(57)【要約】  トロンボポエチンを単独または他の薬剤と組み合わせて、心筋虚血などの心臓傷害を患う、またはそのリスクのある患者に投与することにより、心筋梗塞によるものなどの虚血の治療的または予防的処置法。トロンボポエチンは、被験者の血小板総数または血小板の産生が有意な影響を受けないような濃度で投与される。
2009523818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血の有害作用から哺乳類組織または器官を保護する方法であって、
（ａ）トロンボポエチン受容体リガンドを哺乳類患者に虚血の有害作用の軽減に有効な量で投与することを含んでなり、患者の血小板総数の上昇が１０％未満である、方法。
【請求項２】
上昇が１％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リガンドがヒトトロンボポエチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
０．８〜８０マイクログラムのＴｐｏ受容体リガンドが投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
有効量のリガンドがＴｐｏ受容体リガンド血中レベル０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｌをもたらす、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
リガンドが天然に存在するトロンボポエチン、組換えトロンボポエチンおよび哺乳類トロンボポエチンの改変体に実質的に匹敵する生理学的および生物学的特性を有するトロンボポエチンの改変体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２〜６マイクログラムのＴｐｏ受容体リガンドを含んでなる医薬投与量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リガンドが薬学上許容される担体をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
リガンドがドナー器官に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
リガンドが虚血イベントの発生時または虚血イベントの後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
リガンドが虚血イベントの前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
リガンドが経口、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、鼻腔または坐剤からなる群から選択される方法で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｂ）患者の血小板総数を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（ｂ）虚血の有害作用の軽減を評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳類組織器官を虚血の有害作用から保護する量のＴｐｏ受容体リガンドエフェクターを含んでなり、０．６〜６０マイクログラムのＴｐｏ受容体リガンドを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
組成物が３〜５マイクログラムのＴｐｏ受容体リガンドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｔｐｏ受容体リガンドが天然トロンボポエチンおよび組換えトロンボポエチンからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｔｐｏ受容体リガンドがヒトトロンボポエチンからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は２００６年１月２３日出願の米国仮出願第６０／７６１，１５０号の利益を主張するものである。
【政府支援の研究開発に関する記載】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所(the National Institutes of Health(MH))、国立心臓肺研究所(the National Heart and Lung Institute (NHLI))、ＮＩＨ／ＮＨＬＩ助成第ＨＬ５４０７５号からの政府支援を受けて行われたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
ほとんどの急性心筋梗塞、うっ血性心不全、不整脈および突然心臓死の基礎にある原因である虚血性心疾患は、全工業国の死亡および罹患の主因である。米国では、虚血性心疾患は全死亡数の２０％近くの原因となっている（年間約６０００００人の死亡）。本年、推計千百万人の米国人が新たなまたは再発性の急性心筋梗塞を起こし、多くの生存者が長期罹患し、心不全や死亡へと進行すると思われる。人口が高齢化し、肥満や糖尿病などの併発罹患が増えるので、虚血性心疾患により引き起こされる莫大な公衆衛生負荷はさらに一層増大するものと思われる(Bolli, et al., Circ. Res. 95:125-134, 2004)。
【０００４】
トロンボポエチン（Ｔｐｏ）は身体に見られる、骨髄を刺激して血小板を産生し、それらの発達を助けるタンパク質である。ペグ化（pegylated）組換えヒト巨核球増殖および発達因子（ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ）は、受容体結合領域のみを含み、ＰＥＧの付加により化学的に修飾（Ｎ末端還元的アルキル化）された末端切断型タンパク質（アミノ酸１６３個）であり、ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦはＡｍｇｅｎにより開発された。Ｔｐｏのペグ化は血漿半減期をさらに１０倍引き延ばす。両形態のＴｐｏは包括的な臨床研究を経たが、これら両形態のタンパク質の生物活性は同じである。両形態とも巨核球増殖および血小板産生の強力な刺激因子であることが示され、非骨髄アブレーション的化学療法の血小板減少症軽減において生物的に活性である。全身投与から３〜５日後に、血小板総数が増え始める。
【０００５】
心臓手術および移植（心筋全虚血）および心臓発作（局部的心筋虚血）の状況を含む虚血により引き起こされる傷害に対する心臓の耐性を有効に高める療法および治療製品を提供することが望まれる。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、哺乳類の組織および器官、特に心臓を虚血の有害作用から保護する方法を提供し、また、このような方法に用いるための、Ｔｐｏ受容体リガンドを配合した医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明者らは、本発明の方法に従ってＴｐｏを哺乳類患者に投与することが、特に虚血に対する心臓の耐性を高める上で、心臓に対して有益な即時型および遅延型の心臓保護作用をもたらすことを見い出した。本発明によれば、Ｔｐｏ受容体リガンド、好ましくはＴｐｏは心臓保護のための治療剤として、虚血−再潅流作用により引き起こされる傷害を含む虚血症の治療において投与される。本発明の最も好ましい形態では、この治療は血小板総数を１０％を超えて、最も好ましくは１％を超えて増加させない。
【０００８】
本発明は、ヒトまたは他の哺乳類において心筋虚血の影響を即時に軽減し、心臓に対する損傷を予防または軽減する方法を提供する。本方法はＴｐｏを医薬組成物として、心筋虚血の損傷作用を軽減するのに有効な量で投与することを含む。
【０００９】
一実施形態では、本方法は、患者にＴｐｏ受容体リガンドを、このような傷害をその発生時に実質的に即時に予防または軽減するのに有効な濃度および時間で投与することにより、心筋虚血（虚血性傷害）に対して患者を前処置（precondition）することを含む。例えば、本方法は、外科手術などの予定または計画された虚血イベントの前にＴｐｏを患者に投与して患者を前処置することを含み得る。好ましくは、Ｔｐｏ受容体リガンド組成物を投与して短時間内（好ましくは１〜２０分以内）にＴｐｏ受容体リガンド血中レベル約０．０１〜１０．０ｎｇ／ｍｌをもたらすのに有効なＴｐｏ受容体リガンド量を含有する組成物が、虚血イベント前、一般にイベントの１〜６０分前、好ましくは５〜１５分前に患者に投与される。好ましい用量は、約０．０１〜１．０マイクログラム／ｋｇ患者体重のＴｐｏ受容体リガンドである。
【００１０】
本発明の実施形態では、ドナー器官（例えば心臓）に、移植前にＴｐｏ受容体リガンドが血管系を通じて、移植手順からの虚血および再潅流の影響による傷害を予防または軽減するのに有効な濃度および時間で投与することができる。好ましくは、有効量のＴｐｏ受容体リガンドを、好ましくは約０．０１〜１０．０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴｐｏ受容体リガンドを含有する溶液を移植１〜６０分前、好ましくは５〜２０分前に器官に投与して、器官内に約１．０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴｐｏ受容体リガンドをもたらす。これはＴｐｏ受容体リガンドを器官採取前に体全体に全身投与するか、または器官のみに投与することにより達成することができる。
【００１１】
