(57)【要約】  本発明は、とりわけ、少なくとも１種類の目的薬剤（例えば、免疫抑制剤）に免疫特異的に結合する抗体、かかる抗体を製造する方法、及び該抗体を用いた免疫測定法に関する。さらに、本発明は、診断免疫測定用抗体を選択する方法、及び診断免疫測定用抗原を選択する方法にも関する。本発明は、さらに、活性親薬物の主要な代謝産物の１種類以上の存在下における活性親薬物の抗体認識の改善にも関する。
2009534466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されなかったとき、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったときに、１．９×１０−１１Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で免疫抑制剤に特異的に結合する単離抗体。
【請求項２】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとき、該選択希釈剤に曝露されるとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、１．５２×１０−１０Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で免疫抑制剤に特異的に結合する単離抗体。
【請求項４】
選択希釈剤が、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤、溶媒又はこれらの組合せを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤である、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４３６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７。
【請求項７】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４３６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７から抽出されたＤＮＡから作製された抗体。
【請求項８】
タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７と命名された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４３６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系によって産生されるキメラ抗体又はそのタクロリムス結合断片。
【請求項９】
タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７と命名された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４４６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系。
【請求項１０】
タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７と命名された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４４６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系から抽出されたＤＮＡから作製された抗体。
【請求項１１】
タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７と命名された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４４６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系によって産生されるキメラ抗体又はそのタクロリムス結合断片。
【請求項１２】
可変重ドメイン及び可変軽ドメインを有し、可変重ドメインは、重鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３を含み、可変軽ドメインは軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含み、
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｐｈｅ（配列番号３３）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ１は、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択され、
Ｘａａ２は、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択され、
Ｘａａ３は、トレオニン（Ｔｈｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。）、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号３４）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ４は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ５は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ６は、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群から選択される。）、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号１１）の式のアミノ酸配列を有し、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３５）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ７は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ８は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
Ｘａａ９は、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択される。）、
ただし、重鎖ＣＤＲ２においてＸａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、軽鎖ＣＤＲ１においてＸａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅである場合、軽鎖ＣＤＲ３においてＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓである場合にはＸａａ９はＶａｌ以外であり、又はＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ８はＨｉｓ以外であり、又はＸａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ７はＳｅｒ以外である、
タクロリムスに特異的に結合する単離抗体。
【請求項１３】
請求項１、３、７、８、１０、１１又は１２の抗体を含む、タクロリムス用診断免疫測定法。
【請求項１４】
免疫抑制剤に特異的に結合する単一の抗体を含む、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項１５】
タクロリムスに対する追加の特異的結合パートナーを更に含む、請求項１３に記載の免疫測定法。
【請求項１６】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体を試料と接触させる段階（該試料は、該抗体が結合すると考えられる目的エピトープを含み、該抗体は、バイオディスプレイ形式で存在する。）、
ｂ）抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｃ）段階ｂ）で求めた平衡解離定数、解離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて抗体を選択する段階
を含む、抗体が目的エピトープに結合する、診断免疫測定用抗体を選択する方法。
【請求項１７】
選択希釈剤が、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤、溶媒又はこれらの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
試料が免疫抑制剤を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体をインキュベートする段階（該抗体はバイオディスプレイ形式で存在する。）、
ｂ）前記抗体を試料と接触させる段階（該試料は、該抗体が結合すると考えられる目的エピトープを含む。）、
ｃ）抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｄ）段階ｃ）で求めた平衡解離定数、分離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて抗体を選択する段階
を含む、抗体が目的エピトープに結合する、診断免疫測定用抗体を選択する方法。
【請求項２１】
選択希釈剤が、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤、溶媒又はこれらの組合せを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試験試料が免疫抑制剤を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、特異的結合パートナーを試料と接触させる段階（該試料は目的エピトープを含み、特異的結合パートナーは目的エピトープに結合し、該特異的結合パートナーはバイオディスプレイ形式で存在する。）、
ｂ）特異的結合パートナーの平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｃ）段階ｂ）で求めた特異的結合パートナーの平衡解離定数、解離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて特異的結合パートナーを選択する段階
を含む、診断免疫測定用試験試料中の目的分析物を検出するための特異的結合パートナーを選択する方法。
【請求項２５】
選択希釈剤が、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤、溶媒又はこれらの組合せを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
分析物が免疫抑制剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）酵母細胞の表面に存在する抗体を含む酵母ディスプレイライブラリーを得る段階、
（ｂ）結合競合剤の存在下で、前記酵母細胞を薬剤と接触させる段階、
（ｃ）前記結合競合剤の存在下で前記薬剤との結合を示す抗体が表面に表示された酵母細胞を特定する段階（かかる結合は、該薬剤に対する特異性が改善されたことを示す。）
を含む、酵母ディスプレイを用いて、薬剤に対する特異性が改善された抗体をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
前記結合競合剤が過剰に存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤が免疫抑制剤を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合競合剤が前記免疫抑制剤の代謝産物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫抑制剤が、シクロスポリン及びタクロリムスからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記代謝産物が、Ｍ−Ｉ、Ｍ−ＩＩ、Ｍ−ＩＩＩ、Ｍ１、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１７、Ｍ１８  Ｍ２１及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記代謝産物がＭ１７及びＭ１を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）バイオディスプレイ形式で存在する抗体を含むライブラリーを得る段階（該抗体は変異を含む。）、
（ｂ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、前記抗体を、エピトープを含む試料と接触させる段階、及び
（ｃ）前記選択希釈剤の存在下で、変異を含まない類似の抗体の解離速度よりも低い解離速度を示す、前記バイオディスプレイ形式で存在する抗体を特定する段階（かかる低解離速度は、前記エピトープに対する親和性が改善されたことを示す。）
を含む、目的エピトープに対する親和性が改善された抗体をスクリーニングする方法。
【請求項３６】
前記抗体を前記試料及び前記選択希釈剤と接触させる段階が同時に、又は逐次的に実施される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
選択希釈剤が、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤、溶媒又はこれらの組合せを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
試料が免疫抑制剤を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）バイオディスプレイ形式で存在する特異的結合パートナーを含むライブラリーを得る段階（該特異的結合パートナーは変異を含む。）、
（ｂ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、前記特異的結合パートナーを、エピトープを含む試料と接触させる段階、及び
（ｃ）前記選択希釈剤の存在下で、変異を含まない類似の特異的結合パートナーの解離速度よりも低い解離速度を示す、前記バイオディスプレイ形式で存在する特異的結合パートナーを特定する段階（かかる低解離速度は、前記エピトープに対する親和性が改善されたことを示す。）
を含む、目的エピトープに対する親和性が改善された特異的結合パートナーをスクリーニングする方法。
【請求項４１】
前記抗体を前記試料及び前記選択希釈剤と接触させる段階が同時に、又は逐次的に実施される、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本願は、２００６年１１月３日に出願された米国特許出願第６０／８５６，６１４号、２００６年４月２４日に出願された米国特許出願第６０／７９４，３７０号、及び２００７年４月２３日に事件番号第８１６６ＵＳ０１号（Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍａｉｌ  ＥＶ  ９５９２８４２１９  ＵＳ）として出願された米国出願の優先権を主張するものである。
【０００２】
とりわけ、本発明は、少なくとも１種類の目的薬剤に、例えば免疫抑制剤に、高い結合親和性で免疫特異的に結合する抗体に関する。本発明は、目的薬剤（例えば、免疫抑制剤）に対する抗体を製造する方法、及び該抗体を用いた免疫測定法にも関する。さらに、本発明は、診断免疫測定用抗体を選択する方法、及び診断免疫測定用抗原を選択する方法に関する。本発明は、さらに、活性親薬物の主要な代謝産物の１種類以上の存在下における活性親薬物の抗体認識の改善にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ＦＫ５０６としても知られるタクロリムスは、土壌中の細菌ストレプトミセス  ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋａｂａｅｎｓｉｓ）によって産生されるマクロライド免疫抑制剤の一般名である（Ｉｎａｍｕｒａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ４５（１）：２０６−２０９（１９８８）参照）。タクロリムスの第一世代の主要な代謝産物は、１３−Ｏ−脱メチル化タクロリムス（「Ｍ−Ｉ」）、３１−Ｏ−脱メチル化タクロリムス（「Ｍ−ＩＩ」）及び１５−Ｏ−脱メチル化タクロリムス（「Ｍ−ＩＩＩ」）である。タクロリムスは、特に肝臓、腎臓又は骨髄移植を受けた患者において、臓器拒絶防止のために静脈内及び経口的に使用されている。
【０００４】
シクロスポリン（「ＣｓＡ」）は、ある種の土壌菌類から得られる免疫抑制剤である。ＣｓＡは、移植後の臓器拒絶防止のために主に使用されるが、再生不良性貧血などの他の疾病の治療、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防にも使用されている。
【０００５】
タクロリムスは、シクロスポリンＣｓＡの５０−１００倍のインビボでの効力がある（Ｍｕｒｔｈｙ，  Ｊ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３１（８）：６１３−６１７（１９９８）参照）。タクロリムスの免疫抑制効果は、ＣｓＡとほぼ同じであり、細胞傷害性Ｔ細胞の生成の選択的阻害によると考えられる。同上。分子レベルでは、タクロリムスは、Ｔ細胞応答における初期転写活性を選択的に遮断すると考えられる。同上。タクロリムスのこの作用は、イムノフィリンと称する特定の細胞質タンパク質に薬物が結合して、複合体を形成することに起因する。同上。この複合体は、カルシウム依存性カルシニューリン−カルモジュリントランスロケーション経路と相互作用し、ＩＬ−２  ｍＲＮＡの転写に必要なＩＬ−２遺伝子のエンハンサーポリヌクレオチド配列に結合する転写因子（「ＮＦ−ＡＴ」）の核移行を阻害する。
【０００６】
臨床的に、タクロリムスは、移植患者における拒絶発症を減少させることが知られている。タクロリムスは、治療上有益であるが、腎毒性、胃腸管合併症及び神経毒性を含めて、ＣｓＡに類似したある毒性を示す。同上。ＣｓＡとは異なり、タクロリムスは、多毛症や高コレステロール血症を起こさない。同上。タクロリムスに関係した毒性問題を考慮して、この薬物による治療を受けた患者においてタクロリムスの血中濃度をモニターするために、免疫測定法が用いられる。
【０００７】
種々の診断免疫測定法が、タクロリムスの血中濃度をモニターするために市販されている。これらの免疫測定法の幾つかは、全血試料からタクロリムスを抽出するために有機溶媒を用いる。有機溶媒は、アッセイに用いる抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を増加させ、及び／又は機能活性を低下させる。抗体の活性が低下すると、アッセイ感度が低下し、精度及び堅牢性が低下するおそれがある。抽出プロセス中に使用する有機溶媒の量を削減することによって、アッセイ感度を増加させる試みが成されている。しかし、溶媒量の削減は、抽出効率、したがってアッセイの再現性に影響を及ぼすことが判明した。
【０００８】
同様に、例えば抗シクロスポリン抗体を利用して、ＣｓＡの血中濃度をモニターするために、種々の診断免疫測定法が市販されている。最新の文献によれば、ＣｓＡ代謝産物が生成すると、活性親薬物（ＣｓＡ）の濃度がかき消されるおそれがある。ＣｓＡ免疫抑制剤の適切な用量決定は、臓器移植患者にとって極めて重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、かかる診断免疫測定法に使用することができる（親和性、特異性などの）結合特性が改善された新しい抗体が当分野で求められている。かかる抗体のスクリーニング方法及び入手方法も求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様においては、本発明は、抗体が、少なくとも１種類の選択希釈剤（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｉｌｕｅｎｔ）に曝露されなかったとき、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったときに、１．９×１０−１１Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で免疫抑制剤に特異的に結合する抗体（例えば、単離抗体）に関する。好ましくは、抗体は、１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１３ＭのＫＤを有し、より好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤを有する。
【００１１】
前記抗体が免疫特異的に結合する免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤であり得る。
【００１２】
別の態様においては、本発明は、抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとき、該選択希釈剤に曝露されるとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、１．５２×１０−１０Ｍ未満のＫＤで免疫抑制剤に特異的に結合する単離抗体に関する。
【００１３】
好ましくは、抗体は、１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤを有し、より好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１１ＭのＫＤを有する。前記抗体が免疫特異的に結合する免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド又は免疫抑制代謝拮抗剤であり得る。
【００１４】
少なくとも１種類の選択希釈剤は、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）、溶媒又はこれらの組合せを含み得る。緩衝剤は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、クエン酸塩又はホウ酸塩であり得る。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又は硫酸亜鉛であり得る。洗浄剤は、陰イオン洗浄剤、陽イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤又は双性イオン洗浄剤であり得る。結合競合剤は、代謝産物ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は目的エピトープよりも親和性の低い交差反応物であり得る。溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、メタノール、エタノール又はこれらの組合せであり得る。
【００１５】
別の態様においては、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４３６の（「ＣＨＯ細胞系：タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７」又は「タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７」としても知られる）チャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４３６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７から抽出されたＤＮＡから作製された抗体、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７（該細胞系はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４３６である。）によって産生されるキメラ抗体又はそのタクロリムス結合断片に関する。
【００１６】
更に別の態様においては、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４４６の（「ＣＨＯ細胞系：タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７」又は「タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７」又は「１−１１５７」としても知られる）チャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４４６のチャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７から抽出されたＤＮＡから作製された抗体、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７（該細胞系はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４４６である。）によって産生されるキメラ抗体又はそのタクロリムス結合断片に関する。
【００１７】
更に別の態様においては、本発明は、タクロリムスに特異的に結合する単離抗体に関する。前記抗体は、可変重ドメイン（ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）及び可変軽ドメイン（ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）を有し、可変重ドメインは、重鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３を含み、可変軽ドメインは軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含む。ここで、
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｐｈｅ（配列番号３３）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ１は、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択され、
Ｘａａ２は、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択され、
Ｘａａ３は、トレオニン（Ｔｈｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。）、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号３４）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ４は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ５は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ６は、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群から選択される。）、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号１１）の式のアミノ酸配列を有し、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３５）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ７は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ８は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
Ｘａａ９は、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択される。）、
ただし、重鎖ＣＤＲ２においてＸａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、軽鎖ＣＤＲ１においてＸａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅである場合、軽鎖ＣＤＲ３においてＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓである場合にはＸａａ９はＶａｌ以外であり、又はＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ８はＨｉｓ以外であり、又はＸａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ７はＳｅｒ以外である。
【００１８】
