(57)【要約】  基板の所望領域内での活性な化学基の局在化を支援する基板である素子の使用により、選択された活性な化学的領域を有する基板を作製する方法に関する。本方法は、基板の選択的な活性領域を提供することを意図した、基板の選択された領域内での化学基の堆積、除去、活性化および／または非活性化のための光学的、化学的および／または機械的プロセスを含みうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択的に活性な領域を上部に有する基板を作製する方法であって、
上部に画成された複数のナノ構造を有する基板を提供するステップであって、ここで前記ナノ構造の各々によって、第１の活性化制御物質の、前記基板の表面の選択された部分上に活性な化学基を提供する能力が制限される、ステップと、
前記基板の前記表面の前記選択された部分上に活性な化学基を選択的に提供するように、前記基板を少なくとも前記第１の活性化制御物質に暴露するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ナノ構造によって、前記基板の前記表面の前記選択された部分が前記第１の活性化制御物質へ暴露されることが実質的に阻止される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記提供するステップが、前記基板の前記表面上に非活性化可能な化学官能基を提供するステップを含み、かつ前記第１の活性化制御物質が、前記基板の前記表面の前記選択された部分以外の部分上で前記化学官能基を非活性化する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ構造によって、前記基板表面の前記選択された部分以外の部分が前記第１の活性化制御物質へ暴露されることが実質的に阻止される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記提供するステップが、前記基板の前記表面上に活性化可能な化学官能基を提供するステップを含み、かつ前記第１の活性化制御物質が、前記基板の前記表面の前記選択された部分上で前記化学官能基を活性化する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ構造が、前記基板の前記表面内に配置されたナノスケールのウェルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ構造が、それ以外の部分は不透明な基板内に配置されたナノスケールの光開口部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記提供するステップが、前記基板の前記表面上に化学官能基を提供するステップを含み、前記化学官能基が、前記活性化制御物質へ暴露されると活性化または非活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ構造がナノスケールのウェルを含み、ここで前記選択された領域が前記ナノスケールのウェルの底面を含み、
前記活性化制御物質が、化学官能基を同伴しかつ前記ナノスケールのウェル内に実質的に拡散することのない同伴マトリックスを含み、かつ、
前記同伴マトリックスを除去し、化学官能基を前記基板の前記表面の前記選択された領域内以外の部分から除去するステップをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の活性化制御物質が、前記基板の前記表面上の化学官能基を活性化または非活性化するように選択された波長の光を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記光が前記化学官能基を活性化するように選択され、かつ前記ナノ構造によって、前記基板表面の前記選択された部分以外の部分が前記第１の活性化制御物質へ暴露されることが実質的に阻止される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学官能基が、ニトロベラトリル、１−ピレニルメチル、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル、ジメチルジメトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、メチル、メチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル、２−オキシメチレンアントラキノン、ジメトキシベンジルオキシカルボニル、５−ブロモ−７−ニトロインドリニル、ｏ−ヒドロキシ−α−メチルシンナモイル、およびそれらの混合物から選択される光活性化可能な基を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記光が前記化学官能基を非活性化するように選択され、かつ前記ナノ構造によって、前記基板の前記表面の前記選択された部分が前記第１の活性化制御物質へ暴露されることが実質的に阻止される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学官能基が、光切断可能なリンキング基を介して前記基板の前記表面に連結される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学官能基が第１の活性化可能な化学官能基を含み、
前記第１の活性化制御物質が、前記第１の活性化可能な化学官能基を活性化するように選択された波長の光を含み、
前記基板が不透明層および透明層を含み、
前記ナノ構造が、前記不透明層を通して前記透明層に対して配置されたゼロモード導波路を含み、かつ、
前記暴露するステップが、前記光を前記基板の前記透明層に誘導し、前記第１の活性化可能な化学官能基を活性化し、前記透明層の上または近傍にある前記ゼロモード導波路内に第１の活性な化学官能基を提供するステップを含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記暴露するステップで提供される前記第１の活性な化学官能基をキャップし、前記暴露するステップでの前記光とは異なる波長の光により活性化可能な第２の活性化可能な化学官能基を提供するステップと、
前記第１の活性化可能な化学官能基ではなく前記第２の活性化可能な化学官能基を活性化するように選択された波長の光を前記基板の前記透明層に誘導するステップをさらに含み、
前記誘導するステップが、前記第１の暴露するステップで活性化された前記化学官能基の一部を活性化するための条件下で実施される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化学官能基が非活性化可能な化学官能基を含み、
前記第１の活性化制御物質が、前記非活性化可能な化学官能基を非活性化するように選択された波長の光を含み、
前記基板が不透明層および透明層を含み、
前記ナノ構造が、前記不透明層を通して前記透明層に対して配置されたゼロモード導波路を含み、かつ、
前記暴露するステップが前記基板の前記不透明層に前記光を誘導し、前記不透明層上で化学官能基を非活性化するステップを含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記非活性化可能な化学官能基が、光切断可能なリンキング基を介して前記基板の前記表面に連結された活性な化学官能基を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記非活性化可能な化学官能基が、前記暴露するステップにおける前記光への暴露により少なくとも部分的に非活性化されるタンパク質を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記非活性化可能な化学官能基がフルオロフォア結合タンパク質を含み、かつ前記暴露するステップが前記フルオロフォアの存在下で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記フルオロフォア結合タンパク質が核酸ポリメラーゼを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の活性化制御物質が、前記化学官能基を活性化または非活性化する化学剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の活性化制御物質が、前記化学官能基を非活性化する化学剤を含み、
前記ナノ構造が、前記化学剤のナノスケールのウェルへの拡散を制限する、前記基板の前記表面内に画成された前記ナノスケールのウェルを含み、かつ
前記暴露するステップが、前記ナノスケールのウェルの底面またはその近傍の表面の部分以外の前記基板の前記表面上の化学官能基を非活性化する条件下で、前記基板を前記化学剤に暴露するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学剤が、化学官能基に結合し、それらを不活性化するキャッピング基を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学剤が、前記ナノスケールのウェルへ入ることから少なくとも部分的に排除される排除成分に連結される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記排除成分が大粒子および巨大分子から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記粒子がビーズを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記化学剤が非活性化成分を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記非活性化成分が酵素を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素がプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、およびカルボヒドラーゼから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
選択された活性領域を上部に有する分析用基板を製造する方法であって、
基板の選択された領域に対する改良された光学的アクセスをもたらす、上部に配置された光学的分析構造を有する基板を提供するステップと、
第１の電磁放射により活性化または非活性化可能な表面官能基を提供するステップと、
前記基板に前記第１の電磁放射を誘導するステップであって、それにより前記光学的分析構造が前記電磁放射を誘導し、前記基板の前記選択された領域内で前記表面官能基を選択的に活性化または非活性化し、前記基板の活性領域を選択的に提供する、ステップと
を含む、方法。
【請求項３２】
実質的に導波路の底部に活性な化学的表面を有するゼロモード導波路を提供する方法であって、
基板内に配置されたゼロモード導波路を提供するステップと、
前記ゼロモード導波路の表面上に化学官能基を提供するステップと、
前記ゼロモード導波路の前記表面の第２の部分ではなく第１の部分を、前記第１の部分上の前記化学官能基を選択的に活性化または非活性化する活性化制御物質に暴露し、実質的に前記ゼロモード導波路の底部に活性な化学的表面を提供するステップと、
を含む、方法。
【請求項３３】
ゼロモード導波路アレイであって、
クラッド層内に配置された複数のゼロモード導波路コアであって、各コアが底面を有するコアと、
実質的に前記コア内に限られる化学的に活性な表面と、
を含む、ゼロモード導波路アレイ。
【請求項３４】
前記化学的に活性な表面が前記コアの前記底面上に優先的に局在化される、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３５】
上部に配置された選択された活性領域を有する基板を提供する方法であって、
上部に画成された光学的改良構造を有する基板を提供するステップであって、ここで前記光学的改良構造は電磁放射を誘導し、前記基板表面の選択された領域の近傍に捕捉力を生成するのに十分な増強された電磁界を、前記基板表面の選択された領域の近傍に提供することが可能である、ステップと、
前記基板において電磁放射を誘導するステップであって、前記選択された領域の近傍の活性分子に対して捕捉力を生成するのに十分な前記増強された電磁界を、前記選択された領域に提供する、ステップと、
前記活性分子を前記選択された領域に連結するステップと、
を含む、方法。
【請求項３６】
上部に配置された選択された活性領域を有する基板を作製する方法であって、
化学官能基からなる表面を有する基板およびその上に画成された複数の分離したナノスケールの反応領域を提供するステップと、
１つもしくは複数の化学官能基または活性化制御物質を選択された領域内の前記表面上にパターニングし、実質的に前記分離したナノスケールの反応領域内に限られる活性のある化学的な機能領域を提供するステップと、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記パターニングするステップが、活性化制御物質をマスクを介して誘導し、活性な化学官能基を、実質的に前記分離したナノスケールの反応領域内に限って生成するステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記活性化制御物質が、前記基板の前記表面上の化学官能基を活性化または非活性化するように選択された波長の光を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記パターニングするステップが、前記活性化制御物質をプリンティングプロセスを介して適用するステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
核酸分子の配列を同定する方法であって、
基板上の分離した観察領域内に複数の核酸ポリメラーゼ／鋳型／プライマー複合体を提供するステップと、鋳型依存性の方法でヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の連続的付加を検出し、前記複数の観察領域内での前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込まれた配列を同定するステップと、を含み、
ここで、前記基板が前記観察領域外部の領域内でポリメラーゼ活性、ポリメラーゼの存在、鋳型の存在およびプライマーの存在のうちの１つもしくは複数を実質的に低減するように製造されている、方法。
【請求項４１】
核酸分子の配列を同定する方法であって、
基板表面上の分離した観察領域内に複数の核酸ポリメラーゼ／鋳型／プライマー複合体を提供するステップと、鋳型依存性の方法でヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の連続的付加を検出し、前記複数の観察領域内での前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込まれた配列を同定するステップと、
少なくとも第１および第２の分離した観察領域の間の前記基板表面上に観察領域内バリアを提供し、１つもしくは複数の反応物または生成物の観察領域内での拡散を実質的に阻止するステップと、
を含む、方法。
【請求項４２】
前記バリアが、第１の流体と、前記第１の観察領域からの１つもしくは複数の生成物または反応物の前記第２の観察領域への到達を実質的に阻止するのに十分な前記第１および第２の観察領域の間の距離とを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記基板表面が平面状である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記基板表面が構造化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記バリアが、前記基板表面内に配置された少なくとも第１および第２のナノスケールのウェルをさらに含み、ここで前記第１および第２の観察領域がそれぞれ、前記第１および第２のナノスケールのウェル内に配置される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
基板上に配置される光閉じ込め内に所望の分子を優先的に局在化する方法であって、
前記所望の分子を前記基板の前記表面上部に堆積させるステップと、
前記所望の分子を前記光閉じ込め内でない前記基板の前記表面から選択的に除去するステップと、
を含む、方法。
【請求項４７】
前記基板が不透明層および透明層を含み、かつここで前記光閉じ込めが、前記不透明層を通して前記透明層に対して配置されたゼロモード導波路を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記所望の分子を前記光閉じ込め内でない前記基板の前記表面から選択的に除去するステップが、前記基板を、前記光閉じ込め内に入ることから少なくとも部分的に排除される排除成分に連結された非活性化成分と接触させるステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記非活性化成分が酵素を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵素がプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、およびカルボヒドラーゼからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記酵素が部位特異的プロテアーゼである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記排除成分が大粒子または巨大分子である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記排除成分がビーズを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記排除成分が硬質もしくは半硬質の細長い高分子を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記排除成分が二本鎖核酸分子を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記非活性化成分がプロテアーゼであり、かつ前記排除成分が二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記所望の分子が酵素である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記所望の分子が結合部分を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
前記所望の分子がビオチン分子である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
基板上に配置される光閉じ込め内に分子を局在化する方法であって、
前記光閉じ込め内部を含む前記基板の前記表面に光活性化された連結基を提供するステップと、
前記基板に活性化放射を誘導するステップであって、ここで前記光閉じ込めによって、活性化放射が前記光閉じ込め内部にのみ入射される、ステップと、
前記分子を前記光活性化された連結基に連結させるステップと、
を含む、方法。
【請求項６１】
目的の分子を基板上に選択的に固定化する方法であって、
異なる表面特性を有する第１の表面成分および第２の表面成分を有する基板を提供するステップと、
前記第１の表面成分の前記表面特性と前記第２の表面成分の前記表面特性の間の差異に基づき、前記目的の分子を前記第１の表面成分に選択的に連結させるステップと、
を含む、方法。
【請求項６２】
前記第１の表面成分がＳｉＯ２を含み、かつ前記第２の表面成分が金属もしくは金属酸化物を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記異なる表面特性が表面電荷を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の表面成分が負の表面電荷を有し、かつ前記第２の表面成分が正の表面電荷を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記基板が前記第１の表面成分層上に前記第２の表面成分層を含み、かつここで前記基板は、前記第２の表面成分層を通して前記第１の表面成分層に対して配置されたゼロモード導波路を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記目的の分子が前記第１の表面成分に優先的に結合する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記基板が、前記第１および第２の表面成分の前記表面特性の間の前記差異に基づき、前記第１の表面成分と選択的に結合する第１の組成物と接触される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の組成物が第１の連結基を含み、かつここで前記目的の分子を前記第１の表面成分に選択的に連結させるステップが、前記目的の分子を前記第１の連結基に連結させるステップを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の連結基がビオチンを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１の組成物がシランを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の組成物がビオチン−ＰＥＧ−シランを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の組成物がリン脂質を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の組成物がポリ（Ｌ−リジン）−ポリ（エチレングリコール）またはポリ（Ｌ−リジン）−ポリ（エチレングリコール）−ビオチンを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記基板を、前記第１および第２の表面成分の前記表面特性の間の前記差異に基づき、前記第２の表面成分に選択的に結合する第２の組成物と接触させるステップを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項７５】
