(57)【要約】  高い生産性の細胞系が所望のレベルの蛋白発現も適切な品質の目的とする蛋白も生じさせるその能力について同定されるような、特定の医薬品、薬剤開発、および生物工学的方法における蛋白発現で使用するための、細胞系のハイスループットスクリーニング方法を開示する。
2009534035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞系より得られた試料を第１の結合剤と接触させることによって、該試料をスクリーンに付して、それぞれの細胞系における目的蛋白の発現レベルを決定すること；
ｂ）目的蛋白を、検出可能な標識と作動可能に連結している第２の結合剤と接触させること；
ｃ）目的とする蛋白の発現レベルを決定すること；
ｄ）目的とする蛋白の適切な品質を決定すること；
ｅ）目的とする蛋白のハイスループット蛋白発現のための細胞系を選択すること
を含み、
ここで、細胞系が目的とする蛋白の所望の発現レベルおよび適切な品質を生じる場合にその細胞系を選択する、
蛋白の発現について細胞系をハイスループットスクリーニングする方法。
【請求項２】
目的とする蛋白が、抗体、リガンド、受容体、蛋白のサブユニット、蛋白の断片、融合蛋白、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
目的とする蛋白が、抗体、組換え抗体、またはＦ（ａｂ’）２断片である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第１の結合剤が、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第１の結合剤がプロテインＡまたはストレプトアビジンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
第１の結合剤が、ビーズ、プレート、およびマイクロアレイチップからなる群から選択された固体支持体に付着することができる、請求項４記載の方法。
【請求項７】
固体支持体が、セルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ガラス、またはポリスチレンを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
目的とする蛋白の適切な品質が、電荷、大きさ、酵素活性、抗体−エピトープ相互作用、核酸結合、炭水化物含量、二次構造、三次構造、および結合活性からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
第２の結合剤が、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第２の結合剤が抗体またはその断片である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｆ（ａｂ’）２断片が抗体のＦｃ部分と特異的に結合する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ルテニウムで標識した第２の結合剤を、フルオロフォア、化学色素、放射性結合剤、化学発光性結合剤、電気化学発光剤、磁性結合剤、常磁性結合剤、プロ磁性結合剤、有色産物をもたらす酵素、化学発光性産物をもたらす酵素、および磁性産物をもたらす酵素からなる群から選択される第２の検出可能な標識で標識する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
Ｆ（ａｂ’）２断片が２個またはそれ以上のルテニウム標識と作動可能に連結している、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
試料を樹脂と付着した第３の結合剤と接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
第３の結合剤が、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第３の結合剤がプロテインＡまたはストレプトアビジンである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
第３の結合剤が固体支持体に付着している、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
樹脂を混合物から単離し、発現された目的とする蛋白を第３の結合剤から溶出させる、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
目的とする蛋白を真空溶出および重力流からなる群から選択された方法によって溶出させる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
自動ワークステーションを用いて細胞系をスクリーニングする、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ａ）固体支持体を細胞系から単離した試料と接触させ、ここで該固体支持体はその表面に付着した第１の結合剤を有し、該第１の結合剤は目的とする蛋白との結合能を有すること；
ｂ）試料を目的とする蛋白と結合する第２の結合剤と接触させ、ここで第２の結合剤は検出可能な標識と作動可能に連結していること；
ｃ）目的とする蛋白の発現レベルを、目的とする蛋白と結合した第２の結合剤と作動可能に連結している標識を検出することによって、決定すること；および
ｄ）それぞれの細胞系における目的とする蛋白の発現レベルを目的とする蛋白の平均発現レベルと比較し、その比較に基づいて細胞系を選択すること
を含み、
ここで、細胞系における目的とする蛋白の発現レベルが、すべての細胞系における目的とする蛋白の平均発現レベルより大きいまたはそれ未満のどちらかである場合に、その細胞系を蛋白の産生について選択する、
蛋白発現および産生について細胞系をハイスループットスクリーニングする方法。
【請求項２３】
選択した細胞系から上清を単離すること、および上清を目的とする蛋白と結合する試薬と接触させることをさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
試薬が固体支持体に付着している、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
固体支持体がマルチウェルプレートである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
結合した目的とする蛋白を試薬から溶出させ、適切な品質についてアッセイを行う、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
細胞系が工程ｅ）で選択され、発現された目的とする蛋白が適切な品質を有する場合に、細胞系を蛋白発現について選択する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
目的とする蛋白が抗体、リガンド、受容体、蛋白のサブユニット、蛋白の断片、融合蛋白、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
目的とする蛋白が抗体、組換え抗体、またはＦ（ａｂ’）２断片である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
第１の結合剤が抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
第１の結合剤がプロテインＡまたはストレプトアビジンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
結合剤がビーズ、プレート、およびマイクロアレイチップからなる群から選択された固体支持体と付着することができる、請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
固体支持体がセルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ガラス、またはポリスチレンを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
第２の結合剤が抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項３５】
第２の結合剤が抗体またはその断片である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
抗体が抗体のＦｃ部分と特異的に結合するＦ（ａｂ’）２断片である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
検出可能な標識がフルオロフォア、化学色素、放射性結合剤、化学発光性結合剤、電気化学発光剤、磁性結合剤、常磁性結合剤、プロ磁性結合剤、有色産物をもたらす酵素、化学発光性産物をもたらす酵素、および磁性産物をもたらす酵素からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項３９】
検出可能な標識がルテニウムである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
試薬が第３の結合剤が付着した樹脂を含み、第３の結合剤が目的とする蛋白との結合能を有する、請求項２２に記載方法。
【請求項４１】
第３の結合剤が抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
第３の結合剤がプロテインＡまたはストレプトアビジンである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
樹脂を単離し、目的とする蛋白を第３の結合剤から溶出させる、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
真空溶出および重力流からなる群から選択された方法を用いて目的とする蛋白を第３の結合剤から溶出させる、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
インキュベートした細胞系のスクリーニングに自動ワークステーションを利用する、請求項２２記載の方法。
【請求項４６】
ａ）異なる細胞培養条件でそれぞれの細胞系をインキュベートすること；
ｂ）それぞれの細胞系の試料を固体支持体に付着した第１の結合剤と接触させ、第１の結合剤が細胞系の試料中の目的とする蛋白と結合すること；
ｃ）第１の結合剤と結合した目的とする蛋白を、検出可能な標識と作動可能に連結している第２の結合剤と接触させること；
ｄ）目的とする蛋白と結合した第２の結合剤と作動可能に連結している標識を検出することによって目的とする蛋白の発現レベルを決定すること、および
ｅ）検出された目的とする蛋白の発現レベルに基づいて細胞系を選択すること
を含み、ここで細胞系における目的とする蛋白の発現レベルが、すべての細胞系における目的とする蛋白の平均発現レベルよりも大きいまたはそれ未満である場合に、該細胞系を選択する、
細胞培養工程を開発する方法。
【請求項４７】
選択した細胞系から上清を単離すること、および上清を目的とする蛋白と結合する試薬と接触させることをさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
試薬が固体支持体に付着している、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
固体支持体がマルチウェルプレートである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
結合した目的とする蛋白を試薬から溶出させ、適切な品質についてアッセイを行う、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
細胞系を工程ｅ）にて選択し、発現された目的とする蛋白が適切な品質を有する場合に、該細胞系を蛋白発現について選択する、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
目的とする蛋白が抗体、リガンド、受容体、蛋白のサブユニット、蛋白の断片、融合蛋白、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項５３】
目的とする蛋白が抗体、組換え抗体、またはＦ（ａｂ’）２断片である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
第１の結合剤が抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項５５】
第１の結合剤がプロテインＡまたはストレプトアビジンである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
結合剤がビーズ、プレート、およびマイクロアレイチップからなる群から選択された固体支持体と付着することができる、請求項４６記載の方法。
【請求項５７】
固体支持体がセルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ガラス、またはポリスチレンを含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５８】
第２の結合剤が抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項５９】
