(57)【要約】  本発明は、驚くべきことに、土壌中、植物中および有機物質の他の形態中に存在する、ある一定の胞子を形成する微生物が、土壌または炭化された木材内で火の過剰な熱の中を生き残ることを発見した。このような微生物が植物成長を刺激し、植物産物の栄養価を増強し、二酸化炭素を取り込むことを同定した。従って、本発明は、土壌および炭化された有機物質から植物成長を刺激する微生物を単離および同定する方法を提供する。本発明はまた、植物成長および栄養的価値を増強するのに有用な組成物および方法を提供する。また、本発明は、ヒトDNAを増強するためにヒト各個人によって消費されるDNA増強植物を産生するのに有用な組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法はまた、土壌を改善するために有用である。本発明はまた、担体として炭を使用して植物成長を促進し、１つの生態系から他の生態系に所望の微生物を移動および再配置するための方法を提供する。
2009518012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファイアクライマックス細菌（fire-climax microbes）の単離に適した炭化された有機物質を産生する方法であって、炭化が前記ファイアクライマックス細菌の胞子が死滅する直前にその範囲まで進行するような条件下で、前記ファイアクライマックス細菌の胞子を含む有機物質を加熱することを含む方法。
【請求項２】
前記加熱が、前記ファイアクライマックス細菌の前記胞子の死滅をもたらすであろう条件とは別に1BTUについての条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記加熱が、約600℃で約10〜15分間にわたって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機物質が、植物物質または海洋廃棄物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
産生された炭化物質からの前記ファイアクライマックス細菌の前記胞子を回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
炭化された有機物質からファイアクライマックス細菌を産生する方法であって、
ａ．前記ファイアクライマックス細菌の胞子を含む炭化された有機物質を増殖培地に接種することと、
ｂ．前記胞子が栄養生長を開始できるように前記増殖培地をインキュベートし、前記ファイアクライマックス細菌を産生すること
を含む方法。
【請求項７】
前記炭化された有機物質が、炭化された植物物質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記炭化された植物物質が、炭である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記炭が、メスキート炭またはアーモンド炭である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭化された有機物質が、炭化された海洋有機廃棄物である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記炭化された有機物質が、約600℃で少なくとも10分間にわたって前記有機物質を加熱することによって産生される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ｃ．前記ファイアクライマックス細菌を前記増殖培地から分離すること
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ｃ．前記増殖培地中において産生された前記ファイアクライマックス細菌から個々の株を単離すること、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
土壌サンプルからファイアクライマックス細菌を単離する方法であって、
ａ．前記土壌サンプルを水と混合し、液体懸濁液を得ることと；
ｂ．前記液体懸濁液を煮沸することと；
ｃ．前記煮沸された懸濁液のアリコートを増殖培地に接種することと；および
ｄ．前記増殖培地を維持して前記ファイアクライマックス細菌の前記培地中での栄養生長を可能にすることと
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
ｅ．前記ファイアクライマックス細菌を前記増殖培地から分離すること
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、
ｅ．前記増殖培地中において産生された前記ファイアクライマックス細菌から個々の株を単離すること、
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ファイアクライマックス細菌を含む組成物であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、組成物。
【請求項１８】
前記ファイアクライマックス細菌が、炭化された有機物質、土壌またはこれらの混合物から単離される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ファイアクライマックス細菌が、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法に基づいて調製される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ファイアクライマックス細菌が、バチルス センス ラト（Bacillus sensu lato）である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ファイアクライマックス細菌が、HAB7、AC9、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
単離されたファイアクライマックス細菌であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、単離されたファイアクライマックス細菌。
【請求項２３】
前記ファイアクライマックス細菌が、炭、土壌またはこれらの混合物から単離される、請求項２２に記載の単離されたファイアクライマックス細菌。
【請求項２４】
HAB7またはAC9として命名された単離されたファイアクライマックス細菌。
【請求項２５】
植物の成長を増強することができるファイアクライマックス細菌を同定する方法であって、
ａ．ファイアクライマックス細菌の胞子を含む炭化された有機物質を増殖培地に接種することと；
ｂ．前記胞子が栄養生長を開始できるように前記増殖培地をインキュベートし、前記ファイアクライマックス細菌を産生することと；
ｃ．ステップｂにおいて産生された前記ファイアクライマックス細菌から個々の株を単離することと；
ｄ．植物成長を増強する前記個々の株の能力を決定することと；
ｅ．植物成長を増強するファイアクライマックス細菌の株を同定することと
を含む、方法。
【請求項２６】
前記炭化された有機物質が、炭化された植物物質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記炭化された植物物質が、炭である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記炭が、メスキート炭またはアーモンド炭である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記炭化された有機物質が、炭化された海洋廃棄物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記炭化された有機物質が、約600℃で少なくとも10分間にわたって有機物質を加熱することによって産生される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
植物成長を増強することができるファイアクライマックス細菌を同定する方法であって、
ａ．ファイアクライマックス細菌の胞子を含む土壌サンプルを水と混合し、液体懸濁液を得ることと；
ｂ．前記液体懸濁液を煮沸することと；
ｃ．前記煮沸された懸濁液のアリコートを増殖培地に接種することと；
ｄ．前記胞子が栄養生長を開始できるように前記増殖培地をインキュベートし、前記ファイアクライマックス細菌を産生することと；
ｅ．ステップｄにおいて産生された前記ファイアクライマックス細菌から個々の株を単離することと；
ｆ．植物成長を増強する前記個々の株の能力を決定することと；  植物成長を増強するファイアクライマックス細菌の株を同定することと
を含む、方法。
【請求項３２】
少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を添加された植物培養培地中において植物の栽培品種を成長させることを含む、植物成長および生産力を刺激するための方法であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、方法。
【請求項３３】
前記植物培養培地がまた、炭化された植物物質を添加される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を添加された植物培養培地中において植物の栽培品種を成長させることを含む、植物産物の栄養素または植物化学物質を増加させる方法であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、方法。
【請求項３５】
前記植物培養培地がまた、炭を添加されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記栄養素または植物化学物質が、フラボノイドまたはイソフラボノイドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記栄養素または植物化学物質が、ビタミンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ビタミンが、ビタミンＥ（α-トコフェロールまたはγ-トコフェロール）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物の前記産物中のα-トコフェロールの量が、前記ファイアクライマックス細菌の追加のない状態において成長した植物産物との比較において少なくとも1.3倍まで増加する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記γ-トコフェロールの量が、前記ファイアクライマックス細菌の追加のない状態において成長した植物産物との比較において少なくとも1.3倍まで増加する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記植物が、オリーブ植物またはアーモンド植物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３４に記載の方法によって成長した植物から収穫された栄養的に増強された植物産物。
【請求項４３】
前記植物産物が、アーモンドである、請求項４２に記載の栄養的に増強された植物産物。
【請求項４４】
少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を含む組成物を土壌に添加することを含む、土壌の植物成長を促進する性質を改善する方法であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、方法。
【請求項４５】
第１の土壌中に存在する植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌を、第２の土壌に再配置する方法であって、前記第１の土壌中において生育した植物から炭を得ることと、前記炭を前記第２の土壌に添加することとを含む、方法。
【請求項４６】
第１の土壌中において生育した植物から炭を得ることを含む、前記第１の土壌中に存在する植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌を、第２の土壌に再配置する方法であって、前記炭が前記ファイアクライマックス細菌の胞子を含み、前記胞子の発芽および栄養成長を開始するために前記炭を増殖培地に接種して前記ファイアクライマックス細菌を産生し、かつ前記産生されたファイアクライマックス細菌を前記第２の土壌に添加する、方法。
【請求項４７】
第１の土壌中において生育した植物から炭を得ることを含む、前記第１の土壌中に存在する植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌を、第２の土壌に再配置する方法であって、前記炭が前記ファイアクライマックス細菌の胞子を含み、前記胞子の発芽および栄養成長を開始するために前記炭を増殖培地に接種して前記ファイアクライマックス細菌を産生し、前記ファイアクライマックス細菌の中から前記第１の土壌の植物成長特性を促進する細菌株を同定し、かつ前記同定された細菌株を前記第２の土壌に添加する、方法。
【請求項４８】
第１の土壌の液体懸濁液を煮沸することを含む、前記第１の土壌中に存在する植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌を、第２の土壌に再配置する方法であって、前記ファイアクライマックス細菌の胞子の発芽および栄養成長を開始するために前記煮沸された液体懸濁液のアリコートを増殖培地に接種して前記ファイアクライマックス細菌を産生し、かつ前記産生されたファイアクライマックス細菌を前記第２の土壌に添加する、方法。
【請求項４９】
第１の土壌の液体懸濁液を煮沸することを含む、前記第１の土壌中に存在する植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌を、第２の土壌に再配置する方法であって、前記ファイアクライマックス細菌の胞子の発芽および栄養成長を開始するために前記煮沸された液体懸濁液のアリコートを増殖培地に接種して前記ファイアクライマックス細菌を産生し、前記ファイアクライマックス細菌の中から前記第１の土壌の植物成長特性を促進する細菌株を同定し、かつ前記同定された細菌株を前記第２の土壌に添加する、方法。
【請求項５０】
植物の成長および栄養価を増強する方法であって、炭化された植物物質を補充された植物培養培地中において植物の栽培品種を生育することを含む、方法。
【請求項５１】
土壌の植物成長を促進する性質を改善する方法であって、前記土壌に炭化された植物物質を添加することを含む、方法。
【請求項５２】
前記炭が、少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を含むものから選択され、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４２の植物産物を消費のために動物に提供することを含む、前記動物の免疫系を刺激する方法。
【請求項５４】
請求項４２の植物産物を消費のために動物に提供することを含む、前記動物の微生物叢を増強しかつ健康を促進する方法。
【請求項５５】
植物による太陽エネルギーの転換を増強する方法であって、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の方法によって単離された少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を補充された植物培養培地中において植物の栽培品種を生育することを含む、方法。
【請求項５６】
環境汚染を減少させる方法であって、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の方法によって単離された少なくとも１つのファイアクライマックス微生物を補充された植物培養培地中において植物の栽培品種を生育することを含む、方法。
【請求項５７】
少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を含む組成物を土壌に添加することを含む、非農業地における土壌品質を改善または回復させる方法であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、方法。
【請求項５８】
前記組成物が、炭である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記非農業地が、美しい野生の土地、都市のグリーンベルトまたはゴルフ場である、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は植物成長を刺激する微生物の同定および単離に関する。特に、本発明は、過剰な熱、例えば炭化した植物物質、海洋の廃棄物、および土壌からカプセル化しかつ保護する物質からのファイアクライマックス（fire-climax）微生物の単離に関する。本発明はまた、土壌の改善および修正によって植物成長および栄養上の特性を増強するための微生物の使用に関する。本発明はさらに、微生物の増殖を促進し、かつ所望の微生物を１つの生態系から他の生態系へ移動および再配置するための炭の使用に関する。
【本発明の背景】
【０００２】
辺縁の農地での収穫量を向上させるために使用される従来の農法は、一般に有害な肥料および殺虫剤の過度の使用を利用する。化学肥料は、特に、植物にとってアクセス可能である形態において、窒素、リンおよびカリウム、および他のミネラル分および微量栄養素の源を与える量を増加させるために加えられる。化学肥料は土壌を酸性化し、高レベルの重金属および塩を堆積させた。合成尿素および他の化学物質は、植物にとってアクセスできない必須栄養素およびミネラル分を与えることにより一層のアンバランスを引き起こす。肥料と殺虫剤の過度の使用は、修正した土壌における必須栄養素のアンバランスをもたらし、最終的に農業にとって不適切な土地を与え、極端な場合、植物の命を維持することができなくなる。灌水や雨水は、加えられた肥料および殺虫剤を水路へ浸出させ、その結果、湖、川および他の局所的な水源の富栄養化を引き起こし、実質的に水質汚濁の一因となり、飲料に適さないまたは有毒な水源を生み出す。
【０００３】
有機農法は、環境上の従来の肥料および殺虫剤の悪い効果を軽減するために過去数十年間にわたって導入されてきた。しかしながら、有機農法の慣習は、他の問題をもたらした。例えば、有機農法の中で使用される肥料は、重金属、有機的な汚染物質および微生物の病原体を含むことができる。ロテノン（天然産物から作られ、有機農法の中で使用される殺虫剤)は、ドーパミンを生成するニューロンを破壊し、motordeficitsをもたらす能力を有する。ロテノンが、ラットにおいてパーキンソン病の徴候を生み出すことが示されている(Renner, R. "From Flush to Farm," Scientific American, 10/2002; Karow, J., "Pesticides and Parkinson’s," Scientific American, 11/6/2000; Lozano, A.M. and Kalia, S.K., "New Movement in Parkinson’s: Environmental Culprits," Scientific American, p. 71, 6/27/2005.)。
【０００４】
従って、土壌栄養素において現在のアンバランスを解消し、有毒化学物質のレベルを下げる方法および組成物が必要とされている。そして、周囲の環境への効果を最小限に抑えた自立した農地を作製することが必要とされている。 
「Terra preta」土壌は、その増強された肥沃さおよび生産性のために受賞した高価な土壌である。アマゾン熱帯雨林の一箇所において発見されたこの土壌は、高レベルの有機物および炭素を含む。Terra preta土壌はまた、窒素、リン、カルシウムおよびカリウムの各レベルを含む、より高いレベルの栄養素を含むこと、また、Terra preta土壌以外の土壌よりも多くの栄養素および水分保持能を有していることが観察されている。Sombroek, WG et al., Ambio, 22:417-426 (1966); Smith, N.J.H., Ann. Assoc. Am. Geogr. 70:553-566 (1980); Zech, W., et al., In: McCarthy, P. et al., eds., American Society of Agronomy and Soil Science Society of America, Madison, Wis., pp. 187-202 (1990). Terra preta土壌のように、Terramulata土壌は、暗い灰色がかった褐色の色を示し、高レベルの土壌有機物を含む。
【０００５】
Terra preta土壌の形成に関する数多くの研究にもかかわらず、Terra pretaおよびTerra mulata土壌中の細菌および真菌の正体および機能は、未知のままであった。例えば、Lehmann, J. et al., eds., "Amazonian Dark Earths", Kluwer Academic Publ. (2003)を参照。例えば、科学者らは、炭の普及をTerra preta土壌の重要な要素と認め、また、土壌中に存在する細菌および他の微生物を認知したが、Terra pretaおよびTerra mulata土壌中の細菌および真菌の正体および機能は未知である。例えば、Glaser, B. et al., Biol. Fertil. Soils 35:219-230 (2002); Lehmann et al. (2003).
