(57)【要約】  本発明は、イオノフォアとしてジベンゾ-18-クラウン-6(DB18C6)を使用する、ヒト血清中のカリウムを決定するためのバイオセンサーの開発に関する。ヒト血清はppmレベル、すなわち、137〜200mg/リットルのカリウムを含み、ナトリウムは30倍高い濃度で共存する。このような高濃度はカリウムの選択性を妨げる傾向にあるが、DB18C6はカリウムに向けた優れた選択性を有することがわかり、ヒト血清中に存在する最低レベルのカリウム濃度に対して高い感受性を示す。したがって、本発明は、電極のゲートの上のクロロホルム中に溶解されたクラウンエーテルの単層でコーティングされたISFET(イオン感応電界効果トランジスタ)の組立ておよびキャラクタリゼーションを報告する。
2009532669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロホルム中に溶解されたジベンゾ-18-クラウン-6のコーティングを有することによって特徴づけられたヒト血清中におけるイオンの濃度を測定するためのデバイス。
【請求項２】
請求項1に記載のデバイスであって、以下のものを含むデバイス：
a) P基板(1)、P基板上に埋め込まれた、N+ソース(2)、ドレイン領域(3)、ソースおよびドレインのターミナル接続(4, 5)、アースされた基板接続(6)、フィールド酸化膜(7)、二酸化ケイ素−窒化ケイ素の2重誘電性ゲート(8)からなる作用電極としてのISFET(イオン選択性電界効果トランジスタ)；
b) イオノフォアとしてのジベンゾ-18-クラウン-6； 
c) 参照電極としてのAg/AgCl。
【請求項３】
前記ジベンゾ-18-クラウン-6がクロロホルム中に溶解され、ISFET−二酸化ケイ素−窒化ケイ素ゲート上に単層として被覆される、請求項1に記載のデバイス。
【請求項４】
前記イオノフォアを含む開発されたセンサーの応答時間が1分以内であり、かつ使用中または使用されていない電極のシェルフライフが、最低３か月の期間である、請求項1に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ジベンゾ-18-クラウン-6およびクロロホルムが、200mg〜500mg：0.5ml〜0.75mlの割合で混合される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
0.25〜0.75mlの範囲にある、請求項５に記載の混合物において使用されるクロロホルム。
【請求項７】
好ましくは0.5mlである、請求項5に記載の混合物において使用されるクロロホルム。
【請求項８】
200mgから500mgまでの範囲にある、請求項5に記載の混合物において使用されるジベンゾ-18-クラウン-6の濃度。
【請求項９】
好ましくは200mgである、請求項5に記載の混合物において使用されるジベンゾ-18-クラウン-6の濃度。
【請求項１０】
2.6〜3.2Åの範囲から選択される、請求項5に記載の使用されるジベンゾ-18-クラウン-6のキャビティサイズ。
【請求項１１】
前記デバイスが、ヒト血液中のカリウムイオン濃度を測定するのに有用である、請求項1に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記デバイスが、新鮮または保存血液からのイオンの濃度を測定するのに有用である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記デバイスが、稀釈された血液(1:5〜1:50)において高い特異性をもってイオンの濃度を測定するのに有用である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
請求項1に記載のデバイスを使用してヒト血清中のイオンの濃度を測定する方法であって、以下のステップを含む方法：
a.  ISFETゲートを血清中に浸漬するステップと； 
b.  ISFETゲートのステップa)において発生した電位を読む取るステップと；
c.  ステップb)で読み取られた電位を、基準値と一致させるステップ。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、イオノフォアとしてジベンゾ-18-クラウン-6(DB18C6)を使用する、ヒト血清中のカリウムを決定するためのバイオセンサーの開発に関する。本発明はまた、電極のゲートの上のクラウンエーテルの単層でコーティングされたISFET(イオン感応電界効果トランジスタ)の組立ておよびキャラクタリゼーションを報告する。DB18C6はクロロホルムに溶解して、作用電極の表面で単層を形成する傾向がある。ヒト血清はppmレベル、すなわち、137〜200mg/リットルのカリウムを含み、ナトリウムは30倍高い濃度で共存する。このような高濃度はカリウムの選択性を妨げる傾向にあるが、DB18C6はカリウムに向けた優れた選択性を有することがわかり、ヒト血清中に存在する最低レベルのカリウム濃度に対して高い感受性を示す。 
