(57)【要約】本発明は、多糖材料、特に、軟組織の修復または置換に適した移植特性を得るために乾燥し、その後圧縮することによって加工された微生物セルロースに関する。本発明は、組織閉鎖強化のための、軟組織強化のためのバッドレスのための、回旋腱板修復のための、および組織の修復または再生のための医学的に有用な物質のための担体ビヒクルとしての移植可能な微生物セルロースの使用に関する。2009518466.tif 000007
2009518466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物セルロースを乾燥させ、その後乾燥した微生物セルロースを物理的に修飾することによって得られる、微生物セルロース。
【請求項２】
乾燥が超臨界流体乾燥によって行われる、請求項1に記載の微生物セルロース。
【請求項３】
物理的修飾が圧力手段によって行われる、請求項1または請求項2に記載の微生物セルロース。
【請求項４】
少なくとも80Nの抗張力および少なくとも1g/20cm2の吸収能を有する、前記請求項の一項または複数項に記載の微生物セルロース。
【請求項５】
少なくとも80Nの抗張力および少なくとも1g/20cm2の吸収能を有する、微生物セルロース。
【請求項６】
アセトバクター・キリシナム（Acetobacter xylinum）から産生される、前記請求項の一項または複数項に記載の微生物セルロース。
【請求項７】
滅菌されている、前記請求項の一項または複数項に記載の微生物セルロース。
【請求項８】
電離放射線照射によって、蒸気および圧力によって、または酸化エチレンによって滅菌されている、請求項7に記載の微生物セルロース。
【請求項９】
前記請求項の一項または複数項に記載の微生物セルロースを含む、移植可能な組成物。
【請求項１０】
医学的に有用な物質および微生物セルロースを含む、移植可能な組成物。
【請求項１１】
医学的に有用な物質が成長因子または薬剤である、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
軟組織の置換の修復のための移植材料の製造のための微生物セルロースの使用。
【請求項１３】
移植材料が、軟組織を骨に固定するための組成物などの縫合バットレス（buttress）組成物として適した組織足場のような組織足場、または回旋腱板組成物もしくは唇修復組成物のような肩修復組成物である、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
a) 超臨界流体乾燥を用いて微生物セルロースを乾燥する段階
b) 乾燥したセルロースに加圧する段階
を含む、微生物セルロースを産生する方法。
【請求項１５】
a) 請求項1に記載の微生物セルロース装置、および
b) 滅菌可能な閉じることができる容器
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、開示内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、2005年12月2日に出願された米国特許出願第11/292,075号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多糖材料、より詳細には軟組織の修復または置換に適した移植特性を有する微生物セルロースに関する。本発明はまた、組織閉鎖（closure）強化、軟組織の強化のためのバットレス（buttress）、癒着バリア（barrier）、関節軟骨修復、心膜パッチとしての、および組織の修復もしくは再生のための薬剤または他の活性物質の送達のための担体ビヒクルとしての移植可能な微生物セルロースの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
医療産業における移植可能な装置として用いられる様々な材料は、十分に立証されており、かつ、生物学的物質、合成物質、および生合成されたものに区別することができる。生物学的材料には、自家移植片組織（患者自身の組織）、同種移植片（同じ種の別の個体由来の組織）および異種移植片（別の種由来の組織）が含まれる。自家移植片は、多くの場合、依然として優れた標準であるが、別の部分に移植される体の一部分からの組織の採取は、ある程度の病的状態を有し；採取部位は移植部位よりも痛みのある場合が多い。米国特許第5,073,373号；同第5,290,558号；同第5,510,396号；同第6,030,635号；および同第6,755,863号に記載されるような同種移植片は、移植骨代用物としておよび回旋腱板欠損の修復においてなどの様々な指標のための医学的移植物として用いられている。コラーゲンを含む異種移植片は、移植骨代用物（米国特許第5,830,493号）、腱および靱帯の修復、外科用ステープル補強（buttressing）（米国特許第5,810,855号）、ならびに他の組織の修復物および置換物（米国特許第6,179,872号および同第6,206,931号）として移植された。これらの組織は、ドナーから宿主への疾病の伝達の危険性を有し、多くの場合、細胞傷害性化学物質を用いて架橋され、それらの力学的強度および分解プロファイルを向上させる。
【０００４】
