(57)【要約】本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV）感染を予防または治療する方法であって、有効量の少なくとも一つのHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物とを含むHCVワクチンがヒト個体に少なくとも3回隔週投与される方法に関する。
2009534428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
C型肝炎ウイルス（HCV）感染の予防または治療方法であって、少なくとも一つの有効量のHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物とを含むHCVワクチンがヒト個体に少なくとも3回隔週投与される、方法。
【請求項２】
HCVワクチンが少なくとも4回、好ましくは少なくとも6回隔週投与される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
HCVワクチンが少なくとも8回隔週投与される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が少なくとも4の鎖長のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を含む、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が8より多く、特に20より多くのアミノ酸残基の範囲内で20%より多く、特に50%より多くの塩基性アミノ酸を含むポリペプチド、特にポリアルギニンもしくはポリリジン、ポリカチオン性抗菌性ペプチド、3〜7の疎水性アミノ酸のリンカーにより分離された少なくとも2のKLKモチーフを含むペプチド、またはその混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項７】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が20〜500のアミノ酸残基、特に30〜200の残基を含む、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
HCV T細胞抗原が7〜50のアミノ酸残基、好ましくは8〜45のアミノ酸残基、特に8〜20のアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、各ペプチドが少なくとも一つのT細胞エピトープを含む、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
HCV T細胞抗原が少なくとも一つのT細胞エピトープを含む少なくとも7、好ましくは少なくとも8、特に少なくとも9のアミノ酸残基を含む、以下：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、
GYKVLVLNPSVAAT、
AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、
DLMGYIP(A/L)VGAPL、
GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV、
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、
VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL、
AAWYELTPAETTVRLR、
GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK、
FTDNSSPPAVPQTFQV、
LEDRDRSELSPLLLSTTEW、
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD、
MSTNPKPQRKTKRNTNR、
LINTNGSWHINRTALNCNDSL、
TTILGIGTVLDQAET、
FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE、
ARLIVFPDLGVRVCEKMALY、
AFCSAMYVGDLCGSV、
GVLFGLAYFSMVGNW、
VVCCSMSYTWTGALITPC、
TRVPYFVRAQGLIRAおよび
TTLLFNILGGWVAAQ；
またはそのフラグメントからなる1以上の群から選択される、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
HCVワクチンが少なくとも3、好ましくは少なくとも4、特に少なくとも5の異なるHCV T細胞抗原の混合物を含む、請求項１〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
HCVワクチンが投与用量あたり1〜20 mg、好ましくは3〜10 mg、特に4〜6 mgのHCV T細胞抗原を含む、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
HCVワクチンが皮下または皮内、特に皮内投与される、請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
HCVワクチンが免疫応答修飾物質、好ましくはトール様レセプター（TLR）アゴニスト、特にトール様レセプター（TLR）7アゴニスト、特にTLR 7および8アゴニストまたはTLR 9アゴニストと併用投与される、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
HCVワクチンが好ましくは局所適用製剤、特にクリームとして1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（イミキモド）と併用投与される、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
HCVワクチンが皮下または皮内、好ましくは皮内投与され、イミキモドが好ましくはHCVワクチンの投与の4〜24、特に10〜16時間後にクリーム、好ましくは5重量%クリームとして注射部位に直接的に適用される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも4回の隔週投与のためのHCV感染の治療および予防用HCVワクチンの製造のための少なくとも一つのHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物の使用。
【請求項１７】
少なくとも4回用量の請求項１〜１５のいずれか記載のHCVワクチンおよび隔週投与のための投与ツールを含む、HCV感染の治療および予防のためのキット。
【請求項１８】
さらに請求項１３〜１５のいずれか記載の免疫応答修飾物質を含む、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
隔週投与のための投与ツールが隔週投与についての投与説明書、隔週投与のためのカレンダー、隔週アラーム機能を有する電子アラートデイターまたはその組合せから選択される、請求項１７または１８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HCV感染の予防、およびHCV感染患者、特に慢性肝炎患者の治療のためのワクチンおよびワクチン接種戦略に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性C型肝炎ウイルス（HCV）感染は世界の人口のおよそ3%（約170百万人）に存在する。C型肝炎ウイルス（HCV）はフラビウイルス科（flaviviridiae）のメンバーである。少なくとも6のHCV遺伝子型があり、50より多くのサブタイプが記載されている。米国、欧州および日本において、遺伝子型1、2および3が最も一般的である。HCV遺伝子型の地理的分布は、遺伝子型1aは米国および西部欧州に多いが、1bは南および中央欧州に多いというように大きく変化する。HCVは非経口または経皮経路により感染し、肝細胞にて複製される。約15%の患者はウイルス排除および再生を伴う急性自己限定性肝炎を経験する。約85%の感染者は慢性キャリアとなる。感染は多年にわたってゆっくりと進行しながら無症候的に存続することが多いが、最終的にHCVは肝硬変、末期肝臓疾患および肝臓癌の主な原因である。CD4+ヘルパーT細胞（HTL）およびCD8+細胞毒性T細胞（CTL）の両方の応答の強度および質は、患者が慢性感染を回復するか（自発的にもしくは治療の結果として）または発症するか否かで決定する。C型肝炎の自然経過中20〜30年以内に、肝硬変は約25%の患者に発症し、肝細胞癌は約5%に発症する。実質的なコストは、肝移植などのこれらの慢性C型肝炎の続発症の治療に起因する。
【０００３】
インターフェロン・アルファおよびリバビリンによる併用治療は現在、慢性C型肝炎患者の標準的な治療である。しかし、治療に対する持続応答（SR）−治療停止の6月後に検出可能なウイルス血の欠如により定義される−は約50%の患者、および遺伝子型1に感染した43〜46%の患者のみに達成され、欧州、米国およびカナダに最も流行している。この治療の低耐性および少なからぬ副作用は明らかに、治療ワクチンなどの新規治療的介入を必要とする。それゆえ新規治療様式の評価は当然である。
【０００４】
インターフェロン・アルファによる治療は、インフルエンザ様症候群、熱、頭痛、関節痛、筋肉痛、鬱病、体重減少、脱毛症、白血球減少症および血小板減少症などの実質的な副作用を有する。これらの副作用はしばしばかなり顕著であり、生活の質または仕事の能力を限定することがある。インターフェロン治療は特に血液学的副作用（血小板減少症）により限定され、脾腫を有する肝硬変により予め存在する血小板減少症を有する多くの患者に禁忌である。
【０００５】