前記第２の組成物が高分子電解質を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第２の組成物が高分子電解質−ＰＥＧ共重合体を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２の表面成分上に高分子電解質多層を堆積させるステップを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記第２の組成物が、１つもしくは複数のホスホン酸基を含む化合物を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記第２の組成物がポリビニルホスホン酸である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２の組成物が、
【化１】
2009532032.tif 000010
【化２】
2009532032.tif 000011
および
【化３】
2009532032.tif 000012
からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２の組成物が、２−カルボキシエチルホスホン酸；アミノトリ（メチレンホスホン酸）；１−ヒドロキシエチリデン−１，１，−ジホスホン酸；ヘキサメチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）；ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）；エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）；ビス（ヘキサメチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））；２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボキシル酸；およびモノエタノールアミンジホスホン酸からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２の組成物が、１つもしくは複数のリン酸基を含む化合物を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
前記第２の組成物がアルキルリン酸塩またはアルキルホスホン酸塩を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２の組成物が、オクチルホスホン酸、デシルホスホン酸、ドデシルホスホン酸、ヘキサデシルホスホン酸、オクタデシルホスホン酸、ドコシルホスホン酸、ヒドロキシ−ドデシルホスホン酸、ヒドロキシ−ウンデセニル−ホスホン酸、デカンジイルビス（ホスホン酸）、ドデシルリン酸、およびヒドロキシ−ドデシルリン酸からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２の組成物が第２の連結基を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８６】
前記目的の分子を前記第１の表面成分に選択的に連結させるステップが、前記基板を前記第１の表面成分に選択的に結合する第１の組成物と接触させるステップと、前記目的の分子を前記第１の組成物に連結させるステップと、を含み、
前記方法が前記基板を前記第２の表面成分に選択的に結合する第２の組成物と接触させるステップをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項８７】
目的の分子を基板の選択された領域上に選択的に堆積する方法であって、
導電材料を含む第１の成分および絶縁体を含む第２の成分を有する基板を提供するステップと、
目的の分子と前記第１の成分の表面との結合を増大または低下させるように電位を前記第１の成分に印加するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、デイビッド  Ｒ．ランク（Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｒａｎｋ）らによる「ＡＲＴＩＣＬＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＬＯＣＡＬＩＺＥＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  ＤＩＳＰＯＳＥＤ  ＴＨＥＲＥＯＮ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＳＡＭＥ」という表題の２００６年３月３０日出願の米国仮特許出願第１１／３９４，３５２号明細書の一部継続出願であり、それはあらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する声明
本発明の一部は、国立ヒトゲノム研究所（ＮＨＧＲＩ）助成金番号Ｒ０１−ＨＧ００３７１０−０１の下で政府の助成によって行われたものであり、政府は本発明に対する特定の権利を有しうる。
【０００３】
本発明は、基板の所望領域内での活性な化学基の局在化を支援する基板である素子の使用により、選択された活性な化学的領域を有する基板を作製する方法に関する。基板の選択的な活性領域を提供することを意図した、基板の選択された領域内での化学基の堆積、除去、活性化および／または非活性化のための光学的、化学的および／または機械的プロセスを含む方法について記載される。
【背景技術】
【０００４】
個々の分子、比較的少数の分子、または比較的低濃度の分子における反応を分析するための能力から享受しうる分析的作業の範囲は幅広い。これらの密度が低い（ｓｐａｒｓｅｌｙ  ｐｏｐｕｌａｔｅｄ）反応混合物を提供するためのアプローチについての記載が多数なされている。例えば、核酸配列決定の分野では、多数の研究者が、ポリメラーゼ酵素の活性による核酸の鋳型依存性の合成に関連して配列情報を得るための単一の分子または低濃度のアプローチを提案している。
【特許文献１】米国仮特許出願第１０／９４４，１０６号明細書
【特許文献２】米国仮特許出願第０９／５７２，５３０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，９１７，７２６号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１１／２４０，６６２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号明細書
【特許文献６】米国特許出願第１１／２０１，７６８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４１２，０８７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，１４３，８５４号明細書
【非特許文献１】レービン（Ｌｅｖｅｎｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９（５６０７）：６０９−７６４頁（２００３年）
【非特許文献２】ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔ．Ｗ．グリーネ（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｗｕｔｓ）、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９９年）
【非特許文献３】ブロンダー（Ｂｌｏｎｄｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７年、１１９：１０４６７−１０４７８頁
【非特許文献４】ブロンダー（Ｂｌｏｎｄｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７年、１１９：１１７４７−１１７５７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの配列決定技術に対する様々な異なるアプローチが、一度に１つもしくは２〜３の合成反応のみを監視する異なる方法を提供する。例えば、いくつかの場合、反応混合物は低濃度の反応物を含む液滴に割り当てられる。他の用途では、特定の試薬が溶液中の他の反応成分からの干渉を伴うことなく監視されうるように表面上に固定化される。さらに別のアプローチでは、光閉じ込め技術を用いて、光閉じ込めエリア内で専ら比較的少数の反応物、例えば単一の分子からのシグナル情報を確認することが可能である。上記の技術の利用可能性とは無関係に、分析における反応成分のさらなる選択性があれば望ましいと思われる例が存在する。本発明はこれらの種々の要求を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般に、基板の選択された領域内での機能表面の修飾、例えば活性な化学基を提供する方法とともに、結果的にそれにより作製される基板、ならびにかかる基板の使用を提供する。
【０００７】
第１の態様では、本発明は選択的に活性な領域を上部に有する基板を作製する方法を提供する。本方法は、上部に画成された複数のナノ構造を有する基板を提供するステップを含み、ここで各ナノ構造によって、第１の活性化制御物質の、基板の表面の選択された部分上に活性な化学基を提供する能力が制限される。次いで、基板は少なくとも第１の活性化制御物質に暴露され、基板の表面の選択された部分上に活性な化学基が選択的に提供される。活性な化学基は、例えば化学官能基、活性分子（例えば酵素）、および連結基または結合基を含む。
【０００８】
別の関連の態様では、本発明は上部に選択された活性領域を有する分析用基板を製造する方法を提供する。方法は、基板の選択された領域に対して改良された光学的アクセスをもたらす、上部に配置された光学的分析構造を有する基板を提供する。次いで、第１の電磁放射により活性化または非活性化可能な表面官能基が提供され、電磁放射は基板に誘導され、それにより光学的分析構造が電磁放射を誘導し、基板の選択された領域内の表面官能基を選択的に活性化または非活性化し、基板の活性領域を選択的に提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、実質的に導波路の底部に活性な化学的表面を有するゼロモード導波路を提供する方法を特徴とする。方法は、基板内に配置されたゼロモード導波路を提供するステップと、ゼロモード導波路の表面上に化学官能基を提供するステップと、ゼロモード導波路の表面における第２の部分ではない第１の部分を第１の部分上の化学官能基を選択的に活性化または非活性化する活性化制御物質に暴露し、実質的にゼロモード導波路の底部に活性な化学的表面を提供するステップと、を含む。
【００１０】
本発明は、クラッド層内に配置された複数のゼロモード導波路コアを含むゼロモード導波路アレイを含む、かかる方法を用いて作製される基板およびデバイスも提供し、ここで各コアは底面、および実質的にコア内部に限られる化学的に活性な表面を有する。
【００１１】
本発明は、上部に配置された選択された活性領域を有する基板を提供する方法であって、上部に画成された光学的改良構造を有する基板を提供するステップを含み、ここで光学的改良構造が電磁放射を誘導し、基板表面の選択された領域の近傍に捕捉力を生成するのに十分な増強された電磁界を、基板表面の選択された領域の近傍に提供することが可能である、方法をさらに提供する。電磁放射が基板に誘導され、選択された領域の近傍の活性分子に対して捕捉力を生成するのに十分な増強された電磁界が、選択された領域に提供される。次いで、活性分子は選択された領域に連結される。
【００１２】
本発明は、上部に配置された選択された活性領域を有する基板を提供する方法であって、化学官能基からなる表面を有する基板およびその上に画成された複数の分離したナノスケールの反応領域を提供するステップと、１つもしくは複数の化学官能基または活性化制御物質を選択された領域内の表面上にパターニングし、実質的に分離したナノスケールの反応領域内に限られる活性のある化学的な機能領域を提供するステップと、を含む、方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、核酸分子の配列を同定する方法を提供する。方法は、基板上の分離した観察領域内に複数の核酸ポリメラーゼ／鋳型／プライマー複合体を提供するステップと、鋳型依存性の方法でヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の連続的付加を検出し、複数の観察領域内でのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込まれた配列を同定するステップと、を含む。かかる方法では、基板は観察領域外部の領域内でポリメラーゼ活性、ポリメラーゼの存在、鋳型の存在およびプライマーの存在のうちの１つもしくは複数を実質的に低減するように製造されている。
【００１４】
それに関連し、本発明は、核酸分子の配列を同定する方法であって、基板表面上の分離した観察領域内に複数の核酸ポリメラーゼ／鋳型／プライマー複合体を提供するステップと、鋳型依存性の方法でヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の連続的付加を検出し、複数の観察領域内でのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込まれた配列を同定するステップと、を含む、方法を提供する。かかる方法では、観察領域内バリアが少なくとも第１および第２の分離した観察領域の間の基板表面上に提供され、１つもしくは複数の反応物または生成物の観察領域内の拡散を実質的に阻止する。
【００１５】
本発明は、基板上に配置された光閉じ込め内に所望の分子を優先的に局在化する方法も提供する。方法は、所望の分子を基板の表面上に堆積させるステップと、所望の分子を光閉じ込め内部でない基板の表面から選択的に除去するステップと、を含む。一態様では、基板は不透明（透明性のない）層および透明層を含み、かつ光閉じ込めは、不透明層を通して透明層に対して配置されるゼロモード導波路を含む。
【００１６】
所望の分子を光閉じ込め内部でない基板の表面から選択的に除去するステップは、場合により、基板を、光閉じ込め内に入ることから少なくとも部分的に排除される排除成分に連結された非活性化成分と接触させるステップを含む。非活性化成分はそれが表面から（例えばゼロモード導波路のコアの上面および上壁から）接近可能な分子を除去し、それは排除成分による光閉じ込めまたは光閉じ込めの全体への接近から阻止される。
【００１７】
実施形態の一群では、非活性化成分は、酵素、例えばプロテアーゼ（例えば非特異的または部位特異的プロテアーゼ）、ヌクレアーゼ、またはカルボヒドラーゼを含む。排除成分は、場合によりビーズなどの大粒子、巨大分子、または硬質もしくは半硬質の細長い高分子である。実施形態の一群では、排除成分は、二本鎖核酸分子、例えばプロテアーゼ非活性化成分に連結された二本鎖ＤＮＡ分子を含む。
【００１８】
選択的に固定化される所望の分子は、本質的に任意の分子、例えば酵素（例えば核酸ポリメラーゼ）などの活性分子または他の分子を固定化するのに順に用いられうる結合もしくは連結部分（例えばビオチン分子）を含む分子でありうる。
【００１９】
基板上に配置された光閉じ込め内に分子を局在化する方法であって、光閉じ込め内部を含む基板の表面上に光活性化された連結基を提供するステップを含む、方法がさらに提供される。次いで、活性化放射が基板に誘導され、ここで光閉じ込めによって、活性化放射が光閉じ込め内部にのみ入射される。次いで、分子は光活性化された連結基に連結される。
【００２０】
本発明の別の態様は、目的の分子を基板上に選択的に固定化する方法を提供する。方法は、異なる表面特性を有する第１の表面成分および第２の表面成分を有する基板を提供するステップと、第１の表面成分の表面特性と第２の表面成分の表面特性の間の差異に基づき、目的の分子を第１の表面成分に選択的に連結するステップと、を含む。
【００２１】
実施形態の一群では、異なる表面特性は表面での表面電荷または静電気相互作用を含む。例えば、第１の表面成分は負の表面電荷、第２の表面成分は正の表面電荷を有しうるかまたは獲得しうる（またはその逆もいえる）。別の例として、表面成分は異なる表面化学吸着特性を有しうる。ここで例えば、第２の表面成分は特定の基（例えばホスホン酸塩基またはリン酸塩基）に対して強力な化学親和性を有しうる一方、第１の表面成分は基に対して強力な親和性を有することがない。
【００２２】
本方法を用い、目的の分子を例えばＺＭＷ内または他のハイブリッド基板内に選択的に固定化することが可能である。それ故、例えば基板は、場合により第１の表面成分層上に第２の表面成分層を含み、第２の表面成分層を通して第１の表面成分層まで配置されたゼロモード導波路を有する。（特に）かかる実施形態では、第１の表面成分はＳｉＯ２を含み、かつ／または第２の表面成分は金属もしくは金属酸化物（例えばアルミニウムもしくは酸化アルミニウム）を含みうる。ハイブリッド基板が溶液と接触状態にある実施形態では、基板は、溶液のｐＨ未満のゼロ電荷点を有する材料である第１の表面成分（例えばｐＨ＞２のＳｉＯ２）および／または溶液のｐＨを超えるゼロ電荷点を有する金属酸化物を含む第２の表面成分（例えば、ｐＨ＜８の酸化アルミニウム；中性ｐＨで正に帯電した他の金属酸化物が、限定はされないが、酸化タリウム、酸化鉄、酸化イットリウム、酸化亜鉛、酸化ランタン、および酸化マグネシウムを含む）を含みうる。
【００２３】
特定の実施形態では、目的の分子は第１の表面成分に優先的に結合する。例えば、正に帯電したポリメラーゼ分子が正に帯電した金属表面上部の負に帯電したケイ酸塩に優先的に結合する。他の実施形態では、基板は、第１および第２の表面成分の表面特性の間の差異に基づき、第１の表面成分に選択的に結合する第１の組成物と接触される。第１の組成物はブロック機能を果たしうるか、または目的の分子と直接的または間接的に結合しうる。したがって、例えば実施形態の一群では、第１の組成物は第１の連結基を含み、かつ目的の分子を第１の表面成分に選択的に連結するステップは、目的の分子を第１の連結基（例えば、化学官能基、ビオチンなどの結合基、または同種のもの）に連結するステップを含む。
【００２４】
実施形態の一群では、第１の組成物は、例えばケイ酸塩の第１の表面成分との選択的結合においてはシランを含む。典型的なシランは、限定はされないが、ビオチン−ＰＥＧ−シランを含む。実施形態の別の群では、第１の組成物はリン脂質を含む。実施形態のさらに別の群では、第１の組成物はポリリジン−ＰＥＧまたはポリリジン−ＰＥＧ−ビオチンを含む。
【００２５】
方法は、場合により、第１および第２の表面成分の表面特性の間の差異に基づき、基板を第２の表面成分に選択的に結合する第２の組成物と接触させるステップを含む。第２の組成物による処理が、場合により任意の第１の組成物との処理の前後を含む目的の分子の第１の表面成分への連結の前後に行われる。一部の実施形態では、第２の組成物は典型的には任意の第１の連結基と異なる第２の連結基を含む。典型的な第２の組成物は、例えば高分子電解質および高分子電解質−ＰＥＧ共重合体を含む。方法は、場合により第２の表面成分上に高分子電解質多層を堆積させるステップを含む。
【００２６】
さらなる典型的な第２の組成物が、１つもしくは複数のホスホン酸基または１つもしくは複数のリン酸基を含む化合物を含む。例えば、第２の組成物は、ポリビニルホスホン酸；２−カルボキシエチルホスホン酸；アミノトリ（メチレンホスホン酸）；１−ヒドロキシエチリデン−１，１，−ジホスホン酸；ヘキサメチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）；ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）；エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）；ビス（ヘキサメチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））；２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボキシル酸；またはモノエタノールアミンジホスホン酸を含みうる。さらなる例として、第２の組成物は、アルキルリン酸塩またはアルキルホスホン酸塩、例えばオクチルホスホン酸、デシルホスホン酸、ドデシルホスホン酸、ヘキサデシルホスホン酸、オクタデシルホスホン酸、ドコシルホスホン酸、ヒドロキシ−ドデシルホスホン酸、ヒドロキシ−ウンデセニル−ホスホン酸、デカンジイルビス（ホスホン酸）、ドデシルリン酸、またはヒドロキシ−ドデシルリン酸を含みうる。
【００２７】
２つの表面成分は、異なる組成物により異なる形で修飾されうる。したがって、実施形態の一群では、方法は、基板を第１の表面成分と選択的に結合する第１の組成物と接触させるステップと、目的の分子を第１の組成物に連結させ、目的の分子を第１の表面成分に連結させるステップと、（目的の分子の連結または第１の組成物の堆積の前後に）基板を第２の表面成分と選択的に結合する第２の組成物と接触させるステップと、を含む。
【００２８】
他の態様では、本発明は、目的の分子を基板の選択された領域上に選択的に堆積させる方法であって、導電材料を含有する第１の成分および絶縁体を含有する第２の成分を有する基板を提供するステップと、第１の成分に目的の分子と第１の成分の表面との結合を増大もしくは低下させるように電位を印加するステップと、を含む方法を提供する。
【００２９】
〔図面の簡単な説明〕
図１は用途におけるゼロモード導波路（ＺＭＷ）の概略図を示す。
【００３０】
図２は本発明の光誘導による表面活性化プロセスの概略図を提供する。
【００３１】
図３はＺＭＷのような光閉じ込めの光学的関連部分内に活性表面を提供するためのプロセスの概略図を提供する。
【００３２】
図４は２つの別々の活性化段階にわたる、ＺＭＷの底面からの距離の関数としての表面活性化レベルのシミュレートされたプロットを提供する。
【００３３】
図５は２つの活性化ステッププロセスを用いる交互の光活性化方法の概略図を提供する。
【００３４】
図６は閉じ込め構造内に活性表面を提供するための拡散制限プロセスの概略図を提供する。
【００３５】
図７は基板の無関係な表面上に印刷されたマスク層を提供するためのプロセスの図面を提供する。
【００３６】
図８は活性基を基板表面の無関係な部分から除去するための光切断プロセスを概略的に図示する。
【００３７】
図９は目的の分子を基板表面の無関係な部分から除去するためのサイズ排除された分子に基づくプロセスを図示する。
【００３８】
図１０は電気的駆動系を用いる目的の分子の選択的固定化を図示する。
【００３９】
図１１は同伴マトリックス（ｅｎｔｒａｉｎｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）、次いでリフトオフ技術を用い、分子を基板の無関係な表面から除去するためのプロセスを概略的に図示する。
