(57)【要約】本発明は、ラットＴＲＰＭ７遺伝子の単離された核酸およびアミノ酸配列、ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現カセット核酸配列、ラットＴＲＰＭ７遺伝子の核酸およびアミノ酸配列を含む組換え宿主細胞、ならびにＴＲＰＭ７遺伝子およびタンパク質のモジュレーターをスクリーニングする方法に関する。
2009511015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号５、配列番号６、または配列番号７と少なくとも９６％同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、ラット一過性受容体電位チャンネルＴＲＰＭ７の少なくとも１つの機能ドメインをコードする、単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１を含む請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号５を含む請求項１記載の核酸。
【請求項４】
配列番号６を含む請求項１記載の核酸。
【請求項５】
配列番号７を含む請求項１記載の核酸。
【請求項６】
宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と操作可能に結合する、請求項１記載のラット核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが調節配列とアンチセンス方向で操作可能に結合している請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが調節配列とセンス方向で操作可能に結合している請求項６記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項１記載のポリヌクレオチドまたは細胞の子孫を含む宿主細胞。
【請求項１０】
ラットから単離される請求項１記載の核酸。
【請求項１１】
ポリペプチドが発現される条件下で請求項９記載の宿主細胞を培養し、ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドを産生する方法。
【請求項１２】
請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２と少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたラット一過性受容体電位ＴＲＰＭ７ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２である請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号３と少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むイオン輸送ドメイン。
【請求項１６】
アミノ酸配列が配列番号３である請求項１５記載のイオン輸送ドメイン。
【請求項１７】
配列番号４と少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファキナーゼドメイン。
【請求項１８】
アミノ酸配列が配列番号４である請求項１７記載のアルファキナーゼドメイン。
【請求項１９】
ラットＴＲＰＭ７遺伝子を発現する宿主細胞を提供し；
細胞に候補生物活性剤を添加し；
ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現に対する候補生物活性剤の効果を測定することを含む、生物活性剤をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
生物活性剤の不在下での発現のレベルを生物活性剤の存在下での発現レベルと比較することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ラットＴＲＰＭ７タンパク質に結合する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、
ラットＴＲＰＭ７タンパク質を候補生物活性剤と接触させ；
候補生物活性剤のラットタンパク質との結合を測定することを含む方法。
【請求項２２】
ラットＴＲＰＭ７チャンネルを通るイオン流動を増加または減少させる生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、
候補生物活性剤をＴＲＰＭ７タンパク質と接触させ、ここで、ＴＲＰＭ７タンパク質はＴＲＰＭ７チャンネルを形成し；
ＴＲＰＭ７チャンネルに対する候補生物活性剤の機能的効果を測定することを含む、方法。
【請求項２３】
測定が生物活性剤の不在下でのイオン流動を生物活性剤の存在下でのイオン流動と比較することを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
イオンがＣａ２＋である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ＴＲＰＭ７タンパク質を含むラットＴＲＰＭ７チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、
ラットＴＲＰＭ７チャンネルを候補生物活性剤と接触させ；
チャンネルを活性化させ；
生物活性剤がチャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節するかを検出することを含む、方法。
【請求項２６】
チャンネルを生物活性剤と接触させることにより、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を増加させる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
チャンネルを生物活性剤と接触させることにより、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を減少させる、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
ＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、
ＴＲＰＭ７タンパク質をコードする組換え核酸およびこれに操作可能に結合した誘導プロモーターを含む組換え細胞を提供し；
該組換え細胞を誘発して、ＴＲＰＭ７タンパク質を発現させ、ＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルを形成し；
該組換え細胞を候補生物活性剤と接触させ；
チャンネルを活性化し；
チャンネルの一価または二価カチオン性透過性の調節を検出することを含む、方法。
【請求項２９】
細胞を生物活性剤と接触させることにより、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を増加させる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
細胞を生物活性剤と接触させることにより、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を減少させる、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
チャンネルを生物活性剤と接触させることにより、ＴＲＰＭ７タンパク質を含む細胞の膜電位が変更される、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
ＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、
ＴＲＰＭ７タンパク質をコードする組換え核酸およびこれと操作可能に結合した誘導プロモーターを含む組換え細胞を提供し；
該組換え細胞を誘発させてＴＲＰＭ７タンパク質を発現させ、ＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルを形成させ；
組換え細胞を候補生物活性剤と接触させ；
チャンネルを活性化し；
チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を検出することを含む、方法。
【請求項３３】
検出が、細胞内一価または二価カチオンレベルを、ＴＲＰＭ７タンパク質を発現しないが、生物活性剤と接触している細胞における細胞内一価または二価カチオンレベルと比較することを含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ラットＴＲＰＭ７タンパク質の活性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、
候補生物活性剤をＴＲＰＭ７タンパク質と接触させ、ここで該ＴＲＰＭ７タンパク質はＴＲＰＭ７チャンネルを形成し；
無酸素神経細胞死を誘発し；
細胞死を測定することを含む、方法。
【請求項３５】
ラットＴＲＰＭ７タンパク質の活性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、
候補生物活性剤をＴＲＰＭ７タンパク質と接触させ、ここでＴＲＰＭ７タンパク質はＴＲＰＭ７チャンネルを形成し；
細胞に酸素およびグルコースを供与しないことにより細胞死を誘発し；
細胞死を測定することを含む、方法。
【請求項３６】
ＴＲＰＭ７調節剤の効果を評価する方法であって、
薬剤を哺乳動物に投与し；
細胞サンプルを哺乳動物から除去し；
ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現を測定することを含む、方法。
【請求項３７】
ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現を増大させる方法であって：
ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現が増加される生物系を提供し；
該系をラットＴＲＰＭ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットと接触させ、ここで前記ポリヌクレオチドは真核細胞において操作可能なプロモータの制御下にあり；
タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることを含む、方法。
【請求項３８】
虚血損傷のモジュレータに関してスクリーニングする方法であって、
ラットＴＲＰＭ７遺伝子を発現する組換え細胞または細胞系を試験化合物と接触させ；
細胞死の量の増加または減少を検出することを含む、方法。
【請求項３９】
ラットＴＲＰＭ７遺伝子を含む内因性遺伝子配列が破壊されているノックアウトラット。
【請求項４０】
ラット一過性受容体電位チャンネルＴＲＰＭ７をコードする単離された核酸であって、配列番号１を含む単離された核酸、またはその保存的に修飾された変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年１０月６日に出願された米国仮特許出願番号６０／７２４，０６９の恩恵を主張する、２００６年１０月３日に出願された米国出願第  号（全体として本発明の一部として参照される）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野、ならびに医薬品発見および開発に関する。特に、本発明は、ラットＴＲＰＭ７遺伝子の単離された核酸およびアミノ酸配列、ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現カセット核酸配列、ラットＴＲＰＭ７遺伝子の核酸およびアミノ酸配列を含む組換え宿主細胞、およびＴＲＰＭ７遺伝子およびタンパク質のモジュレータについてスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許、公開された出願、技術論文、および学術論文をはじめとする様々な刊行物が本明細書において言及されている。これらの言及される刊行物のそれぞれは、その全体として本発明の一部として参照される。
【０００４】
一過性受容体電位チャンネルＴＲＰＭ７は、体内の様々なプロセスにおいて重要な役割を果たす２０より多いカチオンチャンネルを含むカチオンチャンネルのＴＲＰスーパーファミリーのメンバーである。ＴＲＰチャンネルは、イオン伝導性孔が、電位依存カルシウムチャンネルおよび環状ヌクレオチド依存性チャンネルと類似した、６の膜貫通らせん状セグメントにより形成されている内在性膜タンパク質である。ＴＲＰチャンネルはその相同性に基づいて３つのファミリーに分類される。このファミリーは、短ＴＲＰチャンネルファミリー、ｏｓｍ  ＴＲＰファミリー、および長ＴＲＰファミリーである。長ＴＲＰチャンネルは、チャンネルセグメントの外側に特に長い延長部分を有することにより識別できる。長ＴＲＰチャンネルは、細胞成長、分化および死を調整する重要な制御メカニズムに関与する（Ｍｏｎｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ２００２、１０８：５９５−５９８、Ｈａｒｔｅｎｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０００、２３：１５９−１６６）
【０００５】
ＴＲＰＭ７チャンネルは長ＴＲＰファミリーに属する。ヒトＴＲＰＭ７タンパク質は、最初にＲｕｎｎｅｌｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１  ２９１：１０４３−１０４７）により同定され、キナーゼおよびイオンチャンネル活性を有する二官能性タンパク質として特定された。Ｎａｄｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  ４１１：５９０−５９５）による別の研究において、ＴＲＰＭ７は、細胞の生存に必要とされるＭｇＡＴＰ調節カチオンチャンネルとして特定された。Ｒｕｎｎｅｌｓにより２００２年に発表された論文（Ｒｕｎｎｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４、３２９−３３６）において、ＴＲＰＭ７はカルシウム透過性イオンチャンネルとして記載されている。ＴＲＰＭ７のキナーゼドメインはホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）のＣ２ドメインと直接結合し、４，５−ビホフェート（ＰＤＰ２）（ＰＬＣの基質）は、ＴＲＰＭ７の重要なモジュレーターであることも報告された。ＴＲＰＭ７チャンネルは、哺乳動物細胞において異種発現された場合に、＋５０から＋１００ｍＶまでの非生理電位で顕著な外向き電流を発生させ、−１００から−４０ｍＶの間の負の電位で僅かの内向き電流を発生させる（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５  １２６（２）、１３７−１５０）。ＴＲＰＭ７の定常活性は、ミリモルレベルの細胞内ｍｇＡＴＰおよびＭｇ２＋により調節できると報告されている。ＴＲＰＭ７は、細胞内ＭｇＡＴＰおよびＭｇ２＋の減少により活性化され、高濃度のＭｇＡＴＰおよびＭｇ２＋により阻害される（ＩＣ５０＝約０．６ｍＭ）（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。ＴＲＰＭ７チャンネルは、ＣＨＡＫ、ＣＨＡＫ１、ＬＴＲＰＣ７、ＦＬＪ２０１１７またはＴＲＰ−ＰＬＩＫチャンネルとも呼ばれる。最近になって、ＴＲＰＭ７チャンネルは、虚血性ＣＮＳ損傷および無酸素神経細胞死に関与することが証明されている（Ａａｒｔｓ  ｅｔａｌ、Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００５  １１（２）：  １１６−１２３；Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ  ２００３  １１５：８６３−８７７）。
【特許文献１】米国仮特許出願番号６０／７２４，０６９
【非特許文献１】Ｍｏｎｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ２００２、１０８：５９５−５９８
【非特許文献２】Ｈａｒｔｅｎｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０００、２３：１５９−１６６
【非特許文献３】Ｒｕｎｎｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１  ２９１：１０４３−１０４７
【非特許文献４】Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  ４１１：５９０−５９５
【非特許文献５】Ｒｕｎｎｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４、３２９−３３６
【非特許文献６】Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５  １２６（２）、１３７−１５０
【非特許文献７】Ａａｒｔｓ  ｅｔａｌ、Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００５  １１（２）：  １１６−１２３
【非特許文献８】Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ  ２００３  １１５：８６３−８７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
虚血性傷害、特に卒中を治療するために実行されている有効な治療法はほとんどない。ＴＲＰＭ７ファミリーはこれらの虚血性傷害を治療するための治療法の新しく、興味深い目標の代表である。ヒトおよびマウスＴＲＰＭ７チャンネルが同定されているが、ラットが虚血性障害、たとえば卒中を治療するための薬剤の開発用動物モデルに最適の動物である。従って、ラットＴＲＰＭ７遺伝子およびタンパク質の同定が必要とされている。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は従って、とりわけ、ラットから単離されたラットＴＲＰＭ７遺伝子の核酸およびアミノ酸配列およびラットＴＲＰＭ７遺伝子のモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供する。
【０００８】
一つの態様において、本発明は、ラット一過性受容体電位チャンネルＴＲＰＭ７の少なくとも１つの機能ドメインをコードする単離された核酸を提供する。核酸は、配列番号１、配列番号５、配列番号６または配列番号７と少なくとも９６％同一性を有する核酸配列を含む。いくつかのこのような態様において、ポリヌクレオチドは、ラット一過性受容体電位チャンネルＴＲＰＭ７をコードする。ある態様において、核酸は配列番号１、配列番号５、配列番号６または配列番号７、その補体、またはその保存的に修飾された変異体を含む。
【０００９】
もう一つ別の態様において、本発明は、配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００１０】
もう一つ別の態様において、本発明は、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むイオン輸送ドメインを提供する。
【００１１】
もう一つ別の態様において、本発明は、配列番号４と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアルファキナーゼドメインを提供する。
【００１２】
もう一つ別の態様において、本発明はベクター、例えば、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。他の態様において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞または宿主細胞の子孫を提供する。ある態様において、宿主細胞は真核生物である。他の態様において、発現ベクターは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの配列を制御する調節配列と操作可能に結合しているラットＴＲＰＭ７ポリヌクレオチドを含む。ある態様において、本発明は、ラットＴＲＰＭ７ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ここで、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、宿主細胞、または細胞の子孫におけるポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と操作可能に結合している。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、調節配列とセンスまたはアンチセンス方向に操作可能に結合することができる。
【００１３】
もう一つ別の態様において、本発明は、（ｉ）本明細書において記載される宿主細胞を、ポリペプチドが発現される条件下で培養し；（ｉｉ）その培地中の培養された宿主細胞からポリペプチドを回収することを含むポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００１４】
もう一つ別の態様において、本発明は：（ｉ）ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドを化合物または薬剤と、前記化合物のラットＴＲＰＭ７ポリペプチドとの結合を許容する条件下で接触させて、複合体を形成し、（ｉｉ）複合体の存在を検出することを含む、ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドと結合する化合物または薬剤を同定する方法を提供する。
【００１５】
もう一つ別の態様において、本発明は：ａ）ラットＴＲＰＭ７遺伝子を発現する細胞を提供し；ｂ）生物活性剤候補を細胞に添加し；ｃ）生物活性剤候補のラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現に対する効果を決定することを含む、生物活性剤をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの方法において、決定は、生物活性剤候補の不在下での発現レベルを、生物活性剤候補の存在下での発現レベルと比較することを含む。
【００１６】
もう一つ別の態様において、本発明は、ラットＴＲＰＭ７タンパク質と結合できる生物活性剤についてスクリーニングする方法であって：ａ）ラットＴＲＰＭ７タンパク質および候補生物活性剤を組み合わせ；ｂ）生物活性剤のラットＴＲＰＭ７タンパク質との結合を測定することを含む方法を提供する。
【００１７】
もう一つ別の態様において、本発明は、ラットＴＲＰＭ７チャンネルを通るイオン流動を増加または減少させる生物活性剤についてスクリーニングする方法であって：ａ）候補生物活性剤をＴＲＰＭ７タンパク質と接触させ（ここで、ＴＲＰＭ７タンパク質はＴＲＰＭ７チャンネルを形成する）；ｂ）生物活性剤のＴＲＰＭ７チャンネルに対する機能的効果を測定することを含む方法を提供する。一つの態様において、測定段階は、生物活性剤の不在下でのイオン流動を生物活性剤の存在下でのイオン流動と比較することを含む。
【００１８】
もう一つ別の態様において、本発明は、ＴＲＰＭ７タンパク質を含むラットＴＲＰＭ７チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ａ）ラットＴＲＰＭ７チャンネルを候補生物活性剤と接触させ；ｂ）チャンネルを活性化させ；ｃ）生物活性剤がチャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節するかどうかを検出する段階を含む。一つの態様において、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性は、チャンネルを生物活性剤と接触させることにより増大する。もう一つ別の態様において、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性は、チャンネルを生物活性剤と接触させることにより減少する。
【００１９】
もう一つ別の態様において、本発明は、ＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、ａ）ＴＲＰＭ７タンパク質をコードする組換え核酸およびこれに操作可能に結合した誘導プロモーターを含む組換え細胞を提供し；ｂ）組換え細胞にＴＲＰＭ７タンパク質を発現させ、またＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルを形成させ；ｃ）組換え細胞を候補生物活性剤と接触させ；ｄ）チャンネルを活性化し；ｅ）チャンネルの一価カチオンまたは二価カチオン性透過性の調節を検出することを含む方法を提供する。一つの態様において、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性は、細胞を生物活性剤と接触させることにより増加する。もう一つ別の態様において、チャンネルの一価または二価カチオン性透過性は、細胞を生物活性剤と接触させることにより減少する。もう一つ別の態様において、チャンネルを生物活性剤と接触させると、ＴＲＰＭ７タンパク質を含む細胞の膜電位が変更される。
【００２０】
もう一つ別の態様において、本発明は、ＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルの一価または二価カチオン性透過性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする方法であって、ａ）ＴＲＰＭ７タンパク質をコードする組換え核酸およびこれに操作可能に結合した誘導プロモーターを含む組換え細胞を提供し；ｂ）組換え細胞にＴＲＰＭ７タンパク質を発現させ、またＴＲＰＭ７タンパク質を含むチャンネルを形成させ；ｃ）組換え細胞を候補生物活性剤と接触させ；ｄ）チャンネルを活性化し；ｅ）チャンネルの一価または二価カチオン性透過性を検出することを含む方法を提供する。一つの態様において、検出段階は、細胞内一価または二価カチオンレベルを、ＴＲＰＭ７タンパク質を発現しないが、生物活性剤と接触する細胞における細胞内一価または二価カチオンレベルを比較することを含む。
【００２１】
もう一つ別の態様において、本発明は、ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供し、ここで、前記ポリヌクレオチドは、真核細胞において操作可能なプロモーターの制御下にある。いくつかの発現カセットにおいて、プロモーターはコード配列に対して異種である。いくつかのこのような発現カセットにおいて、プロモーターは組織特異性プロモーターである。他のこのような発現カセットにおいて、プロモーターは誘導プロモーターである。いくつかのこのような発現カセットには、ウイルスベクター中に含まれる。いくつかのこのような発現カセットにおいて、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかのこのような発現カセットはポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００２２】
もう一つ別の態様において、本発明は、ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む細胞を提供し、ここで、前記ポリヌクレオチドは真核細胞において操作可能なプロモーターの制御下にあり、前記プロモーターは前記ポリヌクレオチドに対して異種である。
【００２３】
もう一つ別の態様において、本発明は、ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現を増加させる方法であって、（ｉ）ラットＴＲＰＭ７遺伝子の発現が増加される生体系を提供し；（ｉｉ）ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットと系を接触させ（ここで、前記ポリヌクレオチドは真核細胞において操作可能なプロモーターの制御下にある）；（ｉｉｉ）タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する段階を含む方法を提供する。
【００２４】
もう一つ別の態様において、本発明は、虚血性傷害のモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供し、前記方法は：ラットＴＲＰＭ７遺伝子を発現する組換え細胞または細胞系を試験化合物と接触させ；細胞死の量の増加または減少を検出することを含む。
【００２５】
もう一つ別の態様において、本発明は、ラットＴＲＰＭ７活性のモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供し、前記方法は：前記の細胞または細胞系を試験化合物と接触させ；ラットＴＲＰＭ７産生の量、またはラットＴＲＰＭ７活性の増加または減少を検出し、これにより試験化合物を、ラットＴＲＰＭ７活性のモジュレーターとして同定することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
１．序章
【００２７】
