異の数を問わず、シグナル検出／増強または全ての変異体において配列を増幅するための共有の標識またはフランキング・アダプター配列を目的としており、それにより多様な目的特異的配列増幅にかかる膨大な手間を回避できる。方法は、全体的または部分的に液剤中、固相培地上で実施され、大規模な場合は，自動化またはセミ自動化分析およびこれらの組み合わせに適合され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二本鎖分子が試験対象と成るリボ核酸（ＲＮＡ）鎖の一方と５‘側オーバーハング（好ましくは少なくとも１つのデオキシチミジン「デオキシ-Ｔ」を持つオーバーハング）が埋め込まれたアンチセンスデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブ鎖の一方を含むことと、第１母集団として前記試料が標的領域内部に完全なハイブリダイゼーションを受けた野生型ヘテロ二本鎖と、第２母集団として１つの標的領域内部にハイブリダイゼーションされていない少なくとも１種類のリボヌクレオチドを持つ変異体ヘテロ二本鎖と、第３母集団として１つの標的領域内部にハイブリダイゼーションされていない多数のリボヌクレオチドの少なくとも１つのストレッチを持つ相同性ヘテロ二本鎖とを含んでいることと、前記リボヌクレアーゼ酵素がハイブリダイゼーションされていないリボヌクレオチドを切り出し、各目的ＲＮＡの３’末端などの消化部位で３‘ヒドロキシ基に接触させることとを特徴とする、多数の多様な遺伝子領域とリボヌクレアーゼ酵素を含む少なくとも１種類のヘテロ二本鎖分子試料をインキュベートするステップと、
単一の基質として４種類のｄＮＴＰの１種類（好ましくはｄＡＴＰを使用）を用いて前記ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のセンス鎖上に３‘側一ヌクレオチドオーバーハングを、鋳型として前記アンチセンスＤＮＡプローブの５’オーバーハングを作製するため、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼにより各目的ＲＮＡの前記３‘末端から配列を伸長させるステップと、
ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドを形成するため、ブロッキング・アダプターと前記ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖の前記３‘一ヌクレオチドオーバーハングとを連結させるステップと、
４種類の反応において４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）のいずれか（または２種類の反応において４種類のｄＮＴＰ中の２種類）を用いてＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼによりニックしたリボヌクレオチド部位における特異的な配列補完（ＤＳＦ）ステップと、
相同性ヘテロ二本鎖および相補ｄＮＴＰにより補完されていない変異体ヘテロ二本鎖における保護されていないデオキシリボヌクレオチドを消化し、相補ｄＮＴＰにより補完された完全に保護された野生型ヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドおよび変異体ヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドを使わずにすませるため、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いてインキュベートするステップと、
完全長配列拡張が実行され、前記完全に保護された変異体ヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッド上の遊離３‘‐ヒドロキシル基を持つ新たな３‘側一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングが作製され、野生型ヘテロ二本鎖では前記ブロッキング・アダプターにより遮断されたままとなり、部分的に保護されたヘテロ二本鎖が断片化されるため、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと４種類全てのｄＮＴＰによりインキュベートするステップと、
特徴的な変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドを形成するため、標識レポーター・アダプターと前記新たに作製された３‘側一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングとを連結させるステップと、
前記特徴的な変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドまたは二本鎖アダプター連結産物を検出するステップとを含む、
多数の多様な試料中の多数の多様な遺伝子の遺伝子変異に対する同時スクリーニングの、方法。
【請求項２】
前記アンチセンスＤＮＡプローブに別のデオキシリボヌクレオチドが埋め込まれておらず、平滑末端連結反応により前記ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドが形成されるため、前記ブロッキング・アダプターとＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を連結させる前にＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡ配列の伸長が不要になることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
ブロッキング・アダプターを用いずに変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの前記形成により突然変異を検出することと、ＲＮＡ試料とアンチセンスＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションステップ、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のリボヌクレアーゼ消化ステップ、ＤＳＦ反応ステップ、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化ステップ、４種類全てのｄＮＴＰによる完全長配列の伸長ステップ、および標識レポーターとの連結ステップとを連続的に利用することにより突然変異を検出し得ることとを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ステップの一部または全てを固相培地上で実施することを特徴とする、請求項１〜請求項３の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスＤＮＡプローブが基質上に固定されていることと、前記プローブのいずれか、あるいは前記プローブの組み合わせが前記基質上の固有の位置に存在することとを特徴とする、請求項１〜請求項３の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスＤＮＡプローブが基質上に固定されていることと、前記プローブが混合物として混合され、前記基質上の不特定の位置に存在し得ることとを特徴とする、請求項１〜請求項３の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ試料が基質上に固定されていることを特徴とする、請求項１〜請求項３の方法。
【請求項８】
組織片または細胞調製品が基質上に固定されていることを特徴とする、請求項１〜請求項３の方法。
【請求項９】
前記レポーター・アダプターが検出／定量化／増幅可能な分子または基質を含むことと、前記検出ステップが前記特徴的なレポーター・アダプター、前記特徴的な変異体‐二本鎖アダプター連結産物、または前記変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドを同定／定量化／増幅することを含むこととを特徴とする、請求項１〜請求項８の方法。
【請求項１０】
前記ブロッキング・アダプターが検出／定量化／増幅可能な分子または基質を含むことと、前記検出ステップが野生型、相同型、および変異体型のハイブリッドなどの前記特徴的なＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドを同定／定量化／増幅することを含むことを特徴とする、請求項１、請求項２、および請求項４〜請求項７の方法。
【請求項１１】
別のアダプター５’と前記変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドまたは前記変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの連結により、あらゆる起源の変異体を検出、定量化、および／または増幅するための共有するフランキング配列を作製する前記ステップをさらに含む、請求項１〜請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記変異体‐二本鎖アダプターハイブリッド、変異体‐三本鎖アダプターハイブリッド、または前記変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの部分長または完全長配列を増幅する前記ステップをさらに含む、請求項１〜請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記配列増幅ステップがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リアルタイムＰＣＲ増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅、核酸増幅法（ＴＭＡ）、または転写増幅後のＰＣＲを含むことを特徴とする、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記変異体‐二本鎖アダプターハイブリッド、変異体‐三本鎖アダプターハイブリッド、または変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドのＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列決定ステップをさらに含む、請求項１２および請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡ試料が、あらゆる供給源由来の細胞、液体、組織，臓器、微生物から単離されることを特徴とする、請求項１〜請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ試料が、ＴＭＡ産物またはＰＣＲ産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写産物であることを特徴とする、請求項１〜請求項１４の方法。
【請求項１７】
遺伝子変異スクリーニングのために請求項１〜請求項１６に記載の方法を実施するキット又はキット一式であって，
前記ＤＮＡプローブのいずれかが固有の遺伝子領域を含むことと、前記ＤＮＡプローブのいずれかが、基質上の固有の位置での固定の有無を問わず、個別あるいは混合物として提供されることを特徴とする１つまたは複数のアンチセンスＤＮＡプローブと、
必要とされる試薬の一部または全てと、請求項１〜請求項１６に記載の方法を実施するためのアダプターと、
請求項１〜請求項１６に記載の方法を実施するための指示からなるユーザーズガイドとを備える、
キットまたはキット一式。
【請求項１８】
