(57)【要約】  本発明は、生物学的活性を有する、特に、抗微生物特性を有するペプチド化合物、その調製及びその適用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗微生物活性を示し、並びに芽胞形成まで、適切な培地中において、バチルス・クラウジイを培養すること、遠心及びろ過後に前記培養物から上清を収集すること、及び抗微生物活性を有する画分を抽出することから取得することができるペプチド化合物。
【請求項２】
２１０７．５Ｄａの分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ランチビオティックであり、並びにランチオニン架橋及び修飾されたアミノ酸を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
Ｐｈｅ−Ｄｈｂ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｄｈａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｂｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｄｈｂ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ
（Ｄｈｂは、ジデヒドロアミノブチラートを表し、
Ｄｈａは、ジデヒドロアラニンを表し、
Ａｂｕは、アミノブチラートを表す。）
【請求項５】
一方は３位のアラニンと７位のアラニンの間、及び他方は１６位のアラニンと２１位のアラニンの間の２つのランチオニン架橋；８位のアミノブチラート残基と１１位のアラニンの間のメチル−ランチオニン架橋及びＣ末端アミノビニル−システイン基と１９位のアラニンの残基の間の第四の架橋を有することを特徴とする、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記アミノ酸残基がＬ形態の鏡像異性体であることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載の化合物の調製方法であり、
−バチルス・クラウジイの株の芽胞形成まで、適切な培地中で、前記株を培養する段階と；
−遠心及びろ過後に、前記培養物から上清を収集する段階と；
−得られた画分の固相抽出及び溶出の段階と；
−必要であれば、得られた画分を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する段階と；
を含む、前記方法。
【請求項８】
請求項１から６の何れか一項に記載の化合物を含むことを特徴とする医薬品。
【請求項９】
請求項１から６の何れか一項に記載の化合物及び医薬として許容される少なくとも１つの賦形剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１０】
腸疾患又は感染性疾患の治療及び／又は予防を目的とする医薬品の調製のための請求項１から６の何れか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
腸内細菌相異常（ディスバイオシス）及び内因性ビタミン疾患の治療及び／又は予防のための、抗生物質治療又は化学療法の結果として変化を受けた腸の微生物叢の回復のための、下痢、特に、急性の下痢又は医薬品の使用に伴う下痢の治療及び予防のための、請求項１０に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
化粧品又は食品組成物中の添加物として、請求項１から６の何れか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的活性を有する、特に、抗微生物特性を有するペプチド化合物、その調製及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の微生物は、ヒト又は動物に生きた状態で投与された場合に、特に、抗微生物物質を産生することによって、宿主の健康に対して有益な効果を発揮できることが知られている。
【０００３】
このような生物は、一般に、プロバイオティック生物と呼ばれている。
【０００４】
特に、下痢、急性の下痢及び医薬の使用に伴う下痢などの胃腸疾患の治療における、ヒト又は動物に対する、これらのプロバイオティック生物の有益な効果が多数の研究によって示されている。
【０００５】
これまでのところ、最もよく研究されているプロバイオティック生物は乳酸菌であるが、他の生きた生物が健康に対して有益な効果を有し得ることも報告されている。
