(57)【要約】  本発明は、配列番号４または位置９４および２３３でのアミノ酸が配列番号４と同一であるという条件で配列番号４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＡを含むサブタイプＨ３Ｎ８の単離イヌインフルエンザウイルス、弱毒化または不活性化ウイルスを含有する組成物、単離または精製されたＨＡ、ＮＭ、ＮＰ、Ｍ１、ＮＳ１、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２のタンパク質およびそれらの断片と、場合によりそれらをコードするベクターの一部としてのそれらまたは核酸を含有する組成物、ならびに動物におけるイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、上記組成物をその動物に投与する工程を含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４または位置９４および２３３でのアミノ酸が配列番号４と同一であるという条件で配列番号４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する赤血球凝集素（ＨＡ）を含むサブタイプＨ３Ｎ８の単離イヌインフルエンザウイルス。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列または位置６８および１３４でのアミノ酸が配列番号２と同一であるという条件で配列番号２に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含むノイラミニダーゼ（ＮＭ）を含む請求項１に記載の単離イヌインフルエンザウイルス。
【請求項３】
以下、すなわち配列番号６のアミノ酸配列またはアミノ酸４０２が配列番号６の配列と同一であるという条件で配列番号６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する核タンパク質（ＮＰ）、配列番号８のアミノ酸配列またはアミノ酸１１１が配列番号８の配列と同一であるという条件で配列番号８に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するマトリックス１タンパク質（Ｍ１）、配列番号１０のアミノ酸配列を有する非構造タンパク質１（ＮＳ１）、配列番号１２のアミノ酸配列またはアミノ酸２３３、２５６、３２７、および５６１が配列番号１２と同一であるという条件で配列番号１２に対して９８％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＡタンパク質、配列番号１４のアミノ酸配列またはアミノ酸２００および２１３が配列番号１４と同一であるという条件で配列番号１４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＢ１、および／または配列番号１６のアミノ酸配列またはアミノ酸１０７、２２１、２９２、および６６１が配列番号１６と同一であるという条件で配列番号１６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＢ２のうちの少なくとも１つをさらに含む請求項１または２に記載の単離イヌインフルエンザウイルス。
【請求項４】
弱毒化された請求項１に記載の単離イヌインフルエンザウイルス。
【請求項５】
免疫応答を誘発するのに十分な量の請求項４に記載の単離イヌインフルエンザウイルスを含有する組成物。
【請求項６】
不活性化された請求項１に記載の単離イヌインフルエンザウイルス。
【請求項７】
免疫応答を誘発するのに十分な量の請求項６に記載の単離イヌインフルエンザウイルスを含有する組成物。
【請求項８】
特許寄託番号ＰＴＡ−７６９４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたサブタイプＨ３Ｎ８の単離イヌインフルエンザウイルス。
【請求項９】
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置９４および２３３で配列番号４の配列と同一であるという条件で配列番号４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＨＡ、あるいは、少なくとも１つが配列番号４の位置９４または２３３で前記アミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項１０】
動物において免疫応答を誘発するのに十分な量の請求項９に記載の単離または精製されたＨＡまたはその断片および生物学的に許容できる担体を含有する組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物を動物に投与することを含む、動物においてイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、該投与によってイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答が動物において誘発される、方法。
【請求項１２】
場合によりベクターの一部である、請求項９に記載のＨＡまたはその断片をコードする単離または精製された核酸。
【請求項１３】
前記ＨＡをコードする前記核酸が配列番号３のヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の単離または精製された核酸または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片。
【請求項１４】
ＨＡまたはその断片を動物において免疫応答を誘発するのに十分な量で発現する、請求項１２または１３に記載の単離または精製された核酸および生物学的に許容できる担体を含有する組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物を動物に投与することを含む、動物においてイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、該投与によってイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答が動物において誘発される、方法。
【請求項１６】
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置６８および１３４で配列番号２の配列と同一であるという条件で配列番号２に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む単離または精製されたＮＭ、あるいは、少なくとも１つが配列番号２の位置６８または１３４で前記アミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項１７】
動物において免疫応答を誘発するのに十分な量の請求項１６に記載の単離または精製されたＮＭまたはその断片および生物学的に許容できる担体を含有する組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組成物を動物に投与することを含む、動物においてイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、該投与によってイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答が動物において誘発される、方法。
【請求項１９】
場合によりベクターの一部である、請求項１６に記載のＮＭまたはその断片をコードする単離または精製された核酸。
【請求項２０】
前記ＮＭをコードする前記核酸が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の単離または精製された核酸または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片。
【請求項２１】
ＮＭまたはその断片を、免疫応答を誘発するのに十分な量で発現する、請求項１９または２０に記載の単離または精製された核酸および生物学的に許容できる担体を含有する組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物を動物に投与することを含む、動物においてイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、該投与によってイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答が動物において誘発される、方法。
【請求項２３】
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置４０２で配列番号６の配列と同一であるという条件で配列番号６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＮＰ、あるいは、少なくとも１つが配列番号６の位置４０２で前記アミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項２４】
場合によりベクターの一部である、請求項２３に記載のＮＰまたはその断片をコードする単離または精製された核酸。
【請求項２５】
前記ＮＰをコードする前記核酸が配列番号５のヌクレオチド配列を有する請求項２４に記載の単離または精製された核酸または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片。
【請求項２６】
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置１１１で配列番号８の配列と同一であるという条件で配列番号８に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＭ１、あるいは、少なくとも１つが配列番号８の位置１１１で前記アミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項２７】
場合によりベクターの一部である、請求項２６に記載のＭ１またはその断片をコードする単離または精製された核酸。
【請求項２８】
前記Ｍ１をコードする前記核酸が配列番号７のヌクレオチド配列を有する請求項２７に記載の単離または精製された核酸または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片。
【請求項２９】
配列番号１０のアミノ酸配列を有する単離または精製されたＮＳ１。
【請求項３０】
場合によりベクターの一部である、請求項２９に記載のＮＳ１をコードする単離または精製された核酸。
【請求項３１】
前記ＮＳ１をコードする前記核酸が配列番号９のヌクレオチド配列を有する請求項３０に記載の単離または精製された核酸。
【請求項３２】
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置２３３、２５６、３２７、および５６１で配列番号１２の配列と同一であるという条件で配列番号１２に対して９８％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＰＡタンパク質、あるいは、少なくとも１つが配列番号１２の位置２３３、２５６、３２７、または５６１で前記アミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項３３】
場合によりベクターの一部である、請求項３２に記載のＰＡまたはその断片をコードする単離または精製された核酸。
