(57)【要約】【課題】ＷＴ１発現癌細胞を治療する方法、ＷＴ１発現癌細胞の発生率を減少させる方法、及びＷＴ１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導する組成物及び方法を提供する。【解決手段】本発明は、ＷＴ１ペプチド、並びに前記ＷＴ１ペプチドを含む組成物及びワクチンを提供する。本発明に係るＷＴ１ペプチドによって、（ａ）炎症サイトカインを生成し、且つ（ｂ）ＷＴ１を提示する細胞を溶解するＴ細胞が生じる。【選択図】図4
2009511637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＷＴ１ペプチドであって、
ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）のアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたＷＴ１ペプチドであって、
ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することを特徴とするペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載の単離されたＷＴ１ペプチドであって、
前記ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子であることを特徴とするペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載の単離されたＷＴ１ペプチドであって、
前記単離されたＷＴ１ペプチドは第２のＨＬＡ−ＤＲＢ分子と結合し、
請求項３に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ分子及び前記第２のＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子によってコードされることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
請求項２に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、他の単離されたＷＴ１ペプチドとを含む組成物であって、
前記他の単離されたＷＴ１ペプチドは、他のＨＬＡクラスＩＩ分子と結合することを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、他の単離されたＷＴ１ペプチドとを含む組成物であって、
前記他のＨＬＡクラスＩＩ分子は、請求項３に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ分子及び請求項４に記載の第２のＨＬＡ−ＤＲＢ分子とは異なる第３のＨＬＡ−ＤＲＢ分子であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、
前記他の単離されたＷＴ１ペプチドは、第４のＨＬＡ−ＤＲＢ分子と結合し、
請求項６に記載の第３のＨＬＡ−ＤＲＢ分子及び前記第４のＨＬＡＤＲＢ分子は、異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子によってコードされることを特徴とする組成物。
【請求項８】
. 
組成物であって、
請求項１に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、
前記ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ分子であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の組成物であって、
前記ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５乃至３８から選択された配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
ワクチンであって、
（ａ）請求項１に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、（ｂ）アジュバント又は担体とを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１２】
請求項１１に記載のワクチンであって、
前記アジュバントは、ＱＳ２１、フロインド不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ、ミョウバン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、Montanide ISA 51、又はＧＭ−ＳＦであることを特徴とするワクチン。
【請求項１３】
単離されたＷＴ１ペプチドであって、
ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）のアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離されたＷＴ１ペプチドであって、
ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することを特徴とするペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離されたＷＴ１ペプチドであって、
前記ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子であることを特徴とするペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離されたＷＴ１ペプチドであって、
前記単離されたＷＴ１ペプチドは第２のＨＬＡ−ＤＲＢ分子と結合し、
請求項１５に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ分子及び前記第２のＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子によってコードされることを特徴とするペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、他の単離されたＷＴ１ペプチドとを含む組成物であって、
前記他の単離されたＷＴ１ペプチドは、他のＨＬＡクラスＩＩ分子と結合することを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、他の単離されたＷＴ１ペプチドとを含む組成物であって、
前記他のＨＬＡクラスＩＩ分子は、請求項１５に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ分子及び請求項１６に記載の第２のＨＬＡ−ＤＲＢ分子とは異なる第３のＨＬＡ−ＤＲＢ分子であることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、
前記他の単離されたＷＴ１ペプチドは、第４のＨＬＡ−ＤＲＢ分子と結合し、
請求項１８に記載の第３のＨＬＡ−ＤＲＢ分子及び前記第４のＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子によってコードされることを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１７に記載の組成物であって、
前記他の単離されたＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１乃至３から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２１】
組成物であって、
請求項１３に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物であって、
前記ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ分子であることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の組成物であって、
前記ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５乃至３８から選択された配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２４】
ワクチンであって、
（ａ）請求項１３に記載の単離されたＷＴ１ペプチドと、（ｂ）アジュバント又は担体とを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２５】
請求項２４に記載のワクチンであって、
前記アジュバントは、ＱＳ２１、フロインド不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ、ミョウバン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、Montanide ISA 51、又はＧＭ−ＳＦであることを特徴とするワクチン。
【請求項２６】
ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療する方法であって、
請求項１１に記載のワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それよって、ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療することを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
対象において、ＷＴ１を発現する癌の発生率又は再発率を減少させる方法であって、
請求項１１に記載のワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それよって、対象において、ＷＴ１を発現する癌の発生率又は再発率を減少させることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項３２】
ＷＴ１を発現する癌細胞に特異的なＣＴＬの形成及び増殖を誘導する方法であって、
請求項１１に記載のワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それよって、ＷＴ１を発現する癌細胞に特異的なＣＴＬの形成及び増殖を誘導することを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療する方法であって、
請求項２４に記載のワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それよって、ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療することを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項３８】
対象において、ＷＴ１を発現する癌の発生率又は再発率を減少させる方法であって、
請求項２４に記載のワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それよって、対象において、ＷＴ１を発現する癌の発生率又は再発率を減少させることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項４１】
ＷＴ１を発現する癌細胞に特異的なＣＴＬの形成及び増殖を誘導する方法であって、
請求項２４に記載のワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それよって、ＷＴ１を発現する癌細胞に特異的なＣＴＬの形成及び増殖を誘導することを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４１に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項４４】
組成物であって、
（ａ）抗原提示細胞と、（ｂ）ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）とＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）とから選択されたペプチドとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の組成物であって、
ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する他のペプチドをさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項４６】
請求項４４に記載の組成物であって、
ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドをさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項４７】
請求項４６に記載の組成物であって、
前記ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ分子であることを特徴とする組成物。
【請求項４８】
請求項４６に記載の組成物であって、
前記ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５乃至３８から選択された配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４９】
請求項４４に記載の組成物であって、
前記抗原提示細胞は、前記細胞のＨＬＡクラスＩＩ分子で前記ペプチドを提示することを特徴とする組成物。
【請求項５０】
ワクチンであって
（ａ）請求項４４に記載の組成物と、（ｂ）アジュバント又は担体とを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項５１】
請求項５０に記載のワクチンであって、
前記アジュバントは、ＱＳ２１、フロインド不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ、ミョウバン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、Montanide ISA 51、又はＧＭ−ＳＦであることを特徴とするワクチン。
【請求項５２】
ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療する方法であって、
請求項４４に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含み、それよって、ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療することを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項５５】
対象において、ＷＴ１を発現する癌の発生率又は再発率を減少させる方法であって、
請求項４４に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含み、それよって、対象において、ＷＴ１を発現する癌の発生率又は再発率を減少させることを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項５８】
ＷＴ１を発現する癌細胞に特異的なＣＴＬの形成及び増殖を誘導する方法であって、
請求項４４に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含み、それよって、ＷＴ１を発現する癌細胞に特異的なＣＴＬの形成及び増殖を誘導することを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、白血病、線維形成性小円形細胞腫瘍、胃癌、結腸癌、肺癌、乳がん、胚細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、肉腫、又は肝細胞癌であることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法であって、
前記ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする方法。
【請求項６１】
対象において抗中皮腫免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）ＷＴ１タンパク質、（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片、（ｃ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子、又は（ｄ）ＷＴ１タンパク質の断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、対象において抗中皮腫免疫応答を誘導すること特徴とする方法。
【請求項６２】
中皮腫を有する対象を治療する方法であって、
（ａ）ＷＴ１タンパク質、（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片、（ｃ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子、又は（ｄ）ＷＴ１タンパク質の断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、中皮腫を有する対象を治療すること特徴とする方法。
【請求項６３】
対象において、中皮腫の発生率又は再発率を減少させる方法であって、
（ａ）ＷＴ１タンパク質、（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片、（ｃ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子、又は（ｄ）ＷＴ１タンパク質の断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、中皮腫の発生率又は再発率を減少させること特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＷＴ１ペプチド、並びにＷＴ１ペプチドを用いて、ＷＴ１発現癌細胞を治療する方法、ＷＴ１発現癌細胞の発生率を減少させる方法、及びＷＴ１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
新生児１００００人当たり１人に発生する小児腎芽細胞腫であるウィルムス腫瘍（Wilms tumor：ＷＴ）は、ここ数年間、緻密な臨床及び基礎研究の対象となってきた。この腫瘍は、胎児に発生し、通常は、出生後最初の５年間に検出される。この腫瘍は、一側性である場合もあれば、両側性である場合もある。ＷＴは、発生中の腎臓の凝縮した後腎間葉細胞が適切に分化しなかったときに発生する。ＷＴの病因にウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）の腫瘍抑制遺伝子が関わっていることから、遺伝子変化が腫瘍発生及び腫瘍形成に対して大きく影響することが示された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、ＷＴ１ペプチド、並びにＷＴ１ペプチドを用いて、ＷＴ１発現癌細胞を治療する方法、ＷＴ１発現細胞の発生率を減少させる方法、及びＷＴ１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０００４】
ある実施形態では、本発明は、ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（配列認識番号（以下、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：と呼ぶ）２）の配列を含むアミノ酸（amino acid：ＡＡ）配列を有する単離されたＷＴ１ペプチドを提供する。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２の配列から成る。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２の配列の一断片から成る。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０００５】
他の実施形態では、本発明は、ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）の配列を含むＡＡ配列を有する単離されたＷＴ１ペプチドを提供する。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４の配列から成る。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４の配列の一断片から成る。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０００６】
他の実施形態では、本発明は、（ａ）抗原提示細胞と、（ｂ）ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）及びＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）の内から選択されたペプチドとを含む組成物を提供する。
【０００７】
他の実施形態では、本発明は、ＷＴ１を発現する癌細胞を有する対象を治療する方法であって、本発明に係るＷＴ１ワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それによって、ＷＴ１を発現する癌細胞を有する対象を治療する方法を提供する。
【０００８】
他の実施形態では、本発明は、対象においてＷＴ１を発現する癌細胞の発生率又はその再発率を減少させる方法であって、本発明に係るＷＴ１ワクチンを前記対象に投与するステップを含み、それによって、対象においてＷＴ１を発現する癌細胞の発生率又はその再発率を減少させる方法を提供する。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は、対象において抗中皮腫免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質、（ｂ）ＷＴタンパク質の一断片、（ｃ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子、又は（ｄ）ＷＴ１タンパク質の一断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、対象において抗中皮腫免疫応答を誘起する方法を提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、中皮腫を有する対象を治療する方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質、（ｂ）ＷＴタンパク質の一断片、（ｃ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子、又は（ｄ）ＷＴ１タンパク質の一断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、中皮腫を有する対象を治療する方法を提供する。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、対象において中皮腫の発生率又はその再発率を減少させる方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質、（ｂ）ＷＴタンパク質の一断片、（ｃ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子、又は（ｄ）ＷＴ１タンパク質の一断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、対象において中皮腫の発生率又はその再発率を減少させる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ＷＴ１ペプチド、並びにＷＴ１ペプチドを用いて、ＷＴ１発現癌細胞を治療する方法、ＷＴ１発現細胞の発生率を減少させる方法、及びＷＴ１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１３】
本明細書に記載したように、本発明に係るペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する（実施例３及び４）。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）の配列を含むアミノ酸（ＡＡ）配列を有する単離されたＷＴ１ペプチドを提供する。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２の配列から成る。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２の配列の一断片から成る。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）の配列を含むＡＡ配列を有する単離されたＷＴ１ペプチドを提供する。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４の配列から成る。他の実施形態では、単離されたＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４の配列の一断片から成る。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の配列を含むＡＡ配列若しくは前記配列から成るＡＡ配列を有する、又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の一断片から成るＡＡ配列を有する単離されたＷＴ１ペプチドを提供する。他の実施形態では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３の配列を含むＡＡ配列若しくは前記配列から成るＡＡ配列を有する、又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３の一断片から成るＡＡ配列を有する単離されたＷＴ１ペプチドを提供する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００１７】
他の実施形態では、本発明に係る単離されたＷＴ１ペプチドは、改変されていない（例えば、その配列は、ＷＴ１タンパク質の一断片と一致し、インビトロで変異が導入されていない）。
【００１８】
他の実施形態では、本発明は、（ａ）抗原提示細胞と、（ｂ）ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）及びＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）の内から選択されたペプチドを含む組成物を提供する。他の実施形態では、前記組成物は、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する他のペプチドをさらに含む。他の実施形態では、前記組成物は、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドをさらに含む。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５乃至３８から選択される配列を含む。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５乃至３８からである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００１９】
本発明に係る方法及び組成物のＷＴ１タンパク質は、当該技術分野で公知の任意のＷＴ１タンパク質である。
【００２０】
本発明に係るペプチドが由来するＷＴ１分子は、他の実施形態では、下記の配列を有する。
ＭＧＳＤＶＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧＧＣＡＬＰＶＳＧＡＡＱＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＧＧＰＡＰＰＰＡＰＰＰＰＰＰＰＰＰＨＳＦＩＫＱＥＰＳＷＧＧＡＥＰＨＥＥＱＣＬＳＡＦＴＶＨＦＳＧＱＦＴＧＴＡＧＡＣＲＹＧＰＦＧＰＰＰＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳＱＰＡＩＲＮＱＧＹＳＴＶＴＦＤＧＴＰＳＹＧＨＴＰＳＨＨＡＡＱＦＰＮＨＳＦＫＨＥＤＰＭＧＱＱＧＳＬＧＥＱＱＹＳＶＰＰＰＶＹＧＣＨＴＰＴＤＳＣＴＧＳＱＡＬＬＬＲＴＰＹＳＳＤＮＬＹＱＭＴＳＱＬＥＣＭＴＷＮＱＭＮＬＧＡＴＬＫＧＶＡＡＧＳＳＳＳＶＫＷＴＥＧＱＳＮＨＳＴＧＹＥＳＤＮＨＴＴＰＩＬＣＧＡＱＹＲＩＨＴＨＧＶＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＰＧＶＡＰＴＬＶＲＳＡＳＥＴＳＥＫＲＰＦＭＣＡＹＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧＥＫＰＹＱＣＤＦＫＤＣＥＲＲＦＳＲＳＤＱＬＫＲＩＩＱＲＲＨＴＧＶＫＰＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨＴＧＫＴＳＥＫＰＦＳＣＲＷＰＳＣＱＫＫＦＡＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬＱＬＡＬ（GenBankアクセス番号：ＡＹ２４５１０５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５０）
【００２１】
