(57)【要約】  本発明は、完全長野生型ＴＧＦ−β３のアミノ酸残基（５８）と（６７）との間のアルファヘリックス形成ドメインが、少なくとも１つのアルファヘリックス安定化置換を含む、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体を提供する。また本発明は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置（６３）のグリシン残基が、プロリンで置換される、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体も提供する。さらに、本発明は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置（１２）のグルタミン酸残基の置換および／または完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置（５２）のアルギニン残基の置換を含む、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体を提供する。また本発明は、そのようなＴＧＦ−β３を使用した、薬剤および治療方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体であって、完全長野生型ＴＧＦ−β３のアミノ酸残基５８と６７との間のアルファヘリックス形成ドメインは、少なくとも１つのアルファヘリックス安定化置換を有する、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項２】
完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３のグリシン残基は、アルファヘリックス安定化アミノ酸残基で置換される、請求項１に記載の、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項３】
前記アルファヘリックス安定化置換は、アラニン、セリン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびフェニルアラニンから成る群から選択される残基の導入を含む、請求項２に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項４】
前記完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３のグリシン残基はアラニンで置換される、請求項３に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項５】
配列識別番号３を有する、請求項４に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項６】
前記完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６１のバリン残基の置換を含まない、いずれの前記請求項に記載の、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項７】
前記完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３のグリシン残基はプロリンで置換される、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項８】
配列識別番号５を含む、請求項７に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項９】
前記完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２のグルタミン酸残基置換および／または前記完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２のアルギニン残基置換を含む、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項１０】
前記置換は、以下、セリン、アラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびロイシンから成る群から選択されるアミノ酸残基で置換される、請求項９に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項１１】
前記完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２のグルタミン酸残基は、セリンによって置換される、請求項９または請求項１０に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項１２】
前記完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２のアルギニン残基は、セリンによって置換される、請求項９から１１のいずれかに記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項１３】
配列識別番号７、配列識別番号９、および配列識別番号１１から成る群から選択される、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のモノマーＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のダイマーＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体。
【請求項１６】
前記請求項のいずれかに記載のＴＧＦ−β３、またはＴＧＦ−β３フラグメント、またはＴＧＦ−β３誘導体の薬剤としての使用。
【請求項１７】
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減、または阻害における使用のための薬剤の調製における、請求項１から１５のいずれかに記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用。
【請求項１８】
上皮再生の促進における使用のための薬剤の調製における、請求項１から１５のいずれかに記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用。
【請求項１９】
前記薬剤は、皮膚に使用するためのものである、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬剤は、目に使用するためのものである、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
線維症の予防および／または治療における使用のための薬剤の調製における、請求項１から１５のいずれかに記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用。
【請求項２２】
前記線維症は、肺線維症、肝線維症、強皮症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎臓線維症、増殖性硝子体網膜症および子宮線維症から成る群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２３】
血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、口腔粘膜炎および腎疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用。
【請求項２４】
誘導骨および誘導軟骨、または体外受精での使用のための薬剤の調製における、請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用。
【請求項２５】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体をコード化する核酸。
【請求項２６】
創傷治癒を加速、および／または瘢痕化を予防、軽減、あるいは阻害する方法であって、請求項１から１３のいずれかに記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の治療有効量を、それらを必要とする患者へ提供するステップを含む、方法。
【請求項２７】
線維症を予防および／または治療する方法であって、前記方法は、請求項１から１３のいずれかに記載のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の治療有効量を、そのような予防および／または治療を必要とする患者へ提供するステップを含む、方法。
【請求項２８】
前記ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体は、前記患者の皮膚へ提供される、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体は、前記患者の目に提供される、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦ−β３に由来するタンパク質、そのようなタンパク質の生物活性フラグメント、さらに、前記タンパク質をコード化する核酸に関する。本発明は、そのようなタンパク質の誘導体または生物活性フラグメントをさらに提供する。本発明は、さらに、本発明のタンパク質、フラグメント、誘導体または核酸を含む薬剤と、さらには、タンパク質、フラグメント、誘導体または核酸の利用方法を提供する。
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、細胞外タンパク質の増殖、移動、アポトーシス、接着、分化、炎症、免疫抑制および発現を含む、多くの細胞過程の調節に関与する増殖因子のスーパーファミリーの一部分である。
ＴＧＦ−β，ＴＧＦ−β１、ＴＧ−β２およびＴＧＦ−β３と呼ばれる、３つの哺乳類アイソフォームが存在する。ＴＧＦ−βは、上皮細胞、内皮細胞、造血細胞、神経細胞、および結合組織細胞を含む、幅広い細胞の種類により生成される。
【０００３】
ＴＧＦ−βは、多くの異なる治療状況で有用性を持ち、特に、ＴＧＦ−β３アイソフォームは、治療利用において有益である。ＴＧＦ−β３の治療可能性の結果として、その薬学的応用に非常に関心がある。完全長野生型ＴＧＦ−β３のアミノ酸配列は配列識別番号１に示され、このＴＧＦ−β３をコード化するｃＤＮＡは配列識別番号２に示される。
ＴＧＦ−β３は、創傷治癒反応の調節において、重要な役割を果たすことは既知である。ＴＧＦ−βの活性は、創傷治癒の速度と、さらに治癒の結果として生じる瘢痕化の範囲に影響する可能性がある。
【０００４】
ＴＧＦ−β３はまた、線維症、肺線維症、肝硬変、強皮症、血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨誘導および軟骨誘導、体外受精、口腔粘膜炎、腎疾患の治療において、瘢痕化の予防、低減、または阻害、末梢神経および中枢神経系における神経再接続の強化、眼手術（レーシック手術またはレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）など）の合併症または眼底の瘢痕化（増殖性硝子体網膜症に関連する瘢痕化など）の予防、低減または阻害する際に、使用することができる。
ＴＧＦ−β３が好適である治療利用は、良く認識された生物活性ＴＧＦ−β３タンパク質原の必要性を証明し、多くの試みが、組み換え法によってこの有益なタンパク質を生成するためになされてきた。しかしながら、ＴＧＦ−β３の生成のための既存過程は、生物活性分子を得るために、複合タンパク質をリフォールディングする必要性により、非常に限定される。
【０００５】
ＴＧＦ−βは、２つの１１２アミノ酸サブユニットを含むホモダイマータンパク質として、自然に存在する。これらのＴＧＦ−β３サブユニットのそれぞれは、活性ペプチドフラグメントの５８番残基と６７番残基の間にアルファヘリックス形成ドメインを含み、さらに、残基５８と残基６７の間にアルファヘリックスを含み、各ＴＧＦ−β３サブユニットは、塩橋およびジスルフィド結合を含む多数のサブユニット内結合をさらに含む。
【０００６】
ＴＧＦ−β３は、１００−ｋＤ潜在的不活性前駆体分子（ＬＴＧＦ−β３）として分泌される。ＬＴＧＦ−β３分子は以下を含む。
ｉ）Ｃ末端２５ｋＤａダイマーシグナルペプチド（活性フラグメント）
ｉｉ）潜在的関連ペプチド（ＬＡＰ）
ＬＴＧＦ−βは、活性フラグメントからＬＡＰが解離することによって、活性化する。ＬＴＧＦ−βの分解は、エンドペプチターゼ様フュ−リン、プラスミンおよびトロンビンなどの酵素作用によって、または細胞周囲空間の酸性化によって媒介してもよい。活性ＴＧＦ−βダイマーフラグメントは、疎水性相互作用およびイオン相互作用により安定化され、それらはさらに、サブユニット内ジスルフィド橋によって強化される。各モノマーは、４つのジスルフィド内結合のうちの３つによって連結された、いくつかの拡張ベータ螺旋構造を含み、「システイン結合」として既知の緊密構造を形成する。
【０００７】
生物活性ＴＧＦ−β３分子の複雑性（上述のように、８つの鎖内ジスルフィド結合および１つの鎖内ジスルフィド結合を有するホモダイマータンパク質）により、それらは真核生物で最初に発現する。しかしながら、真核生物発現システムを使用して、高い費用のそのような過程の組み合わせで得られる可能性のある比較的低いレベルの発現は、微生物宿主の使用はＴＧＦ−β３生成品の市販効果を改善するための試みのために調査されたことを意味する。
複合ジスルフィド結合を含むＴＧＦ−β３などの組み換え分子を発現するための、Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物宿主の使用の不利点は、生成されたタンパク質は通常、不正確にフォールドされ、不溶性封入体を形成する。これらの封入体は可溶化を必要とし、続いて、タンパク質その天然生物活性構造にリフォールドすることを可能にするための再生を必要とする。ＴＧＦ−β３ホモダイマーを効果的に再生するため、正しい配向の共有結合ジスルフィド結合を再生する必要がある。ランダムなジスルフィルド結合形成の過程から正しいＴＧＦ−β３ホモダイマーを形成する可能性は、３４，４５９，２４５の可能ジスルフィド結合の組み合わせが可能である、９つのジスルフィド結合が存在することを考えると、低い。それゆえ、組み換え技術によって生成されＴＧＦ−β３のリフォールディングは、その製造に深刻な影響を与える可能性があるということは、このリフォールディングは１４４時間を要し、典型的には、領域の２０％のリフォールディング効果しか実現しないという理由で、驚くべきことではない。
【０００８】
先行技術に関連するいくつかの問題を未然に防ぎ、または軽減することが本発明の目的である。野生型ＴＧＦ−β３と比較して、リフォールディング効果を改善したＴＧＦ−β３（またはそのフラグメントまたは誘導体）を提供することが、本発明の特定の側面の目的である。ＴＧＦ−β３活性を有する野生型ＴＧＦ−β３以外の薬剤を提供することは、本発明の特定の側面のもう１つの目的である。そのような薬剤は、天然発生ＴＧＦ−β３に対する有益な代替品を提供することができる。
【０００９】
本発明の第１の側面において、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体が提供され、完全長野生型ＴＧＦ−β３のアミノ酸残基５８と６７の間のアルファヘリックス形成ドメインは、少なくとも１つのアルファヘリックス安定化置換を含む。本発明は、本発明の第１の側面によって、ＴＧＦ−β３またはそのフラグメントあるいは誘導体をコード化する核酸、を提供する。
本発明者は、驚くべきことに、本発明の第１の側面に開示される新規ＴＧＦ−β３は、天然発生ＴＧＦ−β３と同様の生物活性を共有し、野生型ＴＧＦ−β３と比較した場合、タンパク質リフォールディング効果を非常に改善したということが明らかにした。この増大したタンパク質リフォールディング効果は、生物活性ＴＧＦ−β３を生成するために使用することができるリフォールディング条件を簡略化し、さらに、原核生物タンパク質発現システムを使用して生成することのできるそのようなタンパク質（またはそのようなタンパク質のフラグメントあるいは誘導体）の生成を大きく増大させるため、著明な利点を構成する。
【００１０】
いかなる仮説にも拘束されるものではないが、本発明の発明者らは、アルファヘリックス安定化置換のアルファヘリックス形成ドメインへの導入は、このドメインによって形成されたアルファヘリックスの柔軟性を有利に軽減させると考える。軽減した柔軟性は、本発明の第１の側面によって、ＴＧＦ−β３の適切なリフォールディングを促進し、生物活性タンパク質（またはそのフラグメントあるいは誘導体）を生成する。アルファヘリックス安定化置換を通じてアルファヘリックスの安定化によって付与された、原要した柔軟性は、正確にリフォールドされたＴＧＦ−β３（部分的にリフォールドされたダイマーＴＧＦ−β３）の生成を増大させるには十分であるが、驚くべきことに、本発明の発明者らは、本発明の第１の側面によって、そのような置換は、ＴＧＦ−β３の生物活性は変化させず、またそれらはその生物活性および治療効果を損なうこともないということを明らかにした。
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＴＧＦ−β３の活性ペプチド部分のアミノ酸配列に基づく。例えば、「完全長野生型ＴＧＦ−β３」の言及は、一般的に、配列識別番号１に示される活性ペプチドのアミノ酸配列を言及するように解釈されるものとし、アミノ酸残基５８と６７の間のアルファヘリックス形成ドメインの言及はそれに応じて解釈されるものとする。
【００１１】
好ましくは、アルファヘリックス安定化置換は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３でのグリシン残基置換を含む。しかしながら、適した置換は、それに加えて、またはそれの代わりに、例えば、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６０または６７でのトレオニン置換の１つあるいは両方、または完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６６でのアスパラギン置換などの置換を含むことができる。本発明による使用のためのアルファヘリックス安定化置換はバリン６１置換を含まないことが好ましい場合がある。
本発明による「アルファヘリックス安定化置換」は、野生型ＴＧＦ−β３に存在する特定のアミノ酸残基はより多くのアルファヘリックス形成傾向を有する置換残基によって置換される置換であるということが理解されるものとする。要するに、アルファヘリックス安定化置換に導入された置換アミノ酸残基は、必ずしもそれ自体がアルファヘリックスへ安定して統合する性質を持つ必要はないが、アミノ酸置換よりも、より安定した統合の傾向にある必要がある。しかしながら、一般的に、アルファヘリックス安定化置換の一部分として導入された置換アミノ酸は、アルファヘリックスへ有利に統合するアミノ酸残基であることが好ましい場合がある。
【００１２】
本発明の発明者は、本発明の第１の側面によって、アルファヘリックス安定化置換に導入することのできる好ましい置換アミノ酸残基は、以下の群、アラニン、セリン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびフェニルアラニンから選択されるアミノ酸のいずれか１つまたはその組み合わせである場合があるということを明らかにした。これらの好ましい置換アミノ酸残基は、すべて、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３でのグリシン残基のアルファヘリックス安定化置換での使用に適していると考えられる。この群から選択される前記の置換アミノ酸残基は、アルファヘリックス安定化置換を提供する可能性のあるアミノ酸残基５８と６７の間のアルファヘリックス形成ドメインのいかなる位置においても置換することができる。
上述のアミノ酸残基は、アルファヘリックス安定化置換で使用するための好ましい残基を示すが、当然のことながら、アミノ酸残基がアルファヘリックス形成の一因となる傾向（それによるアルファヘリックス安定化置換における使用のための残基の適性）を測定することのできる多くの代替定性的システムおよび代替定量的システムが存在し、アルファヘリックス安定化置換における使用のためのその適したアミノ酸残基は、ＴＧＦ−β３の配列の知識と組み合わせてすべてのこれらのシステムを参照して選択することができる。
【００１３】
一例として、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎによって記述される定性的システムは、アルファヘリックス形成の傾向に基づいて、５つの異なる分類のアミノ酸残基を特定する。順番に、
強力なヘリックス形成剤、
弱いヘリックス形成剤、
中性型、
弱いヘリックス破壊剤
強力なヘリックス破壊剤が存在する。
本明細書の目的において、アミノ酸残基グルタミン酸、ヒスチジン、トリプトファン、リジン、アラニン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、グルタミンおよびフェニルアラニンはヘリックス形成剤とみなされ、強力なヘリックス形成剤を構成するグルタミン、メチオニン、アラニンおよびロイシンを伴う。対照的に、アスパラギン、グリシンおよびプロリンは、ヘリックス破壊剤を構成するとみなされ、強力なヘリックス破壊剤であるグリシンおよびプロリンを伴う。
【００１４】
つまり、アルファヘリックス形成の傾向が本定性的スケールを参照して評価される場合、アルファヘリックス安定化置換は好ましくはアミノ酸残基がヘリックス形成剤で置換される置換であるが、当然のことながら適したアルファヘリックス安定化置換は、別の方法として、置換されるアミノ酸残基の性質によって中性型またはさらにはヘリックス破壊剤を利用することができる。例えば、中性型アミノ酸残基がアルファヘリックス安定化置換の対象となるべき場合、適した置換アミノ酸残基は、強力なヘリックス形成剤または弱いヘリックス形成剤であることができる。強力なヘリックス破壊剤がアルファヘリックス安定化置換の対象となるべき場合、置換アミノ酸残基は強力なヘリックス形成剤、弱いヘリックス形成剤、中性型アミノ酸または弱いヘリックス破壊剤であることができる。
従って、本発明によるアルファヘリックス安定化置換は、弱いヘリックス破壊剤、または中性型アミノ酸残基、または弱いヘリックス形成剤、または強力なヘリックス形成剤での強力なヘリックス破壊剤の置換を含むことができる。その代わりとして、またはそれに加えて、適したアルファヘリックス安定化置換は、中性型、弱いヘリックス形成剤、または強力なヘリックス形成剤での弱いヘリックス破壊剤の置換を含むことができる。その代わりとして、またはそれに加えて、適したアルファヘリックス安定化置換は弱いヘリックス形成剤または強力なヘリックス形成剤での中性型アミノ酸の置換を含むことができる。その代わりとして、またはそれに加えて、適したアルファヘリックス安定化置換は、強力なヘリックス形成剤での弱いヘリックス形成剤の置換を含むことができる。
