(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−６の抗原決定基に対して特異性を有する抗体分子、この抗体分子の治療的使用及びこの抗体分子を産生する方法に関する。
2009518023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対する特異性を有する中和抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲ及びＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号７に記載の配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む中和抗体。
【請求項２】
重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号５に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号６に記載の配列及びＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号７に記載の配列を含む請求項１に記載の中和抗体。
【請求項３】
軽鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列を有するＣＤＲ及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つ含む中和抗体。
【請求項４】
軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列を有するＣＤＲ及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つ含む請求項１又は請求項２に記載の中和抗体。
【請求項５】
前記軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列を含む請求項３又は請求項４に記載の中和抗体。
【請求項６】
前記重鎖が配列ｇＨ１３（配列番号１１）を含む請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記軽鎖が配列ｇＬ１０（配列番号１３）を含む請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
配列ｇＨ１３（配列番号１１）を含む重鎖及び配列ｇＬ１０（配列番号１３）を含む軽鎖を有する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体。
【請求項９】
軽鎖の可変ドメインが、請求項８に記載の抗体の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、重鎖の可変ドメインが、請求項８に記載の抗体の重鎖可変ドメインに対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体。
【請求項１０】
配列番号２に記載の配列を含む重鎖及び配列番号４に記載の配列を含む軽鎖を有する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体。
【請求項１１】
配列番号１６に記載の配列を含む重鎖及び配列番号１８に記載の配列を含む軽鎖を有する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体。
【請求項１２】
重鎖及び軽鎖が、請求項１１に記載の抗体の対応する重鎖及び軽鎖に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体。
【請求項１３】
５００ｐＭ又はそれより良好なヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有するヒト化又は完全ヒト中和抗体。
【請求項１４】
５０ｐＭ又はそれより良好なヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有するヒト化、完全ヒト又はキメラ中和抗体。
【請求項１５】
請求項８に記載の抗体が結合するヒトＩＬ−６上のエピトープ。
【請求項１６】
ヒトＩＬ−６のアミノ酸残基Ｓ４７、Ｃ５０、Ｅ９３、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ａ１５３、Ｑ１５６、Ｑ１５９及びＳ１６９を含む請求項１５に記載のエピトープ。
【請求項１７】
アミノ酸残基Ｓ４７、Ｃ５０、Ｅ９３、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ａ１５３、Ｑ１５６、Ｑ１５９及びＳ１６９並びにＣ４４、Ｓ５３、Ａ５８、Ｖ９６、Ｑ１５２、Ｑ１５４、Ｎ１５５、Ｗ１５７、Ｔ１６３、Ｌ１６５及びＥ１７２から選択される１つ又は複数の残基を含む請求項１６に記載のエピトープ。
【請求項１８】
請求項１５、請求項１６又は請求項１７に記載のエピトープに結合する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有するヒト化、完全ヒト又はキメラ中和抗体。
【請求項１９】
ヒトＩＬ−６に対して請求項８に記載の抗体の結合を交差阻止するか、又は請求項８に記載の抗体によりヒトＩＬ−６に対する結合が交差阻止される、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有するヒト化、完全ヒト又はキメラ中和抗体。
【請求項２０】
０．０３８ｎＭのヒトＩＬ−６の活性を１００ｐＭ未満の濃度で５０％阻害することができる、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、前記阻害活性が、ＩＬ−６に誘発されたＴ１１６５細胞の増殖で測定される中和抗体。
【請求項２１】
３．８４ｎＭのヒトＩＬ−６活性を１ｎＭ未満の濃度で５０％阻害することができるヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、前記阻害活性が、ヒトＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに応答したＨＵＶＥＣよるＭＣＰ−１の産生に対して測定される中和抗体。
【請求項２２】
ヒトＩＬ−６に対して請求項８に記載の抗体の結合を交差阻止する請求項２０又は請求項２１に記載の中和抗体。
【請求項２３】
５０ｐＭ又はそれより良好なヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有する請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
請求項１から１４まで又は１８から２３までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖（複数可）をコードする単離したＤＮＡ配列。
【請求項２５】
重鎖をコードするＤＮＡ配列が、配列番号１２又は配列番号１５又は配列番号１５のヌクレオチド５８〜２００８に記載の配列を含む請求項２４に記載の単離したＤＮＡ配列。
【請求項２６】
軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、配列番号１４又は配列番号１７又は配列番号１７のヌクレオチド６１〜７０５に記載の配列を含む請求項２４に記載の単離したＤＮＡ配列。
【請求項２７】
請求項２４から２６までのいずれか一項に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクター。
【請求項２８】
配列番号１５に記載の配列及び配列番号１７に記載の配列を含む請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２７又は請求項２８に記載の１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
ヒトＩＬ−６に対して結合特異性を有する抗体を産生する方法であって、請求項２９に記載の宿主細胞を培養し、抗体を単離することを含む方法。
【請求項３１】
１つ又は複数の薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて請求項１から１４まで又は１８から２３までのいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
他の活性成分をさらに含む請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ＩＬ−６により媒介されるか又はＩＬ−６レベルの増加を伴う病理学的障害の治療又は予防に使用するための、請求項１から１４まで又は１８から２３までのいずれか一項に記載の抗体、又は請求項３１又は請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
ＩＬ−６により媒介されるか又はＩＬ−６レベルの増加を伴う病理学的障害の治療又は予防のための医薬品の製造における、５００ｐＭ又はそれより良好なヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有するヒト化又は完全ヒト中和抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−６の抗原決定基に対して特異性を有する抗体分子に関する。また本発明はこの抗体分子の治療的使用及びこの抗体分子を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−６は、様々な細胞型により産生される多面的な多機能サイトカインである。これは最初、抗体産生細胞へとＢ細胞の最終的な成熟を誘発するＢ細胞分化因子（ＢＳＦ−２）として同定された（Ｈｉｒａｎｏら、１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２４、７３〜７６）。ＩＬ−６は、免疫制御、炎症、造血及び発癌において中心的役割を果たしていることが示されている。免疫系の中でＩＬ−６はＢ細胞の抗体産生を誘発し、ポリクローナル免疫グロブリンの量を増加させる。またこれは、Ｔ細胞上でインターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプターの発現を誘発し（Ｎｏｍｏら、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｌｅｔｔｅｒｓ、１５、３、２４９〜２５３）、活性化されたＴ細胞でＩＬ−２産生を促進し、それにより細胞毒性Ｔ細胞の増殖と分化の両方を誘発する（Ｏｋａｄａら、１９８８  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４１、５、１５４３〜１５４９）。またＩＬ−６は、マクロファージへの単核細胞の分化を決定することが知られている（Ｃｈｏｍａｒａｔ  Ｐら、２０００  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６、５１０〜５１４）。
【０００３】
ＩＬ−６が、造血、血小板新生、破骨細胞形成、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質の上昇をもたらす肝性急性期応答の誘発において作用するとき、ＩＬ−６の機能は免疫応答に限定されない。ＩＬ−６は、表皮ケラチン細胞、腎臓糸球体間質細胞、ミエローマ及びプラズマ細胞腫細胞の成長因子であることが知られている（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９８９  Ｐｒｏｔ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、８６、（１６）６３６７〜６３７１；Ｈｏｒｉｉら、１９８９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３、１２、３９４９〜３９５５；Ｋａｗａｎｏら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、６１５９、８３〜８５）。ＩＬ−６は、単核細胞／マクロファージ、繊維芽細胞、表皮ケラチン細胞、血管内皮細胞、腎臓糸球体間質細胞、グリア細胞、軟骨細胞、Ｔ及びＢ細胞並びに一部の腫瘍細胞を含む多様な細胞型により産生される（Ａｋｉｒａら、１９９０、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、４、１１、２８６０〜２８６７）。構成的にＩＬ−６を産生する腫瘍細胞を除いて、適切に刺激されない限り正常細胞はＩＬ−６を発現しない。
【０００４】
ＩＬ−６は、翻訳後修飾に依存して２１〜２８ｋＤの分子量を有する１８４個のアミノ酸分子の糖タンパク質である。代替性のスプライス変異体が、一部の細胞型で見いださている（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９５、Ｂｌｏｏｄ、８６、４、１２４３〜１２５４）。ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）複合体は、２つの機能的に異なる膜タンパク質である８０ｋＤのＩＬ−６特異的結合鎖（ｇｐ８０）及び１３０ｋＤのシグナル伝達鎖（ｇｐ１３０）を含んでいる。ＩＬ−６はｇｐ１３０に直接結合することはできないが、ＩＬ−６Ｒと結合してＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０の高親和性三重複合体を生成することができる。ＩＬ−６Ｒは低親和性でＩＬ−６を結合するが、ＩＬ−６Ｒは細胞内シグナル伝達ドメインを有さず、したがってこの連結は単独で細胞活性化を導かない。同様にＩＬ−６Ｒの細胞表面発現は、細胞がＩＬ−６刺激に応答性であることを意味しない。タンパク分解性開裂は、循環血中のＩＬ−６を結合できる可溶性のＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ；ｓｇｐ８０）の放出を導き、ＩＬ−６の半減期を増加させる。細胞活性化のために、ＩＬ−６はまず細胞結合ＩＬ−６Ｒ又はｓＩＬ−６Ｒのいずれかに結合し、次いでこのヘテロ二量体ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体は、細胞表面糖タンパク質ｇｐ１３０と結合する。生じた三部から成るヘテロ複合体は、別のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０と結合し、続いてシグナル伝達が起こるので（ＢｒａｖｏとＨｅａｔｈ  ２０００、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９、（１１）、２３９９〜２４１１；Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００、５６２８、２１０１〜２１０４）、細胞結合ＩＬ−６Ｒ及び可溶性ＩＬ−６Ｒの両方が細胞の活性化に関与する。細胞結合ＩＬ−６Ｒを介したＩＬ−６シグナル伝達を、シスシグナル伝達（ｃｉｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と呼ぶのに対して、可溶性ＩＬ−６Ｒを介した細胞活性化は、トランスシグナル伝達（ｔｒａｎｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と述べられている。ＩＬ−６Ｒではなくｇｐ１３０を発現している細胞は、ｓＩＬ−６Ｒを介するＩＬ−６により刺激することができる。
【０００５】
ヒトＩＬ−６に対する中和マウス抗体は、ＩＬ−６Ｒ（サイト１）又はｇｐ１３０（サイト２及び３）へのヒトＩＬ−６の結合を妨害できることが知られている（Ｋａｌａｉら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９、６９０〜７００；Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、１９９０、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４５、５６１〜５６８；Ｗｅｎｄｌｉｎｇら、１９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２９、２５９〜２６２）。
【０００６】
米国特許第５，８５６，１３５号は、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻止するヒトＩＬ−６に対する再構築されたヒト抗体を開示している。これらの抗体はマウス抗体ＳＫ２の可変領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体の可変領域に移植されているマウスモノクローナル抗体ＳＫ２から由来した。
【０００７】
また、ＩＬ−６に対する中和ヒト自己抗体が知られている（Ｈａｎｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９５、２５、３４８〜３５４）。
【０００８】
治療に用いるサイトＩキメラマウス／ヒト抗ＩＬ−６抗体が、ＷＯ２００４０３９８２６に記載された。
【０００９】
ヒト化抗ヒトＩＬ−６レセプターモノクローナル抗体が、関節リウマチ治療のために第３相臨床試験中である（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、２００５、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１〜２１）。また同じ抗体が、クローン病の第２相試験において有効あることが報告されている。また有効性がＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスのループス様疾患において、抗ＩＬ−６及び抗ＩＬ−６Ｒ抗体の両方を用いて実証された（Ｆｉｎｋら、１９９４  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４、５８５；Ｍｉｈａｒａら、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２、３９７）。マウスのＩＬ−６レセプターに対する中和抗体は、疾患の養子移入モデルにおいて大腸炎を抑制した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、２０００  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４、４８７８；Ａｔｒｅｙａら、２０００  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ６、５８３）。また後者の研究では、大腸炎のＩＬ−１０ノックアウトマウスモデル及び腸炎症のＴＮＢＳモデルにおいて、抗レセプター抗体を用いて有効性を実証した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、この度ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて特に有効である高親和性中和抗ＩＬ−６抗体を同定した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
