(57)【要約】  ヒトパピローマウイルスの遺伝子型を高感度で検出および判読する方法を提供する。分析しようとする試料のＨＰＶのＬ１遺伝子を、２次にわたったＰＣＲを介して、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子に作り、これを、本発明で提供するＨＰＶ遺伝子型を特異的に検出することが可能なプローブと交雑反応させた後、プローブとの反応度合いを、ストレプトアビジンに結合した蛍光物質を処理して確認する方法である。本発明で提供する方法は、既存の方法（ＤＮＡチップ、その他の方法）に比べて、試料に存在する微量のＨＰＶも検出することができる程度に非常に敏感であり、タイプ別ＨＰＶを正確に診断することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２５の核酸配列から一つ以上選択されるヒトパピローマウイルス（human papillomavirus、ＨＰＶ）遺伝子型を検出するためのプローブ。
【請求項２】
ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子を増幅する配列番号２７および２８の核酸配列を有するヒトパピローマウイルス増幅用プライマーセット。
【請求項３】
ＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的な配列番号２６の核酸配列を有するＧＡＰＤＨ遺伝子プローブ。
【請求項４】
ＧＡＰＤＨ遺伝子を特異的に増幅する配列番号２９および配列番号３０の核酸配列を有するＧＡＰＤＨ増幅用プライマーセット。
【請求項５】
請求項１のプローブを含むヒトパピローマウイルスタイプ検出用キット。
【請求項６】
請求項２および請求項４のプライマーセット、および請求項３のＧＡＰＤＨ遺伝子プローブをさらに含む、ヒトパピローマウイルスの遺伝型分析および検出用キット。
【請求項７】
（１）分析しようとする試料から、ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子に特異的な正方向および逆方向のプライマーセットを用いて、Ｌ１遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する第１段階と、
（２）前記１次増幅されたＬ１遺伝子産物を、正方向または逆方向の単一プライマーを用いて、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子に２次ＰＣＲ増幅する段階と、
（３）前記２次増幅された、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子産物をヒトパピローマウイルスタイプ検出用プローブと交雑反応させる段階と、
（４）前記反応物を、ストレプトアビジンに結合した蛍光物質と反応させる段階と、
（５）蛍光値を測定してヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型を確認する段階とを含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型を高感度で検出する方法。
【請求項８】
段階（１）の１次増幅の際に、配列番号２７および２８の核酸配列を有するプライマーセットを用いて増幅を行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階（２）の２次増幅の際に、配列番号２８の核酸配列を有するプライマーを用いて増幅を行う、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
段階（２）の単鎖のＬ１遺伝子のビオチン標識のために、ビオチンで標識されたｄＮＴＰの存在下にＰＣＲを行う、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
プローブがビーズに結合した形態である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
段階（３）のプローブが、配列番号１〜２４の核酸配列から一つ以上選択されるプローブ、および配列番号２５の核酸配列を有するプローブである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
（１）分析しようとする試料から、ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的な正方向および逆方向のプライマーセットを用いて、Ｌ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する段階と、
（２）前記１次増幅されたＰＣＲ産物を、正方向または逆方向の単一プライマーを用いて、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子に２次ＰＣＲ増幅する段階と、
