(57)【要約】  本発明は、移植拒絶においてモジュレーションされる遺伝子の分析および同定に関するものである。遺伝子発現のこの改変により、移植拒絶を正確に検出する分子シグネチャーが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における移植臓器の拒絶の兆候を予測する方法であって、
（ａ）移植後試料を対象から入手し、
（ｂ）ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組み合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される複数遺伝子の組合わせの移植後試料における遺伝子発現レベルを測定し、
（ｃ）移植後試料における少なくとも１個の遺伝子の遺伝子発現の規模を、対照試料における同遺伝子の遺伝子発現の規模と比較し
（ｄ）少なくとも１個の遺伝子の発現レベルが対照試料に比べてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされているか否かを測定し、その結果少なくとも１個の遺伝子がアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされていれば、対象が移植拒絶反応を経験している可能性があるものとし、それにより対象における移植臓器の拒絶反応の兆候を予測する
段階を含む方法。
【請求項２】
試料が対象から得た細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料が、移植片生検材料、血液、血清および尿から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
拒絶が慢性／硬化性同種移植(allograph)腎症である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
試料における発現の規模が、対照の発現規模と少なくとも約１.５の係数による差を示す、請求項１記載の方法。
【請求項６】
試料における発現の規模が、対照の発現規模と少なくとも約２の係数による差を示す、請求項１記載の方法。
【請求項７】
対象における移植臓器の拒絶の兆候を予測する方法であって、
（ａ）移植後試料を対象から入手し、
（ｂ）ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組み合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される複数遺伝子の組合わせの移植後試料における遺伝子発現レベルを測定し、
（ｃ）移植後試料における遺伝子組合わせの遺伝子発現パターンを、対照試料における遺伝子の同組み合わせの遺伝子発現パターンと比較し、移植後試料における遺伝子組合わせの遺伝子発現パターンを対照試料発現プロフィールにおける遺伝子の同組み合わせの発現パターンと比較した場合に発現パターンの類似性が認められれば、対象が移植拒絶を経験している可能性があるものとし、それにより対象における移植臓器の拒絶の兆候を予測する
段階を含む方法。
【請求項８】
試料が対象から得た細胞を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
試料が、移植片生検材料、血液、血清および尿から成る群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
拒絶が慢性／硬化性同種移植(allograph)腎症である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
対象における移植拒絶のモニター方法であって、
（ａ）拒絶反応を起こしていないことが判明している移植対象から採取した試料における複数遺伝子の組合わせの遺伝子発現の規模を基準値とし、
（ｂ）移植後患者から採取した試料における複数遺伝子の組合わせに対応する遺伝子発現の規模を検出し、
（ｃ）第一の値を第二の値と比較する
段階を含み、第一の値が第二の値より低いかまたは高い場合、移植対象が拒絶反応発症の危険をはらんでいることが予測され、上記複数遺伝子が、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択されるものである方法。
【請求項１２】
対象における移植拒絶のモニター方法であって、
（ａ）移植当日にドナー対象から入手した試料からの複数遺伝子の組み合わせに対応する遺伝子発現パターンを検出し、
（ｂ）移植後のレシピエント対象から得た試料からの複数遺伝子に対応する遺伝子発現パターンを検出し、
（ｃ）第一の値を第二の値と比較する
段階を含み、第一の値が第二の値より低いかまたは高い場合、レシピエント対象が拒絶反応発症の危険をはらんでいることが予測され、上記複数遺伝子が、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択されるものである方法。
【請求項１３】
移植拒絶の危険がある対象におけるそのモニター方法であって、
（ａ）拒絶阻害剤の投与前に移植対象から投与前試料を入手し、
（ｂ）投与前試料において複数遺伝子の遺伝子発現の規模を検出し、
（ｃ）移植対象から１つまたはそれ以上の投与後試料を入手し、
投与後の一試料または複数試料における複数遺伝子の遺伝子発現パターンを検出し、
投与前試料における複数遺伝子の遺伝子発現パターンを、投与後の一試料または複数試料における遺伝子発現パターンと比較し、
それに応じて作用物質を調節する
段階を含み、上記複数遺伝子が、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択されるものである方法。
【請求項１４】
処置を必要とする対象における移植拒絶の予防、阻止、縮小または処置方法であって、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される遺伝子の１個またはそれ以上の遺伝子またはそれらによりコード化される遺伝子産物の合成、発現または活性をモジュレーションする化合物を対象に投与することを含み、その結果拒絶反応の少なくとも一つの兆候が改善される方法。
【請求項１５】
ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の遺伝子発現レベルをモニターすることを含む、移植拒絶の予防、阻止、縮小または処置に使用する作用物質の同定方法。
【請求項１６】
移植対象が腎臓移植対象である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子によりコード化されるタンパク質の存在を検出することにより、遺伝子発現パターンを評価する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質に特異的に結合する試薬を用いてタンパク質の存在を検出する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ノーザン・ブロット分析、逆転写ＰＣＲおよび実時間定量的ＰＣＲから成る群から選択される技術により、遺伝子発現パターンを検出する、請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
複数遺伝子の遺伝子発現の規模を検出する、請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
移植拒絶に関するバイオマーカーとしてのＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表２、表３または表４に列挙した複数遺伝子またはその発現産物の組合わせの使用。
【請求項２２】
対象における移植拒絶の予防または処置用の医薬の製造を目的とする、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表２、表３または表４に示した１個またはそれ以上の遺伝子またはその発現産物の合成、発現または活性をモジュレーションする化合物の使用。
【請求項２３】
移植拒絶が慢性／硬化性同種移植腎症であり、遺伝子が、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表２、表３および表４に示した遺伝子から成る群から選択される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
試料が、血液、血清および尿から成る群から選択される、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してインビトロ組織試料の分析試験法、さらに具体的には慢性同種移植腎症の予測に有用な遺伝子またはタンパク質に基づく試験法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
慢性移植片機能不全は、移植後徐々に移植片機能の悪化を示す固体臓器移植片における現象であり、結局は移植片生着不全に至り、特有の組織学的特徴を伴うものである。臨床的には、腎臓移植片における慢性移植片機能不全、例えば慢性／硬化性同種移植腎症（「ＣＡＮ」）は、それ自体、通常タンパク尿および動脈高血圧と共に、糸球体濾過量の緩慢な漸進的下降として症状を表わす。効力のある免疫調節剤および生物製剤を臨床適用しているにもかかわらず、急性拒絶反応は、依然としてよく見られる深刻な移植後合併症である。慢性拒絶は、過酷な進行性の経過をたどる。
【０００３】
特に移植後１カ月以内における早期移植片生着不全に関する一つの最も一般的な原因は、同種移植片の免疫学的拒絶反応である。拒絶反応の好ましくない影響は、（ａ）免疫抑制の維持に付加された、高用量抗拒絶療法の使用が、移植に関連した病的状態および死亡の主たる原因となっている、（ｂ）拒絶移植片から生じる「高頻度の(public)」ＨＬＡ特異性に対する免疫化により、この患者集団に対する再移植が困難になる、および（ｃ）移植が失敗した免疫化レシピエントを、移植を待つ患者のプールに戻すことにより、長年続いている臓器不足の問題を助長するという事実により拡大される。
【０００４】
生検組織の組織病理学的評価がＣＡＮの診断についての最も信頼できる標準的手段であって、ＣＡＮの兆候の予測は現時点では不可能である。現行のモニターおよび診断の様相は、初期段階でのＣＡＮの診断には不適切である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、遺伝子発現プロファイリングを用いる分子診断方法に関するものであり、ＢＡＮＦＦ９７疾病分類がさらに細かく分類される（Racusen LC,et al.、Kidney Int.５５（２）：７１３−２３（１９９９））。本発明はまた、他のさらなる慣用的手段では移植片機能不全がまだ検出され得ない移植後の早期時点で適用される場合の予測的または早期診断バイオマーカーとしてのバイオマーカーの使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、一つの態様として、本発明は、対象における移植臓器の拒絶の兆候の予測方法であって、（ａ）移植後試料を対象から入手し、（ｂ）ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組み合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される複数遺伝子の組合わせの移植後試料における遺伝子発現レベルを測定し、（ｃ）移植後試料における少なくとも１個の遺伝子の遺伝子発現の規模を、対照試料における同遺伝子の遺伝子発現の規模と比較し（ｄ）少なくとも１個の遺伝子の発現レベルが対照試料に比べてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされているか否かを測定し、その結果少なくとも１個の遺伝子がアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされていれば、対象が移植拒絶反応を経験している可能性があるものとし、それにより対象における移植臓器の拒絶反応の兆候を予測する段階を含む方法に関するものである。
【０００７】
試料は、対象から入手した細胞を含む。試料は、移植片生検、血液、血清および尿から成る群から選択され得る。拒絶は、慢性／硬化性同種移植腎炎であり得る。試料における発現規模は、対照発現規模と少なくとも約１.５の係数または少なくとも約２の係数による差を示す。
【０００８】
別の態様として、本発明は、対象における移植臓器の拒絶の兆候を予測する方法であって、（ａ）移植後試料を対象から入手し、（ｂ）ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組み合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される複数遺伝子の組合わせの移植後試料における遺伝子発現レベルを測定し、（ｃ）移植後試料における遺伝子組合わせの遺伝子発現パターンを、対照試料における遺伝子の同組み合わせの遺伝子発現パターンと比較し、移植後試料における遺伝子組合わせの遺伝子発現パターンを対照試料発現プロフィールにおける遺伝子の同組み合わせの発現パターンと比較した場合に発現パターンの類似性が認められれば、対象が移植拒絶を経験している可能性があるものとし、それにより対象における移植臓器の拒絶の兆候を予測する段階を含む方法に関するものである。
【０００９】
別の態様として、本発明は、対象における移植拒絶のモニター方法であって、（ａ）拒絶反応を起こしていないことが判明している移植対象から採取した試料における複数遺伝子の組合わせの遺伝子発現の規模を基準値とし、（ｂ）移植後患者から採取した試料における複数遺伝子の組合わせに対応する遺伝子発現の規模を検出し、（ｃ）第一の値を第二の値と比較する段階を含み、第一の値が第二の値より低いかまたは高い場合、移植対象が拒絶反応発症の危険をはらんでいることが予測され、上記複数遺伝子が、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択されるものである方法に関する。
【００１０】
別の態様として、本発明は、対象における移植拒絶のモニター方法であって、（ａ）移植当日にドナー対象から入手した試料からの複数遺伝子の組み合わせに対応する遺伝子発現パターンを検出し、（ｂ）移植後のレシピエント対象から得た試料からの複数遺伝子に対応する遺伝子発現パターンを検出し、（ｃ）第一の値を第二の値と比較する段階を含み、第一の値が第二の値より低いかまたは高い場合、レシピエント対象が拒絶反応発症の危険をはらんでいることが予測され、上記複数遺伝子が、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択されるものである方法に関する。
【００１１】
別の態様として、本発明は、移植拒絶の危険がある対象におけるそのモニター方法であって、（ａ）拒絶阻害剤の投与前に移植対象から投与前試料を入手し、（ｂ）投与前試料において複数遺伝子の遺伝子発現の規模を検出し、（ｃ）移植対象から１つまたはそれ以上の投与後試料を入手し、投与後の一試料または複数試料における複数遺伝子の遺伝子発現パターンを検出し、投与前試料における複数遺伝子の遺伝子発現パターンを、投与後の一試料または複数試料における遺伝子発現パターンと比較し、それに応じて作用物質を調節する段階を含み、上記複数遺伝子が、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択されるものである方法に関する。
【００１２】
別の態様として、本発明は、処置を必要とする対象における移植拒絶の予防、阻止、縮小または処置方法であって、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される遺伝子の１個またはそれ以上の遺伝子またはそれらによりコード化される遺伝子産物の合成、発現または活性をモジュレーションする化合物を対象に投与することを含み、その結果拒絶反応の少なくとも一つの兆候が改善される方法に関するものである。
【００１３】
別の態様として、本発明は、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子から成る群から選択される１個またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の遺伝子発現レベルをモニターすることを含む、移植拒絶の予防、阻止、縮小または処置に使用する作用物質の同定方法に関するものである。
【００１４】
移植対象は腎臓移植対象であり得る。遺伝子によりコード化されたタンパク質の存在を検出することにより、遺伝子発現パターンが評価され得る。タンパク質の存在は、タンパク質に特異的に結合する試薬を用いて検出され得る。ノーザン・ブロット分析、逆転写ＰＣＲおよび実時間定量的ＰＣＲから成る群から選択される技術により、遺伝子発現パターンが検出され得る。一遺伝子または複数遺伝子の遺伝子発現の規模が検出され得る。
【００１５】
別の態様として、本発明は、移植拒絶に関するバイオマーカーとしてのＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表２、表３または表４に列挙した複数遺伝子またはその発現産物の組合わせの使用に関するものである。
【００１６】
別の態様として、本発明は、対象における移植拒絶の予防または処置用の医薬の製造を目的とする、ＰＬＤＳＡモデルおよびＯＰＬＳモデルから成る群から選択される予測モデルと組合わせた表２、表３または表４に示した１個またはそれ以上の遺伝子またはその発現産物の合成、発現または活性をモジュレーションする化合物の使用に関するものである。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１は、組織病理学的評価による安定した同種移植片機能（正常、Ｎ）および慢性同種移植片拒絶（ＣＡＮ）の診断に関する生検試料の時間推移の詳細を示した概要図である；
図２は、バイオマーカー０６週で得られたバイオマーカーデータの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＤＡ）により得られた散布図である；
図３は、実測対予測バイオマーカーデータを比較するバイオマーカー０６週で得られたデータのＰＬＳＤＡにより得られたグラフである；
図４は、バイオマーカー０６週 ＰＬＳＤＡモデル：Validation by Response Permutaion（応答並べ替えによるバリデーション）に関するバイオマーカーデータのグラフである；
【００１８】
図５は、バイオマーカー１２週で得られたバイオマーカーデータの直交部分最小二乗法分析（ＯＰＬＳ）により得られた散布図である；
図６は、バイオマーカー１２週 ＯＰＬＳモデル：「応答並べ替えによるバリデーション」に関するバイオマーカーデータのグラフである；
図７は、実測対予測バイオマーカーデータを比較するバイオマーカー１２週 で得られたデータのＯＰＬＳにより得られたグラフである；
図８は、バイオマーカー０６週 で得られたバイオマーカーデータのＰＬＤＡにより得られた散布図である；
図９は、バイオマーカー１２週 ＰＬＳＤＡモデル：「応答並べ替えによるバリデーション」に関するバイオマーカーデータのグラフである；
図１０は、実測対予測バイオマーカーデータを比較するバイオマーカー１２週 で得られたデータのＯＰＬＳにより得られたグラフである；
図１１は、バイオマーカーデータのグローバル分析における直交シグナル補正（ＯＳＣ）により得られた散布図である；
【００１９】
図１２は、バイオマーカーグローバル分析ＯＳＣモデル：「応答並べ替えによるバリデーション」に関するバイオマーカーデータのグラフである；
図１３は、実測対予測バイオマーカーデータを比較するデータのグローバル分析ＯＳＣモデリングにより得られたグラフである；
