(57)【要約】本発明は、対象における心筋症状態、特に拡張型心筋症を高度の精度で診断するための、便利でかつ極めて有効なマイクロアレイ用ツールおよび方法を提供する。2009544306.tif 000010
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約2種の核酸分子を含むマイクロアレイであって、各核酸分子が、シヌクレインα（アミロイド前駆体の非A4性構成要素）（「SNCA」）、アスポリン（「ASPN」）、分泌性frizzled関連タンパク質4（「SFRP4」）、プレクストリン相同様ドメイン（Pleckstrin homology-like domain）、ファミリーA、メンバー1（「PHLDA1」）、Frizzled関連タンパク質（「FRZB」）、ミオシン重鎖6、心筋、α（心筋症、肥大型1）（「MYH6」）、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2（「CCL2」）、オルニチンデカルボキシラーゼ1（「ODC1」）、レチノイン酸受容体レスポンダー（タザロテン誘導性）1（Retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 1）（「RARRES1」）、補体H因子（「CFH」）、アラニン-グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ2様1（Alanine-glyoxylate aminotransferase 2-like 1）（「AGXT2L1」）、ミオシン重鎖10、非筋肉性（MYH10）、フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有物）3（Ficolin (collagen/fibrinogen domain containing) 3）（Hakata抗原）（「FCN3」）、S100カルシウム結合タンパク質A8（「S100A8」）、Corinセリンペプチダーゼ（「CORIN」）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A（「NPPA」）、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー2（「PCOLCE2」）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体B（「NPPB」）、活性化転写因子3（「ATF3」）、DNA結合阻害因子4、ドミナントネガティブ性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質（「ID4」）、Sparc／オステオネクチン、cwcv様およびkazal様ドメインプロテオグリカン（テスチカン）1（Sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains proteoglycan (testican) 1）（「SPOCK1」）、結合組織増殖因子（「CTGF」）、G0／G1スイッチ2（「GOS2」）、Kelch様3（Kelch-like 3）（ショウジョウバエ）（「KLHL3」）、ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有物16（Zinc finger and BTB domain containing 16）（「ZBTB16」）、AE結合タンパク質1（「AEBP1」）、ならびにETS変異体遺伝子5（ets関連分子）（ETV5）からなる群より選択される標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、マイクロアレイ。
【請求項２】
核酸分子のそれぞれが、SEQ ID NO 1〜27からなる群より選択される標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
核酸分子のそれぞれが、マイクロアレイ中に存在する他の核酸分子のそれぞれと比較して異なるヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
核酸分子がオリゴヌクレオチドまたはプローブである、請求項1記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドまたはプローブが、オリゴヌクレオチドまたはプローブがその対応する標的配列とハイブリダイズした後のシグナル検出を促すための部分によって標識されている、請求項4記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
少なくとも以下の配列、ミオシン重鎖ポリペプチド10（非筋肉性）遺伝子、シヌクレイン遺伝子、α推定的リンパ球G0／G1スイッチ遺伝子、ets変異体遺伝子5、AE結合タンパク質1遺伝子、kelch様3遺伝子、ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有物16遺伝子、およびプロコラーゲンCエンドペプチダーゼエンハンサー2遺伝子に対する相補的配列を含む核酸分子を含む、請求項1記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
SEQ ID NO：1〜27に示された各配列からの配列に対して相補的または部分的に相補的な核酸を含む、請求項1記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
対象における心筋症状態を診断するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）請求項1記載のマイクロアレイを、単離された生物試料に対して曝露させる段階；
（b）収集物（collection）のどの核酸分子が、その対応する標的遺伝子配列とハイブリダイズするかを決定する段階、および
（c）そのハイブリダイゼーションパターンを同じ遺伝子に関する対照のハイブリダイゼーションパターンと比較する段階であって、2つのパターン間の違いによってその対象が心筋症性疾患を有することが示される段階。
【請求項９】
生物試料が組織生検標本である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
組織生検標本が心筋生検標本である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
心筋症性疾患が拡張型心筋症または特発性拡張型心筋症である、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
対象における心筋症状態を診断するためのアッセイ法であって、以下の段階を含むアッセイ法：
（a）対象から単離された生物試料における、SEQ ID NO 1〜27からなる群より選択される遺伝子のうち少なくとも1つの遺伝子発現レベルを決定する段階、および
（b）その発現レベルを健常個体からの生物試料と比較する段階であって、発現レベルの違いによってその対象が心筋症性疾患を有することが示される段階。
【請求項１３】
決定される発現レベルが、各々の遺伝子転写物またはタンパク質のいずれかのレベルである、請求項12記載のアッセイ法。
【請求項１４】
対象の生物試料における27種すべての遺伝子の発現レベルが決定されて、健常対象の生物試料における同じ27種の遺伝子の発現レベルと比較される、請求項12記載のアッセイ法。
【請求項１５】
生物試料が血液または筋肉である、請求項12記載のアッセイ法。
【請求項１６】
筋肉が心筋である、請求項16記載のアッセイ法。
【請求項１７】
遺伝子発現レベルを決定する段階が、マイクロアレイ、PCR、RT-PCR、TaqMan RT-PCR、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、抗体検出、またはELISAのうち少なくとも1つによって行われる、請求項12記載のアッセイ法。
【請求項１８】
心筋症性疾患が拡張型心筋症または特発性拡張型心筋症である、請求項12記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この国際出願は、2007年7月25日に提出された米国仮出願第60/832,959号に対する優先権を主張し、それは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象における心筋症状態、特に拡張型心筋症を高度の精度で診断するための、便利でかつ極めて有効なマイクロアレイ用ツールおよび方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
拡張型心筋症（DCM）は、顕著な冠動脈疾患が存在しない、一方または両方の心室の拡張および収縮障害を特徴とする。DCMの発症率は100,000人当たり約5〜8例、有病率は100,000人当たり36例と推定されている。Dec et al., "Idiopathic dilated cardiomyopathy," N. Engl. J. Med., 1994; 331:1564-75（非特許文献1）を参照。この理由から、DCMは西洋諸国における心不全および心移植の主因と考えられている。Roger et al., "Trends in heart failure incidence and survival in a community-based population," J. Am. Med. Assoc., 2004; 292:344-50（非特許文献2）を参照。
【０００４】
DCMに伴う罹病率および死亡率の高さは、DCMにおいて心不全を招く基礎をなす分子的事象のより良い理解が必要なことを強く示している。現在までのところでは、ナトリウム利尿ペプチドが心不全の診断および管理のための典型的なマーカーである。しかし、これらのナトリウム利尿性分子疾患マーカーの発現レベルには、左室機能だけでは説明されない著しい不均一性がある。Hwang et al., "Microarray gene expression profiles in dilated and hypertrophic cardiomyopathic end-stage heart failure," Physiol Genomics, 2002;10:31-44（非特許文献3）；Tan et al., "The gene expression fingerprint of human heart failure," Proc Natl Acad Sci U S A., 2002;99:11387-92（非特許文献4）；および、et al., "Gene expression profiles in end-stage human idiopathic dilated cardiomyopathy: altered expression of apoptotic and cytoskeletal genes," Genomics, 2004;83:281-97（非特許文献5）を参照。
【０００５】
転写シグネチャー分析は、心不全の診断および治療法にとって最終的に重要になる可能性のある、潜在的な分子標的を同定するための強力な手法である。しかしながら、プラットフォーム技術や実験デザインの違い、ヒト組織試料の使用に伴う生物学的不均一性が、心不全において異なるマイクロアレイ試験によって得られた結果の比較および統合をうまく行う上での障害となっている。さらに、心房、心室および中隔、または心臓の左側および右側を含め、哺乳動物の心筋では、遺伝子発現に関してかなり大きな領域間差異が存在する。Barth et al., "Functional profiling of human atrial and ventricular gene expression," Pflugers Archiv. 2005;450:201-8（非特許文献6）；Nabauer et al., "Regional differences in current density and rate-dependent properties of the transient outward current in subepicardial and subendocardial myocytes of human left ventricle," Circulation. 1996;93:168-77（非特許文献7）；Ramakers et al., "Molecular and electrical characterization of the canine cardiac ventricular septum," J Mol Cell Cardiol. 2005;38:153-61（非特許文献8）；およびTabibiazar et al., "Transcriptional profiling of the heart reveals chamber-specific gene expression patterns," Circ Res. 2003; 93:1193-201（非特許文献9）を参照。
【０００６】
これらの違いは、どの転写物が本当にDCMと関係しているかを明らかにすることを困難にする。実際に、拡張型心筋症の種々の異なる病因および持続時間、年齢、性別および薬物療法ならびに疾患の個々の経過の違いはいずれも、遺伝子発現データのばらつきの原因となる。さらに、ドナー心臓はさまざまな度合いの低酸素または血行力学的ストレスに曝された可能性があり、それらはケモカインおよびBNP遺伝子発現の強力な誘導因子であることが知られているため、真に「非不全性」のヒト心室組織を入手することは困難であろう。Goetze et al., "Acute myocardial hypoxia increases BNP gene expression," FASEB J. 2004; 18:1928-30（非特許文献10）を参照。
【０００７】
本発明は、多数の不全性および非不全性の心臓による独立したマイクロアレイ試験を統合することにより、通常であれば心筋症の診断に対して交絡性となりうるさまざまな変数を考慮に入れている。したがって、本発明は、心筋症状態を正確に診断するための便利でかつ極めて有効なツールおよび方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dec et al., "Idiopathic dilated cardiomyopathy," N. Engl. J. Med., 1994; 331:1564-75
【非特許文献２】Roger et al., "Trends in heart failure incidence and survival in a community-based population," J. Am. Med. Assoc., 2004; 292:344-50
【非特許文献３】Hwang et al., "Microarray gene expression profiles in dilated and hypertrophic cardiomyopathic end-stage heart failure," Physiol Genomics, 2002;10:31-44
【非特許文献４】Tan et al., "The gene expression fingerprint of human heart failure," Proc Natl Acad Sci U S A., 2002;99:11387-92
【非特許文献５】et al., "Gene expression profiles in end-stage human idiopathic dilated cardiomyopathy: altered expression of apoptotic and cytoskeletal genes," Genomics, 2004;83:281-97
【非特許文献６】Barth et al., "Functional profiling of human atrial and ventricular gene expression," Pflugers Archiv. 2005;450:201-8