【請求項３４】
前記ＰＡをコードする前記核酸が配列番号１１のヌクレオチド配列を有する請求項３３に記載の単離または精製された核酸または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片。
【請求項３５】
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置２００および２１３で配列番号１４の配列と同一であるという条件で配列番号１４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＰＢ１、あるいは、少なくとも１つが配列番号１４の位置２００または２１３で前記アミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項３６】
場合によりベクターの一部である、請求項３５に記載のＰＢ１またはその断片をコードする単離または精製された核酸。
【請求項３７】
前記ＰＢ１をコードする核酸が配列番号１３のヌクレオチド配列を有する請求項３６に記載の単離または精製された核酸または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片。
【請求項３８】
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置１０７、２２１、２９２、および６６１で配列番号１６の配列と同一であるという条件で配列番号１６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＰＢ２、あるいは、少なくとも１つが配列番号１６の位置１０７、２２１、２９２、または６６１で前記アミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片。
【請求項３９】
場合によりベクターの一部である、請求項３８に記載のＰＢ２またはその断片をコードする単離または精製された核酸。
【請求項４０】
前記ＰＢ２をコードする前記核酸が配列番号１５のヌクレオチド配列を有する請求項３９に記載の単離または精製された核酸または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００５年１０月１８日出願のU.S. Provisional Patent Application No. 60／727,808、および２００６年１０月５日出願のU.S. Utility Patent Application No. 11／539,123の利益を主張するものであり、その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ウイルス学、分子生物学、および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、イヌインフルエンザウイルス、ならびに動物における免疫応答の誘発における関連組成物および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属するＲＮＡウイルスである。ウイルスＲＮＡは８つの独立セグメントからなり、それらはインフルエンザウイルス内で組換えを容易に行い新たなサブタイプを生成する。
【０００４】
ヌクレオカプシドの主要成分である核タンパク質（ＮＰ）は、５番目のセグメントにコードされる。ＮＰおよびマトリックスタンパク質を用いることで、インフルエンザウイルスがグループＡ、ＢまたはＣに分類される。ＮＰが内部タンパク質であることから、それは宿主の免疫系による選択圧を受けることはない。それはＲＮＡに結合し、転写酵素複合体の一部であり、かつウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の核−細胞質輸送に関与する。
【０００５】
末端シアル酸とその次の糖残基を連結するα−ケト結合を分離することによって感染細胞由来のウイルスの子孫の放出を可能にするノイラミニダーゼ（ＮＭ）は、６つのセグメントによってコードされる。この酵素の９つのサブタイプ（Ｎ１〜Ｎ９）については同定されている。すべてのサブタイプは、２つの構造領域、すなわちストークおよびヘッドを有する。すべてのＮ８タンパク質は４７０個のアミノ酸を有し、その最初の８個は高度に保存される。それに続く領域は、疎水性アミノ酸に豊み、膜透過ドメインであると考えられる。次の５１個のアミノ酸はストーク領域を構成し、ヘッド領域はＣｙｓ９１から開始する。最後の領域は酵素の触媒部位を有する。ヘッドおよびストーク領域内のシステイン残基は、高度に保存される傾向がある。推定上のＮ−グリコシル化部位が６〜８個存在する。
【０００６】
ウイルスの宿主細胞への吸着を担う膜糖タンパク質である赤血球凝集素（ＨＡ）は、中和抗体の対象となる主な抗原である。その抗原の変異がインフルエンザ流行の主な原因である。それは第４のセグメントによってコードされる。１６の異なるサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）が同定されている。ＨＡは、ジスルフィド橋によって連結される１６個のアミノ酸と２個のポリペプチド（ＨＡ１およびＨＡ２）のシグナルペプチドを有する。ＨＡ１はアミノ末端を有する一方、ＨＡ２はカルボキシル末端を有する。ＨＡ２内の疎水性領域はＨＡをウイルス膜に固定する。システイン残基は高度に保存される傾向がある。６つの推定上のグリコシル化部位が存在することで、ウイルスにおけるその抗原部位のマスクが可能になる（非特許文献１）。
【０００７】
他のタンパク質は、マトリックス（ＭまたはＭ１およびＭ２）、非構造性のもの（ＮＳまたはＮＳ１およびＮＳ２）、ＰＡ、ＰＢ１、ならびにＰＢ２を含む。Ｍ１タンパク質は、感染細胞の原形質膜にタンパク質のＮ末端の２つの疎水性領域を介して結合するビリオンの主要成分である一方、Ｍ２はイオンチャネルであり、それ故、必須の膜タンパク質である。ＮＳ１タンパク質は核内に見出され、細胞ＲＮＡの輸送、スプライシング、および翻訳に作用する。ＮＳ２タンパク質は核内および細胞質内に見出され、未知の機能を有する。ＰＡタンパク質は転写酵素であり、プロテアーゼ活性を有しうる一方、ＰＢ１タンパク質は転写伸長における機能を果たし、かつＰＢ２タンパク質は転写でのキャップ結合における機能を果たす。
【０００８】
全世界的には、インフルエンザはヒト、ブタ、ウマおよびトリにおける最も経済的見地から重要な呼吸器疾患である（非特許文献２）。インフルエンザウイルスはその連続的な遺伝子および抗原の変化として知られ、それはウイルスの有効な制御の妨げとなっている（非特許文献３）。流行および汎発の予防においては、遺伝子の混ぜ合わせまたは種間伝播によるウイルスの新しいサブタイプの出現が関心の的となっている（非特許文献２）。
【０００９】
最近、インフルエンザの発生については、従来からインフルエンザウイルスを運搬しないとされているネコとイヌのごとき種において生じている（非特許文献４;非特許文献５;非特許文献６;および非特許文献７）。したがって、インフルエンザウイルスの宿主域は拡大している。
【００１０】
インフルエンザウイルスによる感染により引き起こされる、レース用のグレーハウンドにおける呼吸器疾患の発生については、２００４年にフロリダ州、２００５年４月に東部および西部アイオワ州および２００５年にテキサス州で生じている。同疾患は熱および咳の急激な発症、多呼吸、および出血性鼻汁によって特徴づけられた。罹患率はアイオワ州ではいずれのレーストラックの敷地でもほぼ１００％であったが、死亡率は５％未満であった。大部分の割合の罹患したイヌが回復したが、多数が出血性肺炎で死亡した。広域スペクトルの抗生物質の治療的投与により疾患の重症度が低下したが、それを制御することはできなかった。
【非特許文献１】Skehel et al., PNAS USA 81: 1779 (1984)
【非特許文献２】Wright et al., Orthomyxoviruses.  In:  Fields Virology.  Knipe et al., eds.  Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001.  pp. 1533-1579.
【非特許文献３】Wright et al. (2001), supra; Webster et al., Microbiol. Rev. 56: 152-179 (1992)
【非特許文献４】Keawcharoen et al., Emerg. Infect. Dis. 10: 2189-2191 (2004)
【非特許文献５】Crawford et al., Science 310: 398-485 (October 21, 2005; published online September 29, 2005)
【非特許文献６】Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia.  In: Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Greensboro, NC, October 2005.  p. 158
【非特許文献７】Yoon et al., Emerg. Infect. Dis. 11(12): 1974-1976 (December 2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記を考慮すると、イヌに感染するインフルエンザウイルスを提供することが本発明の目的である。イヌにおけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するための材料および方法を提供することが本発明の別の目的である。これらや他の目的および利点、ならびにさらなる発明の特徴は、本明細書で提供される詳細な説明から明白になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、配列番号４または位置９４および２３３でのアミノ酸が配列番号４と同一であるという条件で配列番号４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＡを含むサブタイプＨ３Ｎ８の単離イヌインフルエンザウイルスを提供する。特に本発明は、２００６年６月２９日に特許寄託番号ＰＴＡ−７６９４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州）に寄託されたサブタイプＨ３Ｎ８の単離イヌインフルエンザウイルスを提供する。したがって、本発明は、弱毒化ウイルスを含有する組成物ならびに不活性化ウイルスを含有する組成物も提供する。
【００１３】
本発明は単離または精製されたタンパク質も提供する。一実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置９４および２３３で配列番号４の配列と同一であるという条件で配列番号４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＨＡ、あるいは、少なくとも１つが配列番号４の位置９４または２３３でそのアミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片を提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置６８および１３４で配列番号２の配列と同一であるという条件で配列番号２に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む単離または精製されたＮＭ、あるいは、少なくとも１つが配列番号２の位置６８または１３４でそのアミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片を提供する。