上記抗体においては、（１）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（２）Ｘａａ１がＡｌａであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（３）Ｘａａ１がＬｙｓであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＶａｌであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（４）Ｘａａ１がＧｌｕであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（５）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（６）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＡｌａであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（７）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｙであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（８）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌであり、（９）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＡｌａであり、（１０）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＡｒｇであり、Ｘａａ９がＡｌａであり、（１１）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＡｓｐであり、（１２）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（１３）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、（１４）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＧｌｙであり、Ｘａａ８がＡｒｇであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（１５）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＧｌｙであり、Ｘａａ８がＶａｌであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（１６）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＴｈｒであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（１７）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＬｙｓであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（１８）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、（１９）Ｘａａ１がＡｌａであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、（２０）Ｘａａ１がＡｌａであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＡｌａであり、（２１）Ｘａａ１がＡｌａであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＧｌｙであり、Ｘａａ８がＡｒｇであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（２２）Ｘａａ１がＡｌａであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、（２３）Ｘａａ１がＡｌａであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＧｌｙであり、Ｘａａ８がＡｒｇであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（２４）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＧｌｙであり、Ｘａａ８がＡｒｇであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（２５）Ｘａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、（２６）Ｘａａ１がＬｙｓであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＶａｌであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、（２７）Ｘａａ１がＧｌｕであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、（２８）Ｘａａ１がＧｌｕであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅであり、Ｘａａ７がＧｌｙであり、Ｘａａ８がＶａｌであり、Ｘａａ９がＣｙｓであり、（２９）Ｘａａ１がＧｌｕであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｙであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＳｅｒであり、又は（３０）Ｘａａ１がＡｌａであり、Ｘａａ２がＴｒｐであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、Ｘａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＧｌｙであり、Ｘａａ６がＬｅｕであり、Ｘａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＳｅｒである。
【００１９】
上記抗体は、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されなかったとき、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったときに、１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１３ＭのＫＤを有し得、該抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとき、該選択希釈剤に曝露されるとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤを有し得る。
【００２０】
上記抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖｓ、抗イディオタイプ抗体、又は機能的に活性なそのエピトープ結合断片であり得る。
【００２１】
更に別の態様においては、本発明は、上記抗体のいずれかを含む、タクロリムス用診断免疫測定法に関する。さらに、前記免疫測定法は、（１）免疫抑制剤に特異的に結合する単一の抗体、又は（２）タクロリムスに対する追加の特異的結合パートナーを含み得る。
【００２２】
更に別の態様においては、本発明は、抗体が目的エピトープに結合する、診断免疫測定用抗体を選択する方法に関する。この方法は以下の段階を含み得る。
【００２３】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体を試料と接触させる段階（該試料は、該抗体が結合すると考えられる目的エピトープを含み、前記抗体は、バイオディスプレイ（ｂｉｏ−ｄｉｓｐｌａｙ）形式で存在する。）、
ｂ）抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、分離（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｃ）段階ｂ）で求めた平衡解離定数、解離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて抗体を選択する段階。
【００２４】
或いは、方法は以下の段階を含み得る。
【００２５】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体をインキュベートする段階（該抗体はバイオディスプレイ形式で存在する。）、
ｂ）少なくとも１種類の抗体を試料と接触させる段階（該試料は、該抗体が結合すると考えられる目的エピトープを含む。）、
ｃ）抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｄ）段階ｃ）で求めた平衡解離定数、分離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて抗体を選択する段階。
【００２６】
上記方法においては、試料は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド、免疫抑制代謝拮抗剤などの免疫抑制剤を含み得る。さらに、上記方法においては、少なくとも１種類の選択希釈剤は、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤、溶媒又はこれらの組合せを含み得る。緩衝剤は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、クエン酸塩又はホウ酸塩であり得る。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又は硫酸亜鉛であり得る。洗浄剤は、陰イオン洗浄剤、陽イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤又は双性イオン洗浄剤であり得る。結合競合剤は、代謝産物ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、メタノール、エタノール又はこれらの組合せであり得る。
【００２７】
別の実施形態においては、本発明は、タクロリムスに結合する診断免疫測定用抗体を選択する方法に関する。この方法は以下の段階を含み得る。
【００２８】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体をタクロリムスと接触させる段階（該抗体はバイオディスプレイ形式で存在する。）、
ｂ）抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｃ）段階ｂ）で求めた平衡解離定数、分離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて抗体を選択する段階。
【００２９】
或いは、方法は以下の段階を含み得る。
【００３０】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体をインキュベートする段階（該抗体はバイオディスプレイ形式で存在する。）、
ｂ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体をタクロリムスと接触させる段階、
ｃ）抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｄ）段階ｃ）で求めた平衡解離定数、分離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて抗体を選択する段階。
【００３１】
さらに、上記方法においては、少なくとも１種類の選択希釈剤は、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤又は溶媒を含み得る。緩衝剤は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、クエン酸塩又はホウ酸塩であり得る。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又は硫酸亜鉛であり得る。洗浄剤は、陰イオン洗浄剤、陽イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤又は双性イオン洗浄剤であり得る。結合競合剤は、代謝産物ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、メタノール、エタノール又はこれらの組合せであり得る。
【００３２】
更に別の態様においては、本発明は、診断免疫測定用試験試料中の目的分析物を検出するための特異的結合パートナーを選択する方法に関する。この方法は以下の段階を含み得る。
【００３３】
ａ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、特異的結合パートナーを試料と接触させる段階（該試料は目的エピトープを含み、特異的結合パートナーは目的エピトープに結合し、該特異的結合パートナーはバイオディスプレイ形式で存在する。）、
ｂ）特異的結合パートナーの平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を求める段階、及び
ｃ）段階ｂ）で求めた特異的結合パートナーの平衡解離定数、解離速度定数、会合速度定数又は機能活性に基づいて特異的結合パートナーを選択する段階。
【００３４】
上記方法においては、試料は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド、免疫抑制代謝拮抗剤などの免疫抑制剤を含み得る。さらに、上記方法においては、少なくとも１種類の選択希釈剤は、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤又は溶媒を含み得る。緩衝剤は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、クエン酸塩又はホウ酸塩であり得る。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又は硫酸亜鉛であり得る。洗浄剤は、陰イオン洗浄剤、陽イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤又は双性イオン洗浄剤であり得る。結合競合剤は、代謝産物ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、メタノール、エタノール又はこれらの組合せであり得る。
【００３５】
別の実施形態においては、本発明は、酵母ディスプレイを用いて、薬剤に対する特異性が改善された抗体をスクリーニングする方法に関する。この方法は以下の段階を含んでいてもよい。
【００３６】
（ａ）酵母細胞表面に存在する抗体（例えば、変異していてもよいｓｃＦｖ）を含む酵母ディスプレイライブラリーを得る段階、
（ｂ）結合競合剤の存在下で、酵母細胞を薬剤と接触させる段階、
（ｃ）結合競合剤の存在下で薬剤との結合を示す抗体が表面に表示された酵母細胞を特定する段階（かかる結合は、薬剤に対する特異性が改善されたことを示す。）。
【００３７】
この方法は、結合競合剤が目的薬剤よりも過剰に存在して、実施してもよい（例えば、約５から約１００倍、約１００倍から約１０００倍、約５倍、約１０倍、約２５倍、約１００倍又は約２００倍過剰）。過剰量は、モル基準（例えば、ナノモル過剰）で計算してもよい。
【００３８】
一実施形態においては、薬剤は免疫抑制剤を含み、結合競合剤は免疫抑制剤の代謝産物である。免疫抑制剤は、シクロスポリン及びタクロリムスからなる群から選択してもよく、代謝産物は、Ｍ−Ｉ、Ｍ−ＩＩ、Ｍ−ＩＩＩ、Ｍ１、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ２１及びこれらの組合せからなる群から選択してもよい。
【００３９】
別の実施形態においては、結合競合剤（例えば、代謝産物）が複数の結合競合剤（例えば、代謝産物）を含むスクリーニング方法を実施する。複数の結合競合剤（例えば、代謝産物）は、２（例えば、これらだけに限定されないが、Ｍ１７とＭ１を含めた代謝産物）、３、４、５  ６、７、８、９又は１０種類の結合競合剤（例えば、代謝産物）を含んでいてもよい。結合競合剤が代謝産物であるときには、複数の代謝産物を、Ｍ−Ｉ、Ｍ−ＩＩ、Ｍ−ＩＩＩ、Ｍ１、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１７、Ｍ１８及びＭ２１からなる群から選択してもよい。
【００４０】
更に別の好ましい実施形態においては、上記方法によって、スクリーニングを段階的に実施して、好ましい諸特性を有する（例えば、特異性の改善された）抗体を得ることができる。例えば、複数の結合競合剤（例えば、代謝産物）を含む代わりに、１種類以上の結合競合剤（例えば、代謝産物）を用いてスクリーニングを実施し、続いて１種類以上の結合競合剤（例えば、代謝産物）を用いて１ラウンド以上の追加のスクリーニングを実施することができる。
【００４１】
さらに、好ましい諸特性（例えば、好ましい親和性、特異性などの好ましい結合特性）を有する抗体を得る本明細書に記載の各スクリーニング方法を組み合わせることができ、同時に、又は逐次的に併用してもよい。例えば、各方法は、目的エピトープに対する親和性が改善された抗体をスクリーニングする方法に関し得る。かかる方法は以下の段階を含み得る。
【００４２】
（ａ）バイオディスプレイ形式で存在する抗体を含むライブラリーを得る段階（該抗体は変異を含む。）、
（ｂ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、前記抗体を、前記エピトープを含む試料と接触させる段階、及び
（ｃ）前記選択希釈剤の存在下で、変異を含まない類似の抗体の解離速度よりも低い解離速度を示す、前記バイオディスプレイ形式で存在する抗体を特定する段階（かかる低解離速度は、前記エピトープに対する親和性が改善されたことを示す。）。
【００４３】
或いは、方法は以下の段階を含み得る。
【００４４】
以下の段階を含む、目的エピトープに対する親和性が改善された特異的結合パートナーをスクリーニングする方法。
【００４５】
（ａ）バイオディスプレイ形式で存在する特異的結合パートナーを含むライブラリーを得る段階（該特異的結合パートナーは変異を含む。）、
（ｂ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、前記特異的結合パートナーを、前記エピトープを含む試料と接触させる段階、及び
（ｃ）前記選択希釈剤の存在下で、変異を含まない類似の特異的結合パートナーの解離速度よりも低い解離速度を示す、前記バイオディスプレイ形式で存在する特異的結合パートナーを特定する段階（かかる低解離速度は、前記エピトープに対する親和性が改善されたことを示す。）。
【００４６】
上記方法においては、前記抗体を前記試料及び前記選択希釈剤と接触させる段階を同時に、又は逐次的に実施することができる。さらに、上記方法においては、少なくとも１種類の選択希釈剤は、緩衝剤、塩、洗浄剤、結合競合剤又は溶媒を含み得る。緩衝剤は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、クエン酸塩又はホウ酸塩であり得る。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又は硫酸亜鉛であり得る。洗浄剤は、陰イオン洗浄剤、陽イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤又は双性イオン洗浄剤であり得る。結合競合剤は、代謝産物ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、メタノール、エタノール又はこれらの組合せであり得る。さらに、上記方法においては、試料は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、コルチコステロイド、免疫抑制代謝拮抗剤などの免疫抑制剤を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
定義
本明細書では「抗体」及び「複数の抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、（完全又は部分ヒト化）ヒト化抗体、（トリ（例えば、アヒル又はガチョウ）、サメ又はクジラ、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）又は非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）などのサル、チンパンジーなど）を含めたほ乳動物など、ただしこれらだけに限定されない動物抗体、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（「ｓｃＦｖ」）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（「ｓｄＦｖ」）、及び（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含めた）抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、並びに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片を指す。特に、抗体としては、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含む分子が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。バイオディスプレイを用いて調製されたコンビナトリー（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ）抗体ライブラリーのスクリーニングによって親和性（すなわち、ＫＤ、ｋｄ又はｋａ）が増加した、又は改善された抗体を、本明細書では「親和性成熟（ｍａｔｕｒａｔｅｄ）抗体」と称する。
【００４８】
本明細書では、特異的結合対（本明細書では、例えば、抗原と抗体）のメンバー間の相互作用に関連した「特異的」又は「特異性」とは、相互作用の選択的反応性を指す。
【００４９】
本明細書では「会合速度定数」、「ｋｏｎ」又は「ｋａ」という用語は、本明細書では区別なく使用され、その標的抗原に対する抗体の結合強度（結合度）、又は以下で示される抗体と抗原の複合体形成の速度を示す値を指す。
【００５０】
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇ
会合速度定数を測定する方法は、当分野で周知である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）（スウェーデン）アッセイを使用することができる。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能であるＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）アッセイを使用することもできる。
【００５１】
本明細書では「バイオディスプレイ」又は「バイオディスプレイ形式」という用語は、目的遺伝子の遺伝子型をそのコードされた表現型に結びつけ、それによって目的形質を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）配列を再生することができる、任意のインビトロでのディスプレイシステム又は方法を指す。バイオディスプレイシステム又は方法の例としては、酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソーム／ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ及びインビトロ区画化（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。より具体的には、本明細書により詳細に記載するように、タクロリムス１−６０−４６抗体を構築し、プラスミドにクローン化し、それによって酵母サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の表面での誘導性発現を可能にし、プラスミド上に存在する栄養要求性マーカーによって該酵母宿主に安定に転換した。
【００５２】
本明細書では「結合競合剤」という用語は、その特異的結合パートナーと相互作用又は結合することから、目的エピトープを含む分子と競合又は交差反応する任意の分子を指す。好ましくは、目的エピトープを含む分子と競合又は交差反応する分子は、目的エピトープを含む分子よりも（低いＫＤ、高いｋｄ、低いｋａなど、ただしこれらだけに限定されない）低い親和性で特異的結合パートナーと結合する。結合競合剤の例としては、タクロリムスの代謝産物である１３−Ｏ−脱メチル化タクロリムス（「Ｍ−Ｉ」）、３１−Ｏ−脱メチル化タクロリムス（「Ｍ−ＩＩ」）及び１５−Ｏ−脱メチル化タクロリムス（「Ｍ−ＩＩＩ」）、シクロスポリンの代謝産物であるＭ１、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１３  Ｍ１７、Ｍ１８又はＭ２１などの代謝産物（例えば、免疫抑制剤を含めて、ただしこれだけに限定されない薬物の代謝産物）、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが挙げられるが、これらだけに限定されない。例えば、シクロスポリン抗体は、親シクロスポリン薬物に対するＫＤが９．５×１０−１０Ｍであり、代謝産物Ｍ１７に対するＫＤが１．４５×１０−８Ｍである。
【００５３】
本明細書では「交差反応する」又は「交差反応性」という用語は、典型的には親和性の異なる２種類のエピトープ、分子又はリガンドが同じ特異的結合パートナー上の同じ部位と反応する能力を指す。
【００５４】
本明細書では「分離速度定数」、「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」という用語は、本明細書では区別なく使用され、その標的抗原からの抗体の分離強度（分離度）、又は以下で示すように、Ａｂ−Ａｇ複合体が次第に遊離Ａｂと抗原に分離することを示す値を指す。
【００５５】
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ
分離速度定数を測定する方法は、当分野で周知である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）（スウェーデン）アッセイを使用することができる。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能であるＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）アッセイを使用することもできる。
【００５６】
本明細書では「阻害定数」、「Ｋｉ」という用語は、下記式で示されるように、特異的結合対の一方のメンバー（例えば、抗体によって特異的に認識される抗原）の非存在下で、特異的結合対の他方のメンバー（例えば、該抗体）の利用可能な結合部位の５０％を占める結合競合剤の濃度を指す。
【００５７】
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ａ］／ＫＤ））
式中、ＩＣ５０は標識抗原の特定の濃度において特異的結合の５０％を置換する結合競合剤の濃度に等しく、［Ａ］は、アッセイに用いる標識抗原の濃度に等しく、ＫＤは特異的結合対のメンバー（例えば、抗原と抗体）の平衡解離定数に等しい。
【００５８】
本明細書では「エピトープ」、「複数のエピトープ」又は「目的エピトープ」という用語は、認識され、その特異的結合パートナー上の相補的部位に結合可能である、任意の分子上の部位を指す。分子及び特異的結合パートナーは、特異的結合対の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、（糖脂質、糖タンパク質、リポ多糖など、ただしこれらだけに限定されない）炭水化物抗原又は多糖であり得、その特異的結合パートナーは、これだけに限定されないが、抗体であり得る。
【００５９】
本明細書では「平衡解離定数」又は「ＫＤ」という用語は、本明細書では区別なく使用され、分離速度定数（ｋｏｆｆ）を会合速度定数（ｋｏｎ）で除算して得られる値を指す。会合速度定数、分離速度定数及び平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すのに用いられる
本明細書では「ヒト化」抗体という用語は、所定の抗原に結合可能であり、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する枠組み領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するＣＤＲとを含む、免疫グロブリン変種又はその断片を指す。通常、ヒト化抗体は、非ヒトである出所からヒト化抗体中に導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖなどの）可変ドメインの実質的に全部を含み、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、枠組み（「ＦＲ」）領域の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の枠組み（「ＦＲ」）領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（「Ｆｃ」）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含むことが最適である。一般に、抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとを含む。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含めた免疫グロブリンの任意のクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含めた任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、１を超えるクラス又はアイソタイプに由来する配列を含み得、所望のエフェクター機能を最適化する特別な定常ドメインの選択は、当業者の範囲内である。
【００６０】
本明細書では「免疫抑制剤に特異的に結合する」という句、及びその類似の用語は、（タクロリムスなど、ただしこれだけに限定されない）免疫抑制剤に特異的に結合し、（代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、薬剤、薬物など、ただしこれらだけに限定されない）他の競合物に特異的に結合しない、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質及び抗体を指す。免疫抑制剤に特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は抗体は、例えば、診断免疫測定法、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）、又は当分野で公知の他のアッセイによって測定して、より低い結合親和性で、他の代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、薬剤又は薬物に結合し得る。免疫抑制剤に免疫特異的に結合する抗体又は抗体断片は、例えば、診断免疫測定法、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）、又は当業者に公知の他の技術によって特定することができる。ある抗体は、放射性免疫測定法（「ＲＩＡ」）、酵素結合免疫吸着検定法（「ＥＬＩＳＡ」）など、ただしこれらだけに限定されない実験技術によって測定して、任意の交差反応性抗原よりも免疫抑制剤に、より高い結合親和性で免疫特異的に結合する（例えば、Ｐａｕｌ，  ｅｄ．，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐａｇｅｓ  ３３２−３３６（１９８９）参照）。例えば、本発明においては、抗体は、（製造者によって禁止された（ｐｒｏｓｃｒｉｂｅｄ））標準アッセイ条件下のＫｉｎＥｘＡ（登録商標）アッセイ、特に実施例１０に記載のＫｉｎＥｘＡ（登録商標）アッセイによって測定して、（リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、１％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）及び１０％メタノールを含む選択希釈剤などの）選択希釈剤の非存在下で１．９×１０−１１Ｍ未満、又は（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールを含む選択希釈剤などの）選択希釈剤に曝露されたときに、該選択希釈剤と一緒にインキュベートしたときに、若しくは該選択希釈剤の存在下で、１．５２×１０−１０Ｍ未満の平衡分離定数（ＫＤ）を免疫抑制剤に対して免疫グロブリンとして示す場合に、免疫抑制剤に免疫特異的に結合する。
【００６１】