抗体の可変ドメインの残基は、通常、Ｋａｂａｔらによって考案された方式に従って番号付けされる。この方式は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（以下、Ｋａｂａｔら（上述））に記載されている。特に示さない限り本明細書でこの番号付け方式が用いられる。
【００１２】
Ｋａｂａｔの残基命名は、アミノ酸残基の直線的な番号付けと必ずしも直接的には対応していない。実際の直線的なアミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造のフレームワーク若しくは相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、構造的成分の短縮又は挿入に対応して厳密なＫａｂａｔの番号付けより少ないか若しくは追加のアミノ酸を含む場合がある。残基の正確なＫａｂａｔの番号付けは、所定の抗体に対して「標準的」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列とこの抗体の配列中の相同性残基を整列させることにより決定できる。
【００１３】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け方式によれば、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に存在する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａによれば（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．とＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１〜９１７（１９８７））、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは、残基２６から残基３２にわたっている。したがって本明細書中で用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付け方式とＣｈｏｔｈｉａの位相的ループ定義の組合せにより記載されるように残基２６から３５を含む。
【００１４】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従って残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）中に存在する。
【００１５】
本明細書中で用いられる、用語「中和抗体」とは、ＩＬ−６の生物学的シグナル伝達活性を、例えばｇｐ１３０レセプターへのＩＬ−６のサイト３での結合を阻止することにより中和できる抗体を意味する。
【００１６】
本発明に使用する抗体は、当該技術で周知の任意の適切な方法を用いて得ることができる。ＩＬ−６ポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞を、ＩＬ−６を特異的に認識する抗体を産生するために用いることができる。このＩＬ−６ポリペプチドは、「成熟した（ｍａｔｕｒｅ）」ポリペプチド又はそれらの生物学的に活性なフラグメント若しくは誘導体であってもよい。このＩＬ−６ポリペプチドは、成熟したポリペプチドであることが好ましい。ＩＬ−６ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作した宿主細胞から、当分野でよく知られている工程により調製され得るか又はこれらは天然の生物源から回収され得る。本発明の適用において、用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれる。これらは特に明記しない限り互換的に用いられる。このＩＬ−６ポリペプチドは場合によっては、例えばアフィニティー標識を融合した融合タンパク質等のより大きなタンパク質の部分であり得る。動物に免疫処置が必要な場合、動物に、好ましくヒト以外の動物に、周知の通常の手法を用いてＩＬ−６ポリペプチドを投与することにより、このポリペプチドに対して生成された抗体を得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ編、第４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６を参照のこと）。多くの温血動物、例えばウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ又はブタを免疫してもよい。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが通常好ましい。
【００１７】
本発明に使用する抗体は、完全な抗体及びこれらの機能的に活性なフラグメント又は誘導体を含み、これに限定されるものではないがモノクローナル、ヒト化、完全なヒト又はキメラ抗体であってもよい。
【００１８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７〜９６，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）等の任意の当分野で知られている方法により作成できる。
【００１９】
本発明に使用する抗体は、特異的抗体産生のために選択された単一のリンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡのクローニング及び発現により、単一のリンパ球抗体法を用いて生成することもでき、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３〜７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７により記載された方法による。
【００２０】
ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、ヒト以外の生物種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有するヒト以外の生物種由来の抗体分子である（例えばＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照のこと）。ＣＤＲ全体よりはむしろ特異性を決定するＣＤＲの残基を移植することのみが必要であることは理解されるであろう（例えばＫａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照のこと）。ヒト化抗体は場合によってはさらに、そのＣＤＲが由来したヒト以外の生物種由来の１つ又は複数のフレームワーク残基を含み得る。
【００２１】
キメラ抗体とは、軽鎖及び重鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によりコードされた抗体である。
【００２２】
本発明に使用する抗体は、当分野で知られている多様なファージディスプレイ方法を用いて生成することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（ｉｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１〜５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７〜１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、２４：９５２〜９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ、１９９７  １８７９〜１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７：１９１〜２８０）並びにＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３；５，９６９，１０８に開示されているものが含まれる。
【００２３】
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖両方（が存在する場合）の可変領域及び定常領域は、全てヒト起源であるか又はヒト起源の配列と実質的に同一であり、必ずしも同じ抗体に由来しないヒト抗体である。完全ヒト抗体の例には、例えば上記のファージディスプレイ方法により産生された抗体及びマウスの免疫グロブリンの可変及び定常領域遺伝子が、この遺伝子のヒト対応物により置換されたマウスで産生された抗体が含まれ得て、例えばＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１に一般的に記載されている。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体を提供し、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲ及びＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号７に記載の配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、重鎖の可変ドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも２つが、以下の配列：ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号５に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号６に記載の配列及びＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号７に記載の配列から選択される、中和抗体を提供する。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５に記載の配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号６に記載の配列を有する重鎖を含むことができる。或いは、抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５に記載の配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号７に記載の配列を有する重鎖を含むことができ、又は抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号６に記載の配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号７に記載の配列を有する重鎖を含むことができる。疑義を回避するため、あらゆる置換を含むことは理解されよう。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、重鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号５に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号６に記載の配列及びＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号７に記載の配列を含む、中和抗体を提供する。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列を有するＣＤＲ及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、中和抗体を提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つが、以下の配列：ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列から選択される、中和抗体を提供する。例えばこの抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号８に記載の配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号９に記載の配列を有する軽鎖を含むことができる。或いは、この抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号８に記載の配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１０に記載の配列を有する軽鎖を含むことができ、又はこの抗体は、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号９に記載の配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１０に記載の配列を有する軽鎖を含むことができる。疑義を回避するため、あらゆる置換を含むことは理解されよう。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、軽鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体であって、この可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列を含む、中和抗体を提供する。
【００３０】
ＩＬ−６に結合する抗体の能力及びＩＬ−６活性を中和する抗体の能力を有意に変化させることなく、本発明により提供されたＣＤＲに対して１つ又は複数のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失がなされ得ることは理解されるであろう。任意のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失の効果は、例えばＩＬ−６の結合及び中和を測定する実施例で記載された方法を使用して、当業者により容易に調べることができる。したがって、一実施例では、本発明は、ＣＤＲＨ−１（配列番号５）、ＣＤＲＨ−２（配列番号６）、ＣＤＲＨ−３（配列番号７）、ＣＤＲＬ−１（配列番号８）、ＣＤＲＬ−２（配列番号９）及びＣＤＲＬ−３（配列番号１０）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する抗体であって、ＣＤＲのうちの１つ又は複数における１つ又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、中和抗体を提供する。
【００３１】
本発明の抗体分子は、それぞれ相補的な軽鎖又は相補的な重鎖を含むことが好ましい。
【００３２】
それゆえに、一実施形態では、本発明の抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号５に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２に対して配列番号６に記載の配列及びＣＤＲ−Ｈ３に対して配列番号７に記載の配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列を含む。
【００３３】
一実施例では、本発明は、重鎖及び軽鎖を含む、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１に対して配列番号５に記載の配列、ＣＤＲＨ−２に対して配列番号６に記載の配列及びＣＤＲＨ−３に対して配列番号７に記載の配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１に対して配列番号８に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２に対して配列番号９に記載の配列及びＣＤＲ−Ｌ３に対して配列番号１０に記載の配列を含み、ＣＤＲのうちの１つ又は複数における１つ又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、中和抗体を提供する。
【００３４】
一実施形態では、本発明の抗体は重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは配列番号２に記載の配列を含む。
【００３５】
別の実施形態では、本発明の抗体は重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号２に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号２に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００３６】
本明細書で用いられる「同一性」とは、整列配列中の任意の特定の位置において、そのアミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で用いられる「類似性」とは、整列配列中の任意の特定の位置において、そのアミノ酸残基が配列間で類似したタイプであることを示す。例えば、ロイシンでイソロイシン又はバリンが置換され得る。互いにしばしば置換され得る他のアミノ酸には、限定されるものではないが、
−  フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−  リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−  システイン及びメチオニン（硫黄を含む側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。同一性及び類似性の程度は、容易に算出することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【００３７】
一実施形態では、本発明の抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号４に記載の配列を含む。
【００３８】
別の実施形態では、本発明の抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００３９】
一実施形態では、本発明の抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは配列番号２に記載の配列を含み、軽鎖の可変ドメインは配列番号４に記載の配列を含む。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号２に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。抗体は重鎖及び軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号２に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含むことが好ましい。
