(57)【要約】本発明は、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼに由来するアルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴｓ）と呼ばれる新規なタンパク質、およびこれらのＡＣＴｓに標識を特異的に移行させるＡＣＴｓのための基質、およびこれらを含む融合タンパク質に関する。本発明に従う基質は、式（Ｉ）（式中、Ｒ１は、芳香族もしくはヘテロ芳香族基であるか、またはＯＣＨ２−に連結された二重結合を有する、場合により置換されている不飽和アルキル、シクロアルキルもしくはヘテロサイクリル基であり；Ｒ２はリンカーであり、そしてＬは標識または複数の同じまたは異なる標識である）で示される置換されたシトシンである。本発明は、更に式（Ｉ）のこれらの基質からＡＣＴｓおよびＡＣＴ融合タンパク質に標識Ｌを移行させる方法に関する。ＡＣＴ−式（Ｉ）の化合物の系は、既知の系Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）−ベンジルグアニンと共に二重標識化研究のために特に適当である。
2009544660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１７】
2009544660.tif 000021
（式中、
Ｒ１は、芳香族もしくはヘテロ芳香族基であるか、またはＯＣＨ２−に連結された二重結合を有する、場合により置換されている不飽和アルキル、場合により置換されているシクロアルキルもしくは場合により置換されているヘテロサイクリル基であり；
Ｒ２は、リンカーであり、そして
Ｌは、標識または複数の同じまたは異なる標識である）
の化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、フェニルである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が、パラ−置換されたフェニルである、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基であって、場合により
（ａ）１個以上の炭素原子が、酸素で置き換えられている、特に３番目毎の炭素原子が、酸素で置き換えられている、例えば１〜１００のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基；
（ｂ）１個以上の炭素原子が、水素原子を有する窒素で置き換えられており、そして隣接炭素原子が、オキソにより置換されており、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を示す；
（ｃ）１個以上の炭素原子が、酸素で置き換えられておりそして隣接炭素原子がオキソにより置換されており、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を示す；
（ｄ）２つの隣接炭素原子間の結合が、二重結合または三重結合であり、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を示す；
（ｅ）１個以上の炭素原子が、フェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、橋かけヘテロ芳香族または橋かけ飽和もしくは不飽和ヘテロサイクリル基で置き換えられている；
（ｆ）２個の隣接炭素原子が、ジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−で置き換えられている；
１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基、または２つ以上の、特に２つもしくは３つの、アルキレンおよび／または前記（ａ）〜（ｆ）下に定義された改変されたアルキレン基の組み合わせであり、これらの基は場合により置換基を含有する、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が、炭素原子が場合によりアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−で置き換えられている、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である、請求項４に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
Ｌが、分光学的プローブ、特異的結合ペアの１つの部分を表す分子、または固体支持体に共有結合により結合した分子である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
Ｌが、発蛍光団である、請求項６に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−テトラメチルローダミン−５−もしくは６−カルボキサミドまたはその混合物。
【請求項９】
請求項７に記載の化合物Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−フルオレセイン−５もしくは６−カルボキサミドまたはその混合物。
【請求項１０】
請求項７に記載の化合物Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−ジアセチルフルオレセイン−５もしくは６−カルボキサミドまたはその混合物。
【請求項１１】
式８
【化１８】
2009544660.tif 000022
のＮ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＤＹ６４７−カルボキサミドである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１２】
式９
【化１９】
2009544660.tif 000023
のＮ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＤＹ５４７−カルボキサミドである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１３】
式１０
【化２０】
2009544660.tif 000024
のＮ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−Ｃｙ５−カルボキサミドである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１４】
式１２
【化２１】
2009544660.tif 000025
の請求項７に記載の化合物ＢＣ−ビオチン。
【請求項１５】
式１３
【化２２】
2009544660.tif 000026
の請求項７に記載の化合物ＢＣ−ＰＥＧ−ビオチン。
【請求項１６】
式１４
【化２３】
2009544660.tif 000027
の請求項７に記載の化合物ＢＣ−３６０。
【請求項１７】
式１５
【化２４】
2009544660.tif 000028
の請求項７に記載の化合物ＢＣ−４３０。
【請求項１８】
式１６
【化２５】
2009544660.tif 000029
の１つの請求項７に記載の化合物ＢＣ−Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎまたはその混合物。
【請求項１９】
式１７
【化２６】
2009544660.tif 000030
の１つの請求項７に記載の化合物ＢＣ−Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎジピバロイルエステ
またはその混合物。
【請求項２０】
式１８
【化２７】
2009544660.tif 000031
の１つの請求項７に記載の化合物ＢＣ−５０５またはその混合物。
【請求項２１】
（ａ）１７０〜２２０アミノ酸からなり；
（ｂ）少なくとも１つのシステインを含み；
（ｃ）Ｏ２−ベンジルシトシンと反応し、それによって同じ条件下にＯ６−ベンジルグアニンとの反応における場合と少なくとも同じに速く（ｂ）のシステインのメルカプト官能基にベンジル置換基を移行させる、
タンパク質であるアキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）。
【請求項２２】
１７７〜１８５アミノ酸を含む、請求項２１に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）。
【請求項２３】
配列番号１に記載のタンパク質；
下記の置換、
Ｒ１１４Ａ、Ｓ１３１Ｖ、Ｅ１４８Ｑ、Ｇ１５７ＷおよびＭ１５９Ｒ、
Ｒ１１４Ｓ、Ｓ１３１Ｔ、Ｄ１３５Ｔ、Ｅ１４８Ｄ、Ｇ１５７ＰおよびＭ１５９Ｅ、
Ｒ１１４Ｎ、Ｓ１３１Ｎ、Ｇ１５７ＡおよびＭ１５９Ｓ、
Ｒ１１４Ａ、Ｓ１３１Ｔ、Ｄ１３５Ｓ、Ｇ１５７ＫおよびＭ１５９Ｅ、
Ｒ１１４Ｅ、Ｓ１３１Ｒ、Ｄ１３５Ａ、Ｇ１５７ＥおよびＭ１５９Ｅ、
Ｒ１１４Ｓ、Ｓ１３１Ｖ、Ｅ１４８Ｑ、Ｇ１５７ＬおよびＭ１５９Ｒ、
Ｒ１１４Ｅ、Ｓ１３１Ｎ、Ｄ１３５Ｎ、Ｇ１５７ＴおよびＭ１５９Ｆ、
により配列番号１とは異なるタンパク質；
および位置１１４、１３１、１３５、１４８、１５７および１５９以外の位置で１個、２個または３個のアミノ酸が異なるこのようなタンパク質；
からなる群より選ばれる、請求項２１に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）。
【請求項２４】
配列番号１の請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項２５】
配列番号１２に記載のタンパク質；
位置６０のアミノ酸が、ＭまたはＩであり、
位置１１４のアミノ酸が、Ａ、Ｅ、Ｎ、ＲまたはＳであり、
位置１２１のアミノ酸が、ＡまたはＶであり、
位置１３１のアミノ酸が、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
位置１３５のアミノ酸が、Ｄ、ＮまたはＴであり、
位置１４８のアミノ酸が、Ｄ、Ｅ、ＱまたはＶであり、
位置１５３のアミノ酸が、ＬまたはＳであり、
位置１５７のアミノ酸が、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、ＰまたはＷであり、そして
位置１５９のアミノ酸が、Ｅ、Ｆ、Ｍ、Ｒ、ＳまたはＬである、
配列番号１２のタンパク質；
および位置６０、１１４、１２１、１３１、１３５、１４８、１５３、１５７および１５９以外の位置で１個、２個または３個のアミノ酸が異なるこのようなタンパク質；
からなる群より選ばれる、請求項２１に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）。
【請求項２６】
配列番号１２に記載のタンパク質および位置６０、１１４、１２１、１３１、１３５、１４８、１５３、１５７および１５９以外の位置で１個のアミノ酸が異なるこのようなタンパク質からなる群より選ばれる、請求項２５に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）。
【請求項２７】
配列番号１２配列の請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２８】
Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ突然変異体またはアキルシトシントランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、１０個までのアミノ酸位置において飽和突然変異誘発により無作為化し、得られたライブラリーを適当なファージミドにトランスフォーメーションし、標識を有するベンジルシトシンとの反応により所望のファージを選択し、次いで標識に対する抗体で被覆された磁性ビーズを使用して標識が移行されたファージを単離することを特徴とする、請求項２１に記載のアキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）を製造するための方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物から、標識Ｌを、請求項２１に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼ、または請求項２１に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼを含む融合タンパク質に移行させる方法。
【請求項３０】
関心のあるタンパク質を請求項２１に記載のアルキルシトシントランスフェラーゼを含む融合タンパク質に組み込み、該アルキルシトシントランスフェラーゼ融合タンパク質を請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物と接触させ、そして標識Ｌを認識および／または処理するためにデザインされたシステムにおいて標識Ｌを使用して、前記アルキルシトシントランスフェラーゼ融合タンパク質を検出しそして場合により更に操作する、関心のあるタンパク質を検出および／または操作するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質から標識を受け入れるように特異的にデザインされたタンパク質部分を有する融合タンパク質に標識を移行させる方法、新規な特異的基質およびこのような方法において適当な特異的基質の標識を受け入れる新規なタンパク質に関する。
【０００２】
発明の背景
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ条件下に関心のあるタンパク質を単離および／または追跡するために関心のあるタンパク質を特異的に標識することを可能とする改良された標識化技術に対する要求が絶えずある。１つの具体的な方法は、ＷＯ０２／０８３９３７に開示されており、これは、関心のあるタンパク質をＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に融合させ、そしてＡＧＴ融合タンパク質を、標識を有する特異的ＡＧＴ基質と接触させ、それにより標識を融合タンパク質に移行させる、関心のあるタンパク質を検出および／または操作するための方法を記載している。次いでＡＧＴ融合タンパク質を検出しそして場合により標識を使用して更に操作する。野生型ＡＧＴのいくつかの突然変異体は、このような標識化方法において野生型ＡＧＴよりも良好に適当であることが示され(WO2004/031404; Juillerat, A. et al., Chem. Biol. 10:313-317, 2003; Gronemeyer, T. et al., Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316, 2006)、そしてＡＧＴおよびＡＧＴ突然変異体を含む融合タンパク質に標識を移行させるのに使用するための広範囲の置換されたベンジルグアニンおよび関連したヘテロアリールメチルグアニン化合物が記載されている（WO2004/031405）。
【０００３】
簡単なＯ２−ベンジル−シトシンが知られている。Freccero, M. et al., J. Am. Chem. Soc. 125:3544-3553, 2003は、シトシンをｏ−キノンメチドと反応させてＯ２−ｏ−ヒドロキシベンジルシトシンを得た。Ward, A.D. and Baker, B. R., J. Med. Chem. 20:88-92, 1977,は、２−クロロ−４−アミノピリミジンおよびベンジルアルコールのナトリウム塩から得られるＯ２−ベンジルシトシンを記載している。
【０００４】
発名の要約
本発明は、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼに由来するアルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴｓ）と呼ばれる新規なタンパク質、およびこれらのＡＣＴｓに標識を特異的に移行させるＡＣＴｓのための基質、およびこのようなＡＣＴを含む融合タンパク質に関する。本発明に従う基質は、式（Ｉ）
【化１】
2009544660.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、芳香族もしくはヘテロ芳香族基であるか、またはＯＣＨ２−に連結された二重結合を有する、場合により置換されている不飽和アルキル、場合により置換されている不飽和シクロアルキルもしくは場合により置換されている不飽和ヘテロサイクリル基であり；
Ｒ２は、リンカーであり、そして
Ｌは、標識または複数の同じまたは異なる標識である）
の置換されたシトシンである。
【０００５】
本発明は、更に式（Ｉ）のこれらの基質からアルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴｓ）およびＡＣＴ融合タンパク質に標識を移行させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】蛍光標識を有する特異的基質ベンジルグアニン（ＢＧ）およびベンジルシトシン（ＢＣ）を使用してＡＧＴおよびＡＣＴを含む融合タンパク質に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ二重標識化実験。ＧＳＴ−ＡＣＴ１および６×ＨｉｓＮＡＧＴの等モル混合物をＢＧＦＬ、ＢＧＣｙ５、ＢＣＦＬ、ＢＣＣｙ５またはＢＧＣｙ５／ＢＣＦＬもしくはＢＧＦＬ／ＢＣＣＹ５の等モル混合物とインキュベーションすることによりアッセイを行った。蛍光染料で標識されたタンパク質混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。実施例１２参照。ＧＳＴ−ＡＣＴ１：ＡＣＴ１（配列番号１）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合タンパク質。６×Ｈｉｓ−ＡＧＴ：ＮＡＧＴ（配列番号２）の短いペプチド６×Ｈｉｓとの融合タンパク質。ＢＧＦＬおよびＢＧＣｙ５：それぞれフルオレセインおよびＣｙ５を有するリンカーで置換されたベンジルグアニン、Juillerat, A. et al., Chem. Biol. 10:313-317, 2003および化合物１１（実施例９）参照 。ＢＣＦＬ：化合物５（実施例４）。ＢＣＣｙ５：化合物１０（実施例８）。
【図２】ＢＣに対する選択性を証明する蛍光標識（ＦＬ）を有する基質ベンジルグアニン（ＢＧ）およびベンジルシトシン（ＢＣ）を使用するＡＣＴ１０に関する標識実験。異なる時間のインキュベーションの後にＳＤＳゲルランの蛍光読み取りを、下部の対応するグラフとともに上部に示す。ＡＣＴから形成されたＡＣＴ−フルオレセインコンジュゲートの百分率（％ＡＣＴ−ＦＬ）をインキュベーション時間（分）に対して示す。ＧＳＴ−ＡＣＴ１０のＢＧＦＬまたはＢＣＦＬとの０．５μM 混合物をインキュベーションすることによりアッセイを行った。ＧＳＴ−ＡＣＴ１０：ＡＣＴ１０（配列番号１２）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質。ＢＧＦＬおよびＢＣＦＬ：図１の説明参照。見出された結合定数：ｋＢＣ＝１１３０±１５０M−１s−１；ｋＢＧ〜１０M−１s−１。
【図３】ＡＣＴ１、ＡＣＴ９およびＡＣＴ１０の尿素で誘導された変性(unfolding)。形成されたＡＣＴ−フルオレセインの百分率（％ＡＣＴ−ＦＬ）を示す。０M尿素［（ＮＨ２）２ＣＯ］で得られた値を１００％に設定する。タンパク質（０．５μM）を、尿素（０〜８M）を補充されたカイネティックバッファー（５０mM ＨＥＰＥＳ, pH７．２、１mM  ＤＴＴ）中で３０分間インキュベーションした。次いで溶液を２０μMＢＣＦＬに調節しそして２時間インキュベーションした。次いでサンプルをＳＤＳバッファー中で９５℃で５分間煮沸した。蛍光染料で標識したタンパク質混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。データセットを、Ｙ＝１００／（１＋１０＾（（ｌｏｇＣ１／２−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））に適合させて、半変性尿素濃度Ｃ１／２を得た。Ｃ１／２の下記の値が異なる突然変異体について見出された。ＡＣＴ１  ２．８±０．１M；ＡＣＴ９  ４．１±０．１M；ＡＣＴ１０  ５．１±０．２M。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、特に式（Ｉ）の基質からの標識の移行に適した、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に由来するアルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴｓ）と呼ばれる新規なタンパク質に関する。
【０００８】
アルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）は、
（ａ）１７０〜２２０アミノ酸、好ましくは１７５〜１９０アミノ酸、最も好ましくは１７７〜１８５アミノ酸からなり；
（ｂ）少なくとも１つのシステインを含み；
（ｃ）Ｏ２−ベンジルシトシンと反応し、それによって同じ条件下にＯ６−ベンジルグアニンとの反応における場合と少なくとも同じに速く（ｂ）のシステインのメルカプト基にベンジル置換基を移行させる、
タンパク質として同定される。
【０００９】