センサーを構成する材料とヒトの電解質の生体サンプルとの間の完全な欠如または非常に低い化学的相互作用は、慢性病および急性の脅迫的状態の両方において非常に重要である。イオン選択性電極に基づいたポテンシオメトリックな方法は、臨床検査室における光学的方法よりもはるかに優れてこの目的を達成する。このポテンシオメトリックに基づいたカリウム バイオセンサーは、調製、組み立てが容易であり、経済的に実行可能である。
【０００２】
ISFETゲートの寸法を有するストリップの形状において作製される場合、これを使い捨ての態様において使用することができる。調製方法は複雑な手順を含まず、かつ新しい単層はそれぞれ500マイクログラム未満のクラウンエーテルしか必要としないので、経済的に非常に有望であり、これらの理由から市場における見込みが非常に高い。イオノフォアの応答時間は、１分以内であった。使用中または使用されていない電極のシェルフライフが、3か月の期間であると分かった。電極表面を再度コーティングして使用することができる。
【発明の背景および先行技術】
【０００３】
全血中のカリウム モニタリングは、臨床検査室において行われた最も重要なルーチン分析のうちの1つである。これは、手術後ショックの早期検出および心臓外科のための両方において大変重要である。さらに、カリウム含有量は腎臓病と関係があるので、血清、尿および食糧のカリウム含有量の決定は臨床・医学の分野において非常に重要である。 これらの疾病は、大量のカリウムを含む食事を患者から制限する。 カリウムの決定から、患者の健康状態に関する医学的情報を得ることができる。低カリウム血症の場合、アルカローシス、肝臓の肝硬変、利尿薬などが疑われる。他方、ヒト血清中のカリウム濃度が9 mmol dm-3よりも高くなるとき、しばしば心停止となる。 
イオン（特に、K+）に関する生物学的能動輸送システムは、生物において重要な機能を有し、多くの細胞内の活動の制御にとって不可欠である。これらのシステムは、神経系による情報の伝達に関係し、かつ筋組織の興奮および弛緩サイクルに関係する。主に、ヒト血清中のカリウムイオンの正確で、容易で、迅速なセンシングは、患者の状態を評価する心臓外科に先立って非常に重要である。
【０００４】
クラウンエーテルは、イオン選択電界効果トランジスタの構築において安価なニュートラルなキャリアであることが報告された。さらに、これらのキャリアは、電気分析的用途のための所望の分子を共有結合するオプションを有する。クラウンエーテルの特性は、その選択的な錯体生成能力である。これは、アルカリおよびアルカリ土類金属塩(ゲスト)のカチオンの部分をクラウン環のキャビティ(ホスト)に結合させる。選択性は、主にクラウン環のキャビティ（穴）とカチオンの直径との相対的大きさ、クラウン環のドナー原子の数および位相幾何学効果およびカチオンの硬度とドナー原子の硬度との関係、およびカチオンの電荷数に原理的に依存する。クラウン複合体の場合、金属カチオン−アニオンの接触は、つねに環面の開いた表面から起こる。ここで使用されるジベンゾ-18-クラウン-6は、2.66Åのカリウムイオンの正確なサイズにフィットする、直径2.6〜3.2Åの環状キャビティを有するものとして示され、カリウムイオンのセンシング材料になる優れた選択能を有する。
【０００５】
イオン選択性電極(ISE)を使用するポテンシオメトリーは、分析の容易で速い実行による選択の方法である。毎年、カリウムの約2億の臨床分析がアメリカでISEを使用して行われる。イオン選択性電極が、対象のイオンと選択的に結合するイオノフォアを含み、かつ膜電位を生成する、高粘度の水非混和液とみなすことができる水−不溶性膜の使用に基づいていることは周知である。イオン選択性電極に基づいたポテンシオメトリックな検出は、単純な方法として、幾つかの利点、例えば調製および手順の速度および容易さ、単純な器械使用、相対的に速い応答、広いダイナミック レンジ、合理的な選択性および低コストを提供する。その上、これらは、実地分析に理想的に適切であり、最近、いくつかの生物学的に関連のあるイオンの分析、プロセス制御および環境分析において適用可能であることが分かった。システムの小型化は、シリコン技術を使用して実現される。カリウム濃度は、同じチップ上で統合されたAg/AgCl参照電極と結合してクラウンエーテルでコーティングされたISFETを電位差滴定で使用して測定される。センサーとタンパク質含有サンプル溶液との長時間の接触から生じる問題を克服するために、自動化された測定プロトコルが、センサーが短時間部分についてのみサンプルと接触された場合に適用された。測定シグナルの標準化直後、チップに一定のカリウム濃度の商用リンゲル液を流す。サンプル／調整溶液サイクルの頻度は、診断要求に依存する。このように、センサーの活性のあるセンシング領域は、サンプルからの時間に対する洗浄された時間である（cleaned time to time from the sample）。さらに、洗浄溶液中のセンサー シグナルは、キャリブレーション ポイントとして役立つ。