合成材料は、ポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）およびポリプロピレンを含む重合体を含み、外科的縫合として長い間用いられている。これらの合成材料は、米国特許第5,441,508号；同第5,830,493号；同第6,031,148号；同第6,852,330号；同第6,940,003号；およびKoh J.L., et al. Supplementation of Rotator Cuff Repair with a Bioresorbable Scaffold, Am. J. Sports Med. 30:410-413, 2002に記載される所期の出願による薄膜、メッシュおよびより複雑な3次元構造に製造された。米国特許第6,156,056号；同第6,245,081号；同第6,620,166号；および同第6,814,741号は、骨トンネルに固定し、その後縫合に取り付ける重合体ベースの縫合バットレスの使用を記載する。広く用いられる合成材料の別の例は、血管移植片（米国特許第4,946,377号および同第5,718,973号）、組織修復のシートおよびパッチ（米国特許第5,433,996号）を含む幅広い医学的移植物品において用いられているポリ（テトラフルオロエチレン）PTFEである。PTFE材料はまた、米国特許第5,702,409号および同第5,810,855号に記載されるような外科的ステープル線の強化装置としても用いられている。重合体ヒドロゲルはまた、外科的移植物（米国特許第4,836,884号）に適合させられ、軟組織および血管代用物のような使用も見出されている。
【０００５】
これらの合成材料は、それらを移植材料として適するようにする一定の物理的特徴を有する。このような特性は、特別な用途に特に重要でありうる、生体適合性、強度、化学的な安定性などを含む。例えば、PTFEは、この強度および管状移植片の生産に重要な、相互連結している小繊維構造を有する。高い水分含量のため生体組織に表面的に類似している合成ヒドロゲルは、補綴装置として役立つ周囲組織に対して最小の刺激を示す。しかしながら、これらの合成材料はまた、限定的な範囲の物理的および生化学的な特性、好ましくない分解の産物およびプロファイル、化学物質の侵出、および難しい取り扱い特性のような制限ならびに不都合も有する。したがって、特別な外科的用途により適した代替的材料を探索する必要性が依然としてある。
【０００６】
生合成材料はまた、組織の修復および増強にも用いられている。キトサン、デキストランおよびポリヒドロキシアルカノエート（PHA）重合体（米国特許第6,867,247号）はすべて、生合成物質と考えられ、生きている生物によって産生されると意味することができる。デキストランおよびPHAは細菌から合成されている一方、キトサンは一定の甲殻類によって産生される。これらの材料は、組織修復パッチ、タック（tack）および縫合、加えて軟組織再生のための足場を含む様々な医学的移植可能な用途における使用について示唆される。その他の用途には、皮膚代用物、創傷手当て用品および止血剤としてのこれらの材料の使用が含まれる。外科的用途への広範囲の使用がある別の生体材料はセルロースであり、移植可能な物品としてのビスコースまたは再生セルロースの使用が公知である。数名の研究者はセルロースおよびその誘導体の組織生体適合性について研究し（Miyamoto, T. et al., Tissue Biocompatibility of Cellulose and its deribatives. J. Biomed. Mat. Res., V. 23, 125-133 (1989)）ならびに材料の特定の用途について調べた。酸化型の再生セルロースは、止血剤および癒着バリアとして長く用いられており（Dimitrijevich, S. D., et al. In vivo Degradation of Oxidized regenerated Cellulose. Carbohydrate Research, V. 198, 331-341 (1990), Dimitrijevich, S. D., et al. Biodegradation of Oxidized regenerated Cellulose Carbohydrate Research, V. 195, 247-256 (1990) ）、かつ非還元型対応物よりもかなり早く分解することが周知である。Martson, et al.によって研究されたセルローススポンジは、皮下移植時の骨および結合組織の形成との優れた生体適合性を示した（Martson, M., et al., Is Cellulose sponge degradable or stable as an implantation material? An in vivo subcutaneous study in rat. Biomaterials, V. 20, 1989-1995 (1999), Martson M., et al., Connective Tissue formation in Subcutaneous Cellulose sponge Implants in rats. Eur. Surg. Res., V. 30, 419-425 (1998), Martson, M., et al., Biocompatibility of Cellulose Sponge with Bone. Eur. Surg. Res., V. 30, 426-432 (1998)）。著者らは、セルロース材料が生存可能な長期間安定な移植物でありうると推測した。セルロースの他の形態および誘導体もまた調査された（Pajulo, O. et al. Viscose cellulose Sponge as an Implantable matrix: Changes in the structure increase production of granulation tissue. J. Biomed. Mat. Res., V. 32, 439-446 (1996), Mello, L. R., et al., Duraplasty with Biosynthetic Cellulose: An Experimental Study. Journal of Neurosurgery, V. 86, 143-150 (1997)）。
