(57)【要約】  本発明により、フリー・フロー電気泳動によって分析物を分離するための新規かつ有利な方法が提供される。この方法は、生物起源のサンプルから主要な成分である例えばアルブミンを枯渇させるのに特に適している。場合によってはサンプルの残部のさらなる分離がこの方法と組み合わされる。サンプルのうちでこの方法によって回収される部分は、下流の用途（例えば１Ｄ−ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、質量分析）で有利に使用できる。本発明のフリー・フロー電気泳動分離法を実施するための緩衝系、そのような緩衝系を含むキットおよび装置も提供される。
2009541726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物組成物から分離する１つの分析物をフリー・フロー電気泳動によって分離する方法であって、
必要に応じ、分析物組成物から分離する１つの分析物のｐＩを同定するステップと；
フリー・フロー電気泳動（ＦＦＥ）チェンバーの中でアノードとカソードの間に、ｐＨの平均が分離する分析物の等電点（ｐＩ）に実質的に対応していて、上限ｐＨと下限ｐＨによって限定されたｐＨ範囲を持つｐＨ分離平坦部と、前記アノードとそのｐＨ分離平坦部の間にあって、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能と、前記カソードとそのｐＨ分離平坦部の間にあって、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能とを含む、ｐＨ機能プロファイルを形成するステップと；
分析物混合物から分離する１つの分析物を含むサンプルを、ＦＦＥチェンバー内の前記ｐＨ分離平坦部、そのｐＨ分離平坦部のアノード側の領域、またはそのｐＨ分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと；
ＦＦＥチェンバーから前記分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を１つまたは複数の画分として回収するステップを含む方法。
【請求項２】
前記サンプルをＦＦＥチェンバー内のｐＨ分離平坦部に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分画化されたサンプルの分析物を分析するため、その分析の前にフリー・フロー電気泳動を実施する操作を含む方法であって、そのフリー・フロー電気泳動が、
請求項１または２のいずれかの方法に従ってフリー・フロー電気泳動により複数の分析物を含むサンプルの分離を行なうことにより、そのサンプルから、少なくとも１つの非枯渇部分と、前記ｐＨ分離平坦部上でその非枯渇部分から分離される分析物を含む部分とを生成させるステップと；
その後、前記ＦＦＥチェンバーから流出した１つ以上の画分を分析するステップを含む方法。
【請求項４】
後で実施する分析に、フリー・フロー電気泳動、ゲル電気泳動、１Ｄ−ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＭＳ、ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ、ＳＥＬＤＩ、ＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（／ＭＳ）、化学発光、ＨＰＬＣ、エドマン・シークエンシング、ＮＭＲ分光、Ｘ線回折、核酸シークエンシング、エレクトロブロッティング、アミノ酸シークエンシング、フロー・サイトメトリー、および円二色性からなる群から選択された１つの技術、またはこれらの組み合わせが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
電気泳動による分離の後に、前記ｐＨ分離平坦部から流出する分析物をＦＦＥチェンバーから流出する１種類以上の分析物から差し引いたものが回収され、回収された分析物の少なくとも一部に対してゲル電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせが実施される、請求項３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記分析の前に、サンプル中の前記非枯渇部分、および／またはサンプル中で前記ｐＨ分離平坦部上で分離される分析物を含む部分に対してサンプル調製法を実施する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分析する前記画分が、サンプル中の少なくとも１つの非枯渇部分に存在する少なくとも１つの分析物を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分析する前記画分が、サンプル中の前記非枯渇部分からｐＨ分離平坦部上で分離される少なくとも１つの分析物を含む、請求項３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
分離される前記少なくとも１つの分析物がタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中の前記非枯渇部分からの少なくとも１つの分析物がバイオマーカーである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＨ分離平坦部のアノード側に隣接していてそのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さなｐＨを持つｐＨ平坦部が、前記ｐＨ機能プロファイルの中に位置する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐＨ分離平坦部のカソード側に隣接していてそのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きなｐＨを持つｐＨ平坦部が、前記ｐＨ機能プロファイルの中に位置する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐＨ分離平坦部のアノード側に隣接していてそのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さなｐＨを持つｐＨ平坦部が、前記ｐＨ機能プロファイルの中に位置し、前記ｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きなｐＨを持つｐＨ平坦部が、そのｐＨ分離平坦部のカソード側に隣接する、請求項１１または１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ｐＨ分離平坦部と前記アノードおよび／またはカソードｐＨ平坦部のｐＨの差が、それぞれ約１ｐＨ単位よりも大きい、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｐＨ分離平坦部と前記アノードおよび／またはカソードｐＨ平坦部のｐＨの差が、それぞれ２ｐＨ単位よりも大きい、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐＨ分離平坦部のアノード側に隣接していて少なくとも０．５ｐＨ単位の範囲にわたるｐＨ勾配が、前記ｐＨ機能プロファイルの中に位置する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｐＨ分離平坦部のカソード側に隣接していて少なくとも０．５ｐＨ単位の範囲にわたるｐＨ勾配が、前記ｐＨ機能プロファイルの中に位置する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐＨ勾配が、それぞれ少なくとも１ｐＨ単位にわたって広がる、請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐＨ機能プロファイルが、前記ｐＨ分離平坦部のアノード側に隣接していて少なくとも０．５ｐＨ単位にわたるｐＨ勾配と、前記ｐＨ分離平坦部のカソード側に隣接していて少なくとも０．５ｐＨ単位にわたるｐＨ勾配とを含んでいて、好ましくは少なくとも１つのｐＨ勾配は１以上のｐＨ単位にわたる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｐＨ機能プロファイルがｐＨ分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にｐＨ勾配が隣り合い、カソード側にｐＨ平坦部が隣り合っている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｐＨ機能プロファイルがｐＨ分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にｐＨ平坦部が隣り合い、カソード側にｐＨ勾配が隣り合っている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
分離する前記タンパク質が、アルブミン、α１アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、カゼイン、ミオシン、およびアクチンからなる群から選択され、そのタンパク質はアルブミンであることが好ましい、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルが生物材料を含んでいて、その生物材料はヒトから得られることが好ましい、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＦＦＥによる分離が天然状態下で実施され、前記ｐＨ分離平坦部のｐＨが、ｐＨ４．７〜ｐＨ５．０の範囲、より好ましくはｐＨ４．８〜ｐＨ４．９の範囲である、請求項２２または２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ＦＦＥによる分離が変性条件下で実施され、前記ｐＨ分離平坦部のｐＨが、ｐＨ６．２〜ｐＨ６．５の範囲、より好ましくはｐＨ６．３〜ｐＨ６．４の範囲であり；必要に応じて前記ＦＦＥによる分離が変性条件下で実施され、このとき興味の対象である分析物が減らされてアルキル化され、前記ｐＨ分離平坦部のｐＨがｐＨ５．９〜ｐＨ６．２の範囲、より好ましくはｐＨ５．９〜ｐＨ６．１の範囲である、請求項２２または２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
２つ以上のサンプルに由来する分析物組成物から分離する１つ以上の分析物をフリー・フロー電気泳動によって同時に分離する方法であって、
必要に応じ、分析物組成物から分離する１つの分析物のｐＩを同定するステップと；
フリー・フロー電気泳動（ＦＦＥ）チェンバーの中で単一のアノードと単一のカソードの間に、Ｎ個の分離領域と、それぞれの分離領域を隣接する各分離領域から隔てる（Ｎ−１）個の電極間安定化媒体とを含むｐＨ機能プロファイルを形成するステップと；
ここで、各分離領域は、ｐＨが分離する各分析物の等電点（ｐＩ）に実質的に対応していて、ｐＨの範囲が上限ｐＨと下限ｐＨによって限定されているｐＨ分離平坦部と、そのｐＨ分離平坦部のアノード側に隣接していて、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能と、そのｐＨ分離平坦部のカソード側に隣接していて、その第１のｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能とを備えており；
分析物組成物から分離する１つの分析物を含む各サンプルを個別に、前記ＦＦＥチェンバーの１つの分離領域のｐＨ分離平坦部、そのｐＨ分離平坦部のアノード側の領域、またはそのｐＨ分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップであって、各分離領域には、分析物組成物から分離するその分析物をその分離領域において分離するのに適したｐＨ分離平坦部が含まれている、ステップと；
ＦＦＥチェンバーから前記分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を１つまたは複数の画分として回収するステップを含む方法。
【請求項２７】
Ｎが２〜９の整数であり、２〜７であることが好ましく、２〜５であることが最も好ましい、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
分離するサンプルの数が２〜９であり、２〜７であることが好ましく、２〜５であることが最も好ましい、請求項２６または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
分析物組成物から分離する前記分析物が、各サンプルで同じである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、各分離領域のｐＨ分離平坦部に個別に導入される、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｐＨ機能プロファイル内の各分離領域が、互いに独立に、請求項１１〜２２のいずれか１項に規定されたものである、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記アノード電極間安定化媒体が、一プロトン性の酸を含む、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記カソード電極間安定化媒体が、一塩基性の塩基を含む、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記一プロトン性の酸のアニオンと、前記一塩基性の塩基のカチオンが、互いに独立に、約４０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒以下の電気泳動移動度を持ち、そのアニオンとカチオンの電気泳動移動度は、約３０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒未満であることが好ましく、約２５×１０-9ｍ2／Ｖ／秒未満であることがより好ましく、約２０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒未満であることが最も好ましい、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記アノード電極間安定化媒体が、グルコン酸、グルクロン酸、アセチルサリチル酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、および両性酸（グッドの緩衝液）からなる群から選択された酸を含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記カソード電極間安定化媒体が、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミン、トリ−イソプロパノールアミン、および２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールからなる群から選択された塩基を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｐＨ機能プロファイルを形成する緩衝系が、市販の両性電解質、ＣＭＰＢＳ媒体、揮発性緩衝液、および二元緩衝酸／緩衝塩基系（Ａ／Ｂ媒体）からなる群から選択される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｐＨ分離平坦部を形成する緩衝系が、ＭＥＳ／グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ／ＥＡＣＡ、ＭＥＳ／ピペリジン−３−炭酸、ＭＯＰＳＯ／ピペリジン−４−炭酸などからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ｐＨ分離平坦部に隣接するｐＨ勾配を形成する前記緩衝系が、市販の両性電解質、ＣＭＰＢＳ媒体、揮発性緩衝液、およびＡ／Ｂ媒体からなる群から選択される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｐＨ分離平坦部を形成する緩衝系がＡ／Ｂ媒体であり、ｐＨ勾配を形成する緩衝系がＣＭＰＢＳ媒体である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つのフォーカス媒体が、ｐＨ分離平坦部に隣接するｐＨ勾配またはｐＨ機能を形成する媒体に隣接して配置される、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つのフォーカス媒体が、ｐＨ分離平坦部を形成する媒体に隣接して配置されていて、ｐＨ機能を形成している、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
アノード・フォーカス媒体が、前記緩衝系で用いる緩衝酸よりも小さなｐＫａを持つ強酸を含んでいて、ｐＨ勾配、ｐＨ機能、またはｐＨ分離平坦部を形成する、請求項４１または４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記フォーカス媒体の強酸のｐＫａと、ｐＨ勾配、ｐＨ機能、またはｐＨ分離平坦部を形成する前記緩衝系の緩衝酸のｐＫａの差が１よりも大きく、２よりも大きいことが好ましく、３よりも大きいことが最も好ましい、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記フォーカス媒体の強酸が、硫酸、塩酸、リン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸またはギ酸から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
カソード・フォーカス媒体が、ｐＨ勾配、ｐＨ機能、またはｐＨ分離平坦部を形成するのに前記緩衝系で用いる緩衝塩基よりも大きなｐＫａを持つ強塩基を含んでいる、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記フォーカス媒体の強塩基のｐＫａと、ｐＨ勾配、ｐＨ機能、またはｐＨ分離平坦部を形成する前記緩衝系の緩衝塩基のｐＫａの差が１よりも大きく、２よりも大きいことが好ましく、３よりも大きいことが最も好ましい、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記フォーカス媒体の強塩基が、アルカリ金属の水酸化物またはアルカリ土類金属の水酸化物であり、水酸化ナトリウムであることが好ましい、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記フォーカス媒体の導電率が、ｐＨ勾配、ｐＨ機能、またはｐＨ分離平坦部を形成する媒体の導電率の少なくとも約２倍である、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記フォーカス媒体の導電率が、ｐＨ勾配またはｐＨ機能を形成する媒体の導電率の少なくとも約３倍、好ましくは少なくとも５倍である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｐＨ機能プロファイルが、前記アノードと、ｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体との間、または前記アノードとフォーカス媒体との間に配置されたアノード安定化媒体を含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｐＨ機能プロファイルが、前記カソードと、ｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体との間、または前記カソードとフォーカス媒体との間に配置されたカソード安定化媒体を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記分析物含有サンプルを、前記ｐＨ分離平坦部を形成する緩衝系を用いて１：３、１：５、１：１０またはそれ以上の比で希釈する、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記フリー・フロー電気泳動を連続モードで実施する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記フリー・フロー電気泳動をインターバル・モードで実施する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記フリー・フロー電気泳動をサイクリック・インターバル・モードで実施する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のフリー・フロー電気泳動分離を実施するためのキットであって、ｐＨ機能プロファイル内に分離領域を形成することのできる少なくとも１つの分離媒体を含むキット。
【請求項５８】
分離領域を形成することのできる少なくとも３つの分離媒体を含んでいて、その分離媒体は、市販の両性電解質、ＣＭＰＢＳ媒体、揮発性緩衝媒体、およびＡ／Ｂ媒体からなる群から選択される、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
緩衝酸と緩衝塩基の濃度比が異なる複数の分離媒体を含む、請求項５７または５８のいずれかに記載のキット。
【請求項６０】
異なる分離媒体の数が２〜１５であり、３〜１２が好ましく、３〜７が最も好ましい、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６１】
各分離媒体のｐＨが、他の分離媒体のｐＨと異なっている、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６２】
前記分離媒体のｐＨが約２ｐＨ〜約１３ｐＨの範囲、好ましくは約４ｐＨ〜約９ｐＨの範囲である、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６３】
１つのアノード安定化媒体および／またはカソード安定化媒体をさらに含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６４】
前記安定化媒体が、前記分離媒体よりも大きな導電率を持ち、その導電率が、その安定化媒体に隣接する分離媒体の導電率と比べて少なくとも２倍であることが好ましく、少なくとも３倍であることが最も好ましい、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
