(57)【要約】  本願発明は、線維性疾患を治療および／または抑制するための方法、および／または、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療または抑制するための方法を提供し、その方法は、ＨＳＰ２０関連ポリペプチドを含むポリペプチドを、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療および／または抑制するのに効果的な量でそれを必要とする個体に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維性疾患を治療および／または抑制する方法であって、
一般式Ｉ：Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ−Ｘ３
に従う配列を含むポリペプチドをそれを必要とする個体に線維性疾患を治療および／または抑制するのに効果的な量で投与することを含み、
ここで、Ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１から１４までの熱ショックタンパク質２０の０−１４アミノ酸配列であり；
Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン・アナログ及びホスホチロシン・アナログからなる群から選択され；
Ｘ３は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０の０−１４０アミノ酸、及び（ｂ）一連の属Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３の０、１、２または３アミノ酸からなる群から選択され；
ここで、Ｚ１は、Ｇ及びＤからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｌ及びＫからなる群から選択され；
Ｚ３は、Ｓ、Ｔ及びＫからなる群から選択される
線維性疾患を治療および／または抑制する方法。
【請求項２】
ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療および／または抑制する方法であって、
一般式Ｉ：Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ−Ｘ３
に従う配列を含むポリペプチドをケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療および／または抑制するのに効果的な量でそれを必要とする個体に投与することを含み、
ここで、Ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１から１４までの熱ショックタンパク質２０の０−１４アミノ酸配列であり；
Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン・アナログ及びホスホチロシン・アナログからなる群から選択され；
Ｘ３は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０の０−１４０アミノ酸、及び（ｂ）一連の属Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３の０、１、２または３アミノ酸からなる群から選択され；
ここで、Ｚ１は、Ｇ及びＤからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｌ及びＫからなる群から選択され；
Ｚ３は、Ｓ、Ｔ及びＫからなる群から選択される
ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療および／または抑制する方法。
【請求項３】
Ｘ１がＷＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｘ３がＧＬＫである請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１から１４までの熱ショックタンパク質２０の０−１４アミノ酸配列のである、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが、ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００）を含み、Ｓ残基がリン酸化される、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが共有結合性導入ドメインを更に含む請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
導入ドメインが、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）およびＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）からなる群から選択されるポリペプチドを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
方法が、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を抑制するために用いられ、それを必要とする個体が、アジア系またはアフリカ系の血統である請求項２−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
方法が線維性疾患を治療または抑制するために用いられ、それを必要とする個体が、一つ以上の糖尿病性ネフロパシ、糸球体硬化症、ＩｇＡネフロパシ、糖尿病性網膜症、黄斑変性、肝硬変、胆汁閉鎖症、鬱血性心不全、硬皮症及び腹部癒着の病気を患っているかまたはその危険にある、請求項１及び３−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ニーズの個体が、標的組織において一つ以上の次の生体指標の高レベルを有する請求項１−１０のいずれかに記載の方法：
ＴＧＦβ１発現；
ＴＧＦβ２発現；
ＣＴＧＦ発現；
リン酸化コフィリン；
リン酸化ＨＳＰ２７；
及びα−平滑筋肉アクチン発現。
【請求項１２】
方法の開始後に、標的組織における一つ以上の次の生体指標のレベルを測定することによって方法の効果をモニタすることを更に含む、請求項１−１１のいずれかに記載の方法：
ＴＧＦβ１発現；
ＴＧＦβ２発現；
ＣＴＧＦ発現；
リン酸化コフィリン；
リン酸化ＨＳＰ２７；
及びα−平滑筋肉アクチン発現。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００６年７月１２日の米国暫定特許出願第６０／８３０，２７９号、及び２００６年１０月２日に出願の第６０／８４９，０４１号の優先権を主張し、両方とも本願明細書において全体として引用された。
【政府支援についての記載】
【０００２】
本事業は、少なくとも一部分においてＮＩＨ認可Ｋ２５ＨＬ０７４９６８及びＮＩＨ  ＳＴＴＲ認可６Ｒ４２  ＨＬ０７１３０９−０３によって支援された。アメリカ政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ケロイド及び肥厚性瘢痕は、過剰産生、細胞外基質の堆積及び収縮による過度の傷によって特徴づけられ、それは線維増殖性異常回復疾患であり、機能的及び表面的奇形を引き起こす（Ｌｅａｓｋ及びＡｂｒａｈａｍ（２００４））。現段階において前記状況に対する効果的治療はない。
【発明の概要】
【０００４】
第１態様において、本発明は、線維性疾患を治療および／または抑制するのに十分な量の、一般式Ｉ：Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ−Ｘ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６）による配列を含むポリペプチドをそれを必要とする個体に投与する方法を含む、線維性疾患を治療および／または抑制する方法を提供する。
（前記一般式において、Ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１及び１４間の熱ショックタンパク質２０の配列の０−１４アミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン・アナログ及びホスホチロシン・アナログからなる群から選択され；
Ｘ３は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０の  ０−１４０アミノ酸及び、（ｂ）一連のＺ１−Ｚ２−Ｚ３属の０、１、２又は３のアミノ酸からなる群から選択され、ここにおいて、Ｚ１は、Ｇ及びＤからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｌ及びＫからなる群から選択され；
Ｚ３は、Ｓ、Ｔ及びＫからなる群から選択される。）
【０００５】
第２の態様において、本発明は、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療および／または抑制するのに十分な量の、一般式Ｉ：Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ  Ｘ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６）による配列を含むポリペプチドをそれを必要とする個体に投与することを含み、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療および／または抑制する方法を提供する。
（前記一般式において、Ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１及び１４間の熱ショックタンパク質２０の配列の０−１４アミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン・アナログ及びホスホチロシン・アナログからなる群から選択され；