前記多数の多様なアンチセンスプローブの目的配列が、疾患、疾患のサブタイプ、疾患の状態、病的状態、細胞性機能、細胞性機能経路、またはこれらの組み合わせと関連のある遺伝子、マーカー、または微生物から選択されることを特徴とする、請求項１７のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年５月２７日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６０／９３２、０９４「特異的な配列補完（ＤＳＦ）により可能になる連続的アダプター連結および増幅を用いたハイスループット突然変異スクリーニング法」の優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示は、多様な遺伝子における多様な遺伝子変性の同時検出を促進する方法および産物に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子変異は、癌および様々な感染症の原因、進行、および薬剤耐性において重要な役割を果たす。遺伝子によっては特定の癌および薬剤性突然変異への関わりに偏りが認められるが、患者間で大きく異なっており、多様な遺伝子が関与すると考えられる。そのため、多様な遺伝子の同時検査を促進する簡易な方法の必要性が強調されている。しかし、ヒトゲノムの複雑性および配列の相同性により、このような目標を達成するのは極めて困難である。遺伝子検出の特異度を確認し、感度を強化するため、現行のアッセイには問題となる各目的遺伝子に特異的な増幅法が必要である。同様に、薬剤耐性菌をもたらす突然変異は患者間で異なり、様々な微生物のサブタイプでは臨床像が類似している。結果として、感染性微生物における突然変異スクリーニングにも、根気のいる多様な増幅法と配列決定法が必要である。さらに、ほとんどのアッセイの感度は、約１〜１０％までである。したがって、より高感度のアッセイが実施できない限りは、発現率の低い突然変異の存在は検出できない。
【０００４】
本開示は、それぞれ「ブロッキング・アダプター」および「レポーター・アダプター」と呼ばれる２種類の一般的なアダプターを用いて、多数の多様な遺伝子領域の同時スクリーニングするための一般化された戦略について記述している。正常な野生型では、ブロッキング・アダプターは、連結される唯一のアダプターである。突然変異存在下では、相補的デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いた特異的な配列補完（ＤＳＦ）により、ブロッキング・アダプターとレポーター・アダプターの連続連結が可能になり、一本鎖ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼ消化および完全長塩基配列の伸長から保護される。これにより、下流のＲＮＡとブロッキング・アダプターのセンス鎖が移動し、レポーター・アダプターと連結するため３’側にオーバーハングが作製され、変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドが形成される。相補ｄＮＴＰによる補完が不完全な変異体および相同性配列は、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化により断片化され、それによって完全長塩基配列の伸長およびレポーター・アダプターとの連結が妨げられる。レポーター・アダプターまたは変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドを目的とすることで、相補ｄＮＴＰにより補完される変異体を検出／定量化または増幅し、頻度の少ない変異体を高感度検出する。関与する突然変異の起源および数を問わず、全ての異なる変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドは、二本鎖アダプターの連結部位に同一の配列を共有していることに留意する。したがって、突然変異の検出力は、まさにこの２種類の一般的なプライマー（ブロッキング・アダプター由来のプライマーとレポーター・アダプター由来のプライマー）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増強される。同様に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）または核酸増幅法（ＴＭＡ）等、その他の配列増幅法も、共有の配列を標的とするようになると考えられる。多様な標的に特異的な配列増幅法の必要がなければ、本開示に記載の方法により、多数の多様な試料中の多数の多様な遺伝子に対するハイスループット突然変異スクリーニングが実行しやすくなる。
【発明の開示】
【０００５】
本開示について基本的理解を得るため、以下に本開示の様々な用途の可能性について概要を記載する。本開示の主要または重要な要素を確認する、あるいは本請求項の範囲を解明または制限するなどの意図はない。その後のより詳細な説明の導入として、一般的な形式で本開示のいくつかの概念を提示するのみである。
【０００６】
非制限的実施形態により、多様な標的に特異的な配列増幅反応の必要がない場合に、多様な遺伝子における多数の多様な遺伝子変性の同時検出を促進する方法を提供する。概して、これは問題の多様な遺伝子領域を含む多数の多様なアンチセンス野生型デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブを用いた、少なくとも１種類のリボ核酸（ＲＮＡ）試料のインキュベート・ステップで開始する。各アンチセンスＤＮＡプローブは、５’末端に少なくとも１つの別のデオキシリボヌクレオチド（好ましくはデオキシチミジン、デオキシ‐Ｔ）を持つ。結果生じるＲＮＡ：ＤＮＡのヘテロ二本鎖分子をリボヌクレアーゼで消化すると、ハイブリダイゼーションされないリボヌクレオチドがミスマッチ部位（一塩基ミスマッチ部位、多塩基ミスマッチ部位、および５’に別のデオキシ‐Ｔが存在するためアンチセンスＤＮＡプローブと対にならない目的ＲＮＡの３’末端など）で加水分解される。一塩基ミスマッチ部位は、概して一塩基突然変異または一塩基多型（ＳＮＰ）に相当する。多塩基ミスマッチ部位は、概して相同遺伝子配列に相当する。リボヌクレアーゼで消化すると、ニック部位および目的ＲＮＡの３’末端で３’‐ヒドロキシル（３’‐ＯＨ）基が遊離することに留意する。アンチセンスＤＮＡプローブ上の５’の別のデオキシ‐Ｔ（’Ｓ）を鋳型として、デオキシアデノシン三燐酸（ｄＡＴＰ）を唯一の基質として、目的ＲＮＡの３’末端の３’‐ＯＨをプイライマーとして用いて、新しいＤＮＡ配列を合成し、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ酵素またはＫｌｅｎｏｗ酵素とＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの複合体等）により伸長させ得る。Ｋｌｅｎｏｗ酵素およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの末端デオキシリボヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性により、新たに伸長した配列の３’末端に別のデオキシアデノシン（デオキシ‐Ａ）が付加される。結果として、ｄＡＴＰ‐修飾ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖分子のセンス鎖上に３’側一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングが生成される。結果的に、３’側一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングによりアンチセンス鎖の３’末端で一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングを持つブロッキング・アダプターと連結可能になり、結果的にＲＮＡ：ＤＮＡのヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドが形成される。ブロッキング・アダプターのセンス鎖が５’および３’末端の両方でリン酸化されることに留意する。５’リン酸基によりｄＡＴＰ修飾ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖の遊離３’‐ＯＨとの連結が可能になる。対照的に、ブロッキング・アダプターのセンス鎖上の３’側のリン酸化により３’‐ＯＨ基が得られなくなり、それによってさらなる連結が妨げられる。そのため、このアダプターを「ブロッキング・アダプター」と呼ぶ。リン酸化を利用する以外に、確立されたその他の方法を用いてブロッキング・アダプターの３’‐ＯＨを妨げることもできる（蛍光染料の吸着または３’‐ＯＨ基への基質の挿入が含まれるが、これらに限定しない）。ＲＮＡ：ＤＭＡヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドが形成されたら、試料を４分割し、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼと４種類の��ＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）のいずれか１つにより配列を補完する。ｄＮＴＰを１種類のみ用いて配列を補完すると、多塩基のニックでは部分的に配列が伸長し、非相補ｄＮＴＰが供給される一塩基のニックでは配列は補完されなくなる。一方、相補ｄＮＴＰが供給される一塩基のニックでは、配列は完全に補完される。そのため、このような配列の補完反応は様々な結果をもたらすことから、「特異的な配列補完（ＤＳＦ）」と呼ぶ。ＤＳＦ反応を合理化するため、試料を２分割する。１つは２種類のｄＮＴＰにより配列を補完し、もう１つはその他の２種類のｄＮＴＰにより配列を補完する。ＤＳＦ反応後、保護されないデオキシリボヌクレオチドを加水分解し、部分的に保護されたＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖分子を消化して小さく断片化する一本鎖特異的ヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼまたはＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼ等が含まれるが、これらに限定しない）で試料を処理する。対照的に、相補ｄＮＴＰにより補完される一塩基のニックは、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化から完全に保護される。結果的に、４種類全てのｄＮＴＰとＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、完全補完部位から新たなＤＮＡ配列が伸長し始め、下流のＲＮＡと置き換わる。さらに、完全長配列が伸長した結果、ブロッキング・アダプターのセンス鎖が移動し、妨げられた３’‐ＯＨ基が遊離３’‐ＯＨ基を持つ新たな３’側一塩基ヌクレオチド「デオキシ‐Ａ」オーバーハングと置き換わる。今度はこの新たに形成された３’側一塩基「デオキシ‐Ａ］オーバーハングにより、アンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端にある５’側リン酸基に相補一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングを持つ標識レポーター・アダプターとの連結が可能になる。５’側のレポーター・アダプターのリン酸により、ＤＳＦにより可能になる完全長配列の伸長から生じた、新たに形成された３’‐ＯＨ基との連結が可能になる。変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドが形成された結果、相補ｄＮＴＰにより補完された変異体を正常な野生型やブロッキング・アダプターによって遮断されたままで、レポーター・アダプターが認められない部分補完産物と容易に識別できるようになると考えられる。レポーター・アダプターまたは変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの標識を目的とすることにより、先行技術において既知のシグナル増強法または配列増幅法を実施し、変異体の検出感度を増強させ得る。非制限的な１つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と２種類の一般的なプライマーの使用である。１つはブロッキング・アダプターに特異的なプライマー、もう１つはレポーター・アダプターに特異的なプライマーである。別の非制限的方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と２種類のアダプターを使用し、二本鎖アダプター連結産物の交差部位を増幅することである。別の非制限的方法は、レポーター・アダプターにＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列を組み込む、あるいはブロッキング・アダプターとレポーター・アダプターの連続連結後にＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列が形成されるようにこの２種類のアダプターを設計することにより可能になる核酸増幅法（ＴＭＡ）を使用することである。結果的に、ＴＭＡを実施し、対応するＲＮＡポリメラーゼとその基質を用いて変異体‐二本鎖アダプターハイブリッド配列を増幅できる。