少なくとも１つのフォーカス媒体をさらに含む、請求項５７〜６４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６６】
前記カソード安定化媒体が、隣接するフォーカス媒体または分離媒体のｐＨ以上のｐＨを持つ、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６７】
前記アノード安定化媒体が、そのアノード安定化媒体に隣接する分離媒体のｐＨ以下のｐＨを持つ、請求項５７〜６６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６８】
前記キットの成分が、フリー・フロー電気泳動の用途でそのまま使用される水溶液として存在している、請求項５７〜６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６９】
前記キットの成分が濃縮された貯蔵水溶液として存在していて、フリー・フロー電気泳動の用途で使用するときに適切な濃度に希釈される、請求項５７〜６７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７０】
前記キットの成分が乾燥形態または凍結乾燥形態で存在していて、フリー・フロー電気泳動の用途で使用するときに水に溶かされて適切な濃度にされる、請求項５７〜６７のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、明確なｐＩを持つある種の分析物を分離し、可能であれば枯渇させることのできる分離条件および媒体を伴う、無担体の連続的な偏向電気泳動のための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動は、直流電流の影響による帯電粒子の移動に基づいて粒子を分離するためのよく確立された１つの技術である。いくつかの異なる操作モード（例えば等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ゾーン電気泳動（ＺＥ）、等速電気泳動（ＩＴＰ））が、上記分離原理のバリエーションとして開発されており、当業者に一般に知られている。
【０００３】
電気泳動技術のうちで、フリー・フロー電気泳動（ＦＦＥ）が最も有望な技術の１つである（Ｋｒｉｖａｎｏｖａ  Ｌ．とＢｏｃｅｋ  Ｐ．、１９９８年、「連続フリー・フロー電気泳動」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第１９巻、１０６４〜１０７４ページ）。ＦＦＥは、吸着によるサンプルの損失を最少にするため無担体媒体（すなわち固定相（または固体支持材料）なしの液体（水性）媒体）の中で分析物を分離する技術である。ＦＦＥは、無担体偏向電気泳動または無マトリックス偏向電気泳動と呼ばれることもしばしばある。
【０００４】
プロテオミクスの分野では、ＦＦＥは、複合タンパク質サンプルをそのさまざまな等電点（ｐＩ）の値に関してあらかじめ決められたように分離するのに選択される技術である。ＦＦＥを利用すると、非常に多彩な分析物（例えば有機分子、無機分子、生体粒子、バイオポリマー、生体分子）を電気泳動移動度に基づいて分離できる。対応する原理はすでに報告されている（例えばＢｏｎｄｙ  Ｂ．他、１９９５年、「分離媒体に含まれる塩化ナトリウムがフリー・フロー電気泳動の細胞適合性を向上させる」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第１６巻、９２〜９７ページ）。
【０００５】
ＦＦＥ法は、例えば安定化媒体と向流媒体によって改善されてきた。そのことが、例えばアメリカ合衆国特許第５，２７５，７０６号（その開示内容は参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）に反映されている。この特許文献によれば、大量の分離媒体と、電極間を移動するサンプルとが連続的に流れている方向とは逆向きの向流媒体が、分離スペースに導入される。両方の媒体（分離媒体と向流媒体）は、画分出口を通って排出されまたは流出し、一般に微量滴定プレートに入る。その結果、空隙の体積が少ない分画法になる。さらに、画分出口の領域では媒体の層流状態が維持される（すなわち渦が非常に少ないか、存在しない）。
【０００６】
インターバルＦＦＥと呼ばれる特別なＦＦＥ法が、例えばアメリカ合衆国特許第６，３２８，８６８号に開示されている。この特許文献では、サンプルと分離媒体の両方が電気泳動チェンバーに導入され、サンプル中の分析物が電気泳動モード（例えばＺＥ、ＩＥＦ、ＩＴＰ）を利用して分離され、最終的にそのチェンバーから画分出口を通じて排出される。'８６８号特許の実施態様には、分離媒体とサンプルがチェンバーの入口の端部から出口の端部へと流動していないときに有効な電圧を印加すると、電気泳動による移動が起こってサンプルと分離媒体が一方向に運動して入口の端部から出口の端部へと移動することが記載されている。これは、サンプルと媒体が装置を通過するときに電場の中で分離されるという従来技術で一般に利用されている技術（連続ＦＦＥと一般に呼ばれる）とは対照的である。
【０００７】
国際特許出願ＷＯ０２／５０５２４には、分離媒体が中を通過する分離チェンバーを備える装置を用いた電気泳動法が開示されている。この分離チェンバーは、床とカバーによって規定される分離スペースと、その床とカバーを互いに隔てるスペーサを備えている。さらに、このＦＦＥ装置には、分離媒体を供給するポンプが含まれている。この分離媒体は、媒体供給ラインを通じて分離チェンバーに入り、出口からこの分離チェンバーを出ていく。このＦＦＥ装置には、分離媒体に電場を印加するための電極と、粒子または分析物の混合物を添加するためのサンプル注入点と、分離媒体の中でＦＦＥによって分離される粒子を除去するための分画点も含まれている。分離された粒子は、分析の目的に使用すること、またはさらに予備処理するために使用することができる。いずれにせよ、この出願には、あらゆる分離媒体の組成が開示されているわけではない。
【０００８】
アメリカ合衆国特許出願公開２００４／０５０６９８にも、分離媒体が中を通過できる少なくとも１つの分離チェンバーを備えるフリー・フロー電気泳動装置が開示されている。さらに、このＦＦＥ装置は、媒体供給ラインを通じて分離チェンバーに入り、出口からこの分離チェンバーを出ていく分離媒体を輸送するための供給ポンプと、分離媒体に電場を印加するための電極と、分離されることになる粒子の混合物を添加するためのサンプル注入点と、分離媒体の中でＦＦＥによって分離された粒子を除去するための分画点を備えている。
【０００９】
分析物（例えば生体粒子やバイオポリマー）を分離するための多数の分離媒体が従来技術で知られている。例えばＫ．  ＨａｎｎｉｇとＫ．Ｈ．  Ｈｅｉｄｒｉｃｈによって出版された書籍『フリー・フロー電気泳動』（ＩＳＢＮ  ３−９２１９５６−８８−９）には、ＦＦＥ、その中でも特にフリー・フローＺＥ（ＦＦ−ＺＥ）に適した分離媒体のリストが記載されている。
【００１０】
（Ｂｉｅｒらに付与された）アメリカ合衆国特許第５，４４７，６１２号には、別の分離媒体が開示されている。この分離媒体は、自由溶液の中に機能的に安定な狭いｐＨゾーン勾配をあらかじめ形成することによって分析物を等電点電気泳動で分離するためのｐＨ緩衝系である。この分離媒体では、相補的な緩衝ペアになった緩衝成分が使用されている。その緩衝成分は、化学的に単純な両性電解質、弱酸、および弱塩基の中から選択され、その解離特性に基づいて互いにペアにされて、０．４〜１．２５ｐＨ単位の間の比較的平坦なｐＨ勾配が提供される。
【００１１】
電気泳動の一般的な上記動作モード（その中にフリー・フロー電気泳動も含まれる）の１つであるＩＥＦ（等電点電気泳動）は、例えばタンパク質のキャラクテリゼーションにおいてタンパク質の等電点を決定する１つの機構として一般的に利用されている技術である（例えば『分析生化学』、アディソン・ウェズレー・ロングマン社、第３版、１９９８年を参照のこと）。ゾーン電気泳動（ＺＥ）は、分離する粒子と使用する分離媒体の帯電種の間の電気泳動移動度の値の差に基づく別の動作モードである。
【００１２】
ＩＥＦには、ｐＨ勾配が含まれる分離媒体、またはｐＨ勾配が含まれるようにできる分離媒体の中を混合物を通過させる操作が含まれる。分離チェンバーは、一方の側が相対的に小さなｐＨにされ、他方の側が相対的により大きなｐＨにされている。この２つの側の間に変化するｐＨ勾配が形成され、そのｐＨ勾配が、電気泳動による帯電粒子の運動を支配する。ＩＥＦはさまざまな文献に記載されており、例えばＰ．Ｇ．  ＲｉｇｈｅｔｔｉとＪ．Ｗ．  Ｄｒｙｓｄａｌｅによる『等電点電気泳動』（ノース・ホランド出版、アムステルダムと、アメリカン・エルゼビア出版、ニューヨーク、１９７６年）がある。
【００１３】
プロテオミクスの研究では、複雑なタンパク質混合物に適用される高分解能の分離技術に、従来の同定法（例えば質量分析（ＭＳ））が組み合わされる。一般に、既存のどの分離・同定法も、それ単独では、複雑な混合物（例えば血清、血漿、滑液、脳脊髄液、尿、ホールセル、細胞画分、組織抽出液などの生物流体）の中のタンパク質の組成や発現を完全に明らかにすることはできない。しかしこの制約があるにせよ、特にタンパク質の存在または不在、またはその発現レベルを疾患状態と相関させることが可能な場合には、広範なタンパク質に関する重要な情報を得るのに既存の方法（または既存のいくつかの技術の組み合わせ）を利用できないわけではない。タンパク質バイオマーカーを探す１つの戦略として、末梢体液の中で直接探すことが挙げられるが、そこではそのマーカーの濃度が比較的小さいことが予想され、しかも現在の検出法では同定することが難しい。
【００１４】
タンパク質バイオマーカーの発見段階において越えるべき最大の障害は、一連の処理の最後に使用する分析ツール（例えば質量分析（ＭＳ）またはゲル電気泳動）に、有限量のタンパク質（またはそのタンパク質に由来するペプチド）の検出限界が明確に存在することである。ＭＳまたはゲル電気泳動によるペプチドの同定を十分に感度限界まで行なうには、潜在的なマーカー候補についてタンパク質混合物を富化する必要がある。そのためには、複雑な末梢体液（例えば血清や血漿）の中に存在する豊富なタンパク質群の濃度をできるだけ小さくせねばならない。
【００１５】
血清と血漿の両方とも高レベルのタンパク質群を含んでいるため、より少量のタンパク質群が検出しにくくなる可能性がある。明確なｐＩを持つサンプルのさらに別の分析物から分離すべき豊富なタンパク質は、例えばアルブミン、トランスフェリン、α−マクログロブリン、アンチトリプシン、ハプトグロブリンである。生物起源のサンプル中に豊富に存在する他のタンパク質として、アクチン、カゼイン、ミオシンなどがある。
【００１６】
血清中には、例えば最も豊富な７種類のタンパク質として、アルブミン、免疫グロブリン（ＩｇＧとＩｇＡの両方）、トランスフェリン、α−マクログロブリン、アンチトリプシン、ハプトグロブリンがある。これら７種類のタンパク質は、合計が全血清タンパク質の約９７％になる。１ｍｌの血清に１００μｇ未満の濃度で存在する最も豊富な３０種類のタンパク質を加算し、全タンパク質の平均含有量が約８０ｍｇ／ｍｌ（血清）であると仮定すると、これらの“非標的”タンパク質または分析物は、血清中の全タンパク質の約９９％に達し、全タンパク質のほんの１％が新規な血清マーカーを同定するための主要な標的として残る。興味の対象であるマーカーがこれらの主要なタンパク質のうちの１つと結合したり錯体を形成したりしないと仮定すると、ＭＳなどの分析を簡単にするには、プロセスの早い段階で非標的タンパク質を除去する必要がある。
【００１７】
アルブミン単独で、血清サンプルに存在する全タンパク質の６０％になる場合がある。アルブミンの濃度が大きいと、低濃度の血清タンパク質の検出が難しくなる。サンプル・ウエルに添加されるタンパク質の量を増やして少量のタンパク質群の検出が可能になるようにすると、血清サンプル中のアルブミンがポリアクリルアミド・ゲル中のレーンを歪ませる。６６ｋＤａのタンパク質であるアルブミンは、少量のタンパク質を不明りょうにする重い（分子量の大きい）バンドとして動くため、５０〜７０ｋＤａのあたりに移動する他のタンパク質も隠してしまう傾向がある。
【００１８】
一例として典型的な濃度が約５０ｍｇ／ｍｌのアルブミンを考え、何らかの精製法によって血清から９９．９％のアルブミンを除去できるとすると、アルブミンの残留（汚染）濃度はそれでも５０μｇ／ｍｌになろう。すなわち約１ｎｇ／ｍｌが存在しているよく知られた腫瘍マーカー（例えば前立腺特異的抗原）の５０，０００倍である。
【００１９】
過去数年の間にヒト血清のプロテオミクス分析が非常に注目されるようになっている。いくつかの研究分野において、ヒト血清のプロテオミクス分析は、興味の対象であるタンパク質または分析物の範囲が広いために大きな挑戦課題である。血清中では、興味の対象であるタンパク質とペプチドの量は、全タンパク質の質量の２〜６０％存在する“豊富”と見なされる量から、１０-12％以下で存在する量までの範囲にわたる。分析の標的となる分子のこの範囲は、多くの場合、効率的かつ有効なプロテオミクス分析で利用できる技術の範囲外である。
【００２０】
タンパク質の研究、より詳細には例えばヒト血漿プロテオームの研究に最近多くの資金が投入されている。要するに、ヒト血漿タンパク質の複雑さは以下の通りである。すなわち、約３００種類の血漿タンパク質（ほぼ３０，０００種類のアイソフォームがある）と、約１０，０００種類の免疫グロブリンのアイソフォームと、約４０，０００個の遺伝子（組織由来のタンパク質からの５００，０００種類のアイソフォームがある）と、５０００を越えるペプチドが存在している。興味の対象となる他の分析物として、ペプチド・ホルモンとタンパク質分解産物がある。ヒトの血液の６〜８％はタンパク質であり、そのうちの豊富なタンパク質群が全タンパク質組成の６０％を越える。
【００２１】
これらサンプルの複雑さに対処する１つの方法は、分析前に、サンプル（例えば血漿サンプル）の分離と分画化を改善できる電気泳動枯渇技術を適用することである。ある種のタンパク質を除去するこれまでの方法は、アルブミンを除去するのに染料（例えばセファロース・ブルー（登録商標））に基づく一般的なアフィニティ吸着剤、または抗体に付着したアフィニティ吸着剤を使用することであった。アルブミンを除去するために例えば固定化されたモノクローナル抗体を含む特別なカラムが従来技術で開発されている（例えばキアジェン社（ドイツ国）から“Ｑプロテオーム・アルブミン枯渇キット”という名称で入手できるキット）。
【００２２】
これらの技術のうちいくつかはアルブミンや豊富に存在する他のタンパク質を除去するのに成功するであろうが、広く利用できるこれらの方法、その中でも特に抗体に基づくアフィニティクロマトグラフィ法は、比較的高コストであることと、サンプルの損失の可能性があることが利用の障害となってきた。さらに、例えばヒト血漿からタンパク質群を枯渇させるのに開発された従来技術で利用できるキットとカラムは、他の哺乳動物の血漿タンパク質ではうまくいかない。なぜならそのキットとカラムは、一般に単一のタンパク質種を枯渇させるようにされているからである。
【００２３】
上記のことを考慮すると、例えば臨床環境において多数の患者から望むバイオマーカーを検出するための特に高スループットの用途を目的として、例えば豊富なタンパク質（例えばアルブミン）を枯渇させる高効率かつ経済的な他の方法が相変わらず必要とされている。
【００２４】
フリー・フロー電気泳動は、従来技術の他の枯渇法で遭遇する欠点の多くを回避することが主として可能なよく知られた技術である。しかし発明者が知る限り、この技術を利用してうまくいき、しかも再現性のある選択的枯渇法はこれまでに開示されていない。それは、ＦＦＥ装置の分離チェンバー内で必須の条件に関する情報が不足しているだけでなく、サンプルから分析物を電気泳動によって分離して／枯渇させている間を通じて十分に安定な条件を維持することが難しいためである。
【００２５】
この文脈では、Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎらのアメリカ合衆国特許出願公開２００４／０５０６９７と２００４／０５０６９８に、フリー・フロー電気泳動法を分析物の選択的枯渇にも利用できることが簡単に言及されているが、これらの出願には、豊富な所定のタンパク質（例えばアルブミン）をうまくしかも再現性があるように枯渇させる方法も記載されていないし、適切な分離用緩衝系の選択、使用するｐＨの条件またはプロファイル、ＦＦＥ装置内で安定な条件を維持するのに必要な安定化媒体に関するいかなるガイドも与えられていないことに注意されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって本発明の１つの目的は、分析物を枯渇させて従来技術の欠点を回避するのに適した方法、キット、装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明の発明者は、ここに提示する方法、キット、装置を用いて豊富な分析物群を選択的に枯渇させることで、従来から利用できる方法と比べて多数の利点を提供できることを見いだした。本発明によって提供される他の利点および改善点（例えば、ＩＥＦモードでフリー・フロー電気泳動の動作をさせているときに遭遇する典型的ないくつかの問題点の改善）は、以下に示す本発明の説明において詳細に明らかにする。
【００２８】
したがって本発明の第１の特徴により、分析物組成物から分離する１つの分析物をフリー・フロー電気泳動によって分離する方法であって、
必要に応じ、分析物組成物から分離する１つの分析物のｐＩを同定するステップと；
フリー・フロー電気泳動（ＦＦＥ）チェンバーの中でアノードとカソードの間に、ｐＨの平均が分離する分析物の等電点（ｐＩ）に実質的に対応していて、上限ｐＨと下限ｐＨによって限定されたｐＨ範囲を持つｐＨ分離平坦部と、アノードとそのｐＨ分離平坦部の間にあって、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能と、カソードとそのｐＨ分離平坦部の間にあって、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能とを含む、ｐＨ機能プロファイルを形成するステップと；
分析物混合物から分離する１つの分析物を含むサンプルを、ＦＦＥチェンバー内のｐＨ分離平坦部、そのｐＨ分離平坦部のアノード側の領域、またはそのｐＨ分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと；
ＦＦＥチェンバーから分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を１つまたは複数の画分として回収するステップを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明のＦＦＥ枯渇／分離法によって実現される優れた結果に照らすと、回収される分析物のすべてまたは一部は、その後の下流での調製および／または分析の用途で使用することができる。
【００３０】
したがって本発明の別の特徴は、分画化されたサンプルの分析物を分析するため、その分析の前にフリー・フロー電気泳動を実施する操作を含む方法であって、そのフリー・フロー電気泳動が、
請求項１または２のいずれかの方法に従ってフリー・フロー電気泳動により複数の分析物を含むサンプルの分離を行なうことにより、そのサンプルから、少なくとも１つの非枯渇部分と、ｐＨ分離平坦部上でその非枯渇部分から分離される分析物を含む部分とを生成させるステップと；
その後、ＦＦＥチェンバーから流出した１つ以上の画分を分析するステップを含む方法に関する。
【００３１】
本発明のさらに別の特徴では、明確なｐＩを持つ分析物を、単一のＦＦＥ装置に導入した２つまたはそれ以上のサンプルから同時に分離／枯渇させることができる。フリー・フロー電気泳動により２つまたはそれ以上のサンプルからの分析物組成物から分離する、１つまたはそれ以上の分析物を同時に分離するためのこのような方法は、
必要に応じ、分析物組成物から分離する１つの分析物のｐＩを同定するステップと；
フリー・フロー電気泳動（ＦＦＥ）チェンバーの中で単一のアノードと単一のカソードの間に、Ｎ個の分離領域と、それぞれの分離領域を隣接した各分離領域から隔てる（Ｎ−１）個の電極間安定化媒体とを含むｐＨ機能プロファイルを形成するステップと；
ここで、各分離領域は、ｐＨが分離する各分析物の等電点（ｐＩ）に実質的に対応していて、ｐＨの範囲が上限ｐＨと下限ｐＨによって限定されているｐＨ分離平坦部と、そのｐＨ分離平坦部のアノード側に隣接していて、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能と、そのｐＨ分離平坦部のカソード側に隣接していて、その第１のｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能とを備えており；
分析物組成物から分離する１つの分析物を含む各サンプルを個別に、ＦＦＥチェンバーの１つの分離領域（各分離領域には、分析物組成物から分離するその分析物をその分離領域において分離するのに適したｐＨ分離平坦部が含まれている）のｐＨ分離平坦部、そのｐＨ分離平坦部のアノード側の領域、またはそのｐＨ分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと；
ＦＦＥチェンバーから分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を１つまたは複数の画分として回収するステップを含んでいる。
【００３２】
Ｎは２以上の整数であり、本質的にＦＦＥ装置の設計（特に異なる媒体入口の数）によってのみ制限される。したがって並列な分離の典型的な数は２〜５だが、少なくとも原則としてそれよりも多くし、いくつかの実施態様では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の並列な分離さえＦＦＥ装置の単一のアノードと単一のカソードの間で同時に実施できるようにすることが可能である。
【００３３】
本発明のさらに別の特徴では、本発明の方法を実施するため、分離媒体と、必要に応じて他の媒体（例えばフォーカス媒体、および／または電極間安定化媒体、および／または安定化媒体）を含むキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】本発明の一実施態様、より詳細には、豊富な１種類のタンパク質の枯渇と分画化の実施態様（ＤＦＥプロトコル）によるＦＦＥ分離チェンバーの概略図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示した本発明の一実施態様の導電率プロファイルとｐＨ勾配プロファイルである。