Ｘ３は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０の  ０−１４０アミノ酸、及び（ｂ）一連のＺ１−Ｚ２−Ｚ３属の０、１、２または３アミノ酸からなる群から選択され、ここにおいて、Ｚ１は、Ｇ及びＤからなる群から選択される。）
【０００６】
本発明の第１および／または第２態様の各種の実施例において、それを必要とする個体は、アジア系またはアフリカ系であり、および／または、それを必要とする個体が標的組織において、ＴＧＦβ１発現、ＴＧＦβ２発現、ＣＴＧＦ発現、リン酸化コフィリン、リン酸化ＨＳＰ２７、及びα−平滑筋肉アクチン発現からなる群から選択される一つ以上の生体指標の高いレベルを有する。
【発明の詳細】
【０００７】
主に本願明細書において、アミノ酸のための単文字指定が使われる。当業者によって周知のとおり、その単文字指定は、次の通りである：
Ａは、アラニンであり；  Ｃは、システインであり；  Ｄは、アスパラギン酸であり；  Ｅは、グルタミン酸であり；  Ｆは、フェニルアラニンであり；  Ｇは、グリシンであり；  Ｈは、ヒスチジンであり；  Ｉは、イソロイシンであり；  Ｋは、リジンであり；  Ｌは、ロイシンであり；  Ｍは、メチオニンであり；  Ｎは、アスパラギンであり；  Ｐは、プロリンであり；  Ｑは、グルタミンであり；  Ｒは、アルギニンであり；  Ｓは、セリンであり；  Ｔは、トレオニンであり；  Ｖは、バリンであり；  Ｗは、トリプトファンであり；及び、Ｙはチロシンである。
【０００８】
ここで使用しているように、文脈が特にはっきり指図しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数形の指示物も含む。例えば、「ポリペプチド」への言及は、一つ以上のポリペプチドを意味する。
【０００９】
ここの開示は、本発明の方法に用いられるポリペプチドが、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）−誘導結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）発現を減少させ、関連するコラーゲン合成を減少させることを証明する。効果は、細胞形態学における変化（星形形態及び張線維の分裂）に関連する。アクチン細胞骨格がＣＴＧＦ発現のために完全でなければならないという理由から、細胞骨格力学を変更する本発明のポリペプチドの能力が、ケロイド線維芽細胞内のＣＴＧＦレベルの減少に重要な意味を持つことを示した。ＣＴＧＦが発育及び線維症反応の保全において中心的な役割を果たすので、本発明の方法は、ケロイド及び広い範囲の線維性疾患を治療するのに広く適用できる。
【００１０】
したがって、一つの形態において、本発明は、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される線維性疾患及び／または傷跡を治療および／または抑制するのに十分な量の、一般式Ｉ：Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ  Ｘ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６）による配列のポリペプチド構成及び成分をそれを必要とする個体に投与することからなる、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される線維性疾患及び／または傷跡を治療および／または抑制する方法を提供する。
（前記一般式において、Ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１及び１４間の熱ショックタンパク質２０の配列の０−１４アミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン・アナログ及びホスホチロシン・アナログからなる群から選択され；
及び、Ｘ３は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０の  ０−１４０アミノ酸、及び（ｂ）一連のＺ１−Ｚ２−Ｚ３属の０、１、２または３アミノ酸からなる群から選択され；ここにおいて、Ｚ１は、Ｇ及びＤからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｌ及びＫからなる群から選択され；
及び、Ｚ３は、Ｓ、Ｔ及びＫからなる群から選択される。）
【００１１】
好ましい実施例において、Ｘ１は、ＷＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり；  Ｚ１は、Ｇであり；  Ｚ２は、Ｌであり；  Ｚ３はＫである。本実施例において、一般式のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３００（ＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ）に基づくアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、そこにおいて、「ｐＳ」はリン酸化セリン残基を示すことが好ましい。別の好ましい実施例において、本発明の方法に用いられるポリペプチドは、式に従うアミノ酸配列：Ｂ１−ＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ−Ｂ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１７）を含むかまたは同アミノ酸配列から構成され、ここにおいて、少なくとも一つのＢ１及びＢ２が、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）からなる群から選択される。
【００１２】
ある実施例において、「それを必要とする個体」は、ケロイド及び肥厚性瘢痕および／または線維性疾患からなる群から選択される傷跡形成になるかまたは、ケロイド及び肥厚性瘢痕および／または線維性疾患からなる群から選択される傷跡形成をもたらした傷を負うかまたは苦しまれる個体である。ここで使用しているように、用語「傷」は、広く皮膚及び皮下の組織の怪我を指す。そのような傷は、裂傷、熱傷、穿刺、褥瘡、床擦れ、口腔潰瘍、外傷、咬傷、瘻管、潰瘍、伝染によって生じる疾患、歯周病、歯内傷、口腔しゃく熱症候群、開腹傷、外科創傷、切開傷、熱傷の後の痙縮、及び表面外科手術から起こる傷を含むが、これだけに限定されるわけではない。
【００１３】
ここで使用しているように、「ケロイド」は、治療された皮膚損傷の部位における組織の発育過多をもたらす傷跡である。ケロイドは、通常ひどい痒さ、激痛及び肉質の変化を伴う。ひどいケースにおいて、それは皮膚の動きに作用することもある。ここで使用しているように、「肥厚性瘢痕」は、最初の傷の境界を越えて育たなくて、時間とともに還元する隆起傷跡である。
【００１４】
ここで使用しているように、表現「ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される還元傷跡形成」とは、患者に治療的または表面利点を提供し、ケロイドまたは肥厚性瘢痕形成のあらゆる減少を意味する。そのような治療的または皮膚表面利点は、例えば、本発明の方法による治療がない場合に、ケロイドまたは肥厚性瘢痕の形成について、ケロイドまたは肥厚性瘢痕のサイズおよび／または深さを減少させることによって、または既存のケロイドまたは肥厚性瘢痕のサイズを還元することによって、達成されることができる。
【００１５】
本願発明は、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡形成を還元する、方法を提供することによって、ケロイド及び肥厚性瘢痕の形成を縮小する臨床的に全ての種類の傷の治療、最初のケロイドまたは肥厚性瘢痕の形成の縮小、及び既存のケロイドまたは肥厚性瘢痕の治療学上の治療（すなわち：形成後のケロイドまたは肥厚性瘢痕の切断、本発明の化合物によるその治療、及びケロイドまたは肥厚性瘢痕の慢性治療）のために役立つ。
【００１６】
好ましい実施例において、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される傷跡を治療または制限する必要がある個体は、大いに有色人種であり、アジア人またはアフリカ血統の個体を含むがこれだけに限るわけではなく、ケロイド及び肥厚性瘢痕に影響されやすく、したがって、ケロイドまたは肥厚性瘢痕の発育を抑制するとともに、ケロイドまたは肥厚性瘢痕を治療する予防治療のために、本発明の方法から恩恵をうけることができる。
【００１７】
各種の他の好ましい実施例において、線維性疾患を治療または限定のための治療を必要とする個体は、組織線維症以外の症状（原因不明の肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、腹膜後腔線維症、嚢胞性線維症、血管線維症及び心臓の組織線維症及び、その他を含む）、糖尿病性ネフロパシ、糸球体硬化症及びＩｇＡネフロパシ（腎臓機能不全の原因、及び透析及び再移植のためのニーズ）、糖尿病性網膜症及び黄斑変性（目の線維症及び盲目の主要な原因）、肝硬変及び胆汁閉鎖症（肝臓線維症及び肝不全の主要な原因）、鬱血性心不全、肺線維症、硬皮症、腹部癒着、及び間質性線維症などを含む、ＴＧＦβ−誘導ＣＴＧＦ発現と関連している一つ以上の線維性疾患になる危険性または苦しみを有する患者である。
【００１８】
本願明細書において開示される全ての実施例の各種の他の好ましい実施例において、ケロイド及び肥厚性瘢痕からなる群から選択される線維性疾患および／または傷跡を治療および／または制限のための治療を必要とする個体は、一つ以上の高いレベルの下記生体指標を有する人である：
形質転換成長因子受容体β１（「ＴＧＦβ１」）発現、
