(57)【要約】  肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する2以上のポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオチドが発現する2以上のタンパク質を含む組合わせを開示する。この組合わせおよびこの組合わせに基づくプローブを用いて、ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、ある動物が肥満であるという診断を下し、物質をスクリーニングしてそれらが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用であるかを判定し、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を試料中で検出する。クラス予測子遺伝子プロフィールを用いて肥満動物および痩身動物を同定する方法をも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される2以上のポリヌクレオチドまたは(b) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される2以上のポリヌクレオチドの発現により生成する2以上のタンパク質を含む組合わせ。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択される、請求項１の組合わせ。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択される、請求項１の組合わせ。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが表２に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択される、請求項１の組合わせ。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが表３に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択される、請求項１の組合わせ。
【請求項６】
ポリヌクレオチドがイヌ類のポリヌクレオチドである、請求項１の組合わせ。
【請求項７】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な2以上のプローブを含む組成物であって、プローブが下記のものを含む組成物：
(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチド；または
(b) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するポリペプチド。
【請求項８】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択される、請求項７の組成物。
【請求項９】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択される、請求項７の組成物。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが表２に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択される、請求項７の組成物。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドが表３に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択される、請求項７の組成物。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドがイヌ類のポリヌクレオチドである、請求項７の組成物。
【請求項１３】
支持体の既知の位置に付着した複数のプローブを有する支持体を含む、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスであって、プローブが下記のものを含むデバイス：
(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチド；または
(b) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質にそれぞれ特異的に結合するポリペプチド。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択される、請求項１３のデバイス。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択される、請求項１３のデバイス。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが表２に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択される、請求項１３のデバイス。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドが表３に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択される、請求項１３のデバイス。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドがイヌ類のポリヌクレオチドである、請求項１３のデバイス。
【請求項１９】
プローブがアレイ状に配置されている、請求項１３のデバイス。
【請求項２０】
ポリペプチドプローブが抗体である、請求項１３のデバイス。
【請求項２１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０のデバイス。
【請求項２２】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の示差発現を試料中で検出するための方法であって、
(a) SEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；
(b)場合により、SEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、標準品中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；
(c)試料および場合により工程(b)の標準品からのハイブリダイゼーション複合体を検出し；そして
(d)試料からのハイブリダイゼーション複合体を標準品からのハイブリダイゼーション複合体と比較し、その際、標準品と試料の間のハイブリダイゼーション複合体の量における2倍以上の差は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子が試料中で示差発現していることの指標となる。
【請求項２３】
プローブがSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択され、差が2.5倍以上である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
プローブがSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択され、差が3倍以上である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
プローブが表２に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項２２の方法。
【請求項２６】
プローブが表３に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項２２の方法。
【請求項２７】
プローブが支持体に結合している、請求項２２の方法。
【請求項２８】
プローブがアレイ状に存在する、請求項２７の方法。
【請求項２９】
検出をある動物について間隔をおいて実施し、その動物において脂肪組織量の調節を試みる際に、脂肪組織調節プログラムに応答したその動物の進行をモニターするために用いる、請求項２２の方法。
【請求項３０】
プローブがイヌ類のポリヌクレオチドである、請求項２２の方法。
【請求項３１】
さらに、試料をハイブリダイゼーション前に被験物質に曝露することを含み、その際、標準品との比較は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を被験物質が試料中で変化させたか否かの指標となる、請求項２２の方法。
【請求項３２】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の示差発現を試料中で検出するための方法であって、
(a)複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと試料中のタンパク質を、プローブとタンパク質の特異的結合が起きうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合するタンパク質はSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成し；
(b)場合により、複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと標準品中のタンパク質を、プローブとタンパク質の特異的結合が起きうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合するタンパク質はSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成し；
(c)試料および場合により工程(b)の標準品における特異的結合を検出し；そして
(d)試料における特異的結合を標準品における特異的結合と比較し、その際、標準品の特異的結合と試料の特異的結合の間の2倍以上の差は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子が試料中で示差発現していることの指標となることを含む方法。
【請求項３３】
プローブがSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択され、差が2.5倍以上である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
プローブがSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択され、差が3倍以上である、請求項３２の方法。
【請求項３５】
プローブが表２に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項３２の方法。
【請求項３６】
プローブが表３に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項３２の方法。
【請求項３７】
プローブが支持体に結合している、請求項３２の方法。
【請求項３８】
プローブがアレイ状に存在する、請求項３７の方法。
【請求項３９】
さらに、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の示差発現をある動物について脂肪組織調節プログラムに際して間隔をおいて検出し、そして遺伝子発現の変化を観察することによりそのプログラムの有効性を判定することを含む、請求項３２の方法。
【請求項４０】
遺伝子発現の低下が動物における脂肪組織の減少の指標となる、請求項３９の方法。
【請求項４１】
プローブがイヌ類のポリペプチドである、請求項３２の方法。
【請求項４２】
さらに、ポリペプチドをタンパク質と反応させる前に試料を被験物質に曝露することを含み、その際、標準品との比較は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を被験物質が試料中で変化させたか否かの指標となる、請求項３２の方法。
【請求項４３】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現に対する被験物質の影響を測定するための方法、および被験物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定するための方法であって、
(a)試験系において被験物質の不存在下でSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの転写生成物または翻訳生成物を測定することにより第１発現プロフィールを判定し；
(b)試験系において被験物質の存在下でSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの転写生成物または翻訳生成物を測定することにより第２発現プロフィールを判定し；
(c)第１発現プロフィールを第２発現プロフィールと比較し、その際、第１発現プロフィールと比較した第２発現プロフィールの2倍以上の変化は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現するポリヌクレオチドの発現に被験物質が影響を及ぼすこと、および被験物質が動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があることの指標となることを含む方法。
【請求項４４】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択され、差が2.5倍以上である、請求項４３の方法。
【請求項４５】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択され、差が3倍以上である、請求項４３の方法。
【請求項４６】
ポリヌクレオチドが表２に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項４３の方法。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドが表３に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項４３の方法。
【請求項４８】
発現プロフィールの判定に複数のポリヌクレオチドを利用する、請求項４３の方法。
【請求項４９】
ポリヌクレオチドが支持体に結合している、請求項４８の方法。
【請求項５０】
プローブがアレイ状に存在する、請求項４９の方法。
【請求項５１】
標準品および被験試料がイヌ類から得られる、請求項４３の方法。
【請求項５２】
請求項４２の方法により同定された物質。
【請求項５３】
ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、またはある動物が肥満であるという診断を下すための方法であって、SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドまたはSEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合する１以上のポリペプチドが、その動物に１以上の痩身動物と比較して示差発現しているかを判定し、その際、その比較によりそれらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその動物において痩身動物と比較して2倍以上示差発現していることが示された場合には、その動物は肥満になる可能性があると判定され、または肥満であると判定することを含む方法。
【請求項５４】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択され、差が2.5倍以上である、請求項５３の方法。
【請求項５５】
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択され、差が3倍以上である、請求項５３の方法。
【請求項５６】
ポリヌクレオチドが表２に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項５３の方法。
【請求項５７】
ポリヌクレオチドが表３に同定されるSEQ ID NOまたはその有用な変異型から選択され、差が2倍以上である、請求項５３の方法。
【請求項５８】
ヒト以外の動物のゲノムまたは動物のゲノム発現を操作するための方法であって、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を撹乱することを含む方法。
【請求項５９】
動物の内因性遺伝子を”ノックアウト”することにより発現を撹乱する、請求項５８の方法。
【請求項６０】
転写または翻訳に干渉することにより発現を撹乱する、請求項５８の方法。
【請求項６１】
SEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチドを用いて構築したポリヌクレオチドにより発現を撹乱する、請求項５８の方法。
【請求項６２】
請求項５８の方法により作製したトランスジェニック動物。
【請求項６３】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現に干渉する１以上の物質を含む、動物のゲノムを操作するのに適切な組成物。
【請求項６４】
物質がアンチセンス分子またはsiRNAである、請求項６３の組成物。
【請求項６５】
物質がSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチドを用いて構築したポリヌクレオチドである、請求項６３の組成物。
【請求項６６】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節し、または動物の脂肪組織の量を調節するための方法であって、遺伝子発現または組織を調節する量のDHA、EPA、EPAおよびDHA、ALA、LA、ARA、ならびにSAのうち１以上を含む組成物を動物に投与することを含む方法。
【請求項６７】
DHAを約1〜約30 mg/kg/日の量で投与し；EPAを約1〜約30 mg/kg/日の量で投与し；EPA/DHAの組合わせ(1.5:1の比率)を約4/2〜約30/45 mg/kg/日の量で投与し；ALAを約10〜約100 mg/kg/日の量で投与し；LAを約30〜約600 mg/kg/日の量で投与し；ARAを約5〜約50 mg/kg/日の量で投与し；SAを約3〜約60 mg/kg/日の量で投与する、請求項６６の方法。
【請求項６８】
さらに、動物の脂肪組織の量を調節する１以上の薬物または他の物質を動物に投与することを含む、請求項６６の方法。
【請求項６９】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節し、または動物の脂肪組織の量を調節するのに適切な組成物であって、遺伝子発現または組織を調節する量のDHA、EPA、EPAおよびDHA、ALA、LA、ARA、ならびにSAのうち１以上を含む組成物。
【請求項７０】
約1〜約30 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のDHA；約1〜約30 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のEPA；約4/2〜約30/45 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のEPA/DHAの組合わせ(1.5:1の比率)；約10〜約100 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のALA；約30〜約600 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のLA；約5〜約50 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のARA；および約3〜約60 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のSAを含む、請求項６９の組成物。
