(57)【要約】  本発明は、サルコグリカン異常症の治療に関する。より正確には、本発明は、特定の形態の疾患の治療を企図した医薬品としての、小胞体関連分解経路のインヒビター、特にマンノシダーゼＩインヒビターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコグリカン異常症を治療することを企図した医薬品の調製のためのクラスＩα−マンノシダーゼインヒビターの使用。
【請求項２】
前記インヒビターがキフネンシンまたは１−デオキシマンノジリマイシン、有利にはキフネンシンであることを特徴とする、請求項１に記載のインヒビターの使用。
【請求項３】
前記疾患がヒトα−サルコグリカンにおけるＲ７７Ｃミューテーションと関連するサルコグリカン異常症であることを特徴とする、請求項１または２に記載のインヒビターの使用。
【請求項４】
前記疾患がヒトδ−サルコグリカンにおけるＥ２６２Ｋミューテーションと関連するサルコグリカン異常症であることを特徴とする、請求項１または２に記載のインヒビターの使用。
【請求項５】
前記疾患がヒトβ−サルコグリカンにおけるＱ１１Ｅミューテーションと関連するサルコグリカン異常症であることを特徴とする、請求項１または２に記載のインヒビターの使用。
【請求項６】
−そのうちの１種がミューテーションを有する４種のサルコグリカン遺伝子（γ、α、β及びδ）で細胞をコトランスフェクションする工程；
−請求項１または２に規定されたインヒビターの存在下で数時間インキュベーションする工程；
−サルコグリカン複合体を局在化させる工程
からなる、サルコグリカン異常症に対するクラスＩα−マンノシダーゼインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【請求項７】
４種の野生型サルコグリカンをコードする遺伝子でコトランスフェクションされた細胞で平行に実施することを特徴とする、請求項６に記載のインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【請求項８】
前記インヒビターなしでインキュベートされた細胞で平行に実施することを特徴とする、請求項６または７に記載のインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【請求項９】
前記複合体の局在化について免疫組織化学的ラベリング方法を使用することを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載のインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルコグリカン異常症の治療に関する。
【０００２】
より正確には、本発明は、特定の形態の疾患の治療を企図した医薬品としての、小胞体関連分解経路のインヒビター、特にマンノシダーゼＩインヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
サルコグリカン異常症は、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）群の常染色体劣性筋疾患である。この疾患の４種の形態（ＬＧＭＤ２Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｄ、ＬＧＭＤ２Ｅ及びＬＧＭＤ２Ｆ）が同定されており、それぞれγ、α、β及びδ−サルコグリカン遺伝子における欠損から由来する（非特許文献１１、非特許文献１７）。
【０００４】
ＬＧＭＤ２Ｃは、地中海地域と、欧州に在住するジプシーの集団に特に広がっている。ＬＧＭＤ２Ｄは、欧州、アフリカ、日本及びブラジルの患者において世界中で診断されている。ＬＧＭＤ２Ｅは、アンマンのコミュニティーの大部分と北アフリカで診断されている。現在まで、ＬＧＭＤ２Ｆはブラジル、トルコ及びイタリア起源の７家族のみで報告されている。サルコグリカン異常症を有する患者は、ふくらはぎ過形成としばしば関連する骨盤と上肢帯筋の段階的な筋弱化を呈する。認知障害は存在しない。心筋症のような心筋合併症は、ＬＧＭＤ２Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｅ及びＬＧＭＤ２Ｆ患者においてしばしば観察される。
【０００５】
組織学的実験では、筋肉は、再生領域と分解領域、炎症性湿潤、線維症、及び線維サイズの変化を示す。疾患の重篤度は同胞であったとしても可変的である。ほとんどの重篤な場合では、患者は３０歳を前に歩行能力を失い、その寿命期待値は減少する。
【０００６】
二つの形態の上記疾患で再発性のミューテーションが生じる。ＬＧＭＤ２Ｃ患者では、ｄｅｌ５２１Ｔ及びＣ２８３Ｙミューテーションが、それぞれ北アフリカ及びジプシーの集団でしばしば観察されている（非特許文献４、非特許文献１３）。
【０００７】
ＬＧＭＤ２Ｄ患者で見いだされる最も頻繁なミューテーションは、７７位のアルギニンがシステインに置換されているＲ７７Ｃ置換である。フィンランドを除き欧州の患者の３分の１がこのミューテーションを有しているが、フィンランドでは患者の１００％で観察され、ほとんどの場合両対立遺伝子について存在する（非特許文献５、非特許文献９）。
【０００８】
サルコグリカン（ＳＧ）は、ジストロフィンと会合してジストロフィン糖タンパク質複合体を形成する細胞膜糖タンパク質の一群である（非特許文献１２）。この複合体は、アクチン細胞骨格と細胞外マトリックスの間での機械的な結合に寄与し、その後に筋線維の膜安定性において役割を果たす（非特許文献１０）。サルコグリカンは、Ｃ末端（α−サルコグリカン）及びＮ末端（γ、β及びδーサルコグリカン）のいずれかであり得る小さな細胞内ドメイン、一本の膜貫通ドメイン、及びＮ−グリコシルカ部位を有する細胞外ドメインからなる。
【０００９】
サルコグリカン複合体のアセンブルは、筋小胞体とゴルジ装置におけるこれらのタンパク質の輸送の間で生ずる（非特許文献６、非特許文献１６）。アセンブルは、β−サルコグリカンがδ−サルコグリカンに結合して開始し、膜内に正確に複合体を配置する。次いでα−サルコグリカンがこの複合体に結合し、次いでγ−サルコグリカンを結合してアセンブルが完結する。いずれかのサルコグリカンにおけるミューテーションは、複合体のアセンブルを破壊することができ、他のサルコグリカンの二次的な欠損を引き起こす。
【００１０】
今日では、サルコグリカン異常症の診断方法、及びγ、α、βまたはδ−サルコグリカンにおける特定のミューテーションに対する表現型の寄与については既知であるが、この疾患を有する患者の治療についてはほとんど手段を有していない。
【００１１】