【００１５】
さらに別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置４０２で配列番号６の配列と同一であるという条件で配列番号６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＮＰ、あるいは、少なくとも１つが配列番号６の位置４０２でそのアミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片を提供する。
【００１６】
さらに別の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するかまたは（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸位置１１１で配列番号８の配列と同一であるという条件で配列番号８に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＭ１、あるいは、少なくとも１つが配列番号８の位置１１１でそのアミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片を提供する。
【００１７】
単離または精製されたＮＳ１も提供され、それは配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置２３３、２５６、３２７、および５６１で配列番号１２の配列と同一であるという条件で配列番号１２に対して９８％（もしくは９９％）を超えて同一のアミノ酸配列を有する単離または精製されたＰＡタンパク質、あるいは、少なくとも１つが配列番号１２の位置２３３、２５６、３２７、および５６１でそのアミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片もさらに提供される。
【００１９】
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置２００および２１３で配列番号１４の配列と同一であるという条件で配列番号１４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＰＢ１、あるいは、少なくとも１つが配列番号１４の位置２００または２１３でそのアミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片もまたさらに提供される。
【００２０】
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または（ｉｉ）インフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置１０７、２２１、２９２、および６６１で配列番号１６の配列と同一であるという条件で配列番号１６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する単離または精製されたＰＢ２、あるいは、少なくとも１つが配列番号１６の位置１０７、２２１、２９２、または６６１でそのアミノ酸に対して同一である少なくとも９つの隣接アミノ酸を含む（ｉ）または（ｉｉ）の断片もまたさらに提供される。
【００２１】
上記を考慮すると、本発明は、動物において免疫応答を誘発するのに十分な量の、ＨＡもしくはＮＭなどの上記のタンパク質またはその断片および生物学的に許容できる担体を含有する組成物をさらに提供する。
【００２２】
さらに上記を考慮すると、本発明は、動物においてイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。本方法は、タンパク質またはその断片を含有する組成物を動物に投与する工程を含む。
【００２３】
動物において免疫応答を誘発するのに十分な量の、ＨＡもしくはＮＭなどのタンパク質またはその断片を発現する単離または精製された核酸および生物学的に許容できる担体を含有する組成物としての、場合によりベクターの一部である、上記のタンパク質またはその断片をコードする単離または精製された核酸も提供される。
【００２４】
したがって、本発明は動物におけるイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する別の方法も提供する。本方法は核酸を含有する組成物を動物に投与する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明では、イヌにおけるインフルエンザウイルスの株の発見について記載される。同株は、東部および西部アイオワ州におけるレース用のグレーハウンドから単離された。株はＨ３Ｎ８サブタイプとして分類されており、Ａ／イヌ／アイオワ／１３６２８／２００５と指定されている。したがって、本発明は、配列番号４または位置９４および２３３でのアミノ酸が配列番号４と同一であるという条件で配列番号４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＡを含むウイルスを提供する。ウイルスは、配列番号２のアミノ酸配列または位置６８および１３４でのアミノ酸が配列番号２と同一であるという条件で配列番号２に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含むＮＭをさらに含みうる。上記ＨＡを含有するウイルスは、単独でまたは上記ＮＭとのさらなる組み合わせにおいて、配列番号６のアミノ酸配列またはアミノ酸４０２が配列番号６の配列に対して同一であるという条件で配列番号６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＮＰ；配列番号８のアミノ酸配列またはアミノ酸１１１が配列番号８の配列に対して同一であるという条件で配列番号８に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＭ１；配列番号１０のアミノ酸配列を有するＮＳ１；配列番号１２のアミノ酸配列またはアミノ酸２３３、２５６、３２７、および５６１が配列番号１２に対して同一であるという条件で配列番号１２に対して９８％（もしくは９９％）を超えて同一のアミノ酸配列を有するＰＡタンパク質；配列番号１４のアミノ酸配列またはアミノ酸２００および２１３が配列番号１４に対して同一であるという条件で配列番号１４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＢ１；ならびに／あるいは配列番号１６のアミノ酸配列またはアミノ酸１０７、２２１、２９２、および６６１が配列番号１６に対して同一であるという条件で配列番号１６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＢ２のうちの少なくとも１つをさらに含有しうる。特に、本発明は、２００６年６月２９日に特許寄託番号ＰＴＡ−７６９４としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）  １０８０１  ユニバーシティブルバード（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．）、マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州  ２０１１０−２２０９、米国に寄託されたサブタイプＨ３Ｎ８の単離イヌインフルエンザウイルスを提供する。
【００２６】
インフルエンザウイルスについては、水性媒体内のウイルスに３，０００〜２０，０００の分子量を有する最大５重量％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧの可溶化力に相当する量の別の線形でフィラメント状の非荷電ポリマーの存在によってもたらされる１つ以上の不溶化する工程と、不溶化画分を不溶化されていない画分から分離する工程と、ウイルスを画分のうちの１つから回収する工程とを施すことにより沈殿されうる（例えばU.S. Pat. No. 3,989,818を参照）。好ましくは、温度は３５℃を超えることなく、ｐＨは６〜９の間であり、かつ水性媒体のイオン強度はウイルスにおける塩析点未満である。不溶化に先立つ水性媒体内のウイルスの濃度は、３２のうちの少なくとも１つの赤血球凝集力価に対応する。凝集されたウイルス粒子が得られ、それらはワクチン注射後のウイルス粒子の徐放によるより良好な抗原効果をもたらすと考えられる。しかし、凝集されない粒子またはあまり凝集されない粒子が望ましい場合、それらは超音波処理などの任意の適切な方法を用いて解離されうる。
【００２７】
ウイルスは、その免疫原性の特徴を完全に保持しながら、ウイルスが疾患をもたらすその能力を失うまで細胞系内を通過することによって弱毒化されうる。例えば、ウイルスは、イヌ種または他の適切な種に由来する細胞の培養物内を約３７℃の温度で連続的に通過されうる。各継代で、ウイルスは１つの培養物から採取され、当該技術分野で既知の方法に従って新しい細胞培養物を含有する培地内に接種される。例えば、ウイルスは組織細胞培養液および／または細胞から回収されうる。場合により、採取の間、細胞培養物に超音波処理を施すことでウイルスの放出が促進されうる。例えばU.S. Pat. Nos. 5,698,433および6,455,298を参照のこと。
【００２８】
必要に応じ、インフルエンザ株を、血清の存在下で鶏卵などの孵化卵の尿膜腔内を少なくとも１回通過させることで、血清耐性ウイルス（ｓｅｒｕｍ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｖｉｒｕｓ）が取得可能である（例えばU.S. Pat. No. 3,953,592; Kilbourne et al., J.Exp. Med. 111: 387 (1960); Kilbourne, Science 160: 74-75 (April 1968);およびLaver et al., Virology 30: 493-501 (1966)を参照）。低発熱性および低内毒素性を有する高効力のインフルエンザワクチンが、弱毒化ウイルスを含有する濃縮された尿膜腔液を酢酸ブチルおよび酢酸エチルで連続的に処理した後、フラッシュ蒸発を行うことによって得られうる（例えばU.S. Pat. No. 4,000,257を参照）。かかるウイルスをワクチンとして鼻腔内に投与してもよい。
【００２９】
ウイルスは、一旦宿主内に接種されると必要とされる初期接種材料が極めて少量ですむような程度まで増殖する。ウイルスは無害でなければならず、かつ感染しやすい接触における感染は最小に保持される必要がある。
【００３０】
あるいは、ウイルスは複製および毒性を根絶することにより不活性化してもよい。これを化学的または物理的手段によって行ってもよい。化学的不活性化を、酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトンもしくはその誘導体、エチレンイミンもしくはその誘導体、有機溶媒（例えばハロゲン化炭化水素）、および／または界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）、デソキシコール酸ナトリウム、スルホベタイン、またはセチルトリメチルアンモニウム塩）によるウイルスの処理によって行ってもよい。必要があれば、化学的に活性化された組成物を中和してもよい。例えば、ホルムアルデヒドが組成物を非活性化するのに用いられる場合、組成物をチオ硫酸塩で中和してもよい。必要があれば、それに続きｐＨを約７の値に戻してもよい。あるいは、ウイルスをエーテルとエタノールの混合物で抽出し、水相と有機相を分離し、かつ残留エーテルを減圧下でウイルス懸濁液から除去してもよい（例えばU.S. Pat. No. 4,431,633を参照）。有利にも、物理的不活性化を、ウイルスに紫外光、γ−放射、またはＸ線などのエネルギーに富む放射を与えることによって行うことが可能である。不活性化形態には比較的大量の接種材料、したがってそれに対応する大量の抗原材料が必要であり、それを作製し、試験し、かつ分布させる必要がある。
