(57)【要約】  本発明は、癌性疾患の診断と治療に関するものであり、詳しくは、原発及び転移のヒト腫瘍細胞の細胞傷害性への介在に関するものであり、最も詳しくは、そのようなヒト腫瘍、たとえば、肝細胞から生じる原発又は転移の腫瘍部位において細胞傷害性反応を惹起するための手段として、任意で１以上の化学療法剤を併用する、単離されたモノクローナル抗体又はその癌性疾患緩和抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に関するものである。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関するものである。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発のヒト腫瘍の部位及び転移の部位を治療する方法であって、前記原発又は転移のヒト腫瘍が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０で寄託されたクローンによって産生される単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢと特異的に結合する抗原の少なくとも１種のエピトープを発現し、その標的抗原への前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢへの結合を競合的に阻害する能力を特徴とし、前記哺乳類の腫瘍の負担の軽減を結果として生じるのに有効な量で前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが細胞傷害性部分に結合される請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞傷害性部分が放射性同位元素である請求項１の方法。
【請求項４】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する請求項１の方法。
【請求項５】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが抗体依存性の細胞性細胞傷害に介在する請求項１の方法。
【請求項６】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢがヒト化される請求項１の方法。
【請求項７】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢがキメラ化される請求項１の方法。
【請求項８】
哺乳類において抗体が誘導する細胞性の細胞傷害に感受性のある原発又は転移のヒト腫瘍部位を治療する方法であって、前記原発又は転移のヒト腫瘍が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０で寄託されたクローンによって産生される単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢと特異的に結合する抗原の少なくとも１種のエピトープを発現し、その標的抗原への前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢの結合を競合的に阻害する能力を特徴とし、前記哺乳類の腫瘍の負担の軽減を結果として生じるのに有効な量で前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項９】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが細胞傷害性部分に結合される請求項８の方法。
【請求項１０】
前記細胞傷害性部分が放射性同位元素である請求項８の方法。
【請求項１１】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する請求項８の方法。
【請求項１２】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが抗体依存性の細胞性細胞傷害に介在する請求項８の方法。
【請求項１３】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢがヒト化される請求項８の方法。
【請求項１４】
前記単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢがキメラ化される請求項８の方法。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａによって産生される単離されたモノクローナル抗体により特異的に結合されるヒトＣＤ６３抗原のエピトープ（単数）又はエピトープ（複数）を発現するヒト癌性腫瘍を治療するプロセスであって、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａによって産生される単離されたモノクローナル抗体により認識されるものと同一のエピトープ（単数）又はエピトープ（複数）を認識する少なくとも１つの単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを前記ヒト癌に罹っている個人に投与することを含み、前記エピトープ（単数）又はエピトープ（複数）の結合が腫瘍の負担の軽減を結果として生じるプロセス。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａによって産生される単離されたモノクローナル抗体により特異的に結合されるヒトＣＤ６３抗原のエピトープ（単数）又はエピトープ（複数）を発現するヒト癌性腫瘍を治療するプロセスであって、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａによって産生される単離されたモノクローナル抗体により認識されるものと同一のエピトープ（単数）又はエピトープ（複数）を認識する少なくとも１つの単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを前記ヒト癌に罹っている個人に投与することを含み、前記投与が腫瘍の負担の軽減を結果として生じるプロセス。
【請求項１７】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａによって産生される単離されたモノクローナル抗体により特異的に結合されるヒトＣＤ６３抗原のエピトープ（単数）又はエピトープ（複数）を発現するヒト癌性腫瘍から選択される組織試料中で癌性細胞の存在を判定する結合アッセイであって、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａによって産生される単離されたモノクローナル抗体により認識されるものと同一のエピトープ（単数）又はエピトープ（複数）を認識する少なくとも１つの単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを提供することと、前記少なくとも１つの単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを前記ヒト組織試料に接触させることと、前記少なくとも１つの単離されたモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢと前記ヒト組織試料との結合を判定することを含み、それによって前記組織試料中での前記癌性細胞の存在が示されるプロセス。
【請求項１８】
前記原発のヒト腫瘍の部位及び／又は転移の部位が肝細胞から生じる請求項１のプロセス。
【請求項１９】
前記原発のヒト腫瘍の部位及び／又は転移の部位が肝細胞から生じる請求項８のプロセス。
【請求項２０】
前記ヒト癌性腫瘍が肝細胞から生じる請求項１５のプロセス。
【請求項２１】
前記ヒト癌性腫瘍が肝細胞から生じる請求項１６のプロセス。
【請求項２２】
前記ヒト癌性腫瘍が肝細胞から生じる請求項１７のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌性疾患の診断及び治療に関するものであり、詳しくは、腫瘍細胞の細胞傷害性の介在、最も詳しくは、任意で細胞傷害性反応を惹起するための手段として１以上の化学療法剤を併用する、癌性疾患緩和抗体（ＣＤＭＡＢ）使用に関するものである。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌におけるＣＤ６３：ＣＤ６３は、テトラスパニンファミリーのＩＩＩ型膜タンパク質であり、テトラスパニンファミリーの現在の３０のメンバーは４つの膜貫通断片の存在を特徴とする。活性化した血小板、顆粒球及びメラノーマ細胞の全細胞調製物に対して作成された抗体を用いて、幾つかのグループが独立してＣＤ６３を同定した。それら同族の糖タンパク質抗原の各ｃＤＮＡのクローニングによって、様々な抗原が１つの同一分子であるという認識が導かれた。第６回白血球型に関する国際ワークショップ（１９９６年）は、続いてこれらの抗体をＣＤ６３抗体として分類した。１９９６年のワークショップ以前には、ＣＤ６３は複数の名称（メラノーマ１抗原、眼のメラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連膜糖タンパク３、グラニュロフィシン、メラノーマ関連抗原ＭＬＡｌ）で知られ、部分的な性状分析及び同定をもたらす抗体と関連付けられることもあった。従って、ＣＤ６３は、抗原ＭＥ４９１（Ｍａｂ  ＭＥ４９１）、神経分泌腺抗原（Ｍａｂｓ  ＬＳ５９，ＬＳ６２，ＬＳ７６，ＬＳ１１３，ＬＳ１４０及びＬＳ１５２）、Ｐｌｙｇｐ４０（Ｍａｂｓ  Ｈ５Ｃ６、Ｈ４Ｆ８及びＨ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（Ｍａｂ  １２Ｆ１２）、骨前駆細胞特異的マーカー（Ｍａｂ  ＨＯＰ−２６）及びインテグリン関連タンパク質（Ｍａｂ  ６Ｈ１）としても示される。ヒトＣＤ６３と交差反応することが見い出されたそのほかの抗体は、８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１との交差反応性）、ＮＫ１／Ｃ３及びＮＫＩ／ブラック−１３（（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３５（３）：２８７−９５（１９８５）；Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ  ａｎｄ  Ｒｕｍｋｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３（２）：９３−ｌ００（１９８６）；Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８４（６）：４２２−９（１９９２）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１０（３）：３９９−４０４（１９９２））であった。免疫親和性で精製したＮＫＩ／Ｃ３抗原に対して作成されたウサギのポリクローナル抗体ＲａＣ３による仕事によって２０ｋＤａ前後の見かけの分子量を持ち、Ｎ結合型炭化水素によって大きく翻訳後修飾を受けたコアポリペプチドとしての標的タンパク質が明らかにされた（Ｇｒｕｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９（２）：４５９−６５（１９８９））。
【０００３】
ＣＤ６３は当初、ＳＫ  Ｍｅｌ２３ヒト癌性メラノーマ細胞株の調製物に対して作成され、メラノーマ細胞への結合についてスクリーニングされた多数の抗体の１つであるＭａｂ  ＭＥ４９１を用いてメラノーマのｃＤＮＡライブラリからクローニングされた。１２５Ｉ−ラクトペルオキシダーゼ標識したメラノーマ細胞の免疫沈降によって細胞表面における３０〜６０ｋＤａのタンパク質の存在が明らかにされた。この抗体によって認識される抗原は翻訳後修飾を高度に受けたタンパク質であることが示された。免疫組織化学によって、抗体は周辺の正常に見える細胞ではなく、腫瘍組織中のメラノーマ細胞を認識することが分かり、それは、腫瘍特異的である可能性がある抗原決定基を認識することを示唆していた（Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４，  ２４３−２５５  （１９８４））。この抗体はまた、ブドウ膜メラノーマの症例の８７％におけるメラノーマ細胞及び後者が存在する症例８６％における気球細胞を染色した。この研究では、正常な眼の組織の染色に変異があり、２、３の正常症例で陽性であったが、形態的に正常なメラニン細胞では稀に陽性だった（Ｆｏｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １０３（２）：２７５−９  （１９８５））。別の実験では、ＳＫ  Ｍｅｌ２３細胞株に対して作成されたモノクローナル抗体、Ｍａｂ６−Ｆ１、Ｍａｂ８−１Ｈ及びＭａｂ８−２Ａは、同一の抗原を認識し、Ｍａｂ  ＭＥ４９１で得られるものに非常によく似た免疫組織化学染色のパターンを示すことが示された。さらに、これらの抗体は、脈絡膜メラノーマ原発の患者において肝転移の腫瘍組織を染色したが、正常な肝細胞は染色しなかった。ヒトのメラノーマ生検の別の研究では、Ｍａｂ  ＭＥ４９１の反応性は、メラノーマの進行と逆相関すると考えられることが示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は、正常なメラニン細胞では低く、メラノーマ進行の早期（異型性母斑及び放射状増殖相（ＲＧＰ）腫瘍）ではさらに高く、垂直増殖相（ＶＧＰ）のようなさらに進行したメラノーマ腫瘍及び転移腫瘍では低下する、又は存在しなくなる。ヒトの原発ブドウ膜メラノーマ細胞に対して作成した別のモノクローナル抗体（Ｍａｂ  ４Ａ３）は、これらの細胞に存在する抗原を特異的に認識することが見い出され、健常な個体のリンパ球にはバックグランド程度の結合しか示さなかった。メラノーマ組織のウエスタン免疫ブロットによってこの抗体で検出される抗原は、５５ｋＤａ程度の見かけの分子量を持つダブレットから成るということは、この抗体によって認識される抗原は、抗ＣＤ６３として群を成す抗体によって認識されるものと同一ではないことを示唆していた（Ｄａｍａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２７（９）：１３６２−７（１９８６））。
【０００４】
トロンビンで活性化した血小板に対して作成したモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ  ２．２８、２．１９、５．１５及び５ｄｌＯ）を用いてヒトの血小板でもＣＤ６３が見い出され、部分的に性状分析が行われた。トロンビンの活性化の際、結合部位数の増加（１０倍を超えて）によって明らかにされたように、これらの抗体は活性化依存性の血小板で５３ｋＤａの膜糖タンパク質を検出した。競合アッセイにて、これらの抗体が互いの結合を阻止したということは、それらが、同一の又は空間的に近接した抗原決定基を認識することを示唆していた。血小板凝集実験の結果は、これらの抗体自体が血小板凝集を引き起こすことはなく、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、トロンビン、コラーゲン及びエピネフリンで誘導された凝集を干渉することもないことが示された。電子顕微鏡のデータは、静止血小板では、これらの抗体は、リソソーム膜に局在する抗原を認識した。免疫組織化学データは、これらの抗体が、脾臓、リンパ節、胸腺及び内皮細胞の制約された領域に存在する抗原を認識することを示した。別の研究では、Ｍａｂ２．２８は、静止血小板及び巨核球及び内皮細胞における内部顆粒を標識し、後者の２つでは、それは、リソソーム区画の既知のマーカーである酵素カテプシンＤに対する抗体と同時局在した。抗体の群分け及び発現クローニングによる追跡試験は、ＣＤ６３としてのこの抗体により認識される抗原の同定をもたらし、さらに、リソソーム区画でのその存在を確認し、リソソーム区画ではそれは、区画特異的マーカーＬＡＭＰ−１及びＬＡＭＰ−２と同時局在していた。この分子のクローニングによってそれがＣＤ６３として同定され、テトラスパニンファミリーにそれを含めることが可能になった。
【０００５】
多数の異なった組織及び細胞種でＣＤ６３の発現は検出された。細胞レベルでは、それは、原形質膜と関連して、又は細胞内の後期エンドソーム小胞構造に関連しても見い出された。細胞の活性化は、特定の場合では、ＣＤ６３の細胞内貯蔵の移動によって表面での発現の増加がもたらされる。ＣＤ６３は、Ｂリンパ球にて、特にＭＨＣクラスＩＩ複合体を表面に排出することに関与するエンドソームとエキソソームにて、及び分泌された小胞の中でＭＨＣクラスＩＩ複合体と同時に、又は物理的に関連して局在することも見い出された。ＣＤ６３は、Ｂ及びＴリンパ球、好中球、乳癌細胞及びメラノーマ細胞を始めとした種々の細胞種において、たとえば、ＣＤ９、ＣＤ８０、ＣＤ１１（インテグリン鎖αＭ．Ｌ．Ｘ．）、ＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ３又はインテグリン鎖α３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ６、インテグリン鎖α６）及びＣＤ２９インテグリン鎖β１）のようなテトラスパニンファミリーのそのほかのメンバーと相互作用することが見い出された。
【０００６】
癌におけるＣＤ６３の役割は明らかではない。ＣＤ６３は当初、幾つかの独立したグループによって、たとえば、血小板及び顆粒球の活性化、ＭＨＣクラスＩＩ依存性の抗原提示、インテグリン依存性の細胞接着と運動性、並びに特定の型の癌における腫瘍の進行のような多様な事象に関与することが発見されたが、その機能は未だ完全には解明されていない。現在の証拠は多様な細胞性の生理的事象におけるその役割を支持しているにもかかわらず、これらの機能が互いに独立しているのかどうか、又はＣＤ６３が関与する基礎を成す共通した細胞性のメカニズムがあるのかどうかは明らかではない。
【０００７】
幾つかのグループが、ＣＤ６３と特定の型の腫瘍、特にメラノーマの進行との関連を検討している。種々の進行段階での腫瘍患者から得られた癌試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために、Ｍａｂ  ＭＥ４９１に加えて多数の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体が開発された。ＣＤ６３の発現低下を反映する可能性が最も高いと著者らに解釈された低下した染色性は、腫瘍の進んだ進行及び転移特性と相関することが観察された。さらに最近の研究では、ＣＤ６３を始めとするテトラスパニンタンパク質ファミリーの幾つかのメンバーの明らかに低下した発現レベル（ｍＲＮＡの定量後）と幾つかの乳癌由来の細胞株の試験管内の浸潤性との間での有意な相関も記載された。別の研究では、エストロゲン剥奪に供された培養乳癌細胞における差次的発現によってＣＤ６３が同定された。このことは、ＣＤ６３の発現をステロイドホルモンで調節することができ、変化したＣＤ６３の存在度及び機能は乳癌の進行に関連してもよいことを示した。
【０００８】
それに対して、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、Ｍａｂ  ＦＣ５．０１による仕事は、その反応性エピトープが、様々な正常組織で変化しやすく発現されることを明らかにした。この抗体はＣＤ６３を認識することが見い出されたけれども、早期のメラノーマと、転移メラノーマを含むさらに進んだ段階のメラノーマの間を区別せず（Ｍａｂ  ＭＥ４９１とは異なって）、このことは、ＣＤ６３抗原はこれらさらに進んだ腫瘍に存在するが、エピトープの一部は異なった段階での細胞において隠されていることを示唆している。これは、コアＣＤ６３ポリペプチドの変化した翻訳後修飾又はそのほかの分子とのＣＤ６３の相互作用によってもよく、それは、抗体の認識及び結合に特異的なエピトープの利用性を変えたのかもしれない。これらの結果は、抗ＣＤ６３Ｍａｂ  ＮＫＩ−Ｃ３による染色は、たとえば、初期、放射状増殖相、垂直増殖相及び転移のメラノーマのような様々な進行段階でのメラノーマの組織切片を区別しなかったというＳｉ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｅｙ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５４（ｌ）：３７−４３（１９９３）によって記載された所見を支持した。他の研究（Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＣｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６（４）：１３９７−４０６（１９９８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５３（３）：９７３−８３（１９９８））では、定量ＰＣＲによる、乳癌及び非小細胞性肺癌からのｍＲＮＡの解析によって、２つのテトラスパニンのファミリーメンバー（ＣＤ９及びＣＤ８２）について、その発現レベルと腫瘍の進行及び患者の予後との間に有意な相関があるが、そのような相関は、その発現がすべての試料で類似しているという点でＣＤ６３については見い出されないことが明らかにされた。これら明らかに矛盾する成績の結果、ＣＤ６３の癌との関連を決定的に実証する強く且つ一貫したデータの欠如がある。
