(57)【要約】  本発明は、マイクロ流動装置内で分離された細胞溶解産物からのｍＲＮＡを検出するための低導電率バッファーを用いる方法及びキットを提供する。バッファーは、細胞核の完全性に影響を及ぼさず、それによりゲノムＤＮＡ汚染を伴わずに逆転写酵素（ＲＴ）−ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）増幅反応においてテンプレートとして直接使用されうる細胞溶解産物の生成が可能となる。
2009528067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のｍＲＮＡの検出方法であって、以下のステップ：
ａ）細胞をバッファーと接触させて、無傷の細胞核を含む細胞溶解産物を生成し、ここで、上記バッファーは１０ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有し；
ｂ）上記細胞核を上記溶解産物から分離して、ｍＲＮＡを含む上清を生成し；
ｃ）マイクロ流動分離を介して逆転写酵素の阻害剤及びＤＮＡポリメラーゼの阻害剤から上記上清中のｍＲＮＡを取り出し；そして
ｄ）逆転写酵素ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を増幅して、上記細胞内のｍＲＮＡを検出する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記マイクロ流動分離が、選択的イオン抽出（ＳＩＥ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離ステップｂ）が、遠心分離を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バッファーが５ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バッファーが２ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バッファーが、以下の濃度で以下の成分を含む、請求項１に記載の方法：
５０ｍＭまでの塩化ナトリウム；
５０ｍＭまでの生物学的緩衝剤、ｐＨ６．０−８．３；
１５ｍＭまでの塩化マグネシウム；
５．０％（ｖ／ｖ）までの非イオン界面活性剤。
【請求項７】
前記バッファーがＲＮＡｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非イオン界面活性剤がＮＰ−４０である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的緩衝剤が、クエン酸塩、リン酸塩、ＴＲＩＳ、及びＭＥＳから成る群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記バッファーが以下の濃度で以下の成分を含む請求項１に記載の方法：
１０ｍＭ  塩化ナトリウム；
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ，ｐＨ７．４；
３ｍＭ  塩化マグネシウム；
０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０；及び
ＲＮＡａｓｅ阻害剤。
【請求項１１】
ゲノムＤＮＡが検出可能な状態で増幅されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
以下の：
ｉ）マイクロ流動チャンネルを含む支持体；及び
ii）１０ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有するバッファー；
を含むキット。
【請求項１３】
前記バッファーが５ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記バッファーが２ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記バッファーが以下の成分を含む、請求項１２に記載のキット：
５０ｍＭまでの塩化ナトリウム；
５０ｍＭまでの生物学的緩衝剤、ｐＨ６．０−８．３；
１５ｍＭまでの塩化マグネシウム；
５．０％（ｖ／ｖ）までの非イオン界面活性剤。
【請求項１６】
前記バッファーがＲＮＡｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記非イオン界面活性剤がＮＰ−４０である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記生物学的緩衝剤が、クエン酸塩、リン酸塩、ＴＲＩＳ、及びＭＥＳから成る群から選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記バッファーが、以下の成分を含む請求項１２に記載のキット：
