(57)【要約】  コーヒー植物のリグニンの生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを開示する。これらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを、コーヒー豆の風味、芳香及び他の特徴の操作とともに、コーヒー植物での病原体、草食動物及び昆虫による攻撃に対する耐性の操作に使用する方法も開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ及びフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼから選択されるリグニン生合成経路酵素をコードするコード配列を有する、コーヒー（コーヒー種（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．））から単離された核酸分子。
【請求項２】
コード配列がカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１５と７５．４％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１５を含むアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１６と４２％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項６】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１６を含むアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１７と４８．１％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項８】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１７を含むアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１８と４７．４％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項１０】
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼが配列番号１８を含むアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
コード配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４を含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項１２】
コード配列がシンナモイルＣｏＡレダクターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
シンナモイルＣｏＡレダクターゼが配列番号１９と４８．７％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
シンナモイルＣｏＡレダクターゼが配列番号１９を含むアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
シンナモイルＣｏＡレダクターゼが配列番号２０と８８．６％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１６】
シンナモイルＣｏＡレダクターゼが配列番号２０を含むアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
コード配列が、配列番号５又は配列番号６を含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１８】
コード配列がシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１９】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２１と４２．３％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２２と７８．２％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２２】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２２を含むアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２３と６１．３％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２４】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２３を含むアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２４と６２．８％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２６】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２５と３１．６％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２８】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２５を含むアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２６と７９．８％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２６を含むアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２７と６８％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項３２】
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが配列番号２７を含むアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
コード配列が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３を含む、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
コード配列がフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３５】
フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼが配列番号２８と５３％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼが配列番号２８を含むアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項３７】
コード配列が配列番号１４を含む、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３８】
コード配列が遺伝子のオープンリーディングフレームである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３９】
請求項３８に記載の遺伝子の転写によって作製されたｍＲＮＡ分子。
【請求項４０】
請求項３９に記載のｍＲＮＡ分子の逆転写によって作製されたｃＤＮＡ分子。
【請求項４１】
請求項１に記載の核酸分子のセグメントと相補的である、長さが８〜１００塩基のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項１に記載の核酸分子のコード配列を含むベクター。
【請求項４３】
プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
核酸分子のコード配列が構成的プロモーターと作動的に連結している、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４５】
核酸分子のコード配列が誘導性プロモーターと作動的に連結している、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４６】
核酸分子のコード配列が組織特異的プロモーターと作動的に連結している、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４７】
組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
種子特異的プロモーターがコーヒー種子特異的プロモーターである、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項４２に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５０】
植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバー、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオ、トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ペチュニア、ヒャクニチソウ、及び芝草からなる植物の群から選択される植物細胞である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
請求項５１に記載の植物細胞から作製された稔性植物。
【請求項５３】
コーヒー豆の風味又は芳香を調節する方法であって、コーヒー種子内で１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素の産生又は活性を調節するステップを含み、リグニン生合成経路酵素が、カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、及びフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼから選択される方法。
【請求項５４】
１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素の産生又は活性を増大するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
コーヒー種子内で１つ又は複数の内因性リグニン生合成経路酵素遺伝子の発現を増大するステップを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
リグニン生合成経路酵素をコードする導入遺伝子を植物中に導入するステップを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素の産生又は活性を低下するステップを含む、請求項５３５に記載の方法。
【請求項５８】
１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒー中に導入するステップを含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、農業バイオテクノロジーの分野に関する。具体的には、本発明は、リグニン合成に関与する酵素をコードするコーヒー植物由来のポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチド、及びポリペプチドを、コーヒー豆の風味、芳香、及び他の特徴の遺伝子制御及び操作に使用する方法を特徴とする。
【０００２】
［発明の背景］
特許、公開された出願及び学術論文を含めた様々な刊行物が本明細書全体にわたって引用されている。これらの各刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書内で完全には示されていない引用文献は、本明細書の末尾に認めることができる。
【０００３】
コーヒーの芳香及び風味は、コーヒーの品種及び銘柄に関する消費者の好みにおいて重要な構成要素である。コーヒーの特徴的な芳香及び風味は、豆を焙煎する間に起こる、風味前駆体が関与する複雑な一連の化学反応（メイラード反応）に由来する。風味前駆体には、緑色コーヒー豆中に存在する化合物及び生体分子がある。今までに、８００を超える化学物質及び生体分子がコーヒーの風味及び芳香に寄与するものとして同定されている。（Ｆｌａｍｅｎｔ，  Ｉ．，  ２００２  「Ｃｏｆｆｅｅ  Ｆｌａｖｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  Ｕ．Ｋ．）コーヒー消費者はますます洗練されてきているので、消費者の好みに合うように芳香及び風味が向上したコーヒーを生産することが望ましい。芳香も風味も、化学的手段によりコーヒー製品に人工的に入れることができる。例えば、米国特許第４，０７２，７６１号明細書（芳香）及び米国特許第３，９６２，３２１号明細書（風味）を参照されたい。しかし、コーヒーの芳香及び風味に対する多糖類、タンパク質、色素や脂質などの天然のコーヒー粒の構成要素の影響に関係する情報が今までに少ししかない。１つの手法は、優れた芳香の特徴を有する既存の生殖質から品種を選択することである。この手法の不利な点は、頻繁に、最高品質の品種が、産出不良や疾患及び環境ストレスに対する低抵抗性などの著しい負の農学的形質をも有することである。産業的農学的形質が異なる品種を交配し、高い品質と良好な農学的成績の両方についてその子孫をスクリーニングする育種の試みから新たな品種を選択することも可能である。しかし、この後者の手法は非常に時間がかかり、１回の交配実験及び３回の生育期にわたる選択に最低限７〜８年かかる。したがって、コーヒーの品質を高める代替の手法は、分子生物学の技術を使用して、コーヒー豆中で天然に認められる風味及び芳香に関与するそれらのエレメントを増強し、又はコーヒー豆中で天然には存在しない芳香及び風味を増強するエレメントを添加することとなる。遺伝子工学は、これらの目的の達成に特に適する。例えば、異なるコーヒー種由来のコーヒータンパク質を交換することができる。代替の方法では、コーヒーの風味に正に寄与する、天然に存在するコーヒータンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することができる。逆に、コーヒーの風味に負に寄与する、天然に存在するコーヒータンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することができる。
【０００４】
異なる品種及び起源由来のコーヒーは、同じように緑色粒試料を焙煎し加工したときに著しい風味及び芳香の品質の差異を示す。品質の違いは、粒試料内での化学的物理的差異の現れであり、それは主として生育及び加工条件の違いから生じ、母系植物と粒両方の遺伝的背景の違いからも生じる。化学組成のレベルでは、少なくとも一部の風味の品質は、異なる品種由来の粒と関係することが認められている糖、酸、フェノール類やカフェインなどの少量の代謝物のレベルの差異と関係し得る。不十分に特徴付けられている他の風味及び風味前駆分子が存在することが認められている。さらに、粒内の構造的差異もコーヒーの品質の違いに寄与する可能性が高い。コーヒーの品質につながるコーヒー粒中の新たな構成要素を見つける１つの手法は、異なる品質の特徴を有する異なる品種において粒試料の成熟の間に差次的に発現する遺伝子及びタンパク質を研究することである。同様に、風味及び風味前駆分子の生合成に関与する遺伝子及びタンパク質を研究することができる。
【０００５】
リグニンはフェノール重合物質であり、被子植物においては、フェニルプロパノイド経路に由来する３つの化合物、ｐ−クマロイルアルコール、コニフェリルアルコール及びシナピルアルコール、すなわち植物で見られる主要なモノリグノールで主に構成される（Ｈａｔｆｉｅｌｄ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。リグニン重合体に組み込まれると、これらのモノリグノールは、それぞれｐ−ヒドロキシフェニルＨ、グアイアシルＧ及びシリンギルＳユニットを生成する。例外が存在するものの、コーヒーなどの双子葉被子植物では、リグニンは主にＧ及びＳユニットからなり、Ｈユニットは極微量である（Ｂｏｅｒｊａｎ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。これらの複合重合体は、細胞外細胞壁の多糖類−タンパク質マトリックスの圧縮強度及び水不浸透性の増加に寄与する（Ｗｈｅｔｔｅｎ  ＲＷ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。植物での病原体侵入に対する１つの応答は、細胞壁でのリグニンの生産を増加させ、それによって、感染部位周囲の細胞を強化し、さらなる病原体の増殖を制限することである（Ｖａｎｃｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  １９８０）。さらに、Ｈ２Ｏ２レベルの上昇及びセルロース合成の減少などの他の種類のストレスもリグニンの増産をもたらし、このことは、リグニン合成の増加が、植物においてより一般的なストレス応答システムの一部であることを示す。（Ｗｕ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７及びＬｏｇｅｍａｎｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）。
