(57)【要約】化学および／または生物学的種（例えば細胞）を操作し、磁場を使用するための方法および装置が提供される。この方法には、磁場モジュレータを用いて磁気感受性の細胞をパターン化する工程を伴いうる。例えば、細胞を含む流体を表面と接触させ、磁場モジュレータを表面に近接して配置すると、細胞が、変調された磁場の部分に並ぶことにより、パターンを形成しうる。ある実施形態では、磁場モジュレータが、表面に一体的に連結されないのが好都合である。そのため、様々な種類の表面上に細胞のパターンを形成でき、表面を変更せずに磁場モジュレータを再配置できる。単一の表面上に複数の細胞型を含むパターンを形成することもできる。そのようなパターンは、細胞間相互作用を研究するため、および、三次元の細胞構造（例えば組織）を形成するために、役立ちうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に近接して細胞のパターンを形成する方法であり、
細胞のパターンの形成を導くための表面を提供する工程と、
磁場を提供する工程と、
該表面に対して第一位置に磁場モジュレータを配置し、該磁場を変調する工程であり、該磁場モジュレータが、該表面に一体的に連結されていない、工程と、
細胞の第一の組を含む流体と、該表面とを接触させる工程と、
該表面に近接して細胞の第一パターンを形成する工程であり、該表面に近接した該細胞の第一パターンの位置が、少なくとも部分的に該磁場モジュレータの該第一位置により決定される、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
細胞の第二の組を含む流体と、前記表面とを接触させて、該細胞の第二の組の少なくとも一部の第二パターンを該表面上に形成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の第二パターンの少なくとも一部が、前記細胞の第一パターンの少なくとも一部の頂部に配置される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の第一パターンの少なくとも一つの特徴が、前記細胞の第二パターンの少なくとも一つの特徴から５００ミクロン未満離れている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞の第一および第二の組が、異なる特徴を少なくとも一つ有する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞の第一および第二の組が、異なる細胞型である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の第一および第二の組が、同じ細胞型である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記パターン化された細胞を前記表面上に付着させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流体と前記表面とを接触させる工程には、該表面を横切って該流体を流す工程が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、三次元の細胞構造体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記三次元の細胞構造体には、組織が含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織には、２以上の型の細胞が含まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の第一パターンには、寸法が３００ミクロン未満の特徴が少なくとも一つ含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞の第一パターンには、寸法が１００ミクロン未満の特徴が少なくとも一つ含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面は可撓性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面は、管状または半管状である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
表面に近接して細胞のパターンを形成する方法であり、
細胞のパターンの形成を導くための表面を提供する工程と、
磁場を提供する工程と、
該表面に対して第一位置に磁場モジュレータを配置し、該磁場を変調する工程と、
該表面に近接して細胞の第一の組の第一パターンを形成する工程であって、該表面に近接した該第一パターンの位置が、少なくとも部分的に該磁場モジュレータの該第一位置により決定される、工程と、
該磁場モジュレータを、該表面に対して第二位置に配置し、該磁場を変調する工程であって、該第一および第二位置が異なる、工程と、
該細胞の第一の組の該第一パターンに近接して細胞の第二の組の第二パターンを形成する工程であり、該第二パターンの位置が、少なくとも部分的に該磁場モジュレータの該第二位置により決定される、工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記磁場モジュレータが、前記表面に一体的に連結されていない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
表面に近接して細胞のパターンを形成する方法であり、
細胞のパターンの形成を導くための表面を提供する工程と、
磁場を提供する工程と、
該表面に対して第一位置に磁場モジュレータを配置し、該磁場を変調する工程と、
細胞の第一の組を含む流体と、該表面とを接触させる工程と、
該表面に近接して細胞の第一パターンを形成する工程であって、該第一パターンの位置が、少なくとも部分的に該磁場モジュレータの該第一位置により決定される、工程と、
該細胞に、三次元の細胞構造体を形成させる工程と
を含む、方法。
【請求項２０】
前記磁場モジュレータが、前記表面に一体的に連結されていない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記三次元の細胞構造体には、組織が含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
表面に近接して細胞のパターンを形成するための装置であり、
細胞のパターンを形成するための表面と、
磁場と、
該磁場および該表面に隣接して配置される磁場モジュレータであり、該表面に一体的に連結されていない、磁場モジュレータと
を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、化学および／または生物学的種を操作する方法および装置に関し、特に、磁場を用いて化学および／または生物学的種を操作する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
化学種（例えば化学試薬）または生物学的種（例えば細胞物質、ポリマー類、タンパク質類、ＤＮＡなど）をマイクロスケールで操作する能力は、多くの用途において重要である。このような用途は、組織工学、生物工学、微量分析、および微量合成などの分野のものである。用途に応じて、操作には、種の配置（例えばパターン化）、分離および／または輸送を伴いうる。
【０００３】
種を操作する一つのアプローチは、磁場にもとづくシステムの使用を伴う。多くの場合には、標的の種に磁性材料を結合し（例えば、種に磁気ビーズを付けることによる）、磁場を用いて種を引きつけ、または分離できる。多くの場合には、種は、基材上に形成された磁気領域の方へ引きつけられる。その後、これらの磁気領域により画定された基材上に、種がパターンを形成しうる。２００３年１月３０日公開の、Ｃａｓａｇｒａｎｄｅ等による“Ｍａｇｎｅｔ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ”と題された特許文献１に、このアプローチの一つの例が載っている。この公開には、磁性材料を伴う一つ以上の細胞を、一つ以上の磁気レセプタクル（単数または複数）が設置された基材上に固定する工程が含まれている。あるいは、デバイスが、磁性材料を伴う細胞を、磁気レセプタクルのパターンが設けられた基材上に整列させる。基材に埋め込まれた永久磁石から、局所化された磁場勾配が得られる。
【０００４】
多くのアプローチが、磁場を使用して、化学および／または生物学的種の配置を可能にするが、これらの技術は一般に、基材の上または中に製造された磁性部品を必要とする。たとえば、種を基材とは無関係に特定の空間的配置に配置しうるような技術進歩は、多様な分野で応用できる。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００２２３７０号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
化学および／または生物学的種の操作に関する方法および装置が提供される。
【０００６】
一実施形態においては、表面に近接して細胞のパターンを形成する方法が提供される。方法には、細胞のパターンの形成を導くための表面を提供する工程と、磁場を提供する工程と、表面に対して第一位置に磁場モジュレータを配置し、磁場を変調する工程であり、磁場モジュレータが表面に一体的に連結されていない工程と、細胞の第一の組を含む流体に表面を接触させる工程と、表面に近接して細胞の第一パターンを形成する工程であり、表面に近接した細胞の第一パターンの配置が、少なくとも部分的に磁場モジュレータの第一位置により決定される工程を伴う。
