(57)【要約】  本発明は、ムチン複合糖質、およびムチン複合糖質の産生方法に関する。本発明は、その生物学的、薬学的および医学的適用に関する。本発明は特に、免疫応答（抗Ｔｎ  ＩｇＧ）を誘導するためにＫＨＬのようなタンパク質担体を必要としないムチン複合糖質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質担体の非存在下で、ヒト腫瘍細胞を認識するＩｇＧ抗体を誘導することができる、免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質であって：
−  免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質は、アポムチン骨格に結合されたＳｅｒまたはＴｈｒ残基に直接的にＯ結合されている炭水化物部分を含み、そして
−  前記アポムチン骨格のＳｅｒまたはＴｈｒ残基に直接的にＯ結合されている炭水化物部分の各々はＧａｌＮＡｃ部分であり、そして
−  前記アポムチン骨格は以下：
ｉ．少なくとも１つのアポムチン、および／または
ｉｉ．少なくとも１つのアポムチンのフラグメントであって、前記少なくとも１つのフラグメントが少なくとも１つのアポムチンタンデム反復単位を含み、そして前記少なくとも１つのフラグメントが抗腫瘍ＩｇＧを誘導する前記能力を保持している、フラグメント、および／または
ｉｉｉ．少なくとも１つのアポムチンのサブフラグメントであって、前記少なくとも１つのサブフラグメントがアポムチンタンデム反復単位の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含み、そして前記少なくとも１つのサブフラグメントが抗腫瘍ＩｇＧを誘導する前記能力を保持している、サブフラグメント、および／または
ｉｖ．アポムチン、またはｉｉにおいて定義するフラグメント、またはｉｉｉにおいて定義するサブフラグメントの少なくとも１つの保存的変異体であって、前記少なくとも１つの保存的変異体の配列が前記アポムチン、またはフラグメント、またはサブフラグメントの配列と、該タンパク質またはフラグメントまたはサブフラグメントの配列の全長にわたって少なくとも７０％の同一性を有し、そして前記少なくとも１つの保存的変異体が抗腫瘍ＩｇＧを誘導する前記能力を保持している、保存的変異体
のアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする、免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項２】
前記アポムチンがＭＵＣ６アポムチンであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項３】
前記ＭＵＣ６アポムチンタンパク質が配列番号９、配列番号６、配列番号７または配列番号１５のタンデム反復単位配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項４】
請求項１のｉｉｉにおいて定義する前記少なくとも１つのサブフラグメントが前記アポムチンタンデム反復単位の少なくとも８５個の連続したアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項２または３に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項５】
前記アポムチンがＭＵＣ３アポムチンであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項６】
前記アポムチンがＭＵＣ４アポムチンであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項７】
前記アポムチンがＭＵＣ５アポムチンであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項８】
前記ＭＵＣ５アポムチンがＭＵＣ５ＡＣアポムチンであることを特徴とする、請求項７に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項９】
請求項１のｉｉｉにおいて定義する前記少なくとも１つのサブフラグメントが、前記アポムチンタンデム反復単位の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１０】
請求項１のｉｉｉにおいて定義する前記少なくとも１つのサブフラグメントが少なくとも１つのＣＴＬエピトープを保持していることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１１】
前記アポムチンがＭＵＣ６アポムチンであり、前記少なくとも１つのＣＴＬエピトープの配列が配列番号１６〜２３からなる群より選択される配列であることを特徴とする、請求項１０に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１２】
前記アポムチン骨格中に含有されるＳｅｒおよびＴｈｒ残基の少なくとも４０％がＧａｌＮＡｃ残基に直接的にＯ結合されていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１３】
前記直接的にＯ結合されたＧａｌＮＡｃ部分の少なくとも１つに結合した少なくとも１つの炭水化物部分をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃに結合した炭水化物部分がＧａｌＮＡｃ部分、シアリル基、またはガラクトース部分であることを特徴とする、請求項１３に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１５】
前記アポムチン骨格が以下：
−  少なくとも２つのアポムチン、および／または
−  少なくとも２つの請求項１のｉｉにおいて定義するフラグメント、および／または
−  少なくとも２つの請求項１のｉｉｉにおいて定義するサブフラグメント、および／または
−  少なくとも１つのアポムチン、および少なくとも１つの請求項１のｉｉにおいて定義するフラグメント、および／または
−  少なくとも１つのアポムチン、および少なくとも１つの請求項１のｉｉｉにおいて定義するサブフラグメント、および／または
−  少なくとも１つの請求項１のｉｉにおいて定義するフラグメント、および少なくとも１つの請求項１のｉｉｉにおいて定義するサブフラグメント
の配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１６】
前記アポムチン骨格中に含有される、前記少なくとも２つのフラグメント、および／または前記少なくとも２つのサブフラグメント、および／または前記少なくとも１つのフラグメントおよび少なくとも１つのサブフラグメントの各々が、異なるアポムチンのフラグメントまたはサブフラグメントであることを特徴とする、請求項１５に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１７】
前記少なくとも２つのフラグメントの各々の配列がアポムチンタンパク質のタンデム反復単位配列であることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項１８】
−  少なくとも１つの請求項１〜１７のいずれか１項に記載の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質、および／または
−  少なくとも１つの免疫グロブリン構造、または少なくとも１つの免疫グロブリンフラグメントであって、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、軽鎖、または重鎖である免疫グロブリンフラグメント
を含む、可溶性免疫複合体。
【請求項１９】
タンパク質担体の非存在下で、ヒト腫瘍細胞を認識するＩｇＧ抗体を誘導することができる、Ｔｎに基づくムチン複合糖質の産生を可能にし、そして少なくとも半調製規模の量での該複合糖質の産生を可能にする、免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生の方法であって、少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をアポムチン骨格の少なくとも１つのＳｅｒまたはＴｈｒ残基上へｉｎ  ｖｉｔｒｏで転移することを含むことを特徴とし、
前記アポムチン骨格は以下：
ｉ．少なくとも１つのアポムチン、および／または
ｉｉ．少なくとも１つのアポムチンのフラグメントであって、前記少なくとも１つのフラグメントが少なくとも１つのアポムチンタンデム反復単位を含み、そして前記少なくとも１つのフラグメントが抗腫瘍ＩｇＧを誘導する前記能力を保持している、フラグメント、および／または
ｉｉｉ．少なくとも１つのアポムチンのサブフラグメントであって、前記少なくとも１つのサブフラグメントがアポムチンタンデム反復単位の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含み、そして前記少なくとも１つのサブフラグメントが抗腫瘍ＩｇＧを誘導する前記能力を保持している、サブフラグメント、および／または
ｉｖ．アポムチン、またはｉｉにおいて定義するフラグメント、またはｉｉｉにおいて定義するサブフラグメントの少なくとも１つの保存的変異体であって、前記少なくとも１つの保存的変異体の配列が前記アポムチン、またはフラグメント、またはサブフラグメントの配列と、該タンパク質またはフラグメントまたはサブフラグメントの配列の全長にわたって少なくとも７０％の同一性を有し、そして前記少なくとも１つの保存的変異体が抗腫瘍ＩｇＧを誘導する前記能力を保持している、保存的変異体
のアミノ酸配列を含み、
そして前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転移は少なくとも１つのＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ）を使用して酵素的に行われる転移である、方法。
【請求項２０】
前記アポムチンがＭＵＣ６アポムチンであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アポムチンがＭＵＣ３アポムチンであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アポムチンがＭＵＣ４アポムチンであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記アポムチンがＭＵＣ５アポムチンであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記アポムチンがＭＵＣ５ＡＣアポムチンであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９のｉｉｉにおいて定義する前記少なくとも１つのサブフラグメントが、前記アポムチンタンデム反復単位の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔがガン細胞の酵素含有抽出物を提供することによって提供されることを特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−ＴがｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ６、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ７、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３であることを特徴とする、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＧａｌＮＡｃの転移がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってモニタリングされることを特徴とする、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔｎに基づくムチン複合糖質が反応混合物から精製されることを特徴とする、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法によって得ることができ、そしてそのアポムチン骨格中に含有されるＳｅｒおよびＴｈｒ残基の総数の少なくとも４０％がＧａｌＮＡｃ部分に直接的にＯ結合されていることを特徴とする、Ｔｎに基づくムチン複合糖質。
【請求項３１】
細胞抽出物を含有する混合物におけるＧａｌＮＡｃバイオコンジュゲーションの過程をモニタリングするための、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の使用。
【請求項３２】
タンパク質担体の使用を必要としない、免疫原性組成物であって、以下：
−  少なくとも１つの請求項１〜１７、または３０のいずれか１項に記載のＴｎに基づくムチン複合糖質、および／または
−  少なくとも１つの請求項１８に記載の可溶性免疫複合体
を含む、免疫原性組成物。
【請求項３３】
抗腫瘍ワクチンであることを特徴とする、請求項３２に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
さらに少なくとも１つの薬学的および／または生理学的に許容可能なビヒクルを含むことを特徴とする、請求項３２または３３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｎに基づくムチン複合糖質、例えばムチン−Ｔｎ、ムチンｓＴｎ、ムチン−ＴＦ複合糖質、および特に寛解、予防、治療による腫瘍の処置の分野における、その生物学的、薬学的、および医学的適用、より特定すると、その免疫原適用に関する。
【０００２】
発明の背景
悪性細胞は、細胞の接着、浸襲および転移において機能的な重要性を有する分子をその表面に選択的に発現する。これらの腫瘍関連構造のいくつかは、グリコシル化経路の封鎖の結果である。特に、Ｏ−グリカン糖鎖の不完全な伸張は、Ｔｎ、シアリル−ＴｎまたはＴＦ抗原のようなより短い炭水化物構造の発現を導く（Hollingsworth and Swanson 2004）。セリンまたはトレオニン残基にα結合したＧａｌＮＡｃ単位（α−ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）として定義されるＴｎ抗原は、最も特異的なヒト腫瘍関連構造の１つである。Ｔｎはヒトガン腫の約９０％において検出され（Springer 1984）、そしてその発現はガン腫の攻撃性と相関している（Springer 1997）。さらに、適切な条件下では、Ｔｎはマウスおよび非ヒト霊長類において強い免疫応答を誘導することができ、生じた抗体はヒトガン細胞を認識することができる（Lo-Man et al. 2001, Lo-Man et al. 2004）。
このＯ結合型エピトープは通常ムチン上にその炭水化物コア構造として発現される（Hollingsworth and Swanson 2004）。ムチンは、上皮表面の防御、潤滑および酸耐性に関与する高分子量のＯ−グリコシル化タンパク質である（その質量の５０〜８０％はＯ結合型糖鎖に起因する）（Gendler and Spicer 1995）。今日までに、様々なムチンが同定され、そしてそれらの記載の年代順に番号付けされている（ＭＵＣ１〜ＭＵＣ２０）（Chen et al. 2004, Filshie et al. 1998, Gum et al. 2002, Higuchi et al. 2004, Moniaux et al. 2001, Pallesen et al. 2002, Williams et al. 2001, Yin and Lloyd 2001）。それらは配列の相同性を示さないが、全てのムチンはタンデム反復数（ＶＮＴＲ）から構成される大きな領域を示す。通常タンデム反復と呼ばれるこれらの領域は、セリン、トレオニン（これらは潜在的なＯ−グリコシル化部位を構成する）およびプロリン残基の高含量によって特徴付けられる。
各々の器官または組織はＭＵＣ遺伝子発現の特有のパターンを示す（Gendler and Spicer 1995）。このムチン発現プロフィールは、病理学的条件下で、そして特に悪性トランスフォーメーションの間に改変され得る。ムチンタンパク質のアップレギュレーション、ダウンレギュレーション、およびｄｅ  ｎｏｖｏ発現がガン上皮細胞において報告されており、そして細胞接着に影響を及ぼし（Hilkens et al. 1992）そして腫瘍の浸襲性に寄与する（Segal-Eiras and Croce 1997）と考えられている。さらに、これらの腫瘍関連ムチンは、正常ムチンとの抗原性の相違を示し、そして高度に免疫原性であり、それでそれらは免疫療法の潜在的な標的として使用され得る（Agrawal et al. 1998, Apostolopoulos et al. 1996）。特に、ＭＵＣ１は抗ガンワクチンとしていくつかの臨床試験を受けている（Finn et al. 1995, Gilewski et al. 2000）。
ＭＵＣ６は最初にヒト胃ライブラリーから単離され（Toribara et al. 1993）、そして正常な胃および胆嚢において高レベルで発現されており、回腸末端、右側結腸および子宮頸内膜においてより弱く発現されている（De Bolos et al. 1995, Ho et al. 1995, Reis et al. 2000, Toribara et al. 1993）。ＭＵＣ６は１６９アミノ酸（各５０７ｂｐ）のタンデム反復単位を有しており（Toribara et al. 1993）、そして最も短いＭＵＣ６アレルのサザンブロット分析によって、それらが少なくとも１５個の反復単位を含有していることが示されている（Vinall et al. 1998）。ＭＵＣ６遺伝子全体は局在化されそして同定されたが、全長ｃＤＮＡは完全には配列決定されていない（Rousseau et al. 2004）。胃組織におけるその正常発現に加えて、ＭＵＣ６はバレット腺ガンおよび化生（Guillem et al. 2000）、腸腺腫およびガン腫（Guillem et al. 2000）、肺ガン腫（Hamamoto et al. 2005, Nishiumi et al. 2003）、直腸結腸ポリープ（Bartman et al. 1999）および乳ガン腫（De Bolos et al. 1995, Pereira et al. 2001）において検出されているが、それぞれの正常組織においては発現されていない。いくつかの場合、ＭＵＣ６の発現は悪性の潜在性に関連した組織病理学の程度と相関することが報告されている（Bartman et al. 1999, Hamamoto et al. 2005, Nishiumi et al. 2003）。本発明者らは最近、ＭＣＦ７乳ガン細胞において、ＭＵＣ６が、Ｔｎ抗原を含有していることから、異常グリコシル化されていることを示した（Freire et al. 2005）。いくつかの研究により、ムチン上の炭水化物構造（コアＴｎ抗原を含む）が腫瘍関連構造の規定に重要であり得ることが示されている（Grinstead et al. 2003, von Mensdorff-Pouilly et al. 2005）。それゆえ、Ｔｎ−ＭＵＣ６複合糖質は、ガン免疫療法において使用されるべき魅力的な標的を表す。特異的抗Ｔｎ抗体応答は、ガン細胞を、その表面上に発現されているＴｎ抗原を通して標的化するはずである。さらに、ムチン特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化は、樹状細胞上のＦｃレセプターによる可溶性ＭＵＣ６−Ｔｎ免疫複合体の取り込みを通して促進されるはずである（Amigorena and Bonnerot 1999）。
【０００３】
しかし、先行技術はムチン−Ｔｎ複合糖質の容易な産生を可能にしない欠点を有していた。
【０００４】
先行技術のムチン−Ｔｎ複合糖質は：
−  天然の複合糖質、または
−  合成糖ペプチド
である。
【０００５】
天然のムチン−Ｔｎ複合糖質は生物学的供給源からの単離によって得られる（Podolsky 1985; Robbe et al. 2004）。そのような複合糖質は非常に少量でしか得ることができない。そのアポムチン骨格は完全なアポムチンタンパク質であり、これは多数の様々な炭水化物残基を保有している。天然のムチン−Ｔｎ複合糖質は、Ｔｎ、ｓＴｎおよびＴＦ抗原のみならず、多数の他の炭水化物残基も含有しており、その性質はそれらが由来する細胞の型、状況および状態に依存して変動する。
天然の抗原性複合糖質の調製は、さらに、多段階の面倒なそして／または時間のかかる精製に依存する。
【０００６】
他の先行技術のムチン−Ｔｎ複合糖質は合成ムチン−Ｔｎ糖ペプチドである。そのアポムチン骨格は数アミノ酸に限定される。
【０００７】
例えば、Kagan et al. 2005は、ＭＵＣ１またはＭＵＣ２糖ペプチドのＫＨＬ複合体を開示している。これらのＫＨＬ複合体のペプチド骨格はＭＵＣ１またはＭＵＣ２  ３２ａａペプチドであり、そしてこれらのペプチドをグリコシル化するために使用される酵素はＴ２および／またはＴ４  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼである。
そのような先行技術の糖ペプチドは、単独で使用した場合、免疫原性応答の誘導がさほど効率的ではない：それらは、その抗原性特性（ある場合）を発揮するために、ＫＬＨのようなタンパク質担体にコンジュゲーションすることを必要とする。その結果、免疫原としてこれまでに使用されたムチン由来の糖ペプチドは、実際、ＫＬＨ複合体である。
【０００８】
他の合成ムチン糖ペプチドが本発明者らによってFreire et al. 2005（Cancer Res. 65(17): 7880-7887）に記載されている。
Freire et al. 2005は、ＭＵＣ６−Ｔｎ糖ペプチド（ＧＴＴＰＰＰＴＴＬＫ；配列番号１４）、およびＭＵＣ１−Ｔｎ、ＭＵＣ２−Ｔｎ、ＭＵＣ５Ｂ−Ｔｎ糖ペプチドの産生を記載している。これらのムチン−Ｔｎ複合糖質のアポムチン骨格は９〜１２ａａのペプチドである（ＭＵＣ６−Ｔｎについては１０ａａ；ＭＵＣ１−Ｔｎについては９ａａまたは１１ａａ；ＭＵＣ２−Ｔｎについては１２ａａ；ＭＵＣ５Ｂ−Ｔｎについては１１；Freire et al. 2005の第7881頁を参照のこと）。
これらのムチン−Ｔｎ糖ペプチドは以下のいずれかによって産生される：
−  保護グリコシル化素材［Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（α−ＧａｌＮＡｃ（ＯＡｃ）３）−ＯＨ］をペプチド配列の適切な位置に使用する非常に高価な糖ペプチド合成方法（第7881頁の"Materials and Methods"節の"synthetic (glyco)peptides"と題された段落を参照のこと）、または
−  ＧａｌＮＡｃのアポムチンペプチド中への酵素的転移、ここで、ＭＣＦ−７ミクロソーム抽出物はｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ活性の供給源として使用され、そしてグリコシル化は逆相ＨＰＬＣによってモニタリングされる（第7881頁の"Materials and Methods"節の"Enzymatic transfer of GalNAc or Gal into MUC6 or MUC6-Tn, respectively"と題された段落を参照のこと；第7882頁のFigure 1も参照のこと）。
しかし、両方の方法は、９〜１２ａａのペプチドのグリコシル化に限定され、半調製（semi-preparative）量の産生（ｍｇ〜ｇ）を達成しない。
Freire et al. 2005は、ＫＬＨのようなタンパク質担体に結合されているにせよそうでないにせよ、これらのＭＵＣ６−Ｔｎ、ＭＵＣ１−Ｔｎ、ＭＵＣ２−Ｔｎ、ＭＵＣ５Ｂ−Ｔｎ糖ペプチドについての免疫化関連結果をさらに開示していない。
【０００９】
Ｔｎ抗原に基づいた抗腫瘍ワクチンをさらに開発するために、本発明者らはＴｎに基づくムチン複合糖質の調製のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的方法を提供し、そして新たなムチン糖ポリペプチドおよび新たな免疫原性組成物を記載する。これらは、先行技術の欠点を克服し、そして高度に効率的な免疫原性応答を誘導することができる。
【００１０】
本発明者らは、少なくとも半調製規模の量で高Ｔｎ密度のムチン複合糖質の産生を可能にする酵素的アプローチを開発した。
【００１１】
先行技術の合成糖ペプチドとは反対に、本発明のムチン複合糖質は、担体タンパク質の非存在下で使用した場合でさえ、免疫原性である。
【００１２】
本発明の免疫原性ムチン複合糖質は、天然の複合糖質とは、その炭水化物成分が不均一で可変性の組成を有しないという点で異なる。本発明の免疫原性ムチン複合糖質の炭水化物成分は厳密な組成を有している：アポムチン骨格のＳｅｒまたはＴｈｒ残基に直接的にＯ結合されている炭水化物部分の各々はＧａｌＮＡｃ部分である。
【００１３】
本発明者らの知る限り、これが、タンパク質担体なしで、Ｔｎ抗原を保有するムチン由来ポリペプチドでの免疫化後のヒト腫瘍細胞特異的抗体の誘導を報告する最初の成果である。
【００１４】