図１４は、バイオマーカーデータのグローバル分析におけるＯＰＬＳにより得られた散布図であり、
図１５は、実測対予測バイオマーカーデータを比較するデータのグローバル分析ＯＰＬＳモデリングにより得られたグラフである；
図１６は、ＣＡＮの臨床／組織病理学的徴候が明らかになる４.５か月前、ＴＸ後６週目の時点を示すチャートである。
図１７は、６週目（ＣＡＮの４.５か月前）でのバイオマーカー同定のグラフである。患者群が明確に分離されている（４９プローブセットによるＰＬＳＤＡモデル）。
【００２０】
図１８は、６週目（ＣＡＮの４.５か月前）でのクロス-バリデーションを示すグラフである。クロス-バリデーション（「７試料のうち１群抜き」）：モデルはＮと前ＣＡＮを明確に分離する。
図１９は、ＣＡＮの臨床／組織病理学的徴候が明らかになる３か月前、ＴＸ後６週目の時点を示すチャートである。
図２０は、６週目（ｔ検定＜０.０５、１.２ＦＣ）および１２週目（ｔ検定＜０.０５、１.５ＦＣ）で同定されたバイオマーカーのオーバーラップを示すチャートである。０６週目および１２週目の生物学的遺伝子リスト間における小さなオーバーラップは、特定時点での異なる根元的生物学的プロセス／経路の存在を示し得る。
図２１は、２０１プローブセットによるＯＳＣモデルの図である。２０１プローブセットによるＯＳＣモデルは、時点および診断により群を区別する。
図２２は、経路分析および生物学的機構を示す図である。異なる時点での経路の一時的活性化。
図２３は、並び替えによるモデルバリデーションを示す図である。並べ替え分析によるモデルバリデーション：１００回繰り返し（すなわち、「リアルモデル」の適合度と比べた１００ＰＬＳモデルの適合度）。
【００２１】
定義
本発明をさらに理解しやすくするため、若干の語および句を以下に定義する：
「ダウンレギュレーション」または「ダウンレギュレーションされた」の語については、本明細書では互換的に使用しており、標的遺伝子または標的タンパク質の量の減少をいう。「ダウンレギュレーション」または「ダウンレギュレーションされた」の語はまた、標的遺伝子または標的タンパク質を伴うプロセスまたはシグナル伝達カスケードの減少をいう。
【００２２】
本明細書で使用している「移植」の語は、一対象から「移植体」または「移植片」と呼ばれる細胞、組織または臓器を取り出し、それまたはそれらを（通常は）異なる対象に植え付ける過程をいう。移植体を提供する対象を「ドナー」と呼び、移植体を受け入れる対象を「レシピエント」という。同種の遺伝的に異なる２対象間で移植された臓器または移植片を、「同種移植片」と呼ぶ。種が異なる対象間で移植された移植体を「異種移植片」と呼ぶ。
【００２３】
本明細書で使用している「移植拒絶（反応）」の語は、レシピエントが発する活性免疫応答に起因し、臓器機能不全の非免疫学的原因とは関係の無い臓器の機能的および構造的悪化として定義される。
【００２４】
本明細書で使用している「慢性拒絶（反応）」の語は、移植臓器（例、腎臓）の拒絶反応をいう。この語は、移植片機能の喪失に至る過程および移植後の最初の３０〜１２０日経過後に現れる後発性移植片（機能）喪失に適用される。腎臓では、腎臓脈管の血管内膜の増殖および内膜繊維増多を伴い、管腔の著しい減少を伴う腎硬化症（腎臓血管の硬化）の発生が認められる。その結果が、腎臓虚血、高血圧、尿細管萎縮、間質性繊維症および糸球体萎縮であり、結果的に腎不全となる。確立されたＨＬＡ不適合性の影響に加えて、ドナー腎臓の年齢、ネフロンの数および虚血歴が、移植患者における最終的な進行性腎不全の誘因となり得る。
【００２５】
本明細書で使用している「対象」の語は、免疫応答が発せられる生物体をいう。対象の語は、ヒト、ヒト以外の霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿および尾の長いサル種、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ、家で飼われる哺乳類、例えばイヌおよびネコ、マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯動物を含む実験動物などを含むが、これらに限定するわけではない。この語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、成体および新生児対象、および胎児が、雄性であろうと雌性であろうと包含されるものとする。
【００２６】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後特定ポリペプチドまたはタンパク質をコード化し得る少なくとも１個の読み枠を含むポリヌクレオチドを含む。本明細書記載のポリヌクレオチド配列のいずれかを用いることにより、それらが会合している遺伝子の大きなフラグメントまたは完全長コーディング配列が同定され得る。大きなフラグメント配列の単離方法は、当業者には公知であり、それらのうちのいくつかを本明細書に記載している。
【００２７】
「遺伝子産物」は、遺伝子が転写および翻訳されたときに生成されるアミノ酸（例、ペプチドまたはポリペプチド）を含む。
【００２８】
本明細書で使用している「発現の規模」の語は、マーカー遺伝子転写物を定量し、この量を構成的に発現された遺伝子の転写物の量と比較する場合に用いる。「発現の規模」の語は、「遺伝子発現の正規化または標準化された量」をいう。例えば、細胞における全遺伝子の全体的発現は変動する（すなわち、一定していない）。増加したｍＲＮＡ転写物の検出が有意であるか否かを正確に評価するためには、遺伝子発現を「正規化」することにより、試料間で発現レベルを正確に比較することが好ましい、すなわちそれが遺伝子発現を比較する場合の基準レベルとなる。一具体例では、発現された遺伝子は、ｗｎｔ経路（例、ＮＦＡＴ、ＮＥ−ｄｌｇ、frizzled−９、ｈｅｓ−１）、ＴＧＦベータ（例、ＮＯＭＯ、ＳｎｏＮ）、グルコースおよび脂肪酸輸送および代謝（例、ＧＬＵＴ４）、血管平滑筋分化（例、アムニオンレス、ＡＣＬＰ、ルミカン）、血管硬化（例、ＴＨＲＡ、ＩＧＦＢＰ４）、ＥＣＭ（例、コラーゲン）、および免疫応答（例、ＴＮＦ、ＮＦＡＴ、ＧＭ−ＣＳＦ）から成る群から選択される生物学的経路／過程と関連している。競合的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて遺伝子転写物の定量化を実施し、発現された遺伝子の遺伝子発現量に対する各マーカー遺伝子の遺伝子発現の量の比を計算することにより、遺伝子発現の規模を測定した。
【００２９】
遺伝子に適用されている場合の「示差的に発現された」の語は、遺伝子または遺伝子によりコード化されたタンパク質産物から転写されたｍＲＮＡの有意差を示す産生を含む。示差的に発現された遺伝子は、正常または対照細胞の発現レベルと比べて過剰発現または過少発現され得る。一態様において、これは、対照試料で検出された発現レベルよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍の割合で高いか低い差を含む。好ましい実施態様では、発現レベルは対照試料より高い。また、「示差的に発現された」の語は、対照細胞で検出できない場合に発現されているかまたは対照細胞で発現される場合に発現されない細胞または組織でのヌクレオチド配列についても包含する。特に、この語は、所与の同種移植片遺伝子発現レベルをいい、対応する基準発現レベルの量より実質的に多いかまたは少ない量として定義される。基準は、健康な組織における発現レベルとして定義される。健康な組織は、病理学的所見を伴わない移植臓器を含む。
【００３０】
本明細書で使用している「試料」の語は、生検材料から得られる細胞をいう。「試料」の語はまた、流体試料、例えば、限定するわけではないが、気管支肺胞洗浄液の試料、胆汁、胸膜液または腹膜液の試料、または機能が正常または異常な状態である同種移植片により分泌または排泄される他の流体、または同種移植片を通して、または同種移植片の解剖学的近位での滲出または濾出から生じる他の流体、または同種移植片との液体連通における流体から得られる細胞をいう。また、流体試験試料は、血液（末梢血を含む）、リンパ液、汗、腹膜液、胸膜液、気管支肺胞洗浄液、心膜液、胃腸液、胆汁、尿、糞便、組織液または腫脹液、関節液、脳脊髄液、または同種移植片の近位にある解剖学的領域から集められるか、または同種移植片との流体連通における（流体）導管から集められる他の特定または不特定の流体を含め、本質的にいかなる体液からでも入手され得る。「移植後流体試験試料」は、移植が行われた後に対象から得られる試料をいう。
【００３１】
また、一連の試料を対象から採取し、本明細書記載の要領で免疫活性化遺伝子マーカーの定量化を実施し、拒絶反応の経過を一定期間にわたって追跡し得る。この場合、例えば、バイオマーカー遺伝子（複数も可）の遺伝子発現の基準規模は、移植後採取した移植後試料における遺伝子発現の規模である。例えば、最初の一試料または複数試料を、非拒絶期間内、例えば移植の１週間以内に採取し、これらの試料におけるバイオマーカー遺伝子の発現規模を、１週間後に採取した試料における遺伝子の発現規模と比較し得る。一実施態様では、試料を移植後６、１２および２４週間目に採取する。
【００３２】
本明細書で使用している「生検材料」の語は、検診用に生きている患者から組織を取り出すことにより得られる標本をいう。この語は、吸引生検、ブラシ生検、絨毛採取生検、内視鏡生検、切除生検、針生検（皮膚または臓器の外表面を穿刺して、検査すべき深層組織へ到達させるのに適切な針またはトロカールを通した吸引による摘出により得られる標本）、直視下生検、パンチ生検（トレフィン）、薄片生検、擦過生検、および楔状生検を包含する。一実施態様では、穿刺吸引生検を使用する。別の実施態様では、ミニコア針生検を使用する。慣用的経皮コア針生検材料も使用され得る。
【００３３】
「アップレギュレーション」または「アップレギュレーションされた」の語については、本明細書では互換的に使用しており、標的遺伝子または標的タンパク質の量の増加または上昇をいう。「アップレギュレーション」または「アップレギュレーションされた」の語はまた、標的遺伝子または標的タンパク質を伴うプロセスまたはシグナル伝達カスケードの増加または上昇をいう。
【００３４】
本明細書で使用している「遺伝子クラスター」または「クラスター」の語は、発現パターンに関連性が見られる一群の遺伝子をいう。言い換えれば、遺伝子のクラスターは、例えば移植片非拒絶対移植片拒絶といった異なる条件の場合でも、全般的に類似したレギュレーションを示す一群の遺伝子である。一クラスターにおける各遺伝子に関する発現プロフィールは、当然そのクラスターにおける他の少なくとも１個の遺伝子の発現プロフィールと相関関係を示す。相関関係は、様々な統計的方法を用いて評価され得る。必ずではないが、多くの場合、一遺伝子クラスターの構成員は、類似した遺伝子発現パターンに加えて類似した生物学的機能を有する。
【００３５】
本明細書で使用している「プローブセット」は、２個またはそれ以上の遺伝子を検出するのに使用され得る核酸の一群をいう。検出は、例えば、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲでの増幅、または例えばマイクロアレイでのハイブリダイゼーション、または例えば１本または２本鎖核酸の選択的酵素分解に基づく検定法における選択的破壊および保護を通して行われ得る。プローブセットにおけるプローブは、１つまたはそれ以上の蛍光性、放射性または他の検出可能な部分（酵素を含む）により標識され得る。目的遺伝子を選択的に検出するのに十分な大きさのプローブであれば、いかなるサイズのプローブでもよい。プローブセットは、マルチプレックスＰＣＲの場合に典型的であるように溶解状態であり得るか、またはプローブセットは、アレイまたはマイクロアレイの場合のように固体表面に付着され得る。ＰＮＡなどの化合物が、核酸の代わりに遺伝子とのハイブリダイゼーションに使用され得ることは公知である。さらに、プローブは、希少または非天然核酸、例えばイノシンを含み得る。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の語は互換的に使用され、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその類似体を包含する。ポリヌクレオチドは、三次元構造を有し得、既知または未知の機能を遂行し得る。以下のものはポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列を有する単離ＤＮＡ、任意の配列を有する単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含み得る。存在するとすれば、ヌクレオチド構造に加えられる修飾は、ポリマー集合の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、さらに重合後に、例えば標識成分で標識することにより修飾され得る。またこの語は、２本および１本鎖分子の両方を含む。特記または要求されなければ、ポリヌクレオチドである本発明の実施態様は全て、２本鎖形態および２本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される２本の相補的１本鎖形態の各々を共に包含する。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、４種のヌクレオチド塩基の特定配列により構成される：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）、およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はグアニンの代わりにウラシル（Ｕ）。この「ポリヌクレオチド配列」の語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピューターにおけるデータベースに入力され、バイオインフォマティクス適用、例えば機能ゲノム学および相同性検索に使用され得る。
【００３８】
「ｃＤＮＡ」の語は、相補的ＤＮＡ、すなわち酵素、例えば逆転写酵素でｃＤＮＡに合成される細胞または生物体に存在するｍＲＮＡ分子を含む。「ｃＤＮＡライブラリー」は、酵素、すなわち逆転写酵素によりｃＤＮＡ分子に変換され、次いで「ベクター」（外来ＤＮＡの付加後に複製し続け得る他のＤＮＡ分子）に挿入される、細胞または生物体に存在するｍＲＮＡ分子の集合体を含む。ライブラリーに関するベクターの例には、バクテリオファージ、細菌に感染するウイルス（例、ラムダファージ）がある。また、ライブラリーは、興味の対象である特異的ｃＤＮＡ（すなわちｍＲＮＡも）について探査され得る。
【００３９】
「プライマー」は、標的とハイブリダイゼーションすることにより興味の対象である試料に存在する標的または「鋳型」に結合する遊離３’−ＯＨ基を一般的に伴い、そのハイブリダイゼーション後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する短いポリヌクレオチドを含む。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」および「下流」プライマーから成る「プライマー対」または「プライマーのセット」、および重合の触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、および典型的には熱安定性ポリメラーゼ酵素を用いて標的ポリヌクレオチドから複製コピーを作成する反応である。ＰＣＲ方法は当業界では公知であり、例えば MacPherson et al.、IRL Press、Oxford University Press（１９９１）に示されている。ＰＣＲまたは遺伝子クローニングなどのポリヌクレオチドの複製コピーの生成過程は全て、本明細書ではまとめて「複製」と称す。プライマーはまた、ハイブリダイゼーション反応、例えばサザンまたはノーザン・ブロット分析におけるプローブとして使用され得る（例、Sambrook,J.、Fritsh,E.F.および Maniatis,T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９参照）。
【００４０】
「ポリペプチド」の語は、２個またはそれ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチドミメティクスの化合物を含む。サブユニットは、ペプチド結合により結合され得る。別の具体例では、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなどにより結合され得る。本明細書で使用している「アミノ酸」の語は、天然および／または非天然または合成アミノ酸、例えばグリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、およびアミノ酸類似体およびペプチドミメティクスを包含する。３個またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを一般にオリゴペプチドと称す。３個またはそれ以上のアミノ酸より大きいペプチド鎖をポリペプチドまたはタンパク質と称す。
【００４１】
「ハイブリダイゼーション」の語は、１個またはそれ以上のポリヌクレオチドが反応することにより、ヌクレオチド残基の塩基間における水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を含む。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン結合、または他の配列特異的な形で起こり得る。複合体は、二重らせん構造を形成する２本鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはそれより多い鎖、単自己ハイブリダイゼーション鎖、またはこれらの組合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、例えばＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的開裂などの広範な過程における一段階を構成し得る。
【００４２】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」条件下で実施され得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、任意の２個の核酸分子が互いにハイブリダイゼーションする際の難度を含む。ストリンジェント条件下において、互いに少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％同一である核酸分子どうしは互いにハイブリダイゼーションするが、同一性パーセントが低い分子の場合ハイブリダイゼーションは起こり得ない。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定な例は、約４５℃で６倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、次いで、５０℃、好ましくは５５℃、さらに好ましくは６０℃、さらに好ましくは６５℃での０.２倍ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄である。
【００４３】
ハイブリダイゼーションが２本の１本鎖ポリヌクレオチド間において逆平行立体配置で起こる場合、この反応は「アニーリング」と呼ばれ、それらのポリヌクレオチドは「相補的」として記される。ハイブリダイゼーションが第一ポリヌクレオチドの鎖の一方と第２ポリヌクレオチドの鎖の一方の間で起こり得る場合、２本鎖ポリヌクレオチドは、もう１つのポリヌクレオチドと「相補的」または「相同的」であり得る。「相補性」または「相同性」（一ポリヌクレオチドがもう一つのポリヌクレオチドと相補的である度合）は、一般的に認められている塩基対合規則にしたがって、互いに水素結合すると予測される向かい合わせの鎖における塩基の比率に関して定量可能である。