【０００７】
別の実施形態では、表面に近接して細胞のパターンを形成する方法が提供される。方法には、細胞のパターンの形成を導くための表面を提供する工程と、磁場を提供する工程と、表面に対して第一位置に磁場モジュレータを配置し、磁場を変調する工程と、表面に近接して細胞の第一の組の第一パターンを形成する工程であり、表面に近接した第一パターンの配置が、少なくとも部分的に磁場モジュレータの第一位置により決定される工程と、表面に対して第二位置に磁場モジュレータを配置し、磁場を変調する工程であり、第一位置と第二位置が異なる工程と、細胞の第一の組の第一パターンに近接して細胞の第二の組の第二パターンを形成する工程であり、第二パターンの配置が、少なくとも部分的に磁場モジュレータの第二位置により決定される工程を伴う。
【０００８】
別の実施形態では、表面に近接して細胞のパターンを形成する方法が提供される。方法には、細胞のパターンの形成を導くための表面を提供する工程と、磁場を提供する工程と、表面に対して第一位置に磁場モジュレータを配置し、磁場を変調する工程と、細胞の第一の組を含む流体に表面を接触させる工程と、表面に近接して細胞の第一パターンを形成する工程であり、第一パターンの配置が、少なくとも部分的に磁場モジュレータの第一位置により決定される工程と、細胞に三次元の細胞構造体を形成させる工程を伴う。
【０００９】
別の実施形態では、表面に近接して細胞のパターンを形成する装置が提供される。装置には、細胞のパターンを形成するための表面と、磁場と、磁場および表面に隣接して配置された磁場モジュレータであり、表面と一体的に連結されていない磁場モジュレータが含まれる。
【００１０】
本発明の他の利点および新規の特徴は、以下の本発明の多様かつ非限定的な実施形態の詳細な記載を、添付の図とともに考慮すれば明らかになる。本明細書および参照により組み込まれる文書に、矛盾および／または不整合な開示が含まれる場合には、本明細書が優先するものとする。参照により組み込まれる二つ以上の文書に、互いに矛盾および／または不整合な開示が含まれる場合には、発効日が後の文書が優先するものとする。
【００１１】
本発明の非限定的な実施形態が、添付の図に関して例として記述されるが、添付の図は概略的であり、原寸に比例するものではない。図においては、図示された同一またはほぼ同一の構成要素の各々は、通常は単一の数字により表わされる。明確化のために、当業者による本発明の理解を可能にする上で図示が必要ではない場合には、すべての図のすべての構成要素に名前が付されてはおらず、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されているわけでもない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は化学および／または生物学的種（例えば細胞）を操作する方法および装置に関し、特に、磁場を用いて化学および／または生物学的種を操作する方法および装置に関する。一実施形態においては、細胞を操作する方法には、磁場ソースにより作られた磁場を変調できる磁場モジュレータを用いた、細胞のパターン化を伴う。細胞は、いくつかの場合においては、たとえば磁性粒子を付けられるなど、磁気感受性でありうる。細胞を含む流体を表面と接触させ、磁場モジュレータを表面に近接して配置すると、細胞が、変調された磁場の部分に並ぶことにより、表面に近接してパターンを形成しうる。細胞のパターンの位置は、少なくとも部分的に表面に対する磁場モジュレータの位置により決定されうる。ある実施形態では、磁場モジュレータが、表面に一体的に連結されていないのが好都合である。そのため、さまざまな表面上に細胞のパターンを形成でき、表面を変更せずに磁場モジュレータを再配置できる。一つの特定の実施形態では、磁場モジュレータを第一位置から第二位置へ移動することにより、表面上および／または細胞の第一パターン上に（または、細胞の第一パターン、表面、両者と接触するなどの態様で、細胞の第一パターンとのいずれかの関係において）細胞の第二パターンを形成できる。この方法により、単一の表面上に複数の細胞型を含む細胞のパターンを形成することが可能となりうる。
【００１３】
本発明の方法および装置は、様々な場面で使用できる。そのような場面の一つは、例えば細胞間相互作用を研究するための、表面に近接した複数の細胞型のパターン化を伴う。別の場面は、三次元の細胞構造体（例えば組織）の形成を伴う。
【００１４】
以下の主な記載は、表面に近接した細胞型のパターン化を伴うが、当然のことながら、本発明を用いて、他の化学および／または生物学的種を操作することにより、他の場面で種を配置、分離、および／または輸送することもできる。
【００１５】
図１は、本発明のある実施形態により、細胞のパターンを形成する方法を示す。図１Ａに示される実施形態においては、装置１０には、磁場ソース３０に近接して配置された、突起２０、２２、および２４を含む磁場モジュレータ１５が含まれる。磁場ソース３０は、永久磁石など、磁場を発する任意の物体でありうる。磁場モジュレータ１５は、磁場ソース３０が発する磁場を変調して、高度に局所化された磁場勾配（すなわち、変調された磁場）を生み出すことができる。いくつかの場合には、以下に詳述するように、モジュレータの突起の形および間隔により、磁場の変調を制御しうる。図示された設定においては、高度に局所化された磁場は、突起２０〜２４に大体そろうように導かれる。当業者は、本発明との関連において有用な様々な磁場パターンを確立するための様々なモジュレータを直ちに選択および／または作成しうる。
【００１６】
磁場モジュレータ１５および磁場ソース３０は、表面３５に近接して置かれうる。図１Ａに示される実施形態においては、磁場モジュレータ１５は、表面３５と物理的に接触していない。しかし、他の実施形態においては、磁場モジュレータ１５は、後述のように、表面３５と直接物理的に接触してもよいし、または、一つ以上のさらなる材料により表面３５から分離されてもよい。いくつかの場合には、表面に対する磁場モジュレータの位置、すなわちｘ、ｙ、またはｚ方向の位置が、表面に近接した細胞のパターンの形成に影響しうる。表面３５に対する磁場モジュレータ１５の水平（ｘ）位置は、例えば位置ＡおよびＢにより定義されうる。
【００１７】
図１Ｂおよび１Ｃに示されるように、複数の細胞４５を含む流体４０を、表面３５の上に堆積させうる。いくつかの場合には、細胞は磁気感受性であり得、たとえば、後で詳述されるように磁性粒子が付けられうる。磁場モジュレータ１５の突起により生み出された、高度に局所化された磁場勾配により、細胞４５を磁場勾配にあわせて並べることができる。例えば、図１Ｃに示されるように、細胞４５は、たとえば磁場勾配が最も大きい、突起２０、２２、および２４に並びうる。したがって、磁力によって表面３５上に積極的に細胞のパターンを形成できる。表面３５上の細胞のパターンの位置は、少なくとも部分的に、表面３５に対する磁場モジュレータ１５の位置により決定されうる。例えば、いくつかの場合には、位置ＡおよびＢの間に磁場モジュレータを置くことにより、位置ＡおよびＢの間に細胞のパターンが形成されうる。
【００１８】
本発明のある方法により、単一の表面上、または単一の表面との関連での、複数の細胞型のパターン化が可能になりうる。例えば、図１Ｄおよび１Ｅに示されるように、細胞５０で定義される細胞の第二の組を、表面３５に堆積させうる。細胞５０も、磁気感受性であればよく、モジュレータ１５の突起２０、２２および２４により生み出された高い磁場勾配にあわせて並びうる。細胞５０は細胞の第二パターンを形成でき、それは例えば、細胞４５により形成された細胞の第一パターンの上に並びうる。
【００１９】
図１の実施形態に示されるように、磁場モジュレータ１５は、表面３５に一体的に連結されていない。都合のよいことに、このことによって、表面を変更せずに磁場モジュレータを再配置することが可能になる。例えば、図１Ｆに示されるように、細胞４５で定義される細胞の第一パターンを表面３５上にパターン化した後、モジュレータ１５を表面３５に対して再配置しうる。たとえば、モジュレータ１５を、位置ＡおよびＢから位置ＣおよびＤまで移動できる。もちろん、他の実施形態では、磁場モジュレータを静止させながら表面を移動させることができ、または、必要に応じて表面および磁場モジュレータの両方を再配置できる。細胞５５で定義される細胞の第二の組を表面３５上に堆積させることにより、細胞の第二パターンを形成でき、その位置は少なくとも部分的に、例えば位置ＣおよびＤなど、モジュレータ１５の新しい位置により決定される。図１Ｇに示されるように、細胞の第二パターンを、細胞の第一パターンの間に形成でき、これにより、細胞４５と５５の交互の列を形成しうる。ある実施形態、特に磁場モジュレータ１５が表面３５に一体的に連結されていないものにおいては、以下に詳述するように、様々な種類の表面３５上に細胞のパターンを形成できる。
【００２０】
磁場モジュレータを用いての、表面に近接した細胞のパターンの形成に関する本明細書の記載においては、当業者は、本明細書の記載とあわせた、技術の一般知識および一定の材料間の磁力の選択に関する入手可能な参考資料に基づいて、表面、材料の種類および形、構成要素の配置等を選択できる。
【実施例】
【００２１】
（実施例１：磁場モジュレータ）