【０００６】
これらの他の生物には、例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ポリフェルメンタンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）が含まれる。
【０００７】
これらのうち、バチルス・クラウジイは、Ｅｎｔｅｒｏｇｅｒｍｉｎａ（Ｒ）の商品名で販売されている医薬組成物中に、長年にわたって使用されてきた。
【０００８】
この医薬組成物は、特に、胃腸疾患を撲滅することを目的としており、バチルス・クラウジイの４つの株の混合物を含む。
【０００９】
これらのプロバイオティック生物の抗微生物生物活性は、一般に、ランチビオティクスなどの抗微生物活性を有する化合物の天然の産生に関連している。従って、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、ストレプトミセス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の株は、それぞれ、サブチリン、ミュータシン及びナイシンを産生する。
【００１０】
現在、多数の抗生物質が、感染性疾患の治療のための治療用物質として使用されているが、病原体は、使用されている医薬に対して、ますます耐性を示すようになってきている。病原体の幾つかは、既に、「多剤耐性」であることが知られており、時折、それらが引き起こす感染症を治療することは極めて困難である。
【００１１】
従って、抗生物質特性を有する新たな分子が、常に探索されている。
【００１２】
本発明の目的は、バチルス・クラウジイから得られる抗微生物活性を有する化合物を提案することによって、この要求を充足することである。
【００１３】
本発明の第一の目的は、抗微生物活性を有する化合物に関する。
【００１４】
本発明の第二の目的は、本発明の抗微生物活性を有する化合物の調製のための方法に関する。
【００１５】
本発明の第三の目的は、本発明の抗微生物活性を有する化合物を含有する医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の第四の目的は、本発明の抗微生物活性を有する化合物の使用に関する。
【００１７】
第一の態様によれば、本発明は、抗微生物活性を有する化合物に関する。
【００１８】
従って、バチルス・クラウジイによって産生され、抗微生物活性を示す分子が単離され、性質決定された。
【００１９】
抗微生物活性を有する本発明の化合物は、ペプチド性であり、並びに芽胞形成まで、適切な培地中において、バチルス・クラウジイを培養すること、遠心及びろ過後に前記培養物から上清を収集すること、及び抗微生物活性を有する画分を抽出することから取得することができる。
【００２０】
主にグラム陽性細菌に対して活性を有する本発明の化合物は、バチルス・クラウジイから得ることができ、ＭＡＬＤＩＴＯＦ及びＥＳＩ法による質量分析法によって測定された２１０７．５Ｄａの分子量を有する。
【００２１】
別の特徴によれば、本発明の化合物は、ランチビオティックであり、並びにランチオニン架橋及び修飾されたアミノ酸をそのペプチド配列中に有する。
【００２２】
その特徴の１つによれば、本発明の化合物は、アミノ酸及びアミノ酸誘導体の以下の配列を含む
Ｐｈｅ−Ｄｈｂ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｄｈａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｂｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｄｈｂ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ
（Ｄｈｂは、ジデヒドロアミノブチラートを表し、）
Ｄｈａは、ジデヒドロアラニンを表し、
Ａｂｕは、アミノブチラートを表す。）
本発明の化合物は、一方は３位のアラニンと７位のアラニンの間、及び他方は１６位のアラニンと２１位のアラニンの間の２つのランチオニン架橋を有する。
【００２３】
さらに、８位のアミノブチラート残基と１１位のアラニンの間にメチル−ランチオニン架橋が存在する。Ｃ末端アミノビニル−システイン基と１９位のアラニンの残基の間に、第四の架橋が存在する。
【００２４】
存在する架橋とともに表すと、本発明の化合物は、以下の配列を有する。
【００２５】
【化１】
2009532456.tif 000002
（Ｄｈａ、Ｄｈｂ及びＡｂｕは、上に定義されているとおりである。）