【００１５】
アルファヘリックス形成のためのアミノ酸残基の傾向の代替評価、およびそのためのアルファヘリックス安定化置換の一部分として使用される安定性は、当業者に既知の定量的スケールのすべての数に基づくことができる。
アルファヘリックス安定化置換における使用に適したアミノ酸残基を決定する際に使用することのできる該定量的スケールは表１に記載される。本表はｋｃａｌ／モルでカリブレートされ、アルファヘリックス形成の一因となるアミノ酸の傾向を反映する値を提供する。表１の高い値はアルファヘリックス形成の低い傾向に関連する。
【００１６】
つまり、本発明の第１の側面によって要求されるアルファヘリックス安定化置換での使用のためのアミノ酸残基の安定性は表１に記載されるような定量的スケールを使用して評価される場合、適したアルファヘリックス安定化置換は、アミノ酸残基は置換される残基よりも、より高いヘリックス形成傾向（より低いｋｃａｌ／モル値で表１に示される）を有する置換アミノ酸残基によって置換される置換である。
本発明に従って使用することができる、適した置換は、人工的な置換アミノ酸を導入するものを含む。アルファヘリックスを安定させるために有益に使用することのできる人工アミノ酸の適した例としては、アルキル側鎖およびヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基が挙げられる。
【００１７】
アラニンは、アルファヘリックス安定化置換での使用に適した部分的に好適な置換アミノ酸残基を示す。またはそのフラグメントあるいは誘導体は、本発明の第１の側面に従って、アラニンによる野生型ＴＧＦ−β３の位置６３でのグリシンの置換を含むことが最も好ましい。
本発明の第１の側面による好ましいＴＧＦ−β３のアミノ酸配列は配列識別番号３（Ｇｌｙ−６３Ａｌａ）に示され、本ＴＧＦ−β３をコード化するＤＮＡは配列識別番号４に示される。完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３でのアラニン置換を含む、配列識別番号３のＴＧＦ−β３のフラグメントまたは誘導体は、本発明の第１の側面に従って、好ましいＴＧＦ−β３フラグメントまたは誘導体を示す。
【００１８】
適した置換は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の５８と６７との間に位置する１つ以上のアミノ酸残基が１つ以上の天然または人工アミノ酸残基で置換される置換であることができる。さらなる明確化によっては、適した置換は１つ以上の置換残基での単一のアミノ酸残基の置換、または１つ以上の置換残基での１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことができる。アミノ酸残基の数が保存される好ましい置換は、例えば、置換されるアミノ酸残基の数は導入される置換アミノ酸残基の数同様である置換であることができる。
さらに当然のことながら、置換される好ましいアミノ酸残基は上記の定性的スケールまたは定量的スケールに基づいて選択されることができる。つまり、アルファヘリックス安定化置換の対象となる好ましいアミノ酸は、上記の定性的スケールに基づいて、ヘリックス破壊剤、または、好ましくは強力なヘリックス破壊剤に分類されることができる。表１に記載の定量的スケールに基づいて、アルファヘリックス安定化の対象となる好ましいアミノ酸は、好ましくは、０．５０以上の、または０．５０に等しいヘリックス傾向値を伴うアミノ酸であり、より好ましくは０．６０以上、または０．６０に等しいヘリックス傾向値を伴うアミノ酸であり、最も好ましくは１．００のヘリックス傾向値であるアミノ酸であることができる。
【００１９】
本発明者らは、ＴＧＦ−β３、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体は、本発明の第１の側面に従って、野生型ＴＧＦ−β３の生物活性の使用が望まれるすべての状況において使用することができる。これらは、特に、治療的使用を含むが、これに限定されない。治療的使用に従って、本発明は、本発明の第１の側面に従って、薬剤としてのＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用も提供する。
当然のことながら、本発明の第１の側面によるＴＧＦ−β３のフラグメントまたは誘導体はアルファヘリックス安定化置換を含む完全長アルファヘリックス形成ドメインを含むことが好ましいが、かならずしもそうであるとは限らない。適したフラグメントまたは誘導体は、切断アルファヘリックス形成ドメインが少なくとも１つのアルファヘリックス安定化置換を含む限り、この切断アルファヘリックス形成ドメインを含む。
【００２０】
本発明の第２の側面において、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３でのグリシン残基はプロリンで置換されるＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体が提供される。本発明は、さらに、本発明の第２の側面に従って、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体をコード化する核酸分子を提供する。
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の第２の側面によるタンパク質（そのフラグメントまたは誘導体）は野生型ＴＧＦ−β３のそれらに類似する生物活性を有するということを発見した。本発見は予想外である。その理由としては、通常、アルファヘリックス形成に関連するＴＧＦ−β３の領域におけるプロリン存在は、該タンパク質の２次構造を阻害しそれによりその生物学的機能を損なわせると考えられる場合があるからである。本発明の第２の側面によるＴＧＦ−β３のリフォールディング効果は野生型ＴＧＦ−β３よりも低いが、予想される機能の不全は、驚くべきことに生じない。
【００２１】
つまり、本発明の第２の側面によるタンパク質（またはそのフラグメントあるいは誘導体）は、当業者に利用可能なＴＧＦ−β３活性を使用することのできる組成物のレパートリーを拡大するという点において当技術に貴重な貢献をする。そのような組成物は、例えば、ＴＧＦ−β３活性を治療的に使用することが望ましい状況において使用することができる。
本発明の第２の側面による好ましいＴＧＦ−β３のアミノ酸配列は配列識別番号５（Ｇｌｙ−６３Ｐｒｏ）に示され、ＴＧＦ−β３をコード化するＤＮＡは配列識別番号６に示される。完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置６３でのプロリン置換を含む、配列識別番号５のＴＧＦ−β３のフラグメントまたは誘導体は本発明の第２の側面による好ましいＴＧＦ−β３フラグメントまたは誘導体を示す。
【００２２】
ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体は、本発明の第２の側面に従って、野生型ＴＧＦ−β３の生物活性の使用が望まれるすべての状況において使用することができると仮定すると、当然のことながらＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用は薬剤として、本発明の第２の側面に従って提供される。本発明者は、そのような薬剤はＴＧＦ−β３の生物活性を使用することで知られるすべての臨床的な状況において使用することができると考える。
【００２３】
本発明の第３の側面において、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸残基置換および／または完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギニン残基置換を含む、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体が提供される。本発明は、本発明の第３の側面に従って、ＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体をコード化する核酸分子も提供する。
当然のことながら、本発明の第３の側面は、要するに、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸は置換されるが、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギニンは保持される、ＴＧＦ−β３を包含する。本発明の第３の側面は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸は保持されるが、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギニンは置換される、ＴＧＦ−β３も包含する。
【００２４】
しかしながら、本発明の第３の側面によるＴＧＦ−β３は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸残基の置換および完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギニン残基の置換の両方を含むことが好ましい。
本発明者は、本発明の第３の側面によるタンパク質はさらに野生型ＴＧＦ−β３に類似する生物活性を有するということを驚くべきことに発見した。本発見は予想外であるが、その理由は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸残基置換および／または完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギニン残基置換の１つまたはその両方は、通常野生型ＴＧＦ−β３で見られるサブユニット間塩橋の１つの形成を妨害するからである。適切な塩橋形成を完了できないことは、ＴＧＦ−βなどのタンパク質の生物活性は、通常、その構造依存するため、本発明の第３の側面によるＴＧＦ−β３の生物活性を低下させると予想される場合がある。
【００２５】
さらに、本発明者は、本発明の第２の側面によるＴＧＦ−β３が野生型ＴＧＦ−β３で観察されるのと丁度同じである高効果の良好なリフォールディングを示すことをさらに発見した。本発明の第２の側面によるＴＧＦ−β３において生じるべきサブユニット間塩橋形成の欠如はリフォールディングの発生に悪影響を与え、それにより生物活性ＴＧＦ−β３の生成を減少させる可能性があるということが当業者によって予想されるため、本発見は非常に驚くべきことである。
つまり、本発明の第３の側面によるタンパク質は、当業者が使用可能であるＴＧＦ−β３活性を使用することが可能である組成物のレパートリーを拡大することに役立つ。上述のように、そのような化合物の効能は、ＴＧＦ−β３活性の治療的な使用が望まれるような状況において重要である。
【００２６】
本発明者は、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸または完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギンのどちらかは、セリン、アラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびロイシンから成る群から選択される、任意の１つのアミノ酸残基（またはアミノ酸残基の任意の組み合わせ）によって置換することができるということを発見した。
セリンは、本発明の第３の側面によるＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体において置換アミノ酸残基として使用されることが好ましい。セリンは、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸または完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギンへの置換に使用することができる。セリンは、完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置１２でのグルタミン酸および完全長野生型ＴＧＦ−β３の位置５２でのアルギンの両方の置換に使用されることが最も好ましい。
【００２７】
本発明の第３の側面による好ましいＴＧＦ−β３の第１の例は、配列識別番号７に示される。本発明は、Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ置換を含む配列識別番号７の生物活性フラグメントまたは誘導体を包含する。この好ましいＴＧＦ−β３をコード化するｃＤＮＡは、配列識別番号８に示される。
本発明の第３の側面による好ましいＴＧＦ−β３の第２の例は、配列識別番号９に示される。Ａｒｇ５２−Ｓｅ置換を含む配列識別番号９の生物活性フラグメントまたは誘導体もまた本発明による好ましいフラグメントまたは誘導体を構成する。この好ましいＴＧＦ−β３をコード化するｃＤＮＡは、配列識別番号１０に示される。
【００２８】
本発明の第３の側面による好ましいＴＧＦ−β３の第３の例は、配列識別番号１１に示される。Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ置換およびＡｒｇ５２−Ｓｅｒ置換の両方を含む配列識別番号１１の生物活性フラグメントまたは誘導体もまた、本発明による好ましいフラグメントまたは誘導体を構成する。この好ましいＴＧＦ−β３をコード化するｃＤＮＡは、配列識別番号１２に示される。
本発明者は、本発明の第３の側面によるＴＧＦ−β３、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体は野生型ＴＧＦ−β３の生物活性を使用することが望まれるすべての状況において使用することができると考える。これらはＴＧＦ−β３の治療的使用を含むが、これに限定されない。従って、本発明は、本発明の第１の側面に従って、薬剤としてのＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の使用をさらに提供する。
【００２９】
本発明のＴＧＦ−β３、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体は、創傷（潰瘍などの慢性創傷を含む）の治療に使用することができる。瘢痕化の予防、減少あるいは阻害による創傷治癒の加速の促進、および／または早々の再上皮化の促進のために、特に使用することができる。本発明のＴＧＦ−β３は、肺線維症、肝硬変、強皮症ならびに糸級体腎炎、肺線維症、肝線維症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎臓線維症、増殖性硝子体網膜症および子宮線維症から成る群からそれぞれ選択することの線維症の予防または治療効果のためにも使用することができる。
本発明のＴＧＦ−β３は、強皮症、血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨および軟骨誘導、体外受精、口腔粘膜炎および腎疾患の治療において使用することができる。一例として、野生型ダイマーＴＧＦ−β３の局所適用は、動物モデルおよび臨床モデルにおいて、慢性的非治癒褥瘡の治癒速度を加速させ、口腔粘膜炎の発生率、重症度、および持続時間を減少させ、癌治療の間の放射線治療および化学療法によりもたらされる、幹細胞への損傷から生じる放射線胃腸症候群の副作用を減少させるということを示した。本発明者は、本発明のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体はこれらのすべての適用において有益に使用することができると考える。
【００３０】
本発明のＴＧＦ−β３は、例えば、例えば線維症、強皮症、血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨および軟骨誘導、体外受精、口腔粘膜炎、腎疾患から成る群からそれぞれ選択される病状の治療のため、瘢痕化の予防、軽減あるいは阻害のための治療、末梢神経系および中枢神経系における神経再接続の強化の治療、および眼手術（レーシック手術またはレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）など）の合併症の予防、軽減または阻害のために、自然に生じるＴＧＦ−β３と同様の方法で使用することができる。本発明のＴＧＦ−β３は、口唇裂および口蓋裂の治療（例、そのような病状の外科的修復と併用して）において、および瘢痕化の軽減または阻害ならびに腱の治癒の加速に使用することができる。本発明に公開されるＴＧＦ−β３の突然変異型は、自然に生じるＴＧＦ−β３と同様の方法で、創傷治癒の加速の促進および／または瘢痕形成の予防、軽減または阻害をすることができる。それらは、さらに、上皮損傷部位において上皮再生を促進することができる。
「本発明のＴＧＦ−β３」は、本発明の第１、２、または３の側面のいずれかによる突然変異ＴＧＦ−β３を包含して解釈される。当然のことながら、本発明のＴＧＦ−β３はＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を包含しない。ＴＧＦ−β３の特定は、その配列を参照して、または、好ましくはその生物活性を参照して決定することができる。つまり、ＴＧＦ−β３は、ＴＧＦ−β３が投与される創傷において瘢痕形成を軽減することができるかということを基準としてＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２と区別することができる。本発明によるＴＧＦ−β３は、好ましくは非天然ＴＧＦ−β３である。
【００３１】
本発明のすべての側面によるＴＧＦ−β３は、ＴＧＦ−β３を使用することが望まれるすべての病状の治療のための薬剤の調製に使用することができる。そのような使用は、本明細書に考慮されるすべての病状の治療を含むが、これに限定されない。本発明によるＴＧＦ−β３は、創傷の治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減あるいは阻害を促進するための薬剤の調合に使用されることが好ましい場合がある。そのような瘢痕化は、創傷および／または線維症に関連する場合がある。本発明のＴＧＦ−β３を使用して生成された薬剤は、好ましくは、皮膚、または目で使用するためのものである場合がある（例えば、皮膚あるいは目の治癒の加速において、または皮膚あるいは目の瘢痕かの予防、減少あるいは阻害において）。
本発明によるＴＧＦ−β３は、潜在的ＴＧＦ−β３あるいは活性ＴＧＦ−β３（例、潜在的関連ペプチドを含む、あるいは含まない）のいずれかであることができる。
【００３２】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本発明によるＴＧＦ−β３へのすべての言及は、そのようなＴＧＦ−β３のフラグメントまたは誘導体を含んで解釈されるべきであり、そのようなフラグメントまたは誘導体は、野生型ＴＧＦ−β３（本発明の目的において解釈される、アミノ酸配列は配列識別番号１によって示される）に由来するフラグメントまたは誘導体とそれらを区別する置換（本発明の第１、２、または３の側面に従って）を含むことを特徴とする。本発明の第１、２または３の側面によるＴＧＦ−β３の適したフラグメントまたは誘導体は、少なくとも１０のアミノ酸残基を含むことができ、好ましくは少なくとも４０のアミノ酸残基を含み、さらに好ましくは、少なくとも７０のアミノ酸残基を含み、最も好ましくは、少なくとも１００のアミノ酸残基を含むことができる。
本明細書において、ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β３フラグメントへの言及は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、そのようなタンパク質あるいはフラグメントの誘導体を包含する。
【００３３】
限定するものではないが、誘導体の適した型の適した例は、本発明ＴＧＦ−β３（またはそのフラグメント）の治療効果のあるペプチド誘導体、本発明ＴＧＦ−β３の活性基（またはそのフラグメント）を含む、またはそれに基づく、治療効果のあるフラグメントあるいは誘導体、本発明のＴＧＦ−β３（またはそのフラグメント）の治療効果のあるペプトイド誘導体、本発明のＴＧＦ−β３（またはそのフラグメント）の治療効果のあるＤ−アミノ酸誘導体、本発明のＴＧＦ−β３（またはそのフラグメント）に基づく治療効果のあるペプチド模倣薬、本発明のＴＧＦ−β３（またはそのフラグメント）の治療効果のあるペプチド類似体、本発明のＴＧＦ−β３の（またはそのフラグメント）に基づく治療効果のある擬ペプチド、ＴＧＦ−β３の（またはそのフラグメント）に基づく治療効果のあるレトロインバーソ型ペプチド、ＴＧＦ−β３の（またはそのフラグメント）に基づく治療効果のあるデプシペプチド誘導体、ＴＧＦ−β３の（またはそのフラグメント）に基づく治療効果のあるβペプチド誘導体、およびＴＧＦ−β３の（またはそのフラグメント）に基づく治療効果のあるレトロペプトイド誘導体から成る群から選択することができる。
当然のことながら、本発明の目的において「ＴＧＦ−β３」はいずれのモノマー型ＴＧＦ−β３およびダイマー型ＴＧＦ−β３を包含するように解釈することができる。本発明者は、本発明のＴＧＦ−β３はその生物学的効果をモノマー型およびダイマー型の両方において使用することができるということを、驚くべきことに、発見した。このことは、ＴＧＦ−β３のようなＴＧＦ−βがダイマー型の場合においてのみ生物活性を使用すると一般的に考えられる先行技術において以前に報告されているものと、驚くべきことに対比する。本発明によるＴＧＦ−β３がモノマー型において使用することができるという本発明の発見は、そのようなモノマー型が、生物活性分子を生成する速度をあげることのできる比較的単純なフォールディング法（その例は以下に詳細に記述される）によって生成され、それと同時にそのような分子の生成に関連する費用を削減するという点で、大きな利点を提供する。
【００３４】
本発明のＴＧＦ−β３は、配列識別番号３、５、７、９、あるいは１１に示されるモノマーＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体であることが好ましい。
「本発明の薬剤」は本発明によるＴＧＦ−β３を含むいかなる薬剤も含むように解釈されるものとする。本発明の薬剤は、さらに、またはその代わりに、本発明によるＴＧＦ−β３をコード化する核酸を含む薬剤であってもよい。これは、薬剤それ自体（例、薬剤が加えられる使用法にかかわらず）と、特定の治療的適用（例、本明細書に考慮される病状の治療または改善）での使用のための薬剤の両方を包含する。本発明の薬剤は、本発明のＴＧＦ−β３の適したフラグメントあるいは誘導体、またはそのようなフラグメントあるいは誘導体をコード化する核酸を含む薬剤を包含するように理解されることを、さらに目的とする。
【００３５】
「本発明の治療の方法」（または「本発明の方法」）は、本発明によるＴＧＦ−β３、またはＴＧＦ−β３をコード化する核酸の治療有効量を使用するすべての治療の方法含むように解釈されるものとする。本発明の治療の方法は、本発明のＴＧＦ−β３の適したフラグメントあるいは誘導体、またはそのようなフラグメントあるいは誘導体をコード化する核酸を使用する治療の方法を包含すると理解されることを、さらに目的とする。