別の実施形態では、Ｔｐｏは、心臓に対する損傷を治療、予防または軽減するために虚血イベントの発生時および／または虚血イベントの後に投与することができる。このようなイベントの例としては、心臓または他の器官の手術などの器官または組織の再潅流時に虚血再潅流傷害が起こり得る外科手術、移植手術などが挙げられる。さらに、例えば心筋梗塞などの病態の症候を受けている患者に、Ｔｐｏ受容体リガンドを投与して、心臓に対する虚血性傷害を実質的に即時に軽減することができる。Ｔｐｏ受容体リガンドは、虚血イベントによって引き起こされる心臓に対する損傷を実質的に即時に軽減または予防するのに有効な治療量のＴｐｏ受容体リガンドを含有する医薬組成物として患者に投与することができる。好ましくは、Ｔｐｏ受容体リガンド血中レベル約０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｌをもたらすのに有効量のＴｐｏ受容体リガンドを含有する組成物が、患者に、虚血イベントの発生時もしくは虚血イベントの発生時付近に、かつ／または虚血イベント後の短時間内に有効期間で投与され、実施的に即時に、好ましくは投与１〜２０分以内に心臓保護および減少した虚血性傷害をもたらす。好ましい用量はＴｐｏ受容体リガンド０．０１〜１．０マイクログラム／ｋｇである。
【００１２】
本発明を限定するものではないが、Ｔｐｏが虚血により引き起こされる傷害を軽減し、実質的に即時に心臓保護作用をもたらし得る１つの方法はカリウムチャネルを活性化することによると考えられる。よって、本発明はまた、例えばカリウムチャネル（例えばＫＡＴＰ）を活性化させて心臓保護作用を得るために心臓保護シグナル伝達経路を活性化させる方法も提供する。好ましくは、投与後実質的に即時に、好ましくは約１〜２０分以内にＴｐｏ受容体リガンド血中レベル約０．０５〜０．５ｎｇ／ｍｌをもたらすのに有効な量のＴｐｏ受容体リガンドを含有する組成物の好ましい用量は、Ｔｐｏ受容体リガンド約０．０１〜１．０マイクログラム／ｋｇである。
【００１３】
本発明はさらに、生理学上許容される担体中にＴｐｏを含んでなる医薬組成物を提供する。これらの組成物は、例えば心臓および／または他の組織または器官に対する虚血の影響を軽減するために実質的に即時に心臓保護作用をもたらすのに有効な量のＴｐｏを提供するよう、好ましくは投与約１〜２０分以内に、好ましくは血中レベル約０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｌ、または好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌをもたらすＴｐｏ受容体リガンド濃度で処方される。好ましい医薬組成物はＴｐｏ受容体リガンド約０．０１〜１．０マイクログラム／ｋｇ、好ましくはＴｐｏ受容体リガンド０．０５マイクログラム／ｋｇの用量を好ましくは１回の処置でもたらすように処方される。典型的な患者では、これはＴｐｏ受容体リガンド０．８〜８０マイクログラム、好ましくは２〜６マイクログラムを含んでなる組成物である。
【００１４】
本発明の方法は有利には、虚血により引き起こされる傷害に対して実質的に即時型（および遅延型）の心臓保護作用をもたらす。心臓発作、脳卒中もしくは他の病態と共存する場合、または例えば器官移植を行う際は、虚血性傷害に対する即時の心臓保護または脳保護が遅効性の作用よりも望ましい。本発明は心臓保護作用までにかかる待機時間をなくす、または実質的に短縮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
概要
トロンボポエチン（Ｔｐｏ、ｃ−ｍｐｌリガンド、巨核球増殖分化因子、血小板新生刺激因子としても知られる）は、分子量およそ７０，０００ダルトンのホルモンである。ｃ−ｍｐｌリガンドであるＴｐｏは巨核球および血小板の発達の主要な生理学的レギュレーターである。Ｔｐｏは主として肝臓で産生される。ｒｈＴｐｏおよびＰＥＧ−ｒＨｕ  ＭＥＤＦをはじめとするいくつかの組換えＴｐｏが臨床評価のために開発されている。ｒｈＴｐｏ(Genentech, South San Francisco, CA)のアミノ酸配列は、内因性のＴｐｏと同じ全長ポリペプチドである。ｒｈＴｐｏは哺乳類細胞で産生され、グリコシル化される。ＰＥＧ−ｒＨｕ  ＭＧＤＦは大腸菌(Escherichia coli)で産生される。
【００１６】
Ｔｐｏの受容体が心臓に存在するかどうか、またはＴｐｏが心臓において生理学的役割を果たすかどうか、または虚血／再潅流から起こる傷害から器官／組織を保護し得るかどうかは分かっていない。
【００１７】
虚血は、心臓または脳（心虚血；虚血性心筋症）など、身体のある部位に血流および酸素が低下または欠損することから起こる症状であり、遮断部から遠位の組織に損傷を起こす。心臓手術および器官移植などのある種の外科手術中では、血流は一時的に停止され、その後、再開（再潅流）されるが、その結果、虚血−再潅流傷害が起こる。心臓発作中、心臓に供給されていた血液は停止され、この場合にも虚血が起こり、梗塞を招くことがある。心臓発作を救済する現行の処置には、血栓溶解薬および経皮経管冠動脈形成術を用いて心臓の虚血領域を再潅流することが必要である。
【００１８】
ＴｐｏはＭｐｌサイトカイン受容体のリガンドであり、巨核球成熟の主要なレギュレーターである。Ｔｐｏは肝臓、腎臓および骨髄で産生され、血漿中に通常５０〜２５０ｐｇ／ｍｌの濃度で循環している。このＭｐｌ受容体は血小板、巨核球、およびＣＤ３４＋再構築幹細胞を含むあらゆる段階の巨核球前駆体で発現する。Ｔｐｏ血中レベルの減少と心疾患の間の関連はまだ結論が出ていない。
【００１９】
一態様において、本発明は、Ｔｐｏを使用して心筋虚血により引き起こされる傷害から患者の心臓または脳を即時に保護する方法を対象とする。「即時に」とは、ＴｐｏまたはＴｐｏ受容体リガンドを含んでなる組成物を投与した後即座に、または短時間内に、好ましくは投与後少なくとも３５分以内、より好ましくは１〜２０分以内、より好ましくは１〜１５分以内、より好ましくは１〜１０分以内、最も好ましくは１〜５分以内に虚血に対する心臓保護作用が生じることを意味する。
【００２０】
別の実施形態において、Ｔｐｏはまた、不安定狭心症の処置に適切な遅効性の心臓保護を与える。「遅効性」とは、ＴｐｏまたはＴｐｏ受容体リガンドを含有する組成物を投与した後、一定の時間の後に虚血に対する心臓保護作用が現れる、好ましくは、心臓保護が２４時間後、好ましくは９６時間後に現れることを意味する。
【００２１】
好適なＴｐｏ調製物
本発明の方法で用いるための好適なＴｐｏ調製物（「Ｔｐｏ受容体リガンド」または「トロンボポエチン受容体リガンド」）としては、天然Ｔｐｏ（例えば、ヒト尿から抽出され、精製されたＴｐｏ）または組換えヒトＴｐｏ（ｒｈＴｐｏ）、および哺乳類Ｔｐｏ、特にヒトＴｐｏおよびｒｈＴｐｏのものに実質的に匹敵する生理学的および生物学的特性（最も好ましくは、血小板総数／血小板数増加能）を有するその改変物がある。血小板総数／血小板数の増加については、Somlo, et al,. Blood 93:2798-7806, 1999およびVadhan-Raj et al., Ann. Intern. Med. 126:673-681, 1997に例示されている。
【００２２】
本発明で用いるのに好適なＴｐｏ調製物は、以下の参照文献に例示されているように血小板総数／血小板数を、上記の参照文献の方法で測定した場合に少なくとも２０％増加させる。
【００２３】
Ｔｐｏは商業的に得られるか、または米国特許第５，８３０，６４７号(Eaton, et al.)および同第５，８７９，６７３号(Thomas, et al.)に記載されているように得ることができる。組換えヒトＴｐｏ（ｒｈＴｐｏ）はGenentech (South San Francisco, CA)およびPfizer (New York, NY)から市販されている。末端切断型分子がAmgen Inc. (Thousand Oaks, CA)により開発されている。
【００２４】
本発明に包含される好適なＴｐｏ受容体リガンドはまた、その分子の血小板新生活性を向上させることに対して活性を有するＴｐｏ誘導分子を含み、限定されるものではないが、例えば、カルボキシ末端にアミノ酸を有するもの；１分子当たり種々の数のシアル酸残基を有するＴｐｏアイソフォーム；米国特許第５，８６９，４５１号、同第５，９３２，５４６号、同第６，０８３，９１３号、同第６，１２１，２３８号、同第５，８６９，４５１号、同第６，２５１，８６４６号、同第５０６，３６２号および同第６，４６５，４３０号ならびに米国特許公開番号ＵＳ２００３／０１５８１１６に記載され、Glaxo Smith Klineからの化合物４９７１１５で例示される、Ｔｐｏ受容体と結合するペプチド、米国特許公開番号ＵＳ２００３／０１９５２３１、ＵＳ２００３／０１６２７２４、ＵＳ２００４／００６３７６４、ＵＳ２００４／００８２６２６に記載されている小分子ミメティクス；Elliot, et al. (Nature Biotechnology 21:414-421, 2003)に記載されているようなグリコシル化により修飾されたポリエチレングリコールＴｐｏで修飾されたＴｐｏ、ＡＭＧ５３１(Amgen, Thousand Oaks, CA)ならびにAlexion Pharmaceuticals (Cheshire, CT)およびXoma (Berkeley, CA)に記載され、米国特許公開番号ＵＳ２００４／０１３６９８０に記載されているＴｐｏアゴニスト抗体を含む。さらなる修飾型としては、限定されるものではないが、カルボニル化Ｔｐｏ、スクシニル化Ｔｐｏ、アセチル化Ｔｐｏ、ビオチニル化Ｔｐｏ、ヨウ素化ＴｐｏおよびカルボキシメチルリシルＴｐｏなどが挙げられる。他の好適なＴｐｏ受容体リガンドは米国特許第６，８８７，８９０号、同第５，９８９，５３８、同第５，７５６，０８３号、同第５，４９８，５９９号および同第６，８６６，９９８号に記載され、特許請求されている。
【００２５】
Ｔｐｏ受容体と結合し、「Ｔｐｏ受容体リガンド」である他の新規な化合物は下記に記載されている（全て引用することにより本明細書の一部とされる）。
1. Wang. B. et al., Clin. Pharmacol. Ther. 73:628-638, 2004.
2. Orita, T., et al., Blood 105:562-566, 2005.
3. Inagaki, K., et al., Blood 104:58-64, 2004.
4. de Serres, M., et al., Stem Cells 17:203-209, 1999.