【０００７】
しかしながら、従来技術は、微生物セルロースの限定された用途のみに言及している。例えば、医療産業における微生物セルロースの使用は、液体付加パッド（米国特許第4,588,400号）、皮膚移植片または外傷に効く覆い（米国特許第5,558,861号）、創傷手当て用品（米国特許第5,846,213号）および局所適用（米国特許第4,912,049号）について記載されている。これらの特許は、局所適用のための微生物セルロースの使用に焦点を合わせており、かつ、移植可能な材料としてのその特定の用途を例証していない。上記のMello et al.は、硬膜形成における微生物セルロースの使用を示唆しているが、力学的に強い材料を産生しない伸縮乾燥法を記載している。アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）から得られる微生物セルロースの移植物としての使用を記載している唯一の特許は、溶媒が脱水された微生物により得られたセルロース材料が具体的には形成および再生のための組織修復材料、組織代用物および充填剤に使用されうる米国特許第6,599,518号である。該'518特許により記載される材料は、それらが最小伸長、高い剛性および相当量の流体の吸収不能のような物理的特徴を有するという点で本発明と異なる。これらの特質は、移植材料を順応させないため、軟組織の増強または補強および筋骨格組織の強化、修復または置換のような特定の外科的用途には有用ではない。また、該'518特許は、移植可能製品を産生するための周囲圧力における溶媒脱水以外の他の加工方法を明記していない。この工程より残存する塩および周囲圧力において乾燥する溶媒は、材料の剛化に役に立つ。'518における材料の形態は、高い抗張力を有するが、液体の最小吸収のみ、およびその結果の最小の膨張のみを可能とする。このように、'518における材料は、流体吸収能が制限されており、かつこの材料は、薬剤、生物学的物質および他の生物活性物質を含む液体を送達する能力を制限する液状溶液とともに添加することができない。
【０００８】
本発明は、強い、さらにより順応性のある移植材料を得るための乾燥および圧縮の新規の組み合わせを記載する。本発明は、圧縮量に依存する多様な細孔サイズを有しうるため、液体を吸収すること、膨張し、空間を充填するかまたは最小膨張を有すること、さらに'518材料より高い順応性を有しうる。
【０００９】
別の可能性のある用途は、抗感染剤または薬剤送達系としての使用のための液状可溶性医用薬剤を微生物セルロースに添加するように加工された微生物セルロースの吸収性特性についての使用である。
【００１０】
微生物セルロースの可能性のある用途は、該'518特許において言及されていない。例えば、回旋腱板外科手術時の強化組織に対するバットレス材料としての微生物セルロースの使用は、これまで開示されていない。癒着バリア、関節軟骨修復、および心膜パッチを含む本特許における材料の他の具体的な用途もまた、記載される。
【００１１】
したがって、以前は軟組織の修復、再生または置換の用途における使用のための微生物セルロースを含む許容される移植可能な材料を提供していなかった。したがって、これまで記載された材料とは異なって加工された微生物セルロースを含む移植可能な材料の必要性が依然としてある。この新規の加工により、望ましい特性を有し、かつ様々な外科的なおよび薬剤送達の用途において使用できる移植可能な材料になる。開放性、腹腔鏡下、関節鏡下、内視鏡下または経皮方法のような微生物セルロースを移植する方法もまた、特に望ましく、かつより順応性のある微生物セルロースにより達成可能である。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、良好な力学的特性と良好な吸収特性とを同時に有する新規の微生物セルロースを提供する。この材料は、したがって移植材料として特に適している。材料の抗張力は、好ましくは少なくとも80Nであり、かつその吸収能は、好ましくは少なくとも3g液体/gセルロース、より好ましくは少なくとも3.2g液体/gセルロースである。
【００１３】
本発明はまた、超臨界流体乾燥による微生物セルロースを乾燥する段階、およびその後乾燥された微生物セルロースに加圧する段階を含む、微生物セルロースを調製する新規の方法も提供する。
【００１４】
この材料を、組織足場、縫合バットレス組成物、または肩修復組成物を提供するために使用することができる。
【００１５】
本発明はまた、微生物セルロースおよび医学的に有用な物質を含む移植可能な組成物も提供する。
【００１６】
本発明の1つの好ましい態様により、回旋腱板修復を含む軟組織の修復および強化（ステープル、縫合など）に関する医学的および外科的用途のために微生物セルロースを用いる移植可能な材料の新規のクラスが提供される。
【００１７】
本発明の別の好ましい態様により、微生物セルロースの望ましい物理的および化学的特性を用いる種々様々な用途において、微生物セルロースを移植する方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の好ましい態様により、特定の製品の用途のために望ましい特性をもたらすと考えられるこれらの前記材料の調製のための工程が提供される。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様により、液状医用薬剤がこの材料に吸収（添加）され、特定の製品の用途のために望ましい特性をもたらすこれらの前記材料の調製のための工程が提供される。