非常に有利な特徴として、本発明に従って産生されるムチン複合糖質は、特異的免疫原性効果である免疫原性効果を誘導する：ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に際して、本発明のムチン複合糖質は、Ｔｎ依存性機構を通してヒト腫瘍細胞を認識することができる抗体、有利にはＩｇＧ抗体、を誘導することができる。
【００１５】
発明の概要
Ｔｎ抗原に基づいた抗腫瘍ワクチンをさらに開発するために、本発明者らは、ムチン複合糖質、より特定するとＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の調製のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的方法を確立した。この目的のために、本発明者らは、少なくとも１つのＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４１、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ）を使用することによって、ムチンのセリンおよびトレオニン残基上へのＧａｌＮＡｃの酵素的転移を行った。
本発明の方法の有利な特徴として、特に反応混合物が複雑な組成を有する場合、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ（表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間）質量分析を使用して、ムチン上のコンジュゲーションをモニタリングする。
【００１６】
本発明による組換えムチンタンパク質のトランスグリコシル化方法は、出発タンパク質の１００％がグリコシル化種に変換されたので、非常に簡便かつ有効である。
【００１７】
さらに、高いグリコシル化率、すなわち高いＴｎ密度が達成される。
【００１８】
本発明者らの知る限り、Ｔｎ、ｓＴｎ、またはＴＦ以外の炭水化物部分を欠いた、Ｔｎ／ｓＴｎ／ＴＦグリコシル化組換えポリペプチドが、少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの使用によって、半調製量で得られるのは、これが最初である。
【００１９】
本発明者らの知る限り、これが、タンパク質担体なしで、Ｔｎ抗原を保有するムチン由来ポリペプチドでの免疫化後のヒト腫瘍細胞特異的抗体の誘導を報告する最初の成果である。
【００２０】
非常に有利な特徴として、本特許出願によって利用可能になった産物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に際して、Ｔｎ依存性機構を通してヒト腫瘍細胞を認識することができるＩｇＧ抗体を誘導することができる。
【００２１】
本発明者らの知る限り、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ（表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間）質量分析を使用して、特に混合物が複雑な組成を有する場合に、ムチン上のコンジュゲーションをモニタリングするのは、これが最初である。
【００２２】
本発明は、規定された炭水化物種（すなわち、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＴＦ抗原）の中から選択される１個または数個の炭水化物部分の組み込みによって、均一なムチン複合糖質を産生する方法、およびこの方法によって得られる均一なムチン複合糖質に関する。
本発明の複合糖質の炭水化物成分は、少なくとも１つのＴｎ、ｓＴｎ、またはＴＦ抗原からなり、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＴＦ以外の炭水化物部分を含まない。それゆえ、本発明の複合糖質は、天然の複合糖質よりも構造的にずっと均一である。
【００２３】
本発明はまた、そのアポムチン成分が少なくとも１つのムチンタンデム反復単位、またはその保存的フラグメントもしくは誘導体を含むアポムチンポリペプチドまたはタンパク質である、均一なムチン糖ポリペプチドまたはムチン糖タンパク質（ムチン−Ｔｎ、ムチン−Ｔ、またはムチン−ｓＴｎ）、ならびにそのような糖ペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸を含むおよび／またはそのような糖ポリペプチドもしくは糖タンパク質を発現するベクターおよび宿主細胞に関する。そのようなムチン糖ポリペプチドまたは糖タンパク質は、本発明の方法によって得ることができる。
【００２４】
本発明はまた、ムチン複合糖質を含み、そして免疫原性効果を誘導するためのタンパク質担体の存在を必要としない組成物、すなわち、医薬組成物、薬物、免疫原性薬物、ワクチンに関する。
本発明はまた、ムチン複合糖質の抗腫瘍適用に関する。
【００２５】
発明の詳細な説明
本出願において、用語「ムチン」、「アポムチン」、「Ｔｎ」は当該分野におけるそれらの通常の意味を有する。
より特定すると、ムチンは当業者によってセリンおよび／またはトレオニン残基における高度のＯ結合型グリコシル化を有する高分子量の糖タンパク質（Ｍ＞１０６）として定義される。ムチン型糖タンパク質は、Ｓ−Ｓ依存性結合によってさらに重合され、そして上皮分泌の主成分である。
２つの明らかに異なる領域が天然の成熟ムチンにおいて見出される：
・  アミノおよびカルボキシ末端領域は非常に軽度にグリコシル化されているが、システインに富んでおり、それはムチン単量体の内部および間でのジスルフィド結合の確立に関与しているようである。
・  半分までのアミノ酸がセリンまたはトレオニンである１０〜１７０残基の複数のタンデム反復から形成される大きな中央領域。この区域は数百のＯ結合型オリゴ糖で飽和される。Ｎ結合型オリゴ糖もまたムチン上に見出されるが、ずっと少量である。
本明細書における用語「アポムチン」は、その炭水化物成分に対して、ムチンのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド部分を指す。
Ｔｎ（Ｔ非依存性）抗原は、ムチンのアポムチン部分のＳｅｒまたはＴｈｒ残基にＯ結合したＮ−アセチルガラクトサミン炭水化物である。Ｔｎ抗原はＧａｌＮＡｃ−α１，Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒである。
【００２６】
本発明は、
−  天然の供給源からの単離によっては得られないが、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成方法によって得ることができ、そして
−  ヒト腫瘍細胞を認識する抗体、より特定するとＩｇＧ抗体を誘導することができる、
Ｔｎに基づくムチン複合糖質、より特定するとムチン−Ｔｎ複合糖質、および有機基の付加によってそれから直接誘導される複合糖質、例えばムチン−Ｔ複合糖質およびムチン−ｓＴｎ複合糖質を提供することの概念によって特に結び付けられる産物、方法、およびその適用に関する。
より特定すると、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、タンパク質担体の非存在下で、ヒト腫瘍細胞特異的抗Ｔｎ抗体、好ましくはヒト腫瘍細胞特異的抗Ｔｎ  ＩｇＧおよび／またはＩｇＡを誘導することができる。
本発明者らの知る限り、本発明は、タンパク質担体の非存在下で、そのような抗体、より特定するとそのようなＩｇＧの産生を誘導することができる、合成で産生されたムチン複合糖質の産生を可能にする手段の最初の記載を提供する。
本発明者らの知る限り、Ｔｎに基づくムチン複合糖質が半調製量で得られるのもまた、これが最初である。
【００２７】
従って、本発明の有利な特徴として、げっ歯類または非ヒト霊長類またはヒトへの投与に際して、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、ヒト腫瘍細胞、例えばJurkat細胞を認識する（すなわち、それに結合する）抗体、好ましくはＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体を誘導することができるが、一方同じであるがグリコシル化されていないムチンはそのようなＩｇ誘導をすることができない（下記実施例１を参照のこと、ここでＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）複合糖質の投与を、ミョウバン＋ＣｐＧ中の非グリコシル化ＭＵＣ６−２タンパク質の投与と比較している）。
【００２８】
本発明に従って誘導されるＩｇＧおよび／またはＩｇＡは、免疫化のために使用される複合糖質に対する（すなわち、その炭水化物成分、例えばＴｎ抗原、および／またはそのＭＵＣ骨格に対する）ものである。
誘導されるＩｇＧおよび／またはＩｇＡは、腫瘍細胞、より特定するとヒト腫瘍細胞、例えばヒト腫瘍細胞株Jurkat（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）を認識する（すなわち、それに結合する）（下記実施例１を参照のこと）。好ましくは、前記ヒト腫瘍細胞は乳腫瘍細胞、および／または膵臓腫瘍細胞、および／または腎臓腫瘍細胞、および／または胃腫瘍細胞、および／または前立腺腫瘍細胞、および／または卵巣腫瘍細胞、および／または腸腫瘍細胞、および／または肺腫瘍細胞、および／または結腸直腸腫瘍細胞である。
【００２９】
有利なことに、この腫瘍認識は、誘導される抗体（例えばＩｇＧおよび／またはＩｇＡ）が腫瘍細胞には結合するが、非腫瘍である以外は等価な細胞には結合しないという意味で特異的であることができる。
所定の複合糖質が腫瘍細胞を認識する抗体（例えば、ＩｇＧおよび／またはＩｇＡ）を誘導するかどうかの試験は、当業者の能力の範囲内である。
例えば（例えば、下記実施例１を参照のこと、図５も参照のこと）、試験すべき複合糖質をＢＡＬＢ／ｃマウス中にｉ．ｐ．注射することができる。前記複合糖質は、例えばミョウバン＋ＣｐＧ中で注射してもよく；次いでコントロールマウスにミョウバン中のＣｐＧのみを与える。血清を、免疫化後に集め、そしてＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳによって免疫化に使用した複合糖質に対するＩｇＧの存在について試験することができる。集めた血清を、フローサイトメトリーによって腫瘍細胞、例えばヒト腫瘍細胞株Jurkat（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）の認識について試験することができる。特異的認識は、集めた血清が非腫瘍細胞、例えば乳房細胞、および／または膵臓細胞、および／または、腎臓細胞、および／または胃細胞、および／または前立腺細胞、および／または卵巣細胞、および／または腸細胞、および／または肺細胞、および／または結腸直腸細胞を認識しないことを決定することによって評価することができる。
【００３０】
所望であれば、誘導される抗体（例えば、ＩｇＧおよび／またはＩｇＡ）を集めた血清から精製することができる。
【００３１】
先行技術のムチン複合糖質は、ＫＬＨのようなタンパク質担体に結合させる必要がある。それゆえ、ヒトにおける抗ガン免疫療法のためのその適用に関して制限を有している。担体分子に対する免疫応答は、産生された抗体の総量に比較して低レベルの所望の抗体を生じる。これは、ヘプテン分子に対する免疫応答の担体誘導性抑制を導き得る（Schutze et al. 1985）。
これらの先行技術の複合糖質とは反対に、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質はＫＬＨのようなタンパク質担体に結合させる必要がない。
さらに、先行技術のＫＬＨ結合複合体とは反対に、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質の構造および組成は、質量分析によって正確に決定することができる。この特徴は、ヒトにおける承認のための規制団体の要件を満たすために重要である。それによって、本発明は、先行技術の複合糖質よりも抗腫瘍ワクチン適用に特にずっと適合した化合物を提供する。
【００３２】
従って、本発明は、タンパク質担体の非存在下で、ヒト腫瘍細胞、例えばJurkat細胞を認識する抗体、好ましくはＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体を誘導することができる免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質に関する。より特定すると、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、ヒト腫瘍細胞特異的抗Ｔｎ抗体、好ましくはヒト腫瘍細胞特異的抗Ｔｎ  ＩｇＧを、タンパク質担体の非存在下で誘導することができる。
【００３３】
本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、アポムチン骨格に結合された少なくとも１つの炭水化物部分、好ましくは複数の炭水化物部分を含む。
これらの炭水化物部分の少なくとも１つは、アポムチン骨格のＳｅｒまたはＴｈｒ残基に直接的にＯ結合される。
本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質において、前記アポムチン骨格のＳｅｒまたはＴｈｒ残基に直接的にＯ結合される炭水化物部分の各々はＧａｌＮＡｃ部分である。
【００３４】
本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質のアポムチン骨格は、有利には、アポムチンタンパク質、または少なくとも１つのタンデム反復単位を保持しているアポムチンフラグメント、またはアポムチンタンデム反復単位の少なくとも１５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸のフラグメントを保持しているアポムチンサブフラグメントである。
好ましくは、前記フラグメントまたはサブフラグメントは、ヒト腫瘍細胞、例えばJurkat細胞を認識する抗体、より特定するとＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体を誘導する前記能力を保持している。
【００３５】
前記アポムチン骨格は、有利には、アポムチンタンパク質、またはアポムチンフラグメントもしくはサブフラグメントの保存的変異体であることができ、前記保存的変異体は、少なくとも１つのヒト腫瘍細胞、例えばJurkat細胞を認識する抗体、より特定するとＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体を誘導する前記能力を保持している。
【００３６】
前記アポムチン骨格は、有利には、少なくとも２つのアポムチンタンパク質、および／または少なくとも２つのアポムチンフラグメントおよび／またはサブフラグメントおよび／または変異体を含む、合成または組換え産生されたアポムチン骨格であることができる。そのようなアポムチン骨格は非常に有利である。なぜならそれが、様々な腫瘍の予防的および／または対症的および／または治癒的処置において有用であり得る、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質を導き得るからである。
前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質および／またはフラグメントおよび／またはサブフラグメントおよび／または変異体の各々は、同一の配列、または異なる配列を有することができる。
【００３７】
前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質および／またはフラグメントおよび／またはサブフラグメントの各々は、同じムチングループ（例えば、ＭＵＣ６、またはＭＵＣ３、またはＭＵＣ４、またはＭＵＣ５）に由来することができる。
前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質および／またはフラグメントおよび／またはサブフラグメントの各々は、異なるムチングループ（例えば、ＭＵＣ６およびＭＵＣ３、ＭＵＣ６およびＭＵＣ４、ＭＵＣ６およびＭＵＣ５、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４、ＭＵＣ４およびＭＵＣ５、ＭＵＣ３およびＭＵＣ５）に由来することができる。従って、前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質は、異なるムチングループに属するムチンのアポムチンであることができる。前記少なくとも２つのアポムチンフラグメントまたはサブフラグメントは、異なるムチングループに属するムチンのアポムチンフラグメントまたはサブフラグメントであることができる。
【００３８】
従って、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質のアポムチン骨格は以下：
ｉ．少なくとも１つのアポムチン、および／または
ｉｉ．少なくとも１つのアポムチンのフラグメントであって、前記少なくとも１つのフラグメントが少なくとも１つのアポムチンタンデム反復単位を含み、そして前記少なくとも１つのフラグメントが抗腫瘍抗体、例えばＩｇＧおよび／またはＩｇＡを誘導する前記能力を保持している、フラグメント、および／または
ｉｉｉ．少なくとも１つのアポムチンのサブフラグメントであって、前記少なくとも１つのサブフラグメントがアポムチンタンデム反復単位の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含み、そして前記少なくとも１つのサブフラグメントが抗腫瘍抗体、例えばＩｇＧおよび／またはＩｇＡを誘導する前記能力を保持している、サブフラグメント、および／または
ｉｖ．アポムチン、またはｉｉにおいて定義するフラグメント、またはｉｉｉにおいて定義するサブフラグメントの少なくとも１つの保存的変異体であって、前記少なくとも１つの保存的変異体の配列が前記アポムチン、またはフラグメント、またはサブフラグメントの配列と、該タンパク質またはフラグメントまたはサブフラグメントの配列の全長にわたって少なくとも７０％の同一性を有し、そして前記少なくとも１つの保存的変異体が抗腫瘍抗体、例えばＩｇＧおよび／またはＩｇＡを誘導する前記能力を保持している、保存的変異体
のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３９】
本発明の有利な実施態様によれば、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、ＫＬＨ、ＢＳＡ、オボアルブミン、またはチログロブリンのようなタンパク質担体（すなわち、免疫応答を刺激することができる抗原性構造、典型的にはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはハプテン）に結合されていない。
【００４０】
前記アポムチンは、当業者が適切であることを見出し得る任意のアポムチンまたは任意のアポムチンフラグメントもしくはサブフラグメントであることができる。
アポムチンは天然のムチンから単離することができ、あるいは公知のムチンのアポムチン、またはアポムチンフラグメントもしくはサブフラグメントの配列に従って合成することができる。従って、前記アポムチン、またはアポムチンフラグメントもしくはサブフラグメントは、天然の細胞から（細胞抽出物として、または精製によって）、または遺伝子操作された細胞から得ることができる。長さの短い骨格を化学合成してもよい。
【００４１】
今日までに、２０個のムチンが同定されている。
公知のムチンは特に以下を含む：ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１０、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１４、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１８、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０。
ＭＵＣ１〜ＭＵＣ２０の各々は、その中央領域に特徴的なタンデム反復単位を含む。
従って、前記アポムチン骨格は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１０、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１４、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１８、ＭＵＣ１９、またはＭＵＣ２０のアポムチンのフラグメントまたはサブフラグメントまたは変異体であることができる。
【００４２】
大部分のムチン、例えばＭＵＣ１およびＭＵＣ２は、偏在性の発現を有する。
本発明によれば、それゆえ、好ましいムチンは、腫瘍細胞に、より特に限定された、または特異的な発現のパターンを有するムチン、例えば、ＭＵＣ６、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４およびＭＵＣ５である。
例えば、ＭＵＣ６およびＭＵＣ５は乳房組織の腫瘍細胞によって発現されるが非腫瘍乳房細胞によっては発現されず、一方ＭＵＣ１は腫瘍および非腫瘍両方の乳房細胞によって発現される。ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ６は膵臓組織の腫瘍細胞によって発現されるが非腫瘍乳房細胞によっては発現されず、一方ＭＵＣ１は腫瘍および非腫瘍両方の膵臓細胞によって発現される。
ＭＵＣ４はさらにアポトーシスに関与する。
【００４３】
様々なムチン（より特定すると、ＭＵＣ６、ＭＵＣ４、ＭＵＣ３、ＭＵＣ５）のそれぞれの構造はHollingsworth and Swanson, 2004に記載されている（その内容を本明細書に参照により組み入れる）。Hollingsworth and Swanson, 2004の第48頁のBox 1は、ムチンのドメイン、より特定するとタンデム反復単位を記載している。
以下の表３は、いくつかのムチンのタンデム反復単位の例示的な配列を示す。
【００４４】
【表１】
2009523137.tif 000002
【００４５】
従って、前記アポムチンはＭＵＣ３、またはＭＵＣ４、またはＭＵＣ５アポムチンであることができる。
例えば、前記ムチンは、配列番号２８のＭＵＣ３タンデム反復単位、または配列番号２９のＭＵＣ４タンデム反復単位、または配列番号３０または３１、好ましくは配列番号３０（ＭＵＣ５ＡＣ）のＭＵＣ５タンデム反復単位を含むことができる。
【００４６】
本発明の非常に有利な特徴として、前記アポムチンはＭＵＣ６アポムチン、またはそのフラグメントもしくはサブフラグメントであることができる。
ＭＵＣ６アポムチンフラグメントを発現する遺伝子操作された細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉクローンＩ−３４９１およびＩ−３４９２であり、これらはブダペスト条約に従ってＣＮＣＭに２００５年８月１０日に寄託されている。
クローンＩ−３４９１は、下記実施例においてＭＵＣ６−１といわれるアポムチンポリペプチドフラグメントを発現する：これは乳ガン細胞株ＭＣＦ７からクローニングされ、そして乳ガンに関連している。
クローンＩ−３４９２は、下記実施例においてＭＵＣ６−２といわれるアポムチンポリペプチドフラグメントを発現する。
ＭＵＣ６のタンデム反復単位は１６９ａａの配列である。ＭＵＣ６タンデム反復単位の例示的な配列は、配列番号９、配列番号１２、配列番号６、配列番号７、配列番号１５のアミノ酸配列である（図１Ａ、１０Ａ、１０Ｂを参照のこと）。
【００４７】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、上記アポムチンの少なくとも１つのフラグメントまたはサブフラグメントを含む。それらはそのようなフラグメントまたはサブフラグメントのいくつかを含んでもよい。
【００４８】
本発明において、そのようなフラグメントまたはサブフラグメントは、上記ｉｉおよびｉｉｉにおいて定義されるとおりである。すなわち：
−  フラグメントは少なくとも１つのアポムチンタンデム反復単位を含み、そして抗腫瘍抗体、例えばＩｇＧおよび／またはＩｇＡを誘導する前記能力を保持しており、
−  サブフラグメントはアポムチンタンデム反復単位の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含み、そして抗腫瘍抗体、例えばＩｇＧおよび／またはＩｇＡを誘導する前記能力を保持している。
【００４９】
好ましくは、上記ｉｉｉ項において定義する前記少なくとも１つのサブフラグメントは、前記タンデム反復単位の少なくとも２０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも２２個の連続したアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２５個の連続したアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも３０個の連続したアミノ酸、なおより好ましくは少なくとも３５個の連続したアミノ酸を含む。