今日まで、特定の治療は開発されておらず、ほとんどの患者は、筋痙攣の悪化を避けるために理学療法を必要としている。しかしながらいくつかのチームは、動物モデルにおいてウイルスベクターを介する遺伝子移入または細胞療法を使用する実験において、ポジティオブな結果を報告している（非特許文献１、非特許文献７、非特許文献１４）。この理由のため、国際特許出願ＷＯ００／２０５８２号は、遺伝子治療アプローチを使用して、特にＡＡＶベクターを使用して、欠損サルコグリカン遺伝子を置換することを推奨している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ００／２０５８２号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Allmand, V., K.M. Donahue, V. Straub, R.L. Davisson, B.L. Davidson, and K.P. Campbell. 2000. Early adenovirus-mediated gene transfer effectively prevents muscular dystrophy in alpha-sarcoglycan-deficient mice. Gene Ther. 7: 1385-91
【非特許文献２】Bartoli, M., J. Poupiot, A. Goyenvalle, N. Perez, L. Garcia, O. Donas, and I. Richard. 2006a. Non-invasive Monitoring of Therapeutic Gene Transfer in Animal Models of Muscular Dystrophies. Gene Therapy. 13: 20-8
【非特許文献３】Bartoli, M., C. Roudaut, S. Martin, F. Fougerousse, L. Suel, J. Poupiot, E. Gicquel, F. Noulet, O. Danos, and I. Richard. 2006b. Safety and efficacy of AAV-mediated calpain 3 gene transfer in a mouse model of limb-girdle muscular dysctrophy type 2A. Mol Ther. 13: 250-9
【非特許文献４】Bonnemann, G.C., J. Wong, K.J. Jones, H.G., Lidov, C.A. Feener, F. Shapiro, B.T. Darras, L.M. Kunkel, and K.N. North. 2002. Primary gamma-sarcoglycanopathy (LGMD 2C): broadening of the mutational spectrum guided by the immunohistochemical profile. Neuromuscul Disord. 12: 273-80
【非特許文献５】Carrie, A., F. Piccolo, F. Leturcq, C. de Toma, K. Azibi, C. Beldjord, J.M. Vallat, L. Merlini, T. Voit, C. Sewry, J.A. Urtizberea, N. Romero, F.M. Tome, M. Fardeau, Y. Sunada, K.P. Campbell, J.C. Kaplan, and M. Jeanpierre. 1997. Mutational Diversity and hot spots in the alpha-sarcoglycan gene in autosomal recessive muscular dystrophy (LGMD2D). J Med Genet. 34: 470-5
【非特許文献６】Chan, Y.M., C.G. Bonnemann, H.G. Lidov, and L.M. Kunkel. 1998. Molecualr organization of sarcoglycan complex in mouse myotubes in culture. J. Cell Biol. 143: 2033-44
【非特許文献７】Dressman, D., K. Araishi, M. Immamura, T. Sasaoka, L.A. Liu, E, Engvall, and E.P. Hoffman. 2002: Delivery of alpha- and beta-sarcoglycan by recombinant adeno-associated virus: efficient rescue of muscle, but differential toxicity. Hum Gene Ther. 13: 1631-46
【非特許文献８】Duclos, F., V. Straub, S.A. Moore, D.P. Venzke, R.F. Hrstka, R.H. Crosbie, M. Durbeej, C.S. Lebakken, A.J. Ettinger, J. van der Meulen, K.H. Holt, L.E. Lim, J.R. Sanes, B.L. Dacidson, J.A. Faulkner, R. Williamson, and K.P. Campbell, 1998. Progressive muscular dustrophy in alpha-sarcoglycan-deficient mice. J Cell Biol. 142: 1461-71
【非特許文献９】Hackman, P., V. Juvonen, J. Sarparanta, M. Penttinen, T. Aarimaa, M. Unsitalo, M. Auranen, H. Pihko, R. Alen, M. Junes, T. Lonnqvist, H. Kalimo, and B. Udd. 2004. Enrichment of the R77C alpha-sarcoglycan gene mutation in Finnish LGMD2D patients. Muscle Nerve.
【非特許文献１０】Lapidos, K.A., R.Kakkar, and E.M. McNally. 2004. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94: 1023-31
【非特許文献１１】Nigro, V. 2003. Molecular bases of autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies. Acta Myol. 22: 35-42
【非特許文献１２】Pzawa, E., Y. Mizuno, Y. Hagiwara, T. Sasaoka, and M. Yoshida. 2005. Molecular and cell biology of the sarcoglycan complex. Muscle Nerve.
