(57)【要約】本出願は、1型(インスリン依存性)糖尿病におけるHIFβ相同Arntl2遺伝子の関与を同定する。よって、本発明は、Arntl2遺伝子の発現レベルに基づいて、対象の進行性インスリン依存性糖尿病に対する感受性を決定する方法を提供する。本発明は、また、必要とする対象においてインスリン依存性糖尿病を治療又は予防するために有効な化合物を同定する方法、並びに該同定法により同定された化合物の有効量を投与することにより、インスリン依存性糖尿病を治療又は予防する方法も提供する。本発明は、また、Arntl2遺伝子遺伝子の発現を増強するか、又はその標的遺伝子の発現を調節することを含む、必要とする対象においてインスリン炎の進行又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法も提供する。【選択図】なし
2009528030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 対象から試料を得て；
b) 前記試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
c) (b)において決定されたArntl2遺伝子の発現レベルを、前記対象が属する個体群から得られた対応するタイプの試料中のArntl2遺伝子の平均発現レベルと比較する
ことを含み、前記対象でのArntl2遺伝子の発現レベルがArntl2遺伝子の平均発現レベルよりも低いことが、進行性インスリン依存性糖尿病における感受性の増加に相関する、対象の進行性インスリン依存性糖尿病に対する感受性を決定する方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも90%相同である請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも95%相同である請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、脾細胞を含む請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記脾細胞が、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージからなる群より選択される少なくとも1つの型である請求項5に記載の方法。
【請求項７】
a) 糖尿病感受性NODマウスから対照試料を得て；
b) 前記対照試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
c) 前記糖尿病感受性NODマウスに少なくとも1つの候補化合物を投与し；
d) 前記投与の後に、前記糖尿病感受性NODマウスから試験試料を得て；
e) 前記試験試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
e) (b)で決定されたArntl2遺伝子の発現レベルを、(e)で決定されたものと比較する
ことを含み、(b)と比較した(e)でのArntl2遺伝子の発現レベルの増加が、インスリン依存性糖尿病耐性の増加に相関する、必要とする対象におけるインスリン依存性糖尿病の治療又は予防に有効な化合物を同定する方法。
【請求項８】
前記対照試料が、前記糖尿病感受性NODマウスの脾臓から得られる請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記試験試料が、前記糖尿病感受性NODマウスの脾臓から得られる請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記対照試料が、前記糖尿病感受性NODマウスの胸腺から得られる請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験試料が、前記糖尿病感受性NODマウスの胸腺から得られる請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記Arntl2遺伝子が、配列番号1の配列と少なくとも90%相同である請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
前記Arntl2遺伝子が、配列番号1の配列と少なくとも95%相同である請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージからなる群より選択される少なくとも1つの型の脾細胞を含む請求項7に記載の方法。
【請求項１５】
前記決定が、定量PCRを含む請求項7に記載の方法。
【請求項１６】
前記定量PCRが、配列番号11及び配列番号12で表されるプライマー対を用いる請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記定量PCRが、配列番号13及び配列番号14で表されるプライマー対を用いる請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記定量PCRが、配列番号31及び逆相補配列の配列番号32により表されるプライマー対を用いる請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
請求項7に記載の方法により同定された化合物を含む組成物の有効量を投与することを含む、必要とする対象においてインスリン依存性糖尿病を治療する方法。
【請求項２０】
前記必要とする対象が、ヒトである請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項7に記載の方法により同定された化合物を含む組成物の有効量を投与することを含む、必要とする対象においてインスリン依存性糖尿病を予防する方法。
【請求項２２】
前記必要とする対象が、ヒトである請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
対象の細胞においてArntl2遺伝子の発現を増強することを含む、必要とする対象においてインスリン炎の進行又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法。
【請求項２４】
前記細胞が脾細胞である請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記脾細胞が、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージからなる群より選択される少なくとも1つの型である請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも90%相同である請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも95%相同である請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、インスリン炎の進行に対する防御を増強する方法である請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法である請求項23に記載の方法。
【請求項３０】
対象の細胞におけるArntl2遺伝子の標的遺伝子の発現を調節することを含む、必要とする対象においてインスリン炎の進行又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法。
【請求項３１】
前記標的遺伝子が、Pla2g4a、Gpx、Chi313及びMpoからなる群より選択される請求項30に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、1型(インスリン依存性)糖尿病の管理におけるHIFβ-相同Arntl2遺伝子の関わりを含む。よって、本発明は、Arntl2遺伝子の発現レベルに基づいて、対象の進行性インスリン依存性糖尿病(developing insulin-dependent diabetes)に対する感受性(susceptibility)を決定する方法を提供する。本発明は、必要とする対象においてインスリン依存性糖尿病を治療又は予防するために有効な化合物を同定する方法、並びに該同定方法により同定された化合物の有効量を投与することにより、インスリン依存性糖尿病を治療又は予防する方法も提供する。本発明は、Arntl2遺伝子の発現を増強することを含む、必要とする対象においてインスリン炎の進行(progression)又は自己免疫性糖尿病の発症(development)に対する防御を増強する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術の説明
1型すなわちインスリン依存性糖尿病(IDDM)は、浸潤性リンパ球によるランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の進行性の破壊を特徴とする自己免疫疾患である(1, 2)。白人個体群の約0.3%に影響するこの疾患は、多因子性及び多遺伝子性であり、MHCクラスII遺伝子座及びインスリン遺伝子座の2つが最もよく研究されている遺伝子座である(3, 4)。
【０００３】
非肥満糖尿病(NOD)マウス(5, 6)は、IDDMのよく特徴付けられた動物モデルである。20を超えるマウスインスリン依存性糖尿病感受性遺伝子座(Idd)が、遺伝子的に同定されているが(7)、これらの非MHC Idd遺伝子の性質に関してはほとんど情報が得られていない。NODレシーバ系統とは、糖尿病になりにくい親のドナー系統に由来する選択された遺伝子領域のみが異なるコンジェニック系統の構築は(8, 9)、疾患に関連する候補領域の決定を可能にするために広く用いられるアプローチである。候補遺伝子の同定のための有望なストラテジは、コンジェニックマウスの種々の表現型の研究を、発現プロファイリング、ハプロタイプ及び突然変異分析と組み合わせることである(10〜13)。
【０００４】
いくつかのIdd遺伝子座が、マウス第6染色体上で同定されている(14〜16)。最近、遠位(distal)第6染色体上のIDDM関連遺伝子座であるIdd6、Idd19及びIdd20が、NOD/Lt遺伝的背景に遺伝子移入された遠位第6染色体についてのC3H/HeJゲノム物質を有する一連のコンジェニック系統の分析によりさらに定義されており、それらの候補領域は、それぞれ4.5、7及び4 cMにまで緻密化されている(17)。
【０００５】
遠位マウス第6染色体上のIdd6遺伝子座でのNOD/Lt対立遺伝子は、IDDMに対する感受性を与えるが、C57BL/6、C57BL/10及びC3H/HeJ対立遺伝子は全て、糖尿病に対する耐性を与える(14, 17, 18)。本研究に記載されるNOD.C3Hコンジェニック系統は、ナチュラルキラー遺伝子複合体(18)及び島特異的BDC-6.9自己抗原遺伝子についての候補領域(19)の両方にNOD対立遺伝子を有し、このことは、これらの遺伝子座がともに、疾患への耐性の原因ではないことを示す。Idd6候補領域は、しかし、未熟T細胞のデキサメタゾンに対する耐性についての候補領域と重複している(20〜22)。Idd6は、未熟NOD胸腺細胞での増殖の低い速度を制御していることも示唆されている(23)。
【０００６】
最近、我々は、コンジェニック系統NOD.C3H 6.VIIIを有するIdd6遺伝子座の詳細な表現型分析を行い(17)、これは、糖尿病の自発的発症に対する耐性を示す。我々は、この耐性が、免疫破壊又は病原性T細胞でのデフォルトに対する島β細胞の耐性に起因するのではないことを示した。コンジェニック系統の防御は、膵島を浸潤する種々の白血球サブセットの割合、特にCD4+ T細胞のものの変化を伴う。Idd6コンジェニックマウスで糖尿病感受性が減少することを理解するためには、それらの脾細胞が糖尿病トランスファーアッセイにおいて糖尿病防御を増強させるという我々の知見が必須であった(24)。
【０００７】