【０００９】
現在まで、ＣＤ６３と、この分子の最終的な腫瘍サプレッサー機能との間の連鎖を確立することを試みた生体内の試験はほとんどない。これらの試験の１つでは、胸腺欠損マウスの皮下又は腹腔内に注射されたヒトＣＤ６３を過剰発現するＨ−ｒａｓで形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞は、元のＣＤ６３を過剰発現していない細胞の挙動と比べた場合、延びた生存期間と共に腫瘍サイズの低下及び転移能の低下によって示されるように、悪性の表現型／腫瘍形成性の表現型の低下を示した。このことは、形質転換した細胞におけるヒトＣＤ６３の存在はその悪性の挙動を抑えてもよいことを示唆している。さらに最近、ヒトＣＤ６３を発現し、ＣＤ６３への免疫寛容を誘導するように作成されたトランスジェニックマウスモデルによる仕事は、ワクシニアウイルスに融合されたヒトＣＤ６３による免疫の際、注射されたヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）と共に同時形質移入されたマウスのメラノーマ細胞株の腫瘍性増殖を抑制することができ、生存を増やすことができることを示した。動物がＣＤ６３単独によって形質移入された細胞株ではなく、ＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩによって同時形質移入された細胞を注射された場合にのみ、腫瘍性増殖の抑制が起きているので、治療効果はＴ細胞依存性であり、内因性の抗ＣＤ６３抗体はこの保護効果に関与しないと考えられることが著者らによって示唆された。この解釈は、精製したヒトＣＤ６３で事前に免疫し、抗ヒトＣＤ６３抗体を作り上げたことを示す野生型動物において腫瘍細胞の増殖に対する保護効果がないという事実によって支持された。ヒトＣＤ６３によって形質移入された、当初ヒト起源であると考えられ、後になってラットの系列であることが分かったＫＭ３細胞株を用いたＲａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６２（５）：６３１−５（１９９５）により記載された仕事によって、種々の形質移入細胞株及び非形質移入細胞株の試験管内の増殖速度の間に有意差はないが、胸腺欠損マウスに皮内注射した場合、元々の非形質移入ＫＭ３細胞を用いて認められたものと比べて、このタンパク質の発現は、これら細胞の増殖及び転移能を低下させることが示唆された。これらの所見は、腫瘍細胞の生体内の及び試験管内の増殖速度の双方に影響を及ぼすそのほかの腫瘍サプレッサー遺伝子の潜在効果からＣＤ６３の潜在効果を区別した。さらに、試験管内のアッセイ（Ｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８（７）：３３５３−８（１９９７））でその任意の運動性を低下させることによって同一細胞で機能的効果を有することが分かった抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、ＭＥ４９１の添加は、試験管内でのその増殖速度に影響を与えなかった。
【００１０】
この研究はまた、ＣＤ６３は、たとえば、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン及びビトロネクチンのような細胞外マトリクス（ＥＣＭ）由来の化学誘引物質に応答した移動を促進してもよく、インテグリンに対する抗体はこれらの効果を阻止することはできないが、この効果は、β１型のインテグリンの機能的関与が介在してもよいという所見を記載した。しかしながら、ビトロネクチンが介在するシグナル伝達（インテグリンαｖβ５の既知のリガンド）の役割と、たとえば、フィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンのようなそのほかのＥＣＭ成分が介在するシグナル伝達の役割との間には、ＣＤ６３を形質移入した細胞に対する拮抗する効果があると思われる。このことは、特定の条件下、ＥＣＭの存在下でＣＤ６３の発現は移動の低下を招き、これが接着と運動性との間の巧妙な均衡に依存してもよいことを示唆した。別の研究では、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（Ｍａｂ  ７１０Ｆ）は、ＰＭＡ処理したＨＬ−６０細胞の接着及び拡散を高めた一方で、別の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（Ｍａｂ２．２８）は同様の効果を促進したが、それは細胞のほんのわずかな分画のみであり、はるかに大量を添加した場合のみだった。これらの結果は、ＣＤ６３に対する多数の抗体が作り上げられているが、その機能的効果はかなり異なりうることを示した。
【００１１】
テトラスパニン類は細胞増殖に関与してもよい。Ｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０（８）：４００７−１５（１９９０）は、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１）を認識するマウスのＭａｂ  ５Ａ６のリンパ腫細胞株に対する抗増殖効果を記載した。別の研究では、ヒトＴリンパ球におけるＣＤ３７の抗体との結合はＣＤ３７が誘導する増殖を阻止した。さらに最近、ＣＤ３７の発現を欠損した（ＣＤ３７ノックアウト）動物モデルによる研究によって、コンカナバリンＡによる活性化及びＣＤ３／Ｔ細胞受容体の結合に対する応答で、野生型動物のＴリンパ球に比べて、この動物のＴリンパ球は過剰増殖性であることが明らかにされた。従って、細胞増殖及び増殖における機能的役割は、テトラスパニンファミリーの共通する特徴であってもよいことが提案された。肝芽腫及び肝細胞癌の細胞による最近の研究によって、これらの細胞と抗ＣＤ８１モノクローナル抗体の結合は、Ｅｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化をもたらすことが明らかにされた。このシグナル伝達経路は、細胞増殖及び増殖事象に関与することが示されている。平行した仕事で、ヒトＣＤ８１を過剰に発現している形質移入細胞株は、見せかけの形質移入である対照の細胞と比べて増殖の増加を示した。従って、利用できる証拠は、細胞増殖及び細胞接着／運動性に関連する事象において、一般にテトラスパニンの役割を、特にＣＤ６３の役割を指摘している。これら２つの種類の細胞事象は、双方共、腫瘍の進行及び転移で中心的な役割を担うので現在、鋭意研究の標的となっている。
【００１２】
アミノ酸配列の決定及び解析は、テトラスパニンとそのほかのタンパク質ファミリーとの間、又は以前性状分析された機能的分子との間で相同性を示さず、以前から既知の酵素活性のいずれも示唆しなかった。その結果、シグナル伝達経路の調節におけるタンパク質のこのファミリーの役割を検討することは非常に難しかった。しかしながら、細胞生理における変化をもたらし、最終的に、シグナル伝達経路の調節に依存するテトラスパニン特異的な試薬を用いて、証拠が発生したが、それは、テトラスパニンがシグナル伝達特性を有することを示唆している。ＣＤ６３は生理学的に、且つ機能的に、それ自体二次メッセンジャーのシグナルの生成に関与する酵素である多数の分子と関連することが示され、又は生理学的に、及び／又は機能的にそのような酵素に関連している。
【００１３】
炎症反応の初期段階の１つであるヒトの好中球と内皮細胞との相互作用を制御するメカニズムを分析するように設計された実験によって、幾つかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３及びＡＨＮ−１６−５）で予備処理された好中球は、培養した内皮細胞層へのその接着を促進することが明らかにされた。さらにこの効果は、多数の細胞内シグナル伝達における周知のモジュレータであり、細胞が刺激抗体に暴露される間の特定の時間に制約された、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在に強く依存した。抗体に対するさらに長い暴露の後、好中球の内皮細胞に対する接着は、Ｃａ２＋のその後の添加に対して非感受性になったので、このことは、動的な、且つ一時的に調節された（一過性の）事象であることと関係しているとみなされた。さらに、ＣＤ６３は、ＣＤ１１／ＣＤ１８タンパク質複合体と物理的に相互作用を行うことが見い出され、この複合体を特異的に標的とする試薬は調節シグナルに介在した。この研究では、ＣＤ６３はまた、酵素チロシンキナーゼ、Ｌｃｋ及びＨｃｋを誘導する複合体と物理的に会合する、又はその一部であることが見い出された。これらの酵素は、特異的表面受容体の活性化の際、細胞内の調節性シグナルに介在することにおいて中心的な役割を担い、細胞特異的な生理的変化を生じるシグナル伝達経路のカスケードの一部であるタンパク質のクラスのメンバーである。別の研究は、テトラスパニン（ＣＤ６３を含む）とモノクローナル抗体の同時連結は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のコラーゲン基質への接着によって誘導される酵素接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化又は活性を高めることができることを示唆した。これは、インテグリンが介在するチロシンキナーゼシグナル伝達経路の調節におけるＣＤ６３（及びそのほかのテトラスパニンのファミリーメンバー）の直接的関与を指摘した。抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、Ｍａｂ  ７１０Ｆによる表面ＣＤ６３の存在及び連結と機能的に交差してもよいそのほかのシグナル伝達経路は、酵素タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、細胞内シグナル伝達経路の別の周知のモジュレータによるリン酸化の調節に依存するものであると思われる。この背景で、Ｍａｂ  ７１０Ｆによる骨髄細胞株ＨＬ−６０における接着及び形態的変化の増大は、ＰＫＣの一時的な関与は結論的に示されてはいないものの、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）による細胞の予備処理に依存した。しかしながら、独立したグループによる後者の仕事は、ＰＫＣの特異的な阻害剤であるＲｏ３１−８２２０がＰＭＡの効果を阻止するので、ＰＭＡ−誘導のＨＬ−６０の分化はＰＫＣ依存性であることを実証した。
【００１４】
ＣＤ６３及びそのほかのテトラスパニンのファミリーメンバーのシグナル伝達経路との関連を支持するさらなる証拠は、チロシンホスファターゼ活性とＣＤ６３（及びＣＤ５３も）分子の間の超分子複合体の直接的な物理的会合又はその一部としての物理的会合を記載する仕事から生じた。この研究では、抗ＣＤ６３抗体によって単離された免疫沈降複合体が、チロシンホスファターゼ活性と関連することが示され、チロシンホスファターゼＣＤ４５と会合することが示されたＣＤ５３とは異なるが、ＣＤ６３が会合するホスファターゼを同定することはできなかった。さらに最近、テトラスパニンファミリーの幾つかのメンバーは、ＩＩ型のホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型ＰＩ−４Ｋ）と会合することが分かった（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（５）：２５９５−８（１９９７））。ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１及びＡ１５／ＴＡＬＬＡでのみ同定され、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２又はＮＡＧ−２では生じることが認められなかったので、この相互作用は特異性が高いと思われた。さらに、各ＰＩ−４キナーゼを含有する複合体は単一のテトラスパニンのファミリーメンバーに限定されているので、テトラスパニンのファミリーメンバーとＰＩ−４Ｋの間の会合は相互に排他的である。特にＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ複合体は、そのほかのテトラスパニンと形成されるものとは異なって、ほとんど全体として脂質ラフト様ドメインにおける細胞内区画に見い出された。この所見は、ＰＩ−４キナーゼと相互作用することが分かったこのＣＤ６３分画が、二次メッセンジャー分子としてのその機能に加えて（Ｍａｒｔｉｎ  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １４：２３１−６４（１９９８））、膜輸送（エンドサイトーシス及びエクソサイトーシス）及び細胞骨格の再構成の調節に関与することで周知であるホスホイノシチド生合成の経路に関係する又は依存する特定の細胞内事象（Ｃｌａａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（１１）：７９７４−８４（２００１））に関与してもよいことを示唆した。
【００１５】
今までにＣＤ６３がシグナル伝達経路で直接会合することが分かったすべての酵素の直接的な及び重要な関与は、これら酵素の活性の下流のレギュレータ分子又はエフェクター分子のいずれかとして、シグナル伝達経路の調節と共にＣＤ６３の会合を支持する証拠をさらに提供した。
【００１６】
腫瘍の進行をもたらすメカニズムの解明は、非常に困難であり、明らかに矛盾した所見によって特徴付けられることが多い複雑な試みであり、その結果、これらの所見が有効な治療法に上手く変換されることは稀である。ＣＤ６３の腫瘍の進行と転移との関連及びシグナル伝達メカニズムとの関連について現在何が判っているかという観点で、その機能を腫瘍細胞で変化させることは可能である。
【００１７】
腫瘍細胞に対して細胞傷害性効果を持ち、認識された抗原を発現する細胞に結合し、且つ、それ自体で又は他の分子と会合して、正常細胞の集団に有意な有害効果を与えずに、試薬が腫瘍細胞の増殖、進行及び転移を抑制するように細胞で又は生体内で生理的な活性を有する抗原特異的な試薬の開発は、見込みのある治療用及び／又は診断用のツールとして極めて有益である。
【００１８】
最近、新しいデータによって、正常細胞の生理の調節におけるＣＤ６３の重要な作用形態が指摘され、変化した場合が、癌を含む、病理学的条件下での細胞の挙動に重要な影響を有してもよいことが指摘された。
【００１９】
乳癌細胞でＣＤ６３の内部移行を起こすことが知られたＭＡｂ抗体Ｆｃ５．０１を用いて、ヒト樹状細胞（ＤＣ）においてＣＤ６３の表面発現及び内部移行のレベルを測定した（Ｍａｎｔｅｚａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０４（４）：１１８３−９０（２００４））。ＣＤ６３は細胞表面及び細胞内に、エンドソーム及びリソソームのマーカーと同時局在にて局在することが分かった。未処理の抗体及びそのＦａｂ断片は、ＣＤ６３の内部移行を誘導することができた。同時に、Ｆｃ５．０１によるＣＤ６３の内部移行は、幾つかのインテグリン分子、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、及びα５の表面発現の低下を生じたが、β３又はＨＬＡ−ＩＩ分子のそれは生じなかった。走化性アッセイの結果は、この抗体、及びタンパク質のテトラスパニンファミリーのそのほかのメンバーを認識するそのほかが、膜障壁を横切って化学誘引物質に向かって移動する細胞の数の増加を起こすことを示した。これらの細胞（未成熟ＤＣ）では、β１，３−グリカン受容体が介在する酵母貪食作用には、細胞表面のＣＤ６３のレベル低下を伴ったが、テトラスパニンＣＤ９、ＣＤ８１及びＣＤ８２の低下、及びＨＬＡ−ＩＩ分子の低下はなかった。他方、マクロファージのマンノース受容体（ＭＭＲ）が関与するデキストラン−ＦＩＴＣによって誘導される内部移行では、ＣＤ６３の表面発現の低下、又はＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＨＬＡ−Ｉ及びＨＬＡ−ＩＩ分子の低下は生じなかった。従って、ＣＤ６３は、β１，３−グリカン受容体、デクチン−１の場合のように時には物理的に、特定の受容体と会合し、内部移行の事象に参画すると思われる。抗体が誘導するＣＤ６３の内部移行の際、幾つかのインテグリン分子の表面発現が低下するという事実はまた、そのようなＣＤ６３依存性の事象が細胞表面の受容体組成に影響を与えるので、ＤＣ移動アッセイにおける効果によって実証されたように、そのような細胞集団の生理に影響を与えることを示唆している。
【００２０】
別の研究では、膜の１型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ）の内部移行がＣＤ６３によって影響されることが分かった。この研究では、ＦＬＡＧでタグを付けたＭＴ１−ＭＭＰが内部移行し、拡散した細胞質での分布を獲得し、それにはその細胞表面でのレベルの低下が伴った。既知のリソソームプロテアーゼの阻害剤であるクロロキンの添加は、この内部移行依存性の細胞表面のＭＴ１−ＭＭＰの消失を部分的に阻害し、ＭＴ１−ＭＭＰがＣＤ６３陽性の内部顆粒型構造と会合したままであるような方法で、同時に内部移行に依存した細胞質の分布を変えた。ＭＴ１−ＭＭＰとＣＤ６３による細胞への同時形質移入は、このメタロプロテアーゼの細胞表面のレベルの低下を生じ、それは、この分子の阻害剤であるＢＢ９４がこの低下に影響を有さなかった一方でクロロキンは有したので、ＭＭＰ活性の全体のレベルには依存しなかった。この所見は、ＣＤ６３の発現の増加は、ＭＴ１−ＭＭＰの代謝回転／内部移行／分解を加速してもよいことを示唆した。ＭＴ１−ＭＭＰの内部移行／分解の増加は、ＭＴ１−ＭＭＰとＣＤ６３の直接的な相互作用に依存する。この種の機能は、ＣＤ６３が、エンドソーム及びリソソームへのタンパク質の仕分けに関与するアダプタタンパク質ＡＰ−２及びＡＰ−３それぞれのμ２及びμ３のサブユニットと直接相互作用するという以前の所見によってもさらに支持された。ＭＴ１−ＭＭＰの細胞質側末端がこの分子の内部移行に重要であり、この事象が浸潤促進活性の調節で重要な役割を担うことも以前示された。ＭＴ１−ＭＭＰはまた、悪性腫瘍細胞の浸潤で重要な役割を担うとみなされている。従って、ＣＤ６３を会合させることによってその全体的なレベルの調節がその相互作用及び内部移行に依存してもよいことは可能である。
【００２１】
別の最近の出版物（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｍｂｏ  Ｊ２３（４）：８１１−２２（２００４））では、網膜の退化に関与するショウジョウバエの眼強化遺伝子の遺伝的スクリーニングによって、多数の遺伝子が同定され、その中で「サングラス」（ｓｕｎ）と命名されたテトラスパニン様の分子の遺伝子が同定された。哺乳類の中で最も近縁のタンパク質はテトラスパニンＣＤ６３であった。そしてＣＤ６３に類似して、「ｓｕｎ」は免疫電子顕微鏡で示唆されたように、リソソームに豊富にあることが分かった。この仕事の結果は、「ｓｕｎ」が、そのほかのＧタンパク質結合受容体の典型であるアレスチン介在性のメカニズムとは独立した、Ｒｈ１シグナル伝達の正常な下方調節に参画することを示唆した。さらに、「ｓｕｎ」は、活性化Ｒｈ１の定期的な代謝回転で重要であるだけでなく、おそらくこの事象に依存して、突然変異ハエで劇的なｓｕｎ依存性の網膜の退化を生じる感棹分体の維持に重要な影響も有した。同時に、データはタンパク質の正常な輸送に依存した代謝回転では哺乳類ＣＤ６３のこの相同体が関係するとみなし、発現／機能における異常が結果として生理的異常を生じる。
【００２２】
受容体の内部移行におけるＣＤ６３の役割に関する別の出版物では、胃イオンポンプＨ、Ｋ−ＡＴＰ分解酵素のβサブユニットとこのテトラスパニンの双方で同時形質移入したＣＯＳ細胞における双方の分子の同時局在が記載された。この研究では、Ｈ、Ｋ−ＡＴＰ分解酵素のβサブユニットは、ＣＤ６３の発現に依存した増大した内部移行を経験し、リソソーム様の細胞質の顆粒構造への局在を経験することも分かった。
【００２３】
上述した仕事からのデータはすべて、内部移行及びリソソーム依存性の分解に参画するので、正常な細胞の生理の制御に参画することによってＣＤ６３も細胞の表面分子の正常な代謝回転に関与することを示唆した。従って、ＣＤ６３のこの機能の操作は、特定の分子又は分子の群の活性に依存した事象を制御する重要なツールであり、その表面発現又は機能は、たとえば、癌のような病態における異常な細胞の挙動に対して変えられ、又は寄与することは可能である。
【００２４】
今まで、抗ＣＤ６３抗体、又はＣＤ６３を発現している細胞を特異的に標的とするそのほかの試薬が、腫瘍細胞の試験管内及び生体内の増殖特性、及び腫瘍細胞増殖の動物モデルの生存時間に同時の影響を有することは報告されなかったし、示されなかった。
【００２５】
癌治療法としてのモノクローナル抗体：癌を示す各個人は独特であり、その人の自己同一性のように他の癌とは異なる癌を有する。これにもかかわらず、現在の治療法は、同一ステージでの同一タイプの癌患者すべてを同一の方法で治療する。これらの患者の少なくとも３０％は最初の治療で失敗するので、さらなる段階の治療に進み、治療の失敗、転移及び最終的な死の可能性につながる。治療の優れたアプローチは、特定個人のために治療を特注することである。それ自体を特注に役立たせる現在の唯一の治療法は外科手術である。化学療法及び放射線療法は患者に誂えることができず、外科手術自体はほとんどの症例で治癒を生じるには不適当である。
【００２６】