第２の結合剤が抗体またはその断片である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
抗体が、抗体のＦｃ部分と特異的に結合するＦ（ａｂ’）２断片である、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
検出可能な標識がフルオロフォア、化学色素、放射性結合剤、化学発光性結合剤、電気化学発光剤、磁性結合剤、常磁性結合剤、プロ磁性結合剤、有色産物をもたらす酵素、化学発光性産物をもたらす酵素、および磁性産物をもたらす酵素からなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項６３】
検出可能な標識がルテニウムである、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
試薬が第３の結合剤が付着した樹脂を含み、第３の結合剤が目的とする蛋白と結合することができる、請求項４６記載の方法。
【請求項６５】
第３の結合剤が抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
第３の結合剤がプロテインＡまたはストレプトアビジンである、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
樹脂を単離し、目的とする蛋白を第３の結合剤から溶出させる、請求項６４記載の方法。
【請求項６８】
真空溶出および重力流からなる群から選択された方法を用いて目的とする蛋白を第３の結合剤から溶出させる、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
インキュベートした細胞系のスクリーニングに自動ワークステーションを利用する、請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その明細書の全体が出典明示により組み込まれている、２００６年４月２１日出願の米国仮出願第６０／７９３，９９１号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、一般に医薬品の分野に関する。より具体的には、本発明は、工業スケールの生産に十分な量および同等の品質の蛋白を生産する能力について、細胞系のスクリーニングを行う方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ハイスループット技術は、医薬および生命工学の研究において重要なツールとなっている。ハイスループット分析方法では、蛋白の活性、蛋白発現レベル、遺伝子発現、および生物系内で起こる無数の化学的相互作用を迅速に分析するために自動手順を利用する。これらの方法および技術によって得られたデータは、癌研究、創薬、および結晶構造解析などの広範な分野で役立てられている（たとえば、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ他（２００６）Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｃｉ．、４（１）：５参照［印刷の前に電子発行］）。
【０００４】
ハイスループット分析は、系内で起こる莫大な化学反応の中から特定の化学的相互作用または化合物を感知する能力に依存する。ハイスループット技術は、数千個の遺伝子の特定の化学的相互作用および発現レベルを短期間でプローブするために使用されている。この困難な作業を達成するために、分子シグナル（たとえばフルオロフォア）および非常に速い速度で情報を処理する自動分析を利用する特定の技法が開発されている（たとえば、Ｐｉｎｈａｓｏｖ他（２００４）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．、７（２）：１３３〜４０参照）。たとえば、数千個の遺伝子の相互作用を一度にプローブする一方で、特定の遺伝子に関する有益な情報を提供するために、マイクロアレイ技術が広く利用されている（たとえば、ＭｏｃｅｌｌｉｎおよびＲｏｓｓｉ（２００７）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、５９３：１９〜３０参照）。
【０００５】
過去数年間で、自動および手動両方のハイスループットの蛋白の発現および精製が、構造および機能の研究のために可溶性蛋白を迅速にスクリーニングおよび生産する利用可能な手段となっている（Ｃａｂｒｉｔａ他（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６：１２参照）。クローニング、発現および精製のためのフィルター−プレートに基づいたアッセイ、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）、ならびに蛋白発現の自己誘導などの開発を自動システムと合わせて、単純かつ対費用効果の高い蛋白の並行生産技法が作成されている（Ｃａｂｒｉｔａ他（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６：１２、Ａｓｌａｎｉｄｉｓ他（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８（２０）：６０６９〜６０７４参照）。これらの手法は、研究者に、医薬品および薬剤開発で使用するために蛋白を工業スケールレベルで生産する、強力なツールを提供している。
【０００６】
しかし、特定の細胞からの蛋白の精製および発現は、特定の問題を提示する。目的とする蛋白が同定された後、かなりの量のその蛋白を精製した形態で得ることは、比較的困難である。その結果、組換え蛋白を産生する細胞系を用いて、工業開発のために蛋白を十分な量で産生させる。
【０００７】
細胞系は、研究者に大量の特定の蛋白を産生する機会を与えることができるが、これらは必ずしも蛋白の効率的な産生体とは限らない。特定の細胞系クローンは最適以下のレベルの蛋白を産生する場合がある。他の細胞系クローンは、最適レベルの蛋白発現を生じるが、構造的形成異常または不適切な翻訳後修飾のどちらかが原因で完全に機能的な蛋白のプールを産生することができない場合がある。このような問題は、生物学的に関連する化合物の開発中に時間および資源の無駄をもたらす可能性がある。したがって、特定の細胞系中で発現された蛋白の品質および量に関する情報を迅速かつ確実に提供するハイスループットスクリーニング方法が必要である。本発明は、これらおよび他の重要な目的を対象とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
目的とする蛋白のフルスケール生産を開始する前に、細胞系中での目的とする蛋白の発現レベルを分析することによって、重要な時間および資源は、ハイスループット蛋白発現に不十分な品質の細胞系に対して浪費されない。本発明は、部分的には、ハイスループットスクリーニング手順およびハイスループット精製手順を行って十分な量の目的とする蛋白を産生する細胞系を決定することができるという発見に基づいている。さらに、これらの手順を利用して、候補細胞系を、それらが所望の品質、たとえば生物活性を有する目的とする蛋白を産生するかどうかを決定するために、スクリーニングすることができる。したがって、これらのハイスループットスクリーニングおよびハイスループット精製技法（以下、まとめて「ハイスループットスクリーニング」と呼ぶ）は、工業スケールの蛋白発現で利用するのに適切な細胞系を決定するための有益な方法である。この発見を活用して、目的とする蛋白の工業スケールの生産に有用な細胞系を同定するためにハイスループットスクリーニング方法の使用を可能にする発明が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、蛋白を発現させるための細胞系のハイスループットスクリーニング方法を提供する。この方法には、それぞれの細胞系における蛋白発現レベルを決定するための、細胞系のハイスループット力価スクリーニングが含まれる。所望の蛋白発現レベルを生じる細胞系を選択し、続いて蛋白のハイスループット精製を行う。細胞系が所望の蛋白発現レベルを生じ、かつ適切な品質を有する場合に、細胞系を蛋白発現について選択する。
【００１０】
一部の実施形態では、蛋白は、抗体、リガンド、受容体、蛋白のサブユニット、蛋白の断片、融合蛋白、組換え蛋白、およびそれらの断片である。特定の実施形態では、蛋白は、抗体、組換え抗体、またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１１】
他の実施形態では、第１の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第１の結合剤は、プロテインＡまたはストレプトアビジンである。さらに他の実施形態では、結合剤は、ビーズ、プレート、およびマイクロアレイチップなどの固体支持体に付着することができる。多くの実施形態では、固体支持体は、セルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ガラス、またはポリスチレンを含む。
【００１２】
他の実施形態では、第２の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第２の結合剤は、抗体およびその断片である。より具体的な実施形態では、抗体はＦ（ａｂ’）２断片であり、さらにより具体的には、抗体のＦｃ部分と特異的に結合するＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１３】
さらに他の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、化学色素、放射性結合剤、化学発光性結合剤、電気化学発光剤、磁性結合剤、常磁性結合剤、プロ磁性結合剤、有色産物をもたらす酵素、化学発光性産物をもたらす酵素、および磁性産物をもたらす酵素である。非常に具体的な実施形態では、検出可能な標識は、ルテニウムまたは複数のルテニウム標識である。
【００１４】
一部の実施形態では、試薬は、具体的な実施形態では第３の結合剤が付着した樹脂を含む。特定の実施形態では、第３の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。一方で、具体的な実施形態では、第３の結合剤は、プロテインＡまたはストレプトアビジンである。一部の実施形態では、蛋白は、真空を用いて試薬から溶出させる。他の実施形態では、遠心分離によって蛋白を溶出させる。さらに他の実施形態では、樹脂を通る重力流によって蛋白を溶出させる。多くの実施形態では、インキュベートした細胞系のスクリーニングに自動ワークステーションを利用する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、蛋白を発現させるための細胞系のハイスループットスクリーニング方法を提供する。この方法には、細胞系を培地でインキュベートする工程と、固体支持体を、それぞれのインキュベートした細胞系由来の試料と接触させる工程とが含まれる。この態様では、固体支持体は、その表面に、それぞれの試料中の蛋白と結合する第１の結合剤が付着している。第１の結合剤と結合した蛋白を、検出可能な標識と作動可能に連結している、その蛋白と結合する第２の結合剤と接触させる。それぞれの試料中の蛋白発現レベルは、蛋白と結合した第２の結合剤と作動可能に連結している標識を検出することによって決定する。また、この方法には、所望の蛋白発現レベルを有する細胞系の選択も含まれる。一部の例では、これは、それぞれの細胞系における蛋白発現レベルとすべての細胞系における平均蛋白発現レベルとを比較することによって決定する。たとえば、すべての細胞系における平均発現レベルと比較して増加した蛋白発現レベルが、所望の蛋白発現レベルである場合がある。あるいは、低下した蛋白発現レベルが、所望の蛋白発現レベルである場合があり、やはりこれも、それぞれのスクリーニングした細胞系における蛋白発現レベルとすべての細胞系における平均蛋白発現レベルとを比較することによって決定する。
【００１６】
本発明のこの態様の方法は、選択した細胞系から上清を単離すること、およびそれぞれの上清をマルチウェルプレートのウェルに分配することをさらに伴う。その後、上清を蛋白と結合する試薬と接触させる。蛋白を試薬から溶出させ、適切な品質についてアッセイを行う。本発明のこの態様によれば、細胞系が工程ｅ）で選択され、細胞系によって発現される蛋白が適切な品質を有する場合に、細胞系を蛋白発現について選択する。一部の実施形態では、蛋白は、抗体、リガンド、受容体、蛋白のサブユニット、蛋白の断片、融合蛋白、組換え蛋白、およびそれらの断片である。特定の実施形態では、蛋白は、抗体、組換え抗体、またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１７】
他の実施形態では、第１の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第１の結合剤は、プロテインＡまたはストレプトアビジンである。さらに他の実施形態では、結合剤は、ビーズ、プレート、およびマイクロアレイチップなどの固体支持体に付着することができる。多くの実施形態では、固体支持体は、セルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ガラス、またはポリスチレンを含む。
【００１８】
