(57)【要約】  本発明により、少なくとも2種類のヒアルロン酸画分またはその塩を含んでいて、1つの画分の平均分子量が8,000〜10,000Daの範囲であり、1つの画分の平均分子量が100,000〜500,000Daの範囲である湿潤化用、化粧用、皺防止用の生成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2種類のヒアルロン酸画分またはその塩を含んでいて、1つの画分の平均分子量が8,000〜10,000Daの範囲であり、1つの画分の平均分子量が100,000〜500,000Daの範囲である湿潤化用、化粧用、皺防止用の生成物。
【請求項２】
上記ヒアルロン酸またはその塩が、好ましくはグラム陰性菌、より好ましくはバシラス（Bacillus）属の細菌によって組み換え産生される、請求項1に記載の生成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトのいずれかを含む、請求項1または2に記載の生成物。
【請求項４】
本明細書に規定したようにして測定したとき、8週間にわたって皮膚の含水量を少なくとも3％、好ましくは少なくとも5％、最も好ましくは少なくとも7％増やすことのできる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項５】
本明細書に規定したようにして測定したとき、8週間にわたって皮膚の全体的な弾性R2を少なくとも4％、好ましくは少なくとも8％、最も好ましくは少なくとも12％大きくすることのできる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項６】
本明細書に規定したようにして測定したとき、8週間にわたって皮膚の平均の粗さの値を少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、最も好ましくは少なくとも15％小さくすることのできる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項７】
本明細書に規定したようにして測定したとき、8週間にわたって皮膚の最大の粗さの値を少なくとも3％、好ましくは少なくとも5％、最も好ましくは少なくとも10％小さくすることのできる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項８】
本明細書に規定したようにして測定したとき、8週間にわたって皮膚の粘弾性比R6を少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、20％、25％、最も好ましくは少なくとも30％大きくすることのできる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項９】
上記ヒアルロン酸またはその塩が、ホウ酸および／またはポリマーαヒドロキシ酸のエステル、好ましくはポリ酢酸またはグリコール酸のエステルを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項１０】
上記ヒアルロン酸またはその塩が、ジビニルスルホン（DVS）で完全に架橋されているか部分的に架橋されている、請求項1〜9のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項１１】
活性成分、好ましくは医薬的に活性な物質も含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項１２】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースも含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の生成物。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物と、医薬的に活性な物質であることが好ましい活性成分とを含む組成物。
【請求項１４】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースも含む、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物の有効量を、医薬的に許容可能な基剤、賦形剤、希釈剤いずれかとともに含む医薬組成物。
【請求項１６】
ビヒクルとしての請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物の有効量を、医薬的に活性な物質とともに含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物の有効量を活性成分として含む化粧品。
【請求項１８】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物を含む衛生製品、医療製品、外科製品であって、その製品が、外科用スポンジまたは癒傷用スポンジであるか、バンド・エイドや他の傷被覆材料の一部であることが好ましい製品。
