(57)【要約】  本発明は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの新規な共有結合複合体、特に機能的に活性で、対応する遊離のＶＩＩ因子ポリペプチドと比較してＸ因子に対して亢進されたタンパク分解活性を有する該複合体、並びにこれらの新規な複合体の製造方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの共有結合複合体であって、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の指定された結合によって共有結合されている複合体。
【請求項２】
ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の特定の結合によって共有結合されている請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の直接結合によって共有結合されている請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
ＶＩＩ因子ポリペプチドが機能的に活性なＶＩＩ因子ポリペプチドである請求項１から３の何れか一項に記載の複合体。
【請求項５】
ＶＩＩａ因子ポリペプチドのタンパク分解活性が、明細書記載のインビトロタンパク分解アッセイによって測定して、遊離の天然（野生型）ＶＩＩａ因子の活性の少なくとも２倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、又は少なくとも２５０倍である請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの共有結合複合体であって、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の結合によって共有結合され、ＶＩＩａ因子ポリペプチドのタンパク分解活性が、明細書記載のインビトロタンパク分解アッセイによって測定して、遊離の天然（野生型）ＶＩＩａ因子の活性の少なくとも２倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、又は少なくとも２５０倍である複合体。
【請求項７】
アミノ酸のセットが一又は複数のシステインアミノ酸を含む請求項１から６の何れか一項に記載の複合体。 
【請求項８】
該セットのそれぞれが１個のシステインアミノ酸を含む請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
該セットのそれぞれが２個のシステインアミノ酸を含む請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
可溶型組織因子ポリペプチドの位置Ｔｈｒ１７、Ｌｙｓ２０、Ｉｌｅ２２、Ｓｅｒ４２、Ｇｌｙ４３、Ａｓｐ４４、Ｔｒｐ４５、Ｌｙｓ４６、Ｓｅｒ４７、Ｐｈｅ５０、Ｃｙｓ５７、Ａｓｐ５８、Ａｓｐ６１、Ｇｌｙ１０９、Ｇｌｎ１１０、Ｌｅｕ１３３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｒｏ２０６及びＶａｌ２０７、特に可溶型組織因子ポリペプチドのＴｒｐ４５、Ａｓｐ５８、Ｇｌｙ１０９、Ｐｒｏ２０６及びＶａｌ２０７のアミノ酸の少なくとも１個が、指定された結合、例えば特定の結合、特に直接結合を生じる反応性側鎖を有するアミノ酸に置き換えられている請求項１から９の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
ＶＩＩ因子ポリペプチドの位置Ｌｅｕ３９、Ｐｈｅ４０、Ｉｌｅ４２、Ｓｅｒ４３、Ｔｙｒ４４、Ｇｌｎ６４、Ｌｅｕ６５、Ｉｌｅ６９、Ｇｌｕ７７、Ｇｌｙ７８、Ａｒｇ７９、Ｖａｌ９２、Ｐｈｅ２７５、Ｖａｌ２７６、Ａｒｇ２７７、Ｍｅｔ３０６、Ｔｈｒ３０７，及びＧｌｕ３２５、特にＶＩＩ因子ポリペプチドのＰｈｅ４０、Ｓｅｒ４３、Ｇｌｎ６４ Ｇｌｕ７７及びＰｈｅ２７５のアミノ酸の少なくとも１個が、指定された結合、例えば特定の結合、特に直接結合を生じる反応性側鎖を有するアミノ酸に置き換えられている請求項１から１０の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
アミノ酸セット
ＦＶＩＩ−Ｉｌｅ６９  −  ｓＴＦ−Ｔｈｒ１７、
ＦＶＩＩ−Ｉｌｅ６９  −  ｓＴＦ−Ｌｙｓ２０、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ７９  −  ｓＴＦ−Ｉｌｅ２２、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ９２  −  ｓＴＦ−Ｓｅｒ４７、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ９２  −  ｓＴＦ−Ｐｈｅ５０、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｙ７８  −  ｓＴＦ−Ｃｙｓ５７、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｕ７７  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｙ７８  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ７９  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ２７７  −  ｓＴＦ−Ｓｅｒ４２、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ２７６  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ４３、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ２７７  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ４３、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ４４、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ２７６  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ４４、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ２７７  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ４４、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ２７６  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ１３４  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ｌｙｓ４６、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｎ６４  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ１０９、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｎ６４  −  ｓＴＦ−Ｇｌｎ１１０、
ＦＶＩＩ−Ｌｅｕ６５  −  ｓＴＦ−Ｇｌｎ１１０、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ７１  −  ｓＴＦ−Ｌｅｕ１３３、
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｓｅｒ２０５、
ＦＶＩＩ−Ｌｅｕ３９  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ４０  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｉｌｅ４２  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｔｙｒ４４  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｌｅｕ３９  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ４０  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７、及び
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７
の少なくとも一つ、特にアミノ酸セット
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ４０  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７、
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｎ６４  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ１０９、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｕ７７  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、及び
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５
の少なくとも一つのアミノ酸の一方又は双方が、指定された結合、例えば特定の結合、特に直接結合を生じる反応性側鎖を有するアミノ酸に置き換えられている請求項１から１１の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
少なくとも一つの直接結合が２個のシステインアミノ酸間にある請求項１から１２の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１４】
少なくとも一つの直接結合が光反応性アミノ酸を介して形成される請求項１から１３の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
光反応性アミノ酸が、ｐｈｏｔｏ−Ｉｌｅ、ｐｈｏｔｏ−Ｌｅｕ及びｐｈｏｔｏ−Ｍｅｔからなる群から選択される請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸の一又は複数のセットのアミノ酸側鎖間のリンカー部分によって共有結合されている請求項１から１５の何れか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
リンカー部分がヘテロ二官能性試薬から誘導される請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
請求項１から１７の何れか一項に記載のＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの複合体の製造方法であって、ａ）（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸分子と該核酸分子に作用可能に結合した発現制御領域を含む発現ベクターと（ｉｉ）組織因子ポリペプチドをコードする核酸分子と該核酸分子に作用可能に結合した発現制御領域を含む発現ベクターとを細胞に形質移入し、ｂ）形質移入細胞を、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの発現条件下で培養し、ｃ）発現された複合体を適切な手段によって単離することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの新規な共有結合複合体、特に機能的に活性で、対応する遊離のＶＩＩ因子ポリペプチドと比較してＸ因子に対して亢進されたタンパク分解活性を有する該複合体に関する。かかる複合体は出血性疾患の治療に特に有用であると考えられる。
