(57)【要約】治療上又は予防上活性な成分としての拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む安定な液体医薬組成物及びその調製において有用な方法を提供する。これらの組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０に組成物のｐＨを維持するための緩衝剤、及び液体組成物をほぼ等張性とするために十分な量の塩酸アルギニンを含む。本発明の安定な液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物は、増殖性疾患及び自己免疫及び／又は炎症の要素を有する疾患を治療するための方法において使用される。
2009534401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な液体医薬組成物であって、以下：
（ａ）治療上又は予防上活性な成分としての拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体はヒトＢ細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合することができ、該モノクローナル抗体は該Ｂ細胞の表面上に発現されるＣＤ４０抗原に結合している場合に有意なアゴニスト活性を有さない、抗体；
（ｂ）該組成物をほぼ等張性とするために十分な量の酸性形態でのアルギニン（塩酸アルギニン）；及び、
（ｃ）約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に該組成物のｐＨを維持するための緩衝剤であって、該緩衝剤はクエン酸塩／クエン酸緩衝剤である、緩衝剤；
を含む、安定な液体医薬組成物。
【請求項２】
前記組成物が約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記緩衝剤の濃度が約５ｍＭ〜約１００ｍＭである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記緩衝剤の濃度が約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記緩衝剤の濃度が約１０ｍＭである請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記緩衝剤がクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤である請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が約５．５のｐＨを有する請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度において塩酸アルギニンを含む請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が約１００ｍＭ〜約１７５ｍＭの濃度において塩酸アルギニンを含む請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が約１５０ｍＭの濃度において塩酸アルギニンを含む請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記緩衝剤の濃度が約５ｍＭ〜約２０ｍＭである請求項８記載の組成物。
【請求項１２】
前記緩衝剤がクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり、該緩衝剤の濃度が約１０ｍＭであり、前記組成物が約ｐＨ５．５のｐＨを有する請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が約１５０ｍＭの濃度において塩酸アルギニンを含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
更に界面活性剤を含む請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記界面活性剤がポリソルベート２０である請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記界面活性剤が約０．００１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０である請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が約０．０２５％〜約０．１％（ｗ／ｖ）の濃度でポリソルベート２０を含む請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物の保存中、前記抗ＣＤ４０モノクローナル抗体における酸化され得るアミノ酸残基少なくとも１つの酸化を抑制するために十分な量のメチオニンをさらに含む請求項１又は請求項１４記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が約０．５ｍＭ〜約２０．０ｍＭの濃度においてメチオニンを含む請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭの濃度においてメチオニンを含む請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が約５．０ｍＭの濃度においてメチオニンを含む請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が下記：
ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２；
ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９又は１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６及び配列番号７に示される配列の双方、及び配列番号６及び配列番号８に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２及び配列番号４に示される配列の双方、及び配列番号２及び配列番号５に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、及び配列番号１及び配列番号３に示される配列の双方よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９又は１２．１２により生産されるモノクローナル抗体を結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｇ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｈ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｉ）競合的結合試験においてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体又は前述の項目ｃ）〜ｉ）の何れか１つのモノクローナル抗体であって、該抗体は組み換え産生される、抗体；及び、
ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）の何れか１つのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、該フラグメントは前記ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体；
よりなる群から選択される請求項１〜２１の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記フラグメントがＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、及び単鎖Ｆｖフラグメントから選択される請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌの濃度において前記組成物中に存在する請求項１〜２３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において前記組成物中に存在する請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において前記組成物中に存在する請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が少なくとも１８カ月の期間、約２℃〜約８℃の温度で安定である請求項１記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が少なくとも３か月の期間約２５℃で安定である請求項１記載の組成物。
【請求項２９】
治療上又は予防上活性な成分としての拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度における酸性形態でのアルギニン（塩酸アルギニン）；および約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に該組成物のｐＨを維持するための緩衝剤を含む安定な液体医薬組成物であって、該緩衝剤は約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり、該拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が下記：
ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２；
ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９又は１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６及び配列番号７に示される配列の双方、及び配列番号６及び配列番号８に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２及び配列番号４に示される配列の双方、及び配列番号２及び配列番号５に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、及び配列番号１及び配列番号３に示される配列の双方よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９又は１２．１２により生産されるモノクローナル抗体を結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｇ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｈ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｉ）競合的結合試験においてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
ｊ）前述の項目ａ）のモノクローナル抗体又は前述の項目ｃ）〜ｉ）の何れか１つのモノクローナル抗体であって、該抗体は組み換え産生される、抗体；及び、
ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）の何れか１つのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、該フラグメントはヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体；
よりなる群から選択される安定な液体医薬組成物。
【請求項３０】
前記フラグメントがＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、及び単鎖Ｆｖフラグメントから選択される請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が約１５０ｍＭの濃度における塩酸アルギニンを含み、前記緩衝剤が約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度におけるクエン酸ナトリウム／クエン酸であり、該組成物が約５．０〜約６．０のｐＨ及び約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有する請求項２９記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が更にメチオニン、ポリソルベート２０、又はメチオニンとポリソルベート２０の両方を含み、該メチオニンは、存在する場合には、約０．５ｍＭ〜約２０．０ｍＭの濃度において該組成物中に存在し、該ポリソルベート２０は、存在する場合には、約０．０２５％〜約０．１％（ｗ／ｖ）の濃度において該組成物中に存在する、請求項２９記載の組成物。
【請求項３３】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において前記組成物中に存在する請求項２９〜３２の何れか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２である請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
ＣＤ４０発現細胞に関連する癌又は前悪性状態を有する対象を治療するための方法であって、該方法が請求項１〜３４の何れか１項に記載の医薬組成物の薬学的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
前記癌が新生物性Ｂ細胞生育を特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、中悪性度Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、プラズマ細胞腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性小型切れ込み核リンパ腫、濾胞性大細胞型リンパ腫、濾胞性混合型小型切れ込み核リンパ腫、びまん性核切れ込み小細胞型リンパ腫、びまん性小リンパ球性リンパ腫、前リンパ性白血病、リンパプラズマ細胞性リンパ腫、辺縁層リンパ腫、粘膜関連リンパ様組織リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾臓性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型リンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、血管内リンパ腫症、びまん性混合型細胞リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エイズ関連リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、及び重鎖疾患よりなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が非Ｂ細胞血液学的悪性疾患である請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記悪性疾患が急性白血病、骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、前骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄性白血病、及び真性赤血球増加症よりなる群から選択される請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記癌がＣＤ４０抗原を発現する新生物細胞を含む固形腫瘍である請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
前記固形腫瘍が肺癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌、結腸癌、膀胱癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌、腎細胞癌、鼻咽頭癌、扁平上皮細胞癌、甲状腺乳頭状癌、子宮頸癌、及び肉腫よりなる群から選択される請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記前悪性状態が意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）である請求項３５記載の方法。
【請求項４３】
ＣＤ４０発現細胞に関連する炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する対象を治療するための方法であって、該方法が請求項１〜３４の何れか１項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記炎症性疾患又は自己免疫疾患が全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、ループス腎炎、サルコイドーシス、若年性関節炎、慢性関節リューマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、痛風性関節炎、臓器又は組織の移植片の拒絶、対宿主性移植片病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン感受性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、硬皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス症、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労性免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎及び皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、血栓崩壊、心筋症、尋常性天疱瘡、肺間質性腺維症、サルコイドーシス、Ｉ型及びＩＩ型の真性糖尿病、１、２、３及び４型遅延過敏症、アレルギー又はアレルギー性障害、喘息、チャーグ−ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性及び刺激性の接触皮膚炎、蕁麻疹、ＩｇＥ媒介アレルギー、アテローム性動脈硬化症、血管炎、特発性炎症性ミオパシー、溶血性疾患、アルツハイマー病、及び慢性炎症性脱髄性多発性神経障害よりなる群から選択される請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
液体医薬組成物中の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の安定性を増大させるための方法であって、該方法が、該抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、該組成物をほぼ等張性とするために十分な量の塩酸アルギニン、及び約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に該組成物のｐＨを維持するための緩衝剤を組み合わせることにより該組成物を製剤することを含み、該緩衝剤はクエン酸塩／クエン酸緩衝剤である、方法。
【請求項４６】
抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を含む液体医薬組成物を調製するための方法であって、該方法が、該抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、該組成物をほぼ等張性とするために十分な量の酸性形態でのアルギニン（塩酸アルギニン）、及び約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に該組成物のｐＨを維持するための緩衝剤を組み合わせることにより該組成物を製剤することを含み、該緩衝剤はクエン酸塩／クエン酸緩衝剤である、方法。
【請求項４７】
前記組成物が約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有する請求項４５又は４６記載の組成物。
【請求項４８】
前記緩衝剤の濃度が約５ｍＭ〜約１００ｍＭであり、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの塩酸アルギニンを前記抗ＣＤ４０モノクローナル抗体及び該緩衝剤と組み合わせる、請求項４５又は４６記載の組成物。
【請求項４９】
前記緩衝剤の濃度が約５ｍＭ〜約２０ｍＭであり、約１００ｍＭ〜約１７５ｍＭの塩酸アルギニンを前記抗ＣＤ４０モノクローナル抗体及び該緩衝剤と組み合わせる請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
前記緩衝剤の濃度が約１０ｍＭであり、約１５０ｍＭの塩酸アルギニンを前記抗ＣＤ４０モノクローナル抗体及び該緩衝剤と組み合わせる請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
前記緩衝剤がクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤である請求項４５〜５０の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物が約５．５のｐＨを有する請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
前記組成物が更にメチオニン、ポリソルベート２０、又はメチオニンとポリソルベート２０の両方を含むように製剤され、該メチオニンは、存在する場合には、約０．５ｍＭ〜約２０．０ｍＭの濃度において該組成物中に存在し、該ポリソルベート２０は、存在する場合には、約０．０２５％〜約０．１％（ｗ／ｖ）の濃度において該組成物中に存在する請求項４５又は４６記載の方法。
【請求項５４】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が下記：
ａ）モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２；
ｂ）ハイブリドーマ細胞株５．９又は１２．１２により生産されるモノクローナル抗体；
ｃ）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６及び配列番号７に示される配列の双方、及び配列番号６及び配列番号８に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｄ）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２及び配列番号４に示される配列の双方、及び配列番号２及び配列番号５に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｅ）配列番号１に示される配列、配列番号３に示される配列、及び配列番号１及び配列番号３に示される配列の双方よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；
ｆ）ハイブリドーマ細胞株５．９又は１２．１２により生産されるモノクローナル抗体を結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｇ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｈ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるヒトＣＤ４０配列の残基８２〜８９を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；
ｉ）競合的結合試験においてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；
ｊ）上記項目ａ）のモノクローナル抗体又は前述の項目ｃ）〜ｉ）の何れか１つのモノクローナル抗体であって、該抗体は組み換え産生される、抗体；及び、
ｋ）前述の項目ａ）〜ｊ）の何れか１つのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体であって、前記フラグメントは前記ヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体；
よりなる群から選択される請求項４５〜５３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記フラグメントがＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、及び単鎖Ｆｖフラグメントから選択される請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌの濃度において前記組成物中に存在する請求項４５〜５５の何れか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において前記組成物中に存在する請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
治療上又は予防上活性な成分としてのモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９又はその抗原結合フラグメント、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度の酸性形態でのアルギニン（塩酸アルギニン）、及び約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に該組成物のｐＨを維持するための緩衝剤であって、該緩衝剤は約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩／クエン酸緩衝剤である、緩衝剤、を含む、安定な液体医薬組成物。
【請求項５９】
ＣＤ４０発現細胞に関連する癌又は前悪性状態を有する対象を治療するための方法であって、前記方法が請求項５８記載の医薬組成物の薬学的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６０】
ＣＤ４０発現細胞に関連する炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する対象を治療するための方法であって、該方法が請求項５８記載の医薬組成物の薬学的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項６１】
液体医薬組成物におけるモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９又はその抗原結合フラグメントの安定性を増大させるための方法であって、該方法が、該モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの酸性形態でのアルギニン（塩酸アルギニン）、及び約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０に該組成物のｐＨを維持するための緩衝剤であって、該緩衝剤は約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩／クエン酸緩衝剤である、緩衝剤、とを組み合わせることにより該組成物を製剤することを含む、方法。
【請求項６２】
モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメントを含む液体医薬組成物を調製するための方法であって、該方法が、該モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの酸性形態でのアルギニン（塩酸アルギニン）、及び約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０に該組成物のｐＨを維持するための緩衝剤であって、該緩衝剤は約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩／クエン酸緩衝剤である、緩衝剤、とを組み合わせることにより該組成物を製剤することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は医薬品製剤の分野、より詳しくは増殖性疾患及び自己免疫及び／又は炎症の要素を有する疾患を治療する場合に使用するための拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む安定な液体医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子操作技術の開発における近年の進歩は薬品としての使用のために十分に多くの種々の生物学的に活性なポリペプチドを提供している。しかしながらポリペプチドは変性及び可溶性及び不溶性の凝集体の形成を包含する物理的不安定性、及び、加水分解、酸化及び脱アミド化のような種々の化学的不安定性の結果として生物学的活性を損失する場合がある。液体医薬品製剤中のポリペプチドの安定性は、例えばｐＨ、イオン強度、温度、凍結−解凍の反復サイクル、及び加工中に起こるもののような機械的剪断力への曝露のような要因により影響される場合がある。凝集体形成及び生物学的活性の損失はまた、保存バイアル内部の溶液中及び気液界面での物理的攪拌及びポリペプチド分子相互作用の結果としても起こり得る。別の立体構造変化は、輸送中の攪拌又は別様に起因する界面の圧縮−伸長の間に気液及び固液界面に吸着したポリペプチドにおいて起こり得る。そのような攪拌はタンパク質をもつれさせ、凝集させ、粒子形成させ、最終的には他の吸着されたタンパク質とともに沈潜させる場合がある。タンパク質医薬品の安定性に関する一般的検討は例えばＭａｎｎｉｎｇ等（１９８９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：９０３−９１８及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ（１９８８）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４２：Ｓ１４を参照できる。
【０００３】
ポリペプチド含有液体医薬品製剤の不安定性は再構成のための適当な液体媒体とともに凍結乾燥された形態におけるこれらの製剤をパッケージ化すること推進した。凍結乾燥は組成物の保存安定性を向上させるが、多くのポリペプチドは乾燥状態における保存の間（Ｐｉｋａｌ（１９９０）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２７：２６−３０）、又は液体製剤として再構成する際の凝集体形成又は触媒活性の損失の結果として、低下した活性を示す（例えばＣａｒｐｅｎｔｅｒ等（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ７４：２２５−２３９；Ｂｒｏａｄｈｅａｄ等（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．１８：１１６９−１２０６；Ｍｕｍｅｎｔｈａｌｅｒ等（１９９４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１２−２０；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ２５：４５９−４７０；及びＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：４７−５３参照）。添加剤の使用は乾燥タンパク質の安定性を向上させているが、多くの再水和した製剤はなお、な凝集したタンパク質を許容できない、又は望ましくない量の不活性な凝集したタンパク質を有している（例えばＴｏｗｎｓｅｎｄ  ａｎｄ  ＤｅＬｕｃａ（１９８３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８０：６３−６６；Ｈｏｒａ等（１９９２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：３３−３６；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ等（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０：６８７−６９１参照）。更に又、再構成の必要性は不便であり、投薬が不正確になる可能性がある。。
【０００４】
薬学的に有用なポリペプチドに包含されるものは組み換えにより製造されたモノクローナル抗体である。これらのクラスの治療薬のうちＴＮＦファミリー受容体メンバーＣＤ４０をターゲティングする拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はＢ細胞関連の悪性疾患及び非血液学的悪性疾患、並びに自己免疫及び／又は炎症の要素を有する疾患の治療において大きく期待されている。ＣＤ４０受容体は正常及び新生物性のヒトＢ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＣＤ８Ｔ細胞、内皮細胞、単球及び上皮細胞、一部の上皮癌細胞、及び多くの固形腫瘍、例えば肺、乳房、卵巣、膀胱及び結腸の癌の表面上に存在する５０〜５５ｋＤａの細胞表面抗原である。ＣＤ４０抗原は又。活性化されたＴ細胞、活性化された血小板、延焼した血管平滑筋細胞、好酸球、慢性関節リューマチの滑膜、皮膚線維芽細胞及び他の非リンパ様細胞型上でも発現される。ＣＤ４０を発現する細胞の型に応じて、ライゲーションにより細胞間接着、分化、活性化及び増殖を誘導することができる。
【０００５】
例えば、ＣＤ４０のその同族リガンドＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４とも標記される）に対する結合はＢ細胞の増殖及びプラズマ細胞への分化、抗体生産、アイソタイプ切り替え、及びＢ細胞メモリー発生を刺激する。Ｂ細胞分化の間、ＣＤ４０は前Ｂ細胞上で発現されるが、プラズマ細胞への分化時には消失する。ＡＰＣ上のＣＤ４０の発現はこれらの細胞の活性化において重要な同時刺激の役割を果たしている。例えばアゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はＢ細胞活性化においてＴヘルパー細胞の作用を模倣することが分かっている。ＦｃγＲＩＩを発現する接着性細胞上で発現されれば、これらの抗体はＢ細胞増殖を誘導する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７０）。更に又、アゴニスト抗ＣＤ４０ｍＡｂはＩＬ−４の存在下でＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＥの分泌に関するＴヘルパーシグナルを置き換えることができる（Ｇａｓｃａｎ等（１９９１）Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８）。更に又、アゴニスト抗ＣＤ４０ｍＡｂはリンパ節から単離されたＢ細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）を防止することができる。
【０００６】
これら、及び他の観察結果は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用が体液性及び細胞媒介性の免疫応答の両方の調節において主軸となる役割を果たしているという現在の理論を裏付けている。より最近の研究は多様な生理学的及び病理学的なプロセスにおけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用のはるかに広範な役割を明らかにしている。