モノクローナル抗体の出現で、各抗体を単一エピトープに向けることができるので、特注治療法のための方法を開発する可能性がさらに現実的になった。さらに、特定の個人の腫瘍を独自に規定するエピトープの集まりに向けられる抗体の組み合わせを作製することができる。
【００２７】
癌性細胞と正常細胞の間の有意な差異は、癌性細胞が形質転換された細胞に特異的である抗原を含有することであることを認識して、科学界は長い間、これら癌抗原に特異的に結合することによって形質転換された細胞を特異的に標的とするようにモノクローナル抗体を設計することができることを考えてきた；従って、モノクローナル抗体は、癌細胞を排除するのに「魔法の弾丸」として役立つことができるという考えを生じている。しかしながら、単一のモノクローナル抗体は癌のあらゆる例で役立つことができるわけではなく、クラスとして、標的とされた癌の治療としてモノクローナル抗体を配置することができることが今や広く認識されている。直ちに開示される本発明の教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、患者に有益である方法で、たとえば、腫瘍の負担を軽減することによって癌性疾患の過程を緩和することが示されており、本明細書では、癌性疾患緩和抗体（ＣＤＭＡＢ）又は「抗癌抗体」と様々に呼ばれるであろう。
【００２８】
現在、癌患者は治療のわずかな選択肢しか有さない。癌治療法への統制的なアプローチによって世界的な生存率及び罹患率で改善を生じてきた。しかしながら、特定の個人にとって、これらの改善された統計は、個人的状況での改善とは必ずしも相関しない。
【００２９】
従って、開業医が同一コホートのそのほかの患者とは独立して各腫瘍を治療することを可能にする方法が提起されたなら、これによってまさにその一人の人にとってのオーダーメイド治療の独特のアプローチが出来たであろう。そのような治療経過は、治癒率を理想的に高め、さらに良好な予後を生み、それによって長い間の切実なニーズを満たすであろう。
【００３０】
歴史的には、ヒトの癌の治療では成功は限定されていたが、ポリクローナル抗体が使用されてきた。リンパ腫や白血病がヒトの血漿で治療されてきたが、寛解や応答の延長はほとんどなかった。さらに、化学療法に比べて再現性もなかったし、追加の利益もなかった。乳癌、メラノーマ及び腎細胞癌のような固形腫瘍もヒトの血液、チンパンジーの血清、ヒトの血漿及びウマの血清で治療されたが、相当する予想される成績及び有効な成績はなかった。
【００３１】
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の多数の臨床試験がある。１９８０年代、特定の抗原に対する抗体を用いた又は組織選択性に基づいた、少なくとも４７人の患者からたった１人の応答者を生じたヒト乳癌に関する少なくとも４つの臨床試験があった。シスプラチンと併用したヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ヘルセプチン（登録商標））を用いた臨床試験が成功したのは１９９８年になってからだった。この試験では、３７人の患者が応答について評価され、そのうちの約１／４が部分的応答率を有し、さらに１／４が軽微な又は安定した疾患の進行を有した。応答者の間での進行に至る中央時間は８．４ヵ月であり、応答持続時間の中央値は５．３ヵ月だった。
【００３２】
ヘルセプチン（登録商標）はタキソール（登録商標）との併用で１９９８年初めて使用が認可された。臨床試験の成績は、タキソール（登録商標）のみを服用した群（３．０ヵ月）と比べて抗体に加えてタキソール（登録商標）を服用したもの（６．９ヵ月）では中央時間の増加を示した。ヘルセプチン（登録商標）に加えたタキソール（登録商標）の治療群対タキソール（登録商標）のみの治療群では生存期間の中央値：２２ヵ月対１８ヵ月でもやや増加した。さらに、抗体に加えたタキソール（登録商標）併用群とタキソール（登録商標）のみを比べると完全応答者（８％対２％）及び部分的応答者（３４％対１５％）と双方で数に増加が見られた。しかしながら、ヘルセプチン（登録商標）とタキソール（登録商標）による治療は、タキソール（登録商標）のみによる治療に比べて心臓毒性の高い発生率を招いた（それぞれ１３％対１％）。また、ヘルセプチン（登録商標）療法は、現在のところ既知の機能又は生理的に重要なリガンドを有さない受容体、ヒト上皮増殖因子受容体（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）を過剰発現する（免疫組織化学（ＩＨＣ）を介して決定されるような）患者；転移乳癌を有する患者のおよそ２５％にとってのみ有効である。従って、乳癌患者にとって未だ対処されていない大きなニーズがある。ヘルセプチン（登録商標）治療からの利益を得ることができた人でさえ未だに化学療法を必要とし、その結果、この種の治療の副作用に未だに少なくともある程度対処しなければならない。
【００３３】
結腸直腸癌を調べる臨床試験には、糖タンパク質及び糖脂質の標的双方に対する抗体が関与する。腺癌にいくらかの特異性を有する１７−１Ａのような抗体は、６０人を超える患者においてフェーズ２の臨床試験を受けているが、たった１人が部分応答を有したにすぎない。ほかの試験では、１７−１Ａの使用は、追加のサイクロホスファミドを用いたプロトコールで５２人の患者のうち、たった１人の完全寛解と２人のやや有効を得たにすぎない。今までに、１７−１Ａのフェーズ３の臨床試験は、ＩＩＩ期の結腸癌に対する補助療法としての改善された有効性を示していない。当初、画像用に認可されたヒト化されたマウスのモノクローナル抗体の使用も腫瘍の退行を生じなかった。
【００３４】
最近、モノクローナル抗体を用いた結腸直腸癌の臨床試験からの肯定的な結果がある。２００４年、イリノテカンを基にした化学療法に不応であるＥＧＦＲを発現している転移結腸直腸癌の患者の第２段階の治療に対してエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ、登録商標）が認可された。２群のフェーズ２臨床試験及び１群の試験の成績は、イリノテカンと併用したエルビタックスが、それぞれ２３％及び１５％の応答率を有し、疾患の進行までの中央時間はそれぞれ４．１ヵ月及び６．５ヵ月であることを示した。同じ２群のフェーズ２臨床試験及び別の１群の試験の成績は、エルビタックス単独による治療は、それぞれ１１％及び９％の応答率を有し、疾患の進行までの中央時間はそれぞれ１．５ヵ月及び４．２ヵ月であることを示した。
【００３５】
その結果、スイス及び米国にてイリノテカンとの併用によるエルビタックス治療が、米国においてエルビタックス単独の治療が、第１段階のイリノテカン療法に失敗した結腸癌患者の第２段階の治療として認可された。従って、ヘルセプチン（登録商標）と同様に、スイスでは化学療法とモノクローナル抗体の併用としてのみ治療が認可されている。さらに、スイス及び米国双方での治療は第２段階の治療法としてのみ患者に対して認可される。また、２００４年、転移結腸直腸癌の第１段階の治療として静脈内の５−フルオロウラシルを基にした化学療法との併用での使用に対してアバスチン（登録商標）が認可された。フェーズ３の臨床試験の成績は、５−フルオロウラシル単独で治療した患者に比べて、アバスチンに５−フルオロウラシルを加えて治療した患者では生存期間の中央値に延長が見られた（１６ヵ月対２０ヵ月）。しかしながら、再びヘルセプチンと同様に、エルビタックスの治療は、モノクローナル抗体と化学療法の併用でのみ認可される。
【００３６】
肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌及び胃癌については貧弱な成績が続いている。非小細胞性肺癌に関する最も有望な最近の成績は、化学療法剤タキソテレ（登録商標）と併用した、細胞殺傷剤ドキソルビシンに結合させたモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗−Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ）が治療に含まれるフェーズ２臨床試験からもたらされた。タキソテレは、肺癌の第２段階の治療についてＦＤＡが認可した唯一の化学療法剤である。当初のデータは、タキソテレ単独と比べて全体的な生存に改善が見られる。この試験に動員された６２人の患者のうち、２／３がタキソテレとＳＧＮ−１５の併用を服用し、残りの１／３がタキソテレのみを服用した。タキソテレとＳＧＮ−１５の併用を服用した患者について、全生存の中央値は７．３ヵ月であるのに比べてタキソテレ単独を服用した患者では５．９ヵ月だった。１年及び１８ヵ月での全生存はタキソテレとＳＧＮ−１５の併用を服用した患者ではそれぞれ２９％及び１８％であったのに比べてタキソテレ単独を服用した患者ではそれぞれ２４％及び８％だった。さらなる臨床試験が計画されている。
【００３７】
前臨床では、メラノーマについてモノクローナル抗体の使用で限定的な成功があった。これらの抗体のうち、ほんのわずかが臨床試験に達したが、今日までに認可されたものはなく、フェーズ３の臨床試験で好都合な成績を上げたものもない。
【００３８】
疾患を治療するための新薬の発見は、明白に疾患の発症に寄与する３０，０００の既知の遺伝子の産物の中で関連する標的の同定を欠くことによって妨げられる。腫瘍学研究では、可能性のある薬剤標的は、それらが腫瘍細胞で過剰発現しているという事実のために単純に選択されることが多い。従って、同定された標的は、複数の化合物との相互作用についてスクリーニングされる。可能性のある抗体療法の場合、これらの候補化合物は普通、ケラーとミルステインによって築かれた基礎原理に従ってモノクローナル抗体を生成する方法に由来する（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ））。抗原（たとえば、全細胞、細胞分画、精製抗原）で免疫したマウスから脾臓細胞を回収し、不死化したハイブリドーマ相手と融合する。標的に最もしっかり結合する抗体の分泌について得られたハイブリドーマをスクリーニングし、選抜する。ヘルセプチン及びリツキシマブを含む、癌細胞に向けられた多数の治療用及び診断用の抗体が、これらの方法を用いて作製され、その親和性に基づいて選択されている。この戦略の欠点は二重である。第１に、治療用又は診断用の抗体結合のための適当な標的の選択が、組織特異的な発癌過程の周辺の知識の少なさ及びそれによって標的が同定される過剰発現による選択のような、結果として生じる単純すぎる方法によって限定される。第２に、最も大きな親和性で結合する薬剤分子が普通、シグナルを開始する又は阻害する最も高い可能性を有するという仮定はいつもそうであるとは限らない可能性がある。
【００３９】
乳癌及び結腸癌の治療でのいくつかの進歩にもかかわらず、単一剤又は併用としての有効な抗体療法の同定及び開発は、あらゆる型の癌については不十分である。
【００４０】
先行特許
特許文献１は、内部移行する癌細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体を選抜し、細胞の代謝に対して翻訳防止及び／又は複製防止の効果を有するモノクローナル抗体を同定する方法を教示する。例証として、ＭＥ４９１抗体はＷ９、ＷＭ３５及びＷＭ９８３メラノーマ細胞及びＳＷ９４８結腸直腸癌細胞において内部移行することが示された。さらに、ＭＥ４９１抗体はＳＷ９４８細胞において転写及び細胞増殖を低下させることが示された。特許文献２（及びその関連出願、ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、ＡＵ０１５３１４０Ａ５）は、ＣＤ６３抗原を含む群から選択された卵巣腫瘍マーカー遺伝子によってコードされる卵巣腫瘍マーカーポリペプチドに結合する抗体によって卵巣腫瘍の増殖又は転移を阻害する方法を主張している。卵巣癌を用いた遺伝子発現の一連の解析を行って卵巣腫瘍マーカー遺伝子を同定し、それが、候補としてのＣＤ６３の同定につながった。特許文献３（及びその関連出願、ＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を主張している。特許文献４は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を主張している。特許文献５は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を主張している。特許文献６は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を主張している。これらの特許及び特許出願は、ＣＤ６３抗原及び抗体を同定しているが、本発明の単離されたモノクローナル抗体を開示できず、又は本発明の単離されたモノクローナル抗体の有用性を開示できない。
【００４１】
ＭＥ４９１ポリペプチド抗原をコードする遺伝子はクローニングされ、１９８８年２月２４日公表のためにその配列を受け取った（非特許文献１）。ＣＤ６３をコードする遺伝子はクローニングされその配列は１９９１年２月公表され（非特許文献２）、出版物はＭＥ４９１とＣＤ６３の同一性を明瞭に示した。
【００４２】
特許文献７（配列番号８９、優先権出願日：２００４年６月２９日）、特許文献８（配列番号１、優先権出願日：２００３年２月１３日（２００３ＷＯ−ＥＰ００１４６１）；そのほかの優先日：２００２年２月１４日（２００２ＧＢ−００００３４８０））、特許文献９（配列番号４０、優先権出願日：２００２年１２月３０日（２００２ＷＯ−ＵＳ０４１７９８）；そのほかの優先日：２００２年１月２日（２００２ＵＳ−０３４５４４４Ｐ））は、すべて、ＣＤ６３に１００パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００４３】
特許文献１０（配列番号９７８７及び１２１０１、優先権出願日：２００２年８月１４日（２００２ＷＯ−ＵＳ０２５７６５）；そのほかの優先日：２００１年８月１４日（２００１ＵＳ−０３１２１４７Ｐ）は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち２３７のアミノ酸との１００パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００４４】
特許文献１１（配列番号２７、優先権出願日：２００３年２月１８日（２００３ＷＯ−ＵＳ００４９０２）；そのほかの優先日：２００２年２月２０日（２００２ＵＳ−０３５８２７９Ｐ））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち２２４のアミノ酸との９４パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００４５】
特許文献１２（配列番号４１６８及び４９１３、優先権出願日：２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；そのほかの優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち、それぞれ２０５のアミノ酸及び９４のアミノ酸と１００パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００４６】
特許文献１３（赤痢菌ｏｓｐＧ＃２６に関するヒト犠牲タンパク質、優先権出願日：２００２年１月１１日（２００２ＷＯ−ＥＰ０００７７７）；そのほかの優先日：２００１年１月１２日（２００１ＵＳ−０２６１１３０Ｐ））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち１３０のアミノ酸との１００パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００４７】
特許文献１４（配列番号７５６、優先権出願日：２０００年３月８日（２０００  ＷＯ−ＵＳ００５９１８）；そのほかの優先日：１９９９年３月１２日（９９ＵＳ−０１２４２７０Ｐ））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち１２７のアミノ酸との９９パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００４８】
特許文献１５（配列番号３２０３、優先権出願日：２００１年６月７日（２００１ＷＯ−ＵＳＯ１８５６９）；そのほかの優先日：２０００年６月７日（２０００ＵＳ−０２０９４６７Ｐ））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち１３２のアミノ酸との９７パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００４９】
特許文献１６（ヒトＣＤ６３タンパク質に由来する大きな細胞外ループ配列、優先権出願日：ｌ９９９年６月１５日（９９ＷＯ−ＵＳ０１３４８０）；そのほかの優先日：１９９８年６月１５日（９８ＵＳ−００８９２２６Ｐ））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち９９のアミノ酸との１００パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００５０】
特許文献１７（配列番号１２０７、優先権出願日：２００２年３月５日（２００２ＷＯ−ＵＳ００５０９５）；そのほかの優先日：２００１年３月５日（２００１ＵＳ−００７９９４５１））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち１０２のアミノ酸との８６パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００５１】
特許文献１８（配列番号４１６９、２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；そのほかの優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を構成する２３８のアミノ酸のうち７４のアミノ酸との１００パーセントの配列相同性を有するポリペプチドを主張している。
【００５２】
これらの特許出願は、ＣＤ６３抗原に対して様々な配列相同性を有するポリペプチドを同定している。ほとんどの場合、これらの出願は、相当するポリペプチド及びそのホモログに対する抗体及び抗体誘導体も主張しているが、本発明の単離されたモノクローナル抗体、又はヒトの肺癌、前立腺癌、結腸癌又はそのほかのヒトの癌を治療することにおける本発明の単離されたモノクローナル抗体の有用性を開示することはできない。重要なことに、上記出願はすべて、ＣＤ６３をコードしているポリヌクレオチドの配列が公表された後に出願された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５３】
【特許文献１】米国特許第５，２９６，３４８号
【特許文献２】米国特許出願第２００３０２１１４９８Ａ１号
【特許文献３】特許出願ＷＯ０２０５５５５１Ａｌ
【特許文献４】特許出願ＣＮ１３２６９６２Ａ
【特許文献５】特許出願ＣＮ１３２６９５１Ａ
【特許文献６】特許出願ＣＮ１３５１０５４Ａ
【特許文献７】ＷＯ２００４０４１１７０．８９
【特許文献８】ＷＯ２００３０６８２６８−Ａ２
【特許文献９】ＷＯ２００３０５７１６０−Ａ２９
【特許文献１０】ＷＯ２００３０１６４７５−Ａ２
【特許文献１１】ＷＯ２００３０７０９０２−Ａ２
【特許文献１２】ＥＰ１０３３４０１−Ａ２
【特許文献１３】ＷＯ２００２５７３０３−Ａ２
【特許文献１４】ＷＯ２０００５５１８０−Ａ２
【特許文献１５】ＷＯ２００２００６７７−Ａ１
【特許文献１６】ＷＯ９９６６０２７−Ａ１
【特許文献１７】ＷＯ２００２７０５３９−Ａ２
【特許文献１８】ＥＰ１０３３４０１−Ａ２
【非特許文献】
【００５４】
【非特許文献１】Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ４８：２９５５，１９８８，Ｊｕｎｅ  １
【非特許文献２】ＪＢＣ  ２６６（５）：３２３９−３２４５，１９９１
【発明の概要】
【００５５】
本出願は、癌性疾患緩和モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するために米国特許第６，１８０，３５７号で教示された患者特異的な抗癌抗体を作製する方法を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍について特異的に作製することができるので、癌治療法の特注を可能にする。本出願の背景の範囲内で、細胞殺傷特性（細胞傷害性）又は細胞増殖阻害性（細胞増殖抑制性）特性のいずれかを有する抗癌抗体を以後、細胞傷害性を持つと呼ぶ。これらの抗体は、癌のステージの決定及び診断の助けとして使用することができ、且つ腫瘍の転移を治療するのに使用することができる。これらの抗体はまた、予防的治療を目的として癌の予防に使用することもできる。伝統的な創薬の模範に従って生成された抗体とは異なって、本方法で生成された抗体は、悪性組織の増殖や生存に不可欠であることが以前示されなかった分子及び経路を標的としてもよい。さらに、これらの抗体の結合親和性は、さらに強い親和性相互作用でなくてもよい細胞傷害性事象の惹起のための必要要件に適応させる。また、標準的な化学療法、たとえば、放射性核種を本発明のＣＤＭＡＢと結合させ、それによって前記化学療法剤の使用に焦点を絞ることも本発明の範囲内である。ＣＤＭＡＢはまた、毒素、細胞傷害性部分、酵素、たとえば、ビオチンを結合した酵素、又は造血性細胞と結合させることができ、それによって抗体抱合体を形成する。
【００５６】