１０ｍＭ  塩化ナトリウム；
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ，ｐＨ７．４；
３ｍＭ  塩化マグネシウム；
０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０；及び
ＲＮＡｓｅ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年３月２日に出願された米国仮出願第６０／７７９，３１２号に基づく利益を請求する。当該仮出願の開示の全体を本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
細胞溶解産物からｍＲＮＡを調製するための現在利用可能なバッファーは、細胞核を破壊し、そして高い導電率を有する（例えば、米国特許公開第２００５／００５３９５２号を参照の子と）。高い導電率は、現在のバッファーを、選択的イオン抽出（ＳＩＥ）を含む、流体力学的な流れと導電学的な流れの組合せを利用するマイクロ流動装置又はマイクロ流動手順における使用に関して不適合なものとしている。さらに、細胞核の破壊は、細胞溶解産物中にゲノムＤＮＡの汚染をもたらす。
【０００３】
本発明は、マイクロ流動手順における使用に好適な十分に低い導電率を有し、かつ、細胞核の完全性を破壊しないバッファーを提供することにより上記の欠点を解決するものである。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の簡単な説明
本発明は、ゲノムＤＮＡで汚染せずにｍＲＮＡを検出するためのテンプレートとして直接使用しうる細胞溶解産物の製造のための導電性バッファーを使用する方法及びキットを提供する。
【０００５】
したがって、第１の側面において、本発明は、細胞内のｍＲＮＡを検出する方法を提供する。ある態様においては、本方法は、以下のステップ：
ａ）細胞をバッファーと接触させ、それにより、無傷の細胞核を含む細胞溶解産物を生成し、ここで上記バッファーは、１０ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有し；
ｂ）上記細胞核を上記溶解産物から分離し、それにより上記ｍＲＮＡを含有する上清を生成し；
ｃ）マイクロ流動分離を介して逆転写酵素の阻害剤及びＤＮＡポリメラーゼの阻害剤から上記上清中のｍＲＮＡを除去し；そして
ｄ）逆転写酵素ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて少なくとも１つのｍＲＮＡ配列を増幅し、それにより細胞内のｍＲＮＡを検出する
を含む。
【０００６】
ある態様では、上記溶解産物から上記細胞核を分離するステップは、遠心分離により行われる。
本方法の実施においては、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、好ましくは、検出可能な状態で増幅されない。
【０００７】
他の側面においては、本方法は、以下の：
ｉ）マイクロ流動チャンネルを含む支持体；及び
ii）１０ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有するバッファー；
を含むキットを提供する。
ある態様においては、上記支持体は、選択的イオン抽出（ＳＩＥ）における使用に好適である。
【０００８】
上記方法及びキットの態様に関しては、バッファーは、約９，８，７，６，５，４，３，２，１ｍｓ／ｃｍの導電率又は約０．５〜１０ｍｓ／ｃｍ間のいずれかの値を有しうる。ある態様においては、バッファーは、５ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有する。ある態様においては、バッファーは、２ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有する。
【０００９】
ある態様においては、バッファーは、以下の濃度で以下の成分を含む：
５０ｍＭまでの塩化ナトリウム、例えば、１０，２０，３０，４０，５０ｍＭ又は５〜２０ｍＭＮａＣｌ；
５０ｍＭまでの生物学的緩衝剤、ｐＨ６．０〜８．３、例えば、１０，２０，３０，４０，５０ｍＭ、又は５〜２０ｍＭ生物学的緩衝剤であって、例えば、６．０，６．５，６．８，７．０，７．２，７．４，７．５，７．７，８．０，８．３のｐＨをもつもの；
１５ｍＭまでの塩化マグネシウム、例えば、約１〜５ｍＭ，３，５，７，１０，１２，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；
５．０％（ｖ／ｖ）の非イオン界面活性剤、例えば、０．２〜５．０％，０．５〜２．０％，０．２，０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，４．０，５．０％非イオン界面活性剤。