即ち、ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の係留とその後のＣＤ４０シグナリングの活性化は正常な免疫応答のための必要な工程であるが；ＣＤ４０シグナリングの脱調節は疾患をもたらす場合がある。ＣＤ４０シグナリング経路は自己免疫疾患に関与することが分かっている（Ｉｃｈｉｋａｗａ等（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２７８１−２７８７及びＭｏｏｒｅ等（２００２）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９：１３９−１４５）。更に又、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用は炎症プロセスにおいて重要な役割を果たしている。例えば、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの両方がヒト及び実験的なアテローム性動脈硬化症患部で過剰発現される。ＣＤ４０刺激はマトリックス分解酵素の発現及び組織因子発現をアテローム関連細胞型、内皮細胞、平滑筋細胞及びマクロファージにおいて誘導する。更に又、ＣＤ４０刺激はプロ炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８及び接着分子、例えばＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭの生産を誘導する。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用の抑制は動物モデルにおいてアテローム形成を防止する。移植モデルにおいて、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用のブロッキングは炎症を防止する。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合はアルツハイマーのアミロイドベータペプチドと相乗作用的に作用して、小グリア細胞の活性化を増進することにより、神経毒をもたらす。慢性関節リューマチ（ＲＡ）を有する患者においては、ＣＤ４０発現は関節の軟骨細胞において増大しており、即ち、ＣＤ４０シグナリングは損傷性のサイトカイン及びマトリックスメタロプロテイナーゼの生産に寄与していると考えられる。Ｇｏｔｏｈ等（２００４）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３１：１５０６−１５１２を参照できる。
【０００７】
同様に、Ｂ細胞系統の腫瘍型に由来する悪性Ｂ細胞はＣＤ４０を発現し、生存及び増殖のためにはＣＤ４０シグナリングに依存していると考えられる。低い、又は高い等級のＢ細胞リンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びホジキン病を有する患者に由来する形質転換細胞はＣＤ４０を発現する。ＣＤ４０発現は又急性骨髄芽球性白血病の症例の２／３及びエイズ関連リンパ腫の５０％で検出されている。
【０００８】
多くの癌及び肉腫もまた高レベルのＣＤ４０発現を示すが、これらの癌細胞上のＣＤ４０発現に関連するＣＤ４０シグナリングの役割はそれほど理解されていない。ＣＤ４０発現癌は膀胱癌（非特許文献１；非特許文献２）、乳癌（非特許文献３；非特許文献４）；前立腺癌（非特許文献５）、腎細胞癌（非特許文献６）、未分化鼻咽頭癌（ＵＮＰＣ）（非特許文献７）、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）（非特許文献８；非特許文献９）、甲状腺乳頭状癌（非特許文献１０）、皮膚悪性黒色腫（非特許文献１１）、胃癌（非特許文献１２）、及び肝臓癌（例えばヒト肝細胞癌を考察している非特許文献１３参照）を包含する。ＣＤ４０発現肉腫に関してはヒト骨肉腫及びユーイング肉腫を考察している非特許文献１４を参照できる。
【０００９】
種々の癌及び自己免疫／炎症性疾患におけるＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリングを調節する場合の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の潜在的な治療上の利点、及びこれらのポリペプチドを製剤化することの困難さを想定すれば、これらの抗体を含む安定な医薬組成物が必要とされている。
【非特許文献１】Ｐａｕｌｉｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４２：５９０−５９５
【非特許文献２】Ｂｒａｅｓｃｈ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４２：５６２−５６７
【非特許文献３】Ｈｉｒａｎｏ等、Ｂｌｏｏｄ（１９９９）９３：２９９９−３００７
【非特許文献４】Ｗｉｎｇｅｔｔ等、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．（１９９８）５０：２７−３６
【非特許文献５】Ｒｏｋｈｌｉｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９７）５７：１７５８−１７６８
【非特許文献６】Ｋｌｕｔｈ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９７）５７：８９１−８９９
【非特許文献７】Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９５）１４７：１１５２−１１６０
【非特許文献８】Ａｍｏ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（２０００）１０：４３８−４４２
【非特許文献９】Ｐｏｓｎｅｒ等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９９）５：２２６１−２２７０
【非特許文献１０】Ｓｍｉｔｈ等、Ｔｈｙｒｏｉｄ（１９９９）９：７４９−７５５
【非特許文献１１】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｏｒｄ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９６）１４９：１９５３−１９６１
【非特許文献１２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．（２００３）２３（６）：１６９７−７０２
【非特許文献１３】Ｓｕｇｉｍｏｔｏ等、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９９）３０（４）：９２０−２６
【非特許文献１４】Ｌｏｌｌｉｎｉ等、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９８）４（８）：１８４３−８４９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
要旨
治療上又は予防上活性な成分としての拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む安定な液体医薬組成物及びその調製において有用な方法を提供する。これらの組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０に組成物のｐＨを維持するための緩衝剤、及び液体組成物をほぼ等張性とするために十分な量の塩酸アルギニンを含む。１つの実施形態において、緩衝剤はクエン酸塩／クエン酸緩衝液であり、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントであり、組成物は等張性付与剤として塩酸アルギニンを含み、組成物は更にノニオン性界面活性剤及び／又はＬ−メチオニンを追加的安定化剤として含む。本発明の安定な液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物は、増殖性疾患及び自己免疫及び／又は炎症の要素を有する疾患を治療するための方法において使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ここで本発明は添付図面を参照しながら更に詳細に説明されることになるが、図面には本発明の全てではなく一部の実施形態のみを示している。実際、本発明は多くの異なる形態において実施してよく、本明細書に記載する実施形態に限定されると考えてはならず；これらの実施形態は本開示が適用される法的基準を満足するように提示している。
【００１２】
本明細書に記載する本発明の多くの変形例及び他の実施形態は、上記した説明及び関連する図面において提示した教示を利用できる本発明の関連する分野の当業者には、想到されるものである。従って、本発明は開示した特定の実施形態に限定されないこと、及び、変形例及び他の実施形態は添付請求項の範囲内に包含されることを意図されていることを理解しなければならない。本明細書において特定の用語を使用するが、それらは包括的で説明的な意味において使用されているのみであり、限定する目的ではない。
【００１３】
本発明は治療上又は予防上活性な成分として拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つを含む安定な液体医薬組成物、及び、それらの調製において有用な方法に関する。本発明の目的のためには、医薬組成物又は製剤に関連する場合の「液体」という用語は「水性」という用語を包含することを意図される。「治療上又は予防上の活性成分」とは、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントが組成物内に特異的に取り込まれることにより、対象内の疾患又は状態の治療、防止又は診断に対する所望の治療上又は予防上の応答を、その対象に医薬組成物が投与された時点においてもたらすことを意図する。
【００１４】
「安定な」とは、本発明の医薬組成物が拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの物理的及び／又は化学的安定性をもたらすことを意味する。即ち、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントは本質的にその物理的及び／又は化学的安定性を保持しており、所望の生物学的活性、即ち本明細書において定義する拮抗剤活性の１つ以上、例えば；Ｔ細胞により刺激される正常なヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリンの分泌の抑制；ＪｕｒｋａｔＴ細胞により刺激される正常なヒト末梢Ｂ細胞の生存及び／又は増殖の抑制；ＣＤ４０Ｌ発現細胞又は可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）により刺激される正常なヒト末梢Ｂ細胞の生存及び／又は増殖の抑制；ｓＣＤ４０Ｌ又は固相ＣＤ４０Ｌにより刺激される何れかの細胞における「生存」の抗アポトーシス細胞内シグナルの抑制；ｓＣＤ４０Ｌ又は固相ＣＤ４０Ｌとのライゲーション時の何れかの細胞におけるＣＤ４０シグナルトランスダクションの抑制；ヒト悪性Ｂ細胞の増殖の抑制；ＣＤ４０担持標的細胞又はＣＤ４０に対する同族リガンドを担持している細胞、例えば限定しないが、Ｔ細胞及びＢ細胞の欠失、アネルギー及び／又は耐容性誘導；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の増殖又は活性化の誘導（例えばＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ干渉を介したドナー同種抗原特異的組織拒絶、Ｍａｕｒｉｋ等（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５４０１−５４０４参照）；何れかの機序による細胞毒性（例えば限定しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、増殖のダウンレギュレーション、及び／又は標的細胞におけるアポトーシス）；標的細胞サイトカイン分泌及び／又は細胞表面分子発現のモジュレーション；及びこれらの組み合わせを有する。
【００１５】
タンパク質安定性をモニタリングするための方法は当該分野で周知である。例えばＪｏｎｅｓ（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０；Ｌｅｅ編（１９９１）Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；及び本明細書において後に開示する安定性試験を参照できる。一般的にタンパク質の安定性は特定の期間、選択された温度において測定される。好ましい実施形態においては、安定な抗体医薬組成物は、室温（約２５℃）において少なくとも１ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、又は少なくとも６ヶ月間、保存された場合に拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの安定性をもたらすか、及び／又は約２〜８℃において少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、安定である。
【００１６】
抗体のようなタンパク質は、医薬組成物中に製剤された場合、それがその医薬組成物中において沈殿、凝集、及び／又は変性の目視可能な兆候（即ち変色又は透明性の損失）、又は測定可能な兆候（例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はＵＶ光散乱を使用）を示していない場合に、所定の時点において物理的安定性を保持していると見なされる。化学的安定性に関しては、抗体のようなタンパク質は、医薬組成物中に製剤された場合、その医薬組成物中において目的の生物学的活性をタンパク質（即ち抗体）が保持していることを化学的安定性の測定が示している場合に、所定の時点においてその化学的安定性を保持していると見なされる。化学的安定性の変化をモニタリングするための方法は当該分野で周知であり、限定しないが、タンパク質の化学的に改変された形態、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ及び／又はマトリックス支援レーザー脱着イオン化／飛行時間型質量飛行時間型質量分析を用いたクリッピングの結果；及び例えばイオン交換クロマトグラフィーを用いた分子の変化に関連（例えば脱アミド化に関連）する分解を検出するための方法を包含する。例えば本明細書において後に開示する方法を参照できる。
【００１７】
拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントは医薬組成物中に製剤された場合、所定の時点において所望の生物学的活性を保持していると見なされるのは、所望の生物学的活性に関する適当な試験において測定した場合に、その時点における所望の生物学的活性が医薬組成物調製時において示された所望の生物学的活性の約３０％以内、好ましくは約２０％以内である場合である。本明細書に開示した拮抗剤抗ＣＤ４０抗体及びその抗原結合フラグメントの所望の生物学的活性を測定するための試験は、仮出願である表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日及び２００４年４月２７日のもの、及び、譲渡された各々の米国特許出願６０／５１７，３３７（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、６０／５２５，５７９（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、及び６０／５６５，７１０（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））、同様に、表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００４年１１月４日、ＷＯ２００５／０４４８５４として公開されたものに記載されている通り実施でき；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。同様に、仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，２８５（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００２（０３５７８４／３０４３１２））、及び相当する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９４１４（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００３（０３５７８４／３１１６１１））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１４３として公開；及び仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，３３６（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００２（０３５７８４／３０４３１１））、及び相当する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９３２５（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００３（０３５７８４／３１１６０８））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１１７として公開されたものに記載された試験も参照でき；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。同様に、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ等（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ���２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎ等（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓ等（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎ等（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎ等（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ等（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７９：４３９−４４４；及び米国特許５，６７４，４９２及び５，８４７，０８２に記載された試験も参照でき；参照として本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本発明の方法に従って製剤される拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントは本明細書に開示する方法を包含する当該分野で知られた何れかの方法を用いて調製できる。１つの実施形態において、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、後述するＣＨＯ細胞系統内で組み換え生産される。
【００１９】
その調製および精製の後、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントは本明細書に記載する態様において液体医薬組成物として製剤できる。拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントをその製剤の前に保存しなければならない場合は、それは例えば−２０℃以下で凍結し、次に室温で解凍してその後の製剤に付すことができる。
【００２０】
本発明の液体医薬組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの治療上又は予防上有効な量を含む。製剤中に存在する抗体又はその抗原結合フラグメントの量は投与経路及び所望の投薬容量を考慮する。
【００２１】
この態様において、本発明の液体医薬組成物は、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９抗体、又はその抗原結合フラグメントを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４０．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約３０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において含む。一部の実施形態においては、液体医薬組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約１５．０ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約２５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３０．０ｍｇ／ｍｌ、約３０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約３５．０ｍｇ／ｍｌ〜約４０．０ｍｇ／ｍｌ、約４０．０ｍｇ／ｍｌ〜約４５．０ｍｇ／ｍｌ、又は約４５．０ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌの濃度において含む。他の実施形態においては、液体医薬組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを、約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２７ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約２９ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３１ｍｇ／ｍｌ、約３２ｍｇ／ｍｌ、約３３ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ、又は約３５ｍｇ／ｍｌの濃度において含む。
【００２２】
本発明によれば、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えば本明細書に記載するモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメントは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲の医薬組成物のｐＨを維持するための緩衝物質、及び組成物をほぼ等張性とするために十分な塩酸アルギニンと本明細書では称する自身の酸性形態のアルギニンの量とともに製剤される。「ほぼ等張性」とは、水性製剤が約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３６０ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは約２４０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３４０ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは約２５０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３３０ｍｍｏｌ／ｋｇ、更により好ましくは約２６０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３２０ｍｍｏｌ／ｋｇ、又更により好ましくは約２７０ｍｍｏｌ／ｋｇ〜約３１０ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有することを意図している。一部の実施形態においては、液体医薬組成物は約２９５ｍｍｏｌ／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有する。溶液の等張性を測定するための方法は当業者の知る通りである。例えばＳｅｔｎｉｋａｒ等（１９５９）Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．４８：６２８を参照できる。
【００２３】
塩酸アルギニンは等張性付与剤として作用するのみならず、本発明の液体医薬組成物の保存中の立体構造的変化、凝集体の形成、フラグメント化、及び／又は脱アミド化に対抗して抗体を安定化させるためにも作用する。「保存中」とは、一旦調製した液体医薬組成物又は製剤が即座に対象に投与されないことを意図している。むしろ、調製後、それは液体形態において、凍結状態において、又は後に再構成して液体形態とするための乾燥形態又は対象への投与に適する他の形態において保存するためにパッケージ化される。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物又は製剤がフリーズドライ（即ち凍結乾燥；例えばＷｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ（１９８４）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４８−５９参照）、噴霧乾燥（Ｍａｓｔｅｒｓ（１９９１），Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｚ，ＵＫ）ｐｐ．４９１−６７６；Ｂｒｏａｄｈｅａｄ等（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ，Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．１８：１１６９−１２０６；及びＭｕｍｅｎｔｈａｌｅｒ等（１９９４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１２−２０参照）又は空気乾燥（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ２５：４５９−４７０；及びＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ，４：４７−５３）の何れかにより乾燥されることを意図している。液体医薬組成物の保存中の立体構造的変化、凝集体の形成、フラグメント化、及び／又は脱アミド化は抗体の生物学的活性に悪影響を及ぼし、医薬組成物の治療効果の損失をもたらす場合がある。更に又、凝集体形成は他の問題点、例えば抗含有医薬組成物を輸液刑を用いて投与する場合に配管、膜又はポンプの遮断を誘発する場合がある。
【００２４】
アルギニンの何れかの立体異性体（即ちＬ、Ｄ又はＤＬ異性体）又はこれらの立体異性体の組み合わせは、アルギニンがその酸性形態、即ち塩酸アルギニンとして存在する限り、本発明の医薬組成物中に存在してよい。好ましくはＬ型の立体異性体を使用する。本発明の組成物は又、このアミノ酸の類縁体を用いて製剤してもよい。「アミノ酸類縁体」という用語は組成物をほぼ等張性とする、並びに、本発明の液体医薬組成物の保存中のポリペプチドの凝集体形成、フラグメント化、及び／又は脱アミド化を低減する所望の作用をもたらす天然に存在するアミノ酸の誘導体を意図している。適当なアルギニン類縁体は例えばアミノグアニジン及びＮ−モノメチルＬ−アルギニンを包含する。アルギニンの場合と同様、アミノ酸類縁体はその酸性の形態において組成物中に配合される。
【００２５】
医薬組成物中の塩酸アルギニンの濃度は張力に対する他の成分の寄与に応じたものとなる。一部の実施形態においては、塩酸アルギニンの濃度は約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１３０ｍＭ〜約１７０ｍＭ、約１３０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、約１３５ｍＭ〜約１５５ｍＭ、約１４０ｍＭ〜約１５５ｍＭ、約１４５ｍＭ〜約１５５ｍＭである。１つのそのような実施形態において、塩酸アルギニンの濃度は約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ又は約１７５ｍＭである。
【００２６】
液体抗体含有医薬組成物のｐＨはそこに含有されている抗体の安定性に対して、主にポリペプチド凝集体形成に対するその作用を介して影響する。即ち、本発明の医薬組成物中に存在する緩衝剤の量は、目的の特定の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の安定性のために最適であるｐＨに応じて変動することになる。この最適ｐＨの決定は当該分野で一般的に使用できる方法、例えば立体構造的安定性を測定する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）；凝集体形成及びフラグメント化を測定するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）；電荷変化関連分解を測定する及びカチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて達成できる。本発明の液体医薬組成物のための好ましいｐＨは約ｐＨ５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９，７．０、及び約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内の他のこのような値である。一部の実施形態においては、緩衝剤は医薬組成物のｐＨを約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５、又は約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．０の範囲に維持する。
【００２７】
約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲に液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体医薬組成物のｐＨを維持する何れの適当な緩衝剤も、抗体の物理化学的安定性及び所望の生物学的活性が上記した通り維持される限り、製剤中で使用することができる。適当な緩衝剤は限定しないが、従来の酸及びその塩を包含し、その場合、対イオンは、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又はマグネシウムであることができる。液体医薬組成物を緩衝するために使用できる従来の酸及びその塩の例は、限定しないが、クエン酸又はクエン酸塩、コハク酸又はコハク酸塩、酢酸又は酢酸塩、酒石酸又は酒石酸塩、リン酸又はリン酸塩、グルコン酸又はグルコン酸塩、グルタミン酸又はグルタミン酸塩、アスパラギン酸又はアスパラギン酸塩、マレイン酸又はマレイン酸塩及びリンゴ酸又はリンゴ酸塩を包含する。当然ながら、緩衝剤は酸と酸の塩型の混合物、例えばクエン酸とクエン酸塩の混合物（本明細書においてはクエン酸塩／クエン酸緩衝液と称する）、コハク酸とコハク酸塩の混合物（本明細書においてはコハク酸塩／コハク酸緩衝液と称する）、酢酸と酢酸塩の混合物（本明細書においては酢酸塩／酢酸緩衝液と称する）、及び上記した酸／酸塩の対の各々に関する同様のものであることができる。緩衝剤の濃度は約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、例えば約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の他のこのような値であることができる。一部の実施形態においては、緩衝剤の濃度は約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、例えば５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲内の他のこのような値であることができる。
【００２８】
本発明の一部の実施形態においては、液体医薬組成物は所望の濃度（即ち上記した通り約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ）の本明細書に記載した拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント、組成物を等張性とするための量の塩酸アルギニン、及びクエン酸塩／クエン酸緩衝液である緩衝剤を含み、ここで、緩衝剤の濃度は緩衝剤が医薬組成物のｐＨを約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、例えば約ｐＨ５．０、５．５、６．０及び６．５の範囲に維持するようなものとする。「クエン酸塩」とは、クエン酸の塩を含む緩衝液を意図している。好ましい実施形態においては、クエン酸塩の対イオンはナトリウムカチオンであり、このため、クエン酸塩緩衝液成分はクエン酸ナトリウムとなる。しかしながら、何れのカチオンも有効であると予測される。他の可能なクエン酸塩カチオンは、限定しないが、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウムを包含する。上記した通り、クエン酸塩／クエン酸緩衝液は酸（即ちクエン酸）および酸の塩形態（即ちクエン酸塩）の混合物を含み、ここで酸の塩形態の対イオンは何れかの適当なカチオンであることができる。１つのそのような実施形態において、酸の塩形態のための対イオンはナトリウムカチオンであり、従って、緩衝剤はクエン酸とクエン酸ナトリウムの混合物を含む。上記した通り、クエン酸塩／クエン酸緩衝液の濃度は約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、例えば約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の他のこのような値であることができる。一部の実施形態においては、クエン酸塩／クエン酸緩衝剤の濃度は約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、例えば５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、又は約１５ｍＭである。
【００２９】
他の実施形態において、液体医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌの濃度の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；組成物を等張性とするための量の塩酸アルギニンを含み；緩衝剤は約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの濃度のクエン酸塩／クエン酸緩衝液である。更に別の実施形態においては、液体医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌの濃度の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；組成物を等張性とするための量の塩酸アルギニンを含み；緩衝剤は約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤である。
【００３０】
一部の好ましい実施形態においては、液体医薬組成物は、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；医薬組成物のｐＨを約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に維持するための緩衝剤を含み；塩酸アルギニンの濃度は約１００ｍＭ〜約２００ｍＭである。これらの実施形態の一部においては、緩衝剤は約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり、液体医薬組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメントを含み、医薬組成物は約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、又は約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．０のｐＨを有する。他の実施形態においては、液体医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約３０．０ｍｇ／ｍｌ、又は約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；約１５０ｍＭの塩酸アルギニンを含み；緩衝剤は約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり；ここで製剤は約ｐＨ５．５のｐＨを有する。
【００３１】
本発明の液体医薬品製剤の処理中の凍結解凍または機械的な剪断力に起因するタンパク質の分解は溶液−気体界面における表面張力を低下させるために製剤に界面活性剤を配合することにより抑制できる。即ち、一部の実施形態においては、液体医薬組成物は、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に医薬組成物のｐＨを維持するための緩衝剤；液体医薬組成物をほぼ等張性とするための量の塩酸アルギニンを含み；更に界面活性剤を含む。他の実施形態においては、液体医薬組成物は、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の範囲内に医薬組成物のｐＨを維持するための緩衝剤；約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、又は約１００ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度の塩酸アルギニンを含み；更に界面活性剤を含む。