本発明は、とりわけ、ラット組織から同定され、クローンされたＴＲＰＭ７をコードする核酸を提供する。ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドは、カチオンチャンネルのＴＲＰスーパーファミリーのメンバーである。
【００２８】
本発明はまた、とりわけ、ラットＴＲＰＭ７タンパク質のモジュレーター（例えば、アクチベーター、阻害物質、刺激物質、エンハンサー、作動物質、および拮抗物質）についてスクリーニングする方法を提供する。かかるモジュレーターは、神経系疾患および神経学的状態、例えば、卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症、てんかん、脊髄小脳失調、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脳損傷、脊髄損傷、および他の外傷性神経系損傷を包含する虚血性傷害の治療において使用できる。
【００２９】
機能的に、ＴＲＰＭ７チャンネルは、とりわけ、細胞の生存に必要なＭｇ−ＡＴＰ調節二価カチオンチャンネルである。これは、虚血性傷害により引き起こされる神経細胞死において重要な役割を果たす。
【００３０】
構造的に、ＴＲＰＭ７は、ＴＲＰスーパーファミリーの他のメンバーとともに、他の公知のイオンチャンネルから、その異常な構造により区別できる。これらは、イオンチャンネルドメインのＣ末端と結合した酵素ドメインからなる。
【００３１】
ラットからのＴＲＰＭ７の単離および特徴付けは、卒中を包含する、ＴＲＰＭ７活性により調節される疾患のラットモデルを包含する、疾患のラットモデルにおいて次いで試験できる、ＴＲＰＭ７活性のモジュレーターについての分析の手段を提供する。
【００３２】
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生態系（もちろん、様々であり得る）に限定されないと理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、具体例のみを記載する目的であり、制限することをいとしないと理解されるべきである。本明細書および添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に記載しない限り複数形を包含する。従って、たとえば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）］という記載は、２以上の細胞の組み合わせなどを包含する。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、「約」とは、測定可能な値、例えば、一時的な期間などについて言及される場合、特定の値から±２０％または±１０％、さらに好ましくは±５％、なおいっそう好ましくは±１％、およびさらに好ましくは±０．１％の変動を包含し、従って変動は開示された方法を実施するために適切である。
【００３４】
特に記載しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および化学用語は、本発明が関連する分野において通常の知識を有する者により一般的に理解される意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または等しい任意の方法および物質を本発明の試験の実施において使用できるが、好ましい物質および方法は、本明細書において記載される。本発明の記載および請求項において、次の用語が使用される。
【００３５】
「ラットＴＲＰＭ７タンパク質」は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％の、ラットＴＲＰＭ７核酸、例えば、配列番号２において示されるラットＴＲＰＭタンパク質によりコードされるアミノ酸配列に対する同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００３６】
「ラットＴＲＰＭ７タンパク質をコードする核酸」または「ＴＲＰＭ７遺伝子」または「ＴＲＰＭ７核酸」とは、少なくとも９６％、または少なくとも９０％、９５％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２  ％，９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％の、配列番号１、配列番号５、その補体、またはその保存的に修飾された変異体との核酸配列同一性を有する核酸配列を意味する。
【００３７】
ラット一過性受容体電位チャンネルＴＲＰＭ７の少なくとも１つの機能的ドメインをコードする核酸とは、少なくとも９６％、または少なくとも９０％、９５％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％，９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％の、配列番号１、配列番号５、配列番号６、または配列番号７において示されるラットＴＲＰＭ７核酸、その補体、またはその保存的に修飾された変異体に対する核酸配列同一性を有する核酸配列を意味する。
【００３８】
ラット一過性受容体電位チャンネルイオン輸送ドメインは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％アミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％の、配列番号３に対する同一性を有するアミノ酸配列を有するイオン輸送ドメインを意味する。イオン輸送ドメインの活性は、パッチ・クランプ技術を包含する本明細書において記載される方法を用いて決定できる。
【００３９】
ラット一過性受容体電位チャンネルアルファキナーゼドメインとは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、たとえば、少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％の、配列番号４に対する同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファキナーゼドメインを意味する。アルファキナーゼドメインの活性は、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動に基づくキナーゼ分析、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ５０９１７５２００、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２、２００５）から入手可能なＬＡＮＣＥ（商標）分析を包含する周知の技術を用いたリン酸化反応を測定することにより決定できる。
【００４０】
本発明の核酸は、好ましくは、ラット一過性受容体電位チャンネルＴＲＰＭ７、ラットＴＲＰＭ７、またはその機能的等価物の少なくとも１つの機能的ドメインをコードする。好ましい実施形態において、これらは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０６０１４２およびＮＰ＿０６７４２５により表されるものを包含する、ヒトまたはマウスＴＲＰＭ７タンパク質をコードしない。好ましい実施形態において、本発明の核酸は、マウスまたはヒトＴＲＰＭ７  核酸配列、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１７６７２．２およびＮＭ＿０２１４５０．１により表されるものを包含しない。
【００４１】
ラットＴＲＰＭ７ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、天然に存在するか、または天然に存在しない。これは、ラットから単離することができるか、または合成により構築することができる。
【００４２】
「発現ベクター」は、組み換えまたは合成により生成された、宿主細胞において特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸エレメントを有する核酸構築物である。発現ベクターはプラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターはプロモーターに操作可能に転写される核酸を包含する。
【００４３】
「機能的効果」なる語句は、ＴＲＰＭ７チャンネルに影響を及ぼす化合物を試験するための分析に関連して、チャンネルの影響下で、間接的または直接的である任意のパラメータの測定を包含する。これは、イオン流動および膜電位の変化、リガンド結合の変化、および他の生理学的効果、例えば、試験化合物の投与後の細胞死の増加または減少を包含する。
【００４４】
「機能的効果の決定」とは、ＴＲＰＭ７チャンネルに対する化合物の機能的効果を決定することを意味する。このような機能的効果は、当業者に公知の手段、例えば、パッチクランピング、膜電位感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導マーカーなどにより測定することができる。
【００４５】
細胞におけるラットＴＲＰＭ７遺伝子およびその遺伝子産物の「阻害物質」、「アクチベーター」、および「モジュレーター」とは、ＴＲＰＭ７チャンネル機能についての分析を用いて同定される抑制または活性化分子を意味する。阻害物質は、活性化を減少、ブロック、防止、遅延させるか、チャンネルを不活性化するか、減感するか、または下方制御する化合物である。アクチベーターは、チャンネル活性を増加、開放、活性化、促進、向上、または上方制御する化合物である。このような阻害物質およびアクチベーターについての分析は、例えば、細胞または細胞膜におけるＴＲＰＭ７の発現、および次にチャンネルを通るイオン流動の測定および分極における変化（すなわち、電位）の決定を包含する。このような分析はさらに、ＴＲＰＭ７を発現する細胞をＴＲＰＭ７活性の推定モジュレーターと接触させた後の細胞死を測定することも含む。阻害の程度を調べるために、ＴＲＰＭ７チャンネルを含むサンプルまたは分析を電位アクチベーターまたは阻害物質で処理し、阻害物質を含まないサンプルと比較する。対照サンプル（阻害物質で処理されていない）は、１００％の相対的ＴＲＰＭ７活性値が割り当てられる。チャンネルの阻害は、対照に対するＴＲＰＭ７活性値が約９０％以下、任意に約８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、または２５−０％である場合に達成される。ＴＲＰＭ７を含むチャンネルの活性化は、対照に対するＴＲＰＭ７活性値が、約１１０％、任意に１２０％、１３０％、１４０％、１５０％以上、２００−５００％以上、１０００−３０００％以上である場合に達成される。
【００４６】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合、「組換え体」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入あるいは天然の核酸またはタンパク質の変更により修飾されるか、あるいは細胞がこのように修飾された細胞から誘導されることを示す。従って、例えば、組換え体細胞は、それ以外の方法では異常に発現されるか、発現が減少するか、または全く発現されない、天然（非組換え体）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現する。
【００４７】
「プロモーター」は、核酸の転写を行う核酸制御配列のアレイとして定義される。本明細書において用いられる場合、プロモーターは、転写の開始部位付近の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩタイププロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントを包含する。プロモーターはさらに、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントであって、転写の開始部位から数千塩基対もの位置にあるものを任意に含んでもよい。
【００４８】
「構成」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境または発生規制下で活性なプロモーターである。
【００４９】
「操作可能に結合した」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）および第二の核酸配列間の機能的結合であって、発現制御配列が第二の配列に対応する核酸の転写を行うものを意味する。
【００５０】
「異種」なる用語は、核酸の部分に関して用いられる場合、核酸が、事実上、互いに同じ関係でない２以上の物質を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には、組み換えにより産生され、新規機能性核酸、例えば、１つの供給源からのプロモーターおよび別の供給源からのコーディング領域を形成するために配列された関係のない遺伝子からの２以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、事実上、互いに同じ関係でない２以上の物質（例えば、融合タンパク質）を含むことを示す。
【００５１】
「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるもの）、ビオチン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよびタンパク質であって、これに関して抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能であるものを包含する（例えば、図において示されるポリペプチドは、たとえば、放射性標識をペプチド中に組み入れることにより検出可能にすることができ、ペプチドと特異的に反応性である抗体を検出するために使用できる）。
【００５２】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーであって、一本鎖または二本鎖形態のいずれかであるものを意味する。この用語は、公知ヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合を含有する核酸であって、合成によるもの、天然に存在するもの、天然に存在しないものであり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと類似の方法で代謝されるものを包含する。かかる類似体の例は、制限無く、ホスホルチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）を包含する。
【００５３】
特に記載しない限り、特定の核酸配列も暗に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明確に表示された配列を包含する。特に、縮重コドン置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの第三位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成させることにより達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１  （１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８  （１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８  （１９９４））。核酸なる用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドとほとんど同じ意味で使用される。
【００５４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書においてはほとんど同じ意味で使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００５５】
「同一」または「同一性」（％）は、２以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で、２以上の配列またはサブ配列であって、同じであるか、または特定のパーセンテージのアミノ酸残基を有するもの、または次の配列比較アルゴリズムの１つを使用するか、または手作業で並べ、目視で調べることにより、比較ウインドウ、あるいは所定の領域全体にわたって最大対応のために比較し、並べた場合、同じ（すなわち、７０％  同一性、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性あるいは特定の領域にわたってそれ以上）であるヌクレオチドである。このような配列は、したがって、「実質的に同一」と言われる。この定義は、試験配列も意味する。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドである領域、またはさらに好ましくは、長さが５０−１００アミノ酸またはヌクレオチドである領域全体にわたって存在する。ほとんどの好ましい実施形態において、配列は、例えば、コーディング領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００５６】
配列比較のためには、典型的には、１つの配列は、これに対して試験配列が比較される参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピューターに入力し、配列整合、必要ならば、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用できるか、別のパラメータを指定できる。配列比較アルゴリズムは次にプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性（％）を計算する。
【００５７】
本明細書において用いられる場合、「比較ウインドウ」とは、２０から６００、通常約５０から約２００、さらに通常約１００から約１５０からなる群から選択される連続した位置の数のいずれか１つのセグメントについての言及を包含し、ここで、２つの配列を最適に整列させた後、配列を同じ数の連続した位置の参照配列を比較することができる。比較のための配列の整列法は当該分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  １９８１、２：４８２，）の局所相同性アルゴリズム、（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９７０，４８：４４３）の相同性整列アルゴリズム、（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９８８、８５：２４４４）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、または手作業での整列および目視検査（ｓｅｅ、ｅ．ｇ．、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ，２００５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）により行うことができる。
【００５８】
配列同一性および配列類似性（％）を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９７７，２５：３３８９−３４０２、ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０、２１５：  ４０３−４１０）において記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を本明細書において記載されるパラメータとともに使用して、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性（％）を決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎＬｔｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列（データベース配列における同じ長さのワードと並べた場合に、ある正の閾値Ｔと適合するか、またはＴを満たすかのいずれかである）において長さＷのショートワードを同定することにより、まず高得点の配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、ｓｕｐｒａ）。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含有するさらに長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとしての作用をする。累積整列スコアが増加し得る限り、ワードヒットは各配列にそって両方向に広がっている。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（マッチする残基ついについての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの拡張は：累積整列得点が、最大の達成された値から量Ｘ減少する場合；１以上の負の得点の残基整列の蓄積のために、累積スコアが０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に中断される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１の語長、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ−４および両ストランドの比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３の語長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９８９、８９：１０９１５参照）５０の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較を使用する。
【００５９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはさらに、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９９３，９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの目安は、最小合計確立（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然起こる確率の目安となる。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較において最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であるならば、核酸は参照配列と類似していると見なされる。
【００６０】
有用なアルゴリズムのもう一つ別の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性および配列同一性（％）を示す漸進的な対ごとのアラインメントを用いて、関連配列の群から複数の配列整列を形成する。これはさらに、アラインメントを形成するためのクラスター化関係を示す、系図またはデンドグラムをプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １９８７、３５：３５１−３６０）の漸進的アラインメント法の単純化を使用する。使用される方法は、（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ、ＣＡＢＩＯＳ  １９８９、５：１５１−１５３）により記載されている方法と類似している。プログラムは、３００配列まで整列することができ、それぞれの最大長さは５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸である。多重アラインメント法は、２つの最も類似した配列の対ごとのアラインメントで始め、２つの整列された配列のクラスターを得る。このクラスターをその後、次に最も関連した配列または整列された配列のクラスターと配列させる。配列の２つのクラスターを、２つの個々の配列の対ごとのアラインメントの単純な拡張により整列させる。最後のアラインメントは、一連の漸進的な対ごとのアラインメントにより得られる。特定の配列および配列比較の領域についてのそのアミノ酸またはヌクレオチド配位を指定し、プログラムパラメータを指定することにより、プログラムを実行する。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列を他の試験配列と比較して、次のパラメータを使用して配列同一性関連性（％）を決定する：デフォルトギャップ重量（３．００）、デフォルトギャップ長重量（０．１０）、および加重エンドギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０から得ることができる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８４，１２：３８７−３９５）。
【００６１】
２つの核酸配列またはポリペプチドが、第一核酸によりコードされるポリペプチドと実質的に同一であるという表現は、以下に記載されるような第二核酸によりコードされるポリペプチドに対して得られた抗体と免疫学的に交差反応性である。従って、ポリペプチドは典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる第二ポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるというもう一つ別の表現は、２つの分子またはその補体が以下に記載するようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の表現は、配列を増幅するために同じプライマーを使用できるということである。
【００６２】
本発明の核酸は全細胞、細胞溶解物において存在するか、あるいは部分的に精製された形態または実質的に純粋な形態において存在し得る。他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該分野において周知の他の技術を包含する標準的技術により精製された場合に、核酸は「単離」されているか、または「実質的に純粋にされる」（例えば、本明細書において記載されるＳａｍｂｒｏｏｋ、ＴｉｊｓｓｅｎおよびＡｕｓｕｂｅｌ参照）。一例において、生きている動物において存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系において共存する物質の一部または全部から分離される同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であるか、または組成物の一部であり、組成物のこのようなベクターがその天然の環境の一部でないという点でさらに単離されている。本明細書において用いられるように、単離された物質または組成物は、「精製された」組成物でもある。すなわち、これは絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対的な定義を目的とする。
【００６３】
本発明の核酸配列および本発明を実施するために使用される他の核酸（ＲＮＡか、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらのハイブリッド）を、種々の供給源から単離し得、遺伝子操作し得、増幅し得、および／または組換え的に発現させ得る。任意の組換え発現系が使用され得、これには細菌（例えば、酵母）に加えて、昆虫、または哺乳動物系が含まれる。あるいは、これらの核酸を、インビトロで化学的に合成し得る。核酸操作のための技術（例えば、発現ベクター中へのサブクローニング、プローブの標識化、配列決定、およびハイブリダイゼーションなど）が、科学技術文書および特許文書に十分に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＴｉｊｓｓｅｎおよびＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと）。核酸は、当業者に周知の多くの任意の一般的手段によって、分析され得、そして定量され得る。これらとしては、例えば、ＮＭＲ、分光測光法、Ｘ線撮影法、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法（例えば、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散法（単一または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ）、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸または標的またはシグナル増幅方法、放射性標識化、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィーのような生化学的分析方法が挙げられる。
【００６４】