リバビリンはまた、臨床的に有意であることがあるいくつかの副作用も有する。リバビリンは組織への酸素送達の減少を引き起こしうる溶血および有意な貧血を誘発し、冠状動脈性心臓病患者における心筋梗塞症と関連している。さらに、リバビリンの投与は催奇性、変異原性および発癌性の可能性がある。それゆえ繁殖力のある男性および女性患者のリバビリン治療中には避妊手段が義務的である。
【０００６】
HCV特異的プロテアーゼ、ポリメラーゼまたはヘリカーゼ阻害剤などの他の可能な治療戦略はまだ、前臨床相または早期臨床開発中にある。それらの臨床的有用性は現時点では予測できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一方での標準的な治療の限定された有効性、他方での重要な副作用のために、C型肝炎についての新規治療様式が緊急に必要である。
【０００８】
追求されている戦略はペプチドベースのワクチンの開発を目指す。この経路がうまくいくことがすでに示されているアプローチは、例えばWO 01/24822、WO 2004/024182、WO 2005/004910またはPCT/EP2005/054773に記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
それゆえ本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV）感染の予防または治療方法であって、有効量の少なくとも一つのHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物とを含むHCVワクチンがヒト個体に少なくとも3回隔週投与される、方法に関する。
【００１０】
本発明によれば、驚くべきことに、HCV T細胞抗原を含むHCVワクチンの有効性は投与速度に非常に依存することが判明した。投与経路、ワクチン投与の総数または投与あたりに適用される抗原の量などの他の投与パラメータもまた重要であるが、最適有効性について投与速度ほどには重要ではない。効率的な投与速度はワクチン接種反応とワクチン接種すべきヒト個体への負担とのバランスを反映すべきである。本発明によれば、HCV T細胞ワクチンの隔週投与は、例えば毎日、毎週または毎月（4週）投与と比較して、総有効性においてすぐれていることが判明した。これは健康なボランティアおよび患者、特に慢性HCV患者の両方における比較臨床試験により証明することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明によれば、14日間隔に可能なように正確に隔週投与を維持することが好ましい。しかし、10〜20日、好ましくは11〜18日、特に12〜16日の間隔におけるワクチン投与（入手可能性および患者の健康状態などの実践的な環境により必要とされうる）もまた、−そのようなワクチン接種戦略のための標準的実践による−「隔週」投与の必要性に適合するようにも考えられる。
【００１２】
ワクチン接種の有効性は2回または3回の隔週投与により排除されないが、本発明によるHCVワクチンが少なくとも4回、好ましくは少なくとも6回、特に少なくとも8回にて隔週投与されることが好ましい。そのような少なくとも12〜16週のワクチン接種戦略は慢性HCV患者に特に有効であることが判明した。中断されたワクチン接種戦略、例えば初めのワクチン接種後の長期中断後の追加注射を適用することもできる。例えば最初のワクチン接種段階後、3、4、5、6、7または8の隔週ワクチン接種が追加後、例えば隔週ワクチン接種の1〜12、好ましくは2〜6月後に続くであろう。
【００１３】
本発明によるHCVワクチンにおけるHCV T細胞エピトープを適切なアジュバント、免疫賦活物質などと組み合わせることは、ワクチンが投与されるべき個体の免疫系へのHCV T細胞抗原の適切な提示を増強するかまたは確実にするために好ましい。それゆえ、本発明によるワクチンは、−HCV抗原に加えて−ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物を含む。好ましくは、本発明によるペプチド結合を含むポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸およびその混合物からなる群から選択される。好ましいペプチド結合を含むポリカチオン性化合物は、少なくとも4の鎖長のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を含む。
【００１４】
従って、ポリカチオン性化合物は、8より多く、特に20より多くのアミノ酸残基の範囲内で20%より多く、特に50%より多くの塩基性アミノ酸を含むポリペプチド、特にポリアルギニンまたはポリリジン、ポリカチオン性抗菌性ペプチド、3〜7の疎水性アミノ酸のリンカーにより分離された少なくとも2のKLKモチーフを含むペプチド、またはその混合物からなる群から選択されることが好ましい。好ましくは、本発明によるペプチド結合を含むポリカチオン性化合物は20〜500のアミノ酸残基、特に30〜200の残基を含む。
【００１５】
これらのポリカチオン性化合物は化学的もしくは組換え的に産生するか、または天然源に由来することができる。
【００１６】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、抗菌性ペプチドであることもできる。これらの（ポリ）ペプチドは原核生物もしくは動物もしくは植物起源であるか、または化学的もしくは組換え的に産生することができる。ペプチドはまた、デフェンシンのクラスにも属することができる。そのようなペプチドの配列は例えば、適切な総説（例えばCurr Pharm Des. 2002; 8(9):743-61）または以下のインターネットアドレス：
http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag2.html
の抗菌性配列データベースに見ることができる。
【００１７】
そのような宿主防御（host defence）ペプチドまたは防御体（defensives）はまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態でもある。一般に、適応免疫系の最終生成物活性化（またはダウンレギュレーション）として可能であり、好ましくはAPC（樹状細胞など）により媒介される化合物は、ポリカチオン性ポリマーとして用いられる。
【００１８】
本発明におけるポリカチオン性物質としての使用のために特に好ましくは、カテリシジン（cathelicidin）由来抗菌ペプチドまたはその誘導体（参考文献により本明細書に引用される国際特許出願WO02/13857）、特に哺乳類、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジン由来抗菌ペプチドである。
【００１９】
天然源由来のポリカチオン性化合物としては、HIV-REVもしくはHIV-TAT（カチオン性ペプチド、アンテナペディアペプチド、キトサンまたは他のキチン誘導体に由来）または生化学もしくは組換え生成物によるこれらのペプチドもしくはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物はカテリン（cathelin）またはカテリンと関連もしくはこれに由来する物質である。例えばマウスカテリンはアミノ酸配列NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOHを有するペプチドである。カテリン関連または由来の物質は少なくとも15〜20のアミノ酸残基を有するカテリン配列の全部または一部を含む。誘導体化は、20の標準アミノ酸ではないアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含むことができる。さらに、さらなるカチオン性残基はそのようなカテリン分子に導入することができる。これらのカテリン分子は抗原と組み合わせることが好ましい。これらのカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを添加しないで、抗原のためのアジュバントとして有効であることも判明している。それゆえ、さらなる免疫活性化物質とともにまたはそれなしで、本発明によるペプチド結合を含むポリカチオン性化合物、例えばワクチン製剤における効率的なアジュバントとしてのそのようなカテリン分子を用いることができる。
【００２０】
本発明により用いられる別の好ましいポリカチオン性物質は、3〜7の疎水性アミノ酸のリンカーにより分離される少なくとも2のKLKモチーフを含む合成ペプチドである（本明細書に引用される国際特許出願WO02/32451）。それゆえ、好ましいHCVワクチンはさらに、配列R1-XZXZNXZX-R2を含むペプチドを含む（ここに、Nは3〜7、好ましくは5の総数であり、Xは正電荷の天然および／または非天然アミノ酸残基であり、ZはL、V、I、Fおよび／またはWからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、R1およびR2は独立してペプチドとともにまたはそれなしで、-H、-NH2、-COCH3、-COH、20までのアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチド反応基またはペプチドリンカーからなる群から互いに選択され；X-R2はペプチドのC-末端アミノ酸残基のアミド、エステルまたはチオエステルであることができる）。
【００２１】
本発明によるポリカチオン性物質はまた、他のイミュナイザーと組み合わせることもできる。そのようなさらなるイミュナイザーについての好ましい例はWO01/93905およびWO02/095027（I-またはU-含有オリゴデオキシヌクレオチド（I-またはU-ODN）；I-ODNはまた、本発明によればTLRリガンドまたはアゴニストとして特異的に用いることもできる（以下を参照のこと））に開示される。好ましくは、I-またはU-ODNはWO02/32451によれば分子（特にKLKLLLLLKLK）またはポリアルギニンと組み合わせる。