【０００６】
イオン感応電界効果トランジスタ(ISFET)に基づいたポテンシオメトリックなイオンセンサーは、主としてその小さなサイズ、頑丈さ、低コスト、速い応答時間および低い出力インピーダンスのために魅力的である。ISFETについて、参照電極の金属接続はリモート ゲートとして機能する。ゲートに接する溶液のpHでの閾値電圧の依存を与える等式は、
【数１】
2009532669.tif 000003
【０００７】
ここで、Erefは一定の参照電極電位であり、Φsiはシリコン仕事関数であり、χは溶媒の表面双極子電位であり、Ψは溶液／誘電性界面での界面静電電位であり、バルクpHにおいて変化するその感度は以下の等式によって表わされる
【数２】
2009532669.tif 000004
【０００８】
Rは一般的なガス定数であり、Ｔは絶対温度であり、Ｆはファラデー定数であり、αは無次元感度パラメーター(0<α<1)であり、以下の式によって与えられる
【数３】
2009532669.tif 000005
【０００９】
kはボルツマン定数であり、Tはケルビン目盛りにおける温度であり、Ｃは絶縁体電解質インターフェースでのディファレンシャル二重層キャパシタンスであり、qは電子電荷であり、そして、βはプロトンを吸収または放出するゲート誘電性表面の能力を決定する表面プロトンバッファ容量である。 
しかし、二酸化ケイ素−窒化ケイ素 ゲートISFETは、水溶液中の様々なイオン、例えばH+イオンに加えて、H+、Na+、K+、Ca+、Zn++、Fe++などに対して感受性を示す。水素イオン以外の化学種を測定するためのISFETの拡張は、重大な研究領域である。異なるイオン種へのイオン感度および選択性を備えたISFETは、ゲート表面上に特定のレセプター分子を含むポリマー膜を堆積させることによって作製することができる。
【００１０】
Shoji Motomizu et al, Analyst, 1988, 113, 743-746による刊行物によって、河川中のカリウムが、溶媒抽出と結びついたフロー注入に関する分光光度法によって決定された。ジベンゾ-18-クラウン-6は、エチルオレンジのジクロロ誘導体と共に使用された。手順は、外来イオンからの低い干渉を有することを示し、10-5Mのカリウムイオン濃度まで感受性を示した。主な問題は、この研究で使用された染料が水酸化リチウム中に溶解され、それゆえ、試薬溶液のpHは10であり、血清中のカリウムイオンを決定するのに不適切であることであった。
【００１１】
E. Malavolti et al, Analytica Chimica Acta 1999, 401,129-136による刊行物によって、全血中のカリウムの連続監視用のオプトロード（optrode）は、その吸光度が局所的環境のpHに依存するイオノフォアおよび中性のクロモイオノフォアとしてバリノマイシンを使用して実現された。膜調製が複雑となり、以下の化学物質を包含する：クロモイオノフォア、テトラヒドロフラン、バリノマイシン、カリウム テトラキス（4-クロロフェニル）ホウ酸塩、ビス（2-エチルヘキシル）セバケートおよびPVC。このプロトコルの主な欠点は、センサーがpHおよび膜の厚みの維持に対して感受性であることである。他に、カリウム濃度が変化したとき、膜バルク中の全成分は、シグナルにおける変化をもたらすであろう新しい平衡にシフトしてしまう。
【００１２】
P. C Pandey and R. Prakash, Sensors and Actuators 1998, B 46, 61-65による刊行物によって、ポリインドール修飾電極の表面にジベンゾ-18-クラウン-6を含浸させたPVCマトリックス膜を使用するカリウムイオン選択性電極が報告されている。カリウムイオンセンサーの最低検出限界は7.0×10-6 mol dm-3である。このワ−クの固有の不利益は、センサー電極の調製が長時間かつ複雑な手順を要し、かつ同一溶液またはヒト血清中の他のカチオンを越えたカリウムイオンの選択性が報告されていないことである。最低の検出限界は、血清中のカリウムの濃度よりも高かった。 
Albrecht Uhlig et al, Sensors and Actuators B, 1996, 34, 252-257による刊行物によって、全血のインビボ カリウム測定のための小型化されたイオン選択性センサチップが報告された。ここで、バリノマイシンはイオノフォアとして使用され、また、カリウム濃度は、同一チップ上で統合されたAg/AgCl/p-HEMA参照電極と組み合わせてイオン選択性高分子膜を電位差滴定で使用して測定される。主な問題は、固体状態の内部接触、膜成分の損失および吸水による、外部試薬および非許容性ドリフトの追加によって防がれなければならない血液の凝固である。