【００３２】
使用される典型的な界面活性剤はノニオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビトールエステル、例えばポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル、例えばプルロニックＦ６８；ポリオキシエチレンアルコール、例えばＢｒｉｊ３５；シメチコン；ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ４００；リソホスファチジルコリン；及びポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。界面活性剤又は乳化剤による医薬品の古典的安定化は例えば参照として本明細書に組み込まれるＬｅｖｉｎｅ等（１９９１）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０−１６５に記載されている。本発明の実施において使用される好ましい界面活性剤はポリソルベート２０又はポリソルベート８０である。界面活性剤を含有させる場合は、それは典型的には約０．００１％〜約１．０％、約０．００１％〜約０．５％、約０．００１％〜約０．４％、約０．００１％〜約０．３％、約０．００１％〜約０．２％、約０．００５％〜約０．５％、約０．００５％〜約０．２％、約０．０１％〜約０．５％、約０．０１％〜約０．２％、約０．０３％〜約０．５％、約０．０３％〜約０．３％、約０．０５％〜約０．５％、又は約０．０５％〜約０．２％の量で添加され、ここでパーセントは重量／容量（ｗ／ｖ）に基づく。
【００３３】
即ち、一部の実施形態においては、液体医薬組成物は、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメントを含み；緩衝剤は約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のクエン酸塩／クエン酸緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり；組成物は約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、又は約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．０のｐＨを有し；塩酸アルギニンが約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在し；医薬組成物は更に界面活性剤、例えばポリソルベート２０を、約０．００１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）又は約０．００１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）の量で含む。他の実施形態においては、液体医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約３０．０ｍｇ／ｍｌ、又は約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度における拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの塩酸アルギニン、例えば約１５０ｍＭの塩酸アルギニンを含み；緩衝剤は約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば約１０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり；医薬組成物は場合により界面活性剤、例えばポリソルベート２０を、約０．００１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）、例えば約０．００１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約０．２５％（ｗ／ｖ）、約０．０２５％〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２５％〜約０．１％（ｗ／ｖ）、又は約０．０５％〜約０．２％（ｗ／ｖ）の量で含み；ここで液体医薬組成物は約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．０、又はｐＨ５．５のｐＨを有する。
【００３４】
液体医薬組成物は保存料及び他の担体、賦形剤又は安定化剤のいずれも実質的に非含有であることができる。或いは、医薬組成物は場合により本明細書に記載した１つ以上の保存料、例えば抗細菌剤、製薬上許容しうる担体、賦形剤又は安定化剤を含むことができるが、ただし、それらは抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの物理化学的安定性に悪影響を及ぼしてはならない。許容される担体、賦形剤及び安定化剤の例は、限定しないが、追加的な緩衝剤、共溶媒、界面活性剤、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン、キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ、金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、及び生体分解性重合体、例えばポリエステルを包含する。製薬上許容しうる担体、安定化剤、及びイソモライト（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の形成及び選択の詳細な考察は、参照として本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１８版；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０）に記載されている。
【００３５】
即ち、１つの実施形態において、本発明の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有液体医薬組成物は更に、抗体ポリペプチド鎖内の酸化され得るアミノ酸残基の酸化を抑制するためのアミノ酸メチオニンを含む。「抑制する」とは、経時的な酸化物質種の最小限の蓄積を意図している。酸化を抑制することにより、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体をその適切な分子の形態において、より多く保持することができる。メチオニンの何れかの立体異性体（Ｌ、Ｄ又はＤＬ異性体）又はそれらの組み合わせを使用できる。添加すべき量は酸化された物質種の量が規制当局の許容するものとなるように酸化され得るアミノ酸残基の酸化を抑制するために十分な量でなければならない。典型的には、このことは、組成物が約１０％〜約３０％を超えない酸化生成物を含有することを意味する。一般的に、これは、添加されたメチオニンのメチオニン残基に対する比が約１：１〜約１０００：１、最も好ましくは１０：１〜約１００：１の範囲となるようにメチオニンを添加することにより達成できる。
【００３６】
添加すべきメチオニンの好ましい量は、実施例１において後述する通り、種々の濃度のメチオニンとともに拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を調製すること、及び、例えば分子種のクロマトグラフィー分離及びポリペプチド分子量標準物質を用いた同定、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによるもの、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いながら、ポリペプチドの酸化の物質種の形成に対する相対的作用を測定することにより、容易に実験的に決定することができる。抗体凝集のアミノ酸関連抑制に対して悪影響を有することなく酸化のアミノ酸残基の酸化の抑制を最大限とするメチオニンの濃度は抗体の安定性を更に向上させるために組成物に添加すべきメチオニンの好ましい量を示すことになる。
【００３７】
即ち、本発明の一部の実施形態においては、液体医薬組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメントを含み；緩衝剤は約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度のクエン酸塩／クエン酸緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり；医薬組成物は約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、又は約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．０のｐＨを有し；塩酸アルギニンが約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在し；界面活性剤は例えば約０．００１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）、又は約０．００１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）の量のポリソルベート２０を又はポリソルベート８０として存在し；医薬組成物は更に、約０．５ｍＭ〜約２０．０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約２０．０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約７．０ｍＭ、約２．０ｍＭ〜約６．０ｍＭ、又は約２．５ｍＭ〜約５．０ｍＭの濃度のメチオニンを含む。他の実施形態においては、液体医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約３０．０ｍｇ／ｍｌ、又は約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度における拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；約５０ｍＭ〜約２００ｍＭの塩酸アルギニン、例えば約１５０ｍＭの塩酸アルギニン；約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば約１０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤；場合により約０．００１％〜約１．０％（ｗ／ｖ）、例えば約０．００１％〜約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約０．２５％（ｗ／ｖ）、約０．０２５％〜約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．０２５％〜約０．１％（ｗ／ｖ）、又は約０．０５％〜約０．２％（ｗ／ｖ）の量の界面活性剤、例えばポリソルベート２０；場合により約０．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約７．０ｍＭ、約２．０ｍＭ〜約６．０ｍＭ、又は約２．５ｍＭ〜約５．０ｍＭ、例えば約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５．０ｍＭ、又は約５．５ｍＭの濃度のメチオニンを含み；ここで液体医薬組成物は約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．０、又はｐＨ５．５のｐＨを有する。
【００３８】
更に他の実施形態においては、液体医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、約１０．０ｍｇ／ｍｌ〜約３５．０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約１５．０ｍｇ／ｍｌ、約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約２５．０ｍｇ／ｍｌ、約３０．０ｍｇ／ｍｌ、又は約３５．０ｍｇ／ｍｌの濃度における拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメント；約１００ｍＭ〜約２００ｍＭの塩酸アルギニン、例えば約１５０ｍＭの塩酸アルギニン；約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば約１０ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤；場合により約０．０２５％〜約０．１％（ｗ／ｖ）の量の界面活性剤、例えばポリソルベート２０；場合により例えば約２．０ｍＭ〜約５．５ｍＭ、例えば約５．０ｍＭの濃度のメチオニンを含み；ここで液体医薬組成物は約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．０、例えば約ｐＨ５．５のｐＨを有する。
【００３９】
上記開示したこれらの薬剤に加えて、他の安定化剤、例えばアルブミン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はその塩の１つ、例えばＥＤＴＡ２ナトリウムも場合により液体医薬組成物の安定性を更に増強するために添加することができる。望ましい場合は、アルブミンの量は約１．０％ｗ／ｖ以下の濃度で添加することができる。ＥＤＴＡは多くの酸化反応を触媒することがわかっている金属イオンのスカベンジャーとして作用することにより、追加的な安定化剤となる。所望によりＥＤＴＡの量は約０．１〜約５．０ｍＭの濃度において添加することができる。
【００４０】
所望により、糖類及び糖アルコールも本発明の安定化された液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物に含有させてよい。何れかの糖類、例えば１糖類、２糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン、例えばフラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースＮａを使用してよい。スクロースが最も好ましい糖添加物である。糖アルコールは−ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを包含し、マンニトールが最も好ましい糖アルコール添加剤である。上記した糖類及び糖アルコールは個別に、又は組み合わせて使用してよい。使用される量には固定された限度はないが、糖類及び糖アルコールは液体調製品中で可溶性であり、本発明の方法を用いて達成される安定化作用に悪影響を及ぼしてはならない。好ましくは、糖類又は糖アルコールの濃度は約１．０％〜約１５．０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約２．０％〜約１０．０％（ｗ／ｖ）である。
【００４１】
本明細書に記載した液体医薬組成物は、調製後、分解を防止するために凍結乾燥することができる。液体組成物を凍結乾燥するための方法は当業者の知る通りである。使用直前に、追加的成分を含んでいてよい滅菌された希釈液（リンゲル液、蒸留水、又は滅菌食塩水等）で組成物を再構成してよい。再構成により、組成物は好ましくは当該分野で知られた方法を用いて対象に投与される。
【００４２】
本発明の液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物は安定であり、従って等張性付与剤として塩化ナトリウムを含む緩衝された溶液中に調製された拮抗剤抗ＣＤ４０抗体組成物と相対比較して、増大した保存安定性を有している。理論に制約されないが、この増大した保存安定性は、後の使用のためにその形態で直接保存されているもの、凍結状態で保存され、使用前に解凍されるもの、又は、後に再構成して使用前に液体形態又は他の形態とするための乾燥形態、例えば凍結乾燥、空気乾燥又は噴霧乾燥された形態の何れであるかに関わらず、液体製剤において観察されている。好ましくは本発明の組成物はその液体形態で直接保存することにより液体形態における増大した保存安定性を有すること、再構成の必要なく投与が容易であること、及び予備充填された即時使用可能なシリンジ中で、又は製剤が制菌剤に適合する場合は多用量調製品として製剤を供給する能力の利便性を最大限に得ることができる。
【００４３】
本発明の組成物は、等張性付与剤としての塩酸アルギニン、及び緩衝剤としての酸とその塩形態、例えばクエン酸ナトリウム／クエン酸の混合物の使用が、塩化ナトリウム及び該当する緩衝剤を使用して調製した液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物と相対比較した場合に、増大した保存安定性を有する液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物をもたらすという発見に関連している。組成物の増大した保存安定性は、治療活性拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の安定性に対するアルギニンの酸性形態の影響、より詳しくは、液体製剤中の保存中のポリペプチド凝集体形成、フラグメント化及び脱アミド化に対するその影響を介して達成される。更に又、上記した態様において緩衝された液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体組成物中に等張性付与剤として塩酸アルギニンを配合することは、塩化ナトリウムのような追加的等張性付与剤を包含させる必要なく、ほぼ等張性の液体医薬組成物をもたらす。
【００４４】
本発明の安定な液体医薬組成物中に配合されたアルギニンの酸性形態は物理的および化学的変化に対抗して治療上活性な拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを保護し、これにより、組成物の保存の間の抗体の安定性を増大させる。「安定性を増大させる」とは、液体医薬組成物の保存中の抗体による凝集体形成、フラグメント化及び脱アミド化の１つ以上が、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体及びこの特定の等張性付与及び安定化剤の非存在以外は同じ製剤成分を含む液体医薬組成物の保存中に観察されるものと相対比較して低下していることを意図している。液体組成物中の保存中の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体凝集体形成に対する塩酸アルギニンの作用は、経時的に溶液中の可溶性抗ＣＤ４０抗体の変化を測定することにより容易に調べることができる。溶液中の可溶性抗ＣＤ４０抗体の量は目的の抗体の検出のために適合された多くの分析試験により定量できる。そのような試験は例えば逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ、サイズ排除（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣ及びＵＶ吸光度測定を包含する。凝集はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてモニタリングすることもできる。本明細書において後述する実施例も参照できる。
【００４５】
凝集の場合、本発明の安定な医薬組成物を得るために拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有液体医薬組成物内に配合すべき塩酸アルギニンの有効量は、経時的に低下した凝集体形成、その結果としての、その非凝集の生物学的に活性な分子の形態における溶液中の可溶性拮抗剤抗ＣＤ４０抗体のより大量の保持をもたらした量としてとらえられる。即ち、例えば拮抗剤抗ＣＤ４０抗体が後述する実施例に記載したＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗ＣＤ４０抗体である場合、本発明の安定な組成物を調製する場合に使用される塩酸アルギニンの有効量は、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体のその単量体分子形態におけるより多い保持をもたらす量である。
【００４６】
理論に制約されないが、本発明の安定な液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有組成物の増大した保存安定性は又、保存中の抗体のフラグメント化及び／又は治療活性抗体内のグルタミン及び／又はアスパラギン残基の脱アミド化に対する塩酸アルギニンの抑制作用に関連していると考えられる。抗体フラグメント化に対する塩酸アルギニンの作用は例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を用いて経時的に製剤内の分子種の変化をモニタリングすることにより容易に調べることができ；本明細書において後述する実施例を参照できる。液体組成物中の保存の間の抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドの脱アミド化に対する塩酸アルギニンの作用は、経時的に拮抗剤地ＣＤ４０抗体がその脱アミド形態で存在する量をモニタリングすることにより容易に測定できる。溶液相中に存在するポリペプチドンの分子種、即ちネイティブ又は脱アミド型を測定するための方法は一般的に当該分野で知られており、。そのような方法は後に実施例において記載する通り、分子種のクロマトグラフィー分離及びポリペプチドの分子量標準物質を用いる同定、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ、又はカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を包含する。
【００４７】
本発明の安定な液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物は、塩酸アルギニンにより達成される一次的安定化作用が悪影響を受けない限り、治療上活性な成分として作用する目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の有効性を増大させるか、所望の品質を増進する他の成分を含有してよい。組成物は選択された経路を介した投与に関して安全でなければならず、滅菌されていなければならず、その所望の治療活性を保持していなければならない。
【００４８】
本発明の医薬組成物は例えば安定化剤及び緩衝剤、及び何れかの他の賦形剤を予備混合した後に目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を配合することにより調製できる。本発明の組成物を更に安定化させるために添加してよい何れかの追加的な賦形剤は、本明細書に記載した新しい組成物を得るために使用されるものとしての緩衝剤と更に組み合わせられる一次的な等張性付与および安定化剤、即ち塩酸アルギニンの安定化作用に悪影響を与えてはならない。概ね等張性及び目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の増大した安定性を達成するための塩酸アルギニンの添加の後、液体組成物のｐＨを、緩衝剤を用いながら、好ましくは本明細書に開示した範囲内に、より好ましくは目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体に対して最適なｐＨに、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２の場合は約ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０、好ましくは約ｐＨ５．５に調節する。ｐＨは組成物への拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の添加の後に調節できるが、このポリペプチドの添加より前に調節するほうがポリペプチドの変性の危険性を低減できることから好ましい。次に適切な機械的装置を用いて成分の適切な混合を達成する。
【００４９】
即ち本発明は液体医薬組成物中の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの安定性を増大させるための方法を提供する。方法は約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０のｐＨに医薬組成物を維持する緩衝剤及び組成物をほぼ等張性とするために十分な量の塩酸アルギニンと拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを組み合わせることを包含する。一部の実施形態においては、緩衝材はクエン酸塩／クエン酸緩衝液であり、緩衝材の濃度は約５ｍＭ〜約５０ｍＭであり、塩酸アルギニンの量は、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ塩酸アルギニンの組成物内のこの等張性付与剤の濃度をもたらす。他の実施形態においては、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９抗体又はその抗原結合フラグメントであり；緩衝剤は約５ｍＭ〜約２５ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤であり；組成物中の塩酸アルギニンの濃度は約１５０ｍＭであり、組成物は約５．０、約５．５、約６．０又は約６．５のｐＨを有する。
【００５０】
目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えば拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体、又はその抗原結合フラグメントを含む安定化された液体医薬組成物は単位剤型として製剤しなければならず、、溶液、懸濁液又は乳液のような注射可能、又は注入可能な形態であってよい。前述の通り、それを凍結保存するか、又は経口又は非経腸の投与経路を含む種々の方法の何れかによる投与の前に液体の溶液、懸濁液又は乳液に再構成することができる凍結乾燥粉末のような乾燥形態に調製することができる。好ましくは、後述する通り、本発明の方法に従って達成される増大した保存安定性を活用するためには液体製剤として保存する。安定化された医薬組成物は好ましくは膜濾過により滅菌し、密封バイアル又はアンプルのような単位用量又は多用量の容器中に保存する。当該分野で一般的に知られている医薬組成物を製剤するための別の方法も、それが本明細書において上記開示した好ましい安定化及び緩衝剤の有益な作用に悪影響を及ぼさない限り、本明細書に開示した液体医薬組成物の保存安定性を更に増大させるために使用してよい。製薬上許容しうる担体、安定化剤等の形成及び選択の詳細な考察は、参照として本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）（第１８版；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）に記載されている。
【００５１】
この態様において、本発明は、本発明の安定な液体拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物を保持する容器を含み、場合によりその使用に関する説明書を含む調製物品を提供する。適当な容器は、例えばバイアル、ビン及びシリンジを包含する。容器は種々の材料、例えばプラスチック又はガラスから形成してよい。１つの実施形態において、容器は３〜５０ｃｃの単回使用のガラスバイアルである。或いは、即時使用可能型の製剤とするには、容器は例えば３〜１００ｃｃのガラスバイアルであってよい。容器は製剤を保持しており、容器上、又は容器に伴ったラベルには使用方法を記載してよい。調製物品は更に商業的及び使用者側の見地から望ましい他の材料、例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針類、シリンジ、及びパッケージインサートを使用方法説明書とともに包含してよい。
【００５２】
本発明の医薬組成物中の抗ＣＤ４０抗体
本発明の医薬組成物は抗ＣＤ４０抗体、特にＣＤ４０受容体をターゲティングし、ＡＤＣＣを調節し、ＣＤ４０シグナリング、特にＣＤ４０のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）との相互作用又は両方により媒介されるＣＤ４０シグナリング経路に干渉する拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」又は「ＣＤ４０」とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーに属する膜貫通糖タンパク質を意図している（例えば５，６７４，４９２及び４，７０８，８７１；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等（１９８９）ＥＭＢＯ８：１４０３；Ｃｌａｒｋ（１９９０）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ３６：３３；Ｂａｒｃｌａｙ  等（１９９７）Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ（第２版；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を参照できる）。この遺伝子のオルタナティブスプライシング転写物変異体によりコードされているヒトＣＤ４０の２つのアイソフォームが発見されている。第１のアイソフォーム（「長鎖アイソフォーム」又は「アイソフォーム１」としても知られている）は、最初の１９残基により示されるシグナル配列を有する２７７アミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号１１（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ６０５９２及びＮＭ＿００１２５０参照）によりコードされる配列番号１２（最初はゲンバンクアクセッション番号ＣＡＡ４３０４５として報告され、ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿００１２４１においてアイソフォーム１として識別されている））として発現される。第２のアイソフォーム（「短鎖アイソフォーム」又は「アイソフォーム２」としても知られている）は、最初の１９残基により示されるシグナル配列も有する２０３アミノ酸前駆体ポリペプチド（配列番号９（ゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿１５２８５４）によりコードされる配列番号１０（ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６９０５９３））として発現される。ヒトＣＤ４０のこれらの２つのアイソフォームの前駆体ポリペプチドはそれらの最初の１６５残基を共有している（即ち配列番号１０及び配列番号１２の残基１〜１６５）。短鎖アイソフォームの前駆体ポリペプチド（配列番号１０に示す）は翻訳のフレームシフトをもたらすコーディングセグメントを欠いている転写物変異体（配列番号９）によりコードされており；結果として生じるＣＤ４０アイソフォームはより短く、ＣＤ４０の長鎖アイソフォームに含有されるもの（配列番号１２の残基１６６〜２７７に示されるＣ末端）とは異なるＣ末端（配列番号１０の残基１６６〜２０３）を含有している。本発明の目的のためには、「ＣＤ４０抗原」、「ＣＤ４０細胞表面抗原」、「ＣＤ４０受容体」又は「ＣＤ４０」という用語はＣＤ４０の短鎖及び長鎖アイソフォームの両方を包含する。
【００５３】
ＣＤ４０抗原は本明細書に記載する通り種々の細胞片の表面上に表示表示される。「表面上に表示される」及び「表面上に発現される」とは、ＣＤ４０抗原の全て又は一部分が細胞の外部に曝露されることを意図している。表示又は発現されたＣＤ４０抗原は完全又は部分的にグリコシル化されることができる。
【００５４】
「アゴニスト活性」とは、物質がアゴニストとして機能することを意図している。アゴニストは細胞上の受容体と組み合わさって、受容体の天然のリガンドにより開始されるもｌのと同様か同じである反応又は活性を開始させる。ＣＤ４０のアゴニストは以下の応答、即ち限定しないが、Ｂ細胞メモリー形成、アイソタイプ切り替え、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーション、及びＩＬ−８、ＩＬ−１２及びＴＮＦのようなプロ炎症性サイトカインの分泌の何れか、又は全てを誘導する。「拮抗剤活性」とは、物質が拮抗剤として機能することを意図している。ＣＤ４０の拮抗剤はＣＤ４０受容体のアゴニストリガンド、特にＣＤ４０Ｌへの結合により誘導される応答の何れかの誘導を防止又は低減する。拮抗剤はアゴニスト結合への応答の何れか１つ以上の誘導を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、最も好ましくは９０％、９５％、９９％、又は１００％低減してよい。抗ＣＤ４０治療薬、例えば抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０リガンド結合特異性及び拮抗剤活性を測定するための方法は当該分野で知られており、限定しないが、結合試験、Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングするための試験、Ｂ細胞増殖試験、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖試験、抗体生産に関するＴ細胞ヘルパー試験、Ｂ細胞増殖試験の同時刺激、及びＢ細胞活性化まかのアップレギュレーションに関する試験を包含する。例えば参照として本明細書に組み込まれるＷＯ００／７５３４８及び米国特許６，０８７，３２９に開示されている試験を参照できる。更に又、仮出願である表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日及び２００４年４月２７日のもの、及び、譲渡された各々の米国特許出願６０／５１７，３３７（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、６０／５２５，５７９（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、及び６０／５６５，７１０（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））、同様に、表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００４年１１月４日、ＷＯ２００５／０４４８５４として公開されたものを参照でき；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。
【００５５】
「有意な」アゴニスト活性とは、Ｂ細胞応答の試験において測定した場合に、中立的な物質又は陰性対照により誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％高値であるアゴニスト活性を意図している。好ましくは「有意な」アゴニスト活性はＢ細胞応答の試験において測定した場合に、中程度の物質又は陰性対照により誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも２倍高値、又は少なくとも３倍高値であるアゴニスト活性である。即ち、例えば、目的のＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合、「有意な」アゴニスト活性は、中立的な物質又は陰性対照により誘導されるＢ細胞増殖のレベルよりも少なくとも２倍高値、又は少なくとも３倍高値であるＢ細胞増殖のレベルの誘導となる。１つの実施形態において、ＣＤ４０に結合しない非特異的免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１が陰性対照として機能する。「有意なアゴニスト活性を有さない」物質は、Ｂ細胞応答の試験において測定した場合に、中立的な物質又は陰性対照により誘導されるアゴニスト活性よりも約２５％高値を超えない、好ましくは中立的な物質又は陰性対照により誘導されるアゴニスト活性よりも約２０％高値、１５％高値、１０％高値、５％高値、１％高値、０．５％高値を超えない、更には約０．１％高値を超えないアゴニスト活性を示すことになる。
【００５６】