図２Ａおよび２Ｂは、一実施形態による磁場モジュレータの例示的な図を示す。磁場モジュレータ１５−１には、基底部１６および突起２６および２８が含まれうる。以下に詳述するように、突起２６および２８の形は、磁場勾配の変調に影響しうる。たとえば、いくつかの場合には、突起２６および２８の幅２６Ａおよび２８Ａが、それぞれ、表面に近接して形成される細胞のパターンの特徴を決定する。しかし、他の場合には、後述するように、細胞のパターンの特徴の決定は、表面に対する磁場モジュレータの位置にも影響されうる。一つの特定の実施形態では、磁場モジュレータ１５−１は、幅ｗ＝５ｍｍ、および高さｈ＝８ｍｍで製造された。モジュレータの各突起は、先端（２６Ａおよび２６Ｂ）が幅２００μｍ、基底（２６Ａ−２）が幅１ｍｍ、高さ（２６Ａ−３＝ｈ０）が３ｍｍで、隣接する突起から５００μｍ離れている（２６Ａ−４）。もちろん、磁場モジュレータを形成するために使用される適切な形、寸法、構造、および材料は変えられ、ルーチン試験を使用して当業者により決定されればよい。
【００２２】
磁場モジュレータが、磁場ソース（例えば永久磁石）により生み出された磁場に近接して配置されると、磁場モジュレータにより、磁場の磁束線および磁場強度が操作され、磁化Ｍの変調された磁場が形成されうる。Ｍは、材料の単位体積あたりの磁気モーメントの大きさである。それは、単位質量あたりで、または特定の磁化（μ０）により表すこともできる。原物質の磁場は印加磁場（Ｈ）と呼ばれ、仮に磁場が真空に印加された場合に存在する総磁場である。磁束密度（Ｂ）は、磁場モジュレータの断面をとおる磁力線の全磁束である。印加磁場からの力線および磁場モジュレータの磁化の両方を考慮すると、磁束密度はＢ＝μ０（Ｈ＋Ｍ）である。
【００２３】
図３Ａおよび３Ｂは、磁気分野モジュレータ１５−１が磁気ソース３０に近接して配置されたときの、磁気ソース３０の磁束線および磁場強度のシミュレーションをそれぞれ示す。磁気ソース３０は、Ｎ極が垂直上方に向き、磁束線３１が磁石の中心から外へ広がっている。ＡＮＳＯＦＴ  Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）２Ｄソフトウェアを使用して、静磁場シミュレーションを行える。ソフトウェアは、分析および操作のための望ましい磁場の解を計算するために必要な有限要素メッシュを自動的に作成した。磁場モジュレータ１５−１は三次元の物体であったが、ソフトウェアはモデルの二次元の断面を分析した上で、有限要素解析を用いてその断面のための解を生み出した。初回の実行の後、目標最小誤差（通常０．８％以下）で解の精度を高めるために、初期メッシュが精緻化された。合計１１０００のメッシュ三角形を用いて、磁場モジュレータの周辺領域およびバックグラウンドが精緻化された。
【００２４】
図３Ａに示されるように、モジュレータ１５−１周辺の磁束線パターンの形は、のこぎりの歯の形の突起２０、２２、２４、および２６の影響を受けた。互いに近い磁力線は強力な磁力をあらわし、広がった線は比較的弱い磁力をあらわした。突起により、突起の先端の近くで、高い磁場勾配（すなわち、ある与えられた方向において強さが変化する磁場）が生まれた。磁場強度は、図３Ｂに示されるようにシミュレートされ、突起の先端で誘発された磁場の大きさである磁束密度が、推定された。磁場モジュレータ１５−１の二つの外側の突起（突起２０および２６）については、磁束密度は０．４３３７Ｔとシミュレートされ、図３Ｂにおいて濃い陰影で表わされる。モジュレータの二つの内側の突起（突起２２および２４）については、より低い磁束密度（０．３２２４Ｔ）が測定された。
【００２５】
（実施例２：細胞をパターン化するための実験設備）
図４は、本発明の一実施形態により、細胞をパターン化するための実験設備の例を示す。この図に示されるように、複数の磁場モジュレータ１５−１を、互いに隣接して配置し、細胞をパターン化するためのより大きなモジュレータを形成しうる。ペトリ皿６０またはガラススライドなどの表面を、磁場モジュレータ１５に近接して（例えば上に）配置しうる。ペトリ皿の細胞を、無菌条件下で、磁力によりペトリ皿６０の底上に引きつけうる。
【００２６】
（実施例３：表面に近接した細胞のパターン化）
ある特定の実施形態では、磁場モジュレータ１５−１を用いて、マディン−ダービー・イヌ腎臓  （ＭＤＣＫ）上皮細胞を表面に近接してパターン化した。約１Ｔの内部磁化のＮｄＦｅＢ永久磁石が、磁場ソースとして使用された。直径１μｍのストレプトアビジン結合超常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を付けたＭＤＣＫ上皮細胞が、表面（例えば滅菌されたペトリ皿またはガラススライドの表面）に近接してパターン化された。表面および細胞を、たとえば図４に示されるように、磁場モジュレータおよび磁場ソースに近接して配置した。数分で、磁場モジュレータ１５−１の突起の近くに、細胞の細密な線を観察できた。図５は、細胞をインキュベートしてから３時間後の、列の形の細胞のパターンを示す。細胞列の内側の対（列７２および７４）は、平均幅が約８０μｍと測定され、これらの細胞は、磁場モジュレータ１５−１の突起２２および２４にそれぞれ並んだ。二つの外側の細胞列（列７０および７６）は、平均幅が約２５０μｍと測定され、これらの細胞は、磁場モジュレータ１５−１の突起２０および２６にそれぞれ並んだ。これらの実験結果は、磁場モジュレータの突起の形および寸法により細胞のパターンの寸法を制御できることを示し、シミュレーション結果を立証した。特に、二つの外側の突起で誘発された磁束密度が、内側の突起のものより高かったため、より多くの細胞が外側の領域に引きつけられて、外側の領域で幅の広い列（列７０および７６）を形成した。
【００２７】
上に示したとおり、磁場モジュレータ１５−１の設計により、四つの突起に不均一な磁場が誘起され、例えば、図５に示される幅が大幅に異なる細胞列など、不均一な細胞のパターンがもたらされた。例えば幅が大体同じ細胞列など、均一の細胞のパターンを生み出すためには、突起の大きさおよび／または突起の間隔が異なるように、磁場モジュレータを設計すればよい。
【００２８】
（実施例４：磁場の変調の制御）
磁場モジュレータの形および構造が、磁場の変調に影響しうる。モジュレータにより生み出される変調された磁場に対する、磁場モジュレータの寸法の影響を示すために、一連の磁場モジュレータ１５−２、１５−３、１５−４、および１５−５が、異なる大きさで設計され、各突起の中心部で生み出される変調された磁場が、モジュレータごとにシミュレートされた（図６）。磁場モジュレータ１５−２、１５−３、１５−４、および１５−５は、隣接する突起から２００μｍの間隔をあけた幅２００μｍの直立側壁の五つの突起を含み、１．８ｍｍの総幅（ｗ）を有するように設計された。磁場モジュレータ１５−２は、３ｍｍの全高（ｈ）および０．４ｍｍの突起高（ｈ０）を有した。モジュレータ１５−２の三つの内側の歯および二つの外側の歯について、それぞれ、０．３８Ｔおよび０．４４Ｔの誘起磁場が推定された。磁場モジュレータ１５−３のモジュレータ設計において、ｈを２ｍｍまで減らし、ｈ０を０．４ｍｍに維持することにより、磁場モジュレータ１５−２と比較して、磁場強度の全体的な増加が達成された。したがって、磁場モジュレータの高さを変えることにより、変調された磁場の強度を変えることができる。変調された磁場の強度は、いくつかの場合には、モジュレータの表面からの距離および／またはモジュレータの磁場ソースからの距離により、制御できる。一般に、磁場強度は、磁場ソースからの距離が増加するとともに減少する。
【００２９】
上記の図においては、ｈを操作することによって、モジュレータ１５−３全体の五つの突起全てに均一の誘起磁場が生まれることはなかった。三つの内側の突起の磁場強度を二つの外側の突起のレベルまで高めるために、ｈ０およびｈ１がそれぞれ、二つの外側の突起および三つの内側の突起の高さである、スタガードの突起高設計を採用できる。例えば、ｈ１を０．４ｍｍで保ちながら、ｈ０を０．７ｍｍに増やすと、真ん中の突起を除き、磁場モジュレータ１５−４の突起全体で磁場がほぼ均一に近づいた（図６）。真ん中の突起の磁場強度を増加させるため、磁場モジュレータ１５−５は、ｈ０＝０．４ｍｍ、およびｈ１＝０．７ｍｍを有するように設計された。この設計により、五つ全ての突起の誘起磁場がほぼ同等のレベルに増加した。モジュレータの全高ｈを１ｍｍに減らすとともに、高さをスタガードにするアプローチにより、磁場モジュレータ１５−２と比較して、五つの突起の誘起磁場が０．５５±０．０１２Ｔまで２０％増加した。この実施例は、磁場モジュレータの相対的寸法により、磁場強度の変調を制御できることを示す。
【００３０】
（実施例５：表面に近接して細胞を並べる）
磁場モジュレータ１５−５を用いて、永久磁石の磁場を変調し、この変調された磁場にしたがって細胞を並べた。図７に示されるように、磁場モジュレータ１５−５を用いて、ＭＤＣＫ細胞を、約１７５μｍのほぼ均一の幅の五つの列にパターン化した。各列の細胞は、磁場モジュレータ１５−５の突起上に並んだ。細胞列の幅は、少なくとも部分的に、突起の形および寸法（例えば高さおよび幅）により制御された。図８は、列にパターン化された細胞の接写写真を示す。図８に示されるように、細胞は、磁場に曝露されてから四時間以内に密集し、表面に付着しうる。
【００３１】
（実施例６：異なる細胞型のパターン化）