【非特許文献１３】Piccolo, F., Jeanpierre, F. Leturcq, C. Dode, K. Azibi, A Toutain, L. Merlini, L. Jarre, C, Navarro, R. Krishnamoorthy, F.M. Tome, J.A. Urtizberea, J.S. Bechmann, K.P. Campbell, and J.C. Kaplan. 1996. A founder mutation in the gamma-sarcoglycan gene of gypsies possibly predating their mifration out of India. Hum Mol Genet. 5: 2019-22
【非特許文献１４】Sampaolesi, M., Y. Torrente, A. Innocenzi, R. Tonlorenzi, G. D'Antona, M.A. Pellegrino, R. Barresi, N. Bresolin, M.G. De Angelis, K.P. Campbell, R. Bottinelli, and G. Cossu. 2003. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dustrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301: 487-92.
【非特許文献１５】Schwenk, F., U. Baron, and K. Rajewsky. 1995. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23: 5080-1.
【非特許文献１６】Shi, W., Z. Chen, J. Schottenfild, R.C. Stahl, L.M. Kunkel, and Y.M. Chan. 2004. Specific assembly pathway of sarcoglycans is dependent on beta- and delta-sarcoglycan. Muscle Nerve. 29: 409-19.
【非特許文献１７】Vainzof, M., M.R. Passos-Bueno, M. Canovas, E.S. Moreira, R.C. Pavanello, S.K. Marie, L.V. Anderson, C.G. Bonnemann, E.M. McNally, V. Nirgo, L.M. Kunkel, and M. Zatz. 1996. The sarcoglycan cmplex in the six autosomal recessive limb-gridle muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 5: 1963-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
先行技術では、プロテアソーム機能を阻害するあらゆる治療アプローチが、筋疾患、特に筋ジストロフィーの治療に試みられていた。しかしながら、非特定的なアプローチは特に有効であるとは思えず、寛容性の問題を導いていた。
【００１５】
それ故、新規な治療アプローチを開発すること、特にサルコグリカン異常症の患者を特異的且つ有効に治療する医薬品を開発することが必須である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、
−サルコグリカン異常症と関連するいくつかのサルコグリカンミューテーションが、欠損したフォールディングを示す糖タンパク質を生産すること；
−これらのミスフォールドタンパク質は、糖タンパク質分解経路と関連する小胞体を介して廃棄されること；
−この経路のインヒビターは、欠損したサルコグリカンタンパク質の分解をブロックすること；
−（インヒビターの存在下で）分解しない場合、欠損したサルコグリカンは細胞膜に正確にトランスロケーションされ、サルコグリカン複合体にアセンブルされ、正常な表現型の回復を導くこと
を示す本発明者によって報告された結果に基づく。
【００１７】
小胞体（ＥＲ）グリコシダーゼは、糖タンパク質生産の質を制御する点で重要な役割を演じていることが思い起こされるべきである。それらは、正確にフォールディングされた糖タンパク質のみをその最終位置に輸送することを確保する。特に、α−マンノシダーゼによるＥＲにおけるマンノース残基の切断は、分解のためのプロテアソームにミスフォールドした糖タンパク質を導くシグナルとして機能する。
【００１８】
α−マンノシダーゼは二つの群に属する。クラスＩマンノシダーゼ（マンノシダーゼＩ）は、１−デオキシマンノジリマイシン及びキフネンシンによって阻害され、クラスＩＩマンノシダーゼは、スワインソニンによって特異的に阻害される。プロテアソームは、細胞質における細胞内タンパク質の分解に関与し、例えばＭＧ１３２またはボルテゾミブによって阻害できる。
【００１９】
理論的には、この分解経路（ＥＲＡＤ：小胞体関連分解）のいずれかのインヒビターを使用することが可能であろう。しかしながら本発明は、非常に選択的な作用形態を有することが証明されており、サルコグリカン異常症を治療するのに顕著に有効であるマンノシダーゼＩインヒビターに焦点を当てた。臨床上の観点から、これは潜在的に少ない副作用に特に対応する。
【００２０】
その結果、本発明は、サルコグリカン異常症を治療することを企図した医薬品の調製のためのクラスＩマンノシダーゼインヒビターの使用に関する。
【００２１】
それ故本発明の文脈において、少なくとも一つのマンノシダーゼＩインヒビターの使用が試験されている。特に、インヒビターの「カクテル」、特に活性／選択性の観点で相補的な阻害活性を有する異なるタイプのインヒビターの混合物の使用は排除されるものではない。
【００２２】
キフネンシン(CAS 109944-15-2)及び１−デオキシマンノジリマイシン(CAS 84444-90-6)分子は、マンノシダーゼＩを阻害することが既知であるため特に好ましい。
【００２３】
しかしながら本発明の範囲はこれらの分子に限定されない。実際に、いずれかの候補の分子を、単純な酵素的アッセイを使用してマンノシダーゼＩ阻害活性について試験しても良い。
