(57)【要約】本発明の一実施形態は、ラマン分光法で使用する色素を産生するために、遷移金属イオンと、適切な配位子基との間の錯化合物の形成に基づいたＳＥＲＲＳ活性標識基を使用する。上記金属イオンおよび適切な配位子基は、遊離状態でしばしば蛍光性である配位子が、錯形成した際に、それらの励起状態からの増強された無放射減衰／緩和を実施できるように選択され、それにより、強力な発色団が形成され、一方では、バックグランド蛍光からのラマンシグナルの妨害が低減され、かつエネルギー移動機序によってラマン散乱が増強される。錯体は、配位子とイオンとの間の静電気引力によって、または疎水性引力によって形成されうる。
2009527733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配位子イオン錯体を含む色素を提供するステップであって、前記配位子が最低空電子準位を有し、かつ前記イオンが励起電子準位を有し、前記イオンの励起電子準位にある電子が前記配位子の最低空電子準位に無放射で遷移しうるようなエネルギー準位を前記配位子の最低空電子準位が有し、前記錯体が基底状態電子準位を有するステップと、
色素の存在、不在、または量を検出するために、特定の波長の放射線を前記色素に照射するステップと、
照射された色素からの放射線を検出するステップと
を含み、
前記基底状態にある電子が光子吸収によって励起状態に昇位されるように、かつ前記イオンの励起電子準位から前記配位子の最低空電子準位に電子が遷移して、前記錯体の基底状態電子準位と前記イオンの励起電子準位との間にある熱的に到達可能な電子準位を介して前記基底状態電子準位への無放射緩和を行うことがエネルギー的に好適であるように、前記錯体の電子準位および前記放射線の波長が設定されている、
反応領域内の試料中の色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項２】
前記配位子の最低空電子準位および前記イオンの励起電子準位のエネルギーが互いのｋｂＴ以内にある、請求項１に記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項３】
前記配位子の最低空電子準位と前記熱的に到達可能な電子準位との間、ならびに前記熱的に到達可能な電子準位と前記基底状態電子準位との間のエネルギー差がどちらもｋｂＴ以下である、請求項２に記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項４】
前記照射放射線が、電子を前記イオンの基底状態から前記イオンの励起電子準位に励起するのに十分なエネルギーの放射線である、請求項１、２、または３に記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項５】
前記照射放射線の波長が、提供されるエネルギーが前記イオンの励起エネルギー準位と前記イオンの基底状態との間のエネルギー差のｋｂＴ以内であるような波長である、請求項４に記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項６】
前記配位子の最低空電子準位に遷移する励起電子が、前記熱的に到達可能な電子準位を介して、スピン転移を必要とせずに前記錯体の基底状態に緩和できる、前記請求項のいずれかに記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項７】
前記熱的に到達可能な電子エネルギー準位の存在により、励起状態にある電子の代替の緩和経路が提供され、前記励起状態にある電子が緩和する際に光子が放出される確率が低減される、前記請求項のいずれかに記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項８】
前記配位子イオン錯体が、電子の熱緩和から生じるエネルギーを受容するのに利用可能な熱振動モードを有する、前記請求項のいずれかに記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項９】
前記配位子イオン錯体が、前記配位子の最低空電子エネルギー準位と前記熱的に到達可能な電子エネルギー準位との間、ならびに前記熱的に到達可能な電子エネルギー準位と前記基底状態電子エネルギー準位との間の電子遷移のエネルギーに熱的に到達可能である振動モードを有する、請求項８に記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項１０】
前記イオンが、２＋イオンを形成でき、かつ八面体配置を有する任意の金属である、前記請求項のいずれかに記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項１１】
前記イオンが、バナジウム、クロム、銅、マグネシウム、または鉄イオンのうちの１つである、前記請求項のいずれかに記載の、色素の存在、不在、または量を検出する方法。
【請求項１２】
結合基と、
配位子イオン錯体であって、前記配位子が最低空電子準位を有し、かつ前記イオンが励起電子準位を有し、前記イオンの励起電子準位にある電子が前記配位子の最低空電子準位に無放射で遷移しうるようなエネルギー準位を、前記配位子の最低空電子準位が有し、前記錯体が基底状態電子準位を有する錯体と
を含み、
前記基底状態にある電子が光子吸収によって励起状態に昇位できるように、かつ前記イオンの励起電子準位から前記配位子の最低空電子準位に電子が遷移して、前記錯体の基底状態電子準位と前記イオンの励起電子準位との間にある熱的に到達可能な電子準位を介して前記基底状態電子準位への無放射緩和を行うことがエネルギー的に好適であるように、前記錯体の電子準位が設定されている色素。
【請求項１３】
前記配位子の最低空電子準位および前記イオンの励起電子準位のエネルギーが互いのｋｂＴ以内にある、請求項１２に記載の色素。
【請求項１４】
前記配位子の最低空電子準位と前記熱的に到達可能な電子準位との間、ならびに前記熱的に到達可能な電子準位と前記基底状態電子準位との間のエネルギー差がどちらもｋｂＴ以下である、請求項１３に記載の色素。
【請求項１５】
前記配位子の最低空電子準位に遷移する励起電子が、前記熱的に到達可能な電子準位を介して、スピン転移を必要とせずに前記錯体の基底状態に緩和できる、請求項１２から１４のいずれかに記載の色素。
【請求項１６】
前記熱的に到達可能な電子エネルギー準位の存在により、励起状態にある電子に代替の緩和経路が提供され、前記励起状態にある電子が緩和する際に光子が放出される確率が低減される、請求項１２から１５のいずれかに記載の色素。
【請求項１７】
前記配位子イオン錯体が、電子の熱緩和から生じるエネルギーを受容するのに利用可能な熱振動モードを有する、請求項１２から１６のいずれかに記載の色素。
【請求項１８】
前記配位子イオン錯体が、前記配位子の最低空電子エネルギー準位と前記熱的に到達可能な電子エネルギー準位との間、ならびに前記熱的に到達可能な電子エネルギー準位と前記基底状態電子エネルギー準位との間の電子遷移のエネルギーに熱的に到達可能である振動モードを有する、請求項１７に記載の色素。
【請求項１９】
前記イオンが、２＋イオンを形成でき、かつ八面体配置を有する任意の金属である、請求項１２から１８のいずれかに記載の色素。
【請求項２０】
