(57)【要約】 医薬的に有効量のグルコース調節ペプチド(ＧＲＰ)及び促進剤の混合物を含む医薬製剤であって、メタボリック症候群の治療に用いられる医薬製剤が開示されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース調節ペプチド（ＧＲＰ）及び浸透促進剤を含み、ここで、前記促進剤が、可溶化剤、表面活性剤、１価のイオノゲン性バッファー及び増粘剤を含む、グルコース調節ペプチド（ＧＲＰ）の上皮送達用医薬製剤。
【請求項２】
前記促進剤が、ＧＲＰの透過性を少なくとも１０％増加させる、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記促進剤が、ＧＲＰの透過性を少なくとも１５倍増加させる、請求項１記載の製剤。
【請求項４】
前記促進剤が、ＧＲＰのバイオアベイラビリティを少なくとも約２５倍増加させる、請求項１記載の製剤。
【請求項５】
前記促進剤が、ＧＲＰのバイオアベイラビリティを少なくとも約５０倍増加させる、請求項１記載の製剤。
【請求項６】
前記促進剤が、ＧＲＰのバイオアベイラビリティが、皮下注射による送達に対して少なくとも約１％である、請求項１記載の製剤。
【請求項７】
前記促進剤が、ＧＲＰのバイオアベイラビリティが、皮下注射による送達に対して少なくとも約５％である、請求項１記載の製剤。
【請求項８】
前記促進剤が、ＧＲＰのバイオアベイラビリティが、皮下注射による送達に対して少なくとも約１０％である、請求項１記載の製剤。
【請求項９】
前記促進剤が、動物内の循環内での最高濃度に達する時間Ｔｍａｘが、約４５分未満である、請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
前記促進剤が、動物内の循環内での最高濃度に達する時間Ｔｍａｘが、約６０分を超える、請求項１記載の製剤。
【請求項１１】
前記促進剤が、動物内の循環内での最高濃度に達する時間Ｔｍａｘが、約３０分未満である、請求項１記載の製剤。
【請求項１２】
キレート剤を更に含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１３】
前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸及びエチレングリコール四酢酸から成る群から選択される、請求項１２記載の製剤。
【請求項１４】
前記可溶化剤が、シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン及びメチル-β-シクロデキストリンから成る群から選択される、請求項１記載の製剤。
【請求項１５】
前記可溶化剤が、メチル-β-シクロデキストリンである、請求項１４記載の製剤。
【請求項１６】
前記表面活性剤が、非イオン性ポリオキシエチレンエーテル、フシジン酸及びその誘導体、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム、Ｌ-α- ホスファチジルコリンジデカノイル、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、セチルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ラノリンアルコール並びにソルビタンモノオレエートから成る群から選択される、請求項１記載の製剤。
【請求項１７】
前記表面活性剤が、Ｌ-α- ホスファチジルコリンジデカノイルである、請求項１６記載の製剤。
【請求項１８】
ＧＲＰ、メチル-β-シクロデキストリン及びＬ-α- ホスファチジルコリンジデカノイルを含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１９】
前記ＧＲＰが、約５０ ｍｇ/ｍＬを超える濃度で存在する、請求項１記載の製剤。
【請求項２０】
前記ＧＲＰが、約０.１ないし約５０ ｍｇ/ｍＬの濃度で存在する、請求項１記載の製剤。
【請求項２１】
前記ＧＲＰが、約０.２５ないし約１０ ｍｇ/ｍＬの濃度で存在する、請求項１記載の製剤。
【請求項２２】
前記ＧＲＰが、ＧＬＰ-１から成る、請求項１記載の製剤。
【請求項２３】
前記ＧＲＰが、エキセンディン-４から成る、請求項１記載の製剤。
【請求項２４】
前記ＧＲＰ誘導体が、疎水性部分に共有結合したＧＲＰを含む、請求項２２又は２３記載の製剤。
【請求項２５】
前記疎水性部分がアルキル鎖を含む、請求項２４記載の製剤。
【請求項２６】
前記疎水性部分が脂肪酸鎖を含む、請求項２４記載の製剤。
【請求項２７】
前記製剤が、非無菌製剤である、請求項１記載の製剤。
【請求項２８】
クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、フェノール、並びにオルト-、メタ-又はパラ-クレゾールから成る群から選択される保存剤を更に含む、請求項２７記載の製剤。
【請求項２９】
前記製剤が、無菌製剤である、請求項１記載の製剤。
【請求項３０】
ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ阻害剤を更に含む、請求項２２記載の製剤。
【請求項３１】
前記ＤＰＰ ＩＶ阻害剤が、ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドである、請求項３０記載の製剤。
【請求項３２】
前記ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドが、少なくとも約５ ｍＭの濃度にある、請求項３１記載の製剤。
【請求項３３】
前記ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドが、少なくとも約３０ ｍＭの濃度にある、請求項３１記載の製剤。
【請求項３４】
前記ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドが、少なくとも約５０ ｍＭの濃度にある、請求項３１記載の製剤。
【請求項３５】
前記製剤が、ＧＬＰ-１の鼻腔内送達に適している、請求項１記載の製剤。
【請求項３６】
前記製剤が、約３ないし約６のｐＨを有する、請求項１記載の製剤。
【請求項３７】
前記製剤が、３.５ ± ０.５０のｐＨを有する、請求項１記載の製剤。
【請求項３８】
ＧＬＰ-１、４５ ｍｇ/ｍｌのメチル-β-シクロデキストリン、１ ｍｇ/ｍｌのＬ-α- ホスファチジルコリンジデカノイル、及び１ ｍｇ/ｍｌのＥＤＴＡを含む、請求項１記載の製剤。
【請求項３９】
哺乳動物内でのメタボリック症候群の治療用薬物であって、ここで、前記薬物が、請求項１ないし３８いずれか１項に記載の製剤を含み、かつ、このような薬物が、医薬的に有効量のＧＲＰを含む、薬物の製造におけるＧＲＰの使用。
【請求項４０】
哺乳動物への前記薬物の上皮投与が、血漿インシュリン濃度を上昇させる、請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
哺乳動物への前記薬物の上皮投与が、血中グルコース濃度を低下させる、請求項３９記載の使用。
【請求項４２】
哺乳動物への前記薬物の上皮投与が、胃排出を遅延させる、請求項３９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
グルコース調節ペプチド（「ＧＲＰ」）は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、妊娠糖尿病、又はインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療、肥満症の治療及び異常脂質血症の治療において治療可能性を有するペプチドの種類である。米国特許第６,５０６,７２４号、米国特許出願公開第２００３００３６５０４Ａ１号、欧州特許第１０８３９２４Ｂ１号、国際公開第９８／３０２３１Ａ１号、及び国際公開第００／７３３３１Ａ２号を参照のこと。これらのＧＲＰは、例えば、ＧＬＰ−Ｉ等のグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、エクセナチドとしても公知のエクセンディン、特にエクセンディン−４、並びにアミリンペプチド及びプラムリンチドのようなアミリン類似体を含む。しかしながら、今日まで、これらのペプチドは、注射によってのみヒトに投与されている。
【０００２】
注射による薬物投与の主な不利点は、多くの場合、薬物を投与するために、訓練を受けた人材が必要とされることである。さらに、訓練を受けた人材は、注射により薬物を投与する際、危険にさらされる。自己投与薬物については、多くの患者が、定期的に自身で注射したがらず、又は注射することができない。注射はまた、感染リスクの増加を伴う。薬物注射の他の不利点としては、個人間の送達結果のばらつき、並びに薬効の強度及び持続時間が予測不可能であることが挙げられる。
【０００３】
経口投与を代替手段として利用可能である。しかしながら、特定の治療薬は、この経路により投与された場合、肝臓の初回通過代謝及び消化管内での分解により、作用中非常に低いバイオアベイラビリティ及びかなりの時間遅延を示す。このように、注射及び又は経口投与以外のＧＲＰ投与方法を開発する必要がある。
【０００４】
治療化合物の粘膜投与は、例えば、簡便性及び送達速度の点で、並びにコンプライアンス問題及び送達に伴う副作用を減少又は排除することから、注射及び他の投与方法を超える確実な利点を提供する。しかしながら、生理活性物質の粘膜送達は、粘膜障壁機能及び他の要因により制限される。上皮細胞は粘膜障壁を構成し、外部環境と粘膜組織及び粘膜下組織、並びに細胞外区画との間の重要な界面を提供する。粘膜上皮細胞の最も重要な機能の１つは、粘膜浸透性を決定且つ制御することである。この状況において、上皮細胞は、異なる生理学的区画間に選択的透過障壁を生成する。選択的透過性は、細胞質を通じた分子の輸送（経細胞経路）及び細胞間空間の透過性（傍細胞経路）を制御した結果である。
【０００５】
上皮細胞間の細胞間結合は、上皮性障壁機能及び細胞間接着の維持及び制御の両方に関与することが公知である。上皮及び内皮細胞の密着結合（ＴＪ）は、傍細胞経路の透過性を制御する細胞間結合のために特に重要であり、また細胞表面を頂端区画と側底区画に分割する。密着結合は、上皮細胞間に連続した環状の細胞間接触を形成し、水、溶質及び免疫細胞の傍細胞移動に対する調節用の障壁を形成する。それらはまた、膜の頂端及び側底ドメイン間の膜脂質の交換を制限することにより細胞極性に寄与する、第２の種類の障壁も提供する。
【０００６】
薬物送達の状況では、送達促進剤の助けを借りない、薬物が粘膜面の上皮細胞層を透過する能力は、分子の大きさ、脂質溶解性及びイオン化を含む多くの因子に関連すると思われる。一般に、約３００ないし１０００ダルトン未満の小さな分子は、多くの場合粘膜障壁を透過することができるが、分子が大きくなるにつれて、透過性は急速に低下する。経皮的薬物送達により、皮膚の上皮細胞層を通じて大きな分子が透過することが可能になる。皮膚貼付のような経皮投与は、より大きな高分子薬物のための別の代替送達経路である。しかしながら、経皮的送達は依然として、注射よりもさらに大きさが制限される場合がある。これらの理由のため、粘膜及び上皮薬物投与は、通常注射による投与よりも大量の薬物を必要とする。大分子の薬物を含む他の治療化合物は、粘膜送達に対して抵抗性であることが多い。固有の低い透過性に加えて、大きな高分子薬物は、制限された拡散、並びに内腔及び細胞による酵素分解、並びに粘膜部での急速なクリアランスにさらされ易い。従って、これらの大きな分子を治療的に有効な量送達するために、細胞透過性促進剤を必要として、これらの粘膜及び皮膚表面を超える通過、及び標的組織で速やかに作用することができる体循環への通過を補助する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ラットにおける、エクセナチド（ＳＱ）及び生理食塩水対照（ＩＮ）と比較した、ＧＬＰ−Ｉの投与後の血中グルコース濃度（内因性グルコースに対して補正した）の減少
【図２】ラットにおける、ＧＬＰ−Ｉの経鼻投与後のインスリン反応
【図３】ラットにおける、ＧＬＰ−Ｉの経鼻投与後の胃内容排出
【図４】ウサギにおける、ＩＮ対照及びＩＶと比較した、２×促進剤をＩＮで、２×促進剤＋ゼラチンをＩＮで、及び１×促進剤＋ゼラチンをＩＮで投与したエクセンディン−４の増強された薬物動態
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明の１の局面には、肥満及び糖尿病を含む人の疾患の治療のために、上皮表面を横断して、ＧＲＰ、ＧＲＰ類似体、ＧＲＰの断片、及びＧＲＰの機能的誘導体を送達させるための医薬製剤の治療上の有用性を含む。
【０００９】
本発明は、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、妊娠糖尿病又はインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、異常脂質血症、高血糖症、肥満を治療するために、個体の満腹中枢を促して、個体の体重減少を促進するＧＬＰ及びＧＬＰ類似体、アミリン又はアミリン類似体、並びにエキセンディン（ｅｘｅｎｄｉｎ）又はエキセンディン類似体のようなＧＲＰの経上皮、特に経粘膜の送達用の新規で効果的な方法、使用、及び組成物を提供することにより先に記載した需要を満たし、さらに付加的な対象や便益を満足させる。
【００１０】
代表的な態様では、本発明の促進された送達方法及び組成物は、対象哺乳動物中の肥満及び摂食障害の予防又は治療のために、ＧＲＰアゴニストを生体細胞の層を横断させる治療上有効な送達法を提供する。本発明の１の局面では、治療上有効量のＧＲＰ及び１又は２種類以上の本明細書に記載される経上皮送達促進剤を含む、経上皮投与に適した医薬製剤が提供され、この製剤は、対象哺乳動物の肥満又は摂食障害の発症又は進行を予防するための本発明の上皮送達方法において有用である。治療上有効量のＧＲＰアゴニスト及び１又は２種類以上の上皮送達促進剤の経上皮送達により、対象内でＧＲＰアゴニストの高い治療用濃度が生み出される。
【００１１】
本発明の促進された送達方法及び組成物は、対象哺乳動物の種々の疾患及び状態の予防又は治療用のＧＲＰの治療上有効な送達を提供する。ＧＲＰは、種々の上皮経路を介して投与することが可能であり、例えば、ＧＲＰを鼻腔内粘膜上皮、気管支又は肺の粘膜上皮、口腔内の頬の表面、口腔及び小腸の粘膜表面、又は表皮表面に接触させることにより投与できる。代表的な態様では、方法と組成物は、鼻腔内送達を対象とするか、又は鼻腔内送達用に製剤される（例えば、鼻粘膜送達又は鼻腔内粘膜送達）。
【００１２】
前述の本発明のＧＲＰ製剤並びに調製方法及び送達方法は、対象哺乳動物へのＧＲＰの上皮送達を向上させる。これらの組成物及び方法は、組合せ製剤又は１若しくは２種類以上のＧＲＰを１又は２種類以上の上皮送達促進剤と共に同時投与することを含む場合がある。上記の製剤及び方法を達成するために選択されるべき上皮送達促進剤には、（Ａ）溶解剤；（Ｂ）電荷修飾剤；（Ｃ）ｐＨ調節剤；（Ｄ）分解酵素阻害剤；（Ｅ）粘液溶解剤又は粘膜除去剤；（Ｆ）繊毛静止剤（ｃｉｌｉｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）；（Ｇ）膜透過促進剤（例えば、（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉｉ）リン脂質若しくは脂肪酸である添加物、混合ミセル、リポソーム若しくは担体、（ｉｖ）アルコール、（ｖ）エナミン、（ｉｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉｉ）低分子疎水性透過促進剤；（ｉｘ）ナトリウム若しくはサリチル酸誘導体；（ｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘｉ）シクロデキストリン若しくはβ-シクロデキストリン誘導体、（ｘｉｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉｉ）キレート剤、（ｘｉｖ）アミノ酸若しくはその塩、（ｘｖ）Ｎ-アセチルアミノ酸若しくはその塩、（ｘｖｉ）選択された膜成分に対する酵素分解剤、（ｘｖｉｉ）脂肪酸合成の阻害剤、（ｘｖｉｉｉ）コレステロール合成の阻害剤；又は、（ｘｉｖ）（ｉ）-（ｘｖｉｉｉ）のいずれかの膜透過促進剤の組み合わせ）；（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）刺激剤、キトサン及びキトサン誘導体のような上皮ジャンクション生理機能の調節剤；（Ｉ）血管拡張剤；（Ｊ）選択的輸送促進剤；並びに（Ｋ）促進された上皮送達用の活性薬剤を安定化させるための安定化送達媒体、担体、支持体、又はＧＲＰが効果的に配合され、抱合され、包含され、封入されるか若しくは結合された錯体形成種（ｃｏｍｐｌｅｘ-ｆｏｒｍｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅ）、がある。
【００１３】
本発明の種々の態様において、ＧＲＰは、上記の(Ａ)-(Ｋ)に列挙される上皮送達促進剤の１、２、３、４又は５種類以上と組み合される。これらの上皮送達促進剤は、単独で若しくは他と一緒にＧＲＰと混合されるか、又は、これらと共に医薬的に許容可能な製剤若しくは送達媒体中に配合される。本明細書の教示に従ってＧＲＰを１又は２種類以上の上皮送達促進剤と製剤すること（任意に、上記の(Ａ)-(Ｋ)から選択される２又は３種類以上の上皮送達促進剤のいずれかの組み合わせを含んでいてもよい）により、対象哺乳動物の上皮表面にこれら製剤を送達させた後に、グルコース調節結合ペプチド（ｇｌｕｃｏｓｅ-ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）のバイオアベイラビリティの増大が提供される。製剤に上皮送達促進剤を添加することに加え、疎水性基の添加等によるＧＲＰの修飾を用いてペプチドのバイオアベイラビリティに作用を及ぼすこともできる。
【００１４】
従って、本発明は、ＧＲＰを含む製剤を経上皮投与することを含む、哺乳動物内で食欲を抑制し、体重減少を促進し、食物摂取量を減少させ、肥満及び/又は糖尿病を治療する方法である。
【００１５】
本発明は更に、哺乳動物内で、高血糖症, 糖尿病, メタボリック症候群, 異常脂質血症を治療し、食欲を抑制し、体重減少を促進し、食物摂取量を減少させるか、又は肥満を治療するためのＧＲＰの経上皮投与用の医薬の製造におけるＧＲＰの使用を提供する。
【００１６】
本発明の医薬製剤について、ＧＲＰの粘膜において有効な投与量は、例えば、体重１ ｋｇ当たり約０.００１ ｐｍｏｌないし約１００ ｐｍｏｌ、体重１ ｋｇ当たり約０.０１ ｐｍｏｌないし約１０ ｐｍｏｌ、又は体重１ ｋｇ当たり約０.１ ｐｍｏｌないし約 ５ ｐｍｏｌである。更なる代表的な態様では、ＧＲＰの投与量は、体重１ ｋｇ当たり約 ０.５ ｐｍｏｌないし約１.０ ｐｍｏｌである。好ましい態様においては、鼻腔内投与での投与量は、０.１ - １００ μｇ/ｋｇ、又は約７ - ７０００ μｇ、より好ましくは０.５ - ３０ μｇ/ｋｇ、又は３５ないし２１００ μｇの範囲内で変化する。鼻腔内投与用ＧＲＰのより具体的な投与量には、２０ μｇ、５０ μｇ、１００ μｇ、１５０ μｇ、２００ μｇないし４００ μｇ、５００ μｇ、８００ないし１０００ μｇ及び１２００ないし１８００ μｇが含まれる。本発明の医薬製剤は、１週間ないし少なくとも９６週間、又は個々の患者若しくは対象の生涯に亘って、１日に１又は２回以上、又は週に３回若しくは週に１回投与することができる。特定の態様では、本発明の医薬製剤は、毎日１若しくは２回以上、毎日２回、毎日４回、毎日６回、又は毎日８回以上投与される。
【００１７】
鼻粘膜表面を含む細胞層内へ又は細胞層間のＧＲＰ送達を促進する上皮送達促進剤が用いられる。受動的に吸収される薬物については、薬物輸送への傍細胞及び経細胞経路の相対寄与率は、ｐＫａ、分配係数、分子半径及び該薬物の電荷、薬物が送達される管腔環境のｐＨ、並びに吸収面積に依存する。本発明の上皮送達促進剤は、ｐＨ調節剤であってもよい。本発明の医薬製剤のｐＨは、薬物輸送への傍細胞及び経細胞経路を介してＧＲＰの吸収に影響を及ぼす因子である。１の態様において、本発明の医薬製剤は、ｐＨが、約ｐＨ ２ないし８へと調整される。更なる態様では、本発明の医薬製剤は、ｐＨが、約ｐＨ ３.０ないし６.０へと調整される。更なる態様では、本発明の医薬製剤は、ｐＨが、約ｐＨ ３.５ないし５.５へと調整される。一般的には、ｐＨは４.５ ± ０.５である。
【００１８】
上述した通り、本発明は、種々の疾患及び状態の治療又は予防のために対象哺乳動物へＧＲＰを上皮送達するための改善された方法及び組成物を提供する。本発明の方法に係る治療及び予防を施すための適切な対象哺乳動物の例には、以下に限定されないが、ヒト及び非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜種、並びにイヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、及びウサギを含む研究用種及びペット種が含まれる。
【００１９】
本発明をより一層よく理解して貰うため、以下の定義を提示する：
【００２０】
グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）
本発明には、ＧＬＰタンパク質及びペプチドの類似体、断片、模倣体、及び機能的誘導体が含まれる。インクレチンは腸由来のホルモンであり、栄養摂取に応じて（グルコース依存的に）インシュリン分泌を促す。２種類の天然インクレチンには、グルコース依存的インシュリン分泌性ペプチド（ＧＰ）及びグルカゴン様ペプチド-１（ＧＬＰ-１）が含まれる。ＧＬＰ-１は、食物に応じて腸内の細胞から放出される。ＧＬＰ-１は、膵臓のβ細胞上のＧＬＰ-１レセプターに結合して、インシュリンの放出を刺激する。プログルカゴン［７８-１０７］としても知られ、最も一般的には「ＧＬＰ-１」として知られるＧＬＰ-１［７-３６］ＮＨ２は、インシュリン分泌促進作用を示し、インシュリン分泌を促す；また、ＧＬＰ-１は、グルカゴン分泌を阻害する［Ｏｒｓｋｏｖ, ｅｔ ａｌ, Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２:６５８-６１, １９９３; Ｄ'Ａｌｅｓｓｉｏ, ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｉｎｖｅｓｔ. Ｐ７:１３３-３８, １９９６］。また、ＧＬＰ-１は、胃排出［Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｂ., ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ. ８１:(?):３２７-３２, １９９６; Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ Ａ., ｅｔ ａｌ., Ｄｉｇ. Ｄｉｓ. ＳｃＬ ３Ｓ:(４):６６５-７３, １９９３］及び胃酸分泌を阻害することが報告されている。［Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒ Ｂ.Ｔ., ｅｔ ａｌ., Ｄｉｇ. Ｄｉｓ. ＳｃＬ ３４(５):７０３-８, １９８９; Ｏ'Ｈａｌｌｏｒａｎ Ｄ.Ｊ., ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １２６(１): １６９-７３, １９９０; Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ Ａ., ｅｔ ａｌ., Ｄｉｇ. Ｄｉｓ. ＳｃＬ ３Ｓ:(４):６６５-７３, １９９３］。そのカルボキシ末端に追加的なグリシン残基を有するＧＬＰ-１［７-３７］も、ヒトにおいてインシュリンの分泌を促す［Ｏｒｓｋｏｖ, ｅｔ ａｌ., Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２:６５８-６１, １９９３］。ＧＬＰ-１のインシュリン分泌促進作用に応答性を示すと考えられている膜貫通型Ｇタンパク質アデニル酸シクラーゼ結合タンパク質が、β細胞のセルラインからクローニングされたことが報告されている［Ｔｈｏｒｅｎｓ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. ＳｃＬ ＵＳＡ ５９:８６４１-４５, １９９２］。
【００２１】
ＧＬＰ-１の治療用途への主たる制限は、広範囲に分布する酵素ジペプチジルペプチダーゼ-ＩＶ（ＤＰＰ-ＩＶ）によるその迅速な分解にある。ＤＰＰ-ＩＶ阻害剤（ＬＡＦ２３７；ＭＫ-０４３１）の使用により、内在性のＧＬＰ-１の活性時間が向上している。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、口腔内でのＤＰＰ-ＩＶ阻害剤である、Ｍｅｒｃｋ & Ｃｏ.社のＪＡＮＵＶＩＡ（商標）（リン酸シタグリプチン(ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ)）を承認し、米国内では２型糖尿病の治療用に入手可能になっている。米国特許出願第２００６０２３４９４０号には、ＤＰＰ-ＩＶ及びＤＰＰ-ＩＶ様酵素の２次的結合部位に結合可能な化合物並びに少なくとも一種類の抗糖尿病薬を同時投与することを含む、哺乳動物内での代謝疾患の治療方法が記載されている。
【００２２】
インクレチン模倣体は、ＧＬＰ-１のような天然のヒトインクレチンホルモンの抗糖尿病作用又はグルコース低下作用を模倣する薬物のクラスである。インクレチン模倣体の作用には、血中糖濃度の上昇に応答してインシュリンを生産する身体能力の刺激、グルカゴンホルモンの放出の阻害、血流内への栄養吸収の遅延、胃排出速度の減少、満腹中枢の促進及び食物摂取量の低下が含まれる。インクレチン模倣体は、２型糖尿病の治療に用いるために開発され、以下を含む：ＧＬＰ-１ 誘導体（リラグルチド(Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ)及びＣＪＣ-１１３１）及びエキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）。ＣＪＣ-１１３１（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ、モントリオール、カナダ）は、血清アルブミンへの共有結合を可能にする反応性リンカーを有しており、これによってＤＰＰ-ＩＶ分解に対する耐性が向上する。リラグルチド（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、コペンハーゲン、デンマーク）は、ＧＬＰ-１誘導体であり、脂肪酸鎖を用いてアシル化することによりＤＰＰ-ＩＶの分解作用を克服するよう設計されている。リラグルチドの構造は、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ ｌｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ, Ｖｏｌ. １７, Ｎｏ. ２ (２００３)に示されている。
【００２３】
本発明には、ペプチドへの脂肪酸等の疎水性基の付加によるＧＲＰの修飾も含まれる。望ましい薬物動態特性を有するＧＲＰの修飾誘導体の更なる例は、Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｅｄ. Ｃｈｅｍ. ４３:１６６４- １６６９, ２０００に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。これらのＧＬＰ-１化合物は、血清アルブミンへの結合を促進することによってその作用を長持ちさせるために、脂肪酸を用いて誘導体化された。以下の親ペプチドとアシル置換が、記載されている：Ｋ８Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｋ１８Ｒ２６'３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ１８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｋ２３Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２３：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｋ２７Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２７：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｒ２６-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ３４：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｋ３６Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ３６：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６,３４：ビス-Ｃ１６-二酸）；ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６,３４：ビス-γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６,３４：ビス-γ-Ｇｌｕ-Ｃ１４；ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６,３４：ビス-Ｃ１２-二酸）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：Ｃ１６-二酸）；Ｒ３４ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：Ｃ１４-二酸）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１８）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１４）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１２）；デスアミノ-Ｈ７Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：ＧＡＢＡ-Ｃ１６）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：β-Ａｌａ-Ｃ１６）；Ｒ３４-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ２６：イソ-Ｎｉｐ-Ｃ１６）；デスアミノ-Ｈ７Ｒ２６-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ３４：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；デスアミノ-Ｈ７Ｒ２６-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ３４：Ｃ８）；デスアミノ-Ｈ７Ｒ２６-ＧＬＰ-１（７-３７）（Ｋ３４：γ-Ｇｌｕ-Ｃ８）；Ｋ３６,３４-ＧＬＰ-１（７-３６）（Ｋ３６：Ｃ２０-二酸）；Ｋ３６,３４-ＧＬＰ-１（７-３６）（Ｋ３６：Ｃ１６-二酸）；Ｋ３６,３４-ＧＬＰ-１（７-３６）（Ｋ３６：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１８）；Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：Ｃ１６-二酸）；Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：Ｃ１２-二酸）；Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１８）；Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：ｙ-Ｇｌｕ-Ｃ１４）；Ｃ８Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｅ３７Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；Ｅ３７Ｃ８Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１６）；及びＥ３７Ｃ８Ｒ２６,３４-ＧＬＰ-１（７-３８）（Ｋ３８：γ-Ｇｌｕ-Ｃ１８）。
【００２４】
ＧＬＰ-１のアミノ酸配列は、とりわけＳｃｈｍｉｄｔ, ｅｔ ａｌ., Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２８:７０４- ７０７, １９８５に提示されている。ヒトＧＬＰ-１は、３７アミノ酸残基から成るペプチドであり、回腸末端、膵臓及び脳内のＬ細胞内で合成されるプレプログルカゴン（ｐｒｅｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）に由来する。プレプログルカゴンのＧＬＰ-１（７-３６）アミド、ＧＬＰ-１（７-３７）及びＧＬＰ-２へのプロセッシングは、主としてＬ細胞内で起こる。近年において、ＧＬＰ-１（７-３７）及びその類似体の興味深い薬理学的特性が多くの注目を集めたものの、これらの分子の構造は殆ど解明されていない。ミセル中のＧＬＰ-１の２次構造が、Ｔｈｏｒｔｏｎ, ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３:３５３２-３５３９, １９９４)に記載されているが、通常の溶液内では、ＧＬＰ-１は、非常にフレキシブルな分子であると考えられている。
【００２５】
ＧＬＰ-１及びＧＬＰ-１類似体並びにこれらの断片は、とりわけ１型及び２型糖尿病並びに肥満の治療に有用である。Ｈｏｉｓｔ, Ｊ., Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ. Ｅｍｅｒｇ. Ｄｒｕｇｓ ９(１):１５５-１６１, ２００４; Ｒｏｌｉｎ, Ｒ., ｅｔ ａｌ., Ａｍ. Ｊ. Ｐｈｙｓｉｏｌ. Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ. Ｍｅｔａｂ. ２５３:Ｅ７４５-Ｅ７５２, ２００２; Ｄｅａｃｏｎ, Ｃ, Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３:２１８１-２１８７, ２００４; Ｐｅｒｒｙ, Ｔ., ｅｔ ａｌ., Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. ＳｃＬ ２４(７):３７７-３８３, ２００３; ＨｏＩｚ, Ｇ., ｅｔ ａｌ., Ｃｕｒｒ. Ｍｅｄ. Ｃｈｅｍ. １０(２２):２４７１-２４８１, ２００３; Ｎａｓｌｕｎｄ, Ｋ, ｅｔ ａｌ., Ｒｅｇｕｌ. Ｐｅｐｔ. ７０６:８９-９５, ２００２; 国際特許出願ＷＯ ８７/０６９４１; ＷＯ ９０/１１２９６; ＷＯ ９１/１１４５７; 欧州特許ＥＰ ０７０８１７９-Ａ２及びＥＰ ０６９９６８６-Ａ２に記載されるＧＬＰ-１類似体、ＧＬＰ-１断片及びＧＬＰ-１の機能的誘導体は、参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【００２６】
ＷＯ ８７/０６９４１には、ＧＬＰ-１（７-３７）を含むＧＬＰ-１断片及びその機能的誘導体、並びにインシュリン分泌剤としてのこれらの使用法が開示されている。
【００２７】
ＷＯ ９０/１１２９６には、ＧＬＰ-１（１-３６）又はＧＬＰ-１（１-３７）のインシュリン分泌促進作用を上回るインシュリン分泌促進作用を有するＧＬＰ-１（７-３７）を含むＧＬＰ-１断片及びその機能的誘導体、並びにインシュリン分泌剤としてのこれらの使用法が開示されている。
【００２８】
ＷＯ ９１/１１４５７には、ＧＬＰ-１部分としても有用であろう、活性なＧＬＰ-１ペプチド７-３４、７-３５、７-３６、及び７-３７の類似体が開示されている。
【００２９】
ＥＰ ０７０８１７９-Ａ２（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ & Ｃｏ.）には、Ｎ末端イミダゾール基を含み、随意に第３４番目の位置のリジン残基に付加された非分枝Ｃ６-Ｃ１０アシル基を含んでいてもよいＧＬＰ-１類似体及び誘導体が開示されている。
【００３０】
ＥＰ ０６９９６８６- Ａ２（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ & Ｃｏ.）には、生物活性を有すると報告されているＧＬＰ-１の特定のＮ末端側切断型断片が開示されている。
【００３１】
ＧＬＰ-１（１-３７）のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＤＥＦＥＲＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ (配列番号１)。
【００３２】
ＧＬＰ-１（７-３７）のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ (配列番号２)。
【００３３】
ＧＬＰ-１（７-３６）のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ (配列番号３)。
【００３４】
ＧＬＰ-１（７-３４）のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫ (配列番号４)。
【００３５】
ＧＬＰ-１（９-３６）のアミノ酸配列は以下の通り：
ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ (配列番号５)。
【００３６】
以下に列挙するＧＬＰ-１類似体は、向上したＤＰＰ-ＩＶ耐性を有する。
【００３７】
ＧＬＰ-１類似体ＧＧのアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ (配列番号６)。
【００３８】
ＧＬＰ-１類似体ＧＧ１のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＰＳＳ (配列番号７)。
【００３９】
ＧＬＰ-１類似体ＧＧ２のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＰＳＳＧＡＰ (配列番号８)。
【００４０】
ＧＬＰ-１類似体ＧＧ３のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＰＳＳＧＡＰＰＰＳ (配列番号９)。
【００４１】
ＧＬＰ-１類似体ＧＬＰ-１ ＥＴのアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ (配列番号１０)。