他の実施形態では、第２の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第２の結合剤は、抗体およびその断片である。より具体的な実施形態では、抗体はＦ（ａｂ’）２断片であり、さらにより具体的には、抗体のＦｃ部分と特異的に結合するＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１９】
さらに他の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、化学色素、放射性結合剤、化学発光性結合剤、電気化学発光剤、磁性結合剤、常磁性結合剤、プロ磁性結合剤、有色産物をもたらす酵素、化学発光性産物をもたらす酵素、および磁性産物をもたらす酵素である。非常に具体的な実施形態では、検出可能な標識は、ルテニウムまたは複数のルテニウム標識である。
【００２０】
一部の実施形態では、試薬は、具体的な実施形態では第３の結合剤が付着した樹脂を含む。特定の実施形態では、第３の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。一方で、具体的な実施形態では、第３の結合剤は、プロテインＡまたはストレプトアビジンである。一部の実施形態では、蛋白は、真空を用いて試薬から溶出させる。多くの実施形態では、インキュベートした細胞系のスクリーニングに自動ワークステーションを利用する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、細胞培養法の開発方法を提供する。この方法には、試験する異なる条件でそれぞれの細胞系をインキュベートする工程が含まれる。その後、細胞系の試料を、それぞれの異なる条件からのそれぞれの細胞系からの固体支持体と接触させる。この態様では、固体支持体は、その表面に、それぞれの試料中の蛋白と結合する第１の結合剤が付着している。第１の結合剤と結合した蛋白を、検出可能な標識と作動可能に連結している、その蛋白と結合する第２の結合剤と接触させる。それぞれの試料中の蛋白発現レベルは、蛋白と結合した第２の結合剤と作動可能に連結している標識を検出することによって決定する。また、この方法には、所望の蛋白発現レベルを有する細胞系の選択も含まれる。一部の例では、これは、それぞれの細胞系における蛋白発現レベルとすべての細胞系における平均蛋白発現レベルとを比較することによって決定する。たとえば、すべての細胞系における平均発現レベルと比較して増加した蛋白発現レベルが、所望の蛋白発現レベルである場合がある。あるいは、低下した蛋白発現レベルが、所望の蛋白発現レベルである場合があり、やはりこれも、それぞれのスクリーニングした細胞系における蛋白発現レベルとすべての細胞系における平均蛋白発現レベルとを比較することによって決定する。
【００２２】
本発明のこの態様の方法は、選択した細胞系から上清を単離すること、およびそれぞれの上清をマルチウェルプレートのウェルに分配することをさらに伴う。その後、上清を蛋白と結合する試薬と接触させる。蛋白を試薬から溶出させ、適切な品質についてアッセイを行う。本発明のこの態様によれば、蛋白の量および品質が試験した他の条件と比較して向上している場合に、適切な細胞培養条件を同定する。
【００２３】
他の実施形態では、第１の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第１の結合剤は、プロテインＡまたはストレプトアビジンである。さらに他の実施形態では、結合剤は、ビーズ、プレート、およびマイクロアレイチップなどの固体支持体に付着することができる。多くの実施形態では、固体支持体は、セルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ガラス、またはポリスチレンを含む。
【００２４】
他の実施形態では、第２の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。特定の実施形態では、第２の結合剤は、抗体およびその断片である。より具体的な実施形態では、抗体はＦ（ａｂ’）２断片であり、さらにより具体的には、抗体のＦｃ部分と特異的に結合するＦ（ａｂ’）２断片である。
【００２５】
さらに他の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、化学色素、放射性結合剤、化学発光性結合剤、電気化学発光剤、磁性結合剤、常磁性結合剤、プロ磁性結合剤、有色産物をもたらす酵素、化学発光性産物をもたらす酵素、および磁性産物をもたらす酵素である。非常に具体的な実施形態では、検出可能な標識は、ルテニウムまたは複数のルテニウム標識である。
【００２６】
一部の実施形態では、試薬は、具体的な実施形態では第３の結合剤が付着した樹脂を含む。具体的な実施形態では、第３の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。一方で、具体的な実施形態では、第３の結合剤は、プロテインＡまたはストレプトアビジンである。一部の実施形態では、蛋白は、真空を用いて試薬から溶出させる。多くの実施形態では、インキュベートした細胞系のスクリーニングに自動ワークステーションを利用する。
【００２７】
具体的な実施形態では、試験する条件は細胞増殖培地である。他の実施形態では、試験する条件は温度である。さらに他の実施形態では、試験する条件は湿度である。さらなる実施形態では、試験する条件は圧力である。さらなる実施形態では、試験する条件は酸素圧である。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、蛋白を生産するための細胞系のハイスループットスクリーニング方法を提供する。この方法には、細胞系を培地中でインキュベートする第１の工程が含まれる。それぞれの細胞系からの試料を固体支持体上に置く、すなわち、固体支持体をそれぞれの試料と接触させる。固体支持体には、それぞれの試料中の蛋白と結合する第１の結合剤がその表面に付着していることに留意されたい。第１の結合剤は細胞試料中の蛋白と結合する。蛋白を、検出可能な標識と作動可能に連結している、その蛋白と結合する第２の結合剤と接触させる。蛋白発現レベルは、それぞれの試料において、蛋白と結合した第２の結合剤と作動可能に連結している標識を検出することによって決定する。細胞系は、その細胞系がスクリーニングした細胞系における平均蛋白発現レベルと比較して所望の蛋白発現レベルを有するかどうかに基づいて、蛋白の産生について選択する。
【００２９】
一部の実施形態では、蛋白は、抗体、リガンド、受容体、蛋白のサブユニット、蛋白の断片、融合蛋白、組換え蛋白、およびそれらの断片である。特定の実施形態では、蛋白は、抗体、組換え抗体、またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００３０】
他の実施形態では、第１の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第１の結合剤は、プロテインＡまたはストレプトアビジンである。さらに他の実施形態では、結合剤は、ビーズ、プレート、およびマイクロアレイチップなどの固体支持体に付着することができる。多くの実施形態では、固体支持体は、セルロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ガラス、またはポリスチレンを含む。
【００３１】
他の実施形態では、第２の結合剤は、抗体、リガンド、受容体、融合蛋白、蛋白のサブユニット、組換え蛋白、およびそれらの断片からなる群から選択される。具体的な実施形態では、第２の結合剤は、抗体およびその断片である。より具体的な実施形態では、抗体はＦ（ａｂ’）２断片であり、さらにより具体的には、抗体のＦｃ部分と特異的に結合するＦ（ａｂ’）２断片である。
【００３２】
さらに他の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、化学色素、放射性結合剤、化学発光性結合剤、電気化学発光剤、磁性結合剤、常磁性結合剤、プロ磁性結合剤、有色産物をもたらす酵素、化学発光性産物をもたらす酵素、および磁性産物をもたらす酵素である。非常に具体的な実施形態では、検出可能な標識は、ルテニウムまたは複数のルテニウム標識である。特定の実施形態では、この方法はシアル酸アッセイをさらに含む。
【００３３】
本発明の前述の目的および他の目的、その様々な特徴、ならびに本発明自体は、添付の図面と一緒に読んだ場合に、以下の説明からより詳細に理解し得るであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本明細書中で言及する特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書中に引用する発行された米国特許、認められた出願、公開された外国出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列を含めた参考文献は、それぞれが具体的かつ個別に参照により組み込まれていることが示された場合と同程度に、本明細書中に参照により組み込まれる。
【００３５】
１．１．概要
本発明の一実施形態は、部分的に、目的とする蛋白を産生する能力について細胞系をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、医薬および生物学的研究のための蛋白の工業スケールの生産において効率を向上させる方法も記載する。具体的には、本発明は、癌、アルツハイマー病、および糖尿病などの疾患の医薬治療に利用することができる蛋白の効率的な生産を可能にする。さらに、本発明の実施形態は、細胞系によって産生される目的とする蛋白の量および品質を決定するための、細胞系のハイスループットスクリーニング方法を提供する。
【００３６】
したがって、本発明の一態様は、蛋白を発現させるための細胞系のハイスループットスクリーニング方法を提供する。この方法は、目的とする蛋白と結合する第１の結合剤および目的とする蛋白と結合する検出可能な標識と作動可能に連結している第２の結合剤を利用する。一部の実施形態では、第１の結合剤は、ビーズ、磁性ビーズ、プレート、またはマイクロアレイチップなどの固体支持体に付着している。また、この方法では、目的とする蛋白と結合する試薬を用い、蛋白の細胞系に由来する試料からの精製を可能にする。本発明の一部の実施形態では、蛋白は、溶出された蛋白を試薬から真空引きを行うことによって、および濾過によって、試薬から精製する。さらに他の実施形態では、重力流によって溶液を試薬に通して流す。
【００３７】
本明細書中で使用する用語「治療蛋白」とは、それが作用する身体内の領域または中間体を介してそれが遠隔作用する身体の領域に対して生物学的効果を有する、蛋白またはペプチドである。治療蛋白は、本明細書中以下にさらに詳述するように、たとえば、抗体、抗体の抗原結合断片、可溶性受容体、受容体融合体、サイトカイン、成長因子、酵素、または凝固因子などの分泌蛋白であり得る。上記蛋白のリストは事実上単に例示的なものであり、限定する列挙であることを意図しない。当業者は、任意の蛋白を本発明に従って使用してよく、また、必要に応じて生産させる特定の蛋白を選択できることを理解されよう。
【００３８】
本明細書で使用する用語、ポリペプチド、蛋白およびペプチドは、同義であり、互換性があるように使用する。したがって、本明細書中で使用する蛋白、ペプチドまたはポリペプチドの大きさは、一般に、２個を超えるアミノ酸を含む。たとえば、蛋白、ペプチドまたはポリペプチドは、約２〜約２０個のアミノ酸、約２０〜約４０個のアミノ酸、約４０〜約１００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸〜約２００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸〜約３００個のアミノ酸などを含むことができる。本明細書中で使用するアミノ酸とは、当分野で知られている任意の天然に存在するアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体または任意のアミノ酸模倣体をいう。具体的な実施形態では、蛋白またはペプチドの残基は逐次であり、アミノ酸でない如何なるものもアミノ酸残基の配列を中断しない。他の実施形態では、配列は１つまたは複数の非アミノ酸部分を含み得る。特定の実施形態では、蛋白またはペプチドの残基の配列は、１つまたは複数の非アミノ酸部分によって中断され得る。
【００３９】