5. de Serres, M., et al., Stem Cells 17:316-326, 1999.
6. Cwirla, S.E., et al., Science 276:1696-1699, 1997.
7. Case, B.C., et al., Stem Cells 18:360-365, 2000.
8. Erickson-Miller, C.L., et al.. Exp. Hematol. 33:85-93, 2005.
【００２６】
医薬組成物
本発明では、Ｔｐｏ受容体リガンドは、Ｔｐｏ受容体リガンドを患者の心筋虚血を軽減して心臓に対する損傷を少なくするのに有効な治療量で薬学上許容される担体と合わせることにより、医薬組成物として処方される。
【００２７】
この医薬組成物は経口、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内、経皮、鼻腔または坐剤により投与することができる。一般に、全身投与が好ましい。
【００２８】
心筋虚血の軽減のための有効成分としてのＴｐｏ受容体リガンドは、無菌蒸留水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液またはハンクス溶液などのように、Ｔｐｏと適合し、実質的に無毒かつ非治療性であり、かつ、患者に生理学的に許容される、注射投与用の便宜な薬学上許容される非経口担体を用いて処方することができる。非経口投与では、Ｔｐｏは溶液または懸濁液、好ましくは緩衝溶液または懸濁液に配合することができる。
【００２９】
鼻腔用処方物は、患者が吸入するための例えばネブライザーまたはアトマイザーを用いて液滴またはスプレーの形態で送達するための溶液または懸濁液としての非経口調製物として調製することができる。非経口用または鼻腔用調製物は、アンプル、バイアル、使い捨てシリンジおよび他の好適な容器に無菌滴に封入することができる。
【００３０】
経皮送達系では、Ｔｐｏ受容体リガンドは、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、ペースト、溶液または懸濁液などの液体または半液体状で局所用組成物として調製することができる。皮膚浸透にＴｐｏの経皮送達は、皮膚に含水させ、皮膚温度を高める密封技術（例えば、ラップまたは不透性プラスチックフィルム）の使用により、あるいは好適な浸透剤（例えば、水、グリセリンやプロピレングリコールなどのポリオール類）の使用により促進することができる。
【００３１】
坐剤投与形は、Ｔｐｏ受容体リガンドと、室温（約２０℃）で固体であり、体温で融解するココアバター基剤、またはポリエチレングリコールおよびグリセリドなどの水溶性もしくは水分散性基剤を含む担体を合わせることにより調製することができる。坐剤は一般に個々にホイル包装するか、または成形プラスチック容器に湿度から密閉する。
【００３２】
本発明の方法を用いた患者の治療は、その意図する目的に好適な用量を提供するのに有効な量でＴｐｏ受容体リガンドを含有する治療量のＴｐｏ受容体リガンド医薬組成物を投与することを含む。
【００３３】
好ましい組成物および調製物は、単位投与形が投与後即時にＴｐｏ受容体リガンド血中濃度０．０１〜１０．０ｎｇ／ｍｌ、好ましくはＴｐｏ受容体リガンド０．０５〜０．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくはＴｐｏ受容体リガンド０．５〜５．０ｎｇ／ｍｌ、好ましくはＴｐｏ受容体リガンド約１．０ｎｇ／ｍｌをもたらすのに有効な量のＴｐｏ受容体リガンドを含有するように調製される。好ましくは、この組成物は、投与後少なくとも３５分以内、好ましくは１〜２０分以内、好ましくは１〜１５分以内、好ましくは１〜１０分以内、好ましくは１〜５分以内に所望のＴｐｏ受容体リガンド血中濃度をもたらすのに有効な量でＴｐｏ受容体リガンドを含む。
【００３４】
投与されるＴｐｏ受容体リガンドの有効用量は投与経路、患者の年齢、体重および／または健康状態、ならびに治療される症状などの他の因子によって異なり得る。
【００３５】
これらの医薬組成物は等張性、生理学的安定性およびｐＨ安定性を維持するためのバッファーや保存剤のような少量のアジュバントを含むことができ、これらのものはＴｐｏ受容体リガンド組成物の有効性に悪影響を及ぼさない。
【００３６】
好ましい実施形態では、患者は、実質的に即時の心臓保護作用を得るためのＴｐｏ受容体リガンド約０．０１〜１．０マイクログラム／ｋｇ、好ましくはＴｐｏ受容体リガンド０．０５マイクログラム／ｋｇの（例えば、多回または反復処置ではなく）１回処置を受ける。
【００３７】
本発明のＴｐｏ受容体リガンドの好ましい用量は典型的な患者では０．６〜６０マイクログラムの間である。最も好ましくは、用量は２〜６マイクログラムの間である。
方法
【００３８】
本発明の方法は、虚血により引き起こされる傷害から患者の影響を受ける組織、好ましくは心臓または脳を保護するためにＴｐｏを利用する。この方法は、Ｔｐｏ受容体リガンドを含んでなる医薬組成物をヒトまたは他の哺乳類に、虚血発生により引き起こされる心筋傷害および／または脳傷害を処置する上で所望の作用を達成するのに有効な量で投与することを含む。
【００３９】
Ｔｐｏ受容体リガンドの投与時間は一般に、Ｔｐｏ受容体リガンド組成物の処方および所望の投与量によって異なる。投与時間を変動させ得る他の因子としては、他の因子の中でも、例えば、提供される処置の種類または実施される手順、例えば、移植される器官の調製、移植（ドナー）器官の前処置、心臓発作または脳卒中患者の処置、心臓手術前、手術中および手術後の処置、虚血−再潅流傷害の予防など；ならびに実施される処置または手順の所望の、または必要な時間が挙げられる。
【００４０】
本発明の方法による虚血性傷害に対する実質的に即時の心臓保護の利益のためには、Ｔｐｏ受容体リガンド組成物が１〜６０分、好ましくは３０分まで、好ましくは２０分まで、好ましくは５〜１５分の間投与されることが好ましい。投与時間は、必要に応じて、患者の正常血小板総数を１０％、または最も好ましくは１％（すなわち、増加が見られない）を超えて増加させずに心臓保護を付与し、かつ／または付加的治療効果をもたらすよう、必要に応じて例えば２４時間まで、またはそれを超えて延長することができる。
【００４１】
虚血性傷害に対する（例えば、狭心症に対する）遅延型心臓保護の利益のためには、Ｔｐｏ受容体リガンド組成物が１〜６０分、好ましくは３０分まで、好ましくは２０分まで、好ましくは５〜１５分の間投与される。
【００４２】
本方法の一実施形態では、Ｔｐｏ受容体リガンドを、虚血イベントを軽減するのに有効な量で含有する医薬組成物を虚血イベントの前、例えば、予定された外科手術前に投与して、患者を虚血性傷害に対して前処置する。例えば、虚血性傷害に至り得る外科手術としては、心臓手術、心臓移植、血管形成術および腹腔鏡手術などが挙げられる。別の例として、Ｔｐｏ受容体リガンドはまた、移植用ドナー器官（例えば、心臓移植物）の保存および器官の虚血−再潅流傷害の予防のためにドナー患者に有益に投与することができる。好ましくは、Ｔｐｏ受容体リガンド組成物は、実質的に即時の心臓保護のためのＴｐｏ受容体リガンド血中濃度が得られるよう、好ましくは、１〜３５分以内にＴｐｏ受容体リガンド血中レベル約０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｌが得られるように、虚血イベント前に患者に投与される。Ｔｐｏ受容体リガンド組成物は好ましくはイベント前少なくとも１〜６０分、好ましくは１〜３０分、好ましくは約１〜２０分、好ましくは５〜１５分の間投与される。
【００４３】
さらなる例としては、器官移植レシピエントにおける心筋虚血の影響を軽減するため、例えば心臓などの被移植器官を、薬学上許容される処方物中の、移植時に器官に対する虚血および再潅流の影響を軽減するのに有効な量のＴｐｏに曝すことができる。移植器官は例えば、有効量のＴｐｏを含有する溶液を血管から被移植器官へ注入することによりＴｐｏに曝すことができる。好ましくは、このＴｐｏ受容体リガンドの器官への注入は、１〜３５分以内にＴｐｏ受容体リガンド約０．５〜５．０ｎｇ／ｍｌという血中Ｔｐｏ受容体リガンド濃度をもたらす。この移植器官のＴｐｏ曝露は移植までの時間継続することができ、好ましくは移植前１〜６０分、好ましくは移植前１〜３０分、好ましくは移植前５〜１５分である。
【００４４】
本発明の別法は、例えば外科手術中または病態の症候を受けている際などの虚血イベントの発生時または発生後に、心臓に対する虚血性傷害を実質的に即時に処置、予防または軽減して、心筋虚血症の重篤度を軽減し、さらなる損傷を予防するのに有効な治療量でＴｐｏ受容体リガンドを投与することを含む。虚血性傷害、特に虚血−再潅流傷害に至り得る外科手術の例としては、心臓手術、心臓移植、血管形成術および腹腔鏡手術などが挙げられる。例えば、Ｔｐｏ受容体リガンドは、処置中の虚血および再潅流により引き起こされる損傷を軽減するために心臓手術中に患者に投与することができる。別の例としては、Ｔｐｏ受容体リガンドは再潅流の開始時、再潅流中、またはその双方に投与することができる。症候の発現時に心臓の虚血性傷害に対して実質的に即時の心臓保護を提供するために本方法が適用可能な病態の例としては、例えば、心筋梗塞、肺梗塞、末梢血閉塞疾患、脳卒中、脳梗塞、血管閉塞、出生前または出生後酸素欠乏、外科手術および放射線療法を含む外傷、慢性閉塞性肺疾患、気腫、成人性呼吸窮迫症候群、敗血性ショック、鎌形赤血球性発作、律動異常、窒素麻酔および心肺バイパス術により引き起こされる神経欠損が挙げられる。