「組換え宿主細胞」（または単純に、「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞をいう。このような用語は、特定の被験細胞のみならず、このような細胞の子孫をもいうことを意図することが理解されるべきである。特定の改変は、変異または環境のいずれかの影響に起因して、後の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお本明細書中で使用されるような用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００６５】
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物をさす。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学構造、すなわち、水素と結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造と異なるが、天然に存在するアミノ酸と類似した方法で機能する構造を有する化合物を意味する。
【００６６】
アミノ酸は、ＩＵＰＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨される、その一般的に知られている３文字記号または１文字記号のいずれかにより本明細書において記載される。ヌクレオチドも同様に、その一般的に承認されている１文字コードにより言及することができる。
【００６７】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の拡散配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一である配列を意味する。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一である核酸は任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンｄＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定される全ての位置は、コードされたポリペプチドを変更することなく記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸変化は、「サイレントバリエーション」であり、これは保存的に修飾された変化の一種である。本明細書において記載されるすべての核酸配列であって、ポリペプチドをコードするものは、あらゆる可能な核酸のサイレントバリエーションも説明する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同じ分子を得ることができることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレントバリエーションは、実際のプローブ配列に関してではなく、発現産物に関するそれぞれの記載された配列に関係する。
【００６８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加（コードされた配列において１つのアミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸を変更、付加または欠失させる）は「保存的に修飾された変異体」であり、ここで、変更の結果、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換されることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は当該分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加され、これらを排除しない。
【００６９】
次の８つの群のそれぞれは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン  （Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）  セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）  システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４参照）。
【００７０】
巨大分子構造、例えば、ポリペプチド構造は、様々なレベルの組織化に関連して記載することができる（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ３：  １９９４）および（Ｃａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔｉ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９８０参照）。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をさす。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に秩序化された、三次元構造を意味する。これらの構造は、一般的に、ドメイン、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、貫膜ドメイン、ポアドメイン、および細胞質尾部ドメインと呼ばれる。ドメインは、ポリペプチドの小さな単位を形成するポリペプチドの部分であり、典型的には、１５から３５０アミノ酸長である。ドメインの例は、酵素活性を有するドメイン、例えば、キナーゼドメインを含む。典型的なドメインは、組成よりも小さなセクション、例えば、３−シートおよびα−へリックスから構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を意味する。「四次構造」とは、独立した第三単位の非共有結合により形成される三次元構造を意味する。異方性項は、エネルギー項としても知られる。
【００７１】
特定の核酸配列も暗に「スプライス変異体」を包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は暗に、この核酸のスプライス変異体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。「スプライス変異体」は、名称として、遺伝子の選択的スプライシング産物である。転写後、異なる（代替）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするように、当初の核酸転写物をスプライスすることができる。スプライス変異体産生のメカニズムは様々であるが、エクソンの交互スプライシングを包含する。リードスルートランスクリプションにより同じ核酸から誘導される代替ポリペプチドはすべてこの定義に含まれる。スプライシング反応の任意の産物、例えば、スプライス産物の組換え体も本発明において想定される。
【００７２】
「〜に対して選択的（または、特異的）にハイブリダイズする」なる語は、配列が複雑な混合物（例えば、総細胞性またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列にのみ分子が結合すること、二重鎖形成すること、またはハイブリダイズすることをいう。
【００７３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」なる語は、典型的には複雑な核酸混合物中で、プローブがその標的部分配列に対してハイブリダイズするが、他の配列には結合しない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、例えば、以下において見出される：Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ、１９９３。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度ｐＨでの特定の配列に対する熱融点（Ｔm）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔmは、標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（Ｔmで標的配列は過剰に存在し、プローブの５０％が平衡状態で占められるような）温度である（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）。ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤、例えば、ホルムアミドを添加することにより達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、ポジティブシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を包含する：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴う。
【００７４】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一ならば、実質的に同一である。このことは、例えば、遺伝子コードにより許容される最大コドン縮重を用いて核酸のコピーが産生される場合に起こる。このような場合において、核酸は典型的には適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例は、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中、３７℃、および１ｘＳＳＣ中４５℃で洗浄を含む。正のハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用して、類似のストリンジェンシーの条件を提供できることが容易にわかるであろう。
【００７５】
無傷の「抗体」は、ジスフィルド結合によって内部連結された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）からなる。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域からなる。この重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域からなる。この軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域を散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得る。各々のＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。用語抗体は、ＴＲＰＭ７に結合する能力を保持する無傷の抗体の抗原結合部位を含む。結合の例は以下である：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスフィルドブリッジによって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【００７６】
「単鎖抗体」または「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」とは、さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨの抗体融合分子である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは、独立した遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、単一のタンパク質鎖として作製し得る合成リンカーによってこれらは連結され得、ここで、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対をなして一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。このような単鎖抗体は、参考文献によって用語「抗体」に含まれる。組換え技術または無傷の抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、フラグメントを調製し得る。
【００７７】
用語「ヒト配列抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発あるいはインビボの体性（ｓｏｍａｔｉｃ）変異誘発によって誘導された変異）。このような抗体は、非ヒトトランスジェニック動物において、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０１／１４４２４およびＷＯ  ００／３７５０４において記載されているように生成させることができる。しかし、本明細書中で使用される場合、用語「ヒト配列抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に接がれた抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含むことを意図しない。
【００７８】
さらに、組換え体免疫グロブリンも産生できる（Ｓｅｅ、Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許番号４，８１６，５６７）；および（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９８９、８６：  １００２９−１００３３）参照。
【００７９】
「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する、単一の結合特異性を示す抗体をいう。１つの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化した細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００８０】
用語「ポリクローナル抗体」は、ヒトＴＲＰＭ７に対する１より多い（２以上）の異なる抗体の調製物をいう。このような調製物は、ある範囲の異なるエピトープに結合する抗体を含む。ＴＲＰＭ７に対する抗体は、ラットＴＲＰＭ７上のエピトープと結合して、ＴＲＰＭ７を阻害することができる。本発明における使用に適したこれらおよび他の抗体は、当該分野において周知の方法に従って調製できる、および／または本明細書において言及される文献において記載されている。
【００８１】
本発明のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製に関して、当該分野において公知の任意の技術を使用できる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｉ、Ｎａｔｕｒｅ  １９７５、２５６：  ４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９８３、４：  ７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ、モノクローナル
ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９８５、７７−９参照）。単鎖抗体を産生するための技術（米国特許番号４，９４６，７７８）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適応させることができる。さらに、トランスジェニックマウス、または他の生命体、例えば、他の哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現することができる。別法として、ファージディスプレー技術を用いて、抗体および選択された抗原に特異的に結合するヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９０、３４８：  ５５２−５５４；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９２、１０：  ７７９−７８３参照）。
【００８２】
「抗ラットＴＲＰＭ７」抗体は、ラットＴＲＰＭ７遺伝子、ｃＤＮＡ、またはそのサブ配列によりコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【００８３】
「イムノアッセイ」は、抗原と特異的に結合するために抗体を使用する検定である。イムノアッセイは、抗原の単離、標的化、および／または定量化のための、特定の抗体の特異的結合特性の使用により特徴づけられる。
【００８４】
「一価カチオンインジケーター」とは、細胞膜に容易に浸透できるかまたは他の方法で、例えばリポソームなどにより細胞中に輸送されやすく、細胞中に入ると、蛍光シグナル、または他の検出可能なシグナルを示す分子、すなわち、一価カチオンとの接触により増進または消光される分子を意味する。本発明において有用な一価カチオンインジケーターの例は、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．  Ｐ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＰｒｏｂｅｓおよびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．、９ｔｈ  ｅｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ  Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、（２００１）において記載されている。
【００８５】
「二価カチオンインジケーター」とは、細胞膜に容易に浸透できるかまたは他の方法で、例えばリポソームなどにより細胞中に輸送されやすく、細胞中に入ると、蛍光シグナル、または他の検出可能なシグナルを示す、すなわち、二価カチオンとの接触により増進または消光される分子を意味する。
【００８６】
ペプチドに関して言及される場合、「特異的な結合」または「特異的に結合する」なる語は、標的分子に対する中間の結合親和性または高い結合親和性を有する、排他的または優勢なペプチド分子をいう。「特異的に結合する」なる語は、タンパク質および他の生物工学製品の異種性集団の存在下での標的タンパク質の存在に決定的な結合反応をいう。従って、指定されたアッセイ条件下で、特定された結合部分は、特定の標的タンパク質に優先的に結合し、そして試験サンプルに存在する他の成分に有意な量では結合しない。このような条件下で、標的タンパク質に対する特異的な結合は、特定の標的抗原に対するその特異性について選択される結合部分を必要とし得る。種々の検定形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に反応するリガンドを選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫検定、免疫沈降、Ｂｉａｃｏｒｅおよびウエスタンブロットを使用して、抗原と特異的に反応するペプチドを同定し得る。典型的には、特異的反応または選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナルまたはノイズであり、そしてより典型的には、１０倍のバックグラウンドである。
【００８７】
物体に適用される場合、用語「天然に存在する」は、物体が天然に見出され得る事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得そして、実験室において作為的に改変されなかった生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００８８】
本発明は、組換え遺伝子工学の分野における慣用の技術に依存する。本発明において有用な一般的方法を開示する基本的テキストは、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２：  １９８９；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  ＴｒａｎｓｆｅｒおよびＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９９０；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００５）を包含する。
【００８９】
ラットＴＲＰＭ７遺伝子、核酸および多型変異体であって、本発明において提供される配列と実質的に同一であるものは、ラットＴＲＰＭ７核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で使用して、ライブラリーをスクリーニングすることにより単離できる。別法として、発現ライブラリーを使用して、免疫学的に発現された相同体をラットＴＲＰＭ７遺伝子および遺伝子産物またはその一部に対して作成された抗血清あるいは精製抗体で検出することにより、ラットＴＲＰＭ７タンパク質（多型変異体を包含する）をクローンすることができる。
２．ラットＴＲＰＭ７をコードする遺伝子の単離
Ａ．一般的組換えＤＮＡ法
【００９０】
本発明を実施するために使用される核酸は、遺伝子組換え、増幅、および／または発現／遺伝子組み換えされたラット組織から単離できる。これらの核酸から生成された組換えポリペプチドは個々に単離でき、望ましい活性について試験することができる。任意の組換え発現系を使用できる。
【００９１】
別法として、これらの核酸は、例えば、（例えば、Ａｄａｍｓ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９８３、１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ、核酸  Ｒｅｓ．  １９９７、２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９９５，１９：  ３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９４、３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９７９  ６８：９０；Ｂｒｏｗｎ  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９７９、６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．  １９８１、２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学的合成技術によりインビトロで合成できる。
【００９２】
核酸の操作についての技術、例えば、サブクローニング、標識プローブ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用したランダム−プライマー標識、ニック翻訳、増幅）、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどは科学および特許文献において十分に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ、２００５（前出）参照）。
【００９３】
ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドおよび核酸は本明細書において記載される検定において使用される。例えば、組換え体ラットＴＲＰＭ７は、ラットＴＲＰＭ７を構造的に発現する組織を調製するために使用できる。このようなポリペプチドおよび核酸は、組換え遺伝子工学の慣例的技術を用いて調製できる。
【００９４】
商業的に入手可能なオリゴヌクレオチドは、（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．  １９８１、２２：  １８５９−１８６２、１９８１）により最初に記載された、固相ホスホルアミダイトトリエステル法にしたがい、（Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８４、１２：  ６１５９−６１６８）において記載されているような自動化合成器を用いて合成できる。オリゴヌクレオチドの精製は、典型的には、（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  １９８３、２５５：  １３７−１４９）に記載されるように、天然のアクリルアミドゲル電気泳動によるか、またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる。クローンされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、（Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  １９８１、１６：２１−２６）の二本鎖テンプレートを配列化するためのチェーン・ターミネーション法を用いてクローニング後に検証できる。ここでも、前述のように、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．などの企業が基本的に任意のオリゴヌクレオチドの安価な商業的供給源を提供する。
【００９５】
クローンされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  １９８１、１６：２１−２６の二本鎖テンプレートを配列化するためのチェーン・ターミネーション法を用いてクローニング後に検証できる。
Ｂ．ラットＴＲＰＭ７をコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニング法
【００９６】
一般に、興味のある遺伝子をコードする核酸、例えば、ラットＴＲＰＭ７は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーから、プローブでのハイブリダイゼーションによりクローンされるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーを使用した増幅技術を用いて単離される。ラットＴＲＰＭ７配列は、典型的には、ラット核酸（ゲノムまたはｃＤＮＡ）ライブラリーから、その配列が本明細書において提供される配列から誘導できる核酸プローブを用いてハイブリダイズすることにより単離される。
【００９７】
プラマーを用いた増幅技術は、例えば、核酸コード化ラットＴＲＰＭ７のＤＮＡまたはＲＮＡからの増幅および単離にも使用できる（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｆａｃｈ  ｅｔ  ａｌ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９９５参照）。これらのプライマーは、例えば、完全長配列または１００から数百ヌクレオチドのプローブのいずれかを増幅するために使用でき、これは次に、哺乳動物ライブラリーを最適の完全長核酸についてスクリーニングするために使用される。例えば、縮重プライマーセットを使用して、ラットＴＲＰＭ７核酸を単離できる。核酸は、抗体をプローブとして使用して発現ライブラリーから単離することもできる。このようなポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、配列番号２の配列を用いて調製できる。
【００９８】
ｃＤＮＡライブラリーを作成するためには、ＴＲＰＭ７  ｍＲＮＡが豊富な供給源を選択すべきである。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡを次にｃＤＮＡ中に作成し、組換え体ベクター中に結紮し、増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主調製物中にトランスフェクトする。ｃＤＮＡライブラリーを作成し、スクリーニングするための方法は周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｇｅｎｅ  １９８３、２５：  ２６３−２６９，；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、ｓｕｐｒａ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  （前出）参照）。
【００９９】
ゲノムライブラリーに関して、ＤＮＡを組織から抽出し、機械的に剪断するか、または酵素により消化して、約１２−２０ｋｂのフラグメントを得る。フラグメントを次に勾配遠心分離により望ましくないサイズから分離し、非ラムダ発現ベクターに構築する。これらのベクターをインビトロでパッケージする。組換えファージを（Ｂｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７７、１９６：１８０−１８２）において記載されているようなプラークハイブリダイゼーションにより分析する。コロニーハイブリダイゼーションを（Ｇｒａｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９７５  ７２：３９６１−３９６５）において一般的に記載されているようにして行う。
【０１００】