個別化された抗癌治療の見通しは、患者を管理する方法に変化をもたらすであろう。ありそうな臨床シナリオは、提示された時に腫瘍の試料を得て、貯めておく。この試料について、事前に存在する癌性疾患緩和抗体のパネルから腫瘍の型を決めることができる。従来のように患者のステージを決めるが、利用可能な抗体を使用してさらに患者のステージを決めることができる。既存の抗体で患者を直ちに治療することができ、本明細書で概説する方法を用いて、又は本明細書で開示されるスクリーニング法と併せたファージディスプレイライブラリの使用を介して、腫瘍に特異的な抗体のパネルを作製することができる。他の腫瘍が治療されたものと同一のエピトープの一部を運ぶことができるという可能性があるので、生成された抗体はすべて抗癌抗体のライブラリに加える。この方法に従って作製した抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する何人もの患者における癌性疾患を治療するのに有用であってもよい。
【００５７】
抗癌抗体に加えて、治療の多様な治療計画の一部として、患者は現在推奨されている治療法を受けることを決心することができる。本方法によって単離された抗体が非癌性細胞に対して相対的に非毒性であるという事実によって、使用される高用量での抗体を単独で、又は従来の治療法と併せて併用することが可能になる。高い治療指数によって短時間規模での再治療が可能になり、それは、治療耐性の細胞の出現の可能性を減らすはずである。
【００５８】
患者が治療法の最初の経過に不応であれば、又は転移が発生すれば、腫瘍に対する特異的抗体を生成するプロセスを再治療のために繰り返すことができる。さらに、抗癌抗体を患者から得た赤血球に結合させ、転移の治療のために再び注入することができる。転移癌のための有効な治療はほとんどなく、転移は普通、死に至る芳しくない予後の前兆となる。しかしながら、転移癌は普通、血管がよく発達しており、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍の部位で抗体を濃縮する効果を有することができる。転移の前でさえ、ほとんどの癌は、その生存のために宿主の血液供給に依存しており、赤血球に結合させた抗癌抗体は、同様に腫瘍のその場で腫瘍に対して有効でありうる。或いは、抗体は、他の造血性細胞、たとえば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞などに結合させてもよい。
【００５９】
抗体には５つのクラスがあり、それぞれがその重鎖によって付与される機能に関連する。一般に、ありのままの抗体による癌細胞の殺傷は、抗体依存性の細胞性細胞傷害性又は補体依存性の細胞傷害性のいずれかが介在すると考えられている。たとえば、マウスのＩｇＭ抗体及びＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ１成分に結合することによってヒトの補体を活性化することができ、腫瘍の溶解を招くことができる補体活性化の古典的経路を活性化する。ヒトの抗体については、最も有効な補体活性化抗体は一般にＩｇＭとＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３のアイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球及び特定のリンパ球による細胞の殺傷を招くＦｃ受容体を有する細胞傷害性細胞を動員するのに有効である。ＩｇＧ１とＩｇＧ３のヒト抗体はＡＤＣＣに介在する。
【００６０】
癌殺傷に介在する抗体の可能性のある別のメカニズムは、細胞膜及びそれに会合する糖タンパク質又は糖脂質における種々の化学結合の加水分解を触媒するように機能する抗体、いわゆる触媒抗体の使用を介してもよい。
【００６１】
抗体が介在する癌の殺傷についてさらに３つのメカニズムがある。第１は、癌細胞に存在する推定上の抗原に対して免疫応答を生じるように生体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖受容体を標的とし、その機能を妨害する、又はその機能を効果的に喪失するように受容体を下方調節する抗体の使用である。第３は、たとえば、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１又はＴＲＡＩＬ  Ｒ２のような死の受容体又はαＶβ３などのようなインテグリン分子の結合のような、直接、細胞死を招いてもよい細胞表面部分の直接結合におけるそのような抗体の効果である。
【００６２】
癌の薬剤の臨床的有用性は、患者にとって受け入れ可能なリスク特性のもとでの薬剤の利益に基づく。癌の治療では、利益の後に生存が一般に最も求められるが、生命を延長することに加えて、多数のよく認識された利益がある。治療が生存に有害に影響しないこれらのそのほかの利益には、症状の一時的緩和、有害事象に対する保護、再発又は疾患のない生存までの時間の延長、及び進行までの時間の延長が挙げられる。これらの基準は一般に受け入れられており、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のような規制当局が、これらの利益を生じる薬剤を認可する（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２：１３７−１４３  ２００２）。これらの基準に加えて、これらの型の利益を事前に予測してもよいそのほかの評価項目があることもよく認識されている。一つには、米国ＦＤＡによって認可された加速された認可過程は、患者の利益を予測すると思われる代わりのものがあることを認めている。年末（２００３年）の時点で、この過程のもとで認可された１６の薬剤があり、このうち４つが完全な認可に進んだ、すなわち、追跡試験によって、代わりの評価項目で予測されたような直接的な患者の利益が実証された。固形腫瘍における薬剤の効果を決定するための重要な評価項目の１つは、治療に対する応答を測定することによる腫瘍の負担の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２（３）：２０５−２１６  ２０００）。そのような評価の臨床的な基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、癌における国際的な専門家のグループである固形腫瘍ワークショップグループにおける応答評価基準によって広められている。ＲＥＣＩＳＴ基準に従って目的の応答によって示されたような、腫瘍の負担に対する実証された効果を持つ薬剤は、適当な対照群と比べて、最終的には直接的な患者の利益を生み出す傾向がある。前臨床の設定では、腫瘍の負担は一般に、評価し、記録するのにさらに簡単である。前臨床試験を臨床の設定に変換できる点で、前臨床モデルで生存の延長を生み出す薬剤は、最も期待された臨床的有用性を有する。臨床治療に対して陽性の応答を生じることに類似して、前臨床の設定で腫瘍の負担を軽減する薬剤は疾患に対して有意な直接的影響を有してもよい。癌の薬剤治療からの臨床的転帰の後、生存の延長が最も求められるが、臨床の有用性を有するそのほかの利益があり、腫瘍の負担が軽減されるのは明らかであり、それが、疾患の進行の遅延、生存の延長又はその双方と相関してもよく、直接的な利益をもたらすことができ、臨床的影響を有することができる（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．開発上の治療学：標的化合物の治験設計の成功と失敗；ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，３９ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００３，ｐａｇｅｓ  ２０９−２１９）。
【００６３】
その内容を参照によって本明細書にそれぞれ組み入れる米国特許第６、１８０、３５７号のプロセスを実質的に用いて、米国特許第７，００９，０４０号で開示されたように、患者の乳癌生検由来の細胞でマウスを免疫したのに続いてマウスのモノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａを得た。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は、異なった組織の起源に由来する広範なヒト細胞株の細胞表面で発現されている。試験管内で、乳癌細胞株ＭＣＦ７及び前立腺癌の細胞株ＰＣ−３は、７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞傷害性効果に試験管内で感受性だった。
【００６４】
培養中の乳癌細胞及び前立腺癌細胞に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞傷害性の成績は、生体内でのこれらの癌に向けた抗腫瘍活性によってさらに拡大した（７，００９，０４０、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されたように）。
【００６５】
７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒト乳癌のＭＢ−２３１予防的生体内モデルで腫瘍増殖及び腫瘍の負担を抑制した。治療後３００日を過ぎてモニタリングは継続した。７ＢＤ−３３−１１Ａで治療したマウスが腫瘍を発生することはなく、７ＢＤ−３３−１１Ａで治療した群の８７．５パーセントは移植後９ヵ月を超えてなお生存していた（マウスのうち１匹は非腫瘍関連の原因で死亡した）。逆に、アイソタイプ対照群では、７２日目（治療後２３日）までに死亡率は１００％だった。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌モデルにおいて生存を高め、腫瘍増殖を抑制した（従って、疾患の進行を遅らせた）。
【００６６】
７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒト乳癌の確立された生体内モデルで腫瘍増殖を有意に抑制し、腫瘍の負担を減らした。８０日目までに（治療後２３日）、７ＢＤ−３３−１１Ａで治療されたマウスは、アイソタイプ対照群に比べて８３％低下した平均腫瘍容量を有した（ｐ＝０．００１）。抗体の有効性の尺度として生存率を用いて、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療群における死亡のリスクは、治療後６０日前後でアイソタイプ対照群の約１６パーセントであると（ｐ＝０．０００６）概算された。治療後５０日までにアイソタイプ対照群の１００％が死亡した。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療が、対照治療群に比べて生存の利益を付与し、腫瘍の負担を軽減することを実証した。
【００６７】
７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、体重減少及び臨床的苦痛を始めとした毒性の兆候を誘発しなかったので安全であると思われた。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａと１Ａ２４５．６の治療は、ヒト乳癌の上手く確立されたモデルにて対照群と比べて双方共、腫瘍の増殖を遅らせ、生存率を高めたので有効であった。
【００６８】
その内容が参照によって本明細書に組み入れられる、２００４年３月２６日に出願された係属出願Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示された研究では、化学療法剤（シスプラチン）単独治療又は併用と比べた７ＢＤ−３３−１１Ａの効果が、２つの異なった確立された乳癌異種移植モデルで判定された。
【００６９】
ＭＢ−２３１モデルでは、８３日目（治療後２０日）にて７ＢＤ−３３−１１Ａ治療は、緩衝液対照治療群と比べて腫瘍増殖で８３％の低下を生じた（ｐ＝０．００２）。シスプラチンのみの治療では、対照に比べて腫瘍サイズで７７％の低下を生じたが、７ＢＤ−３３−１１Ａと併用したシスプラチンは、対照に比べて腫瘍サイズで８８％の低下を生じた（ｐ＝０．００６）。
【００７０】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）モデルでは、６２日目（治療後１２日）にて７ＢＤ−３３−１１Ａと併用したシスプラチンで、腫瘍増殖で大きな低下が見られた（９７％、ｐ＝０．００１）。シスプラチンのみの治療では、緩衝液対照に比べて腫瘍増殖で９５％の低下を生じたが、７ＢＤ−３３−１１Ａのみの治療は、３７％の低下を示した（ｐ＝０．０４６）。
【００７１】
ＭＢ−２３１モデル及びＭＢ−４６８モデルの双方では、７ＢＤ−３３−１１Ａによる治療は、体重によって測定した場合、シスプラチンによる治療に比べて、動物の大きな安らぎをもたらした。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療が、ＭＢ−２３１モデルにおいてシスプラチン単独治療に比べて大きな有効性を有し、双方の乳癌モデルにおいて体重減少のような有害効果がシスプラチンより少なく、より良く認容されることを示した。
【００７２】
種々の用量での７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を判定するために、予防的乳癌異種移植モデル（Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されたように）にて用量反応実験を行った。５５日目（治療後５日）にて０．２ｍｇ／ｋｇ治療群は、アイソタイプ対照治療群に比べて８５％に低下した腫瘍増殖を有した。また、５５日目にて、２ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇの治療群は双方共、まだ腫瘍を新しく作り出してはいなかった。同様の結果は過ぎた１２５日目（治療後７５日）でも得られ、２０ｍｇ／ｋｇの治療群はまだ腫瘍を新しく作り出してはいなかったし、２ｍｇ／ｋｇの治療群は多少の新しい腫瘍増殖を有した。７ＢＤ−３３−１１Ａの治療も生存の利益を示した。アイソタイプ対照群のマウスはすべて１０４日（治療後５４日）までに死亡したが、０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ治療群は、１９７日（治療後１４７日）まで生き延びた。さらに大きな生存の利益は、２．０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ治療群で見られ；２．０ｍｇ／ｋｇ治療群の５０％は２９０日（治療後２４０日）までに死亡したが、２０ｍｇ／ｋｇ治療群では２９０日までに死亡はなかった。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、有意な腫瘍増殖低下を示し、３種の用量すべてで生存率を高め、最大の有効性は最も高い用量で示された。
【００７３】
乳癌の生体内で確立された腫瘍モデルにおける有益な効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、予防的生体内前立腺癌モデル（それぞれその内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示された）におけるＰＣ−３細胞に対する抗腫瘍活性も有した。７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６は、アイソタイプ対照抗体よりも治療期間の直後、腫瘍増殖を抑えることにおいて有意に（それぞれ、ｐ＝０．００１及びｐ＝０．０１７）さらに有効だった。治療相の終了時、７ＢＤ−３３−１１Ａを与えたマウスは、アイソタイプ対照群の３１％に過ぎない増殖した腫瘍を有した。
【００７４】
ＰＣ−３−ＳＣＩＤ異種移植モデルでは、疾患の進行の代わりの指標として体重を用いることができる。５２日目で７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、アイソタイプ対照に比べて５４％で体重低下を有意に防いだ（ｐ＝０．００２）。治療後の生存についてマウスをモニターした。治療後１１日目にて、アイソタイプ対照及び緩衝液対照のマウスは１００％死亡率に達した。代わって、７ＢＤ−３３−１１Ａは、治療後３８日目に１００％死亡率に達し、対照群より３倍長かった。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、ヒト前立腺癌の定評のあるモデルにおいて、アイソタイプ対照治療群に比べて腫瘍増殖を遅らせ、体重減少を防ぎ、生存を延長するので有効であった。
【００７５】
前立腺癌の予防的生体内腫瘍モデルに加えて、確立された生体内腫瘍モデル（それぞれその内容を参照によって本明細書に組み入れる、２００３年６月２３日に出願された係属出願、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６、及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示された）におけるＰＣ−３細胞に対して７ＢＤ−３３−１１Ａは抗腫瘍活性を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａによる治療を再びアイソタイプ対照と比べた。治療直後、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療群は、アイソタイプ対照治療群と比べて有意に（ｐ＜０．０２４）小さな平均腫瘍容積を有することが示された。７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、アイソタイプ対照群と比べて３６％の腫瘍抑制に介在した。
【００７６】
乳癌及び前立腺癌の生体内腫瘍モデルにおける有益な効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療はまた、予防的生体内膵臓癌モデル（Ｓ．Ｎ．１１／３２１，６２４で開示されたように）におけるＢｘＰＣ−３細胞に対する抗腫瘍活性も有した。治療期間の直後、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、腫瘍増殖を抑えることにおいて緩衝液対照よりも有意に有効（７１％、ｐ＝０．０００９）であった。さらに、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、緩衝液対照治療群に比べて生存の利益を付与した。７ＢＤ−３３−１１Ａ治療群では、緩衝液対照群のマウスがすべて死亡した後２週間を超えて、４０％のマウスがなお生存した。
【００７７】
乳癌、前立腺癌及び膵臓癌の生体内腫瘍モデルにおける有益な効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、２つの別々の生体内メラノーマ癌モデル（Ｓ．Ｎ．１１／３２１，６２４で開示されたような）におけるＡ２０５８細胞及びＡ３７５細胞に対する抗腫瘍活性も有した。Ａ２０５８モデル及びＡ３７５モデルの双方において、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、腫瘍増殖を抑えることにおいて緩衝液対照よりも有意に有効（それぞれ７２％、ｐ＝０．０１１及び６３％、ｐ＝０．０００６）であった。乳癌、前立腺癌及び膵臓癌のモデルと同様にメラノーマにおける７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性によって、それが魅力的な抗癌治療剤になる。
【００７８】
ヒトのメラノーマの予防的生体内モデルで示された有益な効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、２つの別々の生体内メラノーマ癌モデル（２００５年１２月２９日に出願された係属出願、Ｓ．Ｎ．１１／３２１，６２４で開示されたような）におけるＡ２０５８細胞及びＡ３７５細胞に対する抗腫瘍活性も有した。腫瘍増殖は、それぞれＡ２０５８モデル及びＡ３７５モデルに対する７ＢＤ−３３−１１Ａの治療群及び７ＢＤ−３３−１１Ａとダカルバジンの併用治療群において有意に阻害された。Ａ２０５８モデルでは、腫瘍の平均容積は対照群の測定値の３０．８７％（ｐ＜０．４４３）であった。Ａ３７５モデルでは、７ＢＤ−３３−１１Ａとダカルバジンの併用治療群は、３９．１日のＴＴＥ（終末までの時間）の中央値を生じたが、それは腫瘍増殖における有意な１４７％の遅延に相当する（ｐ＜０．０１）。いずれのモデルでも毒性の死亡は認められなかった。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａの治療は、安全であると思われ、確立されたヒト癌の乳癌及び今やメラノーマの生体内モデルの治療において有効性を示している。
【００７９】