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子をいうために使用し、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などの抗体断片が含まれる。抗体に基づいた様々な構築体および断片を調製および使用する技法は当分野で周知である。抗体を調製および特徴づける手段も当分野で周知である（たとえば、本明細書中に参照により組み込まれている、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８参照）。たとえば、抗体には、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全長の重鎖、および少なくとも１つ、好ましくは２つの軽鎖が含まれ得る。本明細書中で使用する用語「抗体」には、抗体断片または抗原結合断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、重鎖断片（たとえばラクダ科ＶＨＨ）および結合ドメイン−免疫グロブリン融合体（たとえばＳＭＩＰ（商標））などの変異体分子が含まれる。抗体は、モノクローナルまたは単一特異性抗体であり得る。また、抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体であることもできる。さらに他の実施形態では、抗体は、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択された重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体は、たとえば、κまたはλから選択された軽鎖を有する。一実施形態では、定常領域は、抗体の特性を変更するために変化、たとえば突然変異している（たとえば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能の１つまたは複数を増加または低下させるため）。典型的には、抗体は、所定の抗原、たとえば、神経変性、代謝、炎症性、自己免疫および／または悪性障害などの障害に関連する抗原と特異的に結合する。
【００４０】
小モジュール免疫医薬品（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳＭＩＰ（商標））は、結合ドメインポリペプチドを含む変異体分子の例を提供する。ＳＭＩＰならびにその使用および応用は、たとえば、すべてその全体が本明細書中に参照により組み込まれている、米国公開特許出願第２００３／０１１８５９２号、第２００３／０１３３９３９号、第２００４／００５８４４５号、第２００５／０１３６０４９号、第２００５／０１７５６１４号、第２００５／０１８０９７０号、第２００５／０１８６２１６号、第２００５／０２０２０１２号、第２００５／０２０２０２３号、第２００５／０２０２０２８号、第２００５／０２０２５３４号、および第２００５／０２３８６４６号、ならびにその関連特許ファミリーのメンバーに開示されている。単一ドメイン抗体には、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体が含まれ得る。例には、それだけには限定されないが、重鎖抗体、天然で軽鎖を欠く抗体、慣用の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作した抗体および抗対に由来するもの以外の単一ドメイン骨格が含まれる。単一ドメイン抗体は、当分野の任意のもの、または任意の将来の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、それだけには限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含めた任意の種に由来し得る。本発明の一態様によれば、本明細書中で使用する単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている、天然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、たとえば、国際公開公報ＷＯ９４０４６７８号に開示されている。明確にするために、天然で軽鎖を欠く重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、本明細書中で、ＶＨＨまたはナノ体と呼ぶ。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、たとえば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナで産生させた抗体に由来することができる。ラクダ科以外の他の種も天然で軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する場合があり、そのようなＶＨＨは本発明の範囲内にある。
【００４１】
用語抗体の「抗原結合断片」に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、（ｖｉ）ラクダ科またはラクダ科可変ドメイン、たとえばＶＨＨドメイン、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体、および（ｉｘ）Ｆｃ領域と融合した免疫グロブリン分子の１つまたは複数の断片が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一蛋白鎖にすることを可能にする合成リンカーによって、結合することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、たとえば、Ｂｉｒｄ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜２６、Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：５８７９〜８３参照）。そのような単鎖抗体も、用語抗体の「抗原結合断片」に包含されることを意図する。これらの抗体断片は当業者に知られている慣用技術を用いて得られ、インタクトな抗体と同じ様式で機能について断片の評価を行う。
【００４２】
「二重特異性」または「二官能性」抗体以外では、抗体はその結合部位のそれぞれが同一であると理解される。「二重特異性」または「二官能性抗体」とは、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた様々な方法によって産生することができる。たとえば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８、１５４７〜１５５３（１９９２）参照。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「細胞系」とは、培養中で維持され、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件で増殖する能力を獲得した細胞を意味する。細胞系は、不死化されているか、または「初代細胞系」として一過的に確立されていてよい。特定の実施形態では、細胞系を当分野で知られている技法によって確立させる（たとえばＫｗａｋ他（２００６）Ａｎｉｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７（１）：５１〜８参照）。一部の実施形態では、細胞系は、当分野で知られている技法によって産生することができる抗体産生細胞である（たとえばＤｅｓｓａｉｎ他（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２９１（１〜２）：１０９〜２２）。また、細胞系は、ＡＴＣＣ細胞生物学コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、バージニア州Ｍａｎｎａｓｓａｓ）などの市販の入手源から得ることもできる。
【００４４】
本明細書中で使用する用語「結合剤」とは、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、ロンドン力、または力の任意の組合せによって任意の他の分子と会合することができる分子を意味する。結合剤には、それだけには限定されないが、蛋白およびその断片、ペプチド模倣化合物、抗体およびその断片、核酸、毒素、ならびに小分子が含まれる。
【００４５】
結合剤は、当分野で周知の方法によって誘導体化した固体支持体上に配置することができる。固体支持体には、それだけには限定されないが、ビーズ、磁性ビーズ、マイクロアレイチップ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マルチウェルプレート、およびＰＶＤＦ膜が含まれる。一部の実施形態では、固体支持体は、プレートの下に電極が配置されたプレートであり、電極は、磁性材料と結合した結合剤を引き寄せる磁場を生じる。プレートは製造者のプロトコルに従って使用する（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ参照）。
【００４６】
固体支持体は、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、鉄などの磁性金属、ポリアクリルアミド、セファロース、セルロース、または蛋白と結合する結合剤の能力に影響を与えない任意の不活性支持体から構成されていてよい。固体支持体は、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）から購入する。
【００４７】
さらに、一部の実施形態では、結合剤を、「印刷」と呼ばれる方法によって当業者によって実施される方法を利用して、マイクロアレイチップなどの固体支持体上に配置する（たとえばＳｃｈｅｎａ他、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０（５２３５）：４６７〜４７０参照）。本明細書中で使用する用語「印刷」とは、固体支持体上にスポットを、最大数のスポットが固体支持体上に配置されるように近接して設置することをいう。印刷法は、たとえばロボットプリンターによって実施することができる。Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｐｉｎｓ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いたＶｅｒｓＡｒｒａｙ  ＣＨＩＰ  Ｗｒｉｔｅｒ  Ｐｒｏｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、本態様の集中マイクロアレイチップを生産するために使用することができる印刷装置の非限定的な例である。
【００４８】
本明細書中で使用する用語「適切な品質」とは、目的とする蛋白に特に関連する品質を意味する。適切な品質には、それだけには限定されないが、酵素反応、抗体−エピトープ相互作用、および核酸−蛋白相互作用が含まれる。適切な品質は、目的とする蛋白の特定の物理化学的側面を分析することによってアッセイすることができる。たとえば、適切な品質は、使用できるアッセイの種類を限定することを意図せずに、大きさ、電荷、蛋白の炭水化物含量、結合活性、および酵素活性に関連することができる。ＮＭＲなどの物理的構造分析を用いて蛋白の全体的な三次および二次構造を決定することができる。さらに、以下により詳細に説明するレクチンに基づいたアッセイおよびシアル酸アッセイを用いて、目的とする蛋白の物理化学的側面を決定することができる。言い換えれば、適切な品質は、目的とする蛋白の化学的活性だけでなく、目的とする蛋白の物理的構造も見ることによって決定することができる。
【００４９】
本明細書中で使用する用語「溶出」とは、溶媒を使用することによって樹脂または結合剤から抽出することを意味する。目的とする蛋白を樹脂または結合剤から溶出させる方法は、目的とする蛋白を結合剤から取り外すことができる分子を含む溶液を含むことができる。さらに、溶液は、目的とする蛋白が目的とする蛋白と会合しなくなるように、樹脂または結合剤の結合の特徴を変化させるｐＨを有することができる。その方法が目的とする蛋白の全体的な機能性または品質に影響を与えない限りは、本発明において蛋白を溶出させるために任意の溶液を使用できることに留意されたい。
【００５０】
本明細書中で使用する用語「樹脂」とは、天然または合成由来の、任意の固体または半固体の有機産物を意味する。樹脂には、複合体の混合物からの分子の精製を可能にする部分とコンジュゲートすることができる任意の物質が含まれる。本発明で有用な部分には、陽イオン分子、陰イオン分子、金属、半金属、多糖類、ポリペプチド、蛋白、核酸、ペプチド、有機小分子、およびペプチド模倣化合物が含まれる。具体的には、樹脂は、それ自体が、それだけには限定されないがセファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、または中性多糖類を含めた任意の不活性化合物からなることができる。樹脂は、たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）から購入することができる。
【００５１】
本明細書中で使用する用語「ハイスループット」とは、細胞系における望ましい蛋白発現の存在を決定するために高速かつ単純な方法を可能にすることを意味する。望ましい蛋白発現とは、ハイスループット技法によってスクリーニングした細胞系によって発現される生体分子の量および品質をどちらもいう。また、ハイスループット方法には、生体分子を処理するための自動システムおよび大きなスケールのスクリーニングを行うための自動データ処理も含まれ得る。
【００５２】
本明細書中で使用する用語「ハイスループット力価スクリーニング」とは、細胞によって発現された蛋白の量を決定するために使用する手段を意味する。ハイスループット力価スクリーニングには、細胞に由来する試料中で目的とする蛋白を同定するための結合剤の使用が含まれる。結合剤は、検出可能な標識または固体支持体と作動可能に連結していてよく、すべて以下により詳細に説明する。
【００５３】
本明細書中で使用する用語「ハイスループット精製」とは、複数の細胞試料から蛋白を同時にまたは実質的に同時に精製する方法を意味する。
【００５４】
