(57)【要約】本発明は、治療剤に対する細胞感受性を決定する方法を提供する。この方法は、細胞、またはその細胞成分（例えば、ミトコンドリア）を、ＢＨ３ドメインペプチドと接触させ、アポトーシスを検出することを含む。アポトーシスの存在は、該細胞が、その治療剤に対して感受性を有することを示す。それとは別に、治療剤に対する細胞の感受性は、癌細胞のＢＨ３プロフィールを提供し、コントロールプロフィールとこのＢＨ３プロフィールを比較することによって判定される。コントロールプロフィールと比べた場合の、癌細胞のＢＨ３プロフィールの類似性は、治療剤に対する感受性を有することを示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療剤に対する癌細胞の感受性を予測する方法であって、該細胞、またはその細胞成分を、ＢＨ３ドメインペプチドと接触させること、および、該細胞のアポトーシスを検出することを含み、アポトーシスの存在は、該細胞が、治療剤に対して感受性を有することを示す、方法。
【請求項２】
治療剤に対する癌細胞の感受性を予測する方法であって、該細胞から得られたミトコンドリアを、ＢＨ３ドメインペプチド、またはその模倣物と接触させること、および、該ミトコンドリアからシトクロムｃの放出を検出することを含み、該シトクロムｃの放出は、該細胞が、治療剤に対して感受性を有することを示す、方法。
【請求項３】
対象に対して治療的である薬剤を選択する方法であって：
ａ）該対象から、癌細胞、またはその細胞成分を提供すること；
ｂ）該癌細胞を、ＢＨ３ドメインペプチド、またはその模倣物と接触させること；
ｂ）該ＢＨ３ドメインペプチド、またはその模倣物が、該癌細胞においてアポトーシスを誘発するか否かを判定し、試験ＢＨ３プロフィールを作成すること；および、
ｃ）該試験ＢＨ３プロフィールを、治療剤ＢＨ３プロフィールと比較すること、を含み、
該治療剤ＢＨ３プロフィールと比べた場合の、該試験ＢＨ３プロフィールの類似性が、該薬剤が、該対象に対し治療的であることを示す、方法。
【請求項４】
治療剤に対する癌細胞の感受性を予測する方法であって、該癌細胞のＢＨ３プロフィールを提供すること、および、該ＢＨ３プロフィールをコントロールプロフィールと比較することを含み、該コントロールプロフィールと比べた場合の、該癌細胞の該ＢＨ３プロフィールの類似性は、該癌細胞が、該治療剤に対して感受性を有することを示す、方法。
【請求項５】
前記細胞が、前記ＢＨ３ドメインペプチド、またはその模倣物に接触する前に、浸透化される、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
前記浸透化細胞を、電位差測定用染料に接触させることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記電位差測定用染料が、ＪＣ−１またはジヒドロローダミン１２３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アポトーシスが、前記電位差測定用染料の発光変化を検出することによって測定されるによって測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインから得られる、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１−１４および１５からなる群より選択される、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療剤が、化学療法剤、ＢＨ３ドメイン模倣物、または、アンチ・アポトーシスタンパクの拮抗剤である、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
癌を有する一つ以上の対象から取得された、配列番号１−１２および１３からなる群より選択されるＢＨ３ペプチドに対するミトコンドリア感受性パターンを含むプロフィール。
【請求項１３】
浸透化標識細胞、および、ＢＨ３ペプチドまたはその模倣物を含む細胞系アッセイシステム。
【請求項１４】
前記標識が、電位差測定用染料を含む、請求項１３に記載のアッセイシステム。
【請求項１５】
前記電位差測定用染料が、ＪＣ−１またはジヒドロローダミン１２３である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、一組のＢＨ３ドメインペプチドに対する細胞の感受性パターンを決定することによって、細胞の化学感受性を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスと呼ばれるプログラム細胞死は、全ての多細胞生物における組織ホメオスターシスの発達および維持に不可欠の役割を果たしている（非特許文献１）。線虫からヒトに至る、遺伝学的、分子的分析から、細胞自殺のアポトーシス経路は、高度に保存されることが示された（非特許文献２）。アポトーシスは、正常な発達および維持に不可欠であるばかりでなく、ウィルス感染に対する防衛、および癌発生の予防にも重要である。
【０００３】
複数の細胞内局所から発せられる、種々の内在性細胞死シグナルは、全て、ミトコンドリアからシトクロムｃの放出を誘発し、Ａｐａｆ−１を活性化し、エフェクターカスパーゼ活性をもたらす。ＢＣＬ−２ファミリーのタンパクは、ミトコンドリアにおけるプログラム細胞死施行の主要調節因子であるばかりでなく、細胞死シグナルの実行因子でもある。このファミリーのメンバーは、プロおよびアンチ・アポトーシスタンパクを含むが、これらは、ＢＣＬ−２ホモロジー（ＢＨ）１−４ドメインと呼ばれる、最大４個の保存領域において相同性を共有する（Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｙ，１９９８）。このファミリーは、主に三つのサブクラスに分割することが可能である。ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬを含む、アンチ・アポトーシスタンパクは皆、四つ全てのＢＨドメインにおいて相同性を共有する「マルチドメイン体」である。一方、プロ・アポトーシスタンパクはさらに分割することが可能であり、ＢＡＸおよびＢＡＫなどのマルチドメインタンパクを含み、これらは、ＢＨ１−３ドメインにおいて配列相同性を有する。比較的関連の薄い「ＢＨ３単独」タンパクは、これまでのところ全てアポトーシス刺激性（プロ・アポトーシス）であり、そのアポトーシス機能に必要とされる、両親媒性のα−螺旋ＢＨ３領域内において配列相同性を共有する（Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎら、１９９５；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒら、１９９８；Ｗａｎｇら、１９９６；Ｚｈａら、１９９７）。
【０００４】
ＢＡＸおよびＢＡＫなどのマルチドメインプロ・アポトーシスタンパクは、細胞死シグナルを受容すると、ミトコンドリアの機能障害の実行に参加する。生細胞では、これらのタンパクはモノマーとして存在する。しかしながら、種々の細胞死刺激に反応すると、細胞質ゾルに局在するか、または膜にゆるく付着する不活性ＢＡＸは、ホモ・オリゴマー化マルチマーとして、ミトコンドリアの外膜の中に深く浸透する（Ｅｓｋｅｓら、２０００；Ｇｒｏｓｓら、１９９８；Ｗｏｌｔｅｒら、１９９７）。不活性ＢＡＫはミトコンドリアに滞在し、ここでも、細胞死シグナルに反応してホモ・オリゴマー化を含む立体配座変化を受ける（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９９；Ｗｅｉら、２０００）。ＢＡＸおよびＢＡＫの両方を欠く細胞は、細胞内の複数部位から発せられる、種々の細胞死シグナルに対して耐性を有する（Ｗｅｉら、２００１）。
【０００５】
ＢＨ３単独分子は、このファミリーの第３サブセットを構成し、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＩＫ、ＢＩＭ、およびＢＡＤを含む（Ｋｅｌｅｋａｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９８）。これらのタンパクは、両親媒性α−螺旋ＢＨ３領域においてのみ配列相同性を共有し、この領域は、突然変異分析から、プロ・アポトーシスメンバーとして細胞死活性のために必要であることが示されている。さらに、ＢＨ−３単独タンパクは、このドメインが、「マルチドメイン」のＢＣＬ−２ファミリーのメンバーに対する結合を示すことを要求する。複数結合アッセイ、例えば、酵母２ハイブリッド、界面活性剤可溶化細胞溶解物の共時免疫沈降、およびインビトロプルダウン実験を含むアッセイによって、個々のＢＨ３単独分子は、マルチドメインＢＣＬ−２メンバーに対しある種の選択性を示すことが明らかにされている（Ｂｏｙｄら、１９９５；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒら、１９９８；Ｏｄａら、２０００；Ｗａｎｇら、１９９６；Ｙａｎｇら、１９９５）。ＢＩＤタンパクは、プロ・アポトーシス性ＢＡＸおよびＢＡＫに結合するばかりでなく、アンチ・アポトーシス性ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬに対しても結合する（Ｂｏｙｄら、１９９５；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒら、１９９８；Ｏｄａら、２０００；Ｙａｎｇら、１９９５）。
【非特許文献１】Ｒａｆｆ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６：３９７−４００
【非特許文献２】Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：１１０７−１１１４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
種々の局面において、本発明は、治療剤に対する細胞の感受性を予測する方法であって、該細胞、またはその細胞成分（例えば、ミトコンドリア）を、ＢＨ３ドメインペプチドと接触させ、アポトーシスを検出することによる方法を提供する。アポトーシスの存在は、該細胞が、その治療剤に対して感受性を有することを示す。それとは別に、治療剤に対する細胞の感受性は、癌細胞のＢＨ３プロフィールを提供し、コントロールプロフィールとこのＢＨ３プロフィールを比較することによって判定される。コントロールプロフィールと比べた場合の、癌細胞のＢＨ３プロフィールの類似性は、治療剤に対する感受性を有することを示す。
【０００７】
さらに提供されるものは、対象に対して治療的である薬剤を選択する方法であって、癌細胞、またはその細胞成分を提供すること、該細胞または細胞成分を、ＢＨ３ドメインペプチド、またはその模倣物と接触させること、および、該ＢＨ３ドメインペプチド、またはその模倣物が、前記癌細胞、またはその細胞成分においてアポトーシスを誘発するか否かを判定し、試験ＢＨ３プロフィールを作成することによる方法である。この試験ＢＨ３プロフィールは、治療剤のＢＨ３プロフィールと比較される。治療剤ＢＨ３プロフィールと比較される試験ＢＨ３プロフィールの類似性は、該治療剤が、該対象に対し治療的であることを示す。
【０００８】
アポトーシスは、例えば、ミトコンドリアからのシトクロムＣの放出を検出することによって検出される。治療剤は、化学療法剤、ＢＨ３ドメイン模倣物、または、アンチ・アポトーシスタンパクの拮抗剤である。ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインから得られる。例示のＢＨ３ドメインペプチドとして、配列番号１−１４および１５が挙げられる。このＢＨ３ドメインは、アポトーシスの活性化因子または感作物質である。ＢＨ３ドメインペプチドは、感作物質であることが好ましい。
【０００９】
癌を有する一つ以上の対象から得られたＢＨ３ペプチドに対するミトコンドリア感受性パターンを含むプロフィールも、本発明によって提供される。
【００１０】
別様に定義しない限り、本明細書で用いる技術および科学用語は、全て、本発明の所属する従来技術において当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に記載されるものと近似するか、または等価の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することが可能であるが、適切な方法および材料が下記に記載される。本明細書に言及される、公刊物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全て、引用によりその全体が本明細書に含まれる。不一致の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみであって、限定的であることを意図しない。本発明の他の特質および利点は、下記の詳細な説明および特許請求の範囲から明白であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部は、プログラム細胞死に関する第３の細胞状態の発見に基づく。この状態は、従来から、「死への準備（ｐｒｉｍｅｄ  ｆｏｒ  ｄｅａｔｈ）」と名づけられている。この発見までは、プログラム細胞死に関しては二つの状態しか特定されていなかった。死の準備をする細胞は、生存のために持続性の、アンチ・アポトーシス機能を必要とする。
【００１２】
個々のＢＣＬ−２ファミリーメンバー、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、およびＢＶＬ−１に選択的に拮抗する、ＢＨ３単独タンパクのＢＨ３ドメインから得られる、一組のペプチドを用いると、個々のアンチ・アポトーシスタンパクに対する細胞の「嗜好」が、これらのペプチドに対するミトコンドリアの反応に基づいて診断することが可能であることが示された。この一組のペプチドを表１に示すが、これらを、本明細書ではＢＨ３ドメインペプチドと呼ぶ。アンチ・アポトーシスタンパクＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＦＬ−１、およびＢＣＬ−ｗは、それぞれ、この一組のタンパクと独自の相互作用パターンを持つ。細胞は、生存のために、アンチ・アポトーシスタンパクに依存するが、その依存性は、このペプチド組に対するミトコンドリアの感受性パターンに基づいて解読される。この戦略をＢＨ３プロファイリングと呼ぶ
【００１３】
【表１】
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本発明の一組の感作物質ＢＨ３ペプチド、すなわち、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーの選択的拮抗因子を用いて細胞状態を判断するために、ミトコンドリアを探査した。死への準備を整えたミトコンドリアは、ＭＯＭＰを阻止するためにアンチアポトーシスタンパク機能に依存し、そのため、ミトコンドリアは、感作物質ＢＨ３ペプチドに暴露されると、シトクロムｃを放出する（図１、図４Ａ、図５Ｃ、および図６Ｂ参照）。一方、死への準備をしていない細胞は、感作物質ＢＨ３ペプチドに暴露されてもシトクロムｃを放出しない。したがって、ミトコンドリアを単離することが可能であれば、いずれの細胞であれ、それを試験し、準備細胞または未準備細胞として分類することが可能である。ミトコンドリアの直接試験は、生細胞に対する、ペプチド、タンパク、または発現ベクターによるトランスフェクションによって引き起こされることが予想される、転写、翻訳、または翻訳後修飾事象による寄与が仮にあったとしても、それら全てが除去されるという利点を有する。ある任意の時点におけるアポトーシス状態の「スナップショット」が、既存のアポトーシス機序をほとんど全く撹乱せずに撮影される。以上まとめると、本発明の方法は、細胞生理学の基本的局面に関する情報の捕捉を可能とする。
【００１４】
重要なことに、いくつかのモデルにおいて、ミトコンドリアの振る舞いは、全細胞の振る舞いと相関した。細胞が生理的変化に耐えている間、ミトコンドリアは準備を整えるが、ＢＨ３プロファイリングが、アンチ・アポトーシスタンパクに対する依存性を明らかにするのは、細胞依存性も証明された時だけであった。下記の実施例に示すように、ＦＬ５．１２細胞およびミトコンドリアは、ＩＬ−３が撤去されて始めて細胞死への準備を整えた。２Ｂ４細胞について言えば、細胞およびミトコンドリアは、デキサメタゾン処理後始めて死への準備を整えた。ＢＣＬ−２依存性一次白血病細胞の場合、さらに外部からの介入を要することなく、癌表現型に内在的な、ゲノム不安定、ｍｙｃ癌遺伝子の活性化、およびチェックポイント違反が、ミトコンドリア準備態勢を誘起するのに十分であった。ＳＣＬＣ細胞系統、Ｈ１６４およびＨ１６９３は、ＢＨ３プロファイリングに対し、ＢＣＬ−２感受性パターンを示したが、ＢＣＬ−２拮抗剤ＡＢＴ−７３７に対しても同様に感受性を示す。いずれの場合においても、ミトコンドリア試験によって、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーに対する細胞依存性が適正に診断された。さらに、個々のファミリーメンバーの名前を、我々のペプチド組に対するミトコンドリアの感受性パターンに基づいて解読することが可能となった。これらの結果から、ある細胞、例えば、ＩＬ−３充満ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞では、ＢＣＬ−２の過剰発現は、余分なアンチ・アポトーシス備蓄を供給することが示された。別の細胞、例えば、げっ歯類白血病細胞では、高レベルのＢＣＬ−２が存在するが、このＢＣＬ−２は、活性化因子ＢＨ３タンパクによって大部分占拠されるために、細胞は、アンチ・アポトーシス備蓄をほとんど持たず、実際には細胞死への準備が整えられる。