しかし、従来は、1型、すなわちインスリン依存性糖尿病を制御及び／又は調節する特定の遺伝子の同定に対する必要性があった。さらに、従来は、1型、すなわちインスリン依存性糖尿病を治療又は予防するための安全な療法の同定及び開発に対する必要性があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の必要性と取り組むために、本出願において、本発明者らは、マウスモデル系のIdd6インターバル内の全ての同定された転写産物の転写プロファイリングについて記載する。該インターバルにわたって分布する合計6つの転写産物は、疾患防御コンジェニックNOD.C3H 6.VIII及びNOD対照系統の脾臓組織と比較したときに、発現プロファイルが強く変更されることが見出された。新しく創出したサブコンジェニック系統の分析は、Idd6遺伝子座内の少なくとも3つの糖尿病関連亜遺伝子座(sub-loci)の存在を示す。疾患防御媒介脾細胞の最近同定された対照は、700 kbインターバルにマッピングされ、これはアリール炭化水素レセプター核輸送体様2 (Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 (Arntl2, Bmal2))をコードする遺伝子を含む。この候補遺伝子は、NOD.C3H 6.VIIIコンジェニック系統において強くアップレギュレートされ、多数の配列多形及びオルタナティブスプライス変異型を示した。Arntl2のアップレギュレーションは、インスリン炎の進行及び自己免疫性糖尿病の発症に対する防御に必要であることが最近示されたPla2g4a遺伝子を含むARNT結合部位のアップレギュレーションと相関関係がある。よって、本発明は、1型糖尿病への耐性を制御するために、Arntl2及びその下流の標的をねらいとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、
a) 対象から試料を得て；
b) 該試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
c) (b)で決定されたArntl2遺伝子の発現レベルを、該対象が属する個体群から得られた対応するタイプの試料中のArntl2遺伝子の平均発現レベルと比較する
ことにより、対象の進行性インスリン依存性糖尿病に対する感受性を決定する方法を提供し、ここで、Arntl2遺伝子の平均発現レベルよりも低い、対象におけるArntl2遺伝子の発現レベルは、進行性インスリン依存性糖尿病における感受性が増加していることと相関する。
【００１０】
本発明の別の目的は、
a) 糖尿病感受性(sensitive) NODマウスから対照試料を得て；
b) 該対照試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
c) 糖尿病感受性NODマウスに少なくとも1つの候補化合物を投与し；
d) 糖尿病感受性NODマウスから試験試料を得て；
e) 該試験試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
e) (b)で決定されたArntl2遺伝子の発現レベルを、(e)で決定されたものと比較する
ことにより、必要とする対象においてインスリン依存性糖尿病を治療又は予防するために有効な化合物を同定する方法を提供することであり、ここで、(b)に比較した(e)でのArntl2遺伝子の発現レベルの増加は、インスリン依存性糖尿病に対する耐性の増加と相関する。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、上記の方法により同定された化合物を含む組成物の有効量を投与することにより、必要とする対象におけるインスリン依存性糖尿病を治療する方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、上記の方法により同定された化合物を含む組成物の有効量を投与することにより、必要とする対象におけるインスリン依存性糖尿病を予防する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、対象の細胞内でArntl2遺伝子の発現を増強することにより、必要とする対象におけるインスリン炎の進行又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、対象の細胞内でArntl2遺伝子の標的遺伝子の発現を調節することを含む、必要とする対象におけるインスリン炎の進行又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法を提供することである。この目的において、標的遺伝子は、Pla2g4a、Gpx、Chi313及びMpoの1つ又は複数であり得る。
【００１５】
上記の目的は、本発明のいくつかの態様を強調する。本発明のさらなる目的、態様及び実施形態は、以下の発明の詳細な説明に見出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図面の簡単な説明
本発明のより完全な認識及びその付随の利点の多くは、容易に得られる。なぜならそれらは、以下の詳細な説明に沿って以下の図面を参照することにより、よりよく理解されるようになるからである。
【００１７】
図1は、C3H由来インターバルのサイズの判断を可能にする遠位第6染色体についての大きいマーカーパネルを用いる遺伝子型決定を示す。(A) 異なるマウス系統の累積発病率(Cumulative incidence)、及び(B)脾細胞同時トランスファーにおける糖尿病に対する防御。P値は、6.VIIIについて＜0.0001、6.VIIIaについて＜0.0001、6.VIII cについて0.01、糖尿病発病率におけるCOに対する6.VIIIcについて0.026であり；6.VIIIについて0.012、6.VIIIaについて0.568、6.VIIIbについて0.339、COに対する6.VIIIcについて0.048であり、糖尿病トランスファーアッセイにおいて、糖尿病原性脾細胞(Db)に対するCOについて＜0.0001である。
【００１８】
図2は、元来のNOD.C3H 6.VIII及び新しいサブコンジェニックマウス系統である6.VIIIa、6.VIIIb、6.VIIIcに含まれる遠位第6染色体上のC3H由来インターバル(灰色のバー)のマップを示す。脾細胞サブ表現型についての新しく定義された候補領域(Idd6.3)の局在性は、点線で示す。NCBI ヒトバージョン35.1 2004年6月, マウスバージョン34.1 2005年2月28日に基づく。
【００１９】
図3は、6.VIII系統(白色のバー)及びNOD COマウス(黒色のバー)でのArntl2 (Bmal2)遺伝子の相対的発現を、任意単位として示す。4匹の前糖尿病雌性マウス(A) の脾臓及び胸腺、並びに異なる年齢及び15週齢の糖尿病マウス(B)の脾臓を、Arntl2の発現について、Q-RT-PCRにより分析した。
【００２０】
図4は、Bmal2の転写プロファイルと、構造とを示す。(A) 6.VIII及びNODマウスにおけるBmal2の転写産物プロファイルは、ノザンブロッティングにより示されるように、同一であった。1, 胸腺; 2, 精巣; 3, 脾臓; 4, 骨格筋; 5, 肺; 6, 肝臓; 7, 腎臓; 8, 心臓; 9, 脳。(B) 579、199及び355アミノ酸長の3つのアイソフォームBmal2a、Bmal2b及びBmal2cが、脾臓に存在した(下)。(C) 脾臓において同定される部分配列は、系統特異的アイソフォームの存在を示す(上)。
【００２１】
図5は、Bmal2内のC3H対NODの多形を示す。(A) Bmal2のコード配列内で、71位、425位、426位、450位、455位及び483位の6つのコドン、並びにコドン94に相当する1つの同義変異が、6.VIII系統とNOD系統との間で異なっていた。(B) 6.VIII系統(上側の配列)及びNODからの、Ensembl Chr.6 配列の147,759,731位〜147,760,164位に相当するBmal2遺伝子の部分的3'UTRのアラインメントは、著しい配列の変動を示す。6.VIIIにおけるこの領域の長さは、NODマウスより123塩基短い。
【００２２】
図6は、14時間の明(塗りつぶしていないバー)及び10時間の暗サイクル(塗りつぶしたバー)の下で飼育した単一の8週齢の6.VIII (白丸)及びNOD (黒三角)マウスの脾臓でのArntl2、Arntl1、Per1及びPAI-1発現の日周期の転写プロファイルを任意の単位で示す。ZT=ツァイトゲーバー時間
【００２３】
図7は、6.VIII (白色のバー)及びNOD (黒色のバー)系統の異なる年齢のマウスの脾臓におけるPla2g4a (A)の任意の単位での相対的発現を示す。データは、4匹の前糖尿病の雌性マウスからプールした。(B) 14時間の明(塗りつぶしていないバー)及び10時間の暗(塗りつぶしたバー)の下で維持した8週齢の6.VIII (白丸)及びNOD (黒三角)マウスの脾臓でのPla2g4aの日周期のプロファイル。ZT= ツァイトゲーバー時間。
【００２４】
図8は、mBmal2に関連する情報のグラフ表示を示す。
図9は、mBmal2の転写プロファイルを示す。
図10は、mBmal2の遺伝子構造を示す。
【００２５】
図11は、mBmal2のSNP及びインデルを示す。「Query」と示す配列は、配列番号35であり、「Sbjct」と示す配列は、配列番号36である。
【００２６】
図12A〜Bは、Bmal2コード領域を示す。NOD対照は、配列番号33に示し、6.VIIIは、配列番号34に示す。
【００２７】
図13A〜Cは、ゲノム配列のイントロン及びエキソン部分を明示する。図13A：071-E1 (118F-668R) - 3 SNP (Ensembl Chr.6 147727278〜147727780)、エキソン: 下線部; NOD対照は配列番号37に示し、6.VIIIは配列番号38に示す。図13B: SNP35-38 (SNP35-38-64F+SNP35-38-465R) - 1 SNP (Ensembl Chr.6 147746092〜147746427); NOD対照は配列番号39に示し、6.VIIIは配列番号40に示す。図13C: 071-E5 (131F+465R) - 5 SNPs (Ensembl Chr.6 147751781〜147752273) エキソン: 下線部; NOD対照は配列番号41に示し、6.VIIIは配列番号42に示す。図13D: 071-SNP 75-80 (114F+440R) - 1 SNPs (Ensembl Chr.6 3番目の塩基147758806から開始して147759169まで); NOD対照は配列番号43に示し、6.VIIIは配列番号44に示す。
【００２８】
図14は、エキソンに印をつけたBmal2コード領域を示す。Bmal2コード領域(配列番号45) - 異なる色で印をつけたエキソン(例としてCO) 太字: 同じであるがスプライス形のエキソン(太字及び下線の部分は、mBmal2bにおいてスプライシングによりなくなり(spliced out)、転写の早期停止をもたらす。本発明者らは、NOD及び6.VIIIにも同型の配列を見出した)。下線及び下線を付した斜体: 6.VIIIのオルタナティブエキソン 斜体: NOD対照のオルタナティブエキソン。
【００２９】
図15A〜Bは、Bmal2cに相当する配列決定ファイルを示す(071-43Fから071-2122R)。より具体的には、これらの図は、フォワードプライマーとして配列番号31、及びリバースプライマーとして配列番号32の逆相補配列を用いる増幅による、Bmal2cに相当する配列データを示す。Bmal2cは、pGEM-Tベクターにクローニングした。コード領域に下線を付す。NOD対照(図15A)は、配列番号46に、配列番号47として表されるコードされたポリペプチドとともに示し、6.VIII (図15B)は、配列番号48に、配列番号49として表されるコードされたポリペプチドとともに示す。
【００３０】
図16は、3' UTR (停止コドンの直後)を示し、最初の塩基はEnsembl v37 chr.6 147759660に相当する。NOD対照は配列番号50に示し、6.VIIIは配列番号51に示す。
【００３１】