本発明のＡＣＴｓを、ＡＧＴのファージディスプレイに基づく定方向進化アプローチ（directed evolution approach）においてＡＧＴをコードするＤＮＡから調製した。ファージディスプレイに基づく定方向進化のための出発点として、突然変異体ＮＡＧＴをコードするＤＮＡ（配列番号２、Gronemeyer, T. et al., Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316, 2006）を使用した。ＮＡＧＴは、野生型ｗｔＡＧＴよりベンジルグアニン誘導体に対する約５０倍高い活性を示し、そしてそれ自体ファージディスプレイおよびベンジルグアニン基質を使用して定方向進化により得られた。残基Ｔｙｒ１１４、Ｌｙｓ１３１、Ｓｅｒ１３５、Ｖａｌ１４８、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｇｌｕ１５９のためのコドンを、飽和突然変異誘発(saturation mutagenesis)により無作為化した。ファージミドｐＡＫ１００におけるトランスフォーメーションは、１０７の独立したクローンの突然変異体ＡＧＴライブラリーをもたらした。選択のために、ファージライブラリーを、ベンジルシトシンと反応する突然変異体を標識するための基質としてフルオレセインを有するベンジルシトシン（化合物５）、ＢＣＦＬとインキュベーションした。これは、抗フルオレセイン抗体で被覆された磁性ビーズを使用することにより対応するファージのその後の濃縮を可能とした。ＢＣＦＬに対する活性についての６ラウンドの選択の後、クローンＡＣＴ１〜クローンＡＣＴ８を、ＤＮＡシーケンシングにより解析した（表１、アミノ酸は１文字コードで示された）。その後の試験において、クローンＡＣＴ１〜クローンＡＣＴ８からのタンパク質は、４M尿素による変性に対する限られた安定性しか示さないことが明らかになった。これを改良するために、同じライブラリーを再スクリーニングした。最善の単離されたクローンからのタンパク質は、ＡＣＴ９としてリストされそして４M尿素における良好な安定性を示したが、ベンジルシトシンに対する限定された反応性を示した。次いでＡＣＴ９をコードするＤＮＡのエラープローンＰＣＲ、続いて、その後のファージ選択によりＡＣＴ１０を得、このファージ選択は、尿素による変性に対する高い反応性および高い安定性を有するＡＣＴ変異体として残基Ｍｅｔ６０ＩＩｅ、Ａｌａ１２１ＶａｌおよびＬｅｕ１５３Ｓｅｒの更なる改変をもたらした。クローンを発現させそしてタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として精製した。
【００１０】
ベンジルシトシンに対して特異的なこれらの１０のタンパク質は、アルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）１〜１０と呼ばれ、そして本発明の主題である。
【００１１】
本発明で考慮される更なるタンパク質は、
ＡＣＴ１〜８のホモログでありそして位置１１４、１３１、１３５、１４８、１５７および１５９以外の位置において１、２または３個のアミノ酸がＡＣＴ１〜８とは異なるＡＣＴｓ；および
ＡＣＴ１〜１０のホモログでありそして位置６０、１１４、１２１、１３１、１３５、１４８、１５３、１５７および１５９以外の位置において１、２または３個のアミノ酸がＡＣＴ１〜１０とは異なるＡＣＴｓ；
である。
【００１２】
位置１１４のアミノ酸がＡ、Ｅ、Ｎ、ＲまたはＳであり；
位置１３１のアミノ酸がＮ、Ｓ、ＴまたはＶであり；
位置１３５のアミノ酸がＤ、ＮまたはＴであり；
位置１４８のアミノ酸がＤ、ＥまたはＱであり；
位置１５７のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、ＰまたはＷであり；そして
位置１５９のアミノ酸がＥ、Ｆ、Ｍ、ＲまたはＳである、
ＡＣＴ１（配列番号１）のアナログも考慮される。
【００１３】
位置６０のアミノ酸がＭまたはＩであり；
位置１１４のアミノ酸がＡ、Ｅ、Ｎ、ＲまたはＳであり；
位置１２１のアミノ酸がＡまたはＶであり；
位置１３１のアミノ酸がＮ、Ｓ、ＴまたはＶであり；
位置１３５のアミノ酸がＤ、ＮまたはＴであり；
位置１４８のアミノ酸がＤ、Ｅ、ＱまたはＶであり；
位置１５３のアミノ酸がＬまたはＳであり；
位置１５７のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、ＰまたはＷであり；そして
位置１５９のアミノ酸がＥ、Ｆ、Ｍ、Ｒ、ＳまたはＬである、
ＡＣＴ１０（配列番号１２）のアナログが同様に考慮される。
【００１４】
アルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴ）１、２、７、８および１０と呼ばれるタンパク質が好ましい。配列番号１２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＣＴ１０は特に好ましい。位置６０、１１４、１２１、１３１、１３５、１４８、１５３、１５７および１５９以外の位置の１つのアミノ酸が異なるＡＣＴ１０のホモログも好ましい。
【００１５】
【表１】
2009544660.tif 000004
【００１６】
本発明は、ＡＧＴまたはＡＣＴをコードするＤＮＡを１０個までのアミノ酸位置において飽和突然変異誘発により無作為化し、得られたライブラリーを適当なファージミドにトランスフォーメーションし、標識を有するベンジルシトシンとの反応により所望のファージを選択し、次いで標識に対する抗体で被覆された磁性ビーズを使用して標識を移行されたファージを単離することを特徴とするアルキルシトシントランスフェラーゼを製造するための方法に関する。本発明は、このような定方向進化の方法の産物にも関する。
【００１７】
飽和突然変異誘発は、当技術分野で周知であり、そして例えば、Dube, D. K. and L. A. Biochemistry, 28:5703-5707, 1989により記載のとおりに行われる。
【００１８】
ファージおよびファージミドを使用する定方向進化の方法も周知でありそして、例えば、Smith. G.P. and Petrenko, V.A., Chem.  Rev. 97:391-410, 1997; Hoess, R.H. et al., Chem. Rev. 101: 3205-3218, 2001に記載されている。好ましい方法は、Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H.R. and Pluckthun, A., J. Immunol. Methods 201:35-55, 1997により記載されているシステムにおいてファージミドｐＡＫ１００を使用する。
【００１９】
所望のクローンの選択のために適当な化合物は、式（Ｉ）下に記載されそして本発明に供される基質、特に、Ｒ１がパラ−置換されたフェニルである式（Ｉ）の基質である。所望のＡＣＴに移行させられるこのような基質の標識は、それに対する抗体が容易に得られうる任意の標識であることができ、そして蛍光染料標識または任意の他の分光学的標識
に制限されない。
【００２０】
特定の標識に対する抗体を有する磁性ビーズを使用する分離も当技術分野で処置されておりそして、例えば、Gronemeyer et al., Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316, 2006に記載されている。
【００２１】
更なる局面においては、本発明は、式（Ｉ）
【化２】
2009544660.tif 000005
（式中、
Ｒ１は、芳香族もしくはヘテロ芳香族基であるか、またはＯＣＨ２−に連結された二重結合を有する、場合により置換されている不飽和アルキル、場合により置換されている不飽和シクロアルキルもしくは場合により置換されている不飽和ヘテロサイクリル基であり；
Ｒ２はリンカーであり、そして
Ｌは標識または複数の同じまたは異なる標識である）
で示される化合物に関する。
【００２２】
芳香族基としてのＲ１は、好ましくはフェニルまたはナフチル、特にフェニル、例えばパラ位置またはメタ位置においてＲ２により置換されたフェニルである。
【００２３】
ヘテロ芳香族基Ｒ１は、０、１、２、３または４個の環窒素原子および０または１個の酸素原子および０または１個の硫黄原子を含む一環式または二環式ヘテロアリール基であって、但し少なくとも１個の環原子は窒素、酸素または硫黄原子であるものとし、５〜１２個、好ましくは５または６個の環原子を有しそして置換基Ｒ２を有することに加えて、低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシもしくはエトキシ、ハロゲン、例えば塩素、臭素またはフッ素、ハロゲン化された低級アルキル、例えばトリフルオロメチルまたはヒドロキシからなる群より選ばれる１個以上の、特に１個の更なる置換基により置換されていてもいなくてもよい一環式または二環式ヘテロアリール基である。
【００２４】
好ましくは、一環式または二環式ヘテロアリール基Ｒ１は、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピラゾリル、インダゾリル、プリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キノリニル、プテリジニル、インドリジニル、３Ｈ−インドリル、インドリル、イソインドリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、フラザニル、ベンゾ［ｄ］ピラゾリル、チエニルおよびフラニルから選ばれる。更に好ましくは、一環式または二環式ヘテロアリール基は、ピロリル、イミダゾリル、例えば１Ｈ−イミダゾール−１−イル、ベンズイミダゾリル、例えば、１−ベンズイミダゾリル、インダゾリル、特に５−インダゾリル、ピリジル、例えば、２−、３−または４−ピリジル、ピリミジニル、特に２−ピリミジニル、ピラジニル、イソキノリニル、特に３−イソキノリニル、キノリニル、特に４−または８−キノリニル、インドリル、特に３−インドリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｄ］ピラゾリル、チエニルおよびフラニルから選ばれる。
【００２５】
本発明の特に好ましい態様において、ヘテロアリール基Ｒ１は、チエニル、特に、３−、４−または５−位置、好ましくは４−位置に更なる置換基Ｒ２を有する２−チエニル、または４−位置に更なる置換基Ｒ２を有する３−チエニルである。
【００２６】
場合により置換されている不飽和アルキル基Ｒ１は、１−または２−位置、好ましくは２−位置に更なる置換基Ｒ２を有する１−アルケニルまたは１−アルキニルである。１−アルケニルにおいて考慮される置換基は、例えば低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシまたはハロゲニル、例えばクロロである。本発明の特に好ましい態様において、Ｒ１は１−アルキニルである。
【００２７】
場合により置換されている不飽和シクロアルキル基は、任意の位置に更なる置換基Ｒ２を有する、１−位置において不飽和の５〜７個の炭素原子を有するシクロアルケニル基、例えば１−シクロペンテニルまたは１−シクロヘキセニルである。考慮される置換基は、例えば低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシまたはハロゲニル、例えばクロロである。
【００２８】
場合により置換されている不飽和ヘテロサイクリル基は、３〜１２個の原子を有し、窒素、酸素および硫黄から選ばれる１〜５個のヘテロ原子を有しそしてＯＣＨ２−におけるメチレンにヘテロサイクリル基を連結する位置に二重結合を有する。考慮される置換基は、例えば低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシまたはハロゲニル、例えばクロロである。
【００２９】
特に、場合により置換されている不飽和ヘテロサイクリル基は、ヘテロ芳香族基Ｒ１について前に定義された部分的飽和ヘテロ芳香族基である。このようなヘテロサイクリル基の例は、５−位置に更なる置換基を有するイソオキサゾリジニル、特に３−イソオキサゾリジニル、または３−位置に更なる置換基を有する５−イソオキサゾリジニルである。
【００３０】