【００２２】
本発明により用いられるHCV T細胞抗原は、HCVタンパク質の保存領域からのT細胞抗原であるべきである。それゆえ、好ましくはHCVタンパク質由来の保存ペプチドエピトープが用いられ、これは患者における生産的免疫応答の標的であることが知られている。ウイルス回避を最小限にするため、最も一般的なひずみに保存されるペプチドのプールが好ましくは用いられるべきである。これはHCV特異的T細胞免疫の導入を保護する。ペプチドはMHC分子と連結したT細胞レセプターにより認識される。MHCクラスIの場合、HLA-A2が白人において最も一般的なMHC分子であるので、このHLA対立遺伝子と相互作用するペプチドのみを選択した。結果として、この母集団の群において最適有効性を有するべきであるHCVワクチンについて、いくつかのHLA型、例えばHLA-A2に陽性の個体は、本発明によれば、このHLA型に特異的なT細胞エピトープでワクチン接種すべきである。本発明に用いられるHCV T細胞抗原の長さは重大ではない。最適化は、必要とされるペプチド合成、可溶性、ポリペプチドあたりのT細胞エピトープの数などを考慮に入れるべきである。好ましくは、HCV T細胞エピトープは7〜50のアミノ酸残基、好ましくは8〜45のアミノ酸残基、特に8〜20のアミノ酸残基からなるポリペプチドとして提供され、各ペプチドは少なくとも一つのT細胞エピトープを含む。
【００２３】
本発明に用いられる好ましいHCV T細胞抗原は、WO 01/24822、WO 2004/024182、WO 2005/004910および／またはPCT/EP2005/054773に効率的なエピトープとして開示されるものから選択することができる。好ましくは、T細胞抗原は、少なくとも一つのT細胞エピトープを含む少なくとも7、好ましくは少なくとも8、特に少なくとも9のアミノ酸残基を含む、以下の群：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、
GYKVLVLNPSVAAT、
AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、
DLMGYIP(A/L)VGAPL、
GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV、
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、
VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL、
AAWYELTPAETTVRLR、
GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK、
FTDNSSPPAVPQTFQV、
LEDRDRSELSPLLLSTTEW、
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD、
MSTNPKPQRKTKRNTNR、
LINTNGSWHINRTALNCNDSL、
TTILGIGTVLDQAET、
FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE、
ARLIVFPDLGVRVCEKMALY、
AFCSAMYVGDLCGSV、
GVLFGLAYFSMVGNW、
VVCCSMSYTWTGALITPC、
TRVPYFVRAQGLIRAおよび
TTLLFNILGGWVAAQ；
またはそのフラグメントからなる群から選択される。好ましくは、本発明のHCVワクチンは少なくとも3のT細胞エピトープを含み、それぞれ異なるホットスポット（hotspot）エピトープに由来し、ここに、ホットスポットエピトープはAYAAQGYKVLVLNPSVAAT、GEVQVVSTATQS-FLATCINGVCWTVおよびHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAからなる群から選択されるペプチドを含むエピトープとして定義される。本発明のHCVワクチンはさらにホットスポットエピトープKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKおよびDLMGYIP(A/L)VGAPLからの少なくとも1のエピトープを含む場合にさらに好ましい。好ましくは、少なくとも3のエピトープのそれぞれは、以下の3の群：
GYKVLVLNPSVAAT、AYAAQGYKVLまたはAYAAQGYKVLVLNPSVAAT；
CINGVCWTV、GEVQVVSTATQSFLATまたはGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV；および
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、MWNFISGIQYLAGLSTLPGN、NFISGIQY-LAGLSTLPGNPA、QYLAGLSTLまたはHMWNFISGI
から選択される。さらに、以下の群：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL、YLLPRRGPRL、LPRRGPRL、GPRLGVRATもしくはRLGVRATRK；または
DLMGYIPAV、GYIPLVGAPLもしくはDLMGYIPLVGAPL；
からの少なくとも1のエピトープを含むことも好ましい。
【００２４】
本発明の好ましいHCVワクチンは少なくとも2の以下のエピトープ：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、DLMGYIPAV、LEDRDRSELSPLLLSTTEW、DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV、GYKVLVLNPSVAAT、CINGVCWTV、AAWYELT-PAETTVRLR、YLVAYQATVCARAQAPPPSWD、TAYSQQTRGLLG、HMWNFISGIQY-LAGLSTLPGNPA、IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFKおよびSMSYTWTGALITP
を含む。
【００２５】
好ましくは、HCVワクチンはこの少なくとも4、好ましくは少なくとも5、少なくとも6、少なくとも8または12すべてのエピトープを含む。
【００２６】
本発明の別の好ましいHCVワクチンは少なくとも2の以下のエピトープ：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV
AAWYELTPAETTVRLR、TAYSQQTRGLLG、HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFKおよびSMSYTWTGALITP
を含む。好ましくは、このHCVワクチンはこの少なくとも4、少なくとも5、特に7すべてのエピトープを含む。
本発明のHCVワクチンは、好ましくは少なくとも1のA2エピトープおよび少なくとも1のDR1エピトープを含む。
本発明のHCVワクチンは、好ましくは少なくとも1のDR7エピトープを含む。
【００２７】
エピトープの以下の組合せは特異的に強力（少なくとも3の群(1)〜(5)からの少なくとも1）としてみなされる：
(1) KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKまたはKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLまたはYLLPRRGPRLGVRATRKまたはYLLPRRGPRLまたはLPRRGPRL、またはLPRRGPRLGVRATRKまたはGPRLGVRATRKまたはRLGVRATRKまたはKFPGGYLLPRRGPRLGVRATRK、
(2) AYAAQGYKVLVLNPSVAATまたはAYAAQGYKVLまたはAAQGYKVLVLNPSVAATまたはKVLVLNPSVAATまたはGYKVLVLNPSVAATまたはAYAAQGYKVLVLNPSVまたはAYAAQGYKVLVLNPSVAAまたはAAQGYKVLVLNPSVAまたはAYAAQGYKVLPSVAATまたはAYAAQGYKVLAAT、
(3) DLMGYIP(A/L)VGAPLまたはDLMGYIPALVGAPLまたはDLMGYIP(A/L)VGまたはDLMGYIP(A/L)VGAPまたはDLMGYIP(A/L)VまたはDLMGYIPLVGAPLまたはDLMGY-IPLVGAまたはDLMGYIPLV、
(4) GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVまたはGEVQVVSTATQSFLATまたはCINGVCWTVまたはVSTATQSFLATCINGVCWTVまたはTQSFLATCINGVCWTVまたはGEVQVVSTATQSFLAT-CINGまたはGEVQVVSTATQSFLAT、
(5) HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAまたはMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAまたはHMWNFISGIまたはMWNFISGIQYLAGLSTLPGNまたはNFISGIQYLAGLSTLPGNまたはQY-LAGLSTLまたはHMWNFISGIQYLAGLSTLまたはHMWNFISGISTLPGNPAまたはHMWQY-LAGLSTLPGNPAまたはMWNFISGIQYLAGLSTLPGN；特にエピトープGYKVLVLNPSVAAT、DLMGYIPAV、CINGVCWTVおよびHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAを含むHCVワクチンは特異的に強力であることが判明している。
【００２８】