【００１５】
必ずしも全ての細胞が、アンチ・アポトーシスタンパクの拮抗作用に対して感受性を持つわけではない。感受性細胞は、ＢＣＬ−２ファミリーの、ある選択された一組のプロ・アポトーシスタンパクによって運ばれる細胞死シグナルを通じて「死への準備を整える」。ある癌細胞は、持続的に死の準備態勢にあり、感作物質ＢＨ３単独ドメインを刺激するか、または該ドメインを模倣する介在因子に対して選択的に感受性を持つ。従来、アポトーシスの抑制が、癌発生の要件であることが仮定されている（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｎ，２００２；Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００）。あたかもこの要件を満たす試みであるかのように、多くの種類の癌細胞が、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーを過剰発現する。したがって、これらのタンパクがどのように機能するかを理解することは、癌細胞がどのようにして生存を維持するかを理解するための鍵となる。本発明の方法は、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーが、ミトコンドリア外膜の高浸透化（ＭＯＭＰ）およびアポトーシスへの傾斜を調節するために、どのようにＢＨ３単独メンバーと相互作用を持つかという問題に対する系統的調査を可能とする。アンチ・アポトーシスタンパクは、ＢＨ３単独タンパク由来のＢＨ３ペプチドに対し選択的結合親和性を示す。さらに、アンチ・アポトーシスファミリーメンバーの拮抗作用は、該アンチ・アポトーシスタンパクが、活性化因子ＢＨ３タンパクによって「準備された」時にのみ、ＭＯＭＰをもたらす。これは、活性化ＢＡＸ／ＢＡＫにおける活性因子ＢＨ３ドメインの決定的役割を確かなものとする。細胞培養モデルでは、活性化因子の「準備起動」は、実験的に誘発された細胞死シグナル伝達を追跡すること、および、このような準備起動によって、アンチ・アポトーシスファミリーメンバーに依存性が付与されることから、観察することが可能である。注目すべきことに、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーに対する依存性は、感作物質ＢＨ３ドメインに対するミトコンドリア感受性パターンによって機能的に捕捉することが可能である。したがって、本発明は、治療剤に対する細胞の感受性を定量する方法であって、ＢＨ３ドメインペプチドに対するミトコンドリアの感受性パターンを決定することによって、該細胞が細胞死に対し準備を整えているかどうかを特定することによる方法を提供する。
【００１６】
ＢＨ３プロファイリング
種々の方法において、薬剤に対する細胞の感受性が定量される。細胞の感受性は、細胞、または細胞成分（例えば、ミトコンドリア）を、ＢＨ３ドメインペプチドと接触させることによって定量される。細胞は、アポトーシスが検出されると、薬剤に対し感受性を持つ。それとは別に、細胞の感受性は、細胞の試験ＢＨ３プロフィールを提供し、該プロフィールを、癌細胞のＢＨ３プロフィールと比較することによって定量される。試験プロフィールとコントロールプロフィールの類似性は、該細胞が薬剤に対して感受性を持つことを示す。ＢＨ３プロフィールとは、ＢＨ３ペプチドに対する、細胞の感受性パターンである。感受性は、アポトーシスによって示される。癌細胞のＢＨ３プロフィールは、ある特定の薬剤に対するその反応度、または反応欠如が既知である、癌細胞におけるＢＨ３ペプチドに対する感受性パターンである。試験ＢＨ３プロフィールは、任意に、一つを超える癌細胞のＢＨ３プロフィールと比較される。このように、試験ＢＨ３プロフィールをコントロールＢＨ３プロフィールと比較することによって、薬剤に対する感受性が定量される。
【００１７】
細胞または細胞成分は、癌細胞、または、癌が疑われる細胞である。細胞は、ＢＨ３ペプチドのミトコンドリアに対する接触を可能とするため、高浸透化される。例えば、細胞は、該細胞をジギトニンに接触させることによって高浸透化される。細胞が高浸透化された後、該細胞は、電位差測定用染料（potentiometric dye）によって処理される。電位差測定用染料の例としては、緑色蛍光ＪＣ−１プローブ（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンジミダゾリルカルボシアニンヨウ化物）、またはジヒドロローダミン１２３が挙げられる。
【００１８】
ＪＣ−１は、膜電位に比例してミトコンドリアに進入する、親油性、陽イオン染料である。ＪＣ−１は、低い膜電位（Ｍ）における水中ではモノマーとして存在する。しかしながら、比較的高い電位では、ＪＣ−１は、赤色蛍光の、「Ｊ−凝集体」を形成する。モノマー時、該染料は、５２７ｎｍの、吸光／発光最大値を有するが、一方、高い膜電位では、発光最大値は５９０ｎｍである。したがって、このシアニン染料の発光測定値比を、ミトコンドリア膜電位の感受性尺度として使用することが可能である。この染料は、染料濃度の二重測定を可能とし、しかも、染料濃度は、核または細胞質の参照値の測定を必要としない。単離ミトコンドリア使用の実験によって、ＪＣ−１モノマー体からの５２７ｎｍ発光は、４６から１８２ｍＶ範囲の膜Ｍ電位と共にほぼ直線的に増加するが、一方、５９０ｎｍのＪ−凝集体の発光は、１４０ｍＶよりも陰性度の低いＭ値では、感受性が比較的低いが、１４０から１８２ｍＶの範囲では電位値に対し高度の感受性を有することが示された（Ｄｉ  Ｌｉｓａら、１９９５）。蛍光およびテトラメチルローダミンのために設計された光学フィルターを用いて、モノマー形、およびＪ−凝集形をそれぞれ別々に可視化することが可能である。それとは別に、標準型蛍光長帯域光学フィルターセットを用いて、両形を同時に観察することも可能である。
【００１９】
ジヒドロローダミン１２３は、非荷電、非蛍光剤であるが、酸化によって、蛍光性レーザー染料ローダミン１２３（Ｒ１２３）に転換される。
【００２０】
細胞は、癌を有することが知られるか、または疑われる対象から得られる。この対象は、哺乳動物であることが好ましい。この哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。この対象は、以前に癌を有すると診断され、恐らく既に癌の治療を受けている。それとは別に、対象は、以前に癌を有すると診断されていない。
【００２１】
薬剤は、化学療法剤などの治療剤である。例えば、薬剤は、感作物質ＢＨ３ドメインの模倣物、または、アンチ・アポトーシスタンパクの拮抗剤である。アポトーシス、すなわち、細胞死は、既知の方法によって特定される。例えば、アポトーシスの特徴として、細胞の縮小、表面における泡状の小気泡の発生、分解した核におけるクロマチン（ＤＮＡおよびタンパク）の存在、および、シトクロムｃの放出と共に起こるミトコンドリアの分解、ミトコンドリア膜電位の消失、正常時原形質膜の内部に隠されていた、小さな、膜に包まれた断片、すなわちフォスファチジルセリンの、分解による細胞表面への露出が挙げられる。
【００２２】
ＢＨ３ペプチドに接触されたことがない細胞と比較した場合の、ＢＨ３ペプチドに接触させた細胞のアポトーシスレベルの差は、統計的に有意である。統計的に有意とは、その変化は、偶然のみによって起こると予想される頻度よりも大きいことを意味する。統計的有意性は、従来技術で既知の方法によって決められる。例えば、統計的有意性は、ｐ−値によって決められる。ｐ−値とは、実験時における群間の差が偶然によって起こる確率を表す尺度である。（Ｐ（ｚ≧ｚ観察）。例えば、０．０１のｐ−値は、その結果が偶然によって起こるのは、１００回の機会に１回であることを意味する。このｐ−値が低ければ低いほど、群間の差は、処理によって引き起こされることがより確からしくなる。このｐ−値が０．０５以下である場合、変化は統計的に有意である。ｐ−値は、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１以下であることが好ましい。
【００２３】
本発明はさらに、癌を有する一つ以上の対象から取得されたＢＨ３感作物質ペプチドに対するミトコンドリア感受性パターンのプロフィールを含む。
【００２４】
ＢＨ３ドメインペプチド
ＢＨ３ドメインペプチドは、長さが１９５アミノ酸未満、例えば、長さが、１５０、１００、７５、５０、３５、２５、または１５アミノ酸以下である。例えば、ＢＨ３ペプチドは、表１に示す配列番号１−１３の配列を含む。
【００２５】
ＢＨ３ドメインは、配列ＮＨ２−ＸＸＸＸＸＸＩＡＸＸＬＸＸＸＧＤＸＸＸＸ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）、またはＮＨ２−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＬＸＸＸＸＤＸＸＸＸ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）を含む（全体、または一部）ペプチドを含む。本明細書で用いるＸは、任意のアミノ酸であってよい。それとは別に、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１４または１５の、少なくとも５、６、７、８、９、１５以上のアミノ酸を含む。
【００２６】
ＢＨ３ドメインペプチドは、シグナル伝達ドメインに任意に付着される。伝達ドメイン化合物は、それの存在するペプチドを、所望の細胞内目的地へ向かうように指令する。したがって、伝達ドメインは、該ペプチドを、原形質膜を横切って、例えば、細胞外から、原形質膜を通り、原形質の中に方向づけることが可能である。それとは別に、またはそれに加えてさらに、伝達ドメインは、ペプチドを、細胞内の所望の部位に、例えば、核、リボソーム、ＥＲ、ミトコンドリア、リソソーム、またはペルオキシソームに向けることも可能である。
【００２７】
ある実施態様では、伝達ドメインは、既知の膜転位配列から得られる。それとは別に、伝達ドメインは、膜摂取を促進することが知られる化合物、例えば、ポリエチレングリコール、コレステロール成分、オクタン酸、およびデカン酸である。
【００２８】
例えば、この輸送ペプチドは、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）１ＴＡＴタンパク由来の配列を含んでもよい。このタンパクは、米国特許第５，８０４，６０４および５，６７４，９８０号に記載される。それぞれ引用により本明細書に含める。ＢＨ３ドメインペプチドは、ＴＡＴタンパクを構成する、全８６アミノ酸の内のいくつか、または全てに対して連結される。例えば、８６よりも少数のアミノ酸を有するが、細胞への摂取を示す、ＴＡＴタンパクの、機能的に有効な断片または部分は、使用することが可能である。例えば、Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（２５）：１６０１０−１７（１９９７）を参照されたい。なお、引用によりこの全体を本明細書に含める。さらに、細胞への進入および摂取を仲介する領域を含むＴＡＴペプチドも、既知の技術を用いて定めることが可能である。例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：７３９７−７４０１（１９８９）を参照されたい。転位配列の他の供給源としては、例えば、ＶＰ２２（国際公開第９７／０５２６５号；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３−２３３（１９９７））、ショウジョウバエアンテナペディア（Ａｎｔｐ）ホメオティック転写因子、ポリ−アルギニン、ポリリシン、または非ウィルス性タンパクが挙げられる（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０６９１−１０６９５（１９９２））。
【００２９】
伝達ドメインは、ＢＨ３ドメインペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに連結されてよい。完全融合ペプチドを創出するために、伝達ドメインとＢＨ３ドメインの間に、２プロリン残基のヒンジを加えてもよい。伝達ドメインは、細胞または細胞成分への進入時に、該伝達ドメインがＢＨ３ドメインペプチドから放出されるようなやり方で、ＢＨ３ドメインに対して任意に連結される。
【００３０】
伝達ドメインは、転位タンパク中に存在する、単一（すなわち、連続的）アミノ酸配列であることが可能である。それとは別に、伝達ドメインは、タンパク中に存在はするが、天然のタンパクでは、他のアミノ酸配列によって隔てられる、二つ以上のアミノ酸配列であることが可能である。
【００３１】
天然の転位タンパクのアミノ酸配列は、例えば、該天然タンパク中に存在する少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換によって修飾し、修飾タンパクを生成することが可能である。安定性を増大または減少させた修飾転位タンパクは、既知の技術を用いて生産することが可能である。ある実施態様では、転位タンパクまたはペプチドは、天然のタンパク、またはその部分のものと、同一ではないが、実質的には同じアミノ酸配列を含む。さらに、膜可溶性を増大させた修飾タンパクを生産するために、コレステロールまたはその脂質誘導体を、転位タンパクに加えることが可能である。
【００３２】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび伝達ドメインは、適切であれば、従来技術における任意の方法による化学結合によって連結することが可能である。多くの、既知の化学的架橋結合法は、非特異的である、すなわち、それらの方法は、結合点を、輸送ポリペプチドまたは荷役高分子の特定部位に指定することをしない。そのため、非特異的架橋結合剤の使用は、機能的部位を攻撃したり、または、活性部位を立体配置的に阻害して、接合体タンパクを生物学的に不活性にする場合がある。
【００３３】
結合特異性を上げる一つの方法は、架橋結合されるポリペプチドの一方、または両方に、たった一箇所、または数箇所見出される官能基に対し直接化学結合することである。例えば、多くのタンパクでは、チオール基を含む唯一のアミノ酸であるシテインは、数箇所しか現れない。さらに、例えば、ポリペプチドがリシン残基を含まない場合、一次アミンに対して特異的な架橋試薬は、そのポリペプチドのアミノ末端に対して選択的となる。結合特異性を増すための上記方法を上手く利用するには、該ポリペプチドが、該分子の生物活性を失わずに、変えることが可能な分子の区域に、適当に稀で、かつ反応性を有する残基を持つことが必要となる。
【００３４】
システイン残基は、それらが架橋反応に参加した場合、その反応以外の点で生物活性に干渉する可能性が高いと思われる、ポリペプチド配列の複数部分に出現する場合、置換してもよい。システイン残基を置換した場合、ポリペプチドのフォールド形成に生じる変化を最小化することが通常望ましい。ポリペプチドのフォールド形成変化は、置換基が、システインに対し化学的にも、立体配置的にも近似する場合に最小化される。これらの理由のため、システインに対する置換基としてセリンが好まれる。下記の実施例において実証されるように、システイン残基を、架橋結合目的のために、ポリペプチドのアミノ酸配列の中に導入してもよい。システイン残基を導入する場合、アミノ末端またはカルボキシ末端、またはその近傍における導入が好ましい。このようなアミノ酸配列修飾のためには、対象ポリペプチドが、化学的合成によって生産されたものであろうと、または、組み換えＤＮＡの発現によるものであろうと、従来法の利用が可能である。
【００３５】
二つの構成成分の結合は、結合または接合剤を介して実現することが可能である。利用が可能な、分子間架橋試薬はいくつかある。例えば、Ｍｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，１９７４，ｐｐ．３９−４３を参照されたい。これらの試薬の中でも、特に、例えば、Ｊ−スクシニミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（いずれも、スルフヒドリル基に対して高度の特異性を有し、不可逆結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）、または、６から１１個の炭素メチレン架橋を有する、他の同様の試薬（スルフヒドリル基に対し比較的高い特異性を有する）；および、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノおよびチロシン基と不可逆結合を形成する）が挙げられる。この目的のために有用な、その他の架橋試薬としては：ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルフォン（アミノおよびフェノール基と共に不可逆結合を形成する；ジメチルアジプイミデート（アミノ基に対して特異的である）；フェノール−１，４−ジスルフォニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネート、またはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（主にアミノ基と反応する）；グルタールアルデヒド（いくつかの異なる側鎖と反応する）；および、ジスジアゾベンジジン（主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【００３６】