他の実施形態では、ＷＴ１分子は、下記の配列を有する。
ＡＡＥＡＳＡＢＲＬＱＧＲＲＳＲＧＡＳＧＳＥＰＱＱＭＧＳＤＶＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧＧＣＡＬＰＶＳＧＡＡＱＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＧＧＰＡＰＰＰＡＰＰＰＰＰＰＰＰＰＨＳＦＩＫＱＥＰＳＷＧＧＡＥＰＨＥＥＱＣＬＳＡＦＴＶＨＦＳＧＱＦＴＧＴＡＧＡＣＲＹＧＰＦＧＰＰＰＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳＱＰＡＰＪＱＧＹＳＴＶＴＦＤＧＴＰＳＹＧＰＳＨＨＡＡＱＦＰＮＨＳＦＫＨＥＤＰＭＧＱＱＧＳＬＧＥＱＱＹＳＶＰＰＰＶＹＧＣＨＴＰＴＤＳＣＴＧＳＱＡＬＬＬＲＴＰＹＳＳＤＮＬＹＱＭＴＳＱＬＥＣＭＴＷＮＱＭＮＬＧＡＴＬＫＧＨＳＴＧＹＥＳＤＮＨＴＴＰＩＬＣＧＡＱＹＲＩＨＴＨＧＶＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬＱＬＡＬ（GenBankアクセス番号：ＮＭ＿０００３７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５１）
【００２２】
他の実施形態では、ＷＴ１分子は、下記の配列を有する。
ＭＱＤＰＡＳＴＣＶＰＥＰＡＳＱＨＴＬＲＳＧＰＧＣＬＱＱＰＥＱＱＧＶＲＤＰＧＧＩＷＡＧＡＡＥＡＳＡＥＲＬＱＧＰＪＳＲＧＡＳＧＳＥＰＱＱＭＧＳＤＶＲＤＬＮＬＰＡＳＬＧＧＧＧＧＣＡＬＰＶＳＧＡＡＱＷＪＶＬＤＦＹＰＧＡＳＡＹＧＳＬＧＧＰＡＰＰＰＡＰＰＰＰＰＰＰＰＰＨＳＦＩＫＱＥＰＳＷＧＧＡＥＰＨＥＥＱＣＬＳＡＦＴＶＨＦＳＧＱＦＴＧＴＡＧＡＣＲＹＧＰＦＧＰＰＰＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＰＳＣＬＥＳＱＰＡＩＲＮＱＧＹＳＴＶＴＦＤＧＴＰＳＹＧＨＴＰＳＨＨＪＱＦＰＮＨＳＦＹＪＴＥＤＰＭＧＱＱＧＳＬＧＥＱＱＹＳＶＰＰＰＶＹＧＣＨＴＰＴＤＳＣＴＧＳＱＡＬＬＬＲＴＰＹＳＳＤＮＬＹＱＭＴＳＱＬＥＣＭＴＱＭＮＬＧＡＴＬＫＧＶＡＡＧＳＳＳＳＶＫＷＴＥＧＱＳＮＨＳＴＧＹＥＳＤＮＨＴＴＰＩＬＣＧＡＱＹＲＩＨＴＨＧＶＦＲＧＩＱＤＶＲＲＶＳＲＳＤＱＬＫＲＨＱＲＲＨＴＧＶＫＰＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＦＳＣＲＷＰＳＣＱＫＫＪＪＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬＱＬＡＬ（GenBankアクセス番号：ＮＰ＿０７７７４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５２）
【００２３】
他の実施形態では、ＷＴ１分子は、下記の配列を有する。
ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＥＧＲＨＭＲＲＶＰＧＶＡＰＴＬＶＲＳＡＳＥＴＳＥＫＲＰＦＭＣＡＹＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧＥＫＰＹＱＣＤＦＫＤＣＥＲＲＦＦＲＳＤＱＬＫＲＨＱＲＲＨＴＧＶＫＰＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＦＳＣＲＷＰＳＣＱＫＫＦＡＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬＱＬＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５３）
【００２４】
他の実施形態では、ＷＴ１タンパク質は、GenBankアクセス番号：ＮＭ＿０２４４２６に記載の配列を有する。他の実施形態では、ＷＴ１タンパク質は、GenBankアクセス番号：ＮＭ＿０２４４２５、ＮＭ＿０２４４２４、ＮＭ＿０００３７８、Ｓ９５５３０、Ｄｌ３６２４、Ｄ１２４９６、Ｄ１２４９７、又はＸ７７５４９の内の１つに記載されている配列を有する又は含む。他の実施形態では、ＷＴ１タンパク質は、当該技術分野で公知の他の任意のＷＴ１配列を有する。
【００２５】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態における「ペプチド」は、ＡＡサブユニットがペプチド結合によって連結した化合物を意味する。他の実施形態では、ペプチドは、ＡＡアナログを含む。他の実施形態では、ペプチドは、ペプチド模倣物質（peptidomimetric）を含む。本発明に係る方法及び組成物のペプチドに含まれ得る様々なＡＡアナログ及びペプチド模倣物質は、下記に列挙した。前記サブユニットは、他の実施形態では、ペプチド結合によって連結している。他の実施形態では、前記サブユニットは、他の種類の結合（エステル結合、エーテル結合など）によって連結している。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００２６】
本発明に係る未改変及びヘテロクリティック（heteroclitic）ＷＴ１ペプチド（上記及び下記記載のもの）は、以下まとめて「ＷＴ１ペプチド」と呼ぶことにする。「ＷＴ１ペプチド」に関して以下に列挙する各実施例は、本発明に係る未改変ＷＴ１ペプチド、並びにＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩヘテロクリティックペプチドに適用される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００２７】
他の実施形態では、本発明に係るＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＡ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＰＡ１分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＰＢ１分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＭＡ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＭＢ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＯＡ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＯＢ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、当該技術分野で公知の他の任意のＨＬＡクラスＩＩ分子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００２８】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ分子に対して親和力を示すように設計されている。他の実施形態では、前記親和力は、本明細書に記載したように高親和力である。
【００２９】
他の実施形態で主要組織適合複合体（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）として知られるＨＬＡ分子は、ペプチドと結合してそれらを免疫細胞に提示する。したがって、他の実施形態では、ペプチドの免疫原性は、部分的には、ＨＬＡ分子に対する親和力によって決定される。ＨＬＡクラスＩ分子は、ＣＤ８分子（一般的には、細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）に存在する）と相互作用する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＣＤ４分子（一般的には、ヘルパーＴリンパ球に存在する）と相互作用する。
【００３０】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、免疫原性を有する。他の実施形態では、「免疫原性」は、免疫応答を促進若しくは誘発する能力、又は免疫応答に加わる能力を意味する。他の実施形態では、誘発される免疫応答は、細胞性免疫応答である。他の実施形態では、前記免疫応答は、細胞性応答及び体液性応答の組み合わせである。
【００３１】
他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子−ペプチド複合体と結合すると、活性化し、増殖し、且つそのペプチドを含むタンパク質を発現する細胞を溶解するように誘導される。Ｔ細胞は、通常、最初は「プロフェッショナルな」抗原提示細胞（antigen presenting cell：ＡＰＣ、例えば樹枝細胞、単球、及びマクロファージ）によって活性化される。ＡＰＣは、Ｔ細胞の活性化（アネルギー又はアポトーシスとは対照的）を促進する副刺激分子を提示する。他の実施形態では、前記応答は、本明細書に記載したようにヘテロクリティックであるため、ＣＴＬは、本発明に係るペプチドと相同的なＡＡ配列を有するタンパク質を発現する腫瘍細胞、又は最初にＴ細胞を刺激するのに使用されたペプチドと異なるペプチドを発現する腫瘍細胞を溶解するようにする。
【００３２】
他の実施形態では、Ｔ細胞は、本発明に係るペプチドと接触すると、エフェクター及び／又は記憶Ｔ細胞に分化するようになる。次に、エフェクター又はＴ細胞が同じペプチドと接触すると、又は他の実施形態において本発明に係るペプチドと関連するペプチドと接触すると、さらに速い及び強力な免疫応答が誘導される。このような応答は、他の実施形態では、ペプチドに晒されたＴ細胞集団の増殖の程度を測定することによって評価することができる。他の実施形態では、そのような応答は、以下に列挙する方法の任意のもので測定することができる。
【００３３】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のペプチドは、高い親和力でＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、本明細書で記載したＨＬＡクラスＩＩ分子の任意のものである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００３４】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のペプチドの誘導体は、高親和力でＨＬＡクラスＩ分子と結合する。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、本明細書に列挙したＨＬＡクラスＩ分子の任意のものである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００３５】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のペプチドが高親和力でＨＬＡクラスＩＩ分子と結合するのに対して、本来のペプチドに由来するペプチドは、顕著な親和力でＨＬＡクラスＩ分子と結合する。
【００３６】
他の実施形態では、「親和力」は、ＭＨＣタンパク質への標準ペプチドの結合を５０％阻害するのに必要なペプチドの濃度を意味する。他の実施形態では、「高親和力」は、標準ペプチドの結合を５０％阻害するのに約５００ナノモラー（ｎＭ）以下の濃度のペプチドが必要である親和力を意味する。他の実施形態では、約４００ｎＭ以下のペプチドが必要である。他の実施形態では、結合親和力は、３００ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、２００ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、１５０ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、１００ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、８０ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、６０ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、４０ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、３０ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、２０ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、１５ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、１０ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、８ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、６ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、４ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、３ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、２ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、１．５ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、１ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、０．８ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、０．６ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、０．５ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、０．４ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、０．３ｎＭである。他の実施形態では、結合親和力は、０．３ｎＭ未満である。
【００３７】
他の実施形態では、「親和力」は、ＭＨＣ分子への結合力の測定値を意味する。他の実施形態では、親和力は、競合的結合親和力を測定する、当該技術分野で公知の方法によって測定される。他の実施形態では、当該技術分野で相対的な結合親和力を測定する公知の方法によって、測定される。他の実施形態では、前記方法は、競合的結合アッセイである。他の実施形態では、前記方法は、ラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay：ＲＩＡ）である。他の実施形態では、前記方法は、BiaCore分析である。他の実施形態では、前記方法は、当該技術分野で公知の他の任意の方法である。他の実施形態では、前記方法は、公知の親和力を有する標準タンパク質のＩＣ５０値に対するＩＣ５０値を算出する。
【００３８】
それぞれの親和力及び親和力の測定方法は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００３９】
他の実施形態では、「高親和力」は、０．５〜５００ｎＭのＩＣ５０値を意味する。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、１〜３００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、１．５〜２００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、２〜１００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、３〜１００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、４〜１００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、６〜１００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、１０〜１００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、３０〜１００ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、３〜８０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、４〜６０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、５〜５０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、６〜５０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、８〜５０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、１０〜５０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、２０〜５０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、６〜４０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、８〜３０ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、１０〜２５ｎＭである。他の実施形態では、ＩＣ５０値は、１５〜２５ｎＭである。それぞれの親和力及び親和力の範囲は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４０】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のペプチドは、ＨＬＡ分子のスーパーファミリーに結合する。ＨＬＡ分子のスーパーファミリーは、非常に類似する又は同一の結合モチーフを有する。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、ＨＬＡクラスＩスーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーファミリーである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４１】
「ＨＬＡ結合ペプチド」、「ＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチド」、及び「ＨＬＡクラスＩＩ分子結合ペプチド」という用語は、他の実施形態では、測定可能な親和力でＨＬＡ分子と結合するペプチドを意味する。他の実施形態では、前記用語は、高親和力でＨＬＡ分子と結合するペプチドを意味する。他の実施形態では、前記用語は、Ｔ前駆細胞を活性化するのに十分な親和力でＨＬＡ分子に結合するペプチドを意味する。他の実施形態では、前記用語は、Ｔ細胞が認識するのに十分な親和力でＨＬＡ分子と結合するペプチドを意味する。ＨＬＡ分子は、他の実施形態では、本明細書で列挙したＨＬＡ分子の任意のものである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４２】
「ヘテロクリティック・ペプチド」は、他の実施形態では、そのヘテロクリティック・ペプチドが由来する本来のペプチド（例えば、アンカー残基に変異を含まないペプチド）を認識する免疫応答を発生させるペプチドを意味する。他の実施形態では、「本来のペプチド」は、本発明に係るペプチドを意味する。例えば、ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）は、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）の１番目の残基をチロシンに変異することによって作成した（実施例）。他の実施形態では、「ヘテロクリティック・ペプチド」は、そのワクチン投与によって、ヘテロクリティック・ペプチドが由来する本来のペプチドを認識し、且つ本来のペプチドのワクチン投与によって発生する免疫応答よりも大きい免疫応答を発生させるペプチドを意味する。他の実施形態では、「ヘテロクリティック」免疫応答は、改良されたペプチドが由来する本来のペプチド（例えば、アンカー残基に変異を含まないペプチド）を認識する免疫応答を意味する。他の実施形態では、「ヘテロクリティック」免疫応答は、ヘテロクリティック・ペプチドのワクチンの投与によってヘテロクリティック・ペプチドが由来する本来のペプチドを認識し、且つその強度が本来のペプチドのワクチン投与によって発生する免疫応答よりも大きい免疫応答を意味する。他の実施形態では、ヘテロクリティック・ペプチドのワクチンの投与によって発生する免疫応答は、本来のペプチドのワクチン投与によって発生する免疫応答に実質的に等しい。他の実施形態では、ヘテロクリティック・ペプチドのワクチンの投与によって発生する免疫応答は、本来のペプチドのワクチン投与によって発生する免疫応答よりも小さい。他の実施形態では、本発明に係るヘテロクリティック・ペプチドは、ＨＬＡクラスＩへテロクリティック・ペプチドである。ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ残基を同定する方法、残基を変異することによってＨＬＡ結合を向上する方法は、当該技術分野で公知であり、下記に列挙した。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４３】
他の実施形態は、本発明に係るヘテロクリティック・ペプチドが誘導する免疫応答の程度は、そのヘテロクリティック・ペプチドが由来するＷＴ１ペプチド（「天然ペプチド」）による免疫応答と比較して少なくとも２倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して３倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して５倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して７倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して１０倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して１５倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して２０倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して３０倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して５０倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して１００倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して１５０倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して２００倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して３００倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して５００倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して１０００倍である。他の実施形態では、前記程度は、天然ペプチドによる免疫応答と比較して１０００倍以上である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る単離されたＷＴ１ペプチドから由来するＨＬＡクラスＩＩヘテロクリチック・ペプチドを提供する。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドに由来するヘテロクリティック・ペプチドの作成は、ＨＬＡクラスＩＩ分子へのペプチドの結合を高める変異を導入するステップを含む。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドに由来するヘテロクリティック・ペプチドの作成は、ＨＬＡクラスＩ分子へのペプチドの結合を高める変異を導入するステップを含む。他の実施形態では、変異は、ＨＬＡクラスＩＩアンカー残基に存在する。他の実施形態では、本発明に係るヘテロクリティック・クラスＩＩペプチドは、ＨＬＡクラスＩヘテロクリティック・ペプチドの同定及び検査に使用される方法と同じ方法（本明細書で例示されている）で同定及び検査される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４５】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドにおけるＨＬＡクラスＩＩ分子結合部位は、ＨＬＡクラスＩＩモチーフアンカー残基に変異を導入することで形成される又は向上する。他の実施形態では、改変されるアンカー残基は、Ｐ１部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ２部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ６部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ９部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ６、及びＰ９部位から選択される。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ３部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ４部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ５部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ６部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ８部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ１０部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ１１部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ１２部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ１３部位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、ＨＬＡクラスＩＩ分子結合ペプチドにおける公知の他の任意のアンカー残基である。他の実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ６、及びＰ９以外の残基は、第２のアンカー残基として機能する。したがって、それらに変異を導入すると、ＨＬＡクラスＩＩ分子結合を向上することができる。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４６】
他の実施形態では、ヘテロクリティック・ペプチドは、アンカー・モチーフを形成する変異を導入することによって作成される。「アンカー・モチーフ」又は「アンカー残基」は、他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合する配列における特定の部位の好ましい１つの残基又は残基のセットを意味する。他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合する配列は、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する配列である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合する配列は、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する配列である。他の実施形態では、アンカー・モチーフに相当する部位は、ＨＬＡ分子に結合する際に重要な役割を担う部位である。他の実施形態では、アンカー残基は、第１のアンカー・モチーフである。他の実施形態では、アンカー残基は、第２のアンカー・モチーフである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４７】