【００４１】
一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖の可変ドメインが配列番号２に記載の配列を含み、軽鎖の可変ドメインが配列番号４に記載の配列を含むラット抗体である。このラット抗体を、本明細書では「１３２Ｅ０９３」又は「ドナー」抗体と称する。ラット抗体１３２Ｅ０９の重鎖の可変ドメインの完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２で提供される。ラット抗体１３２Ｅ０９の軽鎖の可変ドメインの完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４で提供される。配列番号５、６、７、８、９及び１０に記載のＣＤＲは、ラット抗体１３２Ｅ０９に由来する。
【００４２】
一実施形態では、本発明の抗体はＣＤＲ移植抗体である。本明細書で用いられる用語「ＣＤＲ移植抗体」とは、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域のフレームワークに移植されたドナー抗体（例えばラット抗体）由来の１つ又は複数ＣＤＲ（必要に応じて、１つ又は複数の改変されたＣＤＲを含む）を含む抗体を指す。Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５〜５３９、１９９８を参照することができる。１つ又は複数のＣＤＲが、ラット抗体１３２Ｅ０９から得られることが好ましい（配列番号５、６、７、８、９及び１０）。一実施形態では、完全なＣＤＲが移植されるよりもむしろ、上述したＣＤＲのいずれか１つに由来する１つ以上の特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークへ移植される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照）。一実施形態では、上述したＣＤＲの１つ又は複数に由来する特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークへ移植される。別の実施形態では、上述したＣＤＲのそれぞれに由来する特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークへ移植される。
【００４３】
ＣＤＲ又は特異性決定残基が移植される場合、そのＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、ラット、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む任意の適切なアクセプターの可変領域のフレームワーク配列を使用することができる。好ましくは、本発明のＣＤＲ移植抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び１つ又は複数の上記のようなドナー抗体に由来するＣＤＲを含む少なくとも１つの可変ドメインを有する。したがって可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及びヒト以外の、好ましくはラットのドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲ移植抗体が提供される。
【００４４】
本発明で使用できるヒトフレームワークの例には、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭがある（Ｋａｂａｔら、前出）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に使用することができ、ＲＥＩは軽鎖のために使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖両方に使用することができる。或いは、ヒト生殖細胞系配列を使用でき、これらの配列は、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で利用できる。
【００４５】
本発明のＣＤＲ移植抗体において、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体から由来する必要はなく、所望であれば異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
【００４６】
本発明のＣＤＲ移植抗体の重鎖のための好ましいフレームワーク領域は、ＪＨ４と共にヒトサブグループＶＨ３配列１−４  ３−７２に由来する（図２に示した配列番号１９及び２０）。したがって、少なくとも１つのヒト以外のドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲ移植抗体が提供され、この重鎖フレームワーク領域はＪＨ４と共にヒトサブグループ配列１−４  ３−７２に由来する。ヒトＪＨ４配列は、以下の通りである：（ＹＦＤＹ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）。ＹＦＤＹモチーフはＣＤＲ−Ｈ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ．ら、１９８１、Ｃｅｌｌ、２７、５８３〜５９１）。このドナー配列は図２に示した１３２Ｅ０９  ＶＨ配列（配列番号２）であり、ドナーＣＤＲ（配列番号５、６及び７）には下線を施してある。
【００４７】
本発明のＣＤＲ移植抗体の軽鎖のための好ましいフレームワーク領域は、図２（配列番号２１及び２２）に示したＪＫ２と共にヒト生殖細胞系サブグループＶＫ１配列２−１−（１）Ｏ１２に由来する。したがって、少なくとも１つのヒト以外のドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲ移植抗体が提供され、軽鎖フレームワーク領域はＪＫ２と共にヒトサブグループ配列ＶＫ１  ２−１−（１）Ｏ１２に由来する。ＪＫ２配列は以下の通りである：（ＹＴ）ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号２２）。ＹＴのモチーフはＣＤＲ−Ｌ３の一部であり、フレームワーク４の一部ではない（Ｈｉｅｔｅｒ，ＰＡ．ら、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７、１５１６〜１５２２）。ドナー配列は、図２に示した（配列番号４）１３２Ｅ０９  ＶＬ配列であり、ドナーＣＤＲ（配列番号８、９及び１０）には下線を施してある。
【００４８】
また本発明のＣＤＲ移植抗体において、フレームワーク領域はアクセプター抗体のフレームワーク領域と正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、まれな残基をそのアクセプター鎖クラス又はタイプにおいて、より高頻度に現れる残基に変えてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域中の選択した残基を、ドナー抗体において同じ位置に見られる残基に一致するように変更してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４を参照のこと）。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限にとどめるべきである。アクセプターフレームワーク領域において、変更する必要がある残基を選択するためのプロトコルが、ＷＯ９１／０９９６７に述べられている。
【００４９】
好ましくは、本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター重鎖がＪＨ４と共にヒトＶＨ３配列１−４  ３−７２を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は１つ又は複数のドナーＣＤＲに加えて、少なくとも位置４９（Ｋａｂａｔらによる（上述））にドナー残基を含む。したがって、重鎖可変ドメインの少なくとも位置４９の残基がドナー残基であるＣＤＲ移植抗体が提供される。
【００５０】
好ましくは、本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター軽鎖がＪＫ２と共にヒトサブグループＶＫ１配列２−１−（１）Ｏ１２を有する場合、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域にドナー残基は使用されず、１つ又は複数のドナーＣＤＲのみが移植される。
【００５１】
ドナー残基はドナー抗体、すなわちＣＤＲがもともと由来する抗体から由来する残基であり、ドナー抗体は本発明の場合、ラット抗体１３２Ｅ０９である。
【００５２】
したがって、本発明は、重鎖可変領域がｇＨ１３（図２；配列番号１１）の配列を含む抗体を提供する。
【００５３】
本発明の一実施形態では、抗体は重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号１１に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。好ましくは、抗体は重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号１１に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００５４】
さらに、本発明は、軽鎖可変領域がｇＬ１０（図２；配列番号１３）の配列を含む抗体を提供する。
【００５５】
本発明の一実施形態では、抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。好ましくは、抗体は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００５６】
好ましくは、本発明のＣＤＲ移植抗体は、ｇＨ１３の配列（配列番号１１）を含む重鎖及びｇＬ１０の配列（配列番号１３）を含む軽鎖を含む。
【００５７】
本発明の一実施形態では、抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号１１に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。好ましくは、抗体は重鎖及び軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１１に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００５８】
本発明の抗体分子は、完全長の重鎖及び軽鎖又はこれらのフラグメントを有する完全な抗体分子を含むことができ、これに限定されるものではないが、Ｆａｂ、改変されたＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントであってもよい（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒとＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６；ＡｄａｉｒとＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  −  Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３）、２０９〜２１７を参照のこと）。これらの抗体フラグメントの作成及び製造方法は、当分野では周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照のこと）。本発明において使用する他の抗体フラグメントは、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントを含む。多価抗体は、多重特異性を含んでもよく、又は単一特異性であってもよい（例えばＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照のこと）。
【００５９】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合には抗体分子の提案された機能及び必要とされることのある特にエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用してもよく、抗体分子が治療的使用を意図しており、抗体エフェクター機能が必要とされる場合は、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプの定常領域ドメインを使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図しており、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、例えば単にＩＬ−６活性の阻止が意図される場合は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列変異体も使用され得ることは理解されるであろう。Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８に記載されているように、例えば位置２４１のセリンがプロリンに変更されたＩｇＧ分子を使用することができる。この変更を含むＩｇＧ４定常ドメインが特に好ましい。当業者なら、抗体が様々な翻訳後修飾を受けることがあることも理解するであろう。これらの修飾のタイプ及び程度は、しばしば抗体を発現するために用いた宿主細胞系及び培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化における変異を含み得る。頻度の高い修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（例えばリシン又はアルギニン）の損失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９〜１３４、１９９５に記載されているような）。したがって、配列番号１６の抗体重鎖のＣ末端リシンは存在しない可能性がある。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明によって提供される抗体は、重鎖定常領域がＡｎｇａｌら、前出、に記載されているように、２４１位のセリンがプロリンに置換されたヒトＩｇＧ４定常領域を含むヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体である。したがって、本発明は重鎖が配列番号１６に記載の配列を含むか又はこの配列から成る抗体を提供する。軽鎖定常領域はｃ−κであることが好ましい。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、重鎖が配列番号１６に記載の配列を含むか又はこの配列から成り、軽鎖が配列番号１８に記載の配列を含むか又はこの配列から成る抗体を提供する。
【００６２】
本発明の一実施形態では、抗体は重鎖を含み、重鎖は、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。好ましくは、抗体は重鎖を含み、重鎖は、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６３】
本発明の一実施形態では、抗体は軽鎖を含み、軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。好ましくは、抗体は軽鎖を含み、軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６４】
本発明の一実施形態では、抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。好ましくは、抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１６に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６５】
また本発明によって、本発明の抗体、特にＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号６）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号７）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）若しくはＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１０）のいずれか１つを含む抗体、例えば抗体１３２Ｅ０９、又は重鎖可変領域配列ｇＨ１３（配列番号１１）及び／若しくは軽鎖可変領域配列ｇＬ１０（配列番号１３）を含む抗体が結合するヒトＩＬ−６の特異的領域又はエピトープが提供される。
【００６６】
ヒトＩＬ−６ポリペプチドのこの特異的領域又はエピトープは、本発明により提供される抗体のいずれか１つと組み合わせて、当分野で知られている任意の適切なエピトープマッピング法により同定することができる。このような方法の実施例には、抗体により認識されるエピトープの配列を含む特異的に抗体に結合することができる最小フラグメントの本発明の抗体への結合に対して、ＩＬ−６に由来する様々な長さのペプチドをスクリーニングすることが含まれる。ＩＬ−６ペプチドは、合成的に又はＩＬ−６ポリペプチドのタンパク分解によって作成されてもよい。抗体を結合するペプチドは、例えば質量分析によって同定できる。別の実施例では、ＮＭＲ分光法を本明細書における実施例に記載されているように、本発明の抗体が結合するエピトープの同定に用いることができる。一度同定されると、本発明の抗体と結合するエピトープのフラグメントを、必要に応じて同じエピトープを結合する新たな中和抗体を得るために免疫原として用いることができる。
【００６７】
一実施例では、本発明の抗体が結合するヒトＩＬ−６のエピトープは、ヒトＩＬ−６の少なくともアミノ酸残基Ｓ４７、Ｃ５０、Ｅ９３、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ａ１５３、Ｑ１５６、Ｑ１５９及びＳ１６９を含む（残基の番号付けはＢｏｕｌａｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００、２１０１〜２１０４による）。一実施例では、本発明の抗体が結合するヒトＩＬ−６のエピトープは、アミノ酸残基Ｓ４７、Ｃ５０、Ｅ９３、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ａ１５３、Ｑ１５６、Ｑ１５９及びＳ１６９並びにＣ４４、Ｓ５３、Ａ５８、Ｖ９６、Ｑ１５２、Ｑ１５４、Ｎ１５５、Ｗ１５７、Ｔ１６３、Ｌ１６５及びＥ１７２から選択される１つ又は複数の残基を含む。