【００５０】
上記ｉｉｉ項において定義する前記少なくとも１つのサブフラグメントは、例えば、およそ半分のタンデム反復単位配列を含んでもよい（ただし、この半分のタンデム反復単位配列は少なくとも１５アミノ酸長である）。
例えば、ＭＵＣ６の場合、前記少なくとも１つのサブフラグメントは、ＭＵＣ６タンデム反復単位由来の少なくとも８５個の連続したアミノ酸を含んでもよい。例示的なサブフラグメント配列は配列番号１２の配列を含む（ＭＵＣ６−２、図１０Ｂを参照のこと）。
【００５１】
上記ｉｉｉ項において定義する前記少なくとも１つのフラグメントの配列は、アポムチンタンパク質のタンデム反復単位配列、例えば、ＭＵＣ６（例えば、配列番号９、配列番号６、配列番号７、または配列番号１５）、ＭＵＣ３（例えば、配列番号２８）、ＭＵＣ４（例えば、配列番号２９）、またはＭＵＣ５（例えば、配列番号３０または３１、好ましくは配列番号３０）のアポムチンのタンデム反復単位からなってもよい。
【００５２】
有利には、前記アポムチン骨格の配列はＭＵＣ６アポムチンであるか、またはＭＵＣ６アポムチンに由来する。
より特定すると、前記アポムチン骨格の配列は：
ａ．ＭＵＣ６アポムチン、または
ｂ．α．ＭＵＣ６アポムチンの少なくとも１つのタンデム反復単位を含むか、または
β．ＭＵＣ６アポムチンタンデム反復単位の少なくとも１つの保存的フラグメントであって、少なくとも３０のＳｅｒおよびＴｈｒ残基の数を保持している、保存的フラグメントを含む
ポリペプチドまたはタンパク質、または
ｃ．ＭＵＣ６アポムチン（ａで定義する）、またはｂで定義するポリペプチドまたはタンパク質の保存的アミノ酸変異体であって、前記保存的変異体の配列は以下：
−  タンデム反復単位配列の全長にわって、前記ＭＵＣ６タンデム反復単位含有アポムチンフラグメント（αで定義する）中に含有される前記少なくとも１つのタンデム反復単位の配列、または
−  保存的フラグメント配列の全長にわたって、ＭＵＣ６アポムチンタンデム反復単位（βで定義する）の前記保存的フラグメントの配列、
と少なくとも７０％の同一性を有し、そして
−  前記保存的変異体の配列が少なくとも３０のＳｅｒおよびＴｈｒ残基の数を保持している、保存的変異体、
であることができる。
好ましくは、ＭＵＣ６またはＭＵＣ６由来アポムチンポリペプチド骨格中に含有されるＳｅｒおよびＴｈｒ残基の最小数は、少なくとも３２、より好ましくは少なくとも３５、なおより好ましくは少なくとも３７、さらに好ましくは少なくとも４０、さらにより好ましくは少なくとも４５である。
【００５３】
本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、任意の所望のＯ−グリコシル化の％を有することができる。
グリコシル化されるべきアポムチン骨格が少数のＳｅｒおよびＴｈｒ残基を有する場合、非常に高いＧａｌＮＡｃ転移率、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、例えば１００％が達成され得る。
本発明の有利な特徴は、それが、複雑なポリペプチドまたはタンパク質骨格、例えばＭＵＣ６に由来するものの上での高Ｔｎ密度の達成を可能にする方法を記載することである。１６９アミノ酸のＭＵＣ６タンデム反復単位において、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基（＝潜在的Ｏ−グリコシル化部位）の総数は約８３である。本発明は、ＭＵＣ６またはＭＵＣ６由来骨格ほど複雑なポリペプチドまたはタンパク質骨格上での高グリコシル化率の達成を可能にする（下記実施例１を参照のこと）。
【００５４】
本発明によれば、アポムチン骨格、例えばＭＵＣ６またはＭＵＣ６由来骨格中に含有されるＳｅｒおよびＴｈｒ残基の総数の少なくとも４０％が、少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に直接的にＯ結合されることができる。
言い換えると、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質、例えば本発明のＭＵＣ６またはＭＵＣ６由来複合糖質中に含有されるＴｎ抗原の全体の密度（または本発明の糖ポリペプチドの炭水化物密度）は、少なくとも４０％である。
より好ましくは、ＧａｌＮＡｃ  Ｏ結合ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の前記総数は、少なくとも４１％、なおより好ましくは少なくとも４２％、さらにより好ましくは少なくとも４３％、さらに好ましくは少なくとも４５％である。
ＧａｌＮＡｃ  Ｏ結合ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の前記総数は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、さらにより好ましくは少なくとも５３％、なおさらにより好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも５７％であることさえできる。
本発明の方法はさらに、Ｔｎに基づくムチン複合糖質、例えばＭＵＣ６またはＭＵＣ６由来複合糖質の産生を可能にし、ここで、ＧａｌＮＡｃ  Ｏ結合ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の総数は、少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも６１％、なおさらにより好ましくは少なくとも６２％、さらに好ましくは少なくとも６５％である。
例えば、下記実施例に記載されるＭＵＣ６またはＭＵＣ６由来ムチン−Ｔｎ糖ポリペプチドは、４２％［ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（Ｔ１）］、５４％［ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）］、５８％［ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（ＭＣＦ７）］、および６４％［ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）］のＴｎ密度（＝ＧａｌＮＡｃ  Ｏ結合ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の％）を有する。
【００５５】
本発明の免疫原性のＴｎに基づくムチン複合糖質は、好ましくは少なくとも１つのＣＴＬエピトープをそのアポムチン骨格中に含む。
有利には、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質のアポムチン骨格中に含まれ得る前記アポムチンフラグメントまたはサブフラグメントは、少なくともＣＴＬエピトープを保持している。
本発明によれば、好ましいタンデム反復単位フラグメントは、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを保持しているものである。
ＣＴＬエピトープは当業者によって、例えば予測サイトhttp://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htmを使用して同定されることができる。
【００５６】
図１Ａに示す配列番号４のＭＵＣ６−１配列（Ｈｉｓタグを有するＭＵＣ６−１）において、ＣＴＬエピトープは特に以下の配列：
−  ３８位〜４６位（ＬＶＴＰＳＴＨＴＶ；配列番号１６）
−  ６６位〜７４位（ＧＴＩＰＰＰＴＴＬ；配列番号１７）
−  ７３位〜８１位（ＴＬＫＡＴＧＳＴＨ；配列番号１８）
−  ６７位〜７５位（ＴＩＰＰＰＴＴＬＫ；配列番号１９）
−  １２０位〜１２８位（ＥＶＴＰＴＳＴＴＴ；配列番号２０）
−  ４０位〜４８位（ＴＰＳＴＨＴＶＩＴ；配列番号２１）
−  ６８位〜７６位（ＩＰＰＰＴＴＬＫＡ；配列番号２２）
−  ３１位〜３９位（ＧＲＧＳＳＴＳＬＶ；配列番号２３）
を含む。
【００５７】
ＨｉｓタグなしのＭＵＣ６−１配列（図１０Ａに示す配列番号９）、ならびに図１Ａにおける配列番号６、配列番号７および配列番号１５に示すＭＵＣ６配列において、これらのＣＴＬエピトープは、それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号１５の：
−  ４位〜１２位；
−  ３２位〜４０位；
−  ３９位〜４７位；
−  ３３位〜４１位；
−  ８６位〜９４位；
−  ６位〜１４位；
−  ３４位〜４０位；
の範囲の配列に対応する。
【００５８】
図１Ａに示す配列番号５のＭＵＣ６−２配列（Ｈｉｓタグを有するＭＵＣ６−２）において、ＣＴＬエピトープは特に以下の配列：
−  ３８位〜４６位（ＬＶＴＰＳＴＨＴＶ；配列番号１６）
−  ６６位〜７４位（ＧＴＩＰＰＰＴＴＬ；配列番号１７）
−  ７３位〜８１位（ＴＬＫＡＴＧＳＴＨ；配列番号１８）
−  ６７位〜７５位（ＴＩＰＰＰＴＴＬＫ；配列番号１９）
−  ４０位〜４８位（ＴＰＳＴＨＴＶＩＴ；配列番号２１）
−  ６８位〜７６位（ＩＰＰＰＴＴＬＫＡ；配列番号２２）
−  ３１位〜３９位（ＧＲＧＳＳＴＳＬＶ；配列番号２３）
を含む。
ＨｉｓタグなしのＭＵＣ６−２配列（図１０Ｂに示す配列番号１２）において、これらのＣＴＬエピトープは：
−  ４位〜１２位；
−  ３２位〜４０位；
−  ３９位〜４７位；
−  ３３位〜４１位；
−  ６位〜１４位；
−  ３４位〜４０位；
の範囲の配列に対応する。
【００５９】
他の好ましい本発明のムチン複合糖質は、少なくとも１つのＣＴＬネオエピトープを保有するものである。実際、糖タンパク質、糖ポリペプチドおよび糖ペプチドは１個または数個のＭＨＣクラスＩＩ分子を結合することができ、そして炭水化物特異的なＣＴＬを誘導することができる（Haurum et al. 1994, Aurum et al. 1999, Abdel-Motal et al. 1996, Apostolopoulos et al. 2003, Glithero et al. 1999, Speir et al. 1999, Xu et al. 2004）。
【００６０】
本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、有機物質、例えばタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドまたは炭水化物であることができるが、アポムチンまたはアポムチンフラグメント（本明細書で定義する）またはＴｎ抗原以外である、少なくとも１つの物質をさらに含んでもよい。
そのような別の物質は、特に前記Ｔｎに基づくムチン複合糖質の産生における補助、および／またはサンプルにおけるその検出の補助、および／またはその生物学的効果の増加のために、実際有用であることが見出され、そして、当業者によって選択され得る。
前記Ｔｎに基づくムチン複合糖質は、例えば、サンプルからのその精製のために有用であることができる少なくとも１つの物質、例えばＨｉｓタグ配列（例えば、配列番号４または配列番号５の最初の３４個のＮ末端アミノ酸（図１Ａを参照のこと））を含んでもよい。
前記Ｔｎに基づくムチン複合糖質は、例えば、サンプル、特に生物学的サンプルにおける複合糖質の検出の助けとなる少なくとも１つの物質を含んでもよい。
前記Ｔｎに基づくムチン複合糖質は、例えば、少なくとも１つの精製および／または検出タグを含んでもよい。
前記Ｔｎに基づくムチン複合糖質は、例えば、宿主細胞からのその分泌のために有用であることができる少なくとも１つの物質、例えばシグナルペプチドを含んでもよい。
その生物学的効果を増加させるために、本発明のムチン複合糖質は、例えば、抗腫瘍剤である、および／または腫瘍細胞の標的化を補助する少なくとも１つの物質を含んでもよい。
本発明のムチン複合糖質は、直鎖状ペプチド骨格、環状ペプチド骨格、多価ペプチド骨格を有することができる。それらは脂質（パルミトイル残基として）、リジンデンドリマー（例えば、ＭＡＧ骨格、EP 969 873を参照のこと）を含むことができる。
【００６１】
本発明はタンパク質担体の非存在下で抗原性であるムチン複合糖質の産生を可能にするが、当業者はもちろん、特定の状況下で、Ｔｎに基づくムチン複合糖質をそのようなタンパク質担体と結合させるかそうでなければ会合させることが適切であるかまたは助けになることを見出し得る。それゆえ、そのような担体結合複合糖質は、本発明の範囲内に含まれる。
しかし、本発明の好ましい実施態様は、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質がいかなるタンパク質担体（例えば、ＫＬＨ）も含まないことである。
【００６２】
本発明はまた、前記直接的にＯ結合されたＧａｌＮＡｃ以外の少なくとも１つの他の炭水化物基の付加によって、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質から誘導することができるムチン複合糖質に関する。
Ｔｎに基づくムチン複合糖質は、より特定すると、前記直接的にＯ結合されたＧａｌＮＡｃ部分の少なくとも１つに結合された少なくとも１つの炭水化物部分を含んでもよい。
【００６３】
そのような誘導可能なムチン複合糖質は、特に、ムチン−ｓＴｎ複合糖質（例えば、ムチン−ｓＴｎ糖ポリペプチド複合体）、およびムチン−Ｔ複合糖質（例えば、ムチン−Ｔ糖ポリペプチド複合体）を含む。
【００６４】
実際、シアリルトランスフェラーゼは、Ｔｎ抗原をシアリル基を用いて伸張して、シアロシル−Ｔｎ、またはシアリル−Ｔｎ、（ｓＴｎ）抗原（ＮｅｕＡｃ−α（２−６）−ＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を形成し得る。この抗原の発現は、発ガンの過程の間に頻繁に誘導される。
【００６５】
Ｔ（またはＴＦ、Thomsen-Friedenreich）抗原は、タンパク質にＯ結合されたムチン二糖：Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃ−α１，Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒによって定義される。Ｔｎ（Ｔ陰性）抗原はＧａｌＮＡｃ−α１，Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒである。従って、Ｔｎのβ１，３−ガラクトシル化がＴエピトープを生じる。
従って、本発明は、ムチン−Ｔ複合糖質への直接的な接近を提供する。これは、本明細書に記載されるＴｎに基づくムチン複合糖質の（少なくとも１つの）β１，３−ガラクトシル化によって得られる。
【００６６】
従って、前記少なくとも１つの他の炭水化物基は：
−  シアリル基（シアリル−Ｔｎ）、例えばＮｅｕ５Ａｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）、Ｎｅｕ５Ｇｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ＫＤＮ、またはそれらの直接的な誘導体、例えば、Ｎｅｕ２ｅｎ５Ａｃ、Ｎｅｕ２ｅｎ５Ｇｃ、ＫＤＮ２ｅｎ；または
−  Ｇａｌ
を含んでもよくまたはそれであってもよい。
【００６７】
従って、前記少なくとも１つの他の炭水化物基は：
−  シアリル基（シアリル−Ｔｎ）、例えばＮｅｕ５Ａｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）、Ｎｅｕ５Ｇｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ＫＤＮ、またはそれらの直接的な誘導体、例えば、Ｎｅｕ２ｅｎ５Ａｃ、Ｎｅｕ２ｅｎ５Ｇｃ、ＫＤＮ２ｅｎ；
−  Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、
−  Ｇａｌ、または
−  特に抗腫瘍適用のために、当業者が適切であることを見出し得る任意の炭水化物基、例えば、糖脂質、特にグリコシド抗原（酸性糖脂質、例えば、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３およびＧＭ３（メラノーマ）ならびに中性糖脂質、例えば、Ｌｅｗｉｓ．ｓｕｐ．ｙ（Ｌｅ．ｓｕｐ．ｙ）（乳房、前立腺、卵巣）およびＧｌｏｂｏ  Ｈ（乳房、前立腺、卵巣）抗原を含む）
を含んでもよくまたはそれであってもよい。
【００６８】
本発明は、より特定すると、前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ結合炭水化物部分がＧａｌＮＡｃ部分、シアリル基、またはガラクトース部分であるＴｎに基づくムチン複合糖質に関する。
【００６９】
本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は、その骨格中に１つより多いアポムチン、またはアポムチンフラグメントもしくはサブフラグメントを含んでもよい。そのようなＴｎに基づくムチン複合糖質は、様々な腫瘍病理学の予防的および／または対症的および／または治癒的処置へ適用されるという利点を有する。
【００７０】
従って、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質は：
−少なくとも２つのアポムチン、および／または
−少なくとも２つの本明細書において定義する（上記ｉｉを参照のこと）フラグメント、および／または
−少なくとも２つの本明細書中ｉｉｉにおいて定義するサブフラグメント、および／または
−少なくとも１つのアポムチン、および少なくとも１つの本明細書中ｉｉにおいて定義するフラグメント、および／または
−少なくとも１つのアポムチン、および少なくとも１つの本明細書中ｉｉｉにおいて定義するサブフラグメント、および／または
−少なくとも１つの本明細書中ｉｉにおいて定義するフラグメント、および少なくとも１つの本明細書中ｉｉｉにおいて定義するサブフラグメント
の配列を含むアポムチン骨格を有してもよい。
有利には、前記アポムチン骨格中に含有される２つのエレメントの各々は異なるアポムチン、好ましくは異なるムチングループ（例えば、ＭＵＣ６およびＭＵＣ３、ＭＵＣ６およびＭＵＣ４、ＭＵＣ６およびＭＵＣ５、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４、ＭＵＣ３およびＭＵＣ５、ＭＵＣ４およびＭＵＣ５）のアポムチンに由来する。
【００７１】
前記アポムチン骨格中に含有される前記少なくとも２つのフラグメント、および／または前記少なくとも２つのサブフラグメント、および／または前記少なくとも１つのフラグメントおよび少なくとも１つのサブフラグメントの各々は、好ましくは異なるアポムチンのフラグメントまたはサブフラグメントである。
【００７２】
有利には、前記アポムチン骨格は、少なくとも２つのアポムチンタンパク質、および／または少なくとも２つの本明細書中ｉｉにおいて定義するフラグメント、および／または少なくとも２つの本明細書中ｉｉｉにおいて定義するサブフラグメントのアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記少なくとも２つのフラグメントまたはサブフラグメントの各々は、異なるアポムチン、さらに好ましくは異なるムチングループ（例えば、ＭＵＣ６およびＭＵＣ３、ＭＵＣ６およびＭＵＣ４、ＭＵＣ６およびＭＵＣ５、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４、ＭＵＣ３およびＭＵＣ５、ＭＵＣ４およびＭＵＣ５）のアポムチンのフラグメントまたはサブフラグメントである。
非常に有利な実施態様によれば、前記少なくとも２つのフラグメントの各々の配列は、アポムチンタンパク質のタンデム反復単位配列である。
【００７３】
本発明はまた、Ｔｎに基づくムチン複合糖質の産生のための方法を提供する。
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的合成である。
従って、本発明は、Ｔｎに基づくムチン複合糖質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生の方法に関する。これは、タンパク質担体の非存在下で、ヒト腫瘍細胞、例えばJurkat細胞を認識する抗体、より特定するとＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体を誘導することができるＴｎに基づくムチン複合糖質の産生を可能にする。非常に有利な特徴として、本発明の方法は、そのようなＴｎに基づくムチン複合糖質の少なくとも半調製規模の量（１００μｇより多く、好ましくはｍｇ量）での産生を可能にする。
本発明の方法は、少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を、タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドアクセプター中に含有されるＳｅｒまたはＴｈｒ残基上にｉｎ  ｖｉｔｒｏで転移することを含む。ここで、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転移は、少なくとも１つのＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ）を使用して酵素的に行われる転移である。
本発明の方法は、インタクトな細胞の活性を必要とせず；インタクトな細胞の存在を必要としない。
本発明の方法の実施の結果、前記アポムチン骨格のＳｅｒまたはＴｈｒ残基に直接的にＯ結合される炭水化物部分の各々がＧａｌＮＡｃ部分となる。
【００７４】
前記タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドアクセプターは、有利には、本明細書において定義するアポムチン骨格、すなわち、アポムチンタンパク質、または少なくとも１つのタンデム反復単位を保持しているアポムチンフラグメント、またはアポムチンタンデム反復単位の少なくとも１５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸のフラグメントを保持しているアポムチンサブフラグメントである。
好ましくは、前記フラグメントまたはサブフラグメントは、ヒト腫瘍細胞、例えばJurkat細胞を認識する抗体、より特定するとＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体を誘導する前記能力を保持している保存的フラグメントである。
【００７５】
前記タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドアクセプターは、有利には、アポムチンタンパク質、またはアポムチンフラグメントもしくはサブフラグメントの保存的変異体であることができ、前記保存的変異体は、少なくとも１つのヒト腫瘍細胞、例えばJurkat細胞を認識する抗体、より特定するとＩｇＧおよび／またはＩｇＡ抗体を誘導する前記能力を保持している。
【００７６】
前記タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドアクセプターは、有利には、少なくとも２つのアポムチンタンパク質、および／または少なくとも２つのアポムチンフラグメントおよび／またはサブフラグメントおよび／または変異体を含む、合成または組換え産生されたアポムチン骨格であることができる。
前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質および／またはフラグメントおよび／またはサブフラグメントおよび／または変異体の各々は、同一の配列または異なる配列を有することができる。
【００７７】
前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質および／またはフラグメントおよび／またはサブフラグメントの各々は、同じムチングループ（例えば、ＭＵＣ６、またはＭＵＣ３、またはＭＵＣ４、またはＭＵＣ５）に由来することができる。
前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質および／またはフラグメントおよび／またはサブフラグメントの各々は、異なるムチングループ（例えば、ＭＵＣ６およびＭＵＣ３、ＭＵＣ６およびＭＵＣ４、ＭＵＣ６およびＭＵＣ５、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４、ＭＵＣ４およびＭＵＣ５、ＭＵＣ３およびＭＵＣ５）に由来することができる。従って、前記少なくとも２つのアポムチンタンパク質は、異なるムチングループに属するムチンのアポムチンであることができる。前記少なくとも２つのアポムチンフラグメントまたはサブフラグメントは、異なるムチングループに属するムチンのアポムチンフラグメントまたはサブフラグメントであることができる。
【００７８】
本発明の方法においてタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドアクセプターとして使用されるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド骨格は、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド骨格と同じ特徴を有する。
本発明の産物に与えられる特徴は本発明の方法に適用される。