本明細書中で使用する用語「細胞培養法の開発」とは、工業スケールまたは小さなスケールでの生産のために、十分な量および品質で蛋白を生産するために必要な条件の最適化をもたらす手段を意味する。細胞培養法の開発を用いて試験することができる条件には、それだけには限定されないが、塩濃度、培地内容物、増殖温度、大気圧、大気酸素含有率、培養物の攪拌、および二酸化炭素含有率が含まれる。細胞培養法の開発には、蛋白の量（ハイスループット力価スクリーニング）および蛋白の品質（ハイスループット精製）を決定する工程が含まれる。
【００５５】
細胞培養法の開発の目的のために蛋白の品質を決定する方法には、それだけには限定されないが、結合アッセイ、レクチンアッセイ、シアル酸アッセイ、ＮＭＲ、円二色性、質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、酵素アッセイ、比色アッセイ、およびアミノ酸配列決定が含まれる。これらのアッセイは、細胞培養法の開発方法中の任意の時点で使用することができる。特定の実施形態では、目的とする蛋白のハイスループット精製が完了した後にアッセイを行う。
【００５６】
本明細書中で使用する用語「目的とする蛋白」とは、生物学的、医学的、医薬品的、または医薬的な目的のために生産した、任意の蛋白または蛋白様分子を意味する。たとえば、目的とする蛋白は治療蛋白であり得る。目的とする蛋白は、染色体または染色体外であるかにかかわらず、それだけには限定されないが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ（「ＨｎＲＮＡ」）、リボソームＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＲＮＡが含まれる核酸配列から生産することができる。核酸配列の染色体外源には、二本鎖ＤＮＡウイルスゲノム、一本鎖ＤＮＡウイルスゲノム、二本鎖ＲＮＡウイルスゲノム、一本鎖ＲＮＡウイルスゲノム、細菌ＤＮＡ、ミトコンドリアゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または目的とする蛋白を生成することができる任意の他の外来核酸源が含まれ得る。目的とする蛋白は、任意の構造または構造の組合せであり得る。たとえば、目的とする蛋白には、それだけには限定されないが、組換え蛋白、四次構造を含む蛋白、グリコシル化蛋白、脂質付加蛋白、オリゴペプチド、ペプチド、蛋白ドメイン、蛋白サブユニット、抗体またはその断片、および抗体様分子が含まれる。また、目的とする蛋白には、たとえば融合蛋白も含まれる。融合蛋白は、一般に、ＮまたはＣ末端で第２のポリペプチドまたは蛋白の全体または一部分と連結した、標的化ペプチドの全体または実質的な部分を有する。たとえば、融合には、異種宿主中における蛋白の組換え発現を可能にするために、他の種からのリーダー配列を用い得る。別の有用な融合には、融合蛋白の精製を容易にするために、抗体エピトープなどの免疫学的に活性のあるドメインの付加が含まれる。融合蛋白には、標的化部分、たとえば可溶性受容体断片またはリガンドと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）を含めた免疫グロブリン鎖、Ｆｃ断片、様々なアイソタイプの重鎖定常領域とが含まれ得る。たとえば、融合蛋白には、たとえばヒト免疫グロブリンＦｃ鎖（たとえば、ヒトＩｇＧ、たとえばヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４、またはその変異型）と融合している受容体の細胞外ドメインが含まれ得る。一実施形態では、ヒトＦｃ配列は、Ｆｃ受容体結合を低減するために、１つまたは複数のアミノ酸で突然変異している、たとえば、野生型配列から残基２５４および２５７で突然変異している。融合蛋白にはさらに、第１の部分と第２の部分、たとえば免疫グロブリン断片とを結合するリンカー配列が含まれ得る。たとえば、融合蛋白には、ペプチドリンカー、たとえば、長さが約４〜２０個、より好ましくは５〜１０個のアミノ酸のペプチドリンカーが含まれ得る；そのペプチドリンカーの長さは８個のアミノ酸である。たとえば、融合蛋白には、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ［式中、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である］を有するペプチドリンカーが含まれ得る。他の実施形態では、発現、立体的な柔軟性、検出および／または単離もしくは精製を容易にするために、さらなるアミノ酸配列を融合蛋白のＮまたはＣ末端に付加することができる。
【００５７】
切断部位を融合接合部またはその付近に含めることにより、精製後の外来ポリペプチドの除去が容易となる。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的化シグナルまたは膜貫通領域などの機能的ドメインの連結が含まれる。融合蛋白内に取り込ませ得る蛋白またはペプチドの例には、細胞分裂抑制蛋白、細胞破壊蛋白、アポトーシス促進剤、抗血管形成剤、ホルモン、サイトカイン、成長因子、ペプチド薬、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体蛋白、酵素、レクチン、ＭＨＣ蛋白、細胞接着蛋白および結合蛋白が含まれる。融合蛋白の生成方法は当業者に周知である。このような蛋白は、たとえば、二官能性架橋結合試薬を用いた化学付着によって、完全な融合蛋白の新規合成によって、または、標的化ペプチドをコードしているＤＮＡ配列を第２のペプチドもしくは蛋白をコードしているＤＮＡ配列と付着させ、次いでインタクトな融合蛋白を発現させることによって、生産することができる。
【００５８】
特定の実施形態では、融合蛋白は、たとえば腫瘍壊死因子αおよびβ受容体の形態の腫瘍壊死因子阻害剤であり（ＴＮＦＲ−１、１９９１年３月２０日公開の欧州特許ＥＰ４１７，５６３号、およびＴＮＦＲ−２、１９９１年３月２０日公開の欧州特許ＥＰ４１７，０１４号、これらのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれている）、本発明に従って分析する（総説には、その全体が本明細書中に参照により組み込まれているＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、Ｊ  Ｉｎｆｌａｍｍ．、４７（１〜２）：１〜７、１９９５〜９６参照）。一部の実施形態によれば、腫瘍壊死因子阻害剤は可溶性ＴＮＦ受容体を含む。特定の実施形態では、腫瘍壊死因子阻害剤は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含めた免疫グロブリン蛋白の一部分と融合した可溶性ＴＮＦＲを含む。特定の実施形態では、本発明のＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲ  ＩおよびＴＮＦＲ  ＩＩの可溶形である。特定の実施形態では、本発明のＴＮＦ阻害剤は可溶性ＴＮＦ結合蛋白である。特定の実施形態では、本発明のＴＮＦ阻害剤は、ＴＮＦＲ−Ｆｃ、たとえばエタネルセプトである。本明細書中で使用する「エタネルセプト」とは、ｐ７５ＴＮＦ−α受容体の細胞外部分の２つの分子の二量体であるＴＮＦＲ−Ｆｃをいい、それぞれの分子はヒトＩｇＧ１の２３５個のアミノ酸のＦｃ部分からなる。本発明に従って、カルノシンなどの抗老化化合物を用いて、ＴＮＦＲ−Ｆｃの生産中の誤折り畳みおよび／または凝集蛋白の量を低下させる。
【００５９】
蛋白またはペプチドは、標準の分子生物学的技法による蛋白、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然源からの蛋白もしくはペプチドの単離、または蛋白もしくはペプチドの化学合成を含めた、当業者に知られている任意の技法によって作製し得る。本明細書中に開示した技法を用いてまたは当業者に知られているように、既知の遺伝子のコード領域を増幅および／または発現させ得る（たとえばＫａｌｅｅｂａ他（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１１（５７６９）：１９２１〜４参照）。あるいは、蛋白、ポリペプチドおよびペプチドの様々な市販の調製物が当業者に知られている。
【００６０】
さらに、本明細書中で使用する用語「所望の発現レベル」とは、蛋白の物理化学的特徴に応じて、続く蛋白の精製を可能にするために必要な蛋白を意味する。目的とする蛋白の所望の発現レベルは、利用する生産方法に関連するいくつかの要因に依存する。たとえば、特定の細胞系からの発現レベルは、蛋白の品質および量の分析ならびに蛋白の効率的な精製を可能にする。したがって、細胞系からの所望の蛋白発現レベルは、蛋白の特徴ならびに蛋白で用いる精製およびアッセイの方法を考慮して、当業者によって決定される。
【００６１】
特定の実施形態では、蛋白発現の所望のレベルは、目的とする蛋白の特定の要件に基づいて選択する。たとえば、当業者は、産生される蛋白の量を最大限にするために、所望の蛋白発現レベルを増加した目的蛋白発現レベルであると選択することができる。他の実施形態では、毒素などの、毒素を産生する細胞において高レベルで毒性がある蛋白の場合、所望の蛋白発現レベルを低下した目的蛋白発現レベルであると選択する。さらに、低下した蛋白発現レベルは、目的とする蛋白が高濃度のレベルで封入体を形成する状況において選択する。したがって、当業者によって選択される蛋白発現レベルは、目的とする蛋白の特徴に依存する。
【００６２】
細胞系によって産生される蛋白の量および品質を決定するにあたって、典型的には細胞系の試料が蛋白発現および蛋白品質評価に必要である。特定の実施形態では、細胞溶解および上清単離などの当分野で知られている手段を用いて細胞系の試料を単離する（たとえば、Ｖａｒａ他（２００５）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２６（１８）：３９８７〜９３、Ｉｙｅｒ他（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３（５）：２６９２〜７参照）。あるいは、細胞系の試料を、抗体、細胞外基質蛋白、または血清蛋白などの分泌蛋白を有する培地から単離する。そのような実施形態では、培地は、蛋白の量および品質について試験する試料である。一実施形態では、本明細書中に詳述するように、培地試料を、事前の精製工程を全く存在させずに、蛋白量について試験するアッセイで用いる。
【００６３】
本発明の別の態様は、蛋白を生産するための細胞系のハイスループットスクリーニング方法を提供する。この方法では、蛋白発現レベルは、固体支持体を、蛋白を含む細胞系の試料と接触させることによって決定する。一実施形態では、細胞系の試料は細胞培養培地である。固体支持体は、その表面に、蛋白と結合することができる第１の結合剤が付着している。また、この方法には、第１の結合剤と結合した蛋白と結合し、固体支持体上に固定されている第２の結合剤も含まれる。第２の結合剤は検出可能な標識と作動可能に連結している。細胞系は蛋白に必要な所望の発現レベルに基づいて選択される。
【００６４】
特定の蛋白の発現レベルは、第１の結合剤をニトロセルロース、ナイロン、またはＰＶＤＦなどの膜上に固定する「ドットブロット」によって測定することができる（たとえばＨｅｉｎｉｃｋｅ他（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、１５２（２）：２２７〜３６参照）。また、蛋白マイクロアレイ技術を用いて、試料中の蛋白の発現を決定することもできる。あるいは、第１の結合剤を含むマルチウェルプレートのウェル内に試料を入れる。そのような実施形態では、ＥＬＩＳＡ分析などの同様の技法が当分野で日常的である（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ページ４．２．１〜４．２．９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照。
【００６５】
一部の実施形態では、自動ワークステーションを用いて細胞系の試料のハイスループットスクリーニングおよび／または精製を行う。さらに、自動ワークステーションを用いて細胞培養法の開発を行うことができる。自動ワークステーションは、一般的に、多数の実験を短期間内に行うために当分野で利用される。自動ワークステーションの例には、それだけには限定されないが、ＴＥＣＡＮ  Ｇｅｎｅｓｉｓワークステーション（ＴＥＣＡＮ  Ｓｃｈｗｅｉｚ  ＡＧ、スイス、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ）およびＢｉｏｍｅｋ  ＦＸワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）が含まれる。使用方法は自動ワークステーションの製造者から得ることができ、当分野で周知である。
【００６６】
１．２．結合剤