架橋試薬は、ホモ二官能性であってもよい、すなわち、同じ反応を経過する二つの官能基を有していてもよい。好ましい、ホモ二官能性架橋結合試薬は、ビスマレイミドヘキサン（“ＢＭＨ”）である。ＢＭＨは、二つのマレイミド官能基を含み、これらの官能基は、穏やかな条件（ｐＨ６．５−７．７）下で、スルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。この二つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続される。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチド同志の、不可逆性架橋結合のために有用である。
【００３７】
さらに、架橋結合試薬は、ヘテロ二官能性であってもよい。ヘテロ二官能性架橋結合剤は、二つの異なる官能基、例えば、アミン反応基およびチオール反応基を有し、これらの反応基は、それぞれ、遊離アミンおよびチオールを有する二つのタンパクを架橋結合する。ヘテロ二官能性架橋剤の例としては、スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（“ＳＭＣＣ”）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（“ＭＢＳ”）、および、ＭＢＳの長鎖模倣物である、スクシニミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（“ＳＭＰＢ”）がある。これらの架橋剤のスクシニミジル基は、一次アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００３８】
架橋結合試薬は、多くの場合、水に対して低溶である。水溶性を向上させるために、スルフォン酸基などの親水性成分をこの架橋結合試薬に加えてもよい。スルフォ−ＭＢＳおよびスルフォ−ＳＭＣＣは、水溶性のために修飾された架橋結合試薬の例である。
【００３９】
多くの架橋結合試薬は、細胞条件下では事実上切断不能な接合体を生成する。しかしながら、ある架橋結合試薬は、細胞条件下で切断が可能な共有結合、例えば、ジスルフィドを含む。例えば、トラウト試薬、ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（“ＤＳＰ”）、およびＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（“ＳＰＤＰ”）は、周知の、切断可能な架橋結合剤である。切断可能な架橋結合試薬の使用は、標的細胞内部への搬送後、荷役成分が輸送ポリペプチドから分離されることを可能とする。直接的ジスルフィド結合も有用である場合がある。
【００４０】
前述のものを含め、多くの架橋結合試薬が市販されている。それらの使用に関する詳細な案内は、供給業者から簡単に入手することが可能である。タンパク架橋結合体および接合体調製に関する一般的参考文献は：Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【００４１】
化学的架橋結合は、スペーサーアームの使用を含んでもよい。スペーサーアームは、接合される成分の間に分子間屈曲性を実現したり、または、分子間距離を調整し、そうすることによって生物活性の保存を助ける。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含む、ポリペプチド成分の形状を取ってもよい。それとは別に、スペーサーアームは、架橋結合試薬、例えば、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，ｃａｔ．Ｎｏ．２１６５１Ｈ）の一部となってもよい。
【００４２】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはそれらの組み合わせから成るポリマーであることが可能である。例えば、各種実施態様において、ペプチドは、Ｄレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドである。この「レトロ−インベルソ異性体」という用語は、その異性体では、配列の方向が逆転し、かつ、各アミノ酸残基のキラリティが翻転する直線的ペプチド異性体を指す。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）を参照されたい。Ｄ−エナンチオマーと逆転合成を組み合わせて得られる最終結果は、各アミド結合におけるカルボニル基およびアミノ基の位置は交換されるが、一方、各アルファ炭素における側鎖基の位置は保存される、ことになる。特に指定して別様に言明しない限り、本発明の任意のＬ−アミノ酸配列は、対応する天然のＬ−アミノ酸配列の配列逆転を合成することによって、Ｄレトロ−インベルソペプチドに変換してもよいことが想定される。
【００４３】
それとは別に、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドは、環状ペプチドである。環状ペプチドは、従来技術で既知の方法によって調製される。例えば、巨視的環形成は、多くの場合、ペプチドのＮ−末端とＣ−末端の間、側鎖とＮ−末端、またはＣ−末端と間［例えば、ｐＨ８．５においてＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６によって］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、または、二つのアミノ酸側鎖の間、にアミド結合を形成することによって実現される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照されたい。
【００４４】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドは、近代的クローン技術を用いて簡単に調製されるが、あるいは、固体法、または部位指向性突然変異発生法によって合成してもよい。ドメインＢＨ３ペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドは、ポリペプチドの、優勢ネガティブ形を含んでもよい。一実施態様では、天然ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドは、標準的タンパク精製技術を用いる、適切な精製スキームによって、細胞、または組織供給源から単離することが可能である。別の実施態様では、ＢＨ３ドメインポリペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドは、組み換えＤＮＡ技術によって生産される。組み換え発現に代わるものとして、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドは、標準的ペプチド合成技術を用い化学的に合成することが可能である。
【００４５】
「単離された」、または「精製された」タンパク、または、生物学的活性を有する、その部分は、細胞物質、または、それから該ＢＨ３ドメインペプチドが得られた、細胞または組織供給源由来の、他の汚染性タンパクを事実上含まないか、または、化学的に合成される場合は、化学的前駆体、または他の化学薬品を事実上含まない。「細胞物質を事実上含まない」という言語は、それから単離されるか、または組み換え的に生産される細胞の細胞内成分から分離される、ＢＨ３ペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドの調製品を含む。一実施態様では、「細胞物質を事実上含まない」という言語は、約３０％（乾燥重量による）未満の、非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチド（本明細書では、「汚染性タンパク」とも呼ぶ）、より好ましくは、約２０％未満の、非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチド、さらに好ましくは、約１０％未満の、非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチド、もっとも好ましくは、約５％未満の、非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチドを有する、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドの調製品を含む。ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチド、または生物学的活性を有するその部分が組み換え的に生産される場合、それは、培養媒体を事実上含まないこと、すなわち、培養媒体の量が、タンパク標本の容量の約２０％未満であることが好ましく、より好ましくは約１０％未満、もっとも好ましくは約５％未満である。
【００４６】
「化学的前駆体または他の化学薬品を事実上含まない」という言語は、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドの調製品において、該タンパクが、化学的前駆体、または、該タンパクの合成に与る他の化学薬品から分離されている調製品を含む。一実施態様では、「化学的前駆体または他の化学薬品を事実上含まない」という言語は、約３０％（乾燥重量による）未満の、化学的前駆体、または非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチド化学薬品、より好ましくは、約２０％未満の、化学的前駆体、または非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチド化学薬品、さらに好ましくは、約１０％未満の化学的前駆体、または非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチド化学薬品、もっとも好ましくは、約５％未満の化学的前駆体、または非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非伝達ドメインペプチド化学薬品を有する、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または伝達ドメインペプチドの調製品を含む。
【００４７】
「生物学的に等価」という用語は、ヒト、ラット、またはマウス供給源のｃＤＮＡライブラリー、または、組み換え発現システムから生産されるｃＤＮＡライブラリーにおいて特定される配列から導かれるＢＨ３ドメインポリペプチドと、必ずしも同程度である必要はないが、同じアポトーシス修飾作用、すなわち、シトクロムＣの放出、またはＢＡＫオリゴマー形成作用の内のいくつか、またはそれらの全てを示すことが可能な本発明の組成物を意味することが意図される。
【００４８】
保存率パーセントは、二つの残基が保存的置換を表す位置（ＰＡＭ２５０残基重み表において０．３以上の対数オッズ値を持つものと定義される）のパーセントに対し、同一残基のパーセントを加えることによって、前述の整列から計算される。保存は、同一性比較のために上に示した配列に対して参照される。この要件を満たす、保存的アミノ酸変化は：Ｒ−Ｋ；Ｅ−Ｄ，Ｙ−Ｆ，Ｌ−Ｍ；Ｖ−Ｉ，Ｑ−Ｈである。
【００４９】
ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＨ３ドメインペプチドのハイブリッドおよび修飾形を含むことが意図される、ＢＨ３ドメインペプチドの誘導体を含むことが可能である。この誘導体は、融合タンパク、およびＢＨ３ドメインペプチドの断片、および、ハイブリッドまたは修飾形がＢＨ３ドメインペプチドの生物活性を保持する限り、ハイブリッド、および、いくつかのアミノ酸が欠失または置換される修飾形、および、一つ以上のアミノ酸が、修飾アミノ酸または異常アミノ酸に変えられる修飾形、およびグルコシル化などの修飾形を含む。生物活性を保持するとは、例えば、組み換え的に生産することが可能な、ヒトまたはマウスにおいて特定される天然のＢＨ３ドメインポリペプチドのものと、必ずしも同レベルの強度をもって誘発されなくともよいが、細胞死が、そのＢＨ３ポリペプチドによって誘発されることを意味する。誘発、および刺激という用語は、本明細書を通じて相互交換的に使用される。
【００５０】
好ましい変異体とは、一つ以上の、必須ではないと予測されるアミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を実行させたものである。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換される置換である。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、既に従来技術において定義済みである。そのようなファミリーとして、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。このようにして、ＢＨ３ドメインポリペプチドの、必須ではないと予測されるアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基によって置換される。それとは別に、別実施態様では、例えば、飽和突然変異発生法によって、ＢＨ３コード配列の全てか、または一部に、突然変異を導入することが可能であり、得られた突然変異体をスクリーニングし、活性を保持する変異体を特定することが可能である。
【００５１】
さらに、事実上相同の意味の中に含まれるものは、本明細書に記載されるＢＨ３ドメインペプチドに対する抗体との交差反応性に基づいて単離される、任意のＢＨ３ドメインペプチドか、または、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含む、そのコードヌクレオチド配列が、本明細書に記載されるＢＨ３ドメインペプチド、またはその断片の、ゲノム、またはサブゲノムヌクレオチド配列、またはｃＤＮＡの、相補配列によるハイブリダイゼーションによって単離される、任意のＢＨ３ドメインペプチドである。
【００５２】
下記の非限定的実施例において、本発明はさらに具体的に説明される。
【実施例】
【００５３】
実施例１
一般的方法
試薬
ＡＢＴ−７３７、および、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーに対してより低い親和性を持つ、その陰性コントロールエナンチオマーを、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｏｌｅｔｅｒｓｄｏｒｆ  Ｔ，２００５）より入手した。
【００５４】
ＧＳＴ−プルダウン
１０ｕｇのＧＳＴ−ＢＣＬ−ｗ（または、ＢＨ３結合欠陥性Ｒ９６Ｐ点突然変異体）を、結合バッファー（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）において、４℃で１時間グルタチオンアガロースビーズと共にインキュベートした。ビーズを洗浄し、４℃で１時間０．２ｕｇのｔＢＩＤとインキュベートした。再びビーズを洗浄し、４℃で１時間ペプチドとインキュベートした。ｔＢＩＤタンパクを、５０ｍＭグルタチオンによってビーズから溶出し、変性ＮｕＰＡＧＥゲルに負荷した。
【００５５】
シトクロムｃの放出
ミトコンドリアは、肝臓およびＦＬ５．１２細胞から前述のように精製した（Ｌｅｔａｉら、２００２）。ミトコンドリアは、ＦＬ５．１２細胞について前述したように白血病細胞および２Ｂ４細胞から精製した。ミトコンドリアは、処理物と、４５分（マウス肝臓ミトコンドリア）、および３５分（ＦＬ５．１２、２Ｂ４、および白血病ミトコンドリア）インキュベートした。シトクロムｃの放出は、処理後、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量した、ペレットおよび上清におけるシトクロムｃの比較によって定量した。複数実験の結果を平均する場合、溶媒のみ（ＤＭＳＯ）処理による結果の値を、各結果から差し引き、０放出は、溶媒単独処理において観察される値を反映するようにした。
【００５６】
それとは別に、ミトコンドリアは、以前に記載したように（Ｌｅｔａｉら、２００２）、単離されたばかりのＣＬＬ細胞および細胞系統から、機械的破壊、次いで差動遠心によって精製した。ミトコンドリア縣濁液は、０．１ｍｇ／ｍｌを用いた、ＡＢＴ−７３７および陰性コントロールエナンチオマー処理の場合を除き、０．５ｍｇタンパク／ｍｌに調製した。シトクロムｃの放出は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量した、ペレットおよび上清におけるシトクロムｃの比較によって定量した。
【００５７】
ペプチド