【００４５】
好ましくは、Ｔｐｏ受容体リガンド組成物は、虚血イベントの発生時および／または虚血イベントの発生後短時間のうちに患者に、１〜３５分以内にＴｐｏ受容体リガンド約０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｌという血中Ｔｐｏ受容体リガンド濃度が得られるように投与される。Ｔｐｏ受容体リガンドを患者に投与するタイミングは、イベント後有効な時間、好ましくは約１〜６０分、好ましくは１〜３０分、好ましくは約５〜１５分であり得る。
【００４６】
本発明のさらに別の方法は、心臓保護シグナル伝達経路を活性化するのに有効な量のＴｐｏ受容体リガンドを投与することである。一実施形態では、本方法は、Ｔｐｏ−Ｒを活性化させて虚血性傷害に対して実質的に即時の心臓保護作用をもたらすのに有効な量および時間で、医薬組成物（好ましくは、１〜３５分間患者（ヒトまたは他の哺乳類）に送達した際にＴｐｏ受容体リガンド血中レベル約０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｌを達成するための組成物）としてのＴｐｏを投与することを含む。Ｔｐｏ受容体リガンドを患者に投与するタイミングは、イベントの前または後の有効な時間、好ましくは約１〜６０分、好ましくは１〜３０分、好ましくは約５〜１５分であり得る。
【００４７】
別の実施形態では、Ｔｐｏは、ＫＡＴＰなどのカリウムチャネルを活性化して、虚血性傷害に対して実質的に即時の心臓保護を達成する、好ましくは、１〜３５分間患者に送達した際にＴｐｏ受容体リガンド血中レベル約０．１〜１０．０ｎｇ／ｍｌを達成するのに有効な量および時間で医薬組成物として投与される。このＴｐｏ受容体リガンド組成物は、虚血性傷害に対して実質的に即時の心臓保護作用をもたらすよう、イベントの前または後の有効な時間、好ましくは約１〜６０分、好ましくは１〜３０分、好ましくは５〜１５分の間患者に投与される。
【００４８】
本発明に従って予防または軽減され得る心筋虚血性傷害としては、例えば、冠動脈疾患、心筋梗塞、冠動脈性心疾患、プリンズメタル型狭心症(Prinzmetal angina)、心破裂およびうっ血性心不全が挙げられる。本組成物およびその投与の有効性は、心酵素漏出、心収縮タンパク質漏出、左心室圧および右心室圧、不整脈ならびにＳ−Ｔ上昇(S-T segment elevation)などの標準的な方法を用い、心筋虚血性傷害の重篤度が無いか、または軽減されていることでモノタリングすることができる。Ｔｐｏ受容体リガンド組成物の作用は、医薬組成物の投与して１〜４８時間後に評価することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、詳細な実施例を示して本発明をさらに説明し、その中で方法論を記載する。これらの実施例は、以上の記載に示された本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神および範囲に留まりつつ、本発明の概念の範囲内の変更および改変を行うことができると理解すべきである。本願中に引用された参照文献、特許および特許出願の開示は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００５０】
実施例１：in vitro全虚血に対するトロンボポエチンおよびカリウムチャネルの活性化による媒介の即時心臓保護作用
虚血性心疾患は、ほとんどの急性心筋梗塞、うっ血性心不全、不整脈および心臓突然死の基礎にある原因であり、全工業国の死亡および罹患の主因である(Bolli et al., Circ. Res. 95:125-134, 2004)。虚血からの心臓の保護は、依然として心臓病専門医および心臓外科医のチャレンジであり続けている。しかしながら、ヒトにおいて虚血の悪影響から心臓を直接保護することが分かっている現行療法はない。最近の研究では、赤血球産生を刺激するために用いられるサイトカインであるエリスロポエチンも、カリウム依存性カリウム（ＫＡＴＰ）チャネルの活性化を含んだ機構により、虚血性傷害から心臓を保護することが示されている(Shi, et al., Basic Res. Cardiol. 99:173-182, 2004)。エリスロポエチンと限定された相同性を有する別のサイトカイン、Ｔｐｏは、細胞移植後の血小板の産生を促進するために臨床使用されている。しかしながら、Ｔｐｏが心筋において生理学的機能を果たすかどうかは現在のところまだ分かっていない。本発明者らは、Ｔｐｏは、虚血／再潅流により引き起こされる傷害から心臓を保護することができ、その結果、梗塞サイズおよびアポトーシスを軽減し、虚血後の血管機能の回復を増強すると仮説を立てた。
【００５１】
心臓保護およびその基礎にある機構におけるＴｐｏの可能性のある役割を調べるため、成体ラットの心臓を虚血前にヒト組換えＴｐｏで処置した。この試験の目的は、心臓のＴｐｏ急性曝露（慢性曝露に対して）がその後の虚血に対する耐性を高めるかどうか、心臓の最適な保護を与えるＴｐｏ濃度および心臓保護の媒介におけるカリウムチャネルの役割を調べることであった。
【００５２】
本試験は、Ｔｐｏ（０．０１〜１０．０ｎｇ／ｍｌ）がラット心臓において即時心臓保護を与えるかどうか、および基礎にある機構へのカリウムチャネルの寄与を調べることを目的とした。正常酸素の８週齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝８／群）の心臓を単離し、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆモードで潅流した。２５分血液停止全虚血および１８０分再潅流前の定常条件下で血流力学的機能を記録した。
【００５３】
方法
動物  本試験に用いたラットは、the National Research Council, 1996により作成された「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」に準拠して人の世話を受けた。８週齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙを正常酸素（ＳａＯ２＞９５％）または環境で維持した。
【００５４】
試薬  組換えヒトＴｐｏはCell Science, Inc. (Norwood, Mass.)から得た。グリベンクラミドはCalbiochem (San Diego, Calif.)から得た。５−ＨＤはSigma-Aldrich (St. Louis, Mo.)から購入した。Ｔｐｏ受容体に対する抗体はSanta Cruz Biotechnologyから得た。二次抗体はZymed (South San Francisco, Calif.)から得たセイヨウワサビペルオキシダーゼであった。
【００５５】
単離心臓の潅流  単離されたラット心臓を、重炭酸バッファーを用い、低圧逆行様式で潅流し、Baker, et al., Am. J. Physiol. Heart Circulat. Phvsiol. 278:1395-1400, 2000に記載のように装備し、必要に応じてこの潅流液にカリウムチャネル遮断薬を加えた。カニューレ部位のすぐ上にある三方向蛇口は、全潅流液を心臓からそらせて、血流停止全虚血をもたらすことを可能とする。再潅流は、潅流液を心臓へ送達させる蛇口の位置を変えることにより達成した。左心室機能は、Baker, et al.,前掲, 2000に記載されているような各実施例により継続的にモニタリングした。終末拡張期圧は最初は２分間、ｍｍＨｇに設定した。次に、バルーンを段階的にマイクロシリンジで膨らませ、左心室では終末拡張期圧を８ｍｍＨｇに設定した（定常条件での拡張期圧および心拍率を記録した）。冠動脈流速は、心臓の右側からの冠動脈流出をメスシリンダーに一定時間採取することにより試験中測定した。冠動脈流速はｍｌ／分／湿重ｇで表した。
【００５６】
心筋虚血に対する耐性  成体ラットの心臓を重炭酸バッファーで潅流し、Baker, et al., 前掲, 2000に記載されているように両心室機能を各実験中、継続的にモニタリングした。濃度応答試験では、次に、心臓を２５分虚血および１８０分再潅流前に１５分間、Ｔｐｏ（０．０１〜１０．０ｎｇ／ｍｌ）で潅流した。用いた試験プロトコールを図２に示す。カリウムチャネル遮断薬を用いる機構試験では、心臓を虚血前、薬剤単独で１５分間、その後Ｔｐｏと組み合わせて１５分間潅流した。虚血前３０分間、Ｔｐｏの不在下、カリウムチャネル遮断薬単独で潅流した心臓をこれらの試験の非処置対照として用いた。虚血後の右心室拡張期圧の回復を、その薬剤前、虚血前の値のパーセンテージとして表した。