本発明の態様は、目的とする蛋白を結合するために結合剤を利用する。特定の実施形態では、結合剤は抗体またはその断片である。蛋白と特異的に結合する結合剤が抗体である場合は、抗体は、それだけには限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作した抗体、二重特異性抗体（二重特異性抗体の特異性の一方がトリオースリン酸イソメラーゼ蛋白と特異的に結合する）、抗体断片（それだけには限定されないが、「Ｆｖ」、「Ｆ（ａｂ’）２」、「Ｆ（ａｂ）」、および「Ｄａｂ」が含まれる）、ならびに抗体の反応性部分を表す単鎖（「ＳＣ−ＭＡｂ」）であり得る。抗体および他の結合剤を作製する方法は周知である（たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ他（１９９１）免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｊｏｎｅｓ他（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５、Ｍａｒｘ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：４５５〜４５６、Ｒｏｄｗｅｌｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４２：９９〜１００、Ｃｌａｃｋｓｏｎ（１９９１）Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、３０５２：３６〜３９、Ｒｅｉｃｈｍａｎ他（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６参照）。
【００６７】
結合剤は、抗体のＦｃ部分と結合する抗体またはその断片であり得る。特定の実施形態では、結合剤は、細胞系の試料中の抗体の検出を可能にする。具体的な実施形態では、第２の結合剤である抗体を、ルテニウムなどの電気化学発光性の検出可能な標識で検出可能に標識する。さらに、第２の結合剤は、ルテニウムなどの電気化学発光性の検出可能な標識で検出可能に標識したＦ（ａｂ’）２断片であり得る。
【００６８】
Ｆ（ａｂ’）２断片を用いた目的とする蛋白の検出を図１に示す。Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｏｒｉタグなどの検出可能な標識と作動可能に連結している。図１では、Ｆ（ａｂ’）２断片は、この図の例中で目的とする蛋白である抗体のＦｃ部分を認識する。抗体はビーズ上に固定されており、これにはプロテインＡまたはストレプトアビジンがコンジュゲートしている（図１）。Ｆ（ａｂ’）２断片の結合は光の生成として観察される（図１）。
【００６９】
本発明の一態様で第１の結合剤として用いる抗体を固体支持体の表面上にカップリングできることに留意することが重要である。第１の結合剤のカップリングは反応のシグナル強度を向上させ、改善された結果が生じる。一般的なカップリング剤には、それだけには限定されないが、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシランを用いたシラン処理、アガロースコーティング、およびポリ−Ｌ−リシンフィルムが含まれる。さらに、支持体とのカップリングを容易にするタグが含まれるように、組換え抗体を操作することができる。たとえば、ヒスチジンタグを有する組換え抗体を、ニッケルでコーティングした支持体とカップリングさせることができる。
【００７０】
さらに、ペプチド、ペプチド模倣化合物、および小分子などの化合物を結合剤として用いることができる。結合剤は、それだけには限定されないが、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体もしくは構造的類似体、またはそれらの組合せなどを含めた、ペプチドまたは他の生体分子から合成することができる。ファージディスプレイライブラリおよび化学コンビナトリアルライブラリを用いて、目的とする蛋白に許容される結合剤である合成化合物を開発および選択することができる。また、ペプトイド、ランダム生体オリゴマー（米国特許第５，６５０，４８９号）、ベンゾジアゼピン、ダイダントイン（ｄｙｄａｎｔｏｉｎ）、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）、β−Ｄ−グルコース足場材料を有する非ペプチドペプチド模倣体、オリゴカルバメートまたはペプチジルホスホネートから作製した潜在的な結合剤の使用も、本発明で想定される。
【００７１】
特定の例では、結合剤は、蛋白と特異的に相互作用、結合、または会合するように設計されたペプチドであり得る。また、ペプチド結合剤は、任意の他の蛋白のアミノ酸配列と相互作用、会合、または結合することもできる。ペプチドをアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの定方向またはランダム化学修飾に供することができる。
【００７２】
ペプチド結合剤の同定およびスクリーニングは、目的とする蛋白の構造的特徴を、たとえば、Ｘ線結晶構造解析、中性子回析、核磁気共鳴分光測定、および構造決定のための他の技法を用いて決定することによってさらに容易となる。コンピュータアルゴリズムにより結合剤の同定をさらに容易にすることができる。既知の三次元構造のペプチドおよび小分子のデータベースを、標的蛋白の部位に幾何学的に当てはまる候補について走査することができるコンピュータアルゴリズムを用いる（たとえばＣｈｅｎおよびＫｅｌｌｏｇｇ（２００５）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、１９（２）：６９〜８２参照）。この種のアルゴリズムのほとんどが、蛋白のドメインの結合ポケットまたは領域の形状に相補的な、幅広い種類の化学構造を探す方法を提供する。特定のデータベースからのペプチド組のそれぞれを比較して、目的とする蛋白と相互作用する潜在性を最も有する特定ペプチドを決定することができる。
【００７３】
本発明の化合物はまた、少なくとも部分的に非天然であり得るペプチド模倣化合物であることもできる。ペプチド模倣化合物は、任意の望ましいアミノ酸配列の一部分の小分子模倣体であり得る。化合物は、模倣体のおかげで安定性、有効性、力価および生体利用度が増加していてよい。さらに、化合物の毒性が低下していてよい。ペプチド模倣化合物は、粘膜腸管透過性が増強されていてよい。化合物を合成によって調製することができる。本発明の化合物には、Ｌ−、Ｄ−または非天然アミノ酸、α，α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸（アラニンの等電子類似体）が含まれ得る。化合物のペプチド主鎖は、少なくとも１つの結合がＰＳＩ−［ＣＨ＝ＣＨ］で置き換えられていてよい（Ｋｅｍｐｆ他（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、３８（３）：２３７〜４１）。化合物にはさらに、トリフルオロチロシン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン、ポリ−Ｌ−プロパルギルグリシン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アリルグリシン、またはポリ−Ｌ−アリルグリシンが含まれ得る。
【００７４】
本発明の一例は、化合物の単結合、ペプチド主鎖またはアミノ酸構成要素が適切な模倣体で置き換えられているペプチド模倣化合物である。適切なアミノ酸模倣体であり得る非天然アミノ酸の例には、それだけには限定されないが、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、システイン（アセトアミドメチル）、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リシン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−δ−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒドロキシプロリン、Ｂｏｃ−Ｌ−チオプロリンが含まれる。（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ他（１９９４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３８（１０）：２２８０〜６、Ｐｉｎｉｌｌａ他（１９９５）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．、３７（３）：２２１〜４０）。
【００７５】
場合によっては、結合剤は、蛋白と結合、相互作用、または会合する小分子であり得る。そのような小分子は、細胞の脂質二重層を透過することができる有機分子であり得る。小分子には、それだけには限定されないが、毒素、キレート化剤、金属、および半金属化合物が含まれる。小分子は、小分子を特定の細胞へと特異的に導くために、標的化剤と付着またはコンジュゲートしていてよい。
【００７６】
一部の実施形態では、結合剤は、生理的条件下で転写因子などの蛋白と結合する、完全長配列、完全長配列の断片または合成オリゴヌクレオチドであり得る核酸配列である。「核酸」とは、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマーをいい、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のポリマーが含まれる。「ヌクレオチド」とは、天然に存在する化合物および天然に存在しない化合物をどちらもいい、ヘテロ環式塩基、糖、およびリン酸エステルなどの連結基を含む。たとえば、２’−Ｏ位のメチルもしくはアリル基または２’−Ｏ基を置換するフルオロ基など、構造基をヌクレオチドのリボシルまたはデオキシリボシル単位に付加し得る。核酸のリン酸ジエステルなどの連結基を、たとえばメチルホスホネートまたはＯ−メチルホスフェートで置換または修飾し得る。塩基および糖も、当分野で知られているように修飾することができる。本開示の目的のために、「核酸」には、ネイティブまたは修飾した核酸塩基がポリアミド主鎖に付着している「ペプチド核酸」も含まれる。
【００７７】
本発明の結合剤を検出可能な標識とコンジュゲートさせることができる。本発明によれば、「検出可能な標識」とは感知できる部分である。一部の実施形態では、検出可能な標識は結合剤と作動可能に連結している。「作動可能に連結した」とは、検出可能な標識が、共有または非共有（たとえばイオン）結合のどちらかによって結合剤に付着していることを意味する。共有結合を生じる方法は知られている（たとえば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．（１９９１）蛋白のコンジュゲーションおよび架橋結合の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｕｒｋｈａｒｔ他（１９９９）アミノ架橋結合剤またはアミノプラストの化学および応用（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｏｒ  Ａｍｉｎｏｐｌａｓｔｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．の一般的なプロトコルを参照されたい）。
【００７８】
本発明に従って、検出可能に標識した結合剤には、検出可能な部分とコンジュゲートした結合剤が含まれる。本発明の別の検出可能に標識した結合剤は融合蛋白であり、一方のパートナーが結合剤であり、他方のパートナーが検出可能な標識である。検出可能に標識した結合剤のさらに非限定的な例は、結合剤と第２の部分に対して高い親和性を有する第１の部分とを含む第１の融合蛋白、および第２の部分と検出可能な標識とを含む第２の融合蛋白である。たとえば、蛋白と特異的に結合する結合剤がストレプトアビジン部分と作動可能に連結している。フルオレセイン部分と作動可能に連結しているビオチン部分を含む第２の融合蛋白を、結合剤−ストレプトアビジン融合蛋白に付加し、第２の融合蛋白と結合剤−ストレプトアビジン融合蛋白との組合せにより、検出可能に標識された結合剤（すなわち、検出可能な標識と作動可能に連結している結合剤）がもたらされる。具体的な実施形態では、検出可能な標識は医学的イメージング装置またはシステムによって検出可能である。たとえば、医学的イメージングシステムがＸ線機器の場合、Ｘ線機器によって検出することができる検出可能な標識は放射性標識（たとえば３２Ｐ）である。結合剤は必ずしも検出可能な部分と直接コンジュゲートしている必要はないことに留意されたい。たとえば、それ自体が検出可能な二次結合剤（たとえばＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウス二次抗体）と特異的に結合している結合剤（たとえば抗体）は、検出可能な部分（すなわちＦＩＴＣ部分）と作動可能に連結している。
【００７９】
検出可能な標識は、それだけには限定されないが、フルオロフォア（たとえば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン、ローダミン）、化学色素、または放射性、化学発光性、電気化学発光性、磁性、常磁性、プロ磁性の化合物、または有色、化学発光性、もしくは磁性であり得る産物を生じる酵素であり得る。シグナルは、分光的、光化学的、生化学的、免疫組織学的、電気的、光学的または化学的な手段を含めた任意の適切な手段によって検出可能である。特定の場合では、シグナルは２つ以上の手段によって検出可能である。特定の実施形態では、蛋白標識には、蛍光色素、放射標識、電気化学発光性、および化学発光性標識が含まれる。
【００８０】