（３）前記２次増幅された、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子産物をヒトパピローマウイルス遺伝子型検出用プローブおよびＧＡＰＤＨプローブと交雑反応させる段階と、
（４）前記反応物を、ストレプトアビジンに結合した蛍光物質と反応させる段階と、
（５）蛍光値を測定してヒトパピローマウイルス遺伝子型を確認する段階とを含む、ヒトパピローマウイルス遺伝子型を高感度で検出する方法。
【請求項１４】
段階（１）の１次増幅の際に、配列番号２７および３０の核酸配列を有するプライマー対を用いて増幅を行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
段階（２）の２次増幅の際に、配列番号２８および３０の核酸配列を有するプライマーを用いて増幅を行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
段階（２）の単鎖の遺伝子のビオチン標識のために、ビオチンで標識されたｄＮＴＰの存在下にＰＣＲを行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
プローブがビーズに結合した形態である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
段階（３）のプローブが、配列番号１〜２４の核酸配列から一つ以上選択されたプローブ、配列番号２５の核酸配列を有するプローブ、および配列番号２６の核酸配列を有するプローブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
蛍光物質が、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドまたはフルオレスカミンである、請求項７または請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒトパピローマウイルスタイプ（ＨＰＶ）を高感度で検出するためのプローブおよび方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
ヒトパピローマウイルス(Human papilloma virus、ＨＰＶ)は、約８ｋｂのＤＮＡウイルスであって、女性の子宮頸癌を誘発する様々な悪性腫瘍と密接に関連していると知られている（非特許文献１）。
【０００３】
子宮頸癌は性接触と密接な関係があり、ＨＰＶの感染は子宮頸部腫瘍の発生に関連していると知られている。現在まで約１００余種のＨＰＶ遺伝子型が報告されているが、これらの中でもヒトに疾病を誘発させるおそれのあるＨＰＶは約３０余種であり、これを高危険群（１６、１８、３１、３３、３５など）と低危険群（６、１１、４２、４３、４４など）に大別されている（非特許文献２）。
【０００４】
現在最も多く施行される検診法は、パパニコロースミア検査であって、検査者の熟練度に依存して検査の正確度が低下するという欠点がある（非特許文献３）。
【０００５】
コルポスコープによる検診を行うと、ＨＰＶの感染を７０％まで診断することができるが、熟練した専門家と高価の装備を必要とし、ヒトパピローマウイルスの遺伝子型を分類することができないという欠点がある（非特許文献４）。
【０００６】
ＨＰＶ遺伝子のＬ１部位をＰＣＲによって増幅した後、制限酵素を使用するＰＣＲ−ＲＦＬＰは、簡単且つ容易に結果を得ることができるという利点があるが、使用する制限酵素が変異部分を認識することができなければ分析不可能であるという利点がある（非特許文献５）。
【０００７】
また、ＨＰＶ遺伝子型によってＰＣＲ増幅の効率が異なって検査の正確度に問題が発生しうる（非特許文献６）。
【０００８】
また、商品化されているハイブリッドキャプチャーキット（Ｄｉｇｅｎｅ、ＵＳＡ）は、ＰＣＲ増幅過程なしで確認可能であるが、高危険群と低危険群に分類可能であるうえ、子宮頸癌と相関関係の高い１６型および１８型とは異なる高危険群を区別することができないという欠点がある（非特許文献７）。
【０００９】
最近開発されたマイクロチップ技術を用いたＨＰＶ遺伝子型分析キット（ＢｉｏＭｅｄＬａｂ、韓国）は、スライド上で反応する２次元的な方法によって交雑反応を行った後、３次にわたって洗浄過程を経なければならないという煩わしさがある。
【００１０】
また、これと同様の方法として、サスペンションアレイを用いた方法のＨＰＶ検出キットが開発されているが、このキットの場合、検出に必要なシグナル値が非常に低くて現実的に検出を行うには限界があるだけでなく、２つ以上のウイルスが感染した場合、低いシグナルは低濃度の感染ウイルスを認識することができないこともある。その他に、前述したマイクロチップ技術を用いた分析キットには、実験の後、検出されていない他のタイプのＨＰＶが感染しているかを確認するために、ＰＣＲ産物を電気泳動して確認しなければならないという煩わしさがあり、ＰＣＲ反応が正常に行われたかを確認することが難しいなどの問題がある。