形質転換成長因子受容体β２（「ＴＧＦβ２」）発現、
結合組織成長因子（「ＣＴＧＦ」）発現、
リン酸化コフィリン、
リン酸化ＨＳＰ２７、及び
α−平滑筋肉アクチン発現。
【００１９】
下記で開示されたとおり、本発明のポリペプチドは、ヒト・ケロイド線維芽細胞におけるＴＧＦβ１−誘導ＣＴＧＦ発現、α−ＳＭＡのＴＧＦβ１−誘導発現及びリン酸化コフィリン及びリン酸化ＨＳＰ２７を抑制し、線維症状況における前記指標の数値の上昇は、これらの生体指標の高値のレベルを有する個体が、特に本発明の方法から利益を得ることができることを示す。ここで使用しているように、一つ以上生体指標の「高値の」レベルは、その個体、又は適切な標的組織において同様の状態にある個体の標準を越えるいかなる増加を意味する。そのような標的組織は、上記に開示されたもの（皮膚、腎臓、肺、肝臓、腹膜、血管、心臓、網膜、その他）を含むがこれだけに限らない線維症に影響を受ける組織から取り出される生検、傷滲出液、血液を含むがこれだけに限らない線維症状況に影響を受けるものである。各種の更なる実施例において、それを必要とする個体は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％または上記通常レベルより高い列挙された生体指標の一つ以上のレベルを有するものである。一つ以上の生体指標レベルを決定することは、開示された下記の内容を含むがこれだけに限らないタンパク質および／または遺伝子発現を測定するための従来技術における標準技術を使用して、行われることができる。
【００２０】
これらの一つ以上の生体指標の「通常の」レベルは、いかなる適切な手段によって確立されてもよく、それは、その個体、または線維症状況および／またはケロイドの非存在下の同様に状態にある個体の通常のレベルを決定すること、または参考のための標準を確立する他のいかなる適切な手段を含むがこれだけには限らない。
【００２１】
ここで使用しているように、用語「治療」または、「治療する」は、以下の一つ以上を達成することを意味する：（ａ）疾患のひどさを減らす；（ｂ）治療される疾患の症状特性の発症を限定又は防止する；（ｃ）治療される疾患の症状特性の悪化を抑制する；（ｄ）以前疾患を有した患者の疾患の再発を限定又は防止する；（ｅ）すでに疾患前兆を示した患者の症状の再発を限定または予防する。
【００２２】
ここで使用しているように、用語「制限」または「抑制する」は、個体の疾患を発病する危険を抑制することを意味する。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、本発明の治療方法の効果をモニタするための方法を提供し、その方法は、本願明細書において開示されるとおりに個体を治療すること、及び下記生体指標の一つ以上のレベルをその後に決定することを含む：
ＴＧＦβ１発現；
ＴＧＦβ２発現；
ＣＴＧＦ発現；
リン酸化コフィリン；
リン酸化ＨＳＰ２７；
及びα−平滑筋肉アクチン発現。
【００２４】
これらの実施例において、一つ以上の生体指標のレベルが、治療前のレベルを確立するための治療の前に測定され、治療後の生体指標レベルの測定が後に続くのが好ましい。その後の生体指標レベル測定のためのタイミングは、主治医によって役立つと考えられる間隔で良い。（即ち、治療後に週一度、週二度、一週おきに、その他に）。治療の有効性が、個体によって経験される症状に対する効果によって確立されることができると共に、生体指標レベルのモニタリングは、追求する治療法を決定する際に主治医に有益である、治療の有効性に関する追加的な情報を提供することができる。例えば、治療法が、個体の症状に顕著な改善を引き起こさなかった場合でも、生体指標レベルは、治療が生体指標レベルを減らし、そして、医師が同じ投薬量及び頻度で治療法を続けることを決めてもよいことを示す。あるいは、症状または生体指標レベルが治療によってインパクトを与えられていない場合、主治医は、投薬量および／または頻度を増やすかまたは組合せ治療を追求することに決めてもよい（ＴＧＦβ−抗体治療、および／またはα−平滑筋アクチン発現を抑制するように、および／またはＨＳＰ２７および／またはコフィリンを脱リン酸化するよう意図されている治療を含むがこれに限らない。）。
【００２５】
一般式からすると、ＨＳＰ２０の残基１６で置換可能なＨＳＰ２０からの残基１５−２１は、一般式Ｉ（Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）によるポリペプチドの構造上のコアを形成する。ＨＳＰ２０の完全な配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８として提供され、下で示される：
Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ。
【００２６】
下線を引かれた残基は、アミノ酸１５−２１を示す。
【００２７】
Ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１及び１４間のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の０−１４アミノ酸である（上のイタリック体にて示される）。したがって、もしＸ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の１及び１４残基の５アミノ酸である場合、Ｘ１は残基１５−２１に隣接する５アミノ酸であり、例えば：ＳＷＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）である。同様に、Ｘ１がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基１−１４のアミノ酸の以下の数字である場合、その本体は下記で示される：
１アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  Ｒ
２アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＲＲ
３アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）
４アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
６アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）
７アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６）
８アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＶＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７）
９アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＰＶＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８）
１０アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＶＰＶＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）
１１アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＰＶＰＶＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１０）
１２アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＩＰＶＰＰＶＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１１）
１３アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＥＩＰＶＰＰＶＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２）
１４アミノ酸  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８：  ＭＥＩＰＶＰＰＶＮＰＳＷＬＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）
【００２８】
他の実施例で、Ｘ１は、配列ＷＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の０、１、２、３、または４アミノ酸である。
【００２９】
他の一実施例において、Ｘ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０間の０−１４０アミノ酸である。この実施例によれば、Ｘ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０間の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３  ８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９又は１４０アミノ酸であることができる。
【００３０】
例えば、Ｘ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９８の残基２１及び１６０間の５アミノ酸である場合、Ｘ３は残基１５−２１に隣接する５アミノ酸であり、例えば：ＧＬＳＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４）である。他の可能なＸ３配列は、本願明細書において提供される教示に基づいて当業者にとって明らかである。
【００３１】