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、明細書中において参照された、ある胞子を形成するファイアクライマックス（fire-climax）微生物または「ファイアクライマックス細菌（fire-climax microbe）」は、土壌および植物体といった有機物質中に存在し、火災による過度の熱といった極端な条件下でも生き残る。植物体は火災によって死滅するが、これらのファイアクライマックス細菌は胞子を形成し、炭化された植物物質および土壌の絶縁性質によって、土壌や炭化された植物物質といった被包性の物質内で生き残る。そして、いったん条件が有利になれば、土壌および植物体中で再増殖する。
【０００７】
したがって、本発明は、このようなファイアクライマックス細菌(fire-climax microbe)を単離および選択するための再生産可能な方法、ならびにその単離された細菌を提供する。また、これらのファイアクライマックス細菌が植物の成長を刺激し、植物産物の栄養価を増強し、二酸化炭素を取り込むことを促す。本発明は、炭化した木材が、植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌の容器として役立つという独特な認識を提供し、従って、生態系再構築のための植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌を再配置するキャリアとして使用することができる。本発明はまた、「炭(charcoal)」がファイアクライマックス細菌の栄養増殖を促進し、これが胞子形成中に生成される、有害な化学因子の吸着を通してファイアクライマックス細菌を保護することによって実現されることを実証する。さらに、terra preta土壌の顕著な肥沃さは、アマゾンの熱帯林における自然かつ人工の火災が原因であり、広い範囲において炭化された木材が生成され、ファイアクライマックス細菌が生き残りかつ繁栄するということを本発明にしたがって提唱する。炭とファイアクライマックス細菌との関係の新しい理解に基づいて、本発明は、農業によってもたらされた環境的損傷を修正し、かつ火災後の自然のシステムにおいて生じる分子的な自己構築(self-assembly)を開始するための自然のリセットボタンを使用するための方法論を提供する。
【０００８】
一実施態様において、本発明は、ファイアクライマックス細菌の胞子を含む炭化された物質を含む増殖培地を播種し、かつ増殖培地を適切な温度で十分な時間にわたって維持して培地内でファイアクライマックス微生物の栄養増殖をもたらすことによって、炭化された有機物質、特に炭化された植物物質、例えば「炭(charcoal)」からファイアクライマックス細菌を単離する方法を提供する。複数の菌株の混合物およびファイアクライマックス細菌の１つの単離された菌株を得ることができる。
【０００９】
本発明はまた、炭化された物質、特に炭化された植物物質を生成するためのプロセスを提供する。このプロセスは、自然の火災における条件を模擬し、かつファイアクライマックス細菌の再現性のある単離および選択を可能にする。特定の実施態様において、このプロセスは、炭化が安定な細菌の死滅前に進行するような条件下で有機物質を加熱または燃やすことを含む。例えば、加熱は、ある温度で一定時間にわたって行うことができる。この加熱は、安定な細菌の死滅をもたらすであろう温度および時間とは別に(away from)約１ＢＴＵになる。好ましい実施態様において、このプロセスは、少なくとも200℃、または少なくとも400℃、より好ましくは600℃の温度で、約５〜約２０分、好ましくは約１０〜約１５分にわたって植物物質を加熱または燃やし、炭化された植物物質を生成することを含む。
【００１０】
他の実施態様において、本発明は、ファイアクライマックス細菌の胞子を含有する土壌の懸濁液を煮沸し、増殖培地を煮沸された懸濁液のアリコートに播種し、かつ培地内でのファイアクライマックス細菌の栄養増殖を可能にするのに十分な時間にわたって適切な温度で増殖培地を維持することによって、ファイアクライマックス細菌を土壌から単離するための方法を提供する。
【００１１】
さらなる実施態様において、本発明は、植物成長を刺激するファイアクライマックス細菌株を同定するための方法を提供する。ファイアクライマックス細菌の個々の菌株は、土壌または炭から単離され、植物成長を刺激する能力についてスクリーニングされる。
【００１２】
さらに他の実施態様において、本発明は、少なくとも200℃または約600℃またはそれ以上の高温まで生き残る胞子を産生する単離されたファイアクライマックス細菌を提供する。好ましいファイアクライマックス細菌には、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）、特に「ＨＡＢ７」の単離株、およびバチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）、例えばＡＣ９の単離株が含まれる。
【００１３】
一実施態様において、本発明は、少なくとも200℃または約600℃の温度で生き残る胞子を生成するファイアクライマックス細菌を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、植物成長を増強し、土壌品質を向上させるのに役立ち、かつ肥料組成物として製造することができる。
【００１４】
他の実施態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を追加した植物培養培地において植物の栽培品種を育てることによって植物成長を増強する方法を提供する。
【００１５】
また、他の実施態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を追加した植物培養培地において植物の栽培品種を育てることによって栄養的に増強された植物産物を産生する方法を提供する。
【００１６】
さらなる実施態様において、本発明は、炭を追加した植物培養培地において植物の栽培品種を育てることによって植物の成長および／または植物の栄養的価値を増強する方法を提供する。好ましくは、当該方法において使用される炭は、所望のファイアクライマックス細菌を含むために選択される。
【００１７】
本発明の方法に基づいて生成された植物および植物産物は、本発明の他の実施態様を形成する。本発明によって生成された植物産物は、これらを経口摂取する動物にとって有益である。なぜなら、ファイアクライマックス細菌は、植物中の植物化学物質の含量を増加させ（例ＸおよびＸＩ）、かつ動物の免疫系を刺激すると考えられているからである。
【００１８】
さらなる実施態様において、本発明は、土壌の植物成長を刺激する特性を向上させ、かつファイアクライマックス微生物を使用することによって土壌中における生物多様性を増加させるための方法、あるいは本発明に従って同定されたファイアクライマックス微生物を含む組成物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、植物による太陽エネルギーの転換を増強するための方法、および植物によるミネラル栄養利用の効率を増強することによって汚染を減少させるための方法を提供する。
【００２０】
本発明のファイアクライマックス微生物および／またはファイアクライマックス微生物を含有する炭はまた、美しい野生の土地、都市のグリーンベルトおよびゴルフ場を含む、非農業的土地に導入することができる。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
開示の明瞭性のために、本発明の詳細な説明は、本発明の一定の特徴、実施態様または用途を記載する以下のサブセクションに分けられる。
【００２２】
本発明のファイアクライマックス細菌の特徴
用語「ファイアクライマックス細菌（fire-climax microbe）」は、本明細書中に使用されるように、高度に進化した、胞子を形成する細菌であり、植物と有益に関連し合い、かつ火との特別な関係を有する。ファイアクライマックス細菌は、環境の変化に適合する能力を有し、かつ生命維持条件と通常結び付く温度よりも高温の状態に耐える胞子を産生する。全てのファイアクライマックス細菌は、炎がこれらの細菌を通過したとき、例えば200℃、400℃、あるいは600℃もの土壌中において生き残る。多くのファイアクライマックス細菌は、ピロロ化された（pyrrolized）炭素基質、例えば、炭または炭化された植物物質の他の形態の中において、および、より高温（例えば、500℃または600℃でさえも）で加熱することによって生成された、炭化された有機物質の他の形態の中において見出すことができる。
【００２３】
本発明によれば、ファイアクライマックス細菌は、４つの利益を火から導く。第１に、火は、胞子の壁を弱くし、その後に胞子の発芽を誘発させるために必要とされる水分の吸い込みを可能にする。第２に、火は、胞子形成を支持する化学因子を吸収することによって栄養成長を持続する状態においてファイアクライマックス細菌を維持する炭を生成する(Gonzalez-Pastoretal.,Science301:510-513,2003)。従って、即時の細菌増殖を促進する。第３に、火は、ファイアクライマックス細菌で競合する多くの微生物を殺す。最後に、火は、植物物質からミネラル栄養分を遊離することによってファイアクライマックス微生物のための繁殖性のプラットフォームを作り出す。ファイアクライマックス微生物の集団は、新しい植物根においてコロニーを形成することによって火災後に繁栄する。最終的に、火−炭の産物、高い栄養レベル、および減少した競合生物の消失によって、ファイアクライマックス細菌は胞子を形成し、火の次のサイクルまで休眠し、再成長が起こる。この意味において、ファイアクライマックス細菌は、火災後に芽生えかつ力強く生育する一般に知られるファイアクライマックス植物種の微生物版ということができる。
【００２４】
本発明によれば、ファイアクライマックス細菌は植物体内に存在し、植物成長および保護のための重要な植物化学物質の産生を刺激することによって宿主植物に利益を与える。さらに、ファイアクライマックス細菌は、根の浸出および呼吸を含む、植物中の重要な代謝経路を刺激し、炭素が地上の植物器官から根に流れるのを助ける。この根の成長の刺激は、ミネラル栄養素および水の能力を増加する。さらに、様々なファイアクライマックス細菌は、Ｎ２をアンモニアに還元し、植物病原体の増殖を阻害し、リン酸塩を可溶化し、かつ二酸化炭素を組み込むことによって植物成長を刺激する。任意の特定の理論によって結び付けられることなく、植物上のファイアクライマックス細菌の刺激効果が後成的に達成されると考えられる。ファイアクライマックス細菌は、宿主植物において選択された遺伝子の発現を上方制御してもよく、例えば、増強された成長および植物化学物質の産生によって特徴づけられる、「遺伝子増強された」または「DNA増強された」植物をもたらす。Grant-Downton and Dickinson, Annals Botany 96: 1143-1164 (2005), Part 1; and Annals Botany (October, 2005), Part 2.による後生学のレビューを参照されたい。
【００２５】
さらに、本発明によれば、ファイアクライマックス細菌はまた、未使用の土壌中にも存在する。火に通している間の胞子としてのファイアクライマックス細菌の生き残りと、水分の存在下における後の増殖のために、新しい植物根をコロニーとするためのラインの上部にファイアクライマックス細菌を配置する。
【００２６】
ファイアクライマックス細菌の単離および同定
一実施態様において、本発明は、炭化された有機物からファイアクライマックス細菌を単離する方法を与える。
【００２７】
有機物は、(1)ファイアクライマックス細菌、(2)それらのDNA、および(3)例えば、炭素ならびに生きている生物体と関連した他の元素、例えば、酸素、水素および窒素からなる不活性な基質を含む、生物学的起源の物質である。ファイアクライマックス細菌を単離するのに適した有機物の例は、植物物質、大洋の廃棄物質、例えば魚粉および藻類および土壌から誘導された有機物質を含む。
【００２８】
炭化は、有機物を炭素を主として含む残留物に転換することを意味する。一般に、このような残留物は、多環式、芳香族炭素分子の混合物で構成されている。
【００２９】