生体内で７ＢＤ−３３−１１Ａによって明らかにされた有効性が全体として又は部分的にＡＤＣＣによるものなのかどうかを判定するために、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス及びＳＣＩＤマウス（Ｓ．Ｎ．１１／３２１，６２４で開示されたような）における確立した腫瘍モデルにてＭＢ−２３１細胞に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性を測定した。ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に機能的に欠損があり、循環する補体を欠き、機能的に成熟したマクロファージ集団を欠く一方でＳＣＩＤマウスは補体活性及び健全なＮＫ細胞活性の双方を欠く。７ＢＤ−３３−１１ＡはマウスのＩｇＧ２ａモノクローナル抗体なので、生体内でのＡＤＣＣ活性が可能である。緩衝液対照、及びそのアイソタイプに基づいてはＡＤＣＣを介した活性を示すはずがないマウスのＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＨ４６０−２２−１の双方と７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性を比べた。ＳＣＩＤ治療群の５４日目（最後の治療から４日目）にて、７ＢＤ−３３−１１Ａ及びＨ４６０−２２−１で治療したマウスは、緩衝液対照で治療したマウスの平均腫瘍容積のそれぞれたった１．９％及び３．６％である腫瘍を新しく作った。代わって、ＮＯＤ  ＳＣＩＤ治療群では、再び５４日目（最後の治療から４日目）にて７ＢＤ−３３−１１Ａで治療したマウスは、緩衝液対照で治療したマウスの平均腫瘍容積の６７％の腫瘍増殖を有した。Ｈ４６０−２２−１で治療したマウスは、ＳＣＩＤマウスと同様に効果を呈し、腫瘍増殖は緩衝液対照で治療したマウスの平均腫瘍容積の１．４％であった。その結果、７ＢＤ−３３−１１Ａの生体内の活性は一部ＡＤＣＣによると思われるが、Ｈ４６０−２２−１の抗腫瘍効果はＡＤＣＣとは独立していると思われる。
【００８０】
薬剤標的としての７ＢＤ−３３−１１Ａのエピトープを確認するために、正常なヒト組織におけるその標的抗原の発現を確定した。それぞれその内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されたように、正常なヒト組織に向けた７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を測定した。ＩＨＣ染色によって、たとえば、腎臓、心臓及び肺のような重要臓器を含む組織の大半は７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を発現することができなかった。７ＢＤ−３３−１１Ａは、唾液腺、肝臓、膵臓、胃、前立腺及び十二指腸を染色したが、強く染色したのは扁桃腺だった。組織染色の結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａは種々の細胞種に制約された結合を示したが、浸潤しているマクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞への結合を有した。７ＢＤ−３３−１１Ａは膜及び細胞質の双方を染色するパターンを呈した。
【００８１】
その内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されたように、７ＢＤ−３３−１１Ａを市販の抗ＣＤ６３抗体（ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６）と比較した。正常なヒト組織の染色の結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は種々の細胞種に制約された結合を示すが、浸潤しているマクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞への結合を有することを示した。ＲＦＡＣ４抗体及びＨ５Ｃ６抗体は、互いに比較して類似するパターンを示した。しかしながら、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６の双方の染色パターンは、７ＢＤ−３３−１１Ａで見られたものとは全く異なっていた。具体的には、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６双方の抗体は、広い範囲の正常組織と結合し、７ＢＤ−３３−１１Ａが陽性である組織でさらに高い染色強度を普通有し、浸潤しているマクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞だけでなく、組織の大半における上皮組織と結合した。
【００８２】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の局在及び乳癌患者の間でのような集団内におけるそれを持つ割合の判定は、この抗体の治療用途を評価し、有効な臨床試験を設計することにおいて重要である。癌患者に由来する乳癌における７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現に対応するために、９８人の乳癌患者からの腫瘍組織試料を７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現についてスクリーニングした（５０人の患者からの結果は、それぞれその内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で以前記載された）。
【００８３】
これらの試験の結果は、組織試料の３７％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原について陽性に染色されることを示した。患者の試料内での７ＢＤ−３３−１１Ａの発現は、染色が悪性細胞に限定されていたので癌細胞に特異的であると思われた。さらに、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌患者からの正常組織の２０試料中どれも染色しなかった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の乳癌での発現は、悪性細胞の膜及び細胞質に局在していると思われ、このことによってＣＤ６３が治療法のための魅力的な標的となった。
【００８４】
その内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されたように、７ＢＤ−３３−１１ＡをＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６と比較し、抗Ｈｅｒ２抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２）と比較した。本試験の結果は、以前の結果と類似しており、腫瘍組織試料の３６％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原について陽性に染色されが、乳癌組織の９４％及び８５％がそれぞれＨ５Ｃ６及びＲＦＡＣ４のエピトープについて陽性だった。患者試料内での７ＢＤ−３３−１１Ａの発現は、染色が悪性細胞に限定されていたので癌細胞に特異的であると思われた。さらに、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌患者からの正常組織の１０試料中どれも染色しなかったが、Ｈ５Ｃ６及びＲＦＡＣ４は、正常乳腺組織の８試料のうち７つを染色した。ｃ−ｅｒｂＢ−２との比較では、７ＢＤ−３３−１１Ａは完全に異なった染色性を示し、その際、７ＢＤ−３３−１１Ａについて陽性である乳腺組織試料の半分がＨｅｒ２発現について陰性であったということは、７ＢＤ−３３−１１Ａは、既知の抗体療法が役立てられていない患者集団を標的にすることを示した。７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２の双方で陽性だった乳癌組織切片の間での染色の強度にも差異があった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体は正常な乳腺組織切片の１つを陽性に染色した。
【００８５】
それぞれその内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１及びＳ．Ｎ．１１／３２１，６２４で開示されたように、乳癌の発生、治療及び予後で重要な役割を担うホルモン、エストロゲン及びプロゲステロンの受容体の乳癌での発現に基づいて７ＢＤ−３３−１１Ａの発現をさらに評価した。エストロゲン受容体の非存在とプロゲステロン受容体の存在と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現の間にわずかな相関があった。癌が進行するステージ又は程度に基づいて腫瘍を分析すると、結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａの陽性発現が多くなればなるほど高い腫瘍ステージに進む傾向を示唆した。同様の結果は、エストロゲンとプロゲステロンの受容体の発現との非常にわずかな相関が示されたが、腫瘍のステージとも明らかな相関はないＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６でも得られたが、試料サイズが小さいために結論は限定された。
【００８６】
７ＢＤ−３３−１１Ａの局在及び前立腺癌患者におけるそれを持つ割合は、前立腺癌患者に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の利益を評価し、有効な臨床試験を設計することにおいて重要である。癌患者の前立腺腫瘍における７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現に対応するために、５１人の前立腺癌患者からの腫瘍組織試料を７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現についてスクリーニングした（その内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されたように）。試験の結果は、組織試料の８８％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原について陽性に染色されることを示した。７ＢＤ−３３−１１Ａは同様に高い強度で正常組織も染色したが、正常試料に比べて腫瘍組織試料で高い程度の膜染色があった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原について染色されない胎児性横紋筋肉腫の組織試料があった。調べた小さなサイズの試料では、腫瘍のステージと７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在との間に直接的な相関があるとは思えなかった。
【００８７】
７ＢＤ−３３−１１Ａの局在及びメラノーマ癌患者におけるそれを持つ割合は、メラノーマ癌患者に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の利益を評価し、有効な臨床試験を設計することにおいて重要である。癌患者のメラノーマ腫瘍における７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現に対応するために、３９人のメラノーマ癌患者からの腫瘍組織試料を７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現についてスクリーニングした（Ｓ．Ｎ．１１／３２１，６２４で開示されたように）。試験の結果は、組織試料の９０％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原について陽性に染色されることを示した。この小さな試料サイズでは、腫瘍のステージと７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在との間に直接的な相関があるとは思えなかった。
【００８８】
７ＢＤ−３３−１１Ａの治療利益の可能性をさらに広げるために、種々のヒト癌組織内における抗原の頻度及び局在も確定した（それぞれその内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１及びＳ．Ｎ．１１／３２１，６２４で開示された）。乳癌及び前立腺癌に加えて幾つかのタイプの癌が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を発現していた。陽性のヒト癌のタイプには、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、子宮（４／４）及び腎臓（３／３）が挙げられた。一部の癌は抗原を発現していなかった。これらには、卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）及びリンパ節（０／２）が挙げられた。ヒトの乳癌、前立腺癌及びメラノーマの癌組織と同様に、７ＢＤ−３３−１１Ａの局在は、これらの腫瘍細胞の膜上及び細胞質の中にあった。従って、試験管内で癌細胞株に結合する７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体に加えて、抗原がヒトにおいて及び複数のタイプの癌で発現されるという証拠がある。
【００８９】
その内容を参照によって本明細書に組み入れるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されたように、生化学のデータも７ＢＤ−３３−１１Ａによって認識される抗原はＣＤ６３であることを示している。このことは、ＣＤ６３に対して反応性であるモノクローナル抗体ＲＦＡＣ４が免疫沈降によって７ＢＤ−３３−１１Ａに結合するタンパク質を同定することを示す研究によって支持される。さらに、細菌での発現の研究によって７ＢＤ−３３−１１ＡはＣＤ６３の細胞外ループ２に結合することが明らかにされた。７ＢＤ−３３−１１Ａのエピトープは立体配座依存性であることによっても識別された。これらのＩＨＣ及び生化学的結果は、７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３抗原に結合することを示している。従って、証拠の優勢は、７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３上に存在する独特の立体配座エピトープとの連結を介して抗癌効果に介在することを示している。本発明の目的で、ハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａによってコードされるモノクローナル抗体、その抗原結合断片又はその抗体抱合体と結合する能力を特徴とする「ＣＤ６３抗原部分」として前記エピトープを定義する。
【００９０】
全体として、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が癌関連抗原であり、ヒトで発現され、病理学的に関連する癌の標的であることを示している。さらに、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体のヒト癌組織への結合を示し、診断用、治療の予測用又は予後用であってもよいアッセイに適宜使用することができる。さらに、この抗原の膜への局在は、ほとんどの非悪性細胞でのこの抗原の発現が相対的に稀であるために細胞の癌の状況を示すことになり、この所見によって、診断用、治療の予測用又は予後用であってもよいアッセイに使用されるこの抗原、その遺伝子又は誘導体、そのタンパク質又はその変異体の使用が可能になる。
【００９１】
本発明は、米国特許第６，１８０，３５７号に記載された方法によって作成され、細胞傷害性アッセイ、動物モデルにおける腫瘍増殖及び癌性疾患に罹ったヒトにおける生存期間の延長においてその効果が同定された７ＢＤ−３３−１１Ａの作成及び使用を記載する。
【００９２】
本発明は、標的分子ＣＤ６３上のエピトープ（単数）又はエピトープ（複数）に特異的に結合し、正常細胞ではなく悪性肝腫瘍細胞に対して試験管内で転移防止特性も有し、ヒト肝癌の生体内モデルにて腫瘍増殖、転移の阻害及び生存の延長に直接介在する試薬を記載するという点で癌治療の分野での前進を代表する。本明細書で開示される証拠の優越は、７ＢＤ−３３−１１Ａが、肝細胞から生じる原発又は転移の腫瘍部位を含むことが広く理解される肝癌で発現されるＣＤ６３に存在するエピトープの連結を介して抗癌効果に介在することを示している。本出願は、肝癌患者についてＣＤ６３の発現が患者の全般的な生存に逆相関することを示している。さらに、ＣＤ６３のさらに高い発現は、原発肝癌の組織試料及び細胞株に対比して転移したもので認められる。本発明はまた、７ＢＤ−３３−１１Ａが、試験管内にてＣＤ６３＋ヒト肝癌細胞の増殖、移動及び浸潤を低下させ、生体内での腫瘍の負担及びヒト肝癌の転移の可能性を軽減することも開示する。
【００９３】
ほかに類似する特性を有することが示されなかったので、これは、以前記載されたそのほかの抗ＣＤ６３抗体に関する進歩である。それは、特定のタイプの腫瘍に関連する事象へのＣＤ６３の直接的な関与を明瞭に示しているのでその分野での進歩も提供する。それは、ヒト患者において同様の抗癌特性を示す可能性を有するので癌治療においても前進を代表する。さらなる前進は、抗癌抗体のライブラリにこれらの抗体を含めることが、異なった抗癌抗体の適切な併用を決定することにとって異なった抗原マーカーを発現する腫瘍を標的とする可能性を高めて腫瘍の増殖及び進展を標的とする及び阻害することにおいて最も有効なことを見い出すことである。
【００９４】
全体で、本発明は、投与された場合、哺乳類において抗原を発現している癌の腫瘍の負担及び転移の可能性を軽減することができ、治療された哺乳類の生存の延長をもたらす治療剤についての標的としての７ＢＤ−３３−１１Ａの使用を教示する。
【００９５】
従って、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株、並びに前記ハイブリドーマ細胞株がコードする、相当する単離されたモノクローナル抗体及びその抗原結合断片を単離するために、特定の個人、又は１以上の特定の癌細胞株に由来する癌性細胞に対して作成された癌性疾患緩和抗体（ＣＤＭＡＢ）を作製する方法を利用することであり、その際、ＣＤＭＡＢは癌細胞に対して細胞傷害性である一方で同時に非癌性細胞に対しては相対的に非毒性である。
【００９６】
本発明の追加の目的は、癌性疾患緩和抗体、リガンド、ＣＤＭＡＢ及びその抗原が結合する断片を教示することである。
【００９７】
本発明のさらなる目的は、その細胞傷害性が抗体依存性の細胞毒性を介して介在する癌性疾患緩和抗体を製造することである。
本発明の追加の目的は、その細胞傷害性が補体依存性の細胞毒性を介して介在する癌性疾患緩和抗体を製造することである。
【００９８】
本発明のその上さらなる目的は、その細胞傷害性が細胞の化学結合の加水分解を触媒する能力の機能である癌性疾患緩和抗体を製造することである。
【００９９】
本発明のその上さらなる目的は、癌性疾患緩和抗体、並びに診断、予後及び癌のモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢｓを製造することである。
【０１００】
本発明のそのほかの目的及び利点は、説明及び例示を目的として本発明の特定の実施態様が述べられる以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
特許又は出願のファイルは少なくとも１枚のカラーで作成された図面を含有する。カラー図面を伴う本特許又は特許出願のコピーは、要求し、必要な料金を支払った際、特許庁により提供されるであろう。
【図１】ヒト肝腫瘍及び正常組織のマイクロアレイ上で結合する７ＢＤ−３３−１１Ａの要約を示す図である。
【図２】（Ａ）肝細胞癌にて７ＢＤ−３３−１１Ａによって、（Ｃ）肝細胞癌にてアイソタイプ対照抗体によって、（Ｂ）転移胆管癌にて７ＢＤ−３３−１１Ａによって、又は（Ｄ）転移胆管癌にてアイソタイプ対照抗体によって得られた肝腫瘍組織における結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。
【図３】原発ＨＣＣ及びそれに相当する転移腫瘍の６０対を含有する組織マイクロアレイ上でのＣＤ６３とＨＣＣ転移の相関を示す図である。
【図４】肝細胞癌（ＨＣＣ）の組織マイクロアレイにおけるＣＤ６３の発現を示す表である。
【図５Ａ】ＨＣＣにおけるＣＤ６３の過剰発現の臨床的意義を示す図である。
【図５Ｂ】ＨＣＣにおけるＣＤ６３の過剰発現の臨床的意義を示す図である。
【図６】ＣＤ６３の過剰発現とＨＣＣ患者の臨床病理学的特徴の相関を示す表である。
【図７】ＣＤ６３の過剰発現と種々のＨＣＣ細胞株の転移能との間の相関を示す図である。
【図８】Ｈｅｐ３Ｂ  ＨＣＣ細胞株の試験管内でのＣＤ６３の機能的役割を示す図である。
【図９】ＭＨＣＣ−９７Ｈ  ＨＣＣ細胞株における７ＢＤ−３３−１１Ａの試験管内の効果を示す図である。
【図１０】確立された同所性ＨＣＣ腫瘍モデルにおけるＨＣＣ腫瘍の増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を示す図である。データ点は平均値±ＳＥＭを示す。
【図１１】確立された同所性ＨＣＣ腫瘍モデルにおける肝臓内転移及び肺転移に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を示す図である。データ点は平均値±ＳＥＭを示す。
【図１２】確立された転移ＨＣＣ腫瘍モデルにおけるＨＣＣ転移に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を示す図である。データ点は平均値±ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
一般に、以下の用語及び語句は、要約、説明、実施例及びクレームで使用される場合、示される定義を有する。