本発明のＴＧＦ−β３、またはその生物活性フラグメントあるいは誘導体を含む薬剤は、創傷（潰瘍のような慢性創傷を含む）の治療において使用することができる。それらは、特に、瘢痕化の予防、軽減あるいは阻害による創傷治癒の加速を促進するため、および／または創傷の再上皮化を促進するために使用することができる。本発明のＴＧＦ−β３は、肺線維症、肝硬変ならびに肝線維症、強皮症、糸級体腎炎、皮膚線維症、放射線線維症、腎線維症、増殖性硝子体網膜症または子宮線維症などの、線維症の予防または治療の効果をもたらすためにも使用することができる。
【００３６】
本発明のＴＧＦ−β３は、強皮症、血管形成障害、再狭窄、癒着、子宮内膜症、虚血性疾患、骨および軟骨誘導、体外受精、口腔粘膜炎、腎疾患、肺線維症、肝硬変ならびに肝線維症、糸級体腎炎、皮膚線維症、放射線線維症、腎線維症および子宮線維症から成る群からそれぞれ選択される病状の治療に使用することができる。一例として、野生型ダイマーＴＧＦ−β３の局所適用は、動物モデルおよび臨床モデルにおいて、慢性的非治癒褥瘡の治癒速度を加速させ、口腔粘膜炎の発生率、重症度、および持続時間を減少させ、癌治療の間の放射線治療および化学療法によりもたらされる、幹細胞への損傷から生じる放射線胃腸症候群の副作用を減少させるということを示した。本発明者は、本発明のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体はこれらのすべての適用において有益に使用することができると考える。
本発明によるＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体によって示される生物活性は、好ましくは、ＴＧＦ−β３の抗瘢痕化活性であることができ、またこの活性は、好ましくは生体内で調査することができる。
【００３７】
本発明のＴＧＦ−β３、またはそのフラグメントあるいは誘導体の治療有効量は、下記の要求を要求される事項をもたらすのに十分な量である。
ｉ）創傷治癒および／または瘢痕化の阻害の加速
ｉｉ）上皮再生の促進
ｉｉｉ）線維症の予防および／または治療
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害、または上皮再生の必要とされ得る範囲は、例えば、その患者のケアに責任を持つ臨床医によって明らかであり、実際にその臨床医によってすぐに判断されるだろう。創傷治癒の進行および／または瘢痕化の阻害、または上皮再生の促進の範囲の適した評価は、臨床医によって判断され、本明細書に記載される提案された測定方法に準拠することができる。
【００３８】
本発明による適したＴＧＦ−β３、さらにはそのようなＴＧＦ−β３の好ましいフラグメントまたは誘導体は、本明細書に記載されるすべての考慮を参照して選択することができる。
本発明のＴＧＦ−β３が創傷の治癒を加速することができることは、治療された創傷によって示される特性を参照して、すぐに認められるおよび／または測定されることができる。本発明において、「治療された創傷」とは本発明の薬剤の治療有効量に曝露された創傷、または本発明の方法による使用を受けた創傷であると見なされることができる。
【００３９】
治療された創傷の治癒の加速は、対照の創傷と比較して、加速した再上皮化の速度によって示されることができる。つまり、本発明の方法および薬剤は、それ以外の場合よりも、創傷面積を網羅する機能性上皮層のより速い再形成を促進する。
別の方法として、または追加として、治療された創傷の治癒の加速は、比較時点で、対照創傷と比較して、減少した幅によって示すことができる。当然のことながら、創傷幅のこの減少は、比較的早い速度の創傷閉鎖（閉鎖される創傷の幅がより少なく存在するため）を確証し、治癒反応を加速させるそのような薬剤の能力を示すものである。縮小した創傷は、より大きい瘢痕よりも審美的に好ましい縮小した瘢痕を結果としてもたらすことができる。
【００４０】
従って、本発明の状況における加速した創傷治癒は、対照の治療された創傷または治療されていない創傷に生じる治癒速度と比較して、治療された創傷の治癒速度のすべての増加を包含するように解釈されるべきである。好ましくは、創傷治癒の加速は、治療された創傷と対照創傷で得られた再上皮化の速度の比較、または比較時点での治療された創傷と対照創傷の相対幅の比較のいずれかに関して評価することができる。さらに好ましくは、加速した創傷治癒は、比較時点で対照創傷と比較して、再上皮化の増加した速度および創傷幅の減少の両方を含んで、定義することができる。
好ましくは、加速した創傷治癒の促進は、対照創傷または治療された創傷に生じる治癒速度よりも、少なくとも５％、１０％、２０％または３０％速い創傷治癒の速度を生じることができる。さらに好ましくは、加速した創傷治癒の促進は、対照創傷の治癒よりも、少なくとも４０％、５０％または６０％速い治癒速度を生じることができる。加速した創傷治癒の促進は、対照創傷に生じる治癒速度よりも少なくとも７０％、８０％、または９０％速い治癒速度を生じることがさらに好ましく、加速した創傷治癒の促進は、対照創傷に生じる速度よりも少なくとも１００％速い治癒速度を生じることが最も好ましい。
【００４１】
通常の創傷治癒反応の不適切な不全、遅延または遅滞を特徴とする、またはそれらを少なくとも部分的に特徴とする広範囲の創傷治癒障害が存在する。加速した創傷治癒を促進するための本発明の特定の方法および薬剤の能力は、つまり、そのような障害の予防または治療における有用性である。
本発明の特定の方法および薬剤は、誘導される再上皮化反応の促進（それにより創傷が閉鎖する速度を増加する）によって創傷治癒の加速をもたらすことができるので、当然のことながら、本発明のこれらの方法および薬剤は、それ以外の方法では再上皮化の不全、遅延または障害になりがちである患者の創傷の治療に特に有益である。例えば、古い皮膚創傷は、新しい個々の皮膚創傷よりも、より活発性のない再上皮化反応を示すということは周知である。創傷治癒が再上皮化遅延または再上皮化不全に関連するその他の病状または障害も多く存在する。例えば、糖尿病を患う患者、ポリファーマシー（例、加齢の結果として生じる）を伴う患者、更年期後の女性、圧損傷（例、対麻痺）を引き起こしやすい患者、静脈疾患を伴う患者、医学的に肥満症の患者、化学療法を受けている患者、放射線治療を受けている患者、ステロイド治療をいけている患者、または免疫障害を持つ患者はすべて、再上皮化不全を伴う創傷治癒に苦しむ場合がある。多くのそのような事例において、適正な再上皮化反応の欠損は、創傷部位での感染を進行させる一因であり、次に、潰瘍などの慢性創傷の形成の一因となる場合がある。従って、当然のことながら、そのような患者は、特に、本発明の適した方法、または薬剤の利益を受ける可能性が高い。
【００４２】
慢性創傷は、おそらく、創傷治癒反応の遅延に関連する障害の最も重要な例である。創傷は、適切な（従来の）治療処置を受ける際、形成の８週間以内にいかなる治癒傾向も示さない場合に、慢性的であると定義される場合がある。慢性創傷の既知の例としては、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍および褥瘡性潰瘍が挙げられるが慢性創傷は、他には、常に通常の急性損傷から生じる場合がある。典型的な慢性創傷は、創傷部位の感染、不適切な創傷治療の結果として、または静脈性血管障害、動脈性血管障害、または代謝性血管障害、圧力、放射線障害、または腫瘍により引き起こされる進行性組織破壊の結果として生じる場合がある。
当然のことながら、創傷治癒を加速させることのできる本発明の方法および薬剤は、その治癒を促進するために、既存の慢性創傷の治療において使用することができる。そのような方法および薬剤は、慢性創傷の再上皮化を促進することができ、それにより、障害の治癒および閉鎖をもたらすことができる。本発明の好ましい方法および薬剤（配列識別番号３、５、７、９または１１を含むＴＧＦ−β３を使用するものなど）は、創傷治癒に関連する瘢痕化を阻害することもできる。そのような状況において瘢痕化の予防は、慢性創傷は、一般的に患者の身体の比較的に広い部分に拡大するため、特に有益であることができる。
【００４３】
既存の慢性創傷の治療におけるその使用に加えて、またはそれとは別として、本発明の適切な方法および薬剤は、慢性創傷に発展する創傷治癒不全に成りやすい患者の急性創傷を予防するために使用することができる。本発明の適切な方法および薬剤は、損傷部位の上皮被膜を促進することができるため、それらは、治療された創傷が感染する可能性を減少させることができる。同様に、この再上皮化の促進は、糖尿病または静脈疾患などのその他の病状の結果として生じる慢性的な使用において有益であることができる。
本発明の方法および薬剤から、特に利益を得ることのできるさらなる患者の群は、免疫システムが低下した患者の群である（例、化学療法または放射線療法を受けた患者、またはＨＩＶに感染した患者）。創傷を受けた後に通常の炎症反応を開始することができない可能性のある免疫障害を持つ患者の創傷は、不十分な治癒結果を伴う傾向にあることが周知である。そのような患者は、本発明の適切な方法および薬剤を伴う治療から利益を得ることができる。
【００４４】
配列識別番号３、５、７、９または１１を含むＴＧＦ−β３のような本発明のＴＧＦ−β３の創傷治癒の加速を促進し、同時に瘢痕化を予防、軽減または阻害する能力は、さらに一般的な臨床条件においても使用できる。これらのさらなる利益の例は、下記のような、第１次癒合、第２次癒合または第３次癒合による創傷の治癒を参照して考慮されることができる。
本発明の目的において、第１次癒合による治癒は、外科的方法（縫合、接着性シート、またはステープルなど）による創傷の相対する縁の閉鎖に関連すると見なすことができる。第１次癒合による治癒は、典型的に、外科的切開またはその他のきれいな創傷において使用され、最小範囲の組織欠損を伴う。当業者は、本発明によるＴＧＦ−β３（配列識別番号３、５、７、９または１１を含むものなど）は創傷幅を軽減することができるため、相対する縁の結合を促進し、つまりは、第１次癒合による創傷治癒において有益であることができるということを理解するだろう。さらに、そのような方法または薬剤は、（さらに以下に記されるように）そのような治癒に生じ得る瘢痕化の予防、軽減または阻害をもたらす可能性がある。本発明の発明者は、本方法での治療は治療された創傷から形成される瘢痕の巨視的外観および微視的外観の両方に影響を及ぼす可能性があり、巨視的には、瘢痕は目立たなく周囲の皮膚になじむことができ、微視的には、瘢痕はより通常の皮膚構造の再生を示すことができる、と考える。
【００４５】
本発明の目的において、第２次癒合による治癒は、直接の外科的介入なく、創傷治癒過程よって、創傷の閉鎖を構成すると考えられる。第２次癒合によって治癒される創傷は、継続的なケア（例、傷口に包帯を巻くことおよび包帯を巻きなおすこと、さらに、適した薬剤を塗布すること）をしなければならない場合があるが、肉芽組織形成および創傷の閉鎖を生じる再上皮化の自然な過程である。当然のことながら、本発明によるＴＧＦ−β３（配列識別番号３、５、７、９または１１を含むものなど）は対照の創傷に生じるものと比較して、再上皮化の速度を上げることが可能であるため、第２次癒合による創傷治癒の促進において有効である。
第３次癒合による治癒は、少なくとも部分的に肉芽組織形成および再上皮化を可能にするために事前に開いたままにされていた創傷の外科的縫合を含むと考えられる。第１次癒合または第２次癒合による治癒における使用に適用させる本発明の好適な方法および薬剤の特性は、第３次癒合による創傷治癒を促進するための状況においても有益である。
【００４６】
瘢痕化を阻害すると同時に、再上皮化を促進（加速した創傷治癒の加速の促進の一部分として）するための、本発明の配列識別番号３、５、７、９または１１のようなＴＧＦ−β３の使用は、移植手順を伴う創傷の治療においても特に効果的である。本発明のそのような方法および薬剤を使用した治療は、移植供与部位（瘢痕形成を予防し、軽減させ、または阻害する一方で機能性上皮層の回復を助けることのできる部位）、および被移植部位（加速された治癒は移植された組織の統合を促進する一方、治療の抗瘢痕化効果が瘢痕形成を阻害する部位）の両方において有益である。本発明者は、本発明の方法および薬剤は皮膚、人工皮膚、または代用皮膚を使用した移植の状況に利益を与えると考える。
本発明者は、配列識別番号３、５、７、９または１１を使用する本発明の方法および薬剤が創傷前、または創傷がすでに形成されてから投与された場合のいずれにおいても、瘢痕化の阻害を伴い加速した創傷治癒を促進することができるということを発見した。
【００４７】
本発明者は、配列識別番号３、５、７、９または１１を含むものなどのＴＧＦ−β３を使用する本発明の方法および薬剤は、上皮再生を促進することが可能であるということを発見した。本発明の範囲内の上皮再生の促進とは、対照の治療された上皮または治療されていない上皮に生じる再生と比較して、上皮再生の速度のいかなる上昇をも包含すると理解されることができる。
本発明による適した方法または薬剤を使用して得られた上皮再生の速度は、当技術分野において既知の任意の適した上皮再生のモデルを使用して、対照の治療された上皮または治療されていない上皮に生じる速度と容易に比較することができる。例えば、既知の範囲を有する実験的上皮損傷の部位が再生する速度は、ＴＯＭＬＩＮＳＯＮ  ＡＮＤ  ＦＥＲＧＵＳＯＮ  （２００３）、ＤＡＶＩＤＳＯＮ  ＥＴ  ＡＬ．（１９９１）およびＰＡＤＤＯＣＫ  ＥＴ  ＡＬ．（２００３）に記載されるようなマウス、ラット、ラビット、またはブタにおける既知の生体内モデルを使用して比較することができる。
【００４８】
いかなる仮説にも拘束されるものではないが、本発明の発明者は、本発明のＴＧＦ−β３によって得られた上皮再生の促進はその上皮細胞移動の促進によって媒介されると考える。上皮細胞（促進された移動）は、それにより、再集合し、治療なしに生じるときよりもより早く損傷した上皮を再生することができる。
当然のことながら、配列識別番号３を含む本発明のＴＧＦ−β３を使用した上皮再生の促進は、再上皮化反応が低下する、阻害される、遅滞する、または不全である状況下で効果的な再上皮化を誘導するために使用することができる。上皮再生の促進は、また、上皮損傷に苦しむ患者において、不全な上皮再生反応または通常の上皮再生反応の速度を加速するように影響することもできる。
【００４９】
身体の再上皮化反応が不全となり得る多くの状況が存在する。例えば、皮膚での再上皮化不全は、天疱瘡、ヘーリーヘーリー病（家族性良性天疱瘡））、中毒性表皮剥離症（ＴＥＮ）／中毒性表皮壊死症、表皮水疱症、皮膚リーシュマニア症および光線性角化症などの病状に関連する。肺の再上皮化不全は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または間質性肺炎に関連する可能性がある。目の再上皮化不全は、部分的な輪舞幹細胞の不全または角膜びらんのような病状に関連する可能性がある。胃腸管または結腸の再上皮化不全は、慢性裂肛（肛門裂創）、潰瘍性大腸炎またはクローン病、およびその他の炎症性腸疾患などの病状に関連する可能性がある。
上述のように、本発明のＴＧＦ−β３は、瘢痕化を予防、軽減、または阻害するために使用することができる。瘢痕化の阻害は、皮膚、目、神経、腱、靭帯、筋肉、および口腔（唇および口蓋を含む）、さらには内臓器官（肝臓、心臓、脳、腹腔、骨盤腔、胸腔、消化器および生殖組織など）を含む、すべての人体の部位において、およびすべての組織または臓器において影響することができる。皮膚において、治療は瘢痕の巨視的外観および微視的外観を改善することができ、巨視的には、瘢痕は目立たなく周囲の皮膚になじむことができ、微視的には、瘢痕内のコラーゲン繊維は、周辺皮膚におけるものとより類似した形態および組織を有することができる。本発明の範囲内の瘢痕の予防、軽減または阻害は、対照の治療された創傷または治療されていない創傷（本明細書の別の場所に定義される）に生じる瘢痕化の程度と比較した瘢痕化の予防、軽減または阻害のいかなる低程度も包含すると理解されるべきである。文脈上他の意味に解すべき場合を除き、瘢痕化の「予防」、「軽減」または「阻害」への言及は、すべて抗瘢痕化活性において見られる同等のメカニズムとして解釈することができる。
【００５０】
本発明の方法および薬剤によって得られる皮膚瘢痕化予防、軽減または阻害は、治療されていない瘢痕の外観と比較して、治療された瘢痕の微視的外観、または、好ましくは巨視的外観のいずれかに基づいて評価および／または測定することができる。より好ましくは、瘢痕化の予防、軽減または阻害は、治療された瘢痕の巨視的外観および微視的外観の両方に基づいて評価することができる。本発明の目的のため、「治療された瘢痕」は、治療された創傷の治癒時に形成される瘢痕であると定義することができるが、その一方、「治療されていない瘢痕」は、治療されていない創傷、またはプラシ−ポあるいは標準のケアによって治療された創傷の治癒時に形成される瘢痕であると定義することができる。適した比較瘢痕は、好ましくは、瘢痕年齢、部位、大きさおよび患者に基づいて、治療された瘢痕に適合することができる。
治療された創傷から得られる瘢痕の巨視的外観を考慮する際、瘢痕化の範囲、つまり得られた瘢痕化におけるすべての予防、阻害または軽減の規模は、パラメータの数字のいずれかを参照して評価することができる。
【００５１】
瘢痕の巨視的評価に適切なパラメータは下記の点を含んでもよい。
（ｉ）瘢痕の色。上記指摘したように、瘢痕は、周辺の皮膚に対して典型的に低色素沈着または高色素沈着である場合がある。瘢痕化の阻害または減少は、治療された瘢痕の色素沈着の方が、治療されていない瘢痕の色素沈着より、瘢痕がない皮膚に酷似する場合、認められる場合がある。同様に瘢痕は周辺の皮膚より赤い場合もある。この場合には、治療されていない瘢痕に比較して、治療された瘢痕の発赤がより早く、またはより完全に、または周辺の皮膚の外観に、より酷似するように薄くなる場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
（ｉｉ）瘢痕の高さ。瘢痕は、周辺の皮膚に比較して典型的に盛り上がる、または窪む場合がある。治療された瘢痕の高さが治療されていない瘢痕より瘢痕のない皮膚の高さに酷似する（つまり、盛り上がらず、窪んでもいない）場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
（ｉｉｉ）瘢痕の表面質感。瘢痕は、周辺皮膚より比較的に滑らかな表面（「光っている」外観の瘢痕を生じて）、または周辺皮膚より粗い表面を有する場合がある。治療された瘢痕の表面質感が治療されていない瘢痕の表面質感より瘢痕のない皮膚に酷似する場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
（ｉｖ）瘢痕の硬さ。瘢痕の構成および構造が異常なので、瘢痕を囲む無傷の皮膚より硬いのが通常である。この場合は、治療された瘢痕の硬さが治療されていない瘢痕の硬さより瘢痕のない皮膚に酷似する場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
好ましくは、治療された瘢痕は、上記瘢痕の巨視的評価に適切なパラメータの少なくとも１つに対して評価する際に瘢痕化の予防、阻害または減少が認められる。また治療された瘢痕は、より好ましくは、瘢痕の巨視的評価に適切なパラメータの少なくとも２つに対して瘢痕化の予防、阻害または減少が認められ、さらに好ましくは少なくとも３つとし、最も好ましくはこれらのパラメータの４つすべてとする。瘢痕化において全体的な評価は、例えば視覚アナログ尺度またはデジタル評価尺度を使用し行ってもよい。
【００５２】
瘢痕の微指摘評価に適切なパラメータは下記の点を含んでもよい。
（ｉ）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）繊維の厚さ。瘢痕は典型的に周辺の皮膚より薄いＥＣＭ繊維を含む。この特性はケロイド瘢痕および肥厚性瘢痕の場合に、さらに顕著である。治療された瘢痕の厚さが治療されていない瘢痕にある繊維の厚さより瘢痕のない皮膚にあるＥＣＭ繊維の厚さに酷似する場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
（ｉｉ）ＥＣＭ繊維の配向。瘢痕中のＥＣＭ繊維は瘢痕のない皮膚にある物（「バスケットウィーヴ」とよく言われる任意の配列を有する物）より、高い程度の相互整列を示す傾向がある。ケロイド瘢痕および肥厚性瘢痕のような病的瘢痕のＥＣＭはさらに異常な配向を示す場合があり、頻繁にＥＣＭ分子の大きい「渦」または「カプセル」を形成する。従って、治療された瘢痕にあるＥＣＭ繊維の配向が治療されていない瘢痕にある該繊維の配向より瘢痕のない皮膚にあるＥＣＭ繊維の配向に酷似する場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
（ｉｉｉ）瘢痕のＥＣＭ構成。瘢痕にあるＥＣＭ分子の構成は、通常の皮膚との違いおよび瘢痕中のＥＣＭ繊維に存在するＸの量の減少が認められる。従って、治療された瘢痕の真皮にあるＥＣＭ繊維の構成が治療されていない瘢痕にある構成より瘢痕のない皮膚にあるそのような繊維の構成に酷似する場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
（ｉｖ）瘢痕の細胞性。瘢痕は瘢痕のない皮膚より比較的に少なく細胞を含む傾向がある。従って当然のことながら、治療された瘢痕の細胞性が治療されていない瘢痕の細胞性より瘢痕のない皮膚の細胞性に酷似する場合、瘢痕化の阻害または減少を認める場合がある。
好ましくは、治療された瘢痕は、上記瘢痕の微視的評価に適切なパラメータの少なくとも１つに対して評価する際に瘢痕化の予防、阻害または減少が認められる。また治療された瘢痕は、より好ましくは、瘢痕の微視的評価に適切なパラメータの少なくとも２つに対して瘢痕化の予防、阻害または減少が認められ、さらに好ましくは少なくとも３つとし、最も好ましくはこれらのパラメータの４つすべてとする。
【００５３】
治療された創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害は、下記の業務において使用される適切なパラメータに対して評価することができる。
（ｉ）瘢痕の巨視的臨床評価、特に対象患者の皮膚にある瘢痕の評価
（ｉｉ）瘢痕の写真画像の評価
（ｉｉｉ）シリコーン型または瘢痕のシリコーン型から作られたギプス包帯の評価
（ｉｖ）瘢痕の微視的評価、例えば、瘢痕の微視的構造の組織学的分析による評価
当然のことながら、そのような適切なパラメータの１つ以上の向上により、治療された創傷の瘢痕化の予防、減少および阻害が示され、また複数のパラメータに対して評価された予防、減少または阻害の場合、これらのパラメータを異なる評価スキームから組み合わせることが出来る（例えば、巨視的評価に使用された少なくとも１つのパラメータおよび巨視的評価に使用された少なくとも１つのパラメータにおける減少、阻害または向上）。
【００５４】
瘢痕化の予防、減少または阻害は、１つ以上のパラメータの向上により認められる場合があり、選択されたパラメータに対して治療された瘢痕が治療されていない瘢痕または対照瘢痕より瘢痕のない皮膚に酷似することを示す。