ＭＨＣクラスＩＩのエピトープを予測する方法は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（(Meister GE, Roberts CG et al., Vaccine 1995 13: 581-91）を使用することで予測される。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（De Groot AS, Jesdale BM et al., AIDS Res Hum Retroviruses 1997 13: 529-3 1）を使用することで予測される。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、予測手法（Predict Method）（Yu K, Petrovsky Net al., Mol Med. 2002 8: 137- 48）を使用することで予測される。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測アルゴリズム（実施例）を使用することで予測される。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、Ｒａｎｋｐｅｐを使用することで予測される。他の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、当該技術分野で公知の他の任意の方法を使用することで予測される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４８】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチド）に関しては、改変されるアンカー残基は、Ｐ１位（例えば、ＣＩＩ（２５９〜２７３）ペプチド（ＨＬＡ−ＤＲの一部のアンカー残基を明らかにするために使用された非関連ペプチド）のＦ２６３に相当する位置）に存在する。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ２位（例えば、ＣＩＩ（２５９〜２７３）ペプチドのＫ２６４に相当する位置）に存在する。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ６位に存在する。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ９位に存在する。他の実施形態では、前記アンカー残基は、Ｐ３位、Ｐ４位、Ｐ５位、Ｐ６位、Ｐ８位、Ｐ１０位、Ｐ１１位、Ｐ１２位、又はＰ１３位に存在する。他の実施形態では、アンカー残基は、ＨＬＡクラスＩＩ分子結合ペプチドの当該技術分野で公知の他のアンカー残基である。他の実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ６、及びＰ９以外の残基は、第２のアンカー残基として機能する。したがって、それらに変異を導入すると、ＨＬＡクラスＩＩ分子との結合を向上することができる。他の実施形態では、上記の残基の任意の組み合わせに変異が導入される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００４９】
他の実施形態では、本発明に係るＷＴ１ペプチドは、２つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、３つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、４つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、５つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、６つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、６つ以上の異なるＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。
【００５０】
他の実施形態では、本発明に係るＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、所定の１つのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子座にある２つ以上の異なる対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、１つの遺伝子座にある３つの異なる対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、１つの遺伝子座にある４つの異なる対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、１つの遺伝子座にある５つの異なる対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、１つの遺伝子座にある６つの異なる対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、１つの遺伝子座にある６つ以上の異なる対立遺伝子にコードされる。
【００５１】
他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、２つの異なる遺伝子座にあるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、２つ以上の異なる遺伝子座にあるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、３つの異なる遺伝子座にあるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、３つ以上の異なる遺伝子座にあるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、４つの異なる遺伝子座にあるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、４つ以上の異なる遺伝子座にあるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子によってコードされる。他の実施形態では、前記遺伝子座は、ＨＬＡ−ＤＲＢの遺伝子座から選択される。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＡ結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱＡ１結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱＢ１結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰＡ１結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰＢ１結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭＡ結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭＢ結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＯＡ結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＯＢ結合ペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、当該技術分野で公知の他の任意のＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００５２】
他の実施形態では、本発明に係るＷＴ１ペプチドは、２つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、３つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、４つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、５つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、６つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、６つ以上の異なるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。
【００５３】
他の実施形態では、本発明に係るＷＴ１ペプチドは、２つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、３つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、４つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、５つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、６つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされる。他の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、６つ以上の異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされる。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００５４】
他の実施形態では、本発明に係るＷＴ１ペプチドは、ＤＲＢ１０１、ＤＲＢ３０１、ＤＲＢ４０１，ＤＲＢ７０１，ＤＲＢ１１０１、及びＤＲＢ１５０１から選択される２つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドは、ＤＲＢ１０１、ＤＲＢ３０１、ＤＲＢ４０１，ＤＲＢ７０１，ＤＲＢ１１０１、及びＤＲＢ１５０１から選択される３つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドは、ＤＲＢ１０１、ＤＲＢ３０１、ＤＲＢ４０１，ＤＲＢ７０１，ＤＲＢ１１０１、及びＤＲＢ１５０１から選択される４つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドは、ＤＲＢ１０１、ＤＲＢ３０１、ＤＲＢ４０１，ＤＲＢ７０１，ＤＲＢ１１０１、及びＤＲＢ１５０１から選択される５つの異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドは、ＤＲＢ１０１、ＤＲＢ３０１、ＤＲＢ４０１，ＤＲＢ７０１，ＤＲＢ１１０１、及びＤＲＢ１５０１のそれぞれのＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされるＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。各可能な形態は、本発明のことなる実施形態に相当する。
【００５５】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る２つの異なるＷＴ１ペプチドを含む組成物を提供する。他の実施形態では、２つの異なるＷＴ１ペプチドは、改変されていない。他の実施形態では、一方のＷＴ１ペプチドは改変されておらず、他方のＷＴ１ペプチドはヘテロクリティックである。他の実施形態では、両方のＷＴ１ペプチドは、ヘテロクリティックである。
【００５６】
他の実施形態では、前記組成物は、本発明に係る３つの異なるＷＴ１ペプチドを含む。他の実施形態では、前記組成物は、本発明に係る４つの異なるＷＴ１ペプチドを含む。他の実施形態では、前記組成物は、本発明に係る５つの異なるＷＴ１ペプチドを含む。他の実施形態では、前記組成物は、本発明に係る５つ以上の異なるＷＴ１ペプチドを含む。
【００５７】
他の実施形態では、前記組成物における２つのＷＴ１ペプチドは、改変されていない。他の実施形態では、前記組成物における２つのＷＴ１ペプチドは、ヘテロクリティックである。他の実施形態では、前記組成物における２つのＷＴ１ペプチドは、改変されておらず、他の２つのＷＴ１ペプチドは、ヘテロクリティックである。他の実施形態では、前記組成物における２つ以上のＷＴ１ペプチドは、改変されていない。他の実施形態では、前記組成物における２つ以上のＷＴ１ペプチドは、ヘテロクリティックである。他の実施形態では、前記組成物における２つ以上のＷＴ１ペプチドは、改変されておらず、他の２つ以上のＷＴ１ペプチドは、ヘテロクリティックである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００５８】
他の実施形態では、本発明に係る組成物における別のＷＴ１ペプチドの１つは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３に記載の配列のセットから選択された配列を有する。他の実施形態では、前記別のＷＴ１ペプチドの２つは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３に記載の配列のセットから選択された配列を有する。他の実施形態では、前記別のＷＴ１ペプチドの３つは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３に記載の配列のセットから選択された配列を有する。
【００５９】
他の実施形態では、当該技術分野で公知の他の任意の免疫原性ＷＴ１ペプチドが、別のＷＴ１ペプチドとして使用される。他の実施形態では、当該技術分野で公知の免疫原性ＷＴ１ペプチドの任意の組み合わせが使用される。
【００６０】
それぞれの別のＷＴ１ペプチド、及びそれらの組み合わせは、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００６１】
他の実施形態では、本発明に係る組成物は、本発明に係る単離された同じＷＴ１ペプチドから由来する２つのＨＬＡクラスＩＩヘテロクリティック・ペプチドを含む。他の実施形態では、２つのＨＬＡクラスＩＩヘテロクリティック・ペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する異なるアンカー残基に変異を有する。他の実施形態では、２つのＨＬＡクラスＩＩヘテロクリティック・ペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する同じアンカー残基に異なる変異を有する。他の実施形態では、２つのＨＬＡクラスＩＩヘテロクリティック・ペプチドは、本発明に係る単離された異なるＷＴ１ペプチドから由来する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００６２】
他の実施形態では、本発明に係る２つのＷＴ１ペプチド、又は本発明に係る２つのＨＬＡクラスＩＩヘテロクリティック・ペプチドに相当するＷＴ１ペプチドは、互いに重複する。他の実施形態では、前記ペプチドの重複部分は、少なくとも７アミノ酸（ＡＡ）である。他の実施形態では、前記重複部分は、８ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、９ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１０ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１１ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１２ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１３ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１４ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１５ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１６ＡＡである。他の実施形態では、前記重複部分は、１６以上のＡＡである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００６３】
他の実施形態では、本発明に係る組成物におけるペプチドは、２つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、３つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、４つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、５つの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、５つ以上の異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。他の実施形態では、前記組成物におけるペプチドは、同じＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。
【００６４】
他の実施形態では、本発明に係る組成物におけるそれぞれのＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合する。他の実施形態は、それぞれのＷＴ１ペプチドは、異なるＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合する。他の実施形態は、前記組成物におけるＷＴ１ペプチドは、同じＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合する。他の実施形態では、２つのＷＴ１ペプチドは、重複する異なるＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合する。他の実施形態では、２つ以上のＷＴ１ペプチドが同じＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合するのに対して、別のＷＴ１ペプチドは、異なるＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合する。他の実施形態では、２つ以上のＷＴ１ペプチドが重複するＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合するのに対して、別のＷＴ１ペプチドは、異なるＨＬＡクラスＩＩ分子セットに結合する。
【００６５】
他の実施形態では、本発明に係る組成物における２つ以上のＷＴ１ペプチドのそれぞれは、１つ以上のＨＬＡ−ＤＲＢ分子に結合する。他の実施形態では、組成物におけるペプチドが結合する４つ以上のＨＬＡ−ＤＲＢは、互いに異なる。他の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子は、異なるＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子にコードされている。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００６６】
他の実施形態では、本発明に係る組成物におけるＷＴ１ペプチドが結合する２つ以上のＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子である。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合する３つ以上のＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子である。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、本明細書に記載の任意のＨＬＡクラスＩＩ分子であり得る。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、所定の１つの遺伝子座にある２つ以上の異なるＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子にコードされている。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩＩ分子は、２つ以上の異なる遺伝子座にあるＨＬＡクラスＩＩ遺伝子にコードされている。
【００６７】
上記の各組成物は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００６８】
他の実施形態では、「ＨＬＡクラスＩＩ分子セット」は、特定の遺伝子座にある異なる対立遺伝子にコードされた複数のＨＬＡクラスＩＩ分子を意味する。他の実施形態では、この用語は、特定の結合特異性を有する複数のＨＬＡクラスＩＩ分子を意味する。他の実施形態では、この用語は、特定のペプチド共通配列を有する複数のＨＬＡクラスＩＩ分子を意味する。他の実施形態では、この用語は、複数のＨＬＡクラスＩＩ分子のスーパーファミリーを意味する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００６９】
他の実施形態では、本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する本発明に係る未改変のＷＴ１ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する第２のＷＴ１ペプチドとを含む組成物を提供する。他の実施形態では、前記組成物は、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドに加えて、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する１つ以上の本発明に係るＷＴ１ペプチドを含む。他の実施形態では、前記組成物は、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドに加えて、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する１つ以上のＷＴ１ペプチドを含む。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００７０】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５〜３８から選択された配列を含む。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドのＡＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５〜３８から選択されたものである。各可能な実施形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００７１】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子結合ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩ分子は、任意のＨＬＡ−Ａ遺伝子にコードされている。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、任意のＨＬＡ−Ｂ遺伝子にコードされている。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、任意のＨＬＡ−Ｃ遺伝子にコードされている。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−０２０１分子である。他の実施形態では、前記分子は、ＨＬＡ  Ａ１である。他の実施形態では、前記分子は、ＨＬＡ  Ａ３．２、ＨＬＡ  Ａ１１、ＨＬＡ  Ａ２４、ＨＬＡ  Ｂ７、ＨＬＡ  Ｂ８、ＨＬＡ  Ｂ２７、又はＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  
Ａ３、ＨＬＡ  Ａ４、ＨＬＡ  Ａ５、若しくはＨＬＡ  Ｂ８、又はＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２．１、若しくはＨＬＡ  Ａ３．２である。他の実施形態では、ＨＬＡＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、又は−ＤＲの任意のＨＬＡ遺伝子にコードされている。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００７２】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のＨＬＡクラスＩ分子結合ＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡクラスＩ分子のスーパーファミリーに結合する。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ａ２スーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ａ３スーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ａ２４スーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ｂ７スーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ｂ２７スーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ｂ４４スーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ｃ１スーパーファミリーである。他の実施形態では、前記スーパーファミリーは、Ｃ４スーパーファミリーである。他の実施形態では前記スーパーファミリーは、当該技術分野で公知の他の任意のスーパーファミリーである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−Ａ０２０１である。
【００７３】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡクラス１ヘテロクリティックペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドは、下記で説明するように、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するアンカー残基に変異を有する。ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＨＬＡ−Ａ０３０１との結合が増大すると予測されるヘテロクリティック・ペプチドを作成するために、本明細書に記載したように、ＷＴ１由来のペプチドのＨＬＡ分子に結合するアンカー残基を改変した。結合が増大すると予測されるペプチドは、実際にＨＬＡクラスＩ分子との結合が増大し、且つ免疫原性が高まることを示した。
【００７４】
他の実施形態では、ＭＨＣとの結合を高める変異は、ＨＬＡクラス１ヘテロクリティック・ペプチドの１位の残基に導入される。他の実施形態では、前記残基は、チロシンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、グリシンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、スレオニンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、フェニルアラニンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、当該技術分野で公知の他の任意の残基に変換される。他の実施形態では、１位の残基を置換（例えば、チロシンへ）すると、２位のアンカー残基の結合が安定化する。
【００７５】
他の実施形態では、変異は、ＨＬＡクラスＩヘテロクリティックペプチドの２位の残基に導入される。他の実施形態では、前記残基は、ロイシンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、バリンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、イソロイシンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、メチオニンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、当該技術分野で公知の他の任意の残基に変換される。
【００７６】
他の実施形態では、変異は、ＨＬＡクラスＩヘテロクリティックペプチドの６位の残基に導入される。他の実施形態では、前記残基は、バリンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、システインに変換される。他の実施形態では、前記残基は、グルタミンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、ヒスチジンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、当該技術分野で公知の他の任意の残基に変換される。
【００７７】
他の実施形態では、変異は、ＨＬＡクラスＩヘテロクリティックペプチドの９位の残基に導入される。他の実施形態では、前記変異により、前記ペプチドのＣ末端の残基が変換される。他の実施形態では、前記残基は、バリンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、スレオニンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、イソロイシンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、ロイシンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、アラニンに変換される。他の実施形態では、前記残基は、システインに変換される。他の実施形態では、当該技術分野で公知の他の任意の残基に変換される。
【００７８】
他の実施形態では、点変異は、第１のアンカー残基に存在する。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する第１のアンカー残基は、２位及び９位にある。他の実施形態では、点変異は、第２のアンカー残基にある。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する第２のアンカー残基は、１位及び８位にある。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する第２のアンカー残基は、１位、３位、６位、７位、及び８位にある。他の実施形態では、点変異は、４位、５位、及び８位から選択された位置にある。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００７９】