【００５７】
心室機能の評価  Baker, et al., 前掲, 2000に記載されているように、左心室機能を各試験中、継続的にモニタリングした。虚血後の左心室圧の回復を用い、虚血に対する耐性を評価した。
３時間再潅流時に梗塞サイズ／リスク面積の評価を用い、心筋虚血に対する耐性を評価した。梗塞サイズの同定のため、心臓を３７℃にて、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＳＩＧＭＡ）を含有する重炭酸バッファー１０ｍｌで潅流した。
【００５８】
心臓を頂部から房室溝へと横断面として２ｍｍの切片にした。各切片を記録し、ホルマリンに入れた。２４時間後、マウントカメラでこの標本のデジタル写真を撮り、標本とレンズの距離をノーマライズした。次に、各写真をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ（商標））に追加し、非梗塞面積に対する梗塞面積の画素密度を測定した。各スライドの梗塞のパーセンテージを全心臓面積のパーセンテージとして表した。全ての標本のパーセンテージを合計すると、各動物の全梗塞パーセンテージとなる。
【００５９】
アポトーシスの測定
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの心臓を重炭酸バッファーで２４５分間潅流し、非虚血対照とした（図５）。心臓を有気的に３５分間潅流し、２５分の全虚血、その後３時間の再潅流を行い、虚血−再潅流対照群とした。心臓を、虚血および再潅流前に２０分間バッファーで有気的に潅流し、次いで１５分間Ｔｐｏ（１ｎｇ／ｍｌ）で潅流し、Ｔｐｏ処置群とした。各心臓を潅流の終了時に液体窒素中で急速凍結させた。各心臓（全部で７２切片）から４つの凍結切片（１０ミクロン厚）に対し、製造業者のプロトコール(Roche)に従い、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。これらのスライドを蛍光顕微鏡（４００倍、励起４９０ｎｍ、発光５１５ｎｍ）で観察した。各心臓サンプルから２２の無作為な高出力視野を選択し、盲険として定量した。ＴＵＮＥＬ結果は％（１視野当たりの陽性核／１視野当たりの全核×１００％）として表す。
【００６０】
統計分析  報告されたデータは平均値±ＳＤである。統計分析は、Ｉ型誤差の膨張リスクを補正するのに用いられるグリーンハウス−ガイザー調整法(Greenhouse-Geisser adjustment)とともに反復測定ＡＮＯＶＡを用いて行った(Baker, et al., Circulation 99:1249-1254, 1999)。有意であれば、どの群が有意に異なるかを特定するため第二段階としてマン−ホイットニー(Mann- Whitney)検定を用いた。ＡＮＯＶＡの後、多重比較に関する差異についてデータを分析した(Baker, et al, 前掲, 1999)。有意性をＰ＜０．０５に設定した。
【００６１】
試験および結果
心臓におけるトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）の存在（図１）
Ｔｐｏ受容体に対するプライマー（フォワードプライマー＝５’−ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣ−３’；リバースプライマー＝５’−ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ−３’）をRouleau, et al.およびＧｅｎＢａｎｋに寄託されているラットのＴｐｏ受容体ｍＲＮＡ配列（ＧＩ番号：３４８７１０７７）に従ってデザインした。
【００６２】
成体ラット心室心筋細胞を雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから、従前に記載されているように(Konorev, et al., Arch. Biochem. Biophys. 368:421-428, 1999)単離した。
ラットのＴｐｏ受容体配列に基づいたプライマーを用い、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ラットの心臓ホモジネートおよび心筋細胞中のＴｐｏ受容体に関するメッセージをサブクローニングした。ラットＴｐｏ受容体の配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託されている（登録番号はＤａｈｌ  ＳラットではＤＱ０１３３４５、Ｂｒｏｗｎ  ＮｏｒｗａｙラットではＤＱ０１３３４４、Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットではＤＱ０１３３４３）。ウサギＴｐｏ受容体の配列もＧｅｎＢａｎｋに寄託されている（登録番号ＤＱ０１３３４２）。次に、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから得られた心臓ホモジネートおよび心筋細胞中のＴｐｏ受容体タンパク質の存在をウエスタンブロット法により検出した。ヒト慢性骨髄性白血病細胞を陽性対照として用いた（図１）。
【００６３】
Ａ．トロンボポエチン濃度応答試験  エリスロポエチンは、カリウムチャネル活性化を含む機構により、虚血傷害から心臓を保護する(Shi, Y., et al., Basic Res. Cardiol. 99:173-182, 2004)。ＴｐｏはＮ末端ドメインにおいてエリスロポエチンとアミノ酸配列でおよそ２５％の相同性を有する。
【００６４】
【表１】
2009523818.tif 000003
【００６５】
８週齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの心臓を単離し、２５分全虚血および１８０分再潅流の前に１５分間、０．０１、０．１、１．０および１０ｎｇ／ｍｌのＴｐｏで潅流した（図２）。Ｔｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）を虚血前に冠動脈流速を６±１ｍｌ／分／ｇから５±１ｍｌ／分／ｇに低下させ、左心室拡張期圧を１１９±１５ｍｍＨｇから１５１±１９ｍｍＨｇに上昇させ、心拍数を２４０±３４拍／分から２２８±１７拍／分に低下させた。表１（上記）は、正常酸素状態の心臓におけるＴｐｏ濃度応答試験の血流力学的数値を示す（図３および４参照）。
【００６６】
Ｔｐｏは、虚血および再潅流後の左心室拡張期圧の回復を釣り鐘型の濃度依存様式で高めた。虚血後左心室および右心室拡張期圧の最大回復をもたらした最適濃度は１．０ｎｇ／ｍｌで見られた（図３）。
【００６７】
Ｔｐｏは、虚血および再潅流後の梗塞サイズを「Ｕ」型の濃度依存様式で軽減した。梗塞サイズの最大軽減をもたらしたＴｐｏの最適濃度は１．０ｎｇ／ｍｌで見られた。Ｔｐｏは、虚血前に１．０ｎｇ／ｍｌ濃度で投与した場合、虚血および再潅流後のアポトーシスを軽減した（図４）。
【００６８】
Ｔｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）は、虚血および再潅流後のアポトーシスを軽減した（図５）。Ｔｐｏが梗塞サイズを軽減し、ＬＶＤＰの回復を高めたことから、本発明者らはまた、Ｔｐｏが虚血心筋をアポトーシスから保護するかどうかを調べた。２５分全虚血、３時間再潅流の後の左心室切片のＴＵＮＥＬ標識により、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は非虚血心臓の場合（１．９１±０．５４％）の２倍観察された（３．５６±０．７５％）。Ｔｐｏ処置群では、有意に低い染色が見られた（１．９４±０．５５％、Ｐ＜０．０５）。代表的なＴＵＮＥＬ染色切片を図５に示すが、これはＴｐｏで処置された心臓ではアポトーシス陽性細胞が少ないことを示す。
【００６９】
Ｂ．心拍数の回復は非処置心臓の虚血前値９４±６％から１．０ｎｇ／ｍｌのＴｐｏで処置した心臓の８５±７％まで低下した  冠動脈流速の回復は１．０ｎｇ／ｍｌによっては影響を受けなかった。これらのデータは、Ｔｐｏが濃度依存様式で虚血性傷害から心臓を即時に保護することを示した。
【００７０】
Ｃ．トロンボポエチン誘導性の心臓保護におけるＡｋｔの役割  Ａｋｔは重要な心臓保護のメディエーターである。Ｔｐｏ誘導性の心臓保護の媒介におけるＡｋｔの役割を調べるため、正常酸素状態のラットにおいて次の試験を行った。
【００７１】
虚血前、心臓をＡｋｔ阻害剤単独で１５分間、その後、Ｔｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせてさらに１５分間潅流した。
【００７２】
