(57)【要約】可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を得るための、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾された植物の使用法。【選択図】図７
2009544299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を得ることを目的とする、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾された植物の使用法。
【請求項２】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物が、変異した不活性の可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を産生する、請求項１に記載の使用法。
【請求項３】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物の、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）の合成が減少しているかまたはない、請求項１に記載の使用法。
【請求項４】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物の、前記可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードするｍＲＮＡの合成が減少しているかまたはない、請求項１に記載の使用法。
【請求項５】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物に由来する可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードする遺伝子が、一つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変異されている、請求項１に記載の使用法。
【請求項６】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物に由来する可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードする遺伝子が、プロモーター配列、イントロン配列、およびエクソン配列で構成されるグループから選択される少なくとも一つの遺伝子配列部分で変異されている、請求項５に記載の使用法。
【請求項７】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物に由来する可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードする遺伝子が、少なくとも一つのイントロンまたは一つのエクソン内における少なくとも一つのヌクレオチドの挿入によって変異されている、請求項５に記載の使用法。
【請求項８】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物がさらにデンプンホスホリラーゼも欠いている、請求項１〜請求項７のいずれか一つに記載の使用法。
【請求項９】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物が単子葉植物または双子葉植物で構成されるグループから選択される、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の使用法。
【請求項１０】
前記ＳＳＩＶ不活性植物が、アブラナ科、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  Ｆａｂａ  Ｌ）、稲（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ビート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、グリンピース（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、および小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）で構成されるグループから選択される種に属する、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の使用法。
【請求項１１】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物が、配列番号６で構成される変異した可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）遺伝子を含む形質転換されたシロイヌナズナからなる、請求項１０に記載の使用法。
【請求項１２】
（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾された植物であり、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼのいずれも欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する植物。
【請求項１３】
単子葉植物または双子葉植物で構成されるグループから選択される、請求項１２に記載の形質転換植物。
【請求項１４】
アブラナ科、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  Ｆａｂａ  Ｌ）、稲（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ビート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、グリンピース（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、および小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）で構成されるグループから選択される種に属する、請求項１３に記載の形質転換植物。
【請求項１５】
配列番号６で構成される変異した可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）遺伝子を含む形質転換されたシロイヌナズナからなる、請求項１３に記載の形質転換植物。
【請求項１６】
請求項１２から請求項１５のいずれか一つに記載の形質転換植物の細胞に由来する、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた、形質転換された植物細胞。
【請求項１７】
植物からデンプンを抽出する過程を含むデンプン産生方法であり、該植物が、
ａ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾され、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する植物、ならびに
ｂ）（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾され、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼのいずれも欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を含む植物細胞を有する植物
で構成されるグループから選択される産生方法。
【請求項１８】
植物に由来する植物細胞からデンプンを抽出する過程を含むデンプン産生方法であり、該植物が、
ａ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾され、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する植物、ならびに
ｂ）（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾され、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼのいずれも欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する植物
で構成されるグループから選択される産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたデンプン合成の特徴を含む、改良された産業上有益な特徴を有する、遺伝的に修飾された植物の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは、穀物粒を含む様々な植物の粒の主要な構成要素であり、穀物粒では、成熟した粒の重量のおよそ６５％〜６７％を占めるものである。一般的に、穀物では乾燥重量でデンプン含有量が４５％から８５％を占め、豆類では乾燥重量の３０％から７０％、そして塊茎類では乾燥重量の６５％から８５％を占めるとされている。
【０００３】
植物のデンプンは二種のグルコースホモポリマーであるアミロースとアミロペクチンで構成される。アミロースは、１０００〜６０００グルコース単位の重合度を有する、わずかに分岐した直鎖状分子である。アミロペクチンはより大きなポリマー単位であり（１０５〜１０６グルコース単位の重合度）、α−１，６分枝結合の頻度が高い（４％〜５％）。
【０００４】
デンプンは、主として、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．２７）、デンプン合成酵素（ＥＣ  ２．４．１．２１）、枝作り酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）、ならびに脱分岐酵素（ＥＣ  ３．２．１．４１およびＥＣ  ３．２．１．６８）を含む多くの酵素の共同作用によって穀物の胚乳のアミロプラストにおいて産生される。
【０００５】
デンプン合成酵素（ＳＳ）は、事前に存在するα−１，４グルカンプライマーへの、ＡＤＰ−グルコースのグルコシル部分（活性化されたグルコシルドナー）の転移を触媒する。ある研究では、植物系統において最も早い段階で枝分かれしていると考えられる、プラシノ藻類の一つであるＯｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉが、非常に小さなゲノムを有しているにも関わらず、稲またはアラブドプシスのゲノムにおいて記載されているものと同じ数、同じファミリー型のデンプン合成酵素を有することが示されている（Ｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３６，３３３３−３３４０）。この高度な経路の保存は、これらの酵素がデンプンの構築において、保存され特異的な機能を果たしていることを示している。植物において、五つの異なったデンプン合成酵素ファミリーが報告されている。これらのうち四つ（ＳＳＩからＳＳＩＶ）が主に可溶性酵素であるのに対し、第五の酵素（ＧＢＳＳＩ）は顆粒結合性である。
【０００６】
いくつかのＳＳＩＶデンプン合成酵素をコードする核酸配列がクローニングされ、そして植物または細菌を形質転換するために利用されている。例えば、米国特許第６２１１４３６号明細書は、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）のＳＳＩＶタンパク質をコードする核酸のクローニング、ならびに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換するために利用されるベクターへの該核酸の挿入を開示している。しかし、米国特許第６２１１４３６号明細書は、厳密には、植物におけるＳＳＩＶ遺伝子発現の実際の生理学的効果に関する、いかなる生物学的アッセイも実験結果も開示していない。また、国際公開第０１／１４５４０号パンフレットとして公開されているＰＣＴ出願は、稲、大豆、および小麦に由来するＳＳＩＶタンパク質（ＳＳＶタンパク質と称する）をコードする核酸の単離を開示している。また、ＰＣＴ出願の国際公開第０１／１４５４０号パンフレットは、ＳＳＩＶをコードする遺伝子によって、トウモロコシ植物の細胞、大豆植物の細胞、および大腸菌細胞を形質転換するために用いることのできる技術も開示している。しかし、ＰＣＴ出願の国際公開公報第０１／１４４５０号パンフレットは、ＳＳＩＶをコードする遺伝子によってトランスフェクトされたあるいは形質転換された生物が対応するＳＳＩＶタンパク質を実際に産生したことを示す、いかなる実験結果も含んでいない。実際、ＰＣＴ出願の国際公開第０１／１４４５０号パンフレットは、植物におけるＳＳＩＶ遺伝子発現の実際の生理学的効果に関して、当業者によって利用可能な情報を与える、いかなる実験データも含んでいない。
【０００７】
明らかにＳＳＩＶを除く、すべてのデンプン合成酵素に対する変異体が、異なる植物系および藻類系で得られ、分析されている。予想されるＳＳＩＶタンパク質は、触媒ドメインおよびデンプン結合ドメインを含むその他のＳＳに高度に類似したＣ末端領域を有する（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２０，２０５−２１６）。逆に、ＳＳＩＶタンパク質のＮ末端側の半分はその他のＳＳアイソフォームとは著しく異なっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、これまで、デンプンの生合成におけるＳＳＩＶの役割に関する遺伝学的証拠は依然として存在していなかった。
【０００９】
クラミドモナス、エンドウ豆、アラビドプシス、および穀物におけるその他のデンプン合成酵素（ＳＳＩからＳＳＩＩＩおよびＧＢＳＳＩ）によって行われた研究から浮かび上がる構図は、各酵素がアミロペクチン構造内における特定のサイズクラスのグルカンの合成に関与しているということである（Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１６２２３−１６２３０、Ｃｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，４１３−４２６、Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．６，２１５−２２２、Ｍｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３４，１７３−１８５、Ｄｅｌｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４３，３９８−４１２．）。さらに、ＧＢＳＳＩは、デンプン内で見られる、分岐が乏しく重要ではない第二の多糖類画分であるアミロースの生合成に関与する唯一の伸長酵素であると考えられる（Ｋｌｏｓｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３，２３７−２４４，Ｄｅｌｒｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，３６１２−３６２０）。これらの特化した機能にも関わらず、いくつかのデンプン合成酵素はある程度の機能的な重複を示し、他のものは示さない。
【００１０】
デンプン、主として植物のデンプンは、食品産業および非食品産業における様々な目的に対して幅広い産業上の利点を有するため、本分野では、生産条件を向上させる方法を介することを含む、適切なデンプンを供給する必要性が存在する。
【００１１】
したがって、本分野では、特に低いコストで一般に向けた様々な最終製品を供給するために、向上した生産条件でデンプンを生産する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第一に、本発明は、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズを有するデンプン粒を含む、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物に関するものである。
【００１３】
また、本発明は、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を得ることを目的とする、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾された植物の使用法にも関するものである。
【００１４】
また、本発明は、そのような可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた修飾された植物に由来する植物細胞ならびに種子にも関するものである。
【００１５】
好ましい実施態様では、本発明による植物は、遺伝的に修飾された植物と呼ぶこともできる、形質転換された植物からなり、該植物は、遺伝子工学によって、すなわち、ほとんどの実施態様では、生物学的に活性なＳＳＩＶタンパク質の産生を阻害またはブロックする影響を与えるＤＮＡ構築物を導入することによって、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いている。
【００１６】
また、本発明は、一つまたは複数の植物細胞に、前記細胞にＳＳＩＶを欠如させるためのＤＮＡ構築物を導入する過程を含む、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた形質転換植物を得るための方法も扱うものである。
【００１７】
本発明において用いる場合、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物は、デンプンホスホリラーゼも欠いた植物を含む、デンプン合成に関与する一つまたは複数のその他のタンパク質、特に酵素も欠いた植物を含んでいる。
【００１８】
また、本発明は、上記方法によって得られる形質転換植物、ならびに該植物に由来する植物細胞および種子にも関するものである。
【００１９】
また、本発明は、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた形質転換植物、ならびに（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた形質転換植物からデンプンを抽出する過程を含む、デンプンの産生方法にも関するものである。
【００２０】
本発明のもう一つの目的は、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼのいずれも欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾された植物からなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アラビドプシスのＳＳ遺伝子の発現プロファイルを示す図である。アラビドプシスの可溶性デンプン合成酵素をコードする全ての遺伝子（ＡｔＳＳ１：Ａｔ５ｇ２４３００、ＡｔＳＳ２：Ａｔ３ｇ０１１８０、ＡｔＳＳ３：Ａｔ１ｇ１１７２０、ＡｔＳＳ４：Ａｔ４ｇ１８２４０）のｍＲＮＡの絶対レベルを、実験方法で説明するように、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。図１−Ｂに示すデータは図１−Ａと同じであるが、その他のＡｔＳＳ遺伝子間の比較をより明確にするために、ＡｔＳＳ１遺伝子の発現は省略している。値は、異なる実験による少なくとも二つのｃＤＮＡ調製物に対する三つの測定値の平均である。
【図２】ＡｔＳＳ４座における変異株の分析を示す図である。図２−Ａ）：ＡｔＳＳ４座のゲノム構造。エクソンおよびイントロンはそれぞれ太い黒い棒と細い黒い棒で示している。それぞれイントロン１１および２での変異株Ａｔｓｓ４−１およびＡｔｓｓ４−２におけるＴ−ＤＮＡの挿入部位は三角形で示している。図２−Ｂ）：Ａｔｓｓ４−１およびＡｔｓｓ４−２変異対立遺伝子ならびにそれらのそれぞれの野生型の葉の粗抽出物のウェスタンブロット分析である。タンパク質（２５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに移し、ＳＳＩＶタンパク質のＮ末端領域にある１７８個のアミノ酸からなる断片に対するウサギ抗血清によって免疫標識した（実験方法参照）。分子マーカー（ｋＤａ）の位置を示している。Ｃｏｌ−ＯおよびＷＳ野生型において予想されるＳＳＩＶの質量に対応するおよそ１１２ｋＤａのバンドを矢印で示している。
【図３】Ａｔｓｓ４変異対立遺伝子およびそれらのそれぞれの野生型の成長を示す図である。変異植物および野生型植物の種子を４℃の水中で３日間インキュベートした後、土壌に蒔いた。植物を、１６時間明期／８時間暗期の光周期で、成長箱において培養した。図３−Ａおよび図３−Ｂ：経時的な実験（種子の発芽後の日数、Ｘ軸）における、植物あたりのｍｇで示した上記の地上器官の生重量（ＦＷ）（Ｙ軸）の測定。垂直なバーは、同時に培養した三つの独立したサンプルについて測定した平均値のＳＥを表している。黒の矢印は野生型植物である（図３−Ａおよび図３−ＢにおいてそれぞれＣｏｌ−ＯおよびＷＳ）。四角は変異植物である（図３−Ａおよび図３−ＢにおいてそれぞれＡｔｓｓ４−１およびＡｔｓｓ４−２）。
【図４】昼夜サイクルにおけるＡｔｓｓ４−１およびＣｏｌ−Ｏ植物の葉におけるデンプンの蓄積を示す図である。２１日間、１６時間明期／８時間暗期の光周期で植物を培養し、各株の三つの植物から採取した一つの葉を指定の時間に回収した。葉におけるデンプン含有量を、実験方法で説明しているように酵素アッセイによって測定した。値は、三つの独立した実験の平均である。垂直なバーは３つの独立したサンプルから計算した標準誤差である。
【図５】図５−Ａ：インビトロでのデンプンホスホリラーゼ活性。実験方法に説明しているように、アミロペクチンを基質として用い、葉の粗抽出物において酵素アッセイを行った。変異株における活性を、１００％だと考えられる、それらのそれぞれの野生型について得られた値に対するパーセントで示している。値は三つの異なる実験の平均である（垂直なバー＝ＳＥ）。図５−Ｂ：Ａｔｓｓ４−１およびＣｏｌ−Ｏ植物の葉におけるＡｔＰＨＳ１（Ａｔ３ｇ２９３２０）遺伝子およびＡｔＰＨＳ２（Ａｔ３ｇ４６９７０）遺伝子の発現。実験方法に説明しているようにリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＰＨＳ１のｍＲＮＡとＰＨＳ２のｍＲＮＡのレベルを判定した。データは、Ｃｏｌ−Ｏ植物について得られた値を１００として、それに対して標準化する。黒いカラム：Ａｔｓｓ４−１植物におけるｍＲＮＡのレベル。白いカラム：Ｃｏｌ−Ｏ植物におけるｍＲＮＡのレベル（垂直なバー＝ＳＥ）。
