(57)【要約】  本発明は、歯周病の予防及び治療において用いられ得るヘム利用能により調節されると同定されるポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質を基礎にしたワクチン組成物及び方法に関する。特に２つの特定のインターナリン様ポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質、即ち宿主細胞によるポルフィロモナス・ジンジバリスのインターナリゼーションに関与するＰＧ０３５０及びＰＧ１３７４、細胞表面リポタンパク質であるとされる仮説的タンパク質ＰＧ１０１９、並びにアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼタンパク質ＰＧ０６１８は、歯周病の予防及び治療のための有用な標的と同定された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離抗原性ポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドであって、以下の：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＧ０３５０タンパク質；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＧ１３７４タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＰＧ１０１９タンパク質；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＰＧ０６１８タンパク質；
（ｖ）配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｖｉ）配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３若しくは配列番号４の連続アミノ酸配列と同一の少なくとも１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列
から成る群から選択される、単離抗原性ポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号２又は配列番号３又は配列番号４の前記アミノ酸配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２又は配列番号３又は配列番号４の連続アミノ酸配列と同一である少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個又は１００個のアミノ酸の連続配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリスに向けられる免疫応答を惹起するのに用いるためのワクチン組成物であって、有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチド、並びに薬学的に許容される担体を含む、ワクチン組成物。
【請求項５】
歯周病に関して被験体を予防するか又は治療する方法であって、請求項４に記載のワクチン組成物を前記被験体に投与することを包含する、歯周病に関して被験体を予防するか又は治療する方法。
【請求項６】
被験体における歯周病の治療のための薬剤の製造における請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドの使用。
【請求項７】
前記被験体がヒト、ヒツジ、畜牛、ウマ、ウシ、ブタ、家禽、イヌ及びネコから成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
ポリクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
歯周病の予防又は治療に有用な組成物であって、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体並びに薬学的に許容される担体を含む、歯周病の予防又は治療に有用な組成物。
【請求項１３】
歯周病の進行に関与するポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドの同定方法であって、以下の：
ａ）ヘム制限条件下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスにより産生されるポリペプチド又はそのペプチドの相対量を測定する工程；並びに
ｂ）工程ａ）より高いヘム条件下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスにより産生されるポリペプチド又はそのペプチドの相対量を測定する工程
を包含する方法であり、工程ｂ）と比較した場合の工程ａ）で検出される前記ポリペプチド又はそのペプチド断片の量の増大が前記ポリペプチドが歯周病の進行に関与するということを示す、歯周病の進行に関与するポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドの同定方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）のヘム制限条件でのヘミン濃度が約０．１μｇ／ｍＬ〜約０．５μｇ／ｍＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｂ）のより高いヘム条件でのヘミン濃度が５μｇ／ｍＬを超える、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）のヘム制限条件における並びに前記工程（ｂ）のより高いヘム条件でのポリペプチドの相対量が定性プロテオミクス手法を用いて測定される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドの前記量が溶液中及びゲル中消化並びにＬＣ−ＭＳ／ＭＳの組合せ戦略を用いて、或いはＭＳと組合せた安定同位体標識戦略（ＩＣＡＴ）を用いた分析により測定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
各鎖中に少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む干渉ＲＮＡ分子であって、前記二本鎖領域の鎖のうちの１つが配列番号５又は配列番号６又は配列番号７又は配列番号８の領域と相補的である、各鎖中に少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む干渉ＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記干渉ＲＮＡの前記二本鎖領域が少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも２５塩基対、最も好ましくは少なくとも３０塩基対を前記二本鎖領域の各鎖中に含む、請求項１８に記載の干渉ＲＮＡ分子。
【請求項２０】
歯周病に関する被験体の治療方法であって、請求項１８又は請求項１９に記載の少なくとも１つの干渉ＲＮＡ分子を前記被験体に投与することを包含する、歯周病に関する被験体の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病の予防及び治療に有用なポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）タンパク質の組成物及び単離方法に関する。より詳細には、本発明は、歯周病の予防及び治療に用いられ得るヘム利用能により調節されることが同定されたポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質を基礎にしたワクチン組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、歯を支持する歯茎及び骨に影響を及ぼす慢性細菌感染である。歯周病は、プラーク（歯の上に絶えず生じる粘着性バイオフィルム）中の細菌が歯茎を炎症させるようになると開始する。歯周病は、歯肉組織（歯茎）；歯根膜（セメント質及び歯槽骨中に埋め込まれる結合組織）；セメント質（歯根を覆っている石化結合組織）；並びに歯槽骨（骨槽窩）に影響を及ぼし得る。疾患の進行によって、歯根膜の破壊、歯槽骨損失並びに結合組織性付着の根尖側移動が起こり得る。進行型歯周病は、細菌プラークを保有する歯周ポケットの形成、歯の進行性弛緩及び結果的損失を生じ得る。歯周病は、歯周炎に進み得る歯肉炎を包含する。慢性歯周炎は、歯肉下歯垢中の特定細菌に関連した歯の支持組織の炎症性疾患である。当該疾患は、約３５％の有歯成人に影響を及ぼし、そして西欧諸国における歯牙損失の一主因である（１）。歯肉下歯垢の正常口腔内微生物相の一成員であるポルフィロモナス・ジンジバリスは、この疾患の進行における主要な日和見病原体の１つとして関連付けられてきた（２）。
【０００３】
ポルフィロモナス・ジンジバリスは、エネルギー産生のためのアミノ酸の発酵に頼る黒色色素性、糖非分解性のグラム陰性嫌気性球桿菌である（３）。大半の細菌と同様に、ポルフィロモナス・ジンジバリスは、それが、配位第一鉄原子を有するプロトポルフィリンＩＸ環（ＰＰＩＸ）から成る分子をヘムの形態で優先的に獲得する鉄に対する必須増殖要件を有する（４）。鉄供給源としてのヘムのこの利用は、ポルフィロモナス・ジンジバリスがｄｅ  ｎｏｖｏでＰＰＩＸを合成できないことを反映し得る（５）。ヘムはヘモグロビンから優先的に得られ、そしておそらくはＴｏｎＢ連結外膜受容体ＨｍｕＲと協力して（８）、細胞表面Ａｒｇ及びＬｙｓ特異的プロテイナーゼ／アドヘシン複合体の活性により獲得される（４，６，７）。シデロフォアを用いて鉄を得る好気性細菌又は通性細菌と違って、ポルフィロモナス・ジンジバリスはシデロフォアを産生せず、そして通常はシデロフォア媒介性鉄獲得と関連する第二鉄レダクターゼ活性を欠く（９，１０）。ポルフィロモナス・ジンジバリスは、酸化的攻撃から細胞を保護するのに役立つ固有のカタラーゼ活性を有するμ−オキソビス−ヘムの形態でヘムをその表面に貯蔵する（１１）。口腔の微量栄養素制限環境内の多数且つ多様な細菌と競合可能であり得る（１２）ポルフィロモナス・ジンジバリスに関しては、それはそれ自体を定着しなければならないだけでなく、多数の宿主防御を忌避するか又は克服しなければならない。
【０００４】
歯周病の開始及び進行は、疾患の部位での出血と関連し、それにより高レベルのヘモグロビンを提供する。したがって、ポルフィロモナス・ジンジバリスが歯肉下歯垢中で定着し、増殖する、そして疾患を開始するメカニズムの理解を助けるために、貧（ヘム制限）微量栄養素条件から富（ヘム過剰）微量栄養素条件への移行中の相対的タンパク質存在量の変化を測定することは重要である。
【０００５】
多数のタンパク質がヘム制限下での増殖と関連付けられてきたが（９，１３）、しかしポルフィロモナス・ジンジバリスプロテオーム又はヘム制限中のプロテオームへの変化に関する広範な研究は報告されていない。
【０００６】
歯周病の予防及び治療に有用である組成物を開発するに際しては、疾患過程の初期段階を妨害し、防止する作用物質を同定することが望ましい。
【０００７】