本明細書では「免疫抑制剤」という用語は、対象における免疫系の活動を遅らせる、又は停止させる薬物を指す。免疫抑制剤は、対象の免疫系が臓器移植後に免疫応答を開始するのを防止するために、又は過活動性の免疫系によって引き起こされる疾患を治療するために、対象に投与することができる。免疫抑制剤の例としては、シクロスポリン、ＩＳＡ（ＴＸ）２４７、タクロリムス、カルシニューリンなど、ただしこれらだけに限定されないカルシニューリン阻害剤、シロリムス、エベロリムス、ＦＫ７７８、ＴＡＦＡ−９３など、ただしこれらだけに限定されないラパマイシン標的、バシリキシマブ、ダクリズマブなど、ただしこれらだけに限定されないインターロイキン２α鎖遮断薬、ミコフェノール酸モフェチルなどのイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、メトトレキサートなど、ただしこれだけに限定されないジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなど、ただしこれらだけに限定されないコルチコステロイド、又はアザチオプリンなど、ただしこれだけに限定されない免疫抑制代謝拮抗剤が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６２】
本明細書では、核酸分子に関連した「単離された」という用語は、核酸分子の自然源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を指す。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、他の細胞材料を実質的に含まなくてもよく、又は組換え技術によって製造されたときに培地を実質的に含まなくてもよく、又は化学合成されたときに化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００６３】
本明細書では「生理希釈剤」という句は、（試験試料などの）前記試料が由来する対象（好ましくはヒト）のインビボでの生理的条件を模倣、近似又はシミュレートするのに使用することができる任意の液体又は固体材料を指す。生理希釈剤の組成は、重要ではなく、生理希釈剤の使用法に応じて変動する。例えば、生理希釈剤は、少なくとも１種類の緩衝剤（この少なくとも１種類の緩衝剤を使用して試料のｐＨを調節する（増加又は減少させる）ことができる。）、少なくとも１種類の塩（この少なくとも１種類の塩を使用して、試料の塩濃度を調節する（増加又は減少させる）ことができる。）、少なくとも１種類のタンパク質（この少なくとも１種類のタンパク質を使用して、非特異的結合を阻止することができ、又は試料に含まれる他のタンパク質を安定化することができる。）などを含み得る。さらに、生理希釈剤は、少なくとも１種類の緩衝剤、少なくとも１種類の塩、少なくとも１種類のタンパク質などの任意の組合せを含み得る。
【００６４】
例えば、試験試料を対象から得た後は、該試験試料が「生理的条件」又は「非生理的条件」にあるとはもはや考えられないことは当分野で周知である。前記試験試料をアッセイに使用する前に、生理希釈剤を使用し、試験試料に添加して、試験試料が由来する対象のインビボでの生理的条件を模倣、近似又はシミュレートすることができ、換言すれば、試験試料をより「生理的のように（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｌｉｋｅ）」することができる。試験試料は、（ａ）７．３５から７．４５のｐＨを有するとき、（ｂ）１３６から１４６ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウム塩を含むとき、（ｃ）３．５から５．１ｍｍｏｌ／Ｌのカリウム塩を含むとき、（ｄ）１０．７から２２．９μｍｏｌ／Ｌの亜鉛を含むとき、（ｅ）０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満のメタノールを含むとき、又は（ｆ）（ａ）−（ｅ）の任意の組合せであるときに、生理的条件を模倣、近似若しくはシミュレートする、又は「生理的のよう」であるとみなされる。（試験試料の生理的条件は、参照により本明細書に援用する、Ｔｉｅｔｚ，  ｅｄ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ，  ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ｐａｇｅ  ６９５（１９８３）に記載されている。）。
【００６５】
使用可能な緩衝剤の例としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩緩衝剤又はこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６６】
使用可能な塩の例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛又はこれらの組合せである。
【００６７】
使用可能なタンパク質の例は、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、アイシングラス、ウシガンマグロブリン又はこれらの組合せである。
【００６８】
本明細書では「選択希釈剤」という用語は、（ａ）前記抗体を前記選択希釈剤と一緒にインキュベートした場合、該選択希釈剤と一緒に使用した場合、若しくは該選択希釈剤に曝露した場合に、少なくとも１種類の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を変えることが当業者に知られている、若しくは少なくとも１種類の抗体のＫＤを変える可能性があると当業者に考えられている、任意の液体若しくは固体材料、（ｂ）前記抗体を前記選択希釈剤と一緒にインキュベートした場合、該選択希釈剤と一緒に使用した場合、若しくは該選択希釈剤に曝露した場合に、少なくとも１種類の抗体の機能活性を変えることが当業者に知られている、若しくは少なくとも１種類の抗体の機能活性を変える可能性があると当業者に考えられている、任意の液体若しくは固体材料、又は（ｃ）上記（ａ）−（ｂ）の任意の組合せである任意の液体又は固体材料を指す。本明細書に記載の選択希釈剤は、種々の方法で使用することができる。しかし、好ましくは、選択希釈剤は、診断免疫測定法の反応条件を近似、模倣又はシミュレートするのに使用される。選択希釈剤の組成は、重要ではなく、選択希釈剤の使用法に応じて変動する。例えば、選択希釈剤は、少なくとも１種類の緩衝剤、少なくとも１種類の塩、少なくとも１種類の洗浄剤、少なくとも１種類の結合競合剤、少なくとも１種類の溶媒などを含み得る。さらに、選択希釈剤は、少なくとも１種類の緩衝剤、少なくとも１種類の塩、少なくとも１種類の洗浄剤、少なくとも１種類の結合競合剤、少なくとも１種類の溶媒などの任意の組合せを含み得る。別の例として、選択希釈剤は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールを含み得る。更に別の例として、選択希釈剤は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１％ＢＳＡ、及び結合競合剤約５から約２００ｎＭを含み得る。しかし、上記したように、結合競合剤の過剰量は、選択希釈剤中の結合競合剤の量が、例えば、約５から約１００ｎＭ、約１００から約１０００ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１００ｎＭ又は約２００ｎＭであり得るように変動し得る。
【００６９】
９０％メタノール、１０％エチレングリコール及び（１００ｍＭ硫酸亜鉛などの）硫酸亜鉛などの溶媒と少なくとも１種類の塩の組合せを含む、診断アッセイに用いられるアッセイ抽出緩衝剤を使用して、対象の治療の一部としてかかる免疫抑制剤を投与された対象から得られた全血試験試料中に含まれる血清タンパク質からタクロリムスを抽出することができる。続いて、全血試験試料からタクロリムスを抽出するのに用いられたアッセイ抽出緩衝剤は、抗体などの検出試薬に遭遇する前に、希釈される。希釈にもかかわらず、ある量の抽出緩衝剤（例えば、１０％メタノール）は試験試料中にまだ存在し（又は残留し）、上記対象におけるタクロリムスの血中濃度をモニターする診断免疫測定法に用いられる抗体のＫＤを増加させ、機能活性を低下させ、又はＫＤを増加させ、かつ機能活性を低下させることが知られている。当業者は、これらの有機溶媒を含むかかる抽出緩衝剤が、かかる診断免疫測定法用に開発される将来の抗体のＫＤを増加させる（したがって、ｋａを減少させ、ｋｄを増加させる）可能性があり、機能活性を低下させる可能性があり、又はＫＤを増加させ、かつ機能活性を低下させる可能性があると予想することができる。したがって、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールを含む選択希釈剤などの選択希釈剤を使用して、試験する抗体のＫＤを増加させる可能性があり、機能活性を低下させる可能性があり、又はＫＤを増加させ、かつ機能活性を低下させる可能性がある診断免疫測定法の反応条件を模倣、近似又はシミュレートすることができる。
【００７０】
更に別の例として、１種類以上の結合競合剤を含む選択希釈剤を使用して、目的エピトープとの結合を１個又は他の分子と競合することができ、又は１個以上の他の分子の結合を妨害して、試験試料中の目的エピトープに結合することができる。具体的には、１種類以上の結合競合剤を含む選択希釈剤は、目的分析物と試験試料の別の成分との結合を置換又は阻止することによって、試験試料の状態を変え得る。或いは、１種類以上の結合競合剤を含む選択希釈剤は、目的分析物に対してより高い特異性を有する（標識抗体などの）検出試薬を試験及び／又は単離するために、使用することができる。例えば、１種類以上の結合競合剤を含む選択希釈剤を使用して、１種類以上の結合競合剤に対して抗体が有する交差反応性の程度を求めることができ、又は１種類以上の結合競合剤との交差反応性が改善された（すなわち低下した）抗体を単離する条件を与えることができる。これらの趣旨に沿って、本発明は、とりわけ、そのそれぞれの主要な代謝産物（例えば、Ｍ−Ｉ、Ｍ−ＩＩ、Ｍ−ＩＩＩ、Ｍ１、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１７、Ｍ１８及びＭ２１）の１種類以上の存在下で活性親薬物（例えば、シクロスポリン又はタクロリムス）の抗体認識を改善する。
【００７１】
使用可能な緩衝剤の例としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩緩衝剤又はこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７２】
使用可能な塩の例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛又はこれらの組合せである。
【００７３】
使用可能な洗浄剤の例としては、陰イオン洗浄剤、陽イオン洗浄剤、非イオン洗浄剤又は双性イオン洗浄剤が挙げられるが、これらだけに限定されない。１種類以上の洗浄剤を含む選択希釈剤を使用して、試験試料などの試料に含まれるタンパク質又は他の目的分析物を安定化及び／又は可溶化し、診断免疫測定法の過程において非特異的結合を阻止し、試料に含まれる細胞を破壊することができる。陰イオン洗浄剤としては、ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩、コール酸、デヒドロコール酸、ジギトニン、ジギトキシゲニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、ドクサートナトリウム塩、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物、グリココール酸ナトリウム塩水和物、グリコデオキシコール酸一水和物、グリコリトコール酸３硫酸二ナトリウム塩、グリコリトコール酸エチルエステル、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン溶液、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール溶液、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、１−ブタンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、無水１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−ノナンスルホン酸ナトリウム、１−プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム水和物、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム一水和物、ドデシル硫酸ナトリウム、無水ヘキサンスルホン酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、無水ペンタンスルホン酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩一水和物、タウロデオキシコール酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸３−硫酸二ナトリウム塩、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、ウルソデオキシコール酸又はこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩから入手可能である。
【００７４】
陽イオン洗浄剤としては、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、ベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨーダート、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、ジラール試薬Ｔ、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム又はこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩから入手可能である。
【００７５】
非イオン洗浄剤としては、ＢｉｇＣＨＡＰ、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ｎ−デシルα−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ−１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアラート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、サポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、Ｔｅｒｉｇｏｌ、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−２１、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−３２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１６、Ｔｒｉｔｏｎ  ＧＲ−５Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−４４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５又はこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩから入手可能である。
【００７６】
双性イオン洗浄剤としては、ＣＨＡＰＳ、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート又はこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩから入手可能である。
【００７７】
使用可能な溶媒の例は、有機溶媒である。使用可能な有機溶媒の例としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、メタノール、エタノール又はこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。好ましい溶媒は、抗体など、ただしこれだけに限定されない検出試薬と一緒にインキュベートする前に、１０％に希釈することができる９０％メタノールである。
【００７８】
本明細書では「特異的結合パートナー」という用語は、特異的結合対のメンバーを意味する。特異的結合対のメンバーは、他方の分子の構造に相補的である少なくとも１つの構造を各々が有する少なくとも２種類の分子を含む。少なくとも２種類の分子は、相補的構造の結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）によって結合し得る。分子という用語は、例えば、Ａｐｏ酵素と補酵素からなる酵素、複数のサブユニットからなるタンパク質、タンパク質と脂質からなるリポタンパク質などの分子複合体も含む。特異的結合パートナーは、天然物質であり得、又は例えば、化学合成、微生物学的技術及び／又は遺伝子操作方法によって調製されている。特異的結合パートナーの例としては、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、リプレッサー、オリゴ−及びポリヌクレオチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃｌｑ、核酸結合タンパク質などが挙げられるが、これらだけに限定されない。特異的結合対としては、抗体−抗原、抗体−ハプテン、オペレーター−リプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビジン、レクチン−多糖、ステロイド−ステロイド結合タンパク質、薬物−薬物受容体、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡ、相補的オリゴ又はポリヌクレオチドなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７９】
本明細書では「厳密な条件」という用語は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（「ＳＳＣ」）中で、フィルターに結合したＤＮＡとの約４５℃におけるハイブリダイゼーションと、それに続く約５０−６５℃における０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる１回以上の洗浄を指す。「極めて厳密な条件下」という用語は、フィルターに結合した核酸との６×ＳＳＣ中での約４５℃におけるハイブリダイゼーションと、それに続く約６８℃における０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳによる１回以上の洗浄、又は当業者に公知である他の厳密なハイブリダイゼーション条件下を指す（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ６．３．１−６．３．６  ａｎｄ  ２．１０．３参照）。
【００８０】
本明細書では「対象」と「患者」という用語は、区別なく使用される。本明細書では「対象」及び「複数の対象」という用語は、動物、一態様においては、トリ（例えば、アヒル又はガチョウ）、別の態様においては、サメ又はクジラ、更に別の態様においては、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）及び霊長類（例えば、カニクイザルなどのサル、チンパンジー及びヒト）を含めたほ乳動物を指す。
【００８１】
本明細書では「試験試料」という用語は、（目的抗体、目的抗原などの）分析物の出所である対象の体の構成要素を指す。これらの構成要素は、当分野で周知である。例えば、試験試料は、対象の血清、血しょう、全血、リンパ、ＣＮＳ液、尿又は他の体液に由来する任意の生物試料であり得る。試験試料は、当業者に公知である定常的な技術を用いて調製することができる。
【００８２】
ＩＩ．  本発明の抗体
本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに免疫特異的に結合する抗体を提供する。より詳細には、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤に対して高い結合親和性を有する抗体を与える。一態様においては、本明細書に記載の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに免疫特異的に結合し、（Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎから入手可能な）（本明細書では「野生型」とも称する）マウスハイブリドーマ細胞系１−６０−４６によって産生される抗体のＫＤ又はｋｄと比較して、その平衡解離定数（ＫＤ）又は分離速度定数（ｋｄ又はｋｏｆｆ）が、少なくとも１．１倍の改善、少なくとも２倍の改善、少なくとも３倍の改善、少なくとも４倍の改善、少なくとも５倍の改善、少なくとも６倍の改善、少なくとも７倍の改善、少なくとも８倍の改善、少なくとも９倍の改善、少なくとも１０倍の改善、少なくとも１１倍の改善、少なくとも１２倍の改善、少なくとも１３倍の改善、少なくとも１４倍の改善、少なくとも１５倍の改善、少なくとも１６倍の改善、少なくとも１７倍の改善、少なくとも１８倍の改善、少なくとも１９倍の改善、又は少なくとも２０倍の改善を示し得る。ＫＤ又はｋｄの上記倍数の改善は、前記抗体が、（少なくとも１種類の溶媒など、ただしこれだけに限定されない）少なくとも１種類の選択希釈剤に（診断免疫測定法などにおいて）曝露されなかったとき、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったときに、示され得る。さらに、これらの抗体は、免疫グロブリンとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤に１．９×１０−１１Ｍ未満のＫＤで結合する。好ましくは、これらの抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤に１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１３ＭのＫＤで結合する。より好ましくは、これらの抗体は、１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤを示す。さらに、これらの抗体は、ｓｃＦｖとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤に１．３×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで結合する。好ましくは、これらの抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤に１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで結合する。より好ましくは、これらの抗体は、１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを示す。
【００８３】
上記抗体が、（少なくとも１種類の選択希釈剤など、ただしこれだけに限定されない）少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されるとき（診断免疫測定前、測定中など。少なくとも１種類の選択希釈剤に抗体を曝露するタイミングは重要ではない。）、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるとき、これらの抗体は、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露した後、又は該選択希釈剤と一緒に野生型をインキュベートした後の野生型のＫＤ又はｋｄと比較して、そのＫＤ又はｋｄが少なくとも１．１倍の改善、少なくとも２倍の改善、少なくとも３倍の改善、少なくとも４倍の改善、少なくとも５倍の改善、少なくとも６倍の改善、少なくとも７倍の改善、少なくとも８倍の改善、少なくとも９倍の改善、少なくとも１０倍の改善、少なくとも１１倍の改善、少なくとも１２倍の改善、少なくとも１３倍の改善、少なくとも１４倍の改善、少なくとも１５倍の改善、少なくとも１６倍の改善、少なくとも１７倍の改善、少なくとも１８倍の改善、少なくとも１９倍の改善、又は少なくとも２０倍の改善を示し得る。さらに、これらの抗体は、免疫グロブリンとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤に１．５２×１０−１０Ｍ未満のＫＤで結合する。好ましくは、これらの抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤に１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤで結合する。より好ましくは、これらの抗体は、１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１１ＭのＫＤを有する。さらに、これらの抗体は、ｓｃＦｖとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤に９．３８×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで結合する。好ましくは、これらの抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤に９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで結合する。より好ましくは、これらの抗体は、９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを示す。
【００８４】
更に別の態様においては、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（以下「ＣＨＯ」）細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体を提供する。これらの細胞系の各々によって産生される抗体は、タクロリムス上の少なくとも１種類のエピトープに免疫特異的に結合する。より具体的には、これらの細胞系の各々によって産生される抗体は、該抗体が、（少なくとも１種類の溶媒など、ただしこれだけに限定されない）少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されていないとき（診断免疫測定前、測定中など）、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされていないとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、タクロリムス上の少なくとも１種類のエピトープに１．９×１０−１１Ｍ未満のＫＤで結合する。好ましくは、これらの抗体は１．２×１０−１２ＭのＫＤを示す。しかし、前記抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露される場合（診断免疫測定前、測定中など）、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされる場合、該抗体は、タクロリムス上の少なくとも１種類のエピトープに１．５２×１０−１０Ｍ未満のＫＤで免疫特異的に結合する。好ましくは、これらの抗体は、１０％メタノール中で１．３×１０−１１ＭのＫＤを示す。さらに、本発明は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７から抽出された核酸（ＤＮＡ）から作製される抗体も企図する。また、本発明は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生されるキメラ抗体又はその結合断片にも関する。
【００８５】
別の態様においては、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系１−６０−４６によって産生される抗体の誘導体又は変種である。より具体的には、本発明者らは、抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されたかどうか、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされたかどうかにかかわらず、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに対して高い結合親和性を示す、ハイブリドーマ細胞系１−６０−４６によって産生される抗体の誘導体又は変種である抗体を製造できることを発見した。より具体的には、本発明の抗体は、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されないとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされないとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、免疫グロブリンとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに１．９×１０−１１Ｍ未満のＫＤで、好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１３ＭのＫＤで、より好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤで結合する。ｓｃＦｖとして、本発明の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに１．３×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで、好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで、より好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄで結合する。
【００８６】