瘢痕の臨床測定および評価に適切なパラメータはＢｅａｕｓａｎｇら（１９９８）およびｖａｎ  Ｚｕｉｊｌｅｎら（２００２）が説明したものを含めて様々な測定または評価に基づいて選択してもよい。
【００５５】
典型的に、適切なパラメータは下記の点を含んでもよい。
（１）視覚アナログ尺度（ＶＡＳ）の瘢痕点数に対する評価
瘢痕化の予防、減少または阻害は、対照瘢痕に比較すると治療された瘢痕のＶＡＳ点数減少により認められる場合がある。瘢痕評価に使用する適切なＶＡＳはＢｅａｕｓａｎｇら（１９９８）が説明した方法に基づいたものであってもよい。
（２）瘢痕の高さ、瘢痕の幅、瘢痕の周囲、瘢痕の面積または瘢痕の容積
瘢痕の高さおよび幅は、対照患者の皮膚で直接に測定できる、例えばカリパスのような手動測定機器を使用できる。瘢痕の幅、周囲および面積は、対照患者の皮膚で直接に測定できるか、または瘢痕の写真の画像分析により測定できる。当業者には、他にも、シリコーン型、超音波、光学的３次元外形測定および高解像度磁気共鳴画像を含めて適切なパラメータを調査するに使用できる非侵襲的な方法および機器が周知である。
瘢痕化の予防、減少または阻害は、治療されていない瘢痕に比較すると治療された瘢痕の高さ、幅、面積または体積、あるいはそれらのいからなる組み合わせでもの減少により認められる場合がある。
【００５６】
（３）瘢痕のない周辺の皮膚に比較された瘢痕の外観および／または色
治療された瘢痕の外観または色は瘢痕のない周辺の皮膚に比較し、（もしあれば）その違いと、治療されていない瘢痕および瘢痕のない皮膚の外観および色の違いを比較することができる。そのような比較は、それぞれの瘢痕および瘢痕のない皮膚の視覚的評価に基づいて行うことができる。瘢痕の外観は、瘢痕が瘢痕のない皮膚より白いか黒いかに対して比較することができる。瘢痕および皮膚のそれぞれの色は、互いに完璧に一致する、わずか一致しない、明らかに一致しないまたは全く一致しない場合がある。
視覚的評価の代わりに、またはそれに加えて、瘢痕および瘢痕のない皮膚の色素沈着および皮膚の発赤（瘢痕または皮膚にある血管性の程度の指標となる場合がある）に関するデータを提供できる、いくつかの非侵襲的な測色機器がある。そのような機器の例として、Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃｈｒｏｎａｍｅｔｅｒ  ＣＲ−２００／３００、Ｌａｂｓｃａｎ  ６００、Ｄｒ．Ｌａｎｇｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｏｕｒ、Ｄｅｒｍａ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、レーザードップラー流量計およびＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＳＩＡ）スコープが挙げられる。
瘢痕化の予防、減少または阻害は、治療された瘢痕および瘢痕のない皮膚の外観または色の違いが、治療されていない瘢痕および瘢痕のない皮膚の違いより低い程度であることにより認められる場合がある。
【００５７】
（４）瘢痕の変形および機械的性能
瘢痕変形は瘢痕および瘢痕のない皮膚の視覚的な比較により評価することができる。適切な比較は、選択された瘢痕が変形なし、わずかな変形、中程度の変形または重度の変形を引き起こすとして分類してもよい。
瘢痕の機械的性能は、吸引、圧力、捻転、張力および音響学に基づいた幾つかの非侵襲的な方法および機器を使用し評価することができる。瘢痕の機械的性能を評価するに使用できる既存の機器の適切な例として、Ｉｎｄｅｎｔｏｍｅｔｅｒ、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ、Ｒｅｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ、Ｖｉｓｃｏ−ｅｌａｓｔｉｃ皮膚分析、Ｄｅｒｍａｆｌｅｘ、Ｄｕｒｏｍｅｔｅｒ、Ｄｅｒｍａｌ  Ｔｏｒｑｕｅ  ＭｅｔｅｒおよびＥｌａｓｔｏｍｅｔｅｒが挙げられる。
瘢痕化の予防、減少または阻害は、治療された瘢痕が引き起こす変形を治療されていない瘢痕が引き起こす変形に比較すると減少になることにより認めることができる。また、当然のことながら瘢痕化の予防、減少または阻害は、瘢痕のない皮膚の機械的な皮膚が治療されていない瘢痕より治療された瘢痕の方によりよく類似することによって認められる場合がある。
【００５８】
（５）瘢痕輪郭および瘢痕質感
瘢痕輪郭は視覚的評価により調査してもよい。そのような評価において検討すべき適切なパラメータは、瘢痕が周辺皮膚に対して同一平面になっているかどうか、わずかに盛り上がっているか、わずかに窪んでいるか、ケロイド瘢痕か、または肥厚性瘢痕かを含む。瘢痕の質感は瘢痕の外観に対して評価してもよく、またこれは、瘢痕のない皮膚に比較すると瘢痕が、例えば、つやがあるかどうか、または外観が粗いか滑らかかに関する視覚的評価により行ってもよい。
瘢痕質感は、瘢痕が瘢痕のない皮膚（通常の質感）と同一の質感を有するか、わずか感じられるか、きついか、または硬いかに対してさらに評価してもよい。また瘢痕の質感はＨａｍｉｌｔｏｎ尺度（Ｃｒｏｗｅら，１９９８に説明した）に対して評価してもよい。
上記の手法に加えて、瘢痕輪郭および／または質感を評価するために光学的または機械的な方法を使用する幾つかの非侵襲的な外形測定機器がある。そのような評価は対象の身体に対して、または例えば、瘢痕のシリコーン型またはその型から作られたギプス包帯に対して行ってもよい。
瘢痕の予防、減少または阻害は、治療された瘢痕の方が治療されていない瘢痕より瘢痕のない皮膚に比較できる瘢痕外形および質感を有する場合、認められる場合がある。
【００５９】
写真による評価
独立した非専門家委員会
治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の写真による評価は、標準化し較正した瘢痕の写真を使用し独立した非専門家の評価委員会により行われてもよい。瘢痕は、Ｂｅａｕｓａｎｇら（１９９８）が説明した方法に基づいた視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）を使用し分類順位データ（例えば任意の治療された瘢痕は、治療されていない瘢痕に比較すると「よりよい」、「より悪い」または「変わらない」である）および定量的データを提供するために、独立した非専門家委員会により評価されてもよい。このデータの取得において、本出願者の同時出願中の特許出願に記載の適切なソフトウェアおよび／または電子システムを使用してもよい。
【００６０】
専門家委員会
さらに、治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の写真による評価は、評価の対象になる瘢痕の標準化し較正した写真を使用し専門家評価委員会により行われてもよい。専門家委員会は、好ましくは形成外科医や適切の分野を得意とする科学者のような適切な当業者から構成されてもよい。
そのような評価は、上記のように、または選択した治療された瘢痕および治療されていない瘢痕の画像の時間経過を比較することに対して分類データを提供する場合がある。
【００６１】
行うべき適切な評価は下記の業務を含んでもよい。
最適な瘢痕の特定。これは本発明の目的において周辺皮膚に最も酷似している瘢痕であると見なされてもよい。一度最適な瘢痕を特定したら、瘢痕間の違いの程度を検討できる、例えば瘢痕間の違いがわずかなのか明らかなのか。さらに検討できるパラメータは、瘢痕間の違いを検知できる瘢痕化後の最も早い時間、瘢痕間の違いがもっとも明らかである瘢痕化後の時間（あるいはその代わりに、評価された最後の時点の後に違いが続ける所見）、またより適切な瘢痕が一貫してより適切になっているかどうかを検討することを含む。
【００６２】
１つの瘢痕がもう１つの瘢痕より一貫して赤いのか、また発赤が検討している時点に渡って薄くなっていくか（あるいは最後の時点の後に続けるか）、またその場合は瘢痕化後に何時に薄くなるかを検討してもよい。専門家委員会は、瘢痕化後に発赤の違いが何時に検知できるようになるか、また瘢痕化後に発赤の違いが何時にもっとも明らかであるかを検討することもある。
専門家委員会は治療された瘢痕または治療されていない瘢痕のうち１つが一貫してもう１つより白いか、瘢痕のない皮膚より白いかも検討してもよい。白色度の違いを検知できる場合、その違いを検知できる瘢痕化後の時間、その違いがもっとも明らかである時間およびその違いがなくなる時間を検討する場合がある。
【００６３】
さらに専門家委員会に評価される場合があるパラメータは治療されたおよび治療されていない瘢痕の質感である。治療されたおよび治療されていない瘢痕を比較する際に、専門家委員会は、どの瘢痕が最良な皮膚質感を有するか、存在するいかなる違いも検知できる瘢痕化後のもっとも早い時間、いかなる違いでも瘢痕化後のもっとも明らかである時間、およびいかなる違いでも瘢痕化後になくなる時間を検討する場合がある。
治療されたおよび治療されていない瘢痕の比較では、どの瘢痕が最も狭いか、どの瘢痕が最も短いかをさらに評価できる。瘢痕の形状および瘢痕周囲が周辺皮膚から区別できる程度も検討してもよい。上記の視覚的評価および色の評価と同様に、色素沈着過度の有無、程度および位置を検討することもある。
【００６４】
上記のように治療されたおよび治療されていない瘢痕の性質を比較する方法の１つは、微視的評価である。瘢痕性質の微視的評価は典型的に瘢痕の組織学的切片を使用し行ってもよい。瘢痕を微視的に評価し測定する過程は下記の適切なパラメータに基づいた分類データを考慮する場合がある。
（１）表皮復元。特に乳頭間隆起の復元の程度および復元された表皮の厚さに注目を払う場合がある。
（２）血管新生および炎症。存在する血管の数、存在する血管の大きさおよび存在する炎症のいかなる程度もの評価を含めて炎症の証拠を検討する場合がある。
（３）コラーゲン組織。コラーゲン組織を評価する際は、瘢痕にあるコラーゲン繊維の配向、その繊維の密度および真皮乳頭層ならびに真皮網状層にあるコラーゲン繊維の厚さを参照してもよい。
（４）真皮乳頭層および真皮網状層におけるコラーゲン組織の視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）評価も、瘢痕性質の有用な指標を提供する場合がある。
（５）瘢痕の微視的な性質を評価する際に考慮されるその他の特性は、瘢痕のない周辺皮膚に対して瘢痕の隆起および陥凹、また通常表皮接触面で瘢痕の突起および可視性を含む。
（６）明らかに上記すべての評価では、治療された瘢痕が、対照、治療されていないまたはその他適切な比較瘢痕と比較するとよりよいか、より悪いか、変わらないかという指標を提供できる瘢痕順位データを生成できるようになる。
【００６５】
分類データに加えて、定量的データ（好ましくは上記パラメータに関連するもの）を、画像分析とともに適切な可視化手法を使用し生成することができる。瘢痕性質を評価する際に使用できる適切な可視化手法の例としては、特定の組織学染色または免疫のラベルが挙げられ、存在する染色またはラベルの程度は画像分析によって判定できる。
定量データは下記のパラメータに対して有用に、また直ぐに生成できる。
(１)瘢痕の幅、高さ、隆起、体積および面積
(２)上皮の厚さおよび網羅（例えば瘢痕に存在する表皮の面積または創傷の表皮網羅割合）
(３)血管の数、大きさ、面積（つまり断面面積）および位置
(４)存在する炎症細胞の炎症程度、数、位置および集団／種類
(５)コラーゲン組織、コラーゲン繊維の厚さ、コラーゲン繊維の密度
【００６６】
瘢痕化の予防、減少または阻害は、治療された瘢痕が対照または治療されていない瘢痕（またはその他適切な比較できるもの）より瘢痕のない皮膚に酷似しているように上記パラメータのいずれかにおける変化により認められる場合がある。
上記の評価およびパラメータは、動物およびヒトにおいて、対照、プラシーボまたは標準医療治療と比較してペプチドの効果の比較に適切である。適切な統計試験は、結果の意味を調査するために、様々な治療から生成されたデータセットを分析するために使用できる。
【００６７】
好ましくは、瘢痕化の予防、減少または阻害は２つ以上のパラメータに対して認められることができる。より好ましくは、瘢痕化の予防、減少または阻害は臨床的なパラメータ（つまり対象で認められた）および写真パラメータの両方に対して認められることができる。さらに好ましくは、瘢痕化の予防、減少または阻害は、臨床的なパラメータ、写真パラメータ、また微視的評価パラメータ（例えば組織学パラメータ）に対して認められることができる。もっとも好ましくは、瘢痕化の予防、減少または阻害は臨床的なＶＡＳ点数、外部非専門家委員会のＶＡＳ点数と順位（写真画像から）、および真皮網状層の微視的ＶＡＳ点数に対して認められることができる。
本発明の適切な方法および薬剤を使用することは、そのように治療された創傷部位の美容上の外観において迅速な向上をもたらすことができる。特に創傷を身体の目立つ部位で形成する際は、いくつかの臨床的な状況において美容な側面を考慮することが重要である。そのため、形成された瘢痕の美容上の外見を向上することが望まれた部位で瘢痕化の阻害（加速された創傷治癒との組み合わせが望ましい）は、本発明の好適な実施形態となる。
【００６８】
美容上の影響に加えて、皮膚の瘢痕化は、そのような瘢痕化にかかっている者を悩ます幾つかの有害効果を引き起こす。例えば、皮膚瘢痕化は、特に収縮瘢痕の場合（例えば肥厚性瘢痕）および／または関節を渡って瘢痕を形成する状況において、物理的かつ機械的な機能の減少に関連する。この場合においては、瘢痕のない皮膚と異なって、瘢痕のある皮膚の変更された機械的な特性および瘢痕収縮の効果は、非常に制限されたその影響を受ける関節の動き（関節動作）をもたらす場合がある。従って本発明の適切な薬剤および方法を身体の関節を網羅する創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害に使用すること（また、好ましくはそのような創傷の治癒を加速すること）は好適な実施形態である。別の好適な実施形態においては、本発明の適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または収縮瘢痕を形成する危険性が高い創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害を行うことに使用することができる。
瘢痕形成の程度、およびそれに伴いその瘢痕が引き起こしうる美容上の障害またはその他の障害の程度は、創傷が形成される部位の張力のような要因から影響を受ける場合がある。例えば、比較的に高い張力の皮膚（例えば胸を渡っている皮膚、または張力線に関連する皮膚）が、他の身体部位に比較してより重大な瘢痕を形成する傾向があることは周知である。従って、好適な実施形態において、本発明の適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または高い皮膚張力の部位に位置する創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害を行うことに使用することができる。瘢痕修正において、減少張力の状態をもたらす、創傷および瘢痕の再配向を可能にする手術法が多い。おそらく最も知られたのは、「Ｚ−ｐｌａｓｔｙ」であり、そこで張力線を回転することを可能にするために２つのＶ字型の皮膚の弁が転置される。従ってより好適な実施形態においては、本発明でそのような薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または外観を損なう瘢痕の修正手術の際に創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害を行うことに使用することができる。
【００６９】
病的な瘢痕化は、比較的に重大な通常瘢痕化の結果として発生するものに比較するとしてもより顕著で有害な効果をもたらす場合がある。病的な瘢痕の通常の例は、肥厚性瘢痕およびケロイド瘢痕を含む。ある一定の創傷種類またはある一定の者は病的瘢痕形成が起こりやすいことが周知である。例えばアフロカリビアン人、日本人または蒙古人種の者または病的な瘢痕化の家族歴がある者が肥厚性瘢痕またはケロイド瘢痕の形成に対して危険性が高いと見なしてもよい。子供の創傷、特に子供の火傷は、より多くの肥厚性瘢痕形成にも関連する。従って、本発明の好適な実施形態においては、適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または病的な瘢痕形成の危険性が高い創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害を行うことに使用することができる。
既に病的な瘢痕化にかかっている者がさらに過度な瘢痕形成が生じやすいが、多くの場合は肥厚性瘢痕またはケロイド瘢痕に対して修正手術が臨床的に必要であり、それに伴い間接的で病的な瘢痕形成の危険性がある。従って、本発明でさらに好適な実施形態においては、適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または病的な瘢痕の修正手術により生じた創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害を行うことに使用することができる。
【００７０】
火傷から生じた創傷（本発明では熱い液体または気体が関与する熱湯熱傷を含むとも捉えられる）がかかる者で大きい面積を渡ることが周知である。従って火傷は、患者の身体の大部分を渡って瘢痕形成を発生する場合があり、それで形成された瘢痕が美容的に大事な部位（例えば顔、首、腕または手）または機械的に重要な部位（特に関節を網羅する部位または関節を囲む部位）を網羅する危険性が高くなる。熱い液体に起因する火傷は、よく子供が負うものであり（例えば、鍋、やかん等を落とす結果として）、子供の身体は比較的に小さいため、身体の面積の大部分を渡って幅広い損傷を引き起こすことは確率が特に高い。本発明でさらに好適な実施形態においては、適切な薬剤および方法は加速創傷治癒を促進することおよび／または火傷により生じた創傷の瘢痕化の予防、減少または阻害を行うことに使用することができる。
上記のように、火傷に対して創傷の治癒は、多くの場合、例えば肥厚性瘢痕の形成といった、有害な瘢痕化結果に関連する。火傷が比較的大きいことによる更なる結果としては、機能する上皮層がないために生じる、火傷が感染および乾燥のような合併症にかかりやすい。上記のことを考慮すると、当然のことながら、本発明の適切な方法および薬剤は、創傷の結果として起こる瘢痕化の程度を減少することおよび／または機能する上皮バリアの再構築を加速することを目的にし、火傷の治療に使用することができる。
【００７１】
本発明者は本発明のＴＧＦ−β３を使用する方法および薬剤が再上皮化を促進できると判明した。従ってそのような方法および薬剤は、上皮層への損傷に関与する全ての損傷の治療において特に効果的である。そのような損傷は、表皮が損傷を受けた皮膚の損傷に例示されるがそれに限定されない。しかし当然のことながら本発明における該方法および薬剤は上皮が損傷を受けた他の種類の創傷にも適用できる、例えば呼吸上皮、消化上皮または内蔵組織あるいは器官を囲む上皮（例えば腹膜の上皮）。
腹膜（内臓器官の上皮および／または滞空の内部）が関与する創傷の治癒は、多くの場合に癒着を生じる。そのような癒着は多くの場合に婦人科または腸の組織が関与する手術の結果である。本発明者は、本発明の方法および薬剤（例えば配列識別番号３、５、７、９または１１に記載したＴＧＦ−β３を含むもの）が瘢痕化を減少しながら腹膜の再生を加速できることは、腹膜の部位が互いに不適切に接着することを減少することによって癒着の発生を減少する場合があると考える。従って、腸の癒着または婦人科癒着の形成を防ぐために本発明における該方法および薬剤を使用することは、本発明の好適な実施形態である。実に腹膜が関与するいかなる創傷の治癒においても、本発明における該方法および薬剤を使用することは、好適な実施形態である。
【００７２】
本発明の方法または薬剤を、例えば、創傷が存在しないが瘢痕または慢性の創傷が形成される部位で予防的に使用してもよい。例として、本発明による薬剤は選択的手当（例えば手術）の結果として創傷を受ける部位に投与することができる。好ましくは、創傷を受ける時前後、または創傷形成の直前（例えば創傷を受ける前に６時間以内の期間）に本発明の薬剤をかかる部位に投与してもよく、または該薬剤は創傷を受ける前により早い時点で投与してもよい（例えば創傷形成の前に４８時間以内）。当業者は創傷形成の前に最も好ましい投与時間が、選択された薬剤の製剤および投与経路、投与する薬剤の投与量、形成する創傷の大きさおよび性質、そして患者の生物学的状態（患者の年齢、健康および治癒中の合併症または有害瘢痕化が起こりやすいかのような要因を考慮して判定してもよい）を含めて幾つかの要因を考慮して判定されることが分かる。本発明による方法および薬剤を予防的に使用することは、本発明の好適な実施形態であり、手術による創傷の場合に創傷治癒の加速を促進することおよび／または瘢痕化の予防、減少または阻害には、特に好ましい。
本発明の方法および薬剤は、創傷形成の後に投与する場合にも創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害を促進することができる。好ましくはそのような投与を創傷形成後にできるだけ早く行うが、本発明の活性剤は完全治癒までいつでも創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少および阻害を促進することができる（つまり、創傷が既に部分的に治癒した場合でも本発明の方法および薬剤は、残っている治癒されていない部分に対して、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少および阻害を促進することに使用できる）。当然のことながら、本発明の方法および薬剤が創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少および阻害を促進できる「期間」は、関連する創傷の性質に依存する（起こられた損傷および創傷面積の広さを含む）。従って大きい創傷の場合は、本発明の方法および薬剤は治癒反応において比較的に遅く投与してもよいが、それでも創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少および阻害を促進することができる。例えば、本発明の方法および薬剤は、好ましくは創傷形成後に２４時間以内に投与されるが、創傷を受ける後に１０日以内、またはそれ以上に投与するとしても創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少および阻害を促進することができる。
【００７３】
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少および阻害を促進するために本発明の方法および薬剤は１回以上投与してもよい。例えば、該薬剤の治療的に効果的な投与量で、完全治癒までに何回も創傷に投与してもよい。例としては、創傷形成後に少なくとも最初３日間に本発明の薬剤は、毎日または１日に２回、創傷に投与してもよい。