【請求項７１】
さらに、動物の脂肪組織の量を調節する１以上の薬物または他の物質を含む、請求項６９の組成物。
【請求項７２】
１以上のグループに収容する動物を選択するための方法であって、(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチドについて、または(b) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質にそれぞれ特異的に結合するポリペプチドについて、動物の発現プロフィールを判定し、そしてその発現プロフィールに基づいて動物をグループに配属することを含む方法。
【請求項７３】
グループが痩身グループおよび肥満グループであり、標準と比較して2倍以上の示差発現に基づいて動物を肥満グループに配属し、2倍未満の示差発現に基づいて動物を痩身グループに配属する、請求項７２の方法。
【請求項７４】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子に関するデータを操作するのに適切なコンピューターシステムであって、痩身動物および／または肥満動物における、SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドおよび／またはSEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するポリペプチドの発現レベルを同定する情報を含むデータベース、ならびにこのデータベースと連絡するためのユーザーインターフェースを含むコンピューターシステム。
【請求項７５】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子を検出する際に使用するのに適切な抗体を調製するための、下記を含む方法：
(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するポリペプチドを用いて、抗体応答を誘発する条件下で動物を免疫化し；
(b)動物の抗体を単離し；そして
(c)単離した抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、これにより該ポリペプチドを特異的に結合する抗体を同定する。
【請求項７６】
請求項７５の方法により調製した単離および精製された抗体。
【請求項７７】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の示差発現を、用途およびキット構成要素に応じて単一パッケージ内の別個の容器または仮想パッケージ内の別個の容器内に肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な2以上のプローブを含む試験系で判定するのに適切なキットであって、プローブが下記のものを含むキット：
(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチド；または
(b) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ならびに
下記のうち少なくとも１つ：(1)本発明のプローブの使用法に関する指示；(2)プローブを使用するのに必要な試薬および装置；(3)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節するのに適切な組成物；(4)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を撹乱するのに適切な組成物；(5)動物の脂肪組織の量を調節するのに適切な食物組成物；ならびに(6)動物の脂肪組織の量を調節する１以上の薬物または他の物質。
【請求項７８】
プローブが支持体に結合している、請求項７７のキット。
【請求項７９】
プローブがアレイ状に存在する、請求項７８のキット。
【請求項８０】
組成物がDHA、EPA、EPAおよびDHA、ALA、LA、ARA、ならびにSAのうち１以上を含む、請求項７７のキット。
【請求項８１】
(1)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を試料中で検出するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(2)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現に対して被験物質が及ぼす影響を測定するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(3)被験物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(4)ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、またはある動物が肥満であるという診断を下すために、本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(5)ヒト以外の動物のゲノムまたは動物のゲノム発現を操作するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(6)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節し、または動物の脂肪組織の量を調節するために、本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(7)１以上のグループに収容する動物を選択するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(8)コンピューターシステムを用いて肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子に関するデータを操作するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(9)本発明物質を単独で、または本発明の他の要素と組み合わせて動物に投与すること、(10)動物の脂肪組織の量を調節するために本発明物質を使用すること、(11)本発明のコンピューターシステムを使用すること、(12)本発明のキットを使用すること、ならびに(13)動物の脂肪組織の量を調節する１以上の薬物または他の物質と共に本発明の方法および組成物を使用することのうち１以上に関する情報または指示を伝達するための手段であって、それらの情報または指示を含む書類、ディジタル記憶媒体、光学記憶媒体、オーディオプレゼンテーションまたはビジュアルディスプレーを含む手段。
【請求項８２】
ディスプレーされたウェブサイト、ビジュアルディスプレー、広告柱、パンフレット、製品ラベル、パッケージ挿入物、広告、ちらし、公開発表、オーディオテープ、ピデオテープ、DVD、CD-ROM、コンピューター可読チップ、コンピューター可読カード、コンピューター可読ディスク、コンピューターメモリー、またはその組合わせよりなる群から選択される、請求項８１の手段。
【請求項８３】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節するための組成物の調製における、表１のポリヌクレオチドデータの使用。
【請求項８４】
肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節するための組成物の調製における、表８および表９のクラス予測子データの使用。
【請求項８５】
動物の身体状態評点を診断するためのキットの調製における、表１のポリヌクレオチドデータの使用。
【請求項８６】
動物の身体状態評点を診断するためのキットの調製における、表８および表９のクラス予測子データの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[0001]  本出願は、米国仮特許出願No. 60/778,567（2006年3月2日出願）および米国仮特許出願No. 60/824,318（2006年9月1日出願）に基づく優先権を主張し、これらの両方をあらゆる目的で本明細書に援用する。
【０００２】
[0002]  配列リストをCFR (コンピューター可読形態)、コピー1およびコピー2と表示した二重のコンパクトディスクで提出する。CFRコピー1とコピー2のコンパクトディスクの内容は同一である。CFRコピー1とコピー2のコンパクトディスクの配列リスト情報は同一である。配列リストは”8123.txt.”という名称のファイル中にある。このファイルは2006年2月24日、午後3:13に作成され、188 KBのデータを含む。このファイルは、Windows （登録商標） 2002オペレーティングシステムを実行するIBM PCコンパティブルコンピューターを用いて作成された。8123.txt中の配列リスト全体を本明細書に援用する。
【０００３】
発明の背景
発明の分野
[0003]  本発明は、一般に動物に示差発現する遺伝子、特に肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子に関する。
【０００４】
関連技術の記述
[0004]  遺伝子が動物の発育において役割をもつこと、また動物の健康および良好な生活状態に影響を及ぼすある疾患または状態の発症に際して遺伝子発現の調節が重要な役割をもつことは、科学分野では一般に受け入れられている。遺伝子の示差発現（differential expression）もそのような疾患および状態の発現における１要因であり、遺伝子発現パターンの評価はそのような疾患および状態の発症および抑制を分子レベルで理解するためにきわめて重要であると認識されるようになった。遺伝子および疾患とそれらの関係の理解を進めるために、遺伝子の示差発現を研究するための多数の方法が開発された：たとえばDNAマイクロアレイ、EST（expressed tag sequencing (発現タグ配列決定)）、SAGE（serial analysis of gene expression (遺伝子発現の系列分析)）、サブトラクティブハイブリダイゼーション（subtractive hybridization）、サブトラクティブクローニング（subtractive cloning）およびmRNAのディファレンシャルディスプレー(differential display、DD)、RAP-PCR（RNA-arbitrarily primed PCR (RNA-アービトラリープライムドPCR)）、RDA（Representational Difference Analysis (リプレゼンテーショナルディファレンス分析)）、二次元ゲル電気泳動、質量分析、ならびにタンパク質マイクロアレイベースのタンパク質に対する抗体結合。
【０００５】
[0005]  痩身動物と比較した肥満動物における遺伝子発現は十分には研究されていない。したがって、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子およびそれらの遺伝子がコードするタンパク質を同定する必要がある。そのような遺伝子、タンパク質、およびそれらのフラグメントは、ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、ある動物が肥満であるという診断を下し、物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定し、またそれらの物質を用いて動物の脂肪組織の量を調節するために有用であろう。
【０００６】
[0006]  肥満動物とは、過剰の体脂肪組織をもつ動物であると定義することができる。一般に、それらの理想体重より15%以上重いヒト、イヌ類およびネコ類などの動物は肥満とみなされる。動物が肥満になる最も一般的な原因は、カロリーの過剰摂取をもたらす食物の過剰摂取である。しかし、動物が肥満になるきっかけを高める可能性のある他の原因がある：たとえば生活様式、健康状態、摂食習慣、品種、卵巣切除、および去勢。また、一般に年齢と共に代謝速度および身体活動が全般的に低下するため、動物が肥満になる率は増大する。探査により、米国において動物病院を訪れるイヌの25%は肥満症の段階まで肥満していると推定される。肥満動物は関節炎、心疾患、呼吸器疾患、糖尿病、膀胱癌、甲状腺機能低下症、および膵臓炎などの疾患のリスクが有意に増大することが研究により示された。
【０００７】
[0007]  動物が肥満するのを予防すること、または肥満動物を治療してその動物の脂肪組織の量を減少させること、または痩身動物を治療してその動物の脂肪組織の量を増加させることを含めて、動物の脂肪組織の量を調節することは困難である。動物の脂肪組織の量を増加させることは、通常は食物摂取量の増加を伴っていた。動物が肥満するのを予防し、または動物の脂肪組織の量を減少させるための最も有効かつ容易な方法は、食事制限および運動によるものである。しかし、食事および運動のプログラムに対するコンプライアンスを保証するのはしばしば困難である。他の方法は薬物、たとえばフェンテルミン（phentermine）、フェンフルラミン（fenfluramine）、シブトラミン（sibutramine）、オルリスタット（orlistat）およびフェニルプロパノールアミンの使用を伴う。残念ながらこれらの薬物を用いると副作用が起きる。たとえば、ヒトの肥満症を治療するためにフェンフルラミンおよびフェンテルミンを投与すると、ヒトの心臓弁の損傷が生じる可能性がある。シブトラミンは血圧を高める可能性があり、オルリスタットは不快な消化器副作用をもつ場合がある。
【０００８】
[0008]  動物の脂肪組織に関する現在の方法に問題があるので、ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、ある動物が肥満であるという診断を下し、物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定し、またそれらの物質を用いて動物の脂肪組織の量を調節するのに有用である、新規な方法および組成物が依然として求められている。
【０００９】
発明の概要
[0009]  したがって本発明の目的は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子または遺伝子セグメントを提供することである。
【００１０】
[0010]  本発明の他の目的は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する2以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの組合わせを提供することである。
[0011]  本発明の他の目的は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な2以上のポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブの組成物、およびそれらのプローブを収容した支持体アレイなどのデバイスを提供することである。
【００１１】
[0012]  本発明の他の目的は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の示差発現を試料中で検出するための方法および組成物を提供することである。
[0013]  本発明の他の目的は、被験物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定するための方法として、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現プロフィールに対する被験物質の影響を測定するための方法を提供することである。
【００１２】
[0014]  本発明の他の目的は、ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、またはある動物が肥満であるという診断を下すための方法を提供することである。
[0015]  本発明の他の目的は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節し、または動物の脂肪組織の量を調節するための方法および組成物を提供することである。
【００１３】
[0016]  これらおよび他の目的のうち１以上が、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する254種類の遺伝子および遺伝子セグメントである295種類のポリヌクレオチドプローブの新規な組合わせを用いて達成される。これらのポリヌクレオチドは、前記の目的、たとえば動物の脂肪組織に関連する状態を予後判定および診断し、物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定するという目的を達成するのに有用な、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現するポリヌクレオチドの状態を判定するための組成物、プローブ、プローブをベースとするデバイス、および方法を得るために使用される。そのような物質が同定されると、それらを用いて動物の脂肪組織の量を調節することができる。プローブの組合わせ、プローブを使用するデバイス、および物質を含む、多様なキットも提供される。
【００１４】
[0017]  同様に本発明の他の目的は、肥満動物と痩身動物を識別するための”クラス予測子（class predictor）”遺伝子プロフィールの使用方法を提供することである。クラス予測子手法を用いて、動物の身体タイプの臨床診断を容易にすることができる。たとえばクラス予測子を血液ベースの検査に用いて、その動物が肥満もしくは痩身である否か、または肥満もしくは痩身になる傾向をもつか否かについて確実な判定を行なうことができる。本明細書に開示するこれらおよび他の目的は、本発明において同定した、肥満動物および痩身動物に関するクラス予測子として作用する65のポリヌクレオチドプローブの新規な組合わせにより、肥満動物および痩身動物から採取した血液試料を用いて達成できる。これらのクラス予測子を用いて、たとえばある動物が肥満であるか、または肥満になる傾向をもつかを推定するための血液ベースの検査キットを開発することができる。あるいは、それらを用いて痩身動物がその痩身性を維持することができるかを推定できる。クラス予測子を用いて動物の身体状態評点を判定することもでき、したがって動物病院において各種の有用な用途をもつ可能性がある。
【００１５】
[0018]  同様に本発明の他の目的は、クラス予測子遺伝子プロフィールを用いて肥満動物を正確に同定し、それらの進行を生化学的レベルで追跡し、それらの遺伝子発現プロフィールが肥満または痩身と一致するか否かを示すための方法を提供することである。
【００１６】
[0019]  同様に本発明の他の目的は、脂肪代謝に関与する遺伝子の発現を調節することがインビトロで示された１以上の有効成分を投与することにより、動物においてインビボで脂肪組織の量を調節するための方法を提供することである。
【００１７】