他の一実施例において、Ｘ３は一連の属Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３の０、１、２または３アミノ酸であり、ここでＺ１はＧ及びＤからなる群から選択され；  Ｚ２は、Ｌ及びＫからなる群から選択され；  Ｚ３はＳ、Ｔ及びＫからなる群から選択される。
【００３２】
例えば、Ｘ３が属Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３の配列の２アミノ酸である場合、Ｘ３の可能性はＧＬ、ＧＫ、ＤＬ及びＤＫである。本実施例における可能な他のＸ３配列は、本願明細書において提供される教示に基づいて当業者にとって明らかである。
【００３３】
一般式Ｉのポリペプチドの各種の実施例によれば、Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、ホスホセリン模倣体またはホスホチロシン模倣体である。Ｘ２がＳ、ＴまたはＹであることが、好まれ；より好ましくはＸ２がＳまたはＴであり、Ｘ２がＳであることが一番好ましい。Ｘ２がＳ、ＴまたはＹであるこれらの実施例において、Ｘ２がリン酸化されることが、最も好適である。Ｘ２がＤまたはＥであるときに、これらの残基はリン酸化状態を模倣する負電荷を有する。Ｘ２がリン酸化、ホスホセリンまたはホスホチロシン模倣体であるかまたはリン酸化アミノ酸残基（例えばＤまたはＥ残基）の別の模倣体である場合に、一般式Ｉのポリペプチドは、最適に本発明の方法に効果的である。模倣体ホスホセリンの実施例は、スルホセリン、リン酸塩酸素のためのメチレン置換を含んでいるアミノ酸模倣体、４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアナリン、及び  Ｌ−２−アミノ−４−（ホスホノ）−４，４−ジフルオロブタン酸を含むが、これに限定されるわけではない。他のホスホセリン模倣体は、当業者によって作られることができる。ホスホチロシン模倣体の実施例は、ホスホノメチルフェニルアラニン、ジフルオロホスホノメチルフェニルアラニン、フルオロ−Ｏ−マロニルチロシン及びＯ−マロニルチロシンを含むが、これに限定されるわけではない。
【００３４】
したがって、これらの各種の実施例によれば、本発明の方法ための一般式Ｉに基づくポリペプチドの代表的なサンプルは、以下の配列を含むかまたは以下の配列から構成されるポリペプチドを含むが、これに限定されるわけではない：（ＡＳＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ    ＩＤ  ＮＯ：３）；  （ＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ    ＩＤ  ＮＯ：４）；  （ＲＡＳＡＰＬＰ） （ＳＥＱ    ＩＤ  ＮＯ：５）；  （ＲＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ    ＩＤ  ＮＯ：６）；      （ＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ    ＩＤ  ＮＯ：７）；  （ＲＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ    ＩＤ  ＮＯ：８）；（ＲＲＡＳＡＰＬＰ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；    （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰ）；  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）  （ＲＲＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）；  ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）；  （ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）；  （ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）；  （ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）；  （ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）；  （ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）；  （ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）；  （ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；  （ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）；  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）；  及び  （ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）；    （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰ）；  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫ）］  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＳ）；  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＴ） （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）Ｒ
ＲＡＳＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ））ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＳＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２００）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＴＡＰＬＰＤ���Ｔ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６８）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７１）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７２）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧ��Ｓ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＧＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７５）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＬＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６）；  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＳ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７）；及び  （（Ｆ／Ｙ／Ｗ）ＷＬＲＲＡＹＡＰＬＰＤＫＴ）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７８）。ここにおいて、（Ｆ／Ｙ／Ｗ）は、残基がＦ、Ｙ及びＷから選ばれることを意味する。一般式Ｉの範囲内である他の特定のポリペプチドは、本願明細書における教示に基づいて当業者が容易に想到可能であることは明らかである。
【００３５】
本発明の方法に使われるために、強化の有効性を提供するため、一般式Ｉのポリペプチドは、多数のコピーに存在してもよい。例えば、ポリペプチドは１、２、３、４または５コピーに存在してもよい。他の実施例において、一般式Ｉに従う配列を含んでいるポリペプチドは、範囲Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ−Ｘ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６）から異なる配列の組合せを含む。本実施例において、例えば、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のコピー、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３のコピーから構成されることができる。異なる実施例において、ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２００の２コピー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２の３コピーから構成されることができる。多数の、そのような組合せが、本願発明の教示に基づいて可能であることは、当業者にとって明らかなことである。
【００３６】