【請求項１９】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物を含むカプセル薬またはマイクロカプセル薬。
【請求項２０】
眼科処置を行なう方法において、改善点として、請求項1〜9のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を使用することを含む方法。
【請求項２１】
変形性関節炎の治療において処置を行なう方法において、改善点として、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を使用することを含む方法。
【請求項２２】
がんの治療において処置を行なう方法において、改善点として、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を使用することを含む方法。
【請求項２３】
医薬的に活性な物質を経皮投与する方法において、改善点として、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を使用することを含む方法。
【請求項２４】
医薬的に活性な物質を皮膚に塗布する方法において、改善点として、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を使用することを含む方法。
【請求項２５】
化粧品を皮膚に塗布する方法において、改善点として、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を使用することを含む方法。
【請求項２６】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を使用する眼科的方法。
【請求項２７】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物の有効量を、好ましくは皮膚に塗布するか、経皮投与するか、経口投与するか、注射によって投与する操作を含む変形性関節炎の治療法。
【請求項２８】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与する操作を含む傷の治療法。
【請求項２９】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を用いて変形性関節炎の治療薬を製造する方法。
【請求項３０】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を用いて目の治療薬を製造する方法。
【請求項３１】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を用いてがんの治療薬を製造する方法。
【請求項３２】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を用いて傷の治療薬を製造する方法。
【請求項３３】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を用いて血管新生のための薬を製造する方法。
【請求項３４】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物を用いてモイスチャライザ、化粧品、クリームを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、深い皺と浅い皺の両方を減らすための加湿用、化粧用、皺防止用いずれかの製剤で利用することを目的として、少なくとも2種類のヒアルロン酸（HA）画分またはその塩を含む組成物、すなわち平均分子量（MW）が非常に小さいHA画分と、MWが低中位のHA画分とを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内の最も豊富な複合多糖はグリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンは分岐していない炭水化物ポリマーであり、二糖繰り返し単位からなる（炭水化物のコア領域で硫酸ケラタンだけが分岐している）。二糖単位は、一般に、第1の糖単位として、修飾された2種類の糖類の一方、すなわちN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）またはN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）を含んでいる。第2の単位は、通常はウロン酸（例えばグルクロン酸（GlcUA））またはイズロン酸塩である。
【０００３】