本発明の一部の実施形態においては、本発明の安定な液体医薬組成物は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む。そのような抗体はヒト細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合に上記した通り有意なアゴニスト活性を有さない。本発明の１つの実施形態において、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は１つの細胞応答において有意なアゴニスト活性を有さない。本発明の別の実施形態において、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は１つより多い細胞応答の試験において有意なアゴニスト活性を有さない（例えば増殖及び分化、又は増殖、分化、及びＢ細胞の場合は、抗体生産）。本発明の一部の実施形態においては、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は、例えば後述する通り、完全なヒトモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９又はその抗原結合フラグメントである。
【００５７】
当該分野で知られた試験のいずれかを用いて、抗ＣＤ４０抗体がＢ細胞応答１つ以上の拮抗剤として機能するかどうか調べることができる。一部の実施形態においては、抗ＣＤ４０抗体はＢ細胞増殖、Ｂ細胞分化、抗体生産、細胞間接着、Ｂ細胞メモリー形成、アイソタイプ切り替え、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレーション、及びＩＬ−８、ＩＬ−１２及びＴＮＦのようなプロ炎症性サイトカインの分泌よりなる群から選択されるＢ細胞応答少なくとも１つの拮抗剤として機能する。特に興味深いものはヒトＢ細胞の表面上のヒトＣＤ４０抗原に結合した場合にＢ細胞増殖に関して有意なアゴニスト活性を有さない拮抗剤抗ＣＤ４０抗体である。
【００５８】
１つのそのような実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は後述する実施例４において記載するもののようなＢ細胞増殖試験において測定した場合にＢ細胞の増殖の拮抗剤であり、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は中立的な物質又は陰性対照により誘導されるＢ細胞増殖よりも約２５％高値を超えない、好ましくは中立的な物質又は陰性対照により誘導されるＢ細胞増殖よりも約２０％高値、１５％高値、１０％高値、５％高値、１％高値、０．５％高値を超えない、更には約０．１％高値を超えないレベルにおいてＢ細胞増殖を刺激する。
【００５９】
他の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は後述する実施例４において記載するもののようなＢ細胞増殖試験において測定した場合に別の抗ＣＤ４０抗体、例えばＳ２Ｃ６抗ＣＤ４０抗体により誘導されるＢ細胞の増殖の拮抗剤であり、、その別の抗ＣＤ４０抗体により拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の存在下に刺激されたＢ細胞増殖のレベルは、別の抗ＣＤ４０抗体により拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の非存在下に誘導されたＢ細胞増殖の約２５％を超えず（即ち少なくとも７５％抑制）、好ましくは別の抗ＣＤ４０抗体により拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の非存在下に誘導されたＢ細胞増殖の約２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％を超えず、更には約０．１％を超えない。
【００６０】
更に別の実施形態においては、抗ＣＤ４０抗体は後述する実施例４において記載するＢ細胞活性化試験において測定した場合に細胞系統ＥＬ４Ｂ５により誘導されるＢ細胞増殖の拮抗剤であり、、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の存在下にＥＬ４Ｂ５細胞系統により刺激されたＢ細胞増殖のレベルは、この細胞系統により拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の非存在下に誘導されたＢ細胞増殖の約２５％を超えず（即ち少なくとも７５％抑制）、好ましくはこの細胞系統により拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の非存在下に誘導されたＢ細胞増殖の約２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％を超えず、更には約０．１％を超えない。
【００６１】
更に別の実施形態においては、抗ＣＤ４０抗体は後述する実施例４において記載するＢ細胞による抗体生産に関するヒトＴ細胞ヘルパー試験において測定した場合にヒトＢ細胞によるヒトＴ細胞誘導抗体生産の拮抗剤である。この態様において、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の存在下にＴ細胞により刺激されたＢ細胞によるＩｇＧ抗体生産、ＩｇＭ抗体生産、又はＩｇＧ及びＩｇＭ両方の抗体生産のレベルは、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の非存在下にＴ細胞により刺激されたＢ細胞によるそれぞれの抗体の生産の約５０％を超えず（即ち少なくとも７５％抑制）、好ましくは拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の非存在下にＴ細胞により刺激されたＢ細胞によるそれぞれの抗体の生産の約２５％、約２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％を超えず、更には約０．１％を超えない。
【００６２】
「ＣＤ４０リガンド」とは、ＣＤ４０シグナリング経路１つ以上に結合して活性化することができる何れかのペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を意図している。即ち「ＣＤ４０リガンド」とは、限定しないが、完全長のＣＤ４０リガンドタンパク質、及びＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナリングに結合して刺激する機能を実施するために十分な活性を保持しているその変異体及びフラグメントを包含する。ネイティブのＣＤ４０リガンド、例えばヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ１５４としても知られている）に対する修飾は、限定しないが、置換、欠失、トランケーション、伸長、融合タンパク質、フラグメント、ペプチドミメティック等を包含する。本発明の一部の実施形態においては拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の生物学的活性を評価するための試験は、ＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナリングを刺激するための可溶性ＣＤ４０Ｌ、例えば可溶性組み換えヒトＣＤ４０Ｌ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）の使用を包含する。
【００６３】
「ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリング」とは、ＣＤ４０リガンドとの細胞表面受容体ＣＤ４０の相互作用から生じる生物学的活性の何れかを意図している。ＣＤ４０シグナリングの例はＣＤ４０発現細胞の増殖及び生存、及びＣＤ４０発現細胞内のＣＤ４０シグナリング経路１つ以上の刺激をもたらすシグナルである。ＣＤ４０「シグナリング経路」又は「シグナルトランスダクション経路」とは、ＣＤ４０受容体のＣＤ４０リガンド、例えばＣＤ４０Ｌとの相互作用から生じ、、シグナル経路を通過して伝達される場合に、シグナリングカスケードにおける下流分子１つ以上の活性化をもたらすシグナルを発生する少なくとも１つの生化学的反応又は生化学的反応のグループを意味することを意図している。シグナルトランスダクション経路には、細胞の原形質膜を通過する、シグナルトランスダクション分子のシリーズ１つ以上を通過する、細胞の細胞質を通過する、一部の場合においては、細胞の核に至る、細胞表面ＣＤ４０受容体からのシグナルの伝達をもたらす多くのシグナルトランスダクション分子が関与している。ＣＤ４０シグナルトランスダクション経路は例えば、ＡＫＴの活性化をもたらし、究極的にはＮＦ−κＢシグナリング経路を介したＮＦ−κＢの活性化をもたらすＡＫＴシグナリング経路；及びそれぞれＥＲＫ及びｐ３８の活性化をもたらすＭＥＫ／ＥＲＫシグナリング経路及びＭＥＫ／ｐ３８シグナリング経路を包含する、有糸分裂促進物質活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナリング経路を包含する。これらのシグナリング経路の活性化及びブロッキングの間の均衡が細胞の生存又はアポトーシスの何れかに好都合なものとなる。
【００６４】
一部の実施形態においては、本発明の安定な医薬組成物はＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリングをブロックする拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む。ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリングをブロックする場合の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の役割のより詳細な説明については、例えば、仮出願である表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日及び２００４年４月２７日のもの、及び、譲渡された各々の米国特許出願６０／５１７，３３７（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、６０／５２５，５７９（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、及び６０／５６５，７１０（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））、同様に、表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００４年１１月４日、ＷＯ２００５／０４４８５４として公開されたものを参照することができ；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。更に又、仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，２８５（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００２（０３５７８４／３０４３１２））、及び相当する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９４１４（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００３（０３５７８４／３１１６１１））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１４３として公開；及び仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，３３６（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００２（０３５７８４／３０４３１１））、及び相当する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９３２５（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００３（０３５７８４／３１１６０８））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１１７として公開されたものも参照でき；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。
【００６５】
本発明の安定な液体医薬組成物は抗ＣＤ４０抗体、特に、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体及び／又はその抗原結合フラグメントを含む。以下の用語及び定義をそのような抗体に適用する。
【００６６】
「抗体」及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。用語は同義語的に使用される。一部の場合においては、免疫グロブリンの抗原特異性は既知であってよい。
【００６７】
「抗体」という用語は広義の意味において使用され、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合できる抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー、抗体キメラ、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体等）、及び上記を含む組み換えペプチドを包含する。
【００６８】
「モノクローナル抗体」及び「ｍＡｂ」という用語は本明細書においては、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体を指し、即ち、集団を含む個々の抗体は、少量において存在してよい可能な天然に存在する突然変異を除き同一である。
【００６９】
「ネイティブの抗体」及び「ネイティブの免疫グロブリン」とは、通常は２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖（）を有する約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合のジスルフィド結合により重鎖に連結されており、ジスルフィド連結部の数は種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖内で変動する。各重鎖及び軽鎖は又、規則的に間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端において可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一端において可変ドメイン（ＶＬ）及びそのもう一方の端部において定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインとアラインされており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインされている。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。
【００７０】
「可変」という用語は可変ドメインの特定の部分が抗体の間で配列において広範に異なっているという事実を指す。可変領域は抗原結合特異性を付与する。しかしながら、変動性は抗体の可変ドメイン全体に渡って均一に分布しているわけではない。それは、共に軽鎖及び重鎖の可変ドメインにある相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）領域に収容されている。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、βプリーツ型シート構造に連結している、一部の場合にはその部分を形成しているループを形成する３つのＣＤＲにより連結されたβプリーツ型シート配置を大半が採用しているＦＲ領域４つを含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により近接して共に保持されており、別の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ等（１９９１）ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐ．６４７−６６９参照）。定常ドメインは抗原への抗体の結合には直接関与していないが、種々のエフェクター機能、例えばＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性細胞性細胞毒性における抗体の参加、補体依存性細胞毒性の開始、及び肥満細胞脱顆粒を示す。
【００７１】
「超可変領域」という用語は本明細書においては、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（即ち軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、及び、重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ等（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）及び／又は「超可変領域」に由来する残基（即ち軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）、及び重鎖可変ドメインの（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｌｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク」即ち「ＦＲ」残基は本明細書において想定する場合は超可変領域以外の可変ドメイン残基である。
【００７２】
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の一部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント；ダイアボディー；線状抗体（Ｚａｐａｔａ等（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。抗体のパパイン消化は各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメント、及び、自身の名称が容易に結晶化する自身の能力を反映している残余の「Ｆｃ」フラグメントを生じさせる。ペプシン処理は２つの抗原複合化部位を有し、なお抗原に交差結合することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせる。
【００７３】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は堅固な非共有結合性の会合における１重鎖及び１軽鎖の可変ドメインの２量体より成る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ２量体の表面上に抗原結合部位を定義するのはこの配置においてである。総合すれば、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与している。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的なＣＤＲを僅か３つしか含まないＦｃの半分）であっても、完全な結合部位よりは低親和性ではあるが、なお抗原を認識して結合する能力を有している。
【００７４】
Ｆａｂフラグメントは又、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からのシステイン１個以上を包含する重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数残基が付加していることにより、Ｆａｂ’フラグメントとは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは遊離のチオール基を定常ドメインのシステイン残基が担持しているＦａｂ’に対する本明細書における標記である。Ｆａｂ’フラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖ジスルフィド架橋を還元することにより生成される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【００７５】
何れかの脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」はその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と称される２つの明確に異なった型の一方に割りつけられる。
【００７６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割りつけることができる。ヒト免疫グロブリンには５つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらの数種はさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分割される。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインはアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューとそれぞれ称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られている。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞毒性）活性を有する。
【００７７】
「標識」という単語は、本明細書においては、「標識された」抗体を形成するように抗体に直接又は間接的に共役されている検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能であってよく（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）、或いは、酵素標識の場合は、検出可能な化合物又は組成物の化学的改変を触媒してよい。
【００７８】
「宿主細胞」とは、本明細書においては、組み換えベクター又は他の転移ポリヌクレオチドに対するレシピエントなることができるか、なっており、トランスフェクトされている元の細胞の子孫を包含することができる、単細胞の実体として培養された微生物又は真核生物の細胞又は細胞系統を指す。当然ながら単細胞の子孫は、天然、偶然又は意図的な突然変異により、元の親と形態学的又はゲノム又は総ＤＮＡ相補体において完全同一ではなくなっていてもよい。
【００７９】
「ヒトエフェクター細胞」ＦｃＲ１つ以上を発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好酸球、及び好中球を包含し、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。ＡＤＣＣ活性を有する抗体は典型的にはＩｇＧ又はＩｇＧ３アイソタイプのものである。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３を単離することに加えて、このようなＡＤＣＣ媒介抗体は非ＡＤＣＣ抗体由来の可変領域又は可変領域フラグメントをＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ定常領域に操作することによっても作成できる。
【００８０】
「Ｆｃ受容体」即ち「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために使用する。好ましいＦｃＲはネイティブ配列のヒトＦｃＲである。更に又、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体、及びこれらの受容体の対立遺伝子変異体及びオルタナティブスプライシング型を包含する。ＦｃγＲＩＩ受容体は、
ＦｃγＲＩＩＡ（活性化受容体）及びＦｃγＲＩＩＢ（抑制受容体）を包含し、これらはその細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有している。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有している（Ｄａｅｒｏｎ（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４参照）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ等（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４；ａｎｄ  ｄｅ  Ｈａａｓ等（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−３４１において考察されている。他のＦｃＲ、例えば将来発見されるものも本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。用語は又、母動物ＩｇＧの胎仔への転移を担っている生仔受容体ＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒ等（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７  ａｎｄ  Ｋｉｍ等（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００８１】
ヒト抗体を作成するための多くの方法が存在する。例えば、分泌細胞はエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）による感染により不朽化することができる。しかしながら、ＥＢＶ感染細胞はクローニングが困難であり、通常は比較的低収率の免疫グロブリンしか生産しない（Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １００：５−４０）。将来において、ヒトＢ細胞の不朽化が形質転換遺伝子の所定の組み合わせの導入により達成される可能性がある。そのような可能性はＳＶ４０大型癌タンパク質及びＨ−ｒａｓの癌遺伝子対立遺伝子を伴ったテロメラーゼ触媒サブユニットの発現が正常ヒト上皮及び線維芽細胞の腫瘍形成性変換をもたらしたことが最近明らかになったことにより注目されている（Ｈａｈｎ等（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４００：４６４−４６８）。現在では、内因性免疫グロブリン生産の非存在下におけるヒト抗体のレパートリーの生産が免疫化により可能となるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作成することができる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ等（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｔｏｍｉｚｕｋａ等（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７；Ｌｉｔｔｌｅ等（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０において考察）。例えば、キメラ及び生殖細胞系統の突然変異体であるマウスにおける抗体重鎖結合部領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が内因性抗体生産の完全な抑制をもたらすことが報告されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５）。ヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖細胞系統突然変異体マウスにおける転移は抗原攻撃時のヒト抗体の生産をもたらす（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８）。Ｍｅｎｄｅｚ等（１９９７）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６）は抗原攻撃時に高親和性の完全ヒト抗体を形成するトランスジェニックマウスの系統を作成している。これは巨大塩基ヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子座の欠失保有マウスへの生殖細胞系統取り込みを上記した通り内因性ＪＨセグメント内へに行うことにより達成されている。これらのマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＩＩ技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））は約６６個のＶＨ遺伝子、完全なＤＨ及びＪＨ領域、及び３個の異なる定常領域を含有する１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を保有しており、更に、３２個のＶκ遺伝子、Ｊκ遺伝子、及びＣκ遺伝子を含有する８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を保有している、これらのマウスにおいて生産される抗体は遺伝子の再配列、組み立て及びレパートリーを包含する全ての点において���ヒトにおいて観察されるものに極めて近似している。ヒト抗体はネズミ遺伝子座内の遺伝子再配列を防止する内因性セグメントの欠失のために、内因性抗体全体に渡って優先的に発現される。このようなマウスを特定の意図する抗原により免疫化してよい。
【００８２】
そのような免疫化された動物に由来する血清は、初期抗原に対する抗体の反応性に関してスクリーニングしてよい。リンパ球はリンパ節又は脾細胞から単離してよく、ＣＤ１３８陰性及びＣＤ１９陽性細胞を得るための選択によりＢ細胞を更に選択してよい。１つの特徴において、そのようなＢ細胞培養物（ＢＣＣ）を更に骨髄腫細胞に融合することにより、上記した通りハイブリドーマを作成してよい。
【００８３】
別の特長において、そのようなＢ細胞培養物を更にスクリーニングすることにより好ましくは初期抗原に対する反応性のあるものを得てよい。そのようなスクリーニングは標的／抗原タンパク質を用いた酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、目的の抗原に結合する既知抗体を用いた競合試験、及び標的抗原を発現する一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ又は他の細胞へのインビトロの結合を包含する。
【００８４】
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は当該分野で知られている。例えば全て参照として本明細書に組み込まれるＭｃＭｉｃｈａｅｌ，ｅｄ．（１９８７；１９８９）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ＩＶ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許５，６７４，４９２；５，８７４，０８２；５，６７７，１６５；６，０５６，９５９；ＷＯ００／６３３９５；国際公開ＷＯ０２／２８９０５及びＷＯ０２／２８９０４；Ｇｏｒｄｏｎ等（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５；Ｖａｌｌｅ等（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３；Ｃｌａｒｋ等（１９８６）ＰＮＡＳ  ８３：４４９４；Ｐａｕｌｉｅ等（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０；Ｇｏｒｄｏｎ等（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５；Ｊａｂａｒａ等（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１；Ｚｈａｎｇ等（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６；Ｇａｓｃａｎ等（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ等（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ３：８；ａｎｄ  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７０におけるＢ細胞抗原に関する項目を参照できる。他の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は限定しないが、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、例えばネズミ抗ＣＤ４０抗体ＳＧＮ−１４（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２２５−３１）のヒト化型であるＳＧＮ−４０（Ｔａｉ等（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２８４６−５２；米国特許６，８３８，２６１）、及び参照として全てが本明細書に組み込まれる米国出願２００４／１２０９４８に開示されているアゴニスト及び拮抗剤を包含する。
【００８５】
本発明において特に有利なものは、ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリングをブロックする作用を有し、、例えば後述するＣＨＩＲ−１２．１２抗体のようにＡＤＣＣも調節してよい拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００８６】
本発明の安定な液体医薬組成物中で使用するための拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はヒト細胞表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合できるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを包含する。一部の実施形態においては、安定な液体医薬組成物中の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はＣＤ４０細胞表面抗原に対して強力な単一部位結合親和性を示す。そのようなモノクローナル抗体はＢｉａｃｏｒｅＴＭのような標準的な試験法を用いて測定した場合、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも３ｘ１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ、より好ましくは１０−８Ｍ〜１０−１２ＭのＣＤ４０に対する解離平衡定数（ＫＤ）を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は当該分野で知られており、詳細は「ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｈａｎｄｂｏｏｋ」に記載されている。ＷＯ０１／２７１６０に記載されている方法も結合親和性を調節するために使用できる。
【００８７】
特に有利なものは、上記定義した通り有意なアゴニスト活性を有さないが、ヒト細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合、特に新生物性のヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合に拮抗剤活性を示す拮抗剤抗ＣＤ４０抗体である。本発明の１つの実施形態においては、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は１つのＢ細胞応答において有意なアゴニスト活性を有さない。本発明の別の実施形態においては、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は１より多いＢ細胞応答（例えば増殖及び分化、又は増殖、分化及び抗体生産）の試験において有意なアゴニスト活性を有さない。適当なモノクローナルの抗ＣＤ４０抗体はひと定常領域を有し；好ましくはそれらはまた完全又は部分的にヒト化されたフレームワーク領域を有し；最も好ましくは完全ヒト抗体又はその抗原結合フラグメントである。そのようなモノクローナル抗体の例はＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２として本明細書に標記する抗体である。
【００８８】