上記のように、本発明の隔週投与されるワクチンは単一の抗原よりも多い混合物（「プール」）を含む。好ましくは、ワクチンは少なくとも3、好ましくは少なくとも4、特に少なくとも5の異なるHCV T細胞抗原を含む。他の具体的態様または例えばより大きな母集団がワクチン接種されるべき場合にて、混合物は5〜20、好ましくは8〜15の異なる（すなわち異なるアミノ酸配列を有する）エピトープを含むことができる。
【００２９】
注射のために提案されるペプチド抗原の量は、先に記載されている用量の範囲内で有効であることが分かっている。従って本発明のHCVワクチンの好ましい用量は、投与量あたり−ペプチドのプールのために全量として−1〜20 mg、好ましくは3〜10 mg、特に4〜6 mgのHCV T細胞抗原を含む。
【００３０】
上記のように、投与の経路はまた、有効性を最適化するのに重要であることも判明している。T細胞ワクチン投与に効率的であると報告されている経路はまた、本発明にも適用可能である。好ましくは、本発明のHCVワクチンは皮下または皮内、特に皮内（用語真皮内（intradermal, i.d.）および皮内（intracutaneous, i.c.）は本明細書にて同じ意味で用いられる）で隔週投与される。
本発明のHCVワクチンは、HCV抗原への免疫応答をさらに刺激するためのさらなる免疫賦活化合物を含むことができる。好ましくは、本発明の医薬製剤におけるさらなる免疫賦活化合物は免疫賦活デオキシヌクレオチド、alumn、フロインド（Freund）の完全アジュバント、フロインドの不完全アジュバント、免疫応答修飾因子、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン、またはその組合せの群から選択される。免疫賦活デオキシヌクレオチドは、例えばDNA、非脊椎動物由来の短いストレッチのDNAまたは特定の塩基コンテクスト中に非メチル化シトシン-グアニンジヌクレオチド（CpG）を含む短いオリゴヌクレオチド（ODN）の形態を含む天然または人工CpGであるが、WO01/93905およびWO02/095027に記載のODN（I-ODN、U-ODN）を含むイノシンおよび／またはウリジンでもある。例えばポリカチオン性物質と組み合わされる神経活性化合物はWO 01/24822に記載されている。
【００３１】
本発明の流れの中で、本発明のHCVワクチンを免疫応答修飾因子、好ましくはトール様レセプター（TLR）アゴニストまたはリガンド、特にトール様レセプター（TLR）7アゴニストと併用投与する場合に優れた結果を得ることができることが判明した。免疫応答修飾因子（IRM）は選択的にトール様レセプター（TLR）を活性化する固有の合成分子のクラスであり、これは自然免疫および細胞媒介免疫を刺激するのに重要である。それらはワクチン抗原への免疫応答の増強を含む広範な潜在的臨床用途ならびに疾患特異的単剤治療を有する。IRM（例えばTLR3、TLR7、TLR8またはTLR7および8、TLR9）の固有のTLR活性化プロファイルは、インターフェロン（IFN）-アルファ、インターロイキン-12、IFN-ガンマおよび腫瘍壊死因子アルファなどの種々のサイトカインの選択的な程度の刺激を引き起こす。IRMにより誘発される範囲のサイトカインは、細胞媒介免疫を増強し、ワクチンアジュバントとしての使用の可能性を強調するTh1応答に向けられる。IRMは例えばUS4,689,338、US5,238,944、US6,083,505、US2004/0076633、WO03/080114およびWO2005/025583に開示される。
【００３２】
好ましいHCVワクチンは、好ましくは局所適用製剤、特にクリームとして1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（イミキモド）と併用投与される。そのようなクリームを含むイミキモドの例はAldaraTMで市販されている。
【００３３】
AldaraTMはイミキモド含有クリームのブランド名である。5%クリームの各グラムはイソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、白ワセリン、ポリソルベート60、モノステアリン酸ソルビタン、グリセリン、キサンタンゴム、精製水、ベンジルアルコール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンからなる灰白色水中油型消失性クリーム基剤にてイミキモド50 mgを含む。
【００３４】
本発明の好ましい具体的態様によれば、本発明のHCVワクチンは皮下または皮内（特に皮内）投与され、イミキモドはクリーム、好ましくは5重量%クリームとして注射部位に直接的に適用される。イミキモド（AldaraTM）は最初に市販されたIRM分子として、ウイルス条件、外性器および肛門周囲疣の治療に承認される。さらなる適応としては、光線角化症および基底細胞癌が挙げられる。IRM、特にイミキモドはランゲルハンス細胞を活性化し、リンパ節への移動を増強するようだ。つい最近、イミキモドはまた、臨床試験において、メラノーマペプチドワクチン接種のためのアジュバントとしても調査されている。
【００３５】
好ましくは、本発明のHCVワクチンの免疫原性を増強するために、クリームは各ワクチン接種後に注射部位（およそ3x3 cm = 9 cm2）に直接適用することができ、注射部位は8hの最小時間後に穏やかにきれいにすることができる。そのようなクリームはまた、注射の数時間後、例えば初期注射の4〜24時間、好ましくは6〜18時間、特に10〜16時間後に塗布することもできる。あるいは、クリームはワクチン接種前、例えばワクチン接種の24時間前に塗布することができる。
別の態様によれば、本発明は、少なくとも3回の隔週投与のためのHCV感染の治療および予防用のHCVワクチンの製造のための少なくとも一つのHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物の使用に関する。
【００３６】
本発明の別の態様は、本明細書に定義されているHCVワクチンの少なくとも4回用量と隔週投与のための投与ツールとを含む、HCV感染を治療および予防するためのキットに関する。
【００３７】
好ましくは、本発明のキットはさらに、本明細書に定義されている免疫応答修飾因子を含む。
【００３８】
本発明のキットは隔週投与のために具体的に設計される。それゆえ、好ましくは、隔週投与のための投与説明書、隔週投与のためのカレンダー、隔週アラーム機能を有する電子アラートデイターまたはその組合せなどの隔週投与に関与する患者または医療関係者のための補助のための手段（ツール）も含む。
【００３９】
本発明はさらに、以下の実施例および図面に記載されているが、それに限定されない。
【実施例】
【００４０】
実施例1: 
HLA-A*0201トランスジェニックマウスにおけるHCV-ペプチド特異的T細胞応答に対する適用部位の影響
マウスHLA-A*0201トランスジェニックマウス（HHD.2）
ワクチン：臨床バッチPD03127（ロットK）
100μl／マウスの注射容積を含む：
抗原として：Ipep 83 (KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL) 200μg、Ipep 84 (GYKVLVLNPSVAAT) 200μg、Ipep 87 (DLMGYIPAV) 200μg、Ipep 89 (CINGVCWTV) 200μg、Ipep 1426 (HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA) 200μg
アジュバントとして：平均重合度40〜50のアルギニン残基を有するポリ-L-アルギニン（多角レーザー光散乱（MALLS）により測定）; ロット113K7277; Sigma Aldrich Inc.; 400μg
さらなるアジュバント：5%イミキモドを含むAldaraTM、TLR7を介して作用する免疫賦活剤; 3M Health Care Ltd.; 用量：およそ20 mg／マウス
製剤緩衝液：5mMリン酸塩／270mMソルビトール
実験設定10マウス／群
1.脇腹への皮下注射
2.背部への真皮内注射
3.背部への真皮内注射後、注射領域におけるAldaraTMクリームの即時塗布
【００４１】
0、14および28日目に、上記化合物を含む全量100μl／ワクチン／マウスを上記の異なる部位にてマウスに注射した。35日目に各実験群について脾臓を摘出し、磁気分離（MACS）によりCD4+ T細胞を濃縮した。CD4+ T細胞枯渇脾臓細胞を用いてCD8+ T細胞応答を測定した。IFN-γELIspotアッセイを用いて各単一HCV由来ペプチドに対するMHCクラスII制限（CD4+ T細胞）ならびにMHCクラスI制限T細胞応答（CD8+ T細胞）を測定した。一般に、無関連ペプチドによる再刺激はIFN-γ産生を全く誘発しなかった。
【００４２】
結果
Fig 1に示されるように、皮下注射にて、Ipeps 84、87および89に対するMHCクラスI制限CD8+ T細胞応答、およびIpeps 84および1426に対するMHCクラスII制限CD4+ T細胞応答を検出することができた。これらの応答はさらに、ワクチンの真皮内適用により増強することができた。さらに、真皮内注射直後のAldaraTMの共適用はさらに、検出された応答、特にIpep 87に対するMHCクラスI制限CD8+ T細胞応答を増大した。
【００４３】
結果として、HCVワクチンの真皮内適用は皮下注射と比較して、より強いHCVペプチド特異的T細胞応答を誘発し、この応答はさらにAldaraTM共適用により改善することができた。
【００４４】
実施例2: 
HLA-A*0201トランスジェニックマウスにおける1、2または3の注射におけるHCV-ペプチド特異的MHCクラスI制限CD8+ T細胞応答
マウスHLA-A*0201トランスジェニックマウス（HHD.2）
ワクチン：100μl注射量／マウスは以下を含む：
抗原として：Ipep 83 200μg、Ipep 84 200μg、Ipep 87 200μg、Ipep 89 200μg、Ipep 1426 200μg