最も好ましくは、本発明の方法および薬剤は創傷形成の前およびその後と両方に投与してもよい。本発明者は、創傷形成の直前に本発明の薬剤を投与して、その後、創傷形成後の数日の間に毎日該活性剤を投与することは、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少および阻害を促進するには特に効果的であることを判明した。
【００７４】
本明細書においては、「活性剤」または「本発明の活性剤」とは、生物学的または治療的に効果のある本発明のＴＧＦ−β３および／または生物学的または治療的に効果のある本発明のＴＧＦ−β３の部分および／または生物学的または治療的に効果のある本発明のＴＧＦ−β３の誘導物を意味する。本発明の活性剤は、本発明のＴＧＦ−β３（またはその部分かその誘導物）をコード化する核酸を含んでもよい。当然のことながら全てのそのような活性剤は本発明に従って薬剤に組み込まれてもよく、本発明の方法および用途に使用してもよい。
当然のことながら創傷に本発明の薬剤を投与すべき投与量は、該薬剤に存在する活性剤の生物学的な作用およびそのバイオアベイラビリティのような幾つかの要因に依存して、またそれは、他の要因も考慮しながら、活性剤の性質および薬剤の投与法に依存する。薬剤の適切で治療的な投与量を判定するには、その他下記の要因を含んでもよい。
（ｉ）治療されている対象における活性剤の半減期
（ｉｉ）治療する特定の病状（例えば急性の創傷または慢性の創傷）
（ｉｉｉ）対象の年齢
【００７５】
投与の頻度は、特に治療されている対象における選択された活性剤の半減期、上記の要因からも影響を受ける。
一般的に、本発明による薬剤が既存の創傷を治療するに使用される場合、該薬剤は創傷を受けた直後に投与すべきである（あるいは、身体内部部位のような直ぐに明らかではない創傷の場合、創傷を診断した直後とする）。本発明による方法または薬剤を使用する治療は、医師が満足するまで、治癒過程の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害まで続くべきである。
【００７６】
投与の頻度は使用された活性剤の生物学的半減期に依存する。典型的に本発明の活性剤を含有するクリームまたは軟膏は、創傷における活性剤の濃度を、治療効果を生じる適切な程度に維持するように、対象組織に投与するべきである。これは毎日、または１日に何度も投与することが必要となる場合がある。
本発明の薬剤は、創傷治癒の促進および／または瘢痕化の予防、減少または阻害という望ましい効果を達成できるいかなる適切な経路でも投与してもよいが、好ましくは、該薬剤を創傷部位に局所的に投与する。
【００７７】
本発明者は、創傷治癒の促進および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を、創傷部位に注射することによって本発明の活性剤を投与することによって、実施できることを判明した。例えば、真皮創傷の場合、本発明の活性剤を皮内注射により投与してもよい。従って本発明による好ましい薬剤は、本発明の活性剤の注射できる溶液を含む（例えば上皮損傷の部位または損傷を受けそうな部位の周囲に注射するもの）。本発明において本実施形態に使用するための適切な製剤は、下記の通りである。
その代わりに、またはそれに加えて、本発明の薬剤は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を促進するために、局所的な形態に投与してもよい。そのような投与は創傷部位に対して最初の、および／またはその後の治療の一環として実施してもよい。
【００７８】
本発明者は、創傷治癒加速の促進および／または瘢痕化の予防、減少または阻害が創傷に（あるいは、予防的な投与の場合、創傷を形成する組織または部位に）本発明の活性剤を局所的に投与することによって特に向上されることをはんめいした。
本発明の活性剤を含有する組成物または薬剤は、特に使い方により、幾つかの形態が可能である。従って、例えば、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、粉末またはエアロゾルの形態が可能である。そのような組成物は全て創傷に局所的に投与することに適切であり、それは治療が必要となる対象（ヒトまたは動物）に対して本発明の活性剤を投与する好ましい手段である。
【００７９】
本発明の活性剤は、創傷または上皮損傷を治療するその他の部位を網羅するに使用できる滅菌包帯またはパッチの形で提供してもよい。
当然のことながら、本発明の活性剤を含む組成物の運搬体は、患者によく耐えられて、創傷に放出することを可能にするものであればよい。そのような運搬体は、好ましくは生物分解性、生物溶解性、生物吸収性および／または非炎症性のものである。
本発明の活性剤を含む薬剤および組成物は、幾つかの用途に使用することができる。従って、例えば、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を促進するために組成物は、創傷の中に、および／または創傷の周囲に投与してもよい。組成物を「既存」の創傷に投与する場合、薬学的に許容される運搬体は比較的に「マイルド」なものであり、つまり、生体適合性、生物分解性、生物溶解性、および非炎症性のものである。
【００８０】
本発明の活性剤またはそのような活性剤をコード化する核酸（以下、さらに説明するように）は、持続放出または遅延放出の装置に組み込まれてもよい。該装置は、例えば、皮膚の上に置くまたは皮膚の下に挿入することができ、そこで活性剤または核酸は数日間、数週間または数ヶ月まで放出される場合がある。該装置は、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を長期的に促進する必要となる患者（慢性の創傷を患う患者等）に対して特に有用である場合がある。該装置は、通常は頻繁的な投与（例えば、他の経路を介して少なくとも毎日の投与）が必要となる活性剤または核酸の投与に使用された際は特に有利である。
本発明の活性剤の毎日投与量は一回の投与として与えられる（例えば、局所製剤の毎日投与または毎日の注射）。その代わりに、本発明の活性剤は１日に２回以上の投与が必要となる場合がある。さらにその代わりに、持続放出装置を使用し、複数の投与量を投与する必要なしに患者に本発明の活性剤の最適な投与量を与えることができる。
【００８１】
一実施形態において、本発明の活性剤を投与する薬学的な運搬体は液体であってもよく、適切な薬学的な組成物は溶液の形態である。別の実施形態においては、薬学的に許容される運搬体は固体であり、適切な薬学的な組成物は粉末または錠剤の形態である。さらに別の実施形態においては本発明の活性剤は、薬学的に許容される経皮貼布の一環として製剤される。
固体運搬体は、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、充填剤、流動促進剤、圧縮剤、結合剤または錠剤崩壊剤として動作しうる１つ以上の物質を含んでもよく、封入材料であってもよい。粉末においては、運搬体は、詳細に分けた本発明の活性剤と混合する詳細に分けた固体である。錠剤においては、本発明の活性剤が適切な割合で必要な圧縮特性を有する運搬体と混合され望ましい形状および大きさで圧縮される。粉末および錠剤は、好ましくは９９％まで本発明の活性剤を含む。適切な固体運搬体は、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチンセルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。
【００８２】
液体運搬体は溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル剤および圧縮された組成物を調製するに使用してもよい。本発明の活性剤は、水、有機溶剤、双方の混合物または薬学的に許容される油脂の中に溶解または懸濁してもよい。液体運搬体はその他の適切な薬学的添加物を含んでもよく、例えば可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定剤または浸透圧調節剤を含んでもよい。経口および非経口投与用の液体運搬体の適切な例は、水（部分的に上記のような添加物を含む、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム溶液）、アルコール（１価アルコールおよび多価アルコールを含む、例えばグリコール）およびその誘導体、および油（例えばヤシ油およびラッカセイ油）。非経口投与においては、運搬体はオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような脂肪酸エステルであってもよい。滅菌液体運搬体は、非経口投与用の滅菌液体清楚物には有用である。圧縮組成物の液体運搬体は、ハロゲン化炭化水素またはその他の薬学的に許容される推進材であってもよい。
滅菌溶液または懸濁剤である液体薬学的組成物は、例えば筋肉内、髄腔内、硬膜外，腹膜内、皮内、基質内（角膜）または皮下の注射により活用することができる。滅菌溶液は静脈内投与も可能である。本発明の活性剤は、滅菌水、食塩水またはその他適切な滅菌注射可能な媒体を使用し投与時に溶解または懸濁される滅菌固体組成物として調製してもよい。運搬体はバインダー、懸濁させる薬剤、潤滑剤および防腐剤の必要な物と不活性の物と双方とも含むことを目的にする。
【００８３】
本発明の活性剤を経口で投与することが望ましい場合、当然のことながら選択された活性剤は、好ましくは分解への抵抗が高い程度にある活性剤である。例えば、本発明の活性剤は消化管中に分解率を減少するように保護される場合がある（例えば、上記の手法を使用する）。
本発明の活性物からなる組成物は、角膜において創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害には適切である。角膜の創傷は偶発的な事故（上記のように）または手術（例えば角膜のレーザー手術）によって生じた眼の外傷の結果である場合がある。この場合は、本発明の好ましい薬剤は点眼薬の形態であってもよい。
【００８４】
本発明の活性剤は様々な「内部」創傷（つまり、外部の表面よりも身体の内部に起こる創傷）において使用してもよい。従って、例えば本発明による薬剤は肺またはその他呼吸上皮で生じる創傷に使用するように吸入剤として製剤されてもよい。
薬学業界で通常に使用された既知の過程（例えば生体内実験、臨床試験等）は、本発明の活性剤を含む組成物の特定の製剤および該組成物の投与のための正確な治療計画（例えば活性剤の毎日の投与量および投与の頻度）を使用して確立してもよい。
【００８５】
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を促進できる本発明による薬剤の適切な毎日の投与量は、創傷を受けた組織の性質、治療する創傷の面積および／または深さ、創傷の重大性および病的な瘢痕または慢性の創傷形成が起こりやすい要因の有無を含めて（但しそれに限定されない）様々な要因に依存する。
例として、創傷または上皮損傷の部位に注射により投与される活性剤の総量は、好ましくは創傷または皮膚損傷のリニアｃｍにつき約５０ｎｇ／１００μＬである。そのような投与量は毎日１回、３日間までに投与してもよく、それで創傷または上皮損傷のリニアｃｍにつき１５０ｎｇの総量を与える。
【００８６】
急性創傷または上皮損傷の部位への局所投与の場合、活性剤の適切な投与量は好ましくは約１００ｎｇ／ｃｍ２である。そのような投与量は毎日１回、３日間までに投与してもよく、それで創傷または上皮損傷に対して３００ｎｇ／ｃｍ２の総量を与える。
さらに例として、毎日創傷または上皮損傷の部位に投与する活性剤の好ましい投与量は創傷または皮膚損傷のリニアｃｍにつき約５０ｎｇ（注射により投与の場合）あるいは創傷または上皮損傷の１００ｎｇ／ｃｍ２である（局所投与の場合）。
【００８７】
また、さらに例として１回だけの治療で創傷または上皮損傷の部位に投与する活性剤の好ましい投与量は創傷または皮膚損傷のリニアｃｍにつき約５０〜２００ｎｇ（注射により投与の場合）あるいは創傷または上皮損傷の１００〜３００ｎｇ／ｃｍ２である（局所投与の場合）。
創傷およびその他上皮損傷の部位の治療に必要となる本発明による薬剤の投与量は典型的に２４時間あたり創傷または皮膚損傷のリニアｃｍにつきｌｐｇ〜ｌｍｇの範囲に入っているが、上記の要因に対応するためこの数字は上または下に変更されてもよい。活性剤は好ましくは活性剤溶液の１ｐｇ／１００μＬ〜１ｍｇ／１００μＬという形態により与えられ、２４時間の期間に創傷または皮膚損傷のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬを投与する。
【００８８】
より好ましくは、該活性剤は１０ｐｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬの溶液として投与され、２４時間の期間に創傷または皮膚損傷のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬを投与する。
最も好ましくは、該活性剤は１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬの溶液として投与され、２４時間の期間に創傷または皮膚損傷のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬを投与する。
【００８９】
一般的に、本発明の活性剤を含む組成物は、創傷に投与すると活性剤の濃度が創傷または上皮損傷のリニアｃｍにつき０．７９ｐＭ〜０．７９ｍＭになるように製剤すべきである。好ましくは該活性剤はリニアｃｍにつき７．９ｐＭ〜０．０７９ｍＭの濃度で与えられる。
本発明の活性剤（例えば配列識別番号３〜８のペプチド）は０．７９ｐＭ〜０．７９ｍＭの濃度で投与してもよい。好ましくは本発明の活性剤（例えば配列識別番号３〜８のペプチド）は７．９ｐＭ〜０．０７９ｍＭの濃度で投与してもよい。最も好ましくは本発明の活性剤（例えば配列識別番号３〜８のペプチド）は０．７９ｎＭ〜０．７９μＭの濃度で投与してもよい。
【００９０】
単純に例として本発明の活性剤の１０ｐｇ／１００μＬ〜１００μｇ／１００μＬを含む注射可能な溶液（例えば配列識別番号３、５、７、９または１１）は、皮内注射として投与し創傷周囲のリニアｃｍにつき１００μＬを投与した場合、皮膚創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害を促進することに適切である。
配列識別番号３のＴＧＦ−β３の場合、創傷への投入において好ましい投与量は１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬの範囲に入っており、創傷周囲のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬが投与される。
【００９１】
配列識別番号５のＴＧＦ−β３の場合、創傷への投入において好ましい投与量は１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬの範囲に入っており、創傷周囲のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬが投与される。
配列識別番号７のＴＧＦ−β３の場合、創傷への投入において好ましい投与量は１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬの範囲に入っており、創傷周囲のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬが投与される。
【００９２】
配列識別番号９のＴＧＦ−β３の場合、創傷への投入において好ましい投与量は１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬの範囲に入っており、創傷周囲のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬが投与される。
配列識別番号１１のＴＧＦ−β３の場合、創傷への投入において好ましい投与量は１ｎｇ／１００μＬ〜１０００ｎｇ／１００μＬの範囲に入っており、創傷周囲のリニアｃｍにつき該溶液の１００μＬが投与される。
【００９３】
本発明の活性剤は、単独治療（例えば本発明の薬剤しか使用しない）として創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を促進するに使用してもよい。その代わりに、本発明の方法および薬剤は創傷治癒または瘢痕化阻害を促進するため、その他の化合物または治療と組み合わせて使用してもよい。そのような治療組み合わせの部分として使用できる適切な治療は当業者に周知である。
本発明者は、本発明によるＴＧＦ−β３は砂糖の存在下で有利に製剤することができる。この砂糖は還元糖または非還元糖および／またはリン酸塩またはホスホン酸塩の誘導体であってもよい。そのような砂糖の例は、マルトース、マンノース、トレハロース、アラビノース、マンニトール、スクロース、フルクトース、Ｄ形グルコースおよびグルコースからなる群から選択してもよいがそれらに限定されない。好ましい砂糖はマルトースおよびトレハロースからなる群から選択してもよい。
【００９４】
当然のことながら、本発明のＴＧＦ−β３を含むペプチドは、その分子をコード化する核酸配列の細胞発現が関与する手法により投与する有利な活性剤であってもよい。そのような細胞発現方法は長期間に渡ってそのペプチドの治療効果が必要となる医療用途には特に適切である、例えば普段ならば不良である創傷治癒反応を、ある一定の期間に渡って向上することが望ましい場合。特に好ましくは細胞発現により投与するＴＧＦ−β３は配列識別番号３、５、７、９または１１により確定されたペプチドまたはその部分あるいは誘導体を含む。これらのペプチドをコード化する核酸は配列識別番号４、６、８、１０または１２に記載される。
創傷のような組織へ本発明のペプチド活性剤を投与する多くの既知の方法は、ペプチド活性剤は生体内に短い半減期を有する場合があるため、数日間でも治療部位で本発明の活性剤の水準を維持するのが困難であるという不利がある。活性剤の半減期が短いことは下記の点を含めて幾つかの理由がある。
（ｉ）プロテアーゼ等による分解
（ｉｉ）結合タンパク質によるクリアランス
（ｉｉｉ）細胞外マトリックス分子による活性作用の結合および阻害
【００９５】
さらに、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、減少または阻害を促進するに使用される活性剤は、適切な運搬体中に投与する必要があり、多くの場合に活性剤および運搬体を含む組成物として提供される。上記のように、そのような運搬体は好ましくは、非炎症生、生物適合性、生物吸収性のものであり活性剤（保存中または使用中）の分解または無効を引き起こさない。しかしながら治療する創傷のある組織へ活性剤を送達するための適切な運搬体を提供することが困難である場合が多い。
これらの問題を防ぐまたは減らす便利な方法は遺伝子治療により治療する領域に本発明の活性剤の治療的に効果的な投与量を与えることである。
【００９６】
本発明の第４の側面によると、遺伝子治療技術に使用するための運搬系が提供され、該運搬系は、配列認識番号３、配列認識番号５、配列認識番号７、配列認識番号９、および配列認識番号１１により定義されるものから成る群から選択されるペプチドをコード化するＤＮＡ分子を含み、該ＤＮＡ分子は、選択されるペプチドの発現を読み取るために転写することができる。
【００９７】
本発明の第５の側面によると、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減、あるいは阻害の促進に使用する薬剤の製造用として先項に定義される、運搬系の使用が提供される。
【００９８】
本発明の第６の側面によると、上皮再生の促進に使用する薬剤の製造用として上記に定義される、運搬系の使用が提供される。
【００９９】
本発明の第７の側面によると、創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減、あるいは阻害を促進する方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする患者に第９の側面に定義されるような治療有効量の運搬系を投与するステップを含む。
【０１００】
本発明の第８の側面によると、上皮再生を促進する方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする患者に第９の側面に定義されるような治療有効量の運搬系の投与するステップを含む。
遺伝子コードの縮重により、本発明に基づく使用に適した活性剤をコード化する核酸配列は、その機能的変異体を提供するために、それによってコード化される生成物の配列に実質的に影響を与えることなく、変化または変更されてもよいことは明らかである。配列認識番号３、５、７、９、または１１により定義されるペプチドをコード化するために使用してもよい、考えられる核酸の配列は、当業者に容易に明らかとなり、当業者は、配列認識番号４、６、８、１０、または１２としてそれぞれ提供される実施例に言及することができるだろう。
【０１０１】
本発明による運搬系は、創傷で、ほとんどの従来の運搬系より長期間に渡り、本発明の活性剤の持続レベルを達成するために、非常に適している。創傷治癒の加速および／または瘢痕化の阻害を促進するために適した本発明の活性剤は、本発明の第４の側面に開示されるＤＮＡ分子で変換された創傷部位の細胞から、継続的に発現されてもよい。従って、本発明の活性剤が生体内で非常に短い半減期を有するとしても、薬剤の治療有効量は、治療される組織から継続的に発現されてもよい。
さらに、本発明の運搬系を、創傷に接触する軟膏またはクリームなどに要求される従来の賦形薬を必要とすることなく、ＤＮＡ分子（および、従って本発明の活性剤）を提供するために使用してもよい。
【０１０２】
本発明の運搬系は、好ましくは、配列認識番号３、５、７、９、１１、または１１から成る群により定義されるペプチド、あるいはそのようなペプチドのフラグメントまたは誘導体を生成するために（運搬系が患者に投与される際に）発現することができるＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子は、組み換えベクターを形成するために、適したベクターの中に包含されてもよい。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミッド、またはファージであってもよい。そのような組み換えベクターは、ＤＮＡ分子で細胞を変換するための本発明の運搬系において、非常に有用である。
また組み換えベクターは、その他の機能要素を含んでもよい。例えば、組み換えベクターは、ベクターが細胞の核を自発的に複製するように設計されてもよい。この場合、ＤＮＡの複製を誘発する要素が組み換えベクター内に要求される場合がある。あるいは、組み換えベクターは、ベクターおよび組み換えＤＮＡ分子を細胞のゲノムに組み込むように設計されてもよい。この場合、標的組み込み傾向のある（例えば、相同的組み換えによって）ＤＮＡ配列は、好ましい。また組み換えベクターは、クローンプロセスにおける選択可能な指標として使用される場合がある遺伝子のＤＮＡコーディングを有してもよい。