【図２】図１Ａと図１Ｂに従うプロトコルの実験結果のフェログラムである。ｐＨ分離平坦部（この明細書ではアルブミン・プールと呼ぶ）には、そのｐＨ分離平坦部のｐＨと実質的に同じｐＩを持つ分析物が含まれている。酸性プールと中性／アルカリ性プールは、ｐＨ分離平坦部と、それに隣接するｐＨ機能との界面に位置する。
【図３】図１Ａ、図１Ｂ、図２に従うプロトコルの実験結果を示している。この図は２つの１Ｄ−ゲルを示しており、アルブミン（約６６ｋＤａ）と、アノードｐＨ機能とカソードｐＨ機能の界面で回収されたタンパク質のうちでアルブミンと実質的に同じｐＩを持つタンパク質とが分離されたことが記録されている。レーンＳは、電気泳動による分離ステップ前のサンプルの組成を示している。
【図４Ａ】本発明の一実施態様、より詳細には、豊富な１種類のタンパク質の枯渇および分画化の実施態様（ＤＳＥプロトコル）によるＦＦＥ分離チェンバーの概略図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示した本発明の一実施態様の導電率プロファイルとｐＨ勾配プロファイルである。
【図５】図４Ａと図４Ｂに従うＤＳＥプロトコルの実験結果のフェログラムであり、溶離した画分のｐＨ値とｐＩマーカーの分布を示している。
【図６】図４Ａと図４Ｂの一実施態様によるＤＳＥプロトコルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示している。ここではサンプルは、ヒト血漿由来のものであった。ｐＨ分離平坦部に隣接するｐＨ勾配に累積するタンパク質からアルブミンが枯渇したことが示されている。
【図７】電極間安定化媒体が２つの分離領域の間に配置された並列動作モードを利用した本発明の一実施態様の導電率プロファイルとｐＨ勾配プロファイルを示している。
【図８】ＦＦＥチェンバー内で異なる２つのサンプルを同時に分離するための改変並列ＤＦＥプロトコルに関する実験結果のフェログラムであり、溶離した画分のｐＨ値と、２つの分離領域内のｐＩマーカーの分布を示している。
【図９】図８に従う改変並列ＤＦＥプロトコルの第１分離領域の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果であって、サンプルはヒト血漿由来のものであり、第１分離領域の分離を示している。
【図１０】図８に従う改変並列ＤＦＥプロトコルの第２分離領域の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果であって、サンプルはヒト血漿由来のものであり、第２分離領域の分離を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、フリー・フロー電気泳動による分離を実施するための方法と装置に関するものであり、その中には、いくつかの分析物を効率的、選択的、再現可能に分離できる媒体と分離条件が含まれる。この明細書に提示する方法と装置により、例えばペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド複合体などを、以下に限られないが、特に天然条件下で分離することができる。あるいはこの方法は、変性条件下で実施することもできる。本発明は、例えばバイオマーカーの発見、特に、少量で濃度が小さいために検出することがすでに難しく、しかも豊富な非マーカー・タンパク質（例えばアルブミン）が存在しているために検出がさらに妨げられるタンパク質または分析物の発見を改善するのに利用できる。例えば多くの細胞抽出液にアルブミンが存在しているため、濃度が小さく量が少ないタンパク質の検出が難しかったり不可能だったりすることがしばしばある。
【００３６】
そのような用途では、本発明を利用して豊富なタンパク質群の選択的な分離／単離ができるため、例えば固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル、１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析するときに豊富なタンパク質によってこれまで隠されてきた非枯渇タンパク質を天然の状態で分析することが可能になる。
【００３７】
本発明の特徴による方法、装置、組成物／キットは、従来技術で知られている他の方法と比べ、以下の主要な利点のうちの少なくとも１つ以上を含んでいる。
（ｉ）興味の対象である化合物からなるサンプルが溶液により多く直接的に回収されること；
（ｉｉ）分離の分解能がより高いこと；
（ｉｉｉ）検出されるタンパク質の幅がより広いこと；
（ｉｖ）帯電した分子が溶液中を移動するのであり、より密なゲルなどの材料の中を通過するのではないため、高分解能の分離がより高速になされること；
（ｖ）少量のタンパク質が富化されること；
（ｖｉ）サンプルの損失がないか、限られていること；
（ｖｉｉ）分離装置を繰り返し使用できること；
（ｖｉｉｉ）豊富なタンパク質群への分析物の非特異的結合が少なくなること；
（ｉｘ）異なる多彩な分析物に対する柔軟性と適用性がより優れていること；
（ｘ）下流の分析技術（例えば以下に限られないが、ゲル電気泳動（１Ｄ−ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥなど）、質量分析（ＭＳ）（ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、ＳＥＬＤＩなど）、ＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−ＭＳ（／ＭＳ）、化学発光、ＨＰＬＣ、エドマン・シークエンシング、ＮＭＲ分光、Ｘ線回折、核酸シークエンシング、エレクトロブロッティング、アミノ酸シークエンシング、フロー・サイトメトリー、円二色性またはこれらの組み合わせ）とそのままで相性がよいこと。
【００３８】
本発明の実施態様により、サンプルに含まれる少量のタンパク質群または分析物群によりうまくアクセスできるようにするために、ある１つのタンパク質のすべてまたは一部を除去する方法、装置、組成物が提供される。本発明のいくつかの実施態様では、少量のタンパク質をよりうまく測定または同定するために、アルブミンが、分析から枯渇または除外されるタンパク質として選択される。
【００３９】
豊富なタンパク質群を除去すると、または枯渇させると、他のタンパク質群の相対濃度が上昇する。これは、ゲル様画像として明らかにすることや、表の形式にした各サンプルのエレクトロフェログラムとして明らかにすることができる。
【００４０】
本発明の実施態様のＦＦＥ法と装置によって枯渇させる分析物または非枯渇分析物のいずれかとして分離できる典型的な分析物は、例えば無機分子と有機分子であり、それは、生体粒子、バイオポリマー、生体分子であることが好ましい。その中には、バイオマーカーとなるタンパク質、タンパク質凝集体、ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ、膜、膜の断片、脂質、糖類、多糖、ホルモン、リポソーム、細胞、細胞小器官、ウイルス、ウイルス粒子、抗体、クロマチンなどが含まれる。本発明のいくつかの実施態様に従って分離できる無機分子または有機分子は、表面電荷が変化したポリマーと粒子であり、例えばメラミン樹脂、ラテックス塗料粒子、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、デキストラン、セルロース誘導体、ポリ酸、違法薬物、爆薬、毒素、医薬、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染性物質などがある。
【００４１】
この明細書では、“バイオマーカー”は、疾患状態のマーカー、または生体内で起こる正常なプロセスや病気プロセス（例えば薬の代謝）のマーカーとなる天然の化合物または合成化合物を意味する。
【００４２】
この明細書では、“タンパク質”は、あらゆるタンパク質（例えば以下に限られないが、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、増殖因子などで、例えばアミノ酸が約２０個以上のもの）を意味する。タンパク質には、構成するアミノ酸が約２０個より多いもの、またはアミノ酸残基が約５０個より多いもの、またはアミノ酸残基が約１００個より多いものが含まれる。
【００４３】
本出願の文脈では、“分離する”と“分離”という用語は、電場中での（例えば異なるｐＩに基づいて起こる）異なる挙動に基づいて２種類以上の分析物からなる混合物を空間的に分離することを意味する。したがって分離には、以下に限られないが、サンプルに含まれるある画分または分析物の分画化や、特異的かつ選択的な富化などが含まれ、それは、枯渇および／または濃縮および／または分離であることが好ましい。したがってこの出願で“分離する”と“分離”という用語が現われるときにはいつでも、上記意味のうち少なくとも１つが含まれるものとする。
【００４４】
“分離する”と“分離”という用語に関する上記の定義とは関係なく、この明細書に記載したいくつかのＦＦＥ分離プロトコルは特に分画化（ＤＦＥプロトコル）を意味し、別のＦＦＥ分離プロトコルは分離（ＤＳＥプロトコル）を意味する。この文脈では、分離は、サンプル中の分析物のさらなる空間的分離の実現を意味するのに対し、分画化という用語は、（枯渇させない）分析物のプールをＦＦＥ分離ステップから回収できることを示すことがわかるであろう。ＦＦＥ分離は、いくつかの画分が順番に回収されるような調製方法で主に実施すること、または単に分析を行なってある画分に含まれる興味の対象である分析物またはその存在を適切な手段で検出するだけで、例えば後で使用するために回収はしないことが可能である。
【００４５】
複数の分析物を含むサンプルから少なくとも１つの分析物を枯渇させることは、本発明の好ましい実施態様の１つである。ＦＦＥに適した装置におけるＦＦＥ分離ステップにより、低濃度のタンパク質／分析物が蓄積するのとは別の場所により豊富なタンパク質／分析物を蓄積させるまたは分離するように、濃度が低いタンパク質／分析物を化学的緩衝系の中に蓄積させることができる。“枯渇”という用語は、決まったｐＩを持つ少なくとも１種類の分析物を、本発明の実施態様によるＦＦＥ分離ステップにより、他の“非枯渇”分析物から分離できるという事実に関係する。言い換えるならば、分離される１つまたは複数の分析物（枯渇させる分析物）は、その分析物のｐＩに対応するｐＨを持つｐＨ分離平坦部に蓄積するのに対し、非枯渇分析物は、ｐＨ分離機能とそれに隣接するｐＨ機能との界面に蓄積するか、隣接するｐＨ機能のｐＨ勾配に蓄積する。したがって枯渇させる分析物（一般に豊富なタンパク質）は、例えば低濃度のタンパク質／分析物の測定または分析をもはや邪魔することができず、それらの低濃度のタンパク質／分析物の検出と同定が容易になる。
【００４６】
“非枯渇（non-depleted）”という用語は、分析物またはサンプルのうちで、元の分析物／サンプルから枯渇した分析物をもはや含んでいないあらゆる部分を意味する。言い換えるならば、“非枯渇”サンプルまたはサンプルの一部は、ＦＦＥ装置の中で、ｐＨ機能プロファイル内の、分離する分析物（または複数の分析物）が蓄積するのとは異なるある位置に蓄積する。したがって、分析物混合物を含む非枯渇分析物、またはサンプル中の非枯渇部分とは、その非枯渇分析物またはサンプル中の非枯渇部分が、分析物混合物／サンプル（例えば豊富なタンパク質／分析物）から分離する所定の分析物から実質的に分離されており、したがってその所定の分析物から枯渇していることを意味するものと理解すべきである。
【００４７】
“分離する分析物”という表現は、サンプルに含まれる別の分析物からＦＦＥによって空間的に分けられる１種類または複数の分析物を意味する。本発明によるｐＨ分離平坦部の平均ｐＨは、分離する分析物のｐＩに実質的に対応する。このような分析物はｐＨ分離平坦部に蓄積するのに対し、ｐＩがｐＨ分離平坦部のｐＨ範囲外にある分析物は、ｐＨ分離平坦部と、隣接したｐＨ機能および／または導電率の段差を含むｐＨ機能との間の境界線に蓄積することになる。
【００４８】
あるいはサンプルの非枯渇部分は、電気泳動によってｐＨ分離平坦部の外に追いやられ、隣接したｐＨ勾配の中で空間的にさらに分けられる。ｐＩがｐＨ分離平坦部のｐＨ範囲外にある分析物は、ｐＨ機能プロファイル内で分離する分析物（例えばより豊富なタンパク質／分析物）が蓄積する場所以外の場所に蓄積するという事実のため、サンプルの“非枯渇”部分を主に表わすと考えられる。したがってフリー・フロー電気泳動の後、１つ以上の画分においてサンプルのそれらの部分が富化される。
【００４９】
この明細書では、“サンプル”という用語に、本発明の実施態様によるＦＦＥ分離媒体に十分に溶ける少なくとも２種類の化合物が含まれる。本発明の方法と装置で用いるサンプルは、タンパク質混合物、他の反応混合物、天然の供給源（例えば生物流体）に由来するものが可能だが、これだけに限られるわけではない。
【００５０】
本発明の文脈における“分画されたサンプル”は、含まれるさまざまな分析物がＦＦＥステップの間に分離されるため、そのＦＦＥ分離ステップの後にいくつかの画分に分割できるサンプルを意味する。当業者であれば、個々の画分を回収する方法がわかるであろう。その画分は、ＦＦＥに適した装置の分離チェンバーから複数の回収出口を通じて出ていき、一般に個々のチューブを通って適切な任意のタイプの個々の回収容器（例えば９６ウエルのプレート、ときにはサイズが異なるプレート（例えば１４４個、２８８個、５７６個、またはそれ以上の数のウエル）の場合もある）へと導かれる。
【００５１】
この明細書では、“生物流体”には、以下に限られないが、血液、血漿、血清、痰、尿、涙、唾液、痰、脳脊髄液、洗浄液、白血球フェレーシスサンプル、乳汁、尿、導管液、汗、リンパ液、精液、臍帯液、羊膜液や、細胞を培養することによって得られる流体（例えば発酵ブロス、細胞培地）などが含まれる。
【００５２】
この明細書では、“タンパク質混合物”のサンプルは、一般に、複数のタンパク質の複雑なあらゆる混合物である。タンパク質には、修飾された形態、修飾されていない形態、処理された形態、処理されていない形態が含まれ、さまざまな供給源から得ることができる。供給源としては、以下に限定されないが、細胞サンプル（例えばライセート、懸濁液、培養プレート上の接着細胞の集合、剥離物、組織の断片または切片、腫瘍、生検サンプル、記録保管用の細胞または組織のサンプル、レーザーで捕獲した解剖細胞など）、生物（例えば細菌や酵母などの微生物）、細胞以下のサイズの断片（例えば核やミトコンドリアなどの細胞小器官、リボソーム、ゴルジ体などの大きなタンパク質複合体などを含む）、卵子、精子、胚、生物流体、ウイルスなどがある。
【００５３】
この明細書では、“反応混合物”という用語は、少なくとも２種類の化合物のあらゆる混合物を意味する。そのうちの少なくとも１つの化合物は化学反応の生成物であり、反応混合物の中に存在しているか存在していた化合物に由来する。
【００５４】
この明細書では、“複合タンパク質混合物”のサンプルには、異なる約２種類、１０種類、２０種類、１００種類、５００種類、１，０００種類、５，０００種類、１０，０００種類、２０，０００種類、３０，０００種類、１００，０００種類、それどころかそれ以上の種類のタンパク質またはペプチドを含むことができる。このようなサンプルは、天然の生物源（例えば細胞、組織、体液、土壌、水のサンプルなど）に由来してもよく、または（例えば天然のタンパク質供給源および／または合成か組み換えによるタンパク質供給源のサンプルを１種類以上組み合わせることによって）人工的に生成させてもよい。
【００５５】
この明細書では、“ペプチド”という用語は、少なくとも１つのペプチド結合を含むあらゆる物質を意味し、Ｄアミノ酸および／またはＬアミノ酸を含むことができる。ペプチドは、約２〜約１５０個のアミノ酸を含むことができる。この数は約２〜約１００個であることが好ましく、約２〜約５０個であることがより好ましく、約２〜約２０個であることが最も好ましい。
【００５６】
この明細書では、“ペプチド混合物”は、一般に、タンパク質を含むサンプルがタンパク質切断した結果として得られた複数のペプチドの複雑な混合物である。
【００５７】
この明細書では、“緩衝系”は、少量の酸または塩基を添加したとき、または希釈したときに、溶液をほぼ一定のｐＨ値に維持することができる、一、二、三プロトン性／塩基性化合物の混合物を意味する。
【００５８】
この明細書では、“緩衝化合物”は、単独で、または第２の化合物すなわち別の化合物と組み合わさって緩衝系を形成する化合物を意味する。
【００５９】
この明細書では、“ｐＨ機能プロファイル”という用語は、ＦＦＥ装置のアノードとカソードに挟まれた全分離空間にわたるｐＨの分布に関係する。本発明のｐＨ機能プロファイルは、“分離領域”を形成する複数の分離媒体および／またはフォーカス媒体によって形成することができる。ｐＨ機能プロファイルは安定化媒体によっても形成されることが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。本発明のいくつかの実施態様では、フォーカス媒体が安定化媒体として機能することができる。本発明の別の好ましい実施態様では、ｐＨ機能プロファイルは２つ以上の分離領域を含むことができる。
【００６０】
この明細書では、“分離領域”は、ｐＨ分離平坦部を含むとともに、そのｐＨ分離平坦部のアノード側のｐＨ機能またはｐＨ勾配と、そのｐＨ分離平坦部のカソード側のｐＨ機能またはｐＨ勾配とをさらに含むと理解すべきである。いくつかの実施態様では、分離領域は、ｐＨ分離平坦部と、そのｐＨ分離平坦部の一方の側のｐＨ機能またはｐＨ勾配とを含んでいる。ｐＨ分離平坦部の他方の側には、フォーカス媒体によって、またはフォーカス媒体として機能する安定化媒体によって、フォーカス領域が隣接して形成される。言い換えるならば、各分離平坦部は、アノード側とカソード側のそれぞれにおいて、ｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはフォーカス領域が隣接している。ｐＨ機能、ｐＨ勾配、フォーカス領域はさらに、フォーカス媒体および／または安定化媒体に隣接していてもよい。
【００６１】
それに加え、ｐＨ機能は、フォーカス媒体を含むこと、またはフォーカス媒体で構成することができる。ｐＨ分離平坦部、ｐＨ機能、ｐＨ勾配のそれぞれは分離媒体で形成することができ、ｐＨ機能の場合には、分離媒体、フォーカス媒体、またはこれらの組み合わせで形成することができる。ｐＨ分離平坦部、ｐＨ機能、ｐＨ勾配は、それぞれ、ＦＦＥ装置への１つの入口に導入される分離媒体によって形成すること、またはＦＦＥに適した装置の隣り合ったいくつかの入口に導入される互いに同じか互いに異なる複数の分離媒体によって形成することができる。
【００６２】
従来の一般的な使用法によると、“ｐＨ勾配”という用語は、ｐＨに突然変化する境界が観察されないことを意味する。この定義では、ＩＥＦ装置でのｐＨ勾配のグラフは、興味の対象となる部分に鋭い跳びがない比較的滑らかな曲線として示されることになろう。ｐＨ勾配はＦＦＥ装置の１つの入口に導入される単一の媒体によって形成できるが、その装置に複数の入口を通じて導入される複数の媒体によって形成することもできる。なおその複数の入口に導入される媒体は、同じでも異なっていてもよい。ｐＨ勾配は、一般に、一方の側がｐＨ分離平坦部に隣接し、他方の側がフォーカス媒体または安定化媒体に隣接している。
【００６３】
一方で、この明細書で用いる“ｐＨ機能”という用語は、広い意味を持つ。その中には“ｐＨ勾配”が含まれるだけでなく、ｐＨの跳び、すなわち２つのｐＨ領域の境界にｐＨの顕著な変化を生じさせうる、ある程度突然に変化するｐＨ段差も含まれる。２つのｐＨ領域の境界における変化（例えば２つのｐＨ平坦部間のｐＨの段差）は、０．５ｐＨ単位よりも大きいことが好ましい。この変化は１ｐＨ単位よりも大きいことがより好ましく、２ｐＨ単位よりも大きいことがさらに好ましい。この明細書の説明とガイドラインを利用して分離用緩衝物質を適切に選択することにより、ＩＥＦ装置において、境界で鋭い変化を持つｐＨ機能を作り出すことができる。
【００６４】
本発明の実施態様と関連して用いるｐＨ機能は、ｐＨ勾配、ｐＨ変化、複数のｐＨ勾配の組み合わせ、複数のｐＨ変化の組み合わせ、またはｐＨ勾配とｐＨ変化の組み合わせを含むことができる。ｐＨ機能は、ＦＦＥに適した装置の１つの入口に導入される１つの媒体によって形成できるが、複数の入口に挿入される複数の媒体によって形成することもできる。なおその複数の入口に導入される媒体は、同じでも異なっていてもよい。ｐＨ機能は、それぞれの側においてｐＨ枯渇平坦部に隣接し、さらに、アノードとカソードに向かう側がそれぞれフォーカス媒体および／または安定化媒体に隣接している。
【００６５】
さらに、ｐＨ機能は、場合によってはｐＨの段差に合わせて、導電率の段差を生成させるフォーカス媒体を含むこと、またはフォーカス媒体で構成することができる。ｐＨ機能は、導電率の鋭い段差を含むことができる。これは、ｐＨ機能がフォーカス媒体としても機能できることを意味する。
【００６６】
この明細書では、“ｐＨ分離平坦部”は、ＦＦＥに適した装置の１つの入口に導入される１つの媒体によって主として形成されるが、当業者であれば、ＦＦＥ装置の２つ以上の入口を利用してこの平坦部を作り出せることがわかるであろう。図１Ｂに示した分離平坦部のｐＨの範囲は理想的には範囲がゼロ（すなわち実質的に平坦で、枯渇させる分析物のｐＩに実質的に対応する一定ｐＨを持つ）だが、典型的な範囲は、その領域に例えば周囲の分離／フォーカス媒体に依存したｐＨの上限と下限が含まれる（すなわち実質的に極めて平坦なｐＨ勾配を形成する）ようなものである。
【００６７】
分離する分析物は、ｐＨ分離平坦部の平均ｐＨの位置に正味の電荷がないｐＩを持つことになるため、電場内で移動が起こらないであろう。一般に、ある分析物のｐＩは、当業者に知られている手段によって知ること、または同定することができねばならない。所定の分析物のｐＩを決定する可能な１つの方法として、もちろん、適切なＦＦ−ＩＥＦ技術による決定が挙げられる。
【００６８】
必ずというわけではないが、（周囲の媒体に応じ）ｐＨ分離平坦部のカソード側ではより大きなｐＨ値へのわずかなシフトが、アノード側ではより小さなｐＨ値へのシフトが通常観察される。したがってｐＨ分離平坦部のアノード側から回収される画分は酸性プールと呼ばれることがしばしばあり、ｐＨ分離平坦部のカソード側から回収される画分はアルカリ性プールと呼ばれることがしばしばある。