好ましい実施例において、一般式Ｉに基づくポリペプチドは、一つ以上の導入ドメインを更に含む。ここで使用しているように、用語「導入ドメイン」は、細胞膜を横切ってポリペプチドを伝達できるアミノ酸配列を意味する。これらのドメインは、細胞膜全体に結合されたポリペプチドの動きを導くために他のポリペプチドにリンクされることができる。場合によっては、変換分子は、共有結合して活性ポリペプチドに結合される必要はない。好ましい実施例において、導入ドメインは、ペプチド結合によって、他のポリペプチドにリンクされる。そのような導入ドメインの例は、（Ｒ）４−９  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９）；  ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０）；  ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）；  ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２）；  ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８３）；  ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８４）；  ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８５）；  ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８６）；  ＶＴＶＬＡＬＧＡＬＡＧＶＧＶＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８７）；  ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８８）；  ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＬＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８９）；  ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９０）；  ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９１）；  ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９２）；  ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＡＡＧＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９３）；  ＡＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９４）；  ＫＡＦＡＡＬＡＡＲＬＹＲＫＡＧＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９５）；  ＫＡＦＡＫＬＡＡＱＬＹＲＫＡＧＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９６），  ＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７），  及び  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）を含むが、これに限定されるものではない。
【００３７】
他の実施例において、ポリペプチドは式Ｂ１−Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ−Ｘ３−Ｂ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１９）のポリペプチドを含むかまたは同ポリペプチドから成る。ここで、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、上記の定義通りであり、そして、Ｂ１及びＢ２は、それぞれ上記通りの導入ドメインを含むかまたは欠ける。
【００３８】
好ましい実施例において、Ｂ１およびＢ２の一方または両方は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９９）および／またはＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）のアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる。最も好ましい実施例において、本願明細書において開示される一般式に一致したポリペプチドは、ポリペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０１）またはＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＷＬＲＲＡｐＳＡＰＬＰＧＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５）を含むかまたはから構成され、ここで、「ｐＳ」はリン酸化セリン残基を示す。
【００３９】
本発明の方法の更なる実施例において、ポリペプチドは下記式のポリペプチドを含むかまたは同ポリペプチドから構成される：Ｊ２−Ｘ１−Ａ（Ｘ２）ＡＰＬＰ−Ｘ３−Ｊ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２１）ここでＸ１、Ｘ２及びＸ３は上記の定義通りであり、ここでＪ２及びＪ３はそれぞれ上記通りの導入ドメインを含むかまたは欠ける。
【００４０】
本発明の方法に用いられるポリペプチドは、強化された半減期を提供するために、例えば、ポリエチレングリコールとつながることによって更に誘導体化されることができる。本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸（これは、インビボにおいてＬ−アミノ酸特有のプロテアーゼに耐性がある）、Ｄ−及びＬ−アミノ酸の組合せ、及び特別な特性を伝達する各種の「デザイナー」アミノ酸（例えばβ−メチル・アミノ酸、Ｃα−メチル・アミノ酸及びＮα−メチル・アミノ酸、その他）を含んでもよい。合成アミノ酸は、リジンのためのオルニチン及びロイシンまたはイソロイシンのためのノルロイシンを含む。
【００４１】
加えて、ポリペプチドは新しい特性を有するポリペプチドを生産するためにペプチド模倣結合、例えばエステル結合を有することができる。例えば、減らされたペプチド結合を組み込むペプチドが、生成されることができ、すなわち、Ｒ１及びＲ２がアミノ酸残基または配列であるＲ１−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２である。減らされたペプチド結合は、ジペプチド・サブユニットとして導入されてもよい。そのようなポリペプチドは、プロテアーゼ活性に耐性があり、インビボにおいて拡張半減期を所有する。
【００４２】
用語「ポリペプチド」が、アミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣薬の一連のサブユニットを指すことに、最も広義に使われる。ポリペプチドが更なる半分を含むことができ、それがペプチド結合によって必ずしもポリペプチドにリンクされるというわけではないにも関わらず、サブユニットは、ペプチド結合によって連結される。例えば（上記のように）、ポリペプチドは芳香族のリングを含む非アミノ酸分子を更に含むことができる。
【００４３】
本願明細書において記載されているポリペプチドは、化学的に合成されるかまたは遺伝子技術によって発現されてもよい。組み換え型発現は、従来技術における標準の方法を使用して達成されることができるが、それは発現媒体動物へポリペプチドの発現を導くことができる核酸配列のクローニングを一般に含むことであり、それは、ポリペプチドの発現を実行するための細胞機構を提供するために、宿主細胞をトランスフェクションまたは変換させるために用いることができる。そのような発現ベクトルは細菌またはウィルス発現ベクトルを含むことができるとともに、そのような宿主細胞は原核または真核であることができる。
【００４４】
好ましくは、本発明の方法に用いられるポリペプチドは、化学的に合成される。固相、液相の周知技術またはペプチド凝結技術またはそれらのいずれかの組合せを使用して調製される合成ポリペプチドは、天然及び非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成のために使用されるアミノ酸は、標準の脱保護を有する標準のＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護のＮα−ｔブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、中和、標準の固相手順の結合及び洗浄プロトコル、または塩基変化  Ｎα−アミノ保護の９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってもよい。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃ  Ｎα−アミノ被保護アミノ酸は、シグマ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、または当業者によく知られている他の化学会社から取得されることができる。加えて、ポリペプチドは、当業者によく知られている他のＮα−保護群によって合成されることができる。
【００４５】
固相ペプチド合成は、自動シンセサイザを用いて、当業者によく知られている技術によって達成され、提供される。
【００４６】
ここで使用しているように、一つ以上のポリペプチドの「効果的な量」は、治療の意図された利点を提供するのに十分な量である。使用されることができるポリペプチドの効果的量は、一般的に約０．０１μｇ／ｋｇ比体重及び約１０ｍｇ／ｋｇ比体重の間で変動し、好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ及び約５ｍｇ／ｋｇ比体重の間で変動する。しかし、投薬量レベルは、様々な要素に基づくものであり、損傷のタイプ、世代、重量、性別、個体の医学状態、状態のひどさ、投与のルート及び使用される特定の合成物である。したがって、用量は広く変化してもよく、標準の方法を使用している医師によって通常決定されることができる。