【００４４】
本明細書で使用している「マーカー」および「バイオマーカー」の語は、互換的に使用され、臓器拒絶反応に関する危険性が無い対象における量または活性に対し、臓器拒絶反応に関する危険性がある対象において、存在するかまたは統計的モデル（例、ＰＬＳＤＡおよびＯＰＬＳ）を用いて測定された量または活性がモジュレーション（すなわち、増強または低減化）されているポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。バイオマーカーの量または活性における相対変化は、拒絶反応の発生または発生の危険性と相関関係をなす。
【００４５】
本明細書で使用している「マーカーのパネル」の語は、統計モデル（例、ＰＬＳＤＡおよびＯＰＬＳ）を用いて測定された一群のバイオマーカーを含み、その各構成員の量または活性は臓器拒絶反応の発生または発生の危険性と相関関係を示す。ある例では、バイオマーカーのパネルは、臓器拒絶反応についての危険性がある対象において量または活性が増強されているバイオマーカーのみを含み得る。他の例では、バイオマーカーのパネルは、臓器拒絶反応についての危険性がある対象において量または活性が低減化されているバイオマーカーのみを含み得る。
【００４６】
抜粋した語に関する略語を下記表１に要約する。
表１：略語：
【表１】
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【発明の効果】
【００４７】
慢性拒絶の予測バイオマーカー
本発明は、一つには、ＣＡＮでは選択された遺伝子がモジュレーションされており、これらの遺伝子は明白なＣＡＮ発症前の予測マーカーとして使用され得るという発見に基づくものである。増大している多量のヒト遺伝子配列情報と組合わせた高度並列自動化ＤＮＡハイブリダイゼーション技術の進歩により、何千もの遺伝子に関する発現レベルを同時に解析することが可能となった（例、Schena et al.、１９９５、Science ２７０：４６７−４７０；Lockhart et al.、１９９６、Nature Biotechnology １４：１６７５−１６８０；Blanchard et al.、１９９６、Nature Biotechnology １４：１６４９；Ashby et al.、１９９６年１０月２９日付米国特許第５５６９５８８号；Perou et al.、２０００、Nature ４０６：７４７−７５２参照）。遺伝子ごとの定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法は、非常に正確ではあるが比較的労働集約的である。定量ＰＣＲを用いて何千もの遺伝子の発現を解析することは可能であるが、それに要する労力と費用は莫大である。それに代わる大規模解析の一例では、ｍＲＮＡの集団全体をｃＤＮＡに変換し、概して１０〜１００００またはそれ以上の遺伝子を表すプローブを規則正しく配列させたアレイとハイブリダイゼーションさせ得る。これらのプローブの各々とハイブリダイゼーションするｃＤＮＡの相対量が、対応する遺伝子の発現レベルの尺度である。次いで、データを統計分析することにより、遺伝子発現の情報的パターンを明らかにさせ得る。事実、腎臓同種移植拒絶の早期診断および新たな予後バイオマーカーは、免疫抑制を最小限にし、個人化するのに重要である。組織病理学的鑑別診断に加えて、遺伝子発現プロファイリングは、「分子シグネチャー」の特定により疾病分類を著しく改善させる。
【００４８】
これまで幾つかの試験法を効果的にトランスクリプトームアプローチに適用することにより、様々な種類の腎臓移植を区別してきた。しかしながら、マイクロアレイプラットフォームおよび様々なデータ分析法は不均質であるため、ＣＡＮの確固たるシグネチャーの同定は困難になっている。
【００４９】
この問題に取り組むため、比較多変量データ分析（例、ＰＬＳＤＡ；ＯＰＬＳ；ＯＳＣ）を、腎臓移植後少なくとも１年間は移植片機能が安定している患者および早期時点（０６週目および１２週目）の生検材料ではなく２４週目生検材料で慢性同種移植腎症（ＣＡＮ；段階Ｉ）と診断された患者からの連続腎臓プロトコル生検材料の遺伝子発現プロフィールについて実施した。実施例１に示した通り、これらの試験は、ＣＡＮの兆しを予測する分子シグネチャーを同定するものである。分子シグネチャーは、様々な時点でのアルゴリズムおよびアルゴリズムにより同定された遺伝子の組み合わせを含む。すなわち、本発明は、拒絶反応中、特に初期ＣＡＮ中にモジュレーション（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）されている遺伝子の同定に関するものである。１つまたはそれ以上のバイオマーカー遺伝子（複数も可）の発現とＣＡＮの間に非常に統計的に有意な相関関係が見出されることにより、移植拒絶（例、ＣＡＮ）に関する「分子シグネチャー」が提供される。これらのバイオマーカー遺伝子およびそれらの発現産物は、拒絶反応が起こっていると思われる臓器を同定するのに有用であるため、それらは移植拒絶の危険がある患者の管理、予後および処置で使用され得る。
【００５０】
ＣＡＮの臨床的特徴
慢性移植片機能不全は、移植後何カ月から何年間かかけて徐々に移植片機能の悪化を示す固体臓器移植片における現象であり、結局は移植片生着不全に至り、特有の組織学的特徴を伴うものである。臨床的には、腎臓移植片における慢性同種移植腎症（すなわち、ＣＡＮ）は、それ自体、通常タンパク尿および動脈高血圧と共に、糸球体濾過量の緩慢な漸進的下降として症状を表わす。
【００５１】
全ての実質同種移植片におけるＣＡＮの基本的な組織病理学的特徴は、線維増殖性動脈内膜炎である。血管病変が動脈の全長をつぎはぎパターンで冒していく。同心円状に筋内膜が増殖することにより、線維性肥厚化および小動脈における内膜の特有な「玉ねぎの皮」様病変が生じる。他の所見には、内皮腫脹、泡沫細胞蓄積、内弾性板の破壊、ヒアリン症および内側肥厚化、および内皮下層Ｔリンパ球およびマクロファージの存在がある（Hruban RH et al.、Am J Pathol １３７（４）：８７１−８２（１９９０））。さらに、永続性限局性脈管周囲炎症も見られることが多い。
【００５２】
血管の変化に加えて、ＣＡＮに冒されている腎臓は、線維症、尿細管萎縮および糸球体症(glumerulopathy)も示す。慢性移植糸球体症−毛細管壁の折れ重なりおよび糸球体間質増加は、ＣＡＮに冒された腎臓の非常に特異的な特徴として認められている（Sorez K、Clin Transplant；８（３Ｐｔ２）：３４５−５０（１９９４））。特異性の劣る病変は、糸球体虚血性虚脱、尿細管萎縮、および間隙性線維症である。さらに、尿細管周囲の毛細管基部分裂および層状化は、晩期の移植片機能衰退に随伴している（Monga M et al、Ultrastruct Pathol.１４（３）：２０１−９（１９９０））。腎臓同種移植片におけるＣＡＮの組織学的診断に関する基準は、腎臓同種移植病理学に関するBanff97 スキーム（Racusen LC et al.、Kidney Int.５５（２）：７１３−２３（１９９９））で国際的に標準化されている（Kouwenhoven et al.、Transpl Int. ２０００；１３（６）：３８５−４０１（２０００）から採用）。表２は、慢性／硬化性同種移植腎症（ＣＡＮ）に関するBanff 97 基準を要約している（Racusen LC et al.、Kidney Int.５５（２）：７１３−２３（１９９９））。
【表２】
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【００５３】
Banff 97についての「適切な」標本は、１０またはそれ以上の糸球体(glumeruli)および少なくとも２つの動脈を伴う生検材料として定義される。ＣＡＮのプロセスを理解するために２つの作業仮説が提起されている（Kouwenhoven et al.、Transpl Int.２０００；１３（６）：３８５−４０１、２０００）。第一の、そして恐らくは最も重要な一群の危険因子は、「アロ抗原依存的」、免疫学的または拒絶関連因子の名称のもとで一まとめにされている。これらのうち、急性拒絶エピソードの後発的発現および数の増加、レシピエント年齢の若さ、男性対女性の性別ミスマッチ、自己免疫肝炎または胆道疾患の一次診断、基準免疫抑制および非白色人種のレシピエントは全て、慢性拒絶発症の危険増加と関連している。さらに具体的には、（ａ）組織適合性：長期移植片生存は、ドナーとレシピエント間における組織適合性の相性度と強い相関関係を示すと思われる；（ｂ）急性拒絶：急性拒絶エピソードの発現、頻度および重症度は、ＣＡＮの独立危険因子である。急性拒絶はＣＡＮ発生について最も一貫して認められている危険因子である；（ｃ）シクロスポリンの低すぎる維持用量またはコンプライアンスの悪さに起因する最適状態には及ばない免疫抑制；および（ｄ）抗ドナー特異的抗体：多くの試験は、移植後、患者の大多数が抗体を産生することを示している。第二群の危険因子は、慢性拒絶反応発症の一因でもある「非アロ抗原依存的」または「非免疫学的」危険因子と称され、ドナーの高齢化、ドナー臓器における既存のアテローム性動脈硬化、および長い冷阻血時間を含む。病気および損傷、例えば虚血に対する非アロ免疫応答は、ＣＡＮを誘発またはさらに悪化させ得る。さらに具体的には、（ａ）もとの疾患、例えば糸球体腎炎の再発；（ｂ）移植手術創傷の結果；（ｃ）阻血の持続時間：内膜過形成は阻血持続時間と相関関係を示す；（ｄ）死体からの腎臓移植片対生きている関連および非関連ドナーからの同移植片；（ｅ）ウイルス感染：ＣＭＶ感染は細胞間接着分子、例えばＩＣＡＭ−１に直接影響を及ぼす；（ｆ）高脂血症；（ｇ）高血圧；（ｈ）年齢；（ｉ）性差：移植動脈硬化の兆候は女性より男性の方が早く現れた；（ｊ）人種；および（ｋ）機能組織の量−ネフロンの数の減少および過剰濾過。
【００５４】
ＣＡＮは、移植臓器の破壊の形態学的形跡を特徴とする。全実質臓器の共通特性は、内膜過形成の発生である。Ｔ細胞およびマクロファージは、優勢な侵入性移植片細胞型であり、ＣＤ８＋ＴよりＣＤ４＋Ｔ細胞が多い。接着分子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）およびＭＨＣ抗原の発現増加は、ＣＡＮに冒された同種移植片で見られ、多くの場合高いＴＧＦ−βが見出される。移植片がＣＡＮを発症し得る経路の簡単な説明は以下の通りである：
【００５５】
虚血、外科的手技および再灌流創傷による内皮細胞活性化。
結果的に、内皮細胞は酸素不含有基を産生し、それらは増量のサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびケモカインＩＬ−８、マクロファージ化学誘引性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質１αおよび１β（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β）、コロニー刺激因子、および多様な成長因子、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）および前血栓分子、例えば組織因子およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）を放出する。これらのサイトカイン類が、損傷部位への好中球、単球／マクロファージおよびＴリンパ球の移動を活性化することにより、それらはＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−およびＥ−セレクチンを含む接着分子を介して内皮細胞と相互作用する。これらの接着分子の発現増加は、サイトカインＩＬ−１β、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αにより誘導される。白血球の管外遊出は、活性化補体および内皮細胞間の透過性を高める酸素不含有基により促進される。
【００５６】
ＣＡＮ診断に関する現行の臨床アプローチに対する限界
拒絶、例えばＣＡＮと移植片機能不全に関する他の病因の診断の区別および有効な治療法の設定は、（ａ）拒絶の診断に利用可能な最善の現行手段である、移植片の経皮的コア針生検は、通常、移植片機能不全および移植片障害（場合によっては不可逆的）が既に存在するという「事実」があって初めて実施される、（ｂ）移植片の形態学的分析からは、所与の拒絶エピソードを後退させる可能性に関する限られた手掛かり、および再発（「リバウンド」）の尤度に関する僅かな手掛かりが得られるに過ぎない、および（ｃ）治療戦略の設計のための前提条件である、拒絶現象の機械論的根拠は、拒絶の形態学的特徴を含む現行の診断指数により十分に定義されているわけではないため、複雑なプロセスとなっている。
【００５７】
例えば、腎臓同種移植拒絶の診断は、通常移植片機能不全の発現（例、血清クレアチニン濃度の増加）および単核細胞浸潤も示している移植片領域における移植片損傷の形態学的証拠により下される。しかしながら、拒絶経過の指標として腎機能の異常を用いることについては、２つ警告すべき点がある：第１に、死体の腎臓移植片の多くは、摘出および生体外保存処置により被った損傷故に移植直後の期間は急性（可逆性）腎不全に陥っていることから、腎機能の衰退が拒絶を診断するための臨床的手掛かりとして必ずしも利用可能とはいえない。第２に、腎臓機能が直接的に損なわれていない場合でさえ、非免疫学的原因、例えば免疫抑制療法そのものにより、移植片機能不全が発生することもあり得る。
【００５８】
例えば、シクロスポリン（ＣｓＡ）の血漿／血液濃度に基づくだけでは容易に識別されない合併症であるＣｓＡ腎毒性は、よく見られる合併症である。拒絶反応に対しては免疫抑制剤用量の段階的上昇、そして腎毒性に対してはＣｓＡ用量の低減化というように治療戦略が全く反対であるため、ＣｓＡ腎毒性から拒絶を区別する臨床的重要性をあまり強調することはできない。
【００５９】
本発明は、一つには、１つまたはそれ以上の遺伝子および／またはコード化されたタンパク質の発現の増加または減少が、ある種の移植片拒絶状態と関連しているという観察に基づいている。本明細書記載のデータの結果として、本方法は、同種移植生検材料が緩やかな細胞浸潤しか示していない場合でさえ、急性および慢性拒絶の迅速で信頼できる診断を下すのに現時点でも利用可能である。本明細書では、同時にモジュレーション（例、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）され、分子シグネチャーを提供することにより移植拒絶を正確に検出させ得る複数遺伝子の分析について記載している。
【００６０】
さらに本発明は、適切なバイオマーカー遺伝子の発現を測定する古典的分子方法および大規模方法を提供する。本明細書記載の方法は、慢性移植拒絶、好ましくは早期慢性移植拒絶を検出するのに特に有用である。一具体例では、慢性移植拒絶はＣＡＮの結果である。最も典型的には、対象（すなわち、移植体のレシピエント）は哺乳類、例えばヒトである。移植臓器は、移植可能な臓器または組織であればよく、例えば腎臓、心臓、肺、肝臓、膵臓、骨、骨髄、腸、神経、幹細胞（または幹細胞由来細胞）、組織成分および組織複合物が含まれ得る。好ましい例では、移植体は腎臓移植体である。
【００６１】
本明細書記載の方法は、抗拒絶療法の効力を評価するのに有用である。上記方法では、バイオマーカー遺伝子の転写物の投与前規模と、同遺伝子の転写物の投与後規模を比較し、遺伝子転写物の投与後規模が同遺伝子転写物の投与前規模より小さい場合、抗拒絶療法が有効であることを示すものとする。移植拒絶の予防および／または処置についての候補（例えば、薬剤、抗体、または拒絶または予防の他の形態）は、候補への暴露の前と後におけるバイオマーカー発現の規模を比較することによりスクリーニングにかけられ得る。さらに、この方法で集められた貴重な情報は、生物学的材料の評価を実施している対象について将来的な臨床管理体制を決定する際の助けとなり得る。評価は、対象からの試料を用いて、バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現の規模を測定する本明細書記載の方法を用いることにより実施され得る。分析は、さらに感染源の検出も含み得る。
【００６２】
本発明バイオマーカーと関連した生物学的経路
本発明のバイオマーカーにより、ＣＡＮによる影響を受ける選択された生物学的経路が同定され、これらの生物学的経路は、それ自体固体臓器同種移植腎症と直接的に関連している。事実、このメタアナリシスは、遺伝子クラスターを表し得る選択された生物学的経路についての堅固なバイオマーカーシグネチャーを明らかにした。上記生物学的経路には、例えばｗｎｔ経路（すなわち、ＮＦＡＴ（Murphy et al.、J Immunol.６９（７）：３７１７−２５（２００２））；ＮＥ−ｄｌｇ（Hanada et al.、Int.J.Cancer ８６（４）：４８０−８（２０００））；frizzled-９（Karasawa et al.、J.Biol.Chem.２７７（４０）：３７４７９−８６（２００２））；Hes-1（Deregowski et al.、J Biol Chem．２８１（１０）：６２０３−１０（２００６）；Piscione et al.、Gene Expr.Patterns４（６）：７０７−１１（２００４））、ＴＧＦベータ／Ｓｍａｄシグナリング経路（すなわち、Ｓｍａｄ３（Saika et al.、Am.J.Pathol.１６４（２）：６５１−６３（２００４）；Ｓｍａｄ２（Ju et al.、Mol.Cell Biol.２６（２）：６５４−６７（２００６）；ｐＭ５／ＮＯＭＯ（Hafner et al.、EMBO J.２００４年８月４日；２３（１５）：３０４１−５０；ＳｎｏＮ（Zhu et al.、Mol.Cell Biol.２５（２４）：１０７３１−４４（２００５）；Wilkinson et al.、Mol.Cell Biol.２５（３）：１２００−１２（２００５））、グルコースおよび脂肪酸輸送および代謝（すなわち、ＧＬＵＴ４（Linden et al.、Am J Physiol Renal Physiol.２９０（１）：F２０５−１３（２００６））、血管平滑筋分化（すなわち、ルミカン（Onda et al.、７２（２）：１４２−９（２００２）；セルロプラスミン（Chen et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.２８１（２）：４７５−８２（２００１）、アムニオンレス（Moestrup SK、Curr Opin Lipidol.１６（３）：３０１−６（２００５）；大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ））、血管硬化（ＴＨＲＡ（Sato et al.、Circ.Res.９７（６）：５５０−７（２００５）；ＩＧＦＢＰ４；ＡＥ結合タンパク質−１（Layne et al.、J.Biol.Chem.２７３（２５）：１５６５４−６０（１９９８）；Abderrahim et al.、Exp.Cell Res.２９３（２）：２１９−２８（２００４））；ＥＣＭ（コラーゲン）、および免疫応答（ＮＦＡＴ（Murphy et al.、J Immunol.６９（７）：３７１７−２５（２００２））；ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ（Steinman R.M.、Annu Rev.Immunol ９：２７１−９６（１９９１）；Xu et al.、Trends Pharmacol.Sci.２５（５）：２５４−８（２００４））があるが、これらに限定されるわけではない。Jehle および共同研究者らは、血清中におけるインスリン様増殖因子結合タンパク質４が慢性腎不全に特有なものであることを立証した。Jehle et al.、Kidney Int．５７（３）：１２０９−１０（２０００）。Azuma および共同研究者らは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が、急性虚血損傷からの腎臓再生および保護において向腎的役割を演じること、およびＨＧＦ処置が、ラットモデルでのＣＡＮの後続的発症に対する感受性の低下に大きく貢献することを示した。Azuma et al.、J.Am.Soc.Nephrol.１２（６）：１２８０−９２（２００１）。