【０１０３】
用語「抗体」は、広義で使用され、具体的には、たとえば、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体、脱免疫化、マウスの、キメラ化又はヒト化抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗体組成物、単鎖抗体、免疫抱合体及び抗体の断片（以下を参照）を網羅する。
【０１０４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を言い、すなわち、わずかな量で存在してもよい自然に生じる突然変異の可能性を除いて集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられている。さらに、様々な決定基（エピトープ）に向けられた様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入することなく合成されてもよいという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を指し、特定の方法による抗体の製造を要求するとして解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ（マウス又はヒト）法によって作成されてもよく、又は組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作成されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
【０１０５】
「抗体断片」は、未処理の抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、完全長に満たない抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖの断片、ダイマー抗体、直鎖抗体、単鎖抗体分子、抗体断片から形成される単鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質及び多重特異性抗体が挙げられる。
【０１０６】
「未処理」の抗体は、抗原結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（たとえば、ヒトの天然配列の定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。好ましくは、未処理の抗体は１以上のエフェクター機能を有する。
【０１０７】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、未処理の抗体は、異なった「クラス」に割り振られる。未処理の抗体には５つの主なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの一部はさらに「サブクラス」（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられる。抗体の異なったクラスに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なったクラスのサブユニット構造及び三次元構造は周知である。
【０１０８】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域又はアミノ酸変異体のＦｃ領域）に起因する生物活性を言う。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体の結合、抗体依存性の細胞介在性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体の下方調節（たとえば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）などが挙げられる。
【０１０９】
「抗体依存性の細胞介在性の細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上に結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性の反応を言う。ＡＤＣＣに介在する主な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。当該分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、たとえば、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されたような試験管内のＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。或いは、又はさらに、当該分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）で開示されたような動物モデルにて生体内で評価してもよい。
【０１１０】
「エフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣのエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣに介在するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられるが、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然の起源、たとえば、本明細書で記載されるようなＰＢＭＣから単離されてもよい。
【０１１１】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｅ領域に結合する受容体を記載するのに使用される。好ましいＦｃＲは天然配列のヒトのＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、対立遺伝子変異体及び代替的にスプライシングされたこれら受容体の形態を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（活性化受容体）及びＦｃγＲＩＩＢ（阻害受容体）が挙げられ、これらは類似したアミノ酸配列を有するが、その細胞質ドメインで主として異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシンを基にした活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンを基にした阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；ａｎｄ  ｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）で概説されている。将来同定されるものを含むそのほかのＦｃＲも本明細書では、用語「ＦｃＲ」によって包含される。用語はまた、母性ＩｇＧを胎児に移行させる役目を持つ新生児の受容体、ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７  （１９７６）ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４２９（１９９４））。
【０１１２】
「補体依存性の細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を言う。補体活性化の経路は、補体系の第１補体（Ｃ１ｑ）を同系抗原と複合体形成した分子（たとえば、抗体）に結合させることによって開始される。補体の活性化を評価するために、たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【０１１３】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列で大規模に異なり、特定の抗原のための特定の抗体の結合及び特性に使用されるという事実を言う。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体を通して均一に配分されるわけではない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインにおける超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中する。可変ドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つの超可変領域が接続する４つのＦＲ、大きく適応するβシート構造を含み、それは接続するループを形成し、場合によっては一部でシート構造を形成する。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって非常に近く一緒に保持され、各鎖の超可変領域は、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与することはないが、たとえば、抗体依存性の細胞性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の参画のような種々のエフェクター機能を呈する。
【０１１４】
用語「超可変領域」は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に責務を負う抗体のアミノ酸残基を言う。超可変領域は一般に「相補性決定領域」又は「ＣＤＣ」（たとえば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（Ｌｌ）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインにおける３１−３５（Ｈｌ）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））からのアミノ酸残基及び／又は「超可変ループ」（たとえば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌｌ）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈｌ）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））からのそれら残基を含む。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」の残基は、本明細書で定義されるような超可変領域以外の可変ドメインの残基である。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、それぞれ単一の抗原結合部位を持つ２つの同一の抗原結合断片及びその名称が容易に結晶化される能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン消化は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２を生じる。
【０１１５】
Ｆｖは完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、非共有の堅固な会合における重鎖１本と軽鎖可変ドメイン１本の二量体から成る。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面で抗原結合部位を規定するのはこの構成においてである。まとめて６つの超可変領域が抗体の抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの超可変領域を含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは親和性は低いものの、抗原を認識し、結合する能力を有する。Ｆａｂ断片も軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域に由来する１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での２、３の残基の付加によってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは本明細書では、少なくとも１つの遊離のチオール基で定常ドメインのシステイン残基を持つＦａｂ’の意味である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、その間のヒンジのシステインを有するＦａｂ’断片の対として生じた。抗体のそのほかの化学結合物も知られている。
【０１１６】
脊椎動物種に由来する抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに識別可能な型の１つに割り当てられる。
【０１１７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさたに、ｓｃＦｖが抗原結合について望ましい構造を形成することが可能であるＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドのリンカーを含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１  １３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【０１１８】
用語「ダイマー抗体」は、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗原断片を言い、その際、断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短すぎて同一鎖上で２つのドメインの間で対を成すことができないリンカーを用いることによって、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を成すことを強いられ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイマー抗体は、たとえば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに完全に記載されている。
【０１１９】
「単離された」抗体は、その天然の環境から同定され、分離された及び／又は回収されたものである。天然の環境の混入する成分は、抗体の診断用途又は治療用途に干渉する物質であり、酵素、ホルモン及びそのほかのタンパク性又は非タンパク性の溶質が挙げられる。単離された抗体には、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内のその場での抗体が含まれる。しかしながら通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【０１２０】
当該の抗原、たとえば、ＣＤ６３の抗原部分を「結合する」抗体は、抗体が、抗原を発現する細胞を標的とすることにおいて治療剤又は診断剤として有用であるように、十分な親和性でその抗原を結合することが可能であるものである。抗体がＣＤ６３抗原部分に結合する場合、それは普通、他の受容体ではなくＣＤ６３抗原部分に優先的に結合し、非特異的なＦｃとの接触のような偶発的な結合、又は他の抗原に共通する翻訳後修飾への結合を含まず、他のタンパク質と有意に交差反応しない。当該抗原を結合する抗体を検出する方法は、当該技術で周知であり、たとえば、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」は相互交換可能に使用され、そのような表示はすべて子孫を含む。周到な又は不慮の突然変異のために、子孫すべてがＤＮＡ内容物で正確に同一でなくてもよいことも理解される。スクリーニングされたように、最初に形質転換された細胞と同様の機能又は生物活性を有する突然変異の子孫は包含される。別個の意味が意図される場合は背景から明らかであろう。
【０１２２】
「治療」は、療法上の治療及び予防上の又は予防的な治療の双方を言い、その際、目的は、標的とされる病態又は障害を防ぐ又は鈍化させる（小さくする）ことである。治療を必要とするものには、障害を持つ傾向があるもの又は障害が防がれるべきものと同様にすでに障害を持つものが挙げられる。従って、本明細書で治療されるべき哺乳類は、障害を有するとして診断されていてもよく、又はその素因があってもよく又は障害に感受性であってもよい。
【０１２３】
用語「癌」及び「癌性」は、通常、無秩序な細胞の増殖又は死を特徴とする哺乳類における生理的な状態を言う又は記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽球腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のさらに詳しい例には、有棘細胞癌（たとえば、上皮性有棘細胞癌）、小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、肺の腺癌及び肺の有棘細胞癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌を含む消化器癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎癌又は腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頚部癌が挙げられる。
【０１２４】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、たとえば、チオテパ及びサイクロホスファミド（シトキサン［商標］）のようなアルキル化剤；ブサルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホネート類；ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ及びウレヂパのようなアジリジン類；アルトレアミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホアミド、トリエチレンチオホスファオラミド及びトリメチローロメラミンを含むエチレンイミン類及びメチラメルアミン類；クロラムブシル、クロラナファジン、クロロホスホアミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン、ヒドロクロリン、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのような窒素マスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カシノマイシン、カラビシン、カルノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルレウシン、ドキソルブシン、エピルブシン、エソルビシン、イダルビシン、メルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、プトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ジルビシンのような抗生物質；メソトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝防止剤；デノプテリン、メソトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、トリアミプリン、チオグアニンのようなプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモファ、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオキシウリジン、５−ＦＵのようなピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミオタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸のような葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミド；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリメチルアミン；ウレタン；ビンデスチン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；サイクロホスファミド；トリオテパ；タクサン類、たとえば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．））及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メソトレキセート；たとえば、シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類縁体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビシン；ナベビシン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ−２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；並びに上記いずれかの薬学上許容可能な塩、酸又は誘導体が挙げられる。また、たとえば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（ファレストン）を含む抗エストロゲン剤、並びにたとえば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、レウプロリド及びゴセレリンのような抗アンドロゲン剤、並びに上記いずれかの薬学上許容可能な塩、酸又は誘導体のような、腫瘍におけるホルモンの作用を調節する又は阻害するように作用する抗ホルモン剤もこの定義に含められる。