【０１０３】
また組み換えベクターは、要求に応じて、遺伝子の発現を制御するプロモータまたはレギュレータをさらに含んでもよい。
ＤＮＡ分子は、（必ずしもというわけではないが）治療を受けている対象の細胞のＤＮＡに組み込まれる１つであってもよい。未分化細胞は、安定して変換され、遺伝子組み換えされた娘細胞の生成を誘導してもよい。この場合、例えば、特定の転写調節因子、遺伝子活性剤、またはより好ましくは誘導プロモータを用いる対象内の発現調節が要求され、具体的に創傷で発見されるシグナルを受けて、遺伝子を転写する。あるいは、運搬系は、治療を受けている対象内の分化した細胞の不安定または一時的な変換を行うように設計されてもよい。この場合、形質転換細胞が死ぬ、またはタンパク質の発現を停止する際（理想的には、瘢痕化の軽減と同時に創傷治癒の加速の促進が効果をもたらす際）、ＤＮＡ分子の発現が停止するため、発現調節は、それほど重要でない場合がある。
【０１０４】
運搬系は、ベクターに組み込まれることなく、対象にＤＮＡ分子を提供してもよい。例えば、ＤＮＡ分子は、リポソームまたはウイルス粒子内に組み込まれてもよい。あるいは、適した方法、例えば、直接エンドサイトーシス摂取により、ＤＮＡ分子「単体」が対象の細胞に挿入されてもよい。
ＤＮＡ分子は、トランスフェクション、感染、顕微注入、細胞融合、原形質融合、または高速弾道衝撃により、治療を受ける対象の細胞に移行されてもよい。例えば、コーティングされた金粒子、ＤＮＡ分子を含むリポソーム、ウイルスのベクター（例えば、アデノウイルス）による弾道トランスフェクション、および局所または注射により、直接創傷にプラスミドＤＮＡを塗布することによって直接ＤＮＡ摂取を提供する方法（例えば、エンドサイトーシス）により移行してもよい。
【０１０５】
本発明の活性剤の細胞の発現は、創傷の周辺の無傷の領域の縁部の細胞によって、または治療のために創傷に移植された細胞（例えば、創傷治癒反応に関係する培養内生または外生細胞）による場合がある。
創傷治癒の加速および／または瘢痕化の予防、軽減、あるいは阻害を促進するために治療的に導入される細胞は、それらが本発明の活性剤のレベルの向上を発現し、そして創傷した領域に導入されるように、生体外で操作されてもよいことが理解されたい。そのような細胞は、好ましくは、創傷治癒の促進に使用される人工皮膚または代替皮膚の調合または製造に使用するための生体外で培養された細胞である。いずれの適した細胞を使用することができることが理解し得るが、より好ましくは、細胞は、自己細胞であってよい。
【０１０６】
従って、本発明の第９の側面において、本発明の活性剤を発現するために誘発される細胞を含む薬剤が提供される。
本発明の活性剤の細胞の発現の誘発は、本発明に基づく使用に適した活性剤の発現を生じる核酸を細胞に組み込むことにより、影響を受ける。
【０１０７】
本発明は、以下の実験手順および研究、ならびに添付図面に関して、例証としてさらに記載する。
表１は、アルファヘリックス形成へのアミノ酸残基の関与傾向を示す数値を示す。
表２は、本発明の変異ＴＧＦ−３ｓに関して使用される用語の詳細を定める。
表３は、本発明の野生型ＴＧＦ−β３の再変性効果を定める。
表４は、細胞増殖阻害アッセイで評価される野生型ＴＧＦ−β３とＧｌｙ６３−Ａｌａ（本発明のＴＧＦ−β３タンパク質）を比較する。
表５は、生体内の創傷治癒研究に使用される試薬の濃度を定める。
表６は、生体内の創傷治癒研究に使用される試薬の濃度を定める。
特に関心のある配列の詳細は、セクション「配列情報」で提供する。
【０１０８】
実験手順および結果
１  本発明の第１および第２の側面による、ＴＧＦ−β３の作成、生成、リフォールディング、ならびに精製
１．１  ｃＤＮＡの作成
ヒト切開創傷の総ＲＮＡ（創傷後５日目に採取）をＤＮＡ−Ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、いかなる汚染ＤＮＡを除去した。総ＲＮＡをテンプレートとして使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＧＦベータ−３ｃＤＮＡが作成した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＱＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔの１−Ｓｔｅｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを調製した。１マイクログラムのＲＮＡを、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＱＲＴ−ＰＣＲバッファ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｌμＬのＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニット、０．４μＭのセンスプライマー（５′ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＧＣ  ３′）、０．４μＭのセンスプライマー（５′−ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  Ｃ  ３′）を含む５０μＬの溶液に添加した。反応物をサーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）に置き、４５℃で３０分間、９５℃で１０分間、そして９５℃で３０秒間を４０サイクル、６５℃を１分間、および７２℃を１分間の条件下で実行した。７２℃の最終工程は１０分間。ＰＣＲ試料を２％（ｗ／ｗ）のアガロースゲル上で進行させ、結合サイズを検証し、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。
【０１０９】
１．２  プラスミドの構成
ｐＢＲ３２２ベクターからｐＥＴ−３ｄベクターを抽出し、ＬａｃＵＶ５制御下のＴ７プロモータおよびアンピシリン耐性標識遺伝子を含有させる。ＴＧＦ−ベータ３ｃＤＮＡフラグメント（セクション３．２で作成した）を、ｐＥＴ−３ｄにＮｃｏ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位（５′−３′それぞれに）サブクローニングした。結果として生じる連結反応は、ＸＬ１０Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと変化し、コロニーＰＣＲ分析を実施して、挿入部分を含むクローンを見つけた。最終クローンを増殖させ、Ｑｉａｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、プラスミドＤＮＡを水中に抽出した。プラスミドを配列し、Ｔ７プロモータプライマー（５′−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３′およびＴ７ターミネータプライマー（５′−ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ−３′）を使用して検証した。
【０１１０】
１．３  部位特異的変異
セクション１．２の「野生型」ＴＧＦ−ベータ３構成を部位特異的変異させ、ＴＧＦ−ベータ３変異タンパク質の２つの変異構成コーディングを作成する。構成／変異という用語およびヌクレオチド配列の変更を表２に要約する。変異が起こったヌクレオチドの位置を配列情報セクションに示す。
生体外部位特異的変異手順は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）  Ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットに基づき、１００ｎｇのプラスミド（セクション１．２の）を、２．５μＬの１０ｘＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファ、Ｑｕｉｃｋ溶液、ｌ００ｎｇのＭｕｔａｇｅｎｉｃプライマー、１ｍＬのｄＮＴＰミックス、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含み、最終容量２．５ｍＬのものに２倍の蒸留水を加えた溶液に添加した。反応物をサーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ  ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）に置き、９５℃で１分間、９５℃で１分間を３０サイクル、５５℃で１分間、および６５℃の最終工程を２分間の条件で実行した。温度サイクリングが完了すると、反応物を氷上に２分間置き、温度を３７℃未満に低下させた。各反応物に１μＬのＤｐｎｌ制限酵素（１０Ｕ／μＬ）を添加し、完全に混合した。反応混合物を遠心分離機にかけ（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｂｉｏｆｕｇｅで１０，０００ｒｐｍで１分間）、３７℃で培養し、親ｄｓ−ＤＮＡを消化した。１〜５μＬのＤｐｎｌで処理された、各変異反応物のＤＮＡを４５μＬのＸＬＩ−Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および２μＬのβ−ＭＥミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に添加した。懸濁液を混合し、氷上で３０分間培養した。懸濁液を水浴に３０秒間、４２℃まで加熱した。混合物を氷上でさらに２分間培養した。０．５ｍＬの予熱（４２℃）ＮＺＹ＋培養液を各細胞懸濁液に添加した。変換培養液を２２５〜２５０ｒｐｍで振盪しながら１時間インキュベートした。１μＬ、１０μＬ、および１００μＬの各変異反応物の変換培養液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）、８０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−イノドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２０ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ）を含むＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で１８時間インキュベートした。青コロニーを変異プラスミドに包含した。各変異型の単一コロニーから寒天をはぎ取り、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地を植菌を植菌するために使用した。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、プラスミドを単離した。プラスミドを配列し、ｐＱＥおよびｐＱＥ  Ｒｅｖプライマーを使用して的確な変異であるかを検証した。
【０１１１】
１．４  変換およびクローニング
１０μＬ（１μｌ当り５０ｎｇ）のプラスミドＤＮＡ（セクション１．２および１．３の）を１ｍＬの低温（４℃）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  ＳｉｎｇｌｅｓＴＭ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に添加した。２０分後、４２℃の水浴で３０秒間培養することにより、細胞に熱ショックを与えた。１００μＬのＰｓｉ媒体を細胞／プラスミド混合物に添加し、３７℃で９０分間振盪した。５０μｌおよび１００μｌのアリコートを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（Ｓｉｇｍａ）の上に置き、３７℃で１８時間インキュベートした。単一コロニーを培養し、冷凍細胞ストックを作成し、−８０℃で保存した。正確な変換を検証するために、細胞からプラスミドＤＮＡを分析した。
【０１１２】
１．５  発現
冷凍変換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（セクション１．４の）のアンプルを回収し、ＬＢ媒体および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むバッフル付三角フラスコで植菌した。振盪しながら３７℃で一晩、フラスコをインキュベートした。５ｍＬのこの一晩培養物を２リットルの三角フラスコ（５００ｍＬのＬＢ媒体／および１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）に添加し、振盪しながら３７℃で培養した。２ｍＬの培養液試料を１時間ごとに取り出し、増殖およびＴＧＦ−ベータ３「野生型」ならびに変異タンパク質発現（誘発後）を監視した。増殖は、波長６００ｎｍでの分光光度計上の吸光度を測定することによって測定した。吸光度０．６Ａｂｓが測定された時、最終濃度１ｍＭまでイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ）を添加することによって、「野生型」および変異ＴＧＦ−ベータ３タンパク質を発現するように細胞を誘発した。培養物をさらに４時間培養した。０．５ｍＬの培養液試料を遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｂｉｏｆｕｇｅで１０，０００ｒｐｍで１０分間）で沈殿し、上澄みを廃棄した。沈殿物を５０μＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動（ＰＡＧＥ）試料バッファに再懸濁し、９５℃の水浴で１０分間加熱した。１０μＬの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに入れた。Ａ．Ｔ  Ａｎｄｒｅｗｓ（１９８６）に記載されるように、Ｈｏｅｆｅｒ（登録商標）Ｍｉｇｈｔｙ  Ｓｍａｌｌ  ＳＥ２４５Ｄｕａｌ  Ｇｅｌ  Ｃａｓｔｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー・ブルー染色を実行した。ゲルは、厚さ１ｍｍで１５％（ｖ／ｖ）のポリアクリルアミドゲルを含んでいた。
【０１１３】
１．６  細胞の採取および封入体の単離
５０００ｇを１０分間、４３１５ロータを有するＲｏｔｏｒＨｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔｉｎａ４６Ｒ遠心分離機で５０００ｇを１０分間遠心分離することによって、セクション１．５の細胞を沈殿した。４℃で細胞破壊および不溶性（封入体）ＴＧＦ−ベータ３タンパク質の再生を実行した。細胞を５０ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、ｐＨ８．３の１０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を、Ｓａｎｊｏ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０を使用する超音波処理によって破壊した０．２％（ｗ／ｗ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を懸濁液に添加し、１時間撹拌した。１５，０００ｇの懸濁液を４０分間遠心分離した。１２、０００ｇのｐＨ８．３の１０ｍＭのＥＤＴＡを４０分間遠心分離する前に、沈殿物を５０ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌに再懸濁した。
【０１１４】
１．７  封入体の可溶化
セクション１．６の堆積物を４０ｍＬのＳＭ尿素１％（ｗ／ｗ）ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に再懸濁し、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｄｉａｘ９００ホモジナイザーで破壊した。懸濁液をカバーし、１時間撹拌して封入体を溶解性にし、ＴＧＦ−ベータ３「野生型」および変異タンパク質を減少させ、それらをモノマー形態にした。そして、１５，０００ｇの懸濁液を３０分間遠心分離した。上澄みを透析し、バッファを８Ｍの尿素（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）から１０％（ｖ／ｖ）の酢酸に交換した。バッファが１０％（ｖ／ｖ）の酢酸に交換される際、８Ｍの尿素に対して溶解性であるＥ．ｃｏｌｉタンパク質を溶液から沈殿させた。１％（ｗ／ｗ）ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）を懸濁液に添加し、カバーし、緩衝交換中にＴＧＦ−β３モノマー間に形成される場合があるいかなるジスルフィド結合を減少させるために、３０分間撹拌した。溶解性および非溶解性タンパク質を分離するために、懸濁液１２，０００ｇを４０分間遠心分離した。尿素の可溶化および緩衝交換工程から試料を取り出し（酢酸溶解性および非溶解性物質）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。
【０１１５】
１．８  限外濾過
セクション１．７の１０％（ｖ／ｖ）の酢酸溶解性物質を、Ｖｉｖｏｆｌｏｗ５０（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上の１０ｋＤａの薄膜を使用して、限外濾過した。この目的は、１０％（ｖ／ｖ）の酢酸懸濁液を３ｍＬまで削減し、低分子量タンパク質（＜１０ｋＤａ）を除去することであった。
【０１１６】
１．９  ゲル精製
１０％（ｖ／ｖ）の酢酸中のセクション１．７の試料を、Ｈｉｐｒｅｐ２６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００高解像度カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、３２０ｍＬ）上で流量１．５ｍＬ／分でクロマトグラフにかけた。モノマー変性ＴＧＦ−ベータ３（１００分から１４０分の間に溶出した）を含む分留が溜まった。
【０１１７】
１．１０  凍結乾燥
変性モノマーＴＧＦ−ベータ３を含む、溜まった分留を、ＩＥＣ  Ｌｙｏｐｒｅｐ−３０００凍結乾燥器を使用して凍結乾燥し、酢酸および水を試料から除去した。
【０１１８】
１．１１  リフォールディング
セクション１．１０の凍結乾燥したモノマーＴＧＦ−ベータ３を、最終ＴＧＦ−ベータ３濃度である１０ｍｇ／ｍＬが達成されるまで、１０ｍＭのＤＴＴを含む８Ｍの尿素内で可溶化した。ＴＧＦ−ベータ３溶液を滴下により添加し、一方、溶液（１Ｍ３−（−ピリジノ）−ｌ−プロパンスルホン酸（ＮＤＳＢ−２０１）、２０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）、２％（ｗ／ｖ）の３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、１ＭのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｗ／ｖ）の還元グリタチオン（ＧＳＨ、Ｓｉｇｍａ）、０．０５ＭのＴｒｉｚｍａ（登録商標）Ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ９．３）を、最終濃度である０．２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３が達成されるまで、撹拌してリフォールディングした。濃縮ＮａＯＨ／ＨＣｌを使用して、ｐＨを９．２〜９．４の範囲に維持することが重要である。モノマーＴＧＦ−ベータ３が酸化できるようにするために、穴のあいたパラフィルムで溶液をカバーし、８℃で撹拌した。１４４時間後、溶液１５，０００ｇを４０分間遠心分離し、形成された沈殿物を除去し、氷酢酸でｐＨをｐＨ３．５に調節した。ダイマーＴＧＦ−ベータ３を含む上澄みは、ジスルフィドを結合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）およびウエスタンブロット法により判断された。セクション２．１に記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。
ウエスタンブロット法では、厚さ１ｍｍ、１５％（ｖ／ｖ）のポリアクリルアミドゲル上に試料を置く。電気泳動が完了後、取扱説明書に概説されるように、ゲル内のタンパク質を、電気泳動により、ＴＥ２２ウエスタンブロット装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してニトロセルロース紙（Ｓｉｇｍａ）に移行した。そしてニトロセルロース上の非特異的結合部位を、リン酸緩衝生理食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で、ブロッキングバッファ（５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳、１％（ｖ／ｖ）のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓｉｇｍａ））でブロックした。ニトロセルロースを洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄した。ニトロセルロースを、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で１：５００に希釈した一次抗体（ＭＡＢ６４３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて、ＰＢＳ内で１時間培養した。１：３０００で０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で希釈した２次抗体ヤギ抗マウス抗体（Ａｂｅａｍ）を用いて、ＰＢＳ内で１時間培養する前に、ニトロセルロースを再洗浄した。抗原−抗体複合物を視覚化するために、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加前に、ニトロセルロースを最終洗浄した。ニトロセルロースを現像剤、固定液、および停止液に浸す前に、暗室でＸ線写真を露光した。そしてニトロセルロースを乾燥した。ＴＧＦ−ベータ３「野生型」および変異モノマータンパク質のリフォールディングは、様々な程度のダイマー形成を示した。その他の不適切にリフォールドされた、または非ダイマーＴＧＦ−ベータ３タンパク質から適切にリフォールドされたダイマーの再生率を表３に示す。
興味深いことに、ＴＧＦ−ベータ３タンパク質のアルファヘリックス内のアミノ酸置換は、リフォールディング収率（ダイマー形成）に最大の影響を生じた。グリシンをアルギニンで置換することによるアルファヘリックスの安定化は、リフォールディング収率を２０％から５０％に向上した。逆に、グリシンをプロリンで置換することによるアルファヘリックスの破壊は、非常に低いダイマー形成率という結果となった。これは、アルファヘリックスがＴＧＦ−ベータ３分子の適切なリフォールディングにおいて、重要な役割を果たすことを示す。「塩架橋」の形成に関連するアミノ酸の置換は、リフォールディング収率に影響しなかった。