前記イオンが、バナジウム、クロム、銅、マグネシウム、または鉄イオンのうちの１つである、請求項１２から１９のいずれかに記載の色素。
【請求項２１】
検出器アセンブリの配置で使用する分析物担体であって、
金属面と、請求項１２から２０のいずれかに記載のある量の色素とを含有する反応領域を含み、
特定の波長の放射線で反応領域を照射し、前記色素からの反応を検出することによって、色素の存在、不在、または量を決定できる分析物担体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の分析物担体を含み、かつ金属表面近傍の領域を照射するように配置されたレーザー光源と、前記色素からの反応を検出することによって色素の存在、不在、または量を検出するように配置された検出器とをさらに含む検出器アセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分光法で使用する分子色素に関する。詳細には、本発明は、ラマン散乱などの光散乱を用いた分光技法で使用される色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分析物分子の作用または存在を検出する多くの技法があることが知られている。そのような技法の１つはラマン散乱（ＲＳ）効果を利用するものである。光が分子から散乱する場合、光子の大部分は弾性的に散乱する。散乱光子の大部分は、入射光子と同じエネルギー（ならびに、したがって振動数および波長）を有する。しかし、その光のうちわずかな割合（およそ１０７光子に１つ）は、入射光子のものとは異なった振動数で散乱する。分子に対して散乱した光子がエネルギーを失った場合、それは入射光子より長い波長を有する（ストークス散乱と呼ばれる）。反対に、散乱光子がエネルギーを獲得した場合、それはより短い波長を有する（アンチストークス散乱と呼ばれる）。通常は、ストークス散乱がより強い効果である。
【０００３】
この非弾性散乱へといたる過程は、それを１９２８年に最初に記述したＳｉｒ  Ｃ．Ｖ．  Ｒａｍａｎにちなんでラマン効果と呼ばれる。それは、分子の振動、回転、または電子エネルギーの変化と関連しており、光子から分子に移動したエネルギーは、通常、熱として放散される。入射光子とラマン散乱光子との間のエネルギー差は、散乱分子の振動状態または電子遷移のエネルギーと等しく、入射レーザーからの、量子化されたエネルギー差で散乱光子をもたらす。散乱光の強度対エネルギー差または波長差のプロットは、ラマンスペクトルと呼ばれ、その技法はラマン分光法（ＲＳ）として知られている。
【０００４】
表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）は、ＲＳ分析技法の変法である。ある種の金属表面に分子が物理的に近接している場合には、分子と金属の表面電子（プラズモン）との間でエネルギーがさらに移動するため、ラマンシグナルの強度を桁外れに増強することができる。ＳＥＲＳを行うには、原子的に粗面化された金属表面に分析物分子を吸着させ、増強ラマン散乱を検出する。ＳＥＲＳは、溶液中の銀コロイドを用いても実施できる。
【０００５】
金属表面から数オングストローム以内の分子またはイオンからのラマン散乱は、溶液中より１０３〜１０６倍大きいものでありうる。可視光に近い波長では、ＳＥＲＳは銀で最も強いが、金、銅、およびアルミニウムでも容易に観察可能である。様々な他の金属からも有用なＳＥＲＳ増強が得られることが最近の研究によって示されている。
【０００６】
ＳＥＲＳ効果は、本質的には、分子と金属表面近傍の電磁場との間の共鳴エネルギー移動である。励起レーザーの電気ベクトルが金属表面で双極子を誘導し、その復元力がこの励起の共鳴振動数の振動電磁場をもたらす。この共鳴の強度および振動数は、主として、いわゆるプラズモン波長を決定する金属表面の自由電子（「プラズモン」）、ならびに金属およびその環境の誘電率によって決定される。表面に吸着されているか、または極めて近接している分子は、例外的に大きな電磁場に曝されるが、その中では、表面で正常な振動モードとの共役が最も強く強化される。これが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果であり、これによって、プラズモンと表面近傍の分子との間の、空間を越えてのエネルギー移動が可能となる。エネルギー移動の効率はレーザー波長と金属のプラズマ波長との間の良好な適合に依存するので、表面プラズモン共鳴の強度は、入射光の波長および金属表面の形態を含めた多くの因子に依存している。
【０００７】
この増強をさらになお増大させるために、発色団部分を用いて、上記エネルギー移動に追加の分子共鳴寄与を与えることができる。これは表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）と呼ばれる技法である。共鳴ラマンピークの強度は、分子の散乱断面積の２乗に比例している。散乱断面積は、次に、遷移双極子モーメントの２乗に関係しており、したがって、通常は吸収スペクトルに従う。それらの吸収スペクトルにおける吸収ピークに近いエネルギーを入射光子が有する場合、それらの分子は、散乱事象が起きたときに励起状態にある可能性が高く、それによって、アンチストークスシグナルの相対強度を増大させる。上記表面効果と共鳴増強効果との組合せは、通常は従来のラマン分光法の１０９〜１０１４倍という莫大なシグナル増強をＳＥＲＲＳが提供できることを意味する。
【０００８】
ラマン散乱の共鳴増強に加えて、最近、レゾナンスデエンハンスメント（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｄｅ−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）に関する記述がある。これは、共鳴エネルギー移動の機序によってラマンシグナルの強度が低減するものである。特定の条件下では、対象とする励起エネルギー状態にエネルギーが近い励起エネルギー状態によって、ラマン散乱の低減が生じうる。この状況では、ラマン強度は断面積の合計の２乗に比例し、それらが異符号のものである場合には、相殺的干渉が起こり、観測されたレゾナンスデエンハンスメントが生じうる。これは、ラマンベースの検出器系で使用する代替の計量法を提供する。すなわち、このレゾナンスデエンハンスメント効果を促進するレーザー振動数を用いることによって、特定のラマン活性発色団からのシグナルをラマンスペクトルから選択的に除去できる。
【０００９】
表面増強ラマン分光法、およびその延長である表面増強共鳴ラマン分光法は、定量的な生物分析ツールとして人気を増しつつある。両技法とも、金属表面における可動伝導電子の「プラズマ」（プラズモン）と、その表面近傍の分子種との間の相互作用に大幅に依存している。この相互作用によって、特定の振動エネルギーにおけるラマン散乱の実質的な増強がもたらされ、ラマン散乱光中に強度なスペクトルシグナルが生じる。
【００１０】