ここで本発明者らは、歯周病の予防及び治療のための適切な標的として用いられ得るヘム利用能により調節される特定のポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質を同定するための方法を開発した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの代謝、病原性及び宿主細胞の侵襲に関与するヘム利用能により調節されるポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質の同定方法を首尾よく開発した。特に２つの特定のインターナリン様ポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質、即ち宿主細胞によるポルフィロモナス・ジンジバリスのインターナリゼーションに関与するＰＧ０３５０及びＰＧ１３７４、細胞表面リポタンパク質であるとされる仮説的タンパク質ＰＧ１０１９、並びにアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼタンパク質ＰＧ０６１８は、歯周病の予防及び治療のための有用な標的と同定された。
【０００９】
本発明の第一の態様は、単離抗原性ポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドであって、以下の：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＧ０３５０タンパク質；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＧ１３７４タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＰＧ１０１９タンパク質；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＰＧ０６１８タンパク質；
（ｖ）配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｖｉ）配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３若しくは配列番号４の連続アミノ酸配列と同一の少なくとも１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列
から成る群から選択されるポリペプチドである。
【００１０】
本発明の第二の態様は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリスに向けられる免疫応答を惹起するのに用いるためのワクチン組成物であって、有効量の本発明の第一の態様の少なくとも１つのポリペプチド、並びに薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００１１】
本発明の第三の態様は、歯周病に関して被験体を予防するか又は治療する方法であって、本発明によるワクチン組成物を被験体に投与することを包含する方法である。
【００１２】
本発明の第四の態様は、本発明の第一の態様のポリペプチドに対して惹起される抗体である。好ましくは抗体は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する。
【００１３】
本発明の第五の態様は、歯周病の予防又は治療に有用な組成物であって、本発明の第四の態様の抗体並びに薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００１４】
本発明の第六の態様は、歯周病の進行に関与するポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドの同定方法であって、以下の：
ａ）ヘム制限条件下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスにより産生されるポリペプチド又はそのペプチドの相対量を測定する工程；並びに
ｂ）工程ａ）より高いヘム条件下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスにより産生されるポリペプチド又はそのペプチドの相対量を測定する工程
を包含する方法であり、工程ｂ）と比較した場合の工程ａ）で検出されるポリペプチド又はそのペプチド断片の量の増大がポリペプチドが歯周病の進行に関与するということを示す方法である。
【００１５】
本発明の第七の態様では、各鎖中に少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む干渉ＲＮＡ分子であって、上記二本鎖領域の鎖のうちの１つが配列番号５又は配列番号６又は配列番号７又は配列番号８の領域と相補的である干渉ＲＮＡ分子が提供される。
【００１６】
本発明の第八の態様では、被験体における歯周病の治療のための薬剤の製造における本発明の第一の態様の少なくとも１つのポリペプチドの使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヘム制限下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスからのタンパク質を同定するために用いられる組合せ戦略の概略図である。超遠心分離を用いて溶解細胞を可溶性及び不溶性画分に前分画し、その後、これら２つの画分を分析した。分離及び分析手順は、２つの主な方法、即ち気相分別によるＬＣＭＳとｇｅＬＣＭＳとから成る。
【図２】ＩＮＣＡ（１４）を用いて算定される同定ポルフィロモナス・ジンジバリスプロテオソーム及び予測ポルフィロモナス・ジンジバリスゲノムのコドン使用頻度指数（ＣＡＩ）分布を示すグラフである。リボソームシンターゼ及びｔＲＮＡシンターゼは高度発現遺伝子として定義された。コドンが１００個未満の遺伝子は除外し、全算定遺伝子を１６８５個とした。
【図３】単一ペプチドの検出に基づいたＰＧ０３９０の分析及び同定を示す図である。（Ａ）総イオンクロマトグラム。（Ｂ）５４．８分での質量スペクトル。差込図はｍ／ｚ  ７０３．９及び７０８．４での拡大ＩＣＡＴペプチドイオン対（比  １：２）（Ｌ／Ｈ）を示す。（Ｃ）前駆体ｍ／ｚ  ７０３．９に関する生成物イオンスペクトル。このペプチドイオンは、配列ＬＶＤＬＮＣ＊ＦＤＩＫ（ＭＡＳＣＯＴスコア＝４０；Ｃ＊はＩＣＡＴ修飾システインを意味する）を有すると同定された。
【図４】ヘム過剰を上回るヘム制限の比率を基礎にしたタンパク質存在量の分布を示す図である（Ｌｏｇ２スケールでのすべての一単位は２倍変化を示す）。
【図５】ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（◆）及びＥＣＲ３１２（■）によるＫＢ細胞への結合を示す図である。２つの生物学的複製（ｎ＝６）を用いて、検定を実行した。差込図は、前方及び側方散乱特性を基礎にした生ＫＢ細胞のゲーティングを示し（左上）、５つのピークは、２５０〜１２５０のポルフィロモナス・ジンジバリス：ＫＢ細胞比でのＫＢ細胞との結合ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（右上）、並びにＥＣＲ３１２（右下）のＦＩＴＣ蛍光を表わす。
【図６】ＰＧ０３５０タンパク質のアミノ酸配列（配列表中にも示されるように配列番号１と呼ばれる）を示す図である。
【図７】ＰＧ１３７４タンパク質のアミノ酸配列（配列表中にも示されるように配列番号２と呼ばれる）を示す図である。
【図８】ＰＧ１０１９タンパク質のアミノ酸配列（配列表中にも示されるように配列番号３と呼ばれる）を示す図である。
【図９】ＰＧ０６１８タンパク質のアミノ酸配列（配列表中にも示されるように配列番号４と呼ばれる）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、歯周病の予防及び治療のための有用な標的としてのヘム利用能により調節されるポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質の同定を有利に提供する。好ましくは本発明は、歯周病の予防及び治療のための有用な標的としてのヘム制限により上方調節されるポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質の同定を提供する。
【００１９】
特に本発明は、単離抗原性ポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドであって、以下の：
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＰＧ０３５０タンパク質；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＧ１３７４タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＰＧ１０１９タンパク質；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＰＧ０６１８タンパク質；
（ｖ）配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｖｉ）配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３若しくは配列番号４の連続アミノ酸配列と同一の少なくとも１０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列
から成る群から選択されるポリペプチドを提供する。
【００２０】
好ましくは、単離抗原性ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２又は配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。
【００２１】
好ましくは、単離抗原性ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２又は配列番号３又は配列番号４の連続アミノ酸配列と同一である少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個又は１００個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【００２２】
好ましい一実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＰＧ１３７４又はＰＧ０３５０又はＰＧ１０１９又はＰＧ０６１８タンパク質の親水性表面露出領域を構成するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
「ペプチド、タンパク質及びポリペプチド」という用語は、本明細書中では互換的に用いられる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、例えば融合ポリペプチドを含み得る。融合ポリペプチドの製造方法は、当業者に周知である。
【００２４】
当業者により十分に理解されるように、配列表中に示されたアミノ酸配列に改変がなされ得る。これらの改変は、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換であり得る。改変ポリペプチドは、天然（即ち、天然供給源から精製又は単離される）又は合成（例えばコード化ＤＮＡ上での部位特異的突然変異誘発）であり得る。配列表に示された配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するこのような改変ポリペプチドは本発明の範囲内である、と意図される。これらの改変ポリペプチドに対して産生される抗体はさらにまた、配列表に示された配列のうちの１つを有するポリペプチドと結合するであろう。
【００２５】
保存的置換の概念は当業者により十分に理解されるが、一方、分かり易くするためには、保存的置換は以下に記述されるものである：
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ；
Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び
Ｐｒｏ、Ｎα−アルキル（alkal）アミノ酸。
【００２６】
本発明の実行は、別記しない限り、当業者に周知の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を用いる。このような技法は、Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)（１５）、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)（１６）、Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)（１７）、Glover & Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)（１８）及びAusubel et al., (Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、今日までのすべての最新情報を含む)（１９）のような出典の文献全体に記載され、説明されている。これらのテキストの開示内容は、参照により本明細書中で援用される。
【００２７】
「単離ポリペプチド」とは、本明細書中で用いる場合、それが天然に生じるか、或いはそれを用いてポリペプチド又はペプチドが合成的に合成され得る他のタンパク質、脂質及び核酸から分離されたポリペプチドを指す。好ましくはポリペプチドは、それを精製するために用いられる物質、例えば抗体又はゲルマトリックス、例えばポリアクリルアミドからも分離される。好ましくはポリペプチドは、精製調製物の乾燥重量の少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％及び８０％を構成する。好ましくは調製物は、タンパク質シーケンシングを可能にするのに十分な量のポリペプチドを含有する（即ち、少なくとも１ｍｇ、１０ｍｇ又は１００ｍｇ）。
【００２８】
本明細書中に記載される単離ポリペプチドは、標準技法、例えばカラムクロマトグラフィー（タンパク質産物と相互作用する種々のマトリックス、例えばイオン交換マトリックス、疎水性マトリックス等を使用する）、アフィニティークロマトグラフィー（タンパク質又はタンパク質と結合するその他のリガンドに特異的な抗体を利用する）により精製され得る。
【００２９】
「抗原性ポリペプチド」とは、本明細書中で用いる場合、検出可能な抗原−抗体複合体を形成するのに十分に高い親和性を有する特定の抗体と結合可能なポリペプチド、その類似体又は断片のような部分である。好ましくは抗原性ポリペプチドは、宿主動物中で体液性及び／又は細胞性の免疫応答を引き出すことが可能な免疫原性構成成分を含む。
【００３０】
「連続アミノ酸配列」とは、本明細書中で用いる場合、アミノ酸の連続伸長を指す。
【００３１】
２つのアミノ酸配列が指定パーセンテージ限度内に入るか否かを決定するに際して、配列の並列比較又は多重アラインメントを実行することが必要である、ということに当業者は気付くだろう。このような比較又はアラインメントでは、アラインメントを実施するために用いられるアルゴリズムによって、非同一残基の位置決めにおいて差異が生じる。本発明の状況では、２つ以上のアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性又は類似性への言及は、当業者に既知の任意の標準アルゴリズムを用いて測定されるような上記の配列間のそれぞれ同一の及び類似の残基の数を指すと解釈される。例えばアミノ酸配列同一性又は類似性は、ＧＡＰプログラムを用いて算定され得るし、及び／又はComputer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America（２０）のＰＩＬＥＵＰプログラムを用いて整列され得る。ＧＡＰプログラムは、Needleman and Wunsch（２１）のアルゴリズムを利用して、同一の／類似の残基の数を最大化し、そしてアラインメント中の配列ギャップの数及び長さを最小化する。代替的に又はさらに、２つより多くのアミノ酸配列が比較される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（２２）が用いられる。
【００３２】
本発明は、被験体においてポルフィロモナス・ジンジバリスに向けられる免疫応答を惹起するのに用いるためのワクチン組成物であって、有効量の本発明の第一の態様の少なくとも１つのポリペプチド並びに薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。
【００３３】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫を付与するために用いられ得る少なくとも１つの抗原を含む抗原性ポリペプチドを含む。本発明の方法により治療される被験体は、ヒト、ヒツジ、畜牛、ウマ、ウシ、ブタ、家禽、イヌ及びネコから成る群から選択され得るが、これらに限定されない。好ましくは、被験体はヒトである。ポルフィロモナス・ジンジバリスに対して向けられる免疫応答は、被験体の免疫系が特定の抗原性ポリペプチドに対する抗体を産生する場合、被験体において達成される。
【００３４】
ワクチン組成物は、好ましくは、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫を誘導し、それにより歯周病を予防するために被験体に投与される。「有効量」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する免疫応答を引き出すのに十分な用量を意味する。これは、被験体並びにポルフィロモナス・ジンジバリス感染のレベルによって変わり、そして終局的には担当する科学者、医者又は獣医により決定される。
【００３５】
本発明のワクチン組成物は、ヒト又は動物被験体に投与するのに適した適切な薬学的に許容される担体、例えば希釈剤及び／又はアジュバントを含む。ワクチンは、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対する特定の免疫応答を惹起するために、好ましくは、鼻噴霧により、或いは注射により、経口的に送達するための適切なアジュバントを含む。本発明のワクチンは、本発明の抗原性ポリペプチドをコードする組換え核酸配列にも基づき得るが、この場合、当該核酸配列は、適切なベクター中に組入れられて、ベクターを含有する適切な形質転換宿主（例えば大腸菌、枯草菌、サッカロミセス・セレビシエ（saccharomyces cerevisiae）、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞及びＨｅＬａ細胞）中で発現される。ワクチンは、本明細書中に示されるような組換えＤＮＡ法を用いて製造され得るし、或いは本発明に記載されるアミノ酸配列から化学的に合成され得る。付加的には、本発明によれば、抗原性ポリペプチドを用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリスにより引き起こされる歯周病及び感染に対する受動免疫化のために有用なポルフィロモナス・ジンジバリス抗血清を生成し得る。
【００３６】
当業者に既知の種々のアジュバントは、ワクチン処方物と関連して一般的に用いられる。アジュバントは、免疫応答を調整することにより、そしてワクチン抗原が単独で投与された場合より少量のワクチン抗原又はより少ない用量を用いて、より永続的な且つより高レベルの免疫を獲得するに際して、助けとなる。アジュバントの例としては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、アジュバント６５（ピーナツ油、モノオレイン酸マンニド及びモノステアリン酸アルミニウムを含有）、オイルエマルジョン、Ｒｉｂｉアジュバント、プルロニック・ポリオール、ポリアミン、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｑｕｉｌ  Ａ、サポニン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１及びミネラルゲル、例えばアルミニウム塩が挙げられる。その他の例としては、水中油型エマルジョン、例えばＳＡＦ−１、ＳＡＦ−０、ＭＦ５９、SeppicのＩＳＡ７２０、並びにその他の粒状アジュバント、例えばＩＳＣＯＭ及びＩＳＣＯＭマトリックスが挙げられる。アジュバントの他の例の広範なしかし包括的な一覧は、Cox and Coulter 1992（２３）に列挙されている。アジュバントのほかに、ワクチンは、必要に応じて、従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、緩衝剤又は希釈剤を含み得る。アジュバントを含有する1回又は複数回用量のワクチンが、歯周病を防止するために予防的に、或いはすでに存在する歯周病を治療するために治療的に投与され得る。
【００３７】
別の好ましいワクチン組成物において、調製物は、粘膜アジュバントと組合され、そして口又は鼻経路を介して投与される。粘膜アジュバントの例は、コレラ毒素及び易熱性大腸菌毒素、これらの毒素の非毒性Ｂサブユニット、低減毒性を示すこれらの毒素の遺伝子突然変異体である。抗原性ポリペプチドを経口的又は経鼻的に送達するために利用され得るその他の方法としては、消化管又は鼻腔からのマイクロスフェアの取り込みを手助けするための、そしてタンパク質の分解を防ぐための、マイクロカプセル封入による生分解性ポリマー（例えばアクリレート又はポリエステル）の粒子中へのポリペプチドの組入れが挙げられる。リポソーム、ＩＳＣＯＭ、ヒドロゲルは、粘膜免疫系への抗原性ポリペプチドの送達のためのＬＴＢ、ＣＴＢ又はレクチン（マンナン、キチン及びキトサン）のような標的分子の組入れによりさらに増強され得る他の可能な方法の例である。ワクチン並びに粘膜アジュバント又は送達系のほかに、ワクチンは、従来の薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、コーティング、分散媒質、抗菌剤及び抗真菌剤、緩衝剤又は希釈剤を必要に応じて含み得る。
【００３８】
この実施形態の別の方式は、ポルフィロモナス・ジンジバリスにより引き起こされる感染に対して防御するために用いられる生組換えウイルスワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え弱毒化細菌ワクチン、又は不活性化組換えウイルスワクチンを提供する。ワクチンウイルスは、他の生物体由来のワクチン抗原を発現するよう工学処理される感染性ウイルスの当該技術分野における最も良く知られた例である。それ自体が疾患を引き起こさないよう弱毒化されるか又はそうでなければ処理される組換え生ワクシニアウイルスは、宿主を免疫化するために用いられる。宿主内の組換えウイルスのその後の複製は、抗原性ポリペプチドのようなワクチン抗原による免疫系の連続的刺激を提供し、それにより長期継続性免疫を提供する。
【００３９】