即ち、一部の実施形態においては、本発明の安定な液体医薬組成物中に存在する拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は、モノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２である。ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２抗体はハイブリドーマ細胞株１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書においては細胞株５．９と称する）及び１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書においては細胞株１２．１２と称する）から生産されるＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である。これらの細胞株はトＩｇＧ１重鎖遺伝子座及びヒトκ鎖遺伝子座を含有する免疫化された異型マウスに由来する脾細胞を用いて作成されている（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＩＩ技術、Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。脾細胞をマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０細胞（Ｓｉｅｒｒａ  ＢｉｏＳｏｕｕｒｃｅ）に融合させた。得られたハイブリドーマを数回サブクローニングし、安定なモノクローナル細胞株５．９及び１２．１２を作成した。本発明の他の抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座に関してトランスジェニックのマウスを用いながら同様に、又は当該分野で知られた、及び／又は本明細書に記載した他の方法により作成してよい。
【００８９】
ＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列、及びＣＨＩＲ−５．９抗体の可変領域のアミノ酸配列は本明細書に開示する通りである。より詳細には、ｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２に関する軽鎖及び重鎖に関するリーダー、可変及び定常領域に関するアミノ酸配列は、配列番号２（ｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖に関する完全な配列）、配列番号４（ｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖に関する完全な配列）、及び配列番号５（配列番号４に示されるｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖の変異体に関する完全な配列；ここで変異体は配列番号４の１５３位のアラニン残基に対してセリン置換を含む）に示される。ｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２に関する軽鎖及び重鎖に関するヌクレオチド配列は配列番号１（ｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の軽鎖に関するコーディング配列）及び配列番号３（ｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の重鎖に関するコーディング配列）に示される。ｍＡｂＣＨＩＲ−５．９に関する軽鎖及び重鎖に関するリーダー、可変及び定常領域に関するアミノ酸配列は、配列番号６（ｍＡｂＣＨＩＲ−５．９の軽鎖に関する完全な配列）、配列番号７（ｍＡｂＣＨＩＲ−５．９の重鎖に関する完全な配列）、及び配列番号８（配列番号７に示されるｍＡｂＣＨＩＲ−５．９の重鎖の変異体に関する完全な配列；ここで変異体は配列番号７の１５８位のアラニン残基に対してセリン置換を含む）に示される。更に又、ＣＨＩＲ−５．９（マウスハイブリドーマ系統１３１．２Ｆ８．５．９（ＣＭＣＣ＃１２０４７）及びＣＨＩＲ−１２．１２（マウスハイブリドーマ系統１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（ＣＭＣＣ＃１２０５６）抗体を発現するハイブリドーマはそれぞれＰＴＡ−５５４２及びＰＴＡ−５５４３の特許寄託記号とともに２００３年９月１７日にＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９（ＵＳＡ））に寄託されている。
【００９０】
拮抗剤活性に加えて、本発明の安定な液体医薬組成物中で使用するための抗ＣＤ４０抗体は腫瘍細胞に対抗する作用の別の機序を有することができる。例えば、ネイティブのＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２抗体はＡＤＣＣ活性を有する。或いは、ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２抗体の可変領域をＡＤＣＣ活性を有する別の抗体アイソタイプ上で発現させることができる。更に又、後に記載する通り、ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２のネイティブ型、組み換え型又は抗原結合フラグメントを細胞毒、治療薬又は放射活性の金属イオン又は放射性同位体に共役することも可能である。
【００９１】
ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体はＥＬＩＳＡ型の試験において可溶性ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０リガンドの細胞表面寄与への結合を防止し、予め結合しているＣＤ４０リガンドを置き換えることがフローサイトメトリー試験により明らかにされている。抗体ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２はＣＤ４０への結合に関して相互に競合するが、共に参照として全てが本明細書に組み込まれる米国仮出願である６０／２３７，５５６、表題「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、出願日２０００年１０月２日、及び、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０８５７、同様の表題「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、出願日２００１年１０月２日（代理人案件番号ＰＰ１６０９２．００３）に記載されている抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である１５Ｂ８とは競合しない。正常ヒト対象由来のＢ細胞の増殖に対する作用に関してインビトロで試験した場合、ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体として作用する。更に又、ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２は正常対象由来のヒトリンパ球の強力な増殖を誘導しない。これらの抗体は抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によりＣＤ４０発現標的細胞を殺傷することができる。ＢｉａｃｏｒｅＴＭ試験で測定した場合、ＣＨＩＲ−５．９のヒトＣＤ４０に対する結合親和性は１．２ｘ１０−８Ｍであり、ＣＨＩＲ−１２．１２の結合親和性は５ｘ１０−１０Ｍであった。
【００９２】
上記したモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２の結合特性を共有する他の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は、限定しないが、以下のもの、即ち（１）それぞれＰＴＡ−５５４２及びＰＴＡ−５５４３の特許寄託記号とともにＡＴＣＣに寄託された１３１．２Ｆ８．５．９（本明細書においては細胞株５．９と称する）及び１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（本明細書においては細胞株１２．１２と称する）と命名されたハイブリドーマ細胞株から生産されるモノクローナル抗体；（２）配列番号２に示される配列、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号２及び配列番号４に示される配列の双方、及び配列番号２及び配列番号５に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（３）配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号８に示される配列、配列番号６及び配列番号７に示される配列の双方、及び配列番号６及び配列番号８に示される配列の双方よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；（４）配列番号１に示すヌクレオチド配列、配列番号３に示すヌクレオチド配列、及び配列番号１及び配列番号３のに示す配列の両方よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；（５）ハイブリドーマ細胞株５．９又はハイブリドーマ細胞株１２．１２により生産されるモノクローナル抗体を結合することが出来るエピトープに結合するモノクローナル抗体；（６）配列番号１０又は配列番号１２に示すアミノ酸配列の残基８２〜８７を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体；（７）競合的結合試験においてモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２と競合するモノクローナル抗体；（８）ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９モノクローナル抗体又は上記項目（１）〜（７）における上記モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであるモノクローナル抗体、ここでフラグメントはヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する能力を保持しているもの、を包含する。
【００９３】
当業者の知る通り、本明細書に記載した抗体及びこれらの抗体の抗原結合フラグメントは、当該分野で周知であり、本明細書において後述する方法を用いて組み換えにより作成された抗体及びその抗原結合フラグメントを包含し、、例えば組み換えにより作成されたモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２を包含する。
【００９４】
追加的な拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はそれぞれＡＴＣＣ水性セッション番号ＨＢ１１３３９、ＨＢ１２０２４及びＨＢ１１３４０を有するハイブリドーマにより分泌される５Ｄ１２、３Ａ８及び３Ｃ６と称されるモノクローナル抗体を包含する。例えば参照として全てが本明細書に組み込まれる米国特許６，３１５，９９８を参照できる。
【００９５】
他の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は当該分野で知られている。例えば参照として全てが本明細書に組み込まれる米国特許出願２００２０１４２３５８及び２００３００５９４２７に開示されているＦ４−４６５と命名されたハイブリドーマにより生産されるヒト抗ＣＤ４０抗体を参照できる。Ｆ４−４６５はＨＡＣマウスから得られており（Ｋｕｒｏｉｗａ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：１０８６（２０００））、このため、ヒトラムダ軽鎖を発現する。
【００９６】
本発明の医薬組成物のための抗体の製造
本発明の医薬組成物において使用するための抗体、例えば本明細書に開示した拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は当該分野で知られた何れかの抗体製造方法を用いて製造できる。即ち、ポリクローナル血清は従来の方法により製造してよい。一般的に、目的の抗原、ＣＤ４０抗原を含有する溶液を先ず使用して適当な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、又はヤギを免疫化する。ウサギ又はヤギは入手できる血清の量及び標識された抗ウサギ及び抗ヤギ抗体の入手し易さのため、ポリクローナル血清の製造のために好ましい。
【００９７】
ポリクローナル血清はトランスジェニック動物、好ましくはヒト免疫グロブリン遺伝子座を担持したマウスにおいて製造できる。好ましい実施形態においては、目的のタンパク質、例えばＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞を免疫原として使用する。免疫化は又、食塩水中、好ましくはフロイントの完全アジュバントのようなアジュバント中に抗原含有溶液を混合又は乳化すること、混合物又は乳液を非経腸的（一般的には皮下又は筋肉内）に注射することにより行うこともできる。５０〜２００μｇ／注射の用量が典型的には十分である。免疫化は一般的に２〜６週間後に食塩水中のタンパク質の注射１回以上により、好ましくはフロイントの不完全アジュバントを用いながら、ブーストする。或いは、本発明の目的のためにはインビボの免疫化と同等とみなされる当該分野で知られたインビトロの免疫化により抗体を作成してもよい。ポリクローナル抗血清はガラス又はプラスチックの容器内に免疫化した動物を放血させること、血液を２５℃で１時間インキュベートすること、その後、４℃で２〜１８時間インキュベートすることにより得られる。血清は遠心分離（例えば１０００ｘｇ、１０分間）により回収される。放血当たり約２０〜５０ｍｌをウサギから得てよい。
【００９８】
Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の作製は参照として本明細書に組み込まれる米国特許６，００４，５５２に開示されている。慨すれば、ＣＤ４０の場合、ヒトＣＤ４０をコードする配列を転移ベクターを用いてバキュロウィルス中に組み換えた。プラスミドをＳｆ９細胞内に野生型バキュロウィルスＤＮＡと同時トランスフェクトした。組み換えバキュロウィルス感染Ｓｆ９細胞を識別し、クローン的に精製した。
【００９９】
好ましくは、抗体は本質的にモノクローナルである。「モノクローナル抗体」という用語は抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体を指し、即ち、集団を含む個々の抗体は、少量において存在してよい可能な天然に存在する突然変異を除き同一である。用語は抗体の種又は原料に関して限定されない。用語は完全な免疫グロブリン並びにフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び抗体の抗原結合機能を保持しているその他のものを包含する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位；例えば抗ＣＤ４０抗体の場合はＣＤ４０細胞表面抗原に対して指向されている。更に又、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向されていた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向される。「モノクローナル」という修飾語は抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、何れかの特定の方法による抗体の製造を必要とするものとはみなさない。例えば本発明により使用するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ等（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５により最初に報告されたハイブリドーマ法により製造してよく、又は、組み換えＤＮＡ方法により製造してもよい（例えば米国特許４，８１６，５６７参照）。「モノクローナル抗体」とは又、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８及びＭａｒｋｓ等（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；及び米国特許５，５１４，５４８に記載された手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
【０１００】
「エピトープ」とは、抗体が生産される対象となる、抗体が結合することになる抗原分子の部分を意図する。エピトープは線状のアミノ酸残基（即ちエピトープ内の残基が線形の状態で相互に逐次的に配置している）、非線状のアミノ酸残基（本明細書においては「非線状エピトープ」と称する；これらのエピトープは逐次的に配置していない）、又は線状及び非線状のアミノ酸残基の両方を含むことができる。
【０１０１】
モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ等（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９６の方法及びその変法を用いて調製できる。典型的には、マウスを抗原を含有する溶液で免疫化する。免疫化は、食塩水中、好ましくはフロイントの完全アジュバントのようなアジュバント中に抗原含有溶液を混合又は乳化すること、混合物又は乳液を非経腸的に注射することにより実施できる。当該分野で知られた何れかの免疫化方法を用いて本発明のモノクローナル抗体を得てよい。動物の免疫化の後、脾臓（及び場合により数個の大型のリンパ節）を摘出し、解離させて単細胞とする。脾細胞は目的の抗原でコーティングされたプレート又はウェルに細胞懸濁液を適用することによりスクリーニングしてよい。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現しているＢ細胞はプレートに結合し、洗浄除去されない。得られたＢ細胞、又は全ての解離した脾細胞を次に骨髄腫細胞と融合するように誘導してハイブリドーマを形成させ、選択培地中で培養する。得られた細胞を連続希釈によりプレーティングし、目的の抗原に特異的に結合する（そして未関連の抗原には結合しない）抗体の生産に関して試験する。選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分泌ハイブリドーマを次にインビトロ（例えば組織培養ビン又は中空糸反応器中）又はインビボ（マウス腹水中等）のいずれかで培養する。
【０１０２】
拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を組み換えＤＮＡ法により調製するべきである場合は、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の操作法を用いて容易に単離され、配列決定される（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。本明細書に記載するハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として機能する。単離後、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれを宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は免疫グロブリンタンパク質を別様には生産しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトすることにより組み換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を達成する。抗体をコードするＤＮＡの細菌内での組み換え発現に関する考察を記述したものはＳｋｅｒｒａ等（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６  ａｎｄ  Ｐｈｉｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１を包含する。或いは、参照として本明細書に組み込まれる米国特許５，５４５，４０３；５，５４５，４０５；ａｎｄ  ５，９９８，１４４に開示されている通り、ＣＨＯ細胞系統のような細胞系統内で生産できる。慨すれば、細胞系統をそれぞれ軽鎖及び重鎖を発現できるベクターでトランスフェクトする。異なるベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることにより、キメラ抗体を作成できる。他の利点は抗体の正確なグリコシル化である。
【０１０３】
一部の実施形態においては、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９抗体又はその抗原結合フラグメントは、マーカーとしてグルタミン合成酵素を使用するＧＳ遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を使用しながらＣＨＯ細胞中に生産させる。同様に、参照として全てが本明細書に組み込まれる米国特許５，１２２，４６４；５，５９１，６３９；５，６５８，７５９；５，７７０，３５９；５，８２７，７３９；５，８７９，９３６；５，８９１，６９３；及び５，９８１，２１６を参照できる。
【０１０４】
更に又、本発明の医薬組成物中で使用するための抗体は所望の結合特性を有するキメラ抗体であることができる。即ち、例えば、本発明の方法において使用するためのキメラ抗ＣＤ４０抗体は本明細書に記載するＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体の結合特性を有する。「キメラ」抗体とは、組み換えＤＮＡ手法を用いて最も好ましく誘導され、ヒト（免疫学的に「関連する」種、例えばチンバンジーを包含する）及び非ヒト成分の両方を含む抗体を意図している。即ち、キメラ抗体の定常領域は最も好ましくは天然のヒト抗体の定常領域と実質的に同一であり；キメラ抗体の可変領域は最も好ましくは非ヒト原料から誘導され、目的の抗原、即ちＣＤ４０抗原に対して所望の抗原特異性を有する。非ヒト原料はヒト抗原に対する抗体、又はヒトＣＤ４０抗原を含む物質を形成するために使用できる何れかの脊椎動物の原料であることができる。そのような非ヒト原料は、限定しないが、げっ歯類（例えばウサギ、ラット、マウス等；例えば参照として本明細書に組み込まれる米国特許４，８１６，５６７参照）、及び非ヒト霊長類（例えば旧世界サル、類人猿等；例えば参照として本明細書に組み込まれる米国特許５，７５０，１０５及び５，７５６，０６９参照）を包含する。本明細書においては、「免疫学的に活性な」という表現は例えばキメラ抗ＣＤ４０抗体に言及して使用する場合、ヒトＣＤ４０に結合するキメラ抗体を意味する。
【０１０５】
「ヒト化」とは、非ヒト免疫グロブリン配列から誘導された最小の配列を含有する抗体の形態を意図している。大部分においては、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、それにおいては、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域、即ちＣＤＲとしても知られている）に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類のような非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）に由来する残基により置き換えられている。「相補性決定基」という表現はネイティブの免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性及び特異性を共に定義するアミノ酸配列である。例えばＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照できる。「定常領域」という表現はエフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。ヒト疾患の治療における使用のための非免疫原性抗体を作成することを目的とした過去の研究において、マウスの定常領域をヒト定常領域で置換している。対象のヒト化抗体の定常領域はヒト免疫グロブリンから誘導されている。しかしながら、これらのヒト化抗体はなおヒトにおいて望ましくない、潜在的に危険な免疫応答を誘発しており、親和性の損失もあった。本発明の医薬組成物におけるヒト化抗体、例えばヒト化抗ＣＤ４０抗体は目的の親抗体、例えば本明細書に記載するＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体により示されるものと同様の結合特性を有している。
【０１０６】
ヒト化は本質的にＷｉｎｔｅｒ等の方法（Ｊｏｎｅｓ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って、げっ歯類又は突然変異体のげっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の相当する配列を置換することにより実施できる。更に又参照として本明細書に組み込まれる５，２２５，５３９；５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；５，８５９，２０５も参照できる。一部の例においてはヒト免疫グロブリンの可変領域１つ以上のフレームワーク領域内の残基が相当する非ヒト残基で置き換えられる（例えば米国特許５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；及び６，１８０，３７０参照）。更に又、ヒト抗体はレシピエント抗体又はＤＮＡ抗体の何れにも存在しない残基を含んでよい。これらの修飾は抗体の性能を更に調整するために行われる（例えば所望の親和性を得るため）。一般的にヒト化抗体は超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである可変ドメイン少なくとも１つ、典型的には２つの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は場合により免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことになる。更に詳細な説明は参照として本明細書に組み込まれるＪｏｎｅｓ等（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照できる。従って、このような「ヒト化」抗体は実質的には未損傷には至らないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の相当する配列により置換されている抗体を包含してよい。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部のＣＤＲ残基及び恐らくは一部のフレームワーク残基がげっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基で置換されたヒト抗体である。例えば米国特許５，２２５，５３９；５，５８５，０８９；５，６９３，７６１；５，６９３，７６２；５，８５９，２０５を参照できる。更に又、ヒト化抗体及び所定の抗原に対して向上した親和性を有するヒト化抗体を作成するための手法を開示している米国特許６，１８０，３７０及び国際公開ＷＯ  ０１／２７１６０も参照できる。
【０１０７】
本発明は又、不活性化された内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を特徴とする非ヒト哺乳類宿主、より詳しくはトランスジェニックマウスにおいて生産された異種又は修飾された抗体を用いて実施できる。そのようなトランスジェニック動物において、宿主免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖サブユニットの発現のためのコンピテントな内因性遺伝子は非機能性とされ、類似のヒト免疫グロブリン遺伝子座で置換される。これらのトランスジェニック動物は軽鎖又は重鎖の宿主免疫グロブリンサブユニットの実質的非存在下においてヒト抗体を生産する。例えば参照として本明細書に組み込まれる米国特許５，８７７，３９７及び５，９３９，５９８を参照できる。
【０１０８】
一部の実施形態においては、例えばＣＤ４０に対する完全ヒト抗体はトランスジェニックマウスを免疫化することにより得られる。そのようなマウスの１つはＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術（Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて得られ、全て参照として本明細書に組み込まれる米国特許６，０７５，１８１，６，０９１，００１及び６，１１４，５９８に開示されている。本明細書に開示する抗体を作成するために、ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子座及びヒトκ軽鎖遺伝子座に関してトランスジェニックであるマウスをヒトＣＤ４０を発現するＳｆ９細胞で免疫化した。マウスはまた他のアイソタイプに関してもトランスジェニックであることができる。本発明の安定な液体医薬組成物において有用な完全なヒト抗ＣＤ４０抗体は本明細書に開示するＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体により示されるものと同様の結合特性を特徴とする。
【０１０９】
目的の特定の抗体、例えば、抗ＣＤ４０抗体、例えば拮抗剤抗ＣＤ４０抗体のフラグメントはそれらが完全長抗体の所望の親和性を保持している限り、本発明の安定な液体医薬組成物中における使用に適している。即ち、例えば、抗ＣＤ４０抗体のフラグメントはＣＤ４０Ｂ細胞表面抗原に結合する能力を保持することになる。そのようなフラグメントは相当する完全長抗体と同様の特性により特徴づけられる。即ち、例えば完全長拮抗剤抗ＣＤ４０抗体のフラグメントはヒト細胞の表面上に発現されているヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合することになり、、有意なアゴニスト活性は有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原への結合時に拮抗剤活性を示す。そのようなフラグメントは本明細書においては「抗原結合」フラグメントと称する。
【０１１０】
抗体の適当な抗原結合フラグメントは完全長抗体の一部分、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例は限定しないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、及び単鎖抗体分子を包含する。「Ｆａｂ」とは、軽鎖及び重鎖の一部を有する免疫グロブリンの１価の抗原結合フラグメントを意図している。Ｆ（ａｂ’）２は両方の軽鎖及び両方の重鎖の部分を含有する免疫グロブリンの２価の抗原結合フラグメントを意図している。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むフラグメントを意図しており、この場合、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。例えば参照として本明細書に組み込まれる米国特許４，９４６，７７８，５，２６０，２０３，５，４５５，０３０、及び５，８５６，４５６を参照できる。一般的に、Ｆｖポリペプチドは更に抗原結合のための所望の構造をｓＦｖが形成できるようにするＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含んでいる。ｓＦｖの考察に関してはＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）のＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，ｅｄ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５を参照できる。本明細書に開示する拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の抗原結合フラグメントは又、後述する通り、標的癌細胞の殺傷を起こすために細胞毒に共役できる。
【０１１１】
抗体又は抗体フラグメントは例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）及び米国特許５，５１４，５４８に記載の手法を用いて作成された抗体ファージライブラリから単離できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８及びＭａｒｋｓ等（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７はファージライブラリを使用するそれぞれネズミ及びヒトの抗体の単離を記載している。その後の文献では、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ等（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）並びに極めて大型のファージライブラリを構築するための方策としてのコンビナトリアルな感染及びインビボの組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）による高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の製造が記載されている。即ち、これらの手法はモノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法の実用的な代替法である。
【０１１２】
種々の手法が抗体フラグメントの作成のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは未損傷抗体のタンパク分解的な消化を介して誘導されている（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ等（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ等（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１参照）。しかしながら、これらのフラグメントは現在では組み換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体フラグメントは上記した抗体ファージライブラリから単離できる。或いは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収して化学的にカップリングすることによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成できる（Ｃａｒｔｅｒ等（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）。別の経路によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。抗体フラグメントの作成のための他の手法は当該分野で知られている。
【０１１３】
本発明の安定な液体医薬組成物における使用のための拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は本明細書に開示したＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体、並びにこれらの抗体とは異なるが、ＣＤＲを保持している抗体；及び、Ｂ細胞増殖及び／又は分化の抑制により拮抗剤活性が測定される１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を有する抗体を包含する。本発明は又、例えば参照として本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ  ９８／５２９７６及びＷＯ００３４３１７に記載されているとおり作成できる脱免疫化抗体、特に脱免疫化拮抗剤抗ＣＤ４０抗体も包含する。この態様において、本発明の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体内の残基は、抗体をヒトに対しては又は低免疫原性とするがヒトＣＤ４０発現細胞に対する拮抗剤活性は保持しているように修飾され、この場合そのような活性は本明細書に記載した試験により測定される。同様に本発明の範囲に包含されるものは、目的の抗体、例えば拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はそのフラグメントを含む融合タンパク質であり、その融合タンパク質は当該分野で知られる通り、合成するか、又は相当するポリヌクレオチドベクターから発現させることができる。そのような融合タンパク質は本明細書に記載する通り抗体のコンジュゲーションを参照しながら説明する。
【０１１４】