【００６９】
一般に、ｐＨ分離平坦部には、最大で０．４ｐＨ単位以下の範囲のｐＨが含まれる。この範囲は、０．３ｐＨ単位以下であることが好ましく、０．１単位以下であることがより好ましい。分析物がタンパク質である実施態様では、分離はタンパク質が天然の状態で行われることが好ましい。例えば天然状態のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の場合、サンプル中にあってＨＳＡのｐＩ（４．８〜４．９である）とは異なるｐＩを持つ他の分析物からタンパク質を分離するためには、ｐＨの範囲は４．７〜５．０であることが望ましく、４．８〜４．９であることがさらに望ましい。
【００７０】
別の好ましい実施態様では、タンパク質含有サンプルは、変性条件下で（例えば尿素または従来技術で知られている適切な洗浄剤の添加によって）分離することができる。当業者であれば、所定の分析物（例えばタンパク質）のｐＩは、その分析物が天然の状態のときのｐＩとは異なっていてもよいことがわかるであろう。したがって例えばヒト血清アルブミンに関するｐＨ分離平坦部の好ましいｐＨの範囲は、上に説明した天然の状態でのＦＦＥ分離とは異なることになろう。
【００７１】
例えば変性条件下では、ＨＳＡのｐＩは通常はｐＨ６．３〜６．４である。したがってｐＨの範囲が約６．２〜約６．５のｐＨ分離平坦部を形成することが望ましいが、ｐＨの範囲は約６．３〜約６．４であることがより一層望ましい。変性条件下でのＨＳＡの還元とアルキル化により、一般にこのタンパク質に関するｐＩの観測値は約６．０になる。したがって後で修飾されたＨＳＡを分離するためのｐＨ分離平坦部のｐＨ範囲は、約５．９〜約６．２の間で選択することが好ましかろう。この範囲は約５．９〜約６．１であることがより好ましく、約５．９〜約６．０であることが最も好ましい。他の豊富なタンパク質に関してｐＨの範囲をそのタンパク質のｐＩに同様にして合わせねばならないことは容易にわかる。
【００７２】
“分離媒体”という用語は、ｐＨ分離平坦部またはｐＨ機能に必要なｐＨ平坦部の形成に適した媒体、またはｐＨ勾配の形成に適した媒体を意味する。ｐＨ勾配を形成する分離媒体の導電率は、隣接するｐＨ分離平坦部を形成する分離媒体の導電率の２倍未満でなければならず、ｐＨ分離平坦部の導電率と同様であることが好ましい。最も好ましいのは、導電率に実質的に差がないことである。ｐＨ分離平坦部に隣接するｐＨ機能を形成する分離媒体の導電率は、そのｐＨ分離平坦部を形成する分離媒体の導電率と同じ、またはその２倍以上、または３倍以上、または５倍以上でなければならない。本発明の実施態様による分離媒体は、二元緩衝系（Ａ／Ｂ媒体）、市販の両性電解質（例えばセルバ社（ドイツ国）のＳｅｒｖａｌｙｔ（登録商標））、相補的マルチ−ペア緩衝系（例えばＢＤ社（ドイツ国）のＢＤ  ＦＦＥ分離用緩衝液ＩとＩＩ）、揮発性緩衝系からなる群から選択できるが、これだけに限定されるわけではない。緩衝系とその成分について以下にさらに詳しく説明する。
【００７３】
適切なさまざまな緩衝系をこの明細書で説明してあるが、ＭＥＳ／グリシルグリシンという緩衝系が、例えばヒト血清アルブミンを天然の状態で分離するための好ましい緩衝系である。分離する分析物（例えばアルブミン）のｐＩは、通常はそのタンパク質が天然の形態で存在するか変性した形態で存在するかによって異なるため、他の緩衝系（例えばＨＥＰＥＳ／ＥＡＣＡ（ε−アミノカプロン酸））を使用するとよい。例えばＨＥＰＥＳ／ＥＡＣＡは、変性条件下でアルブミンを分離するための好ましい緩衝系である。他の可能な緩衝系として、以下に限られないが、ＭＥＳ／ピペリジン−３−カルボン酸、ＭＯＰＳＯ／ピペリジン−４−カルボン酸などがある。
【００７４】
実施する電気泳動法のために選択する分離媒体の性質は、例えば、いくつかのタンパク質を選択的に分離し、そのことによってあるタンパク質種の効果的な枯渇を可能にする一方で、いくつかの場合には他のタンパク質種を富化するようなものにすることができる。異なるさまざまな緩衝系（および添加剤）を使用できるため、興味の対象である分析物の安定性および／または完全性を損なうことなく、異なるいろいろな分析物を本発明の方法で分離できるという利点がさらに提供される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施態様では、分離は、並列モードで実施することができる。その場合、電極間安定化媒体によって分離領域を物理的に分離する必要がある。この明細書では、“電極間安定化媒体”という用語は、カソード電極間安定化媒体とアノード電極間安定化媒体という２種類の必須成分からなる媒体を意味する。アノードおよびカソードという用語の使用は、それぞれ、分離領域とアノードの間、および分離領域とカソードの間に存在することに対応して名づけた電極間安定化媒体の相対位置を意味することが容易にわかる。例えば（ＦＦＥ装置のアノードからカソードに向かっての）典型的な順序は、安定化媒体、第１のｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体、第１のｐＨ分離平坦部を形成する媒体、第２のｐＨ機能を形成する媒体、カソード電極間安定化媒体、アノード電極間安定化媒体、第３のｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体、第２のｐＨ分離平坦部を形成する媒体、第４のｐＨ機能を形成する媒体など、そして最後に（カソード）安定化媒体になろう。したがってここに例として説明した構成では、カソード電極間安定化媒体は、アノード電極間安定化媒体よりもＦＦＥ装置の物理的なアノードに近い。
【００７６】
アノード電極間安定化媒体とカソード電極間安定化媒体は、一プロトン性の酸および／または一塩基性の塩基を含むことができる。当業者であれば、電極間安定化媒体の中に形成されるイオンが十分に小さな電気泳動移動度を持たねばならないことがわかるであろう。
【００７７】
各媒体成分は、電気泳動移動度が約４０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒以下のアニオンとカチオンを含んでいることが好ましい。この電気泳動移動度は、３０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒未満、または２５×１０-9ｍ2／Ｖ／秒未満、さらには２０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒未満であることがより好ましい。アノード安定化媒体成分の例として、グルコン酸、グルクロン酸、アセチルサリチル酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、いくつかの両性酸（グッドの緩衝液として知られている）からなる群から選択された酸が挙げられる。カソード安定化媒体成分の例として、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミン、トリ−イソプロパノールアミン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールからなる群から選択された塩基が挙げられる。
【００７８】
本発明の実施態様では、電極間安定領域は、電極間安定化媒体の２つの成分をＦＦＥ装置中の複数の分離領域の間に導入することによって確立される。図７に、アノードとカソードを有するＦＦＥ装置の２つの分離領域の間に電極間安定領域を配置することによって２つの異なる分離領域が形成された一実施態様を示してある。図７からわかるように、第１のＤＳＥ分離領域のｐＨ分離平坦部は、第２の分離領域のｐＨ分離平坦部とｐＨ値が同じでも異なっていてもよい。したがって、独立したサンプル入口を通じて独立したサンプルを輸送し（各サンプルは、２つ（またはそれ以上）の分離領域のうちの１つに導入される）、一対の電極だけを用いて同時に複数の分画化プロトコルまたは分離プロトコルを実施することが可能である。サンプル入口は、ＦＦＥ装置の媒体入口とは独立に配置することができ、媒体入口から下流に位置することがしばしばある（例えば図１Ａと図４Ａ参照）。さらに、サンプル入口は、ＦＦＥ装置のアノードとカソードに挟まれた任意の所望する位置に配置することができる。
【００７９】
一般に、電極間安定化媒体の導電率は、その電極間安定化媒体に隣接する第１と第２の分離領域または分画化領域の導電率よりも大きいため、分離領域の間でイオン種がクロスオーバーすることと、アノード電極間安定化媒体およびカソード電極間安定化媒体のアニオン種とカチオン種が隣接する分離領域に入ってクロスオーバーすることが回避される。
【００８０】
この明細書では、“フォーカス媒体”は、アノード・フォーカス媒体に関しては酸を、カソード・フォーカス媒体に関しては塩基を含んでいて、隣接するｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離平坦部に対して導電率の段差を形成する媒体を意味する。このフォーカス媒体がフォーカス領域を形成し、そこではアノードまたはカソードに向かう分析物の運動が導電率の段差のために低下して実質的にゼロになる。酸と塩基の濃度は、そのフォーカス媒体の導電率が、隣接するｐＨ分離平坦部、ｐＨ勾配、またはｐＨ機能の導電率の好ましくは少なくとも２倍（少なくとも３倍、少なくとも５倍、またはそれ以上であることがより好ましい）の大きさになるのに十分なように選択する。媒体の導電率の突然の上昇は、分離する分析物のｐＩとは異なるｐＩを持つ分析物を、導電率の値が異なる２つの媒体の境界に位置するｐＨ分離平坦部に蓄積させる上で有用である。というのも、アノードまたはカソードに移動する分析物の移動度は、それぞれ実質的にゼロに低下するからである。
【００８１】
アノード・フォーカス媒体中の酸のｐＫａ値は、隣接するｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離平坦部で用いる酸のｐＫａ値よりも小さくなるように選択する（すなわちアノード・フォーカス媒体ではより強い酸を選択する）。本発明のいくつかの実施態様では、ｐＫａの差は約１ｐＨ単位よりも大きい。この差は、約２ｐＨ単位よりも大きいことが好ましく、約３ｐＨ単位よりも大きいことが最も好ましい。導電率を上昇させる酸として用いるのに適した例は、硫酸、ピリジンエタンスルホン酸、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、およびギ酸からなる群から選択されるが、これだけに限られるわけではない。アノード・フォーカス媒体は、導電率の上昇にとって重要な酸に加え、隣接するｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離平坦部を形成する緩衝化合物、および／またはそのフォーカス媒体のｐＨを調節する弱酸を含むことができる。弱塩基は、隣接するｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離平坦部で用いる塩基のｐＫａよりも小さなｐＫａを持つと理解すべきである。適切な弱塩基の例は、例えば、タウリン、グリシン、２−アミノ−ブチル酸、グリシルグリシン、β−アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン−エタノール、ピリジン−プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルホリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンなどであり、これらは上に説明したｐＫａの基準に従って選択される。
【００８２】
同じ原理が、必要に応じた変更を加えた上で、カソード・フォーカス媒体に含まれる塩基の選択基準に対しても適用される。したがってカソード・フォーカス媒体に含まれる塩基のｐＫａ値は、隣接するｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離平坦部で用いる塩基のｐＫａ値よりも大きくなるように選択される（すなわちカソード・フォーカス媒体ではより強い塩基を選択する）。本発明のいくつかの実施態様では、ｐＫａの差は約１ｐＨ単位よりも大きい。この差は、約２ｐＨ単位よりも大きいことが好ましく、約３ｐＨ単位よりも大きいことが最も好ましい。導電率を上昇させる塩基として用いるのに適した例は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物（例えば水酸化ナトリウム）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸、トリスなどからなる群から選択されるが、これだけに限られるわけではない。カソード・フォーカス媒体は、導電率の上昇にとって重要な塩基に加え、隣接するｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離平坦部を形成する緩衝化合物、および／またはそのフォーカス媒体のｐＨを調節する弱酸を含むことができる。弱酸は、隣接するｐＨ機能、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離平坦部で用いられる酸のｐＫａよりも大きなｐＫａを持つと理解すべきである。適切な弱酸の例は、例えばＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、タウリン、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α−アラニン、β−アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジンなどであり、これらは上に説明したｐＫａの基準に従って選択される。
【００８３】
本発明の実施態様のフォーカス媒体は、導電率が大きいことと組成のため、安定化媒体として機能することもできる。
【００８４】
本発明の方法で用いられる“安定化媒体”は、同時係属中のアメリカ合衆国仮出願ＵＳＳＮ  ６０／８８５，７９２（その開示内容は参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）に記載されている。安定化媒体は、例えば適切な二元緩衝系（ここでは“Ａ／Ｂ媒体”と呼ぶ）によって形成される分離領域内で条件を安定させるのに有用かつ適している。したがって適切な安定化媒体は、分離領域にイオンを供給したり分離領域内のイオンを交換したりする“リザーバ”としても機能する。
【００８５】
本発明の実施態様によれば、安定化媒体は、以下選択する基準に合うように設計することが好ましい。カソード安定化媒体（ＣＳＭ）に含まれる緩衝酸のｐＫａは、サンプル中で最も塩基性の分析物（すなわちｐＩが最大の分析物）のｐＩ値よりも大きくなければならない。同様に、アノード安定化媒体（ＡＳＭ）に含まれる緩衝塩基のｐＫａは、サンプル中で最も酸性の分析物のｐＩ値よりも小さくなければならない。
【００８６】
適切な安定化媒体は、１種類だけの緩衝酸（ＣＳＭ）または１種類だけの緩衝塩基（ＡＳＭ）で設計できるが、安定化媒体は、それぞれ２種類以上の緩衝酸（ＣＳＭ）または緩衝塩基（ＡＳＭ）を含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、２種類、ときには３種類以上の緩衝化合物がそれぞれＣＳＭとＡＳＭの中に存在していてもよいが、媒体の組成はもちろんできるだけ簡単にすることが一般に好ましい。
【００８７】
いくつかの実施態様では、ＣＳＭに含まれる各緩衝酸のｐＫａは、（ｐＩ＋０．３）＜ｐＫａ＜（ｐＩ＋３）の範囲内でなければならない。この範囲は、（ｐＩ＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＩ＋２）であることが好ましく、（ｐＩ＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＩ＋１．３）であることが最も好ましい。同様に、ＡＳＭに含まれる各緩衝塩基のｐＫａは、（ｐＩ−３）＜ｐＫａ＜（ｐＩ−０．３）の範囲内でなければならない。この範囲は、（ｐＩ−２）＜ｐＫａ＜（ｐＩ−０．５）であることが好ましく、（ｐＩ−１．３）＜ｐＫａ＜（ｐＩ−０．５）であることが最も好ましい。
【００８８】
あるいはＣＳＭに含まれる緩衝酸とＡＳＭに含まれる緩衝塩基のｐＫａ値は、分離媒体のｐＨの範囲（すなわちｐＨの最小値と最大値）との関係で定義することもできる。分離媒体のｐＨの範囲に基づいた定義は、分析物のｐＩに関係する定義の代わりに用いること、またはその定義と組み合わせて用いることができる。したがって本発明の安定化媒体に関係するいくつかの実施態様では、ＣＳＭに含まれる各緩衝酸のｐＫａ値は、分離媒体のｐＨの最大値よりも大きくなろう。同様に、ＡＳＭに含まれる各緩衝塩基のｐＫａ値は、ＩＥＦ分離媒体のｐＨの最小値よりも小さくなろう。
【００８９】
好ましいいくつかの実施態様では、ＣＳＭに含まれる各緩衝酸のｐＫａ値は、（ｐＨ最大＋０．３）＜ｐＫａ＜（ｐＨ最大＋３）の範囲内である。この範囲は、（ｐＨ最大＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＨ最大＋２）であることが好ましく、（ｐＨ最大＋０．５）＜ｐＫａ＜（ｐＨ最大＋１．３）であることが最も好ましい。ＡＳＭに含まれる各緩衝塩基のｐＫａは、（ｐＨ最小−３）＜ｐＫａ＜（ｐＨ最小−０．３）の範囲内である。この範囲は、（ｐＨ最小−２）＜ｐＫａ＜（ｐＨ最小−０．５）であることが好ましく、（ｐＨ最小−１．３）＜ｐＫａ＜（ｐＨ最小−０．５）であることが最も好ましい。
【００９０】
２種類以上の緩衝酸（ＣＳＭ）または緩衝塩基（ＡＳＭ）が存在している場合には、追加の緩衝化合物は、上記の範囲内で異なるｐＫａ値を持つように、選択しなければならない。好ましい実施態様では、ＣＳＭに含まれるより弱い緩衝酸とＡＳＭに含まれるより弱い緩衝塩基の濃度は、それぞれ最強の緩衝酸（ＣＳＭ）と最強の緩衝塩基（ＡＳＭ）（すなわち、ＣＳＭに関しては最も塩基性の分析物のｐＩに最も近いｐＫａを持つ緩衝酸、ＡＳＭに関しては最も酸性の分析物のｐＩに最も近いｐＫａを持つ緩衝塩基）の濃度よりも大きくなければならない。
【００９１】
この点に関し、より大きな濃度とは、より弱い酸とより弱い塩基の濃度が、ＣＳＭとＡＳＭにそれぞれ含まれる最強の緩衝酸／塩基の濃度の少なくとも１．１倍になっていること、好ましくは少なくとも約２倍になっていること、より好ましくは少なくとも約３倍になっていること、そしてときには約４倍、約５倍、さらには約１０倍になっていることを意味する。
【００９２】
それに加え、安定化媒体は、１種類以上の緩衝塩基（ＣＳＭ）と緩衝酸（ＡＳＭ）も含むことができる。ただし、ＣＳＭに含まれるすべての塩基の合計濃度は、それぞれの緩衝酸を合計した濃度よりも小さく、ＡＳＭに含まれるすべての酸の濃度は、それぞれの緩衝塩基を合計した濃度よりも小さい。
【００９３】
ＣＳＭのｐＨは、通常は、分離媒体の最大のｐＨ（カソードに向かうｐＨ勾配の端点）よりも大きい。ＣＳＭのｐＨは、分離媒体の最大のｐＨよりも約３ｐＨ単位以上大きくはないことが好ましく、約２ｐＨ単位以上大きくはないことがより好ましい。特に、平坦なｐＨ勾配と超平坦なｐＨ勾配に関しては、ｐＨの差を最小に維持すること（すなわち、例えばｐＨは分離媒体の最大のｐＨよりも１．５ｐＨ単位または１ｐＨ単位しか大きくないこと）が特に好ましい。同様に、ＡＳＭのｐＨは、ＩＥＦ分離媒体の最大のｐＨよりも約３ｐＨ単位以上小さくはないことが好ましく、約２ｐＨ単位以上小さくはないことがより好ましい。平坦なｐＨ勾配と超平坦なｐＨ勾配に関しては、ｐＨの差を最小に維持すること（すなわち、例えばｐＨはＩＥＦ分離媒体の最小のｐＨよりも１．５ｐＨ単位または１ｐＨ単位しか小さくないこと）が特に好ましい。
【００９４】
当業者であれば、安定化媒体で観察されるｐＨ値が全範囲で（特に電極に近づくときに）一定でなくてもよいことがわかるであろう。そのため安定化媒体のｐＨに言及する場合にはいつでも、安定化媒体と分離媒体の境界またはその近くのｐＨとして理解すべきである。さらに、安定化媒体に含まれる緩衝化合物が何であるかが、分離媒体中のｐＨ条件に影響を与えることもわかるであろう。実際、成分の選択とその濃度が、電気泳動の間に電場を印加したときに実現するｐＨ勾配を決定することになる。したがってｐＨの値に言及することは、一般に、平衡条件での（すなわち勾配が形成された後の）ｐＨを一般に意味し、ある条件下で上記の好ましい値からずれることがあっても本発明の精神から外れることはない。
【００９５】
装置とその要素
図１Ａと図４Ａに、分離チェンバー内の２つの電極間を流れる分離媒体に含まれていて正味の電荷および／または等電点によって分離できる種を分離するための本発明の実施態様による装置を示してある。この電気泳動装置は、第１の（下方の）壁と、第２の（上方の）壁と、２つの側壁と、平行に重ねた２つの平らなプレート（図示せず）とを有する長方形の分離チェンバーを備えている。これらの要素が合わさって、密封された分離チェンバーを形成している。高電位の電場の発生が可能なように設計された２つの電極がこの分離チェンバーの中に配置されていて、分離空間を規定しやすくしている。この分離空間は、一般に、これら電極間に位置する領域の一部である。電極は、電極チェンバーとして具現化されることが好ましい。電極チェンバーの中を電極緩衝液が電流供給線と接触することによって流れる。電極チェンバーは、分離チェンバーの隣に位置する半透過性の膜を備えることが好ましい。電極緩衝液は、別々の供給ライン（図１Ａと図４Ａでは一部しか見えない）によって電極チェンバーに供給され、別々の出口を通ってこれらの電極チェンバーから出ていく。追加のポンプ装置（図示せず）を用いて電極緩衝液を循環させ、必要な場合にはサーモスタットを用いてその電極緩衝液を冷却することが好ましい。
【００９６】
分離チェンバーは、第１の端部の位置、またはその近く（すなわちその近傍）に、サンプルを注入するための少なくとも１つのサンプル入口と、分離媒体を注入するための少なくとも１つの分離媒体入口を備えている。複数の入口がある場合には、２種類以上の分離媒体を供給することができる。第２の端部の近傍には、複数のサンプル回収出口と、場合によっては１つ以上の向流媒体入口が位置している。回収出口と向流媒体入口の両方とも、（２つ以上存在する場合には）、一般に流れの方向に垂直な線に沿って配置される。本発明のいくつかの実施態様では、回収出口だけが第２の端部に存在する。しかし別の実施態様では、回収出口と向流媒体入口の両方が第２の端部に存在する。
【００９７】