【００４０】
図１２は特にサイズ排除された粒子プロセスを用いる、本発明の選択的固定化プロセスの効果を図示する。
【００４１】
図１３は交互の排除プロセスを用いる、分子の選択的局在化のためのプロセスを概略的に図示する。
【００４２】
図１４は部位特異的非活性化成分が目的の分子を基板から除去する排除プロセスを用いる、分子の選択的局在化のための典型的なプロセスを概略的に図示する。
【００４３】
図１５は部位特異的非活性化成分が連結部分を基板から除去する排除プロセスを用いる、分子の選択的局在化のための典型的なプロセスを概略的に図示する。
【００４４】
図１６はＺＭＷのようなハイブリッド基板内の異なる材料の異なる表面特性の使用による目的の分子の選択的固定化およびＰＥ−ＰＥＧ共重合体による不動態化を概略的に図示する。
【００４５】
図１７は高分子電解質多層の形成を概略的に図示する。
【００４６】
図１８はＺＭＷのようなハイブリッド基板内の異なる材料の異なる表面特性の使用による目的の分子の選択的固定化および高分子電解質多層による不動態化を概略的に図示する。
【００４７】
図１９はヌクレオチド類似体の、高分子電解質多層で処理された表面への結合に対するプラズマ−ＰＤＭＳで処理された（バイアスなしに処理された）表面への結合を図示する。
【００４８】
図２０はポリメラーゼの、高分子電解質多層で処理された表面への結合に対する未処理のアルミニウム表面への結合を図示する。
【００４９】
図２１は特に選択的シラン化処理および高分子電解質多層不動態化プロセスを用いる、本発明の選択的固定化プロセスの効果を図示する。
【００５０】
図２２は特に選択的シラン化処理および高分子電解質多層不動態化プロセスを用いる、本発明の選択的固定化プロセスの効果を図示する。
【００５１】
図２３はニュートラアビジンで被覆された蛍光ビーズの、ホスホン酸塩で処理されたＺＭＷへの結合に対する未処理のＺＭＷへの結合を図示する。
【００５２】
図２４はヌクレオチド類似体の、ホスホン酸塩で処理されたＺＭＷへの結合に対する未処理のＺＭＷへの結合を図示する。
【００５３】
概略図については必ずしもスケーリングされていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
Ｉ．発明の一般的説明
本発明は、一般に、所望の分子を基板上の予備選択された位置もしくはエリア内にまたは規定の体積内に提供するための方法およびプロセス、ならびにかかる方法またはプロセスから、特に所望の低濃度でまたは個々の分子として、光閉じ込め内で作られる物品を対象とする。特に好ましい態様では、本発明は、特定の空間または体積内に個々の分子を、分子の空間的個別性が例えば化学的、光学的、電気的、またはそれらに類する原理で用いられうるように局在化するための方法を対象とする。本発明は、これらのプロセスにより作製される基板、デバイス、容器など、例えば光閉じ込めも提供する。本発明のプロセスが種々の所与の所望の空間または体積のタイプのいずれかの範囲内に個々の分子を提供するのに広範に実用的でありうる一方、特に好ましい態様では、同プロセスを用い、所望の分子、例えば酵素が光閉じ込めの光学的に接近可能な部分、特にゼロモード導波路（ＺＭＷ）の内部に選択的に堆積または固定化される。
【００５５】
一般に、光閉じ込めを用いることで、それに対して電磁放射が提供されるかあるいは単なる極めて小さい空間または体積からかかる放射が誘導される。かかる光閉じ込めは構造的制限、例えばウェル、凹部、溝、または同種のものを含む場合があるか、あるいは他の成分と連携した光学的プロセスを含む場合があり、放出された放射線に対する照明がもたらされ、放射線が極めてわずかな体積から誘導される。かかる光閉じ込めの例として、例えば、光が透明基板を通して基板内部で全内部反射をもたらす角度で誘導される全内部反射（ＴＩＲ）に基づく光学系を用いる系が挙げられる。ＴＩＲとは無関係に、光の極一部が基板の外部表面を超えて透過し、基板表面からの距離の関数として速やかに減衰し、結果として表面で極めて小さい体積の照明がもたらされることになる。同様に、所望の電磁放射におけるコアの貫通伝播が阻止されるようにコアが寸法化される場合にクラッド層を通して配置される例えば１０〜１００ｎｍの狭いコアを用いるＺＭＷ構造が用いられる場合がある。結果として、放射線がコアの開口から極めて短い距離だけコアを浸透し、その結果、コア内部での照明は極めてわずかな体積に過ぎないことになる。例えば、鋭利な金属先端による場の増強、ナノチューブの閉じ込め、薄いスリットの閉じ込め、近接場共鳴エネルギー伝達の閉じ込め、近接場開口の閉じ込め、回折限界の光閉じ込め、および誘導放出抑制の閉じ込めを含む種々の他の光閉じ込め技術が検討されているとともに、あらゆる他の制限が、米国仮特許出願第１０／９４４，１０６号明細書および米国仮特許出願第０９／５７２，５３０号明細書ならびに米国特許第６，９１７，７２６号明細書（これら各々はあらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００５６】
ゼロモード導波路（ＺＭＷ）は一般にクラッディングに囲まれるコアの存在により特徴づけられ、ここでコアはカットオフ周波数を超える相当量の電磁放射をコアの通過伝播から排除するように寸法化される。結果として、光は、カットオフ周波数未満の周波数の光で照明される場合、コア内の短い距離を浸透するにとどまり、コアの体積の極一部を有効に照明することになる。本発明によると、コアはクラッド層で囲まれた空のまたは好ましくは流体で満たされた空洞を含む。次いでこのコアは、極めてわずかな体積を有するように特徴づけられ、またいくつかの場合では単一の分子または反応分子のセットのみを含むのに十分な化学的、生化学的および／または生物学的反応が生じうるゾーンまたは体積を提供する。ＺＭＷ、その製造、構造、および分析作業での使用については、米国特許第６，９１７，７２６号明細書およびレビーン（Ｌｅｖｅｎｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９（５６０７）：６０９−７６４頁（２００３年）（それらの開示内容全体はここであらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書中に援用される）で詳細に記載されている。
【００５７】
ＺＭＷならびに他の光閉じ込めの内部での化学的または生化学的分析との関連で、目的の反応が閉じ込めの光学的呼掛け（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）部分内で最小限にかつ好ましくは単一の反応のみが各閉じ込めの呼掛け部分内で生じているように生じていることを確認することが明らかに望ましい。一般に多数の方法を用い、観察体積内で各分子を提供することが可能である。種々のこれらについては、２００５年９月３０日出願の同時係属の米国特許出願第１１／２４０，６６２号明細書（あらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されており、それは特に、各分子を約１、２、３もしくは他のいくつかの選択数の分子であれば所与の観察体積内に収まると予想されるような所望の密度で表面に固定化するように設計された修飾表面が記載されている。典型的には、かかる方法では、表面上のかかる基の希釈あるいは目的の分子と相互作用する中間体または最終連結基の希釈、あるいはこれらの組み合わせのいずれかを通じて比較的低密度の連結基を表面上に提供するための希釈技術が用いられる。
【００５８】
いくつかの場合、目的の反応物が観察体積外部、例えば観察体積の内部および外部の双方のＺＭＷ、クラッド層などを収容する基板全体の上の他の領域から低減されるかまたはさらに除外されることがさらに望ましい場合がある。それに対し、特に呼掛けの範囲外での反応が、呼掛け反応に干渉しうるかまたは導波路の呼掛け体積の内外に拡散する検出可能な過剰なバックグラウンド生成物のレベルを提供する、例えば生成物の生成または反応物の消費を通じ、試薬の減少により反応速度に作用し、生成物の濃度を増加させ、シグナルのバックグラウンドノイズレベルに寄与することにより、目的の反応またはその反応の監視に影響を与える場合がある。したがって、反応成分の観察体積内での選択的かつ優先的な堆積および／または固定化が特に本発明の利点である。これらは、上で参照される低密度の堆積方法の代わりとして、また好ましくはそれに加えて一般に実行可能である。上記との関連で、目的の分子については特定の領域内に優先的に位置づけられるかまたは所与の領域内で実質的に局在化されるものとして説明されうる。同用語の使用が優先的に、同分子が優先的に局在化されることのない他の位置の場合を超える濃度または表面密度での所与の位置に局在化されることを示すように意味することは理解されるであろう。したがって、第１の領域内での所与の分子の優先的固定化が、分子が他の領域の場合よりも高い密度または濃度のかかる領域内に存在することを意味することになる。かかる領域内の密度は、他の領域内の濃度または密度の２０％以上、３０％以上、５０％以上、１００％以上、または２００％以上、最大１０００％以上、またいくつかの場合には１００倍以上、１０００倍以上またはそれを超える倍数の程度でありうる。同様の意味が、所与の分子が実質的に所与の領域内に限り存在するという指示に一般に適用可能である。
【００５９】
例えば単一の分子の酵素分析において用いられるＺＭＷの場合、導波路の照明体積内、また好ましくは導波路の底面上またはベース面上に単一の酵素分子を提供することが望ましい場合がある。したがって、上で示したように、さらなる酵素分子が底面以外の表面上、例えばコアの壁面上および／またはコアの一部ではないクラッド層などの表面上に存在しないことを確実にすることがさらに望ましい場合がある。
【００６０】
本発明のプロセスにより作製される基板の特に有用な用途が、プロセス内で「単一の分子の配列決定用途」と称されるものである。例として、鋳型核酸、プライマー配列およびポリメラーゼ酵素の複合体に対する単一の分子に基づく監視により、未完成の鎖の鋳型依存性の合成の間での追加の各ヌクレオチドの取り込みが観察可能である。付加塩基の各々を同定することにより、鋳型内の相補的塩基を同定し、それからその鋳型に対する配列情報を読み取ることができる。ＺＭＷとの関連で、個々のポリメラーゼ／鋳型／プライマー複合体がＺＭＷの観察体積内に提供されうる。４つの標識（例えば蛍光）ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の各々が合成鎖に取り込まれる際、かかるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に対して伸長された標識の存在が結合された光学的検出系により観察可能になる。かかる配列決定プロセスおよび検出系は、例えば２００５年８月１１日出願の公開された米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号明細書および係属中の米国特許出願第１１／２０１，７６８号明細書（これらの開示内容全体はあらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。かかる単一の分子配列決定用途は、本明細書中に記載の方法により、優先的に基板上の選択された領域内部でありかつ／または実質的に基板の他の部分上ではない場合での、ポリメラーゼ、鋳型またはプライマーまたはこれらの任意もしくは全部の複合体の選択された固定化を通じ、有益なものと想定される。
【００６１】
一般に、所与の位置、例えばＺＭＷ内部の照明体積内での目的の分子の選択的供給が、加法的または減法的プロセスのいずれかを用いて行われうる。加法的プロセスは、一般に各分子に対して所望の位置での配置または堆積が行われかつ他の場所で行われないことを意味する。それに対し、減法的プロセスは、目的の分子の堆積がより偏在的にかつ非選択的に、例えば基板表面全体にわたって行われた後、目的の分子が非所望位置から選択的に除去されることを意味する。これらの説明が様々なプロセスの説明において便宜をもたらす一方、１つのプロセスの結果が他のプロセスの結果と区別できない場合があることが理解されるであろう。多数のプロセスが加法的、減法的、またはその双方のいずれかとして説明可能なステップを含む場合があることも理解されるであろう。目的の分子は、一般に酵素または他の高分子基の局在化の観点で考察されるが、本発明の目的として空間特性または促進された局在化を提供することが望まれる場合の種々の異なる機能分子のいずれかでありうる。かかる基は、活性分子、例えば酵素のような触媒分子を含むが、より受動的な機能性、例えば非触媒基、例えば結合基または連結基、疎水基または親水基、例えば接着を促進するための構造改善基（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐｓ）、活性化可能な基または非活性化可能な基、あるいは同種のものを有する分子も含む。結合基または連結基は、小分子連結基を含みうるかあるいは高分子連結基、例えば抗体、抗体断片、特異的結合対、例えばアビジン／ビオチン、結合ペプチド、レクチン、相補的核酸、または種々の他の結合基のいずれかを含みうる。触媒活性分子は、典型的には、単一の分子の分析での利用を意図した、例えば空間特性が望まれる場合の任意の触媒活性分子または同種のものを含むことになる。
【００６２】
少なくとも１つの態様では、本発明は別々の反応および／または観察領域の単離の促進を提供することを対象とする。これはかかる領域間の光学的単離をもたらすだけでなく、かかる領域における化学的および／または環境的単離をもたらすことである。一般的意味では、これは、特定の反応ゾーン外部からの反応物および／または生成物の拡散を、その中で生じる反応またはその反応の観察に介入しかつ潜在的に干渉することから実質的に阻止する反応領域および／または観察領域の間のバリアまたはゾーンを提供することにより行われる。必要な単離を提供する場合、（１）隣接する反応／観察領域の間の十分な分離／単離をもたらすこと、ならびに（２）任意の潜在的に干渉する成分をかかる隣接する領域の間の空間から除去すること、例えば任意の反応物、生成物および／または酵素をかかる空間から除去しかつ観察領域間の「非武装化地帯（ｄｅｍｉｌｉｔａｒｉｚｅｄ  ｚｏｎｅ））の１種を創出すること、のうちの一方または双方が注目されうる。
【００６３】
単離の促進を提供することは、一般に観察領域間のある種のバリアを提供することに関する。一般にかかるバリアは、反応が隣接する観察領域内で行われるとしても他の場所に位置するとしても反応物および生成物が１つの反応から特定の観察領域に拡散することがないような十分な距離を流体系内に含みうるに過ぎない。平面基板を横切るかかる距離を提供するか、または基板上に構造化または成形された表面を提供することにより有効な拡散距離を増加させることができる。例えば、特に好ましい態様では、ナノスケールのウェル内部に別々の反応／観察領域を提供することでかかる領域間の距離を有効に増加させるとともに、かかる基板を処理するかまたはそうでなければ作製することで、任意の反応物および／または生成物を、選択された領域間の空間または領域内、例えばナノスケールのウェルの底面での表面またはそれに向けられた表面以外の表面内に存するかまたは生成されることから低下または除去することができる。
【００６４】
ＩＩ．加法的プロセス
上で示されるように、少なくとも１つの態様では、加法的プロセスを用い、本発明の所望の固定化分子が提供される。加法的プロセスは、典型的には所望の位置での結合基または連結基の選択的供給と、その後の目的の分子の堆積に依存する。さらに、この堆積は加法的または減法的プロセスの結果でありうる。
【００６５】
少なくとも第１の態様では、本発明の加法的プロセスは、典型的には表面上の所望領域内部、例えばＺＭＷなどの光閉じ込めの観察領域内部に限り目的の分子に選択的に結合する、基板表面上での連結基の堆積を含む。活性化可能な官能基を含む官能基の表面への連結が、一般に当該技術分野で既知の種々の方法のいずれかにより行われうる。例えばシリカに基づく基板、例えばガラス、石英、溶融シリカ、シリコン、または同種のものに関連し、十分に特徴づけられたシラン化学反応を用い、他の基を表面に連結させることが可能である。かかる他の基は、官能基、活性化可能な基、および／またはこれらのいずれかに対するリンカー分子、または表面の最終用途における使用を意図した実際の目的の分子を含みうる。他の基質タイプ、例えば高分子材料、金属または同種のものに関連し、他のプロセスが、例えば、それに連結された、または例えばそれに連結された官能基、金属結合基、すなわちキレータ、チオール、もしくは同種のものを有する共重合体を用いる高分子表面から伸びる官能基を有するハイブリッド高分子表面を用いて利用可能である。
【００６６】
本発明の少なくとも第１の態様では、所望のエリアまたは領域内に限り目的の分子の連結を提供するステップは、典型的には所望領域内に限り選択的に活性化された基板全体の表面に連結された活性化可能な連結基を提供するか、または選択的に非活性化可能な連結基を用いかつそれを全部でないが所望領域内で選択的に非活性化することにより実施される。望ましい場合に限られた活性な連結基の選択的供給により、目的の分子の選択的堆積および連結が実質的に所望領域内に限り可能になる。考察を容易にするため、所与の用途のために目的の分子を選択的に提供することが望まれる場合の表面または基板の一部が本明細書中で「所望領域」と称される一方、これらの領域外部の領域が非所望領域と称される。かかる所望および非所望領域は平面を含みうるか、あるいは例えばウェル、凹部、表面不整、ポスト、ピラー、トレンチ、トラフ、チャネル、キャピラリー、多孔質材料のような三次元構造を含みうる。
【００６７】
種々の異なる活性化可能な連結基が、本発明のこの態様との関連で用いられうる。典型的には、かかる基は選択的に除去可能な基でキャップまたはブロックされる連結基を含む。これらは熱的に改変される基、例えば熱不安定性保護基、化学的に改変される基、例えば酸または塩基不安定性保護基、および光改変可能な（ｐｈｏｔｏ  ａｌｔｅｒａｂｌｅ）基、例えば光切断可能または光除去可能な保護基を含む。
【００６８】
例えば非所望領域内での連結基の非活性化が、例えばキャップするかまたは官能基の除去をもたらす熱的、化学的または光誘導的な化学反応の利用、すなわち光誘導的な架橋、光切断、または同種のものを通じての、直接的、選択的に非活性化されうる基の使用を含みうる。あるいは、また特定の好ましい態様では、かかる非活性化方法では、非所望領域内での連結基の選択的活性化と、その後の、中性のまたは不活性なブロッキング基、例えば目的の分子に実質的に連結できない基、または中間リンキング分子を有する得られた活性な連結基の、かかる基の所望領域への連結の後に適用される連結条件下でのブロッキングまたはキャッピングが用いられる。後に付加されるこのブロッキング基は不可逆的または可逆的でありうる。しかし、かかるキャッピングの不可逆性は、もし存在する場合、典型的には内在する活性化可能な連結基の機序以外の機序を含むことになり、そこでは非所望領域内でキャップされた基を再活性化する一方で所望領域内でそれらの内在する活性化可能な基を活性化することが回避される。例えば、光活性化方法を用い、所望領域内で基が選択的に活性化されている場合、非所望領域に適用されたキャッピング基が、典型的には光活性化可能でないかまたはそれ以外では表面が用途において暴露されることになる任意の条件により活性化されないことになる。
【００６９】
非所望領域内での連結基のキャッピング後、所望領域または目的のエリアの内部の連結基は選択的に活性化され、かつ目的の分子と連結されうる。考察を容易にするため、光活性化がブロッキング基の光切断を含む場合、またはより大きいブロッキング基の除去を伴わない化学構造の改変による光活性化が本質的に例えば修飾基または他の基の付加をもたらす場合、それは一般に本明細書中で活性化、例えば光活性化と称されることになる。
【００７０】
少なくとも１つの特に好ましい態様では、光活性化可能な連結基、例えば光不安定性保護基でキャップされた化学的に活性な連結基を用い、目的の分子が所望領域内に選択的に堆積される。かかる光活性化可能な連結機構は、目的の最終反応の観察と連結基の活性化の双方を目的とした光が所望領域、例えばコアが照明されるコア開口に直近のＺＭＷの同領域に限り照明可能であるような光閉じ込めを用いる系にとって特に有用である。特にＺＭＷで誘導された光の活性化が制限された体積、例えば照明体積に限り照明することになることから、目的の分子は実質的に照明体積内に限り選択的に連結されることになる。言い換えると、（典型的にはＺＭＷが配置されるようになる、適用可能な分析作業における観察体積を実質的に規定する）照明体積の小さい制限された体積内での反応に限り監視するように用いられる同じ光閉じ込め効果により、同様にＺＭＷと同じ制限された体積または部分の内部に限り活性化（およびその後の連結）が可能になる。活性化放射を調節することにより、活性化の間での照明体積を適用の間での照明体積よりも小さい体積であるようにさらに制御することができることが理解されるであろう。特に、照明／呼掛け光よりも長い波長の活性化光を用いてより低い出力照明を適用することにより、目的の分子を照明し、活性化することで、最終用途における照明体積内に最終的に含まれる表面のサブセットに限り連結させることができる。
【００７１】
本発明の多数の特定の態様においては、かかる基板の最終用途の観点で、例えば、同基板に対する化学的、生化学的および／または生物学的反応の呼掛け、ならびにかかる分析の間での使用のために目的の分子を所望領域内に選択的に固定化するための選択的に活性化された表面の提供のいずれにしても、電磁放射の所望領域への選択的誘導を提供する基板を用いることが一般に好ましい。要するに、基板の最終用途で用いられる基板の基本的機能が採用され、かつその用途のためのその基板の作製および処理を改善するためのその機能が用いられる。放射の誘導に関連し、かかる領域内での反応の呼掛けにおいて放射を所望領域に集中させるように用いられる基板が同じ放射誘導特性を用いて処理され、同所望領域が選択的に機能化される。
【００７２】