【００２０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、微生物セルロースを含む移植可能な材料を記載する。本移植可能な材料は、インビボ用途に必要なそれらの特性を有し、例えば本発明の移植可能な材料が3次元形状に適合され、所望の流体吸収および柔軟性の特徴を有することができる。
【００２１】
本発明の移植可能な材料は、微生物セルロースから構成される。微生物セルロースを調製するこれらの方法は、当業者に周知であり、例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,846,213号、同第4,912,049号に記載される。未加工の生合成セルロース材料を産生する際に、任意のセルロース産生生物を使用できる。しかしながら、アセトバクター・キシリナムの静置培養物から産生される生合成セルロースが好ましい。
【００２２】
未加工の材料の微生物セルロース含量は、A.x.細菌に供給される培地量に依存する。一旦菌膜を採取すると、未加工材料は、医学的および外科的な使用に適した移植可能な材料となるように、物理的および化学的に加工される。例えば、微生物セルロースは、まず加工され、セルロースパッドに埋め込まれた非セルロース材料すべてを除去するように浄化され、その後水酸化物ナトリウムのような化学物質を用いて脱発熱化（depyrogenate）される。脱発熱化後、セルロースは、その強度が調整される必要がある場合には、放射線照射または化学的手段によって架橋されてもよい。セルロース表面を修飾するために用いられるグリセロールおよびポリエチレングリコールのような他の物質添加はまた、移植可能な材料に望ましい特性である水吸収および柔軟性を調節するために行うことができる。材料は、湿式の（wet）、湿性の（moist）、部分的に脱水させた、または空気、熱、凍結乾燥（lyophilization）、フリーズドライ（freeze-drying）もしくは超臨界流体乾燥による完全に脱水させたままであることができる。好ましい態様において、微生物セルロースは乾燥され、乾燥が液体の除去であり、これは米国特許第6,599,518 B2号に記載の脱水とは異なる。
【００２３】
超臨界流体乾燥が好ましい。超臨界流体乾燥は、その臨界点を越える圧力および温度で保持される流体を用いた乾燥段階を指す。臨界点は、流体が気体および液体として同時に存在しうる最も低い圧力および温度である。例えば、二酸化炭素についての臨界の圧力および温度は、それぞれ72.8気圧と31.1℃である。その臨界点を越える圧力および温度で保持される二酸化炭素は、超臨界の条件または状態にある。本発明により、二酸化炭素は流体として好ましい。したがって、「超臨界乾燥」という用語は、少なくとも1つが一時期超臨界条件下である1つまたは複数の流体を用いて、微生物セルロースのマトリックスの中の水を置換および除去する加工を指す。超臨界流体の圧力が約1分から約120分までの時間にわたって減圧され、凝縮を起こす迅速な冷却を防ぐことが、一般的には望ましい。微生物セルロースの超臨界乾燥は、米国特許第5,772,647号および米国特許第5,580,348号に記載される。これらの特許に記載される方法もまた、本発明に従って用いることができる。
【００２４】
材料は、セルロースを物理的に修飾することによって、好ましくは、繰り返されたまたは維持された力を乾燥材料に直接付加することにより乾燥後薄膜にまで圧縮されることによって、さらに加工されてもよい。
【００２５】
好ましい態様において、加圧段階は一定圧力によって達成される。または、加圧は、繰り返されたハンマーでの打ちつけによって達成され、材料は、γ線照射、eビーム照射、酸化エチレンまたは蒸気滅菌のような標準的な滅菌法を用いて、医学的に移植可能な物品としての用途のためにさらに滅菌されうる。
【００２６】
超臨界乾燥およびその後の圧縮の組み合わせは、移植物材料に特に適した材料を提供する。好ましくは、微生物セルロース含量は1mg/cm2〜50mg/cm2である。抗張力は、好ましくは少なくとも80Nであり、より好ましくは90〜200Nの範囲にある。吸収能は、セルロース1g当たり、好ましくは少なくとも3gであり、より好ましくは少なくとも3.2gであり、最も好ましくは4.5〜10gの範囲である。抗張力および吸収能を決定するための測定法は以下に記載する。さらに、本発明の微生物セルロースは、平均細孔サイズが好ましくは少なくとも約0.01μmであり、より好ましくは0.1〜500μmの範囲にある。さらに、そのかさ密度は、好ましくは0.0001〜約0.5g/cm3の範囲にある。細孔サイズおよびかさ密度は、米国特許第5,580,348号（9段目、6〜63行目を参照されたい）に記載されたように決定される。
【００２７】
乾燥および物理的修飾段階の後に、乾燥したセルロースは再水和されてもよい。
【００２８】
1つの好ましい態様において、本発明は、微生物セルロース材料を提供する段階、および該材料を医学的用途および外科的用途のための移植可能装置に組み込む段階を含む医学的および外科的用途のための移植可能装置を調製するための方法を提供する。一旦産生されると、微生物セルロースは、成形、架橋、化学表面反応、脱水および/もしくは乾燥、切断またはパンチングのような一般に周知である方法によって医療装置に組み込まれてもまたは医療装置にされてもよい。このような医療装置は、損傷軟組織の修理もしくは強化のための組織代用物または足場を含む。