たとえば、結合剤のアミノ酸はＣｙ５／Ｃｙ３蛍光色素とコンジュゲートしていてよい。これらの色素は当分野で頻繁に使用される（たとえばＬｉｎｄｅｒ他（２００２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．、２３（５）：７４０〜９参照）。蛍光標識は、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’ジアミノスチルベン、ピレン、第四級フェンアントリジン塩、９−アミノアクリジン、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノプリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチレート、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、フラビン、キサンテン色素（たとえば、フルオレセインおよびローダミ色素）、シアニン色素、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン色素ならびに蛍光蛋白（たとえば、緑色蛍光蛋白、フィコビリ蛋白）などの非限定的な例を含めた様々な構造的クラスから選択することができる。
【００８１】
他の有用な色素は化学発光色素であり、それだけには限定されないが、ビオチンとコンジュゲートしたアミノ酸が含まれ得る。具体的な実施形態では、電気化学発光プローブが結合剤とコンジュゲートしている。本明細書中で使用する「電気化学発光」とは、電気化学反応に続いて起こる化学発光反応をいう。電気化学発光プローブには、それだけには限定されないが、ルミノール、アクリダンエステル、ルテニウム、ルテニウムキレート、およびルテニウムトリビピリジン、ＮＨＳエステルが含まれる。電気化学発光プローブは、たとえばＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）から購入することができる。
【００８２】
１．３  分析アッセイ
本発明の態様はまた、蛋白の品質のアッセイも利用する。これらのアッセイは、目的とする蛋白のハイスループット力価スクリーニング中に利用することができる。蛋白の品質はまた、細胞培養法の開発中に決定することもできる。蛋白の品質の一部として、蛋白の構造には、蛋白の一次、二次、三次、および四次構造、ならびにグリコシル化、脂質化、およびリン酸化などの翻訳後修飾が含まれる。さらに、蛋白の大きさ、形状、および電荷が蛋白の品質に影響を与える。蛋白の物理的構造は、その正常な機能を行う蛋白の能力に対して著しい効果を与える。酵素反応のコンテキストでは、蛋白の構造は、完全な酵素品質にとって極めて重要である。抗体またはその断片のコンテキストでは、抗体のアミノ酸の大きさ、形状、表面電荷、グリコシル化、およびリン酸化が抗体のエピトープ特異性に対して著しい効果を与える。
【００８３】
一部の実施形態では、ＮＭＲ、マトリックス支援レーザー脱離／飛行時間（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ」）分析、および円二色性を用いて蛋白の物理的構造を決定する（たとえば、米国特許第６，９３０，３０５号、第７，００５，２７２号、および第７，０２９，８７２号参照）。そのような技法は蛋白の全体的な物理的構造の具体的な分析を提供する。これらの技法は当分野で周知である。
【００８４】
具体的な実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて目的とする蛋白の大きさを決定する（たとえばＢｒｏｏｋｓ他（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９７（１３）：７０６４〜７０６７参照）。さらに、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて蛋白の電荷を決定することができる（たとえばＺｈａｎｇおよびＧｌａｔｚ（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１５（１）：１２〜１８参照）。目的とする蛋白の構造を同定するために利用することができる他の技法には、それだけには限定されないが、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動ＳＤＳ、キャピラリーゾーン電気泳動、および高ｐＨ陰イオン交換ＨＰＬＣが含まれる。これらの技法は、当分野で周知の手順を用いて実施することができる。
【００８５】
他の構造的アッセイにはシアル酸アッセイおよびレクチンアッセイが含まれる。これらのアッセイでは、蛋白の品質について情報をもたらす、蛋白の表面上で認められるグリコシル化レベルが同定される。シアル酸アッセイは、試料中に存在する炭水化物の程度を決定するために用いられており、これらの技法は当分野で知られている（たとえば、米国特許第５，８０７，５５３号および第５，８５５，９０１号参照）。レクチンに基づいたアッセイも、試料中の炭水化物の存在を検出するが、蛋白−炭水化物の相互作用の機構を通じて行う（たとえば米国特許第５，６３３，１４８号参照）。レクチンアッセイは炭水化物結合のために当分野で広く用いられており、たとえば米国特許第６，３３１，３１９号に記載されている。
【００８６】
蛋白の物理的構造の決定に加えて、特定の機能を行う蛋白の能力のアッセイを行うことができる（たとえば米国特許第７，０２９，８６２号参照）。また、蛋白またはポリペプチド（たとえば、ハイブリッド形成核酸によってコードされている）の結合機能を、たとえば結合または結合阻害アッセイで、受容体を含む膜画分または受容体を発現する細胞を用いて検出することができる（たとえば、Ｖａｎ  Ｒｉｐｅｒ他（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：８５１  ８５６、Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉ他、米国特許第５，２８４，７４６号参照）。したがって、コードされている蛋白またはポリペプチドが、リガンド、阻害剤および／またはプロモーターと結合する能力を、評価することができる。本発明の核酸によってコードされている蛋白またはポリペプチドの抗原性特性は、免疫ブロッティング、免疫沈降および免疫アッセイ（たとえば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ）などの、蛋白と結合する抗体を用いた免疫学的方法によって決定することができる。
【００８７】
蛋白またはポリペプチド（たとえば、ハイブリッド形成核酸によってコードされている）のシグナル伝達機能は、酵素アッセイによって検出することができる。蛋白またはポリペプチド（たとえば、ハイブリッド形成核酸によってコードされている）の刺激機能は、蛋白またはポリペプチドを発現する細胞を用いた、化学走性またはメディエーターの放出の標準のアッセイによって検出することができる（たとえば、リガンドまたはプロモーターに応答した、化学走性、開口分泌（たとえば、エステラーゼ（たとえばセリンエステラーゼ）、パーフォリン、グランザイムなどの酵素の脱顆粒）またはメディエーターの放出（たとえば、ヒスタミン、ロイコトリエン）をモニターするアッセイ（たとえば、Ｔａｕｂ他（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：３８７７〜３８８８、Ｂａｇｇｌｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．およびＣ．Ａ．Ｄａｈｉｎｄｅｎ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１５：１２７〜１３３、ならびにそれらに引用される参考文献参照）。蛋白受容体に特徴的な機能は他の適切な方法によっても評価することができる。
【００８８】
本発明による方法を実証するため、十分な量の蛋白および十分な品質の蛋白をどちらも産生する細胞系を同定する目的のために、上述のスクリーニング方法を様々な細胞系で行った。
【実施例】
【００８９】
当業者は、日常的な実験しか用いることなく、本明細書中に記載の具体的な物質および手順の数々の均等物を理解する、またはそれを確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
【００９０】
実施例１
ヒトＦｃ蛋白アッセイハイスループットスクリーニング
１．抗Ａβ標準の調製
検量線バッファー（ＳＣＢ）は、２０ｕｌの培地Ｒ５ＣＤ１、ならびに２４ｍｌのアッセイバッファー（ＰＢＳｗ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および１％のウシ血清アルブミン）を、１６アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ、ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で混合することによって調製した。６ｕｌの３２．５ｍｇ／ｍｌの参照標準および６４４ｕｌのＳＣＢを用いて、０．３ｍｇ／ｍｌの中間標準を調製した（毎回新鮮なものを調製した）。１ｕｇ／ｍｌの標準を、２ｍｌの深ウェルプレートのＡ１と指定したウェルおよびさらにＨ１と指定したウェルに入れた。ウェルＡ１は１６個のアッセイプレートで６ｕｌの０．３ｍｇ／ｍｌの中間標準および１７９４ｕｌのＳＣＢを含んでいた。このプロセスをウェルＨ１で繰り返した。ウェル中の９００ｕｌの溶液を採り、１６個のアッセイプレートのそれぞれに９００ｕｌのＳＣＢを加えることによって段階希釈を調製した。希釈液は標準のウェル１個あたり５０ｕｌに分配された。
【００９１】
２．対照の調製
対照は１２０ｕｇ／ｍｌの中間対照の濃度が生じるように調製した。手短に述べると、６ｕｌの３２．５ｍｇ／ｍｌの参照標準および１６１９ｕｌの培地Ｒ５ＣＤ１を混合した。５ｕｌの１２０ｕｇ／ｍｌの中間対照および１９５ｕｌのアッセイバッファーを混合することによって１：４０の希釈液を調製し、２０ｕｌの１：４０の希釈対照および１８０ｕｌのアッセイバッファーを混合することによって１：４００の希釈液を調製した。８０ｕｌの１：４００の希釈対照を採り、２個のアッセイプレート毎に１６０ｕｌのアッセイバッファーを混合することによって、１：１２００希釈の希釈液を調製した。１：１２００の希釈液を、０．１の対照ウェルあたり５０ｕｌの量で分配した。
【００９２】
さらに、１５０ｕｌの１２０ｕｇ／ｍｌの中間対照（上記のように調製）を１３５０ｕｌの培地中に混合することによって、０．０１μｇ／ｍｌの対照を含む対照を調製した。５ｕｌの１２ｕｇ／ｍｌの中間対照を１９５ｕｌのアッセイバッファー中に混合することによって１：４０の希釈液を調製した。２０ｕｌの１：４０の希釈対照を１８０ｕｌのアッセイバッファー中に混合することによって１：４００の希釈液を調製し、８０ｕｌの１：４００の希釈対照を１６０ｕｌのアッセイバッファー／２個のアッセイプレート中に混合することによって１：１２００の希釈液を調製した。対照を、０．０１の対照ウェルあたり５０ｕｌのアリコートの１：１２００の希釈対照で分配した。
【００９３】
２．ＯＲＩタグ付けしたＦ（ａｂ’）２断片の調製
ＯＲＩタグ付けした抗ＦｃＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）の調製は、以下のプロトコルを用いて達成した。手短に述べると、５０μｌのＤＭＳＯを１個のバイアルのＯＲＩＴＡＧ  ＮＨＳエステル（ＢｉｏＶｅｒｉｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に加えた。バイアル底部のＯＲＩＴＡＧが溶けるまで、混合物を最大設定で渦攪拌した。その後、１６３８μｌのａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、５０μｌの溶けたＯＲＩＴＡＧ  ＮＨＳエステルに、１６３８ｕｌまで加えた。混合物を渦攪拌し、室温で６０分間、暗幕中でインキュベートした。バイアルは、インキュベーション中揺り子で回転させた。
【００９４】
２０μｌの２Ｍのグリシンを加えることによって反応を停止させ、チューブを箔で巻き、１０分間、室温でインキュベートした。インキュベーション中、ＰＢＳを含む２つのＰＤ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）カラムを０．１％のＮａＮ３で平衡化し、製造者のプロトコルに従って使用した。チューブ内の全容量を回収するために反応チューブを５秒間遠心分離した。その後、８５４ｕｌの反応物をそれぞれのＰＤ１０カラムに加えた。試料をカラムに添加し、最終的に０．５ｍｌのアリコートの８本のチューブのがそれぞれのカラムから回収された。
【００９５】
蛋白濃度はＢＣＡ蛋白アッセイキットによって決定した。さらに、第２の工程からの未標識の残りの抗体を、蛋白濃度を決定するための標準として用いた。蛋白試料の吸光度は４５５ｎｍで測定した。
【００９６】
適切な蛋白濃度および良好なＯＲＩ−ＴＡＧ：蛋白の比を有する画分をプールした。ウシ血清アルブミンを最終バイアルに加えて、１％のＢＳＡ溶液を作製した。バイアルは４０℃で保存した。
【００９７】
３．細胞系の試料の調製および反応
ＧＰ１ｂα、ＩＬ１３Ｒ、抗ＣＤ２２抗体、抗ルイスＹ抗体、抗Ａβ抗体、またはＴＮＦＲ融合蛋白を生成する細胞系由来の５ｕｌの試料および１９５ｕｌのアッセイバッファーを混合することによって、１：４０の希釈液を調製し、２０ｕｌの１：４０の希釈試料および１８０ｕｌのアッセイバッファーを混合することによって試料の１：４００の希釈液を調製した。最後に、７０ｕｌの１：４００の希釈試料を採り、試料を１４０ｕｌのアッセイバッファーと混合することによって、１：１２００の希釈液を調製した。この最終希釈液をそれぞれの試料ウェルに５０ｕｌで分配した。１：４００も、別のアッセイプレート中の試料ウェルに分配した。