図９Ａ〜９Ｄは、本発明の実施形態を用いて、いくつかの異なる細胞型をパターン化できることを示す。図９Ａは、神経細胞のパターンの形成を示し、図９Ｂは、筋細胞のパターン化を示し、図９Ｃは、繊維芽細胞のパターン化を示し、図９Ｄは、上皮細胞のパターン化を示す。もちろん、他の種類の細胞も、パターン化できる。
【００３２】
（実施例７：表面に近接した一次細胞のパターン化）
一次細胞の培養は、他の細胞株（例えば二次細胞および不死化細胞）よりも難しい場合がある。図１０は、本発明の実施形態を用いて、表面に近接して一次細胞をパターン化できることを示す。細胞の単層または細胞の多層が表面に近接して形成されるように、表面に近接してパターン化された細胞の増殖を制御しうる。図１０Ａおよび１０Ｂは、磁場モジュレータを使用せずに表面上で培養された、ヒト一次近位尿細管細胞およびラット一次肝細胞をそれぞれ示す。磁場モジュレータを使用せずにこれらの細胞を培養すると、ランダムに分散した細胞のパターンができた。いくつかの実施形態においては、図１０Ｃおよび１０Ｄに示されるように、磁場モジュレータを用いて、密集した細胞のパターンを形成しうる。図１０Ｃおよび１０Ｄは、磁場モジュレータを使用して表面に近接して培養された、ヒト一次近位尿細管細胞およびラット一次肝細胞をそれぞれ示す。図１０Ｅは、小麦胚細胞凝集素−ＦＩＴＣで標識された一次肝細胞を示す。図１０Ｆは、磁場モジュレータを使用して形成された、密集して並べられた肝細胞のパターンの写真を示す。これらの細胞には通常の細胞特徴が観察され、磁気マイクロパターン化後に細胞表現型の変化が生じなかったことが示された。
【００３３】
（実施例８：細胞のパターンの特徴の寸法制御）
いくつかの場合には、細胞のパターンの特徴（例えば列）の寸法は、少なくとも部分的に、表面に近接して堆積された細胞の密度により制御されうる。例えば、一実施形態においては、高密度の細胞（例えば、およそ１０５細胞／ｍＬ以上）から、幅約２００μｍの密集した細胞の列が生じうる。別の実施形態においては、低密度の細胞（例えば、およそ５００〜１０００細胞／ｍＬ）から、図１１に示されるように、少ない細胞幅（例えば、約８〜２０μｍ幅）の列が生じうる。いくつかの場合には、単一の列またはその他の細胞のパターンを、表面に近接してパターン化でき、パターンの寸法は１０μｍ未満でありうる。
【００３４】
細胞のパターンの特徴の寸法は、表面に対する磁場モジュレータの位置によっても制御できる。例えば、いくつかの場合には、表面と物理的に接触して置かれた磁場モジュラにより、表面付近に強い磁場強度を形成することが可能になる。これにより、表面に近接して、比較的幅の広い細胞のパターンを形成することが可能になる。たとえば、一実施形態においては、細胞列の幅は、表面に物理的に接触して置かれた磁場モジュレータの突起の幅とほぼ同じくらいである。他の場合には、表面に近接しているが物理的に接触せずに（例えばモジュレータと表面の間にギャップが形成されるように）配置された磁場モジュレータにより、表面付近に弱めの磁場強度が生じうる。これは、磁場ソースからの距離が増加すると共に磁場強度が減少するために生じうる。いくつかの実施形態においては、表面から離して配置された磁場モジュレータにより、表面に近接して、比較的幅が狭い細胞のパターンを形成することが可能になる。例えば、細胞列の幅は、磁場モジュレータの突起の幅よりも大幅に細くなりうる。
【００３５】
（実施例９：表面に近接した複数の細胞型のパターン化）
いくつかの実施形態においては、磁場モジュレータを用いて、表面に近接して一つ以上の種類の細胞をパターン化しうる。特に空間的配置が制御された、表面に近接した複数の細胞型の培養には、様々な用途がある。例えば、そのような細胞の配置により、異なる種類の細胞間の分子間相互作用および複数の細胞型を含む組織の形成の研究が可能になりうる。いくつかの生物の組織は、異なる細胞型の空間的関係により決定される異なる微小構造をもつため、空間的配置が制御された細胞のパターン化は、このような構造の機能的意義の研究を可能にしうる。いくつかの場合には、特に三次元構造における複数の細胞型のパターン化は、バイオ人工臓器の形成につながりうる。
【００３６】
一実施形態においては、磁場モジュレータを用いて細胞の第一の組を表面に近接してパターン化し、磁場モジュレータを用いずに細胞の第二の組を同じ表面上に堆積させて、細胞の第二の組を配置しうる。例えば、図１２Ａは、表面上に列の形でパターン化された細胞の第一の組４５−１（繊維芽細胞）、および、表面上にランダムに配置された細胞の第二の組４５−２（肝細胞）を示す。この方法は、単一表面上にいて、細胞の第一の組を能動的に引き付ける（例えば、磁性体を取り付けた繊維芽細胞を磁場モジュレータに引き付ける）とともに、細胞の第二の組を受動的に引き付ける（例えば細胞をコラーゲン被覆表面に一般的に引き付ける）ことができることを示す。
【００３７】
いくつかの実施形態においては、複数の種類の細胞を、表面上に互いに近接して配置しうる。一つの特定の実施形態では、複数の種類の細胞を、表面上に隣り合って配置しうる。例えば、上の図１Ｆおよび１Ｇで示されたように、第一位置に配置された磁場モジュレータを使用して、表面に近接して細胞の第一の組のパターンを形成でき、モジュレータを表面に対して第二位置に移動させうる。（例えば、互いに対して移動される限り、モジュレータまたは表面を移動させればよい）。モジュレータが第二位置にある間に、細胞の第二の組を表面に近接してパターン化しうる。例えば、一つの特定の実施形態では、細胞の第一の組４５−３（ＭＤＣＫ細胞）が表面に近接して配置され、磁場モジュレータを第一位置の２００μｍ隣に移動した後に、第二の種類の細胞（３Ｔ３繊維芽細胞）が、細胞の第一の組に近接して配置される（図１２Ｂ）。こうして、表面に近接して細胞の共培養系を形成できる。
【００３８】
（実施例１０：表面に近接した複数の細胞型の配置）
さらに別の実施形態においては、複数の種類の細胞を、表面上に重ね合わせて配置できる。例えば、図１Ｄおよび１Ｅに示されるように、磁場モジュレータを表面に対して移動させずに、複数の種類の細胞を重ね合わせてパターン化できる。他の場合には、まず磁場モジュレータが第一位置にある間に細胞の第一の組をパターン化してから、磁場モジュレータが第二位置にある間に細胞の第二の組をパターン化することにより、複数の種類の細胞を重ね合わせて配置できる。例えば、図１２Ｃに示すように、細胞の第一の組４５−５（例えば繊維芽細胞）を、表面に近接して配置しうる。表面に細胞４５−５が付着し、細胞の第一パターンが形成された後、磁場モジュレータを、細胞の第一パターンに対してある角度（例えば９０度）に変化させうる。細胞の第二の組４５−６（例えばＭＤＣＫ細胞）を、細胞の第一の組の上にパターン化できる。図１２Ｃ中の円は、細胞が重なっている領域を画定する。いくつかの場合には、後で詳述されるように、この領域の細胞は三次元の細胞構造体を形成しうる。もちろん、必要に応じて、さらなる細胞組（例えば第三、第四、および第五組）を重ね合わせてパターン化することもできる。
【００３９】
本明細書に示されるように、細胞の第一パターンを、細胞の第二パターンにミクロン精度で近接して配置できる。いくつかの場合には、細胞の第一パターンの少なくとも一つの特徴が、細胞の第二パターンの少なくとも一つの特徴から、一定の距離で離されうる。例えば、細胞の第一パターンの一つ以上の特徴が、細胞の第二パターンの一つ以上の特徴から、５００ミクロン未満、３００未満、２００ミクロン未満、１００ミクロン未満、または５０ミクロン未満離されうる。
【００４０】
本発明の方法および装置を用いて、様々な細胞の任意のもの（例えば哺乳類、細菌、および植物細胞）をパターン化できる。いくつかの実施形態においては、細胞の第一および第二の組は同じである。他の実施態様においては、細胞の第一および第二の組は、少なくとも一つの異なる特徴を有する。例えば、細胞の第一および第二の組は、異なる細胞型であればよく、または、同じ細胞型であるがタンパク質発現など、他の異なる特徴（例えば、細胞内および／または外の）を有していればよい。
【００４１】
一実施形態においては、特定の空間的配置の細胞のアレイを含むパターンが、表面上に形成される。いくつかの場合には、表面上において、特定の空間的配置の細胞の第一の組は、特定の空間的配置の細胞の第二の組と異なる特徴を有しうる。一つの特定の実施形態では、細胞の第一の組は一つの細胞型であり、細胞の第二の組は異なる細胞型でありうる。もちろん、同じまたは異なる細胞型の第三、第四、第五等々の細胞組も、表面上にパターン化されうる。このような細胞アレイには、たとえば異なる細胞型を含む微小組織の形成、細胞間相互作用の研究、および／または細胞アッセイの実施など、多くの利用可能性がある。
【００４２】
上述のように、本発明のいくつかの実施形態を用いて、細胞を二次元の制御された空間的配置にパターン化できる。ある実施形態では、これらの方法をさらに延長して、細胞を三次元でパターン化できる。本明細書で用いられるところの「三次元の細胞構造体」とは、細胞構造体の最小寸法（例えば長さ、幅、深さ、または断面の寸法）が最低１００ミクロンであることを意味する。断面寸法には、例えば、半管状または管状構造体など、細胞を含む空洞または一部空洞の構造体の、単数または複数の表面の二つの対立点の間の距離が含まれうる。いくつかの場合には、三次元の細胞のパターン化は、細胞のテンプレートとして使用できる三次元構造体の内側および／または外側表面に細胞を引きつけることにより、行われうる。これらの三次元テンプレートには、例えば、単一の細管または分岐構造体などの複合管状構造体が含まれうる。このような構造体上に、細胞の単層または多層をパターン化しうる。細胞の三次元パターン化は、再生医療で、例えば、腎臓、肺、肝臓、および血管を含む組織および臓器（またはその一部）など、三次元の細胞構造体を形成するために役立ちうる。