核酸およびその相同体を単離する別の方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用およびＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートの増幅を組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０参照）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの方法を用いて、ラットＴＲＰＭ７などの核酸配列をｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから直接増幅することができる。本発明において提供される配列を使用して、ラットＴＲＰＭ７相同体を増幅するために、縮重オリゴヌクレオチドを設計することができる。制限エンドヌクレアーゼ部位をプライマー中に組み入れることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法は、例えば、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローンするため、生理学的試料におけるｍＲＮＡをコードするＴＲＰＭ７の存在を検出し、核酸配列化または他の目的のためにプローブとして使用するための核酸を調製するためにも有用である。ＰＣＲ反応により俗服された遺伝子は、アガロースゲルから精製し、適切なベクター中にクローンすることができる。
【０１０１】
前述のように、ラットＴＲＰＭ７の遺伝子発現は、当該分野において公知の技術、例えば、ｍＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ増幅およびｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ＋  ＲＮＡの単離、ノーザン・ブロッティング、ドット・ブロッティング、インサイ・チュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、高密度オリゴヌクレオチドのプローブ化などによっても分析できる。
これらの技術はすべて当該分野において標準的である。
【０１０２】
プローブとして使用するため、またはタンパク質の発現のための組換え遺伝子を構築するために、合成オリゴヌクレオチドを用いることができる。この方法は、一連の重複オリゴヌクレオチド（通常長さ４０−１２０ｂｐであり、遺伝子のセンスおよび非センスストランドを表す）を用いて行われる。これらのＤＮＡフラグメントを次にアニールし、結紮し、クローンする。別法として、ＴＲＰＭ７核酸の特異的サブ配列を増幅するための正確なプライマーを用いて、増幅技術を用いることができる。特異的サブ配列は次に発現ベクター中に結紮される。
【０１０３】
最適のタンパク質をコードする核酸は典型的には、複製および／または発現のために、原核または真核細胞中へ形質転換される前に中間ベクター中にクローンされる。これらの中間ベクターは、典型的には、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクターである。任意に、細胞を、操作可能に構成的プロモーターに結合した組換えＴＲＰＭ７でトランスフェクトして、培養された細胞においてより高レベルのＴＲＰＭ７発現を得ることができる。
Ｃ．原核生物および真核生物における発現
【０１０４】
クローンされた遺伝子または核酸、例えば、ラットＴＲＰＭ７をコードするｃＤＮＡの高レベルの発現を得るために、典型的には、転写を行うための強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸に関する場合、転写開始のリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中に、ラットＴＲＰＭ７をクローンする。好適な細菌プロモーターは当該分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．において記載されている。かかる発現系用キットは商業的に入手可能である。ラットを包含する哺乳動物細胞の真核性発現系は当該分野において周知であり、商業的に入手可能でもある。
【０１０５】
異種核酸の発現を行うために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。プロモーターは、好ましくは、その自然環境における転写出発部位から得られたそのままで、異種転写開始部位からほぼ同じ距離離れた位置にある。しかしながら、当該分野において公知のように、この距離におけるある変動はプロモーター機能を失うことなく調整することができる。プロモーターは、典型的には、トランス活性化に反応性であるエレメント、例えば、低酸素反応性エレメント、Ｇａｌ４反応性エレメント、ｌａｃリプレッサー反応性エレメントなども包含し得る。プロモーターは、構成または誘導性相同体であり得る。
【０１０６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的には転写単位または発現カセットであって、宿主細胞における核酸の発現に必要な全ての追加のエレメントを含有するものを含有する。典型的な発現カセットは、従って、例えば、ラットＴＲＰＭ７をコードする核酸配列に操作可能に結合したプロモーター、および転写産物の有効なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルを含有する。カセットの追加のエレメントは、エンハンサー、および、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用されるならば、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンを含み得る。
【０１０７】
プロモーター配列に加えて、有効な終結を提供するために、発現カセットは、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有するべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得ることができる。
【０１０８】
遺伝子情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは特に重要ではない。真核または原核細胞における発現に使用される通常のベクターを使用できる。標準的細菌発現ベクターは、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、および融合発現系、例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺを包含する。エピトープタグも組換えタンパク質に添加してｃ−ｍｙｃなどの通常の単離法を提供できる。
【０１０９】
真核性ウイルスからの調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的には、真核性発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭種ウイルスベクター、およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の真核性ベクター例は、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バクロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが証明されている他のプロモーターの指示下でのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを包含する。
【０１１０】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー、例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸還元酵素を有する。あるいは、ラットＴＲＰＭ７コード化配列を使用して、ポリへドリンプロモーターまたは他の強力なバクロウイルスプロモーターの指示下で、昆虫細胞においてバクロウイルスベクターを使用するなど、遺伝子増幅を含まない高収率発現系も適している。
【０１１１】
典型的には発現ベクター中に含まれるエレメントはさらに、イー・コリにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にするために抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における独自の制限部位も含む。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該分野において公知の多くの耐性遺伝子のいずれかが適している。原核配列は、好ましくは、必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製を妨害しないように選択される。
【０１１２】
大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、例えば、ラット、酵母または昆虫細胞系を産生するために、標準的なトランスフェクション法が使用され、標準的技術を用いてこの細胞系を次に精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８９、２６４：１７６１９−１７６２２；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  タンパク質  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９０、１８２参照）。真核および原核細胞の形質転換は、標準的技術に従って行われる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １９７７、１３２：  ３４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：  ３４７−３６２、ａｎｄ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ、１９８３参照）。
【０１１３】
異種ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための周知の手順のいずれかを使用できるこれらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウイルスベクターならびにクローンされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の異種遺伝物質を宿主細胞中に導入するために他の周知の方法のいずれかの使用を包含する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．上記参照）。使用される特定の遺伝子組換え法が、最適のタンパク質を発現できる宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子をうまく導入できることのみが必要とされる。
３．ペプチドおよびポリペプチド
【０１１４】
発現ベクターが細胞中に導入された後、トランスフェクトされた細胞を、ラットＴＲＰＭ７タンパク質（以下に特定される標準的技術を用いて培養物から回収できる）の発現に適した条件下で培養する。
【０１１５】
本発明は、とりわけ、ラットＴＲＰＭ７ポリペプチド、例えば本発明のポリペプチドの活性を阻害する方法を提供する。本発明は、とりわけ、ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドの活性を阻害するか、またはラットＴＲＰＭ７ポリペプチドと結合する（例えば、活性部位と結合する）組成物に関してスクリーニングする方法も提供する。
【０１１６】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ラットＴＲＰＭ７活性および細胞を酸素および／またはグルコース除去から保護するための薬剤についてスクリーニングするために、組み換えにより、インビトロまたはインビボで発現することができる。
【０１１７】
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、天然源から単離できるか、合成できるか、もしくは組換え技術により生成されたポリペプチドである。ペプチドおよびタンパク質は、インビトロまたはインビボで組換え技術により発現することができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、当該分野において公知の任意の方法を用いて調製でき、単離できる。本発明のポリペプチドおよびペプチドは、全体または一部において、当該分野において周知の化学的方法を用いて合成することもできる。例えば、（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ    Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２１５−２２３、１９８０；Ｈｏｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ    Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２２５−２３２、１９９０；Ｂａｎｇａ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９５）参照。例えば、ペプチド合成は、様々な固相技術を用いて行うことができ（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：  ２０２、１９９５；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：  ３−１３、１９９７）、自動化合成を、例えば、ＡＢＩ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造業者により提供される使用説明書に従って使用して行うことができる。
【０１１８】
ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基のかわりに全てのまたはいくつかの非天然残基を含有することにより、模倣物として特徴づけることもできる。非天然残基は科学文献および特許文献において十分に記載されており；天然アミノ酸残基の模倣物として有用な非天然組成物の数例およびガイドラインを以下に記載する。芳香族アミノ酸の模倣物は、例えば、Ｄ−またはＬ−ナフィルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−またはＬ−１、−２，３−、または４−ピレネイルアラニン；Ｄ−またはＬ−３  チエニルアラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−またはＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；および、Ｄ−またはＬ−アルキルアミン（アルキルは置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−イソチル、ｉｓｏ−ペンチル、または非酸性アミノ酸であってよい）を置換することにより生成させることができる。非天然アミノ酸の芳香環は、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環を包含する。
【０１１９】
酸性アミノ酸の模倣物は、例えば、非カルボキシレートアミノ酸（負の電荷を維持しつつ）；（ホスホノ）アラニン；硫酸化トレオニンを置換することにより生成させることができる。カルボキシル側基（例えば、アスパルチルまたはグルタミル）をカルボジイミド（Ｒ’ＮＣＮＲ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリン−イル−（４−エチル）カルボジイミドまたはｌ−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾することもできる。アスパルチルまたはグルタミルをアンモニウムイオンとの反応によりアルパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することもできる。
【０１２０】
塩基性アミノ酸の模倣物は、例えば、（リシンおよびアルギニンに加えて）アミノ酸オルニチン、シトルリンでの置換により生成させることができるか、もしくは（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ部分を含有）アルギニンで置換できる。模倣物は、例えば、１以上の通常の試薬、例えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、またはニンヒドリンとアルギニルを、好ましくはアルカリ性条件下で反応させることにより生成させることができる。チロシン残基模倣物は、チロシルを例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることにより生成させることができる。Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣物は、システイニル残基を、例えば、アルファ−ハロアセテート、例えば、２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドおよび対応するアミンと反応させることにより生成させることができ；カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基模倣物は、システイニル残基を、例えば、ブロモ−トリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル  ２−ピリジルジスルフィド；ｐ−塩化第二水銀安息香酸塩；２−塩化水銀−４ニトロフェノール；またはクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−ｌ，３−ジアゾールと反応させることにより生成させることもできる。リシン模倣物は、リシニルを、例えば、無水コハク酸または他の無水カルボン酸反応させることにより生成させることができる（またアミノ末端残基を変更することができる）。リシンおよび他のアルファ−アミノ含有残基模倣物を、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４，ペンタンジオンとの反応、およびグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応により生成させることもできる。メチオニンの模倣物は、例えば、メチオニンスルホキシドとの反応により生成させることができる。例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−または４−ヒドロキシ、例えばジエチルプロカーボネートまたはパラ−ブロモフェナシルブロミドの模倣物。他の模倣物は、例えば、ヒドロキシル化により生成させるものを包含する。
【０１２１】
本発明のポリペプチドの成分は、反対のキラリティーを有するアミノ酸（またはペプチド模倣物残基）により置換することもできる。従って、Ｌ構造で天然に存在するアミノ酸（化学物質の構造に応じてＲまたはＳとも呼ばれる）を同じ化学構造種のアミノ酸またはペプチド模倣物であるが、反対のキラリティーを有するアミノ酸（Ｄアミノ酸と呼ばれ、さらにはＲまたはＳ形ともよばれる）で置換することができる。
【０１２２】
当業者は、科学文献および特許文献、例えば（Ｏｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ）において十分に記載されている様々な手順および方法を用いて、これらの模倣物を組み入れた個々の合成残基およびポリペプチドを合成できることを認めるであろう。本発明のペプチドおよびペプチド模倣物は、組み合わせ法を用いて合成することもできる。ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリーを生成するための様々な技術は周知であり、例えば、複数ピン、ティーバッグ、およびスプリット・カップル・ミックス技術を包含する；例えば、（ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９８、９：  ２０５−２２３；Ｈｒｕｂｙ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １９９７、１：  １１４−１１９；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ、Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ．  １９９７、３：  １７−２７；Ｏｓｔｒｅｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９９６、２６７：  ２２０−２３４）参照。本発明の修飾されたペプチドは、化学修飾法によりさらに生成させることができる。例えば、（Ｂｅｌｏｕｓｏｖ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７、２５：  ３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９９５、１９：  ３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９４、３３：  ７８８６−７８９６）参照。
【０１２３】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、例えば、より免疫原性の高いペプチドを産生するため、組換え技術により合成されたペプチドをより容易に単離するため、抗体および抗体発現Ｂ細胞を同定し、単離するためなどで、これに結合した１以上の追加のドメインを有する融合タンパク質として合成し、発現することもできる。検出および精製促進ドメインは、例えば、金属キレート化ペプチド、例えば、ポリヒスチジントラクトおよびヒスチジン−トリプトファンモジュールであって、固定化金属上での精製をかのうにするもの、タンパク質Ａドメインであって、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするもの、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｗａｓｈ．）において用いられるドメインを包含する。開裂可能なリンカー配列、例えば、Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．）を精製ドメインおよび  ペプチドまたはポリペプチドを含むモチーフ間に含めることは、精製を促進する。例えば、発現ベクターは、６のヒスチジン残基に結合したエピトープ−エンコーディング核酸配列とそれに続くチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ開裂部位を含むことができる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５、３４：  １７８７−１７９７；Ｄｏｂｅｌｉ、タンパク質  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  １９９８、１２：  ４０４−１４，）参照。ヒスチジン残基は、検出および精製を促進し、一方、エンテロキナーゼ開裂部位は、エピトープを融合タンパク質の残りから精製する手段を提供する。ベクターコード化融合タンパク質に関連する技術および融合タンパク質の用途は、科学文献および特許文献において十分に記載されている（例えば、Ｋｒｏｌｌ、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９３、１２：  ４４１−５３）参照。
【０１２４】
本発明の方法の実施において、本発明のポリペプチドおよび核酸と合わせて、例えば、ラットＴＲＰＭ７活性についてポリペプチドをスクリーニングするため、ラットＴＲＰＭ７活性の潜在的なモジュレーター（例えば、阻害物質またはアクチベーター）として化合物を本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸についてスクリーニングするため、本発明のポリペプチドを発現する細胞についてスクリーニングするためなどに、さまざまな装置および方法を使用することができる。
【０１２５】
一つの態様において、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、固体支持体に結合させることができる。固体支持体は、例えば、膜（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）、マイクロタイター・ディッシュ（例えば、ＰＶＣ、ポリプロピレン、またはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、ディップ・スティック（例えば、ガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスなど）、マイクロフュージ・チューブ、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属またはポリマービーズまたは他の基質、例えば、紙を包含し得る。一つの固体支持体は、金属（例えば、コバルトまたはニッケル）を含むカラムであって、ペプチド上に操作されたヒスチジンタグに対して特異性で結合するカラムを使用する。
【０１２６】
ペプチドの固体支持体に対する接着は直接的（すなわち、タンパク質が固体支持体と接触する）または間接的（特定の化合物が支持体と結合するか、または化合物は支持体に結合し、標的タンパク質は固体支持体ではなくこの化合物に結合する）である。ペプチドは、共有的にｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｅｉｔｈｅｒ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ（例えば、システイン残基の１つの反応性チオール基を利用（例えば、Ｃｏｌｌｉｕｏｄ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １９９３，４：  ５２８−５３６参照））または非共有的であるが、特異的に（例えば、免疫化抗体による（例えば、Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ、Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １９９１、３：３８８−３９１；Ｌｕ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９５、６７：  ８３−８７）；ビオチン／ストレプトアビジン系（例えば、Ｉｗａｎｅ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １９９７、２３０：  ７６−８０参照）；金属キレート化、例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム（例えば、Ｎｇ、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９５、１１：  ４０４８−５５参照）；ポリヒスチジン融合の結合について、金属キレート化自己集合単層（例えば、Ｓｉｇａｌ、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９６、６８：４９０−４９７参照）のいずれかにより固定化することができる。
【０１２７】
間接結合は、商業的に入手可能な様々なリンカーを用いて達成できる。反応性末端は、これに限定されないが、アミノ反応性末端、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、イミドエステル、アルデヒド、エポキシド、スルホニルハライド、イソシアネート、イソチオシアネート、およびニトロアリールハライド；およびチオール反応性末端、例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、チオフタルイミド、および活性ハロゲンをはじめとする様々な官能基のいずれかであり得る。ヘテロ二官能性架橋試薬は２つの異なる反応性末端、例えば、アミノ−反応性末端およびチオール−反応性末端を有し、一方、ホモ二官能性試薬は２つの類似した反応性末端、例えば、スルフヒドリル含有化合物の架橋を可能にするビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）を有する。スペーサーは様々な長さを有し、脂肪族または芳香族であり得る。商業的に入手可能なホモ二官能性架橋試薬の例は、これに限定されないが、イミドエステル、例えば、ジメチルアジピミデートジヒドロクロリド（ＤＭＡ）；ジメチル  ピメリミデートジヒドロクロリド（ＤＭＰ）；およびジメチルスベリミデートジヒドロクロリド（ＤＭＳ）を包含する。ヘテロ二官能性試薬は、商業的に入手可能な活性ハロゲン−ＮＨＳ活性エステルカップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテートおよびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＬＡＢ）およびスルホスクシンイミジル誘導体、例えば、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を包含する。カップリング剤のもう一つ別の群は、ヘテロ二官能性およびチオール開裂剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｅｌｌ．）である。