【０００２】
（発明の背景）
高められた生物学的活性を有するＶＩＩａ因子ポリペプチドは、組換え型ＶＩＩａ因子の最適以下の作用強度のため一般的な組換え型ＶＩＩａ因子療法には部分的もしくは完全に不応性である止血不能の出血の治療のための望ましい分子である。作用強度を高めるための現在のアプローチ法は、組織因子とは無関係に、活性化血小板に対する直接のＸ因子活性化であると思われる組換え型ＶＩＩａ因子の作用機序を反映させている。
【０００３】
組織因子は、血管外膜の細胞に常在する２６３個のアミノ酸の膜内在性糖タンパク質レセプターである。組織因子は、それぞれ単一のジスルフィド結合によって安定化された２つの緻密なフィブロネクチンＩＩＩ型様ドメインに折り畳まれた細胞外部分（１−２１９）、膜貫通セグメント（２２０−２４２）、及び短い細胞質側末端（２４３−２６３）からなる。組織因子は、血管外傷時に循環系から捕捉されるＶＩＩ因子と密接なＣａ２＋依存性複合体を形成することにより血液凝固の重要な阻害剤として作用する。組織因子はまた最適な巨大分子エキソサイト相互作用のためのスキャフォールドを提供し、ＶＩＩａ因子のプロテアーゼドメインに立体構造変化を誘導して、活性部位領域を正しく形成することによって、その生理学的基質ＩＸ因子及びＸ因子に向けてのＶＩＩａ因子のタンパク分解活性を大きく亢進する。直接のタンパク質間相互作用から生じるＴＦによるＦＶＩＩａの立体構造活性化は、ＶＩＩａ因子に組織因子の可溶型外部ドメインを供給することによってインビトロで反復されうる。
【０００４】
Miyata等, Biochemistry, 36, 1997, 5120-5127は、ホモ二官能性アミン特異的試薬によって化学的に架橋されている組換え型ＶＩＩａ因子と可溶型組織因子の共有結合複合体を開示している。しかしながら、その架橋複合体はＸ因子に対してタンパク分解活性を示さなかった。
【０００５】
（発明の簡単な説明）
本発明は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの新規な共有結合複合体に関する。該複合体は、対応する遊離のＶＩＩ因子ポリペプチドに対して、巨大分子基質Ｘ因子に対する亢進されたタンパク分解活性を示す。
【０００６】
より詳細には、本発明は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの共有結合複合体であって、該ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の指定された結合によって共有結合されている複合体に関する。
【０００７】
更に、本発明は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの共有結合複合体であって、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の結合によって共有結合され、ＶＩＩａ因子ポリペプチドのタンパク分解活性が、明細書記載のインビトロタンパク分解アッセイによって測定して、遊離の天然（野生型）ＶＩＩａ因子の活性の少なくとも２倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、又は少なくとも２５０倍である複合体にも関する。
【０００８】
本発明はまたここで定義されたＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの複合体の製造方法であって、ａ）（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸分子と該核酸分子に作用可能に結合した発現制御領域を含む発現ベクターと（ｉｉ）組織因子ポリペプチドをコードする核酸分子と該核酸分子に作用可能に結合した発現制御領域を含む発現ベクターとを細胞に形質移入し、ｂ）形質移入細胞を、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの発現条件下で培養し、ｃ）発現された複合体を適切な手段によって単離することを含む方法にも関する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明はとりわけＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの共有結合複合体であって、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の指定された結合によって共有結合されている複合体に関する。
【００１０】
本明細書において、「共有結合複合体」なる用語は、少なくとも一つの共有連結又は結合と複数の非共有結合性相互作用、例えば水素結合、疎水性相互作用等々によって関連させられた二分子（ここでは、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチド）のことである。よって、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドはこのようにして共有結合している。
【００１１】
該二つのポリペプチドは、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の指定された結合によって結合している。
【００１２】
ここで用いられる場合、「ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語は、野生型ＶＩＩ因子（つまり、米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）、並びに野生型ＶＩＩ因子に対して実質的に同じか又は改善された生物学的活性を示すＶＩＩ因子の変異体、ＶＩＩ因子誘導体及びＶＩＩ因子コンジュゲートを包含する。「ＶＩＩ因子」なる用語は、その未切断（チモーゲン）型のＶＩＩ因子ポリペプチド、並びにタンパク分解的にプロセッシングされてそのそれぞれの生理活性形態を生じるものを包含することを意図しており、これはＶＩＩａ因子と標記することができる。「ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語はまたＶＩＩａ因子生物学的活性が野生型ＶＩＩａ因子の活性に対して実質的に改変されているか又は些か低減されている変異体を含むポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、限定するものではないが、ポリペプチドの生理活性を変更又は乱す特定のアミノ酸配列改変を導入したＶＩＩ因子又はＶＩＩａ因子が含まれる。
【００１３】
血液凝固におけるＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合し、（ｉｉ）ＩＸ因子又はＸ因子のタンパク分解性切断を触媒して、活性型ＩＸ又はＸ因子（ぞれぞれＩＸａ又はＸａ因子）を生産するその能力から導かれる。
【００１４】
本明細書において、「機能的に活性なＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語は、タンパク分解的にプロセッシングされてその各活性型を生じ、しばしば「ＶＩＩａ因子ポリペプチド」と称される「ＶＩＩ因子ポリペプチド」を意味する。
ある重要な実施態様では、ＶＩＩ因子ポリペプチドは機能的に活性である。
ここで使用される「野生型ヒトＦＶＩＩａ」は米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１５】
ここで使用される「ＶＩＩ因子誘導体」なる用語は、親ペプチドのアミノ酸の一又は複数が、例えばアルキル化、グリコシル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等々によって遺伝的及び／又は化学的及び／又は酵素的に修飾されている、野生型ＶＩＩ因子に対して実質的に同じか又は改善された生物学的活性を示すＦＶＩＩポリペプチドを示すことを意図している。限定されるものではないが、これには、ペグ化ヒトＶＩＩａ因子、システイン-ペグ化ヒトＶＩＩａ因子及びそれらの変異体が含まれる。ＶＩＩ因子誘導体の非限定的な例には、国際公開第０３／３１４６４号及び米国特許出願第２００４００４３４４６号、同第２００４００６３９１１号、同第２００４０１４２８５６号、同第２００４０１３７５５７号、及び同第２００４０１３２６４０号(Neose Technologies, Inc.)に開示された糖ペグ化ＦＶＩＩ誘導体；国際公開第０１／０４２８７号、米国特許出願第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、同第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)及び国際公開第０２／０２７６４号、米国特許出願第２００３０２１１０９４号 (University of Minnesota)に開示されたＦＶＩＩコンジュゲートが含まれる。
【００１６】
「改善された生物学的活性」なる用語は、ｉ）組換え野生型ヒトＶＩＩａ因子と比較して実質的に同じか又は増加したタンパク分解活性を持つＦＶＩＩポリペプチド、あるいはｉｉ）組換え野生型ヒトＶＩＩａ因子と比較して実質的に同じか又は増加したＴＦ結合活性を持つＦＶＩＩポリペプチドあるいはｉｉｉ）組換え野生型ヒトＶＩＩａ因子と比較して実質的に同じか又は増加した血漿中半減期を持つＦＶＩＩポリペプチドを意味する。「ペグ化ヒトＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒトＶＩＩａ因子ポリペプチドにコンジュゲートしたＰＥＧ分子を有するヒトＶＩＩａ因子を意味する。ＰＥＧ分子は、ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は糖鎖部分を含むＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意の部分に結合しうることが理解されなければならない。「システイン-ペグ化ヒトＶＩＩａ因子」なる用語はヒトＶＩＩａ因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートしたＰＥＧ分子を有するＶＩＩａ因子を意味する。
【００１７】
組換え野生型ヒトＶＩＩａ因子と比較して実質的に同じか又は増加したタンパク分解活性をＶＩＩ因子ポリペプチドに付与するＶＩＩ因子ポリペプチド中のアミノ酸の更なる置換の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ(Lino等, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示されたような増大したタンパク分解活性を示すＦＶＩＩａポリペプチドを提供する置換；残基２９０と２９１の間又は残基３１５と３１６の間でタンパク分解的に切断されたＦＶＩＩａポリペプチドを提供する置換(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；ＶＩＩａ因子の酸化型(Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；国際公開第０２／０７７２１８号に開示されたようなＦＶＩＩａポリペプチドにおける置換；及び国際公開第０２／３８１６２(Scripps Research Institute)に開示されたような増加したタンパク分解安定性を示すＦＶＩＩａポリペプチドにおける置換；国際第９９／２０７６７号、米国特許第６０１７８８２号及び同第６７４７００３号、米国特許出願第２００３０１００５０６号(University of Minnesota)及び国際公開第００／６６７５３号、米国特許出願第２００１００１８４１４号、同第２００４２２０１０６号、及び同第２００１３１００５号、米国特許第６７６２２８６号及び同第６６９３０７５号(University of Minnesota)に維持されたような修飾Ｇｌａドメインを有し高い膜結合性を示すポリペプチドを提供するＦＶＩＩａポリペプチドにおける置換；及び国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国特許出願第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)、及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示されたＦＶＩＩａポリペプチドにおける置換が含まれる。