【００４３】
（実施例１１：細胞の三次元パターン化）
図１３は、「リングフィールドモジュレータ」の一例である、基底１６および突起２１を含む磁場モジュレータ１５−６を示す。磁場モジュレータ１５−６を用いて、円またはリングの形のパターンに細胞をパターン化し、場合によっては、三次元の細胞構造体に細胞をパターン化できる。例えば、突起２１は、内径２００μｍの空洞の鋼ピンから形成できる。もちろん、他の寸法、構造、または適切な材料を用いて、モジュレータまたはその一部を製造してもよい。モジュレータ１５−６を用いて、様々な細胞のパターンを形成しうる。例えば、図１４Ａに示されるように、モジュレータにより、細胞の円に一部重なるように細胞を配置しうる。重なり合わない円として配置される細胞の円も、形成できる（図１４Ｂ）。これらの両方のアプローチにより、特定の領域を光学検出などにより分析し、制御された細胞間相互作用を研究できる。いくつかの場合には、磁場モジュレータ１５−６を用いて、細胞を管状に引きつけうる。例えば、図１４Ｃに示されるように、細胞の円を、多層構造として重ね合わせて配置して、微小組織などの三次元の細胞構造体を形成しうる。一実施形態では、細胞を層ごとに表面に加えることにより、三次元の細胞構造体が形成されうる。別の実施形態においては、マクロおよびマイクロ寸法の両方の構造を含む三次元の細胞構造体を組織しうる。三次元の細胞構造体には、例えば小さな毛細細管に囲まれた細尿管など、組織特異的微小構造が含まれうる。
【００４４】
いくつかの実施形態においては、細胞は、三次元の管状構造体にパターン化されうる。このような構造体は、例えば、図１５に示される実施形態を用いて形成できる。図１５は、「半管状フィールドモジュレータ」の例であり、管状構造体３４のものと相補的な凹形および構造を有する磁場モジュレータ１５−７を示す。図１５Ａに示されるように、管状構造体３４は、磁場モジュレータ１５−７に近接して配置されうる。いくつかの場合には、複数の磁場モジュレータ１５−７が使用されうる（図１５Ｂ）。永久磁石が磁場ソース３０として働き、磁場モジュレータに近接して配置されうる。ある実施形態では、管状構造体３４の内側表面３５−１を、細胞を三次元の管状構造体にパターン化するための表面として使用しうる。例えば、複数の細胞を含む流体を、管状構造体３４の内部に堆積させればよく、磁場モジュレータ１５−７により生み出された磁場勾配により、細胞が表面３５−１を引きつけうる。図１６Ａおよび１６Ｂは、１２時間後の、管状構造体３４にパターン化された腎臓細胞を示す写真である。いくつかの場合には、本発明の方法を用いて細胞を管状構造体に培養するのに必要な時間は、最高１０日間かかりうる一定の従来法より大幅に短い。したがって、本明細書に記載の方法は、細胞播種プロセスおよび／またはバイオ人工デバイスの準備を加速するために役立ちうる。
【００４５】
（その他の実施形態）
磁場モジュレータにより、磁性材料を伴う細胞を引き付け、捕捉し、および／または場所を制御することが可能でありうる。そのようなものとして、磁場モジュレータを用いて、表面に近接して様々な細胞のパターンを形成しうる。細胞のパターンには、一つまたは複数の、同じまたは異なる特徴が含まれうる。例えば、パターンには、四角、円、楕円、線などの形の特徴が含まれうる。いくつかの実施形態においては、特徴は、細胞が配置されている領域である（例えば、特徴が四角である場合には、細胞が四角の形に配置されうる）。他の実施態様においては、特徴は、細胞が存在しない領域である（例えば、特徴が四角である場合には、細胞は四角の周囲に配置されうるが、四角の中には配置されない）。特徴は相互に連結でき、または、不連続的である場合もある。表面に近接した細胞のパターンは、磁場モジュレータの形、構造および寸法、磁場モジュレータをつくる材料、および表面に対する磁場モジュレータの位置により制御されうる。いくつかの場合には、たとえば、磁場モジュレータを用いて表面に近接した一定の不連続的な領域に細胞を引き付けて、二および／または三次元のアレイの不連続的な細胞のパターンが形成されうる。他の場合には、磁場モジュレータを用いて、表面に近接した全般的な領域に細胞を集中させることにより細胞をパターン化し、および／または表面に近接して高密度の細胞を形成することができる。図１６に示されるように、管のような表面の内周囲へと細胞を引きつけることは、そのような方法の一例である。
【００４６】
上述の通り、磁場モジュレータの形は変化させうる。例えば、磁場モジュレータには、（例えば、図２に示されるような）一つまたは複数の突起、または、（例えば、図１５に示されるような）細胞の固定化を促進しうる凹状領域が含まれうる。いくつかの場合には、例えば、図１３に示すように、モジュレータは、基底により支えられる突起を有しうる。他の場合には、たとえば各突起が磁場モジュレータとして作用する、基底により支えられていない一連の「突起」を使用して、磁場の変調が達成されうる。さらに他の場合には、磁場モジュレータは、ほぼ平坦でありうる。もちろん、磁場モジュレータの他の形および／または構造も可能である。
【００４７】
磁場モジュレータは、（例えば、センチメートルからマイクロメートルまでの）様々な寸法を有する特徴で製造されうる。例えば、磁場モジュレータは１ｃｍ未満、１ｍｍ未満、５００ミクロン未満、３００ミクロン未満、２００ミクロン未満、または、１００ミクロン未満、５０ミクロン未満、または１０ミクロン未満の寸法を有する少なくとも一つの特徴を有しうる。いくつかの場合には、表面上に形成された細胞のパターンは、磁場モジュレータの寸法とほぼ同じ寸法を有する少なくとも一つの特徴を有する。例えば、２００μｍ×２００μｍの寸法の（例えば、四角形の）突起を有する磁場モジュレータを用いて、表面に近接して約２００μｍ×２００μｍの四角形の細胞のパターンを形成しうる。別の実施形態においては、１０μｍ×１０μｍの寸法の突起を有する磁場モジュレータを用いて、表面に近接して約１０μｍ×１０μｍの四角形の細胞のパターンを形成しうる。もちろん、細胞のパターンの寸法および形は、上述のように磁場モジュレータと表面の間の距離を変更するなど、他の要素または方法により制御されうる。
【００４８】
磁場モジュレータは、磁場を変調するために使用できる任意の適切な材料で作られればよい。いくつかの実施形態においては、磁場モジュレータは、強磁性材料で形成される。鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、ガドリニウム（Ｇｄ）などの強磁性材料、および様々な合金は、容易に磁化できる材料である。換言すれば、強磁性材料は、他の材料に引力または反発力を及ぼしうる。時には、磁場モジュレータは、鋼（強磁性材料）からつくられる。鋼は、一般に硬く、強力で、丈夫で、可鍛性の、鉄と炭素の合金であり、通常は、０．２〜１．５％の炭素と、多くの場合には所望の合金特性によって、他の成分のマンガン（Ｍｎ）、クロミウム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、銅（Ｃｕ）、タングステン（Ｗ）、コバルト（Ｃｏ）、またはシリコン（Ｓｉ）などを含む。一つの特定の実施形態では、磁場モジュレータは、低炭素鋼、例えば鋼１０１０で作られた。磁場モジュレータを形成できる強磁性材料の他の非限定的な例には、ＦｅＯＦｅ２Ｏ３、ＮｉＯＦｅ２Ｏ３、ＣｕＯＦｅ２Ｏ３、ＭｇＯＦｅ２Ｏ３、ＭｎＢｉ、ＭｎＳｂ、ＭｎＯＦｅ２Ｏ３、Ｙ３Ｆｅ５Ｏ１２、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、Ｄｙ、およびＥｕＯが含まれる。
【００４９】
いくつかの実施形態においては、磁場モジュレータは、常磁性材料で形成される。常磁性材料は、磁場を印加すると普通の磁石のように引き寄せたり反発したりし、例えば材料の双極子が、外部の磁場にそろう。しかし、材料に磁場が印加されないときはそろわない。常磁性材料の非限定的な例には、アルミニウム（Ａｌ）、バリウム（Ｂａ）、カルシウム（Ｃａ）、酸素（Ｏ）、プラチナ（Ｐｔ）、ナトリウム（Ｎａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、ウラン（Ｕ）、マグネシウム（Ｍｇ）、およびテクネチウム（Ｔｃ）が含まれる。
【００５０】