【００１１】
そこで、試料に微量で存在するＨＰＶも検出し、そのタイプを正確に診断することが可能な高感度のＨＰＶタイプ検出方法の開発が依然として求められている。
【００１２】
このような背景の下に、本発明者は、ＨＰＶ遺伝子型を検出するプローブと検出方法上の改善によってＨＰＶタイプを高感度で検出しようとした。ＨＰＶタイプ間の変異が激しいＬ１遺伝子からＨＰＶタイプを特異的に検出することが可能な核酸配列を持つプローブを製造した。試料のＬ１遺伝子を１次ＰＣＲ増幅し、さらにビオチンで標識された単鎖の遺伝子を２次ＰＣＲ増幅して準備した後、これを製造したＨＰＶタイプ検出用プローブと反応させ、蛍光で検出する場合、既存の方法に比べて１０倍以上強い信号を得ることができることを確認し、高感度でＨＰＶタイプを検出する方法を完成した。そして、前述したように、全てのＨＰＶ遺伝子型と反応する交雑プローブを開発し、これにより既存のように電気泳動を行わなくてもその他の稀なＨＰＶタイプまでも感染有無を確認する方案を考案した。そして、ＰＣＲ反応の成功有無を確認するために、ＰＣＲ反応の際にサンプル内で常に存在するＧＡＰＤＨ遺伝子を一緒に増幅し、これを交雑プローブと反応させてＰＣＲ反応の成功有無を一目で確認することが可能な方法を開発した。
【００１３】
〔非特許文献１〕Godfroid et al., J. Virol. Method 75:69-81, 1998
〔非特許文献２〕De Villiers, J. Virol. 63:4898-4903, 1989; Jacobs et al., J. Clin. Microbiol. 33:901-905, 1995
〔非特許文献３〕Menezes et al., Acta Cytol. 45:919-926, 2001
〔非特許文献４〕Reid et al., Clin Obstet Gynecol. 32:157-179, 1989
〔非特許文献５〕Lungu et al., JAMA 267:2493-2496, 1992
〔非特許文献６〕Qu et al., J. Clin. Microbiol. 35:1304-1310, 1997; Karksen et al., J. Clin. Microbiol. 34:2095-2100, 1996; Gravitt et al., J. Clin. Microbiol. 38:357-361
〔非特許文献７〕Clavel et al., J. Clin. Pathol. 51:737-740, 1998
【００１４】
〔発明の開示〕
〔発明が解決しようとする課題〕
そこで、本発明の目的は、配列番号１〜２４の核酸配列から一つ以上選択されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型検出用プローブを提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、全ての稀なＨＰＶ遺伝子型タイプの間でも反応を行う配列番号２５の核酸配列を有するヒトパピローマウイルス遺伝子型検出用プローブを提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子を増幅する配列番号２７および配列番号２８の核酸配列を有するヒトパピローマウイルス増幅用プライマーセットを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、サンプル内のＧＡＰＤＨ(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase)遺伝子を増幅する配列番号２９および配列番号３０の核酸配列を有するＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーセットを提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、前記配列番号２９および３０のプライマーで増幅したＧＡＰＤＨ遺伝子と特異的に交雑反応する配列番号２６の核酸配列を有するＧＡＰＤＨプローブ遺伝子塩基配列を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、前記プローブおよび／またはプライマーセットを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型検出用キットを提供することにある。
【００２０】
〔課題を解決するための手段〕