【００２９】
抗張力、3次元構造、縫合維持力、吸収および順応性のような微生物セルロースの物理的特性を、走査型電子顕微鏡法（SEM）、力学的試験または他の標準的な物理的試験のような一般に用いられる技術によってその特徴を示すために測定してもよい。結晶度、活性のある化学基および重合度のような化学的特性をまた、X線結晶解析のような技術によって検査することができる。最終的には、インビトロおよびインビボでの移植可能な微生物セルロースの生体適合性/安全特性を評価してもよい。
【００３０】
移植可能な微生物セルロースの特性を、ポリプロピレンメッシュ、PTFE、重合体ヒドロゲル、コラーゲン、および医療産業で現在用いられているヒトまたは動物由来の組織を含む利用可能な多種様々な移植可能な材料と比較してもよい。強度、順応性、および癒着特性を含むこれらの比較結果に基づいて、多くの移植可能な微生物セルロース物品を一定の用途に合わせて作製してもよい。
【００３１】
本微生物セルロースは、組織工学における代用物または足場として用いてもよい。本態様において、セルロースは、新組織が形成し、方向づけ、かつ成熟させる足場または格子としての働きをする。
【００３２】
好ましい態様において、本発明は、微生物セルロースを含む移植可能な組成物、および該組成物のそれを必要とする対象への移植を含む組織強化の方法を提供する。例えば、本発明は、ステープル、縫合または骨固定物（anchor）が追加され、組織の付着をその支持構造に対して確実にする組織に対する直接的な適用のための乾燥または水和化したパッドとして容易に調製されることができる。多くの場合、修復されている組織はもろく、かつ縫合またはステープル単独では結果的に創傷の切断または引き裂き、および創傷を再び開くことをもたらす。本態様において、ステープルおよび/または縫合は、セルロースおよび組織の両方を突き通し、セルロースが付着のためにより強い裏張りをつくることによって組織を強化するように働く。本願に関して、材料は、摩擦、鋭い縁などにより組織に損傷が生じないように順応性でなければならない。
【００３３】
装置は、組織足場、外科的縫合強化装置、外科的ステープル強化装置、癒着バリア、肩の修理、好ましくは回旋腱板を含むかもしくは唇を含む肩の修復に用いられる装置、または好ましくは組織の骨への固定を含む縫合修理であってよい。装置は、切開手法(open procedure)を通じて、または関節鏡を通じて移植することができる。
【００３４】
本発明はまた、本発明による微生物セルロース装置および滅菌可能な閉じることができる容器を含むキットを提供する。閉じることができる容器は、密封可能な小袋またはふたのついた熱成形された浅箱であってもよい。
【００３５】
好ましい態様において、本発明は、セルロース材料を用いた回旋腱板および他の肩に関連する裂傷の修復方法を提供する。このような移植可能な材料を製造するための方法または工程は、実施例とともに例証される。
【００３６】
材料は、肩およびその周囲の組織を強化するために用いることができる。記載された微生物セルロースは、回旋腱板修復のために外科的装置として使用されうる多次元の強度を有するシートの作製するために、上記の方法を用いて加工することができる。これは、切開および関節鏡による両修復を含み、縫合またはステープル強化を含んでもよい。
【００３７】
本発明はまた、微生物セルロース、および微生物セルロース材料によって吸収される液体に溶解される医学的に有用な物質を含む移植可能な組成物を意図する。移植材料は、その上、体の構造的な支えとして、および移植部位への送達のための生物活性物質または薬剤のための容器としての2つの機能を有することができる。または、この物質は、感染症または移植物の拒絶反応の危険性を低減するために微生物セルロースに組み込まれてもよい。組織修復に有用な、任意の数の医学的に有用な物質は、製造工程の任意の段階においてまたは直接最終組成物に対してのどちらかで、微生物セルロース担体を含む移植可能な組成物に、物質を添加することによって、本発明において用いることができる。
【００３８】
医学的に有用な物質は、治療的、治癒、癒し、回復、または薬効特性を有するものである。このような医学的に有用な物質には、コラーゲンおよび不溶性コラーゲン誘導体および可溶性固体および/またはそれに溶解される液体が含まれる。また、アミノ酸、ペプチド、ビタミン、タンパク質合成のための補因子；ホルモン；内分泌性の組織または組織断片；シンセサイザー（synthesizer）；コラゲナーゼ、ペプチターゼ、オキシダーゼのような酵素；実質細胞を有する細胞足場；このような薬剤を含む血管新生薬剤および重合担体；コラーゲン格子；生体適合性表面活性物質、抗原物質；細胞骨格物質；軟骨断片、軟骨細胞、骨髄細胞、間葉幹細胞のような生きている細胞、天然抽出物、組織移植物、生体接着物（bioadhesive）、トランスフォーミング成長因子（TGF-β）および関連するファミリータンパク質（骨形態形成タンパク質（BMP））、成長分化因子（GDF）など）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、インシュリン様成長因子（IGF-1）および他の成長因子；ソマトトロピンのような成長ホルモン；骨消化剤；抗腫瘍剤；フィブロネクチン；細胞の誘因物質および付着剤；免疫抑制剤；浸透相乗剤；ならびに成長放出因子、およびP-15などのようなペプチドも含まれる。
【００３９】