磁場モジュレータを製造する技術は、磁場モジュレータの所望の形、モジュレータをつくる材料の種類などによって変化しうる。当業者は、磁場モジュレータの製造に使用される適切な技術および材料を決定しうる。ワイヤ切断プロセス（例えばミクロンサイズのワイヤを用いたワイヤ切断機械加工プロセス）およびフォトリソグラフィのような技術を、モジュレータの製造に使用しうる場合もある。他の場合には、市販の材料（例えば鋼管）を、磁場モジュレータとして使用しうる。いくつかの実施形態においては、磁場モジュレータの形成に適切な材料（例えば強磁性粒子）を、ポリマーに埋め込むことにより成形しうる。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、磁場モジュレータは、細胞のパターンの形成を導くための表面に、一体的に連結されていない。本明細書で使用されるところの「一体的に連結される」という用語は、二つ以上の物体を指す場合には、通常の使用中に分離されない物体、および／または分離するには、たとえば破損、剥離など、構成要素の少なくとも一方を損傷すること（接着剤、ツールなどにより互いに固定された構成要素を分離すること）が必要であることを意味する。例えば、一実施形態においては、磁場モジュレータは、（たとえば部分的にも全体的にも）表面に埋め込まれない。一体的に連結されていない磁場モジュレータにより、都合よく表面を変更せずにモジュレータを再配置することが可能になる。例えば、いくつかの場合には、磁場モジュレータを再配置するために、表面を操作したり、移動したりする必要がない。これにより、例えば、同じモジュレータを使用して、同じ表面上に細胞の第二の組をパターン化すること、および／または異なる表面上に細胞の第二の組をパターン化することが可能になりうる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ステージ装置を用いて、表面に近接した磁場モジュレータの配置を容易にしうる。このような装置の例が、図１７および１８に示される。図１７の実施形態に示されるように、ステージ装置８０には、磁場ソース３０および磁場モジュレータ１５を支えるプラットフォーム８２が含まれる。細胞のパターンの形成を導くための表面（例えばペトリ皿またはガラススライド）を、支持部材８４上に配置しうる。磁場モジュレータ１５は、垂直（ｚ）コントロール８６および水平（ｘ）コントロール８８を用いて、支持部材８４に近接して配置されうる（したがって、細胞をパターン化するための表面に近接して配置されうる）。これらのコントロールにより、磁場モジュレータをマイクロメートル精度で移動させることができる。当然のことながら、ステージ装置の利用は例にすぎず、磁場モジュレータを表面に近接して配置する適切な他の技術は当業者に明らかである。
【００５３】
本発明のある実施形態は、複数の細胞を含む流体に表面を接触させることを伴う。場合によっては、ピペット（例えばマニュアルまたは自動ピペット）または他の分配用デバイスを用いて、複数の細胞を含む流体を表面に堆積させうる。他の場合には、表面上に流体を流すことにより、細胞を含む流体を表面に堆積させうる。例えば、表面は、流体装置（例えばマイクロ流体デバイス）と接触し、および／またはその一部でありうる。流体を装置のチャネルに流し、流体が流れている間、または流体が静止している間に、流体内の細胞を、表面に近接して配置した磁場モジュレータに引きつけうる。
【００５４】
多様な表面を用いて、特に磁場マニピュレータが表面に一体的に連結されていない実施形態において、細胞のパターンの形成を導くことができる。ポリマー類（例えばポリスチレン）および非ポリマー類（例えばガラス、クォーツ、セラミックおよびシリコン）を含む任意の適切な材料を用いて表面を製造しうる。表面は、生分解性でも生分解性でなくてもよい。いくつかの場合には、表面は可撓性であり（例えば弾性）、異なる形を有するように形成されうる。表面は、任意の適切な形を有していればよく、湾曲しても、管状でも、ほぼ平面でも、粗くても、滑らかでも、多孔質でも、および／または造作（例えばミクロンサイズの造作）をパターン化してもよい。いくつかの実施形態では、表面は無菌であり、タンパク質の層（単数または複数）（例えば細胞外基材タンパク質）を含むことにより、細胞の付着を促進しうる。表面には、哺乳類の体に移植するための足場や他の材料、および／またはバイオ人工臓器の製造を容易にする表面も含まれうる。
【００５５】
本発明のある実施形態においては、細胞は磁性材料を伴う。細胞は、例えば、磁気ビーズまたは粒子などの磁性材料を細胞に取り付ける（すなわち付ける）ことにより、磁性材料を伴いうる。磁性材料の大きさは様々でありうるが、一般に直径１μｍ未満である。例えば、磁性材料は、直径０．５μｍ未満、直径０．１μｍ未満、または直径１０ｎｍ未満でありうる。磁性材料は、磁場との相互作用に適切な任意の材料で形成されればよい。例には、強磁性および超常磁性材料が含まれる。
【００５６】
いくつかの場合には、細胞は、特定の細胞膜レセプタと結合する抗体を磁性材料に結合することにより、磁性材料を伴いうる。ある特定の例においては、ストレプトアビジンを結合したビーズを含む溶液、およびビオチンを結合したレクチンを含む溶液に細胞を曝すことにより、細胞にストレプトアビジン結合ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ）を取り付けうる（図１９Ａ）。他の例には、抗Ｉｇカッパ軽鎖抗体、抗ＣＤ４５Ｒ抗体、または抗ｓｙｎｄｉｃａｎが含まれ、活性化されたＢ細胞と結合するために使用できる。磁性材料を細胞に結合するために必要な抗体の量は、標的細胞集団の抗原親和性ならびに抗原密度による。このような抗体で被覆された磁気ビーズは、結合する細胞により食菌されうる。あるいは、いくつかの実施形態においては、磁性材料自体が、生体親和性リガンドとして機能しうる。例えば、Ｆｅ２ＦＯ３の粒子は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの一定の細胞の細胞表面に付着し、細胞を磁性にしうる。細胞に磁性材料を結合するための様々な技術が、当業者によって知られているか、決定されうる。
【００５７】
ある場合においては、細胞は本来磁性材料を伴う。例えば、ジオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属のもののような磁性細菌（例えばＧ．ｍｅｔａｌｌｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）は、錆（Ｆｅ（ＯＨ）２）を消費し、錆を本来の磁性材料である磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）にかえる。細菌の磁鉄鉱により、細菌の移動が磁力線に沿って導かれる。
【００５８】
以下の実施例は、本発明のある実施形態を示すことを目的とするが、制限的と解釈されてはならず、本発明の全容を例証するものではない。
【００５９】
（実施例１２：培養細胞の手順）
この実施例は、本発明のある実施形態による、細胞のパターン化のための細胞培養の手順を示す。
【００６０】
米国菌培養収集所（ロックビル、米国）から、マディン−ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、Ｃ２Ｃ１２筋細胞、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞、および神経グリア芽細胞腫の細胞株Ｕ−８７を得た。四つ全ての細胞型を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ、シンガポール）および１％の抗生物質−抗真菌溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ、シンガポール）とともに、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ、シンガポール）で培養した。二工程ｉｎ−ｓｉｔｕコラゲナーゼ消化（Ｓｅｇｌｅｎ、１９７６年）により、ウィスターラットから一次肝細胞が単離された。全ての手順の間、一次肝細胞は、１０−７デキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シンガポール）のＨｅｐａｔｏｚｙｍ−無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ、シンガポール）で培養され、１％の抗生物質−抗真菌溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ、シンガポール）が使用された。
【００６１】
（実施例１３：細胞に磁性材料を結合するための手順）
この実施例は、本発明のある実施形態により、細胞のパターン化のために磁性材料を細胞に取り付ける手順を示す。
【００６２】
図１９Ａに概して示されるように、細胞と結合する磁性材料としてＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｒｅｐａｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、シンガポール）を用い、製造者の説明に従って調製した。体積１００μＬのビーズ溶液を、２５μＬのビオチン化小麦胚細胞凝集素（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、米国）を含む５００ｍＬの無菌ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０に加え、得られた懸濁液を、Ｄｙｎａｌサンプルミキサー（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、シンガポール）を使用して室温で３０分間混合した。得られたレクチン−ビーズ溶液の体積２０μＬを、約７５０万のトリプシン処理された細胞に加え、Ｄｙｎａｌサンプルミキサーを使用して、室温で１５分間ゆっくりインキュベートした。図１９Ｂは、レクチンおよびビーズに曝露した後の、懸濁液中の細胞を示す。ビーズは細胞に結合した。レクチンなしでビーズのみに曝露された懸濁液中の細胞には、ビーズが付着しなかった。この観察結果は、レクチンにより生じる結合プロセスの特異性を示す（図１９Ｃ）。
【００６３】