【００７９】
今日までに、１５個のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔが哺乳動物において同定されており、そしてファミリーの各メンバーの機能的プロフィールが確立されており、これらの酵素が異なる基質特異性のみならず特異的組織発現パターンも有していることが示されている（Cheng et al. 2004, Ten Hagen et al. 2003）。
本発明によれば、適切なｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔは、特に、腫瘍病理学に関与するものを含む。
有利なｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔは、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ６、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ７、およびｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３から選択される腫瘍関連ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを含む。
非常に有利なｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔは、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ３、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ６、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ７、およびｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３から選択される腫瘍関連ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを含む。
【００８０】
前記少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを、純粋なもしくは精製された形態で、または細胞抽出物の形態で提供することができる。
【００８１】
前記少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを、ガン細胞の酵素含有抽出物、例えばミクロソーム抽出物、またはタンパク質抽出物を提供することによって、またはそのような抽出物から精製されたｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを提供することによって、提供することができる。
当業者が適切であることを見出し得る任意のガン細胞を使用することができる。
好ましいガン細胞は、乳ガン細胞、例えば乳ガン細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２）、結腸、肺、卵巣、前立腺ガン細胞を含む。
【００８２】
前記少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔは、組換え産生されたｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ、例えば遺伝子操作された酵母細胞、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）株（例えば、Invitrogenから入手可能なＫＭ７１Ｈ株）、またはバキュロウイルスベクターによって感染された昆虫細胞による発現およびそれからの精製によって得られるｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔであることができる。
【００８３】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転移は、有利には、ＧａｌＮＡｃ転移の最大数に適したｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ量、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ量、およびインキュベーション時間の条件下で行われる。実際、最高のグリコシル化レベルを有するムチン複合糖質は、最高の免疫応答を与えそうに思われ、それゆえワクチン、特に抗腫瘍ワクチンの産生のために非常に有利な活性物質である。
【００８４】
ＭＵＣ６アポムチン（１６９ａａのタンデム反復単位を有する）ほど複雑なアポムチン骨格のためには、そのような至適条件は、特に、前記アポムチン１０μｇ当たり、少なくとも０．１μｇの量の前記ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ、またはそのようなｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを含有する細胞抽出物を提供することによる前記少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの提供を含む。
前記アポムチン１０μｇ当たりのｐｐＧａｌＮＡｃ−ＴまたはそのようなｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを含有する細胞抽出物の前記量は、好ましくは少なくとも０．２μｇ、さらに好ましくは少なくとも０．３μｇ、より好ましくは少なくとも０．４μｇ、なおより好ましくは少なくとも０．５μｇ、例えば２μｇ未満、好ましくは１．５μｇ未満、さらに好ましくは１μｇ以下である（これらの値の組み合わせから生じる任意の数値範囲が本明細書において明示的に包含される）。
所望であれば、いくつかのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ（好ましくはその混合物）を使用することができる。
【００８５】
ＭＵＣ６アポムチンほど複雑なアポムチン骨格のためには、そのような至適条件は、特に、前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃの、潜在的Ｏ−グリコシル化部位に比較してＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ０．５〜２当量のモル当量での提供を含んでもよい。
【００８６】
インキュベーション時間は反応物（アポムチンまたはアポムチンフラグメント、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ、ＵＤＧ−ＧａｌＮＡｃ）の量に依存する。
インキュベーション時間は少なくとも１０時間、好ましくは少なくとも２０時間、例えば少なくとも２４時間であることができる。
【００８７】
反応物、例えばＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを、さらに反応の過程の間に、例えば２４時間の反応の後に添加することができる。
【００８８】
前記ＧａｌＮＡｃ転移を、当業者に公知の任意の手段、例えばＨＰＬＣによってモニタリングすることができる。
本発明の非常に有利な特徴によれば、前記ＧａｌＮＡｃ転移はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってモニタリングされる。
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦは表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間である。
反応混合物が複雑な組成を有する場合（特に、１個または数個の反応物が生物学的抽出物、例えば１個または数個のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを含有する細胞抽出物として提供される場合）にＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は特に有利である。
【００８９】
本発明者らの知る限り、特に混合物が複雑な組成を有する場合に、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ（表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間）質量分析を使用して、ムチン上のコンジュゲーションをモニタリングするのは、これが最初である。
従って、本出願はまた、細胞抽出物を含有する混合物におけるＧａｌＮＡｃバイオコンジュゲーションの過程をモニタリングするための、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の使用に関する。
【００９０】
ＧａｌＮＡｃ転移が所望のレベルに達すると、所望であればそして／または必要であれば、得られるＴｎに基づくムチン複合糖質を反応混合物から精製することができる。
精製を、例えば、アフィニティカラムで（例えば、複合糖質がＨｉｓタグ付加されている場合は、Ni-NTAアガロース（Qiagen、Hilden、Germany）上の吸着）および／または逆相ＨＰＬＣによって行うことができる。
例えば、得られる複合糖質を、Ni-NTAアガロース（Qiagen、Hilden、Germany）を使用して精製し、次いでPerkin-Elmerポンプシステムを２３０ｎｍのＵＶ検出器とともに使用する逆相ＨＰＬＣに供することができる。カラムはSymmetry 300（商標）C18（５μｍ、３００Å、３．９×２５０ｍｍ）（Waters、France）であることができる。溶出を、流速１ｍＬ／分（３０分間にわたる）での水中０．１％トリフルオロ酢酸中１０〜６０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行うことができる。次いで、ピークを集めそして凍結乾燥することができる。次いで、このようにして得られる糖タンパク質を、ＡＡＡおよび質量分析によって特徴付けしてもよい。
【００９１】
下記の実施例１および２によって説明するように、至適ＧａｌＮＡｃ条件下でＭＵＣ６アポムチンフラグメントに対して本発明者らが行った全てのアッセイにおいて、出発ポリペプチドは全て複合糖質に変換された（１００％）。それゆえ、本発明の方法は、非常に高い産生効率を有する。
本発明者らの知る限り、Ｔｎグリコシル化組換えポリペプチドが半調製量で、少なくとも１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの使用によって得られるのは、これが最初である。
【００９２】
本発明の方法を任意の所望のＧａｌＮＡｃ転移％まで行うことができる。上記のように、コンジュゲーション反応をモニタリングするためにＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が好適に使用される。
本発明の方法の有利な特徴は、それが、Ｔｎ抗原の高い全体密度（＝高炭水化物密度）を有するＴｎに基づくムチン複合糖質の産生を可能にすることである。
グリコシル化すべき骨格が少数のＳｅｒおよびＴｈｒ残基を有する場合、もちろん非常に高いＧａｌＮＡｃ転移率、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、例えば１００％を達成することができる。
【００９３】
本発明の有利な特徴は、それがさらに、複雑なポリペプチド骨格、例えばＭＵＣ６由来のものの上での高Ｔｎ密度の達成を可能にすることである。ＭＵＣ６タンデム反復単位において、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基（＝潜在的なＯ−グリコシル化部位）の総数は約８３である。
本発明によれば、アポムチン骨格、例えばＭＵＣ６、ＭＵＣ６由来アポムチン骨格中に含有されるＳｅｒおよびＴｈｒ残基の総数の少なくとも４０％が、少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に直接的にＯ結合されることができる。
【００９４】
より好ましくは、ＧａｌＮＡｃ部分に直接的にＯ結合されるＳｅｒおよびＴｈｒ残基の数は、少なくとも４１％、なおより好ましくは少なくとも４２％、さらにより好ましくは少なくとも４３％、より好ましくは少なくとも４５％である。
前記ＧａｌＮＡｃ  Ｏ結合ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の数は、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の総数の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも５２％、さらにより好ましくは少なくとも５３％、なおさらにより好ましくは少なくとも５４％、さらに好ましくは少なくとも５７％であることさえできる。
本発明の方法はさらに、ＧａｌＮＡｃ  Ｏ結合ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の数が、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基の総数の少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも６１％、なおさらにより好ましくは少なくとも６２％、さらに好ましくは少なくとも６４％である、Ｔｎに基づくムチン複合糖質の産生を可能にする。
上記のＧａｌＮＡｃ％値からの２つの異なる値の組み合わせから生じる各々の％範囲が本発明によって明示的に包含される。
【００９５】
本出願はまた、本発明の方法によって得られるＴｎに基づくムチン複合糖質に関する。
【００９６】
本発明はまた、本発明のＴｎに基づくムチン複合糖質のアポムチンをコードする任意の核酸に関する。
前記コード配列は、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号１５のアポムチンポリペプチドフラグメントをコードすることができる（図１Ａを参照のこと）。
前記コード配列は、例えば、配列番号９または配列番号１２のアポムチンポリペプチドフラグメントをコードすることができる（図１０Ａおよび１０Ｂを参照のこと）。前記コード配列は、配列番号８または配列番号１１の配列であることができる（図１０を参照のこと）。
前記核酸はさらに、前記Ｔｎに基づくムチン複合糖質コード配列の３’末端に終止コドンを含んでもよい。
前記核酸はさらに、精製および／または検出タグ、例えばＨｉｓタグをコードする配列を含む。例えば、前記核酸は、配列番号４または配列番号５のＨｉｓタグ付加アポムチンポリペプチドフラグメントをコードすることができ（図１Ａを参照のこと）；それは例えば配列番号１０または配列番号１３の配列であってもよい（図１０Ａおよび１０を参照のこと）。
前記核酸は、リーダー配列（シグナルペプチドをコードする）をさらに含んでもよい。
【００９７】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明の核酸を含む任意のベクター、例えば複製起点、および少なくとも１つの本発明の核酸を含むプラスミドに関する。
好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。
【００９８】
本発明はまた、遺伝子操作の結果本発明によるＴｎに基づくムチン複合糖質を発現する、および／または本発明による少なくとも１つの核酸および／または本発明による少なくとも１つのベクターを含むように遺伝子操作されている任意の遺伝子操作された宿主細胞に関する。
そのような宿主細胞は、トランスフェクションされた宿主細胞、感染された宿主細胞、形質転換された宿主細胞であることができる。
そのような宿主細胞は、当業者が適切であることを見出し得る任意の宿主細胞であり得る。それは、例えば真核細胞（例えば、酵母、または哺乳動物細胞）、または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、またはバキュロウイルスによって感染された昆虫細胞であることができる。
本発明の有利な宿主細胞は、特に、ブダペスト条約の条件に従って２００５年８月１０日に寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３４９１および寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３４９２の下に寄託されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を含む。
【００９９】
従って、本発明はまた、本発明による宿主細胞によって発現される任意のＴｎに基づく複合糖質、例えば配列番号９または配列番号１２のＴｎに基づくムチン複合糖質に関する（図１０Ａおよび１０Ｂを参照のこと）。
【０１００】
本発明はまた、少なくとも１つのＴｎに基づくムチン複合糖質、および少なくとも１つのムチン、アポムチン、アポムチンフラグメント（本明細書で定義する）、Ｔｎ抗原、または炭水化物以外の物質を含む任意の化合物に関する。
本発明は、より特定すると、以下：
−  少なくとも１つの本発明によるＴｎに基づくムチン複合糖質、および
−  少なくとも１つの免疫グロブリン構造、または少なくとも１つの免疫グロブリンフラグメントであって、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、軽鎖、または重鎖である免疫グロブリンフラグメント
を含む可溶性免疫複合体に関する。
上記免疫複合体中に含有されるアポムチンフラグメントは、有利には、ＭＵＣ６のアポムチンのフラグメント、特にＭＵＣ６アポムチンのポリペプチドフラグメント（可溶性ＭＵＣ６−Ｔｎ免疫複合体）であることができる。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に際して、本発明によって利用可能になるムチン複合糖質は、ヒト腫瘍細胞をＴｎ依存性機構を通して認識することができる抗体、より特定するとＩｇＧ抗体を誘導することができるという有利な特徴を有する。
ＩｇＧ誘導は、免疫原性組成物または免疫原性薬物、およびワクチンが意図される場合、特に有用な特徴である。なぜなら、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、特に腫瘍または前腫瘍細胞に対する、効率的な免疫応答を得るために高度に有用であるからである。従って、ＩｇＧ誘導をすることができるという特徴は、本発明のムチン複合糖質、より特定するとムチン糖ポリペプチド複合体の非常に有利な特徴である。
【０１０２】
別の非常に有利な特徴として、本発明のムチン複合糖質はまた、タンパク質担体の非存在下で、そのような抗体（ＩｇＧを含む）の誘導をすることができる。それゆえ、免疫原性効率は、先行技術のムチン複合糖質と比較して改善される。
また、必要とされるタンパク質担体の非存在は、特に人間への投与が意図される場合に非常に有利である。
【０１０３】
従って、本出願は腫瘍細胞が関与する状態または疾患、例えば特にガン性または前ガン性状況または状態の予防および／または寛解および／または処置に関する。
【０１０４】
本発明の予防および／または寛解および／または処置の方法は、それを必要とする患者への本発明の産物の投与を含む。
【０１０５】
本発明はまた、そのような予防および／または寛解および／または処置のために意図されるアジュバント、組成物、医薬組成物、免疫原性組成物、薬物、免疫原性薬物、およびワクチンに関する。
本発明のアジュバント、組成物、医薬組成物、免疫原性組成物、薬物、免疫原性薬物、およびワクチンは、少なくとも１つの本発明の産物、すなわち以下の要素：
−  本発明によるＴｎに基づくムチン複合糖質、
−  本発明による核酸、
−  本発明によるベクター、
−  本発明よる遺伝子操作された宿主細胞、
−  本発明による可溶性免疫複合体、
−  本発明によるＴｎに基づくムチン複合糖質
の少なくとも１つを含む。
【０１０６】
本発明のアジュバント、組成物、医薬組成物、免疫原性組成物、薬物、免疫原性薬物、およびワクチンは、少なくとも１つの薬学的および／または生理学的に許容可能なビヒクル（担体、希釈剤、賦形剤、添加剤、ｐＨ調整剤、乳化剤または分散剤、保存剤、界面活性剤、ゲル化剤、ならびに緩衝化剤および他の安定化剤および可溶化剤など）をさらに含んでもよい。
【０１０７】
適切な薬学的に許容可能なビヒクルおよび製剤は、全ての公知の薬学的に許容可能なビヒクルおよび製剤、例えば"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Mack Publishing Co.；および"Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Ansel, Popovich and Allen Jr., Lippincott Williams and Wilkinsに記載されるものを含む。
【０１０８】
一般に、担体の性質は用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、１つ以上の造影剤に加えて、薬学的および生理学的に許容可能な液体（水、生理食塩水、平衡塩類溶液、緩衝液、ブドウ糖水溶液、グリセロール、エタノール、ゴマ油、それらの組み合わせなどを含む）をビヒクルとして含む注射用液体を含む。媒質はまた、通常の医薬補助材料、例えば、浸透圧を調整するための薬学的に許容可能な塩、緩衝剤、保存剤などを含んでもよい。担体および組成物は無菌であることができ、そして製剤は投与様式に適する。
【０１０９】
固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル形態）については、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与すべき医薬組成物は、少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラートを含有することができる。
【０１１０】
組成物は液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤、または散剤であることができる。組成物は、従来の結合剤および担体、例えば、トリグリセリドを用いて処方することができる。
【０１１１】
本出願は、より特定すると、本発明の免疫原性組成物、免疫原性薬物、およびワクチンに関する。本発明の免疫原性組成物、免疫原性薬物、およびワクチンを治療および／または予防において使用することができる。
従って、本明細書において用語ワクチンは治療用および予防用ワクチンを包含する。
本発明の免疫原性組成物、免疫原性薬物、およびワクチンは、腫瘍または前腫瘍状況または状態の処置および／または予防および／または寛解のために意図され得る。
従って、本発明は、特に、本発明の抗腫瘍免疫原性組成物、抗腫瘍免疫原性薬物、および抗腫瘍ワクチンに関する。
本発明において、用語「腫瘍」は「ガン」を包含することを意味する。
そのような腫瘍状況または状態は、特に、任意の型のガン腫、腺腫、腺ガン、化生、または任意の型のガン、より特定すると、肺、乳房、腸管が罹患するかまたは罹患することができる腫瘍状況または腫瘍状態、なおより特定すると人間が罹患するかまたは罹患することができる腫瘍状況または腫瘍状態、例えば：
−  バレット腺ガン、
−  腸ガン腫および腺腫、
−  肺ガン腫、
−  直腸結腸ポリープ、
−  乳ガン腫、
−  膵臓、腎臓、胃、前立腺、卵巣、胆管ガン
を含む。
【０１１２】
ＡＴＣＣは、American Type Culture Collection ATCC; P.O. Box 1549; Manassas, VA 20108; U.S.A. である（http://www.lgcpromochem-atcc.com参照）。
ＣＮＣＭは、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; F-75724 PARIS CEDEX 15 ; Franceである（http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Cncm/参照）。
【０１１３】
用語「含む（comprising）」は「含む（including）」または「含有する（containing）」と同義であって、開かれており、そして追加の、記載されていない要素、成分または方法工程を排除せず、一方用語「からなる」は閉ざされた用語であって、明示して記載されていないいかなる追加の要素、工程、または成分も排除する。
用語「本質的にからなる」は部分的に開かれた用語であって、追加の要素、工程または成分が発明の基本的かつ新規な特性に著しくは影響しない限り、追加の、記載されていない要素、工程、または成分を排除しない。
従って、用語「含む」は用語「からなる」および用語「本質的にからなる」を含む。従って、本出願において、用語「含む」は、用語「からなる」および用語「本質的にからなる」をより特定して包含することを意味する。
【０１１４】
本明細書において引用する全ての参考文献の関連する開示の各々を具体的に本明細書に参照により組み入れる。以下の実施例は例示のために与えられるのであって、限定のためではない。
【０１１５】