[0020]  本発明の他の目的には、下記における、本明細書に開示するポリヌクレオチド、プローブ、有効成分およびクラス予測子データの使用が含まれる：たとえば肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節するための、もしくは動物の脂肪組織の量を調節するための、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出するための、および動物の身体状態評点を推定もしくは診断するための（肥満動物と痩身動物の識別同定を含む）本明細書に記載する組成物、デバイスおよびキットの調製；ならびに肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出する方法、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節する方法、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現プロフィールに対する被験物質の影響を測定する方法、被験物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定する方法、ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、もしくはある動物が肥満であるという診断を下す方法、および動物の脂肪組織の量を調製する方法。
【００１８】
[0021]  本発明のさらに他の目的、特徴および利点は、当業者に自明であろう。
発明の詳細な記述
定義
[0022]  用語”動物”は、脂肪組織をもつヒトまたは他の動物を意味し、これには鳥類、ウシ類、イヌ類、ウマ類、ネコ類、ヤギ類、ネズミ類、ヒツジ類、およびブタ類などの動物が含まれる。この用語を肥満動物と痩身動物の比較に関して用いる場合、比較される動物は同一種の動物であり、おそらく同一人種または同一品種の動物である。好ましい態様において、動物はイヌ類またはネコ類、最も好ましくはイヌ類である。
【００１９】
[0023]  用語”抗体”は、特定の抗原に結合するいずれかの免疫グロブリンを意味し、これにはIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE抗体が含まれる。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、ヒト化抗体、ヘテロ接合抗体、ポリエピトープ特異性をもつ抗体組成物、キメラ抗体、二特異性抗体、二価抗体（diabody）、一本鎖抗体、ならびに抗体フラグメント、たとえばFab、Fab'、F(ab')2、およびFv、または他の抗原結合フラグメントが含まれる。
【００２０】
[0024]  用語”アレイ”は、支持体上における少なくとも2つのプローブの秩序配置を意味する。それらのプローブのうち少なくとも１つは対照または標準品であり、それらのプローブのうち少なくとも１つは診断プローブである。支持体上に約2〜約40,000のプローブを配置することにより、プローブと試料ポリヌクレオチドまたは試料ポリペプチドの間に形成されたそれぞれの標識複合体の信号の大きさおよび強度を確実に個々に識別できる。
【００２１】
[0025]  用語”身体状態評点（body condition score）”(BCS)は、動物の身体のサイズおよび形状に基づく身体組成分析法を意味する。幾つかの方法が当業者に知られている：たとえばUSP No. 6,691,639および表題”Small Animal Clinical Nutrition”の参考文献, 第4版, 13章(ISBN 0-945837-05-4)に示される方法。
【００２２】
[0026]  用語”肥満指数”(BMI)は、動物の体重（kg）を身長（m）の二乗で割ったものを意味する。
[0027]  本明細書中で用いる用語”クラス予測子（class predictor）”は、教師あり学習法（supervised learning method）を用いて作成したゲノミクス、プロテオミクスまたはメタボロミクスプロフィールを表わす；その際、重み付き投票法（Weighted Voting）、クラス近傍法（Class Neighbors）、K-近傍法（K-Nearest Neighbors）およびサポートベクターマシン（Support Vector Machines）などのアルゴリズム（これらに限定されない）を用いて、一群の予め定めたサンプル（”トレイニング・セット”）から予測規則を確立し、これを次いで新たなサンプル（”試験セット”）の分類に適用できる。
【００２３】
[0028]  用語”DEXA”は、身体組成分析法である二エネルギーＸ線吸光光度法（dual-energy X-ray absorbtiometry）を意味する。
[0029]  用語”示差発現（differential expression）”または”示差発現した（differentially expressed）”は、試料中の転写されたメッセンジャーRNAもしくは翻訳されたタンパク質の不存在、存在、または少なくとも2倍の量の変化により検出される、遺伝子発現の増大もしくは無調節を意味し、または遺伝子発現の低下またはダウンレギュレーションを意味する。
【００２４】
[0030]  動物に適用した用語”肥満（fat）”は、ヘルスケア提供者その他の当業者に既知の技術および方法を用いて、過剰量の体脂肪組織をもつと判定されたいずれかの動物または過剰量の体脂肪組織が発生する傾向があると判定されたいずれかの動物を意味する。ある動物がその一般集団内の平均的な動物と比較して過剰の脂肪組織が発生する傾向またはより高い可能性をもつ場合、その動物は肥満になる傾向がある。この定義を限定するわけではないが、一般に下記の場合に動物は肥満であるとみなされる：(1)動物が25以上のBMI（動物の状態を解明するある方法で”過体重”および”肥満症”を含むとみなされる数値）をもつ、(2)ヘルスケア専門家または関連の当業者が判定して動物の体重がその”理想”体重より15%以上多い、(3)DEXAにより測定して動物の体脂肪率が27%以上である、あるいは(4)当業者が”Small Animal Clinical Nutrition”, 第4版, 13章 (ISBN 0-945837-05-4)に示される方法または他のBCS法を用いるそれと同等な方法を用いて判定して3を超える身体状態評点をもつ。
【００２５】
[0031]  用語”肥満関連遺伝子”は、本発明において肥満動物に痩身動物と比較して示差発現すると同定されたSEQ ID NO: 1〜295、特に254種類の遺伝子により同定される遺伝子のすべてまたはサブセットを意味する。
【００２６】
[0032]  遺伝子の示差発現の尺度として用いる用語”倍”は、ある動物において比較動物における遺伝子発現量と比較して、たとえば肥満動物を痩身動物と比較して、多数倍または一部である遺伝子発現量を意味する。たとえば、その動物において比較動物の3倍の量で発現する遺伝子は3倍の示差発現をもち、その動物において比較動物の1/3の量で発現する遺伝子も3倍の示差発現をもつ。
【００２７】
[0033]  用語”フラグメント”は、下記を意味する：(1)オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド配列であって、完全配列の一部であり、かつ特定の用途について完全ポリヌクレオチド配列と同一もしくは類似の活性をもつもの、または(2)ペプチドもしくはポリペプチド配列であって、完全配列の一部であり、かつ特定の用途について完全ポリペプチド配列と同一もしくは類似の活性をもつもの。そのようなフラグメントは、特定の用途に適切であると考えられるいずれか任意数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。一般に、完全配列のうち、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドフラグメントは少なくとも約10、50、100または1000個のヌクレオチドを含み、ポリペプチドフラグメントは少なくとも約4、10、20または50個の連続アミノ酸を含む。この用語には、それらのフラグメントのポリヌクレオチドおよびポリペプチドのバリアントが含まれる。
【００２８】
[0034]  用語”遺伝子”は、ポリペプチドの生成に関与するDNAの完全または部分セグメントを意味し、これはコード領域の前後の領域（リーダーおよびトレイラー）および個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。この用語には、遺伝子コード配列の相補体にハイブリダイズするDNA配列がいずれも含まれる。
【００２９】
[0035]  用語”肥満動物において示差発現する遺伝子”は、発現するmRNAの量またはmRNAから翻訳される遺伝子生成物の量が、肥満動物の組織において痩身動物と比較して検出可能なほど異なる（多い、または少ない）遺伝子を意味する。
【００３０】
[0036]  用語”相同体”は下記を意味する：(1)同種もしくは異種動物からのポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO: 1〜295により同定されるポリヌクレオチドに対して30%、50%、70%もしくは90%を超える配列類似体をもち、完全ポリヌクレオチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、かつ同一もしくは実質的に同一の機能を果たすもの、またはSEQ ID NO: 1〜295により同定されるポリヌクレオチドに緊縮条件下で特異的にハイブリダイズする能力をもつものを含めたポリヌクレオチド、あるいは(2)同種もしくは異種動物からのポリペプチドであって、SEQ ID NO: 1〜295により同定されるポリヌクレオチドの発現により同定されるポリペプチドに対して30%、50%、70%もしくは90%を超える配列類似体をもち、完全ポリペプチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、かつ同一もしくは実質的に同一の機能を果たすもの、またはSEQ ID NO: 1〜295により同定されるポリヌクレオチドの発現により同定されるポリペプチドに特異的に結合する能力をもつものを含めたポリペプチド。2つのポリペプチド配列または2つのポリヌクレオチド配列の配列類似性は、当業者に既知の方法、たとえばKarlin and Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990))を用いて判定できる。そのようなアルゴリズムが、Altschul et al. (J. MoI. Biol. 215:403-410 (199O))のNBLASTおよびXBLASTプログラムに導入されている。比較のためのギャップ付きアラインメントを得るためには、Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))に記載のGapped Blastを採用できる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、各プログラム（たとえばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを用いる。http://ww.ncbi.nlm.nih.govを参照。
【００３１】
[0037]  用語”ハイブリダイゼーション複合体”は、１つのポリヌクレオチドのプリンが相補的ポリヌクレオチドのピリミジンと水素結合した際に試料ポリヌクレオチドとの間で形成される複合体を意味する：たとえば5'-A-G-T-C-3'は3'-T-C-A-G-5'と塩基対合する。相補度およびヌクレオチド類似体の使用はハイブリダイゼーション反応の効率および緊縮度に影響を及ぼす。
【００３２】
[0038]  用語”併せて（in conjunction）”は、薬物、食物または他の物質を、(1)組成物、特に食物組成物中において一緒に、または(2)別個に同一もしくは異なる頻度で、同一もしくは異なる投与経路を用いて、ほぼ同じ時期もしくは定期的に、投与することを意味する。”定期的”は、物質を特定の物質について許容できる投与計画で投与することを意味する。”ほぼ同じ時期”は、一般に物質（食物または薬物）を同時に、または互いに約72時間以内に投与することを意味する。”併せて”は、具体的には薬物などの物質を処方された期間投与し、本発明組成物を不定期間投与する、投与計画を含む。
【００３３】
[0039]  動物に適用した用語”痩身（lean）”は、ヘルスケア提供者その他の当業者に既知の技術および方法を用いて、肥満ではないと判定されたいずれかの動物を意味する。限定ではないが、一般に下記の場合に動物は痩身であるとみなされる：(1)動物が25未満のBMIをもつ、または(2)ヘルスケア専門家または関連の当業者が判定して動物の体重がその”理想”体重より15%以上少ない、(3)DEXAにより測定して動物の体脂肪率が27%未満である、あるいは(4)当業者が”Small Animal Clinical Nutrition”, 第4版, 13章 (ISBN 0-945837-05-4)に示される方法または他のBCS法を用いるそれと同等な方法を用いて判定して3以下の身体状態評点をもつ。
【００３４】
[0040]  用語”動物の脂肪組織の量を調節する”は、動物の脂肪組織が増加または減少する傾向がある場合に、動物の脂肪組織を減少させること、動物の脂肪組織を増加させること、または動物の脂肪組織を維持させることを意味する。たとえば、動物の脂肪組織の量を調節することには、痩身動物が肥満するのを予防すること、肥満動物をその動物の脂肪組織の量が減少するように治療すること、および痩身動物を脂肪組織が増加するように適切な環境で治療することが含まれる；たとえば、低体重であると当業者により判定された痩身動物を治療する場合には脂肪組織の増加が望ましい。一般的な方法を用いて、動物の脂肪組織の量を評価し、動物の除脂肪筋重（lean muscle mass）および／または骨無機質含量など、そのような評価に関連する可能性のある情報を判定することができる。
【００３５】
[0041]  用語”ポリヌクレオチド”または”オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。この用語には、一本鎖または二本鎖のDNAおよびRNA (cDNAおよびmRNA)分子が含まれ、一本鎖の場合にはそれの線状または環状の相補配列が含まれる。この用語には、その配列に応じてフラグメント、バリアント、相同体および対立遺伝子であって、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を果たすものも含まれる。これらの配列は、アラインさせた際に完全相補的（不適性塩基対合がない）であってもよく、または最高で約30%の配列不適性塩基対合があってもよい。ポリヌクレオチドについて、好ましくは鎖は約50〜10,000個のヌクレオチド、より好ましくは約150〜3,500個のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドについて、好ましくは鎖は約2〜100個のヌクレオチド、より好ましくは約6〜30個のヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの多様な要因ならびに特定の用途および使用に依存するであろう。この用語には、合成されたヌクレオチドポリマー、ならびに天然供給源から単離および精製されたものが含まれる。用語”ポリヌクレオチド”には”オリゴヌクレオチド”が含まれる。
【００３６】
[0042]  用語”ポリペプチド”、”ペプチド”または”タンパク質”は、アミノ酸のポリマーを意味する。この用語には、自然界に存在するポリマーおよび自然界に存在しない（合成）ポリマー、ならびに１個以上のアミノ酸が人為的な化合物部分で置換されたものが含まれる。この用語には、その配列に応じてフラグメント、バリアントおよび相同体であって、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を果たすものも含まれる。この用語には、任意の長さのポリマー、好ましくは約2〜1000個のアミノ酸、より好ましくは約5〜500個のアミノ酸を含むポリマーが含まれる。この用語には、合成されたアミノ酸ポリマー、ならびに天然供給源から単離および精製されたものが含まれる。
【００３７】
[0043]  用語”プローブ”は下記のものを意味する：(1) RNAもしくはDNAのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドであって、精製された制限酵素消化物中などに自然に存在し、もしくは合成により製造され、そのプローブに相補的な配列をもつポリヌクレオチドとアニーリングもしくは特異的ハイブリダイゼーションしうるもの、または(2)ペプチドもしくはポリペプチドであって、特定のタンパク質もしくはタンパク質フラグメントに、他のタンパク質もしくはタンパク質フラグメントを実質的に排除して特異的に結合しうるもの。オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの厳密な長さは、温度、供給源および用途を含めた多数の要因に依存するであろう。たとえば、診断用には、ターゲット配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは一般に約10〜100、15〜50、または15〜25個のヌクレオチドを含む。ある診断用途において、ポリヌクレオチドプローブは約100〜1000、300〜600個のヌクレオチド、好ましくは約300個のヌクレオチドを含む。本発明におけるプローブは、特定のターゲット配列の異なる鎖に対して”実質的に”相補的となるように選択される。これは、プローブが予め定めた一組の条件下でそれらの各ターゲット配列と特異的にハイブリダイズまたはアニールするのに十分なほど相補的でなければならないことを意味する。このためには、プローブ配列はターゲットの厳密な相補的配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的ヌクレオチドフラグメントがプローブの5'または3'末端に結合し、プローブ配列の残部がターゲット配列に相補的であってもよい。あるいは、プローブ配列がターゲットポリヌクレオチドにアニールするのに十分なほどターゲットポリヌクレオチドの配列との十分な相補性をもつ限り、非相補的塩基または比較的長い配列がプローブ内に散在してもよい。ペプチドプローブまたはポリペプチドプローブは、それらにタンパク質またはペプチドが特異的に結合するいずれの分子であってもよく、これにはDNA（DNA結合タンパク質について）、抗体、細胞膜受容体、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、細胞小器官および細胞小器官膜が含まれる。
【００３８】
[0044]  用語”試料”は、たとえばポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、代謝産物などを含有するいずれかの動物組織または体液を意味し、これにはDNAおよびRNAを含有する細胞および他の組織が含まれる。例には、脂肪組織、血液、軟骨、結合組織、上皮、リンパ組織、筋肉、神経、喀痰などが含まれる。試料は固体または液体であってもよく、DNA、RNA、cDNA、体液、たとえば血液もしくは尿、細胞、細胞調製物、またはその可溶性画分もしくは部分標本、染色体、細胞小器官などであってもよい。
【００３９】
[0045]  用語”単一パッケージ”は、キットの構成要素が１以上の容器内に、または１以上の容器内により、物理的にまとめられており、製造、配布、販売または使用のための単位とみなされることを意味する。容器には、バッグ、箱、ボトル、収縮包装パッケージ、ホッチキス留めその他の形で固定された構成要素、またはその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。単一パッケージは、製造、配布、販売または使用のための単位とみなされる状態で互いに物理的にまとめられた個別の食物組成物の容器であってもよい。