あるいは、１０μＬのレクチン−ビーズ溶液が、７５ｃｍ２培養フラスコ中のコンフルエントの細胞層に加えられ、穏やかに振盪させる条件下で、５％ＣＯ２および３７°で３０分間インキュベートされうる。図１９Ｄおよび図１９Ｅは細胞の単層に取り付けられたビーズを示す。その後、細胞はトリプシン処理された。そして、ＭＣＰ−Ｓマグネティックスタンド（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、シンガポール）において、ビーズを取り付けられた細胞が、ビーズを取り付けられていない細胞から分離され、最後に、ノイバウエル改良型血球計算板（Ｐａｕｌ  Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ、ドイツ）を使用して数えられた。いずれの手順でも、細胞あたり１０〜３０のビーズが取り付けられた。
【００６４】
この実施例は、本発明の実施形態により、簡単な手順を用いて細胞に磁性粒子を付けられることを示す。
【００６５】
（実施例１４：磁場モジュレータを製造する手順）
この実施例は、本発明のある実施形態により、磁場モジュレータを製造する手順を示す。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、図１７に示されるモジュレータ１５、および図６に示されるモジュレータ１５−２〜１５−５などの磁場モジュレータは、低炭素鋼でつくられた。モジュレータは、金属ワイヤ電極を使用してプログラムされた輪郭（例えば前駆構造体）をブロックに切断する精密なワイヤ切断機械加工プロセスである、放電加工（ＥＤＭ）により製造できる。磁場モジュレータは、機械製図および寸法に基づいて、低炭素鋼のブロックから機械加工された。ワイヤは、黄銅合金でつくられ、直径約２０〜３３０μｍの範囲でありうる。ブロックの上下に円錐ブロックまたは異なる輪郭を切断するために、ブロックに対してワイヤに角度をつけた。この機械加工の結果は、ワイヤのサイズに依存し、それは２０ミクロン以上だった。ＥＤＭは、モジュレータが硬い材料で作られる場合、および／またはモジュレータの部分の複雑性（例えばアスペクト比が大きい特徴）により、従来の製造手法が困難または不可能である場合に、モジュレータを製造するための有用な技術でありうる。
【００６７】
別の実施形態においては、モジュレータの部分を、例えば基底上に組み立てうる。例えば、図１３に示される磁場モジュレータ１５−６は、内径２００μｍの空洞の鋼ピンを用いて作られ、それが突起２１として機能した。磁場モジュレータの基底１６は０．５ｍｍの貫通孔のアレイを伴い、低炭素鋼で作られた。その後、鋼ピンが、ピンが穴からゆるまないようにおよび／または落ちないように、これらの穴に密接嵌合して機械的に挿入された。その後、表面が平らになるように基底が接地された。
【００６８】
他の実施形態においては、磁場モジュレータは、フォトリソグラフィおよび電子線リソグラフィなどのリソグラフィを用いて製造されうる。このような技術によって作られるモジュレータには、例えば、伝導層を有するシリコン基板が含まれうる。伝導層は、電気メッキ、真空蒸着、および熱蒸発などの方法により、基材上に金属フィルム（例えば金、銀、チタン、および／またはプラチナ）を堆積させることにより形成されうる。伝導層は導線としての役割を果たし、１０ミクロン未満の寸法を有するように製造されうる。いくつかの場合には、ワイヤを通る電流密度を制御することにより、導線により生み出される電磁場が変調されうる。シリコン上に露光および現像されたフォトレジストパターンを含むモジュレータは、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｇｅｒｏｌｄ  Ｗ．ＮｅｕｄｅｃｋおよびＲｏｂｅｒｔ  Ｆ．Ｐｉｅｒｒｅｔ編集、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，１９８９年など、従来のリソグラフィテキストのいずれかに記載される技術を使用して準備できる。
【００６９】
この実施例は、本発明のある実施形態により、様々な材料および方法を用いて磁場モジュレータを作成できることを示す。
【００７０】
（実施例１５：表面に近接して細胞をパターン化する手順）
この実施例は、本発明のある実施形態により、磁場モジュレータを用いて、表面に近接して細胞のパターンを形成できることを示す。
【００７１】
培養皿（例えばペトリ皿）およびカバースライドをそのまま、あるいはコラーゲンで被覆して、細胞をパターン化するための表面として使用した。実施例３に記載される方法を用いて、磁場モジュレータが製造された。ステージ装置上（例えば、図１７に示されるように、ステージ装置８０の支持部材８４上）に表面を配置し、ステージ装置を用いて、磁場モジュレータを表面に向かって移動させた（例えば、垂直のｚ−方向に）。体積１ｍＬの培地を、表面上の磁場モジュレータの上方の領域に加えた。その後、実施例２に記載の手順を用いてＤｙｎａｂｅａｄｓを付けた２０，０００〜６０，０００の細胞を、１０００−μＬピペットを用いて１ｍｌの培地に加え、全体をＣＯ２インキュベータへ移した。数分で、磁場モジュレータの突起上方に集合した細胞の細密な線が観察できた。４〜５時間の培養後、磁場モジュレータを除去し、基材上の付着していない細胞を、ＰＢＳで穏やかに洗い流した。細胞が付着した表面はさらに培養され、コンフルエントな細胞の列が形成された。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、シンガポール）を用いて、細胞のパターンを視覚化した。デジタルカメラで撮影した後、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ５．５（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州サンノゼ）で処理した。
【００７２】
この実施例は、磁場モジュレータを用いて細胞を並べ、表面に近接して細胞のパターンを形成できることを示す。この実施例は、細胞が、様々な種類の表面上（例えばペトリ皿やガラススライドの表面）にパターンを形成きることも示す。換言すれば、細胞が付着する表面とは無関係に細胞をパターン化できる。
【００７３】
実施例１６：表面に近接して複数の細胞のパターンを形成する手順
この実施例は、本発明のある実施形態により、磁場モジュレータを使用して、異なる細胞型のパターンを表面に近接して形成しうることを示す。
【００７４】
実施例４に記載されたものと類似の手順を用いて、表面に近接して第一位置に細胞の第一パターンを形成した。細胞の第一パターンには、隣接する列から約２００μｍの間隔で離れた約２００μｍの幅の列に並べられた細胞が含まれた。細胞の共培養を形成するために、可動マイクロステージを用いて、磁場モジュレータを第一位置から（ｘ−方向に水平に）２００μｍ離れた第二位置まで移動し、たとえば、磁場モジュレータの突起を、細胞の第一パターンの幅２００μｍの間隔の下に配置した。第二位置は、水平ステージの微調節で決定された。実施例４に記載されたものと類似の細胞培養技術を用いて、磁場モジュレータが第二位置にある間に、細胞の第二の組が表面に近接してパターン化された。同様に磁性粒子を付けられた細胞の第二の組は、磁場モジュレータの突起に合わせて第二位置に並んだ。この手順の結果、表面に近接して細胞の共培養がパターン化された。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ  ４１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、シンガポール）を用いて、細胞のパターンを視覚化した。デジタルカメラで撮影した後、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ５．５（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州サンノゼ）で処理した。
【００７５】
この実施例は、表面に対して磁場モジュレータを再配置することにより、単一の表面上に複数の種類の細胞をパターン化できることを示す。この実施例は、複数の細胞型のパターン化が、細胞がパターン化される表面とは無関係であることも示す。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態を、本明細書に図と共に説明したが、本明細書に記載の機能をはたし、および／または結果および／または一つ以上の利点を得るための、他の様々な手段および／または構造が当業者に明らかであり、このような変化形および／または修正の各々が、本発明の範囲内である。さらに一般的にいえば、当業者には当然のことながら、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、および構造は、例示的であり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構造は、本発明の単数または複数の教示が使用される、特定の単数または複数の用法に依存する。本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物が、当業者に明らかであり、または通常の実験だけを使用して確認できる。したがって、当然のことながら、前述の実施形態は例にすぎず、添付の請求の範囲および等価物の範囲内において、特定の記載および請求以外で本発明を実施することが可能である。本発明は、本明細書に記載の各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しない場合には、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の二つ以上の任意の組み合わせが、本発明の範囲内に含まれる。