【００１０】
バッファーは、ＲＮＡｓｅ阻害剤をさらに含むことができる。ある態様においては、非イオン界面活性剤は、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘｎ（ｎ＝１００〜５００）、ポリオキシアルキレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、グリセリドから成る群から選ばれる。さらなる非イオン界面活性剤は、例えば、米国特許第６，３８３，４７１号中に列挙され、これを本明細書中に援用する。ある態様においては、生物学的緩衝剤は、クエン酸塩、リン酸塩、ＡＣＥＳ，ＢＥＳ，ＥＰＰＳ、グリシン、ヒスチジン、ＨＥＰＥＳ，ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ＴＲＩＳ、及びＭＥＳから成る群から選ばれる。さらなる生物学的緩衝剤は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから商業的に入手可能である。
【００１１】
１の態様においては、バッファーは、以下の濃度で以下の成分を「含むか」又は「から本質的に成るか」又は「から成る」：
１０ｍＭ塩化ナトリウム；
１０ｍＭＴＲＩＳ，ｐＨ７．４；
３ｍＭ塩化マグネシウム；
０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０；及び
場合により、ＲＮＡｓｅ阻害剤。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の詳細な説明
導入
本発明は、ゲノムＤＮＡの不所望の増幅を伴わずにｍＲＮＡを増幅するための、逆転写酵素ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅混合物中で直接的に使用されることができ、かつ、マイクロ流動分離技術における使用に適した細胞溶解産物の製造のための方法及びキットを提供する。本方法及びキットは、細胞核の完全性を破壊せずに細胞外細胞膜を溶解する低導電率バッファーを用いた真核生物細胞の溶解を提供する。
【００１３】
定義
用語「マイクロ流動」とは、１ｍｍ未満の、そしてしばしば５００μｍ未満の、例えば０．１〜５００μｍの少なくとも１つの内径断面寸法をもつ１以上のチャンネルをもつ装置又は支持体及び当該装置又は支持体を用いた方法をいう。
【００１４】
用語「マイクロ流動分離」とは、マイクロ流動装置又は支持体を用いた２以上の分子の分離をいう。
【００１５】
「マイクロ流動支持体」は、マイクロ流動分離手順における使用に好適な支持体である。マイクロ流動支持体は、例えば、プラスチック又はガラスを含むいずれかの好適な材料から作られることができる。
【００１６】
用語「選択的イオン抽出」又は「ＳＩＥ」とは、マイクロ流動装置内での流体力学的な流れと導電学的な流れの制御の組合せを利用した分離技術をいう。選択的イオン抽出を用いて、マイクロ流動支持体（すなわち、マイクロ流動チップ）上のＴ−ジャンクションに送られた化合物又は分子の混合物は、電気泳動移動性に基づき異なるチャンネル内に完全に分離されうる。例えば、Ｋｅｒｂｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）７４：５１７５を参照のこと。米国特許出願第１０／３８６，９００号及び同第１０／７４４，９１５号、及び国際公開第ＷＯ０３／０７６０５２号パンフレットをも参照のこと。これらの各開示を、目的を問わず全体として本明細書中に援用する。
【００１７】
用語「導電率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）」とは、材料又は溶液が電流を通す能力をいう。導電率は、１メーター当りのシーメンス（ｓ／ｍ）又はｍｈｏｓ（オームの逆数）／ｍの単位で計測されうる。
【００１８】
詳細な態様
方法
本法は、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、爬虫類細胞、両性類細胞、鳥類細胞、及び哺乳動物細胞を含む真核生物細胞のいずれかにおけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出するために好適である。細胞は、組織培養物から調製されることもできるし、又は対象から採取された組織サンプルから直接調製されることもできる。例えば、細胞は、個体の生検サンプルから又は血液サンプルから得られうる。組織培養物からの調製のためのセルラインは、例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから得られうる。
【００１９】