【００６８】
一実施例では、本発明の抗体が結合するヒトＩＬ−６のエピトープは、アミノ酸残基Ｃ４４、Ｓ４７、Ｃ５０、Ｓ５３、Ａ５８、Ｅ９３、Ｖ９６、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｑ１５２、Ａ１５３、Ｑ１５４、Ｎ１５５、Ｑ１５６、Ｗ１５７、Ｑ１５９、Ｔ１６３、Ｌ１６５、Ｓ１６９及びＥ１７２を含む。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸残基Ｓ４７、Ｃ５０、Ｅ９３、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ａ１５３、Ｑ１５６、Ｑ１５９及びＳ１６９を含む成熟したヒトＩＬ−６のエピトープに結合する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体を提供する。
【００７０】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸残基Ｓ４７、Ｃ５０、Ｅ９３、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ａ１５３、Ｑ１５６、Ｑ１５９及びＳ１６９並びにＣ４４、Ｓ５３、Ａ５８、Ｖ９６、Ｑ１５２、Ｑ１５４、Ｎ１５５、Ｗ１５７、Ｔ１６３、Ｌ１６５及びＥ１７２から選択される１つ又は複数の残基を含む成熟したヒトＩＬ−６のエピトープに結合する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体を提供する。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、アミノ酸残基Ｃ４４、Ｓ４７、Ｃ５０、Ｓ５３、Ａ５８、Ｅ９３、Ｖ９６、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｑ１５２、Ａ１５３、Ｑ１５４、Ｎ１５５、Ｑ１５６、Ｗ１５７、Ｑ１５９、Ｔ１６３、Ｌ１６５、Ｓ１６９及びＥ１７２を含む成熟したヒトＩＬ−６のエピトープに結合する、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体を提供する。
【００７２】
上記で命名した残基はまた、ＩＬ−６の未処理前駆体のアミノ酸番号付けに基づいて番号を付され得ることは理解されるであろう（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５２３１）。この番号付けを用いて、上記の残基を前記Ｂｏｕｌａｎｇｅｒらに従って、Ｃ４４、Ｓ４７、Ｃ５０、Ｓ５３、Ａ５８、Ｅ９３、Ｖ９６、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｑ１５２、Ａ１５３、Ｑ１５４，Ｎ１５５、Ｑ１５６、Ｗ１５７、Ｑ１５９、Ｔ１６３、Ｌ１６５、Ｓ１６９及びＥ１７２が、それぞれＣ７２、Ｓ７５、Ｃ７８、Ｓ８１、Ａ８６、Ｅ１２１、Ｖ１２４、Ｒ１３２、Ｆ１３３、Ｅ１３４，Ｔ１７７、Ｋ１７８、Ｑ１８０、Ａ１８１、Ｑ１８２，Ｎ１８３、Ｑ１８４、Ｗ１８５、Ｑ１８７、Ｔ１９１、Ｌ１９３、Ｓ１９７及びＥ２００になるように番号付けした。
【００７３】
本発明の抗体は、ヒトＩＬ−６のサイト３に対するｇｐ１３０レセプターの結合を阻止することが好ましい。
【００７４】
ＩＬ−６に対する本発明の抗体の結合を交差阻止する抗体は、ＩＬ−６活性の中和において同様に有効であろう。したがって、また本発明は、ヒトＩＬ−６に対する上記の抗体のいずれか１つの結合を交差阻止する、及び／又はそれらの抗体のいずれか１つによりＩＬ−６に対する結合が交差阻止される、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体が提供される。一実施形態では、このような抗体は上述した抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態では、この交差阻止中和抗体は、上述した抗体が結合するエピトープと隣接する及び／又はオーバーラップするエピトープに結合する。別の実施形態では、本発明のこの態様の交差阻止中和抗体は、本発明の抗体と同じエピトープ又は前記エピトープと隣接する及び／又はオーバーラップするエピトープと結合しない。
【００７５】
ヒトＩＬ−６への交差阻止抗体の結合が、本発明の抗体の結合を妨げる場合又はその逆の場合、交差阻止抗体を当業界の任意の適切な方法を用いて、例えば、競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅを用いて同定することができる。
【００７６】
一実施形態では、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体が提供され、この中和抗体は、ヒトＩＬ−６に対する、抗体１３２Ｅ０９、又はその重鎖が配列ｇＨ１３（配列番号１１）を含む抗体、又はその軽鎖が配列ｇＬ１０（配列番号１３）を含む抗体、又はＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号６）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号７）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）若しくはＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１０）のいずれか１つを含む抗体の結合を交差阻止する。一実施形態では、本発明により提供される交差阻止抗体は、ヒトＩＬ−６に対する、１３２Ｅ０９、又はその重鎖が配列ｇＨ１３（配列番号１１）を含む抗体、又はその軽鎖が配列ｇＬ１０（配列番号１３）を含む抗体、又はＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号６）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号７）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）若しくはＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１０）のいずれか１つを含む抗体の結合を８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上阻害する。
【００７７】
これに代えて、又はこれに加えて、本発明のこの態様による中和抗体は、本発明の抗体のいずれか１つにより、ヒトＩＬ−６に対する結合が交差阻止され得る。したがって、抗体１３２Ｅ０９、又はその重鎖が配列ｇＨ１３（配列番号１１）を含む抗体、又はその軽鎖が配列ｇＬ１０（配列番号１３）を含む抗体、又はＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号６）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号７）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）若しくはＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１０）のいずれか１つを含む抗体により、ヒトＩＬ−６に対する結合が交差阻止される、ヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体分子も提供される。一実施形態では、本発明のこの態様によって提供される中和抗体は、１３２Ｅ０９、又はその重鎖が配列ｇＨ１３（配列番号１１）を含む抗体、又はその軽鎖が配列ｇＬ１０（配列番号１３）を含む抗体、又はＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号６）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号７）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）若しくはＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１０）のいずれか１つを含む抗体により、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上ヒトＩＬ−６に対する結合が阻害される。
【００７８】
本発明の抗体分子は、ヒトＩＬ−６に対する高い結合親和性を有することが好ましく、ピコモルでの親和性を有することが好ましい。親和性は本明細書実施例に記載のようにＢＩＡｃｏｒｅを含む当分野で知られている任意の適当な方法を用いて測定してもよい。親和性は、本明細書に実施例記載のように組換え型ヒトＩＬ−６を用いて測定することが好ましい。本発明の抗体分子は、５００ｐＭ未満のヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有することが好ましい。本発明の抗体分子は、５０ｐＭ未満のヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有することが好ましい。したがって、一実施形態では、本発明の抗体分子は約１〜約５００ｐＭの結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の抗体分子は約１〜約５０ｐＭの結合親和性を有する。本発明の抗体分子は、約１〜約２０ｐＭのヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有することが好ましい。一実施形態では、本発明の抗体は８〜１２ｐＭのヒトＩＬ−６に対する結合親和性を有する。本発明によって提供される抗体の親和性を、当分野で知られている任意の適当な方法を用いて変更することができることは理解されるであろう。したがって、本発明はまたヒトＩＬ−６に対する改善された親和性を有する本発明の抗体分子の変異体に関する。このような変異体は、ＣＤＲ変異誘発（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発株使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ）（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含む多くの親和性成熟化プロトコルによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）はこれらの親和性成熟化の方法について論じている。
【００７９】
本発明の抗体分子は、例えば実施例で記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイでＩＬ−６活性を中和することが好ましい。一実施形態では、これらの抗体はヒトＩＬ−６のサイト３に結合する。
【００８０】
一実施形態では、本発明は、０．０３８ｎＭのヒトＩＬ−６の活性を１００ｐＭ未満の濃度で５０％阻害することができるヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体を提供し、前記阻害活性は、ＩＬ−６に誘発されたＴ１１６５細胞増殖で測定される。一実施形態では、ＩＬ−６を５０％阻害する抗体濃度は５０ｐＭ未満であり、２０ｐＭ未満であることがより好ましい。このアッセイで用いられるヒトＩＬ−６は、ヒト組換え型ＩＬ−６であることが好ましい。一実施形態では、中和抗体はヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、３．８４ｎＭヒトＩＬ−６の活性を１ｎＭ未満の濃度で５０％阻害することができるヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体を提供し、前記阻害活性は、ヒトＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに応答したＨＵＶＥＣによるＭＣＰ−１の産生に関して測定される。アッセイで用いられるヒトＩＬ−６は、ヒト組換え型ＩＬ−６であることが好ましい。一実施形態では、中和抗体はヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。
【００８２】
所望であれば、本発明の抗体は１つ又は複数のエフェクター分子（複数可）とコンジュゲートすることができる。一実施形態では、このエフェクター分子は、単一のエフェクター分子又は本発明の抗体に付着することができる単一部分を形成するように結合された２つ以上のこのような分子を含んでもよいことは理解されるであろう。エフェクター分子とコンジュゲートした抗体フラグメントを得ることが望まれる場合は、これは標準的な化学的手段又は組換えＤＮＡ法によって調製してよく、そこでは抗体フラグメントは直接又はカップリング剤によりエフェクター分子に結合される。抗体に上記のエフェクター分子を結合する技術は、当分野においてよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７、ｐｐ．６２３〜５３；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３、６〜１２３を参照のこと）。具体的な化学的方法には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載されたものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は組換えＤＮＡ法、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されているような方法を用いて達成できる。
【００８３】
本明細書で用いる用語エフェクター分子には、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬剤、トキシン、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然のポリマー、核酸及び核酸のフラグメント例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子並びに蛍光化合物又はＮＭＲ又はＥＳＲ分光法で検出できる化合物等のレポーター基が含まれる。
【００８４】
エフェクター分子の例には、細胞に有害である（例えば殺滅させる）任意の因子を含むサイトトキシン又は細胞毒性因子が含まれ得る。これらの例としては、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、ハリコンドリン（ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉｎ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）、ヘミアステルリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、並びにピューロマイシン及びそのアナログ又はホモログが挙げられる。
【００８５】
さらにエフェクター分子には、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロランブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００８６】
他のエフェクター分子には、キレート化放射性核種例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８、又は薬剤例えば限定するものではないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンを挙げることができる。
【００８７】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。重要な酵素には、限定されるものではないが、タンパク分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。重要なタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されるものではないが、免疫グロブリン、トキシン例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、若しくはジフテリアトキシン、タンパク質、例えばインシュリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子若しくはティシュープラスミノーゲンアクティベーター、血栓性因子若しくは抗血管新生因子、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又は生物学的応答調節物質、例えばリンフォカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の成長因子及び免疫グロブリンが挙げられる。
【００８８】
他のエフェクター分子は、例えば診断に有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放射金属（ポジトロン放出断層撮影用）、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。一般的には、診断に使用する抗体とコンジュゲートできる金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ；適切な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが含まれ；適切なルミネセンス物質には、ルミノールが含まれ；適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ；並びに適切な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｈ及び９９Ｔｃが含まれる。
【００８９】
別の実施例では、エフェクター分子（複数可）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期を増大してもよく及び／又は抗体の免疫原性を減少してもよく及び／又は免疫の系に対する上皮性関門を越えて抗体の送達を増強してもよい。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ＷＯ０５／１１７９８４（２００５年１２月１５日公開）に記載されているような、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合性化合物が挙げられる。
【００９０】
このエフェクター分子がポリマーである場合、これらは一般に合成若しくは天然のポリマー、例えば、任意に置換された直鎖若しくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分枝状若しくは非分枝状多糖、例えばホモ若しくはヘテロ多糖であり得る。