これに対し、これらの抗体が、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されるとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときには、これらの抗体は、免疫グロブリンとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに１．５２×１０−１０Ｍ未満のＫＤで、好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤで、より好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１１ＭのＫＤで結合する。ｓｃＦｖとして、本発明の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに９．３８×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで、好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで、より好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄで結合する。本発明の誘導抗体又は変種抗体は、野生型によって産生される抗体のアミノ酸配列と比較したときに、重鎖相補性決定（「ＣＤＲ」）領域の少なくとも１つ（例えば、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び／又は重鎖ＣＤＲ３）における（少なくとも１つの欠失、付加、置換又はこれらの任意の組合せなどの）少なくとも１つの変異、軽鎖ＣＤＲ領域（例えば、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３）における（少なくとも１つの欠失、付加、置換又はこれらの任意の組合せなどの）少なくとも１つの変異、又は重鎖ＣＤＲ領域の少なくとも１つにおける（少なくとも１つの欠失、付加、置換又はこれらの任意の組合せなどの）少なくとも１つの変異と軽鎖ＣＤＲ領域の少なくとも１つにおける少なくとも１つの変異とを含み得る。さらに、本発明の抗体は、抗体の枠組み領域（「ＦＲ」）など、ただしこれだけに限定されない、ＣＤＲ以外の抗体の一部又は部分における（少なくとも１つの欠失、付加、置換又はこれらの任意の組合せなどの）１つ以上の他の変異も含み得る。かかる誘導体を作製する方法は、当分野で周知であり、部位特異的変異誘発、及びＰＣＲ媒介変異誘発の使用を含む。これについては、後により詳細に考察する。
【００８７】
より具体的には、別の態様においては、本発明の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合し、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｐｈｅ（配列番号３３）の式のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む。
【００８８】
式中、Ｘａａ１は、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択され、
Ｘａａ２は、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択され、
Ｘａａ３は、トレオニン（Ｔｈｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択され、
ただし、Ｘａａ２がチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｘａａ３がトレオニン（Ｔｈｒ）であるときには、Ｘａａ１はトレオニン（Ｔｈｒ）以外である。
【００８９】
更に別の態様においては、本発明の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合し、配列番号１５、１６、１７又は１８で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む。別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体であって、配列番号１５、１６、１７又は１８のアミノ酸配列と少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗体に関する。
【００９０】
更に別の態様においては、本発明の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合し、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号３４）の式のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む。
【００９１】
式中、Ｘａａ４は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ５は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ６は、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群から選択され、
ただし、Ｘａａ５がセリン（Ｓｅｒ）であり、Ｘａａ６がイソロイシン（Ｉｌｅ）であるときには、Ｘａａ４はグルタミン（Ｇｌｎ）以外である。
【００９２】
更に別の態様においては、抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合し、配列番号１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む。別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体であって、配列番号１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列と少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗体に関する。
【００９３】
更に別の態様においては、本発明の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合し、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３５）の式のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００９４】
式中、Ｘａａ７は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ８は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
Ｘａａ９は、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
ただし、Ｘａａ８がヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、Ｘａａ９がバリン（Ｖａｌ）であるときには、Ｘａａ７はセリン（Ｓｅｒ）以外である。
【００９５】
更に別の態様においては、抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合し、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００９６】
別の態様においては、本発明は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２のアミノ酸配列と少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体に関する。
【００９７】
更に別の態様においては、本発明の抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合し、以下のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽可変ＣＤＲ３を有する。
【００９８】
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｐｈｅ（配列番号３３）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ１は、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択され、
Ｘａａ２は、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択され、
Ｘａａ３は、トレオニン（Ｔｈｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。）、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号３４）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ４は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ５は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ６は、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群から選択される。）、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号１１）の式のアミノ酸配列を有し、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３５）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ７は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ８は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
Ｘａａ９は、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択される。）、
ただし、重鎖ＣＤＲ２においてＸａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、軽鎖ＣＤＲ１においてＸａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅである場合、軽鎖ＣＤＲ３においてＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓである場合にはＸａａ９はＶａｌ以外であり、又はＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ８はＨｉｓ以外であり、又はＸａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ７はＳｅｒ以外である。
【００９９】
好ましくは、上記各式の各抗体は、上記各式中のＸａａ１−Ｘａａ８が下記表Ａに示すアミノ酸残基を有する、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１００】
【表１】
2009534466.tif 000003
【０１０１】
ＩＩＩ．  核酸分子
本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する本発明の抗体をコードする、一般に単離された、１種類以上の核酸分子を規定する。一態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合する抗体であって、野生型によって産生される抗体と比較したときにそのＫＤ又はｋｄが少なくとも１．１倍の改善、少なくとも２倍の改善、少なくとも３倍の改善、少なくとも４倍の改善、少なくとも５倍の改善、少なくとも６倍の改善、少なくとも７倍の改善、少なくとも８倍の改善、少なくとも９倍の改善、少なくとも１０倍の改善、少なくとも１１倍の改善、少なくとも１２倍の改善、少なくとも１３倍の改善、少なくとも１４倍の改善、少なくとも１５倍の改善、少なくとも１６倍の改善、少なくとも１７倍の改善、少なくとも１８倍の改善、少なくとも１９倍の改善、又は少なくとも２０倍の改善を示し得る抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明は、本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。ＫＤ又はｋｄの上記倍数の改善は、前記抗体が、（少なくとも１種類の溶媒など、ただしこれだけに限定されない）少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されなかったとき（診断免疫測定前、測定中など）、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったときに、示され得る。
【０１０２】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤と一緒に、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合する抗体であって、「野生型」によって産生される抗体と比較したときにそのＫＤ又はｋｄが少なくとも１．１倍の改善、少なくとも２倍の改善、少なくとも３倍の改善、少なくとも４倍の改善、少なくとも５倍の改善、少なくとも６倍の改善、少なくとも７倍の改善、少なくとも８倍の改善、少なくとも９倍の改善、少なくとも１０倍の改善、少なくとも１１倍の改善、少なくとも１２倍の改善、少なくとも１３倍の改善、少なくとも１４倍の改善、少なくとも１５倍の改善、少なくとも１６倍の改善、少なくとも１７倍の改善、少なくとも１８倍の改善、少なくとも１９倍の改善、又は少なくとも２０倍の改善を示し得る抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明は、本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。平衡解離定数の上記倍数の改善は、前記抗体が、（少なくとも１種類の溶媒など、ただしこれだけに限定されない）少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露された、若しくはされるとき（診断免疫測定前、測定中など）、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートされた、若しくはされるときに、示され得る。
【０１０３】
更に別の態様においては、本発明は、免疫グロブリンとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体であって、１．９×１０−１１Ｍ未満のＫＤ、好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１３ＭのＫＤ、より好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤを有する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明は、さらに、ｓｃＦｖとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体であって、１．３×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄ、好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄ、より好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを有する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明は、本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。上記ＫＤ又はｋｄ値は、前記抗体が、（少なくとも１種類の溶媒など、ただしこれだけに限定されない）少なくとも１種類の選択希釈剤に（診断免疫測定法などにおいて）曝露されなかったとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、示される。
【０１０４】
更に別の態様においては、本発明は、免疫グロブリンとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体であって、１．５２×１０−１０Ｍ未満のＫＤ、好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤ、より好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１１ＭのＫＤを有する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明は、さらに、ｓｃＦｖとして、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体であって、９．３８×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄ、好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄ、より好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを有する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明は、本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。上記ＫＤ又はｋｄ値は、前記抗体が、（少なくとも１種類の溶媒など、ただしこれだけに限定されない）少なくとも１種類の選択希釈剤に（診断免疫測定法などにおいて）曝露された、若しくはされるとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされた、若しくはされるとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、示される。
【０１０５】
更に別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記核酸分子は、ＣＨＯ細胞１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体のポリヌクレオチド配列を含む。本発明は、本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１０６】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。ここで、前記抗体は、マウスハイブリドーマ細胞系１−６０−４６によって産生される抗体の誘導体又は変種を含む。上で考察したように、本発明者らは、抗体が、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されないとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされないとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、免疫グロブリンとして、１．９×１０−１１Ｍ未満のＫＤで、好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１３ＭのＫＤで、より好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤで、又はｓｃＦｖとして、１．３×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで、好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで、より好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄで、特異的に高結合親和性を示す、マウスハイブリドーマ細胞系１−６０−４６によって産生される抗体の誘導体又は変種である抗体が生成され得ることを発見した。これに対し、これらの抗体が、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されるとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるとき、これらの抗体は、免疫グロブリンとして、１．５２×１０−１０Ｍ未満のＫＤで、好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤで、より好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１１ＭのＫＤで、又はｓｃＦｖとして、９．３８×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで、好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで、より好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄで、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合する。
【０１０７】
本発明の誘導抗体又は変種抗体は、野生型によって産生される抗体のアミノ酸配列と比較したときに、重鎖ＣＤＲ領域の少なくとも１つ（例えば、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２又は重鎖ＣＤＲ３）における（少なくとも１つの欠失、付加、置換又はこれらの任意の組合せなどの）少なくとも１つの変異、軽鎖ＣＤＲ領域（例えば、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２又は軽鎖ＣＤＲ３）における（少なくとも１つの欠失、付加、置換又はこれらの任意の組合せなどの）少なくとも１つの変異、又は重鎖ＣＤＲ領域の少なくとも１つにおける少なくとも１つの変異と軽鎖ＣＤＲ領域の少なくとも１つにおける少なくとも１つの変異とを含む。例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発を含めて、当業者に公知の標準技術を使用して、本発明の抗体をコードする核酸分子に（少なくとも１つの欠失、付加、置換又はこれらの任意の組合せなどの）変異を導入することができる。一態様においては、誘導体は、野生型によって産生される最初の抗体に比べて、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、又は７個未満のアミノ酸置換を含む。一態様においては、誘導体は、１個以上の予測される非必須アミノ酸残基（すなわち、抗体が少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに免疫特異的に結合するのに重要ではないアミノ酸残基）においてなされる保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、電荷の類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。電荷の類似した側鎖を有するアミノ酸残基の系列は、当分野で定義されている。これらの系列としては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。或いは、飽和変異誘発などによって、コード配列の全部又は一部に沿って変異を無作為に導入することができ、得られる変異体を生物活性についてスクリーニングして、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープとの高い結合親和性を示す変異体を特定することができる。変異誘発後、コードされた抗体を発現させることができ、抗体の活性を求めることができる。
【０１０８】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｐｈｅ（配列番号３３）の式のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２の式のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を有する。
【０１０９】
式中、Ｘａａ１は、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択され、
Ｘａａ２は、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択され、
Ｘａａ３は、トレオニン（Ｔｈｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択され、
ただし、Ｘａａ２がチロシン（Ｔｙｒ）であり、Ｘａａ３がトレオニン（Ｔｈｒ）であるときには、Ｘａａ１はトレオニン（Ｔｈｒ）以外である。
【０１１０】
本発明は、上記アミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を有する抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１１１】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、配列番号１５、１６、１７又は１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む（又は、からなる）。本発明は、配列番号１５、１６、１７又は１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１１２】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号３４）の式のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を有する。
【０１１３】
式中、Ｘａａ４は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ５は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ６は、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群から選択される、
ただし、Ｘａａ５がセリン（Ｓｅｒ）であり、Ｘａａ６がイソロイシン（Ｉｌｅ）であるときには、Ｘａａ４はグルタミン（Ｇｌｎ）以外である。
【０１１４】
本発明は、上記アミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を有する抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１１５】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、配列番号１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む（又は、からなる）。本発明は、配列番号１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１１６】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３５）の式のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【０１１７】
式中、Ｘａａ７は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ８は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
Ｘａａ９は、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
ただし、Ｘａａ８がヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、Ｘａａ９がバリン（Ｖａｌ）であるときには、Ｘａａ７はセリン（Ｓｅｒ）以外である。
【０１１８】
本発明は、上記アミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１１９】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む（又は、からなる）。本発明は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１２０】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、配列番号１５、１６、１７若しくは１８のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９、２０、２１若しくは２２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１若しくは３２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３、又はこれらのアミノ酸配列の任意の組合せを含む（又は、からなる）。本発明は、配列番号１５、１６、１７若しくは１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９、２０、２１若しくは２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１若しくは３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、又はこれらのアミノ酸配列の任意の組合せを含む抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１２１】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、以下のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽可変ＣＤＲ３を有する。
【０１２２】
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｐｈｅ（配列番号３３）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ１は、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択され、
Ｘａａ２は、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択され、
Ｘａａ３は、トレオニン（Ｔｈｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。）、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号３４）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ４は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アラニン（Ａｌａ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ５は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ６は、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群から選択される。）、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（配列番号１１）の式のアミノ酸配列を有し、
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３５）の式のアミノ酸配列を有し
（式中、Ｘａａ７は、セリン（Ｓｅｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）からなる群から選択され、