【０１２８】
抗体は、本発明のポリペプチドおよびペプチドの固体支持体との結合のために使用できる。これは、ペプチド特異性抗体をカラムに結合させることにより行うことができるか、または例えば、公知エピトープ（例えば、タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ）と結合したモチーフ含有ペプチドを含む融合タンパク質キメラまたは適切な免疫グロブリン定常領域配列（「免疫接着」、例えば、Ｃａｐｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  １９８９、３７７：  ５２５−５３１参照）を形成することにより行うことができる。
【０１２９】
ＴＲＰＭ７ポリペプチドの精製
必要ならば、天然に存在するタンパク質または組換えタンパク質を機能分析において使用するために精製することができる。組換え体ラットＴＲＰＭ７は、任意の好適な発現系から、例えば、イー・コリにおいてラットＴＲＰＭ７を発現し、次いで組換えタンパク質をアフィニティー精製により、例えば、タンパク質上または融合タンパク質の部分上の特異的エピトープを認識する抗体を使用することにより、またはＧＳＴと結合するグルタチオンアフィニティーゲルを用いることにより、精製することができる。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は融合タンパク質であり、例えば、Ｎ末端でＧＳＴまたはＧａｌ４を有するものである。
【０１３０】
最適のタンパク質は、硫酸アンモニウムなどの物質を使用した選択的沈降；カラムクロマトグラフィー、免疫精製法などをはじめとする標準的技術により実質的に純粋まで精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ、１９８２；米国特許番号４，６７３，６４１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、ｓｕｐｒａ；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前出参照。）
【０１３１】
組換えタンパク質が精製される場合に多くの手段を用いることができる。例えば、確率された分子付着特性を有するタンパク質をラットＴＲＰＭ７と可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを使用して、ラットＴＲＰＭ７を選択的に精製カラムに吸着させ、次いで比較的純粋な形態においてカラムから遊離させることができる。融合タンパク質を次に酵素活性により除去する。最後に、免疫親和性カラムを使用して、ラットＴＲＰＭ７を精製することができる。
【０１３２】
ラットＴＲＰＭ７の組換え細菌からの精製
大量の形質転換された細菌により、典型的にはプロモーター導入後、組換えタンパク質を発現することができるが：発現は構成的であり得る。ＥＰＴＧを用いたプロモーター誘導は、誘導プロモーター系の一例である。細菌を当該分野における標準操作手順に従って成長させる。新鮮な細菌細胞または凍結された細菌細胞をタンパク質の単離のために使用する。
【０１３３】
細菌において発現されたタンパク質は不溶性凝集物（封入体）を形成する。いくつかのプロトコルが封入体の精製に適している。例えば、封入体の精製は、典型的には、例えば、５０  ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣＬ  ｐＨ  ７．５，５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１  ｍＭ  ＤＴＴ、０．１  ｍＭ  ＡＴＰ、および１  ｍＭ  ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションにより細菌細胞を破壊することによる、封入体の抽出、分離および／または精製を含む。Ｆｒｅｎｃｈプレスに２〜３回通すことにより、細胞懸濁液を溶解させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  （Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて均質化するか、または氷上で音波処理することができる。細菌溶解の代替法は当業者には明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、前出参照）。
【０１３４】
必要ならば、封入体を可溶化させ、溶解した細胞懸濁液を遠心分離して、望ましくない不溶物を除去する。封入対を形成したタンパク質を適合性緩衝液で希釈または透析することにより再生することができる。好適な溶媒は、これに限定されないが、尿素（約４Ｍから約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、体積／体積基準）、および塩酸グアニジン（約４Ｍから約８Ｍ）を包含する。凝集物形成タンパク質、例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７０％  ギ酸を可溶化できるいくつかの溶媒は、免疫原性および／または活性の欠如を伴うタンパク質の不可逆的変性の可能性のために、この手順における使用には不適切である。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的でなく、除去（例えば、透析による）または変性剤の希釈後に再生が起こり、免疫学的および／または生物活性なタンパク質の再形成が可能になる。他の好適な緩衝液は当業者には公知である。最適のタンパク質は、標準的分離技術により、例えば、ＮｉＮＴＡアガロース樹脂を用いて、他の細菌タンパク質から分離される。
【０１３５】
別法として、組換え体ラットＴＲＰＭ７タンパク質を細菌ペリプラズムから精製することが可能である。細菌の溶解後、タンパク質が細菌のペリプラズム中に輸出される場合、細菌のペリプラズムフラクションを、当業者に公知の他の方法に加えて、冷浸透圧衝撃により単離することができる。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞をペレットから遠心分離する。２０％シュークロースを含有する緩衝液中にペレットを再懸濁させる。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷５ｍＭ  ＭｇＳＯ４中に再懸濁させ、氷浴中に１０分間保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、保存する。上清中に存在する組換えタンパク質を当業者に周知の標準的分離技術により宿主タンパク質から分離することができる。
【０１３６】
ラットＴＲＰＭ７の精製のための標準的タンパク質分離技術
溶解性フラクション
初期段階としてしばしば、特にタンパク質混合物が複雑であるならば、初期塩フラクションを、興味のある組換えタンパク質から、多くの望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培地由来のタンパク質）を分離することができる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を有効に減少させることにより、タンパク質を沈殿させる。タンパク質は次にその溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、低い硫酸アンモニウム濃度でより沈殿しやすい。典型的なプロトコルは、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することを含み、結果として得られる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％の間になる。この濃度は、タンパク質のほとんどの疎水性物質を沈殿させる。沈殿物を次に捨て（興味のあるタンパク質が疎水性である場合を除く）および硫酸アンモニウムを上清に、興味のあるタンパク質を沈殿させることが知られている濃度まで添加する。沈殿物を次に緩衝液中で可溶化させ、必要ならば、透析または膜分離法（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により、過剰の塩を除去する。タンパク質の溶解性に依存する他の方法、例えば、冷エタノール沈殿は当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用できる。
【０１３７】
サイズ分画濾過
異なる孔サイズの膜（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通した限外濾過を用いて、より大きな、またはより小さなタンパク質からタンパク質を単離するために、タンパク質、例えばラットＴＲＰＭ７の分子量を用いることができる。第一段階として、興味のあるタンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフを有する孔サイズの膜を通してタンパク質混合物を限外濾過する。限外濾過の濃縮水を次に、興味のあるタンパク質の分子量よりも大きな分子カットオフの膜に対して限外濾過する。膜を通して組換えタンパク質を濾液中に流す。濾液をつぎに以下に記載するようにクロマトグラフィーに付すことができる。
【０１３８】
カラムクロマトグラフィー
最適のタンパク質は、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて、他のタンパク質から分離することもできる。加えて、タンパク質に対して産生された抗体は、カラムマトリックスに共役させることができ、タンパク質を免疫精製する。これらの方法の全ては当該分野において周知である。クロマトグラフィー技術は、任意のスケールで、多くの異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）から得られる装置を用いて行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【０１３９】
５．ラットのＴＲＰＭ７の免疫学的検出
ラットＴＲＰＭ７遺伝子の検出および核酸ハイブリダイゼーション技術を用いた発現に加えて、ラットＴＲＰＭ７を検出するために、例えば、免疫学的検定も使用できる。免疫学的検定は、ラットＴＲＰＭ７を定性的または定量的に分析するため、例えば、ラットＴＲＰＭ７を検出するため、ラットＴＲＰＭ７活性を測定するため、あるいはＴＲＰＭ７活性のモジュレーターを同定するために使用できる。適用可能な技術の総括は、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ、（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ，１９８８）において見出すことができる。
Ａ．ラットＴＲＰＭ７に対する抗体
【０１４０】
特定のタンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者には公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｃｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ  ２：  １９８６；およびＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  １９７５、２５６：４９５−４９７参照）。このような技術は、ファージまたは類似したベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの黄体の選択による抗体の分離、ならびにウサギまたはマウスの免疫かによるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の分離（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅｌ９Ｓ９、２４６：  １２７５−１２８１；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  １９８９、３４１：５４４−５４６参照）を包含する。加えて、前述のように、多くの企業、例えば、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｌｔｄ．、ＨＴＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓなどは、本質的に任意のペプチドに対する抗体を調製する商業サービスを提供している。
【０１４１】
モノクローナル抗体は、当業者に一般的な様々な技術により得ることができる。簡単に説明すると、所望の抗原で免疫化された動物から得られる脾臓細胞は、通常、骨髄腫細胞との融合により不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９７６  ６：  ５１１−５１９参照）。免疫化の代替法は、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｎ−Ｖｉｒｕｓ、癌遺伝子、またはレトロウイルスでの形質転換、もしくは当該分野において周知の他の方法を包含する。不死化細胞から生じたコロニーを、所望の特異性および抗原に対する親和性を有する抗体の産生についてスクリーンし、かかる細胞により産生されたモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹腔中への注入をはじめとする様々な技術により向上させることができる。別法として、（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９、２４６：  １２７５−１２８１）により概説されている一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡフラグメントをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
【０１４２】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を集め、免疫原タンパク質  ｉｎ  ａｎ  免疫学的検定、例えば、固体支持体上に固定化された免疫原を用いた固相免疫学的検定において、免疫原タンパク質に対して滴定する。典型的には、１０４以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、非ラットＴＲＰＭ７タンパク質、またはさらには他の関連するタンパク質、例えば、他の生体からのものに対するその交差反応性について、競合的結合免疫学的検定を用いて試験する。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．１ｍＭ、さらに一般的には少なくとも約１．ｍｕ．Ｍ、好ましくは少なくとも約０．１．ｍｕ．Ｍ以上、最も好ましくは、０．０１．ｍｕ．Ｍ以上のＫＤで結合する。
【０１４３】
ラットＴＲＰＭ７特異抗体が利用可能になったら、タンパク質を様々な免疫学的検定法により検出することができる。免疫学的および免疫学的検定手順の概説については、（Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、７：  １９９１）参照。さらに、本発明の免疫学的検定は、酵素免疫学的検定において広く概説されているいくつかの設定にいずれかにおいて行うことができる（Ｍａｇｇｉｏ、１９８０；およびＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ、ｓｕｐｒａ）。
【０１４４】
免疫学的結合検定
ラットＴＲＰＭ７は、多くの十分に認識された免疫学的結合検定のいずれかを用いて、検出および／または定量化することができる（例えば、米国特許番号４，３６６，２４１；４，３７６，１１０；４，５１７，２８８；および４，８３７，１６８、ｓｅｅ  ａｌｓｏ  Ａｓａｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７：  １９９３；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ、ＢａｓｉｃおよびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７、１９９１参照）。免疫学的結合検定（または  免疫学的検定）は、典型的には、最適のタンパク質または抗原（この場合、ラットＴＲＰＭ７、またはその抗原性フラグメント）に特異的に結合する抗体を使用する．抗体は、多くの当業者に周知の手段および本明細書において記載される手段のいずれかにより産生することができる。
【０１４５】
免疫学的検定はまた、しばしば、抗体および抗原により形成される複合体と特異的に結合し、標識するために、標識剤を使用する。標識剤は、それ自体、抗体／抗原複合体を含む部分の１つであり得る。従って、標識剤は、標識されたラットＴＲＰＭ７ポリペプチドまたは標識された抗ラットＴＲＰＭ７であり得る。あるいは、標識剤は第三の部分、例えば、抗体／抗原複合体（二次抗体は典型的には、第一抗体が由来する種の抗体に対して特異的である）に特異的に結合する二次抗体である。免疫グロブリン定常領域と特異的に結合できる他のタンパク質、例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇも標識剤として使用できる。これらのタンパク質は、様々な種からの免疫グロブリン定常領域に関して強力な非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌ  ｅｔａｌ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９７３、１１１：  １４０１−１４０６  ；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔａｌ，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８５、１３５：  ２５８９−２５４２参照）。標識剤は、検出可能な部分、例えば、ビオチンであって、これに対して別の分子が特異的に結合するもの、例えば、ストレプトアビジンで修飾することができる。様々な検出可能な部分は、当業者に周知である。
【０１４６】
検定全体にわたって、インキュベーションおよび／または洗浄段階は、試薬の各組合わせ後に必要とされる。インキュベーション段階は、約５秒からす時間まで、好ましくは約５分から約２４時間まで変化し得る。しかしながら、インキュベーション時間は、検定形式、抗原、溶液の体積、濃度などに依存する。通常、検定は、周囲温度で行われるが、ある範囲の温度、例えば、１０℃〜４０℃で行うことができる。
【０１４７】
サンプルにおけるラットＴＲＰＭ７を検出するための免疫学的検定は、競合的であるか、または非競合的であるかのいずれかである。非競合的免疫学的検定は、抗原の量が直接測定される検定である。一つの好ましい「サンドイッチ」検定において、例えば、抗−抗原抗体を、その上にこれらが固定化される固体支持体に直接結合させることができる。これらの固定化された抗体は、次に試験サンプル中に存在する抗原を捕捉する。かくして固定化された抗原を次に標識剤、例えば、標識を有する第二抗体により結合させる。別法として、第二抗体は標識がなくてもよいが、第二抗原が由来する種の抗体に特異的に結合する標識された第三抗体により結合され得る。第二または第三抗体は、典型的には、検出可能な部分、例えば、ビオチンであって、これに対して別の分子が特異的に結合するもの、例えば、ストレプトアビジンで修飾され、検出可能な部分を得る。
【０１４８】
競合的検定形式
競合的検定において、サンプル中に存在するラットＴＲＰＭ７の量は、サンプル中に存在する未知の抗原により抗−抗原抗体から置換（競合により排除）された、既知の添加された（外因性）  抗原の量を測定することにより、間接的に測定される。一つの競合的検定において、既知量の抗原がサンプルに添加され、サンプルを次に、抗原と特異的に結合する抗体と接触させる。外因性抗体に結合する抗原の量は、サンプル中に存在する抗原の濃度と反比例する。特に好ましい実施形態において、抗体は固体支持体上に固定化される。抗体に結合する抗原の量は、抗原／抗体複合体中に存在する抗原の量を測定することによるか、もしくは残存する複合体形成していないタンパク質の量を測定することによるかのいずれかで決定することができる。抗原の量は、標識された抗原分子を提供することにより検出できる。
【０１４９】
ハプテン阻止検定は、もう一つ別の好ましい競合的検定である。この検定において、既知の抗原が固体支持体上に固定化される。既知量の抗−抗原抗体をサンプルに添加し、このサンプルを次に固定化抗原と接触させる。既知固定化抗原と結合した抗−抗原抗体の量は、サンプル中に存在する抗原の量と反比例する。ここでも、固定化抗体の量は、抗体の固定化フラクションまたは溶液中に残存する抗体のフラクションのいずれかを検出することにより検出できる。検出は、直接的（抗体が標識される）であってもよいし、あるいは前記のように抗体に特異的に結合する標識された部分のその後の添加により間接的であってもよい。
【０１５０】
交差反応性の決定
競合的結合形式における免疫学的検定を交差反応性決定のために使用することもできる。例えば、ラットＴＲＰＭ７タンパク質を固体支持体に固定化することができる。タンパク質を、抗血清の固定化抗原に対する結合について競合する検定に添加する。添加されたタンパク質が、固定化タンパク質に対する抗血清の結合について競合する能力を、抗原がそれ自体と競合する納涼と比較する。前記タンパク質の交差反応性（％）は、標準的な研鑽を用いて計算される。１０％未満の交差反応性を有する、タンパク質が添加されたこれらの抗血清を選択し、プールする。交差反応性抗体は任意に、プールされた抗血清から、添加されたタンパク質での免疫吸収により除去される。
【０１５１】
免疫吸着され、プールされた抗血清を次に、前記のような競合的結合免疫学的検定において、おそらくはラットＴＲＰＭ７の対立遺伝子、種間相同体、または多型変異体であると考えられる第二タンパク質を、免疫原タンパク質と比較するために使用する。この比較を行うために、２つのタンパク質をそれぞれ広範囲の濃度で分析し、抗血清の固定化タンパク質に対する結合の５０％を阻害するために必要な各タンパク質の量を決定する。結合の５０％を阻害するために必要な第二タンパク質の量が、結合の５０％を阻害するために必要な第一タンパク質の量の１０倍未満であるならば、第二タンパク質は、最適の免疫原に対して生成されたポリクローナル抗体と特的に結合するといわれる。
【０１５２】
他の検定形式
サンプル中のラットＴＲＰＭ７の素内を検出し、定量するために、ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析を使用することができる。技術は、一般に、分子量に基づくゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を分離し、分離されたタンパク質を適当な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルター）へ移し、およびサンプルを、ラットＴＲＰＭ７と特異的に結合する抗体とともにインキュベートすることを含む。抗−抗原抗体は、固体支持体上の抗原と特異的に結合する。これらの抗体を直接標識してもよいし、あるいは抗−抗原抗体と特異的に結合する標識された抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いてその後に検出してもよい。
【０１５３】
他の検定形式は、例えば、リポソーム免疫学的検定（ＬＩＡ）を包含し、これは、特定の分子（例えば、抗体）と結合するように設計されたリポソームを使用し、封入された試薬またはマーカーを放出する。放出された化学物質は次に標準的技術に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ、Ａｍｅｒ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒｏｄ．  Ｒｅｖ．  １９８６、５：  ３４−４１参照）。
【０１５４】
非特異的結合の減少
当業者は、免疫学的検定において、非特異的結合を最小にすることが望ましいことが多いことを理解するであろう。特に、検定が固体支持体上に固定化された抗原または抗体を含む場合、基質に対する非特異的結合の量を最小限にすることが望ましい。このような非特異的結合を減少させる手段は当業者に周知である。典型的には、この技術は、基質をタンパク様組成物でコーティングすることを含む。特に、タンパク質組成物、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンは広く使用され、粉乳が最も好ましい。
【０１５５】
標識
検定または本発明の任意の他の検定において使用される特定の標識または検出可能な基は本発明の重要な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、免疫学的検定の分野において十分に開発され、一般に、このような方法において有用なほとんどの標識を本発明に適用することができる。このように、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識は、電磁ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５１，３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて通常用いられる他のもの）、および  熱量測定標識、例えば、コロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）を包含する。
【０１５６】
標識を、当該分野において周知の方法に従って、検定の所望の成分と直接的または間接的にカップリングさせることができる。前述のように、広範囲に及ぶ標識を使用でき、標識の選択は、必要とされる感度、化合物との共役の容易性、利用可能な器具類、および処理設備に依存する。
【０１５７】
非放射性標識は、しばしば、間接的手段により結合される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は分子と共有結合する。リガンドは次に別の分子（例えば、ストレプトアビジン）、本質的に検出可能であるか、またはシグナル系に共有結合するかのいずれかである分子、例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物と結合する。リガンドおよびその標的は、特定のタンパク質を認識する抗体、または特定のタンパク質に対する抗体を認識する二次抗体との任意の好適な組み合わせにおいて使用できる。．
【０１５８】
分子は、シグナル生成化合物と、例えば、酵素またはフルオロフォアとの共役により、直接的に共役することもできる。標識として興味のある酵素は、主に、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、あるいはオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを包含する。化学発光化合物は、ルシエリン、および２，３−ジヒドロフタラジン化イオン、例えば、ルミノールを包含する。使用できる様々な標識またはシグナル生成系についての総説については、（米国特許番号４，３９１，９０４）参照。
【０１５９】
標識を検出する手段は当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性標識である場合、検出の手段は、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるような写真用フィルムを包含する。標識が蛍光標識である場合、これは、蛍光色素を適切な波長の光で励起し、得られる蛍光を検出することにより検出できる。蛍光は、写真用フィルムにより、電子検出器、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増管などの使用により、視覚的に検出できる。同様に、酵素標識は、酵素の適切な基質を提供し、得られる反応生成物を検出することにより、検出できる。最後に、簡単な比色分析標識は、標識に関連する色を単に観察することにより検出できる。このように、様々なディップ・スティック検定において、共役した金はしばしばピンク色に見え、一方、様々な共役したビーズはビーズの色に見える。
【０１６０】
いくつかの検定形式は標識された成分の使用を必要としない。例えば、凝集検定は、標的抗体の存在を検出するために使用できる。この場合において、抗原コーティング粒子は、標的抗体を含むサンプルにより凝集する。  この形式において、成分はいずれも標識される必要はなく、標的抗体の存在は、単純な目視検査により検出される。
【０１６１】
ラットＴＲＰＭ７産生または活性のモジュレータについての検定