特異的Ａｋｔ阻害剤ワートマニン（１００ｎＭ）は、Ｔｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）の心臓保護作用を完全に無効にした（図６Ａ／Ｂ）。ワートマニン単独では心臓保護に効果は無かった（図６Ａ／Ｂ）。
【００７３】
よって、Ｔｐｏの心臓保護作用はＡｋｔにより媒介されることが示された。
【００７４】
Ｄ．トロンボポエチン誘導性心臓保護におけるＫＡＴＰチャネルの役割  心筋筋線維膜で発現が高く、心筋ミトコンドリアで発現すると思われるＡＴＰ感受性Ｋ＋（ＫＡＴＰ）チャネルは、心臓保護のメディエーターとして働くことが分かっている。Ｔｐｏ誘導性の心臓保護の媒介におけるＫＡＴＰチャネルの役割を調べるため、正常酸素状態のラットにおいて次の試験を行った。
【００７５】
虚血前、心臓をＫＡＴＰチャネル遮断薬単独で１５分間、その後、Ｔｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせてさらに１５分間潅流した。
【００７６】
非特異的ＫＡＴＰチャネル遮断薬グリベンクラミド（３μＭ）は、Ｔｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）の心臓保護作用を完全に無効にした（図７Ａ／Ｂ）。グリベンクラミド単独では心臓保護に効果は無かった（図７Ａ／Ｂ）。
【００７７】
よって、Ｔｐｏの心臓保護作用はＫＡＴＰチャネルにより媒介されることが示された。
【００７８】
考察
虚血直前に１５分間Ｔｐｏを投与すると、壊死およびアポトーシスが軽減され、心筋虚血後の心臓の心室機能の回復が高まる。拡張期圧の最大回復をもたらしたＴｐｏの最適濃度は１．０ｎｇ／ｍｌで見られた。
【００７９】
この試験は、Ｔｐｏが、カリウムチャネルより媒介される心筋虚血に対する耐性の増強をともなって濃度依存性の心臓保護作用を即時に発揮することを示した。心筋虚血に対する耐性の増強はＴｐｏで処置した直後に見られ、このことはその心臓保護作用の発現に新たな遺伝子の誘導は必要でないことを示唆している。この試験は、Ｔｐｏの生物学的作用は、１つのカリウムチャネルであるＫＡＴＰチャネルの即時の活性化をもたらすシグナル経路により媒介されることを示す。
【００８０】
これらの結果はまた、Ｔｐｏがカリウムチャネル（ＫＡＴＰ）を活性化することにより即時の心臓保護を与えることも示す。心臓にはいくつかの異なるタイプのカリウムチャネルが存在し、その１つであるＫＡＴＰチャネルは低酸素および虚血などの酸素欠乏の症状から心臓を保護する働きをする。これらの結果は、虚血に対するＴｐｏ誘導性の保護が非特異的ＫＡＴＰチャネル遮断薬グリベンクラミドにより完全に妨げられることを示す。グリベンクラミド単独では心臓保護に効果は無かったが、このことはＫＡＴＰチャネルがＴｐｏに曝されていない心臓では活性化されないことを示した。このＫＡＴＰチャネルは、Ｔｐｏ誘導性の心臓保護の媒介において中枢的な役割を果たすと思われる。このカリウムチャネルは細胞内の２つの部位、すなわち筋線維膜とミトコンドリアに存在すると考えられる。一度活性化されると、筋線維膜ＫＡＴＰチャネルはサイトゾルから細胞外へとカリウムの流出を促進し、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルが活性化されると、サイトゾルからミトコンドリアへとカリウムの流入が起こる。筋線維膜ＫＡＴＰチャネルの活性化は、虚血中、細胞内へのカルシウム流入を低下させる働きもする可能性がある。さらに、筋線維膜ＫＡＴＰチャネルはまた、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルの開口も担っている可能性もある。これに対し、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルの活性化はエネルギー特性の改良により心臓保護を媒介する可能性がある(Eells, et al., Circ, Res. 87:915-921, 2000)。
【００８１】
Ｔｐｏが虚血により引き起こされる心臓傷害から保護するシグナル伝達経路は、一部はＡｋｔおよびＫＡＴＰチャネルにより媒介される。Ａｋｔの活性化は心臓の虚血／再潅流傷害を軽減すること、および抗アポトーシス遺伝子のｂｃｌファミリーをアップレギュレーションすることが知られている。このことの裏付けとして、これらの結果は、Ｔｐｏが心臓において虚血および再潅流により誘導されるアポトーシスの程度を軽減したことを示す。また、ＫＡＴＰチャネルの活性化は虚血および薬理的前処置により付与される心筋虚血耐性の増強と関連している。
【００８２】
Ｔｐｏは、虚血の発生後、すなわち症候の発生後に与えた場合、傷害からの保護をもたらす。心筋梗塞の症候を受けている患者または心臓手術を受ける前後の患者においては、心臓に対する虚血性傷害を軽減するためにＴｐｏを急性投与することができる。このように、Ｔｐｏは即時に心臓保護を増強するための重要かつ強力な薬剤であると言える。
【００８３】
Ｔｐｏにより達成される心臓保護のレベルは虚血前処置によって付与されるものに匹敵する(Baker, et al., Circulation 99:1249-1254, 1999)。虚血前処置は強力な内因性の現象であり、有害に至らない虚血性発作の短時間の挿入がより長期の致死的虚血に対する大きな保護を誘導する。虚血前処置の基礎にある分子機構はまだ解明されておらず、虚血前処置の臨床適用はまだどちらとも言えず、治療戦略として広く受け入れられるに至っていない。
【００８４】
虚血に対する薬理学的前処置は、心臓保護の増強を担う分子機構を利用するより実用的な方法を与える。本試験は、Ｔｐｏによる薬理学的前処置が有効であり、心臓手術や血管形成術中に遭遇するような随意的な心筋虚血の状況での新規な心臓保護戦略となることを示した。有利なことに、Ｔｐｏは現在、ヒトの臨床使用に認可されており、利用可能である。この十分許容される化合物は、遺伝子に基づく多くの療法で必要であるような精密な薬物送達系を必要としない。
【００８５】
これらの結果は、Ｔｐｏが虚血に対して心臓を薬理学的に前処置するための好適な外因性薬剤であることを示す。これらの結果はさらに、心臓保護を付与するために、Ｔｐｏは、例えば、心臓手術、血管形成術または移植用ドナー心臓の保存などの計画的虚血イベントを含む虚血発作前に与えるのが有利である。
【００８６】
実施例２：虚血発生前に与えた場合の、局部的心筋虚血に対するトロンボポエチンの即時心臓保護作用に関するin vivo試験
冠動脈結紮モデルを用いてＴｐｏの即時保護作用を示した。本試験に用いた動物は成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜３５０ｇ、一般に３００ｇ）であった。動物は標準的な条件下で飼育し、餌は自由に摂取させた。The Animal Care and Use Committee of the Medical College of Wisconsinは、国立衛生研究所が採択した規制に従って行った全ての手順を認可した。
【００８７】
ラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔した。ヘパリン（１５０Ｕ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を投与して、冠動脈中の血栓の形成を防いだ。６−０プロレン縫合糸を用いて左主動脈を結紮することで心筋梗塞を起こした（例えば、Clements-Jewerv, et al., Br. J. Pharmacol. 135:807-815, 2002; Farkas, et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 39:412-424, 2002参照）。左主冠動脈を特定し、オクルダーとして働かせるため、ポリエチレンチューブに通した５−０プロレン縫合糸で結紮した。対照群は、左主冠動脈に縫合糸を通しただけの擬似手術心臓を含んだ。
【００８８】
動物を虚血発生前１５分間、Ｔｐｏ（０．００５〜０．５マイクログラム／ｋｇ）の静脈投与で処置した。オクルダーを締め、それを緩めることで局部的虚血と再潅流を誘発した。次に、心臓に対して３０分の局部的虚血と続いて３時間の再潅流を行った。３時間再潅流時に左心室拡張期圧の回復および梗塞サイズ／リスク面積を用い、心筋虚血に対する耐性を評価した。梗塞サイズの同定のため、心臓を３７℃にて、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＳＩＧＭＡ）を含有する重炭酸バッファー１０ｍｌで潅流した。
【００８９】
心臓を頂部から房室溝へと横断面として２ｍｍの切片にした。各切片を記録し、ホルマリンに入れた。２４時間後、マウントカメラでこの標本のデジタル写真を撮り、標本とレンズの距離をノーマライズした。次に、各写真をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ（商標））に追加し、非梗塞面積に対する梗塞面積の画素密度を測定した。各スライドの梗塞のパーセンテージを全心臓面積のパーセンテージとして表した。全ての標本のパーセンテージを合計すると、各動物の全梗塞パーセンテージとなる。