個々の分析物が複数の回収出口を通って分離チェンバーから出ていき、一般に、個々のチューブを通って適切な任意のタイプの個々の回収容器へと導かれる。回収容器には、分析物に加えて分離媒体と向流媒体が回収される。回収出口アレイの個々の回収出口間の距離は、適切な分画／分離を行なうため一般にできるだけ小さくすべきである。個々の回収出口間の距離は、回収出口群の中心から測定して約０．１ｍｍ〜約２ｍｍにすることができる。この距離のより典型的な値は、約０．３ｍｍ〜約１．５ｍｍである。
【００９８】
さまざまな実施態様では、分離媒体入口の数は装置の設計によって制限され、媒体入口に関して選択した数に応じ、実際には例えば１〜７、１〜９、１〜１５、１〜４０、またはそれ以上になる。サンプル入口の数は、例えば１〜３６、１〜１１、１〜５、１〜４、さらには１〜３にされるのに対し、回収出口の数は、例えば３〜３８４、または３〜９６にされる。しかし分離装置に合わせて適切な任意の数を選択することができる。向流媒体入口の数は、一般に、例えば２〜９、または３〜７である。設ける入口と出口の数は、一般に、分離装置と分離空間の形状とサイズに依存する。したがって分離媒体の入口と出口を異なる数にすることも可能である。
【００９９】
図１Ａと図４Ａでは、分離媒体は、両方の電極の間を電極の長さ方向に沿って（大きな矢印）層になって流れる（傾斜した、または平坦な分離チェンバーの中を底部から上に向かうことが好ましい）。いくつかの実施態様では、分離媒体は、出口の近くでその分離媒体の向流（小さな矢印）によって減速され、分離チェンバーから複数の画分となって出口を通って出ていく。例えば分離するタンパク質のサンプルがサンプル入口から分離媒体の中に導入され、層流になったその分離媒体によって輸送される。連続動作条件下で動作させるときには、そのタンパク質混合物は電気泳動によって連続的に分離され、電極間の分離媒体の中に発生する電場によって分離緩衝液とサンプルに生じる性質に応じ、異なる画分となって回収される。バッチ動作モードまたは不連続動作モードで動作させるときには、サンプルは、電気泳動プロセスの性質と必要性に応じて調節できる可変サイズのチェンバーを用いて別個の画分として回収できる。
【０１００】
ＦＦＥ装置の中でサンプルと分離媒体の導電率の差が大きくならないように、サンプル入口を通じて本発明の実施態様によるＦＦＥ装置の分離領域に導入する前に、サンプルの希釈が必要な場合がある。サンプルは水または分離媒体で希釈するとよい。その分離媒体は、ＦＦＥ装置のサンプル入口を通じて中にサンプルを導入することになる分離媒体と同じか、少なくとも似ていることが好ましい。本発明の実施態様を実施するのに利用できる典型的な希釈度は、約１：１０にすることができる。場合によっては、希釈因子は、想定する分離領域の外に豊富なタンパク質が漏れ出さないよう、分離領域内で豊富なタンパク質を蓄積させるのに利用できる能力や空間に応じ、１：１０よりも大きく（例えば１：１５、１：２０など）することができる。ＤＦＥ法またはＤＳＥ法（あとでより詳しく説明する）を適用するサンプルに豊富なタンパク質が存在していない場合には、１：１０未満（例えば１：５、１：２、１：１、２：１など）に希釈することが可能である。これは、例えば枯渇カラムを用いて豊富なタンパク質を枯渇させた後にサンプルに本発明の電気泳動分離法を実施する場合に当てはまる。しかしサンプルは、一般に、分離の特定環境下でできるだけ濃縮された状態でＦＦＥ装置に注入すべきである。
【０１０１】
希釈は、ＦＦＥ装置の媒体入口のうちの１つにサンプルを注入することによって実現できる。あるいは希釈は、媒体入口ではないサンプル入口（例えば、媒体入口の入口から下流にサンプル出口の方向に向けて配置されたサンプル入口）にサンプルを注入することによっても実現でき、サンプルをサンプル入口に導入する前に、サンプルを適当な媒体と混合することによって行なうこともできる。
【０１０２】
上記のことから、本発明の別の１つの特徴は、この明細書に記載したＦＦＥ分離法を実施するのに適した、この明細書に記載したＦＦＥ装置に関する。
【０１０３】
適切な緩衝系
本発明の実施態様によるｐＨ機能プロファイルを形成するのにいくつかの緩衝系が役立つ。緩衝系は、市販の両性電解質（例えばセルバ・エレクトロフォレシス社（ドイツ国）がＳｅｒｖａｌｙｔ（登録商標）の名称で販売しているもの）、相補的マルチ−ペア緩衝系（例えばＢＤ社（ドイツ国）が販売しているＢＤ  ＦＦＥ分離用緩衝液１と２）、揮発性緩衝系、Ａ／Ｂ媒体として知られる二元緩衝系からなる群から選択できるが、これだけに限られるわけではない。
【０１０４】
相補的マルチ−ペア緩衝系
本発明のいくつかの実施態様では、ｐＨ勾配を発生させるのに用いる混合物は、その混合物の中を電流が流れるときにその混合物によって滑らかなｐＨの勾配が提供されるように、注意深く組み合わせた酸と塩基からなっていてもよい。市販されている高分子量の両性電解質と比べて緩衝能力を大きくできる低分子量の有機酸と有機塩基の混合物が選択される。注意深く組み合わせた酸と塩基からなるこの混合物は、分子量、ｐＩ、純度、毒性に関する特徴が極めてよくわかっている。一般に、その酸と塩基は、市販の両性電解質よりも分子量が小さい。適切な相補的マルチ−ペア緩衝系は従来技術で知られている。特に、ｐＨの範囲が３〜５の混合物がＢＤ社（ドイツ国）からＢＤ  ＦＦＥ分離用緩衝液１として販売されており、ｐＨの範囲が５〜８の混合物がＢＤ  ＦＦＥ分離用緩衝液２として販売されている。これらの緩衝系は、例えば一般的な形態がアメリカ合衆国特許出願公開２００４／０１０１９７３（その開示内容は参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）に記載されている。上に説明した相補的なマルチ−ペア緩衝系をこの明細書では“ＣＭＰＢＳ”または“ＣＭＰＢＳ媒体”と呼ぶ。
【０１０５】
揮発性緩衝系
本発明の別の実施態様では、揮発性緩衝系を用いると、本発明の実施態様によるｐＨ勾配を形成するためのいくつかの入口を利用し、ｐＨ分離平坦部と、ｐＨ機能およびｐＨ勾配の中のｐＨ平坦部とを形成することができる。このような緩衝系は、ＦＦＥ分離ステップの後に回収された分画化されたサンプルから残留物なしで除去できるという特別な利点を有する。
【０１０６】
本発明の実施態様による揮発性分離媒体は、緩衝系を含むそのまま使用できる形態の組成物（水性組成物が好ましい）であり、その緩衝系には少なくとも１種類の緩衝酸と少なくとも１種類の緩衝塩基が含まれていて、その緩衝化合物がすべて揮発性であると理解すべきである。場合によっては、その緩衝化合物のうちの少なくとも１つが、質量分析の用途、その中でも特にＭＡＬＤＩの用途のための（揮発性）マトリックスとして機能することができる。
【０１０７】
この明細書の緩衝化合物との関係で用いられる“揮発性”という用語は、適切な条件下で水性サンプルから緩衝化合物を完全に除去できる（すなわち残留化合物（例えば塩）をまったく残さずに、すなわち残留物がない状態で、緩衝化合物を蒸発させることができる）緩衝化合物の能力を意味すると理解すべきである。本発明の実施態様による揮発性緩衝化合物は、最も広い意味では、減圧された大気圧、上昇した温度、照射によるエネルギー供給（例えばＵＶ光、レーザー光）などや、これらの任意の組み合わせからなる群から選択した条件下で残留物を残さずに除去することができる。しかし揮発性緩衝化合物は、ＦＦＥ動作条件（すなわち、上に説明したように大気圧かつ一般に０〜４０℃の温度範囲）下で実質的に不揮発性でなければならない。
【０１０８】
この文脈における本発明の一実施態様において、当業者は、揮発性緩衝化合物を含むサンプルに存在する分析物が上記の条件下で不揮発性である（すなわち分析物が（例えば断片化や酸化によって）実質的に変化せず、溶液中にまたは固体状態で留まる）ことがわかるであろう。いくつかの実施態様では、特に質量分析が動作している条件下で、分析物は揮発性であり、（ＭＳによる検出で必要とされる）イオン化が可能である。
【０１０９】
この明細書では、“ＦＦＥ動作条件下で不揮発性である”という表現は、動作条件下かつＦＦＥの分離期間中に緩衝化合物が揮発して分離媒体中で低下する各緩衝化合物の濃度が５％ｗ／ｖ未満（２％ｗ／ｖ未満が好ましい）であることを意味する。最も好ましいのは、動作条件下かつＦＦＥの分離期間中に濃度の低下がまったく観察されないことである。
【０１１０】
本発明の意味での“残留物がない”という表現は、揮発性化合物そのものは完全に蒸発するが、例えば使用した物質中の不純物による残留物が不揮発である可能性があると理解すべきである。しかし分析を目的とする場合には、入手できる最高純度の化合物だけを使用すべきであることが当業者によく知られており、それは特に質量分析に当てはまる。
【０１１１】
この明細書では、“蒸発”による溶媒と緩衝化合物の除去は、化合物を気相にした後、その気相を適切な手段で除去することにより、興味の対象である分析物から除去することを意味すると理解すべきである。したがってこの明細書で定義する蒸発は、緩衝液の交換（“脱塩”と呼ばれることもある）と一般に呼ばれている技術（例えばカラム・クロマトグラフィ法、透析法、カット−オフ濾過法）や、固相抽出または分析物の沈澱として知られる技術による緩衝化合物の除去とは異なる。あるいは蒸発という用語に含まれないいくつかの応用では、塩の形態で存在する緩衝化合物は水で簡単に洗い流されるが、このようにすると望ましくないことにサンプル材料が明らかに失われることに加え、除去される緩衝化合物の量がはっきりしない。当業者であれば、この明細書で定義した揮発性緩衝化合物は、少なくとも原則として、そのような緩衝液交換技術や固相抽出技術によっても除去できるが、この場合にはもちろん緩衝液の揮発性による明らかな利点が失われ（緩衝液交換技術に関係する潜在的な問題点（例えば取り扱いが難しく、サンプルの回収が少ないこと）の観点から意味を成さないことがわかるであろう。
【０１１２】
ＦＦＥ分離ステップで回収されたサンプルから溶媒と揮発性緩衝化合物を蒸発によって除去するための適切な技術の例として、適切な装置（例えばＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）の名称で知られる遠心分離蒸発器または真空遠心分離機）を用いた真空遠心分離や、水性サンプルの凍結乾燥または（穏やかな）加熱があるが、これだけに限られるわけではない。溶媒と揮発性緩衝化合物を蒸発させるための別の可能性として、サンプルを減圧条件にする（例えば質量分析で用いる標的プレートの上にサンプルを置いて真空にする）ことによる蒸発が挙げられる。当業者であれば、たいていの質量分析法は真空条件下で動作するため（例えば真空ＭＡＬＤＩ）、サンプルをＭＳ装置に導入した後かつイオン化前に揮発性緩衝化合物が容易に除去されることがわかるであろう。
【０１１３】
揮発性緩衝化合物は、減圧および／または高温の条件下で除去できることが好ましい。さらに、他の実施態様では、特に揮発性緩衝化合物を含むサンプルが（例えば質量分析のために）少量存在しているのであれば、その揮発性緩衝化合物を周囲温度かつ大気圧の条件下で蒸発させることさえできる。しかしたいていの場合、少なくともいくつかの緩衝溶液はこのような条件で容易に蒸発しない。さらに別の実施態様では、揮発性緩衝化合物は、より厳しい条件（例えば質量分析が動作している条件下で真空および／または高温に加え、場合によっては照射を行なう条件）下でだけ除去することができる。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施態様では、ＦＦＥ分離媒体は揮発性緩衝化合物を含んでおり、そのうちの少なくとも１つの揮発性緩衝化合物は、質量分析のための（揮発性）マトリックスとして機能する。すなわちその化合物は、質量分析が動作している条件下でだけ除去できる。
【０１１５】
揮発性緩衝系の例として、以下に限られないが、ＴＲＩＳ／酢酸の組み合わせ、ジエタノールアミン／ピコリン酸の組み合わせ、ジメチルアミノプロプリオニトリル（dimethylaminoproprionitril）／酢酸の組み合わせ、２−ピリジンエタノール／ピコリン酸の組み合わせ、ベンジルアミン／２−ヒドロキシピリジンの組み合わせ、トリ−ｎ−プロピルアミン／トリフルオロエタノールの組み合わせなどが挙げられる。
【０１１６】
二元緩衝系（Ａ／Ｂ媒体）
以下に規定する二元緩衝系をこの明細書では“Ａ／Ｂ媒体”と呼ぶ。この二元緩衝系は、本発明の各実施態様にとって一般に有用である。分離媒体は、少なくとも１種類の緩衝酸と、少なくとも１種類の緩衝塩基を含んでいる。ただしその緩衝酸のｐＫａ値は分離媒体のｐＨよりも大きく、その緩衝塩基のｐＫａ値は分離媒体のｐＨよりも小さい。言い換えるならば、その緩衝酸のｐＫａ値はその緩衝塩基のｐＫａ値よりも大きい。
【０１１７】
分離媒体が示すｐＨプロファイルは、本質的に直線であってよい（すなわち電気泳動による分離の間を通じてｐＨの大きな段差がない）。使用する安定化媒体と、緩衝酸と緩衝塩基のｐＫａの差とに応じ、本発明のこの特徴によるＡ／Ｂ分離媒体は、分離チェンバー内で実質的に一定の（すなわち平坦な）ｐＨプロファイルを示すか、比較的緩やかな／平坦なｐＨ勾配を示す。分離チェンバー内で電極間に実質的に一定のｐＨである領域を提供するこの分離媒体は、この明細書に説明した方法に従ってｐＨ分離平坦部を作り出す上で特に有用であることがわかるであろう。しかしＡ／Ｂ媒体は平坦なｐＨ勾配または超平坦なｐＨ勾配も形成できるため、この明細書で明らかにしたようなｐＨ機能またはｐＨ勾配を作り出すのにも使用できる。
【０１１８】
本発明の上記の特徴において少なくとも１種類の緩衝酸と少なくとも１種類の緩衝塩基を用いるＡ／Ｂ媒体は、その少なくとも１種類の緩衝酸とその少なくとも１種類の緩衝塩基のｐＫａの差が約０．５〜４ｐＨ単位であることを特徴とする。ただし上に説明したように、その酸のｐＫａは、その塩基のｐＫａよりも大きくなければならない。好ましい実施態様では、ΔｐＫａは１．２〜１．８である。この値は、ＦＦＥ装置の分離チェンバー内で一定のｐＨを持つｐＨ分離平坦部にとって特に有用である。別の好ましい実施態様では、ΔｐＫａは約２．５〜３．３である。この値は、平坦なｐＨ勾配に特に適している。
【０１１９】
Ａ／Ｂ媒体の１つの特徴は、その媒体の導電率が比較的小さいことである。しかし導電率は、妥当な時間内に分析物を許容できる程度に分離するのに十分な大きさでなければならないことがわかるであろう。したがってＡ／Ｂ媒体の導電率は一般に５０〜１０００μＳ／ｃｍ（５０〜５００μＳ／ｃｍであることが好ましい）。しかし当業者であれば、分離媒体中の正確な導電率は、もちろん、分離／分画化の特徴と、媒体中の帯電した他の種（例えばサンプル／分析物の安定化に必要なイオン）の存在と、分析物の電気化学的性質とに依存することがわかるであろう。
【０１２０】
Ａ／Ｂ媒体は、１種類の緩衝酸と１種類の緩衝塩基だけを含んでいることが好ましい。言い換えるならば、このような分離媒体は、１つの化合物の１つの酸機能と、同じ化合物または異なる化合物の１つの塩基機能が、所望のｐＨプロファイルと導電率プロファイルを持つ分離媒体を確立するのに実質的に役立つ二元媒体である。優れた結果は、分離媒体中に２種類以上の緩衝酸と緩衝塩基を用いても実現できるが、一般に、できるだけ少ない成分を用いることが有利である。それは、準備がより容易でおそらくは安価であるだけでなく、分離チェンバーの中に存在する帯電した種の数が増えると媒体の電気化学的性質がより複雑になるからである。
【０１２１】
Ａ／Ｂ媒体という考え方は、同時係属中のアメリカ合衆国仮出願ＵＳＳＮ  ６０／８８５，７９２（その開示内容は参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）に詳しく記載されている。この文脈における適切な緩衝塩基は、例えばタウリン、グリシン、２−アミノ−ブチル酸、グリシルグリシン、β−アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン−エタノール、ピリジン−プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルホリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンなどである。適切な緩衝酸は、例えばＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α−アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジンなどである。ただし、緩衝酸と緩衝塩基の間では、上に説明したｐＫａの関係が満たされている。
【０１２２】
さらに、本発明の方法では、ＦＦＥによって分析物を分離するための例えばアメリカ合衆国特許第５，４４７，６１２号に開示されている二元緩衝系も利用することができる。この二元媒体は、０．４〜１．２５ｐＨ単位の間で比較的平坦なｐＨ勾配を形成するのに適している。
【０１２３】
添加剤
本発明の分離媒体は、１種類以上の添加剤をさらに含んでいてもよい。本発明の実施態様による添加剤は、緩衝酸と緩衝塩基によって提供される緩衝能力に寄与しない（または少なくとも大きくは寄与しない）化合物またはイオンである。一般に、添加剤の数と濃度は最小に維持する必要があるが、分析物または分離によっては、分析物を完全な状態に維持するため、または媒体が所望の性質（例えば変性条件、さまざまな分離媒体間の粘性の適合性など）を持つようにするために追加の化合物が存在している必要がある。
【０１２４】
可能な添加剤は、他の酸および／または塩基、いわゆる“本質的に”１価と２価のアニオンとカチオン、粘性増大剤、洗浄剤、タンパク質可溶剤、アフィニティ・リガンド、還元剤などの中から選択することが好ましい。
【０１２５】
上の説明から明らかなように、他の酸または塩基が本発明の分離媒体の中に存在していてもよいが、その酸または塩基のｐＫａは、溶液の緩衝能力に寄与することを避けるため、分離媒体のｐＨまたはｐＨ範囲から十分に離れている（しかしその酸または塩基は、もちろん媒体の導電率には寄与してもよい）。可能な酸および塩基の例として、溶液中で完全に解離する少量の強酸または強塩基（例えばＮａＯＨ、ＨＣｌなど）、または媒体中で実質的に解離しない（すなわち媒体のｐＨから約４単位以上離れたｐＫａを持つ）種として存在する非常に弱い酸または塩基がある。
【０１２６】
本出願の意味での不可欠な１価と２価のアニオンとカチオンは、サンプル中の分析物の構造および／または機能の完全性を維持するのに必要とされる可能性のあるイオンである。そのような不可欠なアニオンおよびカチオンとして、以下に限られないが、マグネシウム・イオン、カルシウム・イオン、亜鉛イオン、Ｆｅ（ＩＩ）イオン、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、錯化剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）、（例えば細菌による汚染を避けるための）アジド・イオンなどがある。
【０１２７】
分離媒体で一般に使用される粘性増大剤として、ポリアルコール（例えばグリセロールやさまざまなＰＥＧ）、親水性ポリマー（例えばＨＰＭＣなど）、炭水化物（例えばスクロース、ヒアルロン酸など）を挙げることができる。粘性増大剤は、サンプルと媒体の間、または隣り合った異なる媒体間の密度または粘性の差によって生じる乱れを避けるために、分離媒体の粘性を、分離空間に導入されるサンプルの粘性に適合させる、あるいは分離チェンバー内の他の分離媒体および／または安定化媒体の粘性に適合させるのに必要な場合がある。
【０１２８】
存在しうる別の添加剤として、キラル選択剤（例えばいくつかのデキストリンがあり、その例はシクロデキストリンなどである）、アフィニティ・リガンド（例えばレクチンなど）がある。さらに、当業者には多くの適切な洗浄剤が知られている。それは例えば、ＳＤＳ、界面活性剤（例えば脂肪アルコール、オクチルグルコシド、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）として知られるポリソルベート）などである。タンパク質可溶化剤の例として、尿素またはチオ尿素があるが、界面活性剤や洗浄剤も可能である。
【０１２９】
別の好ましい実施態様では、分析物（例えばアルブミン）の分離が変性条件下で実施される。好ましい変性剤は、尿素、チオ尿素、または従来技術で知られている他の適切な洗浄剤である。尿素の濃度は一般に約５Ｍである。濃度は６Ｍであることがより好ましく、８Ｍ以上であることが最も好ましい。
【０１３０】
還元剤を添加して溶液中の分析物の酸化を防止せねばならない場合がある。サンプルおよび／または分離媒体に添加できる適切な還元剤として、メルカプトエタノール、メルカプトプロパノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウムなどがある。
【０１３１】
いずれの場合にも、上記の添加剤の多くは帯電しているため、その濃度は、必要なだけ大きく維持する一方で、分離媒体の導電率を所望の（低い）範囲に維持するためにできるだけ低くする必要がある。
【０１３２】
例えば下流での分析法（例えばＭＡＬＤＩ（／ＭＳ））との関係で、この明細書に記載した揮発性媒体を使用する場合には添加剤を避けるべきであることに注意されたい。なぜならたいていの添加剤は揮発性でないためにサンプル中に留まり、その結果としてその後のＭＳ分析の邪魔になる可能性があるからである。
【０１３３】
フリー・フロー等電点電気泳動（ＦＦ−ＩＥＦ）
等電点電気泳動（ＩＥＦ）（エレクトロフォーカシングとしても知られる）は、異なる分子をその正味の電荷の違いによって分離する技術である。この技術は、フリー・フロー電気泳動条件下でうまく実施することができる。これは、分子の電荷がその周囲のｐＨに合わせて変化するという事実を利用した電気泳動の一種である。ＩＥＦには、ｐＨ勾配またはｐＨ機能を含むか含むようにできる分離媒体の中を、混合物を通過させる操作が含まれる。分離チェンバーは、アノード側が相対的に小さなｐＨであり、カソード側が相対的に大きなｐＨである。その両方の側の間で作り出されるｐＨ勾配プロファイルまたはｐＨ機能プロファイルが形成され、電気泳動による問題の分析物の運動が支配される。ある分子の等電点（ｐＩ）では、その分子の正味の電荷がゼロであるため、分離チェンバーの中でそれ以上の運動は観察されない。
【０１３４】