【００４０】
[0046]  用語”有用な変異型（useful variation）”は、下記を意味する：(1)ポリヌクレオチドについては、ポリヌクレオチドの相補体；ポリヌクレオチドの相同体およびそれの相補体；ポリヌクレオチドのバリアント、それの相補体および相同体；ならびにポリヌクレオチド、それの相同体およびそれのバリアントのフラグメント、ならびに(2)ポリペプチドについては、ポリペプチドの相同体；ポリペプチドのバリアントおよびそれの相同体；ならびにポリヌクレオチド、それの相同体およびそれのバリアントのフラグメント。
【００４１】
[0047]  用語”仮想パッケージ”は、キットの構成要素が、１以上の物理的または仮想キット構成要素に関して利用者に他の構成要素を入手する方法を指令する指示によりまとめられていることを意味する；たとえば、１つの構成要素と、利用者にキットの使用方法についての指示を得るためにウェブサイトを訪れる、記録メッセージを調べる、ビジュアルメッセージを見る、または介護者もしくは指導員と連絡をとることを指令する指示とを収容したバッグ。
【００４２】
[0048]  用語”標準品”は、下記を意味する：(1)肥満動物を検査する場合には痩身動物からの組織を含む対照試料、または痩身動物を検査する場合には肥満動物からの組織を含む対照試料、あるいは(2)被験物質が示差遺伝子発現を引き起こすかを判定するためには、その用途に応じて、対応する痩身動物または肥満動物において試験する被験物質に曝露していない痩身動物または肥満動物からの組織を含む対照試料。
【００４３】
[0049]  用語”緊縮条件”は、下記を意味する：(1) 50% (vol/vol)のホルムアミド、ならびに0.1%のウシ血清アルブミン、0.1%のFicoll、0.1%のポリビニルピロリドン、50 mMのリン酸緩衝液pH 6.5、および750 mMのNaCl、75 mMのクエン酸ナトリウム中、42℃におけるハイブリダイゼーション、(2) 50%のホルムアミド、5×SSC (0.75 MのNaCl, 0.075 Mのクエン酸ナトリウム)、50 mMのリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液（Denhardt's solution）、音波処理したサケ精子DNA (50μg/ml)、0.1%のSDS、および10%のデキストラン硫酸中、42℃におけるハイブリダイゼーション；42℃で0.2×SSCおよび0.1%のSDS中において洗浄、もしくは0.015 MのNaCl、0.0015 Mのクエン酸ナトリウム、0.1%のNa2SO4で50℃において洗浄、または類似の低イオン強度および高温洗浄洗浄剤および類似の変性剤を用いる類似の方法。
【００４４】
[0050]  用語”物質”は、動物の脂肪組織の量を診断、予後判定または調節するために有用な可能性のある元素、化合物、分子、もしくはその混合物、または他のいずれかの材料を意味し、これにはいずれかの薬物、化学物質または生体物質が含まれる。
【００４５】
[0051]  用語”siRNA”は、siRNAがある遺伝子と同一細胞内で発現した場合にその遺伝子の発現を低下または阻害する二本鎖RNAを形成するポリヌクレオチドを意味する。この用語には、相補鎖により形成された二本鎖RNAが含まれる。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するsiRNA相補部分は、一般に実質的または完全な同一性をもつ。一般にsiRNAは少なくとも15〜50個のヌクレオチドを含み、二本鎖siRNAは約15〜50塩基対、好ましくは約20〜30ヌクレオチド塩基対を含む。
【００４６】
[0052]  用語”特異的に結合する”は、2分子間の特殊かつ厳密な相互作用を意味し、これはそれらの構造、特にそれらの分子側鎖基に依存する。たとえば、DNA分子の主溝内への調節タンパク質の挿入、2つの一本鎖核酸間の主鎖に沿った水素結合、またはタンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストもしくは抗体との間の結合。
【００４７】
[0053]  用語”特異的にハイブリダイズする”は、当技術分野で一般に用いられる予め定めた条件下でそのようなハイブリダイゼーションが可能なほど十分に相補的な（時には”実質的に相補的”という）配列の2つの一本鎖ポリヌクレオチド間の結合を意味する。たとえばこの用語は、本発明の１観点によれば、ポリヌクレオチドプローブと非相補配列の一本鎖ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを実質的に排除した、一本鎖DNAまたはRNA分子内に含まれるポリヌクレオチドプローブと実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを表わすことができる。
【００４８】
[0054]  用語”バリアント（variant）”は下記を意味する：(1)ポリヌクレオチド配列からの、またはポリヌクレオチド配列への、１以上のヌクレオチドの置換、変更、修飾、交換、欠失または付加のいずれかを含むポリヌクレオチド配列であって、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を果たすもの、および(2)ポリペプチド配列からの、またはポリペプチド配列への、１以上のアミノ酸の置換、変更、修飾、交換、欠失または付加のいずれかを含むポリペプチド配列であって、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を果たすもの。したがって、この用語には、一塩基多型（SNP）および対立遺伝子バリアントが含まれ、ポリペプチドにおける同類および非同類アミノ酸置換が含まれる。この用語には、適宜、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの化学的誘導体化、および自然界に存在しないヌクレオチドまたはアミノ酸によるヌクレオチドまたはアミノ酸の置換も含まれる。
【００４９】
[0055]  本明細書に記載した特定の方法、プロトコルおよび試薬は変更できるので、本発明はそれらに限定されない。さらに、本明細書中で用いた専門用語は特定の態様を記述するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。本明細書および特許請求の範囲で用いる単数形には、そうではないことが状況から明示されない限り、複数表示が含まれる；たとえば”バリアント”という表現には複数のバリアントが含まれる。さらに、定義した用語には、適正な文法概念で用いられるその用語の変形が含まれる；たとえば用語”特異的に結合する”には、”特異的結合”およびこの用語の他の形が含まれる。同時に、用語”含む（comprise、comprises、comprising）”も除外ではなく包括と解釈すべきである。
【００５０】
[0056]  別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語ならびにいずれかの頭字語は、本発明の分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載したものと類似または均等な組成物、方法、製品、または他の手段もしくは材料をいずれも本発明の実施に使用できるが、好ましい組成物、方法、製品、または他の手段もしくは材料を本明細書に記載する。
【００５１】
[0057]  本明細書中に引用または言及したすべての特許、特許出願、刊行物、および他の参考文献を、法律が許す範囲で本明細書に援用する。それらの参考文献についての考察は、それらにおいてなされた主張をまとめるためのものにすぎない。それらの特許、特許出願、刊行物、もしくは他の参考文献、またはそれらのいずれかの部分が本発明に対する関連先行技術であると認めたわけではなく、特許、特許出願、刊行物、および他の参考文献の正確さおよび関連性に反論する権利は明らかに残されている。
【００５２】
[0058]  １観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子または遺伝子セグメント（本明細書中で定義する”遺伝子”）を提供する。本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する254種類の遺伝子を表わす295種類のポリヌクレオチドの知見に基づく。これらの遺伝子は、肥満と診断された動物の脂肪組織中の遺伝子の発現と、痩身と診断された動物の脂肪組織中の遺伝子とを、Affymetrix GeneChip(登録商標)技術を用いて比較することにより同定された。これらのポリヌクレオチドを配列リストに示し、表１にSEQ ID NO: 1〜295として述べる。表１には同様に、Affymetrixプローブ同定番号（Affymetrix Probe Identification Number）(本明細書中で”APIN”)を欄2に、発現倍率（肥満／痩身）を欄3に、最高BLASTヒットの寄託番号を欄4に、ヒト配列に対する最高BLASTヒットの寄託番号を欄5に示す（欄についての記述は表２および３にも関連する）。推定または実際の遺伝子機能についての記述は、BLASTデータベースから、当業者に既知の方法を用いて得ることができる。一般に、推定または実際の遺伝子機能は下記により決定される：(1)肥満動物に痩身動物と比較して2倍以上発現した各遺伝子についてAPINを同定する、(2) APIN番号を配列と相関させる公開AffymetrixデータベースにAPINを入力することにより、それらの各遺伝子のヌクレオチド配列を決定する、そして(3)そのヌクレオチド配列を、米国国立保健研究所（National Institutes of Health）が提供するBLASTデータベースに入力し、データベース中の相同配列に対して得られた配列一致から推定または実際の遺伝子機能を決定する。表４は対応するSEQ ID NOに対する最高BLASTヒット寄託番号について得た遺伝子記述を示し、表５は対応するSEQ ID NOに対するヒト配列の最高BLASTヒット寄託番号についての遺伝子記述を示す。
【００５３】
[0059]  これらのポリヌクレオチドは幾つかの基準に基づいてグループ分けすることができる。第１に、肥満動物と痩身動物の間の遺伝子示差発現の量または倍数を判定する発現分析に基づいて、ポリヌクレオチドを3グループに分ける。グループ１は、SEQ ID NO:l〜295により同定されるポリヌクレオチドに対応する。これらのポリヌクレオチドは、肥満動物に痩身動物と比較して少なくとも2倍示差発現する。グループ2は、SEQ ID NO:l〜70により同定されるポリヌクレオチドに対応する。これらのポリヌクレオチドは、肥満動物に痩身動物と比較して少なくとも2.5倍示差発現する。グループ3は、SEQ ID NO:l〜25により同定されるポリヌクレオチドに対応する。これらのポリヌクレオチドは、肥満動物に痩身動物と比較して少なくとも3倍示差発現する。第２に、ポリヌクレオチドをそれらの機能に基づいてグループ分けする。グループ4は、表２に同定されるポリヌクレオチドに対応する。これらのポリヌクレオチドは、動物の脂質およびグルコース代謝経路と関連する。第３に、ポリヌクレオチドをそれらの関連性に基づいてグループ分けする。グループ5は、表３に同定されるポリヌクレオチドに対応する。これらのポリヌクレオチドは、示差発現を実施した際に１より多いプローブにより同定されたので、痩身動物と比較して肥満動物に特に関連性があると同定された。
【００５４】
[0060]  これらのポリヌクレオチドおよび遺伝子は、肥満と診断されたイヌ類の脂肪組織からの遺伝子発現と痩身と診断されたイヌ類の脂肪組織からの遺伝子発現との差を測定することにより同定できる。遺伝子発現の変化は、当業者に既知のいずれかの方法で判定できる。一般に、遺伝子発現の変化は転写を測定する（遺伝子が産生するmRNAの量を測定する）か、または翻訳を測定する（遺伝子が産生したタンパク質の量を測定する）ことにより判定される。遺伝子が産生するRNAまたはタンパク質の量は、ポリヌクレオチドおよびタンパク質を定量するための当業者に既知のいずれかの方法を用いて判定できる。一般に、RNAの発現はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)（限定ではないが、逆転写-PCR (RT-PCR)および定量リアルタイムPCR (qPCR)を含む）、RNase保護、ノーザンブロット法、および他のハイブリダイゼーション法を用いて判定できる。測定するRNAは、一般にmRNAまたは逆転写mRNAの形である。タンパク質またはポリペプチドの発現は、多様な比色および分光アッセイ法、ならびにローリーアッセイ法、ビウレットアッセイ法、蛍光アッセイ法、濁度測定法、ビシンコニン酸アッセイ法（bicinchoninic assay）、タンパク質チップ技術、赤外吸収、ニンヒドリンアッセイ、ブラッドフォードアッセイおよび紫外吸収などの方法を用いて判定できる。好ましい方法においては、Affymetrix Inc.から購入できるAffymetrix Canine-1およびCanine-2遺伝子チップならびにそれらのチップを用いて遺伝子発現を判定するための指示により遺伝子発現の変化を判定する。
【００５５】
[0061]  一般に、肥満動物における痩身動物と比較した遺伝子示差発現は、少なくとも１つの遺伝子の発現を測定することにより判定される。好ましくは、2以上の示差発現遺伝子の発現を測定して、遺伝子発現パターンまたは発現プロフィールを得る。より好ましくは、多数の示差発現遺伝子の発現を測定して、より有意の遺伝子発現パターンまたは発現プロフィールに関する追加情報を得る。
【００５６】
[0062]  前記の配列に基づくポリヌクレオチド、遺伝子、ポリヌクレオチドおよび遺伝子がコードするタンパク質、ならびに相補体、相同体、バリアントまたはフラグメントは、動物の脂肪組織の量に関連する多様な予後アッセイおよび診断アッセイに有用であり、被験物質をスクリーニングしてそれらの物質が動物の脂肪組織の量を調節するために有用であるかを判定するのに有用である。他の用途は本明細書に含まれる発明の記述から明らかであろう。
【００５７】
[0063]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する2以上のポリヌクレオチドまたは肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する2以上のポリヌクレオチドの発現により生成する2以上のタンパク質を含む組合わせを提供する。１態様において、この組合わせはSEQ ID NO: 1〜295から選択される2以上のポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオチドから発現するタンパク質を含む。他の態様において、この組合わせはSEQ ID NO: 1〜70から選択される2以上のポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオチドから発現するタンパク質を含む。他の態様において、この組合わせはSEQ ID NO: 1〜25から選択される2以上のポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオチドから発現するタンパク質を含む。他の態様において、この組合わせは表２に同定されるSEQ ID NOから選択される2以上のポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオチドから発現するタンパク質を含む。他の態様において、この組合わせは表３に同定されるSEQ ID NOから選択される2以上のポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオチドから発現するタンパク質を含む。他の態様において、この組合わせはそれらのポリヌクレオチドの有用な変異型を含む。好ましくは、この組合わせは、特定のグループおよび用途に応じて、複数のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから発現するタンパク質、一般に10、20、50、100、200またはそれ以上のポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む。この組合わせが１以上のフラグメントを含む場合、それらのフラグメントは元のポリヌクレオチドまたはタンパク質の特性および機能を維持するいずれかのサイズ、好ましくは元の約30%、60%または90%であってよい。ポリヌクレオチドまたはタンパク質はいずれかの動物、好ましくはイヌ類およびネコ類、最も好ましくはイヌ類に由来するものであってよい。
【００５８】
[0064]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な2以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブを含む組成物を提供する。１態様において、プローブはSEQ ID NO: 1〜295から選択されるポリヌクレオチドを含む。他の態様において、プローブはSEQ ID NO: 1〜70から選択されるポリヌクレオチドを含む。他の態様において、プローブはSEQ ID NO: 1〜25から選択されるポリヌクレオチドを含む。他の態様において、プローブは表２に同定されるSEQ ID NOから選択されるポリヌクレオチドを含む。他の態様において、プローブは表３に同定されるSEQ ID NOから選択されるポリヌクレオチドを含む。他の態様において、プローブはそれらのポリヌクレオチドの有用な変異型を含む。プローブは実質的に専ら適切な相補的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするのに十分な個数のヌクレオチドを含む。好ましくは、プローブは少なくとも約10、15、20、25または30個のヌクレオチドを含む。ある態様において、プローブはより多数のヌクレオチドを含み、少なくとも約30、50、70、90もしくは100個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。プローブは本発明の全長機能性遺伝子を含むことができる。好ましくは、本発明組成物は肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子を検出するのに適切な複数のポリヌクレオチドプローブ、一般に約10、50、200、500、1000もしくは2000、またはそれ以上のプローブを含む。ポリヌクレオチドプローブは、当業者に既知の方法、たとえばヌクレオチドからのインビトロ合成、天然源からの単離および精製、または本発明遺伝子の酵素開裂を用いて調製または入手することができる。
【００５９】