図17A〜Dは、上流ゲノム配列を示す(プライマー: 071-16798F+071-17695R)。図17A: 上流ゲノム配列(プライマー: 071-16798F+071-17695R) - 4 SNPs (6.VIII配列blastからEnsembl Chr.6 : 100番目の塩基から最後まで147715903〜147716583- 1-99の結果はわからず); NOD対照は配列番号52に示し、6.VIIIは配列番号53に示す。図17B: 上流のゲノム配列(プライマー: 071-17610F-18412R) - 5 SNPs (Ensembl Chr.6 147716616〜147717298); NOD対照は配列番号54に示し、6.VIIIは配列番号55に示す。図17C: 上流のゲノム配列(プライマー: 071-18235F-19236R) - 2 SNPs (1番目の塩基=Ensembl Chr.6 147717274 - 配列は、blastの結果においていくつかの小片に分解している); NOD対照は配列番号56に示し、6.VIIIは配列番号57に示す。図17D: 上流のゲノム配列(プライマー: 071-19129F+071-19896R) - 6SNPs (24番目のntから最後まで= Ensembl Chr.6 147718263〜147718817); NOD対照は配列番号58に示し、6.VIIIは配列番号59に示す。
【００３２】
発明の詳細な説明
特に定義しない限りは、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、酵素学、生化学、細胞生物学、分子生物学及び医療科学の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書に記載されるものと同様又は等しい方法及び材料の全ては、本発明の実施又は試験に用いることができ、適切な方法及び材料は本明細書に記載される。全ての出版物、特許出願、特許及び本明細書で言及するその他の参考文献は、その全体が参照として組み込まれる。争いの場合は、定義を含む本明細書が管理する。さらに、材料、方法及び実施例は、例示のみであり、特に明記しない限りは限定することを意図しない。
【００３４】
Idd6マウス1型糖尿病遺伝子座は、脾細胞を用いる糖尿病トランスファーアッセイにより示されるように、末梢免疫系の防御活性を調節することにより糖尿病を制御することが示されている。3つの新規なサブコンジェニックNOD.C3H系統の分析により、700 kbの小領域(subregion)に位置する脾細胞同時トランスファーにより与えられる疾患に対する防御を有する5.4 MbのIdd6インターバル内に少なくとも2つの糖尿病関連遺伝子が存在することが確認されている。このサブインターバルは、2型糖尿病関連ARNT (HIF1β)遺伝子のホモログである日周期リズム関連転写因子Arntl2 (Bmal2)を含む。本明細書の実施例に示されるように、Arntl2は、NOD対照系統、系統特異的スプライシング変異型、並びにコード領域及び非コード領域の両方での多数の多形に比較して、NOD.C3H 6.VIIIコンジェニック系統の脾臓において6倍のアップレギュレーションを示した。Arntl2アップレギュレーションは、脾臓における他の日周期遺伝子の発現レベルでの変化と相関しなかったが、NODマウスにおいてインスリン炎及び自己免疫性糖尿病の進行に対して防御性であることが最近報告されたPla2g4a遺伝子を含むARNT結合モチーフのアップレギュレーションには相関した。本出願は、HIFβ-相同Arntl2遺伝子が1型糖尿病の制御に関わることを示す。
【００３５】
我々及び他の研究者は、免疫系、特に脾臓及び胸腺が、NODマウスにおけるIdd6媒介疾患感受性に必要であることを示している。本出願において、マウス1型糖尿病遺伝子座Idd6についての候補領域内に位置する遺伝子に対する系統的な転写プロファイリングアプローチが記載される。疾患に対して防御されたNOD.C3Hコンジェニック系統6.VIIIとそのNOD対照系統との比較において、6つの遺伝子が、脾臓において異なって発現されることが見出された。我々は、脾細胞同時トランスファーアッセイにおける糖尿病疾患防御のサブ表現型を、700 kbの制限インターバルに対して、3つの新たに創出したNOD.C3Hコンジェニック系統の分析によりマッピングした。この領域(Idd6.3)は10個の転写産物を含むが、日周期時計経路の成分であるbHLH-PAS転写因子スーパーファミリーメンバーArntl2 (Bmal2)のみが、疾患に対して防御された6.VIII系統において異なって発現されることが見出された。
【００３６】
Arntl2は、その転写産物の5'UTR、エキソン及び3'UTR配列内で多数のNOD/C3H多形を含む。Arnt2内でのいくつかの多形は、その機能的ドメイン内での変化を導き、その二量体形成、転写活性及び／又は特異性に影響することが予測できる。さらに、推定上の系統特異的オルタナティブスプライス形が同定された。以前に、ARNTL2 (BMAL2)のこのようなオルタナティブスプライシングが、可能性のある転写活性の広い連続体にわたってCLOCK:BMAL2へテロ二量体機能を調節できる加減抵抗器を組織に提供するであろうこと、及びこのことが種々の代謝要求及び生理的役割に適応するために重要であろうことが示唆されていた(36)。
【００３７】
本出願の実施例において、Arntl2転写産物レベルでの変化が、脾臓における他の日周期性で低酸素により誘導される遺伝子の発現レベルにおける広汎化された変化と関連しないことが示されている。しかし、BMAL-CLOCKへテロ二量体は、E-box要素依存性転写を活性化することが知られており(27)、脾臓試料に対する我々のマクロアレイ分析及び定量RT-PCRは、ARNT結合モチーフを含むサイトソルホスホリパーゼA(2)アルファ(cPLA(2)alpha)を、Arntl2の潜在的な下流の標的として明らかにしている。サイトソルホスホリパーゼA(2)アルファ(cPLA(2)alpha, Pla2g4a)遺伝子は、アラキドン酸経路において重要な役割を演じることが知られている。cPLA(2)alpha欠損非肥満糖尿病(NOD)マウスは、重篤なインスリン炎を示し、糖尿病の発病率が増加する。これらのノックアウトマウスのマクロファージにおいて、プロスタグランジンE(2) (PGE(2))の産生は減少し、腫瘍壊死因子(TNF)-アルファの産生は増加する。全体として、結果は、cPLA(2)alphaが、マクロファージからのTNF-アルファ産生を抑制することにより、インスリン炎の進行及び自己免疫性糖尿病の発症において防御的役割を演じることを示唆する(37)。この知見は、前糖尿病の6.VIIIマウスの腹膜マクロファージが、Tnf-アルファ発現において2.8倍減少する(未発表データ)という我々の発見と関連し、このデータは、Arntl2が6.VIIIマウスのマクロファージにおけるTnf-アルファ経路の制御に関連し得ることを示唆し得る。
【００３８】
6.VIII系統において広く発現されるArntl2遺伝子のアップレギュレーション及び多形が、免疫系の異なる態様の調節にどのように関係しているかをより正確に理解することは、特に、Arntl2の役割が組織ごと及び細胞の型同士の間で変動し得ることが予測できるので、さらなる研究の利益を受ける。例えば、増強された効果を実現する組織特異的スプライシング変異型を同定し、特徴付けることが可能である。その対立遺伝子が胸腺における増殖及びアポトーシスの制御において関係していると見られるIdd6についての以前に記載された表現型に関連して(22, 23)、Arntl2ダウンレギュレーションが細胞増殖を増強することが見出されたことに注目することが重要である(26)。別の研究では、Arntl2が、種々のCD4+CD25+ 調節T細胞亜集団において異なって発現されることを同定している(38)。この発見は、CD4+CD25+ T細胞活性がIdd6対立遺伝子により調節されることが見出されているので、興味深い(24)。
【００３９】
特に興味深いことに、最近のデータは、Arntl2のホモログであるARNT (HIF1β)が、ヒト及びマウスの両方において2型糖尿病に関連し、正常な膵臓ベータ細胞機能及びインスリン産生に必須であることを示している(39, 40)。低酸素誘導因子1 (Hypoxia-Inducible Factor 1)としても知られるARNTは、BMAL1及びBMAL2の両方とヘテロ二量体を形成し、遺伝子転写を調節する。マウスにおける1型糖尿病でのArntl2を意味するこれら及び我々のデータは、1型及び2型糖尿病の遺伝子及び分子経路のいくらかの共有性を示唆し、ARNT様遺伝子が疾患防御の機構のために時計を設定し得ることを示唆する。
【００４０】
上記に鑑みて、本発明は、
a) 対象から試料を得て；
b) 該試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
c) (b)で決定されたArntl2遺伝子の発現レベルを、上記の対象が属する個体群から得られる対応するタイプの試料中のArntl2遺伝子の平均発現レベルと比較する
ことにより、対象の進行性インスリン依存性糖尿病に対する感受性を診断する方法を提供し、ここで、Arntl2遺伝子の平均発現レベルのものより低い上記の対象でのArntl2遺伝子の発現レベルは、進行性インスリン依存性糖尿病における感受性の増加と関連する。
【００４１】
この実施形態において、任意の哺乳動物を対象として用い得る。本発明において用いるのに適する哺乳動物の例は、ヒト、ラット及びマウスを含む。
【００４２】
この実施形態において、Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号4の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同であるタンパク質をコードすることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００４３】
この実施形態において、用語「%相同」は、「%類似性」及び「%同一性」を含む。なお、Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号4の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一のタンパク質をコードすることが好ましい、さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００４４】
Arntl2遺伝子は、普遍的に発現されることがわかっているので(例えばSchoenhardら, Am. J. Physiol Cell Physiol. 2002 Jul; 283(1):C103〜114を参照)、この実施形態において、試料は、いくつかの供給源の1つから得てよい。これらの供給源は、多くの他の体組織及び／又は細胞を含む。特に例示される細胞の型は、粘膜、脾臓、胸腺、血液及び膵臓を含む。当業者は、本発明の方法で用いる試料について最も適切な供給源をどのようにして選択するかを知っているだろう。
【００４５】
好ましくは、試料は、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージからなる群より選択される少なくとも1つの型の細胞を含む。この実施形態のある態様において、試料は脾臓から得られる。
この実施形態において、試料は、当業者に容易に知られる通常の技術により得ることができる。例えば、試料は、組織生検、血液試料又は粘膜試料から得ることができる。
【００４６】
Arntl2遺伝子の発現レベルの決定方法は、任意の既知の方法により達成できる。例えば、Arntl2遺伝子の既知の配列に基づいて設計されたプライマーを用いる定量PCR技術により、Arntl2転写産物の量を定量可能である。当業者は、標準的なPCRプロトコルの解説について、他の周知の論文の中でもCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (2000)を参照する。発現レベルの決定を行うために用い得る他の定量法は、ELISA及び／又はウェスタンブロット法を含む。
【００４７】