他の生ワクチンベクターとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、好ましくはポックスウイルス、例えばワクシニア（２４）、並びに弱毒化サルモネラ菌株（２５〜２８）が挙げられる。生ワクチンは、免疫系を連続的に刺激し、実質的に長期継続性の免疫を付与し得るため、特に有利である。免疫応答がその後のポルフィロモナス・ジンジバリス感染に対して防御的である場合、生ワクチンそれ自体はポルフィロモナス・ジンジバリスに対する防御ワクチンで用いられ得る。特に、生ワクチンは、口腔の共生棲息生物である細菌を基礎にし得る。この細菌は、組換え不活性化ポリペプチドを保有するベクターで形質転換されて、次に、口腔、特に口腔粘膜にコロニー形成するために用いられ得る。一旦口腔粘膜にコロニーが形成されると、組換えタンパク質の発現は、粘膜関連リンパ系組織を刺激して、中和抗体を産生する。例えば分子生物学技法を用いて、ポリペプチドをコードする遺伝子は、エピトープの発現を可能にするが、ワクシニアウイルスベクターの増殖又は複製に負の影響を及ぼさない部位でウイルスゲノムＤＮＡ中に挿入され得る。その結果生じる組換えウイルスは、ワクチン処方物中の免疫原として用いられ得る。同一方法を用いて、不活化組換えウイルスワクチン処方物を構築し得るが、但し、組換えウイルスは、例えば免疫原として用いる前に、そして発現免疫原の免疫原性に実質的に影響を及ぼすことなく、当該技術分野で既知の化学的手段により、不活性化される。
【００４０】
能動免疫化に代わり得るものとして、免疫化は受動的、即ち本発明のポリペプチドに対する抗体を含有する精製免疫グロブリンの投与を包含する免疫化であり得る。
【００４１】
本発明の方法及び組成物に用いられる抗原性ポリペプチドは、適切な賦形剤、例えば乳化剤、界面活性剤、安定剤、染料、浸透強化剤、酸化防止剤、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム及びケイ酸と組合せられ得る。抗原性ポリペプチドは、好ましくは滅菌水溶液として処方される。本発明のワクチン組成物は、歯周病のための現行治療を補足するために用いられ得る。
【００４２】
本発明の第三の態様は、歯周病に関する被験体の予防又は治療方法であって、本発明によるワクチン組成物を被験体に投与することを包含する方法である。
【００４３】
本発明の方法では、被験体は、歯周病のための予防的処置を含めて治療される。歯周病は、単純歯肉炎症から、歯を支持する柔組織及び骨に対する大きな損傷を生じる重篤な疾患まで多岐にわたる。歯周病は歯肉炎及び歯周炎を包含する。細菌、主にグラム陰性種、例えばポルフィロモナス・ジンジバリスは、「歯肉炎」と呼ばれる歯肉の炎症を引き起こす。歯肉炎では、歯肉は赤色になり、腫脹し、そして容易に出血し得る。歯肉炎が治療されない場合、それは「歯周炎」（「歯の周囲の炎症」を意味する）に進行し得る。歯周炎において、歯肉は歯から離れて、感染された「ポケット」を形成する。プラークが広がり、歯肉線より下に増殖すると、身体の免疫系は細菌と戦う。治療されない場合、歯を支持する骨、歯肉及び結合組織は破壊される。歯は、最終的には弛緩するようになり、除去されねばならない。
【００４４】
本発明の第四の態様は、本発明の第一の態様のポリペプチドに対して産生される抗体である。好ましくは抗体は、本発明のポリペプチドに対して特異的に向けられる。
【００４５】
本明細書中では、「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、そして詳細には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、キメラ抗体、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）及び抗体断片を包含する。本発明の抗体は、好ましくは、他のポリペプチドの抗原と交差反応することなく、本明細書中に上記されたような抗原性ポリペプチドと特異的に結合することができる。
【００４６】
「〜と特異的に結合する」という用語は、本明細書中で用いる場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴系及びＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動的評価ソフトウェア（例えばバージョン２．１）を用いて表面プラズモン共鳴分析により測定した場合に１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する抗体の免疫グロブリン可変領域による抗原の結合を指すよう意図される。特異的結合相互作用に関する親和性又は解離定数（Ｋｄ）は、好ましくは約５００ｎＭ〜約５０ｐＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ以下、さらに好ましくは約３００ｎＭ以下、そして好ましくは少なくとも約３００ｎＭ〜約５０ｐＭ、約２００ｎＭ〜約５０ｐＭ、さらに好ましくは少なくとも約１００ｎＭ〜約５０ｐＭ、約７５ｎＭ〜約５０ｐＭ、約１０ｎＭ〜約５０ｐＭである。
【００４７】
抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により実行され得る、ということが示されている。抗体の結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインから成る一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片：ヒンジ部でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＩＩＩドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインから成るＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメイン又はＶＬドメインから成るｄＡｂ断片；並びに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、それらは、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対合して一価分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知である）を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製させる合成リンカーにより、組換え法を用いて接合され得る。他の形態の１本鎖抗体、例えばダイアボディ又はトリアボディも包含される。ダイアボディは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で、しかし同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いて発現され、それにより当該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を作製する二価二重特異性抗体である。
【００４８】
当該技術分野で既知の種々の手法も、本発明の抗原性ポリペプチドと結合し得るモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、並びに種々の組換え体及び合成抗体の産生のために用いられ得る。さらに、宿主種によって免疫学的応答を増大するために用いられ得る種々のアジュバントは当業者に既知であり、例としては、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、並びに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）及びコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体及び抗体断片は、標準技法（例えば発酵器を用いて組織培養物又は無血清中で）により大量に産生され、そしてアフィニティーカラム、例えばプロテインＡ（例えばネズミＭａｂに関して）、プロテインＧ（例えばラットＭａｂに関して）又はＭＥＰ  ＨＹＰＥＲＣＥＬ（例えばＩｇＭ及びＩｇＧ  Ｍａｂに関して）を用いて精製され得る。
【００４９】
組換えヒト又はヒト化バージョンのモノクローナル抗体は、ヒト療法的用途のための好ましい一実施形態である。ヒト化抗体は、文献（２９，３０）中の手法に従って調製され得る。ヒト化モノクローナル抗体の産生のための近年記載された「遺伝子変換突然変異誘発」戦略も、ヒト化抗体の産生に用いられ得る（３１）。代替的には、重鎖領域及び軽鎖領域の無作為組合せの組換え相ライブラリーを生成するための技法は、組換え抗体を調製するために用いられ得る（３２）。
【００５０】
本発明は、歯周病の予防又は治療に有用な組成物であって、本発明の第一の態様のポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドのアンタゴニスト並びに薬学的に許容される担体を含み、当該アンタゴニストがポルフィロモナス・ジンジバリス感染を阻害する組成物も提供する。
【００５１】
本明細書中で用いる場合、「アンタゴニスト」という用語は、対象のポリペプチドの生物学的活性を阻害する核酸、ペプチド、抗体、リガンド又はその他の化学的実体を指す。特定のタンパク質の適切なアンタゴニストを試験し、選択する技法は当業者には既知であり、このような技法は結合検定を包含し得る。ＰＧ０３５０、ＰＧ１３７４、ＰＧ１０１９及びＰＧ０６１８の可能なアンタゴニストは、好ましくは、これらのタンパク質と宿主細胞又は他の基質との結合を阻害する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）であり、或いはそれらは、これらのタンパク質の結合を妨げるタンパク質又はペプチドであり得る。
【００５２】
本発明の抗体及びアンタゴニストは、多数の用途を有し、例えばそれらは、歯垢の制御並びに虫歯及び歯周病に関連する病原体の抑制のための口腔ケア製品（練り歯磨き及び洗口液）における抗菌防腐剤として用いられ得る。本発明の抗体及びアンタゴニストは、薬学的調製物（例えば、局所及び全身抗感染薬）にも用いられ得る。
【００５３】
本発明の第六の態様では、歯周病の進行に関与するポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドの同定方法であって、以下の：
ａ）ヘム制限条件下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスにより産生されるポリペプチド又はそのペプチドの相対量を測定する工程；並びに
ｂ）工程ａ）より高いヘム条件下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスにより産生されるポリペプチド又はそのペプチドの相対量を測定する工程
を包含する方法であり、工程ｂ）と比較した場合の工程ａ）で検出されるポリペプチド又はそのペプチド断片の量の増大がポリペプチドが歯周病の進行に関与するということを示す方法が提供される。
【００５４】
ヘム制限条件下でポルフィロモナス・ジンジバリスを増殖させるためには、ヘミンの濃度は約０．１μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌである、というのが好ましい。ヘム制限条件は、ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞の細胞密度が本発明の方法の工程（ｂ）の増殖条件下で観察されるものより有意に低い場合、達成される。工程（ｂ）のより高いヘム条件は、好ましくは、５μｇ／ｍｌを超えるヘミン濃度を用いて達成される。
【００５５】
ヘム制限条件及び高ヘム条件におけるポリペプチドの相対量の比較は、好ましくは、鑑別プロテオミクス手法を用いることにより決定され得る。好ましくはポリペプチドの量は、当該技術分野で一般に用いられる定性的プロテオーム分析、例えば溶液中消化及びゲル中消化並びにＬＣ−ＭＳ／ＭＳの組合せ戦略、並びにＭＳと組合せた安定同位体標識戦略（ＩＣＡＴ）を用いた分析（これらに限定されない）により測定される。
【００５６】