【００６３】
大規模遺伝子発現解析の出現により、遺伝子群は多くの場合まとめて共役発現されることが明らかにされた。例えば、酵母サッカロマイシス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)における全ゲノム発現解析は、ジオーキシーシフトとして知られる成長条件の変化中における代謝遺伝子の同調的調節を示した（DiRisi et al.、１９９７、Science ２７８：６８０−６８６；Eisen et al.、１９９８、PNAS ９５：１４８６３−１４８６８）。ジオーキシーシフトは、グルコースをエタノールに発酵させる酵母細胞が培地中のグルコースを使い果たし、エタノールを代謝し始めたときに起こる。グルコースの存在下では、解糖経路の遺伝子が発現され、グルコースからエタノールへの発酵を実施する。グルコースが使い果たされたとき、酵母細胞は、クレブス回路および呼吸に大きく依存する過程である、エタノールの代謝を行わなければならない。
【００６４】
したがって、解糖遺伝子の発現が減少し、クレブス回路および呼吸遺伝子の発現が同調的に増加する。同様の同調遺伝子調節は、様々な癌細胞からも見出される。細胞周期の進行およびＤＮＡ合成に関与するタンパク質をコード化する遺伝子は、癌細胞で同調的に過剰発現されることが多い（Ross et al.、２０００、Nature Genet.２４：２２７−２３５；Perou et al.、１９９９、PNAS ９６：９２１２−９２１７；Perou et al.、２０００、Nature ４０６：７４７−７５２）。
【００６５】
遺伝子の同調調節は、機能的観点から見て論理的である。ほとんどの細胞プロセスは、多様な遺伝子を必要とし、例えば、解糖、クレブス回路、および細胞周期の進行は全て多遺伝子プロセスである。したがって、機能的に関連した遺伝子の共役発現は、細胞に様々な細胞活動を遂行させるのに不可欠である。上記の遺伝子群は、「遺伝子クラスター」と称され得る（Eisen et al.、１９９８、PNAS ９５：１４８６３−６８）。
【００６６】
遺伝子発現のクラスタリングは、機能的必要性だけでなく、転写制御機構による当然の成り行きでもある。遺伝子発現は、主として調節エレメントとも呼ばれるシス作用ＤＮＡ配列に結合する転写調節因子により調節される。特定遺伝子に関する発現パターンは、その遺伝子に作用する様々な転写調節因子の活性を合わせた結果である。したがって、類似した一連の調節エレメントを有する遺伝子はまた、類似した発現パターンを有し、群がる傾向を有する。勿論、異なる調節エレメントを有する遺伝子がある種の環境下で共役発現されることも可能であり、全く一般的なことである。
【００６７】
複数の遺伝子クラスターの分析は、移植拒絶の診断のみならず、適切な医学的介入の決定にも有用であることが予測される。例えば、慢性同種移植腎症は、多くの変異型および多種多様な最適な治療戦略を有する疾患についての一般的表現である。一実施態様において、本発明は、同時に移植拒絶を識別し、適切な処置を決定する方法を提供する。概して、本発明は、適切な治療プロトコルを指示する、遺伝子クラスターを表し得る種々の情報的バイオマーカー遺伝子の典型を測定することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
遺伝子発現の検出
本発明のある実施態様では、発現規模を、対象から得た試料における１つまたはそれ以上のバイオマーカー遺伝子について測定する。試料は、対象から、例えば移植片生検材料から得た細胞を含み得る。他の試料には、流体試料、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、ＣＳＦ、嚢胞液、腹水、尿、糞尿および胆汁があるが、これらに限定されるわけではない。また、試料は、気管支肺胞洗浄液、胸膜液または腹膜液、または正常または異常に機能している同種移植片により分泌または排泄される他の流体、または同種移植片を通して、または同種移植片の解剖学的近位での滲出または濾出から生じる他の流体、または同種移植片との液体連通における流体から得られる。
【００６９】
遺伝子発現の測定については多くの異なる方法が当業界では知られている。古典的方法には、定量的ＰＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットおよびリボヌクレアーゼ保護検定法がある。本明細書記載のある例では、競合的逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを用いることにより、バイオマーカー遺伝子の発現の規模を測定する。上記方法を用いることにより、対象遺伝子および遺伝子クラスター全体の発現を調べることが可能である。しかしながら、調べるべき遺伝子の数が増えると、時間と費用も手に負えないものとなり得る。
【００７０】
大規模検出方法により、多くの遺伝子の発現レベルの迅速で安価な同時分析が可能となった。上記方法は、典型的には固体基材に固定化したプローブの規則正しいアレイを必要とする。各プローブは、異なるセットの核酸とハイブリダイゼーションし得る。一方法では、興味の対象である様々な遺伝子のコーディング領域の実質的部分を増幅または合成することにより、プローブを作製する。次いで、これらの遺伝子を固体支持体にスポットする。次いでｍＲＮＡ試料を得、ｃＤＮＡに変換し、増幅および（通常蛍光性標識により）標識する。次いで、標識ｃＤＮＡをアレイに適用し、ｃＤＮＡを、それらの濃度と線形関係を示す形でそれぞれのプローブとハイブリダイゼーションさせる。標識の検出により、アレイに付着した各ｃＤＮＡの量が測定され得る。上記ＤＮＡアレイ実験の多くの実施方法が当業界では公知である。典型的な方法を以下に記載しているが、限定を意図したものではない。
【００７１】
マイクロアレイは当業界では公知であり、遺伝子産物（例、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）に順序どおりに対応しているプローブが既知の位置で結合される表面により構成される。一実施態様において、マイクロアレイは、各位置が遺伝子によりコード化される産物（例、タンパク質またはＲＮＡ）について別々の結合部位を表し、結合部位が生物体ゲノムにおける遺伝子の大部分またはほとんど全部の産物について存在するアレイ（すなわち、マトリックス）である。好ましい実施態様では、「結合部位」（以後、「部位」）は、特定同族ｃＤＮＡが特異的にハイブリダイゼーションし得る核酸または核酸誘導体である。結合部位の核酸または誘導体は、例えば合成オリゴマー、完全長ｃＤＮＡ、完全長未満のｃＤＮＡまたは遺伝子フラグメントであり得る。
【００７２】
通常、マイクロアレイは、少なくとも１００、さらに好ましくは５００、１０００、４０００またはそれ以上の遺伝子に対応する結合部位を有する。ある実施態様において、最も好ましいアレイは、示された特定生物体の遺伝子の約９８〜１００％を有する。他の実施態様では、少数の特に選択された遺伝子に対応する結合部位を有するカスタマイズされたマイクロアレイが使用され得る。ある実施態様において、カスタマイズされたマイクロアレイは、４０００未満、１０００未満、２００未満または５０未満の遺伝子についての結合部位を含み、表４、表５、表６、表７および表８のバイオマーカーのいずれかのうち少なくとも２個、好ましくは少なくとも３、４、５個またはそれ以上の遺伝子についての結合部位を含む。好ましくは、マイクロアレイは、興味の対象である生物学的ネットワークモデルの試験および確認に適切な遺伝子に関する結合部位を有する。
【００７３】
マイクロアレイと接触させる核酸は、様々な方法で製造され得る。全体およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの製造方法は、公知であり、Sambrook et al.、前出で総括的に記載されている。標識ｃＤＮＡは、オリゴｄＴ−プライマーまたはランダム−プライマー逆転写によりｍＲＮＡから製造され、両方とも当業界では公知である（例、Klug および Berger、１９８７、Methods Enzymol．１５２：３１６−３２５参照）。逆転写は、検出可能な標識に結合させたｄＮＴＰ、最も好ましくは蛍光標識ｄＮＴＰの存在下で実施され得る。別法として、単離ｍＲＮＡは、標識ｄＮＴＰの存在下における２本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写により合成される標識アンチセンスＲＮＡに変換され得る（Lockhart et al.、１９９６、Nature Biotech.、１４：１６７５）。ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、検出可能な標識の非存在下で合成され得、それに続いて例えばビオチニル化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを組込むかまたは類似手段（例、ビオチンのプソラレン誘導体をＲＮＡに光架橋する）によりそれらを標識し、次いで標識ストレプトアビジン（例、フィコエリトリン標識ストレプトアビジン）または均等内容物質を付加し得る。
【００７４】
蛍光標識を使用するとき、多くの適切な発蛍光団が知られており、フルオレセイン、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン（Perkin Elmer Cetus）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｃｙ７、蛍光体Ｘ（Amersham）などが挙げられる（例えば、Kricka、１９９２、Academic Press、サンディエゴ、カリフォルニア、参照）。
【００７５】
別の実施態様では、蛍光標識以外の標識を使用する。例えば、一放射性標識、または異なる放射スペクトルをもつ一対の放射性標識が使用され得る（Zhao et al.、１９９５、Gene １５６：２０７；Pietu et al.、１９９６、Genome Res.６：４９２参照）。しかしながら、放射性同位元素の使用はそれほど好ましくない例である。
【００７６】
核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については、標識核酸の集団が、マトリックスに固定化された適切な相補的核酸と特異的にハイブリダイゼーションするように選択する。本願で使用しているところでは、ポリヌクレオチドの短い方が２５塩基またはそれ未満である場合に標準塩基対合規則によると誤対合が無く、またはポリヌクレオチドの短い方が２５塩基より長い場合に誤対合が５％以下であるとき、一方のポリヌクレオチド配列は、他方と相補的であると考えられる。
【００７７】
最適ハイブリダイゼーション条件は、標識核酸および固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ（例、オリゴマー対２００塩基より大きいポリヌクレオチド）およびタイプ（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）により異なる。核酸についての特異的（すなわち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件に関する一般的パラメーターは、Sambrook et al.、前出、および Ausubel et al.、１９８７、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing および Wiley-Interscience、ニューヨーク）に記載されており、これらを目的に応じて出典明示により援用する。アレイへの標識核酸の非特異的結合は、アレイを大量の非特異的ＤＮＡで処理すること、いわゆる「ブロッキング」段階により低減化され得る。
【００７８】
蛍光標識プローブを使用するとき、転写物アレイの各部位での蛍光放射は、好ましくは走査型共焦レーザー顕微鏡により検出され得る。２種の発蛍光団を使用するとき、使用する２種の発蛍光団のそれぞれについて、適切な励起線を用いて別々の走査を実施する。別法として、２種の発蛍光団に対し特異的な波長での同時試料照明を可能にするレーザーが使用され得、２種の発蛍光団からの放射は同時に分析され得る（Shalon et al.、１９９６、Genome Research ６：６３９−６４５参照）。好ましい実施態様では、コンピューター制御Ｘ−Ｙステージおよび顕微鏡対物レンズを備えたレーザー蛍光スキャナーでアレイを走査する。２発蛍光団の連続励起を多波長型混合ガスレーザーで達成し、放射光線を波長により分解し、２つの光電子倍増管で検出する。蛍光レーザー走査装置は、Schena et al.、１９９６、Genome Res.６：６３９−６４５および本明細書で挙げた他の参考文献に記載されている。別法として、Ferguson et al.、１９９６、Nature Biotech.１４：１６８１−１６８４に報告された光ファイバー束を用いることにより、多数の部位で同時にｍＲＮＡ存在量レベルをモニターすることが可能である。蛍光マイクロアレイスキャナーは、Affymetrix、Packard BioChip Technologies、BioRobotics および多くの他の供給会社により市販されている。
【００７９】
様々なコンピューターソフトウェアを用いて、シグナルを記録し、定量化し、分析する。一実施態様では、走査画像を、グラフィクスプログラム（例、Hijaak Graphics Suite）を用いてスペックル除去し、次いで各部位における各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを作成する画像グリッドプログラムを用いて解析する。必要ならば、２つの蛍光体に関するチャンネル間の「クロストーク」（またはオーバーラップ）について実験的に決定した補正を行い得る。転写物アレイ上の特定ハイブリダイゼーション部位について、好ましくは２種の発蛍光団の放射の比を計算する。この比は、同族遺伝子の絶対発現レベルとは無関係であるが、発現が薬剤投与、遺伝子欠失または他の試験事象により著しくモジュレーションされる遺伝子には有用である。
【００８０】
一実施態様において、２種の標識が異なるｃＤＮＡセットの混合物をマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせることにより、興味の対象である細胞の転写状態を反映する転写物アレイを作製する。一方の細胞は興味の対象である細胞であり、他方は標準化対照として使用される。したがって、マイクロアレイとの各細胞のｃＤＮＡの相関的ハイブリダイゼーションは、２細胞における各遺伝子の相対的発現を反映する。
【００８１】
好ましい実施態様では、様々な統計的方法を用いることにより、異なる試料および条件におけるバイオマーカーモデルの遺伝子の発現レベルが比較され得る。様々な統計的方法が、異なる遺伝子の発現パターンにおける関連性の度合いを評価するのに利用可能である。統計的方法は、２つの関連部分に分けられる：１個またはそれ以上の遺伝子の発現パターンの関連性を決定する測定基準法、および適切な測定基準法に基づいた発現データを組織化および分類する、クラスタリング方法（Sherlock、２０００、Curr.Opin.Immunol.１２：２０１−２０５；Butte et al.、２０００、Pacific Symposium on Biocomputing、ハワイ、World Scientific、ｐ４１８−２９）。
【００８２】
一実施態様では、ピアソンの相関関係が測定基準法として使用され得る。簡単に述べると、所与の遺伝子について、遺伝子発現レベルの各データポイントにより、全条件に及ぶその遺伝子に関する遺伝子発現レベルの全体平均からの遺伝子発現の偏差を表すベクトルが定められる。次いで、各遺伝子の発現パターンは、一連のプラスおよびマイナスのベクトルとして考察され得る。次いで、各遺伝子のベクトルを互いに比較することにより、ピアソン相関係数が計算され得る。かかる方法の一例は、Eisen et al.（１９９８、前出）に記載されている。ピアソン相関係数は、ベクトルの向きの説明となるが、規模について説明するものではない。
【００８３】
別の実施態様では、ユークリッド距離測定法が測定基準法として使用され得る。これらの方法では、ベクトルを各条件での各遺伝子について計算し、遺伝子に関するベクトルが描く点の間の多次元空間における絶対距離に基づいて比較する。別の実施態様では、ユークリッド距離測定および相関係数の両方をクラスタリングで使用した。
【００８４】
さらなる実施態様では、遺伝子発現パターンの関連性がエントロピー計算により決定され得る（Butte et al.２０００、前出）。各遺伝子の発現パターンについてエントロピーを計算する。次いで、２遺伝子について計算したエントロピーを比較することにより、相互情報量を測定する。個々に各遺伝子について計算したエントロピーから結合遺伝子発現パターンエントロピーを減じることにより、相互情報量を計算する。２遺伝子の発現パターンが異なるほど、結合エントロピーも高くなり、計算される相互情報量は低くなる。したがって、高い相互情報量は、２つの発現パターン間における非ランダムな関連性を示す。
【００８５】
別の実施態様では、凝集型クラスタリング方法を用いることにより、遺伝子クラスターを同定し得る。一実施態様では、ピアソン相関係数またはユークリッド測定基準を各遺伝子について決定し、次いで樹形図を形成する基礎として使用する。一例では、極めて密接な相関係数をもつ遺伝子対について遺伝子を走査した。次いで、枝の奥行の間の距離を相関度と比例させて、これらの遺伝子を節点で連結した樹形図の２本の枝に配置する。段々に枝を木に付け加えながら、この処理を続行する。最終的に、短い枝で連結された遺伝子がクラスターを表し、長い枝で連結された遺伝子がクラスターを形成していない遺伝子を表す樹形図が形成される。ユークリッド測定基準法による多次元空間における点を用いても樹形図を作成することが可能である。
【００８６】
さらに別の実施態様では、分枝型クラスタリング方法が使用され得る。例えば、各遺伝子の発現パターンにベクトルを割り当て、２つのランダムベクトルを作成する。次いで、各遺伝子を、一ベクトルと適合する可能性に基づいて２つのランダムベクトルのその一方に割り当てる。ランダムベクトルを繰り返し再計算することにより、遺伝子を２群に分割する２つの重心を作成する。この分割により樹形図の基部に主要な枝が形成される。次いで、各群をさらに同じ要領で分割し、最終的に完全に枝分かれした樹形図が得られる。
【００８７】
さらなる実施態様では、自己組織化マップ（ＳＯＭ）を用いてクラスターを形成させ得る。一般的には、例えば上記のユークリッド測定基準法などの測定基準法を用いることにより、遺伝子発現パターンをｎ次元空間でプロットする。次いで、重心の格子をｎ次元空間に配置し、重心を点のクラスターに向かって移動させることにより、遺伝子発現のクラスターが表わされる。最終的に、重心は、遺伝子クラスターの一種の平均的なものである遺伝子発現パターンを表す。ある実施態様では、ＳＯＭを用いて重心を作成し、各重心でクラスターを形成する遺伝子がさらに樹形図により表示され得る。典型的な方法は、Tamayo et al.、１９９９、PNAS ９６：２９０７−１２に記載されている。一旦重心が形成されると、前記方法の一つにより相関関係が評価され得る。