低導電率溶解バッファーは、所望により、使用前に希釈されることができる濃縮保存溶液（例えば、５倍、１０倍、２０倍）として、調製されうる。ある態様においては、溶解すべき細胞に接触される前に、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、又は他の還元剤、及び／又はＲＮａｓｅ阻害剤が溶解バッファーに添加される。
【００２０】
適当なバッファー体積は、溶解されるべき細胞の数及びサイズに依存するであろう。ある態様においては、約１００μＬの溶解バッファーが約１００，０００個の細胞に添加される。大容量の溶解バッファー、例えば、より大きなサイズの１００，０００個細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）のために、使用されうる。より小さいな容量の溶解バッファーも、例えば、１００，０００個のより小さな細胞（例えば、Ｂ又はＴ細胞を含むリンパ球）のために使用されうる。
【００２１】
細胞の細胞外膜は、細胞のサンプルを本発明のバッファーに供することにより溶解され、ここで当該バッファーは約１０ｍｓ／ｃｍ以下の導電率を有する。細胞は、核膜を無傷のままに残しながら細胞外膜を溶解するために十分な条件下で溶解バッファー中でインキュベートされる。細胞は、体温（３７℃）、室温（２５℃）、又は冷蔵温度（４℃）、又は他の温度で、適宜、溶解バッファーに晒されることができる。１の態様においては、細胞は、溶解バッファーに接触され、そしてその後、氷上に置かれる。細胞溶解は、通常、１時間以内、例えば、約３０，２０，１０，５又は数分以内で完結する。溶解バッファーに晒される細胞が細胞外膜を十分に溶解する時間量は、細胞のサイズ、溶解バッファーの単位体積当りの細胞の数、インキュベーションの温度等を含む様々な要因に依存するであろう。細胞は、さらに、溶解を促進するために、例えば、ピペットに数回通過させること又はボルテックスにより、機械的に破壊されることができる。
【００２２】
細胞外膜を溶解した後、無傷の核は、溶解産物から分離される。これは、例えば、細胞溶解産物の遠心分離により行われることができる。核を含有する上清は、その後、ペレットから分離される。
【００２３】
ｍＲＮＡは、その後、マイクロ流動分離手順に上清を供することにより、逆転写酵素の阻害剤とＤＮＡポリメラーゼを含む上清中の他の分子から取り出され又は分離される。上清は、例えば、インジェクション又はキャピラリー取り込みにより、マイクロ流動支持体の適当なチャンバー又はチャンネル内にロードされる。次いで、支持体と細胞上清な、分離が十分に完結するまで、電流及び／又は陽圧又は負圧に供される。マイクロ流動分離手順を実施するための装置及び支持体は、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから商業的に入手可能である。
【００２４】
１の態様においては、マイクロ流動分離手順は、選択的イオン抽出（ＳＩＥ）である。ＳＩＥにおいては、マイクロ流動支持体のチャンネルセグメント内の液体の流れは、流体力学的陽圧と電場の両者により駆動され、そして液体プラグ内に含まれる多数の種は、チャンネルネットワークの各種チャンネルセグメント内の適用された圧力と電場を変化させることにより分離される。米国特許出願第１０／３８６，９００号及び同第１０／７４４，９１５号、並びに国際公開第ＷＯ０３／０７６０５２号を参照のこと、これらの各開示を、目的を問わず、その全体を本明細書中に援用する。
【００２５】
分離されたｍＲＮＡ含有上清フラクションを、その後、ｍＲＮＡが所望される目的のために使用されうる。ある態様においては、ｍＲＮＡを含む上清フラクションは、場合によりさらなるプロセッシングを経ずに、逆転写酵素（ＲＴ）反応又はＲＴ−ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）において直接使用される。上清フラクションは、所望により、１ステップ又は２ステップＲＴ−ＰＣＲにおいて直接使用されうる。反応を使用したＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートのア増幅は周知である（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照のこと）。反応は、好ましくは、所望の温度におけるインキュベーション時間を容易にするためにサーマルサイクラー内で実施される。例えば、ＰＣＲ  ＰＲＩＭＥＲ．Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｄ．２００３）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．を参照のこと。アンプリコンの増幅を許容する例示的なＰＣＲ反応条件は、典型的には、２又は３ステップのいずれかのサイクルを含む。
【００２６】