【０００６】
モノリグノールの生合成経路は論争の的であり、経路のモデルは近年何度か変わっている（Ｄｉｘｏｎ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１及びＨｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。フェニルプロパノイド代謝の一部であるリグニン単量体の合成は、フェニルアラニンの脱アミノから始まり、芳香環での連続したヒドロキシル化及びメチル化反応が続き、側鎖カルボキシルのアルコール基への変換で終了する（Ｂｏｅｒｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。図１に示すように、酵素４−ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）は、モノリグノール合成経路の初期反応、ＣｏＡエステルカフェオイル−ＣｏＡ、フェルロイルＣｏＡ及び５−ヒドロキシ−フェルロイルＣｏＡの形成を触媒する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）このタンパク質をコードするｃＤＮＡが最近コーヒーから得られ、特徴付けされたが、これについては同時係属の米国特許仮出願第［まだ割り当てられていない］号を参照。
【０００７】
被子植物種では、同定された最初のリグノール特異酵素は、カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）であった。ＣＯＭＴは、カフェー酸をフェルラ酸に、並びに、５−ヒドロキシフェルラ酸をシナピン酸に変換することができる。（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）のＣＯＭＴ遺伝子のダウンレギュレーションは、ＣＯＭＴ活性の有意な減少（７０〜８５％の下落）を引き起こし、リグニンの含量及び組成の変化をもたらすことが示され、この酵素がリグニン合成の鍵酵素であることを示す。（Ｐｉｑｕｅｍａｌ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。近年では、コファクターＳＡＨ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）及び基質フェルラ酸と複合したアルファルファＣＯＭＴタンパク質の２．２Å結晶構造が、Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）によって達成された。これは、ＣＯＭＴの触媒機構を説明するモデルの開発を可能にした。このモデルは、３−又は５−ヒドロキシル基がＨｉｓ２６９によって脱プロトン化され、ＳＡＭの反応性メチル基の移動を促進することができることを示す。アルファルファＣＯＭＴの結晶構造は、ａ）ＳＡＭの認識で相互作用し、ｂ）基質の認識に関与し、ｃ）触媒反応の様々な態様に関与する特定の残基も示した（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【０００８】
ＣＯＭＴによって生成されるフェルラ酸は、チトクロームＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼであるフェルラ酸５ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）によってヒドロキシル化して、５−ヒドロキシ−フェルラ酸を形成することができる。Ｆ５Ｈは、コニフェリルアルデヒド及びコニフェリルアルコールをヒドロキシル化して、それぞれ５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒド及び５−ヒドロキシ−コニフェリルアルコールを形成することもできる（Ｍｅｙｅｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）。Ｆ５Ｈは、潜在的にシリンギルリグニン生合成の律速段階であると考えられ、この提案は、Ｆ５Ｈの発現が不十分なアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属突然変異体が、長角果及び種子でのシナピン酸エステルの蓄積のレベルでも影響を受けるとの観察によって裏付けされる（Ｒｕｅｇｇｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。Ｆ５Ｈの全ての生成物は、ＣＯＭＴ１によって触媒される第２のＯ−メチル化の基質でもある（図１）。
【０００９】
ＣＣｏＡＯＭＴは、カフェオイルＣｏＡをフェルロイルＣｏＡに、及び５−ヒドロキシ−フェルロイルＣｏＡをシナピルＣｏＡに変換する二機能性酵素であり（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）、ＣｃＯＡＯＭＴはヒャクニチソウの差別的管状要素でのリグニン生合成に関与することが直接的に示された（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）。ＣＣｏＡＯＭＴタンパク質をコードするｃＤＮＡもコーヒーから単離され、特徴付けされたが、これについては同時係属の米国特許仮出願第［まだ割り当てられていない］号を参照。
【００１０】
リグノール生合成に特に関係する他の酵素は、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）であり、この酵素は、フェルロイルＣｏＡ及び５−ヒドロキシ−フェルロイルＣｏＡの、それぞれコニフェルアルデヒド及び５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒドへの変換を触媒し、Ｇ（コニフェルアルデヒド）及びＳ（５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒド）リグニンユニットの生合成に直接的に導く（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。タバコでは、アンチセンス構築物を用いるＣＣＲ遺伝子のダウンレギュレーションは、異常発育及び生長の減少、並びに異常な葉の形態及び導管の崩壊を示す植物を生んだ。Ｇリグニン化合物レベルの関連する減少もあった（Ｒａｌｐｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。モノリグノール経路に関係する最後の酵素の１つはシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）であり、それは、コニフェルアルデヒド、５−ヒドロキシ−コニフェルアルデヒド及びシナプアルデヒドの対応するアルコールへのＮＡＤＰＨ依存性変換を触媒する（Ｋｉｍ  ＳＪ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）。アラビドプシスでは、ＣＡＤ遺伝子ＡｔＣＡＤ−Ｃ及びＡｔＣＡＤ−Ｄの単一の突然変異体はより低いＣＡＤ活性を有することがわかったが、２つの突然変異体の交配によって得られた二重突然変異体は茎のリグニン含量が４０％低下し、これらが茎のリグニン合成に関係する主なＣＡＤ遺伝子であることが証明された（Ｓｉｂｏｕｔ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。この後者のデータは、リグノール合成の後期の段階を変化させること（すなわちＣＡＤ発現／活性の変化）が、形成されるリグニンの量と同様に、生成されるリグニンの種類に影響を及ぼすために役立つことができることを示す。
【００１１】
成熟した緑色コーヒー粒のリグニンレベルに関して、文献に情報はほとんどない。以前、コーヒー粒は約５％のリグニン含量を有すると示唆された（Ｄａｒｔ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｔｅｎ，  Ｈ．  １９８５  Ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．、Ｃｏｆｆｅｅ，  Ｖｏｌｕｍｎｅ  １；  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｅｄ  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｍａｃｒａｅ，  Ｒ．  ＥＩｓｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ｐ２２３−２６５）。より最近、緑色粒の組成分析により、炭水化物、脂肪及びタンパク質が粒の７２％を占め、粒の残りの２８％はクロロゲン酸、ミネラル類、リグニン、アミノ酸、トリゴネリン、カフェイン及び他の化合物であることが示された（Ｏｏｓｔｅｒｖｅｌｄ．Ａ．，  Ｈａｒｍｓｅｎ，  Ｊ．，  Ｖｏｒａｇｅｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｓ，  Ｈ．  ２００３  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  ｒｏａｓｔｅｄ  Ｃ．  ａｒａｂｉｃａ  ｂｅａｎｓ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ５２，  ２８５−２９６）。この後者データから、緑色粒の約５〜８％がリグニンであると推定することができる。コーヒー粒細胞の二次細胞壁に相当量のリグニンが存在する他の証拠が、いくつかの異なる染色法と光学及び透過型電子顕微鏡の使用によって得られた（Ｄｅｎｔａｎ，  Ｅ．  １９８５．  Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｆｆｅｅ  ｂｅａｎ．、Ｃｏｆｆｅｅ  ｂｏｔａｎｙ，  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅａｎｓ  ａｎｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅ．  Ｅｄｓ  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｓｏｎ，  Ｋ．  Ｃｒｏｏｍ  Ｈｅｌｍ，  Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００１２】
コーヒー粒のリグニンは、細胞構造の維持、特に粒の二次細胞壁での維持におそらく関与し、ストレス及び昆虫耐性にもおそらく寄与する。コーヒー粒の全体の健康及び構造にとって重要であるだけでなく、コーヒー粒の品質が、存在するリグニンの量、種類及び構造によっておそらく影響され得る。リグニン単量体及び重合体は、コーヒーの芳香／風味を形成する化学反応、並びにコーヒーの焙煎の間の緑色コーヒー粒中でのタンパク質及び多糖類の分解を引き起こすそれらの一部に直接関与することができる。例えば、リグニンはメイラード反応に関与すると考えられ、フェニルプロパノイド由来の芳香分子、例えばグアイアコール及び４−ビニルグアイアコールの生成に潜在的に寄与する。（Ｙｅｒｅｔｚｉａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２及びＬｏｇｍａｎｎ；  Ｓａｇｅｈａｓｈｉ，  Ｍ．  Ｍｉｙａｓａｋａ，  Ｎ．  Ｓｈｉｓｈｉｄｏ，  Ｈ．，及びＳａｋｏｄａ，  Ａ．  ２００５，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、印刷中）。
【００１３】
リグニンはコーヒー中のメラノイジンの形成にもおそらく関係し、したがって、この分画の全体の抗酸化能力に寄与する。（Ｄｅｌｇａｄｏ−Ａｎｄｒａｄｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。リグニンの構造及び／又は量は、透水性及び細胞壁構造のような粒特性へのその影響によりコーヒー品質に間接的に影響を及ぼし、それにより、例えばコーヒー焙煎の間の水分消失率及び粒加熱プロフィール、並びに、焙煎の間にコーヒー内乳中で形成される揮発性ガスを閉じ込める粒の能力に影響を及ぼすこともできた（Ｙｅｒｅｔｚｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【００１４】
興味深いことに、本明細書で記載したリグニン合成に関係する１つ又は複数のコーヒーの遺伝子が、イチゴで最近証明されたものと同じように、コーヒーの風味分子又は現在未知の風味前駆体分子の合成に関与すると考えられている。イチゴは、２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−フラノン（ＤＭＭＦ）に関係する変わった一群の芳香化合物を含有する。この特定の化合物は、リグニン合成酵素ＣＯＭＴと非常に高い相同性を有するＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性Ｏ−メチルトランスフェラーゼＦａＯＭＴ経由で２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３（２Ｈ）−フラノン（ＤＭＨＦ）から生成される。ＦａＯＭＴの発現パターン及び果実成熟の異なる段階の酵素活性から、バニリン及びＤＭＭＴなどのイチゴの揮発性物質の生合成で重要な役割を演ずることに加えて、ＦａＯＭＴが、痩果及び拡大果実の維管束内でのリグニン形成にも関与することが示唆される（Ｗｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【００１５】
リグニンの構造及び／又は量の品種間差は、それぞれの焙煎された粒の抽出特性を変化させることもできる。トウモロコシにおいて、４つの褐色のｍｄｒｉｂ（ｂｍ）突然変異体、すなわち、ＣＡＤ活性に影響を及ぼすｂｍ１、ＣＯＭＴの過剰発現と関連するｂｍ２、ＣＯＭＴ遺伝子における挿入及び欠失をそれぞれ表すｂｍ３ａ及び３ｂ、細胞壁組成が影響を受けるｂｍ４突然変異体が知られている。Ｍａｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）は、二重突然変異体ｂｍ１−ｂｍ２は、野生型と比較してリグニン含量が低いことを示した。さらに、エステル型ｐ−クマロイルＣｏＡの平行した減少が、全ての突然変異体で観察された。全ての観察は、トウモロコシ突然変異体での細胞壁分解性の変化と関連していた（Ｍａｒｉｔａ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。
【００１６】
コーヒー植物の全体的な発達に対するリグニン合成の重要性、並びにコーヒー品質のいくつかの側面に及ぼすその可能な影響にもかかわらず、現在、コーヒーのリグニン生合成の詳細な情報は入手不可能である。
【００１７】
前記の論述から、リグニン生合成に関与するタンパク質の産生を遺伝的に調節することによるコーヒー粒中のリグニン含量の調節が、遺伝子工学により作製されたそのようなコーヒー豆から生産されたコーヒー飲料及びコーヒー製品の芳香及び風味を増強するのに非常に有用となることが理解されるであろう。コーヒー植物のリグニン含量を調整することは、コーヒー植物及びその果実を病原体、草食動物及び昆虫から保護することにも関連する。したがって、リグニンの生合成に関与するコーヒー由来の遺伝子及び酵素を同定、単離及び利用する必要がある。本発明はこの必要に対応する。
【００１８】
［発明の概要］
本明細書に記載の発明は、コーヒー植物中でのリグニン生合成経路における酵素をコードする遺伝子、そのコードされたポリペプチド、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドを、コーヒー豆の風味、芳香、及び他の特徴の遺伝子制御及び操作に使用する方法を特徴とする。
【００１９】
本発明の一態様は、リグニン生合成経路酵素をコードするコード配列を有する、コーヒー（コーヒー種（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．））から単離された核酸分子を特徴とする。一実施形態では、この酵素は、配列番号１５と少なくとも７５．４％同一であるカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号１６と少なくとも４２％同一であるカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号１７と少なくとも４８．１％同一であるカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号１８と少なくとも４７．４％同一であるカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号１９と少なくとも４８．７％同一であるシンナモイルＣｏＡレダクターゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２０と少なくとも８８．６％同一であるシンナモイルＣｏＡレダクターゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２１と少なくとも４２．３％同一であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２２と少なくとも７８．２％同一であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２３と少なくとも６１．３％同一であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２４と少なくとも６２．８％同一であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２５と少なくとも３１．６％同一であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２６と少なくとも７９．８％同一であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２７と少なくとも６８％同一であるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼである。他の実施形態では、この酵素は、配列番号２８と少なくとも５３％同一であるフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼである。