【００８８】
別の実施態様では、ＰＬＳＤＡ、ＯＰＬＳおよびＯＳＣ多変量解析が分類手段として使用され得る。実施例１で詳述しているところによると、本発明のバイオマーカーモデル（例、ＰＬＳＤＡ、ＯＰＬＳおよびＯＳＣモデルおよび上記モデルにより同定される遺伝子）は、潜在的ＣＡＮおよび／または早期ＣＡＮに冒された組織を分類するのに有用である。
【００８９】
別の態様において、本発明はプローブセットを提供する。好ましいプローブセットは、１個またはそれ以上の遺伝子の発現を検出するように設計され、移植片の状態に関する情報を提供する。本発明の好ましいプローブセットは、表４、表５、表６、表７および表８のバイオマーカー遺伝子のいずれかに属する少なくとも２個の遺伝子の検出に有用なプローブを含む。本発明のプローブセットは、１００００以下の遺伝子転写物の検出に有用なプローブを含み、好ましいプローブセットは、４０００未満、１０００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満の遺伝子転写物の検出に有用なプローブを含む。本発明のプローブセットは、移植体の状態に関する情報を与える遺伝子転写物の検出に標的を定めている。本発明のプローブセットはまた、移植体の状態に関する情報を与えるわけではない遺伝子転写物を検出する多数または少数のプローブを含み得る。好ましい実施態様では、本発明のプローブセットは、固体基材に固定されることによりプローブのアレイを形成する。プローブセットはまた、マルチプレックスＰＣＲにも有用であり得ることが期待される。プローブセットのプローブは、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的修飾形態）、またはＰＮＡ、または目的核酸配列と特異的に相互作用し得る他のポリマー化合物であり得る。
【００９０】
本発明のバイオマーカー（複数も可）を含むコンピューターで読み取り可能な媒体も提供される。上記で使用している「コンピューターで読み取り可能な媒体」は、コンピューターで読み取り、直接アクセスできる媒体を包含する。上記媒体には、磁気記憶媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；光記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ；電気記憶媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭ；およびこれらの範疇のハイブリッド、例えば磁気／光記憶媒体があるが、これらに限定されるわけではない。現在知られているコンピューターで読み取り可能な媒体のいずれかを用いて、本発明のバイオマーカーをそこに記録させたコンピューターで読み取り可能な媒体を含む製品を作製する方法については、当業者であれば容易に理解できるはずである。
【００９１】
上記で使用している「記録させた」は、コンピューターで読み取り可能な媒体に情報を保存する処理を含む。当業者であれば、コンピューターで読み取り可能な媒体に情報を記録する現在公知の方法のいずれかを採用することにより、本発明のバイオマーカーを含む製品を容易に作製し得るはずである。
【００９２】
様々なデータ処理装置のプログラムおよびフォーマットを用いることにより、コンピューターで読み取り可能な媒体に本発明のバイオマーカー情報を保存することが可能である。例えば、バイオマーカーに対応する核酸配列は、市販のソフトウェア、例えばWordPerfect および MicroSoft Wordでフォーマット化される、言語処理テキストファイルで表示されるか、またはデータベースアプリケーション、例えばＤＢ２、Sybase、Oracleなどに保存される、ＡＳＣIIファイル形式で表示され得る。幾つかのデータ処理装置構造化フォーマット（例、テキストファイルまたはデータベース）を適合させることにより、本発明のバイオマーカーを記録させたコンピューターで読み取り可能な媒体が得られる。
【００９３】
コンピューターで読み取り可能な形態で本発明のバイオマーカーを提供することにより、常用手順で様々な目的に関するバイオマーカー配列情報にアクセスすることが可能である。例えば、当業者であれば、コンピューターで読み取り可能な形態で本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を用いることにより、標的配列または標的構造モチーフを、データ記憶装置内に保存された配列情報と比較することができるはずである。検索手段を用いることにより、特定標的配列または標的モチーフと適合する本発明配列のフラグメントまたは領域が同定される。
【００９４】
本発明はまた、本発明バイオマーカー（複数も可）を含むアレイを包含する。アレイを用いることにより、アレイにおける１個またはそれ以上の遺伝子の発現が検定され得る。一実施態様では、アレイを用いて組織における遺伝子発現を検定することにより、アレイにおける遺伝子の組織特異性を確認することが可能である。この方法では、約４７００までの遺伝子が発現について同時に検定され得る。これにより、１つまたはそれ以上の組織で特異的に発現される一群の遺伝子を示すプロフィールが明らかにされ得る。
【００９５】
上記の定性的測定に加えて、本発明では遺伝子発現が定量化され得る。すなわち、組織特異性に加えて、組織における一群の遺伝子の発現レベルも確認され得る。したがって、遺伝子は、それらの組織発現性そのものおよびその組織での発現レベルに基づいて分類され得る。これは、例えば２つまたはそれ以上の組織の間における遺伝子発現の関係を確かめるのに有用である。すなわち、一組織を揺動させ、第２組織での遺伝子発現に対するその影響が測定され得る。この状況で、生物学的刺激因子に対する応答における一細胞型に対する別の細胞型の影響が測定され得る。かかる測定は、例えば遺伝子発現レベルでの細胞対細胞の相互作用の影響を知るのに有用である。ある細胞型を処置するために治療上作用物質を投与したところ、その作用物質が別の細胞型に対して望ましくない作用を有する場合、本発明は、望ましくない作用の分子的根拠を調べる検定法を提供することから、中和作用物質を併用投与するかまたは別の手段で望ましくない作用を処置する機会を提供するものである。同様に、単細胞型内でさえ、望ましくない生物学的作用が分子レベルで測定され得る。すなわち、標的以外の遺伝子の発現に対する作用物質の効果も確認および中和され得る。
【００９６】
別の実施態様では、アレイを用いることにより、アレイにおける１個またはそれ以上の遺伝子の発現の時間推移をモニターすることが可能である。これは、本明細書で開示した様々な生物学的状況、例えば発生および分化、病気の進行、インビトロ過程、例えば細胞の形質転換および老化、自律神経および神経学的過程、例えば疼痛および本能的欲望、および認知機能、例えば学習または記憶で行われ得る。
【００９７】
アレイはまた、同一細胞または異なる細胞における他の遺伝子の発現に対する一遺伝子の発現の影響を確認するのにも有用である。これは、例えば最終または下流標的が調節され得ない場合に、治療的介入に関する代替的分子標的の選択対象を提供する。
【００９８】
上記アレイはまた、正常および罹患細胞における１個またはそれ以上の遺伝子の示差的発現パターンを確認するのにも有用である。これは、診断または治療的介入に関する分子標的としての役割を果たし得る一群の遺伝子を提供する。
【００９９】
タンパク質
さらに、ある種のタンパク質のレベル増加もまた、移植体に関する診断に役立つ情報を提供し得ることが予測される。ある実施態様では、表４、表５、表６、表７および表８の遺伝子によりコード化される１種またはそれ以上のタンパク質が検出され得、タンパク質レベルの上昇または減少が、移植拒絶の診断に使用され得る。好ましい実施態様では、タンパク質レベルを移植後流体試料で検出し、特に好ましい実施態様では、流体試料は、末梢血または尿である。別の好ましい実施態様では、タンパク質レベルは移植片生検材料から検出される。
【０１００】
この明細書によると、タンパク質の検出方法は当業界では公知である。上記方法の例には、ウエスタン・ブロッティング、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、一および二次元電気泳動、質量分析法および酵素活性の検出がある。適切な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント（たとえばＦａｂフラグメント）、１本鎖抗体および特異結合分子の他の形態が含まれ得る。
【０１０１】
予測医学
本発明は、診断的検定法、予後判定法、薬理遺伝学および臨床試験のモニタリングを予後（予知）目的に用いることにより、対象を診断し、予防的に処置する予知医学分野に関するものである。したがって、本発明の一つの態様は、試料（例、血液、血清、細胞、組織）からのバイオマーカータンパク質および／または核酸発現を測定することにより、対象が移植拒絶を起こす可能性があるか否かを測定する診断的検定法に関するものである。
【０１０２】
本発明の別の態様は、以下の項でさらに詳しく記載している臨床試験におけるバイオマーカーの発現または活性に対する作用物質（例、薬物、化合物）の影響のモニタリングに関するものである。
【０１０３】
試料中における本発明のバイオマーカータンパク質または遺伝子の存在または欠如を検出する方法の一例では、試験対象から試料を入手し、バイオマーカータンパク質または核酸の存在が試料から検出されるように、タンパク質またはバイオマーカータンパク質をコード化する核酸（例、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または作用物質と試料を接触させる。本発明のバイオマーカー遺伝子またはタンパク質に対応するｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい作用物質は、本発明のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションし得る標識核酸プローブである。本発明の診断的検定法での使用に適切なプローブを本明細書では記載している。
【０１０４】
バイオマーカータンパク質の検出に好ましい作用物質は、バイオマーカータンパク質に結合し得る抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う抗体である。抗体は、ポリクローナル、さらに好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体、またはそのフラグメント（例、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。プローブまたは抗体に関する「標識（された）」の語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリング（すなわち、物理的結合）することによるプローブまたは抗体の直接的標識、および直接標識されている別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含するものとする。間接的標識の例には、蛍光標識２次抗体を用いる１次抗体の検出およびビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することにより、それを蛍光標識ストレプトアビジンで検出させ得る方法がある。「試料」の語は、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞および流体を包含するものとする。すなわち、本発明検出方法は、インビトロおよびインビボで試料中におけるバイオマーカーｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するのに使用され得る。例えば、バイオマーカーｍＲＮＡのインビトロ検出技術には、ノーザン・ハイブリダイゼーションおよび in situ ハイブリダイゼーションがある。バイオマーカータンパク質のインビトロ検出技術には、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタン・ブロット、免疫沈降および免疫蛍光がある。バイオマーカーゲノムＤＮＡのインビトロ検出技術には、サザン・ハイブリダイゼーションがある。さらに、バイオマーカータンパク質のインビボ検出技術には、対象への標識抗バイオマーカー抗体の導入がある。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準イメージング技術により検出され得る放射性バイオマーカーで標識され得る。
【０１０５】
一実施態様において、試料は、試験対象からのタンパク質分子を含む。別法として、試料は、試験対象からのｍＲＮＡ分子または試験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい試料は、対象から慣用的手段により単離される血清試料である。
【０１０６】
さらに本方法では、対照対象から対照試料（例、健康な非移植腎臓または拒絶の徴候を全く示していない健康な移植腎臓からの生検材料）を入手し、バイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が試料から検出されるように、バイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または作用物質と対照試料を接触させ、次いで対照試料中におけるバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中におけるバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較する。
【０１０７】
本発明はまた、試料におけるバイオマーカーの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは、試料中のバイオマーカータンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または作用物質；試料中のバイオマーカーの量を測定する手段；および試料中のバイオマーカーの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物または作用物質は、適切な容器に包装され得る。さらにキットは、バイオマーカータンパク質または核酸を検出するためのキットの使用説明書を含み得る。
【０１０８】
さらに、本明細書記載の診断方法は、異常なバイオマーカー発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症する危険がある対象の識別に使用され得る。本明細書で使用する「異常な」の語は、野生型バイオマーカー発現または活性から逸脱したバイオマーカー発現または活性を含む。異常な発現または活性は、増加または減少した発現または活性、および発現の野生型発生パターンまたは細胞レベル下の発現パターンに従わない発現または活性を含む。例えば、異常なバイオマーカー発現または活性は、バイオマーカー遺伝子における突然変異により、バイオマーカー遺伝子の過少発現または過剰発現が誘発される場合および上記突然変異が、非機能性バイオマーカータンパク質または野生型の流儀では機能しないタンパク質、例えばバイオマーカーリガンドと相互作用しないタンパク質または非バイオマーカータンパク質リガンドと相互作用するタンパク質をもたらす状況を含むものとする。
【０１０９】
さらに、本明細書記載の予後判定法は、対象に作用物質（例、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬剤候補）、例えば、シクロスポリンを投与することにより、拒絶の危険性を低減化させ得るか否かを判定するのに使用され得る。すなわち、本発明は、対象が表４、表５、表６、表７および表８における遺伝子組合わせの遺伝子発現または活性の増加に随伴した疾患について作用物質により有効に処置され得るか否かを判定する方法を提供する。
【０１１０】
遺伝子の発現または活性に対する作用物質（例、薬剤）の影響のモニタリングは、基本的薬剤スクリーニングおよび臨床試験の両方で適用され得る。例えば、遺伝子発現、タンパク質レベルの増加、または活性のアップレギュレーションについての本明細書記載のスクリーニング検定法により決定される作用物質の有効性は、対象の臨床試験において作用物質で処置している間に現れる分子シグネチャーおよび分子シグネチャーの何らかの変化を調べることによりモニタリングされ得る。
【０１１１】
例えば、ただし限定するわけではないが、遺伝子活性をモジュレーションする作用物質（例、化合物、薬剤または小分子）での処置により細胞でモジュレーションされる遺伝子およびそれらのコード化タンパク質が同定され得る。臨床試験では、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、拒絶反応に伴う関係遺伝子の発現レベルについて分析し得る。遺伝子発現レベル（例、遺伝子発現パターン）は、本明細書で記載しているノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、または別法として、本明細書記載の方法の一つにより、産生されたタンパク質の量を測定することにより定量化され得る。こうして、遺伝子発現パターンは、作用物質に対する細胞の生理学的応答を示す、分子シグネチャーとしての役割を果たし得る。したがって、この応答状態は、対象を作用物質で処置する前および処置している間の様々な時点で測定され得る。
【０１１２】
好ましい実施態様において、本発明は、作用物質（例、本明細書記載のスクリーニング検定法により同定されるアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬剤候補）による対象の処置の有効性をモニターする方法であって、（ｉ）作用物質の投与前に対象から投与前試料を採取し、（ii）投与前試料における一遺伝子または遺伝子組合わせ、遺伝子によりコード化されたタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、（iii）対象から一つまたはそれ以上の投与後試料を入手し、（iv）投与後試料におけるバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出し、（ｖ）投与前試料におけるバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、投与後の一試料または複数試料における一遺伝子または遺伝子組合わせ、遺伝子によりコード化されたタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの場合と比較し、さらに（vi）その結果に応じて対象への作用物質の投与を改変する段階を含む方法を提供する。例えば、遺伝子の発現または活性を低レベルに低下させる、すなわち、移植拒絶から保護するため作用物質の有効性を高めるのには、作用物質の投与の増加が望ましいことであり得る。他方、バイオマーカーの発現または活性を検出されたレベルより低レベルに低下させる、すなわち作用物質の有効性を減少させる、例えば毒性を回避するのには、作用物質の投与の減少が望ましいことであり得る。上記の態様によると、遺伝子の発現または活性は、観察可能な表現型応答が存在しない場合でも、作用物質の有効性の指標として使用され得る。
【０１１３】