他の実施形態では、点変異は、ＨＬＡクラスＩに結合するモチーフの１位、２位、８位、及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。他の実施形態では、点変異は、１位、３位、６位、及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。他の実施形態では、点変異は、１位、２位、６位、及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。他の実施形態では、点変異は、１位、６位、及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。他の実施形態では、点変異は、１位、２位、及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。他の実施形態では、点変異は、１位、３位、及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。他の実施形態では、点変異は、２位及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。他の実施形態では、点変異は、６位及び９位から選択された位置にある１つ以上の残基に存在する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する
【００８０】
それぞれの上記のアンカー残基及び置換は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００８１】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４〜２６、２８〜３０、３２〜３４、及び３６〜３８に記載の配列から選択された配列を含む。  他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４〜２６、２８〜３０、３２〜３４、及び３６〜３８に記載の配列から選択された配列を有する。
【００８２】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドの長さは、９〜１３ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、８〜１３ＡＡである。他の実施形態では、前記ペプチドは、本発明に係るペプチドに関して本明細書に記載した任意の長さを有する。
【００８３】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドの長さは、９ＡＡである。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するＷＴ１ペプチドの長さは、１０ＡＡである。本明細書に記載したように、９〜１０ＡＡの天然及びヘテロクリティック・ペプチドは、ＨＬＡクラスＩ分子に実質的に結合し、サイトカイン分泌及びＣＴＬによる細胞溶解を引き起こす。
【００８４】
他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子結合ＷＴ１ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ３分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ１１分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｂ８分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−０２０１分子である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、当該技術分野で公知の他の任意のＨＬＡクラスＩ分子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００８５】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のＷＴ１ペプチドの長さは、８〜３０ＡＡである。他の実施形態では、前記ペプチドの長さは、９〜１１ＡＡである。他の実施形態では、前記ペプチドの長さは、７〜２５ＡＡである、又は他の実施形態では８〜１１ＡＡである、又は他の実施形態では８〜１５ＡＡである、又は他の実施形態では９〜２０ＡＡである、又は他の実施形態では９〜１８ＡＡである、又は他の実施形態では９〜１５ＡＡである、又は他の実施形態では８〜１２ＡＡである、又は他の実施形態では９〜１１である。他の実施形態では、前記ペプチドの長さは、８ＡＡである、又は他の実施形態では９ＡＡである、又は他の実施形態では１０ＡＡである、又は他の実施形態では１２ＡＡである、又は他の実施形態では２５ＡＡである、又は他の実施形態ではそれらの間の任意の長さである。他の実施形態では、前記ペプチドの長さは、さらに長く、例えば５０ＡＡ又は１００ＡＡ以上である。この実施形態では、細胞は、長さが７〜２５ＡＡになるようにペプチドを処理する。この実施形態では、細胞は、長さが９〜１１ＡＡになるようにペプチドを処理する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００８６】
他の実施形態では、前記ペプチドの長さは、１５〜２３ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２４ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２５ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２６ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２７ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１５〜２８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜３０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２９ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２６ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２４ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２２ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４〜２０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１６〜３０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１６〜２８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１６〜２６ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１６〜２４ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１６〜２２ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１８〜３０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１８〜２８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１８〜２６ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１８〜２４ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１８〜２２ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１８〜２０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２０〜３０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２０〜２８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２０〜２６ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２０〜２４ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２２〜３０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２２〜２８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２２〜２６ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２４〜３０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２４〜２８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２４〜２６ＡＡである。
【００８７】
上記のそれぞれのペプチド、ペプチドの長さ、及びペプチドの種類は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００８８】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドには、ＨＬＡ分子に対する親和力及びＴＣＲ特異性を変化させることなく、当該技術分野で公知の方法で小さな改変が加えられる。ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの場合、「小さな改変」は、他の実施形態では、例えば、１つのＡＡの挿入、欠失、若しくは置換、又は２位〜９位の残基間における１つ〜３つのＡＡの欠失若しくは付加を意味する。本明細書に記載のコンピュータ・アルゴリズムがペプチドのＭＨＣクラスＩ分子への結合能を予測するのに有用である場合、それらのアルゴリズムの予測精度は６０〜８０％である。したがって、ＭＨＣクラスＩ分子に対する結合親和力に関して最終評価をする前に、ペプチドを実験的に評価する必要がある。したがって、本発明に係るペプチドは、アルゴリズムによってＭＨＣクラスＩ分子に対する結合親和力が強いと予測されるペプチドに制限されない。それぞれの改変は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００８９】
他の実施形態では、実施例に記載されている本発明に係るペプチドは、アンカー残基をＭＨＣクラス１分子への結合のための好ましいアンカー残基に変える変異を導入することによって改変される。他の実施形態では、ＭＨＣクラス１分子への結合のための好ましいアンカー残基を有する本発明に係るペプチドは、その残基の位置において、ＭＨＣクラス１分子への結合のための好ましい他のアンカー残基にさらに変異することで改変される。前記好ましい他の残基は、他の実施形態では、本明細書に記載の任意の好ましい残基であり得る。
【００９０】
他の実施形態では、さらに改変されるアンカー残基は、１位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、２位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、３位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、４位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、５位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、６位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、７位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、８位にある。他の実施形態では、前記アンカー残基は、９位にある。ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの場合、２及び９位の残基以外の残が第２のアンカー残基として機能することができるので、それらに変異を導入することで、ＭＨＣクラスＩ分子への結合を向上することができる。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００９１】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のペプチドは、実施例に記載のペプチドに対して、長さが異なる変異体である。他の実施形態では、前記長さが異なる変異体は、実施例に記載のペプチドよりも１アミノ酸（ＡＡ）分短い。他の実施形態では、前記長さが異なる変異体は、実施例に記載のペプチドよりも２ＡＡ分短い。他の実施形態では、実施例に記載のペプチドよりも２ＡＡ以上短い。他の実施形態では、これらの短いペプチドは、Ｎ末端で短縮している。他の実施形態では、この短いペプチドは、Ｃ末端で短縮している。他の実施形態では、この短縮ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端の両方で短縮している。他の実施形態では、当該技術分野で公知のように、ＨＬＡ分子に対する親和力を変えることなく、ペプチドを短縮することができる。
【００９２】
上記のそれぞれの短縮ペプチドは、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００９３】
他の実施形態では、前記長さが異なる変異体は、実施例に記載の本発明に係るペプチドよりも長い。他の実施形態では、このより長いペプチドは、Ｎ末端で延長している。他の実施形態では、当該技術分野で公知のように、ＨＬＡ分子に対する親和力を変えることなく、ペプチドをこのように延長することができる。そのようなペプチドは、したがって、実施例に記載のペプチドと同等である。他の実施形態では、このＮ末端で延長しているペプチドは、１残基分延長している。他の実施形態では、このＮ末端で延長しているペプチドは、２残基分延長している。他の実施形態では、このＮ末端で延長しているペプチドは、３残基分延長している。他の実施形態では、このＮ末端で延長しているペプチドは、３残基分以上延長している。
【００９４】
他の実施形態では、前記のより長いペプチドは、Ｃ末端で延長している。他の実施形態では、当該技術分野で公知のように、ＨＬＡ分子に対する親和力を変えることなく、ペプチドをこのように延長することができる。そのようなペプチドは、したがって、実施例に記載のペプチドと同等である。他の実施形態では、このＣ末端で延長しているペプチドは、１残基分延長している。他の実施形態では、このＣ末端で延長しているペプチドは、２残基分延長している。他の実施形態では、このＣ末端で延長しているペプチドは、３残基分延長している。他の実施形態では、このＣ末端で延長しているペプチドは、３残基分以上延長している。
【００９５】
他の実施形態では、延長しているペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端の両方で延長している。
【００９６】
上記のそれぞれの延長しているペプチドは、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００９７】
他の実施形態では、本発明に係る短縮ペプチドは、第２の残基及びＣ末端残基において、ＨＬＡ分子に結合するアンカー残基（例えば、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するアンカー残基）を保持し、実施例に記載の本発明に係るペプチドよりも介在残基の数が小さい（例えば、５）。ＨＬＡ分子に対する親和力を変えることなく、ペプチドにこのような変異を導入することができる。他の実施形態では、そのような短縮ペプチドは、上記の１つの配列の介在残基の１つを欠失させるように設計される。他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合するアンカー残基は、第２及び第８の残基で保持されている。他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合するアンカー残基は、第１及び第８の残基で保持されている。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００９８】
他の実施形態では、本発明に係る延長ペプチドは、第２の残基及びＣ末端残基において、ＨＬＡ分子に結合するアンカー残基（例えば、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するアンカー残基）を保持し、実施例に記載の本発明に係るペプチドよりも介在残基の数が大きい（例えば、７又は８）。他の実施形態では、そのような延長ペプチドは、上記の１つの配列の２つの介在残基の間に１つ以上の残基を加えることによって設計される。ＨＬＡに結合するペプチドのＨＬＡに対する親和力を変えることなく、そのペプチドの介在配列において残基を除去する又は付加できることは、当該技術分野で公知である。このようなペプチドは、したがって、実施例に記載のペプチドに同等である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合するアンカー残基は、第２及び第９の残基で保持されている。他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合するアンカー残基は、第１及び第８の残基で保持されている。他の実施形態では、ＨＬＡ分子に結合するアンカー残基は、６つの介在残基で分離される２つの残基で保持されている。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【００９９】
「断片」は、他の実施形態では、１１ＡＡ以上の長さを有するペプチドを意味する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１２ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１３ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１４ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１５ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１７ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１８ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１９ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、２２ＡＡ以上の長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、８〜１２ＡＡの長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、約８〜１２ＡＡの長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１６〜１９ＡＡの長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、約１６〜１９ＡＡの長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、１０〜２５ＡＡの長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、約１０〜２５ＡＡの長さを有する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド断片は、任意の長さを有する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１００】
「ＷＴ１タンパク質の断片」は、他の実施形態では、本明細書に記載の任意の定義の「断片」を意味する。各可能な定義は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１０１】
本明細書に記載されているように、中皮種細胞は、ＷＴ１を発現する（実施例７）。また、中皮種細胞は、本発明に係るペプチド又はそれに対応する天然ペプチドを処理し、提示する（実施例５）。さらに、この提示は、抗ＷＴ１特異的免疫を誘発するほど、十分に強い。したがって、抗ＷＴ１免疫治療で中皮種細胞を治療することができる。
【０１０２】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、実施例に記載のペプチドに対して相同である。「相同性」、「相同」等の用語は、任意のタンパク質又はペプチドを言及する際には、他の実施形態では、候補配列において、対応する天然型ペプチドのアミノ酸残基配列と同一のアミノ酸残基配列のパーセンテージ（アライメントを行ってギャップを導入した後の）を意味する。尚、同類置換は、配列同一性の一部としては見なされない。アライメントのための方法及びプログラムは、当該技術分野で公知である。
【０１０３】
他の実施形態では、「相同性」という用語は、任意の核酸配列を言及する際には、同様に、候補配列において、対応する天然型核酸配列のヌクレオチドと同一のヌクレオチドのパーセンテージを意味する。
【０１０４】
相同性は、他の実施形態では、配列アライメントのためのコンピュータ・アルゴリズムや当該技術分野で公知の方法によって評価することができる。他の実施形態では、核酸配列の相同性に関するコンピュータ・アルゴリズム分析には、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、及びＴＲＥＭＬパッケージが使用される。
【０１０５】
他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して７０％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して７２％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して７５％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して７８％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して８０％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して８２％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して８３％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して８５％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して８７％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して８８％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９０％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９２％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９３％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９５％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９６％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９７％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９８％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して９９％を越える同一性を意味する。他の実施形態では、「相同性」は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３８から選択された１つの配列に対して１００％である同一性を意味する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態を意味する。
【０１０６】
他の実施形態では、相同性は、候補配列のハイブリダイゼーションで評価される。ハイブリダイゼーションの方法は、当該技術分野で公知である（例えば、「"Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1985)」、「Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.」、及び「Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y」を参照）。他の実施形態では、適度（moderate）又はストリンジェント（stringent）な条件下で、天然型のカスパーゼ・ペプチドをコードするＤＮＡの相補配列に対して行われる。ハイブリダイゼーションの条件の例として、例えば、１０〜２０％のホルムアミドと、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）と、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）と、５×Denhardt緩衝液と、１０％の硫酸デキストランと、２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡとを含む水溶液にて４２℃で一晩インキュベートする。
【０１０７】
上記のペプチドの相同物及び実施例に記載の変異体は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１０８】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係るペプチドを含む組成物を提供する。他の実施形態では、前記組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。他の実施形態では、前記組成物は、アジュバントをさらに含む。他の実施形態では、前記組成物は、本発明に係る２つ以上のペプチドを含む。他の実施形態では、前記組成物は、下記に記載の任意の添加剤、化合物、又は賦形剤を含む。他の実施形態では、アジュバントは、ＫＬＨ、ＱＳ２１、完全フロイント・アジュバント、不完全フロイント・アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ、又はミョウバンである。他の実施形態では、担体は、本明細書に記載の任意の担体である。他の実施形態では、アジュバントは、本明細書に記載のアジュバントである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１０９】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係るペプチドを含むワクチンを提供する。他の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞（antigen-presenting cell：ＡＰＣ）と本発明に係るペプチドとを含むワクチンを提供する。他の実施形態では、前記ワクチンは、担体をさらに含む。他の実施形態では、前記ワクチンは、アジュバントをさらに含む。他の実施形態では、前記ワクチンは、ＡＰＣをさらに含む。他の実施形態では、前記ワクチンは、抗原、担体、及び／又はＡＰＣの１つ以上の組み合わせを含む。他の実施形態では、前記ワクチンは、細胞に基づく組成物である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１１０】
他の実施形態では、「ワクチン」という用語は、対象に導入される際に特定の病気、疾患、又はそれらの症状に対して予防効果又は治療効果を提供する物質又は組成物を意味する。他の実施形態では、本発明は、免疫調節化合物（サイトカイン、アジュバントなど）などの本明細書に記載の任意の物質を含むペプチドに基づくワクチンを提供する。
【０１１１】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のワクチンは、アジュバントをさらに含む。他の実施形態では、アジュバントは、モンタニドＩＳＡ５１（Montanide ISA 51）である。モンタニドＩＳＡ５１は、代謝可能な天然油及び精製乳化剤を含む。他の実施形態では、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦである。組み換え型ＧＭ−ＣＳＦは、他の実施形態では、イースト（S. cerevisiae）ベクターから生成されるヒトのタンパク質である。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞、ＡＰＣ、樹状細胞、及びＴ細胞のクローン性増殖及び分化を促進する。