【００１３】
Johan Bobaka et al, Analytica Chimica Acta, 1999, 385, 195-202による刊行物によって、可塑剤を含まない膜を含む、全ての固体状態のポテンシオメトリックなカリウム−選択性電極が、ポリ（3-オクチルチオフェン）の半導体抱合ポリマーマトリックス中にイオノフォアとしてバリノマイシンおよび親油性添加物としてカリウム テトラキス［3,5-ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ホウ酸塩を組み込むことによって調製された。膜成分は、クロロホルム中に溶解され、溶液キャスティングによってガラス状カーボン上に堆積された。主要な欠点は、サブ−Nernstian反応、経時的な反応の低下（特に、薄い膜について）および膜／溶液界面での比較的大きなイオン移行抵抗の観察である。
【００１４】
Carlos Alexandre Borges Garcia et al, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2003, 31, 11-18による刊行物によって、単純かつ迅速な方法が、ポリマー膜中に閉塞された、天然に存在する抗生物質イオノフォア ノナクチンに基づいた還流電極を使用するフロー注入システムを使用するK+イオン決定のために開発された。ノナクチン イオノフォアは、ポリ(エチレン共酢酸ビニル)(EVA)マトリックス中にトラップされ（酢酸ビニル中40%w/w）、黒鉛−エポキシ管状電極表面上に分散した。可塑剤を含まない完全に固体状態のカリウム選択的電極は、トリス-HClバッファ（pH 7.0;0.1M）がキャリアとして使用されたとき、51.5mV per decadeの近接したNernstianの傾斜をもつ5.0×/10−５〜5.0×/10−２の間のK+イオン濃度についてリニアな応答を示した。主要な欠点は、分析上の障害となるイオンであるアンモニウムイオンでのサンプル中の中性pHの維持であり、K+イオン濃度のセンシング範囲は、血清範囲よりも十分に上回っている。
【００１５】
N. Abramova et al, Talanta, 200O5 52, 533-538による刊行物によって、人工腎臓および血液透析によって治療された患者の血漿中の透析溶液のイオン対照のためのイオン感応電界効果トランジスタ（ISFET）に基づいたカリウムイオンセンサーの適用が示されている。商業的なカリウムイオノフォア バリノマイシンが使用される。研究されたISFETは、要求された安定性を有し、人工腎臓装置内の透析溶液中のカリウムイオン濃度をモニターするための感受性を有する。主な欠点は、ISFETが本物の血液サンプル上で試みられなかったことである。
【００１６】
Daniela P.A. Correia et al, Talanta, 2005, 67, 773-782による刊行物によって、血清サンプル中の尿素およびカリウムの同時分析のためのポテンシオメトリックなセンサーの分析が開発された。アンモニウムイオン−選択性電極に結合したBSAおよびグルタルアルデヒドで架橋することによって固定化されたウレアーゼに基づいた尿素バイオセンサーが、カリウム、ナトリウムおよびアンモニウムPVC膜イオン選択性電極と共にアレイ中において含まれた。センサーのアレイ中におけるイオン−選択性電極でのバイオセンサーのカップリングは、反応の制限された安定性および非配向性のクロス−トークに関した幾つかの問題を生じた。このことは、このワーク中における調査にさらされる。３つまでの同一の尿素バイオセンサーがアレイ中に含まれ、データ分析手順がセンサーの相対的性能の評価を可能にする。主な不利益は、尿素センサーと他のバイオセンサーとの間の同一のクロス−トークの欠如である。これは、酵素固定化のために使用された手順の結果として幾つかのバイオセンサーにおける不規則な酵素層をもたらす。
【発明の目的】
【００１７】
本発明の主要な目的は、ヒト血清中のカリウムを決定するためのバイオセンサーを開発することである。ジベンゾ-18-クラウン-6 (DB18C6) は、理想的なイオノフォアであると証明される。2重誘電性SiO2−Si3N4ゲートで作製されたISFET（イオン感応電解効果トランジスタ）は、チャネル長さL=12ミクロンおよびチャネル幅W=4800ミクロンを有し、作用電極として使用される。DB18C6イオノフォアはISFETのゲート上に堆積される。標準KCl溶液におけるキャリブレーションは、カリウムに対するクラウンエーテル-ISFETの感度が窒化物ゲート-ISFETの2倍の感度であったことを示した。同じ観察が血清サンプルについて行われた。 
本発明の他の目的は、標準KCl溶液の存在中におけるナトリウムイオンの交差感度の調査である。 
また、本発明の他の目的は、稀釈されたヒト血清サンプル中のナトリウムイオンの交差感度の調査である。