上記目的を達成するために、本発明は、（１）分析しようとする試料から、ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子に特異的な正方向および逆方向のプライマーセットを用いて、Ｌ１遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する段階と、（２）前記１次増幅されたＬ１遺伝子産物を、正方向または逆方向の単一プライマーを用いて、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子に２次ＰＣＲ増幅する段階と、（３）前記２次増幅された、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子産物をヒトパピローマウイルスタイプ検出用プローブと交雑反応させる段階と、（４）前記反応物を、ストレプトアビジンに結合した蛍光物質と反応させる段階と、（５）蛍光値を測定してヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型を確認する段階とを含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型を高感度で検出する方法を提供する。
【００２１】
〔発明の効果〕
上述したように、本発明のＨＰＶ遺伝子型検出用プローブおよび方法を用いて、ＨＰＶ遺伝子型を正確且つ高感度で検出することができる。そのほか、本発明は特異的なプローブではなくＡＮＹプローブを用いて、ＨＰＶ感染有無を簡単に検出することができる。さらに、本発明によると陰性結果がＧＡＰＤＨシグナルによって正確であるか否かを確認することができる。
【００２２】
〔発明を実施するための最良の形態〕
一つの様態として、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ検出用プローブに関する。
【００２３】
一つの具体的様態として、本発明は、配列番号１〜２４の核酸配列から一つ以上選択されるヒトパピローマウイルスタイプ検出用プローブに関する。
【００２４】
別の具体的様態として、本発明は、配列番号２５の核酸配列を有する前記ヒトパピローマウイルスタイプを含んだ稀なヒトパピローマウイルスタイプを検出することが可能なプローブに関する。
【００２５】
本発明における用語「プローブ」とは、ＨＰＶタイプ間の特異的な検出が可能な短い核酸配列であって、数〜数十塩基に該当する核酸分子を意味する。本発明で提供するＨＰＶの各タイプ別Ｌ１遺伝子特異的なプローブ配列は、表１に開示されており、配列番号１〜２４の核酸配列を有する。本発明で提供する前記配列番号１〜２４の核酸配列を有するプローブは、タイプ別ＨＰＶ Ｌ１遺伝子配列を考慮して製造された他のタイプのＨＰＶと交差反応が殆どない特異的な配列であって、前記プローブを用いて試料と交雑反応させるとき、高い特異性と敏感性によってＨＰＶタイプの特異的な検出および診断が可能である。また、本発明で提供する配列番号２５の核酸配列を有するプローブは、ＨＰＶタイプを問わずに全てのタイプのＨＰＶ Ｌ１遺伝子と反応する特異的な配列から構成されており、前記プローブを用いて試料と交雑反応を行うとき、前記配列番号１〜２４の核酸配列を有するプローブと交雑するＨＰＶタイプだけでなく、前記配列番号１〜２４の核酸配列を有するプローブと交雑しないＨＰＶタイプとも交雑することにより、稀なＨＰＶタイプの特異的な検出および診断を可能にする。また、配列番号２５の核酸配列を有するプローブは、ＰＣＲ反応後の産物を電気泳動してアガロスゲル上で分析するなどの従来の方法ではなく、ビーズアレイ分析器内で簡単にＨＰＶタイプの感染有無を確認するための方法であって、電気泳動をしなくても、前記配列番号２５の核酸配列を有するプローブの検出度合いから稀なＨＰＶタイプの検出有無を判断することができるとともに、低い度合いでＨＰＶが感染しているため電気泳動によって検出されなくても、ＨＰＶの感染有無を確認することができて、その便利性および正確性が向上する。
【００２６】
本発明で提供する各プローブは、次のような変形が可能である。プローブの５’末端側に５〜２０個のチミン（ｄＴＴＰ）配列を含むことができる。また、５’末端にビーズのカルボキシル基と共有結合することが可能なアミン基を有することができる。アミン基は、好ましくは（ＣＨ２）ｎ鎖を介して連結される。この際、ｎは５〜１０、より好ましくは５〜７である。本発明の具体的な実施では、各プローブは１５個のチミン（ｄＴＴＰ）基を有し、（ＣＨ２）６鎖とアミン基を持つように製造された。その他にも、プローブの核酸配列は当該分野における公知の多様な変形が可能である。
【００２７】
別の様態として、本発明は、ヒトパピローマウイルスＬ１遺伝子を増幅する配列番号２７および配列番号２８の核酸配列を有するヒトパピローマウイルス増幅用プライマーセットに関する。
【００２８】
本発明における用語「プライマーセット」とは、相補的なテンプレートと塩基の対を形成することができ、テンプレート鎖の複写のための開始地点として機能をする短い核酸配列を意味する。本発明で提供するプライマーセットは、ＨＰＶタイプを問わずに全てのタイプのＨＰＶのＬ１遺伝子を増幅することができるように考案された正方向と逆方向のプライマーである。本発明の具体的な実施では、配列番号２７および２８の核酸配列を有するプライマーセットを使用した。