【０１１２】
他の実施形態では、アジュバントは、サイトカインである。他の実施形態では、アジュバントは、成長因子である。他の実施形態では、アジュバントは、細胞集団である。他の実施形態では、アジュバントは、ＱＳ２１である。他の実施形態では、アジュバントは、不完全フロイント・アジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。他の実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。他の実施形態では、アジュバントは、ＢＣＧである。他の実施形態では、アジュバントは、ミョウバンである。他の実施形態では、アジュバントは、インターロイキンである。他の実施形態では、アジュバントは、ケモカインである。他の実施形態では、アジュバントは、当該技術分野で公知の任意の種類のアジュバントである。他の実施形態では、ＷＴ１ワクチンは、上記のアジュバントの内の２つのものを含む。他の実施形態では、ＷＴ１ワクチンは、上記のアジュバントの内の２つ以上のものを含む。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１１３】
他の実施形態では、本発明に係るワクチン又は組成物は、本発明に係るＷＴ１ペプチドの任意の実施形態及びその組み合わせを含み得る。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１１４】
本発明に係るペプチド、ワクチン、及び組成物に関して本明細書に記載した、あらゆる実施形態が本発明に係る任意の方法に使用できることを理解されたい。ペプチド、ワクチン、又は組成物と方法との組み合わせは、実施形態に相当する。
【０１１５】
他の実施形態では、本発明は、ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療する方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療する方法を提供する。
【０１１６】
他の実施形態では、本発明は、ＭＤＳを有する対象を治療する方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、ＭＤＳを有する対象を治療する方法を提供する。
【０１１７】
他の実施形態では、本発明は、対象においてＷＴ１を発現する癌の進行を抑制又は停止する方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、対象においてＷＴ１を発現する癌の進行を抑制又は停止する方法を提供する。
【０１１８】
他の実施形態では、本発明は、対象においてＷＴ１を発現する癌の発生率を減少させる方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、対象においてＷＴ１を発現する癌の発生率を減少させる方法を提供する。
【０１１９】
他の実施形態では、本発明は、対象において急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の発生率を減少させる方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、対象においてＡＭＬの発生率を減少させる方法を提供する。
【０１２０】
他の実施形態では、本発明は、対象においてＷＴ１を発現する癌の再発率を減少させる方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、対象においてＷＴ１を発現する癌の再発率を減少させる方法を提供する。
【０１２１】
他の実施形態では、本発明は、対象においてＡＭＬの再発率を減少させる方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、対象においてＡＭＬの再発率を減少させる方法を提供する。
【０１２２】
他の実施形態では、本発明は、ＷＴ１を発現する癌に対する対象のＴ細胞寛容を破壊する方法であって、前記対象に本発明に係るＷＴ１ワクチンを投与するステップを含み、それによって、ＷＴ１を発現する癌に対する対象のＴ細胞寛容を破壊する方法を提供する。
【０１２３】
他の実施形態では、本発明は、ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療する方法であって、（ａ）発明に係る方法によって、ドナーにおいて、悪性癌細胞を認識するヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の形成及び増殖を誘導するステップと、（ｂ）前記対象に前記ヒトＣＴＬを注入するステップとを含み、それによって、癌を有する対象を治療する方法を提供する。
【０１２４】
他の実施形態では、本発明は、ＷＴ１を発現する癌を有する対象を治療する方法であって、（ａ）本発明に係る方法によって、エクスビボで、悪性癌細胞を認識するヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の形成及び増殖を誘導するステップと、（ｂ）前記対象に前記ヒトＣＴＬを注入するステップとを含み、それによって、癌を有する対象を治療する方法を提供する。尚、ヒトに免疫細胞は、ドナーから取得される。
【０１２５】
エクスビボの免疫療法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願番号第２００６／００５７１３０号、第２００５／０２２１４８１号、第２００５／０２１４２６８号、第２００３／０１７５２７２号、第２００に／０１２７７１８号、及び米国特許第５，２２９,１１５号（本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。他の方法も当該技術分野で公知であり、例えば、「Blood dendritic cells generated with Flt3 ligand and CD40 ligand prime CD8+ T cells efficiently in cancer patients. J Immunother. 2006 Sep-Oct;29(5) :499-5 11」（Davis ID et al.）及び「The cytotoxic T cell response to peptide analogs of the HLA-A*0201-restricted MUC1 signal sequence epitope, Ml.2. Cancer Immunol Immunother. 2006 Jul 28」（Mitchell MS et al.）に記載されている。各方法は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１２６】
他の実施形態では、本発明は、ＷＴ１を発現する癌細胞に特異的なＣＴＬの形成及び増殖を誘導する方法であって、リンパ球の集団を本発明に係るワクチンに接触させるステップを含む。他の実施形態では、ワクチンは、本発明に係るペプチドに結合したＡＰＣである。他の実施形態では、ワクチンは、本発明に係るペプチドの混合物に結合したＡＰＣである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１２７】
他の実施形態では、本発明は、対象において、ＷＴ１を発現する癌細胞に対するヘテロクリティック免疫応答を発生させる方法であって、前記対象に本発明に係るワクチンを投与するステップを含み、それによって、ヘテロクリティック免疫応答を発生させる方法を提供する。
【０１２８】
他の実施形態では、本発明は、対象において抗中皮腫免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質又は（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、対象において抗中皮腫免疫応答を誘導する方法提供する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１２９】
他の実施形態では、本発明は、対象において抗中皮腫免疫応答を誘導する方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子又は（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に接触させるステップを含み、それによって、対象において抗中皮腫免疫応答を誘導する方法提供する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１３０】
他の実施形態では、本発明は、中皮腫を有する対象を治療する方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質又は（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、中皮腫を有する対象を治療する方法を提供する。他の実施形態では、中皮腫は、悪性中皮腫である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１３１】
他の実施形態では、中皮腫を有する対象を治療する方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子又は（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、中皮腫を有する対象を治療する方法提供する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１３２】
他の実施形態では、対象において中皮腫の発生率又はその再発率を減少させる方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質又は（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、対象において中皮腫の発生率又はその再発率を減少させる方法を提供する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１３３】
他の実施形態では、対象において中皮腫の発生率又はその再発率を減少させる方法であって、（ａ）ＷＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド分子又は（ｂ）ＷＴ１タンパク質の断片をコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含み、それによって、対象において中皮腫の発生率又はその再発率を減少させる方法を提供する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１３４】
他の実施形態では、本発明に係る方法によって誘起される免疫応答の標的細胞は、本発明に係るＷＴ１ペプチド又は対応するＷＴ１断片をＨＬＡ分子で提示する。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡクラスＩ分子である。他の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡクラス１サブタイプ又は当該技術分野で公知の任意のＨＬＡクラスＩ分子である。他の実施形態では、ＷＴ１ペプチド又はその断片に対する免疫応答は、ヘテロクリティック免疫応答である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１３５】
他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia：ＡＭＬ）である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome：ＭＤＳ）に関連する。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、ＭＤＳである。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer：ＮＳＣＬＣ）である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、ウィルムス腫瘍である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、白血病である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、血液癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、リンパ腫である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、中皮腫である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、悪性中皮腫である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、胃癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、結腸癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、肺癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、乳癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、胚細胞腫瘍である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、卵巣癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、子宮癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、甲状腺癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、肝細胞癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、肝臓癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、腎臓癌である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、カポジ肉腫である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、肉腫である。他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、他の任意の癌腫又は肉腫である。
【０１３６】
他の実施形態では、ＷＴ１を発現する癌は、固形癌である。他の実施形態では、固形癌は、ＷＴ１を発現する癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome：ＭＤＳ）に関連する。他の実施形態では、固形癌は、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer：ＮＳＣＬＣ）に関連する。他の実施形態では、固形癌は、肺癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、乳癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、結腸直腸癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、前立腺癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、卵巣癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、腎臓癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、膵臓癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、脳腫瘍に関連する。他の実施形態では、固形癌は、消化管癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、皮膚癌に関連する。他の実施形態では、固形癌は、メラノーマに関連する。
【０１３７】
他の実施形態では、本発明に係る方法で治療される癌又は腫瘍は、ＷＴ１を発現すると考えられる。他の実施形態では、ＷＴ１の発現は、実際の腫瘍サンプルの検査で確認されていていない。他の実施形態では、癌又は腫瘍は、多くの場合にＷＴ１を発現すると知られている種類のものである。他の実施形態では、前記の種類のものは、大抵の場合にＷＴ１を発現する。
【０１３８】
ＷＴ１を発現する各種類の癌又は腫瘍、及びＷＴ１を発現すると推定される各種類の癌又は腫瘍は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１３９】
本発明に係るペプチド、ワクチン、及び組成物に関して本明細書に記載したあらゆる実施形態は、本発明に係る任意の方法に使用することができ、それぞれの方法は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１４０】
他の実施形態では、本発明に係る複数のペプチドは、本発明に係る方法において免疫応答を促進する。
【０１４１】
本明細書に記載したように、本発明に係るペプチドは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘起する（それぞれ実施例１〜２及び実施例３〜４）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＡＰＣ上のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合しているペプチドを認識する。他の実施形態では、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の誘導及び維持を促進する。他の実施形態では、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することで、免疫を高め、それによって、細胞傷害性Ｔ細胞の活性及び生存を維持する。他の実施形態では、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞に直接接触する、又はアポトーシス経路を活性化することで腫瘍細胞の死を誘起する。中皮腫細胞は、例えば、抗原を処理してＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子で提示することができる。
【０１４２】
他の実施形態では、本発明に係るワクチンには、ＷＴ１抗原を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を活性化又は誘起する利点がある。他の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化又は誘起は、それらの細胞の何れかの活性化と比較すると、相乗的な抗ＷＴ１免疫応答をもたらす。
【０１４３】
本明細書に開示した方法によって、当業者は、ＷＴ１由来の他のペプチドを設計することができる。また、本発明に係る方法によって、他のＨＬＡ分子に結合するペプチドの設計が可能となる。本発明に係る方法によって、さらに、本発明に係る複数のＷＴ１由来ペプチドを組み合わせたワクチンの設計が可能となる。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１４４】
他の実施形態では、本発明に係るワクチンには、異なる様々なＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を有するＷＴ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化又は誘起する利点がある。他の実施形態では、ワクチンには、かなり大きな割合の人においてＷＴ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化又は誘起する利点がある（例えば、異なる実施形態では、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％よりも大きい）。他の実施形態では、ワクチンには、かなり大きな割合の特定の人（例えば、米国の白人）においてＷＴ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化又は誘起する利点がある。
【０１４５】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、対象がすでに有する免疫効果を向上させる。他の実施形態では、本発明に係る方法は、ペプチド、組成物、又はワクチンを２回以上投与するステップを含む。他の実施形態では、ペプチドは、その組成、濃度、又はそれらの組み合わせに関して様々である。他の実施形態では、ペプチドは、関心のある抗原に対する免疫応答を未だ開始していない対象においてその抗原に対する免疫応答を開始する。他の実施形態では、誘起されたＣＴＬは、ＡＰＣ又は癌細胞上のペプチドの提示に応じて増殖する。他の実施形態では、免疫応答の調節は、免疫機構の体液性部分及び細胞性部分（それぞれ、Ｔｈ２及びＴｈ１Ｔヘルパー細胞が関与する）の何れか又はその両方を伴う。
【０１４６】
他の実施形態では、腫瘍の成育に影響する方法によって、（１）腫瘍細胞の分裂が直接抑制される、又は（２）免疫細胞が腫瘍細胞を溶解する、又はその両方が起き、腫瘍細胞の拡張が抑制される。
【０１４７】
当業者は、公知の様々な方法に基づいて、これらの２つの機構の何れかによる腫瘍の生育抑制を容易に評価することができる。他の実施形態では、腫瘍抑制は、腫瘍の実際の大きさを期間にわたって計測することで評価される。他の実施形態では、腫瘍の抑制は、当該技術分野で公知の方法を用いて腫瘍の大きさを（期間にわたって）推定することで評価される。さらに具体的には、腫瘍の大きさは、様々な放射線画像撮像方法（例えば、単光子陽電子放出コンピュータ断層撮影（「"Nuclear Medicine in Clinical Oncology," Winkler, C. (ed.) Springer-Verlag, New York, 1986」を参照））を使用することで推定される。このような方法には、様々な造影剤（例えば、従来の造影剤（例えばクエン酸ガリウム−６７（６７Ｇａ））、並びに代謝画像、リセプター画像、又は免疫画像用の特別な試薬（例えば、腫瘍マーカーに特異的な放射性標識モノクローナル抗体））が使用される。また、超音波法などの非放射性方法（「"Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff and Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, New York, 1984」を参照）をも、腫瘍の大きさを推定するのに使用することができる。
【０１４８】
腫瘍抑制の評価のための上記のインビボの方法に加えて、インビボにおける腫瘍抑制を推定するのに様々なインビトロの方法を使用することができる。代表的な例として、例えば５１Ｃｒ放出アッセイ（実施例）、腫瘍依存性リンパ球増殖（loannides, et aL, J. Immunol. 146(5):1700- 1707, 1991）、腫瘍特異的な抗体のインビトロでの生成（Herlyn, et al., J. Immunol. Meth. 73:157- 167, 1984）、インビトロでの細胞性（例えば、ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞）又は体液性（例えば、抗体）細胞増殖抑制（Gazit, et al., Cancer Immunol Irnn-iunother 35:135-144, 1992）、細胞前駆体の頻度の評価（Vose, mt. J. Cancer 30:135-142 (1982）などでリンパ球媒介性腫瘍細胞溶解活性を評価する。
【０１４９】
他の実施形態では、腫瘍成育を抑制する方法を腫瘍に使用すると、本発明に係るペプチドに接触させなかった、又は晒さなかった腫瘍の生育と比べると、腫瘍の生育は抑制される。腫瘍細胞の成育は、当該技術分野で公知の任意の方法で評価することができる。前記方法の例として、それらに限定されるものではないが、例えば、腫瘍の大きさの計測、腫瘍細胞の増殖の評価（３Ｈチミジン組み込みアッセイを使用して）、又は腫瘍細胞の数の計算がある。腫瘍細胞の生育を「抑制する」は、他の実施形態では、腫瘍の育成を遅らせる、遅延させる、若しくは停止する、又は腫瘍を縮小させることを意味する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１５０】
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、ＷＴ１発現が測定される。他の実施形態では、ＷＴ１の転写産物発現が測定される。他の実施形態では、腫瘍におけるＷＴ１タンパク質のレベルが測定される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１５１】
免疫応答の存在及び程度を評価する方法は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、リンパ球の増殖アッセイとして、Ｔ細胞による放射性物質（例えば、３Ｈチミジン）の取り込みが測定されることで、細胞の増殖が評価される。他の実施形態では、インターロイキン−２（ＩＬ−２）生成、Ｃａ２＋流出、又は染料（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムなど）の取り込みを測定することによって、Ｔ細胞の増殖が評価される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１５２】
他の実施形態では、ＣＴＬの活性化は、当該技術分野で公知の方法（例えば、細胞増殖、サイトカイン生成の検出など）によって評価される。リガンドでパルスされた標的細胞にＴ細胞が接触する際に分泌するサイトカインの種類及び量を分析することで、Ｔ細胞の機能活性を評価することができる。ＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Fujihashi K. et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:181; Tanguay S. and Killion J. J. (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13:259）でサイトカインの生成速度及び全量を測定することができる。
【０１５３】
他の実施形態では、ＣＴＬ活性は、５１Ｃｒ放出アッセイで評価することができる。ペプチドでパルスした５１Ｃｒ標識標的細胞の抗原特異的Ｔ細胞による溶解を、対照ペプチドでパルスした標的細胞のものと比較することができる。他の実施形態では、本発明に係るペプチドによってＴ細胞が刺激され、ＭＨＣで天然ペプチドを発現する標的細胞の溶解を評価することができる。他の実施形態では、溶解の挙動、並びに定時点（例えば、４時間）における標的細胞の溶解でリガンドの性能を評価する（Ware C. F. et al. (1983) J Immunol 131: 1312）。
【０１５４】
ＨＬＡ分子に対するペプチドの親和力を評価する方法は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、親和力は、ＴＡＰ安定性アッセイ（TAP stabilization）（実施例）で評価される。
【０１５５】
他の実施形態では、親和力は、競合型ラジオイムノアッセイによって評価される。他の実施形態では、次のプロトコールが使用される。標的細胞を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ）含有のＰＢＳで２回洗浄する。細胞を１０７／ｍｌになるように氷上で再懸濁する。３ｍｇ／ｍｌのベータ２マイクログロブリンを含むリン酸クエン酸塩緩衝液で細胞表面に結合している天然のペプチドを２分間、０℃で取り除く。沈殿物を、３ｍｇ／ｍｌのベータ２マイクログロブリン及び３０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼを含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡで５×１０６細胞／ｍｌになるように再懸濁する。次に、２００ｍｌのアリコートをＨＬＡに特異的なペプチドの存在下及び非存在下で１０分間、２０℃インキュベートし、その後に１２５Ｉ標識のペプチと共に３０分間、２０℃でインキュベートする。ＰＢＳ／２％ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した後に、結合した全１２５Ｉ量を測定する。相対的親和力は、検査するペプチドの濃度を公知の結合ペプチドの濃度と比較することによって評価する。
【０１５６】
他の実施形態では、生細胞（例えば、ＳＫＬＹ−１６細胞）表面上のＨＬＡに対するペプチドの結合の特異性分析は、ペプチドが適切なＨＬＡ分子に結合することを確認し、さらにその結合の特異性の特徴を確かめるために行われる。この分析には、他の実施形態では、同じ又は異種のＨＬＡ分子に結合すると知られている過剰な非標識ペプチドとの競合分析が含まれ、同じ又は異種のＨＬＡを発現する標的細胞が使用される。このアッセイは、他の実施形態では、生きた新鮮な、又は０．２５％のパラホルムアルデヒドで固定されたヒトＰＢＭＣ、リンパ球細胞株、及びＥＢＶで形質転換された、特定のＨＬＡ型を有するＴ細胞系に対して行われる。特定の細胞のＭＨＣ分子に結合すると知られているペプチドの相対的な親和力は、上記に記載したように、関連するＨＬＡ分子に対して高親和力を示すと知られている１２５Ｉ標識のペプチド（例えば、チロシナーゼ、又はＨＢＶペプチド配列）に対して競合アセイを行うことによって分析される。