【００２０】
特定の実施形態では、核酸分子は、コード配列を含むオープンリーディングフレームを有する遺伝子である。或いは、核酸分子はその遺伝子の転写によって作製されたｍＲＮＡ分子を含んでもよく、又はｍＲＮＡ分子の逆転写によって作製されたｃＤＮＡ分子を含んでもよい。本発明はまた、上記の核酸分子のセグメントと相補的である、長さが８〜１００塩基のオリゴヌクレオチドをも特徴とする。
【００２１】
本発明の他の態様は、上記に記載のリグニン生合成経路酵素をコードする核酸分子を含むベクターを特徴とする。特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、構成的プロモーターと作動的に連結した核酸分子のコード配列を含有する。他の実施形態では、コード配列は誘導性プロモーターと作動的に連結している。他の実施形態では、核酸分子のコード配列は、種子特異的プロモーター、好ましくはコーヒー種子特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターと作動的に連結している。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、上記のベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、植物、細菌、真菌、昆虫又は哺乳動物細胞でよい。特定の実施形態では、宿主細胞は、コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバー、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオ、トマト、トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ヒャクニチソウ、及び芝草のいずれか１つから選択される植物細胞である。本発明はまた、形質転換植物細胞を再生することによって作製された稔性トランスジェニック植物をも特徴とする。具体的な実施形態では、稔性トランスジェニック植物はコーヒー種である。
【００２３】
本発明の他の態様は、コーヒー豆の風味又は芳香を調節する方法を特徴とする。その方法は、コーヒー種子内で１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素の産生を調節するステップを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、例えばコーヒー種子内で１つ又は複数の内因性リグニン生合成経路酵素をコードする遺伝子の発現を増大することによって、或いはリグニン生合成経路酵素をコードする導入遺伝子を植物中に導入することによって、１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素の産生を増大するステップを含む。他の実施形態では、その方法は、例えば１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒー中に導入することによって、１つ又は複数のリグニン生合成経路酵素の産生を低下するステップを含む。
【００２４】
［例示的な実施形態の詳細な説明］
定義：
本発明の生体分子及び他の態様に関係する様々な用語を、本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用する。
【００２５】
「リグニン生合成経路」という用語は、植物、より具体的にはコーヒー植物中でのリグニン生合成に関与するポリペプチドを指す。この用語は、酵素が媒介する、経路中にあるそれぞれの各タンパク質の特定の作用機序を包含する。本明細書で例示されるように、ポリペプチドには、それらに限定されないが、カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（「ＣＯＭＴ」）、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（「ＣＣＲ」）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（「ＣＡＤ」）及びフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）が含まれる。
【００２６】
「単離された」とは、天然の状態から「ヒトの手によって」変化したことを意味する。組成物又は物質が自然界で存在する場合、それが変化し又はその元の環境から取り出され、或いはその両方が起こった場合にそれは「単離」されている。例えば、その用語を本明細書で使用するとき、生存している植物又は動物中に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離」されていないが、その天然の状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離」されている。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」はまた「核酸分子」とも称され、一般に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、それは非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡでもよく、或いは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡでもよい。「ポリヌクレオチド」には、それだけに限らないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖でもよく、又はより典型的には二本鎖でもよく、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物でもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子がある。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つ又は複数の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性のために又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡをも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、及びイノシンなどの珍しい塩基がある。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に認められる、化学的に、酵素的に又は代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、並びにウイルス及び細胞に特徴的な、化学的な形のＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドをも包含する。
【００２８】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、通常はペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと称される短い鎖も、一般にタンパク質と称される長い鎖も指す。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされた２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの自然の過程によって、又は当技術分野で周知である化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。そのような修飾は、基本的な教科書及びより詳細なモノグラフ、並びに多量の研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含めて、ポリペプチド中のどこでも起こる可能性がある。同じ型の修飾が、同じ又は様々な程度で、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に存在してよいことが理解されるであろう。また、所与のポリペプチドは、多数の型の修飾を含んでよい。ポリペプチドは、ユビキチン化により分枝してもよく、分枝を伴う又は伴わない環状のものでもよい。環状ポリペプチド、分枝ポリペプチド及び分枝環状ポリペプチドは、自然の翻訳後の過程から生じるものでもよく、又は合成の方法により作製してもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などタンパク質に対するアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化がある。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３及びＷｏｌｄ，  Ｆ．，  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，  ｐｇｓ．  １−１２，  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  （１９９０）  １８２：６２６−６４６及びＲａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  （１９９２）  ６６３：４８−６２を参照されたい。
【００２９】
「変異体」は、その用語を本明細書において使用するとき、基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドとはそれぞれ異なるが、基本的な特性を保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、ヌクレオチド配列が他の基準ポリヌクレオチドと異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化により、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化してもよく、又は変化しなくてもよい。下記で論じるように、ヌクレオチド変化の結果、基準配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断が生じ得る。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が他の基準ポリペプチドと異なる。一般に違いは限定され、その結果、基準ポリペプチド及び変異体の配列が全体的に密接に類似し、多数の領域で同一である。変異及び基準ポリペプチドは、任意の組合せの１つ又は複数の置換、付加又は欠失によりアミノ酸配列が異なってよい。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものでよく、又はそうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体など天然に存在するものでもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異生成技術又は直接合成によって作製することができる。
【００３０】
突然変異植物に関して、「ヌル突然変異体」又は「機能喪失突然変異体」という用語は、遺伝子産物を無機能にさせ、又はその大部分を欠如させる突然変異を有する生物又はゲノムＤＮＡ配列を示すのに使用する。そのような突然変異は、遺伝子のコード領域及び／又は制御領域中で起こる可能性があり、個々の残基の変化である可能性もあり、或いは核酸の領域の挿入又は欠失である可能性もある。これらの突然変異はまた、タンパク質を無機能にさせ、又はその大部分を欠如させるように、遺伝子及び／又はコードされたタンパク質を制御又は調節することができる他の遺伝子のコード領域及び／又は制御領域中で起こる可能性もある。
【００３１】
「実質的に同じ」という用語は、タンパク質の性質（すなわち、タンパク質の構造、安定性の特徴、基質特異性及び／又は生物活性）に著しくは影響を及ぼさない配列変異を有する核酸又はアミノ酸配列を指す。特に核酸配列に関して、「実質的に同じ」という用語は、コード領域及び発現を支配する保存された配列を指すものとし、主として、同じアミノ酸をコードする縮重コドン、又はコードされたポリペプチド中の保存的な置換アミノ酸をコードする代替コドンを指す。アミノ酸配列に関して、「実質的に同じ」という用語は一般に、構造又は機能の決定に関与しないポリペプチドの領域中の保存的置換及び／又は変異を指す。
【００３２】
「パーセント同一である」及び「パーセント類似する」という用語も、アミノ酸及び核酸配列間の比較において本明細書で使用する。アミノ酸配列に言及するとき、「同一性」又は「パーセント同一である」とは、配列分析プログラムにより比較したアミノ酸配列中で同一のアミノ酸と整合している対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。「パーセント類似する」とは、同一の又は保存されているアミノ酸と整合している対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。保存されているアミノ酸は、構造が異なるが物理的特性が類似するものであり、その結果、１つのアミノ酸と他のものとの交換では、得られたタンパク質の三次構造は感知できるほどには変化しない。保存的置換は、Ｔａｙｌｏｒ  （１９８６，  Ｊ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ｂｉｏｌ．  １１９：２０５）で定義されている。核酸分子に言及するとき、「パーセント同一である」とは、配列分析プログラムにより同一のヌクレオチドと整合している対象核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。用語「同一性」又は「同一の」は、本明細書で用語「相同性」又は「相同の」と互換的に用いる。
【００３３】
「同一性」及び「類似性」は、既知の方法により容易に計算することができる。核酸配列及びアミノ酸配列は、核酸又はアミノ酸の類似した配列を整列し、それによって違いを明らかにするコンピュータプログラムを使用して比較することができる。好ましい方法では、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）及びその中で使用されるパラメーターを使用し、ＤＮＡｓｔａｒシステム（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡ配列の配列断片を整列する。しかし、任意の標準的なアラインメントソフトウェアの使用により、同等のアラインメント及び類似性／同一性の評価を得ることができる。例えば、ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ第９．１版、及びそのプログラムにより使用されている初期設定パラメーター（ギャップ生成ペナルティー＝１２、ギャップ伸長ペナルティー＝４）を使用して、配列同一性及び類似性を比較することもできる。
【００３４】
本明細書において「抗体」には、Ｆａｂ又は他のイムノグロブリン発現ライブラリーの産物を含めて、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ、単鎖、及びヒト化抗体、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）が含まれる。抗体に関して、「免疫学的に特異的な」又は「特異的な」という用語は、対象とするタンパク質の１つ又は複数のエピトープと結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識せずそれと結合しない抗体を指す。抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは当技術分野で周知であり、日常的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．），  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８８），  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００３５】
「実質的に純粋な」という用語は、対象とする化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０〜６０重量％含む調製物を指す。より好ましくは、調製物は対象とする化合物を少なくとも７５重量％含み、最も好ましくは９０〜９９重量％含む。純度は、対象とする化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【００３６】