【０００７】
別の非制限的実施形態により、固相培地上の多数の多様な目的遺伝子の同時突然変異スクリーニング法を提供する。概して、本法により固相培地（スライド、膜、ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレート、またはストレプタビジン被覆磁気ビーズ等が含まれるが、これらに限定しない）上に前述のアンチセンス野生型ＤＮＡプローブを固定する。プローブは、アレイフォーマットに別々に配列する、あるいは容器の不特定位置に混合物として置く。試験対象となるＲＮＡ試料または転写増幅産物を４（または２）分割し、固定プローブによりハイブリダイゼーションする。上述のとおり、次にヌクレアーゼ消化、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼおよびｄＡＴＰによる配列の伸長、ブロッキング・アダプターとの連結、各部分試料の４種類のｄＮＴＰのいずれかによるＤＳＦ（試験対象となる各試料を２分割した場合は、２種類のｄＮＴＰによる）、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化、４種類全てのｄＮＴＰによる配列の伸長、および標識レポーター・アダプターとの連結など、一連の分子反応を実行する。プローブをアレイフォーマットで固定した場合、アレイ上に検出可能なマークが認められるスポットは、対応する標的遺伝子に関与する１つまたは複数の突然変異の存在を示す。アッセイの感度を増強するため、先行技術において既知の適用可能なシグナル増強法（化学発光アッセイ、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ルシフェラーゼアッセイ、ＣＣＤカメラ、蛍光定量法、比色定量法、またはオートラジオグラフィー等が含まれるが、これらに限定しない）を実行する。大規模試験では、多数の多様な遺伝子についてハイスループット突然変異スクリーニングアッセイを実施するため、多数の多様な容器を収容するキャリアーを使用してもよい。多様なアンチセンスＤＮＡを混合し、キャリアーの容器にそれぞれ固定する。結果として、多数の多様な試料中の多数の多様な遺伝子について同時に解析できる。目標は、この初回スクリーニングアッセイにより決定したとおり、費用対効果の高い、迅速なスクリーニングアッセイを提供し、突然変異の詳細な特徴付けという煩雑な作業は、陽性または陽性の疑いのみを対象にすることである。アッセイの感度は、先行技術における適合可能な方法によりさらに増強できる。非制限的方法では、ＰＣＲ、ＬＣＲ、またはＴＭＡによる配列増幅の場合、二本鎖アダプター連結産物が固相培地から遊離できる。別の非制限的な方法では、第３のアダプターが変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの５’末端に付着すると、変異体‐三本鎖アダプター連結産物が形成され、変異体配列は５’末端で第３のアダプターと、３’末端で二本鎖アダプターにフランキングする。結果として、関与する突然変異遺伝子の起源または数を問わず、変異体‐三本鎖アダプター連結産物は、共有するフランキング・アダプター配列由来のプライマー（第３のアダプターに特異的なフォワードプライマーとレポーター・アダプターに特異的なリバースプライマー等）を用いてＰＣＲにより増幅できる。ＰＣＲにより増幅した変異体‐三本鎖アダプター連結産物をＤＮＡ塩基配列決定にかけ、突然変異遺伝子を同定する。
【０００８】
別の非制限的実施形態により、組織片または細胞調製品上の多数の多様な標的遺伝子の同時突然変異スクリーニング法を提供する。概して、本法は細胞の形態を保つ固相培地上に組織片または細胞調製品を固定する初回ステップを含む。続いて、少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ｔ」を持つ野生型ＤＮＡプローブを入れ、固定した組織片または細胞調製品とハイブリダイゼーションする。上述のとおり、次に結果生じるＲＮＡ：ＤＮＡのヘテロ二本鎖分子に対し、リボヌクレアーゼ消化、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼとｄＡＴＰによる配列の伸長、ブロッキング・アダプターとの連結、４種類のスライド上の４種類のｄＮＴＰ（または２種類のスライド上の２種類のｄＮＴＰ）のいずれかによるＤＳＦ、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと４種類全てのｄＮＴＰによる配列の伸長、および標識レポーター・アダプターとの連結を実施する。相補ｄＮＴＰにより補完される目的変異体が認められる細胞の完全長配列を伸長させ、それにより標識レポーター・アダプターとの連結が可能になる。その他はいずれもブロッキング・アダプターにより遮断されたままである。レポーター・アダプターまたは変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの標識を目的とすることで、シグナル検出/増強法を用いて組織片上の変異体を同定できる。別の非制限的実施形態では、標的は固相培地上に固定した組織片または細胞調製品内に常在する感染性微生物とその変異体である。固定した標的感染性微生物のＲＮＡ成分は、アンチセンス野生型ＤＮＡプローブにより直接ハイブリダイゼーションしてもよい。あるいは、固定したＤＮＡ成分または標的感染性微生物のＰＣＲ産物由来のＲＮＡを転写してもよい。あるいは、ＴＭＡにより標的感染性部生物のＲＮＡ転写物を増幅してもよい。上述のとおり、アンチセンス野生型ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーション後、一連の分子反応を実施する。ブロッキング・アダプターおよびレポーター・アダプターは、それぞれ検出可能な固有のマーカーにより標識できることに留意する。結果として、感染性微生物が存在しない細胞では、シグナルは検出されない。野生型感染性微生物が存在する細胞では、ブロッキング・アダプターの標識に特異的なシグナルが検出される。相補ｄＮＴＰにより補完されていない突然変異型微生物も、ブロッキング・アダプターにより標識される。一方、相補ｄＮＴＰにより補完されていない突然変異型微生物が認められる細胞中では、ブロッキング・アダプターの標識とレポーター・アダプターの標識を交換し、完全長配列を伸長させる。ブロッキング・アダプターとレポーター・アダプターを同時に標的とすることにより、同一の組織切片上で野生型微生物が認められる細胞と突然変異型微生物が認められる細胞を区別できる。
【０００９】
別の非制限的実施形態により、多数の多様な遺伝子または感染性微生物の同時突然変異スクリーニング用のキットまたはキット一式を提供する。概して、キットは多数の多様なアンチセンスＤＮＡプローブを備え、各ＤＮＡプローブは標的の遺伝子、マーカー、または感染性微生物の選択領域を対象とする。プローブは、液剤または凍結乾燥粉末剤として個別または混合して提供される。プローブも基質上に固定され、各ＤＮＡプローブは固有の位置に認められる、あるいは混合物として混合され、固定される。キットは、ユーザーズガイドおよび本開示の方法を実行するのに必要とされる試薬の一部または全てをさらに備える。
【００１０】
以下の図面は、本開示について考え得る数多くの実施形態の一部を図示し、本開示について基本的に理解できるようにするものである。これらの図面は、本開示の全ての実施形態の概要を幅広く提供するものではない。これらの図面は、本開示の主要な、あるいは重要な要素を確認する、あるいは本請求項の範囲を解明または制限する意図はない。以下の図面は、一般的な形式で本開示のいくつかの概念を提示するのみである。このように、本開示を詳細に理解するため、以下の詳細な説明および添付図を参照し、要素等に対応する番号を振る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本開示の方法は、多数の多様な遺伝子、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、遺伝マーカー、または感染性微生物内に常在する１つ以上の遺伝子変異の同時検出を促進する。起源が様々な変異体において共有アダプター連結産物を作製することにより、関与する変異体の供給源、数、および性質を問わず、変異体を容易に同定および／または定量化できる。本開示における突然変異スクリーニング法の固有の特性は、それぞれ「ブロッキング・アダプター」および「レポーター・アダプター」という名称の２種類の一般的なアダプターのセットを使用することである。別の固有の特性は、「特異的な配列補完（ＤＳＦ）」と呼ばれる分子反応である。１または２種類のｄＮＰを用いたＤＳＦ、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および４種類全てのｄＮＴＰによる配列の伸長を連続的に利用すると、完全長配列が伸長され、ブロッキング・アダプターとレポーター・アダプターが連結し、ＤＳＦにより相補ｄＮＴＰにより補完される突然変異でのみ、変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドが形成される。対照的に、相補ｄＮＴＰにより補完されない野生型の標的遺伝子、相同性配列、および変異体は、ブロッキング・アダプターにより遮断されたままである。結果的に、レポーター・アダプターの標識を目的とすることにより、適合可能なシグナル検出／定量化法または増強法を用いて変異体を容易に同定できる。さらに、発現頻度の低い突然変異を容易に検出するため、２種類の一般的なプライマーセット（１つはブロッキング・アダプターに特異的なプライマー、もう１つはレポーター・アダプターに特異的なプライマー）を用いて変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの配列を増幅させてもよい。これにより多数の多様な標的の同時検査が可能になり、多様な標的に特異的な配列増幅法は必要なくなる。本開示で使用されているとおり、「遺伝子変異」という用語には先行技術において既知の全ての遺伝子変異、例えば点変異、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、遺伝子欠失、挿入変異、マイクロサテライト不安定性、マイクロサテライト配列多型、転位、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定しない。遺伝子変異は、１つ以上の遺伝子の内部および／または近く等、人間、家畜、植物、または微生物のゲノムの遺伝物質領域、もしくはコーディング領域または非コーディング領域の内部および／または近くで認められる。遺伝物質とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはその両方であり、あらゆる大きさが考えられる。突然変異は病的状態（例えば癌、遺伝性疾患、または感染症等が含まれるが、これらに限定しない）と直接的または間接的に関連していると考えられる。１つの非制限的実施形態では、突然変異は癌の初期段階、発症、進行、および／または寛解と関連がある。突然変異は、疾患または感染性微生物のマーカーとなり得る。突然変異は、治療に対する耐性、例えば医薬品化合物、薬剤、または生物学的応答調節物質に対する耐性、あらゆる種類の放射線療法または免疫療法に対する耐性、およびこれらの組み合わせと関連すると考えられる。このように、本開示の方法および産物は、これらの１種類以上の状況について利用できるが、これらに限定しない。
【００１２】
本開示の方法および産物では、あらゆる供給源由来の核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を使用できる。核酸試料は、１種類以上の人間、家畜、植物、および／または微生物から入手できる。核酸試料は、細胞、組織、または体液（皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、血球、臓器、腫瘍、生検試料、組織片試料、細胞調製品、および細胞培養試料等が含まれるが、これらに限定しない）から単離できる。核酸試料は、先行技術において既知の分子生物学、細菌学、および／または組換えＤＮＡ由来の技術から作製することもできる。本開示に記載した方法を用いた試験の前に、先行技術において既知の方法（ＴＭＡ、ＰＣＲおよびＲＮＡ転写の連続利用、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定しない）により核酸試料を増幅し、ＲＮＡ核酸試料に転写することもできる。