目的の結合親和性を有する何れかの知られた抗体は、例えば参照として本明細書に組み込まれる特許公開ＥＰ０９８３３０３Ａ１、ＷＯ００／３４３１７及びＷＯ９８／５２９７６に記載されている方法を用いて作成された配列変異を有することができる。例えばＣＤＲ内の配列は抗体を、ＭＨＣクラスＩＩに結合させ、望ましくないヘルパーＴ細胞応答をトリガーさせることができる。保存的置換は抗体は結合親和性を保持できるが、なお望ましくないＴ細胞応答をトリガーするその能力を失うようにすることができる。何れかのこのような保存的又は非保存的な置換は当該分野で知られた方法、例えば本明細書に記載するものを用いて行うことができ、、得られた抗体もまた本発明の安定な液体医薬組成物中で使用できる。変異体抗体は特定の活性、例えば拮抗剤活性、親和性及び特異性に関して、本明細書に記載した方法を用いて定型的に試験することができる。
【０１１５】
上記した方法の何れか、又は本明細書に開示した何れかの他の方法により作成された拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９抗体と同様の態様において使用でき、その場合、それは以下の生物学的活性、即ち、Ｔ細胞により刺激される正常なヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリンの分泌の抑制；ＪｕｒｋａｔＴ細胞により刺激される正常なヒト末梢Ｂ細胞の生存及び／又は増殖の抑制；ＣＤ４０Ｌ発現細胞又は可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）により刺激される正常なヒト末梢Ｂ細胞の生存及び／又は増殖の抑制；ｓＣＤ４０Ｌ又は固相ＣＤ４０Ｌにより刺激される何れかの細胞における「生存」の抗アポトーシス細胞内シグナルの抑制；ｓＣＤ４０Ｌ又は固相ＣＤ４０Ｌとのライゲーション時の何れかの細胞におけるＣＤ４０シグナルトランスダクションの抑制；ヒト悪性Ｂ細胞の増殖の抑制；ＣＤ４０担持標的細胞又はＣＤ４０に対する同族リガンドを担持している細胞、例えば限定しないが、Ｔ細胞及びＢ細胞の欠失、アネルギー及び／又は耐容性誘導；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の増殖又は活性化の誘導（例えばＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ干渉を介したドナー同種抗原特異的組織拒絶、Ｍａｕｒｉｋ等（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５４０１−５４０４参照）；何れかの機序による細胞毒性（例えば限定しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、増殖のダウンレギュレーション、及び／又は標的細胞におけるアポトーシス）；標的細胞サイトカイン分泌及び／又は細胞表面分子発現のモジュレーション；及びこれらの組み合わせ、の少なくとも一部分を保有する。本明細書に開示した拮抗剤抗ＣＤ４０抗体及びその抗原結合フラグメントの所望の生物学的活性を測定するための試験は仮出願である表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日及び２００４年４月２７日のもの、及び、譲渡された各々の米国特許出願６０／５１７，３３７（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、６０／５２５，５７９（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、及び６０／５６５，７１０（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））、同様に、表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００４年１１月４日、ＷＯ２００５／０４４８５４として公開されたものに記載されている通り実施でき；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。同様に、仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，２８５（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００２（０３５７８４／３０４３１２））、及び相当する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９４１４（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００３（０３５７８４／３１１６１１））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１４３として公開；及び仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，３３６（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００２（０３５７８４／３０４３１１））、及び相当する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９３２５（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００３（０３５７８４／３１１６０８））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１１７として公開されたものに記載された試験も参照でき；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。同様に、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ等（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎ等（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓ等（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎ等（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎ等（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍ等（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７９：４３９−４４４；及び米国特許５，６７４，４９２及び５，８４７，０８２に記載された試験も参照でき；参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
本明細書において識別されるＣＤ４０抗原エピトープに特異的な拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を検出するための代表的な試験は、「競合的結合試験」である。競合的結合試験は、未知物質を検出し、標識された既知リガンドのその特異的抗体への結合を抑制するそれらの能力により定量する血清学的な試験である。これはまた競合的抑制試験とも称される。代表的な競合的結合試験においては、例えば本発明のモノクローナル抗体のエピトープ１つ以上に対して育成されたモノクローナル抗体と組み合わせて、標識されたＣＤ４０ポリペプチドを試料中の候補抗体により沈殿させる。目的のエピトープと特異的に反応する抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０タンパク質又は目的のＣＤ４０タンパク質の特定のエピトープを含むタンパク質のフラグメントに対して製造された一連の抗体をスクリーニングすることにより識別できる。例えば、ヒトＣＤ４０に関しては、目的のエピトープは、配列番号９によりコードされる配列番号１０に示されるヒトＣＤ４０の短鎖アイソフォーム（ゲンバンクアクセッション番号ＮＰ＿６９０５９３）；ゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿１５２８５４）も参照；又はヒトＣＤ４０の長鎖アイソフォーム（配列番号１１に示される配列によりコードされる配列番号１２に示されるゲンバンクアクセッション番号ＣＡＡ４３０４５及びＮＰ＿００１２４１参照；ゲンバンクアクセッション番号Ｘ６０５９２及びＮＭ＿００１２５０参照）の線状及び／又は非線状のアミノ酸残基を含むエピトープを包含する。或いは、以前に識別されている適当な拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を用いた競合的結合試験を用いて以前に識別されている抗体に匹敵するモノクローナル抗体を選択することができる。
【０１１７】
このようなイムノアッセイにおいて使用される抗体は標識されているか、未標識であってよい。未標識抗体は凝集反応において使用してよく；標識された抗体は広範な種類の標識を用いた広範な種類の試験において使用してよい。抗ＣＤ４０抗体と目的のエピトープとの間の抗体−抗原複合体の形成の検出は、抗体に検出可能な物質を結合させることにより容易にすることができる。適当な検出手段は、標識、例えば放射性核種、酵素、補酵素、蛍光物質、ケミルミネセント物質、発色物質、酵素基質又はコファクター、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、染料等の使用を包含する。適当な酵素の例はセイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンを包含し；ルミネセント物質の例はルミノールであり；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを包含し；適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ及び３Ｈを包含する。このような標識された試薬は種々の良く知られた試験法、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光イムノアッセイ等において使用してよい。例えば米国特許３，７６６，１６２；３，７９１，９３２；３，８１７，８３７；及び４，２３３，４０２を参照できる。
【０１１８】
以前に記載された拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの何れかを本発明の医薬組成物の使用の前に共役してよい。共役された抗体を作成するための方法は当該分野で知られている。即ち、抗体を間接的な標識又は間接的な標識方法を用いて標識してよい。「間接的な標識」又は「間接的な標識方法」とは、キレート形成剤が共有結合的に抗体に結合し、少なくとも１つの放射性核種がキレート形成剤に挿入されることを意図している。例えば参照として本明細書に組み込まれるＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．１８：５８９−６０３に記載されているキレート形成剤及び放射性核種を参照できる。適当な標識は蛍光団、発色団、放射性原始（特に３２Ｐ及び１２５Ｉ）、電子稠密試薬、酵素及び特異的結合相手を有するリガンドを包含する。酵素は典型的にはその活性により検出される。例えば、セイヨウワサビパーオキシダーゼは通常は分校光度計により定量可能な青色顔料に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を変換するその能力により検出される。「特異的結合相手」とは、例えば抗原及びそれに対して特異的なモノクローナル抗体の場合のように、高い特異性でリガンド分子を結合できるタンパク質を指す。他の特異的結合相手はビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、及び、当該分野で知られた多くの受容体−リガンド対を包含する。同じ標識が数種の異なる様式で機能する場合があるため、上記した説明は種々の標識を異なるクラスに範疇化する意味を有さない。例えば、１２５Ｉは放射性標識として、又は電子稠密試薬として作用してよい。ＨＲＰは酵素として、又はｍＡｂに対する抗原として作用してよい。更に又、所望の作用のために種々の標識を組み合わせてもよい。例えばｍＡｂ及びアビジンは又、本発明の実施において標識を必要とし；即ち、ｍＡｂをビオチンで標識し、その存在を１２５Ｉで標識したアビジンを用いて、又はＨＲＰで標識した抗ビオチンｍＡｂを用いて検出してよい。他の序列及び可能性は当業者の知る通りであり、本発明の範囲内の等価物とみなされる。
【０１１９】
或いは、目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を「直接標識」又は「直接標識方法」を用いて標識してよく、その場合、放射性核種は抗体に直接共有結合する（典型的にはアミノ酸残基を介する）。好ましい放射性核種は上記したＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｅ（１９９１）に記載されている。間接的な標識方法が特に好ましい。例えば放射性標識を抗体に結合させるためにリンカーを使用している国際公開ＷＯ  ００／５２０３１及びＷＯ  ００／５２４７３；及び参照として本明細書に組み込まれる米国特許６，０１５，５４２に記載されている抗ＣＤ４０抗体の標識された形態を参照することができる。
【０１２０】
抗体の変異体
本発明の医薬組成物は当該分野で知られている種々の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を用いて製剤できる。そのような変異体は親抗体の所望の結合特性を保持していることになる。即ち、例えば製剤すべき拮抗剤抗ＣＤ４０抗体が親のＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９抗体の変異体である場合、変異体抗体は親ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９抗体の結合特性を保有することになる。抗体変異体を作成するための方法は一般的に当該分野で使用できるものである。
【０１２１】
例えば、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えば本明細書に記載するＣＨＩＲ−５．９及びＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体のアミノ酸配列変異体は目的の抗体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列における突然変異により調製できる。突然変異誘発及びヌクレオチド配列改変のための方法は当該分野で周知である。例えば参照として本明細書に組み込まれるＷａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ等（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；米国特許４，８７３，１９２及びこれらにおいて引用されている文献を参照できる。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は参照として本明細書に組み込まれるＤａｙｈｏｆｆ等（１９７８）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに示されている。保存的置換、例えば１つのアミノ酸の同様の特性を有する別のものとの交換が好ましい。保存的置換の例は限定しないが、ＧｌｙとＡｌａ、ＶａｌとＩｌｅとＬｅｕ、ＡｓｐとＧｌｕ、ＬｙｓとＡｒｇ、ＡｓｎとＧｌｎ、及びＰｈｅとＴｒｐとＴｙｒを包含する。
【０１２２】
目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体ポリペプチド、例えばＣＨＩＲ−１２．１２イムノアッセイＣＨＩＲ−５．９抗体の変異体を構築する場合、変異体が所望の活性、即ち同様の結合親和性を保有し続けるように、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の場合は、ヒト細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合することができるように、有意なアゴニスト活性は有さないが、ヒトＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０抗原への結合時には拮抗剤活性を示すことができるように修飾を行う。当然ながら、変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて生じさせるいかなる突然変異も読み枠外に配列を置いてはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生じさせる相補領域を生じさせない。ＥＰ特許出願公開７５，４４４を参照できる。
【０１２３】
更に又拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の定常領域は多くの方法でエフェクター機能が改変されるように突然変異させることができる。例えば、Ｆｃ受容体への抗体結合を最適化しているＦｃの突然変異を開示している米国特許６，７３７，０５６Ｂ１及び米国特許出願公開２００４／０１３２１０１Ａ１を参照できる。
【０１２４】
好ましくは、レファレンス拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の変異体は、レファレンス抗体、例えば本明細書に記載するＣＨＩＲ−５．９又はＣＨＩＲ−１２．１２モノクローナル抗体に関するアミノ酸配列に対して、又はレファレンス抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％又は７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％又は８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有している。本発明の目的のためには、パーセント配列同一性は、ギャップオープンペナルティー１２、及びギャプエクステンションペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２としてアファインギャップサーチを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムを用いて測定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９に記載されている。変異体は、例えばレファレンスの拮抗剤抗ＣＤ４０抗体とは、１〜１５アミノ酸残基程の少数、１〜１０アミノ酸残基程の少数、例えば６〜１０、５程の少数、４，３、２又は更には１アミノ酸残基程の少数の分だけ異なっていてよい。
【０１２５】
２つのアミノ酸配列の最適なアライメントに関しては、変異体アミノ酸配列の隣接するセグメントはレファレンスのアミノ酸配列に関して、追加的なアミノ酸残基、又は欠失したアミノ酸残基を有していてよい。レファレンスアミノ酸配列との比較のために使用する隣接するセグメントは少なくとも２０隣接アミノ酸残基を含むことになり、、３０、４０、５０又はこれより多いアミノ酸残基であってよい。保存的な残基の置換又はギャップに関連して配列の同一性のための補正を行うことができる（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性検索アルゴリズムを参照）。
【０１２６】
本発明の医薬組成物を用いた治療方法
本発明の医薬組成物はＣＤ４０発現細胞が関連する癌又は前悪性の状態を有する対象を治療する場合に、又はＣＤ４０発現細胞が関連する炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患を治療するために使用される。「治療」とは本明細書においては、対象に対する拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む医薬組成物の適用又は投与、又は、対象に由来する単離された組織又は細胞系統に対する拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む医薬組成物の適用又は投与として定義され、ここで対象は疾患、疾患の症状、又は疾患に至る素因を有し、ここで目的は疾患、疾患の症状、又は疾患に至る素因の治癒、療養、軽減、緩和、改変、緩解、改良、改善又は影響を及ぼすことである。
【０１２７】
「対象」とは何れかの動物を意図する。好ましくは対象は哺乳類であり、最も好ましくは対象はヒトである。ヒト以外の特定の重要な哺乳類は限定しないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ及びブタを包含する。
【０１２８】
治療の目的のために投与する場合、投与は予防的又は治療的な目的のためであってよい。予防的に提供する場合は、医薬組成物は何れかの症状の前に提供する。医薬組成物の予防的投与は何れかのその後の症状を防止又は減衰させる働きを有する。治療的に提供する場合は、医薬組成物は症状の発症時（又はその直後）に提供する。医薬組成物の治療的投与は何れかの実際の症状を減衰させる働きを有する。
【０１２９】
投与の典型的な経路は限定しないが、経口投与及び非経腸投与、例えば静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻内、舌下、動脈内及び腹腔内の注射又は注入、及び皮下注射を包含する。この投与を達成するための方法は当該分野で知られている。
【０１３０】
好ましい実施形態においては、本発明の医薬組成物は静脈内投与される。静脈内投与は投与する拮抗剤抗ＣＤ４０抗体に応じて、好ましくは約１〜分１０時間の期間にわたる、より好ましくは約１〜約８時間にわたる、更に好ましくは約２〜約７時間にわたる、なお好ましくは約４〜約６時間にわたる注入により行う。医薬組成物の初期の注入は約４〜約６時間の期間に渡って行い、後の注入はより速く送達する。後の注入は約１〜約６時間、例えば約１〜約４時間、約１〜約３時間、又は約１〜約２時間の期間に渡って投与してよい。
【０１３１】
本発明の医薬組成物の薬学的有効量を対象に投与する。「薬学的有効量」とは、治療が上記した通り予防的又は治療的な目的のためであることができる疾患又は状態の治療において有用な量を意図する。この態様において、組成物の薬学的有効量は治療を必要とする対象に対し拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の治療上有効な用量又は量を投与するものとなる。「治療上有効な用量又は量」又は「有効量」とは、投与されればＣＤ４０発現細胞を含む疾患を有する患者の治療に関して正の治療応答をもたらす拮抗剤抗ＣＤ４０抗体の量を意図する。本発明の一部の実施形態においては、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体、例えばモノクローナル抗体ＣＨＩＲ−１２．１２又はＣＨＩＲ−５．９、又はその抗原結合フラグメントの治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、
約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、又は約７ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与方法は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効用量の単回投与または治療有効用量の多数回投与を含んでよい。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は抗ＣＤ４０治療薬、より詳しくは拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を用いた治療に応答する癌又は前悪性の状態を有する何れかの対象を治療する場合に使用される。癌又は前悪性の状態の抗ＣＤ４０抗体を用いた治療に対する応答性を測定するための方法は、診断及び予後試験、例えば同時係争中の共通に保有されている暫定特許出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，２８５（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００２（０３５７８４／３０４３１２））、及び相当する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９４１４（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００３（０３５７８４／３１１６１１））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１４３として公開されたものに記載された試験を包含し；これらの内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。同様に、本発明の医薬組成物は抗ＣＤ４０治療薬、より詳しくは拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を用いた治療に応答する炎症性及び／又は自己免疫性の疾患を有する何れかの対象を治療する場合に使用される。炎症性及び／又は自己免疫性の疾患の抗ＣＤ４０抗体を用いた治療に対する応答性を測定するための方法は、診断及び予後試験、例えば同時係争中の共通に保有されている暫定特許出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，３３６（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００２（０３５７８４／３０４３１１））、及び相当する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９３２５（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００３（０３５７８４／３１１６０８））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１１７として公開されたものに記載された試験を包含し；これらの内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
「腫瘍」とは、本明細書においては、悪性又は良性に関わらず全ての新生物性の細胞の成育及び増殖、全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。「新生物性」とは、本明細書においては、異常な組織の成育をもたらす、悪性又は良性に関わらず、脱調節された、又は未調節の細胞の生育の何れかの形態を指す。即ち「新生物性の細胞」とは、脱調節された、又は未調節の細胞の生育を有する悪性及び良性の細胞を包含する。
【０１３４】
「抗腫瘍活性」とは、悪性のＣＤ４０発現細胞の増殖又は蓄積の速度の低下、その結果として生じる既存の腫瘍の成育速度又は治療中に生じた腫瘍の減少、及び／又は既存の新生物性（腫瘍）細胞又は新規に形成された新生物細胞の破壊、その結果として生じる治療中の腫瘍の全体寸法の低下を意図している。本明細書の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物を用いた治療はヒトにおけるＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナリングの刺激に関連する癌及び前悪性の状態の治療に関連して有利である生理学的応答をもたらす。
【０１３５】
「癌」及び「癌性の」という用語は未調節の細胞成育を典型的特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか、説明するものである。癌の例は限定しないが、リンパ腫又は白血病、及び固形腫瘍を包含する。「Ｂ細胞関連癌」又は「Ｂ細胞系統の癌」とは、脱調節された、又は未調節の細胞の生育がＢ細胞に関連している癌の何れかの型を意図している。
【０１３６】
「難治性」とは、癌に関する場合、特定の癌が特定の治療薬、例えば目的の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を用いた治療に対して抵抗性又は非応答性であることを意図している。癌は、特定の治療薬を用いた治療に対して、特定の治療薬を用いた治療の開始時から（即ち治療薬への初回曝露に対して非応答性）、又は治療薬に対する抵抗性の発生の結果として、治療薬を用いた最初の治療機関の過程に渡って、又は治療薬を用いた後の治療期間の間、難治性となる場合がある。
【０１３７】
本発明の医薬組成物はＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナリングの刺激により媒介される癌又は前悪性の状態に対して、又はＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナリングにより媒介される何れかの炎症性又は自己免疫性の疾患に対して、治療介入を必要としている対象を治療する場合に使用される。「ＣＤ４０発現細胞」とは、ＣＤ４０抗原を発現する正常、前悪性及び悪性の細胞を意図している。一部の実施形態においては、ＣＤ４０発現細胞は悪性Ｂ細胞である。「悪性」Ｂ細胞とは、何れかの新生物性のＢ細胞、例えば限定しないが、リンパ腫、例えば低、中及び高等級のＢ細胞リンパ腫、免疫芽細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）誘導リンパ腫、及びエイズ関連リンパ腫、並びにＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ性白血病等から誘導されたＢ細胞を意図している。他の実施形態によれば、ＣＤ４０発現細胞は癌腫又は肉腫の細胞である。「ＣＤ４０発現癌腫細胞」又は「ＣＤ４０発現肉腫細胞」とは、ＣＤ４０細胞表面抗原を発現する固形腫瘍の何れかの悪性（即ち新生物性）又は前悪性の癌腫又は肉腫の細胞を意図している。本発明の目的のためには、ＣＤ４０抗原を発現する癌性及び前癌性又は前悪性の細胞は「ＣＤ４０発現新生物細胞」と称する。細胞におけるＣＤ４０発現を検出するための方法は当該分野で周知であり、限定しないがＰＣＲの手法、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等を包含する。拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを用いた治療が認可される場合、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は何れかの適当な投与経路により投与できる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物を用いた治療介入を要する対象はＣＤ４０発現新生物細胞上のＣＤ４０シグナリングにより媒介される何れかの癌又は前悪性の状態に罹患しているか、発症又は再発の危険性がある場合がある。そのような癌又は前悪性の状態は、限定しないが、Ｂ細胞系統の癌、非Ｂ細胞血液学的悪性疾患、及びＣＤ４０発現新生物細胞上のＣＤ４０シグナリングにより媒介されることが分かっている固形腫瘍を包含する。
【０１３９】
ＣＤ４０発現新生物細胞を含むＢ細胞系統の癌の例は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患及びリンパ腫、例えば限定しないが、びまん性小細胞型リンパ性リンパ腫、小胞性、ＤＬＢＣＬ、粘膜関連のリンパ様組織のリンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、血管内リンパ腫症、免疫芽球リンパ腫、エイズ関連リンパ腫等である。
【０１４０】
即ち、本発明の医薬組成物は異常な、制御不能なＢ細胞の増殖又は蓄積に関連する非ホジキンリンパ腫を有する対象の治療において使用される。本発明の目的のためには、そのようなリンパ腫はＷｏｒｋｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎの分類スキームに従って、低等級、中等級、及び高等級としてカテゴリー化されるＢ細胞となる（Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，”  Ｃａｎｃｅｒ  ４９（１９８２）：２１１２−２１３５参照）。低等級のＢ細胞リンパ腫は、小リンパ球性、小胞性小型切れ込み核細胞、及び小胞性混合型小型切れ込み核細胞、及び大細胞リンパ腫を包含し；中等級リンパ腫は小胞性大細胞、びまん性小型切れ込み核細胞、びまん性混合型小及び大細胞、及びびまん性大細胞リンパ腫を包含し；高等級リンパ腫は大細胞免疫芽球、リンパ芽球、及び小型非切れ込み核細胞リンパ腫のバーキット及び非バーキット型を包含する。
【０１４１】
本発明の医薬組成物はＲｅｖｉｓｅｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ａｎｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＥＡＬ）のシステムに従って分類されるＢ細胞リンパ腫の施療的治療において有用である。そのようなＢ細胞リンパ腫は、限定しないが、前駆体Ｂ細胞新生物に分類されるリンパ腫、例えばＢリンパ芽球性白血病／リンパ腫；末梢Ｂ細胞新生物、例えばＢ細胞慢性リンパ性白血病／小細胞リンパ性リンパ腫、リンパプラズマ細胞様リンパ腫／免疫細胞腫、被膜細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小胞中心リンパ腫（小胞性）（例えばびまん性小細胞、びまん性混合型小及び大細胞、及びびまん性大細胞リンパ腫）、境界域Ｂ細胞リンパ腫（例えば節外、節性、及び脾性）、プラズマ細胞腫／骨髄腫、びまん性大細胞リンパ腫のサブタイプ一次縦隔（胸腺）バーキットリンパ腫、及びバーキット様高悪性度Ｂ細胞リンパ腫；及び未分類の低等級又は高等級のＢ細胞リンパ腫を包含する。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は又、ＭＧＵＳ（意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症）として知られている前悪性状態を有する対象を治療するためにも使用される。ＭＧＵＳを有する患者の約２５％が最終的には多発性骨髄腫（ＭＭ）又は関連のプラズマ細胞障害を発症する（Ｋｙｌｅ（１９９３）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ．Ｐｒｏｃ．６８：２６−３６）。骨髄における悪性プラズマ細胞の増殖、血清中又は尿中の単一クローンタンパク（Ｍタンパク質）の検出、貧血、高カルシウム血症、腎不全、及び崩壊性の骨髄疾患がＭＭの臨床所見であるのに対し、ＭＧＵＳは臨床的にはＭＭの他の臨床特徴を伴わない血清または尿中のＭタンパク質の存在として認識される（例えばＫｙｌｅ  ａｎｄ  Ｌｕｓｔ（１９８９）Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２６：１７６−２００；Ｇｒｅｉｐｐ  ａｎｄ  Ｌｕｓｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（１９９５）１３：１０−２１参照）。ＭＧＵＳ患者は無症候性であり、Ｍタンパク質の安定した測定値を有している（Ｋｙｌｅ（１９９３）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ．Ｐｒｏｃ．６８：２６−３６）。ＭＧＵＳが対象に発見されれば、本発明の適切な医薬組成物、例えば本明細書に開示した拮抗剤抗ＣＤ４０抗体を含む組成物を用いた維持療法がこれらの対象における多発性骨髄腫の発症をブロックする場合がある。
【０１４３】
特に本発明の医薬組成物は第１選択肢の癌療法治療に対して難治性である（即ち抵抗性であるか、又は抵抗性となっている）Ｂ細胞リンパ腫、例えば上記したものを治療するために有用である。「癌療法」という用語は癌の治療、例えば化学療法、手術、放射線療法、単一の抗癌抗体療法、及びこれらの組み合わせを意味する。ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリングを調節する、ＡＤＣＣを調節する、又はその両方である抗ＣＤ４０抗体１つ以上を用いた治療介入が必要である患者のサブ集団が存在する。
【０１４４】
本発明の医薬組成物はまた非Ｂ細胞関連の血液学的悪性疾患を治療するためにも有用である。そのような悪性疾患は、限定しないが急性白血病；骨髄芽球性白血病；急性骨髄性白血病；前骨髄性白血病；骨髄単球性白血病；単球性白血病；赤白血病；顆粒球性白血病（慢性骨髄性白血病）；真性赤血球増加症等を包含する。
【０１４５】
ＣＤ４０発現新生物細胞を含み、このため本発明の医薬組成物を用いた治療に有利に応答する固形腫瘍は、限定しないが卵巣、肺（例えば扁平上皮細胞癌、腺癌、及び第細胞癌腫の型の非小細胞肺癌；及び小細胞肺癌）、乳房、肝臓（例えば肝細胞癌を包含する）、胃、支給警部、前立腺、鼻咽頭、甲状腺（例えば甲状腺乳頭状癌）、皮膚癌、例えば黒色腫、及び肉腫、例えば骨肉腫及びユーイング肉腫を包含する。