[0065]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支持体の既知の位置に付着した本発明のオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブを備えた支持体を含む。このデバイスは本質的に、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブの固定化型である。このデバイスは、遺伝子およびポリヌクレオチドならびにそれらの発現のパターンおよびプロフィールを迅速かつ特異的に検出するのに有用である。一般に、それらのプローブは支持体またはこれに類する固体状保持体に結合しており、１以上のポリヌクレオチド（たとえば遺伝子、PCR生成物、リガーゼ連鎖反応(LCR)生成物、増幅法により合成したDNA配列、またはその混合物）を含有する試料を、試料ポリヌクレオチド（１以上）がプローブにハイブリダイズしうる状態でプローブに曝露する。プローブ、試料ポリヌクレオチド（１以上）、または両方を、一般に発蛍光団、または他のタグ、たとえばストレプトアビジンで標識し、当業者に既知の方法で検出する。試料ポリヌクレオチド（１以上）が標識されている場合、結合した蛍光を検出することによりハイブリダイゼーションを検出できる。プローブが標識されている場合、一般に標識の消光によりハイブリダイゼーションが検出される。プローブと試料ポリヌクレオチド（１以上）の両方が標識されている場合、一般に2種類の結合標識の近接により生じる色のシフトのモニターすることによりハイブリダイゼーションを検出する。特に蛍光標識のための、多様な標識法および標識が当業者に知られている。好ましくは、当技術分野で既知のものに匹敵するアレイ（DNAマイクロアレイ、遺伝子チップ、バイオチップ、DNAチップ、および遺伝子アレイを含めた幾つかの名称で知られている）を形成するのに適切な支持体にプローブを固定化する。
【００６０】
[0066]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な2以上のペプチドプローブまたはポリペプチドプローブを含む組成物を提供する。１態様において、プローブはSEQ ID NO: 1〜295から選択される配列を含む１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを含む。他の態様において、プローブはSEQ ID NO: 1〜70から選択される配列を含む１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを含む。他の態様において、プローブはSEQ ID NO: 1〜25から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを含む。他の態様において、プローブは表２に同定されるSEQ ID NOから選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを含む。他の態様において、プローブは表３に同定されるSEQ ID NOから選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを含む。他の態様において、プローブはそれらのポリペプチドの有用な１以上の変異型の発現により生成するタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを含む。プローブは、適切なポリペプチドと特異的にハイブリダイズするのに十分な個数のアミノ酸を含む。好ましくは、プローブは少なくとも約4、10、20、40または80個のアミノ酸を含む。ある態様において、プローブはより多数のアミノ酸を含み、少なくとも約100個、またはそれ以上のアミノ酸を含む。プローブは、本発明により同定された全長機能性遺伝子の発現から誘導される全長機能性タンパク質を含むことができる。好ましくは、本発明は肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子を検出するのに適切な複数のポリペプチドプローブ、より好ましくは約10、50、200、500もしくは1000、またはそれ以上のプローブを合わせたものを提供する。１態様において、本発明プローブは抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００６１】
[0067]  ポリペプチドプローブは、常法により、たとえば本発明のポリヌクレオチドについて提供するヌクレオチド配列データおよび当技術分野で既知の方法を用いて調製できる。そのような方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリペプチドを細胞から直接単離する、ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAを単離または合成し、そのDNAまたはRNAを用いて組換え生成物を調製する、個々のアミノ酸からポリペプチドを化学合成する、および既存のポリペプチドの化学的開裂によりポリペプチドフラグメントを調製する。
【００６２】
[0068]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支持体の既知の位置に付着した複数の本発明のペプチドプローブまたはポリペプチドプローブを備えた支持体を含む。このデバイスは本質的に、本明細書に記載するペプチドプローブまたはポリペプチドプローブの固定化型である。このデバイスは、タンパク質およびそれらの発現パターンを迅速かつ特異的に検出するのに有用である。一般に、それらのプローブは支持体に結合しており、１以上のタンパク質を含有する試料を、試料タンパク質がプローブにハイブリダイズしうる状態でプローブに曝露する。プローブ、試料タンパク質、または両方を、一般に発蛍光団、または当業者に既知の他の物質で標識し、検出する。一般に、ポリヌクレオチドマイクロアレイを読み取るために用いるものと同じ方法および計測器をタンパク質アレイに適用できる。好ましくは、アレイを形成するのに適切な支持体にプローブを固定化する。
【００６３】
[0069]  試料中のタンパク質の量または濃度を検出するための方法は当業者に既知である。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、およびELISAアッセイが含まれる。抗体を用いる方法には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が適切である。そのような抗体は、タンパク質、タンパク質エピトープまたはタンパク質フラグメントに免疫学的に特異的であってもよい。
【００６４】
[0070]  本発明のある態様は、本発明のポリヌクレオチドの発現により生成したタンパク質の検出および定量のために抗体を利用する。タンパク質は免疫沈降法、アフィニティー分離、ウェスタンブロット分析、タンパク質アレイなどにより検出できるが、好ましい方法にはELISA法を用いる。この方法では、抗体を固体支持体に固定化し、ターゲットであるタンパク質またはペプチドを固定化抗体に曝露する。プローブ、ターゲット、または両方を既知の方法で標識できる。
【００６５】
[0071]  ある態様においては、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する複数の遺伝子発現パターンまたは発現プロフィールを、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出のためのプローブのアレイを利用して観察する。１態様においては、オリゴヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを利用でき、一方、他の態様では本発明の示差発現する遺伝子の生成物に特異的に結合する抗体または他のタンパク質のアレイを利用できる。そのようなアレイは市販されているか、あるいは当業者に既知の方法、たとえば固体支持体上でのインサイチュー合成により、または予め合成したプローブをマイクロプリンティング技術で固体支持体に結合させることにより、注文生産することができる。多様な態様において、本発明の示差発現遺伝子により生成する転写体またはタンパク質を特異的に検出するように、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを注文生産する。
【００６６】
[0072]  １態様においては、表２に同定される2以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子により生成する転写体またはタンパク質を特異的に検出するように、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを注文生産する。これらのプローブは、動物の脂質およびグルコース代謝経路と関連する遺伝子を検出するように設計される。他の態様においては、表３に同定される2以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子により生成する転写体またはタンパク質を特異的に検出するように、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを注文生産する。これらのプローブは、痩身動物と比較して肥満動物に特に関連する遺伝子を検出するように設計される。
【００６７】
[0073]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の示差発現を試料中で検出するための方法を提供する。この方法は下記を含む：(a)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；(b)場合により、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、標準品中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；(c)試料および場合により工程(b)の標準品からのハイブリダイゼーション複合体を検出し；そして(d)試料からのハイブリダイゼーション複合体を標準品からのハイブリダイゼーション複合体と比較し、その際、標準品と試料の間のハイブリダイゼーション複合体の量における2倍以上の差は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子が試料中で示差発現していることの指標となる。多様な態様において、複数のポリヌクレオチドプローブは下記のものから選択される；SEQ ID NO:l〜295：2倍以上の差、SEQ ID NO:l〜70：2.5倍以上の差、SEQ ID NO:l〜25：3倍以上の差、表２に同定されるポリヌクレオチド：2倍以上の差、表３に同定されるポリヌクレオチド：2倍以上の差、およびそれらのポリヌクレオチドの変異型：そのグループに適切な倍数の差。これらのポリヌクレオチドを用いてプローブを調製し、これらを試料ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を形成させ、これらを検出し、そして標準品のものと比較する。ある態様においては、試料ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションの前に増幅する。ある態様においては、プローブを支持体に、好ましくはアレイ状に結合させる。
【００６８】
[0074]  工程(b)、および工程(c)の一部は任意であり、2以上の試験系を比較的同時に比較すべき場合に用いられる。しかし、好ましい態様においては、比較のために用いる標準品はその方法を用いて予め求めたデータに基づく。
【００６９】
[0075]  これらのプローブを試料に曝露してハイブリダイゼーション複合体を形成させ、これらを検出し、そして標準品のものと比較する。試料と標準品の間のハイブリダイゼーション複合体の差は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現するポリヌクレオチド、したがって遺伝子が、試料中で示差発現していることの指標となる。好ましい態様において、プローブは本発明により同定された１以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより生成するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを特異的に検出するように作成される。ハイブリダイゼーション複合体を検出する方法は当業者に既知である。
【００７０】
[0076]  １態様において、本発明方法はさらに、動物または試料をハイブリダイゼーション前に被験物質に曝露することを含む。その場合、比較は試料中の肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現を被験物質が変化させたか否かの指標となる。
【００７１】
[0077]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の示差発現を試料中で検出するための方法を提供する。この方法は下記を含む：(a)複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと試料中のタンパク質を、プローブとタンパク質の特異的結合が起きうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合するタンパク質は肥満動物に痩身動物と比較して示差発現し；(b)場合により、複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと標準品中のタンパク質を、プローブとタンパク質の特異的結合が起きうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合するタンパク質は肥満動物に痩身動物と比較して示差発現し；(c)試料および場合により工程(b)の標準品における特異的結合を検出し；そして(d)試料における特異的結合を標準品における特異的結合と比較し、その際、標準品の特異的結合と試料の特異的結合の間の差は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子が示差発現していることの指標となる。
【００７２】
[0078]  多様な態様において、複数のポリペプチドプローブは下記のものから選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するプローブである；SEQ ID NO:l〜295：2倍以上の差、SEQ ID NO:l〜70：2.5倍以上の差、SEQ ID NO:l〜25：3倍以上の差、表２に同定されるヌクレオチド：2倍以上の差、表３に同定されるポリヌクレオチド：2倍以上の差、およびそれらのポリヌクレオチドの変異型：そのグループに適切な倍数の差。これらのポリヌクレオチドを用いてプローブを調製し、これらをタンパク質と特異的に結合させ、これらを検出し、そして標準品のものと比較する。ある態様においては、プローブを支持体に、好ましくはアレイ状に結合させる。１態様において、プローブは抗体である。
【００７３】
[0079]  工程(b)、および工程(c)の一部は任意であり、2以上の試験系を相対的に同時に比較すべき場合に用いられる。しかし、好ましい態様においては、比較のために用いる標準品はその方法を用いて予め求めたデータに基づく。
【００７４】
[0080]  これらのプローブを試料に曝露して特異的結合を形成させ、これを検出し、そして標準品のものと比較する。試料と標準品の間の特異的結合の差は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現するタンパク質、したがって遺伝子、特に肥満関連遺伝子が、試料中で示差発現していることの指標となる。好ましい態様において、プローブは本発明により同定された１以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより生成するタンパク質またはそのフラグメントを特異的に検出するように作成される。
【００７５】
[0081]  １態様において、本発明方法はさらに、ポリペプチドをタンパク質と反応させる前に動物または試料を被験物質に曝露することを含む。その場合、比較は試料中の肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現を被験物質が変化させたか否かの指標となる。
【００７６】
[0082]  他の観点においては、動物の脂肪組織の量を調節することを試みる際に、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を試料中で検出するための方法を用いて、脂肪組織調節プログラムに応答した動物の進行をモニターする。この方法は、調節プログラムに際して間隔をおいて、好ましくは設定した間隔で実施され、調節プログラムに際して2以上の時点でこの方法の結果を比較することにより動物のプログラムをモニターする。比較の結果、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現または遺伝子発現パターンの変化があること、またはいかなる変化もないことは、その調節プログラムの有効性の指標となる。たとえば、動物の脂肪組織の量を減少させるために計画した脂肪組織調節プログラムをモニターし、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の遺伝子発現量がそのプログラムにおける刺激に応答して経時的に減少していれば、有効であることを示すことができる。同様に、痩身または過度に痩身である動物において脂肪組織を増加させるプログラムは、そのような遺伝子の発現プロフィールを高めるべきである。調節プログラムは、食事、運動、薬物、またはこれらに類する他のプログラムなど、動物の脂肪組織の量を調節するためのいかなる計画であってもよい。
【００７７】
[0083]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現プロフィールに対する被験物質の影響を測定するための方法、および被験物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定するための方法を提供する。この方法は下記を含む：(a)試験系において被験物質の不存在下でSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される2以上のポリヌクレオチドの転写生成物または翻訳生成物を測定することにより第１発現プロフィールを判定し；(b)試験系において被験物質の存在下でSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される2以上のポリヌクレオチドの転写生成物または翻訳生成物を測定することにより第２発現プロフィールを判定し；(c)第１発現プロフィールを第２発現プロフィールと比較する。
【００７８】
[0084]  第１発現プロフィールと比較した第２発現プロフィールの2倍以上の変化は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現に被験物質が影響を及ぼすこと、および被験物質が動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があることの指標となる。好ましい態様において、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子は肥満関連遺伝子であり、少なくとも2つの遺伝子における第１発現プロフィールと第２発現プロフィールの間の発現変化は2倍以上である。本発明は、この方法で同定した物質をも提供する。
【００７９】
[0085]  １態様において、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 1〜70またはその有用な変異型から選択され、変化は2.5倍以上である。他の態様において、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 1〜25またはその有用な変異型から選択され、変化は3倍以上である。他の態様において、ポリヌクレオチドは表２もしくは３またはその有用な変異型に同定され、変化は2倍以上である。