ペプチドは、Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙが合成し、ＨＰＬＣで精製した。その構造は、質量分析によって確認した。保存液は、ＤＭＳＯ液として作製した。蛍光偏光のために使用されるペプチドは、Ｎ−末端蛍光タグ、および６−アミノヘキサン酸リンカーを備えるように合成された。配列は、げっ歯類ＢＡＤ（ＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＬＲＲＭＳＤＥＦＥＧＳＦＫＧＬ（配列番号４））（Ｋｅｌｅｋａｒら、１９９７）、ＢＡＤｍｕ（ＬＷＡＡＱＲＹＧＲＥＡＲＲＭＳＤＥＦＥＧＳＦＫＧＬ（配列番号１３）、ＢＣＬ−２に対する結合を中絶する点突然変異Ｌ−＞Ａに注意）（Ｚｈａら、１９９７）、ＮＯＸＡ  Ａ（ＡＥＬＰＰＥＦＡＡＱＬＲＫＩＧＤＫＶＹＣ（配列番号６））（Ｏｄａら、２０００）、ＢＭＦ（ＨＱＡＥＶＱＩＡＲＫＬＱＬＩＡＤＱＦＨＲ（配列番号１１））（Ｐｕｔｈａｌａｋａｔｈら、２００１）、およびヒトＢＩＤ（ＥＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲ（配列番号１））（Ｗａｎｇら、１９９６），ＢＩＭ（ＭＲＰＥＩＷＩＡＱＥＬＲＲＩＧＤＥＦＮＡ（配列番号２））（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８）、ＢＩＫ（ＭＥＧＳＤＡＬＡＬＲＬＡＣＩＧＤＥＭＤＶ（配列番号５））（Ｂｏｙｄら、１９９５）、ＢＮＩＰ３−α（ＶＶＥＧＥＫＥＶＥＡＬＫＫＳＡＤＷＶＳＤ（配列番号９））（Ｙａｓｕｄａら、１９９９），ｈａｒｉ−ｋｉｒｉ（ＨＲＫ）（ＳＳＡＡＱＬＴＡＡＲＬＫＡＬＧＤＥＬＨＱ（配列番号８））（Ｉｎｏｈａｒａら、１９９７）およびＰＵＭＡ（ＥＱＷＡＲＥＩＧＡＱＬＲＲＭＡＤＤＬＮＡ（配列番号１０））（Ｎａｋａｎｏ  ａｎｄ  Ｖｏｕｓｄｅｎ，２００１）の公刊配列から採用した。
【００５８】
組み換えタンパク
アンチ・アポトーシスタンパクは、細菌で発現させ、以前に記載したように（Ｌｅｔａｉら、２００２）グルタチオンアガロース（ＧＳＴ結合タンパクのために）を用いるか、または、メーカー（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールにしたがってニッケルＮＴＡアガロースビーズ（Ｈｉｓ−タグ付きＭＣＬ−１のために）によってアフィニティー精製した。選ばれたサンプルは、さらに、陰イオン交換ＦＰＬＣによって精製し、変性ゲルのクーマシーブルー染色によって判断する限り十分な純度を得た。いずれの場合も、水溶液における可溶性を維持するために、Ｃ−末端膜貫通ドメインを切断短縮した。結合アッセイのために、ＧＳＴ−結合タンパクを、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、およびＢＦＬ−１のために用い、ＨｉｓタグＭＣＬ−１を用いた。ミトコンドリアアッセイでは、ＭＣＬ−１を除いては同じタンパクを用い、ＭＣＬ−１の場合は、ＧＳＴ−結合タンパクを用いた。ＧＳＴ−ＭＣＬ−１、ＧＳＴ−ＢＦＬ−１、およびＧＳＴ−ＢＣＬ−ｗを発現する構築体は、Ｔｉｌｍａｎ  Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆの恵与によるものであり、ＨｉｓタグＭＣＬ−１構築体は、Ｒｕｔｈ  Ｃｒａｉｇの恵与によるものであった。それぞれについて、ヒトの配列を用いた。組み換えｔＢＩＤは、以前に記載したようにして作製した。この組み換え体は、二重の、システイン−＞セリン置換を含むが、これは、シトクロムｃ放出を誘発する野生型の能力を維持する（Ｏｈら、２００５）。
【００５９】
蛍光偏光結合アッセイ
結合アッセイは、以前に記載した通りに（Ｌｅｔａｉら、２００２）蛍光偏光を用いて行った。最低３回の独立実験を用いて各解離定数を決定した。ＢＩＭ  ＢＨ３転移アッセイでは、結合バッファーに溶解した０．５ｕＭ  ＧＳＴ−ＢＣＬ−２、または０．１ｕＭ  ＧＳＴ−ＭＣＬ−１に対し、２５ｎＭフルオレセイン結合ＢＩＭ  ＢＨ３ペプチドを結合させた。次に、ＮＯＸＡまたはＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドを滴定し、ＢＩＭ  ＢＨ３の転移を、蛍光偏光の消失で監視した。
【００６０】
免疫沈降
細胞溶解物を、１％ＣＨＡＰＳバッファー（５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４；２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ；１００ｍＭ塩化ナトリウム；１％ｗ／ｖＣＨＡＰＳに、プロテアーゼ阻害剤添加（完全錠剤；Ｒｏｃｈｅ））において、６Ｃ８ハムスター抗ヒトＢＣＬ−２抗体（３ｕｇ）と共に、室温で少なくとも１時間インキュベートした。プロテインＡ−セファローズビーズ（Ｓｉｇｍａ）を加え、ＢＣＬ−２を含む複合体を沈殿させた。このビーズを、上清をゲルに負荷させる前に、負荷バッファーと混合した。ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１免疫沈降のために、２Ｂ４細胞を、１００ｎＭデキサメタゾンによって２４時間処理し、１％ＣＨＡＰＳバッファーにおいて分解させた。２５０ｕｇのタンパク溶解物を、抗ＦＬＡＧ抗体接合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と４℃で１時間インキュベートした。タンパクを、洗浄されたビーズから、２．５ｕｇのＦＬＡＧペプチドによって溶出した。溶出液を変性ゲルに負荷し、電気泳動に備えた。
【００６１】
それとは別に、細胞溶解物（２５０μｇ）を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００バッファーにおいて、６Ｃ８ハムスター抗ヒトＢＣＬ−２抗体（３μｇ）と４℃で少なくとも１時間インキュベートした。ビーズを負荷バッファーと混合し、次いで、上清を、１０％ビス−トリスポリアクリルアミドゲルに負荷し、分析した。転移反応のために、５０μｇの溶解物を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００バッファーまたはＣＨＡＰＳバッファーにおいて、３μｇの６Ｃ８  ＢＣＬ−２抗体と４℃において少なくとも１時間インキュベートした。プロテインＡ−セファローズビーズを加え、１時間インキュベートした。次に、ビーズをペレットとし、３回洗浄し、ＨＥバッファー（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、（Ｃｈｉｐｕｋ  ｅｔ  ａｌ．２００４）の記載の通り）に再縣濁した。この試験管に、１μＭ  ＡＢＴ−７３７、１μＭ陰性コントロールエナンチオマー、またはＤＭＳＯを加え、一晩インキュベートした。上清を、１０％ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷し、分析した。
【００６２】
イムノブロット
タンパク溶解物を、１％ＣＨＡＰＳバッファーにおける細胞分解によって得た。タンパクサンプルを、１０％ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＮｕＰＡＧＥにおいて分画した。膜上の下記のタンパクを検出するために抗体を用いた：ＢＩＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，２２−４０）；ＢＣＬ−２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，／１００）；ＰＵＭＡ（Ｐｒｏｓｃｉ，ＮＴ）；ウサギポリクロナール抗げっ歯類ＢＩＤ（Ｗａｎｇら、１９９６）；ＢＡＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｎ−２０）；アクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＭＡＢ１５０１）；ＣＤ−４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＨＭ４０−３）；ＭＣＬ−１（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）。ＢＡＸオリゴマー形成は、以前に記載した通りに行った（Ｌｅｔａｉら、２００２）。
【００６３】
それとは別に、タンパク溶解物は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（１４２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ））、ＲＩＰＡ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４ｐＨ７．２、０．２ｍＭ  ＮａＶＯ４、５０ｍＭ  ＮａＦ、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、および％ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ））、またはＣＨＡＰＳ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＮａＰＯ４、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ））バッファーで、完全プロテアーゼ阻害剤混合錠剤（Ｒｏｃｈｅ）添加バッファーにおける細胞分解によって得た。タンパクサンプルは、１０％ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＮｕＰＡＧＥにおいて電気泳動的に分離した。膜上の下記のタンパクを検出するために抗体を用いた：ＢＩＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，２２−４０、またはＡｂｇｅｎｔ  ＢＨ３ドメイン）；ＢＣＬ−２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，／１００）；ＭＣＬ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＲＣ−１３）。
【００６４】
アネキシン−Ｖアッセイ
細胞を、アネキシンＶ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）およびヨウ化プロピジウムから成る蛍光接合体によって染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において分析した。
【００６５】
ヒト細胞の単離および短期培養
ヘパリン処理試験管に納めた１５ｍｌの血液を、各ＣＬＬ匿名患者から得、凍結することなく処理した。等量の培養液（ＲＰＭＩ培養液、１０％ヒトウシ血清、１０μｇ／ｍｌインスリンおよび１０ｍｇ／ｍｌトランスフェリン添加）を、各サンプルと混ぜ合わせ、ＣＬＬ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰＡＱＵＥ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の遠心によって単離した。細胞を培養液にて２回洗浄し、２．０×１０６細胞／ｍｌの密度となるように最大４８時間培養した。図１１Ａのサンプルは、ＷＢＣ＞５０，０００／μｌの、２４名の連続患者から得た。ＩＲＢプロトコール＃９９−２２４（Ｄａｎａ−Ｆａｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）にしたがって、全てのガイドラインおよび規制に従った。正常ＰＢＭＣを、匿名の正常ドナーによる血小板献血後に捨てられた管から得、インスリンおよびトランスフェリン無添加で培養したことを除いては、前述の通りに処理した。
【００６６】
ＣＬＬ臨床基準
ＦＩＳＨ分析は、多色プローブセットから成るＣＬＬパネル（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．）（Ｄｏｈｎｅｒら、２０００）を用い、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ‘ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが行った。ＣＬＬ細胞を処理し、ＩｇＶＨおよびＺＡＰ７０状態は、以前に確立された方法（Ｒａｓｓｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４）を用い、ＣＬＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｒｅが判定した。ＩｇＶＨ座位における体性超突然変異は、生殖系統に対し＞９８％相同性が測定された場合、不在に分類された。患者サンプルは、＞２０％細胞が陽性の場合、ＺＡＰ７０陽性と分類され、＞３０％細胞が陽性の場合、ＣＤ３８陽性と分類された。複数骨髄腫細胞培養体ＬＰ１およびＬ３６３細胞（Ｒｕｂｅｎ  Ｃａｒｒａｓｃｏの恵与による）を、１０％ウシ胎児血清添加Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培養液において培養した。
【００６７】
細胞培養
ＦＬ５．１２細胞は、１０％ＷＥＨＩ−３Ｂサプリメント（ＩＬ−３分泌性ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞の上清）によって供給されるＩＬ−３添加、または無添加の、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培養液、１０％ウシ胎児血清、１０００ｕｇ／ｍｌＧ４１８において、以前に記載した通りに培養した。ＦＬ５．１２細胞に、ネオマイシン耐性構築体、およびヒトのＢＣＬ−２  ｃＤＮＡ（ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２）、または、挿入体無し（ｗｔ）のいずれかを含むベクターを安定にトランスフェクトした。２Ｂ４細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｕＭ非必須アミノ酸、および８ｕｌ／Ｌのベータメルカプトエタノールを添加した、ＲＰＭＩ１６４０において培養した。ｐＬＺＲ−ＧＦＰレトロウィルスベクター、またはＦｌａｇ−Ｍｃｌ−１含有ベクター（Ｊｏｅ  Ｏｐｆｅｒｍａｎの恵与による）によるトランスフェクション後、安定にトランスフェクトされた２Ｂ４細胞を単離した。
【００６８】
カスパーゼ抑制実験
１０６細胞／ｍＬのＮｅｏまたはＢＣＬ−２ＦＬ５．１２細胞を、ＩＬ−３を含む培地の上にプレートするか、または、２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞を、１ＸＰＢＳで２回洗浄し、ＩＬ−３無添加培地にプレートし、２４時間インキュベートした。カスパーゼ阻害剤を投与された細胞は、全ての追加の処理前に、２００μＭのＺＶＡＤ．ｆｍｋ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に１時間インキュベートした。細胞を、１μＭ  ＡＢＴ−７３７またはＮＣＥで、指示にしたがって、３０分、１、２、３、または４時間処理し、次に、アネキシン−Ｖ／ＰＩで染色し、アポトーシス状態を評価した。タンパク分析のために、細胞を収集し、１Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、１％ＣＨＡＰＳバッファーにおいて溶解物を調製した。１０ｕｇを、１０％ビス−トリスタンパクゲルに負荷した。得られた免疫ブロットを、切断および未切断ＰＡＲＰタンパクの両方を認識する、抗ＰＡＲＰ抗体（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）によって探査した。
【００６９】
ＢＡＸオリゴマー形成
１０７の、単離されたばかりのＣＬＬ細胞を、ＤＭＳＯ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、または１μＭのＡＢＴ−７３７、または、陰性コントロールエナンチオマーと４時間インキュベートし、％細胞死をアネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析によって評価し、次いで、０．３％サポニンおよび１０μＭ  ＢＭＨによって氷上で３０分処理した。次に、細胞を分解し、１０％ビストリスポリアクリルアミドゲルに負荷し、展開し、ＢＡＸを求めて免疫ブロットした。
【００７０】
マウス
白血病傾向マウスを、以前に記載した通りに生成した（Ｌｅｔａｉ，２００４）。マウスの実験プロトコールは、関連規制基準に合致しており、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得た。
【００７１】
統計学的分析
異なるＣＬＬサンプルから得られた溶解物またはミトコンドリアを用いて、複製実験を実行した。Ｐ値が与えられる主要データ体では、スチューデントの両側ｔ−検定によってＰ値を得、Ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。非線形用量−反応曲線適合によってＥＣ５０値を決めるために、かつ、表５におけるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙのノンパラメトリック検定を実行するために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた。
【００７２】
（実施例２）
アンチ・アポトーシスタンパクは、感作物質ＢＨ３ペプチドに対する結合について差別的プロフィールを示す
アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーと、ＢＨ３単独タンパクのＢＨ３ドメインとの間の相互作用における選択性を決めるために、蛍光偏光結合アッセイ（ＦＰＡ）を用いた。アンチ・アポトーシスタンパクＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−ｗ、およびＢＦＬ−１を、トランスフェクト細菌から、ＧＳＴ融合タンパクとして精製した。ＢＨ３ドメインは、表２ａに示すように、２０−２５マーとして合成した。ＦＰＡのために用いられるオリゴペプチドは、Ｎ−末端ＦＩＴＣ成分によって標識された。表２ｂは、解離定数によって結合を定量する。
【００７３】
【表２】
2009532033.tif 000004
アンチ・アポトーシスファミリーメンバーは、個々のＢＨ３ドメインに対する親和度に基づいて相互に区別することが可能であることが直ちに注目される。例えば、ＢＣＬ−ＸＬは、ＨＲＫ  ＢＨ３に対するはるかに大きい親和度によって、ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ｗから区別される。それ以外の点では、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＢＣＬ−ｗの結合パターンの間には定量的違いがあるが、その定性的結合パターンはまったく類似する。これは、これら三つの分子の疎水性結合ポケットの類似性を示唆する。
【００７４】
この群とは対照的に、ＭＣＬ−１は、ＢＡＤ  ＢＨ３に結合しない。これは、プルダウン（Ｏｐｆｅｒｍａｎら、２００３）、酵母２ハイブリッド（Ｌｅｏら、１９９９）；および、表面プラズモン共鳴（Ｃｈｅｎら、２００５）アッセイによって生成されるデータと一致する。げっ歯類ＮＯＸＡは、二つの、５推定ＢＨ３ドメイン（Ｏｄａら、２０００）を有するという点で、既知のＢＨ３単独タンパクの中で特異である。他の四つのタンパクが、試験したＮＯＸＡ  ＢＨ３ドメインのいずれとも相互作用を持たないのに、ＭＣＬ−１は、その両方と相互作用を持つのが注目される。このことは、ＮＯＸＡとＭＣＬ−１の間の相互作用が、実際に生物学的に有意味であることを示唆する。ＢＨ３の両ドメインと結合可能であることは、ＭＣＬ−１とげっ歯類ＮＯＸＡの間に新規の、マルチマー相互作用のある可能性か、または、それとは別に、ＮＯＸＡにおける二つのＢＨ３ドメインの暴露に対し差別的調節のあることを示唆する。
【００７５】
さらに異なるのはＢＦＬ−１である。このものはＢＩＤおよびＢＩＭには結合するが、試験した感作物質の中ではＰＵＭＡのみに結合する。さらに、活性化因子ＢＩＤおよびＢＩＭ  ＢＨ３は、試験したアンチ・アポトーシス因子全てによって結合されることが注目される。これは、ＰＵＭＡを除いて、比較的選択的な結合パターンを示す感作物質と異なる。さらに注目されるのは、ＢＮＩＰ−３αから得られたＢＨ３ドメインが、試験したタンパクのどれとも結合せず、ＢＡＸまたはＢＡＫも活性化しないことである。ＢＮＩＰ  ＢＨ３が、未試験の、複数ドメインのプロ、またはアンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーと相互作用を持つ可能性を排除することはできないが、ＢＮＩＰ−３αが、ＢＨ３−ファミリーメンバーとしては全く機能しないこともあり得る（Ｒａｙら、２０００）。
【００７６】
（実施例３）
個々のアンチ・アポトーシスタンパクに対する依存性は、感作物質ＢＨ３ペプチドに対する感受性パターンから導くことが可能である；アンチ・アポトーシスタンパクの抑制は、活性化因子ｔＢＩＤが存在しない場合、ＭＯＭＰには不十分である。
【００７７】
以前の結果から、ＢＩＤおよびＢＩＭのＢＨ３ドメインは、精製ミトコンドリアシステムにおいて、ＢＡＸおよびＢＡＫオリゴマー形成およびシトクロムｃの放出を誘発する能力を持つことが示された（Ｌｅｔａｉら、２００２）。このクラスをＢＨ３ドメイン「活性化因子」と呼ぶ。ＢＡＤおよびＢＩＫのＢＨ３ドメイン（「感作物質」と名づける）は、それ自体では、シトクロムｃの放出を誘発できなかった。しかしながら、活性化因子が、ＢＣＬ−２によって結合、隔離され、そのため、活性化因子と、ＢＡＸまたはＢＡＫとの相互作用が阻止されると、感作物質は、活性化因子のＢＣＬ２結合を競合的に抑制することによって活性化因子を遊離させ、ミトコンドリアアポトーシスを刺激して、ＢＡＸまたはＢＡＫオリゴマー形成をさせ、シトクロムｃの放出を誘発する。このようにして、二つの増感性ＢＨ３ドメインは、ＢＣＬ−２アンチ・アポトーシス機能に対する拮抗因子であることが示された。ＢＣＬ−２機能に拮抗する能力は、ＢＣＬ−２に対する高親和性結合と相関した。
【００７８】
上の表１ｂでは、本実験で試験したＢＨ３ドメインの拡張範囲は、アンチ・アポトーシスタンパクに対しはっきりと異なる結合パターンを示す。選択的結合が、個々のＢＨ３ドメインの有する、アンチ・アポトーシス機能に選択的に拮抗する能力に対応するかどうかを試験するために、アポトーシス決定臨界分子機構が再構成される、精製ミトコンドリアシステムを構築した。活性化因子機能のために、カスパーゼ８切断ＢＩＤタンパク、ｔＢＩＤを用いた。ｔＢＩＤは、精製ミトコンドリア（Ｗｅｉら、２０００）、および合成リポソーム（Ｋｕｗａｎａら、２００５；Ｋｕｗａｎａら、２００２）において、ＢＡＸ／ＢＡＫオリゴマー形成およびシトクロムｃ放出を誘発することが可能な原型活性タンパクである。ｔＢＩＤによる、シトクロムｃ放出、およびアポトーシスの誘発には、ＢＡＸまたはＢＡＫが必要である（Ｃｈｅｎｇら、２００１；Ｗｅｉら、２００１）。複数ドメインプロ・アポトーシス機能は、マウス肝臓のミトコンドリアに貯留するＢＡＫによって実現される；マウス肝臓のミトコンドリアは、検出可能なＢＡＸタンパクを含まない（Ｌｅｔａｉら、２００２）。優勢アンチ・アポトーシス機能は、結合アッセイで使用された、６通り、５種の異なる組み換えアンチ・アポトーシスタンパクの内の一つによって実現した。ＢＨ３ペプチドは、増感機能を実現した。
【００７９】
シトクロムｃの放出は、システムの読み取り値であるので、ペプチドがそれ自体で、活性化因子ＢＩＤまたはＢＩＭ  ＢＨ３のように、マウス肝臓のミトコンドリアにおいてシトクロムｃを放出するかどうかを試験することが重要である（Ｌｅｔａｉら、２００２）。図１Ａは、感作物質のＢＨ３ペプチドのいずれも、図１Ｂ−Ｆで使用されるものよりも１０倍以上高い濃度においても、それ自体ではシトクロムｃの放出を、背景レベルを顕著に超えて誘発することができないことを示す、確認アッセイである。このことは、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ  ＡおよびＮＯＸＡ  ＢのＢＨ３については、以前に示されていたが、ＨＲＫ、ＢＮＩＰ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦ  ＢＨ３ドメインについては新規所見である。
【００８０】
後続パネルのそれぞれにおいて、ｔＢＩＤによるシトクロムｃの放出が示され、次いで、ＢＣＬ−２（ｂ）、ＢＣＬ−ＸＬ（ｃ）、ＢＣＬ−ｗ（ｄ）、ＭＣＬ−１（ｅ）、またはＢＦＬ−１（ｆ）のいずれかの添加によってシトクロムｃの放出は抑制された。アンチ・アポトーシス保護に拮抗する、一連のＢＨ３ドメインの能力を、シトクロムｃの放出測定で定量した。注目すべきことに、いずれの場合も、アンチ・アポトーシス機能に拮抗する能力は、表１ｂの結合特異性にそのまま対応する。これは、表１ｂに明らかにされた結合パターンが生物機能に対応することの重要な確証である。
【００８１】
増感ペプチドのみによる処理は、仮にそれが、試験したアンチ・アポトーシスタンパク全てに結合、拮抗するもの、例えば、ＰＵＭＡ、ＢＨ３、または、ＮＯＸＡおよびＢＡＤ  ＢＨ３の組み合わせによるものであっても、シトクロムｃの放出をもたらすには不十分である（図１Ａ）ことを強調することは重要である。さらに、一連の増感ＢＨ３ペプチドを、アンチアポトーシスタンパクＢＣＬ−ＸＬの存在下に試験した場合、依然としてシトクロムｃの回復は見られなかった。これは、ＢＨ３ペプチドが、何らかの形でアンチ・アポトーシスタンパクを直接プロ・アポトーシス機能に変換するという可能性を形式的に排除する。ＭＯＭＰおよびシトクロムｃの放出を誘発するためには、活性化因子機能、この場合はｔＢＩＤによって供給される機能が絶対必要条件であるようである。
【００８２】
これらのデータは、これら一連のペプチドは、ミトコンドリアが、その完全性を維持するためにアンチ・アポトーシスタンパクに依存するかどうかを決定することが可能であることを決定的に証明する。さらに、決定的アンチ・アポトーシスタンパクの名前は、この一連の感作物質ＢＨ３ペプチドに対する感受性パターンに基づいて導くことが可能である。この戦略をＢＨ３プロファイリングと名づける。
【００８３】
（実施例４）
感作物質は、アンチ・アポトーシスタンパクから活性化因子を転移させる
感作物質ＢＨ３ペプチドは、それ自体はシトクロムｃの放出を誘発できないが、活性化因子と、アンチ・アポトーシスタンパクとが、感作物質の、アンチ・アポトーシスタンパクに対する結合を模倣するパターンで存在する場合、シトクロムｃの放出を誘発することが可能となることから、これらの感作物質は、アンチ・アポトーシスタンパクから活性化因子を転移することが仮定された。この仮説の一試験として、アンチ・アポトーシスＢｃｌ−ｗからｔＢＩＤを転移させる、増感ペプチドの能力を、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを用いて調べた。グルタチオンアガロースビーズに結合したタンパクを、グルタチオンで溶出し、ウェスタンブロットで分析した。図３Ａでは、ｔＢＩＤは、ＢＣｌ−ｗから、増感ＢＨ３ペプチドによって、図１Ｄのパターンそのままのパターンで転移させられる。補則試験として、ＢＡＤおよびＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドによる、活性化因子ＢＩＭ  ＢＨ３ペプチドの、ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１からの転移を定量した。図３Ｂでは、表１ｂと一致して、ＢＡＤ  ＢＨ３は、ＢＩＭ  ＢＨ３を、ＢＣＬ−２から効率的に転移させるが、ＭＣＬ−１からはそうではなく、他方、ＮＯＸＡ  Ａ  ＢＨ３  ７は、ＢＩＭを、ＭＣＬ−１から効率的に転移させるが、ＢＣＬ−２からはそうではない。これらの実験は、感作物質ＢＨ３ペプチドが、活性化因子を、アンチ・アポトーシス結合間隙から転移させる能力を有することを支持する。
【００８４】
（実施例５）
ＢＣＬ−２に対する細胞内要求は、感作物質ＢＨ３パネルに対するミトコンドリア感受性の「ＢＣＬ−２パターン」に一致する。
【００８５】
個々のアンチ・アポトーシスタンパク機能に対するミトコンドリアの依存性が、細胞行動と相関するかどうかを試験するために、定義されたアンチ・アポトーシス依存性の細胞モデルを調べた。先ず、細胞生存のための、ＢＣＬ−２に対する細胞要求が、図１Ｂに見られた増感ＢＨ３ドメインに対するミトコンドリア感受性の、ＢＣＬ−２プロフィールと相関するかどうかを求めた。げっ歯類リンパ球前駆体のＦＬ５．１２細胞系統は、生存維持のためにＩＬ−３を必要とする。ＩＬ−３排除によって誘発されるアポトーシスは、ＢＣＬ−２の過剰発現によって抑制される（図４Ａ）。したがって、ＩＬ−３を奪われて、ＢＣＬ−２を過剰発現するＦＬ５．１２（ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２）細胞は、ＢＣＬ−２依存性生存のモデルとなる。ＩＬ−３の存在下に増殖するＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞は、ＢＣＬ−２独立細胞の例となる。
【００８６】
ＩＬ−３枯渇ＦＬ５．１２細胞の、ＢＣＬ−２に対する依存性は、図４Ａにおいて遺伝学的に実証されるが、この依存性は、細胞浸透性ＢＣＬ−２拮抗因子を用いて確かめられた。ＡＢＴ−７３７は、ＢＣＬ−２（および、ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−ｗ）に対して拮抗することが示されている（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら、２００５）。以前の報告と一致して、ＡＢＴ−７３７は、ＩＬ−３枯渇細胞においては細胞死を誘発したが、ＩＬ−３充満ＢＣＬ−２保護細胞では細胞死を誘発しなかった（図４Ｂ）。さらに、ＡＢＴ−７３７は、ストレスを与えない、ＩＬ−３充満ｗｔＦＬ５．１２細胞に対しては無毒であった。この細胞死はカスパーゼ依存性であり、これは、細胞死が、アポトーシス経路を通じて起こっていることを示す（図４Ｃ）。ＩＬ−３細胞は、化合物による処理の開始前２４時間ＩＬ−３不在下に増殖させた。全ての細胞は、収集前２４時間化合物で処理した。
【００８７】
ＢＣＬ−２依存性細胞システムの信頼性を確かめた後、次に、ＢＣＬ−２依存性が、ミトコンドリアレベルで単離することが可能かどうかを決めた。ＩＬ−３の除去は、ミトコンドリア上のＢＣＬ−２に活性化因子ＢＨ３タンパクを「負荷する」であろうと仮定した。さらに、「負荷」ＢＣＬ−２を担持するミトコンドリアは、ＢＣＬ−２結合間隙を求めてＢＣＬ−２と競合する感作物質ＢＨ３ペプチドで処理した場合、シトクロムｃを放出するであろうと仮定した。ＩＬ−３除去によって下ごしらえされたＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞における、ＡＢＴ−７３７によるＢＣＬ−２抑制は、カスパーゼ依存性で、きわめて速やかであった（図５）。ＩＬ−３枯渇ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞は、死への「準備を整えている」とする解釈は、ＡＢＴ−７３７処理後の、それらの細胞の速やかな死によって支持される（図５）。
【００８８】
ミトコンドリアを、ＩＬ−３存在下のｗｔＦＬ５．１２細胞およびＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞、および、ＩＬ−３枯渇２４時間後のＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞から単離した。ＩＬ−３枯渇後、アポトーシスが進行したため、ｗｔＦＬ５．１２細胞からは、ミトコンドリアを十分量単離することができなかった。図６Ａは、活性化因子ＢＩＤおよびＢＩＭは、ｗｔＦＬ５．１２細胞から単離されたミトコンドリアからシトクロムｃの放出を強力に誘発するのに、残余の増感ペプチドは、そのような誘発を見せない（青色バー）ことを示す。したがって、アンチ・アポトーシスファミリーメンバーの抑制は、それ自体では、ＭＯＭＰを誘発するのに十分ではない。次に、ＢＣＬ−２の過剰発現は、以前に示した用量−反応曲線（赤色バー）（Ｌｅｔａｉら、２００２）と一致して、１０μＭのＢＩＤ  ＢＨ３によって誘発される放出は抑制するが、１０μＭ  ＢＩＭ  ＢＨ３によるものに対してはそうしない。しかしながら、ＩＬ−３を枯渇させたＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞からのミトコンドリアを試験すると、いくつかの増感ペプチドは、シトクロムｃ放出誘発能力を示し（褐色バー）、かつ、１０μＭ  ＢＩＤ  ＢＨ３に対する感受性も回復する。ＢＣＬ−２に対して高い親和性を持つ増感ペプチドのみが、ＭＯＭＰを引き起こすことはもっとも注目すべきことである。ＢＩＫ  ＢＨ３は、この背景ではシトクロムｃの放出を誘発しないが、このものは、ＢＣＬ−２に対し、その親和度が、ＢＡＤ、ＰＵＭＡ、またはＢＭＦ  ＢＨ３のものよりも約１０倍低いことに注意しなければならない。したがって、細胞のＢＣＬ−２依存性は、この一連の増感ＢＨ３ペプチドに対するミトコンドリアの感受性パターンから「診断する」ことが可能であることが見て取れる。この依存性によって、関与する活性化因子が、図１の場合のように組み換えタンパクであるか、あるいは、恐らくＩＬ−３除去後の場合がそうであろうと思われるが、一つを超える分子を含む、より複雑な混合物であるかを「診断する」ことが可能である。増感ペプチドの必ずしも全てがＩＬ−３充満ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２ミトコンドリアにおいて放出を誘発することができるわけではないことからみ見て取れるように（図６Ａ）、ＢＣＬ−２の抑制だけでは、シトクロムｃ放出を誘発するのに十分ではないことに注意すべきである。事実、広範囲のアンチ・アポトーシスタンパク結合を実現するペプチド同士、ＢＡＤおよびＮＯＸＡ  ＢＨ３の組み合わせは、活性化分子の不在下では、シトクロムｃ放出を誘発することができない（図６Ｂ）。ＭＯＭＰを誘発するためには、先ず、ＩＬ−３除去によって生成される、細胞死シグナルを通信する分子によって、ＢＣＬ−２の「準備を整えさせ」なければならない。ＩＬ−３不在下に２４時間育成したＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞から単離されたミトコンドリアを、ＮＯＸＡまたはＢＡＤペプチド（３０ｕＭ）、または１０ｕＭのコントロールエナンチオマーで３５分処理した。ミトコンドリアペレットに対し、以前に記載したように（Ｌｅｔａｉら、２００２）化学的架橋結合を行った。ＢＣＬ−２は、ＢＡＸオリゴマー形成の上流ではアポトーシスを阻止し、ＩＬ−３枯渇ミトコンドリアに対するＢＣＬ−��作用の、ＢＡＤ  ＢＨ３およびＡＢＴ−７３７による抑制は、ＢＡＸオリゴマー形成をもたらす（図６Ｃ）。したがって、この細胞死シグナルは、活性化因子ＢＨ３タンパクである可能性のあることが仮定された。
【００８９】