Ｘａａ８は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
Ｘａａ９は、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）及びセリン（Ｓｅｒ）からなる群から選択され、
ただし、重鎖ＣＤＲ２においてＸａａ１がＴｈｒであり、Ｘａａ２がＴｙｒであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、軽鎖ＣＤＲ１においてＸａａ４がＧｌｎであり、Ｘａａ５がＳｅｒであり、Ｘａａ６がＩｌｅである場合、軽鎖ＣＤＲ３においてＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ８がＨｉｓである場合にはＸａａ９はＶａｌ以外であり、又はＸａａ７がＳｅｒであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ８はＨｉｓ以外であり、又はＸａａ８がＨｉｓであり、Ｘａａ９がＶａｌである場合にはＸａａ７はＳｅｒ以外である。
【０１２３】
本発明は、上記アミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、重鎖ＣＤＲ３領域、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域及び軽鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体をコードする本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
【０１２４】
さらに、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子も提供する。前記抗体は、上記配列を有する、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含み、Ｘａａ１−Ｘａａ８は、上記表Ａに示すアミノ酸残基を有する。本発明は、本明細書に記載の核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。核酸分子は、上記アミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、重鎖ＣＤＲ３領域、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域及び軽鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体をコードし、Ｘａａ１−Ｘａａ８は、表Ａに示すアミノ酸残基を有する。
【０１２５】
更に別の態様においては、本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。前記抗体は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される。本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体をコードする核酸分子と厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。前記抗体は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  Ｍ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される。
【０１２６】
ＩＶ．  本発明の抗体の調製方法
本発明の抗体は、当業者に公知である定常的な技術を用いて調製することができる。
【０１２７】
一態様においては、本発明の抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。抗体を組換え発現させるために、軽鎖及び重鎖が宿主細胞中で発現され、好ましくは、宿主細胞を培養する培地中に分泌され、この培地から抗体を回収することができるように、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を有する１個以上の組換え発現ベクターを宿主細胞に移入する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （ｅｄｓ），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９８９）及び米国特許第４，８１６，３９７号に記載の方法などの標準組換え核酸（ＤＮＡ）方法を使用して、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み入れ、ベクターを宿主細胞に導入する。
【０１２８】
本発明の抗体を発現させるために、軽鎖及び重鎖領域をコードする核酸分子を最初に得る。これらの核酸分子は、抗体１−６０−４６を発現するマウスハイブリドーマ細胞系から得ることができ、（部位特異的変異誘発などの）当分野で周知の手段によって改変して、例えば、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体を含めて、本発明の抗体を生成することができる。抗体１−６０−４６を発現するマウスハイブリドーマ細胞系は、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎから入手可能である。抗体１−６０−４６のＶＨ及びＶＬ遺伝子の核酸配列を図２並びに配列番号４３及び４５に示す。
【０１２９】
例えば、１−６０−４６可変重（ＶＨ）及び可変（ＶＬ）核酸断片を得た後、これらの配列、又はＣＤＲなどのこれらの配列内の特定の領域を変異させて、本明細書に開示するＡＭ２又はＡＭ２関連（図６−７及び１０参照）アミノ酸配列をコードすることができる。１−６０−４６  ＶＨ及びＶＬ  ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をＡＭ２又はＡＭ２関連配列と比較して、ＡＭ２関連配列中の異なるアミノ酸残基を特定する。起こすべきヌクレオチド変化を決定する遺伝コードを用いて、変異配列が、ＡＭ２又はＡＭ２関連アミノ酸配列をコードするように、抗体１−６０−４６の適切なヌクレオチドを変異させる。（ＰＣＲ産物が変異を含むように、変異核酸がＰＣＲプライマー中に組み入れられる）ＰＣＲ媒介変異誘発、部位特異的変異誘発などの標準方法によって、１−６０−４６配列の変異誘発を実施することができる。
【０１３０】
或いは、別の態様においては、化学合成装置を用いて、当業者に公知である定常的な技術によって、ＶＨ及びＶＬ鎖をコードする核酸分子を合成することができる。例えば、セクションＩＩＩに記載の核酸分子由来のＶＨ及びＶＬ鎖を、当分野で公知の定常的な技術によって化学合成することができる。担体に結合した３’末端塩基から出発して、ヌクレオチドを段階的に結合させる。５’末端（ｍｏｓｔ  ５’）ヌクレオチドの付加後、ヌクレオチドを固体担体から切り離し、脱塩、続いてポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＰＡＧＥ」）（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ）によって精製する。
【０１３１】
（上述したようにＶＨ及びＶＬ遺伝子の増幅及び変異誘発によって）ＡＭ２又はＡＭ２関連ＶＨ及びＶＬセグメントをコードする核酸断片を得た後、これらの核酸断片を標準組換えＤＮＡ技術によって更に操作して、例えば、可変領域遺伝子を（完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子など、ただしこれらだけに限定されない）抗体に転化することができる。これらの操作においては、ＶＬ又はＶＨをコードする核酸断片を、抗体定常領域、柔軟なリンカーなど、別のタンパク質をコードする別の核酸断片に作用可能に連結する。本明細書では「作用可能に連結する」という用語は、２個の核酸断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２個の核酸断片を連結することを意味するものとする。
【０１３２】
別法では、ｓｃＦｖ遺伝子を（抗体１−６０−４６のＣＤＲ領域などの）野生型ＣＤＲ領域を用いて構築し、次いで当分野で公知の技術を用いて変異させることができる。
【０１３３】
ＶＨ領域をコードする単離核酸分子は、ＶＨをコードする核酸分子を重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別の核酸分子に作用可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に転化することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知である（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）参照）。別の態様においては、本発明は、ヒト重鎖定常領域のすべての公知アロタイプを含めて、ただしこれらだけに限定されない、すべての公知ヒト重鎖定常領域を更に包含する。これらの領域を包含する核酸断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得る。
【０１３４】
ＶＬ領域をコードする単離核酸分子は、ＶＬをコードする核酸分子を軽鎖定常領域ＣＬをコードする別の核酸分子に作用可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に転化することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知である（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）参照）。本発明は、ヒト軽鎖定常領域のすべての公知アロタイプを含めて、ただしこれらだけに限定されない、すべての公知ヒト軽鎖定常領域を包含する。これらの領域を包含する核酸断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。
【０１３５】
特定の重鎖又は軽鎖領域内のＦＲ及びＣＤＲ領域の具体的名称は、かかる領域を識別するのに用いられる慣行又は付番方式に応じて変わり得ることを理解されたい（例えば、すべて当業者に公知である、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。本発明では、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ付番方式を用いる。
【０１３６】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードする核酸断片を、アミノ酸配列ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号３６）によってコードされるリンカーなどの柔軟なリンカーをコードする別の断片に作用可能に連結する。本発明に使用可能な他のリンカー配列の例は、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載されている。
【０１３７】
本発明の抗体又は抗体部分を発現させるために、上述したように得られた部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作用可能に連結されるように発現ベクターに挿入する。本明細書では「作用可能に連結する」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する所期の機能を果たすように、抗体遺伝子をベクターに連結することを意味するものとする。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子は別個のベクターに挿入することができ、又はより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子を発現ベクターに標準方法（例えば、抗体遺伝子断片上とベクター上の各相補的制限酵素切断部位の連結、又は制限酵素切断部位がない場合には平滑末端連結）によって挿入する。軽鎖又は重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは抗体定常領域配列を既に有し得る。例えば、ＶＨ及びＶＬ配列を完全長抗体遺伝子に転化する一手法は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨ「セグメント」に作用可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作用可能に連結されるように、それぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターにこれらの配列を挿入することである。これに加えて、又はこれとは別に、組換え発現ベクターは、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローン化することができる。単一のペプチドは、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）シグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１３８】
抗体鎖遺伝子に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中で抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を有し得る。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現調節要素（例えば、ポリアデニレーションシグナル）を含むものとする。かかる制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。制御配列の選択を含めて、発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因によって左右され得ることを当業者は理解されたい。ほ乳動物宿主細胞発現用の好ましい制御配列としては、（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなどの）サイトメガロウイルス（以下「ＣＭＶ」）、（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなどの）シミアンウイルス４０（以下「ＳＶ４０」）、（アデノウイルス主要後期プロモーター（「ＡｄＭＬＰ」）などの）アデノウイルス及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなど、ほ乳動物細胞中で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス要素などが挙げられる。ウイルス調節エレメント及びその配列の更なる記述については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，５１０，２４５号及び米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０１３９】
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中でベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）、選択マーカー遺伝子などの追加の配列を含み得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同４，６３４，６６５号及び同５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、メトトレキサート選択／増幅を用いたｄｈｆｒ−宿主細胞用ジヒドロ葉酸還元酵素（以下「ＤＨＦＲ」）遺伝子、Ｇ４１８選択用ネオマイシン（以下「ｎｅｏ」）遺伝子などが挙げられる。
【０１４０】
軽鎖及び重鎖の発現の場合、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術によって宿主細胞に移入する。「移入」という用語の多様な形態は、外因性ＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に導入するのに一般に使用される多種多様な技術、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン移入などを包含するものとする。原核生物宿主細胞でも真核生物宿主細胞でも本発明の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞、最も好ましくはほ乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。というのは、かかる真核細胞、特にほ乳動物細胞は、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体を高収率で産生するには効果的でないことが報告された（Ｂｏｓｓ，  Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，  Ｃ．Ｒ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３（１９８５）参照）。
【０１４１】
本発明の組換え抗体を発現するのに好ましいほ乳動物宿主細胞としては、（例えば、Ｒ．Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．  Ｓｈａｒｐ，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６０１−６２１（１９８２）に記載のＤＨＦＲ選択可能マーカーと併用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０（１９８０）に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含めた）ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＳＰ２細胞などが挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターをほ乳動物宿主細胞に導入するときには、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現に十分な期間、より好ましくは宿主細胞が成長する培地中に抗体を分泌するのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準タンパク質精製法によって培地から回収することができる。
【０１４２】
宿主細胞は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ分子など、完全抗体の一部を産生するのにも使用することができる。上記手順の変形手順も本発明の範囲内であることを理解されたい。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖（ただし、両方ではない。）をコードする核酸分子を宿主細胞に移入することが望ましい場合もある。組換えＤＮＡ技術を使用して、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合するのに不要である軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードする核酸分子の一部又は全部を除去することもできる。かかる切断型核酸分子から発現される分子も本発明の抗体に包含される。
【０１４３】
本発明の抗体又はその抗原結合部の組換え発現の好ましい系においては、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リポソームによって媒介される移入によってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子は、高レベルの遺伝子転写をもたらすＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに各々作用可能に連結される。組換え発現ベクターは、ベクターが移入されたＣＨＯ細胞を選択することができるＤＨＦＲ遺伝子も有する。ヒポキサンチンとチミジンを含まない培地中で細胞を培養して、移入ベクターからＤＨＦＲ遺伝子を獲得したＣＨＯ細胞を得た。抗原特異的スクリーニング法を用いて、最大量の抗体を発現するクローンを特定した。個々のクローンを拡大し、常法に従って再スクリーニングした。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７及びタクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７の２つの細胞系を、更なる特性評価用に選択した。選択した形質転換宿主細胞を培養して、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、完全抗体を培地から回収する。標準分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培地から回収する。
【０１４４】
上記（ｆｏｒｇｏｉｎｇ）を考慮して、本発明の別の態様は、本発明の抗体及び抗体部分の組換え発現に使用することができる核酸、ベクター及び宿主細胞組成物に関する。ＡＭ２及びその変種の重鎖ＣＤＲ２領域をコードするアミノ酸配列は、配列番号１６で示される。ＡＭ２軽鎖ＣＤＲ１領域をコードするアミノ酸配列は、配列番号２２で示される。ＡＭ２軽鎖ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列は、配列番号２３で示される。
【０１４５】
Ｖ．  組換え抗体の選択
本明細書に開示するＡＭ２又はＡＭ２関連抗体を含めて、本発明の抗体は、コンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。コンビナトリアル抗体ライブラリーは、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソーム／ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、インビトロ区画化など、ただしこれらだけに限定されない当分野で公知のバイオディスプレイ技術を用いて調製することができる。例えば、コンビナトリアル抗体ライブラリーは、ネズミ、キメラ、ヒト化又はヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを用いて調製される、ｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリーなどの組換えコンビナトリアルライブラリーである。かかるライブラリーの調製及びスクリーニング方法は当分野で公知である。（ｐＹＤ１ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａなどの）酵母ディスプレイライブラリー作製用市販ベクターに加えて、抗体ディスプレイライブラリーの作製及びスクリーニング用に特に適した方法及び試薬の例は、例えば、Ｂｏｄｅｒ  Ｅ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．，  Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｆｆｉｎｉｔｙ，  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ３２８：４３０−４４（２０００）、Ｂｏｄｅｒ  Ｅ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．，  Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（６）：５５３−７（Ｊｕｎｅ  １９９７）及びＨａｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｈａｗｌｅｙ，  ｅｄｓ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  ｐａｇｅｓ  ３１１−３３２（２００４）に記載されている。
【０１４６】
好ましい実施形態においては、本明細書のセクションＩＩに記載の抗体のいずれかなどの高結合親和性抗体を単離するために、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに免疫特異的に結合することが知られている抗体をまず使用して、酵母（好ましくは、サッカロミセス  セレビシエ）の表面でｓｃＦｖとして発現されるネズミ重鎖及び軽鎖配列を作製する。（ハイブリドーマ細胞系１−６０−４６によって産生される抗体などの）これらの抗体ｓｃＦｖを分析して、これらの抗体の分離速度定数（すなわち、ｋｏｆｆ又はｋｄ）を求める。次いで、かかる構築体を、好ましくは（以下「ｂｔ−ｔａｃｒｏ」と記述する）ビオチン化タクロリムス抗原を用いて、スクリーニングする。次いで、分離速度定数データを平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）対時間（秒）としてプロットすることができる。一次減衰式（ｄｅｃａｙ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）によって、データを適合させることができる。使用可能なかかる式の例は、
ｙ＝ｍ１＊ｅｘｐ（−ｍ２＊Ｍ０）＋ｍ３
である。式中、ｍ１は、ゼロ時における最大蛍光であり（＊＝掛け算及びｅｘｐ＝指数）、
ｍ２は解離速度定数であり（ｏｆｆ速度を求める式は当業者に周知である。）、
Ｍ０は時間ｘであり（ｘは、測定した時間である。）、
ｍ３は系から発生するバックグラウンドである。
【０１４７】
解離速度定数データを使用して、解離速度が改善された本発明の抗体を変異原ライブラリーから特定することができる。
【０１４８】
好ましいＶＨ／ＶＬ対のＶＨ及びＶＬセグメントは、好ましくは自然免疫応答（ｎａｔｕｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）中の抗体の親和性成熟の原因であるインビボ体細胞変異プロセスに類似したプロセスにおけるＶＨのＣＤＲ２領域、ＶＬのＣＤＲ１領域及び／又はＣＤＲ３領域内で、無作為に変異し得る。このインビトロでの親和性成熟は、標的ＣＤＲ内の３個のアミノ酸をコードする縮重一本鎖オリゴヌクレオチドで各ＣＤＲの一部を置換することによって実施することができる。各ＣＤＲの一部を新しい無作為化配列（最高８０００の可能性）で置換することは、酵母における相同組換えによって実施することができる（例えば、実施例４参照）。これらの無作為に変異させたＶＨ及びＶＬセグメントを、ｓｃＦｖに関連した少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープとの結合について分析することができる。次いで、蛍光が改善されたｓｃＦｖであって、（ａ）生理希釈剤（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び１％ＢＳＡ）の存在下で、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合し、１．３×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄ、好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄ、より好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを有するｓｃＦｖ、又は（ｂ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合し、９．３８×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄ、好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄ、より好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを有するｓｃＦｖを単離し、ＣＤＲ変異を配列決定によって特定することができる。
【０１４９】
結合親和性を更に増加させるために、上記変異原ライブラリーから単離された個々の変異を組み合わせる。好ましい実施形態においては、ＶＬ遺伝子のＣＤＲ１領域において得られた異なる変異及び／又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ３領域において得られた異なる変異と一緒にされた、ＶＨ遺伝子のＣＤＲ２領域において得られた異なる変異を含むｓｃＦｖ遺伝子を構築する。別の実施形態として、ＶＬ遺伝子のＣＤＲ１領域において得られた異なる変異とＶＬ遺伝子のＣＤＲ３領域において得られた異なる変異とを含むｓｃＦｖ遺伝子を構築する。これらの変異体の組合せを作製する遺伝子操作は、当分野で公知の技術を用いる。次いで、蛍光の改善された組合せ変異ｓｃＦｖクローンであって、（ａ）少なくとも１種類の生理希釈剤（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び１％ＢＳＡ）の存在下で、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合し、１．３×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄ、好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄ、より好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを有するｓｃＦｖクローン、又は（ｂ）少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露後、又は少なくとも１種類の選択希釈剤と一緒にインキュベートした後、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに結合し、９．３８×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄ、好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄ、より好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄを有するｓｃＦｖクローンを分析し、ＣＤＲ変異を配列決定によって検証することができる。
【０１５０】
組換えｓｃＦｖディスプレイライブラリーのスクリーニング後、所望の特性を有するクローンを転化用に選択する。選択した抗体をコードする核酸分子を（例えば、酵母発現ベクター由来の）ディスプレイパッケージから回収し、標準組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。必要に応じて、核酸を更に操作して（例えば、追加の定常領域などの追加の免疫グロブリンドメインをコードする核酸に連結された）本発明の他の抗体形態を作製することができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離した組換えヒト抗体を発現させるために、上記セクションＩＶで詳述したように、抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクターにクローン化し、ほ乳動物宿主細胞に導入する。