この実施形態において、候補の対象のAnrtl2遺伝子の発現レベルは、該対象が属する個体群から得られる対応する型(すなわち、対象からの試料が脾臓から得られ、比較発現レベルが脾臓からであるなど)の脾臓試料中のArntl2遺伝子の平均発現レベルと比較される。本発明において、試料が種々の供給源(例えば胸腺、脾臓、膵臓、血液、粘膜など)からであり、比較発現レベルが既知の標準的な供給源(例えば血液)についてであることも考えられる。
【００４８】
このために、個体群のそれぞれの個体メンバーの基本的発現レベルを、候補対象のものと同じ手順で得ることができる。候補対象が属する個体群における代表的な数のメンバーの収集の後に、候補対象の発現レベルと比較できる平均発現レベルを決定する。この実施形態において、個体群の代表が、それらの1型糖尿病の状態について、偏りがない個体群であることを確実にするように、臨床スクリーニングされることが好ましい。
【００４９】
本明細書の実施例に記載するように、糖尿病に対して耐性がある対象において、Arntl2遺伝子の発現レベルは、糖尿病感受性対象で見出されるものより著しく高い。候補対象でのArntl2遺伝子の発現レベルがArntl2遺伝子の平均発現レベルよりも低い場合、この低下した発現は、進行性インスリン依存性糖尿病における感受性の増加に相関し得る。
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、
a) 糖尿病感受性NODマウスから対照試料を得て；
b) 該対照試料でのArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
c) 少なくとも1つの候補化合物を糖尿病感受性NODマウスに投与し；
d) 上記の投与の後に、糖尿病感受性NODマウスから試験試料を得て；
e) 該試験試料中のArntl2遺伝子の発現レベルを決定し；
e) (b)で決定されたArntl2遺伝子の発現レベルを、(e)で決定したものと比較する
ことにより、必要とする対象においてインスリン依存性糖尿病を治療又は予防するのに有効な化合物を同定する方法であり、ここで、(b)に比較した(e)でのArntl2遺伝子の発現レベルの増加は、インスリン依存性糖尿病に対する耐性の増加に相関する。
【００５１】
この実施形態において、Arntl2遺伝子が、配列番号1の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号2の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００５２】
この実施形態において、「%相同」は、「%類似性」及び「%同一性」を含む。なお、Arntl2遺伝子が、配列番号1の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号2の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一のタンパク質をコードすることが好ましい、さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００５３】
この実施形態の好ましい態様において、対照試料は、糖尿病感受性NODマウスの脾臓から得られる。好ましくは、対照試料は、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージからなる群より選択される少なくとも1つの型の脾細胞を含む。代わりに、上記の対照試料は、糖尿病感受性NODマウスの胸腺、膵臓、血液試料又は粘膜試料から得ることができる。
【００５４】
この実施形態の好ましい態様において、試験試料は、糖尿病感受性NODマウスの脾臓から得られる。好ましくは、試験試料は、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージからなる群より選択される少なくとも1つの型の脾細胞を含む。代わりに、上記の試験試料は、糖尿病感受性NODマウスの胸腺から得ることができる。さらに、試験試料は、他の組織及び／又は細胞の供給源、例えば膵臓から得ることができる。組織生検に加えて、試料は、血液試料又は粘膜試料から得ることもできる。
【００５５】
この実施形態において、試料は、当業者に容易に知られる通常の技術により得ることができる。例えば、試料は、組織生検、血液試料又は粘膜試料から得ることができる。
【００５６】
Arntl2遺伝子の発現レベルの決定方法は、任意の既知の方法により達成できる。例えば、Arntl2遺伝子の既知の配列に基づいて設計されたプライマーを用いる定量PCR技術により、Arntl2転写産物の量を定量可能である。適切なPCRプライマーの例は、配列番号11 (071-248F)及び配列番号12 (071-334R)、又は配列番号13 (AY-56F)及び配列番号14 (AY-136R)で表されるプライマー対を含む。用いるのに適するさらなるプライマーは、プライマー対：071-43F - GGGAGGATTGTTAGCACGTCTGTGA (配列番号31)及び071-2122R - 5'-CACTGTACTCTTGAGCACTGTATTG-3' (配列番号32)の逆相補配列である。
【００５７】
当業者は、標準的なPCRプロトコルの解説について、他の周知の論文の中でもCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (2000)を参照する。発現レベルの決定を行うために用い得る他の定量法は、ELISA及び／又はウェスタンブロット法を含む。
【００５８】
本明細書の実施例に記載するように、糖尿病に対して耐性がある対象において、Arntl2遺伝子の発現レベルは、糖尿病感受性対象で見出されるものより著しく高い。対照試料と比較した試験試料でのArntl2遺伝子の発現レベルが、候補化合物との接触により増加する場合、増加したArntl2遺伝子発現レベルは、インスリン依存性糖尿病に対する耐性の増加に相関し得る。
【００５９】
本発明の関係において、発現レベルの差は、再現性があり、顕著であり及び／又は測定できる差である場合に、「著しい」とみなす。より好ましくは、用語「著しい」とは、統計的に有意な差のことをいう。当業者に認識されるように、統計的な有意性は、任意の通常の統計分析法により決定できる。差は、p値が5%、より好ましくは1%、最も好ましくは0.1%である場合に統計的に有意であるとみなす。
【００６０】
この実施形態において、候補化合物は特に限定されない。本明細書において、候補化合物が薬剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドの免疫原性フラグメント、ホルモンなど又はそれらの塩であり得ることが考えられる。さらに、この実施形態において、対象に同時に投与され得る化合物の数は特に制限されない。言い換えると、化合物は、分割して投与できるか、複数の化合物を連続的又は同時に投与できる。さらに、化合物は、1又は複数の医薬的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤及びアジュバント又はこれらの混合物を含む医薬組成物として投与できる。
【００６１】
また、本発明は、広範な剤形及び投与量の効果の決定に適合させ得る。よって、化合物は、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下又は局所を含む任意の経路を介して、液体又は固体の形で投与できることが考えられる。
【００６２】
候補化合物の投与と試験試料の回収との間の時間は、即時から分、時間、週までの範囲であり得る。さらに、投与は、単回投与であり得るか、又は試験化合物の回収の前の複数の反復投与事象を含み得る。例えば、本発明は、1時間に1回、4〜6時間ごと、1日2回、1日1回、1週間に1回などでの、同じ(又は異なる化合物)の反復個別投与事象を含む。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「インスリン依存性糖尿病の対象を治療するために有効な」との句、又は「治療(する)」との用語は、化合物の投与が、インスリン依存性糖尿病に関連する症状、又はインスリン誘発性糖尿病により誘発され、引き起こされ又は媒介される少なくとも1つの障害が、少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも75%、さらにより好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%低減されることを意味する。
【００６４】
本明細書で用いる場合、「対象がインスリン依存性糖尿病になることを予防するのに有効な」との句、又は「予防(する)」との用語は、化合物の投与が、インスリン依存性糖尿病を発症する傾向があるか又は発症する危険性があると考えられる対象が実際にインスリン依存性糖尿病を発症する見込みの低下をもたらすことを意味する。好ましくは、本発明の関係において、この句は、化合物の投与が、インスリン依存性糖尿病を発症する傾向があるか又は発症する危険性があると考えられる対象が実際にインスリン依存性糖尿病を発症する見込み又は蓋然性の排除をもたらすことを意味する。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、上記の実施形態の方法により、インスリン依存性糖尿病の患者を治療するのに有効であると決定された化合物を含む組成物の有効量を投与することにより、必要とする対象におけるインスリン依存性糖尿病を治療する方法である。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は、上記の実施形態の方法により、必要とする対象においてインスリン依存性糖尿病を予防するのに有効であると決定された化合物を含む組成物の有効量を投与することにより、必要とする対象におけるインスリン依存性糖尿病を予防する方法である。
【００６７】
本出願において用いる場合、「必要とする個体」との用語は、インスリン依存性糖尿病により誘発され、引き起こされ又は媒介される少なくとも1つの障害の予防及び／又は治療についての必要性が認識される対象のことをいうために用いられる。この実施形態及び本発明全体において、対照は、限定されないが、ヒト、ラット及びマウスを含む任意の哺乳動物であり得る。
【００６８】
この実施形態において、対象に同時に投与され得る化合物の数は特に制限されない。言い換えると、化合物は、分割して投与できるか、複数の化合物を連続的又は同時に投与できる。さらに、化合物は、1又は複数の医薬的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤及びアジュバント又はこれらの混合物を含む医薬組成物として投与できる。
【００６９】
また、本発明は、広範な剤形及び投与量に適合できる。よって、化合物は、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下又は局所を含む任意の経路を介して、液体又は固体の形で投与し得ることが考えられる。
【００７０】
この実施形態において、組成物は、単回投与量又は反復投与量で投与できる。例えば、組成物は、1時間に1回、4〜6時間ごと、1日2回、1日1回、1週間に1回などで投与できる。
さらに、「有効量」の用語は、インスリン依存性糖尿病に関連する症状、又はインスリン誘発性糖尿病により誘発され、引き起こされ又は媒介される少なくとも1つの障害を、少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも75%、さらにより好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%低減する任意の量である。
【００７１】
しかし、化合物の性質、投与方法の性質及び投与量は、上記の同定方法により有効であると決定されたように仕立てることが一般的に好ましい。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、対照の細胞においてArntl2遺伝子の標的遺伝子の発現を調節することを含む、必要とする対象でのインスリン炎の進行又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法である。
【００７３】