アジュバントとして：平均重合度40〜50のアルギニン残基を有するポリ-L-アルギニン（MALLSにより測定）; ロット113K7277; Sigma Aldrich Inc.; 400μg
さらなるアジュバント：5%イミキモドを含むAldaraTM、TLR7を介して作用する免疫賦活剤; 3M Health Care Ltd.; 用量：およそ20 mg／マウス
製剤緩衝液：5mMリン酸塩／270mMソルビトール
実験設定30マウス／群（10／分析時点）
1.背部への真皮内注射
2.背部への真皮内注射後、注射領域におけるAldaraTMクリームの即時塗布
【００４５】
0、14および28日目にて、上記化合物を含む全量100μl／ワクチン／マウスをマウスに真皮内注射した。各実験群について7、21および35日目に脾臓を摘出し、磁気分離（MACS）によりCD4+ T細胞を枯渇させた。単一HCV由来ペプチドによる再刺激におけるMHCクラスI制限CD8+ T細胞によるIFN-γ産生をELISpotアッセイにより測定した。一般に、無関連ペプチドによる再刺激はIFN-γ産生を全く誘発しなかった。
【００４６】
さらに、インビボCTLアッセイは、単一または追加注射におけるMHCクラスI制限CD8+ T細胞のエフェクター機能を決定するために行った。簡潔には、ナイーブマウスから調製した抗原提示細胞（APC）は、Ipep 87を充填してCFSEhighで標識するか、または対照のためにIpep1247（無関連ペプチド（irrelevant peptide））を充填してCFSEmediumで標識するか、またはペプチドなしで充填してCFSElowで標識した。これらのAPCを一緒に混合し（1:1:1）、6、20または34日目にワクチン接種マウスに静脈内注射により養子導入した。その翌日に（7、21または35日目）、関連ペプチドを充填した導入APCの非存在（ワクチン接種誘発死滅の示唆）または存在を検出するためにFACS分析を行った。いずれの実験においてもAPC非充填の死滅は観察されなかった。
【００４７】
結果
Fig 2の上グラフに示されるように、MHCクラスI制限CD8+ T細胞によるHCVペプチド特異的IFN-γ産生は、いくつかのペプチドへの応答強度に関して異なる単一または追加真皮内注射にて検出可能である。
【００４８】
詳細には、単一真皮内注射にてIpep 89に対する応答のみ検出可能であったが、2回の注射にてIpep 84、87および89に対する応答は同程度の強度にて引き起こされた。この応答はさらに、Ipeps 89および84に対する応答よりもIpep87に対する応答の優性を明らかに示す3回目の注射により増強された。
【００４９】
一方、AldaraTMの共適用は、単一注射においてすでに三つすべてのペプチドに対する応答を引き起こした。2回目の適用において、Ipep 87に対して優勢な応答がすでに見られた。3回目の適用はさらに、Ipep 87特異的応答の強度を増大した。
【００５０】
Fig 2の下グラフに示されるように、MHCクラスI制限CD8+ T細胞のIpep 87特異的エフェクター機能を引き起こすために2回の注射が必要であった。さらに、エフェクター機能は有意であり、AldaraTMの共適用にて強く増大した。
【００５１】
要するに、結果は、注射数の増大がHCV特異的免疫応答を増強したことを示す。さらに、さらなる免疫賦活剤（AldaraTM）の適用はいくつかのMHCクラスI制限CD8+ T細胞エピトープに対してより速くより明白な応答を与えた。
【００５２】
実施例3: 
HLA-A*0201トランスジェニックマウスにおける3または6回の注射におけるHCV-ペプチド特異的MHCクラスI制限CD8+ T細胞応答
マウスHLA-A*0201トランスジェニックマウス（HHD.2）
ワクチン臨床バッチPD03127（ロットK）
100μl注射量／マウスは以下を含む：
抗原として：Ipep 83 200μg、Ipep 84 200μg、Ipep 87 200μg、Ipep 89 200μg、Ipep 1426 200μg
アジュバントとして：平均重合度40〜50のアルギニン残基を有するポリ-L-アルギニン（MALLSにより測定）; ロット113K7277; Sigma Aldrich Inc.; 400μg
さらなるアジュバント：5%イミキモドを含むAldaraTM、TLR7を介して作用する免疫賦活剤; 3M Health Care Ltd.; 用量：およそ20 mg／マウス
製剤緩衝液5mMリン酸塩／270mMソルビトール
実験設定20マウス／群（10／分析時点）
1.脇腹への皮下注射
2.背部への真皮内注射
3.背部への真皮内注射後、注射領域におけるAldaraTMクリームの即時塗布
【００５３】
0、14、28、43、58および71日目にて、上記化合物を含む全量100μl／ワクチン／マウスを上記の異なる部位にてマウスに注射した。各実験群について35または78日目に脾臓を摘出し、磁気分離（MACS）によりCD4+ T細胞を枯渇させた。単一HCV由来ペプチドによる再刺激におけるMHCクラスI制限CD8+ T細胞によるIFN-γ産生をELISpotアッセイにより測定した。一般に、無関連ペプチドによる再刺激はIFN-γ産生を全く誘発しなかった。
【００５４】
結果
Fig 3はMHCクラスI制限CD8+ T細胞によるIFN-γ産生が6回対3回注射にて得られたことを示す。適用部位から独立して、特にIpep 87に対する応答はさらにさらなるワクチン接種により増強することができる。最も強い応答は常にワクチンおよびAldaraTMの共適用にて見られた。
【００５５】
要するに、データは、注射数の増大がHCV特異的免疫応答を増強したことを示す。さらに、さらなる免疫賦活剤（AldaraTM）の適用はいくつかのMHCクラスI制限CD8+ T細胞エピトープに対してより明白な応答を与えた。
【００５６】
実施例4: 
異なる注射間隔に基づく3回の注射におけるHLA-A*0201トランスジェニックマウスにおける短期および長期HCV-ペプチド特異的MHCクラスI制限CD8+ T細胞応答
マウスHLA-A*0201トランスジェニックマウス（HHD.2）
ワクチン：100μl注射量／マウスは以下を含む：
抗原として：Ipep 83 200μg、Ipep 84 200μg、Ipep 87 200μg、Ipep 89 200μg、Ipep 1426 200μg
アジュバントとして：平均重合度40〜50のアルギニン残基を有するポリ-L-アルギニン（MALLSにより測定）; ロット114K7276; Sigma Aldrich Inc.; 400μg
さらなるアジュバント：5%イミキモドを含むAldaraTM、TLR7を介して作用する免疫賦活剤; 3M Health Care Ltd.; 用量：およそ20 mg／マウス
製剤緩衝液5mMリン酸塩／270mMソルビトール
実験設定20マウス／群（10／分析時点）
1.脇腹への皮下注射
2.背部への真皮内注射
3.背部への真皮内注射後、注射領域におけるAldaraTMクリームの即時塗布
【００５７】
マウスに、示された異なる部位にて上記化合物を含む100μl全量／ワクチン／マウスで1週、2週または4週間隔にて3回注射した。3回注射後7および110日目に各実験群について脾臓を摘出し、磁気分離（MACS）によりCD4+ T細胞を枯渇させた。単一HCV由来ペプチドによる再刺激におけるMHCクラスI制限CD8+ T細胞によるIFN-γ産生をELISpotアッセイにより測定した。一般に、無関連ペプチドを有する再刺激はIFN-γ産生を全く誘発しなかった。
【００５８】
結果
Fig 4の上グラフに示されるように、1または4週注射間隔と比較して皮下または真皮内2週注射間隔において、わずかに強いMHCクラスI制限CD8+ T細胞応答がそれぞれの適用部位にて見られた。注射間隔の影響についての有意な差はワクチンおよびAldaraTMの共適用では全く見られなかった。
【００５９】
Fig 4の下グラフは、異なる注射間隔がHCVペプチド特異的MHCクラスI制限CD8+ T細胞応答の持続への影響はないことを示す。しかし、データは、ワクチンのみの真皮内または皮下注射に対してAldaraTMの共適用におけるIpep 87およびIpep 89特異的MHCクラスI制限CD8+ T細胞応答の優れた誘発を明らかに示す。
【００６０】
要するに、注射間隔が短期応答に影響し、さらなる免疫賦活剤（AldaraTM）の共適用がいくつかのHCV特異的MHCクラスI制限エピトープに対して非常に持続する応答を誘発したことが示される。
【００６１】
実施例5〜7: 
臨床試験
臨床試験はHCV T細胞抗原のプールで行った（ワクチンは「IC41」と称され、合成T細胞アジュバントとしてポリ-L-アルギニンを加えたHCVの保存T細胞エピトープを示す合成ペプチドの混合物からなり；IC41はHCVポリペプチドからの異なる領域、すなわち以下の3のエピトープ：HMWNFIS-GIQYLAGLSTLPGNPA、CINGVCWTVおよびDLMGYIPAVからの5のペプチドを含む）。それゆえIC41は、患者に生産的免疫応答の標的であることが知られている非構造的な領域NS3およびNS4に主に由来する5の合成ペプチドを含む。それらは少なくとも4のHLA-A*0201制限CTL-エピトープおよび3の非常に不規則なCD4+ ヘルパーT細胞エピトープを有し、これらはすべて標準的な治療を受けたかまたはHCVから自然回復した患者に標的化したことを示している。一つだけ例外として、ペプチド配列は遺伝子型1にて高く保存されている。IC41は合成アジュバントとしてポリ-L-アルギニンを含み、動物研究にてTh1/Tc1（IFN-γ）応答を増強することが示されている。IC41の臨床データは、ワクチンの投与が安全かつ耐性が高く、IC41が健康なボランティアならびに慢性HCV患者にてHCV特異的Th1/Tc1応答を引き起こしうることを示した。
【００６２】