【０１１９】
１．１２  疎水相互作用クロマトグラフィー
セクション１．１１の再生溶液を、Ｖｉｖｏｆｌｏｗ５０（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上の１０ｋＤａ（分画分子量）の薄膜を使用する限界濾過により、５０ｍＬまで濃縮した。２Ｍの硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）および１０％（ｖ／ｖ）の酢酸を含む溶液で再生溶液を１：１で希釈した。フェニル−セファロースＦｌａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で充填した２ｍｌのＢｉｏｒａｄカラムをバッファＡ（１．０Ｍの硫酸アンモニウムおよび１０％（ｖ／ｖ）の酢酸）で平衡化した。２０ｍＬの希釈した再生溶液を、流量１ｍＬ／分（手順全体を通してこの流量が使用された）でこのカラムに加えた。そして、２８０ｎｍでの吸光度測定値がベースライン値（１０ｍＬ）に達するまで、バッファＡ内でカラムを洗浄した。１００％のバッファＢ（１０％（ｖ／ｖ）の酢酸、３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール）をカラムに加えた。モノマーおよびダイマーの両方の型のＴＧＦ−ベータ３タンパク質を含む第１のピークにまとめられた（図１参照）。
【０１２０】
１．１３  陽イオン交換クロマトグラフィー
モノマーからダイマーＴＧＦ−ベータ３タンパク質を単離するために、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用した。１０％（ｖ／ｖ）の酢酸、３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールを含むバッファＡを用いて、２ｍＬのＵＮＯ−Ｓ１カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を平衡化した。セクション３．１２の溜まった分留を、流量１ｍＬ／分でＵＮＯ−Ｓ１カラムに加えた。そして、２８０ｎｍでの吸光度測定値がベースライン値（５分）に達するまで、バッファＡ内でカラムを洗浄した。５分間に渡り直線勾配を行い、最終的に６０％のバッファＡおよび４０％のバッファＢ（１０％（ｖ／ｖ）の酢酸、３０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール、および１ＭのＮａＣｌ）の混合物にした。さらに１５分間、このバッファ混合物を加え続けた。試料注入１０分後にカラムからモノマーＴＧＦ−ベータ３が溶出した。第２の直線勾配を５分間に渡り行い、最終的に１００％のバッファＢとなり、その状態を１０分間維持した。試料注入３０分後にカラムからダイマーＴＧＦ−ベータ３が溶出した（図２参照）。
【０１２１】
１．１４  限外濾過／ディアフィルトレーション
セクション１．１３の精製モノマーおよびダイマーＴＧＦ−ベータ３分子を含む分留を限外濾過／ディアフィルトレーションし、バッファを２０ｍＭの酢酸、２０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと交換し、試料を〜１０ｍｇ／ｍＬ（ＴＧＦ−ベータ３濃度は、紫外線分光分析により測定される）に濃縮した。境界１０ｋＤａを有するＶｉｖｏｆｌｏｗ５０（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、バッファを交換し、試料を濃縮した。
【０１２２】
２  本発明のＴＧＦ−β３ｓ生体外特性付け
２．１  本発明の精製ＴＧＦ−β３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
精製ＴＧＦ−ベータ３変異タンパク質（セクション１．１４の）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、純度および分子量を測定した。セクション３．１４のＴＧＦ−ベータ３変異体試料の低ｐＨのため、タンパク質脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、バッファをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファに交換した。３μｇの精製ＴＧＦ−ベータ３変異タンパク質（還元および非還元試料）、３μｇの「野生型」ＴＧＦ−ベータ３陽性対照（還元および非還元）、および１０μＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋ１２分子量標準をポリアクリルアミドゲル（１０％〜２０％（ｖ／ｖ）のアクリルアミド勾配）に置いた。電気泳動が完了すると、ゲルをクマシー・ブルーで染色した。
予想通り、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３およびＧｌｙ６３−Ａｌａ変異タンパク質は、ゲル上で同一位置に至った（還元試料においては、〜１３ｋＤａ、非還元試料においては、２５ｋＤａ）。興味深いことに、非還元ゲルでＧｌｙ６３−Ｐｒｏ変異タンパク質結合は１つも検出されなかったが、還元ゲルでは検出された。Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏのリフォールディング効率が非常に低い（＜１％）ため、クマシーで検出可能なレベルを下回る（＞１μｇ）、複数のリフォールディング種が生成された。しかしながら、これらの種が減少した場合、還元Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏモノマーの濃度が１μｇクマシー染色検出限界を上回り、従って、Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏを還元ゲル上に見ることができる。還元Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏタンパク質結合の位置付けは、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３との結合よりわずかに高い。これは、プロリンで置換したグリシン６３がＧｌｙ６３−Ｐｒｏ変異タンパク質を「野生型」ＴＧＦ−ベータ３より大きな分子にすると予想された（図３参照）。
【０１２３】
２．２  本発明のＴＧＦ−β３の生物活性をその野生型ＴＧＦ−β３と比較する細胞増殖阻害アッセイ
細胞増殖阻害アッセイ（Ａ  Ｍｅａｇｅｒ、１９９１）は、ＴＧＦ−ベータ分子の生体外生物活性試験である。比色分析アッセイは、ミンク肺上皮細胞の増殖におけるＴＧＦ−ベータ分子の阻害効果に基づく。１×１０４のＭＬＥＣ細胞／ｍＬ、および完全培地（ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．０１ＭのＨｅｐｅｓバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−アルギニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−アスパラギン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および５％の仔牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含む１００μＬの細胞懸濁液を、９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加した。３７℃で一晩培養後、５％のＣＯ２、１００μＬの逐次希釈した（１０ｐｇ／ｍＬから５００ｐｇ／ｍＬ）ダイマーＴＧＦ−ベータ３変異体試料（セクション３．１４の）をプレートに添加した。対照ウェルに２００μＬの完全培地および１０％（ｖ／ｖ）の０．２５Ｍの麦芽糖を入れた。プレートをさらに１２０時間インキュベートし、５０μＬの２ｍｇ／ｍＬの３−［４、５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（チアゾイルブルー（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。プレートをさらに４時間インキュベートし、媒体を取り出した。１００μＬの０．０５ＭのＨＣｌ（ＢＤＨ）、純イソプロパノール（ＢＤＨ）を各ウェルに添加し、得られた可溶化されたホルマザンは、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０）を使用して、５７０ｎｍと定量化された。
本発明のＴＧＦ−β３であるＧｌｙ６３−Ａｌａは、０〜５００ｐｇ／ｍＬを上回る濃度のＭＬＥＣ細胞に対して、阻害効果を有した。表４に見られるように、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３が２６ｐｇ／ｍＬのＩＣ５０のを有するのに対して、Ｇｌｙ６３−Ａｌａ変異タンパク質は、３４ｐｇ／ｍＬのＩＣ５０を有した。
【０１２４】
２．３  アミノ酸配列分析
セクション３．１４の精製した「野生型」および変異ＴＧＦ−ベータ３試料５０マイクロリットルを真空乾燥し、そして、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３および１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルを含む溶液２０μＬに再懸濁した。シークエンシンググレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μｇを、供給される再懸濁液バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ）キット１０μＬに再懸濁し、トリプシン濃度を２μｇ／μＬにした。そして、これを５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３および１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルに希釈し、最終トリプシン濃度０．２μｇ／μＬにした。トリプシンを「野生型」および変異ＴＧＦ−ベータ３タンパク質と１：２０（ｗ／ｗ）の比率で添加することにより、消化を一晩実施した。最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）までギ酸（Ｆｌｕｋａ）を添加することにより、消化を抑制した。試料を１ｐｍｏｌｅ／μＬまで希釈した。そして、ナノフローＲＰＬＣ−ＭＳ（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｑ−ＴｏＦ２とオンラインのＤｉｏｎｅｘ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）のプロセスで、ペプチドを分析した。５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルから５５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの４５分の勾配を利用して、７５μｍのＣ１８カラム（ＬＣ  ｐａｃｋｉｎｇｓ）に対してクロマトグラフィーを実施した。ＭＳ分析は、データ依存分析形式をとり、ＬＣから溶出するペプチドイオンのｍ／ｚを測定し、ＭＳ−ＭＳ分析に適したイオンを選択し、配列情報をレンダリングするために、フラグメントペプチドイオンに対して、衝突誘発分解を採用した。
【０１２５】
３  本発明のＴＧＦ−β３の生体内特性付け
成人雄ラットの切開および切除創傷治癒（創傷後３日間）ならびに瘢痕化（創傷後７０日間）におけるリフォールディング活性「野生型」および変異ＴＧＦ−ベータ３タンパク質の生物学的作用を調査した。
３．１  創傷治癒における本発明の野生型ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β３の作用比較
雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）をハロタンで麻酔し、背中を剃る。図４に示されるように、標準テンプレートを使用し、皮膚マーキングインクで創傷位置に印をつけた。０．２５Ｍの麦芽糖（Ｓｉｇｍａ）、０．００２％（ｖ／ｖ）の酢酸、および０．３３％（ｖ／ｖ）のイソプロピルアルコールを含む無菌賦形剤バッファに、表４に記載される濃度まで試料を希釈した。すべての試料は、濾過により、無菌の内毒素フリーにした。各治療グループに４匹のラットを使用した。各治療グループ（表４）の試料１００μＬを印を付けた創傷位置ＡおよびＢに皮内注射した（治療を受けていない（未投与）ラットを除く）。創傷位置ＡおよびＢでパンチ生検を行った。すべての動物を別々に檻に入れた。２４時間後、動物に２回目の試料の投与を行った。３日後、創傷の写真を撮り、巨視的ビジュアルアナログ採点法（Ｂｅａｕｓａｎｇ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９８から変更）を使用して分析した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ／Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ試験を使用して、データの統計分析を行った。ｐ＜０．０５の数値は、有効だとみなす。
【０１２６】
３．２  野生型ＴＧＦ−β３または本発明のＴＧＦ−β３で治療した３日目の切開創傷の創傷治癒の巨視的ビジュアルアナログスケールを使用した評価
３日後に巨視的ビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）を使用して、切開創傷を調べた。この１０点等級において、０点は、創傷がかなり治癒したことを示し、１０点は、創傷がほとんど治癒していないことを示す。
野生型ＴＧＦ−ベータ３の５０ｎｇ／１００μＬまたは１００ｎｇ／１００μＬによる治療は、未治療（未投与対照）と比較し、ＶＡＳの点を減少する（すなわち、創傷の巨視的外観を改善）。１００ｎｇ／１００μＬの投与による治療は、未治療（未投与対照）と比較し、創傷の外観を大幅に改善（ｐ＜０．０５）、すなわち治癒を促進した。
５０ｎｇ／１００μＬまたは１００ｎｇ／１００μＬのＧｌｙ６３−Ａｌａ変異体による治療は、未治療（未投与対照）と比較し、ＶＡＳ点数を減少し、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３で治療した創傷と同程度である、すなわち、治癒を悪化しない。
５０ｎｇ／１００μＬまたは１００ｎｇ／１００μＬのＧｌｙ６３−Ｐｒｏ変異体による治療は、未治療（未投与対照）と比較し、ＶＡＳ点数を減少し、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３で治療した創傷と同程度である、すなわち、治癒を悪化しない。
【０１２７】
３．３  野生型および変異ＴＧＦ−ベータ３タンパク質で治療した３日目の切除創傷の創傷幅の顕微鏡評価
３日後に、切除創傷幅を顕微鏡で評価した。ＴＧＦ−ベータ３「野生型」および変異タンパク質で治療したすべての創傷は、プラセボおよび未治療（未投与）対照と同程度の創傷幅を示し、ＴＧＦ−ベータ３変異タンパク質は、治癒において副作用を有さないことを確認した（図６）。
【０１２８】
３．４  「野生型」および変異ＴＧＦ−ベータ３タンパク質の創傷瘢痕化における作用（創傷７０日目）
雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）をハロタンで麻酔し、それらの背中を剃る。図７に示されるように、標準テンプレートを使用し、皮膚マーキングインクで創傷位置に印をつけた。０．２５Ｍの麦芽糖（Ｓｉｇｍａ）、０．００２％（ｖ／ｖ）の酢酸、および０．３３％（ｖ／ｖ）のイソプロピルアルコールを含む無菌賦形剤バッファに、表５に概要される濃度まで試料を希釈した。すべての試料は、無菌の内毒素フリーであり、ピロゲンフリーであった。各治療グループに４匹のラットを使用した。各治療グループ（表６）の試料１００μＬに印を付けた創傷位置ＡおよびＢに皮内注射した（治療を受けていない（未投与）ラットを除く）。創傷位置ＡおよびＢに、１１番の手術用メスで長さ１ｃｍの全層切開を行った。すべての動物を別々に檻に入れた。２４時間後、動物に２回目の試料の投与を行った。７０日後、瘢痕の写真を撮り、巨視的ビジュアルアナログ採点法（Ｂｅａｕｓａｎｇ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ  １９９８から変更）を使用して分析した。創傷を摘出し、ワックスブロックに加工する前に、１０％の酸緩衝生理食塩水中に置いた。ワックスブロックを５μＭの連続切片に切断し、スライドに置いた。スライドをＭａｓｓｏｎｓ  ＴｒｉｃｈｉＯｉＴｉｅで染色し、分析した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ／Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ試験を使用して、データの統計分析を行った。ｐ＜０．０５の数値は、有効だとみなす。
【０１２９】
３．５  巨視的ＶＡＳを使用した７０日目の切開創傷の評価
７０日後に巨視的ＶＡＳ法を使用して、切開創傷を調べた。１０点はひどい瘢痕を示し、０点は、正常な皮膚を示す（図８）。創傷７０日目のＶＡＳ分析は、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３（投与量５０ｎｇ／１００μＬおよび１００ｎｇ／１００μＬ）は、プラセボ治療および投薬されていない創傷と比較し、瘢痕化を軽減したことを示す。両方の投与量に対して、この軽減は、プラセボ治療創傷と比較し、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。
Ｇｌｙ６３−Ａｌａ変異体（投与量５０ｎｇ／１００μＬおよび１００ｎｇ／１００μＬ）は、プラセボ治療および未投与の創傷と比較し、瘢痕化を軽減した。投与量５０ｎｇ／１００μＬに対して、この軽減は、プラセボ治療創傷と比較し、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。
Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏ（投与量５０ｎｇ／１００μＬおよび１００ｎｇ／１００μＬ）は、プラセボ治療および未投与の創傷と比較し、瘢痕化を軽減した。
Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ変異体（投与量５０ｎｇ／１００μＬおよび１００ｎｇ／１００μＬ）は、プラセボ治療および未投与の創傷と比較し、瘢痕化を軽減した。投与量５０ｎｇ／１００μＬに対して、この軽減は、プラセボ治療創傷と比較し、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。
投与量５０ｎｇ／１００μＬおよび１００ｎｇ／１００μＬでの２倍のセリン変異体（Ｇｌｕｌ２−ＳｅｒおよびＡｒｇ５２−Ｓｅｒ）は、プラセボ治療および未投与の創傷と比較し、瘢痕化を軽減した。
【０１３０】
３．６  ７０日目の切開創傷の巨視的評価
ＶＡＳ採点法を使用して示される巨視的作用を、組織学的分析により確認した。組織学的スライドの例示的な実施例を図１２および１３に示す。組織学的顕微鏡写真は、本発明に基づくＴＧＦ−β３タンパク質の添加は、「野生型」ＴＧＦ−β３で見られるものと同等の改善を生じることを示す。本発明のタンパク質は、周辺の正常な皮膚と同様の形態および組織を有するように、瘢痕内にコラーゲン繊維を生じる。
【０１３１】
４  結論
アルファヘリックス（アミノ酸残基５８〜６７の間）の柔軟性は、リフォールディング中の機能的な、適切にリフォールドされたダイマーＴＧＦ−ベータ３の形成に影響する。グリシン６３をアラニンで置換することによってアルファヘリックスを安定化することは、リフォールディング効率を大幅に向上する一方、グリシン６３をプロリンで置換することによってアルファヘリックスを不安定化することは、逆効果を有する。
グリシン６３をアラニンまたはプロリンで置換することは、「野生型」ＴＧＦ−ベータ３と比較して、創傷治癒に変化を与えない。
Ｇｌｙ６３−ＡｌａおよびＧｌｙ６３−Ｐｒｏは、プラセボ治療および未治療創傷と比較し、瘢痕化を軽減する。
「塩架橋（Ａｒｇ５２とＧｌｕｌ２との間）」の形成は、ＴＧＦ−ベータ３のリフォールディング効率に変化を与えない。
Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒおよび２倍のセリン変異体は、プラセボ治療および未治療創傷と比較し瘢痕化を軽減する。
【０１３２】
５．  本発明に基づくモノマーまたはダイマーＴＧＦ−β３を生成するための好ましい手順
適切にリフォールドされた、本発明に基づくモノマーＴＧＦ−ベータ３の作成に好ましい条件は、以下の通りである。
０．７Ｍの２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、０．４ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
３０ｍＭのタウロデオキシコール酸、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
１ＭのＮＤＳＢ−２０１、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
３０ｍＭのタウロデオキシコール酸と１ＭのＮＤＳＢ−２２１、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
３０ｍＭのタウロデオキシコール酸と０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、２ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
３０ｍＭのタウロデオキシコール酸、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、２ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
一般的に、本発明に基づくＴＧＦ−β３は、可溶化された、鎖がほどけた状態のモノマーＴＧＦ−β３を、
（ｉ）２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）またはその機能的アナログ、と、
（ｉｉ）低分子量スルフヒドリル／ジスルフィドレドックスシステム、とを含む溶液に添加するステップと、
溶液内の成長因子をダイマー生物活性ＴＧＦ−β３が形成されるまで培養するステップと、を備える方法により、ダイマー生物活性型にフォールディングされてもよい。
適切にリフォールドされた、本発明に基づくダイマーＴＧＦ−ベータ３の作成に好ましい条件は、以下の通りである。