本発明の範囲内の適切な標的は、Pla2g4a、Gpx、Chi313及びMpoを含む(実施例8を参照)。
【００７４】
よって、別の実施形態において、本発明は、対象の細胞においてArntl2遺伝子の発現を増強することにより、必要とする対象においてインスリン炎の進行及び／又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強する方法である。
【００７５】
この実施形態は、Arntl2のアップレギュレーションが、脾臓における他の日周期遺伝子の発現レベルの変化に関連しなかったが、NODマウスにおいてインスリン炎及び自己免疫性糖尿病の進行に対して防御性であることが最近報告されたPla2g4a遺伝子を含むARNT結合モチーフのアップレギュレーションには関連したことを示す以下の実施例での知見に基づく。本出願は、HIFβ-相同Arntl2遺伝子が1型糖尿病の制御に関わることを示す。よって、対象の細胞でのArntl2遺伝子の発現を増強することは、Pla2g4a遺伝子の発現レベルをアップレギュレートすることが予測され、次いでこのことがインスリン炎の進行及び／又は自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を増強するだろう。
【００７６】
上記で定義される「必要とする個体」の定義に関連して、この実施形態において、対象は、限定されないが、ヒト、ラット及びマウスを含む任意の哺乳動物であり得る。
【００７７】
この実施形態において、Arntl2遺伝子が、配列番号1の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号2の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同であるタンパク質をコードすることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００７８】
この実施形態において、用語「%相同」は、「%類似性」及び「%同一性」を含む。なお、Arntl2遺伝子が、配列番号1の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号2の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一のタンパク質をコードすることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００７９】
この実施形態において、Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号4の配列と少なくとも70%相同、好ましくは少なくとも80%相同、より好ましくは少なくとも90%相同、最も好ましくは少なくとも95%相同のタンパク質をコードすることが好ましい、さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００８０】
この実施形態において、用語「%相同」は、「%類似性」及び「%同一性」を含む。なお、Arntl2遺伝子が、配列番号3の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であることが好ましい。さらに、Arntl2遺伝子が、配列番号4の配列と少なくとも70%同一、好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一のタンパク質をコードすることが好ましい、さらに、Arntl2遺伝子産物が、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を有することが好ましい。
【００８１】
上記のように、Arntl2遺伝子は、普遍的に発現されることがわかっているので(例えばSchoenhardら, Am. J. Physiol Cell Physiol. 2002 Jul; 283(1):C103〜114を参照)、この実施形態及び本発明全体において、試料は、いくつかの供給源の1つから得てよい。これらの供給源は、多くの他の体組織及び／又は細胞を含む。特に例示される細胞の型は、脾臓、胸腺、血液、粘膜及び膵臓を含む。
【００８２】
この実施形態のある態様において、試料は、脾臓から得られる。好ましくは、試料は、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージからなる群より選択される少なくとも1つの型の脾細胞を含む。
この実施形態において、試料は、当業者に容易に知られる通常の技術により得ることができる。例えば、試料は、組織生検、血液試料又は粘膜試料から得ることができる。
【００８３】
Arntl2遺伝子の発現を増強する手段として、適切な方法の網羅的なリストであることを意図しないが、以下の方法を挙げることができる：
-     遺伝子治療による過剰発現；
-     Arntl2タンパク質分解を阻害する特定の薬剤の投与；
-     Arntl2の安定形を産生するための療法。
【００８４】
本明細書で用いる場合、用語「Arntl2」は、マウスから得られる配列番号1、及びヒトから得られる配列番号3のポリヌクレオチド配列、並びに配列番号2又は4で表されるポリペプチドと同じ機能を有するポリペプチドをコードする相同な配列を指すために用いられる。特に、用語「Arntl2」は、エキソン及びイントロンを含むオープンリーディングフレームのことを指すために用いられる。しかし、Arntl2遺伝子によりコードされるタンパク質は、エキソン領域のみを構成するであろうことが認識される。区別することが必要な場合、本発明では、マウスArntl2遺伝子を「mArntl2」、ヒトArntl2遺伝子を「hArntl2」という。
【００８５】
本発明は、Arntl2のポリヌクレオチド配列の相補鎖、又はそのホモログ及び／又はフラグメントにストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドも含む。
【００８６】
用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、その条件下でポリヌクレオチドが、他の配列よりも検出可能に大きい程度(例えばバックグラウンドの少なくとも2倍大きい)で、その標的配列とハイブリッド形成する条件のことを含む。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境下で異なる。ハイブリッド形成及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに100%相補的な標的配列を同定できる(相同プローブ結合(probing))。代わりに、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出されるように、いくらかのミスマッチを可能にするように調整できる(非相同プローブ結合)。
【００８７】
典型的には、ストリンジェントな条件は、pH 7.0〜8.3で塩濃度が約1.5 M Naイオン未満、典型的には約0.01〜1.0 M Naイオン濃度(又は別の塩)であり、温度が、短いプローブ(例えば10〜50ヌクレオチド)について少なくとも約30℃、及び長いプローブ(例えば50ヌクレオチドを超える)について少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成してもよい。低いストリンジェンシー条件の例は、37℃にて30〜35%のホルムアミド、1 M NaCl、1% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)のバッファー溶液でのハイブリッド形成、及び50〜68℃、好ましくは50〜55℃での1×〜5×SSC、好ましくは1×〜2×SSC (20×SSC=3.0 M NaCl/0.3 Mクエン酸三ナトリウム)での洗浄を含む。中程度のストリンジェンシー条件の例は、37℃にて40〜45%ホルムアミド、1 M NaCl、1% SDSでのハイブリッド形成、及び55〜60℃での0.5×〜1×SSCでの洗浄を含む。高いストリンジェンシー条件の例は、37℃にて50%ホルムアミド、1 M NaCl、1% SDSでのハイブリッド形成、及び60〜65℃での 0.1×SSCでの洗浄を含む。
【００８８】
特異性は、典型的には、ハイブリッド形成後の洗浄の関数であり、重要な因子は、イオン強度及び最終の洗浄溶液の温度である。DNA-DNAハイブリッドについて、Tmは、Meinkoth及びWahl, Anal. Biochem., 138:267〜284 (1984)の等式: Tm =81.5℃+16.6 (log M)+0.41 (%GC)-0.61 (% form)-500/L (式中、Mは1価のカチオンのモル濃度であり、%GCはDNA中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、% formは、ハイブリッド形成溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Lは塩基対でのハイブリッドの長さである)から概算できる。Tmは、相補標的配列の50%が完全にマッチするプローブとハイブリッド形成する温度(規定されたイオン強度及びpHの下で)である。Tmは、1%のミスマッチごとに約1℃減少する。つまり、Tm、ハイブリッド形成条件及び／又は洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリッド形成するように調整できる。例えば、約90%の同一性を有する配列を求める場合、Tmを10℃低下させ得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びpHの下で特定の配列とその相補鎖についての熱融解点(Tm)よりも約5℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェント条件は、熱融解点(Tm)よりも1、2、3又は4℃低いハイブリッド形成及び／又は洗浄を用い得る。中程度のストリンジェント条件は、熱融解点(Tm)よりも6、7、8、9又は10℃低いハイブリッド形成及び／又は洗浄を用い得る。低いストリンジェント条件は、熱融解点(Tm)よりも11、12、13、14、15又は20℃低いハイブリッド形成及び／又は洗浄を用い得る。等式、ハイブリッド形成及び洗浄組成物、並びに所望のTmを用いて、当業者は、ハイブリッド形成及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が、本質的に記載されていることを理解するだろう。ミスマッチの所望の程度が45℃(水溶液)又は32℃(ホルムアミド溶液)未満のTmをもたらすならば、より高い温度を用いることができるようにSSCの濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリッド形成についての詳細な手引きは、Current Protocols in Molecular Biology, 第2章, Ausubelら編, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (2000)に見出される。
【００８９】
本発明の関係において、ポリヌクレオチド配列は、その塩基組成及び塩基配列の少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%が、本発明による配列(すなわちArntl2)と同一である場合、本発明による配列と「相同」である。
【００９０】
本発明の別の目的は、Arntl2によりコードされるポリペプチド配列、又はそのホモログである。本発明のポリペプチドは、アリール炭化水素レセプター核輸送体活性を示す。
【００９１】
本発明によると、「相同タンパク質」又は「相同ポリペプチド」は、その少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%がArntl2によりコードされるアミノ酸配列に相当する(すなわち、同一及び／又は類似)アミノ酸配列を含むタンパク質(ポリペプチド)を含むと理解される。相同タンパク質が、野生型炭化水素レセプター核輸送体活性の残存活性の少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%を保持することが特に好ましい。相同タンパク質は、同族及び非同族アミノ酸置換、並びに多形及びオルタナティブスプライシングされた変異型を包含する。