【００２４】
このアプローチの目的がヒトサルコグリカン異常症のための治療溶液を見出すことであることを考慮すると、試験に使用される酵素は、ヒト起源のクラスＩα−マンノシダーゼ、特に登録番号NP_005898（マンノシダーゼ、アルファ、クラス１Ａ、メンバー１［ホモ・サピエンス］）でデータベースに参照されている酵素であるべきである。
【００２５】
そのようなインヒビターを試験するのに適した酵素アッセイは、例えばJ. Biol. Chem. 2004 Oct 8; 279(41): 42638-47. Epub 2004 Jul 22. "The twisted abdomen phenotype of Drosophila POMT1 and POMT2 mutants coincides with their heterophilic protein O-mannosyltransferase activity", Ichimiya T, Manya H, Ohmae Y, Yoshida H, Takahashi K, Ueda R, Endo T, Nishihara Sで印刷された文献に記載された。
【００２６】
投与方法、投与用量、及び投与頻度は、当業者に既知の古典的なプロトコールを使用して、各特定の場合について測定される。これらのパラメーターは、治療されるミューテーションと使用されるインヒビターとに特に依存する。
【００２７】
キフネンシンは好ましい選択肢である。このインヒビターは非常に特異的であり、水溶性であるという利点を有し、それ故経口投与に適している。
【００２８】
加えて、この治療方法は、ヒトα−サルコグリカンＲ７７Ｃミューテーション（遺伝子の２２９Ｃ＞Ｔミューテーションに対応するタンパク質のＡｒｇ７７Ｃｙｓ）によって生ずるサルコグリカン異常症の治療に特に適している。上述の通り、このミューテーションは、特に欧州での多数の臨床上の場合で関与している。しかしながら本出願人は、１−デオキシマンノジリマイシンもキフネンシンの代わりに使用できることを示した。されに、本発明の文脈では、観察された効果は特定のサブユニットの特定のミューテーションに特異的ではないことが示された。
【００２９】
実際、同じ有益な効果が、使用されるインヒビターに関わりなく、β及びδ−サブユニット、より正確にはそれぞれＱ１１Ｅ及びＥ２６２Ｋミューテーションについて観察された。
【００３０】
この理由のため、この治療は、４種のヒトサルコグリカンにおける全ての既知のミューテーションに関連する疾患について潜在的に投与されて良い。しかしながら、ナンセンスミューテーションまたは欠失による切り詰められたタンパク質は理論的に、分解されなくても活性ではないので、ポイントミューテーションのみがこのアプローチについて考慮されるべきである。
【００３１】
今回報告された主たるポイントミューテーションが以下の表に記載されている。このリストは排他的なものではない。
【表１】
2009543854.tif 000002
【００３２】
本発明の第二の特徴点は、サルコグリカン異常症の治療のために使用される、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路のインヒビターの効力のin vitro評価のために使用されるアッセイである。このアッセイは以下の工程からなる：
−そのうちの一つが試験されるミューテーションを有する４種のサルコグリカン遺伝子（γ、α、β及びδ）と細胞とをコトランスフェクションする工程；
−インヒビターの存在下で数時間インキュベーションする工程；
−サルコグリカン複合体を局在化する工程。
【００３３】
有利には、ポイントミューテーションを有するヒトサルコグリカン遺伝子が使用されるべきである。
【００３４】
複合体が細胞膜に局在することが見出されたら、インヒビターが試験されるミューテーションに有効であると同定し、それ故特定の形態のサルコグリカン異常症を治療することを目的とする治療アプローチでの使用が考慮できる。
【００３５】
細胞膜における複合体の検出は、以下のことを意味する：
−初めにインヒビターが欠損タンパク質の分解を妨げた；
−次いでミュータントタンパク質が正確にトランスロケーションされ、細胞膜複合体に挿入された。
【００３６】
有利には、この方法は以下の細胞を平行に考慮する：
−４種の野生型サルコグリカン遺伝子とコトランスフェクトされた細胞：これはポジティブコントロールである；
−同じ実験条件だが、インヒビターが存在しないでインキュベートされた細胞：これはネガティブコントロールであり、インヒビターの考えうる効果を評価する基礎を提供する。
【００３７】
好ましくは、複合体の検出は、少なくとも一つのサルコグリカンに対する抗体を使用して、免疫組織化学的方法によって実施される。
【００３８】
別法として、サルコグリカンの一つを、特に蛍光タグを使用してタグ化し、次いで顕微鏡またはフローサイトメトリーによって検出できる。この解決法は、より少ない実験工程を含むため、免疫学的方法と比較して有利である。しかしながら、融合タンパク質（サルコグリカン＋タグ）が複合体のアセンブルを破壊しないことを確認することが重要である。
【００３９】
両者の場合（抗体の選択またはタグ化されるサルコグリカンの選択）で、検出方法はミューテーションを有するサルコグリカンを標的化できるが、必ずそうすることが必要であるわけではない。
【００４０】
このインヒビターのスクリーニング方法は、特に関連するサルコグリカンミューテーションを有するトランスジェニックマウスにおいて、in vivoで使用されても良いことに注意すべきである。
【００４１】
本発明及びそれが呈する利点は、本明細書に添付した図面によって説明される以下の一連の実験によって最もよく示される。しかしながら、これらの実験は本発明の範囲を制限するものとは考慮されるべきではない。
【００４２】
本発明は、ＭＧ１３２（プロテアソームインヒビター）及びキフネンシン（マンノシダーゼＩインヒビター）の存在下で、Ｒ７７Ｃミューテーションを有するα−サルコグリカンタンパク質を使用する実験によってほぼ説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、α−サルコグリカンＲ７７Ｃミューテーションを有する患者から得た筋肉生検標本における、α、β、γ−サルコグリカン及びジストロフィンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。