アノード近くの酸性条件下で正の正味電荷を持つ帯電した各分析物は、アノードから遠ざかるであろう。その分析物がＩＥＦシステムのチェンバーの中を移動するとき、より大きなｐＨを持つ領域に入り、正電荷が減少していく。各分析物は、個々の等電点に到達したとき、その特定のｐＨにおいてもはや正味の電荷を持たないために運動を停止する。したがってカソード近くの塩基性条件下で負の正味電荷を持つ分析物はカソードから遠ざかる。その分析物がＩＥＦシステムのチェンバーの中を移動するとき、より小さなｐＨを持つ領域に入り、負電荷が減少していく。各分析物は、個々の等電点に到達したとき、その特定のｐＨにおいてもはや正味の電荷を持たないために運動を停止する。このようにすることで、さまざまな分析物が、異なるｐＩのために効果的に分離される。興味の対象である分離された分子は、さまざまな手段でＩＥＦ装置から取り出すこと、または染色したり他の方法で特徴づけたりすることができる。
【０１３５】
分析物の混合物を含むサンプルから分析物を分離する、または単離する、または枯渇させるための本発明のＦＦＥ法は、さまざまなモード（例えば連続モード、インターバル・モード、サイクリック・インターバル・モード）で実施することができる。
【０１３６】
“連続モード”の用途では、サンプル溶液をチェンバーの中に連続的に注入し、そのことによって分析物（特にタンパク質）を分離媒体の連続流のもとで分離プロセス全体を通じて電場を中断することなく印加して分離する。この電気泳動による分離の後、分析物の一部または全部を連続的に回収することができる。
【０１３７】
ＦＦＥの文脈における連続モードは、注入ステップと分離ステップが連続的かつ同時に起こることを意味すると理解すべきである。電気泳動による分離は、媒体と分析物が電気泳動チェンバーの中を通過する間に起こり、異なる種が、そのｐＩ（ＩＥＦ）、正味の電荷密度（ＺＥ）、電気泳動移動度（ＩＴＰ）に従って分離される。連続モードＦＦＥにより、何回かの独立した“試行”（１回の試行は、サンプルの注入、分離、その後の回収および／または検出という一連の操作であると理解される）を行なう必要なしに分析物を連続的に注入し、回収することができる。
【０１３８】
連続モードＦＦＥには、分析物が電極間の分離空間を通過するときに分離時間を長くするため、バルクの流速を初期のバルクの流速よりも小さくする（がゼロではない）分離技術が含まれることがわかるであろう。しかしこの場合には、真の連続モードとはもはや言えない。なぜならバルクの流速の低下は、限られた量のサンプルについてのみ意味を成すからである。
【０１３９】
ＦＦＥの用途に関していわゆる“インターバル・モード”として知られる別のＦＦＥ動作モードも従来技術で報告されている。例えば不連続（すなわちインターバル）偏向電気泳動法が、アメリカ合衆国特許第６，３２８，８６８号（その開示内容は参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）に示されている。この特許文献では、サンプルと分離媒体の両方が電気泳動チェンバーに導入された後、電気泳動モード（例えばゾーン電気泳動、等速電気泳動、等電点電気泳動）を利用して分離され、最後にチェンバーから画分出口を通って追い出される。'８６８号特許の実施態様には、分離媒体とサンプルの運動が一方向であり、チェンバーの入口から出口に向かって移動することが記載されている。この方向は、伝統的なキャピラリー電気泳動とは異なり、細長い電極の向きと共通である。例えば'８６８号特許に記載されている静的インターバル・モードでは、ポンプまたはそれ以外の何らかの流体移動要素によって起こる電極間でのサンプルの加速は、電場がオフのとき、あるいはそうでないとしても少なくとも電場が電気泳動による移動にとって有効でないとき、すなわちサンプルのどの部分も有効な電場を受けないときにしか起こらない。
【０１４０】
言い換えるならば、インターバル法は、サンプルと媒体を電気泳動装置の分離チェンバーに導入する装填段階の後、分離するための電場を印加している間はサンプルを含む媒体のバルク流が止まる分離プロセスであることを特徴とする。サンプルの分離／分画化の後、電場をオフにするか小さくして有効でないようにした後、バルク流を再びオンにすることで、分画化されたサンプルが出口に向かい、その後適切な容器（例えば微量滴定プレート）に回収／で検出されるようにする。
【０１４１】
この明細書におけるＦＦＥという文脈でのいわゆるサイクリック・モードまたはサイクリック・インターバル・モードは、同時係属中の２００６年８月２９日に出願されたアメリカ合衆国仮出願ＵＳＳＮ  ６０／８２３，８３３と、ＵＳＳＮ  ６０／８８３，２６０（両方の開示内容は参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）に記載されている。要するに、サイクリック・インターバル・モードは、サンプルが細長い電極間の電気泳動の場に保持されている間にバルク流の方向が少なくとも１回、そして可能な場合には複数回逆転することを特徴とする。静的インターバル・モードとは異なり、サンプルは常に運動しているため、より大きな電場にすることができ、したがってよりよい（またはより高速の）分離が可能になる。さらに、細長い電極間でサンプルのバルク流を逆転させることにより、電場の中に分析物が滞在する時間を著しく長くすることができる。そのため分離時間が長く、および／または分離効率と分解能がよりよくなる。バルク流を細長い電極に平行ないずれかの方向に逆転させること（サイクルと呼ぶ）は、個々の状況に合わせて何回でも繰り返すことができる。しかし実際的な理由と、短時間での分離が望ましいこととにより、一般にこのモードで実施されるサイクルの数は限られる。
【０１４２】
インターバル・モードの用途では、分離媒体は不連続状態または非定常状態で流れる。例えばサンプルは、高電圧源をオフにした状態で注入または導入することができる。あるいは分離チェンバーから流出している間は電場の強度を小さくすることが有利な場合もある。
【０１４３】
サンプルを導入した後、電極間で媒体のバルク流が維持されるようにするため、分離媒体の移動をオフにするか、場合によっては分離媒体の移動を何度も逆転させる。サンプルが所望の程度まで導入されると、サンプルが電気泳動によって分離されるまで高電圧源の電流をオンにするか増大させる。ある時間が経過した後、電圧をオフにするか小さくし、媒体の流れを増やすことによって、あるいは少なくとも媒体を回収出口に移動させることによって、分離されたサンプルを分離チェンバーから流出させて回収する。補助媒体供給ライン（媒体供給ラインと直接向かい合ったＦＦＥ装置の端部に位置することが好ましい）を通じて分離チェンバーに補助媒体が導入され、画分出口を通じて分離媒体とともに抽出されるようにすることもできる。この場合、補助媒体を向流媒体と呼び、補助媒体供給ラインがチェンバーと交わる点を向流入口と呼ぶ。
【０１４４】
分離ステップがあるため、低濃度のタンパク質が蓄積するのとは異なる場所により豊富なタンパク質が蓄積または分離されるように、低濃度の化合物を化学的緩衝系に蓄積させることができる。分離されたより豊富なタンパク質は分析せず、より少ないタンパク質を分析する場合には、その豊富なタンパク質は実質的に枯渇状態であるため、低濃度のタンパク質、化合物、分析物の測定を妨げることはなく、それらの検出と同定が容易になる。さらに、同定の目的では、化学的緩衝系に、１つの化合物または１つのクラスの化合物を特異的に同定する手段を付随させることも有利な可能性がある。
【０１４５】
分離プロトコル
１つまたは複数のｐＨ平坦部を本発明の実施態様で利用して、ｐＨ分離平坦部またはその周囲でタンパク質の枯渇または分離が容易する一方で、他のタンパク質はそのｐＨ分離平坦部に隣接した部分またはそのｐＨ分離平坦部から離れた部分で富化することができる。その平坦部のｐＨ値を変化させることにより、どのタンパク質をサンプルの残部から分離するか、または枯渇させるかに影響を与えることができる。
【０１４６】
２つのＦＦＥ−ＩＥＦ動作モードを、ここでより詳しく説明する。ユーザーは、この２つのＦＦＥ−ＩＥＦ動作モードによって調製法または分析法を改善し、サンプルから分析物を分離する、および／または選択的に枯渇させることができる。一実施態様では、ある分析物の枯渇、分画、富化（ＤＦＥプロトコル）を実現できる。第２の実施態様では、ある分析物の枯渇、分離、富化（ＤＳＥプロトコル）を実現できる。枯渇させる分析物の例は、例えば、アルブミン、α１アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、カゼイン、ミオシン、アクチンなどからなる群から選択した豊富なタンパク質だが、これだけに限られるわけではない。
【０１４７】
上述のように、分析物の組成物から分離すべき１つの分析物をフリー・フロー電気泳動によって分離する方法は、必要に応じ、分析物組成物から分離する１つの分析物のｐＩを同定するステップと；フリー・フロー電気泳動（ＦＦＥ）チェンバーの中でアノードとカソードの間に、ｐＨの平均が分離する分析物の等電点（ｐＩ）に実質的に対応していて、上限ｐＨと下限ｐＨによって限定されたｐＨ範囲を持つｐＨ分離平坦部と、アノードとそのｐＨ分離平坦部の間にあって、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能と、カソードとそのｐＨ分離平坦部の間にあって、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能とを含む、ｐＨ機能プロファイルを形成するステップと；分析物混合物から分離する１つの分析物を含むサンプルを、ＦＦＥチェンバー内のｐＨ分離平坦部、そのｐＨ分離平坦部のアノード側の領域、またはそのｐＨ分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと；ＦＦＥチェンバーから分析物を流出させるステップを含んでいる。必要に応じ、分析物のすべてまたは一部を、１つの画分または複数の画分に回収することができる。
【０１４８】
ＤＦＥプロトコル
本発明の実施態様によるＤＦＥプロトコルは、フリー・フローＩＥＦによって分析物の混合物から分析物（例えば特定のタンパク質）を分離するのに役立つ。
【０１４９】
ＤＦＥプロトコルに適したｐＨ機能プロファイルは、混合物中の他の分析物から分離する分析物のｐＩを包含するｐＨ分離平坦部と、アノードとそのｐＨ分離平坦部の間にあってそのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さなｐＨを持つｐＨ機能と、カソードとそのｐＨ分離平坦部の間にあってそのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きなｐＨを持つｐＨ機能とを含んでいる。ＤＦＥでは、２つのｐＨ機能とｐＨ分離平坦部の間に、少なくとも０．５ｐＨ単位の明確なｐＨの段差がある。この段差は１ｐＨ単位であることが好ましく、２ｐＨ単位以上であることがより好ましい。あるいは、および／またはそれに加え、ｐＨ分離平坦部に隣接するｐＨ機能は、より大きな導電率にすることができる。言い換えるならば、ｐＨ機能を形成する媒体は、上により詳しく説明した“フォーカス媒体”となる。
【０１５０】
分離する分析物を含む分析物混合物からなるサンプルをＦＦＥ装置の分離チェンバーの内部にあるｐＨ分離平坦部に導入した後、この分析物混合物に電気泳動の電場を印加することによって分離する。サンプルから分離される分析物は、その後、適切な手段によって装置の分離領域から複数の回収出口を通じて回収される。
【０１５１】
当業者であれば、当業者に知られている技術を利用して分析物のｐＩを同定する方法を知っている。あるいは当業者であれば、現在の等電点電気泳動法を例えば後で実施するゲル電気泳動や免疫検出と組み合わせて使用し、タンパク質のｐＩを同定にすることができる。ＤＦＥ分離プロトコルの間、電圧をＦＦＥ装置のアノードとカソードの間に印加して分離緩衝液と分離媒体の中に電流を流す。すると電気泳動のカーテンが電極間に確立され、図１、図２、図４、図５、図７、図８に図示したようにｐＨ機能プロファイルと導電率プロファイルが形成される。
【０１５２】
ＦＦＥに適した装置と、ＤＦＥ実験の一例におけるｐＨプロファイルおよび導電率プロファイルを図１Ａと図１Ｂに示してある。入口を通じて導入される媒体は、一旦安定化してその媒体領域および隣接した媒体領域の電気泳動移動特性と安定化特性に基づいて形成する機会があると、それぞれの組成物領域を形成する。言い換えるならば、入口１を通じて導入される媒体は領域１を形成し、入口Ｎを通じて導入される媒体は領域Ｎを形成する。ここにＮは、本発明の実施例に示してあるように１〜７の整数だが、他の実施態様では、ＦＦＥ装置に設ける媒体入口の数に応じて１〜８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４０、またはそれ以上であってもよい。さらに、２つ以上の入口を用いて単一の組成物領域を形成できることが容易にわかる（すなわち同一の媒体を隣り合ったいくつかの媒体入口を通じてＦＦＥ装置に導入する）。
【０１５３】
領域間の境界は、各領域の媒体の電気化学的特性に応じ、明確であったり、場合によっては重複して明確でなかったりする可能性がある。入口の組成物と組成物領域はｐＨがさまざまであるため、等電点電気泳動モードをｐＨ勾配プロファイルの形成中と形成後に電気泳動チェンバーの中で実施することができる。
【０１５４】
（図１Ｂの入口４によって形成される）ｐＨ分離平坦部と一方の電極の間に位置する領域は、通常ｐＨ分離平坦部と異なるｐＨを持つため、それらの領域は、ｐＨ分離平坦部に留まるのに必要なｐＩとは異なるｐＩを持つ、ｐＨ分離平坦部に注入または導入される両性分析物の移動を可能にする。したがってその分析物はｐＨ分離平坦部を離れ、電極の一方に向かって移動する。より詳細には、ｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さなｐＩを持つサンプル中の両性分析物は、ｐＨ分離平坦部の中に置かれたときに負の正味電荷を持つため、アノードに向かって移動する。さらに、サンプルに含まれていてｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きなｐＩを持つ両性分析物またはタンパク質は、ｐＨ分離平坦部内に置かれると正の正味電荷を持つため、カソードに向かって移動する。サンプルの性質と組成に応じ、サンプルは一般にＦＦＥ装置のｐＨ分離平坦部に、またはｐＨ分離平坦部とアノードの間にある領域に、またはｐＨ分離平坦部とカソードの間にある領域に注入または導入することができる。しかしサンプルはｐＨ分離平坦部に注入することが好ましい。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施態様では、チェンバーに導入される分離媒体によって作り出されるｐＨ分離平坦部に隣接した両方の領域が、分離空間（図１Ｂの入口３と５）に注入または導入される分離媒体と緩衝液が何であるかに応じて酸性またはアルカリ性のｐＨ平坦部になる。アノードとｐＨ分離平坦部に挟まれた領域は実質的に酸性のｐＨ平坦部を形成し、カソードとｐＨ分離平坦部に挟まれた領域はアルカリ性のｐＨ平坦部を形成する。この明細書で説明するＤＦＥプロトコルにより、ｐＨ分離平坦部に残る枯渇プールの実質的に隣に両性分析物の酸性プールとアルカリ性プールが濃縮されて生じることになろう。
【０１５６】
この明細書の実施例１では、ｐＨ分離平坦部のｐＨは、豊富なヒト血清タンパク質であるアルブミンの天然状態のｐＩに対応するように選択した。他の実施態様では、ｐＨ分離平坦部のｐＨは、枯渇させるタンパク質がｐＨ分離平坦部内に留まる一方で、異なるｐＩを持つ他の分析物はｐＨ分離平坦部内に留まらず、その正味の電荷のためにｐＩと周囲の媒体のｐＨ差によってｐＨ分離平坦部から離れて移動するように、選択することができると考えられる。
【０１５７】
酸性とアルカリ性のｐＨ平坦部領域は一般にある広がりを持ちうるため、ユーザーは、望むのであれば、そのｐＨ平坦部の広がりに沿ったある位置に回収または濃縮された分画化タンパク質の酸性プールまたはアルカリ性プールを持つことが可能である。両性分析物が停止しうる地点は、ｐＨ分離平坦部から最も遠い酸性ｐＨ平坦部とアルカリ性ｐＨ平坦部の端部を超えた位置に自然に発生しうるため、本発明のいくつかの実施態様では、例えばこの明細書に記載したフォーカス媒体によって実現した導電率の“壁”を利用して粒子またはタンパク質の電気泳動による移動を停止させる、または引き止めることにより、ユーザーは、望むのであれば、特定の位置で分析物を回収することが可能である。
【０１５８】
酸性ｐＨ平坦部とアルカリ性ｐＨ平坦部の内部または隣に位置するある種の媒体の導電率が著しく大きいため、分析物はこれらの平坦部を通過して移動することが阻止され、アノードとカソードに向かって連続状態になるのではなく濃縮されてプールになることができる。さらに、ｐＨ分離平坦部に隣接していて導電率がそのｐＨ分離平坦部の導電率よりも大きな領域を選択することにより、ｐＨ分離平坦部から離れていく両性分析物は、それぞれ酸性領域とｐＨ分離平坦部の間、またはｐＨ分離平坦部とアルカリ性領域の間のいわゆる“界面”に直ちに蓄積する。ｐＨ分離平坦部とその隣にある酸性またはアルカリ性の領域のｐＨ段差は、通常０．５ｐＨ単位よりも大きい。この段差は、１．０ｐＨ単位よりも大きいこと、さらには２ｐＨ単位よりも大きいことが好ましい。この方法を適用する分析物の正確な電気泳動の挙動は、分離するサンプルの性質と量、ならびにサンプルの分離に用いる分離媒体に依存する。
【０１５９】
したがって本発明の実施態様では、分離媒体、および／または安定化媒体、および／またはフォーカス媒体を適切に選択することにより、酸性平坦部とアルカリ性平坦部の両方ではなくとも一方の内部に導電率の大きな“壁”が確立される（図１Ｂのそれぞれ領域３と領域５）。得られる酸性プールとアルカリ性プールは、上記の条件下では、いくつかの分析物に関して蓄積効果または濃縮効果を示す。
【０１６０】
例えば図２に示した分離結果は、ｐＨ平坦部と導電率の大きな媒体をフリー・フロー等電点電気泳動法と組み合わせることによって可能になった。３つの画分（ｐＨ枯渇領域の画分すなわち枯渇プールと、酸性プールと、アルカリ性プール）が回収されると、研究者は、その画分のすべて、または一部、または組み合わせに対してさらに調製操作または分析操作をさまざまな方法で実施することができる。方法としては、以下に限られないが、電気泳動（例えばネイティブ・ゲル電気泳動、１Ｄ−ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ）、クロマトグラフィ、ＭＳ、ＮＭＲ、円二色性、ＩＲ分光、ＵＶ分光、生化学的アッセイ（例えば活性アッセイ）などがある。
【０１６１】
本発明の一実施態様では、分離された豊富なタンパク質プールだけが混合物から失われる、または枯渇するように、酸性プールとアルカリ性プールをグループにするまたは再度組み合わせる。次に、組み合わせた酸性プールとアルカリ性プールさらに処理または分析してもよい。例えば組み合わせたプールを例えば電気泳動法（ゾーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動など）を利用してその後分離することができる。場合によっては、最終的に枯渇させる同じタンパク質または場合によっては異なる豊富なタンパク質に合わせたＤＦＥプロトコルを利用し、組み合わせたプールを再び処理することができる。したがって粒子、分析物、タンパク質は、上記の最初の分画化ステップにおいて枯渇状態にされたタンパク質の影響を受けずに電気泳動によって分離または移動する。このようにするとサンプルの複雑さが低下し、したがってより少量のタンパク質を表に出すことが可能になる。したがって１Ｄ−ＰＡＧＥまたは２Ｄ−ＰＡＧＥ分析を利用したサンプルの分析では、豊富なタンパク質が存在していないこと、または通常の濃度ではないことの利益が得られるため、より少量のタンパク質の分解能または可視化を改善することができる。言い換えるならば、上記の技術を利用することで分解能が向上するため、例えば改善されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる同定において少量のタンパク質を表に出すことができる。さらに、非枯渇タンパク質は元々豊富なタンパク質に非特異的に結合している場合があるため、本発明のいくつかの要素を利用すると、以前なら豊富なタンパク質に結合していたであろうタンパク質の測定、処理、分析が可能になろう。
【０１６２】
別の一実施態様では、酸性プールとアルカリ性プールを廃棄してもよく、豊富なタンパク質を含む枯渇領域を回収し、例えば電気泳動法（例えばゾーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動）を利用してさらに分離または分画化する。豊富なタンパク質に最終的に結合するか、豊富なタンパク質の電気泳動移動度の特性と似ているためにその豊富なタンパク質とともに分離されて残った粒子、分析物、タンパク質は、上記の最初の分画化ステップにおいて枯渇状態にされなかったタンパク質の影響を受けずに電気泳動によって分離または移動する。
【０１６３】
ＤＳＥプロトコル
サンプル（一般にタンパク質を含む）の電気泳動による枯渇、分画、富化（ＤＦＥ）のための上記のプロトコルを利用すると、天然状態または変性状態のタンパク質の少なくとも２つの画分（３つの画分がより好ましい）がうまく生成する。その画分のうちの１つは、枯渇させる（すなわちサンプル中の別の分析物から分離する）分析物を含んでおり、残る画分は、その後の処理および／または分析で利用することができる別の分析物を含んでいる。
【０１６４】
枯渇させたタンパク質を除くタンパク質サンプルの全体を分析するため、オプションとしての追加のＩＥＦステップにおいてサンプルを電気泳動によって分離する前に上に説明したＤＦＥプロトコルの酸性プールとアルカリ性プールを再度組み合わせることを選択する代わりに、本発明の実施態様によるＤＳＥプロトコルでは、例えば少量のタンパク質の分離と、例えば豊富なタンパク質の枯渇の両方を、単一ステップの電気泳動で同時に実施することができる。上記の最初のプロトコルと同様、ここに記載するＤＳＥプロトコルにより、フリー・フロー電気泳動法および装置を利用してサンプルから例えば豊富なタンパク質を枯渇させることができるが、このＤＳＥプロトコルには、サンプルの“非枯渇”部分をさらに分離できるという追加の利点もある。これはすべて、単一のＦＦＥ分離試行でなされる。
【０１６５】
ＤＳＥプロトコルは、低濃度の分析物を例えば豊富な分析物（豊富なタンパク質など）からフリー・フローＩＥＦによって分離するのに特に役立つ。一般に、このプロトコルはＤＦＥプロトコルと同等である。枯渇させる豊富な分析物のｐＩは、既知であるか、同定されていなければならない。さらに、ＦＦＥ装置の中でＤＳＥプロトコルのために作り出されるｐＨ機能プロファイルは、混合物中の他の分析物から分離される分析物のｐＩを包含するｐＨ分離平坦部を含んでいる。
【０１６６】