最近まで、増強機序の理解は論争に包まれていた。化学増強機序と電磁増強機序との間での１０６を超える増強因子の分配に関して、２つの主要な分派が意見を相違していた。化学増強機序は、現在では１０２の増強因子の寄与があると考えられており、これは、金属と吸着質分子との間に電荷移動状態が生成されることと調和する。この機序は、部位特異的かつ分析物依存的である。上記分子が化学増強を受けるためには、上記表面に直接的に吸着されていなければならない。電磁増強機序は、通常のラマン散乱に対して１０４倍を超える増強に寄与する。電磁増強を理解するためには、表面のナノスケール粗度特徴のサイズ、形、および材質を考慮しなければならない。正しい波長の光が金属粗度特徴を照射した場合には、伝導電子のプラズマが集合的に振動する。この集合的振動は、電子のこのプラズマ表面に局在するので、それは局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）として知られている。ＬＳＰＲは、共鳴波長の吸収および散乱を可能にし、上記粗度特徴の周りに大きな電磁場を生成する。分子が電磁場内に置かれたならば、増強ラマンシグナルが測定される。
【００１１】
電磁場の強度および局所密度は、様々なパラメーターによって決定される。散乱光の波長は、そのエネルギーを決定し、金属の組成および形態は、表面プラズモンが光子エネルギーと共役する強度および効率を決定する。金属および分析物溶液の相対誘電性質などの他の因子も、この効果に強く寄与する。加えて、電磁場と金属表面近傍の任意な分子との間のエネルギー移動の効率は、例えば、赤外スペクトル領域の特定の振動モードおよび紫外線における電子エネルギー移動を含めた分子それ自体における共鳴エネルギー状態によって決定される。これは、ＳＥＲＲＳが従来のＳＥＲＳを上回る性能を獲得する機序である。
【００１２】
本発明者らは、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を用いた場合でさえ、ラマン散乱効果が提供するラマン散乱放射線が、レイリー散乱（この場合、散乱光子が入射光子と同じエネルギーを有する）と比較して少量であるという問題を認識した。したがってラマンシグナルはノイズと比較して弱いので、ラマンシグナルをノイズと区別するのを助ける機序を導入する必要があると、本発明者らはさらに認識した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
本発明は、それへの参照が指示されている、特許請求の範囲で定義される。
【００１４】
本発明の一実施形態は、ラマン分光法で使用する色素を産生するために、遷移金属イオンと、適切な配位子基との間の錯化合物の形成に基づいたＳＥＲＲＳ活性標識基を使用する。
【００１５】
上記金属イオンおよび適切な配位子基は、遊離状態でしばしば蛍光性である配位子が、錯形成した際に、それらの励起状態からの増強された無放射減衰／緩和を実施できるように選択され、それにより、強力な発色団が形成され、一方では、バックグランド蛍光からのラマンシグナルの妨害が低減され、かつエネルギー移動機序によってラマン散乱が増強される。錯体は、配位子とイオンとの間の静電気引力によって、または疎水性引力によって形成されうる。
【００１６】
発色団は、当然、当業者に周知であり、本明細書では、特定の光学特徴を有する基を包含するものとして使用される。「色素」という用語は、ある種の機能性を与えるために付着された１つまたは複数の連結基を有する発色団を指す。そのような機能性は、例えば、金属表面探索基（ｍｅｔａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｅｅｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）、または分析物への結合を可能にする基を付加した結果得ることができる。発色団は、表面増強に適した波長の励起レーザーを強力に吸収するものであるべきである（最も一般的なラマンレーザーは、５１４ｎｍ、５３２ｎｍ、および７８５ｎｍである）。これは緑色〜赤色の可視範囲にあり、それゆえ、伝統的な明色発色団は、特に良好なラマン活性色素の成分であることが分かっている。
【００１７】
分析物は、検出または定量化することが望まれている任意の化学物質である。適した分析物の例には、生体分子（タンパク質、抗体、核酸、糖質、プロテオグリカン、脂質、またはホルモンなど）、医薬品または他の治療薬およびそれらの代謝産物、依存性薬物（例えば、アンフェタミン、オピエート、ベンゾジアゼピン、バルビツラート、カンナビノイド、コカイン、ＬＳＤ、およびこれらの代謝産物）、爆発物（例えば、ＴＮＴ、ＲＤＸ、ＰＥＴＮ、およびＨＭＸを含めたニトログリセリンおよびニトロトルエン）、ならびに環境汚染物質（例えば、除草剤、殺虫薬）が含まれる。
【００１８】
分析物試料は、分析物の存在または量について試験することが望まれている任意の試料である。分析物の存在、不在、または量について試験することが望ましい状況は多数存在する。例としては、臨床適用（例えば、血液または尿試料などの生物試料中における抗原または抗体の存在を検出すること）、依存性薬物（例えば違法試料、または体液もしくは呼気試料などの生体試料中のもの）の存在の検出、爆発物の検出、あるいは環境汚染物質（例えば、液体、空気、土、または植物試料中のもの）の検出が含まれる。
【００１９】
分析物自体を直接的に検出することに加えて、対象とする分析物の存在下で、ラマンシグナルの検出可能な変化を生成できるレポーター分子を用いてそれらを間接的に検出することも可能である。これの一例は、分析物特異的な抗体の抗原結合部位からの色素標識ペプチドの置換除去であり、それによって遊離レポーター分子を放出し、それらが次に、ＳＥＲＲＳ活性金属表面と相互作用できる。本発明者らの目的では、そのようなレポーター分子も「分析物」とみなすことができる。
【００２０】
色素は、分析物試料のその他の成分の存在下、そして試料中の分析物の存在（または量）を検出できるように、検出法が行われる条件下で、分析物に選択的に結合する任意の薬剤である選択剤によって分析物に結合しうる。選択剤の性質は、当然、分析物の同一性に依存する。多くの場合、選択剤は抗体となる。しかし、他の適切な分析物結合パートナーも使用できる。例えば、分析物が抗体である場合には、選択剤は、その抗体が選択的に結合する抗原または抗原誘導体でありうる。分析物が核酸である場合には、選択剤は、分析物核酸にハイブリッド形成する核酸または核酸類似体でありうる。
【００２１】
「抗体」という用語は、本明細書では、分析物に選択的に結合して、分析物の検出を可能にすることができる抗体もしくは断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一鎖Ｆｖ分子、またはＣＤＲ領域）、または抗体もしくは断片の誘導体を含むように使用される。
【００２２】
分析物自体が内因的にラマン活性でもよい。そのような実施形態では、色素が分析物と化学的に同一でありうる。
【００２３】
一般には、色素の成分は、別々のリンカーによって連結されることが予測される。使用可能である多数の適切なリンカーが考えられることは当業者には明らかであろう。リンカーの同一性は、色素の成分の同一性に依存するであろう。選択剤結合基がペプチドを含むならば、リンカーが従来のペプチド連結化学反応に適合している場合が有利である。例えば、リンカーは、好ましくは、ペプチドのＮ末端と反応させるための単一カルボン酸基を含んでよい。
【００２４】