本発明の第六の態様で明示される方法に従って同定される単離抗原性ポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチドは、歯周病を治療し、予防するための標的として用いられ得る。特に、単離ポリペプチドは、ポルフィロモナス・ジンジバリス、例えばポルフィロモナス・ジンジバリス感染、例えば歯周病に対するワクチン組成物を開発するために用いられ得る。
【００５７】
本発明は、本発明の第一の態様のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子に対して標的にされる干渉ＲＮＡ分子も提供する。したがって本発明の第七の態様では、各鎖中に少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む干渉ＲＮＡ分子であって、二本鎖領域の鎖のうちの１つが配列番号５又は配列番号６又は配列番号７又は配列番号８の領域と相補的である干渉ＲＮＡ分子が提供される。
【００５８】
いわゆるＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉは周知であり、ＲＮＡｉに関するさらなる情報は、Hannon (2002) Nature 418: 244-251及びMcManus & Sharp (2002) Nature Reviews: Genetics 3(10): 737-747（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に提供されている。
【００５９】
本発明は、ｓｉＲＮＡ安定性を増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの安定性を向上し、それらの使用を支持するｓｉＲＮＡの化学的修飾（複数可）も意図する（例えばShen et al, (2006) Gene Therapy 13: 225-234参照）。これらの修飾は、センス鎖オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端での逆方向脱塩基部分、並びにアンチセンス鎖の３’末端での最後の２つのヌクレオチド間の単一ホスホルチオエート結合を含み得る。
【００６０】
干渉ＲＮＡの二本鎖領域は、二本鎖領域の各鎖中に少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも２５塩基対、最も好ましくは少なくとも３０塩基対を含む、というのが好ましい。本発明は、歯周病に関する被験体の治療方法であって、本発明の干渉ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つを被験体に投与することを包含する方法も提供する。
【００６１】
本発明の性質がより明白に理解され得るために、ここで、その好ましい形態を以下の実施例を参照しながら説明する。
【実施例】
【００６２】
[実施例１]
１．  材料及び方法
１．１  細菌株及び化学物質
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（ＡＴＣＣ  ５３９７８）を、the Centre for Oral Health Science, The University of Melbourneの培養コレクションから得た。用いられる化学物質は超高純度であったが、但し、ＭＳ作業に関しては、ＬＣ  ＭＳ等級試薬（Sigma, Reidel-de Haen）を用いた。
【００６３】
１．２  ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖及び採取
４００ｍＬの作業容積を有するＢｉｏｆｌｏ  １１０発酵器／バイオリアクター（New Brunswick Scientific）を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０を連続培養で増殖させた。増殖培地は、５ｍｇ／ｍＬのフィルター滅菌塩酸システイン、５．０μｇ／ｍＬのヘミン（ヘム過剰）又は０．１μｇ／ｍＬのヘミン（ヘム制限）を補足された３７ｇ／ｍＬの脳心臓注入培地（Oxoid）であった。同一培地（ヘム過剰）中で増殖させたポルフィロモナス・ジンジバリスの２４時間バッチ培養（１００ｍＬ）を培養容器に接種することにより増殖を開始した。２４時間のバッチ培養増殖後、培地貯蔵槽ポンプを作動させて、培地流を調整して、０．１  ｈ−１（平均生成時間（ＭＧＴ）６．９時間）の希釈率を生じた。容器の温度を、ｐＨ７．４±０．１で３７℃に維持した。９５％Ｎ２中の５％ＣＯ２で、培養を連続的にガス処理した。定常状態増殖中に細胞を採取し、５０００ｇで３０分間、洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２）で３回洗浄し、１３８ＭＰａでフレンチプレス細胞破砕機（SLM, AMINCO）に３回通して破砕した。次に溶解細胞を２０００ｇで３０分間遠心分離して、非破壊細胞を除去し、その後、１０００００ｇで超遠心分離して、可溶性画分（上清）及び膜画分を生じた。全画分を氷上で実行した。
【００６４】
１．３  非定量的プロテオーム分析のための試料の調製
２つの方法、即ち、トリプシンによる溶液中消化とその後の気相分別（ＧＰＦ）によるＬＣＭＳ、並びにゲル中消化とその後の組合せ戦略の一部としてのＬＣＭＳ（ｇｅＬＣ−ＭＳ）を用いて、非定量的プロテオーム分析を実行した（図１）。溶液中消化法に関しては、タンパク質を９５℃で３分間煮沸し、ＴＣＡ（１６％）を用いて沈殿させて、可溶化緩衝液（８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ）中に再懸濁した。ＢＣＡタンパク質試薬（Pierce）を用いてタンパク質濃度を測定し、２μｇ／μＬに調整した。１ｍＭのＤＴＴを用いて３０分間、還元を実行し、１０ｍＭのヨードアセトアミドを用いて６０分間、アルキル化した。溶液を水で希釈して最終濃度を１Ｍの尿素とした後、消化した。消化は、１：１００（ｗ／ｗ）トリプシン対タンパク質の比率で、３７℃で１６時間、シーケンシング等級修飾トリプシン（Promega）を用いて実行した。蟻酸を添加して最終濃度を１％（ｖ／ｖ）とすることにより、消化を終結させた。次に、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（Waters）を用いてペプチドを脱塩し、真空遠心分離機（Thermosavant）を用いて乾燥し、そして０．１％ＴＦＡ中５％アセトニトリル中に再懸濁した。２μｇと等価のペプチドの量を、各ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために注入した。
【００６５】
ｇｅＬＣ−ＭＳ法に関しては、２５μｇのタンパク質をプレキャストＮｏｖｅｘ  １２％トリス−ＨＣｌグリシンゲル（Invitrogen）上で分離し、クーマシー・ブリリアントブルーＧ−２５０（Sigma）で一晩染色した。ゲルを３０の個々の断片に分けて、これを次に切り出して、約１ｍｍ３の立方体に切断した。５０％エタノール及び２５ｍＭの重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）緩衝液の溶液で３回、脱色を実行して、その後、１００％エタノールで脱水した。２５ｍＭのＡＢＣ中の１０ｍＭのＤＴＴとともに、５６℃で６０分間、脱水ゲル立方体をインキュベートすることにより、還元を実行した。次に還元溶液を２５ｍＭのＡＢＣ中５５ｍＭのヨードアセトアミドに取り替えて、４５分間インキュベートした。ゲル立方体を５０ｍＭのＡＢＣ中で２回洗浄し、１００％エタノールで脱水した。３０μＬの修飾シーケンシング等級トリプシンを、２５ｍＭのＡＢＣ緩衝液及び１ｍＭのＣａＣｌ２中に５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、４℃で３０分間インキュベートした。過剰量のトリプシン溶液を除去し、１５μＬの２５ｍＭのＡＢＣ緩衝液を添加した。消化を３７℃で一晩実行し、ＴＦＡを添加して最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）とすることにより、終結させた。次に上清をエッペンドルフ管に移した。ゲル片に、０．１％ＴＦＡ中の５０％エタノールを５０μＬ添加し、１５分間超音波処理した。当該プロセスを反復し、１つのゲル断片由来の全上清をプールして、真空遠心機を用いて乾燥して約１０μＬとした。
【００６６】
１．４  定量的ＩＣＡＴ分析のための試料の調製
タンパク質の標識化及び分離は、開裂性ＩＣＡＴ試薬（Applied Biosystems）を用いるｇｅＬＣ−ＭＳ／ＭＳアプローチ（３３）を基礎にした。ＴＣＡ（１６％）を用いてタンパク質を先ず沈殿させて、６Ｍの尿素、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を用いて可溶化した。ＢＣＡタンパク質試薬を用いてタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌに調整した。各増殖条件からのタンパク質１００μｇを、別々に、２μＬの５０ｍＭのトリス（２−カルボキシ−エチル）ホスフィン塩酸塩を用いて、３７℃で１時間、還元した。次にヘム制限増殖条件からの還元タンパク質をＩＣＡＴｈｅａｖｙ試薬で、そしてヘム過剰増殖条件からのタンパク質をＩＣＡＴｌｉｇｈｔ試薬でアルキル化した。次に２つの試料を合わせ、プレキャストＮｏｖｅｘ  １０％ＮＵＰＡＧＥゲル（Invitrogen）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen）を用いて５分間染色し、その後、水で脱色した。次に、ゲルレーンを、ゲルの上部から染色前面まで、２０の断片に切り出した。
【００６７】
切断断片をさらにさいの目に切って１ｍｍ３の立方体として、一晩ゲル内消化し、上記の手順に従って２回抽出した。プールした上清を減圧下で乾燥して約５０μＬとし、その後、５００μＬのアフィニティーローディングバッファーと混合した後、メーカーの使用説明書（Applied Biosystems）に従ってアフィニティーカラム上に載せた。溶離ペプチドを乾燥し、ビオチンタグを、３７℃で２時間、ニートＴＦＡで切断し、その後、減圧下で乾燥した。乾燥試料を、０．１％ＴＦＡ中の５％アセトニトリル  ３５μＬ中に懸濁した。
【００６８】
１．５  液体クロマトグラフィー及び質量分析
ＵｌｔｉＭａｔｅ  Ｎａｎｏ  ＬＣシステム（LC Packings - Dionex）と接続されたＥｓｑｕｉｒｅ  ＨＣＴイオントラップ質量分光計（Bruker Daltonics）を用いて、ＭＳを実行した。LC Packings逆相カラム（Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ  １００、内径７５μｍ×１５ｃｍ、３μｍ、１００Å）を用いて分離を達成し、以下のアセトニトリル勾配を用いて０．１％蟻酸で溶出した：０分〜５分（０％）、５分〜１０分（０％〜１０％）、１０分〜１００分（１０％〜５０％）、１００分〜１２０分（５０％〜８０％）、１２０分〜１３０分（８０％〜１００％）。
【００６９】
ＬＣ出力を、ナノスプレーイオン源と直接接続した。１００ミリ秒の最大蓄積時間で、３００〜１５００のｍ／ｚ範囲で、１０００００のイオン荷電制御下で、ＭＳ獲得を実施した。ＧＰＦを用いる場合、３つの付加的ｍ／ｚ範囲（３００〜８００、７００〜１２００及び１１００〜１５００）を用いて前駆体イオンに関して選択し、そして各ｍ／ｚ範囲を二重反復実験で実行して、同定されるペプチドの数を増大した。ＭＳ／ＭＳ獲得を１００〜３０００ｍ／ｚの質量範囲全体で得て、初期完全プロテオーム分析に関して１０個までの前駆体で、そして２分の能動除去時間を有する最強多重荷電イオンに関してはＩＣＡＴ分析のために３個の前駆体で実施した。
【００７０】