実施例
実施例１：抗腫瘍ワクチン接種のためのＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の酵素的大規模合成
要旨
ガンにおいて、ムチンは異常にＯ−グリコシル化されており、その結果それらは腫瘍関連抗原、例えばＴｎ決定基（α−ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を発現する。それらはまた、正常組織と比較して異なる発現のパターンを示す。特に、ＭＵＣ６は正常には胃組織においてのみ発現されるが、腸、肺、結腸直腸および乳ガン腫において検出されている。最近、本発明者らの研究室は、ＭＣＦ７乳ガン細胞株がＭＵＣ６−Ｔｎ糖タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現することを示した。ガン関連ムチンは、正常ムチンとの抗原性の相違を示し、それでそれらは免疫療法の潜在的な標的として使用され得る。Ｔｎ抗原に基づいた抗ガンワクチンを開発するために、本発明者らはいくつかのＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質を調製した。この目的のために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｎ抗原合成を触媒するＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ）を使用することによって、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された２つの組換えＭＵＣ６タンパク質へのＧａｌＮＡｃの酵素的転移を行った。本発明者らは、ＭＣＦ７乳ガン細胞抽出物由来のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの混合物または組換えｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を使用した。両方の場合に、本発明者らは半調製規模（ｍｇ量）でのＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の合成を達成した。これらの糖タンパク質は高レベルのＴｎ抗原を示したが、全体の密度は酵素供給源およびタンパク質アクセプターの両方に依存する。これらのＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質は、ヒトガン細胞に特異的な２つの抗Ｔｎモノクローナル抗体によって認識された。さらに、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ供給源としてＭＣＦ７抽出物を使用してグリコシル化されたＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質は、ヒト腫瘍細胞株を認識するＩｇＧ抗体を誘導することができた。結論として、腫瘍関連グリコフォームを有するＭＵＣ６の多量の産生は、有効な抗ガンワクチンの開発を大いに有望にし、そしてそれらの免疫学的特性のさらなる研究が保障される。
【０１１６】
緒言
本実施例において、本発明者らは、ガン細胞のグリコシル化をより良く模倣するために、組換えｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１またはｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを含有するＭＣＦ７乳ガン細胞由来のミクロソーム抽出物を使用した。
本発明者らは、ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の調製のための本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的方法（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを使用することによる、ムチンのセリンおよびトレオニン残基上へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧａｌＮＡｃの酵素的転移）が非常に効率的であり、そして高炭水化物密度を有する半調製量の様々なＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の調製を可能にすることを示す。得られたＭＵＣ６複合糖質は、ヒトガン細胞に特異的な２つの抗Ｔｎモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による認識によって判断したところ、抗原性であることが示された。さらに、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ供給源としてＭＣＦ７抽出物を使用してグリコシル化されたＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質は、ヒト腫瘍細胞株を認識するＩｇＧ抗体を誘導することができた。
【０１１７】
結果
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭＵＣ６組換えタンパク質産生およびＴｎ発現ＭＵＣ６ムチンの酵素的合成
半調製量のＴｎ発現ＭＵＣ６糖タンパク質を得るために、本発明者らは、ＭＣＦ７乳ガン細胞株からクローニングし、そして：
−  全体のタンデム反復単位（ＭＵＣ６−１；配列番号４のタンパク質配列、ここで最初のＮ末端３４ａａはＨｉｓタグ配列であり、そして続く１６９ａａはＭＵＣ６タンデム反復単位の配列である）、または
−  半分のタンデム反復（ＭＵＣ６−２；配列番号５のタンパク質配列、ここで最初のＮ末端３４ａａはＨｉｓタグ配列であり、そして続く８５ａａは半分のＭＵＣ６タンデム反復単位の配列である）
を含有する２つの組換えＭＵＣ６タンパク質を設計した；
図１Ａを参照のこと。
【０１１８】
異なる数の潜在的Ｏ−グリコシル化部位を有する（ＭＵＣ６−１については８５個、ＭＵＣ６−２については４８個）異なる大きさの２つの関連するタンパク質のグリコシル化を研究するために、これら２つの異なる構築物を選択した。わずかなアミノ酸変化が２つのクローニングされたＭＵＣ６  ｃＤＮＡおよび報告された胃組織からクローニングされたＭＵＣ６  ｃＤＮＡ（配列番号６および配列番号７はＴＲ１およびＴＲ２と一致）（Toribara et al. 1993）の間で検出された（図１Ａ中のアラインメントを参照のこと）。このことは、ムチンタンデム反復において見出される高い多型に起因し得る。
ＭＵＣ６−１およびＭＵＣ６−２ポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そしてNi-NTAアガロースを使用して精製した（図１ＢおよびＣ）。
ＭＵＣ６−１を産生するＥ．ｃｏｌｉクローンおよびＭＵＣ６−２を発現するＥ．ｃｏｌｉクローンは２００５年８月１０日にＣＮＣＭにそれぞれアクセッションナンバーＩ−３４９１およびＩ−３４９２の下に寄託されている。
ＭＵＣ６−１については、Ｃ１８カラムを使用した１つの追加の精製工程が必要であった（図１Ｂ）。その結果、精製ＭＵＣ６−１およびＭＵＣ６−２タンパク質が、＞９５％の純度レベルで（ＨＰＬＣによって評価）、培地１リットル当たりそれぞれタンパク質２ｍｇおよび３．４ｍｇの収率で得られた。
これらの精製ムチンタンパク質（ＭＵＣ６−１またはＭＵＣ６−２）を、組換えｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１またはＭＣＦ７細胞抽出物を使用することによって、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスグリコシル化反応に供した（図６）。反応を、分析規模で、様々な条件下で（インキュベーション時間、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ当量および酵素量）行った。転移の過程を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によってモニタリングし、そして最も高いＴｎ密度を与える反応パラメーターを選択した（下記実施例２を参照のこと）。ＭＵＣ６−Ｔｎの半調製規模の合成（約０．３〜３ｍｇ）を行うためにこれらの条件（下記表１を参照のこと）を使用した。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
上記表１において：
１：当量を全潜在的Ｏ−グリコシル化部位（すなわち、全セリンおよびトレオニン残基）に比較して表す
２：単離産物収率は、グリコシル化反応および得られた糖タンパク質の精製の後に得られた収率を指す。ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質をエンドトキシンレベルについて試験し、そしてそれは全ての場合で２ＥＵ／ｍｇ糖タンパク質より低いことが見出された
３：複合糖質の平均分子量およびＧａｌＮＡｃ数を中央ピークから算出した
４：得られたグリコシル化された部位の％を、タンパク質中のセリンおよびトレオニン残基の総数（ＭＵＣ６−１については８５、ＭＵＣ６−２については４８）（１００％）に比較しての各複合糖質について得られたＧａｌＮＡｃ数を考慮して算出した
５：同量のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ当量および酵素を反応の開始時、次いで２４時間目に添加した
【０１２１】
同じグリコシル化反応条件に再び供した後に、精製ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質はさらにグリコシル化されなかったので、最大のＧａｌＮＡｃ転移が達成された。得られた糖タンパク質をＨＰＬＣによって分析し（図２Ａおよび２Ｂ）、精製し、次いでＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって特徴付けした（図２Ｃおよび２Ｄ）。全てのアッセイにおいて、出発タンパク質は全て複合糖質に変換された。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳプロフィールは、タンパク質の異なるＧａｌＮＡｃグリコシル化レベルを示した（主要ピーク±３個のＧａｌＮＡｃ）（図２Ｃおよび２Ｄ）。同様の多分散が、タンパク質アクセプターおよび使用した酵素供給源にかかわらず、粗混合物および精製複合糖質について観察された。
【０１２２】
合成した複合糖質の物理化学的特徴付け
４つの異なるＭＵＣ６複合糖質を、この酵素的トランスグリコシル化によって合成し、そしてNi-NTAアガロースおよびＨＰＬＣによって精製した。次いで、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し（図３）、予想分子量における精製糖タンパク質の存在を確認した。ＭＵＣ６糖タンパク質は、ムチン骨格および使用した異なるｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ供給源に依存して異なるＴｎ含量を示した（表１）。ＭＣＦ７乳ガン細胞抽出物を使用した場合、アクセプターとして使用したムチンにかかわらず、平均５４〜５８％の潜在的Ｏ−グリコシル化部位がグリコシル化された（全分子量の３０〜３２％に相当）。ムチンタンパク質を精製ｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１によってグリコシル化した場合、異なるＴｎ密度が得られた。ＭＵＣ６−２はより少なくグリコシル化された（２０個のＧａｌＮＡｃ、全Ｏ−グリコシル化部位の４２％に相当）。他方、ＭＵＣ６−１は、潜在的Ｏ−グリコシル部位の６４％がグリコシル化されたので（５４個のＧａｌＮＡｃ）、ｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１によってずっとより多くグリコシル化された。
【０１２３】
ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質は抗Ｔｎ−ｍＡｂによって認識される
ＭＵＣ６糖タンパク質を抗Ｔｎ（８３Ｄ４）および抗Ｈｉｓ  ｍＡｂを使用するウエスタンブロッティングによって同定した（図４）。予想した通り、抗Ｈｉｓ  ｍＡｂは全てのＭＵＣ６タンパク質（非グリコシル化ＭＵＣ６を含む）を認識した（図４Ａ）。反対に、抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４はＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質を認識するのみであった（図４Ｂ）。
これらのＭＵＣ６複合糖質の抗原性を、ヒトガン細胞に対して惹起された２つの抗Ｔｎ  ｍＡｂ（ＭＬＳ１２８および８３Ｄ４）およびポリクローナル抗ＭＵＣ６血清を使用するＥＬＩＳＡによって分析した。図４Ｃ〜Ｄは両方の抗Ｔｎ  ｍＡｂが、異なる速度ではあるが、ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質を認識したが、一方対応する非グリコシル化ＭＵＣ６タンパク質は認識しなかったことを示す。抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４は同様にＭＵＣ６−１およびＭＵＣ６−２複合糖質を認識したが（図４Ｃ）、ＭＬＳ１２８は、最も低いＴｎ密度を有するＭＵＣ６−２：Ｔｎ（Ｔ１）複合糖質とのより低い反応性を示した（図４Ｄ）。全てのＭＵＣ６糖タンパク質および非グリコシル化ＭＵＣ６タンパク質は抗ＭＵＣ６血清によって異なって認識された（図４Ｅ）。非グリコシル化ＭＵＣ６タンパク質は、おそらく高度にグリコシル化されたタンパク質中のタンパク質骨格への接近可能性の欠如に起因して、ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質よりわずかに反応性であった。
【０１２４】
ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）複合糖質は腫瘍細胞を認識する抗体を誘導する
ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の１つの免疫原性を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ミョウバン＋ＣｐＧ中のＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）複合糖質または非グリコシル化ＭＵＣ６−２タンパク質を用いて免疫化し、そして血清をヒト腫瘍細胞株Jurkatを認識するその能力について試験した（図５）。コントロールマウスにはミョウバン中のＣｐＧのみを与えた。全てのＭＵＣ６糖タンパク質が非常に低いエンドトキシンレベル（＜２ＥＵ／ｍｇタンパク質）を示したことは注目に値する。ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）複合糖質を用いた免疫化はJurkatヒト腫瘍細胞株を認識するＩｇＧ抗体を誘導したが、非グリコシル化ＭＵＣ６−２タンパク質を用いた免疫化はそうではなかった（図５Ａ）。
これらの抗体がこの細胞上のＴｎ抗原を認識することを確認するために、本発明者らはアシアロ−ＯＳＭ（Ｔｎ抗原を保有する）または脱グリコシル化ＯＳＭを使用して阻害アッセイを行った。図５Ｂに示すように、アシアロ−ＯＳＭのみが、ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）を用いた免疫化の後に得られた血清および抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４（コントロールとして使用）によるJurkat細胞の認識を阻害した。対照的に、抗ＣＤ４抗体のJurkat細胞への結合は２つの場合のいずれにおいても影響されなかった（図５Ｂ）。これらの実験は、ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）がＴｎ＋腫瘍細胞を認識する抗Ｔｎ抗体を誘導することができることを明らかに示す。
【０１２５】
考察
ガン免疫療法の目的は、付随する自己免疫障害を引き起こすことなしにガン細胞に対する防御免疫を誘起することである。１つのアプローチは、ガン関連抗原による腫瘍特異的免疫応答の誘導に基づく。この目的のために、ムチンを、治療的抗腫瘍免疫を誘起するために設計されたワクチン中の免疫原として使用することができる。
ガン関連変化は、正常組織と異常組織との間のムチンタンパク質発現のみならず、ガンムチンを正常ンムチンから区別するＯ−グリコシル化のパターンにおいても生じる。実際、ムチンは正常には高度にグリコシル化されており、従って抗原性ペプチドコアは免疫系、特に抗体に物理的に接近不可能である。しかし、腫瘍細胞においては、ムチンはＯ結合型糖鎖のガン関連切断を示し、腫瘍特異的ＴＦ、Ｔｎおよびシアリル−Ｔｎ抗原を生じる（Hollingsworth and Swanson 2004）。このことは、そのようなグリコシル化ムチンが特定のガンの処置のための標的として使用できることを示唆する。
Ｔｎ構造に基づく種々のワクチンが開発され、そして前臨床または臨床モデルにおいて試験されている。脱シアル酸化ヒツジ顎下ムチン（高Ｔｎレベルを発現する）（Singhal et al. 1991）およびＴｎタンパク質複合体（Kuduk et al. 1998; Longenecker et al. 1987; US 2003/0083235 A1; Toyokuni et al. 1994; US 5,660,834）はマウスにおいて高いＴｎ特異的抗体力価を誘導し、腫瘍チャレンジに対する防御を生じた。ヒトにおいて、脱シアル酸化赤血球（ＴｎおよびＴ抗原に富む）は進行乳ガンの再発に対する防御を可能にした（Springer et al., 1993）。より最近に、Ｔｎタンパク質複合体を用いた臨床試験の結果、ＰＳＡ勾配の低下によって決定される抗腫瘍効果が生じた（Slovin et al., 2003）。本発明者らの研究室はまた、Ｔｎ抗原に基づく全合成ワクチン、ＭＡＧ（多抗原性糖ペプチド）の調製を報告した（Bay et al. 1997）。ＭＡＧ：Ｔｎワクチンは、マウスおよび非ヒト霊長類において、ヒト腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害性を媒介できる強い腫瘍特異的抗Ｔｎ抗体を誘導することができる（Lo-Man et al. 2004）。しかし、そのような複合体の大規模調製は、合成方法全体の複雑さによって制限されている。
本発明者らのアプローチの範囲を臨床試験にさらに拡張するために、本発明者らは、Ｔｎ抗原をムチンコアタンパク質に酵素的に付加することを提案する。本実施例において、本発明者らは、様々なガンにおいて異常に発現されており、そしてそれ自体が標的抗原を構成し得るＭＵＣ６ムチンを選択した。実際、ＭＵＣ６は、腸、肺、結腸および乳腺ガンにおいて検出されているが、それぞれの正常組織によっては発現されていない（Bartman et al. 1999, De Bolos et al. 1995, Guillem et al. 2000, Hamamoto et al. 2005, Nishiumi et al. 2003, Pereira et al. 2001）。さらに、本発明者らの予備的なデータは、ＭＣＦ７乳ガン細胞においてＭＵＣ６がＴｎ抗原を保有することを示唆する（Freire et al. 2005）。本実施例において、本発明者らは、Ｔｎ発現ＭＵＣ６複合糖質の酵素的合成を記載する。多量のＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質を産生するために、本発明者らは、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔを使用することによってＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された組換えＭＵＣ６タンパク質へのＧａｌＮＡｃの転移を行った。この大きなファミリーの酵素は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＧａｌＮＡｃ残基のセリンまたはトレオニンへの結合（すなわち、Ｔｎ抗原の合成）を触媒する。今日までに、１５個のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔが哺乳動物において同定されており、そしてファミリーの各メンバーの機能的プロフィールが確立されており、これらの酵素が異なる基質特異性のみならず特異的組織発現パターンも有することが示されている（Cheng et al. 2004, Ten Hagen et al. 2003）。
グリコシルトランスフェラーゼは、トランスグリコシル化反応を行うためのツールとして広く使用されている。なぜなら、それは大きなグリコシルアミノ酸の全化学合成に対する魅力的な代替であるからである（Marcaurelle and Bertozzi 2002）。Ｏ結合型グリカンを有する糖ペプチドおよび複合糖質の合成は、特にシアリル−Ｔｎ（George et al. 2001）およびシアリル−Ｔ抗原（Ajisaka and Miyasato 2000, George et al. 2001）について既に報告されている。ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔもまた、糖ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成のために首尾よく使用されている。研究の大部分は、ＭＵＣ１（Takeuchi et al. 2002）またはＭＵＣ２（Irimura et al. 1999, Kato et al. 2001）由来の種々のペプチド基質に対するこれらの様々な酵素（組換えまたは細胞抽出物由来）の特異性の研究を目指しており、そしてそれらは分析規模（０．１〜１０μｇの範囲）で行われた。しかし、興味深いことに、組換えｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ４は、免疫化目的に使用されたＭＵＣ１−Ｔｎ糖ペプチドの調製を可能にした（Kagan et al. 2005, Sorensen et al. 2005）。
本実施例において、本発明者らは、ＭＵＣ６組換えタンパク質のセリンおよびトレオニン残基への最大のＧａｌＮＡｃ転移を達成するために、ガン細胞抽出物由来のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔまたは精製組換えウシｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を使用した。これら２つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ供給源を２つの理由で選択した。
一方で、ガン細胞におけるＭＵＣ６のｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｏ−グリコシル化部位をより良く模倣するために、乳ガン細胞抽出物を使用した。
他方で、組換えｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は非常に広い特異性を有しており、そして精製組換えタンパク質を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化アッセイは、より再現性のある結果を与え、そしてより容易な精製を可能にすることが期待される。
実際、両方のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ供給源を使用して得られた産物収率は異なり、組換えｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を使用した場合、より高かった（ｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１についての５９〜６９％に対してＭＣＦ７抽出物についての２５〜３４％）。この差異は、ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質をＭＣＦ７細胞抽出物を含有する反応混合物から精製するために必要なさらなる追加の工程に起因する。