特定の実施態様において、炭化された物質は、炭である。炭は、自然から得ることもできるし、あるいは当業者に既知の多くの方法によって人工的に産生することもできる。例えば、炭は、現代において乾燥した木材から産生することができ、効率的なダンパーシステムを有する低放射の薪ストーブになる。この目的に適した１つのストーブは、20"×20"×15"(W×D×H)の内寸を有する。オペレーターは、分割された赤色木、マツやオークの分割された木材を使用して火入れを行って火を起す。マツやオークの木材は、数回にわたって補給されるべきであり、ストーブを十分に加熱し、かつ炭素の適切な床を生み出すために完全に開放されたダンパーで燃焼されるべきである。約３〜４時間後、おおよそ5"の深さまで炭素を成長させる床が、ストーブの底に存在すべきである。
【００３０】
炭を生成するための木材は、未処理であっても分割したものであってもよいが、経験上は未処理の木材が高い収量の炭を与える。炭の生成のために選択された３〜４本の木材は、完全に開いたダンパーで燃えている（オレンジ色に輝く）石炭上に配置されるべきである。新しい薪は、典型的には約１０分以内に炎に包まれる。これは木材の水分量に依存しており、強力な炎が約２０分以内にもたらされるべきである。全ての薪が炎に包まれてから数分間、ダンパーは酸素の利用可能性を減少させるために完全に閉じられるべきである。炎は、すぐに弱まり、薪が炭になって同時に燃える。薪を含むストーブは、本明細書中において記載された条件下で、さらなる管理をすることなく終夜にわたって維持することができる。次の日の朝、ストーブは冷却され、炭になった残りの薪が残る。炭になった薪が、より小さくなった炭の断片に破壊される。
【００３１】
重量単位の炭の収量は、非常に可変的である。経験を積んだ炭焼き人であれば25％の収量を得ることができるが、本明細書中に記載された条件下でのより典型的な収量は、約15〜20％である。
【００３２】
炭内部のファイアクライマックス細菌を遊離させるために、炭の粉末（直径約2mm〜15mmのダスト状粒子)を、より大きな炭の塊から分離する。その後、細かい炭粒子を、細菌培養に適した任意の培地から選択された増殖培地に接種する。接種は、液体の増殖培地へ炭粒子を直接加えることにより達成することができる。代わりに、固体の増殖培地を使用することもでき、その場合には、炭粒子は培地の調製の間に、およびその凝固(例えば、培地がオートクレーブ処理された直後)に先立って増殖培地に加える。その後、炭粒子で接種を受けた増殖培地は、培地内のファイアクライマックス細菌の栄養成長を可能にするのに十分な時間にわたって5℃〜55℃の範囲の適切な温度で維持される。このように産生されたファイアクライマックス細菌は、さらなる使用のために増殖培地から容易に分離することができる。
【００３３】
所望の場合、ファイアクライマックス細菌の個々の種類も単離することができる。例えば、培地が凝固する前に、炭粒子は、増殖培地の液体の懸濁液に加えることができる。プレート上の単一のコロニーを得るために、炭は、約0.5％から約10％までの濃度の液体懸濁液に好ましくは約1％から約5％、より好ましくは約3％(w/v)添加される。その後、培地の懸濁液は、ペトリ皿に注がれ凝固する。個々のファイアクライマックス細菌株を表わす単一のコロニーは、プレート上で発展し、さらなる使用または分析のために回収することができる。コロニーの16S rDNAをシークエンスすることによって種レベルでファイアクライマックス細菌を同定することができる。
【００３４】
他の実施態様において、ファイアクライマックス微生物を単離するための炭化された物質は、炭化が前記火に安定な細菌が死滅する直前にその範囲まで進行するような条件下で、前記ファイアクライマックス微生物または胞子を含む有機物質（例えば、断片化された樹皮組織および植物の木部、または海洋有機廃棄物）を加熱することによりもたらされる。例えば、その加熱は、前記火に安定な細菌の死滅をもたらすであろう条件とは別に1BTUについての条件下で行うことができる。
【００３５】
特定の実施態様において、有機物質、例えば、断片化された樹皮組織および植物の木部、または海洋有機廃棄物は、非常に高温(すなわち熱処理)で加熱、例えば、約600℃で一定の時間、好ましくは約10〜15分、最も好ましくは600℃で10分間にわたって加熱される。一貫して完全な炭化を達成するために、加熱プロセスは、後述する例IIIにおいて例証されるように、小さなチャンバーを有する炉を使用して行うことができる。例IIIの木材は、燃え尽きさせることができるが、炭化プロセスは約10分で停止させ、細菌が死滅する（すなわち、回収された次のサンプル（600℃で15分間にわたって加熱）中に生きた胞子が残らない）直前に細菌胞子を回収する。
【００３６】
「約600℃」とは、585℃〜615℃の範囲における温度、好ましくは590℃〜610℃、またはより好ましくは595℃〜615℃の温度を意味する。炭化の所望の程度を達成するために必要とされる正確な温度（すなわち、火に安定な細菌が死滅する直前)は、火に安定な細菌を被包する有機物質の、特定の密度、含水率、数または量、均一度、形、大きさ、濃度、化学組成、酸素レベル、圧力、化学処理(もしあれば)に依存するであろう。
【００３７】
温度と時間を含む熱の条件は、出発原料のおよそ10〜20％重量の残留物を得られるようにすべきである。本発明に関して、熱の条件は、有機物からファイアクライマックス細菌を遊離するか、回収するか、単離するか、得るのに必要なエネルギーによって適切に定義されてもよい。定式（温度をかけた時間）は、有機物からファイアクライマックス細菌を遊離するか、回収するか、単離するか、得るのに必要なエネルギーに比例する。600℃で10分間にわたる有機物質の熱処理が、ファイアクライマックス細菌を遊離するか、回収するか、単離するか、得るのに必要なエネルギーの100％を供給する場合において、同じ温度で、5分または15分間にわたる有機物の熱処理は、それぞれ50％および150％のエネルギー値を与えるであろう。従って、本発明によれば、有機物からファイアクライマックス細菌を遊離するか、回収するか、単離するか、得るのに適切な熱の条件は、例えば、51％〜149％のエネルギーを供給するものである。
【００３８】
炭に関して前述したように、得られた炭化物質は、その後に細菌の培養に適した増殖培地に接種するために使用される。
【００３９】
他の実施態様において、本発明は、土壌からファイアクライマックス細菌を単離する方法を与える。この実施態様に従って、土壌は、例えば1:1(v/v)の比率で、水で懸濁することができる。その後、懸濁液は、煮沸溶液中に約2〜4分間、好ましくは約3分間にわたって静置される。アリコートは懸濁液から得られ、細菌増殖に適した固体の増殖培地上に静置される。このような増殖培地の一例は、TY培地（Bacto Tryptone (5 g/1), Bacto Yeast Extract (3 g/l) および CaCl2 (1.3 g/l), Bacto Agar (15 g/l))である。個々の細菌のコロニーは、固体の増殖培地上で発達し、単一の細菌株を得るのに必要な場合、さらに２次培養することができる。
【００４０】
上述したように単離された細菌は、植物成長と生産性を増強する能力のために、さらにスクリーニングすることができる。植物成長と生産性は、苗条乾重量、種子産出、根の成長、および／または果物の収量または大きさに基づいて決定することができる。実験培地上で使用することができる植物には、土壌中で育てられる全ての植物が事実上含まれる。典型的な植物には、日用的な穀物作物（例えばトウモロコシ、コムギおよびダイズ)およびモロコシが含まれる。他の例には、結実およびナッツ成木(例えばアーモンド)、ダイズ、ピーナッツ、ブドウ、リンゴ、ベリー(イチゴ、ブラックベリー、ラズベリー)、塊茎(例えばジャガイモ、サツマイモ)、トウモロコシ、穀物(例えばコムギ、コメ、ライムギ)、トマト、タマネギ、ウリ科の植物(例えばスイカ、キュウリおよびカンタロープ)、葉菜(例えばレタス、ホウレンソウ、エンダイブ)、綿および他の日用的な作物を含む、生の農業作物が含まれる。
【００４１】
ファイアクライマックス細菌の単離された株
他の実施態様において、本発明は、上述した本発明の方法に基づいて単離されたファイアクライマックス細菌を提供する。
【００４２】
本発明の方法によって単離されたファイアクライマックス細菌は、少なくとも200℃または約600℃の高温に耐える胞子をもたらす細菌である。そのようなファイアクライマックス細菌は、バチルス センス ラト（Bacillus sensu lato）の種、例えば、バチルス フシホルミス（Bacillus fusiformis）、バチルス スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）、バチルス シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス シンプレキス（Bacillus simplex）、バチルス ニアシニ（Bacillus niacini）、バチルス スファエリクス（Bacillus sphaericus）、バチルス アミルオリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス インソリツス（Bacillus insolitus）、バチルス プシクロズランス（Bacillus psychrodurans）、バチルス スポロテルモズランス（Bacillus sporothermodurans）、ブレビバクテリウム フリゴリトレランス（Brevibacterium frigoritolerans）、パエニバチルス アゾトフィキサンス（Paenibacillus azotofixans）、パエニバチルス アミルオリチクス（Paenibacillus amylolyticus）、パエニバチルス ラウツス（Paenibacillus lautus）、ブレビバクテリウム エスピー.（Brevibacterium spp.）、ブレビバチルス エスピー.（Brevibacillus spp.）、パエニバチルス エスピー（Paenibacillus spp.）、ゲオバチルス エスピー（Geobacillus spp.）、アリシクロバチルス エスピー（Alicyclobacillus spp.）、スルホバチルス エスピー（Sulfobacillus spp.）、アンモニフィルス エスピー（Ammoniphilus spp.）、および アノイリニバチルス エスピー（Aneurinibacillus spp.）であると考えられている。
【００４３】
単離したファイアクライマックス細菌の例は、メスキート炭(図１)から単離されたもの、特に、CP1-2、CP1-6、CP1-13およびCP1-14として指定された4つの単離株を含む。これらの4つの単離株の16S rDNA配列には、Genbankにおける配列と97％を超えて一致するものはなかった。
【００４４】
単離したファイアクライマックス細菌のさらなる例は、アーモンド炭（図３Ａ〜３Ｂ)から単離されたもの、特に、「C17304 AC23con」として指定された単離株である。「C17304 AC23 con」(図３Ｂ)は、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）であると決定され、スペクチノマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに対する耐性を有する。
【００４５】
単離したファイアクライマックス細菌の他の例は、土壌から単離された「ＨＡＢ７」である。「C17304 AC23 con」と同様、「ＨＡＢ７」はまた、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）の株であり、スペクチノマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに対する耐性を有する。「ＨＡＢ７」および「C17304 AC23 con」は、１つおよび同一の単離株であると考えられる。「C17304 AC23con」を含む炭は、「ＨＡＢ７」が単離されたのと同じ土壌中で成長するアーモンド樹木から作られた。さらに、「ＨＡＢ７」および「C17304 AC23 con」は、分析対象となったそれらの16S rDNA配列(500bp)において同一である。さらに、「ＨＡＢ７」および「C17304 AC23 con」は、同じ抗生物質に対する耐性を共有し、すなわち、スペクチノマイシン(25μg/mL)、テトラサイクリン(1μg/mL)およびクロラムフェニコール(2.5μg/mL)の組み合わせに対する耐性を示す。