【００９０】
各群間で体重、心臓重またはリスク領域に有意な差はなかった。心拍数、平均動脈圧、心拍数×血圧(rate pressure product)をベースライン、虚血１５分および再潅流２時間で定量し、各群について非処置擬似手術ラットと比較した（表２）。擬似手術と比べた際、いくつかの群で平均動脈圧および心拍数×血圧に有意な差が見られた。各群について全左動脈重と比較してリスク面積を算出した。群間で有意差は見られなかった（データは示されていない）。
【００９１】
【表２】
2009523818.tif 000004
【００９２】
図８は、左主冠動脈の結紮により誘発されるin vivo局部的心筋虚血の１５分前にＴｐｏを投与した際の心筋梗塞サイズの軽減を示す。Ｔｐｏは「Ｕ」型濃度依存様式で虚血後梗塞サイズを軽減した。梗塞サイズの最大の軽減をもたらした最適濃度は０．０５μｇ／ｋｇで見られた（図８）。
【００９３】
実施例３：虚血発生後に投与した場合の、局部的心筋虚血に対するトロンボポエチンの即時心臓保護作用に関するin vivo試験
冠動脈結紮モデルを用いてＴｐｏの即時保護作用を示した。本試験に用いた動物は成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜３５０ｇ、一般に３００ｇ）であった。動物は標準的な条件下で飼育し、餌は自由に摂取させた。The Animal Care and Use Committee of the Medical College of Wisconsinは、国立衛生研究所が採択した規制に従って行った全ての手順を認可した。
【００９４】
６−０プロレン縫合糸を用いて左主動脈を結紮することで心筋梗塞を起こした（例えば、Clements-Jewerv, et al., 前掲, 2002; Farkas, et al., 前掲, 2002参照）。ラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔した。左主冠動脈を特定し、オクルダーとして働かせるため、ポリエチレンチューブに通した５−０プロレン縫合糸で結紮した。対照群は、左主冠動脈に縫合糸を通しただけの擬似手術心臓を含んだ。
【００９５】
オクルダーを締め、それを緩めることで局部的虚血と再潅流を誘発した。次に、心臓に対して３０分の局部的虚血と続いて３時間の再潅流を行った。３時間再潅流時に左心室拡張期圧の回復および梗塞サイズ／リスク面積を用い、心筋虚血に対する耐性を評価した。梗塞サイズの同定のため、心臓を３７℃にて、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＳＩＧＭＡ）を含有する重炭酸バッファー１０ｍｌで潅流した。
【００９６】
心臓を頂部から房室溝へと横断面として２ｍｍの切片にした。各切片を記録し、ホルマリンに入れた。２４時間後、マウントカメラでこの標本のデジタル写真を撮り、標本とレンズの距離をノーマライズした。次に、各写真をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ（商標））に追加し、非梗塞面積に対する梗塞面積の画素密度を測定した。各スライドの梗塞のパーセンテージを全心臓面積のパーセンテージとして表した。全ての標本のパーセンテージを合計すると、各動物の全梗塞パーセンテージとなる。
【００９７】
各群間で体重、心臓重またはリスク領域に有意な差はなかった。心拍数、平均動脈圧、心拍数×血圧(rate pressure product)をベースライン、虚血１５分および再潅流２時間で定量し、各群について非処置擬似手術ラットと比較した（表２）。擬似手術と比べた際、いくつかの群で平均動脈圧および心拍数×血圧に有意な差が見られた。各群について全左動脈重と比較してリスク面積を算出した。群間で有意差は見られなかった（データは示されていない）。
【００９８】
図９は、左主冠動脈の結紮により誘発されるin vivoにおける３０分の局部的心筋虚血後の潅流１５分前にＴｐｏ（０．０５μｇ／ｋｇ）を投与した際の心筋梗塞サイズの軽減を示す。
【００９９】
実施例４：再潅流後に投与した場合の、局部的心筋虚血に対するトロンボポエチンの即時心臓保護作用に関するin vivo試験
冠動脈結紮モデルを用いてＴｐｏの即時保護作用を示した。本試験に用いた動物は成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜３５０ｇ、一般に３００ｇ）であった。動物は標準的な条件下で飼育し、餌は自由に摂取させた。The Animal Care and Use Committee of the Medical College of Wisconsinは、国立衛生研究所が採択した規制に従って行った全ての手順を認可した。
【０１００】
６−０プロレン縫合糸を用いて左主動脈を結紮することで心筋梗塞を起こした（例えば、Clements-Jewerv, et al., 前掲, 2002; Farkas, et al., 前掲, 2002参照）。ラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔した。左主冠動脈を特定し、オクルダーとして働かせるため、ポリエチレンチューブに通した５−０プロレン縫合糸で結紮した。対照群は、左主冠動脈に縫合糸を通しただけの擬似手術心臓を含んだ。
【０１０１】
オクルダーを締め、それを緩めることで局部的虚血と再潅流を誘発した。次に、心臓に対して３０分の局部的虚血と続いて３時間の再潅流を行った。３時間再潅流時に左心室拡張期圧の回復および梗塞サイズ／リスク面積を用い、心筋虚血に対する耐性を評価した。梗塞サイズの同定のため、心臓を３７℃にて、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＳＩＧＭＡ）を含有する重炭酸バッファー１０ｍｌで潅流した。
【０１０２】
各群間で体重、心臓重またはリスク領域に有意な差はなかった。心拍数、平均動脈圧、心拍数×血圧(rate pressure product)をベースライン、虚血１５分および再潅流２時間で定量し、各群について非処置擬似手術ラットと比較した（表２）。擬似手術と比べた際、いくつかの群で平均動脈圧および心拍数×血圧に有意な差が見られた。各群について全左動脈重と比較してリスク面積を算出した。群間で有意差は見られなかった（データは示されていない）。
【０１０３】
図１０は、左主冠動脈の結紮により誘発されるin vivoにおける３０分の局部的心筋虚血後の潅流の後１０秒でＴｐｏを投与した際の心筋梗塞サイズの軽減を示す。
【０１０４】
実施例５：局部的心筋虚血に対するトロンボポエチンの遅延型心臓保護作用に関するin vivo試験
冠動脈結紮モデルを用いてＴｐｏの遅延型保護作用を示した。本試験に用いた動物は成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜３５０ｇ、一般に３００ｇ）であった。動物は標準的な条件下で飼育し、餌は自由に摂取させた。
【０１０５】
ラットをナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔した。ヘパリン（１５０Ｕ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を投与して、冠動脈中の血栓の形成を防いだ。６−０プロレン縫合糸を用いて左主動脈を結紮することで心筋梗塞を起こした（例えば、Clements-Jewerv, et al., 前掲, 2002; Farkas, et al., 前掲, 2002参照）。左主冠動脈を特定し、オクルダーとして働かせるため、ポリエチレンチューブに通した５−０プロレン縫合糸で結紮した。対照群は、左主冠動脈に縫合糸を通しただけの擬似手術心臓を含んだ。
【０１０６】
動物をＴｐｏ（０．０５マイクログラム／ｋｇ）の腹膜内投与で処置し、これらの動物を虚血の発生前に２４時間回復させた。オクルダーを締め、それを緩めることで局部的虚血と再潅流を誘発した。次に、心臓に対して３０分の局部的虚血と続いて３時間の再潅流を行った。３時間再潅流時に左心室拡張期圧の回復および梗塞サイズ／リスク面積を用い、心筋虚血に対する耐性を評価した。梗塞サイズの同定のため、心臓を３７℃にて、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＳＩＧＭＡ）を含有する重炭酸バッファー１０ｍｌで潅流した。
【０１０７】
各群間で体重、心臓重またはリスク領域に有意な差はなかった。心拍数、平均動脈圧、心拍数×血圧(rate pressure product)をベースライン、虚血１５分および再潅流２時間で定量し、各群について非処置擬似手術ラットと比較した（表２）。擬似手術と比べた際、いくつかの群で平均動脈圧および心拍数×血圧に有意な差が見られた。各群について全左動脈重と比較してリスク面積を算出した。群間で有意差は見られなかった（データは示されていない）。