【非特許文献７】Nabauer et al., "Regional differences in current density and rate-dependent properties of the transient outward current in subepicardial and subendocardial myocytes of human left ventricle," Circulation. 1996;93:168-77
【非特許文献８】Ramakers et al., "Molecular and electrical characterization of the canine cardiac ventricular septum," J Mol Cell Cardiol. 2005;38:153-61
【非特許文献９】Tabibiazar et al., "Transcriptional profiling of the heart reveals chamber-specific gene expression patterns," Circ Res. 2003; 93:1193-201
【非特許文献１０】Goetze et al., "Acute myocardial hypoxia increases BNP gene expression," FASEB J. 2004; 18:1928-30
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一般的な局面は、生物試料における特定の核酸またはタンパク質の発現レベルの検出であり、それはその試料の発現プロファイルを作成するために有用であり、ここでそのプロファイルはその試料に付随する健常状態または罹患状態の指標となる。1つの態様において、本発明は、心筋症に伴う、またはその症候であるさまざまな状態における発現プロファイルを提供する。それ故に、本発明は、例えば、心筋症組織と健常組織とを、不全性および非不全性の心臓状態を、ならびに虚血性および非虚血性の心筋症を鑑別するために有用な発現プロファイルを生成する。
【００１０】
したがって、本発明の1つの局面は、ヒト患者などの個体からの生物試料からの発現プロファイルを、健常個体の発現プロファイル、または被験個体が有すると考えられるか疑われる心筋症状態を有しない個体発現プロファイルと比較する段階を必然的に伴う。
【００１１】
本発明の1つの局面は、このため、その各個が、特定の心筋症状態と関連づけられている特定の標的遺伝子または標的核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの配列に対する配列同一性を有する、任意の所与の試料におけるそれらの標的遺伝子の発現レベルを決定するために有用な核酸の収集物（collection）を提供する。理想的には、各核酸は、標的遺伝子または標的核酸の配列に対して相補的または部分的に相補的な配列を含む。1つの態様において、収集物の核酸配列は、標的遺伝子または標的核酸の、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500個、または500個を上回る連続したヌクレオチドに対して完全または部分的に相補的である。完全に相補的な核酸配列とは、標的の等価な配列に対してその全体が同一である配列を含むもののことである。すなわち、収集物の核酸は、対応する標的配列と比較してヌクレオチドミスマッチを全く有しない配列を含む。
【００１２】
したがって、本発明の1つの態様は、核酸分子の収集物を含むマイクロアレイまたはナノアレイなどのアレイであり、ここで各核酸分子は、以下にSEQ ID NO：1〜27として列記された以下の遺伝子のうち1つの標的配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。アレイの表面上に付着または固定化された核酸の収集物は、これらの27種の配列の一部またはすべてに対して配列同一性を有する配列を含みうる。ある場合には、アレイは複数の核酸を含むことができ、そのそれぞれは
（1）シヌクレインα（アミロイド前駆体の非A4性構成要素）（「SNCA」）（SEQ ID NO：1）；
（2）アスポリン（「ASPN」）（SEQ ID NO：2）；
（3）分泌性frizzled関連タンパク質4（「SFRP4」）（SEQ ID NO：3）；
（4）プレクストリン相同様ドメイン（Pleckstrin homology-like domain）、ファミリーA、メンバー1（「PHLDA1」）（SEQ ID NO：4）；
（5）Frizzled関連タンパク質（「FRZB」）（SEQ ID NO：5）；
（6）ミオシン重鎖6、心筋、α（心筋症、肥大型1）（「MYH6」）（SEQ ID NO：6）；
（7）ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2（「CCL2」）（SEQ ID NO：7）；
（8）オルニチンデカルボキシラーゼ1（「ODC1」）（SEQ ID NO：8）；
（9）レチノイン酸受容体レスポンダー（タザロテン誘導性）1（Retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 1）（「RARRES1」）（SEQ ID NO：9）；
（10）補体H因子（「CFH」）（SEQ ID NO：10）；
（11）アラニン-グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ2様1（Alanine-glyoxylate aminotransferase 2-like 1）（「AGXT2L1」）（SEQ ID NO：11）；
（12）ミオシン重鎖10、非筋肉性（MYH10）（SEQ ID NO：12）；
（13）フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有物）3（Ficolin (collagen/fibrinogen domain containing) 3）（Hakata抗原）（「FCN3」）（SEQ ID NO：13）；
（14）S100カルシウム結合タンパク質A8（「S100A8」）（SEQ ID NO：14）；
（15）Corinセリンペプチダーゼ（「CORIN」）（SEQ ID NO：15）；
（16）ナトリウム利尿ペプチド前駆体A（「NPPA」）（SEQ ID NO：16）；
（17）プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー2（「PCOLCE2」）（SEQ ID NO：17）；
（18）ナトリウム利尿ペプチド前駆体B（「NPPB」）（SEQ ID NO：18）；
（19）活性化転写因子3（「ATF3」）（SEQ ID NO：19）；
（20）DNA結合阻害因子4、ドミナントネガティブ性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質（「ID4」）（SEQ ID NO：20）；
（21）Sparc／オステオネクチン、cwcv様およびkazal様ドメインプロテオグリカン（テスチカン）1（Sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains proteoglycan (testican) 1）（「SPOCK1」）（SEQ ID NO：21）；
（22）結合組織増殖因子（「CTGF」）（SEQ ID NO：22）；
（23）G0／G1スイッチ2（「GOS2」）（SEQ ID NO：23）；
（24）Kelch様3（Kelch-like 3）（ショウジョウバエ）（「KLHL3」）（SEQ ID NO：24）；
（25）ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有物16（Zinc finger and BTB domain containing 16）（「ZBTB16」）（SEQ ID NO：25）；
（26）AE結合タンパク質1（「AEBP1」）（SEQ ID NO：26）；および
（27）ETS変異体遺伝子5（ets関連分子）（ETV5）（SEQ ID NO：27）である。
【００１３】
1つの態様において、マイクロアレイ上の収集物中の核酸分子のそれぞれは、収集物中の他の核酸分子のそれぞれと比較して異なる配列を含む。
【００１４】
もう1つの態様において、収集物中の核酸分子のそれぞれは、収集物中の他の核酸分子のそれぞれにおける相補的標的遺伝子配列とは異なる、標的遺伝子に対する相補的配列を含む。
【００１５】
1つの態様において、核酸分子はオリゴヌクレオチドまたはプローブである。1つの態様において、オリゴヌクレオチドまたはプローブは、オリゴヌクレオチドまたはプローブがその対応する標的配列とハイブリダイズした後のシグナル検出を促すための部分によって標識されている。
【００１６】
もう1つの態様において、収集物は、少なくとも以下の配列：ミオシン重鎖ポリペプチド10（非筋肉性）遺伝子、シヌクレイン遺伝子、α推定的リンパ球G0／G1スイッチ遺伝子、ets変異体遺伝子5、AE結合タンパク質1遺伝子、kelch様3遺伝子、ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有物16遺伝子、ならびにプロコラーゲンCエンドペプチダーゼエンハンサー2遺伝子に対する相補的配列を含む核酸配列を含む。
【００１７】
本発明のもう1つの局面は、対象における心筋症状態を診断するための方法であって、以下の段階を含む方法に向けられる：（i）請求項1記載のマイクロアレイを、単離された生物試料に対して曝露させる段階、（ii）収集物のどの核酸分子が、その対応する標的遺伝子配列とハイブリダイズするかを決定する段階、および（iii）そのハイブリダイゼーションパターンを同じ遺伝子に関する対照のハイブリダイゼーションパターンと比較する段階であって、2つのパターン間の違いによってその対象が心筋症を有することが示される段階。
【００１８】
1つの態様において、生物試料は血液または組織生検標本である。1つの態様において、組織生検標本は心筋生検標本である。
【００１９】
この方法のもう1つの態様において、心筋症は拡張型心筋症または特発性拡張型心筋症である。
【００２０】
本発明のもう1つの局面は、対象における心筋症状態を診断するためのアッセイであって、以下の段階を含むアッセイに向けられる：（i）以下のもの：
シヌクレインα（アミロイド前駆体の非A4性構成要素）（「SNCA」）、アスポリン（「ASPN」）、分泌性frizzled関連タンパク質4（「SFRP4」）、プレクストリン相同様ドメイン、ファミリーA、メンバー1（「PHLDA1」）、Frizzled関連タンパク質（「FRZB」）、ミオシン重鎖6、心筋、α（心筋症、肥大型1）（「MYH6」）、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2（「CCL2」）、オルニチンデカルボキシラーゼ1（「ODC1」）、レチノイン酸受容体レスポンダー（タザロテン誘導性）1（「RARRES1」）、補体H因子（「CFH」）、アラニン-グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ2様1（「AGXT2L1」）、ミオシン重鎖10、非筋肉性（MYH10）、フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有物）3（Hakata抗原）（「FCN3」）、S100カルシウム結合タンパク質A8（「S100A8」）、Corinセリンペプチダーゼ（「CORIN」）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A（「NPPA」）、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー2（「PCOLCE2」）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体B（「NPPB」）、活性化転写因子3（「ATF3」）、DNA結合阻害因子4、ドミナントネガティブ性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質（「ID4」）、Sparc／オステオネクチン、cwcv様およびkazal様ドメインプロテオグリカン（テスチカン）1（「SPOCK1」）、結合組織増殖因子（「CTGF」）、G0／G1スイッチ2（「GOS2」）、Kelch様3（ショウジョウバエ）（「KLHL3」）、ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有物16（「ZBTB16」）、AE結合タンパク質1（「AEBP1」）、ならびにETS変異体遺伝子5（ets関連分子）（ETV5）、
からなる群より選択される遺伝子または核酸のうち1つまたは複数の遺伝子発現レベルを決定する段階であって、遺伝子または核酸が対象から単離された生物試料中にある段階、ならびに（ii）その発現レベルを健常個体からの生物試料と比較する段階であって、発現レベルの違いによってその対象が心筋症を有することが示される段階。1つの態様において、心筋症は拡張型心筋症または特発性拡張型心筋症である。
【００２１】
1つの態様において、決定される発現レベルは、各々の遺伝子転写物またはタンパク質のいずれかのレベルである。
【００２２】
さらにもう1つの態様においては、対象の生物試料における、1つまたは複数の、少なくとも約2種、少なくとも約3種、少なくとも約4種、少なくとも約5種、少なくとも約6種、少なくとも約7種、少なくとも約8種、少なくとも約9種、少なくとも約10種、少なくとも約11種、少なくとも約12種、少なくとも約13種、少なくとも約14種、少なくとも約15種、少なくとも約16種、少なくとも約17種、少なくとも約18種、少なくとも約19種、少なくとも約20種、少なくとも約21種、少なくとも約22種、少なくとも約23種、少なくとも約24種、少なくとも約25種、少なくとも約26種、または約27種の遺伝子の発現レベルが決定される。もう1つの態様においては、対象の生物試料における27種すべての遺伝子の発現レベルが決定されて、健常対象の生物試料における同じ27種の遺伝子の発現レベルと比較される。
【００２３】
このアッセイの1つの態様において、生物試料は血液または組織生検標本である。もう1つの態様において、組織生検標本は心筋である。
【００２４】
このアッセイの1つの態様において、遺伝子発現レベルを決定する段階は、マイクロアレイ、PCR、RT-PCR、TaqMan RT-PCR、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、抗体検出、ELISA、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される方法のうち少なくとも1つによって行われる。
【００２５】
対象が拡張型心筋症を有するか否かを診断することに加えて、本発明はまた、本明細書に記載した組成物および方法を用いる他の心筋症の診断も範囲に含む。例えば、本発明は、本明細書に開示した遺伝子、検出方法およびアッセイを用いる虚血性心筋症（ICM）の診断または予後判定を範囲に含む。本発明の前記の概要、ならびに以下の図面の簡単な説明および本発明の詳細な説明はいずれも例示的および説明的であり、請求される本発明のさらなる詳細を提示することを意図している。その他の目的、利点および新規な特徴は、本発明の以下の詳細な説明から当業者には直ちに明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】データセットA（白抜きバー）およびB（縞入りバー）の、DCMにおけるアップレギュレート性遺伝子（黄のバー）およびDCMにおけるダウンレギュレート性遺伝子（緑のバー）を比較している、選択された遺伝子クラスに関するジーンオントロジー（Gene Ontology）に基づく機能分析を示している。星印を付した遺伝子クラスにおける差は、「FatiGO」（20）によると統計学的に有意であった（Fisherの直接確率検定、p＜0.05）。
【図２】マイクロアレイについての予測分析（「PAM」）分類を示している。第1の段階では、PAM分類を4種のデータセットすべてに対して別々に適用した。データセットA、BおよびDでは非不全性（NF）試料とDCM試料との分類に関して極めて低い誤分類率が認められたが、この分類アルゴリズムはデータセットCではまったく能力を示さなかった。第2の段階では、データセットBから得られた最小の遺伝子シグネチャーを用いて手順を繰り返したところ、今度はデータセットCを含むすべての試験で、DCM試料とNF試料との分類に関して90％を上回る精度が達成された。
