(57)【要約】本発明は、脂質中に捕捉されたリルゾールからなるナノ粒子と、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症の治療用医薬品を調製するための、それらの使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質中に捕捉されたリルゾールからなるナノ粒子。
【請求項２】
脂質がベヘン酸とのグリセリドの混合物からなる、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
１００ｎｍ未満の直径を有する球形の、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
請求項１から３に記載のナノ粒子を含有する医薬組成物。
【請求項５】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および多発性硬化症の治療用薬物を調製するための、請求項１から３に記載のナノ粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リルゾールを含有するナノ粒子脂質ベクター、ならびにその調製および特性決定に関する。得られた系は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、遊離薬物とは異なった生体分布を有し、医薬製剤の調製に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
当該技術の現状
固体脂質ナノ粒子は、それらの生分解性、および様々な生理活性化合物を捕捉するそれらの能力に鑑みて、調節薬物放出の系としての使用に適している。例えば、脂質ナノ粒子は、生理的脂質の使用、調製過程における有機溶剤の不在、広範な適用範囲、および低価格での大規模製造の可能性など、他のコロイド性ベクターに優る特定の利点を有する。これらの系は、それらに捕捉された薬物の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物動力学および生体分布を改変することもできる。脂質ナノ粒子は、様々な投与経路で使用できる。残念ながら、これらの系は純粋な脂質からなるので、それらの一部は結晶化する傾向があり、その結果、それらの薬物負荷はかなり限定的であり、それらは経時的に薬物を排出する傾向がある。
【０００３】
したがって、製薬分野で既に賦形剤として使用されているが、併せて混合した際に結晶化しない脂質に基づいた材料を開発することが必要である。このようにして、脂質マトリックスが非晶質である系が得られる。これは、より多量の薬物が捕捉でき、かつそれが経時的に、より安定であることを意味する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の説明
脂質、とりわけ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および多発性硬化症（ＭＳ）の治療で現在使用されている薬物であるリルゾールが捕捉されている、グリセリドおよびベヘン酸の混合物を使用する場合、１００ｎｍ未満の直径を有する球形ナノ粒子を得ることができ、それらは、遊離形態の薬物より多い量のリルゾールを中枢神経系に送達できることが、今では見出されている。さらに、運搬される薬物は、遊離薬物よりはるかに低い程度までしか、非標的臓器に蓄積されない。このすべては、この担体の使用が薬物のターゲッティングを増大させるだけでなく、無差別分布によって引き起こされる副作用も低減させることを実証している。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本発明による系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験の結果を示すグラフである。
【図２】脳における所定の投与時間後のリルゾールレベルを示すグラフである。
【図３】血清における所定の８時間後のリルゾールレベルを示すグラフである。
【図４】肝臓におけるリルゾール分布を示すグラフである。
【図５】脾臓におけるリルゾール分布を示すグラフである。
【図６】肺におけるリルゾール分布を示すグラフである。
【図７】心臓におけるリルゾール分布を示すグラフである。
【図８】腎臓におけるリルゾール分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の説明
植物起源のベヘン酸との、モノ−、ジ−、およびトリグリセリドの混合物は、現在、錠剤用の潤滑剤として製薬技術で使用されており、Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ（登録商標）という商標で市販されている。前記混合物を約８５℃で融解させ、その溶融塊に５ｍｇから１５０ｍｇの間のリルゾールを添加する。したがって、ホスファチジルコリンなどの界面活性物質と、タウロコール酸ナトリウム塩などのコサーファクタントとを使用して、熱いマイクロエマルションが得られる。その後、熱いマイクロエマルションを撹拌しながら冷水中に分散させる。マイクロエマルションを調製するのに使用した界面活性物質を除くために、得られたナノ粒子を超遠心分離によって精製し、その後凍結乾燥する。
【０００７】