【０１５１】
ＶＩ．  診断免疫測定法
別の態様においては、本発明は、試験試料中の少なくとも１種類の免疫抑制剤（すなわち、分析物）の定性（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ）及び／又は定量化に使用することができる診断免疫測定法に関する。本発明の診断免疫測定法は、（順方向及び逆方向競合阻害アッセイを含めた）競合阻害形式、蛍光偏光形式など、ただしこれらだけに限定されない、当分野で公知の任意の形式を用いて実施することができる。
【０１５２】
試験試料中の少なくとも１種類の免疫抑制剤を定性的に検出する診断免疫測定法においては、少なくとも１種類のその免疫抑制剤の少なくとも１種類のエピトープに結合する少なくとも１種類の抗体を、少なくとも１種類の免疫抑制剤を含むと考えられ、又は含むことが知られ、抗体−免疫抑制剤免疫複合体を形成する、少なくとも１個の試験試料と接触させる。本明細書のセクションＩＩに記載の抗体をかかる免疫測定法に使用して、少なくとも１個の試験試料中でかかる抗体−免疫抑制剤免疫複合体を形成することができる。次いで、これらの免疫複合体を、当業者に公知である定常的な技術を用いて検出することができる。例えば、本発明の抗体を、検出可能な標識で標識して、抗体−免疫抑制剤複合体の存在を検出することができる。或いは、試験試料中の少なくとも１種類の免疫抑制剤を、検出可能な標識で標識し、生成した抗体−免疫抑制剤免疫複合体を、当業者に公知である定常的な技術を用いて検出することができる。検出可能な標識、及びその抗体との結合については、後により詳細に考察する。
【０１５３】
本発明者らは、診断免疫測定法が、本発明の抗体を用いて実施できることを発見した。より具体的には、本発明の抗体を前記免疫測定法に使用することができる。好ましくは、本発明の抗体は、免疫グロブリンとして、（ａ）前記抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されなかったとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、１．９×１０−１１Ｍ未満のＫＤで、好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１３ＭのＫＤで、最も好ましくは１．８９×１０−１１Ｍから１．０×１０−１２ＭのＫＤで、又は（ｂ）前記抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されたとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされたとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに（抗体は、免疫測定前又は測定中に、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露し、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートすることができ、曝露又はインキュベーションのタイミングは重要ではない。）、１．５２×１０−１０Ｍ未満のＫＤで、好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１１ＭのＫＤで、最も好ましくは１．５１×１０−１０Ｍから１．０×１０−１１ＭのＫＤで、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する。ＳｃＦｖとして、本発明の抗体は、（ａ）前記抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されなかったとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされなかったとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに、１．３×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで、好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで、より好ましくは１．２９×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄで、又は（ｂ）前記抗体が少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露されたとき、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされたとき、又は該選択希釈剤の存在下にあるときに（抗体は、免疫測定前又は測定中に、少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露し、又は該選択希釈剤と一緒にインキュベートすることができ、曝露又はインキュベーションのタイミングは重要ではない。）、９．３８×１０−４／ｓｅｃ未満のｋｄで、好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−６／ｓｅｃのｋｄで、より好ましくは９．３７×１０−４／ｓｅｃから１．０×１０−５／ｓｅｃのｋｄで、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する。
【０１５４】
好ましい実施形態においては、公知濃度の少なくとも１種類の免疫抑制剤の標識抗原の一定分量を用いて、順方向競合アッセイ形式における（本発明の抗体などの）抗体との結合について、試験試料中の少なくとも１種類の免疫抑制剤と競合させることができる。免疫抑制剤の抗原、及び該抗原を作製する方法は、当分野で周知であり、市販されている。免疫抑制剤又は該免疫抑制剤の抗原は、当業者に公知である任意の検出可能な標識で標識することができる。非限定的な例として、検出可能な標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素標識、アクリジニウムエステル、ルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなどの化学発光標識、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナートなど）、ローダミン、フィコビリンタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（硫化亜鉛でキャッピングされたセレン化カドミウム）などの蛍光標識、温度測定（ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｒｉｃ）標識、又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識、標識手順及び標識検出の序論は、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９９７）及びＨａｕｇｌａｎｄ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）に記載されている。これは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇｏｎによって刊行された総合ハンドブック・カタログである。例えば、本明細書の実施例に記載のように、ビオチン化タクロリムス又はアクリジニウム−タクロリムス抗原を前記競合形式で使用することもできる。
【０１５５】
順方向競合アッセイにおいては、（本発明の抗体などの）固定化抗体を試験試料、標識された免疫抑制剤、又は免疫抑制剤の抗原と逐次的に、又は同時に接触させることができる。免疫抑制剤又は該免疫抑制剤の抗原は、当業者に公知である任意の検出可能な標識で標識することができる。このアッセイでは、本発明の抗体を固体担体に固定することができる。さらに、必要に応じて、固体担体を誘導体化して、抗体上の種々の官能基と反応させることができる。かかる誘導体化は、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなど、ただしこれらだけに限定されないある種のカップリング剤を使用する必要がある。或いは、本発明の抗体は、微粒子などの固体担体に固定された、抗異種（ａｎｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）抗体などの抗体と結合させることができる（実施例９参照）。
【０１５６】
抗体（又は複数の抗体）−免疫抑制剤複合体を形成させるために、標識された免疫抑制剤又は該免疫抑制剤の抗原、試験試料及び抗体をインキュベートする。インキュベーションは、ｐＨ約４．５から約１０．０で、温度約２℃から約４５℃で、少なくとも約１分から約１８時間、好ましくは約１−２４分間、最も好ましくは約４−１８分間実施することができる。次いで、２種類の抗体−免疫抑制剤複合体が生成する。具体的には、生成した抗体−免疫抑制剤複合体の一方は、検出可能な標識を含み、他方の抗体−免疫抑制剤複合体は、検出可能な標識を含まない。抗体−免疫抑制剤複合体は、検出可能な標識を定量する前に、試験試料の残部から分離し得るが、分離しなくてもよい。次いで、抗体−免疫抑制剤複合体を試験試料の残部から分離する、しないにかかわらず、抗体−免疫抑制剤複合体中の検出可能な標識を定量する。例えば、酵素標識を使用する場合、標識された複合体を、発色などの定量化可能な反応を与える標識用基質と反応させる。標識が放射性標識である場合、シンチレーションカウンターを用いて標識を定量する。標識が蛍光標識である場合、（「励起波長」として知られる）１色の光で標識を刺激し、刺激に応じて標識によって発せられる（「発光波長」として知られる）別の色を検出することによって標識を定量する。標識が化学発光標識である場合、視覚的に、又は照度計、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを用いて、発せられた光を検出することによって標識を定量する。次いで、抗体−免疫抑制剤複合体中の検出可能な標識の量を検量線と比較することによって、試験試料中の少なくとも１種類の免疫抑制剤の濃度を求めることができる。検量線は、公知濃度の少なくとも１種類の免疫抑制剤の段階希釈、質量分析、重量測定、及び当分野で公知の他の技術によって、作製することができる。
【０１５７】
抗体−免疫抑制剤複合体は、固体担体などの固体担体に抗体を結合させ、次いで試験試料の残部を固体担体との接触から解除することによって、試験試料から分離することができる。例えば、少なくとも第１の抗体がウェル、ビーズなどの固体担体に結合している場合、分離は、（試験試料からの）流体を固体担体との接触から解除することによって実施することができる。
【０１５８】
逆方向競合アッセイにおいては、固定された免疫抑制剤、又は該免疫抑制剤の抗原を、試験試料及び少なくとも１種類の標識抗体と逐次的に、又は同時に接触させることができる。少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体の例は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４  ６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体である。抗体は、当業者に公知である任意の検出可能な標識で標識することができる。検出可能な標識は、抗体に直接、又はカップリング剤を介して、結合させることができる。使用可能なカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）である。使用可能な他のカップリング剤は、当分野で公知である。検出可能な標識を抗体に結合させる方法は、当分野で公知である。さらに、ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られるＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド、ＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られるＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミドなど、検出可能な標識と抗体のカップリングを促進する末端基を既に含む多数の検出可能な標識を購入又は合成することができる。
【０１５９】
免疫抑制剤、又は該免疫抑制剤の抗原は、順方向競合形式に関連して上で考察した固体担体などの固体担体と結合させることができる。
【０１６０】
固定された免疫抑制剤、又は該免疫抑制剤の抗原、試験試料及び少なくとも１種類の標識抗体を、サンドイッチアッセイ形式に関連して上述した条件と類似の条件下でインキュベートする。次いで、２種類の免疫抑制剤−抗体複合体が生成する。具体的には、生成した免疫抑制剤−抗体複合体の一方は、固定され、検出可能な標識を含み、他方の免疫抑制剤−抗体複合体は、固定されず、検出可能な標識を含む。固定されていない免疫抑制剤−抗体複合体、及び試験試料の残部は、洗浄などの当分野で公知の技術によって、固定された免疫抑制剤−抗体複合体の存在から除去される。固定されていない免疫抑制剤抗体複合体を除去した後、次いで、固定された免疫抑制剤−抗体複合体中の検出可能な標識を定量する。次いで、免疫抑制剤複合体中の検出可能な標識の量を検量線と比較することによって、試験試料中の少なくとも１種類の免疫抑制剤の濃度を求めることができる。検量線は、公知濃度の少なくとも１種類の免疫抑制剤の段階希釈、質量分析、重量測定、及び当分野で公知の他の技術によって、作製することができる。
【０１６１】
蛍光偏光アッセイでは、一実施形態において、抗体又は機能的に活性なその断片を、少なくとも１種類の免疫抑制剤を含むと考えられる非標識試験試料とまず接触させて、非標識免疫抑制剤−抗体複合体を形成する。次いで、非標識免疫抑制剤−抗体複合体を蛍光標識免疫抑制剤、又は該免疫抑制剤の抗原に接触させる。標識免疫抑制剤、又は該免疫抑制剤の抗原は、抗体又は機能的に活性なその断片との結合について、試験試料中の少なくとも１種類の任意の非標識免疫抑制剤と競合する。形成された標識免疫抑制剤−抗体複合体の量を求め、試験試料中の免疫抑制剤の量を検量線を用いて求める。
【０１６２】
好ましくは、蛍光偏光アッセイに用いられる抗体は、免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する。少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体の例は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体である。
【０１６３】
抗体、標識免疫抑制剤、又は該免疫抑制剤の標識抗原、試験試料、及び少なくとも１種類の標識抗体を、順方向競合アッセイ形式に関連して上述した条件と類似の条件下でインキュベートする。
【０１６４】
或いは、別の実施形態においては、抗体又は機能的に活性なその断片を、蛍光標識免疫抑制剤、又は免疫抑制剤の抗原と、少なくとも１種類のその免疫抑制剤を含むと考えられる非標識試験試料とに同時に接触させて、標識免疫抑制剤−抗体複合体と非標識免疫抑制剤−抗体複合体の両方を形成する。形成された標識免疫抑制剤−抗体複合体の量を求め、試験試料中の免疫抑制剤の量を検量線を用いて求める。この免疫測定法に用いられる抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する。少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体の例は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体である。
【０１６５】
或いは、更に別の実施形態においては、（ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体などの本発明の抗体などの）抗体、又は機能的に活性なその断片を、蛍光標識免疫抑制剤、又は該免疫抑制剤由来の抗原にまず接触させて、標識免疫抑制剤−抗体複合体を形成する。次いで、標識免疫抑制剤−抗体複合体を、免疫抑制剤又は免疫抑制剤の抗原を含むと考えられる非標識試験試料に接触させる。試験試料中の少なくとも１種類の任意の非標識免疫抑制剤は、抗体又は機能的に活性なその断片との結合について、標識免疫抑制剤又は免疫抑制剤の抗原と競合する。形成された標識免疫抑制剤−抗体複合体の量を求め、試験試料中の免疫抑制剤の量を検量線を用いて求める。この免疫測定法に用いられる抗体は、少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する。少なくとも１種類の免疫抑制剤上の少なくとも１種類のエピトープに特異的に結合する抗体の例は、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７によって産生される抗体である。
【０１６６】
ＶＩＩ．  抗体及び特異的結合パートナーを選択する方法
本発明は、抗体又は特異的結合パートナーを選択する方法も提供する。本明細書に記載の方法に従って選択された抗体又は特異的結合パートナーを診断免疫測定法に使用して、試験試料中の分析物を検出することができ、試験試料中の分析物を定量することができ、又は試験試料中の分析物を検出して、試験試料中の分析物を定量することができる。
【０１６７】
一態様においては、本発明は、（親和性成熟抗体などの）抗体を選択する方法に関する。方法は、少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、少なくとも１種類の抗体を試料と接触させることを含む。或いは、方法は、少なくとも１種類の抗体を少なくとも１種類の選択希釈剤と一緒にまずインキュベートし、次いで少なくとも１種類の抗体を試料と接触させることを含む。少なくとも１種類の抗体、試料及び少なくとも１種類の選択希釈剤、又は事前のインキュベーションの場合には、少なくとも１種類の抗体及び少なくとも１種類の選択希釈剤、続いて少なくとも１種類の抗体及び試料を接触させる順序は重要ではなく、逐次的に、又は同時に実施することができる。さらに、方法に用いられる抗体、試料又は両方の量も重要ではない。試料が由来する対象のインビボでの生理的条件を近似、模倣又はシミュレートする（換言すれば、試験試料をより「生理的のように」する）ために、試料を少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露する前に、少なくとも１種類の生理希釈剤を試験試料に添加してもよい（試験試料に添加すべき生理希釈剤の量は、当業者が容易に決定することができる。）。前記試料を少なくとも１種類の生理希釈剤に曝露する場合、少なくとも１種類の選択希釈剤を試験試料に添加すると、又は試験試料を少なくとも１種類の選択希釈剤に曝露すると、少なくとも１種類の選択希釈剤は、試験試料の状態を変化させ、「非生理学的」にすると予想される。例えば、少なくとも１種類の生理希釈剤を試験試料に添加する場合、少なくとも１種類の選択希釈剤を試験試料に添加すると、試験試料のｐＨが上昇又は低下し、試験試料中のナトリウム又はカリウム塩の量が増加し、試験試料中の溶媒の量が増加し得る。
【０１６８】
方法に用いられる試料は、少なくとも１種類の目的エピトープを含む分析物源である。試料は、対象から得られる試験試料であり得、又は対象に由来しなくてもよいが、それでもなお少なくとも１種類の目的エピトープを含む分析物を含む。試料は、これらだけに限定されないが、目的とする抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含み得る。例えば、試料は、タクロリムス、シクロスポリンなどの免疫抑制剤（すなわち、薬物自体）であり得る。或いは、試料は、対象から得られる、タクロリムス又はシクロスポリンを含む全血試料であり得る。或いは、試料は、アビジンで標識されたタンパク質を含み得る。
【０１６９】
本明細書に記載の方法において試験用に選択された少なくとも１種類の抗体は、少なくとも１種類の目的エピトープに結合することが当業者に知られている（すなわち、少なくとも１種類の抗体は、目的エピトープを含む分析物（抗原）に対する特異的結合パートナーであることが知られている。）。好ましくは、抗体及び抗原は、特異的結合対の一部である。例えば、試料は、タクロリムス（すなわち、薬物自体）であり得る。抗体は、タクロリムスに結合する、本明細書に記載のハイブリドーマ細胞系１−６０−４６、ＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７又はＣＨＯ細胞系１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７から産生される抗体であり得る。本明細書に記載の方法を実施する前に、少なくとも１種類の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を選択希釈剤の存在下及び非存在下で該方法において試験し、ベースライン測定として役立つことを判定することが、必須ではないが、好ましい。
【０１７０】
好ましくは、本明細書に記載の方法用に選択された選択希釈剤は、（ａ）該方法において試験される少なくとも１種類の抗体のＫＤを増加させる（したがってｋａを減少させ、及び／又はｋｄを増加させる）ことが当業者に知られ、又は該方法において試験される少なくとも１種類の抗体のＫＤを増加させる可能性があると該当業者に考えられており、（ｂ）もし前記少なくとも１種類の抗体が、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとしたら、又は（診断免疫測定前又は測定中に使用されるなど、ただしこれらだけに限定されずに）該選択希釈剤と一緒に、若しくは該選択希釈剤の存在下で使用されるとしたら、該方法において試験される少なくとも１種類の抗体の機能活性を低下させることが当業者に知られ、又は該方法において試験される少なくとも１種類の抗体の機能活性を低下させる可能性があると該当業者に考えられており、又は（ｃ）（ａ）−（ｂ）の任意の組合せである。
【０１７１】
９０％メタノールと１０％エチレングリコール（及び場合によっては１００ｍＭ硫酸亜鉛）の組合せなどの１種類以上の有機溶媒を含むアッセイ抽出緩衝剤を用いて、対象の治療の一部としてこの免疫抑制剤を投与された対象から得られた全血試験試料からタクロリムスを抽出する。本発明者らは、診断免疫測定法に使用されるこれらのアッセイ抽出緩衝剤が、該免疫測定法に用いられる１種類以上の抗体のＫＤ、機能活性、又はＫＤと機能活性の両方を変化させることを発見した。したがって、本明細書に記載の方法においては、選択希釈剤を用いて、診断免疫測定法の反応条件を近似、シミュレート又は模倣することが好ましい。選択希釈剤を用いて診断免疫測定法の反応条件を近似、シミュレート又は模倣することによって、本発明の方法は、当業者が、診断免疫測定法において、この方法に従って選択されない抗体よりも高い親和性又は機能活性を示す抗体を選択できるようにする。
【０１７２】
方法を容易にするために、方法に用いられる少なくとも１種類の抗体の全部又は一部のみを（バイオディスプレイなどの）本明細書のセクションＩＶ及びＶに記載の技術を用いて、該抗体の表現型を該抗体の遺伝子型に結びつけるように、発現させることができる。好ましくは、これによって、選択圧の適用後に、すなわち非生理的条件をもたらす選択希釈剤とのインキュベーション、又は結合競合剤を含む選択希釈剤とのインキュベーション後に、目的形質（例えば、有機溶媒の存在下の解離速度の減少）を示す前記抗体の遺伝子を単離することができる。さらに、出発抗体遺伝子配列に種々の変化を導入する組換えライブラリーを、当業者に公知の方法、及び本明細書のセクションＩＶ及びＶに記載の方法を用いて、構築することができる。方法に用いられる試料は、酵素免疫測定法（「ＥＩＡ」）プレート中に存在する吸収剤ポリマー、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ガラスなど、ただしこれらだけに限定されない他のマトリックスなど、ただしこれらだけに限定されない固体担体に固定することができ、当業者に公知の手段によって天然又は組換え細胞系の細胞表面で（未変性形態、組換え形態などで）発現させることができる。或いは、試料を固定せず、溶液中に単に存在させることができる。さらに、少なくとも１種類の抗体、試料又は両方を、セクションＶＩに記載の技術を用いて、検出可能な標識で標識することができる。
【０１７３】
抗体（又は複数の抗体）−分析物複合体、分析物−抗体複合体、又は抗体（複数の抗体）−分析物複合体と分析物−抗体複合体の組合せを形成させるために、少なくとも１種類の抗体、試料及び少なくとも１種類の選択希釈剤、又は（抗体を少なくとも１種類の選択希釈剤と一緒に前もってインキュベートした場合）少なくとも１種類の抗体と試料をインキュベートする。インキュベーションは、ｐＨ約４．５から約１０．０で、温度約２℃から約４５℃で、少なくとも約１分から約４８時間実施することができる。
【０１７４】
インキュベーション後、所望の形質に対して表現型の向上を示す抗体を、望ましくない抗体の除去後に、選択的に富化する。望ましくない抗体は、表現型特性の向上した抗体と同じ程度には固定試料に結合し得ないので、洗浄によって除去することができる。或いは、所望の形質に対して表現型の向上を示す抗体を、セクションＶＩに記載のようにレポーターシステムを用いて望ましくない抗体から富化して、所望の抗体を明確にし、続いて望ましくない抗体から分離することができる。非限定的な好ましい実施形態は、蛍光標識された試料と併せて、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）を使用して、所望の表現型の向上した抗体を選択的に特定し、単離する。試料上の重複していないエピトープに結合し得る第２の蛍光標識試薬が利用可能である場合、非標識試料を用いて、ＦＡＣＳと併せて、所望の表現型の向上した抗体を特定し、単離することもできる。典型的には、富化された、表現型形質の向上したクローンを増幅し、選択プロセスを繰り返して、更に富化し、精製する。
【０１７５】
複数ラウンドの上記選択後、少なくとも１種類の抗体のＫＤ、ｋｄ、ｋａ若しくは機能活性又はその組合せを、当分野で公知の定常的な技術を用いて求めることができる。例えば、ＫＤ、ｋｄ又はｋａをＫｉｎＥｘＡ（登録商標）又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって求めることができる。抗体の機能活性を求める方法も当分野で周知であり、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）及びＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ、放射性免疫測定法（「ＲＩＡ」）、酵素免疫測定法（「ＥＩＡ」）、化学発光免疫測定法（「ＣＩＡ」）、蛍光相関分光法（「ＦＣＳ」）、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）又は蛍光偏光免疫測定法（「ＦＰＩＡ」）が挙げられるが、これらだけに限定されない。試験（及び場合によってはベースライン測定）された他の抗体と比較したときに、選択希釈剤の存在下で最良のＫＤ、ｋｄ若しくはｋａ又は機能活性を示す抗体は、改善された抗体（例えば、親和性成熟抗体）であるとみなされ、診断免疫測定法における使用などの更なる開発用に選択される。
【０１７６】
第２の態様においては、本発明は、試験試料中の分析物を検出するための特異的結合パートナーを選択する方法に関する。方法は、少なくとも１種類の選択希釈剤の存在下で、特異的結合パートナーを試料と接触させることを含む。特異的結合パートナー、試料及び少なくとも１種類の選択希釈剤を接触させる順序は重要ではなく、逐次的に、又は同時に実施することができる。さらに、方法に用いられる特異的結合パートナー又は試料の量も重要ではない。
【０１７７】
方法に用いられる試料は、少なくとも１種類の目的エピトープを含む分析物源である。試料は、対象から得られる試験試料であり得、又は対象に由来しなくてもよいが、それでもなお少なくとも１種類の目的エピトープを含む分析物を含む。試料は、これらだけに限定されないが、目的とする抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含み得る。例えば、試料は、タクロリムス、シクロスポリンなどの免疫抑制剤（すなわち、薬物自体）であり得る。或いは、試料は、対象から得られる、タクロリムス又はシクロスポリンを含む全血試料であり得る。
【０１７８】
本明細書に記載の方法における試験用に選択された少なくとも１種類の特異的結合パートナーは、試験試料中の分析物に含まれる少なくとも１種類の目的エピトープに結合することが当業者に知られている。例えば、試料は、タクロリムス又はシクロスポリン（すなわち、薬物自体）であり得る。特異的結合パートナーは、（血清などの）試験試料中に存在する、サイクロフィリン、ＦＫ結合タンパク質（「ＦＫＢＰ」）など、ただしこれらだけに限定されないタンパク質であり得る。本明細書に記載の方法を実施する前に、少なくとも１種類の特異的結合パートナーの平衡解離定数（ＫＤ）、分離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）又は機能活性を選択希釈剤の存在下及び非存在下で該方法において試験し、ベースライン測定として役立つことを判定することが、必須ではないが、好ましい。
【０１７９】
好ましくは、本明細書に記載の方法用に選択された選択希釈剤は、（ａ）該方法において試験される少なくとも１種類の抗体のＫＤを増加させる（したがってｋａを減少させ、及び／又はｋｄを増加させる）ことが当業者に知られ、又は該方法において試験される少なくとも１種類の抗体のＫＤを増加させる可能性があると該当業者に考えられており、（ｂ）もし前記少なくとも１種類の抗体が、該選択希釈剤と一緒にインキュベートされるとしたら、又は（診断免疫測定前又は測定中に使用されるなど、ただしこれらだけに限定されずに）該選択希釈剤と一緒に、若しくは該選択希釈剤の存在下で使用されるとしたら、該方法において試験される少なくとも１種類の抗体の機能活性を低下させることが当業者に知られ、又は該方法において試験される少なくとも１種類の抗体の機能活性を低下させる可能性があると該当業者に考えられており、又は（ｃ）（ａ）−（ｂ）の任意の組合せである。
【０１８０】
上述したように、９０％メタノールと１０％エチレングリコール（及び場合によっては１００ｍＭ硫酸亜鉛）の組合せなどの１種類以上の有機溶媒を含むアッセイ抽出緩衝剤を用いて、対象の治療の一部としてこの免疫抑制剤を投与された対象から得られた全血試験試料からタクロリムスを抽出する。したがって、本明細書に記載の方法においては、選択希釈剤を用いて、診断免疫測定法の反応条件を近似、シミュレート又は模倣することが好ましい。診断免疫測定法の反応条件を近似、シミュレート又は模倣する選択希釈剤を使用することによって、本発明の方法は、当業者が、診断免疫測定用の更に評価することができる改善された特異的結合パートナーを選択できるようにする。
【０１８１】