【００１８】
野生型ＦＶＩＩａと比較して増大した生物学的活性を有するＦＶＩＩポリペプチドを提供するＦＶＩＩａポリペプチドにおける更なる置換の非限定的な例には、国際公開第０１／８３７２５号、同第０２／２２７７６号、同第０２／０７７２１８号、同第０３／０２７１４７号、同第０４／０２９０９０号、同第０３／０２７１４７号；同第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示された置換；及びＪＰ２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示された亢進した活性を有するＦＶＩＩａポリペプチドが含まれる。
【００１９】
本発明のＦＶＩＩａポリペプチドにおける更なる置換の例には、限定するものではないが、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ１５７Ａ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ、及びＳ３３６Ｇ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ；Ｒ１５２Ｅ、Ｓ３４４Ａ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列における置換、付加又は欠失；
３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列における置換、付加又は欠失；及び１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇまでのアミノ酸配列における置換、付加又は欠失が含まれる。
【００２０】
ここで使用される「変異体」又は「変異体群」なる用語は、その親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、及び／又はその親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が欠失されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸がタンパク質に挿入されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている、米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列を有するＶＩＩ因子を示すことを意図している。かかる付加は親タンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れか又は双方において生じうる。この定義内の「変異体」又は「変異体群」はその活性化型においてＦＶＩＩ活性をなお有している。一実施態様では、変異体は米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列と７０％同一である。一実施態様では、変異体は米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列と８０％同一である。他の実施態様では、変異体は米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列と９０％同一である。更なる実施態様では、変異体は米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列と９５％同一である。
【００２１】
本明細書において、「組織因子ポリペプチド」なる用語は、組織因子の可溶型外部ドメイン、つまりアミノ酸１−２１９（以下においてｓＴＦ又はｓＴＦ（１−２１９）と言う）を含むポリペプチド、又はその機能性変異体又は切断型を意味する。好ましくは、組織因子ポリペプチドは組織因子のアミノ酸配列６−２０９に対応する断片を少なくとも含む。その例は、特にｓＴＦ（６−２０９）、ｓＴＦ（１−２０９）及びｓＴＦ（１−２１９）である。
【００２２】
成熟型ヒト組織因子のアミノ酸配列（１−２６３）は配列番号２に与えられ、Spicer等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5148-5152に開示されている。
Ｓｅｒ１−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ１０−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ２０−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ３０−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ４０−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ５０−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ６０−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ７０−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ８０−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ９０−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ１００−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ１１０−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ１２０−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ１３０−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ１４０−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ１５０−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ１６０−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ１７０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ１８０−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ１９０−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｒｇ２００−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ２１０−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ２２０−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ２３０−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ２４０−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ２５０−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ２６０−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ２６３（配列番号２）。
【００２３】
本明細書において、「指定された結合」及び「指定された結合群」なる用語は、（場合によってはリンカー部分を介して）共有結合したアミノ酸側鎖の一又は複数のセットによって、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが共有結合していることを意味することを意図しており、ここで、複合体種の少なくとも９０％のセットが複合体種の集団全体においてセットの各々内における２個のアミノ酸の少なくとも一つの位置とタイプについて同一である。このような結合は、アミノ酸側鎖間の直接結合として、例えばシステインアミノ酸側鎖間のＳ-Ｓ架橋の形態で、あるいはアミノ酸側鎖を結合させるリンカー部分によって確立されうる。
【００２４】
好ましくは、複合体種の少なくとも９５％、又は更には少なくとも９８％、又は更には実質的に全てが複合体種の集団全体においてセットの各々内における２個のアミノ酸の少なくとも一つの位置とタイプについて同一である。
【００２５】
共有結合されたアミノ酸側鎖のセットの数は特に重要ではないが、現在の実験結果に鑑みれば、一つのセットだけが必要であると思われる。結合は「指定」されている、つまりセットの各々内における２個のアミノ酸の少なくとも一方の位置とタイプが予め決まっているので、一般的な（ホモ）二官能性架橋剤を使用する「ショットガン」アプローチ法とは異なり、関連したポリペプチドの機能性及びタンパク分解活性を維持することができることが理解されなければならない。換言すれば、共有結合されたアミノ酸側鎖のセットの数は典型的には１−１０、例えば１−５、例えば１−４、又は１−３、１−２、又は２−４、又は２−３の範囲、又は１もしくは２の結合、特に１又は２の結合、好ましくはただ一つの結合である。
【００２６】
一又は複数の指定された結合の形成は、それぞれが他のポリペプチドのアミノ酸と反応することができる一又は複数のアミノ酸を一方又は双方のポリペプチドに導入するか、又は一又は複数の特定のアミノ酸（好ましくは１−１０個だけのアミノ酸）と反応することができる架橋剤（最も好ましくはヘテロ二官能性架橋剤）を添加することにより、達成することができる。
【００２７】
重要な一実施態様では、ＶＩＩ因子ポリペプチド及び組織因子ポリペプチドの各々は、分子内ジスルフィド結合を樹立するようにはなされていないがＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチド間に分子内ジスルフィド結合、つまり共有結合を形成することができる一又は複数のシステインアミノ酸を含む。
【００２８】
ＶＩＩ因子ポリペプチドのタンパク分解活性を保持するためには、図１に示されているように、そのようなシステインアミノ酸が対応する非共有結合複合体中のＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチド間の天然界面に位置しているのが有利である。成功裡に設計された場合、分子内ジスルフィド結合は、複合体を安定化させ、ＶＩＩａ因子の触媒的にコンピテントな立体構造を促進する。ジスルフィド設計は、ＶＩＩａ因子／組織因子複合体のＸ線構造の応用により実施されている(特にＰＤＢエントリーコード１ＤＡＮを持つ構造(Banner等(1996) Nature, 380, 41-46))。２個の導入されたシステインアミノ酸間にジスルフィド結合を樹立するための重要な一つの基準は、そのＣα原子間の距離が７Å未満であることである(Petersen等(1999) Protein Eng., 12, 535-548)。ＶＩＩａ因子−組織因子複合体中のＶＩＩａ因子と組織因子のＣα原子間の距離の計算は１７の潜在的なシステイン対を生じる。これらの間のジスルフィド結合の形成の可能性の更なる評価は、ジスルフィドをモデル化(CHARMMパッケージ, Accelrys, SanDiego)した後 、視覚検査によって実施した。Petersen等(1999) Protein Eng., 12, 535-548によって確立された基準を満たすジスルフィドが生化学評価の候補と考えられる。