【００２９】
別の様態として、本発明は、ＰＣＲ反応が正常に行われたことを確認するためのＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅する配列番号２９および配列番号３０の核酸配列を有するＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーセットに関する。
【００３０】
本発明で提供するＧＡＰＤＨプライマーセットは、サンプル内の内在遺伝子として常に発現されるＧＡＰＤＨ遺伝子を特異的に増幅することができるように考案されたプライマーセットである。発明の具体的な実施では、配列番号２９および３０の核酸配列を有するプライマーセットを使用した。
【００３１】
別の様態として、本発明は、増幅されたＧＡＰＤＨ遺伝子を検出するためのＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的な配列番号２６の核酸配列を有するプローブに関する。前記プローブは、試料との交雑反応の際に前記ＨＰＶ特異的なプローブと同時に交雑反応を行う。これにより、ＰＣＲ反応が成功的に起こったことをビーズアレイ分析器内で直ちに確認することができるため、ＰＣＲ増幅失敗による不検出の場合の数を大幅低めることができる。
【００３２】
別の様態として、本発明は、前記ヒトパピローマウイルスタイプ検出用プローブを含むヒトパピローマウイルスタイプ検出用キットに関する。
【００３３】
ＨＰＶタイプ検出用プローブは、目的に応じて多様な形態のキットとして提供される。好ましい例は、ビーズに結合したビーズアレイ形態である。
【００３４】
本発明の前記検出用キットは、ＨＰＶタイプ検出用プローブの他にも、ＨＰＶ Ｌ１遺伝子増幅用プライマー配列をさらに含むことができる。また、本発明の前記検出用キットは、ＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマー配列をさらに含むことができる。また、本発明の前記検出用キットは、ＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的な配列を有するプローブを含むことができる。
【００３５】
その他にも、本発明の検出用キットは、次の構成成分、すなわち増幅反応チューブまたは他の適切なコンテイナー、反応緩衝溶液、ｄＮＴＰｓ、ビオチン化ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、滅菌水などを含むことができる。また、キットは陽性および陰性対照群を含むことができる。
【００３６】
別の様態として、本発明は、前記プローブを用いてヒトパピローマウイルスタイプを高感度で検出する方法に関する。
【００３７】
より具体的な様態として、本発明は、（１）分析しようとする試料から、ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子に特異的な正方向および逆方向のプライマーセットを用いて、Ｌ１遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する段階と、（２）前記１次増幅されたＬ１遺伝子産物を、正方向または逆方向の単一プライマーを用いて、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子に２次ＰＣＲ増幅する段階と、（３）前記２次増幅された、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子産物をヒトパピローマウイルス遺伝子型検出用プローブと交雑反応させる段階と、（４）前記反応物を、ストレプトアビジンに結合した蛍光物質と反応させる段階と、（５）蛍光値を測定してヒトパピローマウイルス遺伝子型を確認する段階とを含む、ヒトパピローマウイルスタイプを高感度で検出する方法に関する。
【００３８】
より具体的な様態として、本発明は、（１）分析しようとする試料から、ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的な正方向および逆方向のプライマーセットを用いて、Ｌ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子を１次ＰＣＲ増幅する段階と、（２）前記１次増幅されたＰＣＲ産物を、正方向または逆方向の単一プライマー遺伝子セットを用いて、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子に２次ＰＣＲ増幅する段階と、（３）前記２次増幅された、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子産物を、ヒトパピローマウイルスタイプ検出用プローブおよびＧＡＰＤＨプローブと交雑反応させる段階と、（４）前記反応物を、ストレプトアビジンに結合した蛍光物質と反応させる段階と、（５）蛍光値を測定してヒトパピローマウイルスタイプを確認する段階とを含む、ヒトパピローマウイルスタイプを高感度で検出する方法に関する。