グリコサミノグリカンは負に帯電した分子であり、溶液になったときに大きな粘性率を与える広がったコンホメーションを有する。グリコサミノグリカンは、主に細胞の表面または細胞外マトリックスに位置する。グリコサミノグリカンは、溶液中での圧縮率が小さく、その結果として、生理学的潤滑流体として理想的である（例えば関節）。グリコサミノグリカンは堅固であるため、構造的に欠陥のない細胞になるとともに、細胞間の通路が提供され、細胞が移動できるようになる。生理学的に最も重要なグリコサミノグリカンは、ヒアルロナン、硫酸コンドロイチン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸デルマタン、硫酸ケラタンである。たいていのグリコサミノグリカンは、特定の多糖構造を通じてプロテオグリカンのコア・タンパク質に共有結合する。ヒアルロナンは、ある種のプロテオグリカンと大きな凝集体を形成するが、自由な炭水化物鎖がプロテオグリカンと非共有結合した錯体を形成するときは別である。
【０００４】
体内におけるヒアルロナンの多くの役割が明確にされている（Laurent, T.C.とFraser, J.R.E.、1992年、FASEB J.、第6巻、2397〜2404ページ；『Extracellular matrix of cell Biology』（Hay E.D.編、プレナム社、ニューヨーク、1991年）の中の305〜341ページ、Toole, B.P.、「Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation」を参照のこと）。ヒアルロナンは、硝子軟骨、滑液、皮膚組織（真皮と表皮の両方）に存在している。ヒアルロナンは、多数の生理学的機能（例えば接着、発生、細胞の死、がん、血管新生、傷の治癒）においてある役割を果たしていると考えられている。ヒアルロナンはユニークな物理的、生物学的特性を持つため、目と関節の手術で使用されており、他の医療処置において評価がなされているところである。
【０００５】
“ヒアルロン酸”という用語は、文献では、細胞の表面の中、脊椎動物の結合組織の塩基性細胞外物質の中、関節の滑液の中、目の眼球内液の中、ヒト臍帯組織の中、とさかの中に自然に生じるD-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミンからなるさまざまな分子量の酸性多糖を意味する。
【０００６】
“ヒアルロン酸”という用語は、実際には、さまざまな分子量のD-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミンが交互になった一連の多糖の全体を普通は意味し、それが分解した画分を意味することさえある。したがって“ヒアルロン酸群”という複数形を用いるほうがより正確であるように思われる。しかしこの説明では単数形を用いる。さらに、この用語の代わりに“HA”という略号をしばしば使用する。
【０００７】
HAは、生体内で多くの組織（例えば皮膚、腱、筋肉、軟骨）の細胞の力学的支持体として重要な役割を果たしている。HAは、生物学的プロセスにおいて他の重要な役割（例えば組織の湿潤化、潤滑）も果たす。
【０００８】
HAは上記の天然組織から抽出できるが、感染性物質が移動する潜在的な危険性を最少にするため、生成物の均一性を大きくするため、生成物の品質を向上させるため、生成物を利用しやすくするため、今日では微生物学的方法によって調製するほうが好まれる（WO 03/0175902、ノボザイム社）。
【０００９】
HAおよびそのさまざまな分子サイズの画分と、そのそれぞれの塩が、特に関節症の治療では薬として、特に眼科手術と美容外科手術では天然の器官や組織のための補助物質および／または代替物質として、化粧用調製物では含有成分として使用されてきた。整形外科、リューマチ学、皮膚学で使用するためのヒアルロナン製品も開発されている。
【００１０】
平均分子量が約1〜約1.5DaのHAの高分子量画分は、化粧用組成物（例えばローション、クリーム）に優れた湿潤特性を与えることがよく知られている。
【００１１】
HAの非常に低分子量の画分は、皺防止特性を示すことが報告されている。その理由として、その画分には皮膚関門を通過する能力があることが主張されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
湿潤化特性と皺防止特性の両方が多くの用途において非常に望ましく、両方の性質を示す単一の組成物があれば、市場において大いに注目されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の発明者は、最近、別々の2種類のHA画分を含んでいて、一方は非常に小さな平均分子量であり、他方の画分は低中位の分子量であるいくつかのHA組成物を調製し、その湿潤化効果と皺防止効果を評価した。
【００１４】
驚くべきことに、これらの組成物は、湿潤化効果と皺防止効果の両方を示した。
【００１５】