これに関連し、目的の分子における後に基板上に堆積されかつ基板に連結されるという性質に応じて種々の異なる連結基が用いられる場合がある。例えば、連結基は、官能化学部分、例えばアミン基、カルボキシル基、水酸基、スルフヒドリル基、金属、キレータなどを含みうる。代わりにまたはそれに加え、それらは、特異的な結合要素、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、レクチン、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（商標）またはそのための基質（コバリス・バイオサイエンシーズ  エーゲー（Ｃｏｖａｌｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ）；ＳＮＡＰ−ｔａｇ（商標）は哺乳類のＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼに基づくポリペプチドであり、ＳＮＡＰ−ｔａｇ基質はベンジルプリンおよびピリミジンの誘導体である。）、会合もしくは結合ペプチドまたはタンパク質、抗体または抗体断片、核酸または核酸類似体、あるいは同種のものを含みうる。それに加えまたは代わりに、連結基を用い、目的の分子と連結または結合するのに用いられる追加的な基に連結することが可能であり、それはいくつかの場合に化学官能基および特異的な結合要素の双方を含みうる。例として、光活性化可能な連結基、例えば光活性化可能なビオチンが、基板表面上に堆積され、所与のエリア内に選択的に活性化されうる。次いで、中間結合剤、例えばストレプトアビジンが第１の連結基に連結されうる。次いで、この特定例であればビオチン化されることになる目的の分子はストレプトアビジンに連結される。
【００７３】
本発明のこの態様にて用いられる光不安定性保護基が、例えば、米国特許第５，４１２，０８７号明細書および米国特許第５，１４３，８５４号明細書（それら各々はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のニトロベラトリル、１−ピレニルメチル、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル、ジメチルジメトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、メチル、メチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル、２−オキシメチレンアントラキノン、ジメトキシベンジルオキシカルボニル、５−ブロモ−７−ニトロインドリニル、ｏ−ヒドロキシ−α−メチルシンナモイル、およびそれらの混合物を含む種々の既知の光切断可能な保護基を含みうる。
【００７４】
光活性化可能な連結基の目的の表面に対する連結が、当該技術分野で既知の多数の方法により行われうる。例えば、光保護基または活性化可能な基が、水酸基を介して表面上に連結されるかまたはリンカー基、例えばＰＥＧ分子を介して表面に付着されるカルボキシル基を含みうる。あるいは、光活性化可能な基上のアミン基が、表面に結合されたエポキシ基に連結されうる。あるいは、リンカー分子、例えばＰＥＧ基に予め連結された活性化可能な基が、既知のプロセスを通じてシラン化され（ｓｉｌａｎａｔｅｄ）、表面に直接付着されうる。
【００７５】
例えばＭｅＮＰＯＣで保護されたビオチンを用いる上記の連結方法で用いられる化合物の例が以下に図示される。
【化１】
2009532032.tif 000002
【００７６】
さらなる感光性保護基が、連結アミンに有用な基、例えばトリメチルフェニロキシカルボニル（ＴＭＰＯＣ）、連結酸に有用な基、例えばフェナシルエステル（３１３ｎｍ切断）、α−フェナシルエステル、デシルエステル（３５０ｎｍ）、ビス（ｏ−ニトロフェニル）メチルエステル（３２０ｎｍ）、１−ピレニルメチルエステル（３４０ｎｍ）、Ｎ−８−ニトロ−ｌ，２，３，４−テトラヒドロキノリルアミド（３５０ｎｍ）、ならびに以下の化合物
【化２】
2009532032.tif 000003
のエステルを含む。
【００７７】
活性化または脱保護のためにより長い波長を用いる本発明のそれらの態様においては、臭素化７−ヒドロキシクーマリン−４イル−メチルなど、適切なより長い波長の不安定基であれば用いられることになり、それは約７４０ｎｍで光不安定である。他のかかる基は当業者にとって既知である。
【００７８】
例えば、上記の基の一部、ならびにｐ−ニトロベンジルオキシメチルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、モノ、ジもしくはトリメトキシトリチル、ジフェニルメチルシリルエーテル、シリルエーテル、３'，５'−ジメトキシベンゾインカーボネート、メタンスルホン酸塩、トシレートなどを含むアルコールに対する連結において、かかる光不安定基も有用である。これらおよび種々の他の光切断可能な基が本発明のこの態様に関連して用いられる場合があり、例えば、ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔ．Ｗ．グリーネ（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｗｕｔｓ）、第３版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９９年）（これら各々はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００７９】
本発明は、上記の比較的大きい光除去可能な保護基の使用に加えまたはその代わりとして、光活性化可能な基、例えばかかるブロッキング基の除去以外により化学的に改変された基の使用も含む。例えば、ビニル基またはアリル基が、表面に連結されると同時に照明され、かつ例えばスルフヒドリル基を担持する連結されるべき適切な基、例えば直接にまたはリンカー分子を介してそれに連結されるスルフヒドリル基を有するビオチンと連結される場合があり、それらは活性化されたビニル基またはアリル基と反応し、表面に連結する。あるいは、ニトロアリールアジドのような他の基が活性化可能な連結基として用いられうる。例えばニトロスピロピラン基を含む多種多様な他の光活性化可能な化合物が同様に用いられうる（ブロンダー（Ｂｌｏｎｄｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７年、１１９：１０４６７−１０４７８頁、およびブロンダー（Ｂｌｏｎｄｅｒ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７年、１１９：１１７４７−１１７５７頁を参照）。
【００８０】
一態様では、光開始剤、例えば長波長の光開始剤、例えば５３０ｎｍ程度の波長でフリーラジカル反応を開始させうるＩｒｇａｃｕｒｅ７８４（ビス−（η５−２，４−シクロペンタジエン−１−イル）ビス［２，６−ジフルオロ−３−（１Ｈ−ピロール−１−イル）フェニル］チタン；チバ・スペシャルティ・ケミカルズ（Ｃｉｂａ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））が用いられる。かかる長波長の光開始剤は種々の用途を有する。例えば、表面（例えば金属酸化物表面）がビニル−アルキル−ホスホン酸で被覆されうる。Ｉｒｇａｃｕｒｅ７８４およびビオチン−ＰＥＧ−ＳＨの存在下での表面の所望領域の５３０ｎｍレーザへの暴露の結果、ビオチン−ＰＥＧ−アルキル−ホスホン酸がその領域内で形成される。次いでビオチンを用い、目的の分子を所望領域に固定化することが可能である。
【００８１】
関連の態様では、活性化可能な成分は、溶液中に提供され、局在化が望ましいとされる表面領域の近傍で活性化されうる。例えば、活性化可能な結合成分または他の目的の分子を活性シラン表面上に移殖することができる。かかる系の一例として光活性化可能なソラレン−ビオチン化合物（例えばアンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）から入手可能）が挙げられ、それはシラン化された表面、例えばトリメトキシシランで修飾された表面との連結のためにＵＶ光下で活性化可能である。
【００８２】
表面の選択的活性化を用いる加法的プロセスを含む本発明のそれらの態様は、一般に所望位置における選択的活性化のための多数の異なる方法を包含する。かかる方法は、単一の活性化ステップ、複数の活性化ステッププロセス、活性化および非活性化の双方のステップまたはプロセスを含む複数のステッププロセス、あるいは同種のものを含みうる。考察を容易にするため、かかる複数のステッププロセスは光活性化および／または光非活性化（ｐｈｏｔｏｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）プロセスに関連して説明されるが、他の非光駆動プロセスが同様に用いられうることが理解されるであろう。
【００８３】
少なくとも第１の比較的単純な態様では、所望領域内での光活性化可能な連結基の選択的活性化は、所望領域での活性化放射を誘導し、かつ目的の分子を上部に配置された活性化された連結基に連結させる単一のステップを含む。上記のように、目的の分子、例えば酵素を照明体積内に局在化することが望ましい場合の光閉じ込めの場合、単一のステップでの光駆動活性化の結果、実質的に照明体積内に限って連結がなされるべきである。さらに上記のように、活性化放射を調節することにより、例えば固定化されたポリメラーゼ酵素を用いる核酸配列決定における最終用途を通して呼掛けられる照明体積のサブセット内での活性化、それによる目的の基の連結にさらに注目することができる。
【００８４】
ＺＭＷ構造の基本的な機能的構造が図１に概略的に図示される。図示のように、透明基板層１０４上に堆積されたクラッド層１０２を含むＺＭＷ構造１００が提供される。コア１０６がクラッド層を通して配置され、下部の透明層１０４が暴露される。コアは、コアを通るカットオフ周波数未満に該当する電磁放射の伝播を阻止することにより光閉じ込めを提供するように寸法化される。それに対し、光はコア内へほんの短い距離透過し、点線１０８による制約として示される比較的小さい体積を照明する。観察体積内に目的の反応物、例えば酵素１１０および基質１１２を提供することにより、それらの働きを、反応物、例えば観察体積、例えば上部の線１０８の外部の基質１１４からの干渉を伴うことなく選択的に観察することができる。
【００８５】
上記のように、分子分析、例えば酵素分析の実施において目的の分子が照明または観察体積内に優先的に提供されることが一般に望ましい。したがって、ＺＭＷに適用される簡素な活性化方法が図１と関連した図２に概略的に図示される。図示のように、ＺＭＷ構造１００を最初に処理し、例えば実線２０２で示される活性化可能な表面が提供されうる。図示のように、処理ステップはクラッド層１０２を含む構造の表面全体にわたりかかる活性化可能な表面を提供するという点で選択的なものではない。次いで、例えば点線１０８により制約された照明体積内に存在する活性化可能な基に（点線２０４で示されるように）活性化が施される。ＺＭＷ構造に関連し、これは典型的には活性化可能な基を（波形矢印２０６で示されるように）透明基板１０４を通して活性化放射に暴露するステップを含む。活性化放射は照明体積を十分に越えると減衰し、そういうことからその内部の基、例えば点線１０８より下部の基のみを実質的に活性化することが理解されるであろう。次いで、目的の分子、例えば酵素または酵素に特異的な連結基が表面上以外の他でもない観察体積内で活性化基に連結される。考察を容易にするため、十分に限定された境界を有するものとしての照明体積への参照が簡素化され、ＺＭＷコアを通る照明の減衰があまり急激なものではないことが理解されるであろう。結果を予想すれば、照明とその結果のかかる照明からの表面の光活性化のレベルの双方が、導波路コアの照明の限界からの距離の増加に関連した形で低下することになる。放射減衰の速度および活性化レベルは、活性化プロセスの性質、例えば任意のポイントで飽和に達しているか否かや、活性化プロセスが単一の光子プロセスであるかまたは複数の光子プロセスであるかに応じて異なる速度で減少しうる。
【００８６】
他のプロセスでは、追加の活性化ステップを用い、目的の分子の連結対象でありうる領域をさらに選択することが可能である。特に、光閉じ込め、例えばＺＭＷ内での所与の活性化ステップでは、図１および２に示される照明の結果、一般に閉じ込め内に活性化のスペクトルが得られるとともに、照明が最大である場所、例えば導波路の底面に、より活性化された基が存在する。導波路内へのさらなる浸透とともに照明が低下する際、活性化レベルまたは活性化の効率が活性化可能な基の特性、照明の強度および暴露される時間量に応じて低下することになる。この結果、光の浸透が低下し、それ故に照明が低下する場合、照明領域の一部における基が活性化する確率が減少することになる。次いでこれらの活性化基を第２の光除去可能な基でキャップし、活性化ステップを繰り返すことで、存在する基が高照明から離れて活性化される確率が同様に制限されるが、この場合、それはより少数の基に適用される。これは以下の例でさらに図示される。すなわち、ＺＭＷ構造内で導波路の底からの特定の距離で光の第１の波長で活性化可能な均一な分布の光活性化可能な基を有する場合、存在するすべての活性化可能な基の半分が活性化される。次いで活性基が異なる波長で活性化される第２の光活性化可能な基でキャップされる場合、それらの基の活性化により再活性化される、特定の距離に存在する活性化可能な基は半数になるに過ぎないか、または元から活性化可能な基は４分の１になる。活性化スペクトルを超えて適用される場合の結果では、より狭く焦点化された活性化／連結エリアが得られ、それは導波路構造の底に接近している。
【００８７】
２通りの活性化方法の概略図が図３に提供される。２通りの活性化方法によると、例えば導波路構造３００に（パネルＩに黒菱形３０２で示される）表面上に均一に適用された光活性化可能な基の表面コーティングが提供される。第１の活性化ステップ（パネルＩＩ）を用い、例えば活性化光を導波路３００の底面３０６を通して誘導することにより、（白菱形３０４で示されるように）導波路内の活性化可能な基が活性化される。目的の分子をそれらの活性化基に連結するのではなく、異なる波長の光により活性化される（パネルＩＩＩ内の黒丸３０８で示される）第２の活性化可能な基を用いて活性化基３０４のキャッピングが可能である。次いで、その後の活性化ステップ（パネルＩＶ）により、（白丸３１０で示されるように）新規にキャップされた基のサブセットが活性化され、次いで（図示されない）目的の分子がこれらの新しい活性化基に連結される。図４は、第１および第２の双方の活性化ステップにおける、表面活性化（活性化された表面基の濃度）に対するＺＭＷの底面からの距離の典型的なシミュレートされたプロットを提供する。図示のように、第１の活性化ステップであればＺＭＷの底面から離れる活性化光の減衰の速度と相まって低下する活性化特性がもたらされると予想されることになる。第２の光除去可能な基でのキャッピングおよび異なる波長での再活性化の後であれば、先に活性化された基のみに基づくことを除き、同様の減衰特性が予想されることになる。その結果、活性化基であれば、導波路の底面で単一の活性化ステップだけの場合よりも集光性が高まることになる。２つのステップの観点で述べられるが、より多くのステップを実施すれば表面上の活性化領域にさらに集光性を高めることが可能であることが理解されるであろう。
【００８８】
特定の文脈から他に指定されない限り、本明細書で用いられるキャッピングは、一般に追加の基の、他の場合として得られた化合物がさらに適用される連結または他の目的の反応に対して活性を示さないような反応基に対する連結を示す。かかるキャッピング分子は、典型的には露光された連結基に連結することになるがそれ以外では所望の反応に対してナチュラルな（ｎａｔｕｒａｌ）基を含み、かつ基のキャップされる性質に応じて変化することになる。それらはシラノール表面基をキャップするための中性シラン基を含みうるか、またはそれらは他の非反応性材料、例えば非反応性有機材料、例えばアルコール、アルキル基、アルケニル基、または同種のものを含みうる。かかるキャッピング基は小分子でありうるかまたはより大きい高分子または高分子構造、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または同種のものを含みうる。キャッピング化学反応は、例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（キャス（Ｃａｓｓ）およびリグラー（Ｌｉｇｌｅｒ）編）  オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９８年、およびヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎｎ）ら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）  １９９２年（それらの全開示内容はあらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書中に援用される）にて考察されている表面修飾、誘導体化および不動態化プロセスにおいて広く行われる。
【００８９】
別の多段階アプローチでは、目的の分子の連結に注目するのに活性化および非活性化の反復ステップが用いられうる。先に示したように、例えば所望領域以外の領域が活性化されかつキャッピングまたはブロックされた後、目的の領域内での活性化および目的の分子の連結が行われる場合、光活性化可能な基が上記の非活性化スキームに従って用いられうる。この方法がＺＭＷに基づく用途においてより有用であることが判明する場合がある。特に導波路の開口端からの照明を通じ、典型的には、クラッド層の上面上だけでなく導波路コアの壁面上の活性化可能な基の一部で活性化可能な基が活性化され、最終的にキャップされることになる。次いで、コアの底または閉端からのその後の活性化によっては、まだキャップされていない活性化可能な基が活性化可能になるだけである。この結果、活性化放射がコアの長さの半分より長く浸透する程度まで、ＺＭＷの底でまたは底に向けて堆積のための活性化の選択性が拡大することになる。かかる方法は図５に概略的に図示される。
【００９０】
特に、表面全体にわたり、例えば閉じ込めの内外に光活性化可能な連結基（黒菱形５０２）を含む均一な表面を、上部に配置された光閉じ込め、例えばＺＭＷ５００を有する基板上に提供することができる（ステップＩ）。その後のステップ（ステップＩＩ）では、表面は上側、例えば目的の分子の固定化が望まれる領域から隔絶した上側からの活性化放射に露光される。次いで、活性化基（白菱形５０４）は、別の保護基（黒丸５０６）、例えば除去可能でない保護基によるキャッピングにより非活性化される（ステップＩＩＩ）。次いで、ＺＭＷは底から照明されることで、照明体積は所望領域を含みかつその領域内の連結基は活性化される（ステップＩＶ、白菱形５０８）。次いで、目的の分子はこれらの活性化基に連結される。初期の活性化照明の制御により、後の活性化ステップに先立ってキャップされる活性化可能な基の量を有効に制御することができる。特に、第１の活性化ステップにおける、活性化放射または活性化放射において導波路のコアの半分を越えて有効に伝播することを可能にする導波路の構成もしくは他の暴露条件の使用により、第１の活性化およびキャッピングステップにおいて半数を超える活性化可能な基を有効にキャップすることができる。次いで活性化放射を底側から誘導することにより、残存する活性化可能な基の実質的に全部は、第１のステップにおいて活性化、キャッピングがなされていないと思われるコアの底に向けて主に実質的に配置され、次いで活性化されかつ目的の分子への連結のために使用されうる。上記の様々なアプローチを組み合わせることで選択性をさらに高めることが可能であることが理解されるであろう。
【００９１】
上記の光活性化方法に図式的に類似した他のプロセスでは、遠ＵＶエッチングプロセスが、所望領域内、例えばＺＭＷの底面で活性表面を生成するのに用いられうる。特に、遠ＵＶ露光、例えば、真空下、２００ｎｍ未満での、すなわち遠ＵＶレーザ、遠ＵＶランプ、例えばＸｅｒａｄｅｘエキシマランプを用いる照明を用い、表面に結合された有機または無機材料が選択的に分解されており、そのようなことからＵＶ露光は、直接に、例えばプロセスの間に形成されうる酸素ラジカルからの援助なしに化学結合を破壊可能であり、それは過剰なエッチングに寄与しうる。かかる露光を真空下または酸素ラジカルにおける他の表面に接触しかつそれをエッチングする能力に関する他の制限下で行うことにより、有機および無機材料に照射する結果として選択された基板領域からそれらを制御可能に除去することができる。
【００９２】
本発明の表面との関連で、例えば、ＺＭＷ基板に追加の連結基に対して実質的に不活性な第１のブロッキング層を提供可能であり、例えばそれは最終的に目的の分子を表面にリンキングするのに用いられる連結方法の場合には非反応性を示す。結果として、元の表面上の官能基はこのブロッキング層により有効にブロックされる。ブロッキング層の例として、有機シラン、例えばＰＥＧ−シラン、遠ＵＶレジスト、または他の長鎖の有機シランが挙げられる。次いで、底または基板側からの導波路の遠ＵＶ放射への露光により、導波路内および優先的には導波路の底面でブロッキング層が分解される。
【００９３】
露光またはエッチングプロセスの間、酸素ラジカルにおける表面の他の部分、例えばＺＭＷの外部またはＺＭＷの底の方の観察領域の外部に接触する能力を制限することが望ましい場合がある。かかる場合、系は真空下で動作可能であり、または代わりにまたはそれに加え、シーリング層がＺＭＷ上部に提供されうる。かかるシーリング層は硬質層、例えばガラスまたはシリコンウエハー、あるいはより柔らかい材料、例えば高分子シート、例えばＰＤＭＳ、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、または導波路構造をシーリング可能な種々の高分子材料のいずれかを含む場合があり、好ましくは過剰なガス放出またはそれ以外では望ましくない化学残基の導波路への供給を伴わない。
【００９４】
露光後、基板は目的の分子と連結するのに用いられる官能基を含む材料と接触され、ブロックされていない領域、例えば「エッチング」プロセスにより暴露された、露光されたシラノール基に優先的に結合する。この追加材料は、官能基の密度を制御するのに機能化された基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｇｒｏｕｐｓ）のみかまたは機能化された基と不活性基の混合物、ひいては導波路構造内の目的の分子を含みうる。かかる機能化された基は、反応性化学種および／または特異的な結合部分、例えばアビジン、ビオチン、または同種のものでありうる。
【００９５】
一旦適切な密度の連結基が所望領域内、例えば導波路構造の底面に堆積されると、目的の分子は、例えば、反応基を介してまたは付加されたビオチン基もしくはアビジン基または連結基に対するもしくは連結基にリンキングされる他の特異的な結合相手を介して連結基に連結されうる。
【００９６】