しかしＤＦＥプロトコルとは異なり、ＤＳＥに適したｐＨ機能プロファイルは、アノードとｐＨ分離平坦部の間にあって、隣接するｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さな平均ｐＨを持つｐＨ勾配、および／またはｐＨ分離平坦部とカソードの間にあって、隣接するｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きな平均ｐＨを持つｐＨ勾配をさらに含んでいる。
【０１６７】
ＤＳＥの用途で有用なｐＨ勾配は、通常、０．５ｐＨ単位以上の範囲にわたる。この値は１ｐＨ単位以上であることがときにあり、いくつかの実施態様では、２ｐＨ単位以上、または３ｐＨ単位以上になることさえある。分離する分析物を含む分析物の混合物からなるサンプルをＦＦＥ装置の分離チェンバーの内部でｐＨ分離平坦部に導入した後、その分析物混合物を枯渇させ、電気泳動の電場を印加することによって分離し、その後サンプルから分離された分析物を流出させ、必要に応じて、適切な手段によって装置の分離領域から複数の回収出口を通じて回収する。
【０１６８】
複数の媒体入口が電気泳動チェンバーの入口の端部に配置されている。本発明の一実施態様では、少なくとも５つの入口を利用してさまざまな溶液をチェンバーの中に供給し、本発明の実施態様による方法を実施しやすくする所望のｐＨ機能プロファイルと導電率プロファイルを作り出す。特にこのような既存のＦＦＥ装置では、７つまたは９つの入口を利用してさまざまな分離媒体、安定化媒体、フォーカス媒体を分離チェンバーに供給することが好ましい。本発明の実施態様に関する実験を行なうのに用いるＦＦＥ装置の設計では、７つまたは９つの入口を利用することが現在のところ好ましいが、入口の数が７または９に限定されることはなく、５、６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の入口を備えていて、それらを用いて所望のｐＨ機能プロファイルを形成することもできる。
【０１６９】
電圧をアノードとカソードの間に印加すると電流が分離緩衝液と分離媒体の中を流れるため、電気泳動のカーテンが電極間に確立され、図４Ｂと図７に図示したようなｐＨ機能プロファイルと導電率プロファイルが形成される。
【０１７０】
入口を通じて導入されるさまざまな媒体は、一旦安定化してその媒体領域および隣接した媒体領域の電気泳動移動特性と安定化特性に基づいてｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する機会があると、それぞれの組成物領域を形成する。言い換えるならば、入口１を通じて導入される媒体は領域１を形成し、入口Ｎを通じて導入される媒体は領域Ｎを形成する。ここにＮは、本発明の実施例に示してあるように１〜７の整数だが、他の実施態様では、ＦＦＥ装置に設ける媒体入口の数に応じて１〜８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４０、またはそれ以上であってもよい。さらに、２つ以上の入口を用いて単一の組成物領域を形成できることが容易にわかる（すなわち同一の媒体を隣り合ったいくつかの媒体入口を通じてＦＦＥ装置に導入する）。
【０１７１】
ＤＳＥプロトコルに関しては、ＤＳＥにとって望ましいｐＨプロファイルを実現する上で、３つの異なる領域に対応して（３つの異なる媒体入口を通じて導入される）少なくとも３種類の異なる分離媒体が必要とされることが容易にわかる。同じことが一般にＤＦＥプロトコルに当てはまるが、ｐＨ平坦部に隣接する２つのｐＨ機能は、安定化媒体または電極間安定化媒体によって形成することもできる（このようにすると、複数の分離領域を並列モードで動作させるときにＤＦＥプロトコルで必要とされる異なる媒体の数が少なくなる）。
【０１７２】
領域間の境界は、各領域の媒体の電気化学的特性と、媒体の性質に基づいてどの程度まで重複が可能であるかとに応じ、明確であったり明確でなかったりする。入口の組成物と組成物領域はｐＨがさまざまであるため、等電点電気泳動モードをそれぞれＤＦＥとＤＳＥに適したｐＨ機能プロファイルの形成中と形成後に電気泳動チェンバーの中で実施することができる。
【０１７３】
ＤＳＥプロトコルを示す本発明の一実施態様を図４に示してある、本発明のこの実施態様では、ｐＨ分離平坦部が、例えば図４Ｂに示した領域４に主として形成される。ｐＨ分離平坦部を構成する分離媒体と緩衝溶液の組成は、枯渇させる分析物のｐＩに合わせて選択するが、“平坦部”は、一般に、分析物（例えば枯渇させたいタンパク質（例えば豊富なタンパク質））の等電点を包含するある小さな範囲のｐＨを示す。図４Ｂに示した枯渇領域（領域４）のｐＨの傾斜はゼロだが、実際には傾斜があってこの領域にｐＨの上限と下限が含まれていてもよく、枯渇させるタンパク質は、選択されたｐＨ範囲内で正味がゼロの電荷が維持されるような元来の等電点（ｐＩ）を有する。したがって、緩衝系で用いる化学物質の濃度と数に応じ、ｐＨ勾配の傾斜をゼロから小さなｐＨ幅の傾斜まで変化させることができる。
【０１７４】
ｐＨ分離平坦部と一方の電極の間に配置される追加の領域は、ｐＨ分離平坦部とは異なるｐＨプロファイルを持つため、ｐＨ分離平坦部に留まるのに必要なｐＩとは異なるｐＩを持つ、ｐＨ分離平坦部に注入または導入される両性分析物の移動を可能にする。したがってその粒子はｐＨ分離平坦部から一方の電極へと遠ざかるように移動する。より詳細には、ｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さなｐＩを持つ両性分析物は、ｐＨ分離平坦部の中に置かれたときに負の正味電荷を持つため、あらゆる非両性アニオンとともにアノードに向かって移動する。さらに、ｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きなｐＩを持つ両性分析物は、ｐＨ分離平坦部の中に置かれたときに正の正味電荷を持つため、あらゆる非両性カチオンとともにカソードに向かって移動する。
【０１７５】
本発明のＤＳＥのいくつかの実施態様では、ｐＨ分離平坦部に隣接する両方の領域が、ｐＨ分離平坦部とは異なるｐＨ勾配プロファイルを持ち、ｐＨ分離平坦部を形成する分離媒体の隣に注入または導入される分離媒体と緩衝液が何であるかに応じて、酸性またはアルカリ性のｐＨ勾配（直線勾配が好ましい）を形成する。ｐＨ分離平坦部とアノードに挟まれた空間に導入される媒体は、アノードからｐＨ分離平坦部に向かうより酸性のｐＨ勾配を主として形成し、ｐＨ分離平坦部とカソードの間に導入される媒体は、ｐＨ分離平坦部から出てカソードに向かって増えるよりアルカリ性のｐＨ勾配を形成する。より酸性のｐＨ勾配は、分離することを望むあらゆるタンパク質のうちで、枯渇させるタンパク質のｐＩ範囲としてｐＨ分離平坦部について選択したｐＩよりも小さなｐＩを持つものに適合したｐＨ範囲と緩衝能力を持たねばならず、アルカリ性のｐＨ勾配は、分離することを望むあらゆるタンパク質のうちで、枯渇させるタンパク質のｐＩ範囲としてｐＨ分離平坦部について選択したｐＩよりも大きなｐＩを持つものに適合したｐＨ範囲と緩衝能力を持たねばならない。
【０１７６】
この明細書で説明したＤＳＥプロトコルにより、酸性勾配領域とアルカリ性勾配領域を形成し、ｐＨ分離平坦部によって確立された枯渇プールの実質的に隣に位置させることができる。この明細書の実施例２では、ｐＨ分離平坦部のｐＨは、ヒト血漿中で最も豊富なタンパク質の１つであるアルブミンのｐＨ（ｐＩが約４．８）となるように選択した。ｐＨ分離平坦部のｐＨはアルブミンのｐＩに対応するように選択されるため、アルブミンは枯渇プールの中に維持されるのに対し、ｐＨ分離平坦部のｐＨ範囲の外にあるｐＩを持つタンパク質は、そのタンパク質のｐＩに応じ、電気泳動によってアノードまたはカソードに向かう。
【０１７７】
別の豊富なタンパク質の枯渇を想定する別の実施態様では、ｐＨ分離平坦部のｐＨを選択するにあたり、最終的に枯渇させようとするタンパク質混合物はｐＨ分離平坦部の中に留まる一方で、異なるｐＩを持つ分析物はそのｐＨ分離平坦部の中に留まらず、そのｐＩと周囲媒体のｐＨの差によって生じる正味の電荷のためにそのｐＨ分離平坦部から離れていくように選択できる。
【０１７８】
サンプル中の粒子またはタンパク質は、ｐＨ勾配が確立した後にｐＨ分離平坦部に注入または導入すると、正味の電荷が実質的にゼロになる等電点に達するまで自然に移動を続けると考えられるため、電気泳動による非両性イオン種の移動を停止させる、または引き止めるとともに、等電点が一般に酸性緩衝領域の最低ｐＨ領域の等電点よりも低い粒子またはタンパク質と、一般にアルカリ性緩衝領域の等電点よりも高い粒子またはタンパク質の電気泳動による移動を停止させる、または引き止める必要がある。したがって本発明のいくつかの実施態様では、分離媒体、および／または安定化媒体、および／またはフォーカス媒体は、ｐＨ機能プロファイルの内部においてｐＨ勾配の内部または近傍に、導電率の大きな“壁”が確立されるように適切に選択する。実際的な理由により、ｐＨ勾配領域とアノードの間と、ｐＨ勾配とカソードの間とに、フォーカス媒体および／または安定化媒体をそれぞれ供給することが望ましかろう。このような設定は、例えば図４Ｂに示してある。
【０１７９】
酸性領域とアルカリ性領域の内部に配置されているか、これらの領域に隣接して配置されているある種の緩衝液は導電率が大きいため、粒子またはタンパク質の移動が阻止され、したがってさらにアノードとカソードに向かう望ましくない移動を制御することができる。
【０１８０】
したがってこの明細書でフォーカス媒体として言及した媒体は、それぞれアノード領域とカソード領域において、酸性ｐＨ機能とアルカリ性ｐＨ機能の一方または両方の内部または近傍、またはｐＨ勾配の内部または近傍に導電率の大きな“壁”が確立されるように設計することができる。したがって導電率の大きな壁を形成するこのようなフォーカス媒体を用いると、酸性勾配のｐＩよりも小さくてアルカリ性勾配のｐＩよりも大きなｐＩを持つタンパク質サンプルの濃度は、ユーザーがどこにその導電率を確立したいかに応じた影響を受ける。
【０１８１】
ＤＦＥ／ＤＳＥの後の画分の利用
分離された画分をすべて回収すると、研究者は、その画分の全部または一部に対してさらに調製操作を実施することができ、場合によってはさまざまな方法でその画分を分析することもできる。
【０１８２】
本発明の一実施態様では、研究者は、酸性勾配とアルカリ性勾配において回収されたサンプルを電気泳動によってさらに分離することにより、最初のＤＳＥステップで枯渇させたタンパク質を差し引いた全回収タンパク質を電気泳動で分離することができる。
【０１８３】
本発明の別の一実施態様では、研究者は、枯渇させることを望むタンパク質に関係する複数のｐＨ平坦部を選択することにより、どのタンパク質を枯渇させるかを調節することができる。例えば枯渇させる候補であるアルブミン（本来のｐＩは約４．８）と、トランスフェリンの最も豊富なアイソフォームの１つ（そのｐＩは５．４）を分離することを選択するのであれば、研究者は、媒体と緩衝系を設計して２つの枯渇のｐＨ平坦部をそれぞれ４．８と５．４の位置に作り出すことができ、そのときアノードと４．８平坦部に挟まれた領域、４．８平坦部と５．４平坦部に挟まれた領域、５．４平坦部とカソードに挟まれた領域では、上昇するｐＨ勾配となる。このような設定では、分離平坦部の中またはその近傍に導入されるタンパク質混合物は、それぞれのｐＩに従って移動し、アルブミンはｐＨ４．８平坦部に移動してそこに留まり、トランスフェリンのアイソフォームはｐＨ５．４平坦部に移動してそこに留まる。
【０１８４】
すべての画分が回収され、ｐＨ４．８分離平坦部とｐＨ５．４分離平坦部に回収されたタンパク質が廃棄されると、研究者は、分析で利用されず分離平坦部により決定される豊富な複数のタンパク質が少なくなっている、等電点電気泳動によって分離されたサンプルからタンパク質混合物を分析することができる。言い換えるならば、後で行なう分析中に利用されないｐＨ平坦部の両方の領域により、タンパク質サンプルから枯渇させた豊富な複数のタンパク質が存在しない、タンパク質混合物を分析することができる。
【０１８５】
ＤＦＥプロトコルまたはＤＳＥプロトコルに従って回収した流出サンプルは、その全体または一部をさらに処理し、または分画化し、または組み合わせて、そして多彩な分離法（例えばゾーン電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動などの電気泳動法）でさらに分離するのに使用できる。
【０１８６】
ＤＦＥプロトコルと同様、ＤＳＥプロトコルにより、上に説明したＤＳＥ分離ステップの間に分離されたタンパク質に影響を与えることなく、粒子またはタンパク質を電気泳動によって分離または移動させることができる。したがってこのプロトコルによりサンプルの複雑さを低下させ、より豊富なタンパク質が存在しているためにそれまで可視化が妨げられていたより少量のタンパク質を表に出すことができる。したがって１Ｄ−ＰＡＧＥまたは２Ｄ−ＰＡＧＥ分析を利用したサンプルの分析は改善され、より少量のタンパク質の分解能または可視化が改善される。要するに、上記の方法を利用すると、少量のタンパク質を表に出すことによって分解能を向上させることができる。特に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳと、下流の１Ｄまたは２Ｄのゲル電気泳動分析が改善される。
【０１８７】
上の説明から、本発明のいろいろな方法を自由に組み合わせることで、その中でも特にＦＦＥ装置の分離チェンバーの中で所望する任意のｐＨプロファイルを実現するのに用いるさまざまな媒体を自由に組み合わせることで、フリー・フロー電気泳動法を非常に柔軟にできることが容易にわかるであろう。例えば、アノード側にｐＨ勾配が隣接し、カソード側にｐＨ平坦部が隣接した、またはその逆になったｐＨ分離平坦部を含むｐＨ機能プロファイルを作り出すことができる（このようなプロトコルは、組み合わせＤＦＥ／ＤＳＥプロトコルと呼ぶことができよう）。
【０１８８】
さらに、さまざまなプロトコル（例えばＤＦＥやＤＳＥ）をいくつかのＦＦＥ分離ステップにおいて順番に組み合わせることもできる。例えばＤＦＥプロトコルを利用してＦＦＥ分離ステップを実施し、そこから回収された画分に対し、同じプロトコルまたは異なるプロトコル（すなわち、緩衝系、ｐＨ機能、ｐＨ平坦部などが同じ、または異なる）を利用した別のＦＦＥ分離ステップを実施することができる。したがってＤＳＥ／ＤＳＥ、ＤＦＥ／ＤＳＥ、ＤＳＥ／ＤＦＥ、ＤＦＥ／ＤＦＥというプロトコルの組み合わせや、これらプロトコルまたはプロトコルの組み合わせのうちの任意のものをこの明細書または公知文献に記載されているさらに別のＦＦＥプロトコルと組み合わせたものも、この明細書では具体的に考慮される。
【０１８９】
並列分離モード
本発明のさらに別の一実施態様では、２つ以上のサンプルに由来する分析物組成物から分離しようとする１つ以上の分析物をフリー・フロー電気泳動によって同時に分離する方法およびプロトコルとして、
必要に応じ、分析物組成物から分離する１つの分析物のｐＩを同定するステップと；
フリー・フロー電気泳動（ＦＦＥ）チェンバーの中で単一のアノードと単一のカソードの間に、Ｎ個の分離領域と、それぞれの分離領域を隣接した各分離領域から隔てる（Ｎ−１）個の電極間安定化媒体とを含むｐＨ機能プロファイルを形成するステップと；
ここで、各分離領域は、ｐＨが分離する各分析物の等電点（ｐＩ）に実質的に対応していて、ｐＨの範囲が上限ｐＨと下限ｐＨによって限定されているｐＨ分離平坦部と、そのｐＨ分離平坦部のアノード側に隣接していて、そのｐＨ分離平坦部のｐＨよりも小さな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部よりも大きな導電率を持つｐＨ機能と、そのｐＨ分離平坦部のカソード側に隣接していて、その第１のｐＨ分離平坦部のｐＨよりも大きな平均ｐＨを持つおよび／またはそのｐＨ分離平坦部のよりも大きな導電率を持つｐＨ機能とを備えており；
分析物組成物から分離する１つの分析物を含む各サンプルを個別に、ＦＦＥチェンバーの１つの分離領域（各分離領域には、分析物組成物から分離するその分析物をその分離領域において分離するのに適したｐＨ分離平坦部が含まれている）のｐＨ分離平坦部、そのｐＨ分離平坦部のアノード側の領域、またはそのｐＨ分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと；
ＦＦＥチェンバーから分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を１つまたは複数の画分として回収するステップを含む方法が想定される。
【０１９０】
この実施態様の一例では、並列ＤＦＥプロトコルまたは並列ＤＳＥプロトコルの２つの分離領域を形成する。そのときそれぞれの領域には、ｐＨ分離平坦部と、そのｐＨ分離平坦部に隣接したアノードｐＨ機能およびカソードｐＨ機能とが含まれている。アノードまたはカソードという用語の使用は、所定の領域、機能、または平坦部と、それぞれアノードおよびカソードに挟まれた対応する名称の領域／機能または平坦部の相対位置を意味することが容易にわかるであろう。例えばＦＦＥチェンバーに導入する媒体の典型的な順序は、（ＦＦＥ装置のアノードからカソードに向かって）アノード安定化媒体、場合によっては存在するフォーカス媒体、第１のｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体、第１のｐＨ分離平坦部を形成する媒体、第２のｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体、場合によっては存在するフォーカス媒体を形成する媒体、カソード電極間安定化媒体、アノード電極間安定化媒体、場合によっては存在するフォーカス媒体、第３のｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体、第２のｐＨ分離平坦部を形成する媒体、第４のｐＨ機能またはｐＨ勾配を形成する媒体、場合によっては存在するフォーカス媒体、そしてカソード安定化媒体になろう。この順番は、３つ以上の分離領域を持つプロトコルに拡張することができる。本発明のいくつかの実施態様すなわちＤＦＥプロトコルでは、電極間安定化媒体はフォーカス媒体として機能することが可能なため、実施例３に示したようにｐＨ分離平坦部とその電極間安定化媒体に挟まれたｐＨ機能を除くことができる。並列ＦＦＥ分離法の分離領域は、隣接するｐＨ機能またはｐＨ平坦部よりも導電率が大きな電極間安定化媒体によって隔てられている。したがって並列ＦＦＥ分離法は、２つ以上のサンプルから分析物を同時に分離するのに適している。各サンプルは、所定の分離領域の中に形成されたｐＨ分離平坦部に導入されることが好ましい。しかし場合によっては、サンプルをその分離領域のアノードｐＨ機能またはカソードｐＨ機能に導入することもできる。
【０１９１】
ＮはＦＦＥチェンバー内の分離領域の数であり、２以上の整数である。この数は、本質的にＦＦＥ装置の設計、特に異なる媒体入口の数によってのみ制限される。したがって並列な分離の数は一般に２〜５だが、少なくとも原則としてそれよりも数を増やすことが可能であり、いくつかの実施態様では、ＦＦＥ装置の単一のアノードとカソードの間で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の並列な分離を同時に実施できる。言い換えるならば、Ｎの典型値は２〜９の整数であり、２〜７がより好ましく、２〜５が最も好ましい。
【０１９２】
分離領域では、ＤＦＥ分離法、またはＤＳＥ分離法、またはこれらの組み合わせを利用する。上に説明したのと同じ媒体を本発明の並列分離法で用いることができる。したがって当業者にとって、１．ＤＦＥとＤＦＥ、２．ＤＦＥとＤＳＥ、３．ＤＳＥとＤＦＥ、４．ＤＳＥとＤＳＥのため、さまざまな分離領域に個別にｐＨ機能を組み込めることは明らかであろう。さらに別の組み合わせも可能であってこの明細書で考慮される。それは例えば、第１の分離領域が（ＤＦＥ）ｐＨ機能を第１のｐＨ分離平坦部の一方の側に備え、（ＤＳＥ）ｐＨ勾配をその第１のｐＨ分離平坦部の他方の側に備え（またはその逆）、第２の分離領域が１つのＤＦＥ  ｐＨ機能を第２のｐＨ分離平坦部の一方の側に備え、ＤＳＥ  ｐＨ勾配をその第２のｐＨ分離平坦部の他方の側に備える（またはその逆）場合である。
【０１９３】
さらに、本発明の実施態様で用いるＦＦＥ装置に設ける媒体入口の数に応じ、分離チェンバー内の異なる分離領域の数を増やして３、４、５、またはそれ以上にすることが可能であろう。上述のように、ＤＳＥタイプの分離領域では、３つの媒体入口が一般に必要とされる。言い換えるならば、異なる２つのＤＳＥ分離領域に供給するための媒体入口の数は１０になろう。各分離領域は３つの入口を有する。２つの入口は電極間安定化媒体（その中にはアノード電極間安定化媒体とカソード電極間安定化媒体が含まれる）のために使用され、それぞれの側の１つの入口は、第１の分離領域とアノードに挟まれたアノード安定化媒体と、第２の分離領域とカソードに挟まれたカソード安定化媒体をそれぞれ形成するのに用いられる。同じ原理を適用することにより、３つの異なるＤＳＥ分離領域だと、すべての媒体（その中には分離媒体、電極間媒体、安定化媒体が含まれる）のためには合計で少なくとも１５の入口がＦＦＥ装置に必要となろう。
【０１９４】
上に説明したように、所定数の媒体入口あたりの異なるＤＦＥ分離領域の数は、少しだけより多くすることができる。なぜなら電極間安定化媒体は、導電率が大きいためにフォーカス媒体としても同時に機能しうるからである。例えば１５の異なる媒体入口を有するＦＦＥ装置は、４つの電極間安定化媒体（それぞれに２つの媒体入口）によって隔てられた５つのｐＨ分離平坦部と、アノード安定化媒体と、カソード安定化媒体とを備えることができる。
【０１９５】
このような説明の後には、当業者には他の可能性が明らかであろう。いずれの場合にも、この明細書で説明した並列分離モードでは、３つ以上の電極を使用することが排除されているわけではなく、複数の分離領域または分画化領域を一対の電極の間に配置し確立する実施態様を記載している。
【０１９６】
並列分離モードの一実施態様を図７に示してある。この図では、２つの異なる分離領域がＦＦＥ装置の分離チェンバーの中に配置されている（図７は、電気泳動を実施している間の媒体のｐＨプロファイルと導電率プロファイルを示している）。図７から明らかなように、この実施態様で用いる緩衝液は、各分離平坦部に隣接した領域にｐＨ勾配を形成することができる。言い換えるならば、図７は、ＤＳＥタイプの２つの分離領域を持つ並列モードの分離を示している。
【０１９７】