【００３１】
上記を考慮すると、本発明は、弱毒化または不活性化ウイルスを含有する組成物も提供する。ウイルスは、免疫応答を誘発するのに十分な量で存在し、望ましくは攻撃された時に保護をもたらす必要がある。一般に、特に組成物が不活性化ウイルスを含有する場合、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント、サポニン、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）（Ｃｏｐａｒｖａｘ（登録商標））、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはこれらの混合物などのアジュバントが組成物に添加される。タンパク質加水分解物および／またはアミノ酸を添加することで組成物を安定化することが可能である（例えばU.S. Pat. No. 4,537,769を参照）。あるいは、組成物はマルコル（Ｍａｒｃｏｌ）および／またはアーラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）などのオイルを用いて水中油エマルジョンとして調合されうる。
【００３２】
組換えインフルエンザ株は、例えば本明細書中に提供される、「過剰に弱毒化された」（すなわち、弱毒化のための継代の数が病原性を除去するのに通常必要な分よりも実質的に多い）インフルエンザＡ親株、例えばＡ２と毒性のあるインフルエンザ株との組み合わせからも調製されうる（例えばU.S. Pat. No. 3,991,179を参照; またU.S. Pat. Nos. 4,009,258; 4,278,662; 4,318,903; 4,338,296; および4,693,893も参照）。組換え株については、好ましくは、毒性株の例えばＨＡおよびＮＭタンパク質の抗原特性と共役した、過剰に弱毒化された株の成長特性を有する。ワクチン製剤のためのインフルエンザウイルスの株の選択については、U.S. Pat. No.5,162,112に記載されている。組換え株は、免疫応答を誘発するための組成物として調合されうる。
【００３３】
冷蔵庫内での保存のため、ショ糖、アルギニン一塩酸塩、グルタミン酸のモノナトリウム一水和物、およびゼラチン加水分解物を用いると、インフルエンザウイルス組成物が安定化されうる。例えば、U.S. Pat. App. Pub. No. 2006／0110406を参照のこと。
【００３４】
上記を考慮すると、本発明は単離または精製されたＨＡも提供する。ＨＡは、配列番号４のアミノ酸配列を有するか、またはインフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置９４および２３３で配列番号４の配列と同一であるという条件で配列番号４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。少なくとも９個（９、１２、１５、１８、２１もしくは２４個など）の隣接アミノ酸であって、そのうちの少なくとも１つが配列番号４の位置９４または２３３でそのアミノ酸に対して同一である、隣接アミノ酸を含むＨＡの断片も提供される。
【００３５】
単離または精製されたＮＭもまた提供される。ＮＭは配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはインフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置６８および１３４で配列番号２の配列と同一であるという条件で配列番号２に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも９つの隣接アミノ酸であって、そのうちの少なくとも１つが配列番号２の位置６８または１３４でそのアミノ酸に対して同一である、隣接アミノ酸を含むＮＭの断片も提供される。
【００３６】
単離または精製されたＮＰがさらに提供される。ＮＰは配列番号６のアミノ酸配列を有するか、またはインフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置４０２で配列番号６の配列と同一であるという条件で配列番号６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。少なくとも９つの隣接アミノ酸であって、そのうちの少なくとも１つが配列番号６の位置４０２でそのアミノ酸に対して同一である、隣接アミノ酸を含むＮＰの断片も提供される。
【００３７】
さらに単離または精製されたＭ１も提供される。Ｍ１は配列番号８のアミノ酸配列を有するか、またはインフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置１１１で配列番号８の配列と同一であるという条件で配列番号８に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。少なくとも９つの隣接アミノ酸であって、そのうちの少なくとも１つが配列番号８の位置１１１でそのアミノ酸に対して同一である、隣接アミノ酸を含むＭ１の断片も提供される。
【００３８】
さらに単離または精製されたＮＳ１も提供され、それは配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
単離または精製されたＰＡタンパク質もまた提供される。ＰＡは配列番号１２のアミノ酸配列を有するか、またはインフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置２３３、２５６、３２７、および５６１で配列番号１２の配列と同一であるという条件で配列番号１２に対して９８％（もしくは９９％）を超えて同一のアミノ酸配列を有する。少なくとも９つの隣接アミノ酸であって、そのうちの少なくとも１つが配列番号１２の位置２３３、２５６、３２７、または５６１でそのアミノ酸に対して同一である、隣接アミノ酸を含むＰＡの断片も提供される。
【００４０】
単離または精製されたＰＢ１が提供される。ＰＢ１は配列番号１４のアミノ酸配列を有するか、またはインフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置２００および２１３で配列番号１４の配列と同一であるという条件で配列番号１４に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。少なくとも９つの隣接アミノ酸であって、そのうちの少なくとも１つが配列番号１４の位置２００または２１３でそのアミノ酸に対して同一である、隣接アミノ酸を含むＰＢ１の断片も提供される。
【００４１】
単離または精製されたＰＢ２もまた提供される。ＰＢ２は配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、またはインフルエンザウイルスに由来しかつアミノ酸配列がアミノ酸位置１０７、２２１、２９２、および６６１で配列番号１６の配列と同一であるという条件で配列番号１６に対して９９％よりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。少なくとも９つの隣接アミノ酸であって、そのうちの少なくとも１つが配列番号１６の位置１０７、２２１、２９２、または６６１でそのアミノ酸に対して同一である、隣接アミノ酸を含むＰＢ２の断片も同様に提供される。
【００４２】
上記タンパク質およびその断片を、当該技術分野で既知の方法に従い、（断片を生成するための化学的または物理的断片化と共役させて）精製または合成してもよい。例えば、固相タンパク質合成においてはMeienhofer, Hormonal Proteins and Peptides 2: 46, Academic Press, NY (1973)、および溶液相タンパク質合成においてはSchroder et al., The Peptides, vol. 1, Academic Press, NY (1965)を参照のこと。製造業者の使用説明書に従い、自動システムを用いてかかる技術を実行してもよい。治療量を組換え的に生成し、かつ精製してもよい。
【００４３】
あるいは、タンパク質、特にＨＡおよびＮＭを選択的可溶化により単離する一方、すべての非本質的なウイルス成分が入った無傷の脂質／タンパク質膜からなる残存するサブウイルス粒子を残してもよい。可溶化タンパク質および残存するサブウイルス粒子のサイズ／密度における差異により、物理特性における差異に基づく、勾配遠心分離および断片化、沈降、分子ふるいクロマトグラフィー、または超遠心分離機内でのペレット化による分離が可能になる。ＨＡおよびＮＭの選択的可溶化は、ウイルスのカチオン界面活性剤による処理により実施可能である（例えばU.S. Pat. No. 4,140,762；いわゆる‘762特許を参照）。ウイルス全体を含有する、細胞培養物から得られる流体は、ＤＮＡ消化酵素で処理後、カチオン界面活性剤の添加および表面抗原タンパク質の単離がなされうる（例えばU.S. Pat. No. 5,948,410を参照）。流体にいくつかの超遠心分離工程を施すか、またはウイルスを両親媒性の非イオン界面活性剤の存在下で断片化後に濾過することで望ましくない物質が除去されうる（例えばU.S. Pat. No. 6,048,537を参照）。あるいは、膜濾過および化学的分離を用い、ウイルスタンパク質が取得されうる（例えばU.S. Pat. No. 4,327,182を参照）。他の方法については、U.S. Pat. Nos. 4,064,232および4,057,626に記載されている。好ましくは、ウイルスは‘762特許（col. 2, ll. 10 et seq）中に例示のように処理前に増幅される。
【００４４】
マッピングを行い、免疫応答を誘発するウイルスタンパク質のエピトープを同定する、すなわち「エピトープマッピング」を行ってもよい。かかるマッピングは、タンパク質の重複ペプチド（９、１２、１５、１８、２１もしくは２４個のアミノ酸を含むペプチドなど）への断片化を含む。タンパク質をタンパク質分解酵素で断片化してもよい。次いで、個々のペプチドにおける、天然タンパク質により誘発される抗体に結合するかまたはＴ細胞もしくはＢ細胞の活性化を誘発するそれらの能力について試験される。あるいは、親水性残基がタンパク質の表面上に存在することが多く、それ故に抗体に接近可能であることから、タンパク質の親水性領域が選択されうる。抗原−抗体複合体のＸ線結晶分析を行うことも可能である。ＭＨＣ分子に結合する可能性が高いことで知られるペプチド配列である有望なＨＬＡアンカー結合モチーフについては、タンパク質のアミノ酸配列から同定されうる。好ましくは、選択対象のエピトープは、タンパク質断片を含有するかまたは発現する組成物が投与されることになる対象の動物において広範に見出される配列と共有する配列同一性がほとんどまたは全くないものである。
【００４５】