ＴＲＰＭ７は、調節されたＭｇＡＴＰおよび細胞の生存に必要とされるカルシウム透過性イオンチャンネルとして同定されている。イオンチャンネルとして、ＴＲＰＭ７は、細胞を脱分極させ、細胞内カルシウムを増大させるために、カルシウムおよび一価カチオンを伝導する。ＴＲＰＭ７流は、低ＭｇＡＴＰレベルで活性化され、多くの二価および多価カチオン、例えば、マグネシウム、亜鉛、スペルミン、２−アミノフェノキシボレート、Ｍｎ（ｌＨ）テトラキス（４−安息香酸）ポルフィリンクロリド、およびランタンによりブロックされる（Ｈａｒｔｅｎｅｃｋ、Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒａｍｃｏｌ  ２００５  ３７１”３０７−３１４）。Ｍｇ２＋およびＺｎ２はどちらもＴＲＰＭ７チャンネルを透過し、これを通る一価カチオン流をブロックする（Ｋｏｚａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２００３  ８４：２２９３−２３０５）。ＴＲＰＭ７チャンネルは、哺乳動物細胞において異種発現された場合、顕著な非生理的電圧で＋５０から＋１００  ｍＶの範囲の顕著な外向き電流および負の電位で−１００から−４０  ｍＶの間の小さな内向き電流を発生させる（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００５  １２６（２）、１３７−１５０）。ＴＲＰＭ７はさらに、Ｓｒｃファミリーのキナーゼ（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、ＪＢｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００３  ２７８：４２８６７−４２８７６）、ホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート  （ＰＩＰｉ）（Ｒｕｎｎｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２  ４：３２９−３３６）、およびそれ自身のａ−キナーゼドメイン（Ｔａｋｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２００４  １０１：６００９−６０１４）により調節されることが証明されている。異種発現されたＴＲＰＭ７チャンネル、例えば、ＨＥＫ−２９３細胞において発現されたＴＰＲＭ７チャンネルは、高いＣａ２＋透過性での電流、外側整流Ｉ−Ｖ曲線、低Ｃａ２＋濃度による向上および多価カチオンガドリニウムによる電流のブロックを示す。ＴＲＰＭ７チャンネルの過剰発現は、ＨＥＫ−２９３細胞に対して致命的であることが証明されている。致死性は、細胞外Ｍｇ２＋を増加させて、Ｍｇ２＋恒常性を回復することにより防止できる（Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、細胞  ２００３  １１５：８６３−８７７）。
【０１６２】
ＴＲＰＭ７チャンネルは、神経細胞死、特に、無酸素細胞死において重要な役割を果たすことが証明されている。ＴＲＰＭ７は虚血による毒性、特に、酸化的ストレスにより活性化される虚血による傷害のメディエーターである。ＴＲＰＭ７の抑制は、虚血による毒性後の細胞の生存率を増加させることが証明されている。（Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００５  １１（２）：  １１６−１２３；Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、細胞  ２００３  １１５：８６３−８７７）
【０１６３】
本発明は、特に、細胞ベースのシステムであって、モジュレーター、例えば、阻害物質またはＴＲＰＭ７産生または活性のアクチベーターを同定するために使用できるものを提供する。ＴＲＰＭ７チャンネルの量または活性は、様々な検定、例えば、電流の測定、膜電位の測定、イオン流動の測定リガンド結合の測定、第二メッセンジャーおよび転写レベルまたは生理学的効果、例えば、細胞生存の測定を用いて評価できる。
【０１６４】
ＴＲＰＭ７チャンネルのモジュレーターは、生物活性なＴＲＰＭ７（組換え体または天然に存在するもののいずれか）を用いて試験することができる。ラットＴＲＰＭ７を単利子、細胞において同時発現または発現することができるか、あるいは細胞由来の膜において発現することができる。潜在的なＴＲＰＭ７チャンネル阻害物質またはアクチベーターで処理されたサンプルまたは検定を、試験化合物を含まない対照サンプルと比較し、調節の程度を調べることができる。対照サンプル（アクチベーターまたは阻害物質で処理されていない）は、相対的ＴＲＰＭ７活性値１００％である。ＴＲＰＭ７を含むチャンネルの阻害は、対照に対するイオンチャンネル活性が、例えば、約９０％、好ましくは約５０％、さらに好ましくは約２５％である場合に達成される。ＴＲＰＭ７を含むチャンネルの活性化は、対照に対するイオンチャンネル活性値が１１０％、さらに好ましくは１５０％、さらに好ましくは２００％以上である場合に達成される。
【０１６５】
イオン流動における変化は、ＴＲＰＭ７チャンネルを発現する細胞膜の分極（すなわち、電位）における変化を測定することにより評価できる。細胞分極における変化を測定するための好ましい手段は、電圧固定およびパッチ・クランプ技術、例えば、「細胞接着」形式、「インサイド・アウト」形式、および「全細胞」形式で、電流における変化を測定する（これにより、分極における変化を測定する）ことによる（例えば、Ｒｕｎｎｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１  ２９１：１０４３−１０４７、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００５  １２６（２）、１３７−１５０参照）。全細胞電流は、標準的手順を用いて都合よく測定される（例えば、Ｈａｍｉｌ  ｅｔ  ａｌ、ＰＦｌｕｇｅｒｓ．Ａｒｃｈｉｖ．  １９８１、３９１：８５参照）。他の公知検定は：放射性標識されたルビジウムフラックス検定およびイオン感受性色素、膜電位感受性色素を用いた蛍光検定を包含する（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．  １９８８、８８：６７−７５；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｍｅｔｈ．  １９９１，２５：１８５−１９３；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４、１３７：５９−７０参照）。一般に、試験される化合物は、約１ｐＭ〜約１００ｍＭの範囲で存在する。
【０１６６】
本発明は、とりわけ、ＴＲＰＭ７と結合する分子を同定する方法、ＴＲＰＭ７イオンチャンネル活性を調節する分子を同定する方法、および／または細胞内のＴＲＰＭ７の発現を変更する分子を同定する方法を提供する。これらの分子は、ＴＲＰＭ７イオンチャンネル活性により調節される状態または疾患、例えば、卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症、てんかん、脊髄小脳失調、球脊髄性筋ジストロフィー、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脳損傷、脊髄損傷、および他の外傷性神経系損傷の治療に有用であり得る候補生物活性剤である。好ましい実施形態において、これらの方法は、ラットＴＲＰＭ７チャンネル活性を阻害する薬剤候補を特定するために使用できる。
【０１６７】
本発明は、ＴＲＰＭ７と結合できる候補生物活性剤についてスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態において、候補生物活性剤は、ＴＲＰＭ７タンパク質の特定のドメイン、例えば、Ｃ−末端キナーゼドメインと結合する。
【０１６８】
結合検定の一つの実施形態において、ＴＲＰＭ７または候補生物活性剤のいずれかが標識される。標識は、検出可能な標識、例えば、本明細書において記載されるものである。標識は、候補剤のＴＲＰＭ７に対する結合を検出する手段を提供する。いくつかの結合検定において、ＴＲＰＭ７は、表面に固定化または共有結合され、標識された候補生物活性剤と接触させられる。他の検定において、候補生物活性剤のライブラリーを表面に固定化するか、または表面、例えばバイオチップに共有結合させ、標識されたＴＲＰＭ７と接触させる。
【０１６９】
本発明は、ラットＴＲＰＭ７遺伝子発現をブロックまたは減少させる方法ならびにＴＲＰＭ７遺伝子発現、したがってＴＲＰＭ７活性をブロックまたは減少させることができる候補生物活性剤についてスクリーニングするための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭ７遺伝子発現は、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイムによるか、または体内の標的細胞における標的遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成する標的遺伝子の調節領域に対して相補性であるデオキシリボヌクレオチド配列を標的とすることにより、ブロックされる。（一般に、Ｈｅｌｅｎｅ、ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇ  Ｄｅｓ．、６：  ５６９−５８４、１９９１；Ｈｅｌｅｎｅ、ｅｔａｌ、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、６６０：  ２７−３６、１９９２；Ｍａｈｅｒ、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、１４：  ８０７−８１５、１９９２参照）。
【０１７０】
アンチセンス核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾、類似体など）は、核酸を産生するための任意の好適な方法、例えば、本明細書において記載される化学的合成法および組換え法を用いて調製することができる。一つの実施形態において、例えば、本発明のアンチセンスＲＮＡ分子は、デノボ化学合成によるか、またはクローニングにより調製することができる。例えば、ラットＴＲＰＭ７  ｍＲＮＡとハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡは、ベクター（例えば、プラスミド）においてプロモーターと逆方向に操作可能に結合したＴＲＰＭ７配列を挿入（結紮）することにより調製できる。プロモーター  および、好ましくは終始およびポリアデニル化シグナルが適切に配置されていると仮定すると、非コーディングストランドに対応する挿入された配列のストランドは転写され、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する。
【０１７１】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。リボソーム作用のメカニズムは、標的ＲＮＡに対して相補性のリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続いてエンドヌクレアーゼ的切断を含む。本発明の範囲内にはラットＴＲＰＭ７配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効果的に触媒する、人工ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位は、まず、次の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位の標的分子をスキャンすることにより同定される。同定されると、開裂部位を含有する標的遺伝子に対応する１５から２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、予想される構造特性、例えば、オリゴヌクレオチド配列を不適当にし得る二次構造について評価できる。候補標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護検定を用いて、相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接近可能性を試験することによっても評価できる。
【０１７２】
転写の阻害のために三重らせん形成において使用される核酸分子は、一本鎖であり、デオキシヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドの基本組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合則（プリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが二本鎖の一本鎖上に存在することを必要とする）により三重らせん形成を促進するように設計されなければならない。ヌクレオチド配列はピリミジンエースであり、その結果、三重らせんの３つの関連するストランド全体にわたってＴＡＴおよびＣＧＣ＋トリプレットが得られる。ピリミジンリッチな分子は、二本鎖の一本鎖において、前記ストランドに対して平行な方向にで、プリンリッチな領域に対して塩基相補性を提供する。加えて、プリンリッチな核酸分子、例えば、Ｇ残基のストレッチを含有するものを選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対が豊富なＤＮＡ二本鎖（ここにおいて、プリン残基の大部分は、標的二本鎖の一本鎖上に位置し、損結果、三本鎖における３つのストランド全体にわたってＧＧＣトリプレットが得られる）と三重らせんを形成する。
【０１７３】
あるいは、三重らせん形成を目標とされ得る潜在的な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を形成することにより増加させることができる。スイッチバック分子は、交互５’−３’、３’−５’の方法で合成され、したがって、二本鎖の第一のストランドを塩基対合させ、次に他のものを対合させて、プリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが二本鎖の一本鎖上に存在する必要性を排除する。
【０１７４】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、リボザイムおよび三重らせん分子は、ＲＮＡ分子合成の分野において公知の任意の方法により調製することができる。これらは、当該分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成する技術、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成を包含する。別法として、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成させることができる。このようなＤＮＡ配列は、国的なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターを含有する広範囲に及ぶベクター中に組み入れることができる。別法として、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、使用されるプロモーターに応じて、安定して細胞系中に導入することができる。
【０１７５】
ＴＲＰＭ７遺伝子発現をブロックまたは軽減する代替法は、センス抑制である。核酸がプロモーターに関してセンス方向に設定されているベクターの導入は、標的遺伝子をブロックする有効な手段であることが証明されている。遺伝子機能を阻害する別の手段は、ドミナント・ネガティブ突然変異を形成することによる。この方法において、本発明のポリペプチドの非機能的突然変異体（野生型サブユニットと相互作用する能力を保持する）が導入される。
【０１７６】
ＴＲＰＭ７の発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）等の方法によって特異的に抑制することもできる。この技術の総説は、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：  １３７０−１３７２（２０００）において見られる。簡単に説明すると、遺伝子抑制の伝統的な方法は、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを用い、興味のある遺伝子の逆配列と結合して、結合がその後の細胞プロセスを干渉し、従って対応するタンパク質の合成をブロックすることにより機能する。ＲＮＡｉはまた、翻訳後レベルに作用し、特異的配列であるが、遺伝子発現をはるかに効果的に抑制する。ＲＮＡ干渉法において、転写後遺伝子サイレンシングは、配列特異性ＲＮＡ縮重プロセスによりもたらされ、その結果、配列に関連する遺伝子の転写の迅速な縮重が起こる。小核酸分子、例えば、短い干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、および短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子は全てＴＲＰＭ７遺伝子の発現を調節するために使用できる。ＴＲＰＭ７をＲＮＡ干渉により抑制できる小核酸分子は、当該分野において公知の方法により調製できる。例えば、米国公開番号２００５／０１２４５６７およびＡａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、細胞  ２００３  １１５：８６３−８７７参照。
【０１７７】
従って、本発明は、ラットＴＲＰＭ７活性を調節、例えば、ブロックまたは減少させることができる分子、ならびにラットＴＲＰＭ７活性を調節できる候補生物活性剤、例えば、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および他の小核酸分子、例えば、本明細書に記載されているものについてスクリーニングする方法を提供する。これらの薬剤の全ては、あるＴＲＰＭ７遺伝子のインビボでの発現をブロックするための治療薬として使用できる。いくつかの実施形態において、これらは、ｍＲＮＡへのＴＲＰＭ７遺伝子転写を防止し、ＴＲＰＭ７  ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害し、前から存在するＴＲＰＭ７タンパク質の活性をブロックするために使用できる。標準的免疫学的検定、例えば、ウェスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡなどを行って、候補生物活性剤がＴＲＰＭ７遺伝子発現に対して影響を及ぼすことを確認することができる。別法として、ＴＲＰＭ７発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより決定することができる。ＲＴ−ＰＣＲを行う方法は当該分野において公知であり、したがって、本明細書においては記載しない。これらの分子のＴＲＰＭ７チャンネル活性に対する効果は、本明細書において記載される様々な検定、例えば、電流の測定、膜電位の測定、イオン流動の測定、および細胞生存の測定を用いて評価することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＴＲＰＭ７チャンネルの二価または一価カチオン性透過性を調節する分子を同定する方法を提供する。
【０１７９】
ＴＲＰＭ７チャンネルの一価カチオン性透過性の調節は、例えば、全細胞パッチ・クランプ検定または単一チャンネルメンブラン・パッチ検定において、候補生物活性剤の存在下および不在下で、内向き電流および外向き電流を測定することにより決定できる。もう一つ別の実施形態において、一価カチオン活性の調節は、ＴＲＰＭ７チャンネルを含む細胞のカチオン電流および／または膜電位の関数としてモニターすることができる。例えば、膜電位の調節は、膜電位−感受性プローブ、例えば、ビス−（ｌ，３−ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（３））（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、９ｔｈ  ｅｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して検出できる。蛍光膜電位−感受性プローブの使用により、蛍光顕微鏡検査法、フローサイトメトリーおよび蛍光分光法、例えば、蛍光検出を利用した高スループットスクリーニング法の使用などの方法を使用して、蛍光における変化をモニターすることにより、膜電位における変化の迅速な検出が可能になる（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ、ｅｔ  ａｌ、”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１３（２）：  １６７−１９５、（２０００））。
【０１８０】
候補剤によるＴＲＰＭ７チャンネルの一価カチオン性透過性の調節は、ＴＲＰＭ７を発現する細胞を一価カチオンおよび一価カチオンインジケーターであって、一価カチオンと反応して、シグナルを発生させるものと接触させることにより決定できる。一価カチオンの細胞内レベルは、候補生物活性剤の存在下および不在下でのインジケーターシグナルの検出により測定できる。さらに、ＴＲＰＭ７を発現しない細胞を含むＴＲＰＭ７を発現する細胞における細胞内一価カチオンレベルを、候補生物活性剤の存在下および不在下で比較することができる。
【０１８１】
一価カチオンインジケーターは、例えば、ナトリウムまたはカリウムインジケーターであり得る。ナトリウムインジケーターの例は、ＳＢＦＩ、ＣｏｒｏＮａ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｒｏＮａ  Ｒｅｄ、およびナトリウム  Ｇｒｅｅｎを包含する（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、９ｔｈ  ｅｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。カリウムインジケーターの例は、ＰＢＦＩを包含する（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、９ｔｈ  ｅｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。
【０１８２】
本発明は、ＴＲＰＭ７チャンネルの二価カチオン性透過性を調節する分子を同定する方法を提供する。ＴＲＰＭ７チャンネルは、二価カチオン、亜鉛、ニッケル、バリウム、コバルト、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム、カドミウム、およびカルシウムに対して透過性である（Ｈａｒｔｅｎｅｃｋ、Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００５  ３７１：３０７−３１４）。ＴＲＰＭ７チャンネルの二価カチオン性透過性の調節は、例えば、全細胞パッチ・クランプ検定または単一チャンネルメンブラン・パッチ検定において、候補生物活性剤の存在下および不在下で、内向き電流および外向き電流を測定することにより決定できる。もう一つ別の実施形態において、二価カチオン活性の調節は、ＴＲＰＭ７チャンネルを含む細胞のカチオン電流および／または膜電位の関数としてモニターできる。
【０１８３】
候補剤によるＴＲＰＭ７チャンネルの二価カチオン性透過性の調節は、ＴＲＰＭ７を発現する細胞を、二価カチオンおよび二価カチオンと反応して、シグナルを発生させる二価カチオンインジケーターを接触させることにより決定できる。二価カチオンの細胞内レベルは、候補生物活性剤の存在下および不在下でインジケーターシグナルを検出することにより測定できる。さらに、ＴＲＰＭ７を発現しない細胞を含むＴＲＰＭ７を発現する細胞における細胞内二価カチオンレベルは、候補生物活性剤の存在下および不在下で比較することができる。
【０１８４】
二価カチオンインジケーターは、例えば、蛍光マグネシウムインジケーターであってよい。マグネシウムインジケーターの例としては、ｆｕｒａｐｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓTM、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能）が挙げられる。
【０１８５】
神経変性疾患の多くの形態は、カルシウムイオンが原因である。過剰のＣａ２＋流入または細胞内貯蔵からの放出は、Ｃａ２＋−レギュレーターメカニズムの容量を超えるレベルまでＣａ２＋ロードを上昇させ得る（Ａａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ  ２００３  １１５：８６３−８７７）。本発明の方法は、ＴＲＰＭ７チャンネルを通るＣａ２＋流束を検出する方法を包含する。細胞内Ｃａ２＋レベルは、例えば、Ｃａ２＋に対して特異的なインジケーターを用いて検出可能である。Ｃａ２＋に対して特異的であるインジケーターとしては、これに限定されないが、ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｒｈｏｄ−２、ｆｕｒａ−４Ｆ、ｆｕｒａ−５Ｆ、ｆｕｒａ−６Ｆおよびｆｕｒａ−ＦＦ、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８  ＢＡＰＴＡ、カルシウムグリーン、Ｘ−ｒｈｏｄ−１およびｆｕｒａ−ｒｅｄが挙げられる（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、９ｔｈ  ｅｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。Ｃａ２＋ローディングは、細胞におけるＣａ２＋蓄積を測定することにより決定できる。例えば、Ｓａｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、１９９８  ７１、２３４９−２３６４およびＡａｒｔｓ  ｅｔａｌ、Ｃｅｌｌ  ２００３  １１５：８６３−８７７参照。
【０１８６】
細胞中への一価および二価カチオンのレベルはどちらも、別々に、または同時に測定することができる。例えば、Ｃａ２＋特異的インジケーターを用いて、Ｃａ２＋のレベルを検出することができ、一価カチオン特異的インジケーターを用いて、一価カチオンのレベルを検出することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａ２＋インジケーターおよび一価カチオン特異的インジケーターは、インジケーターからのシグナルが同時に検出され得るように選択される。例えば、いくつかの実施形態において、両インジケーターは蛍光シグナルを有するが、両インジケーターの励起および／または発光スペクトルは異なるので、各インジケーターからのシグナルを同時に検出できる。
【０１８７】
さらに別の実施形態において、二価または一価カチオンのレベルおよび膜電位における変化の両方を同時に測定することができる。この実施形態において、Ｃａ  ＋特異的インジケーターを用いて、Ｃａ２＋のレベルを検出することができ、膜電位感受性プローブを用いて、膜電位における変化を検出することができる。Ｃａインジケーターおよび膜電位感受性プローブは、インジケーターおよびプローブからのシグナルが同時に検出され得るように選択することができる。例えば、いくつかの実施形態において、インジケーターおよびプローブはどちらも蛍光  ｗｉｌｌ  蛍光シグナルを有するが、両インジケーターの励起および／発光スペクトルは異なるので、インジケーターからのシグナルを同時に検出できる。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施形態において、ＴＲＰＭ７チャンネルの調節を測定できる前に、ＴＲＰＭ７を活性化しなければならない。ＴＲＰＭ７チャンネルをミリモルレベルのＭｇＡＴＰレベルにより活性化する（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  ４１１：５９０−５９５）。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ＴＲＰＭ７のイオン透過性を、無傷の細胞、例えば、ＴＲＰＭ７をコードする核酸およびこれに操作可能に結合した誘導プロモーターを含むベクターで形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞において測定する。プロモーターの誘発後、ＴＲＰＭ７ポリペプチドを産生し、ＴＲＰＭ７チャンネルを形成する。細胞内イオンの内因性レベルを誘発前に測定することができ、次に誘発後に測定された細胞内イオンのレベルと比較する。一つの実施形態において、蛍光分子を用いて、細胞内一価および二価カチオンレベルを検出することができる。
【０１９０】
ある実施形態において、候補生物活性剤は、例えば、様々な細胞、例えば、脊椎動物の神経系の細胞におけるＴＲＰＭ７チャンネルを開くことができ、好ましい実施形態においては、候補生物活性剤は、様々な細胞、例えば、神経の細胞におけるＴＲＰＭ７チャンネルを閉じる、例えば、阻害する。好ましい候補生物活性剤は、ＴＲＰＭ７チャンネルを閉じるか、または阻害する。ＴＲＰＭ７チャンネルの閉鎖または阻害は、例えば、虚血性傷後の神経細胞死を防止するか、または著しく減少させることができる。