著しい進歩が複合糖質の合成において最近なされているが、この型の高分子への接近は、特に多くの量が必要である場合、非常に困難なままである。本発明者らの知る限り、Ｔｎグリコシル化組換えタンパク質がｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの使用によって半調製量で得られるのはこれが最初である。最大のＧａｌＮＡｃ転移のために最良の条件を選択することによって、本発明者らは、高密度のＴｎ抗原を保有するＭＵＣ６複合糖質を得た。これらの様々なＴｎ密度（ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）については５４個のＧａｌＮＡｃ、ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（ＭＣＦ７）については４９個のＧａｌＮＡｃ、ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（Ｔ１）については２０個のＧａｌＮＡｃ、およびＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）については２６個のＧａｌＮＡｃ）は、独立した再現性のある実験の結果である。酵素供給源に依存して、本発明者らは異なるＴｎレベルを有する複合糖質を産生した。このことは、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの特異性（全てのトレオニンおよびセリン残基が１つのｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔによって認識されるわけではない）によって説明され得る（Ten Hagen et al. 2203）。
本発明者らはまた、ＧａｌＮＡｃ転移がタンパク質の長さによって影響されるかどうかを評価するために、異なる大きさの２つのＭＵＣ６組換えタンパク質（ＭＵＣ６−１については２０３ａａ、ＭＵＣ６−２については１１９ａａ）のグリコシル化を調べた。組換えｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を使用した場合、本発明者らは、ＭＵＣ６−１およびＭＵＣ６−２についてそれぞれ８５個および４８個の潜在的Ｏ−グリコシル化部位（ＴｈｒおよびＳｅｒ残基の総数）のうち平均５４個および２０個の組み込まれたＧａｌＮＡｃ残基を得、これはＯ−グリコシル化部位の約６４％および４３％に相当する。構造研究は、これらの異なるグリコシル化率がｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１のムチンタンパク質中のアクセプター部位への接近可能性の欠如に起因するかどうかの決定の助けとなる。
ガンに対するワクチンの設計においてまず重要なのは、ワクチン中の抗原が腫瘍上の抗原を模倣することである。ガン細胞中に存在するネイティブなＴｎクラスターに近い構造を合成するために、本発明者らはまた、他のヒトガン細胞株について既に示されていたように、種々のｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔアイソフォームを発現し得るＭＣＦ７乳ガン細胞抽出物を使用したＧａｌＮＡｃ転移を行った（Freire et al. 2005, Mandel et al. 1999, Marcos et al. 2003）。この場合、同様なＧａｌＮＡｃ密度が得られ、潜在的Ｏ−グリコシル化部位の、ＭＵＣ６−１については４９個およびＭＵＣ６−２については２６個（それぞれ５８％および５４％に相当）であった。従って、精製組換えｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１およびＭＣＦ７細胞抽出物を用いて得られたグリコシル化の程度は異なり、そして驚くべきことに、Ｔｎ密度は後者の場合において必ずしもより高くはない。このことは、協調的かつ連続的に作用し、そしてタンパク質の全体のグリコシル化に正または負に寄与し得る細胞抽出物中の異なるｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔの存在によって説明され得る。
ガン細胞または組織に対して惹起された抗Ｔｎ抗体の大部分は、通常Ｔｎクラスターと呼ばれる隣接するＴｎエピトープの群を認識する。実際、８３Ｄ４およびＭＬＳ１２８抗Ｔｎ  ｍＡｂは、基質認識のために少なくとも２つの連続したＴｎ残基の存在を必要とする（Nakada et al. 1993, Osinaga et al. 2000）。ＭＵＣ６−１およびＭＵＣ６−２中のＴｈｒおよびＳｅｒ残基の２／３がクラスターに配列されていることを考慮すると、Ｔｎ抗原の大部分が、少なくとも、２つのＴｎのクラスターとして提示される可能性が高い。腫瘍免疫療法のためのＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の潜在的な関連性は、それらの抗原性の分析によって証明される。実際、ＭＵＣ６上のＴｎ抗原は、Ｔｎ特異的モノクローナル抗体、例えばＭＬＳ１２８および８３Ｄ４によって認識され、そしてＴｎクラスターの存在を確認する。様々なＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質中のグリコシル化部位を決定するためのＭＵＣ６タンパク質におけるＯ−グリコシル化の分析は進行中である。
例として、本発明者らはまた、ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の１つが免疫原性であることを示した。実際、ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）はＩｇＧ抗体をマウスにおいて誘導し、これはＴｎ依存性機構を通してヒト腫瘍細胞を認識することができた。本発明者らの知る限り、これが、タンパク質担体なしで、Ｔｎ抗原を保有するムチン由来タンパク質での免疫化後のヒト腫瘍細胞特異的抗体の誘導を報告する最初の成果である。実際、これまでに免疫原として使用されたムチン由来糖ペプチドは、ＫＬＨ複合体である（Kagan et al. 2005, Sorensen et al. 2005）。
結論として、ここに示す組換えムチンタンパク質のトランスグリコシル化方法は、出発タンパク質の１００％がグリコシル化種に変換されたので、非常に簡便かつ有効である。
さらに、高グリコシル化率が達成された。腫瘍関連グリコフォームを有する組換えＭＵＣ６を多量に産生する能力は無比のものであり、そして前臨床、免疫学および腫瘍防御研究のために非常に価値がある。ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の抗腫瘍効力は現在進捗中である。
【０１２６】
材料および方法
ＭＵＣ６のクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉにおける発現
ヒトＭＵＣ６の１つのタンデム反復を含有するｃＤＮＡクローンをＭＣＦ７乳ガン細胞の全ｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離し、そしてｐＧｅｍ−Ｔ（Promega, France）中にクローニングした。ＰＣＲ産物を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー：
−  ＭＵＣ６−Ｆ、５’−ｃｇｇｇａｔｃｃＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＣＴ−３’（配列番号１）、および
−  配列５’−ｇｇａａｇｃｔｔＴＴＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣＧＴＧ−３’（配列番号２）のＭＵＣ６−１Ｒ（ＭＵＣ６−１用）、または配列５’−ｇｇａａｇｃｔｔＡＴＴＡＧＧＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡ−３’（配列番号３）のＭＵＣ６−２Ｒ（ＭＵＣ６−２用）
（小文字はそれぞれフォワードおよびリバースプライマー中のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を示す）
を用いて増幅したヒトＭＵＣ６の１つのタンデム反復（ＭＵＣ６−１、１６９アミノ酸）または半分のタンデム反復（ＭＵＣ６−２、８５アミノ酸）をコードするように設計した。
【０１２７】
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化後、各産物をｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Novagen, Fontenay-sous-Bois, France）中に、Ｎ末端に６ヒスチジンテールを保有するタンパク質をコードするようにクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＡＴＣＣ  ５３８６８）形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢプレート上で選択し、そして陽性クローンをＰＣＲ配列決定によって確認した。
プラスミドを選択したクローンから精製し、そしてそれを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬｉ５化学的コンピテント細胞（Novagen, Fontenay-sous-Bois, France）を形質添加した。組換え体をＥ．ｃｏｌｉ  Ｂｌｉ５において１ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導によって発現させ、そしてＮｉ２＋−ニトリロ酢酸カラムで変性条件下で製造者（Qiagen, Germany）の説明書に従って精製した。ＭＵＣ６−１タンパク質を、Perkin-Elmerポンプシステムを２３０ｎｍのＵＶ検出器とともに使用するＨＰＬＣによってさらに精製した。カラムはSymmetry 300（商標）C18（５μｍ、３００Å、３．９×２５０ｍｍ）（Waters、France）であった。溶出を、流速１ｍＬ／分（３０分間にわたる）での水中０．１％トリフルオロ酢酸中１０〜６０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行った。ＭＵＣ６タンパク質をアミノ酸分析（ＡＡＡ）およびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって特徴付けした。これらの分析は、Ｎ末端配列決定とともに、両方のタンパク質がＮ末端メチオニン残基を欠いていることを示した。
【０１２８】
乳ガン細胞株抽出物
乳ガン細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２）を１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸、２ｍＭグルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Life Technologies, Inc., Cergy Pontoise, France）中５％ＣＯ２、３７℃で９０％コンフルエンスになるまで増殖させた。トリプシン処理の後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、２５０ｍＭスクロース中に再懸濁し、そしてホモジナイズした。次いで、細胞を３，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。得られた上清を再び１００，０００ｇで１時間４℃で遠心分離した。ペレットを０．１ＭイミダゾールｐＨ７．２および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に再懸濁した。細胞抽出物を小分けし、そして−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度をＢＣＡ法（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）によって決定した。
【０１２９】
組換えウシｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１
可溶性形態のウシｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（ｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１）を酵母ピキア・パストリスＫＭ７１Ｈ株（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）において発現させ、そして培養上清から精製した（Duclos et al. 2004を参照のこと）。
【０１３０】
可溶性形態のｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（アミノ酸５２〜５５９）のｃＤＮＡコード領域を、Ｎ末端６ＨｉｓタグおよびＣ末端ＦＬＡＧタグを導入するように改変したｐＰＩＣＺαＡ発現ベクター（Invitrogen）のα因子配列シグナルコード領域の３’側に導入した。ＫＭ７１Ｈ株をPichia EasyComp（商標）キット（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）を使用してコンピテントにし、そして製造者の説明書に従って形質転換した。０．５％メタノール中での１２０時間の誘導の後、分泌されたｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１をNi-NTAアガロース（Qiagen, Hilden, Germany）で記載のように（Duclos et al. 2004）精製した。酵素活性を含有する画分をプールしそして超純水に対して透析し、タンパク質を凍結乾燥しそして使用するまで−２０℃で貯蔵した。組換えｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の比活性を以前に記載されるように試験し（Duclos et al. 2004）、そして３Ｕ／ｍｇタンパク質と評価した（１単位は３７℃で１分間当たり１μｍｏｌのＧａｌＮＡｃをアクセプターペプチド［ＳＴＰ］５に転移する）。
【０１３１】
ＭＵＣ６タンパク質へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧａｌＮＡｃ転移
１．ＭＣＦ７抽出物の使用
両方のＭＵＣ６タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化のための至適条件を、様々なアッセイ条件を分析規模で試験し、そして得られた糖タンパク質を実施例２に記載のようにＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ciphergen Biosystems, California）によって特徴付けした後に選択した。簡潔に記載すると、ＭＣＦ７乳ガン細胞のミクロソーム抽出物を３７℃でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび精製ＭＵＣ６−１またはＭＵＣ６−２とともに１５ｍＭ  ＭｎＣｌ２および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する５０ｍＭイミダゾールｐＨ７．２中でインキュベーションした。アリコートを様々な時点で取り、そして−２０℃で凍結した。ＩＭＡＣ３０チップアレイの表面を１００ｍＭ  ＮｉＣｌ２を用いて室温で１５分間活性化し、次いで水およびＰＢＳで洗浄した。スポットを粗グリコシル化混合物のアリコートとともに４０分間室温でバイオプロセッサーアダプターを使用してインキュベーションし、次いでＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（２×５分間）、ＰＢＳ（３×２分間）および５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２×５分間）で洗浄した。次いで、チップを機器（Ciphergen ProteinChip Reader, PBS II）中で読み取り、そして各アレイスポットをレーザーサンプリングした。スペクトルをCiphergen ProteinChipソフトウェア3.2.1を使用して処理した。
その結果、以下の条件を選択し、そして半調製規模のグリコシル化転移アッセイのために使用した。精製ＭＵＣ６−１またはＭＵＣ６−２（４０〜８０μＭ）をＭＣＦ７抽出物（６μｇタンパク質／μｇムチン）およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（ムチン糖タンパク質中のＴｈｒ／Ｓｅｒ当量当たり２当量）とともに５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する５０ｍＭイミダゾールｐＨ７．２中３７℃でインキュベーションした。２４時間のインキュベーションの後、同量のＭＣＦ７抽出物およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを添加し、そしてさらに２４時間インキュベーションした。得られたＭＵＣ６−１：ＴｎまたはＭＵＣ６−２：ＴｎをNi-NTAアガロース（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して精製し、次いでPerkin-Elmerポンプシステムを２３０ｎｍのＵＶ検出器とともに使用する逆相ＨＰＬＣに供した。カラムはSymmetry 300（商標）C18（５μｍ、３００Å、３．９×２５０ｍｍ）（Waters、France）であった。溶出を、流速１ｍＬ／分（３０分間にわたる）での水中０．１％トリフルオロ酢酸中１０〜６０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行った。ピークを集め、次いで凍結乾燥した。ＭＵＣ６−１：ＴｎおよびＭＵＣ６−２：Ｔｎ糖タンパク質を、ＡＡＡおよび質量分析によって特徴付けした。
２．ｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の使用
ｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を使用するＧａｌＮＡｃ転移の至適半調製条件を、ＭＣＦ７抽出物について記載したようにCiphergen（登録商標）技術を使用して設定した。ＭＵＣ６−１またはＭＵＣ６−２精製タンパク質（４０〜８０μＭ）を３７℃で２４時間ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（ムチン糖タンパク質中のＴｈｒ／Ｓｅｒ当量当たり２当量）およびｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（０．１μｇ／μｇムチン）とともに１５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有する５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５中でインキュベーションした。得られたＭＵＣ６−１：ＴｎまたはＭＵＣ６−２：Ｔｎを逆相ＨＰＬＣに直接供し、そして上記で説明したように精製した。ピークを集め、凍結乾燥し、そしてＡＡＡおよび質量分析によって特徴付けした。
【０１３２】
抗体
Ｔｎ抗原を特異的に認識する（Osinaga et al. 2000）ｍＡｂ  ８３Ｄ４（ＩｇＭ）（Pancino et al. 1991）を、侵襲性ヒト乳ガンのホルマリン固定パラフィン包埋切片から得た細胞懸濁物を用いて免疫化したマウスから産生した（Pancino et al. 1990）。次いで、これを鉱質除去水に対する４℃での透析によって腹水から沈殿させ、少量のＰＢＳ中０．５Ｍ  ＮａＣｌ中に溶解し、そしてSephacryl S-200でのゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。
抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ＭＬＳ１２８（ＩｇＧ１）（ＭＬＳ１２８  ｍＡｂ（ｐ５０）： Numata et al. 1990）をヒト結腸ガン細胞（ＬＳ１８０）（Numata et al. 1990）を用いて免疫化したマウスから得、そしてプロテインＡ−Sepharoseでのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。両方の抗Ｔｎ  ｍＡｂは、クラスターに構成されたＴｎ残基を認識する（Nakada et al. 1993, Osinaga et al. 2000）。
ＭＵＣ６−２抗血清を、ミョウバン（１ｍｇ）およびＣｐＧ（１０μｇ）中の精製ＭＵＣ６−２（下記参照のこと）１０μｇでのＢＡＬＢ／ｃマウスの注射によって得た。マウスに０日目、２１日目および４２日目にｉ．ｐ．注射し、そして２０日目、２８日目および４９日目に放血した。ＭＵＣ６−１およびＭＵＣ６−２に対するＭＵＣ６−２抗血清の反応性をＥＬＩＳＡアッセイによって確認し、そして血清を−２０℃で使用するまで貯蔵した。
【０１３３】
抗Ｔｎ  ｍＡｂおよび抗ＭＵＣ６血清によるＭＵＣ６−１：ＴｎおよびＭＵＣ６−２：Ｔｎの認識
マイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）をｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した糖タンパク質（０．１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、そして一晩乾燥させた。プレートをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ／Ｔ）で３回洗浄し、そして非特異的結合部位をＰＢＳ中１％ゼラチン（ＰＢＳ／Ｇ）で２時間３７℃でブロッキングした。洗浄後、抗Ｔｎ  ｍＡｂ（８３Ｄ４もしくはＭＬＳ１２８）またはポリクローナル抗ＭＵＣ６血清を添加し、そして２時間３７℃でインキュベーションした。ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した後、プレートをＰＢＳ／ＴＧ中で希釈したヤギ抗マウスＩｇＭまたは抗ＩｇＧペルオキシダーゼ複合体（Sigma, St. Louis, Mo）とともに１時間３７℃でインキュベーションした。プレートをｏ−フェニレンジアミン／Ｈ２Ｏ２を使用して発色させ、そしてＥＬＩＳＡオートリーダー（Dynatech, Marnes la Coquette, France）中４９２ｎｍで測光法で読み取った。
【０１３４】
ＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質のウエスタンブロット分析
ＭＵＣ６−Ｔｎ糖タンパク質を、抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（Qiagen, Hilden, Germany）および抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４を使用するウエスタンブロッティングによって分析した。複合糖質を１３％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動中で分離し、そしてニトロセルロースシート（Amersham, Saclay, France）に３０Ｖで一晩２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１９２ｍＭグリシン、１０％エタノールで既に記載されるように移した（Towbin et al. 1992）。残存するタンパク質結合部位を、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との３７℃で２時間のインキュベーションによってブロッキングした。次いで、ニトロセルロースを抗Ｈｉｓ  ｍＡｂまたは抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４とともに２時間３７℃でインキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで３回洗浄した後、メンブランを１時間室温で０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および１．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたヤギ抗マウス免疫グロブリン（Sigma, St. Louis, Mo）とともにインキュベーションし、そして反応を増感化学発光（ＥＣＬ）（Amersham, Saclay, France）を用いて発色させた。ネガティブコントロールとして、同じ手順を抗体を省略して行った。
【０１３５】
エンドトキシンレベルの決定
エンドトキシンレベルを全てのグリコシル化および非グリコシル化ＭＵＣタンパク質において製造者の説明書に従ってLimulus Amebocyte Lysate QCL-1000キット（Cambrex, France）を使用して決定した。
【０１３６】
マウスの免疫化
６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをJanvier（Le Genest Saint-Isle, France）から購入した。マウスに、ミョウバン（１ｍｇ）（Serva, Heidelberg, Germany）＋ＣｐＧ（１０μｇ）（Proligo, France）と混合したＭＵＣ６−２またはＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）（１０μｇ）を３週間間隔で３回ｉ．ｐ．注射した（１群当たり５匹のマウス）。コントロールマウスにミョウバン＋ＣｐＧのみを与えた。血清を各免疫化後に集め、そして抗ＭＵＣ６および抗Ｔｎ抗体の存在についてＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって試験した。