一部の状況では、使用される特定の成分に応じて、別々のリンカーを使用せずに、例えば色素における異なった成分の化学基間の反応によって、色素の２つ以上の成分を併せて連結することが可能でありうる。
【００２５】
金属表面結合基によって色素が表面に結合した場合に色素が金属表面近傍の領域内にあるならば、色素の成分は、いかなる順序で連結されていてもよい。
【００２６】
色素の金属表面結合基は、金属表面に（通常は吸着により）優先的に結合する基であるべきである。一部の状況では、金属表面への金属表面結合基の結合が、色素を金属表面に固定するのに十分に強力であることが望ましいことがある。金属表面結合基の化学的性質は、使用される金属表面に依存するであろう。適切な銀結合官能基には、オキサゾール、チアゾール、ジアゾール、トリアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、オキサチアゾール、チアトリアゾール、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、ベンゾイミダゾール、インダゾール、イソインダゾール、ベンゾジアゾール、またはベンズイソジアゾールなど、複素環窒素を有する基が含まれる。他の適切な官能基には、アミン、アミド、チオール、サルフェート、チオサルフェート、ホスフェート、チオホスフェート、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシレート、およびチオカルバメートが含まれる。システイン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、またはアルギニンなどのアミノ酸も銀結合を与える。
【００２７】
本発明の実施形態を、ほんの一例として、添付図面を参照しながら下記に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
発明の実施形態の説明
記載の実施形態は、分光法で使用する改良された色素を特徴とする。本発明は、分光法、とりわけラマン分光法、ならびにそれから派生したＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳに最適な特徴を備えた色素を産生するために、遷移金属／配位子錯体を用いる。共鳴ラマン分光法に必要な吸光ピークを与えるのに加えて、そのような錯体によってもたらされる、より低度な蛍光は、蛍光バックグランドによるラマンシグナルへの妨害を低減し、蛍光を発する原因となる機序から、ラマン散乱を生成する原因となる機序へのエネルギー移動を可能にすることによって、ラマン強度をさらに増強することができる。蛍光は、それが、ラマンシグナルを不明瞭にするバックグランドノイズを本質的に産生するので、ラマン色素にとって望ましくない特徴である。
【００２９】
吸光
スペクトルの可視領域（４００〜８００ｎｍ）は、１５０から３００ｋＪｍｏｌ−１の間の光子エネルギーを含み、近紫外領域（２００ｎｍ以上）は、このエネルギー範囲を約６００ｋＪｍｏｌ−１にまで拡大する。これらのエネルギーはすべて、分子電子を、より高いエネルギー軌道へ昇位または励起するのに十分である。図１は、有機分子内で起こりうる様々な種類の電子励起を示す。
【００３０】
図１に示す６種の遷移のうち、最もエネルギーの低い２種のもの、すなわち１および２（実線の矢印で示されている）のみが、２００から８００ｎｍのスペクトルで利用可能なエネルギーによって実現可能である。これらの両方に反結合π軌道（３）への遷移が関与し、したがって、広範なπ系を有する有機分子はとりわけ良好な発色団である。
【００３１】
発色団分子が、その分子内で起こりうる電子遷移に一致したエネルギーを有する光子に曝露された場合、その一部は、より高エネルギーの軌道に電子が昇位された際に吸収されうる。エネルギー的に好適な電子昇位は、通常、最高被占分子軌道（ＨＯＭＯ）から最低空分子軌道（ＬＵＭＯ）へのものとなる。分子軌道の概念は周知であり、それらは分子内の電子エネルギーレベルとして考えることもできる。
【００３２】
蛍光およびリン光
蛍光およびリン光は関連した現象であり、それらの現象では、光エネルギーが吸収され、特徴的な発光プロフィールで再放出される。この発光プロフィールの形は励起波長に依存しないが、その強度は化合物の吸光度プロフィールに従う。関与する電子エネルギー遷移を図２に示す。
【００３３】
図２は、一般的蛍光／リン光分子の基底状態、一重項励起状態、および三重項励起状態、ならびにこれらの状態間の遷移がどのように蛍光またはリン光のいずれかを生成しうるかを示す。ｙ軸は様々な状態のエネルギーを示し、ｘ軸は「Ｑ」値を示す。Ｑ値は、分子の結合の長さとして考えることができる。蛍光では、基底状態のスピン多重度と発光励起状態のスピン多重度とが同じである。ほとんどの有機分子では、基底状態が一重項状態である（すなわちすべての電子スピンが対になっている）。蛍光は、吸光遷移２０１によって分子が励起一重項状態に昇位され、その後、発光遷移２０２〜２０５によって基底一重項状態に減衰して戻る際に生じる。
【００３４】
リン光は、励起状態と基底状態とが異なったスピン多重度を有する発光過程である。有機分子の基底状態は一重項であるが、有機分子には、エネルギー的に到達可能な三重項励起状態（不対スピンを２つ有する）がいくつかある。吸光遷移２０１によって多数の一重項励起状態に励起した後に、分子は、三重項励起状態への無放射減衰（項間交差２０７）を行いうる。この三重項状態は、その後、上記分子が基底状態に減衰して戻る際に、放射遷移２０８〜２１１によって光子を放出しうる。
【００３５】
図２のエネルギー曲線は、分子の振動状態および回転状態に関係する様々な微視的な状態を示す。室温の電子は、約０．０４ｅＶのエネルギーを有し、これらの微視的状態間の分離は平均的にほぼ同じである。したがって、電子は通常、隣接している状態に到達可能であり、それらの間で遷移できる。微視的状態間の遷移は無放射性であり、電子が上記状態を通って移行する際に、エネルギーが分子それ自体の回転および振動モードへと移動する。蛍光およびリン光は通常、吸光によってどの励起一重項状態が最初に生み出されたかにかかわらず、第１の励起一重項／三重項状態（すなわち、最もエネルギー低い励起一重項／三重項状態）からのみ生じる。
【００３６】
それらは励起状態の最低エネルギーバンドから基底状態のエネルギーバンドへの遷移に関与するものなので、蛍光およびリン光発光プロフィールの形は、異なった照射波長で変化しない。しかし、それらの強度は、光子が吸収されて励起状態を生成する効率に依存しており、それゆえ、蛍光およびリン光発光強度は、分子の吸光プロフィールに従う。
【００３７】
通常、三重項励起状態は、一重項励起状態よりわずかに低いエネルギーのものとなる。一重項分子励起状態から三重項分子励起状態への電子の項間交差（図２に示す通り）は、そうするのが電子にとってエネルギー的に好適である場合に可能である。すなわち、一重項状態における、ある微視的状態と、それよりエネルギーが低い連続した次の微視的状態との間のエネルギー差が、前記微視的状態と三重項状態における微視的状態との間のものより大きい場合である。光子を放出せずに電子が微視的状態の間を移動すること、または項間交差を行うことが可能となるには、連続した状態間のエネルギー差がほぼｋｂＴ、またはそれ未満でなければならない（式中、ｋｂはボルツマン定数であり、Ｔは電子の温度である）。