【図３】データセットA〜DにおけるNF試料（黒のバー）およびDCM試料（赤のバー）中でのプロ-BNPの平均発現±S.E.Mを示している。統計学的比較はStudentのt検定によって行った。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本発明は、心筋症状態を分類および診断するために有用な遺伝的バイオマーカーを同定するための方法および組成物を提供する。本発明は、拡張型心筋症（DCM）に関与することが知られているか、またはそれと関連づけられているかのいずれかである、遺伝子および生物学的過程を特定する。不全性および非不全性（NF）の心臓において差異を伴って発現される遺伝子のサブセットを同定してコレートする（collating）ことにより、本発明は、DCMなどの心筋症の症候でありうる対象の状態を評価するための診断検査に用いることのできる遺伝的「シグネチャー」を作り出す。
【００２８】
A．定義
本明細書で用いる場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、単数のみを指し示すことが明示的に述べられている場合を除き、単数および複数の両方を指し示す。
【００２９】
タンパク質の特異的なコンフォメーションまたは凝集状態。
【００３０】
「タンパク質」という用語は、その意味の範囲に「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語（これらは時折、本明細書において互換的に用いられることがある）を含むと解釈される。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「約」は、当業者によって理解されていると考えられ、それが用いられる文脈によってある程度変化すると考えられる。この用語が、それが用いられる文脈からみて、当業者に明白でなく使用されている場合、「約」はその特定の用語を最大で±10％したものを意味すると考えられる。
【００３２】
「組換えタンパク質またはポリペプチド」とは、組換えDNA法によって生産された、すなわち、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする外因性組換えDNA発現構築物による形質転換を受けた微生物または哺乳動物の細胞から産生された、タンパク質またはポリペプチドのことを指す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質またはポリペプチドは、典型的にはグリカンを含まない。酵母において発現されるタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞において発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有することがある。
【００３３】
「ネイティブ性」または「天然の」タンパク質またはポリペプチドとは、自然界に存在する源から回収されるタンパク質またはポリペプチドのことを指す。
【００３４】
DNAまたはポリヌクレオチドの「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた時に、mRNAへと転写されてポリペプチドへと翻訳されるDNA配列またはポリヌクレオチド配列のことである。コード配列の境界は、5'N末端にある翻訳開始コドンおよび3'C末端にある翻訳終止コドンである。コード配列には、原核生物配列、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれうる。転写終結配列は通常、コード配列の3'側に位置すると考えられる。
【００３５】
「DNA配列またはポリヌクレオチド配列」とは、デオキシリボヌクレオチド（塩基はアデニン、グアニン、チミン、シトシン）のヘテロポリマーのことである。DNA配列またはポリヌクレオチド配列を、合成cDNA由来のDNA断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築することができる。
【００３６】
「類似体」、「断片」、「誘導体」、および「変異体」という用語は、本発明の核酸に言及している場合、本明細書に記載したようなネイティブ性または天然の核酸に対して、例えば、少なくとも約60％の配列同一性、少なくとも約70％の配列同一性、少なくとも約80％の配列同一性、少なくとも約90％の配列同一性、少なくとも約91％の配列同一性、少なくとも約92％の配列同一性、少なくとも約93％の配列同一性、少なくとも約94％の配列同一性、少なくとも約95％の配列同一性、少なくとも約96％の配列同一性、少なくとも約97％の配列同一性、少なくとも約98％の配列同一性、少なくとも約99％の配列同一性、または少なくとも約100％の配列同一性を有する、そのようなヌクレオチドの類似体、断片、誘導体、および変異体のことを意味する。
【００３７】
2つのポリヌクレオチドの間の「類似性」は、各ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列を、第2のポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列と比較することによって決定される。1つのアミノ酸配列のアミノ酸は、第2のアミノ酸配列の対応するアミノ酸と、それが同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるならば類似している。保存的置換には、Dayhoff, M.O., ed., The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978)、およびArgos, P. (1989) EMBO J. 8:779-785に記載されたものが含まれる。例えば、以下の群の1つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換に相当する：
-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr：
-Cys、Ser、Tyr、Thr；
-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；
-Lys、Arg、His；
-Phe、Tyr、Trp、His；および
-Asp、Glu。
【００３８】
「哺乳動物」には、ヒトおよび飼い慣らされた動物、例えばネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギなどが含まれる。
【００３９】
本明細書において用いられる他のすべての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に用いられているのと同じ意味を有する。
【００４０】
B．発明の態様
本発明の1つの局面は、非不全性心臓試料と拡張型心筋症の心臓試料とを90％を上回る精度で首尾良く鑑別するための有用な標的である、27種の遺伝子の収集物に向けられる。すなわち、これらの27種の遺伝子のうち1つまたは複数またはすべての存在または発現レベルを同定することにより、心筋症の表現型が示される。本発明の他の態様においては、対象の生物試料における、27種の遺伝子の任意の組み合わせの発現レベル、例えば、1つまたは複数の、少なくとも約2種、少なくとも約3種、少なくとも約4種、少なくとも約5種、少なくとも約6種、少なくとも約7種、少なくとも約8種、少なくとも約9種、少なくとも約10種、少なくとも約11種、少なくとも約12種、少なくとも約13種、少なくとも約14種、少なくとも約15種、少なくとも約16種、少なくとも約17種、少なくとも約18種、少なくとも約19種、少なくとも約20種、少なくとも約21種、少なくとも約22種、少なくとも約23種、少なくとも約24種、少なくとも約25種、少なくとも約26種、または約27種の遺伝子の発現レベルを測定することができる。もう1つの態様においては、対象の生物試料における27種すべての遺伝子の発現レベルが決定されて、健常対象の生物試料における同じ27種の遺伝子の発現レベルと比較される。
【００４１】
27種の遺伝子の一群は以下のものを含み、それらはDCMにおけるそれらの個々の関与に関する既存の知識に基づいてカテゴリー化されている。
群（1）：公知の心筋症バイオマーカーである遺伝子
ナトリウム利尿ペプチド前駆体B（BNP）
ナトリウム利尿ペプチド前駆体A（NPPA）
群（2）：心筋症と強い関連性のある遺伝子
corin（CORRIN）
ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2（CCL2）
ミオシン、重鎖ポリペプチド6、心臓、α（MYH6）
活性化転写因子3（ATF3）
結合組織増殖因子（CTGF）
群（3）：心筋症とそれほど強い関連性のない遺伝子
分泌性frizzled関連タンパク質4（SFRP4）
アスポリン（ASPN）
frizzled関連タンパク質（FRZB）
プレクストリン相同様ドメイン、ファミリーA1（PHLDA1）
オルニチンデカルボキシラーゼ1（ODC1）
レチノイン酸受容体レスポンダー1（RARRES1）
アラニン-グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ2様1（AGXT2L1）
補体H因子関連物3（complement factor H-related 3）（CFHL3）
sparc／オステオネクチンプロテオグリカン（SPOCK）
S100カルシウム結合タンパク質A8（S100A8）
フィコリン3（FCN3）
DNA結合阻害因子4（ID4）
群（4）：これまでにいずれの心筋症とも関連性がない遺伝子
ミオシン、重鎖ポリペプチド10、非筋肉性（MYH10）
シヌクレイン、α（SNCA）
推定的リンパ球G0／G1スイッチ遺伝子（GOS2）
ets変異体遺伝子5（ETV5）
AE結合タンパク質1（AEBP1）
kelch様3（KLHL3）
ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有物16（ZBTB16）
プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー2（PCOLCE2）
【００４２】
本発明は、これらの27種の遺伝子に対するマーカーの配列物を提供し、それらのマーカーは特定の生物試料が心筋症性心疾患を示すか否かを決定するためにまとめて用いることができる。本明細書の他の箇所にある表の中では略号が用いられている。
【００４３】
本発明は、27種すべての遺伝子に対するマーカーの使用法、ならびに27種の遺伝子のサブセットに対するマーカーの使用法を範囲に含む。例えば、第4群遺伝子の1つまたは複数に対するマーカーを、第1群遺伝子の1つまたは複数のマーカーと並べて配列するか組み合わせることができる。それ故に、本発明は、以下の例示的な組み合わせに従った各群の1つまたは複数のマーカーのような、以上に概説した4つの群に基づく遺伝子マーカーのさまざまな組み合わせを想定している。
（a）第1群および第2群
（b）第1群および第3群
（c）第1群および第4群
（d）第1群、第2群、および第3群
（e）第1群、第2群、第3群、および第4群
（f）第2群および第3群
（g）第2群および第4群
（h）第2群、第3群、および第4群
（i）第3群および第4群
【００４４】
マイクロアレイの種類
マイクロアレイは、癌特異的遺伝子および炎症特異的遺伝子を同定するために有用である。DeRisi et al., Nat. Genet. 14(4):457-60 (1996)；およびHeller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(6):2150-55 (1997)を参照。
【００４５】
マイクロアレイは典型的には、固体支持体に対して固定された多数の一意的な一本鎖核酸配列、通常は合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはcDNA断片のいずれかから構成されうる。それ故に、「マイクロアレイ」という用語は、基質、例えば紙、ナイロンまたは他の種類の膜、フィルター、チップ、スライドガラス、または任意の他のそのような適した固体支持体上に配置、配列または他の様式で付着された、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアレイのことを意味する。本発明によれば、1つのマイクロアレイは、4つの群へと特徴づけられる以上に示した27種の遺伝子のうち1つまたは複数に対して配列同一性を有する、またはその全体に対して配列同一性を有する、核酸配列の1つまたは複数の組み合わせを含みうる。
【００４６】
表面に結合された核酸
本発明の1つの態様は、遺伝子発現を検出するために、固体支持体に基づくオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法を用いる。本発明を実施するのに適した固体支持体に基づく方法は広く知られており、例えば、PCT出願WO 95/11755号；Huber et al,, Anal. Biochem. 299: 24 (2001)；Meiyanto et al., Biotechniques. 31: 406 (2001)；Relogio et al., Nucleic Acids Res. 30:e51 (2002)に記載されている。オリゴヌクレオチドが共有的または非共有的に結合しうる任意の固体表面を用いることができる。そのような固体支持体には、フィルター、ポリ塩化ビニル製の皿、シリコンまたはガラスを基にしたチップが非限定的に含まれる。
【００４７】
ある態様においては、核酸分子を、固体支持体に直接結合させること、または典型的には核酸配列と固体支持体との間に配置するリンカーアームを介して結合させることができる。核酸分子と基質との間の距離を延長させるリンカーアームは、ハイブリダイゼーション効率を高めることができる。リンカーアームを配置するためのやり方は数多くある。1つの一般的なアプローチでは、多数の反応性末端／部位を備えたリンカーアームを与えるポリマー層によって固体支持体をコーティングする。この種の一般的な一例は、ポリリジンでコーティングされたスライドガラスであり（米国特許第5667976号を参照）、これは市販されている。または、リンカーアームを核酸分子の一部として合成するか結合させ、続いてこの複合体を固体支持体に結びつけてもよい。例えば、1つのアプローチは、極めて親和性の高いビオチン-ストレプトアビジンの相互作用を利用する。このストレプトアビジン-ビオチン化反応はストリンジェントな洗浄条件に十分に耐えるほど安定であり、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析といったある種の検出システムで用いられるレーザーパルスによっては切断されないほど十分に安定である。このため、ストレプトアビジンを固体支持体に共有結合させ、核酸分子をビオチン基で標識することができる（またはその反対）。ビオチン化された核酸分子は、ストレプトアビジンで覆われた支持体表面上のどの場所に配置されても有効に接着する。この方法の1つの変法では、アミノコーティングされたシリコンウェーハをビオチンのn-ヒドロキシスクシンイミド-エステルと反応させて、ストレプトアビジンと複合体化させる。ビオチン化オリゴヌクレオチドは、1mm2当たり約20fmolのDNAという濃度で表面に結合させる。
【００４８】
または、例えばカルボジイミドを用いて、DNAを支持体に直接結合させてもよい。1つのそのような方法では、支持体をヒドラジド基でコーティングし、続いてカルボジイミドで処理する。続いて、カルボキシ修飾された核酸分子を、処理した支持体とカップリングさせる。アミン修飾したオリゴヌクレオチドを用いた、エポキシドに基づく化学反応も用いられている。核酸分子を固体基質とカップリングさせるための他の化学反応も当業者に公知である。
【００４９】
表面上への核酸の配置