ＢＩＭは、以前に、ＦＬ５．１２細胞において、ＩＬ−３除去後の細胞死に関与することが示された（Ｈａｒａｄａら、２００４）。図６Ｄは、細胞内の全体ＢＩＭレベルだけでなく、ＢＣＬ−２と複合体形成するＢＩＭのレベルも、ＩＬ−３除去後急激に増加することを示す。ＢＣＬ−２、ＢＡＸ、およびＢＡＫのレベルが、同じ期間ほぼ定常であることに注意すべきである。これらの結果から、活性化因子ＢＩＭ（および、恐らくＰＵＭＡも）は、ＦＬ５．１２細胞においてＩＬ−３除去後、細胞死反応の動的介在因子となること、および、該活性化因子は、アポトーシス阻止のために隔離されることが示唆される。次に、「負荷」ＢＣＬ−２を担持する細胞およびミトコンドリアは、ＢＣＬ−２に「耽溺依存」し、ＢＣＬ−２機能が拮抗されると死を遂げる。さらに、細胞のＢＣＬ−２依存は、感作物質ＢＨ３ドメインに対するミトコンドリアの感受性パターンによって診断することが可能である。ＩＬ−３枯渇ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−ＸＬ細胞の分解産物に対する、抗ヒトＢＣＬ−２抗体による免疫沈降の陰性コントロールは、図示のように、バンドを全く生成しなかった。
【００９０】
このモデルから、ＢＣＬ−２は、活性化因子ＢＨ３分子を遮断することによって、ＢＡＸ活性化の上流において作用すると予測される。この予測を試験するために、図６Ｅにおいて、Ｎ−末端エピトープを露出するＢＡＸの活性形（Ｄｅｓａｇｈｅｒら、１９９９；Ｈｓｕ  ａｎｄ  Ｙｏｕｌｅ，１９９７）のみを認識する抗体による免疫沈降を実行した。ｗｔまたはＢＣＬ−２発現ＦＬ５．１２細胞を、表示のようにＩＬ−３除去に暴露した。ＩＬ−３除去は、ｗｔ  ＦＬ５．１２細胞ではＢＡＸ活性化を誘発したが、一方、全体ＢＡＸレベルを定常なままであった。しかしながら、ＩＬ−３除去による細胞死に対してＢＣＬ−２保護される場合、ＢＣＬ−２はさらに、ＢＡＸの立体配座変化も阻止した。これは、ＢＣＬ−２が、ＢＩＭのような活性化因子を、それら因子がＢＡＸと相関作用を持つ前に、隔離するという所見と一致する（第４および第８レーンを比較せよ）。さらに、ＡＢＴ−７３７による処理は、シトクロムｃ放出およびＢＡＸ活性化を回復した。これは、ＡＢＴ−７３７は、活性化因子をＢＣＬ−２から転移することによって機能するとする所見と一致する。以上まとめると、これらの結果は、ＢＣＬ−２は、ＢＡＸ活性化の上流でアポトーシスを阻止することを示す。
【００９１】
（実施例６）
ＢＨ３プロファイリングは、ＭＣＬ−１細胞依存性を、ＢＣＬ−２細胞依存性から区別することを可能とする。
【００９２】
このアンチ・アポトーシス「準備」モデルが、ＢＣＬ−２以外の、他のアンチ・アポトーシスタンパクにも拡張が可能であるかどうかを試験するために、ＢＣＬ−２によって保護される細胞の振る舞いを、ＭＣＬ−２によって保護されるものと比較した。Ｆｌａｇ−ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２、または空のベクター構築体によってトランスフェクトした２Ｂ４細胞を、表示濃度のデキサメタゾンの存在下に２４時間培養した。このげっ歯類ハイブリドーマ２Ｂ４細胞系統は、デキサメタゾン処理に対し感受性を有する。ＦＬＡＧ標識ＭＣＬ−１またはＢＣＬ−２の過剰発現は、デキサメタゾン誘発性アポトーシスに対し耐性を付与する（図７Ａ）。したがって、ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１発現細胞は、細胞のＭＣＬ−１依存性のモデルとなり、一方、デキサメタゾン処理の、ＢＣＬ−２発現細胞は、細胞のＢＣＬ−２依存性のモデルとなる。２Ｂ４細胞を、デキサメタゾン、および、ＡＢＴ−７３７またはエナンチオマーのいずれかと、２４時間インキュベートした。ＭＣＬ−１保護、デキサメタゾン処理細胞の、ＡＢＴ−７３７による処理は、何の作用も示さなかった。これは、該細胞が、生存のためにＢＣＬ−２には依存しないことを示す。これと全く対照的に、ＢＣＬ−２によってデキサメタゾン誘発性アポトーシスから保護される２Ｂ４細胞は、ＡＢＴ−７３７に対し極めて高い感受性を有する（図７Ｂ）。
【００９３】
細胞データから、デキサメタゾンで処理された、２Ｂ４−ＭＣＬ−１細胞から単離されたミトコンドリアは、ＮＯＸＡ  ＢＨ３に対しては感受性を持つが、ＢＡＤ  ＢＨ３に対しては感受性を持たないと考えられ、ＩＬ−３枯渇ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞では、反対パターンが観察されると考えられるという予測が喚起される。デキサメタゾン処理、ベクターまたはＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１トランスフェクト２Ｂ４細胞、未処理でベクタートランスフェクトまたはＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１トランスフェクト細胞からミトコンドリアを単離した。デキサメタゾン処理ベクタートランスフェクト細胞からは、アポトーシスが進行しすぎてミトコンドリアの単離ができなかった。図７Ｃにおいて見て取れるように、ＭＣＬ−１依存性細胞から単離されたミトコンドリアのみが、感作物質ＢＨ３ペプチドに対する感受性の「ＭＣＬ−１パターン」を再現する。ＦＬ５．１２細胞の場合と同様、感作物質ＢＨ３ペプチドは、未処理細胞ではシトクロムｃ放出をほとんど引き起こさないので、感作物質ＢＨ３ペプチドによる、ＭＣＬ−１（および、そこに存在する可能性のある他のアンチ・アポトーシスタンパク）の抑制は、それ自体は、アポトーシスを誘発するのに十分ではないことは明らかである。ＭＣＬ−１の「準備を整え」、それによって、感作物質によるＭＣＬ−１拮抗作用が、ミトコンドリアの可浸透性を招くことが可能となるためには、さらに、細胞死シグナル（この場合は、デキサメタゾン処理によって起動される）が必要とされる。この戦略の実効性を明らかにするために、デキサメタゾンで処理し、この度はＢＣＬ−２で保護した、２Ｂ４細胞に対し、ＢＨ３プロファイリングを実行した。この準備モデルと一致して、ＢＣＬ−２パターンが明らかにされた（図７Ｄ）。したがって、ＢＣＬ−２依存性と同様、ＭＣＬ−１依存性も、感作物質ＢＨ３パネルに対するミトコンドリアの感受性によって「診断する」ことが可能である。
【００９４】
ＦＬ５．１２細胞の場合と同様、デキサメタゾン処理が、ＭＣＬ−１およびＢＣＬ−２による、活性化因子ＢＨ３タンパクの隔離の増大をもたらすかどうかを求めた。ベクターまたはＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１トランスフェクト２Ｂ４細胞を、０または１００ｎＭのデキサメタゾンで処理して、分解させた。図７Ｅから、ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１は、ＢＣＬ−２と同様（図７Ｆ）、デキサメタゾン処理によって誘発された細胞死シグナル伝達後、増加量のＢＩＭを隔離することが示された。この処理の間、ＢＡＸおよびＢＡＫのレベルは定常を維持していることに注意されたい。さらに、デキサメタゾンによる処理前に、細胞に結合していた少量のＢＡＸが、処理後減少することにも注意されたい。一つの解釈は、ＢＡＸが、ＢＣＬ−２に結合するＢＩＭのレベルの増大によって転移させられたということである。これは重要である。なぜなら、このことは、ＭＣＬ−１からのＢＡＸの転移は、ＭＯＭＰおよび細胞死を誘発するには不十分であることを示唆するからである。
【００９５】
このミトコンドリアアッセイが、真の細胞依存性を反映することをさらに明らかにするため、あらかじめデキサメタゾンで処理した、ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１トランフエクト２Ｂ４細胞に対し、電気穿孔によってペプチドをトランスフェクトした。これは、少なくとも一部はＢＩＭによって輸送される細胞死シグナルによってＭＣＬ−１の準備を整えると想定される。殺作用パーセントを、アネキシンＶ染色によって確認した。ＮＯＸＡ  Ａのトランスフェクションによる殺作用は、ＢＡＤによるものよりも有意に大きいことに注意されたい。この結果は、同じ細胞系統の単離ミトコンドリアにおいて観察された同じＭＣＬ−１パターンを再現する（図７Ｇ、表１ｂ、図１ｅ、図７Ｃと比較せよ）。Ｎ＝３であり、誤差バーは標準偏差を表す。これらの結果は、ミトコンドリアＢＨ３プロファイリンアッセイに対する細胞関与を支持する。
【００９６】
（実施例７）
白血病におけるＢＣＬ−２への依存性は、「ＢＣＬ−２パターン」およびＢＩＭ隔離において、感作物質に対するミトコンドリア感受性と一致する。
【００９７】
アンチ・アポトーシスタンパクに対する依存性は、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２ファミリータンパクが、治療標的として徹底的調査の対象とされる癌関係分野において、恐らくもっとも重要であろう。発癌遺伝子依存の概念が、最近注目を集めているが（Ｊｏｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，２００４；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，２００２）、特定の発癌遺伝子に対する依存の分子的詳細は、十分には理解されていない。発癌遺伝子依存の実証モデルである、ＢＣＬ−２依存性げっ歯類白血病を用いて、ＢＣＬ−２「依存」の分子的基礎を調べた。
【００９８】
従来の結果は、ｃ−ｍｙｃは構成的に発現されるが、ＢＣＬ−２の発現は抑えられる、マウス急性リンパ球白血病モデルを記載した。このモデルでは、ＢＣＬ−２導入遺伝子の発現がドキシサクリンの投与によって除去されると、白血病細胞はアポトーシスを経過し、白血病の急速な寛解をもたらす（Ｌｅｔａｉ，２００４）。これは、ＢＣＬ−２依存性癌の、理想的なインビボモデルを提供する。ＢＣＬ−２に対する依存性は、ＩＬ−３枯渇ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞のものと同じ機構によること、すなわち、細胞死シグナルは、活性化因子ＢＨ３分子によって起動され、運ばれるが、ＢＣＬ−２が、該シグナルに結合し、該シグナルと、複数ドメインのプロ・アポトーシスタンパクとの相互作用を阻止することが仮定された。
【００９９】
ミトコンドリアを、白血病細胞から単離し、感作物質ＢＨ３ペプチドに暴露した。次いで、シトクロムｃの放出を測定した。それと平行して、内部コントロールとして、白血病マウスの肝臓からミトコンドリアを単離した（図８Ａ）。増感ＢＨ３ペプチドは、正常マウスの非悪性肝臓（図１ａ）のミトコンドリア、および非悪性の、ＦＬ５．１２細胞（図６Ａ）または２Ｂ４細胞（図７Ｃ）のミトコンドリアからシトクロムｃの放出を誘発することができなかったのと同様に、白血病マウスの非悪性肝細胞ミトコンドリアからシトクロムｃの放出を誘発することができなかった。混乱的ではあるが、いくつかの増感ＢＨ３ペプチドは、白血病ミトコンドリアから全体に近いシトクロムｃの放出を誘発することができた（図８Ｂ）。重要なことは、放出を誘発したペプチドのパターンが、ＢＣＬ−２に高い親和度において結合したペプチド（表１ｂ）と、すなわち、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦと正確に一致したことである。ＢＣＬ−２に対するＢＡＤ  ＢＨ３の親和度よりも、親和度が約１０倍低いことと一致して、ＢＩＫ  ＢＨ３は、シトクロムｃ放出を発揮するために１０倍高い濃度を要求することに注意されたい。ＮＯＸＡ  Ａペプチド濃度の１０倍増加は、何の作用も示さなかった。これも、ＮＯＸＡ  Ａは、ＢＣＬ−２に対しきわめて低い親和度しか持たないという所見と一致する。
【０１００】
これらの結果から、細胞死シグナルは絶えず起動されるが、活性化因子ＢＨ３分子を隔離しアポトーシスを阻止するために、ＢＣＬ−２が必要とされることが示唆される。上で試験した非悪性システムとは対照的に、白血病細胞ＢＣＬ−２は、増殖因子除去またはデキサメタゾン処理などの介入をこれ以上要することなく、あたかも活性化タンパク（単複）によってすでに「準備が整えられている」かのように振舞う。図８Ｃは、ＢＩＭが、白血病細胞に発現されること、かつ、それがＢＣＬ−２によって結合されることを示す。このモデルにおいて、細胞死シグナル伝達におけるＢＩＭシグナルの重要性を支持して、ＢＩＤも溶解物の中に存在するが、ＢＣＬ−２によって結合されない。ＰＵＭＡも、ＢＣＬ−２によって結合されることが判明しており、これは、ＰＵＭＡ欠乏は、ｍｙｃ−誘発リンパ腫の発達を加速する可能性のあることを示す報告（Ｈｅｍａｎｎら、２００４）と一致することに注意されたい。ＰＵＭＡ  ＢＨ３は、ＢＡＸまたはＢＡＫを直接活性化する能力を欠くので、ＰＵＭＡは、この状況では感作物質として作用し、結果的に、ＢＩＭとの結合に利用可能なＢＣＬ−２の量と、恐らくＢＡＸまたはＢＡＫの量を下げることが仮定された。
【０１０１】
もしもＢＣＬ−２が、主にＢＩＭを隔離することによって、この白血病細胞の生存を維持するのであるなら、ＢＩＭの機能消失は、ＢＣＬ−２の過剰発現の代りとなって、白血病発生においてｃ−ｍｙｃと協力することが可能であろうと予測することができる。事実、この実験は既に行われた。ＢＩＭ欠乏は、実際に、ｃ−ｍｙｃと協力して、ＢＣＬ−２過剰発現がｃ−ｍｙｃと協力することによって本実験でもたらされたものと同様の、Ｂリンパ球白血病の前駆状態をもたらすことが見出された（Ｅｇｌｅら、２００４）。これらの結果は、ＢＣＬ−２が白血病の生存に必要とされる理由は主に、ＢＣＬ−２がＢＩＭを隔離し、そうすることによってＢＡＸ／ＢＡＫの、次いでＭＯＭＰの活性化を阻止するのに必要であるというモデルを支持する。したがって、この白血病細胞は、正常でも健康でもないが、死んでいるわけでもなく、むしろ死への準備を整えたものである。
【０１０２】
（実施例８）
ＢＨ３プロファイリングの、インビボにおけるＢＣＬ−２依存性を検出する能力を調べる別の試験として、二種類の小細胞型肺癌（ＳＣＬＣ）細胞系統を調べた。二つのＳＣＬＣ細胞系統、Ｈ１４６およびＨ１９６３からミトコンドリアを単離し、一連のＢＨ３ペプチドに暴露した。シトクロムｃの放出をＥＬＩＳＡによって定量した。いずれも、インビボにおけるＡＢＴ−７３７処理、および、インビボのげっ歯類異種移植モデル（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ  Ｔ，２００５）に感受性を持っていた。Ｈ１４６およびＨ１９６３のいずれも、ＢＣＬ−２感受性の診断となる感受性パターンを示す（図８Ｄ）。この結果は、図４Ｂおよび７Ｅの結果に加えてさらに、ミトコンドリアのＢＨ３プロファイリングが、どの細胞が、インビトロおよびインビボにおいてＢＨ３様薬剤に対し感受性を持つかを示す強力な予測機構となることを支持する。
【０１０３】
（実施例９）
ＡＢＴ−７３７細胞は、低ナノモル範囲においてＣＬＬ細胞を殺す。
【０１０４】
ＡＢＴ−７３７は、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、およびＢＣＬ−ｗに対し、ナノモル未満の範囲の親和度を持つ、細胞浸透性小型分子である。陰性コントロールエナンチオマー（ｅｎａｎｔ）は、ＢＣＬ−２に対しより低い親和度で結合する、ＡＢＴ−７３７の立体異性体であり、機能欠損コントロールとして使用されてきた（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら、２００５）。ＣＬＬ細胞は、ＡＢＴ−７３７に対して感受性を持つことが示されているので、ＢＣＬ−２依存性の、可能な癌初発モデルとして選ばれた（Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら、２００５）。単離したばかりの一次ＣＬＬ細胞を、ＡＢＴ−７３７、または陰性コントロールエナンチオマーとインキュベートした。４８時間後、死亡率を、アネキシンＶ染色によって評価した。試験した２４個のＣＬＬサンプル全てにおいて、ＡＢＴ−７３７によって４８時間以内にアポトーシスが誘発され、ＥＣ５０は、４．５＋２．２ｎＭであった（図１２Ａ）（１．９−９．４ｎＭの範囲、表３参照）。アポトーシス機構を直接標的することができるならば、それは、急速にアポトーシスを誘発することが期待される。４時間処理した５サンプルの反応は、４８時間処理と比べ近似していた（図１２Ｂ）。正常なドナーから得た、非悪性抹消血単球（ＰＢＭＣ）は、ＡＢＴ−７３７に対して耐性を示し、ＥＣ５０＞１０００ｎＭであった（図１２Ｃ）。
【０１０５】
【表３】
2009532033.tif 000005
（実施例１０）
ＢＣＬ−２およびＢＩＭレベルは、細胞サンプルの間で一定である。
【０１０６】
ＡＢＴ−７３７に対する反応が一定なのであるから、ＢＣＬ−２タンパクの発現も、ＣＬＬ細胞において均一であると仮定された。さらに、プロ・アポトーシスＢＩＭは、リンパ球においてアポトーシス採択の重要な決定因子であることが示されている（Ｂｏｕｉｌｌｅｔら、１９９９；Ｏｐｆｅｒｍａｎら、２００３）。１５個のＣＬＬサンプルにおいて、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２およびプロ・アポトーシスＢＩＭのレベルは、著しく均一であった（図１３Ａ）；ＰＢＭＣにおけるＢＣＬ−２およびＢＩＭのレベルは一貫して低かった（図１３Ｂ）。短期培養は、ＢＣＬ−２またはＢＩＭレベルに影響を及ぼさないが、ＡＢＴ−７３７に対する反応を変えるであろうという予想を確かめるために、タンパク溶解物を、単離の時点、および４８時間の培養後に得たＣＬＬサンプルから調製した。ＢＣＬ−２レベルも、ＢＩＭレベルも、培養中変化しなかった（図１３Ｃ）。ＣＬＬ細胞におけるＢＣＬ−２レベルを、濾胞性リンパ腫、すなわち、ｔ（１４；１８）転座のためにＢＣＬ−２が過剰発現される癌におけるレベルと比較した（図１３Ｄ）。ＢＣＬ−２レベルは、この二つの疾患において際立って近似していた。