第二の態様によれば、本発明は、本発明の化合物の調製のための方法に関する。
【００２６】
本発明によれば、本発明の化合物は、以下の方法に従って、バチルス・クラウジイから抽出することができる。
【００２７】
本発明の化合物の調製方法は、
−バチルス・クラウジイの株の芽胞形成まで、適切な培地中で、前記株を培養する段階と；
−遠心及びろ過後に、前記培養物から上清を収集する段階と；
−得られた画分の固相抽出及び溶出の段階と
を含む。
【００２８】
必要であれば、本発明の分子に対応する得られた画分は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製することが可能である。
【００２９】
別の実施形態によれば、本発明の化合物は、当業者に公知の方法に従い、慣用の化学合成によって調製することができる。
【００３０】
本発明の化合物は、グラム陽性細菌に対する抗微生物活性を示す。特に、本発明の化合物は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ，）、ミクロコッカス種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及び口腔のグラム陽性細菌に対して抗微生物活性を示した。
【００３１】
そのランチビオティック特性のために、本発明の化合物は、生物学的活性のより幅広いスペクトル、例えば、抗ウイルス、抗寄生生物又は免疫調節活性を示すことができる。
【００３２】
従って、本発明の化合物は、医薬品の調製のために使用することができる。
【００３３】
従って、その別の態様によれば、本発明は、本発明の化合物を含有する医薬品に関する。
【００３４】
これらの医薬品は、治療に用途を見出し、特に、感染性疾患の治療及び予防に用途を見出す。
【００３５】
これらの医薬品は、腸疾患の治療及び／又は予防に、例えば、腸内細菌相異常（ディスバイオシス）及び内因性ビタミン疾患の治療及び予防に、並びに、抗生物質治療又は化学療法の結果として変化を受けた腸の微生物叢の回復における補助的治療にも用途を見出す。
【００３６】
これらの医薬品は、下痢、特に、急性の下痢及び医薬品の使用に伴う下痢の予防及び治療にも用途を見出す。
【００３７】
その別の態様によれば、本発明は、活性成分として、本発明の化合物を含む、上記病変の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、本発明の化合物の有効用量及び医薬として有効な少なくとも１つの賦形剤を含有する。
【００３８】
前記賦形剤は、医薬形態及び所望の投与経路に従って、当業者に公知の通常の賦形剤から選択される。
【００３９】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、局所的（ｌｏｃａｌ）、気管内、経鼻、経皮又は直腸投与用の本発明の医薬組成物では、前記化合物は、慣用の医薬賦形剤と混合され、上記疾患又は疾病の予防又は治療のために、投薬単位で、動物及びヒトに投与することができる。
【００４０】
適切な投薬単位は、錠剤、軟又は硬カプセル、粉末、顆粒及び経口溶液又は懸濁液などの経口経路用形態；投与の舌下、頬、気管内、眼内、経鼻及び吸入形態；投与の局所、経皮、皮下、筋肉内又は静脈内形態；投与の直腸形態並びにインプラントを含む。局所適用に関して、本発明の化合物は、クリーム、ゲル、軟膏又はローション中に使用することができる。
【００４１】
本発明の組成物は、特に、感染の性質、当該宿主の種類、宿主の年齢、体重及び全般的な状態、同時に受けている治療並びに治療及び治療原理に対する宿主の応答に応じた最も適切な経路及び用量で投与することができる。
【００４２】
一般に、ヒトに投与する場合、組成物は、芽胞の医薬組成物の形態で、経口経路によって投与される。例えば、用量は、単回投薬又は数回投薬で、１日に約１０×１０９個の芽胞、例えば、１日に１から８×１０９個の芽胞、特に、１日に２、４または６×１０９個の芽胞の用量であり得る。
【００４３】
より高い又はより低い用量が適切である特殊な事例が存在し得るが、このような用量も、本発明の範囲に属する。
【００４４】
その別の態様によれば、本発明は、上記病変の予防及び／又は治療を目的とした医薬品の調製のための、本発明の化合物の使用に関する。
【００４５】
その別の態様によれば、本発明は、本発明の化合物の有効量の患者への投与を含む、上記病変の治療方法にも関する。
【００４６】
その別の態様によれば、本発明の化合物は、化粧品又は食品組成物中の添加物として使用することもできる。この使用によれば、本発明の化合物は、化粧品又は食品組成物中での細菌の増殖の増加を阻害し、従って、それらの防腐を可能とするのに十分な量で添加される。