【００４６】
本発明の好ましいファイアクライマックス細菌は、植物成長を増強するために決定されるものであり、また、炭素固定をすることができ、それは、例えば、HAB7、C17304 AC23conである。
【００４７】
細菌株HAB7およびAC9は、2006年11月7日にthe American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108に寄託された。 
ファイアクライマックス細菌を含む組成物
炭および上述したような土壌から調製されたファイアクライマックス細菌は、植物成長を増強し、土壌を向上させるのに役立つ組成物を調製するために使用することができる。従って、本発明は、本発明の方法によって単離された少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を含む植物肥料組成物および土壌改善組成物を与える。
【００４８】
「少なくとも１つのファイアクライマックス細菌」とは、単一のファイアクライマックス細菌株、または多数のファイアクライマックス細菌の組み合わせ(すなわち、少なくとも２以上)を意味する。例えば、組成物は、ファイアクライマックス微生物の胞子を含む炭を増殖培地に接種し、かつファイアクライマックス微生物の栄養成長を開始させる時間にわたって増殖培地をインキュベートすることによって産生されたファイアクライマックス細菌の混合液を含むことができる。本発明の組成物を調製するためにファイアクライマックス細菌の個々の株を単離する必要は必ずしもない。しかしながら、好ましい実施態様において、一以上の単離されたファイアクライマックス細菌株が、植物成長を増強するためのまたは土壌を改善させるための組成物を調製するために使用される。本発明の組成物で使用される特に好ましいファイアクライマックス細菌は、植物成長を増強することが明らかになったものであり、例えばHAB7およびAC9である。特定の実施態様において、組成物は、HAB7およびAC9の両方を含む。
【００４９】
細菌に加えて、本発明の組成物は、炭を含むことができる。炭は、独立してファイアクライマックス細菌の栄養成長を促進するために本発明によって示された。これはまた、植物成長を刺激する。
【００５０】
本発明の組成物はまた、肥料組成物において使用するために適した他の組成または成分を含むことができる。
【００５１】
植物成長を増強し、かつ土壌を改善させる方法：
一実施態様において、本発明はまた、本発明のファイアクライマックス細菌の使用により植物成長を増強する方法を与える。植物の栽培品種は、増強された増殖を達成するために本発明の少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を補充された植物培養培地において成長する。
【００５２】
本発明によれば、ファイアクライマックス細菌は、植物成長と生産性を増強するのに有効な量において土壌のような植物培養培地または合成培養培地に加えられる。例えば、ファイアクライマックス細菌は、2×10７〜2×1011CFU/ft2、または好ましくは2×10８〜2×101０CFU/ft2、またはより好ましくは約2×10９CFU/ft2での播種前、中または後に土壌に添加される。ファイアクライマックス細菌は、任意の適切な様式（ファイアクライマックス細菌を含む粉末または液体懸濁液を噴霧することを含む）において胞子または細胞の形状において培養培地に接種することができる。当業者は、植物成長を促進するのに効果的である、正確な量のファイアクライマックス細菌および接種のタイミングおよび頻度を容易に決定することができる。増強された植物成長は、ファイアクライマックス細菌を添加しない、それ以外は同一の培地で育てた植物と比較した、増加した苗条乾重量、種子収量、根の成長および／または果実の収量／大きさに基づいて決定することができる。
【００５３】
本発明によれば、様々な植物の成長を、本発明の方法を実施することによって増強することができる。ここでいう、様々な植物には、これらに限定されるわけではないが、例えば、穀物作物（例えばトウモロコシ、コムギおよびダイズ)、モロコシ、結実およびナッツ成木（例えばアーモンド）、ダイズ、ピーナッツ、ブドウ、リンゴ、ベリー（イチゴ、ブラックベリー、ラズベリー）、塊茎（例えばジャガイモ、サツマイモ）、トウモロコシ、穀物（例えばコムギ、コメ、ライムギ）、トマト、タマネギ、ウリ科の植物（例えばスイカ、キュウリおよびカンタロープ）、葉菜（例えばレタス、ホウレンソウ、エンダイブ）、綿および他の日用的な作物が含まれる。
【００５４】
他の実施態様において、植物の栽培品種は、栄養的には増強された植物産物をもたらすために本発明の少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を補充された植物培養培地において成長する。
【００５５】
「栄養的には増強された植物産物」とは、本発明の少なくとも１つのファイアクライマックス細菌の存在下において生育した植物産物が、ファイアクライマックス細菌(複数可)が存在しない状態において生育した植物産物と比較して、植物化学物質または栄養素の増加した量をもつことを意味する。植物産物には、消費を目的とした植物の任意の一部分、例えば根、幹、葉、汁、果実、油または花が含まれる。
【００５６】
用語「植物化学物質」は非栄養植物物質についての総称である。多くの植物化学物質、および消費後のそれらの転換産物が、疾病に対して保護的であることが示されている。植物化学物質には、例えばカロテノイド、酸化防止剤（例えばフラボノイド）、およびトコフェロール(例えばαおよびγ-トコフェロール)が含まれる。
【００５７】
特定の実施態様において、増加した栄養素または植物化学物質は、フラボノイドまたはイソフラボノイドである。他の実施態様において、栄養素または植物化学物質は、ビタミン、例えばビタミンE(α-トコフェロールまたはγ-トコフェロール)である。本発明の方法は、少なくとも1.3倍、または約1.3倍〜2倍までのα-トコフェロールの量における増加を達成することができ、また、少なくとも1.3倍、または約1.3倍〜3倍までのγ-トコフェロールの量における増加を達成することができる。
【００５８】
本発明の方法は、果物(例えばブドウ、リンゴ、ベリー、例えばイチゴ、ブラックベリーおよびラズベリー)、塊茎(例えばジャガイモ、サツマイモ)、ナッツ(例えばアーモンド、ピーナッツ)、ダイズ、トウモロコシ、穀物(例えばコムギ、コメ、ライムギ)、トマト、タマネギ、ウリ科の植物(例えばスイカ、キュウリおよびカンタロープ)、葉菜(例えばレタス、ホウレンソウ、エンダイブ)を含む様々な植物産物において栄養素または植物化学物質の含量を増加させるために適用することができる。特定の実施態様において、植物産物はアーモンドである。また、栄養学的に増強された産物が収穫される植物は、アーモンド植物である。
【００５９】
さらなる実施態様において、本発明は、炭を補充した植物培養培地において植物の栽培品種を生育させることにより、植物の成長および／または栄養的価値を増強する方法を提供する。特定の実施態様において、本発明の方法に使用される炭は、植物成長を刺激する少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を含むものが選択された。
【００６０】
細菌の存在下で生育した植物およびそのような植物の産物は、本発明の他の実施態様を形成する。ファイアクライマックス細菌の存在下において生育した植物は、遺伝子およびDNAが増強されていると考えられ、これは、増強された成長および増加した生産性（例えば、植物化学物質）から明白である。このようなDNAが増強された植物および植物産物は、これを食する動物にとって有益である。それは、増強された植物の栄養価および植物産物を与えるだけでなく、DNAが増強された植物物質が動物(例えば、ヒト)のDNAを調整および増強すると考えられるからである。例えば、動物において増強された生得的かつ順応性のある免疫系をもたらす。従って、一実施態様において、本発明のファイアクライマックス細菌を含む産物は、微生物叢(flora)を増強し、健康を促進および改善し、疾病を軽減するために、ヒトを含む動物によって摂取される。特定の機構または理論によって拘束されずに、摂取されたファイアクライマックス細菌は、動物のシステムにおいて疾病を引き起こす細菌を抑制または死滅させるものと考えられる。従って、健康を増進し、疾病を軽減することができる。
【００６１】
さらなる実施態様において、本発明に従って単離されたファイアクライマックス細菌は、土壌を改善および再構築し、かつ土壌の生物多様性を増加させるために使用される。土壌品質を改善する方法およびその結果として得られた修正された土壌は、本発明のさらなる実施態様である。
【００６２】
修正された土壌には、胞子または細胞の形状においてファイアクライマックス細菌を接種することができる。ファイアクライマックス細菌の単一の株または多数の株の混合物を使用することができる。代わりに、ファイアクライマックス細菌を含む炭粒子は、炭内のファイアクライマックス細菌を単離せずに直接土壌に加えることができ、あるいは炭内の細菌の最小量の培養および処理で加えることもできる。土壌の接種は、例えばファイアクライマックス細菌を含む粉末または液体懸濁液を噴霧することによって、あるいはファイアクライマックス細菌を含む炭の粒子の噴霧することによって達成することができる。
【００６３】
本発明は、土壌中に存在するファイアクライマックス微生物がその土壌中において生育する植物の成長および生産性を増強することを同定した；さらに、ファイアクライマックス細菌は植物内で生育し、植物の炭化から産生された炭内で生き残る。炭化された木材は、生態系若返りの一因となる物理的および化学的な特徴を有する。微生物を保存することに加えて、炭化された木材は、多様な化学的触媒を含む。炭化された木材のナノレベルのパラメーターは、生命およびガスを捕捉および放出する数えきれない空洞を形成する化学反応のための無数の表面を作り出す。その結果は、植物生命体の有機的残渣と微生物の復活した活性との間の、深在性の高度に進化した界面である。炭化された木材の１つの望ましい特徴は、多くの異なる酸化還元電位で電子を供給および授与することができる新たに認識された触媒がまかれた、結びついた水性および非水性の環境を含むということである。この複雑で、よく理解されていなかったマトリックスは、内部で結びついた微生物の複雑なコミュニティーを育てる。１つの単純な例として、通性の嫌気性細菌は、N2がO2の欠乏下においてアンモニアに還元されるときH2を放出する。その間、周囲の炭化された木材ミセルにおける好気性細菌が、H2を使用してCO2を減少させることができる。その間、電子をO2に移動し、嫌気性環境を好むN2固定を作り出す。炭化された材料中に存在するバチルス センス ラト（Bacillus sensu lato）種は、全てのこれらの機能を満たすことができる。
【００６４】
炭の値は、本発明によって独自に認識された。本発明によれば、炭は、ある生態系から他の生態系までファイアクライマックス細菌を移動させ、かつ１つの地理的な位置における土壌の植物成長を促進する特性を他の場所に移動する、ファイアクライマックス細菌の担体として使用することができる。例えば、プレミアムなぶどう栽培地域における適切な細菌を、炭によって他の選択された地理的な位置に移動させることができる。
【００６５】
本発明によって改善された土壌は、商業的な化学肥料と殺虫剤に依存しない植物成長を支持し、環境汚染を作り出さない。さらに、ファイアクライマックス細菌の炭素固定性質は、土壌中の有機化合物中に固定された大気の炭素が、二酸化炭素を空気から取り除き、かつ土壌中の炭素貯蔵を向上させる。
【００６６】