並列モードは、さまざまな状況（例えば臨床における多数の資料サンプルの分析／調製）で特に有用であることが理解されよう。あるいは同じサンプルまたは異なるサンプルから豊富なさまざまな分析物を枯渇させることができる。この方法では、２つ以上の分離平坦部のｐＨは、一般に、ＦＦＥ装置内の他方の分離平坦部とは異なるように選択される。
【０１９８】
キットと電気泳動媒体組成物
当業者には、この明細書で想定される分離媒体は、選択できること、調製できること、単独で使用でするか、他の安定化媒体、フォーカス媒体、分離媒体とそれぞれ組み合わせて使用できることが明らかであろう。
【０１９９】
したがって本発明の別の特徴は、ＦＦＥ法（例えば本発明の実施態様によるＤＦＥまたはＤＳＥ）を実施するためのキットにも関する（このキットは、所望の方法を実施するための電気泳動用分離媒体を含んでいる）。通常は少なくとも３つの異なる分離媒体がＤＦＥとＤＳＥの両方の用途で必要であることが理解されよう。この文脈では、ｐＨ分離平坦部に隣接する２つの媒体が、安定化媒体および／またはフォーカス媒体としての特性も持ちうることに注意されたい。
【０２００】
本発明の実施態様に従ってＦＦＥ分離法を実施するためのキットは、３種類以上の分離媒体に加え、上記の少なくとも１種類の安定化媒体をさらに含むことができる。安定化媒体は、カソード安定化媒体またはアノード安定化媒体であってよい。安定化媒体は、一般に、それぞれアノード／カソードと分離媒体の間に配置される。
【０２０１】
本発明の一実施態様では、安定化媒体は、２つのｐＨ機能プロファイルの間に位置する。安定化媒体は、一般に、導電率が分離媒体の導電率よりも大きいことを特徴とする。導電率は、２倍の大きさにすることができる。倍率は３倍であることが好ましく、３倍より大きいことが最も好ましい。分離媒体と安定化媒体の導電率の差は、すでに詳しく説明したように、さまざまな方法によって、例えば安定化媒体に導電性イオンをさらに添加すること、または安定化媒体に含まれる緩衝化合物の濃度を大きくすることによって実現される。
【０２０２】
安定化媒体の導電率は隣接する分離媒体の導電率よりも大きいが、安定化媒体のｐＨは、分離の状況に応じ、隣接する分離媒体のｐＨよりも大きい、そのｐＨとほぼ等しい、またはそのｐＨよりも小さいことが可能である。安定化媒体の緩衝化合物は、分離媒体の緩衝化合物と同じでも異なっていてもよい。
【０２０３】
アノードとカソードの安定化は、両方とも特にＦＦＥにおける電気泳動がうまくいく上で特に有用であるため、キットは、分離媒体に加え、この明細書で規定した１種類のアノード安定化媒体と１種類のカソード安定化媒体を含むことが好ましい。
【０２０４】
さらに別の一実施態様では、キットは、電気泳動による所定の分離に必要なあらゆる媒体、すなわちアノード安定化媒体、カソード安定化媒体、分離媒体（すでに説明したようにいくつかの下位画分からなる）を含むことになる。このような実施態様では、分離媒体と安定化媒体は、もちろん目的とするプロトコルで役立つように選択される。
【０２０５】
キットは、さまざまな媒体をそのまま使用される１種類以上の水溶液として含むこと（すなわちすべての成分が、電気泳動による分離にとって望ましい濃度で存在する）、または使用前に所定量の溶媒を用いて希釈される濃縮溶液の形態になった１種類以上の媒体を含むことができる。あるいはキットは、媒体のさまざまな成分を含む乾燥形態または凍結乾燥形態になった１つ以上の媒体をいくつかの容器（１つの容器が好ましい）に入れて含んでもよい。その媒体は、その後、電気泳動による分離プロセスで使用する前に所定量の溶媒を用いてもどされる。
【０２０６】
この明細書に記載した好ましい分離媒体のすべてに加え、好ましいカソード安定化媒体および／またはアノード安定化媒体とフォーカス媒体が本発明のキットに含まれることが理解されよう。
【０２０７】
各媒体（分離媒体、カソード安定化媒体、アノード安定化媒体、向流媒体）は別々の容器に存在していることが一般に好ましいが、当業者には、他の組み合わせや包装を選択できること、そしてある状況ではそれが有用であることは明らかであろう。例えばＩＥＦの用途での分離媒体は、上に説明したように、電気泳動装置の中にｐＨ勾配をあらかじめ作り出すため、成分の濃度が異なる（したがってｐＨが異なる）決まった数の“下位画分”からなっていてもよい。一実施態様では、勾配の形成に用いる各分離媒体のｐＨは異なっている。ＩＥＦの用途で用いる下位画分の数は、分離と、分離媒体によって実現される所望のｐＨの範囲と、分離に用いる電気泳動装置とに依存することになろう。ＦＦＥの用途では、装置は一般にいくつかの媒体入口（例えばＮ＝７、８、９個の入口）を備えているため、装置内で分離空間を作り出す下位媒体は、少なくとも１つの入口〜最大で（Ｎ−２）個の入口（安定化媒体（存在する場合）のためにそれぞれの側に少なくとも１つの入口が通常は確保される）に導入することができる。したがってＦＦＥに適した装置に挿入することのできる分離媒体の数は、一般に２〜１５、または３〜１２、または４〜９である。
【０２０８】
一実施態様では、キットに含まれる分離媒体は、１つのｐＨ分離平坦部と、そのｐＨ分離平坦部の隣にある２つのｐＨ機能を形成することになる。別の一実施態様では、分離媒体は、１つのｐＨ分離平坦部と、そのｐＨ分離平坦部の隣にある２つのｐＨ勾配を形成することになる。さらに別の一実施態様では、これら２つの方法を組み合わせて、ｐＨ分離平坦部と、その平坦部のアノード側のｐＨ機能（例えばｐＨ段差）およびカソード側のｐＨ勾配（またはその逆）とが含まれるようにすることが可能である。本発明の別の実施態様では、分離媒体が複数のｐＨ機能プロファイルを形成する。すなわちｎ個のｐＨ分離平坦部のそれぞれの側にｐＨ機能またはｐＨ勾配がそれぞれ隣り合う。この場合、さまざまなｐＨ機能プロファイルは、電極間安定化媒体または電極間安定化領域によって隔てられる（その媒体または領域自体は、すでに詳細に説明したようにカソード部分とアノード部分から構成される）。
【０２０９】
特に好ましい一実施態様では、キットに含まれる分離媒体は、１種類の緩衝酸と１種類の緩衝塩基だけを含む二元緩衝系によって構成される。この明細書に記載したすべての分離媒体を、それが好ましいかどうかに関係なく、本発明のキットに含めることが想定される。
【０２１０】
当業者には、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、この明細書に記載した実施態様に対して多くの変更やバリエーションが可能であることは明らかであろう。本発明とその利点を例示としての以下の実施例でさらに説明する。
【実施例】
【０２１１】
例１：ＤＦＥプロトコルに従うヒト血漿の分離
この実施例では、ＤＦＥプロトコルによるゲル、支持マトリックス、または担体がないＦＦＥ電気泳動法とこの方法を実施するのに適した装置を利用し、豊富なタンパク質（ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）をヒト血漿サンプルから分離することを示す。天然状態のヒト血漿を、図１Ａに示した装置の媒体入口４の媒体を用いて１：１０に希釈し、サンプル装填速度５ｍｌ／時間でサンプル入口４を通じて分離領域に注入または導入する。
【０２１２】
以下の媒体を装置に導入した：
媒体入口１と２：１００ｍＭの硫酸＋１０％グリセロール（ｐＨ１．３０）
媒体入口３：２００ｍＭの２−アミノ−ブチル酸、１００ｍＭのグルコン酸、５０ｍＭのピリジンエタンスルホン酸（ＰＥＳＳ）、３０ｍＭのグリシルグリシン、１０％グリセロール（ｐＨ３．３９）
媒体入口４：３０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのグリシルグリシン、１０％グリセロール（ｐＨ４．９２）
媒体入口５：２００ｍＭのＭＯＰＳＯ、２０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのβ−アラニン、５０ｍＭのＢＩＳＴＲＩＳ、１０％グリセロール（ｐＨ６．０６）
媒体入口６と７：１００ｍＭのＮａＯＨ＋１０％グリセロール（ｐＨ１１．８０）
【０２１３】
場合によっては、特に連続調製動作モードの間に、１０％グリセロールを含む蒸留水からなる組成物を複数の向流入口を通じて向流で注入または導入することができる。この任意選択ステップは、特に出口から出口へのサンプルの正確な管理が必要な場合に、目指す出口へのサンプルと分離媒体の流れを増大させることができる。
【０２１４】
ｐＨ分離平坦部は、図１Ａによる装置の媒体入口４を通じて導入される分離媒体によって形成される。サンプルは、専用のサンプル入口を通じ、形成されたｐＨ分離平坦部に導入することができる。サンプルは、場合によっては、媒体入口３〜５を通じて導入される分離媒体によって規定される分離領域に隣接したアノードｐＨ機能またはカソードｐＨ機能に導入することができる。ｐＨ分離平坦部に隣接するｐＨ機能は、媒体入口３と５を通じて導入される分離媒体によって形成される。フォーカス媒体および／または安定化媒体は、媒体入口１、２、６、７を通じて導入することができる。領域１と２の間と領域６と７の間の緩衝組成物、したがって導電率プロファイルとｐＨプロファイルはこの実験では変化しないが、例えばフォーカス媒体を領域６に導入し、安定化媒体を領域７に導入する場合にはこれらのプロファイルが変化する可能性がある。
【０２１５】
図２は、ＤＦＥ等電点電気泳動プロセスの有効な結果を示している。ここでは、分画化チェンバーの出口で回収された流出サンプルを測定または分析することを通じて３つのｐＨプールまたは画分が蓄積している。各回収サンプル出口のｐＨ測定値とｐＩマーカーの濃度の測定値を図２に示してある。この図は、導電率の“壁”の原理と影響を証明している。
【０２１６】
図２に示した分離結果は、枯渇領域に隣接する媒体の導電率が大きいことを利用するとともに、図１Ｂと図２に示したｐＨプロファイルを用意することによって実現した。
【０２１７】
図３は、上に説明したＤＦＥプロトコルに従って分画化したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。画分の番号とＭＷマーカーを示してある。枯渇領域（ｐＨ分離平坦部。図２ではアルブミン・プールと表記してある）に対応する画分からアルブミン（約６６ｋＤａ）がうまく枯渇したことが容易にわかる。さらに、アルブミンのｐＨ範囲を含むゲル画分内には、アルブミンとは分子量が異なるタンパク質群がわずかに存在していることが観察される。これらのタンパク質は、枯渇領域内での電気泳動移動度が非常に小さいために枯渇領域を完全に離れることができない。
【０２１８】
ｐＨ分離平坦部のｐＩをアルブミンに対応するように選択したため、アルブミンは枯渇プールの中に維持され、ｐＩがｐＨ分離平坦部のｐＨの外にあるタンパク質は、酸性領域とｐＨ分離平坦部の界面、およびアルカリ性領域とｐＨ分離平坦部の界面にそれぞれ回収された（４０近傍の画分と６０近傍の画分）。
【０２１９】
この方法により、ｐＨ分離平坦部の上限ｐＨと下限ｐＨの間に留まることのできるｐＩを持つあらゆるタンパク質を実質的に分離できる。３つの画分（ｐＨ枯渇領域の画分すなわち枯渇プール、酸性プール、アルカリ性プール）が回収されると、研究者は、その画分のすべて、または一部、または組み合わせに対してさらに調製操作または分析操作をさまざまな方法で実施することができる。方法としては、以下に限られないが、電気泳動（例えば別のＦＦＥ分離、ネイティブ・ゲル電気泳動、１Ｄ−ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ）、クロマトグラフィ、ＭＳもしくはカップルしたＭＳ、ＮＭＲ、円二色性、ＩＲ分光、ＵＶ分光、生化学的アッセイ（例えば活性アッセイ）またはこれらの組み合わせがある。
【０２２０】
例２：ＤＳＥプロトコルに従うヒト血漿の分離
この実施例では、ＤＳＥプロトコルによるゲル、支持マトリックス、または担体がないＦＦＥ電気泳動法とこの方法を実施するのに適した装置を利用し、豊富なタンパク質（ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）をヒト血漿サンプルから分離することを示す。天然状態のヒト血漿を、図４に示した装置の媒体入口４の媒体を用いて１：１０に希釈し、サンプル装填速度５ｍｌ／時間でサンプル入口４を通じて分離領域に注入または導入する。
【０２２１】
以下の媒体を装置に導入した：
媒体入口１：１００ｍＭの硫酸：１０％グリセロール
媒体入口２：１００ｍＭの硫酸：１０％グリセロール
媒体入口３：２５％ＢＤ  ＦＦＥ分離緩衝液１＋１０％グリセロール
媒体入口４：３０ｍＭのＭＥＳ；１００ｍＭのグリシルグリシン；１４％ＢＤ  ＦＦＥ分離緩衝液２；１０％グリセロール
媒体入口５：２５％ＢＤ  ＦＦＥ分離緩衝液２＋１０％グリセロール、（ｐＨ６．９４）
媒体入口６：１５０ｍＭのＮａＯＨ＋５０ｍＭのエタノールアミン、１０％グリセロール
媒体入口７：１５０ｍＭのＮａＯＨ＋５０ｍＭのエタノールアミン、１０％グリセロール
【０２２２】
場合によっては、特に連続調製動作モードの間に、１０％グリセロールを含む蒸留水からなる組成物を複数の向流入口を通じて向流で注入または導入することができる。この任意選択ステップは、特に出口から出口へのサンプルの正確な管理が必要な場合に、目指す出口へのサンプルと分離媒体の流れを増大させることができる。
【０２２３】
ｐＨ分離平坦部は、図４Ａによる装置の媒体入口４を通じて導入された分離媒体によって形成される。ｐＨ分離平坦部に隣接するｐＨ機能は、媒体入口３と５を通じて導入される分離媒体によって形成される。サンプルは、専用のサンプル入口を通じ、形成されたｐＨ分離平坦部に導入することができる。サンプルは、場合によっては、媒体入口３〜５を通じて導入される分離媒体によって規定されるｐＨ分離平坦部（分離領域）に隣接したアノードｐＨ機能またはカソードｐＨ機能に導入することができる。フォーカス媒体および／または安定化媒体は、媒体入口１、２、６、７を通じて導入することができる。領域１と２の間と領域６と７の間の緩衝組成物、したがって導電率プロファイルとｐＨプロファイルはこの実験では変化しないが、例えばフォーカス媒体を領域６に導入し、安定化媒体を領域７に導入する場合にはこれらのプロファイルが変化する可能性がある。
【０２２４】
図５に示した分離結果は、一般的な等電点電気泳動法において、枯渇させることを望むｐＨ範囲での緩衝能力を特に大きくすることによって実現した。ｐＨプロファイルと導電率プロファイルは図４Ｂに示してある。回収した画分のｐＨとｐＩマーカー（対照）の分布は図５に示してある。さらに図５には、回収した画分に対する媒体入口１〜７のおおまかな位置も示してある。図５のフェログラムからわかるように、ｐＨ３．５〜４．７とｐＨ５〜９での直線状のｐＨプロファイルは、この実施例で説明した設定と媒体によって実現した。アルブミンは領域４に残ったが、領域４とは異なるｐＩを持つ帯電種は、個々のｐＩの値に応じ、領域３と５に向かって移動する。
【０２２５】
図６は、上に説明したＤＳＥプロトコルに従って分画化したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。画分の番号とＭＷマーカーも示してある。枯渇領域（ほぼ画分３９から５０の間）に対応する画分からアルブミンがうまく枯渇したことが容易にわかる。さらに、この実施例で説明したＤＳＥプロトコルを適用することにより、アルカリ性プールに含まれるタンパク質の実質的な分離が観察された。
【０２２６】
図６からわかるように、回収された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンは、所定のウエルにアルブミンを分離することで、ヒト血清アルブミンのｐＩに対応するｐＨ範囲の外側に来る低濃度のタンパク質を識別できたことを示している。さらに、アルブミンのｐＨ範囲を含むゲル画分内には、アルブミンとは分子量が異なるタンパク質群がわずかに存在していることが観察される。これらのタンパク質は、枯渇領域内での電気泳動移動度が非常に小さいために枯渇領域を完全に離れることができない。
【０２２７】
分離されたすべての画分が回収されると、研究者は、その画分のすべて、または一部に対してさらに調製操作または必要に応じて分析操作をさまざまな方法で実施することができる。方法としては、以下に限られないが、電気泳動（例えば別のＦＦＥ分離、ネイティブ・ゲル電気泳動、１Ｄ−ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ）、クロマトグラフィ、ＭＳもしくはカップルしたＭＳ、ＮＭＲ、円二色性、ＩＲ分光、ＵＶ分光、生化学的アッセイ（例えば活性アッセイ）またはこれらの組み合わせがある。
【０２２８】
例３：２つのサンプルからの分析物の並列ＤＦＥ分離
この実施例では、改変した並列ＤＦＥプロトコルを利用した本発明のＦＦＥ電気泳動法と、この方法を実施するのに適した装置とを利用し、豊富なタンパク質（ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）を２つのヒト血漿サンプルから同時に分離することを示す。この実施例で利用するプロトコルでは、アノードからカソードに向かって、アノード安定化媒体、第１のｐＨ機能と第１のｐＨ分離平坦部を含む第１の分離領域、分離領域１と２のｐＨ分離平坦部に隣接したフォーカス媒体としても機能する電極間安定化媒体、第２のｐＨ分離平坦部と第２のｐＨ機能を含む第２の分離領域、カソード安定化媒体を利用した。
【０２２９】
媒体入口２の媒体を用いて天然状態の第１のヒト血漿サンプルを１：１０に希釈し、その媒体入口２の近くに位置するサンプル入口を通じてサンプル装填速度５ｍｌ／時間で分離領域に注入または導入する一方で、媒体入口６の媒体を用いて天然状態の第２のヒト血漿サンプルを１：１０に希釈し、その媒体入口６の近くに位置するサンプル入口を通じてサンプル装填速度５ｍｌ／時間で分離領域に注入または導入するという操作を同時に行なった。
【０２３０】
以下の媒体を装置に導入した：
アノード溶液：１００ｍＭのＨ2ＳＯ4
媒体入口１：２００ｍＭの２−アミノブチル、１００ｍＭのグルコン酸、５０ｍＭのピリジンエタンスルホン酸（ＰＥＳＳ）、３０ｍＭのグリシルグリシン；１０％グリセロール
媒体入口２：３０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのグリシルグリシン；１０％グリセロール
媒体入口３：２００ｍＭのＭＯＰＳＯ、５０ｍＭのＢＩＳＴＲＩＳ、２０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのβ−アラニン；１０％グリセロール
媒体入口４：なし
媒体入口５：２００ｍＭの２−アミノブチル、１００ｍＭのグルコン酸、５０ｍＭのＰＥＳＳ、３０ｍＭのグリシルグリシン；１０％グリセロール
媒体入口６：３０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのグリシルグリシン；１０％グリセロール
媒体入口７：２００ｍＭのＭＯＰＳＯ、５０ｍＭのＢＩＳＴＲＩＳ、２０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのβ−アラニン；１０％グリセロール
カソード溶液：１００ｍＭのＮａＯＨ
【０２３１】
電極間安定領域は、媒体入口３と５の媒体によって形成した。その場合、ＢＩＳＴＲＩＳとβ−アラニンが塩基であり、グルコン酸とＰＥＳＳが酸であり、電気泳動移動度は、適切な電極間安定化領域を形成するのに十分なだけ小さい。図８からわかるように、本発明による改変した並列ＤＦＥプロトコルの電極間安定化媒体は、分離領域１と２のｐＨ分離平坦部のフォーカス媒体としても機能する。場合によっては、ｐＨ機能を電極間安定化媒体とｐＨ分離平坦部の間に配置することができる。図７に示した並列ＤＳＥプロトコルに関しては、ｐＨ分離平坦部と電極間分離媒体の間に適切なｐＨ勾配を形成する媒体が必要である。
【０２３２】
場合によっては、特に連続調製動作モードの間に、１０％グリセロールを含む蒸留水からなる組成物を複数の向流入口を通じて向流で注入または導入することができる。この任意選択ステップは、特に出口から出口へのサンプルの正確な管理が必要な場合に目指す出口へのサンプルと分離媒体の流れを増大させることができる。
【０２３３】
図８に示した分離結果は、改変した並列ＤＦＥプロトコルを利用して実現した。回収した画分のｐＨとｐＩマーカー（対照）の分布が図８に示されている。アルブミンは領域２と６にそれぞれ残ったのに対し、領域２または６とは異なるｐＩを持つ帯電種は、個々のｐＩに応じ、領域１と３または領域５と７にそれぞれ向かって移動する。
【０２３４】
図９と図１０に、上に説明した改変ＤＦＥプロトコルによって分画化したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示してある。画分の番号とＭＷマーカーも示してある。ｐＨ分離平坦部のｐＩをアルブミンに対応するように選択したため、アルブミンは枯渇プール（ｐＨ分離平坦部）に残った。ｐＨ分離平坦部のｐＨの外側にあるｐＩを持つタンパク質は、ｐＨ分離平坦部と、隣接するｐＨ機能または電極間安定化媒体（ここでの設定ではフォーカス媒体としても機能する）との界面に位置する酸性プール（画分１３〜１６（分離領域１）と画分６８〜７１（分離領域２））とアルカリ性プール（画分３０〜３３（分離領域１）と画分８４〜８７（分離領域２））に回収されたため、そのタンパク質からアルブミンがうまく枯渇したことは明らかである。
【０２３５】
図９と図１０に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからわかるように、アルブミンのｐＨ範囲を含むゲル画分内には、アルブミンとは分子量が異なるタンパク質群がわずかに存在していることが観察される。これらのタンパク質は、枯渇領域内での電気泳動移動度が非常に小さいために枯渇領域を完全に離れることができない。
【０２３６】
画分（ｐＨ分離平坦部（枯渇領域）の画分、酸性プールの画分、アルカリ性プールの画分）が回収されると、研究者は、その画分のすべて、または一部、または組み合わせに対してさらに調製操作または分析操作をさまざまな方法で実施することができる。方法としては、以下に限られないが、電気泳動（例えば別のＦＦＥ分離、ネイティブ・ゲル電気泳動、１Ｄ−ＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ）、クロマトグラフィ、ＭＳもしくはカップルしたＭＳ、ＮＭＲ、円二色性、ＩＲ分光、ＵＶ分光、生化学的アッセイ（例えば活性アッセイ）またはこれらの組み合わせがある。
【図１Ａ】
2009541726.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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