【図６】変異対立遺伝子（Ａｔｓｓ４−１およびＡｔｓｓ４−２）ならびにそれらのそれぞれのる野生型（Ｃｏｌ−ＯおよびＷＳ）に関するアミロペクチンの鎖長（ＣＬ）の分布のプロファイルを示す図である。アミロペクチンはＣＬ−２Ｂカラムを用いて精製し、続いてイソアミラーゼおよびプルラナーゼの混合物で脱分岐した。生じた直鎖グルカンを、それらの非還元末端に蛍光分子（ＡＰＴＳ）を結合した後、ＦＡＣＥで分析した。集団全体における各グルカンについての相対的な割合が、鎖の総数のパーセントで表されている。Ｘ軸は鎖の重合度（ＤＰ）を表している。Ｙ軸はモル濃度％を表している。下部の二つの図において、各野生型に対して標準化された値が、それらのそれぞれの変異対立遺伝子の値から差し引かれており、その場合、Ｙ軸はモル濃度％の差を表している。値は三つの異なる実験の平均である。標準偏差は平均の□１５％より小さい。
【図７】変異植物および野生型植物に由来するデンプンの走査型電子顕微鏡分析（図７−Ａおよび図７−Ｂ）と透過型電子顕微鏡分析（図７−Ｃおよび図７−Ｄ）を示す図である。デンプン粒は、実験方法で説明しているように、８時間の光照射（日中）後に回収した葉からパーコール勾配によって単離した。図７−Ａ）Ｃｏｌ−Ｏ。図７−Ｂ）Ａｔｓｓ４−１。図７−Ｃ）ＷＳ。図７−Ｄ）Ａｔｓｓ４−２。
【図８】以下のＳＳＩＶタンパク質をコードする核酸配列の並びを示す図である。−ライン１（上のライン）：稲（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来のＳＳＩＶ−２、−ライン２：小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来のＳＳＩＶ、−ライン３：稲由来のＳＳＩＶ−１、−ライン４：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＳＳＩＶ、−ライン５（下のライン）：ササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃuｌａｔａ）由来のＳＳＩＶ。
【図９】野生型および変異体のシロイヌナズナ植物に由来するデンプン粒の顕微鏡写真である。図９は、同一の拡大率における、デンプン粒の走査型電子顕微鏡による顕微鏡写真を示しており、該デンプン粒はそれぞれ、−図９−Ａ：野生型のシロイヌナズナ、−図９−Ｂ：ＳＳＩＶを欠いた修飾シロイヌナズナ、−図９−Ｃ：デンプンホスホリラーゼを欠いた修飾シロイヌナズナ、ならびに−図９−Ｄ：ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼの両方を欠いた（二重変異）修飾シロイヌナズナ、に由来している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
驚くべきことに、本発明により、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物よりも細胞内で産生するデンプン粒が少ないが、これら数の少ないデンプン粒は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物によって産生されるデンプン粒と比較してサイズが大きく、したがって多量のデンプンを含有することが明らかになっている。
【００２３】
また、ＳＳＩＶを欠いた植物において誘発されるこのデンプン粒のサイズの増大が、ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物においてさらに増幅され得ることも確認されている。
【００２４】
実際、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠き、選択的にデンプンホスホリラーゼも欠く植物のこれらの特徴は、デンプンを抽出するための向上した方法、とりわけより良い生産収率を可能にする方法を実施するために有益となり得る。本明細書で後述するように、デンプン粒のサイズは、最適な質的および／または量的な産業上のデンプン抽出過程の実施を考慮した際の主要なパラメータを構成するものである。
【００２５】
より詳細には、本発明によれば、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の変異によって可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物は、全デンプン産生量が緩やかではあるが有意に減少するにもかかわらず、同一であるが欠いていない植物によって産生されるデンプン粒よりもかなりサイズが大きなデンプン粒を産生することが明らかになっている。特に、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物は、同一であるがＳＳＩＶを欠いていない植物に由来するデンプン粒よりも少なくとも１．５倍大きいサイズを有するデンプン粒を産生することが明らかになっている。
【００２６】
さらに、デンプン粒の構造は、ＳＳＩＶを欠いたそのような植物においては影響を受けていない。
【００２７】
さらに、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物は、同一であるがＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼを欠いていない植物に由来するデンプン粒よりも少なくとも４倍大きなサイズを有するデンプン粒を産生することが明らかになっている。
【００２８】
さらに、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物は、同一であるがＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼを欠いていない植物よりもかなり高いデンプン含有量を有することが明らかになっている。これらの特定のＳＳＩＶを欠いた植物では、デンプン含有量は同一であるが野生型である植物よりも少なくとも１．５倍高く、さらには同一であるが野生型である植物よりも、少なくとも２倍、２．５倍、３倍、または３．５倍高い。本発明の実施例で示すように、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いたシロイヌナズナ植物では、同一であるが野生型である植物で見られるデンプン含有量のおよそ４倍のデンプン含有量が測定されている。
【００２９】
本明細書を通して、ＳＳＩＶを欠いた植物とは、（１）ＳＳＩＶのみを欠いた植物と、（２）（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物との両方を含むことが了解されているものとする。
【００３０】
また、驚くべきことに、ＳＳＩＶを欠いた植物は、同一であるが欠いてはいない植物によって産生されるデンプン分子に化学組成が同一ではないまでも、少なくとも高度に類似したデンプン分子を産生することも明らかになっている。特に、同程度のアミロース含有量またはさらには同一のアミロース含有量、ひいてはさらに同程度または同一のアミロース／アミロペクチン割合が、ＳＳＩＶを欠いた植物とＳＳＩＶを欠いていない植物の両方で見られている。また、ＳＳＩＶを欠いた植物は、同一であるが欠いていない植物に高度に類似した鎖長（ＣＬ）分布のプロファイルを有するデンプンを産生し、該デンプンは、ＤＰ＝７〜１０の鎖の量の偶発的なわずかな減少によって示されるような、アミロペクチン構造に偶発的なわずかな変化を伴うのみである。
【００３１】
本明細書の意図するところでは、デンプンアミロースおよびアミロペクチンの総重量に基づくアミロースの重量パーセントで表すことができるデンプンアミロース含有量の値が、３０％未満、好ましくは２５％未満の相対的差異値を有する場合に、第一の植物に由来するデンプンのデンプンアミロース含有量は、第二の植物に由来するデンプンのデンプンアミロース含有量と「同程度」であるとする。
【００３２】
例えば、本発明によって、シロイヌナズナの野生型植物が約２１％ｗ／ｗのアミロース含有量を有する（したがって７９％ｗ／ｗのアミロペクチン）のに対し、ＳＳＩＶを欠いたシロイヌナズナの変異植物は約２０％ｗ／ｗのアミロース含有量（したがって８０％ｗ／ｗのアミロペクチン）を有することが明らかになっている。この例によると、この二種の植物は、デンプンアミロース含有量における１％ｗ／ｗの絶対的差異値と、デンプンアミロース含有量における４．８％の相対的差異値（＝［ＷＴとＳＳＩＶを欠いたものとの差］／ＷＴ、ここでは１／２１）とを有する。
【００３３】
アミロースおよびアミロペクチンのデンプン含有量を測定するための様々な方法が当業者に知られている。典型的には、当業者は、慣用的なアミログルコシダーゼアッセイを用いて、デンプンのアミロースおよびアミロペクチンの含有量を測定することができる。
【００３４】
したがって、本発明によって初めて、構造的によく知られている植物の可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）がデンプン粒の数の制御において特定の機能を有していることが明らかになっている。
【００３５】
さらに、本発明では、生物学的に活性なＳＳＩＶによる植物細胞の産生の変化は、その他のＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、およびＧＢＳＳＩデンプン合成酵素の合成を含む、デンプンの産生に関与するその他の酵素の合成には検出可能なレベルでは影響しないことも示されている。デンプンホスホリラーゼの合成の増加だけが、ＳＳＩＶを欠いた植物において誘発され得る。
【００３６】
本発明の対象は、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物からなる。
【００３７】
前記ＳＳＩＶを欠いた植物は、生物学的に活性な可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）の産生を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズを有するデンプン粒を含む植物細胞を含んでいる。
【００３８】
本明細書においてより詳細に説明するように、前記ＳＳＩＶを欠いた植物はまた、生物学的に活性な可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）の産生を欠いていない同一の植物と比較して同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞も含む。
【００３９】
本発明のもう一つの対象は、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して粒のサイズが大きく、同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を得るための、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾された植物の使用法からなる。
【００４０】
本発明の意図するところでは、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を「欠いた」植物、植物の一部、または植物細胞は、通常の量の生物学的に活性なＳＳＩＶを合成または産生する野生型の植物細胞におけるような、デンプンを代謝するために十分な量のＳＳＩＶを合成または産生しない。特に、ＳＳＩＶを「欠いた」植物、植物の部分、および植物細胞は、変化したデンプン合成経路を有しており、該合成経路は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られる細胞あたりのデンプン粒の数よりも大幅に少ない、細胞あたりのデンプン粒の平均数の産生をもたらすものである。例えば、本明細書の実施例で示すように、ＳＳＩＶを欠いたシロイヌナズナ植物は、葉緑体あたり１つの、または例外的に２つのデンプン粒を産生するのに対し、ＳＳＩＶを欠いていない同一のシロイヌナズナ植物は、葉緑体あたりおよそ４〜５個のデンプン粒を産生する。
【００４１】
特筆すべきことに、（ａ）ＳＳＩＶを欠いたシロイヌナズナ、または（ｂ）ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼを欠いたシロイヌナズナに関してここで開示した結果は、本発明者らによって、（ａ）ＳＳＩＶを欠くか、または（ｂ）ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼを欠くように修飾された稲植物でも得られている。
【００４２】
本発明で用いる場合、デンプン粒の「サイズ」は、前記デンプン粒の絶対的な寸法値、ならびに、比較されるデンプン粒の二つの集団の平均サイズの相対値を含む。いくつかの実施態様では、絶対的な寸法値によるデンプン粒の「サイズ」は、例えばＷｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｃｅｒｅａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３８：２５９−２６８）で開示されている技術を用いて、画像分析法およびレーザー回折法によって測定することができる。その他の実施態様では、デンプン粒の「サイズ」は、Ｒｅｓｃｈｉｇｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２，Ａｎｎ  Ｃｈｉｍ，Ｖｏｌ．９２（４）：４５７−４６７）で開示されているように、重力フィールドフローフラクショネーション法（ＧＦＦＦ）にしたがって測定することができる。さらなる実施態様では、デンプン粒のサイズを測定するためのより簡易な方法が用いられる。デンプン粒のサイズを測定するためのこれらのより簡易な方法は、（ｉ）サイズ測定すべきデンプン粒集団の少なくとも一つの顕微鏡写真を撮影すること、（ｉｉ）少なくとも１０、好適には少なくとも３０、より好適には少なくとも５０、最も好適には少なくとも１００個のサイズ測定すべきデンプン粒の最大直径を測定すること、そして、（ｉｉｉ）調査したデンプン粒集団におけるデンプン粒の最大直径の平均を計算することを含み、前記最大直径の平均値は前記デンプン粒の「サイズ」からなり、したがって該サイズは、その他のデンプン粒集団の最大直径の平均（「サイズ」）と比較することができる。また、デンプン粒のサイズを測定するためのこれらのより簡易な方法は、（ｉ）サイズ測定すべきデンプン粒集団の少なくとも一つの顕微鏡写真を撮影すること、（ｉｉ）少なくとも１０、好適には少なくとも３０、より好適には少なくとも５０、最も好適には少なくとも１００個のサイズ測定すべきデンプン粒の可視表面領域を測定すること、そして（ｉｉｉ）調査したデンプン粒集団のデンプン粒の最大可視表面領域の平均を計算することを含み、前記可視表面領域の平均値は前記デンプン粒の「サイズ」からなり、したがって該サイズは、その他のデンプン粒集団の可視表面領域の平均（「サイズ」）と比較することができる。
【００４３】
通常、本明細書において、サイズの増加またはサイズの減少といったサイズの差は、異なる二つのデンプン粒集団の比較にしたがって得られる。デンプン粒集団の最初に撮影した顕微鏡写真によってデンプン粒の「サイズ」を測定する方法を用いることで、比較される二つのデンプン粒集団の間における、サイズの絶対値の少なくとも１．５倍の増加または減少を精密に測定することができ、それにより、測定されるサイズの差は、デンプン粒サイズの統計的に有意な増加または減少として得られる。
【００４４】
比較される二つのデンプン粒集団が、それぞれ、好ましくは、茎、葉などの同一の植物の部分または同一の植物の組織に由来する（ｉ）ＳＳＩＶを欠いた植物および（ｉｉ）ＳＳＩＶを欠いていない植物であるとき、本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物は、同一であるがＳＳＩＶを欠いていない植物で見られるデンプン粒のサイズよりも少なくとも１．５倍大きいデンプン粒のサイズを有している。ほとんどの実施態様において、本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物は、同一であるがＳＳＩＶを欠いていない植物で見られるデンプン粒のサイズよりも少なくとも二倍大きいデンプン粒のサイズを有している。
【００４５】
比較される二つのデンプン粒集団が、それぞれ、好ましくは、茎、葉などの同一の植物の部分または同一の植物の組織に由来する（ｉ）欠いた植物および（ｉｉ）欠いていない植物であるとき、本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物のうち、（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物は、同一であるが（ｉ）ＳＳＩＶを欠いておらず（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼも欠いていない植物で見られるデンプン粒のサイズよりも少なくとも３倍大きなデンプン粒のサイズを有している。ほとんどの実施態様において、本発明による（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物は、同一であるが欠いていない植物で見られるデンプン粒のサイズよりも少なくとも四倍大きいデンプン粒のサイズを有している。
【００４６】
多くのＳＳＩＶの核酸配列および／またはＳＳＩＶのアミノ酸配列が既に本分野で知られているため、ＳＳＩＶを欠いた植物、植物の部分、または植物細胞において、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物、植物の部分、または植物細胞と比較した、デンプンの代謝に十分な量の生物学的に活性なＳＳＩＶの欠如からなる欠陥は、当業者によく知られている様々な方法を用いて人工的に誘発することができる。ＳＳＩＶを欠いた植物を得る方法は、
（ｉ）ＳＳＩＶをコードするゲノム核酸の改変を引き起こすことで、（ｉ）対応するｍＲＮＡを非常に少量産生するかもしくは全く産生しないようにするか、または（ｉｉ）生物学的に活性ではないＳＳＩＶをコードする改変したｍＲＮＡを産生する技術、
（ｉｉ）ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの合成を阻害またはブロックする技術、
（ｉｉｉ）ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡからのＳＳＩＶタンパク質の産生を阻害またはブロックする技術、および、
（ｉｖ）産生されたＳＳＩＶタンパク質の生物学的活性を阻害またはブロックする技術
を含む。
【００４７】
上記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の技術が好ましい。上記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の技術には、植物、植物の部分、または植物細胞の遺伝子修飾の過程が含まれ、該遺伝子修飾の過程は通常、一つまたは複数の植物細胞、場合によっては一つもしくは複数の植物の部分または一つもしくは複数の植物に少なくとも一つのＤＮＡ構築物を導入することからなり、該ＤＮＡ構築物は、（ｉ）例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するＴ−ＤＮＡなどの、ＳＳＩＶタンパク質をコードするゲノム核酸の改変を引き起こすＤＮＡ配列、（ｉｉ）例えばＳＳＩＶ特異的なセンス核酸などの、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの合成を阻害またはブロックするＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）例えばＳＳＩＶ特異的なアンチセンス核酸またはＳＳＩＶ特異的なリボザイムなどの、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡからのＳＳＩＶタンパク質の産生を阻害またはブロックするＤＮＡ配列で構成されるグループから選択したＤＮＡ配列を含む。
【００４８】
植物、植物の部分、または植物細胞がＳＳＩＶを欠いているかどうかを判定するためのアッセイは、当業者によく知られた様々な技術にしたがって行うことができる。
【００４９】
いくつかの実施態様では、ＳＳＩＶを欠いた表現型を判定するための技術は、試験すべき植物、植物の部分、または植物細胞におけるＳＳＩＶの生物学的活性の存在を検出するアッセイからなる。例えば、タンパク質抽出物を、対応する植物サンプルから調製し、その後、抗ＳＳＩＶ抗体が固定されているイムノアフィニティークロマトグラフィーの基質と接触させることができる。抗ＳＳＩＶ抗体の産生は本発明の実施例で開示している。次に、最終的にクロマトグラフィーの基質に固定したＳＳＩＶタンパク質分子を溶出させ、生じた溶出物のサンプルをデンプン合成酵素の生物学的活性の存在についてアッセイするが、これは場合によっては、例えばＤｅｌｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４３，３９８−４１２）によって開示されている技術にしたがって、ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、およびＧＢＳＳＩのうちの一つまたは複数のその他の外因性デンプン合成酵素をインビトロで添加した後であってもよい。これらの技術を用いて、ＳＳＩＶを欠いた表現型が、ＳＳＩＶを欠いていない同一の野生型植物の５０％またはそれより低いＳＳＩＶの生物学的活性を示す、試験した植物、植物の部分、または植物細胞に対して判定される。
【００５０】
その他の実施態様では、ＳＳＩＶを欠いた表現型を判定するための技術は、試験すべき植物、植物の部分、または植物細胞におけるＳＳＩＶタンパク質分子の存在を検出するアッセイからなる。例えば、タンパク質抽出物を、対応する植物サンプルから調製し、その後ゲル電気泳動に付すことで、前記タンパク質抽出物に最初から含まれていた様々なタンパク質を、定められたタンパク質バンドに分離する。次に、染色した後、ＳＳＩＶの予想される位置におけるタンパク質バンドの存在に関する判定が行われる。最終的に、デンプン合成酵素の活性を、既知の技術にしたがって、分離したタンパク質バンドについてアッセイすることができる。さらに、例えば、タンパク質抽出物を、対応する植物サンプルから調製し、その後、例えば抗ＳＳＩＶ抗血清などの抗ＳＳＩＶ抗体を用いた免疫ブロット分析に付す。このようなゲル電気泳動または免疫ブロットを用いたＳＳＩＶアッセイは、例えばＤｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔａｎｙ，５６（Ｎｏ．４１２）：６２３−６３２）ならびに本発明の実施例で開示されている。これらの技術を用い、ＳＳＩＶを欠いた表現型は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の野生型植物の５０％またはそれより低いＳＳＩＶタンパク質の量を示す試験した植物、植物の部分、または植物細胞に対して判定される。
【００５１】