ワクチン免疫原性の読み出しとして、記載のように有効T細胞アッセイ（インターフェロン・ガンマELIspotアッセイ、T細胞増殖アッセイ、HLA四量体／FACSアッセイ）を用いた。これらのアッセイは治療的HCVワクチンIC41により誘発されるエピトープ特異的T細胞応答の確実な測定を可能にする。ワクチン誘発T細胞免疫応答は有効性の代理パラメータとして供される。ELIspotはヒト血液などの生体サンプルにおけるペプチド特異的、機能的（すなわちサイトカイン分泌）T細胞の定量化を可能にする。アッセイの基本は、T細胞レセプターにより特異的に認識されるペプチドによる刺激におけるT細胞がIFN-γなどのサイトカインの分泌により反応することである。96ウェルプレートにてこの反応を行うことができる。このプレートのフィルターウェルをIFN-γに特異的なMabでコーティングする。結果的に、IFN-γを分泌する各細胞はIFN-γspotを離し、これは次の呈色反応で視覚化することができる。スポットは自動プレートリーダーを用いてカウントすることができる。得られた数はサンプルのペプチド特異的IFN-γ-分泌T細胞の頻度についての測定である。ELIspotはIC41の5のペプチドのそれぞれについて個別に行い、さらにより長いペプチド内に含まれる3のHLA-A2エピトープを個別に試験した。
【００６３】
臨床試験IC41-102（健康なボランティア）、IC41-201（慢性的な非レスポンダー患者、PCT/EP2005/054773）およびIC41-103（健康なボランティアにおける最適化適用）における各ELIspotアッセイプレートの外部標準の使用により、これらの試験からのデータの直接的な比較が可能となる（臨床研究の設計IC41-102、IC41-201およびIC41-103はFig. 6に示される）。
【００６４】
実施例5: 
改善されたレスポンダー速度
試験されたいずれのペプチドも、ワクチン接種中または接種後の時点にて、ベースライン値を少なくとも3倍上回るか、またはベースラインがゼロであるなら少なくとも有意に陽性であるときには、応答をスコアした。
【００６５】
IC41-103の全群は、IC41-102にて適用された4週ごとに4回スケジュールと比較して改善された応答速度を示した。CD8+ T細胞応答についての最高レスポンダー速度は最も頻繁なスケジュール（毎週）で群3にて達成した。可能な説明は、激しく頻繁なワクチン接種刺激を通した少なくとも部分的にCD4+ Tヘルパー細胞に独立のCD8+ T細胞活性化である。
【００６６】
第1表：群K、IC41-102と比較したIC41-103研究における群1〜5のELIspotレスポンダー速度
（NRE: ELIspotにおける非レスポンダー、REIV: CD8+ T細胞ELIspotレスポンダー、REV: CD4+ T細胞レスポンダー）
群    N     NRE    CD8+    CD4+   %CD8    %CD4
分析          (REIV)  (REV)
1     8      0      7       8      88%    100%
2     7      2      5       5      71%     71%
3     8      0      8       5     100%     63%
4     9      1      7       7      78%     78%
5     9      1      6       8      67%     89%
102-K  12      6      5       6      42%     50%
【００６７】
実施例6: 
ワクチンの合計および改善されたクラスI ELIspotの合計
IC41ワクチン接種により引き起こされるIFN-ガンマT細胞応答を定量的に評価するために、各個体についてのELIspot応答の経時変化を測定した：ワクチンの合計はバックグラウンドの差し引き後のIC41の5のペプチドそれぞれ（差し引かれた無関連HIVペプチド）に対して個別に測定したELIspotを加算することにより算出した。クラスIの合計はバックグラウンドの差し引き後のIC41の5のHLA-A2エピトープそれぞれ（差し引かれた無関連HIVペプチド）に対して個別に測定したELIspotを加算することにより算出した。ワクチンの最大合計およびクラスIの最大合計（通常ともに最後のワクチン接種後に記録した）を測定し、全レスポンダー／群にわたる平均値を測定した（第2表を参照のこと）。
【００６８】
第2表：全ELIspotはIC41を通して引き出した。ワクチンの合計およびクラスIの合計の測定について、本文を参照のこと、nはELIspotレスポンダーの数を特定する。
【表１】
2009534428.tif 000003
【００６９】
IC41-201において、I型（IFN-ガンマ）の関連、CD8+ T細胞応答およびHCV RNAの減少が数人の患者にて観察された：得られたデータは、少なくとも50のCD8+ T細胞ELIspot／無数のPBMCの閾値レベルがHCV RNAの急速でより大きな一つのlog10減少に必要であることを示唆した。それゆえ、最適化研究の一つのねらいは少なくともワクチンのサブセットにおける免疫原性のこのレベルを達成することであった。
【００７０】
第2表に示されるように、IC41-103群1、2および4におけるELIspotクラスIレスポンダーにおける平均合計クラスIはこの閾値に達したが、4週ごとに旧4（IC41-102）または6回（IC41-201）スケジュールで処置された群3および全レスポンダーは達しなかった。明らかに、IC41-103群5は必要とされる閾値の2倍以上の達成に最も良かった。
【００７１】
群1〜5についての平均合計ワクチンおよび平均合計クラスIの経時変化をFigure 6AおよびBに示す。4週ごとに旧4（IC41-102）または6回（IC41-201）スケジュールと比較して、臨界CD8+クラスI T細胞応答における劇的な増大をFigure 6Cに示す。
【００７２】
実施例7: 
改善された臨界クラスI（CD8+）T細胞応答の幅
突然変異エピトープエスケープなどのエスケープ機序を防止するために、別の目標は、広範な応答、すなわち同時に同じ個体における二以上のクラスIエピトープに対する同時T細胞応答を達成することであった。4週ごとに旧4（IC41-102）または6回（IC41-201）スケジュールを適用する前に結論付けられる二つの研究にて、せいぜい一つの優性CD8+ T細胞エピトープが応答を誘発した。
【００７３】
クラスI応答の幅を比較するために、一つの対象内の応答を上昇させるCD8+ T細胞エピトープの平均数を全ELIspotクラスIレスポンダー／群間で決定した（第3表を参照のこと）。
【００７４】
第3表にて示されるように、対象内の応答を引き起こすCD8+ T細胞エピトープの平均数は、IC41-103群1、3および4にて2倍であることができる。また、IC41-103群5は、最も良くて、対象内に同時に標的化される平均3（可能な5のうち）のCD8+ T細胞エピトープを達成する。
【００７５】
第3表：臨界クラスI（CD8+）T細胞応答の幅。Nトータルは処置された対象／患者の数を特定し、nはELIspotクラスIレスポンダーの数を特定する。
【表２】
2009534428.tif 000004
【００７６】
これらの臨床および前臨床結果は、インターフェロン・ガンマELIspot応答の強度および幅（第2および3表を参照のこと）の観点におけるIC41の最適適用が最も好ましくは2週の注射間隔の群5であることを同定したことを示す。1週が隔週よりも弱く；4週が明らかに悪い。皮内（真皮内）処置は皮下処置よりもわずかにすぐれていた（群1（s.c.）および4（i.d.）間の差異はない）が、群5の結果が最も良い。AldaraTM／イミキモド、トール様レセプター7アゴニストの局所適用は臨床結果の改善をもたらした。
【００７７】
群3（毎週, s.c.）はCD8+ T細胞レスポンダーを100%示すが、CD4+ T細胞応答（Tab 1レスポンダー速度）を63%だけ示す。これは、頻繁な（毎週）適用を通してCD8+ T細胞のCD4+独立活性化として解釈される。群1（s.c.）および4（i.d.）の比較は経路について有意な差異がないことを示唆する。注射の絶対数が強度を増大しないようだということも示される（Tab 2：群2および3における16ワクチン接種対他の群における8ワクチン接種）およびFigure 5最上部：8週にてすでに水平 = 4週後（または群2および3における8週）ワクチン接種）。最後に、個々の対象／患者（より大きな配列内に最小クラスIエピトープを含む「ホットスポット」ペプチド（WO2004/024182）の処理を必要とする）内のCD8+応答 = いくつかのクラスIエピトープに対する同時応答の幅は、群5にて最もうまく働く。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Fig. 1は、HLA-A*0201トランスジェニックマウスにおいてHCVワクチンの真皮内適用が皮下注射と比較してより強いHCVペプチド特異的T細胞応答を誘発し、この応答はAldaraTM（免疫賦活剤：イミキモド）の共適用によりさらに改善することができたことを示す。
【００７９】
【図２】Figs. 2および3は、HLA-A*0201トランスジェニックマウスにおいて注射数の増大によりHCVペプチド特異的免疫応答が増強され、さらなる免疫賦活剤の適用がいくつかのHCV特異的MHCクラスI制限エピトープ（CD8+ T細胞応答）に対してより速くより明白な応答を与えることを示す。
【００８０】
【図３】Figs. 2および3は、HLA-A*0201トランスジェニックマウスにおいて注射数の増大によりHCVペプチド特異的免疫応答が増強され、さらなる免疫賦活剤の適用がいくつかのHCV特異的MHCクラスI制限エピトープ（CD8+ T細胞応答）に対してより速くより明白な応答を与えることを示す。
【００８１】
【図４】Fig. 4は、HLA-A*0201トランスジェニックマウスにおいて注射間隔が短期応答への影響を有し、さらなる免疫賦活剤の共適用がいくつかのHCV特異的MHCクラスI制限エピトープに対する持続応答を誘発したことを示す。
【００８２】
【図５】Fig. 5は、実施例5〜7による臨床研究設計を示す。
【００８３】