【００１３】
本開示の方法により、試料中に存在する発現頻度が極めて低い１種類以上の標的において遺伝子変性の同時検出が可能になる。例えば、変異体は数十万の非突然変異のなかに存在するが、ほとんどの突然変異検出アッセイは検出感度が約１〜１０％までに限られる。さらに、本開示の方法および産物により、同時に、連続的に、あるいはこれらを組み合わせて解析され得る１種類以上の試料中の多数の多様な標的の同時突然変異解析が可能になる。
【００１４】
概して、図１に示されるとおり、本開示の方法には一連の分子反応が含まれる。（１）試験対象となる試料からＲＮＡを採取する、あるいは転写物を増幅する、（２）それぞれ５’末端に少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ｔ」を持つアンチセンス一本鎖野生型ＤＮＡプローブを合成する、（３）試験対象となるＲＮＡ試料を４（２）分割し、それぞれを液剤または固相培地上に固定された状態で存在するアンチセンスＤＮＡプローブによりハイブリダイゼーションする、（４）結果生じるＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子をリボヌクレアーゼで消化する、（５）ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼおよびｄＡＴＰによりニックされたリボヌクレオチド部位および目的ＲＮＡの３’末端から配列を伸長し、結果生じるｄＡＴＰ修飾ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖上に３’一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングを生成する、（６）アンチセンス鎖上に３’側一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングおよびセンス鎖上に二本鎖（５’および３’）のリン酸化を持つブロッキング・アダプターと連結する、（７）ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼと試験対象となる試料の４分割部分中の４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）のいずれか１つを用いる（または２種類の反応における２種類のｄＮＴＰを別々に使用する）ことにより特異的な配列補完（ＤＳＦ）を実施する、（８）相補ｄＮＴＰにより補完された一塩基ニックは完全に保護されるが、ニックのあるリボ核酸部位が補完されない、あるいは部分的に補完されている場合は、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化により保護されないまたは部分的に保護されたデオキシリボヌクレオチドを加水分解する、（９）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと４種類全てのｄＮＴＰにより、完全に保護された補完部位より完全長配列を伸長させると、下流のＲＮＡとブロッキング・アダプターのセンス鎖が移動し、続いて遊離３’‐ＯＨを持つ新たな一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングが形成される、（１０）アンチセンス鎖に３’一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングを持つ標識レポーター・アダプターとの連結により、突然変異検出および／または定量化するための変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドが形成される。レポーター・アダプター上の標識を目的とし、先行技術において既知のシグナル検出、定量化法、または増強法により、突然変異を検出および／または定量化できる。さらに、発現頻度の低い突然変異を高感度検出するため、変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの配列を増幅（ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、またはこれらの組み合わせ等が含まれるが、これらに限定しない）してもよい。変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドが形成されると、関与する突然変異遺伝子の数、起源、および位置を問わず、それぞれブロッキング・アダプターおよびレポーター・アダプター由来の２種類の一般的なプライマーセットを用いてＰＣＲを実施することができる。別の非制限的方法では、ＬＣＲおよび２種類の一般的なアダプターセットを用いて配列を増幅し、二本鎖アダプター連結産物の交差部位にある共有の配列を増幅させる。別の非制限的配列増幅法では、ＴＭＡを使用する。これは、レポーター・アダプターにＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーター配列を組み込む、あるいは目的突然変異の３’末端でレポーター・アダプターとブロッキング・アダプターを連結した後にＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーター配列が形成されるように設計することにより達成され得る。結果として、対応するＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼとその基質を使用することにより、ＴＭＡを用いて変異体‐二本鎖アダプターハイブリッド配列が増幅され、突然変異の高感度検出および特徴付けが可能になる。別の非制限的方法では、第３のアダプターを変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの５’末端と連結し、変異体‐三本鎖アダプターハイブリッドを形成させる。結果的に、変異体配列は５’末端の第３のアダプターおよび３’末端の二本鎖アダプターにフランキングする。第３のアダプターおよびレポーター・アダプター由来のプライマーを用いたＰＣＲを使用して、変異体‐三本鎖アダプターハイブリッドの増幅・配列決定・同定を実施する。
【００１５】
概して、本開示のブロッキング・アダプターおよびレポーター・アダプターは、長さが少なくとも１０塩基対（ｂｐｓ）、好ましくは少なくとも１２塩基対であり、数千塩基対の大きさも考えられる。１つの非制限的実施形態では、アダプターの長さは約１６〜約５０ｂｐｓである。１つの非制限的実施形態では、ブロッキング・アダプターには（１）アンチセンス鎖上の３’側一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングによりｄＡＴＰ修飾ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖の３’側一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングとの連結が可能になる、（２）センス鎖上のリン酸により５’ｄＡＴＰ修飾ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖上の３’「デオキシ‐Ａ」オーバーハングの遊離３’‐ＯＨとの連結が可能になる、（３）リン酸基または不活性物質の連結によりセンス鎖上の３’‐ＯＨが遮断され、アダプターとのさらなる連結が妨げられる、という３つの固有の特性がある。対応するレポーター・アダプターは、アンチセンス鎖上に３’側一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングを、センス鎖上に５’側リン酸を持つ。さらに、レポーター・アダプターは、先行技術において既知の適合可能なシグナル検出、定量化法、または増強法により検出および／または定量化するための検出可能なマーカー、分子、または基質で標識できる。本開示で使用されているとおり、「標識」とは検出可能および／または定量可能なシグナルをもたらすのに使用される、あるいはシグナル増幅用に使用され、核酸、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂肪酸、脂質、糖蛋白質、糖脂質、分子、化合物、またはこれらの組み合わせに付加し得る原子、分子、化合物、または基質である。先行技術において既知の標識には、本開示では蛍光染料、着色剤、アイソトープ、化学発光基質、ＥＬＩＳＡ基質、ルシフェラーゼ基質、およびこれらの組み合わせなどが含まれるが、これらに限定しない。標識は、先行技術において既知の適切な方法（蛍光定量法、比色定量法、シンチレーションカウンタ、オートラジオグラフィー、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＣＣＤカメラ等のカメラの使用、ルミノメトリー、磁気、酵素力、およびこれらの組み合わせ等が含まれるが、これらに限定しない）により検出可能、定量可能、および／または増幅可能と考えられる。
【００１６】
上述のとおり、ブロッキング・アダプターとＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖分子との連結では、好ましくはＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のセンス鎖上の一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングならびにブロッキング・アダプターのアンチセンス鎖上の一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングを利用する。しかし、その他の非制限的方法も使用できる。例えば、アンチセンスＤＮＡプローブの５’末端に少なくとも１つの別のデオキシシチジン（デオキシ‐Ｃ）を埋め込み、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のリボヌクレアーゼ消化後の配列伸長用の単独の基質としてｄＧＴＰを用いて、一塩基「デオキシグアニジン（デオキシ‐Ｇ」オーバーハングを作製することもできる。結果的に、アンチセンス鎖上に一塩基「デオキシ‐Ｃ」を持つブロッキング・アダプターを用いることで、このブロッキング・アダプターは一塩基「デオキシ‐Ｇ」オーバーハングを持つＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖と連結され得る。同様に、アンチセンスＤＮＡプローブに、少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ａ」または「デオキシ‐Ｇ」を埋め込む場合、リボヌクレアーゼ消化後の配列伸長用に使用される基質は、それぞれｄＴＴＰおよびｄＣＴＰである。また、ブロッキング・アダプターのアンチセンス鎖上の一塩基オーバーハングは、「デオキシ‐Ａ」および「デオキシ‐Ｇ」となる。さらに、連結反応では高濃度のリガーゼを用いることにより平滑末端連結も利用できるようになる。そのような場合、アンチセンスＤＮＡプローブの５’末端に別のデオキシリボヌクレオチドを埋め込む必要がなくなる。ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖に対するリボヌクレアーゼ消化後、平滑末端ブロッキング・アダプターは連結されるが、粘着末端を作製するためにＲＮＡプライマーを用いてＤＮＡ配列を伸長する必要はない。一般原則としてまとめると、ブロッキング・アダプターとＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖との連結は、先行技術において既知のヌクレオチド結合法（酵素反応、化学反応、物理反応、またはこれらの組み合わせなどが含まれるが、これらに限定しない）を用いて適合する粘着末端連結または平滑末端連結により実行され得る。
【００１７】