【０１０７】
表４は、図１２Ａのサンプル提供患者の臨床特徴を要約する。ＥＣ５０値を、ＣＬＬの予後判定に有用であると以前に特定された要因によって二分割された群の間で比較した。この分析から、いずれの場合においても、平均ＥＣ５０の、２群間の差は、２ｎＭを超えないことが明らかになった。２群間のノンパラメトリックな統計的比較から、白血球数によって二分割された群を除いて、いずれも統計的有意差を持たないことが示された（表５）。したがって、ＡＢＴ−７３７に対する生物反応は、従来の予後判定要因からは、ほとんど独立しているようである。
【０１０８】
【表４】
2009532033.tif 000006
【０１０９】
【表５】
2009532033.tif 000007
（実施例１１）
ＣＬＬミトコンドリアは、外膜の完全性維持のためＢＣＬ−２機能への持続的依存性を示す。
【０１１０】
ＢＣＬ−２は、内在的アポトーシス経路、すなわち、ミトコンドリアアポトーシス経路に反対するのであるから、ＡＢＴＴ−７３７の毒性は、ＣＬＬにおけるＢＣＬ−２機能に対するミトコンドリアの要求に基づくものであると仮定した。いくつかの遺伝学的に定められたモデルシステム（Ｌｅｔａｉら、２００２）（および、ＭＣ，ＶＤＭ，Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｍ，Ｗｅｉ  Ｇ，Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ  Ｓ，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  Ｓ，ＡＬ，公刊準備中）において、ＢＣＬ−２機能の選択的拮抗因子として振舞う、ＢＨ３単独タンパクのＢＨ３ドメインから得られた、一連のペプチドの特徴を解明した。例えば、ＢＡＤ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、および、強度は低いが、ＢＩＫから得られたＢＨ３ペプチドは、ＢＣＬ−２に結合し、その機能を抑制するが、一方、ＮＯＸＡ、ＨＲＫ、およびＢＮＩＰ−３ＡからのＢＨ３ドメインは、ＢＣＬ−２と相互作用を持たない。このペプチド配列（パネル）は、他のアンチ・アポトーシスファミリーメンバーに対しても確認され、かつ、この相互作用パターンは、各アンチ・アポトーシスタンパクについて異なるので、各タンパクの機能は、この「ＢＨ３プロファイリング」によって特異的に検出される。したがって、その外膜の完全性の維持のためにＢＣＬ−２機能に依存するミトコンドリアは、ＢＡＤ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦで処理されると、外膜浸透の誘発を示すが、ＮＯＸＡ、ＨＲＫ、およびＢＮＩＰ−３Ａペプチドで処理されてもそうはならない。
【０１１１】
ＣＬＬミトコンドリアを、ＢＨ３ペプチド、および、ＡＢＴ−７３７および陰性コントロールエナンチオマーとインキュベートした（図１４）。活性化因子ＢＩＤおよびＢＩＭ  ＢＨ３ペプチドは、試験した全てのアンチ・アポトーシスタンパクと相互作用を持ち、さらに、ＢＡＸおよびＢＡＫを直接活性化することが可能である（Ｌｅｔａｉら、２００２）ことに注意されたい。そのため、これらのペプチドは、シトクロムｃ放出アッセイにおいて陽性コントロールとして活動する。ＢＡＤ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦは、シトクロムｃの放出を誘発するが、一方、ＮＯＸＡ、ＨＲＫ、およびＢＮＩＰ−３Ａペプチド、および、ＢＡＤの無効点突然変異のＢＨ３は誘発しない。このパターンは、ミトコンドリアのＢＣＬ−２依存性を診断する。ＡＢＴ−７３７もシトクロムｃの放出を誘発する。これは、その標的が、ＣＬＬ細胞のミトコンドリアにあり、かつ、ミトコンドリア外膜の完全性の維持に必要とされることを裏づける。したがって、これらの「ＢＨ３プロファイリング」実験は、ＣＬＬミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜の完全性を維持するためにＢＣＬ−２機能に依存することを証明し、ＡＢＴ−７３７処理に対するＣＬＬ細胞の繊細な感受性の機序を解明する。感作物質パネルのＢＨ３ペプチドは、ＢＡＸおよびＢＡＫを直接活性化する能力を欠くので、これらの実験はさらに、ＣＬＬにおいてＢＣＬ−２によって構成的に隔離される活性化分子の存在をも示唆した。
【０１１２】
（実施例１２）
ＢＣＬ−２に結合したＢＩＭは、ＡＢＴ−７３７による殺作用に対し、ＣＬＬ細胞の死への準備を整える。
【０１１３】
以前の実験によって、ＡＢＴ−７３７および感作物質ＢＨ３ペプチドは、アンチ・アポトーシス性ＢＣＬ−２の拮抗因子として活動するが、ＢＡＸおよびＢＡＫを直接活性化する能力を欠くことが示された。ＭＯＭＰを誘発するために、感作物質は、ＢＩＭまたはＢＩＤなどの活性化因子の存在を要求する（Ｌｅｔａｉら、２００２；Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら、２００５）。したがって、上の結果は、活性化因子が、ＢＣＬ−２に結合し、次いで、ＡＢＴ−７３７、またはＢＣＬ−２結合性ＢＨ３ペプチドによって転移されることを示唆する。転移後、遊離活性化因子は、ＢＡＸおよびＢＡＫとの相互作用を介してＭＯＭＰを誘発することが可能となることが仮定された。
【０１１４】
図１３は、ＣＬＬサンプルにおけるＢＩＭの存在を示した。他方の確立された活性化因子ＢＨ３単独タンパクであるＢＩＤのレベルは、イムノブロットでは極めて貧弱で、切断され、活性化されたＢＩＤは、ほとんど完全に検出不能であった（図示せず）。ＢＩＭは実際にＢＣＬ−２によって結合されることが仮定された。図１５Ａは、ＢＩＭが、一次ＣＬＬ細胞ではＢＣＬ−２によって隔離されることを示す。さらに、ＡＢＴ−７３７によって処理すると、より程度は低いが、比較的活性の低い陰性コントロールエナンチオマーが、ＢＣＬ−２に結合するＢＩＭの量において急激な低下をもたらす（図１５Ｂ）。興味深いことに、転移されたＢＩＭはより不安定となるらしく、ＡＢＴ−７３７処理後、ＢＣＬ−２はそうはならないのに、ＢＩＭの全細胞レベルは低下した。汎カスパーゼ抑制因子ＺＶＡＤ−ｆｍｋとの共時処理は、ＡＢＴ−７３７誘発による細胞死から保護するが、これはさらに、アポトーシス細胞死の関与を示唆する。ＺＶＡＤ−ｆｍｋも、ＢＩＭ細胞レベルを保存するが、これは、転移ＢＩＭが、以前に報告されたように（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，２００４）カスパーゼによって切断される可能性のあることを示唆する。溶解物中の界面活性因子が、感作物質の、ＢＣＬ−２疎水性間隙に対する結合を妨げる可能性がある（図示せず）。そこで、ＡＢＴ−７３７およびＺＶＡＤ−ｆｍｋ処理後において、ＢＣＬ−２に対するＢＩＭの、観察される持続的結合は、ＢＣＬ−２に対する、ＡＢＴ−７３７の結合を抑制する、溶解物中の界面活性因子によるアーチファクトである可能性のあることが仮定された。ＡＢＴ−７３７の作用機構に関して二つの競合仮説が生成された。第１では、ＡＢＴ−７３７は、ＢＣＬ−２からＢＩＭを転移させ、ＢＡＸのオリゴマー形成およびカスパーゼ活性化を誘発し、最後に、この転移されたＢＩＭのカスパーゼ切断を誘発する。第２では、ＢＩＭ分解は、単にＭＯＭＰの結果であり、カスパーゼ活性化は、ＢＩＭ転移とは独立した機構によって起動される。
【０１１５】
これらの競合仮説を試験するため、全細胞溶解物を、ＡＢＴ−７３７の存在または不在下に、ＢＣＬ−２：ＢＩＭ複合体のレベルについて調べた。界面活性因子非含有条件下では、ＡＢＴ−７３７は、ＢＣＬ−２からＢＩＭを転移し上清に追いやるが、陰性コントロールエナンチオマーはそうしなかった（図１５Ｃ）。ＢＩＭは、ＢＡＸを活性化し、そのオリゴマー形成を誘発することが示されている（Ｌｅｔａｉら、２００２；Ｍａｒａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，２００２）。この機序と一致して、ＣＬＬ細胞は、ＡＢＴ−７３７による処理後４時間以内にＢＡＸのオリゴマー形成を示す（図１５Ｄ）。
【０１１６】
もしも第２仮説が正しく、ＢＣＬ−２拮抗作用後ＭＯＭＰを誘発するのにＢＩＭが必要とされるのであれば、ＢＩＭの選択的隔離は、ＣＬＬミトコンドリアに対するＢＣＬ−２の拮抗作用後、シトクロムｃ放出の低下を招くはずである。図１５Ｅにおいて、ＢＣＬ−２機能は、感作物質ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドによって拮抗される。図１２で示したように、ＢＡＤ  ＢＨ３は、それだけでシトクロムｃの放出を誘発した。一方、ＢＩＭのＢＨ３ドメインに結合する抗体の添加は、シトクロムｃの放出に著明な低下をもたらした。無関係な抗体は作用しなかった。ＢＩＭを隠蔽することによってシトクロムｃの放出を阻止することは、第１仮説、すなわち、ＡＢＴ−７３７の拮抗作用は、ＢＩＭの、ＢＣＬ−２：ＢＩＭ複合体からの転移のために（図１５Ｃ）ＣＬＬ細胞に対して有毒であるという仮説を支持する。転移されたＢＩＭは次に、ＢＡＸのオリゴマー形成（図１５Ｄ）、ＭＯＭＰ、およびプログラム細胞死の採択を誘発する。これらの結果の意味する重要内容は、ＢＣＬ−２発現は必要ではあるが、ＡＢＴ−７３７、または感作物質ＢＨ３ペプチドによるＢＣＬ−２の拮抗作用に対する反応を指令するには十分ではないということである。細胞が、ＢＣＬ−２の拮抗作用に感受性を持つためには、活性化因子ＢＨ３単独タンパクは、ＢＩＭ同様、ＢＣＬ−２によって隔離されなければならない。
【０１１７】
（実施例１４）
ＢＨ３プロファイリングによる薬剤反応の予測
ＢＨ３プロファイリングは、抗癌治療剤に対する癌細胞の反応の予測を可能とする。本出願の目的のため、治療剤は、アンチ・アポトーシスＢＣＬ−２タンパクを標的とするもの、および、従来の薬剤に分割することが可能である。モデル試験システムとして、四つのリンパ腫細胞系統ＳＵ−ＤＨＬ４、ＳＵ−ＤＨＬ６、ＳＵ−ＤＨＬ８、およびＳＵ−ＤＨＬ１０を用いた。ＢＨ３プロファイリングを実行するため、一連の増感ペプチドについて、これらのリンパ腫細胞から単離されたミトコンドリアにおいてミトコンドリア外膜浸透化（ＭＯＭＰ）を誘発する能力を試験した。参照を簡単にするために、図１８Ａは、ＢＨ３ペプチドと、アンチ・アポトーシスタンパクとの間の相互作用パターンを示す。ＭＯＭＰは、シトクロムｃの放出をＥＬＩＳＡによって定量することによって測定した。
【０１１８】
図１８に示すように、ＢＨ３プロファイリングは、四つのリンパ腫細胞系統から成る我々のサンプルにおいて、これら三つのブロッククラスを区別することができることを証明した。ＳＵ−ＤＨＬ４およびＳＵ−ＤＨＬ６は、感作物質ＢＨ３ペプチドに対する感受性に基づくと「準備済み」表現型である。アンチ・アポトーシスタンパクの全てと相互作用を持つＰＵＭＡ  ＢＨ３ペプチドに対する強い反応は、ミトコンドリアが準備済みであるかどうかを見るための有力な指示計を提供する。この感受性パターン（ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＢＡＤ、＋／−ＢＩＫ）は、ＳＵ−ＤＨＬ−４では、ＢＣＬ−２に対する依存性を示した。ＳＵ−ＤＨＬ６も、強いＰＵＭＡ  ＢＨ３およびＢＭＦ  ＢＨ３シグナルによって示されるように、準備済みであった。比較的選択性の高いＢＨ３ペプチド、ＢＡＤ  ＢＨ３およびＮＯＸＡ  Ａ  ＢＨ３の両方に対し、より弱いが、はっきりした反応が見られたことは、ＢＣＬ−２とＭＣＬ−１の両方への依存性を示す。ＰＵＭＡ  ＢＨ３および他の感作物質に対する少ない反応を見ると、ＳＵ−ＤＨＬ−８の準備態勢は劣っているように見えるが、それでも、活性化因子ＢＩＭ  ＢＨ３およびＢＩＤ  ＢＨ３に対し強く反応することによって、エフェクターアームは無傷であることを示した。ＳＵ−ＤＨＬ−１０は、増感および活性化の両ペプチドに対しその反応が劣っており、エフェクターアームの欠如を示した。
【０１１９】
生存のためにＢＣＬ−２に依存する細胞のみが、ＡＢＴ−７３７のようなＢＣＬ−２拮抗因子に対して反応することが予測される。したがって、ＢＨ３プロファイリングは、ＳＵ−ＤＨＬ４およびＳＵ−ＤＨＬ６は、ＡＢＴ−７３７に反応するはずであると予測する。この仮説は試験され、ＢＨ３プロファイリングは、ＡＢＴ−７３７に対する反応を正確に予測することが確認された（図１９Ａ）。さらに、ＢＨ３プロファイリングは、ＳＵ−ＤＨＬ４およびＳＵ−ＤＨＬ６は、死への「準備済み」なのであるから、他の化学療法剤に対してもより高い感受性を持つ可能性があるが、ＳＵＤＨＬ８とＳＵＤＨＬ−１０はそうはならないであろうと予測した。このことを試験するために、細胞をビンクリスチンで処理した。ＢＨ３プロファイリングによって予測されたように、ＳＵ−ＤＨＬ４およびＳＵ−ＤＨＬ６が、もっとも感受性の高い細胞系統であった（図１９Ｂ）。
【０１２０】
（実施例１５）
細胞系ＢＨ３プロファイリング
ミトコンドリア系ＢＨ３プロファイリングを細胞系アッセイに転換する方法が開発された。このアッセイでは、細胞をジギトニンによって浸透可として、ペプチドのミトコンドリア到達を可能とした。細胞を、蛍光染料ＪＣ−１で処理し、ミトコンドリアの膜横断電気化学電位の、ペプチド処理による損失を評価した。アポトーシスによるミトコンドリアの完全性の損失は、５９０ｎｍから５２０ｎｍへの蛍光ピークのシフトによって観察することが可能である。ＴＥＣＡＮ  Ｓａｆｉｒｅ２蛍光計測計を用い、９６−、または３８４ウェルプレートにおいて複数のアッセイを平行に読み取ってもよい。このシステムを試験するために、このシステムを、ＢＣＬ−２依存性が知られる、いくつかの細胞系統に適用したところ、ミトコンドリアＢＨ３プロファイリングと、細胞ＢＨ３プロファイリングとの間に優れた相関が得られた。図２０に二つの例が見て取れる。
【０１２１】
（その他の実施例）
本発明が、その詳細な説明と関連して記載されたわけであるが、前述の記載は、付属の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を具体的に示すことを意図するもので、限定することを意図するものではない。他の局面、利点、および改変は、付属の特許請求の範囲の中にある。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】マウス肝臓ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、感作物質ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。ペプチド濃度は、別様に示さない限り、１０ｕＭであるが、ｔＢＩＤ濃度は１３ｎＭであった。各アンチ・アポトーシスタンパクについて実行した少なくとも３回の独立アッセイの平均および標準偏差を示す。
【図１Ｂ】ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、ｔＢＩＤ（第１バー）およびＢＣＬ−２（１．２ｕＭ、第２バー）の作用を示す棒グラフである。さらに、シトクロムｃの放出回復に及ぼす感作物質ＢＨ３ペプチドの作用が示される。各場合において、シトクロムｃの放出回復は、表１ｂの高親和性相互作用に一致することに注意されたい。
【図１Ｃ】ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、ｔＢＩＤ（第１バー）およびＢＣＬ−ＸＬ（０．２５ｕＭ、第２バー）の作用を示す棒グラフである。さらに、シトクロムｃの放出回復に及ぼす感作物質ＢＨ３ペプチドの作用が示される。
【図１Ｄ】ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、ｔＢＩＤ（第１バー；この実験ではｔＢＩＤの濃度が４３ｎＭであることに注意）およびＢＣＬ−ＸＬ（６．３ｕＭ、第２バー）の作用を示す棒グラフである。さらに、シトクロムｃの放出回復に及ぼす感作物質ＢＨ３ペプチドの作用が示される。
【図１Ｅ】ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、ｔＢＩＤ（第１バー）およびＭＣＬ−１（１．１ｕＭ、第２バー）の作用を示す棒グラフである。さらに、シトクロムｃの放出回復に及ぼす感作物質ＢＨ３ペプチドの作用が示される。
【図１Ｆ】ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、ｔＢＩＤ（第１バー）およびＢＦＬ−１（２．４ｕＭ、第２バー）の作用を示す棒グラフである。さらに、シトクロムｃの放出回復に及ぼす感作物質ＢＨ３ペプチドの作用が示される。
【図２】シトクロムｃ放出に対する、ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。ＭＬＭは、０．２ｕＭのＢＣＬ−ＸＬタンパクの存在下、または不在下に、１０ｕＭの表示のペプチドによって処理した。
【図３】図３Ａは、ＧＳＴ−ＢＣＬ−ｗ（または、点突然変異Ｒ９６Ｐ）を、ｔＢＩＤタンパクおよび表示のＢＨ３ペプチド（１０μＭ）と組み合わせた、ＧＳＴ−プルダウンアッセイの結果を示すウェスタンブロットの写真である。ＢＣＬ−ｗのＢＨ１ドメインＲ９６Ｐ突然変異体は、ＢＨ３ドメインに結合する能力を欠く。便利のために、ＢＣＬ−ｗ結合パターンを表１ｂから抽出して下に示した。図３Ｂは、蛍光偏光で見た、ＢＣＬ−２およびＭＣＬ−１タンパクからの、フルオレセイン標識ＢＩＭ  ＢＨ３ペプチドの転移に対する、ＢＡＤおよびＮＯＸＡ  ＢＨ３ペプチドの作用を示す線グラフである。図示は、各組み合わせについて３回の独立実験から得られた代表的プロットである。