一本鎖核酸分子に関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野で一般に使用される所定の条件下でそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子間の関係を指す（時折「実質的に相補的な」と称される）。具体的には、その用語は、オリゴヌクレオチドと、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指し、オリゴヌクレオチドと、相補的でない配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションの実質的な除外を指す。
【００３７】
「コード配列」又は「コード領域」とは、配列が発現するときに、アミノ酸又はポリペプチドなどの遺伝子産物の産生に必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン又は５’若しくは３’非翻訳領域）を含んでもよく、又は（例えば、ｃＤＮＡなどで）そのような介在非翻訳配列を欠いてもよい。
【００３８】
「イントロン」とは、タンパク質合成に関係する情報をコードしない、核酸中のポリヌクレオチド配列を指す。そのような配列はｍＲＮＡに転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質へと翻訳される前に除去される。
【００３９】
「作動的に連結した」又は「作動的に挿入した」という用語は、コード配列の発現に必要な制御配列を、コード配列の発現が可能となるように、コード配列に対して適当な位置で核酸分子中に置くことを意味する。一例として、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写又は発現を調節することができるとき、そのコード配列と作動的に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンスの方向でプロモーター又は制御配列と作動的に連結することができる。「作動的に連結した」という用語は、発現ベクター中の他の転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に時折適用される。
【００４０】
転写及び翻訳調節配列はプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ制御配列であり、それは、宿主細胞中でのコード配列の発現をもたらす。
【００４１】
「プロモーター」、「プロモーター領域」又は「プロモーター配列」という用語は一般に遺伝子の転写制御領域を指し、それはコード領域の５’又は３’側、或いはコード領域内、又はイントロン内に認めることができる。典型的には、プロモーターは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドより上の検出可能なレベルでの転写の開始に必要な最小限の数の塩基又はエレメントを含む。プロモーター配列内には、（好都合なことにヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって定義される）転写開始部位、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（共通配列）がある。
【００４２】
「ベクター」とは、他の核酸セグメントの複製又は発現をもたらすようにそのセグメントを作動的に挿入することができるプラスミド、ファージ、コスミドやウイルスなどのレプリコンである。
【００４３】
「核酸構築物」又は「ＤＮＡ構築物」という用語は、適当な制御配列と作動的に連結し、細胞を形質転換するベクター中に挿入した１つ又は複数のコード配列を指すのに時折使用する。この用語は、「形質転換用ＤＮＡ」又は「導入遺伝子」という用語と互換的に使用することができる。そのような核酸構築物は、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子とともに、対象とする遺伝子産物のコード配列を含有してよい。
【００４４】
「マーカー遺伝子」又は「選択マーカー遺伝子」とは、そのコードされた遺伝子産物が、その遺伝子を含有する細胞がその遺伝子を含有しない細胞の中から選択されることを可能にする特徴を付与する遺伝子である。遺伝子工学に使用されるベクターは、典型的には１つ又は複数の選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子の型には、（１）抗生物質耐性遺伝子、（２）除草剤寛容性又は耐性遺伝子、及び（３）形質転換細胞が、その他の場合では細胞が産生することができない必須の構成要素、通常はアミノ酸を合成することを可能にする代謝又は栄養要求性マーカー遺伝子がある。
【００４５】
「レポーター遺伝子」もマーカー遺伝子の一種である。それは、典型的には、標準的な実験室の手段（例えば、酵素活性、蛍光）によってアッセイ可能又は検出可能な遺伝子産物をコードする。
【００４６】
遺伝子の「発現する」、「発現された」又は「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。その過程では遺伝子がｍＲＮＡへと転写され、次いでｍＲＮＡが１つ又は複数のポリペプチドへと翻訳され、その過程は天然に存在する全ての翻訳後修飾を包含する。
【００４７】
「内因性」とは、特定の生物内で天然に認めることができる任意の構成成分、例えば、遺伝子又は核酸、或いはポリペプチドを指す。
【００４８】
核酸構築物の「異種」領域とは、自然界では大きな分子に関連して認められない、大きな分子内にある核酸分子の同定可能なセグメント（又は複数のセグメント）である。したがって、異種領域が遺伝子を含むとき、遺伝子は通常、供給源の生物のゲノム中ではゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接する。他の例では、異種領域は、コード配列自体が自然界で認められない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、又は天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異又は天然に存在する突然変異事象からは、本明細書で定義したＤＮＡの異種領域は生じない。上記で定義した「ＤＮＡ構築物」という用語は、異種領域、特に細胞の形質転換で使用するために構築されたものを指すのにも使用される。
【００４９】
外因性又は異種ＤＮＡが細胞内に導入されているとき、細胞は、そのようなＤＮＡにより「形質転換」又は「トランスフェクト」されている。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれて（共有結合して）もよく、又は組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞では、形質転換用ＤＮＡをプラスミドなどのエピソームエレメント上に維持することができる。真核細胞に関して、安定形質転換細胞とは、形質転換用ＤＮＡが染色体中に組み込まれており、その結果、それが染色体複製により娘細胞に遺伝する細胞である。この安定性は、真核細胞が形質転換用ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる細胞系統又はクローンを樹立できることによって実証される。「クローン」とは、単一細胞、又は有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系統」とは、多数の世代へと安定してｉｎ  ｖｉｔｒｏで  増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００５０】
「粒」、「種子」、又は「豆」とは、他のそのような植物へと成長することができる顕花植物の再生単位を指す。本明細書において、特にコーヒー植物に関しては、その用語は、同義的にかつ互換的に使用される。
【００５１】
本明細書において、「植物」という用語は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、苗条、根）、種子、花粉、植物細胞、植物細胞小器官、及びその子孫への言及を含む。例えば、トランスジェニック植物又はその子孫に由来する植物細胞、原形質体、組織、カルス、胚並びに花、茎、種子、花粉、果実、葉、又は根を含むトランスジェニック植物の部分は、本発明の範囲内で理解されるべきである。
【００５２】
説明：
その態様の１つでは、本発明は、リグニン生合成経路に関与する様々なタンパク質をコードするコーヒー由来の核酸分子を特徴とする。リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする核酸分子の代表的な例は、幼葉並びに発生の様々な段階で採取したサクランボの粒及び果皮組織から単離されたＲＮＡを用いて作製されたいくつかのコフィアカネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ）（ロブスタ）ｃＤＮＡライブラリーの４７，０００を超える発現配列タグ（ＥＳＴ）のデータベースから同定された。重複するＥＳＴを同定し、それを完全なコード配列を含むユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）（コンティグ）へと「クラスター化」した。ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））の重複のないタンパク質データベースに対する個々の各配列のＢＬＡＳＴ検索を行うことによってユニジーン配列に注釈を付けた。
【００５３】
公的データベースの生化学的に特徴付けられたタンパク質の配列を使用するコーヒーＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ検索から、コーヒー植物中のリグニン生合成経路のいくつかの重要な酵素に相当する遺伝子の配列が明らかとなった。これらの配列のいくつかの完全なオープンリーディングフレームが得られ、他のいくつかの配列については部分的なオープンリーディングフレームが得られた。これらのｃＤＮＡ及びそのコードされたタンパク質を下記の通りに称する：
【００５４】
【表１】
2009511062.tif 000002
【００５５】
重要なステップであるコフィアカネフォラ由来のリグニン生合成経路を触媒するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを本明細書で記載し例示するが、本発明は、下記に記載の目的でＣ．カネフォラ（Ｃ．  ｃａｎｅｐｈｏｒａ）ポリヌクレオチド及びタンパク質と互換的に使用するのに十分に類似した他のコーヒー種由来の核酸及びコードされたタンパク質を包含するものとする。したがって、「リグニン生合成経路を構成する」ポリペプチド及びタンパク質という用語を本明細書で使用するとき、その用語は、本明細書に記載の一般的な物理的、生化学的及び機能的特徴を有するコーヒー属タンパク質、並びにそれをコードするポリヌクレオチドを全て包含するものとする。
【００５６】
その配列の点から考慮すると、リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドには、Ｃ．アラビカ及びＣ．カネフォラの異なる品種中で認められる可能性が高い配列番号１〜１４の対立遺伝子変異体及び天然突然変異体、並びに異なるコーヒー種で認められる可能性が高い配列番号１〜１４の相同体がある。そのような変異体及び相同体は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列における特定の違いを有することが予想されるので、本発明は、配列番号１５〜２８のいずれか１つと少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、４５％、５０％又は５５％、より好ましくは少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％又は７０％、より好ましくは少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％、さらに好ましくは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、さらに好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、最も好ましくは９６％、９７％、９８％及び９９％以上の同一性を有し、配列番号１〜１４のいずれか１つと同等の範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。リグニン生合成経路を構成するタンパク質の間で存在する可能性が高い天然配列変異、並びに異なるコーヒー品種及び種においてそれをコードする遺伝子のために、当業者なら、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの独特の特性を依然として維持しながら、このレベルの変異を見つけることを予想するであろう。そのような予想は、部分的にはコードされたタンパク質の性質を感知できるほどには変化させない遺伝コードの縮重、並びに保存的アミノ酸配列変異の既知の進化的な成功に起因する。したがって、そのような変異体及び相同体は、互いに実質的には同じであるとみなされ、本発明の範囲に含まれる。
【００５７】
リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子と関係する遺伝子制御配列は実用性があり、本発明の範囲内にあるとみなされる。下記に記載する方法によって任意のコーヒー種由来のリグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及び他の遺伝子制御配列を得ることができ、それを本発明に従って利用することができる。リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現の組織特異性及び時間的特異性を支配するプロモーター及び制御エレメントを使用して、他にも有用性はあるが、そのような修飾を含むコーヒー豆から生産されるコーヒー製品の風味及び芳香を増強する目標に向けて、リグニン生合成経路を構成するタンパク質の発現を促進し、変化させ又は修飾することができる。
【００５８】
下記の節では、本発明の実施に関与する一般的な手順を示す。特定の物質について述べる限り、それは単に例示の目的のものに過ぎず、本発明を限定するものではない。別段の指定がない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）又はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （２００５）で示すものなどの一般的な生化学及び分子生物学的手順を使用する。
【００５９】
核酸分子、タンパク質及び抗体：
２つの一般的な方法によって本発明の核酸分子を調製することができる：（１）その分子は適当なヌクレオチド三リン酸から合成することができ、又は（２）その分子は生物学的供給源から単離することができる。どちらの方法も、当技術分野で周知のプロトコルを利用する。
【００６０】
配列番号１〜１４を有するｃＤＮＡなどのヌクレオチド配列情報が利用できることにより、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子の調製が可能となる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又は類似する装置で使用されるホスホラミダイト法によって調製することができる。得られた構築物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など、当技術分野で知られている方法に従って調製することができる。本発明のＤＮＡ分子などの長い二本鎖ポリヌクレオチドは、現在のオリゴヌクレオチド合成法に固有のサイズ限界により、段階的に合成しなくてはならない。したがって、例えば、長い二本鎖分子は、適当な相補性を有するいくつかの小さなセグメントとして合成することができる。こうして作製された相補的セグメントは、各セグメントが、隣接するセグメントの結合に適した付着末端を有するようにアニールすることができる。隣接するセグメントをＤＮＡリガーゼの存在下で付着末端をアニールすることにより連結して、長い二本鎖分子全体を構築することができる。次いで、そのように構築された合成ＤＮＡ分子をクローン化し、それを適当なベクター中で増幅することができる。
【００６１】
本発明によれば、リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のコード領域及び／又は制御領域の一部又は全部との適当なレベルの配列相同性を有する核酸を、適当なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用することによって同定することができる。ゲノム配列に適用するとき、上記の戦略によって、リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のコード配列の単離が可能となることに加えて、制御配列自体が適切なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相同性を有していない可能性があっても、リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子と関係するプロモーター及び他の遺伝子制御配列の単離も可能となることが当業者に理解されるであろう。
【００６２】