【００３９】
本発明は、段階（１）と（２）で進行する一連のＰＣＲを行うことを特徴とする。段階的ＰＣＲによって、分析を希望する試料において、パピローマウイルスのＬ１遺伝子は、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子として増幅されて準備されるので、高感度検出を可能とし、ＧＡＰＤＨ遺伝子も、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子として増幅されて準備される。
【００４０】
段階（１）は、試料ＤＮＡからのＬ１遺伝子に特異的な正方向および逆方向のプライマーセットを使用するＰＣＲ方法によってＨＰＶのＬ１遺伝子を増幅させる段階であって、この段階で、Ｌ１遺伝子は指数的に(exponential)増幅される。本発明の具体的な実施では、配列番号２７および２８のプライマーセットを使用した。ＧＡＰＤＨ遺伝子も同じ原理で増幅され、ＧＡＰＤＨ遺伝子は具体的な実施で配列番号２９および３０のプライマーセットを使用した。
【００４１】
段階（２）は、段階（１）で増幅されたＨＰＶ Ｌ１遺伝子および／またはＧＡＰＤＨ遺伝子を、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子に増幅する段階であって、この段階で、Ｌ１遺伝子は線形的に増幅される。単鎖への増幅のために正方向または逆方向の単一プライマーを使用する。交雑反応を行うプローブがアンチセンス鎖の場合には正方向のプライマーを用いてセンス鎖を増幅させ、交雑反応を行うプローブがセンス鎖の場合には逆方向のプライマーを用いてアンチセンス鎖を増幅させるようにする。Ｌ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子のビオチン標識は、ビオチンで標識されたプライマーを用いるか、あるいはビオチンで標識されたｄＮＴＰの存在下にＰＣＲを行うことにより可能である。本発明の具体的な実施では、ビオチンで標識されたｄＣＴＰの存在下に配列番号２８の逆方向プライマーおよび配列番号３０の逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ビオチンで標識された単鎖の遺伝子を製造した。
【００４２】
すなわち、段階（１）のＰＣＲ反応によって指数的に増幅された遺伝子産物が、段階（２）のＰＣＲ反応によって、プローブに相補的な鎖のみ増幅されて存在するので、プローブと遺伝子産物との交雑効率が増加する。
【００４３】
段階（１）と（２）のＰＣＲにおける変性、結合、合成反応が起こる時間および温度とサイクル回数などは調節できる。
【００４４】
段階（３）は、段階（１）と（２）の方法で準備した、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子産物を、本発明で製造したヒトパピローマウイルスタイプ検出用プローブと交雑反応させる段階である。好ましくは、ＨＰＶ特異的な配列番号１〜２４の核酸配列、ＨＰＶ存在有無のみを確認するための配列番号３０の核酸配列、およびＧＡＰＤＨ特異的な配列番号２９の核酸配列を有するプローブを使用した。
【００４５】
本発明におけるプローブは、好ましくはビーズに結合したビーズアレイの形で提供される。プローブに結合するビーズの種類は特に限定されず、ビーズアレイの製造は当分野における公知の一般な方法による。
【００４６】
交雑反応の際に使用されるバッファー、時間および温度条件は調節できる。本発明の具体的な実施では、交雑反応の際に２×Ｈｙｂｒｉｓｏｌ（ＹｅＢＴ．，Ｃｏ．ＬＴＤ．）バッファーを用いて９５℃で５分間反応させた後、４０℃で３０分間反応させた。洗浄はＴＭバッファーを使用した。
【００４７】
段階（４）と（５）は、前記プローブと前記方法で加工されて準備された試料との反応度合いを、ストレプトアビジンに結合した蛍光物質を処理して蛍光で確認する段階である。ストレプトアビジンは、ビオチンと特異的に結合するので、試料中に存在するターゲット遺伝子を蛍光で測定可能である。
【００４８】
蛍光物質は、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレスカミンなどを例示することができるが、特に限定されない。本発明では、フィコエリトリンを使用した。
【００４９】