【００４２】
ＧＬＰ-１合成類似体ＮＮ２２１１のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ*ＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ (配列番号１１)、配列中、アミノ酸鎖の第２６番目の位置にあるＫ*は、ヘキサデカノイル側鎖（即ち、Ｋ-Ｎ-ε-(γ-Ｇｌｕ (Ｎ-α-ヘキサデカノイル))）を作り出すためにアシル化による修飾を受けている。
【００４３】
ＧＬＰ-１合成類似体ＣＪＣ-１１３１のアミノ酸配列は以下の通り：
ＨＡ*ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＫ* (配列番号１２)、配列中、アミノ酸鎖の第８番目の位置にあるＡ*は、Ｌ-アラニンが置換されたＤ-アラニンであり、アミノ酸鎖の第３７番目の位置にあるＫ*は、そのεアミノ基に［２-［２-［２-マレイミドプロピオンアミド(エトキシ)エトキシ］アセトアミドリンカーを有する。
【００４４】
ＧＬＰ-１合成類似体ＬＹ３１５９０２のアミノ酸配列は以下の通り：
ｄｅｓ-ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫ*ＧＲＧ (配列番号１３)、配列中、Ｎ末端（ｄｅｓ-Ｈ）のヒスチジン残基は、アミノ基を含まず、アミノ酸鎖の第３４番目の位置にあるＫ*は、オクタノイル側鎖（即ち、Ｋ-(オクタノイル)）を作り出すためにアシル化による修飾を受けている。
【００４５】
本発明によれば、ＧＬＰ-１には、遊離塩基、ペプチドの酸付加塩又はカリウム塩もしくはナトリウム塩といった金属塩、並びにアミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化及び他によく知られる共有結合的修飾法といったプロセスによって修飾されたＧＬＰ-１ペプチドも含まれる。
【００４６】
エキセンディン及びエキセンディンアゴニスト
本発明には、エキセンディンタンパク質及びペプチドの類似体、断片、及び機能的誘導体が含まれる。エキセンディンは、最初に、アリゾナ州で発見されたトカゲであるアメリカドクトカゲ、及びメキシコドクトカゲの唾液分泌物から単離されたペプチドである。エキセンディン-３は、ヘロデルマホリダム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｈｏｒｒｉｄｕｍ）の唾液分泌物中に存在し、エキセンディン-４は、ヘロダルマサスペクタム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液分泌物中に存在する［Ｅｎｇ, Ｊ., ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６５:２０２５９-６２, １９９０; Ｅｎｇ., Ｊ., ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６７:７４０２-０５, １９９２］。エキセンディンは、グルカゴン様ペプチドファミリーの複数のメンバーとある程度の配列類似性を示し、インクレチンホルモンＧＬＰ-１［７-３６］ＮＨ２に対しては、最も高い５３％のホモロジーを示す［Ｇｏｋｅ, ｅｔ ａｌ, Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６８:１９６５０- ５５, １９９３］。
【００４７】
合成エキセンディン-４の一般名称は、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）である[ＷＨＯ Ｄｒｕｇ ｌｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ, Ｖｏｌ. １８, Ｎｏ. １, ２００４]。エキセナチドは、合成エキセンディン-４である。エキセナチドは、ＧＬＰ-１の効果を反映するものであるが、そのＤＰＰ-ＩＶ分解に対する耐性のため、より効力が強い。ＢＹＥＴＴＡ（登録商標）は、エキセナチドの市販版（Ａｍｙｌｉｎ & Ｌｉｌｌｙ）である。米国ＦＤＡは、２型糖尿病において、血糖コントロールを達成するために、メトホルミン及び/又はスルホニル尿素の経口投与による治療では十分でない場合の補助的療法としてＢＹＥＴＴＡ（エキセナチド）の注射を承認した。血糖コントロールの向上に加え、エキセナチドを用いた試験の対象は、体重減少も体験した。
【００４８】
本発明は、エキセンディン、エキセンディン類似体、エキセンディンアゴニスト、修飾エキセンディン、修飾エキセンディン類似体、若しくは修飾エキセンディンアゴニスト、又はこられのいずれかの組み合わせ（例として、以下を参照）を経鼻投与することを含む、糖尿病及び血漿グルコースを低下させるか、又は胃排出を遅延及び/若しくは減速させるか、又は食物摂取を阻害することが有益である病状を治療するための新規な方法を目的とする。
【００４９】
エキセンディン-３：
Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ (配列番号１４)、
【００５０】
又は、エキセンディン-４（合成エキセンディン-４（エキセナチド））：
Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ配列中、Ｃ末端のセリンはアミド化されている (配列番号１５)、
【００５１】
又は、エキセンディン-４のインシュリン分泌促進性断片：
エキセンディン-４（１-３１） Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ (配列番号１６); 
ｙ.ｓｕｐ.３１ エキセンディン-４（１-３１） Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ (配列番号１７)、
【００５２】
又は、エキセンディン-４の阻害性断片：
エキセンディン-４（９-３９） Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｉｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ (配列番号１８)
【００５３】
又は、他の好ましいエキセンディンアゴニスト：
エキセンディン-４（１-３０） Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｉｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ (配列番号１９)、エキセンディン-４（１-３０）アミド Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｉｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ-ＮＨ.ｓｕｂ.２ (配列番号２０)、エキセンディン-４（１-２８）アミド Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｉｐ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ-ＮＨ.ｓｕｂ.２ (配列番号２１)、.ｓｕｐ.１４ Ｌｅｕ,.ｓｕｐ.２５ Ｐｈｅ エキセンディン-４ アミド Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ-ＮＨ.ｓｕｂ.２ (配列番号２２)、.ｓｕｐ.１４ Ｌｅｕ, .ｓｕｐ.２５ Ｐｈｅ エキセンディン-４（１-２８）アミド Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ-ＮＨ.ｓｕｂ.２ (配列番号２３)、及び .ｓｕｐ.１４ Ｌｅｕ, .ｓｕｐ.２２ Ａｌａ, .ｓｕｐ.２５ Ｐｈｅ エキセンディン-４（１-２８）アミド Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ-ＮＨ.ｓｕｂ.２ (配列番号２４)。
【００５４】
又は、米国特許第５,４２４,２８６号；米国特許第６,５０６,７２４号；米国特許第６,５２８,４８６号；米国特許第６,５９３,２９５号；米国特許第６,８７２,７００号；米国特許第６,９０２,７４４号；米国特許第６,９２４,２６４号；及び米国特許第６,９５６,０２６号に開示され、参照により取り込まれる配列、
【００５５】
又は、糖尿病及び血漿グルコースを低下させるか、又は胃排出を遅延及び/若しくは減速させるか、又は食物摂取を阻害することが有益である病状の治療に有用な、エキセンディンの作用が発揮されるレセプターに効果的に結合する他の化合物。糖尿病の治療及び高血糖症の予防における、インシュリン分泌促進剤としてのエキセンディン-３及びエキセンディン-４の使用が、米国特許第５,４２４,２８６に開示されている。また、エキセンディンは、トリグリセリド濃度の調節及び異常脂質血症の治療において有用なことも実証されている。
【００５６】
従って、本発明は、本明細書に記載するような、エキセンディン又はその断片の生物活性を包含し、合成により作製されるか又は天然供給源から精製された、ペプチド又はペプチド断片を提供する。
【００５７】
本発明によれば、エキセンディンには、遊離塩基、ペプチドの酸付加塩又はカリウム塩もしくはナトリウム塩といった金属塩、並びにアミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化及び他によく知られる共有結合的修飾法といったプロセスによって修飾されたエキセンディンペプチドも含まれる。
【００５８】
従って、本発明によれば、上述のペプチドは、経上皮送達、特に鼻腔内及び皮膚送達に適した製剤内へと取り込まれる。
【００５９】
生体膜
「生体膜」とは、生命体、好ましくは動物、より好ましくはヒトの内部に存在し、その生命体の一つの領域を、別の領域から隔てる膜物質として定義される。多くの場合、生体膜は、生命体をその外側の周囲又は環境から隔てている。生体膜の非限定的な例には、ヒトの粘膜及び皮膚が含まれる。
【００６０】
上皮送達促進剤
「上皮送達促進剤」は、水、塩及び/又は通常のバッファー並びにＧＲＰ（コントロール製剤）を含む製剤に添加した場合に、最大血液濃度、最大血清濃度、又は最大脳脊髄液濃度（Ｃｍａｘ）若しくは濃度対時間のプロットにおける曲線下面積 ＡＵＣによる測定において、生体膜間のＧＲＰの輸送を著しく上昇させる製剤を作り出す化学物質及びその他の賦形剤として定義される。上皮生体膜には、鼻、口腔、腸、頬、気管支肺、膣、直腸及び皮膚の表面が含まれる場合がある。経上皮送達促進剤は、担体と呼ばれる場合もある。
【００６１】
粘膜送達促進剤
「粘膜送達促進剤」は、水、塩及び/又は通常のバッファー並びにＧＲＰ（コントロール製剤）を含む製剤に添加した場合に、最大血液濃度、最大血清濃度、又は最大脳脊髄液濃度（Ｃｍａｘ）若しくは濃度対時間のプロットにおける曲線下面積 ＡＵＣによる測定において、粘膜間のＧＲＰの輸送を著しく上昇させる製剤を作り出す化学物質及びその他の賦形剤として定義される。粘膜には、鼻、口腔、腸、頬、気管支肺、膣及び直腸粘膜の表面が含まれ、実際には、体の窪み又は外界に通じる通路を覆う全ての粘液分泌性の膜が含まれる。粘膜送達促進剤は、担体と呼ばれる場合もある。
【００６２】
エンドトキシン不含製剤
「エンドトキシン不含製剤」とは、ＧＲＰ及び１又は２種類以上の上皮送達促進剤を含み、実質的にエンドトキシン及び/又は関連する発熱物質を含まない製剤を意味する。エンドトキシンには、微生物内部に閉じ込められ、その微生物が破壊されるか又は死んだ時にのみ放出される毒素が含まれる。発熱物質には、細菌及び他の微生物の外膜に由来する熱を生じさせ、熱安定性を示す物質（糖タンパク質）が含まれる。これらの両方の物質は、人間に投与した場合に発熱、低血圧及びショックを引き起こす可能性がある。エンドトキシン不含の製剤を製造するには、特別な装置と専門的技術を有する者が必要とされる場合があり、また、エンドトキシン不含ではない製剤の製造と比べて、著しく高い費用を要する場合もある。げっ歯類にエンドトキシンの注射と同時にＧＬＰ又はアミリンを静脈内投与すると、エンドトキシンのみの投与に伴う低血圧症及び死までもを防止することから（米国特許第４,８３９,３４３号）、これらの治療剤のエンドトキシン不含製剤を製造することは、非腸管外（非注射）の投与において必要ではないと見込まれる。
【００６３】
非注入投与
「非注入投与」とは、動脈又は静脈への直接的な注射を伴わないあらゆる送達方法を意味するものであり、針、シリンジ若しくは他の侵襲手段によって、何かの内部に（典型的には液体を）押し込むか又は送り込む方法、特に体の部分内に導入する方法を意味する。非注入投与には、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、又は生体膜への非注射的送達方法が含まれる。
【００６４】
送達の方法及び組成物
対象哺乳動物へＧＲＰを上皮投与するための改善された方法と組成物により、ＧＲＰ投与スケジュールが最適化される。本発明は、ＧＲＰ投与量の放出が、十分に正規化され、そして/又は、上皮投与後に約０.１ないし２.０時間；０.４ないし１.５時間；０.７ないし１.５時間；又は０.８ないし１.０時間の範囲のＧＲＰ放出の有効送達時間に亘って前記ＧＲＰ投与量の放出が持続される、１又は２種類以上の上皮送達促進剤を含むＧＲＰ製剤を提供する。達成されるＧＲＰの徐放は、本発明の方法及び組成物を利用して、外因性ＧＲＰを繰り返し投与することにより促進される。
【００６５】
徐放の組成物及び方法
対象哺乳動物へＧＲＰを上皮投与するための改善された方法と組成物により、ＧＲＰ投与スケジュールが最適化される。本発明は、１又は２種類以上の上皮送達促進剤及び随意に含まれてもよい徐放促進剤との組合せでＧＲＰを含む製剤の向上した上皮（例、鼻）送達を提供する。本発明の上皮送達促進剤により、例えば、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）が増大することで上皮投与されたＧＲＰの治療活性が増大させるように、送達が効果的に向上される。血漿及びＣＮＳ内でのＧＲＰの治療活性に影響を及ぼす第２の要因は、滞留時間（ＲＴ）である。徐放促進剤は、鼻腔内送達促進剤との組合せにおいて、ＧＲＰのＣｍａｘを増大させ、滞留時間（ＲＴ）を増加させる。徐放促進製剤を生み出す、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の、本発明のポリマー送達媒体及び他の薬剤並びに方法が、本明細書中に開示される。本発明は、対象哺乳動物内での肥満、糖尿病、高血糖、メタボリック症候群、冠不全症候群（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、大腸癌、エキセンディン癌（ｅｘｅｎｄｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、心筋断裂（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ）に関連する症状を治療し、神経発生を促進し、食欲を抑制し、体重減少を促進し、そして食物摂取量を低下させるための向上したＧＲＰ送達方法及び剤形を提供する。
【００６６】
本発明の上皮送達製剤及び方法において、ＧＲＰは、多くの場合、上皮送達に適した担体又は媒体と組み合されるか又は同時に投与される。本明細書において、「担体」という用語は、医薬的に許容可能な固体又は液体の充填剤、希釈剤又は封入材料を意味する。水含有液体担体には、酸性化剤、アルカリ化剤、抗微生物保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、キレート剤、錯化剤、可溶化剤、湿潤剤、溶剤、懸濁及び/又は増粘剤、等張化剤、湿潤剤又は他の生体適合性材料のような医薬的に許容可能な添加物が含まれていてもよい。上記の分類によって列挙された成分を表にまとめたものを、米国薬局方国民医薬品集１８５７-１８５９、１９９０に見出すことができる。医薬的に許容可能な担体として機能できる物質のいくつかの例としては、ラクトース、グルコース及びスクロース等の糖類；コーンスターチ及びジャガイモデンプン等のデンプン；セルロース及びカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース等のセルロース誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂及び坐剤用ワックス等の添加剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油等の油；プロピレングリコール等のグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール等のポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含水；等張食塩水；Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ溶液、エチルアルコール及びリン酸緩衝溶液、並びに医薬組成物で用いられる他の非毒性の適合材料がある。ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤, 乳化剤及び潤滑剤、並びに着色剤, 剥離剤, コーティング剤, 甘味料, 香料添加剤及び芳香剤, 保存剤並びに酸化防止剤も、製剤者の所望に従って組成物中に存在していてもよい。医薬的に許容可能な抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性酸化防止剤；アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロール等の油溶性酸化防止剤；並びにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が含まれる。単一の剤形を作り出すために担体物質と配合可能な有効成分の量は、特定の投与方法に応じて変化することになる。
【００６７】
本発明の上皮送達組成物及び方法においては、細胞層内への又は細胞層間のＧＲＰの送達を促進する種々の送達促進剤を用いることができる。この点に関し、上皮間のＧＲＰの送達は、「経細胞的に」又は「傍細胞的に」生じる場合がある。これらの経路がＧＲＰの全フラックス及び生物学的有効度に寄与する程度は、その生体膜の環境、活性薬剤の物理化学的特性、及び上皮の特性に依存する。経細胞輸送は、受動拡散にのみ関係するが、傍細胞輸送は、受動的な、促進された又は積極的なプロセスによっても起こり得る。一般的に、親水性で、受動輸送され、極性を有する溶質は、傍細胞経路を通じて拡散し、より親油性が高い溶質は、経細胞経路を用いる。多様な、受動的及び積極的に吸収された溶質の吸収量と生物学的有効度（例えば、透過係数又は生理学的アッセイに反映されるような）は、本発明の範囲内で選択されるあらゆるＧＲＰについて、傍細胞及び経細胞の両方の送達成分に関して、直ちに評価することができる。受動的に吸収された薬物の場合、薬物輸送への傍細胞と経細胞経路の相対寄与率は、ｐＫａ、分配係数、分子半径及び該薬物の電荷、薬物が送達される管腔環境のｐＨ、並びに吸収面積に依存する。傍細胞経路は、鼻粘膜上皮の接近可能面積の比較的小さな分画を表す。一般的に、細胞膜は、傍細胞空間が占める面積の数１０００倍大きな表面積を占めることが報告されている。従って、その小さな接近可能領域並びに高分子透過に対するサイズ及び電荷に基づく排除性により、一般的に、薬物輸送のためには傍細胞経路よりも経細胞送達が好ましくあろうことが示唆されるであろう。驚くべきことに、本発明の方法及び組成物は、傍細胞経路を介した生物学的治療剤の粘膜上皮内への輸送又は粘膜上皮間の輸送を著しく促進させる。従って、本発明の方法及び組成物は、単一の方法若しくは組成物の代わりに、又は単一の方法若しくは組成物の範囲内で、良好に傍細胞及び経細胞経路の両方を標的とする。
【００６８】
本明細書中で用いる場合には、上皮送達促進剤には、ＧＲＰ又は他の生物活性化合物の放出若しくは溶解度（製剤用送達媒体からの）、拡散速度、透過能及びタイミング、取り込み、滞留時間、安定性、有効半減期、ピーク時もしくは持続的な濃度レベル、クリアランス及び他の所望の上皮送達特性（例えば、送達部位、又は血流若しくは中枢神経系等の選択された標的活性部位で測定されるような）を向上させる薬剤が含まれる。従って、上皮送達の向上は、例えば、ＧＲＰの拡散、輸送、持続性又は安定性の増大、膜流動性の増大、細胞内又は傍細胞透過を調節するカルシウム及び他のイオンの利用可能性又は作用の調節、膜成分（例、脂質）の可溶化、粘膜組織内での非タンパク質及びタンパク質のスルフヒドリル値の変更、細胞層間の水流量の増加、上皮ジャンクションの生理機能の調節、粘膜上皮を覆う粘膜の粘性の低下、粘膜線毛クリアランス率の低下及び他のメカニズム等の種々のメカニズムのいずれによっても起こり得る。
【００６９】
本明細書中で用いる「ＧＲＰの有効量」は、種々の送達経路又は移動経路を要するであろう、対象内の薬物活性の標的部位へのＧＲＰの効果的な送達を意図するものである。例えば、任意の活性薬剤が、粘膜の細胞間の間隙を通じて、その進路を見出して隣接した血管壁に到達する場合もあり、一方で、別の経路によって、薬剤が、受動的又は積極的に粘膜細胞内に取り込まれて細胞内で作用するか 、又は細胞の外側に排出若しくは輸送されて体循環等の２次的標的部位に到達する場合もある。本発明の方法及び組成物は、１又は２種類以上のこのような代替的経路に沿って活性薬剤のトランスロケーションを促進するか、又は粘膜組織若しくは周辺の血管組織に直接的に作用して、活性薬物の吸収又は透過を促進することができる。この文脈における吸収又は透過の促進は、上記のメカニズムに限定されるものではない。
【００７０】
本明細書で用いる「血漿内のＧＲＰのピーク濃度（Ｃｍａｘ）」、「血漿内のＧＲＰの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）」、「血漿内のＧＲＰの最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）」は、当業者に知られる薬物動態学的パラメーターである。Ｌａｕｒｓｅｎ, ｅｔ ａｌ., Ｅｕｒ. Ｊ. Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ７５５:３０９-３１５, １９９６。「濃度対時間曲線」は、対象の血清内のＧＲＰの濃度対鼻腔内、筋肉内、皮下又は他の非経口投与経路のいずれかによって対象にＧＲＰの投与量を投与した後の時間を測定するものである。「Ｃｍａｘ」は、対象へのＧＲＰの１回投与の後の対象の血清中のＧＲＰの最大濃度である。「ｔｍａｘ」は、対象へのＧＲＰの１回投与の後の対象の血清中のＧＲＰの最大濃度に達するまでの時間である。
【００７１】
本発明で用いる「血漿内のＧＲＰの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）」は、線形台形公式に従い、残余面積を足すことによって計算する。２回の投与の間の２３％の減少又は３０％の増加は、９０％の確からしさ（第二種の過誤β=１０％）で検出されることになる。「送達速度」又は「吸収速度」は、最大濃度（Ｃｍａｘ）に達するまでの時間（ｔｍａｘ）を比較することにより評価される。Ｃｍａｘ及びｔｍａｘの両方は、ノンパラメトリック法を用いて解析される。筋肉内、皮下、静脈内及び鼻腔内のＧＲＰ投与の薬物動態の比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。ペアごとの比較には、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ-Ｈｏｌｍｅｓ逐次処理法を用いて有意性を評価する。３回の鼻投与間の用量反応関係を回帰分析によって評価する。Ｐ＜０.０５を有意性があるものと見なす。結果は、平均値+/-標準誤差で示す。
【００７２】
吸収促進のメカニズムは、本発明の異なる上皮送達促進剤によって変化する可能性があるが、この文脈において有用の試薬とは、実質的に組織に悪影響を及ぼすことがなく、特定のＧＲＰ又は他の活性薬剤若しくは送達促進剤の物理化学的特性に応じて選択される試薬となるであろう。この点において、粘膜組織の透過又は浸透を増大させる送達促進剤は、粘膜の保護的な浸透障壁をある程度変化させることになるであろう。これらの送達促進剤が本発明の範囲内の値を取るためには、生体膜の浸透性におけるあらゆる有意な変化が、所望の薬物送達時間に適切な時間枠内で可逆的であることが一般的に望ましい。更にまた、長期間の使用によって、実質的な蓄積性のある毒性、又は生体膜の障壁特性への恒久的な劣化が引き起こされてはならない。
【００７３】
本発明の特定の局面では、本発明のＧＲＰの同時投与用又は組合せ製剤用の吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、エタノール、プロピレングリコール、及び２-ピロリドンを含む低分子の親水性分子から選択されるが、これらに限定されるものではない。上記に代わり、例えば、ジアシルメチルスルホキシド、アゾン、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸及び胆汁酸塩を用いてＧＲＰの生体膜透過を促進することもできる。更なる局面では、ＧＲＰの経上皮送達を促進するための補助的化合物、処理剤（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）又は製剤用添加剤として表面活性剤（例、ポリソルベート）が用いられる。ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコール、及びエタノール等の薬剤は、送達環境下に十分に高濃度で存在する場合（例えば、事前投与又は治療法製剤への組み込みにより）には、粘膜の水層に進入してその溶解特性を変化させ、それによってＧＲＰの媒体から生体膜内への分離を促進する。
【００７４】
本発明の同時投与及び処理方法及び組合せ製剤に有用な更なる上皮送達促進剤には、以下に限定されるものではないが、混合ミセル；エナミン：酸化窒素ドナー（例えば、Ｓ-ニトロソ-Ｎ-アセチル-ＤＬ-ペニシラミン、ＮＯＲ１、Ｎ０Ｒ４−;これらは好ましくは、カルボキシ-ＰＩＴＯ又はジクロフェナクナトリウム等のＮＯスカベンジャーと共に同時投与される); サリチル酸ナトリウム; アセト酢酸のグリセリンエステル（例、グリセリ-１,３-ジアセトアセタート 又は１,２-イソプロピリデングリセリン-３-アセトアセテート）；及び、その他の上皮送達のための生理学的適合性を有する放出拡散剤又は上皮内若しくは経上皮の透過促進剤が含まれる。その他の吸収促進剤は、ＧＲＰの上皮送達、安定性、活性又は経上皮透過を促進する種々の担体、基剤及び賦形剤から選択される。これらには、とりわけ、シクロデキストリン及びβ-シクロデキストリン誘導体（例、２-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン及びヘプタキス(２,６-ジ-Ｏ-メチル-β-シクロデキストリン）が含まれる。随意に１又は２種類以上の有効成分と抱合していてもよく、更に随意に油性の基剤中に製剤されていてもよいこれらの化合物は、本発明の上皮用製剤中でのバイオアベイラビリティを向上させる。上皮送達用に適用される更なる吸収促進剤には、モノ-及びジグリセリド（例、ココナッツ油のカプリン酸ナトリウム抽出物、カプムル）、並びにトリグリセリド（例、アミロデキストリン、Ｅｓｔａｒａｍ ２９９、Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１０）を含む中鎖脂肪酸が含まれる。
【００７５】
本発明の上皮治療及び予防用組成物は、生体膜障壁間のＧＲＰの吸収、分散又は透過を促進するあらゆる適切な透過促進剤が補充されていてもよい。透過促進剤は、医薬的に許容可能なあらゆる促進剤であってよい。従って、本発明のより詳細な局面では、サリチル酸ナトリウム及びサリチル酸誘導体（アセチルサリチル酸、サリチル酸コリン、サリチルアミド等）；アミノ酸及びその塩（例、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン等のモノアミノカルボン酸；セリン等のヒドロキシアミノ酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；並びにリジン等の塩基性アミノ酸-これらのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩も含まれる；並びにＮ-アセチルアミノ酸（Ｎ-アセチルアラニン、アセチルフェニルアラニン、Ｎ-アセチルセリン、Ｎ-アセチルグリシン、Ｎ-アセチルリジン、Ｎ-アセチルグルタミン酸、Ｎ-アセチルプロリン、Ｎ-アセチルヒドロキシプロリン等)及びこれらの塩（アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩）、から選択される１又は２種類以上の透過促進剤が取り込まれた組成物が提供される。本発明の方法及び組成物の範囲内で透過促進剤として提供されるものには、乳化剤等として一般的に使用される物質（例、オレイルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル等）、カプロン酸、乳酸、リンゴ酸及びクエン酸並びにこれらのアルカリ金属塩、ピロリドンカルボン酸、アルキルピロリドンカルボン酸エステル、Ｎ-アルキルピロリドン、プロリンアシルエステルがある。
【００７６】
本発明の種々の局面では、投与部位と選択された標的部位との間に存在する生体膜障壁間における本発明のＧＲＰ及び他の治療薬の送達を可能にする、向上した鼻粘膜送達用の製剤及び方法が提供される。特定の製剤は、選択された標的細胞、組織若しくは器官、又は特定の病状用に特別な適合が施される。他の局面では、製剤と方法により、特に特定の細胞内又は細胞間経路に沿った経路を通るＧＲＰの効率的で、選択的なエンドサイトーシス又はトランスサイトーシスが提供される。典型的には、ＧＲＰは、単体又は他の送達媒体中に有効量で効果的に注入されて、例えば、鼻粘膜において、及び/又は細胞内区画と膜を通り離れた薬物作用の標的部位までの移動（例えば、血流又は特定の組織、器官、又は細胞外区画）において送達され安定な形態で保持される。ＧＲＰは、送達媒体又は修飾されて（例えば、プロドラッグの形態において）提供されてもよく、この場合、ＧＲＰの放出又は活性化は、生理学的刺激（例えば、ｐＨの変化、リソソーム酵素等）に誘発される。場合によっては、ＧＲＰは、その活性の標的部位に到達するまで薬理学的に不活性である。殆どの場合、ＧＲＰ及び他の製剤成分は、非毒性であり、非免疫原性である。この点において、担体及び他の製剤成分は、一般的に、迅速に分解して生理学的条件下で排泄される能力に基づいて選択される。同様に、製剤は、効率的な保存のため、剤形内で化学的及び物理的に安定である。
【００７７】
ペプチド及びタンパク質の類似体及び模倣体
本発明の範囲内で使用する生物活性ペプチド及びタンパク質の定義には、天然又は合成、治療活性又は予防活性を有する、ペプチド（２又は３個以上の共有結合したアミノ酸から構成される）、タンパク質、ペプチド又はタンパク質の断片、ペプチド又はタンパク質の類似体、及び活性なペプチド又はタンパク質の化学修飾した誘導体又は塩が含まれる。本発明では、広範囲な種類の有用なＧＲＰの類似体及び模倣体を使用することが意図されており、これらは、公知の方法に従って生産可能であり、その生物活性について試験することができる。場合によっては、本発明の範囲内で使用するＧＲＰのペプチド若しくはタンパク質、又は他の生物活性を有するペプチド若しくはタンパク質は、天然又は自然（例えば、野生型、天然の突然変異体、又は対立遺伝子変異体等）のペプチド配列又はタンパク質配列内のアミノ酸の部分的置換、付加又は欠失により直ちに入手可能なムテインである。これに加え、自然のペプチド又はタンパク質の生物学的に活性な断片も含まれる。このような変異誘導体及び断片は、自然のペプチド又はタンパク質の所望の生物学的活性を保持している。ペプチド又はタンパク質が糖鎖を有する場合、これらの糖種における変異により特徴付けられる生物学的に活性な変異体も、本発明に包含される。
【００７８】
本明細書において使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似する側鎖を有するアミノ酸の一般的な互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の通常置換可能なグループは、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインとメチオニンである。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような非極性（疎水性）残基の、別の非極性（疎水性）残基との置換が含まれる。同様にして、本発明は、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、及びスレオニンとセリン間といった、極性（親水性）残基の置換も意図している。加えて、リジン、アルギニン、若しくはヒスチジンといった塩基性残基の他の塩基性残基への置換、又は、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸といった酸性残基の他の酸性残基への置換も意図している。代表的な保存的アミノ酸置換のグループには、以下のものがある：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、及びアスパラギン-グルタミン。ペプチド又はタンパク質類似体を任意に対応する天然ペプチド又はタンパク質とアラインメントさせることにより、そして例えばタンパク質の接着アッセイ又はレセプター結合アッセイ等の、選択された生物学的活性を決定するための適切なアッセイを用いることにより、本発明に係る方法及び組成物に使用するための機能的ペプチド及びタンパク質類似体を直ちに同定することができる。機能的ペプチド及びタンパク質類似体は、典型的に、対応する自然のペプチド又はタンパク質に対して産生された抗体に対して特異的な免疫反応性を有する。
【００７９】
本発明に係る固体タンパク質製剤を安定化させる方法は、例えば、凍結乾燥されたタンパク質等の、精製タンパク質の物理的安定性を増加させることである。これにより、疎水性相互作用による凝集、並びにタンパク質がアンフォールディングするにつれて増加であろう共有結合的経路を介した凝集が阻害されることになろう。このような状況における製剤の安定化には、例えば、生分解性のヒドロゲル製剤/送達系等のポリマーを基礎とする製剤が挙げられる。上述したように、タンパク質の構造、機能及び安定性における水の決定的な役割はよく知られている。典型的に、タンパク質はバルク水が除去された固体状態において比較的安定である。しかしながら、固体の治療用タンパク質製剤は、高湿度における保存により水和する可能性があり、又は徐放性組成物若しくは装置からの送達中に水和する可能性もある。タンパク質の安定性は、一般的に水和の増加により低下する。水は、例えば、タンパク質の柔軟性を増加させて反応基への接触性を増加させたり、反応物質に移動相を提供したり、そして、β脱離や加水分解といった複数の有害なプロセスにおいて反応物質として振舞うことにより、固体タンパク質の凝集において重要な役割を果たす可能性もある。
【００８０】
約６％ないし２８％の水を含有するタンパク質製剤は、最も不安定である。これを下回るレベルであれば、結合水の移動性とタンパク質の内部運動は低度なものとなる。これを上回るレベルであれば、水の移動性とタンパク質の運動は、完全な水和状態のものに近くなる。一定の程度までの水和の増加に伴う固相凝集への感受性の増加が、複数の系で観察されている。しかしながら、より高い含水率においては、希釈効果により、比較的低度の凝集が観察される。
【００８１】
上記の原理に従えば、粘膜送達のためにペプチドとタンパク質を固相凝集に対して安定化させる効果的な方法は、固体製剤中の含水率を制御して該製剤中での水分活性を適正レベルに維持することである。このレベルはタンパク質の性質に依存するが、一般的に、そのタンパク質の「単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）」水付着率（ｗａｔｅｒ ｃｏｖｅｒａｇｅ）未満に維持されたタンパク質は、優れた固体状態の安定性を示すことになる。
【００８２】
効果的に含水率を調節してタンパク質の安定性を向上させる種々の添加剤、希釈剤、基剤及び送達媒体が、本発明の範囲内において提供される。この意味において抗凝集剤として有効なこれらの試薬と担体材料には、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、及びカルボキシメチルセルロースといった種々の機能性を有するポリマーが含まれ、これらポリマーは、該ポリマーと一緒に混合された、又は該ポリマーと結合されたペプチド及びタンパク質の安定性を顕著に増加させ、固相凝集を減少させる。場合によっては、タンパク質の活性及び物理的安定性は、該ペプチド又は蛋白質薬剤の水溶液への種々の添加剤によっても向上させることができる。例えば、ポリオール（糖を含む）、アミノ酸、コラーゲン及びゼラチンを含むタンパク質、並びに種々の塩といった添加剤を用いることができる。
【００８３】
特定の添加剤、特に糖及びその他のポリオールも、例えば、凍結乾燥タンパク質等の乾燥タンパク質に顕著な物理的な安定性を付与する。本発明の範囲内でこれらの添加剤を用いて、凍結乾燥時だけではなく、乾燥状態での保存時における凝集に対してもタンパク質を保護することもできる。例えば、スクロースとＦｉｃｏｌｌ ７０（スクロース単位を有するポリマー）は、種々の条件下で、固相インキュベーション時のペプチド又はタンパク質凝集に対する顕著な保護力を示す。これらの添加材は、ポリマーマトリックス内に埋め込まれた固体タンパク質の安定性も増加させることができる。
【００８４】
たとえば、スクロース等の更なる添加剤は、本発明の特定の徐放製剤に生じ得る高温で湿った雰囲気下での固相状態の凝集に対してタンパク質を安定化させる。ゼラチンやコラーゲン等のタンパク質は、安定剤又は充填剤としても機能して、この文脈における不安定なタンパク質の変性と凝集を減少させる。これらの添加剤は、本発明の範囲内のポリマー溶解プロセス及び組成物に取り込むことができる。例えば、ポリペプチド微小粒子は、単に上述の安定化添加物を含有する溶液を凍結乾燥させるか又はスプレードライすることによって調製することができる。
【００８５】