典型的な例示として、５×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬（Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び最大で５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を使用するＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の方法に従ってハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼーションを３７〜４２℃で少なくとも６時間実施する。ハイブリダイゼーション後、フィルターを下記の通りに洗浄する：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分；（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分；（３）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間；（４）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３０分毎に溶液を交換しながら４５〜５５℃で２時間。
【００６３】
特定の配列相同性を有する核酸分子間でのハイブリダイゼーションを実現するのに必要となるストリンジェンシー条件を計算する１つの一般式（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中の塩基対数
【００６４】
上記の式の例示として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドと、ＧＣ含量４２％及び平均プローブサイズ２００塩基を使用すると、Ｔｍは５７℃となる。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％低下する毎に１〜１．５℃低下する。したがって、約７５％を超える配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用すると観察される。一実施形態では、上記のハイブリダイゼーション及び洗浄溶液を用いて、ハイブリダイゼーションは３７℃で行い、最終洗浄は４２℃で行う；他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃で行い、最終洗浄は５０℃で行う；さらに他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃で行い、最終洗浄は６５℃で行う。高いストリンジェンシー条件では、上記のハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイゼーションを４２℃で行い、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で最終洗浄を６５℃で１０分間行う。
【００６５】
任意の便利なクローン化ベクター中のＤＮＡとして本発明の核酸を維持することができる。好ましい実施形態では、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）やｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）などのプラスミドクローン化／発現ベクター中でクローンを維持し、これらのベクターは全て、適切な大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）宿主細胞中で増殖させることができる。
【００６６】
本発明の核酸分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片があり、それらは一本鎖、二本鎖でよく、さらに三本鎖でもよい。したがって、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は例えばＰＣＲ増幅によって植物組織の試験試料中のｍＲＮＡを検出するためのプローブとして、或いはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳時又はその前の、リグニン生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現の正又は負の制御に有用である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをそのようなアッセイのプローブとして利用することができる方法には、それだけに限らないが、（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション；及び（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＲＴ−ＰＣＲを含む）やリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの様々な種類の増幅反応がある。
【００６７】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、知られている方法に従って、様々な形で調製することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕで産生された場合、ポリペプチドは、適当な供給源、例えば、種子、果皮や他の植物の部分から調製することができる。
【００６８】
或いは、ポリペプチドをコードする核酸分子が利用できることにより、当技術分野で知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現方法を使用したタンパク質の産生が可能となる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用のｐＳＰ６４やｐＳＰ６５などの適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクター中にｃＤＮＡ又は遺伝子をクローン化し、その後コムギ胚芽やウサギ網状赤血球などの適切な無細胞翻訳系で無細胞翻訳を行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系は、例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、ＢＲＬ、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから市販されている。
【００６９】
好ましい実施形態に従って、リグニン生合成経路において活性である大量のポリペプチドを、適切な原核生物又は真核生物系中での発現によって産生することができる。例えば、配列番号１〜１４を有するｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子の一部又は全部を、細菌細胞（大腸菌など）又は酵母細胞（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）中での発現に適合されたプラスミドベクター、或いは昆虫細胞中での発現用のバキュロウイルスベクター中に挿入することができる。そのようなベクターは、宿主細胞中でのＤＮＡの発現を可能にするように位置している、宿主細胞中でのＤＮＡの発現に必要な制御エレメントを含む。発現に必要となるそのような制御エレメントには、プロモーター配列、転写開始配列、及び場合によってはエンハンサー配列がある。
【００７０】
組換え原核生物又は真核生物系中での遺伝子発現によって産生された、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドは、当技術分野で知られている方法に従って精製することができる。好ましい実施形態では、市販されている発現／分泌系を使用し、それによって組換えタンパク質が発現され、その後宿主細胞から分泌されて、その周囲の培地からそれを容易に精製することができる。発現／分泌ベクターを使用しない場合、代替の手法では、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用などの親和性分離により組換えタンパク質を精製する。そのような方法は、熟練した専門家によって一般に使用される。
【００７１】
上記の方法によって調製された、本発明のリグニン生合成経路を構成するポリペプチドは、標準的な手順に従って分析することができる。
【００７２】
知られている方法に従って、コーヒーから精製され、又は組換えにより産生されたリグニン生合成経路を構成するポリペプチドを使用して、本明細書で定義したポリクローナル又はモノクローナル抗体、抗体の断片又は誘導体を生成することができる。本発明のリグニン生合成経路を構成するポリペプチドの断片を認識しそれと結合する抗体も、その抗体がリグニン生合成経路を構成するポリペプチドに特異的であるという条件で企図される。例えば、タンパク質の分析又はサザン及びクローン化の分析（下記を参照）からクローン化された遺伝子が多重遺伝子族に属することが示唆される場合、タンパク質の非保存的領域と対応する合成ペプチドに対して作製された構成要素特異的抗体を生成することができる。
【００７３】
本明細書に記載したいずれかの目的のための本発明の抗体を含むキットも本発明の範囲に含まれる。一般に、そのようなキットは、抗体が免疫特異的であるコントロール抗原を含む。
【００７４】
ベクター、細胞、組織及び植物：
本発明によれば、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、或いはオリゴヌクレオチド、又はセンス若しくはアンチセンス方向のその相同体、類似体若しくは変異体、或いはレポーター遺伝子、及び細胞又は組織特異的プロモーターの制御下にある他の構築物、並びに他の制御配列を含有する、トランスジェニック宿主細胞を産生するベクター及びキットも特徴とする。適切な宿主細胞には、それだけに限らないが、植物細胞、細菌細胞、酵母及び他の真菌細胞、昆虫細胞並びに哺乳動物細胞がある。多様なこれらの宿主細胞を形質転換するベクターは当業者に周知である。そのベクターには、それだけに限らないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに他の細菌、酵母及びウイルスベクターがある。典型的には、トランスジェニック宿主細胞を産生するキットは、１つ又は複数の適当なベクター及びベクターを使用してトランスジェニック細胞を産生するための使用説明書を含有する。キットは、いくつか例を挙げると、細胞を培養する培地、細胞の形質転換を行う試薬、及び遺伝子発現についてトランスジェニック細胞を試験する試薬などの１つ又は複数のさらなる構成要素をさらに含んでよい。
【００７５】
本発明は、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドをコードする１コピー又は複数コピーの遺伝子、或いはリグニン生合成経路を構成する植物の内因性ポリペプチドの産生又は機能を阻害する核酸配列を含むトランスジェニック植物を含む。これは、下記に記載する天然又は組換えの制御配列によって調節される、ＲＮＡを含めた、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドのコード配列の一部又は全部、或いはその突然変異体、アンチセンス又は変異体を含む導入遺伝子で植物細胞を形質転換することによって実現される。トランスジェニック植物としては、それだけに限らないが、Ｃ．アベオクタエ（Ｃ．  ａｂｅｏｋｕｔａｅ）、Ｃ．アラビカ（Ｃ．  ａｒａｂｉｃａ）、Ｃ．アーノルディアナ（Ｃ．  ａｒｎｏｌｄｉａｎａ）、Ｃ．アルベミエンシス（Ｃ．  ａｒｕｗｅｍｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ベンガレンシス（Ｃ．  ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、Ｃ．カネフォラ、Ｃ．コンゲンシス（Ｃ．  ｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｃ．デベブレイ（Ｃ．  ｄｅｗｅｖｒｅｉ）、Ｃ．エキサルサ（Ｃ．  ｅｘｅｌｓａ）、Ｃ．ユーゲニオイデス（Ｃ．  ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）、及びＣ．ヘテロカリクス（Ｃ．  ｈｅｔｅｒｏｃａｌｙｘ）、Ｃ．カパカタ（Ｃ．  ｋａｐａｋａｔａ）、Ｃ．カシアナ（Ｃ．  ｋｈａｓｉａｎａ）、Ｃ．リベリカ（Ｃ．  ｌｉｂｅｒｉｃａ）、Ｃ．モルンドウ（Ｃ．  ｍｏｌｏｕｎｄｏｕ）、Ｃ．ラセモサ（Ｃ．  ｒａｓｅｍｏｓａ）、Ｃ．サルバトリクス（Ｃ．  ｓａｌｖａｔｒｉｘ）、Ｃ．セシフローラ（Ｃ．  ｓｅｓｓｉｆｌｏｒａ）、Ｃ．ステノフィラ（Ｃ．  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、Ｃ．トラベンコレンシス（Ｃ．  ｔｒａｖｅｎｃｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ウィッチアナ（Ｃ．  ｗｉｇｈｔｉａｎａ）及びＣ．ザングエバリエ（Ｃ．  ｚａｎｇｕｅｂａｒｉａｅ）を含めたコーヒー種が好ましい。任意の種の植物も本発明中に含まれる；これらの植物には、それだけに限らないが、タバコ、シロイヌナズナ及び他の「実験に適した」種、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバーなどの禾穀類、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオなどの油を産生する植物、トマト、トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメなどの野菜、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ペチュニア、ヒャクニチソウ、芝生や芝草などの園芸植物がある。
【００７６】
当業者に知られている標準的な植物形質転換法を使用して、トランスジェニック植物を生成することができる。これらの方法には、それだけに限らないが、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター、原形質体のポリエチレングリコール処理、微粒子銃ＤＮＡ送達、ＵＶレーザーマイクロビーム、ジェミニウイルスベクター又は他の植物ウイルスベクター、原形質体のリン酸カルシウム処理、単離原形質体のエレクトロポレーション、形質転換用ＤＮＡで被覆したマイクロビーズを入れた溶液中の細胞懸濁物の撹拌、形質転換用ＤＮＡで被覆したケイ素繊維を入れた溶液中の細胞懸濁物の撹拌、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームが媒介するＤＮＡ取り込みなどがある。そのような方法は当技術分野で刊行されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，  ｅｄｓ．，  １９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＆  Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，  ｅｄｓ．，  １９８９）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｇｅｌｖｉｎ，  Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，  Ｖｅｒｍａ，  ｅｄｓ．，  １９９３）；及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｍａｌｉｇａ，  Ｋｌｅｓｓｉｇ，  Ｃａｓｈｍｅｒｅ，  Ｇｒｕｉｓｓｅｍ  ＆  Ｖａｒｎｅｒ，  ｅｄｓ．，  １９９４）を参照されたい。
【００７７】
形質転換の方法は、形質転換する植物によって決まる。アグロバクテリウムベクターは、双子葉植物種の形質転換にしばしば使用される。アグロバクテリウムバイナリーベクターには、それだけに限らないが、ＢＩＮ１９及びその誘導体、ｐＢＩベクターシリーズ、及びバイナリーベクターｐＧＡ４８２、ｐＧＡ４９２、ｐＬＨ７０００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＹ２３４３３０）並びにｐＣＡＭＢＩＡベクター（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｓｖａｂ  ＆  Ｍａｌｉｇａ，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：  ９８９−９９４によって構築されたｐＰＺＰベクターに由来し、ＣＡＭＢＩＡ、ＧＰＯ  Ｂｏｘ  ３２００、Ｃａｎｂｅｒｒａ  ＡＣＴ  ２６０１、オーストラリアから又はワールドワイドウェブＣＡＭＢＩＡ．ｏｒｇを介して入手可能）のうち任意の適切なものがある。単子葉植物種の形質転換では、形質転換用ＤＮＡで被覆した粒子及び形質転換用ＤＮＡで被覆したケイ素繊維を用いた遺伝子銃照射が核形質転換にしばしば有用である。或いは、アグロバクテリウム「スーパーバイナリー」ベクターは、イネ、トウモロコシ及び様々な他の単子葉植物種の形質転換に使用することに成功している。
【００７８】
選択された植物を形質転換するＤＮＡ構築物は、適当な５’制御配列（例えばプロモーター及び翻訳制御配列）及び３’制御配列（例えばターミネーター）と作動的に連結した対象とするコード配列を含む。好ましい実施形態では、その天然の５’及び３’制御エレメントの調節下で、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドをコードするコード配列を利用する。他の実施形態では、コード配列と制御配列を交換して、例えば風味、芳香又は他の特徴において表現型を改良するために形質転換された植物の種子のタンパク質含量を変化させる。
【００７９】