場合によりベクターの一部である上記のタンパク質またはその断片をコードする単離または精製された核酸もまた提供される。ＨＡをコードする核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列または少なくとも９個（９、１２、１５、１８、２１もしくは２４個）の隣接アミノ酸をコードするその断片を含みうる。必要に応じてＨＡに基づく三価ワクチンを調製してもよく、ここではＨＡのうちの１つは配列番号４のアミノ酸配列を含む（例えばU.S. Pat. Nos. 5,762,939および6,245,532を参照；四価ワクチンについては例えばU.S. Pat. No. 6,740,325を参照）。ＮＭをコードする核酸は配列番号１のヌクレオチド配列または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片を有しうる一方（例えばU.S. Pat. No. 6,605,457およびU.S. Pat. App. Pub. No. 2003／0129197を参照）、ＮＰをコードする核酸は配列番号５のヌクレオチド配列または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片を有し、Ｍ１タンパク質をコードする核酸は配列番号７のヌクレオチド配列または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片を有し、ＮＳ１タンパク質をコードする核酸は配列番号９のヌクレオチド配列を有し、ＰＡをコードする核酸は配列番号１１のヌクレオチド配列または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片を有し、ＰＢ１をコードする核酸は配列番号１３のヌクレオチド配列または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片を有し、かつＰＢ２をコードする核酸は配列番号１５のヌクレオチド配列または少なくとも９つの隣接アミノ酸をコードするその断片を有しうる。しかし、当業者は、遺伝子コードの縮重に起因し、かかるアミノ酸配列をコードしうる極めて多数の他のヌクレオチド配列が存在することを理解するであろう。
【００４６】
ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる上記核酸およびその断片は合成されうる（例えばOligonucleotide Synthesis, Gait, ed., 1984を参照）。かかる分子は、所望のアミノ酸配列をコードする非天然ヌクレオチド／塩基を含みうる。例えば、塩基または糖はメチル化されうる。さらに、核酸分子の骨格は変性可能であり、例えばホスホロチオエート骨格、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４７】
あるいは、単離ｖＲＮＡに逆転写酵素を施してＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを生成することが可能であり、それからＲＮＡを消化して除去し、残りのＤＮＡを処理してヘアピン末端を有するｄｓＤＮＡを生成し、それを一本鎖に特異的なヌクレアーゼで処理してｖＲＮＡの二分子の二本鎖コピーが生成される（例えばU.S. Pat. No. 4,357,421を参照）。ヘルペスウイルスの非存在下でインフルエンザを調製するためのタンデム転写カセットの使用においては、例えばU.S. Pat. App. Pub. No. 2006/0166321を参照のこと。
【００４８】
核酸は場合により少なくとも１つのプロモーターを含むＤＮＡベクターの一部であり、その場合、各ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結され、それは同じかまたは異なる可能性がある。プロモーターに加え、終結シグナルなどの他の対照配列はＤＮＡベクターの一部でありうる。
【００４９】
例えば、核酸は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびチフス菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）などの細菌、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、またはアスベルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）などの糸状真菌に対して適合した、適切な組換え発現ベクターに導入可能である。細菌、酵母、または真菌は連続培養で成長可能である。次いで、培養期間中に生成されるポリペプチドは単離され、精製されうる。あるいは、核酸分子は、ポックスウイルス科（例えばファウルポックス（ｆｏｗｌｐｏｘ）に基づくベクター）、ヘルペスウイルス科（例えば、仮性狂犬病ウイルスに基づくベクター、七面鳥ヘルペスウイルスに基づくベクター、ネコヘルペスウイルスに基づくベクター、ニワトリ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）に基づくベクター、およびウシヘルペスウイルスに基づくベクター）、アデノウイルス科（例えばウシアデノウイルス（例えば血清型３）、ヒトアデノウイルス（例えば血清型４または７）、およびイヌアデノウイルス（例えば血清型２；ＣＡＶ２；例えばU.S. Pat. No. 6,090,393を参照）、あるいは組換えバキュロウイルス（例えばアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ））などの昆虫ウイルス発現ベクターに導入可能であり、次いでそれを用い、昆虫のスポドテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来する感染しやすい培養されたＳＦ９細胞への感染が可能である。他のウイルスベクターには、ワクシニア（例えばU.S. Pat. No. 4,722,848を参照）、アデノウイルス、アデノ様ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびポックス（例えばHruby, Vet. Parasitol. 29: 281-282 (1988); Uiu, “AIDS Research Reviews,” Dekker, Inc., 1991, 1: 403-416を参照）が含まれ、それを皮膚のスクラッチまたは注射により、場合によりリポソーム製剤として投与可能である。他のベクターには、バシル・カルメット・ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ；Stover et al., Nature 351: 456-460 (1991)）、解毒された炭疽菌毒素ベクターなどが含まれる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞さらには植物細胞を用い、適切なコンストラクトからポリペプチドを発現してもよい。当業者は、宿主細胞の選択が翻訳後プロセシング（例えばグリコシル化、フォールディングなど）の性質に作用し、次いでポリペプチドの免疫原性、および次の精製技術に影響しうることを理解するであろう。
【００５０】
発現を発現ベクターで形質転換／形質移入される任意の適切な宿主細胞内で行ってもよい。適切な宿主細胞の例として、上記のものが挙げられるがこれらに限定されない。したがって、本発明は発現ベクターで形質転換／形質移入される宿主細胞も提供する。
【００５１】
タンパク質またはその断片を培地内に分泌する宿主／ベクター系からの上清をアフィニティーカラムまたはイオン交換カラムなどの精製用マトリックスに適用してもよい。１つ以上の逆相ＨＰＬＣ工程を用い、組換えタンパク質またはその断片をさらに精製してもよい。
【００５２】
融合タンパク質としてのタンパク質またはその断片の生成が生成を安定化させうる。これは、ペプチドリンカーを伴う場合または伴わない場合に、２種類以上のタンパク質（またはその断片）をコードするポリヌクレオチド配列を適切な発現ベクターにライゲートすることによって行われうる。望ましくは、ポリヌクレオチド配列のリーディングフレームは、各タンパク質（またはその断片）の生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質が生成されるように一致している。１〜約５０アミノ酸のペプチドリンカーを用い、得られたタンパク質（またはその断片）は、各タンパク質（またはその断片）がその天然の二次、三次、および四次構造に適切に折り畳むことを確実にするように分離されうる（例えばMaratea et al., Gene 49: 39-46 (1985); Murphy et al., PNAS USA 83: 8258-8262 (1986); U.S. Pat. No. 4,935,233;およびU.S. Pat. No. 4,751,180を参照）。柔軟な広がった高次構造を選択する能力、タンパク質の片方もしくは両方のいずれかの上で機能的アミノ酸であれば相互作用しうる二次構造を選択できない点、ならびにタンパク質のうちの片方もしくは両方のいずれかであれば反応しうる疎水性のまたは帯電した残基の欠如が因子であり、それらはペプチドリンカーの選択において考慮される。リンカーは、連結されるべきタンパク質の末端が、末端を用いることで機能的ドメインが分離されかつ立体干渉が阻止されうるように必須領域を有しない場合、必要とされない。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性に近い残基も使用されうる。
【００５３】
他の追加のアミノ酸配列を、タンパク質またはその断片の発現および／または免疫原性を高めるように選択してもよい。例えば、タンパク質またはその断片は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の重鎖または抗原提示細胞（ＡＰＣ）への結合タンパク質または樹状細胞への結合タンパク質、ＩＬ−Ｄ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、またはＦＬＴ−３リガンドなどに融合されうる。脱水剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）の使用、またはスルフヒドリル基、イプシロンアミノ基、カルボキシル基などの間での連結の創出などの技術を用いてもよい。必要に応じ、切断部位を融合タンパク質に導入してタンパク質（またはその断片）の非天然配列からの分離を可能にしてもよい。切断部位の例として、タンパク質分解酵素の標的配列またはメチオニンがタンパク質（またはその断片）に存在しない場合にはメチオニンが挙げられ、それらはシアノゲンブロミドにより順に切断される。かかる方法は当該技術分野で既知である。タンパク質またはその断片は、さらに当該技術分野で既知の方法に従い、グリコシル化または他の誘導体化（例えばアセチル化またはカルボキシル化）によって変性されうる。
【００５４】
タンパク質（またはその断片）は、適切な発現系から原位置で発現されうる。所望の環境下でコードされたタンパク質またはその断片を生成するのに有効な任意のＤＮＡコンストラクトを用い、上記のようにタンパク質またはその断片を発現することが可能である。
【００５５】
あるいは、核酸分子は、「裸ＤＮＡ」として動物に注射される場合、原位置で有効な発現系としての挙動を示しうる（例えばUlmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993);およびCohen, Science 259: 1691-1692 (1993)を参照）。ＤＮＡ送達はまた、ブピビカイン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）、ポリマー、およびペプチド、あるいはカチオン脂質複合体、粒子、または圧力の使用により促進されうる（例えばU.S. Pat. No. 5,922,687を参照）。