従って、さらなる実施態様において、本発明のファイアクライマックス細菌を使用して、植物による太陽エネルギー転換を増強し、かつ植物によるミネラル栄養素利用の効率を増強することによって環境汚染を軽減することができる。この増加した効果の基礎は、植物根の成長を増加させるファイアクライマックス微生物の能力による。より大きな根が、土壌水および無機栄養素へのより大きなアクセスを与える。これらの限定因子の増加は、太陽エネルギーの植物バイオマスへの光合成転換を増強する。ＵＳ農業地の80％で25％まで促進する植物成長は、全炭素貯蔵を増加させることができ、したがって、バイオマス産生の潜在能を20％まで増加させることができる。この技術のさらなる利点は、しばしば、地下水を有毒化し、また地表の水流の富栄養化を促進する、肥料の浸出の減少をもたらす。
【００６７】
本発明は、次の例によってさらに例証される。
【例】
【００６８】
例Ｉ．メスキート(Mesquite)炭における新規なファイアクライマックス細菌株の同定
培養物は、メスキート木材を燃焼させることにより得られたメスキート木炭で増殖した。炭粉末、直径約2mm〜15mmのダスト状粒子を、炭の大きな破片から分離した。細菌をCP-1(メスキート炭のソース)粉末から単離するために、15lb/in2で45分間にわたってフラスコ中の250mlのTY寒天培地をオートクレーブ処理し、前記オートクレーブから培地を取り出して、無菌の寒天培地の温度が約200°Ｆになっている間、５ｇの非無菌のCP1「粉末」を250mlの溶液に添加することによって2%の炭懸濁液を調製した。フラスコを振って懸濁液を混合し、炭を含む20mlの寒天培地を各々90mmのペトリ皿に注いだ。プレートを室温に冷却し、寒天を凝固させた。28時間後、細菌および真菌のコロニーをプレート上で発達させた。72時間後、14個の細菌のコロニーを採取し、新鮮なTY寒天プレートに移した。14個のコロニーのうちの12個は、プレートの第２のセット上で増殖した。これらの12個のコロニーは、TY寒天プレートの第３のセット上で再び継代した。第３の継代から増殖したコロニーの16S rDNAを、部分的にシークエンスした（Midi Labs, Newark, DE）。
【００６９】
図１は、最も近い配列を有する細菌および対応する配列のパーセント差異を示す。４つの単離株、CP1-2、CP1-6、CP1-13およびCP1-14は、同定することができなかった。「最も近いもの」とは、＞5％の配列差を有する各々の単離株を意味する。従って、同一である可能性が低いものも含まれる。図２は、４つのマッチしなかった単離株に対して見つかった最も近い配列を有するGenBankのものを示す。CP1-2、CP1-6、CP1-13およびCP1-14の16S rDNA配列について、配列の一致性が97％を超えるものはGenBankでは見つからなかった。
【００７０】
例II．アーモンド(Almond)炭における新規なファイアクライマックス細菌株の同定
アーモンド炭からの29個の単離株の16S rDNA配列について調べた。これらの単離株のうち、一つは、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）として同定された。さらに、19個の異なる単離株のうち、８個は種のレベル(≦1％差異)に同定され、６個は１％から５％より大きいかまたは等しい既知の種とは異なり、３個は5％より大きい既知の種とは異なる。配列の同一性の表を、図３Ａ〜３Ｃに示す。
【００７１】
部分的な16S rDNA配列分析によって、図３Ｂで「C17304 AC23 con」として指定されたアーモンド炭単離株が、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）と0.29％の差異をもつことがわかった。HAB7についても同様である。HAB7は、例IIIにさらに記載されるように、土壌から単離された細菌株である。C17304 AC23 con はまた、25mg/Lのスペクチノマイシン、1mg/Lのテトラサイクリン、および2.5mg/Lのクロラムフェニコールの組み合わせの中で増殖することがわかった。HAB7についても同様である。
【００７２】
例III．ダグラスファー(Douglas Fir)木材および樹皮の削りくず(Bark Shavings)を炭化するプロセス、および炭化された物質からのファイアクライマックス細菌の単離
最近切り倒されたダグラスファー木材を、14の断片に切断した。樹皮組織(すなわち篩部)および木質(すなわち木部)を、20"のチェーンソーで別々に寸断して回収した。2つの植物組織を、1:1の割合において一緒に混合し、70℃で終夜乾燥させ、後の使用のために密封したガラス・ジャーに格納した。
【００７３】
一連の2"直径のセラミック製のるつぼに10gの混合された組織を添加した。240V バーンステッド インターナショナル マッフル（Barnstead International muffle） 炉、モデルF47920-80（プログラム可能な温度対照機構および5"(W)×4"(H)×6"(D)の炉室を備える）を、この例に記載されたすべての実験に使用した。この炉（1093℃で連続的に稼働させることも、あるいは1200℃で断続的に稼働させることもできる）を使用して、山火事の状態を模擬した。炉を600℃にあらかじめ熱し、個々のるつぼを様々な時間で炉に置いた。るつぼを炉室内に置くと、温度は約585℃にいったん低下し、その後に600℃まで再上昇した。4分後、炉の温度は数分間にわたって605℃まで上昇し、その間に黒い煙が上部の通気口から漏れ出た。るつぼを5、10および15分後に取り出し、冷却してアルミホイルで包んだ。2つのるつぼを、それぞれの時間にわたって別々に処理した。1つは微生物を単離するために使用し; 他方を撮影した。この例において報告されたすべての実験は、特定の時間にわたって炉内にるつぼを１つだけ置くことによって一貫した炭化を達成するものである。
【００７４】
様々な時間にわたって処理されたサンプルの物理的特徴は、全く異なっていた。600℃で5分後に取り出したサンプルは、乾重量の減少から評価すると、およそ50％炭化されており、多くの木材片は黒色化しなかった。10または15分間にわたって炉内にとどめ置いたものは完全に黒色化し、質量で80〜90％減少した。600℃で10または15分後に自然な木材の色を維持した木片は存在しなかった。
【００７５】
多数の細菌単離株を、異なる様々な時間にわたって処理されたサンプルから得た。細菌を、およそ100℃でのオートクレーブから出てきた250mLの熱い無菌のTY培地中で各々の炭化されたサンプルを懸濁することによって単離した。懸濁液を激しく撹拌し、12枚の100mmのペトリ皿に各混合液を注いだ。20〜25℃での4日間のインキュベーション後、各プレートを観察し、41の細菌コロニーのうち14を16srDNAシークエンシングによって同定するために採取した。大半の単離株は、古典的バシラス様細菌に属する。しかしながら、Rhodococcus globerulusは、ストレプトマイセスのような土壌微生物とより密接に関係する放線菌生物体である（表１）。数のカウントによって、600℃での10分間という条件が、これらの実験において木材からファイアクライマックス微生物を単離するための最適な条件であることが明らかになった。木質および樹皮組織の他の組み合わせは、異なる熱の特徴をもつので、最適値は変更されるであろう。他の木種がさらなる細菌種を含んでいてもよい。
【００７６】
本発明に従って示されるように、サンプルそれ自体の物理的な性質は重要である。その理由は、とりわけ、サンプルの数、形状、大きさおよび濃度が、外部熱がどれくらい速くサンプル全体にもたらされるのかということに効果を与えるからである。
【００７７】
サンプル内に含まれる湿気またはサンプルを取りまく空気もまた、炭化の特徴を変化させるであろう。その理由は、高熱の水の気化は、水を液体から気相に変換する(すなわち、沸騰させる)ために熱エネルギーを使用するからである。したがって、(すなわち気圧)、相対的なパーセント湿度および海抜（すなわち、大気圧）は、炭化の割合を変化させることができる。
【００７８】
炉での熱の設定と暴露時間もまた、炭化の割合に効果を与えるであろう。一定温度の数の値は重要である。より高い温度は、より低い温度と比較して炭化を促進するであろう。サンプルが燃焼する限り、より低い温度でより長い時間は、より高い温度でより短い時間と等価であろう。温度のプログラムされた変化はまた、炭化の同様の状態について異なる状態を生み出すであろう。
【表１】
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【００７９】
細菌種はまた、炭化された有機物の他の形態からも単離された。商業的に利用可能な魚粉（フィッシュミール）のサンプル、これは海洋の有機廃棄物の形態にあり、多くの有機園芸店において入手することができるが、これを600℃に加熱し、95℃ TY寒天培地に懸濁して細菌を単離し、16S rDNAの部分的シークエンシングによって同定した（表２）。MicroSeqデータベースから1％以上逸脱する配列については、GenBankのデータベースとも比較した。異なる時間に回収された単離株は、互いに排他的に扱った。
【表２】
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【００８０】
例IV．土壌からのファイアクライマックス細菌の培養
培養物を、砂壌土サンプル(Mid-Cal Ranch, California)から増殖し、サンプル中に存在する胞子形成能を有する細菌を同定した。この目的のために、当量の土壌と水を懸濁することによって調製された2.0mlの溶液を、3分間にわたって沸騰水槽中に静置し、その後にTY寒天培地 (Difco Bactoトリプトン(5 g/l), Difco Bacto Yeast Extract (3 g/l) および CaCl2 (1.3 g/l), Difco Bacto Agar (15 g/l)を含む)上にアリコート（例えば、0.5ml）を静置した。
【００８１】
これらの処置によって最初に単離された細菌は、500塩基対の16S rDNA配列によって、好気性の内生胞子形成細菌種として同定された。これらの単離体は、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）、バチルス スブチリス（Bacillus subtilis）およびバチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）として同定された(Midi Labs, Newark, DE)。図４は、各々のサンプルDAP-1からDAP-6について、最も近縁な細菌配列を有するもの、およびサンプル株と最も近縁な株との間の配列におけるパーセント差異を示す。DAP-2(本明細書中ではHAB7としても言及される)は、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）であると決定された。
【００８２】
HAB7は、多数の抗生物質に対する耐性を有し、かつ25mg/Lのスペクチノマイシン、1mg/Lのテトラサイクリン、および2.5mg/Lのクロラムフェニコールの組み合わされた存在中において豊富な寒天培地(TY)上で増殖することができることが見い出された。部分的な16S rDNA配列に基づいて、HAB7は、種の一致を示す、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）から0.29％の差異を有することが見い出された。ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）から0.10％の差異を示す、HAB7について得られた完全な16S-rDNA配列を、図５に示す。
【００８３】
例IV．植物成長における細菌株HAB7およびAC9の効果
全体的な植物成長を促進するHAB7の能力を、2つの研究において評価した。最初の研究では、コムギ種を、2×109 CFU/ft2のHAB7とともに、およびHAB7なしで、高(100〜11.25-15 lb/ac)および低(30〜11.5-15 lb/ac)NPKの組み合わせを含む、異なる土壌処理を使用してフィールドプロット中に植え付けた。土壌を植え付け２日後に処理し、植え付け４ヶ月後に収穫した。３つの隣接するプロット(各3フィート×5フィート)を、表３において指定された各々の5つの条件下で培養した。従って、合計１５のプロットを使用し、表に示される各々の数は、同じ処理を行った３つのプロットからの平均値を表わしている。領域1×3 ft2は、各プロットの中心において収穫した。HAB7が、高または低NPKの存在中において種子収量を著しく増加させることが見い出された。根の成長については測定しなかった。処理および結果を表３に示す。