さらなる実施態様では、ＳＳＩＶを欠いた表現型を判定するための技術は、試験すべき植物、植物の部分、または植物細胞においてＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡを検出および／または定量するアッセイからなる。例えば、全ＲＮＡを対応する植物サンプルから抽出した後、一つまたは複数の適切なプライマーのセットを用いてＰＣＲ増幅し、次に、生じたＰＣＲ産物を分離した後、例えば染色によって検出および／または定量する。このようなＰＣＲによるＳＳＩＶアッセイは例えばＤｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔａｎｙ，５６（Ｎｏ．４１２）：６２３−６３２）ならびに本発明の実施例に開示されている。例えば、ＳＳＩＶ特異的なシロイヌナズナのｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に用いることのできるプライマーのセットには、本発明で開示される配列番号１２〜１３および配列番号２０〜２１が含まれる。これらの技術を用いて、ＳＳＩＶを欠いた表現型は、ＳＳＩＶを欠いていない野生型の同一の植物の５０％またはそれより少ないＳＳＩＶのｍＲＮＡの量を示す、試験した植物、植物の部分、または植物細胞に対して判定される。
【００５２】
さらなる実施態様では、ＳＳＩＶを欠いた表現型を判定するための技術は、試験すべき植物、植物の部分、または植物細胞に含まれる染色体ＤＮＡに含まれるＳＳＩＶをコードする遺伝子の改変を検出するアッセイからなる。例えば、対応する植物サンプルの全ＤＮＡを抽出した後、適切なプライマーのセットを用いてＰＣＲ増幅産物を生じさせ、その後、前記ＰＣＲ増幅産物を分離し、例えばＰＣＲ増幅産物の単一ゲル電気泳動法または該産物のシーケンシングによって、ＳＳＩＶをコードする遺伝子における偶発的なゲノムの改変の特徴付けを行う。また、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の改変は、本発明の実施例で開示しているものを含む、当業者によく知られている技術を用いて、対応するｍＲＮＡにおける改変を検出することによっても検出することができる。これらの技術を用いて、ＳＳＩＶを欠いた表現型は、試験した植物、植物の部分、または植物細胞に対して、ゲノムの改変がプロモーター配列における変異またはコード領域のイントロンもしくはエクソンにおける変異を含むかどうかについて判定されるのだが、該変異には、エクソンとイントロンの間の接合領域における変異、ならびに、ＳＳＩＶタンパク質のアミノ酸配列の改変をもたらすエクソンにおける変異が含まれる。
【００５３】
デンプンホスホリラーゼ活性をアッセイするための技術は当業者によく知られている。このような技術は、例えば、米国特許第５９９８７０１号明細書またはＰＣＴ出願の国際公開第２００５／０９７９９９号パンフレットで説明されており、これらの全体は引用することで本発明に含まれることとする。
【００５４】
既に上述したように、植物デンプンの代謝経路は、同一のデンプン合成系が、プラシノ藻類から、小麦や稲のような穀物を含む最も高等な多細胞植物体にいたるまで見られるため、植物の系統発生を通して高度に保存されている。この高度な保存は、ＳＳＩＶを含むデンプン合成酵素のようなデンプン合成に関与する酵素がデンプンの構築において保存的で特異的な機能を果たしていることを示唆している。また、このことはデンプンホスホリラーゼについても当てはまり、該デンプンホスホリラーゼは、アルファ−１，４グルカンホスホリラーゼとも呼ばれ、国際的にＥＣ２．４．１．１．酵素に分類されており、一般的に当業者に知られている。例えば、よく知られたデンプンホスホリラーゼには、シロイヌナズナ（ＰＣＴ出願の国際公開第２００５／０９７９９９号パンフレット）、ソラマメ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース、アクセス番号Ｐ５３５３６）、ジャガイモ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース、アクセス番号Ｐ０４０４５またはＰ５３５３５）、ビート、ホウレンソウ、トウモロコシ（ＰＣＴ出願の国際公開第９８／４０５０３号パンフレット）、グリーンピース、稲（ＥＭＢＬデータベース、アクセス番号Ｄ２３２８０またはＱ９ＡＵＶ８）、ならびに小麦（ＥＭＢＬデータベース、アクセス番号ＡＡＱ７３１８１）に由来するデンプンホスホリラーゼが含まれる。実際、その他のデンプンホスホリラーゼは、例えば、ＢｌａｓｔプログラムまたはＦａｓｔＤＢプログラムのようなアミノ酸配列または核酸配列を抽出するコンピュータ・プログラムを用い、例えば上述したデンプンホスホリラーゼ配列のいずれか一つを基準配列として用いてデフォルトのパラメータとすることで、当業者が十分に利用することができる。また、その他のデンプンホスホリラーゼも、基準となるハイブリダイゼーション材料として上述したデンプンホスホリラーゼ核酸のいずれか一つを用い、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、とりわけ、パラグラフ１１．１から１１．６１）により開示されている方法にしたがってストリンジェンシーが高いハイブリダイゼーションアッセイを行うことで、ハイブリダイゼーションアッセイを通して当業者に利用可能である。
【００５５】
このように、特定の理論に縛られようとすることなく、本出願人は、ＳＳＩＶ活性における欠陥が、シロイヌナズナで見られる、より大きなサイズのデンプン粒という同一の表現型をあらゆる植物で誘発すると考えている。この考えは、様々な植物に由来する既知のＳＳＩＶタンパク質のアミノ酸配列のすべてではなくともほとんどが高いアミノ酸同一性を共有しているという事実によって、非常に強められる。例えば、シロイヌナズナに由来するＳＳＩＶタンパク質のアミノ酸配列は、ササゲに由来するＳＳＩＶと６８％の同一性を有し、小麦由来のＳＳＩＶとは５６％の同一性を有し、稲由来のＳＳＩＶ−１とは５４％の同一性を有し、そして稲由来のＳＳＩＶ−２とは５６％の同一性を有している。さらに、例えば、ｃＤＮＡのレベルでは、シロイヌナズナ由来のＳＳＩＶタンパク質をコードする核酸配列は、２３２３個のヌクレオチドからなる核酸長のササゲ由来のＳＳＩＶとは７３％、２０５１個のヌクレオチドからなるヌクレオチド長の小麦由来のＳＳＩＶとは６７％、それぞれ１８６５個と２０５３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド長の稲由来のＳＳＩＶ−１およびＳＳＩＶ−２とは６７％の同一性を有している。重要なことに、すべてのＳＳＩＶの間における最も高いアミノ酸同一性ならびに最も高い核酸同一性は、すべてのＳＳＩＶタンパク質のＮ末端部分とＣ末端部分にそれぞれ位置する二つのタンパク質領域で見られる。すべてのＳＳＩＶタンパク質の間における高い同一性を有する最もＳＳＩＶ特異的なタンパク質領域は、前記タンパク質のＮ末端部分の、各ＳＳＩＶタンパク質の２００位のアミノ酸残基から４２０位に位置するアミノ酸残基を含むタンパク質領域に位置している。したがって、あらゆる植物でＳＳＩＶを欠くようにするとき、当業者は、ＳＳＩＶタンパク質の前記共通するＮ末端領域をコードするＳＳＩＶ特異的なＤＮＡ領域またはＲＮＡ領域を標的とする核酸配列を含む、ＳＳＩＶをコードする核酸を特異的に標的とするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を必要とする技術を含む、本明細書で開示した技術のいずれかを用いることになる。
【００５６】
本発明の実施例では、植物は、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の変異によって、より詳細には、ＳＳＩＶをコードする遺伝子配列内に異種核酸を挿入することによってＳＳＩＶを欠くようにすることができること、および、得られたＳＳＩＶを欠いた形質転換植物または組換え植物が、対応する野生型植物よりも細胞あたりの数は少ないがより大きなサイズのデンプン粒を産生することを示している。ＳＳＩＶを欠いたこれらの形質転換植物または組換え植物には大きな産業上の利点があるが、それはとりわけ、これらの形質転換植物または組換え植物によって、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物と比較してより簡単でコストの低い産業的なデンプン抽出が可能となるためである。
【００５７】
また、本発明の実施例では、植物は、ＳＳＩＶをコードする遺伝子およびデンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子の両方の変異によって、（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠くようにすることができることを示している。より詳細には、本発明では、これらの変異は、（ｉ）ＳＳＩＶをコードする遺伝子の配列および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子の配列の中に異種核酸を挿入することによって生じさせ得ること、ならびに、得られたＳＳＩＶを欠いた形質転換植物または組換え植物が、（ｉ）対応する、ＳＳＩＶを欠き／デンプンホスホリラーゼを欠いていない植物、および（ｉｉ）ＳＳＩＶを欠いておらず／デンプンホスホリラーゼも欠いていない植物の両方よりも、細胞あたりの数は少ないがより大きなサイズのデンプン粒を産生することを示している。これらのＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼの両方を欠いた形質転換植物または組換え植物には重要な産業上の利点があるが、それはとりわけ、これらの形質転換植物または組換え植物によって、ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼを欠いていない同一の植物と比較してかなり簡単でコストの低い産業的なデンプン抽出が可能となるためである。
【００５８】
したがって、本発明のもう一つの対象は、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼのいずれも欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有している、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾された植物からなる。
【００５９】
好ましくは、本発明の実施例に示すように、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾された植物のデンプン粒のサイズは、同一であるが（ｉ）ＳＳＩＶを欠いておらず（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼも欠いていない植物で見られるデンプン粒のサイズよりも３倍以上大きい。
【００６０】
ＳＳＩＶを欠いた植物の好ましい実施態様によっては、ＳＳＩＶ活性は完全に消失しているかまたはブロックされ、あるいはわずかなＳＳＩＶ活性のみが残っている。これら好ましい実施態様では、わずかに残ったＳＳＩＶ活性は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られるＳＳＩＶ活性の２０％を超えない。最も好ましくは、わずかに残ったＳＳＩＶ活性は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られるＳＳＩＶ活性の１９．５％、１９％、１８．５％、１８％、１７．５％、１７％、１６．５％、１６％、１５．５％、１５％、１４．５％、１４％、１３．５％、１３％、１２．５％、１２％、１１．５％、１１％、１０．５％、１０％、９．５％、９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％またはさらには０．１％を超えない。
【００６１】
本発明の実施例で例示される好ましい実施態様では、すべての例示される形質転換植物または組換え植物が、改変したメッセンジャーＲＮＡの合成を引き起こすＳＳＩＶをコードする遺伝子内での変異についてホモ接合体であるため、ＳＳＩＶ活性は全く存在しない。
【００６２】
このように、本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物の実施態様では、前記植物は変異した不活性のＳＳＩＶを産生するように遺伝的に修飾されている。植物を遺伝的に修飾するための本分野でよく知られている技術であり、変異した不活性のＳＳＩＶタンパク質の産生を引き起こすために本発明に採用されている技術は、本明細書において以下に詳細に説明する。
【００６３】
本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物のその他の実施態様では、前記植物は、ＳＳＩＶの合成が減少するようにまたはなくなるように遺伝的に修飾されている。本発明の意図するところでは、減少したＳＳＩＶの合成とは、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られる量の５０％未満の量の活性ＳＳＩＶタンパク質が測定されることを意味し、好適には、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られる量の１０％未満、さらに好ましくは、９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％または０．１％未満が測定されることを意味する。遺伝的に植物を修飾するための本分野でよく知られた技術であり、ＳＳＩＶタンパク質の合成を減少させるかまたはなくすために本発明で採用されている技術は、本明細書で以下に詳細に説明する。これらの技術には、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の転写を阻害またはブロックするための方法、ならびに、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害またはブロックするための方法が含まれる。
【００６４】
本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物のさらなる実施態様では、前記植物は、前記可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードするｍＲＮＡの合成が減少するかまたはなくなるように遺伝的に修飾されている。本発明で意図するところでは、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの減少した合成とは、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られる量の５０％未満の量のＳＳＩＶ特異的なｍＲＮＡが測定されることを意味し、好適にはＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られる量の１０％未満、より好ましくは、９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％または０．１％未満が測定されることを意味する。遺伝的に植物を修飾するための本分野で知られている技術であり、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの合成を減少させるかまたはなくすために本発明で採用されている技術は、本明細書で以下に詳細に説明する。
【００６５】
本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物のさらなる実施態様では、前記植物は、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害またはブロックすることによりＳＳＩＶタンパク質の合成が減少するかまたはなくなるように遺伝的に修飾されている。本発明の意図するところでは、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの減少した翻訳とは、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られる量の５０％未満の量のＳＳＩＶタンパク質が測定されることを意味し、好適にはＳＳＩＶを欠いていない同一の植物で見られる量の１０％未満、より好ましくは、９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％または０．１％未満が測定されることを意味する。植物を遺伝的に修飾するために本分野でよく知られている技術であり、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの翻訳を減少させるために本発明で採用されている技術は、本明細書で以下に詳細に説明する。
【００６６】
本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物のさらなる実施態様では、前記植物は、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の核酸配列内に変異を導入するように遺伝的に修飾されており、該変異には、対応するＳＳＩＶタンパク質をコードするゲノム配列において一つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、および欠失を導入することが含まれる。ＳＳＩＶをコードする遺伝子の核酸配列における変異を、プロモーター配列および／またはコード領域に導入することができる。ＳＳＩＶをコードする遺伝子のコード領域に導入されたとき、変異は、エクソン配列および／またはイントロン配列に位置し得、これは、エクソン配列およびイントロン配列の間の接合部分からなる配列に位置することを含む。特に、本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物には、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の少なくとも一つのイントロン配列および／または一つのエクソン配列の核酸配列に一つまたは複数のヌクレオチドを導入または挿入することで遺伝的に修飾されている植物が含まれる。植物を遺伝的に修飾するために本分野でよく知られている技術であり、ＳＳＩＶをコードする遺伝子における変異を引き起こすために本発明で採用されている技術は、本明細書で以下に詳細に説明する。
【００６７】
ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼの両方を欠いている、本発明による修飾植物に関して、ＳＳＩＶ活性における欠陥を誘発するために用いられるものと同一の技術を、デンプンホスホリラーゼ活性の欠陥を誘発するためにもそのまま利用することができる。特に、本発明の実施例では、（ｉ）ＳＳＩＶをコードする遺伝子および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子の両方の変異によって、ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼの両方を欠いている修飾植物が提供される。より詳細には、本発明の実施例では、（ｉ）ＳＳＩＶをコードする遺伝子および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子の両方の少なくとも一つのイントロン配列および／または一つのエクソン配列の核酸配列に一つまたは複数のヌクレオチドを導入または挿入することで、ＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼの両方を欠いた修飾植物が提供される。植物を遺伝的に修飾するために本分野でよく知られている技術であり、ＳＳＩＶをコードする遺伝子および／またはデンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子における変異を引き起こすために本発明で採用されている技術は、本明細書で以下に詳細に説明する。
【００６８】
通常、本発明にしたがった遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、単子葉植物および双子葉植物で構成されるグループから選択される。双子葉植物の例には、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌｏｎａｃｅａｅ）、豆類、シロイヌナズナを含むアラビドプシス種に由来する植物が含まれる。単子葉植物の例には、小麦、トウモロコシ、および稲のような穀物が含まれる。
【００６９】
好ましくは、本発明にしたがった遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、栄養的または技術的な、特に産業的な目的のために人によって栽培される有用な植物である。該植物は、好ましくはデンプンの多い植物であり、穀物種（ライ麦、大麦、オート麦、小麦、キビ、サゴなど）、稲、エンドウ豆、マロー豆（ｍａｒｒｏｗ  ｐｅａ）、キャッサバおよびジャガイモ、トマト、菜種、大豆、麻、亜麻、ひまわり、ササゲまたはクズウコン、繊維形成植物（例えば亜麻、麻、綿）、油脂の多い植物（菜種、ひまわり、大豆）、ならびにタンパク質の多い植物（豆類、穀類、大豆類）が含まれる。また、これらの植物は果樹およびヤシも含まれる。デンプンの多い植物が好適である。サトウキビおよびテンサイ、トウモロコシ、稲、小麦、ササゲ、およびトマトが特に好ましく、ジャガイモが最も好ましい。
【００７０】
したがって、本発明はデンプンを産生または多く含むすべての植物に適用可能である。このような植物の例には、トウモロコシ、小麦、稲、ソルガム、大麦のような穀類、バナナ、リンゴ、トマトまたはナシのような果実を産生する種、キャッサバ、ジャガイモ、ヤムイモ、ビート、カブのような根菜類、菜種、キャノーラ、ヒマワリ、オイルパーム、ココナツ、アマニ、または落花生のような油料種子作物、大豆、ソラマメ、エンドウマメのような食用作物、ならびにその他のあらゆる適切な植物種が含まれる。
【００７１】
好ましい実施態様では、本発明にしたがった遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、アブラナ科、トウモロコシ、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  Ｆａｂａ  Ｌ）、稲、ビート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、グリンピース（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、および小麦属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）から選択される種に属している。
【００７２】
好ましい実施態様では、遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、ＳＳＩＶをコードする野生型の遺伝子が配列番号１の核酸配列を含むシロイヌナズナで構成される。
【００７３】
その他の好ましい実施態様では、遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、ＳＳＩＶをコードする野生型の遺伝子が配列番号２の核酸配列（ＳＳＩＶ−１アイソフォーム）または配列番号３の核酸配列（ＳＳＩＶ−１アイソフォーム）を含む稲で構成される。