【００５６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１６に対する少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるかまたはそれらを超える同一性など、少なくとも約９５％であるかまたは９５％を超える同一性があるアミノ酸配列の例として、１つ以上の置換、挿入、付加および／または欠失を有しうるアミノ酸配列が挙げられる。配列同一性は、ポリペプチド配列を整列しかつＢＬＡＳＴＰ（Pearson et al., PNAS USA 85: 2444-2448 (1988); Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990);およびAltschul et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）などの公的に利用可能なコンピュータ・アルゴリズムを適用することにより判定可能である。ＢＬＡＳＴＰ用のソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）またはＮＣＢＩ、ナショナル・ライブラリー・オブ・メディスン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ３８Ａ、Ｒｏｏｍ８Ｎ８Ｏ５、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド州  ２０８９４のＦＴＰサーバー上で利用可能である。一旦ポリペプチド配列が整列されると、整列された部分全体にわたる同一アミノ酸の数が同定され、同一アミノ酸の数が目的のポリペプチドのアミノ酸の総数によって除され、その結果に１００を掛けることで配列同一性の百分率が決定される。
【００５７】
これに関し、当業者は、所定のアミノ酸配列の断片が、アミノ酸配列に対して９６％、９７％、９８％もしくは９９％など、少なくとも約９５％であるかまたは９５％を超える同一性がありうることを理解するであろう。それ故、断片については、「配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１６に対して少なくとも約９５％（または９６％、９７％、９８％もしくは９９％）またはそれを超える同一性があるアミノ酸配列」によって包含されるように意図される。かかる断片は、望ましくは完全長タンパク質の免疫原性を保持する。機能断片については、タンパク質をコードする核酸の変異分析およびそれに続く得られた変異タンパク質の発現またはタンパク質自体の化学的／酵素的消化によって生成可能である。
【００５８】
置換、挿入、付加および／または欠失などの変性が、当該技術分野で既知の方法に従い、核酸またはタンパク質（またはその断片）に導入されうる（例えばオリゴヌクレオチドに特異的な部位特異的突然変異誘発においてはAdelman et al., DNA 2: 183 (1983)を参照）。望ましくは、変性はタンパク質断片の免疫原性を実質的に低減することはなく、むしろ免疫原性が実質的に同等に保たれるかまたは未変性タンパク質に対して増大することが好ましい。
【００５９】
「保存的置換」とは、アミノ酸が類似の特性、すなわち類似の二次構造およびハイドロパシック（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性を有する別のアミノ酸に置換される置換である。アミノ酸の置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われうる。例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの負に帯電したアミノ酸が交換可能である一方、リジンおよびアルギニンなどの正に帯電したアミノ酸が交換可能であり、かつ類似の親水性値を有する帯電していない極性の頭部基（ｐｏｌａｒ  ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐｓ）を有するアミノ酸が交換可能である。これに関し、ロイシン、イソロイシンおよびバリンが交換可能であり、グリシンおよびアラニンが交換可能であり、アスパラギンおよびグルタミンが交換可能であり、かつセリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが交換可能である。交換可能なアミノ酸における他の基には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒおよびｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒおよびｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａおよびｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇおよびｈｉｓ、ならびに（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、およびｈｉｓが含まれる。
【００６０】
上記を考慮すると、単離または精製されたタンパク質／核酸またはそれらのいずれかの断片および生物学的に許容できる担体を含有する組成物も提供される。核酸またはその断片はベクターの一部でありうる。例えば、活性成分としてＮＭを含有するインフルエンザワクチンに関するU.S. Pat. No. 4,029,763、および活性成分としてＨＡおよびＮＭを含有するインフルエンザワクチンに関するU.S. Pat. No. 4,140,762を参照のこと。U.S. Pat. No. 4,826,687では、ムラミルジペプチドのＨＡおよびＮＭを含有するワクチンへの添加について記載されている。必要に応じ、Ｍ１のアミノ酸１４８〜１６２、１６３〜１６６、および／もしくは２１５〜２３９に実質的に対応するポリペプチドがタンパク質／核酸またはその断片の組成物に添加されうる（U.S. Pat. Nos. 5,136,019; 5,616,327; および5,741,493を参照）。任意の適切な生物学的に許容できる担体を組成物中に用いてもよい。例えば、タンパク質／核酸／それらの断片を、場合により例えばリン酸塩緩衝液で緩衝化される希釈剤中、例えば０．９％塩化ナトリウム溶液中に再懸濁してもよい。ウイルスの精製から残存する任意のショ糖を透析により低下させてもよい。透析またはゲルクロマトグラフィーを用い、残存するカチオン界面活性剤を除去してもよい。好ましくは、タンパク質またはその断片は、動物において免疫応答（すなわち細胞性または体液性）を誘発するのに十分な量で存在する。よく選択される医薬品および抗原用の担体はポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である。ＰＬＧＡは生分解性ポリエステルであり、抗原の制御放出において使用可能である（Eldridge et al., Curr. Topics Micro. Immuno. 146: 59-66 (1989)；U.S. Pat. No. 6,090,393も参照）。直径が１〜１０μのＰＬＧＡマイクロスフィア内での抗原の捕捉においては、経口投与される場合に顕著なアジュバント効果を有することが示されている。
【００６１】
必要に応じ、保護剤またはホルムアルデヒドのごとき不活性化剤を添加してもよい。保護剤／不活性化剤の慣用的な量は１０，０００部当たり１部の割合である。
【００６２】
必要に応じ、上記のＨＡなどの１つ以上のタンパク質（またはそれらの免疫原性断片）をプロテオソームと結合させてもよい。例えばU.S. Pat. No. 6,743,900およびU.S. Pat. App. Pub. No. 2004／0156867を参照のこと。
【００６３】
免疫原性は、水酸化アルミニウム（例えば約０．２％）またはリン酸アルミニウム、アルミニウム（例えば、U.S. Pat. Nos. 6,372,223, 6,635,246, 6,861,244および7,052,701ならびにU.S. Pat. App. Pub. Nos. 2004／0096464および2006／0147468を参照）、キトサン（例えばU.S. Pat. Nos. 6,136,606および6,534,065を参照）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウムの形態のミョウバン、鉱油（例えばＢａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）およびＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標））、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにＱｕｉｌ  Ａ成分を含有するサポニンなどの従来の免疫学的アジュバントの封入により改善されうる。免疫原性は、インターロイキンなどのサイトカインの添加、またはタンパク質またはその断片の抱合によっても改善されうる。好ましくは、タンパク質またはその断片は、タンパク質（例えば血清アルブミン、スカシ貝ヘモシアニン、免疫グロブリン、チログロブリン、およびオバルブミン）、多糖類（例えばラテックスで官能化されたセファローズ、アガロース、セルロースビーズなど）、リン脂質、高分子アミノ酸（例えばポリグルタミン酸、ポリリシンなど）、またはアミノ酸共重合体（例えばU.S. Pat. Nos. 5,136,019および5,612,037を参照）などの高分子担体と抱合される。あるいは、タンパク質またはその断片はプロテオリポソームまたは脂質小胞とともにカプセル化されうる。
【００６４】
免疫応答を誘発しうる組成物は、懸濁液の形態で調製されるかまたは凍結乾燥されうる。凍結乾燥される場合、１種もしくは複数種の安定剤を添加することが好ましい。適切な安定剤は、例えばショ糖、リン酸塩、グルタミン酸塩、およびアルブミン（ＳＰＧＡ；Bovarnick, J. Bacteriol. 59: 509 (1950)）、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、デキストラン、およびグルコース）、タンパク質（例えばアルブミンおよびカゼイン）またはそれらの分解生成物、タンパク質を含有する作用物質（例えばウシ血清またはスキムミルク）、ならびに緩衝液（例えばアルカリ金属リン酸塩）である。
【００６５】
あるいは、組成物は制御放出組成物として調合されうる。弱毒化／不活性化ウイルスまたは組換えベクターは、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルトエステル、およびポリアミドなどのポリマーとともにマイクロカプセル化されうる。選択される特定のポリマーは、ポリマー合成およびマイクロカプセル化の再現性、材料およびプロセスのコスト、毒物学的特性、変動する放出速度に対する要件、ならびにポリマーおよびウイルス／ベクターの物理化学的適合性を含む多数の要素に依存する。
【００６６】