【００３８】
一重項励起状態は、有機分子の蛍光の原因となるものだが、通常はナノセカンド単位で測定される有限な寿命を有する。三重項励起状態から一重項基底状態まで減衰するには、電子がそのスピンを反転させる（スピン転移としても知られる）必要があるので、リン光は蛍光より長いタイムスケールで起こる。電子がスピンを反転する確率は熱に依存的であり、結果として、三重項励起状態は、はるかに長い寿命、しばしばミリ秒以上の寿命を有する。
【００３９】
結晶場分裂
遊離原子またはイオンでは、ｄ軌道間の唯一の相違がそれらの方向性であるので、ｄ軌道のすべてが同じエネルギーを有する。しかし、分子または錯体では、それらが正しい方向性を有していれば、最も外側の電子が隣接している原子の電子と相互作用しうる。５つのｄ軌道の方向性および形を図４に示す。
【００４０】
図５Ａに示すものなど、八面体場では、３本すべての軸の各側に対して１つある、６つの原子が中心原子と相互作用する。これら他の原子の電子は、軸上にあるｄ軌道（ｄｚ２、およびｄｘ２−ｙ２）に対して反発する。エネルギー保存の要求は、これらの２つの軌道が不安定である（すなわちエネルギーがより高い）場合、他の３つの軌道（ｄｘｙ、ｄｘｚ、およびｄｙｚ）が安定でなければならない（エネルギーがより低い）ことを意味し、そのため正味の影響がエネルギー的に無変化となる。低エネルギーｄ軌道（ｄｘｙ、ｄｘｚ、およびｄｙｚ）と、高エネルギーｄ軌道（ｄｚ２およびｄｘ２−ｙ２）との間のエネルギー差は、結晶場分裂エネルギー、すなわちΔｏである（式中、下付の「ｏ」は八面体幾何学的配置を示す）。このエネルギー分裂を図５Ｂに図示する。
【００４１】
図６Ａのものなど、四面体場では、４原子の相互作用原子が軸間に位置する。これは、ｄｚ２およびｄｘ２−ｙ２軌道は安定であり、ｄｘｙ、ｄｘｚ、およびｄｙｚ軌道は不安定であることを意味する。したがって、四面体結晶場分裂エネルギー、すなわちΔｔは、八面体配置の反対の配置をとる（図６Ｂを参照）。
【００４２】
４原子による連結の別の幾何学的配置は、図７Ａに示す正方形平面である。正方形平面場は、八面体場と同様であるが、１本の軸沿いの原子がない。その結果、八面体配置の各準位が再分裂している。したがって、ｄ軌道は図７Ｂに示す通りのエネルギー配置をとる。正方形平面結晶分裂エネルギーはΔｓｐと呼ばれる。
【００４３】
分裂の規模は、分裂のタイプ、分裂が起こる原子のタイプ、および分裂の原因となる原子のタイプに依存する（原則として、Δｏ＞Δｔ）。Δｔが比較的小さいので、通常、四面体幾何学的配置の電子は、スピンパートナーと対合するより、より高エネルギーのｄ軌道に行く方がエネルギー的に好適である。八面体幾何学的配置では、（Δｏがより大きい場合に）電子が対合することを選ぶか、または（Δｏが小さい場合に）より高い軌道に行くことを選ぶかは、Δｏの規模に依存する。電子が対合することを選ぶ化合物は低スピンと呼ばれる。電子がより高いエネルギーの軌道を選ぶ化合物は高スピンと呼ばれる。
【００４４】
ｄ軌道の分裂は、遊離金属原子では存在しない電子遷移の誘導を引き起こす。例えば、３．７３４×１０−１９Ｊのｄ軌道分裂を引き起こす錯体の形成により、可視範囲の中央にある波長５３２ｎｍの光の吸収をもたらす電子遷移が起こる。多くの遷移金属錯体が、ほぼこの規模のｄ軌道分裂を行い、それらに特徴的な明色をもたらしている。
【００４５】
望ましい特徴を有する発色団の形成を実現する１つの方法は、金属−配位子電荷移動錯体（ＭＬＣＴ錯体）を形成できる金属および配位子の組合せを選択することである。ＭＬＣＴ錯体は、金属イオンと配位子とを含む対であって、上記対の一方のメンバーが電子供与性であり、かつもう一方が電子受容性であり、励起電子状態でドナーからアクセプターへの電子電荷の部分的な移動が起こる対として定義される。ＭＬＣＴ錯体は、通常、励起分子状態と基底状態との間の電子エネルギー遷移を有し、それがＵＶ／可視領域での励起に適したエネルギーギャップと、励起状態の無放射熱緩和を促進する電子遷移経路をどちらも提供する。
【００４６】
ＭＬＣＴ錯体によって提供される無放射電子遷移経路は、イオンと配位子との間で形成される化学結合の結果生じる。この結合は、錯体の基底状態電子準位と、イオンの励起電子準位との間に、熱的に到達可能な電子準位を提供し、電子が光子を放出せずに基底状態へと熱緩和することを可能にする。この無放射減衰は、配位子の最低空電子準位と上記熱的に到達可能な電子準位との間、ならびに上記熱的に到達可能な電子準位と基底状態電子準位との間のエネルギー差が、互いのｋｂＴ以内にある場合に起こりうる。「熱的に到達可能」という用語は、当業者には既知であり、それには、上述の例にある通り、電子によって占有されているエネルギー準位のｋｂＴ以内にあるエネルギー準位が含まれる。
【００４７】
適当な遷移金属および配位子を選択することによって、基底状態であるＨＯＭＯが金属イオンのｄｚ２軌道と関連しており、一方、励起状態であるＬＵＭＯが三重項状態でもある配位子のπ＊軌道と関連しているようなＭＬＣＴ錯体を産生することができる。金属イオンの軌道のｄｚ２軌道がＨＯＭＯであり、かつ配位子のπ＊軌道がＬＵＭＯであるので、基底状態電子密度は、本質的には、Ｆｅ２＋イオンに集中している。金属イオンが光子エネルギーを吸収し、電子が上記イオンの励起エネルギー状態に昇位され、その後、配位子のＬＵＭＯに移動する。配位子のＬＵＭＯへの移動は、イオンの励起準位のエネルギーがＬＵＭＯエネルギー準位のｋｂＴ以内にある場合に起こりうる。これは、エネルギー状態だけでなく、ＭＬＣＴ内で実際に物理的に（金属イオンから配位子へと）電子の位置が移っていることを意味する。
【００４８】
実際に物理的に電子の位置が移った結果、錯体の熱運動の増大、およびラマンシグナルのさらなる増強が起こる。
【００４９】
分子の温度／熱運動の増大により、電子におけるエネルギー微視的状態（図２に示したものなどの微視的状態）の利用可能性が増大する。共鳴ラマン分光法では、入射光子のエネルギーは、分子の電子遷移に可能な限り緊密に適合したものである。共鳴ラマン分光法で必須であるように、錯体の電子遷移とほぼ同じエネルギーで利用可能なより多くの微視的状態が存在すれば、電子は、特定の電子遷移エネルギーに「調整された」光子を吸収しており、（仮想的状態とは対照的に）「現実」の微視的状態に昇位されている可能性が高くなる。したがって、共鳴ラマン効果に応じて起こる遷移の確率が増大する。実際に共鳴ラマン分光法を行う際には、入射または照射放射線は、実質的な比率の電子を分子の基底状態から励起電子準位まで励起させるのに十分なエネルギーの放射線でありさえすればよいことに留意するべきである。必要なエネルギーは、概ね、問題の分子の励起エネルギー準位と基底状態との間のエネルギー差のｋｂＴ以内のエネルギーであると考えられている。
【００５０】
配位子を金属イオンと錯形成させ、配位子のπ＊軌道のエネルギー準位を、金属イオンの不安定化されたｄ軌道のものと適合させることによって、三重項励起状態が一重項励起状態を超えて安定化される。これは、三重項状態への電子の項間交差を促進し、その結果、蛍光機序が量子力学的に不可能な遷移となり、次いで消光すると言われる。適切な配位子を適切なイオンと錯形成させることによって、その錯体のＬＵＭＯと基底状態との間に位置する追加のエネルギー準位を提供する化学結合が形成されうる。この追加のエネルギー準位は、光子を放射せずに、電子がＬＵＭＯから基底状態に熱緩和することを可能にする。