【００７４】
その他の好ましい実施態様では、遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、ＳＳＩＶをコードする野生型の遺伝子が配列番号４の核酸配列を含む小麦で構成される。
【００７５】
その他の好ましい実施態様では、遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、ＳＳＩＶをコードする野生型の遺伝子が配列番号５の核酸配列を含むササゲで構成される。
【００７６】
ある実施態様では、遺伝子操作によってＳＳＩＶを欠いた植物は、ＳＳＩＶをコードする遺伝子がイントロンの核酸配列に異種Ｔ−ＤＮＡを挿入することで変異したシロイヌナズナで構成される。これらの植物は、Ｔ−ＤＮＡがイントロン１１に挿入され、ＳＳＩＶをコードする変異した遺伝子が配列番号６の配列を含むシロイヌナズナを含み、前記形質転換植物は本発明では「Ａｔｓｓ４−１」と称する。また、これらの植物は、Ｔ−ＤＮＡが配列番号１のイントロン２に挿入されたシロイヌナズナも含み、前記形質転換植物は本発明では「Ａｔｓｓ４−２」と称する。
【００７７】
本発明のもう一つの対象は、配列番号７からなる変異した可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を含む形質転換されたシロイヌナズナで構成される、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物からなる。
【００７８】
本発明のもう一つの対象は、さらにデンプンホスホリラーゼを欠いた、上述したＳＳＩＶを欠いた植物から構成される。
【００７９】
したがって、本発明のもう一つの対象は、遺伝子操作によるものも含む、（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた、ＳＳＩＶを欠いた植物からなる。
【００８０】
ある実施態様において、遺伝子操作によってＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼを欠いた植物は、（ｉ）ＳＳＩＶをコードする遺伝子および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子が、イントロンまたはエクソンの核酸配列内に異種Ｔ−ＤＮＡを挿入することによって変異しているシロイヌナズナで構成される。これらの植物は、実施例で示すように、本発明で「ｐｈｓ１−／ｓｓ４−」と称されるシロイヌナズナを含む。
【００８１】
また、本発明は、本明細書で定義される可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物に由来する、あらゆる植物の組織または器官、細胞、プロトプラスト、茎、花、および葉を含む、植物の部分にも関するものである。
【００８２】
また、本発明は、本明細書で定義される可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物に由来する植物細胞にも関するものである。
【００８３】
また、本発明は、本明細書で定義される可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物に由来する植物の種子も扱うものである。
【００８４】
本分野で一般的に知られており、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物を得るために採用することのできる様々な技術は以下で説明する。
【００８５】
ＳＳＩＶを欠いた植物を得るための方法。
下記に開示する方法はすべて、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の発現または機能を阻害またはブロックすること、あるいは、ＳＳＩＶタンパク質の酵素活性を阻害またはブロックすることで、前記ＳＳＩＶをコードする遺伝子の発現または機能が阻害またはブロックされていない、同一であるが修飾されていない植物と比較して細胞あたりのデンプン粒の数が少ない修飾植物を得ることを目的としている。
【００８６】
本分野で知られている、遺伝子の発現または機能を阻害する影響を与えるあらゆるメカニズムを、生物学的に活性なＳＳＩＶタンパク質の最終的な産生に最適に干渉するように用いることができる。
【００８７】
下記で説明する技術は、（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物を含む、本明細書で開示されるＳＳＩＶを欠いた植物のいずれか一つを得るために利用することができる。したがって、以下の技術はＳＳＩＶタンパク質またはＳＳＩＶをコードする核酸を標的として使用することに関するものであるが、これらの技術はまた、デンプンホスホリラーゼタンパク質またはデンプンホスホリラーゼをコードする核酸を標的として用いても容易に利用することができる。
【００８８】
ＳＳＩＶ酵素活性を阻害またはブロックするための方法
ある実施態様では、ＳＳＩＶを欠いた植物は、活性なＳＳＩＶタンパク質を発現する植物を、ＳＳＩＶタンパク質の酵素活性を阻害またはブロックする一つまたは複数の有機化合物または無機化合物と接触させることで得ることができる。
【００８９】
このようなＳＳＩＶの阻害化合物は、本分野で知られているあらゆる方法によって選択することができ、該方法には、
ａ）活性なＳＳＩＶタンパク質を発現する植物を用意する過程と、
ｂ）過程ａ）の植物を、試験すべき阻害化合物の候補と接触させる過程と、
ｃ）過程ｂ）の最後に得られた植物に由来する植物細胞におけるＳＳＩＶの酵素活性を測定する過程と、
ｄ）過程ｃ）で測定されたＳＳＩＶの酵素活性が、過程ｂ）が省略されたときに測定されるＳＳＩＶの酵素活性より低い場合に、前記候補化合物を陽性として選択する過程
を含むスクリーニング法も含まれる。
【００９０】
最も好ましくは、上記のスクリーニング法によると、前記候補化合物は、過程ｃ）で測定されたＳＳＩＶの酵素活性が、過程ｂ）が省略されたときに過程ｃ）で測定されるＳＳＩＶの酵素活性の１０％未満、好ましくは９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、さらには０．１％より少ないときに、過程ｄ）で陽性として選択される。
【００９１】
候補化合物はあらゆる有機化合物または無機化合物で構成され得る。好ましくは、候補化合物は低分子量の化合物で構成され、最も好ましくは、候補化合物は、１００００Ｄａより低い分子量、さらには５０００Ｄａより低い分子量を有し、そのため、これらの候補化合物は容易に植物細胞内に浸透できる。
【００９２】
上記スクリーニング法の第一の特徴によると、候補化合物、より具体的には候補となる阻害化合物は、あらかじめ合成された化合物のライブラリーから選択することができる。
【００９３】
上記スクリーニング法の第二の特徴によると、候補化合物、より具体的には候補となる阻害化合物は、化学構造がデータベース、例えば電子データベースで定義されている化合物から選択される。
【００９４】
上記スクリーニング法の第三の実施態様によると、候補化合物、より具体的には候補となる阻害化合物は、新たに考案することができる。
【００９５】
候補化合物は、（ａ）タンパク質またはペプチド、（ｂ）核酸、および（ｃ）有機化合物または無機化合物で構成されるグループから選択することができる。
【００９６】
例えば、事前に選択された候補核酸のライブラリーは、目的のＳＳＩＶタンパク質を標的分子として用いてＳＥＬＥＸ法を行うことで、当業者によって得ることができる。ＳＥＬＥＸ法を実施するために、当業者は、米国特許第５４７５０９６号明細書および米国特許第５２７０１６３号明細書の内容を参照することができ、これら二つの文献の内容は引用することで本発明に含まれる。
【００９７】
さらに例えば、候補化合物は、目的のＳＳＩＶタンパク質に対して特異的な抗体で構成され得る。
【００９８】
ＳＳＩＶをコードする遺伝子の発現を阻害する方法
本発明で用いる場合、ＳＳＩＶタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するための方法は、対応するメッセンジャーＲＮＡの合成を阻害またはブロックする方法、ならびに、対応するメッセンジャーＲＮＡの活性ＳＳＩＶタンパク質への翻訳を阻害またはブロックする方法を含む。
【００９９】
遺伝子発現を阻害するための方法は本分野でよく知られており、該方法には、これらに限定されるわけではないが、相同性依存の遺伝子サイレンシング、アンチセンス技術、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などが含まれる。相同性依存の遺伝子サイレンシングという一般用語は、シス不活性化、トランス不活性化、およびコサプレッション（Ｆｉｎｎｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：８８３−８８８およびＭａｔｚｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７：６７９−６８５で開示されており、これらはともに引用することで全体が本発明に含まれるものとする）の現象を含む。これらのメカニズムは、植物におけるタンパク質の発現の減少をもたらす導入遺伝子／導入遺伝子または導入遺伝子／内在性遺伝子の干渉を伴う遺伝子サイレンシングのケースにあたる。「導入遺伝子」は、形質転換方法によってゲノムに導入された組換えＤＮＡ構築物である。あるいは、植物にＳＳＩＶ特異的なアンチセンスＲＮＡを組み込むことで、ＳＳＩＶをコードする内在性遺伝子の発現を阻害し、ゲノムにおける機能的変異を誘発することができる。その効果は、細胞内に、ＳＳＩＶをコードするｍＲＮＡの配列に相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することで得られる（例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．９：２０７−２２６で開示されており、該文献は引用することでその全体が本発明に含まれる）。相同性依存の遺伝子サイレンシング、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはその他の阻害メカニズムによる植物の遺伝子発現の操作は、活性なＳＳＩＶタンパク質の最終的な産生を阻害またはブロックすることを通してデンプンの生合成に最適に干渉するように用いることができ、このことによって、植物、または該植物の細胞および種子を含む該植物の所望の部分において、サイズの増大したデンプン粒が産生される。
【０１００】
ＳＳＩＶをコードする遺伝子の発現を阻害するために用いることのできるあらゆる核酸は、好ましくは、ＳＳＩＶをコードするすべての配列で見られる、ｍＲＮＡを含む、対応するＤＮＡまたはＲＮＡのＳＳＩＶをコードする部分、特に、ＳＳＩＶタンパク質のＮ末端部分をコードする核酸部分、より詳細には、あらゆるＳＳＩＶのアミノ酸配列の２００位のアミノ酸残基から４２０位のアミノ酸残基に位置するアミノ酸配列を含むＮ末端部分を標的としている。
【０１０１】
上記実施態様は、センス核酸またはアンチセンス核酸をコードする適切な核酸ならびにＲＮＡｉまたはさらにリボザイムを選択する場合に好適である。
【０１０２】
Ｔｉｌｌｉｎｇ
本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物を得るために、「ｔｉｌｌｉｎｇ」（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）と称され、当業者によく知られているもう一つの技術も用いることができる。ｔｉｌｌｉｎｇの方法は、例えば、Ｍｃ  Ｃａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２３：４３９−４４２）で開示されている。
【０１０３】
ＳＳＩＶ遺伝子における変異の同定および特徴付けは、ＴＩＬＬＩＮＧシステムを用い、以下の過程を含む下記の方法にしたがって、四つの過程で行われる。
ａ）化学的突然変異誘発によって植物変異体のコレクションを生成する過程。変異は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）による化学的突然変異誘発（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）で、３００００個の種子に対して突然変異誘発し、変異体を播種し、５０００個のＭ１植物からＭ２世代を産生することにより得られた。
ｂ）Ｍ２ファミリーあたり２０個の植物からＤＮＡを抽出し、１０００００個のＭ２植物（５０００ファミリー）の集団から３次元のＤＮＡプールを形成する過程。
ｃ）標的遺伝子のＰＣＲ増幅を行い、変性ＨＰＬＣによって変異を調査する過程。ＳＳＩＶ遺伝子をシーケンシングする。次に、ＰＣＲ産物を変性させ、ヘテロ二本鎖の形成を可能にするように対合させる。その後、変異を、変性ＨＰＬＣ（ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）またはヘテロ二本鎖における「ミスマッチ」の検出を可能にする酵素による手段（ＣＥＬ１酵素、Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）のいずれかによって検出する。
ｄ）デンプン粒との振る舞いを評価するために変異体を特徴付ける過程。過程ｄ）は、好ましくは、変異植物で見られるデンプン粒の平均サイズを測定すること、あるいは、変異植物で見られるデンプン粒の平均サイズを、野生型の植物を含む、ＳＳＩＶを欠いていない植物で見られるデンプン粒の平均サイズと比較することからなる。
【０１０４】
アンチセンス核酸およびセンス核酸。
１．アンチセンス核酸
植物遺伝子をサイレンシングするためのアンチセンス核酸およびセンス核酸の使用は本分野でよく知られている。遺伝子発現のアンチセンス抑制は、特に、米国特許第５１９０９３１号明細書および第５２７２０６５号明細書、米国特許第５４７８３６９号明細書、米国特許第５４５３５６６号明細書、Ｗｅｉｎｔｒａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎ．１：２２−２５、およびＢｏｕｒｑｕｅ  ａｎｄ  Ｆｏｌｋ（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６４１−６４７で開示されている。アンチセンスヌクレオチド配列は、生物の表現型を変化させるための代謝経路を操作する上で特に効果的である。遺伝子発現の減少は、ＤＮＡレベル、および転写レベル、転写後レベル、または翻訳レベルで仲介することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、転写後のプロセスおよびＤＮＡメチル化の両方によって遺伝子発現を抑制すると考えられている（Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｚａｍｏｒｅ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４３１−２４３３）。アンチセンスポリヌクレオチドは、植物細胞に導入されると、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、スプライシング、輸送、翻訳、および／または安定性に干渉して遺伝子発現を阻害すると考えられる。アンチセンスポリヌクレオチドは、染色体ＤＮＡ、一次ＲＮＡ転写物、またはプロセシングされたｍＲＮＡを標的とすることができる。好ましい標的領域には、スプライス部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドン、ならびにオープンリーディングフレーム内のその他の配列が含まれる。
【０１０５】
当然のことながら、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドはＳＳＩＶをコードする標的遺伝子またはＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡに対して完全に相補的である必要はなく、また、それらは、発現を調節するかまたは特異的ハイブリッドを形成するために互いの全長にわたったハイブリダイゼーションをしない。さらに、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子またはＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡに対して完全長である必要もない。一般的に、相同性が高ければ、ポリヌクレオチド長の短さを補うことができる。典型的には、アンチセンス分子は、標的遺伝子の少なくとも８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、５００、または少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドと６０％〜１００％の配列同一性を有するＲＮＡを含むものである。好ましくは、配列同一性は少なくとも７０％であり、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、最も好ましくは少なくとも９９％である。標的遺伝子には、配列番号１から配列番号５で構成されるグループから選択される核酸配列を含む、ＳＳＩＶをコードする遺伝子が含まれる。
【０１０６】
アンチセンスポリヌクレオチドは、エクソン、イントロン、エクソン−イントロンの境界、プロモーター領域、および転写開始部位や翻訳開始部位のようなその他の調節領域に結合するように設計することができる。完全なｃＤＮＡおよび部分的なｃＤＮＡ、３’非コード領域、ならびにコード領域の比較的短い断片に対応するアンチセンスＲＮＡを用いて植物の遺伝子発現を阻害するための方法は本分野で知られている（引用することで内容が本発明に含まれる米国特許第５１０７０６５号明細書および米国特許第５２５４８００号明細書、Ｓｈｅｅｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８８０５−８８０９、Ｃａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３９−４７、およびＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１０００６−１００１０）。さらに、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６）は、組織特異的な方法で植物遺伝子を阻害するためのアンチセンスＲＮＡの使用法を記載している。
【０１０７】
導入されたセンスポリヌクレオチドによる植物における発現の遺伝子特異的な阻害は「コサプレッション」と呼ばれる。コサプレッションの方法は本分野で知られている。部分的および完全な長さのｃＤＮＡが植物の内在性遺伝子のコサプレッションに用いられている（引用することでそれぞれの内容が本発明に含まれる、米国特許第４８０１３４０号明細書、米国特許第５０３４３２３号明細書、米国特許第５２３１０２０号明細書、および米国特許第５２８３１８４号明細書。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２９１−２９９、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２４：４７７−４８１、およびＮａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９）。
【０１０８】
２．センス核酸
センス抑制については、センスポリヌクレオチドの導入によって、対応する標的遺伝子の転写がフロックされると考えられている。本発明の方法では、センスポリヌクレオチドは、植物のＳＳＩＶをコードする標的遺伝子またはＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡと、少なくとも８０％、９０％、９５％またはそれより高い配列同一性を有するものである。導入されるセンスポリヌクレオチドは標的遺伝子または標的転写産物に対して完全長である必要はない。好ましくは、センスポリヌクレオチドは、配列番号１〜５にリストされているヌクレオチド配列を含む、ＳＳＩＶをコードする遺伝子またはＳＳＩＶをコードするＲＮＡの少なくとも１００個の連続するヌクレオチドと、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するものである。同一領域には、イントロンおよび／またはエクソンならびに非翻訳領域が含まれる。導入されるセンスポリヌクレオチドは、植物の染色体レプリコンまたは染色体外レプリコンに安定的に組み込まれる。
【０１０９】
本発明の方法では、センスポリヌクレオチドは標的とする植物のＳＳＩＶタンパク質のアミノ酸配列、または標的とする植物のＳＳＩＶタンパク質と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、もしくはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列をコードするものである。好ましくは、配列番号１〜５にリストされたポリヌクレオチド配列を含むセンスポリヌクレオチドは、種の間で高度には保存されていない、アミノ酸残基における５個またはそれより少ない改変を含む。導入されるセンスポリヌクレオチドは、植物の染色体レプリコンまたは染色体外レプリコンに安定的に組み込まれる。
【０１１０】
二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉとも称される）
もう一つの特徴において、本発明は、植物のＳＳＩＶをコードする標的遺伝子の転写後の阻害を目的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供する。本発明の方法では、ｄｓＲＮＡはＳＳＩＶをコードする標的遺伝子またはＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡに特異的である。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の塩基対長である（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＆  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０）。典型的には、ハイブリダイズしているＲＮＡは同じ長さであり、５’末端または３’末端での突出もギャップも有さない。しかし、５’または３’での１００個までのヌクレオチドの突出を有するｄｓＲＮＡを本発明の方法で用いることができる。
【０１１１】
したがって、一つの実施態様では、本発明は、配列番号１〜５にリストされたヌクレオチド配列を含む、ＳＳＩＶをコードする遺伝子またはＳＳＩＶをコードするＲＮＡの少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％の相補性を有する第一のリボ核酸、および第一のリボ核酸に実質的に相補的な第二のリボ核酸を含んだｄｓＲＮＡを提供する。