薬剤は、その遊離した塩基または酸の形態をとるか、または塩、エステルもしくは任意の他の薬理学的に許容される誘導体、鏡像異性的に単一な形態、互変異性体、または分子複合体の構成要素としての形態をとることができる。組成物に組み込まれる薬剤量は、特定の薬剤、所望の治療効果、および装置が治療を提供する予定である期間に依存して変動する。全体として、本発明の目的のために、この系における薬剤量は、組成物の全重量について、約0.0001％から60％程度まで、好ましくは約0.01重量％から約50重量％まで、より好ましくは約0.1重量％から約10重量％まで変動しうる。
【００４０】
活性物質は、炎症を低減させる、細胞付着を増加させる、細胞を補充する、および/または細胞分化により損傷組織を修復させるために用いられてもよい。
【００４１】
さらに、微生物セルロースを用いる移植可能な材料は、他の軟組織の代用物または足場を含むが、これらに限定されない多くの他の有用な範囲において適用されてもよい。
【００４２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の実施例から明らかである。しかしながら、本発明の精神および範囲内の様々な変化および改変が当業者には詳細な説明より明らかであるため、本発明の好ましい態様を指し示す限り、この詳細な説明と具体的な例は、例証としてのみ示されることが理解されるべきである。このように全体として記載された本発明は、本発明の例証として提供され、かつ本発明の限定を意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【００４３】
実施例1：
移植可能なセルロースの調製
本発明の微生物セルロースを調製するために、アセトバクター・キシリナム微生物は、摂氏30度で開始pH3〜6において液体栄養培地を含むバイオリアクター中で培養された。培地は、ショ糖または他の炭水化物に基づいた。
【００４４】
バイオリアクターは、気密性のふたに合うプラスチック製の箱から構成された。測定されたバイオリアクターの直径は、3.5インチ×3.5インチであった。通気口は、適切な酸素圧の達成を可能としたバイオリアクター中に作製された。
【００４５】
培地中の微生物が無傷のセルロース菌膜を産生する間、静止条件下での発酵工程により、約10〜14日間進行させた。一旦培地が消費されると、発酵は停止し、菌膜がバイオリアクターから除去された。この材料は'250'と呼ばれた。
【００４６】
1. 加工および脱発熱化手法
菌膜中に含まれる過剰な培地を、化学的浄化とその後の菌膜の加工の前の機械的圧縮によって除去した。セルロース菌膜は、未加工のセルロース薄膜を医学的等級および非発熱性移植可能な材料に変換するために一連の化学的洗浄段階に供された。加工は、摂氏70〜75度で1時間、8％ 水酸化ナトリウム水溶液より開始し、次に、脱イオン水中でのリンスおよびその後の摂氏70〜75度で1時間、0.25％過酸化水素中での浸漬が続けられた。
【００４７】
得られた薄膜は、発熱物質および力学的特性について試験された。加工後のセルロースパッド中に残された細胞砕片量は、21 CFR10.90において米国食品医薬品局（FDA）によって概説されるように確認されたリムルスアメーバ様細胞溶解物（LAL）試験によって測定される。上記に概説される本浄化工程は、非発熱性セルロースパッドを提供した（≦0.50 EU/ml）。LAL試験段階は、試験キット製造業者によって規定され、セルロース薄膜における発熱物質レベルを得るために簡単に続けられることができる。
【００４８】
2. 最終製品加工
一旦浄化されると、菌膜は機械により加圧され、水分含量を低減された。次に、材料は、100％ メタノール中に約1時間浸漬された。メタノール水混合物はデカントされ、試料は再度100％メタノール中に一晩浸漬された。メタノールは約16時間で、さらに24時間で替えられた。メタノール交換に続いて、菌膜はメタノールを減少させるために再加圧された。次に菌膜は、ポリプロピレンメッシュによって隔てたれた圧力容器中に置かれ、メタノールが除去され材料が乾燥するまで、2000psiおよび摂氏40度において超臨界二酸化炭素乾燥（SCD）にかけられた。
【００４９】
得られた乾燥パッドは、形作られるよう切断され、単一のまたは二重の箔の小袋に包装され、25〜35kGyでγ線照射によって滅菌される。
【００５０】
実施例2：
材料は、実施例1においてと同様のものを調製されたが、追加の培地は始めに添加され、菌膜は14〜17日増殖可能にされた。得られた菌膜は、'360'と呼ばれた。浄化、白化、乾燥、包装および滅菌は実施例1と同一であった。
【００５１】
実施例3：
材料は、実施例1においてと同様のものを調製されたが、追加の培地は始めに添加され、菌膜は21〜25日増殖可能にされた。得られた菌膜は、'440'と呼ばれた。浄化、白化、乾燥、包装および滅菌は実施例1と同一であった。
【００５２】
実施例4：
材料は、実施例2におけるように最初に浄化され、白化、および乾燥された。それは、それを機械的圧力に供し、'360P'と呼ばれるより薄いバージョンを作製することによってさらに加工された。本実施例に関して、材料はプラスチック製の槌により打ちつけられ、セルロースを薄く平たいものに圧縮された。次に、これは、実施例1におけるように、包装され、滅菌された。
【００５３】
実施例5：
材料は、実施例3におけるように最初に浄化され、白化、および乾燥された。それは、それを機械的に供し、'440P'と呼ばれるより薄いバージョンを作製することによってさらに加工された。本実施例に関して、材料はプラスチック製の槌により打ちつけられ、セルロースを薄く平たいものに圧縮された。次に、これは、実施例1におけるように、包装され、滅菌された。
【００５４】
実施例6：
調製された移植可能な微生物セルロース材料の力学的特性