【００４７】
ポリペプチドは、殺菌のような従来の製薬工程に委ねられてもよく、および／または、例えば防腐剤、スタビライザ、湿潤剤、乳化剤、バッファなどの通常アジュバントを含んでもよい。
【００４８】
投与のために、ポリペプチドは通常投与の表示ルートに適当な一つ以上のアジュバントと結合される。合成物は、ラクトース、蔗糖、澱粉粉、アルカン酸、ステアリン酸、タルク、マグネシウム・ステアリン酸塩、酸化マグネシウムのセルロース・エステル、リン酸及び硫黄酸のナトリウム及びカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、デキストラン硫酸塩、ヘパリン含有ゲルおよび／またはポリビニルアルコールと混ぜられてもよく、通常の投与のために錠剤にされるかまたはカプセル化されてもよい。あるいは、本発明の合成物は、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチル・セルロース・コロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、胡麻油、トラガカントゴムおよび／または各種のバッファにおいて分解されてもよい。投与の他のアジュバント及びモードが、製薬技術で周知である。キャリアまたは希釈剤は、例えば、グリセリル・モノステアリン酸またはグリセリル・ジステアリン酸またはワックスを有するグリセリル・ジステアリン酸、または公知技術の他の材料のような遅延材料を含んでもよい。
【００４９】
ポリペプチドまたはその製薬配合は、口で、親から、吸入噴霧、直腸にまたは、通常の薬学的に受け入れられるキャリアを含む投薬量ユニット処方、アジュバント及び媒体を含むいかなる適切なルートによって投与されてもよい。本願明細書において使用する期間非経口は、皮下、静脈、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、髄腔内、頭蓋内、胸腔内、または、腹膜組織内注入技術を含む。投与のための好ましい実施例は、治療状態に関連して変化する。好ましい実施例において、ポリペプチドまたは製薬配合は、創傷被覆材または他の局所性投与に配置される。そのような創傷被覆材は、従来技術において使用されるいずれかであることができる。具体的に、フィルム（例えばポリウレタン・フィルム）、親水コロイド（ポリウレタン・フォームに結合される親水性コロイド粒子）、ヒドロゲル（少なくとも６０％の水を含んでいるクロスリンクされたポリマー）、フォーム（泡沫）（親水性または疎水性）、カルシウム・アルギン酸塩（カルシウム・アルギン酸塩からのファイバの不織布複合物）、セロハン、及び例えば米特許出願公開第２００３０１９０３６４号明細書（２００３年１０月９日公開）に記載されている生物学的ポリマーなどを含むがこれに限らない。
【００５０】
ポリペプチドは、固体の状態（微粒、粉または坐薬を含む）、または液体の状態（例えば溶液、懸濁液またはエマルジョン）で構成されてもよい。本発明のポリペプチドは、様々な溶液において利用されてもよい。本発明に基づく方法に適切な溶液はポリペプチドの充分な量を殺菌、分解し、提案された利用のために有害でない。
【実施例１】
【００５１】
ケロイド及び肥厚性瘢痕は、線維増殖性異常回復疾患であり、過剰産生、細胞外基質の堆積及び収縮のための過剰傷によって特徴づけられ、それは、機能的及び表面奇形になる（Ｌｅａｓｋ及びＡｂｒａｈａｍ  ２００４）。現在この状況の効果的な治療法はない。
【００５２】
負傷−治療カスケードを始めることに関係している一次制御因子のうちの１つが、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βである。３つの指定される哺乳類イソ型、ＴＧＦ−β１、−β２及び−β３がある。ＴＧＦ−βは、細胞状況及び表示されたイソ型のバランスに依存する効果的多機能分子である。ＴＧＦ−β３が抗線維症機能を有してもよいのに対して、ＴＧＦ−β１は、線維症反応の開始に関与していると思われる（Ｌｅａｓｋ及びＡｂｒａｈａｍ、２００４、Ｍｉｌｌｅｒ及びＮａｎｃｈａｈａｌ、２００５）。
【００５３】
線維芽細胞において、ＴＧＦ−βは、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の発現を刺激する。ＣＴＧＦは、ＴＧＦ−βの下流の媒体として作用するシステインに富むペプチドであり、線維芽細胞増殖、胞外基質製造（コラーゲン及びフィブロネクチン含有）及び肉芽組織形成を促進する（Ｄｕｎｃａｎ他、１９９９、Ｌｅａｓｋ及びＡｂｒａｈａｍ、２００４）。ＣＴＧＦの発現は、さらに組織損傷において発散される他の合成物、例えばトロンビン及びエンドセリンによって調整され（Ｃｈａｍｂｅｒｓ他、２０００、Ｓｈｉ−Ｗｅｎ他、２００４、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｔａ他、２００５）、したがって、細胞−マトリックス・サイトカイン相互作用の複合のネットワークが、傷が治る過程及び病理学的線維性疾患の開始を調整することを提案する（Ｄｕｎｃａｎ他、１９９９）。ケロイド及び肥厚性瘢痕におけるＣＴＧＦの過剰発現がＴＧＦ−βへの線維化誘導性反応を強化するので、ＣＴＧＦは、傷跡線維症の病因に関与すると考えられている（Ｃｏｌｗｅｌｌ他、２００４）。それゆえに、ＣＴＧＦ発現の封鎖は、結合組織細胞増殖及びマトリックス堆積を予防することによって、病理学的傷の線維増殖性反応を減らすことができると考えられる。
【００５４】
サイトカイン及びプロテアーゼに加えて、細胞構造における変更態様は、ＣＴＧＦの発現に影響を及ぼす。したがって、微小管を崩壊させ、ＲｈｏＡを起動させ、アクチン・ファイバを安定させる薬品は、腎臓線維芽細胞のＣＴＧＦ発現を増やすことが証明されたが、アクチン解重合に導く薬品（例えばラトランクリン）は、ＣＴＧＦ発現を減少させた（Ｏｔｔ他、２００３）。
【００５５】
タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と呼ばれているペプチド・キャリアに結合されるＰ２０ペプチド（熱ショックタンパク質２０に対するリンペプチド・アナログ）が、細胞に透過し、血清またはリゾホスファチジン酸による刺激に対して繊維応力形成を抑制するこたが最近証明された（Ｄｒｅｉｚａ他、２００４）。これは、Ｐ２０ペプチドによる細胞骨格分裂が、ＣＴＧＦ形成を抑制し、線維増殖性状況を抑制できることを仮定させた。この仮説を検証するために、我々はＰＴＤ−Ｐ２０ペプチド処理がＴＧＦ−β刺激ケロイド線維芽細胞によって、ＣＴＧＦ及びコラーゲン発現を減らすかどうか調査した。
【００５６】
方法
線維芽細胞培養物：
ヒト・ケロイド線維芽細胞は、１０％のＦＢＳ及び追加的なペニシリン及びストレプトマイシン（１％）でＤＭＥＭの７０％の集合に、３７℃及び１０％のＣＯ２で１０ｃｍ２皿において育てられた。細胞は、実験の前に４８時間、０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭにおいて血清飢餓培養された。分析の開始時に、新しい培養基が、皿に加えられ、細胞は、ＴＧＦ−β１、（０．６から５ｎｇ／ｍＬまで変動している投与）、Ｐ２０リンペプチド（５０−２００μＭで変動している投与）、ホルスコリン（１０μＭ、ＦＳＫ）またはＳＮＡＰ（５００μＭ）で２４時間非処理（対照）または処理される。血清飢餓の影響を検査するために、我々はさらに培養基（対照の高い血清）を含んでいる１０％のＦＢＳで細胞を処理した。
【００５７】
ウエスタンブロット法分析：
実験終了後、細胞はＰＢＳで洗い落され、ＵＤＣバッファを使用して均質にした。溶解物は、混合され、２０分間遠心分離機で分離され（６０００×ｇ）、上澄みは、ＣＴＧＦ及びコラーゲン発現の判定のために使われた。サンプル（２０μｇのタンパク質）は、１５または１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せられ、タンパク質は電気泳動法でイモビロン膜組織へ転送された。非特異的結合を抑止するために、膜組織は、１：１（ｖ／ｖ）トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）ブロッキングバッファ（オデッセイ）で培養され、ＣＴＧＦ（トーリー・パイン）及びコラーゲン（皮質）に対する一次抗体で室温で１時間染色され、ＴＢＳで３回洗浄された。続いて、膜組織は、第２の抗ウサギ及び抗マウス抗体によって培養され、トゥイーンを含んでいるＴＢＳによって洗浄された。タンパク質−抗体複合体は、オデッセイ直接的赤外線蛍光性画像処理システム（Ｌｉ−Ｃｏｒ，  Ｌｉｎｃｏｌｎ，  ＮＥ）を使用して視覚化された。
【００５８】
免疫細胞学：
ヒト・ケロイド線維芽細胞は、２．５ｘ１０５の細胞／ウェルでのカバースリップで６−ｗｅｌｌウェルに育てられた。それらは、２４時間飢餓培養され、その後興奮剤で処理される。非処理（対照）またはＴＧＦ−β１（１．２または２．５ｎｇ／ｍＬ）および／またはＰ２０リンペプチド（５０Ｍ）で処理された細胞は、４％のパラホルムアルデヒドによって取り付けられ、０．１％のトリトンＸによって透過処理された。細胞は、それからアクチン・フィラメントを視覚化するためにＡｌｅｘａ  ３５０  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色された。蛍光イメージは、ＵＶフィルタ及びツァイス・ソフトウェアを備えているツァイス顕微鏡を使用して取得された。
【００５９】
統計分析：
全ての数値データは、３−６実験から平均値標準偏差として示される。Ｔｕｋｋｅｙ事後試験が続く分散分析が、実験群を比較するために用いられた。有意水準は、ｐ＜０．０５にセットされた。
【００６０】
結果
ＴＧＦ−β１及びＣＴＧＦ発現：