本明細書に記載の組成物では、単独使用または他の活性成分／組成物との併用が可能である。例として、イヌジステンパー、イヌ伝染性肝炎（ＣＡＶ−１およびＣＡＶ−２）、狂犬病、パラインフルエンザ、イヌコロナウイルス、麻疹、レプトスピラ症、およびボルデテラに対する免疫応答を誘発しうる組成物が挙げられる。ポリフェノールはヒトにおけるインフルエンザ感染を阻害することが開示されている（例えばU.S. Pat. No. 5,173,922；いわゆる‘922特許を参照）。したがって、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキン、遊離テアフラビン、テアフラビンモノガレートＡ、テアフラビンモノガレートＢ、および／またはテアフラビンジガレートなどのポリフェノールの添加は有益でありうる（‘922特許を参照）。ＮＭの阻害についてはU.S. Pat. No. 5,453,533に開示されている。免疫増強物質としてのサイトカインの使用およびリポソームカプセル化についてはU.S. Pat. No. 5,919,480に記載されている。
【００６７】
組成物中の核酸の量は広範に変化しうる。例えば、濃度は約０．１重量％未満から約２０〜５０重量％以上程度、通常は少なくとも約２％の範囲でありうる。組成物中のタンパク質の濃度もまた広範に変化しうる。例えば、濃度は約０．１重量％未満から約２０〜５０重量％以上程度、通常は少なくとも約２％の範囲でありうる。流体容量および粘度は、最終濃度を決定する場合に考慮される。
【００６８】
したがって、動物におけるイヌインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法も提供される。感染に対する動物の感染しやすさはプラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）（U.S. Pat. No. 4,315,073）または赤血球凝集試験を用いて評価可能である。方法は、単離または精製されたタンパク質／核酸またはその断片を含有する上記組成物を動物に投与する工程を含む。組成物が核酸（またはその断片）をベクターの一部として含有する場合、好ましくはタンパク質（またはその断片）は動物における免疫応答を誘発するのに十分な量で発現される。例えば、動物体重１ｋｇあたり約９〜約４３国際単位の単回用量が投与されうる。より大型の哺乳類においては、単回用量は約６００〜約３０００国際単位／ｋｇ体重を含みうる。受精卵の尿膜腔内でウイルスを培養し、ウイルスを採取し、かつ必要に応じて採取されたウイルスをペプトンまたはショ糖などの安定剤で安定化し、次いでその後の凍結乾燥のためにグラスバイアル内に分布させることによって調製されるワクチン組成物においては、有効なワクチン用量単位はウイルスの少なくとも１０７ＥＩＤ５０（５０％卵感染用量）を含有しうる。後者の状況では、凍結乾燥されたワクチンは、投与に先立ち、例えば経鼻スプレーまたは点鼻の形態での水または別の医薬的に許容できる希釈剤の添加によりもどされる。必要に応じ、ワクチンは、１週間の間隔をあけて２回の連続投与で投与されうる。
【００６９】
組成物は、子犬に対し、１２週齢でまたは６週齢（例えば６、９および１２週齢）から反復的にまたは４週目から毎週、単回投与として投与されうる。投与における有効用量および経路は、組成物の性質、発現産物の性質、ＬＤ５０、および組換えベクターが用いられる場合にはベクターの発現レベル、ならびにイヌの品種およびその年齢、性別、体重、および状態により決定される。発現された産物の用量は、数μｇ〜数百μｇ、例えば５〜５００μｇの範囲でありうる。ウイルスまたは組換えベクターの好ましい用量は、約１０３〜約１０６ｐｆｕの範囲でありうる。生きた弱毒化株における用量は、少なくとも約１０３ＴＣＩＤ５０でありうる。
【００７０】
組成物は、非経口投与されうるか（すなわち注射（例えば皮内、皮下、または筋肉内）によるかまたは経鼻などの感染経路による）または経腸投与されうる（すなわち経口投与による）。皮内投与された免疫原性組成物に対する免疫応答を高めるためのゲル化剤および粘着剤または生体接着剤の使用は、U.S. Pat. App. Pub. No. 2005／0255121に記載されている。必要に応じ、免疫応答を誘発するための組成物は、Chu et al. (２００６年８月３日に公開されたU.S. Pat. App. Pub. No. 2006／0171960）に従い、水またはシロップを飲むことによって投与されうる。ここで、経口投与は、動物に対してストレスや不快感をもたらしうる、時間のかかる労働集約的な筋肉内注射を回避することから利点がある。不快感は、レース用のイヌの能力に次第に影響を与えうる。あるいは、少なくとも１つの免疫応答を誘発するエピトープを発現する組換えベクターを含有する組成物は、免疫応答の局在化された発現および誘発のために皮膚に直接適用されうる。
【００７１】
免疫応答を誘発しうる組成物の有効性は、子犬をイヌインフルエンザウイルスの毒性株に暴露することによって実証可能である。未治療のイヌはイヌインフルエンザウイルス感染の特徴がある臨床徴候を呈する一方、治療されたイヌは呈することがない。
【００７２】
当該技術分野で既知の方法に従い、組換えベクターおよびそれらから発現された産物を用い、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの抗体を産生することが可能である（Harlow and Lane, Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies:  A Laboratory Manual (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Shepherd and Dean, Monoclonal Antibodies:  A Practical Approach, Oxford University Press, U.S.A. (2000)); およびHarris and Adair, Antibody Therapeutics, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1997)）。抗体、特にｍＡｂｓを結合アッセイおよび診断キット／試験において用い、イヌインフルエンザウイルスの抗原の存在／非存在またはウイルスに対する免疫応答が刺激されているか否かを判定することが可能である。抗体を用い、免疫吸着クロマトグラフィーにより材料を回収することも可能である。
【００７３】
抗体は受動免疫ももたらしうる。例えば、宿主動物またはハイブリドーマ細胞系に由来する部分精製された免疫血清を動物に注射してもよい。抗体は、感染性インフルエンザウイルスに結合しかつそれを中和することにより治療効果をもたらす。
【００７４】
アミノ酸配列配列番号１または配列番号３からなるタンパク質のごとき、上記タンパク質のエピトープの内部イメージを有する抗イディオタイプ抗体を含有する組成物もまた提供される。
【００７５】
当業者は、例えば本明細書中に記載されるエピトープの内部イメージを担持する抗イディオタイプ抗体の調製が可能であることを理解するであろう。例えばHerlyn et al., Science 232: 100-102 (1986)）を参照のこと。ポリペプチドの内部イメージを担持するモノクローナルおよびポリクローナル抗イディオタイプ抗体を調製する方法については、例えばU.S. Pat. No.5,053,224に記載されている。つまり、ポリクローナル抗イディオタイプ抗体を、ポリペプチドに対して作られかつポリペプチドとの反応性についてスクリーニングされたモノクローナルイディオタイプ抗体で動物を免疫し、ポリペプチドに対するイディオタイプ抗体と反応する抗血清についてスクリーニングすることによって産生可能である。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を、かかる動物から動物の抗体分泌細胞を不滅化しかつポリペプチドと競合したイディオタイプ抗体を有する培養物をスクリーニングする標準技術を用いて調製することも可能である。ｍＡｂｓが好ましい一方、種々の哺乳類系内で調製されるポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ）も使用可能である。
【００７６】
イヌにおいてＣＩＶに対する免疫応答を誘発するための別の方法も提供される。この方法は、上記の抗イディオタイプ抗体を含有する組成物の有効量をイヌに投与する工程を含む。
【００７７】
単離または精製された核酸分子またはそれらを含むベクターを用い、プローブ／プライマーに対するＤＮＡを生成することが可能であり、それらを用い、ハイブリダイズ可能なＤＮＡの有無を検出し、ｃＤＮＡなどのＤＮＡを増幅することが可能である。
【００７８】
アッセイでは、標識タンパク質またはその断片ならびに標識核酸またはその断片の使用が可能である。アッセイ方法には、蛍光免疫アッセイ（smith et al., Ann. Clin. Biochem. 18: 253-275 (1981)）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および酵素−増殖イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ；Enzyme Immunoassay, Maggio, ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1980.  pp. 141-150; 234-235, and 242-243を参照）が含まれる。かかる方法を用い、ウイルスの存在を検出しかつ感染症の状態を診断することが可能である。
【００７９】
ウイルスはそれ自体でベクターとして使用可能である。ベクターとしてのウイルスの使用は当業者の技術の範囲内である。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本発明を例示するのに役立つ。実施例は、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。実施例では、イヌインフルエンザウイルスの同定および部分的な特徴づけについて記載される。
【００８１】
咳、熱、多呼吸、および出血性鼻汁によって特徴づけられる急性呼吸器疾患の発生については、２００５年４月に東部および西部アイオワ州に位置する２つのレーストラックの敷地内でグレーハウンドに生じた。大部分の割合の罹患したイヌが回復する一方、多数が出血性肺炎で死亡した。
【００８２】
罹患したイヌの肺は広範な赤から赤黒への変色を呈し、中等度から顕著な触診可能の堅さおよび軽度の線維素性胸膜炎を伴った。肺切片は重篤な出血性間質性肺炎から気管支間質性肺炎（ｂｒｏｎｃｈｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）によって特徴づけられた。肺胞中隔肥厚を伴う斑状の間質性変化、肺胞内の残渣の凝固物、および関連する肺拡張不全が見られることは明白であった。変性細胞および残渣による気道の拡張を伴う限局的に広汎性の膿肉芽腫性気管支間質性肺炎が観察された。散在性脈管炎および血栓が見られることは明白であった。
【００８３】