２ステップサイクルは、変性ステップとその後のハイブリダイゼーション／伸長ステップをもつ。３ステップサイクルは、変性ステップとその後のハイブリダイゼーションステップとその後の別個の伸長ステップを含む。所望により、単一の又は多数のｍＲＮＡ配列が増幅されうる。ある態様においては、ｃＤＮＡライブラリーが作製され、そして場合により、さらなる操作、発現等のために適当なベクター内にクローン化される。
【００２７】
キット
本発明は、本発明に係る方法のために前記したような、本発明の低導電率バッファーと、１以上のマイクロ流動チャンネルを有するマイクロ流動支持体（すなわち、マイクロ流動チップ）を含むキットをさらに提供する。本キットは、場合により、さらに、対照核酸、例えば対照ｍＲＮＡ配列を含むことができる。さらに、本キットは、ヌクレオチド（例えば、Ａ，Ｃ，Ｇ、及びＴ）、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマー（例えば、オリゴｄＴ、ランダム又は特異的）及び適当なバッファーを含む増幅試薬、その他の、増幅反応を促進するための他の試薬を含みうる。本キットは、標的ｍＲＮＡ配列を増幅するためのキットを使用するための指示書及び増幅のための対照をも含みうる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５−２００６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【実施例】
【００２８】
実施例
実施例１
以下の実施例は、「バッファーＥ」が細胞溶解のために使用されるとき、その細胞核が溶解されないことに因り、ゲノムＤＮＡが溶液中に放出されないことを証明する。
【００２９】
材料：
・ＤＭＥＭプラス１０％胎児子ウシ血清（ＦＢＳ）１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸中で培養した新鮮ＨｅＬａセルライン
・リン酸塩緩衝液化生理食塩水（ＰＢＳ）
・トリプシン
・ＨｅＬａＳ３ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）
・ヒト  ｇＤＮＡ
・ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット
ｉＱ  Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ
ｉＱ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ
・ｍＲＮＡからヒト・チューブリン遺伝子を増幅するためのプライマー
・ゲノムＤＮＡから血液凝固第５因子を増幅するためのプライマー
・組換えＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔａｌｏｇ番号  Ｎ２５１１）
・Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡTMII（Ａｍｂｉｏｎ）
・Ａｕｒｕｍ全ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット
・バッファーＥ：１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，３ｍＭ  ＭｇＣｌ2，及び０．５％  ＮＰ４０。
【００３０】
装置：
・Ｖｏｒｔｅｘｅｒ
・ｉＣｙｃｌｅｒ／ＭｙＣｙｃｌｅｒ
・細胞培養フード
・血球計。
【００３１】
手順：
細胞培養：
ＨｅＬａ細胞を、７５ｃｍ2直方形フラスコ内に接種し、そして細胞が９０〜９５％集密になるまで、培養した。次いで、細胞をトリプシン処理により集めた。細胞をカウントした後、約１００，０００個細胞のアリコートを調製した。
【００３２】
核染色：
ＨｅＬａ細胞を、２４ウェル接着細胞培養プレート内にも接種し、そして細胞が９０〜９５％集密になるまで培養した。まず、２４ウェルプレート内の細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染料で染色して、顕微鏡を用いてＵＶ光下で細胞核を肉眼観察した。無傷の核は、上記染料が２本鎖ＤＮＡに結合するとき青色蛍光を発するので、容易に同定された。次いで、バッファーＥを、上記プレートのウェルに添加した。プレートをボルテックスして、溶解をさらに促進させた。核が上記バッファーにより溶解されたか否かを調べるために、上記溶解産物を顕微鏡下で観察した。
【００３３】
細胞溶解：