凝集しやすいペプチド及びタンパク質の上皮送達用製剤であって、可溶化剤を用いて該製剤中のペプチド又はタンパク質が、実質的に純粋で非凝集形態にて安定している製剤を生じる、種々の更なる調製成分及び調製方法、並びに特別な製剤用添加剤が本明細書にて提供される。広範囲な成分と添加剤が、これらの方法及び製剤へ使用されることが意図される。これら安定化剤の典型例は、ポリペプチドの疎水性側鎖に選択的に結合するシクロデキストリン（ＣＤ）である。これらＣＤは、顕著に凝集を阻害するようにタンパク質の疎水性パッチに結合することが判明している。この阻害は、ＣＤ及び関与するタンパク質の両方に対して選択的である。このような選択的なタンパク質凝集の阻害は、本発明に係る鼻腔内送達方法及び組成物において更なる有益性を提供する。この関連において使用される更なる薬剤には、ペプチドとタンパク質の凝集を特異的にブロックする、リンカーにより制御された種々のジオメトリ（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を有するＣＤの２量体、３量体及び４量体が含まれる。更に、本発明の範囲内に取り込まれる可溶化剤と方法には、ペプチド及びペプチド模倣剤を用いて選択的にタンパク質-タンパク質相互作用をブロックすることが含まれる。１の局面において、ＣＤ多量体について報告される疎水性側鎖への特異的結合は、同様にタンパク質凝集をブロックするペプチド及びペプチド模倣剤の使用により、タンパク質にまで拡張される。本発明に係る組成物及び方法に取り込まれるものとして、広範囲の適切な方法及び抗凝集剤が利用可能である。
【００８６】
電荷修飾及びｐＨ調整用薬剤及び方法
疎水性生体膜障壁間の改善された送達用の生物活性薬剤（ＧＲＰ、他の活性ペプチド及びタンパク質、並びに高分子及び低分子薬物）の輸送特性を改善するため、本発明は本明細書に記載する選択された生物活性薬剤又は送達促進剤の電荷を修飾する技術と試薬も提供する。この点について、高分子の相対浸透性は、一般的にその分配係数と相関する。ｐＫａに依存する分子の電離度、及び生体膜表面のｐＨも分子の浸透性に影響する。本発明のＧＲＰ及び類似体を含む、上皮送達用の生物活性薬剤の浸透及び分配は、活性薬剤又は浸透化剤の電荷の変化又は電荷の拡散によって促進され、電荷の変化又は電荷の拡散は、例えば、帯電性官能基の変化、活性薬剤を送達する送達媒体又は溶液のｐＨの調整、又は活性薬剤と電荷又はｐＨ変化剤の同時投与によって達成される。
【００８７】
これらの一般的教示に従えば、本発明の方法及び組成物の範囲内にある、ＧＲＰ及び他の生物活性ペプチド及びタンパク質を含む帯電高分子種の上皮送達は、活性薬剤が、実質的に、非イオン化又は中性の電荷状態で上皮表面に送達されたときに十分に向上される。
【００８８】
本発明の範囲内で使用される上皮製剤の特定のＧＲＰ並びにその他の生物活性ペプチド及びタンパク質成分は、電荷修飾を受けることでペプチド又はタンパク質の正電荷密度が増大することになるであろう。これらの修飾は、本明細書に開示されるペプチド及びタンパク質の抱合体、担体及び他の送達形態のカチオン化にまで及ぶ。カチオン化により、本発明の範囲内のタンパク質及び高分子の体内分布及び輸送特性を変化させる簡便な手段が提供される。カチオン化は、実質的に活性薬剤の生物活性を維持して、組織損傷及び毒性を含む潜在的に有害な副作用を制限するように行われる。
【００８９】
「緩衝剤」は、一般的に、溶液のｐＨを略一定に維持するために用いられる。緩衝剤は、少量の強酸又は強塩基が溶液に添加された場合であっても、水素又は水酸化イオン濃度の大きな変化を防ぐか又は中和することによって、溶液のｐＨを維持する。一般的に、緩衝剤は、弱酸とその適切な塩（又は弱塩基とその適切な塩）から成る。弱酸用の適切な塩には、該弱酸中に存在するのと同じ陰イオンが含まれる（Ｌａｇｏｗｓｋｉ, Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, Ｖｏｌ. １, Ｓｉｍｏｎ & Ｓｃｈｕｓｔｅｒ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, １９９７, ｐ. ２７３-４を参照）。緩衝剤の記述には、ヘンダーソン‐ハッセルバルチの式、
【００９０】
【数１】
2009518315.tif 000003
が用いられ、この式は、弱酸の解離に関する標準的な等式ＨＡ＝Ｈ＋＋Ａ−に基づく。一般的に用いられる緩衝剤供給源の代表例には、以下のものが含まれる：グルタメート、アセテート、シトレート、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、メチオニン、ラクテート、ホルメート、グリコレート、タルトレート及びこれらの混合物。
【００９１】
「緩衝容量」は、有意なｐＨ変化が生じるまで緩衝溶液に添加可能な酸又は塩基の量を意味する。ｐＨが、弱酸のｐＫ-１及びｐＫ+１の範囲内にある場合には、緩衝用量は、評価可能であるが、この範囲の外側にある場合には、緩衝用量は、殆ど評価することが出来ない。従って、任意の系は、弱酸（又は弱塩基）のｐＫの正負いずれかの側の１ｐＨ単位の範囲内で有用な緩衝作用を示す（Ｄａｗｓｏｎ, Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ, １９８６, ｐ. ４１９を参照）。一般的には、溶液のｐＨが、弱酸（又は弱塩基）のｐＫａに近くなるように、適切な濃度が選択される（Ｌｉｄｅ, ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ, ８６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｔａｙｌｏｒ & Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ, ２００５-２００６, ｐ. ２-４１を参照）。更に、強酸及び強塩基の溶液は、通常緩衝溶液として分類されず、これらは、２.４ないし１１.６のｐＨ値で緩衝容量を示すことがない。
【００９２】
分解酵素の阻害剤及び阻害方法
経上皮製剤に含まれてもよい他の賦形剤として、分解酵素の阻害剤がある。本発明に係る上皮送達製剤と方法において有用な、代表的な粘膜付着性ポリマー−酵素阻害剤複合体には、以下のものが含まれるが、これに限定されるものではない：カルボキシメチルセルロース-ペプスタチン (抗ペプシン活性を有する); ポリ(アクリル酸)-ボーマン・バーク（Ｂｏｗｍａｎ-Ｂｉｒｋ）インヒビター(抗キモトリプシン); ポリ(アクリル酸)-キモスタチン (抗キモトリプシン); ポリ(アクリル酸)-エラスタチナール(抗エラスターゼ); カルボキシメチルセルロース-エラスタチナール(抗エラスターゼ); ポリカルボフィル-エラスタチナール(抗エラスターゼ); キトサン-アンチパイン(抗トリプシン); ポリ(アクリル酸)-バシトラシン(抗アミノペプチダーゼＮ); キトサン-ＥＤＴＡ (抗アミノペプチダーゼＮ、抗カルボキシペプチダーゼＡ); キトサン-ＥＤＴＡ-アンチパイン(抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ)。下記に更に詳細に記載されるように、本発明の特定の態様には、新規なキトサン誘導体又はキトサンの化学的に修飾された形態が任意に取り込まれるであろう。本発明の範囲内で用いるための、このような新規な誘導体の一つは、β-[１→４]-２-グアニジノ-２-デオキシ- Ｄ-グルコースポリマー (ポリＧｕＤ)として表わされる。
【００９３】
酵素の活性を阻害して生物活性薬剤を保護するあらゆる阻害剤を、本発明の組成物及び方法に有益に用いることができる。生物学的に活性なタンパク質及びペプチドを保護するための有用な酵素阻害剤には、例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶインヒビター、大豆トリプシンインヒビター、エキセンディントリプシンインヒビター、キモトリプシンインヒビター並びにジャガイモ（ソラヌム・ツベロスムＬ.(Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ.)）の塊茎から単離されたトリプシン及びキモトリプシンインヒビターが含まれる。阻害剤の組合せ又は混合物を用いることもできる。本発明の範囲内にて用いるための更なるタンパク分解酵素の阻害剤には、オボムコイド酵素、メシル酸ガベキサート（ｇａｂａｘａｔｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、α１-アンチトリプシン、アプロチニン、アマスタチン（ａｍａｓｔａｔｉｎ）、ベスタチン、ピューロマイシン、バシトラシン、ロイペプシン（ｌｅｕｐｅｐｓｉｎ）、α２-マクログロブリン、ペプスタチン並びに卵白又は大豆トリプシンインヒビターが含まれる。これらの阻害剤や他の阻害剤を単独で、又は組み合わせて用いることができる。阻害剤は、生物活性薬剤との組合せにおいて、又は個別に投与される（例えば、事前投与される）製剤において、例えば親水性ポリマー等の担体に取り込まれるか若しくは結合していてもよく、鼻粘膜に接触する剤形表面にコーティングされていてもよく、又は該表面の表層に取り込まれていてもよい。
【００９４】
本発明の組成物に任意に取り込まれてもよい阻害剤、例えば、タンパク分解酵素阻害剤等の量は、（ａ）具体的な阻害剤の特性、（ｂ）該分子内に存在する官能基(反応することにより、ヒドロゲル形成モノマーの共重合に必要なエチレン基の不飽和を導入することが可能な官能基)の数、及び（ｃ）阻害剤分子内に存在する、グリコシド等のレクチン基の数、に依存して変化するであろう。また、投与が予定される具体的な治療剤にも依存するであろう。一般的にいえば、酵素阻害剤の有効量は、製剤（即ち、別個のプロテアーゼ阻害剤製剤又は阻害剤と生物活性薬剤との複合製剤）１ ｍｌ当たりに、約０.１ ｍｇないし約５０ ｍｇであり、しばしば約０.２ ｍｇないし約２５ ｍｇであり、そしてより一般的には約０.５ ｍｇないし約５ ｍｇである。
【００９５】
トリプシン阻害の場合、適切な阻害剤は、例えば、アプロチニン、ＢＢＩ、大豆トリプシンインヒビター、ニワトリオボムコイド、ニワトリオボインヒビター、ヒトエキセンディントリプシンインヒビター、メシル酸カモスタット、フラボノイド阻害剤、アンチパイン、ロイペプチン 、ｐ-アミノベンザミジン（ｐ-ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）、ＡＥＢＳＦ、ＴＬＣＫ (トシルリジンクロロメチルケトン（ｔｏｓｙｌｌｙｓｉｎｅ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）)、ＡＰＭＳＦ、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、及びポリ(アクリレート)誘導体、から選択することができる。キモトリプシン阻害の場合、適切な阻害剤は、例えば、アプロチニン、ＢＢＩ、大豆トリプシンインヒビター、キモスタチン、ベンジルオキシカルボニル-Ｐｒｏ-Ｐｈｅ-ＣＨＯ、ＦＫ-４４８、ニワトリオボインヒビター、糖ビフェニルボロン酸複合体、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、β-プロピオン酸フェニル、及びポリ(アクリレート)誘導体、から選択することができる。エラスターゼ阻害の場合、適切な阻害剤は、例えば、エラスタチナール、メトキシスクシニル-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ｖａｌ-クロロメチルケトン（ＭＰＣＭＫ）、ＢＢＩ、大豆トリプシンインヒビター、ニワトリオボインヒビター、ＤＦＰ、及びＰＭＳＦ、から選択することができる。
【００９６】
本発明において用いるための更なる酵素阻害剤は、その作用強度と毒性の程度において異なる広範囲な非タンパク質阻害剤から選択される。下記においてさらに詳細に記載するように、これら補助剤のマトリックス若しくは他の送達担体への固定化、又は化学的に修飾された類似体の開発を直ちに実行して、これらが阻害剤と遭遇した場合に、毒性効果を減少させるか、又は除去することが可能である。本発明の範囲内で用いるための上記酵素阻害剤候補の広いグループの中でも、とりわけ、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン及びキモトリプシン）の強力で不可逆性の阻害剤である、ジイソプロピルフルオロリン酸 (ＤＦＰ)とフッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)といった有機リン阻害剤がある。これらの化合物によるアセチルコリンエステラーゼの更なる阻害は、非制御下での送達環境において、これらを非常に有毒なものにする。別の阻害剤候補である、４-(２-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド（４-(２-ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ)-ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）(ＡＥＢＳＦ)は、ＤＦＰやＰＭＳＦと同程度の阻害活性を有するが、これらに比べて顕著に毒性が低い。(４-アミノフェニル)-メタンスルホニルフルオリドヒドロクロリド（(４-Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ)-ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）(ＡＰＭＳＦ)は、トリプシンの別の有効な阻害剤であるが、非制御下環境において毒性を有する。これらの阻害剤とは対照的に、４-(４-イソプロピルピペラジノカルボニル)フェニル１,２,３,４,-テトラヒドロ-１-ナフトエートメタンスルホネート（４-(４-ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｉｐｅｒａｄｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ １,２,３,４,-ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ-１-ｎａｐｈｔｈｏａｔｅ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）(ＦＫ-４４８)は、低毒性物質であり、キモトリプシンの有効で特異的な阻害剤を代表するものである。この阻害剤候補の非タンパク質グループの更なる代表例であり、また低い毒性リスクを示すものは、メシル酸カモスタット(Ｎ,Ｎ'-ジメチルカルバモイルメチル-ｐ-(ｐ'-グアニジノベンゾイルオキシ)フェニルアセテートメタンスルホネート（Ｎ,Ｎ'-ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍｏｙｌｍｅｔｈｙｌ-ｐ-(ｐ'-ｇｕａｎｉｄｉｎｏ- ｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ)ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ ｍｅｔｈａｎｅ-ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）)である。
【００９７】
更に、本発明の方法及び組成物において用いるための他の種類の酵素阻害剤は、特定の治療用化合物の酵素的分解を妨害するアミノ酸又は修飾アミノ酸である。この文脈における使用に関し、アミノ酸及び修飾アミノ酸は、実質的に無毒であり、低コストで生産することができる。しかしながら、その低い分子サイズと良好な可溶性のために、これらは粘膜環境において直ちに希釈されて吸収されてしまう。そうであったとしても、適切な条件下においては、アミノ酸は、プロテアーゼ酵素の可逆的で競合的な阻害剤として作用することができる。特定の修飾アミノ酸は、一層強力な阻害活性を示すことができる。この文脈における望ましい修飾アミノ酸は、「遷移状態」阻害剤として知られている。これら化合物の強力な阻害活性は、その遷移状態構造での基質に対する構造的類似性に基づくものであるが、これらは、基質そのものよりも酵素の活性部位に対して一層高い親和性を有するように選択される。遷移状態阻害剤は、可逆性の競合阻害剤である。この種の阻害剤の例には、ボロロイシン（ｂｏｒｏ-ｌｅｕｃｉｎｅ）、ボロバリン（ｂｏｒｏ-ｖａｌｉｎｅ）及びボロアラニン（ｂｏｒｏ-ａｌａｎｉｎｅ）のようなα-アミノボロン酸誘導体がある。これら誘導体中のホウ素原子は、アミノペプチダーゼによる加水分解中のペプチドの遷移状態に類似すると考えられている、四面体のボロン酸イオンを形成することができる。これらアミノ酸誘導体は、アミノペプチダーゼの強力な可逆的阻害剤であり、ボロロイシン（ｂｏｒｏ-ｌｅｕｃｉｎｅ）は、酵素阻害において、ベスタチンの１００倍を超える効果を有し、ピューロマイシンの１０００倍を超える効果を有することが報告されている。強力なプロテアーゼ阻害活性が報告された別の修飾アミノ酸は、アミノペプチダーゼＮの酵素活性を阻害するＮ-アセチルシステインである。この補助剤も、粘膜拡散障壁の効果を減少させるために本発明の方法及び組成物において用いることが可能な粘膜分解特性を示す。
【００９８】
本発明に係る同調投与法（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）及び組み合わせ処方において用いるための更に他の有用な酵素阻害剤は、ペプチド及び修飾ペプチド酵素阻害剤から選択することができる。この種の阻害剤の重要な代表例は、バシラスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から得られる環状ドデカペプチドのバシトラシンである。これらの種類のペプチドに加え、特定のジペプチド及びトリペプチドも、一定のプロテアーゼに対して弱い、非特異的な阻害活性を示す。アミノ酸との類似性により、これらの阻害活性は化学的修飾により向上させることができる。例えば、ホスフィン酸ジペプチド類似体も、アミノペプチダーゼに対する強力な阻害活性を有する「遷移状態」阻害剤である。これらを用いることで、経鼻投与されたロイシンエンケファリンが安定化されたことが報告されている。遷移状態類似体の別の例は、修飾ペンタペプチドのペプスタチンであり、これは非常に強力なペプシン阻害剤である。複数の合成類似体の阻害活性を試験することによるペプスタチンの構造解析により、阻害活性に関与する該分子の主な構造機能特性が証明された。別の特別な種類の修飾ペプチドには、その構造の末端に局在するアルデヒド機能を有する阻害剤が含まれる。例えば、キモトリプシンの公知の１次及び２次特異性の要件（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）を満足する、ベンジルオキシカルボニル-Ｐｒｏ-Ｐｈｅ-ＣＨＯという配列は、この標的プロテイナーゼの強力な可逆性の阻害剤であることが明らかとなった。アンチパイン、ロイペプチン、キモスタチン及びエラスタチナール等の末端に局在するアルデヒド機能を有する更なる阻害剤の化学構造も、ホスホラミドン、ベスタチン、ピューロマイシン及びアマスタチン（ａｍａｓｔａｔｉｎ）のような、他の公知の可逆性の修飾ペプチド阻害剤の構造と同様に、当該技術分野において公知である。
【００９９】
ポリペプチドプロテアーゼ阻害剤は、その比較的大きな分子量のために、小さな化合物よりも、薬物-担体マトリックス中での濃縮送達（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に適している。本発明に係る製剤及び方法の範囲内にある更なるプロテアーゼ阻害剤には、錯化剤を用いることが含まれる。これらの薬剤は、鼻腔内環境（又は製剤組成物又は治療用組成物）から、多くのプロテアーゼにとっての補因子である２価のカチオンを奪い取ることにより、酵素阻害を媒介する。例えば、適切な濃度において、同調的に投与される補助剤又は組合せて製剤される補助剤として、錯化剤であるＥＤＴＡとＤＴＰＡは、選択されたプロテアーゼを十分に阻害し、これによって、本発明に係る生物活性薬剤の鼻腔内送達を促進させる。この種の阻害剤の更なる代表例は、ＥＧＴＡ、１,１０-フェナントロリン及びヒドロキシキノリンである。加えて、その２価のカチオンをキレートする傾向により、これら及び他の錯化剤は、本発明において直接的な吸収促進剤として有用である。
【０１００】
本明細書の別の個所でより詳細に述べられるように、本発明に係る同調投与、多重処理（ｍｕｌｔｉ-ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及び/又は組合せによる処方の方法並びに組成物において、酵素阻害剤として種々のポリマー、特に粘膜付着性ポリマーを使用することも意図されている。例えば、ポリ（アクリル酸）及びポリカルボフィルといったポリ（アクリレート）誘導体は、トリプシン、キモトリプシンを含む種々のプロテアーゼの活性に作用することが可能である。これらポリマーによる阻害作用も、Ｃａ２+及びＺｎ２+のような２価のカチオンの錯化に基づくものであろう。更に、これらのポリマーが、上記されたような、更なる阻害剤の抱合パートナー又は担体として機能するであろうことも意図されている。例えば、キトサン-ＥＤＴＡ複合体が開発されており、亜鉛依存性プロテアーゼの酵素活性に対して強力な阻害作用を示す点で本発明において有用である。この文脈におけるポリマーの粘膜付着性質は、他の酵素阻害剤が共有結合的に付加した後に、実質的に弱められるはずはなく、また、このようなポリマーが有する本発明の範囲内にある生物活性薬剤のための送達媒体としての一般的な有用性が低減するはずもない。対照的に、粘膜付着のメカニズムにより短縮された送達媒体と粘膜表面間の距離により、活性薬剤の前全身的代謝（ｐｒｅｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）が最小化されると共に、共有結合した酵素阻害剤が、薬剤送達部位に集中して留まるので、不所望の阻害剤の希釈効果、並びにこれによって生じる毒性作用及び他の副作用も最小化される。このようにして、希釈効果の排除により、同調的に投与される酵素阻害剤の有効量を減少させることができる。
【０１０１】
本発明に係る粘膜製剤及び方法において有用な代表的な粘膜付着性ポリマー-酵素阻害剤複合体には、以下のものが含まれるが、これに限定されるわけではない：カルボキシメチルセルロース-ペプスタチン (抗ペプシン活性を有する); ポリ(アクリル酸)-ボーマン・バークインヒビター (抗キモトリプシン); ポリ(アクリル酸)-キモスタチン (抗キモトリプシン); ポリ(アクリル酸)-エラスタチナール (抗エラスターゼ); カルボキシメチルセルロース-エラスタチナール (抗エラスターゼ); ポリカルボフィル-エラスタチナール (抗エラスターゼ); キトサン-アンチパイン (抗トリプシン); ポリ(アクリル酸)-バシトラシン (抗アミノペプチダーゼＮ); キトサン-ＥＤＴＡ (抗アミノペプチダーゼＮ、抗カルボキシペプチダーゼＡ); キトサン-ＥＤＴＡ-アンチパイン (抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ)。
【０１０２】
粘液分解及び粘膜除去の薬剤及び方法
鼻腔内投与による生物治療剤の効果的な送達には、粘膜層の糖たんぱくへの結合による薬物の喪失に加え、鼻粘膜を覆う保護粘膜間の低い薬物輸送効率を考慮しなければならない。通常の粘膜は、水、電解質、ムチン、高分子及び脱落した上皮細胞を含む、粘弾性のあるゲル状の物質である。粘膜は、主として、その下にある粘膜組織の細胞保護のための潤滑性のある皮膜として機能する。粘液は、鼻上皮及び他の粘膜上皮内に位置し、ランダムに分布する分泌細胞から分泌される。粘液の構造単位はムチンである。この糖タンパク質が、主として粘液の粘弾性に関与しているが、他の高分子も粘弾性に寄与している可能性がある。気道粘液では、これらの高分子には、局所的に生産される分泌性のＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、リゾチーム及び気管支トランスフェリン（ｂｒｏｎｃｈｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）も含まれ、これらの高分子も宿主防御機構において重要な役割を果たしている。
【０１０３】
本発明の同調投与方法では、随意に、効果的な粘膜分解剤又は粘膜除去剤を組み込んでもよく、これらの粘膜分解剤又は粘膜除去剤は、鼻腔内粘膜表面の粘液を分解するか、薄くするか、又は取り除くことで、鼻腔内投与された生物治療剤の吸収を促進する働きをする。これらの方法では、粘膜分解剤又は粘膜除去剤は、補助的な化合物として同調投与され、生物活性薬剤の鼻腔内送達を促進することになる。これに代わり、有効量の粘膜分解剤又は粘膜除去剤が、本発明の多重処理方法において、有効量の粘膜分解剤又は粘膜除去剤を処理剤として取り込まれるか、本発明の組合せ製剤において添加剤として取り込まれることで、鼻腔内粘膜の障壁効果を低下させることにより生物治療用化合物の鼻腔内送達を促進する向上した製剤が提供される。
【０１０４】
本発明の方法及び組成物に取り込むための種々の粘膜分解剤又は粘膜除去剤が利用可能である。粘膜分解剤又は粘膜除去剤は、その作用機構に基づき、多くの場合、以下のグループに分類することができる：ムチン糖タンパク質のタンパク質コアを切断するプロテアーゼ（例、プロナーゼ、パパイン）；ムコタンパク質のジスルフィド結合を切るスルフヒドリル化合物；並びに粘液内の非共有結合を破壊する界面活性剤（例、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、Ｔｗｅｅｎ ２０）。この文脈における更なる化合物には、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム及びリゾホスファチジルコリン等の胆汁酸塩及び界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
胆汁酸塩の粘液の構造分解を起こす効率性は、以下の順序である：デオキシコレート＞タウロコレート＞グリココレート。粘液の粘性又は接着性を低下させて、本発明の方法に係る鼻腔内送達を促進する他の効果的薬剤には、例えば、短鎖脂肪酸、及び、Ｎ-アシルコラーゲンペプチド、胆汁酸塩及びサポニン等（後者は、粘膜層構造の維持に重要な役割を果たすＣａ２＋及び/又は Ｍｇ２＋のキレート化によって部分的に機能する）の錯体化によって作用する粘膜分解剤が含まれる。
【０１０６】
本発明の方法及び組成物において使用する更なる粘膜分解剤には、気管支肺の粘液の粘性及び接着性の両方を低下させる強力な粘膜分解剤であり、麻酔をかけたラット内でヒト成長ホルモンの経鼻バイオアベイラビリティを適度に上昇させる（７.５ないし１２.２％）ことが報告されているＮ-アセチル-Ｌ-システイン（ＡＣＳ）が含まれる。これら及び他の粘膜分解剤又は粘膜除去剤は、典型的には、生物活性薬剤との同調投与と共に約０.２ないし２０ ｍＭの濃度範囲で鼻粘膜と接触して、鼻腔内粘液の極性粘性及び／又は弾性を低下させる。
【０１０７】
更に別の粘膜分解剤又は粘膜除去剤は、粘液糖タンパク質内のグリコシド結合を切断可能な種々のグリコシダーゼ酵素から選択することが可能である。α-アミラーゼ及びβ-アミラーゼは、その粘膜分解作用に制限があるかもしれないが、上記のクラスの酵素を代表するものである。対照的に、細菌性のグリコシダーゼは、これらの微生物が宿主の粘膜層に浸透することを可能にする。
【０１０８】
ペプチド及びタンパク質治療剤を含む、本発明の殆どの生物活性薬剤との組合せの使用において、一般的に、非イオノゲン界面活性剤も粘膜分解剤又は粘膜除去剤として有用である。これらの薬剤は、典型的に、治療用ポリペプチドの活性を変化させたり、又は実質的に損なうことがない。
【０１０９】
粘性増加剤
粘性増加剤又は懸濁剤は、投与製剤からの薬物放出の速度及び吸収に影響を及ぼす可能性がある。結果として、粘性増加剤を用いて、いくつかのグルコース調節タンパク質の浸透性を変化させることができる。医薬的に許容可能な粘性増加剤として使用できる物質の例には、メチルセルロース（ＭＣ）；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；セルロース；ゼラチン；デンプン；ヘタスターチ；ポロキサマー；プルロニック；ナトリウムＣＭＣ；ソルビトール；アラビアゴム；ポビドン；カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）；ポリカルボフィル；キトサン；キトサンマイクロスフェア；アルギネートマイクロスフェア；キトサングルタメート；アンバーライト樹脂；ヒアルロナン；エチルセルロース；マルトデキストリンＤＥ；ドラム乾燥されたトウモロコシデンプン（ＤＤＷＭ）；分解性デンプンマイクロスフェア（ＤＳＭ）；デオキシグリココレート（ＧＤＣ）；ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）；ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）；微晶性セルロース（ＭＣＣ）；ポリメタクリル酸及びポリエチレングリコール；スルホブチルエーテルＢシクロデキストリン；架橋されたエルデキソマーデンプンバイオスフェア（ｅｌｄｅｘｏｍｅｒｓｔａｒｃｈｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）；タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）；Ｎ-トリメチルキトサンクロリド（ＴＭＣ）；分解されたデンプンマイクロスフェア；アンバーライト樹脂；キトサンナノ粒子；スプレー乾燥されたクロスポビドン；スプレー乾燥されたデキストランマイクロスフェア；スプレー乾燥された微晶性セルロース ；及び架橋されたエルデオキシマーデンプンマイクロスフェアがある。
【０１１０】
繊毛静止剤及び繊毛静止方法
特定の粘膜組織（例えば、鼻粘膜組織）の粘膜繊毛クリアランスによる自己浄化能は、防御機能（ほこり、アレルゲン及び細菌の除去）として必要であるから、一般的には、この機能は粘膜用薬物によって実質的に損なわれるべきではないと考えられている。気道内の粘膜繊毛輸送は、感染に対する特に重要な防御機構である。この機能を達成するため、鼻及び気道経路内で拍動する繊毛は、吸入した粒子や微生物を除去するように粘膜に沿って粘液層を移動させる。
【０１１１】
繊毛静止剤は、本発明の方法及び組成物において、粘膜（例えば、鼻腔内で）投与された、本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の滞留時間を増大させる用途をもつ。特に、本発明の方法及び組成物におけるこれらの薬剤の送達は、粘膜細胞の繊毛活動を可逆的に阻害する機能を有する１又は２種類以上の繊毛静止剤との同調投与又は組合せ製剤により、著しく促進され、粘膜投与された活性薬剤の滞留時間が一時的に可逆的に増大されることになる。本発明のこれらの局面で用いる場合、先述の繊毛静止因子は全て、繊毛の活動に特異的であれ、又は間接的であれ、許容できない有害な副作用を起こさせることなく、粘膜投与部位の粘膜繊毛クリアランスを一時的（即ち、可逆的）に低下又は停止させて、本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の送達を促進させるような、適切な量（送達の濃度、時間及び方法に依存する）で繊毛静止剤として良好に用いるための候補である。
【０１１２】
単離され、文献中に特徴付けられる種々の細菌性繊毛静止因子を、本発明の態様で用いることができる。シュードモナスアエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の細菌由来の繊毛静止因子には、フェナジン誘導体、ピオ（ｐｙｏ）化合物（２-アルカリ-４-ヒドロキシキノリン）及びラムノリピッド（ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ）（ヘモリジンとしても知られる）が含まれる。ピオ化合物は、５０ μｇ/ｍｌの濃度で、明確に超微小構造を損傷することなく繊毛静止を生じさせた。フェナジン誘導体も繊毛運動を阻害したが、ピオ化合物より十分に高い濃度の４００ μｇ/ｍｌにおいては、ある程度の膜破壊も起こした。気管の外植片を限定的にラムノリピッドに曝露すると、繊毛膜の変化に伴う繊毛静止が生じた。より大量のラムノリピッドへの曝露は、軸糸からのダイニン腕の除去を伴う。
【０１１３】
表面活性剤及び界面活性方法
本発明のより詳細な局面では、本発明の上皮送達方法又は製剤に１又は２種類以上の膜透過促進剤を用いて、本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の上皮送達を促進することができる。この文脈における生体膜透過促進剤は、以下から選択することができる：（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム又は担体、（ｉｖ）アルコール、（ｖ）エナミン、（ｖｉ）ＮＯ供与化合物、（ｖｉｉ）長鎖両親媒性分子（ｖｉｉｉ）低分子疎水性透過促進剤；（ｉｘ）ナトリウム又はサリチル酸誘導体；（ｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル（ｘｉ）シクロデキストリン若しくはβ-シクロデキストリン誘導体、（ｘｉｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉｉ）キレート剤、（ｘｉｖ）アミノ酸若しくはその塩、（ｘｖ）Ｎ-アセチルアミノ酸若しくはその塩、（ｘｖｉ）選択された膜成分に対する酵素分解剤、（ｘｖｉｉ）脂肪酸合成の阻害剤、（ｘｖｉｉｉ）コレステロール合成の阻害剤；又は、（ｘｉｘ）（ｉ）-（ｘｖｉｉｉ）に記載の膜透過促進剤のいずれかの組み合わせ。
【０１１４】
特定の表面活性剤（界面活性剤）は、上皮吸収促進剤として、本発明の上皮送達製剤及び方法に直ちに組み込まれる。本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤と共に同調投与又は組み合せて製剤できるこれらの薬剤は、広範囲に亘る公知の界面活性剤から選択することができる。界面活性剤は、一般的に以下の２種類のクラスに分類される：（１）非イオン性ポリオキシエチレンエーテル；（２）グリココール酸ナトリウム（ＳＧＣ）及びデオキシコレート（ＤＯＣ）のような胆汁酸塩；並びに（３）タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）のようなフシジン酸誘導体。これらの種々のクラスの表面活性剤の作用機構には、典型的には、生物活性薬剤の可溶化が含まれる。しばしば凝集体を形成するタンパク質及びペプチドの場合には、これら吸収促進剤の表面活性特性により、界面活性剤で皮膜されたモノマーのようなより小さな単位が、より迅速に溶液中に維持されるようなタンパク質との相互作用が可能になる。他の表面活性剤の例には、Ｌ-α- ホスファチジルコリンジデカノイル（ＤＤＰＣ）ポリソルベート８０及びポリソルベート２０がある。これらのモノマーは、おそらく凝集体よりも輸送し易い単位である。第二の可能性がある機構は、粘膜環境中のプロテアーゼによるタンパク質分解からのペプチド又はタンパク質の保護である。胆汁酸塩及びあるフシジン酸誘導体は、両方とも、鼻ホモジェネートによるタンパク質のタンパク質分解を、タンパク質吸収の促進に必要とされる濃度を下回るか又は同程度の濃度で阻害することが報告されている。このプロテアーゼ阻害は、短い生物学的半減期を有するペプチドに特に重要となるであろう。
【０１１５】
分解酵素並びに脂肪酸及びコレステロールの合成阻害剤
本発明の適切な局面では、生体膜投与用の本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤は、分解酵素、又は代謝刺激剤又は脂肪酸合成阻害剤、ステロール又は他の選択された上皮障壁成分、米国特許第６,１９０,８９４号、から選択される透過促進剤と共に製剤されるか又は同時投与される。例えば、ホスホリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ及びコンドロイチナーゼのような分解酵素を用いることで、粘膜障壁に不可逆性の損傷を与えることなく、ＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の粘膜透過を促進することができる。１の態様では、コンドロイチナーゼを本明細書に提示する方法又は組成物で用いて粘膜の浸透障壁の糖タンパク質又は糖脂質の成分を変化させ、それによって、本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の粘膜吸収が促進される。
【０１１６】
粘膜障壁成分の合成の阻害剤に関しては、遊離脂肪酸が上皮脂質の２０-２５重量％を占めることが特筆される。遊離脂肪酸の生合成における２種類の律速酵素は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ及び脂肪酸合成酵素である。遊離脂肪酸は、一連の工程を経て、リン脂質へと代謝される。従って、本発明の方法及び組成物で用いるための遊離脂肪酸の合成及び代謝の阻害剤には、５-テトラデシルオキシ-２-フランカルボン酸（ＴＯＦＡ）等のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤；脂肪酸合成酵素の阻害剤；ゴミシンＡ等のホスホリパーゼＡ、２-(ｐ-アミルシナミル)アミノ-４-クロロ安息香酸、ブロモフェナシルブロマイド、モノアリド（ｍｏｎｏａｌｉｄｅ）、７,７-ジメチル-５,８-エイコサジエン酸、ニセルゴリン、セファランチン、ニカルジピン、ケルセチン、ジブチリル-サイクリックＡＭＰ、Ｒ-２４５７１,Ｎ-オレイルエタノールアミン、Ｎ-(７-ニトロ-２,１,３-ベンゾキサジアゾール-４-イル)ホスファチジルセリン、シクロスポリンＡ、ジブカイン、プレニラミン及び全てのトランス及び１３-シス-レチノイン酸等のレチノイドを含む局所麻酔剤、Ｗ-７、トリフルオペラジン、Ｒ-２４５７１(カルミダゾリウム(ｃａｌｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ))、１-ヘキサドシル-３-トリフルオロエチルグリセロ-ｓｎ-２-ホスホメントール(ＭＪ３３)の阻害剤；ニカルジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン、及びニモジピンを含むカルシウムチャネルブロッカー；キナクリン、メパクリン、クロロキン及びヒドロキシクロロキンを含む抗マラリア剤；プロパナロール及びラベタロールを含むβブロッカー；カルモジュリンアンタゴニスト；ＥＧＴＡ；チメルゾール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）；デキサメタゾン及びプレドニゾロンを含む副腎皮質ステロイド；並びにインドメタシン及びナプロキセンを含む非ステロイド系抗炎症剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