【０１１２】
ｄｓＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルリボシル残基のような、リボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド類似体、またはその組み合わせを含み得る（米国特許第４１３０６４１号明細書および米国特許第４０２４２２２号明細書）。ｄｓＲＮＡのポリリボイノシン酸：ポリリボシチジル酸は、米国特許第４２８３３９３号明細書に記載されている。ｄｓＲＮＡを作成し、使用するための方法は、本分野で知られている。ある方法では、インビボ、または単一のインビトロでの反応混合物における、二つの相補的なＤＮＡ鎖の同時転写が含まれる（引用することで内容が本発明に含まれる、米国特許第５７９５７１５号明細書）。本発明の方法では、ｄｓＲＮＡは二つの相補的なＲＮＡの転写を通して植物細胞内で発現する。
【０１１３】
ＳＳＩＶをコードする遺伝子を破壊する方法
ＳＳＩＶをコードする遺伝子に変異を導入するための方法を含む、本分野で知られている様々な方法を、ＳＳＩＶをコードする遺伝子を破壊するために用いることができる。
【０１１４】
ＳＳＩＶを欠いた変異植物は、化学的突然変異誘発、電離放射線発突然変異、Ｘ線誘発突然変異、ガンマ線誘発突然変異、Ｕ．Ｖ．誘発突然変異、部位特異的突然変異誘発、およびトランスポゾン誘発突然変異を含むランダムな突然変異誘発を含む、多くの方法で生成することができる。
【０１１５】
上記で説明したように、本発明による植物のＳＳＩＶタンパク質の遺伝子発現レベルまたはタンパク質活性のレベルの操作は、植物細胞においてＳＳＩＶをコードする遺伝子の破壊を引き起こすことで行うこともできる。上記で定義したように、「遺伝子で破壊を引き起こす」という用語は、本発明では遺伝子の発現を変化させるという意味を指すように使われる。また、適切な技術および方法には、例えば、リボザイムの使用、部位特異的突然変異誘発およびランダム突然変異誘発（化学的または放射線誘発）、Ｔ−ＤＮＡまたはトランスポゾンの挿入、ならびに標的遺伝子のアクセサリータンパク質の発現の変化のような、遺伝子破壊技術も含まれる。
【０１１６】
したがって、本発明の一つの実施態様は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物と比較して細胞あたりの数が少ないデンプン粒を産生する、ＳＳＩＶを欠いた植物を得るための方法であり、前記方法は、
ａ）植物細胞内でＳＳＩＶをコードする遺伝子の破壊を引き起こす過程と、
ｂ）ＳＳＩＶをコードする内在性遺伝子の破壊を有し、変化したデンプン代謝、特に、前記ＳＳＩＶをコードする遺伝子が破壊されていない同一の植物細胞と比較して細胞あたりのデンプン粒の数が少ない植物を、植物細胞から再生させる過程、
を含んでいる。
【０１１７】
上記方法の好ましい実施態様において、過程ａ）は、
ａ１）ＳＳＩＶをコードする遺伝子の破壊を引き起こし得る作用物質に植物細胞をさらす過程と、
ａ２）過程ａ１）の最後に得られた植物細胞において、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の破壊の発生に関してスクリーニングを行う過程と、
ａ３）破壊されたＳＳＩＶをコードする遺伝子を有する植物細胞を陽性として選択する過程、
を含んでいる。
【０１１８】
これらの好ましい実施態様では、過程ｂ）は、過程ａ３）で陽性としてあらかじめ選択されている細胞でのみ行われる。
【０１１９】
通常、スクリーニングの過程ａ２）は、ＳＳＩＶをコードする核酸またはその部分のＰＣＲ増幅、および、例えば増幅産物のシーケンシングまたは適切なオリゴヌクレオチドプローブを用いた変異の検出による増幅産物の破壊の検出によって行われる。
【０１２０】
特定の実施態様では、過程ａ１）は、目的の培養された植物細胞を、化合物または化合物の混合物、電離放射線、Ｘ線、ガンマ線、紫外線（ＵＶ）などのような、ランダム突然変異誘発物質と接触させることからなる。
【０１２１】
１．リボザイムによる破壊
このような方法の一つはリボザイムを用いるものである。本発明の方法では、リボザイムは、ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子、またはＡＧＢ１、ＧＰＡ１、もしくはそのオルソログである、ＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡの発現を減少させるために用いられる。
【０１２２】
リボザイムを作成し、使用するための方法は、当業者に知られている（引用することで内容が本発明に含まれる、米国特許第６０２５１６７号明細書、米国特許第５７７３２６０号明細書、米国特許第５６９５９９２号明細書、米国特許第５５４５７２９号明細書、米国特許第４９８７０７１号明細書、および米国特許第５４９６６９８号明細書、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ＆  Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８６−５９１、Ｖａｎ  Ｔｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：２３、Ｈｉｓａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２９：１７３、Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５６７（ヘアピン型リボザイムにおける必須のヌクレオチドを記載している）、Ｈａｍｐｅｌ  ＆  Ｔｒｉｔｚ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ＆  Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：４３（自己切断反応に必要な配列を記載している）、およびＦｅｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：５３）。当業者であれば、様々なリボザイムモチーフ、および特にヘアピン型リボザイムの詳細を、Ａｈｓｅｎ  ＆  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ（１９９３）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １５：２９９、Ｃｅｃｈ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．２：６０５、およびＨａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５：３７の文献で理解することができる。
【０１２３】
ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子またはＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡ転写物にハイブリダイズするリボザイムの部分は、典型的には少なくとも７個のヌクレオチド長である。好ましくは、この部分は少なくとも８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０個、あるいはそれより多いヌクレオチド長である。ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子またはＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡにハイブリダイズするリボザイムの部分は、ハイブリダイゼーションが前記標的に特異的である限り、前記標的と完全に相補的である必要はない。好ましい実施態様では、リボザイムは、ＳＳＩＶをコードする標的ＲＮＡの部分に対して１００％の相補性を有する、少なくとも７個または８個のヌクレオチドを有する部分を含む。実施態様の一つでは、標的ＲＮＡ転写物は、配列番号１〜５にリストされたヌクレオチド配列を含む、ＳＳＩＶをコードする遺伝子に対応している。
【０１２４】
２．Ｔ−ＤＮＡの挿入またはトランスポゾンの挿入による破壊
同様に、植物のＳＳＩＶをコードする標的遺伝子を破壊させる方法には、Ｔ−ＤＮＡまたはトランスポゾンの挿入法が含まれる。病気の経過の一部として、アグロバクテリウム属の細菌はＤＮＡ断片を宿主である植物細胞の核へと移送する。この移送されたＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は宿主ゲノム中のランダムな位置に組み込まれる。標的遺伝子のオープンリーディングフレームまたはプロモーター領域内にＴ−ＤＮＡを組み込まれたトランスジェニック植物は、当業者に知られているポリメラーゼ連鎖反応のスクリーニング法を用いて同定される（Ｋｒｙｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８１４５−５０）。
【０１２５】
また、ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子の不活性化は、前記ＳＳＩＶをコードする遺伝子のプロモーター領域またはコード領域にトランスポゾンを挿入することでも実施することができる。本発明の方法では、遺伝子を不活性化するために用いられるトランスポゾンは、突然変異誘発が行われる種に固有であるか（例えばＢｌａｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：２８７−９７）または異なる種に由来するものである（例えばＫｏｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６６：１−１１）。いずれの場合にも、上記の方法に類似したポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、所望の遺伝子破壊を伴う植物株を同定する。挿入による突然変異誘発技術はＰａｒｉｎｏｖ  ＆  Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１５７−６１とＫｒｙｓａｎ，Ｙｏｕｎｇ  ＆  Ｓｕｓｓｍａｎ（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：２２８３−９０で概観されている。
【０１２６】
３．ＳＳＩＶをコードする遺伝子にその他の変異を導入することによる破壊
植物のＳＳＩＶをコードする標的遺伝子を阻害するためのその他のよく知られた遺伝子破壊技術も本発明の方法で用いることができる。このような方法の一つは、ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子の定方向突然変異誘発またはランダムな突然変異誘発に関するものである。したがって、本発明のもう一つの実施態様では、標的であるＳＳＩＶタンパク質の活性の定方向の変化は、ＳＳＩＶをコードするクローニングされたｃＤＮＡのコード領域の遺伝子操作によって実施される。クローニングされたｃＤＮＡの定方向の遺伝子操作によって、ＳＳＩＶをコードする標的の高度に保存された領域において変異が生じ、この結果、遺伝的に優性な仕方で、標的であるＳＳＩＶタンパク質の活性を不活性化または変化（つまり低下）させる、非保存的なアミノ酸の置換が生じる。あるいは、ＳＳＩＶをコードするクローニングされたｃＤＮＡの定方向の遺伝子操作は、対応するＳＳＩＶタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から一つまたは複数のアミノ酸を欠失させるか、または前記末端へ一つまたは複数のアミノ酸を付加することを含む、対応するＳＳＩＶタンパク質のアミノ酸配列内において一つまたは複数のアミノ酸の欠失（いわゆる切断）または付加を行うために用いられる。
【０１２７】
このような定方向の遺伝子操作の方法は一般的に本分野で知られている。例えば、不活性なＳＳＩＶタンパク質を産生する植物は、目的の天然ＳＳＩＶタンパク質をコードするクローニングされたＤＮＡ配列における変異によって調製することができる。突然変異誘発およびヌクレオチド配列の改変のための方法は本分野でよく知られている（引用することですべてが本発明に含まれる、Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、米国特許第４８７３１９２号明細書、および該文献で引用されている文献）。
【０１２８】
したがって、本発明の実施態様の一つには、
ａ）ＳＳＩＶをコードする変異した配列であり、部位特異的な優性変異を含むセンスヌクレオチド配列を含む発現カセットを植物細胞に導入する過程、および
ｂ）過程ａ）で植物細胞に導入された発現カセットを安定的に組み込んでいる植物を再生させる過程であって、植物がＳＳＩＶを欠いていない同一の植物と比較して細胞あたりの数が少ないデンプン粒を産生する過程
を含む、ＳＳＩＶをコードする遺伝子内に変異を導入することによってＳＳＩＶを欠いた植物を得るための方法も含まれる。
【０１２９】
４．ランダム突然変異誘発による破壊
本発明の方法には、ランダム突然変異誘発法を用いて、植物内のＳＳＩＶをコードする標的遺伝子を破壊するための方法も含まれる。標的遺伝子のランダム突然変異誘発のために、突然変異誘発は化学物質、放射線を用いて実施される。
【０１３０】
上記で既に開示してあるＴ−ＤＮＡまたはトランスポゾンの挿入もランダム突然変異誘発技術に含まれることに注意されたい。
【０１３１】
したがって、本発明のもう一つの実施態様では、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の突然変異誘発は、化学的な変異誘発化合物またはＤＮＡの放射線照射のいずれかを用いてランダムに実施することができる。ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子の不活性化は、好ましくはＳＳＩＶをコードする標的遺伝子の高度に保存された領域において、非保存的なアミノ酸置換をもたらす変異を生じさせることで実施される。あるいは、ＳＳＩＶをコードする標的遺伝子の不活性化は、標的遺伝子のコード領域におけるあらゆるコドンの改変によって得られ、それにより、得られるＳＳＩＶタンパク質の切断が生じる。標的遺伝子におけるランダムな変異を生じさせるためのこのような技術は本分野でよく知られている（Ｋｏｎｃｚ，Ｃｈｕａ  ＆  Ｓｃｈｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．））。
【０１３２】
ＳＳＩＶを欠いたトランスジェニック植物
本発明は、アンチセンス、センス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、またはＳＳＩＶをコードする配列からなる植物のヌクレオチド配列に対する逆方向反復であるヌクレオチド配列を含む発現カセットがゲノム中に安定的に導入されているトランスジェニック植物を含む。さらに、ＳＳＩＶをコードする、植物に内在的な遺伝子からなる遺伝子内に破壊を有しているトランスジェニック植物も本発明に含まれる。本発明のトランスジェニック植物には、本明細書の別の箇所に記載したように、双子葉植物ならびに単子葉植物が含まれる。
【０１３３】
本発明には、アブラナ科、トウモロコシ、ジャガイモ、ソラマメ、稲、ビート、ホウレンソウ、グリンピース、および小麦で構成されるグループから選択される植物種に由来する、ＳＳＩＶを欠いたトランスジェニック植物が含まれる。
【０１３４】
ＳＳＩＶを欠いたトランスジェニック植物を得るための方法
本発明のトランスジェニック植物は、本発明で説明する方法および本分野で知られている方法によって作成される。
【０１３５】
本発明のポリヌクレオチドはあらゆる植物または植物細胞に導入することができる。植物とは単子葉植物および双子葉植物、ならびにそれらの細胞、器官、および組織を意味する。ポリヌクレオチドを植物に導入する方法およびトランスジェニック植物を生成する方法は当業者に知られている（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  （１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ、Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．６７−８０）。
【０１３６】
本発明の発現カセットを含むベクターが本発明の方法において用いられる。「ベクター」とは、宿主細胞で複製することのできるポリヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、ベクターは形質転換細胞の同定および／または選択に有用なマーカーとして役立つ遺伝子を含んでいる。このようなマーカーには、これらに限定されるわけではないが、バルナーゼ（ｂａｒ）、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、ゲンタマイシンなどが含まれる。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、一本鎖または二本鎖、および直鎖または環状とすることができる。様々な植物発現ベクターおよびレポーター遺伝子が、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．８９−１１９，１９９３、およびＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３：２５３−２７７に記載されている。好ましい実施態様では、ベクターは大腸菌／アグロバクテリウム・ツメファシエンスのバイナリーベクターである。本発明のもう一つの好ましい実施態様では、発現カセットはアグロバクテリウムのＴｉプラスミドの左右のＴ−ＤＮＡ境界の間に挿入される。
【０１３７】
本発明の組換え「発現カセット」は、目的のポリヌクレオチドの転写および終結に必要な５’および３’調節配列を含んでいる。通常、発現カセットは少なくとも一つのプロモーターと転写ターミネータを含む。本発明のプロモーターは、より詳細に本明細書において説明する。本発明のいくつかの実施態様では、その他の機能的な配列が発現カセットに含まれる。このような機能的配列には、これらに限定されるわけではないが、イントロン、エンハンサー、転写開始部位および転写終結部位、ならびにポリアデニル化部位が含まれる。調節配列は少なくとも一つの植物、植物細胞、または植物組織において機能する。これらの配列は、一つまたは複数の遺伝子に由来し得るか、または組換え技術を用いて作成することもできる。ポリアデニル化シグナルには、これらに限定されるわけではないが、アグロバクテリウムのオクトピン合成酵素シグナル（Ｇｉｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８３５−８４６）およびノパリン合成酵素シグナル（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３）が含まれる。転写終結領域には、これらに限定されるわけではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドのオクトピン合成酵素遺伝子およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターが含まれる（Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１４４、Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９、Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１２７２、Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１５８、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４、およびＳａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．５：１４１４９）。
【０１３８】
本発明の発現カセットは、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーをコードするポリヌクレオチドに共有結合させることができる。このようなマーカーの例には薬剤耐性または除草剤耐性をコードする遺伝子が含まれ、該耐性とは例えば、ハイグロマイシン耐性（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））、スペクチノマイシン耐性（ａａｄＡ遺伝子によりコードされる）、カナマイシンおよびゲンタマイシン耐性（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ））、ストレプトマイシン耐性（ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＳＰＴ））、ホスフィノトリシン耐性またはバスタ耐性（バルナーゼ（ｂａｒ））、クロロスルフロン耐性（アセトラクターゼ合成酵素（ＡＬＳ））、クロラムフェニコール耐性（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、Ｇ４１８耐性、リンコマイシン耐性、メトトレキサート耐性、グリホサート耐性などである。さらに、本発明の発現カセットは、容易にアッセイできる酵素をコードする遺伝子と共有結合させることができ、該酵素とは例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ（ベータ−ｇａｌ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）などである。
【０１３９】