【０１５７】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の結合に必要な最低の長さ（他の実施形態では、１２ＡＡ）よりも長い。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの長さが増すと、ペプチドは１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ分子と結合できるようになる。他の実施形態では、前記長さが増すと、ペプチドは結合モチーフが未知のＨＬＡクラスＩＩ分子と結合できるようになる。他の実施形態では、前記長さが増すと、ペプチドはＨＬＡクラスＩ分子と結合できるようになる。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子の結合モチーフは、周知されている。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１５８】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物に使用されるペプチドは、非古典的なアミノ酸を含む。この非古典的アミノ酸の例として、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸塩（Kazmierski et al. (1991) J. Am Chem. Soc. 113:2275-2283）、（２Ｓ,３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチルフェニルアラニン、（２Ｒ,３Ｓ）−メチルフェニルアラニン、及び（２Ｒ,３Ｒ）−メチルフェニルアラニン（Kazmierski and Hruby (1991) Tetrahedron Lett. 32(41): 5769- 5772）、２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボキシル酸（Landis (1989) Ph.D. Thesis, University of Arizona）、ヒドロキシ１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸塩（Miyake et al. (1984) J. TakedaRes. Labs. 43:53-76）、ヒスチジンイソキノリンカルボキシル酸（Zechel et al. (1991) Tnt. J. Pep. Protein Res. 38(2):131-138）、並びにＨＩＣ（ヒツジン環状尿素）（（Dharanipragada et al.(1993) Tnt. J. Pep. Protein Res. 42(1):68-77)）及び（(1992) Acta. Crst., Crystal Struc. Conmi. 48(IV):1239-124））がある。
【０１５９】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、ＡＡ類似体又はペプチド模倣体（他の実施形態では、特定の二次構造を誘導又は促進する）を含む。そのようなペプチドとして、ジペプチド類似体を誘導するβターンであるＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−ピペリドン−６−カルボキシル酸）、（Kemp et al. (1985) J. Org. Chem. 50:5834-5838）、類似体を誘導するβシート（Kemp et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:5081-5082）、類似体を誘導するβターン（Kemp et al. (1988) Tetrahedron Left. 29:5057-5060）、類似体を誘導するアルファへリックス（Kemp et al. (1988) Tetrahedron Left. 29:5057-5060）、類似体を誘導するガンマターン（Kemp et al. (1989) J. Org. Chem. 54:109:115）、参照文献「Nagai and Sato (1985) Tetrahedron Left. 26:647-650」及び「DiMaio et al. (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans. p. 1687」に記載の類似体、Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体（Kahn et al. (1989) Tetrahedron Lett. 30:2317）、アミド結合アイソスター（amide bond isostere）（Jones et al. (1988) Tetrahedron Left. 29(3 1):3853-3856）、テトラゾール（Zabrocki et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880）、ＤＴＣ（Samanen et al. (1990) Tnt. J. Protein Pep. Res. 35:501:509）、及び「Olson et al.(1990) J. Am. Chem. Sci. 112:323-333 and Garveyet al. (1990) J. Org. Chem. 55(3) :936-940」に記載の類似体がある。ベータターン及びベータバルジ（beta bulge）の配座固定された模倣体、並びにそのそれらを含むペプチドは、１９９５年８月８日にKahnに付与された米国特許第５，４４０，０１３号に記載されている。
【０１６０】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、下記に記載の他の様々な分子に結合する（共有結合又は非共有結合である）。他の実施形態では、前記分子の種類は、目的に応じて異なる。他の実施形態では、ペプチドは、高分子担体（例えば、免疫原性担体）に共有結合している、又は非共有結合している。前記高分子担体として、それらに限定されるわけではないが、例えば、天然及び合成ポリマー、タンパク質、多糖類、ポリペプチド（アミノ酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及び脂質がある。他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、基質に結合している。他の実施形態では、リポソームへ導入されるように、脂肪酸と結合している（米国特許第５，８３７，２４９号）。他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、固体担体（solid support）（当該技術分野では、様々な種類のものが知られている）と結合している。他の実施形態では、担体、基質、脂肪酸、又は固体担体へのペプチドの結合は、免疫応答を増大させるためである。
【０１６１】
他の実施形態では、前記担体は、チログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（ポリリシン、ポリグルタミン酸など）、インフルエンザタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン、又は他の担体タンパク質若しくは担体ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子組み換え型ワクチン、又はＡＰＣである。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１６２】
他の実施形態では、「アミノ酸」（ＡＡ）という用語は、天然型、又は他の実施形態では、非天然型若しくは合成ＡＡを意味し、他の実施形態では、グリシン、Ｄ−若しくはＬ光学異性体、ＡＡ類似体、ペプチド模倣体、及びそれらの組み合わせを含み得る。
【０１６３】
他の実施形態では、「癌」又は「腫瘍」は、同じ意味で使用され、悪性形質転換を経て宿主の生物に対して病的細胞となった細胞を意味する。原発性癌細胞（悪性形質転換部位の付近から得られた細胞）は、確立された技術（とりわけ、組織学的検査）で容易に非ガン性細胞から区別することができる。本明細書に使用される癌細胞の定義は、原発性癌細胞だけでなく、癌原細胞から由来するあらゆる細胞をも含む。これには、転位癌細胞、並びに癌細胞由来のインビトロ培養細胞及び細胞株が含まれる。他の実施形態では、腫瘍は、腫瘍塊に基づいて検出することができ（例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴映像法（magnetic resonance imaging：ＭＲＩ）、Ｘ線検査、超音波検査、又は触診法などの手順で）、他の実施形態では、生化学的又は免疫学的検査で同定される（後者は、他の実施形態と同様に癌細胞を検出するのに使用される）。
【０１６４】
ペプチドを合成する方法は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、適切な固相合成法（solid-state synthetic procedure）で合成される（例えば、「Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968)」、「Merrifield (1967) Recent Progress in Hormone Res 23: 451」を参照）。これらのペプチドの活性は、他の実施形態では、本明細書に記載のアセイで検査される。
【０１６５】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和力クロマトグラフィー、及びサイジングカラム（sizing column）クロマトグラフィー）、遠心分離法、溶解度の差を利用した方法、又はタンパク質精製のための他の任意の標準的な方法で精製される。他の実施形態では、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーが使用される。イムノアフィニティー・クロマトグラフィーでは、目的のペプチド又は本発明に係る関連ペプチドに対する抗体が固相担体で固定されたアフィニティー・カラムにエピトープを結合することで精製する。
【０１６６】
他の実施形態では、ペプチドを適切なアフィニティー・カラムに通過させるだけで容易に精製できるようにするために、ヘキサＨｉｓ（Invitrogen）、マルトース結合ドメイン（New England Biolabs）、インフルエンザコート配列（Kolodziej et al. (1991) Meth. Enzymol. 194:508-509）、グラチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティー・タグを本発明に係るペプチドに結合する。他の実施形態では、タンパク質分解、磁気共鳴、及びＸ線結晶学的技法を使用することで精製したペプチドの物理的な特徴を確認することができる。
【０１６７】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、公知の方法（当業者ならば、理解できるであろう）を介してインビトロ翻訳で作成される。他の実施形態では、ペプチドは、翻訳の間に又は翻訳後に特異的に修飾される（例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋結合、アシル化、タンパク質分解的切断、又は抗体分子、膜分子、若しくは他のリガンドへの結合（Ferguson et al. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:285-320）で）。
【０１６８】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、検出可能な標識をさらに有する。前記標識は、他の実施形態では蛍光性であり、他の実施形態では発光性であり、他の実施形態では放射能性であり、他の実施形態では高電子密度性である。他の実施形態では、検出可能な標識には、例えば、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein：ＧＦＰ）、ＤＳレッド（赤色蛍光タンパク質）、分泌型アルカリホスファターゼ（secreted alkaline phosphatase：ＳＥＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、３２Ｐ、１２５Ｉ及び１４Ｃ、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル及びウンベリフェロン、ルシフェリン、又は当業者に周知な他の標識がある。使用される特定の標識は、使用されるイムノアッセイに種類による。
【０１６９】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、基質に結合しており、前記基質は、他の実施形態では、担体として働く。他の実施形態では、ペプチドを基質に結合させると、免疫応答を増大させる。
【０１７０】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、本明細書に記載されているように、カルボジイミド等の架橋剤によって他の分子と結合している。カルボジイミドの例として、１−シクロヘキシル−３−（２モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、及び１−エチル−３−（４−アゾニア−４４−ジメチルペンチル）カルボジイミドがある。
【０１７１】
他の実施形態では、架橋剤として、臭化シアン、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸がある。一般的には、ホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイミド、ホモ二官能性ハロゲン化アルキル、ホモ二官能性ピリジルジスルフィド、ホモ二官能性ハロゲン化アリル、ホモ二官能性ヒドラジド、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体、及びホモ二官能性光反応性化合物などのホモ二官能性物質を使用することができる。他の実施形態では、例えばアミン反応性基と反応性基とを有する化合物、アミン反応性基と光反応性基とを有する化合物、及びカルボニル反応性機とスルフヒドリル反応性基とを有する化合物などのヘテロ二官能性化合物の使用も考えられる。
【０１７２】
他の実施形態では、ホモ二官能性架橋剤として、二官能性Ｎ−ヒドロキシイミドエステル（ジチオビス（スクシンイミジルプロパネート）、ジスクシンイミジルスベレート、及び酒石酸ジスクシンイミジル）、二官能性イミドエステル（ジメチルアジピイミデート、ジメチルピメリミデート、及びジメチルスベリミデート）、二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤（１，４−ジ−［３´−（２´−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイミドヘキサン、及びビス−Ｎマレイミド１，８−オクタン）、ハロゲン化アリール（１，５ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、及び４、４´ジフルオロ−３，３´ジニトロフェニルスルホン）、二官能性アルデヒド（ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びアジパルデヒド）、二官能性エポキシド（１，４ブタンジオールジグリシジルエーテルなど）、二官能性ヒドラジド（アジピン酸ヒドラジド、カルボヒドラジド、及びコハク酸ジヒドラジド）、二官能性ジアゾニウム（ｏ−トリジン、ジアゾ化及びビスジアゾ化ベンジジン）、二官能性ハロゲン化アルキル（Ｎ１Ｎ´エチレン−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、並びにハロゲン化ベンジル及びハロゲン化マスタード（halomustard）（それぞれａ１ａ´−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、及びトリス（２−クロロエチル）アミンなど）がある。
【０１７３】
他の実施形態では、ペプチドを他の分子に連結するのに使用されるヘテロ二官能性架橋剤として、それらに限定されるものではないが、例えば、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、ＧＭＢＳ（Ｎ−（ガンマ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド）、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、及びＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートがある。
【０１７４】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドには、イオン相互作用、吸着的な相互作用、又は生体特異性相互作用で単量体が非共有結合で結合している。大きな正電荷又は負電荷で荷電した分子を有するペプチドの複合体は、他の実施形態では、低イオン強度の環境下（脱イオン水など）で塩橋を形成することで得られる。他の実施形態では、ポリ−（Ｌ−グルタミン酸）又はポリ（Ｌ−リシン）（それぞれ大きな負電荷及び正電荷を有する）などの荷電したポリマーを使用することで大きい複合体を作成することができる。他の実施形態では、微粒子ラテックスビーズなどの表面又は他の疎水性ポリマーに吸着されており、架橋したタンパク質又は他の実施形態では化学的に重合したタンパク質を効果的に模倣する非共的に結合したペプチド−超抗原複合体を形成する。他の実施形態では、他の分子間の生体特異的な相互作用を使用することで、ペプチドは、非共有的に結合している。例えば、アビジン又はストレプトアビジン又はその誘導体などのタンパク質に対するビオチンの強力な親和力を使用することでペプチド複合体を形成することができる。この態様によれば、且つ他の実施形態では、一般的なビオチン化剤（Ｄ−ビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルなど（アミン基と反応する））を使用することでビオチン基を有するようにペプチドを修飾することができる。
【０１７５】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、担体と結合している。他の実施形態では、担体は、ＫＬＨである。他の実施形態では、担体は、当該技術分野で公知の他の任意の担体であり、その例として、例えばチログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリリシン及びポリグルタミン酸などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質、Ｂ型肝炎の遺伝子組換え型ワクチンなどがある。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０１７６】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、Ｐ３ＣＳＳなどの脂質に結合している。他の実施形態では、本発明に係るペプチドは、ビーズに結合している。
【０１７７】
他の実施形態では、本発明に係る組成物は、免疫調節化合物をさらに含む。他の実施形態では、免疫調節化合物は、サイトカイン、ケモカイン、免疫機構の補助要素若しくは接着分子の発現を促進する補完的な要素、それらの受容体、又はそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、免疫調節化合物は、インターロイキン（例えば、インターロイキン１〜１５）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor：ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（macrophage colony stimulating factor：Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte colony stimulating factor：Ｇ−ＣＳＦ）、好中球活性化タンパク質（neutrophil activating protein：ＮＡＰ）などのケモカイン、マクロファージ化学誘因物質及び活性化因子（macrophage chemoattractant and activating factor：ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性ペプチドＭＩＰ−１ａ及びＭＩＰ−１ｂ、補体、又はそれらの組み合わせである。他の実施形態では、免疫調節化合物は、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ（ｇｐ３４）、リンフォタクチン、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＴＲＡＰ、ＩＣＡＭ−１、２若しくは３、サイトカイン受容体、又はそれらの組み合わせの発現を促進する。
【０１７８】
他の実施形態では、免疫調節化合物は、免疫応答に関わる副刺激物質の発現を誘導又は促進する。前記副刺激物質には、幾つかの実施形態では、ＣＤ４０若しくはそのリガンド、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４若しくはＢ７分子が含まれる。他の実施形態では、免疫調節化合物は、熱安定抗原（heat stable antigen：ＨＳＡ）（Liu Y. et al. (1992) J. Exp. Med. 175:437-445), chondroitin sulfate-modified MHC invariant chain (Ti- CS) (Naujokas M. F. et al. (1993) Cell 74:257-26）、コンドロイチン硫酸で修飾されたＭＨＣ不変鎖（Ｉｉ−ＣＳ）（Naujokas M. F. et al. (1993) Cell 74:257-268）、又は細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（Van R. H. (1992) Cell 71:1065-1068）（他の実施形態では、Ｔ細胞にある同種リガンドと相互作用することで副刺激を補助する）の発現を誘導又は促進する。
【０１７９】
他の実施形態では、組成物は、水、分散媒、細胞培養液、等張剤などの溶媒を含む。他の実施形態では、溶媒は、約７．０のｐＨを有する等張緩衝水溶液である。他の実施形態では、組成物は、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は生理食塩水などの希釈剤を含む。他の実施形態では、組成物は、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、及び植物油などの非水性溶媒を含む。
【０１８０】
他の実施形態では、組成物は、当業者に公知の様々な方法で投与できるように調整されている。例えば、本発明に係る組成物は、非経口投与、静脈投与、皮下投与、皮内投与、粘膜内投与、局所投与、経口投与、又は吸入投与される。
【０１８１】
他の実施形態では、本発明に係るペプチドを含むワクチンは、細胞集団をさらに含む。他の実施形態では、前記細胞集団は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹枝状細胞、内皮細胞、幹細胞、又はそれらの組み合わせを含む。前記細胞は、他の実施形態では、互いに対して自己細胞、同系細胞、又は同種異系細胞である。他の実施形態では、前記細胞集団は、本発明に係るペプチドを含む。他の実施形態では、前記細胞集団は、ペプチドを取り込む。各可能な形態は、本発明に係る実施形態に相当する。
【０１８２】
他の実施形態では、本発明に係る細胞集団は、例えば、末梢血、白血球血液製剤、アフェレーシス血液製剤、末梢リンパ節、腸管関連リンパ系組織、脾臓、胸腺、臍帯血、腸間膜リンパ節、肝臓、免疫傷害部位（sites of immunologic lesions）、関節液、膵臓、脳脊髄液、腫瘍標本、肉芽腫組織、又はそのような細胞が得られる他の細胞源などのインビボの細胞源から得られる。他の実施形態では、細胞集団は、ヒトから得られる。前記ヒトは、胎児、新生児、子供、又は成人である。他の実施形態では、本発明に係る細胞集団は、例えば、ブタ若しくはサル、又は関心のある他の動物などから得られる。他の実施形態では、本発明に係る細胞集団は、正常の対象から得られる。他の実施形態では、本発明に係る細胞集団は、疾患を有する対象から得られる。他の実施形態では、本発明に係る細胞集団は、関心のある疾患を患う傾向のある対象から得られる。
【０１８３】
他の実施形態では、本発明に係る細胞集団は、アフィニティーに基づく分離方法によって分離される。アフィニティー分離方法として、他の実施形態では、磁気分離（抗体で被覆された磁性ビーズを使用して）、アフィニティー・クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した若しくはモノクローナル抗体と共に使用される細胞毒性剤（例えば、補体及び細胞毒素）、プレートなどの固体マトリックスに結合した抗体による「パニング」（panning）、又は従来の他の方法がある。他の実施形態では、分離方法には、蛍光活性化細胞分類の利用が含まれる。他の実施形態では、本発明に係る細胞集団の分離を可能にする如何なる方法を使用することができ、その方法は本発明の一部と見なされる。
【０１８４】
他の実施形態では、樹枝状細胞は、様々なリンパ系組織及び非リンパ系組織で見られる形態的に同様の様々な細胞集団から得られる（Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296）。他の実施形態では、本発明に使用される樹枝状細胞は、骨髄から単離される。他の実施形態では、前記樹枝状細胞は、骨髄から単離される。他の実施形態では、前記樹枝状細胞は、骨髄前駆細胞から由来する。他の実施形態では、前記樹枝状細胞は、末梢血から単離される／由来する。他の実施形態では、前記樹枝状細胞は、細胞株から由来する、又は細胞株である。
【０１８５】
他の実施形態では、本明細書に記載されている細胞集団は、哺乳動物（マウス、サル、又はヒトなど）の白血球画分から単離される（例えば、国際公開第９６／２３０６０を参照）。白血球の画分は、他の実施形態では、哺乳動物の末梢血から単離される。
【０１８６】
樹枝状細胞の単離方法は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、樹枝状細胞を単離する方法は、（ａ）ロイコフォレーシス（leukophoresis）などの当該技術分野で公知の方法で哺乳動物から白血球画分を得るステップと、（ｂ）対流遠心エルトリエーションによって、ステップ（ａ）の白血球画分を４つ以上の副画分に分離するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の１つ以上の画分の単球をカルシウムイオノフォア、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−１３、又はＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−４に接触させることで前記単球が樹枝状細胞に変換するのを促進するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の樹枝状細胞の濃縮画分を同定するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の濃縮画分を回収する（好ましくは、４℃で）ステップとを含む。
【０１８７】
他の実施形態では、樹枝状細胞の濃縮画分は、蛍光活性化細胞分類によって同定される。蛍光活性化細胞分類によって、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、又はＢ７．２の内の少なくとも１つのマーカーが同定される。また、蛍光活性化細胞分類によって、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、５６、５７、及びＣＤ１９、２０が同時に欠失しているのが確認される。
【０１８８】
他の実施形態では、細胞集団は、リンパ球（他の実施形態では、Ｔ細胞であり、他の実施形態では、Ｂ細胞である）を含む。Ｔ細胞には、他の実施形態では、ＮＫ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性細胞（ＣＴＬ）、ＴＩＬ、ナイーブＴ細胞、又はそれらの組み合わせが含まれる。初代細胞、細胞株、クローン等であるＴ細胞は、本発明の一部であると見なされることを理解されたい。他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＴＬ若しくはＣＴＬ細胞株、ＣＴＬクローン、又は腫瘍、炎症、若しくは他の浸潤物から単離されたＣＴＬである。
【０１８９】