【表３】
2009518012.tif 000005
【００８４】
表３に示されるように、低NPKへのHAB7の付加は、苗条乾重量の8％の増加および種子収量の38％の増加をもたらした。高NPKへのHAB7の付加は、苗条乾重量の16％の増加および種子収量の35％の増加をもたらした。窒素の大きな増加がまた、HAB7/高NPK処理土壌中で生育したコムギ植物中において測定された。
【００８５】
根の成長については、すべての根を回収可能なポットにおいて最も正確に評価し、高または低NPKとともに、HAB7の存在または非存在中において種子から一年生のライ麦草を生育させる第２の研究において測定した。この草を、64個の10インチのポットに植えた。HAB7 細胞を、各HAB7処理ポットに2×109CFU/ft2で供給した。根がポットの束縛を受けるようになる前に、この草を植え付け28日後に収穫した。この植物は、開花に先立って収穫し、従って、種子収量の測定は行わなかった。植物を乾燥した後、すべての砂、小石および残骸を取り出し、植物を苗条と根に分けた。この実験の処理および結果を表４に示す。この表は、結合したHAB7/高NPK処理が与えられたとき、根の成長がHAB7の存在中において11％(P≦0.05)、および33％(p<0.05)まで増加したことを示す。
【表４】
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【００８６】
AC9、およびHAB7とAC9の混合物はまた、富栄養鉢植え用土壌において植物成長を促進することを示した。2つの試験からの代表的なデータを、表５に与える。未接種の対照植物における変化は、その年の異なる数か月において変化する温度および光の影響によるものである。
【表５】
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【００８７】
例VI．細菌増殖に対する炭の効果
代表的な細菌の増殖に対する炭の増進効果は、容易にHAB7で実証された。HAB7を、添加物を含まない、または1.5％破砕メスキート炭(「CP-1」)を含むTY細菌培地において増殖させた。全ての培地を接種前にpH 6.74に調節した。接種後、細胞を、0、3および5日目に通常の稀釈操作でTY寒天プレート上でコロニー形成単位(CFU)としてカウントした。接種直後の細胞密度は、5×104 CFU/mlであった。結果は、未処理の対照培養物と比較したときに、炭中において３日目で約２０倍および５日目で約８倍に細菌の増殖が増強された（図６）。各処理について３つの複製培養物を使用して決定された５日目の効果は、非常に顕著であった(P≦0.01)。３日目の効果は、各処理における１つの複製物で測定した。
【００８８】
実験を同様に行い、より低い(0.375％)およびより高い(3％)濃度の破砕された炭について試験を行い、未処理の対照培養物に対して1.5％の炭で増強された細菌の増殖が認められた。一方で、より低い濃度では増殖について顕著な効果がなかったが、胞子形成が著しく減少した。3％の炭処理は、1.5％の炭処理と比較して細菌の増殖についてより大きな増強効果を示し、かつより少ない胞子をもたらした。接種３日後に測定されたデータを表６に示す。胞子から発達したコロニーは、栄養細胞から発達したコロニーよりも、その遅延した発達および３日目のより小さなコロニーサイズによって同定した。
【表６】
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【００８９】
例VII．HAB7による炭素固定
13CO2から13Cを取り込むHAB7の能力について試験を行った。９つの50mlのエルレンマイヤーフラスコ（各々25mlの無菌のTY液体培地を含む）に、終夜培養からの2％接種のHAB7を供給し、36時間にわたって増殖させた。培養液を25℃で145rpmの振盪機に静置した。すべてのフラスコをゴム隔壁で密閉した。3つの同じフラスコは、約0.042％ CO2を含む大気CO2を含んでいた(1.085原子％13C)。６つの同じフラスコに、2N HC1を含む60ccの注射器中の13C重炭酸ナトリウム(98原子％13C)から生成された5％ 13CO2を供給した。12、18および36時間後に5mlのアリコートを各フラスコから回収し、細菌細胞をエッペンドルフチューブにおいて遠心分離によって取り出した。フラスコを空気に対して開放し、無菌の移動フードにおいて再封止し、および毎時間サンプリングに5％13CO2で指定されたものを5％13CO2で再補充した。エッペンドルフチューブ内のサンプルを凍結乾燥し、12C/13Cアイソトープ比質量分析を行った。標準参照1.08504原子％13Cと比較した13Cの変化を計算し、Δ13C原子％として報告した。HAB7のコンタミネーションの可能性は、通常のTY培地上での細胞稀釈カウント数を、HAB7についての選択的な3つの抗生物質の混合物を含むTY上でのカウント数と比較することによって実験の最後に除外した。データ(CFU中)は、各フラスコにつき２つの培地上で類似した。
【００９０】
図７において示されるように、HAB7細胞は、全炭素の約0.25％のレベルまでCO2を取り込んだ(黒丸)。12〜18時間の間、および12〜36時間の間の13C含量の増加は、非常に顕著であった (p<0.001)。増加したCO2濃度（黒三角）は、周囲大気のCO2（白三角）と比較して、細胞増殖（質量）をT12(12時間)で50％まで増進させ(P<0.01)、T36(36時間)で12％まで増進させた(P<0.01)。 
例VIII．炭中のファイアクライマックス細菌による炭素固定
実験は、メスキート炭(CP-1)中に存在するファイアクライマックス細菌が明らかにCO2を吸収したことを実証した（表４）。エルレンマイヤーフラスコ(50mlの大きさ)(各々が25mlの無菌TY液体培地を含む)に以下の１）〜４）を接種した。１）バックグラウンド13Cの吸着に対する炭のあらゆる物理的な効果を定量するために周囲CO2の存在下においてオートクレーブされたCP-1、または２）高度にラベルされた13CO2(98原子％13C)からの13Cの吸着に対する炭のあらゆる物理的な効果を定量するために5％の13CO2の存在下においてオートクレーブされたCP-1、または３）高度にラベルされた13CO2(98原子％13C)からの13Cの取り込みについてのCP-1中の微生物のあらゆる効果を定量するために5％ 13CO2の存在下において非無菌のCP-1、または４）CO2を取り込むこれらの細菌の実証された能力をこの実験における他の処理に関係づけるために5％ 13CO2の存在下においてHAB7dを接種された無菌のCP-1。したがって、CO2レベルは、周囲で0.42％ CO2(1.08515原子％13C)または5％ CO2(98原子％13C)であった。フラスコは、全72時間の実験のために封止し続けた。処理１および２におけるフラスコからのサンプルを、13C分析の前に無菌状態を確認するために研究の終わりにTY培地上に静置した。処理３および４におけるフラスコを、72時間後にオートクレーブし、続いて、炭を、ろ過によってこれらの各々のフラスコ内の細菌懸濁液から分離した。炭は、13C分析の前に75℃で乾燥させた。処理３および４における細菌(およびいくつかのCP-1)を、細菌懸濁液の遠心分離によって回収し、13C分析前の熱ランプ下で乾燥させた。各サンプルの13C含量について12C/13Cアイソトープ比質量分光測定を行った。1.08504の原子13Cを含む標準参照と比較した13Cの変化は、Δ13C原子％として計算および報告した。
【００９１】
データは、CO2を取り込んだCP-1微生物が、無菌の13C対照(P<0.01)よりも著しく大きいこと、およびHAB7処理において測定されたもの、例VIIにおいてCO2を取り込むことが実証された生物体に類似していることを示した。
【表７】
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【００９２】
例IX．二酸化炭素によるHAB7増殖の促進
HAB7の増殖に対するCO2の効果を評価した。TY培地中で増殖するHAB7の終夜培養液を使用して、各々、25mlのTYおよび前記液体上方に30mlの大気を含む50mlのフラスコ中に2％接種物を供給した。コロニー形成単位(CFU)は、T0(接種時)、T15(15時間後の接種)、T36(36時間後の接種)、およびT42(42時間後の接種)でTY寒天培地上での稀釈プレーティングによってカウントした。接種後および各サンプリング後、液体上方の空気スペース内の大気CO2を、体積ベースで大気(約0.042％)、5％CO2、または9.8％CO2を含むように調整した。細胞収量は、遠心分離によって細胞を収集後T42で計量した。データを表８に示す。5％および9.8％ CO2処理は、log増殖(T15)中にCFU/mlを著しく増加させたが、9.8％ CO2は、42時間のサンプリング時間でCFU/mlを著しく減少させた。
【００９３】
これらの結果は、さらなるCO2がlog増殖中において脂肪酸の合成および膜の形成を刺激するが、最も高いCO2処理が最終的に細胞の死亡率を増加させることを示しているように解釈することができる。追加の膜を使用して実験の始めに追加のCO2を供給したフラスコ中において細胞の数を増加させた。なぜなら、TY培地は非常に富栄養状態にあり、基質の制限がなかったからであり、したがって、細胞呼吸が最適な膜合成を支持するのに十分なCO2を生成したとき、対照処理は、高濃度のCO2フラスコと同じ水準に達した。乾燥重量データは、対照処理における細胞がより高濃度のCO2で増殖した培養物よりも多くの多糖類を生成したことを示唆している。
【表８】
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【００９４】
例Ｘ．土壌生成の調節因子は、植物ビタミンE含量を増加させる。
ビタミンE(α-およびγ-トコフェロール)のレベルを、伝統的に栽培された植物から得られた植物産物、および炭で処理された土壌中で生育した植物において分析し、植物栄養性質についての本発明の組成物および方法の効果を評価した。
【００９５】
２つのアーモンド ナッツ サンプル（各々の３つの同じもの)を分析した。１つのサンプルは、データ表における「Diamond」で示した商業的ブランド「Diamond of California」であった。第２のサンプルを、前の２年の各々において200ポンド/acreの割合で例Ｉに記載されたように調製された商用炭で処理された土壌中においてMid-Cal Ranch ("Mid-Cal")で生育した木から収穫された大きくなったアーモンドから得た。アーモンドサンプル（６オンス／サンプル）をコーヒーひきの中で細砕し、トコフェロール内容物の分析のために商用研究所(Analytical Laboratories in Anaheim, Inc., Anaheim, CA)に付託した。アーモンドの「ペースト」はメタノールで抽出し、トコフェロールをHPLCを使用して単離し、LC-MS (液体クロマトグラフィー質量分析)方法を使用して分析し、かつ標準と比較した。
【００９６】
各サンプルの中で観察されたトコフェロールのレベルを表９に示す。Mid-Cal Ranch アーモンドのα-トコフェロールの含量は、Diamondアーモンドのそれよりも39％(P≦0.05)高かった。Mid-Cal Ranch アーモンドのγ-トコフェロール含量は、Diamondアーモンドのそれよりも200％(P≦0.01)高かった。
【００９７】
植物産物におけるトコフェロール含量を評価するのに役立つ他の方法は、例えば、Gutierrez et al., 1999, "Influence of ecological cultivation on virgin olive oil quality," J. Amer. Oil Chemists Soc. 76: 617-621 and Martinez, J.M. et al., 1975, "Report About the Use of Abencor Yields Analyser," Grasas Aceites 26: 379-385.によって記載されている。
【表９】
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【００９８】