上記の光活性化方法に類似の別のプロセスでは、架橋またはグラフトされた光開始剤が用いられる。目的の分子の特異的な固定化のための、アクリル酸塩、アルケンのラジカル重合またはリガンドを有するキャッピング試薬の末端ラジカルの付加を開始しかつ制御するジチオカルバメート（ＤＴＣ）などの光イニファーターが特に注目される。光開始剤で被覆された表面の所望領域が照明され、その領域内に限り反応が開始する。例えば、ヒドロキシル化されたシリコン基板がＮ，Ｎ−（ジエチルアミノ）ジチオカルバモイルベンジル（トリメトキシ）−シラン（ＳＢＤＣ）などの光イニファーターで処理可能であり、それにより基板の表面上に自己組織化単層が形成される。次いで、メチル−メタクリレート溶液が供給され、表面の所望領域へのＵＶ放射により重合が開始され、その領域内に限り（例えば連結基を含む）ＰＭＭＡの表面に架橋された高分子ブラシが形成される。
【００９７】
基板表面上の所望領域内で目的の分子を選択的に固定化する別の方法が、異なる領域内で異なる特性を有しかつ選択的な固定化プロセスにおける表面の異なる特性に依存する材料の選択的パターニングを含む。本明細書中に記載の典型的なＺＭＷ基板（ならびに他のハイブリッド基板タイプ、例えば表面に結合された目的の分子に依存する金属または半導体に基づくセンサ、例えばＣｈｅｍＦＥＴＳ）では、かかるパターニングされたハイブリッド表面は既に存在する。特にＺＭＷ基板は、典型的には金属クラッド層、例えば、シリカに基づく層、例えばＳｉＯ２上部に堆積された典型的には酸化アルミニウム表面層を含むアルミニウムであってＳｉＯ２層の上にクラッド層を通して配置された開口を有するものを含む。得られた導波路の構造は、金属壁または金属酸化物壁、例えばＳｉＯ２基板を有するＡｌ２Ｏ３を含む。酸化アルミニウム表面が典型的には水溶液中で比較的強く正に帯電される一方、ＳｉＯ２表面は実質的な負の電荷を保有する。かかる電荷差を用い、目的の分子が容易に他方の表面に対して一方の表面上に選択的に局在化され、固定化されうる。
【００９８】
例として、ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、典型的には比較的高レベルに正に帯電した表面残基を有する。結果として、ポリメラーゼは一般に、導波路構造の基板の負に帯電したガラス表面に付着され、吸着された状態で、正に帯電した金属クラッド層により反発されることになる。連結基が同様に堆積され、次いでポリメラーゼ（または別の目的の分子）が連結基に連結されうる。環境の性質を調節して酵素の電荷、例えばイオン強度、ｐＨ、添加剤などを改変するか、各表面を修飾して表面上の電荷成分を増減させるかあるいは金属を電気的に（放電）帯電させるか、あるいは酵素、連結試薬、または他の目的の分子を修飾し、例えば酵素の突然変異または荷電群、例えばポリリジン、ポリアルギニン、もしくは同種のもののようなポリイオンへの連結を通じてその表面電荷のレベルを調節することにより、異なる表面の相対引力／斥力を容易に修飾することができる。一態様では、ポリメラーゼ（または他の基または目的の分子）の負に帯電した表面上への堆積後、下記により詳細に考察されるように、正に帯電した表面はそれをウシ血清アルブミン（例えばアセチル化ＢＳＡ）、ポリグルタミン酸塩、高分子電解質、高分子電解質多層、高分子電解質−ＰＥＧ共重合体、ホスホン酸塩、またはリン酸塩などの作用物質で被覆することにより不動態化される。例えば、かかる不動態化は、単一の分子の核酸配列決定への適用の間、ヌクレオチド類似体のＺＭＷコアの正に帯電した金属壁への非特異的結合を阻止しうる。関連の態様では、不動態化は、ポリメラーゼ（または他の基または目的の分子）の堆積に先立って行われ、場合により選択的堆積を、例えばポリメラーゼの壁への結合をブロックすることにより促進する。
【００９９】
上記のように、材料の表面電荷は、一部の実施形態では、例えばｐＨの調整および／または表面の外部分極により対応可能な活性のある調整可能な特性でありうる。例えば、酸化スズ（透明材料）をドープすることでそれを導電性にでき、かつその表面電荷（分極）を所望の値に調節することが可能である。
【０１００】
同様に、他の表面選択の化学反応が利用可能である。例えば、異なるリン脂質組成物が、カルシウムの存在および不在の下で、金属酸化物表面および二酸化ケイ素に基づく表面の上に異なるレベルの支持されたリン脂質二重層を形成するという能力を示している。脂質組成物の選択およびカルシウムの存在または不在により、ブロッキング基または連結基のいずれかの分子の異なる表面タイプ上への堆積を標的にすることができる。例えば、金属酸化物表面への高い結合選択性を有するリン脂質を選択し、それを用いて表面の金属部分をブロックすることができる。あるいは、内在するガラス基板への高い結合選択性を有する適切な連結基を有するリン脂質を用いることにより、追加の基を透明基板に選択的に連結することができる。これらの選択性のリン脂質組成物の例が、例えばロセッティ（Ｒｏｓｓｅｔｔｉ）ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２００５年；２１（１４）：６４４３−５０頁（これはあらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。つまり、ハイブリッドＴｉＯ２／ＳｉＯ２表面に添加された、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）中に５０％〜２０％のＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファジルセリン）を含有するリン脂質小胞がカルシウムの不在下、ＳｉＯ２表面上で脂質二重層の選択的形成を示す一方、カルシウムの存在により同様にＴｉＯ２表面上での二重層形成が可能になる。
【０１０１】
ガラス選択性のリン脂質二重層（または他の表面への選択性の組成物）を連結基として用いるかまたはそれを金属層上へのその後のブロッキング層の堆積におけるマスク層として用いることができることが理解されるであろう。次いでこれを仮定すると、その後に脂質二重層のガラス基板からの除去と、その後の目的の分子の連結が行われることになる。
【０１０２】
あるいは、異なる表面の間の物理的／化学的差異が、具体的には選択の化学反応に基づく異なる結合に従う場合がある。例えば、特定の金属基と結合する特異的な基を用い、分子を他方の表面に対する一方の表面に選択的に局在化することが可能である（例えば、金／チオールの化学反応など）。
【０１０３】
別の例として、シラン（例えばメトキシ−シラン試薬）がＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合形成を介してシリカ表面と安定な結合を形成するが、適切に選択された反応条件下でアルミニウムまたは酸化アルミニウム表面を有意に修飾することはない（例えば、溶液中で特定の条件が好ましいようにシリカ表面の修飾には気相が好ましい）。したがって、シラン、例えば酵素または他の目的の分子（例えば米国特許出願第１１／２４０，６６２号明細書中に記載のビオチン−ＰＥＧ−シランなど）の付着における連結基で修飾されたシランを用い、シリカ表面を有するＺＭＷなどのハイブリッド基板を選択的にパターニングすることが可能である。Ａｌ２Ｏ３で予め修飾されたＳｉ表面についての偏光解析および接触角測定によると、シラン試薬の堆積での検出不能なレベルが示される。さらに、蛍光標識されたニュートラアビジンがビオチン−ＰＥＧ−シランのスライド上への堆積後にＡｌ２Ｏ３で修飾された溶融シリカのスライドに特異的に結合することがない一方、それに対し、（Ａｌ２Ｏ３で修飾されていない）溶融シリカのスライドをビオチン−ＰＥＧ−シランで修飾する結果、ニュートラアビジンのビオチンリガンドを介する結合において極めて高い特異性が得られる。かかる結果は、メトキシシラン試薬を用い、ＺＭＷまたはデバイスのアルミニウムの壁もしくは上面の修飾をほとんど有しない類似のデバイスの溶融シリカの底のみを修飾することの実行可能性を示す。
【０１０４】
別の例として、負に帯電した表面が、正の高分子電解質ブロックおよびＰＥＧ化（または類似の防汚）ブロックを有する共重合体の吸着により選択的に修飾されうる。ポリカチオンブロックが負に帯電したデバイスの領域に結合し、かつＰＥＧ成分が非反応性表面を提供し、非特異的結合を阻害する。典型的な高分子電解質−ＰＥＧ共重合体がＰＬＬ−ＰＥＧ（ポリ（Ｌ−リジン）−ポリ（エチレングリコール））を含む。ＰＥＧ基またはそのサブセットは、ビオチンなどの連結基または本明細書中に記載の他方の基を含みうる（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１２８２３４号明細書、「Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ」、ヒュベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）ら、ファン（Ｈｕａｎｇ）ら（２００２年）  「Ｂｉｏｔｉｎ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ））−ｇ−Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｉｎｇ」  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １８（１）：２２０−２３０頁を参照）。したがって、例えばＺＭＷのＳｉＯ２表面はＰＬＬ−ＰＥＧ−ビオチンで被覆され、次いでビオチン化ポリメラーゼがＰＬＬ−ＰＥＧ−ビオチンへのアビジンまたはストレプトアビジン結合を介してＺＭＷの底に連結されうる。
【０１０５】
一態様では、ハイブリッド基板（例えばＺＭＷ）内での目的の分子の１種の材料の上への選択的固定化が他種の材料の修飾により補償または促進される。例えば、単一の分子の核酸配列決定などの用途に用いられるべきＺＭＷにおいては、ポリメラーゼをＺＭＷの底のシリカ表面に選択的に固定化することが望ましく、かつ（ポリメラーゼの固定化の前後に）デバイスの金属壁および上面を不動態化することも望ましい。上記のように水溶液中で正に帯電する傾向がある未修飾のアルミニウムまたは酸化アルミニウムのＺＭＷ表面では、タンパク質（ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンおよびポリメラーゼなど）、（例えば類似体のリン酸基による）ヌクレオチド類似体、および色素（例えばスルホン酸基またはカルボキシル酸基を有する色素）の望ましくない非特異的結合が示されうる。上記のように、かかる望ましくない静電気相互作用は不活性化剤の表面への結合により最小化されうるが、適切な不活性化剤のさらなる例として、限定はされないが、ポリ（スチレンスルホン酸塩）およびポリ（アクリル酸）などの陰イオン高分子電解質ならびにヘパリンおよびアルギニンなどの高分子が挙げられる。
【０１０６】
しかし、一部の例では、陰イオン高分子電解質の正に帯電した表面への吸着の結果、表面の正味電荷の過補償が生じる可能性があり、そこではポリアニオンの吸着により、正味の表面電荷が正から負に変化する結果となる。この変化はヌクレオチド類似体または他の負に帯電した化合物の表面への非特異的吸着を原理的に最小化するが、多数のタンパク質（例えばポリメラーゼ）が負に帯電した表面に対して親和性を有するという不利を有する。したがって、かかる過補償により生成される負に帯電した表面が、不都合にも高レベルのポリメラーゼの非特異的結合をもたらす可能性がある。この問題は高塩の固定化条件の使用により対処可能であるが、高塩のレジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は高分子電解質層の膨張および高分子電解質の部分的低下を引き起こしうる。さらに、表面の高分子電解質によるコーティングが動的プロセスであり、かつポリメラーゼが最終的に高分子電解質と安定な活性をブロックする複合体を形成しうるという可能性がある。
【０１０７】
場合により、正に帯電した表面を陰イオン高分子電解質の吸着により不動態化するのではなく、正に帯電した表面が高分子電解質ブロック（負）およびＰＥＧ化ブロックを有する共重合体構造の結合により不動態化されうる。共重合体の高分子電解質ブロックは高分子を正に帯電したデバイスの領域（例えばＺＭＷのアルミニウムまたは酸化アルミニウムエリア）に吸着または固着させ、かつＰＥＧ成分はポリメラーゼの表面付着または高分子電解質ブロックとの複合体化を阻害する非イオン性のクッションをもたらす。例えば、高分子電解質（ＰＥ）−ＰＥＧ共重合体は、ジブロック（ＰＥＧ−ＰＥ）またはマルチブロック共重合体（例えばＰＥ−ＰＥＧ−ＰＥまたはＰＥＧ−ＰＥ−ＰＥＧ）、ならびに分枝高分子、櫛型高分子、またはデンドロンのような高分子でありうる。数種の典型的な線状および分岐状共重合体が図１６のパネルＶＩに概略的に図示される。本明細書中に記載の典型的な共重合体にＰＥＧが用いられる一方、任意の防汚骨格、例えばポリピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン、およびポリアクリルアミドなどが適用可能であることが明らかであろう。例えば、米国特許出願公開第２００２／０１２８２３４号明細書、ヴォロス（Ｖｏｒｏｓ）ら  （２００３年）  「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｕｓｈｉｏｎｓ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」  ＢｉｏＷｏｒｌｄ  ２：１６−１７頁、ファン（Ｈｕａｎｇ）ら  （２００２年）  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １８（１）：２２０−２３０頁、およびゾウラリアン（Ｚｏｕｌａｌｉａｎ）ら  （２００６年）  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １１０（５１）：２５６０３−２５６０５頁を参照のこと。
【０１０８】
異なる表面特性において異なる選択性を有する２種の組成物によるハイブリッド基板の直交性修飾が図１６に概略的に図示される。パネルＩに示されるように、ＺＭＷ１６００は、アルミニウムクラッド層１６０４を通して透明シリカ基板１６０６に対して配置されたコア１６０２を含む。アルミニウムコアは、薄い酸化アルミニウム層１６０５をその表面上に有する。パネルＩＩに示されるように、ＺＭＷの底面は、（例えば、場合により１つのコア当たり１つとし、表面上に、ビオチン連結基、ひいては最終的に目的の分子における所望の密度を提供するように選択された比での）ビオチン−ＰＥＧ−シラン１６２０とＰＥＧ−シラン１６２２の混合物で選択的に修飾される。次いで、パネルＩＩＩに図示のように、デバイスの壁および上面はポリアニオン−ＰＥＧ共重合体１６３０で選択的に修飾される。パネルＶにおける拡大図に示されるように、共重合体１６３０はポリアニオン（Ａ）ブロック１６３１およびＰＥＧ（Ｂ）ブロック１６３２を含む（アルミニウム表面の修飾が場合によりシリカ表面の修飾の後ではなく前に行われることは注目に値する。）。次いで、パネルＩＶに示されるように、ビオチン化ポリメラーゼ１６０８が、ニュートラアビジン１６０９を介してビオチン−ＰＥＧ−シラン１６２０上のビオチン連結基に結合される。
【０１０９】
一態様では、目的の分子が付着されていない表面（例えばアルミニウム表面）を不動態化するのに用いられる組成物はまた、機能性を表面に付加する、選択された密度の部分を有しうる。例えば、上記のＰＥ−ＰＥＧ共重合体では、蛍光消光部分１６４０がＰＥＧブロックの官能末端に付着されうる（図１６のパネルＶ）。別の例として、直交性リガンドのスキームを用い、タンパク質を付着させ、同スキームはポリメラーゼまたは他の目的の分子とともに縦列に機能可能であり、例えばビオチンがポリメラーゼ１６０８を固定化するのに用いられる場合の実施形態では、官能基１６４０はＳＮＡＰ、ＨＡ、ＧＳＴ、または類似の非ビオチン連結基であることで適切に修飾された第２のタンパク質に結合しうる。これらの第２のタンパク質を用いることで、新規に合成されたＤＮＡ鎖が破壊され、反応生成物の溶液からの除去が促進され、反応物の反応領域への移動が促進され、トリプレットクエンチャーの再生が促進され、またはそれに類することが行われる可能性がある。
【０１１０】
別の例として、目的の分子が固定化されることがないハイブリッド基板の表面は高分子電解質多層を用いて不動態化されうる。高分子電解質多層は、便利にも逆電荷の高分子電解質の層を交互に連続的に堆積することにより形成される。例えばデシェー（Ｄｅｃｈｅｒ）  （１９９７年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１２３２頁を参照のこと。高分子電解質多層の形成が図１７に概略的に図示される。パネルＩおよびＩＩに示されるように、ステップ１における正に帯電した基板１７０５はポリアニオン１７３２と接触され、それは基板の表面に吸着する。過剰なポリアニオンがステップ２で洗い流される。ステップ３において、ポリカチオン１７３４の層がステップ１で形成されたポリアニオン１７３２の層上に堆積され、過剰なポリカチオンがステップ４で洗い流される。ステップ１〜２および／または３〜４は必要に応じて繰り返され、逆帯電した高分子電解質の層が交互に堆積されかつ本質的に任意の所望の厚みの多層が形成され、表面電荷が得られる（ポリアニオンが最後に堆積される場合には負、またはポリカチオンが最後に堆積される場合には正）。パネルＩＩＩは、典型的なポリカチオンポリ（エチレンイミン）および典型的なポリアニオンポリ（アクリル酸）を図示し、それらは場合により用いられ、高分子電解質多層が形成される。
【０１１１】
場合により高分子電解質多層内の最後の層は、高分子電解質−ＰＥＧ共重合体、例えば（多層内の先行する層の電荷に応じて正または負のいずれかの）高分子電解質ブロックおよびＰＥＧ化ブロックを有する上記の共重合体などを含む。唯一の例として、高分子電解質多層内のポリ（アクリル酸）層の次にＰＬＬ−ＰＥＧまたはポリグルタミン酸塩−ＰＥＧの層が続くことで最後にＰＥＧが提供されうる。本明細書中に記載の典型的な共重合体にＰＥＧが用いられる一方、任意の防汚骨格、例えばポリピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン、およびポリアクリルアミドが適用可能であることは明白であろう。
【０１１２】
異なる表面特性において異なる選択性を有する２種の組成物によるハイブリッド基板の異なる表面の誘導体化および高分子電解質多層の形成が図１８に概略的に図示される。パネルＩに示されるように、ＺＭＷ１８００は、アルミニウムクラッド層１８０４を通して透明溶融シリカ層１８０６に対して配置されたコア１８０２を含む。アルミニウム壁は薄い酸化アルミニウム層１８０５をその表面上に有する。パネルＩＩに示されるように、ＺＭＷの底面は、ビオチン−ＰＥＧ−シラン１８２０とＰＥＧ−シラン１８２２の混合物により選択的に修飾される。次いで、パネルＩＩＩに図示のように、高分子電解質多層１８３０はデバイスの壁上および上面上に堆積される。高分子電解質多層は図１７に図示のように堆積可能であり、例えばポリアニオン（例えばポリ（アクリル酸））の層が正に帯電した酸化アルミニウム層１８０５の上に堆積され、次いでポリカチオン（例えばポリ（エチレンイミン））の層、次いでポリアニオンの別の層などが堆積される。単一の分子配列決定または類似の用途においては、高分子電解質多層の最後の層は典型的にはポリアニオン層であることから、高分子電解質多層の表面は負に帯電され、ヌクレオチド類似体（あるいは場合により、さらに表面に類似体に対する低い結合力を提供する、高分子電解質−ＰＥＧ共重合体または類似体）が反発される。次いで、パネルＩＶに示されるように、ビオチン化ポリメラーゼ１８０８はニュートラアビジン１８０９を介してビオチン−ＰＥＧ−シラン１８２０上のビオチン連結基に結合される。ＺＭＷを構成する材料の表面特性における差異のかかる利用、例えば非特異的結合を阻害するためのグラス底に特異的なシラン化処理（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）ならびに酸化アルミニウムの側面および上面の高分子電解質多層による不動態化により、ＺＭＷの底に対するポリメラーゼの占有が制限され、側壁面および上面に対するポリメラーゼの占有が回避されうる一方、ヌクレオチド類似体または同種のものの非特異的結合が制限されうる。
【０１１３】
ハイブリッド基板内で異なる材料がそれらの異なる表面特性に基づき異なる形で修飾されうる場合の方法のさらなる別の例として、（表面に特異的な化学吸着および／または自己組織化された単層形成を示す他の化合物が用いられうることから）リン酸塩およびホスホン酸化合物が用いられうる。リン酸塩またはホスホン酸部分は金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化タンタル、酸化ニオブ、酸化鉄、および酸化スズ）に強く結合するが、酸化ケイ素に強く結合することはない。したがって、少なくとも１つのリン酸基（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、プロトン化され、部分的もしくは完全に脱プロトン化され、かつ／または部分的もしくは完全に中和される）あるいはホスホン酸基（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、プロトン化され、部分的もしくは完全に脱プロトン化され、かつ／または部分的もしくは完全に中和される）を含む化合物を用い、ＺＭＷまたは類似のハイブリッド基板の酸化アルミニウム表面が選択的に修飾されうる。
【０１１４】