【０１３７】
フローサイトメトリー
マウスの血清を、１：５００希釈で、ヒト腫瘍細胞株Jurkat（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）に対するフローサイトメトリーによって試験した。細胞をまず、１５分間血清とともに４℃で５％ウシ胎児血清および０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中でインキュベーションした。次いで、細胞を１５分間ＰＥにコンジュゲーションした抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Caltag, Burlingame, CA）とともにインキュベーションした。パラホルムアルデヒド固定した細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）で分析し、そして分析をCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて行った。阻害アッセイについては、細胞を、アシアロ−ＯＳＭ［ヒツジ顎下ムチン］または脱グリコシル化ＯＳＭ（Tettamanti G, Pigman W. (1968), Mendicino J, Sangadala S. (1998)、Freire T, Casaravilla C, Carmona C, Osinaga E. (2003)に以前に記載されたように調製した）の段階希釈物とまず混合した血清とともに１５分間４℃でインキュベーションした。次いで、抗体の細胞への結合を、ＰＥにコンジュゲーションした抗マウスＩｇＧヤギ抗体を使用して示した。抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４をポジティブコントロールとして使用した。抗ＣＤ４  ｍＡｂ（Caltag, Burlingame, CA）もまた、このｍＡｂの細胞への結合がＯＳＭタンパク質によって影響されないことを確認するために使用した。
【０１３８】
実施例２：方法の至適化のための表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）による酵素的コンジュゲーション反応の効率的なモニタリング
要旨
バイオコンジュゲーション反応の効率的な分析は、多量の複合体の再現性のある産生を至適化しそして最終的に達成するための最も挑戦的な仕事の１つである。特に、いくつかの反応混合物の複雑さは、多量の混入物の存在のために、既存の方法の大部分の使用を妨げる。代替の方法として、本発明者らは表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）をＮ−アセチルガラクトサミン残基の組換えムチンタンパク質ＭＵＣ６へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的トランスグリコシル化をモニタリングするために使用した。ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ）によって触媒されるこの反応のために、本発明者らは組換えｐｐＧａｌＮＡｃＴ１またはＭＣＦ−７腫瘍細胞抽出物中に含有されるｐｐＧａｌＮＡｃＴの混合物を使用した。
本実施例において、本発明者らは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳが従来の方法を上回る特有の利点を与えることを示す。これは、細胞抽出物のような不均一なサンプル中でさえも、バイオコンジュゲーションの過程をモニタリングするための、迅速で、正確で、感度が良く、再現性のあるそして非常に簡便な分析方法である。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、トランスグリコシル化の反応パラメーターを至適化し、そして抗腫瘍免疫療法適用のためのＴｎ抗原グリコシル化ムチンの大規模調製を達成するために非常に有用であることが判明した。
【０１３９】
緒言
バイオコンジュゲーション技術は生命科学研究のほぼ全ての分野において広く使用されている（Niemeyer et al. 2004, Hermanson 1996）。適用領域の１つは免疫化目的、抗体産生およびワクチン研究のためのハプテン担体複合体の調製である。実際、炭水化物のような小さなハプテン分子は単独で効率的な免疫応答を誘起することができない。それらを免疫原性にするために、それらを適切な担体分子、典型的にはタンパク質に結合しなければならない。
得られる複合体の特徴は、免疫応答の強度および質において重大な役割を担う。特に、いくつかのグループが、産生される抗体のレベル、特異性および親和性に対するハプテン密度の影響を報告している（Hubbard et al. 1993, Singh et al. 2004）。それゆえ、複合体の再現性のある産生を達成するためには、複合体の慎重な追跡調査が非常に重要である。
これらの複合体を分析しそしてその至適な調製を確認するために様々なアプローチが一般に用いられている。方法の選択はハプテンおよび担体の両方の物理化学的特性ならびに架橋ストラテジーに依存する。最も頻繁に使用される手順は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を伴うかまたは伴わない（Oda et al. 2004, Singh et al. 2004, Weller et al. 2003, Weller et al. 2003, Adamczyk et al. 1996-9）、ゲルろ過（Hermanson et al. 1993）、吸光（Pauillac et al. 2002）および蛍光（Singh et al. 2004, Weller et al. 2003）分析法、ゲル電気泳動（Pawlowski et al. 2000, Singh et al. 2004, Adamczyk et al. 1996）、スルフヒドリル基（Riddles et al. 1979）、アミノ基（Sashidhar et al. 1994）、または炭水化物残基（Manzi et al. 1993）を含む反応のための比色アッセイを伴う質量分析を含む。
効率的ではあるが、これらの既存の方法はいくつかの欠点を有している。まず、これらはしばしばサンプルのさらなる処理を必要とし、時間がかかり、そして多数のサンプルを分析すべき場合に実施が容易ではない。さらに、それらは通常さほど正確ではなく、そして複合体の分子量および完全性のおおよその評価を与えるのみである。最後に、いくつかの反応混合物（細胞抽出物、血清、組織ホモジネートなど）の複雑さは、多量の他の化合物（脂質、界面活性剤、塩、他のタンパク質など）の存在に起因して、分析の有効性に悪影響を及ぼし得る。
それゆえ、特に複雑かつ不均一なサンプルを用いる、バイオコンジュゲーション反応をモニタリングするための、迅速で感度の良い分析方法の必要性が存在する。さらに、そのような効率的な方法は、バッチ間の一貫性を確実にしながら、方法を至適化し、そして複合体の産生をスケールアップするための、開発において重要である。
ProteinChip（登録商標）アレイ技術または表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）は、２つの強力な技術、クロマトグラフィーおよび質量分析を組み合わせることによって複雑なタンパク質混合物の分析を可能にする。チップ表面上での選択的保持の後、目的の化合物をレーザ脱離／イオン化質量分析によってその後分析する。この技術は多くの分野、例えばバイオマーカーの発見、生体分子相互作用の研究、タンパク質のプロファイリング、翻訳後修飾の分析などで首尾よく使用されている（Tang et al. 2004, Issaq et al. 2002）。
【０１４０】
これらの適用に比較して、反応のモニタリング（化学的にせよ酵素的にせよ）または得られる産物の分析のためのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦの使用を示す例はこれまでに非常に少ししか記載されていない。最近、酵素消化（Caputo et al. 2003, Merchant et al. 2000）または限定的酸加水分解（Lin et al. 2001）後のペプチドまたはタンパク質の直接的な分析がオンチップ（on-chip）で、タンパク質配列を同定する目的で首尾よく行われている。オンチップの酵素反応およびその後の特徴付けもまた、翻訳後修飾を研究するために行われている。この方法を使用して、組換え抗体のグリコシル化の程度がＰＮＧａｓｅＦを使用する脱グリコシル化手順を用いてモニタリングされており（Cleverley et al. 2003）、そしてペプチドまたはタンパク質のリン酸化状態がキナーゼ（Cardone et al. 1998）またはホスファターゼ（Voderwulbecke et al. 2005）の作用の後に評価されている。この最後の例は経時研究を含んでいた。
別の特徴付け研究において、Hubalek et al.は、ビオチン化組換えヒトモノアミンオキダーゼの消化、およびアフィニティカラムでのその後の精製後の、ビオチン化トリプシンペプチドの分析を記載している。同様に、プロテアーゼ活性化受容体２に関連する合成ペプチドから酵素的に遊離されたペプチドがＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって同定された（Dulon et al. 2005）。興味深いことに、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳはまた、培養上清から直接的に、細菌タンパク質の自己活性化プロセスの過程を追跡することを可能にしている（Boyle et al. 2001）。
最後に、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの有用性が、スクエア酸ジエステル化学を使用するコンジュゲーション方法による、細菌オリゴ糖のタンパク質への付加のモニタリングについて実証されている（Chernyak et al. 2001, Saksena et al. 2003）。しかし、反応は、合成リンカー誘導体化オリゴ糖、タンパク質担体および緩衝液から構成される単純な混合物における化学的連結であった。
本発明者らの知る限り、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳが、複雑な混合物におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的コンジュゲーション反応をモニタリングするために使用されたことはない。
ハプテン分子の中で、炭水化物が特に興味深い。なぜなら、炭水化物は細菌決定基の一部であり、そして腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でもあるからである。その結果、多数の炭水化物−タンパク質複合体が感染性疾患およびガンに対するワクチンとして開発されている（Lo-Man et al. 2004）。乳房、肺、前立腺および結腸ガンにおいて過剰発現される炭水化物ＴＡＡである（Springer 1984, Freire et al. 2003）Ｔｎ抗原（α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を提示する種々の複合体の調製（Lo-Man et al. 2004, Kuduk et al. 1998, Slovin et al. 2003）が記載されている。得られる糖ペプチド（Lo-Man et al. 2004）または糖タンパク質（Kuduk et al. 1998, Slovin et al. 2003）はガンの標的化のための高度に有望なワクチンの候補であることが示されている。
しかし、そのような複合体の調製は、多段階の面倒な合成および／または時間のかかる精製に依存する。これらの困難を回避するために、本発明者らは、高Ｔｎ密度を有するタンパク質複合糖質を産生するための酵素的アプローチを開発した。
Ｔｎムチンは抗腫瘍免疫療法のための魅力的な標的である。なぜなら、炭水化物はムチン内の腫瘍関連構造の重要な部分であることが示されているからである（Grinstead et al. 2002）。タンパク質骨格として、本発明者らは、肺（Hamamoto et al. 2005, Nishiumi et al. 2003）および乳房（De Bolos et al. 1995, Pereira et al. 2001）ガン腫を含む様々な腫瘍において記載されているＭＵＣ６胃ムチン（Toribara et al. 1993）を選択した。このムチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｎ抗原合成を担う酵素であるウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ、ＥＣ  ２．４．１．４１）の天然基質である。
抗腫瘍免疫療法のためのＭＵＣ６−Ｔｎ複合体の大規模調製を達成するために、本発明者らは、ムチンアクセプター上へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的なＴｎ抗原の転移を行った。本発明者らは、本明細書において、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるコンジュゲーションのモニタリングを記載し、そしてこの方法が、複雑な混合物を含む反応パラメーターを至適化するために非常に迅速かつ効率的であることを示す。
【０１４１】
実験手順
ＭＵＣ６のクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１つのＭＵＣ６のタンデム反復を含有するｃＤＮＡクローンを、ＲＴ−ＰＣＲによってＭＣＦ７乳ガン細胞の全ｃＤＮＡから単離し、そしてｐＧｅｍ−Ｔ（Promega, France）中にクローニングした。ＰＣＲ産物を半分のタンデム反復（８７アミノ酸）をコードするように設計し、実施例１に記載のように増幅した。
組換え体を、１ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導によってＥ．ｃｏｌｉ  Ｂｌｉ５において発現させ、そしてＮｉ２＋−ニトリロ酢酸カラムで変性条件下で製造者（Qiagen, Germany）の説明書に従って精製した。
【０１４２】
乳ガン細胞株抽出物  
乳ガン細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２）を１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸および２ｍＭグルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Life Technologies, Inc.）中５％ＣＯ２、３７℃で９０％コンフルエンスになるまで増殖させた。トリプシン処理の後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてホモジナイズした。細胞を３，０００ｇで１０分間４℃で、そして１００，０００ｇで１時間４℃で遠心分離した。得られたペレットを０．１ＭイミダゾールｐＨ７．２および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に再懸濁した。細胞抽出物を小分けし、そして−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度をＢＣＡ法（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）によって決定した。
【０１４３】
組換えウシポリペプチドＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ１
可溶性形態のウシｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（Duclos et al. 2004）を酵母ピキア・パストリスＫＭ７１Ｈ株（Invitrogen）において発現させ、そして実施例１に記載するように精製した。
【０１４４】
ＭＵＣ６タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧａｌＮＡｃ転移
ＭＣＦ７乳ガン細胞のミクロソーム画分を３７℃でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび精製組換えＭＵＣ６とともに５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する５０ｍＭイミダゾールｐＨ７．２中でインキュベーションした。組換えｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を使用した場合、ＭＵＣ６精製タンパク質をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとともに５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５中３７℃で２４時間インキュベーションした。
アリコートを様々な時点で取り、そして−２０℃で凍結した。様々な反応条件を下記の表２に詳述する。
【０１４５】
【表３】
2009523137.tif 000004
【０１４６】
上記表２において：
ａ  モル当量を潜在的Ｏ−グリコシル化部位（４７個のセリンおよびトレオニン残基）に比較して表す；
ｂ  ６５μｇを反応の開始時に添加し、そして６５μｇの添加を２４時間目に繰り返した；
ｃ  ネオ複合糖質の平均分子量を、図１および２において矢印で印を付した中央ピークから算出した；
ｄ  ＧａｌＮＡｃの分子量  Ｍｇ＝２０３．１９。
【０１４７】
得られたＭＵＣ６−ＴｎをNi-NTAアガロース（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して精製し、次いでPerkin-Elmerポンプシステムを２３０ｎｍのＵＶ検出器とともに使用する逆相ＨＰＬＣに供した。カラムはSymmetry 300（商標）C18（５μｍ、３００Å、３．９×２５０ｍｍ）（Waters、France）であった。溶出を、流速１ｍｌ／分（３０分間にわたる）での水中０．１％トリフルオロ酢酸中１０〜６０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行った。ピークを集め、次いで凍結乾燥した。ＭＵＣ６−Ｔｎ糖タンパク質を、アミノ酸分析および質量分析によって特徴付けした。
【０１４８】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによる反応のモニタリング
ＩＭＡＣ３０チップアレイの表面を１００ｍＭ  ＮｉＣｌ２を用いて室温で１５分間活性化し、次いで水およびＰＢＳで洗浄した。スポットを全グリコシル化混合物のアリコートとともに４０分間室温でバイオプロセッサーアダプターを使用してインキュベーションし、次いでＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（２×５分間）、ＰＢＳ（３×２分間）および５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（２×５分間）で洗浄した。次いで、チップをPBS II機器中で読み取り、そして各アレイスポットをレーザーサンプリングした。スペクトルをCiphergen ProteinChipソフトウェア3.2.1を使用して処理した。
【０１４９】
結果および考察
組換えＭＵＣ６タンパク質を、酵素（組換えｐｐＧａｌＮＡｃＴ１（Duclos et al. 2004）またはＭＣＦ−７腫瘍細胞抽出物中に含有されるｐｐＧａｌＮＡｃＴの混合物）の存在下での炭水化物活性化ドナーＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのトランスグリコシル化反応に供した（図６）。反応物の小アリコートを取り出し、そして固定化金属アフィニティ捕獲（ＩＭＡＣ３０）を通したProteinChip表面上の固定化後にＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって直接分析した。
図７Ａ〜７Ｇに示すように、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１はＧａｌＮＡｃ残基のＭＵＣ６タンパク質上へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転移を非常に効率的に触媒することができる。反応の進行を、出発材料の質量に比較しての、ＧａｌＮＡｃ残基の転移によって引き起こされる、より高い質量への移動によってモニタリングする（図７Ａ）。スペクトルは、複合体の増大する分子量を示し、そして平均ハプテン−タンパク質化学量論、ならびに複合体の分布／多分散の決定を可能にする一組のピークを示す。
トランスグリコシル化反応を種々の実験条件下で調べた（表２を参照のこと）。
【０１５０】
転移の程度を、２当量のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃドナー（モル当量は、潜在的Ｏ−グリコシル化部位、すなわち全セリンおよびトレオニン残基を指す）および可変量の組換えｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を用いて、２４時間のインキュベーションの後に分析した。図７Ｂ〜７Ｅに示すように、酵素の添加の結果、５（図７Ｂ）〜１９（図７Ｅ）の平均Ｔｎ量での有意なグリコシル化の増加を示す、顕著なそして進行するスペクトルの移動が生じた。
酵素単独またはＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと一緒の酵素のさらなる添加は、転移を有意には改善しなかった。同様に、２４時間より長いインキュベーション期間は、観察可能な分子量の増加を生じなかった。このことは、少なくともこれらの型の条件において、最大Ｔｎレベルが達成されたことを示す。
ドナーの量の効果をパネルＥ〜Ｇに示す（図７）。より少量のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを使用した場合、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳプロフィールは匹敵することが見出されたが、転移のわずかな低下が０．５当量のドナーを用いて観察された（図７Ｇ）。
高価なドナーＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを節約しつつ多量の複合体を産生するために、本発明者らは反応のスケールアップのために図７Ｆの実験条件を選択した（１当量のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび１μｇの酵素／１０μｇのＭＵＣ６）。半調製量（ｍｇ範囲のムチン）でトランスグリコシル化を行った場合、転移ＧａｌＮＡｃ残基数は分析レベルで得られたものと実質的に同じであることが見出された。その結果、複数ｍｇのネオ複合糖質の調製が達成され、そしてその免疫学的特性の評価を実施例１において報告する。
選択した条件での代表的なスペクトルの拡大は（図７Ｆ）、質量増大の詳細を示す（図８Ａ）。各ピーク間の差異は、単一ＧａｌＮＡｃ残基の予想平均質量に対応し（２０３．１９３）、このことは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳが、少なくともこの分子量範囲で、分解能を有する方法であることを実証する。対照的に、逆相ＨＰＬＣプロフィールは異なる種の分離を示さなかった（図８Ｂ）。
【０１５１】
次いで、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦを、より複雑な混合物における、すなわち、ＭＣＦ−７腫瘍細胞由来の抽出物中に含有されるｐｐＧａｌＮＡｃＴ触媒を用いるトランスグリコシル化の分析に適用した（図９）。粗混合物を用いて得られた質量分布は、組換え酵素を用いて観察されたものと類似している。しかし、２４個のＴｎ／タンパク質分子の平均密度が５０時間の反応および２回の細胞抽出物の添加の後に達成されたので、転移率はより良好である（図９Ｂ）。得られた最大Ｔｎ−タンパク質化学量論がｐｐＧａｌＮＡｃＴ  Ｔ１の場合より高いという事実は、転移がタンパク質の立体構造（セリンおよびトレオニン残基の接近可能性の欠如）のみならず酵素の特異性によっても制限されることを示す。
興味深いことに、細胞抽出物中の多数の混入物の存在は、Ｓ／Ｎ比にほとんど影響せず、このことはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦがそのような複雑な分析のために有用であり得ることを示す。