【００９２】
「同族アミノ酸」の表現は、特にそれらの電荷、疎水性、立体化学特性などに関して類似の特性を有するもののことをいう。
【００９３】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の相同性、配列類似性又は配列同一性は、BestFit又はGap対比較プログラム(GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711)のような既知のソフトウェア又はコンピュータプログラムを用いることにより通常決定できる。BestFitは、Smith及びWaterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482〜489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、2つの配列間の最も高い同一性又は類似性のセグメントを見つける。Gapは、Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48:443〜453 (1970)の方法を用いて、一方の配列の全体と別の類似配列の全体との全体的なアラインメントを行う。BestFitのような配列アラインメントプログラムを用いて配列相同性、類似性又は同一性の程度を決定する場合、デフォルト設定を用い得るか、又は適切なスコア行列を選択して、同一性、類似性又は相同性のスコアを最適化できる。同様に、BestFitのようなプログラムを用いて2つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性又は相同性を決定する場合、デフォルト設定を用い得るか、又はblosum45若しくはblosum80のような適切なスコア行列を選択して、同一性、類似性又は相同性のスコアを最適化できる。配列アラインメントは、Align.ppcプログラム(Mac Molly TetraLite, Mologen)又はClustalWを用いて行うこともできる。
【００９４】
当業者は、タンパク質の活性にいずれの基本的な変化をもたらさない、すなわち機能的に天然である「センス変異」としてのタンパク質中の保存アミノ酸置換、例えばグリシンのアラニンによる、又はアスパラギン酸のグルタミン酸による置換も認識している。また、タンパク質のN-及び／又はC-末端の変化が、その機能を本質的に損なわず、むしろその機能を安定化し得ることも知られている。
【００９５】
用語「単離された」は、その天然の環境から分離されたことを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、通常、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドのことであり、非修飾RNA若しくはDNA、又は修飾RNA若しくはDNAを表し得る。さらに、この用語は、組換えポリヌクレオチドを包含する。もちろん、この用語は、その塩の形も包含する。
【００９６】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合している2以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を意味すると理解される。さらに、この用語は、組換えポリペプチドを包含する。もちろん、この用語は、その塩の形も包含する。
【００９７】
本発明者らは、NOD/Lt及びC3HHeJ系統でのマウス遺伝子Arntl2の配列決定をし、糖尿病感受性系統NOD/Lt及び糖尿病耐性系統C3HHeJの間の多形を同定した(実施例6及び図8〜17を参照)。これらの多形は、本発明の一部分を形成する。参照配列NM_172309は、糖尿病耐性C57BL/6J系統のことである。本発明者らは、糖尿病耐性コンジェニックNOD.C3H系統6.VIIIでアップレギュレートされるArntl2の転写レベルの変化も同定したことに注目すべきである。
【００９８】
上記の本発明についての記載は、いずれの当業者が本発明を作製して用いることができるように、本発明を作製し用いる様式及び方法を提供し、この実行可能性は、特に、当初の記載の一部分をなす添付の特許請求の範囲の主題について提供される。
【００９９】
上記で用いられるような「からなる群より選択される」「選択される」などの句は、特定される物質の混合物を含む。
【０１００】
数値限定又は範囲が本明細書に記載される場合、その終点が含まれる。また、数値限定又は範囲内の全ての値及びその下位の範囲(subrange)は、明示的に記載されているかの如く具体的に含まれる。
【０１０１】
上記の記載は、当業者が本発明を作製して用いることができるように記載され、特定の使用及びその要件に関して提供される。好ましい実施形態への種々の改変は、当業者に容易に認識され、本明細書で定義される一般的な原理は、本発明の範囲を逸脱しない他の実施形態及び使用に当てはめ得る。つまり、本発明は、記載される実施形態に限定されることを意図しないが、本明細書に記載される原理及び特徴に矛盾しない最大の範囲に一致する。
【０１０２】
本発明を一般的に記載したが、説明のためにのみ本明細書に記載され、かつ特に明記しない限りは限定することを意図しない特定の実施例を参照にして、さらなる理解が得られる。
【実施例】
【０１０３】
実施例
材料及び方法
RNA調製、cDNA合成及びマイクロアレイ分析-
トータルRNAは、RNABle (Eurobio)を用いて調製した。ランダムcDNA合成は、6μgのDNAseI処理トータルRNAに対して、SuperScriptTM II逆転写酵素(Invitrogen)を製造業者の条件に従って用いて行った。マイクロアレイ実験について、RNAの質を、Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent)を用いて調べた。DNAマイクロアレイ(8kマウスcDNA, Agilent)を、それぞれCy3-dCTP又はCy5-dCTPの存在下で転写された10μgのトータルRNAを用いてハイブリッド形成させた。データは、4つの独立した実験からであり、色素の交換を伴うそれぞれは、Feature Extraction及びRosettaリゾルバーソフトウェア(p＜0.05)を用いて分析し、SOURCEソフトウェア(Genetics Department, Stanford Universityより提供)を用いてアノテーションした。
【０１０４】
ノザンブロット及びRACE実験-
6.VIII系統及びNOD対照系統からの種々の組織のトータルRNAは、1%ホルムアミドを含む1%アガロースゲル上のTBE中で分離し、Hybond N+メンブレン(Amersham)に移した。ノザンブロットは、Arntl2特異的プライマーAY-555F 5'-AGGCAACACCAGAGCACTGA-3' (配列番号5)及びAY334R 071-334R 5'-GCCAGGATTACAAAGTGTGCAC-3' (配列番号6)を用いて増幅した3' NOD cDNAフラグメントを用いてハイブリッド形成させた。5'及び3' RACE実験は、NOD CO及び6.VIII系統から抽出した両方のトータル脾臓RNA、並びにGeneRacerキット(Invitrogen)を用いて行った。
【０１０５】
定量PCR -
定量PCRは、ABIPRISM 7700配列検出器において、SYBR Green PCR Master Mix (PE Biosystems)を製造業者の条件に従って用いて行った。プライマーは、PrimerExpressソフトウェアを用いて設計し、最適濃度を用いた。増幅産物の定量は、標準曲線法を用いて行った。日周期リズムの分析のために、ΔCT法及びレポーターとしてGapdh遺伝子発現を用いた。用いたオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりであった。
【０１０６】
【表１】
2009528030.tif 000003
【０１０７】
配列分析-
DNAフラグメントを、NOD.C3H系統6.VIII及びNOD対照マウスのゲノムDNA又はcDNAから増幅して配列決定した。多形は、Megalign (DNASTAR Inc.)を用いる配列アラインメントにより同定した。可能性のある転写因子結合部位は、Genomatix Software GmbH (Munich, Germany) (41)から入手可能なMatInspectorプログラムを用いることにより同定した。
【０１０８】
マウス系統の構築-
サブコンジェニック系統を、ともにC3H/HeJマウスとNOD/Ltマウスとの交雑に元来由来する(17)Idd6コンジェニックNOD.C3H 6.VIII系統(6.VIII)と、NOD対照コンジェニック系統(CO)とを交雑受精させることにより構築した。Idd6インターバルについての雄性マウスヘテロ接合体を、次いで、CO系統と戻し交配させた。組換え子孫を、多形マーカーD6Mit14、D6Mit15、D6Mit294及びD6Mit304を用いて選択した。対応するサブコンジェニックインターバルを、CO系統との戻し交配から得られるヘテロ接合体子孫の交雑受精により固定した。
【０１０９】
糖尿病の評価及びトランスファーアッセイ-
自発的糖尿病発病を、10週齢から30週齢まで、糖尿の評価(Diabur試験, Roche)により毎週監視した。脾細胞同時トランスファーを、糖尿病性NODマウスからの107の脾細胞を、種々のマウス系統の7週齢のマウスからの2×107脾細胞とともに、5週齢のNOD/Scidマウスにトランスファーすることにより行った。累積糖尿病発病を、トランスファーの10週後にわたって、毎週監視した。
【０１１０】
統計分析-
統計は、群の比較についてKaplan-Meier推定及びログランク検定により行った。定量RT-PCRからのプールしたデータは、平均＋／−標準偏差として比較した。
【０１１１】
実施例1：ハプロタイプマッピングによるIdd6インターバルの緻密化-
糖尿病耐性Idd6コンジェニック系統NOD.C3H 6.VIII (系統6.VIII)の元来のマイクロサテライトに基づく遺伝子型決定は、C3H遺伝子移入ドナー配列が第6染色体の末端に、マイクロサテライトマーカーD6Mit113の遠位に位置することを示した(17, 25)。ゲノムデータベースに列挙される潜在的SNPの無作為サンプリングは、マウス第6染色体上のbpで144,874,468と144,874,516の間に位置する4つの多形を同定した。これらのSNPは、D6Mit113に遠位に位置するSox5遺伝子のサイレントアミノ酸交換と関連する144,874,516位のbpでのSNPを含んでいた(Mus musculusについてEnsemblマウスデータベース) (表1)。これらの新しく同定されたSNPのマッピングは、Idd6遺伝子座が、Sox5遺伝子座とマウス第6染色体のテロメアとの間に存在する6.1 Mbから5.4 Mbまでのインターバルに拘束されることを可能にした。
【０１１２】
【表２】
2009528030.tif 000004
【０１１３】
実施例2：サブコンジェニック系統の構築及び糖尿病の発病率-
遠位マウス第6染色体の4 cM (5.4 Mb)内に局在化する1型糖尿病関連Idd6候補領域をさらに緻密にするために、C3H/HeJマウス系統とNOD/Ltマウス系統との交雑に元来由来するIdd6コンジェニックNOD.C3H 6.VIII系統(6.VIII)と、NOD対照コンジェニック系統(CO)とを交雑受精させることにより、一連のサブコンジェニック系統を構築した。交雑受精により得られたヘテロ接合体雄性マウスを、CO系統と再び戻し交配させ、子孫の中から組換え体を多形マーカーD6Mit14、D6Mit15、D6Mit294及びD6Mit304を用いて選択した(図1)。試験した200 BX1動物のうち、3つが組換え体であることがわかった。対応するサブコンジェニックインターバルは、さらにCO系統と戻し交配させ、ヘテロ接合体組換え動物の交雑受精により固定した。図1に示すような、遠位第6染色体についての大きいマーカーパネルを用いる遺伝子型決定により、C3H由来インターバルのサイズの見積りが可能であった。我々は、組換えについての3つの全ての区切り点(breakpoints)が、マーカーD6Mit294とD6Mit373との間に位置することに注目し、このことは、この領域がIdd6インターバル内において、他のものよりも頻繁に組換えを起こし得ることを示唆する。