【０１４６】
癌又は前悪性の状態を有する対象に本発明の医薬組成物を投与することにより達成できる有利な結果はその癌又は状態に関する何らかの正の治療応答を包含する。「正の治療応答」とは、癌治療に関する場合、抗ＣＤ４０治療薬の抗腫瘍活性に関連する疾患の改善及び／又は目的の疾患に伴う症状の改善を意図している。即ち、抗増殖作用、更に腫瘍が派生することの防止、腫瘍サイズの低減、癌細胞数の低減、及び／又はＣＤ４０発現細胞の刺激により媒介される症状１つ以上の低下が観察される。即ち、例えば、正の治療応答とは疾患における以下の改善点、即ち、（１）腫瘍サイズの低減；（２）癌（新生物）細胞数の低減；（３）新生物細胞の死滅の増大；（４）新生物細胞の生存の抑制；（４）腫瘍生育の抑制（即ち、ある程度までの緩徐化、好ましくは停止）；（５）周辺臓器内への癌細胞の浸潤の抑制（即ち、ある程度までの緩徐化、好ましくは停止）；（６）腫瘍転移の抑制（即ち、ある程度までの緩徐化、好ましくは停止）；（７）更に腫瘍が派生することの防止；（８）患者生存率の増大；及び（９）癌に伴う症状１つ以上のある程度までの緩解、の１つ以上を指す。何れかの所定の悪性疾患における正の治療応答はその悪性疾患に特化された標準化された応答の基準により測定できる。腫瘍の応答はスクリーニング手法、例えば磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影画像化、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、骨スキャン画像化、内視鏡撮影、及び腫瘍生検試料採取、例えば骨髄吸引（ＢＭＡ）及び循環系中の腫瘍細胞の計数を用いながら腫瘍形態（即ち全体的腫瘍負荷、腫瘍サイズ等）の変化に関して試験することができる。これらの正の治療応答の他に、本発明の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有医薬組成物を用いた治療を受けている対象は疾患に伴う症状の改善の有利な作用を経験する場合がある。即ちＢ細胞腫瘍に関しては、対象はいわゆるＢ症状、即ち寝汗、発熱、体重減少、及び／又は蕁麻疹の低下を経験する場合がある。前悪性状態に関しては、抗ＣＤ４０治療薬を用いた治療は関連の悪性状態の発症、例えば意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）に罹患した対象における多発性骨髄腫の発症をブロック及び／又はそれに至る時間を延長する場合がある。
【０１４７】
「抗炎症活性」とは、炎症の低減又は防止を意図している。本発明の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有液体医薬組成物を用いた治療は疾患にＣＤ４０抗原を発現する細胞が関与している場合の自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療に関して有利である生理学的応答を誘発する。本発明の組成物は増殖、活性化などのような細胞における表現型の変化を防止する場合に有用である。
【０１４８】
本発明の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有液体医薬組成物を用いた治療介入を受けている対象はＣＤ４０発現細胞上のＣＤ４０シグナリングにより媒介される何れかの炎症性または自己免疫性の疾患に罹患しているか、発症又は再発の危険性がある場合がある。炎症性疾患は炎症及び組織の破壊又はこれらの組み合わせを特徴とする。「炎症性疾患」は自己免疫応答の開始事象又は標的に非自己抗原、例えば同種抗原、異種抗原、ウィルス抗原、細菌抗原、未知抗原又はアレルゲンが関与している何れかの炎症性の免疫媒介性のプロセスを包含する。
【０１４９】
更に又、本発明の目的のためには「炎症性疾患」という用語は「自己免疫疾患」を包含する。本明細書においては、「自己免疫」という用語は一般的に「自己」抗原が関与する炎症性免疫媒介のプロセスを包含すると理解される。自己免疫疾患においては、自己抗原が宿主免疫応答をトリガーする。
【０１５０】
更に又、本発明の医薬組成物は組織移植片拒絶に関連する炎症の治療のために使用できる。「移植片拒絶」又は「移植組織拒絶」とは移植片、例えば限定しないがＨＬＡ抗原、血液型群抗原等を包含するがこれらに限定されない移植片に対しての、何れかの宿主性の免疫応答を指す。
【０１５１】
本発明の医薬組成物は又対宿主性移植片病、例えば骨髄移植に関連する者の治療のために有用である場合がある。そのような対宿主性移植片病において、ドナーの骨髄はリンパ球及び成熟してリンパ球となる細胞を包含する。ドナーのリンパ球はレシピエントの抗原を非自己として認識し、炎症免疫応答を生じさせる。従って、本明細書においては、「対宿主性移植片病」又は「対宿主性移植片反応」とはドナーリンパ球が宿主の抗原に反応する何れかのＴ細胞媒介免疫応答を指す。
【０１５２】
自己免疫性及び／又は炎症性の疾患の例は、限定しないが全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、ループス腎炎、サルコイドーシス、炎症性関節炎、例えば若年性関節炎、慢性関節リューマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、及び痛風性関節炎、臓器又は組織の移植片の拒絶、超急性、急性又は慢性の拒絶及び／又は対宿主性移植片病、多発性硬化症、高ＩｇＥ症候群、結節性多発性動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病（グルテン感受性腸症）、自己免疫性肝炎、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、乾癬、硬皮症、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス症、橋本甲状腺炎、免疫複合体病、慢性疲労性免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、多発性筋炎及び皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、血栓崩壊、心筋症、尋常性天疱瘡、肺間質性腺維症、Ｉ型及びＩＩ型の真性糖尿病、１、２、３及び４型遅延過敏症、アレルギー又はアレルギー性障害、治療用タンパク質に対する望ましくない／意図しない免疫応答（例えば米国特許出願ＵＳ２００２／０１１９１５１及びＫｏｒｅｎ等（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４９−６０参照）、喘息、チャーグ−ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性及び刺激性の接触皮膚炎、蕁麻疹、ＩｇＥ媒介アレルギー、アテローム性動脈硬化症、血管炎、特発性炎症性ミオパシー、溶血性疾患、アルツハイマー病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害等を包含する。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は肺の炎症、例えば限定しないが、肺の移植片拒絶、喘息、サルコイドーシス、肺気腫、嚢胞性線維症、特発性肺線維症、慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎及び肺のアレルギー性疾患、例えば過敏性肺炎、好酸球性肺炎、骨髄及び／又は肺の移植又は他の原因による閉塞性細気管支炎、移植片のアテローム性動脈硬化症／移植片の静脈硬化症、並びにコラーゲンに起因する肺線維症、血管及び自己免疫性の疾患、例えば慢性関節リューマチ及びエリテマトーデスに対して個体を治療するために使用される。
【０１５３】
他の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、ＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリングのモジュレーション、ＡＤＣＣのモジュレーション、又は両方を介するものではない作用様式を有する他の既知治療法に対して初期に抵抗性であるか抵抗性を発生させる自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するために有用である。本発明の医薬組成物はＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリングを調節するか、ＡＤＣＣを調節するか、両方である拮抗剤抗ＣＤ４０抗体１つ以上を用いた治療介入が望ましい患者のサブ集団を治療するために有用である場合がある。
【０１５４】
炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する対象に本発明の医薬組成物を投与することにより達成できる有利な結果はその疾患に関する何れかの正の治療応答を包含する。「正の治療応答」とは、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患に関する場合、これらの抗体又はその抗原結合フラグメントの抗炎症活性に関連する疾患の改善、及び／又は疾患に関連する症状の改善を意図している。即ち、抗増殖作用、ＣＤ４０発現細胞の追加的増殖の防止、炎症応答の低減、例えば限定しないが炎症性サイトカイン、接着分子、補欠分子族、免疫グロブリン（ＣＤ４０担持細胞がＢ細胞の場合）、これらの組み合わせ等の分泌の低減、抗炎症タンパク質の生産増大、自己反応性細胞の数の低減、免疫耐容性の増大、自己反応性細胞の生存の抑制、及び／又はＣＤ４０発現細胞の刺激により媒介される症状１つ以上の低下が観察できる。そのような正の治療応答は投与経路に限定されず、ドナー、ドナー組織（例えば臓器灌流）、宿主、これらの何れかの組み合わせなどへの投与を含んでよい。
【０１５５】
臨床応答はスクリーニング手法、例えば磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影画像化、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析、組織学、肉視的病理学、及び血液科学、例えば限定しないがＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィー等により検出可能な変化を用いて試験できる。これらの正の治療応答のほかに、本発明の拮抗剤抗ＣＤ４０抗体含有液体医薬組成物による治療を受けている対象は疾患に関連する症状における改善の有利な作用を経験する場合がある。
【０１５６】
以下の実施例は説明のために提示しており、限定するものではない。
【実施例】
【０１５７】
ＣＨＩＲ−１２．１２はＣＨＯ細胞培養プロセスにより製造される完全ヒト化抗ＣＤ４０ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。分子は１５０ｋＤａの分子量を有し、分子構造はジスルフィド結合により共に連結された重鎖２つ及び軽鎖２つより成る。ＣＨＩＲ−１２．１２はヒトＣＤ４０細胞表面受容体タンパク質をターゲティングする。これは強力な拮抗剤であり、正常Ｂ細胞のインビトロのＣＤ４０リガンド媒介増殖を抑制、並びにＮＨＬ及びＣＬＬ患者由来の癌細胞のインビトロのＣＤ４０リガンド媒介増殖を抑制する。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体を発現するハイブリドーマ系統１５３．８Ｅ２．Ｄ１０．Ｄ６．１２．１２（ＣＭＣＣ＃１２０５６）は特許寄託番号ＰＴＡ−５５４３の下に２００３年９月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ２０１１０−２２０９（ＵＳＡ）］に寄託されている。
【０１５８】
理論に制約されないが、ＣＨＩＲ−１２．１２抗体は属性の独特の組み合わせを有する二重作用性の拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である。この完全ヒトモノクローナル抗体はＢ細胞の生存及び増殖のためのＣＤ４０Ｌ媒介ＣＤ４０シグナリング経路をブロックし；この亀甲作用は究極的には細胞死をもたらす。ＣＨＩＲ−１２．１２は又エフェクター細胞による認識及び結合を媒介し、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を開始させる。ＣＨＩＲ−１２．１２がエフェクター細胞に結合すると細胞溶解酵素が放出され、Ｂ細胞のアポトーシス及び溶解をもたらす。
【０１５９】
ＣＨＩＲ−１２．１２の生物学的活性及びそれを測定するために使用される試験に関するより詳細な説明に関しては、仮出願である表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００３年１１月４日、２００３年１１月２６日及び２００４年４月２７日のもの、及び、譲渡された各々の米国特許出願６０／５１７，３３７（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００１（０３５７８４／２５８４４２））、６０／５２５，５７９（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００２（０３５７８４／２７１５２５））、及び６０／５６５，７１０（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００３（０３５７８４／２７７２１４））、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７１５２（代理人案件番号ＰＰ２０１０７．００４（０３５７８４／２８２９１６））、同様に、表題「Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」、出願日２００４年１１月４日、ＷＯ２００５／０４４８５４として公開されたものを参照できる。同様に国際公開ＷＯ２００５／０４４３０４、ＷＯ２００５／０４４３０５、ＷＯ２００５／０４４３０６、ＷＯ２００５／０４４８５５、ＷＯ２００５／０４４３０７、及びＷＯ２００５／０４４２９４も参照でき；その内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。更に又、仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，２８５（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００２（０３５７８４／３０４３１２））、及び相当する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９４１４（代理人案件番号ＰＰ０２８０３５．０００３（０３５７８４／３１１６１１））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１４３として公開；及び仮出願である表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」、出願日２００５年１２月９日、及び譲渡された米国特許出願６０／７４９，３３６（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００２（０３５７８４／３０４３１１））、及び相当する国際特許出願（代理人案件番号ＰＰ０２８０６２．０００３（０３５７８４／３１１６０８））、出願日２００６年５月１８日、ＷＯ２００６／１２５１１７として公開されたものに記載された試験も参照でき；これらの各々の内容は参照として全てが本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
ＣＨＩＲ−１２．１２の主要な臨床適用は、Ｂ細胞関連悪性疾患、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及びＣＤ４０発現細胞に関連する自己免疫及び／又は炎症性の疾患の治療である。臨床治験用のＣＨＩＲ−１２．１２薬品は液体製剤中２０ｍｇ／ｍＬＣＨＩＲ−１２．１２抗体において製剤される。以下の試験は最適な緩衝液、等張性付与剤、及び液体製剤中の抗体を安定化させるための種々の賦形剤を決定するために実施した。
【０１６１】
実施例１：ＣＨＩＲ−１２．１２の安定化に対する種々の緩衝物質種及びメチオニンの作用
溶液の条件（例えばｐＨ、緩衝物質種、及びイオン強度）及び賦形剤（例えば界面活性剤及び安定化剤）は液体製剤中のタンパク質の安定性のための重要な要因である。ＣＨＩＲ−１２．１２の物理化学的安定性はｐＨ５．５において最適となる。しかしながらＣＨＩＲ−１２．１２タンパク質は望ましくない溶液条件下では凝集形成及びフラグメント化を介して分解する場合があり；更に又、特に過酸化物の夾雑物及び／又はＴｗｅｅｎのような生原料賦形剤と共に導入される金属の痕跡量の存在下において、酸化する場合もある。以下の実験は最適ｐＨ５．５において製剤した場合に、凝集形成、フラグメント化及び酸化に対抗してＣＨＩＲ−１２．１２を安定化させるための最良の鑑賞物質種及び適切な賦形剤を発見するために実施した。
【０１６２】
材料
試験のためのＣＨＩＲ−１２．１２薬品物質（ＤＳ）ロットはＣＨＯ誘導精製バルクのロット＃ＣＤ０２１１０５Ａ及びロット＃ＰＤ０１０７０５Ａであった。ＤＳロットはＸｏｍａ，Ｌｔｄ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）において製造された。本試験のための製剤試料は該当する緩衝溶液に対するＤＳの透析とその後のＴｗｅｅｎ所望量の強制添加により調製した。全試料中のＣＨＩＲ−１２．１２タンパク質の濃度は約２０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１６３】
分析方法
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣ−ＨＰＬＣは分子量が低下する順序で分子を分離する。その結果、ＣＨＩＲ−１２．１２凝集体はＨＰＬＣカラムから溶出する最初のものであり、その後、単量体が続き最後にフラグメントが溶出する。ＣＨＩＲ−１２．１２の純度、凝集及びフラグメント化は、０．７ｍＬ／分の流量において移動相として５０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いながらＴｏｓｏｈａａｓＴＳＫ−ＧＥＬ３０００ＳＷＸ１カラムを有するＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＨＰＬＣにより分析した。
【０１６４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＣＨＩＲ−１２．１２の酸化はＷａｔｅｒＡｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを用いながらＴｏｓｈｏＴＳＫゲルブチル−ＮＰＲカラム、移動相Ａとしての２Ｍ硫酸アンモニウム／２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．０、及び移動相Ｂとしての２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．０を用いて流量１．０ｍｌ／分で測定した。ＣＨＩＲ−１２．１２抗体をパパインで消化することによりＦａｂおよびＦｃフラグメントが生じる。ＣＨＩＲ−１２．１２の酸化生成物は酸化Ｆｃフラグメント（ｍｅｔＳＯ）であり、これはＨＰＬＣカラムから主要なＦａｂ物質種と主要なＦｃ物質種の間に溶出する前Ｆｃ物質種である。
【０１６５】
実験及び結果
凝集及びフラグメント化に対するクエン酸塩緩衝液の安定化作用
ＤＳロット＃ＰＤ０１０７０５Ａに由来するＣＨＩＲ−１２．１２を１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０及びｐＨ５．５において、１０ｍＭのクエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、又はリン酸塩の緩衝溶液中２０ｍｇ／ｍｌで製剤した。製剤試料は３ｃｃのガラスバイアル内に１．２ｍｌ溶液として充填し、５℃、２５℃および４０℃において保存した。ＣＨＩＲ−１２．１２安定性試料はＳＥＣ試験により所定の時点において分析した。
【０１６６】
図１〜３は２５℃で保存した試料における、それぞれ純度、凝集体及びフラグメントに関するＳＥＣ分析を示す。図４〜６は４０℃で保存した試料における、それぞれ純度、凝集体及びフラグメントに関するＳＥＣ分析をまとめたものである。すべてのけｋｋはクエン酸塩系の製剤試料が試験した４製剤のうちで最も高い純度及び最も低い凝集及びフラグメント化のレベルを維持していたことを示している。５か月を通じて５℃で保存した試料については殆ど変化が観察されなかったが（データ示さず）、加速ＳＥＣデータは、クエン酸塩緩衝液が他の３つの一般的に使用されている緩衝物質種よりも凝集及びフラグメント化に対抗してＣＨＩＲ−１２．１２の長期リアルタイム安定性を改善する場合に優秀であると考えられることを予測している。
【０１６７】
ＣＨＩＲ−１２．１２に対するクエン酸塩緩衝液の酸化抑制作用
ＣＨＩＲ−１２．１２安定性試料を０．１％及び０．２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を用いながらクエン酸塩、酢酸塩及びコハク酸塩中に調製した。試料を５℃、２５℃および４０℃において保存し、所定の時点において酸化に関して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により分析した。ＣＨＩＲ−１２．１２の酸化生物はＰｒｅＦｃピーク物質種の合計のパーセント、すなわちＰｒｅ−Ｆｃ％として測定した。表１に示す結果はクエン酸塩系の製材がコハク酸塩及び酢酸塩の緩衝製剤よりも少ない酸化生成物を形成し、クエン酸塩緩衝液がＣＨＩＲ−１２．１２の酸化を最小限としたことを示している。これらの結果は、クエン酸が恐らくはキレート形成剤として作用することによりＣＨＩＲ−１２．１２タンパク質の微量金属誘導酸化を抑制したことを示唆している。
【０１６８】
ＳＥＣ及びＨＩＣ分析は凝集及びフラグメント化からＣＨＩＲ−１２．１２を保護する場合にコハク酸塩、酢酸塩及びリン酸塩緩衝物質種よりもクエン酸塩緩衝液が優れていることを示している。クエン酸塩緩衝液は又ＣＨＩＲ−１２．１２タンパク質の酸化を最小限にすることから、コハク酸塩及び酢酸塩の緩衝液よりも優れている。
【０１６９】
表１  ＨＩＣ試験により測定した場合のＣＨＩＲ−１２．１２（２０ｍｇ／ｍｌ）の酸化に対する緩衝物質種の作用
【０１７０】
【表１】
2009534401.tif 000003
Ｎ／Ｄ：測定せず。
【０１７１】
ＣＨＩＲ−１２．１２に対するＬ−メチオニンの酸化抑制作用
ＤＳロット＃ＣＤ０１０７０５Ａを１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０又はＴｗｅｅｎ２０、並びに種々の量（０〜５ｍＭ）のＬ−メチオニン中、２０ｍｇ／ｍｌに製剤した。製剤試料は３ｃｃのガラスバイアル内に２．５ｍｌを充填し、４０℃において保存した。表２は初期及び４０℃３か月における試料に関するＨＩＣ結果を示す。初期においては全製剤中のＣＨＩＲ−１２．１２の酸化は元のバルク薬品物質（ＤＳ）ロット＃ＣＤ０１０７０５Ａと同等であった。Ｌ−メチオニンを含有しない製剤における酸化のレベルは４０℃３か月では倍加を超過していた。しかしながらＬ−メチオニンを含有する製剤における酸化のレベルは４０℃における３か月の保存中を通して殆ど変化していなかった。
【０１７２】
結果は５ｍＭのＬ−メチオニンが高ストレス保存条件下のＣＨＩＲ−１２．１２の酸化の防止において有効かつ十分であることを示している。ＣＨＩＲ−１２．１２に対するＬ−メチオニンの酸化抑制作用はＬｙｃ−ペプチドマップにより確認した。
【０１７３】
表２  ＣＨＩＲ−１２．１２の酸化に対するＬ−メチオニンの抑制作用
【０１７４】
【表２】
2009534401.tif 000004
Ｎ／Ｄ：測定せず。
【０１７５】
総括すれば、クエン酸塩緩衝液はＣＨＩＲ−１２．１２の凝集、フラグメント化及び酸化最小限とし、これによりＣＨＩＲ−１２．１２液体製剤のための最適な緩衝液となっている。Ｌ−メチオニンはＣＨＩＲ−１２．１２の酸化を効果的に抑制し、５ｍＭのＬ−メチオニンが好ましい。
【０１７６】
実施例２：ＣＨＩＲ−１２．１２に対する塩酸アルギニンの安定化作用
以下の試験は静脈内注入を介した投与を意図した液体医薬組成物として製剤されたＣＨＩＲ−１２．１２の長期保存安定性のために張力付与剤および安定化剤を選択することを目的とした。タンパク質の非経腸製品に対してはＮａＣｌが最も一般的に使用されている張力付与剤であるが、抗体治療薬に対しては最適な安定化作用を有していない。本試験は水性製剤中のＣＨＩＲ−１２．１２に対する塩化ナトリウム及びアルギニンの酸性形態（塩酸アルギニン）の比較対照させた安定化作用に関して報告する。
【０１７７】
ＣＨＩＲ−１２．１２バルク抗体薬品物質をＣＨＩＲ−１２．１２液体製剤に対して２９５ｍＯｓｍ／ｋｇの目標浸透圧重量モル濃度を達成するために１５０ｍＭＮａＣｌ又は１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニンのいずれかを用いながらクエン酸塩緩衝液中ｐＨ５．５において製剤した。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びカチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いてＣＨＩＲ−１２．１２抗体の生物物理的及び／又は生物化学的な安定性を評価した。試験は１５０ｍＭの塩酸Ｌ−アルギニンがＣＨＩＲ−１２．１２水性製剤に等張性を付与するのみならず、凝集、フラグメント化及び脱アミド化に対抗してＣＨＩＲ−１２．１２の立体構造的安定性を増大させることを示した。塩酸Ｌ−アルギニンは加速安定性試験条件下においてＮａＣｌよりも優れていることが証明された。更に又、加速安定性データはＣＨＩＲ−１２．１２塩酸Ｌ−アルギニン製剤に関してより長期のシェルフライフを予測させている。
【０１７８】
材料
本試験のために使用したＣＨＩＲ−１２．１２薬品物質（ＤＳ）はＣＨＯ誘導精製バルクのロット＃ＣＤ０２１１０５Ａであった。ＤＳロットはＸｏｍａ  Ｌｔｄ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）において製造された。
【０１７９】
ＤＳロット由来のＣＨＩＲ−１２．１２を以下の製剤において使用した。
製剤１：２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及びｐＨ５．５
製剤２：２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニン、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及びｐＨ５．５
分析方法
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＣＨＩＲ−１２．１２製剤試料の立体構造的安定性は、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ−ＤＳＣを用いながら、１℃／分で１５℃〜９０℃に加熱することにより評価した。
【０１８０】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
ＣＨＩＲ−１２．１２の純度、凝集、及びフラグメント化は、０．７ｍＬ／分の流量において移動相として５０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いながらＴｏｓｏｈａａｓＴＳＫ−ＧＥＬ３０００ＳＷＸＬカラムを有するＷａｔｅｒｓ  ＡｌｌｉａｎｃｅＨＰＬＣにより分析した。
【０１８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元及び還元）
ＣＨＩＲ−１２．１２の純度もまた非還元及び還元条件下において１２％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを用いながら評価した。タンパク質はクーマシーブルー染色により検出した。
【０１８２】
カチオン交換ＨＰＬＣ（ＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ）
ＣＨＩＲ−１２．１２の電荷変化関連脱アミド化は、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏｐａｃＷＣＸ−１０カラムを有するＷａｔｅｒＡｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム、移動相Ａとしての５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３及び移動相Ｂとしての５００ｍＭＮａＣｌ含有５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３を用いながら、０．８ｍｌ／分の流量で測定した。
【０１８３】
以下に後述する結果のセクションにおいて言及する図面における略記に対する略語一覧を示す。
コハク酸塩、ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗ８０＝１０ｍＭコハク酸ナトリウム／コハク酸緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０，ｐＨ５．５
クエン酸塩、ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗ８０＝１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０，ｐＨ５．５
酢酸塩、ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗ８０＝１０ｍＭ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０，ｐＨ５．５
リン酸塩、ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗ８０＝１０ｍＭ２塩基性リン酸ナトリウム／１塩基性リン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０，ｐＨ５．５
クエン酸塩、Ａｒｇ，０．１％Ｔｗ８０＝１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤、１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニン、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０，ｐＨ５．５
結果
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
図７は上記「材料」のセクションにおいて記載した２種の製剤中のＣＨＩＲ−１２．１２のＤＳＣセオグラムを示す。ＣＨＩＲ−１２．１２の熱的展開（ｔｈｅｒｍａｌ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）は少なくとも２つの熱遷移を呈し、恐らくはそれぞれＦａｂ及びＦｃドメインの展開／融解を示していると考えられる。より高温においては、タンパク質はおそらくは凝集し、ＤＳＣシグナルの損失をもたらす。本試験においては、最低の熱遷移温度は融解温度Ｔｍとして定義した。塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤はＮａＣｌ含有製剤よりも高値のＴｍを呈し、塩酸Ｌ−アルギニンがＮａＣｌを用いた場合よりも高い立体構造的安定性を有するＣＨＩＲ−１２．１２を与えることが示唆された。
【０１８４】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
６か月まで５℃でインキュベートしたのち、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによれば塩酸Ｌ−アルギニン及びＮａＣｌ含有製剤中ではタンパク質の凝集体およびフラグメントの量は無視できる程度であり（＜０．５％）、２種の製剤の間には安定性にほとんど差がなかった（データ示さず）。加速保存条件下、即ち２５℃６か月においては、塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤は図８に示す通りより高値のパーセントの単量体を含有していた。単量体に費やされたため、凝集体およびフラグメントの含量は両方とも保存時間とともに緩徐に増大した。しかしながら、塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤が発生した凝集体及びフラグメンはそれぞれ図９及び１０に示す通りＮａＣｌ含有製剤よりも少量であった。同様に、４０℃で保存した場合、塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤はそれぞれ図１１、１２及び１３に示す通り、ＮａＣｌ含有製剤の場合よりも高値のパーセントの単量体及び低値のパーセントの凝集体及びフラグメントを示していた。４０℃４カ月保存により、塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤では残存単量体９１．８％、凝集体１．７％、及びフラグメント６．５％であったのに対し、ＮａＣｌ含有製剤の場合は、単量体８７．９％、凝集体２．２％、及びフラグメント９．９％であった。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果は塩酸Ｌ−アルギニンはＮａＣｌと比較して、ＣＨＩＲ−１２．１２タンパク質の安定性を向上させることを示している。
【０１８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元及び還元）
表３は非還元（ＮＲ）及び還元（Ｒ）条件下に分析した塩酸Ｌ−アルギニン及びＮａＣｌ含有製剤に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ＣＨＩＲ−１２．１２の純度は非還元条件下の主要バンドのパーセントとして、又は、還元条件下の重鎖及び軽鎖の合計のパーセントとして測定した。ゼロ時を除き、塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤は非還元及び還元条件下の両方においてＮａＣｌ含有製剤の場合よりも高値の純度を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの観察結果はＮａＣｌよりも塩酸Ｌ−アルギニンがＣＨＩＲ−１２．１２の安定性を増大させたＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果と合致していた。
【０１８６】
表３  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による塩酸Ｌ−アルギニンとＮａＣｌの比較
【０１８７】
【表３】
2009534401.tif 000005
ＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析
ＣＩＥＸ−ＨＰＬＣは酸性の変異体が主要ピーク物質種の前に溶出し、、塩基性の変異体が主要ピーク物質種の後に溶出するように電荷に基づいて分子を分離する。ＣＨＩＲ−１２．１２の純度及びその脱アミド化産物の含有量をそれぞれ主要ピークのパーセント及び酸性変異体のパーセントとして測定した。
【０１８８】
図１４、１５及び１６はそれぞれ、２種の製剤中の純度、脱アミド化産物の含有量、及び塩基性変異体の含有量を示す。ゼロ時においては、２種の製材は純度６８．６％及び脱アミド化産物１５．５％並びに塩基性変異体１５．９％を有していた。２５℃で保存した場合、塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤はＮａＣｌ含有製剤よりも高値の純度及び高値の塩基性変異体含有量を有しており、低いパーセントの脱アミド化産物を示した。２５℃６カ月保存時には、塩酸Ｌ−アルギニン含有製剤は純度４７．３％、塩基性変異体１２．５％、及び生成した脱アミド化産物４０．０％を有していたのに対し、ＮａＣｌ含有製剤は純度４５．６％、塩基性変異体１１．７％、及び脱アミド化産物４２．７％を有していた。塩酸Ｌ−アルギニン及びＮａＣｌ含有製剤は５℃で６カ月保存中を通じてほとんど変化を示さなかったが、加速保存条件（２５℃）下のＣＩＥＸ−ＨＰＬＣの結果は、塩酸Ｌ−アルギニンが脱アミド化に対抗してＣＨＩＲ−１２．１２の長期リアルタイム安定性を改善する場合にＮａＣｌよりも優秀であると考えられることを予測している。
【０１８９】