本発明は、移植拒絶阻止を目的とする予防および治療の両方法を提供する。予防および治療の両処置方法に関して、上記処置は、薬理遺伝学分野から得られた知識に基づいて特異的に調整または修正され得る。本明細書で使用している「薬理遺伝学」は、臨床開発中および市販されている薬剤へのゲノミクス技術、例えば遺伝子配列決定、統計的遺伝学、および遺伝子発現解析の適用を包含する。さらに具体的には、この語は、対象の遺伝子が薬剤に対する彼または彼女の応答（例、対象の「薬剤応答表現型」または「薬剤応答遺伝子型」）を如何にして決定するかの研究をいう。すなわち、本発明の別の態様は、対象の薬剤応答遺伝子型にしたがって、本発明のバイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーターにより対象の予防的または治療的処置を調整する方法に関するものである。薬理遺伝学により、臨床医学者または医師は、予防的または治療的処置を、その処置が非常に有益なものとなる対象にターゲッティングし、毒性薬剤関連副作用を経験することになる対象の処置を回避することが可能となる。
【０１１４】
一態様において、本発明は、バイオマーカー発現をモジュレーションする化合物または作用物質を対象に投与することによる、バイオマーカー発現または活性の増加に関連した対象における移植拒絶の阻止方法を提供する。上記化合物または作用物質の例は、例えば免疫抑制特性を有する化合物または作用物質、例えば移植で使用される物質（例、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）；ｍＴＯＲ阻害剤（例、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、ビオリムス−７またはビオリムス−９）；免疫抑制特性を有するアスコマイシン（例、ＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など）；コルチコステロイド類；シクロホスファミド；アザチオプレン；メトトレキセート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸または塩；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンまたはその免疫抑制性相同体、類似体または誘導体；ＰＫＣ阻害剤（例、国際公開第０２／３８５６１号または同第０３／８２８５９号に開示されている、実施例５６または７０の化合物）；ＪＡＫ３キナーゼ阻害剤（例、Ｎ−ベンジル−３,４−ジヒドロキシ−ベンジリデン−シアノアセトアミド  ａ−シアノ−（３,４−ジヒドロキシ）−］Ｎ−ベンジルシナマミド（チルホスチンＡＧ４９０）、プロジギオシン２５−Ｃ（ＰＮＵ１５６８０４）、［４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６,７−ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、［４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６,７−ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ−Ｐ１５４）、［４−（３’,５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６,７−ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ−Ｐ９７、ＫＲＸ−２１１、３−｛（３Ｒ,４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル−（７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−アミノ］−ピペリジン−１−イル｝−３−オキソ−プロピオニトリルの遊離形態または医薬上許容される塩形態、例えばモノ−クエン酸塩（ＣＰ−６９０５５０とも呼ばれる）、または国際公開第０４／０５２３５９号または国際公開第０５／０６６１５６号に開示された化合物）；Ｓ１Ｐ受容体アゴニストまたはモジュレーター（例、所望によりリン酸化されていてもよいＦＴＹ７２０またはその類似体、例えば所望によりリン酸化されていてもよい２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］エチル−１,３−プロパンジオールまたは１−｛４−［１−（４−シクロヘキシル−３−トリフルオロメチル−ベンジルオキシイミノ）−エチル］−２−エチル−ベンジル｝−アゼチジン−３−カルボン酸またはその医薬上許容される塩類）；免疫抑制性モノクローナル抗体（例、白血球受容体に対するモノクローナル抗体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそれらのリガンド）；他の免疫モジュレーター化合物（例、ＣＴＬＡ４またはその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部分、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列と結合されたＣＴＬＡ４またはそ���突然変異体、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えばＡＴＣＣ６８６２９と称す）またはその突然変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙの少なくとも細胞外部分を有する組換え結合性分子）；接着分子阻害剤（例、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４アンタゴニスト）である。また、これらの化合物または作用物質は併用され得る。
【０１１５】
本発明の別の態様は、治療目的のためにバイオマーカータンパク質の発現または活性をモジュレーションする方法に関するものである。したがって、本発明のモジュレーション方法の典型的実施態様では、細胞に関連するバイオマーカータンパク質活性の１つまたはそれ以上の活性をモジュレーションするバイオマーカータンパク質または作用物質と細胞を接触させる。バイオマーカータンパク質活性をモジュレーションする作用物質は、本明細書記載の作用物質、例えば核酸またはタンパク質、バイオマーカータンパク質の天然に存する標的分子（例、バイオマーカータンパク質基質）、バイオマーカータンパク質抗体、バイオマーカータンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト、バイオマーカータンパク質アゴニストまたはアンタゴニストのペプチドミメティック、または他の小分子であり得る。一実施態様では、作用物質は、１つまたはそれ以上のバイオマーカータンパク質活性を刺激する。上記刺激性作用物質の例には、活性バイオマーカータンパク質および細胞に導入されたバイオマーカータンパク質をコード化する核酸分子がある。別の実施態様において、作用物質は、１つまたはそれ以上のバイオマーカータンパク質活性を阻害する。上記阻害性作用物質の例には、アンチセンスバイオマーカータンパク質核酸分子、抗バイオマーカータンパク質抗体、およびバイオマーカータンパク質阻害剤がある。これらのモジュレーション方法は、インビトロ（例、作用物質と共に細胞を培養することによる）または別法としてインビボ（例、対象への作用物質の投与による）で実施され得る。本発明それ自体は、バイオマーカータンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した対象の処置方法を提供する。本方法の一実施態様では、バイオマーカータンパク質の発現または活性をモジュレーション（例、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）する作用物質（例、本明細書記載のスクリーニング検定法により同定される作用物質）または作用物質の組合わせを投与する。本方法の別の実施態様では、低下したか、または異常なバイオマーカータンパク質の発現または活性を補償するための治療としてバイオマーカータンパク質または核酸分子を投与する。
【０１１６】
バイオマーカータンパク質活性の刺激は、バイオマーカータンパク質が異常にダウンレギュレーションされている状況および／またはバイオマーカータンパク質活性の増加が有益な効果を有すると思われる状況では望ましい。例えば、バイオマーカータンパク質活性の刺激は、バイオマーカーがダウンレギュレーションされている状況および／またはバイオマーカータンパク質活性の増加が有益な効果を有すると思われる状況では望ましい。同様に、バイオマーカータンパク質活性の阻害は、バイオマーカータンパク質が異常にアップレギュレーションされている状況および／またはバイオマーカータンパク質活性の減少が有益な効果を有すると思われる状況では望ましい。
【０１１７】
本発明のバイオマーカータンパク質および核酸分子、並びに本明細書記載のスクリーニング検定法により同定されるバイオマーカータンパク質活性（例、バイオマーカー遺伝子発現）に対して刺激または阻害効果を及ぼす作用物質またはモジュレーターを対象に投与することにより、異常なバイオマーカータンパク質活性に随伴したバイオマーカー関連疾患（例、前立腺癌）が（予防的または治療的に）処置され得る。上記処置と関連して、薬理遺伝学（すなわち、対象の遺伝子型と外来化合物または薬剤に対する前記対象の応答の関係の研究）が考慮され得る。治療薬の代謝の差異は、薬理活性薬剤の用量と血中濃度の関係を改変することにより深刻な毒性または治療の失敗を誘発し得る。したがって、医師または臨床医学者は、バイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーターを投与するべきかどうかを決定し、その用量および／またはバイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーターによる処置の治療体制を調整する際に直接関連する薬理遺伝学研究で得られた知識を適用しながら考究すればよい。
【０１１８】
薬剤応答を予測する遺伝子の同定への薬理遺伝学的アプローチは、「全ゲノム関連解析」として知られ、主として既知遺伝子関連バイオマーカーから成るヒトゲノムの高解像度地図（例、ヒトゲノム上の６００００〜１０００００の多型または可変部位から成る「２対立遺伝子」遺伝子バイオマーカー地図、それぞれ２変異型を有する）に信頼を置くものである。上記の高解像度遺伝子地図を、II／III相薬剤治験に参加している統計的有意数の対象の各々のゲノムの地図と比較することにより、観察される特定薬剤応答または副作用に関連したバイオマーカーが同定され得る。別法として、上記の高解像度地図は、ヒトゲノムにおける１０００万程度の既知一塩基多型（ＳＮＰ）の組合わせから作成され得る。本明細書で使用している「ＳＮＰ」は、ＤＮＡの一伸長範囲において一ヌクレオチド塩基で起こる共通した変化である。例えば、ＳＮＰは、ＤＮＡの１０００塩基ごとに１回起こり得る。ＳＮＰが病気の経過に関与している場合もあり得るが、疾患関連性の無いものが大多数であり得る。上記ＳＮＰの発生に基づいた遺伝子地図を考慮に入れれば、対象は、彼らの対象ゲノムにおけるＳＮＰの特定パターンによって遺伝的範疇に分類され得る。この方法で、遺伝的類似対象間で共通したものであり得る特性を考慮に入れながら、上記の遺伝的類似対象の群に治療体制を適合させることが可能である。
【０１１９】
別法として、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法が、薬剤応答を予測する遺伝子の同定に利用され得る。この方法によると、薬剤標的をコード化する遺伝子が既知の場合（例、本発明のバイオマーカータンパク質）、その遺伝子の共通した変異型は全て、母集団からかなり容易に同定され得ることから、ある遺伝子型に対して別の遺伝子型を有することが特定薬剤応答と関連しているか否かが測定され得る。
【０１２０】
複数の上記薬理遺伝学アプローチから得られる情報を用いることにより、対象の予防的または治療的処置に関して適切な用量および処置体制が決定され得る。この知識を投薬または薬剤選択に適用することにより、有害な反応または治療上の失敗が回避され得るため、バイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーター、例えば本明細書記載の典型的スクリーニング検定法の一つにより同定されたモジュレーターで対象を処置する場合に治療または予防効率を高めることができる。
【０１２１】
以下、実施例により本発明についてさらに詳しく説明するが、限定的なものとみなすべきではない。本明細書全体で引用した全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容については、出典明示により援用する。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：慢性／硬化性同種移植腎症を予測するバイオマーカーの同定
１．緒論および試験目的
生検組織の組織病理学的評価は慢性腎臓同種移植腎症（ＣＡＮ）の診断についての最も信頼できる標準的手段であって、ＣＡＮの兆候の予測は現時点では不可能である。遺伝子発現プロファイリングといった分子診断方法は、ＢＡＮＦＦ９７疾病分類をさらに細かく分類する助けとなり得（Racusen LC, et al.、Kidney Int.５５（２）：７１３−２３（１９９９））、また、他の手段では移植片機能不全がまだ検出され得ない移植後の早期時点で適用される場合には予測的または早期診断バイオマーカーとしても使用され得る。本試験では、移植後少なくとも約１年以内に移植片機能の明白な衰退を示さなかった患者、および０６週目および１２週目の生検材料ではなく２４週目生検材料で明白な慢性同種移植腎症（ＣＡＮ）と診断された患者からの連続腎臓プロトコル生検材料から抽出した生検ＲＮＡに遺伝子発現プロファイリングを適用した（図１参照）。具体的には、腎臓移植患者の腎臓生検材料から誘導したｍＲＮＡ発現レベルに基づいた、慢性／硬化性同種移植腎症のゲノムバイオマーカーの同定により、同腎臓の組織病理学的検査がＣＡＮを診断し得ない時点での将来的なＣＡＮの早期検出／診断（予測）が可能となる。３種の分析法に従った：（１）ＴＸ後０６週目（ＣＡＮの組織病理学的診断の１８週前）での早期診断（予測）に関するゲノムバイオマーカーの同定；（２）ＴＸ後１２週目（ＣＡＮの組織病理学的診断の１２週前）での早期診断（予測）に関するゲノムバイオマーカーの同定；および（３）ＴＸ後０６週目（ＣＡＮの組織病理学的診断の１８週前）またはＴＸ後１２週目（ＣＡＮの組織病理学的診断の１２週前）での早期診断（予測）、またはＣＡＮ対Ｎの診断のためのゲノムバイオマーカーの同定。
【０１２３】
１.１  患者層別化
全３時点での腎臓移植患者からの腎臓生検サンプルを分析した。この試験において、データセットは、６７生検サンプルまたはこれらのサブセットを含んでいた。異なるグレードの慢性／硬化性同種移植腎症（ＣＡＮ）全体におけるサンプル分布を下表３Ａに示す。
表３Ａ：２つの臨床センターから補充した異なるグレードの疾患を伴うサンプル数
【表３】
2009532047.tif 000004
【０１２４】
「正常」サンプルを、下記要領で以下の群に層別化した：
ソース：全観測期間を通して腎臓同種移植片機能が安定している患者（生検サンプル数：３６）
ソース：２４週目の生検材料での診断によると、腎臓同種移植片機能が下降している患者；
ＴＸ後６週目（ＣＡＮの組織病理学的徴候の１８週前）：８サンプル
ＴＸ後１２週目（ＣＡＮの組織病理学的徴候の１２週前）：８サンプル
【０１２５】
「ＣＡＮグレード１」サンプルを、移植後任意の時点で患者から入手した。
表３Ｂ：拒絶または腎症の臨床徴候が無い患者（Ｎ＝１２）および２４週目で明白なＣＡＮを示す患者（Ｎ＝８）からのデータの比較。
【表４】
2009532047.tif 000005
【０１２６】
２  サンプル処理
２.１  ＲＮＡ抽出および精製
各冷凍組織片から酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（Trizol、Invitrogen Life Technologies）により全ＲＮＡを入手し、次いで全ＲＮＡを製造業者の使用説明書に従ってアフィニティー樹脂（RNeasy、Qiagen）で精製し、定量化した。全ＲＮＡをλ＝２６０ｎｍでの吸光度（Ａ２６０ｎｍ）により定量化し、Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比により純度を評価した。非変性アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡ分子の完全性を確認した。ＲＮＡを分析時まで約−８０℃で貯蔵した。
【０１２７】
ジーンチップ（GeneChip）実験
全ＤＮＡマイクロアレイ実験を、GeneChipシステムの製造業者（Affymetrix Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）の使用説明書に従って前記要領（Lockhart DJ et al.、Nat Biotechnol. １４（１３）：１６７５−８０（１９９６））によりスイス国バーゼルの Genomics Factory EU で実施した。
【０１２８】
Trizol（Invitrogen Life Technologies、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を用いて酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（Chomczynski P et al.、Anal Biochem １６２（１）：１５６−９（１９８７））により急速冷凍腎臓サンプルから全ＲＮＡを入手し、製造業者の使用説明書に従ってアフィニティー樹脂カラム（RNeasy；Qiagen、ヒルデン、ドイツ国）で精製した。５４０００を超えるプローブセットを含み、２８０００以上の十分に実証されたヒト遺伝子からの３５０００を超える転写物および変異型を分析する、ヒトHG＿１３３＿plus2＿標的アレイ［Affymetrix］を用いた。一組織、一動物につき一つのGeneChipを用いた。得られた画像ファイル（.dat ファイル）を、マイクロアレイ・アナリシス・スイート５（ＭＡＳ５）ソフトウェア（Affymetrix）を用いて処理した。シグナル強度（シグナル）および絶対的発現レベル測定値（絶対コール）に関するデータを含むタブ区切りしたファイルを得た。１５０の「標的強度」を用いて、未処理データを発現レベルに変換した。電子データベースへアップロードする前にデータを品質についてチェックした。
【０１２９】
２.３  データ解析
Silicon Genetics ソフトウェアパッケージGeneSpring バージョン７.２およびスウェーデン国Umetrics ABによる SIMCA-P+（バージョン１１）を用いて、データ解析を実施した。
【０１３０】
２.３.１  フィルタリング、解釈
これらのソフトウェアパッケージにおける様々なフィルタリングおよびクラスタリングツールを用いて、データセットを探索し、細胞および組織機能の改変を知らせ、化合物の作用方式に関する作業仮説を確立するのに使用され得る転写物レベルの変化を識別した。
【０１３１】
実験的なマイクロアレイ全域にわたる強度の変動を説明するため、各アレイに関する全測定結果をそのアレイの５０パーセント点で割ることによりそれらを正規化した。さらに、各遺伝子に関する発現値を対照群におけるその遺伝子についてのメディアン発現値で割ることによりそれらを正規化した。
【０１３２】