例XI．HAB7は、レタスの植物化学物質の含量を増加させた。
Buttercrunchレタスを、Ace 鉢植え用土壌を含む2ガルのポットを使用してCasparの温室内に植えた。8つのポットのうちの4つにHAB7を接種した。各ポットで発芽後に2つの植物まで間引いた。植物を約2か月で収穫し、計量し、分析のために研究所へ輸送される間に氷上または冷蔵下で冷却した。等価な大きさのレタスを、ビタミン分析のための各処理から選択した。全てのデータを、生の値および対数変換された数を使用して変化の2分法分析で調査した。
【００９９】
結果は、収穫された全生物 (2つの株/ポット)が、対照とHAB7処理との間で著しく異ならなかったことを示した。各ポットにおけるレタスのより大きな株は、ビタミン含有量の測定のために使用し、また、これらの株についての平均値(+SE)は、それぞれ対照およびHAB7処理されたポットについて163±17および159±16であった。
【０１００】
HAB7で処理されたポットで育てられたレタスのビタミンC含量は50％以上に増加し、また、全ビタミンE含量(α-およびγ-トコフェロール)が80％以上まで増加した。
【表１０】
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【０１０１】
例XII．HAB7に対する尿素の影響
HAB7の増殖および存続に対する尿素の影響を、尿素の存在下においてHAB7を培養することによって試験した。
【０１０２】
１エーカー当たり200ポンドの窒素を加える従来の農業習慣に基づいて、100mMの尿素を、通常の土壌の上層１インチに一時的に存在するであろう濃度として計算した。HAB7をTY培地内に接種し、室温で終夜にわたって生育させて約1×107 CPU/mlとした。
【０１０３】
終夜培養物を、TY(３つのフラスコ)またはTY＋100mM尿素(３つのフラスコ)のいずれかを含むフラスコ (フラスコ当たり200μlの終夜培養)に接種した。30時間後、一連の10倍の稀釈液を、６つの各フラスコから調製し、各稀釈チューブから１つの50μlのアリコートをTY寒天上に静置した。この50μlの液滴から発達するコロニー形成単位(CFU)をカウントして各フラスコ内の生存可能な細胞の数を計算するために使用した。平均値±標準誤差は、Studentの試験を使用して尿素処理効果について比較した。
【０１０４】
図８は、尿素の存在または非存在下における30時間後の細菌密度における増加を示す。TYでは、細菌は12倍以上に倍増するが、100mM 尿素の存在下では５倍未満の倍増が起こる。結果として、尿素を含むフラスコは、対照フラスコとして多くのHAB7細胞として1％未満であった。この試験(t=2.91、n=4)における尿素の効果は、顕著であった(P≦0.05)。
【０１０５】
フラスコの稀釈液と同時に、一連の10倍の稀釈液は、終夜培養したもの自体から調製した。終夜培養物の様々な稀釈液からの50μlの３つの独立したアリコートを、TYまたはTY+100mM尿素のいずれかを含む別々の寒天プレート上に播種した。
【０１０６】
プレーティング実験は、終夜培養からの細胞の58％がTY寒天＋100 mM尿素プレート上で増殖しなかったことを示した。例えば、10-4の稀釈プレートは、TY上で50.0±5.5のコロニーをもたらし、TY+100mM尿素上で21.3±3.2のコロニーをもたらした。この試験(t=4.51、n=4)における尿素の効果は、顕著であった(P≦0.05)。
【０１０７】
従って、一般的な農作業において使用される濃度の尿素は、HAB7細菌の増殖に悪影響を与える。
【０１０８】
例XIIII．植物フラボノイド含量に対する土壌生成の調節因子の効果
本明細書中に開示された微生物および炭素源はまた、植物化学物質の含量、特にイソフラボノイド、例えばフィトエストロジェン、および他のフラボノイドを増加させるために使用することができる。植物を、メスキート炭のような炭素源で修正された土壌中において生育させることができる。その後、土壌は、細菌生物、例えばバチルス セントロスポルス（Bacillus centrosporus）、バチルス スブチリス（Bacillus subtilis）またはバチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）で修正することができる。また、微生物の組み合わせを使用して土壌における土壌生成の核としてもよい。可視的増殖の後、植物根および植物葉について、イソフラボノイドおよびフラボノイド含量を含む、植物化学物質の含量について分析する。
【０１０９】
フラボノイド含量は、Ren, H., et al., 2001, "Antioxidative and antimutagenic activities and polyphenol content of pesticide-free and organically cultivated green vegetables using water-soluble chitosan as a soil modifier and leaf surface spray," J. Sci. Food Agric. 81: 1426-1432.によって記載されたように決定することができる。本発明の方法に従って調製された土壌または植物培養培地中において生育した収穫された野菜を、冷蔵用コンテナ内に入れて分析のために実験室まで運び、修正されなかった土壌中において生育した参照となるサンプル野菜と比較した。野菜の一部（各々50〜60 kg）は、個々の差異を除去するために、各種の5〜20 サンプル（各野菜について総量中 1.5〜2.0 kg）からランダムに切り出すことができる。サンプルを水道水および純水で洗浄し、ペーパータオルで拭き取り、ジューサー(model MJ-C29, Matsushita Electric Co., Kobe, Japan)で処理する。ジューサーを3800×gで遠心分離し、その後に10分間にわたって5℃で13500×gで遠心分離し、微細な粒子を除去する。微生物学的分析のために、上清を、放射線殺菌膜を通して濾過する（ポアサイズ 0.45μｍ、Toyo Advantec, Tokyo, Japan)。全てのサンプルを、ポリフェノール含量について分析するまで80℃で無菌化されたバイアル中において保管する。
【０１１０】
全ポリフェノールおよびオルトジフェノールは、Vazquez, A., et al., 1973, "Determinacion de los Polifenoles Totales del Aceite de Oliva," Grasas Aceites 24:350-357.によって記載されたFolin-Deni試薬またはアンモニウム モリブデン酸塩を使用して比色定量によって決定することができる。個々のフラボノイドレベルは、STR ODS-IIセミ-マイクロカラム (150mm×2.1 mm id, Shinwa Chemical Industry, Kyoto, Japan)と組み合わせて、液体クロマトグラフィー／質量分析(LC/MS)についてのＱＰ-8000α (Shimadzu, Kyoto, Japan) 機器を使用して測定することができる。移動相として、0.2％酢酸溶液（Ａ）およびメタノール（Ｂ）が、(1) 30〜50％ B(0〜5mm)、(2) 50〜90％ B(5〜10mm)、(3) 90％ B(10〜15mm)、(4) 30％ B(15〜25mm)の勾配曲線を備えたカラムを通過することができる。
【０１１１】
較正基準として使用するために、純粋な試薬（例えば、Caffeic acid, hesperidin, hesperitin, myricetin, quercitrin, quercetin, apigenin and baicalein)を、例えばSigma Chemical (St. Louis, MO, USA)から商業的に利用することができる。これらはメタノール中において個々に溶解し、その後に30％メタノール中の適切な濃度に調整した。クロマトグラフィーは、0.2 ml/分の一定の流速で行うことができる。注入されたサンプル体積は５μlであり、カラムはオーブン内に40℃で保持される。気圧化学イオン化(APCI)をインターフェースのために使用し、窒素フローを噴霧器ガスとして2.5リットル／分に調整する。各化合物を、標準物質と比較したときの保持時間およびMS検出器から得られた分子量情報によって同定した後、定量的な決定を選択されたイオン モニタリングによって得られた１点の絶対的な検量線を使用して行う。
【０１１２】
試験サンプルは、少なくとも３つの異なる月において別個に収穫された野菜から調製される。各試験は、３つの異なる月に調製された野菜ジュースを使用して２回繰り返す。また、得られたデータの６つのセットを使用して各サンプルの生物活動および化学組成を評価する。実験サンプルと参照サンプルとの間の差異の統計的有意性は、Studentのt検定を使用して決定することができる。
【０１１３】
例XIV．生得的な免疫系活性に対する植物栄養素、植物化学物質および細菌抗原の効果
本明細書中に開示された方法および組成物で生育した植物から単離された微生物抗原、植物栄養素および植物化学物質はまた、哺乳動物種における免疫系活性を増加させるために使用することができる。例えば、イソフラボノイドおよびフラボノイドを含む、微生物抗原または栄養素および植物化学物質は、植物ルートまたは植物物質サンプルから単離することができ、ラットまたはマウスに供給することができる。代わりに、植物抽出液は、本明細書中に開示された方法および組成物を使用して生育した植物から調製することができる。その効果は、生得的な免疫系の活性を含む免疫系活性を、IgAの増加した産生を通して、あるいは生得的な免疫系におけるトール(toll)用受容体の刺激を通してモニタリングすることによって決定することができる。生得的な免疫は、対象の血液中における、リゾチームおよびラクトフェリンを含む、免疫タンパク質の測定によって評価することができる (Bard, E., et al., 2003, Feb, Clin. Chem. Lab. Med. 41(2): 127-33)。
【０１１４】
血液サンプルを、乾燥チューブ内に回収し、直ちに氷上に静置し、10分間4℃で1000×gで遠心分離することによって濁りを除去した。アプロチニン(0.0025％)およびアジ化ナトリウム(0.1％)を上清に添加し、200μlのアリコートを使用するまで-20℃で貯蔵する。
【０１１５】
唾液サンプルは、口内の片側において５分間にわたって小孔Stenon管(the ostium Stenon canal)の軸の歯ぐきと頬との間に「Salivette」(Sarstedt, Orsay, France)を置き、その後にもう一方の片側で同じことを繰り返すことによって得ることができる。得られた唾液を氷上に直ちに静置し、10分間4℃で1000×gで遠心分離することによって濁りを除去し、「Salivette」から唾液を分離する。アプロチニン(0.0025％)およびアジ化ナトリウム(0.1％)を上清に添加し、200μlのアリコートを使用まで-20℃で貯蔵する。
【０１１６】
糞便試料は、１リットルのプラスチックジャー内に収集し、実験室への移動の前に収集後２時間以内に４℃で遠心処理を行った。糞便の生重量を測定し、糞便内におけるタンパク質の排出量を決定する。排泄物のタンパク濃度は、３倍に薄められたサンプルを使用して決定した。排泄物のタンパク質を抽出するために、５gの均質化された糞便を、１時間にわたって４℃で10mlのNaCl(0.15M)とともに、マグネティック撹拌器で激しく撹拌する。４℃で１０分間にわたって3000×gでの遠心分離後、アジ化ナトリウム（排泄物濃度0.1％重量/体積)およびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)(5mMの最終濃度)を、排泄物の抽出液に加える。アジ化ナトリウムは、微生物の増殖の抑制剤であり、また、PMSFは消化酵素(トリプシン、ペプシン)および細菌の抑制剤である。その後、排泄物の抽出物を、200μlのチューブ内に分配し、-20℃で冷凍する。
【０１１７】