【００５１】
蛍光の低減は、ラマン分光法にとって２つの利点を有する。蛍光による散乱光子の数が低減されるだけでなく、無放射減衰によって「排出」されるエネルギーの一部が、散乱分子の熱運動または代替の電子遷移へと移動し、それによって、従来のラマン分光法の増強を超えるラマンシグナルのさらなる増強がもたらされうる。配位子イオン錯体は、電子の熱緩和から生じるエネルギーを受容するのに利用可能な熱振動モードを有する。すなわち、本発明に従って提供される配位子イオン錯体は、配位子の最低空電子エネルギー準位と熱的に到達可能な電子エネルギー準位との間、ならびに熱的に到達可能な電子エネルギー準位と、基底状態電子エネルギー準位との間の電子遷移のエネルギーに熱的に到達可能（のｋｂＴ以内）である振動モードを有する。そうでなければ蛍光機序に関与する電子に、本発明に従った場合のように、代替の無放射緩和経路が提供された場合、エネルギーが電子からこれらの熱振動モードに移動して、錯体の熱エネルギーが増大し、その結果、ラマンシグナルが増強される。
【００５２】
図８は、ＰｈｅｎおよびＭＬＣＴ錯体［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋の分子エネルギー準位の典型例を示す。Ｆｅ２＋遷移金属とＰｈｅｎ配位子との間の結合によって、追加の電子エネルギー準位がＨＯＭＯとＬＵＭＯとの間に導入される。電子が三重項励起状態に遷移した場合、それは、最低の微視的振動状態にまで移動するが、そのスピンを反転せずには基底状態に戻ることができない。これがリン光の機序である。熱的に到達可能な電子エネルギー準位の存在により、励起状態の電子に代替の緩和経路が提供され、光子が放出される確率が低減するので、ＨＯＭＯとＬＵＭＯとの間にある追加のエネルギー準位は、三重項励起状態から基底状態への遷移が無放射であることを熱学的に好適なものにする。
【００５３】
本発明による錯体では、配位子の最低空電子準位に遷移する励起電子が、スピン転移を必要とせずに、熱的に到達可能な電子準位を介して、錯体の基底状態に緩和できる。錯体の基底状態電子準位とイオンの励起電子準位との間にある熱的に到達可能な電子準位が電子によって占有されていない場合、無放射経路を介して熱緩和する電子は、そのスピンを反転する必要がない。錯体の基底状態電子準位とイオンの励起電子準位との間にある熱的に到達可能な電子準位が電子によって占有されている場合、この電子のスピンが配位子の最低空電子準位の緩和電子のものと反対のスピンであるという条件において、同じことがあてはまる。
【００５４】
上述のように、励起イオンエネルギー準位から、配位子のエネルギー準位に遷移する場合、配位子のＬＵＭＯに電子が遷移することが好ましい。電子が別の熱緩和経路に沿って熱緩和できるようになる前に、それはＬＵＭＯに存在しなければならない。ＬＵＭＯより上の微視的状態に電子が遷移する場合には、それは、別の熱緩和経路を利用できるようになる前に、ＬＵＭＯに熱緩和する必要がある。そのような時間遅延は、それによって錯体がその励起状態から緩和することが可能となり、錯体による放射の可能性を増大させる結果となるので望ましくない。
【００５５】
光学的範囲の遷移は、遷移金属ではｄ軌道間で起こり、有機分子ではπ軌道とπ＊軌道との間で起こる。遷移金属と有機分子との間で形成された錯体は、上記有機分子のπ軌道とπ＊軌道との間のエネルギー差がｄ軌道エネルギー分裂に適合しているという条件において、それに利用可能な機序をどちらも有する。遷移金属のｄ軌道または有機分子のπ軌道以外の軌道も、使用するＲＳレーザーにエネルギーギャップを適合させることができるならば使用可能である。上記のエネルギーギャップは、５３２ｎｍの波長を有する典型的なレーザーに好都合なものである。
【００５６】
Ｐｈｅｎ／鉄の実施形態
本発明の特定の一実施形態は、１，１０−フェナントロリン（Ｐｈｅｎ）と鉄との錯体形成を用いるものであり、以下にそれを説明する。Ｐｈｅｎは、５３２ｎｍの照明下で蛍光性である浅黄色水溶液を形成する。Ｐｈｅｎは、Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋の酸化還元指示薬としてもよく知られており、それぞれ［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋（深紅色）または［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］３＋（水色）を形成する。
【００５７】
ＰｈｅｎのＨＯＭＯは、主としてπ共役系として、分子の大部分にわたって非局在化されている。最低一重項励起状態および三重項励起状態（ＬＵＭＯ）も、異なった電子密度分布を有するπ系である。したがって、Ｐｈｅｎによる吸光にはおそらくπ→π＊遷移が関与する。
【００５８】
Ｐｈｅｎは、以下の反応、すなわち、
Ｆｅ２＋  ＋  ３Ｐｈｅｎ  →  ［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋
に従って、鉄（ＩＩ）との錯体を容易に形成する。［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋（詳細には、トリス−１，１０−フェナントロリン鉄（ＩＩ））は、図１１に示す構造を有する。中心のＦｅ２＋イオンは、３つのＰｈｅｎ基によって、八面体配置で囲まれている。
【００５９】
図９の太線は、波長５３２ｎｍの照明下における水溶液中でのＰｈｅｎの発光スペクトルを示す。広がったベースラインの「こぶ状」の特徴は蛍光によるものであり、この上に重なっている、より尖鋭なピークがラマン散乱光子である。塩化鉄（ＩＩ）の添加の際に、［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋錯体が形成され、それによって浅黄色溶液が深紅色に変色し、発光シグナルが大幅に低減される（ｘ軸近傍の細い線）。これは、Ｆｅ２＋との錯体を形成することによって、Ｐｈｅｎ蛍光が実際に大幅に低減することを示す。
【００６０】
［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋錯体の分子軌道の量子力学的解析は、どの軌道がこの現象に関与しているかを示す。上述の通り、最初の吸光事象は、一重項基底状態である最高被占分子軌道（ＨＯＭＯ）に由来するものであり、蛍光発光した任意の光子は、最低空分子軌道（ＬＵＭＯ）と、この基底状態との間での遷移に由来する。［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋のこれらの軌道は、上記、図１６に示されている。
【００６１】
ＨＯＭＯは、本質的にはＦｅ２＋イオンのｄｚ２軌道であり（Ｐｈｅｎ基からのごくわずかな寄与を伴う）、ＬＵＭＯは、Ｆｅ２＋に対して配位された６つの「ピリジン」系の環原子に限定される非局在π系である。錯体内のＰｈｅｎ分子それぞれにおけるＬＵＭＯの電子密度は、本質的には、遊離Ｐｈｅｎの三重項励起状態におけるＬＵＭＯと同じであることに留意するべきである。