ヒト・ケロイド線維芽細胞は、４８時間０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培養基において飢餓培養され、２４時間ＴＧＦ−β１の異なる投与によって処理される。ＣＴＧＦ発現は、違いをロードすることを修正するために、ウエスタンブロット法の濃度学によってＧＡＰＤＨ発現と関連づけられる。対照セルのＣＴＧＦの発現は、異なる弱点の比較のために１にセットされた。データは、２４時間の用量依存的ＴＧＦ−β１処理が、ヒト・ケロイド線維芽細胞の（２．１−から４．６−フォールド）ＣＴＧＦ発現を強化したことを証明した。
【００６１】
Ｐ２０処理及びＣＴＧＦ発現：
ヒト・ケロイド線維芽細胞は、４８時間０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培養基において飢餓培養され、１．２から５ｎｇ／ｍＬまで変動しているＴＧＦ−β１投与によって刺激され、２４時間Ｐ２０リンペプチド（５０、１００または２００μＭ）で付随して処理される。ウエスタンブロット法バンドは、濃度学によって定量化され、ＣＴＧＦ発現は、違いをロードするために修正するＧＡＰＤＨ発現と関連づけられた。対照細胞のＣＴＧＦの発現は、異なる弱点の比較のための１にセットされた。データは、ＰＴＤ−Ｐ２０（ｐ＜０．０５）処理が、ケロイド線維芽細胞におけるＴＧＦ−β１−誘導ＣＴＧＦ発現をかなり減らしたことを示す。５３％及び２９％の減少は、それぞれ、１．２及び２．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１のために観察された。他方、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１が細胞を刺激するために用いるときに、より高い投与（１００及び２００μＭ）で使われるときでも、ＰＴＤ−Ｐ２０処理はＣＴＧＦ発現を減らさなかった。
【００６２】
Ｐ２０処理及びコラーゲン製造：
ＰＴＤ−Ｐ２０処理が１．２及び２．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１によって刺激される細胞におけるＣＴＧＦ発現を減らしたことを観測して、我々はコラーゲン合成が同様に減らされるかどうか、次に調査した。ヒト・ケロイド線維芽細胞は、４８時間０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培養基において飢餓培養され、１．２から２．５ｎｇ／ｍＬまでのＴＧＦ−β１投与によって刺激され、２４時間Ｐ２０リンペプチド（５０μＭ）で付随して処理される。ウエスタンブロット法バンドは、濃度学によって定量化され、コラーゲン発現は、違いをロードするために修正するＧＡＰＤＨ発現と関連づけられた。対照細胞のコラーゲンの発現は、異なる弱点の比較のために１にセットされた。データは、ＰＴＤ−Ｐ２０処理が、４８％までコラーゲン合成を減らしたことを証明する。
【００６３】
環状アデノシン一リン酸及び環状ＧＭＰを高める合成物による処理：
我々は、次にケロイド線維芽細胞におけるＣＴＧＦ発現上の環状アデノシン一リン酸（ホルスコリン（ＦＳＫ））または環状ＧＭＰ（ＳＮＡＰ）を高める合成物の影響を評価した。ヒト・ケロイド線維芽細胞は、０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培養基において４８時間飢餓培養されて、２．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１投与によって刺激され、付随して２４時間ＦＳＫ（１０μＭ）で処理された。ウエスタンブロット法バンドは濃度学によって定量化され、ＣＴＧＦ発現は違いをロードするように修正するＧＡＰＤＨ発現と関連づけられた。対照細胞におけるＣＴＧＦの発現は、異なるブロットの比較のために１にセットされた。ＦＳＫによるＴＧＦ−β１−刺激線維芽細胞（２．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１投与）の処理は、〜５０％のＣＴＧＦ発現の減少を結果した。非刺激された線維芽細胞がＦＳＫで処理されるときに、非処理の細胞と比較して違いはＣＴＧＦ発現において観察されなかった。他方、ＳＮＡＰによるＴＧＦ−β１−刺激細胞の処理は、ＣＴＧＦ発現を減少させなかった。加えて、非刺激細胞のＳＮＡＰ処理は、非処理の（対照）細胞と比較して、ＣＴＧＦ発現の著しい増加（ｐ＜０．０５（二倍増加））を引き起こした。これらの結果は、ＣＴＧＦ発現に対する抑制効果が環状アデノシン一リン酸を高める薬品のために選択的に見えたことを示している前の報告（Ｄｕｎｃａｎ他、１９９９）に基づく。加えて、最近の研究は、外因性一酸化窒素に対するケロイド線維芽細胞の暴露が、投与依存方法（Ｈｓｕ他、２００６）の増加するコラーゲン発現を引き起こしたことを証明した。
【００６４】
細胞のアクチン細胞骨格でのＰＴＤ−Ｐ２０処理の影響：
ヒト・ケロイド線維芽細胞は０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培養基において４８時間飢餓培養され、そして、ＴＧＦ−β１（１．２または２．５ｎｇ／ｍＬ）および／またはＰ２０（５０μＭ）によって２４時間刺激された。細胞は、それからアクチン細胞骨格上のＰＴＤ−Ｐ２０処理の影響を評価するためにファロイジンで染色された。ＰＴＤ−Ｐ２０処理は、放射状の細胞形態学に導き、非刺激細胞のアクチン細胞骨格を崩壊させ、それらは１．２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１によって刺激される。ＴＧＦ−β１投与が２．５ｎｇ／ｍＬであるときに、この効果は明白ではなかった。
【００６５】
概要
現在、ケロイド及び他の線維性疾患のための効果的治療方法がない。現在、研究された治療学の大部分は、カスケードの信号を送っているＴＧＦ−βの範囲内で細胞表面受容体または酵素を目標とする。我々のグループによって確認されたキナーゼ・カスケードでの下流タンパク質の治療的な使用を提案するという理由から、ここで示される方法は、革新的である。本願明細書において提示される結果は、ＰＴＤ−Ｐ２０が、ＴＧＦ−β１−誘導のＣＴＧＦ発現（ＦＳＫに匹敵するレベル）を減少させ、関連するコラーゲン合成を減らすことを証明する。ＰＴＤ−Ｐ２０の効果は、細胞形態学（繊維応力の放射状形態学及び分裂）の変化に関連した。アクチン細胞骨格がＣＴＧＦ発現のために完全でなければならないという理由から、我々は細胞骨格の動態を変更するＰＴＤ−Ｐ２０の能力が、ケロイド線維芽細胞のＣＴＧＦレベルの減少のための重要な意味を有することを主張する。ＣＴＧＦが発症及び線維症反応の保全において中心的な役割を果たすという理由から、ＰＴＤ−Ｐ２０の使用はケロイド及び他の線維性疾患を処理する潜在的方策を示す。
【００６６】
実施例１の参考文献
Ｌｅａｓｋ  Ａ，  Ａｂｒａｈａｍ  ＤＪ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １８（７）：８１６−２７，  ２００４
Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＣ，  Ｎａｎｃｈａｈａｌ  Ｊ．  ＢｉｏＤｒｕｇｓ，  １９（６）：３６３−８１，  ２００５
Ｄｕｎｃａｎ  ＭＲ，  ｅｔ  ａｌ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １３（１３）：１７７４−８６，  １９９９
Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，１０；２７５（４５）：３５５８４−９１，  ２０００
Ｓｈｉ−Ｗｅｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．，  １５（６）：２７０７−１９，  ２００４
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｔａ  Ｊｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １１１（１９）：２５０９−１７，  ２００５
Ｃｏｌｗｅｌｌ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．，  １１６（５）：１３８７−９０，  ２００５
Ｏｔｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．    Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ２７８（４５）：４４３０５−１１，  ２００３
Ｄｒｅｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １９（２）：２６１−３，  ２００５
Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ．，  １４（４）：３２７−３４，  ２００６
【実施例２】
【００６７】
線維芽細胞は、広く線維症、創傷治癒及び組織修復にかかわるクリティカルな細胞型として認められる。筋線維芽細胞に対する線維芽細胞の形質転換が、それらの機能を実行する細胞のキー、おそらくもっと重要な、イベントであるという概念は、あまり理解されなかった（Ｐｏｗｅｌｌ他、１９９９及びＴｏｍａｓｅｋ他、２００２）。筋線維芽細胞は、α−平滑筋線アクチン（α−ＳＭＡ）を表示し、アクチン・フィラメントから成る収縮装置及び顕著な繊維応力に有機物化される関連するタンパク質を含む平滑筋線維芽細胞である（Ｔｏｍａｓｅｋ他、２００２）。組織ホメオスタシスの通常役割及び修復に加えて、筋線維芽細胞の変更された数及び機能は、増加する細胞外基質（ＥＣＭ）堆積及び結果的線維症の疾患に関わり、例えばそれらは肺（肺線維症）、血管（内膜過形成）、心臓（心臓線維症）及び皮膚（ケロイド）を含む（Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ他、２００３、Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ他、２００５、Ｈｅｗｉｔｓｏｎ他、１９９５、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、１９８９、Ｚｈａｎｇ他、１９９４、Ｎａｕｇｌｅ他、２００６、Ｃｈｉｐｅｖ他、２０００、Ｐｅｐｐｅｒ他、１９９７、Ｈｅｕｓｉｎｇｅｒ−Ｒｉｂｅｉｒｏ他、２００１）。したがって、線維芽細胞から筋線維芽細胞表現型変調の抑制は、興奮剤（例えばＴＧＦβ１及び他の媒体）に応えて、線維症を抑制するために平均値を提供してもよい。