【００９１】
上述の合成ポリマーの上に存在し得る具体的な任意の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が含まれる。
【００９２】
合成ポリマーの具体例には、任意に置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はこれらの誘導体、特に任意に置換されたポリ（エチレングリコール）例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はこれらの誘導体が含まれる。
【００９３】
具体的な天然のポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はこれらの誘導体が含まれる。
【００９４】
本明細書で用いる「誘導体」とは、反応性誘導体、例えばマレイミドその他などのチオール選択的反応性基を含むことを意図している。反応性基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して結合され得る。このような基の残基は、ある場合には抗体フラグメントとポリマー間の連結基としての産物の一部形成することは理解されるであろう。
【００９５】
ポリマーのサイズは所望により変動され得るが、一般には平均分子量５００Ｄａから５００００Ｄａ、好ましくは５０００から４００００Ｄａ、より好ましくは２００００から４００００Ｄａの範囲であろう。ポリマーサイズは、特に産物の意図された用途、例えば腫瘍などの特定の組織に局在する能力又は循環血中の半減期を延長する能力に基づき選択され得る（総論については、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５を参照のこと）。したがって、例えば産物が血行から離れて組織に侵入することを意図している場合、例えば腫瘍の治療における使用のためには、低分子量ポリマー、例えば５０００Ｄａ付近の分子量を有するポリマーを使用することは有益かもしれない。産物が血行中にとどまる用途においては、より高分子量のポリマー、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーを使用することは有益であるかもしれない。
【００９６】
特に好ましいポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）又は、特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはこれらの誘導体が含まれ、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するものが含まれる。
【００９７】
一実施例では、本発明に使用する抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着されている。１つの特定の実施例において、抗体は、抗体フラグメントであり、ＰＥＧ分子は、任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は抗体フラグメント中に存在する末端アミノ酸官能基例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基を介して付着できる。上記のアミノ酸は、抗体フラグメントに天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いてフラグメントに加工してもよい（例えばＵＳ５，２１９，９９６、ＵＳ５，６６７，４２５、ＷＯ９８／２５９７１を参照のこと）。一実施例では、本発明の抗体分子は改変されたＦａｂフラグメントであって、その改変は、エフェクター分子の付着を可能にするために１つ又は複数のアミノ酸をその抗体の重鎖のＣ末端への付加することである。追加のアミノ酸が、エフェクター分子が付着し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む改変されたヒンジ領域を形成することが好ましい。複数の部位を、２又はそれ以上のＰＥＧ分子を付着するために用いることができる。
【００９８】
ＰＥＧ分子は、抗体フラグメント中に存在する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合的に結合されることが好ましい。改変された抗体フラグメントに付着したそれぞれのポリマー分子は、そのフラグメント中に存在するシステイン残基の硫黄原子に共有結合的に結合してもよい。共有結合は一般にジスルフィド結合又は、特に硫黄−炭素結合であろう。チオール基を付着部位として用いる場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミド及びシステイン誘導体などのチオールに選択的な誘導体を使用することができる。上述したポリマー改変抗体フラグメントの調製において、活性化ポリマーを出発材料として使用することができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応性基を含む任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料は商業的に入手し得るか（例えばＮｅｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡ）から）、又は通常の化学的方法を用いて市販の出発材料から調製され得る。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ（以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ）から入手可能）を含む。
【００９９】
一実施形態では、抗体は改変Ｆａｂフラグメント又はＰＥＧ化されている、すなわち例えばＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７で開示される方法に記載のジＦａｂ（ｄｉＦａｂ）に対して共有結合で付着されたＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有するジＦａｂである［“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、１９９８、Ｍ．ＡｓｌａｍとＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２、５４：５３１〜５４５も参照のこと］。一実施例では、ＰＥＧはヒンジ領域中のシステインに付着している。一実施例では、ＰＥＧ改変Ｆａｂフラグメントは、改変されたヒンジ領域中の単一のチオール基に共有結合的に結合したマレイミド基を有する。リシン残基はマレイミド基に共有結合的に結合されてもよく、リシン残基のそれぞれのアミン基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが付着されてもよい。したがって、Ｆａｂフラグメントに付着したＰＥＧの総分子量は約４０，０００のＤａであろう。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、配列番号１１に記載の配列を含む重鎖及び配列番号１３に記載の配列を含む軽鎖を有し、その重鎖のＣ末端にエフェクター分子が付着する少なくとも１つのシステイン残基を含む改変ヒンジ領域を有する改変ＦａｂフラグメントであるヒトＩＬ−６に対して特異性を有する中和抗体分子を提供する。好ましくは、エフェクター分子はＰＥＧであり、（ＷＯ９８／２５９７１及びＷＯ２００４０７２１１６）に記載されている方法を用いて付着し、それにより、重鎖のＣ末端でリシル−マレイミド基がシステイン残基に付着し、リシル残基のそれぞれのアミノ基は、それに共有結合的に結合した約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を有する。したがって抗体に付着したＰＥＧの総分子量は約４０，０００Ｄａである。
【０１０１】
別の実施例では、エフェクター分子は、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載された方法を用いて、抗体フラグメントに付着され得る。
【０１０２】
また本発明は、本発明の抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖（複数可）をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。このＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードすることが好ましい。本発明のＤＮＡ配列は、例えば化学的処理、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はこれらの任意の組合せにより作成された合成ＤＮＡを含み得る。
【０１０３】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者には周知である方法により得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列は、所望により決定したＤＮＡ配列から又は対応するアミノ酸配列に基づき合成され得る。
【０１０４】
アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く入手可能であり、その既知のアミノ酸配列に基づき容易に合成することができる。
【０１０５】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製するために、分子生物学の標準的な技法を使用することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技法を用いて完全に又は部分的に合成することができる。適切ならば、部位特異的変異導入及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。
【０１０６】
適切なＤＮＡ配列の例が、配列番号１、配列番号３、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１７に示されている。配列番号１５のヌクレオチド１〜５７及び配列番号１７の１〜６０は、切断されて本発明の中和抗体分子を与えるマウス抗体Ｂ７２．３（Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１（６）４９９〜５０５）由来のシグナルペプチド配列をコードする。したがって、また本発明は、配列番号１５のヌクレオチド５８〜２００８を含む本発明の抗体の重鎖をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。また本発明は、配列番号１７のヌクレオチド６１〜７０５を含む本発明の抗体の軽鎖をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。
【０１０７】
また本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。クローニング又は発現ベクターは、本発明の抗体分子のそれぞれ軽鎖及び重鎖をコードする２つのＤＮＡ配列を含むことが好ましい。本発明のベクターは、配列番号１５及び１７に記載の配列を含むことが好ましい。配列番号１５のヌクレオチド１〜５７及び配列番号１７の１〜６０は、最も好ましくは切断されて本発明の中和抗体分子を与えるマウス抗体Ｂ７２．３由来のシグナルペプチド配列をコードする。
【０１０８】
ベクターを構築することができる一般的な方法であるトランスフェクション法及び培養法は、当業者によく知られている。この点に関して、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇから出版されているＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照することができる。
【０１０９】
また、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために、任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用してもよい。細菌系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物系を用いてもよく、又は真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系を用いてもよい、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照のこと。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＮＳ０、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞が含まれる。適切な発現系の例には、ＷＯ８７／０４４６２に記載されているグルタミン合成酵素発現系が含まれる。
【０１１０】
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現を誘発するのに適した条件下で培養し、抗体分子を単離することを含む、本発明による抗体分子を産生する方法を提供する。
【０１１１】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含んでもよく、その場合は重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列のみを宿主細胞にトランスフェクションするために使用する必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む産物の産生のためには、細胞系に、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターをトランスフェクションされ得る。或いは軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
【０１１２】
本発明の抗体は、病的状態の治療及び／又は予防に有用であるので、本発明はまた１つ又は複数の薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて本発明の抗体分子を含む薬学的又は診断用組成物を提供する。したがって、薬剤の製造のための本発明の抗体の使用が提供される。薬学的に許容し得る担体を通常は含む無菌の医薬組成物の一部として組成物は通常供給される。本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得るアジュバントを含んでもよい。
【０１１３】
本発明はまた、１つ又は複数の薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤又は担体と共に本発明の抗体分子を添加し混合することを含む、薬学的又は診断用組成物を調製する方法を提供する。
【０１１４】
この抗体分子は、薬学的若しくは診断用組成物の中で唯一の活性成分であってもよく、或いは他の抗体構成分子を含む他の活性成分、例えば抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＮＦγ抗体若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体構成分子を伴っていてもよい。
【０１１５】
この医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を含むことが好ましい。本明細書で用いる用語「治療有効量」とは、対象とする疾病若しくは症状を治療、改善若しくは予防するために必要な、又は検知し得る治療的若しくは予防的効果を顕在化するために必要な治療剤の量を意味する。いずれの抗体についても、治療有効量は最初に細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類において評価することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用できる。このような情報は、次いでヒトにおける有用な用量及び投与のための経路を決定するために使用できる。
【０１１６】
ヒト対象に関する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の健康状態、年齢、対象の体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤（複数可）、反応感受性並びに治療に対する寛容性／応答性に依存するであろう。この量は日常的な実験法によって決定することができ、医師の判断の範囲内である。一般に治療有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。医薬組成物は、本発明の活性因子を用量当り所定の量を含む便利な単位投与剤形で提供することができる。
【０１１７】
組成物は患者に個々投与されてもよく、或いは他の物質、薬剤又はホルモンと組み合わせて（例えば同時に、経時的に又は別々に）投与されてもよい。
【０１１８】
本発明の抗体分子が投与される用量は、治療される症状の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に使用されるか又は既存の症状を治療するために使用されるかどうかに依存する。
【０１１９】
投与頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依存する。抗体分子が短い半減期（例えば２〜１０時間）を有する場合、１日に１回又は複数回の投与が必要かもしれない。或いは抗体分子が長い半減期（例えば２〜１５日又は２〜３０日）を有する場合、１日に１回、１週間に１回又は１〜２ヵ月毎に１回のみの投与しか必要でないかもしれない。
【０１２０】
薬学的に許容し得る担体は、それ自体その組成物を投与された患者に有害な抗体の産生を誘発してはならず、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの大きなゆっくり代謝される巨大分子であってよい。
【０１２１】
薬学的に許容し得る塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸塩を使用することができる。
【０１２２】
治療的組成物中の薬学的に許容し得る担体はさらに、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含み得る。さらに湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝化物質などの補助物質が、このような組成物中に存在し得る。このような担体は患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤及び懸濁剤として製剤化することを可能にする。