そこで本発明の第1の特徴は、少なくとも2種類のヒアルロン酸画分またはその塩を含んでいて、1つの画分の平均分子量が8,000〜10,000Daの範囲（10〜90kDa、または20〜80kDa、または30〜70kDaの範囲が好ましく、40〜60kDaの範囲がさらに好ましく、約50kDaが最も好ましい）であり、1つの画分の平均分子量が100,000〜500,000Daの範囲（150〜450kDaが好ましく、200〜400kDaがより好ましく、250〜350kDaの範囲がさらに好ましく、約300kDaが最も好ましい）である湿潤化用、化粧用、皺防止用の生成物に関する。
【００１６】
本発明の第2の特徴は、第1の特徴による生成物と、活性成分とを含む組成物に関する。活性成分は、医薬的に活性な物質であることが好ましい。
【００１７】
本発明の第3の特徴は、第1の特徴による生成物の有効量を、医薬的に許容可能な基剤、賦形剤、希釈剤のいずれかとともに含む医薬組成物に関する。
【００１８】
第4の特徴は、ビヒクルとしての第1の特徴による生成物を医薬的に許容可能な物質とともに含む医薬組成物に関する。
【００１９】
第5の特徴は、第1の特徴による生成物の有効量を活性成分として含む化粧品に関する。
【００２０】
本発明の第6の特徴は、第1の特徴による生成物を含む衛生製品、医療製品、外科製品に関する。この製品は、外科用スポンジまたは癒傷用スポンジであるか、バンド・エイドや他の傷被覆材料の一部であることが好ましい。
【００２１】
1つの重要な特徴は、第1の特徴による生成物を含むカプセル薬またはマイクロカプセル薬に関する。
【００２２】
本発明の最後の特徴は、眼科処置を行なう方法、変形性関節症またはがんの治療において処置を行なう方法、傷の治療法、医薬的に活性な物質を皮膚に塗布する方法、医薬的に活性な物質を経皮投与する方法、化粧品を皮膚に塗る方法において、改善点として、第1の特徴による生成物、または第2、第3、第4の特徴いずれかによる組成物を使用することを含む方法に関する。
【００２３】
多数の特徴が、第1の特徴による生成物、または第2、第3、第4の特徴いずれかによる組成物を利用して、変形性関節炎、がんを治療するための薬を製造する方法、目を治療するための薬を製造する方法、傷を治療するための薬を製造する方法、血管新生のための薬を製造する方法、モイスチャライザを製造する方法に関係している。
【００２４】
いくつかの図面にはヒストグラムに1つの星印が付けてある。これは、t=0における値と比べて統計的に有意差があることを示す；p≦0.05。2つの星印が付いたヒストグラムは、t=0における値と比べて統計的に大きな有意差があることを示す；p≦0.01。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】比較的長期間の皮膚含水量の比較結果である。含水量の有意な増加が、4週間処理した後と8週間処理した後にHAの3つの分子量の画分で得られた。
【図２】詳細な説明に記載したようにして皮膚測定器で測定するさまざまな皮膚弾性パラメータを示している。
【図３】4週間塗布した後と8週間塗布した後の皮膚の全体的弾性R2の測定値の比較である。全体的弾性（R2）の有意な増加が、すべての活性クリームで明確に観察された。異なる分子量のHA画分の間に有意差は観察されなかった。
【図４】平均の粗さの相対値の測定は上に説明した通りであり、その結果を図4に示してある。平均粗さの値は、4週間塗布した後と8週間塗布した後に有意に低下した。この効果は、皮膚の表面に優先的に蓄積する300,000Da MWの画分でより顕著であった。
【図５】最大の粗さの相対値の測定は上に説明した通りであり、その結果を図5に示してある。これらの値も、4週間塗布した後と8週間塗布した後に有意に低下した。この効果は、皮膚に浸透することのできる非常に低分子量である50kDaのHA画分でより顕著であった。
【図６】実施例で説明してあるようにして4週間塗布した後と8週間塗布した後の粘弾比R6の相対的な値を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
“ヒアルロン酸”は、本明細書では、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）とグルクロン酸（ClcUA）が交互にβ-1,4グリコシド結合とβ-1,3グリコシド結合によって結合した二糖繰り返し単位からなる硫酸塩化されていないグルコサミノグリカンとして定義する。ヒアルロン酸は、ヒアルロナン、ヒアルロン酸塩、HAとしても知られている。ヒアルロナン、ヒアルロン酸という用語は、本明細書では同じ意味で用いる。
【００２７】
本発明の第1の特徴は、少なくとも2種類のヒアルロン酸画分またはその塩を含んでいて、1つの画分の平均分子量が8,000〜10,000Daの範囲（10〜90kDa、または20〜80kDa、または30〜70kDaの範囲が好ましく、40〜60kDaの範囲がさらに好ましく、約50kDaが最も好ましい）であり、1つの画分の平均分子量が100,000〜500,000Daの範囲（150〜450kDaが好ましく、200〜400kDaがより好ましく、250〜350kDaの範囲がさらに好ましく、約300kDaが最も好ましい）である湿潤化用、化粧用、皺防止用の生成物に関する。