ＤＳＦ反応とその後の一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化により、（１）完全に保護された野生型ヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッド、（２）一塩基のニックにおいて相補ｄＮＴＰにより完全に補完された結果として、完全に保護された変異体ヘテロ二本鎖、（３）非相補ｄＮＴＰにより補完されない変異体ヘテロ二本鎖において、一塩基のニックで加水分解される保護されないデオキシリボヌクレオチド、および（４）部分的に補完される相同ヘテロ二本鎖において、消化される多塩基のニック、という４種類の産物が生じる可能性がある。結果として、保護されないまたは部分的に保護された産物は、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化後に断片化する。対照的に、相補ｄＮＴＰにより補完される一塩基のニックを有する突然変異の完全長配列は引き続き伸長され、ブロッキング・アダプターのセンス鎖が移動し、新たな一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングが形成され、標識レポーター・アダプターとの連結が可能になり、変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドが形成される。野生型ヘテロ二本鎖は一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化から完全に保護されるが、新たな配列伸長を開始するためのリボヌクレオチドのニックも、デオキシリボヌクレオチドによる補完も認められない。したがって、野生型ヘテロ二本鎖はブロッキング・アダプターにより遮断されたままであるため、二本鎖アダプター連結産物を形成することができない。レポーター・アダプターまたは変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの標識を目的とすることにより、突然変異を検出および／または定量化できる。
【００１８】
本開示においてＤＳＦ、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および４種類全てのｄＮＴＰによる完全長配列の伸長を連続的に利用する２つの主な目的は、（１）配列の相同性から生じる偽陽性を回避することと、（２）多様な目的遺伝子を解析するため現行の突然変異検出アッセイで必要とされる多様な標的に特異的な増幅を回避することである。同様に、本開示においてブロッキング・アダプターとレポーター・アダプターの連続連結を用いる目的は、（１）突然変異検出法の特異度を確認することと、（２）あらゆる起源の突然変異に関する配列増幅ステップを一般化することである。しかし、修正が加えられ、ＤＳＦ反応の原理を利用する代替法が考案され、ブロッキング・アダプターを使用する必要がなくなった。結果として、変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの代わりに変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドを形成する。非制限的実施形態では、以下のとおり、ブロッキング・アダプターを用いずに突然変異検出アッセイを実行することができる。（１）ＲＮＡ試料とアンチセンスＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによりＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を形成する、（２）リボヌクレアーゼ消化によりミスマッチ・リボヌクレオチドにニックを入れる、（３）試料を４分割（または２分割）し、４種類のｄＮＴＰ（あるいは一部で２種類のｄＮＴＰ、別の部分でその他の２種類のｄＮＴＰ）についてそれぞれＤＳＦを実施する、（４）一本鎖特異的ヌクレアーゼで処理し、部分的に補完されたヘテロ二本鎖を消化する、（５）４種類全てのｄＮＴＰにより完全長配列を伸長することにより、相補ｄＮＴＰにより補完される突然変異ヘテロ二本鎖上に３’側一塩基「デオキシ‐Ａ」を作製する、（６）アンチセンス鎖上に３’側一塩基「デオキシ‐Ｔ」を持つ標識レポーター・アダプターと連結する、（７）レポーター・アダプターの標識を目的とする、あるいは結果生じる変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの配列を増幅することにより突然変異を検出し、シグナルを増強する。レポーター・アダプターと変異体ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖の連結は、制限酵素（ＲＥＳ）の粘着末端を介して実施できることにも留意する。そのような場合、「ＲＥＳ」配列はアンチセンスＤＮＡプローブの５’末端に組み込む。相補ｄＮＲＰを用いて補完された突然変異ヘテロ二本鎖において完全長配列が伸長されると、対応する「ＲＥＳ」部位が形成される。対応する「ＲＥＳ」による消化後、この「ＲＥＳ」に粘着末端が形成され、それにより適合する粘着末端を持つ標識レポーター・アダプターとの連結が可能になる。突然変異の検出または増幅は、レポーター・アダプターまたは結果生じる変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの標識を目的とする。１つの非制限的方法では、結果生じる変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドの配列を増幅させるため、レポーター・アダプターにＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーターを埋め込む。対応するＲＮＡポリメラーゼとその基質を用いて、変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドを増幅・同定する。別の非制限的方法では、アンチセンスＤＮＡプローブの３’末端に、伸長した既知の配列（Ｔ３、Ｔ７、またはＤＰ６プロモーター配列あるいはＭ１３配列等が含まれるが、これらに限定しない）を埋め込む。一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化する前に、相補オリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖をインキュベートすることにより、アンチセンスＤＮＡプローブに埋め込まれた配列を保護する。完全長配列の伸長およびレポーター・アダプターとの連結後、結果生じるあらゆる起源の変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドは、同一のフランキング配列、すなわち一方の末端にはＴ３、Ｔ７、ＳＰ６プロモーター配列またはＭ１３配列、もう一方の末端にはレポーター・アダプター配列を共有する。結果的に、２種類の一般的なプライマーを用いてＰＣＲを実施し、変異体‐レポーター・アダプターハイブリッドを増幅できる。
【００１９】
上述のとおり、ブロッキング・アダプターとＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖の連結で適合するＡ／Ｔ粘着末端を利用する場合は、本開示の一本鎖アンチセンスＤＮＡプローブの、好ましくは５’末端に少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ｔ」を埋め込む。このアンチセンスプローブは、一本鎖アンチセンスＤＮＡの生成に役立つと考えられる、先行技術において既知の方法により合成される。１つの非制限的実施形態では、正常ＲＮＡの試料を逆転写（ＲＴ）媒介ＰＣＲの鋳型として使用し、目的遺伝子のｃＤＮＡフラグメントを増幅する。結果生じるｃＤＮＡフラグメントを鋳型として使用し、５’末端に少なくとも１つの別のデオキシリボヌクレオチド（好ましくは別の「デオキシ‐Ｔ」）を持つ対応するリバースプライマーを用いてＰＣＲを実行することにより、アンチセンス一本鎖ＤＮＡプローブを合成できる。別の非制限的実施形態では、目的遺伝子領域にフランキングしたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、ＲＴ媒介ＰＣＲを実施する。リバースプライマーが、５’末端に少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ｔ」およびビオチン分子を持つことに留意する。したがって、結果生じる目的遺伝子のＰＣＲ増幅ｃＤＮＡフラグメントは、アンチセンス鎖の５’末端に少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ｔ」およびビオチン分子を持つ。さらに、アンチセンス鎖上のビオチン分子により、ビオチン化アンチセンス鎖は共有結合によりストレプタビジン被覆固相培地上にしっかりと固定され、非ビオチン化センス鎖は結合されないままとなり、変性および洗浄後に容易に除去され得る。固定されたアンチセンス一本鎖ＤＮＡは、本開示に記載した突然変異検出法用のプローブとして使用できる。本開示で使用されるプローブは、ヌクレオチドが約２０〜数キロ塩基の範囲、好ましくは約５０〜約１０００ヌクレオチドの範囲と考えられる。
【００２０】
本開示で使用されるＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖分子を作製するために実行されるハイブリダイゼーション反応は、１種類以上のアンチセンスＤＮＡプローブを含むと考えられ、各プローブは様々な遺伝子領域に特異的である。例えば、プローブＡは遺伝子Ａに、プローブＢは遺伝子Ｂに、プローブＣは遺伝子Ｃ等に特異的である。ハイブリダイゼーション反応は１種類以上の転写物、例えば遺伝子Ａの転写物Ａ、遺伝子Ｂの転写物Ｂ、遺伝子Ｃの転写物Ｃ等を含んでいると考えられる。そのため、結果生じるＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖分子は、２種類／母集団以上のＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖（ヘテロ二本鎖Ａ、ヘテロ二本鎖Ｂ、ヘテロ二本鎖Ｃ等）を含むと考えられる。この１種類以上のヘテロ二本鎖は、１つ以上の変異体（変異体Ａ、変異体Ｂ、変異体Ｃ等）を含むと考えられる。あらゆる種類のヘテロ二本鎖に２つ以上の突然変異が存在し、検出される可能性もある。例えば、ヘテロ二本鎖Ａにおいて、変異体Ａ１は突然変異１を、変異体Ａ２は突然変異２を、変異体Ａ３は突然変異３を含んでいる。様々な突然変異は、それぞれ個々の変異体により示され、検出される。
【００２１】
本開示の突然変異検出法には一連の様々な分子反応が含まれ、各反応には様々な反応産物および／または試薬が含まれる。１つのステップの産物および／または試薬は、その後の反応を妨げることがある。本開示の方法の開発時および最適化時に、これらの分子反応は固相培地上で容易に実行され、アンチセンスＤＮＡプローブまたはＲＮＡ試料が固定され得ることが明らかになった。結果として、一連の様々な反応は同一容器中で連続的に実行可能であり、単純な洗浄後、適切な試薬を入れ、最適化条件でインキュベートされる。多数の多様なＤＮＡプローブを容器中に固定し、試験対象となる試料を入れる。多数の多様な容器を収容するキャリアーでこれらの分子反応を実施することにより、多数の多様な試料の同時検査が可能になる。結果として、多数の多様な標的について、多数の多様な試料中で同時に分析できる。図２に示される１つの非制限的実施形態では、ストレプタビジン被覆９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルで多数の多様なビオチン化アンチセンスＤＮＡプローブを混合し、固定する。試験対象となるＲＮＡ試料をそれぞれ等しく４分割し、９６ウェルプレートのウェルに別々に入れ、それぞれ「Ａ」「Ｃ」「Ｇ」「Ｔ」と表示する。ｄＡＴＰを用いたＤＳＦ反応は「Ａ」と表示されたウェルで実施する。ｄＧＴＰを用いたＤＳＦ反応は「Ｃ」と表示されたウェルで実施する。ｄＧＴＰを用いたＤＳＦ反応は「Ｇ」と表示されたウェルで実施する。ｄＴＴＰを用いたＤＳＦ反応は「Ｔ」と表示されたウェルで実施する。結果として、９６ウェルプレートは２４種類のＲＮＡ試料を収容し、それぞれについて４種類のＤＳＦ反応を実施する。図２に示されるとおり、一連の分子反応は、自動化マイクロタイタープレート洗浄機中で洗浄後、適切な試薬を使用し、最適化条件でインキュベートすることにより連続的に実施される。したがって、時間と手間を最小限に抑えながら２４種類の試料で多数の多様な標的を同時検査するため、最初のプローブによるハイブリダイゼーションから最終ステップであるレポーター・アダプター連結までの一連の様々な分子反応は、ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレートで完了する。試験対象となる試料数は、ＤＳＦ反応がペアで（１つのウェルで２種類のｄＮＴＰを、別のウェルで他の２種類のｄＮＴＰを使用する等）実施する場合は、４８種類まで増やせる。３８４ウェルプレートを使用すれば、試験対象となるＲＮＡ試料数は１９２種類まで増やせる。収容能は、多数のプレートを同時に収容する自動化マイクロタイタープレート洗浄機をさらに使用することにより増やせる。標識レポーター・アダプターとの連結後、相補ｄＮＴＰにより補完される変異体を持つウェルは、先行技術において既知の適合可能なシグナル検出、定量化法、または増強法により検出および／または定量化できる。突然変異検出および／または定量化は、二本鎖アダプター連結産物を標的にすることによっても実行できる。図２に示される１つの非制限的実施形態では、ブロッキング・アダプターは制限酵素（ＲＥＳ）埋め込み部位を持つ。したがって、変異体‐二本鎖アダプター連結産物は、「ＲＥＳ」消化により固相培地から遊離される。ＰＣＲ、ＬＣＲ、またはＴＭＡにより配列を増幅すれば、少量でも変異体‐二本鎖アダプター連結産物を増幅、高感度検出、および／または定量化できるようになる。「ＲＥＳ」消化のほか、先行技術において既知の方法（熱またはアルカリ処理による変性等が含まれるが、これらに限定しない）によっても変異体‐二本鎖アダプター連結産物を固相培地から遊離させられる。