総括すれば、本試験は１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニンがＣＨＩＲ−１２．１２液体製剤に等張性を付与するのみならず、凝集、フラグメント化及び脱アミド化に対抗してＣＨＩＲ−１２．１２の立体構造的安定性を増大させることを示している。塩酸Ｌ−アルギニンは加速安定性試験条件下においてＮａＣｌよりも優れており、、加速安定性データはＣＨＩＲ−１２．１２塩酸Ｌ−アルギニン製剤に関してより長期のシェルフライフを予測させている。
【０１９０】
実施例３：凍結保存由来のＣＨＩＲ−１２．１２バルク薬品物質の凝集を最小限とする場合のＴｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ２０の作用
ＣＨＩＲ−１２．１２バルク薬品物質の凍結保存は幾つかの理由、例えば向上した製品の安定性及びシェルフライフ、低下した微生物生育、並びに輸送中の発泡の排除などのために、液体保存よりも好ましい。しかしながら凍結及びその後の解凍は、氷／液体の界面及び溶液の濃度勾配をもたらすことにより、タンパク質溶液にストレスをもたらす場合がある。ストレスはタンパク質を変成させ、凝集、及び悪い例においては目視可能な粒子又は沈殿物の形成をもたらす場合がある。タンパク質の凝集体は低減した薬剤の力価及び増大した免疫原性を伴う場合が多いため、タンパク質製剤の成分及び凍結解凍条件を最適化することにより凝集を最小限とすることは極めて重要である。
【０１９１】
製剤賦形剤、例えば糖類、多価アルコール、アミノ酸、及び界面活性剤は恐らくはタンパク質及び抗体を凝集に対抗して安定化させることができる。１つのモノクローナル抗体試験において、数種の一般的に使用されている糖類、多価アルコール、及びアミノ酸が凍結解凍誘発性の凝集体形成の低減において界面活性剤よりも有効であることが分かっている。しかしながら、ＣＨＩＲ−１２．１２を用いた早期の試験は糖類（例えばトレハロース）、多価アルコール（例えばソルビトール）、又はアミノ酸（例えばグリシン）を単独で使用した場合には凍結及び解凍の間のＣＨＩＲ−１２．１２の凝集を有意に低減できなかったことを示している。
【０１９２】
本試験は凍結及び解凍の間のＣＨＩＲ−１２．１２の凝集を最小限とするための製剤方法に着目している。この態様において、ＣＨＩＲ−１２．１２の凍結解凍誘導性の凝集を最小限にするために種々の界面活性剤を評価した。実際に凍結されているＣＨＩＲ−１２．１２薬品物質が本試験で評価するように多数回の凍結解凍のサイクル反復を経験することは考えにくいが、広範な凍結解凍ストレス試験は、長期の保存及び輸送の間に偶発的に多数回の凍結及び解凍が起こったとした場合に、製剤バルク薬品が凝集する潜在的可能性を予測するために使用される最悪事例のシナリオの評価となる。
【０１９３】
材料
ＣＨＩＲ−１２．１２バルクＤＳロット＃ＵＡ７８７０、＃ＴＣ２３−２、＃ＵＢ１２９１、＃ＰＤ０１０７０５Ａ、及び＃ＣＤ０８３００５Ａを本試験のために使用した。Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｒｉｊ３５、及びプルロニックＦ６８はそれぞれ、Ｓｉｇｍａ、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ及びＭｅｄｉａＴｅｃｈＣｅｌｌｇｒｏより購入した。ＣＨＩＲ−１２．１２薬品物質の凍結保存用のポリカーボネート（ＰＣ）ビンはＮａｌｇｅｎｅから購入した。
【０１９４】
方法
対照試料を除いて、全ての他の試料は−２０℃及び−６０℃における完全凍結とその後の多数サイクル反復する周囲温度における完全解凍に付した。
【０１９５】
これらの分析方法は単量体から目視可能な凝集体までの範囲のＣＨＩＲ−１２．１２タンパク質を検出するために使用した。目視による観察は目視可能な粒子を検出するためのＴｙｎｄａｌライト（Ｍ．Ｗ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の下で実施した。液体粒子計数システム（ＨＩＡＣ／Ｒｏｙｃｏ）を用いて≧１０μｍおよび≧２５μｍの目視可能に至らない凝集体を計数した。動的光散乱分析器（ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏＳｅｒｉｅｓ）を用いて単量体及び凝集体の流体力学的直径及び粒径分布を測定した。
【０１９６】
目視可能な粒子の評価
凍結解凍試験のための試料はＣＨＩＲ−１２．１２薬品物質ロット＃ＵＡ７８７０及び＃ＴＣ２３−２から作成した。全試料は１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、及びｐＨ５．５の緩衝溶液中、透析とその後の種々のパーセント（０〜０．５％ｗ／ｖ）の以下のノニオン系界面活性剤、即ちＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｒｉｊ３５、及びプルロニックＦ６８の１つを添加することにより製剤した。２．５ｍｌの各試料をガラスバイアル中に充填し、−６０℃で一夜凍結し、最大８サイクルまで周囲温度において完全解凍した。初期（ゼロ時）及び各凍結解凍サイクル後の試料を透明性及び目視可能な沈殿／凝集体に関して目視的に検査した。
【０１９７】
目視可能に至らない粒子の計数
ＣＨＩＲ−１２．１２薬剤物質ロット＃ＵＢ１２９１及び＃ＰＤ０１０７０５Ａを溶液（２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中に製剤し、その後０〜０．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０又はＴｗｅｅｎ２０を添加した。製剤試料２０ｍｌの小分量ずつを１２５ｃｃのポリカーボネートのビンに充填し、−６０℃凍結及び周囲温度解凍に付した。凍結解凍５サイクルの後、ＨＩＡＣ−Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数システムを用いて≧１０μｍ及び≧２５μｍの目視可能に至らない凝集体に関して試料を測定した。
【０１９８】
動的光散乱分析
５サイクルの凍結解凍の前後において、製剤（２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニン、５ｍＭＬ−メチオニン、０〜０．２％Ｔｗｅｅｎ２０及びｐＨ５．５）を動的光散乱分析器を用いて凝集体に関して評価した。
【０１９９】
動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトル分析器はストークス−アインシュタインの方程式及び粒子が球形であるという仮定を用いながら、粒子の拡散係数測定値から単量体及び凝集体を包含する粒子の流体力学的直径を計算する。凝集体物質種の数および多分散性もまたＤＬＳ試験から求められる。
【０２００】
結果
目視可能な粒子の評価
表４は目視による観察の結果を総括したものである。凍結解凍サイクルを開始する前であるゼロ時において、試料は全て僅かに不透明であるが目視可能な凝集体／沈殿は含有していなかった。１回の凍結解凍サイクルの後、界面活性剤無添加の製剤全てにおいて、Ｔｗｅｅｎ８０を０〜０．０５％（ｗ／ｖ）含有する製剤において、及び０〜０．１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ３５を含有する製剤において、並びに０〜０．５％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ６８を含有する試料において、数個の目視可能な凝集体／沈殿が形成していた。０．０％〜０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する試料には凍結解凍８サイクル全体に渡って如何なる凝集体及び沈殿も観察されなかった。このことは、Ｔｗｅｅｎ２０は多数回の凍結解凍サイクルに起因する大型の不溶性凝集体の形成を防止することにおいてＴｗｅｅｎ８０よりも有効であることを示唆している。Ｂｒｉｊ３５及びプルロニックＦ６８はＴｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ２０よりもはるかに低有効性であった。
【０２０１】
表４  界面活性剤の種々の濃度を用いた場合のクエン酸塩緩衝製剤におけるＣＨＩＲ−１２．１２の目視的外観
【０２０２】
【表４】
2009534401.tif 000006
注：ＸＦＴ＝凍結解凍サイクル数；ＳＯ＝僅かに不透明；ｐｐｔ＝沈澱／凝集体。
【０２０３】
目視可能に至らない粒子の計数
表５は種々の濃度のＴｗｅｅｎ８０を含有するクエン酸塩／クエン酸緩衝製剤のｍｌ当たりの目視可能に至らない凝集体の計数値を示す。Ｔｗｅｅｎ８０濃度の上昇に伴って目視可能に至らない粒子の計数値の低下傾向が観察され、目視可能に至らない粒子の計数の低下はＴｗｅｅｎ８０が０．１％（ｗ／ｖ）を超えている場合に顕著さが低下し、Ｔｗｅｅｎ８０の使用に関する適切な濃度は０．１〜０．２％（ｗ／ｖ）であることが示唆された。
【０２０４】
表５  ２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び種々の濃度（０〜０．２％）のＴｗｅｅｎ８０をｐＨ５．５で含有する製剤における目視可能に至らない粒子の計数
【０２０５】
【表５】
2009534401.tif 000007
表６は種々の濃度のＴｗｅｅｎ２０含有又は非含有のクエン酸塩／クエン酸緩衝製剤のｍｌ当たりの目視可能に至らない凝集体の計数値を示す。製剤中のＴｗｅｅｎ２０添加により凝集体計数は大きく低減した。Ｔｗｅｅｎ２０が０．０５％（ｗ／ｖ）以上になった時点で、目視可能に至らない凝集体の計数値の低下はほぼ平衡状態に達し、Ｔｗｅｅｎ２０の適切な濃度は約０．０５〜０．２％（ｗ／ｖ）であることが示唆された。
【０２０６】
表６  ２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び種々の濃度（０〜０．２％）のＴｗｅｅｎ２０をｐＨ５．５で含有する製剤における目視可能に至らない粒子の計数
【０２０７】
【表６】
2009534401.tif 000008
更に又、表５及び表６はＴｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ２０含有製剤の両方において≧２５μｍの凝集体の形成は殆ど無く、Ｔｗｅｅｎ２０含有製剤ではＴｗｅｅｎ８０含有製剤の場合よりも≧１０μｍ凝集体が少数であることが５サイクルの凍結解凍後に観察されたことを示している。結果はＣＨＩＲ−１２．１２クエン酸塩／クエン酸緩衝製剤における目視可能に至らない凝集体の形成を最小限とすることにおいてはＴｗｅｅｎ２０がＴｗｅｅｎ８０より効果的であることを示している。
【０２０８】
表４，５及び６における結果に基づけば、ＣＨＩＲ−１２．１２製剤における凝集体の形成を最小限にするためにはＴｗｅｅｎ２０がＴｗｅｅｎ８０より好ましい賦形剤となる。従って、な試験を実施することによりＣＨＩＲ−１２．１２製剤における凝集体の形成を防止するために必要なＴ２０の濃度を最適にするために追加的な試験を実施した。製剤（２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニン、５ｍＭＬ−メチオニン、０〜０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５）をＣＨＩＲ−１２．１２薬品物質ロット＃ＣＤ０８３００５Ａから調製した。２０ｍｌの製剤試料を１２５ｃｃのポリカーボネートのビンに充填し、−２０℃凍結及び周囲温度解凍に付した。凍結解凍５サイクルの前後において、ＨＩＡＣ−Ｒｏｙｃｏ液体粒子計数器を目視可能に至らない粒子の計数値について製剤試料を測定した。結果を表７に総括する。
【０２０９】
表７  ２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニン、５ｍＭＬ−メチオニン、０〜０．２％Ｔｗｅｅｎ２０をｐＨ５．５で含有する製剤における目視可能に至らない粒子の計数
【０２１０】
【表７】
2009534401.tif 000009
注：ＸＦＴ＝凍結解凍サイクル数。
【０２１１】
凍結解凍５サイクルの後、塩酸Ｌ−アルギニン及びＬ−メチオニンを含有する試料は塩酸Ｌ−アルギニン及びＬ−メチオニンを含有しない製剤よりもはるかに少数の凝集体を形成し、即ち、１６９粒子／ｍｌ≧１０μｍであったのに対し、Ｔｗｅｅｎ２０非存在下においては１４３９又は１６７１粒子／ｍｌ≧１０μｍであった（表６及び７参照）。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ２０を導入するまでは、塩酸Ｌ−アルギニン及びＬ−メチオニンは凍結解凍誘導凝集体を最低レベルまで有意に低下させることはなかった。このことは塩酸Ｌ−アルギニン及びＬ−メチオニンはＣＨＩＲ−１２．１２の凍結解凍誘導凝集を最小限とするためには十分効果的ではないことを示唆している。
【０２１２】
表５〜７に総括したデータから、０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する凍結解凍試料の目視可能に至らない凝集体の計数値は凍結解凍サイクル実施前の対応する試料と同等であり続けた。このことは塩酸Ｌ−アルギニン及びＬ−メチオニンと組み合わせてＴｗｅｅｎ２０を含有する製剤は最小限の目視可能に至らない凝集体を形成したことを示している。即ち、Ｔｗｅｅｎ２０は凍結及び解凍の間の目視可能に至らない凝集体の形成からＣＨＩＲ−１２．１２を効果的に回避させる製剤中の賦形剤である。Ｔｗｅｅｎ２０の有効濃度は０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）であると決定された。
【０２１３】
動的光散乱分析
表８はＣＨＩＲ−１２．１２の粒子の平均の流体力学的直径、多分散性及び単量体物質種のパーセント強度を示す。動的光散乱分析は単量体物質種の１００％強度で示されるとおり、凍結解凍の５サイクルの前後における全試料において唯一の単量体物質種のみを検出している。このことは全試料が主に単量体よりなるものであったことを示唆している。凍結乾燥試験５サイクルの後、流体力学的直径及び多分散性の増大により示される通り、Ｔｗｅｅｎ２０を含有しない、０．００５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する試料中では、数個の凝集体（恐らくは２量体又は３量体）が単量体と共存していると考えられる。０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する試料は流体力学的直径及び多分散性の値の変化を殆ど示しておらず、それらがそれほど凝集体形成をすることなく単量体の以前のレベルであり続けたことを示している。
【０２１４】
表８  ２０ｍｇ／ｍｌＣＨＩＲ−１２．１２、１０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、１５０ｍＭ塩酸Ｌ−アルギニン、５ｍＭＬ−メチオニン、及び種々の濃度（０〜０．２％）のＴｗｅｅｎ２０をｐＨ５．５で含有する製剤における凍結解凍５サイクルの前後のＣＨＩＲ−１２．１２の動的光散乱分析
【０２１５】
【表８】
2009534401.tif 000010
注：ＦＴ＝凍結解凍；ＸＦＴ＝凍結解凍サイクル数。
【０２１６】
目視による観察、目視可能に至らない粒子の計数値、及び動的光散乱分析に基づけば、凍結解凍誘導性の凝集体の形成からＣＨＩＲ−１２．１２を回避させるためのＴｗｅｅｎ２０の最適濃度は０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）であると決定された。
【０２１７】
総括すれば、Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０の両方とも凍結及び解凍の間のＣＨＩＲ−１２．１２の凝集を最小限とすることが分かった。Ｔｗｅｅｎ２０及びＴｗｅｅｎ８０の最適濃度はそれぞれ０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）及び０．１〜０．２（ｗ／ｖ）％であった。Ｔｗｅｅｎ２０が及びＴｗｅｅｎ８０よりも有効であった点は、より低濃度のＴｗｅｅｎ２０が凝集体形成の数及び程度をより低いレベルまで低減した点である。本試験は好ましくは塩酸Ｌ−アルギニン及びＬ−メチオニンと組み合わせたＴｗｅｅｎの最適濃度の添加が有意な凝集を伴うことなく−２０℃以下においてクエン酸塩／クエン酸緩衝ＣＨＩＲ−１２．１２バルク薬品物質の保存を可能にすることを示している。
【０２１８】
実施例4:抗ＣＤ40抗体の拮抗剤活性に関する試験
抗ＣＤ４０抗体の拮抗剤活性を評価するために以下の試験を使用することができる。これらの試験のためのヒトＢ細胞は例えば本質的にＤｅ  Ｇｒｏｏｔ等（１９９０）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９０）９：３２１に記載されている通り、扁桃腺切除術を受けた個体から得られた扁桃腺から単離することにより得ることができる。慨すれば、組織をメスの刃を用いて分散させ、貪食細胞及びＮＫ細胞を５ｍＭＬ−ロイシンメチルエステル処理により枯渇させ、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウムで処理したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）とのロゼット形成１サイクルによりＴ細胞を除去する。得られたＢリンパ球プレパレーションの純度は抗（ＣＤ２０）ｍＡｂＢ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｌｏｎｅ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＡ）又は抗（ＣＤ３）ｍＡｂＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）及びウサギ抗（マウスＩｇ）のＦＩＴＣ共役Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いた間接的免疫蛍光標識及びＦＡＣＳ分析により確認できる。
【０２１９】
Ｂ細胞増殖試験
Ｂ細胞（ウェル当たり４ｘ１０４）を平底９６穴マイクロプレート中１０％うし胎児血清を添加した２００μｌのＩＭＤＭ中で培養する。固定化抗（ＩｇＭ）抗体（イムノビーズ；５μｇ／ｍｌ；ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を添加することによりＢ細胞を刺激する。所望により１００Ｕ／ｍｌの組み換えＩＬ−２を添加する。種々の濃度の被験モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をマイクロ培養物発生時に添加し、第３日に１８時間パルス処理後の（３Ｈ）チミジンの取り込みの測定により増殖を評価する。
【０２２０】
拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は固定化された抗ＩｇＭの存在下、又は固定化された抗ＩｇＭ及びＩＬ−２の存在下においてヒトＢ細胞増殖を有意に同時刺激しない。
【０２２１】
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖試験
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７０に記載されたものと類似の培養系においてＢ細胞増殖を刺激する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の能力に関して試験するために、ヒトＦｃγＲＩＩのＨＲ対立遺伝子型を発現するマウス３Ｔ６トランスフェクション体を使用する。Ｂ細胞（ウェル当たり２ｘ１０４）を１０％ウシ胎児血清及び１００Ｕ／ｍｌ組み換えＩＬ−４を添加した２００μｌのＩＭＥＭ中、１ｘ１０４のトランスフェクション体細胞（５０００Ｒａｄで照射）の存在下に平底マイクロウェル中で培養する。Ｂ細胞添加の前に、３Ｔ６細胞を少なくとも５時間培養プラスチックに接着させる。抗ＣＤ４０ｍＡｂを１５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの種々の濃度で添加し、Ｂ細胞の増殖を第７日に［３Ｈ］チミジンによる１８時間パルス処理後のチミジン取り込みの測定により評価する。
【０２２２】
拮抗剤抗ＣＤ４０ｍＡｂを用いたＳ２Ｃ６刺激Ｂ細胞増殖の抑制
拮抗剤抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はまた上記したＢ細胞増殖試験を用いながらＳ２Ｃ６（正常Ｂ細胞の増殖のＣＤ４０刺激のアゴニストとも報告されているＳＧＮ−１４としても知られている；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２２５−３２３１）のような抗ＣＤ４０抗体によるＢ細胞増殖の刺激を抑制するそれらの能力により特性化することもできる。ヒト扁桃腺Ｂ細胞（４ｘ１０４）をセファロースビーズにカップリングさせた抗ＩｇＭ（５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ４０ｍＡｂＳ２Ｃ６（１．２５μｇ／ｍｌ）の存在下にマイクロウェル中２００μｌ中で培養する。種々の濃度の目的の抗ＣＤ４０を添加し、［３Ｈ］チミジン取り込みを３日後に試験する。対照として抗（グルコセレブロシダーゼ）ｍＡｂ８Ｅ４を同濃度において添加できる。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４：５８５。拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は例えば少なくとも７５％以上ｍＡｂＳ２Ｃ６による抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖の同時刺激を抑制できる（即ち、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体存在下のＳ２Ｃ６刺激増殖は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体非存在下に観察されるものの２５％以下である）。これとは対照的に、β−グルコセレブロシダーゼに対して指向された非関連のｍＡｂ８Ｅ４の等量を用いた場合には有意な抑制は観察されない。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄ等、上出。このような結果は、抗ＣＤ４０ｍＡｂはヒトＢ細胞の増殖のための刺激シグナルは送達しないが、逆に、別のｍＡｂでＣＤ４０をトリガーすることにより生じる刺激シグナルを抑制することができることを示している。
【０２２３】
ＥＬ４Ｂ５細胞を用いたＢ細胞活性化試験
Ｚｕｂｌｅｒ等（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３４：３６６２の観察によれば、ＥＬ４Ｂ５として知られているマウス胸腺腫ＥＬ−４系統の突然変異体サブクローンは、ネズミ及びヒトの両方の起源のＢ細胞が増殖して免疫グロブリン分泌プラズマ細胞に分化することをインビトロで強力に刺激することができる。この活性化は、抗原非依存性であり、ＭＨＣ制限性ではないことがわかっている。ヒトＢ細胞の最適な刺激のためには、活性化ヒトＴ細胞由来の上澄みの存在が必要であったが、Ｂ細胞応答は又ＥＬ４Ｂ５細胞をホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）又はＩＬ−１で予備活性化した場合にも起こっている。Ｚｕｂｌｅｒ等（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９９：２８１；及びＺｈａｎｇ等（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：２９５５。この培養系におけるＢ細胞活性化は効率的であり、限界希釈法による実験ではヒトＢ細胞の大多数が活性化されて増殖し、抗体分泌細胞に分化した。Ｗｅｎ等（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７。
【０２２４】
Ｂ細胞（ウェル当たり１００）を１０％熱不活性化ウシ胎児血清、５ｎｇ／ｍｌホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ）及び５％ヒトＴ細胞上澄みを添加した２００μｌのＩＭＤＭ中、平底マイクロウェル中で照射（５０００Ｒａｄ）ＥＬ４Ｂ５細胞（ウェル当たり５ｘ１０４）とともに培養する。培養開始時にｍＡｂを種々の濃度で添加し、第６日に［３Ｈ］チミジンによる１８時間パルス処理後のチミジン取り込みを試験する。Ｔ細胞上澄みの調製のためには、精製したＴ細胞を１μｇ／ｍｌＰＨＡ及び１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡの存在下に３６時間１０６／ｍｌの密度で培養する。Ｗｅｎ等（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１７：８８７。Ｔ細胞上澄みは細胞を遠心分離することにより得られ、−２０℃において保存する。ＥＬ４Ｂ５細胞培養におけるヒトＢ細胞の増殖を増強する場合のＴ細胞上澄みの有効性を試験し、最も有効な上澄みを実験で使用するためにプールする。ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖に対する抗ＣＤ４０抗体の作用を試験する場合は、ＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）のようなモノクローナル抗体を対照として加えることができる。
【０２２５】
拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は例えば少なくとも７５％以上ＥＬ４Ｂ５細胞系統により刺激されたＢ細胞増殖を抑制できる（即ち、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体存在下のＥＬ４Ｂ５誘導Ｂ細胞増殖は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体非存在下に観察されるものの２５％以下である）。これとは対照的に、ＭＯＰＣ−１４１のような対照抗体はＥＬ４Ｂ５誘導Ｂ細胞増殖に対して有意な作用を有さない。
【０２２６】
Ｂ細胞による抗体生産に関するヒトＴ細胞ヘルパー試験
拮抗剤抗ＣＤ４０抗体はＢ細胞による免疫グロブリン生産の拮抗剤として機能できる。抗ＣＤ４０抗体はこの型の拮抗剤活性に関して、Ｔ細胞ヘルパー試験において活性化されたＴ細胞により接触依存性の態様において刺激されているＢ細胞による免疫グロブリン生産を抑制する抗体の能力を評価することにより試験できる。この態様において、９６穴組織培養プレートを抗ＣＤ３ｍＡｂＣＬＢ−Ｔ３／３の復水１：５００希釈物でコーティングした（ＣＬＢ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｅｒｌａｎｄｓ）。記載通り、」同時刺激性のｍＡｂ、即ち、抗ＣＤ２ｍＡｂＣＬＢ−Ｔ１１．１／１及びＣＬＢ−Ｔ１１．２／１た（ＣＬＢ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｅｒｌａｎｄｓ）、両方の復水１：１０００、及び抗ＣＤ２８ｍＡｂＣＬＢ−２８／１（ＣＬＢ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｅｒｌａｎｄｓ）を添加する。その後、扁桃腺Ｔ細胞（照射、３０００Ｒａｄ；ウェル当たり１０５）、扁桃腺Ｂ細胞（ウェル当たり１０４）、及びｒＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を添加した。各細胞培養物の最終容量は２００μｌとする。８日後、細胞を回転沈降させ、細胞非含有上澄みを採取する。（希釈した）試料中のヒトＩｇＭ及びＩｇＧの濃度は後述する通りＥＬＩＳＡにより推定する。
【０２２７】
１つの実施形態においては、ヒト扁桃腺Ｂ細胞（１０５／ウェル）を照射された精製Ｔ細胞（３０００Ｒａｄ；１０５／ウェル）とともに、抗ＣＤ３ｍＡｂでコーティングされた９６穴プレート中、異なるｍＡｂの存在下又は非存在下において培養することによりＴ細胞を同時刺激した。培養８日間の後、上澄みを採取してＢ細胞による免疫グロブリン生産の測定に付す。Ｂ細胞による免疫グロブリン生産は後述するＥＬＩＳＡにより試験する。目的の抗ＣＤ４０抗体を培養開始時から種々の濃度で添加する。対照としてｍＡｂＭＯＰＣ−１４１を添加できる。
【０２２８】
拮抗剤抗ＣＤ４０抗体は少なくとも５０％以上ヒトＴ細胞により刺激されたＢ細胞のＩｇＧ及びＩｇＭ抗体生産を抑制できる（即ち、拮抗剤抗ＣＤ４０抗体存在下のＢ細胞によるＴ細胞誘導抗体生産は拮抗剤抗ＣＤ４０抗体非存在下に観察されるものの５０％以下である）。これとは対照的に、ＭＯＰＣ−１４１のような対照抗体はＢ細胞によるＴ細胞誘導抗体生産に対して有意な作用を有さない。
【０２２９】
免疫グロブリン定量のためのＥＬＩＳＡ試験
ヒトＩｇＭ及びＩｇＧの濃度はＥＬＩＳＡにより推定される。９６穴ＥＬＩＳＡプレートを４℃で１６時間インキュベートすることにより４μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧｍＡｂＭＨ１６−０１（ＣＬＢ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）又は１．２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＭＭａｂ４１０２（Ｔａｇｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａ，ｅ．ＣＡ）でコーティングする。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、１時間ＢＳＡで飽和させる。２回洗浄後、プレートを被験試料の種々の希釈度で３７℃１時間インキュベートする。３回洗浄後、結合したＩｇを１μｇ／ｍｌのパーオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧｍＡｂＭＨ１６−０１（ＣＬＢ）又はマウス抗ヒトＩｇＭｍＡｂＭＨ１５−０１（ＣＬＢ）とともに、３７℃で１時間インキュベートすることにより検出する。プレートを４回洗浄し、結合パーオキシダーゼ活性を気質としてＯ−フェニレンジアミンを添加することにより顕在化する。ヒト標準血清（Ｈ００，ＣＬＢ）を用いて各試験に関する標準曲線を確立する。
【０２３０】
本明細書においては、単数表記の物品は物品の文法的対象１つ又は１つより多く（即ち少なくとも１つ）を指す。例えば「要素」とは１つ以上の要素を意味する。
【０２３１】
本明細書において言及した全ての公開物及び特許出願は本出願関連する技術の当業者の水準を示している。全ての公開物及び特許出願は、各個別の公開物又は特許出願が特に個別に参照として本明細書に組み込まれることを示す場合と同程度に参照として本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
上記した本発明は理解の明確化の目的のために説明および例示により一部詳細に説明したが、特定の変更及び改変は添付請求項の範囲内で実施されることは明らかである。
【０２３３】
【数１】
2009534401.tif 000011
【０２３４】
【数２】
2009534401.tif 000012
【０２３５】
【数３】
2009534401.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】図１はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の３ヶ月間又は５ヶ月間２５℃において採点されたｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２製剤の純度に対する緩衝物質種の作用を示す。
【図２】図２はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の３ヶ月間又は５ヶ月間２５℃において採点された種々の抗体製剤内におけるｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の凝集体形成に対する緩衝物質種の作用を示す。
【図３】図３はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の３ヶ月間又は５ヶ月間２５℃において採点された種々の抗体製剤内におけるｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２のフラグメント化に対する緩衝物質種の作用を示す。
【図４】図４はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の３ヶ月間又は５ヶ月間４０℃において採点されたｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２製剤の純度に対する緩衝物質種の作用を示す。
【図５】図５はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の３ヶ月間又は５ヶ月間４０℃において採点された種々の抗体製剤内におけるｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の凝集体形成に対する緩衝物質種の作用を示す。
【図６】図６はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の３ヶ月間又は５ヶ月間４０℃において採点された種々の抗体製剤内におけるｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２のフラグメント化に対する緩衝物質種の作用を示す。
【図７】図７は等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２に関する示差走査熱量測定のサーモグラムを示す。
【図８】図８はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２、４又は６ヶ月間２５℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中に残存するｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％単量体形態を示す。
【図９】図９はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２、４又は６ヶ月間２５℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％凝集体を示す。
【図１０】図１０はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２、４又は６ヶ月間２５℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％フラグメントを示す。
【図１１】図１１はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２又は４ヶ月間４０℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中に残存するｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％単量体形態を示す。
【図１２】図１２はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２又は４ヶ月間４０℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％凝集体を示す。
【図１３】図１３はＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２又は４ヶ月間４０℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％フラグメントを示す。
【図１４】図１４はＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２、４又は６ヶ月間２５℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％純度を示す。
【図１５】図１５はＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２、４又は６ヶ月間２５℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％酸性変異体を示す。
【図１６】図１６はＣＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析により測定した場合の２、４又は６ヶ月間２５℃において採点された等張性付与剤としてＮａＣｌ又は塩酸Ｌ−アルギニンの何れかを含有する製剤中のｍＡｂＣＨＩＲ−１２．１２の％塩基性変異体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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