１．６  非定量的プロテオーム分析のためのタンパク質同定
化合物検出閾値  １００００並びにシグナル対ノイズ閾値  ５で、Ａｐｅｘピークファインダーアルゴリズムを用いるＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ３．２（Bruker Daltonics）を用いて、ピーク一覧を作成した。エクスポートされたデータに関して、＋２及び＋３という全体的負荷制限を設定した。ゲノム研究所（ＴＩＧＲ）ウェブサイト（www.tigr.org）から得られるポルフィロモナス・ジンジバリスデータベースに対して問い合わされるＭＳ／ＭＳデータに関するＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（ＭＡＳＣＯＴ２．１．０２、Matrix Science）を用いて、タンパク質同定を達成した。以下の判定基準を用いて、整合ペプチドをさらに評価した：ｉ）最大０．０５のｐ値に対応する確率ベースのＭｏｗｓｅスコアを有するペプチドは、当該スコアが−ｌｏｇＸ１０（ｌｏｇ（Ｐ））でありそしてＰが観察された整合が無作為事象である確率である場合、ポジティブに同定されるとみなされた；ｉｉ）特定タンパク質の同定に１つのペプチドだけが用いられ、そしてＭＡＳＣＯＴスコアが３０より低い場合、スペクトルの手動的立証が実施された。
【００７１】
１．７  ＩＣＡＴに関するタンパク質同定
特に単一ペプチドヒットを有するものに関するＩＣＡＴ標識化タンパク質の同定における信頼を増大するために、付加的フィルターを以下のように適用した：ｉ）ＩＣＡＴ対の重ペプチド及び軽ペプチドは、それらの抽出イオンクロマトグラムから測定されるような溶離ピークと密接に示されていなければならない；ｉｉ）単一の独特のペプチドを有するタンパク質に関しては、このペプチドは（例えば、異なるＳＤＳ−ＰＡＧＥ画分で、又は軽ＩＣＡＴ型及び重ＩＣＡＴ型の両方で）１回より多く同定されていなければならない；或いはｉｉｉ）単一ペプチドが（ｉｉ）の判定基準を満たさない場合、ＭＡＳＣＯＴスコアは２５以上でなければならず、期待値≦０．０１及びＭＳ／ＭＳスペクトルは、強いイオンが説明されている「ｂ」又は「ｙ」型イオンの連続シリーズを示していなければならない。
【００７２】
１．８  擬陽性の概算
擬陽性割当のレベルを別々に概算するために、タンパク質数、アミノ酸のサイズ及び分布に関する標準データベースに対してサイズで当該データベースを同定するよう、各タンパク質に関するアミノ酸配列の順序を逆にすることにより、ポルフィロモナス・ジンジバリスの逆データベースを作製した（３４）。したがって擬陽性率は、ＮＲ／ＮＦ（ここで、ＮＲ＝逆データベースで同定されるペプチドの数（逆データベースに関する閾値を上回るペプチドのＭＡＳＣＯＴスコア）、並びにＮＦ＝標準データベースで同定されるペプチドの数（標準データベースに関する閾値を上回るペプチドのＭＡＳＣＯＴスコア））と概算された。包括的プロテオーム分析（ＮＦ＝１８３７５ペプチド）及び定量的ＩＣＡＴ分析（ＮＦ＝５３０ペプチド）から、擬陽性を測定した。
【００７３】
１．９  相対的存在量の定量
同位体的に重い１３Ｃ対軽い１２Ｃ  ＩＣＡＴ標識化ペプチドの比率を、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ（Bruker Daltonics）からのスクリプトを用いて測定し、単一ＭＳスペクトルでのモノアイソトピックピーク強度の測定値（シグナル強度及びピーク面積）に基づいて、手動で立証した。定量のために用いられる親イオンの最小イオン計数は２０００であったが、９６％を超える重及び軽前駆体イオンは１００００を超えた。貧解析スペクトルの場合、親イオンの再構成抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の面積から、当該比率を決定した。単一親タンパク質由来の多ペプチドに関して平均を算定し、外れ値を、Ｇｒｕｂｂ検定を用いて除外した（α＝０．０５）。
【００７４】
１．１０  ゲノム分析
ＣＥＬＬＯ（http://cello.life.nctu.edu.tw）（３５）を用いてポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質の、そしてＴＩＧＲから得られる配列に基づいたＴＭＨＭＭ２．０（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）を用いて膜貫通へリックスの細胞内局在性を予測した。理論的プロテオームと比較した場合の同定されたタンパク質の相対的発現レベルを概算するために、高度発現遺伝子と定義されているリボソームタンパク質及びｔＲＮＡシンターゼを伴うプログラムＩＮｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １．１２ａ（http://www.bioinfo-hr.org/inca）（１４）を用いて、ｇｅｎｅｂａｎｋ（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/genomes/Bacteria/Porphyromonas_gingivalis_W83/)からのポルフィロモナス・ジンジバリスのコーディング配列に基づきＣＡＩ値を算定した。Microbesonlineのウェブサイト（http://microbesonline.org）（３６）から、オペロン予測を実行した。
【００７５】
１．１１  ＥＣＲ３１２突然変異体の構築
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０オープンリーディングフレームＰＧ１３７４は、潜在的に、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ８３ゲノムを基礎にして免疫反応性４７ＫＤａ抗原（ＰＧ９７）をコードする（www.tigr.org）。ポルフィロモナス・ジンジバリスＰＧ１３７４突然変異体を構築するために、プライマーＥＣＲ３１２ＡｐａＩ−Ｆｏｒ（５’−ＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＡＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴ−３’）及びＥＣＲ３１２ＡａｔＩＩ−Ｒｅｖ（５’−ＴＧＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴ−３’）を用いたＰＣＲにより、Ｗ５０ゲノムＤＮＡから、フランキングＡｐａＩ及びＡａｔＩＩ制限部位（下線付き）を有するＰＧ１３７４遺伝子の６７２ｂｐ上流断片を生成した。この断片を、サブクローン化ｅｒｍＦカセット（３７）を含有するｐＡＬ３０、ｐＧｅｍ（登録商標）Ｔ−ｅａｓｙ（Promega）上のＡａｔＩＩ及びＢａｍＨＩ部位中でクローン化して、ｐＡＬ３６を作製した。同様に、フランキングＰｓｔＩ及びＮｄｅＩ制限部位を有するＰＧ１３７４の下流の５６５ｂｐ断片を、ＥＣＲ３１２ＰｓｔＩ−Ｆｏｒ２（５’−ＴＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＴＣＧＡＣＣＴＴＧＧＡＴＣＴＴ−３’）及びＥＣＲ３１２ＮｄｅＩ−Ｒｅｖ２（５’−ＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＣＧＧ−３’）プライマーを用いて増幅して、ｐＡＬ３６中のＰｓｔＩ及びＮｄｅＩ制限部位中にクローン化した。その結果生じたプラスミド（ＰＧ１３７４オープンリーディングフレームの上流及び下流断片が側面に位置するｅｒｍＦカセットを有する）（ｐＡＬ３６．１と呼ばれる）をＳｃａＩで直線化し、以前記載されたように（３８）ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０中で形質転換した。１０μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを含有するＨＢＡプレート上で、嫌気性条件下で３７℃で７日間のインキュベーション後、形質転換細胞を選択した。ＰＣＲ分析によりＤＮＡ組込みの確認を実施して、その結果生じた突然変異体をＥＣＲ３１２と名付けた。
【００７６】
１．１２  抗生物質防御侵襲検定
Ｗ５０及びＥＣＲ３１２の侵襲効率を比較するために、２４ウエル細胞培養プレート中で、以前記載されたように（３９）抗生物質防御検定を実行した。要するに、一定数のポルフィロモナス・ジンジバリス細胞をＫＢ単層に侵襲させた（各ウエル中に約１０５個の細胞）。ゲンタマイシン（３００μｇ／ｍＬ）及びメトロニダゾール（２００μｇ／ｍＬ）とともに１時間さらにインキュベートすることにより、非侵襲細胞又は接着細胞を殺した。次に侵襲細菌のコロニー形成単位を、ウマ血液寒天プレート上で数えた。
【００７７】
１．１３  細胞結合検定
以前記載されたように（４０）、細胞結合検定を実行した。要するに、ポルフィロモナス・ジンジバリスを先ず、中対数期に増殖させて、約２．９×１０９細胞／ｍＬの細胞密度とした。次に細胞を洗浄し、その後、５００μｇのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Invitrogen）で標識し、５００μＬのＤＭＳＯ中に再懸濁した後、振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をさらに洗浄し、不完全アール最小必須培地（JRH Biosciences）中に再懸濁して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いた細胞計数に基づいて、ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞を調整した。ＦＩＴＣの緑色発光を、５２５ｎｍフィルター（ＦＬ１）を用いて測定した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて、多重パラメータデータを分析した。全測定を二重反復実験で実行し、ＦＩＴＣ蛍光の定量に関しては、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を用いた。
【００７８】
野生型ポルフィロモナス・ジンジバリス及びＥＣＲ３１２の結合を、３７℃で４０分間、５％ＣＯ２大気でＫＢ細胞上に２００μＬの細胞懸濁液を接種することにより、並行して実行した。インキュベーション後、ＫＢ細胞及び細菌を含有する上清を、１．５ｍＬ管に移した。次に、残りの結合細胞を、３７℃で５分間、２００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ混合物（JRH Bioscience）を用いてウエルから剥がし、対応する収集上清とともにプールした。次に５００μＬの完全ＥＭＥＭを添加してトリプシンを不活性化し、その後、３回洗浄して、最後に１ｍＬのＰＢＳ中に懸濁した。以前記載されたようにフローサイトメーターで、結合細胞を計数した。
【００７９】
２．  結果及び考察
２．１  連続培養中のポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖
過剰ヘムを含有する富栄養培地中で連続培養で増殖した場合、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０は、２．０３±０．０４ｍｇの細胞乾燥重量／ｍＬの接種後約４８時間で定常状態細胞密度を達成した。増殖培地中のヘミンの濃度が５．０μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌに低減された場合、０．９９±０．２０ｍｇの細胞乾燥重量／ｍＬという有意に低い定常状態細胞密度が達成されたが、これは、ヘム利用能が増殖を制限していた、ということを実証する。ヘムが培養物に添加し戻された場合、細胞密度に及ぼすヘム制限の作用は軽減された。