他の実施形態では、造血幹細胞又は初期前駆細胞は、本発明に使用される細胞集団を含む。他の実施形態では、そのような細胞集団は、ロイコフォレーシスによって単離される。他の実施形態では、ロイコフォレーシスは、サイトカイン投与後に、骨髄、末梢血（ＰＢ）、又は新生児の臍帯血に対して行われる。他の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞は、ＣＤ３４＋として知られる表面抗原マーカーが発現すること、及び表面抗原マーカーであるＬｉｎの発現が見られないこと特徴付けられる。
【０１９０】
他の実施形態では、対象には、骨髄細胞と共に本発明に係るペプチド、組成物、又はワクチンが投与される。他の実施形態では、骨髄細胞との投与は、対象における癌を抑制及び治療するための治療の一部分として、対象に行われる放射線照射の後に実施される。
【０１９１】
他の実施形態では、「細胞を接触させる」又は「細胞集団を接触させる」という文は、晒すことを意味し、これは他の実施形態では、直接的又は間接的に行われる。他の実施形態では、そのような接触には、当該技術分野で公知の任意の方法による細胞の直接注入（マイクロインジェクション等）が含まれる。また、他の実施形態では、細胞への供給は、間接的であり、例えば、細胞周囲の培養液へ供給することで行われる、又は当該技術分野で公知の任意の経路で対象に投与することで行われる。
【０１９２】
他の実施形態では、本発明に係る方法におけるＣＴＬは、インビボで発生させられ、インビトロで本発明に係るペプチドに接触させた抗原提示細胞を対象に導入することで誘発される（例えば、「Paglia et al. (1996) J. Exp. Med. 183:317- 322」を参照）。
【０１９３】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のペプチドは、ＡＰＣに送達される。他の実施形態では、免疫応答を誘発する、又は腫瘍を治療する、又は腫瘍の成長若しくは再発を抑制するために、ペプチドでパルスしたＡＰＣが対象に投与される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態を表す。
【０１９４】
他の実施形態では、ペプチドは、そのペプチドをコードするｃＤＮＡの形態でＡＰＣに送達される。他の実施形態では、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、必要なＭＨＣ／副刺激分子（Ｔ細胞に提示抗原を効果的に認識させる）を発現する樹枝状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、又は他の種類の細胞を意味する。他の実施形態では、ＡＰＣは、癌細胞である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態を表す。
【０１９５】
他の実施形態では、ＣＴＬは、２つ以上のＡＰＣ集団に接触させられる。他の実施形態では、２つ以上のＡＰＣ集団は、異なるペプチドを提示する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態を表す。
【０１９６】
他の実施形態では、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）のサイトゾルで抗原を発現させる方法によって、ＡＰＣにペプチドを送達する。ＡＰＣで抗原を発現させる方法は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、この方法には、（１）本発明に係るペプチドをコードする裸のＤＮＡをＡＰＣに導入する方法、（２）本発明に係るペプチドを発現する組み換え型ベクターをＡＰＣに感染させる方法、（３）リポソームを用いて本発明に係るペプチドをＡＰＣのサイトゾルに導入する方法が含まれる（「Boczkowski D. et al. (1996) J. Exp. Med. 184:465-472」、「Rouse et al. (1994) J. Virol. 68:5685-5689; and Nair et al. (1992) J. Bxp. Med. 175:609-612」を参照）。
【０１９７】
他の実施形態では、本明細書に例示されているように、ヒト細胞株１７４×ＣＥＭ．Ｔ２（以下、Ｔ２と呼ぶ）から由来し、且つ抗原処理経路において、内因性ペプチドが細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子と結合するのを制限する変異を有する育成ＡＰＣ（Zweerink et al. (1993) J. Immunol. 150:1763-1771）が使用される。
【０１９８】
他の実施形態では、本明細書に記載されているように、対象は、発現される天然型のタンパク質とは異なる本発明に係るペプチドに、又は前記ペプチドを含む組成物／細胞集団に晒される。その後、宿主において天然型のタンパク質／抗原との免疫交差反応が発達する。
【０１９９】
他の実施形態では、本発明に係る方法及び実施形態で言及される対象は、ヒトである。他の実施形態では、対象は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ネコ、イヌ、サル、又はエープ等の動物である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０２００】
他の実施形態では、本発明に係るペプチド、ワクチン、及び組成物は免疫応答を促進し、その免疫応答によって、腫瘍細胞は溶解する。
【０２０１】
他の実施形態では、本明細書に記載の任意の方法が、インビトロでＣＴＬを誘起するのに使用される。他の実施形態では、ＣＴＬは、エクスビボで誘起される。他の実施形態では、ＣＴＬは、インビトロで誘起される。誘起されたＣＴＬは、他の実施形態では、対象に投与され、それによって、本発明に係るペプチド、ペプチドを含む発現産物、又はその相同体に関連する疾患が治療される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０２０２】
他の実施形態では、本発明に係る方法は、本発明に係るペプチドをコードする遺伝子配列の導入を含み、それには、例えば１つ以上の核酸送達方法が使用される。本発明に係る核酸は、他の実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡとＲＮＡとの混合物を含む、又はＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡを非核酸要素と共に含む。他の実施形態では、本発明に係る方法は、本発明に係るペプチドをコードする核酸を含むベクターを対象に投与するステップを含む（Tindle, R. W. et al. Virology (1994) 200:54）。他の実施形態では、本発明に係る方法は、ペプチドをコードする裸のＤＮＡを対象に投与するステップ、又は他の実施形態では、本発明に係る２つ以上のペプチドを対象に投与するステップを含む（Nabel, et al. PNAS-USA (1990) 90: 11307）。他の実施形態では、複数のエピトープ、アナログに基づく癌ワクチンが使用される（Fikes et al., Design of multi- epitope, analogue-based cancer vaccines. Expert Opin Biol Ther. 2003 Sep;3(6):985-93）。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態に相当する。
【０２０３】
核酸は、当該技術分野で公知の任意の方法で対象に投与することができる。この投与方法には、非経口投与若しくは静脈内投与、又は他の実施形態では、遺伝子銃による投与が含まれる。他の実施形態では、核酸は、組成物に含まれた状態で投与される。他の実施形態では、前記組成物は、本明細書に記載の任意の実施形態に相当する。
【０２０４】
本発明に係る方法で使用されるベクターは、本発明に係るペプチドの発現を促進する、又は可能にする任意のベクターである。ベクターとして、幾つかの実施形態では、ワクシニア若しくは鶏痘などの弱毒化ウイルス（米国特許第４，７２２，８４８号に記載（参照により、本明細書に含まれる））がある。他の実施形態では、ベクターとしてＢＣＧ（Bacille Calmette Guerin）（「Nature 351:456-460 (1991)」（Stover et al.）に記載されている）がある。本明細書の記載内容から、本発明に係るペプチドの治療用投与及び予防接種に有用な他の様々なベクター（例えば、チフス菌（Salmonella typhi）のベクターなど）が当業者に明白となるであろう。
【０２０５】
他の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のように、免疫調節因子をさらにコードする。他の実施形態では、本発明に係るペプチドをコードするベクターを対象に投与すると同時に、又はその前に、又はその後に、免疫調節因子をコードする他のベクターが対象に投与される。
【０２０６】
他の実施形態では、本発明に係るペプチド、組成物、及びワクチンは、他の抗癌化合物及び化学療法薬（癌の代替抗原（alternate cancer antigen）標的にするモノクローナル抗体、又は他の実施形態では、本発明に係るペプチドが由来するペプチド若しくはその一部分に相当するＡＡ配列から成るエピトープを標的にするモノクローナル抗体など）と共に対象に投与される、又は本発明に係る方法で使用される。
【０２０７】
本発明では、投与量の様々な範囲が考えられる。他の実施形態では、投与量は２０μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は１０μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は３０μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は４０μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は６０μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は８０μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は１００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は１５０μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は２００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は３００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は４００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は６００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は８００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は１０００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は１５００μｇペプチド／日である。他の実施形態では、投与量は２０００μｇペプチド／日である。
【０２０８】
他の実施形態では、投与量は、１０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、３０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、４０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、６０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、８０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、１００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、１５０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、２００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、３００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、４００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、６００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、８００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、１０００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、１５００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、２０００μｇペプチド／投与である。
【０２０９】
他の実施形態では、投与量は、１０〜２０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、２０〜３０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、３０〜６０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、４０〜８０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、５０〜１００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、５０〜１５０μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、１００〜２００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、２００〜３００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、３００〜４００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、４００〜６００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、５００〜８００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、８００〜１０００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、１０００〜１５００μｇペプチド／投与である。他の実施形態では、投与量は、１５００〜２０００μｇペプチド／投与である。
【０２１０】
他の実施形態では、１回の投与当たり又は１日当たりのペプチドの全量は、上記の量の１つである。他の実施形態では、１回の投与当たりの全ペプチド投与量は、上記の量の１つである。
【０２１１】
各可能な形態は、本発明の異なる実施形態を示す。
【実施例】
【０２１２】
≪実施例１：ＨＬＡ−Ａ０２０１及び−Ａ０３０１へのＷＴ１由来の合成ペプチドアナログの結合≫
【０２１３】
＜材料及び方法＞
【０２１４】
ペプチド：
【０２１５】
ペプチドは、Genemed Synthesis Inc, CAによって、フルオレニルメチルオキシカルボニル基による化学反応及び固相合成で合成され、高圧液体クロマトグラフィー（high pressure liquid chromatography：ＨＰＬＣ）で精製された。ＨＰＬＣ分析でペプチドの性質を評価し、マトリックス支援レーザー脱離質量分析法で分子量を測定した。ペプチドは無菌状態にあり、その純度は＞９０％であった。濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように、ペプチドをＤＭＳＯに溶解してｐＨ７．４のＰＢＳ又は生理食塩水で希釈した。このペプチド溶液を−８０℃で保存した。インビトロの実験には、無関係の対照ペプチドであるＨＬＡ  Ａ２４コンセンサスを使用した。
【０２１６】
ペプチド配列の分析：
【０２１７】
ペプチドの配列分析には、２つのデータベースを使用した。第１のものは、Bioinformatics & Molecular Analysis Section（National Institutes of Health, Washington, DC）（「Parker KC et al., Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J Immunol 152: 163-175, 1994」を参照）のソフトウエアである。このソフトウエアは、ＨＬＡクラスＩ分子からの解離の予想ハーフタイムに基づいて９〜１０アミノ酸残基のペプチドにランク付けをする。第２のデータベースは、SYFPEITHI予想ソフトウエアであり、「SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50: 213-219, 1999」（Rammensee HG et al.）に記載されている。インビトロの実験のために使用された無関係の対照ペプチドは、クラスＩＩに対しては、ＲＡＳ（ＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＰＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４６）又はＣＭＬ  ｂ２ａ２（ＶＨＳＩＰＬＴＩＮＫＥＥＡＬＱＲＰＶＡＳＤＦＥ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４７）であり、クラスＩに対しては、ＨＩＶ  ｐ０１  （ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４８）又はＣＭＬ  Ｆ  （ＹＬＫＡＬＱＲＰＹ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４９）であった。
【０２１８】
細胞株：
【０２１９】
細胞株は、５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）とペニシリンとストレプトマイシンと２ｍＭのグルタミンと２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０にて、３７℃、５％のＣＯ２を含む加湿空気下で培養した。Ｔ２は、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２を欠失するヒトの細胞株なので、サイトゾルタンパク質由来のペプチドを提示することができない。Ｒａｊｉ細胞は、高レベルのＴＡＰ発現を示すバーキットリンパ腫である。
【０２２０】
実験に使用したヒトの中皮腫細胞株には、肉腫細胞（ＶＡＭＴ、Ｈ２３７３、Ｈ２８）、類上皮細胞（Ｈ２４５２）、及び２相型中皮腫細胞（ＪＭＮ、ＭＳＴＯ及びＨ−ＭｅｓｏｌＡ）が含まれる。細胞株は、次のソースから取得した。Ｈ−ＭｅｓｏｌＡは国立癌研究所（ＮＣＩ）（Bethesda, MD）から、ＪＭＮ及びＶＡＭＴは、メモリアル・スローン・ケタリング癌センター（Memorial Sloan Kettering Cancer Center：ＭＳＫＣＣ）のSirotnak博士から、Ｈ−２４５２及びＨ２３７３はウェイン州立大学のKarmanos Cancer Institute（Detroit, MI）のPass博士から、Ｈ２８及びＭＳＴＯはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ）（Manassas, VA）から取得した。細胞株は、提供者が推薦した培地にて、５％のＣＯ２を含む加湿インキュベータで培養した。
【０２２１】
中皮腫細胞株であるＭｅｓｏ１１、Ｍｅｓｏ２４、Ｍｅｓｏ３７、Ｍｅｓｏ４７、及びＭｅｓｏ５６は、M Gregoire博士（Institute of Biology, Nantes, France）から取得し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシンと１％のＬ−グルタミンとを含有するＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies）で培養した。全ての細胞には、ＭＳＫＣＣの細胞免疫部門（Department of Cellular Immunology）にてＨＬＡがタイプされた。メラノーマの細胞株であるＭｅｗｏ（ＷＴ１−、Ａ２０１＋）は、ＡＴＣＣから取得した。ＳＫＲＣ−５２腎細胞癌は、Ludwig InstituteのL. Oldから取得した。白血病細胞株は、１０％のＦＣＳ１と１％のペニシリン−ストレプトマイシンと２ｍＭのグルタミンと２−メルカプトエタノールとを含有するＲＰＭＩ１６４０にて、３７℃、５％のＣＯ２下で培養した。Ｐｈ＋白血病であるＬＡＭＡ８１、ＢＶ１７３及び６９７は、全てＷＴ１＋及びＡ０２０１＋であり、ロンドン大学のユニバーシティ・カレッジのHJ Stauss博士から提供された。ヒトＢ細胞リンパ腫であるＳＫＬＹ−１６（ＷＴ１−、Ａ０２０１＋）、並びにＷＴ１＋であるＫ５６２、ＲｗＬｅｕ４、及びＨＬ６０は、ＡＴＣＣから取得した。
【０２２２】
ペプチド結合及びＨＬＡ−Ａ０２０１分子の安定性に関するＴ２アッセイ：
【０２２３】
Ｔ２細胞（ＴＡＰ−、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋）は、５μｇ／ｍｌのヒトβ２ｍ（Sigma, St Louis, MO）を含むＦＣＳ欠失ＲＰＭＩ培地にて、１×１０６個の細胞／ｍｌの濃度、２７℃、様々な最終濃度（５０、１０、１、及び０．１μｇ／ｍｌ）の陽性基準チロシナーゼペプチド又はテストしようとするペプチドの存在下又は非存在下（陰性対照）で１晩インキュベートした。Ｔ２細胞を、５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Sigma）と共に４時間インキュベートした後に、飽和濃度の抗ＨＬＡ−Ａ２．１（ＢＢ７．２）のモノクローナル抗体で、３０分間、４℃で標識した。次に細胞を、飽和濃度のＦＩＴＣ融合抗マウスＩｇヤギＩｇＧＦ（ａｂ´）２（Caltag, San Francisco, CA）と共に、３０分間、４℃でインキュベートした。次に、細胞を２回洗浄し、１％のパラホルムアルデヒド含有のＰＢＳで固定し、FACS Calibur（登録商標）サイトフルオロメータ（cytofluorometer）（Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, San Jose, CA）で分析した。
【０２２４】
それぞれのペプチドの濃度に関して観察された平均蛍光強度（mean intensity of fluorescence：ＭＩＦ）は、ペプチド結合の指標として使用し、「蛍光インデックス」して表した。安定アッセイは、同様に行った。時間０においてペプチド結合に関する最初の評価を行った後に、ペプチドを除去するために細胞をＲＰＭＩ完全培地で洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡが常に存在する状態で２、４、６、又は８時間インキュベータした。
【０２２５】
安定なペプチド−ＨＬＡ−Ａ２．１複合体の数は、上記の免疫蛍光法で推定した。複合体のハーフタイムは、時間０におけるＭＩＦ値が５０％減少するのに必要な推定時間である。
【０２２６】
＜結果＞
【０２２７】
ＷＴ１配列から、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＨＬＡ−Ａ０３０１分子に対して親和力を有すると予想されるペプチドを同定した。ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＨＬＡ−Ａ０３０１分子に対する結合が増大すると予想されるヘテロクリティックペプチドが得られるように、表１及び２に示されているように、これらのＷＴ１天然型ペプチドを改変した。ＴＡＰ１／２陰性細胞株（Ｔ２）及びＨＬＡ−０３０１を有するＲａｊｉ細胞を使用して熱安定化アッセイ行ったところ、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＨＬＡ−０３０１分子を著しく安定させたヘテロクリティックペプチドが幾つか確認された。とりわけ、ＷＴ１−Ａ１、Ｂ１、及びＣ１は、対応する天然型のペプチドＷＴ−１Ａ、Ｂ、及びＣと比較して同様な又はより増大した結合度を示した。ＷＴ１−Ｄ１は、対応する天然型のペプチドＷＴ１−Ｄと比較して同様な又は増大した結合度を示した（図１Ａ）。ＷＴ１−Ａ、−Ｂ、及び−ＤのＨＬＡ−Ａ０３０１への結合度を、それぞれの３つのアナログのものと比較すると、同様な結果が確認された（図１Ｂ〜５Ｅ）。
【０２２８】
したがって、本発明に係るヘテロクリティックＷＴ１ペプチドの、ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合度は大きい。
表１．ＨＬＡ−Ａ０２０１に結合する、ＷＴ１由来の天然型ペプチド及びそれらの合成アナログ
2009511637.tif 000003
表２．ＨＬＡ−Ａ０２０１に結合する、ＷＴ１由来の天然型ペプチド及びそれらの合成アナログ
2009511637.tif 000004
【０２２９】
≪実施例２：ＷＴ１由来の合成ペプチドアナログに対する免疫応答の誘導≫
【０２３０】
＜材料及び方法＞
【０２３１】
ペプチド刺激：
【０２３２】
遠心分離によって、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性の健康なドナー及びＣＭＬ患者からＰＢＭＣをFicoll-Paque遠心培地（Amersham Biosciences）で精製した。末梢血の樹枝状細胞（ＤＣ）を下記のように発生させた。プラスチック付着法で、単球が濃縮したＰＢＭＣ画分を全ＰＢＭＣから単離した。プラスチックに付着した細胞を、１〜５％の自己血漿と１０００Ｕ（ユニット）／ｍＬの組換え型ヒトインターロイキン（ＩＬ）−４（Schering-Plough, N.J.）と１０００Ｕ／ｍＬの組換え型ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）でさらに培養した。
【０２３３】
インキュベーションの２日目及び４日目に、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを含有する新鮮な培地を加えた。６日目には、培地の半分を、ＩＬ−４とＧＭ−ＳＦと１０ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファ（R&D system）と５００ｎｇ／ｍｌ三量体型溶解性ＣＤ４０Ｌ（Immunex, Seattle）とを含有する培地と交換した。９日目には、細胞を回収して抗原刺激のためのＡＰＣとして使用した。細胞は、ＤＣ関連の抗原（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６など）、並びにＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩを細胞表面に発現していた。
【０２３４】
抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ５６、及び抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（Miltenyi, CA）で陰性選択することによって同じドナーからＴリンパ球を単離した。１×１０６個のＴリンパ球を、１×１０５個の自己ＤＣと共に、１０μｇ／ｍＬのペプチド及び２μｇ／ｍｌβ２マイクログロブリン含有の加熱不活性化された５％のヒト自己血漿と５ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＩＬ−７（Genzyme）と０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ１２を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、２４個のウエルで培養した。
【０２３５】
３日間培養した後、２０Ｕ／ｍｌの組換え型ＩＬ−２（Sandoz Pharmaceutical）を加えた。１０日後、磁気的に単離したＣＤ１４＋自己単球を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、及び１０μｇ／ｍＬのペプチドと共に加えることによって、１×１０６個の細胞を再び刺激した。場合によっては、さらに７日間培養した後に、同様に細胞を刺激した（３回目）。最後の刺激の後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気的に単離し、細胞傷害性及びガンマＩＦＮ分泌を評価した。
【０２３６】
＜結果＞
【０２３７】
ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドが天然型及びヘテロクリティックＷＴペプチドに対する免疫応答を発生させるかどうかを確認するために、健康なドナーのＣＤ３＋ＰＢＭＣのサブ集団を単離し、ペプチドでパルスした自己単球由来ＤＣで刺激し、次にペプチドでパルスしたＣＤ１４＋単球で再刺激した。次に、パルスしたＨＬＡ適合白血病細胞を使用して、活性化した抗原特異的なＴ細胞が存在するかどうかを確認した。ＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴ（図２Ａ）及びクロム放出アッセイ（図２Ｂ）を行ったところ、幾つかのアナログペプチドがより大きな免疫応答を発生させた（すなわち、天然型のペプチドと比較して、Ｔ細胞前駆体の頻度が増加した）ことが確認された。ドナーＣＤ３＋のサブ集団（図３のＢ〜Ｄ）及びＣＤ８＋のサブ集団（図３Ａ）を使用したところ、同様な結果が観察された。さらに、ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドで刺激されたＣＤ８＋細胞は、天然型のＷＴ１ペプチドと交差反応し、ＨＬＡ適合ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）芽球を溶解することができた（図４Ａ〜Ｂ）。