【００６８】
タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と呼ばれているペプチド・キャリアに結合されるＰ２０ペプチド（熱ショックタンパク質２０に対するリンペプチド・アナログ）が、細胞に浸透し、血清またはリゾホスファチジン酸により刺激に対する張線維形成を抑制することが最近証明された（Ｄｒｅｉｚａ他、２００４）。上記のように、このペプチドＰＴＤ−Ｐ２０は、さらにヒト・ケロイド線維芽細胞のＴＧＦβ１−誘導ＣＴＧＦ発現を抑制する。これらの実験において、ＰＴＤ−Ｐ２０の抗線維症活性は、追加的な線維症分子に対する効果を決定することによって更に調べられた：α−ＳＭＡ及びアクチン・アクセサリ・タンパク質コフィリン及びＨＳＰ２７。アクチン・フィラメントを解重合するために脱リン酸化されるときに、コフィリンが活性化されるが、ＨＳＰ２７はリン酸化に活性化され、張線維形成と関連している。したがって、線維症表現型は、コフィリン及びＨＳＰ２７の増加するリン酸化と関連している。これらの結果は、ＰＴＤ−Ｐ２０がα−ＳＭＡのＴＧＦβ１−誘導発現及びコフィリン及びＨＳＰ２７のリン酸化を抑制することを示す。このような情報は、ＰＴＤ−Ｐ２０の治療のメカニズムの理解を増加し、ＰＴＤ−Ｐ２０または線維症疾患状態のいずれかの活性を検出するために用いることができた潜在的生体指標を確認する。
【００６９】
方法
線維芽細胞培養：
ヒト・ケロイド線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ及び追加的なペニシリン及びストレプトマイシン（１％）を有するＤＭＥＭ内の７０％集合に、１０ｃｍ２皿で、３７℃及び１０％ＣＯ２で育てられた。細胞は、実験の前に４８時間０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭにおいて飢餓培養された。分析の開始時に、新しい培養基が皿に加えられ、細胞は、ＴＧＦ−β１（０．６から５ｎｇ／ｍＬまでの投与）、Ｐ２０リンペプチド（５０−２００μＭの投与）、ホルスコリン（１０μＭ、ＦＳＫ）またはＳＮＡＰ（５００μＭ）で２４時間処理されるかまたは処理されない（対照）。血清飢餓の影響を検査するために、我々はさらに培養基（対照、高血清）を含んでいる１０％のＦＢＳに細胞をおいた。
【００７０】
ウエスタンブロット法分析：
実験終了後、細胞はＰＢＳで洗い落され、ＵＤＣバッファを使用して均質化にした。溶解物は混合され、２０分間遠心分離機で分離され（６０００×ｇ）、上澄みはタンパク質発現の判定のために使われた。サンプル（２０μｇのタンパク質）は１５または１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せられ、タンパク質は電気泳動法でイモビロン膜組織へ転送された。非特異的結合を抑止するために、膜組織は、１：１（ｖ／ｖ）トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）：ブロッキングバッファ（オデッセイ）で培養され、室温で、１時間α−平滑筋肉アクチン発現に対する一次抗体、リン酸化ＨＳＰ２７及びリン酸化コフィリンで染色され、ＴＢＳで３回洗浄された。続いて、膜組織は第２の抗ウサギ及び抗マウス抗体によって培養され、トゥイーンを含んでいるＴＢＳによって洗浄された。タンパク質−抗体複合体は、オデッセイ直接的赤外線蛍光性画像処理システム（ｔｈｅ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｌｉ−Ｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用して視覚化された。
【００７１】
統計分析：
全ての数値的なデータは、３−６実験からの平均標準偏差として示される。チューキー後知恵実験に続く分散分析が、実験群を比較するために用いられた。有意水準が、ｐ＜０．０５にセットされた。
【００７２】
結果
Ｐ２０処理及びα−平滑筋肉アクチン発現：
ヒト・ケロイド線維芽細胞が、０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培養基の中で４８時間飢餓培養され、ＴＧＦβ１（２．５ｎｇ／ｍＬ）の有無にかかわらず、ＰＴＤ−Ｐ２０（５０μＭ）で２４時間処理された。α−ＳＭＡ及びβ−アクチンの発現レベルが、ウエスタンブロット法の濃度学によって定量化され、違いをロードするように修正するためにＧＡＰＤＨ発現に正常化された。対照細胞のタンパク質発現が、異なるブロットの比較のために１にセットされた。データは、ＰＴＤ−Ｐ２０（ｐ＜０．０５）処理が、ＴＧＦβ１処理（図１）の有無にかかわらず、ケロイド線維芽細胞においてα−ＳＭＡ発現をかなり減らしたことを示す。他方、ＰＴＤ−Ｐ２０は、その活性がα−ＳＭＡに特有なことを示唆するβ−アクチン発現（キー線維症マーカー）に、影響を及ぼさなかった。
【００７３】
Ｐ２０処理及びＨＳＰ２７及びコフィリンのリン酸化：
ヒト・ケロイド線維芽細胞が、４８時間０．５％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培養基において飢餓培養され、ＴＧＦβ１（２．５ｎｇ／ｍＬ）の有無にかかわらず、ＰＴＤ−Ｐ２０（５０μＭ）で２４時間処理される。リン酸化コフィリン及びＨＳＰ２７の発現レベルは、ウエスタンブロット法の濃度学によって定量化され、違いをロードするために修正するＧＡＰＤＨ発現に正常化された。対照細胞におけるタンパク質発現が、異なるブロットを比較するために１にセットされた。データは、ＰＴＤ−Ｐ２０処理が、コフィリンのＴＧＦβ１−誘導増加及びケロイド線維芽細胞のＨＳＰ２７リン酸化をかなり（ｐ＜０．０５）減らしたことを証明する。完全コフィリン及びＨＳＰ２７（リン酸化プラス非リン酸化）のレベルは、変化しなかった。これらのデータは、ＰＴＤ−Ｐ２０がアクチン細胞骨格に影響を与える多様なレベルでＴＧＦβ１線維症反応を抑制することを示唆する。
【００７４】
概要
本願明細書において提示される結果は、ＰＴＤ−Ｐ２０がＴＧＦβ１−誘導のα−ＳＭＡ発現を低下させ、コフィリン及びＨＳＰ２７のリン酸化を減らすことを証明する。前の結果は、ＰＴＤ−Ｐ２０処理が、細胞形態学（放射状の形態学及び張線維の分裂）の変化及びＣＴＧＦ発現の抑制と関連することを示した。完全なアクチン細胞骨格がＣＴＧＦ発現にとって重要であるので、これらのデータはＰＴＤ−Ｐ２０が細胞骨格の動態を変更することによって線維症反応を抑制することを示唆する。アクチン細胞骨格が、線維症反応の発症及び保全に中心的な役割を果たすので、ＰＴＤ−Ｐ２０の使用は、ケロイド及び他の線維性疾患を治療するための潜在的方法を示す。総合すれば、これらの結果は、さらにＰＴＤ−Ｐ２０または線維症疾患状態のいずれかの活性を検出するために用いることができた潜在的生体指標（ＣＴＧＦ、α−ＳＭＡ、コフィリン及びＨＳＰ２７）を識別する。
【００７５】
「０６−５５８−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名称を与えられ、２００７年７月５日につくられ、８６，９６４バイトの大きさを有する、これと共に提出される配列リストのテキストファイルは、全体として本願明細書に引用された。
【００７６】
実施例２の参考文献
Ｃｈｉｐｅｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ７，  １６６−１７６  
Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８３，  １６８９−１７０７  
Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  １３，  ７−１２
Ｈｅｕｓｉｎｇｅｒ−Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ  Ａｍ  ２８−３７  
Ｈｅｗｉｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １５，  ４１１−４１７  
Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ６０，  ６４３−６５０  
Ｎａｕｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９０，  Ｈ３２３−３３０
Ｐｅｐｐｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．  （１９９７）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ８，  ２１−４３
Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７７，  Ｃ１−９  
Ｔｏｍａｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，  ３４９−３６３
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４５，  １１４−１２５
【配列表】
2009543800000001.app
【国際調査報告】
2009543800.tif 000002