【０１１４】
我々は、全ての3つのサブコンジェニック系統について、親の系統と並行して、30週の期間にわたって毎週、糖尿病発病率を試験した(図2)。雌性マウスにおいて、全ての新しく創出した系統は、各系統が6.VIII系統よりもわずかに少なく防御されてはいたが、CO系統に比較して防御した。各系統の雄性マウスは雌性マウスよりも糖尿病の発症がより少なかったが、データは、雄性マウスについて同様であった。この結果は、少なくとも2つのインターバル(Idd6.1及びIdd6.2)並びにIdd6領域のいくつかの遺伝子が、6.VIII系統の全体的な糖尿病に対する防御に寄与するとの結論を導く(表1)。
【０１１５】
実施例3：糖尿病トランスファーの阻害の分析-
我々は、以前に、Idd6が、脾細胞を用いた場合に、同時トランスファーアッセイにおいて糖尿病の抑制を改変することを示した。我々は、この脾細胞のサブ表現型が、新しく導いたC3H由来サブインターバルの1つ又はその他に分離されるかについて試験した。7週齢のマウスからの合計で2×107の脾細胞を、NOD/Scidレシピエントマウスに、糖尿病マウスからの合計107の脾細胞とともに注射した。予測されたように、糖尿病誘発性の細胞単独の注射では、NOD/Scidレシピエントにおいて糖尿病の迅速な誘導をもたらした。脾細胞の同時トランスファーは、試験した全ての群において糖尿病のトランスファーを阻害した(図2)。以前に記載されたように、より強い防御が、CO脾細胞を用いるよりも6.VIII脾細胞を用いて見出された。同様の著しい防御が、系統6.VIIIcについて見られたが、系統6.VIIIa又は6.VIIIbのいずれについても見られなかった。系統6.VIIIcは、系統6.VIIIaから、マーカーD6Mit294 (147.2 Mb, 系統6.VIIIcにおけるC3H対立遺伝子、6.VIIIaにおけるNOD対立遺伝子)とD6Mit373 (147.9 Mb, 6.VIIIc及び6.VIIIaの両方におけるC3H対立遺伝子)との間に存在する700 kb C3H由来インターバル(Idd6.3)のみが異なる。
【０１１６】
実施例4：Idd6インターバルにおける遺伝子の転写プロファイリング-
糖尿病関連遺伝子は、機能的コード配列変異型であるか、又は糖尿病感受性系統と糖尿病耐性系統との間で異なる調節を示すかのいずれかであると予測される。機能的コード変異型の検出は、数百の可能性のある遺伝子を含む5.4 Mb Idd6候補インターバルの全体を通しての網羅的な配列決定の努力を必要とし、このことは、評価のために非常に多数の配列変異型をもたらす可能性がある。よって、我々は、まず、IDDMの感受性の原因である潜在的な候補遺伝子の同定のための発現解析を行った。Idd6内の可能性があるマウス転写産物は、Celera及び公共のデータベースから同定した。さらなる情報は、12p11-p12.2染色体領域をマッピングするヒトゲノムにおけるIdd6にシンテニーな領域の試験により得られた(NCBIバージョン35.1, 図1)。
【０１１７】
我々の以前の結果は、脾細胞が、Idd6により媒介される疾患の調節に寄与することを示したので、脾臓における可能性のある転写産物の発現プロファイルを調べた。脾臓において発現されたこれらの遺伝子を、次いで、糖尿病感受性NODマウスと糖尿病耐性コンジェニック系統6.VIIIとでの発現の違いについて、リアルタイムRT-PCRにより分析した。4週齢及び6〜7週齢の両方のマウスからの脾臓試料を、顕性糖尿病の開始前の疾患進行の一次段階の間に違いを示す遺伝子を捕らえるために、選択した。6つの転写産物が、脾臓においてそのような示差的発現を有することが見出された。これらの遺伝子は、Bcat1、Csac1 (Las1)、Arntl2 (Bmal2)、2つのESTクローンBE647206及びAW120472により表される未知の機能の遺伝子、Mlstd1 (Msl2)、及び推定転写産物mCG1027210であった(Celeraデータベース) (表1)。
【０１１８】
700 kbのIdd6.3インターバルは、合計で10個の遺伝子を含み(図1, 表2)、7つの転写産物4933424B01Rik、Tm7sf3、Stk381、LOC232534、1700023A16Rik、Ppfib1、及び2210417D09Rikは、それらの既知の役割及び不適切な発現パターンのために、IDDMについての候補ではないようである。しかし、これらの遺伝子のいずれも、6.VIII系統の脾臓において6倍過剰発現されたArntl2 (Bmal2) (脳-筋肉-ARNT-様タンパク質2；brain-muscle-ARNT-like protein 2)遺伝子以外は、6.VIII系統とCO系統との間で示差的発現を示さなかった。我々は、よって、Arntl2の詳細な分析を行った。
【０１１９】
【表３】
2009528030.tif 000005
【０１２０】
実施例5：Arntl2候補遺伝子の発現及び転写分析-
Arntl2遺伝子は、基本的なヘリックス-ループ-ヘリックス-Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS)転写因子をコードし、日周期時計により媒介される活動及び細胞増殖の調節に機能的に連結している(26)。Arntl2遺伝子は、4週齢又は6〜7週齢の糖尿病耐性系統6.VIIIの動物から得られる脾臓において、糖尿病感受性NODマウスからのものよりも著しく高い量で発現された(図3A)。同じ群の動物から得られた胸腺は、系統6.VIIIとNODマウスの間で、2倍の違いしかなかったが、類似の傾向を示した(図3B)。B細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+CD25+調節性T細胞を含むリンパ球のサブセットは、組織全体の調製物に対して類似の発現の違いを示した。脾臓のさらなる発現プロファイリングは、Arntl2の発現の違いは、動物の年齢から独立しており、2〜12週齢、及び糖尿病性の動物において維持されたことを示した(図3C)。これらの結果は、2つのマウス系統でのArntl2の発現の違いが、疾患の進行から独立していることを示唆する。
【０１２１】
複数の組織におけるArntl2の詳細な転写パターンを、系統6.VIII及びNODマウスにおいて調べた。脳又は肺のような調べた器官のほとんどについて、同定された主要な転写産物は、9 kb又は0.6 kbのサイズであった。脾臓及び胸腺の転写産物プロファイルは、しかし、他の器官のものと比較して驚くほど多様であり、さらなる3.9 kb及び1.6 kbの転写産物が、脾臓及び胸腺の両方で見出された。1.4 kbの転写産物は、胸腺においてのみ見出された。ほとんどの器官に存在する共通の0.6 kbの転写産物は、胸腺において同定されなかった(図4)。脾臓及び胸腺に特異的な転写産物を含むこのような複雑な転写プロファイルは、免疫系におけるArntl2遺伝子の特異的な役割を示し得る。
【０１２２】
以前の研究は、それぞれ579及び199アミノ酸を含む、Bmal2の2つのタンパク質産物であるBmal2a及びBmal2bを同定した(27)。系統6.VIII及びNOD COマウスの脾臓において発現される転写産物を調べるうちに、3番目の推定オルタナティブスプライス変異型であるBmal2cが、5' RACE実験において同定された。この転写産物は、コンセンサスmRNA(AY005163, Arntl2a mRNA)においてエキソン7の開始の100ヌクレオチド上流のイントロン内で開始された。この転写産物は、全長タンパク質のC-末端の半分のみを含む355アミノ酸タンパク質をコードし、bHLH及びPAS-Aドメインの両方を欠いている(図4B)。これらの転写産物の全ては、6.VIIIとNODの脾臓の間で同一であったが、ネステッドプライマーから増幅された部分cDNA配列の分析は、異なるエキソンの使用により作製された、系統6.VIII及びNODに特異的な転写産物の存在を示した(図4C)。
【０１２３】
実施例6：Arntl2遺伝子中の配列多形-
候補遺伝子としてのArntl2を確認するために、そのコード3' UTR及び5' UTR領域の配列を、系統6.VIII及びNOD COマウスの間の多形について分析した。エキソン領域内で、アミノ酸94 (6.VIII: A及びNODマウス: G)のゆらぎ位置での1つの同義多形、5つの非同義多形、及び1つの挿入／欠失を同定した(図5A)。系統6.VIIIのアミノ酸71位にてHLH領域のヘリックスIに位置するロイシン残基は、NODマウスにおいてメチオニンに置き換えられていた。bHLHファミリーで高度に保存されているこのロイシン残基は、ヘリックス構造の形成においてヘリックスIIの残基と相互作用することにより重要な接触部位として働き、タンパク質の二量体形成においても関わっている(28, 29)。同定されたその他の多形は、PAS-BドメインとC末端との間に全て位置した。系統6.VIIIのアミノ酸425位、426位及び455位の3つのセリン残基は、NODマウスにおいて全てグリシン残基により置き換えられていた。NODマウスにおいて、系統6.VIII の450位のバリン残基は、イソロイシンにより置き換えられ、483位のグルタミン酸は欠失されていた。
【０１２４】
Arntl2遺伝子の3' UTR配列も、著しい多様性を示した。Arntl2の停止コドンから90ヌクレオチドほど遠位に位置する147,759,748位と、マウス第6染色体上の147,760,154位との間の配列に存在する複数の長い挿入／欠失は、6.VIII (409 bp)及びNOD (529 bp)において、DNAフラグメントの長さの主な変動をもたらした。多数の塩基置換も同定された(図5B)。
【０１２５】
ESTクローンBY242187の分析により、Arntl2の上流5'UTR配列の同定が可能になった。2つのさらなるエキソンが、147,716,951位と147,717,036位の間(E1')、及び147,723,827位と147,723,947位の間で同定され、E1'エキソンはATGの約9.4 kb上流に位置した。AY005163の当初のエキソンのスプライスドナーの位置は、ATGの95ヌクレオチド程度上流の147,726,370位で見出された。5'UTR領域内で、多形は同定されなかった。しかし、多数のSNPが、E1'エキソンに接して同定された。
【０１２６】
上記の配列及び説明のための情報は、以下のことに相当する図8〜17に示す。
図8は、mBmal2に関する情報のグラフ表示を示す。
図9は、mBmal2の転写プロファイルを示す。
図10は、mBmal2の遺伝子構造を示す。
【０１２７】
図11は、mBmal2のSNP及びインデルを示す。「Query」と示す配列は、配列番号35であり、「Sbjct」と示す配列は、配列番号36である。
【０１２８】
図12A〜Bは、Bmal2コード領域を示す。NOD対照は、配列番号33に示し、6.VIIIは、配列番号34に示す。
【０１２９】
図13A〜Cは、ゲノム配列のイントロン及びエキソン部分を明示する。図13A：071-E1 (118F-668R) - 3 SNP (Ensembl Chr.6 147727278〜147727780)、エキソン: 下線部; NOD対照は配列番号37に示し、6.VIIIは配列番号38に示す。図13B: SNP35-38 (SNP35-38-64F+SNP35-38-465R) - 1 SNP (Ensembl Chr.6 147746092〜147746427); NOD対照は配列番号39に示し、6.VIIIは配列番号40に示す。図13C: 071-E5 (131F+465R) - 5 SNPs (Ensembl Chr.6 147751781〜147752273) エキソン: 下線部; NOD対照は配列番号41に示し、6.VIIIは配列番号42に示す。図13D: 071-SNP 75-80 (114F+440R) - 1 SNPs (Ensembl Chr.6 3番目の塩基147758806から開始して147759169まで); NOD対照は配列番号43に示し、6.VIIIは配列番号44に示す。