【００２９】
他の実施態様では、ＶＩＩ因子ポリペプチド及び／又は組織因子ポリペプチドは、光活性化されると、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの間に対応する分子間結合、つまり共有結合を形成することができる一又は複数の反応性アミノ酸を含む。そのような光反応性アミノ酸の例は、Suchanek等(Suchanek等 2005;スキーム１を参照)によって開発されたフォト-イソロイシン(ｐｈｏｔｏ−Ｉｌｅ)、フォト-メチオニン(ｐｈｏｔｏ−Ｍｅｔ)、及びフォト-ロイシン(ｐｈｏｔｏ−Ｌｅｕ)、及びp-ベンゾイル-L-フェニルアラニンである。
【００３０】
2009532048.tif 000002
タンパク質中へのｐｈｏｔｏ−Ｉｌｅ、ｐｈｏｔｏ−Ｍｅｔ、及びｐｈｏｔｏ−Ｌｅｕの導入と次の光誘導架橋はSuchanek等(2005) Nature methods, 2, 261-267に記載されている。
【００３１】
あるいは、一又は複数の指定された結合は、ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と組織因子ポリペプチドのアミノ酸の一又は複数のセットのアミノ酸側鎖間のリンカー部分によって樹立される。そのようなリンカー部分の例は、特定のアミノ酸側鎖、例えばポリペプチドの一方のシステイン側鎖と反応し、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが非共有結合複合体を形成する場合にその特定のアミノ酸側鎖と密に空間的に近接している別のアミノ酸側鎖と反応することができるヘテロ二官能性試薬から誘導されたものである。
【００３２】
特に適したヘテロ二官能性試薬の例は、システインアミノ酸側鎖と最初に反応し、つづいて（好ましくは活性化、例えば光活性化又はロジウム触媒された際）密に空間的に近接している別のアミノ酸側鎖と反応することができるものである。その特定の例は、Zhang等(Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol. 217, 3, 1995, 1177-1184)によって開示されているもの、例えばｐ-アジドヨードアセトアニリド、臭化ｐ-アジドフェナシル及びｐ-アジドブロモアセトアニリド、及び
2009532048.tif 000003
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等々である。
【００３３】
上記に鑑みると、共有結合が反応性側鎖によって又はヘテロ二官能性試薬によって樹立される実施態様は、必ずしも全ての種が同一ではない複合体種の集団を生じうることは明らかである。これは、反応性側鎖（例えば光反応性側鎖）とヘテロ二官能性試薬（アミノ酸側鎖との特定の反応後さえ）が、側鎖／試薬のサイズが減少すると「反応対」の数が劇的に減少するけれども、更なる反応時に一を越える潜在的「反応対」を経験しうるためである。
【００３４】
しかしながら、ある実施態様では、実質的に一つの可能な「反応対」が存在するように関連アミノ酸側鎖（又は二官能性試薬）を選択することができる。これは、可能な「反応対」（つまり、他のシステイン）の存在量が非常に限られているため、結合がジスルフィド結合の形態にあるときに特にしかりである。
【００３５】
よって、好ましい実施態様では、本発明は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の特定の結合によって共有結合されている上に定義された複合体を提供する。
【００３６】
本明細書において、「特定の結合」及び「特定の結合群」なる用語は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、共有結合アミノ酸側鎖の一又は複数のセットによって共有結合していることを意味することを意図しており、ここで、複合体種の少なくとも９０％のセットが複合体種の集団全体のセットの各々内の各アミノ酸の位置及びタイプに対して同一である。
好ましくは、複合体種の少なくとも９５％、又は更には少なくとも９８％、又は実質的に全部が複合体種の集団全体のセットの各々内の各アミノ酸の位置及びタイプに対して同一である。
【００３７】
更により好ましくは、上記一又は複数の特定結合は、ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と組織因子ポリペプチドのアミノ酸の一又は複数のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の直接結合として樹立される。
よって、本発明は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の直接結合によって共有結合されている上に定義された複合体を提供する。
【００３８】
本明細書において、「直接結合」及び「直接結合群」なる用語は、ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸側鎖と組織因子ポリペプチドのアミノ酸側鎖間の少なくとも一つの共有結合が、架橋剤、試薬等から誘導された残基を含まないが、例えばシステインアミノ酸側鎖間のＳ-Ｓ架橋の形態で、しかしそのようなアミノ酸が天然アミノ酸である必要はないが例えば光反応性側鎖でありうることを考慮して、各アミノ酸側鎖から誘導された原子によって形成されていることを意味することを意図している。従って、直接結合の形成は二官能性試薬等を含まない。
【００３９】
上記に鑑みると、アミノ酸のセットは一又は複数のシステインアミノ酸を含んでいることが好ましい。
一変形例では、セットの各々は、例えばヘテロ二官能性試薬へのカップリングの際に使用される１個のシステインアミノ酸を含んでいる。
他の変形例では、セットの各々は２個のシステインアミノ酸を含んでいる。この変形例では、ジスルフィド結合が樹立される。
【００４０】
タンパク分解活性は主として保持され又は亢進さえもされることが見出された。よって、好ましい実施態様は、ＶＩＩａ因子ポリペプチドのタンパク分解活性が、ここに記載のインビトロタンパク分解アッセイによって測定して、遊離の天然（野生型）ＶＩＩａ因子の活性の少なくとも２倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、又は少なくとも２５０倍であるものである。
【００４１】
よって、本発明はまたＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの共有結合複合体であって、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸のセットのアミノ酸側鎖間の一又は複数の結合によって共有結合され、ＶＩＩａ因子ポリペプチドのタンパク分解活性が、ここに記載のインビトロタンパク分解アッセイによって測定して、遊離の天然（野生型）ＶＩＩａ因子の活性の少なくとも２倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、又は少なくとも２５０倍である複合体に関する。
【００４２】
上述の如く、組織因子ポリペプチドは組織因子の可溶型外部ドメイン（１−２１９）又はその機能性変異体又は切断型である。
ある重要な実施態様では、可溶型組織因子ポリペプチド中の位置Ｔｈｒ１７、Ｌｙｓ２０、Ｉｌｅ２２、Ｓｅｒ４２、Ｇｌｙ４３、Ａｓｐ４４、Ｔｒｐ４５、Ｌｙｓ４６、Ｓｅｒ４７、Ｐｈｅ５０、Ｃｙｓ５７、Ａｓｐ５８、Ａｓｐ６１、Ｇｌｙ１０９、Ｇｌｎ１１０、Ｌｅｕ１３３、Ｓｅｒ２０５、Ｐｒｏ２０６及びＶａｌ２０７、特に可溶型組織因子ポリペプチド中のＴｒｐ４５、Ａｓｐ５８、Ｇｌｙ１０９、Ｐｒｏ２０６及びＶａｌ２０７のアミノ酸の少なくとも一つが、指定された結合、例えば特定結合、特に直接結合を生じる反応性側鎖を有するアミノ酸によって置換されている。好ましい変形例では、該少なくとも一つのアミノ酸はシステインアミノ酸である。
【００４３】
好ましくは前記のものと組み合わせられる他の重要な実施態様では、ＶＩＩ因子ポリペプチドの位置Ｌｅｕ３９、Ｐｈｅ４０、Ｉｌｅ４２、Ｓｅｒ４３、Ｔｙｒ４４、Ｇｌｎ６４、Ｌｅｕ６５、Ｉｌｅ６９、Ｇｌｕ７７、Ｇｌｙ７８、Ａｒｇ７９、Ｖａｌ９２、Ｐｈｅ２７５、Ｖａｌ２７６、Ａｒｇ２７７、Ｍｅｔ３０６、Ｔｈｒ３０７、及びＧｌｕ３２５、特にＶＩＩ因子ポリペプチドのＰｈｅ４０、Ｓｅｒ４３、Ｇｌｎ６４  Ｇｌｕ７７及びＰｈｅ２７５のアミノ酸の少なくとも一つが、指定された結合、例えば特定結合、特に直接結合を生じる反応性側鎖を有するアミノ酸によって置換されている。好ましい変形例では、該少なくとも一つのアミノ酸はシステインアミノ酸である。
【００４４】
より詳細には、アミノ酸セット
ＦＶＩＩ−Ｉｌｅ６９  −  ｓＴＦ−Ｔｈｒ１７、
ＦＶＩＩ−Ｉｌｅ６９  −  ｓＴＦ−Ｌｙｓ２０、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ７９  −  ｓＴＦ−Ｉｌｅ２２、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ９２  −  ｓＴＦ−Ｓｅｒ４７、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ９２  −  ｓＴＦ−Ｐｈｅ５０、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｙ７８  −  ｓＴＦ−Ｃｙｓ５７、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｕ７７  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｙ７８  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ７９  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ２７７  −  ｓＴＦ−Ｓｅｒ４２、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ２７６  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ４３、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ２７７  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ４３、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ４４、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ２７６  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ４４、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ２７７  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ４４、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５、
ＦＶＩＩ−Ｖａｌ２７６  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５、
ＦＶＩＩ−Ａｒｇ１３４  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ｌｙｓ４６、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｎ６４  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ１０９、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｎ６４  −  ｓＴＦ−Ｇｌｎ１１０、