【０１２３】
投与のための好ましい形態には、非経口投与、例えば注射又は注入、例えばボーラス注射又は連続注入によるものに適した形態が含まれる。産物が注射又はインフュージョン用である場合、これは油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳液の形態をとることができ、懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含んでいてもよい。或いは抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体を用いて再構成する乾燥形態であってもよい。
【０１２４】
本発明の組成物は、製剤化されると、対象に直接投与することができる。治療する対象は動物であってもよい。しかしこの組成物は、ヒト対象に投与するために適合されることが好ましい。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、経皮膚（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸的、局所的、舌下、腟内又は直腸経路を含むがこれに限定されない種々の経路によって投与されてもよい。またハイポスプレーも本発明の医薬組成物を投与するために使用できる。典型的には、この治療的組成物は注射可能薬物として、液体液剤又は懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射に先立つ液状ビヒクル中の溶液又は懸濁液のために適切な固体形態も調製することができる。
【０１２６】
この組成物の直接的な送達は、一般には皮下、腹膜内、静注、若しくは筋肉内注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。この組成物はまた病巣部へ投与することもできる。投薬治療は単回投与スケジュールであっても多回投与スケジュールであってもよい。
【０１２７】
この組成物の活性成分は抗体分子であることは理解されるであろう。したがってこれは消化管での分解に感受性であろう。したがってこの組成物が消化管を利用した経路によって投与される場合、この組成物は抗体を分解から保護するが、消化管から吸収されたならば抗体を放出する物質を含む必要があろう。
【０１２８】
薬学的に許容し得る担体についての詳細な説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）から得ることができる。
【０１２９】
本発明の抗体は、遺伝子治療を用いることにより投与され得ることも予測される。これを達成するためには、適切なＤＮＡ要素の制御下にある、抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を患者に導入し、抗体鎖をＤＮＡ配列から発現させｉｎ  ｓｉｔｕでアセンブルさせる。
【０１３０】
本発明はまた、炎症性疾患の制御に用いる抗体分子を提供する。この抗体分子は、炎症過程を低減するために又は炎症過程を予防するために用いることができることが好ましい。
【０１３１】
また、ＩＬ−６により媒介されるか又はＩＬ−６レベルの増大を伴う病理学的障害の治療及び／又は予防に使用するための本発明の抗体分子が提供される。さらに本発明は、ＩＬ−６により媒介されるか又はＩＬ−６レベルの増加を伴う病理学的障害の治療及び／又は予防のための医薬品の製造における、本発明の抗体分子の使用を提供する。好ましくは、病的状態は、感染症（ウイルス、細菌、真菌及び寄生生物）、感染症と関連する内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、骨盤腹膜炎、アルツハイマー病、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸症候群、キャッスルマン病、強直性脊椎炎、皮膚筋炎、ブドウ膜炎、ペーロニー病、小児脂肪便症、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、手術に起因する癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病関節炎、髄膜脳炎、多発性硬化症及びギランバレー症候群などの中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介炎症性疾患、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、癌（両方の固形癌、例えば黒色腫、肝芽腫、肉腫、扁平上皮癌、移行細胞癌、卵巣癌及び血液学的悪性腫瘍及び特に急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、胃癌及び結腸癌）、心筋梗塞などの虚血性疾患を含む心臓疾患及びアテローム性動脈硬化、血管内凝固、骨吸収、熱傷患者、骨粗鬆症、歯周炎及びヒポクロリジア（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｈｙｄｉａ）から成る群から選択される。
【０１３２】
この病理学的障害は、関節リウマチ又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）であることが好ましい。
【０１３３】
本発明はまた、疼痛の治療又は予防に用いる本発明の抗体分子を提供する。
【０１３４】
本発明はさらに、疼痛の治療又は予防のための医薬品の製造における本発明の抗体分子の使用を提供する。
【０１３５】
本発明の抗体分子は、ヒト又は動物体内のＩＬ−６の効果を低減することが望まれるどのような治療においても使用することができる。ＩＬ−６は体内において循環していることも又は望ましくない高レベルで体内の特定の部位に、例えば炎症部位に局在することもある。
【０１３６】
本発明の抗体分子は、炎症性疾患の制御に用いられることが好ましい。
【０１３７】
本発明はまた、ＩＬ−６により媒介される疾患に罹患しているか又はその危険のあるヒト又は動物対象の治療方法であって、対象に本発明の抗体分子の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１３８】
本発明の抗体分子は、診断、例えば、ＩＬ−６が関与する疾患状態のｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び画像診断にも使用することができる。
【０１３９】
本発明はさらに、添付の図面を参照する以下の実施例において単なる例示として記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４０】
ＤＮＡ操作及び一般的方法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、トランスフォーメーション及びルーチン培養増殖に使用した。ＤＮＡ制限酵素及び修飾酵素は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。プラスミド調製は、Ｍａｘｉプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２１６５）を用いて実施した。ＤＮＡ塩基配列決定反応は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーター配列決定キット（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）（カタログ番号４３０４１４９）を用いて実施し、ＡＢＩ３１００自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。データは、ｐｒｏｇｒａｍ  ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。オリゴヌクレオチドはＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮから入手した。合成遺伝子はＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎで作成した。Ｆａｂ及びＩｇＧの濃度は、アセンブリーＥＬＩＳＡ（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。
【実施例】
【０１４１】
（実施例１）
１３２Ｅ０９の分離
ラットを３週間おきに、最初はフロイントの完全アジュバントと共に、その後はフロイント不完全アジュバントと共に組換え型ヒトＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の皮下注射により免疫した。最後の免疫の１〜２週間後に脾臓を採取し、単個細胞浮遊液を調製した。免疫したラットのリンパ球を、照射したマウス胸腺腫ＥＬ４細胞及びウサギＴ細胞馴化培地の存在下で、９６穴マイクロタイタープレート中で１週間培養した。上清をヒトＩＬ−６に特異的抗体の存在についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性のものをＤＳ１細胞系アッセイでヒトＩＬ−６の生物学的効果を中和する能力についてさらにスクリーニングした（Ｂｏｃｋら、１９９３、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、５、４８０〜４８９）。
【０１４２】
適切な結合特性を有する抗体を分泌している個々のＢ細胞を、選択されたリンパ球抗体法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｔｈｏｄ）により陽性のマイクロタイターウェルから分離し（Ｂａｂｃｏｏｋら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、７８４３〜７８４８；ＷＯ９２／０２５５１）、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を単一のラットＢ細胞から逆転写ＰＣＲでクローニングした。結合を確かめるために可変領域を組換え型ＩｇＧ形式で発現させ、抗体１３２Ｅ０９をヒト化及び今後の研究のために選択した。ラット可変領域配列をＣＡ０３０＿００２４０として登録した。
この可変領域配列を、配列番号１〜４に示す。
【０１４３】
（実施例２）
１３２Ｅ０９のＣＤＲ移植
１３２Ｅ０９由来のＣＤＲ超可変領域に加えて様々な数のフレームワーク残基がヒト可変領域アクセプターフレームワーク上へ移植された一連のヒト化ＶＬ及びＶＨ領域を設計した。
【０１４４】
１０の移植されたＶＬ領域（ｇＬ１〜１０）を設計し、遺伝子をオリゴヌクレオチドアセンブリー及びＰＣＲ突然変異誘発により作成した。また２つの異なるフレームワーク領域、ＶＨ３  １−４  ３−７２及びＶＨ３  １−３  ３−２１を用いて、合計１３の移植されたＶＨ領域（ｇＨ１〜１３）を作成した。ヒトＣ−カッパー定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含む軽鎖移植配列を、ヒト軽鎖発現ベクターｐＫＨ１０．１にサブクローニングした。ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを含むヒトガンマ−４定常領域をコードするＤＮＡを含む重鎖移植配列を、ヒトガンマ−４発現ベクターｐＶｈｇ４Ｐ  ＦＬにサブクローニングした（Ａｎｇａｌら、上記）。プラスミドを、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトし、産生された抗体をＩＬ−６結合の活性及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでスクリーニングした。製造者（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８）の指示に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００の手法を用いて、ＣＨＯ細胞のトランスフェクションを行った。
【０１４５】
作成した１３の重鎖移植片の中で、２つは４９位に１つのフレームワークドナー残基（Ａｌａ）のみを含み、これらは２つの異なる重鎖フレームワークの両方を用いて作成した。このＶＨ３  １−３  ３−２１移植片はＣＨＯ細胞で弱く発現し、ＩＬ−６に対して低減した親和性を示した。対照的に、ＶＨ３  １−４  ３−７２フレームワークを用いた移植片は良好に発現し、ドナー抗体の親和性を保持していた。１つのドナーフレームワーク残基のみを含むこの重鎖移植片を、ＣＤＲのみを移した軽鎖移植片ｇＬ１０と組み合わせて選択した。
【０１４６】
図１は、ドナーラット配列１３２Ｅ０９とアクセプターヒトフレームワーク間のアラインメントを示す。重鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列ＶＨ３  １−３  ３−７２であり、ヒトＪＨ領域生殖細胞系ＪＨ４のこの部分に由来するフレームワーク４を有する。軽鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列ＶＫ１  ２−１−（１）Ｏ１２であり、ヒトＪＫ領域生殖細胞系ＪＫ２のこの部分に由来するフレームワーク４を有する。ｇＨ１３及びｇＬ１０についての移植配列（配列番号１１、１２、１３及び１４）を図１に示す。この移植された抗体を、ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１と名づける。これは、上述のように２４１位でセリンからプロリンへの置換を含む完全なＩｇＧ４として作成された。完全に翻訳された重鎖及び軽鎖配列を、それぞれ図２ａ及び２ｂに示す。重鎖の完全なアミノ酸配列が配列番号１６で提供され、軽鎖の完全なアミノ酸配列が配列番号１８で提供される。重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、それぞれ配列番号１５及び１７で提供される。配列番号１５及び図２ａのヌクレオチド１〜５７は、マウス抗体Ｂ７２．３  ＶＨ由来のシグナルペプチド配列をコードし、配列番号１７及び図２ｂのヌクレオチド１〜６０は、マウス抗体Ｂ７２．３  ＶＬ由来のシグナルペプチド配列をコードする。
マウス抗体Ｂ７２．３は、Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１（６）４９９〜５０５に記載されている。
【０１４７】
（実施例３）
結合親和性
ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１結合親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅテクノロジーは、リアルタイムで標識化を必要とすることなく生体分子間結合をモニターする。リガンドと呼ばれる反応体の１つは固定された表面上に直接に固定されるか又は捕獲されるが、分析物と呼ばれる他のものは溶液中で捕獲された表面上を流れる。センサーは、表面上で分析物がリガンドと結合して複合体を形成するときのセンサー表面上の質量の変化を検出する。これは会合過程に対応する。解離過程は、分析物が緩衝液により置換されるときにモニターされる。親和性ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて、リガンドはＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１完全ＩｇＧ４であり、分析物はヒトＩＬ−６である。
【０１４８】
器具
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ
【０１４９】
センサーチップ
ＣＭ５（リサーチグレード）カタログ番号ＢＲ−１００１−１４、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ。チップは４℃で保存した。
【０１５０】
ＢＩＡ標準化溶液
７０％（ｗ／ｗ）グリセロール。ＢＩＡｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅキットカタログ番号ＢＲ−１００２−５１の一部、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ。ＢＩＡ保存キットは４℃に保存した。
【０１５１】
アミンカプリングキット
カタログ番号ＢＲ−１０００−５０、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ。
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）。蒸留水で７５ｍｇ／ｍＬとし、−７０℃で２００μＬずつ保存した。
Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）。蒸留水で１１．５ｍｇ／ｍＬとし、−７０℃で２００μＬずつ保存した。
１Ｍのエタノールアミンハイドロクロライド−ＮａＯＨ  ｐＨ８．５。−７０℃で２００μＬずつ保存した。
【０１５２】
緩衝液
泳動緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０が存在している）。カタログ番号ＢＲ−１００１−８８、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ。緩衝液は４℃に保存した。
固定化緩衝液：アセテート５．０（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０が存在している）。カタログ番号ＢＲ−１００３−５１、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ。緩衝液は４℃に保存した。
【０１５３】
リガンドキャプチャ
Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）カタログ番号１０９−００６−０９８。試薬は４℃に保存した。
【０１５４】
分析物
組換え型ヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｏｘｏｎ．カタログ番号２０６−ＩＬ−０５０、ロット番号Ａ１３１４０２Ａ）は−７０℃に保存し、各アッセイ用に一度解凍した。
【０１５５】
組換え型カニクイザルＩＬ−６及び組換え型アカゲザルＩＬ−６は、ＣＨＯ細胞の一過性のトランスフェクションにより作成した。この物質は、未精製の定量化されていない細胞培養上清として使用した。
【０１５６】
再生溶液
４０ｍＭ  ＨＣｌは１１．６Ｍストック溶液（ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ。カタログ番号１０１２５４Ｈ）から蒸留水で希釈して調製した。
５ｍＭ  ＮａＯＨは５０ｍＭのストック溶液から蒸留水で希釈して調製した。
カタログ番号ＢＲ−１００３−５８、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ。
【０１５７】
アッセイ方法
ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ相互作用分析）は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いて実施した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカプリング化学によって約５０００の応答単位（ＲＵ）のキャプチャレベルにＣＭ５センサーチップ上に固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を、流速１０μｌ／分で泳動緩衝液として使用した。４μｇ／ｍＬでＣＡ０３０＿２４０．ｇ１の１０μｌ注入を、固定した抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃによるキャプチャのために使用した。流速３０μＬ／分で種々の濃度において、捕獲したＣＡ０３０＿２４０．ｇ１についてヒトＩＬ−６を滴定した．４０ｍＭ  ＨＣｌを１０μＬ注入し続いて流速１０μＬ／分で５ｍＭ  ＮａＯＨを５μＬの注入して表面を再生した。
【０１５８】
バックグラウンドサブトラクション結合曲線を、標準的方法に従ってＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．２）を用いて分析した。キネティックパラメータ（Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は、フィッティングアルゴリズムから決定した。
【０１５９】
ＣＡ０３０＿２４０．ｇ１の１つのバッチをこの研究で使用した。親和性は２０ｎＭ又は２０ｎＭ未満のヒトＩＬ−６濃度で測定した。ＣＡ０３０＿２４０．ｇ１に対して決定された親和性値は９．０２〜１０．５０ｐＭの範囲であり、９．７６±０．７４ｐＭの平均±標準誤差を有した（表１．１）。ＩＬ−６を固定することは固有のコンフォメーションの喪失を生じるので、ＢＩＡｃｏｒｅチップに固定されたヒトＩＬ−６との親和性を測定することは不可能であった。
【０１６０】
カニクイザル又はアカゲザルのＩＬ−６を定量化することは不可能であったので、ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１とＩＬ−６の相互作用に関する正確なキネティックパラメータを決定することも不可能であった。しかし、結合センソグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）の目視検査では、ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１は、ヒトＩＬ−６に対する親和性と類似した親和性で、これらヒト以外の霊長類のＩＬ−６に結合することを示している。
【０１６１】
表１．１：ヒトＩＬ−６に対するＣＡ０３０＿２４０．ｇ１の親和性。
【表１】
2009518023.tif 000003
【０１６２】
（実施例５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける中和アッセイ
抗体ＣＡ０３０  ００２４０．ｇ１（以後２４０．ｇ１と略記する）の効力を、２つの異なるアッセイを用いて測定した。第１のアッセイは、マウス、アカゲザル、カニクイザル及びヒトＩＬ−６に応答して増殖するＴ１１６５と呼ばれるマウスＩＬ−６依存性細胞系を用いた。細胞表面ＩＬ−６レセプターへのこの直接的なＩＬ−６のシグナル伝達は、ｇｐ１３０と呼ばれるシグナル伝達レセプターサブユニットと共に、シスシグナル伝達（ｃｉｓ−ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）と名づける。第２のアッセイには、単核細胞ケモアトラクタント（ｃｈｅｍｏａｔｒａｃｔａｎｔ）タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の産物である読み出し物と共に、ＩＬ−６と可溶性のＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）で刺激したヒト臍静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用した。このアッセイでは、ＩＬ−６は外部から添加するか又はサイトカインであるインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）でＨＵＶＥＣを刺激することにより産生することもできた。これらの２つのアッセイの変形は、ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６Ｒをどちらも外部から添加するとき、ＨＵＶＥＣはＩＬ−６Ｒを発現しないで応答のみができる、すなわちＭＣＰ−１を産生できるので、トランス−シグナル伝達（ｔｒａｎｓ−ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）と名づけた。
【０１６３】
これらの種々のアッセイを用いて、ヒト（組換え型及び天然型）、アカゲザル、カニクイザル及びマウスのＩＬ−６に対する２４０．ｇ１のＮＤ５０（中和用量５０％）値を作成することができた。
【０１６４】
材料
培地
Ｔ１１６５培地−１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）及び１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え型ＩＬ−６、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫを補充したＲＰＭＩ１６４０。
【０１６５】
ＨＵＶＥＣ培地−大血管内皮細胞基礎培地（ＬＶＥＣＢＭ）ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ、ＵＫ、大血管血管内皮細胞増殖補充物ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ、ＵＫ及び抗生物質補充物ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ、ＵＫ。
【０１６６】
インハウスで作成したＰＢＳ中、濃度６．８３ｍｇ／ｍｌのＣＡ０３０  ００２４０．ｇ１。ヒトＩＬ−６  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ、ヒト哺乳動物由来のＩＬ−６（インハウスでヒトＩＬ−６  １００１７１０８／６７でトランスフェクションしたＣＨＯ由来）、アカゲザルＩＬ−６（インハウスでアカゲザルＩＬ−６  １００１７１０８／６７でトランスフェクションしたＣＨＯ由来）、カニクイザルＩＬ−６（インハウスでカニクイザルＩＬ−６  １００１７１０８／６７でトランスフェクションしたＣＨＯ由来）、マウスＩＬ−６  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ。抗ヒトＭＣＰ−１捕捉抗体（５５５０５５）及び抗ヒトＭＣＰ−１検出抗体（５５４６６４）及びヒト組換え型ＭＣＰ−１（８９０２２５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＭＤＥＸ）Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ。トロンビン  Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ。
ｓＩＬ−６Ｒ  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ。ヒトＩＬ−１７  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ。
Ｔ１１６５アッセイ−ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＡ。
ＴＭ  Ｂｌｕｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＧＡ）。
【０１６７】
Ｔ１１６５細胞のＩＬ−６依存性増殖を用いる２４０．ｇ１活性の測定
Ｔ１１６５細胞は、使用の４日前に解凍し、１０％ＦＣＳ、抗生物質、グルタミン及び１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６補充ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞生存率は、トリパンブルー排除を用いてモニターし、少なくとも９０％生存可能であると考えられる細胞のみを使用した。使用前に細胞をヒトＩＬ−６の非存在下でＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した。次いで細胞を計数し、ウェル当り５×１０４／細胞の密度で９６穴平底プレートに供給した。別々のプレートで、２４０．ｇ１の階段希釈を、固定濃度１ｎｇ／ｍｌ（０．０３８ｎＭ）のヒト組換え型、ヒト哺乳動物由来（ヒトＣＨＯ  ＩＬ−６とも呼ばれる）、アカゲザル、カニクイザル又はマウスのＩＬ−６のいずれかの存在下でインキュベートした。次いで予め混合した２４０．ｇ１及びＩＬ−６の複合物を、Ｔ１１６５細胞を含むウェルへ移し、湿潤な５％ＣＯ２の雰囲気下で３７℃で４８時間インキュベートした。最後の６時間のインキュベーション中に、２０ｍｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓを添加して増殖している細胞数を測定した。２４０．ｇ１によるＴ１１６５細胞のＩＬ−６依存性増殖阻害を、ＩＬ−６のみで処理したウェルから細胞は含むがＩＬ−６を含まない対照ウェルを引いたパーセンテージ阻害として表した。
【０１６８】
ヒト組換え型、ヒト哺乳動物由来、アカゲザル、カニクイザル及びマウスＩＬ−６に誘発された細胞系Ｔ１１６５の増殖に対する２４０．ｇ１の活性が図３ａに示されている。２４０．ｇ１は、ヒト組換え型、ヒト哺乳動物由来、アカゲザル、カニクイザルのＩＬ−６活性を強力に阻害したが、マウスのＩＬ−６活性は阻害しなかった。
【０１６９】
ヒト組換え型のＩＬ−６に対するＮＤ５０は、１．１±０．５ｎｇ／ｍｌ（７．２６±３．３ｐＭ）であった。ヒト哺乳動物由来のＩＬ−６に対するＮＤ５０は、３．６±２．４ｎｇ／ｍｌ（２３．７６±１５．８４ｐＭ）であった。アカゲザルのＩＬ−６に対するＮＤ５０は、２．２±１．１ｎｇ／ｍｌ（１４．５２±７．２６ｐＭ）であった。カニクイザルのＩＬ−６に対するＮＤ５０は、５．４±１．１ｎｇ／ｍｌ（３５．６４±７．２６ｐＭ）であった。
【０１７０】
ＨＵＶＥＣにおいてＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６レセプターで誘発されたＭＣＰ−１産生を用いる２４０１．ｇ１活性の測定
ＨＵＶＥＣ（ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ、ＵＫ）を大血管内皮細胞基礎培地（ＬＶＥＣＢＭ）中で増殖し、５回を超えない継代培養を行った。使用前に細胞を７５％コンフルエントになるまで増殖した。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて解離し、再懸濁して新鮮なＬＶＥＣＢＭで１回洗浄した。次いで細胞を計数して、ウェル当り２×１０４／細胞の密度で９６穴平底プレートに投与した。続いて細胞を湿潤な５％ＣＯ２の雰囲気下で３７℃で一夜培養した。翌日、細胞をビオチン化トロンビン（３Ｕ／ｍｌ）を補充した新鮮な培地で洗浄して取りのけておいた。別々のプレート中で、２４０．ｇ１の階段希釈を、ヒト組換え型ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ；３．８４ｎＭ）及び５００ｎｇ／ｍｌ（１０．１５ｎＭ）の固定濃度のｓＩＬ−６Ｒの存在下でインキュベートした。さらに、２４０．ｇ１を、ＨＵＶＥＣを刺激してＩＬ−６を産生するヒト組換え型ＩＬ−１７（２５ｎｇ／ｍｌ；１．１８ｎＭ）、及び５００ｎｇ／ｍｌ（１０．１５ｎＭ）の固定濃度のｓＩＬ−６Ｒと共にインキュベートした。次いで予め混合した２４０．ｇ１及びＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−１７／ｓＩＬ−６Ｒの複合物を、ＨＵＶＥＣを含むウェルへ移し、湿潤な５％ＣＯ２の雰囲気下で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、無細胞上清を採取し、ヒトＭＣＰ−１レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した（プロトコルは以下に示す）。２４０．ｇ１によるＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−１７／ｓＩＬ−６Ｒに誘発されたＭＣＰ−１産生の阻害を、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ又はＩＬ−１７／ｓＩＬ−６Ｒで処理されたウェルから細胞を含むが刺激を与えていない対照ウェルを引いたパーセンテージ阻害として表した。さらに、ｓＩＬ−６Ｒ非存在下で添加したヒトＩＬ−６に対する細胞応答を示すために対照を追加した。
【０１７１】
ＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、２μｇ／ｍｌの濃度の抗ＭＣＰ−１捕捉抗体でコートした。プレートを＋４℃で一夜インキュベートし、次いでＰＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）で２回洗浄した。プレートを１時間、ＰＢＳ＋５％ウシ血清アルブミンでブロックした。次いでプレートを、洗浄緩衝液で４回洗浄し、標準物質及び試料を添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、ビオチニル化抗ＭＣＰ−１抗体を１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。プレートをさらに２時間インキュベートした後、４回洗浄した。次いでストレプトアビジン−ＨＲＰの１：５０００希釈を添加し、プレートを３０分間インキュベートした。プレートを最後に４回洗浄し、ＴＭＢ基質を添加した。比色測定は６３０ｎｍで行い、バックグラウンド測定は４９２ｎｍで行った。ＭＣＰ−１濃度は、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＩＩＩソフトウェアに基づき、フォア−パラメータロジスティック曲線（ｆｏｕｒ−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）適合を用いる標準曲線から得た。
【０１７２】
ＨＵＶＥＣにおけるヒト組換え型ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに誘発されたトランスシグナル伝達に対する２４０．ｇ１の活性が図３ｂに示されている。２４０．ｇ１は、ヒト組換え型ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに誘発されたＨＵＶＥＣによるＭＣＰ−１産生を強力に阻害した。このＮＤ５０は、６４±６２ｎｇ／ｍｌ（４２２±４０９ｐＭ）であった。
【０１７３】
ＨＵＶＥＣにおけるＩＬ−１７に誘発された内在性のＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに誘発されたトランスシグナル伝達に対する２４０．ｇ１の活性が図３ｃに示されている。２４０．ｇ１は、ＨＵＶＥＣによるＩＬ−１７に誘発された内在性のＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに誘発されたＭＣＰ−１産生を強力に阻害した。このＮＤ５０は、９３±７０ｎｇ／ｍｌ（６１４±４６２ｐＭ）であった。
【０１７４】
結論
ＩＬ−６シスシグナル伝達アッセイで、２４０．ｇ１はヒト組換え型、ヒト哺乳動物由来、アカゲザル及びカニクイザルのＩＬ−６の生物活性を中和することができるが、マウスのＩＬ−６の生物活性の中和はできなかった。さらに２４０．ｇ１は、組換え型又は内在性のＩＬ−６のどちらかにより誘発されたトランスシグナル伝達ＩＬ−６を中和することができる。
【０１７５】
（実施例６）
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性
ＩＬ−６は、急性期タンパク質を誘発することが知られている。マウスで、最も顕著な急性期タンパク質は血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）である。ヒトＩＬ−６はマウスレセプターに作用することができ、したがってヒトＩＬ−６をマウスに注射することは可能であり、血清中のＳＡＡ産生物を測定できる。
【０１７６】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、サイト３特異的抗ｈＩＬ−６抗体であるＣＡ０３０＿２４０．ｇ１完全ＩｇＧ４を皮下に注射した。２４時間後、マウスに、ｈＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００−０６、ロット番号０２０３Ｂ１６）を３０μｇ／ｋｇで腹腔内に注射した。２０時間後に血液を心臓穿刺で採取し、血清をＥＬＩＳＡ（Ｔｒｉｄｅｌｔａロット番号２２ＫＴ０２２）による血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）を算定するために採取した。図４に示すように、ｈＩＬ−６によるＳＡＡ誘発は、０．３、０．１及び０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で認められる統計的に有意なＳＡＡの減少を伴いＣＡ０３０＿２４０．ｇ１により阻害された。
ｎ＝７〜８／群、ＰＢＳ  ｎ＝６は除く。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔを用いるＡＮＯＶＡによる統計学的分析、＊＊Ｐ＜０．０１  ＩＬ−６単独と比較した。
さらに２つの実験で、ＣＡ０３０＿２４０．ｇ１による０．３及び０．１ｍｇ／ｋｇの用量での有意なＩＬ−６（３０μｇ／ｋｇ）誘発性ＳＡＡ阻害を認めた。
【０１７７】
（実施例７）
ＣＡ０３０  ００２４０．ｇ１のエピトープマッピング
ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１が認識するヒトＩＬ−６上のエピトープを、Ｆａｂ’フラグメントとして２４０．ｇ１を使用しＮＭＲ技術を用いてマップした。これは、ヒトＩＬ−６が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現し、１５Ｎ／１３Ｃ／２Ｈの安定な同位元素で一様に標識されることを必要とした。完全な配列特異的バックボーン共鳴帰属が遊離のＩＬ−６について得られ、ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１のＦａｂ’フラグメントの結合により誘発されたこれらのシグナルの位置の変化が、３Ｄ  ＴＲＯＳＹ  ＨＮＣＯスペクトルを用いて検出された。