【００２８】
トサカは、ヒアルロナンの重要な商業的供給源である。微生物も別の供給源である。アメリカ合衆国特許第4,801,539号には、ヒアルロン酸を調製するためにストレプトコッカス・ゾオエピデムクス株が関与する発酵法が開示されており、1リットルにつき約3.6gのヒアルロン酸が得られたことが報告されている。ヨーロッパ特許第0694616号には、改良したストレプトコッカス・ゾオエピデムクス株を用いる発酵法が開示されており、1リットルにつき約3.5gのヒアルロン酸が得られたことが報告されている。WO 03/054163（ノボザイム社、その出願内容の全体が本明細書に組み込まれているものとする）に開示されているように、ヒアルロン酸またはその塩は、例えばグラム陰性バシラス宿主の中での組み換え産生が可能である。
【００２９】
脊椎動物、細菌性病原体、藻類ウイルスからのヒアルロナンシンターゼが報告されている（DeAngelis, P.L.、1999年、Cell. Mol. Life Sci.、第56巻、670〜682ページ）。WO 99/23227には、ストレプトコッカス・エキシミリスからのグループIのヒアルロン酸シンターゼが開示されている。WO 99/51265とWO 00/27437には、パスツレラ・ムルトシダからのグループIIのヒアルロン酸シンターゼが記載されている。Ferrettiらは、ストレプトコッカス・ピオゲネスのヒアルロナンシンターゼ・オペロン（ヒアルロン酸シンターゼ、UDPグルコースデヒドロゲナーゼ、UDP-グルコースピロホスホリラーゼをそれぞれコードするhasA、hasB、hasCという3つの遺伝子からなる）を開示している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第98巻、4658〜4663ページ、2001年）。WO 99/51265には、ストレプトコッカス・エキシミリスのヒアルロナンシンターゼのコード領域を含む核酸断片が記載されている。
【００３０】
組み換えバシラス細胞のヒアルロナンは培地に直接発現されるため、単純な方法を利用して培地からヒアルロナンを単離することができる。最初に、バシラス細胞と細胞のごみを培地から物理的に除去する。望むのであれば、培地をまず希釈して培地の粘性率を小さくするとよい。培地から細胞を取り出す多くの方法が当業者に知られている（例えば遠心分離、微細濾過）。望むのであれば、残った上清を次に（例えば限外濾過によって）濾過して濃縮し、ヒアルロナンから小さな分子汚染物を除去する。細胞と細胞のごみを除去した後、培地からヒアルロナンを単純に沈澱させる操作を公知の方法で実施する。塩、またはアルコール、または塩とアルコールの組み合わせを利用し、濾液からヒアルロナンを沈澱させることができる。沈殿物が得られると、物理的手段によってヒアルロナンを溶液から容易に単離することができる。ヒアルロナンは、従来から知られている蒸発技術（例えば凍結乾燥、スプレー乾燥）によって濾液から乾燥させること、または濃縮することができる。
【００３１】
宿主細胞
好ましい一実施態様は、ヒアルロン酸またはその塩が、好ましくはグラム陽性細菌または宿主細胞によって、より好ましくはバシラス属の細菌によって組み換え産生される第1の特徴による生成物に関する。
【００３２】
宿主細胞としては、ヒアルロン酸を組み換えで産生させるのに適した任意のバシラス細胞が可能である。バシラス宿主細胞は、野生型バシラス細胞、またはその変異体が可能である。本発明の実施に役立つバシラス細胞として、バシラス・アガラデルヘンス、バシラス・アルカロフィルス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・ブレビス、バシラス・サークランス、バシラス・クラウシイ、バシラス・コアグランス、バシラス・フィルムス、バシラス・ラウトゥス、バシラス・レントゥス、バシラス・リケニフォルミス、巨大菌、バシラス・プミルス、バシラス・ステアロテルモフィルス、枯草菌、バシラス・チューリンゲンシスの細胞などが挙げられる。組み換え発現に特に適した変異した枯草菌細胞が、WO 98/22598に記載されている。被嚢性でないバシラス細胞が本発明において特に有用である。
【００３３】
好ましい一実施態様は、バシラス宿主細胞は、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・クラウシイ、バシラス・レントゥス、バシラス・リケニフォルミス、バシラス・ステアロテルモフィルス、枯草菌の細胞である。より好ましい一実施態様では、バシラス細胞は、バシラス・アミロリケファシエンスの細胞である。別のより好ましい一実施態様では、バシラス細胞は、バシラス・クラウシイの細胞である。別のより好ましい一実施態様では、バシラス細胞は、バシラス・レントゥスの細胞である。別のより好ましい一実施態様では、バシラス細胞は、バシラス・リケニフォルミスの細胞である。別のより好ましい一実施態様では、バシラス細胞は、枯草菌の細胞である。非常に好ましい一実施態様では、バシラス宿主細胞は、枯草菌A164Δ5（アメリカ合衆国特許第5,891,701号を参照のこと）または枯草菌168Δ4である。