【図６】Fig. 6は、最適化されたスケジュールを適用するIC41ワクチン接種に対するインターフェロン・ガンマELIspot応答の経時変化を示す。5の処置群中のレスポンダーのうち全ELIspot応答（CD4およびCD8 T細胞）(A)およびCD8 T細胞応答(B)の平均を示す（ワクチンの合計およびクラスIの合計の計測値について、実施例5〜7を参照のこと）。(C)最適化された旧スケジュールを適用する臨界CD8+クラスI T細胞応答。全ELIspotクラスIレスポンダーのうちのクラスIの平均合計を示す。
【図１】
2009534428.tif 000005
【図２】
2009534428.tif 000006
【図３】
2009534428.tif 000007
【図４】
2009534428.tif 000008
【図５】
2009534428.tif 000009
【図６】
2009534428.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月21日(2008.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
C型肝炎ウイルス（HCV）感染の予防または治療方法であって、少なくとも一つの有効量のHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物とを含むHCVワクチンがヒト個体に少なくとも3回隔週投与される、方法。
【請求項２】
HCVワクチンが少なくとも4回、好ましくは少なくとも6回隔週投与される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
HCVワクチンが少なくとも8回隔週投与される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が少なくとも4の鎖長のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を含む、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が8より多く、特に20より多くのアミノ酸残基の範囲内で20%より多く、特に50%より多くの塩基性アミノ酸を含むポリペプチド、特にポリアルギニンもしくはポリリジン、ポリカチオン性抗菌性ペプチド、3〜7の疎水性アミノ酸のリンカーにより分離された少なくとも2のKLKモチーフを含むペプチド、またはその混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項７】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が20〜500のアミノ酸残基、特に30〜200の残基を含む、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
HCV T細胞抗原が7〜50のアミノ酸残基、好ましくは8〜45のアミノ酸残基、特に8〜20のアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、各ペプチドが少なくとも一つのT細胞エピトープを含む、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
HCV T細胞抗原が少なくとも一つのT細胞エピトープを含む少なくとも7、好ましくは少なくとも8、特に少なくとも9のアミノ酸残基を含む、以下：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、
GYKVLVLNPSVAAT、
AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、
DLMGYIP(A/L)VGAPL、
GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV、
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、
VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL、
AAWYELTPAETTVRLR、
GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK、
FTDNSSPPAVPQTFQV、
LEDRDRSELSPLLLSTTEW、
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD、
MSTNPKPQRKTKRNTNR、
LINTNGSWHINRTALNCNDSL、
TTILGIGTVLDQAET、
FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE、
ARLIVFPDLGVRVCEKMALY、
AFCSAMYVGDLCGSV、
GVLFGLAYFSMVGNW、
VVCCSMSYTWTGALITPC、
TRVPYFVRAQGLIRAおよび
TTLLFNILGGWVAAQ；
またはそのフラグメントからなる1以上の群から選択される、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
HCVワクチンが少なくとも3、好ましくは少なくとも4、特に少なくとも5の異なるHCV T細胞抗原の混合物を含む、請求項１〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
HCVワクチンが投与用量あたり1〜20 mg、好ましくは3〜10 mg、特に4〜6 mgのHCV T細胞抗原を含む、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
HCVワクチンが皮下または皮内、特に皮内投与される、請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
HCVワクチンが免疫応答修飾物質、好ましくはトール様レセプター（TLR）アゴニスト、特にトール様レセプター（TLR）7アゴニスト、特にTLR 7および8アゴニストまたはTLR 9アゴニストと併用投与される、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
HCVワクチンが好ましくは局所適用製剤、特にクリームとして1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（イミキモド）と併用投与される、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
HCVワクチンが皮下または皮内、好ましくは皮内投与され、イミキモドが好ましくはHCVワクチンの投与の4〜24、特に10〜16時間後にクリーム、好ましくは5重量%クリームとして注射部位に直接的に適用される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
HCVワクチンがヒト個体に少なくとも4回隔週投与されるHCV感染の治療および予防のためのHCVワクチンの製造のための少なくとも一つのHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物の使用。
【請求項１７】
少なくとも4回用量の請求項１〜１５のいずれか記載のHCVワクチンおよび隔週投与のための投与ツールを含む、HCV感染の治療および予防のためのキット。
【請求項１８】
さらに請求項１３〜１５のいずれか記載の免疫応答修飾物質を含む、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
隔週投与のための投与ツールが隔週投与についての投与説明書、隔週投与のためのカレンダー、隔週アラーム機能を有する電子アラートデイターまたはその組合せから選択される、請求項１７または１８記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月25日(2008.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009534428000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月22日(2009.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
C型肝炎ウイルス（HCV）感染の予防または治療用キットであって、少なくとも一つの有効量のHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物とを含むHCVワクチンがヒト個体に少なくとも3回隔週投与される、キット。
【請求項２】
HCVワクチンが少なくとも4回、好ましくは少なくとも6回隔週投与される、請求項１記載のキット。
【請求項３】
HCVワクチンが少なくとも8回隔週投与される、請求項１記載のキット。
【請求項４】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか記載のキット。
【請求項５】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が少なくとも4の鎖長のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を含む、請求項１〜４のいずれか記載のキット。
【請求項６】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が8より多く、特に20より多くのアミノ酸残基の範囲内で20%より多く、特に50%より多くの塩基性アミノ酸を含むポリペプチド、特にポリアルギニンもしくはポリリジン、ポリカチオン性抗菌性ペプチド、3〜7の疎水性アミノ酸のリンカーにより分離された少なくとも2のKLKモチーフを含むペプチド、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか記載のキット。