【０１２５】
治療を目的とした「哺乳類」は、たとえば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのようなヒト、マウス、ＳＣＩＤマウス又はヌードマウス又は系統マウス、家畜、動物園の動物、スポーツ用動物又は愛玩動物を含む哺乳類として分類される動物を言う。好ましくは、哺乳類は本明細書ではヒトである。
【０１２６】
「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（たとえば、ＥＰ  ２６６，０３２，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ４  Ｍａｙ  １９８８に記載されたような固相法を用いたホスホトリエステル法、ホスフィト法又はホスホルアミダイト法、又はＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７，１９８６によって記載されたデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して）で化学的に合成される長さの短い、一本鎖又は二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。次いで、それらをポリアクリルアミドゲル上で精製する。
【０１２７】
特に指示されない限り、用語「ＣＤ６３抗原部分」は本明細書で使用されるとき、メラノーマ１抗原、眼のメラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連膜糖タンパク質３、グラニュロフィシン、メラノーマ関連抗原ＭＬＡ１とも呼ばれるテトラスパニンファミリーのＩＩＩ型膜タンパク質を言う。
【０１２８】
「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一であるか又は相同である一方で、鎖の残りの部分は、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一であるか又は相同である免疫グロブリン、並びに所望の生物活性を有する限りそのような抗体の断片である（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１２９】
非ヒト（たとえば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少の配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又は断片（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体のそのほかの抗原結合配列）である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、受入者抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、たとえば、マウス、ラット又はウサギのような非ヒト種のＣＤＲの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（受入者抗体）である。たとえば、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）の残基が相当する非ヒトＦＲ残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受入者抗体にも、取り込まれたＣＤＲ又はＦＲにも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高め、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当するＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべて及びＦＲ残基のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１本、通常は２本の可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた最適には、少なくとも免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の一部、通常、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。
【０１３０】
「脱免疫化」抗体は、所与の種に対して免疫原性ではない又は免疫原性の低い免疫グロブリンである。脱免疫化は、抗体に対する構造的変化によって達成することができる。当業者に既知の任意の脱免疫化法を採用することができる。抗体を脱免疫化する好適な方法の１つは、たとえば、２０００年６月１５日に公開されたＷＯ００／３４３１７に記載されている。
【０１３１】
「相同性」は、必要に応じて最大の相同率を達成するために配列を並べ、ギャップを導入した後、同一であるアミノ酸配列変異体における残基の比率として定義される。整列ための方法及びコンピューターのプログラムは当該技術で周知である。
【０１３２】
本明細書の全体を通して、ハイブリドーマ細胞株及びそれから産生される単離されたモノクローナル抗体は二者択一的に、その内部表示によって７ＢＤ−３３−１１Ａ又は寄託表示ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０を言う。
【０１３３】
本明細書で使用されるとき、「抗体−リガンド」には、標的抗原に対する結合特異性を示す部分であって、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０として表されるハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体によって結合される抗原（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗原）を特異的に認識し、結合する未処理の抗体分子、抗体断片、及びその少なくとも抗原結合領域又は部分を有する任意の分子（すなわち、抗体の可変部分）、たとえば、Ｆｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、又は任意の遺伝子工学的分子であってもよい部分が挙げられる。
【０１３４】
本明細書で使用されるとき、「癌性疾患緩和抗体」（ＣＤＭＡＢ）は、患者に有益である方法にて、たとえば、担癌個体の腫瘍の負担を軽減し、生存を延長することによって癌性疾患の過程を緩和するモノクローナル抗体、及びその抗体−リガンドを言う。
【０１３５】
本明細書で使用されるとき、「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する分子の部分を意味する。
【０１３６】
本明細書で使用されるとき、「競合的に阻害する」は、従来の相互抗体競合アッセイ（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  Ｃ．ａｎｄ  Ｄｕｆｏｕｒ  Ｄ．（１９７３）、競合的、サンドイッチ法によるαフェトプロテインのための酵素結合免疫アッセイ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８，１５）を用いて、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０として表されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗体）が向けられる決定部位を認識し、結合することができることを意味する。
【０１３７】
本明細書で使用されるとき、「標的抗原」はＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗原又はその一部である。
【０１３８】
本明細書で使用されるとき、「免疫抱合体」は、たとえば、細胞毒素、放射活性剤、酵素、毒素、抗腫瘍薬剤又は治療剤に化学的に又は生物学的に連結された抗体のような分子又は抗体−リガンドを意味する。抗体又はＣＤＭＡＢは、標的を結合することができる限り、分子に沿って任意の位置で細胞毒素、放射活性剤、酵素、毒素、抗腫瘍薬剤又は治療剤に化学的に又は生物学的に連結されてもよい。免疫抱合体の例には、抗体毒素化合物抱合体及び抗体毒素融合タンパク質が挙げられる。
【０１３９】
本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」は、抗体結合領域が、生物学的に活性のある分子、たとえば、毒素、酵素又はタンパク質薬剤に接続されるキメラタンパク質を意味する。
【０１４０】
本明細書で記載される本発明がさらに完全に理解されてもよいように、以下の記載が述べられる。
【０１４１】
本発明は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗原を特異的に認識し、結合するＣＤＭＡＢ（すなわち、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０  ＣＤＭＡＢ）を提供する。
【０１４２】
受入番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される単離されたモノクローナル抗体のＣＤＭＡＢは、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０によって産生された単離されたモノクローナル抗体の標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域をそれが有する限り、いかなる形態であってもよい。従って、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗体と同じ結合特異性を有するいかなる組換えタンパク質（たとえば、抗体がリンホカイン又は腫瘍阻害性増殖因子のような第２のタンパク質と組み合わせられる融合タンパク質）も本発明の範囲内に入る。
【０１４３】
本発明の実施態様の１つでは、ＣＤＭＡＢは、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗体である。
【０１４４】
別の実施態様では、ＣＤＭＡＢは、Ｆｖ分子（たとえば、単鎖Ｆｖ分子）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、ヘテロ抗体、又はＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗体の抗原結合領域を有する組換え分子であってもよい抗原結合断片である。本発明のＣＤＭＡＢは、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗体が向けられるエピトープに向けられる。
【０１４５】
本発明のＣＤＭＡＢは修飾されてもよく、すなわち、誘導体分子を製造するように分子内でのアミノ酸修飾によって修飾されてもよい。化学修飾が可能であってもよい。
【０１４６】
誘導体分子は、ポリペプチドの機能的特性を保持する、すなわち、そのような置換を有する分子は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９０抗原又はその一部へのポリペプチドの結合を可能にする。
【０１４７】
これらのアミノ酸置換には、「保存的」として当該技術で知られるアミノ酸置換が挙げられるが、必ずしもこれに限定されない。
【０１４８】
たとえば、「保存的アミノ酸置換」と題する特定のアミノ酸置換が、タンパク質の立体配座又は機能のいずれかを変化させることなくタンパク質で頻繁に行われることは、タンパク質化学の定評ある原理である。
【０１４９】
そのような変更には、これら疎水性アミノ酸のそのほかに対するイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）；グルタミン酸（Ｅ）に対するアスパラギン酸（Ｄ）及び逆もまた同様；アスパラギン（Ｎ）に対するグルタミン（Ｑ）及び逆もまた同様；スレオニン（Ｔ）に対するセリン（Ｓ）及び逆もまた同様が挙げられる。他の置換も、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して保存的とみなすことができる。たとえば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）は、アラニンとバリン（Ｖ）がそうなので、相互交換可能であることが多い。相対的に疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシン及びイソロイシンと相互交換できることが多く、時にはバリンと相互交換することができる。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが有意でない位置で相互交換可能であることが多い。さらにほかの変更も特定の環境で「保存的」であるとみなすことができる。
【０１５０】
抗体を考えると、個々の当業者は、競合的に阻害するＣＤＭＡＢ、たとえば、同一エピトープを認識するものである競合抗体を生成することができる（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）。方法の１つは、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原で免疫することが必要であればよい。試料には、組織、単離したタンパク質又は細胞株が挙げられてもよいが、これらに限定されない。たとえば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又は免疫沈降のような、試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するものである競合アッセイを用いて、得られたハイブリドーマをスクリーニングすればよい。別の方法は、ファージディスプレイライブラリ及び前記抗原を認識する抗体のパンニングを使用すればよい（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。いずれの場合も、その標的抗原への元々の抗体の結合に競り勝つ能力に基づいてハイブリドーマを選抜する。従って、そのようなハイブリドーマは、元々の抗体と同じ抗原を認識する特徴を持ち、同じエピトープをさらに特異的に認識する。
【０１５１】
実施例１
ヒト肝腫瘍組織の染色
ＩＨＣ試験を実施してヒト肝腫瘍組織への７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を評価した。さらなる実験の条件を決定するためにＩＨＣ最適化試験をあらかじめ行った。
【０１５２】
組織切片は、５８℃のオーブンで１時間乾燥することによってパラフィンを除き、キシレンに各４分間５回浸漬することによってワックスを除いた。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％〜７５％）に続いて、切片を水で水和した。１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）にスライドを浸漬し、次いで高、中、低の出力設定で各５分間電子レンジにかけ、次いで１５分間室温に放置し、各５分間、ＰＢＳで３回洗浄した。次いでスライドを３％の過酸化水素水に１０分間浸漬し、各５分間、ＰＢＳで３回洗浄し、次いでユニバーサルブロッキング溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）と共に室温にて５分間インキュベートした。７ＢＤ−３３−１１Ａ、モノクローナルマウス抗α−フェトプロテイン（Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）又はアイソタイプ対照（哺乳類組織には存在もしないし、誘導も出来ない酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグルコースオキシダーゼに向けられた；Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を抗体稀釈緩衝液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）で各抗体の作用濃度（５μｇ／ｍＬ）に稀釈したが、抗α−フェトプロテインは例外的にデータシートに従って稀釈し（１０μｇ／ｍＬ）、室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで各５分間３回洗浄した。室温にて３０分間供給されたＨＲＰを結合した二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）によって一次抗体の免疫反応性を検出し／視覚化した。この工程に続いて、スライドをＰＢＳで各５分間３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色用のＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質溶液を室温にて１０分間添加することによって発色反応を行った。水道水でスライドを洗浄することによって発色反応を終了した。メイヤーズヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ））による対比染色に続いて、段階的エタノール（７５％〜１００％）によってスライドを脱水し、キシレンで透明化した。封入剤（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて、スライドをカバースリップで覆った。次いで、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｅｉｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を用いてスライドを顕微鏡的に調べ、デジタル画像を取得し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を用いて保存した。組織病理学者によって結果が記録され、スコア化され、解釈された。
【０１５３】
ヒトの肝臓、正常及び腫瘍の組織マイクロアレイ（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて４９のヒト肝腫瘍（４５の肝細胞癌及び４の胆管癌）及び９の非腫瘍性肝組織に対する抗体の結合を実施した。図１は、ヒトの非腫瘍性肝組織及び腫瘍肝組織のアレイにおける７ＢＤ−３３−１１Ａの染色の結果の要約を表す。各非腫瘍性試料又は腫瘍試料は１つのスポットで表される。図１に示されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒトの肝腫瘍組織のマイクロアレイにて３９／４９（８０％）の切片に結合した。抗体は、３／４９の切片で強い（＋＋＋）染色、１５／４９の切片で中程度（＋＋）の染色、１８／４９の切片で弱い（＋）染色及び３／４９の切片で疑わしい（＋／−）染色を示した。結合は腫瘍細胞に制約され、一部の腫瘍では浸潤している炎症性細胞に制約された。細胞での局在は、顆粒状の染色パターンで細胞質及び膜であった。＜１０％〜＞５０％の範囲の間で腫瘍細胞に対する不均質な結合が認められた。組織マイクロアレイ上で利用可能な肝腫瘍の組織的な型に従って、肝細胞癌の３６／４５（８０％）及び胆管癌の３／４（７５％）に結合があった。７ＢＤ−３３−１１Ａは転移肝腫瘍に結合優先性を示した。原発肝細胞癌の２９／３７（７８％）に比べて転移肝細胞癌の７／８（８８％）に結合があり、原発胆管癌の１／２（５０％）に比べて転移胆管癌の２／２（１００％）に結合があった。非腫瘍性肝組織の９／９（１００％）に結合があったが、結合は肝細胞であった。細胞での局在は、顆粒状の染色パターンで細胞質及び膜であった（図２）。
【０１５４】
原発肝細胞癌の腫瘍の分化に関連して、分化が乏しい、中くらいに分化した及びよく分化した原発肝細胞癌のそれぞれ４／４（１００％）、１６／１９（８４％）及び４／５（８０％）に結合があったので、７ＢＤ−３３−１１Ａは、分化の乏しい腫瘍に高い結合を示す傾向があった。
【０１５５】
肝癌のＡＪＣＣステージに関連して、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶからの切片でそれぞれ１／２（５０％）、１５／１７（８８％）、１２／１６（７５％）及び５／８（６３％）に抗体の結合があった。従って、抗体の結合とＴＮＭステージの間に相関はなかった。相関の欠如は癌のステージの一部で試料サイズが小さいことによるのかも知れない。
【０１５６】
従って、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は、転移肝腫瘍組織に多少の結合優先性を持って肝腫瘍組織に発現されると思われる。分化に乏しい肝細胞癌に高い結合の傾向もあった。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは、肝細胞癌に対する診断剤として、及び肝癌の治療における治療剤として有用性を有する。