【００２２】
図３に示されるとおり、マイクロアレイフォーマットにおいて固相培地上で突然変異検出を実施するための非制限的方法を提供する。本開示において、固相培地は先行技術において既知の材料（スライド、フィルム、またはマイクロアレイフォーマットにおいて一本鎖ＤＮＡプローブを固定し得る膜等が含まれるが、これらに限定しない）である。固相培地を保持するホルダーデバイスを用いて、上述の一連の様々な分子反応の実行を促進できる。ホルダーデバイスは、自動化マイクロタイタープレート洗浄機で使用するために適合されることに留意する。非制限的実施形態では、このホルダーデバイスは標準的な顕微鏡スライド６枚を保持し、アセンブリ後、標準的な９６ウェルプレートへ変換する。図３に示されるとおり、何百もの多数の多様なアンチセンスＤＮＡプローブをアレイフォーマットで各ウェルに固定し、それぞれ「１」から「Ｎ」までの番号をふった特定の位置に各プローブをスポットし、ダブルスポットされたプローブは、それぞれ「Ａ」および「Ｂ」と表示する。このホルダーデバイスでは、少なくとも２４種類のＲＮＡ試料について検査できる。ＲＮＡ試料は試験対象となる試料から採取するか、あるいは試験対象となる試料由来の目的遺伝子の転写物を増幅できる、先行技術において既知の方法（ＴＭＡまたはＲＮＡ転写後のＰＣＲ増幅の利用等が含まれるが、これらに限定しない）により合成できる。試験対象となる各ＲＮＡ試料をそれぞれ等しく４分割し、ホルダーデバイスのウェルで４種類のｄＮＴＰによりそれぞれに対しＤＳＦを実施する。上述のとおり、一連の分子反応は、自動化マイクロタイタープレート洗浄機中で洗浄後、適切な試薬を入れ、最適化条件でインキュベートすることにより連続的に実施可能である。標識レポーター・アダプターと連結した後、スライドまたは膜をホルダーデバイスから取り外し、レポーター・アダプターまたは変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドの標識を目標とする、先行技術において既知の適合可能な検出法またはシグナル増強法を用いたシグナル解析を実施する。図３に示されるとおり、相補ｄＮＴＰにより補完され、完全長配列が伸長される変異体が認められるウェルでは、Ａ１（Ｂ１）、Ａ３（Ｂ３）、Ａ４（Ｂ４）の位置のシグナルが検出可能である。各プローブの特定の位置は既知であるため、検出可能なシグナルが認められるスポットにより、関与する突然変異遺伝子を即時に同定できる。試験対象となる試料の数は、１つのウェルで２種類のｄＮＴＰを、別のウェルで２種類のｄＮＴＰによりＤＳＦ反応を実施する場合は４８種類まで倍増させてもよい。収容能については、３８４ウェルプレートに変換するホルダーデバイスを使用することにより、試料を１９２種類まで増やせる。試験対象となる試料の数は、多数のプレートを収容する自動化マイクロタイタープレートをさらに使用することにより増やせる。
【００２３】
図４を参照しながら、感染性微生物および薬剤耐性変異体（ＨＩＶ‐１および薬剤耐性変異体等が含まれるが、これらに限定しない）を検出するための非制限的方法の概要を提供する。図４に示されるとおり、様々な系統のＨＩＶ‐１のｐｏｌ遺伝子に特異的なアンチセンスＤＮＡプローブを、アレイフォーマットで固相培地に別々に固定する。プローブに番号を振り、２列に並べる。「Ａ」列と「Ｂ」列は同じである。上述のとおり、各アンチセンスＤＮＡプローブは、５’末端に少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ｔ」を持つ。先行技術において既知の方法（ＰＣＲ増幅ＨＩＶ‐１  ｐｏｌ  ｃＤＮＡのＴＭＡまたはＲＮＡ転写等が含まれるが、これらに制限されない）により、試験対象となる試料由来のウイルス性ＲＮＡを採取・増幅できる。次にＲＮＡ試料を４分割し、アンチセンスＤＮＡプローブによりハイブリダイゼーションする。ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖分子が形成された後、固相培地上で一連の分子反応（リボヌクレアーゼ消化、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼおよびｄＡＴＰを用いた配列の伸長、標識ブロッキング・アダプターとの連結、それぞれ４種類のｄＮＴＰによるＤＳＦ、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと４種類全てのｄＮＴＰによる配列伸長、および標識レポーター・アダプターとの連結等）を実施する。ブロッキング・アダプターには、先行技術において既知の検出可能なマーカー（蛍光染色、フルオレセイン（ＦＬ）等が含まれるが、これらに限定しない）で標識可能であり、レポーター・アダプターは、検出可能な別のマーカー（別の蛍光染色、Ｃｙ３．５（Ｃｙ））で標識可能であることに留意する。図４の左パネルに示されるとおり、ＦＬ標識ブロッキング・アダプターとの連結後、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を形成するためのＨＩＶ‐１  ＲＮＡが認められないことから、ＨＩＶ‐１ウイルスのない正常試料では蛍光は検出されない。一方、野生型ＨＩＶ‐１または薬剤耐性変異体を持つ試料は、まずＦＬ標識ブロッキング・アダプターにより染色される。図４の右下パネルに示されるとおり、さらなる操作によりスポットＡ３およびＢ３で完全長配列が伸長され、Ｃｙ標識レポーター・アダプターと連結し、薬剤耐性変異体は相補ｄＮＴＰにより補完され、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化から完全に保護される。対照的に、完全長配列が伸長されないため、ＦＬ標識ブロッキング・アダプターは、同一系統の野生型ＨＩＶ、様々な系統の野生型ＨＩＶ、および相補ｄＮＴＰにより補完される変異体で占められたスポットに保持される（図４の中央パネル）。
【００２４】
図５を参照しながら、感染性微生物および変異体（ＨＩＶ‐１および薬剤耐性変異体等が含まれるが、これらに限定しない）の存在を確認する迅速スクリーニングおよび高感度検出の非制限的方法の概要を提供する。図５に示される１つの非制限的実施形態では、様々な系統のＨＩＶ‐１  ｐｏｌ遺伝子に特異的なビオチン化アンチセンス野生型ＤＮＡプローブをストレプタビジン被覆マイクロタイタープレートの各ウェルに固定する。ウイルス性ＲＮＡは、試験対象となる試料から採取する。アッセイの感度を増強するため、目的ＲＮＡの増幅に適合可能な先行技術において既知の方法により、ウイルス性ＲＮＡの転写物を増幅させる。試験対象となるＲＮＡ試料を４分割し、ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレートのウェルに別々に入れる。プローブによるハイブリダイゼーションからレポーター・アダプターとの連結までの一連の分子反応は、試薬を入れ、最適化条件で適切インキュベートすることにより連続的に実施され、自動化マイクロタイタープレート洗浄で洗浄される。ブロッキング・アダプターは制限酵素（ＲＥＳ）部位を持ち、レポーター・アダプターは検出可能なマーカーにより標識されることに留意する。図５の左パネルに示されるとおり、ウェルにアダプターが認められない場合、ＨＩＶ‐１ウイルスは存在しない。図５の中央部２枚のパネルに示されるとおり、ブロッキング・アダプターは同一系統または異なる系統の野生型ＨＩＶ‐１が認められるウェルに付着する。相補ｄＮＴＰにより補完されない変異体も、前述のブロッキング・アダプターにより遮断される（図なし）。対照的に、図５の右パネルに示されるとおり、相補ｄＮＴＰにより補完される変異体は完全長配列が伸長され、標識レポーター・アダプターとブロッキング・アダプターとの連結が可能になる。結果として、レポーター・アダプターの標識を目的とすることにより、適合可能なシグナル検出／定量化法または増強法を用いて、相補ｄＮＴＰにより補完されるＨＩＶ‐１変異体が認められる試料を同定できる。さらに、ブロッキング・アダプターに埋め込まれた「ＲＥＳ」部位を利用することにより、対応する「ＲＥＳ」酵素消化が、２種類の一般的なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅され得る二本鎖アダプター連結産物を遊離させ、少量のＨＩＶ‐１を高感度で検出する。代替方法として、上述のとおり、ＬＣＲまたはＴＭＡを用いて発現頻度の低い変異体を増幅・検出できる。
【００２５】
固相培地に固定された組織片または細胞調製品（顕微鏡スライドまたは膜等が含まれるが、これらに限定しない）の多数の多様な遺伝子内に常在する突然変異を検出するための非制限的方法の概要も提供する。この非制限的方法により多数の多様な遺伝子変異の同時検査が可能になり、顕微鏡検査用の細胞の形態が保存される。一般的な方法は、試験対象となる細胞性ＲＮＡ試料が先行技術において既知のスライドまたは固相培地上に固定されることを除けば、図３および図４で示された方法とほぼ同じである。４枚のスライドセットについて検査する。目的転写物が少量であるならば、細胞性核酸成分を固定後、先行技術において既知の転写物増幅法を実施し、アッセイの感度を増強させる。再水和後、多数の多様な遺伝子領域を標的とするアンチセンス野生型ＤＮＡプローブ混合物により、組織片または細胞調製品をハイブリダイゼーションする。上述のとおり、各アンチセンスプローブは、５’末端に少なくとも１つの別の「デオキシ‐Ｔ」を持つ。固相培地上にＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖が形成された後、一連の分子反応（リボヌクレアーゼ消化、ＲＮＡプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼとｄＡＴＰを用いた配列伸長、ブロッキング・アダプターとの連結、スライド上の４種類のｄＮＴＰ（または１つのスライドに２種類のｄＮＴＰ、別のスライド上に別の２種類のｄＮＴＰ）のいずれかによるＤＳＦ、一本鎖特異的ヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと４種類全てのｄＮＴＰによる配列伸長、標識レポーター・アダプターとのその後の連結等が含まれるが、これらに限定しない）を実施する。上で説明したとおり、相補ｄＮＴＰにより補完され、完全長配列が伸長された目的変異体が認められる細胞のみが標識レポーター・アダプターと連結できる。レポーター・アダプター上の検出可能な標識を目的とすることにより、適合可能なシグナル検出法または増強法を用いて変異体を同定できる。例えば、レポーター・アダプター上の標識が蛍光染料の場合、蛍光顕微鏡または蛍光ＣＣＤカメラにより変異体を同定できる。別の非制限的実施形態では、レポーター・アダプター上の標識には、シグナル増強用の着色可能な基質が含まれている。結果として、変異体は光学顕微鏡下で同定できる。
【００２６】