様々なバイオマーカーを同定するため、種々のフィルターを適用したが、各バイオマーカーについては別々に記載している。これらのデータの情報内容は、多様な変化と生物学的情報を兼備したものであり、データと様々なデータベースおよび科学文献を比較することによりそれを評価した。幾つかのデータベース、例えば PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、ＮＩＨ David（http://david.niaid.nih.gov）、Affymetrix（https://www.affymetrix.com）、および内部データベースなどを用いて、データセットの生物学的関連性を探索した。その関係の値は分析者により評価され、この分析から組み立てられた仮説は、他の分析および実験技術によるさらなる確認を必要とする。
【０１３３】
２.３.２  予測モデリングおよび確認技術
適合度（Ｒ２）と予測精度（Ｑ２）間のトレードオフを最小限にするという難題に取り組んだ。
【表５】
2009532047.tif 000006
正規化発現値を対数変換し、パレートスケーリングした。予測モデルの中には、データが直交シグナル補正を受ける場合もあった。部分最小二乗法（ＰＬＳ）を教師あり学習アルゴリズムとして用いた。
【０１３４】
２.３.３  部分最小二乗法による教師あり学習
部分最小二乗法（ＰＬＳ）は、問題点が変数の予測であり、非常に多数の相関予測変量が存在するときの卓越した方法の一つである。多重共線性および観測値よりもかなり多数の変数があるときには、最善の統計的予測アプローチの一つであると思われる。
【０１３５】
ＰＬＳ回帰の目標は、一連の応答変数Ｙと一連の予測変数Ｘとを関連付けたい状況における次元縮小戦略を提供することである。我々は、直交Ｘ成分ｔｈ＝Ｘｗｈ＊およびｔｈおよびｕｈ間の共分散を最大にするＹ成分ｕｈ＝Ｙｃｈを求めた。それは、ＸおよびＹの主成分分析およびＸおよびＹの正準相関分析間の妥協点であった。ただし、観測結果よりもさらに多くの予測変量（ｃＤＮＡクローン）があるため、正準相関分析または多変量回帰は直接適用され得なかったものとする。さらに、発現レベルのサブセットが選択された場合でさえ、マイクロアレイデータにより観察される多重共線性が高いことにより、多変量回帰および正準分析の分析能力は不十分なものとなる。対照的に、ＰＬＳ方法は、マイクロアレイデータによる場合のように（Perez-Encisol M et al.、Human Genetics １１２（５−６）：５８１−９２（２００３））、観測結果よりも多くのさらなる予測変量が存在する場合でさえ適用可能である。ＰＬＳ−ＤＡの特定のケースは、ＹがＸに関するカテゴリー変数のカテゴリーを描く一連の２値変数である、すなわち数依存的または応答変数がカテゴリーの数に等しいＰＬＳ回帰である。別の判別戦略は、Nguyen およびRocke（Nguyen DV et al.、Bioinformatics １８：３９−５０（２００２））により報告されている。各応答変数ｙｋについて、Ｘ成分に関する回帰モデルが記載されている：
【数１】
2009532047.tif 000007
［式中、ｗｈ＊は、ｋ番目成分においてもとの各変数に与えられた重みを含むｐ次元ベクトルであり、ｃｈは、ｈ番目Ｘ成分変数に関するｙｋの回帰係数である］
我々は、Wold et al.（Wold et al.、The multivariate calibration problem in chemistry solved by the PLS method、Ruhe A、Kagstrom B（編）Proc Conf Matrix Pencils、Springer、ハイデルベルグ、２８６−２９３頁（１９８３））により開発された欠測値を見込むアルゴリズムを使用した。ＰＬＳで意味のある答を得るための基本的必要条件は、ある程度の予備的な変数選択である。我々は、各変数に関するＶＩＰに基づいて変数を選択することによりこれを行った。ＶＩＰは、ＰＬＳ文献における平易な尺度であり、以下の通り変数ｊについて定義される：
【数２】
2009532047.tif 000008
（Eriksson L, et al.、Umetrics、Umea（１９９９）；（Tenenhaus M, La regression PLS. Editions Technip、パリ（１９９８））（各ｊ番目予測変数ｊ＝１、ｐについて）、式中、Ｒ２（ａ,ｂ）は、ベクトルのアイテムａおよびｂ間の相関の平方を表し、ｔｈ＝Ｘｈ−１ｗｈ、式中、Ｘｈ−１は、成分ｔ１…ｔｈ−１についてのＸの回帰における残差行列であり、ｗｈはノルム１のベクトルである（ＰＬＳ回帰アルゴリズムにおいて、ｔｈはこの正規化に制約されて立てられる）。ただし、
【数３】
2009532047.tif 000009
は、ｈ番目ＰＬＳ成分への各変数ｊの寄与度を測定する。すなわち、ＶＩＰｊは、モデルの総平方和に対し、全成分にわたって総計した各変数の応答およびカテゴリー応答（Ｙにおける２つを超えるカテゴリーについて）に対する影響を定量化する。これによって、ＶＩＰは各ｃＤＮＡクローンのグローバル効果の直観的に魅力のある尺度となる。ＶＩＰはまた。
【数４】
2009532047.tif 000010
のプロパティーを有する。
【０１３６】
この作業では、全変数（ｃＤＮＡレベル）により第１分析を実施し、ＶＩＰを各変数について評価した。新成分がＱ２基準を満たす場合、ＰＬＳ成分の数を選択した：すなわち
【数５】
2009532047.tif 000011
［式中、ＰＲＥＳＳｈは、ｈ成分を含むモデルの予測平方和であり、ＲＥＳＳｈ−１は、ｈ−１成分を含むモデルの残差平方和である］。ＰＲＥＳＳは、クロスバリデーションにより計算される、
【数６】
2009532047.tif 000012
（ただし、ｈ−１成分を当てはめるとき、ｙｈ−１、ｉは実測値ｉの残差であり、
【数７】
2009532047.tif 000013
は、ｉ番目の実測値を除いたときに得られる予測ｙｉである）。新たな実測値の予測は、単に
【表６】
2009532047.tif 000014
（式中、ｘｉは、新たな実測値ｉに関する変数記録を含むベクトルである）
として得られる。
【０１３７】
モデルバリデーションを並べ替えにより実施した。並べ替え検定は、その柔軟性およびコンピューター性能の増大ゆえに近年非常に人気の出てきたコンピューター集約技法の一部である（Good PI、PERMUTATION TESTS: A PRACTICAL GUIDE TO RESAMPLING METHODS FOR TESTING HYPOTHESES．Springer、ニューヨーク）。原理は非常に単純なもので、所与のサンプルにおける統計値Ｔの有意性を試験するため、応答ベクトル（Ｙ）をＮ回ランダム化し、Ｔｉ、ｉ＝１、Ｎを並べ替えセットのそれぞれについて計算し、帰無仮説下でのＴの分布を一連のＴｉ値により概算する；例えば、５％有意性最低水準は、全Ｔｉの０.０５×Ｎ最大値となる。本例では、応答ベクトル（Ｙ）を２００回並べ替え、分析を再び実施し、Ｑ２およびＲ２の値をプロットした、
【数８】
2009532047.tif 000015
およびＲ２は、モデルにより説明される総平方和の分数である。Ｑ２はモデルの予測能力の尺度であり、Ｒ２はモデルの適合度と関連している。ＳＩＭＣＡ−Ｐソフトウェア（Eriksson L, et al.、Umetrics、Umea（１９９９））により分析を行った。
【０１３８】
３  結果
３.１  移植後０６週目のバイオマーカー
３.１.１  戦略
腎臓移植（「ＴＸ」）後少なくとも１２カ月まで移植片機能が安定している１２患者からＴＸ後６週目に採取した腎臓同種移植生検サンプルの遺伝子発現プロフィールを、２４週目で腎臓移植片機能が低下しており、組織病理学的にＣＡＮの診断が下された８患者の場合と比較した。重要なことに、０６週目の時点で、この試験における生検材料は全て安定していると診断された。
【０１３９】
３.１.２  データ処理
ＭＡＳ５変換データを各マイクロアレイの５０パーセント点に正規化し、次いでハイブリダイゼーションのバッチにしたがって（GeneSpringバージョン７.２）、移植片機能が安定している患者からの全正常サンプルのメディアンに基づいて正規化した。１患者群当たりの遺伝子発現強度をトリム平均（Ｔmean）として計算し、上位および下位発現範囲に対しては外れ値サンプルとした（Windows Excel 2002）。変動係数（ＣＶ）を一群の発現範囲の２０および８０パーセント点の差分の６順位として計算し、その群のＴmeanのパーセンテージとして表した。腎臓同種移植片が長期間安定していた患者からのサンプルの群において変動係数（ＣＶ）が２０％より小さい遺伝子のみをさらなる分析に含ませた。次いで、これらの遺伝子を以下の基準によりフィルタリングした：
（１）２群のいずれかにおいてＴmean＞１００
（２）ｔ検定（両側検定、等分散性）のｐ−値＜０.０５
（３）２群のＴmean間の変化率＞１.２
このフィルターにより１８８プローブセットを得た。
【０１４０】
正規化データを予測モデリングおよびバリデーション技術（２.３.２、２.３.３項）にかけることにより、このデータセットについて最善のモデルを同定した。
【０１４１】
３.１.３  バイオマーカー・ＴＸ後０６週目（「Ｎ２−前ＣＡＮ」対「Ｎ」）、結果
本例では、４９のプローブセットが、正しい群への各サンプルの帰属関係を予測するのに十分かつ必要であると認識された。
【０１４２】
図２は、バイオマーカー・０６週、ＰＬＳ−ＤＡモデルの散布図である。
散布図または散布グラフは、それぞれ水平軸および垂直軸に座標をもつ有限的な多くの点のみを示すことにより２セットの関連した量的または数的データを視覚的に表示および比較するために統計で使用されるグラフである。図２において、各ドットは患者のサンプルを表す。データポイント間の相対的距離は、関連性／類似性の尺度である。「前ＣＡＮ」サンプルからの「Ｎ」サンプルの分離は、４９プローブセットの使用によりデータポイント間を判別するアルゴリズム／モデルの有効性を示す。
【０１４３】
図３は、バイオマーカー・０６週ＰＬＳＤＡモデルについての実測データ対予測データを比較するグラフである。
【０１４４】
Ｙ空間サンプルの予測は、散布図としてプロットされ得る。ＲＭＳＥ（標準誤差）は、予測残差（誤差）の標準偏差であり、（Σ（実測値−予測値）２／Ｎ）の平方根として計算される。小ＲＭＳＥは、モデルの適合度の尺度である。プロットのＹ軸は、モデルの実測クラスを表し、Ｘ軸は、予測クラスを表す。このプロットにおけるＹ値およびＸ値のマッチは、モデルの適合度を立証する。
【０１４５】
図４は、バイオマーカー・０６週ＰＬＳＤＡモデル:「応答並べ替えによるバリデーション」を示す。応答並べ替えによるバリデーションは、サンプルのトレーニングセットおよび試験セットを作成する内部クロスバリデーションである。モデルを適合させることにより、トレーニングセットに基づいて試験セットを説明し、Ｒ２Ｙ（被説明分散）およびＱ２（予測分散）についての値を計算し、プロットする。トレーニングおよび試験セットの無作為並べ替えにより、若干のＲ２Ｙ／Ｑ２が得られる。次いで、「実際の」ものを含む全モデルのＲ２Ｙ／Ｑ２値をＹ軸で表し、Ｘ軸を並べ替えた応答変数およびもとの応答変数間の相関係数に割り当てることにより、バリデーションプロットを作成する。次いで、回帰直線をＲ２Ｙポイント間に当てはめ、Ｑ２ポイントを通してもう１本を当てはめる。回帰直線の切片は、データを当てはめるため得られた「バックグラウンド」Ｒ２ＹおよびＱ２の尺度として解釈され得る。切片がＲ２Ｙについては０.４前後およびそれ未満およびＱについては０.０５前後およびそれ未満であれば有効なモデルを示す。このモデルではこれらの基準が満たされるため、それは、本データセットについて有効なモデルの指標である。
【０１４６】
組織移植６週後の分子シグネチャーを形成するバイオマーカー遺伝子の組合わせを表４に示す。安定した移植片は、当然移植後のいかなる時点でもＣＡＮを発症しない患者からのサンプル群の群値を描いており、「ベースライン」レベルでの遺伝子の発現レベルを示す。
表４：バイオマーカー・０６週、ＰＬＳＤＡモデルの遺伝子
【表７】
2009532047.tif 000016
【表８】
2009532047.tif 000017
【表９】
2009532047.tif 000018
【表１０】
2009532047.tif 000019
【０１４７】
一実施態様において、６週目に同定された好ましい遺伝子には、ＮＦＡＴ（Murphy et al.、（２００２）J.Immunol １０／１；１６９（７）：３７１７−２５）、ディスク・ラージ３、ｄｌｇ３（Hanada et al.（２０００）Int.J.Cancer ５／１５；８６（４）：４８０−８）、および甲状腺ホルモン受容体アルファ（Sato et al.、Circ Res.（２００５）９／１６；９７（６）：５５０−７、Epub ２００５年８月１１日）があるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４８】
３.２  バイオマーカー・移植後１２週
３.２.１  戦略
腎臓ＴＸ後少なくとも１２カ月まで移植片機能が安定している１２患者からＴＸ後１２週目に採取した腎臓同種移植生検サンプルの遺伝子発現プロフィールを、２４週目で腎臓移植片機能が低下しており、組織病理学的にＣＡＮの診断が下された８患者の場合と比較した。重要なことに、１２週目の時点で、この試験における生検材料は全て安定していると診断された。
【０１４９】
３.２.２  データ処理
ＭＡＳ５変換データを各マイクロアレイの５０パーセント点に正規化し、次いでハイブリダイゼーションのバッチにしたがって（GeneSpringバージョン７.２）、移植片機能が安定している患者からの全正常サンプルのメディアンに基づいて正規化した。１患者群当たりの遺伝子発現強度をトリム平均（Ｔmean）として計算し、上位および下位発現範囲に対しては外れ値サンプルとした（Windows Excel 2002）。変動係数（ＣＶ）を一群の発現範囲の２０および８０パーセント点の差分の６順位として計算し、その群のＴmeanのパーセンテージとして表した。腎臓同種移植片が長期間安定していた患者からのサンプルの群において変動係数（ＣＶ）が２０％より小さい遺伝子のみをさらなる分析に含ませた。次いで、これらの遺伝子を以下の基準によりフィルタリングした：
（１）２群のいずれかにおいてＴmean＞１００
（２）ｔ検定（両側検定、等分散性）のｐ−値＜０.０５
（３）２群のＴmean間の変化率＞１.５
このフィルターにより６６４プローブセットを得た。正規化データを予測モデリングおよびバリデーション技術にかけることにより（２.３.２、２.３.３項）、このデータセットについて最善のモデルを同定した。
【０１５０】
３.２.３  バイオマーカー・ＴＸ後１２週：ＯＰＬＳモデル、結果
図５は、バイオマーカー・１２週ＯＰＬＳモデル：散布図を示す。
散布図または散布グラフは、それぞれ水平軸および垂直軸に座標をもつ有限的な多くの点のみを示すことにより２セットの関連した量的または数的データを視覚的に表示および比較するために統計で使用されるグラフである。図５において、各ドットは患者のサンプルを表す。データポイント間の相対的距離は、関連性／類似性の尺度である。「前ＣＡＮ」サンプルからの「Ｎ」サンプルの分離は、これらのプローブセットの使用によりデータポイント間を判別するアルゴリズム／モデルの有効性を示す。
【０１５１】
図６は、バイオマーカー・１２週ＯＰＬＳモデル:「応答並べ替えによるバリデーション」を示す。応答並べ替えによるバリデーションは、サンプルのトレーニングセットおよび試験セットを作成する内部クロスバリデーションである。モデルを適合させることにより、トレーニングセットに基づいて試験セットを説明し、Ｒ２Ｙ（被説明分散）およびＱ２（予測分散）についての値を計算し、プロットする。トレーニングおよび試験セットの無作為並べ替えにより、若干のＲ２Ｙ／Ｑ２が得られる。次いで、「実際の」ものを含む全モデルのＲ２Ｙ／Ｑ２値をＹ軸で表し、Ｘ軸を並べ替えた応答変数およびもとの応答変数間の相関係数に割り当てることにより、バリデーションプロットを作成する。次いで、回帰直線をＲ２Ｙポイント間に当てはめ、Ｑ２ポイントを通してもう１本を当てはめる。回帰直線の切片は、データを当てはめるため得られた「バックグラウンド」Ｒ２ＹおよびＱ２の尺度として解釈され得る。切片がＲ２Ｙについては０.４前後およびそれ未満およびＱについては０.０５前後およびそれ未満であれば有効なモデルを示す。このモデルではこれらの基準が満たされるため、それは、本データセットについて有効なモデルの指標である。
【０１５２】
図７は、バイオマーカー・１２週ＯＰＬＳモデル：実測対予測を示す
Ｙ空間サンプルの予測は、散布図としてプロットされ得る。ＲＭＳＥ（標準誤差）は、予測残差（誤差）の標準偏差であり、（Σ（実測値−予測値）２／Ｎ）の平方根として計算される。小ＲＭＳＥは、モデルの適合度の尺度である。プロットのＹ軸は、モデルの実測クラスを表し、Ｘ軸は、予測クラスを表す。このプロットにおけるＹ値およびＸ値のマッチは、モデルの適合度を立証する。
【０１５３】
ＯＰＬＳ分析により測定された組織移植後１２週目の分子シグネチャーを形成するバイオマーカーの組合わせを表５に示す。
表５：バイオマーカー・１２週ＯＰＬＳモデルの遺伝子
【表１１】
2009532047.tif 000020
【表１２】
2009532047.tif 000021
【表１３】
2009532047.tif 000022
【表１４】
2009532047.tif 000023
【０１５４】
３.２.４  バイオマーカー・ＴＸ後１２週（「Ｎ１−前ＣＡＮ対Ｎ」）：ＰＬＳＤＡモデル、結果
図８は、バイオマーカー・１２週ＰＬＳＤＡモデル：散布図を示す。散布図または散布グラフは、それぞれ水平軸および垂直軸に座標をもつ有限的な多くの点のみを示すことにより２セットの関連した量的または数的データを視覚的に表示および比較するために統計で使用されるグラフである。図８において、各ドットは患者のサンプルを表す。データポイント間の相対的距離は、関連性／類似性の尺度である。「前ＣＡＮ」サンプルからの「Ｎ」サンプルの分離は、これらのプローブセットの使用によりデータポイント間を判別するアルゴリズム／モデルの有効性を示す。
【０１５５】
図９は、バイオマーカー・１２週ＰＬＳＤＡモデル:「応答並べ替えによるバリデーション」を示す。応答並べ替えによるバリデーションは、サンプルのトレーニングセットおよび試験セットを作成する内部クロスバリデーションである。モデルを適合させることにより、トレーニングセットに基づいて試験セットを説明し、Ｒ２Ｙ（被説明分散）およびＱ２（予測分散）についての値を計算し、プロットする。トレーニングおよび試験セットの無作為並べ替えにより、若干のＲ２Ｙ／Ｑ２が得られる。次いで、「実際の」ものを含む全モデルのＲ２Ｙ／Ｑ２値をＹ軸で表し、Ｘ軸を並べ替えた応答変数およびもとの応答変数間の相関係数に割り当てることにより、バリデーションプロットを作成する。次いで、回帰直線をＲ２Ｙポイント間に当てはめ、Ｑ２ポイントを通してもう１本を当てはめる。回帰直線の切片は、データを当てはめるため得られた「バックグラウンド」Ｒ２ＹおよびＱ２の尺度として解釈され得る。切片がＲ２Ｙについては０.４前後およびそれ未満およびＱについては０.０５前後およびそれ未満であれば有効なモデルを示す。このモデルではこれらの基準が満たされるため、それは、本データセットについて有効なモデルの指標である。
【０１５６】
図１０は、バイオマーカー・１２週ＰＬＳＤＡモデル：実測対予測を示す。
Ｙ空間サンプルの予測は、散布図としてプロットされ得る。ＲＭＳＥ（標準誤差）は、予測残差（誤差）の標準偏差であり、（Σ（実測値−予測値）２／Ｎ）の平方根として計算される。小ＲＭＳＥは、モデルの適合度の尺度である。プロットのＹ軸は、モデルの実測クラスを表し、Ｘ軸は、予測クラスを表す。このプロットにおけるＹ値およびＸ値のマッチは、モデルの適合度を立証する。
【０１５７】
ＰＬＳＤＡ分析により測定された組織移植後１２週目の分子シグネチャーを形成するバイオマーカーの組合わせを表６に示す。
表６：バイオマーカー・１２週、ＰＬＳＤＡモデルの遺伝子
【表１５】
2009532047.tif 000024