例えば、金属酸化物表面がアルキルリン酸塩またはアルキルホスホン酸塩で修飾されうる（ホスホン酸およびホスホン酸塩という用語は本明細書中で同義的に用いられる。）。典型的なアルキルリン酸塩およびアルキルホスホン酸塩は、限定はされないが、アルキル基が直鎖非置換アルキル基（例えば１〜２６個の炭素、例えば８〜２０個の炭素、例えば１２〜１８個の炭素を有する直鎖アルキル基）である場合のアルキルリン酸塩またはアルキルホスホン酸塩を含む。さらなる典型的なアルキルリン酸塩およびアルキルホスホン酸塩が、機能化または置換されたアルキルホスホン酸塩およびアルキルリン酸塩、例えば機能化されたＸ−アルキル−ホスホン酸塩およびＸ−アルキル−リン酸塩（式中、Ｘは、ビニル（ＣＨ２）、メチル（ＣＨ３）、アミン（ＮＨ２）、アルコール（ＣＨ２ＯＨ）、エポキシド、アクリレート、メタクリレート、チオール、カルボン酸塩、活性化エステル（ＮＨＳ−エステル）、マレイミド、ハロゲン化物、ホスホン酸塩、もしくはリン酸基を含むかまたはそれらよりなる末端基）、あるいはエチレングリコール（ＥＧ）オリゴマー（ＥＧ４、ＥＧ６、ＥＧ８）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、光開始剤（例えばジチオカルバメート（ＤＴＣ）などのフォトイニファーター（ｐｈｏｔｏ−ｉｎｉｆｅｒｔｅｒｓ））、フォトケージド（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）基、あるいは光反応基（例えばソラレン）を含む。Ｘ−アルキル−ホスホン酸塩またはＸ−アルキル−リン酸塩分子におけるアルキル鎖スペーサーは、場合により１〜２６、好ましくは８〜２０、およびより好ましくは１２〜１８のメチレン（ＣＨ２）のリピートユニットを有する疎水性の架橋鎖（ｔｅｔｈｅｒ）である。アルキル鎖は、１つもしくは複数（最大で全部）のフッ素化基を含む場合があり、かつ／または代わりに鎖に沿って１つもしくは複数の二重もしくは三重結合を有する炭化水素鎖でありうる。Ｘ−アルキル−リン酸塩層またはＸ−アルキル−ホスホン酸塩層は、表面スタックの他のリガンドまたは成分、例えば高分子電解質多層または化学吸着された多層を固着するための基板としてさらに用いられうる。アルキルリン酸塩／ホスホン酸塩は内在する材料（例えばアルミニウム）を腐食などから保護しうる安定な溶媒耐性のある自己組織化単層を形成する可能性があり、上記の構造内でのアルキル架橋鎖の役割は、水性環境下での化学吸着された単層の側部の安定性を高めることである。ホスホン酸塩またはリン酸塩化合物が不飽和炭化水素鎖を含む場合の実施形態では、二重もしくは三重結合は化合物を含む自己組織化単層を安定化するための側部の架橋部分として機能しうる。
【０１１５】
特定の典型的なアルキルリン酸塩およびアルキルホスホン酸塩は、限定はされないが、オクチルホスホン酸、デシルホスホン酸、ドデシルホスホン酸、ヘキサデシルホスホン酸、オクタデシルホスホン酸、ドコシルホスホン酸（すなわちＣ２２ホスホン酸）、ヒドロキシ−ドデシルホスホン酸（ＨＯ（ＣＨ２）１２Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ヒドロキシ−ウンデセニル−ホスホン酸、デカンジイルビス（ホスホン酸）、ドデシルリン酸、およびヒドロキシ−ドデシルリン酸を含む。偏光解析および／または接触角測定によると、オクチルホスホン酸、オクタデシルホスホン酸、ヒドロキシ−ドデシルホスホン酸、およびドデシルホスホン酸が、Ｓｉ／ＳｉＯ２表面に対するアルミニウム／酸化アルミニウム表面に向けての特異性を示すことが示される。金属酸化物のかかるリン酸塩およびホスホン酸塩による修飾が、例えば、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００１年）１７：３４２８頁、Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．（２００４年）１６：５６７０頁；Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００５年）１０９：１４４１頁、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００６年）２２：６４６９頁、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００６年）２２：９２５４頁、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００６年）２２：３９８８頁、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００３）１０７：１１７２６頁、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００３年）１０７：５８７７頁、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００１年）１７：４６２頁、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００６年）１１０：２５６０３頁、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００２）１８：３９５７頁、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００２年）１８：３５３７頁、およびラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００１年）１７：４０１４頁に記載されている。
【０１１６】
金属酸化物表面が同様にポリリン酸塩またはポリホスホン酸塩で修飾されうる。例えばポリホスホン酸塩の化学吸着が、リガンド（ホスホン酸部分）が基板（例えば、アルミナ、ジルコニア、またはチタニア）と化学複合体を形成する点で上記の高分子電解質吸着とは異なる。かかる相互作用は単純な静電気相互作用よりも強力でかつ塩交換に対して可逆性が低い。例として、限定はされないが、例えばゾウラリアン（Ｚｏｕｌａｌｉａｎ）ら（２００６年）  「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ａｌｋｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）」  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １１０（５１）：２５６０３−２５６０５頁に記載のＰＥＧ−ホスホン酸、またはＰＥＧ−ポリビニル（ホスホン酸塩）共重合体が挙げられる（一般に、化学吸着部分＋ＰＥＧまたは他の防汚部分を含む共重合体が本明細書中で検討されている）。
【０１１７】
他の適切なホスホン酸塩が、ポリビニルホスホン酸（ＰＶＰＡ）
【化３】
2009532032.tif 000004
の
【化４】
2009532032.tif 000005
および
【化５】
2009532032.tif 000006
（各々、ローディア（Ｒｈｏｄｉａ）からＡｑｕａｒｉｔｅ（登録商標）ＥＣ４０２０およびＡｑｕａｒｉｔｅ（登録商標）ＥＳＬとして市販）
など、末端キャップされた（ｅｎｄ−ｃａｐｐｅｄ）ホスホン酸塩、ならびに
ビニルホスホン酸−アクリル酸共重合体
【化６】
2009532032.tif 000007
（ローディア（Ｒｈｏｄｉａ）からＡｌｂｒｉｔｅｃｔ（商標）ＣＰ３０として市販）
などの共重合体などの高分子量の高分子ホスホン酸塩を含む。
【０１１８】
適切なホスホン酸塩には、２−カルボキシエチルホスホン酸（３−ホスホノプロピオン酸としても既知；ローディア（Ｒｈｏｄｉａ）からＡｌｂｒｉｔｅｃｔ（商標）ＰＭ２として市販）および表１に列挙される化合物（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のソルティア社（Ｓｏｌｕｔｉａ，Ｉｎｃ．）からＤｅｑｕｅｓｔ（登録商標）化合物として市販などの低分子量のホスホン酸塩も含まれる。ホスホン酸塩化合物は、塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、またはアンモニウム塩）あるいは好ましくは遊離酸として供給されうる。
【表１】
2009532032.tif 000008
【表１−２】
2009532032.tif 000009
【０１１９】
ポリメラーゼなどの目的の分子がＺＭＷ導波路コアのシリカ底面上に選択的に固定化される場合のＺＭＷの処理については、ホスホン酸塩およびリン酸塩のいくつかの典型的な使用が以下に示される。他のハイブリッド基板の処理に対して同様の検討が加えられることは明白であろう。一例として、ＺＭＷチップをホスホン酸塩で処理することでＺＭＷの酸化アルミニウム表面の不動態化が可能であり、次いで正に帯電したポリメラーゼが負に帯電したシリカ表面への選択的結合により固定化されうる。同様に、ＺＭＷチップはホスホン酸塩で処理可能であり、その後のポリメラーゼ（例えばニュートラアビジン）の固定化において使用可能な捕捉試薬がシリカ表面への結合により固定化可能であり、次いでポリメラーゼは捕捉剤への結合により固定化可能である。これらの例では、ホスホン酸塩は、酸化アルミニウム表面を不動態化し、（例えば酸化アルミニウムのブロッキングにより）バイアスをもたらし、かつ表面にヌクレオチド類似体などの弱い非特異的結合をもたらす。関連する例では、ポリメラーゼまたは捕捉剤の固定化後、高分子電解質多層が酸化アルミニウム表面上に形成され、それらが不動態化される。ホスホン酸塩およびリン酸塩はまた、ＺＭＷのシリカ表面を選択的に修飾する化合物とともに用いられうる。したがって、例えば酸化アルミニウム表面はホスホン酸塩で不動態化および／またはブロック可能であり、次いでシラン試薬を用いてシリカ表面の修飾が可能である（または逆にホスホン酸塩の堆積に先行するシリカ表面の修飾の場合も同様である）。
【０１２０】
実施形態の一群では、リン酸塩またはホスホン酸塩化合物は、高分子電解質多層が例えば上記のように逆帯電した高分子電解質の連続堆積により表面上に構築される第１の層として機能する。実施形態の関連群では、化学吸着された多層が表面上に形成される。化学吸着された多層は、例えば多重のホスホン酸塩を含有する試薬（例えばジホスホン酸塩、例えば１，ｎ−アルキルジホスホン酸、またはポリホスホン酸塩、例えばポリビニルホスホン酸）およびジルコニウム（ＩＶ）リガンドにおける交互の層を含みうる。ホスホン酸塩に対するジルコニウム（ＴＶ）リガンドが、ジルコニウムｔ−ブトキシド、アセチルアセトン酸ジルコニウム、またはジルコニウムエトキシドなどの前駆体を提供することにより提供可能であり、それからホスホン酸塩はリガンドをジルコニウム周辺に変位させる。多層は、当該技術分野で周知の方法を用い、例えば、基板または表面をホスホン酸塩の溶液中およびジルコニウム前駆体の溶液中に交互に浸漬する（中間に熱アニーリングステップを伴う）か、あるいはジルコニウムの有機金属化学蒸着（ＭＯＣＶＤ）または高速熱化学蒸着（ＲＴ−ＣＶＤ）を用いてホスホン酸塩の溶液中に交互に浸漬する（必要があればアニーリングステップを伴う）ことにより形成されうる。かかる化学吸着された多層は堅牢であり、高分子電解質多層に類似しているが、高分子電解質多層など、物理静電気層ではなく隣接層の間の化学吸着された「架橋」に等価なものを有するという利点がある。
【０１２１】
別の態様では、熱力学または拡散制限プロセスが、所望または非所望領域の選択的活性化および／または非活性化において用いられうる。特に、活性連結基がＺＭＷ構造内を含む基板表面上部に配置され、かつ活性形態で提供されうる。次いでそれらは、基板のキャッピング基またはブロッキング基へのいかなる追加的連結も阻止することになるそれらの基に暴露することにより後に選択的に非活性化される。所望領域上に存在する連結基がＺＭＷ内、例えば底面に存在することから、キャッピング剤またはブロッキング剤のこれらの基への拡散がやや制限される。その結果、それら連結基がブロックされる傾向が低下し（決してブロックされない基になる可能性が高く）、それらを用いることで目的の分子がＺＭＷの底面の方に連結されうる。特に、全体として基質のブロッキング剤への暴露の時間、ブロッキング剤の濃度、およびキャッピング反応の他の条件、例えば温度などを制御することにより、導波路内の連結基がブロックまたはキャップされた状態になる程度を制御することができる。本発明のこの態様では、ブロッキング成分が特定の連結基に特異的に結合し、目的の分子の連結を阻止する必要がないことが理解されるであろう。いくつかの場合、かかるブロッキング基またはキャッピング基が導波路または表面の他の部分の内部でのその存在を通じてかかる結合を阻止しうる。これは表面上部に薄層または単層を形成することで目的の分子の結合をブロックしうる疎水性または親水性のコーティング材を含みうるか、または所与の連結基での結合に対して連結基の活性な連結成分に実際に結合することなく空間的または立体的バリアを提供する。
【０１２２】
本発明の上記の態様は図６に概略的に図示される。図示のように、導波路構造６００に（白菱形で示される）その上に配置された連結基６０２の均一なコーティングが提供される。構造全体を（黒丸で示される）キャッピング基６０４に接触させることにより、導波路構造内に拡散制限されたキャッピングが得られ、その結果として、導波路構造の底面の方に後の接触ステップで目的の分子に連結するためのより活性な（キャップされていない）連結基６０２が残る。
【０１２３】
表面全体にわたり活性な連結基を提供する初期ステップは、例えばガラス基板上のシラノール基のように、単に基を内在する表面に直接連結させることを望む場合には回避されうることが理解されるであろう。特に、最初に表面上の任意の活性な連結基を比較的短時間ブロックすることにより、例えばＺＭＷの底領域内に存在しない、最も接近可能な同基は最初にブロックされることになる。その後、部分的にブロックまたはキャップされた表面基をかかる表面基に結合可能な連結基により長時間暴露することで、導波路構造の底領域上に固定化されたかかる連結基が得られることになる。各ステップでの時間、濃度、温度、および他の条件の量が、ブロッキングステップおよび連結ステップの各々における最適な条件を提供するように変更可能であり、かつ容易に同定可能な特性および単純な実験に基づき決定可能である。
【０１２４】
所望の位置に目的の分子を加法的に提供するための他のアプローチが、例えば光学的「ピンセット（ｔｗｅｅｚｅｒ）」技術を用いる所望の位置での分子の光学的捕捉によるものである。特に、光閉じ込め、例えばＺＭＷ内で集光レーザエネルギーにより生成される強力に増強された電場を用い、目的の分子などの粒子の濃度を高めるか、またはＺＭＷの焦点領域内でのその存在について高め、その後にそれを同領域内に位置する結合基に連結させることができる。捕捉に向く十分に大きい粒子を提供するため、目的の分子は、追加の基、例えばアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチン、または粒子、例えばビーズ、例えばヘパリンスパース（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｐａｒｓｅ  ｂｅａｄｓ）ビーズのようなものなどに連結した状態で提供されうる。かかる光学的捕捉／増強技術の利用により１０ｎｍ程の小さい粒子に対して捕捉力を発揮することについて、詳細な記載がなされている。例えば、ノボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）ら、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔｓ．７９（４）：６４５−６４８頁（１９９７年７月）（それはあらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１２５】
本発明は、上記または下記に考察の選択的活性化／非活性化プロセスに対する代替または追加プロセスとして、場合によりまたは追加的に目的の分子に連結することが望ましくないエリア上に中性基または不活性基を提供するための初期パターニングステップを含みうる。かかるパターニングは、最終の選択された表面をもたらすように特に意図されていない点で、典型的には局在化に対して粗い選択性をもたらす。例えば、マイクロウェルまたはナノウェルまたはそれ以外の平面内に提供される他の構造と関連し、かかる材料をナノ構造、例えばＺＭＷに堆積することなく、不活性基が印刷されるか、塗布されるか、またはそれ以外では基板の平面上部にパターニングされうる。まず不活性基と無関係な表面をブロックすることにより、そこで活性基を関連の領域内に堆積し、連結させることができる。さらに、ＺＭＷアレイとの関連では、アレイの密度、例えば導波路構造により占有される基板全体の百分率に依存し、無関係な表面の相当量がブロックされ、それにより、それ以外では例えば基板の減少、過剰な生成物の形成などによりデバイスの最終用途に干渉しうる目的の分子を保有することから阻止されうる。
【０１２６】
かかるパターニングは、不活性分子の不活性基が上部の凹部を貫通することがない表面上への単純なスタンピングを含みうるか、または不活性基を基板表面全体の上部に選択的に堆積することを目的とした選択的堆積、インクジェットプリンティング、または同種のものを提供するための、ナノリソグラフィーにより生成されるスタンプのいずれかを用いたより複雑なプリンティングパターンを含みうる。本発明のプロセスの例が図７に概略的に図示される。
【０１２７】
図示のように、（パネルＩにおける）基板表面７０４内に配置されたＺＭＷ７０２のアレイを含む基板７００が、活性官能基の基板表面７０４への連結を阻止する印刷可能な材料７０８を上部に担持する分離した基板７０６と接触される（パネルＩＩ）。表面７０４を印刷可能な材料７０８と接触させることにより、材料はＺＭＷ７０２に浸透することなく表面７０４に移る（パネルＩＩＩおよびＩＶ）。結果として、それに続く目的の分子の基板７００の上面７０４への連結がブロックされる。印刷可能な材料は、例えば表面上の任意の活性基を単にキャップする不活性表面と結合する基を含む種々の異なる材料のいずれかを含みうる。あるいは、かかる材料は、目的の分子との会合を阻止するコーティング材料、例えば疎水性もしくは親水性材料、任意の結合もしくは他の会合に反発する強力に帯電した材料、またはかかる材料、例えば高分子コーティング、レジストのようなものに浸透不可のバリアを提供する材料を含みうる。
【０１２８】
上記プロセスのいずれかは、表面選択性および／または局在化をさらに促進する、本明細書中に記載の他のプロセスと連携させることで実行可能であることが理解されるであろう。
【０１２９】
ＩＩＩ．減法的プロセス
上記のように、他の態様では、減法的プロセスを用いることで目的の分子が基板の所望領域内にかつ分子の所望の濃度および／または密度で提供される。上記のように、減法的プロセスは一般に特徴づけられており、目的の分子を例えば所望領域内を含む基板表面全体にわたりより遍在的に堆積させる点で上記の加法的プロセスとは異なる。次いで、例えば非所望領域内に位置する過剰な目的の分子が除去される。かかる減法的プロセスでは、種々の異なるプロセスが用いられうる。
【０１３０】
一例では、上記の光活性化可能なプロセスのほぼ逆のプロセスが用いられうる。特に、目的の分子の連結が、選択的に切断可能なリンカーまたは連結基を用い、基板表面上部で行われうる。種々の光切断可能なリンカーの化学物質は当該技術分野で既知であり、２−ニトロベンジルリンカー（例えば、ロデボー  Ｒ．（Ｒｏｄｅｂａｕｇｈ  Ｒ．）；フレイザー−レイド  Ｂ．（Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ  Ｂ．）；ゲイセン  Ｈ．Ｍ．（Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９７年、３８、７６５３−７６５６頁を参照）、ならびに多数の他の既知の光切断可能なリンカータイプを含む（例えば、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２（１５）、２３１５−２３１７頁、２０００年を参照）。
【０１３１】
本発明との関連で、連結基が、光切断可能なリンカー基を用い、基板表面に広範に適用可能である。次いで、目的の分子は実質的に非選択的に連結基に連結される。次いで、所望領域外部の領域の選択的照明によりこれらのエリアから目的の分子が放出され、かかる分子は実質的に単に所望領域内に連結された状態で残る。次いで基板の洗浄により、同分子が所望の用途との何らかの潜在的干渉から除外される。
【０１３２】
本発明のこの態様は図８に概略的に図示される。特に（白菱形で示される）連結基８０２が、導波路構造の表面上部の均一なコーティング内に提供されるが、その表面に（黒丸で示される）光切断可能なリンカー基８０４を介して付着される。次いで、連結が最終的に望ましくない場合、例えばＺＭＷコアの底面８０６ではない目的のエリア外部の表面が（波形矢印８０８で示される）光に暴露され、非所望領域内でリンカー基が切断され、同連結基が後の連結のために連結において使用可能な所望領域内、例えば底面８０６に残存する。
【０１３３】
目的の分子の特にナノ構造化されたウェルまたは他の閉じ込め空間、例えばＺＭＷのような光閉じ込めの内部への選択的固定化に対する別の減法的アプローチでは、例えば目的の分子またはその分子を表面にリンキングする成分のいずれかを非活性化するかあるいはそれ以外ではかかる分子の表面からの消化、非活性化、放出または排除を引き起こす非活性化成分が用いられる。考察を容易にするため、かかる成分が目的の分子を、例えば活性部位への非可逆的結合またはかかる目的の分子の他の修飾のようなものを通じて分解しかつ／または消化し、かかる分子を非活性化するか、あるいはそれらを表面から例えばリンキング基または別のものの切断を通じて単に放出することとは無関係に、かかる成分は本明細書中で「非活性化成分」と称される。
【０１３４】
より大きい非活性化成分、例えば酵素、すなわちプロテアーゼ、または他のより大きい高分子化合物、または同種のものが図６に示される連結基の拡散制限されたキャッピングと同様に導波路内により遅くることになり、かかるアプローチはＺＭＷ内での非活性化または排除を選択的に回避するのに熱力学に依存しうる。
【０１３５】
あるいは、本方法は、非活性化成分を閉じ込め空間、例えばＺＭＷの内部での目的の分子への接近から阻止するための追加成分の使用に依存しうる。かかる阻止の特に好ましい一態様は、非活性化成分の、ＺＭＷに少なくとも部分的に結合できない大きい成分、例えばビーズまたは他の粒子、または大きい高分子または分子の凝集体への連結を含む。かかるより大きい成分は、基板上のＺＭＷなどの凹部から少なくとも部分的に排除されるように大きさまたは形状が調整されることから、一般に排除成分と称される。非活性化成分が排除成分に連結されることから、それはＺＭＷを内蔵する基板の上面の上もしくは近傍に暴露された目的の分子に接近可能であるだけかまたはより接近可能であり、それ故に非活性化成分に接近可能であり、かつ構造内に十分に存在する同分子に接近できない。
【０１３６】
本発明のこの態様によると、非活性化成分であれば、例えば特定のリンキング分子、例えばビオチンを切断するための標的プロテアーゼを用いる、例えば非特異的もしくは特異的方法のいずれかでのタンパク質もしくはペプチドに基づく目的の分子またはリンキング成分の消化、切断または放出のための、消化分子、例えばプロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼ、すなわちプロテイナーゼＫ、スブチリシンなど、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼを含みうる。あるいは、かかる非活性化成分であれば、炭水化物もしくは核酸に基づくリンキング分子または目的の分子の消化または切断のための、炭水化物消化酵素（カルボヒドラーゼとも称される）、例えばセルラーゼおよびアミラーゼ、またはヌクレアーゼ、例えばエキソ−もしくはエンドヌクレアーゼなどを含みうる。本発明のこの態様は図９に概略的に図示される。