【００４７】
以下に挙げられている実施例は、本発明を例示するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００４８】
１．分子の作製
上清の作製
（Ｅｎｔｅｒｏｇｅｒｍｉｎａ（Ｒ）の商品名で販売されている医薬組成物から得られる）バチルス・クラウジイのＯ／Ｃ株を、本株の芽胞形成が生じるまで、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地上、３７℃及び１８０回転／分で、３日間培養する。
【００４９】
次いで、培養物を遠心し、全ての残存する細胞を除去するために、０．４５μｍの孔サイズを有する膜で、上清をろ過する。
【００５０】
抽出
ＳｅｐＰａｋプラスＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）上、固相中で、抗微生物活性を有する化合物を抽出する。このために、前段階で得られた上清１５０ｍＬをカートリッジの上に置き、ＮＨ４ＨＣＯ３２５ｍＭ，ｐＨ８；ＮＨ４ＨＣＯ３２５ｍＭ，ｐＨ８＋１０％メタノール及びＮＨ４ＨＣＯ３２５ｍＭ，ｐＨ８＋５０％メタノールでの連続する３回の洗浄後に、１００％メタノールで溶出を行う。
【００５１】
１００％メタノールで溶出された活性画分の全てを合わせて、１０の容量低下率が得られるまで、真空蒸発によって濃縮する。
【００５２】
濃縮物を−２０℃で保存する。これらの条件で、保存の６ヶ月後に、活性の喪失は観察されなかった。
【００５３】
精製
固相中で抽出された物質の均質化まで、ＨＰＣＬによって精製を行う。
【００５４】
第一の半調製段階は、カラムＣ４Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ１００×８ｍｍ上で実施する。抗微生物活性を示す溶出液の画分を集め、合わせる。この段階の終わりに得られた化合物の純度は８０％超であり、抽出−精製における収量は、約６ｍｇ／上清１リットルである。
【００５５】
第二の分析段階は、カラムＣ１Ｂｉｓｃｈｏｆｆ１５０×４．６ｍｍ上で行う。抗微生物活性を示す溶出液の画分を集め、合わせる。この段階の終わりに得られた化合物の純度は、９０％超である。
【００５６】
２．構造の調査
分子量の測定
上の実施例１で得られた、精製された化合物は、ＭＡＬＤＴＯＦ法を用いた質量分析法によって測定され、ＥＳＩ法を用いた質量分析法によって確認された２１０７．５Ｄａの分子量を有する。
【００５７】
ＵＶ／可視吸収スペクトル
本発明の化合物は紫外線中で吸収し、特に、その構造中に芳香族アミノ酸が存在することと合致して、２６５ｎｍにピークを有する。
【００５８】
アミノ酸の組成
真空下、１１５℃で１６時間の、ＨＣｌ５．７Ｎによる完全な加水分解後に、精製された化合物の構造中に、様々なアミノ酸の存在が検出される。
【００５９】
アミノ酸の様々な鏡像異性体形態の調査
完全な酸加水分解後に、Ｓｚｏｋａｎ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．，１９８８，４４４，ｐｐ．１１５−１２２）によって記載されている方法に従って、Ｎα−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド（Ｍａｒｆｅｙの試薬）での誘導体化によって、抗微生物活性を有する化合物の配列を構成するアミノ酸の鏡像異性のＬ型及びＤ型を調べた。結果は、抗生物質分子を構成しているアミノ酸の全ての残基はＬ型の鏡像異性体であることを示している。
【００６０】
構造に対する酵素的又は化学的処理の効果
プロナーゼでの酵素的処理後に活性が完全に失われることによって、新規抗生物質化合物はペプチド性であることが確認される。
【００６１】
システイン特異的アッセイが陰性であることが判明したので、ジスルフィド結合は除外される。これに対して、アルカリ溶媒中での還元処理（Ｍｅｙｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２３，ｐｐ１８５−１９０，１９９４）に感受性を有するランチオニン架橋の存在は、逆相ＨＰＬＣによって検出される、構造的修飾後にβメルカプトエタノールの存在下で観察される活性の喪失を説明することができる。ＤＴＴ２５ｍＭの存在下での、中性ｐＨにおける温置など、より激しくない処理の終了時に測定される、部分的に留まる活性の低下は、構造中に存在するジデヒドロアミノ酸の特異的な還元の結果であり得る。これらの観察によって、バチルス・クラウジイによって産生される抗微生物分子がランチビオティックである仮説を立てることが可能となる。抗生物質のこのファミリーは、通常、それらの構造中のランチオニン架橋及び修飾されたアミノ酸の存在によって特徴付けられる。