方法には、これらに限定されるわけではないが、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８２：５８２４、Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、粒子衝撃（引用することで内容が本発明に含まれる米国特許第４９４５０５０号明細書および米国特許第５２０４２５３号明細書、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３、ＭａｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６）、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ（１９８５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：１７９−１８５、Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、炭化ケイ素介在性のＤＮＡ取り込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ９：４１５−４１８）、直接的な遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、プロトプラスト融合（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１８５９−１８６３）、ポリエチレングリコール沈殿（Ｐａｓｚｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２、Ｋｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：７２−７４）、シリコン繊維移送法、アグロインフェクション（引用することで本発明に含まれる米国特許第５１８８９５８号明細書、Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５：１３５３（リポソーム介在性のＤＮＡ取り込み）、Ｈｉｎｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５−９２１、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６−４９８、Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４８０３、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：３０３９−３０４１、Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−７６４、Ｇｒｉｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：１６７７−１６７９、Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５：４２６−４３４、Ｋｉｎｄｌｅ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１２２８（ボルテックス法）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．ｐｐ１９−２３所収のＢｅｃｈｔｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）（減圧浸潤）、Ｓｃｈｅｌｌ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１１７６−１１８３、およびＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｇｅｌｖｉｎ  ＆  Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，１９９４）が含まれる。
【０１４０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドはアグロインフェクションによって植物細胞に導入される。この方法では、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスベクターにおけるＴ−ＤＮＡの左右の境界の間に挿入される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主細胞の毒性タンパク質が、細菌で感染した植物細胞への挿入されたＤＮＡの移送に介在する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス／Ｔｉプラスミド系に代わるものとして、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）が介在した形質転換を用いることができる（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６，Ｒｉｂｇｙ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７所収のＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＆  Ｆｕｌｌｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，ＩＲＩ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５所収のＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＆  Ｄｒａｐｅｒ）。
【０１４１】
一つまたは複数の植物配偶子が形質転換されると、トランスジェニック種子およびトランスジェニック植物を直接産生することができる。例えば、トランスジェニック種子およびトランスジェニック植物を産生する一つの方法は、花のアグロインフェクションと、アグロインフェクションされた花から産生されたトランスジェニック種子の回収を必要とする。あるいは、形質転換された植物細胞は、当業者に知られた方法によって植物内で再生させることができる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＭａｃＭｏｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３、およびＶａｓｉｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｖｏｌ  １１，１９８６）。
【０１４２】
一度トランスジェニック植物が得られれば、該植物を後代の植物および植物株を産生するための親として用いることができる。従来の植物育種方法を用いることができ、該方法には、これらに限定されるわけではないが、交配および戻し交配、自家受粉、ならびに栄養繁殖が含まれる。植物を育種するための技術は当業者に知られている。トランスジェニック植物の後代は、後代がトランスジェニック構築物のすべてまたは一部を含む限り、本発明の範囲に含まれる。後代は無性生殖の方法および有性生殖の方法の両方で生成することができる。植物の後代には、トランスジェニック種子、トランスジェニック植物の次代、およびその種子が含まれる。
【０１４３】
したがって、本発明のある実施態様は、従来の育種方法および／または遺伝形質転換の連続的な反復を用いて、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の破壊を含む遺伝子型および変化したデンプン代謝を含む表現型を有する、ＳＳＩＶを欠いた植物株を産生することを含み、前記表現型は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物と比較して細胞あたりの数が少ないデンプン粒を含む表現型を含んでいる。
【０１４４】
方法
このように、本発明は、
ａ）植物細胞を用意する過程と、
ｂ）過程ａ）で用意された植物細胞に、前記植物細胞が可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性を欠くようにするＤＮＡ構築物を導入することで、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性を欠いた、形質転換された植物細胞を得る過程と、
ｃ）過程ｂ）の最後で得られた形質転換された植物細胞から植物全体を再生させる過程、
を含む、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた形質転換植物を得るための方法にも関するものである。
【０１４５】
上記方法で用いられる「ＤＮＡ構築物」は、本明細書で開示されているあらゆる「発現カセット」を含む。したがって、前記ＤＮＡ構築物は、アンチセンス、センス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、または本発明で説明しているＳＳＩＶをコードする配列からなる植物のヌクレオチド配列に対する逆方向反復であるヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【０１４６】
上記方法のいくつかの実施態様では、過程ｂ）において、前記植物細胞がデンプンホスホリラーゼ活性も欠くようにするＤＮＡ構築物を用いることができ、このことによって、過程ｃ）では、デンプンホスホリラーゼ活性も欠いている、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性を欠いた形質転換植物の細胞が得られる。
【０１４７】
これらの実施態様の第一の特徴によると、植物が（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠くように、過程ｂ）で、ＳＳＩＶをコードする遺伝子およびデンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子の両方の不活性化を引き起こし得る単一のＤＮＡ構築物を用いることができる。例えば、このようなＤＮＡ構築物は、Ｔ−ＤＮＡ、または、標的特異的ではない、Ｔ−ＤＮＡを有するあらゆるベクターからなるものであってよい。
【０１４８】
これらの実施態様の第二の特徴によると、植物が（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠くようにするために、過程ｂ）において、それぞれＳＳＩＶに特異的な第一のＤＮＡ構築物およびデンプンホスホリラーゼに特異的な第二のＤＮＡ構築物である少なくとも二つの異なるＤＮＡ構築物が用いられる。例えば、このようなＤＮＡ構築物は、それぞれＳＳＩＶおよびデンプンホスホリラーゼを対象とした、標的特異的なセンス核酸もしくはアンチセンス核酸をコードするＤＮＡ構築物を含むか、またはこれらからなるものとすることができる。
【０１４９】
また、本発明は、トランスジェニック植物とも呼ばれる、ＳＳＩＶを欠き上記方法によって得られる形質転換植物も扱うものである。
【０１５０】
前記形質転換植物またはトランスジェニック植物は、単子葉植物および双子葉植物で構成されるグループから選択することができる。
【０１５１】
好ましくは、前記形質転換植物またはトランスジェニック植物は、アブラナ科、トウモロコシ、ジャガイモ、ソラマメ、稲、ビート、ホウレンソウ、グリンピース、および小麦で構成されるグループから選択される植物種に属している。
【０１５２】
本発明のさらなる対象は、ＳＳＩＶをコードする遺伝子が、配列番号１（シロイヌナズナ）、配列番号２および配列番号３（稲）、配列番号４（小麦）、ならびに配列番号５（ササゲ）の核酸配列で構成されるグループから選択されるＳＳＩＶ配列における変異によって不活性化されている、ＳＳＩＶを欠いた形質転換植物またはトランスジェニック植物からなる。
【０１５３】
特に、本発明は、配列番号７からなる変異した可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）遺伝子を含む、形質転換植物またはトランスジェニック植物に関するものである。
【０１５４】
また、本発明は、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物の同一の材料と比較して細胞あたりの数が少ないデンプン粒を含む、上記で定義した形質転換植物またはトランスジェニック植物に由来する植物細胞および植物の種子を含む、植物の部分にも関するものである。
【０１５５】
デンプンを産生する方法および該デンプンの使用法
本明細書の上記で何度も既に開示しているように、本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物は、細胞内に、ＳＳＩＶを欠いていない同一の植物よりも細胞あたりの数が少ないがより大きなサイズのデンプン粒を有している。
【０１５６】
上述しているように、ＳＳＩＶを欠いた植物は、同一であるがＳＳＩＶを欠いていない植物に由来するデンプン粒よりも少なくとも１．５倍大きいサイズを有するデンプン粒を産生するのに対し、デンプン粒の構造は、ＳＳＩＶを欠いたこのような植物において影響を受けていない。
【０１５７】
さらに、（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物は、同一であるがＳＳＩＶを欠いておらずデンプンホスホリラーゼも欠いていない植物に由来するデンプン粒よりも少なくとも４倍大きいサイズを有するデンプン粒を産生することが分かっている。
【０１５８】
さらに、機能的なＳＳＩＶタンパク質を産生する植物（野生型植物）が平らな形のデンプン粒を比較的産生するのに対し、ＳＳＩＶを欠いた植物は丸い形のデンプン粒を比較的産生することが示されている。
【０１５９】
第一に、少なくとも、大きなサイズのデンプン粒は小さなサイズのデンプン粒よりもより良く早い堆積が可能となるということのみにより、ＳＳＩＶを欠いた植物に由来する、より大きなサイズのデンプン粒によって、産業的なデンプン製造においてより良い生産性が得られる。したがって、少なくとも、植物繊維から抽出した後にデンプン粒を洗浄する過程を行う場合、デンプン粒のロスは、ＳＳＩＶを欠いた植物に由来するデンプン粒を用いる場合に、より少なくなる。
【０１６０】
第二に、本出願人はいかなる特定の理論にも縛られることを望まないが、ＳＳＩＶを欠いた植物に由来する、サイズが大きく、丸い形をしたデンプン粒は、産業的なデンプン製造の過程で酵素加水分解を受けにくく、したがって最終製品の収率をかなり増大させると考えられる。
【０１６１】
この、本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物の本質的な特徴によって、ＳＳＩＶを欠いていない植物と比較して、粒または種子を含む適切な植物の部分から、より容易に、より低いコストでデンプンを抽出することが可能となる。
【０１６２】
このように、本発明はさらに、ＳＳＩＶを欠いた本発明による植物に由来するデンプンの製造および使用まで範囲に含むものである。
【０１６３】
本発明のもう一つの対象は、
ａ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾され、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する植物、ならびに
ｂ）（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾され、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼのいずれも欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を含む植物細胞を有する植物
で構成されるグループから選択される植物からデンプンを抽出する過程を含むデンプン産生方法からなる。
【０１６４】
本発明のもう一つの対象は、
ａ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠くように修飾され、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のデンプンアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する植物、ならびに
ｂ）（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠くように修飾され、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼのいずれも欠いていない同一の植物と比較して大きな粒サイズおよび同程度のアミロース含有量を有するデンプン粒を含む植物細胞を有する植物
で構成されるグループから選択される植物に由来する植物細胞からデンプンを抽出する過程を含む、デンプン産生方法からなる。
【０１６５】
また、本発明は、本発明によるトランスジェニック植物の細胞、植物、および／または植物の部分をデンプンの産生／抽出プロセスに導入する過程を含む、デンプンを産生するためのプロセスにも関する。
【０１６６】
さらに、本発明は、本発明によるデンプンを、デンプンの化学的および／または物理的な修飾／処理のプロセスに導入する過程を含む、修飾されたデンプンの産生プロセスにも関するものである。
【０１６７】
また、本発明は、本明細書で開示した可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた植物からデンプンを抽出する過程を含む、デンプン産生方法にも関するものである。
【０１６８】
植物、植物細胞、または該植物の部分からデンプンを抽出するプロセスは本分野でよく知られている。このようなプロセスは、例えば、Ｅｃｋｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．７３（１９９６），５４−５７）に記載されている。トウモロコシデンプンの抽出は、例えば「湿式粉砕」によって行われる。様々な植物からデンプンを抽出するためのその他の方法は、例えば、Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．：Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，ＢｅＭｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｓｃｈａｌｌ（１９９４）２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＬＴＤ；ＩＳＢＮ  ０−１２−７４６２７０−８；Ｃｈａｐｔｅｒ  ＸＩＩ，ｐａｇｅ  ４１７−４６８、Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  Ｓｏｒｇｈｕｍ  Ｓｔａｒｃｈｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；ｂｙ  Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；Ｃｈａｐｔｅｒ  ＸＩＩＩ，ｐａｇｅ  ４６９−４７９、Ｔａｐｉｏｃａ，Ａｒｒｏｗｒｏｏｔ  ａｎｄ  Ｓａｇｏ  Ｓｔａｒｃｈｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｒｂｉｓｈｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ＸＩＶ，ｐａｇｅ  ４７９−４９０、Ｐｏｔａｔｏ  Ｓｔａｒｃｈ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ；ｂｙ  Ｍｉｔｃｈ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ＸＶ，ｐａｇｅ  ４９１−５０６、Ｗｈｅａｔ  ｓｔａｒｃｈ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ；ｂｙ  Ｋｎｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ＸＶＩ，ｐａｇｅ  ５０７−５２８、Ｒｉｃｅ  ｓｔａｒｃｈ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ；ｂｙ  Ｒｏｈｗｅｒ  ａｎｄ  Ｋｌｅｍ）で説明されている。植物材料からデンプンを抽出するための方法において一般的に用いられる手段は、分離器、デカンタ、液体サイクロン、および、例えばスプレードライヤーやジェットドライヤーなどの、デンプンを乾燥させるための様々な種類の機械である。
【０１６９】
本発明によるＳＳＩＶを欠いた植物からより簡単な抽出および／または収率の増加した抽出によって得ることのできるデンプン製品は、食用製品および非食用製品の両方で慣用的に用いることができる。
【０１７０】
本発明は、以下の実施例においてさらに例証されるが、該実施例に限定されるものではない。
【０１７１】
実施例
Ａ．実施例の材料および方法
Ａ．１．アラビドプシス株、成長条件、および培地
ヴェルサイユにあるＩＮＲＡのＵＲＧＶで生成されたＴ−ＤＮＡ変異体コレクション（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１６，１１９４−１１９９、Ｂｏｕｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１６，１１８８−１１９３）およびＧＡＢＩ−ＫＡＴ変異体コレクション（Ｒｏｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５３，２４７−２５９．）から、シロイヌナズナの変異株を得た。野生型（Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ、ＷＳ、およびＣｏｌｕｍｂｉａすなわちＣｏｌ−Ｏ）ならびに変異株を、２３℃（日中）／２０℃（夜）で１６時間の明期／８時間の暗期の光周期、湿度７０％、そして白色蛍光灯によって供給される１２０μＥｍ−２ｓ−１という植物レベルでの光強度下の培養箱で成長させた。種子を土壌に播種し、０．５×ＭＳ培地で水を与えた（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５，４７３−４９７）。
【０１７２】
Ａ．２．ＲＮＡ抽出および逆転写
全ＲＮＡを（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  １９８７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．４，２１９−２２４）にしたがって単離した。コンタミネーションしているゲノムＤＮＡを取り除くため、ｃＤＮＡ合成の前に、ＲＮＡ調製物を３７℃で１０分間にわたって１０ユニットのＤＮＡｓｅ  Ｉ  ＦＰＬＣ  Ｐｕｒｅとインキュベートし、フェノールおよびクロロホルムを用いて抽出し、沈殿させ、そしてヌクレアーゼを有していないＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。第一の相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を、製造者の指示にしたがってＭＭＬＶ−ＲＴおよびｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて、１０μｇの全ＲＮＡから合成した。反応は３７℃で２時間にわたってインキュベートし、ヌクレアーゼを有さない１ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を添加して停止した。すべての試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ウプサラ、スウェーデン）製である。
【０１７３】
Ａ．３．ＳＳＩＶに対するポリクローナル抗体の産生