【０１５７】
実施例２
肝細胞癌組織のマイクロアレイにおける免疫染色
実施例１で得られた結果をさらに検討するために、７ＢＤ−３３−１１Ａの結合をヒトの原発と転移の肝細胞癌組織で直接比較した。図３を参照して、以下に概説するように、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）組織のマイクロアレイを構築した。手短には、１９９５年〜１９９９年にＥａｓｔｅｒｎ  Ｈｅｐａｔｏ−ｂｉｌｉａｒｙ  外科病院（Ｓｈａｎｇｈａｉ，  Ｃｈｉｎａ）で組織試料を得て、標準のプロトコールを用いてパラフィンに包埋した。包埋した試料で新しく切片を作り、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。病変の代表的な領域を慎重に見直し、２人の病理学者が特徴付けた。臨床病理学的な情報に基づいて、組織シリンダーに検体をグループ分けし、提供者ブロックの選択した領域から０．６ｍｍの直径を取り、次いで、組織アレイ機器（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて受入者のパラフィンブロックに正確に打ち込んだ。ミクロトームでマイクロアレイブロックの連続５μｍ切片を作成した。最終的に、６０対の原発及び相当する転移のＨＣＣ試料（３１の肝臓内及び２９の肝臓外の転移を含む）でＴＭＡ切片を構築した。
【０１５８】
ＨＣＣ転移におけるＣＤ６３の可能性のある役割を割り出すために、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体による免疫染色によってＨＣＣ組織マイクロアレイ上でＣＤ６３の発現を評価した。ＴＷＩＳＴ発現を示す６０対の原発ＨＣＣと相当する転移腫瘍を含有する組織アレイ切片の概観は図３Ａに示す。６０対の原発ＨＣＣと相当する転移腫瘍のうち、細胞質での高いＣＤ６３の発現は、原発及び転移のＨＣＣでそれぞれ２６／５４（４８％）及び４３／５７（７５％）検出することができた（図３Ｂ）。原発及び転移のＨＣＣの６０症例は組織マイクロアレイに点在したが、参考になる症例は、原発及び転移のＨＣＣの症例でそれぞれ５４及び５７に見られた。ＣＤ６３の発現は、ＨＣＣの転移に有意に関連した（ｐ＜０．００１）。原発及び相当する転移のＨＣＣにおけるＣＤ６３の発現を図４に要約する。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＨＣＣの診断において有用性を有する。
【０１５９】
実施例３
パラフィン包埋したＨＣＣ腫瘍組織の５０症例における免疫染色
ＣＤ６３の発現と幾つかの臨床病理学的特徴の相関を割り出すために、１９９９年〜２００１年の間にＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｑｕｅｅｎ  Ｍａｒｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇで得られたパラフィン包埋されたヒトＨＣＣの臨床試料の５０症例で７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体による免疫染色が行われた（図５）。
【０１６０】
染色された腫瘍細胞の比率同様に染色強度を視覚的に評価する２人の独立した観察者によってＣＤ６３の細胞質での発現が判定された。陽性細胞の比率は以下のようにランク付けされた：１１〜５０％陽性の腫瘍細胞は２点；５１〜８０％陽性の細胞は３点、及び＞８１％の陽性細胞は４点。染色強度は以下のようにランク付けされた：弱い強度は１点、中程度の強度は２点、及び強い強度は３点。発現用の点数及び陽性細胞の比率の点数を加え、全体の点数：陰性、強度にかかわりなく１０％の陽性に染色された細胞；弱い発現、３点；中程度の発現、４〜５点；及び強い発現６〜７点；に従って検体を４群に分けた。陰性から低いＣＤ６３の発現を表した弱いＣＤ６３の発現を第１群にランク付けしたが、一方で中程度から強いＣＤ６３の発現を、高いＣＤ６３発現を表す第２群としてランク付けした。
【０１６１】
正常な健常提供者の肝臓では細胞質の染色がなかった。非腫瘍組織（非肝硬変及び肝硬変）では、ＣＤ６３の発現は、１５／５０（３０％）の試料で検出された。非腫瘍性の肝臓切片に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの３０％の結合は、実施例１で見い出されたものよりも低い。このことは、組織の採取、染色方法又はスコア化システムの相違によってもよい。
【０１６２】
ＨＣＣでは、５０症例中４８症例（９６％）でＨＣＣでの陽性の細胞質の染色が示された（図３Ａ）。ＣＤ６３の発現と臨床病理学敵特徴との間の相関を図６にまとめた。ＣＤ６３の発現が高い３９症例は、最初の１年の間での癌の再発（ｐ＝０．００１）、進行癌のステージ（ｐ＝０．０１４）及び静脈浸潤（ｐ＝０．００１）と有意に相関した。次いで、ＨＣＣ患者を腫瘍細胞における低い又は高いＣＤ６３の発現と比較することによって無病での生存（ＤＦＳ）及び全体の生存（ＯＳ）を分析した。カプラン−マイヤーの分析では（図５）、高いＣＤ６３の発現を持つ患者ほど、ＣＤ６３の発現を有さない又は低いＣＤ６３発現しか有さない患者よりも短いＤＦＳを有した（ｐ＝０．００６５）。また、一貫して高いＣＤ６３の発現を示す患者は、低いＣＤ６３発現の患者より短いＯＳを有した（ｐ＝０．００８５）。
【０１６３】
従って、データは、ＣＤ６３の発現が、癌の再発のさらに大きな可能性、進んだ腫瘍ステージ、静脈への浸潤及び乏しい無病の生存又は全体的生存と相関することを示している。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは、癌の再発のさらに大きな可能性、進んだ腫瘍ステージ、静脈への浸潤及び乏しい無病の生存又は全体的生存のＨＣＣとの相関を判定することにおいて有用性を有する。
【０１６４】
実施例４
種々のＨＣＣ細胞株の転移能とＣＤ６３との相関
実施例２及び３にて、臨床試料においてＣＤ６３の発現とＨＣＣの転移との間に相関があることが明らかにされた。試験管内でこの相関をさらに評価するために、７ＢＤ−３３−１１Ａを用いたフローサイトメトリーによってＣＤ６３の発現について、種々の転移能を持つ６つのＨＣＣ細胞株、ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、Ｈｕｈ−７（日本、札幌の北海道大学医学部のＤｒ．Ｈ．Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，から供与）、ＰＬＣ（日本、東京の日本癌研究バンク）、ＭＨＣＣ−９７Ｌ及びＭＨＣＣ−９７Ｈ（Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を評価した。種々のＨＣＣ細胞株においてＣＤ６３の発現を検出するために、７ＢＤ−３３−１１Ａ（１０μｇ／ｍＬ）及びアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ、クローンｅＢＭ２ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、１０μｇ／ｍＬ）で１時間、細胞を染色し、次いで１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に３０分間インキュベートした。次いで試料をＦＡＣＳによって解析した。
【０１６５】
フローサイトメトリーによって、ＣＤ６３タンパク質のレベルは、原発非転移の細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ−７及びＰＬＣ）と比べたとき、転移ＨＣＣ細胞株（ＭＨＣＣ−９７Ｌ及びＭＨＣＣ−９７Ｈ）の方が高いことが分かった（図７）。このことは、ＣＤ６３の過剰発現が進行したＨＣＣと関連することを明らかにしているので、７ＢＤ−３３−１１Ａはこの判定に使用することができる。この証拠は実施例２及び３と一致する。
【０１６６】
実施例５
セルソーティングによるＨＣＣにおけるＣＤ６３の機能的解析
図８を参照して、セルソーティングによってＨＣＣ細胞株におけるＣＤ６３過剰発現の機能的役割を調べた。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を先ず、抗ＣＤ６３（ＭＸ−４９．１２９．５，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）抗体１μｇで１時間標識した。ＣＤ６３陽性細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分別し、１０％のＦＢＳを伴ったＤＭＥＭ培地にＣＤ６３＋及びＣＤ６３−の細胞を分別した。増殖アッセイ、創傷治癒アッセイ及び浸潤アッセイを行って、分別した細胞の増殖、運動性及び浸潤性を評価した。
【０１６７】
増殖アッセイについては、１０００個の細胞／ウエルにて細胞を６穴プレートに入れた。２週間後、ギエマ染色によってコロニーの増殖を調べた。細胞の移動は、２００μＬのピペット管にて創った（０時間）擦り取った無細胞領域への細胞の移動を測定することによって評価し、傷閉鎖の速度を２４時間モニターした。浸潤アッセイは、血清を含まないＤＭＥ中の対照又はマトリゲルをコートしたフィルター上に置いた細胞を用いて、２４穴バイオコートマトリゲルインベージョンチャンバー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）にて行った。ＰＬＣ又はＰＬＣ−Ｔｗｉｓｔの細胞で調整した培地を化学誘引物質としてチャンバーの下段に入れた。２２時間の培養の後、綿棒によって擦り取ることによりフィルターの上面から細胞を剥がした。マトリゲルを介して浸潤し、膜の底に付着した細胞は、クリスタルバイオレット染色で染色された。細胞に会合した染料を１０％酢酸で溶出し、５９５ｎｍでのそのＯＤを測定した。各実験は３回一組で行い、平均値±ＳＥＭを提示した。
【０１６８】
セルソーティングの後、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の２つの集団の純度をフローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ６３＋集団の細胞は９２％の純度であったが、ＣＤ６３−集団の細胞の純度は８６％だった（図８Ａ）。コロニー形成アッセイによって、ＣＤ６３−細胞と比べてＣＤ６３＋細胞は細胞増殖の早い速度を有することが示された（図８Ｂ）。浸潤アッセイによって評価されたＨＣＣの浸潤性は、ＣＤ６３＋の方がＣＤ６３−に比べて高い浸潤を示すことを明らかにした（図８Ｃ）。図８Ｄに示される創傷治癒アッセイは、ＣＤ６３＋Ｈｅｐ３Ｂ細胞の移動速度の方がＣＤ６３−Ｈｅｐ３Ｂ細胞よりも速いことを明らかにした。矢印は、２つの細胞集団間での示差移動速度を示す。要約すると、これらの結果は、ＨＣＣにおけるＣＤ６３の発現が、細胞増殖、高い浸潤及び高い移動と相関しており、７ＢＤ−３３−１１Ａがそのような検出に有用であることを明らかにしている。
【０１６９】
実施例６
ヒトＭＨＣＣ−９７Ｈ  ＨＣＣ細胞の増殖、運動性及び浸潤に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの試験管内での有効性
Ｈｅｐ３Ｂ細胞株と共に実施例５で得られた結果をさらに進めるために、コロニー形成アッセイについては２週間、創傷治癒アッセイと浸潤アッセイについては４８時間、２、１０及び２０μｇ／ｍＬの用量で７ＢＤ−３３−１１ＡをＭＨＣＣ−９７Ｈ細胞に加えた（図９）。上述のように、コロニー形成、細胞の運動性及び浸潤のアッセイを採用して、ヒトＭＨＣＣ−９７Ｈ  ＨＣＣ細胞の増殖、細胞の移動性及び浸潤に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を評価した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＭＨＣＣ−９７Ｈの増殖を用量依存性に抑制した（図９Ａ）。さらに、７ＢＤ−３３−１１Ａは、創傷治癒及び浸潤のアッセイで証拠付けられるようにそれぞれ、ＭＨＣＣ−９７Ｈの細胞の運動性及び浸潤性を有意に抑制した（図９Ｂ及び図９Ｃ）。これらの結果は、実施例５の結論を支持し、さらに、ヒト転移ＨＣＣ細胞の増殖、移動及び浸潤を低減することにおける７ＢＤ−３３−１１Ａの直接的な有用性を明らかにしている。
【０１７０】
実施例７
ＭＨＣＣ−９７Ｈ細胞による同所性ＨＣＣ腫瘍モデル
生体内でのヒト転移肝癌に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を測定するために、０．２ｍＬの培地中の約１ｘ１０７個のヒト転移ＨＣＣ、ＭＨＣＣ−９７Ｈ細胞を５週令のオスのヌードマウス（Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｎｉｔ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇから入手）の右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射し、その後、腫瘍発生の兆候について毎日観察した（図１０及び１１）腫瘍がいったん直径１〜１．５ｃｍに達したら、以前記載された方法（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を用いて、取り出して約１〜２ｍｍ角に切断して５週令のオスのヌードマウスの肝葉に移植した。１０日後、ヌードマウスを５匹ずつ６群に無作為に分け、２、５又は１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ、クローンｅＢＭ２ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は７ＢＤ−３３−１１Ａで処理した。７ＢＤ−３３−１１Ａ試験抗体は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含有する希釈液でストック濃度から稀釈した後、２００μＬの容量で各コホートに腹腔内投与した。次いで、週に２回、合計１２回、移植後５０日目まで同様に抗体を投与した。試験期間中、動物の体重は週に１回記録した。５０日目に、香港大学の授業と研究における生きた動物の使用に関する委員会の指針に従って動物すべてを安楽死させた。長さｘ幅２ｘ０．５の方程式を用いて腫瘍の増殖を算出した。
【０１７１】
ヒトＨＣＣの確立されたモデルにて７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍の負担を有意に軽減した。アイソタイプ対照と比べて７ＢＤ−３３−１１Ａは用量２、１０及び２０ｍｇ／ｋｇについてそれぞれ、原発肝腫瘍の容積を１５５９±２５２ｍｍ３から８５４±８６ｍｍ３、３４６．５±２４ｍｍ３及び６５±３．４ｍｍ３減らした（ｐ＝０．００１２、図１０Ａ及び図１０Ｂ）。図１０Ａにおける矢印は肝内転移を示す。週間隔で測定した体重は、良好な生存及びよく育つことへの失敗の代用として用いた。試験の経過にわたって２群の間で平均体重には有意差はなかった。
【０１７２】
さらに、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒトＨＣＣの確立された同所性モデルにおける肝内転移及び肺転移を有意に抑制した。治療群及びアイソタイプ対照群における肺転移と肝内転移のマウスの数を図１１Ｂに示す。図１１Ａにおける矢印は、肺転移を示す。７ＢＤ−３３−１１Ａは、２ｍｇ／ｋｇの用量で４／５（８０％）〜１／５（２０％）肝内転移を有意に抑制した。７ＢＤ−３３−１１Ａはまた、２ｍｇ／ｋｇの用量で５／５（１００％）〜１／５（２０％）肺転移を有意に抑制した。アイソタイプ対照群のマウスはすべて腎臓転移及び脾臓転移を示さなかった。
【０１７３】
要約すれば、７ＢＤ−３３−１１Ａは、確立されたヒト同所性ＨＣＣ腫瘍モデルにおいて、上手く認容され、腫瘍の負担及び肝内と肺への転移の可能性を減らした。
【０１７４】
実施例８
ＭＨＣＣ−９７Ｈ細胞による転移ＨＣＣ腫瘍モデル
上記モデルにおける肺及び肝内への転移に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの効果は間接的な効果の結果である可能性がある；原発腫瘍の縮小が転移の低い可能性を生じる。ＨＣＣに対する７ＢＤ−３３−１１Ａの転移防止有効性をさらに評価し、それが転移の発生に直接的な効果を有するのかどうかを判定するために、転移ＨＣＣ腫瘍モデルを採用した。図１２を参照して、０．１ｍＬの培養培地中の２ｘ１０６個のヒト転移ＭＨＣＣ−９７Ｈ細胞を、５週令のオスのヌードマウス（香港の香港大学実験動物ユニットから入手）に尾静脈注射を介して静脈に注射した。１日後、ヌードマウスを５匹ずつ無作為に群に分け、アイソタイプ対照（濃度、どの抗体、どこから）又は５若しくは１０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａで処理した。７ＢＤ−３３−１１Ａ試験抗体は、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含有する希釈液でストック濃度から稀釈した後、２００μＬの容量で各コホートに腹腔内投与した。次いで抗体を週に２回、合計１２用量、２ヵ月間同じ方法で投与した。２ヵ月後、動物を屠殺し、剖検してヌードマウスの肺及び肝臓の双方での腫瘍形成について調べた。
【０１７５】
７ＢＤ−３３−１１Ａは、確立された転移ＨＣＣ腫瘍モデルで肝転移及び肺転移を有意に（ｐ＜０．００１）抑制した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、５及び１０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ、５／５（１００％）から１／５（２０％）及び０／５（０％）に肝転移を有意に抑制した（図１２Ａ及び１２Ｃ）。７ＢＤ−３３−１１Ａは、５及び１０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ、５／５（１００％）から０／５（０％）及び０／５（０％）に肺転移を有意に抑制した（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。
【０１７６】
要約すれば、７ＢＤ−３３−１１Ａは上手く認容され、この確立されたヒト同所性ＨＣＣ腫瘍モデルにおいて肝内転移及び肺転移の可能性を低下させた。このことは、実施例７のデータをさらに支持し、７ＢＤ−３３−１１Ａ治療が原発腫瘍の腫瘍サイズを縮小することに加えて、第２の部位での惹起を防ぐことを明らかにしている。
【０１７７】
証拠の優越性は、７ＢＤ−３３−１１Ａが、肝癌上に発現されるＣＤ６３上に存在するエピトープとの連結を介して抗癌効果に介在することを示している。肝癌患者については、ＣＤ６３の発現は患者の全体的な生存と逆相関することが示されている。さらに、原発のヒト癌組織試料及び細胞株と対比して転移したものでさらに高いＣＤ６３の発現が認められる。７ＢＤ−３３−１１Ａはまた、試験管内でＣＤ６３＋ヒト肝癌細胞の増殖、移動及び浸潤を低下させ、生体内でヒト肝癌の腫瘍の負担及び転移の可能性を低減することも示されている。従って、７ＢＤ−３３−１１Ａは、肝細胞から生じる原発及び転移の腫瘍部位を含むと広く理解される、肝癌の診断及び治療のための療法上の可能性を有する。
【０１７８】
本明細書で言及された特許及び出版物はすべて、本発明が関係する当業者のレベルを示す。特許及び出版物はすべて、個々の出版物が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられることが指示されたかのように同程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１７９】
本発明の特定の形態が説明されるが、本明細書で記載され、示される部分の具体的な形態又は配置に限定されるべきではないことが理解されるべきである。本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行ってもよく、本発明は本明細書で示され、記載されたものに限定されるとはみなされるべきではないことが当業者に明らかになるであろう。当業者は、目的を実行し、そこで固有のものと同様に結果及び利点を得るように本発明が上手く取り入れられることを容易に十分に理解するであろう。本明細書に記載されたいかなるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順及び技法は目下、好ましい実施態様の代表であり、例示であることが意図され、範囲の限定としては意図されない。本発明の精神の範囲内に包含され、添付のクレームの範囲で定義されるそこでの変更及びそのほかの用途が、当業者の頭に浮かぶであろう。具体的な好ましい実施態様と関連して本発明を説明してきたが、請求されるとき、本発明はそのような具体的な実施態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である本発明を実施するために記載された形態の種々の修正が以下のクレームの範囲内で意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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