【０１３７】
図示のように、閉じ込め構造のアレイ９００、例えばＺＭＷ９０２に、例えばクラッド層９０８および基板層９１５の表面を含むその表面全体にわたりランダムに堆積された目的の分子９０４が提供される（ステップＩ）。次いで、それらの表面上に固定化された非活性化成分（またはそれ以外では目的の分子を非活性化、切断または放出する成分）を有する大粒子、例えばビーズ９１２がアレイ９００と接触される。ビーズ９１２が導波路９０２に対する開口よりも大きいことから、ビーズ上に固定化された非活性化成分は、構造９０２の外部にあるかまたはビーズ９１２上の固定化成分により接近可能なようにかかる構造の開口に対して十分に近傍にある表面上に堆積された目的の分子に対して接近および非活性化、消化、切断または放出可能であるに過ぎない。結果として、ＺＭＷ構造外部の表面の上もしくは近傍に存在する分子が排除されるかまたはそれ以外では非活性化され、導波路の閉じ込め空間内または排除空間内に十分に存在する同分子だけが残存する（ステップＩＩＩ）。本発明のこの態様はまた下記にさらに例示される。
【０１３８】
関連の態様では、ビーズに目的の分子とまたはそれに対して結合または架橋を行う結合または架橋成分が提供されうる。次いで、ビーズは、ビーズを有する目的の分子の少なくとも一部を取り込む表面から機構的に排除されうる。
【０１３９】
化学的および生化学的分析で一般に用いられるビーズ、すなわちアガロース、アクリル、シリカ、またはポリアクリルアミドビーズまたは同種のもの、あるいは他のクロマトグラフまたは酵素固定化用担体／マトリックス、例えばモビテック・ゲーエムベーハー（ＭｏＢｉＴｅｃ、ＧｍｂＨ）（独国、ゲッティンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ））から入手可能なＦ７ｍもしくはＧ３ｍマトリックス、磁気ビーズあるいは他の金属ビーズを含む種々の異なるタイプのビーズが用いられうる。同様に、非活性化成分をビーズにリンキングするための方法を変更することで所望の結果が得られうる。例えば、可変長を有するリンカー基を用い、非活性化成分を部分的にＺＭＷ内または他の閉じ込め空間内に浸透させることが可能になりうる。同様に、リンカーの剛性をリンカーの化学的構造および／または架橋により調節することで、非活性化成分におけるＺＭＷなどの閉じ込め空間に対する結合能の増大または低下がもたらされうる。
【０１４０】
ビーズの使用に対する他のアプローチでは、他の足場材料を用い、非活性化成分が支持され、かつその成分に、基板全体の上面、およびいくつかの場合、その表面上の凹部、例えば導波路コアの内部の表面のサブセットへの接近性が提供されうる。特に足場成分であれば、基板表面上の所与の凹部、例えばゼロモード導波路コアから全体的に排除されることがない非活性化成分が得られることになる。例として、非活性化成分は、凹部から単に部分的に排除されるかまたは特定の配向で提供される場合に限って排除される足場または支持分子に架橋または連結された状態で提供されうる。例えば、硬質もしくは半硬質の線状分子、例えば二本鎖核酸または他の硬質もしくは半硬質の細長い高分子の使用が可能であり、それは中間位置でそれに連結される非活性化成分、例えばプロテアーゼを含む。支持分子は、それが適切に、例えば縦方向に配向される場合に限って凹部に移動可能な十分な長さで提供される。凹部の縦方向に入るかまたは上面上に保持される結果として、上面上または凹部内部であって非活性化成分の到達範囲内でない同分子のみが非活性化されることになる。類似性によると、支持分子および中間の非活性化成分は、少なくとも部分的に支持分子上の非活性化成分の中間の位置決めにより、指定のように目的の分子を基板の上面および凹部内部の特定の距離から排除するための煙突掃除人（ｃｈｉｍｎｅｙ  ｓｗｅｅｐ）として機能する。
【０１４１】
深さが約１００ｎｍおよび直径が７０ｎｍの比較的典型的なゼロモード導波路構造の場合、例えば１５０ｎｍの長さの二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであればそれに非活性化成分、例えばプロテアーゼまたは同種のものが付加された状態で用いられうる。位置決めおよび連結が、一末端もしくは両末端から所与の距離の選択された位置でのオリゴヌクレオチド配列に挿入されているヌクレオチド類似体に対する共有結合による連結化学反応を通じて行われる。二本鎖ＤＮＡが機構的に硬質であることから、非活性化成分の付着対象のオリゴヌクレオチドの中央部分が支持分子の末端から離れている。二本鎖ＤＮＡの支持分子の末端のみが、導波路コアへの入力時にコアの底に到達可能となり、それ故、非活性化成分はコアの底または他の閉じ込め空間から離れて幾何学的に制限されることになる。したがって、ＺＭＷの（例えば）上面上または側壁上に存在する目的の分子であれば排除されることになる一方、ＺＭＷの底の上もしくは近傍、例えば照明体積内の目的の分子であれば残存することになる。非活性化成分の二本鎖核酸に対する位置による（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）連結が種々の方法により行われうる。例えば、タンパク質、例えばプロテアーゼまたは他の酵素の核酸の支持分子に対する連結の場合、プロテアーゼまたは他の酵素が、ＧＭＢＳ（ピアス（ＰＩＥＲＣＥ）から入手可能）などの二官能性架橋剤との複合によりマレイミド活性化されうる。このマレイミド活性化されたタンパク質は、内部チオール修飾を有するＤＮＡの一本鎖または二本鎖（例として、例えばオペロン社（Ｏｐｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．）から入手可能なＴＨＳＳで内部標識された分子）に直接連結されうる。チオール修飾はジスルフィドを介してキャップされ、ＴＣＥＰ（これもピアス（ＰＩＥＲＣＥ）から入手可能）による複合の間に排除される。同様に、内部チオールを有する核酸が、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば、ＭＡＬ−ＮＨＳ、マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と複合され、次いでアミン−ＮＨＳ反応を介してプロテアーゼに複合される。同様の反応を用い、アミノ修飾されたＤＮＡがその表面の上もしくは近傍で得られるチオールを有するプロテアーゼに複合されうる。
【０１４２】
上記プロセスは図１３に概略的に図示される。図示のように、ＺＭＷデバイス１３００は、クラッド層１３０４（さらに内在する透明層１３０６に延在する）内に配置されたコア１３０２を含む。パネルＩに示されるように、多数の目的の活性分子、例えばポリメラーゼ分子１３０８が（点線１３１０で示される）所望の照明領域内、上面１３１２上およびコア１３０２の上部壁面の双方を含む基板全体の表面に吸着されるかまたはそれ以外では連結される。本発明との関連で、またパネルＩＩに示されるように、非活性化成分、例えばプロテアーゼ分子１３１４が、中間位置で硬質の線状もしくは細長い支持分子、例えばｄｓＤＮＡ分子１３１６に連結される。結合した非活性化成分１３１４を有する支持分子１３１６は、そのサイズおよび構造的剛性故に、導波路構造１３００のコア１３０２をエンドオン（ｅｎｄ−ｏｎ）方向にだけ浸透するか、または全体構造の上面１３１２全域に置かれる。この結果、上面上または導波路コア内の部分距離を浸透する非活性化成分の到達範囲内に配置されるポリメラーゼのみが非活性化成分により潜在的な作用を受けることになる。そのようなものとして、導波路コアの底面またはその近傍、例えば照明領域内に配置されるポリメラーゼ分子は非活性化を免れることになる（パネルＩＩＩ）。非活性化成分の位置決めおよび／または支持分子の剛性は一般に非活性化が生じうるコア構造内の深さを調節するように選択されうることが理解されるであろう。
【０１４３】
上記のように、非活性化成分は場合により活性分子または連結基などを非特異的に消化するプロテイナーゼＫなどのプロテアーゼであることから、それが基板の表面から除去される。他の実施形態では、非活性化成分は部位特異的プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、または当該技術分野で使用可能な種々の他の部位特異的プロテアーゼのいずれか）である。部位特異的プロテアーゼの使用によりプロテアーゼの排除成分からの自動タンパク質分解的（ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断が回避される可能性があり、そうであれば不都合なことに構造の最適な閉じ込められた照明体積に接近可能である可溶性の活性プロテアーゼが放出されることになる。
【０１４４】
部位特異的プロテアーゼを用いる典型的な実施形態が図１４に概略的に図示される。図示のように、ＺＭＷデバイス１４００がクラッド層１４０４（さらに内在する透明層１４０６に延在する）内に配置されたコア１４０２を含む。この例では、ポリメラーゼ分子１４０８がペプチドリンカー１４２１を介してビオチン１４２０に共有結合され、それは部位特異的プロテアーゼ１４１５に対する切断認識部位を含む。ビオチン１４２０がストレプトアビジン１４０９に結合し、ストレプトアビジン１４０９が次いで基板の表面に吸着またはそれ以外では連結されるビオチン１４２２に結合されることで、ポリメラーゼ１４０８が表面に連結される。パネルＩに示されるように、多数の目的の活性分子、例えばポリメラーゼ分子１４０８が、（点線１４１０で示される）所望の照明領域内およびコア１４０２の上部壁面（および場合によりさらに上面１４１２上）の双方を含む基板全体の表面に連結される。パネルＩＩに示されるように、プロテアーゼ１４１５によるリンカー１４２１の切断によりポリメラーゼ１４０８が表面から放出される。部位特異的プロテアーゼ分子１４１５は、硬質の線状または細長い支持分子、例えばｄｓＤＮＡ分子１４１６に中間位置で連結される。上記の実施形態に関しては、そのサイズおよび構造的剛性故に、結合したプロテアーゼ１４１５を有する排除成分１４１６は、導波路構造１４００のコア１４０２をエンドオン方向にだけ浸透するか、または全体構造の上面１４１２全域に置かれる。この結果、上面上または導波路コア内の部分距離を浸透する非活性化成分の到達範囲内に配置されるポリメラーゼのみが非活性化成分により潜在的な作用を受ける。そのようなものとして、導波路コアの底面またはその近傍、例えば照明領域内に配置されるポリメラーゼ分子は、それらのリンカーがプロテアーゼに接近できす、切断されることがないことから表面に付着した状態になる。
【０１４５】
部位特異的プロテアーゼを用いる別の典型的な実施形態が図１５に概略的に図示される。図示のように、ＺＭＷデバイス１５００が、内在する透明層１５０６に延在するクラッド層１５０４内に配置されたコア１５０２を含む。この例では、パネルＩに図示のように、ビオチン連結基１５２２が基板全体の表面にペプチドリンカー１５２１を介して連結され、それは部位特異的プロテアーゼ１５１５に対する切断認識部位を含む。プロテアーゼ１５１５によるリンカー１５２１の切断により、ビオチン１５２２が表面から放出される。パネルＩＩに示されるように、プロテアーゼ１５１５が排除成分の二本鎖ＤＮＡ１５１６に連結されることから、プロテアーゼはビオチン１５２２を、コア１５０２の最下位部分を除く表面のあらゆる箇所から除去する。次いで、パネルＩＩＩに示されるように、ビオチン１５２０に連結されたストレプトアビジン１５０９（またはニュートラアビジンなど）およびポリメラーゼ１５０８は基板上に堆積され、最適な閉じ込め照明体積１５１０内に限りビオチン１５２２に結合することにより保持される。
【０１４６】
目的の分子の選択的局在化における別の代替の減法的方法が、非所望領域内でのその分子自体のそれに対する活性の使用を含む。例えば固定化された核酸ポリメラーゼ酵素の場合、かかる酵素が蛍光標識されたヌクレオチドを励起照明下で取り込む場合における光損傷の結果として実質的不活性化を被る可能性があることが確認されている。本発明の減法的態様によると、蛍光標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の存在下での核酸合成の間に導波路基板の上面で酵素に長期の照明を施すことにより、それらの分子を有効に不活性化することができる。上記の活性化／不活性化に基づく加法的アプローチのように、照明を破壊する場合にはＺＭＷの底面または目的のエリアへの浸透が生じることがないことから、かかる酵素がこれらの位置に存在するのあれば活性を維持することになることが理解されるであろう。フルオロフォア媒介性のポリメラーゼの不活性化については、２００５年１２月２日に出願され、あらゆる目的で全体が本明細書中に援用される同一出願人による米国特許出願第１１／２９３，０４０号明細書中に詳細に考察されている。他の酵素／蛍光基質ペアであれば、例えばＡＴＰ結合タンパク質／蛍光標識されたＡＴＰなど、類似の特性が得られることが予想されることになる。さらに、放射時にラジカルを生成する他の成分が用いられる場合があり、その放射により拡散的接触内部に存在するそれら分子が損傷を受けることになる。例えば、かかる化合物の存在下で導波路構造の上面を照明するのであれば酸素または他の遊離基を生成することができ、それらはかかる化合物の拡散の到達範囲内で目的の分子を非活性化することになる。種々のかかる化合物は当該技術分野で既知であり、例として、例えばインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））から入手可能なメチレンブルー、ヒポクレリン（ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ）Ａ、ヒポクレリンＢ、ヒペリシン、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ  Ｂｅｎｇａｌ）の二酢酸塩、メロシアニン５４０、および他の色素を含む。
【０１４７】
本発明の別の態様では、目的の分子の減法的な選択においては基板の構造特性が盛んに用いられうる。特に、ＺＭＷなどの光閉じ込めを含む基板が、典型的には透明層、例えばガラスまたは石英の上に堆積された金属層を含み、それを通して導波路が配置され、導波路の底面に透明基板が暴露される。本発明によると、金属層およびガラス層の双方に連結された目的の分子を含む基板全体が選択的に分割される場合があり、例えば金属層とその上部に堆積された溶液の間に例えばかかる流体と接触状態にある電極の使用を通じて電位を印加することにより例えば金属表面から目的の分子が除去される。内在する基板が導電性を示さないことから、基板の表面と流体の間の場が金属層と流体の間の場よりも実質的に弱いことになる。次いで電位を用い、目的の分子を金属表面から溶液中に選択的に駆動することが可能である（図１０を参照）。この駆動力を選択しかつ／または制御することで、例えば非所望表面領域内の表面から外部へと帯電した目的の分子を駆動するかまたはかかる表面の方へキャッピング基を駆動する電気泳動力、あるいは代わりにまたはそれに加え、金属表面での局所環境内での変化、例えば金属表面での陽子の生成に起因するｐＨ変化が得られ、その結果、例えば酸不安定性リンカー、電荷に基づく連鎖、例えば水素結合の使用による表面からの放出、局所的に厳しい環境の生成を通じた金属表面上での目的の分子の加水分解的分解のようなものがもたらされる。
【０１４８】
別の態様では、電気化学的に放出可能なリンカー化合物を用い、電気的に活性な表面から目的の分子を放出することが可能である。例として、電気化学的に制御可能な連結を含むリンキング分子がハイブリッド（金属／絶縁体）基板の表面全体上にパターニングされうる。表面の金属部分を通して電流を加える結果、連結分子が放出される。かかる電気的に切替可能なリンカーの例として、キノンプロピオン酸エステルにリンキングされるビオチンの自己組織化単層を担持するリンカー化合物、すなわち金表面上のアルカンチオレートが挙げられる。内在する金属基板への電位の印加の結果、キニーネ架橋型の分子、例えばビオチンの放出に伴い迅速にラクトン化を受けるヒドロキノンへの還元がもたらされる（例えば、ホドネランド（Ｈｏｄｎｅｌａｎｄ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００年、１２２：４２３５−４２３６頁を参照）。
【０１４９】
光閉じ込め内でのかかる方法の使用に加え、かかる電気泳動的かつ／または電気化学的選択および固定化プロセスが、例えば表面に結合される目的の分子に依存する金属もしくは半導体に基づくセンサ、例えばＣｈｅｍＦＥＴＳ（化学的電界効果トランジスタ）などを含む他のハイブリッド分析用基板タイプに同様に適用されうることが理解されるであろう。特に金属または半導体センサ素子は、連結を促進するための、センサの表面からのまたは表面に向かう異なる基の反発または吸引における１つの電極として用いられうる。
【０１５０】
他の減法的プロセスでは、それ以外で活性表面が基板の上面上に目的の分子を同伴するリフトオフ層で被覆される場合、およびＺＭＷ内に特定の距離だけ透過するいくつかの場合、リフトオフ法が用いられうる。層のリフトオフにより層に同伴された目的の分子がもたらされ、同伴されない同分子、例えばＺＭＷの底面に存在する同分子の維持が可能になる。
【０１５１】
この技術は図１１に概略的に図示される。図示のように、均一またはランダム分布された目的の分子１１０４が、かかる分子にとって望ましい選択された領域を含む基板１１００上部に堆積される（ステップＩ）。図１１の場合、かかる領域はＺＭＷ１１０２のような光閉じ込めを含む。次いで、コーティング層１１０６が、例えば１以上の粘度を有する粘稠液として表面上部に堆積される（ステップＩＩ）。その相対的粘度および導波路１１０２の比較的小さい寸法および／または導波路コア内に存在する液体材料中での材料の比較的遅い拡散が原因で、コーティング層１１０６は典型的には導波路構造内に完全に流れることがなくなる。次いで、コーティング層は、典型的には、例えば風乾、加熱またはＵＶ放射への暴露、化学的架橋、コーティング層内での目的の分子、例えば目的の分子１１０８の同伴により除去可能である。除去時、コーティング層内に同伴される任意の目的の分子が同様に除去され、導波路構造内に十分に存在した目的の分子、例えば分子１１１０のみが残存する（ステップＩＩＩ）。上記の方法がコーティング層における導波路構造を浸透してかかる構造内に目的の分子を残すという限られた能力に依存するが、かかる方法がかかる制限された構造の不在下で適用可能であることは理解されるであろう。例えば、コーティング層を例えばスクリーニングまたはインクジェットプリンティング法を通じて表面上に選択的にパターニングすることで、目的の分子を選択された領域から同伴させ、除去することが可能である。
【０１５２】
別の減法的で選択的な固定化プロセスが一般に、目的の分子にとって望ましい場所への局在化を保証するためのマスキング方法に依存する。特にかかるマスキング方法では、典型的には、目的の分子を非所望位置から除去するのに除去可能であるか、または目的の分子の均一に分布した集団上部に堆積されることで同分子に所望の働きに接近できない非所望位置が与えられるといったマスク層が用いられる。
【０１５３】
他のより単純なブルートフォース（ｂｒｕｔｅ  ｆｏｒｃｅ）技術が、特に減法的プロセスに関連した本発明の特定の態様の範囲内に該当する。例えば、連結基を暴露表面、例えば導波路アレイ基板の上面の上または近傍の表面を除去するための単純な除去プロセスを用いることができる。かかる基の除去であれば、導波路構造の外部の表面に結合される目的の分子の量の減少が予想されることになる。かかる除去プロセスは、接触時または暴露時に材料を除去することになる、例えばレーザ除去技術、高純度の（ｈｉｇｈ  ｓｈｅｅｒ）流体除去技術、機械摩耗技術などを含む。上面でかかる除去可能なプロセスを誘導することにより、除去力が導波路構造にほとんど伝播することがほとんどないことが予想される。追加の調節を行うことでプロセスの選択性がさらに高まる可能性がある。例えば、レーザ除去技術を用いれば、基板の上面に対する傾斜角でビームを誘導することで、高い縦横比の凹部、例えばＺＭＷに最小距離だけ浸透させることができる。同様に、除去エネルギーであれば、調節により、例えばアレイ内のＺＭＷ間の基板表面領域または空間に焦点が合わされた、目的の分子の最終的な連結が望ましい場合の領域を含まない領域に集光させることが可能である。
【０１５４】
一旦連結基が基板の表面上、例えばＺＭＷの底面など、所望領域内に提供されていると、目的の分子はそこで同活性基に連結される。本明細書中の他の箇所で示されるように、連結は化学官能基、例えば水酸基、アミノ基、エポキシ基のような基を介しうる。あるいは、例えば特異的な結合対の一方のメンバーが表面に付着された連結基であり（または表面に付着される連結基に付着され）、かつ結合対の他方のメンバーが目的の分子に付着されるかまたは一体化される場合、連結が特異的な結合相手を通して生じうる。特に好ましい態様では、かかる特定の結合対を用いて目的の分子が表面に連結され、これには例えば結合対の一方のメンバーとしてのアビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンの使用、および他方のメンバーとしてのビオチンの使用が含まれる。さらに、サンドイッチ結合法が用いられる場合があり、例えばビオチンの目的のエリア内の表面への連結、その後にアビジンへのリンキング、次いで目的の分子に連結されたビオチン分子へのリンキングが生じる。典型的には、シランリンカー基が最初の官能基として用いられる。この基は、表面上に直接提供されるか、または先に示唆されたように追加の連結に対して不活性な類似のシランリンカーで希釈される場合がある。特に好ましい態様では、シランリンカーを担持する例えばビオチン基が初期ステップで固定化され、その後に目的の分子、例えばポリメラーゼ酵素の、酵素リンキング型ビオチン基に連結された架橋アビジン基を介する連結が行われる。種々の異なる配置のいすれかが本発明との関連で実用可能であることが理解されるであろう。
【０１５５】