【００６２】
ＨＯＭＯはＦｅ２＋イオンに限局しており、ＬＵＭＯはＰｈｅｎ配位子に限局しているので、これらの軌道間をジャンプする電子は、Ｆｅ２＋イオンと配位子のπシステムとの間で電荷移動を行うはずであり、これは、提唱されているＭＬＣＴの機序を支持するものである。この遷移を引き起こすのに必要な光の波長は約５１０ｎｍである。
【００６３】
上記実施形態は、１，１０−フェナントロリンの使用について記述したが、Ｐｈｅｎ配位子の５−および６−炭素原子における任意のＬＵＭＯ電子密度の不在は、これらの原子を欠失した関連分子である２，２’−ビピリジン（「Ｂｉｐｙ」）がＰｈｅｎに極めて類似した様式で作用することが示唆されることにも留意するべきである。同様に、５，６−ジヒドロ−１，１０−フェナントロリンおよびその誘導体も適切であるはずである。
【００６４】
上述した実験は、バルク溶液中の系の挙動を示すが、この場合、表面増強効果の可能性は全くなく、［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋錯体は照明波長（５３２ｎｍ）近傍に吸収ピーク（５１０ｎｍ）を有するので、したがってそれは共鳴ラマン分光法（ＲＲＳ）の例である。上記錯体を銀表面上に吸着させることによって（例えば、銀コロイドを添加するか、上記溶液を溶着銀表面に曝露することによって）、より高感度の表面増強共鳴ラマン分光（ＳＥＲＲＳ）検出法を利用することができる。
【００６５】
図１０は、波長５３２ｎｍの照明下における、銀コロイドを添加した水溶液中の［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋の発光スペクトルを示す。銀コロイドを含有しない溶液ラマンシグナルよりはるかに強いＳＥＲＲＳシグナルが生じており、これは、表面増強効果が実現していることを示す。蛍光バックグランドが極めて少ないことに留意するべきである。これは、本発明で概略を示した概念に従って選択した［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋が、意図された特徴を正確に示していることを実証している。この技法を用いた場合、ラマンシグナルが非常に強いので、裸眼でもこの効果が見える。
【００６６】
ＳＥＲＲＳ標識
本発明者らは、モデル錯体である［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋が、ＳＥＲＲＳ発色団として有望な特徴を示すと認識した。そのような錯体を実用的なＳＥＲＲＳ標識基にするためには、当技術分野で知られている通り、分析物への結合がそれを介して実現されうる官能基が必要である。加えて、本発明者らはそれがＳＥＲＲＳ活性を示すことを実証したが、特定の表面結合基の添加は、さらに大きな表面増強効果を与えるであろう。
【００６７】
誘導体化されたフェナントロリンおよびビピリジン基は、適切な機能的ＳＥＲＲＳ標識を構築する開始点として働きうる。例えば、化合物（ｘｙｚｘｙｚ）は、従来の連結化学を用いたペプチドへの結合に適した部位を与えるカルボン酸基を含有し、さらに銀表面への強力な結合を与えるベンゾトリアゾール基も含有する。この化合物は、フェナントロリン基の窒素原子を介してＦｅ２＋イオンを配位することによって、Ｐｈｅｎと同じ形でＦｅ２＋との錯体を形成する。
【００６８】
Ｆｅ２＋およびこれらの３種の非対称な配位子から形成された錯体は、様々なエナンチオマーおよび幾何異性体の形成をもたらす（図１１）。これらの半分は、次善の配座で配置された表面結合基を有する（図１１の最も左側および最も右側の構造のみが、表面に向いている３つの金属結合基すべてを有する）。
【００６９】
この状況は、金属イオン（図１１中の「Ｍ」）の周りの配位子の方向性を制約することによって回避できる。配位子基のそれぞれが、一端で共通リンカー（「Ｌ」）に付着し、もう一端で表面結合基に付着している場合には、それらは、金属イオンと自己集合し、図１２に示すような三脚構造を形成するであろう。図１２の分子はどちらも、１つまたは複数の官能基と共に発色団が存在している点で色素を構成していることに留意するべきである。表面結合基（Ｓ）またはリンカー（Ｌ）のいずれかを除去しても、この分子はなお「色素」として残る。しかし、これらの官能基の両方を除去した場合には、発色団のみが残され、それはそれ自体ではもはや色素を構成しなくなる。
【００７０】
上記錯体は２種のエナンチオマー（図１２に示す鏡像）を形成しうるが、両方とも、依然として、正しい方向性にある表面結合基を有するであろう。リンカー基は、金属イオン錯体の形成を実質的に妨げてはならない。以下に説明し、図１３に示す一例では、配位子は、フェナントロリン錯形成基と、表面結合用のベンゾトリアゾール基と、リンカーとの結合用のカルボン酸とを有する。ＳＥＲＲＳ化学増強を最大にするには、発色団基は、非局在結合系を介して表面に付着されているべきである。三価リンカーは、各配位子基への付着用に１つずつ、３つのアミノ基を有し、それらに加えて、分析物分子への付着に必要な結合官能性を提供するカルボン酸基を有する。
【００７１】
構築された錯体は、図１５に示すような配座をとると予測されている（一方のエナンチオマーのみ示す）。
【００７２】
配位子基は、追加の発色団を保持しうる。例えば、ベンゾトリアゾール基が、エテンスペーサーによって上記分子内のフェナントロリン基とつながる。これらは、アゾ基に容易に置換することができる。この結果生じる錯体は、４つの発色団、すなわち［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋基および３つのアゾ基を有する。発色団の特定の選択に応じて、発色団間遷移機序を介した、より一層のシグナル増強を実現することもできる。
【００７３】
分析物を標識する代替戦略では、それを１つの配位子基に共有結合によって結合させ（可能性としてスペーサー／リンカーを介して）、金属イオンおよび付加的な遊離配位子基の添加によって錯体を構築する（図１４）。得られたラマン発光スペクトルにおいて、１つまたは複数の特有なピークを提供できる官能基を上記配位子基が保持している場合には、これは、多重適用用の様々な関連したＳＥＲＲＳタグを生成する手段を提供する。適切なラマン活性基は、本発明者らの以前のハロメタロセン特許の場合と同様に、ハロゲン原子を含むものでありうる。但し、フェナントロリン系へのこれらの直接的添加は、非局在系のエネルギー特性を、それらによって、発色団が比較的乏しいものとなりうる程度にまで妨げることが予測されている。
【００７４】
本発明による色素の一連の代替物は、以下に概説する合成に基づくものである。３当量の２−ブロモ−１，１０−フェナントロリンおよび１当量の２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールから開始して、例えば、９当量のＮａＨの存在下で、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、０℃で２４時間撹拌することによって、（図１８に示す）三脚配位子Ａを産生することができる。
【００７５】
構造的に関連した発色団中心を得るために、６−ブロモ−２，２’−ビピリジンまたは２−ブロモ−５，６−ジヒドロ−１，１０−フェナントロリンと用いて、類似の反応を行うことができる。異なったハロゲンを有する開始物質を用いて類似の反応を行うこともできる。