【請求項７】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が20〜500のアミノ酸残基、特に30〜200の残基を含む、請求項１〜６のいずれか記載のキット。
【請求項８】
HCV T細胞抗原が7〜50のアミノ酸残基、好ましくは8〜45のアミノ酸残基、特に8〜20のアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、各ペプチドが少なくとも一つのT細胞エピトープを含む、請求項１〜７のいずれか記載のキット。
【請求項９】
HCV T細胞抗原が少なくとも一つのT細胞エピトープを含む少なくとも7、好ましくは少なくとも8、特に少なくとも9のアミノ酸残基を含む、以下：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、
GYKVLVLNPSVAAT、
AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、
DLMGYIP(A/L)VGAPL、
GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV、
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、
VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL、
AAWYELTPAETTVRLR、
GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK、
FTDNSSPPAVPQTFQV、
LEDRDRSELSPLLLSTTEW、
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD、
MSTNPKPQRKTKRNTNR、
LINTNGSWHINRTALNCNDSL、
TTILGIGTVLDQAET、
FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE、
ARLIVFPDLGVRVCEKMALY、
AFCSAMYVGDLCGSV、
GVLFGLAYFSMVGNW、
VVCCSMSYTWTGALITPC、
TRVPYFVRAQGLIRAおよび
TTLLFNILGGWVAAQ；
またはそのフラグメントからなる1以上の群から選択される、請求項１〜８のいずれか記載のキット。
【請求項１０】
HCVワクチンが少なくとも3、好ましくは少なくとも4、特に少なくとも5の異なるHCV T細胞抗原の混合物を含む、請求項１〜９のいずれか記載のキット。
【請求項１１】
HCVワクチンが投与用量あたり1〜20 mg、好ましくは3〜10 mg、特に4〜6 mgのHCV T細胞抗原を含む、請求項１〜１０のいずれか記載のキット。
【請求項１２】
HCVワクチンが皮下または皮内、特に皮内投与される、請求項１〜１１のいずれか記載のキット。
【請求項１３】
HCVワクチンが免疫応答修飾物質、好ましくはトール様レセプター（TLR）アゴニスト、特にトール様レセプター（TLR）7アゴニスト、特にTLR 7および8アゴニストまたはTLR 9アゴニストと併用投与される、請求項１〜１２のいずれか記載のキット。
【請求項１４】
HCVワクチンが好ましくは局所適用製剤、特にクリームとして1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（イミキモド）と併用投与される、請求項１〜１３のいずれか記載のキット。
【請求項１５】
HCVワクチンが皮下または皮内、好ましくは皮内投与され、イミキモドが好ましくはHCVワクチンの投与の4〜24、特に10〜16時間後にクリーム、好ましくは5重量%クリームとして注射部位に直接的に適用される、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
さらに隔週投与のための投与ツールを含む、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
隔週投与のための投与ツールが隔週投与についての投与説明書、隔週投与のためのカレンダー、隔週アラーム機能を有する電子アラートデイターまたはその組合せから選択される、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
HCVワクチンがヒト個体に少なくとも4回隔週投与されるHCV感染の治療および予防のためのHCVワクチンの製造のための少なくとも一つのHCV T細胞抗原とペプチド結合を含むポリカチオン性化合物の使用。
【請求項１９】
HCVワクチンが少なくとも6回隔週投与される、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
HCVワクチンが少なくとも8回隔週投与される、請求項１８記載の使用。
【請求項２１】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸およびその混合物からなる群から選択される、請求項１８〜２０のいずれか記載の使用。
【請求項２２】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が少なくとも4の鎖長のアミノ酸残基を有するペプチド鎖を含む、請求項１８〜２１のいずれか記載の使用。
【請求項２３】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が8より多く、特に20より多くのアミノ酸残基の範囲内で20%より多く、特に50%より多くの塩基性アミノ酸を含むポリペプチド、特にポリアルギニンもしくはポリリジン、ポリカチオン性抗菌性ペプチド、3〜7の疎水性アミノ酸のリンカーにより分離された少なくとも2のKLKモチーフを含むペプチド、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１８〜２１のいずれか記載の使用。
【請求項２４】
ペプチド結合を含むポリカチオン性化合物が20〜500のアミノ酸残基、特に30〜200の残基を含む、請求項１８〜２３のいずれか記載の使用。
【請求項２５】
HCV T細胞抗原が7〜50のアミノ酸残基、好ましくは8〜45のアミノ酸残基、特に8〜20のアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、各ペプチドが少なくとも一つのT細胞エピトープを含む、請求項１８〜２４のいずれか記載の使用。
【請求項２６】
HCV T細胞抗原が少なくとも一つのT細胞エピトープを含む少なくとも7、好ましくは少なくとも8、特に少なくとも9のアミノ酸残基を含む、以下：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、
GYKVLVLNPSVAAT、
AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、
DLMGYIP(A/L)VGAPL、
GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV、
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、
VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL、
AAWYELTPAETTVRLR、
GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK、
FTDNSSPPAVPQTFQV、
LEDRDRSELSPLLLSTTEW、
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD、
MSTNPKPQRKTKRNTNR、
LINTNGSWHINRTALNCNDSL、
TTILGIGTVLDQAET、
FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE、
ARLIVFPDLGVRVCEKMALY、
AFCSAMYVGDLCGSV、
GVLFGLAYFSMVGNW、
VVCCSMSYTWTGALITPC、
TRVPYFVRAQGLIRAおよび
TTLLFNILGGWVAAQ；
またはそのフラグメントからなる1以上の群から選択される、請求項１８〜２５のいずれか記載の使用。
【請求項２７】
HCVワクチンが少なくとも3、好ましくは少なくとも4、特に少なくとも5の異なるHCV T細胞抗原の混合物を含む、請求項１８〜２６のいずれか記載の使用。
【請求項２８】
HCVワクチンが投与用量あたり1〜20 mg、好ましくは3〜10 mg、特に4〜6 mgのHCV T細胞抗原を含む、請求項１８〜２７のいずれか記載の使用。
【請求項２９】
HCVワクチンが皮下または皮内、特に皮内投与される、請求項１８〜２８のいずれか記載の使用。
【請求項３０】
HCVワクチンが免疫応答修飾物質、好ましくはトール様レセプター（TLR）アゴニスト、特にトール様レセプター（TLR）7アゴニスト、特にTLR 7および8アゴニストまたはTLR 9アゴニストと併用投与される、請求項１８〜２９のいずれか記載の使用。
【請求項３１】
HCVワクチンが好ましくは局所適用製剤、特にクリームとして1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン（イミキモド）と併用投与される、請求項１８〜３０のいずれか記載の使用。
【請求項３２】
HCVワクチンが皮下または皮内、好ましくは皮内投与され、イミキモドが好ましくはHCVワクチンの投与の4〜24、特に10〜16時間後にクリーム、好ましくは5重量%クリームとして注射部位に直接的に適用される、請求項３１記載の使用。
【国際調査報告】
2009534428.tif 000011
2009534428.tif 000012
2009534428.tif 000013
2009534428.tif 000014