従来のウイルス剤および細菌剤に対する微生物学的試験では、試験対象のすべての動物由来の肺組織内に存在したストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）亜種のズーエピデマイカス（ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）以外では有意な病原体が全く見られなかった。リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ；Harmon et al., Development of a PCR-based differential test for H1N1 and H3N2 swine influenza viruses.  In:  Proceedings of the 42nd Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians.  San Diego, CA.  October 1999.  p. 44.）を用いると、試験対象の４つのうちの２つの肺試料ではインフルエンザウイルスが陽性であった。インフルエンザウイルスのＮＰに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いる免疫組織化学（Vincent et al., J. Vet. Diagn. Invest. 9: 191-195 (1997)）によると、試料上での抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（Ｄｉｒｅｃｔｇｅｎ（商標）Ｆｌｕ  Ａ、ベクトン／ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）、メリーランド州）試験のように、両肺のウイルス性肺炎の病変内部では陽性であった。ＰＣＲによると、試験対象の２つの陽性肺に由来する気管支肺胞洗浄（Ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ）試料ではインフルエンザウイルスが陽性であった。
【００８４】
イヌにおけるインフルエンザウイルス感染に関する報告が１つしか存在しなかったことから（Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia.  In:  Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians.  Greensboro, NC.  October 2004.  p. 158.）イヌ肺におけるインフルエンザウイルスの検出については想定外の観察であったことが理由で、ウイルスの単離を試みた。オンドリ赤血球を凝集可能なウイルスを、インフルエンザウイルスが免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイおよびＰＣＲにより検出された、２つの動物のうちの一方の肺および気管支肺胞洗浄体液からマディン−ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞内で単離した。ＰＣＲによると、単離物はＨ３サブタイプのインフルエンザウイルスであると判定された。ＨＡ−阻害およびＮＭ−阻害アッセイを用い、ウイルス単離物はＨ３Ｎ８というサブタイプとされた。ウイルス単離物は、マイアミ（Ｍｉａｍｉ）（（Ａ／Ｅｑ／ＭＩ／１／６３−Ｈ３Ｎ８）６４０−１２８０）、ＡＫ（（Ａ／Ｅｑ／ＡＫ／２９７５９／９１−Ｈ３Ｎ８）３２０−６４０）、およびケンタッキー（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（（Ａ／Ｅｑ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ／８１−Ｈ３Ｎ８）１６０−３２０）を含む様々なＨ３ウマインフルエンザウイルスに対して作られた抗血清により認識された。
【００８５】
両方の単離物におけるＨＡおよびＮＡ遺伝子の配列決定では、２つの単離物間でそれぞれ１００％および９９．８％の同一性が示された。単離物のＨＡ遺伝子は、系統発生学的に最近におけるＨ３Ｎ８ウマインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子に対して遺伝的に近いものであった（９６〜９８％のヌクレオチド相同性）（Macken et al., The value of a database in surveillance and vaccine selection.  In:  Options for the Control of Influenza IV.  Osterhaus et al., eds.  Elsevier Science, Amsterdam.  2001.  pp. 103-106.）。単離物のＮＡ遺伝子はまた、最近におけるＨ３Ｎ８ウマインフルエンザウイルスのＮＡ遺伝子と９６〜９８％の相同性を示した。アイオワ州内で地理的に離れた２つの異なるレーストラックでのグレーハウンドが、罹患したウマと関わりなく疾患で同時に死亡したことから、インフルエンザウイルス単離物がイヌにおいて永存しかつイヌの中で広まる可能性があるイヌ適合株であることが示される。多数の異なる動物種における呼吸器疾患および敗血症に伴う問題に関与しているストレプトコッカス・ズーエピデマイカス（Ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）（Wood et al., J. Clin. Microbiol. 43: 120-126 (2005);およびGillespie et al., The General Staphylococcus and Streptococcus.  In:  Hagan and Bruner’s Infectious Diseases of Domestic Animals.  7th ed.  Comstock／Cornell University Press.  Ithaca, NY.  1981.  pp. 164-180）は、疾患の重症度に寄与した可能性が高い。
【００８６】
本明細書中で引用される出版物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、あたかも各参考文献が参照により援用されるものとして個別かつ具体的に示され、かつ本明細書中のその全体にて示される場合と同程度に、参照により本明細書中に援用される。
【００８７】
本発明を記載する文脈の中での（特に特許請求の範囲の文脈の中での）「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語および類似の指示語の使用は、本明細書中で他に指定がない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数と複数の双方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で他に指定がない限り、あくまで範囲内に該当する別々の各値を個別に参照する省略方法として役立つように意図されており、別々の各値は、あたかも本明細書中で個別に列挙されるように本明細書中に援用される。本明細書中に記載されるすべての方法は、本明細書中で他に指定がない限りまたはさもなければ文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施されうる。ありとあらゆる例または本明細書中の典型的な用語（例えば「のごとき（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、あくまで本発明をよりよく例示するように意図されており、特に特許請求されない限り、本発明の範囲に関して限定するものではない。本明細書中の用語は、本発明の実行に不可欠である、任意の特許請求されない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００８８】
本発明の実施における発明者らに既知の最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態については本明細書中に記載される。例示される実施形態があくまで例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでないことは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＮＭ遺伝子のドメインコード配列（ＣＤＳ）の部分ヌクレオチド配列（配列番号１；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＤＱ１４６４２０も参照）である。慣例に従い、配列は左から右、上から下に示される。
【図２】配列番号１でコードされるアミノ酸配列（配列番号２；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＤＱ１４６４２０も参照）である。慣例に従い、配列は一文字形式で左から右、上から下に示される。
【図３】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＨＡ遺伝子のＣＤＳの完全ヌクレオチド配列（配列番号３；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＤＱ１４６４１９も参照）である。
【図４】配列番号３でコードされるアミノ酸配列（配列番号４；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＤＱ１４６４１９も参照）である。
【図５】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＮＰ遺伝子のＣＤＳの完全ヌクレオチド配列（配列番号５）である。
【図６】配列番号５でコードされる推定アミノ酸配列（配列番号６）である。
【図７】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＭ１タンパク質遺伝子のＣＤＳの完全ヌクレオチド配列（配列番号７）である。
【図８】配列番号７でコードされる推定アミノ酸配列（配列番号８）である。
【図９】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＮＳ１タンパク質遺伝子のＣＤＳの完全ヌクレオチド配列（配列番号９）である。
【図１０】配列番号９でコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１０）である。
【図１１】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＰＡタンパク質遺伝子のＣＤＳの完全ヌクレオチド配列（配列番号１１）である。
【図１２】配列番号１１でコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１２）である。
【図１３】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＰＢ１タンパク質遺伝子のＣＤＳの完全ヌクレオチド配列（配列番号１３）である。
【図１４】配列番号１３でコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１４）である。
【図１５】イヌインフルエンザウイルスのサブタイプＨ３Ｎ８由来のＰＢ２タンパク質遺伝子のＣＤＳの完全ヌクレオチド配列（配列番号１５）である。
【図１６】配列番号１５でコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１６）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月13日(2008.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2009511080.tif 000045
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