リンカー基Ｒ２は、好ましくは、標識Ｌまたは複数の同じまたは異なる標識Ｌを基質に連結する柔軟性リンカーである。リンカー単位は、もくろむ用途において、即ち、ＡＣＴを含む融合タンパク質への基質の移行において選ばれる。それらは、適切な溶媒への基質の溶解度も増加させる。使用されるリンカ−は、実際の用途の条件下に化学的に安定である。リンカーは、ＡＣＴとの反応を妨害もしなければ、標識Ｌの検出も妨害しないが、ＡＣＴを含む融合タンパク質と式（Ｉ）の化合物の反応の後にある時点で切断されるように構築されうる。
【００３１】
リンカーＲ２は、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基であって、場合により
（ａ）１個以上の炭素原子が酸素により置き換えられている、特にすべての第３の炭素原子が酸素で置き換えられている、例えば１〜１００のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基；
（ｂ）１個以上の炭素原子が水素原子を有する窒素で置き換えられており、そして隣接炭素原子がオキソにより置換されており、アミド基−ＮＨ−ＣＯ−を示す；
（ｃ）１個以上の炭素原子が酸素で置き換えられておりそして隣接炭素原子がオキソにより置換されて、エステル基−Ｏ−ＣＯ−を示す；
（ｄ）２つの隣接炭素原子間の結合が二重結合または三重結合であり、−ＣＨ＝ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を示す；
（ｅ）１個以上の炭素原子がフェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、橋かけヘテロ芳香族または橋かけ飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、橋かけヘテロ芳香族もしくは橋かけ飽和もしくは不飽和ヘテロサイクリル基で置き換えられている；
（ｆ）２個の隣接炭素原子が、ジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−で置き換えられている、
１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基、または２つ以上の、特に２つまたは３つのアルキレンおよび／または前記（ａ）〜（ｆ）下に定義された改変されたアルキレン基の組み合わせであり、これらの基は場合により置換基を含有する。
【００３２】
考慮される置換基は、例えば低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシまたはハロゲニル、例えばクロロである。
【００３３】
考慮される更なる置換基は、例えば、α−アミノ酸、特に天然に存在するα−アミノ酸が、炭素原子が（ｂ）で定義されたアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−により置き換えられているリンカーＲ２に組み込まれるときに得られる置換基である。このようなリンカーにおいて、アルキレン基Ｒ２の炭素鎖の一部は、基−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ｎ−（式中、ｎは１〜１００であり、Ｒはα−アミノ酸の種々の残基を表す）により置き換えられている。
【００３４】
更なる置換基は、光切断可能なリンカーＲ２をもたらす置換基、例えばｏ−ニトロフェニル基である。特にこの置換基ｏ−ニトロフェニルは、アミド結合に隣接した炭素原子に位置しており、例えば基−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−ＮＨ−ＣＯ−にあるか、またはポリエチレングリコール鎖における置換基として、例えば基−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−Ｏ−にある。考えられる他の光切断可能なリンカ−は、例えばフェナシル、アルコキシベンゾイン、ベンジルチオエーテルおよびピバロイルグリコール誘導体である。
【００３５】
先に（ｅ）で定義された炭素原子に取って代わるフェニレン基は、例えば１，２−、１，３−または好ましくは１，４−フェニレンである。特定の態様においては、フェニレン基は、更にニトロ基により置換されておりそして（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）で上記した他の置き換えと組み合わされて、光切断可能な基を表し、そして例えば、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−４−ニトロ−１，３−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＯ−におけるような４−ニトロ１，３−フェニレン、または、例えば−ＣＨ２−Ｏ−２−メトキシ−５−ニトロ−１，４−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−におけるような２−メトキシ−５−ニトロ−１，４−フェニレンである。光切断可能なリンカーを表す他の特定の態様は、例えば−１，４−フェニレン−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−（フェナシル基）、−１，４−フェニレン−ＣＨ（ＯＲ）−ＣＯ−１，４−フェニレン−（アルコキシベンゾイン）、または−３，５−ジメトキシ−１，４−フェニレン−ＣＨ２−Ｏ−（ジメトキシベンジル部分）である。先に（ｅ）で定義された炭素原子に取って代わる飽和または不飽和シクロアルキレン基は、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキルに由来し、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシルに由来し、そして例えば１，２−もしくは１，３−シクロペンチレン、１，２−、１，３−もしくは好ましくは１，４−シクロヘキシレンであるか、または例えば１−位置もしくは２−位置で不飽和である１，４−シクロヘキシレンでもある。先に（ｅ）で定義された炭素原子に取って代わる飽和または不飽和ビシクロアルキレン基は、７または８個の炭素原子を有するビシクロアルキルに由来し、そして例えばビシクロ［２．２．１］ヘプチレンまたはビシクロ［２．２．２］オクチレン、好ましくは、場合により２−位置で不飽和であるかまたは２−位置および５−位置で二重に不飽和である１，４−ビシクロ［２．２．１］ヘプチレン、および場合により２−位置で不飽和であるかまたは２−位置および５−位置で二重に不飽和である１，４−ビシクロ［２．２．２］オクチレンである。先に（ｅ）で定義された炭素原子に取って代わる橋かけヘテロ芳香族基は、例えばトリアゾリデン、好ましくは１，４−トリアゾリデン、またはイソオキサゾリデン、好ましくは３，５−イソオキサゾリデンである。先に（ｅ）で定義された炭素原子に取って代わる橋かけ飽和もしくは不飽和ヘテロサイクリル基は、例えば上記Ｒ１で定義された不飽和ヘテロサイクリルに由来し、例えばイソオキサゾリジネン、好ましくは３，５−イソオキサゾリジネンであるか、または３〜１２個の原子を有し、その１〜３個が窒素、酸素および硫黄から選ばれるヘテロ原子である、完全飽和ヘテロサイクリル基、例えばピロリジンジイル、ピペリジンジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキサンジイル、モルホリンジイル、またはテトラヒドロチオフェンジイル、好ましくは２，５−テトラヒドロフランジイルまたは２，５−ジオキサンジイルである。考慮される特定のヘテロサイクリル基は糖部分、例えばα−もしくはβ−フラノシルまたはα−もしくはβ−ピラノシル部分である。
【００３６】
リンカーＲ２における環状サブ構造は、Ｒ２内の回転可能な結合の数により評価される分子柔軟性を減少させ、これはすべてのｉｎ  ｖｉｖｏ標識化用途にとって重要な、より良好な膜透過速度をもたらす。
【００３７】
リンカーＲ２は、好ましくは、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基であるか、または場合により−ＣＨ＝ＣＨ−もしくは−Ｃ≡Ｃ−基によりＲ１に結合した、４〜１００個のエチレンオキシ単位を有する直鎖ポリエチレングリコール基である。更なる好ましいものは、炭素原子が場合によりアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−により置き換えられておりそして場合により光切断可能なサブユニット、例えばｏ−ニトロフェニルを有する、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である。更なる好ましいものは、３〜６個のエチレングリコール単位のポリエチレングリコール基を含み、そして炭素原子がアミド結合により置き換えられているアルキレン基を含みそして更に置換されたアミノおよびヒドロキシ官能基を有する、分岐状リンカーである。他の好ましい分岐状リンカーは、アミン、カルボキサミドおよび／またはエーテル官能基がアルキレン基の炭素原子に取って代わる樹状構造を有する。
【００３８】
特に好ましいリンカーＲ２は、１個または２個の炭素原子が窒素により置き換えられており、そして場合により窒素に隣接したオキソにより置換されている、２〜２０個の炭素原子の直鎖アルキレン基である。
他の特に好ましいリンカーＲ２は、３〜１２個の炭素原子が酸素により置き換えられておりそして１個または２個の炭素原子が窒素により置き換えられており、場合により窒素の隣接したオキソにより置換されている、１０〜４０個の場合によりオキソにより置換されている炭素原子の直鎖アルキレン基である。
【００３９】
リンカーＲ２は、１個以上の同じまたは異なる標識、例えば１〜１００個の同じまたは異なる標識、特に１〜５個、好ましくは１、２または３個の、特に１個または２個の同じまたは異なる標識を有することができる。
【００４０】
低級アルキルは、１〜７、好ましくは１〜４個のＣ原子を有するアルキルであり、そして線状または分岐状であり；好ましくは低級アルキルは、ブチル、例えばｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、プロピル、例えばｎ−プロピルまたはイソプロピル、エチルまたはメチルである。最も好ましくは、低級アルキルはメチルである。
【００４１】
低級アルコキシにおいて、低級アルキル基は、前記に定義したとおりである。低級アルコキシは、好ましくはｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、イソプロポキシ、エトキシまたはメトキシ、特にメトキシを示す。
【００４２】
低級アシルオキシ基においては、低級アシルはホルミルまたは低級アルキルが前記に定義されている低級アルキルカルボニルの意味を有する。低級アシルオキシは、好ましくはｎ−ブチロキシ、ｎ−プロピオノキシ、イソプロピオノキシ、アセトキシまたはホルミルオキシ、特にアセトキシを示す。
【００４３】
ハロゲンはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード、特にクロロである。
【００４４】