このようにして得られたナノ粒子系を、光子相関分光（ＰＣＳ）技法を用いて、サイズおよび多分散指数に関して特性決定した。ナノ粒子を２回蒸留水、食塩水（ＮａＣｌ  ０．９％）、およびｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に分散させた。サイズは１００ｎｍ未満であり、多分散指数は０．２５であった。それらを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）技法でも特性決定した。これは、粒子が球形であることを実証し、ＰＣＳ技法で得られたサイズを確認した。
【０００８】
本発明による系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験を、一部の生物体液をシミュレートした培地（１から７．４の間のｐＨ範囲を分析した）を用いて、０．２５から７２時間の間のインキュベーション時間、３７℃で行った。結果は、本発明による系が薬物を緩徐に、７２時間以内に最大７５％まで放出することを実証した。ヒト血漿中で行った放出試験は、薬物の７９％が２４時間以内に放出されることを実証した（図１）。
【０００９】
ナノ粒子によって運搬される薬物と遊離薬物との間における生体分布の相違を評価するために、本発明による系のｉｎ  ｖｉｖｏ試験をラットで行った。この試験は、上記系によって送達される薬物の神経保護作用が、遊離薬物のものより有効であったかどうかを確定するようにも設計されていた。詳細には、運搬されているリルゾールで処置されたラットが、多発性硬化症（ＭＳ）の実験モデルであるアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床徴候を、遊離リルゾールで処置されたものより緩徐に表したかどうか確定する試験を行った。結果は、本発明によるナノ粒子系が、より容易に脳血液関門（ＢＢＢ）を横断し、したがって、薬物が中枢神経系でより高濃度に達するのを可能にすることを実証した。これらの結果は、ラットにおける急性試験および慢性試験の両方で確かめられた。
【実施例】
【００１０】
実験は、体重２５０〜３００ｇの成体雄性スプラーグドーリーラットで行った。動物ユニット内で１週間飼育した後、実験アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて、ラットに免疫処置を行った。このため、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株Ｈ３７ＲＡを尾の基部に皮下接種した。治療には、２種の製剤、すなわち遊離薬物と、ナノ粒子脂質担体内に捕捉された薬物とを用いた。リルゾールを含有するナノ粒子脂質バッチに関しては、ＨＰＬＣによって薬物負荷が１４．５％であると算出された。媒体（２０％トゥイーン８０）中に溶解させた上記２種の製剤を８ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、腹腔内経路で投与した。
【００１１】
リルゾールは神経保護作用を有するので、それを前処置として、すなわちＥＡＥの臨床徴候が現れる前に投与することに決定した。ＥＡＥの臨床徴候は、通常、この疾患が誘導された後の１４日目から観測される。動物を２つの群に分割し、各群に上述した２種の製剤のうちの１種を腹腔内投与した。この処置は免疫処置後の７日目に開始した。この予防段階では炎症過程が不在なので、脳血液関門はまだ完全であると考えられる。各データポイントにつき４匹の動物を用いた。
【００１２】
投与の８、１６、および３０時間後にラットを屠殺し、血液、脳、肝臓、脾臓、心臓、肺、および腎臓試料を採取した。
【００１３】
リルゾールレベルはＨＰＬＣによって測定した。血清５０μｌにＣＨ3ＣＮ  １ｍｌを添加して上記薬物を血清から抽出した。この混合物を撹拌し、その後１００００ｒｐｍで１５分間遠心処理を行った。ＣＨ3ＣＮ  １ｍｌを用いてこの抽出を反復した。有機抽出物を０．４５ｍｍナイロンに通して濾過し、ＨＰＬＣシステムに注入した。除タンパクの後に、脳および他の臓器からリルゾールを抽出した。各臓器を重量測定し、ｐＨ８．５のトリス１Ｍ緩衝液２ｍｌを用いてホモジナイズした。ＣＨ3ＣＮを用いてこの混合物の液液抽出を行い、外界温度で１５分間維持した。沈殿したタンパク質を４℃、１００００ｒｐｍの遠心処理で除去した。０．４５μｍナイロンフィルターに通して濾過した後、この有機抽出物をＨＰＬＣによってアッセイした。
【００１４】
結果は、本発明によるナノ粒子系に捕捉されたリルゾールで処置されたラットが遊離リルゾールで処置されたものより遅くにアレルギー性脳脊髄炎の臨床徴候を発症したことを実証した。結果は、本発明による系に捕捉されたリルゾールの効力が遊離リルゾールの効力より有意に大きいことを示した。脂質ナノ粒子内のリルゾールは、遊離リルゾールより容易に脳血液関門を横断し、中枢神経系で、より高濃度に達し、その効力の有意な増大をもたらした（図２〜３）。
【００１５】
捕捉されたリルゾールは、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、および肺における蓄積も、遊離リルゾールより小さかった（図４〜８）。これは、この系によって送達される薬物が遊離薬物より低毒性であることを実証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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