材料を実施例1〜3におけるように加工した。抗張力、伸長、および縫合維持力を含むこれらの移植可能な微生物セルロース形態の力学的特性は、United Tensile Tester（モデル SSTM-2kN）を用いて解析された。
【００５５】
各ロットに関して、張力と縫合（1cm×4cm）の両方についての試料を試験した。試料は、試験前に30〜35分間それらを脱イオン水に浸漬することによって調製された。張力試験は、25mm間隙が試験されるように2つのグリップ間に試料を置くことによって行われた。1Nの事前負荷が加えられ、試験は破損まで300mm/分で行われた。破損時の張力負荷と伸長の両方を記録した。縫合試験は、単一の2.0 Prolene縫合を試験試料の一方の端を縫うように進むことによって行われた。60mmの間隙長さが達成されるように、試料を一方の端のグリップに置き、縫合を他方のグリップに置いた。1Nの事前負荷を加え、試験を破損まで300mm/分において行った。ヤング率は張力試験結果と試料測定から計算された。
【００５６】
（表１）試料の力学的平均値
2009518466.tif 000003
【００５７】
表1および図1は、セルロース含量の増加とともに、増加した抗張力、ヤング率および縫合維持力を示す。伸長率の低下により、セルロースの増加とともに材料が堅くなることが示唆される。
【００５８】
実施例7：
加圧と非加圧の移植可能な微生物セルロースを比較する力学的特性
材料を実施例2〜5におけるように加工された。これらの移植可能な微生物セルロース形態の力学的特性は、United Tensile Tester（モデル SSTM-2kN）を用いて行われた。試験には抗張力、伸長、縫合維持力および織物剛性が含まれた。
【００５９】
各ロットに関して、張力と縫合の両方についての試料（1cm×4cm）および剛性についての試料（4cm×5cm）を試験した。力学的試験試料は、試験前に30〜35分間それらを脱イオン水に浸漬することによって調製された。張力試験は、25mm間隙が試験されるように2つのグリップ間に試料を置くことによって行われた。1Nの事前負荷が加えられ、試験は破損まで300mm/分で行われた。破損時の張力負荷と伸長の両方を記録した。縫合試験は、単一の2.0 Prolene縫合を試験試料の一方の端を縫うように進むことによって行われた。60mmの間隙長さが生じるように、試料を一方の端のグリップに置き、縫合を他方のグリップに置いた。1Nの事前負荷を加え、試験を破損まで300mm/分において行った。剛性試験は、4cm×5cm片の試験材料を織物剛性試験用リグの上に置くことによって行われた。次に、1.2cm直径の平らな部分を基にしたプローブを、試料まで下ろし、試験材料を、2.5cm（OD）、45度のはす縁を有する内径2cmの孔を通して押しつけるために必要とされるピーク力を記録した。
【００６０】
（表２）試料についての力学的平均値
2009518466.tif 000004
【００６１】
表2および図2は、非圧縮対照に対して圧縮試料の増加した抗張力を示すが、縫合維持強度に変化はないことを示す。
【００６２】
実施例8：
吸収試験
440構成における材料は、実施例3（SCD対照）および実施例5（SCD強打）におけるように、ならびに米国特許'518（溶媒脱水）に従うように調製された。第4の材料は、実施例3におけるように調製されるが、次に60秒間、80 PSIの圧力（SCD 60秒加圧）下で加圧した。これにより、SCD対照とSCD強打との間の中間の厚さの材料を生じた。試料は、30〜35分間、実施例7におけるように水和化された後で張力または縫合強度のどちらかについて試験されたか、または以下のように吸収試験にかけられた。4×5cmの寸法である試料は、0.9％食塩水溶液中に浸漬されたスポンジの上部に置かれ、試験用チャンバーを閉めた。試験前におよびスポンジ上への配置後24時間において、試料の重量を計った。
【００６３】
図5は、様々な材料についての吸収量と抗張力の比較を図示する。材料が張力において強くなるにつれて、それが吸収するのが少なくなることに留意されたい。これは、SCD法のいずれかを用いて加工された材料と比較した場合、'518材料（溶媒脱水）が医学的に有用な物質用の送達ビヒクルとして有用ではないことを示す。
【００６４】
図6は、ゆっくり時間をかけても'518（溶媒脱水）が本発明において記載されるように調製された材料を用いて観察された吸収レベルに到達しないことを図示する。
【００６５】
実施例9
移植可能な微生物セルロース材料の物理的特徴
移植可能な微生物セルロースの物理的特徴が、移植可能な微生物セルロース材料のSEM像を示す図3および4においてわかる。図3における相互連結された繊維と図4における薄層構造に留意されたい。
【００６６】
実施例10：
移植可能な微生物セルロースの安全性試験
生体適合性試験および移植研究は、移植可能な微生物セルロース安全性プロファイルを評価するために行われた。細胞傷害性、感作、皮内刺激、全身性毒性および遺伝毒性を含む一組のインビトロおよび動物生体適合性の試験は、微生物セルロースについて行われ、結果により材料が生体適合性であることが示された。最長24週のウサギにおける筋肉移植研究が行われ、組織学的および全体の剖検結果により、有意でない組織反応、最小の細胞間相互作用、および組織への非常に低い癒着が示された。表3は試験と結果を列挙する。
【００６７】
（表３）生体適合性試験および移植可能な微生物セルロースの結果
2009518466.tif 000005
【００６８】
実施例10：
肩修復適用に必要とされる既存の移植可能な材料との比較