【００１８】
本発明の目的は、様々な濃度範囲  カリウム：100〜400mg/L； ナトリウム：200：1000mg/dlにおけるカリウムおよびナトリウムイオンに対するゲート上にクラウンエーテル層を含む／含まないISFETの感度を研究することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、ゲート上にクラウンエーテル層を（ａ）含まないおよび（ｂ）含むISFET応答特性を研究することにある。これは、ヒト血清範囲中の濃度で標準KCl溶液中において標準化測定を実行する（図３）。
【００２０】
また、本発明の他の目的は、ナトリウムイオンに対するゲート上にクラウンエーテルを含むまたは含まないISFETの感度を研究することである。これは、カリウムについてのクラウンISFETの感度よりも相対的に低いことがわかり、血清中のナトリウムが測定を妨害しないことを証明した（図１０）。
【発明の要約】
【００２１】
従って、本発明は、ヒト血清中の全カリウム濃度のポテンシオメトリックな決定を導くためのバイオセンサーの開発を扱う。開発されたバイオセンサーは、イオノフォアとしてのジベンゾ-18-クラウン-6、およびインビルドAg/AgCl参照電極を備えた基板としてのISFET(イオン感応電界効果トランジスタ)からなる。通常、二酸化ケイ素−窒化ケイ素 ゲートISFETは、水溶液中の様々なイオン、例えば、H+に加えてH+、Na+、K+、Ca+、Zn++、Fe++などに対して感受性を示す。水素イオン以外の種を測定するためのISFETの拡張は、重要な研究領域である。イオン感受性および異なるイオン種に対して感受性を有するISFETは、ゲート表面上に特定のレセプター分子を含むポリマー膜を堆積させることによって作製することができる。アンスリルアザクラウン（anthryl azacrown）構造（クラウン-5、クラウン-6）を使用する早期のワークは、他のものの中でナトリウムおよびカリウムカチオンに対して感受性を示した。ただし、これらのイオンの感受性は、他のアルカリ金属イオンを上回るが、穏やかなものであった。したがって、ヒト血清中の他のカチオンの存在中においてカリウムを特異的に選択するイオノフォア、例えばジベンゾ-18-クラウン-6を同定することは重要であり、興味深い発見である。血清電解質の内容は以下のとおりである：Cl (97〜107mM)、Na(132〜144mM)、K(3.6〜4.8mM)、Ca(2.0〜2.7mM)、Mg(0.7〜1.2mM)、Al(17〜32.6μM)、Br(0.09μM)、Cu(12〜22.5μM)、F(5.3〜23.7μM)、I(0.4〜0.7μM)、Fe(5.7〜31.7μM)、Pb(0.1〜0.4μM)、Mn(1.5〜3.5μM)、Sn(0.3〜8μM)、Zn(0.9〜3.7μM)。本発明の特徴は、低濃度範囲の血清中においてさえ正確にカリウムを選択するクラウンエーテル イオノフォアの能力である。最も興味深いことには、このイオノフォアは、36%より高いナトリウム濃度条件においてさえカリウムに対して特異的な選択性を示す。これがネルンストの法則に従い、かつ電位 対 濃度のプロットについて59.2mV/decadeの傾斜値を与えるとき、バイオセンサーの性能が確認される。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
従って、本発明は、ヒト血清中においてカリウムの低濃度範囲（3.6〜4.8mMまたは151.22〜205.4mg/リットル)を決定するためにバイオセンサーの向上したかつ高度なバージョンを提供する。図2に示されたような、および本明細書中に記載されたようなバイオセンサーの構成要素は、以下のとおりである：
1：  P-基板：ISFETが作製される出発材料。本明細書では、抵抗15〜20ohm-cm(7.4 ×1014cm-3)およびオリエンテーション<100>のＰ型のCzochralskiシリコン ウェハが使用された。 
2, 3：  N+ソースおよびドレイン領域：P-基板中の重いリンの拡散領域。ソースの命名は、チャネルを通して流れる電荷キャリア（N-チャネルについての電子、P-チャネルについてのホール）の源であることに由来する；同様に、ドレインは、電荷がチャネルを離れる場所である。
【００２３】
4, 5：  ソースおよびドレインのターミナル接続：これらは、ISFETのソースおよびドレイン領域から接続を取るためのワイヤまたはリードである。
【００２４】
6：  アース(grounded)された基板接続：ISFET起動中にアース電位で維持されるP-基板からのワイヤまたはリード。 
7：  フィールド酸化膜：MOSデバイス中の厚い酸化被膜。これは活性デバイス領域の半導体外側表面を不動態化および保護するために形成される。実際には、ISFETの一部であるが、デバイス起動には関与しない。
【００２５】