【図２】図２は、マウス、正常（ＷＴ）、Ｓｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃ、及びＳｇｃａ−／−筋肉における、α、β、γ−サルコグリカン及びジストロフィンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。
【図３】図３は、Ｓｇｃａ−／−、ＷＴ及びＳｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃ筋肉の組織学的写真である（Ｑｕａ＝四頭筋、Ｇａ＝腓腹筋、Ｐｓｏ＝腰筋、Ｄｅｌ＝三角筋）。
【図４】図４は、Ｓｇｃａ−／−及びＳｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃ筋肉におけるエバンス染色を使用する壊死細胞の検出を示す写真である。
【図５】図５は、ＡＡＶ−ヒトＳｇｃａ７７Ｃの注射の後のＳｇｃａ−／−筋肉におけるα−サルコグリカン及びβ−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。左側：α−サルコグリカン；中央：β−サルコグリカン；右側：α及びβ−サルコグリカン。
【図６】図６は、ＡＡＶ−Ｓｇｃａ７７Ｃの注射の後のＳｇｃａ−／−筋肉の組織学的写真である。（左側：形質導入していない領域；右側：形質導入した領域）。
【図７】図７は、非浸透化クアッドリトランスフェクト細胞におけるα−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。左側：正常α−サルコグリカンでのクアッドリトランスフェクト；右側：ミュータントα−サルコグリカンでのクアッドリトランスフェクト。
【図８】図８は、α−サルコグリカン（左側）及びカルレチクリン（中央）の免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。右側：両染色のオーバーラップ。
【図９】図９は、ＭＧ１３２の存在下でのミュータントα−サルコグリカンでのクアッドリトランスフェクト細胞におけるα−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。
【図１０】図１０は、キフネンシンの存在下でのミュータントα−サルコグリカンでのクアッドリトランスフェクト細胞におけるα−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。
【図１１】図１１は、ミュータントα−サルコグリカンで注射したマウスＳｇｃａ−／−筋肉におけるキフネンシンでの一週間の治療後の凝集物の不在を示す、α−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。
【図１２】図１２Ａは、３種のβ、γ及びδ−サルコグリカンと正常なα−サルコグリカン（左側）または１００μＭの１−デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＪ）の非存在下（中央）または存在下（右側）ミュータントＲ７７Ｃα−サルコグリカンでクアッドリトランスフェクションされた細胞における、α−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。図１２Ｂは、１−デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＪ）の５または１００μＭの存在下または非存在下での、３種のα、β及びγ−サルコグリカンとミュータントＥ２６２Ｋδ−サルコグリカンでクアッドリトランスフェクションされた細胞における、δ−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。図１２Ｃは、１−デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＪ）の５，５０または１００μＭの存在下または非存在下での、３種のα、γ及びδ−サルコグリカンとミュータントＱ１１Ｅβ−サルコグリカンでクアッドリトランスフェクションされた細胞における、β−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。
【図１３】図１３Ａは、キフネンシン５μＭの存在下または非存在下での、３種のα、β及びγ−サルコグリカンとミュータントＥ２６２Ｋδ−サルコグリカンでクアッドリトランスフェクションされた細胞における、δ−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。図１３Ｂは、キフネンシン５μＭの存在下または非存在下での、３種のα、γ及びδ−サルコグリカンとミュータントＱ１１Ｅβ−サルコグリカンでクアッドリトランスフェクトされた細胞における、β−サルコグリカンの免疫組織化学的ラベリングを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
１．Ｓｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃマウスの生産