遊離ステロール、主としてコレステロールは、上皮脂質の２０-２５重量パーセントを示す。コレステロールの生合成における律速酵素は、３-ヒドロキシ-３-メチルグルタリル（ＨＭＧ）ＣｏＡレダクターゼである。本発明の方法及び組成物に用いるためのコレステロール阻害の阻害剤には、シンバスタチン、ロバスタチン、フルインドスタチン（フルバスタチン）、プラバスタチン、メバスタチン等の（ＨＭＧ）ＣｏＡレダクターゼの競合阻害剤、並びにオレイン酸コレステロール、硫酸コレステロール及びリン酸コレステロール、並びに２５-ＯＨ−;及び２６-ＯＨ-コレステロール等の酸化型ステロール等の他のＨＭＧＣｏＡレダクターゼの競合阻害剤；スクアレン合成酵素の阻害剤；スクワレンエポキシダーゼ；２２,２５-ジアザコレステロール、２０,２５-ジアザコレステノール、ＡＹ９９４４、及びトリパラノール等のＤＥＬＴＡ７又はＤＥＬＴＡ２４レダクターゼの阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
脂肪酸合成の阻害剤又はステロール合成の阻害剤のそれぞれを、１又は２種類以上の本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤と共に同調投与するか、又は組み合せて製剤することで、活性薬剤の上皮透過を促進することができる。粘膜送達用の治療製剤又は補助的製剤中のステロール阻害剤の効果的な濃度の範囲は、一般的に全体の約０.０００１重量％ないし約２０重量％、より典型的には、約０.０１％ないし約５％である。
【０１１９】
一酸化窒素供与剤及び一酸化窒素供与方法
本発明の別の適切な局面において、一酸化窒素（ＮＯ）供与体が、１又は２種類以上の本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の上皮送達を促進するための生体膜透過促進剤として選択される。種々のＮＯ供与体が、当該技術分野で公知となっており、本発明の方法及び組成物にて有効な濃度で有益なものとなる。代表的なＮＯ供与体には、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ＮＯＣ５［３-(２-ヒドロキシ-１-(メチルエチル)-２-ニトロソヒドラジノ)-１-プロパンアミド］、ＮＯＣ１２［Ｎ-エチル-２-(１-エチルヒドロキシ-２-ニトロソヒドラジノ)エタンアミン］、ＳＮＡＰ［Ｓ-ニトロソ-Ｎ-アセチル-ＤＬ-ペニシラミン］、ＮＯＲＩ及びＮＯＲ４が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法及び組成物では、有効量の選択されたＮＯ供与体がは、１又は２種類以上の本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤と共に、上皮内へ又は上皮を介して、同調投与されるか又は組み合わせて製剤される。
【０１２０】
上皮ジャンクションの構造及び/又は生理機能を調節するための薬剤
本発明は、本明細書に開示する上皮送達促進剤と共に１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体及び模倣体、及び/又は他の生物活性薬剤を含み、上皮送達用医薬製剤中に製剤された医薬組成物を提供する。
【０１２１】
透過化処理剤は、典型的に、対象内の、上皮ジャンクション構造及び/又は粘膜上皮表面の生理を調節することにより、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に促進する。この効果は、典型的に、透過化処理剤による、隣り合う上皮細胞の上皮膜接着タンパク質間のホモタイプ又はヘテロタイプの結合の阻害を伴う。このホモタイプ又はヘテロタイプの結合をブロックするための標的タンパク質は、種々の適切なジャンクション接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）、又はクローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）から選択することができる。その例としては、これらタンパク質の細胞外ドメインに結合する抗体、抗体断片又は一本鎖抗体がある。
【０１２２】
更なる詳細な態様では、本発明は、粘膜上皮傍細胞輸送を促進するための透過化ペプチド並びにペプチド類似体及び模倣体を提供する。対象のペプチド並びにペプチド類似体及び模倣体は、典型的に、対象哺乳物内の上皮ジャンクションの構造及び/又は生理機能を調節することによって本発明の組成物及び方法で機能する。特定の態様では、ペプチド並びにペプチド類似体及び模倣体は、ジャンクション接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン又はクローディンから選択される上皮膜接着タンパク質のホモタイプ及び/又はヘテロタイプの結合を効果的に阻害する。
【０１２３】
このような薬剤のうちで十分に研究が行われた１つが、「閉鎖帯毒素（ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ ｔｏｘｉｎ）」（ＺＯＴ）として知られるコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来の細菌毒素である。上記毒素は、感染した対象内で腸粘膜の浸透性の増加を媒介し、下痢を含む疾患症状を生じさせる。Ｆａｓａｎｏ, ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ. Ｎａｔ. Ａｃａｄ. ＳｃＩ, Ｕ.Ｓ.Ａ. ５:５２４２-５２４６, １９９１。ウサギの回腸粘膜で試験した場合、ＺＯＴは、細胞間タイトジャンクションの構造を調節することで腸透過性を増大させた。より最近では、ＺＯＴが、腸粘膜内のタイトジャンクションを可逆的に開放できることが判明している。また、ＺＯＴは、鼻粘膜内のタイトジャンクションを可逆的に開放できることも報告されている。米国特許第５,９０８,８２５号。
【０１２４】
本発明の方法及び組成物において、ＺＯＴ並びにＺＯＴ活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして機能するＺＯＴの種々の類似体及び模倣体は、鼻粘膜内への又は鼻粘膜間の傍細胞吸収を増大させることから、生物活性薬剤の鼻腔内送達の促進に有用である。この点において、ＺＯＴは、典型的に、ジャンクションタンパク質ＺＯ１の位置の変化により特徴づけられる、タイトジャンクションの構造の再構築を生じさせることで、作用を及ぼす。本発明のこれらの局面において、ＺＯＴは、有効量の生物活性薬剤と共に同調投与されるか又は組み合わせて製剤されることで、実質的に有害な副作用を起こすことなく、鼻粘膜の透過性を可逆的に増大させて、活性薬剤の吸収を顕著に促進する。
【０１２５】
血管拡張剤及び血管拡張方法
本発明の方法及び組成物に係る同調投与及び組合せ製剤において、有益な実用性を示す吸収促進剤の別のクラスは、血管作用性の化合物であり、より具体的には血管拡張剤である。これらの化合物は、本発明において、粘膜下の脈管系の構造及び生理機能を調節して、上皮内へ若しくは上皮を介した、及び/又は特定の標的組織若しくは区画（例えば、体循環又は中枢神経系）への、ＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の輸送率を増大させる機能を有する。
【０１２６】
本発明で用いるための血管拡張剤は、典型的には、細胞質内のカルシウムを減少させるか、一酸化窒素（ＮＯ）を増大させるか、又はミオシン軽鎖キナーゼを阻害するかのいずれかにより粘膜下の血管を弛緩させる。これらの血管拡張剤は、以下９のクラスに分類される：カルシウムアンタゴニスト、カリウムチャネル開口剤、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、α-アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト及びイミダゾールレセプターアンタゴニスト、β１-アドレナリン作動性アゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エイコサノイド並びにＮＯ供与体。
【０１２７】
化学的な差異にも関わらず、カルシウムアンタゴニストの薬理動態特性は類似している。体循環内への吸収率が高く、従って、こららの薬剤は、相当な肝臓による初回通過代謝を受けることになり、個々の薬物動態の差を生じることになる。ジヒドロピリジン型（アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニルバジピン、ニソルジピン及びニトレンジピン）の新たな薬物を除けば、カルシウムアンタゴニストの半減期は短い。従って、これらの多くの効果的な薬物濃度を維持するためには、本明細書中の別の個所に記載するような多重投与、又は徐放製剤による送達を必要とする場合がある。カリウムチャネル開口剤ミノキシジルを用いた処理は、その潜在的な有害な副作用により、投与のレベルと方法が限定される可能性がある。
【０１２８】
ＡＥＣ阻害剤は、アンギオテンシン-Ｉからアンギオテンシン-ＩＩへの変換を防止し、特にレニンの生産が増加した場合に最も効果を示す。ＡＣＥは、強力な内在性血管拡張剤であるブラディキニンを不活性化させるキニナーゼＩＩと同一であるので、ＡＣＥの阻害は、ブラディキニン分解を低下させる。ＡＣＥ阻害剤は、モデル動物内で心臓の線維症及び心室肥大を予防して進行を反転させることで心臓保護及び心臓回復作用という更なる有益性を提供する。殆どのＡＣＥ阻害剤の主な排出経路は、腎排泄を介する。従って、腎臓障害は、低い排泄率と関連し、中程度から重度の腎臓障害を患う患者では、投与量を２５ないし５０％低下させることが推奨される。
【０１２９】
ＮＯ供与体に関しては、これらの化合物は、その粘膜浸透性に対する更なる作用のため、本発明において特に有用である。上述のＮＯ供与体に加えて、ＮＯ/求核試薬又はＮＯＮＯａｔｅと呼ばれる求核試薬とのＮＯの複合体は、生理的ｐＨにある水溶液中に溶解した場合に、自然に非酵素的にＮＯを放出する。対照的に、ニトログリセリン等のニトロ系血管拡張剤は、ＮＯ放出に特別な酵素活性を要する。ＮＯＮＯａｔｅは、特定の化学量論にて、ジエチルアミン/ＮＯの場合の３分未満ないしジエチレントリアミン/ＮＯ（ＤＥＴＡＮＯ）の場合の約２０時間の範囲内の予想可能な速度でＮＯを放出する。
【０１３０】
本発明の特定の方法及び組成物では、選択された血管拡張剤が、１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤と共に、活性薬剤の粘膜吸収を促進するのに効果的な量で同調投与される（例えば、全身的に又は鼻腔内で、同時に又は効果的な時間的関連性を持った組合せで）か、又は組み合わせて製剤されて、対象内の標的組織又は区画（例えば、肝臓、肝門静脈、ＣＮＳの組織若しくは液体、又は血漿）へ到達する。
【０１３１】
選択的な輸送促進剤及び輸送促進方法
本発明の組成物及び送達方法は、随意に、１又は２種類以上の生物活性薬剤の輸送を促進する選択的な輸送促進剤を取り込んでもよい。１又は２種類以上の本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体を用いた組合せ製剤又は同調投与のプロトコルにこれらの輸送促進剤を用いて、１又は２種類以上の更なる生物活性薬剤の生体膜輸送障壁間の送達を同調的に促進し、活性薬剤の上皮送達を促進して、対象内の標的組織又は区画（例えば、粘膜上皮、肝臓、ＣＮＳの組織若しくは液体、又は血漿）へ到達させることができる。これに代わり、組合せ製剤又は同調投与のプロトコルに輸送促進剤を用いて、更なる生物活性薬剤の送達を促進するとともに又は促進することなしに、１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体及び模倣体の上皮送達を直接的に促進することもできる。
【０１３２】
本発明の上記局面で用いるための代表的な選択的輸送促進剤には、グリコシド、糖含有分子、及び上皮輸送障壁成分と特異的に相互作用することが知られているレクチン等の結合剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、レセプター媒介性相互作用によって細胞表面の糖部分に結合する、種々の植物及び細菌由来のレクチンを含む、特定の「生体接着性」リガンドを、本発明の範囲内の生物活性薬剤の粘膜、例えば、鼻送達を促進するための担体又は抱合した輸送媒体として用いることができる。本発明で用いるための特定の生体接着性リガンドは、特別な細胞輸送プロセス（エンドサイトーシス又はトランスサイトーシス）による該接着性リガンドの選択的取り込みを開始させる、生物学的シグナルの上皮標的細胞への伝達を媒介するであろう。従って、これらの輸送媒体を「担体系」として用いて、粘膜上皮内及び/又は粘膜上皮を通る、１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体及び模倣体、並びに他の生物活性薬剤の選択的取り込みを刺激するか又は支配することができる。これら及び他の選択的輸送促進剤は、本発明の範囲内の高分子生物医薬（特に、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのベクター）の上皮送達を著しく促進する。レクチンは、、真核細胞の糖タンパク質及び糖脂質の表面上に認められる特定の糖に結合する植物タンパク質である。レクチンの濃縮溶液は、「粘膜牽引（ｍｕｃｏｔｒａｃｔｉｖｅ）」作用を示し、種々の研究により、粘膜表面間におけるレクチン及びレクチン抱合体（例えば、コロイド状の金粒子と抱合したコンカナバリンＡ）の迅速なレセプター媒介性エンドサイトーシス（ＲＭＥ）が実証されている。更なる研究により、レクチンの取込み機構は、インビボでの腸用薬物のターゲッティングに利用できることが報告されている。これらの研究から確かなことは、ポリスチレンナノ粒子（５００ ｎｍ）がトマトのレクチンに共有結合していたことであり、ラットへの経口投与後に全身の取込みが改善されたことが報告されている。
【０１３３】
植物のレクチンに加え、細菌由来の接着因子及び侵入因子も、本発明の粘膜送達方法及び組成物で接着性の/選択的な輸送担体として用いられる候補物質の豊富な供給源を提供する。細菌性の接着プロセスには、バクテリア由来の「アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ）」（接着因子又は定着因子）及び宿主細胞表面上のレセプターといった、２種類の成分が必要とされる。粘膜感染を起こす細菌は、上皮表面に付着する前に粘液層を透過する必要がある。上記付着は、細胞表面の他の成分も、このプロセスに寄与するであろうが、通常は細菌の繊毛又は毛状構造によって媒介される。付着細菌は、標的細胞内部でシグナル伝達機構を介した（毒素による助けを借りるか又は借りずに）増殖と一連の生化学反応の開始によって、粘膜上皮に定着する。これらの侵入機構に関するものとして、本来種々の細菌及びウィルスから生産された多種多様な生体接着性タンパク質（例えば、インベーシン、インターナリン）が知られている。これらの生体接着性タンパク質によって、このような微生物が、驚くべき選択性をもって、宿主種及び更には特定の標的組織へ細胞外接着することが可能になる。このようなレセプター-リガンド相互作用により伝達されるシグナルは、エンドサイトーシス及びトランスサイトーシスのプロセスによる、無傷の生きた微生物の、上皮細胞の中への輸送、最終的にはそれを貫通した輸送を開始させる。このような自然界で起こる現象は、本明細書の教示に従って、生体膜内へ若しくは生体膜間の、及び/又は薬物作用の他の指定の標的部位への生物活性化合物の送達促進に利用することができる（例えば、ＧＲＰのような生物活性薬剤をアドヘシンと複合体化させる等によって）。
【０１３４】
特異的な、レクチンの様な方法で上皮表面に結合する種々の細菌及び植物由来毒素も、本発明の方法及び組成物にて有用である。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ＲＭＥによって迅速に宿主細胞内へ侵入する。同様に、大腸菌易熱性毒素のＢサブユニットは、腸の上皮細胞の刷子縁に、非常に特異的なレクチンの様な方法で結合する。腸細胞の基底外側への上記毒素の取込み及びトランスサイトーシスは、インビボ及びインビトロで報告されている。他の研究者は、大腸菌内のジフテリア毒素の膜貫通ドメインをマルトース結合性融合タンパク質として表現し、高い分子量をもつポリ-Ｌ-リジンへ化学的に結合させた。得られた複合体は、インビトロでのレポーター遺伝子の内在化の媒介を成功させた。上記の例に加え、スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、スーパー抗原及び毒素の両方として作用する一連のタンパク質（例えば、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ＳＥＢ、トキシックショック症候群毒素Ｉ（ＴＳＳＴ-Ｉ））を生産する。これらのタンパク質に関する研究では、Ｃａｃｏ-２細胞内でのＳＥＢ及びＴＳＳＴ-Ｉの容量依存的なトランスサイトーシスの促進が報告されている。
【０１３５】
ウィルスの赤血球凝集素は、本発明の方法及び組成物の範囲内の生物活性薬剤の粘膜送達を促進するための別の種類の輸送剤を構成する。多くのウィルス感染の最初のステップは、粘膜細胞への表面タンパク質（赤血球凝集素）の結合である。これらの結合タンパク質は、ロタウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、アデノウイルス、ジャガイモ葉巻ウイルス、及びレオウイルスを含む殆どのウィルスについて同定されている。これら及び他の代表的なウィルス由来赤血球凝集素を、１又は２種類以上の本明細書に記載のＧＲＰ、類似体及び模倣体と共に組合せ製剤（例えば、混合又は抱合製剤）又は同調投与のプロトコルで用いて、１又は２種類以上の更なる生物活性薬剤の粘膜送達を同調的に促進することができる。これに代わり、組合せ製剤又は同調投与のプロトコルにウィルス由来赤血球凝集素を用いて、更なる生物活性薬剤の送達を促進するとともに又は促進することなしに、１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体及び模倣体の粘膜送達を直接的に促進することもできる
【０１３６】
種々の内在性の、選択的輸送媒介因子を本発明で利用することもできる。哺乳動物細胞は、特定の物質の内在化を促進し、これらの物質を特定の区画にターゲッティングする種々の機構を発達させてきた。集合的には、これらの膜の変形過程は、「エンドサイトーシス」と呼ばれ、食作用、飲作用、レセプター媒介性エンドサイトーシス（クラスリン媒介性ＲＭＥ)、及びポトサイトーシス（非クラスリン媒介性ＲＭＥ)が含まれる。ＲＥＭは、高度に特殊化した細胞の生物学的プロセスであり、その名称が示すように、種々のリガンドが細胞表面のレセプターに結合し、続いて、細胞内へ内部移行して輸送されることで生じる。多くの細胞では、３０分未満で、全ての膜表面が内部移行して置き換わる程、エンドサイトーシスのプロセスが活発に起こっている。その細胞膜内での配向に基づいて、２クラスのレセプターが提唱されている；Ｉ型レセプターのアミノ末端は、膜の細胞外側に位置するが、ＩＩ型レセプターは、同じタンパク質尾部を、細胞内環境に有する。
【０１３７】
本発明の更なる態様では、上皮送達された生物活性薬剤の担体又はＲＭＥの刺激剤としてトランスフェリンが利用される。８０ ｋＤａの鉄輸送糖タンパク質であるトランスフェリンは、ＲＭＥによって細胞内へ効率的に取り込まれる。トランスフェリンレセプターは殆どの増殖中の細胞表面に見ることができ、赤芽球及び多くの種類の腫瘍表面ではその数が増大している。トランスフェリン（Ｔｆ）及びトランスフェリン抱合体のトランスサイトーシスは、真菌の代謝物であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の存在によって増加することが報告されている。別の研究では、ＢＦＡ処理により、ＭＤＣＫ細胞の頂端部でのリシンとＨＲＰの両方のエンドサイトーシスが迅速に増大されることが報告されている。従って、本発明の方法において、ＢＦＡ及びレセプター媒介性輸送を促進する他の薬剤を、組み合せて製剤され（例えば、抱合される）、そして/又は同調的に投与される薬剤として用いることで、ＧＲＰ、類似体及び模倣体を含む生物活性薬剤のレセプター媒介性輸送を促進することができる。
【０１３８】
ポリマー送達賦形剤及び方法
本発明の特定の局面の範囲内で、本明細書中に開示したＧＲＰ、類似体、及び模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、他の生理活性物質、並びに上記のような送達促進剤は、担体又は基剤として機能する生体適合性ポリマーを含む経上皮（例えば、経鼻）的に投与される製剤内に、個別に又は組み合わせて組み込まれる。かかるポリマー担体としては、数あるポリマー形態の中でも、ポリマー粉末、マトリクス、又は微粒子送達賦形剤が挙げられる。ポリマーは、植物、動物、又は合成起源であってよい。ポリマーは、架橋している場合が多い。さらに、これらの送達系では、ＧＲＰ、類似体、又は模倣体をポリマーと共有結合し、単に浸漬（ｉｓｈｉｎｇ）することによってポリマーから分離不可能にすることができる様式で官能化することができる。他の態様では、生理活性物質及び／又は送達促進剤を分解又は不活化することができる酵素又は他の薬剤の阻害剤で、ポリマーを化学修飾する。特定の製剤では、ポリマーは、例えば、ヒドロゲル等の、部分的に又は完全に水不溶性であるが水膨潤性を示すポリマーである。本発明のこの局面で有用なポリマーは、本質的に水相互作用性及び／又は親水性であって、大量の水を吸収することが望ましく、水と平衡に達するのに十分な期間、水又は水性媒質と接触して配置された場合にヒドロゲルを形成することが多い。より詳細な態様では、ポリマーは、過剰な水と接触して配置された場合、室温で水に曝露した際平衡状態でその重量の少なくとも２倍の水を吸収するヒドロゲルである（米国特許第６,００４,５８３号）。
【０１３９】
生分解性ポリマーに基づいた薬物送達系は、かかる系が加水分解又は酵素反応のいずれかによって非毒性分子に分解されるため、多くの生物医学的用途において好ましい。分解速度は、生分解性ポリマーマトリクスの組成を操作することによって制御される。したがって、かかる種類の系は、生理活性物質の長期放出のための特定の状況で使用することができる。ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ−（乳酸）（ＰＬＡ）、及びポリ（Ｄ,Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）のような生分解性ポリマーは、これらのポリマーの分解産物の毒性が低いことが見出されているため、可能な薬物送達担体として非常に注目されている。身体の正常な代謝機能中に、これらのポリマーは二酸化炭素と水に分解される。これらのポリマーはまた、優れた生体適合性も示す。
【０１４０】
本明細書中に開示したＧＲＰ、類似体、模倣体、及び他の生理活性物質、並びに任意の送達促進剤の生物活性を延長するために、これらの薬剤を、例えば、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、又はポリエステル等のポリマーマトリクスに組み込んでよい。これにより、例えば、ポリマーマトリクスの分解によって測定したところ、活性物質の活性及び放出が維持された。合成ポリマー内の生物治療分子の封入によって保存及び送達中にこれらの分子を安定化することができるにもかかわらず、ポリマー系放出技術の最大の障害は、多くの場合、熱、超音波処理、又は有機溶媒の関与する製剤過程中に治療分子の活性が喪失することである。
【０１４１】
本発明の範囲内での使用が意図される吸収促進ポリマーは、改変、修飾、又はブレンドが、水吸収、ヒドロゲル形成、及び／又は化学的安定性等のような、有用な用途のための所望の特性に悪影響を与えない限り、他の天然又は合成ポリマー、ゴム、樹脂、及び他の薬剤、並びにこれらの材料の互いの又は他のポリマーとのブレンドに加えて、前述の種類のポリマーの誘導体及び化学的又は物理的な修飾バージョンを含んでよい。本発明のより詳細な局面では、ナイロン、アクリラン、及び他の通常は疎水性の合成ポリマーのようなポリマーを、反応により十分に修飾し、水膨潤性にし、及び／又は水性媒質中で安定なゲルを形成してもよい。
【０１４２】
本発明の吸収促進ポリマーとしては、アクリル酸及びメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート又はメタクリレート、ビニルピロリドン等のビニルモノマー、並びにポリビニルアルコール及びそのコポリマー及びターポリマー、ポリビニルアセテート及び上記に列挙したモノマーとのコポリマー及びターポリマー、並びに２−アクリルアミド−２−メチル−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ（登録商標））の種々の組み合わせに基づいたホモポリマー及びコポリマーの群由来のポリマーを挙げることができる。上記に列挙したモノマーと、エステル基が炭素数１ないし６のアルキル置換基を含んでよい４つ以下の芳香環を有する直鎖又は分岐アルキル、アリール基由来である、アクリル又はメタクリルアミドアクリレート又はメタクリレートエステル類のような共重合可能な官能性モノマー、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノアルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルオキシアルキルトリメチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリルオキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライドのようなステロイド系、硫酸、リン酸、又はカチオン性モノマーとのコポリマーが非常に有用である。
【０１４３】
本発明の範囲内で使用されるさらなる吸収促進ポリマーは、デキストラン、デキストリンとして分類されるポリマー、天然ゴム及び樹脂として分類される材料分類に由来するポリマー、又は加工コラーゲン、キチン、キトサン、プルラン、ズーグラン（ｚｏｏｇｌａｎ）、アルギン酸塩、及び「ケルコロイド（Ｋｅｌｃｏｌｏｉｄ）」（ポリプロピレングリコール修飾アルギン酸塩）のような修飾アルギン酸塩、「ケロコゲル（Ｋｅｌｏｃｏｇｅｎ）」のようなジェランガム、「ケルトロール（Ｋｅｌｔｒｏｌ）」のようなキサンタンガム、エスタスチン、αヒドロキシブチレート及びそのコポリマー、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリ乳酸及びグリコール酸のような天然ポリマー分類に由来するポリマーである。
【０１４４】
本発明の範囲内で適用可能なポリマーの非常に有用な分類は、少なくとも１つの活性炭−炭素オレフィン炭素二重結合及び少なくとも１つのカルボキシル基を含むオレフィン性不飽和カルボン酸、即ち、カルボキシル基に対するα−β位の又は末端メチレン基の一部としてのいずれかのモノマー分子中に存在するために、重合において容易に機能するオレフィン二重結合を含む酸に容易に変換される酸又は官能基である。この分類のオレフィン性不飽和酸としては、アクリル酸自体、α−シアノアクリル酸、βメチルアクリル酸（クロトン酸）、α−フェニルアクリル酸に代表されるアクリル酸、β−アクリルオキシプロピオン酸、桂皮酸、ｐ−クロロ桂皮酸、１−カルボキシ−４−フェニルブタジエン−１,３−イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、グルタコン酸、アコニット酸、マレイン酸、フマル酸、及びトリカルボキシエチレンに代表されるアクリル酸のような材料が挙げられる。本明細書中で使用する時、「カルボン酸」という用語は、ポリカルボン酸及び無水物基が同一のカルボン酸分子上に位置する２つのカルボキシル基からの１つの水分子の脱離により形成される無水マレイン酸のような、これらの無水酸を含む。
【０１４５】
本発明の範囲内で吸収促進剤として有用な代表的なアクリル酸塩としては、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸メチル、エタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ノニル、アクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ｎ−ヘキシル等が挙げられる。高級アルキルアクリル酸エステルは、アクリル酸デシル、メタクリル酸イソデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸ベヘニル、及びアクリル酸メリシル、並びにこれらのメタクリル酸バージョンである。２又は３又は４種類以上の長鎖アクリル酸エステルの混合物を、１種類のカルボン酸モノマーと首尾よく重合することができる。他のコモノマーとしては、αオレフィン類を含むオレフィン類、ビニルエーテル類、ビニルエステル類、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１４６】
アクリル酸ニトリルを含む他のビニリデンモノマーもまた、本発明の方法及び組成物の範囲内の吸収促進剤として使用し、被験体内の標的組織又は区画（例えば、肝臓、肝門静脈、ＣＮＳ組織若しくは体液、又は血漿）への活性物質の送達促進を含む、１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質の送達及び吸収を増強することができる。有用なα−、β−オレフィン性不飽和ニトリル類は、好ましくは、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等のような炭素数３ないし１０のモノオレフィン性不飽和ニトリルである。アクリロニトリル及びメタクリロニトリルが最も好ましい。モノオレフィン性不飽和アミドを含む、炭素数３ないし３５のアクリル酸アミドを使用してもよい。代表的アミド類としては、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−シクロヘキシルアクリルアミド、窒素上のアルキル基が炭素数８ないし３２である高級アルキルアミド類、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−プロパノールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−メチロールマレイミド、Ｎ−メチロールマレイン酸エステル、Ｎ−メチロール−ｐ−ビニルベンズアミド等のような炭素数４ないし１０のものを含む、α、β−オレフィン性不飽和カルボン酸のＮ−アルキロールアミドを含むアクリル酸アミドが挙げられる。
【０１４７】
さらに有用な吸収促進物質は、炭素数２ないし１８、より好ましくは炭素数２ないし８のα−オレフィン類；炭素数４ないし１０のジエン類；酢酸ビニルのようなビニルエステル類及びアリルエステル類；スチレン、メチルスチレン、及びクロロスチレンのようなビニル芳香族化合物類；ビニルメチルエーテル及びメチルビニルケトンのようなビニル及びアリルエーテル類並びにケトン類；クロロアクリレート類；α−シアノメチルアクリレート並びにα−、β−、及びγ−シアノプロピルアクリレートのような、シアノアルキルアクリレート類；メトキシエチルアクリレートのようなアルコキシアクリレート類；クロロエチルアクリレートのようなハロアクリレート類；ハロゲン化ビニル及び塩化ビニル、塩化ビニリデン等；ジビニルエーテル、ジエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、メチレン−ビス−アクリルアミド、アリルペンタエリスリトール等のようなジビニル類、ジアクリレート類、及び他の多官能性モノマー；並びにビス（β−クロロエチル）ビニルホスホネート等のようなビス（β−ハロアルキル）アルケニルホスホネートであり、これらは当業者に公知である。カルボキシ含有モノマーが微量成分であるコポリマー及び主成分として存在する他のビニリデンモノマーは、本明細書中に開示した方法にしたがって容易に調製される。
【０１４８】
本発明の範囲内の吸収促進剤としてヒドロゲルを使用する場合、これらは、水相互作用性及び水膨潤性を示す、アクリル酸基及びメタクリル酸基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）基若しくはヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）基、並びにビニルピロリドン基由来の合成コポリマーから構成されてよい。特にペプチド又はタンパク質の送達に有用なポリマーの具体的な実例は、以下の種類のポリマーである：（メタ）アクリルアミド及び０.１ないし９９重量％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリルアミド類及び０.１ないし７５重量％の（メタ）アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド；（メタ）アクリルアミド及び０.１ないし７５重量％の（メタ）アクリルアミド；アクリル酸及び０.１ないし７５重量％のアルキル（メタ）アクリレート類；（メタ）アクリルアミド及び０.１ないし７５重量％のＡＭＰＳ.ＲＴＭ.（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ社の商標）；（メタ）アクリルアミド及び０ないし３０重量％のアルキル（メタ）アクリルアミド類、及び０.１ないし７５重量％のＡＭＰＳ.ＲＴＭ.；（メタ）アクリルアミド及び０.１ないし９９重量％のＨＥＭＡ；（メタ）アクリルアミド及び０.１ないし７５重量％のＨＥＭＡ、及び０.１ないし９９重量％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリル酸及び０.１ないし９９重量％のＨＥＭＡ；５０モル％のビニルエーテル及び５０モル％の無水マレイン酸；（メタ）アクリルアミド及び０.１ないし７５重量％の（メタ）アクリルオキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；（メタ）アクリルアミド及び０.１ないし９９重量％のビニルピロリドン；（メタ）アクリルアミド及び５０重量％のビニルピロリドン、及び０.１ないし９９.９重量％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリル酸及び０.１ないし７５重量％のＡＭＰＳ.ＲＴＭ.、及び０.１ないし７５重量％のアルキル（メタ）アクリルアミド。上記例では、アルキルは、Ｃ１ないしＣ３０、好ましくはＣ１ないしＣ２２の直鎖及び分岐鎖並びにＣ４ないしＣ１６の環式を意味し、（メタ）を使用する場合、メチル基を含む及び含まないモノマーが含まれることを意味する。他の非常に有用なヒドロゲルポリマーは、ポリ（ビニルピロリドン）デンプン、カルボキシメチルセルロース、及びポリビニルアルコールの膨潤性を示すが不溶性であるバージョンである。
【０１４９】
本発明の範囲内で有用なさらなる重合ヒドロゲル物質としては、（ポリ）ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート：アニオン性及びカチオン性ヒドロゲル：ポリ（電解質）錯体；酢酸残渣の少ないポリ（ビニルアルコール類）：架橋寒天と架橋カルボキシメチルセルロースとの膨潤性混合物：微架橋寒天と混合したメチルセルロースを含む膨潤性組成物；無水マレイン酸とスチレン、エチレン、プロピレン、又はイソブチレンとの微粉コポリマーの分散によって生成された水膨潤性コポリマー；Ｎ−ビニルラクタム類の水膨潤性ポリマー；及びカルボキシメチルセルロースの膨潤性ナトリウム塩等が挙げられる。
【０１５０】
本発明の範囲内の生理活性物質の粘膜送達のための親水性ヒドロゲルの形成に有用な他のゲル性流体吸水及び保持ポリマーとしては、ペクチン；寒天、アラビアゴム、カラヤ、トラガセント（ｔｒａｇａｃｅｎｔｈ）、アルギン、及びグアー、並びにその架橋バージョンのような多糖類；アクリル酸ポリマー、コポリマー、及び塩誘導体、ポリアクリルアミド類；水膨潤性インデン無水マレイン酸ポリマー；デンプングラフトコポリマー；原重量の約２ないし４００倍の水吸収性を有するアクリレート型ポリマー及びコポリマー；ポリグルカンのジエステル類；架橋ポリ（ビニルアルコール）とポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）との混合物；ポリオキシブチレン−ポリエチレンブロックコポリマーゲル；イナゴマメゴム；ポリエステルゲル；ポリ尿素ゲル；ポリエーテルゲル；ポリアミドゲル；ポリイミドゲル；ポリペプチドゲル；ポリアミノ酸ゲル；ポリセルロースゲル；架橋インデン−無水マレイン酸アクリレートポリマー；及び多糖類が挙げられる。
【０１５１】
本発明の範囲内で使用される合成ヒドロゲルポリマーは、幾つかの比率での幾つかのモノマーの無数の組み合わせによって作製することができる。ヒドロゲルは架橋してよく、これは、一般に、流体を同化して吸収し、拡大した平衡状態に膨潤又は膨張する能力を有する。ヒドロゲルは、通常、鼻粘膜表面への送達時に膨潤又は膨張し、その重量の約２ないし５倍、５ないし１０倍、１０ないし５０倍、５０ないし１００倍、又はそれを超えるの水を吸収する。様々な生理活性物質について、ポリマーによって輸送され又はポリマー内に捕捉され、若しくは封入される活性物質の分子量、大きさ、溶解性、及び拡散特性、並びに各ポリマーに関連する特定のスペーシング及び協同の結鎖運動のような要因に依存して、所与のヒドロゲルの最適な膨潤度が決定される。
【０１５２】
本発明の範囲内で有用な親水性ポリマーは、水不溶性であるが、水膨潤性である。かかる水で膨潤したポリマーを、通常、ヒドロゲル又はゲルという。かかるゲルは、適切な架橋剤によるポリマーの架橋過程によって水溶性ポリマーから都合良く生成することができる。しかしながら、安定なヒドロゲルはまた、当該分野で公知の方法にしたがって、ｐＨ、温度、及び／又はイオン濃度の規定された条件下で特定のポリマーから形成することもできる。通常、架橋された、即ち、ポリマーが良好な親水性を有する程度に架橋されたポリマーは、（同一又は類似の型の非架橋ポリマーと比較して）物理的完全性が向上し、適切な位置及び時間で活性物質を放出する能力を保持しながら、目的の生理活性物質及び、サイトカイン又は酵素阻害剤のような、それと同時投与するためのさらなる化合物をともにゲルネットワーク内で保持する能力が向上する。
【０１５３】
一般に、本発明の範囲内で使用されるヒドロゲルポリマーは、コポリマーを形成するモノマーの重量に基づいて０.０１ないし２５重量％、より好ましくは０.１ないし２０重量％、より頻繁には０.１ないし１５重量％の量の二官能性架橋剤と架橋する。架橋剤の別の有用な量は、０.１ないし１０重量％である。三官能性、四官能性、又はそれ以上の多官能性架橋剤を使用してもよい。かかる試薬を使用する場合、同等の架橋密度、即ち架橋度、又は生理活性物質を効率的に含有するのに十分なネットワーク特性を得るために必要な量は少量でよい。
【０１５４】
架橋は、含水流体の存在下で膨潤する能力を有するポリマーとの共有結合、イオン結合、又は水素結合であってよい。かかる架橋剤及び架橋反応は当業者に公知であり、多くの場合、ポリマー系に依存する。したがって、不飽和モノマーのフリーラジカル共重合によって架橋ネットワークを形成することができる。ポリマーヒドロゲルは、アルコール類、酸類、アミン類のようなポリマー上に見出される官能基と、グリオキサール、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド、二無水物のような基との反応による予備形成ポリマーの架橋によって形成してもよい。