本発明は、本発明の試料のうちヒトパピローマウイルス遺伝子を、ビオチンで標識された単鎖のＬ１遺伝子として加工する場合、既存の二重鎖のＰＣＲ産物に直接蛍光標識を行うことより１０倍程度強いシグナル値を得ることができることを実験的に確認した。したがって、本発明は、ヒトパピローマウイルスが増殖する前に、微量で存在するヒトパピローマウイルスまで早期診断することが可能な正確度および信頼度が高い、簡単な高感度の検出方法を提供する。
【００５０】
前記方法の多様な変形および応用が可能であり、これは本発明の範囲に含まれる。
【００５１】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
〔実施例〕
実施例１：探針およびビーズアレイの製作
１−１．探針の作製
分析キットに含まれたビーズアレイは、ＨＰＶのＬ１遺伝子部位を含んで、５’末端に１５個のチミン（ｄＴＴＰ）、６個のＣＨ２鎖およびアミン基を含む２０〜２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド探針がビーズに固定されている。
【００５３】
使用した選別用探針は、次のとおりである。
［表１］
【００５４】
【表１】
2009528051.tif 000003
【００５５】
１−２．ビーズアレイの製作
このような探針を用いて、各準備されたビーズ（xMAP carboxylated microspheres；Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてビーズに探針を付ける作業によってビーズアレイを製作した。
【００５６】
１．実施例１−１で作製された探針をそれぞれ１００μＭの濃度で溶かして準備した。
【００５７】
２．反応しようとするビーズを各番号に合わせてよく混合した後、それぞれ４０μＬを取って準備した（各探針に応じてそれぞれ異なる番号のビーズを準備し、よく混合し、探針との反応のためにビーズがよく混ぜられている状態で４０μＬをピペットで取り、新しいチューブに加えて準備する。）。
【００５８】
３．０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ４．５）２０μＬを混ぜ、準備された探針を２μＬ取ってビーズと混ぜた。
【００５９】
４．新しく作った１０ｍＬ／ｍＬ ＥＤＣ(1-Ethyl-3-(3-dimetnylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride、ＰＩＥＲＣＥ)溶液１μＬを入れて反応した。
【００６０】
５．暗所で約３０分間よく攪拌して反応させた。
【００６１】
６．再び、新しく作った１０ｍＬ／ｍＬのＥＤＣ溶液１μＬを入れ、約２０分間さらに反応させた。
【００６２】
７．その後、各チューブに５００μＬの０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０溶液を入れてよく混ぜた。
【００６３】
８．各チューブのビーズを遠心分離して上澄み液を取り除き、さらに５００μＬの０．１％ＳＤＳ溶液をよく混合した。
【００６４】
９．各チューブのビーズを８．のように遠心分離して上澄み液を取り除いた。
【００６５】
１０．その後、１５０μＬのＴＥ（ｐＨ８．０）バッファーに溶かしてよく混ぜた後、４℃の暗室で保管した。
【００６６】
実施例２：ビーズアレイを用いたＨＰＶ遺伝子型の分析
２−１．試料からのＤＮＡ抽出
試料のＤＮＡを分離するために、綿棒で膣の内壁を掻き出したサンプルを溶菌液(lysis solution)４００μLに溶解し、これをプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬに添加した後、５８℃で１時間反応させ、しかる後に、沸騰水に１５分間反応させて準備した。
【００６７】
２−２．ＤＮＡにおけるＨＰＶ遺伝子の増幅
ＨＰＶ検出および遺伝型分析のために、実施例２−１で準備したＤＮＡ５μＬをテンプレートとし、ＨＰＶプライマーセット０．４μＭ、ＧＡＰＤＨプライマーセット０．１μＭ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｕｌｔｒａｔｏｏｌｓ、スペイン）１Ｕにして増幅した。この際、使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
【００６８】
ＨＰＶプライマーセット
ＹＢＴ Ｌ１Ｆ：５’−ｇｃｍｃａｇｇｇｗｃａｙａａｙａａｔｇｇ３’（配列番号２７）
ＧＰ６−１：５’−ａａｔａａａｃｔｇｔａａａｔｃａｔａｔｔｃｃｔｃ３’（配列番号２８）
ＧＡＰＤＨプライマーセット
ＧＡＰＤＨ Ｆ：５’−ｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔｔｇｇｔｃｇｔ−３’（配列番号２９）
ＧＡＰＤＨ Ｒ：５’−ｔｔｇａｔｔｔｔｇｇａｇｇｇａｔｃｔｃｇ−３’（配列番号３０）
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