方法を容易にするために、方法に用いられる少なくとも１種類の特異的結合パートナーの全部又は一部のみを、本明細書のセクションＩＶ及びＶに記載の技術を用いて、該抗体の表現型を該抗体の遺伝子型に結びつけるように、発現させることができる。好ましくは、これによって、選択圧の適用後に、すなわち非生理的条件をもたらす選択希釈剤とのインキュベーション、又は結合競合剤を含む選択希釈剤とのインキュベーション後に、目的形質（例えば、有機溶媒の存在下の解離速度の減少）を示す前記特異的結合パートナーの遺伝子を単離することができる。さらに、出発特異的結合パートナー遺伝子配列に種々の変化を導入する組換えライブラリーを、当業者に公知の方法、及び本明細書のセクションＩＶ及びＶに記載の方法を用いて、構築することができる。方法に用いられる試料は、酵素免疫測定法（「ＥＩＡ」）プレート中に存在する吸収剤ポリマー、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ガラスなど、ただしこれらだけに限定されない他のマトリックスなど、ただしこれらだけに限定されない固体担体に固定することができ、当業者に公知の手段によって天然又は組換え細胞系の細胞表面で（未変性形態、組換え形態などで）発現させることができる。或いは、試料を固定せず、溶液中に単に存在させることができる。さらに、少なくとも１種類の特異的結合パートナー、試料又は両方を、セクションＶＩに記載の技術を用いて、検出可能な標識で標識することができる。
【０１８２】
特異的結合パートナー（又は複数の特異的結合パートナー）−分析物複合体を形成するために、特異的結合パートナー、試料及び少なくとも１種類の選択希釈剤をインキュベートする。インキュベーションは、ｐＨ約４．５から約１０．０で、温度約２℃から約４５℃で、少なくとも約１分から約４８時間実施することができる。
【０１８３】
インキュベーション後、所望の形質に対して表現型の向上を示す特異的結合パートナーを、望ましくない特異的結合パートナーの除去後に、選択的に富化する。望ましくない特異的結合パートナーは、表現型特性の向上した特異的結合パートナーと同じ程度には固定試料に結合し得ないので、洗浄によって除去することができる。或いは、所望の形質に対して表現型の向上を示す特異的結合パートナーを、セクションＶＩに記載のようにレポーターシステムを用いて望ましくない特異的結合パートナーから富化して、所望の特異的結合パートナーを明確にし、続いて望ましくない特異的結合パートナーから分離することができる。非限定的な好ましい実施形態は、蛍光標識された試料と併せて、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）を使用して、所望の表現型の向上した特異的結合パートナーを選択的に特定し、単離する。試料上の重複してないエピトープに結合し得る第２の蛍光標識試薬が利用可能である場合、非標識試料を用いて、ＦＡＣＳと併せて、所望の表現型の向上した特異的結合パートナーを特定し、単離することもできる。典型的には、富化された、表現型形質の向上したクローンを増幅し、選択プロセスを繰り返して、更に富化し、精製する。
【０１８４】
複数ラウンドの上記選択後、特異的結合パートナー−分析物複合体を形成した特異的結合パートナーのＫＤ、ｋｄ、ｋａ若しくは機能活性を、当分野で公知の定常的な技術を用いて求めることができる。例えば、ＫＤ、ｋｄ又はｋａをＫｉｎＥｘＡ（登録商標）又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって求めることができる。特異的結合パートナーの機能活性を求める方法も当分野で周知であり、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）及びＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光相関分光法、蛍光活性化細胞選別又は蛍光偏光免疫測定法が挙げられるが、これらだけに限定されない。試験された他の特異的結合パートナーと比較したときに、分析物との結合において最良のＫＤ、ｋｄ若しくはｋａ又は機能活性を示す特異的結合パートナーは、改善されたとみなされ、診断免疫測定法における使用などの更なる開発用に選択される。以下、非限定的な例として、本発明の実施例を記述する。
【実施例１】
【０１８５】
免疫グロブリン遺伝子の同定
メッセンジャーＲＮＡを抗タクロリムス１−６０−４６ハイブリドーマ細胞から市販キットを用いて単離した。Ｎｏｖａｇｅｎ（（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙの系列会社である）Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｎｏ．６９８３１−３）から購入したマウスＩｇプライマーセットキットを用いて、キットに含まれる免疫グロブリン遺伝子特異的プライマーと一緒に、１−６０−４６  ｍＲＮＡを逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法に利用した。生成したＰＣＲ産物の配列を決定し、免疫グロブリン可変重鎖及び可変軽鎖遺伝子を特定した（図２、６及び７Ａ−７Ｂ並びに配列番号１−１４、４３及び４５参照）。
【実施例２】
【０１８６】
タクロリムス１−６０−４６ｍＡｂから単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）への転化
酵母ディスプレイシステムを用いて、（下記）未変異（野生型（「ｗｔ」））抗タクロリムスタンパク質及び抗タクロリムスタンパク質ライブラリーを、酵母結合タンパク質ＡＧＡ２との融合物として酵母表面で発現させた（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５：５５３−５５７（Ｊｕｎｅ  １９９７）参照）。ＰＣＲ  ｓｉｎｇｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（「ＳＯＥ」）によって、可変重遺伝子（「ＶＨ」）と可変軽遺伝子（「ＶＬ」）を配列ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号３６）の柔軟なリンカーを介して連結して、ＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖ構築体を作製した（図１参照）。プライマーＴａｃｒｏ  ｓｃＦｖ  ＶＨ順方向−（ＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ（配列番号４７））及びＴａｃｒｏ  ｓｃＦｖ  ＶＬ逆方向（ＣＧＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＧＧＣＧＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ（配列番号４８））を用いて、１−６０−４６  ＶＨ遺伝子（配列番号４３）を増幅した。プライマーＴａｃｒｏ  ｓｃＦｖ  ＶＬ順方向−（ＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡ（配列番号４９））及びＴａｃｒｏ  ｓｃＦｖ  ＶＬ逆方向（ＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ（配列番号５０））を用いて、１−６０−４６  ＶＬ遺伝子（配列番号４５）を増幅した。続いて、１−６０−４６  ｓｃＦｖ  ＤＮＡを酵母ディスプレイベクターｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に標準分子生物学技術を用いてクローン化した。このベクターは、ガラクトース誘導性プロモーター、Ｃ末端Ｖ５エピトープタグ並びにそれぞれＥＢＹ１００及びＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）選択用のトリプトファン及びアンピシリンマーカーを含む。タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖ＿ｐＹＤベクターをＤＨ５α  Ｅ．コリに転換し、配列を検証した。
【０１８７】
タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖ＿ｐＹＤベクターをトリプトファン欠乏Ｓ．セレビシエ系統ＥＢＹ１００にＧｉｅｔｚとＳｃｈｉｅｓｔｌの方法を用いて転換した（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  ａｎｄ  Ｇｉｅｔｚ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６（５−６）：３３９−４６（Ｄｅｃ．  １９８９））。形質転換反応物の希釈物を（トリプトファンを欠く）選択的グルコースプレート（２％グルコース（０．６７％酵母窒素ベース、０．１０５％Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉａ（「ＨＳＭ」）−ｔｒｐ（トリプトファン）−ｕｒａ（ウラシル）、１．８％細菌寒天、１８．２％ソルビトール、０．８６％ＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏ、１．０２％Ｎａ２ＨＰＯ４  ７Ｈ２Ｏ））に蒔き、３０℃で４８−７２時間インキュベートした。選択グルコース培地に個々のコロニーを接種し、３０℃で１６−２０時間振とう増殖させた。細胞０．５  ＯＤ６００／ｍｌ（１×１０７（「１ｅ７細胞」）／０．５ＯＤ／ｍｌ）を選択ガラクトース培地に移すことによって、タンパク質発現をコロニー中で誘導した。コロニーを２０℃で１６−２４時間振とうし、次いで（「ｂｔ−ｔａｃｒｏ」と称する）分子の３２位に結合したビオチン基を有するタクロリムス抗原（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）及び抗Ｖ５モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との結合についてフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーアッセイでは、１−６０−４６  ｓｃＦｖを発現する酵母細胞を、ｂｔ−ｔａｃｒｏ及び抗Ｖ５モノクローナル抗体、続いてストレプトアビジン：フィコエリトリン（ＳＡ：ＰＥ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びヤギ抗マウス免疫グロブリン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒａ  ４８８（ＧＡＭ：４８８、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの系列会社である）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒にインキュベートした。図１Ｃに示すフローサイトメトリーデータの二変量プロットは、１−６０−４６  ｓｃＦｖ（抗Ｖ５）の完全長表面発現、及び１−６０−４６  ｓｃＦｖとｂｔ−ｔａｃｒｏの結合（ＳＡ：ＰＥ）を示す。
【実施例３】
【０１８８】
酵母上の１−６０−４６  ｓｃＦｖの解離速度分析
０．０５ＯＤ酵母（１×１０６細胞）を１００ｎＭ  ｂｔ−ｔａｃｒｏ（１０倍モル過剰）及び抗Ｖ５抗体（２．５ｕｇ／ｍｌ）で室温で３０−６０分間飽和させることによって、酵母上の１−６０−４６  ｓｃＦｖ及び１−６０−４６変種の解離速度測定値を測定した。（ａ）（リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、ｐＨ７．４及び１％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）で構成された生理希釈剤、及び（ｂ）（ＰＢＳ、ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中で反応を実施した。次いで、細胞を２回洗浄し、１００倍モル過剰の非標識タクロリムス（Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）と一緒に適切な希釈剤（上記生理希釈剤又は選択希釈剤）中で室温でインキュベートした。個々の試料を種々の時点で抜き取り、フローサイトメトリーによって分析して、二次染色試薬ＳＡ：ＰＥ（１：２００希釈）及びＧＡＭ：４８８（１：１００希釈）の添加後に残留した結合ｂｔ−ｔａｃｒｏの量を求めた。図１Ｄは、平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）対時間（秒）としてプロットした解離速度データである（図１Ｄ参照）。一次指数減衰式（ｙ＝ｍ１＊ｅｘｐ（−ｍ２＊ｍ０）＋ｍ３）によって、データを適合させた。ＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖの解離は、１０％メタノールなしで１×１０−４（±２×１０−５）／ｓｅｃ、１０％メタノールありで９×１０−４（±２×１０−４）／ｓｅｃと求められた。１−６０−４６  ｓｃＦｖ半減期（ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆ））は、１０％メタノールの非存在下で１１５分、１０％メタノールの存在下で１３分であった。
【実施例４】
【０１８９】
１−６０−４６  ＣＤＲ変異原ライブラリーの作製
抗タクロリムス抗体１−６０−４６の全６個のＣＤＲ（図３、４、６及び７Ａ−７Ｂ並びに配列番号２、４、６、９、１１及び１３参照）を変異誘発に供した。３連続ＣＤＲアミノ酸位置を無作為に変異させた、８０００個のメンバーで構成された個々のライブラリーを作製した（図３及び４参照）。特定の重鎖又は軽鎖可変領域内のＣＤＲ領域の具体的名称は、かかる領域を識別するのに用いられる慣行又は付番方式に応じて変わり得ることを理解されたい（例えば、すべて当業者に公知である、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＩＭＧＴ  Ｖ−ｑｕｅｓｔ）。しかし、かかる名称は重要ではない。各ＣＤＲの特定の領域を欠く、直線化されたｐＹＤ１ベクターをＰＣＲによって調製し、酵母に固有の相同組換えシステムを用い、Ｇｉｅｔｚライブラリー転換プロトコル（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  ａｎｄ  Ｇｉｅｔｚ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６（５−６）：３３９−４６（Ｄｅｃ  １９８９）参照）を用いて、標的ＣＤＲ中の３アミノ酸変異原性ウィンドウ内の全１９個のアミノ酸置換候補をコードする縮重一本鎖オリゴヌクレオチドで「ギャップ」を置換した。転換された酵母細胞を、再構成されたベクター上に存在する栄養要求性トリプトファンマーカーを用いて選択的に回収した。合計５０個のライブラリーを作製した。図３及び４に模式的に示す。
【実施例５】
【０１９０】
１−６０−４６変異原ライブラリーの選択
解離速度選別戦略によって、（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中で結合特性が改善された全５０個の変異原ライブラリーから１−６０−４６変種を特定した。各ＣＤＲ領域内の個々のライブラリーを選択前にプールした（例えば、Ｈ１ライブラリー１−８を組み合わせて、Ｈ１マスターライブラリーを作製した。）。しかし、各ＣＤＲマスターライブラリーは、選択プロセス中に互いに別個のままにされた。１−６０−４６変異原ライブラリーをまず選択希釈剤中で室温でｂｔ−ｔａｃｒｏで２０分間飽和させ、１０分間氷冷した。親ｗｔ  １−６０−４６  ｓｃＦｖよりも結合が改善された変種を選択するために、細胞を洗浄し、次いで選択希釈剤中で室温で１００倍モル過剰で６５−７２分間（５×ＷＴ  ｓｃＦｖ  ｔ１／２）インキュベートした。解離インキュベーション後、細胞を再冷却し、洗浄し、標識した。個々の細胞上に残留したｂｔ−ｔａｃｒｏ抗原の量をＳＡ：ＰＥ（１：２００希釈）を用いて検出した。抗原結合を、抗Ｖ５  ｍＡｂ（２ｕｇ／ｍｌ）及びＧａＭ−４８８（１：１００希釈）を用いた個々の細胞上のｓｃＦｖ発現量に対して正規化した。対照試料を調製して蛍光補償（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）を設定し、非特異的結合をモニターした。比較のために、（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤中でインキュベートした試料も調製した。所望の結合特性を有する変種の集団を、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）によって選択的に富化した。
【０１９１】
各ライブラリー試料について３ラウンドの選択を実施した。代表的なライブラリーを図５に示す。各ラウンドの選択は、ｓｃＦｖ発現シグナルに対してプロットされた、ＳＡ：ＰＥ（抗原結合性）チャネル中で最大の蛍光度を有する細胞の０．１％−１％を選択的に通過させること（ｇａｔｉｎｇ）からなった。選択された細胞を収集し、デキストロースを含む培地中で３０℃で２−３日間再増殖させた（選択ラウンド出力（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｒｏｕｎｄ  ｏｕｔｐｕｔ））。デキストロースは、ガラクトースプロモーターからの発現を阻害し、それによってｓｃＦｖ発現を阻止する。各ライブラリーの一定分量を取り出して、保存用の各ラウンド出力とした。次いで、ｓｃＦｖ発現のために、ガラクトースを含む培地を用いて、２０℃で１２−２４時間出力を誘導し、選択プロセスを繰り返した。選択希釈剤中で解離速度を減少させる変異を含むライブラリーは、選択の各ラウンドを通して次第に鮮明になった（Ｈ２、Ｌ１及びＬ３）のに対して、有利な変化を欠くライブラリーは鮮明にならず、それ以上分析しなかった。第３ラウンドの選別後の細胞の一定分量を選択培地に蒔いて、更なる分析用に個々のクローンを得た。
【実施例６】
【０１９２】
選択された１−６０−４６変種の分析
上記選択から（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中でｂｔ−ｔａｃｒｏとの結合が改善された各マスターＣＤＲライブラリー（Ｈ２、Ｌ１及びＬ３）由来の幾つかの個々のクローンからｓｃＦＶ領域をＰＣＲによって増幅した。ベクター特異的プライマー（ｐＹＤ４１順方向−ＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号３７）及びｐＹＤ４１逆方向−ＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧ（配列番号３８））を用いてｓｃＦｖ遺伝子を増幅し、配列を決定して、アミノ酸置換を確認した。図６及び７は、得られた各独特のクローンの配列決定結果を強調したものである。
【０１９３】
各独特のクローンを誘導して、ｓｃＦｖを発現させ、選択された変異ｓｃＦｖの結合特性をフローサイトメトリーによって評価した。各変異体の解離速度（ｋｏｆｆ）を、１０％メタノールの存在下及び非存在下で、反応中に、上で概説したように評価した（図８参照）。すべての変異クローンは、ＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖに比べて両反応条件下でｋｏｆｆが２から８倍改善し、最良のクローン（Ｌ３−１Ａ）の解離速度は、１０％メタノール中で１．２×１０−４／ｓｅｃであった。
【０１９４】
各マスターＣＤＲライブラリーからの、解離速度の改善が最大であるクローンを更に特性評価した。ｂｔ−ｔａｃｒｏ抗原に対する平衡解離定数（ＫＤ）を、（ａ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤と、（ｂ）（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤の両方で求めた。ｓｃＦｖ発現を誘導された酵母クローンを、種々の濃度のｂｔ−ｔａｃｒｏ（抗原濃度の範囲）と混合し、適切な希釈剤中で平衡にした（４−１８時間）。反応物を氷上でクエンチし、洗浄し、上述したようにフローサイトメトリー測定用に標識した（例えば、Ｈａｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｈａｗｌｅｙ，  ｅｄｓ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  ｐａｇｅｓ  ３１１−３３２（２００４）参照）。抗体正規化、抗原結合平均蛍光強度を抗原濃度に対してプロットし、非線形最小二乗適合（ｙ＝ｍ１＋ｍ２＊ｍ０／（ｍ３＋ｍ０））によってＫＤを求めた。変異体は、ＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖに比べて２から８倍の改善を含み、最大親和性クローン（Ｈ２−１Ａ）は、１０％メタノール中でＫＤ＝１．３×１０−１０Ｍであった。
【実施例７】
【０１９５】
タクロリムス１−６０−４６コンビナトリアル変異クローンの作製及び分析
各マスターＣＤＲライブラリーからの、解離速度が最も改善したクローンを用いて、個々の変異の種々の組合せを含むｓｃＦｖ遺伝子を構築した。この手法によって、個々の変異を組み合わせると結合特性が更に向上するかどうかを判定することができる。Ｈ２（Ｈ２−１Ａ、Ｈ２−１Ｂ、Ｈ２−３Ｂ）、Ｌ１（Ｌ１−１Ｂ、Ｌ１−４Ａ）及びＬ３（Ｌ３−Ａ、Ｌ３−１Ａ、Ｌ３−２Ａ、Ｌ３−１Ｂ、Ｌ３−２Ｂ）ＣＤＲ領域に種々の変異を含むコンビナトリアルクローンをＰＣＲ増幅によって構築し、当業者に公知である定常的な技術を用いて組み合わせた。コンビナトリアル変異クローンの配列を検証し、更なる特性評価用に、上述したように酵母に転換した。（上述したように）各コンビナトリアル変異クローンを誘導してｓｃＦｖを発現させ、結合特性をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１９６】
各クローンに対する解離速度を（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤を用いて求めた。さらに、幾つかのクローンを（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤中でも分析した（図８及び９参照）。タクロリムス１−６０−４６組合せ変異クローンの多くは、ｋｏｆｆが１０倍を超える改善を示し、最良のクローン（Ｈ２−１Ａ／Ｌ３−１Ａ）の解離速度は１０％メタノール中で５．５×１０−５／ｓｅｃであり、一般に最初のタクロリムス１−６０−４６変異体のどれよりも、特にＷＴ  １−６０−４６クローンよりもかなり改善された。ｂｔ−ｔａｃｒｏ抗原に対する平衡解離定数も上記選択希釈剤中で求めた。変異の大部分のコンビナトリアル組合せは、最初のタクロリムス１−６０−４６変異体とＷＴ  １−６０−４６クローンの両方に比べて親和性が改善する（図８及び９参照）。クローンＨ２−１Ａ／Ｌ１−１Ｂ／Ｌ３−Ａは、ＫＤが３．８×１０−１１Ｍであった。
【実施例８】
【０１９７】
酵母ディスプレイ由来の抗体のクローニング及び発現
可変ドメインをＰＣＲ増幅し、続いてこれらのドメインをｐＢＯＳベクター中に存在する完全なＩｇＧ２ａ定常領域又はκ領域に連結することによって、選択タクロリムス１−６０−４６変異ｓｃＦｖクローン（図１０参照）をネズミＩｇ２ａ／κ抗体（ＩｇＧ）に転化した（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １８：５３２２，（１９９０））。選択１−６０−４６変異体ＶＨ遺伝子を、Ｔａｃｒｏ  ＶＨ  ＩｇＧ２ａ順方向−（ＴＴＣＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴ（配列番号５１））及びＴａｃｒｏ  ＶＨ  ＩｇＧ２ａ逆方向−（ＴＧＴＴＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴ（配列番号５２））を用いたＰＣＲによって増幅した。選択１−６０−４６変異体ＶＬ遺伝子を、Ｔａｃｒｏ  ＶＬ  ｍＣｋ順方向−（ＣＣＣＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴ（配列番号５３））及びＴａｃｒｏ  ＶＬ  Ｃｋ逆方向−（ＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴ（配列番号５４））を用いたＰＣＲによって増幅した。重鎖領域と軽鎖領域をコードするｐＢＯＳプラスミドを、ＨＥＫ−２９３又はＣＯＳ細胞に過渡的に移入し、細胞培養から生成した上清をプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムによって精製した。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ１  ＩｇＧは、Ｈ２−１Ａ、Ｌ１−１Ｂ及びＬ３−２Ｂ変異を含む。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＩｇＧは、Ｈ２−１Ａ、Ｌ１−１Ｂ及びＬ３−Ａ変異を含む。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ３  ＩｇＧは、Ｈ２−１Ａ及びＬ３−２Ｂ変異を含む。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ４  ＩｇＧは、Ｈ２−１Ａ、Ｌ１−１Ｂ及びＬ３−１Ａ変異を含む。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ５  ＩｇＧは、Ｈ２−１Ｂ、Ｌ１−１Ｂ及びＬ３−１Ｂ変異を含む。精製ＩｇＧをリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）中に透析し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。次いで、精製抗体をアッセイの実施及び親和性測定によって評価した。
【実施例９】
【０１９８】
タクロリムス１−６０−４６変異ＩｇＧ免疫測定評価
親和性成熟抗タクロリムス抗体（ＡＭ１、ＡＭ２、ＡＭ３）を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（「ＧＡＭ」）で被覆された常磁性微粒子に個々に固定した。これらの粒子を調製するために、ＧＡＭを粒子に共有結合させ、次いで抗タクロリムス抗体を含有する緩衝安定化溶液と粒子を混合した。ＧＡＭと抗タクロリムスは、微粒子表面に安定な複合体を形成した。これらの抗タクロリムス−ＧＡＭ−常磁性微粒子を、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて、競合形式の自動タクロリムスアッセイで試験した。
【０１９９】
アッセイでは、上記装置によって、アッセイ抽出緩衝剤（すなわち９０％メタノール、１０％エチレングリコール及び１００ｍＭ硫酸亜鉛）を含む試験試料を微粒子及びトレーサー試薬と混合する。トレーサー分子は、アクリジニウムの３２位にリンカーを介して共有結合したタクロリムスを含む（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。トレーサーと試料由来のタクロリムスとは、微粒子上の限定数の抗タクロリムス結合部位を競合する。インキュベーション時間後、微粒子を磁石に引きつけ、次いで洗浄して、結合していない材料を除去する。次いで、上記装置によって、誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）溶液を添加して、結合したトレーサーのアクリジニウム部分における化学発光を惹起する。化学発光を光度計によって測定する。化学発光シグナル量は、試料中のタクロリムス量に逆比例する。
【０２００】
アッセイの低濃度タクロリムス検出能力は、抗タクロリムス抗体からトレーサーを移動させるタクロリムスの能力に直接関係する。このタクロリムスの能力は、薬物に対する抗体の親和性に直接関係する。図１０の結果によれば、野生型抗体を用いて、タクロリムス濃度３ｎｇ／ｍＬの試料は、トレーサーの約４０％を移動させ得た。３種類の親和性成熟抗体（ＡＭ  １−３）の場合、同じ３ｎｇ／ｍＬタクロリムス試料は、７８−８０％を移動させた。この移動が多いほど、組換え抗体を用いて、より低いタクロリムス濃度を検出することができる。
【実施例１０】
【０２０１】
タクロリムス１−６０−４６変異ＩｇＧ抗体の親和性測定
ネズミハイブリドーマ細胞系１−６０−４６によって産生された１−６０−４６  ＡＭ２  ＩｇＧと１−６０−４６  ＷＴ  ｍＡｂ  ＩｇＧの平衡解離定数を、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））によって求めた（Ｄａｒｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｒａｕｌｔ，  ＡＳＳＡＹ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ２（６）：６４７−６５７（２００４）参照）。一定量のＩｇＧ抗体（ＡＭ２又はＷＴ）を種々の濃度（１０−８Ｍから１０−１３Ｍ）の（Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎから市販されている）タクロリムス薬物と一緒にインキュベートし、試料採取前に平衡にした（２時間から１４時間）。固相に固定されたｂｔ−ｔａｃｒｏ上に抗体：タクロリムス反応混合物を注入することによって、空いた結合部位の量を求めた。続いて、Ｃｙ５（ＧＡＭ−Ｃｙ５）蛍光色素とのヤギ抗マウスポリクローナル抗体複合体（ＧＡＭ）を注入することによって、固相に固定されたｂｔ−ｔａｃｒｏに結合したタクロリムスＩｇＧ抗体を検出した。ＧＡＭ−Ｃｙ５結合度は、固定ｂｔ−ｔａｃｒｏに結合したタクロリムスＩｇＧの量に比例し、適切な波長で励起した後に検出された。製造者（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）によって提供されたソフトウェアを用いて、空いた結合部位の量と反応試料中に存在する抗原の量とを分析することによって、ＫＤを求めた。（ａ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤及び（ｂ）（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中で実験を実施した。結果を下記表Ｂに要約する。生理希釈剤中の１−６０−４６  ＡＭ２  ＩｇＧのＫＤは、１．２×１０−１２Ｍであった。これは、１−６０−４６  ＷＴ  ＩｇＧ値１．９×１０−１１Ｍの１６倍の改善である。選択希釈剤中の１−６０−４６  ＡＭ２  ＩｇＧのＫＤは、１．３×１０−１１Ｍであった。これは、１−６０−４６  ＷＴ  ＩｇＧ値１．５×１０−１０Ｍの１２倍の改善である。
【０２０２】
【表２】
2009534466.tif 000004
【実施例１１】
【０２０３】
タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＩｇＧ安定ほ乳動物細胞系開発