葉の全ＲＮＡを用いて、上述したようにｃＤＮＡを得た。オリゴヌクレオチドＳＡ２１５（５’−ＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＴＴ−３’、配列番号１２）およびＳＡ２１６（５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＡＡＡＣＧＴＴＧＧＣ−３’、配列番号１３）を用いて、ＳＳＩＶアミノ酸配列のグルタミン酸２３６からグルタミン酸４１４までをコードする、ＳＳＩＶのｃＤＮＡの５２１ｂｐの断片を増幅した。これらのオリゴヌクレオチドには、それぞれｃＤＮＡ断片の５’末端および３’末端におけるＮｄｅＩおよびＸｈｏＩに対する制限部位を導入し、これらを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子の３’末端に対するフレーム内に融合している発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）においてｃＤＮＡ断片をクローニングするために用いた。構築物をＤＮＡシーケンシングによって確認し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株へと形質転換した。タンパク質発現、グルタチオンアガロースによるＧＳＴ−ＳＳＩＶ断片融合タンパク質の精製、およびトロンビンによるマトリクスに結合したＧＳＴ融合タンパク質の切断によるＳＳＩＶ断片の精製は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）の方法にしたがって行った。ウサギのポリクローナル抗血清を、精製したＳＳＩＶ断片に対して産生させた。最後に、製造者の指示にしたがって、タンパク質Ａのセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、抗血清の免疫グロブリンＧ断片をＦＰＬＣによって精製した。
【０１７４】
Ａ４．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
リアルタイム定量逆転写ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを、ｉＣｙｃｌｅｒという器具（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて行った。ＰＣＲ反応混合物は、全体量２５μｌに、５μｌのｃＤＮＡ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１：１０００００希釈のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州、アメリカ）／フルオレセインキャリブレーション色素（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州、アメリカ）、０．３ユニットのＴａｑポリメラーゼ、２．５μｌの１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、および０．２μＭの各プライマーを含むものであった。用いた特異的オリゴヌクレオチドは、ＡｔＳＳ１に対するＳＡ１９８（５’−ＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＡＣＣＣＧＡＡＡ−３’、配列番号１４）およびＳＡ１９９（５’−ＣＣＡＴＡＧＡＴＴＴＴＣＧＡＴＡＧＣＣＧＡ−３’、配列番号１５）、ＡｔＳＳ２に対するＳＡ１２６（５’−ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’、配列番号１６）およびＳＡ１２７（５’−ＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’、配列番号１７）、ＡｔＳＳ３に対するＳＡ２００（５’−ＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’、配列番号１８）およびＳＡ２０１（５’−ＣＡＣＧＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡ−３’、配列番号１９）、ＡｔＳＳ４に対するＳＡ４１９（５’−ＣＧＴＧＡＣＴＴＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＡ−３’、配列番号２０）およびＳＡ４２０（５’−ＧＣＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡ−３’、配列番号２１）、ＡｔＰＨＳ１に対するＳＡ５４６（５’−ＴＧＧＡＡＧＧＡＡＡＣＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧ−３’、配列番号２２）およびＳＡ５４７（５’−ＴＧＴＣＴＴＴＧＧＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＧＡ−３’、配列番号２３）、ＡｔＰＨＳ２に対するＳＡ５４８（５’−ＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＡＴＴ−３’、配列番号２４）およびＳＡ５４９（５’−ＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＣＴＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡ−３’、配列番号２５）、ＵＢＱ１０に対するＵＢＱＦ（５’−ＧＡＴＣＴＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴ−３’、配列番号２６）およびＵＢＱＲ（５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧ−３’、配列番号２７）であった。熱サイクルは、９４℃で３分と、その後、９４℃で１０秒、６１℃で１５秒、および７２℃１５秒を４０サイクルで構成される。その後、溶融曲線を作成して、増幅した断片の特異性を確認した。上記の条件におけるすべてのプライマーの効率は、試験したすべてのサンプルにおいて７５％〜１１０％の間であり、産物の同一性は配列分析によって確認した。アラビドプシスユビキチン１０（Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｃａｌｌｉｓ，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１，１０１７−１０２７）を発現分析におけるハウスキーピング遺伝子として用いた。増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、アメリカ）においてクローニングし、該クローンを外部較正標準として用いることで、絶対的定量（Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ，２００２，Ｅｘｐｅ���．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０，５０３−５１２）を行った。
【０１７５】
Ａ．５．デンプンの抽出と精製
デンプンの構造と組成を分析するために、明期の最後にアラビドプシスの葉を採取した。１００ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）のエタンジオールからなる３０ｍｌの緩衝液において、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、バートルズビル、オクラホマ州、アメリカ）を用いて、およそ１０ｇの生の材料を均質化した。ミラクロスの二つの層を通してホモジネートを濾過し、４℃、４０００ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを３０ｍｌのパーコール９０％（ｖ／ｖ）に再懸濁し、４℃、１００００ｇで４０分間遠心分離した。デンプンのペレットを滅菌蒸留水で６回洗浄した（各洗浄の間に、４℃、１００００ｇで１０分間）。デンプンは最終的に４℃で２０％エタノールに保存した。概日周期に沿った葉のデンプン含有量を分析するために、方法の規模を縮小し、三つの異なる植物の３つの葉（およそ３００ｍｇ）を各点で用いた。材料は液体窒素で冷凍し、すり鉢とすりこぎで均質化し、１ｍｌの緩衝液に再懸濁した。デンプンの単離は、上述したパーコール勾配遠心分離を用いて行った。
【０１７６】
Ａ．６．デンプンおよびＷＳＰの含有量の測定ならびにデンプン・ヨウ素複合体のスペクトル特性
葉のデンプン含有量をＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）によって以前に説明されているように酵素的に定量した。λｍａｘ（ヨウ素・多糖類複合体の最大吸光波長）の測定の細則はＤｅｌｒｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，３６１２−３６２０．）を参照することができる。葉の水溶性グルカン含有量をＺｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５，８４９−８５８）で説明されているように測定した。
【０１７７】
Ａ．７．サイズ排除クロマトグラフィーによるデンプン多糖類の分離
デンプン（１．５．〜２．０ｍｇ）を５００μｌの１０ｍＭ  ＮａＯＨに溶解し、次に、セファロースＣＬ−２Ｂカラム（内径０．５ｃｍ×６５ｃｍ）に入れ、該カラムを平衡にし、１０ｍＭのＮａＯＨで溶出させた。３００μｌの画分を、１．５分に１画分の割合で回収した。画分中のグルカンは、ヨウ素との反応によって検出し、アミロペクチンとアミロースのレベルはアミログルコシダーゼアッセイによって測定した。
【０１７８】
Ａ．８．アミロペクチンの鎖長分布
脱分岐したアミロペクチンのＦＡＣＥ：セファロースＣＬ−２Ｂカラムにおける精製の後、５００ｍｇのアミロペクチンを蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。アミロペクチンのペレットを１ｍｌの５５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）緩衝液に再懸濁し、シュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）（株式会社林原生物化学研究所、岡山、日本）から単離した２０ユニットのイソアミラーゼおよび肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、アメリカ）から単離した１ユニットのプルラナーゼと、４２℃で一晩インキュベートした。次に、塩をｅｘｔｒａｃｔ−ｃｌｅａｎカーボグラフカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ、ディアフィールド、イリノイ州、アメリカ）を通すことで除去した。誘導体化法：グルカンを製造者（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州、アメリカ）の推奨にしたがって８−アミノ−１，３，６−ピレントリスルホン酸（ＡＰＴＳ）によって誘導体化した。簡潔に説明すると、１５％の酢酸溶液における２ｍｌのＡＰＴＳ、およびテトラヒドロ葉酸塩における１ＭのＮａＢＨ３ＣＮ  ２ｍｌを添加し、３７℃の暗所において一晩結合反応させた。キャピラリー電気泳動分析：ＡＰＳＴに結合したグルカンの分離および定量を、４−ｍＷのアルゴンイオンレーザーを用いるレーザー励起蛍光システムを備えたＰ／ＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、カリフォルニア州、アメリカ）で行った。励起波長は４８８ｎｍであり、５２０ｎｍで放射される蛍光を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥステーションソフトウェアシステム（バージョン１．０）で記録した。長さ５７ｃｍ×内径７５μｍの被覆していない石英ガラスの毛細管を用いた。ランニングバッファーはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製である。サンプルを１０ｋＶで１０秒間のエレクトロインジェクションによって毛細管にロードし、３０ｋＶの電圧を、２５℃の一定の温度で２０分間印可した。
【０１７９】
Ａ．９．ザイモグラム技術
これらの技術の完全な説明はＤｅｌｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４３，３９８−４１２）を参照することができる。
【０１８０】
Ａ．１０．デンプン合成酵素のインビトロでのアッセイ
ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを、Ｃｒｅｖｉｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，２８５０８−２８５１５）に記載されている方法にしたがって合成方向でアッセイした。デンプン合成酵素の活性は（Ｄｅｌｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）に記載されているように、アミロペクチンまたはクリコーゲンをプライマーとして用いてアッセイした。分岐酵素、デンプンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカノトランスフェラーゼの活性はＺｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５，８４９−８５８）によって説明されている方法にしたがって行った。
【０１８１】
Ａ．１１．ウェスタンブロット分析
製造者の指示にしたがい、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ転移セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、アメリカ）におけるエレクトロブロッティングによって、タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に移した。ブロットは、ウサギ抗ＳＳＩＶ血清をプローブとして結合させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ血清をプローブとして結合させ、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄウェスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて検出した。
【０１８２】
Ａ．１２．顕微鏡分析
１６時間明期／８時間暗期の光周期で培養した植物から完全に開いた葉を指定した時間に回収した。葉の小片（２ｍｍ２）をカミソリの刃で切り、すぐに、１ｍｌあたり２５ｍｇのショ糖を含む０．０５ＭのＮａ−カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の１％のパラホルムアルデヒドおよび０．５％のグルタルアルデヒドで固定した（４℃で３．５時間、真空下）。固定し、同一の緩衝液ですすいだ後、組織をエタノール系で脱水し、段階的にＬＲ白色樹脂（Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｉｎ  Ｃｏ．、レディング、イギリス）に埋め込んだ。樹脂は−２０℃でＵＶ光によってポリマー化した（Ｆｅｄｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔａ  ２０９，２５−３２）。あるいは、いくつかのサンプルを上述した緩衝液中の３％のグルタルアルデヒドで固定し、Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８，Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  ２０４，６１−７０）に記載されているように、Ａｒａｌｄｉｔｅ  Ｄｕｒｃｕｐａｎ  ＡＣＭに埋め込んだ。半薄（１μｍ）と極薄（６０ｎｍ）の切片を、ダイヤモンドナイフを備えたＬｅｉｋａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔミクロトーム（Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）で切り出した。光学顕微鏡用の半薄切片は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡写真機（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）で直接観察するために、水性の１％ホウ酸ナトリウム中の１％（ｗ／ｖ）のトルイジンブルーで染色した。透過型電子顕微鏡用の極薄折半は、２％水性酢酸ウラニルとクエン酸鉛で対比染色した（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，１９６３，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７，２０８−２１３）。観察は、Ｇａｔａｎ  Ｂｉｏｓｃａｎ  ７９２デジタルカメラ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、カリフォルニア州、アメリカ）を備えたＳＴＥＭ  ＬＥＯ  ９１０電子顕微鏡（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）によって８０ｋＶで行った。少なくとも三つの異なる葉のサンプルからの異なる切片を分析した。
【０１８３】
走査型電子顕微鏡分析のために、サンプルを金でスパッタコーティングし、ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−５４００顕微鏡（東京、日本）で観察した。
【０１８４】
透過型顕微鏡分析はＤｅｌｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４３，３９８−４１２）に記載されているように行った。
【実施例１】
【０１８５】
実施例１：様々な器官におけるＳＳＩＶのｍＲＮＡのレベル
ＳＳＩＶアイソフォームの機能を特徴づける第一の過程として、ＡｔＳＳ４遺伝子（Ａｔ４ｇ１８２４０座）の発現の空間的なパターンを明らかにした。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、このパターンをその他のクラスのＳＳ（それぞれＡｔＳＳ１座、ＡｔＳＳ２座、およびＡｔＳＳ３座によってコードされる、ＳＳＩ、ＳＳＩＩ、およびＳＳＩＩＩ）のパターンと比較した。四つの遺伝子は研究したすべての器官（葉、根、花、および熟していない実）で発現した。すべてのケースで、ＡｔＳＳ１のｍＲＮＡの定常レベルは、その他のＡｔＳＳ遺伝子のレベルと比較して１０倍高かった（図１Ａ）。逆に、ＡｔＳＳ４のｍＲＮＡは、分析したすべての器官で同程度のレベルで蓄積し、ＡｔＳＳ３遺伝子について得られたものと同等の値であった（図１Ｂ）。
【実施例２】
【０１８６】
実施例２：ＳＳＩＶを欠いた変異株の単離
ＡｔＳＳ４（Ａｔ４ｇ１８２４０）遺伝子は４番染色体に位置し、１６個のエクソンと１５個のイントロンで構成されている。該遺伝子は１０４０個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしており、予想される質量は１１７７４７Ｄａである。このタンパク質は、ササゲ（７１％の同一性、受託番号ＡＪ００６７５２）、小麦（５８．２％の同一性、受託番号ＡＹ０４４８４４）、または稲（ＳＳＩＶａ（受託番号ＡＹ３７３２５７）およびＳＳＩＶｂ（受託番号ＡＹ３７３２５８）でそれぞれ５６．８％と５８．３％の同一性）などの、その他の種で見られる、上で注記したＳＳＩＶタンパク質との高レベルの類似性を示す。生物情報学的な分析では、最初の４２個のアミノ酸を含み、１１２９９７Ｄａの成熟したタンパク質を生じさせる、葉緑体を標的としたシグナルの存在が予測された（ＣｈｌｏｒｏＰ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／、（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９））。二つの独立した変異対立遺伝子により設計される、Ａｔｓｓ４−１（Ｃｏｌ−Ｏ型）、およびＡｔＳＳ４遺伝子におけるＴ−ＤＮＡの挿入に対応するＡｔｓｓ４−２（ＷＳ型）が、それぞれＧＡＢＩ−ＫＡＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇａｂｉ−ｋａｔ．ｄｅ／、（Ｒｏｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３））およびＧｅｎｏｐｌａｎｔｅ−ＩＮＲＡ（ｈｔｔｐ：／／ｆｌａｇｄｂ−ｇｅｎｏｐｌａｎｔｅ−ｉｎｆｏ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆｓｔ／、（Ｂａｌｚｅｒｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１））の変異体コレクションで見られた。Ｔ−ＤＮＡの挿入はイントロン１１と２に位置している（それぞれ、Ａｔｓｓ４−１およびＡｔｓｓ４−２の開始コドンに関して＋３７６３ｂｐと＋２２７の位置）（図２）。
【０１８７】
ホモ接合の変異植物を選択し、ＡｔＳＳ４変異対立遺伝子の発現を、遺伝子の様々な領域に特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。この分析は、ＡｔＳＳ４に対応する修飾されたメッセンジャーが両方の対立遺伝子に依然として存在していることを示した（データは図示せず）。続いて、ウェスタンブロット分析を行って、両方の変異株でＳＳＩＶタンパク質の不存在について確認した。用いたウサギ抗血清は、その他すべてのＳＳアイソフォームと類似性を示さない領域に対応するＳＳＩＶタンパク質の１７８個のアミノ酸からなるポリペプチド断片に対するものであった（グルタミン酸２３６からグルタミン酸４１４）（実験方法を参照）。ウェスタンブロットは、両方の野生型でおよそ１１２ｋＤａの質量を有する二つの近接したバンドが存在することを示した（図２Ｂ）。これらのバンドは予想される成熟したＳＳＩＶタンパク質のサイズと合致し、両方とも、二つの変異対立遺伝子において存在しない。ＳＳＩＶタンパク質の切断された形態はいずれの変異株でも検出されなかった（より小さい非特異的なバンドが、変異株およびＷＴ株の両方で見られた）（図２Ｂ）。両方の野生型におけるこれら２つのバンドの存在は依然解明されていないが、タンパク質の翻訳後修飾に起因している可能性がある。
【実施例３】
【０１８８】
実施例３：Ａｔｓｓ４変異対立遺伝子の表現型の特徴