【００６２】
天然分子の配列決定
Ｎ末端から始まるＥｄｍａｎ反復分解によるＰｒｏｃｉｓｅ４９２Ａ自動配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて、配列決定が実施される。形成されるＰＴＨアミノ酸は、マイクロボアＣ１８カラム上の逆相ＨＰＬＣによって分析される。天然状態にある抗生物質分子の配列決定は、Ｅｄｍａｎ化学分解の最初の工程の終了時に遮断される。同定された唯一の残基は、Ｎ末端位置を占有するフェニルアラニンに対応する。
【００６３】
化学的修飾後における分子の配列決定
アミノ酸組成の分析及び還元溶媒中の挙動から得られる情報と組み合わされた、遺伝子をコードする配列から推測された、バチルス・クラウジイによって産生される新規抗微生物物質の推定配列に関する情報は、ランチビオティックスに特徴的な翻訳後修飾の存在を明らかにする。
【００６４】
構造中のジデヒドロアミノ酸及びランチオニン架橋の存在は、天然状態の分子の配列決定の遮断の起点に位置する。Ｄｈａ（ジデヒドロアラニン）及びＤｈｂ（ジデヒドロアミノブチラート）などのデヒドロアミノ酸は、Ｅｄｍａｎ化学分解の間に脱アミノ化され、従って、配列決定の進行を遮断する。これらの同じ残基Ｄｈａ及びＤｈｂは、同じ理由のため、完全な酸加水分解後のアミノ酸組成の分析によっては検出不能であり、それらの脱アミノ化が、第一級アミン官能基に特異的な６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバマートとの又はＡＱＣ（Ｗａｔｅｒｓ）との誘導体化の反応を無効なものとする。
【００６５】
修飾されたアミノ酸及びランチオニン架橋の存在と関連する問題を克服する目的で、ペプチド抗生物質の配列決定の前に、二重の化学反応をペプチド抗生物質に適用した。用いた方法は、「Ｓｍｉｔｈ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００，２６７，ｐ．６８１０−６８１６」の研究から修正した。この目的のために、精製されたペプチド５０ｎｍｏｌを、Ｈ２Ｏ１０μＬ＋ＮａＢＨ４４ｍｇ中に採取する。変性及び抗酸化溶液１９０μＬ（塩化グアニジン５７０ｍｇ＋Ｎ−エチルモルホリン０．１ｍＬ、ｐＨ８．５になるように、及び１ｍＬの最終容量になるようにＨ２Ｏで調整される。）を添加し、次いで、３７℃で７２時間、Ｎ２流の中で、反応混合物を温置する。
【００６６】
この処置は、ランチオニン架橋に影響を与えずに、ジデヒドロアミノ酸を特異的に還元する。
【００６７】
ＰＶＤＦ膜を搭載したＰｒｏｓｏｒｂカラム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で、このようにして還元されたペプチドを回収する。０．１％ＴＦＡの２００μＬで膜を洗浄した後、この支持体上に吸収されたペプチドを、エタンチオール（メタノール２８０μＬ＋Ｈ２Ｏ２００μＬ＋ＮａＯＨ６５ｍＬ＋エタンチオール６０μＬを含む溶液２０μＬの添加）の存在下で、１時間、５０℃での第二の還元に供する。
【００６８】
バチルス・クラウジイを用いて産生された抗生物質分子の共有結合構造
共有結合構造は、得られたデータの全てと合致している。単一同位体残基の質量に基づいて計算された分子量は２１０７．５Ｄａである。バチルス・クラウジイによって分泌される抗微生物分子は、その構造中に、４つのランチオニン架橋及びメチルランチオニン並びに３つのジデヒドロアミノ酸残基を有するランチビオティックである。構造は、観察された質量２１０７．５Ｄａ、分子に対して化学的修飾を行った後に得られた結果、Ｂ．クラウジイ中に見出される、その産生をコードする遺伝子に基づいて推測されたアミノ酸配列と合致している。構造は、ＮＭＲ分析によって確認された。
【００６９】
医薬組成物Ｅｎｔｅｒｏｇｅｒｍｉｎａ（Ｒ）中に存在するバチルス・クラウジイの他の３つの株（Ｎ／Ｒ、ＳＩＮ、Ｔ）は、Ｏ／Ｃ株と同じ抗微生物活性の特性を示した。
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月3日(2009.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009532456000001.app
【国際調査報告】
2009532456.tif 000003
2009532456.tif 000004
2009532456.tif 000005