代替の実施形態では、遺伝子のコード領域を、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターやゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの強力な構成的プロモーター下に置く。本発明での使用に企図される他の構成的プロモーターには、それだけに限らないが、Ｔ−ＤＮＡマンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーターがある。他の実施形態では、強力な単子葉植物プロモーター、例えば、トウモロコシユビキチンプロモーター、イネアクチンプロモーター又はイネチューブリンプロモーターを使用する（Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  １２３：  １００５−１４，  ２０００）。
【００８０】
誘導性プロモーター下でリグニン生合成経路を構成するポリペプチドを発現するコード配列を有するトランスジェニック植物が本発明の範囲内にあることも企図されている。誘導性植物プロモーターには、ほんのいくつか例を挙げると、テトラサイクリンリプレッサー／オペレーター調節プロモーター、熱ショック遺伝子プロモーター、ストレス（例えば、傷害）誘導プロモーター、防御反応性遺伝子プロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害誘導遺伝子プロモーター（例えば、ヒドロキシプロリンリッチ細胞壁タンパク質遺伝子）、化学誘導性遺伝子プロモーター（例えば、硝酸レダクターゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子など）及び暗所誘導性遺伝子プロモーター（例えば、アスパラギンシンターゼ遺伝子）がある。
【００８１】
組織特異的及び成長特異的プロモーターも本発明での使用に企図される。種子特異的プロモーターの非限定的な例には、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａザイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）、及びｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）（Ｕ．Ｓ．  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒ．  Ｎｏ．  ０９／３７７，６４８）、マメベータ−ファゼオリン、ナピン、ベータ−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、トウモロコシ１５ｋＤａザイン、２２ｋＤａザイン、２７ｋＤａザイン、ｇ−ザイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２、及びグロブリン１、ダイズ１１Ｓレグミン（Ｂａｕｍｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）、及びＣ．カネフォラ１１Ｓ種子貯蔵タンパク質（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ  ａｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３７：  ２７３−２８２）がある。ｅｎｄ１及びｅｎｄ２遺伝子由来の種子優先的プロモーターが開示されている国際公開第００／１２７３３号パンフレットも参照されたい。それらに限定されないが、本願権利者が所有する同時係属の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２６１２１に記載のオレオシン遺伝子プロモーター、本願権利者が所有する同時係属の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２６２３４に記載のデヒドリン遺伝子プロモーター、及び、本願権利者が所有する同時係属の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３４４０２に記載の９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ遺伝子プロモーターを含め、他のコーヒー属種子特異的プロモーターを利用することもできる。他の組織特異的プロモーターの例には、それだけに限らないが、光合成組織中での発現用のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子プロモーター（例えば、Ｍａｒｒａｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３に記載のコーヒー小サブユニットプロモーター）又はクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子プロモーター；及び根での発現が所望される根特異的グルタミンシンターゼ遺伝子プロモーターがある。
【００８２】
コード領域はまた、適当な３’制御配列とも作動的に連結している。天然の３’制御配列を使用しない実施形態では、ノパリンシンターゼポリアデニル化領域を使用することができる。他の有用な３’制御領域には、それだけに限らないが、オクトピンシンターゼポリアデニル化領域がある。
【００８３】
適当な制御エレメントの制御下にある選択されたコード領域は、カナマイシン耐性などの核薬物耐性マーカーと作動的に連結している。他の有用な選択マーカー系には、抗生物質又は除草剤耐性（例えば、ハイグロマイシン、スルホニル尿素、ホスフィノスリシン、又はグリホサートに対する耐性）を付与する遺伝子、或いは選択的増殖を付与する遺伝子（例えば、マンノース上での植物細胞の増殖を可能にするホスホマンノースイソメラーゼ）がある。選択マーカー遺伝子には、それだけに限らないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）やハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするものなどの抗生物質耐性をコードする遺伝子、並びにグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ及び／又はグリホサートオキシドレダカターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）（ＧＯＸ）、ブロモキシニルに対する耐性についてのブロモキシニルニトリラーゼ（ＢＸＮ）、イミダゾリノンに対する耐性についてのＡＨＡＳ遺伝子、スルホニル尿素耐性遺伝子や、２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性遺伝子などの除草性化合物に対する耐性を付与する遺伝子がある。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明によって包含されるプロモーター及び他の発現制御配列をレポーター遺伝子と作動的に連結する。本発明での使用に企図されるレポーター遺伝子には、それだけに限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ハナギンチャクオレンジ蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、（α−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃＺ、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、或いはホタル又は細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする遺伝子がある。本発明の実施と関係する多数の標準的な手順のように、当業者なら、マーカー又はレポーターの機能を果たすことができるさらなる配列に気づくであろう。
【００８５】
細胞宿主中の遺伝子発現を増強するさらなる配列修飾は当技術分野で知られている。これらの修飾には、余分なポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列、及び遺伝子発現にとって有害である可能性がある他の十分に特徴付けられているそのような配列の除去がある。或いは、必要なら、コード配列のＧ／Ｃ含量を、コーヒー植物細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することによって計算される、所与のコーヒー植物細胞宿主で平均のレベルに調整することができる。また、可能であるとき、コード配列を修飾して、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避する。遺伝子発現を増強する他の代替方法は、５’リーダー配列を使用することである。翻訳リーダー配列は当技術分野で周知であり、それには、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（オメガ）のシス作用性誘導体（オメガ’）、ブロムモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス、及びカブラ黄色モザイクウイルス由来の５’リーダー配列がある。
【００８６】
植物を形質転換し、その後、導入遺伝子産物の存在、導入遺伝子がコードするｍＲＮＡ、又は導入遺伝子の発現と関係する表現型の変化を含めた１つ又は複数の特性についてそれをスクリーニングする。発現の量、並びに形質転換植物中での導入遺伝子の発現の組織及び時間特異的パターンが、核ゲノム中にそれが挿入された位置に応じて様々となり得ることが認識されるべきである。そのような位置の効果は当技術分野で周知である。この理由で、いくつかの核形質転換体を再生し、導入遺伝子の発現についてそれを試験すべきである。
【００８７】
方法：
本発明の核酸及びポリペプチドは、そのタンパク質が、コーヒー植物を病原体から、及び草食動物、昆虫又は病原体の攻撃から保護する役割、並びに、そのタンパク質を発現するコーヒー植物の豆から最終的に生産されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は芳香を強化する役割を果たすことができるように、タンパク質生成物をコーヒー植物で発現させることができるいくつかの方法のいずれか１つで用いることができる。同様に、本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドから合成されるリグニン及びそのような他の植物化学生成物が、植物を病原体から、及び草食動物又は昆虫の攻撃から保護する役割、並びに、リグニンを含有するコーヒー植物の豆から最終的に生産されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は芳香を強化する役割を果たすことができるいくつかの方法のいずれか１つで用いることができる。
【００８８】
病原体、草食動物及び昆虫による攻撃からの植物の保護に関して、リグニンは植物細胞壁を強化して、細胞壁多糖類の分解、特に消化を阻止し、したがって植物の主要な防御線の働きをする。（Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。したがって、植物でリグニンの生合成経路を構成するポリペプチドの生産を操作する能力は、又は、そのような遺伝子発現を監視するために本発明のポリヌクレオチド及びタンパク質を用いる能力でさえも、病原体、草食動物又は昆虫の攻撃に対するコーヒー植物の応答の研究及び操作を可能にする。この知識は、病原体、草食動物又は昆虫による疾患又は大損害に対してより効果的に装備された、改変コーヒー植物の生成を可能にする。
【００８９】
焙煎コーヒー粒の風味及び芳香に関して、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドが、タンパク質自体の内容物、又はそれが産生するリグニンなどの産物を用いた、焙煎の間に起こるメイラード反応によるコーヒーの風味の生成に対して何らかの影響を及ぼすことが予想される。タンパク質、特にタンパク質分解産物（ペプチド及びアミノ酸）が、重要な群の風味前駆体となる（Ｓｐａｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。したがって、リグニン生合成経路を構成するものなどの比較的豊富なタンパク質が、コーヒーを焙煎する間に起こる風味生成反応に対して何らかの寄与を果たすことが予想できる。そのような寄与は、コーヒー豆中のタンパク質自体の濃度、或いはそのタンパク質から最終的に産生されるリグニンの濃度に由来する可能性がある。本明細書に記載の方法に従って、本発明のポリヌクレオチドにより、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドのタンパク質発現プロファイルを（例えば、マーカーによって支援される育種を介して）モニターし又は操作することができる。
【００９０】
したがって、本発明の一態様は、植物中のリグニン生合成経路を構成するポリペプチドのプロファイルを変化させる方法を特徴とし、その方法は、植物中のリグニン生合成経路を構成する１つ又は複数のポリペプチドの量又は活性を増大又は低下させるステップを含む。例えば、本発明の一実施形態では、その固有の発現調節配列の調節下にあるリグニン生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を使用して、植物中のそのポリペプチドの産生を増大させる目的で植物を形質転換する。或いは、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドのコード領域を、構成的又は誘導性プロモーターなどの異種発現調節領域と作動的に連結する。
【００９１】
機能喪失（ヌル）突然変異植物は、作製することもでき、又は現在入手可能な植物突然変異体の集団から選択することもできる。本明細書に記載の１つ又は複数の方法を利用して、リグニン生合成経路を構成する特定のポリペプチドを過剰発現する突然変異体について突然変異植物集団をスクリーニングできることも当業者には理解されるであろう。化学的突然変異生成、放射線突然変異生成、及びトランスポゾン又はＴ−ＤＮＡの挿入、或いはゲノムに誘導した局所的損傷部位のターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＴＩＬＬＩＮＧ、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３５（２）：  ６３０−６３６；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ＆  Ｈａｕｇｈｎ，  ２００５，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ８（２）：  ２１１−２１５を参照）によって突然変異体集団を作製することができる。突然変異体集団を作製する方法は当技術分野で周知である。
【００９２】
本発明の核酸を使用して、様々な植物種中でリグニン生合成経路を構成する突然変異ポリペプチドを同定することができる。トランスポゾン挿入系統が入手可能であるトウモロコシやシロイヌナズナなどの種では、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子中の挿入について系統がスクリーニングされるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。次いで、育種を介して、分断された遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性である植物系統を生じさせることができる。
【００９３】
突然変異生成技術によって作製されたヌル突然変異体で認められるものと類似した表現型を示す植物を工学的に作製することもできる。リグニン生合成経路を構成する突然変異型の選択されたポリペプチドを発現させて「優性阻害効果」を引き起こすことによって、トランスジェニックヌル突然変異体を作製することができる。任意の一機構に本発明を限定するものではないが、この突然変異タンパク質は、タンパク質又は他の細胞因子との相互作用について野生型タンパク質と競合する。この型の「優性阻害」効果の例は、昆虫と脊椎動物のどちらの系についても周知である（Ｒａｄｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４５：  １６３−１７１；Ｋｏｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：  ４２６−４２８）。
【００９４】
「転写後遺伝子サイレンシング」によりリグニン生合成経路を構成するポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、他の種のトランスジェニックヌル突然変異体を作製することができる。下方制御の標的とする種由来の遺伝子、又はその断片を利用して、コードされたタンパク質の産生を調節することができる。完全長アンチセンス分子をこの目的に使用することができる。或いは、翻訳にとって決定的に重要なｍＲＮＡの特定の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用することができる。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるアンチセンス分子の使用は当技術分野で知られている。アンチセンス分子は、転写後にアンチセンスＲＮＡ配列を産生するＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換することによって、ｉｎ  ｓｉｔｕで提供することができる。そのような構築物は、完全長の又は部分的なアンチセンス配列が産生されるように設計することができる。大量のｄｓＲＮＡが産生されるように、導入遺伝子により遺伝子コード配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡをどちらも過剰発現させることによって、この遺伝子サイレンシング効果を増強することができる（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  ＰＮＡＳ  ９５：  １３９５９−１３９６４を参照）。これに関して、少なくとも１つのイントロンの一部又は全部と対応する配列を含有するｄｓＲＮＡが特に有効であることがわかっている。一実施形態では、コード配列アンチセンス鎖の一部又は全部は導入遺伝子によって発現される。他の実施形態では、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドのコード配列の一部又は全部のハイブリダイズ用センス及びアンチセンス鎖は、導入遺伝子により発現される。