【００８０】
ヘム制限中のポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖は、６．９時間のポルフィロモナス・ジンジバリス平均世代時間を有するケモスタットを用いた従来の研究（４１，４２）と一致した。ポルフィロモナス・ジンジバリスがＰＰＩＸを合成できないため、この必須栄養素はヘモグロビン及び血漿タンパク質を含むその他のヘムのタンパク質分解により獲得されると考えられ（９）、したがってヘムにおける欠損は有意に低い細胞密度に反映された。
【００８１】
２．２  ヘム制限下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテオーム分析
２つの異なるアプローチにより、ヘム制限下で増殖されるポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテオームを広範に分析した。溶液中消化とその後の気相分別を伴うＬＣＭＳを用いて、３４４種のタンパク質を同定した。ｇｅＬＣＭＳアプローチでは、３８５種のタンパク質を同定したが、一方、２４７種のタンパク質は両方のアプローチにより見出された。組合せ戦略を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリス逆データベースに対する検索から算定される０．４％という概算擬陽性率を伴って、総計４７８種のタンパク質を同定した（表１参照）。個々のＬＣＭＳ実行から（異なるｍ／ｚ範囲又はＳＤＳ  ＰＡＧＥ帯域から）の２以上の独特のペプチドにより、又は２以上の同一ペプチドにより、全タンパク質の７７．０％を同定した。４７８種の同定タンパク質は、全ゲノム分析（４３）により同定される１９８８個の割当タンパク質コード遺伝子のうちの約２５％を表わす。総予測プロテオームの４分の１を同定したが、この数字は、いずれかの増殖条件中に発現される遺伝子の実数を考慮する場合、より高くなる。緑膿菌及び枯草菌では、単一増殖条件中に転写される総ＯＲＦのパーセンテージは、それぞれ６０％及び４０％であると概算された（４４、４５）。それらの質量分光計のデューティーサイクル限界を調べることにより、ＯＲＦを予測されたポルフィロモナス・ジンジバリスの約６０％がそれらの増殖条件下で発現される、ということをZhangと共同研究者ら（４６）は概算した。したがってこれらの数字に基づいて、本発明の増殖条件下で発現されたポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質の４１％〜６２％が同定されている。４７８種の同定タンパク質の機能的分類を、表１に示す。
【００８２】
【表１】
2009544279.tif 000002
【００８３】
今日まで、多元的プロテオミクス手法を用いて全体的にポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質を同定するための試みは、１つだけ報告されている。１０１４ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ  ３３２７７タンパク質がこの菌株がケラチノサイト増殖培地中で培養され、同一培地が分泌された上皮細胞構成成分に曝露された場合に同定されたZhangと共同研究者らの研究と比較して、本発明者らは、ヘム制限下での連続培養中に発現される４７８種のポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０タンパク質を同定した。用いられた菌株、増殖条件、並びにＭＳデータの処理は２つの試験で異なったので、２つのデータセット間で直接比較を行なうことは困難である。それにもかかわらず、本発明の方法では、７５のタンパク質を独自に同定した。
【００８４】
細胞内タンパク質局在化を予測するためにＣＥＬＬＯを用いて、この試験で同定されたタンパク質のほとんどが、細胞質（予測された１３５０のタンパク質のうち３４７）から、その後、ペリプラズム空間（４８／１１３）、外膜（４７／１５４）、内膜（２４／２５６）及び細胞外（１２／３５）由来であると予測された。予測通り、低パーセンテージの予測内膜タンパク質を同定した。内膜タンパク質の予測信頼度をさらに増大するために、膜貫通隠れマルコフモデル（ＴＭＨＭＭ）を用いた。ＴＭＨＭＭアプローチを用いて、２を超える膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を有すると予測された２４２のタンパク質のうちの２０が同定され、そして１０を超えるＴＭＤを有すると予測された４４のタンパク質のうちの５つが同定された。注目すべきは、１０を超える膜貫通ドメインを有する１２の膜タンパク質のすべてが溶液中消化法から同定された。
【００８５】
２．３  同定タンパク質の有意性
多数の細菌中での高度発現遺伝子は、コドン使用に関する強い組成の偏りを有することが多い。コドン使用頻度指数（ＣＡＩ）を用いて、そのコドン配列を基礎にした遺伝子の発現レベルを予測することができ、ＣＡＩ値が高いということは発現が増大したことを示す（４７）。１００を超えるコドンを有するポルフィロモナス・ジンジバリスゲノム中の１６８５遺伝子のうち、ほぼ９２％が０．６２〜０．８０のＣＡＩ値を有する（図２）。この範囲は真核生物と比較して狭いが（４８）、しかしそれは、予測遺伝子の８９％が０．３５〜０．５０のＣＡＩ値を有する好熱性サーモアナエロバクター・テングコンゲンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）と類似する。この試験における４７８の同定タンパク質をコードする遺伝子のＣＡＩ値は、理論的プロテオームと類似の分布を有するが、より高いタンパク質存在量の検出への偏りがあった。この偏りにも拘わらず、非常に低いＣＡＩを有する遺伝子によりコードされる多数のタンパク質が同定された。この結果は、明らかに、細胞中のタンパク質存在量の大きなダイナミックレンジという問題を例示し、このことは、すべてのタンパク質を一度に検出することが現在のところ不可能であることを示す。
【００８６】
同定タンパク質の最高パーセンテージを有するタンパク質の機能的クラスは、エネルギー代謝に関与するもの（表１）、典型的には発酵（９５％、ＣＡＩ  ０．７０〜０．８０）、解糖（８２％、ＣＡＩ  ０．７１〜０．８３）、並びにアミノ酸及びアミンの代謝（８１％、ＣＡＩ  ０．７１〜０．８４）に関与するものである。これは、細菌細胞中で非常に豊富であることが示されているエネルギー代謝のような基礎代謝機能に関与する必須タンパク質として大いに期待された。これらのタンパク質のほぼ９０％が細胞質中に存在すると予測され、このことがさらにまた膜タンパク質と比較して検出を容易にさせる、ということは最も重要である。最少を示したタンパク質の機能的クラスは、仮説的タンパク質の転位及び調節機能に関与するものである。
【００８７】
ポルフィロモナス・ジンジバリスの完全ゲノムはシーケンシングされているが、細胞機能に関する多数の重大な問題は依然として解決されていない。したがって翻訳遺伝子産物を同定するプロテオーム試験は、機能的ゲノムへの付加的洞察を提供するのに役立つ。例えばポルフィロモナス・ジンジバリスは糖非分解性であることが既知であるが（３）、しかしゲノムは、解糖経路の全酵素に関する推定ＯＲＦを含有する（４３）。この経路が十分に利用されないことは、グルコキナーゼ（glucose kinase：グルコースキナーゼ）遺伝子が挿入エレメントにより妨害される原因となっている（４３）。この知見と一致して、グルコキナーゼ、或いは別の解糖特異的酵素であるホスホフルクトキナーゼは同定されなかった。それに反して、糖新生に関与するすべての酵素が見出され、このことは、多糖生合成のようなプロセスに必要なグルコースがこの経路により得られ得る、ということを示唆した。
【００８８】
２．４  ＩＣＡを用いて測定した場合のヘム制限に対するポルフィロモナス・ジンジバリスの応答
ヘム制限に対するポルフィロモナス・ジンジバリス応答の定量的ＩＣＡＴ分析を実行するために、溶液中ＩＣＡＴ法が強妨害三価イオン（strong interfering triply charged ions）の存在のため要求を満たさなかったので、ｇｅＬＣＭＳアプローチを選択した。これらの三価イオンの存在により、極少数のタンパク質同一性が生じた。したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＩＣＡＴ標識化可溶性及び不溶性タンパク質画分を別々に分離し、各ゲルレーンをゲル中トリプシン消化のために２０断片に分けて、その後アフィニティー精製及びＬＣＭＳ処理した。全体で１４２のタンパク質を同定した。逆データベースとの整合は得られなかったが、これは、低レベルの擬陽性同一性を示した。両画分中で検出されたタンパク質を考慮すると、多くて０．０５のｐ値に対応する確率ベースのＭｏｗｓｅスコアを有する２以上の独特のペプチドの存在に基づいて、５３のタンパク質（３４．０％）が同定され、２以上の異なる画分或いは両ＩＣＡＴ標識状態（それらのうちの５８が２５以上のＭＡＳＣＯＴスコアを有する）から同定される１つの独特のペプチドの存在に基づいて６０のタンパク質（３８．５％）が同定され、そして２５以上のＭＡＳＣＯＴスコア、０．０１以下の期待値、「ｂ」又は「ｙ」型イオンの連続シリーズを有する単一独自ペプチドに基づいて４３のタンパク質（２７．５％）が同定された（手動で妨害するのは強イオンのためである）。単一独自ペプチドの分析に基づいたタンパク質同一性の一例を、図３に示す。
【００８９】
同定されたタンパク質のうち、１０３は可溶性画分中に見出され、５３は不溶性画分中に見出され、そして１４のタンパク質は両画分中に見出された。ヘム過剰からヘム制限への環境条件の変化に応答して、同定タンパク質のうちの７０は存在量における少なくとも２倍の変化を示した（図４）。これらのうち、５３のタンパク質の存在量は２倍より多く増大し、そして１７のタンパク質の存在量はヘム制限中に２分の１未満に低減した。本発明のデータの再現性を査定するために、そして不溶性画分に関するタンパク質同一性を増大するために、ヘム制限及び過剰増殖中の異なる日に、ケモスタットから細胞を採取した。次に、異なる抽出方法とその後のＩＣＡＴ標識化を、変法プロトコル（示されていない）で反復した。得られたデータは、表２に示した選択タンパク質に関して類似の存在量比率を示すタンパク質に関して再現性があった（例えばＰＧ０６９５  Ｌ／Ｈ＝１．１、再標識化＝１．３；ＰＧ０３５０  Ｌ／Ｈ＝３．２、再標識化＝２．６；ＰＧ０１５９  Ｌ／Ｈ＝２．０、再標識化＝２．２；ＰＧ０２３２  Ｌ／Ｈ＝０．４、再標識化＝０．４）。データをさらに検証するために、オペロンを形成する遺伝子によりコードされると予測される同定タンパク質の相対的存在量を比較した（５０）。タンパク質の５つの群が、予測オペロンにより、又は特定の遺伝子座で分類される遺伝子によりコードされることが判明した（表２  影付）。各々の場合、コード化タンパク質の存在量は同様であると思われた。予測オペロンのうちの１つは、外膜タンパク質Ｏｍｐ４０（ＰＧ０６９４）及びＯｍｐ４１（ＰＧ０６９５）をコードし、その存在量は１．１の比率（ヘム制限／ヘム過剰、  Ｌ／Ｅ）で不変であった。これらのタンパク質は、グラム陰性細菌のＯｍｐＡ様ポリンとの高い配列類似性を有し（５１）、そして外膜とペプチドグリカン層との間の物理的連結を提供すると考えられる。これらの構造タンパク質は、環境ヘムレベルの変化を伴って存在量を変えるとは予期されない。残り４つの予測オペロンは、グルタメート又はアスパルテート異化作用と関連付けられることが判明した。