基質の標識Ｌは、融合タンパク質の意図する用途に依存して当業者により選ばれうる。標識は、標識Ｌを有する標識された融合タンパク質が容易に検出されるかまたはその環境から容易に分離されるような標識である。考慮される他の標識は、標識された融合タンパク質および／または基質の環境の変化を感知しおよび誘導することができる標識、または基質の物理的および／または化学的性質により融合タンパク質を操作するのを助けそして特に融合タンパク質に特異的に導入される標識である。本発明の文脈で理解される標識は、水素とは異なるまたは標準官能基と異なる置換基、特に水素、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン、カルボキシラート、カルボキサミド、カルボキシルエステル、ニトリル、シアナート、イソシアナート、スルホナート、スルホンアミド、スルホン酸エステル、アルデヒド、ケトン、エーテル、およびチオエーテル置換基とは異なる置換基である。
【００４５】
標識の例は、分光学的プローブ、例えば発蛍光団もしくは発色団、磁性プローブ、またはコントラスト試薬；放射能標識された分子；パートナーに特異的に結合することができる特異的結合ペアの一つの部分である分子；他の生物分子と相互作用する疑いのある分子；他の生物分子と相互作用する疑いのある分子のライブラリー；他の分子に架橋することができる分子；Ｈ２Ｏ２およびアスコルベートに暴露されるとヒドロキシルラジカルを発生することができる分子、例えばつなぎ鎖でつながれた(tethered)金属キレート；光を照射されると反応性ラジカルを発生することができる分子、例えばマラカイトグリーン；ガラススライド、マイクロタイタープレートまたは当業者に知られている任意のポリマーであることができる固体支持体に共有結合された分子；相補鎖と塩基対形成することができる核酸またはその誘導体；膜挿入性を有する脂質または他の疎水性分子；所望の酵素的、化学的または物理的性質を有する生物分子；または上記した性質のいずれかの組み合わせを有する分子を含む。
【００４６】
更なる標識Ｌは、生きている細胞の細胞膜を超えて結合した分子が移動するのを促進することが知られている正に帯電した線状または分岐状ポリマーである。これは、低い細胞膜透過性を有するかまたは生きている細胞の細胞膜に対して事実上非透過性である物質にとって特に重要である。非細胞透過性ＡＣＴ基質は、このような基Ｌにコンジュゲーションされると細胞膜透過性となるであろう。このような細胞膜輸送エンハンサー基Ｌは、例えば、６〜１５個のアルギニン残基を有するＤ−および／またはＬ−アルギニンの線状ポリアルギニン、各々がグアニジニウム基を有する６〜１５サブユニットの線状ポリマー、６〜５０サブユニットのオリゴマーまたは短い長さのポリマーであって、該サブユニットの一部がグアニジニウム基に結合しているオリゴマーまたは短い長さのポリマー、および／またはＨＩＶ−ｔａｔタンパク質の配列の一部、特にサブユニットＴａｔ４９−Ｔａｔ５７（１字アミノ酸コードで表すとＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）を含む。ＡＣＴ基質は、先に定義されたリンカーＲ２を通じてこの基Ｌに共有結合しており、該リンカーＲ２は、好ましくは生きている細胞の内側で不安定であり、そして例えば細胞内エステラーゼによるエステル基Ｒ２の開裂により分解されることができ、直接またはエステル基の開裂により引き起こされる更なる反応において、ＡＣＴ基質と細胞膜透過性を増強する単位Ｌの分離をもたらす。
【００４７】
標識Ｌとして好ましいものは、分光学的プローブでありそしてパートナーに特異的に結合することができ特異的結合ペアの一つの部分である分子、いわゆるアフィニティー標識である。固体支持体に共有結合した分子も標識Ｌとして好ましい。好ましい分光学的プローブは発蛍光団である。
【００４８】
標識Ｌが発蛍光団、発色団、磁性標識、放射能標識等であるとき、検出は標識に適合した標準手段によりそして方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用されるかまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるかによる。Ｌが発蛍光団であるならば、方法は関心のあるタンパク質に遺伝子的に融合されそして生きている細胞においてタンパク質の研究を可能とする、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の適用に匹敵することができる。標識Ｌの特定の例は、非線形光学的性質を示すホウ素化合物でもある。特に好ましいものは、１つの基質のＬ（Ｌ１）が、２つの相互作用性分光学的プローブＬ１／Ｌ２（該２つの相互作用性分光学的プローブＬ１／Ｌ２においては、ドナーとアクセプター（クエンチャー）が極めて近接するとき（１０ナノメートル未満の距離）、動的または静的クエンチングによりドナーとアクセプター（クエンチャー）との間でエネルギーが非放射的に移行されうる）の１つのメンバーでありそして他方の基質のＬ（Ｌ２）が該２つの相互作用性分光学的プローブＬ１／Ｌ２の他方のメンバーであるような標識である。このような標識Ｌ１／Ｌ２のペアは、Ｌ１を有する標識された基質のＡＣＴ融合タンパク質との反応およびＬ２を有する他方のタイプの標識された基質（例えばベンジルグアニン型）の他の対応する融合タンパク質、例えばＡＧＴ融合タンパク質との反応時に、その分光学的性質を変える。標識Ｌ１／Ｌ２のこのようなペアの例は、更に詳細に下記で説明するＦＲＥＴペアである。
【００４９】
考慮される特定の発蛍光団は、Alexa Fluor３５０、４８８、５３２、５４６、５５５、６３５および６４７を含むAlexa Fluor染料(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008, USA, Panchuk-Voloshina, N. et al., J. Histochem. & Cytochem. 47:1179-1188, 1999を参照);  クマリン、例えば７−ジメチルアミノ−クマリン−４−酢酸（Invitrogen Molecular Probesにより製品Ｄ３７４として供給されたスクシンイミジルエステル）、７−アミノ−４−メチル−クマリン−３−酢酸および７−ジエチルアミノ−クマリン−３−カルボン酸；Ｃｙａｎｉｎｅ−３（Ｃｙ３）、Ｃｙａｎｉｎｅ５（ＣＹ５）、およびＣｙａｎｉｎｅ５．５（ＣＹ５．５）（Amersham-GE Healthcare, Solingen, Germany）；ＡＴＴＯ４４８、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ６００およびＡＴＴＯ６５５（Atto-tec, D57076 Siegen, Germany）；ＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、ＤＹ−６３２およびＤＹ−６４７（Dyomics, Jena, Germany）；および５（６）−カルボキシフルオレセインおよびジフルオロ−５（６）−カルボキシフルオレセイン(Oregon Green)である。式（Ｉ）の基質上のこれらの特定の標識を、既知のＡＧＴ−ベンジルグアニン系と組み合わせることができ、この場合、ベンジルグアニン上の標識は、ＡＣＴと反応する式（Ｉ）の基質上の発蛍光団とＦＲＥＴペアを創生するためのクエンチャーである。このようなクエンチャーは、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ９およびＱＳＹ２１(Invitrogen Molecular Probes)；ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３(Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA94949, USA のBlack Hole Quencher（商標、）；ＡＴＴＯ５４０ＱおよびＡＴＴＯ６１２０Ｑ(Atto-Tec, D57076 Siegen, Germany)；４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニル誘導体(Dabsyl)および４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−カルボニル誘導体(Dabcyl)である。
【００５０】
標識Ｌの性質に依存して、関心のあるタンパク質およびＡＣＴを含む融合タンパク質は、基質との反応により固体支持体に結合されうる。ＡＣＴを含む融合タンパク質と反応する基質の標識Ｌは、ＡＣＴとの反応に入るときは既に固体支持体に結合されていてもよく、またはその後、即ちＡＣＴへの移行後に、固体支持体に標識されたＡＣＴ融合タンパク質を結合させるために使用されうる。標識は、特異的結合ペアの一方のメンバーであることができ、その他方のメンバーは、固体支持体に共有結合によりまたは任意の他の手段により結合されるているかまたは結合可能である。考慮される特異的結合ペアは、例えばビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンである。結合ペアのいずれかのメンバーは、基質の標識Ｌであることができ、他方は固体支持体に結合される。固体支持体への便利な結合を可能とする標識の更なる例は、例えば、マルトース結合タンパク質、糖タンパク質、ＦＬＡＧタグまたは、反応性置換基であって、このような置換基と固体支持体の表面の相補性官能基との化学選択的反応を可能とする反応性置換基である。反応性置換基と相補性官能基のこのようなペアの例は、例えばアミンおよびアミドを形成する活性化されたカルボキシル基、アジドおよび１，３−二極性環状付加反応を受けるプロピオ−ル酸誘導体、アミンおよび活性化されたビスジカルボン酸のタイプの添加された二官能性リンカー試薬と反応して２つのアミド結合を生じる他のアミン官能基、または当技術分野で知られている他の組み合わせである。
【００５１】
便利な固体支持体の例は、例えば、ガラス表面、例えばガラススライド、マイクロタイタープレートおよび適当なセンサーエレメント、特に官能化されたポリマー（例えば、ビーズの形態にある）、化学的に改変された酸化物表面、二酸化ケイ素、五酸化タンタルまたは二酸化チタン、または化学的に改変された金属表面、例えば貴金属表面、例えば金または銀表面である。次いで、不可逆的に結合するおよび／またはスポッティングするＡＣＴ基質を使用して、空間的に解像される方式で、特にスポッティングにより、タンパク質マイクロアレー、ＤＮＡマイクロアレーまたは小分子のアレーを表す固体支持体上にＡＣＴ融合タンパク質を結合させることができる。
【００５２】