8：  SiO2+Si3N4ゲート誘電体：ISFETのゲートおよび基板の間で使用される、2層の、二酸化ケイ素および窒化ケイ素でできた絶縁体。
【００２６】
9：  クラウンエーテル層：ゲート上に適用されたカリウムイオン選択層。
【００２７】
構成要素1〜8はISFETを含む。構成要素9（ゲート上をコーティングするクラウンエーテル）は、カリウムイオンについてセンサーに選択性を提供する。クラウンエーテル層によってK+イオンをトラッピングすると、ゲート−ソース電位が増加する。カリウムイオン濃度の関数としてのゲート−ソース電位の変化は、センサーのキャリブレーション特性を与える。
【００２８】
血清サンプルが狭い広がりのpH範囲をもつとき、測定に対するpH変化の影響はわずかである。また、ナトリウム イオンに関してクラウンエーテルISFETの交差感受性について調査を行い、無視しうる影響であることがわかった。センシング材料またはイオノフォア、ジベンゾ-18-クラウン-6が化学的修飾を容易に受け入れるとき、これらはイオン対形成を介してカリウムを付着し、選択的ホスト−ゲスト化学を示す。バイオセンサーの応答時間は30〜60秒であり、イオノフォアは1週間のサイクル寿命の間は安定である。シェルフライフは強く、何か月にもわたって使用せずにいることができ、KCIの稀釈溶液中に浸漬させることによって反応させることができる。また、イオンセンサーの最も重要な必要条件は、以下に示すように我々のバイオセンサーによって満たされる： (1) 小さな-5mlのサンプル容積、保証された分析のために必要とされる12/4800μ dimensions (ISFET)； (2) 生体サンプル中に見出されうる他のイオンの存在中における高い選択性； (3) 血清濃度範囲中のセンサー反応の高い線形性。 
本発明の実施形態において、クロロホルム中に溶解されたジベンゾ-18-クラウン-6のコーティングを有することによって特徴づけられた、ヒト血清中のイオンの濃度を測定するためのデバイスが提供される。
【００２９】
本発明の他の実施形態において、ジベンゾ-18-クラウン-6は、血清中のカリウムの特異的な選択性を可能にするために、イオノフォアとして使用される。
【００３０】
また、本発明の他の実施態様において、ジベンゾ-18-クラウン-6は、2.66Åのカリウムイオン（ゲスト）の正確なサイズに適合する2.6〜3.2Åのキャビティサイズを有するホストとして機能し、カリウムイオンについてのセンシング材料になる優れた選択性を生み出す（図１）。
【００３１】
本発明の他の実施形態において、コーティングに使用されたクラウンおよびクロロホルムの量は、それぞれ200〜500mgおよび0.25〜0.75mlであった。
【００３２】
また、本発明の他の実施形態において、クラウンエーテルは、クロロホルム中にクラウンエーテルを溶解させ、かつISFETゲート全体に液滴を滴下することによってISFETゲート上に堆積された。 
また、本発明の他の実施形態において、各1mlのヒト血清は50倍まで稀釈された。
【００３３】
本発明の実施形態において、血清サンプル中のpHの影響は皆無であることが証明された。これらの稀釈されたサンプルは一定のpH7.0〜7.1を示し、人体による精密許容差内のpHの維持が確認され；したがって、サンプル中のpH変化による全ての誤差が排除された（図５）。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、ゲートおよび誘導プロット上にクラウンエーテル層を (a) 含まないおよび (b) 含む、非常に低いKCl濃度（血清範囲）でのISFET反応特性は、クラウンエーテルを含まないゲートと比較して、クラウンエーテルを含むゲートは、2.16倍の高い感度を示す（図６および７）。
【００３５】
また、本発明の他の実施形態において、血清（新鮮または格納）サンプルは、ISFET−クラウンエーテル ゲートを使用してカリウム濃度について試験され、外電位が記録された（図８）。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、クロロホルムは、ジベンゾ-18-クラウン-6を溶解させるために使用される。
【００３７】
本発明は、本発明を例証するために提供される以下に挙げられた例を参照して詳細に説明される。したがって、これらの例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
【００３８】
例１
ISFETデバイスの製造およびパッケージ：