【００９８】
タグ付けしたＦ（ａｂ’）２断片を、５３４４ｕｌのバッファー中に６ｕｌのＦ（ａｂ’）２断片を含む５３５０μｌのアリコートで、それぞれのアッセイプレートに分配した。５０ｕｌの溶液／ウェルであった。
【００９９】
プロテインＡビーズをＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から得た。ビーズは、５ｍｌのアッセイバッファー／プレート中に３０ｕｌの量で分配した。溶液は５０ｕｌの容量／ウェルで分配した。
【０１００】
すべての試薬および試料を以下のようにプレートに分配した。添加標準、対照、および試料を最初にウェルに添加した。その後、抗ＦｃＯＲＩタグ付けしたＦ（ａｂ’）２断片を添加した。最後に、プロテインＡビーズを添加した。
【０１０１】
混合物を２時間、室温で混合しながらインキュベートし、「ＦｃＨｕｍａｎ１５０」方法を用いてＭ８またはＭ３８４分析装置で読み取った。
【０１０２】
４．データ分析
実験に用いた標準許容指針は、標準点の繰り返し間の読取値のＣＶの、１０個の標準のうち少なくとも８個が約２０％であるべきとするものであった。さらに、対照許容指針は８０〜１２０％内でなければならない。また、試料許容指針は、試料の繰り返し間の読取値のＣＶが約２０％であることを要件とする。これらの範囲内に収まる読取値のみを考察した。
【０１０３】
５．結果
ＰＳＧＬに対するＦ（ａｂ’）２断片のルテニウムでの標識により、有意に高い信号対雑音比が示された（図２）。０．１μｇ／ｍｌおよび０．４μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２断片のデータを雑音に対して正規化し、棒グラフ上に配置した。Ｊａｃｋｓｏｎ１、Ｊａｃｋｓｏｎ２、Ｒｏｃｋｌａｎｄ１、およびＳｏｕｔｈｅｒｎ  ＢｉｏｔｅｃｈのＦ（ａｂ’）２断片は、ルテニウムで標識した際に信号対雑音比が増加していた（図２）。これらの実験は、抗ＣＤ２２に対するＦ（ａｂ’）２断片を用いて確認した（図３）。
【０１０４】
これらの結果は、Ｆｃ融合蛋白ＧＰ１ｂα、ＩＬ１３受容体、およびＴＮＦＲ融合蛋白に対するＦ（ａｂ’）２断片を利用した実験でさらに詳述する（図４）。プロットは、標的融合蛋白の濃度が増加するにつれて、Ｆ（ａｂ’）２断片を用いた蛋白の検出も増加したことを示す（図４）。Ｆｃ融合蛋白の代わりに抗ＧＤＦ８、抗ＣＤ２２、および抗ルイスＹ抗体を標的として用いても同様の結果が得られた（図５）。
【０１０５】
試料中の蛋白の量を同定するために標識したＦ（ａｂ’）２断片を用いて、力価スクリーニング方法をＨＰＬＣなどの標準のカラム手順に対して試験した。結果により、力価スクリーニング方法が、蛋白の力価を決定するＨＰＬＣクロマトグラフィーよりもはるかに速い速度であったことが示された（図６）。蛋白の量の読取値を得るために要した時間は、７００個を超えるまでの試料を分析した際に、ハイスループット力価スクリーニングと比較してＨＰＬＣを用いた場合に１０倍以上多かった（図６）。
【０１０６】
ハイスループットスクリーニングが標準のカラム手順よりも速いことに加えて、蛋白の量の決定においても正確である（図７、９、１０、および１１）。上記詳述したＨＰＬＣおよび力価スクリーニング手順を比較した際、抗ルイスＹ蛋白、ＰＳＧＬ、抗Ａβ、およびＴＮＦＲ融合蛋白でほぼ同一の力価量が同定された（図７、９、１０、および１１）。したがって、本明細書中に詳述した力価スクリーニングアッセイは、蛋白の量を決定することにおいて、標準のカラム技法よりも速く、類似の効率を有していた。
【０１０７】
上記で利用したハイスループットスクリーニングでは、適切な量の抗体を発現する細胞系を同定することができた（図８）。図８に示すように、ハイスループット力価スクリーニングにより、目的とする抗体の最も高い産生体の同定が可能となり、これはクローン１個あたりの力価（μｇ／ｍｌ）の増加によって示される。これらの実験では、最高力価のクローンを１と番号づけ、２番目に高い力価のクローンを２と番号づけ、以下同様にした。したがって、最高級のクローンがアッセイによって迅速に同定された。
【０１０８】
実施例２
ハイスループット精製および適切な細胞培養条件の同定
１．遠心分離を用いた蛋白の手動精製
細胞培養の開発の潜在的な開発を向上させるために、実施例１のハイスループット力価スクリーニング手順を以下に詳述するハイスループット精製手順と連結することができる。
【０１０９】
薄い樹脂は２０％のエタノール中で届けられた。さらに２０％のエタノール溶液を加えて、落ち着いた容量の５０％を構成した。溶液を十分に混合し、フィルタープレート（Ｗｈａｔｍａｎ  ７７００〜２８０４、ロングドリップ、２５ｕｍ、９６個のウェル×８００ｕＬ、Ｗｈａｔｍａｎ  ＬａｂＳｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｏｒａｎｇｅ）のウェルに２００ｕＬのアリコート／ウェルで分配した。フィルタープレートを空のマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ、ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上に積み重ね、３分間７００ｒｐｍ（約１０４Ｇに等しい）で遠心分離して（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ）２０％のエタノールを除去した。その後、２００ｕＬ／ウェルのＲＯＤＩ水を加え、空のマクロプレートを下に置いてプレートを３分間遠心分離した。このプロセスを２回繰り返した。
【０１１０】
洗浄バッファーを２００ｕＬのアリコート／ウェルで加えた。空のマイクロプレートを下に置いてプレートを３分間遠心分離した。このプロセスをさらに２回繰り返した。すべての試料が少なくとも１７０ｕｇ／ｍＬとなった際、同じ試料の組の力価がほぼ同じ範囲（＋／−２０％）となるように最小希釈を行った。試料は、最低濃度に近くなるように希釈した。１７０ｕｇ／ｍＬ未満の試料はすべて複数回添加した。複数回の添加が必要な場合、添加した蛋白の全質量が同じ範囲内（＋／−２０％）にあることを確認するだけのために試料を希釈した。複数回の添加を行う場合、必要な試料を最初に加え、空のウェルに２００ｕＬの洗浄バッファーを加えた。必要に応じてフィルタープレートを遠心分離した。
【０１１１】
すべての試料は、通常のように参照物質のスパイクおよび培地ブランクと共に添加した。試料を５００ｕＬの添加容量でプロテインＡ樹脂（プロテインＡ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加した。スパイク標準を試験試料の組全体に近い濃度で、培地中で調製した。スパイク物質および培地ブランクを５００ｕｌ／ウェルで添加した。
【０１１２】
樹脂を試料とマルチチャネルピペットを用いて混合することによって再懸濁させた。樹脂および試料を５〜１０分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を７００ｒｐｍで３分間遠心分離し、試料の流動物を深ウェルマイクロプレート（Ｗｈａｔｍａｎ  ７７１０〜５７５０、Ｗｈａｔｍａｎ  ＬａｂＳｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｏｒａｎｇｅ）に回収した。その後、２００ｕＬ／ウェルの洗浄バッファー（５ｍＭのトリス、２０、５０または１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、混合物を、空のマイクロプレートを下に置いて３分間遠心分離した。洗浄バッファーを２００ｕＬ／ウェルで加えた。空のマイクロプレートを下に置いて試料を３分間遠心分離した。その後、ＵＶ回収プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ、ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）に対して中和させるために４ｕＬのトリス（２．０Ｍのトリス、ｐＨ８．５、または１．０Ｍのトリス、ｐＨ８．５）を混合物に加えた後、溶出を行った。溶出バッファー（５０ｍＭのグリシン、２０または５０または１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５または３．０）を２００ｕＬの容量／ウェルでフィルタープレートに加えた。樹脂および溶出バッファーをマルチチャネルピペットで混合した。その後、下に回収プレートを置いてフィルタープレートを３分間遠心分離した。プレートをＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＡ２８０で読み取った。
【０１１３】
２．カラムクロマトグラフィーを用いた蛋白の品質の決定
ＣＥＸアッセイ：溶出液を５０ｕＬのアリコートで１００ｕＬのＣＥＸ移動相Ａを含むＡｇｉｌｅｎｔプレートに移した。溶液を混合した。標準の手順を用いてカラム精製手順を行った。
【０１１４】
ＳＥＣアッセイ：溶出液を３０ｕＬの容量でＡｇｉｌｅｎｔプレートに移した。溶液を混合した。標準の手順を用いてカラム精製手順を行った。
【０１１５】
ＨＩＣおよびシアル酸アッセイ：４μｌの２ＭのトリスをＵＶプレートに加え、ＵＶプレートに直接溶出させた。溶液を混合し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘプレートリーダーを用いてＡ２８０で読み取った。
【０１１６】
３．結果
上記技法を用いた試料のハイスループット精製により、プレート１個あたり９６個までの試料の迅速な精製が可能となった。この精製技法は、精製レベルを低下させずに試料の迅速な精製を生じた（図１２および１３）。それぞれの試料中に存在する高分子量蛋白の量によって決定されるように、ハイスループット精製技法は他の技法と同等の性能であった（図１２および１３）。具体的には、ハイスループット精製を標準のプロテインＡ精製と比較した場合である（図１２および１３）。
【０１１７】
さらに、高分子量蛋白の量を用いて、様々な細胞培養条件で増殖した細胞によって生成された蛋白の品質を決定した（図１４）。図１４に示すように、試験した様々な培地は精製後に異なる量の高分子量蛋白を示し、これは培地に依存していると考えられる。具体的には、特定の培地条件が、高分子量蛋白の量に関して他の培地と比較して統計的に有意な向上を示した（図１４、大きな矢印）。したがって、上記で利用した細胞培養法の開発手順では、下流の精製において向上した増殖の特徴を示した培地が同定された。
【０１１８】
均等物
当業者は、日常的な実験しか用いることなく、本明細書中に記載の具体的な組成物および手順の数々の均等物を理解する、またはそれを確認することができるであろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあるとみなされ、以下の特許請求の範囲にカバーされる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】細胞試料中の抗体の検出を示す、ハイスループット蛋白発現アッセイを表す図である。
【図２】ルテニウムとコンジュゲートした様々なＦ（ａｂ’）２断片を用いたシグナル対バックグラウンド比を示すハイスループットスクリーニングアッセイを表すグラフである。
【図３】ルテニウムとコンジュゲートした様々なＦ（ａｂ’）２断片を用いたシグナル対バックグラウンド比を示すハイスループットスクリーニングアッセイを表すグラフである。
【図４】様々な濃度のＧＰ１ｂα、ＩＬ１３受容体、およびＴＮＦＲ融合蛋白を検出するハイスループットスクリーニングアッセイの感度を示すプロットを表すグラフである。
【図５】様々な濃度の抗ＧＤＦ８、抗ＣＤ２２、および抗ルイスＹ抗体を検出するハイスループットスクリーニングアッセイの感度を示すプロットを表すグラフである。
【図６】ハイスループット力価スクリーニングアッセイおよびＨＰＬＣアッセイに必要なアッセイ時間を示すプロットを表すグラフである。
【図７】試料中のＴＮＦＲ融合蛋白のレベルを決定することにおける、ハイスループットスクリーニングアッセイとＨＰＬＣとの比較を示すグラフである。
【図８】ハイスループット力価スクリーニングアッセイによって決定された、クローン中の発現レベルを示すグラフである。
【図９】試料中の抗ルイスＹ抗体のレベルを決定することにおける、ハイスループットスクリーニングアッセイとＨＰＬＣとの比較を示すグラフである。
【図１０】試料中のＰＳＧＬおよびＧＰ１ｂαのレベルを決定することにおける、ハイスループットスクリーニングアッセイとＨＰＬＣとの比較を示すグラフである。
【図１１】試料中の抗Ａβのレベルを決定することにおける、ハイスループットスクリーニングアッセイとＨＰＬＣとの比較を示すグラフである。
【図１２】様々な精製手順を用いて精製した試料中に見つかる高分子量蛋白の割合を示すグラフである。
【図１３】様々な精製手順を用いて精製した試料中に見つかる高分子量蛋白の割合を示すグラフである。
【図１４】様々な条件で増殖させた様々な細胞系から単離した試料中に見つかる高分子量蛋白の量を示す棒グラフを表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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