【００３４】
本発明の核酸構造体を用いたバシラス宿主細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換によって（例えばChangとCohen、1979年、Molecular General Genetics、第168巻、111〜115ページを参照のこと）、コンピテント細胞を用いることによって（例えばYoungとSpizizen、1961年、Journal of Bacteriology、第81巻、823〜829ページ；DubnauとDavidoff-Abelson、1971年、Journal of Molecular Biology、第56巻、209〜221ページを参照のこと）、電気穿孔によって（例えばShigekawaとDower、1988年、Biotechniques、第6巻、742〜751ページを参照のこと）、接合によって（例えばKoehlerとThorne、1987年、Journal of Bacteriology、第169巻、5271〜5278ページを参照のこと）実施することができる。
【００３５】
分子量
ヒアルロン酸のレベルは、改変したカルバゾール法（BitterとMuir、1962年、Anal Biochem.、第4巻、330〜334ページ）に従って決定することができる。さらに、ヒアルロン酸の平均分子量は、従来技術における標準的な方法を利用して決定することができる。その方法は、例えば、Ueno他、1988年、Chem. Pharm. Bull.、第36巻、4971〜4975ページ；Wyatt、1993年、Anal. Chim. Acta、第272巻、1〜40ページ；Wyatt Technologies、1999年、「Light Scattering University DAWN Course Manual」と「DAWN EOS Manual」、Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, Californiaに記載されている。
【００３６】
塩と架橋したHA
好ましい一実施態様は、第1の特徴による生成物であって、ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトのいずれかを含むものに関する。
【００３７】
ヒアルロン酸ナトリウムをポリ乳酸塩化モノアシルまたはポリ乳酸塩化ジアシルと反応させると、連結または架橋したHA-PLA生成物またはHA-PLA-HA生成物が得られることが見いだされた。その生成物は、処理していないHAまたはPLAの標準的なスペクトルとは異なり、IRスペクトルの最も強いピークが1736cm-1にある。これは、連結したHA-PLA生成物の中に新たに形成されたポリ乳酸エステルが存在していることに対応する。
【００３８】
したがって好ましい一実施態様は、ヒアルロン酸またはその塩がポリマーαヒドロキシ酸（ポリ乳酸またはグリコール酸が好ましい）のエステルを含む、第1の特徴による生成物に関する。
【００３９】
ヒアルロン酸ナトリウムの溶液をホウ酸で処理すると架橋したHA-ホウ酸塩ヒドロゲルが得られることも見いだされた。このヒドロゲルは、処理していないNa-HAの標準的なスペクトルとは異なり、FT-IRスペクトルで1200と945cm-1に新しいピークがあった。これは、架橋したHA-ホウ酸塩ヒドロゲルの中に新たに形成されたホウ酸塩エステルが存在していることに対応する。
【００４０】
したがって好ましい一実施態様は、ヒアルロン酸またはその塩がホウ酸エステルを含む、第1の特徴による生成物に関する。
【００４１】
第1の特徴による生成物の別の好ましい一実施態様では、ヒアルロン酸またはその塩は、ジビニルスルホン（DVS）と全体または一部が架橋している。
【００４２】
湿潤化および皺防止の効果
以下の実施例に示すように、第1の特徴による生成物は、皮膚をしっとりとさせる効果を有する。それは、皮膚含水稜を増大させる能力として表わされ、好ましい一実施態様では、以下の実施例に記載したようにして測定したときに8週間にわたって少なくとも3％である。この値は少なくとも5％であることが好ましく、少なくとも7％であることが最も好ましい。
【００４３】
さらに、第1の特徴による生成物は、以下の実施例に記載したようにして測定したときに皮膚の全体的な弾性R2を大きくすることができる。好ましい一実施態様では、この値が8週間にわたって少なくとも4％増大するが、少なくとも8％であることが好ましく、少なくとも12％であることがより好ましい。
【００４４】
また、好ましい一実施態様では、第1の特徴による生成物は、本明細書に記載したようにして測定したときに皮膚の平均の粗さの値を8週間にわたって少なくとも5％小さくすることができる。この値は少なくとも10％であることが好ましく、少なくとも15％であることが最も好ましい。