核酸分子は典型的には基質材料に送達される。アレイの小型化の理由で、送達手法は極めて少量の液体（例えば、1ナノリットル未満）を、極めて小さな領域（例えば、直径100mのドット）に互いに非常に近接して（例えば、250mの離隔距離で）配置させることができて、かつ自動化を適用できるべきである。そのような送達を達成するためにいくつかの手法および装置を利用可能である。これらの中には、機械的機構（例えば、GeneticMicroSystems, MA, USAによるアレイヤー（arrayer））およびインクジェット技術がある。極細ピペットを用いることもできる。他の形式も本発明の文脈において適している。例えば、ニトロセルロースまたはナイロンに対する核酸の固定を伴う96ウェル形式を用いることもできる。
【００５０】
表面上の非特異的な部位のブロッキング
核酸分子が固体支持体に結合した後には、核酸分子に対する結合において消費されない固体支持体上の反応部位をブロックすることがしばしば有用である。そうしなければ、プローブがある程度、固体支持体それ自体に直接的に結合し、いわゆる非特異的結合を生じると考えられる。非特異的結合は時に、低レベルの特異的結合を検出する能力を妨げる恐れがある。種々の有効なブロッキング剤（例えば、粉乳、遊離アミノ基を有する血清アルブミンまたは他のタンパク質、ポリビニルピロリドン）を用いることができ、他のものも当業者に公知である（例えば、米国特許第5994065号を参照）。選択は少なくとも一部には結合化学反応に依存する。
【００５１】
オリゴヌクレオチドの使用
診断利用のために適したオリゴヌクレオチドマイクロアレイの作製および使用の方法は、米国特許第5,492,806号；第5,525,464号；第5,589,330号；第5,695,940号；第5,849,483号；第6,018,041号；第6,045,996号；第6,136,541号；第6,142,681号；第6,156,501号；第6,197,506号；第6,223,127号；第6,225,625号；第6,229,911号；第6,239,273号；WO 00/52625号；WO 01/25485号；WO 01/29259号に開示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【００５２】
オリゴヌクレオチドは好ましくは、約6〜約60ヌクレオチド長、またはこれらの2つのパラメーターの間の任意の長さであってよい。本発明の他の態様において、オリゴヌクレオチドは約15〜約30ヌクレオチド長または約20〜約25ヌクレオチド長であってよい。ある種のマイクロアレイに関しては、約7〜約10ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。マイクロアレイは、公知の5'または3'配列をカバーするオリゴヌクレオチド、完全長配列をカバーする逐次的オリゴヌクレオチド；または配列の長さのうち特定の区域から選択された一意的オリゴヌクレオチドを含みうる。マイクロアレイに用いられるポリヌクレオチドは、配列の少なくとも一断片が公知である関心対象の1つもしくは複数の遺伝子に対して特異的な、またはある特定の細胞種、発生もしくは疾患の状態に共通な1つもしくは複数の未同定のcDNAに対して特異的な、オリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５３】
このため、本発明の1つの態様は、多数の遺伝子または遺伝子産物の発現を同時に観察するためのオリゴヌクレオチドアレイ、すなわちマイクロアレイを用いる。オリゴヌクレオチドアレイは、固体支持体上に用意された2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで各プローブは支持体上の一意的な位置を占有する。各プローブの位置は、所与の位置での検出可能なシグナルの検出が、実体が判明しているオリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションの指標となるように、前もって定めることができる。前もって定められた各位置は、プローブの複数の分子を含みうるが、前もって定められた位置の内部の各分子は同一な配列を有する。そのような前もって定められた位置は、フィーチャー（feature）と呼ばれる。例えば、単一の固体支持体上に、2個、10個、100個、1,000個、2,000個または5,000個またはそれ以上のそのようなフィーチャーが存在しうる。1つの態様において、各オリゴヌクレオチドは、アレイ上の一意的な場所に、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、または少なくとも10回ずつ位置する。
【００５４】
遺伝子発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブアレイは、例えば、Lockhart et al, Nat'l Biotech. 14: 1675 (1996)、McGall et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93: 13555 (1996)、およびHughes et al,. Nature Biotechnol. 19:342 (2001)に記載された従来の手法に従って、作製および使用することができる。種々のオリゴヌクレオチドアレイのデザインが、本発明の実施のために適している。
【００５５】
1つの態様において、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、それぞれが特定の種類の組織中で発現される異なる遺伝子とハイブリダイズする、多数のオリゴヌクレオチドを含む。1つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下のいずれかの遺伝子の核酸配列とハイブリダイズする：シヌクレインα（アミロイド前駆体の非A4性構成要素）（「SNCA」）、アスポリン（「ASPN」）、分泌性frizzled関連タンパク質4（「SFRP4」）、プレクストリン相同ドメイン、ファミリーA、メンバー1（「PHLDA1」）、Frizzled関連タンパク質（「FRZB」）、ミオシン重鎖6、心筋、α（心筋症、肥大型1）（「MYH6」）、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2（「CCL2」）、オルニチンデカルボキシラーゼ1（「ODC1」）、レチノイン酸受容体レスポンダー（タザロテン誘導性）1（「RARRES1」）、補体H因子（「CFH」）、アラニン-グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ2様1（「AGXT2L1」）、ミオシン重鎖10、非筋肉性（MYH10）、フィコリン（コラーゲン／フィブリノーゲンドメイン含有物）3（Hakata抗原）（「FCN3」）、S100カルシウム結合タンパク質A8（「S100A8」）、Corinセリンペプチダーゼ（「CORIN」）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体A（「NPPA」）、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー2（「PCOLCE2」）、ナトリウム利尿ペプチド前駆体B（「NPPB」）、活性化転写因子3（「ATF3」）、DNA結合阻害因子4、ドミナントネガティブ性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質（「ID4」）、Sparc／オステオネクチン、cwcv様およびkazal様ドメインプロテオグリカン（テスチカン）1（「SPOCK1」）、結合組織増殖因子（「CTGF」）、G0／G1スイッチ2（「GOS2」）、Kelch様3（ショウジョウバエ）（「KLHL3」）、ジンクフィンガーおよびBTBドメイン含有物16（「ZBTB16」）、AE結合タンパク質1（「AEBP1」）、ならびにETS変異体遺伝子5（ets関連分子）（ETV5）。もう1つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、SEQ ED NO：1〜27のいずれかの配列の核酸配列とハイブリダイズする。
【００５６】
核酸およびオリゴヌクレオチドの標識
一般に、本明細書において標識とも称する検出可能な分子が、アレイの核酸配列に組み入れられるか付加される。多くの種類の分子を本発明の文脈において用いることができる。そのような分子には、蛍光色素、化学発光性分子、発色性分子、放射性分子、質量分析用タグ、タンパク質などが非限定的に含まれる。他の標識も当業者には直ちに明らかであろう。間接的検出を本発明の文脈において用いることもできる。二本鎖DNAとは結合するが一本鎖DNAとは結合しないと考えられるタンパク質および他の分子が入手可能である。したがって、ハイブリダイゼーションを測定することができる。このため、1つの態様において、ある個体から入手した核酸試料を増幅し、任意で、検出可能な標識によって標識することができる。そのような目的に適した任意の核酸増幅の方法および任意の検出可能な標識を用いることができる。例えば、増幅反応を、（試料組織から抽出されたRNAに対して核酸配列の点で相補的な）「アンチセンス」RNAまたは「aRNA」を作り出す、Ambion社のMessageAmpなどを用いて行うことができる。RNAを任意で、CyDye蛍光標識を用いて標識することもできる。増幅段階の間に、結果として生じるaRNAの中にaaUTPが組み入れられる。CyDye蛍光標識は、非酵素的反応においてaaUTPとカップリングされる。増幅および標識の段階の後に、標識され増幅されたアンチセンスRNAを沈降させ、適切な緩衝液で洗浄して、続いて純度に関してアッセイする。例えば、純度は、NanoDrop分光光度計を用いてアッセイすることができる。続いて、核酸試料を、試料中に存在する可能性のある関心対象の核酸とハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド試料プローブが固体基質（「マイクロアレイスライド」）に付着されたオリゴヌクレオチドアレイと接触させる。接触の段階は、関心対象の核酸とアレイ上に存在するオリゴヌクレオチドプローブとの間でハイブリダイゼーションが起こりうる条件下で行われる。続いて、非特異的に結合した核酸を除去するためにアレイを洗浄し、固体基質上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしたままの標識分子からのシグナルを検出する。検出の段階は、用いた標識の種類に合った任意の方法を用いて達成することができる。例えば、検出の段階を、レーザースキャナーまたは検出器を用いて達成することができる。例えば、マイクロアレイスライド上のシグナルの場所を分析するためにGenePix Proソフトウエアを任意で用いてAxonスキャナーを用いることができる。1つまたは複数のマイクロアレイスライドからのデータを、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって分析することができる。
【００５７】
マイクロアレイ手法を含む本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドプローブは、PCRを用いて生成させることができる。プローブの生成に用いられるPCRプライマーは、例えば、SEQ ID NO：1〜27の配列に基づく。
【００５８】
1つの態様においては、オリゴヌクレオチド対照プローブも用いられる。例示的な対照プローブは、本明細書において（1）標準化対照、（2）発現レベル対照、および（3）陰性対照と称する、3つのカテゴリーのうち少なくとも1つに該当しうる。マイクロアレイ法では、これらの対照プローブの1つまたは複数を、本発明の細胞周期遺伝子関連オリゴヌクレオチドとともにアレイ上に用意することができる。
【００５９】
標準化対照は、色素の偏り、組織の偏り、粉塵、スライドの不規則さ、変形したスライドスポットなどを補正する。標準化対照は、スクリーニングしようとする核酸試料に添加される標識参照オリゴヌクレオチドまたは他の核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドもしくは他の核酸プローブである。ハイブリダイゼーション後に標準化対照から得られるシグナルは、完全なハイブリダイゼーションのシグナルがアレイ間で異なる原因となりうる、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、読み取り効率および他の要因のばらつきに関する対照となる。1つの態様においては、本方法に用いられた他のすべてのプローブからのシグナル（例えば、蛍光強度または放射能）読み取り値を、対照プローブからのシグナルによって除算し、それによって測定値を標準化する。
【００６０】
事実上あらゆるプローブを標準化対照として利用することができる。しかし、ハイブリダイゼーション効率は塩基組成およびプローブ長によって異なる。好ましい標準化プローブは、用いられる他のプローブの平均長を反映するように選択されるが、ある範囲の長さをカバーするようにそれらを選択することもできる。さらに、用いられる他のプローブの平均塩基組成を反映するように標準化対照を選択することもできる。1つの態様においては、1つまたは少数の標準化プローブのみを用い、それらが十分に（すなわち、二次構造を形成することなく）ハイブリダイズし、かついかなる被験プローブとも一致しないようにそれらを選択する。1つの態様において、標準化対照は哺乳動物遺伝子である。
【００６１】
発現レベル対照プローブは、生物試料中に存在する、構成的に発現される遺伝子と特異的にハイブリダイズする。事実上あらゆる構成的に発現される遺伝子が、発現レベル対照プローブの適した標的となる。典型的には、発現レベル対照プローブは、ある種の光合成遺伝子を非限定的に含む、構成的に発現される「ハウスキーピング遺伝子」の部分配列に対して相補的な配列を有する。
【００６２】
「陰性対照」プローブは、被験オリゴヌクレオチド（すなわち、本発明の細胞周期遺伝子関連オリゴヌクレオチド）、標準化対照および発現対照のいずれに対しても相補的でない。1つの態様において、陰性対照は、試料中のいかなる他の配列に対しても相補的でない哺乳動物遺伝子である。
【００６３】
「バックグラウンド」および「バックグラウンドシグナル強度」とは、標識された標的核酸（すなわち、生物試料中に存在するmRNA）とオリゴヌクレオチドアレイの構成要素との間の非特異的結合または他の相互作用に起因するハイブリダイゼーションシグナルのことを指す。バックグラウンドシグナルはまた、アレイ構成要素それ自体の内因性蛍光によっても生じうる。単一のバックグラウンドシグナルをアレイ全体に関して算出することもでき、または複数の異なるバックグラウンドシグナルを各標的核酸に関して算出することもできる。1つの態様において、バックグラウンドは、用いられるオリゴヌクレオチドプローブのうち最も低い5〜10％に関しての、または各標的遺伝子に関して複数の異なるバックグラウンドシグナルを算出する場合には、各遺伝子に関するプローブのうち最も低い5〜10％に関しての、平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として算出される。特定の細胞周期遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドプローブが標的配列と十分にハイブリダイズし、それ故にそれに対して特異的に結合すると思われる場合には、それらをバックグラウンドシグナルの算出に用いるべきではない。または、バックグラウンドを、試料中に認められるいずれの配列に対しても相補的でないプローブ（例えば、対向センス（opposite sense）の配列または試料中に認められない遺伝子を対象とするプローブ）に対するハイブリダイゼーションによって生じる平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として算出することもできる。マイクロアレイ法において、バックグラウンドは、オリゴヌクレオチドプローブが全くないアレイの領域によって生じる平均シグナル強度として算出することができる。
【００６４】