Ｓｇｃａ遺伝子を含むファージのＢａｍＨＩ−ＳｆｉＩ切断によって得られたＳｇｃａ遺伝子のエキソン２及び３を有する１０７５ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、次いでｐＳＰ７２プラスミドベクター(Promega)に挿入した。以下のプライマー：5'-GCCCAGGTGGCTGTGCTACACACAGCGCA-3'(配列番号１)及び5'-TGCGCTGTGTGTAGCACAGCCACCTGGGC-3'(配列番号２)を使用するサイトディレクトミュータジェネシスにより、エキソン３においてＨ７７Ｃミューテーションを生産した。ポイントミューテーションの存在をシークエンシングによって確認した。約４ｋｂの５’ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片と２９８１ｂｐの３’ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩ断片を、ミュータント挿入部位の各側でｐＳＰ７２ベクター内にクローン化した。ｐＧＥＭ−ｎｅｏｒベクター由来のｌｏｘＰ−ｎｅｏｒ−ｌｏｘＰカセットを、イントロン３におけるＥｃｏＲＶ部位を介して挿入し、チミジンキナーゼ（ＴＫ）カセットを、３’断片の下流に挿入し、最終組換えベクターを生産した。組換えベクター（２５μｇ）をＳａｌＩ切断によって直線化し、エレクトロポレーションによってＳＥ１２９Ｓｖ細胞に導入した。次いでＧ４１８耐性コロニーのＤＮＡを単離し、ＰＣＲまたはサザンブロットにより分析し、組換え現象をチェックした。二つの別個の組換えクローン（ＩＢ４及びＶＩＩＩＣＩＩ）をＣ５７Ｂｌ／６未分化胚芽細胞に注射し、キメラマウスを生産した。キメラのオスをＣ５７Ｂｌ／６の雌と交雑し、異種接合マウスを生産した。ｄｅｌｅｔｅｒ株との交雑によりｎｅｏｒカセットを除去した（１５）。ｎｅｏｒカセットが摘出されている生成したマウスを交配し、異種接合ミュータントマウスを生産した。Qiagen DNeasy Tissue Kitを使用して抽出された尾のＤＮＡに対して、上流プライマーa-sarcoQ 5':5'-TATAACCCTGGCTTCCTCTA-3'(配列番号３)及びtestNeo1 5'-CGAATTCGCCAATGACAAGACGCT-3'(配列番号４)、並びに下流プライマーa-sarcoQ3' 5'-TAGTGGCTCATGCCTTTAAT-3'(配列番号５)を使用してＰＣＲによりジェノタイピングを実施し、以下のＰＣＲ条件：９４℃で３分、次いで、９４℃で３０秒、６１℃で４０秒、及び７２℃で１分からなる３０サイクル、次いで７２℃で３分を使用して、ｎｅｏｒカセットを有するミュータント対立遺伝子について６３９ｂｐ産物と、野生型対立遺伝子について４８４ｂｐ産物とを生産した。ｎｅｏｒカセットの摘出の後、a-sarcoQ5'(配列番号３)及びa-sarcoQ3'(配列番号５)プライマーでジェノタイピングを実施し、ミュータント対立遺伝子について５７５ｂｐ産物を生産した。Ｈ７７ＣミューテーションがモデルのＳｇｃａ遺伝子に存在することをチェックするために、プライマーKIgenoseq2.s 5'-TGTGTTTGGGACTTATGGGG-3'(配列番号６)及びKIgenoseq2.as 5'-CAATCAGCAGCAGCAGCCTC-3'(配列番号７)で尾のＤＮＡに対してＰＣＲを実施し、６５９ｂｐのＰＣＲ産物を生産してそれを配列決定した。
【００４５】
２−組織学的及び免疫組織化学的分析
凍結筋肉由来の８μｍ切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を使用して染色した。エバンスブルーで注射したマウス由来の切片を、６３３ｎｍでの蛍光励起によって視覚化した。切片を乾燥してＰＢＳで脱水するか、ＰＢＳ中の１％トリトンで２０分間固定化した細胞を処理し、次いで１５％胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中で室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。切片をポリクローナル抗サルコグリカン抗体（α−サルコグリカン：希釈１／１０００、ヒトα−サルコグリカンのアミノ酸３６６−３７９を標的化する；β−サルコグリカン：希釈１／２０、NCL-b-SARC (Novocastra)；γ−サルコグリカン：希釈１／２０、NCL-g-SARC (Novocastra)；ジストロフィン：希釈１／２０、NCL-DYS2 (Novocastra)：及びカルレチクリン：希釈１／７０、ab4109 (Abcam)）で室温で１から２時間インキュベートし、次いでＰＢＳで３回洗浄した。室温で１時間のインキュベーションの後、フルオロクロムAlexa488 (A-11032, Molecular Probes)またはAlexa594 (A-11037, Molecular Probes)で接合し、ＰＢＳで１：１０００に希釈した二次抗体で、一次抗体を視覚化した。次いで切片をＰＢＳで３回洗浄し、フルオロマウント−Ｇ(Southern Biotech 0100-01)で搭載し、次いで共焦点顕微鏡(Leica)で観察した。ヒト生検標本の免疫組織化学的分析をHackman等（非特許文献９）に記載されたように実施した。
【００４６】
３−プラスミド及びＡＡＶベクターの構築
プラスミドpAAV_C5-12_α-SG、pcDNA3_α-SG、pcDNA3_β-SG、pcDNA3_γ-SG、及びpcDNA3_δ-SGを、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen)を使用して骨格筋ｃＤＮＡとクローンに対するＰＣＲにより生産した。プラスミドpcDNA3_α-SG-R77C及びpAAV_C5-12_α-SG-R77Cを、Quickchangeサイトディレクトミュータジェネシスキット(Stratagene)と以下のプライマー：5'-GCCCCGGTGGCTCTGCTACACCCAGCGC-3'(配列番号８)を使用するサイトディレクトミュータジェネシスにより、pcDNA3-α-SGまたはpAAV_C5-12_α-SGから得た。この構築物を、酵素的切断とシークエンシングによってチェックした。アデノウイルスフリーのAAV 2/1ウイルス調製物を、トリトランスフェクションプロトコールを使用してAAV1キャプシドに組換えAAV2-ITRゲノムを導入することにより生産した（非特許文献２）。一連の標準的プラスミド希釈物と比較して、ドットブロットによりウイルスゲノムを定量した。
【００４７】
４−細胞培養