【００９５】
他の実施形態では、植物の系に現在利用可能である様々な他の転写後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）技術の使用によりリグニン遺伝子をサイレンシングすることができる。ＲＮＡサイレンシングでは、ＲＮアーゼＨに基づく酵素（「ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）」又は「ダイサー様酵素」）により二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をプロセシングして短鎖の２１〜２８ヌクレオチドの断片にする。ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）である切断産物を、配列特異的な形で遺伝子発現を制御するタンパク質エフェクター複合体中に組み込む（植物中のＲＮＡサイレンシングの総説については、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，  ２００４，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７２：  ６５−７３；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：  ３５６−３６３；  Ｈｅｒｒ，  ２００４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３２：  ９４６−９５１を参照されたい）。
【００９６】
短鎖干渉ＲＮＡを化学的に合成し、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び増幅し、次いでそれを細胞中に送達することができる。送達は、微量注入（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、化学的トランスフェクション（Ａｇｒａｗａｌ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、エレクトロポレーション又はカチオン性リポソームが媒介するトランスフェクション（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、或いは当業者によって認められる、当技術分野で利用可能な任意の他の手段によるものでよい。或いは、例えばプラスミドを用いて対象とする細胞中にｓｉＲＮＡのＤＮＡ鋳型を挿入することにより細胞内でｓｉＲＮＡを発現させることもでき（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、それを特異的に標的として細胞を選択することもできる。短鎖干渉ＲＮＡは植物中に導入することに成功している（Ｋｌａｈｒｅ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【００９７】
本発明で好ましいＲＮＡサイレンシング方法は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。特定の所望されるｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターを、任意の一般的な手段によって標的細胞中に送達する。細胞中に入った後、ＤＮＡ配列はＲＮＡ分子へと継続的に転写され、それは折り重なり分子内塩基対形成を介してヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、細胞によりプロセシングを受けた後、ｓｉＲＮＡ分子と同等となり、細胞により使用されて所望のタンパク質のＲＮＡサイレンシングを媒介する。植物中のＲＮＡサイレンシングについて特に有用な種々の構築物は、上記のＨｏｒｉｇｕｃｈｉ，  ２００４に記載されている。典型的には、そのような構築物は、プロモーター、「センス」方向のサイレンシングされる標的遺伝子の配列、スペーサー、標的遺伝子配列のアンチセンス、及びターミネーターを含む。
【００９８】
「同時抑制」の技術によって、さらに他の型の合成ヌル突然変異体を作製することもできる（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １６（６）：  ６５１−６５９）。抑制の標的とする内因性遺伝子のコピーで植物細胞を形質転換する。多くの場合、この結果、天然の遺伝子並びに導入遺伝子が完全に抑制される。一実施形態では、対象とする植物種由来の、リグニン生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、それを使用してその同じ種の細胞を形質転換する。
【００９９】
本発明によれば、上記の方法のいずれかによって産生された突然変異又はトランスジェニック植物も特徴とする。好ましくは、植物は稔性であり、それによって育種の目的に有用となる。したがって、突然変異体或いは１つ又は複数の上記の望ましい表現型を示す植物を植物の育種に使用することもでき、或いは農業又は園芸への適用で直接使用することもできる。それらは、色素及び光合成と関係するコーヒー種子の風味、芳香及び他の特徴におけるリグニン生合成経路を構成するポリペプチドの関与をさらに解明するための研究ツールとしても有用となる。増強された又は組合せの表現型を有する植物を産生するために、１つの導入遺伝子又は特定の突然変異を含有する植物を、相補的な導入遺伝子又は遺伝子型を含有する植物と交雑することもできる。
【０１００】
本発明はまた、種子優先的又は種子特異的な形で、植物中で任意の選択された異種遺伝子産物を産生する組成物及び方法も特徴とする。対象とするコード配列を、種子特異的コーヒープロモーター或いは他の適当な制御配列の調節下に置いて、種子特異的キメラ遺伝子を作製する。本明細書に記載の又は当技術分野で知られている形質転換法のいずれかによってキメラ遺伝子を植物細胞中に導入する。これらのキメラ遺伝子及び方法を使用して、それだけに限らないが、（１）上記で列挙したＧＦＰやＧＵＳなどの検出可能な遺伝子産物；（２）その酵素活性によって微量栄養素（例えば、ベータ−カロテンとしても知られるプロビタミンＡ）又は抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、オメガ脂肪酸、リコペン、イソプレン、テルペン）が産生されるものなどの、農業又は園芸上の利点を付与する遺伝子産物；或いは（３）Ｍｏｕｒｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８），  ＴｉｂＴｅｃｈ  １６：  ２０３−２１０に記載されているような病原体若しくは害虫を調節する遺伝子産物、又は植物の種子に対して保護的であり若しくは病原体に対して有害であることが知られている他のものを含めて、対象とする様々な遺伝子産物を植物中で産生することができる。
【０１０１】
下記の実施例を提供して、本発明をより詳細に記載する。実施例は本発明を例示するものでありそれを限定するものではない。
【０１０２】
実施例１
以下の実施例のための材料及び方法
コーヒーのリグニン合成を理解するための第１の手法として、ゲノム戦略を選択した。この戦略は、最近完了したＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ  ＥＳＴ（発現された配列タグ）ライブラリーに基づき、それは、４６，９１４個の高品質のＥＳＴ配列を含む。これらの配列は、若葉、発達中の果皮組織（全ての段階が混ざる）及びいくつかの異なる段階の発達中の粒で発現されているＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子に相当する、１３，１７５個の独特のＤＮＡ配列（ユニジーン）にｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでアセンブルされた。
【０１０３】
Ｎｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌデータベースのユニジーンセットは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ公開データベースに存在する生化学的に特徴付けられた植物タンパク質と高い類似性を示す、カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ及びフェルラ酸−５−ヒドロキシラーゼをコードするポリペプチドの完全又は部分的なＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）をコードするコーヒー配列について、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０）を用いて検索した。各タンパク質配列検索について最高のヒット率を有するユニジーンの最長ｃＤＮＡを次に単離し、配列決定をした。完全なＥＳＴデータベース（すなわち、異なる組織ライブラリーで各ユニジーンのＥＳＴ数が既知）を用いて各コーヒー遺伝子について観察されたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子発現プロフィールを、各遺伝子を発現する組織について示すために提示する。しかし、組織で見られるＥＳＴの数が少ない場合は（提示する大部分のリグニン遺伝子の場合のように）、この種の発現データは、各組織での相対的な発現レベルの概算値だけを与えることが指摘される。ＥＳＴの非存在は、その特定の組織にこの遺伝子の発現が存在しないことを意味しない。
【０１０４】
ＤＮＡシークエンシング。プラスミドＤＮＡは、製造業者によって与えられる説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて精製した。プラスミドＤＮＡ及びＰＣＲ生成物は、ジデオキシターミネーション法を用いて、ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって配列決定された（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７）。場合によっては、ＰＣＲ増幅反応の場合と同じプライマーを用い、精製及びクローニングなしで、５’ＲＡＣＥ及びゲノムウォーキング実験から生成された独特のＰＣＲ断片を直接的に配列決定した。コンピュータ解析は、Ｌａｓｅｒ  Ｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて実施した。公開ＧｅｎＢａｎｋデータベース内の配列との相同性は、Ｎｅｓｔｌｅサーバー上に位置するＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０）を用いて特定した。
【０１０５】
実施例２
カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）をコードするコーヒー属ｃＤＮＡクローンの単離及び特性評価
コーヒーカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを見つけるために、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いたＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ「ユニジーン」セット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として、ムラサキウマゴヤシＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４６６２３（配列番号３１）、Ｇｏｗｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１）からの生化学的に特徴付けされたＣＯＭＴタンパク質、及び、ヒャクニチソウＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ４３２３９（配列番号３３）、Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）のタンパク質配列を用いた。Ｍ．ｓａｔｉｖａのＣＯＭＴタンパク質配列による第１の検索は、８個のユニジーン、すなわち、＃１２３８０２（ｅ値＝ｅ−１６５）、＃１３１９３７（ｅ値＝１ｅ−７２）、＃１２０１７８（ｅ値＝２ｅ−６３）、＃１２８３７６（ｅ値＝１ｅ−５５）、＃１２０３８７（ｅ値＝１ｅ−３５）、＃１２８１６３（ｅ値＝２ｅ−２８）、＃１２７２０１（ｅ値＝５ｅ−２４）及び＃１２０３９０（ｅ値＝１ｅ−２３）を検出した。これらのユニジーンは、比較的高レベルの相同性を示した。ヒャクニチソウ（配列番号３３）からのＣＯＭＴによる第２の検索は、同じ８個のユニジーン、すなわち、＃１２３８０２（ｅ値＝ｅ−１５９）、＃１３１９３７（ｅ値＝７ｅ−６７）、＃１２０１７８（ｅ値＝２ｅ−６０）、＃１２８３７６（ｅ値＝２ｅ−５４）、＃１２０３８７（ｅ値＝１ｅ−３２）、＃１２８１６３（ｅ値＝１ｅ−２７）、＃１２０３９０（ｅ値＝２ｅ−２３）及び＃１２７２０１（ｅ値＝６ｅ−２２）を検出した。
【０１０６】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＯＭＴ１（完全なＯＲＦ）。ＣＯＭＴの完全なＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２３８０２（ｐｃｃｃｓ４６ｗ１７ｊ２２）の５’末端を表すｃＤＮＡを、４６週粒ライブラリー（開花後４６週）から単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｓ４６ｗ１７ｊ２２（配列番号１）の挿入断片は長さが１３１４ｂｐであり、１０５３ｂｐの完全なＯＲＦ配列をコードすることが発見され、それをＣｃＣＯＭＴ１（配列番号１）と呼んだ。推測されたタンパク質配列（配列番号１５）は、３５０個のアミノ酸、及び３８．２６ｋＤａの予測分子量を有する。ｐｃｃｃｓ４６ｗ１７ｊ２２（配列番号１）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号１５）の手動により最適化した整列は、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣＯＭＴタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２７）（配列番号２９）、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２６）（配列番号３０）、ムラサキウマゴヤシからのＭｓＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４６６２３（配列番号３１）、生化学的及び結晶学的情報が入手可能（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２））、タバコからのＮｔＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ９１５０６）（配列番号３２）、及びヒャクニチソウからのＺｅＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ４３２３９）（配列番号３３）を用いて実施した。
【０１０７】
整列は、ＣｃＣＯＭＴ１タンパク質（配列番号１５）が、上のタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ、ＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ、ＭｓＣＯＭＴ、ＮｔＣＯＭＴ及びＺｅＣＯＭＴ（配列番号２９、３０、３１、３２及び３３）とそれぞれ１００％及び９９．５％及び７５．８％及び５７．４％及び７５．３％の同一性を共有することを証明し（図２）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼとしてのｐｃｃｃｓ４６ｗ１７ｊ２２（配列番号１）の最初の注釈を裏付ける。さらに、ｐｃｃｃｓ４６ｗ１７ｊ２２（配列番号１）と２つのコーヒーＣＯＭＴ配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ及びＣｃＣＯＭＴｌｅａｆとの間のこの整列及び同一性は、それらが対立遺伝子配列であることを示唆する。
【０１０８】