酵素またはその他では活性タンパク質である目的の分子の場合、固定化の方向は酵素の活性を最適化する重要な特性でありうる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの場合、ポリメラーゼの表面へのランダム吸着により、一部の分子がそれらの最適な活性の提示を阻止するような方法で配向される結果として少なくとも部分的に実質的に１００％未満の活性がもたらされうる。そのようなものとして、分子上への固着基（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）の提供により分子の特定の配向をもたらし、正確な配向の確率を増大させることが望ましい場合がある。かかる方法は、先行的に２００５年１２月２２日に出願され、あらゆる目的で全体が参照により本明細書中に援用される公有の米国仮特許出願第６０／７５３，４４６号明細書中に記載されている。あるいは、酵素の活性部位をブロックする方法で表面吸着を阻止しうる基質分子または代理基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｒｏｘｙ）を酵素に提供することができる。例として、鋳型核酸分子の存在下での核酸ポリメラーゼ酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼの固定化により、活性が実質的に高まった表面固定化ポリメラーゼが得られることが確認されている。働きについての特定の理論に縛られないとして、ポリメラーゼの活性部位内での鋳型分子の存在により、結合した鋳型からの立体的干渉または他の干渉に起因し、ポリメラーゼの固定化が活性部位に干渉する様式で阻止されると考えられる。鋳型核酸分子が用いられうる一方、例えばＬＮＡ高分子鎖、ＰＮＡ高分子、または他の核酸類似体を含む他の鋳型様の分子も用いられうる。
【実施例】
【０１５６】
実施例１：ＤＮＡポリメラーゼの選択的固定化のための光活性化可能な基
ガラス基板層の上に堆積されたアルミニウムクラッド層を有するガラス層を含む基板が使用可能である。ＺＭＷコアのアレイをクラッド層内に作製し、クラッド層を通してガラス基板に対して開口を提供する。場合により基板全体をさらに処理し、例えばクラッド層およびコアの上部に薄い絶縁層を提供し、実質的に均一の表面を提供する。かかる層は、典型的には、例えばＣＶＤおよびＭＶＤ法を含む蒸着技術、ならびに例えばスピンオンガラス系を用いる流体堆積または原位置形成などの他の方法により適用されるＳｉＯ２コーティングを含む。基板表面を誘導体化し、まず表面に連結されたアミノ末端基の相対的に均一な集団を提供する。例えばガラス表面においては、かかる誘導体化では典型的に当該技術分野で既知の標準のアミノシランの化学反応を用いる。あるいは、アミン基を、既存の水酸基を介して表面かまたはそれ以外では誘導体化された表面に連結されたリンカー分子上に提供可能である。かかる連結基を、最終的に表面に結合されることになる目的の分子の密度をさらに制御するため、制限された密度で提供可能である（例えば、２００５年９月３０日出願の同一出願人による米国特許出願第１１／２４０，６６２号明細書（あらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される）を参照）。
【０１５７】
次いで、適切な光不安定性保護基、例えばＭｅＮＰＯＣでキャップされたビオチン分子を、既知の化学反応を用い、例えばビオチン分子上に含まれるエポキシ基を介し、誘導体化された表面と連結させる。
【０１５８】
表面の洗浄後、適切な照明放射を透明ガラス基板層を通して基板に誘導し、ＺＭＷの底面またはその近傍のビオチン基のみを照明し、脱保護する。次いで、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンにリンキングされたＤＮＡポリメラーゼ酵素を基板と接触させ、それは導波路の底部で暴露されたビオチンと選択的に結合する。
【０１５９】
第２の典型的なプロセスでは、光活性化可能な酸基、例えば表面に連結されたα−メチルフェナシルエステルを上記と同様に表面に連結させる。ＺＭＷを通しての例えば３１３ｎｍでの照明により、導波路の底面に酸基が生成し、次いでそれにおけるアミノビオチン基との接触、その後のアビジンとリンキングしたポリメラーゼ酵素との連結により、導波路の底面またはその近傍でのみ酵素群が生成する。
【０１６０】
実施例２：ビーズと結合されたプロテアーゼを用いるＤＮＡポリメラーゼ酵素の選択的消化
（プライミング層を提供するため）ＰＤＭＳガスケットの存在下で予めプラズマ処理したＺＭＷに、クラッド層の上面上を含むアレイの表面全体にわたり実質的に均一に表面吸着された（環状鋳型核酸と複合体を形成した）Φ２９Ｎ６２ＤＤＮＡポリメラーゼを提供した。
【０１６１】
次いで、アレイを、ビーズを担持する固定化されたＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｋ
（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、Ｐ０８０３またはＰ９２９０）と、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡの中、室温で５分間接触させた。ビーズ直径はアレイ上の導波路コアの公称直径よりもはるかに大きく、ビーズまたはそれと結合したプロテアーゼ分子のコアへの侵入がいかなる実質的程度であっても阻止された。
【０１６２】
次いで、４つのｄＮＴＰを含む重合反応混合物をＤＮＡ合成に適する条件（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．７ｍＭ  ＭｎＣｌ２）下でアレイに接触させ、３０℃で３０分間、合成を進行させた。
【０１６３】
合成後、アレイ上の任意の合成ＤＮＡをＳｙｂｒＧｏｌｄ染色で染色した。次いで、アレイを標準の蛍光顕微鏡を用いて画像化した。アレイの画像および負の対照実験の画像を図１２に示す。負の対照（ローＩ）に示されるように、底側の照明（カラムＡ）が導波路構造内での有意な量のＤＮＡの存在を示す一方、上側の照明および観察（カラムＢ）がアレイの表面全体にわたって生成されたＤＮＡの均一な層を示す。プロテイナーゼで処理されたアレイ（ローＩＩ）では、底側（カラムＡ）と上側（カラムＢ）の双方が特定の導波路内でのＤＮＡの存在における類似パターンを示す。さらに分かるように、アレイ内の導波路内部以外の上面上にＤＮＡがほとんど存在せず、これは対照実験において存在するＤＮＡ合成が高レベルから実質的に低下することを示す。さらに注目すべきことは、上面からのＤＮＡの存在を示す導波路が下部表面からのＤＮＡの存在を示す同じ導波路をたどり、それはＤＮＡ合成が導波路コアの外部ではなく導波路構造内部で生じていることを示す。これはまた、導波路構造内部で合成されるＤＮＡが、直径が約７０ｎｍでかつ深さが１００ｎｍのコア領域を有する導波路構造の頂部および底部での照明領域に及ぶことから、例えば５００を超える塩基長、潜在的に最大で１０００以上の塩基長といった実質的長さを有することを示す。
【０１６４】
ＤＮＡ合成実験を末端リン酸基で標識された標識ヌクレオシドポリリン酸類似体の存在下でも行った（例えば、公開された米国特許出願公開第２００３−００４４７８１号明細書およびレビーン（Ｌｅｖｅｎｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００３年）  ２９９：６０９−７６４頁（これらの開示内容全体はあらゆる目的でそれら全体が本明細書中に援用される）を参照）。これらのアッセイによると、プロテイナーゼで処理されていない導波路アレイよりも実質的に優れたシグナル対ノイズ比が示され、それは例えばポリメラーゼ反応の生成物により標識された他のノイズ源からの干渉が著しく低下したことを示す。結果として、分析用基板の所望領域、すなわち観察領域の内部に限ってのポリメラーゼ酵素などの目的の分子の供給が基板が適用される用途に対して極めて有用な結果を有しうることが明らかであると思われる。
【０１６５】
実施例３：表面の異なる修飾によるＤＮＡポリメラーゼの選択的固定化
以下に、ＺＭＷの底面上でのＤＮＡポリメラーゼの選択的固定化および高分子電解質多層を有する残りのＺＭＷ表面の不動態化を実証する一連の実験を示す。シランとガラスおよび酸化アルミニウムとの異なる反応性を用いるプロセスを図１８に概略的に図示する。ＰＥＧ−ビオチンのシラン化処理が用いられる条件下でガラスに特異的であることにより、ＺＭＷ底面のみに化学的誘導体化がもたらされる。次いで、アルミニウム層を高分子電解質多層、この実施例ではＰＡＡ／ＰＥＩ／ＰＡＡ／ＰＥＩ／ＰＡＡ（ここでＰＡＡはポリ（アクリル酸）、ＰＥＩはポリ（エチレンイミン）である）の２．５倍の多層を用いて不動態化する。ビオチンでタグ化されたポリメラーゼは高分子電解質多層により拒絶されるが、アビジン化学反応を介してビオチン化ＰＥＧ表面に結合し、それによりポリメラーゼのＺＭＷの底面へのバイアスされた固定化がもたらされる。さらに、高分子電解質多層はヌクレオチド類似体のアルミニウム層への非特異的結合を制限する。
【０１６６】
ＺＭＷの底面上へのポリメラーゼのバイアスされた固定化を以下のように行った。ＺＭＷチップを酸素プラズマ中、２トール（中程度の出力設定）で２分間清浄する。ＰＥＧ−ビオチンのシラン化処理を、２７０：１（ｗ／ｗ）エタノール：メタノール溶媒中のＰＥＧメトキシシランおよびビオチン−ＰＥＧシランの混合物（ポリマー・ソース社（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｃ．））を用い、４℃で３時間行う。試料をメタノールですすぎ、熱水（７０℃）中で３分間超音波処理し、冷水で洗浄した。高分子電解質の手順は２０ｍｇ／ｍｌのポリアクリル酸およびポリエチレンイミン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＨＣｌで調整したｐＨ７．５）中、室温で５分間のチップの連続浸漬からなるものであり、各ステップの後にＰＡＡ／ＰＥＩ／ＰＡＡ／ＰＥＩ／ＰＡＡの順に水で３回すすぐ。最後の洗浄を５容量に相当する水で行う。
【０１６７】
４つのヌクレオチド類似体のバイアスされた固定化表面（ＰＥＧ−シランの混合物による処理とその後の高分子電解質多層形成がなされたＺＭＷチップ）および対照表面（プラズマ−ＰＤＭＳで処理されたチップ）に対する非特異的結合を比較した（図１９）。対照チップに対して用いたプラズマ−ＰＤＭＳ処理では、構造全体が均一な層で被覆されることからバイアスが除去され、これは２００６年１１月２７日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５，４２９を参照のこと。チップを蛍光標識されたヌクレオチド類似体の混合物（Ａ４８８−ｄＡ４Ｐ、ＦＡＭ−Ａ５３２−ｄＧ４Ｐ、ＦＡＭ−Ａ５９４−ｄＴ４Ｐ、Ａ６３３−ｄＣ４Ｐ、各々５μＭ；類似体の命名法については例えば米国特許出願第１１／６４５，２２３号明細書を参照。）とともにインキュベートし、レーザ照明を施した。１００ｆｐｓのカメラ速度で１分間の動画を撮影した。各々のスペクトル分離された類似体について、蛍光トレースを閾値アルゴリズムを用いて特注の分析ソフトウェアにより分析し、グラフで示される非特異的吸着事象の数を判定した。図１９で示されるように、バイアスされた固定化表面は非特異的な類似体との結合の阻止にはプラズマ−ＰＤＭＳ表面と同程度に良好である（それは良好な非特異的結合特性を示す）。類似体が単一のパルスが同定できない程度まで未処理表面に結合することから、類似体の未処理表面への結合を定量しなかった。
【０１６８】
図２０に図示のように、高分子電解質多層のアルミニウム表面上への堆積によりポリメラーゼの非特異的結合が阻止される。２．５×ＰＡＡ／ＰＥＩ／ＰＡＡ／ＰＥＩ／ＰＡＡ高分子電解質多層で処理したアルミニウム表面上でＤＮＡ合成が本質的に全く観察されない一方（パネルＩ）、高分子電解質多層で処理されていない対照表面の表面全体にわたりＤＮＡが生成される（パネルＩＩ）。重合反応を以下のように行った。すなわち、１００ｎＭのポリメラーゼを、２５ｍＭトリス−酢酸塩、ｐＨ７．５、３００ｍＭの酢酸カリウム、０．０５％のトゥイーン２０および５ｍＭのジチオトレイトールを含有するＢＦ−３００緩衝液中で（１５０ｎＭで過剰に存在する）ニュートラアビジンに４℃で３０分間結合させた。溶液を、酢酸カリウム（ＢＦ−Ｏ）を含有しない点以外は上記と同じ緩衝液を用いての２倍の希釈により、１５０ｍＭの有効な酢酸カリウム濃度に希釈した。ポリメラーゼ／ニュートラアビジン混合物をＺＭＷチップ上で４℃で３０分間インキュベートし、ＢＦ−１５０緩衝液（ＢＦ−３００と同じ緩衝液であるが１５０ｍＭの酢酸カリウムを含む）で３回洗浄した。１００ｎＭの鋳型を、４ｍＭ  ＥＤＴＡを補充した反応緩衝液（５０ｍＭトリス酢酸塩、ｐＨ７．５、７５ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．０５％トゥイーン２０および５ｍＭジチオトレイトール）中、４℃で２０分間付加した。鋳型溶液を除去し、反応緩衝液中に０．７ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０μＭの各ｄＡＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ＣｈｒｏｍａＴｉｄｅ  ４８８−ｄＣＴＰ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する伸長反応混合物を添加した。ＤＮＡ合成を室温で１０分間進めた後、１ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＢＦ−１５０で５回洗浄した。ＣｈｒｏｍａＴｉｄｅヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みを、ＺＭＷチップの上（溶液）側を画像化するための６０×０．９ＮＡの生理学（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）対物レンズおよび底側における６０×１．２ＮＡの対物レンズを用いる広視野蛍光顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））上で画像化した。
【０１６９】
バイアスされた固定化手順（ＺＭＷチップのＰＥＧ−シランの混合物による処理とその後の高分子電解質多層形成）の結果、ポリメラーゼの導波路内での選択的固定化がもたらされる。重合反応を、バイアスされた固定化ＺＭＷチップ上および対照ＺＭＷチップ（底面をプラズマ−ＰＤＭＳ層で均一に被覆後、ＰＥＧ−メトキシ／ビオチン−ＰＥＧシランによる誘導体化）上で前パラグラフで記載のように行った。バイアスされた固定化ＺＭＷアレイの画像および対照アレイの画像を図２１に示す。対照（カラムＩＩ）に示されるように、底側の照明（ローＢ）が導波路構造内部での有意な量のＤＮＡの存在を示す一方、上側の照明（ローＡ）がアレイの表面全体にわたって生成されたＤＮＡの均一な層を示す。それに対し、バイアスされた固定化のＺＭＷアレイ（カラムＩ）においては、底側（ローＢ）および上側（ローＡ）の双方が特定の導波路内部にＤＮＡの存在の類似パターンを示す。さらに分かるように、アレイ内の導波路内部以外の上面上にＤＮＡがほとんど存在せず、それは対照実験にて存在するＤＮＡ合成が高レベルから実質的に低下することを示す。さらに注目すべきことは、上面からのＤＮＡの存在を示す導波路が下部の表面からのＤＮＡの存在を示す同じ導波路をたどり、それはＤＮＡ合成が導波路コアの外部ではなく導波路構造内部で生じていることを示し、バイアスされた固定化ＺＭＷアレイの上面での画像（パネルＩ）および同じアレイの底面での画像（パネルＩＩ）が重ね合わされた（パネルＩＩＩ）図２２を参照のこと。
【０１７０】
これらの結果は、高分子電解質多層がヌクレオチド類似体に比較的非粘性を示し、かつ高分子電解質多層がアルミニウム表面に対するポリメラーゼ結合に対して十分に不動態化することを示す。異なるＰＥＧ−ビオチン−シラン化学反応とその後の高分子電解質多層の不動態化により、高コントラストを有するポリメラーゼのバイアスされた固定化がもたらされる。
【０１７１】
実施例４：ホスホン酸を用いる選択的固定化および不動態化
ポリビニルホスホン酸（ＰＶＰＡ）を未処理のＺＭＷ上に堆積する結果、アルミニウム表面に結合する非特異的タンパク質（例えばニュートラアビジンおよびポリメラーゼ）およびヌクレオチド類似体から不動態化されたＺＭＷが得られる。ＰＶＰＡは、アルミニウムに特異的であり、ＺＭＷのＳｉＯ２底面に作用することなく、非特異的な捕捉剤あるいは特異的なポリメラーゼ堆積のための重合固定化またはその後の誘導体化（例えばＰＬＬ−ＰＥＧなどの化合物のシラン化処理または結合による）において用いられうる。
【０１７２】
ＰＶＰＡと混合された材料基板（例えばガラス上の１００ｎｍのアルミニウム膜）の処理の結果、図２３に図示のように、基板の一部としてアルミニウム上ではなくＳｉＯ２上に優先的にニュートラアビジン捕捉剤の固定化がもたらされる。ＰＶＰＡで処理されていない基板については、さらなるニュートラアビジンが基板のＳｉＯ２部分（パネルＩのローＢ）上よりもアルミニウム部分（パネルＩのローＡ）上に堆積される。それに対し、ＰＶＰＡで処理された基板については、ニュートラアビジンが基板のＳｉＯ２部分（パネルＩＩのローＢ）上に選択的に固定化される一方、基板のアルミニウム部分（パネルＩＩのローＡ）に付着するニュートラアビジンはほとんど存在しない。
【０１７３】
ニュートラアビジンの結合を評価するため、チップをアセトンで１回すすぐことにより保護フォトレジスト層から清浄した後、イソプロパノールですすぎ、窒素の流れで乾燥させる。それらをプラズマクリーナー（ハリック（Ｈａｒｒｉｃｋ））、２トール（中程度の出力設定）で２分間清浄する。ＰＶＰＡ処理を９０℃に設定したヒートブロック上で行い、チップをヒートブロック上に載せ、９０℃のＰＶＰＡ溶液（分子量２４，０００、ポリサイエンシーズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州ワリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））から入手、水中で２％の使用溶液濃度に希釈した２５％のストック）をチップ上に２分間載せた後、水ですすぐ。過剰な水を窒素の流れにより吹き飛ばした後、加熱処理をドライオーブン内、８０℃で１０分間施す。４０ｎｍのＡ４８８−ニュートラアビジンラテックスビーズ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を緩衝液（５０ｍＭのＭＯＰＳ−酢酸塩、ｐＨ７．５、７５ｍＭの酢酸カリウム、５ｍＭのＤＴＴ）中で０．０１％に希釈し、チップとともに室温で１５分間インキュベートする。チップを水ですすぎ、６０×０．９ＮＡ生理学対物レンズを用いる広視野蛍光顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））上で画像化した。
【０１７４】
図２４に図示のように、ＰＶＰＡ処理によりヌクレオチド類似体の結合が低下する。実施例３、上記のように、ＺＭＷチップをＰＶＰＡで処理し、ヌクレオチド類似体のチップへの非特異的結合を分析した。図２４に示されるように、未処理のＺＭＷに対する類似体の非特異的結合が大きいことが示される一方（パネルＩＩ）、ＰＶＰＡで処理されたＺＭＷに対する類似体の結合についてはほとんど観察されない（パネルＩ）。
【０１７５】
例示目的でやや詳細に説明されるが、当業者により既知であるかまたは理解されている多数の変形が本発明の範囲内で行われうることが容易に理解されるであろう。他に文脈から除かれるかまたは明示的に述べられる場合を除き、本明細書中に提供される任意の濃度値が一般に、混合物の特定の成分の添加時または添加後に生じる任意の変換に無関係に値または百分率の混合の観点から与えられる。この開示において引用されるあらゆる公開された参考文献および特許文書が、本明細書中にいまだ明示的に援用されていなくても、あらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】用途におけるゼロモード導波路（ＺＭＷ）の概略図を示す。
【図２】本発明の光誘導による表面活性化プロセスの概略図を提供する。
【図３】ＺＭＷのような光閉じ込めの光学的関連部分内に活性表面を提供するためのプロセスの概略図を提供する。
【図４】２つの別々の活性化段階にわたる、ＺＭＷの底面からの距離の関数としての表面活性化レベルのシミュレートされたプロットを提供する。
【図５】２つの活性化ステッププロセスを用いる交互の光活性化方法の概略図を提供する。
【図６】閉じ込め構造内に活性表面を提供するための拡散制限プロセスの概略図を提供する。
【図７】基板の無関係な表面上に印刷されたマスク層を提供するためのプロセスの図面を提供する。
【図８】活性基を基板表面の無関係な部分から除去するための光切断プロセスを概略的に図示する。
【図９】目的の分子を基板表面の無関係な部分から除去するためのサイズ排除された分子に基づくプロセスを図示する。
【図１０】電気的駆動系を用いる目的の分子の選択的固定化を図示する。
【図１１】同伴マトリックス（ｅｎｔｒａｉｎｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）、次いでリフトオフ技術を用い、分子を基板の無関係な表面から除去するためのプロセスを概略的に図示する。
【図１２】特にサイズ排除された粒子プロセスを用いる、本発明の選択的固定化プロセスの効果を図示する。
【図１３】交互の排除プロセスを用いる、分子の選択的局在化のためのプロセスを概略的に図示する。
【図１４】部位特異的非活性化成分が目的の分子を基板から除去する排除プロセスを用いる、分子の選択的局在化のための典型的なプロセスを概略的に図示する。
【図１５】部位特異的非活性化成分が連結部分を基板から除去する排除プロセスを用いる、分子の選択的局在化のための典型的なプロセスを概略的に図示する。
【図１６】ＺＭＷのようなハイブリッド基板内の異なる材料の異なる表面特性の使用による目的の分子の選択的固定化およびＰＥ−ＰＥＧ共重合体による不動態化を概略的に図示する。
【図１７】高分子電解質多層の形成を概略的に図示する。
【図１８】ＺＭＷのようなハイブリッド基板内の異なる材料の異なる表面特性の使用による目的の分子の選択的固定化および高分子電解質多層による不動態化を概略的に図示する。
【図１９】ヌクレオチド類似体の、高分子電解質多層で処理された表面への結合に対するプラズマ−ＰＤＭＳで処理された（バイアスなしに処理された）表面への結合を図示する。
【図２０】ポリメラーゼの、高分子電解質多層で処理された表面への結合に対する未処理のアルミニウム表面への結合を図示する。
【図２１】特に選択的シラン化処理および高分子電解質多層不動態化プロセスを用いる、本発明の選択的固定化プロセスの効果を図示する。
【図２２】特に選択的シラン化処理および高分子電解質多層不動態化プロセスを用いる、本発明の選択的固定化プロセスの効果を図示する。
【図２３】ニュートラアビジンで被覆された蛍光ビーズの、ホスホン酸塩で処理されたＺＭＷへの結合に対する未処理のＺＭＷへの結合を図示する。
【図２４】ヌクレオチド類似体の、ホスホン酸塩で処理されたＺＭＷへの結合に対する未処理のＺＭＷへの結合を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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