バッファーＥを、１０倍保存溶液から調製し、そして１％ＢＭＥとＲＮａｓｅ阻害剤を添加した。各溶解バッファー（バッファーＥと、Ａｍｂｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡTMIIバッファー（“Ｃ−ｔｏ−Ｃバッファー”））１００μＬを、１００，０００個ＨｅＬａ細胞アリコートに添加した。細胞溶解産物を、ピペットに、数回通過させ、そしてボルテックスして、細胞をさらに破壊した。上記Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡ溶解産物を、上記キットの指示マニュアルに従って、サーマルサイクラーを用いて１０分間７５℃でインキュベートした。全ての細胞溶解産物を、室温で１０分間５，０００ｇで遠心分離して、細胞残渣を除去した。スピニング後、各溶解産物からの上清を新鮮管に移し、そして氷上に置いた。バッファーＥを用いて溶解された細胞の無傷の核を図１に示す。
【００３４】
ヒトｇＤＮＡからの血液凝固第５因子を増幅するためのリアルタイムＰＣＲを、５０μＬＰＣＲ反応のための各バッファーについて細胞溶解産物２μＬを用いて実施した。反応を２連で行った。結果を図２に示す。
【００３５】
１０倍の希釈シリーズを、上記細胞溶解産物から調製した。上記希釈サンプルの各々からの２μＬを、逆転写酵素を用いた４０μＬｃＤＮＡ合成を調製するために使用した。ｃＤＮＡ合成の後、１００μＬＰＣＲ反応のためのｃＤＮＡ１０μＬを用いて２連でチューブリン遺伝子増幅のためのリアルタイムＰＣＲを実施した。反応を３連で行った。結果を図３に示す。
【００３６】
結論：
バッファーＥを用いて、我々は、ＨｅＬａ細胞を溶解し、そしてＲＴ−ＰＣＲ反応において細胞溶解産物を直接使用した。バッファーＥは、商業的に入手可能なキットと同様に標的ｍＲＮＡ配列を増幅することができたが、細胞核を破壊しなかった。したがって、バッファーＥの使用は、ゲノムＤＮＡ汚染の導入を回避又は最小化する。
【００３７】
上記実施例は、本発明の範囲を制限するためではなく本発明を例示するために提供される。本発明の他の変形は、当業者に自明であり、そして添付クレームにより包含される。本明細書中に引用する全ての公表物、データベース、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許、及び特許出願を、ここに援用する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、バッファーＥに供されたＨｅＬａ細胞の無傷の核を示す。パネルＡ：バッファーＥによる細胞溶解に供されなかった無傷の細胞の位相差画像。パネルＢ：Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染料をロードされ、かつ、バッファーＥによる細胞溶解に供されなかった細胞の無傷の細胞核の蛍光画像。パネルＣ：バッファーＥによる細胞溶解に供された細胞の無傷の細胞核の位相差画像。パネルＤ：バッファーＥによる細胞溶解に供された細胞の無傷の細胞核の蛍光画像。バッファーＥを用いて溶解された細胞においては、その核は未だ無傷であり、そしてゲノムＤＮＡは溶解産物中に放出されなかった。全画像を４０倍で撮影した。
【図２】図２は、新鮮ＨｅＬａ細胞からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からの血液凝固第５因子遺伝子の増幅結果を示す。青色のプロット：Ａｍｂｉｏｎ’ｓ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡTM溶解バッファー。黒色のプロット：ｇＤＮＡ陽性対照。赤色のプロット：バッファーＥ。ゲノムＤＮＡからのアンプリコンは、バッファーＥを用いて調製した溶解産物からは増幅されなかった。このデータは、図１に示すデータと矛盾しない。
【図３】図３は、上記Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡTMキット（Ａｍｂｉｏｎ）又は本発明に係るバッファーＥのいずれかを用いて生成されたｍＲＮＡを用いたチューブリンｍＲＮＡ配列のためのリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）を示す。緑色がかった青色のプロット：Ａｍｂｉｏｎ’ｓ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡTM溶解バッファー。緑色のプロット：バッファーＥ。バッファーＥのための全希釈のためのサイクル域（Ｃｔ）値は、上記Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡTMバッファーのためのＣｔ値と同一であった。それゆえ、細胞から抽出されたＨｅＬａ  ｍＲＮＡの量は、上記２つのバッファーに関して等価であった。標的ｍＲＮＡ配列の増幅においてバッファーＥは商業的に入手可能なバッファーと同様に機能した。
【図１】
2009528067.tif 000003
【図２】
2009528067.tif 000004
【図３】
2009528067.tif 000005
【国際調査報告】
2009528067.tif 000006