【０１９１】
本発明は、細胞内のＴＲＰＭ７の発現レベルを調節する候補生物活性剤を同定する方法を提供する。細胞内のＴＲＰＭ７の発現を全体的または部分的に抑制または向上させ、これにより細胞表現型を変更する候補剤を使用することができる。これらの候補剤の例は、アンチセンスｃＤＮＡおよびＤＮＡ、調節結合タンパク質および／または核酸、ならびにＴＲＰＭ７をコードする核酸の転写または翻訳を調節する、本明細書において記載される他の候補剤のいずれかを包含する。
【０１９２】
本発明さらに、ＴＲＰＭ７ポリペプチド上の独自のエピトープ、例えば、タンパク質の独自のエピトープと特異的に結合する抗体を提供する。このような抗体は、ＴＲＰＭ７との結合についてだけでなく、ＴＲＰＭ７一価カチオン性透過性を調節するその能力についても評価することができる。抗ＴＲＰＭ７ポリペプチド抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含み得る。抗ＴＲＰＭ７ポリペプチド抗体はさらに一価抗体を含み得る。抗ＴＲＰＭ７ポリペプチド抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。抗ＴＲＰＭ７ポリペプチド抗体はさらに、ヘテロ共役抗体を含み得る。ヘテロ共役抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。
【０１９３】
本発明における使用に特に有用な検定は、興味のある化合物の、酸素およびグルコースが与えられていないＴＲＰＭ７を発現する細胞に対する影響を測定する。酸素およびグルコース除去後の細胞生存または細胞死を測定し、対照細胞サンプル中の細胞生存の量対試験化合物で処理された細胞サンプルにおける細胞生存の両を比較することにより、試験化合物がＴＲＰＭ７活性および虚血性死のモジュレーターであるかどうかを決定することができる。細胞生存を測定する検定は当該分野において公知であり、例えば、死んでいる細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼを測定する検定および生きている細胞におけるＡＴＰを測定する検定を包含する。好ましい候補生物活性剤は、酸素およびグルコースを与えられていない細胞を救済する。望ましいならば、さらなる試験を行って、化合物が、ＴＲＰＭ７遺伝子発現またはタンパク質の生物アッセイに対して影響を及ぼすことを確認することができる。標準的免疫学的検定、例えば、ウェスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡなどを使用できる。ｍＲＮＡの測定に関して、増幅（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲを使用）、またはハイブリダイゼーション検定、例えば、ノーザン・ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、ドット・ブロッティングが好ましい。タンパク質またはｍＲＮＡのレベルは、例えば、直接または間接的に標識された検出剤、例えば、蛍光または放射標識された核酸、放射または酵素標識された抗体などを用いて、本明細書において記載されるようにして、検出することができる。化合物がラットＴＲＰＭ７活性および／または遺伝子またはタンパク質発現および／または細胞生存に対して影響を及ぼすことが断定された後、化合物を、動物モデル、特に、例えば卒中をはじめとする虚血性傷害のラットモデルにおいて使用することができる。
【０１９４】
好ましくは、これらの検定において使用されるＴＲＰＭ７は、配列番号２において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一性を有する。好ましくは、ラット細胞および細胞系が使用される。
Ａ．候補生物活性剤
【０１９５】
本明細書において用いられる「モジュレーター」、「候補物質」、「候補生物活性剤」、「医薬候補」、「薬剤」または文法的等価物は、標的遺伝子、タンパク質、または細胞の活性を直接または間接的に変更することができる生物活性剤について試験される分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ）である。従って、本明細書においてもちいられる「候補生物活性剤」なる用語は、ＴＲＰＭ７と結合するか、ＴＲＰＭ７イオンチャンネルの活性を調節するか、または細胞内のＴＲＰＭ７の発現を変更する任意の分子を言う。候補剤は、イオンチャンネルタンパク質と結合することが知られているか、または結合すると考えられるか、もしくはイオンチャンネルタンパク質の活性を調節するか、細胞内のイオンチャンネルタンパク質の発現を変更することが知られている生物活性剤である。候補剤はまた、イオンチャンネルタンパク質と結合することが知られているか、または結合すると考えられるか、もしくはイオンチャンネルタンパク質の活性を調節するか、または細胞内のイオンチャンネルタンパク質の宇発現を変更することが知られている生物活性剤の模倣物でもあり得る。特に好ましい方法において、候補剤は、反応を誘発するか、または必要とされているような反応、例えば、虚血傷害後の神経細胞死の減少を維持する。
【０１９６】
候補剤は、多くの化学種を含むが、典型的には、これらは有機分子である。候補剤は、合成または天然化合物を包含する広範囲に及ぶ供給源から得られる。例えば、多くの手段が、広範囲に及ぶ有機化合物および生体分子のランダムおよび有向合成、例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現に利用可能である。別法として、細菌、真菌、植物および動物エキスの形態における天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に産生される。さらに、天然または合成により産生されるライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾される。公知の薬剤を、有向またはランダム化学修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化に付して、構造類似体を形成することができる。
Ｂ．コンビナトリアル化学ライブラリー
【０１９７】
本発明は、ラットＴＲＰＭ７活性のモジュレーター（例えば、阻害物質、アクチベーター）についての同定／スクリーニング法を提供する。本発明のスクリーニング法の実施において、候補化合物が提供される。コンビナトリアル化学ライブラリーは、例えば、ラットＴＲＰＭ７活性を阻害する化合物に至る新規化合物の生成を援助するための一つの手段である。  コンビナトリアル化学ライブラリーは、多くの化学的「ビルディングブロック」、例えば、試薬を組み合わせることによる化学合成または生物学的合成のいずれかにより生成される様々な化合物の集合である。例えば、直線状コンビナトリアル化学ライブラリー、例えば、ポリペプチドライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる化学ビルディングブロックのセットを、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）ついてあらゆる可能な方法で組み合わせることにより形成される。数百万の化合物を、化学ビルディングブロックのこのような組み合わせ混合により合成することができる。例えば、１００の交換可能な系統的組み合わせ混合の結果、１億のテトラマー化合物または１００億のペンタマー化合物の理論的な合成が得られる。（例えば、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４、３７：  １２３３−１２５０）参照。コンビナトリアル化学ライブラリーの分離およびスクリーニングは当業者に周知である（例えば、米国特許番号６，００４，６１７；５，９８５，３５６参照）。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーは、これに限定されないが、ペプチドライブラリーを包含する（例えば、米国特許番号５，０１０，１７５；Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．  １９９１、３７：  ４８７−４９３；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１、３５４：  ８４−８８参照）。多様な化学ライブラリーを生成するための他の化学物質は、これに限定されないが：ペプトイド（例えば、ＷＯ  ９１／１９７３５参照）、コードされたペプチド（例えば、ＷＯ  ９３／２０２４２参照）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ  ９２／０００９１参照）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許番号５，２８８，５１４参照）、ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ、例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（例えば、Ｈｏｂｂｓ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９３、９０：  ６９０９−６９１３参照）、ビニル性ポリペプチド（例えば、Ｈａｇｉｈａｒａ、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９２、１１４：  ６５６８参照）、ベータ−Ｄ−グルコース付着物を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（例えば、Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１９９２、１１４：  ９２１７−９２１８参照）、小化合物ライブラリーの類似の有機合成（例えば、Ｃｈｅｎ、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９４、１１６：  ２６６１参照）、オリゴカーバメート（例えば、Ｃｈｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６１：１３０３参照）、および／またはペプチジルホスホネート（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４、５９：  ６５８参照）を包含する。（Ｇｏｒｄｏｎ��Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４、３７：  １３８５）；核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリーについては（例えば、米国特許番号５，５３９，０８３参照）；抗体ライブラリーについては、（例えば、Ｖａｕｇｈｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６，１４：  ３０９−３１４参照）；炭水化物ライブラリーについては、（例えば、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６、２７４：１５２０−１５２２、米国特許番号５，５９３，８５３参照）；小有機分子ライブラリーについては、（例えば、イソプレノイドについては、米国特許番号５，５６９，５８８参照）；チアゾリジノンおよびメタチアザノンについては、（米国特許番号５，５４９，９７４）；ピロリジンについては、（米国特許番号５，５２５，７３５）および５，５１９，１３４；モルホリノ化合物については（米国特許番号５，５０６，３３７）；ベンゾジアゼピンについては（米国特許番号５，２８８，５１４）も参照。  
【０１９８】
コンビナトリアルライブラリーの分離のための装置は商業的に入手可能である（例えば、米国特許番号６，０４５，７５５；５，７９２，４３１；３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ参照）、（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  Ｋｙ．、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓ．、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、９０５０  Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）。多くのロボットシステムも溶液相化学反応のために開発されてきた。これらのシステムは、自動化ワークステーション、例えば、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＬＴＤ．（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）により開発された自動化合成装置など、およびロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、Ｍａｓｓ；Ｏｒｃａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）であって、科学者により行われる手作業の合成操作を模倣するものを包含する。前記装置の任意のものは本発明に関する使用に適している。本明細書において検討されるように操作できるようにするためのこれらの装置の変更の性質および実施は（もしあれば）、関連する分野において通常の技術を有する人に明らかであろう。加えて、多くのコンビナトリアルライブラリーはそれ自体、商業的に入手可能である（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ、Ｍｏｓｃｏｗ、ＲＵ、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｍｄ．などを参照）。
【０１９９】
ラットＴＲＰＭ７遺伝子または遺伝子産物のモジュレーターとして試験される化合物は、任意の小有機分子、または生物学的物質、例えば、タンパク質、例えば、抗体またはペプチド、糖、核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ、またはリボザイム、または脂質であり得る。あるいは、モジュレーターはラットＴＲＰＭ７タンパク質の遺伝的に変更されたバージョンであり得る。典型的には、試験化合物は、小有機分子、ペプチド、脂質、ａｎｄ  脂質類似体である。
【０２００】
本質的に、任意の化合物を本発明の検定において潜在的なモジュレーターまたはリガンドとして使用できるが、ほとんどの場合、化合物は水性または有機（特にＤＭＳＯベースの）溶液中に溶解することができる。検定は、分析段階を自動化し、任意の都合のよい供給源からの化合物を、典型的には平行して実行される分析に提供する（例えば、ロボット分析におけるマイクロタイタープレート上マイクロタイター形式）ことにより、大きな化学ライブラリーをスクリーニングするために設計される。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などをはじめとする、多くの化合物の供給業者が存在すると理解される。
【０２０１】
一つの実施形態において、高スループットスクリーニング法は、コンビナトリアル小有機分子または多数の潜在的な治療化合物（潜在的なモジュレーターまたはリガンド化合物）を含有するペプチドライブラリーを提供することを含む。このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」（前述）を次に１以上の検定において前述のようにスクリーンして、これらのライブラリーメンバー（特に化学種またはサブクラス）であって、所望の特徴的活性を示すものを同定する。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」としての役目を果たすことができるか、またはそれ自体をリード化合物または実際の治療薬として使用することができる。
Ｃ．アレイまたは「バイオチップ」
【０２０２】
本発明は、アレイを用いて、ラットＴＲＰＭ７活性のモジュレーター（例えば、阻害物質、アクチベーター）を同定／スクリーニングの方法を提供する。小分子、核酸、ポリペプチド（抗体を包含する）を含む潜在的なモジュレーターをアレイに固定することができる。本発明の核酸またはポリペプチドはアレイに固定化または適用することができる。アレイは、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸またはポリペプチドの活性と結合または調節するその能力について、スクリーンまたはモニターするために使用できる。例えば、本発明の一つの態様において、モニターされるパラメータは、本発明の核酸を含む遺伝子の転写産物発現である。１以上、または全ての細胞、または、細胞の転写産物の代表的なもの、または細胞の転写産物に対して相補性である核酸の転写産物は、アレイ、すなわち「バイオチップ」上の固定化された核酸に対するハイブリダイゼーションにより、細胞の転写産物を含むサンプルのハイブリダイゼーションにより測定できる。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を使用することにより、細胞の転写産物の一部または全部を同時に定量化することができる。別法として、ゲノム核酸を含むアレイも、本発明の方法により作製された新たに操作された株の遺伝子型を決定するために使用できる。ポリペプチドアレイは、複数のタンパク質を同時に定量化するために使用できる。小分子アレイは、複数のＴＲＰＭ７調節または結合活性を同時に分析するために使用できる。
【０２０３】
本発明は、任意の公知「アレイ」（「マイクロアレイ」または「核酸アレイ」または「ポリペプチドアレイ」または「抗体アレイ」または「バイオチップ」またはその変形としても知られる）を用いて実施できる。アレイは、一般的に、複数の「スポット」または「標的エレメント」であり、各標的エレメントは、サンプル分子、例えば、ｍＲＮＡ転写産物との特異的結合のために基質分子の所定の部分上に固定化された、所定の量の１以上の生物学的分子、例えば、オリゴヌクレオチドを含む。本発明の法補の実施において、任意の公知アレイおよび／またはアレイの製造および使用法を全体として、または一部、またはその変形を、例えば、米国特許番号６，２７７，６２８；６，２７７，４８９；６，２６１，７７６；６，２５８，６０６；６，０５４，２７０；６，０４８，６９５；６，０４５，９９６；６，０２２，９６３；６，０１３，４４０；５，９６５，４５２；５，９５９，０９８；５，８５６，１７４；５，８３０，６４５；５，７７０，４５６；５，６３２，９５７；５，５５６，７５２；５，１４３，８５４；５，８０７，５２２；５，８００，９９２；５，７４４，３０５；５，７００，６３７；５，５５６，７５２；５，４３４，０４９；（ｓｅｅ  ａｌｓｏ、例えば、ＷＯ  ９９／５１７７３；ＷＯ  ９９／０９２１７；ＷＯ  ９７／４６３１３；ＷＯ  ９６／１７９５８；ｓｅｅ  ａｌｓｏ、例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８、１９９８；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９７、２３：  １０８７−１０９２；Ｋｅｒｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９７、２３：  １２０−１２４；Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ、Ｇｅｎｅｓ、１９９７、２０：  ３９９−４０７；Ｂｏｗｔｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐ．  １９９９．  ２１：  ２５−３２）において記載されているように、組み入れることができる。公開された米国特許出願番号２００１００１８６４２；２００１００１９８２７；２００１００１６３２２；２００１００１４４４９；２００１００１４４４８；２００１００１２５３７；２００１０００８７６５も参照される。
【０２０４】
本明細書においてもちいられる「アレイ」または「マイクロアレイ」または「バイオチップ」または「チップ」なる用語は複数の標的エレメントであり、各標的エレメントは、所定の量の１以上のポリペプチド（抗体を含む）または基質表面の所定の部分上に固定化された核酸を含む。
Ｄ．固体状態および可溶性高スループット検定
【０２０５】
ある実施形態において、本発明は、分子、例えば、ドメイン、例えば、リガンド結合ドメイン、活性部位など；異種タンパク質と共有結合して、キメラ分子を作製するドメイン；ラットＴＲＰＭ７；ラットＴＲＰＭ７を発現する細胞または組織（天然に存在するか、または組換え体のいずれか）を用いた可溶性検定を提供する。もう一つ別の実施形態において、本発明は高スループット形式における固相ベースのインビトロ検定（ここにおいて、ドメイン、キメラ分子、ラットＴＲＰＭ７、あるいはラットＴＲＰＭ７を発現する細胞または組織は固相基質に付着している）を提供する。
【０２０６】
本発明の高スループット検定の例において、数千の異なるモジュレーターまたはリガンドを１日でスクリーンアップすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択された潜在的なモジュレーター二対して別の検定を実行することができるか、あるいは濃度またはインキュベーション時間効果が観察されるならば、５〜１０ウェルごとに１つのモジュレーターを試験することができる。このように、１つの標準的マイクロタイタープレートは約１００（例えば、９６）のモジュレーターを分析することができる。１５３６  ウェルプレートが使用されるならば、１つのプレートは約１００−１５００の異なる化合物を容易に分析できる。１日にいくつかの異なるプレートを分析することが可能である；約６，０００−２０，０００までの異なる化合物についてスクリーン分析が本発明の総合システムを用いて可能である。
【０２０７】
興味のある分子を固体状態の成分に、直接あるいは共有または非共有結合により、例えばタグにより間接的に結合させることができる。タグは、様々な成分のいずれかであり得る。一般に、タグと結合する分子（タグバインダー）を固体支持体に固定し、標識された興味のある分子を、タグおよびバインダーの相互作用により固体支持体に付着させる。
【０２０８】
多くのタグおよびタグバインダーを、文献において十分に記載されている公知分子相互作用に基づいて用いることができる。例えば、タグが天然バインダー、例えば、ビオチン、タンパク質Ａ、またはタンパク質Ｇを有する場合、適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートロアビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域など）とあわせて用いることができる。ビオチンなどの天然のバインダーを有する分子に対する抗体も広範囲に利用可能であり、適切なタグバインダーである；ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９８  ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ参照。
【０２０９】
同様に、任意のハプテンまたは抗原化合物を、適切な抗体と組み合わせて使用して、タグ／タグバインダー対を形成することができる。数千の特異抗体が商業的に入手可能であり、多くのさらなる抗体が文献において記載されている。例えば、１つの一般的な構造において、タグは第一抗体であり、タグバインダーは、第一抗体を認識する第二抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、レセプター−リガンド相互作用もタグおよびタグバインダー対として適切である。例えば、細胞膜レセプターの作用物質および拮抗物質（例えば、細胞レセプター−リガンド相互作用、例えば、トランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルスレセプターリガンド、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、インターロイキンレセプター、免疫グロブリンレセプターおよび抗体、カドヘレイン（ｃａｄｈｅｒｅｉｎ）ファミリー、インテグリンファミリー、レクチンファミリーなど；例えば、Ｐｉｇｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ、１９９３参照）。同様に、毒素および毒、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン剤、ステロイドなど）、細胞内レセプター（例えば、様々な小リガンドの効果を媒介するもの、例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤ；ペプチド）、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖おｙび環状ポリマー構造の両方）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗体はすべて様々な細胞レセプターと相互作用できる。
【０２１０】
合成ポリマー、例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素，ポリアミド、ポリエチルエネルミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシリルオキサン、ポリイミド、およびポリアセテートは適切なタグまたはタグバインダーを形成することもできる。多くの他のタグ／タグバインダー対も、この開示の再検討により当業者には明らかであるように、本明細書において記載される検定において有用である。
【０２１１】
一般的なリンカー、例えば、ペプチド、ポリエーテルなどもタグとして機能することができ、ポリペプチド配列、例えば、約５から２００アミノ酸の間のポリグリ配列を包含する。このような柔軟なリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａから入手可能である。これらのリンカーは任意にアミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有する。
【０２１２】
現在利用可能な様々な方法のいずれかを用いて、タグバインダーを固体基質の固定することができる。固体基質は一般的に基質の全部または一部を、化学基をタグバインダーの一部と反応性である表面に固定する化学試薬に暴露することにより、誘導体化させるか、または官能化させる。例えば、さらに長い鎖部分への付着に適した基としては、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを様々な表面、例えば、ガラス表面を官能化するために使用できる。このような固相バイオポリマーアレイの構造は文献において十分に記載されている。（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９６３  ８５：  ２１４９−２１５４（例えば、ペプチドの固相合成を記載）；Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｍｅｔｈ．  １９８７  １０２：  ２５９−２７４  （ピン上の固相成分の合成を記載）；Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８８、４４：  ６０３１−６０４０、（セルロースディスク上の様々なペプチド配列の合成を記載）；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５１：  ７６７−７７７；Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔａｌ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３、３９：  ７１８−７１９；およびＫｏｚａｌ  ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９６、７：  ７５３−７５９  （すべて固相基質に固定されたバイオポリマーのアレイを記載）参照。タグバインダーを基質に固定するための非化学的方法は、他の一般的な、例えば、熱、ＵＶ照射による架橋などを包含する。
Ｅ．コンピューターベースの検定
【０２１３】
ラットＴＲＰＭ７活性を調節する化合物のさらに別の検定は、コンピューター支援医薬設計（アミノ酸配列によりコードされる構造情報に基づいてラットＴＲＰＭ７の三次元構造を生成させるためにコンピューターシステムを使用する）を含む。インプットアミノ酸配列はコンピュータープログラムにおいて事前準備されたアルゴリズムと直接かつ積極的に相互作用して、タンパク質の二次、三次、および四時構造モデルを得る。タンパク質構造のモデルを次に、結合する能力を有する構造の領域、例えば、リガンドを特定するために調べる。これらの領域を次に、タンパク質と結合するリガンドを同定するために使用する。
【０２１４】
ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドをコードする少なくとも１０アミノ酸残基のラットＴＲＰＭ７アミノ酸配列または対応する核酸配列をコンピューターシステムに入力することにより、タンパク質の三次元構造モデルを作製する。ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のアミノ酸配列を、本明細書において提供される配列およびその保存的に修飾された変形からなる群から選択する。アミノ酸配列は、タンパク質の構造情報をコードするタンパク質の一次配列またはサブ配列を表す。少なくとも１０残基のアミノ酸配列（または１０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）をコンピューターキーボード、コンピューターで読み取れる回路基板から入力し、これらは、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスケット、得テープ、カートリッジ、およびチップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）、インターネットサイトにより配布されている情報、およびＲＡＭによるなどを含むが、これに限定されない。当業者に公知のソフトウェアを使用して、アミノ酸配列およびコンピューターシステムの相互作用により、タンパク質の三次元構造モデルを次に作製する。タンパク質の三次元構造モデルは次にコンピューターで読み取れる形態で保存でき、さらなる分析（例えば、タンパク質の潜在的なリガンド結合領域の同定、および遺伝子の突然変異、対立遺伝子および種間相同体のスクリーニング）に使用できる。
【０２１５】
アミノ酸配列は、興味のあるタンパク質の二次、三次および四次構造を形成するために必要な情報をコードする一次構造の代表である。ソフトウェアは一次配列によりコードされるあるパラメータを検査して、構造モデルを作製する。これらのパラメータは「エネルギー項」と称し、主に、静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触可能表面、および水素結合を含む。二次エネルギー項は、ファンデアワールスポテンシャルを含む。生物学的分子は、累積的方法でエネルギー項を最小にする構造を形成する。コンピュータープログラムは、従って、一次構造またはアミノ酸配列によりコードされるこれらの項を使用して、二次構造モデルを作製する。
【０２１６】
二次構造によりコードされるタンパク質の三次構造は、次に、二次構造のエネルギー項に基づいて形成される。この時点での使用者は、追加の変数、例えば、タンパク質が膜結合しているか、または可溶性であるか、体内でのその位置、およびその細胞の位置、例えば、例えば、細胞質、表面または核を入力できる。これらの変数を、二次構造のエネルギー項とともに使用して、三次構造のモデルを形成する。三次構造のモデル化において、コンピュータープログラムは二次構造の疎水面を同等のものと、二次構造の親水面を同等のものと適合させる。
【０２１７】
構造が作製されたら、コンピューターシステムにより、潜在的なリガンド結合領域を銅定する。前述のように、アミノ酸またはヌクレオチド配列または化合物の化学式を入力することにより、潜在的なリガンドの三次元構造を作製する。潜在的リガンドの三次元構造を次にラットＴＲＰＭ７タンパク質のものと比較して、ラットＴＲＰＭ７と結合するリガンドを同定する。エネルギー項を使用して、タンパク質およびリガンド間の結合親和力を決定して、どのリガンドがタンパク質に対する結合の可能性が向上されているかを決定する。この結果、例えば、潜在的なリガンドの三次元構造およびリガンドの結合親和性もコンピューターで読み取れる形態で保存し、さらなる分析（例えば、リガンドについての結合親和力が変更された突然変異タンパク質の三次元モデルを作製する）のために使用できる。
【０２１８】
７．トランスジェニックおよび「ノックアウト」動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、発現カセットまたはベクターまたはトランスフェクトまたは形質転換された細胞を含むトランスジェニックラットを提供する。「トランスジェニックラット」は、細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含有する細胞を有するラットであり、そのＤＮＡは、細胞から発生する動物のゲノムの一部となる。
【０２１９】
これらのラットは、例えば、インビボのラットＴＲＰＭ７活性を調節する薬剤についてスクリーニングするためのインビボモデルとして使用できる。
【０２２０】
一つの態様において、挿入されたトランスジェニック配列は、機能的ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドを発現しないように設計された本発明の配列である。  欠損は、転写、翻訳および／またはタンパク質レベルに基づいて設計される。
【０２２１】
トランスジェニック非ヒト動物において発現されるポリペプチド、例えば、ラットＴＲＰＭ７  ポリペプチドのコード配列は、構成的であるように、または、組織特異性、成長特異的または誘導性転写調節因子の制御下で設計できる。トランスジェニックラットは、当該分野において公知の任意の方法を用いて設計し、発生させることができる；（例えば、米国特許番号６，２１１，４２８；６，１８７，９９２；６，１５６，９５２；６，１１８，０４４；６，１１１，１６６；６，１０７，５４１；５，９５９，１７１；５，９２２，８５４；５，８９２，０７０；５，８８０，３２７；５，８９１，６９８；５，６３９，９４０；５，５７３，９３３；５，３８７，７４２；５，０８７，５７１（形質転換された細胞および卵およびトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシの作成および使用を記載）参照）。遺伝的に変更されたラットを産生する方法の一例は、胚幹細胞を遺伝的に修飾することである。修飾された細胞を  胚盤胞の卵割腔中に注入する。これを次に偽妊娠したメスの子宮中で成長させる。キメラ子孫を容易に検出するために、胚幹細胞と異なる親系統から胚盤胞を得ることができる。例えば、胚盤胞および胚幹細胞は、異なる毛色または他の容易に観察できる表現型を有する親系統から誘導することができる。結果として得られるキメララットを繁殖させて、生殖細胞系伝達により修飾された遺伝子を受け継いだ非キメララットを得ることができる。胚幹細胞の胚盤胞中への導入技術および結果としてのトランスジェニック動物の発生は周知である。
【０２２２】
細胞は１より多い遺伝子のコピーを含有するので、ターゲティングの第一ラウンドから得られる細胞系は、標的とされる対立遺伝子についてヘテロ接合である可能性が高い。両対立遺伝子が修飾される同型接合性は、多くの方法により達成できる。一つの方法において、１つのコピーが修飾された多くの細胞を成長させる。異なる選択可能なマーカーを用いてこれらをターゲティングの別のラウンドに付す。別法として、修飾された対立遺伝子に対してヘテロ接合である動物を、伝統的なメンデル遺伝学に従って繁殖させることにより、ホモ接合体を得ることができる。いくつかの状況において、２つの異なる修飾された対立遺伝子を有するのが望ましい。これは、遺伝子ターゲティングの連続ラウンドにより、またはそのそれぞれが望ましい修飾された対立遺伝子の一つを持つヘテロ接合体の繁殖により達成できる。例えば、（米国特許番５，７８９，２１５）参照。
【０２２３】
様々な方法が、本発明に関連するトランスジェニックラットの産生に利用可能である。
ＤＮＡをオスおよびメス前核の融合前の受精卵の前核中に注入できるか、または胚細胞の核中に注入し（例えば、２細胞胚の核）、続いて細胞分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  １９８５、８２：  ４４３８−４４４２）。胚をウイルス、特に、本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するように修飾されたレトロウイルスで感染させることができる。
【０２２４】
胚の内細胞塊から誘導され、培養物中で安定化された多能性幹細胞は、本発明のヌクレオチド配列を組み入れるために培養物中で操作できる。育ての母中に移植された胚盤胞中に移植し、出産日まで放置することにより、トランスジェニックラットをかかる細胞から産生できる。
【０２２５】
齧歯類胚の操作およびＤＮＡの接合体の前核中へのマイクロインジェクションの手順は、当業者に周知である（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。
【０２２６】
胚幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、エレクトロポレーション、カルシウム  ホスフェート／ＤＮＡ沈殿および直接注入などの方法を用いて、ＤＮＡをＥＳ細胞中に導入することによりトランスジェニック動物を産生する方法も当業者に周知である（Ｅ．Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓおよび胚ｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８７）。
【０２２７】
ランダム遺伝子統合を含む場合、本発明の配列を含有するクローンは、耐性をコードする遺伝子とコトランスフェクトされる。あるいは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を本発明の配列と物理的に結合させる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は、当業者に周知のいくつかの方法のいずれかにより行われる（Ｅ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、前出）。
【０２２８】
ＥＳ細胞中に導入されるＤＮＡ分子は、相同的組換えのプロセスにより染色体中に統合することもできる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９、２４４：１２８８−１２９２）。組換え事象の正の選択法（すなわち、ネオ耐性）および二重正負選択（すなわち、ネオ耐性およびガンシクロビル耐性）およびその後のＰＣＲによる所望のクローンの同定は、（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、ｓｕｐｒａ  およびＪｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９８９、３３８：  １５３−１５６）により記載され、その教唆は図面を包含するその全体として本発明の一部として参照される。手順の最終段階は、標的ＥＳ細胞を胚盤胞中へ注入し、胚盤胞を偽妊娠したメスに移すことである。結果として得られるキメラ動物を繁殖させ、子孫をサザンブロッティングにより分析して、トランス遺伝子を持つ個体を特定する。非齧歯哺乳動物および他の動物を産生するための手順は、他の者により検討されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｐｕｒｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９、２４４：  １２８１−１２８８；およびＳｉｍｍｓ  ｅｔａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８、６：  １７９−１８３）。
Ａ．ラットＴＲＰＭ７機能性ノックアウト
【０２２９】
本発明は、その内因性ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドを発現しないか、またはその内因性ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドを野生型レベルよりも低いレベルで発現するラットを提供する（したがって、完全に「ノックアウト」されていないが、そのラットＴＲＰＭ７活性は機能的に「ノックアウト」されている）。本発明はさらに、「ノックアウト動物」およびこれらの調製法および使用法を提供する。例えば、一つの態様において、本発明のトランスジェニックラットまたは修飾ラットは、内因性遺伝子、例えば、内因性ラットＴＲＰＭ７遺伝子であって、本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する遺伝子と置換されているものを発現しないように操作された「ノックアウトラット」を含む。従って、一つの態様において、挿入されたトランスジェニック配列は、機能的ラットＴＲＰＭ７ポリペプチドを発現しないように設計された本発明の配列である。転写、翻訳および／またはタンパク質レベルに関して欠損を設計することができる。内因性ラットＴＲＰＭ７遺伝子は「ノックアウト」されているので、本発明の挿入されたポリペプチドのみが発現される。
【０２３０】
「ノックアウト動物」は、これから通常にコードされたポリペプチドの生物活性を、変更されていない遺伝子と比較して少なくとも８０％減少させる核酸配列における変更を含有するＤＮＡを含有する細胞を有する特定の種類のトランスジェニック動物である。変更は、挿入、欠失、フレームシフト突然変異、ミスセンス変異、停止コドンの導入、重要なアミノ酸残基の突然変異、イントロン連結の除去などであり得る。好ましくは、変更は、挿入または欠失であるか、あるいは停止コドンを形成するフレームシフト突然変異である。典型的には、特異的内因性遺伝子の分裂は、遺伝子のある部分を削除するか、またはこれを他の配列と置換して、ヌル対立遺伝子を生成させることにより達成できる。ヌル対立遺伝子を有する交雑育種哺乳動物は、遺伝子の活性コピーが欠如したホモ接合性哺乳動物を生成させる。
【０２３１】
この基本技術に対するバリエーションも存在し、当該分野において周知である。例えば、「ノックイン」構築物は、正の選択可能なマーカーをコードする核酸と結合する５’ゲノム座フラグメントをコードする核酸であって、次に、３’ゲノム座フラグメントをコードする核酸と結合するが、コード配列のいずれも省略されず、従って、使用される５’および３’ゲノムフラグメントが、正の選択可能なマーカー遺伝子をコードする核酸の導入により破壊される前に、最初に連続しているという点で異なる、同じ基本配列を言う。この「ノックイン」タイプの構築物は、従って、遺伝子のゲノム座のごく限られた領域のみが突然経にする場合、例えば、１つのエクソンがクローニングおよび遺伝子操作に利用可能である場合に、突然変異トランスジェニック動物の構築に非常に有用である。あるいは、「ノックイン」構築物は、標的とされる遺伝子の１つの機能的ドメインを特異的に拝上するために使用することができ、その結果、コードされたポリペプチドの他のドメインの機能を保持しつつ、１つの機能が欠損した標的とされる遺伝子のポリペプチドを発現するトランスジェニック動物が得られる、このタイプの「ノックイン」突然変異体は、しばしば、いわゆる「ドミナント・ネガティブ」突然変異体の特徴を有し、これは、特にホモマルチマー化するタンパク質の場合に、これは、これが誘導される野生型遺伝子のポリペプチド生成物の作用を特異的にブロックできる。
【０２３２】
細胞中に挿入される各ノックアウト構築物は、まず直線状形態でなければならない。従って、ノックアウト構築物がベクター中に挿入される場合、ＤＮＡを、ノックアウト構築配列内ではなく、ベクター配列内のみで切断するように選択された好適な制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、線形化が行われる。挿入に関して、当業者に周知のように、ノックアウト構築物をＥＳ細胞に、選択された挿入法に適切な条件下で添加する。１より多い構築物がＥＳ細胞中に導入される場合、各ノックアウト構築物を同時に、または一度に導入することができる。
【０２３３】
ノックアウト構築物を適切な位置において含有する好適なＥＳ細胞を前記で概要を記載した選択技術により同定した後、細胞を胚中に挿入することができる。挿入は、当業者に公知の様々な方法で行うことができるが、好ましい方法は、マイクロインジェクションによる。マイクロインジェクションに関して、約１０−３０の細胞をマイクロピペット中に集め、発生の適切な段階である胚中に注入して、ノックアウト構築物を含有する外来ＥＳ細胞を発生中の胚中に統合する。  例えば、形質転換されたＥＳ細胞を、未分化胚芽細胞中に微量注入することができる。ＥＳ細胞の挿入に使用される胚の発生の適当な段階は、非常に種依存的である。胚は、妊娠しているメスの子宮をかん流することにより得られる。これを行うための好適な方法は、当業者に公知である。ＥＳ細胞が胚中に導入された後、前述のように、胚を妊娠のために偽妊娠した養母の子宮中に移植することができる。  
【０２３４】
ノックアウトの調製またはトランスジェニック動物を崩壊させるさらに別の方法も公知である。例えば、（Ｈｏｇａｎ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、２ＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）参照。ノックアウトに依存するリコンビナーゼも、標的配列を挿入するために相同的組換え、標的遺伝子の組織特異性および／または不活性化の一時的制御が組換え配列により制御できるようにすることにより生成させることができる（以下に記載）。
【０２３５】
１より多いノックアウト構築物および／または１より多いトランス遺伝子発現構築物を含有する動物をいくつかの方法のいずれかで調製することができる。調製の好ましい方法は、それぞれが所望のトランスジェニック表現型の１つを含有する一連の哺乳動物を産ませることである。このような動物を一緒に一連の交配、戻し交配および選択により繁殖させ、最終的に、全ての望ましい  ノックアウト構築物および／または発現構築物を含有する単一動物を得る。ここで、動物は他の方法では野生型に対して、ノックアウト構築物および／またはトランス遺伝子が存在する以外はコンジェニック（遺伝的に同一）である。
【０２３６】
本発明の機能的ラットＴＲＰＭ７「ノックアウト」ラットは、いくつかの種類のものである。機能的ラットＴＲＰＭ７「ノックアウト」である本発明のあるラットは、機能的ポリペプチドのレベルを減少させルア、または発現をノックアウトするために十分なレベルのラットＴＲＰＭ７阻害核酸、例えば、本発明のアンチセンス配列またはリボザイムを発現する。本発明は機能的ラットＴＲＰＭ７「ノックアウト」である本発明のあるラットは、遊離内因性活性ラットＴＲＰＭ７の有効量が減少するために十分なレベルのラットＴＲＰＭ７ドミナント・ネガティブポリペプチドを発現する。ラットＴＲＰＭ７「ノックアウト」である本発明のあるラットは、遊離内因性活性ラットＴＲＰＭ７の有効量が減少するために十分なレベルの本発明の抗体、例えば、ラットＴＲＰＭ７抗体を発現する。機能的ラットＴＲＰＭ７「ノックアウト」である本発明のヒト以外のある動物は、その内因性ラットＴＲＰＭ７遺伝子が破壊または突然変異させられている点で「通常の」ノックアウトである。
【０２３７】
８．ＴＲＰＭ７活性のモジュレーターを同定するためのキット
ＴＲＰＭ７活性モジュレーターの同定を可能にするキットも提供される。一つの実施形態において、このようなキットは、インビトロでラットＴＲＰＭ７の活性を評価するために必要な物質を提供する。一つの実施形態において、このキットは、単離されたラットＴＲＰＭ７および培養された細胞のアリコートを含有する。もう一つ別の実施形態において、キットは、野生型または突然変異ラットＴＲＰＭ７のいずれかを発現する細胞系を含有する。さらに別の実施形態において、これらのキットのいくつかにおけるさらなる成分は、検定を行うための使用説明書も含み得る。他の実施形態において、反応容器および補助試薬、例えば、色原体、緩衝液、培地、酵素などもキット中に含めることができる。
実施例
【実施例１】
【０２３８】
ラットＴＲＰＭ７遺伝子のクローニング
ラットｃＤＮＡをラット脳ＲＮＡから逆転写し、ラットＴＲＰＭ７遺伝子のＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰＣＲプライマーをラットＴＲＰＭ７の実質的なｃＤＮＡ配列に基づいて設計した。オープンリーディングフレームおよびあるＵＴＲ領域（４３５５ｂｐおよび４５６６ｂｐ領域）におよぶ２片のＰＣＲフラグメントを得、ＰＣＲｎ  ＴＯＰＯベクター中にクローンした。これらを１片の６９８２ｂｐ挿入物として一緒にＰＣＲＩＩベクター中に入れた。配列を確認し、ヒト、マウスおよびラットゲノム配列と整列させた。
【０２３９】
プライマーは次のように設計された
ｒＴＲＰＭ７Ｆ３８    ５’ＡＧＣＴＧＧＴＣＧＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧ３’  （配列番号１０）
ｒＴＲＰＭ７Ｒ４９３９    ５’ＡＴＡＣＴＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＣＡＴＣＡ３’  （配列番号１１）
ｒＴＲＰＭ７Ｆ２４５６    ５ＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧ３’（ＳＥＱＢＤＮＯ：１２）
ｒＴＲＰＭ７Ｒ７０２２    ５’ＣＡＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴ３’  （配列番号１３）
【実施例２】
【０２４０】
ラット、マウスおよびヒトＴＲＰＭ７核酸の配列アラインメント
［０２４６］        ラットＴＲＰＭ７オープンリーディングフレーム（配列番号１）をマウスＴＲＰＭ７  （ＮＭ＿０２１４５０．１）（配列番号１４）と比較した。結果を図２に示す。
【０２４１】
ラットＴＲＰＭ７オープンリーディングフレーム（配列番号１）をヒトＴＲＰＭ７（ＮＭ＿０１７６７２．２）（配列番号１５）と比較した。結果を図３に示す。
【実施例３】
【０２４２】
タンパク質配列アラインメント
【０２４３】
ラットＴＲＰＭ７（配列番号２）をマウスＴＲＰＭ７（配列番号１６）と比較した。結果を図４に示す。
【０２４４】
ラットＴＲＰＭ７（配列番号２）をヒトＴＲＰＭ７（配列番号１８）と比較した。結果を図５に示す。
【実施例４】
【０２４５】
ＴＲＰＭ７活性を調節する生物活性剤についてスクリーニングする検定
ＴＲＰＭ７は虚血誘発毒性を媒介する。ＴＲＰＭ７を過剰発現する細胞は、従って、
培地からの酸素およびグルコースの除去に対して対照細胞よりも感受性である。ＴＲＰＭ７活性を阻害する生物活性剤は、グルコースおよび酸素を与えられていない細胞に対して保護効果を有する。  虚血により誘発される細胞死を測定するために使用できる検定の２つの例は、死ぬ細胞から放出されるラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定する検定および個々の細胞におけるＡＴＰを測定する検定、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａから得られるＧｌｏ  ｋｉｔ（登録商標）を包含する。細胞死は、ヨウ化プロピジウムおよびジヒドロローダミンの蛍光測定によっても測定できる。
【０２４６】
ＬＤＨ検定の一例は次のとおりである。細胞をポリリシンでコートされたプレート中にプレートする。細胞が少なくとも９０％コンフルーエントである場合にプレートを使用する。培地を除去し、３００  ｕｌ／ウェルＨＢＳＳまたはＤＭＥ（Ｏ２およびグルコースを含まない）で置換する。ＬＤＨ評価のために５０μｌサンプルを異なる時点で集め、透明９６ウェルプレートに移す。２００μｌのＮＡＤＨ溶液（１ｍｇ／１０  ｍｌ  ＰＢＳ）を５０μｌサンプルの各ウェルに添加する。少なくとも２０分後、１０μｌの２２．７  ｍＭピルビン酸塩溶液（５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）を添加し、吸光度を３４０ｎｍで読み取る。Ｏ２またはグルコースの除去前または除去後に候補生物活性剤を添加して、薬剤が細胞生存に関して影響を及ぼすかどうかを決定することができる。
【０２４７】
細胞Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏキット検定の一例は次のとおりである。細胞をポリリシンでコートされたプレート中にプレートする。細胞が少なくとも９０％コンフルーエントである場合にプレートを使用する。培地を除去し、３００  ｕｌ／ウェルＨＢＳＳまたはＤＭＥ（Ｏ２およびグルコースを含まない）で置換する。溶液および試薬のバイアルを解凍する。溶液を試薬に添加し、よく混合する。１００  ｕｌの試薬混合物を各ウェルに添加する。細胞に覆いをし、回転プラットフォーム上に置いて、溶液を少なくとも１０分間混合する。発光をＦＬＥＸステーションで読み取る（＠５  ｒｅａｄｓ  ＝通常の解像度）。細胞生存に関して薬剤が栄養を及ぼすかどうかを決定した後に、候補生物活性剤を添加することができる。
【０２４８】
細胞死は、マルチウェルプレート蛍光スキャナーを用いて、それぞれヨウ化プロピジウムおよびジヒドロローダミンの蛍光測定により測定することもできる。
【実施例５】
【０２４９】
酸素−グルコース除去
細胞から酸素およびグルコースを奪うために、５％  ＣＯ２、１０％  Ｈ２、および８５％  Ｎ２  （＜０．２％  Ｏ２）雰囲気を含有する嫌気性チャンバーに細胞を移す（Ｇｏｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １９９３  １３：３５１０−３５２４）。細胞を５００μｌの非酸素化無グルコース重炭塩溶液で洗浄し、無酸素状態で、３７℃で適切な時間維持する。酸素−グルコース除去は、培養物を酸素化グルコース含有（２０ｍＭ）重炭酸塩溶液で洗浄することにより停止させる。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】ラットＴＲＰＭ７の遺伝子構造、例えば、エクソン配位を示す図である。
【図２】図２Ａ−ＨはラットＴＲＰＭ７  ｃＤＮＡ（配列番号１）のマウスＴＲＰＭ７  ｃＤＮＡ  （ＮＭ＿０２１４５０．１）（配列番号１４）との位置合わせを示す図である。
【図３】図３Ａ−ＨはラットＴＲＰＭ７  ｃＤＮＡ（配列番号１）のヒトＴＲＰＭ７  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０１７６７２．２）（配列番号１５）との位置合わせを示す図である。
【図４】図４Ａ−ＣはラットＴＲＰＭ７（配列番号２）のマウスＴＲＰＭ７（配列番号１６）との位置合わせを示す図である。コンセンサス配列（配列番号１７）は保存アミノ酸を「＋」として示し、非保存アミノ酸について空白を示す。
【図５】図５Ａ−ＣはラットＴＲＰＭ７（配列番号２）のヒトＴＲＰＭ７（配列番号１８）との位置合わせを示す図である。コンセンサス配列（配列番号１９）は保存アミノ酸を「＋」として示し、空白は非保存アミノ酸である。
【図６】図６Ａ−Ｂは５’非翻訳領域を有するラットＴＲＰＭ７  ＲＮＡの完全ｃＤＮＡ（配列番号５）を太字で示し（配列番号８）、３’非翻訳領域を太字で示す（配列番号９）図である。
【図７】イオン輸送ドメインに下線が施された（配列番号３においても）ラットＴＲＰＭ７タンパク質（配列番号２）、およびアルファキナーゼドメインが灰色陰影付けで示される（配列番号４においても）を示す。イオン輸送ドメインおよびアルファキナーゼドメインをコードする核酸は、それぞれ配列番号６および配列番号７において示される。
【図１】
2009511015.tif 000003
【図２Ａ】
2009511015.tif 000004
【図２Ｂ】
2009511015.tif 000005
【図２Ｃ】
2009511015.tif 000006
【図２Ｄ】
2009511015.tif 000007
【図２Ｅ】
2009511015.tif 000008
【図２Ｆ】
2009511015.tif 000009
【図２Ｇ】
2009511015.tif 000010
【図２Ｈ】
2009511015.tif 000011
【図３Ａ】
2009511015.tif 000012
【図３Ｂ】
2009511015.tif 000013
【図３Ｃ】
2009511015.tif 000014
【図３Ｄ】
2009511015.tif 000015
【図３Ｅ】
2009511015.tif 000016
【図３Ｆ】
2009511015.tif 000017
【図３Ｇ】
2009511015.tif 000018
【図３Ｈ】
2009511015.tif 000019
【図４Ａ】
2009511015.tif 000020
【図４Ｂ】
2009511015.tif 000021
【図４Ｃ】
2009511015.tif 000022
【図５Ａ】
2009511015.tif 000023
【図５Ｂ】
2009511015.tif 000024
【図５Ｃ】
2009511015.tif 000025
【図６Ａ】
2009511015.tif 000026
【図６Ｂ】
2009511015.tif 000027
【図７】
2009511015.tif 000028
【配列表】
2009511015000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月4日(2008.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2009511015000001.app
【国際調査報告】
2009511015.tif 000094
2009511015.tif 000095
2009511015.tif 000096
2009511015.tif 000097