【００４５】
さらに別の好ましい一実施態様では、第1の特徴による生成物は、本明細書に記載したようにして測定したときに皮膚の最大の粗さの値を8週間にわたって少なくとも3％小さくすることができる。この値は少なくとも5％であることが好ましく、少なくとも10％であることが最も好ましい。
【００４６】
第1の特徴による生成物の別の好ましい一実施態様は、本明細書に記載したようにして測定したときに皮膚の粘弾性比R6を8週間にわたって少なくとも10％増大させることができる。この値は少なくとも15％、20％、25％であることが好ましく、少なくとも30％であることが最も好ましい。
【００４７】
他の成分
好ましい一実施態様では、本発明の生成物は、他の成分を含むこともできる。それは、1種類以上の活性成分、1種類以上の医薬的に活性な物質、水溶性賦形剤（例えばラクトース）であることが好ましい。
【００４８】
別の好ましい一実施態様では、本発明の生成物は、1種類以上の酵素も含むことができる。好ましい酵素は、リガーゼ、および／またはトランスフェラーゼ、および／またはオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、および／またはリアーゼ、および／またはイソメラーゼであり、より好ましいのは、デンプン分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解酵素、オキシドレダクターゼ、植物の細胞壁分解酵素のいずれかであり、さらに好ましいのは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼからなるグループの中から選択した活性を有する酵素である。
【００４９】
本発明で使用できる活性成分または医薬的に活性な物質の例として、タンパク質薬および／またはペプチド薬である例えばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン／ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、骨誘導因子、インターフェロンまたはその誘導体、インスリンまたはその誘導体、アトリオペプチン-III、モノクローナル抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍退化因子、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベータ、VII因子、VIII因子、ウロキナーゼが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５０】
活性成分を安定させることを目的として水溶性賦形剤が含まれていてもよく、そのような賦形剤として、タンパク質（例えばアルブミン、ゼラチン）、アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシン）とその塩、炭水化物（例えばグルコース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、硫酸コンドロイチン）、無機塩（例えばリン酸塩）、界面活性剤（例えばトゥイーン（登録商標）（ICI社）、ポリエチレングリコール）や、これらの混合物がある。賦形剤または安定剤は、生成物の0.001〜99重量％の量を使用することができる。
【００５１】
本発明のいくつかの特徴は、第1の特徴による生成物の有効量と、活性成分（活性成分は医薬的に活性な物質であることが好ましい）と、医薬的に許容可能な基剤、賦形剤、希釈剤のいずれか（水溶性賦形剤が好ましく、ラクトースが最も好ましい）とを特に含むさまざまな組成物と医薬に関する。
【００５２】
さらに、本発明のさまざまな特徴は、第1の特徴による生成物、または別の特徴および実施態様による組成物を含む製品（例えば化粧品、衛生製品、医療製品、外科製品）に関する。本発明の最後の特徴は、第1の特徴による生成物、または本発明の別の特徴および実施態様による組成物を含むカプセル薬またはマイクロカプセル薬に関する。
【００５３】
生成物または組成物の利用法
本発明のさまざまな特徴は、例えば医療の分野において第1の特徴による生成物または本発明の組成物を用いて治療処置を行なう方法に関する。
【００５４】
1つの特徴は、眼科処置を行なう方法に関するものであり、この方法は、第1の特徴による生成物または本発明の組成物を用いる操作を含んでいる。
【００５５】
別の特徴は、変形性関節症の治療において処置を行なう方法に関するものであり、この方法は、第1の特徴による生成物または本発明の組成物を用いる操作を含んでいる。
【００５６】
さらに別の特徴は、がんの治療において処置を行なう方法に関するものであり、この方法は、第1の特徴による生成物または本発明の組成物を用いる操作を含んでいる。
【００５７】
1つの特徴は、医薬的に活性な医薬を経皮投与する方法または皮膚に塗布する方法に関するものであり、この方法は、第1の特徴による生成物または本発明の組成物を用いる操作を含んでいる。