【００８０】
[0086]  １態様において、この試験系はインビトロ試験系、たとえば組織培養、細胞抽出物、または細胞系である。他の態様において、この試験系はインビボ試験系、すなわちイヌ類などの動物である。他の態様において、この試験系はエクスビボ組織系またはインシリコ（in silico）系である。
【００８１】
[0087]  被験物質は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現するポリヌクレオチドまたは遺伝子、特に肥満関連遺伝子に対して影響をもつ可能性のあるいかなる物質であってもよい。被験物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子、高分子、ビタミン、無機質、単糖類；複合糖類；多糖類；炭水化物；中鎖トリグリセリド(MCTs)；トリアシルグリセリド(TAG)；n-3 (オメガ-3)脂肪酸：DHA, EPA, ALAを含む；n-6 (オメガ-6)脂肪酸：LA, γ-リノレン酸(GLA)およびARAを含む；SA、共役リノール酸(CLA)；コリン源、たとえばレシチン；下記を含む脂溶性ビタミン：ビタミンAおよびその前駆物質、たとえばカロテノイド(たとえばβ-カロテン)、ビタミンD源、たとえばビタミンD2(エルゴカルシフェロール)およびビタミンD3 (コレカルシフェロール)、ビタミンE源、たとえばトコフェロール(たとえばα-トコフェロール)およびトコトリエノール、ならびにビタミンK源、たとえばビタミンK1(フィロキノン)およびビタミンK2 (メナジオン)；下記を含む水溶性ビタミン：B系列ビタミン、たとえばリボフラビン、ナイアシン(ニコチンアミドおよびニコチン酸を含む)、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチンおよびコバラミン；ならびにビタミンC (アスコルビン酸)；抗酸化剤：前記ビタミンの一部を含む、特にビタミンEおよびC；ならびにバイオフラボノイド、たとえばカテキン、ケルセチンおよびテアフラビン；キノン類、たとえばユビキノン；カロテノイド、たとえばリコペンおよびリコキサンチン；レスベラトール；ならびにα-リポ酸；L-カルニチン；D-リモネン；グルコサミン；S-アデノシルメチオニン；ならびにキトサン。好ましい態様において、被験物質はサプリメントとして食物に添加または摂取できる栄養素である。例には脂肪酸、たとえばオメガ-3脂肪酸(たとえばDHAおよびEPA)およびオメガ-6脂肪酸(たとえばARA)、カルニチン、メチオニン、ビタミンC、ビタミンEおよびビタミンDが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
[0088]  好ましい態様において、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子、特に肥満関連遺伝子に影響を及ぼすために有用な物質は、出願中の米国仮特許出願No.60/657980（2005年3月2日出願）およびそれに基づく優先権を主張するいずれかの米国または外国の後続出願に開示された方法を用いて同定できる。
【００８３】
[0089]  他の観点において本発明は、ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、またはある動物が肥満であるという診断を下すための方法を提供する。この方法は、SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドが、またはSEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合する１以上のポリペプチドが、その動物において１以上の痩身動物と比較して示差発現しているかを判定することを含む。その比較によりそれらのポリヌクレオチドがその動物において痩身動物と比較して2倍以上示差発現していることが示された場合には、その動物は肥満になる可能性があると判定され、または肥満であると判定される。
【００８４】
[0090]  多様な態様において、予後または診断はSEQ ID NO: 1〜70、SEQ ID NO: 1〜25、表２に同定される配列、表３に同定される配列、またはそれらの有用な変異型から選択されるポリヌクレオチドに基づく。
【００８５】
[0091]  比較に際して用いる痩身動物についての発現プロフィールは、被験動物についての発現プロフィールと同時に１以上の痩身動物から得ることができ、または痩身動物の発現プロフィールのデータベースから得ることができる。好ましくは、長年蓄積されてきた痩身動物についての発現プロフィールのデータベースを参考として用いるために入手できる。
【００８６】
[0092]  ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが差発現しているかの判定は、当業者に既知の方法でポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することにより達成でき、それらのうち若干を本明細書に記載する。
【００８７】
[0093]  他の観点において本発明は、動物、特にヒト以外の動物のゲノムまたはゲノム発現を操作するための方法を提供する。この方法は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を、好ましくはSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドを用いて構築したオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドにより撹乱することを含む。
【００８８】
[0094]  ゲノムの操作方法は当業者に既知である。そのような方法には、トランスジェニック動物およびノックアウト動物の作製ならびに転写または翻訳の撹乱が含まれる。１態様においては、SEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドを用いて、動物において対応する内因性遺伝子を撹乱または”ノックアウト”するのに有用な構築体を作成する。この方法により、その遺伝子座についてヌル変異をもつ動物が作製される。他の態様において動物は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現の低下または完全排除を示す。本発明は、この方法で作製した動物をも提供する。多様な態様において、SEQ ID NO: 1〜70、SEQ ID NO: 1〜25、表２に同定される配列、表３に同定される配列、またはそれらの有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドを用いてゲノムを操作する。トランスジェニック動物は、好ましくは哺乳類、たとえばげっ歯類、たとえばマウスおよびラットであるが、他の哺乳類、たとえばネコ類およびイヌ類であってもよい。
【００８９】
[0095]  ゲノムの発現を操作する方法は当業者に既知である。そのような方法にはアンチセンス分子またはsiRNAの使用が含まれ、それらの分子を用いてゲノムの転写または翻訳を撹乱する。１態様においては、SEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドを用いて、転写を撹乱するアンチセンス分子およびこれに類するDNA結合分子を作成し、または転写を機能的に撹乱するのに有用な短い（低分子）干渉RNA（siRNA）を作成する。要約すると、遺伝子発現は、アンチセンス分子によりDNAへの結合および転写阻止によって、またsiRNAによりRNA干渉(RNAi)またはPTGS（post-transcriptional gene silencing (翻訳後遺伝子サイレンシング)）によって阻害される。siRNAは、そのsiRNA分子が覆う領域内のmRNA分子の開裂による破壊について、相同mRNA分子をターゲティングする。したがって、肥満関連遺伝子から転写されたmRNAをターゲティングおよび開裂しうるsiRNAを用いて、それらの遺伝子のうち１以上の発現を低下または排除する。他の態様において、グループ2、グループ3、グループ4またはグループ5のポリヌクレオチドまたは遺伝子から選択される１以上のDNAに結合しうるアンチセンス分子、およびそれらの１以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子から転写されたmRNAをターゲティングおよび開裂しうるsiRNAを用いて、これらの遺伝子のうち１以上の発現を低下または排除することができる。好ましい態様において、siRNAはSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチドの転写体から構築される。
【００９０】
[0096]  他の観点において、本発明は動物のゲノムを操作するのに適切な組成物を提供する。この組成物は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現に干渉する１以上の物質を含む。好ましくは、物質は、１以上の前記遺伝子またはそれらの転写生成物に結合してそれらの複製、転写または翻訳に干渉するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、最も好ましくはSEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチドを用いて構築したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む。多様な態様において、これらの物質はアンチセンス分子またはsiRNAを含む。
【００９１】
[0097]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現を調節し、または動物の脂肪組織の量を調節するための方法であって、遺伝子発現または組織を調節する量の、DHA、EPA、EPAおよびDHA、ALA、LA、ARA、ならびにSAのうち１以上を含む組成物を動物に投与することを含む方法を提供する。好ましい態様において、組成物は下記を含む：DHAを約1〜約30、好ましくは約3〜約15 mg/kg/日の量で；EPAを約1〜約30、好ましくは約3〜約15 mg/kg/日の量で；EPA/DHAの組合わせ(1.5:1の比率)を約4/2〜約30/45、好ましくは9/6〜約18/12 mg/kg/日の量で；ALAを約10〜約100、好ましくは約30〜約60 mg/kg/日の量で；LAを約30〜約600、好ましくは約60〜約300 mg/kg/日の量で；ARAを約5〜約50、好ましくは約15〜約30 mg/kg/日の量で；SAを約3〜約60、好ましくは約6〜約30 mg/kg/日の量で；CLA（対照として）を約6〜約120、好ましくは約12〜約60 mg/kg/日の量で。この組成物は、その組成物に適切ないずれかの様式または形態で動物に投与することができる。好ましくは、組成物を食物組成物またはサプリメントの形態で動物に経口投与する。食物組成物はいずれかの形態、たとえば当技術分野で既知の栄養バランスのとれた食物組成物、たとえば動物、特に愛玩動物、たとえばネコ類およびイヌ類の動物用の乾燥食物、半湿潤食物、および湿潤食物であってもよい。サプリメントには、錠剤、カプセル剤、およびこれらに類する剤形が含まれる。他の観点において組成物は、動物の脂肪組織の量を調節する１種類以上の他の薬物または他の物質と組み合わせて投与される。これらの薬物または物質には、食欲を抑制し、代謝を高め、または特に食物からの特定の栄養素の吸収を妨げる物質が含まれるが、これらに限定されない。例にはオルリスタット（脂肪の分解および吸収を遮断する）、食欲不振誘発薬、たとえばデキセドリン（dexedrine）（食欲を抑制する）、食欲抑制薬、たとえばフェンフルラミンおよびフェンテルミンおよびシブトラミンおよびフェニルプロパノールアミンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
[0098]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現を調節し、または動物の脂肪組織の量を調節するのに適切な組成物を提供する。この組成物は、遺伝子発現または組織を調節する量の、DHA、EPA、EPAおよびDHA、ALA、LA、ARA、ならびにSAのうち１以上を含む。多様な態様において、組成物は下記を含む：約1〜約30 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のDHA；約1〜約30 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のEPA；約4/2〜約30/45 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のEPA/DHAの組合わせ(1.5:1の比率)；約10〜約100 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のALA；約30〜約600 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のLA；約5〜約50 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のARA；約3〜約60 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のSA；および約6〜約120 mg/kg/日を動物に投与するのに十分な量のCLA（対照として）。これらの物質は動物の脂肪組織の量を調節するのに有用である。好ましくは、これらの物質は複数の前記遺伝子の発現に影響を及ぼす。１態様において、組成物はさらに、動物の脂肪組織の量を調節する１種類以上の薬物または他の物質を含む。
【００９３】
[0099]  他の観点において本発明は、１以上のグループまたはサブグループに収容する動物を選択するための方法を提供する。この方法は、(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチドについて、または(b) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質にそれぞれ特異的に結合するポリペプチドについて、動物の発現プロフィールを判定し、そしてその発現プロフィールに基づいて動物をグループに配属することを含む。これらのグループは有用ないずれかのグループ、好ましくは研究実験、試験、臨床試験、またはこれに類する他のカテゴリーに関係するものであってもよい。たとえば、これらのグループは１以上の対照グループおよび１以上の処置グループを必要とする研究実験または臨床試験に関係するグループであってもよい。１態様において、対照グループは痩身動物を含み、処置グループは肥満動物を含む；あるいは互いにその逆である。複数の動物の発現プロフィールを判定し、動物をそのプロフィールの結果に基づいて対照グループまたは処置グループに配属することができる；すなわち、標準と比較して2倍以上の示差発現を伴う動物を肥満グループに配属し、標準と比較して2倍以下の示差発現を伴う動物を痩身グループに配属する。この方法は、動物の脂肪組織の量を減少させる能力について可能性のある薬物または他の物質を検査する際に、動物を臨床試験に配属するために特に有用である。
【００９４】
[00100]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子に関するデータを操作するのに適切なコンピューターシステムを提供する。このシステムは、痩身動物および／または肥満動物における、SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドおよび／またはSEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するポリペプチドの発現レベルを同定する情報を含むデータベース、ならびにこのデータベースと連絡するための、特に異なる動物または異なるカテゴリーの動物、たとえば痩身動物または肥満動物に関する情報を入力、操作および閲覧するためのユーザーインターフェースを含む。１態様において、データベースはさらに、SEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドがコードする１以上のポリペプチドの活性レベルを同定する情報を含む。他の態様において、データベースはさらに、SEQ ID NO: 1〜295またはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドに関する配列情報を含む。他の態様において、データベースは１以上の動物種における遺伝子の推定記述を記載した追加情報を含む。このコンピューターシステムは、データを収容および操作でき、かつユーザーと連絡できる、いずれかのエレクトロニクスデバイス、たとえば本発明の使用および動物の状態に関する結果の出力を可能にするように設計された一般的なコンピューターまたは分析機器である。
【００９５】
[00101]  他の観点において本発明は、本発明のコンピューターシステムを用いて、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現プロフィールを同定する情報を提示するための方法を提供する。この方法は、試料に由来するSEQ ID NO: 1〜295から選択される2以上のポリヌクレオチドまたはそれらのポリヌクレオチドから発現する2以上のタンパク質の発現レベルを、このコンピューターシステムにおけるポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現プロフィールと比較することを含む。
【００９６】
[00102]  他の観点において本発明は、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の示差発現を、試験系で判定するのに適切なキットを提供する。このキットは、用途およびキット構成要素に応じて単一パッケージ内の別個の容器または仮想パッケージ内の別個の容器内に、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な2以上のプローブを含み、プローブは下記のものを含む：(a) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択されるポリヌクレオチド；または(b) SEQ ID NO: 1〜295もしくはその有用な変異型から選択される１以上のポリヌクレオチドの発現により生成するタンパク質に特異的に結合するポリペプチド；ならびに下記のうち少なくとも１つ：(1)本発明のプローブの使用法に関する指示；(2)プローブを使用するのに必要な試薬および装置；(3)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を調節するのに適切な組成物；(4)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現を撹乱するのに適切な組成物；(5)動物の脂肪組織の量を調節するのに適切な食物組成物；ならびに(6)動物の脂肪組織の量を調節する１以上の薬物または他の物質。好ましい１態様において、プローブは支持体に、好ましくはアレイ状に結合している。
【００９７】
[00103]  キットが仮想パッケージを含む場合、キットは仮想環境における指示を１以上の物理的キット構成要素と組み合わせたものに限定される。１態様において、キットはプローブおよび／または他の物理的構成要素を含み、プローブおよび他のキット構成要素を使用するための指示はインターネットを介して入手できる。キットは追加アイテム、たとえば試料、プローブおよび試薬を混合するためのデバイス、ならびにキットを使用するためのデバイス、たとえば試験管または混合用器具を含むことができる。