チャイニーズハムスター卵巣細胞に、当業者に公知である技術を用いて、タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＩｇＧ重鎖（「ＨＣ」）（図１１（配列番号３９）参照）及びＩｇＧ軽鎖（「ＬＣ」）（図１２（配列番号４１））遺伝子配列を含むプラスミドを移入した。ある栄養素を欠く培地中でジヒドロ葉酸還元酵素機能を回復した後、安定な細胞系を確認した（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ３３：４０５−４１２（１９８３）参照）。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  ２−５７７と命名されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系は、ブダペスト条約に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に２００６年３月１５日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４３６を割り当てられた。タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２  ＣＨＯ  １−１１５７と命名されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系は、ブダペスト条約に従ってＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に２００６年３月２７日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７４４６を割り当てられた。
【実施例１２】
【０２０４】
抗シクロスポリン（「ＣｓＡ」）ハイブリドーマ２９−５６−１４免疫グロブリン遺伝子の特定、及び単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）への転化
図１６は、ＣｓＡ、及び本明細書では「ＡＭ１又はＭ１７」と称するＣｓＡ代謝産物の構造である。ＣｓＡ及びその代謝産物は、参照により本明細書に援用するＫａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ：  Ｈａｗｋ’ｓ  Ｃａｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ，”  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．，  ３６／８：１５１０−１５１６（１９９０）に詳述されている。
【０２０５】
ＣｓＡに対する免疫グロブリン遺伝子を特定し、実施例１及び２に記載の手順を用いてｓｃＦｖに転化した。メッセンジャーＲＮＡを抗ＣＳＡ  ２９−５６−１４マウスハイブリドーマ細胞（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から市販キットを用いて単離した。Ｎｏｖａｇｅｎ（（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙの系列会社である）Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ  Ｎｏ．６９８３１−３）から購入したマウスＩｇプライマーセットキットを用いて、キットに含まれる免疫グロブリン遺伝子特異的プライマーと一緒に、２９−５６−１４ハイブリドーマｍＲＮＡを逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法に利用した。生成したＰＣＲ産物の配列を決定し、免疫グロブリン可変重鎖及び可変軽鎖遺伝子を特定した（図１３Ａ及び１３Ｂ参照）。
【０２０６】
酵母ディスプレイシステムを用いて、未変異（野生型（「ＷＴ」））及び変異抗シクロスポリン可変軽鎖及び重鎖タンパク質を、酵母結合タンパク質ＡＧＡ２との融合物として酵母表面で発現させた（図１Ｂ及びＢｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５：５５３−５５７（Ｊｕｎｅ  １９９７）参照）。ＰＣＲ  ｓｉｎｇｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（「ＳＯＥ」）によって、可変重遺伝子（「ＶＨ」）と可変軽遺伝子（「ＶＬ」）を配列ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号３６）の柔軟なリンカーを介して連結して、ＷＴシクロスポリン２９−５６−１４  ｓｃＦｖ構築体を作製した。
【０２０７】
以下のプライマー、すなわち、ＣｓＡ  ｓｃＦｖ  ＶＨ順方向−ＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣＴＧＧ（配列番号５９）とＣｓＡ  ｓｃＦｖ  ＶＨ  ４０逆方向−ＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＧＧＣＧＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号６０）を用いて、２９−５６−１４  ＶＨ遺伝子（図１３Ａ、配列番号５５）を増幅した。
【０２０８】
プライマー：ＣｓＡ  ｓｃＦｖ  ＶＬ  ４０順方向−ＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣ（配列番号６１）とＣｓＡ  ｓｃＦｖ  ＶＬ逆方向−ＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号６２）を用いて、２９−５６−１４  ＶＬ遺伝子（図１３Ｂ、配列番号５７）を増幅した。
【０２０９】
続いて、２９−５６−１４  ｓｃＦｖ  ＤＮＡを酵母ディスプレイベクターｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に標準分子生物学技術を用いてクローン化した。このベクターは、ガラクトース誘導性プロモーター、Ｃ末端Ｖ５エピトープタグ並びにそれぞれＥＢＹ１００及びＥ．コリ選択用のトリプトファン及びアンピシリンマーカーを含む。シクロスポリンＷＴ  ２９−５６−１４  ｓｃＦｖ＿ｐＹＤベクターをＤＨ５α  Ｅ．コリに転換し、配列を検証した。
【０２１０】
シクロスポリンＷＴ  ２９−５６−１４  ｓｃＦｖ＿ｐＹＤベクターをトリプトファン欠乏Ｓ．セレビシエ系統ＥＢＹ１００にＧｉｅｔｚとＳｃｈｉｅｓｔｌの方法を用いて転換した（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  ａｎｄ  Ｇｉｅｔｚ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６（５−６）：３３９−４６（Ｄｅｃ．  １９８９））。形質転換反応物の希釈物を（トリプトファンを欠く）選択的グルコースプレート（２％グルコース（０．６７％酵母窒素ベース、０．１０５％Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉａ（「ＨＳＭ」）−ｔｒｐ（トリプトファン）−ｕｒａ（ウラシル）、１．８％細菌寒天、１８．２％ソルビトール、０．８６％ＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏ、１．０２％Ｎａ２ＨＰＯ４  ７Ｈ２Ｏ））に蒔き、３０℃で４８−７２時間インキュベートした。選択グルコース培地に個々のコロニーを接種し、３０℃で１６−２０時間振とう増殖させた。細胞０．５  ＯＤ６００／ｍｌ（１×１０７（「１ｅ７細胞」）／０．５ＯＤ／ｍｌ）を選択ガラクトース培地に移すことによって、タンパク質発現をコロニー中で誘導した。コロニーを２０℃で１６−２４時間振とうし、次いで「ｂｔ−ＣｓＡ」と称する）環式ウンデカペプチドの１位に結合したビオチン基を有するシクロスポリン抗原及び抗Ｖ５との結合についてフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーアッセイでは、２９−５６−１４  ｓｃＦｖを発現する酵母細胞を、ｂｔ−ＣｓＡ及び抗Ｖ５抗体、続いてストレプトアビジン：フィコエリトリン（ＳＡ：ＰＥ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びヤギ抗マウス免疫グロブリン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒａ  ４８８（ＧＡＭ：４８８、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの系列会社である）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒にインキュベートした。図１Ｃと類似したフローサイトメトリーデータの二変量プロットが得られ、２９−５６−１４  ｓｃＦｖ（抗Ｖ５）の完全長表面発現、及び２９−５６−１４  ｓｃＦｖとｂｔ−ｔａｃｒｏの結合（ＳＡ：ＰＥ）を示した。
【実施例１３】
【０２１１】
酵母細胞上で発現された２９−５６−１４  ｓｃＦｖのＣｓＡに対する親和性測定
ｂｔ−ＣｓＡ抗原に対する平衡解離定数（ＫＤ）を（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤中で求めた。ｓｃＦｖ発現を誘導された酵母クローンを、種々の濃度のｂｔ−ＣｓＡと混合し、（ａ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤及び（ｂ）（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中で平衡にし（４−１８時間）、氷冷し、洗浄し、フローサイトメトリー測定用に標識した。抗体正規化、抗原結合平均蛍光強度を抗原濃度に対してプロットし、非線形最小二乗適合（ｙ＝ｍ１＋ｍ２＊ｍ０／（ｍ３＋ｍ０））によってＫＤを求めた。ＷＴ  ＣｓＡ  ２９−５６−１４  ｓｃＦｖ  ＫＤは、生理希釈剤中で５．６×１０−１０Ｍ、選択希釈剤中で２．０×１０−９Ｍであった。ｂｔ−ＣｓＡに対するＫＤ値を、過剰の競合剤の存在下で変異原ライブラリーのスクリーニングに用いた。
【実施例１４】
【０２１２】
２９−５６−１４  ＣＤＲ変異原ライブラリーの作製
抗シクロスポリン抗体２９−５６−１４の全６個のＣＤＲを、実施例４に記載の手順によって変異誘発に供した。３連続ＣＤＲアミノ酸位置を無作為に変異させた、８０００個のメンバーで構成された個々のライブラリー。各ＣＤＲの特定の領域を欠く、直線化されたｐＹＤ１ベクターをＰＣＲによって調製し、酵母に固有の相同組換えシステムを用い、Ｇｉｅｔｚライブラリー転換プロトコル（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  ａｎｄ  Ｇｉｅｔｚ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６（５−６）：３３９−４６（Ｄｅｃ  １９８９））を用いて、標的ＣＤＲ中の３アミノ酸変異原性ウィンドウ内の全１９個のアミノ酸置換候補をコードする、縮重一本鎖オリゴヌクレオチドで「ギャップ」を置換した。転換された酵母細胞を、再構成されたベクター上に存在する栄養要求性トリプトファンマーカーを用いて選択的に回収した。合計５３個のＣＤＲ変異原ライブラリーを作製し、個々のＣＤＲ変異原ライブラリーを組み合わせて、８個のＣＤＲプールライブラリーを作製した。各ＣＤＲ領域内の個々のライブラリーを選択前にプールした（例えば、Ｈ１ライブラリー１−８を組み合わせて、Ｈ１マスターライブラリーを作製した。）。しかし、各ＣＤＲマスターライブラリーは、選択プロセス中に互いに別個のままにされた。
【実施例１５】
【０２１３】
Ｍ１７競合剤の存在下における２９−５６−１４変異原ライブラリーの選択
フローサイトメトリー選別を用いた競合的選択戦略によって、２０−１００倍モル過剰のＣｓＡ代謝産物（Ｍ１７）の存在下で、ｂｔ−ＣｓＡに対する結合特性が改善された８プールのＣＤＲ変異原ライブラリーから２９−５６−１４変種を特定した。初期ラウンドのライブラリースクリーニングでは、２９−５６−１４変異原ライブラリーを、（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中で１ｎＭ  ｂｔ−ＣｓＡ＋２０ｎＭ  Ｍ１７と一緒に室温で終夜インキュベートした。細胞を洗浄し、個々の細胞上に残留したｂｔ−ＣｓＡ抗原の量をＳＡ：ＰＥ（１：２００希釈）を用いて検出した。抗原結合を、抗Ｖ５  ｍＡｂ（２．５ｕｇ／ｍｌ）及びＧａＭ−４８８（１：２００希釈）を用いた個々の細胞上のｓｃＦｖ発現量に対して正規化した。対照試料を調製して蛍光補償を設定し、非特異的結合をモニターした。ｂｔ−ＣｓＡ結合が改善された変種の集団を、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選択的に富化した。
【０２１４】
４ラウンドの選択を各ライブラリープールに対して実施した。各ラウンドの選択は、ｓｃＦｖ発現シグナルに対してプロットされた、ＳＡ：ＰＥ（抗原結合性）チャネル中で最大の蛍光度を有する細胞の０．１％−０．５％を選択的に通過させることからなった。選択された細胞を収集し、デキストロースを含む培地中で３０℃で２−３日間再増殖させた（選択ラウンド出力）。デキストロースは、ガラクトースプロモーターからの発現を阻害し、それによってｓｃＦｖ発現を阻止する。各ライブラリーの一定分量を取り出して、保存用の各ラウンド出力とした。次いで、ｓｃＦｖ発現のために、ガラクトースを含む培地を用いて、２０℃で１２−２４時間出力を誘導し、Ｍ１７代謝産物競合剤１００ｎＭ（１００倍モル過剰）を用いて選択プロセスを繰り返した。Ｍ１７競合剤の存在下でｂｔ−ＣｓＡの結合を増加させる変異を含むライブラリーは、選択の各ラウンドを通して次第に鮮明になった。第４ラウンドの選別後の細胞の一定分量を選択培地に蒔いて、更なる分析用に個々のクローンを得た。
【実施例１６】
【０２１５】
Ｍ１７代謝産物との交差反応性が低下した、選択された２９−５６−１４変種の配列解析
実施例１５に記載の選択から過剰のＭ１７代謝産物の存在下でｂｔ−ＣｓＡとの結合が改善された各マスターＣＤＲライブラリー（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３−１、Ｈ３−２、Ｌ１−１、Ｌ１−２、Ｌ２及びＬ３）由来の幾つかの個々のクローンからｓｃＦＶ領域をＰＣＲによって増幅した。ベクター特異的プライマー（ｐＹＤ４１順方向−ＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号３７）及びｐＹＤ４１逆方向−ＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧ（配列番号３８））を用いてｓｃＦｖ遺伝子を増幅し、配列を決定して、ＣＤＲアミノ酸置換を確認した。
【実施例１７】
【０２１６】
シクロスポリン２９−５６−１４コンビナトリアル変異クローンの作製及び分析
各マスターＣＤＲライブラリーから４ラウンドのフローサイトメトリー選択後に確認されたＣＤＲ変異体配列を用いて、個々の変異の異なる組合せを含むｓｃＦｖ遺伝子を構築した。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ２及びＬ３  ＣＤＲ領域に種々の変異を含むコンビナトリアルクローンをＰＣＲ増幅によって構築し、当業者に公知の技術を用いて組み合わせた。コンビナトリアル変異クローンの配列を検証し、実施例１５に記載したように、Ｍ１７競合剤１００ｎＭ（１００倍モル過剰）の存在下における更なるフローサイトメトリー選択用に、上述したように酵母に転換した。Ｍ１７代謝産物の存在下でｂｔ−ＣｓＡに対する特異性の改善されたコンビナトリアル変異クローンを富化するのにわずか１ラウンドの競合的選別しか必要としなかった。
【０２１７】
ベクター特異的プライマー（ｐＹＤ４１順方向−ＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号３７）及びｐＹＤ４１逆方向−ＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧ（配列番号３８））を用いてｓｃＦｖ遺伝子を増幅し、配列を決定して、複数のＣＤＲアミノ酸置換を確認した。配列解析によって、ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３、Ｌ２及びＬ３における変異をコードするわずか４個の組合せからなる集団を特定した（図１４参照）。ＩＣ５０データに基づいて、変異コンビナトリアルクローンＲ２−９を最良のクローンとして選択した。ＷＴ及び変異コンビナトリアルクローンを、０から５ｕＭのＭ１７競合剤濃度の存在下で、０．５ｎＭ  ｂｔ−ＣｓＡと一緒に終夜インキュベートした。（ａ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤及び（ｂ）（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中で試験したクローンＲ２−９のＩＣ５０データを図１５に示す。クローンＲ２−９においてコードされた変異は、ＷＴ  ＣｓＡ  ２９−５６−１４と比較して、Ｍ１７代謝産物のＩＣ５０を３０−１００倍増加させる。
【実施例１８】
【０２１８】
Ｍ１７及びＭ１競合剤の存在下における２９−５６−１４変異原ライブラリーの選択
この実施例は、シクロスポリン親薬物に対する選択を改善し、主要な代謝産物に対する特異性を低下させる（低交差反応性）抗シクロスポリン抗体によってコードされるＣＤＲ（相補性決定領域）変異を選択する、酵母ディスプレイを用いたスクリーニング方法を記述する。
【０２１９】
抗シクロスポリンマウスハイブリドーマ２９−５６−１４は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖からなる単鎖構築体（ｓｃＦｖ）が酵母細胞表面で発現されるモデル系であった。ＣＤＲ走査手法を利用した複数の抗原結合部位における変異をコードするｓｃＦｖ酵母ライブラリーを、結合競合剤として５−２００倍モル過剰のＡＭ１（Ｍ１７）代謝産物とＡＭ９（Ｍ１）代謝産物の一緒の存在下で、ビオチン化ＣｓＡとの結合の改善についてフローサイトメトリーによってスクリーニングした。幾つかの重鎖及び軽鎖ＣＤＲにおける変異をコードする異なる酵母クローンを単離した。これらの酵母クローンは、ＣｓＡ野生型酵母対照と比較して、ＡＭ１（Ｍ１７）に対するＫｉ（阻害定数）が最高１，０００倍増加し、ＡＭ９（Ｍ１）に対する５倍を超えるＫｉを示した。ＣｓＡに対する親和性の最小変化は、ＡＭ１（Ｍ１７）及びＡＭ９（Ｍ１）に対する結合が減少した変異体で認められた。本実施例及び前の実施例で使用したスクリーニング手法によって、免疫抑制剤に対する改善された特異性、及び代謝産物に対するより好都合な交差反応性（より低い結合）を有する抗体を開発することができる方法であって、最終的に診断免疫測定法に利用することができる方法が確立されたことが、これらの結果から確認される。
【０２２０】
当業者は、本発明が、その目的を実行して、記載した成果及び効果、並びに本発明に固有の成果及び効果を得るのに、十分に適合していることを容易に理解するはずである。本明細書に記載する組成物、処方、方法、手順、処置、分子、具体的化合物は、好ましい実施形態の現時点での典型であり、例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示する本発明に種々の置換及び改変をなし得ることを、当業者は容易に理解できるはずである。
【０２２１】
本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示している。すべての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により援用されるように具体的かつ個々に指示されたごとく、同じ程度に参照により本明細書に援用される。
【０２２２】
本明細書に説明的に記述された本発明は、本明細書に具体的に開示しない任意の要素、制約の非存在下で適切に実施し得る。すなわち、例えば、本明細書の各例においては、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれも、他の２つの用語のどちらかと置換し得る。使用した用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定的な用語ではない。かかる用語及び表現の使用においては、示した、また、記述した特徴又はその一部の任意の等価物を除外することを意図したものではない。そうではなく、特許請求する本発明の範囲内で種々の改変が可能であることを認識されたい。したがって、本発明を好ましい実施形態、及び必須ではない特徴によって具体的に開示したが、本明細書で開示する概念の改変及び変形が当業者によってなされ得るものであり、かかる改変及び変形は、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１Ａ】図１Ａはタクロリムスの構造である。図１Ｂは、ｓｃＦｖ抗体の酵母細胞表面ディスプレイの概略図である。図１Ｃは、フローサイトメトリーアッセイによって測定された、野生型（「ＷＴ」）１−６０−４６  ｓｃＦｖ酵母によるｓｃＦｖ発現と抗原結合を示す二変量プロットである。図１Ｄは、タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖフローサイトメトリーの解離速度アッセイプロットである。
【図１Ｂ】図１Ａはタクロリムスの構造である。図１Ｂは、ｓｃＦｖ抗体の酵母細胞表面ディスプレイの概略図である。図１Ｃは、フローサイトメトリーアッセイによって測定された、野生型（「ＷＴ」）１−６０−４６  ｓｃＦｖ酵母によるｓｃＦｖ発現と抗原結合を示す二変量プロットである。図１Ｄは、タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖフローサイトメトリーの解離速度アッセイプロットである。
【図１Ｃ】図１Ａはタクロリムスの構造である。図１Ｂは、ｓｃＦｖ抗体の酵母細胞表面ディスプレイの概略図である。図１Ｃは、フローサイトメトリーアッセイによって測定された、野生型（「ＷＴ」）１−６０−４６  ｓｃＦｖ酵母によるｓｃＦｖ発現と抗原結合を示す二変量プロットである。図１Ｄは、タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖフローサイトメトリーの解離速度アッセイプロットである。
【図１Ｄ】図１Ａはタクロリムスの構造である。図１Ｂは、ｓｃＦｖ抗体の酵母細胞表面ディスプレイの概略図である。図１Ｃは、フローサイトメトリーアッセイによって測定された、野生型（「ＷＴ」）１−６０−４６  ｓｃＦｖ酵母によるｓｃＦｖ発現と抗原結合を示す二変量プロットである。図１Ｄは、タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖフローサイトメトリーの解離速度アッセイプロットである。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、タクロリムス１−６０−４６  ＷＴ重鎖可変（「ＶＨ」）配列（配列番号４３）（図２Ａ）及び軽鎖可変（「ＶＬ」）配列（配列番号４５）（図２Ｂ）の核酸配列である。これらの核酸配列によってコードされるアミノ酸を表す３文字表記を上に示す。
【図３】タクロリムス１−６０−４６  ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）変異原ライブラリーの略図である。無作為化された３アミノ酸配列の各々の左側にライブラリー名を示す。タクロリムス１−６０−４６  ＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列を各ＣＤＲの下に示す。
【図４】タクロリムス１−６０−４６  ＶＬ  ＣＤＲ変異原ライブラリーの略図である。無作為化された３アミノ酸配列の各々の左側にライブラリー名を示す。タクロリムス１−６０−４６  ＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列を各ＣＤＲの下に示す。
【図５】図５Ａ−５Ｃは、３ラウンドの選択中の代表的なタクロリムス１−６０−４６変異原性ＣＤＲライブラリーの二変量プロットである。ｓｃＦｖ発現をＸ軸上に示す。Ｙ軸上に示す抗原結合性に対してｓｃＦｖ発現をプロットする。代表的なソートゲートは、抗原結合性クローンの最も鮮明な（ｂｒｉｇｈｔｅｓｔ）０．１％−１．０％を分離した。これらを各プロット中に示す。
【図６】タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ＶＨ領域のアミノ酸配列（配列番号１−７）を、変異原性ＶＨ  ＣＤＲライブラリーから単離された変異クローンと比較した表である。クローン名を左側に示す。ＶＨ配列を含む種々の領域を上段に示す。ＷＴ  １−６０−４６配列とは異なるアミノ酸を下線を引いた太字で示す。種々の変異クローンのＣＤＲ  Ｈ２領域を配列番号１５−１８で示す。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｂは、タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ＶＬ領域のアミノ酸配列（配列番号８−１４）を、変異原性ＶＬ  ＣＤＲライブラリーから単離された変異クローンと比較した表である。クローン名を左側に示す。ＶＨ配列を含む種々の領域を上段に示す。ＷＴ  １−６０−４６配列とは異なるアミノ酸を下線を引いた太字で示す（図７Ａ）。変異クローンのＣＤＲ  Ｌ１領域を配列番号１９−２２で示す（図７Ｂ）。変異クローンのＣＤＲ  Ｌ３領域を配列番号２３−３２で示す。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｂは、タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ＶＬ領域のアミノ酸配列（配列番号８−１４）を、変異原性ＶＬ  ＣＤＲライブラリーから単離された変異クローンと比較した表である。クローン名を左側に示す。ＶＨ配列を含む種々の領域を上段に示す。ＷＴ  １−６０−４６配列とは異なるアミノ酸を下線を引いた太字で示す（図７Ａ）。変異クローンのＣＤＲ  Ｌ１領域を配列番号１９−２２で示す（図７Ｂ）。変異クローンのＣＤＲ  Ｌ３領域を配列番号２３−３２で示す。
【図８】タクロリムスＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖクローンの親和性パラメータを独特の変異体と比較した表である。クローン名を左側に示す。種々の変異の組合せを含むクローンは、個々の変異を含むクローンの配列リストによって命名される。試験した親和性パラメータ（１０％メタノールあり又はなし）を上段に示す。ＷＴ  １−６０−４６  ｓｃＦｖ値と変異ｓｃＦｖ値の比を用いて、上記パラメータに対する改善値を求めた。
【図９】図９Ａ−９Ｂは、（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中のタクロリムス１−６０−４６  ＷＴ  ｓｃＦｖ及びコンビナトリアル変異クローン（Ｈ２  １Ａ／Ｌ１−１Ｂ／Ｌ３−２Ｂ、Ｈ２−１Ａ／Ｌ１−１Ｂ／Ｌ３−Ａ、Ｈ２−１Ａ／Ｌ３−１Ｂ及びＨ２−１Ｂ／Ｌ１−１Ｂ／Ｌ３−１Ｂ）の親和性分析結果を示すグラフである。図９Ａは、解離速度分析結果を示すグラフである。各クローンについて非解離（ｎｏ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）対照ｒｘに対して抗原結合性シグナルを正規化し、秒単位で測定した時間に対してプロットした。図９Ｂは、平衡解離定数（ＫＤ）分析結果を示すグラフである。各クローンについて飽和抗原条件における最大平均蛍光強度値に対して抗原結合性シグナルを正規化し、（「ｂｔ−ｔａｃｒｏ」と称する）抗原の濃度に対してプロットした。
【図１０】図１０Ａは、ＷＴ  １−６０−４６（ＷＴ）配列を有するＩｇＧに転化されたタクロリムス１−６０−４６変異クローン由来のＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲ領域のすべてにおけるアミノ酸残基を比較した表である。任意の所与の配列中に存在する種々の変異の組合せを、個々の変異を含むクローンの配列リストによって左側に示す。生成した各１−６０−４６変異ＩｇＧの名称を右側に示す（すなわち、ＡＭ１、ＡＭ２、ＡＭ３、ＡＭ４又はＡＭ５）。ＷＴ  １−６０−４６配列とは異なるアミノ酸を下線を引いた太字で示す。図１０Ｂは、アッセイ抽出緩衝剤を用いてＷＴ  １−６０−４６  ＩｇＧを種々の１−６０−４６変異ＩｇＧ（ＡＭ１、ＡＭ２又はＡＭ３）と比較した免疫測定結果を示すグラフである（アッセイ抽出緩衝剤は、９０％メタノール、１０％エチレングリコール及び１００ｍＭ硫酸亜鉛を含んだ。）。示したＩｇＧで被覆された微粒子を、非標識タクロリムス抗原の種々の濃度（０ｎｇ／ｍｌ−３０ｎｇ／ｍｌ）において、（トレーサーとして用いた）標識タクロリムス抗原と一緒にインキュベートした。（Ｘ軸上に示した）トレーサーシグナルの比を、（Ｙ軸上に示した）非標識タクロリムスの濃度に対してプロットした。
【図１１】タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２ネズミ重鎖ＩｇＧの核酸配列（配列番号３９）である。この核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列（配列番号４０）を上に示す。
【図１２】タクロリムス１−６０−４６  ＡＭ２ネズミ軽鎖の核酸配列（配列番号４１）である。この核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列（配列番号４２）を上に示す。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、シクロスポリンハイブリドーマ２９−５６−１４  ＷＴ重鎖可変（ＶＨ）配列（配列番号５５）及び軽鎖可変（ＶＬ）配列（配列番号５７）の核酸配列である。これらの核酸配列によってコードされるアミノ酸（それぞれ、配列番号５６及び５８）を表す３文字表記を上に示す。
【図１４】２９−５６−１４  ＷＴ及びコンビナトリアル変異体Ｒ２−９  ＣＤＲ配列である。ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３、Ｌ２及びＬ３中の交差反応性の改善に寄与するアミノ酸変異を変異体Ｒ２−９について特定した。ＣｓＡ  ２９−５６−１４  ＷＴとは異なる変異配列を下線を引いた太字で示す。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、（ａ）（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１％ＢＳＡで構成された）生理希釈剤又は（ｂ）（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ及び１０％メタノールで構成された）選択希釈剤中で分析されたＭ１７代謝産物の濃度を増加させて測定した、ｂｔ−ＣｓＡ結合に対する２９−５６−１４  ＷＴ及び変異体Ｒ２−９酵母クローンのＩＣ５０データを示すグラフである。
【図１６】シクロスポリンＡ（左）、及び本明細書では「ＡＭ１又はＭ１７」と称するシクロスポリンＡの代謝産物（右）の構造である。シクロスポリンＡ及び代謝産物Ｍ１７（ＡＭ１）の分子式及び分子量を、対応する構造の下に記載する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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