【０１３０】
図14は、エキソンに印をつけたBmal2コード領域を示す。Bmal2コード領域(配列番号45) - 異なる色で印をつけたエキソン(例としてCO) 太字: 同じであるがスプライス形のエキソン(太字及び下線の部分は、mBmal2bにおいてスプライシングによりなくなり、転写の早期停止をもたらす。本発明者らは、NOD及び6.VIIIにも同型の配列を見出した)。下線及び下線を付した斜体: 6.VIIIのオルタナティブエキソン 斜体: NOD対照のオルタナティブエキソン。
【０１３１】
図15A〜Bは、Bmal2cに相当する配列決定ファイルを示す(071-43Fから071-2122R)。より具体的には、これらの図は、フォワードプライマーとして配列番号31、及びリバースプライマーとして配列番号32の逆相補配列を用いる増幅による、Bmal2cに相当する配列データを示す。Bmal2cは、pGEM-Tベクターにクローニングした。コード領域に下線を付す。NOD対照(図15A)は、配列番号46に、配列番号47として表されるコードされたポリペプチドとともに示し、6.VIII (図15B)は、配列番号48に、配列番号49として表されるコードされたポリペプチドとともに示す。
【０１３２】
図16は、3' UTR (停止コドンの直後)を示し、最初の塩基はEnsembl v37 chr.6 147759660に相当する。NOD対照は配列番号50に示し、6.VIIIは配列番号51に示す。
【０１３３】
図17A〜Dは、上流ゲノム配列を示す(プライマー: 071-16798F+071-17695R)。図17A: 上流ゲノム配列(プライマー: 071-16798F+071-17695R) - 4 SNPs (6.VIII配列blastからEnsembl Chr.6 : 100番目の塩基から最後まで147715903〜147716583- 1-99の結果はわからず); NOD対照は配列番号52に示し、6.VIIIは配列番号53に示す。図17B: 上流のゲノム配列(プライマー: 071-17610F-18412R) - 5 SNPs (Ensembl Chr.6 147716616〜147717298); NOD対照は配列番号54に示し、6.VIIIは配列番号55に示す。図17C: 上流のゲノム配列(プライマー: 071-18235F-19236R) - 2 SNPs (1番目の塩基=Ensembl Chr.6 147717274 - 配列は、blastの結果においていくつかの小片に分解している); NOD対照は配列番号56に示し、6.VIIIは配列番号57に示す。図17D: 上流のゲノム配列(プライマー: 071-19129F+071-19896R) - 6SNPs (24番目のntから最後まで= Ensembl Chr.6 147718263〜147718817); NOD対照は配列番号58に示し、6.VIIIは配列番号59に示す。
【０１３４】
実施例7：Arnt2遺伝子及び日周期遺伝子の日周期調節-
脾臓におけるArntl2 (Bmal2)の日周期発現を、14時間の人工光及び10時間の暗所のサイクルの下で飼育したマウスにおいて調べた。これらの設定は、糖尿病の発病を監視したときに用いたものと同一である。Bmal2の脾臓での発現は日中の間に適度に振動し、系統6.VIIIとNOD対照との間の転写レベルの差は、24時間の期間全体にわたって維持された(図6A)。Bmal2転写産物レベルの系統間の違いは、Bmal2により調節される他の日周期遺伝子の発現が変更される可能性を示唆した。主日周期遺伝子でありBmal2の近縁のホモログであるArntl1 (Bmal1)は、暗段階の始めに最低の発現を示し、明段階の始めに最高を示すサイクルで振動した(図6B)。Bmal1により負に調節されるBmal1又はPer1のいずれについても著しい違いは見出されなかった(図6C)。同様の結果が、Per2、Per3及びDec1のような自己調節フィードバックループに関する他の日周期遺伝子について観察された。
【０１３５】
さらに、Bmal2によりインビトロで調節される下流の日周期出力遺伝子である(30)プラスミノゲンアクチベータ阻害剤1 (PAI-1)遺伝子は、転写レベルにおいて系統特異的な違いを示さなかった(図6D)。Arntl2とインビトロでヘテロ二量体を形成可能なタンパク質である(31)低酸素誘導性因子-1α(Hif-1α)は、アドレノメデュリンの発現を媒介し、これが次いでT細胞の生存に関わる(32, 33)。アドレノメデュリン発現の分析は、6.VIII系統とNOD対照の脾臓の間の違いを明らかにすることはできなかった。我々は、系統6.VIIIにおけるBmal2のアップレギュレーションは、脾臓における他の日周期及び低酸素誘導性遺伝子の転写レベルの全体的な変化を導かないと結論付けた。
【０１３６】
実施例8：サイトソルホスホリパーゼA2は、Arntl2の潜在的下流標的である-
4匹の8週齢前糖尿病のメスからのプールした脾臓試料を用いるマイクロアレイ実験から、我々は、5.4 Mb Idd6インターバルのC3H対立遺伝子による置き換えが、COマウスに比較して、6.VIIIマウスにおいて約5%のトランスクリプトームの調節解除をもたらすと結論付けた。我々は、既知の又は潜在的な免疫機能を有する7個のダウンレギュレーションされた転写産物及び14個のアップレギュレートされた転写産物を選択して、6.VIIIマウスの脾臓におけるそれらの発現の違いが、Arntl2の発現と相関関係があるかについて試験した。
【０１３７】
6〜7週齢のメスからのプールされたRNAを用いるリアルタイムRT-PCRにより、1.5倍を超える倍数の変化を示す、ダウンレギュレーションされた遺伝子の2つ及びアップレギュレーションされた遺伝子の9つについてのマイクロアレイの結果が確認された。6.VIIIマウスにおける最高のアップレギュレーションは、キチナーゼ3-様1 (Chi3l1) (5.6倍)、ミエロペルオキシダーゼ(Mpo) (2.1倍)、及びサイトソルホスホリパーゼA2 (Pla2g4a) (1.7倍)遺伝子で見出された。異なる年齢のマウスからの脾臓試料を用いる詳細な転写分析に遺伝子を共した場合、低酸素関連Pla2g4a遺伝子(34, 35)は、Arntl2のように、全ての年齢で系統6.VIIIにてアップレギュレーションされるかのように特定の興味深い発現を示した(図7)。系統6.VIIIcからの脾臓試料を、6.VIIIa試料と比較したときに、2倍のアップレギュレーションも測定され、このことにより、アップレギュレーションが、少なくともいくらかの程度はIdd6.3内に存在する因子に指向されることが確かめられた。
【０１３８】
潜在的なARNT結合部位(TGCGTG)は、その転写開始部位の+101〜+106で同定され、このことは、Pla2g4aがArntl2の直接の標的であることを示す。Arntl2と同様に、Pla2ga4a発現は、CD4(+) T細胞、CD8(+) T細胞、B細胞及びマクロファージを含む異なる脾細胞集団においてアップレギュレーションされた。我々は、その日周期プロファイルを分析し、Pla2g4aの発現は緩やかに振動したが、系統6.VIII及びCOマウスの間の変動は、1日を通して維持されたことを示した(図7)。興味深いことに、Pla2g4aの日周期プロファイルは、Arntl1 (Bmal1)及びArntl2 (Bmal2)のものと非常によく似ているが、Per1及びPAI-1のものと明らかに異なっていた。このことは、Pla2g4a日周期発現が、Bmal1及びBmal2のものと相関関係があり、これらの転写因子により調節され得ることを示唆する。
【０１３９】
実施例9：Arntl2遺伝子の試験のための細胞性エクスビボシステムの確立-
本発明者らは、候補遺伝子の特徴決定におけるエクスビボシステムの妥当性を探索することに興味を持った。このために、本発明者らは、RAW264.7細胞マクロファージ系統と、いくつかのその他の現在用いられているマウス株化細胞についての研究を行った。本発明者らは、これらの株化細胞が、それらをレンチウイルスベクターにサブクローニングする前のpSUPERベクター系(Oligogene)にクローニングされたRNAi構築物の系統的な試験に用い得ることを示すことができている。これらの研究のいくつかについて、RAW264.7は特に興味深い。なぜなら、これは、媒介されるArntl2経路の機能的研究に用いることもできるからである。
【０１４０】
これらの実験において、RAW264.7株化細胞のリポフェクション法(jetPEITMトランスフェクション試薬, Polyplus)を用いる一過性のトランスフェクションは、Arntl2変異型で試験したときに、遺伝子発現の60%の減少をもたらす。安定な構成要素は、発現の約90%の低下を示すと予想された。Arntl2のダウンレギュレーションは、糖尿病の発症に関することが知られている別の遺伝子の調節解除をもたらした。
【０１４１】
本発明の多数の改変及び変動は、上記の教示に鑑みて可能である。よって、添付の特許請求の範囲内で、本明細書に具体的に記載された以外の方法で本発明を行うことができることが理解される。
【０１４２】
【表４】
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【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
【表７】
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【０１４６】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】C3H由来インターバルのサイズの判断を可能にする遠位第6染色体についての大きいマーカーパネルを用いる遺伝子型決定を示す。
【図２】元来のNOD.C3H 6.VIII及び新しいサブコンジェニックマウス系統である6.VIIIa、6.VIIIb、6.VIIIcに含まれる遠位第6染色体上のC3H由来インターバル(灰色のバー)のマップを示す。
【図３】6.VIII系統(白色のバー)及びNOD COマウス(黒色のバー)でのArntl2 (Bmal2)遺伝子の相対的発現を、任意単位として示す。
【図４】Bmal2の転写プロファイルと、構造とを示す。
【図５】Bmal2内のC3H対NODの多形を示す。
【０１４８】
【図６】14時間の明(塗りつぶしていないバー)及び10時間の暗サイクル(塗りつぶしたバー)の下で飼育した単一の8週齢の6.VIII (白丸)及びNOD (黒三角)マウスの脾臓でのArntl2、Arntl1、Per1及びPAI-1発現の日周期の転写プロファイルを任意の単位で示す。
【図７】6.VIII (白色のバー)及びNOD (黒色のバー)系統の異なる年齢のマウスの脾臓におけるPla2g4a (A)の任意の単位での相対的発現を示す。
【図８】mBmal2に関連する情報のグラフ表示を示す。
【図９】mBmal2の転写プロファイルを示す。
【図１０】mBmal2の遺伝子構造を示す。
【０１４９】
【図１１】mBmal2のSNP及びインデルを示す。
【図１２】Bmal2コード領域を示す。
【図１３】ゲノム配列のイントロン及びエキソン部分を明示する。
【図１４】エキソンに印をつけたBmal2コード領域を示す。
【図１５】Bmal2cに相当する配列決定ファイルを示す(071-43Fから071-2122R)。
【図１６】3' UTR (停止コドンの直後)を示し、最初の塩基はEnsembl v37 chr.6 147759660に相当する。
【図１７】上流ゲノム配列を示す(プライマー: 071-16798F+071-17695R)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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