1つの代替的な態様においては、核酸分子を酵素と直接的または間接的にカップリングさせる。ハイブリダイゼーションの後に、発色性基質を適用し、呈色した生成物を電荷結合カメラなどのカメラによって検出する。そのような酵素の例には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが含まれる。本発明はまた、切断可能な質量分析用タグ（CMST）によって核酸分子を標識する方法も提供する（例えば、米国特許第60279890号を参照）。アッセイが完了し、一意的にCMSTで標識したプローブをアレイ全体にわたって分布させた後に、アレイの各要素に対してレーザービームを逐次的に差し向ける。レーザービームからの光はタグ-核酸分子結合物からの一意的なタグを切断するとともにそれを揮発させる。揮発したタグを質量分析計に向かわせる。タグの質量スペクトルおよびタグ標識ヌクレオチドをいかにして調製したかの知識に基づいて、タグが付着した核酸分子を明確に同定することができる（例えば、WO9905319号を参照）。
【００６５】
このように、核酸はさまざまな手法のうち任意のものによって容易に標識することができる。多様性パネル（diversity panel）を増幅によって生成させる場合には、標識dNTPの組み入れまたは標識された増幅プライマーの使用により、核酸を反応中に標識することができる。増幅プライマーがRNAポリメラーゼのプロモーターを含むならば、標識NTPの存在下でRNAを合成することによって反応後標識を達成することができる。増幅中に標識されなかった増幅断片または増幅されなかった核酸分子は、さまざまな末端標識手法のいずれかによって、またはニック翻訳、ランダムプライム（random-primed）DNA合成などの転写方法によって標識することができる。これらの方法の詳細は当業者には周知であり、方法に関する書籍（例えば、Ausubelら、前記）中に詳述されている。別の種類の標識反応は、RecAのようなDNA結合性分子の存在下における核酸分子の変性、およびRecAが組み込まれた安定なDNA複合体の形成を促す条件下でのその後のハイブリダイゼーションによって行われる。
【００６６】
検出のための、PCRに基づく方法
もう1つの態様においては、遺伝子発現を検出するためにPCRに基づく方法が用いられる。これらの方法には、リアルタイムおよびエンドポイントでの定量的な逆転写酵素を介したポリメラーゼ連鎖反応（Q-RTPCR）を含む、逆転写酵素を介したポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）が含まれる。これらの方法は当技術分野において周知である。例えば、定量的PCRの方法を、例えば、Applied BioSystems社およびStratagene（登録商標）社から市販されているキットおよび方法を用いて実施することができる。Kochanowski, QUANTITATIVE PCR PROTOCOLS (Humana Press, 1999)；Innis et al, 前記；Vandesompele et al., Genome Biol. 3: RESEARCH0034 (2002)；Stein, Cell Mol. Life Sci. 59: 1235 (2002)も参照のこと。
【００６７】
また、遺伝子発現を、Q-RTPCRを用いて溶液中で観察することもできる。Q-RTPCRは、PCR産物の増幅中に比例的に生成される蛍光シグナルの検出に依拠している。Innisら、前記を参照。慣例的なPCR法と同じように、この手法は、対向鎖および関心対象のDNA領域に隣接する領域とハイブリダイズする、典型的には15〜30塩基長であるPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。さらに、プローブ（例えば、TaqMan（登録商標）、Applied Biosystems）は、PCR法において慣例的に用いられる順方向プライマーと逆方向プライマーとの間の標的配列とハイブリダイズするように設計される。プローブは5'末端で、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）などのレポーター蛍光団および6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン（TAMRA）のようなクエンチャー蛍光団によって標識される。プローブが損傷されていない限り、蛍光エネルギー転移が起こり、クエンチング性蛍光団によるレポーター蛍光団の蛍光発光の吸収をもたらす。しかし、Taqポリメラーゼがプライマーを伸長させるのに伴って、Taqの内因性5'→3'ヌクレアーゼ活性がプローブを分解し、レポーター蛍光団を放出させる。増幅サイクル中に検出される蛍光シグナルの増加は、各サイクルで生成される産物の量に比例する。
【００６８】
順方向および逆方向増幅プライマーならびに内部ハイブリダイゼーションプローブは、標的遺伝子の転写物に由来する1つのヌクレオチドと特異的かつ一意的にハイブリダイズするように設計される。1つの態様において、プライマー配列およびプローブ配列に関する選択基準は、TaqMan（登録商標）の要求条件に適応するようにヌクレオチドの含量およびサイズに関する制約条件を取り入れている。
【００６９】
以上に考察したTaqman（登録商標）型アッセイの代わりに、プローブを用いない（probe-less）Q-RTPCRとして、SYBR Green（登録商標）を用いることができる。ABI PRISM（登録商標）7900 SEQUENCE DETECTION SYSTEM USER GUIDE APPLIED BIOSYSTEMS, chap. 1-8, App. A-F. (2002)。
【００７０】
あるデバイスは、PCR増幅中の蛍光発光強度の変化を測定する。測定は「リアルタイム」で行われ、すなわち、増幅産物が反応中に蓄積する。プローブ消化に起因する蛍光の変化を測定するために他の方法を用いることもできる。例えば、蛍光偏光により、大きな分子と小さな分子を分子タンブリング（molecular tumbling）に基づいて識別することができる（米国特許第5,593,867号を参照）。
【００７１】
ハイブリダイゼーションのパラメーター
典型的には、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためには、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件が、約500bpを上回る核酸分子に対しては有用である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、Tmよりも25℃〜30℃低い、約1M Na+を含む溶液；例えば、5×SSPE、0.5％ SDS、65□Cが含まれる；Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1995；Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989)を参照。Tmは、G+C含量およびNa+の濃度の両方に依存する。約500bpを上回る核酸分子のTmを計算するための式は、Tm＝81.5＋0.41(％(G+C))-log10[Na+]である。洗浄条件は一般に、少なくともハイブリダイゼーションと等価なストリンジェンシー条件で行われる。バックグラウンドレベルが高い場合には、Tmよりも15℃前後低いというような、より高度のストリンジェンシーで洗浄を行う。
【００７２】
低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、Tmよりもおよそ40℃低い条件で行われ、これは例えば約500bp未満の短い断片に対して用いられる。約100〜500bpの断片に関しては、500bpよりも50bp短くなるごとにTmが約1.5℃ずつ低下する。例えば約50bp未満の極めて小さな断片に関して、Tmを計算するための式は、各AT対について2℃、各GC対について4℃である。Tmよりもおよそ10℃低い条件で、極めて高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションが行われる。
【００７３】
ハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドの長さおよびGC含量に合わせて調整される。適したハイブリダイゼーション条件はSambrookら、前記、Ausubelら、前記に記載があり、さらにハイブリダイゼーション溶液が、ハイブリダイゼーションの特異性を高めるためにテトラメチルアンモニウムクロリドもしくは他のカオトロピック試薬、またはハイボトロピック（hybotropic）試薬などの添加物を含んでもよい（例えば、PCT/US97/17413号を参照）。
【００７４】
ハイブリダイゼーションは、さまざまなやり方で、かつさまざまな装置を用いて検出することができる。方法は一般に、多様性パネルに組み入れられた検出可能な分子に依拠するものと、二本鎖核酸（すなわち、ハイブリダイズした核酸）を一本鎖核酸（すなわち、ハイブリダイズしていない核酸）から識別する測定可能な特性に依拠するものとにカテゴリー化される。後者のカテゴリーの方法には、二本鎖核酸中への臭化エチジウムなどの色素のインターカレーション、二本鎖核酸と一本鎖核酸の吸収特性の較差、および二本鎖核酸と選好的に結合するタンパク質の結合などが含まれる。
【００７５】
ハイブリダイゼーションの後には、反応がうまく行われたことを検出するための何らかの手段を取るべきである。検出の手段は、用いた標識の種類に依存する。例えば、放射性標識を用いる場合には、オートラジオグラフィーまたはストレージホスファスクリーン（storage phosphor screen）（PhosphorImager）が、検出のための一般的な方法である。化学発光標識および蛍光標識をオートラジオグラフィー、電荷結合カメラまたは共焦点顕微鏡検査と併せて含む他のシステムも、豊富にある検出システムの一部である。放射性、蛍光性または化学発光性の標識とともに用いうる代替的な検出システムには、CCD一体型シリコンウェーハがある。このシステムでは、高エネルギーβ粒子または光子を検出するように設計された電荷結合素子（CCD）が、アレイ用のシリコン支持体と直接接触して配置される。固定化された核酸に試料が結合すると、放射性同位体の崩壊生成物または光子が生成される。電子-空孔対がシリコン中に生成され、続いて電子がCCDによって集められる。
【００７６】
蛍光分子のための代替的な検出システムは、1つまたは複数の蛍光標識を検出するレンズベース（lens based）のカメラである。上述したように、これらのカメラには、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡および電荷結合カメラが含まれる。これらの蛍光システムでは、レーザーが蛍光標識を励起させ、放出された光をバンドパスフィルターを通して集め、光子を算定するための電子機器を有する光電子増倍管によってシグナルを検出する。
【００７７】
他の標識も、レンズベースのカメラまたはCCDのいずれかとともに用いるのに適用しうると考えられる。例えば、化学発光標識または発色性基質を、レンズベースの電荷結合カメラによって検出することができる。
【００７８】
いくつかの態様において、標識は、切断可能な質量分析用タグである。続いてそのような標識を質量分析計を用いて検出する。多くの検出システムが市販されている（例えば、Affymetrix, Santa Clara, CA）。当業者は、用いた標識に対して適切な検出手段および装置を選択することができる。
【００７９】
ハイブリダイゼーションのパターンは、ハイブリダイゼーションの有無、ハイブリダイゼーションの度合い、またはこれらのいくつかの組み合わせとして表すことができる。最も単純な分析は、ハイブリダイゼーションの有無を決定することによって行われる。遺伝子型判定を行おうとする生物のゲノムの複雑度が、アレイ上に提示されたゲノムの複雑度を上回る場合には、ハイブリダイゼーションの欠如が多型の決定的な現れとなる。複雑度がアレイ上よりも小さい場合には、ハイブリダイゼーションの欠如は多型の現れでありうるか、プロービング用多様性パネルにそのような配列が提示されていないことの現れでありうる。しかし、ハイブリダイゼーションの存在は、いずれの筋書きにおいても多型の欠如の現れとは必ずしもならない。以下にさらに詳細に説明するように、ハイブリダイゼーションのパターンには情報的価値がある。
【００８０】
シグナルの有無をアッセイする場合には、標識に対して適切な方法を用いて、各アドレス指定可能領域に対してハイブリダイゼーションに関するクエリーを行う。例えば、Cy3およびCy5などの蛍光標識を用いる場合には、緑および赤のシグナルの両方をアッセイする。陽性対照および陰性対照がアレイ上に含まれる場合には、シグナルを対照と比較して、各アドレス指定可能領域にある値、例えば、検出可能なハイブリダイゼーションに対しては1、検出不能なハイブリダイゼーションに対しては0を割り当てる。一般に、値1は閾値レベルを超える検出に対して割り当てられ、0は閾値レベル未満の検出に対して割り当てられる。多型の検出が、複数の多様性パネルとハイブリダイズさせた時の、任意の特定のアレイフィーチャーに関するシグナル値の二項分布の所見に主として基づくことは当業者には理解されるであろう。パネルは、多様性アレイを作り出すために用いられるものと同じであることが好ましい（実施例5参照）。多様性パネルがある多型に関するヘテロ接合体から作製される場合には、続いて三峰分布を検出することが考えられる。そのような場合には、2つの閾値値を計算する：第1の閾値は「0」クラスター（ハイブリダイゼーションが欠如）を「0／1」クラスター（ヘテロ接合体）と分離し、第2の閾値は「0／1」クラスターを「1」クラスター（ハイブリダイゼーションが存在）と分離する。閾値レベルの決定には従来の統計学的方法を用いることができる。
【００８１】
続いて、生物の遺伝子型を、各アドレス指定可能領域に関する値として表すことができる。理解を助けるための例示として、アドレス指定可能アレイが96スポット形式（8行（A〜G）×12列（1〜12）のグリッド）であり、ハイブリダイゼーションに関する値が1であり、検出不能なハイブリダイゼーションについては0であるならば、そのような1／0検出を反映する二次元グリッド上に、その個体の発現プロファイルを視覚化することが可能である。同様の様式で、ハイブリダイゼーションの程度を測定しようとする場合には、各アドレス指定可能位置に対して相対値を割り当てる。相対値は一般に対照に対して標準化される。比較を容易にするとともに、遺伝子型ツリーの構築といったさらなる分析を行うために、全データをデータベース形式に収集することができる。
【００８２】
したがって、本明細書に開示した27種の遺伝子（SEQ ID NO：1〜27）の一部またはすべてのオリゴヌクレオチドを、任意の組み合わせで、マイクロアレイの構成要素として用いることができる。当然ながら、本発明は、表記された27種の遺伝子を特異的に標的とする、オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブなどのマーカーには限定されない。27種の遺伝子のいずれか1つの標的アイソフォームおよび相同体に対して、核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドを設計することもできる。
【００８３】
タンパク質の発現プロファイル
核酸転写物を検出することによって発現レベルを決定する代わりに、またはそれに追加して、試料の発現プロファイルを決定するために、タンパク質を、免疫学的方法、酵素アッセイおよびタンパク質アレイ／プロテオミクスの手法を含む、当技術分野で公知の任意の手段によって観察することもできる。タンパク質の翻訳状態の測定は、タンパク質に関するいくつかの方法に従って行うことができる。例えば、全ゲノムでのタンパク質のモニタリング‐「プロテオーム」‐は、結合部位が、SEQ ID NO：236〜470および718〜737のいずれかのアミノ酸配列を有する多数のタンパク質、またはSEQ ID NO：1〜235および698〜717の遺伝子またはそれらの保存的変異体によってコードされるタンパク質に対して特異的な、固定化された、好ましくはモノクローナル性である抗体を含むようなマイクロアレイを構築することによって実施することができる。Wildt et al., Nature Biotechnol. 18: 989 (2000)を参照。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための方法は周知であり、例えば、Harlow & Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)に記載されている。
【００８４】