それゆえ、化学的コンジュゲーション反応のモニタリングがP. Kovacおよび共同研究者らによって以前に報告されているが（Chernyak et al. 2001, Saksena et al. 2003）、本発明者らは、そのようなモニタリングを複雑な混合物（細胞抽出物）中の酵素反応についても混入物からの干渉なしに行うことができることをここに示す。これらの結果は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳが、バイオコンジュゲーション反応をモニタリングするための強力なツールであることを意味する。この技術は従来の分析方法に対する非常に効率的な代替を提供する。
第一に、複合体を１０ｎｇほどの少量（１ｐｍｏｌ範囲）から少なくとも１０，０００〜２０，０００の分子量範囲で約２０３の質量増大について効率的に分析することができたので、これは感度が良くそして正確な方法である。免疫化目的で使用される従来のタンパク質担体は通常、より高い分子量（約６０，０００（ウシ血清アルブミンまたはＢＳＡ、ジフテリアトキソイド）〜数百万（キーホールリンペットヘモシアニンまたはＫＬＨ））を有する。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの正確さおよび分解能は、より高い分子量範囲（特にＫＬＨの）に明確に限定される。これはまたハプテンの分子量に依存する。これらの問題点を克服するために、ZipTip（登録商標）ピペットチップの使用を考慮することができる。この方法は、サンプルの微小規模の浄化を含み、これを次いで高性能質量分析計（ＭＡＬＤＩまたはエレクトロスプレー）に適用することができ、高分子量範囲での効率的な分析が可能になる。しかし、低分子量については、ProteinChip（登録商標）アレイ技術は依然としてより単純であることは注目に値する。なぜなら、これは同じデバイス上での精製工程および質量分析を可能にするからである。このことは、移動工程の必要性を除き、そしてサンプルの至適な回収をもたらす。
【０１５２】
第二に、この方法は、分析の前にサンプルを精製または誘導体化する必要なしに、粗反応物に対して直接行うことができるので、非常に迅速である。さらに、いくつかのサンプルを容易に平行して分析することができるという事実は、コンジュゲーションの効率に対する種々の条件の影響を調べるために非常に価値があり得る。それゆえ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、高スループット至適化ストラテジーのために潜在的に非常に有用である。
最後に、本発明者らの知見は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦがｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的コンジュゲーション由来の複雑な粗サンプルを分析するために適切であることを示す。
これはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて行われる細胞内反応をモニタリングするために直接的に適用可能であり得る。そのような分析は、組換えタンパク質産生を至適化するために（Clerverley et al. 2003, Savage et al. 2004）、または細菌タンパク質の分泌および自己活性化を分析するために（Boyle et al. 2001）、粗発酵または細胞培養供給源について既に報告されている。ムチンタンパク質に対する同様の研究は研究室において現在進捗中である。
【０１５３】
略語
ＢＣＡ：ビシンコニン酸；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−エタンスルホン酸；ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；ＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド；ｍＡｂ：モノクローナル抗体；ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応；ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ：ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間質量分析；ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン
【０１５４】
【表４】
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【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１Ａ】ＭＵＣ６クローン化タンパク質の２つの公知のＭＵＣ６タンデム反復とのアラインメント。  アラインメントを、ＭＣＦ７乳ガン細胞由来のクローン化ＭＵＣ６タンパク質の得られた予測配列（配列番号４のＭＵＣ６−１、第１のアラインメント行；および配列番号５のＭＵＣ６−２、第２のアラインメント行）を、既報の正常胃ライブラリーから増幅されたＭＵＣ６タンデム反復（ＴＲ１およびＴＲ２およびＴＲ３、それぞれ第３〜第４のアラインメント行）（アクセッションナンバーＱ１４３９５）とともに使用して、ClustalWを用いて行った。Ｏ−グリコシル化の潜在的部位を、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/のNetOGlyc3.1サーバーを使用して決定し、そしてグレーに陰影を付す。融合Ｈｉｓタグに対応する配列に下線を付す（すなわち、配列番号４および５の最初の３４個のＮ末端アミノ酸）。同一のアミノ酸を［＊］で印を付す。
【図１Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、ＭＵＣ６−１組換えタンパク質の精製。  ＭＵＣ６−１組換えタンパク質をNi-NTAアガロースおよびＨＰＬＣを使用して精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１３％）によって分離し、そしてクーマシーブルーで染色した。レーン１〜４：Ni-NTAアガロース溶出画分；レーン５：ＨＰＬＣ後の精製ＭＵＣ６−１。分子量マーカーをｋＤａで表す。
【図１Ｃ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、ＭＵＣ６−２組換えタンパク質の精製。  ＭＵＣ６−２組換えタンパク質をNi-NTAアガロースを使用して精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１３％）によって分離し、そしてクーマシーブルーで染色した。レーン１〜４：Ni-NTAアガロース溶出画分。分子量マーカーをｋＤａで表す。
【図２Ａ】ＭＵＣ６タンパク質へのＧａｌＮＡｃの転移およびＧａｌＮＡｃ数の決定。  トランスグリコシル化反応を、ｂｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（３００μｇ）を使用してＭＵＣ６−１精製ムチン（３ｍｇ、０．１４μｍｏｌ）およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（７．８ｍｇ、１１．５μｍｏｌ）を用いて、またはＭＣＦ７細胞抽出物（１２ｍｇ、２回で）を使用してＭＵＣ６−２精製ムチン（１ｍｇ、０．０８２μｍｏｌ）およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（３．２ｍｇ、４．９２μｍｏｌ、２回で）を用いて行った。ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）糖タンパク質をＨＰＬＣによって直接分析した。
【図２Ｂ】ＭＵＣ６タンパク質へのＧａｌＮＡｃの転移およびＧａｌＮＡｃ数の決定。  ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）糖タンパク質をNi-NTAアガロースを使用して精製し、ＨＰＬＣによって分析した。
【図２Ｃ】ＭＵＣ６タンパク質へのＧａｌＮＡｃの転移およびＧａｌＮＡｃ数の決定。  ＨＰＬＣによる精製後、ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）（図２Ｃ）およびＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）（図２Ｄ）をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。各ピークにダルトンでの質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値を表示する。取り込まれたＧａｌＮＡｃ単位の対応する数を括弧内に示す。
【図２Ｄ】ＭＵＣ６タンパク質へのＧａｌＮＡｃの転移およびＧａｌＮＡｃ数の決定。  ＨＰＬＣによる精製後、ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）（図２Ｃ）およびＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）（図２Ｄ）をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。各ピークにダルトンでの質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値を表示する。取り込まれたＧａｌＮＡｃ単位の対応する数を括弧内に示す。
【図３】精製ＭＵＣ６−１およびＭＵＣ６−２ならびにそれらの複合糖質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。  精製複合糖質（０．５μｇ）を１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、そしてクーマシーブルーで染色した。レーン１：ＭＵＣ６−２；レーン２：ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（Ｔ１）；レーン３：ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）；レーン４：ＭＵＣ６−１；レーン５：ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）；レーン６：ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（ＭＣＦ７）。分子量マーカーをｋＤａで示す。
【図４Ａ】ウエスタンブロッティング（Ａ〜Ｂ）およびＥＬＩＳＡ（Ｃ〜Ｅ）による、抗Ｔｎ  ｍＡｂによるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識。  複合糖質を１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、そしてニトロセルロースシート上に移した。抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（図４Ａ）および抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４（図４Ｂ）を添加し、続いて抗マウスペルオキシダーゼ複合体を添加し、そして反応を増感化学発光を用いて発色させた。レーン１：ＭＵＣ６−２；レーン２：ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（Ｔ１）；レーン３：ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）；レーン４：ＭＵＣ６−１；レーン５：ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）；レーン６：ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（ＭＣＦ７）。分子量マーカーをｋＤａで示す。
【図４Ｂ】ウエスタンブロッティング（Ａ〜Ｂ）およびＥＬＩＳＡ（Ｃ〜Ｅ）による、抗Ｔｎ  ｍＡｂによるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識。  複合糖質を１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、そしてニトロセルロースシート上に移した。抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（図４Ａ）および抗Ｔｎ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４（図４Ｂ）を添加し、続いて抗マウスペルオキシダーゼ複合体を添加し、そして反応を増感化学発光を用いて発色させた。レーン１：ＭＵＣ６−２；レーン２：ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（Ｔ１）；レーン３：ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）；レーン４：ＭＵＣ６−１；レーン５：ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（Ｔ１）；レーン６：ＭＵＣ６−１：Ｔｎ（ＭＣＦ７）。分子量マーカーをｋＤａで示す。
【図４Ｃ】ウエスタンブロッティング（Ａ〜Ｂ）およびＥＬＩＳＡ（Ｃ〜Ｅ）による、抗Ｔｎ  ｍＡｂによるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識。  抗Ｔｎモノクローナル抗体８３Ｄ４（図４Ｃ）およびＭＬＳ１２８（図４Ｄ）ならびにポリクローナル抗ＭＵＣ６血清（図４Ｅ）によるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識をＥＬＳＡによっても試験した。アシアロ−ヒツジ顎下ムチン（ａＯＳＭ、Ｔｎリッチムチン）をコントロールとして使用した。
【図４Ｄ】ウエスタンブロッティング（Ａ〜Ｂ）およびＥＬＩＳＡ（Ｃ〜Ｅ）による、抗Ｔｎ  ｍＡｂによるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識。  抗Ｔｎモノクローナル抗体８３Ｄ４（図４Ｃ）およびＭＬＳ１２８（図４Ｄ）ならびにポリクローナル抗ＭＵＣ６血清（図４Ｅ）によるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識をＥＬＳＡによっても試験した。アシアロ−ヒツジ顎下ムチン（ａＯＳＭ、Ｔｎリッチムチン）をコントロールとして使用した。
【図４Ｅ】ウエスタンブロッティング（Ａ〜Ｂ）およびＥＬＩＳＡ（Ｃ〜Ｅ）による、抗Ｔｎ  ｍＡｂによるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識。  抗Ｔｎモノクローナル抗体８３Ｄ４（図４Ｃ）およびＭＬＳ１２８（図４Ｄ）ならびにポリクローナル抗ＭＵＣ６血清（図４Ｅ）によるＭＵＣ６−Ｔｎ複合糖質の認識をＥＬＳＡによっても試験した。アシアロ−ヒツジ顎下ムチン（ａＯＳＭ、Ｔｎリッチムチン）をコントロールとして使用した。
【図５Ａ】ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）免疫化マウス由来の血清によるヒトJurkat腫瘍細胞の認識。  フローサイトメトリー分析を、ＭＵＣ６−２、ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）またはミョウバン＋ＣｐＧ単独（コントロール群）を用いて免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹）から集めた個別の血清（１：５００希釈）とともにインキュベーションしたヒトＴｎ＋Jurkat腫瘍細胞に対して行った。
【図５Ｂ】ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）免疫化マウス由来の血清によるヒトJurkat腫瘍細胞の認識。  阻害アッセイのために、細胞を、ＭＵＣ６−２：Ｔｎ（ＭＣＦ７）で免疫化したマウス由来の血清のプールとともに、種々の濃度のアシアロ−ＯＳＭ（Ｔｎ＋ムチン）または脱グリコシル化ＯＳＭ（Ｔｎ−ムチン）と一緒にインキュベーションした。抗Ｔｎ  ＩｇＭ  ｍＡｂ  ８３Ｄ４および抗ＣＤ４  ＩｇＧ  ｍＡｂをコントロールとして使用した。抗体結合を、マウス免疫グロブリンに特異的なＰＥ標識抗体を使用して検出した。アシアロ−ＯＳＭまたは脱グリコシル化ＯＳＭのために使用した濃度は、０μｇ／ｍｌ（-------）；０．０１μｇ／ｍｌ（--------）；１μｇ／ｍｌ（......）；１００μｇ／ｍｌ（- -）であった。マウス血清を用いて得られた結果は２回の独立した実験の結果である。
【図６】組換えｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１またはＭＣＦ−７腫瘍細胞抽出物を使用した、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＭＵＣ６ムチンへＧａｌＮＡｃの酵素的トランスグリコシル化のスキーム。
【図７Ａ】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。  ドナー量（パネル図７Ｂ〜７Ｅ）および酵素量（パネルＥ〜Ｇ）に依存する、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を使用したＭＵＣ６（分子量、１２１４４．３、図７Ａ）上のＧａｌＮＡｃトランスグリコシル化の進行のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。パネルＡは出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を各パネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図７Ｂ】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。  ドナー量（パネル図７Ｂ〜７Ｅ）および酵素量（パネルＥ〜Ｇ）に依存する、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を使用したＭＵＣ６（分子量、１２１４４．３、図７Ａ）上のＧａｌＮＡｃトランスグリコシル化の進行のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。パネルＡは出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を各パネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図７Ｃ】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。  ドナー量（パネル図７Ｂ〜７Ｅ）および酵素量（パネルＥ〜Ｇ）に依存する、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を使用したＭＵＣ６（分子量、１２１４４．３、図７Ａ）上のＧａｌＮＡｃトランスグリコシル化の進行のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。パネルＡは出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を各パネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図７Ｄ】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。  ドナー量（パネル図７Ｂ〜７Ｅ）および酵素量（パネルＥ〜Ｇ）に依存する、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を使用したＭＵＣ６（分子量、１２１４４．３、図７Ａ）上のＧａｌＮＡｃトランスグリコシル化の進行のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。パネルＡは出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を各パネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図７Ｅ】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。  ドナー量（パネル図７Ｂ〜７Ｅ）および酵素量（パネルＥ〜Ｇ）に依存する、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を使用したＭＵＣ６（分子量、１２１４４．３、図７Ａ）上のＧａｌＮＡｃトランスグリコシル化の進行のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。パネルＡは出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を各パネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図７Ｆ】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。  ドナー量（パネル図７Ｂ〜７Ｅ）および酵素量（パネルＥ〜Ｇ）に依存する、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を使用したＭＵＣ６（分子量、１２１４４．３、図７Ａ）上のＧａｌＮＡｃトランスグリコシル化の進行のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。パネルＡは出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を各パネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図７Ｇ】ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。  ドナー量（パネル図７Ｂ〜７Ｅ）および酵素量（パネルＥ〜Ｇ）に依存する、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ１を使用したＭＵＣ６（分子量、１２１４４．３、図７Ａ）上のＧａｌＮＡｃトランスグリコシル化の進行のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。パネルＡは出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を各パネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図８Ａ】図７Ｇの代表的な実験に対する分析方法の分解能の比較（１当量のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび１μｇのｐｐＧａｌＮＡｃＴ  Ｔ１／１０μｇのＭＵＣ６）。  質量増大の詳細を示す拡大したＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ダルトンでのｍ／ｚ値）。
【図８Ｂ】図７Ｇの代表的な実験に対する分析方法の分解能の比較（１当量のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび１μｇのｐｐＧａｌＮＡｃＴ  Ｔ１／１０μｇのＭＵＣ６）。  逆相ＨＰＬＣプロフィール；クロマトグラフィー条件：Waters Symmetry C18（５μｍ、３００Å、３．９×２５０ｍｍ）、流速１ｍＬ／分、３０分間にわたる水（０．１％トリフルオロ酢酸）／アセトニトリル（１０〜６０％）での勾配。
【図９Ａ】出発材料ＭＵＣ６（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃなしのインキュベーション反応）についてのコントロールとして作用する。平均質量数／電荷数（ｍ／ｚ）値（ダルトン）を両方のパネルにおいて矢印で印を付した中央ピーク上に示す。条件の詳細については、表２を参照のこと。
【図９Ｂ】ＭＣＦ−７腫瘍細胞抽出物を使用したコンジュゲーション反応のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。
【図１０Ａ】ＭＵＣ６−１（配列番号８の核酸配列および配列番号９のアミノ酸配列；Ｈｉｓタグを有するＭＵＣ６−１の核酸配列＝配列番号１０）、およびＭＵＣ６−２（配列番号１１の核酸配列および配列番号１２のアミノ酸配列；Ｈｉｓタグを有するＭＵＣ６−２の核酸配列＝配列番号１３）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図１０Ｂ】ＭＵＣ６−１（配列番号８の核酸配列および配列番号９のアミノ酸配列；Ｈｉｓタグを有するＭＵＣ６−１の核酸配列＝配列番号１０）、およびＭＵＣ６−２（配列番号１１の核酸配列および配列番号１２のアミノ酸配列；Ｈｉｓタグを有するＭＵＣ６−２の核酸配列＝配列番号１３）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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