【０１５５】
ポリマーは、例えば、デカジエン又はトリビニルシクロヘキサン等の任意のポリエン；Ｎ,Ｎ−メチレン−ビス（アクリルアミド）のようなアクリルアミド；トリメチロールプロパントリアクリレートのような多官能性アクリレート類；又は、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、アリルアクリレート等を含む、少なくとも２つの末端ＣＨ２基を含む多官能性ビニリデンモノマーと架橋してもよい。特定の態様では、コポリマーの調製で使用するための架橋モノマーは、例えば、少なくとも２個の炭素原子及び少なくとも２個の水酸基を含有する多価アルコールのエーテル化によって作製される、所望により、オレフィン二重結合が末端メチレン基（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）に結合して存在するアルケニル基を有する場合のある、１分子あたり１超過のアルケニルエーテル基（ａｌｋｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を有するポリアルケニルポリエーテル類である。この種類の化合物は、アリルクロライド又はアリルブロミドのようなハロゲン化アルケニルと、１又は２種類以上の多価アルコール類の強アルカリ性水溶液との反応によって生成することができる。生成物は、ポリエーテル類と種々の数のエーテル基との複合混合物であってよい。ポリエーテル架橋剤の効率は、分子上の潜在的に重合可能な基の数とともに向上する。通常、１分子あたり平均２又は３つ以上のアルケニルエーテル基（ａｌｋｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含有するポリエーテル類を使用する。他の架橋モノマーとしては、例えば、ジアリルエステル類、ジメタアリルエーテル類、アリル又はメタアリルアクリレート類及びアクリルアミド類、テトラビニルシラン、ポリアルケニルメタン類、ジアクリレート類、及びジメタクリレート類、ジビニルベンゼンのようなジビニル化合物、ポリアリルホスフェート、ジアリルオキシ化合物、並びに亜リン酸エステル類等が挙げられる。代表的な薬剤は、アリルペンタエリスリトール、アリルスクロース、トリメチロールプロパントリアクリレート、１,６−ヘキサンジオールジアクリレート、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、ペンタエリスリトールトリアクリレート、テトラメチレンジメタクリレート、エチレンジアクリレート、エチレンジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート等である。アリルペンタエリスリトール、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、及びアリルスクロースは、適切なポリマーを提供する。架橋剤が存在する場合、ポリマー混合物は、通常、全カルボン酸モノマーに基づいて、例えば、１重量％、５重量％、又は１０重量％、又はそれ以上等の約０.０１ないし２０重量％の架橋モノマー、さらに他のモノマーを含有する。
【０１５６】
本発明のより詳細な局面では、本明細書中に開示したＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質の上皮送達は、例えば、分解酵素の作用から活性物質を保護するヒドロゲルのような徐放性又は酵素的若しくは生理学的保護担体若しくは賦形剤中に活性物質を保持することにより促進される。特定の態様では、活性物質を、化学的手段によって担体又は賦形剤に結合させ、それは、酵素阻害剤、サイトカイン等のようなさらなる薬剤と混合又は結合させてもよい。あるいは、活性物質を、十分な物理的捕捉を通して、例えば、ポリマーマトリクス等の担体又は賦形剤内に固定化してよい。
【０１５７】
本発明の範囲内で有用なヒドロゲルのようなポリマーは、それと共に処方する活性物質の鼻腔内バイオアベイラビリティの増強のために、ポリマーに化学的に組み込んだグリコシド類のような機能的結合剤を組み込んでよい。かかるグリコシド類の例は、グルコシド類、フルクトシド類、ガラクトシド類、アラビノシド類、マンノシド類、及びそれらのアルキル置換誘導体、並びにアルブチン、フロリジン、アミグダリン、ジギトニン、サポニン、及びインジカンのような天然グリコシド類である。代表的なグリコシドがポリマーに結合することができる方法が幾つか存在する。例えば、グリコシド又は他の類似の炭水化物の水酸基の水素を、ヒドロゲルポリマー由来のアルキル基に置換してエーテルを形成することができる。また、グリコシド類の水酸基を反応させて、ポリマーヒドロゲルのカルボキシル基をエステル化し、ｉｎ ｓｉｔｕでポリマーエステルを形成することができる。別の手法は、アセトブロモグルコースとマレイン酸のコポリマー上のコレスト−５−エン−３β−オールとの縮合を使用することである。活性化ポリマーとω−アミノアルキルグリコシド類との反応によって、以下のＮ置換ポリアクリルアミド類を合成することができる：（１）（炭水化物スペーサー）（ｎ）−ポリアクリルアミド、「偽多糖類（ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」；（２）（炭水化物スペーサー）（ｎ）−ホスファチジルエタノールアミン（ｍ）−ポリアクリルアミド、ネオ糖脂質類、ホスファチジルエタノールアミンの誘導体；（３）（炭水化物スペーサー）（ｎ）−ビオチン（ｍ）−ポリアクリルアミド。これらのビオチン化誘導体は粘膜表面上のレクチンに付着し、例えば、ポリマー封入ＧＲＰ等の生理活性物質の吸収を促進することができる。
【０１５８】
本発明のより詳細な局面の範囲内で、所望により、プロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、細胞間結合生理機能のさらなる調節因子等の二次活性物質を含む、本明細書中に開示した１又は２つ以上のＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに／又は他の生理活性物質は、修飾され、ポリマー担体又はマトリクスに結合する。例えば、架橋ポリマーネットワーク内でのペプチド又はタンパク質活性物質と他の活性物質との化学結合によってこれを達成することができる。ポリマーを個別にグリコシド含有分子のような相互作用剤で化学修飾することも可能である。特定の局面では、生理活性物質及び任意の二次活性物質を官能化、即ち、適切な反応性基を同定するか又は活性物質に化学的に付加してもよい。ほとんどの場合、エチレン重合基を付加し、次いで、溶液重合（通常、水中）、乳化重合、懸濁重合、又は分散重合のような標準的な重合方法を使用して、官能化活性物質をモノマー及び架橋剤と共重合する。多くの場合、官能化剤は、確実に活性物質上の幾つかの部位が官能化されるのに十分な濃度の官能基又は重合基を備える。例えば、１６個のアミン部位を含むポリペプチド中では、一般に、少なくとも２、４、５、７、及び８又は９個以上の部位が官能化されることが望ましい。
【０１５９】
官能化後、官能化活性物質を、モノマー及び目的のポリマーが形成される試薬を含む架橋剤と混合する。次いで、この媒質中で重合を誘導し、結合した活性物質を含有するポリマーを作製する。次いで、ポリマーを、水又は他の適切な溶媒と組み合わせ、さもなければ精製して微量の未反応不純物を除去し、必要に応じて、撹拌、メッシュへの圧入、超音波処理、又は所望の粒径にする他の好適な手段のような物理的手段によって粉砕又は分解する。次いで、溶媒（通常、水）を、活性物質が変性しない又はさもなければ分解しないような様式で除去する。１の所望の方法は、凍結乾燥（フリーズドライ）であるが、例えば、真空乾燥、風乾、噴霧乾燥等の他の方法も利用可能であり、使用することができる。
【０１６０】
本発明の範囲内のペプチド、タンパク質、及び他の活性物質中に重合基を導入するために、利用可能なアミノ基、水酸基、チオール基、及び他の反応基と、不飽和基を含む求電子剤とを反応させることが可能である。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル基、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、トリクロロフェニルカーボネート等のような活性炭酸塩、トレシレート、オキシカルボニルイミダゾール類、エポキシド、イソシアネート類及びアルデヒド、並びに不飽和カルボキシメチルアジド類及び不飽和オルソピリジル−ジスルフィドを含有する不飽和モノマーは、この試薬分類に属する。不飽和試薬の実例は、アリルグリシジルエーテル、塩化アリル、臭化アリル、ヨウ化アリル、塩化アクリロイル、イソシアン酸アリル、塩化アリルスルホニル、無水マレイン酸、及び無水マレイン酸とアリルエーテルとのコポリマー等である。
【０１６１】
アルデヒドを除く全てのリジン活性誘導体は、一般に、局所環境がこれらの基の求核性を増強する場合、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンの水酸基、及びシスチンのチオール基のような他のアミノ酸と反応することができる。アルデヒド含有官能化試薬は、リジン特異的である。これらの種類の、リジン、システイン、チロシン由来の利用可能な基との反応は、文献で広範に記述されており、当業者に公知である。
【０１６２】
アミン基を含有する生理活性物質の場合、かかる基と塩化アクリロイルのような塩化アシロイルとを反応させ、反応した薬剤に重合性アクリル基を導入することが都合がよい。次いで、アクリルアミドとアクリル酸とのコポリマーの架橋中等のようなポリマーの調製中、官能化活性剤を、アクリル基を介して、ポリマーに付着させ、結合させる。
【０１６３】
本発明のさらなる局面では、ｉｎ ｖｉｖｏで生理活性のあるペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、及び他の分子を含む生理活性物質は、１又は２種類以上の活性物質と、その例えば、直鎖ポリアルキレングリコール等の親水性部分、親油性部分の両方の複合的な部分として組み込まれるポリマーとの共有結合によって抱合安定化する（例えば、米国特許第５,６８１,８１１号を参照のこと）。一局面では、生理活性物質は、（ｉ）直鎖ポリアルキレングリコール部分及び（ｉｉ）親油性部分を含むポリマーと共有結合し、ここで活性物質、直鎖ポリアルキレングリコール部分、及び親油性部分は、（即ち、それに結合したポリマーを欠く非抱合形態における類似の条件下での安定性と比較して）活性治療薬が酵素分解に対するｉｎ ｖｉｖｏ耐性を増強するように高次構造的に相互に関連して配置される。別の局面では、抱合安定化製剤は、（ｉ）直鎖ポリアルキレングリコール部分及び（ｉｉ）親油性部分を含むポリソルベート複合体と共有結合した生理活性物質を含む三次元高次構造を有し、ここで活性物質、直鎖ポリアルキレングリコール部分、及び親油性部分は、（ａ）親油性部分が三次元高次構造の外部で利用可能であり、且つ（ｂ）組成物中の活性物質の酵素分解に対するｉｎ ｖｉｖｏ耐性が増強されるように高次構造的に相互に関連して配置される。
【０１６４】
さらに関連する局面では、トリグリセリド骨格部分の炭素原子で結合したポリアルキレングリコールスペーサー基を介してトリグリセリド骨格部分と共有結合した生理活性物質及びトリグリセリド骨格部分の炭素原子に直接共有結合しているか又はポリアルキレングリコールスペーサー部分を介して共有結合している少なくとも１つの脂肪酸部分を含む多リガンド抱合複合体を提供する（例えば、米国特許第５,６８１,８１１号を参照のこと）。かかる多リガンド抱合治療薬複合体では、トリグリセリド生理活性部分のα‘及びβ炭素原子は、直接的共有結合又はポリアルキレングリコールスペーサー部分を介した間接的共有結合のいずれかによって結合した脂肪酸部分を有してよい。あるいは、脂肪酸部分は、直接的又はポリアルキレングリコールスペーサー部分を介してトリグリセリド骨格部分のα及びα‘炭素に共有結合してよく、生理活性治療薬は、直接的に共有結合しているか、又はポリアルキレングリコールスペーサー部分を介して間接的に結合しているトリグリセリド骨格部分のγ炭素に共有結合している。本発明の範囲内で、トリグリセリド骨格部分を含む多リガンド抱合治療薬複合体には、広範な種々の構造的、組成的、及び高次構造的形態が可能であると認められる。本発明の範囲内で、かかる多リガンド抱合治療薬複合体では、生理活性物質は、アルキルスペーサー基又は他の許容可能なスペーサー基を介してトリグリセリド修飾骨格部分と共有結合していれば有利であることが、さらに述べられる。かかる状況で使用される時、スペーサー基の許容性とは、立体的、組成的、及び最終用途特異的な許容性を指す。
【０１６５】
本発明のさらなる局面では、そのα、α‘、及びβ炭素原子に、（ｉ）脂肪酸基及び（ｉｉ）生理活性物質又は、例えばポリエチレングリコール基の適切な官能基に結合した等の、それに共有結合した部分を有するポリエチレングリコール基を含む官能基が共有結合したトリグリセリド骨格を含む、ポリソルベート部分を含むポリソルベート複合体を含む抱合安定化複合体を提供する。かかる共有結合は、例えば、ポリエチレングリコール基の水酸末端官能基等との直接的共有結合であってよく、又は、例えば、得られたキャッピングポリエチレングリコール基が生理活性物質又は部分を共有結合してよい末端カルボキシ官能基を有するように、ポリエチレングリコール基の末端カルボキシ官能スペーサー基との水酸末端の反応的キャッピングによる等の、間接的共有結合であってもよい。
【０１６６】
本発明のさらなる局面では、生理学的に適合性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された糖脂質部分に共有結合した、本明細書中に開示した１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに／又は他の生理活性物質を含む安定な水溶性の抱合安定化複合体を提供する。かかる複合体では、生理活性物質は、活性物質の遊離アミノ酸基での不安定な共有結合によって生理学的に適合性のＰＥＧで修飾された糖脂質部分に共有結合してよく、ここで不安定な共有結合は、生化学的加水分解及び／又はタンパク質分解によってｉｎ ｖｉｖｏで切断可能である。生理学的に適合性のＰＥＧで修飾された糖脂質部分は、例えば、モノパルミテート、ジパルミテート、モノラウレート、ジラウレート、トリラウレート、モノオレエート、ジオレエート、トリオレエート、モノステアレート、ジステアレート、及びトリステアレートから成る群より選択される脂肪酸エステル基を含むポリソルベートポリマー等のポリソルベートポリマーを含んでいれば有利である。かかる複合体では、生理学的に適合性のＰＥＧで修飾された糖脂質部分は、脂肪酸のポリエチレングリコールエーテル類及び脂肪酸のポリエチレングリコールエステル類から成る群より選択されるポリマーを好適に含んでよく、ここで脂肪酸は、例えば、ラウリル酸、パルミチン酸、オレイン酸、及びステアリン酸から成る群より選択される脂肪酸を含む。
【０１６７】
材料の保存
本発明の特定の局面では、本明細書中の併用製剤及び／又は協調的投与方法は、有効量の、荷電ガラスへ付着してそれにより容器中の有効濃度を低減する可能性があるペプチド及びタンパク質を組み込む。例えばシラン化ガラス容器のような、シラン化容器を用いて、最終製品を保管し、ガラス容器へのポリペプチド又はタンパク質の吸着を低減する。
【０１６８】
本発明のさらなる局面では、哺乳動物被験体の治療用キットは、哺乳動物被験体の粘膜送達のために処方した１又は２種類以上のＧＲＰ化合物の安定な医薬品組成物を含み、該組成物は許容不可能な有害な副作用を伴うことなく被験体の糖尿病、肥満、癌、高血糖症、異常脂質血症、メタボリックシンドローム、冠状動脈症候群、心筋梗塞、又は神経疾患の１又は２種類以上の症状を緩和するのに有効である。キットは、さらに、１又は２種類以上のＧＲＰ化合物を収容するための医薬品用試薬バイアルを含む。医薬品用試薬バイアルは、医薬品グレードのポリマー、ガラス、又は他の好適な材料から構成される。医薬品用試薬バイアルは、例えば、シラン化ガラスバイアルである。キットは、さらに、組成物を被験体の鼻粘膜表面に送達するための開口部を含む。送達開口部は、医薬品グレードのポリマー、ガラス、又は他の好適な材料から構成される。送達開口部は、例えば、シラン化ガラスである。
【０１６９】
シラン化技術は、シラン化すべき表面の特殊クリーニング技術と低圧でのシラン化過程とを組み合わせる。シランは気相であり、高温で表面がシラン化される。この方法により、単層の特徴を有する、安定で均質な官能シラン層を有する再生可能な表面が得られる。シラン化表面は、本発明のポリペプチド又は粘膜送達促進剤のガラスへの結合を防ぐ。
【０１７０】
この手順は、本発明のＧＲＰ組成物を保持するためのシラン化医薬品用試薬バイアルを調製するのに有用である。使用前に再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）でリンスすることによりガラストレイを清浄する。次いで、シラントレイを、９５％ＥｔＯＨでリンスし、アセトントレイをアセトンでリンスする。医薬品用試薬バイアルを、アセトン中で１０分間超音波処理する。アセトン超音波処理後、試薬バイアルをｄｄＨ２Ｏトレイ中に少なくとも２回浸漬する。試薬バイアルを、０.１Ｍ ＮａＯＨ中で１０分間超音波処理する。試薬バイアルをＮａＯＨ中で超音波処理し、ドラフト中でシラン溶液を作製する。（シラン溶液：８００ｍＬの９５％エタノール；９６Ｌの氷酢酸；２５ｍＬのグリシドキシプロピルトリメトキシシラン）。ＮａＯＨ超音波処理後、試薬バイアルをｄｄＨ２Ｏトレイ中に少なくとも２回浸漬する。試薬バイアルをシラン溶液中で３ないし５分間シラン化する。試薬バイアルを、１００％ＥｔＯＨトレイ中に浸漬する。試薬バイアルを、予備精製したＮ２ガスで乾燥させ、使用前に１００℃のオーブンで少なくとも２時間保存する。
【０１７１】
生体接着送達賦形剤及び方法
本発明の特定の局面では、本明細書中の併用製剤及び／又は協調的投与方法は、１又は２種類以上の生理活性物質の上皮送達を増強するための補助化合物又は担体として有効量の非毒性生体接着剤を組み込む。この状況での生体接着剤は、１又は２種類以上の成分又は標的生体膜の表面に対して一般的又は特異的接着を示す。生体接着剤は、粘膜中の又は粘膜を通過する生理活性物質の所望の濃度勾配を保持し、上皮中の又は上皮を通過する巨大分子（例えば、ペプチド及びタンパク質）の透過さえも確実にする。通常、本発明の方法及び組成物の範囲内の生体接着剤の使用により、上皮中の又は上皮を通過するペプチド及びタンパク質の透過性を２倍ないし５倍、多くの場合、５倍ないし１０倍増加させる。この上皮透過の増強により、多くの場合、例えば、鼻上皮の基底部分又は隣接細胞外区画若しくは血漿又はＣＮＳ組織若しくは流体中に巨大高分子が有効に経粘膜送達される。
【０１７２】
送達が促進されたことにより、生理活性ペプチド、タンパク質、及び他の高分子治療種の送達効率が非常に向上する。これらの結果は、化合物の親水性に一部依存し、それにより、水不溶性化合物と比較して、親水性種を用いるより高い透過性が得られる。これらの効果に加えて、生体膜表面での薬物の持続性を増強するための生体接着剤の使用により、薬物送達を持続させるためのリザーバ機構を誘発することができ、それにより、化合物が生体膜を介して透過するだけでなく、表面上の物質が枯渇した時点で、表面に逆拡散する。
【０１７３】
経口投与分野では、種々の好適な生体接着剤は、米国特許第３,９７２,９９５号；同第４,２５９,３１４号；同第４,６８０,３２３号；同第４,７４０,３６５号；同第４,５７３,９９６号；同第４,２９２,２９９号；同第４,７１５,３６９号；同第４,８７６,０９２号；同第４,８５５,１４２号；同第４,２５０,１６３号；同第４,２２６,８４８号；同第４,９４８,５８０号；米国再発行特許第３３,０９３号に開示されており、これらは本発明の新規方法及び組成物で使用されている。本発明の方法及び組成物の範囲内の、例えば鼻粘膜等の粘膜送達プラットフォームとしての種々の生体接着ポリマーの能力は、ＧＲＰを保持及び放出する能力の測定、並びに、その中の活性物質を組み込んだ後に粘膜表面と相互作用する能力によって容易に評価することができる。さらに、周知の方法を適用して、粘膜投与部位の組織との選択されたポリマーの生体適合性を判定する。標的粘膜が粘液で覆われている場合（即ち、粘膜溶解処理又は粘液除去処理を行わない）、下にある粘膜上皮に繋がる接続物として機能し得る。したがって、本明細書中で使用する時、「生体接着剤」という用語はまた、本発明の範囲内の生理活性物質の粘膜送達の促進に有用な粘膜接着化合物を対象とする。しかしながら、粘液ゲル層への接着を介して媒介される粘膜組織への接着接触は、急速な粘液クリアランスが起こる粘液層とその下にある組織（特に、鼻腔面）との間の不完全又は一過性の付着によって制限される場合がある。これに関して、ムチン糖タンパク質が継続的に分泌され、細胞又は腺からのその放出直後に、粘弾性ゲルが形成される。しかしながら、接着性ゲル層の管腔表面は、機械的作用、酵素的作用、及び／又は繊毛作用により継続的に浸食される。かかる活性がより顕著な場合又はより長い接着時間が望ましい場合、本発明の協調的投与方法及び併用処方方法は、上記の本明細書中に開示した粘液溶解及び／又は繊毛静止（ｃｉｌｉｏｓｔａｔｉｃ）方法又は薬剤をさらに組み込んでよい。
【０１７４】
通常、本発明の範囲内で使用される粘膜接着ポリマーは、複雑であるが非特異的な機構によって湿潤した粘膜組織表面に接着する天然又は合成高分子である。これらの粘膜接着ポリマーに加えて、本発明はまた、レセプターにより媒介されるものを含む、特異的相互作用を用いて、粘液よりもむしろ細胞表面に直接接着する生体接着剤を組み込む方法及び組成物を提供する。この特異的様式で機能する生体接着剤の一例は、レクチンとして公知の化合物群である。これらは、例えば、糖タンパク質又は糖脂質等の糖分子を特異的に認識して結合する能力を有する糖タンパク質であり、これは鼻腔内上皮細胞膜の一部を形成し、「レクチンレセプター」として見なすことができる。
【０１７５】
本発明の特定の局面では、生理活性物質の経鼻送達を促進するための生体接着物質は、湿潤した粘膜表面に接着することができる、例えば、水溶性又は水膨潤性等の親水性ポリマー又はポリマー混合物のマトリクスを含む。これらの接着剤を、軟膏、ヒドロゲル（上記を参照のこと）、薄膜、及び他の適用形態として処方することができる。多くの場合、これらの接着剤は、活性物質の遅延放出又は局所送達を達成するために、それと混合された生理活性物質を有する。例えば、個体の循環系へ鼻粘膜を通過する活性物質の透過を促進するためのさらなる成分を処方したものもある。
【０１７６】
種々のポリマー（天然及び合成の両方）は、生理学的条件下で粘液及び／又は粘膜上皮表面への有意な結合を示す。この相互作用の強度は、機械的剥離試験又は剪断試験によって容易に測定することができる。湿性の粘膜表面に適用する場合、多くの乾燥材料が少なくとも僅かに自発的に接着する。かかる初期接触後、幾つかの親水性材料が吸着、膨潤、又は毛管力によって水を吸引し始め、この水がその下に存在する基質又はポリマー組織界面から吸収される場合、接着は、生理活性物質の粘膜吸収を促進する目的を達成するのに十分であり得る。かかる「水和による接着」は、非常に強力であり得るが、この機構を使用するように適合させた製剤は、投与量が水和粘液に変換するように膨潤し続ける一因でなければならない。前水和状態で適用した場合に一般に非接着性を示す本発明の範囲内で有用な多数のヒドロコロイド、特に、幾つかのセルロース誘導体のためにこれを計画する。それにもかかわらず、上皮投与のための生体接着剤送達系は、かかる材料を乾燥ポリマー粉末、微粒子、又はフィルム型の送達形態で適用した場合に本発明の範囲内で有用である。
【０１７７】
他のポリマーは、乾燥状態で適用した場合だけでなく、完全に水和した状態、及び過剰量の水の存在下でも上皮面に接着する。したがって、粘膜接着剤の選択には、組織への接触を形成及び維持する、生理学的条件並びに物理化学的条件を十分に考慮する必要がある。特に、意図する接着部位に通常存在する水又は湿気の量及び一般的なｐＨは、様々なポリマーの粘膜接着結合強度に大きな影響を与えることが公知である。
【０１７８】
幾つかのポリマー生体接着剤送達系は、過去２０年間に作製及び研究されているが、常に成功しているわけではない。しかしながら、種々のかかる担体は、現在、歯科、整形外科、眼科、及び外科での使用に関与する臨床応用で使用されている。例えば、生体接着デバイスのためにアクリル系ヒドロゲルが広範に使用されている。アクリル系ヒドロゲルは、損傷を引き起こす接触した組織への摩擦を減少させる、部分的に膨潤した状態での可撓性及び非磨耗特性のために生体接着剤として十分に好適である。さらに、膨潤状態でのその透過性の高さにより、未反応のモノマー、非架橋ポリマー鎖、及び開始剤を、重合後にマトリクスから浸漬することが可能になり、これは、本発明の範囲内で使用される生体接着材料の選択のための重要な特徴である。アクリル系のポリマーデバイスは、非常に高い接着結合強度を示す。ペプチド薬及びタンパク質薬の上皮送達を制御するために、本発明の方法及び組成物は、所望により、タンパク質分解性の破壊から生理活性物質を保護するように一部機能する、例えば、ポリマー送達賦形剤等の担体の使用を含むと同時に、鼻粘膜中の又は鼻粘膜を通過するペプチド又はタンパク質の透過を増強する。この状況では、生体接着ポリマーは、経口薬物送達を促進する十分な能力が証明されている。例として、粘膜接着性ポリ（アクリル酸）誘導体であるポリカルボフィルの１％（ｗ／ｖ）生理食塩水分散液と共にラットに十二指腸内投与した９−デスグリシンアミド、８−アルギニンバソプレシン（ＤＧＡＶＰ）のバイオアベイラビリティは、このポリマーを含まないペプチド薬の水溶液と比較して３ないし５倍増加する。
【０１７９】
ポリ（アクリル酸）型の粘膜接着ポリマーは、幾つかの腸プロテアーゼの強力な阻害剤である。酵素阻害機構は、トリプシン及びキモトリプシンのような金属プロテアーゼの不可欠な補因子である、カルシウム及び亜鉛のような２価の陽イオンに対するこの分類のポリマーの強い親和性によって説明される。ポリ（アクリル酸）によるプロテアーゼの補因子の欠乏は、酵素活性の喪失によって達成される酵素タンパク質の不可逆的な構造の変化を誘導することが報告されている。同時に、他の粘膜接着ポリマー（例えば、幾つかのセルロース誘導体及びキトサン）は、特定の条件下でタンパク質分解酵素を阻害することができない。例えば、アプロチニン、ベスタチン等の、本発明の範囲内での使用が意図される、比較的小分子である他の酵素阻害剤と対照的に、阻害ポリマーの経鼻吸収は、これらの分子のサイズの観点からごく僅かである可能性が高く、それにより、有害な副作用の可能性が排除される。したがって、特に、ポリ（アクリル酸）型の粘膜接着ポリマーは、吸収促進接着剤及び酵素保護剤の両方として機能し、特に、安全上の懸念が考慮される場合にペプチド薬及びタンパク質薬の制御送達を促進し得る。
【０１８０】
酵素分解に対する保護に加えて、本発明の範囲内で使用される生体接着剤及び他のポリマー若しくは非ポリマー吸収促進剤は、生理活性物質に対する上皮透過性を直接増加させることができる。ペプチド及びタンパク質のような、鼻上皮性関門を通過する巨大且つ親水性の分子の輸送を容易にするために、粘膜接着ポリマー及び他の薬剤は、送達系の前粘膜滞留時間の延長によって説明される効果を超える透過効果の増強をもたらすと考えられてきた。報告によれば、薬物血漿濃度の経時変化により、生体接着微粒子が、鼻粘膜を通過するインスリン透過性を、急速であるが一過的に増加させることが示唆された。例えば、キトサン等の、本発明の範囲内で使用される他の粘膜接着ポリマーは、報告によれば、水溶液又はゲルとして適用した場合でさえ、特定の粘膜上皮の透過性を増強する。上皮透過性に直接影響を与えることが報告されている別の粘膜接着ポリマーは、ヒアルロン酸及びそのエステル誘導体である。本発明の協調的投与及び／又は併用処方方法並びに組成物の範囲内の特に有用な生体接着剤は、キトサン並びにその類似体及び誘導体である。キトサンは、低毒性及び良好な生体適合性を示す好ましい性質のために、薬学的及び医学的適用のために広く使用されている非毒性、生体適合性且つ生分解性のポリマーである。キトサンは、アルカリでのＮ脱アセチル化によってキチンから調製される天然のアミノ多糖類である。本発明の方法及び組成物の範囲内で使用される場合、キトサンは、適用した粘膜部位での本明細書中に開示したＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質の滞留を増加させる。この投与様式はまた、患者の服薬遵守及び許容性を改善することができる。本明細書中でさらに提供するように、本発明の方法及び組成物は、所望により、新規のキトサン誘導体又はキトサンの化学修飾形態を含む。本発明の範囲内で使用される１つのかかる新規の誘導体を、β−［１→４］−２−グアニジノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースポリマー（ポリ−ＧｕＤ）と示す。キトサンは、キチンのＮ脱アセチル化生成物であり、経口及び経鼻製剤のための微粒子を調製するために広く使用されている天然に存在するポリマーである。キトサンポリマーはまた、非経口薬物送達のための可溶性担体としても提案されている。本発明の一局面の範囲内で、ｏ−メチルイソ尿素を使用して、キトサンアミンをそのグアニジニウム部分に変換する。グアニジニウム化合物は、例えば、ｐＨ８.０超過でのキトサンの等規定液（ｅｑｕｉ-ｎｏｒｍａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とｏ−メチルイソ尿素との反応によって調製する。
【０１８１】
本発明の範囲内で使用される生体接着剤として分類されるさらなる化合物は、通常、生体接着化合物の相補的構造と粘膜上皮表面成分との間の「レセプター−リガンド相互作用」として分類される、特異的相互作用の媒介によって作用する。多くの天然物の例は、レクチン−糖相互作用によって例示されるような、特異的結合生体接着剤の形態を説明する。レクチンは、多糖類又は複合糖質に結合する非免疫起源の（糖）タンパク質である。
【０１８２】
幾つかの植物レクチンは、可能な薬学的吸収促進剤として調査されている。ある植物レクチン（インゲンマメ血球凝集素（ＰＨＡ））は、ラットへの給餌後に１０％を超える高い経口バイオアベイラビリティを示す。トマト（リコペルシコン・エスキュレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｕｔｕｍ））レクチン（ＴＬ）は、種々の投与様式で安全であると思われる。
【０１８３】
要約すると、上記生体接着剤は、所望により、１又は２種類以上のＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質の持続性を延長するか又は別の方法で上皮吸収を増加させるのに有効な量及び形態の生体接着剤を組み込んだ、本発明の併用製剤及び協調的投与方法において有用である。生体接着剤は、本発明の併用製剤内の補助化合物又は添加物として協調的に投与してよい。特定の態様では、生体接着剤は、「薬学的のり」として作用するのに対して、他の態様では、ある場合には、上皮細胞「レセプター」との特異的なレセプター−リガンド相互作用の促進により、別の場合には、送達標的部位（例えば、肝臓、血漿、又はＣＮＳ組織又は流体）で測定される薬物濃度勾配を有意に増加させるための上皮透過性の増加により、生体接着剤の補助送達又は併用製剤は、生理活性物質と鼻粘膜との接触を強化するように機能する。本発明の範囲内で使用されるさらなる生体接着剤は、生体接着剤と協調的に送達されるか又は併用製剤中の粘膜投与生体治療薬の安定性を増強するための酵素（例えば、プロテアーゼ）阻害剤として作用する。
【０１８４】
リポソーム及びミセル送達賦形剤
本発明の協調的送達方法及び併用製剤は、所望により、有効な脂質又は脂肪酸系担体、加工助剤、又は送達賦形剤を組み込み、ＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質の上皮送達のために改良された製剤を得る。例えば、リポソーム、混合ミセル担体、又は乳濁液と混合又は封入又は、共に協調的に投与された、ペプチド又はタンパク質のような１又は２種類以上のこれらの活性物質を含む粘膜送達のための種々の製剤及び方法を提供し、粘膜送達時に（例えば、タンパク質分解、化学修飾、及び／又は変性に対する感受性の減少によって）生理活性物質の化学的及び物理的安定性を増強し、半減期を増加させる。
【０１８５】
本発明の特定の局面の範囲内で、生理活性物質専門の送達系は、リポソームとして公知の脂質小胞を含む。これらは、通常、天然、生分解性、非毒性、及び非免疫原性脂質分子から作製し、ペプチド及びタンパク質を含む薬物分子をその膜中又は膜上に効率的に捕捉又は結合させることができる。封入されたタンパク質が小胞内のその好ましい水性環境下に残存し得る一方で、リポソーム膜がタンパク質分解及び他の不安定化因子からタンパク質を保護するという事実によって本発明の範囲内のペプチド及びタンパク質送達系としてのリポソームの魅力が増す。たとえ公知の全てのリポソーム調製方法が、その固有の物理的及び化学的性質によってペプチド及びタンパク質の封入を実現可能な訳ではないとしても、幾つかの方法により、実質的に失活することなくこれらの高分子を封入可能である。
【０１８６】
米国特許第４,２３５,８７１号、同第４,５０１,７２８号、及び同第４,８３７,０２８号等の種々の方法を、本発明の範囲内で使用されるリポソームの調製に利用可能である。リポソーム送達と共に使用するために、生理活性物質は、通常、リポソーム若しくは脂質小胞内に捕捉されるか又は小胞の外側に結合する。
【０１８７】
リポソームのように、粘膜吸収増強活性をも有する不飽和長鎖脂肪酸は、二重層様構造（いわゆる、「ウファソーム（ｕｆａｓｏｍｅ）」）を有する、閉鎖した小胞を形成することができる。これらは、例えば、本発明の範囲内の、例えば、鼻腔内等の粘膜送達のための生理活性ペプチド及びタンパク質を捕捉するためにオレイン酸を使用して形成することができる。
【０１８８】
本発明の範囲内で使用される他の送達系は、ポリマー及びリポソームを併用し、天然ポリマーであるフィブリンの内部への封入のような両小胞の有利な性質を組み合わせる。さらに、この送達系からの生体治療化合物の放出は、共有結合架橋の使用及びフィブリンポリマーへの抗フィブリン溶解剤の添加によって制御可能である。
【０１８９】
本発明の範囲内で使用される、より単純化した送達系としては、脂質担体と、タンパク質及びポリアニオン性核酸のような荷電生理活性物質との間の静電相互作用を得るために有効に使用することができる送達小胞又は担体としてのカチオン性脂質の使用が挙げられる。これにより、薬物が粘膜投与及び／又はその後の全身区画への送達に適切な形態に有効にパッケージングされる。
【０１９０】
本発明の範囲内で使用されるさらなる送達賦形剤としては、長鎖及び中鎖脂肪酸並びに脂肪酸を含む界面活性剤混合ミセルが挙げられる。エステル形態である、大部分が天然に存在する脂質は、粘膜表面を通過する脂質自体の輸送に関して重要な意味を持つ。遊離脂肪酸及び極性基が結合したモノグリセリドは、混合ミセルの形態で、透過増強剤として腸障壁で作用することが証明された。この、遊離脂肪酸（鎖長が炭素数１２ないし２０で変動するカルボン酸）及びその極性誘導体の障壁改変機能の発見により、粘膜吸収促進剤としてのこれらの薬剤の用途に関する広範な研究が促されている。
【０１９１】
本発明の方法の範囲内で使用するために、長鎖脂肪酸類、特に、融合性脂質（オレイン酸、リノール酸、リノール酸、モノオレイン等のような不飽和脂肪酸類及びモノグリセリド類）により、本明細書中に開示したＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質の粘膜送達を促進するための有用な担体が得られる。中鎖脂肪酸類（Ｃ６ないしＣ１２）及びモノグリセリド類はまた、腸薬物吸収活性の増強を示し、本発明の粘膜送達製剤及び方法の範囲内での使用に適応することができる。さらに、中鎖及び長鎖脂肪酸類のナトリウム塩類は、本発明の範囲内での生理活性物質の上皮送達のための有効な送達賦形剤及び吸収促進剤である。したがって、脂肪酸は、ナトリウム塩の可溶化形態で使用する、又は、例えば、ポリオキシエチレン化水素化ヒマシ油、タウロコール酸ナトリウム等の非毒性界面活性剤の添加により使用することができる。本発明の範囲内で有用な他の脂肪酸及び混合ミセル剤としては、所望により、グリコール酸塩及びタウロコール酸塩のような胆汁塩と組み合わせた、カプリル酸ナトリウム（Ｃ８）、カプリン酸ナトリウム（Ｃ１０）、ラウリン酸ナトリウム（Ｃ１２）、又はオレイン酸ナトリウム（Ｃ１８）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
ペグ化
本発明の範囲内で提供されるさらなる方法及び組成物は、例えば、デキストラン類、ポリビニルピロリドン類、糖ペプチド類、ポリエチレングリコール、及びポリアミノ酸類等のポリマー物質の共有結合による生物活性ペプチド及びタンパク質の化学修飾を含む。得られた抱合ペプチド及びタンパク質は、上皮投与のためのその生理活性及び溶解性を保持している。別の態様では、ＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性ペプチド及びタンパク質は、ポリアルキレンオキシドポリマー、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に抱合する。米国特許第４,１７９,３３７号。
【０１９３】
本発明の範囲内で使用されるアミン反応性ＰＥＧポリマーとしては、分子量が２０００、５０００、１００００、１２０００、及び２００００のＳＣ−ＰＥＧ、Ｕ−ＰＥＧ−１００００、ＮＨＳ−ＰＥＧ−３４００−ビオチン、Ｔ−ＰＥＧ−５０００、Ｔ−ＰＥＧ−１２０００、及びＴＰＣ−ＰＥＧ−５０００が挙げられる。生理活性ペプチド及びタンパク質のペグ化は、カルボキシ部位（例えば、カルボキシル末端に加えてアスパラギン酸基又はグルタミン酸基）の修飾によって行うことができる。酸性条件下でのカルボジイミド活性化タンパク質カルボキシル基の選択的修飾におけるＰＥＧ−ヒドラジドの有用性が記載されている。あるいは、生理活性ペプチド及びタンパク質の二官能性ＰＥＧ修飾を使用することができる。幾つかの手順では、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸を含む、荷電アミノ酸残基は、顕著なタンパク質表面上の溶媒接近可能（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）傾向を示す。
【０１９４】
活性物質の他の安定化修飾
ペグ化に加えて、本発明の範囲内で使用されるペプチド及びタンパク質のような生理活性物質を修飾し、例えば、１又は２種類以上の免疫グロブリン鎖のような１又は２種類以上の担体タンパク質に結合した活性ペプチド、タンパク質、類似体、又は模倣体との融合タンパク質の作製により、他の公知の保護化合物又は安定化化合物への抱合を介した活性物質の保護によって循環半減期を増強することができる。