【００９０】
【表２】
2009544279.tif 000003
2009544279.tif 000004
【００９１】
２．５  宿主細胞侵襲関連タンパク質
宿主細胞の侵襲に関与すると思われる３つのタンパク質、インターナリン関連タンパク質（ＰＧ０３５０）、免疫反応性４７ｋＤａタンパク質（ＰＧ１３７４）及びエンドペプチダーゼＰｅｐＯ（ＰＧ０１５９）は、ヘム制限中の存在量がより高かった（表２）。抗生物質防御侵襲検定中、機能的ＰＧ１３７４を欠くポルフィロモナス・ジンジバリスは、野生型と比較して、上皮細胞中への約５０％低い侵襲能力を有した（Ｗ５０、３２６２５±２５８２ｃｆｕ／ｍＬ、ＥＣＲ３１２、１６２５０±１０８９ｃｆｕ／ｍＬ；ｐ＜０．０１、スチューデントＴ検定）。別個の結合検定において、野生型Ｗ５０と比較した場合、ＰＧ１３７４突然変異体の付着において有意差は認められない（図５）。
【００９２】
ＰＧ１３７４及びＰＧ０３５０は、リステリア・モノサイトジェネス（L. monocytogenes）インターナリンタンパク質ＩｎｌＪと類似の富ロイシン反復ドメインを有するシステイン含有タンパク質の新規のクラスに属する（５２）。リステリア・モノサイトジェネスにおいて、インターナリンファミリーの少なくとも１５の成員が存在し、そしてすべてが、シグナルペプチド、Ｎ末端富ロイシン反復ドメインとその後の保存反復間領域から成る或る種の構造的特徴を共有することが判明している。これらのタンパク質の多くが、細胞侵襲過程に関与する（５３）。多数のインターナリンがなぜ存在するかは実証されていないが、それらは、異なる細胞型への向性を付与するよう意図される（５４）。
【００９３】
最新の研究におけるヘム制限中のＰＧ１３７４及びＰＧ０３５０のより高い存在量（それぞれ６．５倍増及び３．２倍増）は、これら２つのタンパク質の発現が低ヘム増殖条件中に刺激されることを示唆する。配列情報及び予測構造から、インターナリンＬＲＲ残基の半分より多くが外側に面し、そして可変性であって、このことは、それらが異なるインターナリンクラスに特異的なタンパク質−タンパク質相互作用表面に関するものであることを示唆する（５５）。ＰＧ１３７４及びＰＧ０３５０はともに、シグナルペプチドを有し、そして約８０残基の保存Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）は別として、有意の配列類似性を有しない３４までの細胞表面に位置する外膜タンパク質の新規のクラスの一部である（５６）。さらに、ＰＧ１３７４は、ヒト歯周炎患者からの血清で精査される場合、強免疫原性であって（５７）、このことは、ＰＧ１３７４が細胞表面タンパク質相互作用に関与することをさらに示唆する。
【００９４】
歯肉上皮細胞中へのポルフィロモナス・ジンジバリスのインターナリゼーションのプロセスは、フィムブリエ並びに種々の細胞表面プロテイナーゼにより媒介される付着及び侵襲の協調プロセスを包含すると考えられる（５８〜６０）。機能的推定インターナリン（ＰＧ０３５０）を欠くポルフィロモナス・ジンジバリス３３２７７突然変異体は、野生型細菌と類似の侵襲特質を表示することが示されたが、バイオフィルム形成能力は低減された（４６、６１）。類似の侵襲は菌株３３２７７による上皮細胞侵襲にも関与するフィムブリエの存在のためであると考えられたが、この突然変異体の類似の侵襲性は、ポルフィロモナス・ジンジバリスゲノムにおいてコードされた第二の推定インターナリンタンパク質（ＰＧ１３７４）の存在のためである、という可能性もあった。これら２つの推定インターナリンタンパク質のダブルノックアウトは、それらの考え得る協同的侵襲的役割を潜在的に解明する。
【００９５】
ＥＣＲ３１２による上皮細胞侵襲の５０％低減並びに細胞結合において差異がないことは、ＰＧ１３７４が欠損したポルフィロモナス・ジンジバリスによる上皮細胞中への観察された侵襲低減がより少ない付着のためでなく、侵襲プロセスで実質的に欠損する、ということを明らかに実証する（図５）。細菌侵襲は、多数のタンパク質及び受容体が関与する高度複合プロセスであることが示されている（６２）。ポルフィロモナス・ジンジバリス侵襲に関与する多数の因子の関連性は、フロリダ大学のLamontのグループにより実証されており、例としては、ハロ酸デハロゲナーゼ、エンドペプチダーゼ、陽イオン輸送ＡＴＰアーゼ、及びＡＴＰ結合カセット輸送体が挙げられる（６０、６３）。したがって上皮細胞侵襲関連タンパク質としてのＰＧ１３７４の発見は、細菌病原体によるこの複合宿主細胞侵襲プロセスに関与するタンパク質の一覧に加える。
【００９６】
多数の細菌病原体に関しては、鉄利用能が病原性及び侵襲プロセスに影響を及ぼす、ということが十分に確立されているが、ポルフィロモナス・ジンジバリス侵襲遺伝子の発現に及ぼすヘムの影響についてはほとんど分かっていない。本発明者らは、μ−オキソビス・ヘム形態の鉄ＰＰＩＸの保護層を欠くためであると思われる酸化ストレスからのポルフィロモナス・ジンジバリスの高死亡率のために、ヘム制限細胞に関する結合及び侵襲検定を実施できなかった（６４）〜（６６）。しかしながらこの試験において、推定侵襲関連タンパク質ＰｃｐＯ、ＰＧ０３５０及びＰＧ１３７４のレベルはヘム制限下で増大し、そしてＰＧ１３７４は細胞侵襲に関与する、ということを本発明者らは示した。
【００９７】
上記のこれらの実験は、環境条件の変化に対するポルフィロモナス・ジンジバリスの応答の最初の定量的プロテオーム分析であり、完全プロテオーム分析と組合された安定同位体標識アプローチの有用性を実証する。ポルフィロモナス・ジンジバリスは、酸化ストレス応答、病原性及び宿主細胞の侵襲と関連付けられる多数のタンパク質の存在量により必須微量栄養素の制限に応答する。
【００９８】
２．６  細胞表面に位置するタンパク質ＰＧ１０１９
ポルフィロモナス・ジンジバリス仮説的タンパク質ＰＧ１０１９は、細菌がヘム制限下で増殖された場合、２５倍より豊富に存在することが観察された。バイオインフォマティック分析は、ＰＧ１０１９が、予測オペロン中の推定外膜受容体タンパク質（ＰＧ１０２０）をコードする遺伝子の直ぐ上流に位置する遺伝子によりコードされるリポタンパク質である、ということを示唆する。既知のポルフィロモナス・ジンジバリスＴｏｎＢ連結外膜受容体とのＰＧ１０２０の多重アラインメント（示されていない）は、ＴｏｎＢ連結受容体の特質の１つである推定ＴｏｎＢボックス（残基１１８〜１２６）（６７）、並びにSimpson及び共同研究者ら（６８）がＴｏｎＢボックスＩＶ領域と呼ぶ保存領域（残基２３６〜２７２）の存在を示す。ＴｏｎＢ連結外膜受容体は、多数の鉄、鉄錯体及びその他の微量栄養素取込み系と関連付けられている。ヘム制限増殖条件下でのＰＧ１０１９の高存在量は、このタンパク質が細胞中への鉄／鉄錯体の輸送に関与するＴｏｎ−Ｂ連結系に対するアクセサリータンパク質であることと一致するが、これは未だ実証されていない。プロテオームデータのほかに、機能ｆｅｏＢ１遺伝子を欠く突然変異体（ポルフィロモナス・ジンジバリスＦＢ１）と比較されるポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０のカスタムポルフィロモナス・ジンジバリスＤＮＡマイクロアレイを用いるトランスクリプトーム（transcriptomic）分析を実施した。野生型Ｗ５０及びＦＢ１突然変異体をともに、ヘム過剰条件で連続培養で増殖させた。ポルフィロモナス・ジンジバリスＦＢ１は、野生型Ｗ５０の細胞鉄含量の約半分を有した（６９）。したがって転写の増大を示す遺伝子は、細胞内又は環境鉄含量の低減に応答して上方調節されると思われる。ＰＧ１０１９及びＰＧ１０２０はともに、野生型と比較して、ＦＢ１突然変異体において類似のレベルに有意に上方調節された。生物学的複製においてＰ＜０．０５の有意レベルでＰＧ１０１９は２．４６のＬｏｇ２増大を示し、そしてＰＧ１０２０は２．３３のＬｏｇ２増大を示し、これは、これらの遺伝子がオペロン中に存在する、というさらなる証拠である。さらに、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の別個のトランスクリプトームＤＮＡマイクロアレイ分析は、ヘム過剰増殖中にＰＧ１０１９遺伝子の発現がほとんど又は全く認められない、ということを示した。
【００９９】
２．７  アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼタンパク質ＡｈｐＣ（ＰＧ０６１８）
ポルフィロモナス・ジンジバリスにおけるペルオキシド耐性に重要な役割を果たすことが示されているペルオキシド除去酵素であるアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼタンパク質ＡｈｐＣ（ＰＧ０６１８、表２）を用いて、ヘム過剰からヘム制限への移行中のポルフィロモナス・ジンジバリスのタンパク質存在量における最も実質的な変化を観察した（６５）。ポルフィロモナス・ジンジバリスにおいて、細胞表面に酸素を有するμ−オキソビス・ヘム形態の鉄ＰＰＩＸの層の形成は、その固有のカタラーゼ様活性のために酸化緩衝剤として作用すると考えられる（１１）。この層は、鉄及びＰＰＩＸの細胞表面貯蔵にも役立ち得る（７０）。ヘム制限中、鉄ＰＰＩＸのこの供給源の枯渇は、酸化ストレスに対する感受性増大を生じることが示された（６４）。したがってヘム制限中のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼの存在量の実質的増大は、μ−オキソビスヘム層の非存在／低減により引き起こされる酸化ストレス増大に応答し得た。ＯｘｙＲ（酸素感受性転写活性剤）も、嫌気性増殖中のアルキルヒドロペルオキシドの発現において関与するが（７１）、この場合、ポルフィロモナス・ジンジバリスＯｘｙＲ−突然変異体は、遺伝子発現の１６分の１の低減を示す。さらに近年、Duran-Pinedo及び共同研究者らも、ＲｐｒＹ応答レギュレーターによるａｐｈＣ発現の正の調節を実証した。したがって存在量の実質的増大は、ヘム利用能がＲｐｒＹ及びＯｘｙＲ制御遺伝子発現において関与し得る、ということを示唆する。興味深いことに、このタンパク質の非常に高いコドン使用頻度指数（ＣＡＩ）値（０．８３８）は、このタンパク質が、このようなストレスに応答して迅速誘導のために細胞中で高度に発現され得る、ということを示唆する。
【０１００】
本明細書全体を通して、「〜を含む」という単語、或いは「〜を含む（単数）（comprises）」又は「〜から成る（comprising）」という変形は、記述された素子、整数又は工程、或いは素子、整数又は工程の群を包含することを意味するが、任意の他の素子、整数又は工程、或いは素子、整数又は工程の群の排除を意味しないと理解される。
【０１０１】
本明細書中で言及された出版物はすべて、参照により本明細書中で援用される。本明細書中に包含されている文書、行為、材料、装置、論文等についての任意の考察は、単に、本発明に一情況を提供するためにある。これらの事柄のいずれか又はすべてが従来技術基礎の一部を構成する、或いは本出願の各特許請求の優先日前にどこかに存在したので、本発明に関連する分野における共通の一般知識であった、ということを認めるものと解釈されるべきでない。
【０１０２】
広範に記載したような本発明の精神又は範囲を逸脱しない限り、特定の実施形態に示したように、多数の変更及び／又は修正が本発明に対して成され得る、と当業者は理解する。したがって本発明の実施形態は、すべての点において例示であって、本発明を限定するものではない、と考えられるべきである。
引用文献
【０１０３】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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