【図４Ａ】ｗｔＦＬ５．１２およびＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞の生存率に及ぼす、ＩＬ−３除去の作用を示す線グラフである。アネキシンＶによって染色されない細胞をＦＡＣＳ分析において生存とした。図示は、３回の独立実験の平均および標準偏差である。
【図４Ｂ】ＩＬ−３充満およびＩＬ−３枯渇ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞の生存率に及ぼす、ＢＣＬ−２の拮抗因子であるＡＢＴ−７３７の作用を示す線グラフである。アネキシンＶによって染色されない細胞をＦＡＣＳ分析において生存とした。図示は、３回の独立実験の平均および標準偏差である。
【図４Ｃ】ＦＬ５．１２細胞の生存率に対する、ＡＢＴ−７３７およびＺＶＡＤ．ｆｍｋの作用を示す棒グラフである。さらに、イムノブロットの写真は、ＰＡＲＰ切断に対するＡＢＴ−４３７の作用を示す（最下段）。
【図５】ＦＬ５．１２の生存率に対する、ＡＢＴ−７３７およびＺＶＡＤ．ｆｍｋの作用を示す棒グラフである。ＦＬ５．１２は、ＩＬ−３の存在下、または不在下に２４時間育成し、次いで、表示のように、３０分、１、２、または３時間処理した。細胞死は、ＦＡＣＳ分析においてアネキシンＶ染色によって測定した。
【図６Ａ】下記の細胞の単離ミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に及ぼすＢＨ３ペプチド（１０ｕＭ）の作用を示す棒グラフであり、２４時間ＩＬ−３の存在下に育成したｗｔＦＬ５．１２細胞（青色バー）；２４時間ＩＬ−３の存在下（赤色バー）、または不在下（褐色バー）に育成したＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２細胞である。図示は、３回の独立実験の平均および標準偏差である。便利のために、ＢＣＬ−２結合パターンを表１ｂから抽出して下に示した。
【図６Ｂ】ＩＬ−３の存在下に育成したｗｔおよびＢＣＬ−２ＦＬ５．１２細胞から単離したミトコンドリアからの、シトクロムｃ放出に及ぼす、ＮＯＸＡおよびＢＡＤ  ＢＨ３の作用を示す棒グラフである。図示は、３回の独立実験の平均および標準偏差である。
【図６Ｃ】ＩＬ−３不在下に２４時間育成されたＦＬ５．１２細胞からのシトクロムｃ放出に及ぼす、ＮＯＸＡ  Ａ、ＢＡＤ、ＡＢＴ−７３７、またはコントロールエナンチオマーの作用を示すウェスタンブロットの写真である。
【図６Ｄ】ＦＬ５．１２−ＢＣＬ−２全細胞溶解物のＢＩＭレベルに及ぼすＩＬ−３除去の作用（左側）、および、ヒトＢＣＬ−２導入遺伝子産物を指向する抗体によって免疫沈降されるサンプル（右側）を示すウェスタンブロットの写真である。最上段の数字は、ＩＬ−３除去後の時間を指す。右のコントロールレーンは、プルダウンにおいて抗ヒトＢＣＬ−２抗体無しで実施したものである。
【図６Ｅ】免疫沈降アッセイの結果を示すウェスタンブロットの写真である。ＢＡＸの全ての立体配座を認識する抗体（Δ２１）、または、Ｎ−末端露出体を持つ活性立体配座のみを認識する抗体（ＮＴ）を用いて、ＢＡＸを免疫沈降した。細胞において誘発された死亡率を下に示す。右では、ＩＬ−３枯渇細胞から単離されたミトコンドリアに対し、ＡＢＴ−７３７、またはコントロールエナンチオマーで処理し、表示のようにＮＴによる免疫沈降を実行した。ＣＤ５６は、ＣＤ５６を認識する、無関係の抗体によるコントロール免疫沈降反応を示す。
【図７Ａ】２Ｂ４細胞において、デキサメタゾンによって誘発される細胞死に及ぼす、ＭＣＬ−１およびＢＣＬ−２の作用を示す線グラフである。生存率は、ＦＡＣＳ分析においてアネキシンＶ染色の不在によって定量した。図示は、３回の独立実験の平均および標準偏差である。
【図７Ｂ】ＭＣＬ−１依存性２Ｂ４細胞、およびＢＣＬ−２依存性２Ｂ４細胞に対する、ＢＣＬ−２拮抗因子ＡＢＴ−７３７の作用を示すセングラフである。図示は、３回の独立実験の平均および標準偏差である。
【図７Ｃ】表示のように処理されたＭＣＬ−１発現２Ｂ４細胞から単離されたミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。図示は、３回の独立実験の平均および標準偏差である。便利のために、ＭＣＬ−１結合パターンを表１ｂから抽出して下に示した。
【図７Ｄ】表示のように処理されたＢＣＬ−２発現２Ｂ４細胞から単離されたミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。便利のために、ＢＣＬ−２結合パターンを表１ｂから抽出して下に示した。
【図７Ｅ】ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１トランスフェクト２Ｂ４細胞に対するデキサメタゾンの作用を示すイムノブロットの写真である。アガロースビーズに結合したＦＬＡＧ抗体は、ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１と複合体を形成するタンパクを免疫沈降させた。ＭＣＬ−１によるＢＩＭ隔離の増加は、ＭＣＬ−１依存性と相関する。
【図７Ｆ】ＦＬＡＧ−ＢＣＬ−２トランスフェクト２Ｂ４細胞に対するデキサメタゾンの作用を示すイムノブロットの写真である。
【図７Ｇ】デキサメタゾン処理ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１  ２Ｂ４細胞に対するＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。ＢＨ３ペプチドでトランスフェクトされた準備ＦＬＡＧ−ＭＣＬ−１  ２Ｂ４細胞はＭＣＬ−１パターンを示す。
【図８−１】図８Ａは、肝臓から単離したミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に及ぼす、ＢＨ３ペプチド（別様に指示しない限り、１０μＭ）の作用を示す棒グラフである。図８Ｂは、ＢＣＬ−２依存性白血病から単離したミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に及ぼす、ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。便利のために、ＢＣＬ−２結合パターンを表１ｂから抽出して下に示した。図示は、１回しか行わなかった３０および１００μＭ処理を除き、３回の独立実験の平均および標準偏差である。
【図８−２】図８Ｃは、ＢＣＬ−２依存性白血病から得られたサンプルのイムノブロットのチャートである。第１レーンは、２５ｕｇ負荷全細胞溶解物；第２レーンは、ヒトのＢＣＬ−２導入遺伝子産物に対する抗体による免疫ブロット産物；第３レーンは、プロテインＡビーズのみによるコントロール；第４レーンは、げっ歯類ＣＤ−４０を認識する、無関係のハムスターモノクロナール抗体によるコントロールイムノブロットである。図８Ｄは、二つのＳＣＬＣ細胞系統、Ｈ１４６およびＨ１９６３から単離されたミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に及ぼす、ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。それぞれについてＮ＝３であり、誤差バーは、標準偏差を表す。
【図９】増感ＢＨ３作用剤処理に対する選択的癌感受性のモデルである。生存未準備細胞（Ｉ）は、細胞死刺激（ＩＩ）後、死への準備を整える。白血病細胞は、外部からの介入（ＩＩ）無しに、絶えず死への準備を促される。準備状態の細胞は、アンチ・アポトーシス拮抗因子（ＩＩＩ）に反応してアポトーシスの経過をたどるが、未準備状態の細胞はそうしない。Ａ）ＦＬ％．１２−ＢＣＬ−２。Ｂ）２Ｂ４−ＭＣＬ−１。Ｃ）ｍｙｃ／ＢＣＬ−２白血病細胞。
【図１０】プログラム細胞死に対するＢＣＬ−２ファミリー調節モデルを描く模式図である。細胞死シグナルは、ＢＨ−３単独タンパクの、誘発性または翻訳後活性化を引き起こす。ＢＩＤおよびＢＩＭを含む活性化因子ＢＨ３単独タンパクは、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫのオリゴマー形成を誘発し、ＭＯＭＰ、シトクロムｃの放出、およびカスパーゼの活性化を引き起こし、細胞死をもたらす。アンチ・アポトーシスタンパクは、活性化因子ＢＨ３単独タンパクおよびＢＡＸ／ＢＡＫを、ＢＡＸ／ＢＡＫオリゴマー形成の上流において隔離することによってアポトーシスを阻止する。感作物質ＢＨ３単独タンパクは、アンチ・アポトーシスタンパクに結合すること、活性化因子ＢＨ３単独タンパクを転移し、ＢＡＸ／ＢＡＫオリゴマー形成を誘起することによって細胞死を促進する。
【図１１】内在的、またはミトコンドリア系プログラム細胞死経路を示す模式図である。細胞死シグナル伝達に反応して、活性化因子ＢＨ３単独タンパクが起動されて、ＢＡＸおよびＢＡＫと相互作用を持ち、ＢＡＸおよびＢＡＫオリゴマー形成を誘発する。このオリゴマー形成に続いて、ミトコンドリア外膜の浸透化が起こり、これによって、シトクロムｃのようなプロ・アポトーシス因子が細胞質ゾルに放出される。細胞質ゾルのシトクロムｃは、ＡＰＡＦ−１およびカスパーゼ９と複合体を形成し、アポプトソームと呼ばれるホロ酵素を造り、これが、次に、エフェクターカスパーゼ３を活性化し、広範なタンパク分解をもたらす。この経路は、ＢＣＬ−２のようなアンチ・アポトーシスメンバーによって遮断され、かつ、これらのメンバーは、活性化因子ＢＨ３単独タンパクに結合し、該タンパクの、ＢＡＸおよびＢＡＫとの相互作用を阻止する。この抑制作用そのものは、感作物質ＢＨ３単独ドメインによって拮抗される。すなわち、該ドメインは、ＢＣＬ−２における結合部位を求めて競合し、ＢＣＬ−２によって結合される活性化因子を転移させる。
【図１２Ａ】ＣＬＬ細胞の生存率に対するＡＢＴ−７３７の作用を示す線グラフである。２４名の患者から得たＣＬＬ細胞を、種々の濃度の化合物と共に４８時間培養した。死亡率は、アネキシンＶ染色によって定量し、溶媒（ＤＭＳＯ）処理コントロールに対して正規化された。
【図１２Ｂ】ＣＬＬ細胞の生存率に対するＡＢＴ−７３７の作用を示す線グラフである。５名の患者から得たＣＬＬ細胞を、種々の濃度の化合物と共に４８時間培養した。死亡率は、（Ａ）と同様に定量した。
【図１２Ｃ】正常なＰＢＭＣの生存率に対するＡＢＴ−７３７の作用を示す線グラフである。ＰＢＭＣは、表示の濃度の化合物の存在下に２４時間培養した。
【図１３】図１３Ａは、ＣＬＬサンプルから得られた全細胞溶解物におけるＢＣＬ−２およびＢＩＭタンパクレベルを示すイムノブロットの写真である（数字は、図１２Ａの患者番号に一致する）。ＢＩＭの三つの異性形（ＢＩＭｅｘｔｒａ  ｌｏｎｇ−ＢＩＭＥＬ、ＢＩＭｌｏｎｇ−ＢＩＭＬ、およびＢＩＭｓｈｏｒｔ−ＢＩＭＳ）が示される。図１３Ｂは、ＰＢＭＣから得られた全細胞溶解物におけるＢＣＬ−２およびＢＩＭタンパクレベルを示すイムノブロットの写真である。三つの正常ＰＢＭＣ溶解物は左に、ＣＬＬ溶解物は右に示す。図１３Ｃは、細胞採取時（前）および培養後４８時間（後）に作製した二つの独立ＣＬＬ一次サンプルから得られた全細胞溶解物におけるＢＣＬ−２およびＢＩＭタンパクレベルを示すイムノブロットの写真である。図１３Ｄは、一次ＣＬＬ細胞（Ａ−Ｆ）、および一次濾胞性リンパ腫細胞（ＦＬ）におけるＢＣＬ−２タンパクレベルを示すイムノブロットの写真である。イムノブロットの配置は、ｔ（１４；１８）含有Ｈ２ヒトリンパ腫細胞系統からの溶解物に対して合わせられる。
【図１４】一次ＣＬＬ患者の独立サンプルから単離したミトコンドリアからのシトクロムｃ放出（ＥＬＩＳＡによって測定）に及ぼす、ＢＨ３単独ドメインペプチド（１００μＭ）または化合物（１００μＭ）の作用を示す棒グラフである。ＢＡＤｍｕ＝ＢＡＤ  ＢＨ３単独ドメインの点突然変異体、陰性コントロールとして使用。Ｎ＝７、ただし、ＢＡＤｍｕではＮ＝５、陰性コントロールエナンチオマーではＮ＝３。誤差バーは、標準偏差を表す。
【図１５Ａ】７個の独立ＣＬＬサンプルの全細胞溶解物における、ＢＣＬ−２およびＢＩＭタンパクのイムノブロットの写真である。
【図１５Ｂ】一次ＣＬＬ細胞の全細胞溶解物における、ＢＣＬ−２およびＢＩＭタンパクのイムノブロットの写真である。一次ＣＬＬ細胞は、１００ｎＭ  ＡＢＴ−７３７、１００ｎＭ陰性コントロールエナンチオマー、またはベヒクル（ＤＭＳＯ）＋２００μＭ  ＺＶＡＤ．ｆｍｋと共に２４時間培養した。死亡率は、アネキシンＶ染色によって定量した。各処理群からの溶解物使用の免疫沈降（ｉ．ｐ．）を、抗ＢＣＬ−２抗体を用いて実行した。図示の結果は、３回の独立実験を表す。
【図１５Ｃ】イムノブロットの写真である。４個の独立患者サンプルから得られたＣＬＬ溶解物においてＢＣＬ−２を免疫沈降させるためにＢＣＬ−２抗体を用いた。界面活性因子を濯ぎ除去した後、ビーズに結合した複合体を、ＤＭＳＯ、１μＭ陰性コントロールエナンチオマー、または１μＭ  ＡＢＴ−７３７とインキュベートした。図示は、このようにして得られた、上清に転移した分画の、ＢＩＭ探査イムノブロットである。
【図１５Ｄ】イムノブロットの写真である。単離したばかりのＣＬＬ細胞を、ＤＭＳＯ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、または１μＭのＡＢＴ−７３７、または陰性コントロールエナンチオマーと４時間インキュベートした。死滅％は、アネキシンＶ染色によって評価した。ＢＡＸのオリゴマー形成は、化学的に架橋結合された全細胞溶解物の抗ＢＡＸイムノブロットによって評価した。
【図１５Ｅ】ＣＬＬサンプルから単離されたミトコンドリアに対する、１％ＤＭＳＯ、または１００μＭ  ＢＡＤ  ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。サンプルは、表示のように、ヒトのＢＩＭ  ＢＨ３ドメイン（Ａｇｅｎｔ）を指向する抗体、または、無関係抗原（ＣＤ５６）を指向する抗体と共にあらかじめインキュベートした。Ｎ＝５、バーは、＋標準偏差を示す。
【図１６Ａ】ＬＰ１細胞から単離されたミトコンドリアからのシトクロムｃ放出に対する、１００μＭ  ＢＨ３ペプチドの作用を示す棒グラフである。
【図１６Ｂ】ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−２、およびＢＩＭのレベルを比較する、ＬＰ１およびＬ３６３細胞系統のイムノブロットの写真である。
【図１６Ｃ】Ｌ３６３細胞およびＬＰ１細胞の生存率に及ぼす、ＡＢＴ−７３７による４８時間処理の作用を示す線グラフである。Ｎ＝３、バーは、＋標準偏差を示す。
【図１７】ミトコンドリアにおけるＡＢＴ−７３７誘発細胞死のモデルを示す模式図である。ミトコンドリアＢＣＬ−２は、ＣＬＬ細胞においてＢＩＭを隔離する。ＡＢＴ−７３７を添加すると、ＢＩＭは転移され、ＢＣＬ−２はＡＢＴ−７３７によって占拠される。次に、解放されたＢＩＭは、ＢＡＸまたはＢＡＫと相互作用を持ち、オリゴマー形成を誘発し、シトクロムｃの放出、および、プログラム細胞死の不可逆性採択をもたらす。活性化ＢＨ３単独タンパクによって準備されたＢＣＬ−２は、癌細胞に、ＡＢＴ−７３７の外、恐らく他の化学療法剤による処理に対しても感受性を持つようにさせる。
【図１８Ａ】ＢＨ３ペプチドと、アンチ・アポトーシスタンパクの間の相互作用パターンを示すチャートである。
【図１８Ｂ】リンパ腫細胞系統Ｓｕ−ＤＨＬ４のＢＨ３プロフィールを示す棒グラフである。
【図１８Ｃ】リンパ腫細胞系統Ｓｕ−ＤＨＬ６のＢＨ３プロフィールを示す棒グラフである。
【図１８Ｄ】リンパ腫細胞系統Ｓｕ−ＤＨＬ８のＢＨ３プロフィールを示す棒グラフである。
【図１８Ｅ】リンパ腫細胞系統Ｓｕ−ＤＨＬ１０のＢＨ３プロフィールを示す棒グラフである。
【図１９】図１９Ａは、ＡＢＴ−７３７に対する細胞感受性を示す線グラフである。図１９Ｂは、ビンクリスチンに対する細胞感受性を示す線グラフである。
【図２０Ａ】ミトコンドリア系および細胞系ＢＨ３プロファイリングの比較を示す、一連の棒グラフである。
【図２０Ｂ】ミトコンドリア系および細胞系ＢＨ３プロファイリングの比較を示す、一連の棒グラフである。
【図２０Ｃ】ミトコンドリア系および細胞系ＢＨ３プロファイリングの比較を示す、一連の棒グラフである。
【図２０Ｄ】ミトコンドリア系および細胞系ＢＨ３プロファイリングの比較を示す、一連の棒グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
2009532033.tif 000054
【図１８Ｅ】
2009532033.tif 000055
【図１９】
2009532033.tif 000056
【図２０Ａ】
2009532033.tif 000057
【図２０Ｂ】
2009532033.tif 000058
【図２０Ｃ】
2009532033.tif 000059
【図２０Ｄ】
2009532033.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月15日(2008.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009532033000001.app
【国際調査報告】
2009532033.tif 000061
2009532033.tif 000062
2009532033.tif 000063
2009532033.tif 000064
2009532033.tif 000065