【０１７８】
組換え型ヒトＩＬ−６の発現と精製：
ヒトＩＬ−６を、このタンパク質の成熟形態のコード配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター（ｐＥＴ３ｄ）から調製した。タンパク質はＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞で発現し、高収量の不溶性産物をもたらした。１５Ｎ、１５Ｎ／１３Ｃ及び１５Ｎ／１３Ｃ／２Ｈで標識されたＩＬ−６のサンプルを、適切に標識された富栄養培地（Ｃｅｌｔｏｎｅ）で増殖した細胞から調製した。
【０１７９】
ＩＬ−６を、十分に確立された方法を用いて形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から精製した。最初に培養培地のうちの１１から採取した細胞を、４０ｍＬの緩衝液Ａ［１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、２５％（ｗ／ｖ）スクロース、溶解プロテアーゼインヒビター錠剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）］に再懸濁した。１０ｍＬの緩衝液Ｂ［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍｌのリソチーム］を添加し、この懸濁液を氷上で時々旋回しながら１０〜３０分間インキュベートした。次いで５０ｍｌの緩衝液Ｃ［１Ｍ  ＬｉＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０］を添加し、懸濁液を２０，０００ｐｓｉで２回フレンチプレスに通した。次いでホモジェネートを４℃で１５分間、１６，０００ｇ  ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを保存した。ペレットを４０ｍｌの緩衝液Ｄ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ、溶解プロテアーゼ錠剤］に再懸濁し、フレンチプレスに通して前記と同様に遠心分離した。この段階を繰り返した。次いでペレットを４０ｍｌの緩衝液Ｅ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ、溶解プロテアーゼ錠剤］に再懸濁し、フレンチプレスに通して前述のように遠心分離する。この段階を繰り返す。最後にペレットを、６ｍＬの６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に溶解し、４℃で３０分間、４８，０００ｇで遠心分離して清澄化した。上清を保存し、可溶化したＩＬ−６を分光光度的に定量した。
【０１８０】
可溶化したＩＬ−６を、２．５ｍｇ／ｍＬ［５Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＧＳＨ、０．２ｍＭ  ＧＳＳＧ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］に希釈し、１時間２５℃でインキュベートした。次いでサンプルを、滴下様式で２５０μｇ／ｍＬ［５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＧＳＨ、０．２ｍＭ  ＧＳＳＧ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］にさらに希釈し、２５℃で３時間インキュベートした。この段階で形成された全ての析出物を、４℃で３０分間、３０，０００ｇで遠心分離して除去する。清澄化した物質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ  ９．０に対して、４℃で最小限１６時間、２回緩衝液を交換して透析した。透析後この溶液を４℃で３０分間、３０，０００ｇで遠心分離して清澄化した。上清を保存し、８ｍＬのｍｏｎｏＱ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）イオン交換カラムにロードし、塩化ナトリウム（０〜１．０Ｍ）の直線濃度勾配を用いて溶出した。リフォールディングされたＩＬ−６を含む分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、次いでプールして２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．５中にろ過分離した。
【０１８１】
ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１のＦａｂ’フラグメントを作成し、精製して２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．５中に調製した。ＩＬ−６とＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１のＦａｂ’フラグメント間の１：１の複合体を、このタンパク質の等モル量を約０．２〜０．６ｍＭの濃度で混合してＮＭＲ分析用に調製した。
【０１８２】
ＮＭＲ分光法：
ＮＭＲ実験は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５（９５％Ｈ２Ｏ及び５％Ｄ２Ｏ）中の０．３５ｍｌのタンパク質及び複合体サンプルで実施した。１５Ｎ／１３Ｃ／２Ｈ標識ＩＬ−６及びＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１の非標識Ｆａｂ’フラグメント間の１：１複合体を、ＮＭＲ分析用にこのタンパク質の等モル量を混合して０．１ｍＭの終濃度を達成することにより調製した。ＮＭＲデータは、遊離ＩＬ−６について及びＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１複合体のＩＬ−６：Ｆａｂ’フラグメントについて、三重共鳴（１５Ｎ／１３Ｃ／１Ｈ）クライオプローブ（ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ）を備えた８００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ分光計で２５℃で得た。標準ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ及びＨＮＣＯスペクトル（Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．とＭｕｅｌｌｅｒ，Ｌ．（１９９３）Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  １０１（２）、２０１；Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．とＢａｘ，Ａ．（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ  ３（２）、１８５〜２０４；Ｍｕｈａｎｄｉｒａｍ，Ｄ．Ｒ．とＫａｙ，Ｌ．Ｅ．（１９９４）Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  １０３（３）、２０３；Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．とＢａｘ，Ａ．（１９９２）Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  ９６（２）、４３２）を、０．９ｍＭの一様に１５Ｎ／１３Ｃで標識したサンプルを用いた遊離ＩＬ−６について、完全な配列特異的フレームワーク共鳴帰属（１５Ｎ、１３Ｃ及び１Ｈ）を作成するために使用した。
【０１８３】
ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１のＦａｂ’フラグメントの結合により誘発されたＩＬ−６フレームワークシグナルの位置の変化が、３Ｄ  ＴＲＯＳＹ−ＨＮＣＯスペクトルを用いて検出された（Ｓａｌｚｍａｎｎ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（２３）、１３５８５〜１３５９０）。全ての３Ｄ  ＮＭＲ実験のための典型的な収集パラメータを表１に示す。
【０１８４】
全てのスペクトルは、３Ｄデータの１５Ｎディメンションにおける有効収集時間を約３０ｍｓに延長するために使用した線型予測を用いてＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏ，Ｆ．ら、（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ  ６（３）、２７７〜２９３）で処理した。軽度の解像度増強を、シフトしたサイン２乗関数を用いて全てのディメンションに適用した。スペクトルの解析は、Ｓｐａｒｋｙを用いて実施した（Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｔ．Ｄ．とＫｎｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．ＳＰＡＲＫＹ  ３．Ｉｎ．、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）。
【０１８５】
Ｆａｂ結合データの解析：
ミニマルシフト法（ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）（Ｆａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｔ．ら、（１９９６）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３（１２）、９９５；Ｍｕｓｋｅｔｔ，Ｆ．Ｗ．ら、（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（３４）、２１７３６〜２１７４３）を、ＣＡ０３０＿００２４０．ｇ１のＦａｂ’フラグメントの結合から生じるＩＬ−６  ＮＭＲシグナルの位置における変化を測定するために使用した。最初に、遊離のＩＬ−６の３Ｄ  ＨＮＣＯスペクトル及びｇ１３２Ｅ０９  Ｆａｂに結合したＩＬ−６の３Ｄ  ＴＲＯＳＹ−ＨＮＣＯスペクトルにおける全てのピークをその中心に選んだ。フレームワーク共鳴の化学シフトの１５Ｎ及び１Ｈの値を、複合体と遊離タンパク質のスペクトル間の温度における差異について補正した（１５Ｎに対して−０．８ｐｐｍ及び１Ｈに対して−０．０５ｐｐｍ）（Ｂａｘｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．とＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ  ９（４）、３５９〜３６９）。遊離及びＦａｂ結合ＩＬ−６間のピークに対する位置における最小の変化は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて、Ｆａｂ複合体のＴＲＯＳＹ−ＨＮＣＯスペクトルで全ての観察されたピークと比較して、遊離タンパク質のＨＮＣＯスペクトルでそれぞれの帰属するピークに対する１５Ｎ、１３Ｃ及び１Ｈにおける組み合わせた化学シフトの差異を算出することにより得られた。組み合わせたアミドプロトン、窒素及び炭素の化学シフトの差異（Δδ）は以下の式（式１）により定義され、ここで△δＨＮ、△δＮ及び△δＣは、比較されたＨＮＣＯピークの一組間の１Ｈ、１５Ｎ及び１３Ｃシフトにおける差異に対応し、αＮ及びαＣは、アミドプロトン、アミド窒素及び炭素の化学シフト範囲における差異を説明するために必要とされる０．２及び０．３３のスケーリングファクターである。個々のＨＮＣＯピークに対する、Ｆａｂ結合により誘発されるミニマルシフトを、最低の可能な組み合わせたシフト値（△δ）と見なした。
【数１】
2009518023.tif 000004
ＩＬ−６上のＦａｂ結合サイト（エピトープ）を同定するために、組み合わせたミニマルシフトに対するタンパク質配列のヒストグラムを、有意に乱れたシグナルを含むＩＬ−６の領域を明らかにするために使用した。個々のアミノ酸に対する組み合わせた化学シフト変化のサイズが、それらのアミノ酸の全てに対する組み合わせた化学シフト変化の平均の閾値プラスその平均の標準偏差の１つ分を超える場合、これらの残基をＦａｂ結合サイトにおける接触可能な残基としてさらなる評価のために選択した。候補の結合サイト残基の位置を、最終的にＩＬ−６の高解像度の構造上で調べ（Ｘｕ，Ｇ．Ｙ．ら、（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６８（２）、４６８〜４８１）、タンパク質表面に位置する残基のみがＦａｂ結合に利用可能であると考えられた。
【０１８６】
２つの異なる閾値、平均ミニマルシフト＋１ＳＤ（０．１４３）及び平均ミニマルシフト＋２ＳＤ（０．２１３）が、Ｆａｂにより結合される残基を同定するために適用された。抗体の結合サイトは、Ｔｒｐ１５７の重要なサイト３サイン残基（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）を含むことが認められた（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００、２１０１〜２１０４）。上述のＢｏｕｌａｎｇｅｒらにおいて使用されたアミノ酸の番号付けを用いて、抗体２４０ｇ．１は、少なくとも以下の残基、Ｓ４７、Ｃ５０、Ｅ９３、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ａ１５３、Ｑ１５６、Ｑ１５９及びＳ１６９に結合することが認められた（平均＋２ＳＤ（０．２１３））。この抗体は以下の残基、Ｃ４４、Ｓ４７、Ｃ５０、Ｓ５３、Ａ５８、Ｅ９３、Ｖ９６、Ｒ１０４、Ｆ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｑ１５２、Ａ１５３、Ｑ１５４、Ｎ１５５、Ｑ１５６、Ｗ１５７、Ｑ１５９、Ｔ１６３、Ｌ１６５、Ｓ１６９及びＥ１７２の全てに結合する可能性がある（平均＋１ＳＤ（０．１４３））。
【０１８７】
また同じ残基が、ＩＬ−６の未処理前駆体のアミノ酸番号付けに基づいて番号を付され得ることは理解されるであろう（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５２３１）。この番号付けを用いて、抗体２４０ｇ．１は少なくとも以下の残基、Ｓ７５、Ｃ７８、Ｅ１２１、Ｒ１３２、Ｆ１３３、Ｅ１３４、Ｔ１７７、Ｋ１７８、Ａ１８１、Ｑ１８２、Ｑ１８７及びＳ１９７に結合する。この抗体は以下の残基、Ｃ７２、Ｓ７５、Ｃ７８、Ｓ８１、Ａ８６、Ｅ１２１、Ｖ１２４、Ｒ１３２、Ｆ１３３、Ｅ１３４、Ｔ１７７、Ｋ１７８、Ｑ１８０、Ａ１８１、Ｑ１８２，Ｎ１８３、Ｑ１８４、Ｗ１８５、Ｑ１８７、Ｔ１９１、Ｌ１９３、Ｓ１９７及びＥ２００の全てに結合する可能性がある。
【０１８８】
表２：ＮＭＲ実験の基本的パラメータ。
【表２】
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１４ｐｐｍの掃引幅及び８５ｍｓのデータ採取時間で、ダイレクト１Ｈディメンション（Ｆ３又はＦ２）を得た。
【０１８９】
本発明を実施例のみにより説明したが、いささかも限定することを意味するものではなく、詳細の変更が特許請求の範囲内になされることが当然理解されるであろう。それぞれの他の実施形態に関しては、本発明の各実施形態の好ましい特徴を準用する。本明細書で引用した特許及び特許出願を含むがこれに限定されるものではない全ての文献の内容は、個々の文献のそれぞれの内容が、具体的且つ個別的に十分に記載されているかのように本明細書中に参考として援用されるように、本明細書中で参考として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】２４０．ｇ１重鎖（図２ａ；配列番号１１）及び軽鎖（図２ｂ；配列番号１３）配列に対する移植片構成を示す図である。記号（｜）は、ドナー：アクセプター：移植されたフレームワーク配列間の相違点を強調している。ＣＤＲには一重下線を付した。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ定義の両方を包含するＣＤＲ−Ｈ１を除き、これらはＫａｂａｔによって定義されている通りである。二重下線を付した配列は、移植片中に保持されたドナーフレームワーク残基である。
【図２ａ】２４０．ｇ１  ＩｇＧ４重鎖の翻訳された配列を示し、イントロン／エキソン境界を示す図である。
【図２ｂ】２４０．ｇ１軽鎖の翻訳された配列を示し、イントロン／エキソン境界を示す図である。
【図３ａ】抗体２４０．ｇ１による、ヒト組換え型、ヒト哺乳動物由来、アカゲザル、カニクイザル及びマウスＩＬ−６に誘発されたＴ１１６５細胞増殖の阻害を示す図である。
【図３ｂ】抗体２４０．ｇ１による、ＨＵＶＥＣにおけるヒト組換え型ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに誘発されたＭＣＰ−１産生の阻害を示す図である。
【図３ｃ】抗体２４０．ｇ１による、ＨＵＶＥＣにおけるＩＬ−１７に誘発された内在性のＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒに誘発されたＭＣＰ−１産生の阻害を示す図である。
【図４】ＣＡ０３０＿２４０．ｇ１（サイト３抗体）の投与（ｎ＝７〜８／群、ＰＢＳ  ｎ＝６を除外する）による、マウスにおけるｈＩＬ−６に誘発されたＳＡＡのｉｎ  ｖｉｖｏ中和を示す図である。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔを用いるＡＮＯＶＡによる統計学的分析、＊＊Ｐ＜０．０１  ＩＬ−６単独と比較した。
【図１】
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【図２ａ−１】
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【図２ａ−２】
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【図２ａ−３】
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【図２ａ−４】
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【図２ｂ−１】
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【図２ｂ−２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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