【表１６】
2009532047.tif 000025
【表１７】
2009532047.tif 000026
【０１５８】
一実施態様において、１２週目に同定された好ましい遺伝子には、ルミカン（Onda et al.、Exp.Mol.Pathol.（２００２）４月；７２（２）：１４２−９）、Ｓｍａｄ３（Saika et al.、Am.J.Pathol.（２００４）２月；１６４（２）：６５１−６３）、ＡＥ結合タンパク質１（Layne et al.、J.Biol.Chem.（１９９８）６／１９；２７３（２５）：１５６５４−６０）、およびｆｒｉｚｚｌｅｄ−９（Karasawa et al.（２００２）J.Biol.Chem １０／４；２７７（４０）：３７４７９−８６．Epub２００２年７月２２日）があるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５９】
３.３  バイオマーカー「グローバル分析」：腎臓移植の前および２４週後でのゲノム予測バイオマーカーの同定
３.３.１  戦略
２４週目で腎臓移植片機能が低下しており、組織病理学的にＣＡＮの診断が下された８患者からの腎臓ＴＸ後１２週目に採取した連続腎臓プロトコル生検サンプルの遺伝子発現プロフィールを、ＴＸ後少なくとも１２カ月まで同種移植片機能が安定している患者からの３３腎臓生検サンプル、およびＣＡＮグレードＩの組織学的徴候がある１８生検サンプルの場合と比較した。サンプルのクラスを以下の通り定義した：
Ｎ（正常；長期間安定した腎臓同種移植片）：ｎ＝３３
０６週（ＴＸ後１２週および２４週の間に明白なＣＡＮを発現している合併症のない患者からの生検材料）：ｎ＝８
１２週（ＴＸ後１２週および２４週の間に明白なＣＡＮを発現している合併症のない患者からの生検材料）：ｎ＝８
ＣＡＮ：慢性同種移植腎症の組織病理学的徴候：ｎ＝１８
【０１６０】
３.３.２  データ処理
ＭＡＳ５変換データを各マイクロアレイの５０パーセント点に正規化し、次いでハイブリダイゼーションのバッチにしたがって（GeneSpringバージョン７.２）、移植片機能が安定している患者からの全正常サンプル（ｎ＝３３）のメディアンでの時点およびバッチにより正規化した。未処理発現強度がサンプル（ｎ＝１８）の少なくとも２５％で少なくとも１００であるプローブセットのみを、以下の分析に含ませた（２０５４９プローブセット）。
【０１６１】
これらのプローブセットをフィッシャーの正確検定にかけることにより、遺伝子発現変化およびクラス帰属関係間の関連を見出した。関連試験オプションを用いたFind Significant Parameters により、パラメーターおよび寄与度全体にわたって各遺伝子についての関連試験が実施される。数値および非数値パラメーターおよび寄与度の両方が試験され得る。
【０１６２】
この分析では、群を１.１項記載の要領で定義した。試験の結果、１.１項記載のクラス帰属関係と０.０００１未満の相関関係を示す５７８プローブセットのリストが得られた。正規化データを予測モデリングおよびバリデーション技術（２.３.２、２.３.３項）にかけることにより、このデータセットについて最善のモデルを同定した。
【０１６３】
３.３.３  バイオマーカー「グローバル分析」；ＯＳＣモデル、結果
図１１は、バイオマーカーグローバル分析ＯＳＣモデル：散布図を示す。散布図または散布グラフは、それぞれ水平軸および垂直軸に座標をもつ有限的な多くの点のみを示すことにより２セットの関連した量的または数的データを視覚的に表示および比較するために統計で使用されるグラフである。図１１において、各ドットは患者のサンプルを表す。データポイント間の相対的距離は、関連性／類似性の尺度である。「０６週・前ＣＡＮ」、「１２週・前ＣＡＮ」および「ＣＡＮ」サンプルからの「Ｎ」サンプルの分離は、これらのプローブセットの使用によりデータポイント間を判別するアルゴリズム／モデルの有効性を示す。
【０１６４】
図１２は、バイオマーカーグローバル分析ＯＳＣモデル:「応答並べ替えによるバリデーション」を示す。応答並べ替えによるバリデーションは、サンプルのトレーニングセットおよび試験セットを作成する内部クロスバリデーションである。モデルを適合させることにより、トレーニングセットに基づいて試験セットを説明し、Ｒ２Ｙ（被説明分散）およびＱ２（予測分散）についての値を計算し、プロットする。トレーニングおよび試験セットの無作為並べ替えにより、若干のＲ２Ｙ／Ｑ２が得られる。次いで、「実際の」ものを含む全モデルのＲ２Ｙ／Ｑ２値をＹ軸で表し、Ｘ軸を並べ替えた応答変数およびもとの応答変数間の相関係数に割り当てることにより、バリデーションプロットを作成する。次いで、回帰直線をＲ２Ｙポイント間に当てはめ、Ｑ２ポイントを通してもう１本を当てはめる。回帰直線の切片は、データを当てはめるため得られた「バックグラウンド」Ｒ２ＹおよびＱ２の尺度として解釈され得る。切片がＲ２Ｙについては０.４前後およびそれ未満およびＱについては０.０５前後およびそれ未満であれば有効なモデルを示す。このモデルではこれらの基準が満たされるため、それは、本データセットについて有効なモデルの指標である。
【０１６５】
図１３は、バイオマーカーグローバル分析ＯＳＣモデル：実測対予測を示す。Ｙ空間サンプルの予測は、散布図としてプロットされ得る。ＲＭＳＥ（標準誤差）は、予測残差（誤差）の標準偏差であり、（Σ（実測値−予測値）２／Ｎ）の平方根として計算される。小ＲＭＳＥは、モデルの適合度の尺度である。プロットのＹ軸は、モデルの実測クラスを表し、Ｘ軸は、予測クラスを表す。このプロットにおけるＹ値およびＸ値のマッチは、モデルの適合度を立証する。
【０１６６】
ＯＳＣモデルを用いたグローバルデータ分析により測定された組織移植後に分子シグネチャーを形成するバイオマーカーの組合わせを表７に示す。
表７：バイオマーカーグローバル分析、ＯＳＣモデルの遺伝子
【表１８】
2009532047.tif 000027
【表１９】
2009532047.tif 000028
【表２０】
2009532047.tif 000029
【表２１】
2009532047.tif 000030
【表２２】
2009532047.tif 000031
【表２３】
2009532047.tif 000032
【表２４】
2009532047.tif 000033
【表２５】
2009532047.tif 000034
【表２６】
2009532047.tif 000035
【表２７】
2009532047.tif 000036
【表２８】
2009532047.tif 000037
【表２９】
2009532047.tif 000038
【表３０】
2009532047.tif 000039
【表３１】
2009532047.tif 000040
【表３２】
2009532047.tif 000041
【表３３】
2009532047.tif 000042
【表３４】
2009532047.tif 000043
【表３５】
2009532047.tif 000044
【表３６】
2009532047.tif 000045
【表３７】
2009532047.tif 000046
【表３８】
2009532047.tif 000047
【０１６７】
３.３.４  バイオマーカー「グローバル分析」；ＯＰＬＳモデル、結果
図１４は、バイオマーカーグローバル分析ＯＰＬＳモデル：散布図を示す。散布図または散布グラフは、それぞれ水平軸および垂直軸に座標をもつ有限的な多くの点のみを示すことにより２セットの関連した量的または数的データを視覚的に表示および比較するために統計で使用されるグラフである。図２において、各ドットは患者のサンプルを表す。データポイント間の相対的距離は、関連性／類似性の尺度である。「０６週・前ＣＡＮ」、「１２週・前ＣＡＮ」、「ＣＡＮ」サンプルからの「Ｎ」サンプルの分離は、これらのプローブセットの使用によりデータポイント間を判別するアルゴリズム／モデルの有効性を示す。
【０１６８】
図１５は、バイオマーカー・グローバル分析ＯＰＬＳモデル:実測対予測を示す。応答並べ替えによるバリデーションは、サンプルのトレーニングセットおよび試験セットを作成する内部クロスバリデーションである。モデルを適合させることにより、トレーニングセットに基づいて試験セットを説明し、Ｒ２Ｙ（被説明分散）およびＱ２（予測分散）についての値を計算し、プロットする。トレーニングおよび試験セットの無作為並べ替えにより、若干のＲ２Ｙ／Ｑ２が得られる。次いで、「実際の」ものを含む全モデルのＲ２Ｙ／Ｑ２値をＹ軸で表し、Ｘ軸を並べ替えた応答変数およびもとの応答変数間の相関係数に割り当てることにより、バリデーションプロットを作成する。次いで、回帰直線をＲ２Ｙポイント間に当てはめ、Ｑ２ポイントを通してもう１本を当てはめる。回帰直線の切片は、データを当てはめるため得られた「バックグラウンド」Ｒ２ＹおよびＱ２の尺度として解釈され得る。切片がＲ２Ｙについては０.４前後およびそれ未満およびＱについては０.０５前後およびそれ未満であれば有効なモデルを示す。このモデルではこれらの基準が満たされるため、それは、本データセットについて有効なモデルの指標である。
【０１６９】
図１６は、バイオマーカーグローバル分析ＯＰＬＳモデル：実測対予測を示す。
Ｙ空間サンプルの予測は、散布図としてプロットされ得る。ＲＭＳＥ（標準誤差）は、予測残差（誤差）の標準偏差であり、（Σ（実測値−予測値）２／Ｎ）の平方根として計算される。小ＲＭＳＥは、モデルの適合度の尺度である。プロットのＹ軸は、モデルの実測クラスを表し、Ｘ軸は、予測クラスを表す。このプロットにおけるＹ値およびＸ値のマッチは、モデルの適合度を立証する。
【０１７０】
ＯＰＬＳモデルを用いたグローバルデータ分析により測定された組織移植後分子シグネチャーを形成するバイオマーカー遺伝子の組合わせを表１１に示す。
表１１：バイオマーカーグローバル分析、ＯＰＬＳモデルの遺伝子
【表３９】
2009532047.tif 000048
【表４０】
2009532047.tif 000049
【表４１】
2009532047.tif 000050
【表４２】
2009532047.tif 000051
【表４３】
2009532047.tif 000052
【表４４】
2009532047.tif 000053
【表４５】
2009532047.tif 000054
【表４６】
2009532047.tif 000055
【表４７】
2009532047.tif 000056
【表４８】
2009532047.tif 000057
【表４９】
2009532047.tif 000058
【表５０】
2009532047.tif 000059
【表５１】
2009532047.tif 000060
【表５２】
2009532047.tif 000061
【表５３】
2009532047.tif 000062
【表５４】
2009532047.tif 000063
【表５５】
2009532047.tif 000064
【表５６】
2009532047.tif 000065
【表５７】
2009532047.tif 000066
【表５８】
2009532047.tif 000067
【表５９】
2009532047.tif 000068
【表６０】
2009532047.tif 000069
【表６１】
2009532047.tif 000070
【表６２】
2009532047.tif 000071
【表６３】
2009532047.tif 000072
【０１７１】
一実施態様において、グローバル分析を用いて同定される好ましい遺伝子には、セルロプラスミン（Chen et al.、Biochem,Biophys Res Commun.（２００１）；２８２；４７５−８２）、ｐＭ５／ＮＯＭＯ（Ju et al.、Mol.Cell.Biol.（２００６）、２６；６５４−６７）、コロニー刺激因子２受容体（Steinman et al.、Annu Rev.Immunol.（１９９１）、９；２７１−９６）、Hairy and enhancer of split-1（Ｈｅｓ−１）（Deregowski et al.、J.Biol.Chem（２００６））、インスリン増殖因子結合タンパク質４（Jehle et al.、Kidney Int.（２０００）、５７；１２０９−１０）、肝細胞増殖因子（ヘパポイエチンＡ）（Azuma et al.、J.Am.Soc.Nephrol（２００１）、１２；１２８０−９２）、溶質担体ファミリー２（Linden et al.、Am.J.Physiol Renal.Physiol.（２００６）１月；２９０（１）：F２０５−１３．Epub２００５年８月９日）、ｓｋｉ様（ｓｎｏＮ）（Zhu et al.、Mol.Cell.Biol.（２００５）１２月；２５（２４）：１０７３１−４４）があるが、これらに限定されるわけではない。
【０１７２】
４．検討
ＣＡＮの予測／早期診断用のゲノムバイオマーカーを同定することを目標として、腎臓同種移植プロトコル生検材料の遺伝子発現プロファイリングを実施した。バイオマーカーは、組織学的パラメーターによりＣＡＮが明白となる１８週および／または１２週前に潜在的ＣＡＮグレードＩを診断する分子ツールとして有用である。
【０１７３】
連続腎臓プロトコル生検材料からの遺伝子発現データの統計分析により、ＣＡＮ Ｉの予測／早期診断バイオマーカーが同定され得た。個々のバイオマーカーモデルを、
−ＣＡＮの臨床／組織病理学的徴候が現れる４.５か月前
−ＣＡＮの臨床／組織病理学的徴候が現れる３か月前
−様々な時点および診断
について作製した。
【０１７４】
バイオマーカー変数（すなわち、プローブセット）は、個々の時点、この場合ＣＡＮ Ｉの組織病理学的診断が下される４.５か月および３か月前では全く異なる。バイオマーカーの有効性は、新しいデータセットでのバリデーションにより証明されなければならない。ＣＡＮの発現に関与する分子レベルでの生物学的過程を明らかにするため、
−一時的に発現された遺伝子およびネットワーク、および
−ＣＡＮで存在する遺伝子、そこでの発現および遡って早期時点までの経路の追跡
に焦点をあてて分析を実施する。
【０１７５】
均等な事物
本発明は、本明細書に記載した特定実施態様に関して制限されるのではなく、それらの態様は単に本発明の個々の態様の説明に過ぎないものとする。当業者には明白なことであるが、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、多くの修正および変形が加えられ得る。本発明の範囲内における機能的に均等内容の方法および装置は、本明細書で列挙されているものに加えて、前述の記載内容から当業者には容易に理解できるものである。上記の修正および変形も、添付の請求の範囲内に包含されるものとする。本発明は、請求の範囲に従う均等内容事項の全範囲と一緒に、添付の請求の範囲によってのみ制限される。
【０１７６】
表１２：バイオマーカー同定：１２週（ＣＡＮの３か月前）＊
【表６４】
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＊  機能的に注をつけていないプローブセットを省かないバイオマーカーのプローブセット
【０１７７】
表１３：１２週（ＣＡＮの組織学的診断の３か月前）：免疫関連遺伝子の過剰出現
【表６５】
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【表６６】
2009532047.tif 000075
【０１７８】
表１４：１２週（ＣＡＮの組織学的診断の３か月前）：ＥＣＭ関連遺伝子の過剰出現
【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【０１７９】
表１５：「グローバル分析」に関する概観。
【表７０】
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【０１８０】
表１６：グローバル分析からの遺伝子の抜粋
【表７１】
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【表７２】
2009532047.tif 000081
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】組織病理学的評価による安定した同種移植片機能（正常、Ｎ）および慢性同種移植片拒絶（ＣＡＮ）の診断に関する生検試料の時間推移の詳細を示した概要図。
【図２】バイオマーカー０６週で得られたバイオマーカーデータの部分最小二乗法判別分析（ＰＬＤＡ）により得られた散布図。
【図３】実測対予測バイオマーカーデータを比較するバイオマーカー０６週 で得られたデータのＰＬＳＤＡにより得られたグラフ。
【図４】バイオマーカー０６週 ＰＬＳＤＡモデル：Validation by Response Permutaion（応答並べ替えによるバリデーション）に関するバイオマーカーデータのグラフ。
【図５】バイオマーカー１２週 で得られたバイオマーカーデータの直交部分最小二乗法分析（ＯＰＬＳ）により得られた散布図。
【図６】バイオマーカー１２週 ＯＰＬＳモデル：「応答並べ替えによるバリデーション」に関するバイオマーカーデータのグラフ。
【図７】実測対予測バイオマーカーデータを比較するバイオマーカー１２週 で得られたデータのＯＰＬＳにより得られたグラフ。
【図８】バイオマーカー０６週 で得られたバイオマーカーデータのＰＬＤＡにより得られた散布図。
【図９】バイオマーカー１２週 ＰＬＳＤＡモデル：「応答並べ替えによるバリデーション」に関するバイオマーカーデータのグラフ。
【図１０】実測対予測バイオマーカーデータを比較するバイオマーカー１２週 で得られたデータのＯＰＬＳにより得られたグラフ。
【図１１】バイオマーカーデータのグローバル分析における直交シグナル補正（ＯＳＣ）により得られた散布図。
【図１２】バイオマーカーグローバル分析ＯＳＣモデル：「応答並べ替えによるバリデーション」に関するバイオマーカーデータのグラフ。
【図１３】実測対予測バイオマーカーデータを比較するデータのグローバル分析ＯＳＣモデリングにより得られたグラフ。
【図１４】バイオマーカーデータのグローバル分析におけるＯＰＬＳにより得られた散布図。
【図１５】実測対予測バイオマーカーデータを比較するデータのグローバル分析ＯＰＬＳモデリングにより得られたグラフ。
【図１６】ＣＡＮの臨床／組織病理学的徴候が明らかになる４.５か月前、ＴＸ後６週目の時点を示すチャート。
【図１７】６週目（ＣＡＮの４.５か月前）でのバイオマーカー同定のグラフ。患者群が明確に分離されている（４９プローブセットによるＰＬＳＤＡモデル）。
【図１８】６週目（ＣＡＮの４.５か月前）でのクロス-バリデーションを示すグラフ。クロス-バリデーション（「７試料のうち１群抜き」）：モデルはＮと前ＣＡＮを明確に分離する。
【図１９】ＣＡＮの臨床／組織病理学的徴候が明らかになる３か月前、ＴＸ後６週目の時点を示すチャート。
【図２０】６週目（ｔ検定＜０.０５、１.２ＦＣ）および１２週目（ｔ検定＜０.０５、１.５ＦＣ）で同定されたバイオマーカーのオーバーラップを示すチャート。０６週目および１２週目の生物学的遺伝子リスト間における小さなオーバーラップは、特定時点での異なる根元的生物学的プロセス／経路の存在を示し得る。
【図２１】２０１プローブセットによるＯＳＣモデルの図。２０１プローブセットによるＯＳＣモデルは、時点および診断により群を区別する。
【図２２】経路分析および生物学的機構を示す図。異なる時点での経路の一時的活性化。
【図２３】並び替えによるモデルバリデーションを示す図。並べ替え分析によるモデルバリデーション：１００回繰り返し（すなわち、「リアルモデル」の適合度と比べた１００ＰＬＳモデルの適合度）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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