ＳＳＩＶタンパク質の不存在は植物の成長に有害な影響を与える。変異株は両方とも、それぞれの野生型と比較して、１６時間日中／８時間夜の光周期において遅い成長速度を示した（図３−Ａおよび図３−Ｂ）。変異対立遺伝子のロゼット葉はＷＴのロゼット葉よりも小さかった（図示せず）。さらに、開花時期の遅れも記録され、Ａｔｓｓ４−１では３１＋／−３日であるのに対しＣｏｌ−Ｏでは２５日であり、Ａｔｓｓ４−２では２１日であるのに対しＷＳ型では１８＋／−１日であった。しかし、種子をつける時期のロゼッタ葉の数は変異体とＷＴ植物で同じであり、このことは、開花時の遅れは、変異株において成長速度が低下した結果として生じることを示している。
【０１８９】
果実のサイズ、長角果あたりの種子の数、および発芽率は、変異株で変化していなかった。葉のデンプン量も変異株で測定した。照射期間の最後におけるデンプン含有量は両方のケースで減少しており、ＷＴの遺伝的バックグラウンドに対して、Ａｔｓｓ４−１では３５％の減少、Ａｔｓｓ４−２では５０％の減少であった。昼／夜サイクルに沿ったデンプン蓄積のより詳細な分析をＡｔｓｓ４−１株に対して行った。図４に示されているように、概日周期に沿ったデンプンの代謝回転はＷＴ植物よりも変異体で低く、合成速度および分解速度の両方が明らかに減少していた。明期の最初におけるデンプンの量はＷＴ植物よりＡｔｓｓ４−１の方で多かった。しかし、変異体におけるデンプン合成の速度の低下は、照射時期の最後における変異体のデンプンレベルを低下させる。
【実施例４】
【０１９０】
実施例４：Ａｔｓｓ４変異株の酵素学的特徴
ザイモグラムおよびインビトロでのアッセイの両方を用いて（実験方法参照）、デンプンの合成および分解に関与する酵素活性のレベルを変異株で測定した。プライマーとしてウサギの肝臓のグリコーゲンまたはアミロペクチンを用いたところ、可溶性デンプン合成酵素の全活性の減少は、両方の変異体においてインビトロで観察されなかった（表１）。アッセイに用いた基質に応じて全活性が１．４から２倍増加したデンプンホスホリラーゼを除いて（表１）、その他のデンプン代謝酵素は影響を受けなかった（表１）。ザイモグラム分析は、この誘発がデンプンホスホリラーゼの細胞質基質のアイソフォーム（ＰＨＳ２）とプラスチドのアイソフォーム（ＰＨＳ１）の両方の活性の増大によって引き起こされることを示した（図示せず）。変異株に不在のＳＳＩＶとデンプンホスホリラーゼタンパク質との相互作用またはその他の間接的な効果がこの増大の原因と考えられるかどうかを試験するために、Ａｔｓｓ４−１における両方のＰＨＳ遺伝子のｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって判定した。図５−Ｂは、両方の遺伝子の発現がＷＴ型と比較して変異株で増加したことを示している。ＰＨＳのｍＲＮＡの誘発の程度は、ＰＨＳ活性で見られる程度に匹敵しており（図５−Ａおよび図５−Ｂ）、このことは、ＳＳＩＶの不存在によって、プラスチドおよび細胞質基質の両方のＰＨＳ遺伝子発現の誘発を引き起こす代謝の変化を介したデンプンホスホリラーゼ活性が誘発されることを示している。
【実施例５】
【０１９１】
実施例５：デンプンの構造および組成に対するＳＳＩＶを削除する効果
ＡｔＳＳ４座の遮断はインビトロでの可溶性デンプン合成酵素の全活性に影響しなかった（表１）。しかし、デンプン合成は変異体で明らかに減少した。Ａｔｓｓ４の変異がデンプンの構造および組成を変化させているかどうか判定するため、アミロース／アミロペクチンの割合およびアミロペクチンの鎖長の分布を両方の変異対立遺伝子で分析した。
【０１９２】
セファロースＣＬ−２Ｂカラム上で実施するサイズ排除クロマトグラフィーを用いてアミロースおよびアミロペクチンのポリマーを分離し、アミログルコシダーゼアッセイによって定量した。この分析は、アミロース／アミロペクチンの割合がＡｔｓｓ４変異体では影響を受けないことを示した。
【０１９３】
次に、精製したアミロペクチンを完全な酵素的脱分岐に付し、生じた直鎖グルカンをＡＰＴＳに結合した後、フルオロフォアを用いたキャピラリー電気泳動（ＦＡＣＥ）によって鎖長（ＣＬ）分布を判定した。Ａｔｓｓ４変異対立遺伝子のＣＬ分布のプロファイルと、それらのそれぞれのＷＴ型との比較は、Ａｔｓｓ４の変異がアミロペクチンの構造に対してわずかな影響しか持たないことを示した（図６）。実際、ＤＰ＝７〜１０の鎖の量に対するわずかな減少しか観察することができなかった（図６における異なるプロットのスケールに注意されたい）。
【０１９４】
デンプン粒の形態およびサイズを、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の両方を用いて分析した。デンプン粒は、日中に回収し、実験方法で説明したように処理した、Ａｔｓｓ４変異体および野生型の葉から単離した。デンプン粒の形態は変異植物においては影響を受けていないと考えられた（図７）。しかし、粒サイズの劇的な増大が両方の変異対立遺伝子で検出された（図７−Ｂおよび図７−Ｄ）。より詳細な研究を、明期の４時間および１２時間に回収した葉の切片に対する透過型電子顕微鏡分析（図示せず）および光学顕微鏡分析（図示せず）によって行った。二つの関連する結果がこれらの分析から得られた。すなわち、日中の開始時において（明期の４時間、図示せず）、Ｃｏｌ−ＯおよびＡｔｓｓ４−１のデンプン粒の間で最も大きなサイズの差が観察された。この結果は、その後の暗期でより大きなデンプン粒を生み出すことが期待される、変異植物で観察されたデンプン分解の速度の低さ（図４）に沿ったものである。第二に、Ａｔｓｓ４−１変異植物におけるほとんどの葉緑体が、小数の例外（葉緑体あたり二つの粒）を除いて一つのデンプン粒を含んでいる。この所見は、葉緑体あたり４〜５個のデンプン粒が観察できるＷＴの葉緑体で得られたものと明らかに対照的である。異なる葉のサンプルの異なる切片を分析したところ、すべてのケースで同じ結果となった（データは図示せず）。したがって、我々は、ＡｔＳＳ４座での機能変異の喪失が葉緑体で合成されるデンプン粒の数とサイズに影響を与えると結論づけた。
【０１９５】
実施例１〜実施例５で示した結果に関するさらなる議論
本研究では、デンプン合成酵素クラスＩＶ（ＳＳＩＶ）の特異的な喪失によって引き起こされる表現型の変化を分析した。Ｃｏｌ−ＯおよびＷＳ型のような二つの異なる遺伝的バックグラウンドで得られる二つの独立したＴ−ＤＮＡ挿入変異体の分析は、二つの変異体で見られる共通した表現型の変化がＳＳＩＶタンパク質の喪失によって特異的に引き起こされることを示している。Ｔ−ＤＮＡの挿入は、本実施例で研究した二つの変異対立遺伝子におけるＡｔＳＳ４遺伝子座（Ａｔ４ｇ１８２４０）のイントロン２および１１に位置している（図２）。これらの挿入が、両方のケースにおいて、修飾されたＳＳＩＶのｍＲＮＡの合成を決定した。しかし、ウェスタンブロッティング分析は、これらのメッセンジャーが野生型ＳＳＩＶタンパク質を産生し得なかったことを示した（図２）。この分析で用いられた抗体は、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の上流である、タンパク質のアミノ末端領域にある１７８個のアミノ酸からなる断片に対するものであったため、小さい変異体特異的なポリペプチドがウェスタンブロットによって検出されず、変異対立遺伝子におけるＳＳＩＶタンパク質の切断形態の存在もまた排除される（図２）。
【０１９６】
その他三つのデンプン合成酵素のいずれか一つの変異体で見られたものとは異なり、Ａｔｓｓ４変異体は、それぞれの野生型で見られたものに類似したアミロペクチンのＣＬプロファイルを示した。短い鎖の量（ＤＰ７からＤＰ１０）の、弱いが再現性のある減少のみが観察できた（図６）。アミロース／アミロペクチンの割合および水溶性多糖類のレベルは、両方の変異対立遺伝子において、それぞれのＷＴにおける値と比較して不変のままであった。野生型（ＷＴ）植物のアミロース含有量が２１＋／−２％であるのに対し、Ａｔｓｓ４変異植物のアミロース含有量は２０＋／−１％である。ザイモグラム分析はＳＳＩアイソフォームまたはＳＳＩＩＩアイフォソームのいずれの活性レベルのいかなる変化も反映しておらず（図示せず）、このことによって、ＳＳＩＶの喪失を補うその他のデンプン合成酵素の活性の選択的な増大をもたらす補填メカニズムの存在は排除される。これらの結果は総合的に、ＳＳＩＶアイソフォームの主要な機能が、デンプンの生合成過程におけるアミロペクチン鎖の伸長とは異なる可能性があることを示唆している。
【０１９７】
Ａｔｓｓ４変異体のデンプン代謝における主要な変化は、デンプンの合成速度および分解速度の減少にあり（図４）、該減少は、デンプン粒のサイズの増大および葉緑体あたりの粒の数の減少（図７）と相関関係にある。概日周期に沿ったデンプン代謝回転速度の低下は、デンプン代謝酵素の活性の低下によっては説明することができず、それは、このような活性の有意な変化がインビトロおよびザイモグラム分析の両方で検出できなかったためである（表１）。
【０１９８】
また、Ａｔｓｓ４変異体におけるデンプン粒の数の減少は、これらの粒で見られるサイズの増大の原因となっている可能性もある（図７）。この場合、すべてのＡＤＰ−グルコースプールが一つまたは二つの粒となっているはずであり、それにより、変異体において、野生型の植物と比較してかなり大きなデンプン粒がもたらされる。ここで報告したデータは、葉緑体あたりのデンプン粒の正確な数を判定するためにはＳＳＩＶが必要であるということ、および多糖類の表面の量がデンプンの合成速度と分解速度の重要な決定要因であることを示している。
【実施例６】
【０１９９】
実施例６：ＳＳＩＶを欠いたさらなる植物
ここでは、ＳＳＩＶをコードする遺伝子の改変以外に、デンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子の改変も導入されている、ＳＳＩＶを欠いたさらなる植物が提供される。
【０２００】
したがって、実施例６では、（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いたシロイヌナズナ植物が提供される。
【０２０１】
より詳細には、実施例６のＳＳＩＶを欠いたシロイヌナズナ植物は、
−イントロン２および１１に位置する、Ｔ−ＤＮＡの挿入によって変異したＳＳＩＶをコードする遺伝子を有し、
−イントロン６に位置する、Ｔ−ＤＮＡの挿入によって変異したデンプンホスホリラーゼをコードする遺伝子を有している。
【０２０２】
（ｉ）野生型（ＷＳ）のシロイヌナズナ植物、（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼを欠いたシロイヌナズナ植物（ｐｈｓ１−）、および（ｉｉｉ）本発明によるＳＳＩＶを欠いた二つのシロイヌナズナ植物（ｓｓ４−、ｐｈｓ１−／ｓｓ４−）の葉のデンプン含有量を測定した。結果は以下の表２に示している。
【０２０３】
【表１】
2009544299.tif 000003
【０２０４】
上の表２に示されているように、ＳＳＩＶのみを欠いた植物（ｓｓ４−）の全デンプン含有量は、野生型植物とは大幅には異なっていない。しかし、図９に示されるように、（ｓｓ４−）植物に由来するデンプン粒は、野生型植物（ＷＳ）よりもかなり大きなサイズを有している。図９の顕微鏡写真からは、（ｓｓ４−）植物に由来するデンプン粒のサイズは、野生型植物（ＷＳ）に由来するデンプン粒のサイズよりもおよそ二倍から三倍大きいと判定される。
【０２０５】
上の表２に示されているように、（ｉ）ＳＳＩＶおよび（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いた植物（ｐｈｓ１−／ｓｓ４−）のデンプン含有量は、野生型植物（ＷＳ）と比較しておよそ四倍増加している。さらに、図９に示されているように、（ｐｈｓ１−／ｓｓ４−）植物に由来するデンプン粒は、野生型植物（ＷＳ）に由来するデンプン粒よりもかなり大きなサイズを有している。図９の顕微鏡写真からは、（ｐｈｓ１−／ｓｓ４−）植物に由来するデンプン粒のサイズは、野生型植物（ＷＳ）に由来するデンプン粒のサイズよりもおよそ四倍から五倍大きいと判定される。
【０２０６】
さらに、図９に示されているように、野生型植物（ＷＳ）に由来するデンプン粒は、比較的平らな形状であるのに対し、ＳＳＩＶを欠いた両方の植物、すなわち（ｓｓ４−）と（ｐｈｓ１−／ｓｓ４−）に由来するデンプン粒は比較的丸い形状をしている。
【０２０７】
【表２】
2009544299.tif 000004
【０２０８】
【表３】
2009544299.tif 000005
【先行技術文献】
【特許文献】
【０２０９】
【特許文献１】米国特許第６２１１４３６号明細書
【特許文献２】米国特許第５９９８７０１号明細書
【図１】
2009544299.tif 000006
【図２Ａ）】
2009544299.tif 000007
【図２Ｂ）】
2009544299.tif 000008
【図３】
2009544299.tif 000009
【図４】
2009544299.tif 000010
【図５】
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【図６】
2009544299.tif 000012
【図７】
2009544299.tif 000013
【図８−１】
2009544299.tif 000014
【図８−２】
2009544299.tif 000015
【図８−３】
2009544299.tif 000016
【図８−４】
2009544299.tif 000017
【図８−５】
2009544299.tif 000018
【図８−６】
2009544299.tif 000019
【図８−７】
2009544299.tif 000020
【図８−８】
2009544299.tif 000021
【図８−９】
2009544299.tif 000022
【図８−１０】
2009544299.tif 000023
【図８−１１】
2009544299.tif 000024
【図９Ａ】
2009544299.tif 000025
【図９Ｂ】
2009544299.tif 000026
【図９Ｃ】
2009544299.tif 000027
【図９Ｄ】
2009544299.tif 000028
【配列表】
2009544299000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月19日(2009.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン粒を得るための、遺伝的に修飾された植物またはその細胞の使用法であり、
ｉ．前記遺伝的に修飾された植物が可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いている一方で、対応する野生型植物はＳＳＩＶを欠いておらず、
ｉｉ．前記遺伝的に修飾された植物が、デンプンアミロース含有量が同程度である、対応する野生型植物よりも大きなデンプン粒を産生する
使用法。
【請求項２】
前記遺伝的に修飾された植物が、不活性の可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を産生する、請求項１に記載の使用法。
【請求項３】
前記遺伝的に修飾された植物が、可溶性デンプン合成酵素を合成しないか、または対応する野生型植物と比較して可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）の合成が減少している、請求項１に記載の使用法。
【請求項４】
前記遺伝的に修飾された植物が、前記可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードするｍＲＮＡを合成しないか、または対応する野生型植物と比較して前記ｍＲＮＡの合成が減少している、請求項１に記載の使用法。
【請求項５】
可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードする、前記遺伝的に修飾された植物の遺伝子が、ヌクレオチドの一つまたは複数の挿入、欠失、または置換によって変異されている、請求項１に記載の使用法。
【請求項６】
可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードする、前記遺伝的に修飾された植物の遺伝子が、プロモーター配列、イントロン配列、およびエクソン配列で構成されるグループから選択される少なくとも一つの遺伝子配列部分で変異されている、請求項５に記載の使用法。
【請求項７】
可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）をコードする、前記遺伝的に修飾された植物株の遺伝子が、少なくとも一つのイントロンまたは一つのエクソン内における少なくとも一つのヌクレオチドの挿入によって変異されている、請求項５に記載の使用法。
【請求項８】
遺伝的に修飾された植物がさらにデンプンホスホリラーゼも欠いている一方で、対応する野生株はデンプンホスホリラーゼを欠いていない、請求項１〜請求項７のいずれか一つに記載の使用法。
【請求項９】
遺伝的に修飾された植物が単子葉植物または双子葉植物で構成されるグループから選択される、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の使用法。
【請求項１０】
遺伝的に修飾された植物が、アブラナ科、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  Ｆａｂａ  Ｌ）、稲（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ビート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、グリンピース（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、および小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）で構成されるグループから選択される種に属する、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の使用法。
【請求項１１】
遺伝的に修飾された植物が、配列番号７で構成される変異した可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）遺伝子を含む形質転換されたシロイヌナズナからなる、請求項１０に記載の使用法。
【請求項１２】
可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）およびデンプンホスホリラーゼを欠いていない野生型植物種に由来する、遺伝的に修飾された植物であり、（ｉ）可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）および（ｉｉ）デンプンホスホリラーゼの両方を欠いており、かつ、デンプンアミロース含有量が同程度である、対応する野生型植物よりも大きなデンプン粒を産生する植物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の植物に由来する植物細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載の植物から得られる種子。
【請求項１５】
可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性およびデンプンホスホリラーゼ活性の両方を欠いた、遺伝的に修飾された植物を得るための方法であり、
ａ）植物細胞を用意する過程と、
ｂ）過程ａ）で用意された植物細胞に、前記植物細胞が可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性を欠くようにするＤＮＡ構築物、および前記植物細胞がデンプンホスホリラーゼ活性を欠くようにするＤＮＡ構築物を導入することで、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性およびデンプンホスホリラーゼ活性の両方を欠いた、形質転換された植物細胞を得る過程と、
ｃ）過程ｂ）の最後で得られた形質転換された植物細胞から植物全体を再生させる過程、
を含む方法。
【請求項１６】
植物細胞がＳＳＩＶを欠くようにする、過程ｂ）で導入されるＤＮＡ構築物が、アンチセンス、センス、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、またはＳＳＩＶをコードする配列からなる植物のヌクレオチド配列に対する逆方向反復で構成されるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む発現カセットからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法により得られる、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性およびデンプンホスホリラーゼ活性の両方について遺伝的に修飾された植物。
【請求項１８】
単子葉植物または双子葉植物で構成されるグループから選択される、請求項１２または１７に記載の遺伝的に修飾された植物。
【請求項１９】
アブラナ科、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  Ｆａｂａ  Ｌ）、稲（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ビート（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、グリンピース（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、および小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）で構成されるグループから選択される種に属する、請求項１８に記載の遺伝的に修飾された植物。
【請求項２０】
配列番号７で構成される変異した可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）遺伝子を含む形質転換されたシロイヌナズナからなる、請求項１８に記載の遺伝的に修飾された植物。
【請求項２１】
請求項１７〜請求項２０のいずれか一つに記載の形質転換植物の細胞に由来する、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）活性およびデンプンホスホリラーゼ活性の両方を欠いた、形質転換された植物細胞。
【請求項２２】
請求項１２、１３、および２１のいずれか一つに記載の植物細胞から、または、
ａ）請求項１〜１１のいずれか一つに記載の、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）を欠いた、遺伝的に修飾された植物、ならびに
ｂ）請求項１２〜２０のいずれか一つに記載の、可溶性デンプン合成酵素ＩＶ（ＳＳＩＶ）およびデンプンホスホリラーゼを欠いた、遺伝的に修飾された植物
で構成されるグループから選択される遺伝的に修飾された植物から、またはその細胞から、デンプンを抽出する過程を含む、デンプン産生方法。
【国際調査報告】
2009544299.tif 000029
2009544299.tif 000030
2009544299.tif 000031