グルタミン、ゲンタマイシン、及び１０％胎児ウシ血清を補ったダルベッコ修飾イーグル培地で、NIH3T3または911細胞を成育させた。１μｇのプラスミド当たり６μｌのFugene (ROCHE)を使用して細胞をトランスフェクションした。６穴のディッシュにおいてウェル当たり０．５μｇの各プラスミド(α-SGまたはα-SG-R77C及びβ-SG、γ-SG、δ-SG)を使用した。インヒビターによる処理のため、トランスフェクションの４３時間後に、マンノシダーゼインヒビター（キフネンシン５μＭ、VWR）またはプロテアソームインヒビター（ＤＭＳＯで希釈したＭＧ１３２ ５μＭ、Sigma）のいずれかで、細胞を５時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳですすぎ、室温で１５分間ＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、その後免疫組織化学的ラベリングを実施した。
【００４８】
５−in vivo実験
３の連続日数でトレッドミル(Columbusトレッドミル装置Exer 6M)で１日当たり３０分間Ｓｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃマウスを運動させた。１５°の下方の傾斜角を有するトレッドミルにマウスを配置し、速度を分当たり１０メーターに設定した。３日目の最後で、エバンスブルー染料（０．５ｍｇ／ｇ）でマウスを腹膜内で注射した。注射の後のみにマウスを殺傷し、三角筋、腰筋、臀筋、足の長指伸筋、及び四頭筋を切断し、液体窒素で冷却したイソペンタンで迅速に凍結した。
【００４９】
rAAV2/1ウイルス調製物を、Ｓｇｃａ−／−マウスの左脛骨前頭筋に注射した（３０μｌの全体積中に１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ））。注射後の第２０、２２、２５及び２７日目で、１０μＭのキフネンシンまたは２０μＭのＭＧ１３２を筋肉内に注射した（即ち、筋肉内での拡散を考慮してin vitroで使用される濃度の２倍または４倍のいずれかで）。殺傷する前日（第２７日目）で、マウスにエバンスブルーを腹膜内に注射した。左及び右の脛骨筋の両方を切断し、液体窒素で冷却したイソペンタンで迅速に凍結した。
【００５０】
ＩＩ）結果
１−ミュータントＲ７７Ｃα−サルコグリカンはヒトの膜に不存在である
ヒトにおけるα−サルコグリカンのＲ７７Ｃミューテーションの存在は、複合体の各種の別個のタンパク質に対する抗体を使用する免疫組織化学的ラベリングによって示されるように、サルコグリカン複合体の脱安定化を導く（図１）。
【００５１】
２−マウスでは、７７位でのシステインの存在はα−サルコグリカン膜標的化を妨げず、病理的状態を導かない
複合体の脱安定化の理由を調査するために、相同的組換えによって、７７位でシステインを有する動物モデル（Ｓｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃ）を生産した。正常なマウスはこの位置でヒスチジン残基を有し、アルギニン残基を有さないことに注意すべきである。各種のＤＧＣ複合体タンパク質に対する抗体を使用するこれらのマウス由来の筋肉の免疫組織化学的分析により、このミューテーションは、α−サルコグリカンの膜標的化、またはサルコグリカン複合体のアセンブルを妨げないことが示された（図２）。野生型及びα−サルコグリカン欠損（Ｓｇｃａ−／−、非特許文献８）由来の組織切片をコントロールとして使用した。
【００５２】
３から６月齢のＳｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃマウス由来の三角筋、腰筋、腓腹筋、及び四頭筋の組織を、ヘマトキシリン／エオシン染色によって調べ、Ｓｇｃａ−／−マウス組織と比較した。後者は重篤なジストロフィーの兆候を示したが、Ｓｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃ筋肉では異常は検出されなかった（図３）。
【００５３】
筋肉の異常の不在を機能的分析によって確認した。Ｓｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃマウスを常軌を逸した筋肉収縮に供し、次いで壊死細胞を特異的に染色するエバンスブルーで腹膜内で注射した。エバンスブルー染料の浸透は、Ｓｇｃａ７７Ｃ／７７Ｃマウスの筋肉では観察されなかった（図４）。システイン残基が７７位で存在する場合のマウスとヒトの間で観察された差異が、ヒトタンパク質の固有の特性に関連するものであるかを調べるために、７７位でミューテートされたヒトα−サルコグリカン遺伝子を有するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から由来するウイルスベクターを使用して、α−サルコグリカン欠損マウスの筋肉に遺伝子導入実験を実施した。これらの注射された筋肉の分析により、ミュータントタンパク質は膜に局在するが、いくつかのタンパク質は小胞体に維持されること、サルコグリカン複合体のアセンブリーと病理的表現型が関連していることが示された（図５及び６）。図５で観察されるように、α−サルコグリカンはいくつかの細胞の核周辺空間に蓄積していることに注意すべきである。
【００５４】
３−ミューテーションはα−サルコグリカンの保持とプロテアソームによる分解を導く
４種の各種のサルコグリカンをコードするクアッドリトランスフェクションプラスミドによって、ヒトにおいて観察された現象を再現する細胞モデルを確立した。このモデルでは、正常なα−サルコグリカンを３種の他のサルコグリカンと共に共導入した際に、膜で正確に複合体がアセンブル形成する。しかしながら、Ｒ７７Ｃα−サルコグリカンを導入すると、正確なアセンブルは膜で観察されない。これは、非透過性細胞に対するα−サルコグリカンの細胞外部分に対する抗体を使用する免疫組織化学的ラベリングによって示された。
【００５５】
透過性細胞におけるα−サルコグリカンと小胞体マーカー（カルレチキュラム）の二重ラベリングにより、ミュータントタンパク質は分泌経路に維持されることが示された（図８）。
【００５６】
ミュータントα−サルコグリカンは、小胞体のタンパク質の質のコントロールシステムによって異常と認識され、次いでプロテアソームにより分解されると仮定される。これは、膜の標的化を回復するプロテアソームインヒビターＭＧ１３２の使用によって確認された（図９）。
【００５７】
４−膜標的化はマンノシダーゼインヒビターにより回復される