本デバイスは、抵抗15〜20ohm-cm(7.4 ×1014cm-3)およびオリエンテーション<100>のＰ型のCzochralskiシリコン ウェハ上で作製された。NMOSFET技術に基づいたISFETの製造技術には、以下のプロセス工程が含まれる： (i) 酸化物の厚み=0.9μmを与えるフィールド酸化（1100℃、30分。乾燥O2+120分。湿潤O2+30分、乾燥O2）。(ii) ソース／ドレインN+拡散のための第１のフォトリソグラフィ、および酸化物エッチング。 (iii) 亜リン酸の分散（1050℃、30分）：シート抵抗 ＜3 ohms/cm2。(iv) ゲート ウィンドウのための第２のフォトリソグラフィ、および酸化エッチング。(v) ゲート酸化（外界トリクロロエチレン）、1000℃、120分、乾燥O2、酸素流速2リットル／分、小TCE蒸気が、25℃、tox＝140nmでTCEバブラーを通してN2の遅い血流によってチューブを下って運ばれた。(vi) 窒化物形成(LPCVD)、780℃、25分、初期圧＝0.02トル、ジクロロシランおよびアンモニアガス混合物の堆積圧＝0.2トル、ジクロロシラン=20cc、アンモニア200cc、ガス比＝1：10、tニトリド＝100nm； N2中で30分間にわたって900℃でアニールされた。(vii) コンタクトホールのための第3のフォトリソグラフィ、および酸化物エッチング。(viii) クロミウム(50nm)および金(500nm)のスパッタリング。(ix) 金属パターン描写のための第4のフォトリソグラフィ、および金属エッチング。(x) 金属焼結、(xi) ウェハスクライビング、およびチップのソーティングおよびセラミック基板上へのマウンティング。(xii)ワイヤ ボンディング。(xiii) 金属パッドおよびワイヤを、RTV化合物によって保護されたハンダ付けパッドを含む絶縁性エポキシ（Epotek H 70E/H74、120℃で30分間にわたって硬化）によって保護する。ゲート領域は露出されたままとした。
【００３９】
例２
ISFETのゲート領域上でのクラウンエーテルの堆積：
クラウンエーテルは、ペーストを形成するために数滴のクロロホルム中にクラウンエーテルを溶解させることによってISFETゲート上に堆積された。通常、数マイクログラムのイオノフォアは、ゲートISFETをコーティングするのに十分であった。
【００４０】
例３
ゲート上でのコーティングの最適化：
クロロホルム溶媒中に溶解した200mgのクラウンは、ゲートの表面上でコーティングの単層を形成する。室温で空気に接触すると、クロロホルムは直ちに蒸発し、イオノフォアが残る。 
例４
測定手順：
測定は、pHの直接的読み取りのために室内に組み立てられた信号処理回路を使用して行なわれた。Ag/AgCl参照電極が使用された。この回路はISFETが浸漬される溶液のpHと等しい出力電圧を与える。ISFETを含む回路は20の全電圧利得がある。この測定は、クラウンエーテル層の堆積の前後に行った。デバイスオペレーション： クラウンエーテル層によってK+イオンをトラッピングすると、ゲート−ソース電位が増加する。カリウムイオン濃度の関数としてのゲート−ソース電位の変化は、センサーのキャリブレーション特性を与える。次のステップは、カリウムイオン濃度の測定に関係する：
a) ISFETゲートを血清中に浸漬するステップ
ISFETを、電位を測定するために50mlの標準溶液および血清に浸漬した。 
b) 電位を読み取るステップ
電位を、各標準および血清サンプルについて読み取った。標準プロット−電位差／濃度を標準サンプルについて作成した。
【００４１】
c) 読み取られた電位を標準値の電位と一致させるステップ： 血清サンプル中のカリウム濃度を標準グラフから得た。
【００４２】
例５
ISFETのキャラクタリゼーションおよび標準化およびキャリブレーション：
ISFETのキャラクタリゼーションは、ヒト血清分析について関心の高い範囲である100〜400mg/リットルのKCl濃度に関して行われた。クラウンエーテルを含むおよび含まない状態においてKCl溶液でのISFETの標準化が行われた（図３）。血清サンプルを、1mlの各ヒト血清サンプルを50mlまで稀釈（なぜなら、1ml溶液は参照電極と共にISFETを浸漬するには不十分である）することによってISFETでの測定のために調製した。
【００４３】
異なる血清サンプル中のカリウムイオン濃度と関係した電位の測定が、ISFETゲート上にクラウンエーテルを含むおよび含まない状態において行われた。 
標準KCl溶液および稀釈ヒト血清サンプルについて原子吸光分光学を使用するISFETキャリブレーション。
【００４４】
利点：
１．バイオセンサーは、50倍希釈された血液中においてさえ高い特異性を示すヒト血清中のカリウムイオンを検出することができる。
【００４５】
２．バイオセンサーの感度および特異性は、2重誘電性 二酸化ケイ素 窒化ケイ素 ゲート全面に及ぶ、クラウンエーテル（ジ ベンゾ18-クラウン6-エーテル）のコーティングによるものである。
【００４６】
３．調製、組み立てが容易であり、かつ経済的に実行可能である。
【００４７】
４．ISFETゲートの寸法を有するストリップの形状において作製される場合、DB18C6イオノフォアを使い捨ての態様において使用することができる。