【０２３８】
したがって、本発明に係るヘテロクリティックＷＴ１ペプチドは、（ａ）炎症性サイトカインを分泌すること、及び（ｂ）ＷＴ１ペプチドを提示する細胞を溶解することができる。また、ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドによって発生したＴ細胞は、天然型及びヘテロクリティックのＷＴ１ペプチドを認識する。
【０２３９】
≪実施例３：ＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する合成ＷＴ１ペプチドの選択≫
【０２４０】
様々なＨＬＡクラスＩＩ分子と、比較的高い親和力で結合するＷＴ１ペプチドを同定するために、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）のＭＨＣデータベースを使用して、米国の白人人口におけるＨＬＡ−ＤＲＢの対立遺伝子の頻度が得られた（Wheeler DL et al., Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33:D39-45; Wheeler DL et al, Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34:D 173-80）。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測アルゴリズムを使用したところ、ＷＴ１から、比較的高い親和力でＨＬＡ−ＤＲＢと結合すると予想される２つのペプチドが同定された（表３）。
表３．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズムに基づいて、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子産物と結合すると予想されるＷＴ１の天然型ペプチド（０（低）〜２８（高））
2009511637.tif 000005
【０２４１】
表３のペプチドのＡＡ配列は、ＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（４２７）、ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ（４２３）、ＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲ（３３１）、及びＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ（３２８）である。
【０２４２】
したがって、本発明に係るＨＬＡクラスＩＩ分子結合ＷＴ１ペプチドは、多くのＨＬＡクラスＩＩ分子と結合する。
【０２４３】
≪実施例４：ＨＬＡクラスＩＩ分子と結合するＷＴ１ペプチドはＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する≫
【０２４４】
＜材料及び実験方法（この実施例及び後続の実施例）＞
【０２４５】
血液からＰＢＭＣをファイコール（Ficoll）で精製し、１％の自己血漿含有のEx-Vivo-15（登録商標）培地で５×１０６個／ｍｌになるように再懸濁した。３７℃で２時間インキュベーションした後に、非付着画分を回収し、ＰＢＳで繰り返し洗浄し、次に１×１０３ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと０．００３２ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４とを含有する培地に再懸濁した。２日目及び４日目に、再供給のために同じ培地を加えた（すなわち、皿全体に対して十分なサイトカインを含む１／２量の培地を加えた）。５日目に１０μｇ／ｍｌのペプチドを加えた。
【０２４６】
６日目に、サイトカインの成熟カクテルを加え、細胞をさらに４８時間培養した。成熟カクテルは、４×１０２ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、０．００３２ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４、１×１０３ＩＵ／ｍｌのＩＬ−６、１×１０３ＩＵ／ｍｌのＧＭＣＳＦ、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファ、及び１μｇ／ｍｌのＰＧＥ２から構成されていた。
【０２４７】
７日目に、ＤＣを回収し、ＲＰＭＩで２回洗浄し、その数を数えた。ＤＣを分割して１×１０６個／ｍｌになるようにX-vivo 15（登録商標）（血清なし）で再懸濁した。最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにペプチドを加え、２時間、３７℃、５％のＣＯ２下でインキュベートした（１５分ごとに穏やかに懸濁した）。次に、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、適切な濃度になるように（次のステップで単離されるエフェクターの数に応じて）５％の自己血漿含有のＲＰＭＩに再懸濁した。
【０２４８】
また、７日目に、別のＰＢＭＣを使用して別のＤＣ及びＣＤ３＋細胞を発生させた。付着画分からＤＣを単離し、１４日目にエフェクター細胞に第２の刺激を行うために上記のような処理をした。ＣＤ３＋細胞を、陰性選択で非付着画分から単離し、２×１０６個の細胞／ｍｌになるように５％の自己血漿含有のＲＰＭＩで再懸濁し、予め処理をしたＤＣ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を加えて刺激した（エフェクター：ＤＣ＝２０：１の比で）。次に細胞を、２ｍｌの培養液に懸濁し、３７℃、５％のＣＯ２下で１週間インキュベートした。
【０２４９】
１４日目に、第２バッチのＤＣでＣＤ３＋細胞に第２の刺激を同様に行った（但し、エフェクター：ＤＣが５０：１になるようにＤＣを１×１０６個の細胞／ｍｌのＣＤ３＋細胞と混合した）。１８日目には、再供給のために同じ培地を加えた。２０日目には、前世代のＤＣを解糖し、成熟サイトカイン含有のX-vivo 15（登録商標）培地でインキュベートした。２１日目にはｍＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
【０２５０】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
【０２５１】
プレートを７０％アルコール（３０μｌ／ウエル）で湿らせ（アルコールが表面全体を覆うようにプレートを揺らす）、滅菌ＰＢＳ（１５０μｌ／ウエル）で３回洗浄した。次に１０μｇ／ｍｌのコーティング抗体（抗ＩＮＦクローン）含有のＰＢＳをプレートに加えて（１００μｌ／ウエル）、プレートをアルミニウムホイルで包み、４℃で１晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ（１５０μｌ／ウエル）で２回洗浄し、１０％の自己血漿（ＡＰ）含有のＲＰＭＩで１回洗浄し、５％のＡＰ含有ＲＰＭＩ（１５０μｌ／ウエル）で２時間、３７℃でブロックした。１×１０６個の細胞／ｍｌになるようにＰＢＭＣを５％のＡＰ含有のＲＰＭＩに懸濁した。各ウエルに１×１０５個の細胞及び２μｇの適切なペプチド加え、容量が２００μｌ／ウエルになるように培地を加えた。対照用のウエルには、２．５ｍｇ／ｍｌのＰＨＡを加えた（１μｌ／ウエル）。プレートをアルミニウムホイルで包み、２０時間、３７℃でインキュベートした。
【０２５２】
次に、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２含有のＰＢＳで３回洗浄し、さらに、ＰＢＳで３回洗浄した。０．５％ＢＳＡ含有のＰＢＳで５００倍希釈した抗ＩＮＦ−ガンマ−ビオチン（クローン７−Ｂ６−１）を加え（１００μｌ／ウエル）、プレートを２時間、３７℃でインキュベートした。１時間３０分後、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体（Avidin-peroxidase Complex：ＡＢＣ）（Vectastain Elite Kit, Vector）を、１滴の試薬Ａ及び１滴の試薬Ｂを１０ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳに加えることで作成し、アルミニウムホイルで覆って室温で保存した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有のＰＢＳで３回洗浄し、さらに、ＰＢＳで３回洗浄した。プレートにアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を加えた（１００μｌ／ウエル）。プレートをアルミニウムホイルで覆って室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳで３回洗浄し、さらに、ＰＢＳで３回洗浄した。基質を加え（１００μｌ／ウエル）、プレートを４分間、暗下でインキュベートし、水で反応を停止した。ウエルを乾燥させ、１晩、暗下、室温で保存した。スポット数は、コンピュータ及びビデオ画像分析器をKS ELISPOT 4.0ソフトウエア（Carl Zeiss Vision, Germany）と共に使用することで自動的に得られた。
【０２５３】
基質の用意：
【０２５４】
２３．４ｍｌの脱イオン水と、２．３ｍｌの０．１Ｎ酢酸と、５．５ｍｌの０．１Ｎ酢酸ナトリウムとを混合して水溶液＃１（緩衝酢酸溶液）を作成した。１錠のＡＥＣ（Sigma）を２．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解して溶液＃２を作成した。次に、１．２５ｍｌの溶液＃２を２３．７ｍｌの溶液＃１と混合し、１３μｌの３０％のＨ２Ｏ２を加えてよく混合し、０．４５μｍのフィルターに通した。
【０２５５】
クロスプライミング実験：
【０２５６】
上記のように、ＣＤ３＋細胞をインビトロで刺激した。３回の凍結溶解サイクルで２×１０６個の腫瘍細胞から作成した細胞ライゼートと共に２×１０６個の未熟ＤＣをインキュベートした。１８時間のインキュベーションの後に、上記にしたがって成熟サイトカインをＤＣに加えた。これらの自己成熟ＤＣでＣＤ３＋細胞を３回刺激した。その後、未熟期においてＣＤ４＋ペプチドでパルスした自己成熟ＤＣに対する反応性に関して、Ｔ細胞をＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイで分析した。上記のように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの際にＤＣを再びペプチドに晒した。
【０２５７】
クロム５１細胞傷害性アッセイ：
【０２５８】
４時間の標準的クロム放出アッセイで特異的なＣＴＬが存在するかどうかを確認した。標的細胞を、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドで、１晩、３７℃でパルスし、３００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA）で標識した。よく洗浄した後に、標的細胞をＴ細胞と共にインキュベートした（Ｅ：Ｔ＝１００：１〜１０：１の比で）。これらの条件全てを３通り行った。プレートを４時間、３７℃、５％のＣＯ２下でインキュベートした。上澄みを回収し、ガンマカウンターで放射能を測定した。特異的溶解のパーセンテージは、１００×［（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］として算出した。最大放出は、２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００における放射能標識標的細胞の溶解で求めた。
【０２５９】
統計：
【０２６０】
統計分析は、対応のない両側ｔ−検定を用いてStatviewソフトウエア（SAS Institute, Cary, NC）で行った（統計的有意水準は０．０５）。
【０２６１】
＜結果＞
【０２６２】
本発明に係るＨＬＡクラスＩＩ結合ＷＴ１ペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激できるかを確認するために、健康なドナーのＣＤ４＋ＰＢＭＣサブ集団を単離し、ペプチドでパルスした自己単球由来ＤＣで刺激し、ＣＤ１４＋単球で再刺激した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴで示されたように、ペプチド３２８、及びより低い強度ではあるが、ペプチド４２３は、異なるＨＬＡ−ＤＲＢ１型の様々なドナーにおいてペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を著しく刺激した（図５）。予想通り、ＲＡＳ（無関係な対照ペプチド）又はＡＰＣのみで刺激した細胞は、バックグラウンドのレベルに対してより大きなレベルのＩＦＮ−γを生じさせなかった。
【０２６３】
したがって、本発明に係るＨＬＡクラスＩＩ結合ＷＴ１ペプチドは、ＷＴ１ペプチドを提示する細胞を認識するようにＴ細胞を刺激することができる。
【０２６４】
≪実施例５：ＷＴ１発現細胞は、本発明に係るペプチドを処理して提示する。≫
【０２６５】
ＷＴ１発現細胞が本発明に係るペプチド又は対応する天然型ペプチドを処理して提示するかどうかを確認するために、クロスプライミング試験を行った。３つの異なる細胞株（ｅ１ａ２白血病細胞株である６９７（ＷＴ１＋、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋）、２相型中皮腫細胞株であるＪＭＮ（ＷＴ１＋、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋）、及び悪性メラノーマ細胞株であるＭｅＷｏ（ＷＴ１−、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋））から腫瘍ライゼートを作成した。健康なＡ０２０１＋ドナーからのＤＣを、腫瘍のラーゼートと共に１８時間インキュベートし、自己ＣＤ３＋Ｔ細胞を刺激するのに使用した。Ｔ細胞を３回刺激した後に、ＷＴ１ペプチドでパルスした自己ＤＣに対する反応性に関して調べた。ＷＴ１＋腫瘍ラーゼートで刺激されたＴ細胞は、ＨＬＡクラスＩＩ分子結合ペプチドを認識したのに対して（図６Ａ及びＢ）、ＭｅＷｏライゼートでパルスされたＤＣによって刺激されたＴ細胞はＷＴ１特異的Ｔ細胞を刺激しなかった。陽性対照として６９７ライゼートをＥＬＩＳＰＯＴに使用したところ、４２３及び３２８とほぼ同じスポット数を示した。これらの実験を５人の異なる患者に対して繰り返し行った。刺激されたＴ細胞は、３／５の実験においてＷＴ１ＤＲペプチド３２８を認識し、全ての実験においてＷＴ１ＤＲ４２７を認識した。したがって、中皮腫細胞株においてＷＴ１の転写産物の発現が低いにも関わらず（下記参照）、本発明に係るＷＴ１は、処理され、中皮腫細胞のＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される。
【０２６６】
これらの結果は、（ａ）本発明に係るペプチドがＡＰＣによって取り込まれて抗原という形で提示されること、（ｂ）本発明に係るペプチドがＷＴ１発現腫瘍細胞に晒されたＡＰＣに提示されること、及び（ｃ）ＷＴ１  １２２及び１２２Ａ１ペプチドに晒されたＡＰＣがＷＴ１発現腫瘍細胞を認識するＴ細胞の形成を誘起することを示す。したがって、中皮腫及び白血病細胞などのＷＴ１発現細胞は、本発明に係るペプチド又は対応する天然型のペプチドを処理して提示する。
【０２６７】
≪実施例６：本発明に係るペプチドによって発生した抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＷＴ１を発現する腫瘍細胞を認識する。≫
【０２６８】
本発明に係るペプチドによって発生した抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞がＷＴ１を発現する腫瘍細胞を認識するかどうかを確認するために、ペプチドで刺激したＴ細胞をＩＦＮ−γＥｌＩＳＰＯＴにおいてＷＴ１＋及びＷＴ１陰性細胞でチャレンジさせた。対照のＷＴ１陰性中皮腫細胞と比較して、ＷＴ１ＤＲペプチドで刺激されたＴ細胞が中皮腫細胞を認識するのに十分な量のＷＴ１ペプチドがＷＴ１＋中皮腫細胞の表面上に提示されていた（図７）。したがって、本発明に係るペプチドでワクチン投与をすると、ＷＴ１を発現する腫瘍に対して活性を示す抗原特異的Ｔ細胞が発生する。
【０２６９】
≪実施例７：ヒト中皮細胞株におけるＷＴ１発現≫
【０２７０】
＜材料及び実験方法＞
【０２７１】
ＷＴ１転写産物に対する定量ＲＴ−ＰＣＲ：
【０２７２】
フェノール／クロロホルム抽出法で細胞株から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの純度は、２６０ｎｍにおける吸光度で確認した。ＲＴ反応は、Appled Biosystems（Foster City, CA）から提供されたプロトコールにしたがって行った。１ｍｃｇの全ＲＮＡと共にランダムなヘキサマー（random hexamers）及び逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを単離した。ＰＣＲ反応を行うために、ｃＤＮＡをＷＴ１プライマー及びプローブと混合した。尚、ＷＴ１のフォワード・プライマー（エキソン７に位置する）は５´−ＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３９）であり、リバース・プライマー（エキソン８に位置する）は５´−ＧＡＡＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４０）である。プローブには、Taqmanプローブ（エキソン７に位置する）を使用し、その配列は、５´−ＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＣＴＧ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４１）であった。蛍光ＷＴ１プローブ５´−５６−ＦＡＭ／ＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＡＣＴＧ／３ＢＨＱ＿１／−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４２）は、５´末端でレポーターダイとしての６-カルボキシ-フルオレセイン（ＦＡＭ）で標識し、３´末端で消光ダイであるカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識した（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）。ＰＣＲ反応のパラメータに関しては、２分間５０℃、１０分間９５℃になるように設定し、その後に１５秒間９５℃及び６０秒間６２℃のサイクルを５０回行った。１つのウエルにおいて＞１Ｃｔの不一致（discrepancies1＞ Ct）を除外した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ及び蛍光測定は、Applied Biosystems 7500 Real Time（登録商標）のＰＣＲシステムで行った。対照ＡＢＬのフォワード・プライマーは５´−ＴＧＧＡＧＡＴＡＡＣＡＣＴＣＴＡＡＧＣＡＴＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４３、ＥｎＦ−１００３０に位置する）であり、リバース・プライマーは５´−ＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＣＣＡ−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４４、ＥＮＲ−１０６３に位置する）であった。蛍光プローブは、５´−／５６ＦＡＭ／ＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴ／３ＢＨＱ＿ｌ／−３´（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４５、ＥＮＰｒ−１０４３に位置する）であった。
【０２７３】
＜結果＞
中皮腫細胞におけるＷＴ１発現レベルを確認するために、ヒトの中皮腫細胞株（肉腫様、類上皮、二相型）におけるＷＴ１の転写物をＲＴ−ＰＣＲで定量し、ＷＴ１を発現すると知られる様々な白血病細胞株と比較した。１２／１２の中皮腫細胞株はＷＴ１メッセージＲＮＡを発現し、多くの場合、そのレベルは白血病細胞株よりも低かった（図８）。対照的に、メラノーマ（ＭｅＷｏ）及びリンパ腫（ＳＫＬＹ１６）細胞株はＷＴ１陰性であった。成熟有足腎細胞が低レベルのＷＴ１発現を示すにも関わらず、ヒト腎細胞癌の細胞株であるＳＫ−ＲＣ−５２は、ＷＴ１を発現しなかった。フローサイトメトリー分析により、全ての中皮腫細胞がクラスＩＩ分子を発現し、その一部（ＪＭＮ及びＨ−２４５２）がクラスＩ分子を発現したことが確認された。
【０２７４】
したがって、本発明に係る方法は、中皮腫細胞に対する免疫応答の誘導及びワクチン投与に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１Ａ】ＨＬＡ−Ａ０２０１細胞における天然型及び合成ＷＴ１ペプチドのＴ２安定アッセイを示す図。Ｘ軸は、テストしたペプチドのウエル当たりの濃度である。
【図１Ｂ−Ｃ】ＨＬＡ−Ａ０３０１細胞における天然型及び合成ＷＴ１ペプチドのＴ２安定アッセイを示す図。蛍光インデックスは、ペプチドをテストした際の平均蛍光度：ペプチドが無い場合の平均蛍光度の比である。Ｘ軸は、テストしたペプチドのウエル当たりの濃度である。
【図１Ｄ−Ｅ】ＨＬＡ−Ａ０３０１細胞における天然型及び合成ＷＴ１ペプチドのＴ２安定アッセイを示す図。蛍光インデックスは、ペプチドをテストした際の平均蛍光度：ペプチドが無い場合の平均蛍光度の比である。Ｘ軸は、テストしたペプチドのウエル当たりの濃度である。
【図２】健康なＨＬＡ−Ａ０２０１ドナーのＣＤ３＋を、ペプチドでパルスしたＴ２細胞と反応させたときのガンマインターフェロン（ＩＮＦ）ＥＬＩＳＰＯＴ（Ａ）及び細胞傷害性（Ｂ）の結果を示す図である。尚、それぞれのバーはＴ２細胞のパルスに使用したペプチドを示す。第１のバーはペプチド無し、第２のバーは刺激に使用されたペプチドと同じペプチド、第３のバーは対応する天然型のペプチド、第４のバーは陰性対照のペプチドである。Ｘ軸は、刺激に使用されたペプチドである。実験は、３回行われ、３〜５回確認された。
【図３Ａ−Ｂ】図２と同様に、健康なＨＬＡ−Ａ０２０１ドナーからのＣＤ８＋（Ａ）及びＣＤ３＋（Ｂ）のガンマＩＦＮに対するＥＬＩＳＰＯＴを示す図である。各バーが示すペプチドの種類は、図２と同様である。
【図３Ｃ−Ｄ】図２と同様に、健康なＨＬＡ−Ａ０２０１ドナーからのＣＤ３＋のガンマＩＦＮに対するＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す図である。各バーが示すペプチドの種類は、図２と同様である。尚、図３のＢ、Ｃ、及びＤは、同じ実験を繰返して行った際の結果を示す。
【図４】合成ＷＴ１−Ａ１ペプチドで刺激したＨＬＡ−Ａ０２０１ドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の、天然型ペプチド配列を提示するＣＭＬ芽球に対する細胞傷害性アッセイの結果を示す図である。Ａは結果のバーグラフである。各シリーズにおける第１のバーは、ＳＫＬＹ−１６（ＷＴ１−）、第２のバーはＢＶ１７３（ＷＴ１＋）、第３のバーはＬＡＭ８１（ＷＴ１＋）、第４のバーはＣＭＬＡ（陰性対照）である。Ｂは死滅曲線である。四角印はＳＫＬＹ−１６である。ダイヤモンド印は６９７細胞である。Ｇ３、Ｆ４、Ｃ５、及びＧ５は、インビトロでの複数の刺激の後に発生した健康なＨＬＡ−Ａ０２０１ドナー由来のＴ細胞クローンである。Ｙ軸は、細胞傷害性のパーセンテージである。Ｘ軸は、Ｔ細胞：標的細胞の比である。
【図５（１）】異なる種類のＨＬＡ−ＤＲＢ１を有する健康なドナー由来のＣＤ３＋Ｔ細胞をＷＴ１ペプチドで刺激した後にガンマＩＦＮに対してＥＬＩＳＰＯＴを行ったときの結果を示す図である。Ｙ軸は、細胞傷害性のパーセンテージである。Ｘ軸はエフェクター細胞：標的細胞の比である。
【図５（２）】異なる種類のＨＬＡ−ＤＲＢ１を有する健康なドナー由来のＣＤ３＋Ｔ細胞をＷＴ１ペプチドで刺激した後にガンマＩＦＮに対してＥＬＩＳＰＯＴを行ったときの結果を示す図である。ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ａ：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１００１／１５０１、Ｂ：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７０１／１２０２、Ｃ：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１／９０１、Ｄ：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０７／１３０２）をペプチドＷＴ１ＤＲ３２８又はＷＴ１ＤＲ４２３で２回刺激した。刺激したＴ細胞を、ＩＦＮガンマに対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて次の細胞でチャレンジさせた。灰色のバー：未チャレンジ対照、黒色のバー：刺激ペプチド（ＷＴ１ＤＲ３２８又はＷＴ１ＤＲ４２３）でパルスしたＣＤ１４＋細胞、白色のバー：無関係のＣＤ４＋ペプチドエピトープ（ＲＡＳ）でパルスしたＣＤ１４＋細胞、斜線模様のバー：パルスしていないＣＤ１４＋細胞。＊対照と比較して、ｐ＜０．０５である。Ｙ軸は、１×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞当たりのスポット数である。Ｘ軸は、Ｔ細胞の刺激に使用したペプチドである。
【図６】本発明に係るペプチドが処理され、提示され、ヒトのＴ細胞によって認識されることを示す図である。Ａ：予め６９７腫瘍ライゼートと共にインキュベートした自己ＤＣで、ＨＬＡ−Ａ０２０１／３０１、ＤＲＢ１＊１３０１／１３０２の健康なドナーからのＣＤ３＋Ｔ細胞を刺激した。ＩＦＮガンマに対するＥＬＩＳＰＯＴにおいて、予め６９７腫瘍ライゼート、ＷＴ１ペプチド、又は対照ペプチドと共にインキュベートした自己ＤＣ又は未パルスのＤＣ（ｘ軸）でＣＤ３＋Ｔ細胞をチャレンジした。Ｂ：予めＪＭＮ（黒のバー）又はＭｅＷｏ（白のバー）のライゼートと共にインキュベートした自己ＤＣで、ＨＬＡ−Ａ０２０１／１０１、ＤＲＢ１＊０３０１／１６０１の健康なドナーからのＣＤ３＋Ｔ細胞を刺激した。ＩＦＮガンマに対するＥＬＩＳＰＯＴにおいて、予めＪＭＮ若しくはＭｅＷｏ腫瘍ライゼート、ＷＴ１ＤＲペプチド、又は対照クラスＩＩペプチド（ｘ軸）と共にインキュベートした自己ＤＣでＴ細胞をチャレンジした。斜線模様のバーは、Ｔ細胞の非存在下でインキュベートした自己ＤＣからのスポットのバックグラウンド・レベルである。＊対照ペプチドに対してＰ＜０．０５である。Ｙ軸は、１×１０５個のＣＤ３＋細胞当たりのスポット数である。
【図７】中皮腫細胞株でチャレンジさせたＣＤ３＋細胞のガンマインターフェロンに対して行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。ＨＬＡ−Ａ０２０１ドナー由来の全ＰＢＭＣを、異なるＷＴ１ＤＲペプチドで２回刺激し、ＩＦＮ−ガンマに対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて中皮腫Ｈ−Ｍｅｓｏ１Ａ細胞株（黒のバー：ＷＴ１＋、Ａ０２０１＋）又は対照メラノーマＭｅＷｏ細胞株（灰色のバー：ＷＴ１ー、Ａ０２０１＋）でチャレンジした。＊対照細胞株ＭｅＷｏに対してＰ≦０．０１である。Ｙ軸は、２×１０５個のＰＢＭＣ当たりのスポット数である。Ｘ軸は、細胞の刺激に使用されたペプチドを示す。
【図８】中皮腫細胞株でチャレンジさせたＣＤ３＋細胞のガンマインターフェロンに対して行ったＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。ＨＬＡ−Ａ０２０１ドナー由来の全ＰＢＭＣを、異なるＷＴ１ＤＲペプチドで２回刺激し、ＩＦＮ−ガンマに対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて中皮腫Ｈ−Ｍｅｓｏ１Ａ細胞株（黒のバー：ＷＴ１＋、Ａ０２０１＋）又は対照メラノーマＭｅＷｏ細胞株（灰色のバー：ＷＴ１ー、Ａ０２０１＋）でチャレンジした。＊対照細胞株ＭｅＷｏに対してＰ≦０．０１である。Ｙ軸は、２×１０５個のＰＢＭＣ当たりのスポット数である。Ｘ軸は、細胞の刺激に使用されたペプチドである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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【図５（１）】
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【図５（２）】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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