【００５８】
別の特徴は、化粧品を皮膚に塗る方法に関するものであり、この方法は、本発明の生成物または組成物を用いる操作を含んでいる。
【実施例】
【００５９】
実施例１
分子量が異なるさまざまなヒアルロン酸（HA）ナトリウム画分を使用した。表1に、重量平均分子量（Mw）、数平均分子量（Mn）、多分散度（I=Mw/Mn）をまとめてある。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
化粧用組成物に含まれる分子量が明確なHAの効果的なテストを、以下の組成物（表2）を用いて実施した。プラセボのクリームは、同じ成分にしてHAを除いたもので構成した。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
この研究の目的は、化粧品を長期（1ヶ月と2ヶ月）にわたって使用した後の皺防止効果を評価し、その結果をプラセボ・クリームと比較することである。
【００６４】
12人の被験者に2ヶ月にわたって活性クリームとプラセボを1日に2回家庭で塗ってもらった。この研究の開始時と、1ヶ月処理した後と、研究の終了時に、目の周囲の領域で皮膚の含水量と弾性を機械で測定した。同じ領域の皮膚表面のプラスチック製レプリカを作り、皮膚角質層の微細な凹凸をそのレプリカの画像分析によって評価した。さらに、調べた領域のディジタル写真を撮影した。
【００６５】
評価法
研究は、生物気候室（24℃、相対湿度50％）の中で実施した。ボランティアに、測定前の少なくとも3時間は顔を洗わず、テストに関係する領域にいろいろな製品を塗らないように依頼した。研究の開始時（T0）に、再現可能なやり方で印を付けた左と右の目の領域で、皮膚の含水量、弾性、粗さを機械で評価した。同じ領域のディジタル写真も撮影した。
【００６６】
一方の側を活性クリームで処理し、残りの半分の側を対照としてのプラセボ・クリームで処理した顔の評価を行なった。2種類のクリーム（活性クリームとプラセボ）を塗った顔の左側と右側をランダム化した。被験者は、自分の顔に2種類の生成物を2ヶ月にわたって1日に2回塗った。
【００６７】
1ヶ月処理した後（T30d）とテストの終了時（2ヶ月処理した後、T60d）に被験者に実験室に再び来てもらって機械による測定を繰り返し、新しいディジタル画像を取得した。次に、得られたデータを分析し、統計的に比較した。
【００６８】
長期の含水量
角質測定を利用して皮膚表面の含水量を評価した。角質測定では角質層（SC）の能力が測定されるため、SCの相対的な湿り具合がわかる。この測定は、角質測定器Combi CM 825を利用して実施した（CourageとKhazaka）。結果を図1に示してある。含水量の有意な増加が、4週間と8週間にわたって処理した後のすべての分子量のHAで明らかに見られた。
【００６９】
弾性
皮膚測定器SEM 575を用いて皮膚の弾性を測定した（CourageとKhazaka）。この皮膚測定器では、測定プローブの開口部に吸い込まれるときの皮膚の鉛直方向の変形を測定する。この方法により、図2に示したような皮膚の弾性に関する変形パラメータが得られる。そのパラメータは以下のものである。
・UA/UF = 皮膚の全体的な弾性（R2パラメータ）
・UV/UE = 粘弾性比（R6パラメータ）
・UA = 応力なしの期間が終了したときの変形からの回復の合計
・UF = 皮膚の伸びの合計
・UＶ= 弾性変形の後に起こる粘弾性クリープ
・UE = 応力を加えることによる皮膚の弾性変形。
【００７０】
8週間塗布した後に測定した全体的弾性R2を図3に示してある。全体的な弾性（R2）の有意な上昇が、すべての活性なクリームで明らかに観察された。異なる分子量のHA画分の間で有意差は観察されなかった。
【００７１】
皺防止
皮膚表面の形状を、皮膚表面のレプリカと画像分析によって評価した。このテストの原理は、迅速に硬化する合成ポリマー（SILFLO（登録商標）、フレクシコ社、イギリス国）を塗ることによって皮膚表面のネガ・プリントを取得するというものである。次にこのレプリカを画像のディジタル化によって分析する。この画像から標準的な粗さパラメータであるRa（平均の粗さ）とRz（深い皺の最大の粗さ）を計算した。
【００７２】
平均の粗さの結果を図4に示してある。平均の粗さの値は、4週間塗布した後と8週間塗布した後に有意に低下した。この効果は、皮膚の表面に優先的に蓄積する300,000Da MWの画分でより顕著であった。
【００７３】
最大の粗さの結果を図5に示してある。分子量が最も小さい2つの画分についてだけ、4週間塗布した後と8週間塗布した後に値が著しく低下した。この効果は、皮膚に浸透できる分子量が非常に小さな50kDaの画分で顕著であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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