本開示の別の非制限的実施形態は、本開示の突然変異検出法の実行を促進する産物を目的とする。１つの非制限的実施形態では、試薬および本開示の方法の実施について指示を与えるユーザーズガイドを備えるキット（またはキット一式）を提供する。ユーザーズガイドには、紙の印刷物、コンピューター可読形式の媒体、およびこれらの組み合わせが含まれる。キットは１つ以上の目的遺伝子の解析用として特別仕様である、あるいはキットは本開示の方法に基づく広範な突然変異スクリーニングの用途にとって重要な試薬および材料を備える、あるいはキットは本開示の方法を用いる全てまたは一部の試薬および材料を備えており、１種類以上の病的状態または疾患（遺伝性疾患、感染性微生物、細胞機能、または細胞機能経路等）と一般的に関連のあるおよび／または観察される多数の突然変異を検出する。概して、本キットの試薬および材料には、遺伝子領域をスクリーニングするのに必要なプローブも含まれる。プローブは本開示で上述されるとおり合成できる。プローブは個別に提供される、あるいは多様なプローブ混合物は液剤または凍結乾燥粉末剤として提供される、あるいは多数の多様なプローブは固相培地上に固定し得る。１つの非制限的実施形態では、提供されるプローブは固相培地上に固定されるため分子または標識と連結し、適切な緩衝溶液で懸濁されるか、あるいは凍結乾燥剤に含められる。別の非制限的実施形態では、プローブは固相培地上にアレイフォーマット（１種類以上のマイクロタイタープレート上、膜上、スライド上、またはＤＮＡマイクロアレイ／チップとしてアレイに蒸着される等）で提供される。ＤＮＡアレイを作製するための先行技術において既知の方法を用いて、本開示のＤＮＡマイクロアレイを作製できる。別の非制限的実施形態では、混合されたプローブをマイクロタイタープレートの各ウェル上に固定する。ＲＮＡ試料は、提供される本開示のキットにより検定できる。本開示で以前記述したとおり、ＲＮＡ転写物を調製または増幅できる。概して、キットは特定の分子の生物学的機能、経路、またはマーカーを標的としている。このようなキットは例えば１）癌遺伝子の突然変異スクリーニングに特異的で、既知の癌遺伝子に特異的なプローブを備えるキット、（２）癌抑制遺伝子の突然変異スクリーニングに特異的で、既知の癌抑制遺伝子に特異的なプローブを備えるキット、（３）ミスマッチ修復遺伝子の突然変異スクリーニングに特異的で、既知のミスマッチ修復遺伝子に特異的なプローブを備えるキット、（４）「チロシンキノーム」とも呼ばれるチロシンキナーゼ遺伝子の突然変異スクリーニングに特異的で、チロシンキナーゼに特異的なプローブを備えるキット、（５）成長因子受容体遺伝子の突然変異スクリーニングに特異的で、成長因子受容体遺伝子に特異的なプローブを備えるキット、（６）Ｄ‐ループまたは非Ｄ‐ループのいずれかの内部（コーディング）領域に認められるミトコンドリアＤＮＡの突然変異スクリーニングに特異的で、この領域に特異的なプローブを備えるキット、（７）マイクロＲＮＡスクリーニングに特異的で、マイクロＲＮＡに特異的なプローブを備えるキット、（８）ＳＮＰマーカーに特異的で、ＳＮＰマーカーに特異的なプローブを備えるキット、（９）マイクロサテライト多型マーカーのスクリーニングに特異的で、マイクロサテライト多型マーカーに特異的なプローブを備えるキット、および（１０）感染性微生物および変異体スクリーニングに特異的で、目的微生物に特異的なプローブを備えるキットであるが、これらに限定しない。キットは、疾患の突然変異としばしば関連のある遺伝子領域について、選択的に組み合わせた様々なプローブを備えることにより疾患も標的とする。このようなキットは、例えば乳癌用キット、大腸癌用キット、前立腺癌用キット、および肺癌用キット等が含まれるが、これらに限定しない。キットは、選択的に組み合わせた様々なプローブも備え、疾患のステージ、サブタイプ、または臨床状態（乳癌の上皮内癌、乳癌の浸潤性乳管内癌、転移性乳癌、または特定の種類の治療に対する耐性等が含まれるが、これらに限定しない）を標的とする。
【００２７】
ユーザーズガイドおよびプローブの他に、キットは上述の一連の分子反応の実行に必要な全てまたは一部の試薬をさらに備えることがある。キットには、上述のブロッキング・アダプターおよびレポーター・アダプターセットが含まれることもある。ユーザーズガイドの指示に基づき、キットにはＲＮＡ抽出用の試薬、提供されるプローブによるハイブリダイゼーションで使用されるＲＮＡ転写物の調製および増幅用のＰＣＲまたはＴＭＡが含まれ、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖が作製され得る。キットは、上述の変異体‐二本鎖アダプターハイブリッド産物および／または変異体‐三本鎖アダプター産物をリアルタイムＰＣＲ、ＬＣＲ、またはＴＭＡにより増幅できるようにする試薬およびプライマーを備えるように設計されることもある。キットには、キットで提供される前述のレポーター・アダプターおよび／またはブロッキング・アダプターのシグナル検出／定量化および／または増強用の試薬も含まれることがある。キットには、変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドおよび／または変異体‐三本鎖アダプターハイブリッドのＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列決定を実施するための試薬およびプライマーも含まれることがある。
【００２８】
他で述べていない限り、本開示を実施するにあたっては、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を活用する。本開示で利用され適合される全ての一般的技術および支援技術は、文献中で完全に説明される。ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、プローブによるハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ消化のための試薬および機構にはリボヌクレアーゼ、一本鎖特異的ヌクレアーゼ、制限酵素、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ反応物、連結物、転写物の増幅、検出／定量化法が含まれるが、これらに限定するものではない。その他の全ての分子生物学的技術および組換えＤＮＡ技術は当業者にとっては既知であり、本開示での使用に適している。既知の反応の変数（反応温度、反応時間、試薬濃度、標識の有無を問わず、ＰＣＲまたはＬＣＲ用のオリゴヌクレオチドの設計等）の単純な調節について不当な実験法であると悪く解釈せずに、当業者内で理解すべきものとする。
【００２９】
本開示は、下記の請求項の範囲および本質を制限するのではなく、説明するものとする。本開示について検討後、多くの修正および変更（本開示に記載された要素に対し同等の機能的および／または構造的代替物の使用および／または本開示に記載された反応に対し同等の機能的反応の使用等）が当業者に開示される。若干の変更は、下の請求項の範囲内で考慮する。
【実施例】
【００３０】
アダプターの連続的連結および増幅を可能にしたＤＳＦによる多数の多様な遺伝子の同時解析用ストレプタビジンを用いた突然変異アッセイ
【００３１】
本実施例は、ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレートを用いて突然変異の存在について調べるための多様な遺伝子の同時スクリーニング用の１つの非制限的用途を例示する。ＲＮＡ試料は、陰性対照である８種類の正常血液試料と様々な起源の１０種類の新生細胞株（ＮＣＩ‐Ｈ４６０肺癌細胞、ＨＣＴ‐１５大腸癌細胞、ＳＷ‐４８０大腸癌細胞、ＭＣＦ７乳癌細胞、ＫＧ‐１骨髄性白血病細胞、ＨＬ‐６０骨髄性白血病細胞、ＫＢＭ７骨髄性白血病細胞、Ｂ１５リンパ芽球性白血病細胞、ＨＵＴ‐７８ヒトＴ細胞白血病細胞、およびＲｙａｎ  Ｂ細胞リンパ腫細胞）から採取する。標的は、９種類の遺伝子Ｋ‐ｒａｓ、ＴＰ５３、Ｅｒｂ‐ｂ２、ＶＥＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＣＨＥＫ２、ＢＲＩＰ１、ＬＫＢ１、およびＰＩＫ３ＣＡにおいて突然変異が多くみられる領域である。このストレプタビジンを用いた突然変異スクリーニングアッセイは、次のように実施する。
【００３２】
ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレートにおけるビオチン化アンチセンス一本鎖野生型ＤＮＡプローブの調製および固定
【００３３】
正常ＲＮＡ試料については、表１に記載したプライマーセットを用いてＰＣＲにより逆転写し、増幅する。各プライマーセットは、目的遺伝子のホットスポットにフランキングしたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを備える。各リバースプライマーはビオチン化されており、５’末端に２つの別の「デオキシ‐Ｔ」が埋め込まれていることに留意する。したがって、結果生じるＰＣＲ増幅ｃＤＮＡフラグメントは、アンチセンス鎖の５’末端にビオチン分子および２つの「デオキシ‐Ｔ」を持つ。
【００３４】
【表１】
2009543582.tif 000002
９つの目的遺伝子用ビオチン化ｃＤＮＡプローブの合成に使用する９種類のプライマーセットの配列
【００３５】
ＰＣＲ増幅後、この９種類のビオチン化ＰＣＲ産物は、それぞれ最終濃度１ナノグラム（ｎｇ）／マイクロリッター（μｌ）のカクテルで混合し、次に室温で５分間０．１  Ｍ  ＮａＯＨ中で変性させる。変性したビオチン化ＰＣＲ産物（３０μｌ）をストレプタビジン被覆９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、室温で２０分間インキュベート後、自動化マイクロタイタープレート洗浄機中で広範囲にわたって洗浄する。結果として、ストレプタビジン被覆プレートにおいてビオチン化アンチセンス鎖は共有結合によりウェルにしっかり固定され、センス鎖はビオチン分子がないため結合されず、除去される。
【００３６】
プローブによるハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ消化、およびｄＡＴＰを用いた配列伸長
【００３７】
試験対象となるＲＮＡ試料から、２分割部分（各１マイクログラム）を採取し、それぞれ「ＧＡ」および「ＴＣ」と表示する。ストレプタビジン被覆マイクロタイタープレートにおいて、各分割部分をそれぞれ１０  ｍＭトリス（ｐＨ７．５）５０  μｌ、１．２５  Ｍ  ＮａＣｌ、３０％ホルムアミド、および上述の９種類の固定されたアンチセンス野生型ＤＮＡプローブを含有するウェル中で、４５℃で１時間ハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖分子形成後、自動化プレート洗浄機中でマイクロタイタープレートを洗浄し、各ウェルは最適化緩衝液中にて３７℃で１時間、ＲＮａｓｅ  ＯＮＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マジソン市）２０ユニットで処理する。自動化プレート洗浄機中で洗浄後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素５ユニット、ＮａＣｌ５０  ｍＭ、ＭｇＣｌ２５ｍＭ、ｄＡＴＰ２００  μＭ、およびＤＴＴ５  ｍＭ含有反応緩衝液（５０  μｌ）中で、ｄＡＴＰを用いて３７℃で３０分間配列を伸長する。結果生じるｄＡＴＰ修飾ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のセンス鎖上に、３’側一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングが作製される。
【００３８】
ブロッキング・アダプターの調製およびｄＡＴＰ修飾ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖とブロッキング・アダプターとの連結
【００３９】
ＢＡｄｐ‐Ｐｓｔ（＋）５’‐［Ｐｈｏｓ］ＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡ［Ｐｈｏｓ］‐３’およびＢＡｄｐ‐Ｐｓｔ（−）５’‐ＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴ‐３’という２種類の相補オリゴヌクレオチドは、ＮａＣｌ５０  ｍＭおよびＴｒｉｓ１０  ｍＭ（ｐＨ８．３）含有緩衝液において、１０  ｎｇ／μｌの等モル濃度で、６５℃で１５分間アニーリングする。ＢＡｄｐ‐Ｐｓｔ（＋）は、５’および３’末端でリン酸化される。ＢＡｄｐ‐Ｐｓｔ（−）は、３’末端に別の「デオキシ‐Ｔ」を持つ。下線でより強調されるとおり、ＢＡｄｐ‐Ｐｓｔ（＋）とＢＡｄｐ‐Ｐｓｔ（−）のどちらにも制限酵素Ｐｓｔ‐１の配列ＣＴＧＣＡＧが埋め込まれている。したがって、結果生じる二本鎖ブロッキング・アダプターは、センス鎖上に５’リン酸基と３’リン酸基、アンチセンス鎖上に３’側「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングと、Ｐｓｔ‐１部位を持つ。センス鎖上の５’リン酸およびアンチセンス鎖上の３’側「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングの存在により、このブロッキング・アダプターとｄＡＴＰ修飾ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖のセンス鎖上の３’側「デオキシ‐Ａ」突出末端の連結が可能になる。このような連結反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ４００ユニットおよびブロッキング・アダプター１０  ｎｇ含有最適化緩衝液（５０  μｌ）中にて室温で１時間実行する。ブロッキング・アダプターのセンス鎖上には３’‐ＯＨ基がないため、結果生じるＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖‐ブロッキング・アダプターハイブリッドはさらなる連結に備えて活性がない。