標識Ｌが、外部刺激にさらされると、反応性ラジカル、例えばヒドロキシルラジカルを発生することができる場合には、発生したラジカルは次いでＡＣＴ融合タンパク質およびＡＣＴ融合タンパク質に極めて近縁のこれらのタンパク質を不活性化させることができ、これらのタンパク質の役割を研究することを可能とする。このような標識の例は、Ｈ２Ｏ２およびアスコルベートに曝露されるとヒドロキシルラジカルを生成するつなぎ鎖で結ばれた金属キレート錯体(tethered metal-chelate complexes)、および発色団、例えばレーザー照射されるとヒドロキシルラジカルを生成するマラカイトグリーンである。ヒドロキシルラジカルを発生するのに発色団とレーザーを使用することもまた、発色団支援レーザー誘導不活性化(chromophre assisted laser induction inactivation)（ＣＡＬＩ）として当技術分野で知られている。本発明において、ＡＣＴ融合タンパク質を、標識Ｌとしてマラカイトグリーンなどの発色団を有する基質で標識することおよびその後のレーザー照射は、標識されたＡＣＴ融合タンパク質およびＡＣＴ融合タンパク質と相互作用するこれらのタンパク質を、時間的にコントロールされそして空間的に解像された方式で不活性化する。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの両方に適用されうる。更にＡＣＴ融合タンパク質に極めて近縁のタンパク質は、そのようなものとして特異的抗体によりそのタンパク質のフラグメントを検出することにより、高解像力二次元電気泳動ゲル上のこれらのタンパク質の消失により、または分離および配列決定技術、例えば質量分析法またはＮ末端分解によるタンパク質配列決定による解裂したタンパク質断片の同定により同定されうる。
【００５３】
標識Ｌが他のタンパク質に架橋することができる分子、例えばマレイミド、活性エステルまたはアジドおよび当業者に知られている他の官能基などの官能基を含有する分子であるとき、このような標識されたＡＣＴ基質を他のタンパク質と相互作用する（ＡＣＴ融合タンパク質と接触させるｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ことは、ＡＣＴ融合タンパク質のその相互作用性タンパク質との標識を介する共有結合架橋をもたらす。これは、ＡＣＴ融合タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を可能とする。光架橋するための標識Ｌは、例えば、ベンゾフェノンである。架橋の特定の面においては、標識Ｌは、ＡＣＴ融合タンパク質の二量体化をもたらすそれ自体ＡＣＴ基質である分子である。このような二量体の化学構造は、対称的（ホモ二量体）または非対称的（ヘテロ二量体）であることができる。
【００５４】
考慮される他の標識Ｌは、例えばフラーレン、中性子捕捉処理用のボラン、例えばセルフアドレッシングチップのためのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、および金属キレート、例えばＤＮＡに特異的に結合する白金キレートである。
【００５５】
望ましい酵素的性質、化学的性質または物理的性質を有する特定の生物分子は、メトトレキセートである。メトトレキセートは、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の強力な結合阻害剤である。Ｌがメトトレキセートである式（Ｉ）の化合物は、周知のクラスのいわゆる「二量体化の化学的インデュ−サー」（ＣＩＤｓ）に属する。ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡとのＡＣＴの融合タンパク質を使用しそしてＬがメトトレキセートである式（Ｉ）の化合物によるＡＣＴ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ標識化に転写活性化ドメインＢ４２を有するＤＨＦＲを加えることは、ＡＣＴ−ＬｅｘＡ融合タンパク質とＤＨＦＲ−Ｂ４２融合タンパク質のカップリング（「二量体化」）を誘導し、ＬｅｘＡとＢ４２の空間的近接およびその後の転写の刺激をもたらす。
【００５６】
基質が２つ以上の標識を有するならば、これらの標識は、同じであるかまたは異なることができる。特定の好ましい組み合わせは、２つの異なるアフィニティー標識または１つのアフィニティー標識と１つの発色団標識、特に１つのアフィニティー標識と１つの発蛍光団標識、または分光学的相互作用性標識のペアＬ１／Ｌ２、例えばＦＲＥＴペアである。
【００５７】
好ましいものは、Ｒ１がフェニル、特にパラ置換されたフェニルである、式（Ｉ）の化合物である。
【００５８】
好ましいのは、Ｌが分光学的プローブ、例えば発蛍光団である、式（Ｉ）の化合物である。同様に好ましいのは、Ｌが特異的結合ペアの１つの部分を表す分子である式（Ｉ）の化合物およびＬが固体支持体に共有結合で結合した分子である化合物である。
【００５９】
最も好ましいのは実施例の化合物である。
【００６０】
本発明は、更に関心のあるタンパク質を検出および／または操作するための方法であって、関心のあるタンパク質をＡＣＴ融合タンパク質に組み込み、ＡＣＴ融合タンパク質を前記した標識を有する式（Ｉ）の化合物と接触させ、そしてＡＣＴ融合タンパク質を検出しそして場合により更に標識を認識および／またはハンドリングするためにデザインされたシステムにおいて標識を使用して操作する、方法に関する。
【００６１】
本発明の方法において、関心のあるタンパク質またはペプチドをＡＣＴに融合させる。関心のあるタンパク質またはペプチドは、任意の長さであることができ、そして第二級、第三級または第四級構造を持っていてもいなくてもよく、好ましくは少なくとも１２アミノ酸〜２０００アミノ酸からなる。このような関心のあるタンパク質またはペプチドの例は、例えば酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核内レセプタータンパク質、核内局在シグナルタンパク質、タンパク質補因子、小モノマーＧＴＰａｓｅ、(small monomeric GTPases)、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特定の細胞区画にタンパク質をターゲティングする責任を担う配列を有するタンパク質、標識またはアフィニティータグとして一般に使用されるタンパク質、および前記したタンパク質のドメインまたはサブドメインである。関心のあるタンパク質またはペプチドは、好ましくは、酵素により、例えばＤＮＡ段階で適当な制限酵素により開裂されうるリンカーおよび／またはタンパク質段階で適当な酵素により開裂されうるリンカーによってＡＣＴに融合される。
【００６２】
ＡＣＴは、基質上に、即ち式（Ｉ）の化合物上に存在する標識を融合タンパク質のＡＣＴ形成部分のシステイン残基の１つに移行させる性質を有する。好ましい態様においては、ＡＣＴは前記に定義されたＡＣＴ１〜ＡＣＴ１０およびそのホモログからなる群より選ばれる。特に好ましいのはＡＣＴ１０である。
【００６３】
関心のあるタンパク質およびＡＣＴを含む融合タンパク質を、式（Ｉ）の特定の基質と接触させる。反応の条件は、ＡＣＴが基質と反応しそして基質の標識を移行させるように選ばれる。通常の条件は、室温、例えば約２５℃で約ｐＨ７のバッファー溶液である。しかながら、ＡＣＴは種々の他の条件下でも反応しそしてここに述べられたこれらの条件は本発明の範囲を限定するものではないと理解される。
【００６４】
基質の標識Ｌは、融合タンパク質が意図される用途に依存して当業者により選ばれる。ＡＣＴを含む融合タンパク質を基質と接触させた後、標識Ｌは融合タンパク質に共有結合により結合される。標識されたＡＣＴ融合タンパク質は、次いで更に処理されおよび／または種々の移行した標識により検出される。標識Ｌは複数の同じまたは異なる標識からなることができる。基質が１つより多くの標識Ｌを含有するならば、対応する標識されたＡＣＴ融合タンパク質は、標識された融合タンパク質を更に操作および／または検出するためのより多くの選択を与える１つより多くの標識も含むであろう。
【００６５】
本発明の意味における「検出された」は、標識Ｌを有するＡＣＴを有する融合タンパク質は標識の性質により局在させることができそして融合タンパク質の量を直接または標準を参照することにより決定することができることを意味する。本発明の意味で「操作された」は、標識Ｌを有するＡＣＴを有する融合タンパク質が標識の性質により更に反応させることができること、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ系から単離し、濃縮しそして精製し、即ち他のタンパク質および／または非タンパク質性物質から分離し、溶液とし（例えば特に融合タンパク質が可溶性ではないならば）、沈澱させ（例えば特に融合タンパク質が可溶性であるならば）またはそうでなければ固体に固定することができること、そして例えば標識を切り離しそして融合タンパク質を再生するリンカーを開裂することにより更に処理することもできることを意味する。当業者は、標識Ｌの性質およびＬを融合タンパク質に連結するリンカーＲ２の性質による標識Ｌを有する融合タンパク質を更に操作するための多くの可能性をよく理解する。
【００６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、本発明の基質とＡＣＴ融合タンパク質の反応は一般に細胞抽出物中でまたはＡＣＴ融合タンパク質の精製した形態または濃縮した形態で行うことができる。
【００６７】
本発明の基質に関する実験をｉｎ  ｖｉｖｏまたは細胞抽出物中で行うならば、内在性ＡＧＴの反応は、式（Ｉ）の基質とＡＣＴ融合タンパク質の反応を妨害しないであろう。何故ならば、該基質は内在性ＡＧＴとは相互作用せず（または少なくとも検出可能には反応しない）、ＡＣＴとのみ反応するからである。これは、先行技術に記載のＡＧＴ−ベンジルグアニン型基質の標準的組み合わせに対する、本発明のＡＣＴ−式（Ｉ）の基質の組み合わせの実質的な利点である。
【００６８】
前記した式（Ｉ）の基質上の特定の発蛍光団標識は、ベンジルグアニン上の標識がＡＣＴと反応する式（Ｉ）の基質上の発蛍光団とＦＲＥＴペアを創生するためのクエンチャーである、既知のＡＧＴ−ベンジルグアニン系と組み合わせることができる。好ましいのは、式（Ｉ）の基質のための標識Ｌとして前記に列挙されたクエンチャーである。
【００６９】
または、式（Ｉ）の基質上の標識Ｌは、上記したクエンチャーの１つであることができ、そしてＡＣＴとの反応は、ベンジルグアニン上の標識が挙げられた発蛍光団の１つであるＡＧＴ融合タンパク質−ベンジルグアニン基質組み合わせとの混合物において達成されうる。
【００７０】
本発明の基質は、一般に当技術分野で知られている標準方法により製造される。有用な出発物質は２−クロロピリミジン−４−アミンまたはピリミジン環の位置２に活性化された離脱基を有する他のシトシン誘導体である。この化合物を、次いで式ＨＯ−ＣＨ２−Ｒ１−Ｒ２−Ｌのアルコールまたは類似した化合物ＨＯ−ＣＨ２−Ｒ１−Ｒ２’（式中、Ｒ２’は標識Ｌの導入を可能とし、それにより残基Ｒ２−Ｌを完成するリンカーＲ２の前駆体である）と反応させる。特に有用な前駆体Ｒ２’は、例えばアミド官能基を組み込んでいるリンカーＲ２を生じさせるスクシンイミジルエステルの形態にある、カルボキシル官能基を有する標識との縮合反応を可能とする、アミノ官能基を有する前駆体である。
【００７１】
もくろむ官能性のための適切な保護基は、当業者により選ばれることができ、そして例えばGreen, T. W. and Wuts, P. G. M. in "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 1991に要約されている。
【００７２】
本発明は、更に式（Ｉ）のこれらの基質からアルキルシトシントランスフェラーゼ（ＡＣＴｓ）およびＡＣＴ融合タンパク質に標識を移行させる方法に関する。
【００７３】