実施例1〜3において調製される移植可能な微生物セルロース材料を、肩修復に使用される既存の医療装置と比較した。コラーゲンに基づいた製品の縫合維持力特性（ヒトおよび動物の両方から由来）およびPTFE材料は、移植可能な微生物セルロースと比較された。これらは以下のインビトロモデルにおいて試験された。
【００６９】
ニワトリのアキレス腱を、新鮮な足から採取し、使用前には等張食塩水に保存された。これらの標品は、おおよそ5cm長、1cm幅および2mm厚であった。試験標品は、個々に調製され、Instron Mini 44の機械において試験された。
【００７０】
試験取り付け具は、両側面と上部において一列に2.5mm間隔で並べられた3個の0.5mmの孔（孔の端が縫合損傷を防ぐために研磨されている）を有する3mm厚のアルミニウム「L」形の板から構成された。
【００７１】
上部の孔は取り外し（pull-off）試験のために用いられ、側面の孔は剪断試験のために用いられた。No.2 Mersilene（商標）の縫合は、板の裏面から、かつ腱および移植片（存在する場合）を通って導入され、2.5mmまたは5mmの縫合間隙のどちらかを維持する腱を通って戻り、板の裏面においてこま結び（square knot）によって結ばれた。板は、Instronの一方のグリップによって保持され、中心の小さい（small eye）ボルトを通過された腱のつながれていない端は、他方のグリップによって保持され、止血鉗子により抑えられた。張力は、破損まで1.0cm/分で付加された。破損負荷と破損機序とが決定された。
【００７２】
移植片および2.5mmと5mmの縫合間隙のない腱を対照とした。試験材料には、PTFE-テフロン織物（Gore-Tex（登録商標）軟組織パッチ）、ヒト由来の架橋コラーゲン（GRAFTJACKET（商標））、ウシ心膜（Peri-Guard）、ならびに実施例1および2の移植可能なセルロース材料が含まれた。試験単位は、縫合間隔5mmである1cm2パッチであった。
【００７３】
それぞれの試験材料および移植片材料についての12個の標品が実施された。2個の最小破損負荷値は捨てられ（こま結びまたは腱クランプのゆるみのため）、残りの10個は破損強度を決定するために平均がとられた。平均は独立スチューデントt検定によって比較された。
【００７４】
試験結果を表4に示す。修復はまず置換し始めた際に、破損負荷は生じ、縫合/移植片が腱を貫通するにつれてこれらの負荷は徐々に減少した。移植可能な微生物セルロースおよびウシ心膜移植片は、両試験についての増強されない縫合より有意に強かった（p＜0.05）。すべての増強されない標本は、腱に沿って縫合が薄く切られること（切り離し（tear-off））によって破損した（fail）。ヒトコラーゲン移植片のみ同様の様式で破損した。他の移植片は、様々な量の切り取り（cut-out）および切り離しによって破損し、ウシ心膜が主に切り離しによって破損した。しかしながら、切り取り破損のすべてにおいて、縫合は移植片のいずれかを通って切断されなかったが、それを腱の中に引き入れおよび通常は腱によって引っ張った。移植片/縫合は、続いて腱に沿って薄く切り取られた。これらの切り取り破損は、全体としてより強い強度をもたらした。
【００７５】
（表４）ニュートン単位の腱増強の強度（SD）
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T=切り離しにより破損した試験の割合
【００７６】
前記の説明と実施例から明らかであるように、本発明は、傷害された整形外科的な軟組織を修復および置換するための医学的用途ならびに医療装置に使用することができる微生物セルロースを用いた1クラスの移植可能な材料に向けられている。様々な形態（例えば、薄膜、パッド、水和化、乾燥）において、ならびに様々な物理的および化学的な特性が変動して、製品が構成されてもよい。さらに、この材料は、コラーゲン、タンパク質、および特定の用途に対するその有効性を高めるための他の生物活性物質と組み合わせて用いることができる。多くの他の変形物ならびに構造、組成物および構成の詳細は、当業者には明らかであると思われ、このような変形物は本発明の範囲内であると意図される。
【００７７】
実施例11：
材料は、実施例3におけるように最初に浄化され、白化、および乾燥された。組織1/1メッシャー（mesher）にそれを置くことによって、それを貫通に供することによって、それはさらに加工された。これは、1次元における強度が維持される間、材料において肉眼で見える孔を作製した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】抗張力、伸長、縫合維持力強度およびヤング率の力学的特性に対するセルロース含量の影響を図示する、移植可能な微生物セルロースの3つのバリエーションの力学的特性のグラフである。
【図２】抗張力、伸長、縫合維持力強度および剛性の力学的特性に対する加工およびセルロース含量の影響を図示する、対照と圧縮された移植可能な微生物セルロースを比較する力学的特性のグラフである。
【図３】超臨界流体乾燥の後の移植可能な微生物セルロースの水平面において撮られたSEM像である。
【図４】超臨界流体乾燥の後の移植可能な微生物セルロースの垂直面において撮られたSEM像である
【図５】'518特許からの材料と本発明のものを比較する抗張力に対する吸収量のグラフである。
【図６】'518特許の方法を用いて調製された材料と比較された本発明の材料についての時間に対する吸収量のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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