または、タンパク質を、二次元ゲル電気泳動システムによって分離することもできる。二次元ゲル電気泳動は当技術分野で周知であり、典型的には、第1の次元に沿った等電点電気泳動の後に第2の次元に沿ったSDS-PAGE電気泳動を行うことを伴う。例えば、Hames et al, GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press, 1990)を参照。結果として得られた電気泳動図は、質量分析法、ウエスタンブロット法、ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いるイムノブロット分析、ならびに内部およびN末端マイクロシークエンシングを含む、さまざまな手法によって分析することができる。
【００８５】
「標的」とは、例えばcorin遺伝子に対する核酸マーカーが、corin特異的遺伝子配列に対して相補的な、オリゴヌクレオチドまたはプローブなどの核酸配列でありうることと解釈される；そのため、それを基質表面に付着させると、プローブは、corin遺伝子核酸転写物に対して、それがゲノムDNA、cDNA、またはRNAのいずれであってもアニールまたはハイブリダイズするようになると考えられる。
【００８６】
したがって、発明によれば、以上に表記した27種の遺伝子のいずれかおよびすべてに対して、オリゴヌクレオチドを設計することができる。さらに、本発明は、同じ遺伝子とアニールまたはハイブリダイズするように設計された、特定の基質上の複数のオリゴヌクレオチドの存在も想定している。ある態様においては、マイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドの対を用いることが適切であると考えられる。その「対」は、好ましくは配列の中央に位置する1つのヌクレオチドを除いて同一であると考えられる。対における第2のオリゴヌクレオチドは、対照としての役を果たす。オリゴヌクレオチド対の数は2から100万までの範囲にわたりうる。光により導かれる（light-directed）化学過程を用いて、オリゴマーを基質上の指定領域で合成させる。基質は紙、ナイロンまたは他の種類の膜、フィルター、チップ、スライドガラスまたは任意の他の適した固体支持体であってよい。
【００８７】
公知の配列に対するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイ用に作製するためには、関心対象の遺伝子を、ヌクレオチド配列の5'末端から、またはより好ましくは3'末端から始めて、コンピュータアルゴリズムを用いて調べる。アルゴリズムにより、その遺伝子に対して好ましくは一意的であり、GC含量がハイブリダイゼーション用に適した範囲内にあり、かつハイブリダイゼーションを妨げる恐れがある二次構造が予測されない、規定された長さのオリゴマーが同定される。
【００８８】
もう1つの態様においては、化学的カップリング手順、および、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、PCT出願WO95/251116号（Baldeschweiler et al.）に記載されたようなインクジェット適用装置を用いて、オリゴヌクレオチドを基質の表面で合成させる。もう1つの態様においては、真空システム、熱、UV、機械的または化学的な結合手順を用いて、cDNA断片またはオリゴヌクレオチドを基質の表面に配置して連結させるために、ドットまたはスロットドットに類似した「グリッド入り（gridded）」アレイを用いることができる。上記のもののようなアレイは、手作業によって、または利用可能なデバイス（スロットブロットまたはドットブロット用の装置）、材料（任意の適した固体支持体）および機械（自動機器を含む）を用いることによって作製することができる。
【００８９】
標的特異的核酸のオリゴヌクレオチド、プローブ、または小片は、標的核酸に対するそれらのアニーリングまたはハイブリダイゼーションによって検出可能なシグナルが生成されるような様式で標識することができる。
【００９０】
それ故に、本発明のマイクロアレイは、血液、尿、唾液、痰、胃液、培養細胞、組織生検標本、または他の組織調製物といった生物試料と接触するように置かれる；続いて、検出システムを用いて、異なる配列のすべてに関してハイブリダイゼーションの欠如、存在および／または量を同時に測定する。このデータは、試料間での配列、突然変異、変異体または多型に関する大規模相関研究のために用いることもできる。
【００９１】
したがって、本発明は、本明細書に記載したように、対象が拡張型心筋症などの心筋症に関して症候性であるか罹患しているかを判定する目的で対象からの生物試料を評価するために用いることができる、以上に群1〜4として表記されたSEQ ID NO：1〜27の遺伝子の少なくとも1個、少なくとも約2個、または約2個から最大で27個までの間の任意の数、またはそのすべてを有するマイクロアレイを想定している。
【００９２】
しかし、本発明は、遺伝子発現レベルの分析を介して心筋症を診断するためのマイクロアレイアッセイの使用には限定されない。本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、定量的PCRおよびリアルタイムPCR、定量的競合逆転写PCRおよびリアルタイム検出5'-ヌクレアーゼ-PCRなどの手法の使用も想定している。後者はTaqMan RT-PCRとしても知られている。
【００９３】
TaqMan RT-PCRは、試料組織中のタンパク質の濃度をそのmRNA発現と相関づけるために有用である。Hirayama et al., "Concentrations of Thrombopoietin in Bone Marrow in Normal Subjects and in Patients with Idiopathic Thrombocytopenic Purpura, Aplastic Anemia, and Essential Thrombocythemia Correlate With Its mRNA Expression of Bone Marrow Stromal Cells," Blood, 92(1): 46 52, 1998を参照。
【００９４】
この定量的で反復的な方法は、RT-PCR反応における5'-ヌクレアーゼアッセイの存在に依拠しており、ここで、標的タンパク質に対して特異的なプローブは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）のような蛍光部分をその5'末端に含み、6-カルボキシテトラメチルフルオレセイン（TAMRA）のようなリン酸キャップされた（phosphate-capped）クエンチャー蛍光部分をその3'末端に含む。標的タンパク質に対するmRNAの増幅が進行するのに伴って、FAM部分の蛍光の強度は、プローブの5'-エンドヌクレアーゼ切断のために時間およびmRNA濃度の関数として増加し、溶液中にFAM部分が次第に放出されていく。
【００９５】
また、DNAの定量のために、TaqMan RT-PCRをABI Prism 7700配列検出システムまたは競合PCRと組み合わせることもできる。Desjardin et al., "Comparison of the ABI 7700 System (TaqMan) and Competitive PCR for Quantification of IS6110 DNA in Sputum During Treatment of Tuberculosis," J. Clin. Microbiol., 36(7): 1964-1976, 1998を参照。
【００９６】
本発明が想定しているもう1つのアッセイは、対象の生物試料から、表記された27種の遺伝子のうち1つまたは複数のタンパク質産物を検出するためのELISAアッセイである。ELISAアッセイおよび付随するプレートリーダー装置は当業者に周知である。
【００９７】
マイクロアレイについての予測分析（「PAM」）は、マイクロアレイデータに意味を帰属させるために有用なツールである。このため、これは特定の生物被験試料を分類および診断するために極めて有用なツールである。Tibshirani et al., "Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression," Proc Natl Acad Sci U S A., 2002;99:6567-72を参照。
【００９８】
データセットBからの分類のための最小の遺伝子セットに基づき、PAM法は4つのすべてのヒト心不全データセットを低い誤分類率で分類した。特に、単一の遺伝子については遺伝子発現の値に大きなばらつきがあったにもかかわらず、全体としてのクラシファイア（classifier）はDCM試料とNF試料とを鑑別するのに非常に有益であった。これらの結果は、診断用途に対するこの分子アプローチの有用性を裏づける。さらに、DCM心臓およびNF心臓に基づくクラシフィケータ（classificator）遺伝子セットは、DCM試料と同じくICMにおいても同様に高い分類精度を達成しており、このことはこの遺伝子セットが心不全全般の分子的変化の代表となりうることを示唆する。
【００９９】
注目すべきことに、データセットBに基づくクラシフィケータは、データセットAおよびDにおいても、あたかもこれらの2つのデータセットのみから生成されたクラシフィケータを用いたかのような遂行能力を示した。さらに、データセットBからの遺伝子シグネチャーは、データセットCにおいてもNF試料とDCM試料とを正確に識別した。データセットCに関する著者らによる指摘のように、遺伝子発現の違いは、DCM群における左室補助装置（LVAD）下の心臓と非LVAD心臓との間の方が、DCM試料とNF試料との間よりも大きかった（13）。この特質は、このデータセット自体の内部でのDCMとNFとの間の有用なクラシファイアを同定するためのPAMアプローチに対する妨げとなる可能性がある。
【０１００】
このクラシファイア遺伝子シグネチャーは、DCMの病態に関して複数の異なる機能セットにグループ分けすることができる。心筋症マーカーであるプロ-ANPおよびプロ-BNPのアップレギュレーションは心不全において十分に実証されており（23）、これは神経ホルモンの調節不全によって媒介される（27）。線維化促進性（pro-fibrotic）ストレスホルモン経路の活性化はDCMにおける顕著な構造リモデリングを招き、このことはミオシン6および10、アスポリン、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー2（PCOLCE2）、kelch様3（KLHL3）およびAE結合タンパク質1（AEBP1）のようなサルコメア構造および細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の調節不全によって例証される。プロ-BNPに加えて、転写因子ZBTB16（28）、結合組織増殖因子CTGF（29）およびケモカインCCL2（30）を含む、クラシファイア遺伝子のこのセットのそのほかの転写物も、それらはすべてアンジオテンシン-IIによって誘導されることが示されているため、不全性心筋におけるレニン-アンジオテンシン系の重要な標的の特徴をなしている。
【０１０１】
このクラシファイア遺伝子セットの他の転写物は、抗アポトーシス過程（PHLDA1、SNCA、CCL2）および細胞増殖過程（FRZB、SFRP4、SPOCK、CTGF）に属する。注目すべきことに、frizzled関連タンパク質（FRZB）および分泌性frizzled関連タンパク質4（SFRP4）をコードする2つの遺伝子は、創傷治癒および心不全の再生と関連づけられているWntシグナル伝達経路のメンバーである（31, 32）。特に、WntアンタゴニストSFRP4の発現は、過負荷誘発性心不全における筋細胞アポトーシスと関連がある（31）。
【０１０２】
さらに、補体H因子関連物3（CFHL3）、フィコリン3（FCN3）、ケモカインリガンド2（CCL2）およびカルグラニュリンA（S100A8）をコードする遺伝子は、ストレスおよび免疫応答に関係している。注目されることに、GOクラスの「免疫応答」および「炎症反応」は、本発明者らの2つのデータセットAおよびBにおいて、すべての生物学的過程に関して最も有意な変化を示した。DCMが極めて異種混交的な病因を有することを考えれば、DCMのサブグループが感染後自己免疫疾患に相当し、特に遺伝的感受性のある個体ではそうであることは妥当と思われる。しかし、心筋症の独立した実験モデルにより、心臓リモデリングそれ自体が免疫応答の誘因となりうることが示唆されている（33, 34）。CCL2は、免疫過程および炎症過程に関するより広範な機能グループの重要なメンバーであり、データセットAおよびBの両方でダウンレギュレートされることが見いだされている。TNF-αおよびIL-6関連経路と相互作用しうるこのケモカインは、免疫組織化学によれば心筋細胞区画に局在する（24）。これは不全性心筋への活性化白血球の誘引および侵入を促進するが、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびコラーゲン代謝回転の活性を調節することによる細胞外マトリックスの成形（35）ならびに細胞増殖およびアポトーシス誘導（24）にも関与する。このため、末期心不全におけるCCL2転写物のダウンレギュレーションは、細胞生存を促すための適応機構である可能性がある。注目すべきことに、CCL11およびCCL18のような別のサイトカインもダウンレギュレートされることが、それぞれAffymetrixアレイおよびUnigeneアレイにおいて見いだされている。
【０１０３】
公知の心筋症マーカーであるプロ-ANPおよびプロ-BNPに加えて、ナトリウム利尿系および免疫応答過程に関与するそのほかの遺伝子も本発明によって同定された。これらは疾患バイオマーカーの有望な候補である。この点に関して、種々のマイクロアレイプラットフォームおよび独立した試験を通じてのDCMの分子診断用遺伝子シグネチャーの同定は、これらの心不全バイオマーカーの検証およびそれらの臨床的有用性の検討のために有用である。
【０１０４】
以下の実施例は例示のみを目的としており、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲を限定するものと解釈されるべきではないことは理解されるであろう。米国特許を含む、本明細書において特定されたすべての参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【０１０５】
実施例
実施例1：試験デザイン
以下のデータセットに従って、合計40件の患者試料に対して、2件のマイクロアレイ試験を行ったが、それらはGene Expression Omnibus（GEO, http://www.ncbi.nlm,nih.gov/geo）に寄託されており、GEOシリーズのアクセッション番号GSE3585およびGSE3586によってアクセス可能である。移植患者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。調査は施設内審査委員会による承認を得た。下記の通り、4件の独立した試験からの68件のDCM試料および40件のNF試料を分類のために用いた。
【０１０６】
データセットA：移植時の13例のDCM心臓および明白な冠石灰化のために移植されなかった15例のNFドナー心臓から入手した28件の中隔心筋試料を用いたcDNAマイクロアレイ試験。後者の患者群は顕性の心血管疾患の病歴はないことが判明していた。詳細な患者特性は表3に列記されている。
【０１０７】
データセットB：7例のDCM患者および5例のNFドナーから収集した12件の別個の心内膜下左室試料を用いたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ試験。詳細な患者特性は表3に列記されている。
【０１０８】
摘出後に、すべての組織標本を液体窒素中で凍結させて、-80℃で寒冷保存した。RNAの単離、試料調製、標識、RZPD Unigene 3.1 cDNA（37.5K）アレイおよびAffymetrix U133A（22.2K）アレイに対するハイブリダイゼーションは、以前の記載の通りに行った（6, 11, 12）。
【０１０９】
クラシファイア遺伝子セットの分類および検証のために、さらに2つの試験を含めた。
【０１１０】