ＦＶＩＩ−Ｌｅｕ６５  −  ｓＴＦ−Ｇｌｎ１１０、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ７１  −  ｓＴＦ−Ｌｅｕ１３３、
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｓｅｒ２０５、
ＦＶＩＩ−Ｌｅｕ３９  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ４０  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｉｌｅ４２  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｔｙｒ４４  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｌｅｕ３９  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７、
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ４０  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７、及び  
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７
の少なくとも一つ、
特にアミノ酸セット
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ４０  −  ｓＴＦ−Ｖａｌ２０７、
ＦＶＩＩ−Ｓｅｒ４３  −  ｓＴＦ−Ｐｒｏ２０６、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｎ６４  −  ｓＴＦ−Ｇｌｙ１０９、
ＦＶＩＩ−Ｇｌｕ７７  −  ｓＴＦ−Ａｓｐ５８、及び
ＦＶＩＩ−Ｐｈｅ２７５  −  ｓＴＦ−Ｔｒｐ４５
の少なくとも一つのアミノ酸の一方又は双方が、指定された結合、例えば特定結合、特に直接結合を生じる反応性側鎖を有するアミノ酸によって置換されている。
【００４５】
好ましい変形例では、少なくとも一つの直接結合はジスルフィド結合、つまり２個のシステインアミノ酸間の結合である。より好ましくは、全ての共有結合はジスルフィド結合の形態の直接結合である。特に、そのような結合の数は、１−５、特に１の結合である。
他の変形例では、少なくとも一つの直接結合は、特に、ｐｈｏｔｏ−Ｉｌｅ、ｐｈｏｔｏ−Ｌｅｕ及びｐｈｏｔｏ−Ｍｅｔからなる群から選択される光反応性アミノ酸を介して形成される。
【００４６】
また更なる実施態様では、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸と（ｉｉ）組織因子ポリペプチドのアミノ酸の一又は複数のセットのアミノ酸側鎖間のリンカー部分によって共有結合されている。特に、リンカー部分はヘテロ二官能性試薬から誘導される。
【００４７】
複合体の調製
ヘテロ二官能性試薬を使用する組織因子とＶＩＩ因子の架橋
一つの興味深い変形例では、複合体の調製方法は、可溶型組織因子のシステイン変異体を生産し、ついで可溶型組織因子中のシステインを、官能基の一つがシステイン反応性であるヘテロ二官能性試薬で標識し、最後に試薬の第二官能基によってＶＩＩａ因子に架橋させることを含む。大腸菌中での組織因子のシステイン変異体のクローニング及び発現並びにシステイン特異的試薬での標識の方法は過去に記載されている（Stone等(1995) Biochem. J., 310, 605-614；Freskgard等(1996) Protein Sci., 5, 1521-1540；Owenius等(1999) Biophys. J., 77, 2237-2250；Osterlund等(2001) Biochemistry, 40, 9324-9328）。一つの特異的システイン及び一つの光活性化可能な官能基を含むヘテロ二官能性試薬を使用するタンパク質の光架橋はZhang等(1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, 1177-1184に記載されている。
【００４８】
ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの同時発現
一つの特に興味深い変形例では、複合体の調製方法は、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの同時発現を含み、これにより、２つのポリペプチド間に共有結合を直ぐに樹立させることができる。
【００４９】
より詳細には、本発明は、ここに記載のＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの複合体の製造方法であって、ａ）（ｉ）ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸分子と該核酸分子に作用可能に結合した発現制御領域を含む発現ベクターと（ｉｉ）組織因子ポリペプチドをコードする核酸分子と該核酸分子に作用可能に結合した発現制御領域を含む発現ベクターとを細胞に形質移入し、ｂ）形質移入細胞を、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドの発現条件下で培養し、ｃ）発現された複合体を適切な手段によって単離することを含む方法にも関する。
【００５０】
この特に興味深い一実施態様では、二つのポリペプチドは、ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチド間の特定結合、より詳細には直接結合、例えば一又は複数のジスルフィド結合によって結合されている。
【００５１】
細胞中でのタンパク質の発現は、タンパク質生産の当業者によく知られている。本発明の方法の実施において、細胞は典型的には真核生物細胞、より好ましくは、限定するものではないが、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、及びＨＥＫ２９３（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３；Graham等, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）細胞株を含む樹立された真核生物細胞株である。好ましいＢＨＫ細胞株は、以下ではＢＨＫ５７０細胞と称されるｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株（Waechter及びBaserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982）である。ＢＨＫ５７０細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852からＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０３１４として入手可能である。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株はまた受託番号ＣＲＬ１６３２としてもＡＴＣＣから入手可能である。好ましいＣＨＯ細胞株は、受託番号ＣＣ１６１としてＡＴＣＣから入手できるＣＨＯ Ｋ１細胞株である。
【００５２】
他の適切な細胞株には、限定するものではないが、Ｒａｔ ＨｅｐＩ（Ｒａｔ肝細胞腫；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６００）、Ｒａｔ ＨｅｐＩＩ（Ｒａｔ肝細胞腫；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９．１）；ＤＵＫＸ細胞（ＣＨＯ細胞株）（Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980）（ＤＵＫＸ細胞はＤＸＢ１１細胞とも称される）、及びＤＧ４４（ＣＨＯ細胞株）（Cell, 33: 405, 1983,及びSomatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986）が含まれる。また有用なものは３Ｔ３細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、メラノーマ及びメラノーマと他の細胞との融合体である。ある実施態様では、細胞は変異体又は組換え細胞、例えばそれらが誘導される細胞型とは定性的又は定量的に異なった範囲のタンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素(例えばグリコシル化酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼ及び／又はグリコシダーゼ、又はプロセシング酵素、例えばプロペプチド)を発現する細胞でありうる。適切な昆虫細胞株には限定するものではないが鱗翅類(Lepidoptera)細胞株、例えばスポドプテラ・フルギペルダ細胞又はイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞(例えば米国特許第５０７７２１４号を参照)が含まれる。
【００５３】
ある実施態様では、本発明の実施に使用される細胞は懸濁培養で増殖することができる。ここで使用される場合、懸濁コンピテント細胞は大きな堅い凝集体をつくることなく懸濁体中で増殖し得るもの、つまり単分散性であるか凝集体当たり数個のみの細胞を伴って疎凝集体として増殖する細胞である。浮遊コンピテント細胞には、限定するものではないが、適合化又は操作なしに増殖する細胞(例えば造血細胞又はリンパ球細胞)及び懸濁増殖への付着依存性細胞 の漸次的適応化により懸濁コンピテントにされた細胞が含まれる。
【００５４】
本発明の実施に使用される細胞は接着細胞（足場依存性又は付着依存性細胞としても知られている）でありうる。ここで使用される場合、接着細胞はそれ自身を繁殖及び増殖に適した表面に接着させ又は固着させる必要のあるものである。本発明の一実施態様では、使用される細胞は接着細胞である。これらの実施態様では、増殖段階と生産段階の双方がマイクロキャリアの使用を含む。使用される接着細胞は、増殖段階中において担体上に移動し（マクロポーラス担体が使用される場合には担体の内部構造中に）、製造バイオリアクターに移される場合に新しい担体まで移動することができなければならない。接着細胞がそれ自身で新しい担体まで十分に移動することができない場合には、それらは、細胞含有マイクロキャリアをタンパク分解酵素又はＥＤＴＡに接触させることによって担体から遊離させることができる。使用される培地は（特に動物由来成分がない場合）接着細胞を支持するのに適した成分を更に含まなければならない；接着細胞の培養に適した培地は商業的な供給者、例えばＳｉｇｍａから入手できる。
【００５５】
細胞はまた懸濁適合化又は懸濁コンピテント細胞でありうる。そのような細胞が使用される場合、細胞の増殖は懸濁状態で行わせることができ、よってマイクロキャリアは生産培養容器自体での最終増殖段階及び生産段階においてのみ使用される。懸濁適合化細胞の場合、使用されるマイクロキャリアは典型的にはマクロポーラス担体であり、そこでは、細胞は担体の内部構造内の物理的捕捉体によって付着させられている。そのような実施態様では、真核生物細胞は典型的にはＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、メラノーマ細胞等々から選択される。
【００５６】
ＶＩＩ因子ポリペプチドと組織因子ポリペプチドはまた例えば公開番号ＷＯ０５／０７５６３５の国際特許出願に開示されているように大腸菌又はバクテリア又はトランスジェニック動物中で同時発現させることもできる。
【実施例】
【００５７】