【００４０】
４種類全てのｄＮＴＰによるＤＳＦ、Ｓ１ヌクレアーゼ処理、および配列伸長
【００４１】
試験対象となる各ＲＮＡ試料について、２種類のＤＳＦ反応を実施し、それぞれ「ＧＡ」および「ＴＣ」と表示する。「ＧＡ」と表示されているウェルでは、ｄＧＴＰ２００  μＭ、ｄＡＴＰ２００  μＭ、Ｋｌｅｎｏｗ酵素５ユニット、ＮａＣｌ５０  ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、ＤＴＴ５  ｍＭ、およびＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）１０  ｍＭ含有最適化緩衝液（５０  μｌ）にて室温で４５分間ＤＳＦを実施する。同様に、「ＴＣ」と表示されたウェルで、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを用いたＤＳＦを実施する。ＤＳＦおよび洗浄後、試料をＳ１ヌクレアーゼ処理し、最終濃度１０ユニット／μｌのＳ１ヌクレアーゼ含有最適化緩衝液（５０  μｌ）にて３７℃で一晩かけ、保護されないデオキシリボヌクレオチドを消化する。洗浄後、未結合かつ断片化された核酸を除去する。４種類全てのｄＮＴＰによる配列伸長は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ５ユニット、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）１０  ｍＭ、ＫＣｌ５０  ｍＭ、ＭｇＣｌ２２．５  ｍＭ、および４種類のｄＮＴＰのいずれか２００  μＭ含有最適化緩衝液（ウェル当たり５０  μｌ）にて６０℃で２０分間実施する。完全に補完された部位より開始し、下流のＲＮＡと前述のブロッキング・アダプターのセンス鎖が移動する完全長配列伸長の結果として、相補ｄＮＴＰにより補完される変異体ヘテロ二本鎖上に新たな３’側一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングおよび遊離３’‐ＯＨが作製される。対照的に、相補ｄＮＴＰにより補完されていない野生型ヘテロ二本鎖、部分的に保護されたヘテロ二本鎖、および変異体ヘテロ二本鎖は、ブロッキング・アダプターにより遮断されたままである。
【００４２】
レポーター・アダプターの調製、完全長配列伸長産物とレポーター・アダプターの連結、および二本鎖アダプター連結産物の遊離
【００４３】
フォワードプライマーＥ２Ｆ‐ＴＡＡ（＋）において下線を引いたとおり、Ｅ２Ｆ１遺伝子由来の２種類のプライマーＥ２Ｆ‐ＴＡＡ（＋）５’‐ＧＧＣＡＣＴＣＧＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣ‐３’およびＥ２Ｆ７（−）５’‐ＴＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧ‐３’を用いて、ＴＡＡ‐１制限酵素部位、ＡＣＡＧＴを含むｃＤＮＡフラグメント（〜１６０  ｂｐ）を増幅させる。ＴＡＡ‐１処理後、ＰＣＲフラグメントを消化して２つの小さなサブフラグメント（アンチセンス上に一塩基「デオキシ‐Ｔ）オーバーハングを持つ１４５  ｂｐのサブフラグメントとセンス鎖上に一塩基「デオキシ‐Ａ」オーバーハングを持つ１５  ｂｐのサブフラグメント）にする。ゲル電気泳動によるサイズ分画後、１４５  ｂｐのサブフラグメントを精製し、レポーター・アダプターとして使用する準備をする。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ４００ユニット含有最適化緩衝液（５０  μｌ）にて室温で１時間、連結用にレポーター・アダプター（各１  ｎｇ）を各ウェルに入れる。レポーター・アダプター上の３’側一塩基「デオキシ‐Ｔ」オーバーハングにより、相補ｄＮＴＰにより補完される変異体ヘテロ二本鎖由来の完全長配列伸長産物とのみ、連結が可能になる。したがって、変異体‐二本鎖アダプターハイブリッドは、相補ｄＮＴＰにより補完される変異体ヘテロ二本鎖で形成され、野生型ヘテロ二本鎖、部分的に保護される相同性ヘテロ二本鎖、および相補ｄＮＴＰにより補完されない変異体ヘテロ二本鎖は、ブロッキング・アダプターにより遮断されたままである。ブロッキング・アダプターに埋め込まれたＰｓｔ‐１部位を利用して、引き続きＰｓｔ‐１消化を実施し、ＰＣＲ増幅用として二本鎖アダプター連結産物を上清に遊離させ、発現頻度の低い変異体を検出する。
【００４４】
二本鎖アダプター連結産物のＰＣＲ増幅および変異体の同定
【００４５】
セミネステッドＰＣＲを実施し、相補ｄＮＴＰにより補完される変異体ヘテロ二本鎖から生じる二本鎖アダプター連結産物を増幅する。それぞれブロッキング・アダプターおよびレポーター・アダプター由来のフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして前述のＢａｄｐ（＋）およびＥ２Ｆ７（−）を用いて、ＰＣＲの第１ラウンドを実施する。ＰＣＲの第１ラウンド後、フォワードプライマーと別のオリゴヌクレオチドＥ２Ｆ５（−）としてＢａｄｐ（＋）を、リバースプライマーとして５’‐ＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡＣ‐３’を用いて第２ラウンドを実施する。プライマーＥ２Ｆ５（−）は、Ｅ２Ｆ１遺伝子上の５’に隣接する配列からプライマーＥ２Ｆ７（−）までの配列より生じる。結果生じるセミネステッドＰＣＲ産物Ｂａｄｐ‐Ｅ２Ｆ５は、〜１３５  ｂｐの大きさである。Ｂａｄｐ‐Ｅ２Ｆ５  ＰＣＲ産物の範囲は、Ｓａｌ‐１制限酵素部位にまたがることに留意する。Ｂａｄｐ‐Ｅ２Ｆ５  ＰＣＲ産物をＳａｌ‐１消化すると、標準ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により、あまり見ることのできない〜１１０  ｂｐサブフラグメントおよび〜２５  ｂｐサブフラグメントが検出可能になる。したがって、変異体は１３５  ｂｐのアンプリコンの存在により同定し、〜１１０  ｂｐサブフラグメントを作製するＳａｌ‐１消化により確認する。
【００４６】
アッセイの感度を測定する希釈実験
【００４７】
陽性細胞株ＫＧ‐１の総細胞性ＲＮＡを１０分の１まで連続希釈し、陰性対照の総細胞性ＲＮＡ１マイクログラムとそれぞれ混合すると、試料セットは様々な陽性反応を呈する（１、１：１０、１：１０２、１：１０３、１：１０４、１：１０５、１：１０６）。これらの連続希釈試料を上述のとおり検査し、１３５  ｂｐのアンプリコンＢａｄｐ‐Ｅ２Ｆ５の存在により陽性を同定する。このようにして、本法の感度を測定する。
【結果】
【００４８】
９種類の目的遺伝子Ｋ−ｒａｓ、ＴＰ５３、Ｅｒｂ‐ｂ２、ＶＥＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＣＨＥＫ２、ＢＲＩＰ１、ＬＫＢ１、およびＰＩＫ３ＣＡにおける変異体の存在を確認するため、１０種類の新生細胞株および８種類の正常血液試料について検査する。予想どおり、８種類の陰性対照試料は、いずれも陰性となる。４種類の新生細胞株（ＭＣＦ７乳癌細胞、Ｂ１５リンパ芽球性白血病細胞、ＨＬ‐骨髄性白血病細胞、およびＫＢＭ７骨髄性白血病細胞）も陰性の結果を示す。陽性反応は、以下のとおり同定される。ＮＣＩ‐４６０肺癌細胞は「ＧＡ」により、ＳＷ‐４８０大腸癌細胞は「ＧＡ」により、ＨＣＴ‐１５大腸癌細胞は「ＧＡ」および「ＴＡ」により、ＫＧ‐１骨髄性白血病細胞は「ＧＡ」により、ＨＵＴ‐７８ヒトＴ細胞白血病細胞は「ＴＣ」により、Ｒｙａｎ  Ｂ細胞リンパ腫細胞は「ＧＡ」により補完される。図６で代表的に示されるとおり、結果はＲｙａｎ  Ｂ細胞リンパ腫細胞（上パネルの左４列）、ＫＧ‐１骨髄性白血病細胞（上パネルの右４列）、ＨＣＴ‐１５大腸癌細胞（下パネルの左４列）、ＳＷ‐４８０大腸癌細胞（下パネルの右４列）から得られる。「ＧＡ」により補完されるＲｙａｎ細胞リンパ腫細胞、「ＧＡ」により補完されるＫＧ‐１骨髄性白血病細胞、「ＧＡ」および「ＴＣ」により補完されるＨＣＴ‐１５大腸癌細胞、および「ＧＡ」により補完されるＳＷ‐４８０大腸癌細胞において、陽性反応はＰＣＲアンプリコンＢａｄｐ‐Ｅ２Ｆ５の存在により大きさ別に示され（「Ｕ」列）、Ｓａｌ‐１消化（「Ｓ」列）により確認される。本法の感度を測定するため、様々な濃度のＫＧ‐１白血病細胞ＲＮＡ（１、１：１０、１：１０２、１：１０３、１：１０４、１：１０５、１：１０６）を持つ連続希釈試料および陰性対照セットについて分析する。「ＧＡ」を用いてＤＳＦ反応が実施される試料の結果を図７に示す。図７で示されるとおり、１３５  ｂｐのＢａｄｐ‐Ｅ２Ｆ５  ＰＣＲアンプリコンは１〜６列で明確に検出され、ＫＧ‐１ＲＮＡはそれぞれ１、１：１０、１：１０２、１：１０３、１：１０４、および１：１０５の希釈時に認められる。陰性対照（８列）ではバンドは検出できないが、ＫＧ‐１ＲＮＡが１：１０６まで希釈される７列に薄いバンドが存在する可能性がある。まとめると、これらの結果は、数十万の正常細胞において変異体の有無を調べるための本アッセイにより、多数の多様な遺伝子の同時スクリーニングが可能になることを示す。
【００４９】
ＤＮＡ塩基配列決定による突然変異の特徴付け
【００５０】
これら１８種類の試料における９種類の目的遺伝子についてＤＮＡ塩基配列決定を実施する。試験対象となる１０種類の新生細胞株の突然変異については、表２に要約する。
【００５１】
【表２】
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１０種類の新生細胞株に関する塩基配列決定により同定される突然変異 
注１：＊は９２２の位置のヌクレオチドの「Ｇ」のうしろにＧＡＴＴＡを挿入することを意味する 
注２：ＷＴ：野生型 
注３：各変異体におけるヌクレオチドの配列の変化（下線）と関与するコドンおよび予想されるアミノ酸の変化（上線）を示す
【００５２】
ＤＮＡ塩基配列決定の結果は、本ＤＳＦ突然変異スクリーニング法の結果と一致していると考えられる。本ＤＳＦ法により確認された全ての陽性反応は、ＤＮＡ塩基配列決定により検出されたとおり、９種類の目的遺伝子の少なくとも１つに突然変異が存在することを示す。本ＤＳＦ法により確認された全ての陰性反応も、ＤＮＡ塩基配列決定により陰性の結果を示す。さらに、ＤＳＦで使用された相補ｄＮＴＰは、ＤＮＡ塩基配列決定により同定されたとおり、ヌクレオチドの配列の変化と一致する陽性反応を示す。これらの所見により、本ＤＳＦ突然変異スクリーニング法の特異度が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】多数の多様な目的遺伝子の多様な遺伝子変性の同時検出を促進する、本開示に記載した一連の分子反応の概要である。
【図２】ストレプタビジンをベースとする固相培地を用いて、本開示に記載した一連の分子反応を促進し、発現頻度の少ない変異体を検出する非制限的方法の概要である。
【図３】多数の多様な遺伝子を対象とするマイクロアレイフォーマットにおける遺伝子変異を検出するための非制限的方法の概要。
【図４】アレイフォーマットにおける様々な系統のＨＩＶ‐１のｐｏｌ遺伝子のＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および突然変異を検出するための非制限的方法の概要である。
【図５】発現頻度の少ない薬剤耐性ＨＩＶ‐１突然変異を検出するための非制限的方法の概要である。
【図６】本開示の突然変異検出法の代表的な結果である。
【図７】本開示の突然変異検出法の感度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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