データセットC：Affymetrix HG-U133Aアレイに対してハイブリダイズさせた、6件のNF試料、21件のDCM試料および10件のICM試料（13）。標準化された遺伝子発現データは、Gene Expression Omnibus（アクセッション番号GSE1869）からダウンロードした。
【０１１１】
データセットD：National Heart, Lung, and Blood Instituteによって助成されたゲノム用途のためのプログラムを通じてオンラインで入手可能であり、Affymetrix HG-U133 2.0 plusアレイに対してハイブリダイズさせた14件のNF試料、27件のDCM試料および32件のICM試料からなる（http://www.cardiogenomics.org）（14）。
【０１１２】
実施例2：データ抽出および統計学的分析
前処理および大部分の統計学的分析は、R（www.r-project.org）およびBioconductor（www.bioconductor.org）を用いて行った。品質管理の後に、すべてのcDNAマイクロアレイデータをarrayMagic（15）および「VSN」（16）を用いて標準化した。標準化されたデータを、シグナル強度に関してフィルタリングした。HG-U133Aアレイの品質は、ダイナミックレンジ、完全マッチ飽和（perfect match saturation）、ピクセルノイズ、グリッド配列不良（misalignment）および信号雑音比を制御することによって確実なものにした。マイクロアレイ試験Bにおける全試料のマイクロアレイデータは、Bioconductorの「affy」パッケージに組み込まれたロバストマルチアレイ平均（robust multi-array average）（RMA）（17）を用いて共通に標準化した。いずれかの群（NFおよびDCM）において組織試料の50％超でコールが「存在せず」であったプローブセットは除外した。
【０１１３】
差異を伴って発現される遺伝子を同定するために、2つのクラスの独立したマイクロアレイ有意性分析（SAM）（18）を両方の試験に対して適用した。遺伝子発現の差は、q＜0.05の偽発見率（FDR）および1.2以上の倍数変化が達成されれば、統計学的に関連ありとみなした。
【０１１４】
cDNAクローンとAffymetrixプローブセットとの間の転写物のマッピングは、MatchMinerソフトウエアツール（19）によって達成した。差異を伴って発現される遺伝子の機能上の注釈は、GOドメインの「細胞成分」「生物学的過程」および「分子機能」の階層的体系を基にした。遺伝子セットにおける特定のGOクラスの過剰出現（overrepresentation）については、「FatiGO」（20）によって統計学的に分析した。
【０１１５】
選択された転写物の発現の値は、定量的リアルタイムPCR（Taqman）によって検証した。RT-PCRによって調べた遺伝子の詳細な一覧は、RT-PCRのために用いたプロトコールを含めて、補遺の項「材料および方法」に提示されている。
【０１１６】
実施例3：DCMに関する遺伝子発現シグネチャーの同定
マイクロアレイについての予測分析（PAM）（21）を分類のために用いた。DCM試料およびNF試料の状態を正しく分類する能力を、Bioconductorパッケージ「MCRestimate」（22）に組み込まれた完全交差検証によって評価した。まず、全試験における試料を、サイズの等しいサブセットに無作為に分けた。以後の各段階では、1つのサブセットを考慮に入れずに、クラシファイア（フィルタリングおよびPAM）を残りの試料（訓練セット）に対して構築した。除外しておいた試料の状態（NFとDCMとの比較）を予測して、臨床的に診断された状態と比較した。PAMパラメーターおよび分散フィルタリング後に残る遺伝子の数の最適化は、各訓練セット内部での第2の交差検証によって達成した。訓練セットの異なる試料組成物に基づく交差検証結果のばらつきを見積もるために、この手順を50回繰り返した。試料は、それがすべての交差検証のうち半数を超えて誤って分類されたならば「誤分類された」と呼んだ。
【０１１７】
実施例4：拡張型心筋症における生物学的過程の共通の変化
差異を伴って発現される遺伝子を同定するために、データセットAおよびBをSAM分析を用いて分析し、それらから以下の結果を得た。
【０１１８】
データセットA：DCMにおいて1353種の転写物がアップレギュレートされ、384種がダウンレギュレートされた。
【０１１９】
データセットB：DCMにおいて399種の転写物がアップレギュレートされ、75種の転写物がダウンレギュレートされた。
【０１２０】
いずれの試験においても、アップレギュレーションの頻度はダウンレギュレーションよりも約4〜5倍多く、このことは心不全における正味の転写活性化を示している。
【０１２１】
全体で、76種の転写物がいずれの試験においても一貫して調節不全の状態にあり、これは単一遺伝子レベルでは両方のマイクロアレイ試験間でおよそ16％の重複に相当した。
【０１２２】
これらの76種の転写物の中には、プロ-脳性ナトリウム利尿ペプチド（NPPB）（23）およびケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2（CCL2）（24）といった心不全の公知のマーカー遺伝子が含まれたが、これまでに心筋症と関連づけられていない多くの遺伝子もあった。
【０１２３】
マイクロアレイ発現値の検証は、定量的リアルタイムPCR（Taqman（登録商標））を用いることによって行った。データセットAにおいて分析した12種の差異を伴って発現される遺伝子のうち11種については、アレイおよび定量的PCRの発現比の間に強い相関が認められた。
【０１２４】
DCMに伴う生物学的過程に関して包括的な見通しを得るために、差異を伴って発現される遺伝子をその各々のGOクラスと関係づけた。それにより、両方の試験でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた転写物を一貫して多く含む、特定の生物学的過程を同定することが可能であった。例えば、両方の試験で、DCMにおけるタンパク質生合成に関与する転写物の顕著なアップレギュレーションが示された。
【０１２５】
この機能的GOクラスが、2つの試験において質的に異なる遺伝子を含むことは興味深い。データセットA（cDNAマイクロアレイ試験）は多くの伸長因子を検出したが、リボソーム転写物はデータセットB（Affymetrix試験）においてより高い頻度で認識された。
【０１２６】
免疫学的遺伝子
DCMにおいてダウンレギュレートされる遺伝子の群において、最も有意な変化を呈したのは、「免疫」および「炎症反応」の生物学的過程であった。これらの機能的遺伝子クラスには、補体系の成分（C1QB、C1QR1、C1R、C3）、ケモカイン（CCL2、CCL11、CCL18）、インターフェロン誘導性遺伝子（IFI27、IFI30、IFITM1、IFITM3、STAT3）、カルグラニュリン（S100A8、S100A9）および白血球抗原（CD14、CD53、CD163）が含まれた。このことは、DCMにおける免疫系の著しい調節不全を示唆する。図1参照。DCMにおける免疫応答遺伝子のダウンレギュレーションに一致して、「ケモカイン活性」の機能的クラスは、GOカテゴリー「分子機能」がレベル6であることによって特定される、最も顕著なダウンレギュレーションを呈した。
【０１２７】
細胞外遺伝子
末期DCMにおける顕著な構造リモデリングに一致して、多くの調節不全性転写物が細胞外マトリックス組成物および代謝回転と関係づけられた。特に、コラーゲン転写物（COL5A1、COL8A1）、および、I型プロコラーゲンと結合してプロコラーゲンC-プロテイナーゼによるその切断を増強するプロコラーゲンCOOH-末端プロテイナーゼエンハンサー2（PCOLCE2）のアップレギュレーションが観察された。さらに、細胞外マトリックスタンパク質2（コラーゲン原線維形成のために重要な低分子ロイシンリッチプロテオグリカン（SLRP）のメンバー）、アスポリンおよびSLRPファミリーのその他の大部分のメンバーも同じくアップレギュレートしていることが見いだされ（デコリン、ルミカン、ビグリカン、フィブロモジュリン、オステオグリシンおよびオステオモジュリン）、細胞外リモデリングにおけるそれらの重要性が強く示された。
【０１２８】
Z-ディスク遺伝子
さらに、カルデスモン1、サルコスパン（sarcospan）、サルコグリカンε、ユートロフィン、スペクトリン、タイチン、ビンキュリン、サルコグリカンDおよびG、α-アクチニン、LIM-ドメイン結合物3、ならびにα-2-キャッピングタンパク質を含む、Z-ディスクの構成要素をコードする遺伝子の顕著なアップレギュレーションも認められた。Z-ディスクはセンサーとして作用して、生体力学的な力とストレス経路の活性化を結びつけると考えられている（25）。
【０１２９】
この意味において、本発明者らは、末期DCMにおけるアドレナリン作動性β-1-受容体のダウンレギュレーションという遺伝子発現分析により、βアドレナリン作動性シグナル伝達の脱感作を立証することができた。
【０１３０】
シグナル伝達の著しい変化は、GOカテゴリー「細胞成分」がレベル6であることによって特定される、GOクラス「原形質膜に内在」のダウンレギュレーションにも反映されていた。重要なシグナル伝達経路の調節不全に関連して、本発明者らは、JAK-STAT経路を介した心不全からの心筋の保護に関与する、オンコスタチンM受容体（OSMR）、抗アポトーシス遺伝子BCL2L1およびシグナル伝達因子STAT3の転写レプレッションを見いだした。
【０１３１】
最終的には、アポトーシス促進性プログラムと抗アポトーシス性プログラムとのバランスにより、筋細胞の重大な損失が起こるか否かが決定される可能性がある。この考え方に一致するように、これらの試験では、抗アポトーシス性転写物（FGF1、DSIPI、CCL2）およびアポトーシス促進性転写物（BCLAF1、FOXO3A）のアップレギュレーションが認められた。
【０１３２】
実施例5：DCMに関する遺伝子発現シグネチャーの同定
本発明の実験の第2の目標は、DCM試料とNF試料を確実に分類しうると考えられる、転写物の特定のセットを同定することであった。それを行うために、分類方法「PAM」を4件の独立したマイクロアレイ試験に対して行った。極めて低い誤分類率が、NF試料とDCM試料との分類に関する2件の試験（データセットAおよびB）およびデータセットDで認められた（図2）。具体的には、データセットBで誤分類されたのは12件の試料のうち1件であった。同様に、データセットAおよびDも同様な結果を示し、それぞれ28件のうち1件および41件のうち3件が誤分類試料であった。対照的に、この分類アルゴリズムはデータセットCでは予測力を示さなかった。プロ-BNAまたはプロ-ANPを含む、確立された心筋症分子マーカーの発現レベルから、NF試料と不全性心室試料との明確な分離が示唆されていたため、このことは予想外であった（図3）。
【０１３３】
データセットBでは、分類のために用いられたプローブセットの数が最小であることが見いだされ、中央値は5種のプローブセットであり、31種の異なるプローブセットを含み、絶対偏差の中央値は2.9であった。このため、27種の遺伝子（表3）をコードする31種のプローブセットのこのセットがDCM試料とNF試料を正しく分類する能力について、残りの3件の試験において評価した：データセットBにおける分類のために用いた31種のプローブセットへと縮小されたデータセットCおよびD。
【０１３４】
次に、PAMを分類用の縮小セットに対してフィルタリングを行わずに用い、完全な分類手順を行うことによって予測力を見積もった。データセットAについては、cDNAマイクロアレイ上の27種の遺伝子のうち17種の存在をまず決定し、続いて上記のように分類を進めた。
【０１３５】
まとめると、4件の独立した試験のすべてを通じて、DCM心臓とNF心臓とを分類するにはこの27種の遺伝子のセットで十分であり、精度は90％を上回ることが見いだされた（図2）。注目すべきことに、この包括的遺伝子セットは、PAM法が最初はうまくいかなかったデータセットCにおいて、DCM試料とNF試料を正確に分類することができた。
【０１３６】
この27種の遺伝子のシグネチャーには、心不全の公知のマーカー遺伝子が含まれた：プロ-BNP、プロ-ANP、コーリン（corin）（プロ-ANPを生物活性のあるANPに変換する）、サルコメア構造タンパク質（MYH6、MYH10）、抗アポトーシス過程（CCL2、PHLDA1、SNCA）、細胞増殖（FRZB、SFRP4、SPOCK、CTGF）および細胞周期制御（GOS2、ETV5、RARRES1）をコードする転写物。注目すべきことに、プロ-BNPのような個々の公知のマーカー遺伝子のみの選択では、108件の心筋試料全体を通じての異種混交的な遺伝子発現のため、DCM症例を分類するのに不十分であった（図3）。
【０１３７】
心不全に関して以前に記載されているいくつかの遺伝子がクラシファイア遺伝子セットの一部であったため、その妥当性は、病因にかかわらず心不全全般について十分に成り立つ可能性があると考えられる。この仮説を、PAM分析により、データセットC（ICM n＝10；NF n＝6）およびD（ICM n＝32；NF n＝14）に含まれるICM試料およびNF試料に関して検討したところ、この遺伝子セットはこれらの試料も90％を超えて正しく分類したことが見いだされた（非提示データ）。
【０１３８】
（表１）
2009544306.tif 000002
【０１３９】
実施例6：マイクロアレイアレイ実験
Unigene 3.1 cDNAマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション：マイクロアレイのスポッティング
この試験のために用いたスライドガラスは、Human UniGene 3.1クローンセット（German Resource Center for Genome Research, Berlin, Germany）から選択された37,530種のcDNAクローンを保有していた。cDNAクローンからのPCR産物をイソプロパノール沈殿によって精製し、70％エタノール中で洗浄して、3×SSC／1.5Mベタイン中に溶解させた。VersArray ChipWriter Pro System（Biorad, Munich, Germany）およびSMP3ピン（Telechem, Sunnyvale, CA, USA）を用いて、DNAをエポキシシラン製スライドガラス（Quantifoil, Jena, Germany）に対してスポッティングした。スポッティングの後に、マイクロアレイを再水和させ、DNAを沸騰水で変性させた後に、0.2％ SDS、水、エタノール、およびイソプロパノールで洗浄した。アレイを大気圧下で乾燥させた。
【０１４０】
RNAの単離および増幅
これらの組織切削物からRNeasy Mini-Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて全細胞RNAを単離し、その後に液体窒素中にて急速凍結させ、Micro-Dismembrator S（Braun Biotech, Melsungen, Germany）を用いてホモジネート化した。全RNAの品質はAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies GmbH, Waldbronn, Germany）を用いて確かめた。試料のすべてから高品質のRNA（28S／18S rRNAおよびE260／E280の比は1.8を上回った）が得られ、以降の実験のために用いることが可能であった。マイクロアレイハイブリダイゼーションのために用いるすべてのRNA試料を一度増幅させた。直線的増幅は、MessageAmp（商標）aRNA Kit（Ambion, Huntingdon, United Kingdom）を製造元の指示に従って用いて行った。増幅RNA（aRNA）の品質は、Agilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies GmbH, Waldbronn, Germany）を用いて確かめた。電気泳動図において、すべてのaRNA試料は50〜6000ヌクレオチドの長さ分布を示し、最大のピークは約900〜1000ヌクレオチドにあった。全RNA試料と比較して、aRNA試料の長さのわずかな短縮が観察された。T7 RNAポリメラーゼに基づく直線的増幅の有用性は以前に示されている。Sultmann et al., "Gene expression in kidney cancer is associated with cytogenetic abnormalities, metastasis formation, and patient survival," Clin Cancer Res. 2005；11:646-655を参照。