【０１０８】
図１１は、左主冠動脈の結紮により誘発されるin vivoにおける３０分の局部的心筋虚血の２４時間前にＴｐｏを投与した際の心筋梗塞サイズの軽減を示す。
【０１０９】
実施例６：トロンボポエチン処置は血小板総数およびヘマトクリットの増加をもたらさない
in vivoにおいて即時型および遅延型の心臓保護を付与するＴｐｏの単回投与が血小板総数の増加をもたらしたかどうかを調べるため、ラットをＴｐｏ（０．０５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）で前処置した。処置前の未処置ラットの血小板総数は８５０±９６  １０３／μｌであり、未処置ラットのヘマトクリットは４３．８±１．８％であった。図１２Ａ／Ｂは、Ｔｐｏ処置の後、血小板総数およびヘマトクリットの値は１４日の追跡期間の間変化しなかった。
【０１１０】
本発明者らの試験に用いた即時型および遅延型の心臓保護を付与するための０．０５μｇ／ｋｇというＴｐｏ用量は癌患者で血小板の産生を刺激するため(Vadhan-Raj, et al., Ann. Intern. Med. 126:673-681, 1997)、また末梢血前駆体細胞を可動化するため(Gajewski, et al., Biol. Blood Marrow Transplant. 8:550-556, 2002; Linker, et al, Biol. Blood Marrow Transplant. 9:405-413, 2003)にヒトで用いられるもののおよそ１０倍少ない。最初のヒト試験では、１〜５μｇ／ｋｇのＴｐｏ用量は血小板産生を健常個体の、また、悪性腫瘍の化学療法を受けようとしている人の５〜１０倍増強した。同様にラットでも、その用量のペグ化Ｔｐｏを用いて血小板減少症を軽減し（１００μｇ／ｋｇ）(Harada, et al., J. Pharm. Pharmacol. 52:321-325, 2000)、カルボプラチン処置ラットの血小板減少症を緩和し（１〜３０μｇ／ｋｇ）、Ide, et al., Int. J. Hematol. 70:91-96, 1999もまた、本発明者らが用いた用量よりもかなり高い。本発明者らが用いたＴｐｏ（０．０５μｇ／ｋｇ）の１回投与では、１４日の追跡期間の間、血小板総数およびヘマトクリットを上昇させなかった。
【０１１１】
図１３Ａ／Ｂは、血小板総数およびヘマトクリットに対するＴｐｏ（１．０μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）の１回投与を評価した追加データのプロットである（平均値±標準偏差、ｎ＋６／群）。
法に従い、本発明を構造的特徴および方法論的特徴について言語で記載した。しかしながら、本明細書に開示される手段は本発明を達成する好ましい形態を含むので、本発明は、示され、記載されている特定の特徴に限定されるものではないと理解すべきである。従って、本発明は、均等性の原則に従って適宜解釈される付属の特許請求の範囲の適切な範囲内にあるそのいずれかの形態または改変形においても請求される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】心臓におけるＴｐｏ受容体の存在を示すウエスタンブロットである。
【図２】Ｔｐｏ濃度応答試験に用いた試験プロトコールを表す。
【図３】２５分全虚血および１８０分再潅流前に０．０１、０．１、１．０および１０．０ｎｇ／ｍｌのＴｐｏで１５分処置した後の心臓の梗塞サイズ（左心室（ＬＶ）％）の減少を示すin vitroＴｐｏ濃度応答試験の結果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝８心臓／群である。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ対薬剤無し対照。
【図４】２５分全虚血および１８０分再潅流前に０．０１、０．１、１．０および１０．０ｎｇ／ｍｌのＴｐｏで１５分処置した後の心臓の、左心室拡張期圧の回復率（％）（黒四角）を示すin vitroＴｐｏ濃度応答試験の結果を示したグラフである。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝８心臓／群である。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ対薬剤無し対照。
【図５】２５分全虚血および１８０分再潅流前にＴｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）で１５分処置した後にＴｐｏが制限するアポトーシスの範囲を示したグラフである。＊＝Ｐ＜０．０５、対再潅流、＃＝Ｐ＜０．０５、対虚血／再潅流。
【図６】Ａｋｔにより媒介されるＴｐｏ心臓保護作用の結果を示すグラフである。in vitro２５分全虚血および１８０分再潅流前にＴｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）およびＡｋｔ阻害剤で１５分処置した後の、左心室拡張期圧(Left Ventricular Developed Pressure (LVDP))の回復（図６Ｂ）および梗塞サイズの程度（図６Ａ）。用いたＡｋｔ阻害剤はワートマニン(wortmannin)（「Ｗｏｒｔ」）１００ｎＭであった。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝８心臓／群）である。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ対薬剤無し対照。＋＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ＋薬剤対Ｔｐｏ。
【図７】カリウムチャネルにより媒介されるＴｐｏの心臓保護作用の結果を示すグラフである。in vitro２５分全虚血および１８０分再潅流前にＴｐｏ（１．０ｎｇ／ｍｌ）およびカリウムチャネル遮断薬で１５分処置した後の、左心室拡張期圧(Left Ventricular Developed Pressure (LVDP))の回復（図７Ｂ）および梗塞サイズの程度（図７Ａ）。用いたカリウムチャネル遮断薬はグリベンクラミド(Glibenclamide３μＭであった。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝８心臓／群）である。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ対薬剤無し対照。＋＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ＋薬剤対Ｔｐｏ。
【図８】左主冠動脈結紮によって誘発した３０分のin vitro局部的心筋虚血および３時間の再潅流の１５分前に静脈投与した際のin vivo心筋梗塞サイズ（リスク面積の割合％として）に対するＴｐｏ（０．０５マイクログラム／ｋｇ）の作用を示すグラフである。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ有対Ｔｐｏ無し（対照）。
【図９】左主冠動脈結紮によって誘発した３０分のin vivo局部的心筋虚血および３時間の再潅流開始の１５分後に静脈投与した際のin vivo心筋梗塞サイズ（リスク面積の割合％として）に対するＴｐｏ（０．０５μｇ／ｋｇ）の作用を示すグラフである。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ有対Ｔｐｏ無し（対照）。
【図１０】左主冠動脈結紮によって誘発した３０分のin vivo局部的心筋虚血後３時間の再潅流開始１０秒後に静脈投与した際のin vivo心筋梗塞サイズ（リスク面積の割合％として）に対するＴｐｏ（０．０５μｇ／ｋｇ）の作用を示すグラフである。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ有対Ｔｐｏ無し（対照）。
【図１１】左主冠動脈結紮によって誘発した３０分のin vitro局部的心筋虚血および３時間の再潅流の３０分前に２４時間Ｔｐｏ（０．０５マイクログラム／ｋｇ）を静脈投与した際のin vivo心筋梗塞サイズの減少を示すグラフである。＊＝Ｐ＜０．０５、Ｔｐｏ有対Ｔｐｏ無し（対照）。
【図１２】Ｔｐｏ（０．０５マイクログラム／ｋｇ）で１回処置した後の、１４日追跡期間にわたる血小板総数（図１２Ａ）／ヘマトクリット（図１２Ｂ）を示したグラフである。
【図１３】Ｔｐｏ（１．０マイクログラム／ｋｇ）で１回処置した後の、２８日追跡期間にわたる血小板総数（図１３Ａ）／ヘマトクリット（図１３Ｂ）を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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