Cervico-膣分泌物は、Belec, et alによって記載された洗浄技術を使用して得ることができる。3ミリリッターの無菌のリン酸塩で緩衝された生理食塩水(PBS)を、ピペットで膣内に入れた。各々60秒間続く流出および逆流サイクルの後、2〜3mlの液体を収集する。このサンプルを、10分間にわたって４℃で1000×gで遠心処理を行う。上清は、細胞および他の粘液を含むペレットを今後の研究のために冷凍している間、LzおよびLfを測定するために使用される。血液汚染の可能性は、Hem Check 1 試験によって除去することができる。希釈要素(dilution factor)は、しばしば頚膣部の洗浄に使用することができる。
【０１１８】
LzおよびLfの測定を、収集した血清、唾液、糞便および頚膣部の分泌液中において時間分解された免疫蛍光分析(TR-IFMA)によって分析する。 
Microwell Immuno Plates (Microwell Maxisorp, Life Technologie, France)をコートし、かつK2HPO4バッファー(50mmol/l、pH8.5)において5mg/l濃度のヒトLz (ウサギ抗ヒトLz精製ポリクローナルJgG、Dako, Dakopans, Copenhagen, Denmark)および5mg/l濃度のヒトLf (ウサギ抗ヒトLf精製されたポリクローナルIgG, Dako)に、精製されたIgGで4℃で終夜にわたってインキュベートする。非特異的なタンパク質結合部位を、ブロッキング溶液(50 mmol/l Na2HPO4, 1%ウシ血清アルブミン(BSA))でのプレートのインキュベーションによって遮断する。試験サンプルの連続的な希釈液（割合2.5）および標準的な精製されたLz（７つのレベル：1.02; 2.55; 4; 6.4; 10; 16および25μg/l)またはLf（８つのレベル：1.02; 2.55; 6.4; 10; 16; 40および100μg/l）(Human Milk Lz, Sigma, Bourgoin Jallieu, France; Human Milk Lf, Sigma, Bourgoin Jallieu)をウェルに添加する。Blankおよびポジティブコントロール(３つの異なる濃度(標準試験の直線性における)でのHuman Milk Lz, Human Milk LU)を、使用された各プレートについて系統的に加える。プレートを速やかな撹拌下で実験室温度で２時間にわたってインキュベートする。これらを自動プレート洗浄機で６回にわたって洗浄し、その後に250μg/lウサギ抗ヒトLzビオチン濃度または250μg/lのウサギ抗ヒトLf/ビオチン濃度のビオチン結合したIgGで速やかな撹拌下で２時間にわたってインキュベートする。100μg/l濃度でユーロピウムと結合したストレプトアビジン（ユーロピウムで標識されたストレプトアビジン, DelfiaTM, Wallac, Turku, Finland）をウェルに添加し、室温での速やかな撹拌下で２時間にわたってインキュベートする。自動プレート洗浄機での６回にわたる洗浄後、反応を、撹拌下で10分間にわたって増強溶液（Delfia, Ref. 1244-104, Wallac, Turku, Finland）を添加することによって開始する。蛍光シグナルは、Victor 2 蛍光測定器で615 nmで測定される (Wallac 1420 Multilabel counter, Turku, Finland)。データをソフトウェアによって分析する(Multicalc 2000 TM , Wallac, Turku, Finland)。定量的な結果は、標準曲線の参照によって決定する。濃度は、TR-IFMA技術の稀釈を考慮して稀釈因子によって訂正される。
【０１１９】
各タンパク質についての排泄物の相対的係数（RCE）は、ヒト排泄物中のタンパク質の排泄物のパラメーターを比較するために、また、他の種との比較を可能にするために決定することができる。RCEは、受動拡散による血漿から全体的に得られるアルブミンと比較したタンパク質の排泄率を表わす。アルブミンに言及するRCEは、アルブミンが酵素、すなわち唾液および頚膣部の分泌液によって分解されない液体にのみ適用可能である。従って、AATに言及するRCEが、糞便サンプル中では使用された。RCEは以下の式によって得られる：[（血清中のアルブミンまたはAAT）／（液体中のアルブミンまたはAAT）]／[（血清中のタンパク質）／（液体中のタンパク質）]。分泌と浸出との間の境界（カット-オフ地点）は、（アルブミンまたはＡＡＴのＲＣＥ）に等しい。この境界下、血清区画からの浸出が生じる一方、これより大きいＲＣＥは、少量の浸出とともに優位な局所的分泌を実証する。
【０１２０】
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）、中央値および範囲値として表わすことができる。分泌物間の平均の比較は、マン・ウィットニーＵ試験によって証明される。顕著な差異は、0.05と等しいまたは少ないｐに設定することができる。統計的分析は、PC（SAS Institute Inc.）のStatViewTMソフトウェアを使用して行われる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、炭（Charcoal）から単離された細菌の部分的な16S rDNA配列と既知の細菌配列との比較結果を示す。この図は、最も近縁な細菌とこれに対する配列のパーセント差異を示している。４つの単離株、CP1-2、CP1-6、CP1-13およびCP1-14については同定できなかった。「最も近縁なもの」とは、＞５％までの配列の差異を有する単離株を意味し、したがって、同一である可能性が低いものも含まれる（例Ｉを参照）。
【図２】図２は、炭（Charcoal）から単離された細菌の部分的な16S rDNA配列とGenBank配列との比較結果を示す。この図は、前記４つのマッチングしなかった単離株について見つかった最も近いGenBank配列のものを示している（例Ｉを参照）。
【図３Ａ】図３Ａは、アーモンド炭（Almond Charcoal）から単離された細菌の16S rDNA配列の分析結果を示す。分析対象の２９個の単離株のうちの１つ（図３Ｂを参照）がブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）として同定された（例ＩＩを参照）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、アーモンド炭（Almond Charcoal）から単離された細菌の16S rDNA配列の分析結果を示す。分析対象の２９個の単離株のうちの１つ（図３Ｂを参照）がブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）として同定された（例ＩＩを参照）。
【図４】図４は、土壌から単離された細菌からの部分的な16S rDNA配列の分析結果を示す。この図は、各々のサンプルDAP-1からDAP-6について、最も近い細菌配列を有するもの、および500塩基対16S rDNAシークエンシングに基づいたサンプル株と最も近縁な株との間の配列におけるパーセント差異を示す。DAP-2は、ブレビバチルス セントロスポルス（Brevibacillus centrosporus）であると決定された（例IIIを参照）。
【図５】図５は、ＨＡＢ７について得られた全16S-rDNA配列の結果を示す（例ＩＩＩを参照）。
【図６】図６は、細菌の増殖に対する炭の効果を示す。グラフは、炭によって、未処理の対照培養物と比較したときに、３日目で約２０倍および５日目で約８倍に細菌の増殖が増強されたことを示している。各処理について３つの複製培養物中の生存細胞を測定することによって決定された５日目の効果は、非常に顕著であった(P≦0.01)。３日目の効果は、各処理における１つの複製物で測定した（例５を参照）。
【図７】図７は、ＨＡＢ７による炭素固定の結果を示す。ＨＡＢ７細胞は、全炭素の約0.25％のレベルまでＣＯ２を取り込んだ（黒丸）。12〜18時間の間、および12〜36時間の間の13C含量の増加は、非常に顕著であった (p<0.001)。増加したCO2濃度（黒三角）は、周囲大気のCO2（白三角）と比較して、細胞増殖（質量）をT12(12時間)で50％まで増進させ(P<0.01)、T36(36時間)で12％まで増進させた(P<0.01)（例ＶＩを参照）。
【図８】図８は、ＨＡＢ７の増殖に対する尿素の影響を示す。３０時間にわたる尿素の存在または非存在下において培養されたＨＡＢ７の増殖が評価された。この図は、尿素がＨＡＢ７の増殖を著しく阻害したことを示している（例Ｘを参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年9月30日(2008.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファイアクライマックス細菌（fire-climax microbes）の単離に適した炭化された有機物質を産生する方法であって、炭化が前記ファイアクライマックス細菌の胞子が死滅する直前にその範囲まで進行するような条件下で、前記ファイアクライマックス細菌の胞子を含む有機物質を加熱することを含む方法。
【請求項２】
炭化された有機物質からファイアクライマックス細菌を産生する方法であって、
ａ．前記ファイアクライマックス細菌の胞子を含む炭化された有機物質を増殖培地に接種することと、
ｂ．前記胞子が栄養生長を開始できるように前記増殖培地をインキュベートし、前記ファイアクライマックス細菌を産生すること
を含む方法。
【請求項３】
土壌サンプルからファイアクライマックス細菌を単離する方法であって、
ａ．前記土壌サンプルを水と混合し、液体懸濁液を得ることと；
ｂ．前記液体懸濁液を煮沸することと；
ｃ．前記煮沸された懸濁液のアリコートを増殖培地に接種することと；および
ｄ．前記増殖培地を維持して前記ファイアクライマックス細菌の前記培地中での栄養生長を可能にすることと
を含む、方法。
【請求項４】
ファイアクライマックス細菌を含む組成物であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、組成物。
【請求項５】
前記ファイアクライマックス細菌が、炭化された有機物質、土壌またはこれらの混合物から単離される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ファイアクライマックス細菌が、バチルス センス ラト（Bacillus sensu lato）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記ファイアクライマックス細菌が、HAB7、AC9、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
単離されたファイアクライマックス細菌であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、単離されたファイアクライマックス細菌。
【請求項９】
HAB7またはAC9として命名された単離されたファイアクライマックス細菌。
【請求項１０】
少なくとも１つのファイアクライマックス細菌を添加された植物培養培地中において植物の栽培品種を成長させることを含む、植物産物の栄養素または植物化学物質を増加させる方法であって、前記ファイアクライマックス細菌が好気性細菌であり、かつ約600℃の温度で生き残る胞子を産生する、方法。
【請求項１１】
前記植物培養培地がまた、炭を添加されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記栄養素または植物化学物質が、フラボノイドまたはイソフラボノイドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記栄養素または植物化学物質が、ビタミンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビタミンが、ビタミンＥ（α-トコフェロールまたはγ-トコフェロール）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物が、オリーブ植物またはアーモンド植物である、請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
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