【００７７】
本明細書で定義および使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味に優先するものとする。
【００７８】
本明細書の本文および請求項で用いられる不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、逆の明示がない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解されなければならない。
【００７９】
本明細書の本文および請求項で用いられるところの、「および／または」という句は、そのように結ばれた要素の「いずれかまたは一方」を意味する、すなわち、いくつかの場合には共同で存在し、他の場合には選言的に存在する要素を意味すると理解されなければならない。「および／または」を伴ってリストされた複数の要素は、同じように解釈されなければならず、すなわち、そのように結ばれた要素の「一つ以上」と解釈されなければならない。「および／または」の節で特定された要素以外の他の要素は、特定された要素に関係するか無関係であるかを問わず、選択的に存在しうる。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」という指示は、「含む」などの制限のない語法とともに使用される場合には、一実施形態においてはＡのみ（Ｂ以外の要素を選択的に含む）、別の実施形態ではＢのみ（Ａ以外の要素を選択的に含む）、さらに別の実施形態ではＡおよびＢの両方（他の要素を選択的に含む）、等々を指しうる。
【００８０】
本明細書の本文および請求項で使用されるところの「または」とは、上に定義された「および／または」と同じ意義を有すると理解されなければならない。例えば、リストのアイテムを分ける場合の「または」または、「および／または」は、包括的であり、すなわち、リストされた多くの要素の少なくとも一つを含むが、一つ以上も含み、選択的にリストされていない他の品目も含むと解釈されなければならない。「の一つだけ」、または「の正確に一つ」など逆を明示する用語、または請求項において使用される場合には、「からなる」のみが、多数またはリストの要素のうち正確に一つを含むことをさす。一般に、本明細書で用いられるところの「または」という用語は、「いずれか」、「の一つ」、「の一つだけ」または「うち正確に一つ」などの排他的用語が先行する場合には、排他的選択肢（すなわち、どちらか一方であるが両方ではない）をさすものとだけ解釈されなければならない。請求項において使用される場合の、「から基本的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【００８１】
本明細書の本文および請求項で使用されるところの、一つ以上の要素のリストに関する「少なくとも一つ」という句は、リストの要素の中の任意の一つ以上の要素から選択される少なくとも一つの要素を意味するが、要素のリストの中に特にリストされている一つ一つの要素の少なくとも一つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせが除外されないと理解されなければならない。この定義は、「少なくとも一つ」という句が係る要素のリストに特定されている要素以外の要素が、特定された要素と関係するか、あるいは無関係であるかを問わず、選択的に存在しうることも許容するものである。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも一つ」（または、同義の「ＡまたはＢの少なくとも一つ」、または、同義の「Ａおよび／またはＢの少なくとも一つ」）は、一実施形態においては、少なくとも一つ、選択的に一つ以上のＡを含み、Ｂが存在しないこと（および選択的にＢ以外の要素を含む）；別の実施形態においては、少なくとも一つ、選択的に一つのＢ以上を含み、Ａが存在しないこと（および選択的にＢ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態においては、少なくとも一つ、選択的に一つ以上のＡを含み、少なくとも一つ、選択的に一つ以上のＢを含むこと（および選択的に他の要素を含む）；等々をさしうる。
【００８２】
当然のことながら、逆の明示がない限り、本明細書に記載の任意の方法に、一つ以上の工程または行為が含まれる場合には、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が記載された順序に必ずしも限定されない。
【００８３】
請求項においても、上記明細書においても、「含む」、「含まれる」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「持つ」、「から構成される」などの全ての移行句は、制限がなく、すなわち、〜を含むがこれに限られない、という意味であると理解されなければならない。米国特許審査手続便覧のセクション２１１１．０３に説明されるとおり、「からなる」、および、「から基本的になる」という移行句だけを、それぞれ制限的または半制限的な句とする。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは、本発明の一実施形態による、表面に近接して一つ以上の細胞のパターンを形成する方法を示すスキームである。
【図１−２】図１Ｄ〜１Ｇは、本発明の一実施形態による、表面に近接して一つ以上の細胞のパターンを形成する方法を示すスキームである。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータの略図を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータにより誘起された磁束線および磁場強度のシミュレーションを示す。
【図４】図４は、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて細胞をパターン化するための実験設備の例を示す。
【図５】図５は、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて表面に近接して形成された細胞のパターンの写真である。
【図６】図６は、本発明の別の実施形態による、異なる設計の磁場モジュレータにつきシミュレートされた一連の誘起磁場を示す。
【図７】図７は、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて表面に近接して形成された別の細胞のパターンの写真である。
【図８】図８は、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて表面に近接して形成された細胞のパターンの拡大写真である。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて表面に近接して形成された、異なる細胞型のパターンの写真である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、磁場モジュレータを用いずに表面に堆積させた一次細胞の写真である。図１０Ｃ〜１０Ｆは、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて表面にパターン化された一次細胞の写真である。
【図１１】図１１は、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて表面に近接して形成された細い細胞列の写真である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いた、表面に近接した複数の細胞型のパターン化の写真である。
【図１３】図１３は、本発明の別の実施形態による、別の磁場モジュレータの略図を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、本発明の別の実施形態による、図１３に示される磁場モジュレータを用いて形成できる細胞のパターンの略図を示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、本発明の別の実施形態による、別の磁場モジュレータの略図を示す。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、本発明の別の実施形態による、図１５に示される磁場モジュレータを用いて形成された管状の細胞のパターンの写真である。
【図１７】図１７は、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて細胞をパターン化するための実験設備例の写真である。
【図１８】図１８は、本発明の別の実施形態による、磁場モジュレータを用いて細胞をパターン化するための実験設備例の別の写真である。
【図１９】図１９Ａは、本発明の別の実施形態による、細胞に磁性粒子を付ける方法を示した概略図を示す。図１９Ｂ〜１９Ｅは、本発明の別の実施形態による、磁性粒子を付けた細胞の写真である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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