【０１９５】
製剤の調製、製造及び投与
本発明の上皮送達製剤は、通常、１又は２種類以上の薬学的に許容可能な担体及び所望により他の治療成分と組み合わせたＧＲＰ、類似体、及び模倣体を含む。担体は、製剤の他の成分と適合し、且つ被験体に悪影響を及ぼさないという意味で「薬学的に許容可能」でなければならない。かかる担体は、本明細書の上部に記載されている、又は薬理学分野の当業者に周知である。望ましくは、製剤は、投与すべき生理活性物質に適合しないことが公知である酵素又は酸化剤のような物質を含むべきではない。製剤は、薬学分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【０１９６】
本発明の組成物及び方法の範囲内で、本明細書中に開示したＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質は、経口、経直腸、経膣、鼻腔内、肺内、若しくは経皮送達、又は眼、耳、皮膚、若しくは他の粘膜表面への局所送達を含む種々の粘膜投与様式によって被験体に投与してよい。本発明の組成物及び方法はまた、経皮投与様式も含む。所望により、本明細書中に開示したＧＲＰ、類似体、及び模倣体、並びに他の生理活性物質は、皮膚貼付、皮膚に適用する局所用製剤、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、又は非経口経路を含む非粘膜経路によって協調的又は補助的に投与してよい。他の代替態様では、生理活性物質は、例えば、好適な液体又は固体担体中に生理活性物質を含有するｅｘ ｖｉｖｏ組織又は器官治療製剤の成分として、哺乳動物被験体由来の細胞、組織、又は器官への直接曝露によってｅｘ ｖｉｖｏ投与してよい。
【０１９７】
本発明による組成物は、多くの場合、鼻腔又は肺用スプレーとして水溶液で投与し、当業者に公知の種々の方法によって噴霧形態で投薬してよい。鼻腔用スプレーとして液体を投薬するための好ましい系は、米国特許第４,５１１,０６９号に開示されている。製剤は、例えば、米国特許第４,５１１,０６９号に開示の密封投薬システム等の複数回投与容器内に存在し得る。さらなるエアゾール送達形態としては、例えば、水、エタノール、又はこれらの混合物等の薬学的溶媒中に溶解又は分散した生理活性物質を送達する、例えば、圧縮空気、ジェット、超音波、及び圧電噴霧器を含んでよい。
【０１９８】
本発明の鼻腔及び肺用スプレー溶液は、通常、所望により、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）のような表面活性剤及び１又は２種類以上の緩衝液を用いて処方した、薬物又は送達すべき薬物を含む。本発明のある態様では、鼻腔用スプレー溶液は、噴射剤をさらに含む。鼻腔用スプレー溶液のｐＨは、所望により約ｐＨ２.０ないしｐＨ８、好ましくはｐＨ４.５±０.５である。これらの組成物の範囲内で使用される好適な緩衝液は上記の通り、又は当該分野で公知である。保存料、界面活性剤、分散剤、又は気体を含む他の成分を添加して、化学的安定性を増強又は維持することができる。好適な保存料としては、フェノール、メチルパラベン、パラベン、ｍ−クレゾール、チオマーサル、クロロブタノール、塩化ベンジルアルコニウム、安息香酸ナトリウム、エタノール、フェニルエチルエーテル、ベンジルアルコール等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な界面活性剤としては、オレイン酸、トリオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート類、レシチン、ホスファチジルコリン類、並びに種々の長鎖ジグリセリド類及びリン脂質類が挙げられるが、これらに限定されない。好適な分散剤としては、エチレンジアミン四酢酸等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な気体としては、窒素、ヘリウム、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、ヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）、二酸化炭素、及び空気等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
代替態様の範囲内で、粘膜製剤は、経鼻投与に適切な粒径又は適切な粒径範囲内の乾燥（通常、凍結乾燥）形態の生理活性物質を含む乾燥粉末製剤として投与する。乾燥製剤はまた、経皮送達にも適している。鼻腔又は肺経路内での沈着に適切な最小粒径は、多くの場合、０.５μの空気動力学的等価粒子径中央値（ＭＭＥＡＤ）、一般には、約１μＭＭＥＡＤ、より典型的には、約２μＭＭＥＡＤである。鼻腔内蓄積に適切な最大粒径は、多くの場合、約１０μＭＭＥＡＤ、一般には、約８μＭＭＥＡＤ、より典型的には、約４μＭＭＥＡＤである。これらの粒径範囲内の鼻腔内呼吸用粉末は、ジェット製粉、噴霧乾燥、溶媒沈殿、及び超臨界流体濃縮のような種々の従来技術によって製造することができる。適切なＭＭＥＡＤのこれらの乾燥粉末は、従来の乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）を介して患者に投与してよく、この吸入器は、肺吸入又は鼻吸入の際、患者の呼吸に依存して、粉末をエアゾール化された量分散させる。あるいは、例えば、ピストンポンプ等の、粉末をエアゾール化された量分散するための外部電源を使用する空気補助デバイスを介して乾燥粉末を投与してよい。
【０２００】
乾燥粉末デバイスは、通常、単回エアゾール化用量（「パフ」）を製造するために約１ｍｇないし２０ｍｇの範囲の質量の粉末を必要とする。生理活性物質の必要用量又は所望の用量がこの量よりも少ない場合、粉末化活性物質を、通常、薬学的乾燥充填粉末と組み合わせて、必要な総粉末質量を得る。好ましい乾燥充填粉末としては、スクロース、ラクトース、デキストロース、マンニトール、グリシン、トレハロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及びデンプンが挙げられる。他の好適な乾燥充填粉末としては、セロビオース、デキストラン、マルトトリオース、ペクチン、クエン酸ナトリウム、及びアスコルビン酸ナトリウム等が挙げられる。
【０２０１】
本発明の範囲内の上皮送達のための組成物を処方するために、生理活性物質を、種々の薬学的に許容可能な添加物並びに活性物質の分散のための基剤又は担体と組み合わせてよい。所望の添加物としては、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、酢酸のようなｐＨ調節剤が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、局部麻酔薬（例えば、ベンジルアルコール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）、溶解増強剤（例えば、シクロデキストリン及びその誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、及び還元剤（例えば、グルタチオン）を含んでよい。上皮送達用組成物が液体である場合、製剤の張度を、単位として用いた生理食塩水の張度（０.９％（ｗ／ｖ））を基準として測定した場合、通常、投与部位の鼻粘膜で実質的に不可逆的な組織損傷が誘導されない値に調整する。一般に、溶液の張度を、約１／３ないし３、より典型的には１／２ないし２、最も頻繁には３／４ないし１.７の値に調整する。
【０２０２】
生理活性物質は、活性物質及び任意の所望の添加物を分散する能力を有する親水性化合物を含み得る基剤又は賦形剤に分散してよい。基剤は、ポリカルボン酸類又はその塩類、無水カルボン酸類（例えば、無水マレイン酸）と他のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸等）とのコポリマー、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンのような親水性ビニルポリマー、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、及びキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びその非毒性金属塩のような天然ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない広範な好適な担体から選択してよい。多くの場合、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸−グリコール酸）コポリマー、及びこれらの混合物等の生分解性ポリマーを、基剤又は担体として選択する。あるいは又はさらに、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル等のような合成脂肪酸エステル類を、担体として使用してよい。親水性ポリマー及び他の担体は、単独又は組み合わせて使用してよく、部分的結晶化、イオン結合、架橋等によって担体の構造一体性を高めることができる。流体又は粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、微粒子、及びフィルムを含む、鼻粘膜への直接適用のための種々の形態で担体を提供してよい。この状況での選択された担体の使用により、生理活性物質の吸収を促進することができる。
【０２０３】
生理活性物質は、種々の方法にしたがって基剤又は担体と組み合わせることができ、活性物質を、担体の拡散、崩壊、水チャネルの関連製剤によって放出することができる。ある環境では、例えば、イソブチル２−シアノアシレート等の好適なポリマーから調製したマイクロカプセル（微粒子）又はナノカプセル（ナノ粒子）中に活性物質を分散させ、鼻粘膜に適用される生体適合性分散媒中に分散させ、それにより長期間にわたり送達及び生物活性が持続する。
【０２０４】
本発明の範囲内の医薬品の上皮送達をさらに増強するために、活性物質を含む製剤はまた、基剤又は賦形剤として親水性低分子量化合物を含んでもよい。かかる親水性低分子量化合物により、生理活性ペプチド又はタンパク質等のような水溶性活性物質が基剤を介して、活性物質を吸収することができる体表に拡散する経路媒体が得られる。親水性低分子量化合物は、所望により、粘膜又は投与環境由来の水分を吸収し、水溶性活性ペプチドを溶解する。親水性低分子量化合物の分子量は、一般に、１００００以下、このましくは３０００以下である。代表的な親水性低分子量化合物としては、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、トレハロース、Ｄ−ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリン、及びポリエチレングリコールのようなオリゴ糖類、二糖類、及び単糖類のようなポリオール化合物が挙げられる。本発明の範囲内の担体として有用な親水性低分子量化合物の他の例としては、Ｎ−メチルピロリドン及びアルコール（例えば、オリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール等）が挙げられる。これらの親水性低分子量化合物は、単独又は、互いに若しくは経鼻製剤の他の活性若しくは不活性物質と組み合わせて使用することができる。
【０２０５】
あるいは、本発明の組成物は、必要に応じて、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等の、ｐＨ調節剤、緩衝剤、張度調節剤、及び湿潤剤等のような、生理的条件に近づけるための薬学的に許容可能な担体物質を含有してよい。固体組成物については、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウム等を含む、従来の非毒性の薬学的に許容可能な担体を使用してよい。
【０２０６】
生理活性物質の投与のための治療組成物は、高濃度の活性成分に好適な溶液、マイクロエマルジョン、又は他の規則正しい構造として処方してもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び脂質ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってよい。溶液に適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散性製剤の場合の所望の粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、又は塩化ナトリウム等の張化剤を含むことが望ましい。例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンのような、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含むことにより、生理活性物質の吸収を延長することができる。
【０２０７】
本発明の特定の態様では、生理活性物質は、例えば、遅延放出ポリマーを含む組成物等の徐放製剤中で投与する。例えば、ポリマー、マイクロカプセル化送達系、又は生体接着ゲルのような放出制御賦形剤等の急速な放出を防止する担体を用いて活性物質を調製してよい。本発明の種々の組成物中の活性物質の送達は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ヒドロゲル、及びゼラチン等の組成物中に、吸収を遅延させる薬剤を含むことにより延長することができる。生理活性物質の放出制御製剤が望ましい場合、本発明に従った使用に好適な放出制御結合剤としては、活性物質に対して不活性であり、且つ生理活性物質を組み込むことができる任意の生体適合性放出制御物質が挙げられる。多数のかかる物質は当該分野で公知である。有用な放出制御結合剤は、経鼻送達後の生理的条件下で（例えば、鼻粘膜表面において、又は経粘膜送達後の体液の存在下で）ゆっくり代謝される物質である。適切な結合剤としては、当該分野において徐放性製剤に既に使用されている生体適合性ポリマー及びコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。かかる生体適合性化合物は周囲の組織に対して非毒性且つ不活性であり、鼻腔への刺激、免疫応答、炎症等のような著しい副作用を誘発しない。これらは、これも生体適合性を示し、体内から容易に排出される、代謝産物に代謝される。
【０２０８】
この状況で使用される代表的なポリマー材料としては、加水分解性エステル結合を有するコポリマー及びホモポリマーのポリエステル類由来のポリマーマトリクスが挙げられるが、これらに限定されない。これらの多数は、生分解性を示し、毒性が全くないか毒性が低い分解産物が得られることが当該分野で公知である。代表的ポリマーとしては、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＤＬ ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ−乳酸−コ−グリコール酸）（Ｄ ＰＬＧＡ）、及びポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（Ｌ ＰＬＧＡ）が挙げられる。他の有用な生分解性又は生体浸食性ポリマーとしては、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ε−アプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（ε−アプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）のようなヒドロゲル類、ポリアミド類、ポリ（アミノ酸類）（即ち、Ｌ−ロイシン、グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルタミド）、ポリアセタールポリマー、ポリオルソエステル類、ポリカーボネート、ポリマレアミド類、多糖類、及びこれらのコポリマーのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。かかる製剤の調製方法の多くは、一般に、当業者に公知である。他の有用な製剤としては、例えば、マイクロカプセル等の放出制御組成物（米国特許第４,６５２,４４１号及び同第４,９１７,８９３号）、マクロカプセル及び他の製剤の作製に有用な乳酸−グリコール酸コポリマー（米国特許第４,６７７,１９１号及び同第４,７２８,７２１号）、及び水溶性ペプチド用の徐放性組成物（米国特許第４,６７５,１８９号）が挙げられる。
【０２０９】
鼻腔用スプレー製品の製造過程は、一般に、８５％未満の水に加えて、ＧＲＰを含まない鼻腔用スプレー製剤の成分を含む、ＧＲＰ鼻腔用スプレー用の希釈剤の調製を含む。次いで、希釈剤のｐＨを測定し、必要に応じて、水酸化ナトリウム又は塩酸で所望の製剤ｐＨに調節する。水を用いて、最終標的容積の希釈剤を得る。最終標的容積の８５％未満の希釈剤をねじ口瓶に非無菌的に移動させることにより、ＧＲＰ鼻腔用スプレーを調製する。適切な量のＧＲＰを添加し、完全に溶解するまで混合する。ｐＨを測定し、必要に応じて、水酸化ナトリウム又は塩酸で所望の製剤ｐＨに調節する。十分な量の希釈剤を添加し、最終標的容積にする。ねじ口瓶に充填し、ふたをする。上記製造過程の説明は、薬物製品の初期臨床バッチを調製するために用いる方法を表す。この方法を開発過程で修正し、製造過程を最適化してもよい。
【０２１０】
現在販売されているＧＲＰは、ＦＤＡの規制を遵守するために滅菌製造条件を必要とする。注射又は注入用ＧＲＰを含む非経口投与は、滅菌（無菌）製造過程を必要とする。滅菌薬剤製造のための医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）としては、設計及び構造の特徴に対する規格（ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ）（連邦規制基準２１条§２１１.４２（２００５年４月１日））；試験及び成分の認可又は棄却、薬物製品容器及び密閉に対する規格（ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ａｐｐｒｏｖａｌ ｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ, ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ, ａｎｄ ｃｌｏｓｕｒｅｓ）（§２１１.８４）；微生物汚染の制御に対する規格（ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）（§２１１.１１３）；並びに他の特殊試験要件（ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）（§２１１.１６７）が挙げられる。本発明の経鼻投与製品のような、非腸管外（Ｎｏｎ-ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）（非無菌）製品は、これらの特殊な滅菌製造条件を必要としない。容易に認識することができるように、滅菌製造過程の要件は、非滅菌製品の製造過程に必要とされる要件より、大幅に高く且つそれ相応に高価である。これらの原価は、設備のためのより高額な資本化原価、並びにより高額な製造原価、つまり、さらなる部屋及び空調を含む滅菌製造のための追加設備、さらなる労働力、大規模な品質管理及び品質保証、並びに管理上の支援を含む滅菌製造に付随する追加原価を含む。結果として、本発明の製品のような経鼻投与ＧＲＰ製品の製造原価は、非経口的に投与されるＧＲＰ製品の製造原価より著しく安価である。本発明は、ＧＲＰの非滅菌製造過程に対する要求を満たす。
【０２１１】
本発明は、保存料無添加のＧＲＰ薬物製品を含む。かかる製剤は、保存料を含有しない。抗微生物付形剤の非存在下では、製剤は滅菌条件下で保存料無添加鼻腔用スプレー装置に充填される、又は皮膚貼付剤に組み込まれる。該装置は、送達系内で製剤を汚染させることなく、有効量を送達することができる。かかるＧＲＰ薬物製品は、同一容器から複数回投薬することができ、それにより使い捨て薬物製品に比べて、商品の原価が著しく低減される。複数回使用保存料無添加ＧＲＰ製剤の利点は、安定性の向上、微生物汚染防止の代替手段、及び製品の商品化をより容易に実行可能にできる商品の原価低減である。
【０２１２】
必要量の活性化合物を、１又は２種類以上の上記に列挙した成分を有する適切な溶媒へ組み込み、必要に応じて、次いで濾過滅菌することにより、滅菌溶液を調製することができる。一般に、基剤となる分散媒及び上記に列挙した必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤へ活性化合物を組み込むことによって、分散体を調製する。滅菌粉末の場合、調製方法は、予め濾過滅菌した溶液から、活性成分に加えて任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥及びフリーズドライを含む。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって微生物作用を防止することができる。
【０２１３】
投薬及び副作用を制御及びモニタリングするための十分な予防手段が整っているならば、本発明の粘膜及び皮膚投与により、患者による有効な自己投与治療が行える。粘膜及び皮膚投与はまた、痛みがあり、患者を感染の危険性にさらし、薬物バイオアベイラビリティの問題が存在し得る、注射のような他の投薬形態の特定の欠点も克服する。鼻送達及び肺送達のために、噴霧としての液体治療薬のエアゾール投薬を制御するためのシステムは周知である。一態様では、定量の活性物質を、特別に構築した機械ポンプ弁を用いて送達させる（米国特許第４,５１１,０６９号）。別の態様では、活性物質は皮膚貼布技術により送達される。
【０２１４】
投薬量
予防及び治療目的のために、本明細書中に開示した生理活性物質は、長期間の持続的送達（例えば、持続的な経皮、粘膜、又は静脈内送達）による単回ボーラス送達又は反復投与プロトコール（例えば、１時間毎、１日毎、又は１週間毎の反復投与プロトコール）において被験体に投与してよい。この状況において、治療有効用量のＧＲＰは、上記の標的疾患又は容態に関連する１又は２種類以上の症状又は検出可能な容態を緩和する、臨床的に有意な結果が得られる長期予防又は治療計画の範囲内での反復投与を含んでよい。この状況における有効投薬量の決定は、通常、動物モデル実験及びその後のヒト臨床試験に基づき、被験体の標的疾患の症状又は容態の発症又は重症度を有意に減少させる有効投薬量及び投与プロトコールを決定することにより導かれる。これに関する好適なモデルとしては、例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、非ヒト霊長類、及び当該分野で公知の他の許容できる動物モデル被験体が挙げられる。あるいは、有効投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル（例えば、免疫アッセイ及び組織病理学アッセイ）を使用して決定してもよい。かかるモデルを使用すれば、一般の計算及び調整を要するだけで、通常、治療有効量（例えば、所望の応答を誘発するための経鼻、経皮、静脈内、又は筋肉内で有効な量）の生理活性物質の適切な濃度及び投与量が決定される。
【０２１５】
別の態様では、本発明は、ＧＲＰの経鼻送達のための組成物及び方法であって、長期投与期間中に治療に有効な、増減する拍動性濃度のＧＲＰを維持するために１日毎又は１週間毎のスケジュールでのＧＲＰの被験体への複数回投与を含む、経鼻有効投薬レジメンによってＧＲＰ化合物を反復投与する、組成物及び方法を提供する。組成物及び方法により、８時間ないし２４時間にわたる投与期間中に治療に有効な増減する拍動性濃度のＧＲＰを維持するために、毎日１回ないし６回経鼻製剤として被験体によって自己投与されるＧＲＰ化合物が得られる。
【０２１６】
キット
本発明はまた、哺乳動物被験体の疾患及び他の容態の予防及び治療で用いる上記の薬学的組成物、活性成分、及び／又はその投与手段を含むキット、包装、及び多容器ユニットを含む。要約すると、これらのキットは、上皮送達のために医薬品中に配合された、本明細書中に開示した上皮送達促進剤と併用する１又は２種類以上のＧＲＰタンパク質、類似体、若しくは模倣体、及び／又は他の生理活性物質を含む容器又は製剤を含む。
【０２１７】
本発明の経鼻製剤は、任意の噴霧瓶又は注射器を使用して又は点滴によって投与してよい。鼻腔用スプレー瓶の例は、１噴出あたり０.１ｍＬの用量を送達し、浸漬管の長さが３６.０５ｍｍである「Ｎａｓａｌ Ｓｐｒａｙ Ｐｕｍｐ ｗ／Ｓａｆｅｔｙ Ｃｌｉｐ,Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＳＡＰ ＃６０５４８」である。これは、ニュージャージー州プリンストン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）のＰｆｅｉｆｆｅｒ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ社から購入することができる。
【０２１８】
ＧＲＰのエアロゾル経鼻投与
我々は、上記のＧＲＰが、鼻スプレー又はエアロゾルを用いて鼻腔内投与できることを見出した。多くのタンパク質とペプチドは、噴霧又はエアロゾルを作り出す際に、アクチュエーターにより生み出される機械的力により引き千切られるか又は変性してしまうことが示されていたので、このことは驚くべきことであった。この分野においては、以下の定義が有用である。
【０２１９】
１．  エアロゾル−圧力下でパッケージングされ、適切なバルブ装置の作動により放出される治療用の有効成分を含む産物。
【０２２０】
２．  定量エアロゾル−各作動により一定量の噴霧の送達を可能にする定量投与バルブから成る加圧式剤形。
【０２２１】
３．  粉末エアロゾル−圧力下でパッケージングされ、適切なバルブ装置の作動により放出される治療用の有効成分を、粉末の形態で含む製品。
【０２２２】
４．  スプレーエアロゾル−エアロゾル産物であって、圧縮ガスを噴射剤として利用して、該産物を湿った噴霧として発射するために必要な力を提供するエアロゾル産物；一般的に、水性溶媒中の薬剤の溶液に用いることができる。
【０２２３】
５．  スプレー−空気又はスチームの噴流により微細に分離された液体。鼻スプレー薬剤産物は、非加圧式ディスペンサー中の溶液又は賦形剤の混合物に溶解又は懸濁された治療用の有効成分を含む。
【０２２４】
６．  定量スプレー−各作動により特定量の噴霧の分与を可能にするバルブから成る、非加圧式剤形。
【０２２５】
７．  懸濁スプレー−液体媒体中に分散した固体粒子を含み、液滴又は微細に分離した固体の形態にある液体製剤。
【０２２６】
定量鼻スプレーポンプにより放出されたエアロゾルスプレーの、薬物送達装置（「ＤＤＤ」）としての流体力学的なキャラクタリゼーション。スプレーのキャラクタリゼーションは、新規及び既存の鼻スプレーポンプの研究開発、品質保証及び安定性試験方法についての、食品医薬品局（「ＦＤＡ」）による承認のために必要な提出書類に不可欠な部分である。
【０２２７】
スプレーのジオメトリの徹底的なキャラクタリゼーションは、鼻スプレーポンプの全体的性能の最高の指標になることが判明した。特に、スプレーが装置から出る際のスプレーの発散角度（プルームジオメトリ（ｐｌｕｍｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ））の測定；スプレーの断面楕円率、均一性、及び粒子/液滴分布（スプレーパターン）；発生するスプレーの時間を追った広がりが鼻スプレーポンプのキャラクタリゼーションにおける、最も代表的な性能量であることが判明した。品質保証と安定性試験の間、プルームジオメトリ（ｐｌｕｍｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ）とスプレーパターンの測定値が、鼻スプレーポンプの承認されたデータ判定基準との一致性及び適合性を証明するための要となる識別子である。
【０２２８】
プルーム高（Ｐｌｕｍｅ Ｈｅｉｇｈｔ）−アクチュエーターの先端から、直線流の崩壊によりプルームの角度が非直線になる点までの長さ。デジタル画像の目視検査に基づき、スプレーパターンの最も遠い測定点と一致する、幅の測定点を設定するため、３０ ｍｍの高さをこの試験のために規定した。
【０２２９】
長軸‐基本単位(ｍｍ)で測った、ＣＯＭｗを横切る近似スプレーパターン中に引くことが可能な最も長い弦  
【０２３０】
短軸‐基本単位(ｍｍ)で測った、ＣＯＭｗを横切る近似スプレーパターン中に引くことが可能な最も短い弦
【０２３１】
楕円率‐短軸に対する長軸の比率であり、好ましくは１.０ないし１.５であり、最も好ましくは１.０ないし１.３である。
【０２３２】
Ｄ１０‐サンプルの総液体体積の１０％が、その液滴より小さな直径(μｍ)を有する液滴から構成される、液滴の直径
【０２３３】
Ｄ５０‐サンプルの総液体体積の５０％が、その液滴より小さな直径(μｍ)を有する液滴から構成される、液滴の直径であり、質量中央径（ｍａｓｓ ｍｅｄｉａｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ）としても知られている
【０２３４】
Ｄ９０‐サンプルの総液体体積の９０％が、その液滴より小さな直径(μｍ)を有する液滴から構成される、液滴の直径
【０２３５】
スパン‐分散の幅の長さ、値が小さい程、分散が狭い。スパンは以下のように計算される
【０２３６】
【数２】
2009518315.tif 000004
【０２３７】
ＲＳＤ％‐相対標準偏差の百分率、標準偏差を系列の平均値で割った値に１００を掛けた値であり、ＣＶ％としても知られる。
【０２３８】
体積‐各作動によって送達装置から放出される液体又は粉末の体積であり、好ましくは０.０１ ｍＬないし約２.５ ｍＬ、最も好ましくは０.０２ ｍＬないし０.２５ ｍＬである。
【実施例】
【０２３９】
上記の開示は、本発明を一般的に説明するものであり、本発明は、以下の実施例によって更に例示される。これらの実施例は、単に例示の目的のためだけに記載されており、本発明の範囲の制限を意図するものではない。ここでは特定の用語及び値が用いられてはいるが、これらの用語及び値も、同様に例示的なものであって、本発明の範囲を制限しないものとして理解されるであろう。
【０２４０】
実施例１
使用した材料及び装置
本実施例では、本出願の実施例２以降の実施例で用いられた試薬、装置及びこれらの供給源を例示する。表１には、実施例２以降の実施例で使用されたサンプル試薬が例示されている。
【０２４１】
【表１】
2009518315.tif 000005
【０２４２】
表２には、本出願の実施例２で更に詳細に記載されるＭａｔＴｅｋ ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍの供給源と成分が例示されている。
【０２４３】
【表２】
2009518315.tif 000006
【０２４４】
表３には、本出願の実施例２で更に詳細に記載されるＬＤＨアッセイ系の供給源と成分が例示されている。
【０２４５】
【表３】
2009518315.tif 000007
【０２４６】
表４には、ここでそれぞれ用いた、器具及び他の関連する実験消耗品及び供給源が例示されている。
【０２４７】
【表４】
2009518315.tif 000008
【０２４８】
実施例２
グルカゴン様ペプチド-１（ＧＬＰ-１）医薬製剤のインビトロでの透過動態
本実施例では、賦形剤のＤＤＰＣ、ＥＤＴＡ及び単体で又は組合せでＭ-β-ＣＤを含む本発明の代表的な医薬製剤が、上皮細胞単層間のＧＬＰ-１の透過を促進することを実証する。表５には、どの製剤が、著しい細胞毒性を生じることなく、最も高いＧＬＰ-１の組織透過度と経上皮抵抗（ＴＥＥＲ）の低下を達成したかを決定するために、インビトロのＥｐｉＡｉｒｗａｙ Ｍｏｄｅｌ Ｓｙｓｔｅｍにて、経上皮抵抗アッセイ（ＴＥＥＲ）、細胞生存率アッセイ（ＭＴＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ細胞死アッセイ（ＬＤＨ）及び組織透過アッセイによってスクリーニングされた製剤が例示されている。
【０２４９】
各製剤とコントロールの３つの重複する系のサンプルを、ＭａｔＴｅｋ社(アッシュランド、マサチューセッツ州)製のインビトロのモデルの気管/気管支上皮細胞膜インサート、ＥｐｉＡｉｒｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号＃Ａｉｒ-１００）を用いて評価した。ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）ｓｙｓｔｅｍは、気道で層をなしている偽重層上皮のモデルとして、ＭａｔＴｅｋ社 (アッシュランド、マサチューセッツ州)により開発された。該上皮細胞を、底が多孔性メンブランの細胞培養インサート上で、空気-液体境界面にて増殖させると、結果として、細胞が非常に極性を帯びた形態へと分化する。頂端部表面は、微絨毛超微細構造の繊毛を有し、該上皮は、粘液を生産する（ムチンの存在がイムノブロッティング法により確認された）。細胞は、出荷の約３週間前に工場でインサート上に播種される。インサートは、０.８７５ ｃｍの直径を有し、０.６ ｃｍ２の面積を提供する。細胞は、出荷から約３週間前に工場でインサート上に播種される。
【０２５０】
ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）培養膜は、実験を開始する１日前に受け取った。これらの培養膜は、フェノールレッド不含かつヒドロコルチゾン不含の、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ (ＤＭＥＭ)中で出荷された。各組織インサートは、０.９ ｍｌの無血清ＤＭＥＭを含む６ウェルプレートのウェルに静置した。膜を、３７℃/５％ ＣＯ２で２４時間培養することで、組織を平衡化させた。このＤＭＥＭ系培地は、無血清であったが、上皮増殖因子及び他の因子が補充されている。
【０２５１】
培地は、毎回、鼻腔内送達に関して考えられるあらゆるサイトカインと成長因子の内在レベルについて試験されるが、インシュリン以外のサイトカイン又はこれまでに研究された因子は皆無であった。体積は、ユニットの高さにおいて、基底部分との接触を提供するが、上皮の頂端部表面を、直接空気と接触したまま残すのに十分な量である。本工程と、その後のユニットを液体含有ウェルに移すことを含む全ての工程において、ユニットの底部と培地の間に絶対に空気が入らないように、滅菌されたピンセットを用いる。
【０２５２】
ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）モデルシステムを用いて、各ＧＬＰ-１含有製剤による、ＴＥＥＲ、細胞生存率（ＭＴＴアッセイ）、細胞毒性（ＬＤＨアッセイ）及び透過に対する作用を評価した。これらのアッセイについては、以下に詳細に記載する。
【０２５３】
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）
ＴＥＥＲ値は、誘導電極を有する上皮電圧抵抗計に連結された組織抵抗測定チャンバーを用いて測定した。上皮電圧抵抗計及び組織抵抗測定チャンバーは、両方ともＷｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製であった。実験を開始した日に、各インサートについて、最初にバックグラウンドのＴＥＥＲを測定した。ＴＥＥＲを測定した後に、１ ｍｌの新鮮な培地を６ウェルプレートの各ウェルの底部に注いだ。インサートは、ペーパータオル上で余分な水分を吸い取り、該インサートは、バックグラウンドＴＥＥＲ測定値と対応するように番号付けした状態で、新鮮な培地の入った新しいウェル中に静置した。１００μｌの実験製剤を各インサートに添加した。インサートを、１００ ｒｐｍで、３７℃の振とうインキュベーター内に１時間静置した。
【０２５４】
キャリブレーションをチェックする前に、電源をオフにして電極と組織培養ブランクインサートを新鮮な培地中にて、少なくとも２０分間平衡化させた。バックグラウンドの抵抗を、Ｅｎｄｏｈｍ組織チャンバー中の１.５ ｍｌの培地と、ブランクのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ-ＣＭインサート中の３００ μｌの培地を用いて測定した。先端電極を、培地中に浸るが、インサートメンブランの上端表面とは接触しないように調節した。ブランクインサートのバックグラウンド抵抗は、約５-２０オームであった。各ＴＥＥＲ測定において、３００μｌの培地をインサートに添加し、これに続いて、Ｅｎｄｏｈｍチャンバー内に静置する前に２０分間室温でインキュベートしてＴＥＥＲを測定した。抵抗は、（抵抗測定値−ブランク）Ｘ ０.６ ｃｍ２として表わした。全てのＴＥＥＲ値は、組織の面積の関数として報告する。ＴＥＥＲは、以下の式によって計算した：
【０２５５】
【数３】
2009518315.tif 000009
【０２５６】
ここで、ＲＩは、膜を有するインサートの抵抗であり、Ｒｂは、ブランクインサートの抵抗であり、Ａは、膜の面積（０.６ ｃｍ２）である。コントロール値（コントロール = 約１０００オーム-ｃｍ２；１００に基準化する）に対するＴＥＥＲ値の低下は、細胞膜抵抗の低下と粘膜上皮細胞透過性の上昇を示す。１時間のインキュベーションを完了した後、組織インサートをインキュベーターから取り出した。２００ μｌの新鮮な培地を２４ウェルプレートの各ウェルに注ぎ、組織インサートをその２４ウェルプレートに移した。２００ μｌの新鮮な培地を、各組織インサートにゆっくりと添加した。各インサートについてＴＥＥＲを再度測定した。
【０２５７】
組織培養インサートを６ウェルプレートから２ウェルプレートに移した後に、基礎培地を、３つの系に分配し、エッペンドルフチューブ内で保存した。全ての３つの分配した培地は、使用するまで-８０℃中に静置した。
【０２５８】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイ
細胞死の量は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ (Ｐｒｏｍｅｇａ社)を用いて、細胞からのＬＤＨの放出を測定することにより評価した。本試験は、各組織培養インサートについて、３つの重複するサンプルに対して行った。回収した５０ μｌの培地（４℃で保存）を９６ウェルプレートに３つの系で注入した。新しい、細胞を含まない培地をブランクとして用いた。５０ μｌの基質溶液（キットに従って作製した基質ミックスの新しいボトルに１２ ｍｌのアッセイ用バッファーを添加した）を各ウェルに添加し、プレートをを暗所にて室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに５０μｌの停止溶液を添加し、プレートをμＱｕａｎｔ吸光度プレートリーダー上でＫＣＪｒソフトウェアを用いて４９０ｎｍで読み取った。