ＡＣＴ−式（Ｉ）の基質の組み合わせは、既知のＡＧＴ−ベンジルグアニン型基質と組み合わせて２つの異なるタンパク質を追跡するのに特に適当である。何故ならば、式（Ｉ）の基質およびベンジルグアニン型基質は、それらの標識をそれぞれＡＣＴおよびＡＧＴ融合タンパク質に選択的に移行させるからである。
【００７４】
ＡＣＴｓを使用する特異的二重標識化の実行可能性を証明するために、ヘキサヒスチジンタグ化ＮＡＧＴ（６×Ｈｉｓ−ＮＡＧＴ）およびＧＳＴ−ＡＣＴ１融合タンパク質の等モル混合物を、ＢＧＦＬ、ＢＧＣｙ５、ＢＣＦＬ、ＢＣＣｙ５あるいはＢＧＣｙ５／ＢＣＦＬまたはＢＧＦＬ／ＢＣＣｙ５の等モル混合物とインキュベーションした。ＢＧＦＬまたはＢＧＣｙ５とのインキュベーションは、６×Ｈｉｓ−ＮＡＧＴの完全な標識化およびＧＳＴ−ＡＣＴ１の非常に低い標識化（両方の場合に５％未満であると評価された）をもたらす。反対の方法において、ＢＣＦＬまたはＢＣＣＹ５とのインキュベーションは、ＧＳＴ−ＡＣＴ１の完全な標識化および６×Ｈｉｓ−ＮＡＧＴの部分的標識化（それぞれ、７６％および６％）をもたらす。
【００７５】
しかしながら、ＢＧＣｙ５／ＢＣＦＬ（またはＢＧＦＬ／ＢＣＣｙ５）の等モル混合物とのインキュベーションは、特異的二重カラー標識化、即ちＣｙ５染料（または、それぞれフルオレセイン）による６×Ｈｉｓ−ＮＡＧＴの特異的標識化ならびにフルオレセイン（またはＣｙ５染料、それぞれ）によるＧＳＴ−ＡＣＴ１の特異的標識化をもたらした。両方の場合に、クロス標識化は、１％未満であると評価された。
【００７６】
【表２】
2009544660.tif 000006
【００７７】
実施例
略号
ＢＣ＝ベンジルシトシン
ＢＧ＝ベンジルグアニン
ＤＴＴ＝ジチオトレイトール
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＭＰＬＣ＝中圧液体クロマトグラフィー
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＲＴ＝室温
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
【００７８】
実施例１：Ｎ−（４−（（４−アミノピリミジン−２−イルオキシ）メチル）ベンジル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１）
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチル−ベンジル）−アセトアミド７６０mg（３．２５ミリモル）を乾燥したジメチルアセトアミド３mL中にアルゴン雰囲気下に溶解し、そしてＮａＨ２７３mg（８．１５ミリモル）を５分間にわたり加える。次いで２−クロロピリミジン−４−アミン２１１mg（１．６３ミリモル）を加えそして溶液を一夜９０℃で攪拌する。水１mLを注意深く加えてすべての過剰のＮａＨをクエンチし、そして混合物を０．５N ＨＣｌ５０ml中に注ぐ。粗生成物を酢酸エチルで抽出し、一緒にした有機相をブラインで洗浄しそしてＭｇＳＯ４上で乾燥する。溶媒の蒸発後、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配酢酸エチル：シクロヘキサン１：１〜３：１）により精製する。収率：３５０mg（５２％）。ＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ３２７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００７９】
実施例２：２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）４−アミノピリミジン（２）
Ｎ−（４−（（４−アミノピリミジン−２−イルオキシ）メチル）ベンジル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１）１５０mg（０．４６ミリモル）をメタノール２mL中に溶解しそしてメチルアミン（エタノール中の３３％）５mLで処理する。反応混合物を室温で一夜攪拌しそしてすべての揮発分を真空中で除去する。生成物を次の工程で更なる精製をしないで使用する。ＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ２３１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００８０】
実施例３：Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（３）およびＮ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド（４）
【化３】
2009544660.tif 000007
２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）ピリミジン−４−アミン（２）（３．６mg、０．０１６ミリモル）および５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（８．２mg、０．０１６ミリモル）をＴＥＡ２．４μLを有するＤＭＦ８００μL中に溶解しそして３１℃で一夜加熱する。溶媒を真空中で蒸発させそして化合物を、水：アセトニトリルの線状勾配（２０分内に９５：５から２０：８０まで、０．０８％ＴＦＡ）を使用してＣ１８カラム上の逆相ＭＰＬＣ（中圧液体クロマトグラフィー）により単離する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ６４３［Ｍ−Ｃｌ］＋。
【００８１】
実施例４：Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−フルオレセイン−６−カルボキサミド（５）、ＢＣＦＬ
【化４】
2009544660.tif 000008
２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）ピリミジン−４−アミン（２）（３．９mg、０．０１７ミリモル）および５（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（８．３mg、０．０１７ミリモル）をＴＥＡ２．６μLを有するＤＭＦ８００μL中に溶解しそして３１℃で一夜加熱する。溶媒を真空中で蒸発させそして生成物を、水：アセトニトリルの線状勾配（２０分において９５：５から２０：８０まで、０．０８％ＴＦＡ）を使用してＣ１８カラム上の逆相ＭＰＬＣにより単離する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ５８９［Ｍ＋Ｈ］＋。精製方法に依存して、生成物は対応する異性体５−カルボキサミドも含有することもある。
【００８２】
実施例５：Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−ジアセチルフルオレセイン−６−カルボキサミド（６）およびＮ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−ジアセチルフルオレセイン−５−カルボキサミド（７）
【化５】
2009544660.tif 000009
２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）ピリミジン−４−アミン（２）（４．１mg、０．０１８ミリモル）および５（６）−カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（１０mg、０．０１８ミリモル）をＴＥＡ２．７μLを有するＤＭＦ８００μL中に溶解しそして３１℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして化合物を、水：アセトニトリルの線状勾配（２０分において９５：５から２０：８０まで、０．０８％ＴＦＡ）を使用してＣ１８カラム上の逆相ＭＰＬＣにより単離する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ６７３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００８３】
実施例６：Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＤＹ６４７−カルボキサミド（８）
【化６】
2009544660.tif 000010
２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）ピリミジン−４−アミン（２）（１．５mg、０．００７ミリモル）およびＤＹ−５４７−ＮＨＳ（Dyomics染料）（５mg、０．００７ミリモル）をＴＥＡ１．０μLを有するＤＭＦ５００μL中に溶解しそして３１℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水：アセトニトリルの線状勾配（２０分において９５：５から２０：８０まで、０．０８％ＴＦＡ）を使用してＣ１８カラム上の逆相ＭＰＬＣにより単離する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ８５３［Ｍ−Ｎａ］−。
【００８４】
実施例７：Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＤＹ５４７−カルボキサミド（９）
【化７】
2009544660.tif 000011
２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）ピリミジン−４−アミン（２）（１．５mg、０．００７ミリモル）およびＤＹ−５４７−ＮＨＳ（Dyomics染料）（５mg、０．００７ミリモル）をＴＥＡ１．０μLを有するＤＭＦ５００μL中に溶解しそして３１℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水：アセトニトリルの線状勾配（２０分において９５：５から２０：８０まで、０．０８％ＴＦＡ）を使用してＣ１８カラム上の逆相ＭＰＬＣにより単離する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ８２７［Ｍ−Ｎａ］−。
【００８５】
実施例８：Ｎ−［４−（４−アミノピリミジン−２−イルオキシメチル）−ベンジル−Ｃｙ５−カルボキサミド（１０）ＢＣＣｙ５
【化８】
2009544660.tif 000012
２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）ピリミジン−４−アミン（２）（１．５mg、０．００７ミリモル）およびＣｙ５−ＮＨＳ（GE healthcare染料）（５．４mg、０．００７ミリモル）をＴＥＡ１．０μLを有するＤＭＦ５００μL中に溶解しそして３１℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水：アセトニトリルの線状勾配（２０分において９５：５から２０：８０まで、０．０８％ＴＦＡ）を使用してＣ１８カラム上の逆相ＭＰＬＣにより単離する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ８６８［Ｍ−Ｎａ］−。
【００８６】