次の実施例で使用されるアミノ酸置換の用語法は次の通りである。最初の文字は配列番号１又は配列番号２のある位置に天然に存在しているアミノ酸を表している。次の数は配列番号１又は配列番号２中の位置を表している。二番目の文字は天然のアミノ酸に置換される異なったアミノ酸を表している。一例はＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃであり、配列番号１の位置４０のフェニルアラニンがシステインに置き換えられている。他の例は、ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃで、配列番号２の２０７位のバリンがシステインで置き換えられている。
【００５８】
実施例１
材料  −  Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトンをＢａｃｈｅｍから購入した。発色Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５）、及びＨ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２８８）基質をＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Sweden）から得た。ヒト血漿由来Ｘ因子（ｈＦＸ）、Ｘａ因子（ｈＦＸａ）、及びＩＸａ因子（ｈＦＩＸａ）をＥｎｚｙｍｅ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（South Bend, IN）から得た。ヒト全脳マラソン既成ｃＤＮＡライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Mountain View, CA）から得た。大腸菌中に発現された可溶型組織因子１−２１９（ｓＴＦ（１−２１９））は公開された手順（Freskgard等(1996) Protein Sci., 5, 1531-1540）に従って調製した。組換え型ＶＩＩａ因子の発現と精製を、過去に記載されているようにして(Thim等(1988) Biochemistry, 27, 7785-7793；Persson等(1996) FEBS Lett., 385, 241-243)実施した。他の全ての化学物質は分析用等級又はそれ以上のものであった。
【００５９】
ＶＩＩ因子及びＶＩＩＦ４０Ｃ変異体をコードするＤＮＡの構築  −  そのプレ（シグナル配列）及びプロ領域を含むＶＩＩ因子の配列をコードするＤＮＡを、製造者の推奨に従ってＥｘｐａｎｄ・Ｈｉｇｈ・Ｆｉｄｅｌｉｔｙ・ＰＣＲシステム(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) とプライマーｏＨＯＪ１０４−ｆ及びｏＨＯＪ１０４−ｒを使用し、フランキングＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位(プライマー配列は表１に列挙)を導入するＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応のＤＮＡ鋳型は公開番号ＷＯ０２／０７７２１８の国際特許出願に開示されたＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、ついでｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega, Madison, WI) の対応部位に結合させてｐＨＯＪ３００を得た。天然（野生型）ＶＩＩ因子のアミノ酸は配列番号１に与えられている。そのプレ（シグナル配列）及びプロ領域を含む天然（野生型）ＶＩＩ因子のＤＮＡ配列は配列番号３に与えられている。
【００６０】
ＶＩＩ因子Ｆ４０ＣをコードするプラスミドｐＨＯＪ３４４を、製造者（Stratagene, La Jolla, CA）の指示書に従って、プライマーｏＨＯＪ１４３−ｆ及びｏＨＯＪ１４３−ｒと鋳型としてｐＨＯＪ３００を用いるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)部位特異的突然変異誘発によって構築した。全てのクローン化配列の正確な同一性はＤＮＡ配列決定によって実証した。
【００６１】
ｓＴＦ（１−２１９）及びｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ変異体をコードするＤＮＡの構築  −  そのシグナル配列を含むｓＴＦ（１−２１９）のＤＮＡコード配列を、製造者の推奨に従ってＥｘｐａｎｄ・Ｈｉｇｈ・Ｆｉｄｅｌｉｔｙ・ＰＣＲシステム(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) とプライマーｏＨＯＪ１５２−ｆ及びｏＨＯＪ１５２−ｒを使用し、フランキングＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位(プライマー配列は表１に列挙)を導入するＰＣＲによって、ヒト全脳ｃＤＮＡライブラリー(マラソン既成ｃＤＮＡ; Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA)から増幅させた。精製されたＰＣＲ産物をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ついでｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega, Madison, WI) の対応部位に結合させてｐＨＯＪ３５６を得た。
【００６２】
2009532048.tif 000009
【００６３】
ｓＴＦ（１−２１９）のアミノ酸は配列番号４に与えられる。そのシグナル配列を含むｓＴＦ（１−２１９）のＤＮＡ配列は配列番号５に与えられる。
ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７ＣをコードするプラスミドｐＨＯＪ３５７は、製造者（Stratagene, La Jolla, CA）の指示書に従って、プライマーｏＨＯＪ１４４−ｆ及びｏＨＯＪ１４４−ｒと鋳型としてｐＨＯＪ３５６を用いるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)部位特異的突然変異誘発によって構築した。全てのクローン化配列の正確な同一性はＤＮＡ配列決定によって実証した。
【００６４】
ＶＩＩ因子Ｆ４０Ｃ及びｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃの同時発現  −  ＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ及びｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃを、製造者の指示に従って、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ２９３発現システム（Invitrogen, Carlsbad, CA）での一過性発現によって同時発現させた。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で１．５×１０７細胞の７２−ｍｌ振盪培養物を最初に樹立することによって凍結保存培養物から増殖させた。ついで、培養物を１２日の期間をかけて２０００ｍｌの２．２×１０９細胞まで増殖させた。細胞は軌道振盪インキュベーター（Multitron II, Infors, Switzerland）中において３７℃、８％ＣＯ２、及び１００−１２５ｒｐｍで、緩いキャップを有する整流コニカルＰＥＧＴフラスコ（Nunc, Denmark）中で増殖させた。細胞密度は培養物の増殖前は１．４×１０６細胞／ｍｌを決して越えておらず、フラスコ体積はおよそ３：１に維持した。最初の７２−ｍｌ培養物を除いて、提供された増殖培地に、ＶＩＩ因子の翻訳後γカルボキシル化に必要とされる５ｐｐｍ（Sigma）までビタミンＫ１を補填した。拡大したＨＥＫ２９３Ｆ培養物（２０００ｍｌ，２．２×１０９細胞）についで８００μｇのプラスミドｐＨＯＪ３４４（１μｇ／μｌ）及び１５００μｇのプラスミドＤＮＡ ｐＨＯＪ３５７（１μｇ／μｌ）を含む混合物を形質移入した。プラスミドＤＮＡ及び２３９フェクチン(ｆｅｃｔｉｎＴＭ）（Invitrogen, Carlsbad, CA）のＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標)Ｉ溶液（Invitrogen, Carlsbad, CA）への添加、並びにこれらの混合と、形成された脂質ＤＮＡ複合体の細胞培養物への続く添加を、受け入れる溶液を穏やかに回旋しながら製造者の指示書に従って滴下して実施した。３７℃、８％ＣＯ２、及び１００ｒｐｍでの９６時間の形質移入培養物のインキュベーション後に、ＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ複合体を含む条件増殖培地を遠心分離によって回収し、更なるプロセシングまで−８０℃で保存した。
【００６５】
ＶＩＩ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ複合体の精製  −  １０ｍＭの濃度までＣａＣｌ２を加えた条件培地を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に結合させたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２(Novo Nordisk A/S, Bagsvard, Denmark)を含む２５ｍｌカラムに充填した。そのカラムを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５で平衡にした。平衡バッファー及び２ＭのＮａＣｌを含む平衡バッファーで洗浄した後、結合した物質を、ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのＥＤＴＡを含む平衡バッファーで溶出させた。ついで、集めたピーク画分に２０ｍＭの最終濃度まで塩化カルシウムを加えた。
【００６６】
少量の遊離ＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃを除去するために、製造者の指示書に従って４ｍｇのｓＴＦ（１−２１９）が結合された１−ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳカラム（GE Healthcare）に調製物を通過させた。充填前に、カラムを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５で平衡にした。ＶＩＩ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ複合体を含み、検出可能な遊離ＶＩＩ因子Ｆ４０Ｃ及びｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃを欠くフロースルーを集めた。
【００６７】
ＶＩＩ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ複合体の活性化を促進するために、ヒトＩＸａ因子を０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証しての完全な活性化後に、ＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ複合体を、５−ｍｌカラムを使用し、平衡バッファーを１０ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０とした以外は、上述のようなＦ１Ａ２セファロース４Ｂ親和性クロマトグラフィーによって精製した。最終のタンパク質調製物は−８０℃でアリコートとして保存した。
【００６８】