【０２５９】
ＭＴＴアッセイ
各細胞培養インサートの細胞生存率は、ＭＴＴアッセイにより試験した。細胞生存率はＭＴＴアッセイ(ＭＴＴ-１００、ＭａｔＴｅｋキット)を用いて評価した。このキットは、テトラゾリウム塩の取り込みと、ホルマザン色素への変換を測定する。ＭＴＴ濃縮物を融解させて、ＭＴＴ：培地が２ ｍｌ: ８ ｍｌの培地を用いて希釈した。希釈したＭＴＴ濃縮物を、２４ウェルプレートへピペッティングした（３００ μｌ）。組織インサートを徐々に乾燥させ、プレートのウェル内に置き、暗室内で３７℃にて３時間インキュベートした。インキュベーションの後、各インサートをプレートから取り出し、緩やかに吸水し、２４ウェル抽出用プレート内に静置した。該細胞培養インサートを、１ウェル当たり２.０ｍｌの抽出溶液（サンプルを完全にカバーするため）中に浸した。抽出溶媒の蒸発を減らすために、抽出用プレートをカバーして密封した。暗所で室温にて一晩インキュベートした後に、各インサート中の液体を、それを取り出したウェルにデカントして戻し、インサートを捨てた。各ウェルからの抽出溶液（５０μｌ）を、抽出ブランクと共に、９６ウェルマイクロタイタープレートに３つの重複する系でピペッティングし、新鮮な抽出溶液１５０ μｌを添加して希釈した。サンプルの吸光度は、μＱｕａｎｔ吸光度プレートリーダー上でＫＣＪｒソフトウェアを用いて５５０ ｎｍで読み取った。
【０２６０】
組織透過アッセイ
ＥｐｉＡｉｒｗａｙ上皮細胞単層の頂端部表面から側底面へ透過するＧＬＰ-１（７-３６）の量は、ＧＬＰ-１の透過度を表していた。培養細胞の側底面上に認められたＧＬＰ-１タンパク質量は、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＧＬＰ-１（７-３６）アミドＥＬＩＳＡキットは、Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（セントチャールズ、ミシガン州）から購入した。ＥＬＩＳＡアッセイは、製造元のプロトコルに従って行った。回収したサンプルは、キットに提供されたアッセイ用バッファーで希釈した。インビトロでのスクリーニングを複数回繰り返して行った。透過パーセントは、細胞の側底面上のＥＬＩＳＡで測定したＧＬＰ-１の測定量を、細胞の頂端部に添加したＧＬＰ-１開始物質の全量で割った値に１００を掛けることによって計算した。最初に、異なる量の賦形剤ＥＤＴＡ、Ｍ-β-ＣＤ及びＤＤＰＣを用いて実験計画（ＤＯＥ）の試験を行った。結果を表５にまとめる。１又は２種類以上の賦形剤を含む全ての製剤で、賦形剤を含まないコントロール（＃３１）に対する透過性の向上が示された。
【０２６１】
【表５】
2009518315.tif 000010
【０２６２】
更にインビトロでのＴＥＥＲ、ＭＴＴ、ＬＤＨ及び透過％試験においてテストした鼻腔内医薬製剤を表６に示す。これらの製剤についてのＴＥＥＲ、ＭＭＴ、ＬＤＨ及び透過の結果を表７にまとめる。
【０２６３】
【表６】
2009518315.tif 000011
【０２６４】
【表７】
2009518315.tif 000012
【０２６５】
コントロールに対する測定されたＴＥＥＲ値の低下は、細胞膜抵抗の低下、又は換言すれば、上皮単層の頂端部から側底部へのイオン種の通過を表す。表７に示すデータは、全ての促進剤製剤が、コントロール製剤との比較で有意にＴＥＥＲを低下させたことを示す。
【０２６６】
ＭＴＴアッセイは細胞生存率を測定し、一方で、ＬＤＨアッセイは細胞毒性を測定した。細胞の「健康」に対する医薬製剤の効果を測定するため、これらのアッセイは、組み合せて用いられる。ＭＴＴ及びＬＤＨの結果は、両方ともパーセントで表した。ＭＴＴパーセントは、各製剤について測定されたＭＴＴ値を、コントロール製剤のＭＴＴ値で割った値に１００を掛けることによって算出した。従って、ＭＴＴポジティブコントロールは、１００％であり、全ての他の製剤とのベースライン比較として用いられた。８０％未満のＭＴＴ値は、細胞の生存率に対する負の作用を表す。同様に、ＬＤＨパーセントは、各製剤について測定されたＬＤＨ値を、コントロール製剤のＬＤＨ値で割った値に１００を掛けることによって算出した。従って、ＬＤＨポジティブコントロールは、１００％であり、全ての他の製剤とのベースライン比較として用いられた。ＭＴＴアッセイの結果は、１つの製剤（表７の＃１２）を除くすべての製剤で、細胞生存率が８０％未満に低下しなかったことを示す。このデータは、大多数の製剤が、有意な細胞毒性レベルを示さなかったことを示すＬＤＨ細胞毒性アッセイによって更に支持される。
【０２６７】
ＧＬＰ-１組織透過性は、透過％及びコントロール製剤（サンプル＃１３）の透過性に対する増加倍数で表わされる。賦形剤含有製剤のコントロールに対する増加倍数では、ＧＬＰ-１透過を、コントロールの透過に対して約７４倍ないし３４１倍促進させたことになる。これらのデータは、賦形剤ＤＤＰＣ、ＥＤＴＡ及びＭ-β-ＣＤを含有することにより、上皮細胞単層間のＧＬＰ-１透過が有意に促進されることを示す。表７の製剤#１、#２、#６及び#１２では、賦形剤を含まないコントロール（表７の＃１３）に対して透過％が２００倍超に向上する結果となった。
【０２６８】
要約すると、インビトロでのデータは、２ ｍｇ/ｍｌのＧＬＰ-１、１０ ｍｇ/ｍｌのＥＤＴＡ及び１ＯｍＭのクエン酸バッファーを含む本発明の代表的な医薬製剤（表６の＃６）が、最も良好なＧＬＰ-１透過促進能及びＴＥＥＲ低下能を示すと同時に細胞生存率に対して最小の負の作用を示した。従って、この製剤は、肥満及び糖尿病を含むヒト疾患の治療における、例えば鼻腔内（ＩＮ）薬物投与等の、粘膜表面間のＧＬＰ-１の送達のための理想的な候補を代表するものである。
【０２６９】
実施例３
ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ亜鉛塩又はＥＤＴＡマグネシウム塩を含むグルカゴン様ペプチド-１（ＧＬＰ-１）医薬製剤のインビトロでの透過動態比較
本実施例では、ＧＬＰ-１医薬製剤のインビトロでの透過動態が、その製剤中に用いるＥＤＴＡの形態に対して感受性を示すことを実証する。以下の表８には、インビトロのＥｐｉＡｉｒｗａｙ Ｍｏｄｅｌ Ｓｙｓｔｅｍにて、経上皮抵抗（ＴＥＥＲアッセイ）、細胞生存率（ＭＴＴアッセイ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨアッセイ；細胞死）及び組織透過によってスクリーニングされた製剤が例示されている。コントロールとして機能したサンプル＃９及び＃１０を除き、全てのサンプルは２ ｍｇ/ｍｌのＧＬＰ-１を含んでいた。製剤は、製造してから２４時間以内に使用したので、保存剤は添加しなかった。各製剤は、０.５ ｍｌの総体積で作製し、３つの重複する系（ｎ = ３）で評価した。各サンプルは、実施例２に詳細に説明したプロトコルに従って評価した。
【０２７０】
【表８】
2009518315.tif 000013
【０２７１】
略語
Ｍ-β-ＣＤ = メチル-β-シクロデキストリン、ＥＤＴＡ =エデト酸二ナトリウム、ＤＤＰＣ = Ｌ-α-ホスファチジルコリンジデカノイル、ＣＢ = クロロブタノール、Ｍｇ ＥＤＴＡ = ＥＤＴＡ二ナトリウムマグネシウム塩；Ｚｎ ＥＤＴＡ = ＥＤＴＡ二ナトリウム亜鉛塩；ＭＴＴ = ＭＴＴアッセイ；ＬＤＨ = ＬＤＨアッセイ；ＴＥＥＲ = 経上皮抵抗。
【０２７２】
結果
例えば、賦形剤ＤＤＰＣ、ＥＤＴＡ及びＭ-β-ＣＤ等の鼻腔内送達促進剤を含む医薬製剤のＥｐｉＡｉｒｗａｙ（商標）Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（粘膜上皮細胞層）に対する作用が示される。透過動態の結果は、表９にまとめられており、細胞を表８に示す製剤とインキュベートした１時間後に行った測定が表わされている。
【０２７３】
【表９】
2009518315.tif 000014
【０２７４】
先のデータは、種々のＥＤＴＡ塩の形態を医薬製剤に用いて、薬物透過動態を操作できることを示している。
【０２７５】
実施例４
ＧＬＰ-１の安定性
本実施例では、例えばＭ-β-ＣＤ、ＥＤＴＡ及びＤＤＰＣ等の低分子賦形剤は、医薬製剤中でＧＬＰ-１の物理的安定性を向上させないことを示す。本実施例では、ＧＬＰ-１の安定性を、以下の表１０に記載する２種類の製剤を用いて評価した。本実施例の目的は、ＧＬＰ-１の加熱によりタンパク質分解が生じるかどうかを決定することであった。
【０２７６】
【表１０】
2009518315.tif 000015
【０２７７】
再スキャンを伴う１種類の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を表１０のサンプル＃１に対して行った；サンプルは、６０℃/時間のスキャン速度で、５℃から１００℃までスキャンした。データは、Ｃｐ（ｃａｌ/℃）対温度（℃）としてグラフ化した。最初の熱スキャンにおいて、３５℃付近に鋭い遷移ピークが観察される。遷移後のノイズと８０℃から９０℃の間の熱容量の大きな減少は、凝集体の形成を示唆する。溶液は、スキャン後に僅かに濁っていることが観察され、沈澱の形成が確認された。遷移ピークは、ペプチドのアンフォールディングについて予期されるよりも一層狭いものであり、これは、ペプチドのアンフォールディング直後に凝集が起った結果による可能性がある。これらのデータから、ＧＬＰ-１は、３５℃又は３５℃前後から変性及び/又は凝集形成を開始することが示される。
【０２７８】
サンプル＃２に対しても再スキャンを伴うＤＳＣ実験を行った；サンプルは、６０℃/時間のスキャン速度で、５℃から１００℃までスキャンした。データは、Ｃｐ（ｃａｌ/℃）対温度（℃）としてグラフ化した。最初の熱スキャンにおいて、４６℃付近に非常に幅広いピークが観察される。８０℃と９０℃の間の熱容量の大幅な減少は、凝集体の形成による可能性がある。しかしながら、スキャン後にも溶液は濁って見えず、非常に小さな凝集体であることが示唆された。これらのデータから、ＧＬＰ-１は、製剤中で、４６℃又は４６℃前後から変性及び/又は凝集形成を開始することが示される。
【０２７９】
これらのデータから、ＧＬＰ-１製剤へ表１０に記載する賦形剤を添加することによっては、その物理的安定性が向上されないことが示される。
【０２８０】
実施例５
選択された医薬製剤中のグルカゴン様ペプチド-１（ＧＬＰ-１）の鼻腔内及び静脈内投与のウサギ内での薬物動態（ＰＫ）評価
本実施例では、鼻腔内投与によるＧＬＰ-１のバイオアベイラビリティが、製剤中に、例えば、Ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジド等のジペプチジルペプチダーゼ-ＩＶ（ＤＰＰ-ＩＶ）を含有させることによって有意に促進されることを実証する。ウサギでの薬物動態（ＰＫ）試験を行って、静脈内（ＩＶ）注射に対する、鼻腔内（ＩＮ）送達により投与された種々の製剤ついてのＧＬＰ-１の血漿内薬物動態特性を評価した。全体の実験設計を、表１１に示す。＃１ないし＃４の製剤は、ＩＮ製剤を代表し、一方で＃５の製剤は、ＩＶ注射された製剤を代表する。
【０２８１】
【表１１】
2009518315.tif 000016
【０２８２】
本試験では、ニュージーランド白ウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔ）（Ｈｒａ: (ＮＺＷ) ＳＰＦ）を試験対象として用いて、鼻腔内投与及び静脈内注射によるＧＬＰ-１の血漿内薬物動態を評価した。ウサギに投与された薬物から得られる薬物動態プロファイルは、ヒト体内の同一の薬物のＰＫプロファイルに酷似することから、本試験ではウサギを対象動物として選択した。
【０２８３】
本試験では、ＧＬＰ-１の４種類の鼻腔内製剤と１種類の静脈内製剤を評価した。各製剤の媒体組成を、表１２に提示する。ＧＬＰ-１鼻腔内製剤及び静脈内製剤は、最終調製及び試験のために製造した。
【０２８４】
各投与溶液について、成分は、部分Ａと部分Ｂの２つの部分で提供した（表１２を参照）。各鼻腔内グループ（グループ１-４）の最終製剤は、等量の部分Ａ（１ ｍＬ）と部分Ｂ（１ ｍＬ）を混合することによって作り出した。静脈内グループ（「グループ５」については、１.５ ｍＬの部分Ａと３.５ ｍＬの部分Ｂを混合した。全てのグループの最終投与溶液は、調製から６時間以内に用いた。
【０２８５】
【表１２】
2009518315.tif 000017
【０２８６】
４種類の鼻腔内製剤において、ＧＬＰ-１の濃度は一定であった。クエン酸濃度及びｐＨも４種類の製剤において一定であった。ＥＤＴＡ濃度は、製剤１、３及び４については一定であった、製剤２は、先に上皮細胞層間のペプチドの送達を促進することが示されたタイトジャンクション調節剤のＰＮ１５９を含んでいたが、ＥＤＴＡは含んでいなかった。製剤５は、クエン酸、ＥＤＴＡ及び塩化ナトリウムを含み、これらはそれぞれ静脈内投与に適切な濃度にあった；ＧＬＰ-１の濃度は、ＧＬＰ-１の全投与量が鼻腔内投与の１０％になるように少なくした。
【０２８７】
Ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドは、活性ＧＬＰ-１（７-３６アミノ酸の断片）の不活性な代謝物（９-３６アミノ酸の断片）への代謝に関与する主たる酵素、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶの特異的阻害剤である。この試験の評価では、Ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの濃度は、製剤１及び製剤２の濃度が同じであることを除けば、各鼻腔内投与グループでそれぞれ異なっていた。Ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの総投与量は、グループ１及び２（鼻腔内グループ）、並びにグループ５（静脈内グループ）で約０.０４ ｍモル/ｋｇであった。
【０２８８】
ＧＬＰ-１アッセイ方法
グルカゴン様ペプチド-１（活性）ＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ# ＥＧＬＰ-３５Ｋ）を用いて、試験サンプル、スタンダード及び品質コントロールサンプルのアッセイを行った。各サンプルは、２つの重複する系で分析した。
【０２８９】
このアッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル内に固相化されたモノクローナル抗体（Ｎ末端領域に特異的）による活性なＧＬＰ-１（７-３６及び７-３６アミド断片）の捕獲、及び抗ＧＬＰ-１アルカリホスファターゼ標識２次抗体による検出に基づくものである。洗浄の後に、アルカリホスファターゼの存在下で蛍光生成物のウンベリフェロンを形成する、メチルウンベリフェリルホスフェート（ｍｅｔｈｙｌ ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を各ウェルに添加する。生じる蛍光量は、未知のサンプル中の活性ＧＬＰ-１の濃度と正比例し、これは、公知の濃度の活性ＧＬＰ-１の参照スタンダードを用いた基準曲線からの内挿により得られる。
【０２９０】
ヒトとウサギのＧＬＰ-１の種の類似性により、アッセイで、内在性の（即ち、ウサギの）活性ＧＬＰ-１を検出するであろうことが予想された。ウサギＧＬＰ-１の内在レベルは、時刻Ｏに測定する。９-３６のＧＬＰ-１断片は、その供給源に関係なく、本アッセイで検出されなかった。
【０２９１】
薬物動態評価
薬物動態の計算は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトフェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、バージョン４.０、マウンテンビュー、カリフォルニア州）及び血管外投与の非コンパートメントモデルを用いて行った。評価のパラメーターを、表１３に記載する。
【０２９２】
【表１３】
2009518315.tif 000018
【０２９３】
薬物動態パラメーター分析
鼻腔内及び静脈内の両方のグループについての平均ＧＬＰ-１薬物動態データを表１４に提示する。
【０２９４】
血清又は血漿中の内在性ＧＬＰ-１の投与前（ベースライン）濃度は、一般的に１０ ｐｇ/ｍＬ未満である。いくつかのサンプルについては、サンプル量が制限されているため、正確な結果を得るために分析を繰り返し行うことが妨げられた。これらのサンプルについては、＜４ ｐｇ/ｍＬの値を報告した。グループの平均値を計算して、薬物動態を評価するため、データは適切な場合にはベースライン補正を行った。＜ＮＵＭＢＥＲとして表わされる結果は、「＜ＮＵＭＢＥＲ/２」に設定し、この方法により、＜４ ｐｇ/ｍＬの値も、２ ｐｇ/ｍＬに設定した。
【０２９５】
投与後の、個々の動物の血漿ＧＬＰ-１値は、ベースラインの１０ ｐｇ/ｍＬを超えた。静脈内投与後の最終時点（９０分）では、ＧＬＰ-１の血漿濃度は、ベースライン値であるか又はこの前後にあり、注射及び排出相は、本試験で用いたサンプリングの時間枠内に捕えられたことが示唆された。鼻腔内滴注の後、複数の動物が、ベースライン濃度を超えるＧＬＰ-１血漿濃度を示した。ＡＵＣｉｎｆを測定して、ＧＬＰ-１の全体的な曝露プロファイルを評価した。
【０２９６】
【表１４】
2009518315.tif 000019
【０２９７】
製剤１/グループ１
ＧＬＰ-１のピーク濃度（Ｔｍａｘ）は投与から５分ないし２０分の間に起った（グループの平均では１１分）。グループの平均Ｃｍａｘは、８４４.９ ｐｇ/ｍＬであった。血漿濃度は、投与後９０分においてもベースラインを上回ったままであり、この時刻において排出が完了していなかったことが示唆される。このことは、２０,７９２.７ 分*ｐｇ/ｍＬのＡＵＣｌａｓｔ及び３２,４１５.９ 分*ｐｇ/ｍＬのＡＵＣｉｎｆに反映されている。平均末端半減期（ｔ１/２）は、５５.５分間であると推定された。
【０２９８】
製剤２/グループ２
グループ２の平均Ｃｍａｘは、４２４.０ ｐｇ/ｍＬであると推定された。平均Ｔｍａｘは、４３分間であると推定された；しかしながら、このパラメーターについては、動物間で相当なばらつきがあった。これらの動物の濃度対時間プロファイルの調査により、吸収（増大）及び排出（減少）相が示された。グループ２の平均ＡＵＣｌａｓｔは、１７,０６９.８ 分*ｐｇ/ｍＬであった。グループ内の２羽の動物において、明確な排出相が存在しなかったため、ｔ１/２は推定することが出来なかった。しかしながら、このグループ内の残りの動物について回収したデータに基づいた平均ｔ１/２は、６６.８分間であった。平均ＡＵＣｉｎｆ（Ｋｅｌを測定できた３羽の動物）は、３３,３２４.４ 分*ｐｇ/ｍＬであった。
【０２９９】
製剤３/グループ３
グループ３の平均Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ｔ１/２、及びＡＵＣｌａｓｔは、それぞれ ２８３.９ ｐｇ/ｍＬ、２５分間、３９.３分間及び９,３３１.５ 分*ｐｇ/ｍＬであった。このグループの１羽の動物が、６０分において、予想値よりも高い値を示したので、正確なＫｅｌを測定することができず、従って、ｔ１/２も測定できなかった。従って、この値は、グループの平均ｔ１/２の３９.３分間及びグループの平均ＡＵＣｉｎｆの１３,２３２.７ 分*ｐｇ/ｍＬに含めなかった。
【０３００】
製剤４/グループ４
グループ４の平均Ｃｍａｘは、１５４.５ ｐｇ/ｍＬであると推定された。グループの平均Ｔｍａｘは４７分間であったが、２羽の動物は、そのＧＬＰ-１の最高測定血漿濃度を９０分に示した。これらの動物については、明確な排出相が存在しなかったためＫｅｌ（及びｔ１/２）及びＡＵＣｉｎｆを測定することが出来なかった。他の３羽の動物についての平均ｔ１/２及びＡＵＣｉｎｆは、それぞれ２２.４分間及び５,７３４.４ 分*ｐｇ/ｍＬであると推定された。
【０３０１】
製剤５/グループ５
注入過程において、グループ５の１羽の動物に、ポンプ装置の機械的故障が生じたため、５分から１０分の時点の間に更なる〜１００ μｌを更に送達した。このことは、１０分における＞５０００ ｐｇ/ｍＬの濃度値に反映されている。注入の正確な条件を決定することが出来なかったので、この動物についてのデータは、グループ５の薬物動態評価に含めなかった。
【０３０２】
静脈内注入の１０分におけるの平均Ｃｍａｘは、３.１８３.６ ｐｇ/ｍＬであった。３羽の動物は、５分間のＴｍａｘを示し、１羽の動物は、１０分間のＴｍａｘを示した；しかしながら、ＧＬＰ-１の濃度は、４羽全ての動物について、５分及び１０分の時点において大体同じであった。このグループの最終ｔ１/２は、３０.９分間であると推定された。２８,８８３.２ 分*ｐｇ/ｍＬの平均ＡＵＣｌａｓｔは、ＡＵＣｉｎｆがこれを少しだけ上回る２９,１４９.５ 分*ｐｇ/ｍＬであったため、曝露プロファイルの大部分を捉えていた。
【０３０３】
１０分（注入の終了時）から２０分における濃度対時間の対数プロファイルの調査により、ＧＬＰ-１の２相からなる排出が示唆された。２相からなるプロファイルのより早いα相は、一般的に血管外の分布及び排出と関連し、より遅いβ相は、最終排出を表すものと考えられている。この時間枠内の排出速度の計算により、２分間又は２分未満の初期ｔ１/２が示された。この初期ｔ１/２は、注入時間の公判１０分間における明確な定常状態の達成を一致するであろう。
【０３０４】
バイオアベイラビリティ
ＡＵＣｌａｓｔ及びＡＵＣｉｎｆを用いて、鼻腔投与後のＧＬＰ-１バイオアベイラビリティを計算した；これらの推定値を表１５に示す。グループ１、３及び４では、製剤中の阻害剤Ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの濃度は、それぞれ０ ｍＭ、１５ ｍＭ、又は２５ ｍＭであった。阻害剤の不存在下では、ＧＬＰ-１バイオアベイラビリティは、約２％であったが、製剤への１５ ｍＭのＬｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの添加（グループ３）によって、ＧＬＰ-１バイオアベイラビリティは、約３％ないし５％に増加した。ＧＬＰ-１バイオアベイラビリティは、製剤への２５ ｍＭのＬｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの添加（グループ１）によって、更に約７％ないし１１％に増加した。
【０３０５】
ポリペプチドＰＮ１５９は、低分子賦形剤と比較して、ペプチドのバイオアベイラビリティを増加することが実証されている。ＰＮ１５９及び２５ ｍＭのＬｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドを含有する製剤２（グループ２）は、試験した際に、約６％ないし１１％のＧＬＰ-１バイオアベイラビリティを示したが、これは、ＰＮ１５９を含まないが２５ ｍＭのＬｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの存在下でのＧＬＰ-１について観察されるバイオアベイラビリティと同等である。ＰＮ１５９は、ＧＬＰ-１のＩＮバイオアベイラビリティに対して１０ ｍＭのＥＤＴＡと同等の効果を有する。
【０３０６】
【表１５】
2009518315.tif 000020
【０３０７】
ウサギ内でのＧＬＰ-１の最終半減期は約３０分であり、ラット及びヒトについて１０分間又は１０分未満の最終半減期を報告した文献（Ｐａｒｋｅｓ, Ｄ., ｅｔ ａｌ., "Ｐｈａｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｘｅｎｄｉｎ-４ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ: Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｇｌｕｃａｇｏｎ-ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ-１," Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３:２６０-２６７, ２００１; Ｄｅａｃｏｎ, Ｃ, Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｇｌｕｃａｇｏｎ-ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ-１, Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３:２１８１-２１８９, ２００４）に基づいて予想していたよりも長いものであった。ウサギのｔ１/２は、各グループ及び各動物間で一致していたので、本試験に支持される。
【０３０８】
最終の計算は、勾配の決定に用いられる濃度対時間の対数曲線の部分に依存する（表１３中のＫｅｌの定義を参照）。上記の推定については、モデリングプログラムにより、Ｋｅｌの推定のために最良の適合が選択された。１０分（注入の終了時）から９０分まで適合する曲線の手作業による選択により、１０ないし１２分間の範囲内にある最終半減期が示された（データ開示無し）。
【０３０９】
クリアランスによる、投与後の薬物の処理を評価するための第２の手段が提供される。クリアランスは、身体又はその器官が血液から薬物を除去する本質的能力であると考えることができる（Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ, ２ｎｄ ｅｄ., Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ, Ｉｎｃ. Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ, Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ.）。しかしながら、この場合、ＧＬＰ-１は血中にとどまることができるが、クリアランスを評価する目的のため、除去されたと見なすこともできる。このことの根拠は、ＧＬＰ-１が２種類の異なる状態で存在することである；アミノ酸７-３６によって代表されるペプチド断片から成る活性状態、及びアミノ酸９-３６に代表されるペプチド断片から成る、代謝の結果生じる、不活性状態。不活性状態へ変換される時点で、ＧＬＰ-１は、身体から効果的に除去されたものとみなされる。ＧＬＰ-１の検出にここで用いたアッセイ法は、ＧＬＰ-１の活性形態（７-３６）に特異的なものであったので、血中のＧＬＰ-１の不活性形態の存在は、ＧＬＰ-１のクリアランスの評価に干渉していない。
【０３１０】
鼻腔内グループの場合、グループ４について１５,１６０.０ ｍＬ/分/ｋｇのグループ平均の最大クリアランス値（ＣＬ-Ｆ）が示された。グループ３の平均値は、６,９７７.０ ｍＬ/分/ｋｇであった。グループ２及び１については、クリアランスが近似しており、ぞれぞれ２,７１６.０ ｍＬ/分/ｋｇ及び３,０３２.８ ｍＬ/分/ｋｇであった。予想されるように、各グループのクリアランス推定値は、全身曝露に対して反比例する。
【０３１１】
鼻腔内グループのクリアランス値は、ＧＬＰ-１のバイオアベイラビリティに対しても修正した。グループ４及び３の修正したクリアランスは、それぞれ７,５８０ ｍＬ/分/ｋｇ及び１,３９５ ｍＬ/分/ｋｇであった。グループ１及び２（それぞれ〜１１％のバイオアベイラビリティ）についは、修正されたクリアランス値は、それぞれ２７５ ｍＬ/分/ｋｇ及び２４７ ｍＬ/分/ｋｇであると測定された。グループ１及び３の修正されたクリアランスは、静脈内投与グループ（グループ５）のクリアランス推定値２５９.８ ｍＬ/分/ｋｇに近似していた。
【０３１２】
Ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの総投与量は、グループ１、２及び５について約０.００４ ｍモル/ｋｇであった。この試験においてＬｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドの血中レベルは測定しておらず、従って、鼻腔内投与後のバイオアベイラビリティは未知である。鼻用製剤中にＬｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドが存在することによって、活性ＧＬＰ-１を、鼻粘膜内の代謝及び、その合理的なバイオアベイラビリティから仮定するに、体循環内の代謝から保護することが可能になる。鼻粘膜による代謝からの保護は、Ｌｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドが製剤内に存在した場合における、ＧＬＰ-１のより高いＣｍａｘとも一致する。しかしながら、ＧＬＰ-１の両断片は、恐らく体循環内へ交差して進入するであろうから、活性ＧＬＰ-１がより高いパーセンテージとなることを確認するために、総ＧＬＰ-１（７-３６アミノ酸と９-３６アミノ酸の断片）についてのアッセイを行うことが必要であろう。
【０３１３】
血液内での代謝からの保護は、静脈内グループ（グループ５）と最も高い阻害剤濃度を有する鼻腔内グループ（グループ１及び２）ののＧＬＰ-１のクリアランス値の類似性によって示される。
【０３１４】
まとめ
上記のデータは、ＤＰＰ ＩＶ阻害剤のＬｙｓ(４-ニトロ-Ｚ)-ピロリジドを含むＧＬＰ-１の鼻腔内医薬製剤の送達が、ＧＬＰ-１バイオアベイラビリティを増大させたという驚くべき予期せぬ発見を実証するものである。更に、ＧＬＰ-１バイオアベイラビリティは、製剤内の阻害剤の濃度に依存していた。阻害剤の不存在下では、ＧＬＰ-１のバイオアベイラビリティは、約２％であった。Ｌｙｓ（４-ニトロ-Ｚ）-ピロリジドを１５ ｍＭで含むことにより、ＧＬＰ-１バイオアベイラビリティは、約５％にまで増加し、２５ ｍＭのＬｙｓ（４-ニトロ-Ｚ）-ピロリジドでは、ＧＬＰ-１のバイオアベイラビリティは約１１％であった。得られたデータからはＧＬＰ-１代謝の局所的（鼻組織）及び全身的な阻害の可能性が示唆された。２５ ｍＭのＬｙｓ（４-ニトロ-Ｚ）-ピロリジドに加えて、ＰＮ１５９を含む製剤についても、このタイトジャンクション調節剤によるより高いバイオアベイラビリティ達成の可能性を評価するために、調査を行った。本試験の条件下では、ＧＬＰ-１のバイオアベイラビリティに対するＰＮ１５９の効果は、製剤中のＥＤＴＡの効果を上回るものではなかった。
【０３１５】
実施例６
ＧＬＰ-１製剤の使用中及び固体としての安定性
「使用中」の安定性は、アクチュエーターが取り付けられたバイアル中に保存され、適切な治療計画（この場合、１日３回（ＴＩＤ））に従って噴霧され、そして特定の保存温度下に静置された製剤を用いる試験によって定義される。バイアルは、最初にプライムされ、その後のスプレーまでの間はプライムされない。プライミングとは、最初の完全な噴霧が視覚的に明確となるまでスプレーし、次いで投与前に１又は２回以上作動させることと定義される。バイアルを常時３０℃/６５％相対湿度（ＲＨ）で保管し、各投与のためチャンバーから取り出して１０分間以内にスプレーした。バイアルは、各試験に選択した計画に応じて１日３回又は１回作動させた。各噴霧と噴霧の間に最低でも１時間を設け、視覚的/物理的観察を記述した。
【０３１６】
ＴＩＤ/３０℃での「使用中」の試験を行った。本試験で使用した製剤には、５ｍｇ/ｍＬのＧＬＰ-１、１０ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）が含まれ、保存剤は含まれていなかった。バイアルを充填し、プライムして、ＴＩＤで作動させ、３０℃/６５％ ＲＨで１０日間保管した。７日間ＴＩＤスプレーした後のＧＬＰ-１の使用中の回収率と純度を表１６及び１７に示す。「使用中」のペプチドの回収率は、７日目まで９５ ± ２.２％を超えていた。「使用中」の総ペプチド純度は、１０日間のＴＩＤ/３０℃/６５％ ＲＨの後に、９８±２.１％であった。
【０３１７】
【表１６】
2009518315.tif 000021
【０３１８】
【表１７】
2009518315.tif 000022
【０３１９】
「密封状態」の安定性は、密封（即ち、キャップを取り付けた）バイアル中に保存され、特定の保管場所に高温度条件（即ち、５℃、２５℃、４０℃、及び/又は５０℃）下で特定の時間静置された製剤を用いる試験により定義される。「密封状態」の安定性試験は、インビトロでの一連のスクリーニングで良好な結果を示した製剤に対して行った。製剤を製造し、５℃、２５℃及び３５℃で保存した。表１８には、試験した製剤が示されている。製剤＃５及び＃６（ＧＬＰ-１及びＥＤＴＡを含有）についての結果は、５６日間の保存の後にＧＬＰ-１の回収率が、５℃で１００％、２５℃で＞９７％、そして３５℃で＞９０％であったことを示す。
【０３２０】
【表１８】
2009518315.tif 000023
【０３２１】
「密封状態」の安定性アッセイは、「使用中」試験のために作製した製剤（５ｍｇ/ｍＬのＧＬＰ-１、１０ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー(ｐＨ ３.５)、保存剤は無し）と同じバッチの製剤に対して行った。製剤は、５℃で保存した。「密封状態」の安定性の結果を以下の表１９ないし２０に示す。
【０３２２】
【表１９】
2009518315.tif 000024
【０３２３】
【表２０】
2009518315.tif 000025
【０３２４】
実施例７
鼻腔内ＧＬＰ-１製剤のインビトロでの薬力学
３つの試験により、ＧＬＰ-１の鼻腔内（ＩＮ）投与後の血中グルコースに対するＧＬＰ-１（７-３６）アミド及び合成エキセンディン-４（エクセナチド）の薬力学的（ＰＤ）作用を、ＤＰＰ-ＩＶ阻害剤又はエクセナチドの皮下注射（ＳＱ）有り又は無しで比較した。本試験は、ヒトの研究で使用される経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）のＺＤＦラットモデルにより行った。
【０３２５】
薬力学的作用は、血中グルコース及び血中インシュリン濃度をモニターすることにより評価した。グルコースの血液中の濃度は、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ４アナライザーと適切なＧｌｕｃｏｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ブレア、カリフォルニア州、米国）を用いて測定した。薬物動態パラメーターは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、バージョン５.０１、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いて測定した。血液中のインシュリン濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０３２６】
血液中のアセトアミノフェン濃度は、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ４アナライザーとＡｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ブレア、カリフォルニア州、米国）を用いて測定した。アセトアミノフェンは、一般的に胃から無視できる程度にしか吸収を示さないので、胃排出のマーカーとしてアセトアミノフェンを用いた。投与後のピーク濃度までの時間（Ｔｍａｘ）及びピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、胃排出が起る時間を反映し、胃排出のプロファイル（例えば、胃から放出された後の体循環内への吸収など）は、排出までの時間を反映する。ＡＵＣは、全体的な曝露を反映する。アセトアミノフェンを、試験２及び３で投与して胃排出をモニターした。
【０３２７】
試験１
試験１における、血中のグルコースとインシュリンの値を評価するための全体的な実験計画を表２１に概略する。
【０３２８】
【表２１】
2009518315.tif 000026
【０３２９】
試験１におけるＧＬＰ-１処理ラット用の製剤は、以下の通りであった：Ｆ１ = １Ｏ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）、阻害剤無し；Ｆ２ = １０ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）及び２５ ｍＭの Ｈ-Ｌｙｓ（４-ニトロ-Ｚ）-ピロリジド（阻害剤は、Ｂａｃｈｅｍ 社から市販されている）；及び、Ｆ３ = １０ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）及び２５ ｍＭのＬ-プロリン-ボロプロリン（プロ-ボロプロ(Ｐｒｏ-ｂｏｒｏｐｒｏ)は、特許出願第２００４/０２２９８２０ Ａ１号、Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ, Ｗｉｌｌｉａ, Ｗ. ｅｔ ａｌ.の情報に基づいて合成した)。
【０３３０】
試験１のＰＤの結果を表２２に示す。ＧＬＰ-１製剤（ＤＰＰ-ＩＶ有り又は無し）で処理したラットのグルコースのＡＵＣ(０-１５０)は、エクセナチド及びプラセボで処理したラットよりも〜１５％低かった。試験１では、グルコースは、２ ｇ/ｋｇ投与されたが、試験２以降の試験では、グルコースは、１ ｇ/ｋｇ投与された。結果として、試験１では、グルコースの負荷が大きかったため、観察されたグルコース低下率は、他の試験のグルコース低下率（例えば、０-１６％のＡＵＣ(０-１５０)）と比べて低かった。試験１では、胃排出をモニターするためにアセトアミノフェンを投与することはなかった。
【０３３１】
【表２２】
2009518315.tif 000027
【０３３２】
経口でのグルコース投与の＋２０分後に投与した場合には、ＧＬＰ-１製剤間で血中グルコースの差はなかった。-１０分で、事前投与した場合には、阻害剤有りのＧＬＰ-１製剤（Ｆ２及びＦ３）対阻害剤無しのＧＬＰ-１製剤（Ｆ１）間で血中グルコースプロファイルに差が認められた。ＤＰＰ-ＩＶ阻害剤を含む両方の製剤（Ｆ２及びＦ３）で、Ｃｍａｘの遅延が生じた（４５分間から約１２０分間へ）。ＧＬＰ-１の有意レベルにより、胃排出が遅延した；ウサギのＰＫ試験では、ＤＰＰ-ＩＶ阻害剤を含むＧＬＰ-１製剤で、含まない場合より５倍高いＢＡ％が示された。試験２では、アセトアミノフェンを、ＤＰＰ-ＩＶ阻害剤を含む製剤に添加して、阻害剤を含まないＧＬＰ-１製剤の胃排出と比較した。
【０３３３】
-１０分でのプラセボ、-１０分でのＧＬＰ-１ Ｆ１（阻害剤無し）及び＋２０分でのＧＬＰ-１ Ｆ１（阻害剤無し）についてのインシュリン及びグルコース測定のデータにより、インシュリン増加は、-１０分及び+２０分のいずれで投与された場合でも、プラセボと比較して、ＧＬＰ-１ Ｆ１でより拡大することが示される。
【０３３４】
試験２
ＯＧＴＴのラットモデル内での鼻腔内滴下（ＧＬＰ-１）後の血中グルコースに対するＤＰＰ-ＩＶ阻害剤存在下及び非存在下でのＧＬＰ-１（７-３６アミド）のＰＤ作用を、試験２でアッセイした。血中のグルコース及びインシュリンの値を評価するための全体的な実験設計の概要を表２３に示す。試験２のＯＧＴＴは、１ ｇ/ｋｇのグルコース溶液一括投与を経口胃管で投与することにより行った。アセトアミノフェンを、１００ ｍｇ/ｋｇの投与量で、グルコース溶液と同時投与した。時間計測の目的のため、ＯＧＴＴを時刻０分に定めた。