【００９８】
[00104]  他の観点において本発明は、下記のうち１以上に関する情報または指示を伝達するための手段を提供する：(1)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子の発現を試料中で検出するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(2)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子の発現に対して被験物質が及ぼす影響を測定するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(3)被験物質をスクリーニングしてそれが動物の脂肪組織の量を調節するのに有用な可能性があるかを判定するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(4)ある動物が肥満になる可能性があるという予後を明確にし、またはある動物が肥満であるという診断を下すために、本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(5)ヒト以外の動物のゲノムまたは動物のゲノム発現を操作するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(6)肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する１以上の遺伝子、特に肥満関連遺伝子の発現を調節し、または動物の脂肪組織の量を調節するために、本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(7)１以上のグループに収容する動物を選択するために本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(8)コンピューターシステムを用いて肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子、特に肥満関連遺伝子に関するデータを操作するために、本発明のポリヌクレオチドを使用すること、(9)本発明物質を単独で、または本発明の他の要素と組み合わせて動物に投与すること、(10)動物の脂肪組織の量を調節するために本発明物質を使用すること、(11)本発明のコンピューターシステムを使用すること、(12)本発明のキットを使用すること、ならびに(13)動物の脂肪組織の量を調節する１以上の薬物または他の物質と共に本発明の方法および組成物を使用すること。この手段は、それらの情報または指示を含む書類、ディジタル記憶媒体、光学記憶媒体、オーディオプレゼンテーションまたはビジュアルディスプレーを含む。ある態様において、伝達手段は、それらの情報または指示を含むディスプレーされたウェブサイト、ビジュアルディスプレー、広告柱（kiosk）、パンフレット、製品ラベル、パッケージ挿入物、広告、ちらし（handout）、公開発表、オーディオテープ、ピデオテープ、DVD、CD-ROM、コンピューター可読チップ、コンピューター可読カード、コンピューター可読ディスク、コンピューターメモリー、またはその組合わせを含む。有用な情報には、下記のうち１以上が含まれる：(1)動物の健康および良好な生活状態を増進するための方法、ならびに(2)動物の介護者が本発明のおよびその使用に関して質問のある場合に用いるための連絡情報。有用な指示には、プローブを使用するための技術、遺伝子発現アッセイを実施するための指示、ならびに本発明物質の投与の量および頻度が含まれる。この伝達手段は本発明を使用することの有益性に関して説明するために有用である。
【００９９】
[00105]  本明細書に本発明の代表的な好ましい態様を開示し、特定の用語を用いたが、本明細書に含まれる教示からみて本発明の多数の改変および変更が可能であるので、それらは一般的な説明の意味で用いたにすぎず、限定のためのものではない。本発明を以下の実施例によりさらに説明できるが、これらの実施例は説明のために記載したにすぎず、別途明記しない限り本発明の範囲を限定するためのものではないことは理解されるであろう。
【０１００】
実施例
材料および方法
組織からのリボ核酸（RNA）の単離
[00106]  採集し、液体窒素中で凍結し、融解した組織試料をホモジナンズし、TRIzol(登録商標) RNA抽出法により処理すると良質のRNAが得られ、これを次いでさらにゲノム分析する。
【０１０１】
[00107]  材料：氷、液体窒素、凍結したイヌ類またはネコ類の組織、TRIzol(登録商標)細胞溶解試薬、クロロホルム最低99%、イソプロピルアルコール、70%エタノール(無水エタノール、およびRNaseを含まない脱イオン水を用いて調製)、RNase Zap(登録商標)、脱イオン水、RNA Storage Solution(登録商標) (RNA保存液)：Ambionから。
【０１０２】
[00108]  装置：Ultra-Turrax T25強力ホモジナイザー、Beckman Coulter Allegra 25R遠心機、エッペンドルフ(Eppendorf)遠心機、鉗子、メス、硬質カッティング面、すなわちカッティングボード、DNaseおよびRNaseを含まない無菌の1.5mLミクロ遠心管、DNaseおよびRNaseを含まない無菌の5OmL使い捨てポリプロピレン試験管、PlOOO、P200、P20、PlOおよびP2 Rainin Pipetmanピペット、DNaseおよびRNaseを含まない無菌のPlOOO、P200、P20、PlOおよびP2ピペット用フィルター付きピペットティップ、ならびに糸屑を含まない無菌の拭布。
【０１０３】
[00109]  調製：4mLのTRIzol(登録商標)を入れた5OmLポリプロピレン試験管を用意する（RNA単離用に選択した各組織につき１本の試験管）。
[00110]  組織ホモジナイゼーション：液体窒素を保持しうる容器に3〜4匙の液体窒素を充填する。凍結組織片を速やかにこの容器に入れ（組織はほぼ豆の大きさとすべきである）、適宜ラベルを付けた5OmLポリプロピレン試験管（既に4mLのTRIzol(登録商標)が入っている）に組織を入れる。直ちにUltra-Turrax T25強力ホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションを開始する。最高設定(6)で10〜15秒間ホモジナイズする。試料をさらに10〜15秒間氷冷し、次いで繰り返す。組織が完全にホモジナイズされて溶液が混濁するまで継続する。完全にホモジナイズした時点で5OmL試験管に蓋をし、氷に戻す。ホモジナイズした組織を室温で5分間インキュベートした後、単離操作を進める。
【０１０４】
[00111]  RNAの単離：一般に、TRIzol(登録商標)試薬に添えられたInvitrogenの指示に示された手順に従う。ホモジナイズした試料を4本の1.5mLミクロ遠心管に1mLずつ4つに分ける。20OuLのクロロホルムを各1mLの部分標本に添加する。試験管に蓋をし、15秒間、渦撹拌し、次いで上下に振とうする。その結果、ピンク色の乳状液体になるはずである。試験管を室温で2〜3分間インキュベートする。試験管を14,000 rpmおよび4℃で15分間遠心する。水相（上層）を無菌の1.5mLミクロ遠心管へ移す。この新たな試験管へ移すべき水相の一般的な容量は約50OuLである。中間相または下相を決して移さないようにする。水層を入れた各ミクロ遠心管に50OuLのイソプロピルアルコールを添加することにより、溶液からRNAを沈殿させる。試験管を少なくとも20秒間、上下に振とうする。試料を室温で10分間インキュベートする。試料を14,000 rpmおよび4℃で10分間遠心する。ペレットを決して失わないように液体を吸引することにより、慎重に上清を除去する。1mLの70%エタノールを添加してペレットを洗浄する。試験管を軽くはじく（または試験管をベンチ上で軽く叩く）ことによりペレットを離脱させ、振とう混合する。8,200 rpmおよび4℃で5分間遠心する。ペレットを決して失わないように液体を吸引することにより、慎重に上清を除去する。糸屑を含まない拭布を用いて過剰のエタノールを慎重に吸い取って、ペレットを確実に乾燥させる。各ペレットを3OuLのRNA Storage Solutionに再懸濁する。RNAが溶液に戻るまでピペッティングすることによって穏やかに混合し、次いで-80℃に保存する。RNAの再懸濁を促進するために試料を数秒間、低速で渦撹拌することが必要な場合がある。これが必要な場合、凍結前にミクロ遠心機で試料を遠心沈殿させる。
【０１０５】
[00112]  RNA洗浄：RNeasy(登録商標) Mini Handbookに示された手順に従う。
OptiCellチャンバー内でRNeasy Miniキットを用いて培養した細胞からのRNAの単離
[00113]  哺乳類細胞系から培養した細胞を用いて良質のRNAを単離し、次いでこれを以後のゲノム分析に用いる。細胞培養に関連するすべての作業を厳密な無菌条件下で実施すべきである。
【０１０６】
[00114]  試薬：1O×PBS、脱イオンH2O、無水エタノール、RNA Storage Solution、β-メルカプトエタノール、RNase Zap(登録商標)、緩衝液RLTおよび緩衝液RWlおよび緩衝液RPE (RNeasy Miniキット内に備えられている)。
【０１０７】
[00115]  装置／材料：RNeasy Miniキット、QIAshredderスピンカラム、OptiCellナイフ、2OmLの無菌注射器、OptiCellティップ、細胞掻き取り具、PlOOO Pipetmanピペット, Rainin、P200 Pipetmanピペット, Rainin、100-lOOuLフィルター付きピペットティップ、1-20OuLフィルター付きピペットティップ、無菌トランスファーピペット、55mLの無菌溶液槽、1.5mLの無菌ミクロ遠心管、およびエッペンドルフミクロ遠心機。
【０１０８】
[00116]  溶液：緩衝液RLT (RNeasy Miniキット内に原液が備えられている)；緩衝液RLT 1OmLにつきlOOuLのβ-メルカプトエタノールをプロトコル開始前に添加する。70%エタノール：35mLの無水エタノールを、RNaseを含まない15mLの脱イオン水に添加することにより、5OmLの70%エタノールを調製する。1×PBS：RNaseを含まない水。溶液を22umフィルターで濾過する。
【０１０９】
[00117]  手順：細胞をOptiCellチャンバーから取り出す(一度に１つのOptiCellに着手する)。RNAを単離する前に細胞を顕微鏡下で検査して、細胞が生存していることを確認する。細胞培地を分離して廃棄する。OptiCellナイフで上膜を切除して細胞を下膜上に露出させる。細胞が付着している膜を1×PBSで3回洗浄する。6OOuLの緩衝液RLT(β-メルカプトエタノールを含有)を細胞が付着している膜の中心にピペットで添加する。細胞掻き取り具を用いて緩衝液RLTを穏やかに膜の表面全体に広げ、次いで液体を一隅に集める。緩衝液RLT全量をピペットで取り出してQIAshredderスピンカラムに乗せる。
【０１１０】
[00118]  RNAの単離：QIAshredderスピンカラムを14,000 rpmで2分間遠心する。スピンカラムを廃棄し、ただし採集管とその内容物を保存する。60OuLの70%エタノールを採集管に添加し、ピペッティングによって十分に撹拌する(この時点で全量は1.2mL)。60OuLの細胞溶解物をRNeasyミニカラムへ移し、14,000 rpmで15秒間遠心する。流出液を廃棄し、ただし採集管とスピンカラムを保存する。残量の細胞溶解物(約600uL)をスピンカラムへ移し、遠心を繰り返す。流出液を廃棄し、ただし採集管とスピンカラムを保存する。70OuLの緩衝液RWlをスピンカラムに添加する。14,000 rpmで15秒間遠心してカラムを洗浄する。流出液と採集管を廃棄する。スピンカラムを新たな2mL採集管へ移し、50OuLの緩衝液RPEをカラムに添加する。14,000 rpmで15秒間遠心する。流出液を廃棄し、採集管／カラムを保存する。さらに50OuLの緩衝液RPEをカラムに添加する。14,000 rpmで2分間遠心する。スピンカラムを1.5mL採集管へ移す。3OuLのRNA Storage Solutionをシリカゲル膜に直接添加し、14,000 rpmで１分間遠心してRNAを溶離する。最終RNAを-70℃に貯蔵する。
【０１１１】
RNA 6000 Nanoアッセイ
[00119]  Agilent 2100 BioanalyzerおよびRNA 6000 Nanoアッセイを用いて、培養哺乳動物細胞、リンパ球または組織から単離したRNAを定性分析する。
【０１１２】
[00120]  試薬：RNA 6000 Nanoゲルマトリックス、RNA 6000 Nano色素濃縮液、RNA 6000 Nanoマーカー(前記の試薬はすべてRNA 6000 Nanoアッセイキットに含まれる：Agilent)、RNA 6000ラダー、RNase Zap、およびRNaseを含まない水：Ambionから。
【０１１３】
[00121]  装置／他の材料：Agilent Chip Priming Station(チッププライミングステーション), Agilent、RNA 6000チップ, Agilent、電極クリーナー、P2、PlO、P200およびPlOOO Rainin Pipetmanピペット、DNase/RNaseを含まない無菌のフィルター付きピペットティップ、無菌の1.5mLミクロ遠心管、ボルテックス, IKAボルテックスミキサー、ミクロ遠心機、ならびに加熱ブロック。
【０１１４】
[00122]  手順：手順はAgilent Technologies によるReagent Kit Guide, RNA 6000 Nano Assay,2003年11月版に示されている。この手引きに示された手順に従い、下記の変更を行なう：ゲルの調製、p. 17−濾過したゲルをそれぞれ65uLに小分けするのではなく、濾過したゲル原液を元のミクロ遠心管内に保存し、必要に応じて65uLに小分けする。RNA 6000 Nano Markerの装填、p. 22−RNaseを含まない水(RNA 6000 Nano Markerの代わりに)1uLを、試料を入れない予定の試料ウェルそれぞれに添加する。これはマーカーの使用量を節約するだけでなく、RNaseを含まない水を含めていずれの試薬も汚染していないことを示す陰性対照としても役立つ。ラダーおよび試薬の装填、p. 23−試料およびRNA 6000ラダーを71℃でさらに30秒間(合計2.5分間)、熱変性する。チップ操作の開始、p. 26−アッセイメニューから”Eukaryote Total RNA(真核細胞全RNA) Nano”オプションを選択する。
【０１１５】
Affymetrix Genechip発現分析
[00123]  Affymetrix, Inc.(95051カリフォルニア州サンタクララ)から市販されているAffymetrix Canine-1およびCanine-2 GeneChip(登録商標)アレイを用いて遺伝子発現を分析する。全RNAをcDNAに逆転写する。このcDNAを用いてcRNAを生成させ、これを分断し、GeneChipハイブリダイゼーション用プローブとして用いる。遺伝子チップを洗浄し、ハイブリダイゼーション信号をAffymetrixレーザースキャナーで測定する。次いでこのハイブリダイゼーションデータを以後の分析のために確認および規準化する。
【０１１６】
[00124]  材料：Affymetrixが大部分の試薬およびキットを提供している。Affymetrixマニュアルに挙げられているがキット内に供給されていない他の試薬、RNase Zap(登録商標)および脱イオン水は、別個に入手できる(詳細についてはGeneChip Expression Analysis Technical Manual (701021 Rev.4)を参照)。
【０１１７】
[00125]  装置：エッペンドルフミクロ遠心機、DNaseおよびRNaseを含まない無菌の1.5mLミクロ遠心管、DNaseおよびRNaseを含まない無菌の5OmL使い捨てポリプロピレン試験管、PlOOO、P200、P20、PlOおよびP2 Rainin Pipetmanピペット、DNaseおよびRNaseを含まない無菌のPlOOO、P200、P20、PlOおよびP2ピペット用フィルター付きピペットティップ、ならびにPeltierサーマルサイクラーPTC-200。
【０１１８】
[00126]  手順：すべての手順をGeneChip Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix Copyright 1999-2003)の記載に厳密に従う。第１鎖cDNA合成のために5μgの全RNAを用いる。反応およびプローブ変性に際しての温度制御のためにPeltierサーマルサイクラーPTC-200または加熱ブロックを用いる。RNA NanoDropチップをBioAnalyer 2100と共に用いて品質管理を行なう。前記のイヌ用GeneChipには100 Format (Midi Array)を用いる。
【０１１９】
実施例１
肥満動物と痩身動物からの脂肪組織試料間の遺伝子示差発現の判定
[00127]  常法により”肥満”または”痩身”と診断されたイヌ類の動物16匹(3匹は痩身、13匹は肥満)から脂肪組織試料を得る。動物の”肥満”または”痩身”は、常法を用いるDEXAによる測定、または5点身体状態評点システムに基づいて判定される。たとえば、2もしくは2.5の身体状態評点および／またはDEXA総体脂肪率27%以下をもつ場合、動物は痩身とみなされる。4以上の身体状態評点および総体脂肪率30%以上をもつ場合、動物は肥満とみなされる。すべての組織試料を動物から摘出した直後に液体窒素内で瞬間凍結する。
【０１２０】
[00128]  肥満動物に痩身動物と比較して示差発現している遺伝子がある場合、どの遺伝子がそうであるかを判定するために、Affymetrix”Canine-2”イヌ類遺伝子チップを用いて常法により組織を分析する。肥満動物および痩身動物からのデータをGeneSpringおよびR-Bioconductorソフトウェアにより比較および分析する。いずれか特定の遺伝子に”存在”呼出しが割り当てられるためには、それは以後の精査に考慮すべき2倍の発現レベル変化を示さなければならない。さらに、１つの条件にのみ存在し、他のグループには”不存在”または”境界(marginal)”である遺伝子も、以後の精査のために選択される。結果を次表に示す。
【０１２１】
【表１−１】
2009528064.tif 000002
【０１２２】
【表１−２】
2009528064.tif 000003
【０１２３】
【表１−３】
2009528064.tif 000004
【０１２４】
【表１−４】
2009528064.tif 000005
【０１２５】
【表１−５】
2009528064.tif 000006
【０１２６】
【表１−６】
2009528064.tif 000007
【０１２７】
【表２】
2009528064.tif 000008
【０１２８】
【表３−１】
2009528064.tif 000009
【０１２９】
【表３−２】
2009528064.tif 000010
【０１３０】
【表４−１】
2009528064.tif 000011
【０１３１】
【表４−２】
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【０１３２】