【００４８】
５．調製方法は複雑な手順を含まず、かつ新しい単層はそれぞれ500マイクログラム未満のクラウンエーテルしか必要としないので、経済的に非常に有望である。
【００４９】
６．イオノフォアの応答時間は、１分以内であった。
【００５０】
７．使用中または使用されていない電極のシェルフライフが、3か月の期間であると分かった。
【００５１】
８．電極表面を再度コーティングして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】クラウンエーテル分子構造内へのカリウムイオンの結合
【図２】カリウムISFETの模式的な断面図
【図３】ゲート上にクラウンエーテル層を含まないもの(a)および含むもの(b)でのISFET応答特性；測定は、ヒト血清範囲中の濃度を示す標準KCl溶液中において行われた。
【図４】ISFET特性から得られたカリウムイオン濃度の対数関連の電位のプロット。
【図５】血清サンプルのpH分布の調査
【図６】ゲート上にクラウンエーテル層を含まないもの(a)および含むもの(b)での非常に低いKCl濃度でのISFET応答特性
【図７】ISFET特性についての片対数プロット
【図８】患者の数とISFET電位の分布
【図９】患者の数とカリウムイオン濃度の分布
【図１０】ゲート上にクラウンエーテル層を含むおよび含まないISFETについての電位対NaCl濃度のプロット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月26日(2007.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロホルム中に溶解されたジベンゾ-18-クラウン-6のコーティングを有することによって特徴づけられたヒト血清中におけるイオンの濃度を測定するためのデバイス。
【請求項２】
請求項1に記載のデバイスであって、以下のものを含むデバイス：
a) P基板(1)、P基板上に埋め込まれた、N+ソース(2)、ドレイン領域(3)、ソースおよびドレインのターミナル接続(4, 5)、アースされた基板接続(6)、フィールド酸化膜(7)、二酸化ケイ素−窒化ケイ素の2重誘電性ゲート(8)からなる作用電極としてのISFET(イオン選択性電界効果トランジスタ)；
b) イオノフォアとしてのジベンゾ-18-クラウン-6； 
c) 参照電極としてのAg/AgCl。
【請求項３】
前記ジベンゾ-18-クラウン-6がクロロホルム中に溶解され、ISFET−二酸化ケイ素−窒化ケイ素ゲート上に単層として被覆される、請求項1に記載のデバイス。
【請求項４】
前記イオノフォアを含む開発されたセンサーの応答時間が1分以内であり、かつ使用中または使用されていない電極のシェルフライフが、最低３か月の期間である、請求項1に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ジベンゾ-18-クラウン-6およびクロロホルムが、200mg〜500mg：0.25ml〜0.75mlの割合で混合される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記ジベンゾ-18-クラウン-6およびクロロホルムが、200mg〜500mg：0.5ml〜0.75mlの割合で好ましくは混合される、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記混合物中に使用されるクロロホルムの量が、好ましくは0.5mlである、請求項５に記載のデバイス。
【請求項８】
前記混合物中に使用されるジベンゾ-18-クラウン-6の量が、好ましくは200mgである、請求項５に記載のデバイス。
【請求項９】
前記デバイスが、ヒト血液中のカリウムイオン濃度を測定するのに有用である、請求項1に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記デバイスが、新鮮または保存血液からのイオンの濃度を測定するのに有用である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記デバイスが、稀釈された血液(1:5〜1:50)において高い特異性をもってイオンの濃度を測定するのに有用である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
請求項1に記載のデバイスを使用してヒト血清中のカリウムイオンの濃度を測定する方法であって、以下のステップを含む方法：
a.  ISFETゲートを血清中に浸漬するステップと； 
b.  ISFETゲートのステップa)において発生した電位を読む取るステップと；
c.  ステップb)で読み取られた電位を、基準値と一致させるステップ。
【国際調査報告】
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