小胞体のタンパク質の質のコントロールシステムは、不正確にフォールドされたタンパク質の分解を導く。マンノシダーゼＩ酵素は、サルコグリカンのようなグリコシル化タンパク質のオリゴサッカリド鎖を変性することによってこの工程で重要な役割を演じる。これらの事実と発明者の結果を心に留めて、この酵素のインヒビターの使用は、ミュータントα−サルコグリカンタンパク質の膜標的化を回復するであろうと仮定した。この仮説を、ミュータントα−サルコグリカンでクアッドリトランスフェクトされ、次いでキフネンシンにより処理された細胞における発明者の細胞モデルにおいて実証した（図１０）。
【００５８】
ヒトとマウスの間で観察された差異は、ヒトにおいて観察された分子現象に対応するin vivoマウスモデルを有さなかったことを意味する。しかしながら、遺伝子導入の後のミュータントタンパク質の部分的保持における減少は、マンノシダーゼＩ阻害がα−サルコグリカン膜標的化に対する有益な効果を有することを示唆するであろう。このインヒビターの使用がin vivoで有効であるかを調べるために、Ｓｇｃａ−／−マウスに最初にＡＡＶ−ＳＧＣＡ７７Ｃベクターの注射を与え、次いで（１５日後に）一週間の期間に亘りこのインヒビターの３回の筋肉内注射を与えた。インヒビターを注射された筋肉は、細胞内凝集物のほぼ完全な不在を示し、特に核周辺空間における蓄積の不在を示した。これらの結果は発明者の作業仮説を実証した（図１１）。
【００５９】
同じく証明された結果は、サルコグリカン複合体由来の２種の他のサブユニットに対する２の他のポイントミューテーション：サブユニットδに対するＥ２６２Ｋミューテーション（図１３Ａ）及びサブユニットβに対するＱ１１Ｅミューテーション（図１３Ｂ）についてキフネンシンで得られた。
【００６０】
５−１−デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＪ）による回復
α−サルコグリカンのＲ７７Ｃミューテーションに対してキフネンシンで実施されたものと同様の実験を、別のクラスＩマンノシダーゼインヒビターである１−デオキシマンノジリマイシン（ｄＭＪ）を使用して実施した。その結果が図１２Ａに示され、ミュータントα−サルコグリカン（Ｒ７７Ｃミューテーション）の膜標的化を回復するためのこの物質の効力を示す。
【００６１】
更に、同様の実験は、サルコグリカン複合体の他のサブユニットに対する他のミューテーション：サブユニットδに対するＥ２６２Ｋミューテーション（図１２Ｂ）及びサブユニットβに対するＱ１１Ｅミューテーションについての発明者の作業仮説を確認した。
【００６２】
結論として、７７位でシステインを有するミュータントα−サルコグリカンは、マウス及びヒト細胞において非常に異なった管理を受け、このミュータントタンパク質は、正確に局在した場合に機能的であり、サルコグリカン欠損に関連する病理的状態を治療できることが示された。更に細胞モデルにおいて、マンノシダーゼＩ阻害はミュータントサルコグリカンの分解を防止し、膜標的化を回復することが示された。in vivoでのこの物質の使用も、同じ結果を生ずるものと考慮される。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１】
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【図２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月7日(2008.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコグリカン異常症を治療することを企図した医薬品の調製のためのクラスＩα−マンノシダーゼインヒビターの使用。
【請求項２】
前記インヒビターがクラスＩα−マンノシダーゼ阻害活性を有する分子であることを特徴とする、請求項１に記載のインヒビターの使用。
【請求項３】
前記インヒビターがキフネンシンまたは１−デオキシマンノジリマイシン、有利にはキフネンシンであることを特徴とする、請求項２に記載のインヒビターの使用。
【請求項４】
前記疾患がヒトα−サルコグリカンにおけるＲ７７Ｃミューテーションと関連するサルコグリカン異常症であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のインヒビターの使用。
【請求項５】
前記疾患がヒトδ−サルコグリカンにおけるＥ２６２Ｋミューテーションと関連するサルコグリカン異常症であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のインヒビターの使用。
【請求項６】
前記疾患がヒトβ−サルコグリカンにおけるＱ１１Ｅミューテーションと関連するサルコグリカン異常症であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のインヒビターの使用。
【請求項７】
−そのうちの１種がミューテーションを有する４種のサルコグリカン遺伝子（γ、α、β及びδ）で細胞をコトランスフェクションする工程；
−請求項１から３のいずれか一項に規定されたインヒビターの存在下で数時間インキュベーションする工程；
−サルコグリカン複合体を局在化させる工程
からなる、サルコグリカン異常症に対するクラスＩα−マンノシダーゼインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【請求項８】
４種の野生型サルコグリカンをコードする遺伝子でコトランスフェクションされた細胞で平行に実施することを特徴とする、請求項７に記載のインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【請求項９】
前記インヒビターなしでインキュベートされた細胞で平行に実施することを特徴とする、請求項７または８に記載のインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【請求項１０】
前記複合体の局在化について免疫組織化学的ラベリング方法を使用することを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載のインヒビターの効力を評価するためのin vitroアッセイ。
【国際調査報告】
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