活性部位滴定アッセイ  −  天然（野生型）ＶＩＩａ因子及びＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃの活性部位濃度を、本質的に他の場所で記載されているようにして(Bock P.E. (1992) J.Biol.Chem., 267, 14963-14973)、準化学量論的レベルのＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｍｋ）での滴定の際のアミド分解活性の不可逆的損失から決定した。簡潔に述べると、各タンパク質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．０のバッファーに、およそ３００ｎＭの濃度まで希釈した。ついで、希釈したタンパク質（２０μｌ）を、遊離ＶＩＩａ因子の場合には２０μｌの１．５μＭ ｓＴＦと、ＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃの場合には２０μｌのバッファーと組合せ、最後に２０μｌの０−１．２μＭ ＦＦＲ−ｃｍｋ（ＤＭＳＯに溶解させたＦＦＲ−ｃｍｋ原液からバッファー中で新鮮に調製し−８０℃で保存）と組み合わせた。室温での一晩のインキュベーション後、残留アミド分解活性を測定した。サンプルの１０倍希釈物に対応する、およそ１０ｎＭのＶＩＩａ因子又はＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体を含む最終体積の２００μｌのアッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４）でポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）において活性アッセイを実施した。室温での１５分のプレインキュベーション後に、１ｍＭの発色基質Ｓ−２２８８を添加し、吸光度を、ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で４０５ｎｍにて１０分間連続的にモニターした。アミド分解活性はブランク減算後の線形プログレス曲線の傾きとして報告された。活性部位濃度は、アミド分解活性を完全に消滅させるＦＦＲ−ｃｍｋの最小濃度に対応するゼロ活性まで外挿によって決定した。
【００６９】
インビトロタンパク分解アッセイ  −  天然（野生型）ＶＩＩａ因子とＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃを平行してアッセイして、その特異的活性を比較した。アッセイはマイクロタイタープレート(Nunc, Denmark)で実施した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ  ７．４の１００μｌバッファー中のＶＩＩａ因子（３００ｎＭ）又はＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ（１５ｎＭ）及びヒトＸ因子（０．２μＭ）を、雰囲気温度で２０分間インキュベートした。ついで、Ｘ因子活性化を、ＴＦへのＦＸ結合部位をブロックする０．５μＭのＴＦ８−５Ｇ９抗体を含む、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４の５０μｌのバッファーを添加することによって停止させた(Ruf等(1991) Thromb. Haemost., 66, 529-533)。生成されたＦＸａの量は、５０μｌの発色基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５）を最終濃度０．５ｍＭまで添加することによって、測定した。４０５ｎｍの吸光度を、ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)を装備したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ３４０マイクロプレート分光光度計で連続的に測定した。アッセイにおいてブランク減算後にタンパク質濃度によって割った線形プログレス曲線の傾きとして報告された、アミド分解活性比を使用して、ＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体と野生型ＶＩＩａ因子のタンパク分解比活性間の比を計算した：
比＝（（Ａ４０５ｎｍＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体）／［ＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体］）／（（Ａ４０５ｎｍＶＩＩａ因子野生型）／［ＶＩＩａ因子野生型］）
結果は表２に与える。
【００７０】
2009532048.tif 000010
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析  −  ＶＩＩａ因子とＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ（それぞれおよそ１．５μｇ）を、製造者の推奨に従って、ＭＥＳバッファー(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)中で３５分間２００Ｖで実施される４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥ(登録商標)ゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)での非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。ゲルは水で洗浄し、製造者の推奨に従って、Ｓｉｍｐｌｙ・ＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で染色した。ゲルは図２に示す。
【００７２】
配列番号１−天然（野生型）ヒトＶＩＩ因子のアミノ酸配列（１−４０６）。３文字表記「ＧＬＡ」は４-カルボキシグルタミン酸（γ-カルボキシグルタメート）を意味する。
Ala1-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro10-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys-GLA-GLA20-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-Ile30-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg-Thr-Lys-Leu-Phe40-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys50-Ala-Ser-Ser-Pro-Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser60-Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys70-Phe-Cys-Leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn80-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile90-Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln100-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr-Lys-Arg110-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu120-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser-Cys-Thr-Pro-Thr130-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ile-Pro-Ile140-Leu-Glu-Lys-Arg-Asn-Ala-Ser-Lys-Pro-Gln150-Gly-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro160-Lys-Gly-Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu170-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly180-Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser190-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile-Lys-Asn200-Trp-Arg-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu210-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His-Asp-Gly-Asp-Glu220-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-Gln-Val-Ile-Ile230-Pro-Ser-Thr-Tyr-Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn240-His-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-His-Gln250-Pro-Val-Val-Leu-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro260-Leu-Cys-Leu-Pro-Glu-Arg-Thr-Phe-Ser-Glu270-Arg-Thr-Leu-Ala-Phe-Val-Arg-Phe-Ser-Leu280-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-Leu-Leu-Asp-Arg290-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leu-Met-Val-Leu300-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met-Thr-Gln-Asp-Cys310-Leu-Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser320-Pro-Asn-Ile-Thr-Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala330-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys340-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr350-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly360-Ile-Val-Ser-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr370-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr-Arg-Val380-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Leu-Gln-Lys-Leu390-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg-Pro-Gly-Val-Leu400-Leu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro406
【００７３】
配列番号３−そのプレ（シグナル）及びプロ領域（下線部）を含む天然（野生型）ＶＩＩ因子のＤＮＡ配列
ATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCAAGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACGGGCATCGTCAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCAACCGTGGGCCACTTTGGGGTGTACACCAGGGTCTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCCACGCCCAGGAGTCCTCCTGCGAGCCCCATTTCCCTAG
【００７４】
配列番号４−ｓＴＦ(１−２１９)のアミノ酸配列
Ser1-Gly-Thr-Thr-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyr10-Asn-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser-Thr-Asn-Phe-Lys20-Thr-Ile-Leu-Glu-Trp-Glu-Pro-Lys-Pro-Val30-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gln-Ile-Ser-Thr40-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-Phe50-Tyr-Thr-Thr-Asp-Thr-Glu-Cys-Asp-Leu-Thr60-Asp-Glu-Ile-Val-Lys-Asp-Val-Lys-Gln-Thr70-Tyr-Leu-Ala-Arg-Val-Phe-Ser-Tyr-Pro-Ala80-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Thr-Gly-Ser-Ala-Gly90-Glu-Pro-Leu-Tyr-Glu-Asn-Ser-Pro-Glu-Phe100-Thr-Pro-Tyr-Leu-Glu-Thr-Asn-Leu-Gly-Gln110-Pro-Thr-Ile-Gln-Ser-Phe-Glu-Gln-Val-Gly120-Thr-Lys-Val-Asn-Val-Thr-Val-Glu-Asp-Glu130-Arg-Thr-Leu-Val-Arg-Arg-Asn-Asn-Thr-Phe140-Leu-Ser-Leu-Arg-Asp-Val-Phe-Gly-Lys-Asp150-Leu-Ile-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Ser160-Ser-Ser-Ser-Gly-Lys-Lys-Thr-Ala-Lys-Thr170-Asn-Thr-Asn-Glu-Phe-Leu-Ile-Asp-Val-Asp180-Lys-Gly-Glu-Asn-Tyr-Cys-Phe-Ser-Val-Gln190-Ala-Val-Ile-Pro-Ser-Arg-Thr-Val-Asn-Arg200-Lys-Ser-Thr-Asp-Ser-Pro-Val-Glu-Cys-Met210-Gly-Gln-Glu-Lys-Gly-Glu-Phe-Arg-Glu219
【００７５】
配列番号５−そのシグナル配列（下線部）を含むｓＴＦ(１−２１９)のＤＮＡ配列
ATGGAGACCCCTGCCTGGCCCCGGGTCCCGCGCCCCGAGACCGCCGTCGCTCGGACGCTCCTGCTCGGCTGGGTCTTCGCCCAGGTGGCCGGCGCTTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAATCAACTAATTTCAAGACAATTTTGGAGTGGGAACCCAAACCCGTCAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATGCTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGGTCTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTCACACCTTACCTGGAGACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAACAAAAGTGAATGTGACCGTAGAAGATGAACGGACTTTAGTCAGAAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACTTAATTTATACACTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAAAGAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATTGATGTGGATAAAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCCGAACAGTTAACCGGAAGAGTACAGACAGCCCGGTAGAGTGTATGGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAATAA
【００７６】
実施例２
ｓＴＦ（１−２１９）  Ｗ４５Ｃ、ｓＴＦ（１−２１９）Ｄ５８Ｃ、ｓＴＦ（１−２１９）Ｇ１０９Ｃ、及びｓＴＦ（１−２１９）Ｐ２０６ＣをコードするＤＮＡの構築  −  製造者（Stratagene, La Jolla, CA）の指示書に従って、表３に挙げたプライマー対（順方向及び逆方向）と鋳型としてｐＨＯＪ３５６を用いるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)部位特異的突然変異誘発によって、ｓＴＦ（１−２１９）の変異体を構築した。全てのクローン化配列の正確な同一性はＤＮＡ配列決定によって証明される。
【００７７】
2009532048.tif 000011
ＶＩＩ因子Ｓ４３Ｃ、ＶＩＩ因子Ｑ６４Ｃ、ＶＩＩ因子Ｅ７７Ｃ、及びＶＩＩ因子Ｆ２７５ＣをコードするＤＮＡの構築  −  製造者（Stratagene, La Jolla, CA）の指示書に従って、表４に挙げたプライマー対（順方向及び逆方向）と鋳型としてｐＨＯＪ３００を用いるＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)部位特異的突然変異誘発によって、ＶＩＩ因子の変異体を構築した。全てのクローン化配列の正確な同一性はＤＮＡ配列決定によって証明される。
【００７８】
2009532048.tif 000012
【００７９】
ＶＩＩ因子Ｓ４３Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｐ２０６Ｃ、ＶＩＩ因子Ｑ６４Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｇ１０９Ｃ、ＶＩＩ因子Ｅ７７Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｄ５８Ｃ、及びＶＩＩ因子Ｆ２７５Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｗ４５Ｃの同時発現  −  ＶＩＩａ因子とｓＴＦ（１−２１９）のシステイン変異体を、製造者の指示と実施例１に詳細に記載したようにして、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ２９３発現システム(Invitrogen, Carlsbad, CA)での一過性発現によって同時発現させた。
【００８０】
ＶＩＩ因子Ｑ６４Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｇ１０９Ｃの免疫ブロット検出  −  ＶＩＩ因子Ｑ６４Ｃ及びｓＴＦ（１−２１９）Ｇ１０９Ｃの一過性同時発現からの条件培地を、製造者の推奨に従って、ＭＥＳバッファー(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)中で２００Ｖで３５分間実施した４−１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＮｕＰＡＧＥ(登録商標)ゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)での非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ついで、複合体を、モノクローナルマウス抗ヒトＦＶＩＩａ及び抗ヒトＴＦ一次抗体及び二次西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合ウサギ抗マウス抗体の混合物を使用して当業者に知られているような免疫ブロット法によって検出した。免疫複合体を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＲ・Ｗｅｓｔ・Ｐｉｃｏ化学発光検出キット（Pierce）及びＬＡＳ−３０００イメージリーダー（FUJIFILM Corporation）を使用して検出した。結果を図３に示す。
【００８１】
実施例３
ｓＴＦ（１−２０９）及びｓＴＦ（１−２０９）Ｖ２０７ＣをコードするＤＮＡの構築  −  そのシグナルペプチドを含むＴＦ（１−２０９）のＤＮＡコード配列を、製造者の推奨に従ってＥｘｐａｎｄ・Ｈｉｇｈ・Ｆｉｄｅｌｉｔｙ・ＰＣＲシステム（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN）及びプライマーｏＨＯＪ１５２−ｆ（配列は表１に示す）及びｏＨＯＪ１７８−ｒ（配列は表５に示す）を使用し、フランキングＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を導入するＰＣＲによって、ヒト全脳ｃＤＮＡライブラリー（Marathon-ready cDNA; Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA）から増幅させる。精製したＰＣＲ産物をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ついで対応するｐＣＩ−ｎｅｏ（Promega, Madison, WI）の対応する部位に結合させる。ついで、得られたプラスミドは、製造者（Stratagene, La Jolla, CA）の指示書に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)部位特異的突然変異誘発及びプライマーｏＨＯＪ１７９−ｆ及びｏＨＯＪ１７９−ｒ（配列は表５に示す）を使用してのｓＴＦ（１−２０９）Ｖ２０７Ｃの構築のためのテンプレートとなる。全てのクローン化配列の正確な同一性はＤＮＡ配列決定によって証明される。
【００８２】
2009532048.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は可溶型組織因子のＶ２０７ＣとＶＩＩａ因子のＦ４０Ｃ間に界面架橋ジスルフィドを含んでいるＶＩＩａ因子と可溶型組織因子の共有結合複合体モデルを示す。Ｖ２０７Ｃ又はＦ４０Ｃから界面をわたっての天然（野生型）システイン残基までのＣａ距離は、二分子間の意図しないジスルフィド対の形成を妨げる７Åよりも有意に大きい。
【図２】図２は、それぞれ非還元及び還元条件下での天然（野生型）ＶＩＩａ因子（レーンＡ）及び精製したＶＩＩａ因子 Ｆ４０Ｃ-ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ（レーンＢ）の複合体のクーマシー染色ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルを示す。
【図３】図３は、野生型ＶＩＩａ因子（レーンＡ）、ＶＩＩ因子Ｑ６４Ｃ及びｓＴＦ（１−２１９）Ｇ１０９Ｃ（レーンＢ）、及び精製ＶＩＩａ因子Ｆ４０Ｃ−ｓＴＦ（１−２１９）Ｖ２０７Ｃ複合体（レーンＣ）の免疫ブロットを示す。
【図１】
2009532048.tif 000014
【図２】
2009532048.tif 000015
【図３】
2009532048.tif 000016
【国際調査報告】
2009532048.tif 000017
2009532048.tif 000018
2009532048.tif 000019