【表４−３】
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【０１３３】
【表４−４】
2009528064.tif 000014
【０１３４】
【表４−５】
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【０１３５】
【表４−６】
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【０１３６】
【表４−７】
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【０１３７】
【表４−８】
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【０１３８】
【表４−９】
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【０１３９】
【表４−１０】
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【０１４０】
【表４−１１】
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【０１４１】
【表５−１】
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【０１４２】
【表５−２】
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【０１４３】
【表５−３】
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【０１４４】
【表５−４】
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【０１４５】
【表５−５】
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【０１４６】
【表５−６】
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【０１４７】
【表５−７】
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【０１４８】
【表５−８】
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【０１４９】
【表５−９】
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【０１５０】
【表５−１０】
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【０１５１】
実施例２
多様な物質または成分がイヌ類細胞系における遺伝子発現に及ぼす影響の判定
[00129]  Affymetrixイヌ類遺伝子チップCanine-1およびCanine-2を用いて、下記の多様な試験物質または成分が4つのイヌ類細胞系および適切な対照における遺伝子発現に及ぼす影響を判定する：たとえばMCT類；TAG類；ALA；EPA；DHA；リノール酸；ステアリン酸(SA)、共役リノール酸(CLA)、GLA；アラキドン酸；レシチン；ビタミンA、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチン、ビタミンC、カテキン、ケルセチン、テアフラビン；ユビキノン；リコペン、リコキサンチン；レスベラトール；α-リポ酸；L-カルニチン；D-リモネン；グルコサミン；S-アデノシルメチオニン；キトサン、これらの化合物のうち１以上を含有する多様な物質、およびその多様な組合わせ。各成分を、選択した試料成分について表６に示すように2種類の濃度で試験する。2種類の濃度のうち高い方の溶媒を対照として用いる。4つのイヌ細胞系を用いる：CCL34 (腎臓)、CRL1430 (胸腺)、CCL183 (骨) (The American Tissue Culture Collectionから入手)およびCTAC (甲状腺) (参照：イヌ末梢リンパ球から精製したエフェクター細胞におけるNK活性の測定, Veterinary Immunology and Immunopathology, 35 (1993) 239-251)。特定濃度の成分で処理した細胞系を”処理”と呼び、非処理試料を”対照”と呼ぶ。用語”遺伝子”と”プローブ”をこの方法においては同義に用いる。Affymetrixチップに備えられた指示を用いて処理細胞系と対照について遺伝子発現を測定する。
【０１５２】
[00130]  遺伝子発現データを、いずれか特定の処理について”アップ”または”ダウン”レギュレーションのいずれかとして測定する。遺伝子が”アップ”または”ダウン”のいずれであるかについての決定は変化倍数に基づいてなされ、倍数は個々の各プローブについて処理強度／対照強度として計算される。この数値が＜1/1.5（4つの細胞系すべての分析について）または＜1/2（細胞系内分析について）であれば変化倍数はダウンレギュレーションとみなされ、この数値が＞1.5（4つの細胞系すべての分析について）または＞2（細胞系内分析について）であればアップレギュレーションとみなされる。同様に、用いるソフトウェアに従って、比較される条件（処理または対照）のうち１つのみにおいて存在と呼出され、他の条件においては”不存在”または”境界”であり、変化倍数が有意である場合、プローブは以後の精査のために有意とみなされる。2つの処理において反対の方向に調節されると思われるプローブは以後の分析から除外する。
【０１５３】
[00131]  GeneSpringバージョン7.0 (GS)ソフトウェア(Agilent Corporation)を用いて粗データを分析し、R-Bioconductor (RB)フリーウェアを用いて評価する。両ソフトウェアパッケージを用いて、Affymetrix Instrumentが作成したCELファイルからプローブ強度を算出する。プローブ毎の存在／不存在／境界細胞およびP-値は、R-BioconductorおよびGeneSpringソフトウェアを別個に用いて算出される。
【０１５４】
[00132]  2つのスキームをデータ分析に用いる。第１；”細胞系全体”および”個々の細胞系内”。第１スキームでは、遺伝子がすべての細胞系にわたって有意かつ共通であることが認められた場合に採点のために選択される。”細胞系全体”は最小のノイズで最高の信頼データをもたらし、どの遺伝子が個々の成分により影響を受けるかについて可能な最良の手掛かりを与える可能性がある。第２スキームでは、個々の細胞系内で両方のソフトウェアパッケージに従った2つの処理において有意倍数の変化を示す遺伝子のみを採点する。これらの実験から得たデータのサンプルを表７に示す。表７は、処理物質（欄1）、プローブ（データリンク）（欄2）、方向（欄3）、最良BLAST標記（統計的に判定）（欄4）、およびヒト寄託番号（欄5）間の相関性を示す。被験成分すべてについての情報を参考のためにデータベースに蓄積する。
【０１５５】
[00133]  イヌ類の生理的状態（肥満としての診断）および表１〜７からの情報の比較に基づいて、すなわち被験物質または成分により影響を受けかつ肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子に注目して、肥満イヌ類のための食物組成物を選択および調製するのに有用な栄養処方は下記の成分のうち１以上を下記の量で含有するものであると考えられる（一日当たり体重１キログラム当たりのミリグラム数(mg/kg/日)のインビボ量はインビトロでの使用量から外挿に基づく）：たとえばDHA−約1〜約30；EPA−約1〜約30；EPA/DHA組合わせ(比率1.5:1)−約4/2〜約30/45；ALA−約10〜約100；LA−約30〜約600；ARA−約5〜約50；およびSA−約3〜約60。これらのデータに基づいて、これらの成分のうち１以上を含有する食物組成物および関連の食事を調製して、肥満動物に痩身動物と比較して示差発現する遺伝子を調整するために使用することができる。そのような調整はその動物の脂肪組織の量を調節し、したがって１態様においては望ましい状態または正常な（より痩せた）状態への移行を促進し、より良好な健康状態および生活状態を促進するであろう。
【０１５６】
【表６】
2009528064.tif 000032
【０１５７】
【表７−１】
2009528064.tif 000033
【０１５８】
【表７−２】
2009528064.tif 000034
【０１５９】
【表７−３】
2009528064.tif 000035
【０１６０】
【表７−４】
2009528064.tif 000036
【０１６１】
【表７−５】
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【０１６２】
【表７−６】
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【０１６３】
【表７−７】
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【０１６４】
【表７−８】
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【０１６５】
【表７−９】
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【０１６６】
【表７−１０】
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【０１６７】
【表７−１１】
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【０１６８】
【表７−１２】
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【０１６９】
【表７−１３】
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【０１７０】
【表７−１４】
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【０１７１】
【表７−１５】
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【０１７２】
【表７−１６】
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【０１７３】
【表７−１７】
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【０１７４】
【表７−１８】
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【０１７５】
【表７−１９】
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【０１７６】
【表７−２０】
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【０１７７】
【表７−２１】
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【０１７８】
【表７−２２】
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【０１７９】
【表７−２３】
2009528064.tif 000055
【０１８０】
実施例３
肥満動物と痩身動物のクラス予測子として使用できる、肥満動物と痩身動物の血中で示差発現する遺伝子
臨床分析および科学分析を簡略化し、生存動物から生体組織採取しなくてはならない固体組織試料を用いる必要性を排除するために、肥満イヌおよび痩身イヌから血液試料を採取し、肥満動物と痩身動物の識別に使用できる”クラス予測子”の作成に用いることができる。クラス予測子は、2つのグループまたはクラスの動物を認識および識別できる遺伝子または遺伝子生成物のグループを判定するために当業者に慣用される、教師あり学習アルゴリズムを用いるパターン認識の形態である（たとえば重み付き投票法、クラス近傍法、K-近傍法およびサポートベクターマシン）。クラス予測子の作成は一般に下記のステップを伴う：
トレイニング・ステップ：
このステップでは、明白に特定された2つのグループまたはクラスの動物（たとえば肥満動物および痩身動物）を用いて、それらを認識および識別するためのアルゴリズムを学習する。
このステップにより、遺伝子の”クラス予測子”セットが作成される。”クラス予測子”グループの遺伝子または遺伝子生成物が確立および検証されると、それを用いて新たな未知の試料の入手に応じてそれらの試料を分類できる。
【０１８１】
検証または検査ステップ：
次いで、トレイニング・ステップで用いたものと異なる新たな試料を用い、そのアルゴリズムにトレイニング・ステップで学習したものを用いて新たな各試料が属するクラスを予測させることにより、クラス予測子が２グループを区別する能力を検査する。
【０１８２】
肥満動物および痩身動物に関する本発明者らの研究においては、Affymetrix Canine-2 GeneChipを前記に示した方法に従って用いて、一般的に肥満と臨床同定された動物（身体状態評点4または5の動物28匹）または痩身と臨床同定された動物（身体状態評点2または2.5の動物12匹）から採取した血液試料における遺伝子発現レベルを測定する。次いでこのGeneChipデータを用いて、ソフトウェアプログラムGeneSpring (バージョン7.2 , Agilent Technologies)に収容されたアルゴリズム（サポートベクターマシン）を学習させて、クラス予測子を作成する。したがって、データは肥満試料と痩身試料の間で”p”値0.01の発現レベル差（偽発見率補正の適用後）を示す65のプローブを示す（表８を参照）。表９に示すRMA規準化データは、痩身動物と比較した肥満動物における発現変化倍数の強度を表わす；１より大きい数値はその遺伝子が肥満動物においてアップレギュレーションされていることを示し、数値１は痩身動物と比較して肥満動物において発現に変化がないことを示し、１未満の数値はその遺伝子の発現が痩身動物において肥満動物より多いことを示す。したがって本発明において、これらのプローブならびにそれらが表わす遺伝子および遺伝子生成物は、脂肪組織試料を用いる必要なしに血液試料を用いて肥満動物および痩身動物を同定するためのクラス予測子として使用できると考えられる。
【０１８３】
【表８−１】
2009528064.tif 000056
【０１８４】
【表８−２】
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【０１８５】
【表８−３】
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【０１８６】
【表９−１】
2009528064.tif 000059
【０１８７】
【表９−２】
2009528064.tif 000060
【０１８８】
実施例４
多量の長鎖脂肪酸を含有する食事は減量を促進し、これらを用いて、痩身になりかつ痩身性を維持する傾向を反映するように動物の遺伝子発現をリプログラミングすることができる。
【０１８９】
前記に述べたインビトロ成分スクリーニングから得たデータは、長鎖脂肪酸含量の高い成分（表７を参照）が、脂肪代謝に関与する遺伝子の発現に全体として動物の痩身性を促進するように影響を及ぼす可能性をもつことを示す。これは、一般的なコンピューターアルゴリズム分析を用いて前記に述べた脂肪組織および成分アッセイから得た分析データにより判定される。これに関して有用なアルゴリズムのコードは当業者に周知であり、多大な実験なしに作成できる。そのようなコードの例を以下に示す：
【０１９０】
【化１】
2009528064.tif 000061
【０１９１】
イヌに与える飼料におけるリノレン酸またはEPA/DHA (1.5:1)の含有がイヌの減量に実際に影響を及ぼすことを確認するために、イヌの減量を誘発することが知られている高繊維飼料の比較のための3種類の高タンパク飼料を調製した：長鎖脂肪酸を含有しないもの(飼料A)またはリノレン酸を添加したもの(乾燥物質基準で100%に対し約1%、飼料B)またはEPA/DHAを添加したもの(1.5:1、約0.30%：0.20%) (飼料C)。この試験では、臨床的に肥満のイヌ45匹すべてに、試験開始前30日間、最初に完全栄養対照飼料を与える。この最初の30日間の後、イヌをランダムに4グループに分ける。4グループ中の3グループに被験飼料のうちいずれかを与え、１グループには対照として高繊維飼料を一定期間、たとえば4カ月間与える。結果は、3種類の実験飼料(飼料A、BおよびC)が高繊維飼料より実質的に高い消化性をもつことを示す。結果は、EPA/DHA含有飼料を摂取しているイヌの約38%がそれらの減量目標に90日目に到達することも示す。興味深いことに、EPA/DHA飼料を摂取しているイヌは除脂肪筋量および骨無機質含量も維持する。これらの結果は、少なくとも臨床レベルで、EPA/DHA含有飼料は減量効果において高繊維飼料と同程度に有効な可能性があることも示す。
【０１９２】
クラス予測子プローブセットを検証し、それが動物の肥満性または痩身性を推定する能力を試験するために、クラス予測子プローブセット（前記の実施例３に記載）を、前記の実験に参加した45匹の動物から得た遺伝子発現データに適用する（発現データは示していない）。クラス予測子分析により、試験開始時に”肥満”と診断された45匹中41匹の動物(約90%)が実際に肥満であることが確認される（この不一致は、現在臨床的に用いられている一般的な身体状態採点システムの主観性によるものであろう）。興味深いことに、前記の４飼料を14日間与えた後、クラス予測子はすべての動物が飼料に関係なく”痩身”遺伝子発現プロフィールを呈することを示す。試験終了時には、対照の高繊維飼料を摂取したすべての動物が”肥満”遺伝子発現プロフィールを反映し、被験飼料AおよびBを摂取した動物の約25%が生化学的に”痩身”遺伝子発現プロフィールを反映し、EPA/DHAを含有する飼料Cを摂取した動物の約40%が生化学的に”痩身”遺伝子発現プロフィールを示すことが分かる（表１０を参照）。
【０１９３】
【表１０】
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【０１９４】
実施例５
減量維持可能性実験
前記に述べた減量実験に基づいて、EPA/DHAを含有する飼料を与えた動物は体重が減少するだけでなく、他の被験および対照高繊維飼料を与えた動物と比較してその減量をより長期間維持するという仮説が立てられる。
【０１９５】
飼料A、BおよびCならびに高繊維飼料が減量維持に及ぼす影響を解明するために、たとえば下記の実験を実施できる：
肥満動物に4種類の異なる飼料（実施例４に記載したもの）を動物が最適レベルの”痩身性”に達するまで与えることができる。次いで動物を、それまで与えていた同一被験飼料を与え続けるサブグループ、または栄養バランスがとれてはいるが減量を誘発もしくは維持するように設計されておらず、たとえば認識できる量のリノレン酸もしくはEPA/DHAを含有しない維持飼料に切り換えるサブグループにランダムに分ける。
【０１９６】
次いで動物を一定期間、たとえば最高3カ月間、動物の体重を１日１回記録し、身体状態評点を週１回判定し、一般的なDEXA法により体脂肪率を月１回判定しつつ、観察することができる。
【配列表】
2009528064000001.xml
【国際調査報告】
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