【０１４１】
RNAの標識およびハイブリダイゼーション
2μgの増幅aRNAの標識は、1μgのランダムヘキサマープライマーを用いて行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、以前の記載の通りに行った（Schneider et al., "Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments," BMC Genomics, 2004. 30;5:29）を参照。試料aRNAはCy3で標識し、共通の参照aRNA（Stratagene, La Jolla, CA, USA）はCy5で標識した。Cy3およびCy5で標識されたプローブを、Microcon YM-30カラム（Milipore, Bedford, MA, USA）で精製し、合わせた上で、10×デンハルト溶液および2ng／μl Cot1-DNA（Invitrogen）を含む、50μlの1×DIG-Easyハイブリダイゼーション緩衝液（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）中に再懸濁させた。ハイブリダイゼーションはUnigene 3.1マイクロアレイ上で2件ずつ行った。
【０１４２】
画像定量およびデータ解析
ハイブリダイズさせたアレイをGenePix 4000Bマイクロアレイスキャナー（Axon Instruments Inc., Union City, CA, USA）でスキャンして、GenePix Pro 4.1ソフトウエア（Axon Instruments）で解析した。
【０１４３】
AffymetrixオリゴヌクレオチドHG-U133Aマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション
4件の試料に対する第1の実験シリーズにおいて、本発明者らは、HG-U133Aマイクロアレイプラットフォームの技術的再現性を評価するために重複的な反復を行った。反復試験試料の散布図により、対応するプローブセットの優れた相関性が判明した。反復試験対のすべてについてピアソン相関係数を算出した。すべての相関係数が0.99を超える値を達成した。2標本Kolmogorov-Smirnov検定により、反復試験試料の値の分布の等しさが判明した（非提示データ）。対での観察の差の分析によって対称分布（中央値は0.01未満、範囲-1〜+1）が示され、このアレイプラットフォームについて発表されている優れた再現性が確かめられた。この高度の再現性、およびAffymetrix実験が未だに比較的高価なことを考慮して、各ヒト心臓試料に対して、22.283種のプローブセットを提示したHG-U133Aチップ（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）を1つのみ用いた。配列は、GenBank、dbESTおよびRefSeqから得た。配列クラスターは、UniGeneのBuild 133（April 20, 2001）から作製した。Gene Chip Systemに関するそのほかの情報は、www.affymetrix.comで入手可能である。Liu et al., "NetAffx: Affymetrix probesets and annotations," Nucleic Acids Res., 2003;31:82-6を参照。
【０１４４】
mRNA-調製およびAffymetrix HG-U133Aマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション
ホモジネート化した冷凍組織試料から、製造元によって記載されたTRIZOL標準プロトコール（GibcoBRL, Eggenstein, Germany）に従って全RNAを精製し、光度測定によって定量した。150ngの全RNAを、RNA 6000 Nano LabChipキットおよびAgilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）を用いる品質管理のために用いた。
【０１４５】
Superscript二本鎖cDNA合成キット（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）をT7 RNAポリメラーゼプロモーター（GENSET, La Jolla, CA, USA）を含むHPLC精製オリゴ（dT）プライマーとともに製造元のプロトコールに従って用いて、10μgの全RNAから二本鎖cDNAを合成した。ビオチン化cRNAプローブは、ENZO BioArray RNA転写物標識キット（ENZO Diagnostics, Farmingdale, NY, USA）を用いたインビトロ転写によって合成した。10μgのビオチン化cRNAの断片化、ならびにその後のハイブリダイゼーション、洗浄および染色の段階は、Affymetrix社（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）によって与えられた指示に従って行った。
【０１４６】
画像定量およびデータ解析
ハイブリダイズさせたアレイをGeneChip Scanner 2500（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）によってスキャンし、Microarray Suite 5ソフトウエア（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）を用いて前処理した。
【０１４７】
実施例7：TAQMAN（登録商標）PCRによる検証
無作為に選択した6種の遺伝子の発現パターンを、検証済みのTaqManプローブ（Applied Biosystem, Assay on Demands）を用いるリアルタイムRT-PCRによって検証した。GAPDHを、リアルタイムRT-PCR実験における内部対照として利用した。PCR増幅の前に、単離したRNAから、Ambion社（Austin, Texas, USA）のDNA-free-kitを用いて混入性のゲノムDNAを除去した。続いて全RNA含量を分光法によって定量した。インビトロ逆転写のために、200ngの全RNAをランダムヘキサマープライマーとともに70℃で10分間プレインキュベートした。続いて、1μlのRNアーゼ阻害薬（1.5 U／μl；RNAsin；Promega, Heidelberg, Germanyによる）、1μlのdNTP混合物（各デスオキシリボヌクレオチドを10mMの濃度で含む）、2μlの0.1Mジチオスレイトール、4μlの5×反応バッファー（250mM Tris-HCl pH=8.4、375mM KCl、15mM MgCl2；Invitrogen, Karlsruhe, Germanyによる）および1μlのSuperscript II RNアーゼH--逆転写酵素を添加して総容積を20μlとし、続いて42℃で60分間インキュベートした。最後に、酵素を70℃で15分間かけて失活させた。
【０１４８】
遺伝子特異的プライマーおよびプローブは、転写物の3'末端近くの長さ70〜150塩基対の断片を増幅するように、Primer 3ソフトウエア（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて設計した。リアルタイムPCRは、各試料に関して希釈cDNA（1：3）の10μlアリコートを用いて三つ組で行った。TaqManプローブを用いて検討する遺伝子に関しては、Perkin Elmer社の2×Universal PCR Master-Mix（AmpliTaq Gold（商標）DNA-ポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTPを伴うdNTP、受動的参照色素、およびMgCl2を含む最適化された緩衝液を含む）、900nMプライマーおよび200nMプローブを用いた。
【０１４９】
cDNAのPCR増幅は、SureStart Taqポリメラーゼの95℃での10分間の「高温開始（hot start）」活性化で開始し、その後に、95℃での15秒間の変性、58℃での60秒間のアニーリング、および72℃での10秒間の伸長の40サイクルを行った。分散係数が10％を上回った試料に関するすべての実験結果は再び検討した。遺伝子発現の差を評価するには、Plafflによって開発されたREST-プログラムに基づく相対定量法（ΔΔCt）を用いた。Pfaffl et al., "Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR," Nucleic Acids Res., 2002;30(9):e36を参照。
【０１５０】
12種の候補遺伝子に関するTaqmanでの検証。GAPDHをハウスキーピング遺伝子として利用した。マイクロアレイ分析に関しては「マイクロアレイ有意性分析」（SAM）に基づくq値が与えられるが、TaqmanデータはStudentのt検定によって分析した。Taqmanデータに関しては、Ct値の最小値、最大値および中央値を示している。TaqmanアッセイはデータセットAのみからの心筋試料を用いて行った。
【０１５１】
（表２）
2009544306.tif 000003
【０１５２】
キー：
2009544306.tif 000004
【０１５３】
以下は、データセットAおよびBからのDCM心臓のすべてにおいていずれも発現レベルがアップレギュレートされていた遺伝子からの76種の転写物の一覧である：アンキリンリピートおよびBTBドメイン含有物2（ankyrin repeat and BTB domain containing 2）、アクチン、α2、平滑筋、大動脈、老化細胞においてアップレギュレートされるATPアーゼファミリー相同体（ATPase family homolog up-regulated in senescence cells）、Aキナーゼアンカータンパク質13、アダプター関連タンパク質複合体3、μ2サブユニット、ADP-リボシル化因子4、アスポリン、ATPアーゼ、クラスVI、11B型、アタキシン10、BMPおよびアクチビン膜結合性阻害因子相同体（アフリカツメガエル）、BCL2関連転写因子1、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン含有、クラスB、3、染色体16オープンリーディングフレーム45、カルデスモン1、CDC14細胞分裂周期14相同体B（S.セレビシエ）、糖質（N-アセチルグルコサミン6-O）スルホトランスフェラーゼ5、コラーゲン、V型、α1、コラーゲン、VIII型、α1、コートマータンパク質複合体、サブユニットζ2、Sp1転写活性化のために必要な補因子、サブユニット6、77kDa、結合組織増殖因子、ディスク、大型総合体1（ショウジョウバエ）、ダイニン、細胞質性、軽鎖ポリペプチド1、細胞質分裂貢献因子9（dedicator of cytokinesis 9）、デルタ睡眠誘導ペプチド、イムノレアクター（immunoreactor）、細胞外マトリックスタンパク質2、雌性器官および脂肪細胞特異的、外骨腫症（多発性）1、線維芽細胞増殖因子1（酸性）、仮想的タンパク質FLJ22662、forkheadボックスO3A、高速移動群ヌクレオソーム結合ドメイン2、熱ショック90kDaタンパク質1、β、イソロイシン-tRNAシンテターゼ、インスリン受容体、インテグリン、β5、ラミニン、β1、潜在性トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質1、潜在性トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質2、微小管関連タンパク質1B、微小管関連タンパク質4、メタロチオネイン1E（機能性）、ミオシン、重鎖ポリペプチド10、非筋肉性、ヌクレオソーム集合タンパク質1様3、核因子I／B、ナトリウム利尿ペプチド前駆体B、NAD(P)H:キノンオキシドレダクターゼ3型、ポリペプチドA2、オルニチンデカルボキシラーゼ1、ポリ(A)結合タンパク質、細胞質1、プロピオニル補酵素Aカルボキシラーゼ、βポリペプチド、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼエンハンサー2、ホスホイノシチド-3キナーゼ、触媒性、αポリペプチド、プロリンシンテターゼ同時転写相同体（細菌）、プロテアーゼ、セリン、11（IGF結合性）、プロテインチロシンホスファターゼ、非受容体型基質1、RAB28、RAS癌遺伝子ファミリーメンバー、RNA結合モチーフタンパク質15、Rho関連BTBドメイン含有物1、リボソームタンパク質L22、リボソームタンパク質L4、sin3関連ポリペプチド、18kDa、SEC31様1（S.セレビシエ）、セプチン2、サルコグリカン、ε、溶質担体ファミリー25（ミトコンドリア担体）、メンバー5、溶質担体ファミリー30（亜鉛輸送体）、メンバー1、sparc／オステオネクチン、cwcvおよびkazal様ドメインプロテオグリカン（テスチカン）、sprouty関連、EVH1ドメイン含有物2、sprouty相同体1、FGFシグナル伝達のアンタゴニスト（ショウジョウバエ）、サルコスパン、t-複合体関連-精巣発現物1様1（t-complex-associated-testis-expressed 1-like 1）、膜貫通性タンパク質43、チオレドキシンドメイン含有物7���およびエクスポーチン1（CRM1相同体、酵母）。
【０１５４】
3種の転写物が両方のデータセットからダウンレギュレートされた：トロンボスポンジ1型モチーフ、9を伴うディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（レプロライシン型）（disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 9）；ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2；およびオンコスタチンM受容体。
【０１５５】
（表３）DCMにおけるクラシファイア遺伝子セット
DCM試料とNF試料とを分類する27種の転写物（データセットBからPAM分類により生成され、アルファベット順に列記されている）。データセットBのDCM試料およびNF試料に関する発現値に加えて、PAM-パラメーターに基づくデータセットA〜Dの分類に関する個別の遺伝子のランキングも示されている。転写物が2種のプローブセットに提示されている場合には、両方のランキングを示している。データセットAにおいて線を付して示した遺伝子は、cDNAアレイのデータセット中に存在しなかった。
2009544306.tif 000005
【０１５６】
本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の方法および組成物にさまざまな修正および変更を行えることは当業者には明らかであろう。したがって、添付する特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲に含まれる限り、本発明の修正物および変形物も本発明は範囲に含むものとする。
【０１５７】
参考文献
2009544306.tif 000006
2009544306.tif 000007
2009544306.tif 000008
2009544306.tif 000009
【図１】
2009544306.tif 000011
【図２】
2009544306.tif 000012
【図３】
2009544306.tif 000013
【配列表】
2009544306000001.app
【国際調査報告】
2009544306.tif 000014
2009544306.tif 000015
2009544306.tif 000016
2009544306.tif 000017
2009544306.tif 000018
2009544306.tif 000019