【００６９】
９５℃で５分の後、４０サイクルを９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒行った後、７２℃で７分間反応した。
【００７０】
２−３．２次単鎖ＰＣＲ標識反応(2nd Single Strand PCR labeling)
実施例２−２で形成されたＰＣＲ産物に対して、どのタイプのＨＰＶが検出されるかを確認しなければならない。このために、本発明では２次単鎖ＰＣＲ標識反応によって増幅産物を標識した。
【００７１】
標識のためにＰＣＲ産物２μＬを使用し、ＨＰＶ逆方向プライマー（配列番号２８）０．５μＭ、ＧＡＰＤＨ逆方向プライマー（配列番号３０）０．５μＭ、５０μＭ ｄＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰｍｉｘ、２０μＭビオチン−ｄＣＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｕｌｔｒａｔｏｏｌｓ、スペイン）１Ｕにして、単鎖線形増幅(Single strand liner amplification)を行った。
【００７２】
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。９４℃で５分の後、３０サイクルを９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒行った。
【００７３】
２−４．ビーズアレイを用いたハイブリダイゼーション
実施例２−１、２−２および２−３で加工された試料遺伝子を２Ｘ ＴＥＺハイブリダイゼーションバッファ（ＫＯＭＡ ｂｉｏｔｅｃｈ）に溶かした後、実施例１−２で製造した混成ビーズを用いて交雑反応させた。９５℃で５分間反応の後、４０℃で３０分間反応を行った。その後、９６ウェルフィルタープレート(96 well Filter plate)に試料をビーズと一緒に同時に移した後、ＴＭバッファーを用いて３回洗浄した。洗浄の後、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓ３４０２）を、５００倍希釈した溶液１００μＬを用いて１５分間暗室で攪拌させた。
【００７４】
２−５．ビーズアレイのシグナル検出
このように準備された混成ビーズサンプルを用いてＬｕｍｉｎｅｘ１００機械でウェル別にビーズを読み取る。Ｌｕｍｉｎｅｘ１００は２本のレーザーを用いる。１本のレーザーはビーズ(bead)番号を、もう１本のレーザーは反応されたフィコエリトリンの量を計算して数値で表わす。合計２６種類のビーズを読み取りながら、それぞれのＨＰＶ遺伝型はＨＰＶ遺伝型を代表するビーズのＭＦＩ(mean fluorescence index)として決定される。
【００７５】
実施例３：患者サンプルを用いたＨＰＶ遺伝子型の分析結果
Ｌｕｍｉｎｅｘ１００機械で２次線形増幅反応が終わったチューブに、それぞれのタイプを代表するプローブが付いているビーズを混ぜて作った混合ビーズとの交雑反応および洗浄過程の後、ストレプトアビジンフィコエリトリンと反応させた後、読み取った蛍光数値（Mean fluorescent intensity；ＭＦＩ）を表わした。この患者の場合、１６番タイプのＨＰＶに感染していることが分かった。また、ＧＡＰＤＨ増幅が正常に行われたので、ＰＣＲ反応に異常がなかったことが分かり、Ａｎｙプローブが出ることを確認し、ＨＰＶに感染していることを確認することができた（図１）。
【００７６】
実施例４：多重感染しているＨＰＶ遺伝子型の分析結果
前記方法を用いてＨＰＶ遺伝子型を分析した結果、３５番、３９番および６７番の多重感染を確認することができる（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】患者サンプルをビーズアレイで分析した結果であって、ＨＰＶタイプ１６に感染していることを示す。また、実験上でＰＣＲ反応が正常に行われたことを確認するためのＧＡＰＤＨのシグナルと、アレイに探針を持っていない稀なＨＰＶタイプを分析するための、全てのＨＰＶタイプと反応する配列番号２５の核酸配列を有するプローブシグナルが検出されたことを確認することができる。
【図２】患者サンプルをビーズアレイで分析した結果であって、ＨＰＶタイプ３５、タイプ３９およびタイプ６７に同時に感染していることを示す。また、実験上でＰＣＲ反応が正常に行われたことを確認するためのＧＡＰＤＨのシグナルと、アレイに探針を持っていない稀なＨＰＶタイプを分析するための、全てのＨＰＶタイプと反応する配列番号２５の核酸配列を有するプローブシグナルが検出されたことを確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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