【０３３５】
【表２３】
2009518315.tif 000028
【０３３６】
試験２における製剤は、以下を含む：Ｆ１ = １Ｏ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）、阻害剤無し； Ｆ３ = １０ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）及び２５ ｍＭのＬ-プロリン-ボロプロリン。血中グルコースは以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後５、１０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１８０及び２４０分。血中インシュリンは以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後１５、３０、６０、１２０及び２４０分。ＡＰＡＰの血中濃度は以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後５、１０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０及び１８０分。試験２の結果は、特に阻害剤を含まない製剤（Ｆ１）について、コントロールと比較してグルコースＡＵＣ（ベースライン修正された）の低下があったことを示す。阻害剤を含む製剤及び含まない製剤の両方（Ｆ１及びＦ３）で、投与後にインシュリンの増加が起る。１００ ｕｇ/ｍＬのＧＬＰ-１のＩＮ投与では、阻害剤の存在下では、胃放出が遅延することが示された。より大量のＩＮでのＧＬＰ-１投与では、阻害剤が存在しない場合でも胃排出が影響を受けた。大量の投与又は阻害剤の存在によって胃排出が遅延した場合、グルコースの吸収も遅延した。表２４には、プラセボとの比較における、処理グループのグルコースＡＵＣの差が示されている。
【０３３７】
【表２４】
2009518315.tif 000029
【０３３８】
試験３
試験３では、ＯＧＴＴのラットモデル内での鼻腔内滴下（ＧＬＰ-１又は食塩水）又はエクセナチドの皮下注射後の血中グルコースに対する阻害剤非存在下でのＧＬＰ-１（７-３６アミド）及びエクセナチドの薬力学的（ＰＤ）作用をアッセイした。試験３ではＤＰＰ-ＩＶ阻害剤を有しないＧＬＰ-１製剤を用いた（Ｆ１ = １Ｏ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）、阻害剤無し）。試験３の主たる目的は、ＧＬＰ-１ Ｆ１（ＩＮ）をエクセナチド（ＳＱ）と比較することであった。ＰＤは、血中グルコースと血中インシュリンの濃度をモニターすることによって評価した。アセトアミノフェンを投与して胃排出をモニターした（試験２より）。
【０３３９】
試験３では、１ ｇ/ｋｇのグルコース溶液一括投与を経口胃管で投与することによりＯＧＴＴを行った。適切な場合には、アセトアミノフェンを、１００ ｍｇ/ｋｇの投与量で、グルコース溶液と同時投与した。時間計測の目的のため、ＯＧＴＴを時刻０分に定めた。処理の投与の時間は、ＯＧＴＴと相対的なものであった。１回処理投与は、-１０分で投与した。２回投与は、１回目の投与を-１０分に、２回目の投与を+３５分に行った。従って、食塩水、ＧＬＰ−１、又はエクセナチドの投与は、ＯＧＴＴに対して、-１０分、+３５分、又は-１０分及び+３５分に行った。
【０３４０】
ＡＵＣ０-２４Ｏ及びＣｍａｘの計算を含む、薬力学分析のために血液を回収した。血中グルコースは以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後（５、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１８０及び２４０分）。血中インシュリンは以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後（５、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０及び１８０分）。アセトアミノフェンの血中濃度は以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後（１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０及び１８０分）。血中のグルコースとインシュリンの値を評価するための試験３での全体的な設計の概要を表２５に示す。胃排出を評価するための全体的な設計の概要を表２６に示す。
【０３４１】
【表２５】
2009518315.tif 000030
【０３４２】
【表２６】
2009518315.tif 000031
【０３４３】
試験３の結果は、食塩水又はエクセナチドのＳＱ投与との比較における、ＧＬＰ-１鼻腔内投与後の、修正された血液グルコースのＡＵＣ０-２４Ｏの劇的な低下（〜６０％）を示す。ＡＵＣ０-２４ＯとＣｍａｘ値を表２７に示す。内在性グルコースに対して修正されたグルコース濃度の変化を、図１に示す。
【０３４４】
これらの薬力学的結果は、ＧＬＰ-１の医薬製剤の鼻腔内投与が、血中のグルコース濃度を低下させたという驚くべき予期せぬ発見を示す。
【０３４５】
【表２７】
2009518315.tif 000032
【０３４６】
試験３のＧＬＰ-１処理グループとプラセボについてのグループ平均インシュリンデータを図２に示す。食塩水処理した（プラセボ）ラットのインシュリン濃度は、ＯＧＴＴ後に僅かな低下を示した。１００ μｇ/ｋｇのＧＬＰ-１の-１０分での１回投与により、ＯＧＴＴに応じた顕著な血中インシュリン濃度の上昇がみられた。-１０分及び+３５分でのＧＬＰ-１の投与により、各投与の直後にインシュリンのスパイクが生じた。このパターンは、ＧＬＰ-１が、血中グルコースの上昇に応じたインシュリンの放出に関与していることを示す。
【０３４７】
ＧＬＰ-１処理グループとプラセボについてのグループ平均アセトアミノフェンデータ（プラセボグループの標準偏差と共に）を図３に示す。試験３では、全体の曝露（ＡＵＣ）を測定したところ、３種類の処理グループ間で、体循環内に吸収されたアセトアミノフェンの総量に、３％未満の差異しか存在しなかったことが示された。ＡＵＣ値は、食塩水コントロール（プラセボ）、１００ μｇ/ｋｇのＧＬＰ-１、及び１０００ μｇ/ｋｇのＧＬＰ-１のグループについて、それぞれ、６,８０４ μｇ*分/ｋｇ、６,６７２ μｇ*分/ｋｇ、及び６,９５１ μｇ*分/ｋｇであった。しかしながら、吸収のプロファイルは異なっていた。プラセボ処理したラットでは、アセトアミノフェンのＴｍａｘは、投与後３０分であり、グループ平均Ｃｍａｘは、７８ μｇ/ｍＬで、その標準偏差は± ２１ μｇ/ｍＬであった。１００ μｇ/ｋｇのＧＬＰ-１グループで、投与後３０分に、僅かに低い６６ ± ２１ ｕｇ/ｍＬのＣｍａｘが認められた；しかしながら、評価を行った殆どの時点で、このグループとコントロールグループの間でアセトアミノフェンの濃度は近似していた。アセトアミノフェンのＣｍａｘは、１０００ μｇ/ｋｇのＧＬＰ-１のグループでより低く、４５ ± ３０ ｕｇ/ｍＬであった。更に、Ｔｍａｘは、投与後３０分ないし９０分の間に生じると考えられ、アセトアミノフェンの血中濃度は、後半の時点で顕著に一層高かった。１０００ μｇ/ｋｇのＧＬＰ-１グループについての結果は、胃排出の遅延及び、大量のＧＬＰ-１投与後の胃排出のより延長したプロファイルと一致する。試験３の結果は、阻害剤を含まないＧＬＰ-１が、有意にグルコースを低下させ、用量は、食前又は食後に投与できることを示す。ＩＮのＧＬＰ-１製剤は、グルコースＡＵＣを低下させたが、エクセナチドを０.６又は３ ｕｇ/ｋｇのいずれでＺＤＦラットにＳＱ投与した場合には、低下させなかった。
【０３４８】
ＰＤの結果のまとめ
薬力学的結果は、ＧＬＰ-１の医薬製剤の鼻腔内投与が、血中のグルコース濃度を低下させるという驚くべき予期せぬ発見を示す。更に、血中インシュリン濃度のパターンにより、ＧＬＰ-１が、血中グルコースの上昇に応じたインシュリン放出に関与する因子であることを示す。アセトアミノフェンの試験の結果は、胃排出の遅延及び、ＤＰＰ-ＩＶ阻害剤の不存在下での大量のＧＬＰ-１投与後の胃排出のより延長したプロファイルと一致する。低い血中グルコースにおいて効果的な低用量のＧＬＰ-１は、胃排出に対して影響を示さなかった。血液中のグルコース濃度を低下させることは、特にインシュリン濃度の上昇を介した場合には、２型糖尿病の治療に効果的である。更に、胃排出の遅延により、満腹感を高め、体重減少を促進することができる。これらのデータは、これらのアッセーで説明されるＧＬＰ-１鼻腔内製剤の、肥満及び糖尿病といった代謝障害治療への使用における有効性を指示するものである。
【０３４９】
実施例８
合成エキセンディン-４（エクセナチド）の促進剤を含む経粘膜製剤
経粘膜エクセナチド製剤のインビトロでの最適化のために種々の賦形剤を試験した。エクセナチドと賦形剤（透過促進剤、溶解剤、界面活性剤、キレート剤、安定剤、バッファー、等張化剤及び保存剤を含む）を組み合わせることにより、経粘膜エクセナチド製剤を作り出した。
【０３５０】
製剤のスクリーニングを複数回行い、ＡとＢの２つの系列に分類した。系列Ａでは、溶解剤（Ｍｅ-β-ＣＤ）、界面活性剤（ＤＤＰＣ）、キレート剤（ＥＤＴＡ）、及び安定剤（ゼラチン）の賦形剤濃度を変化させることに焦点を当てた。クエン酸バッファー、酒石酸バッファー、及びグルタメート（ＭＳＧ）等のバッファーについても試験を行った。系列Ｂでは、代わりの賦形剤について、そのエクセナチド透過を促進する能力に対してスクリーニングを行った。シクロデキストリン、グリコシド、脂肪酸、ホスファチジルコリン、ＧＲＡＳ化合物、ＰＮ１５９、ゼラチン及びその他の透過促進剤候補の種々の濃度について試験した。透過促進剤候補のスクリーニングに加え、バッファー（クエン酸バッファー、酒石酸バッファー）及び等張化剤/安定剤の賦形剤（マンニトール、ＮａＣｌ）の異なる濃度に対してもスクリーニングを行った。安息香酸ナトリウム（ＮａＢｚ）及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）等の保存剤についても試験した。インビトロでのスクリーニングで試験した賦形剤を表２８に示す。試験を行った３７２種類の独自の製剤のうち、１１種類の製剤を、インビボでのウサギの前臨床的ＰＫ試験での使用に推奨した、表２９を参照。
【０３５１】
【表２８】
2009518315.tif 000033
2009518315.tif 000034
【０３５２】
【表２９】
2009518315.tif 000035
【０３５３】
実施例９
経粘膜エクセナチド製剤は、インビトロでタイトジャンクションの開放を促進する
上記の実施例２中のプロトコルに記載されるエクセナチド製剤について、インビトロでＴＥＲ、ＬＤＨ、ＭＴＴ及び透過のアッセイを行った。促進剤を含む全てのエクセナチド製剤について、ＴＥＲは、６０分間のインキュベーション時間の後に、約３５０-７００ ｏｈｍｓ ｘ ｃｍ２から約５-２０ ｏｈｍｓ ｘ ｃｍ２へと低下した。コントロールを除き、全てのエクセナチド製剤はＥＤＴＡを含んでいた。ＥＤＴＡは、カルシウムキレート剤として、カルシウムを取り除くことによりタイトジャンクションを開放させることが知られている。ここで用いるインビトロ組織培養系のような静的環境では、溶液からのカルシウムの除去により、有意にタイトジャンクションが開放される。等張化剤としての塩化ナトリウムと共にグルタミン酸バッファー中にエクセナチドのみを含有する、エクセナチド＋グルタメートコントロール（ＭＳＧ）ではＴＥＲの低下が観察されなかった。エクセナチド＋グルタメートコントロールは、タイトジャンクションを開放させることが、エクセナチド自体の本質的特性ではないことを示す。グルタメートコントロールに６０分間曝露した後のインサートのＴＥＲは、培地に６０分間曝露したインサートのＴＥＲと同程度である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘコントロールでは、最も低い潜在的ＴＥＲとなったが、これは、予想通り、細胞障壁を死滅させることにより生じたことである。
【０３５４】
エクセナチド製剤によるＴＥＲ低下が、細胞死ではなく、促進剤によるタイトジャンクション調節の結果生じたことを確認するため、ＴＥＲで用いたのと同一のＭａｔＴｅｋ社製のセルラインを用いてＬＤＨ及びＭＴＴアッセイを行った。ＬＤＨ％で測定したところ、エクセナチド製剤は、細胞毒性の有意な増大を示さなかった。エクセナチド製剤は、２０％未満のＬＤＨ喪失を示しただけであった。同様に、培地コントロールも細胞毒性を示さなかった。対照的に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘコントロール処理グループは、予想通り、有意な細胞毒性を示した。細胞生存率は、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴ- １００、ＭａｔＴｅｋ ｋｉｔ）を用いて評価した。エクセナチド製剤は、ＪＷ-２３９-１２６-１４、ＪＷ-２３９-１２６-１９及びＪＷ-２３９-１２６-２４の３種類の製剤が約５０％のＭＴＴを示したことを除いては、ＭＴＴ％で測定したところ、有意に細胞毒性を増加させることはなかった。これに反し、エクセナチド製剤は、８０％のＭＴＴを超える生存率を示した。同様に、培地コントロールは細胞毒性を示さなかった。対照的に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘコントロール処理グループは、予想通り、有意な毒性を示した。透過試験の結果を表３０に示す。
【０３５５】
【表３０】
2009518315.tif 000036
【０３５６】
製剤の透過の結果は、３ ｍｇ/ｍＬのエクセナチド及びグルタミン酸モノナトリウムのみを含むコントロール製剤に対して、３００倍ないし８３０倍の透過性の増加を示した。半分の用量を投与された製剤では、コントロールに対して１４００倍ないし２２００倍の透過性の増加が示された。
【０３５７】
実施例１０
経粘膜エクセナチド製剤のウサギ内のＰＫの結果
インビボでの試験用に調製したエキセンディン-４製剤を表３１に示す。
【０３５８】
【表３１】
2009518315.tif 000037
【０３５９】
エキセンディン-４のＰＫ試験をウサギで行い、ＩＶ及びＩＮによって投与されたエキセンディン-４のＰＫ結果を比較した。ＩＮ製剤には、ＩＮコントロール（促進剤無し）、ＩＮ １Ｘ 促進剤＋ゼラチン、ＩＮ ２Ｘ促進剤、及びＩＮ ２Ｘ促進剤＋ゼラチン（製剤は表３１に示す）が含まれた。ＰＫ試験の結果を表３２と図４に示す。
【０３６０】
【表３２】
2009518315.tif 000038
【０３６１】
ＰＫの結果は、ＩＮ ２Ｘ促進剤及びＩＮ ２Ｘ促進剤＋ゼラチンが、ウサギを用いた試験でテストした中で、最も性能の高いエキセンディン-４製剤であったことを示す。ＩＮ ２Ｘ促進剤及びＩＮ ２Ｘ促進剤＋ゼラチンの両方とも、ＩＶ又はＩＮコントロールよりも高いＰＫ値を示した。
【０３６２】
実施例１１
別の経粘膜エクセナチド製剤
経粘膜投与用の別のエキセンディン-４製剤を開発して、以下について試験を行った：１）保存安定性の向上、２）エキセンディン-４のバイオアベイラビリティの向上、並びに、３）インシュリン及びグルコースの濃度を測定することで決定される薬力学的作用の増大。
【０３６３】
１種類の製剤を除く、全ての製剤中のＤＤＰＣ及びゼラチンを除去することによって、先に試験したエキセンディン-４製剤の改変を調整した。１０ ｍＭ の酢酸バッファー中に８０ ｍｇ/ｍＬのＭｅ-β-ＣＤ及び５ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ（ＤＤＰＣ又はゼラチンは含まない）を含む製剤の参照には、「ＯＥＦ」を用いた。先に試験した製剤への第２の変更は、いくつかの製剤へアルギニンを添加することであった。ＯＥＲ製剤については、表３３に記載する。
【０３６４】
【表３３】
2009518315.tif 000039
【０３６５】
透過パーセント
インビトロでの透過試験は、ＯＥＦ製剤（ＤＤＰＣ及びゼラチンを含まない）が、先に試験したエキセンディン-４製剤（表３１の先に試験した製剤を参照）と比べて、同等又は良好な細胞生存率を提示しながら、より大幅にエキセンディン-４の透過を促進したことを示す。製剤を比較した透過の結果を表３４に示す。
【０３６６】
【表３４】
2009518315.tif 000040
【０３６７】
薬物動態試験
ウサギ内でのインビボでの薬物動態（ＰＫ）試験は、「ＯＥＦ＋アルギニン」及び「２Ｘ促進剤＋ゼラチン、アルギニン」の製剤が、鼻腔内送達された場合に、先に試験した製剤と同程度か、又はこれを超える程度にエキセンディン-４のバイオアベイラビリティを向上させることを示した。平均のピークエキセンディン-４血漿濃度は、ＯＥＦ＋アルギニン製剤で最大であった。表３５には、試験された製剤の平均ＰＫパラメーター（Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ｔ１/２及びＫｅｌ）の比較が示されている。各ＰＫパラメーターの分散係数を表３６に示し、各鼻腔内製剤のバイオアベイラビリティ絶対値（Ｆ％）を表３７に示す。
【０３６８】
【表３５】
2009518315.tif 000041
【０３６９】
【表３６】
2009518315.tif 000042
【０３７０】
【表３７】
2009518315.tif 000043
【０３７１】
ＰＫ試験の結果は、ＯＥＦ＋アルギニンが最も高いバイオアベイラビリティ％（１６.６％）を有していたことを示す。また、他の２種類の鼻腔内製剤、２Ｘ促進剤及び２Ｘ促進剤＋ゼラチンも、ＩＮコントロールと比べてバイオアベイラビリティを有意に促進した（それぞれ、１２.６％及び１１.５％）。
【０３７２】
薬力学的試験
ウサギ内でのインビボでの試験により、「ＯＥＦ＋アルギニン」及び「２Ｘ促進剤＋ゼラチン、アルギニン」の製剤が、鼻腔内送達された場合に、先に記載された製剤（表３１参照）と同等か又はこれを超える程度に、インシュリン反応及びグルコース反応を引き起こしたことを示す薬力学的（ＰＤ）パラメーターが提示された。表３８には、平均インシュリン濃度のＰＤパラメーター（Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ）が含まれ、表３９には、平均グルコース濃度のＰＤパラメーター（Ｔｍｉｎ及びＣｍｉｎ）が示されている。驚くべきことに、「２Ｘ促進剤＋ゼラチン、アルギニン」製剤は、ＰＫ試験においてエキセンディン-４のバイオアベイラビリティを最も増大させなかったのにも拘わらず、最も大きなＰＤ反応を引き出した。
【０３７３】
【表３８】
2009518315.tif 000044
【０３７４】
【表３９】
2009518315.tif 000045
【０３７５】
安定性
加速安定性試験により、「ＯＥＦ」製剤の変種が、「２Ｘ促進剤＋ゼラチン」製剤に対して、エキセンディン-４の安定性を向上させることが示される。「ＯＥＦ」製剤の安定性は、市販のＢＹＥＴＴＡ（登録商標）の安定性と同程度であった。４０℃で４週間経過後、「ＯＥＦ」製剤の純度は、８５.８ - ８６.０％であり、一方で、「２Ｘ促進剤+ゼラチン」の純度は、８３.７％であった。５０℃で４週間経過後、「ＯＥＦ」製剤の純度は、ＢＹＥＴＴＡ（登録商標）と同程度であり（７２.２ - ７２.９％対７２.９％）、一方で、「２Ｘ促進剤＋ゼラチン」製剤は、沈澱を生じた。単一製剤（ｓｉｍｐｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）では沈殿は観察されなかった。
【０３７６】
要約すると、加速安定性試験では、酒石酸バッファーと比べて、酢酸バッファーは、エキセンディン-４製剤の物理的安定性を向上させたことが示された。酢酸で緩衝化された製剤では、酒石酸で緩衝化された製剤よりも、少ない沈澱が観察された。一般的に、１価のイオノゲン性（ｍｏｎｏ-ｉｏｎｏｇｅｎｉｃ）バッファー（酢酸、アルギニン、乳酸）は、多価イオノゲン性（ｐｏｌｙ-ｉｏｎｏｇｅｎｉｃ）バッファー（酒石酸、クエン酸）よりも良好な安定性を提供した。ｐＨ ４.７ - ５.５の範囲では、ｐＨ ≦ ４.２５の場合と比べて、エキセンディン-４の化学的安定性が向上した。アルギニンも、僅かに化学的安定性を向上させた。メチオニン及びアスパラギン酸の添加により、エキセンディン-４の化学的安定性は低下した。エキセンディン-４の化学的安定性にとっての最適オスモル濃度は、２００ - ２５０ ｍＯｓｍ/ｋｇ Ｈ２Ｏであった。
【０３７７】
上記に加え、加速安定性試験により、「ＯＥＦ」製剤の変種が、既存の、「２Ｘ促進剤+ゼラチン」製剤と比べて、エキセンディン-４の安定性を向上させることが示される。「ＯＥＦ」製剤の安定性は、市販のＢＹＥＴＴＡ（登録商標）の安定性と同程度である。４０℃で４週間経過後、「ＯＥＦ」製剤の純度は、８５.８ - ８６.０％であり、一方で、「２Ｘ促進剤+ゼラチン」の純度は、８３.７％であった。より劇的には、５０℃で４週間経過後、「ＯＥＦ」製剤の純度は、ＢＹＥＴＴＡ（登録商標）と同程度であったが（７２.２ - ７２.９％対７２.９％）、一方で、「２Ｘ促進剤+ゼラチン」製剤は、沈澱を生じた。 
【０３７８】
本試験では試験を行っていないが、増粘剤を製剤に添加することも可能であろうことが予想される。製剤には、保存剤が含まれていてもよく、保存剤には、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン及びプロピルパラベン、及び/又はクロロブタノールが含まれていてもよいが、これらに限定されるものではない。抗菌作用を促進するために製剤中に含まれてよい、先に試験された他の保存剤の例には、以下の組み合わせが含まれる：０.０３３ ％の メチルパラベン + ０.０１７％の プロピルパラベン ；０.１８％のメチルパラベン + ０.０２％のプロピルパラベン；０.１０％ないし０.５０％のクロロブタノール；０.１０％ないし０.２５％のクロロブタノール + ０.０３３％のメチルパラベン + ０.０１７％のプロピルパラベン；０.１０％ないし０.２５％のクロロブタノール + ０.１８％のメチルパラベン + ０.０２％のプロピルパラベン；０.５％のベンジルアルコール；０.５％のベンジルアルコール + ０.０３３％のメチルパラベン + ０.０１７％のプロピルパラベン；０.５％のベンジルアルコール + ０.１８％のメチルパラベン + ０.０２％のプロピルパラベン；０.５％のフェニルエタノール + ０.１ないし０.２５％のクロロブタノール；０.５％のフェニルエタノール + ０.０３３％のメチルパラベン + ０.０１７％のプロピルパラベン；０.５％のフェニルエタノール + ０.１８％のメチルパラベン + ０.０２％のプロピルパラベン；５ ｍｇ/ｍｌのＥＤＴＡ；０.０１-０.１％の塩化ベンザルコニウム；７ ｍｇ/ｍＬのエタノール；５ ｍｇ/ｍＬのベンジルアルコール + ２.５ ｍｇ/ｍＬのフェニルエチルアルコール。
【０３７９】
例えば、０.５ ｍｇ/ｍｌないし６ ｍｇ/ｍｌの濃度のように、エクセナチドの濃度を変化させることを用いて所望の投与量を達成することもできる。「ＯＥＦ」製剤及び「ＯＥＦ+アルギニン」製剤は、他のＧＬＰ-１類似体を含むが、これに限定されない、他のＧＲＰの安定性及びバイオアベイラビリティを向上させることもできる。
【０３８０】
向上した保存寿命、低い商品原価、及び高いバイオアベイラビリティを有する経粘膜投与用のエキセンディン-４製剤が、エキセンディン-４製剤に対するＯＥＦの改善によって同定された。向上した保存寿命とは、商品がより長く持ちこたえて、期限切れの商品を減らし、必要な生産量を低下させることになることを意味する。高いバイオアベイラビリティとは、医薬品の潜在的な高い有効性と治療への有用性を意味する。また、医薬品の一定の有効性に必要とされるＡＰＩ（エキセンディン-４、ＧＬＰ-１）の量を低下させることによって、費用を抑えることも意味するであろう。ＤＤＰＣは、新規な賦形剤であるから、ＤＤＰＣを除去することによって、ＦＤＡによる製品への承認がより得やすくなる可能性がある。また、ＤＤＰＣを除去することによって、製品の製造に要する時間も短縮されることになる。更に、ＤＤＰＣは、高価な賦形剤であるから、これを除去することによって、医薬品に関する商品原価が著しく低下される。ゼラチンを取り除くことにより、製品の製造に要する時間が短縮され、また、ある賦形剤を取り除くことで製造の費用が抑えられる。
【０３８１】
本発明には、保存剤不含のＧＲＰ製剤も含まれる。このような製剤は、保存剤を含有しない。抗菌賦形剤の不存在下では、製剤は、無菌条件下で保存剤不含送達装置内へと充填される。保存剤不含エクセナチド製剤には、表４０及び表４１に示すような製剤が含まれていてもよい。エクセナチド濃度は、２ - １２ ｍｇ/ｍｌの範囲で変化していてもよい。
【０３８２】
【表４０】
2009518315.tif 000046
【０３８３】
【表４１】
2009518315.tif 000047
【０３８４】
他の態様では、以下のような透過促進成分の濃度が変化してもよい：Ｍｅ-β-ＣＤ（２０ - ８０ ｍｇ/ｍｌ）、ＤＤＰＣ（０ - ２ ｍｇ/ｍｌ）、ＥＤＴＡ （２ - １０ ｍｇ/ｍｌ）、酒石酸バッファー（０ - ３０ ｍＭ）、ゼラチン、及び塩化ナトリウム。別の態様には、異なる製剤が含まれていてもよい：Ｍｅ-β-ＣＤ（８０ ｍｇ/ｍｌ）、ＥＤＴＡ（５ ｍｇ/ｍｌ）、アルギニン（２.８又は１０ ｍＭ）及び/又は酢酸バッファー（１０ ｍＭ）、並びに塩化ナトリウム（ｐＨ ４.９ - ５.６）。上記賦形剤の濃度は変化してもよい。製剤には、更に、ゼラチン、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロール又はカルボポル等の増粘剤が含まれていてもよい。エクセナチドの濃度を変化させることで、所望の投与量を達成することが可能である。例えば、濃度は、０.５ ｍｇ/ｍｌないし２５ ｍｇ/ｍｌの範囲内にあってもよい。
【０３８５】
実施例１２
経口ブドウ糖負荷試験(ＯＧＴＴ)ラットモデル内でのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）の鼻腔内投与による単一投与量の薬力学的（ＰＤ）試験
経口ブドウ糖負荷試験(ＯＧＴＴ)ラットモデル内でのＧＬＰ-１（７-３６アミド）及びエキセンディン-４の鼻腔内注入後の血中グルコースに対する薬力学的作用を試験した。２種類のエキセンディン-４の製剤を評価し、ＧＬＰ-１の単一製剤を使用した。ＧＬＰ-１（ＥＤＴＡ系）製剤（＃２）は、ＧＬＰ-１（７-３６アミド）及び以下の成分を含んでいた：１０ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム；１０ ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ ３.５）。エキセンディン-４（ＥＤＴＡ系）製剤（#２、#３、#４及び#５）は、エキセンディン-４及び以下の成分を含んでいた：１０ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム；１０ ｍＭのアルギニンバッファー（ｐＨ ４.０）。エキセンディン-４（ＰＤＦ系）製剤（#６及び#７）は、エキセンディン-４及び以下の成分を含んでいた：４５ ｍｇ/ｍＬのＭｅ-β-ＣＤ、１ ｍｇ/ｍＬのＤＤＰＣ、１ ｍｇ/ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム、１００ ｍＭのソルビトール、２５ ｍＭのラクトース、５ｍｇ/ｍＬのＣＢ、及び１０ ｍＭのアルギニンバッファー（ｐＨ ４.０）。試験した製剤の概要を表４２に示す。実験計画及びグループの名称を表４３に示す。
【０３８６】
【表４２】
2009518315.tif 000048
【０３８７】
【表４３】
2009518315.tif 000049
【０３８８】
血中グルコースと血中インシュリンの濃度をモニターすることにより薬力学を評価した；アセトアミノフェンをグルコースと同時投与して胃排出をモニターした。本試験には、週齢約１１週のＺＤＦラット（各処理グループに５匹のラット）の単一投与による処理が含まれていた。ＯＧＴＴは、１ ｇ/ｋｇのグルコース溶液一括投与を経口胃管により行った。アセトアミノフェンは、１００ ｍｇ/ｋｇの投与量で投与した。時間計測の目的のため、ＯＧＴＴを時刻０分に定めた。食塩水、ＧＬＰ-１、又はエキセンディン-４の投与は、ＯＧＴＴに対して-１０分に行った。血中グルコースは以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前（２回）、並びにＯＧＴＴ後５、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１８０及び２４０分。血中インシュリンは以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後５、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０及び１８０分。ＡＰＡＰの血中濃度は以下の時点で評価した：ＯＧＴＴ前、並びにＯＧＴＴ後１５、３０、４５、６０、７５、９０、１２０及び１８０分。
【０３８９】
薬力学的試験の結果
表４４にグルコース濃度の薬力学的試験の結果を示す。グルコースのピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、ＧＬＰ-１を投与した動物において、コントロールの７０％であった；同様に、ＯＧＴＴ後０から６０分の時間枠でのグルコースのＡＵＣ（ＡＵＣ０-６０）も、コントロールの７０％であった。エキセンディン-４の投与は、Ｃｍａｘ（コントロールの８６％ないし９９％の範囲）及びＡＵＣ０-６０（コントロールの９１％ないし１０３％の範囲）に対して最小の作用を示したのみだった。エキセンディン-４については、明確な用量反応が見られなかった。
【０３９０】
【表４４】
2009518315.tif 000050
【０３９１】
表４５には、内在性グルコースに対して修正された後のグルコース濃度の薬力学的試験の結果が示されている。グルコースのピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、ＧＬＰ-１を投与した動物において、コントロールの５１％であった；同様に、ＯＧＴＴ後０から６０分の時間枠でのグルコースのＡＵＣ（ＡＵＣ０-６０）も、コントロールの４６％であり、ＡＵＣ０-２４０（ＯＧＴＴ後０ないし２４０分）は、コントロールの８８％であった。ＥＤＴＡ系製剤又はＰＤＦ系製剤中のエキセンディン-４の投与は、Ｃｍａｘ（コントロールの７３％ないし８７％の範囲）及びＡＵＣ０-６０（コントロールの９１％ないし１０３％の範囲）に対して中程度の作用を示した。ＡＵＣ０-２４０に対する作用は、最小から皆無であり、コントロールの７７％ないし１２５％であった。
【０３９２】
【表４５】
2009518315.tif 000051
【０３９３】
インシュリン反応性（内在性インシュリンに対して修正された）の結果は、コントロール動物内でのＯＧＴＴ後のインシュリン濃度が、投与前の値と比べて、同等であるか又は僅かに低かったことを示した。１００ μｇ/ｋｇでのＧＬＰ-１の経鼻投与は、ＯＧＴＴ後、５ないし４５分におけるインシュリンの最大２倍の増加を伴った。エキセンディン-４の２、１０及び２０ μｇ/ｋｇ（ＥＤＴＡ系製剤）の投与後のインシュリン濃度は、用量依存的なインシュリンの増加を示し、そのピーク濃度は、各グループの上記の投与前の値のそれぞれ約０.７倍、１.５倍及び４倍であった。反応は、ＯＧＴＴ後の約４５分間に限られていた。ＰＤＦ系製剤中のエキセンディン-４の２又は１０ μｇ/ｋｇの投与量での経鼻投与後、ピークインシュリン濃度は、それぞれ、上記投与前の１.５倍又は２.７倍であった。反応は、ＯＧＴＴ後の約４５分間に限られていた。
【０３９４】
胃排出の結果
表４６は、アセトアミノフェン（胃排出）の結果を示す。コントロールでは、７３ ｎｇ/ｍＬのピークアンフェタミン濃度（Ｃｍａｘ）は、投与後３０分（Ｔｍａｘ）で生じた。ＧＬＰ-１を投与した動物では、僅かに低いＣｍａｘ（６６ ｎｇ/ｍＬ）が認められた；しかしながら、Ｔｍａｘは、より長く、この投与レベルでの胃排出の遅延が示唆された。ＥＤＴＡ系製剤中に２若しくは１０ μｇ/ｋｇで、又はＰＤＦ系製剤中に２ μｇ/ｋｇでのエキセンディン-４の投与は、Ｔｍａｘ（３０ないし４５分）及びＣｍａｘ（約７０ないし７３ ｎｇ/ｍＬ）に関してコントロールと同程度であった。ＥＤＴＡ系製剤中に２０ μｇ/ｋｇで、又はＰＤＦ系製剤中に１０ μｇ/ｋｇでのエキセンディン-４の投与により、Ｃｍａｘ（約５１ないし５４ ｎｇ/ｍＬ）の低下が示され、そして、少なくとも２０ μｇ/ｋｇ（ＥＤＴＡ系製剤）については、僅かに延長された曝露プロファイルが示された。結果は、これらの投与量レベルによって胃排出が影響を受けたことを示唆するものであった。
【０３９５】
【表４６】
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【０３９６】
まとめ
グルコース依存的なインシュリン放出の刺激に関するＧＬＰ-１とエキセンディン-４の薬理学的作用に基づき、記載されたＥＤＴＡ系及びＰＤＦ系鼻腔内製剤は、活性薬物を効果的に全身の標的へ送達した。インシュリン放出の刺激は、用量依存的であった。
【０３９７】
ＧＬＰ-１又はエキセンディン-４を投与した動物では、コントロールとの比較において、血中グルコースのピーク濃度（Ｃｍａｘ）及び曝露（ＡＵＣ）の変化が示された。ＧＬＰ-１及びエキセンディン-４によるインシュリン放出の刺激及び胃排出の調節が、恐らく経口グルコース注入後の血中グルコースプロファイルの変化の薬理学的根拠であると思われる。
【０３９８】
胃排出の阻害は、ＧＬＰ-１及びエキセンディン-４の公知の薬理学的作用である。アセトアミノフェンについてのピーク濃度までの時間（Ｔｍａｘ）又はピーク濃度（Ｃｍａｘ）の変化は、ＧＬＰ-１及びエキセンディン-４誘導性の薬理学的特性と一致していた。これらのデータにより、上記のアッセイに記載されるＧＬＰ-１及びエキセンディン-４製剤の、肥満及び糖尿病等の代謝障害の治療における使用の有効性が支持される。
【０３９９】
前述の発明は、明確な理解を目的として実施例により詳細に説明されているが、当業者には、本開示から特定の変更及び改変が把握され、添付された、限定ではなく例示のために表わされる請求項の範囲内で過度の実験を行うことなく、これらの変更及び改変を実施できることが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月31日(2008.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量のエクセンディン-４又はエクセンディン-４アゴニスト類似体、透過性を促進する可溶化剤、透過性を促進する陽イオンキレート剤、バッファーを含み、随意に透過性を促進する増粘剤を含んでいてもよい鼻腔内送達用の水性医薬製剤であって、ここで、
ａ.  前記可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン、ジメチル-β-シクロデキストリン、メチル-β-シクロデキストリン及びクレモフォールＥＬから成る群の少なくとも１つから選択され、
ｂ.  前記増粘剤が、ゼラチン、メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースから成る群の少なくとも１つから選択され、ここで、
ｃ.  前記製剤が、インビトロでの組織透過アッセイにおいて、少なくとも５％のエクセンディン４透過率を提供し、１５０ ｃｐｓ以下の粘性率を有し、２ないし８のｐＨを有し、５℃にて少なくとも２週間安定である、製剤。
【請求項２】
前記可溶化剤が、メチル-β-シクロデキストリンである、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記メチル-β-シクロデキストリンが、９０ ｍｇ/ｍｌ以下の濃度で存在する、請求項２記載の製剤。
【請求項４】
前記メチル-β-シクロデキストリンが、８０ ｍｇ/ｍｌで存在する、請求項３記載の製剤。
【請求項５】
前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸及びエチレングリコール四酢酸から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
前記キレート剤が、１０ ｍｇ/ｍｌ以下の濃度で存在する、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
前記キレート剤が、５ ｍｇ/ｍｌで存在する、請求項６記載の製剤。
【請求項８】
前記可溶化剤の濃度が８０ ｍｇ/ｍｌであり、前記キレート剤の濃度が５ ｍｇ/ｍｌである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
前記バッファーが、１価のイオノゲン性バッファーである、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記１価のイオノゲン性バッファーが、酢酸、アルギニン及び乳酸から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項９記載の製剤。
【請求項１１】
前記１価のイオノゲン性バッファーが、アルギニンである、請求項１０記載の製剤。
【請求項１２】
アルギニンが、２.８ ｍＭを超えるか又は２.８ ｍＭに等しい濃度で存在する、請求項１１記載の製剤。
【請求項１３】
前記ｐＨが、４.７ないし５.５である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１４】
保存剤が存在しない、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記粘性率が、１.５ないし１０.０ ｃｐｓである、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記製剤が、５℃にて少なくとも４週間安定である、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１７】
高血糖、インシュリン依存性糖尿病、妊娠性糖尿病, インスリン非依存性糖尿病、肥満若しくは異常脂質血症から成る群から選択される代謝疾患の治療用、又は食欲を抑制し、満腹感を増加させ、体重減少を促進し、食物摂取量を減少させ、胃排出を遅延させ、血漿グルコースを低下させるか又はインシュリン分泌を促進することが有益となる状態の治療用に対象へ鼻腔内投与するための薬物の製造における、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の水性医薬製剤の使用。
【国際調査報告】
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