【００７６】
配位子Ａは、鉄（ＩＩ）イオンとの安定錯体を形成して、八面体幾何学的配置中に中心イオンを有する錯体を生じる（図１９に示す通り）。上記錯体は、塩化鉄（ＩＩ）水溶液との混合の際に自発的に形成される。そして、この速度は、必要な場合、過熱することによって促進できる。
【００７７】
この錯体は、発色団と、例えばペプチドまたは核酸との結合体を形成するさらなる誘導体化に適した反応性アミンとを含む。上記発色団部分は、２＋の電荷量を有し、ＳＥＲＲＳ活性金属表面に結合する固有の親和性を有するであろう。この親和性は、図２０の反応に示されているように、ベンゾトリアゾールなどの金属結合基を添加することによって増強できる。
【００７８】
これらの反応の組合せによって、発色団、ペプチド／核酸連結部位、および３つのベンゾトリアゾール銀結合基を含むＳＥＲＲＳ色素が産生される。
【００７９】
金属表面に結合した場合における、発色団中心からのベンゾトリアゾール基の間隔、およびこれらの基の方向性は、ベンゾトリアゾールフェニル環とカルボン酸基との間にある原子の数およびタイプが異なる開始物質を用いることによって制御できる。ベンゾトリアゾール基の方向性も、４−または５−置換ベンゾトリアゾール誘導体のいずれかを用いることによって制御できる。
【００８０】
様々な部位で、これらの分子内にラマン活性基を置換することによって、特徴的なラマンピークを構築することができる。図２１に示す構造内のいずれのＣ−Ｈ基も、誘導体化に適した点となる。したがって、色素混合物からのスペクトル内で、それぞれが１つまたは複数の特徴的なラマンピークを生成でき、それによって、同時多重測定が可能となる１パネルの色素を構想することができる。
【００８１】
三脚配位子の別の例を図２２に示す。図中、「Ｒ」は１〜４原子鎖長を有するスペーサー基である。３つのアミド基を類似のスペーサー基（１〜４原子鎖長）で置換してもよい。この配位子は、３つの追加の発色団中心を与えるジアゾ基を使用することもできる。
【００８２】
特定の例を示したが、ＳＥＲＲＳ標識として使用するのに適した関連の金属イオン錯体が一団全体として存在する。Ｆｅ２＋に限定されることはなく、これは、単純に、典型的な５３２ｎｍレーザーを良好な効率で吸収すると予測される一金属イオンである。使用されるイオンは、２＋イオンを形成することができ、かつ八面体配置を有するいかなる金属でもよい。遷移金属は、しばしばこの目的に適している。上記イオンは、バナジウム、クロム、銅、マグネシウム、または鉄イオンのうちの１つでありうる。コバルトまたはニッケルなどの他の遷移金属は、おそらく、異なった励起レーザーを用いた使用に供する類似した錯体を形成する。実際、上記イオンが金属である必要性はなく、それは、それが上記に詳述した要件を満たすならば、例えば、有機分子でありうる。
【００８３】
同様に、３つの二座配位子を有する八面体錯体に限定されることはない。一座配位子および他の配位子を有する四面体および正方形平面錯体も、本発明の概念に従って作用するはずである。鍵となる概念は、励起状態から無放射減衰過程にエネルギーを移動できる電子構造を有し、それによって蛍光の減弱およびラマン散乱の増強がもたらされるように配位子を選択または構築するべきであるということである。ＭＬＣＴ機序はこれを実現する１つの方法であるが、同じ目標を実現する別の機序が存在しうることを理解するべきである。
【００８４】
本発明の実施形態は、分析されるべき分子と共に、上述の色素を支持する、分析物領域内にある分析物担体と、上記担体上の分析物領域にレーザー放射を提供し、上記分析物領域から受信した放射線を検出する感知器を有する検出器とを含みうる。色素の反応は、入射レーザー放射から生じる散乱放射線であり、これらの感知器によって検出される。分析物担体および検出器は、共に、検出器アセンブリを構成する。
【００８５】
分析物担体は、上記に説明したＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳを行うための金属表面を含有しうる。検出器それ自体は、様々な形態のレーザー光源および感知器を含みうる。上記検出器に適した分析物担体の実施形態は、様々な形態をとりうる。好ましい実施形態はマイクロ流体チップであるが、他の実施形態には、後述の、適切に改良されたマイクロタイタープレートが含まれる。したがって、分析物担体は、いわゆる「チップ上の実験室」である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】有機分子で起こりうる様々な種類の電子励起を示す図である。
【図２】蛍光およびリン光に関与する電子エネルギー遷移を示す図である。
【図３】ラマン散乱に関与する電子エネルギー遷移を示す図である。
【図４】様々なｄ軌道を示す図である。
【図５Ａ】八面体分子配置を示す図である。
【図５Ｂ】八面体配置に関与するｄ軌道エネルギー準位の変化を示す図である。
【図６Ａ】四面体分子配置を示す図である。
【図６Ｂ】四面体配置に関与するｄ軌道エネルギー準位の変化を示す図である。
【図７Ａ】正方形平面分子配置を示す図である。
【図７Ｂ】正方形平面配置に関与するｄ軌道エネルギー準位の変化を示す図である。
【図８】典型的な有機分子（フェナントロリン）の電子エネルギー準位、および金属イオン／有機物配位子錯体の電子エネルギー準位を示す図である。
【図９】水溶液中でのＰｈｅｎの発光スペクトルを示す図である。
【図１０】波長５３２ｎｍの照明下における、銀コロイドを添加された水溶液中の［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋の発光スペクトルを示す図である。
【図１１】トリス−１，１０−フェナントロリン鉄（ＩＩ）、すなわち［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋の構造を示す図である。
【図１２】中心イオンおよび３つの非対称配位子から形成されうるエナンチオマーおよび幾何異性体の可能な配置を示す図である。
【図１３】発色団および機能的リンカー基を組み込んだ色素の可能な図示構造を示す図である。
【図１４】本発明による錯体で使用する可能な配位子の例を示す図である。
【図１５】分析物を標識するための代替の配置を示す図である。
【図１６】本発明に従って構築された錯体の予測された配置を示す図である。
【図１７】［Ｆｅ（Ｐｈｅｎ）３］２＋の基底軌道および励起軌道を示す図である。
【図１８】本発明で使用する代替の配位子を産生するための反応を示す図である。
【図１９】図１８の配位子Ａおよび鉄（ＩＩ）イオンから形成された錯体の構造を示す図である。
【図２０】フェナントロリンへのベンゾトリアゾールの添加を示す反応を示す図である。
【図２１】図１８および２０に示した反応の組合せによって形成された、発色団、ペプチド／核酸連結部位、および３つのベンゾトリアゾール銀結合基を含む色素の構造を示す図である。
【図２２】三脚配位子の例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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