実施例９：Ｏ６−［４−（Ｃｙ５）−アミノメチチル］−ベンジルグアニン（１１）、ＢＧＣｙ５
【化９】
2009544660.tif 000013
Ｏ６−４−アミノメチル−ベンジル−グアニン（１．９mg、０．００７ミリモル）およびＣｙ５−ＮＨＳ（（GE healthcare染料）（５．４mg、０．００７ミリモル）をＴＥＡ１．０μLを有するＤＭＦ５００μL中に溶解しそして３１℃で一夜加熱する。溶媒を真空下に蒸発させそして生成物を、水：アセトニトリルの線状勾配（２０分において９５：５から２０：８０まで、０．０８％ＴＦＡ）を使用してＣ１８カラム上の逆相ＭＰＬＣにより単離する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ９０８［Ｍ−Ｎａ］−。
【００８７】
実施例１０
実施例３と同様にして２−（４−（アミノメチル）ベンジルオキシ）ピリミジン−４−アミン（２）から下記の化合物を製造する。
式１２のＢＣ−ビオチン：
【化１０】
2009544660.tif 000014
式１３のＢＣ−ＰＥＧ−ビオチン
【化１１】
2009544660.tif 000015
式１４のＢＣ−３６０
【化１２】
2009544660.tif 000016
式１５のＢＣ−４３０
【化１３】
2009544660.tif 000017
式１６の化合物の混合物からなるＢＣ−Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ
【化１４】
2009544660.tif 000018
式１７の化合物の混合物からなるＢＣ−Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎジピバロイルエステル
【化１５】
2009544660.tif 000019
式１８の化合物の混合物からなるＢＣ−５０５
【化１６】
2009544660.tif 000020
【００８８】
実施例１１：ライブラリー構築およびファージ選択
プライマー１〜５およびテンプレートとしてＮＡＧＴ遺伝子（配列番号２）を使用するオーバーラップ伸長ＰＣＲ(overlap extension PCR)は、ＮＡＧＴの残基１１４、１３１、１３５、１４８、１５６、１５７および１５９を無作為化することを可能とした。ＮＡＧＴは、最後の２５アミノ酸が欠失しておりそして突然変異Ｋ３２Ｉ、Ｌ３３Ｆ、Ｃ６２Ａ、Ｑ１１５Ｓ、Ｑ１１６Ｈ、Ｋ１２５Ａ、Ａ１２７Ｔ、Ｒ１２８Ａ、Ｇ１３１Ｋ、Ｇ１３２Ｔ、Ｍ１３４Ｌ、Ｒ１３５Ｓ、Ｎ１５０Ｑ、Ｉ１５１Ｇ、Ｎ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｌ、Ａ１５４Ｄ、Ｎ１５７ＧおよびＳ１５９Ｅを有するｗｔＡＧＴの１８２アミノ酸突然変異体である(Gronemeyer et al., Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316,2006)。プライマー１（Ｎ，ＡＧＴ、配列番号３）およびプライマー２（Ｃ，ＡＧＴ、配列番号４）はＳｆｉ１制限部位を含有し；プライマー３（配列番号５）は、位置１１４に無作為化のための無作為化された塩基を含有し；プライマー４（配列番号６）は、位置１３１および１３５に無作為化のための無作為化された塩基を含有し；プライマー５（配列番号７）は、位置１４８、１５６、１５７および１５９に無作為化のための無作為化された塩基を含有する。ＰＣＲ生成物を、ファージディスプレイベクターｐＡＫ１００にライゲーションしそして得られる構築物をE.coli XL1-blue(Stratagene, USA)にエレクトロポレーションした。これは約１０７クローンを含有するライブラリーをもたらした。
【００８９】
ライブラリー細胞を２ＹＴ培地（２５μg/mLクロラムフェニコール、１％グルコース、１mM  ＭｇＣｌ２）中で３７℃で光学密度ＯＤ６００が０．６に達するまで成長させた。次いで２×１０１０ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを加え、そして培養物を、振とうすることなく３７℃で３０分間および１７０rpmにて３７℃で３時間インキュベーションした。
【００９０】
細胞を遠心（４０００rpm、５分、室温）により回収し、ＳＢ−ＭＯＰＳ（５０mM３−モルホリノプロパンスルホン酸、２５μg/mLクロラムフェニコール、７０μg/mLカナマイシン、１mM  ＭｇＣｌ２）中に再懸濁させ、２２０rpmで３７℃にて１〜４時間インキュベーションし、次いで２２０rpmで２４℃で一夜インキュベーションした。細胞をペレット化し、ファージを含有する上清を１mM  ＤＴＴに調節しそして選択前に4℃で貯蔵した。選択のために、ＢＣＦＬ（化合物５）を５μMの最終濃度となるようにファージ溶液（１mL）に加え、室温で３０分間穏やかに回転させた。反応を８μM  ＢＣおよび２００μM  ＢＧの添加によりクエンチした。ファージを、ポリエチレングリコール８０００（４％重量／重量）およびＮａＣｌ（３％重量／重量）を使用して４℃で沈殿させ、卓上遠心器（１３０００rpm、４℃）において遠心しそして５００μL  ＰＢＳ中に再懸濁させた。この溶液に、ＰＢＳＭＭ（４％脱脂粉乳を有するＰＢＳ）５００μLを加え、溶液を室温で６０分間穏やかに回転させた。抗フルオレセイン抗体で覆われた磁性ビーズ２００μL（ＰＢＳで２回洗浄されそしてＰＢＳＭＭで６０分間ブロックされた）をファージ調製物に加え、４℃で３０分間回転させた。標識されたファージの固定化後、ビーズをＰＢＳＭＭで３回、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。ビーズを０．１Mグリシン１００μL、ｐＨ２．５と５分間インキュベーションすることによりファージを溶離し、溶液を５０μLの１MＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８で中和した。E.coli JM101を溶離したファージで感染させ、１％グルコースおよび２５μg/mLのクロラムフェニコールを補充された２ＹＴプレート上でプレートし、次いで３７℃で一夜インキュベーションした。次の日、コロニーをプレートから掻き取り、アリクォートを採り、次のラウンドの選択の前に−８０℃で貯蔵した。６ラウンドの選択を行った。
【００９１】
実施例１２：ＧＳＴ融合タンパク質としての選ばれたＡＣＴｓの特徴付け
実施例９に従う選択の後に単離された突然変異体の遺伝子を、それぞれ、ｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Amersham Bioscience, Otelfingen,Switzerland）へのその後のサブクローニングのためのＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１制限部位を含有するプライマー６（Ｎ，ＡＧＴ、配列番号８）および７（Ｃ，ＡＧＴ，配列番号９）を使用するＰＣＲにより増幅させた。ＧＳＴ−ＡＣＴ融合タンパク質としてのタンパク質の発現および精製を、ＡＧＴ融合タンパク質について前に記載したとおりに行った(A.Juillerat, T.Gronemeyer, A. Keppler, S. Grendreizig, H. Pick, H. Vogel, K. Johnson, Chem. Biol. 10:313,2003)。ＢＣＦＬ（化合物５）およびフルオレセインを有するＢＧ（ＢＧＦＬ、ＷＯ０２／０８３９７）による標識化の反応速度を、反応バッファー（５０mM  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１mMＤＴＴ、２００μg/mLのＢＳＡ）中で対応するＡＣＴタンパク質（０．２〜０．４μM）を適切な蛍光源基質(fluorogenic substrate)(２〜２０μM)と２４℃でインキュベーションすることにより決定した。サンプルを異なる時間に採取し、そして標識反応を、４×ＳＤＳバッファー（８％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール、２４０mM  Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、４０％グリセロール）の添加および９５℃で５分間のインキュベーションによりクエンチした。反応の進行をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける蛍光染料で標識されたタンパク質の検出およびPharox FX（商標）分子イメージャーを使用する蛍光強度の定量により決定した。データは、擬一次反応モデルに適合した。次いで擬一次定数を蛍光源基質の濃度で割ることにより、二次速度定数を得た。
【００９２】
実施例１３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特異的二重標識化アッセイ
ＧＳＴ−ＡＣＴ１と６×Ｈｉｓ−ＮＡＧＴの等モル混合物（０．５μM最終濃度）を、ＢＧＦＬ（フルオレセインを有するベンジルグアニン、ＷＯ０２／０８３９７）、ＢＧＣｙ５（蛍光染料Ｃｙ５を有するベンジルグアニン、化合物１１、実施例９）、ＢＣＦＬ（化合物５、実施例４）、ＢＣＣｙ５（化合物１０、実施例８）（５μM）またはＢＧＣｙ５／ＢＣＦＬもしくＢＧＦＬ／ＢＣＣｙ５の等モル混合物（各々５μM）と、反応バッファー（５０mM  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１mM ＤＴＴ、２００μg/mLのＢＳＡ）中で２４℃にて６０分間インキュベーションすることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ二重標識化アッセイを行った。標識化反応を、４×ＳＤＳバッファー（８％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール、２４０mM  Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、４０％グリセロール）の添加および９５℃で５分間のインキュベーションによりクエンチした。蛍光染料で標識されたタンパク質混合物を、前記したとおりＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００９３】
実施例１４：哺乳動物細胞発現ベクターの構築
哺乳動物細胞における融合タンパク質ＮＡＧＴ−ＮＬＳ３、ＮＡＧＴ−βＧａｌ、ＡＣＴ１−ＮＬＳ３およびＡＣＴ１βＧａｌの発現のために、ＮＡＧＴおよびＡＣＴ１遺伝子を、プライマー８（Ｎ，ＡＧＴ、配列番号１０）およびプライマー９（Ｃ，ＡＧＴ、配列番号１１）を使用してＰＣＲ増幅させ、そして哺乳動物発現ベクターｐＥＣＦＰ−Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する哺乳動物発現プラスミドのＮｈｅｌ／ＢｇｌＩＩ制限部位に挿入した。
【図１】
2009544660.tif 000032
【図２】
2009544660.tif 000033
【図３】
2009544660.tif 000034
【配列表】
2009544660000001.app
【国際調査報告】
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