０．７Ｍの２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）、０．４ｍＭの酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
３０ｍＭのタウロデオキシコール酸、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、０．４ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
３０ｍＭのタウロデオキシコール酸、０．７ＭのＣＨＥＳ、２ｍＭのＧＳＨ、２ｍＭのＧＳＳＧ、０．１２ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３、２〜８℃でｐＨ９．５。
【０１３３】
好ましい試験条件：
５．１  ベクタークローニングおよびホスト細胞変換
ｐＢＲ３２２ベクターからｐＥＴ−２４ｄベクターを抽出し、ＬａｃＵＶ５制御下のＴ７プロモータおよびカナマイシン耐性標識遺伝子を含有させる。
本発明のＤＮＡコーディングＴＧＦ−β３を、０．７５μＬのＮｃｏ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、０．７５μＬのＢａｍＨ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を１ＸのＢａｍＨ１バッファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、１５μＬの反応物（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ、Ｎｏｖａｇｅｎ）に３７℃で４時間消化してもよい。同一の方法で、１マイクロリットルのｐＥＴ−２４ｄプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）を消化してもよい。消化したｃＤＮＡおよび大きなプラスミドフラグメントを、アガロースゲル精製し、ＳｐｉｎＰｒｅｐゲルＤＮＡ抽出キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）により回収した。
精製ｃＤＮＡおよびプラスミドフラグメントをＴ４リガーゼキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して結紮する。結紮ｃＤＮＡ／プラスミドをＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）変換キット）に変換する。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬｕｒｉａ培養液（ＬＢ）寒天プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にめっきすることによって、形質転換細胞を選択した。制限消化および／または発現のために、適したクローンを選択する。
【０１３４】
５．２  生成物発現のためのクローンスクリーニング
クローンを反強度の「Ｔｅｒｒｉｆｉｃ培養液」（６ｇ／Ｌのフィトンペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１２ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２ｇ／Ｌのグリセロール（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、１．１６ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、６．２５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、ＱＳの蒸留水で１リットルにした）の振盪フラスコ培養物内で成長させ、１ｍＭのイソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＪＪＰＴＧ）を用いて、ＯＤ６００が０．６５から０．８５の間で指数増殖期を誘発させる。ＩＰＴＧ添加の３時間後に誘発後試料を取り出し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、生成物の誘発および発現を分析する。適したクローンの試料をＮｕＰ  ＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、１．０ｍｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、１２０ミリアンペア、２００ボルトでおよそ４０〜５０分間進行させ、そしてクマシー・ブルーで染色する。本発明に基づくＴＧＦ−β３の発現は、従って、これらの培養物内で誘発されてもよい。
【０１３５】
５．３  冷凍細胞ストック
クローンを振盪フラスコ内の半強度のＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液内でおよそ１ＯＤ６００まで成長させ、グリセロールを２０％（ｖ／ｖ）まで添加することによって、グリセロールストックとして保存する。１．２ｍＬの培養液を１２×２ｍＬのクライオバイタル（０．３ｍＬのグリセロールを含んだ）に等分し、−７０℃で保存した。
【０１３６】
５．４  ＴＧＦ−ベータ３遺伝子の配列確認
グリセロールを添加する前に、冷凍細胞ストックに使用した培養物の試料を取り出し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔを使用するプラスミドの単離に使用する。単離したプラスミドを配列し、Ｔ７プロモータプライマー（５′−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３′）およびＴ７ターミネータプライマー（５′−ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ−３′）を使用して検証する。
【０１３７】
５．５  種培養
選択された適切なクローンを、５００ｍＬのＨｙＳｏｙ媒体（１２ｇ／Ｌ  ＨｙＳｏｙ（Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、２４ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、および１０ｇ／Ｌのグリセロール（Ｓｉｇｍａ）、ならびに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する、２リットルのバッフルＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに接種する。フラスコを振盪しながら３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートし、ＯＤ５５０を測定するために、定期的に抽出する。培養物のＯＤが３．２１ＬＶｍＬに達した時（７時間後）、自己細胞培養液を使用して、１５０Ｌの発酵槽（可動範囲１００Ｌ）に種をまく。
【０１３８】
５．６  発酵
９００ミリリットルの細胞培養液（セクション３．６の）を使用して、９０Ｌのバッチ培養媒体（０．６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＫＨ２ＨＰＯ４、１．２５ｇ／ＬのＮＨ４ＳＯ４、１２ｇ／ＬのＨＹ−Ｓｏｙ、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、および１０ｇ／Ｌのグリセロール）を含む、１５０Ｌの発酵槽（ＷＨＥ）に植菌する。発酵作業パラメータを以下のように制御する。温度設定：３７℃、ｐＨ設定：７．０（４Ｎ水酸化アンモニウムおよび４Ｎリン酸を使用して維持する）、および溶存酸素（ＤＯ）を初期１００％に調節する。毎分、培地容量毎に対して、１つの空気量（ｖｖｍまたはｓｌｐｍ）が伴い、容器の上部圧力は７ｐｓｉであり、撹拌および空気流量は、それぞれ２００〜４００ｒｐｍであった。発酵設定パラメータを以下の優先事項に従いながら調節し、ＤＯが２０％を上回るように維持する。撹拌（最高４００ｒｍｐ）、給気（最大１．５ｗｉｎ）、酸素補給（最大３３．３Ｉｐｍ）、および背圧（最大１２ｐｓｉ）。プルロニックＬ−６１（２５％ｖ／ｖ）で泡立ちを制御した。培養物のＯＤが１０Ｕ／ｍＬに達した時、流量４５ｍＬ／分でグリセロールの供給（５０％ｖ／ｖ）を開始する。ＯＤが４０Ｕ／ｍＬに達した時、ＩＰＴＧの添加により、最終濃度０．２ｍＭまで細胞が誘発される。
【０１３９】
５．７  収穫
誘発の４時間後、発酵槽を１０℃まで冷却し、空気流量および撹拌を０．３ｖｖｍおよび１００ｒｐｍまでそれぞれ下げる。泡およびｐＨ制御を終了し、背圧を３ｐｓｉに調節する。Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  ＣＳＡ８連続遠心分離機による１０℃での連続遠心分離により、培養物を収穫する。遠心分離機を１５，０００ｒｐｍ、流量毎分３リットルで運転し、細胞スラリーを回収する。
【０１４０】
５．８  細胞溶解およびＩＢ回収
発酵細胞ペースト（セクション５．７の）を溶解バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｚｍａＢａｓｅ（Ｔｒｉｓ）、３．７ｇ／Ｌのエチレンジアミノテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、５８．４４ｇ／ＬのＮａＣｌ、および１０ｇ／ＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０１）で１：５に希釈し、手持ち型ホモジナイザーを使用して再懸濁する。再懸濁細胞ペーストを高圧ホモジナイザー（パラメータ：圧力１０，０００ｐｓｉｇ、４５０ｍＬ／分、および温度１５℃）に２回通過させる。そして、均質化した細胞溶解物を、４℃で５，０００ｘｇを２０分間、遠心分離する（バケット遠心分離機、固定角ロータ）。不溶性（封入体）ＴＧＦ−β３を残し、上澄みを廃棄する。手持ち型ホモジナイザーを使用して、封入体（ＩＢ）ペレットを洗浄バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｓおよび３．７２ｇ／ＬのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、遠心分離する（４℃で５，０００ｘｇを２０分間）。
【０１４１】
５．９  封入体の可溶化
セクション５．８の堆積物を可溶化バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｓ、１５．４ｇ／ＬのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および３６０．４ｇ／Ｌの尿素、ｐＨ８．０）で１：１０に希釈し、手持ち型ホモジナイザーを使用して再懸濁する。懸濁液をカバーし、室温で６０〜７５分間撹拌し、封入体を可溶化し、ＴＧＦ−β３をそのモノマー形態に還元する。２回目の６０〜７５分間の培養の前に、再懸濁したペレットのｐＨを、ＮａＯＨ／酢酸でｐＨ９．４〜９．６に調節する。
【０１４２】
５．１０  浄化／限外濾過およびディアフィルトレーション
セクション５．９の可溶化した物質を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で浄化し、濃縮し、ディアフィルトレーションを行う。予め調整された浄化ＴＦＦ薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  １０００ｋＤａ、再生セルロース、スクリーンＶ）を用いて、初期浄化および濃度を達成する。浄化したＴＧＦ−β３は、透過物内に集められる。限外濾過／ディアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ５ｋＤａ、再生セルロース、スクリーンＣ）に切り替え、そして６ディアボリュームの可溶化バッファ（６．１ｇ／ＬのＴｒｉｓ、１５．４ｇ／ＬのＤＴＴ、および３６０．４ｇ／Ｌの尿素、ｐＨ９．５）内でＴＧＦ−β３を洗浄する。
【０１４３】
５．１１  限外濾過／疎水相互作用クロマトグラフィー
選択されるリフォールディング溶液を限外濾過（薄膜は、フラットシートＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ５ｋＤａ、０．１ｍ２、再生セルロース、スクリーンであってもよい）により、５フォールドに濃縮する。そして、希釈バッファ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、２６４．２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１００ｇ／Ｌの酢酸、および２１０．７ｇ／Ｌの塩酸アルギニン、ｐＨ３．３）に１：１で希釈する前に、氷酢酸を使用して、濃縮したリフォールディング物質のｐＨを２．５〜２．８のｐＨに調節する。４カラム容量のバッファＡ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１３２．１４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、および１００ｇ／Ｌの酢酸、ｐＨ３．３）で、ブチルセファロース４ファーストフローカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ベッドの高さ１６ｃｍ）を平衡化する。リフォールディング物質を、ブチルセファロースカラムに装填する前に、０．２２μＭの薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルタ）で、流量１００ｃｍ／時（手順全体を通してこの流量を使用した）で濾過する。カラムを、４カラム容量のバッファＡで洗浄する。バッファＢ（２．７２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１００ｇ／Ｌの酢酸、および３００ｇ／Ｌのエタノール、ｐＨ３．３）を使用して、ＴＧＦ−ベータ３タンパク質をカラムから流出させる。モノマーおよびダイマータンパク質の分離前に、モノマーおよびダイマーの両方の型のＴＧＦ−β３タンパク質を含む第１のピークがまとめられる。
【０１４４】
配列情報
ＴＧＦ−β３（配列認識番号１）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＷＫＳＣＫＣＳ
【０１４５】
変異ＴＧＦ−β３「ＧＩｙ６３−Ａｌａ」（配列認識番号３）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＡＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＷＫＳＣＫＣＳ
【０１４６】
変異ＴＧＦ−β３「Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏ」（配列認識番号５）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＰＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＷＫＳＣＫＣＳ
【０１４７】
変異ＴＧＦ−β３「Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ」（配列認識番号７）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＳＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＷＫＳＣＫＣＳ
【０１４８】
変異ＴＧＦ−β３「Ａｒｇ５２−Ｓｅｒ」（配列認識番号９）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＳＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＷＫＳＣＫＣＳ
【０１４９】
変異ＴＧＦ−β３「Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ／Ａｒｇ５２−Ｓｅｒ」（配列認識番号１１）
ＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＳＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＳＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＷＫＳＣＫＣＳ
【０１５０】
配列認識番号２−野生型ヒトＴＧＦ−β３をコード化するＤＮＡ
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ
【０１５１】
配列認識番号４−Ｇｌｙ６３−ＡＩａ変異体をコード化するＤＮＡ
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ
【０１５２】
配列認識番号６−Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏ変異体をコード化するＤＮＡ
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ
【０１５３】
配列認識番号８−Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ変異体をコード化するＤＮＡ
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ
【０１５４】
配列認識番号１０−Ａｒｇ５２−Ｓｅｒ変異体をコード化するＤＮＡ
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ
【０１５５】
配列認識番号１２−Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ／Ａｒｇ５２−Ｓｅｒ変異体をコード化するＤＮＡ
ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ
【０１５６】
2009543542.tif 000002
【０１５７】
表２
2009543542.tif 000003
【０１５８】
表３
本発明の野生型ＴＧＦ−β３およびＴＧＦ−β３類のリフォールディング効率
2009543542.tif 000004
【０１５９】
表４
細胞成長阻害アッセイにより評価した野生型ＴＧＦ−β３およびＧｌｙ６３−Ａｌａ（本発明のＴＧＦ−β３タンパク質）の生物活性
2009543542.tif 000005
【０１６０】
表５  創傷部位治療
2009543542.tif 000006
【０１６１】
表６  創傷部位治療
2009543542.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】フェニル−セファロースの欄にＴＧＦ−ベータ３「野生型」のクロマトグラムを示す。
【図２】ＵＮＯ−Ｓ１の欄にＴＧＦ−ベータ３「野生型」モノマーおよびダイマーのクロマトグラムを示す。
【図３】クマシー・ブルーで染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＴＧＦ−ベータ３変異タンパク質と「野生型」ＴＧＦ−ベータ３の比較を示す（Ｇｌｙ６３−ＡｌａとＧｌｙ６３−Ｐｒｏ変異タンパク質の緩衝交換は、ある試料の損失をもたらし、従って、ゲルに付加される実際の濃度は、規定される３μｇより少ないことに留意されたい）。
【図４】切除創傷に使用されるテンプレートを示す。
【図５】本発明の野生型ＴＧＦ−ベータ３またはＴＧＦ−β３で治療した切開創傷（ＡおよびＢ）の３日目の平均巨視的評価点数を示し、「＊」は、未投与の創傷と比較し、治癒の大幅な向上（ｐ＜０．０５）を示す。
【図６】「野生型」および変異ＴＧＦ−ベータ３タンパク質で治療した切除創傷（ＣおよびＤ）の３日目の巨視的平均創傷幅を示す。
【図７】切開創傷に使用されるテンプレートを示す。
【図８】「野生型」ＴＧＦ−ベータ３、Ｇｌｙ６３−Ａｌａ、およびＧｌｙ６３−Ｐｒｏで治療した創傷の巨視的瘢痕点数（７０日目）を示す。
【図９Ａ】「野生型」ＴＧＦ−ベータ３、およびＧｌｙ６３−Ａｌａで治療した創傷の巨視的瘢痕画像（７０日目）を示す。
【図９Ｂ】Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏで治療した創傷の巨視的瘢痕画像（７０日目）を示す。
【図１０】「野生型」ＴＧＦ−ベータ３、Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ、および２倍のセリン変異体（Ｇｌｕ１２−ＳｅｒおよびＡｒｇ５２−ｓｅｒ）で治療した創傷の巨視的瘢痕点数（７０日目）を示し、「＋」は、プラセボ治療創傷と比較し、瘢痕化の大幅な軽減（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１１Ａ】「Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒ、および２倍のセリン変異体（Ｇｌｕｌ２−ＳｅｒおよびＡｒｇ５２−Ｓｅｒ）で治療した創傷の巨視的瘢痕画像（７０日目）を示す。
【図１１Ｂ】「野生型」ＴＧＦ−ベータ３で治療した創傷の巨視的瘢痕画像（７０日目）を示す。
【図１２Ａ】「野生型」ＴＧＦ−ベータ３、およびＧｌｙ６３−Ａｌａ変異タンパク質で治療した創傷の例示的な巨視的瘢痕画像（創傷後７０日目）を示す。
【図１２Ｂ】Ｇｌｙ６３−Ｐｒｏ変異タンパク質で治療した創傷の例示的な巨視的瘢痕画像（創傷後７０日目）を示す。
【図１３Ａ】Ｇｌｕｌ２−Ｓｅｒで治療した創傷の例示的な巨視的瘢痕画像（創傷後７０日目）を示す。
【図１３Ｂ】２倍のセリン変異体（Ｇｌｕｌ２−ＳｅｒおよびＡｒｇ５２−Ｓｅｒ）で治療した創傷の例示的な巨視的瘢痕画像（創傷後７０日目）を示す。
【図１】
2009543542.tif 000008
【図２】
2009543542.tif 000009
【図３】
2009543542.tif 000010
【図４】
2009543542.tif 000011
【図５】
2009543542.tif 000012
【図６】
2009543542.tif 000013
【図７】
2009543542.tif 000014
【図８】
2009543542.tif 000015
【図９Ａ】
2009543542.tif 000016
【図９Ｂ】
2009543542.tif 000017
【図１０】
2009543542.tif 000018
【図１１Ａ】
2009543542.tif 000019
【図１１Ｂ】
2009543542.tif 000020
【図１２Ａ】
2009543542.tif 000021
【図１２Ｂ】
2009543542.tif 000022
【図１３Ａ】
2009543542.tif 000023
【図１３Ｂ】
2009543542.tif 000024
【国際調査報告】
2009543542.tif 000025
2009543542.tif 000026
2009543542.tif 000027
2009543542.tif 000028