整列は、ＣｃＣＯＭＴ１タンパク質（配列番号１５）が、Ｘ線結晶学でアルファルファカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼの構造がａ）ＳＡＭ認識で相互作用し、ｂ）基質認識に関与し、ｃ）触媒反応に関与すると判定したＺｕｂｉｅｔａ（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）によって特定されたアミノ酸残基のほとんど全て（１つを除く）を含むことも証明する。この整列データは、ｐｃｃｃｓ４６ｗ１７ｊ２２（配列番号１）が、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａカフェオイルＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの完全長ｃＤＮＡをコードすることも示す。
【０１０９】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＯＭＴ２ｐ（部分ＯＲＦ）。ＣＯＭＴの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１３１９３７（ｐｃｃｃｌ２１ｎ１８）の５’末端を表すｃＤＮＡを葉のライブラリーから単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｌ２１ｎ１８で得られた部分配列は、長さが８９３ｂｐであり、部分ＯＲＦ配列をコードする。このｃＤＮＡの最初の９６ｂｐ（５’末端）は相同タンパク質に合致せず、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにホモログを有しないので、この配列はイントロン配列を含むようである。ｐｃｃｃｌ２１ｎ１８の部分ＯＲＦは、長さが６７２ｂｐであり、ＣｃＣＯＭＴ２ｐ（配列番号２）と名付けた。推測された部分タンパク質配列（配列番号１６）は、２２３個のアミノ酸のポリペプチドであり、２４．６６ｋＤａの予測分子量を有する。
【０１１０】
ＣｃＣＯＭＴ１（３５０ａａ）（配列番号１５）の完全なＯＲＦとの配列整列に基づき、ＣｃＣＯＭＴ２ｐタンパク質（配列番号１６）は、Ｎ末端の１２７個のアミノ酸にわたって欠落していると仮定された。ｐｃｃｃｌ２１ｎ１８によってコードされる推測されたタンパク質配列の手動により最適化した整列は、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣＯＭＴタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２７）、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２６）、ムラサキウマゴヤシからのＭｓＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４６６２３）、タバコからのＮｔＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ９１５０６）、及びヒャクニチソウからのＺｅＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ４３２３９）（配列番号２９、３０、３１、３２及び３３）を用いて実施した。
【０１１１】
整列は、ＣｃＣＯＭＴ２ｐタンパク質（配列番号１６）が、上のタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ、ＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ、ＭｓＣＯＭＴ、ＮｔＣＯＭＴ及びＺｅＣＯＭＴ（配列番号２９、３０、３１、３２及び３３）とそれぞれ４１．７％、４２．６％、３８．２％、４２．９％及び３８．９％の同一性を共有することを証明し（図２）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼとしてのｐｃｃｃｌ２１ｎ１８（配列番号２）の最初の注釈を裏付ける。図２で示すように、アルファルファＣＯＭＴの結晶構造で記載する特徴付けされた部位の６つが、ｃｏｆｆｅａタンパク質配列ＣＯＭＴ２ｐで異なる。これらの差は以下の通りである。ａ）ＭｓＣＯＭＴ（配列番号３１）の、基質結合に関与すると判断された１２個の保存アミノ酸（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）の４つ、Ｐｈｅ１７２、Ｈｉｓ１８３、Ｉｌｅ３１６及びＩｌｅ３１９は、ＣｃＣＯＭＴ２ｐ（配列番号１５）で、それぞれＴｙｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ及びＬｅｕ残基によって置換され、ｂ）３つの触媒性残基（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）の１つ、Ｇｌｕ２９７は、ＣｃＣＯＭＴ２ｐタンパク質（配列番号２）でＡｓｐ残基によって置換され、ｃ）コファクターＳＡＭ認識に関係する１４個の残基（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）の２つ、Ｔｈｒ２１１及びＡｓｐ２３１は、ＣｃＣＯＭＴ２タンパク質（配列番号２）でそれぞれＬｅｕ及びＧｌｕ残基によって置換される。
【０１１２】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＯＭＴ３ｐ（部分ＯＲＦ）。ＣＯＭＴの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２０１７８（ｐｃｃｃｌ２８ｄ５）の５’末端を表すｃＤＮＡを葉のライブラリーから単離し、５’末端を部分的に配列決定した。ｐｃｃｃｌ２８ｄ５で得られた部分配列は、長さが４７５ｂｐであり、部分ＯＲＦ配列をコードする。ｐｃｃｃｌ２８ｄ５（配列番号３）の部分ＯＲＦは、長さが３０９ｂｐであり、ＣｃＣＯＭＴ３ｐ（配列番号３）と名付けた。推測された部分タンパク質配列（配列番号１７）は、１０３個のアミノ酸のポリペプチドであり、１０．９ｋＤａの予測分子量を有する。
【０１１３】
ＣｃＣＯＭＴ１（３５０ａａ）（配列番号１５）の完全なＯＲＦとの整列に基づき、ＣｃＣＯＭＴ３ｐタンパク質（配列番号１７）は、Ｃ末端の２４８個のアミノ酸にわたって欠落していると仮定された。ｐｃｃｃｌ２８ｄ５（配列番号３）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号１７）の手動により最適化した整列は、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣＯＭＴタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２７）、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２６）、ムラサキウマゴヤシからのＭｓＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４６６２３）、タバコからのＮｔＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ９１５０６）、及びヒャクニチソウからのＺｅＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ４３２３９）（配列番号２９、３０、３１、３２及び３３）を用いて実施した。
【０１１４】
整列は、ＣｃＣＯＭＴ３ｐタンパク質（配列番号１７）が、上のタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ、ＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ、ＭｓＣＯＭＴ、ＮｔＣＯＭＴ及びＺｅＣＯＭＴ（配列番号２９、３０、３１、３２及び３３）とそれぞれ４４．３％、４４．３％、４８．１％、４０．６％及び４１．５％の同一性を共有することを証明し（図２）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼとしてのｐｃｃｃｌ２８ｄ５（配列番号３）の最初の注釈を裏付ける。
【０１１５】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＯＭＴ４ｐ（部分ＯＲＦ）。ＣＯＭＴの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２８３７６（ｐｃｃｃｐ２０ｌ２２）の５’末端を表すｃＤＮＡを果皮のライブラリーから単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｐ２０ｌ２２で得られた部分配列は、長さが９８３ｂｐであり、部分ＯＲＦ配列をコードする。ｐｃｃｃｐ２０ｌ２２の部分ＯＲＦは、長さが７６２ｂｐであり、ＣｃＣＯＭＴ４ｐ（配列番号４）と名付けた。推測された部分タンパク質配列は２５３個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号１８）であり、２８．２０ｋＤａの予測分子量を有する。
【０１１６】
ＣｃＣＯＭＴ１（３５０ａａ）（配列番号１４）の完全なＯＲＦとの整列に基づき、ＣｃＣＯＭＴ４ｐタンパク質（配列番号１８）は、Ｎ末端の９７個のアミノ酸にわたって欠落していると仮定された。ｐｃｃｃｐ２０ｌ２２（配列番号４）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号１８）の手動により最適化した整列は、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣＯＭＴタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２７）、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａからのＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ０３７２６）、ムラサキウマゴヤシからのＭｓＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４６６２３）、タバコからのＮｔＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ９１５０６）、及びヒャクニチソウからのＺｅＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ４３２３９）（配列番号２９、３０、３１、３２及び３３）を用いて実施した。
【０１１７】
整列は、ＣｃＣＯＭＴ４ｐタンパク質（配列番号１８）が、上のタンパク質配列ＣｃＣＯＭＴｆｒｕｉｔ、ＣｃＣＯＭＴｌｅａｆ、ＭｓＣＯＭＴ、ＮｔＣＯＭＴ及びＺｅＣＯＭＴ（配列番号２９、３０、３１、３２及び３３）とそれぞれ４３．７％、４３．７％、４０．５％、４７．４％及び４２．４％の同一性を共有することを証明し（図２）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａカフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼとしてのｐｃｃｃｐ２０ｌ２２（配列番号４）の最初の注釈を裏付ける。図２で示すように、アルファルファＣＯＭＴの結晶構造で記載する特徴付けされた部位の７つが、Ｃｏｆｆｅａタンパク質配列ＣＯＭＴ４ｐ（配列番号１８）で異なる。これらの差は以下の通りである。ａ）ＭｓＣＯＭＴ（配列番号３１）の基質結合に関与すると判断された１２個の保存アミノ酸（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）の５つ、Ｌｅｕ１３６、Ｉｌｅ３１６、Ｉｌｅ３１９、Ｍｅｔ３２０及びＡｓｎ３２４は、ＣｃＣＯＭＴ４ｐ（配列番号１８）で、それぞれＰｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｖａｌ及びＴｙｒ残基によって置換され、ｂ）３つの触媒性残基（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）の１つ、Ｇｌｕ２９７は、ＣｃＣＯＭＴ２ｐタンパク質（配列番号１５）でＡｓｐ残基によって置換され、ｃ）コファクターＳＡＭ認識に関係する１４個の残基（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）の２つ、Ｔｈｒ２１１及びＡｓｐ２３１は、ＣｃＣＯＭＴ４ｐタンパク質（配列番号１８）でそれぞれＬｅｕ及びＧｌｕ残基によって置換される。
【０１１８】
実施例３
シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）をコードするＣｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ｃＤＮＡクローンの単離及び特性評価
コーヒーのシンナモイルＣｏＡレダクターゼをコードするｃＤＮＡを見つけるために、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いたＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ「ユニジーン」セット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として、生化学的に特徴付けされたＣＣＲタンパク質Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉ  ＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｔ１０７３５（配列番号３４）、Ｌａｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）、及び、コムギＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ０８１０７（配列番号３５）、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）のタンパク質配列を用いた。Ｅ．ｇｕｎｎｉｉ  ＣＣＲタンパク質配列による第１の検索により、比較的高レベルの相同性を示す１つのユニジーン＃１２９５８１（ｅ値＝ｅ−１２１）が発見された。ヒャクニチソウ由来のＣＯＭＴによる第２の検索により、同じユニジーン＃１２９５８１（ｅ値＝９ｅ−８３）が発見された。
【０１１９】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＣＲ１（完全なＯＲＦ）。Ｅ．ｇｕｎｎｉｉ及びＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のシンナモイルＣｏＡレダクターゼと非常に関係のあるクローンＡ５−１２３２（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｔ１０７３５及びＡＡＸ０８１０７）（配列番号３４及び３５）が、ＴｏｕｒｓコーヒーｃＤＮＡコレクションで発見された。ｐＡ５−１２３２（配列番号５）の挿入断片は長さが１２６５ｂｐであり、９８１ｂｐの完全なＯＲＦ配列をコードすることが発見され、それをＣｃＣＣＲ１（配列番号５）と名付けた。推測されたタンパク質配列（配列番号１９）は、３２６個のアミノ酸のタンパク質であり、３６．３１ｋＤａの予測分子量を有する。
【０１２０】
ｐＡ５−１２３２によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号１９）の手動により最適化された整列は、Ｅ．ｇｕｎｎｉｉからのＣＣＲタンパク質配列ＥｇＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｔ１０７３５）、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍからのＴａＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ０８１０７）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）からのＬｅＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＹ４１８８０）及びジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からのＳｔＣＣＲ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ７１７６１）（配列番号３４、３５、３６及び３７）を用いて実施した。この整列は、ＣｃＣＣＲ１タンパク質（配列番号１９）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＣＲ、ＴａＣＣＲ、ＬｅＣＣＲ及びＳｔＣＣＲ１（配列番号３４、３５、３６及び３７）とそれぞれ４４．４％、４１％、４８．７％及び４８．７％の同一性を共有することを示し（図３）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナモイルＣｏＡレダクターゼとしてのｐＡ５−１２３２の最初の注釈を裏付ける。
【０１２１】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＣＲ２（完全なＯＲＦ）。ＣＣＲの完全なＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２９５８１（ｐｃｃｃｓ４６ｗ２７ｋ２）の５’末端を表すｃＤＮＡを、４６週粒ライブラリー（開花後４６週）から単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｓ４６ｗ２７ｋ２（配列番号６）の挿入断片は長さが１３５４ｂｐであり、９９９ｂｐの完全なＯＲＦ配列をコードすることが発見され、それをＣｃＣＣＲ２（配列番号６）と名付けた。推測されたタンパク質配列（配列番号２０）は、３３２個のアミノ酸のタンパク質であり、３６．７７ｋＤａの予測分子量を有する。
【０１２２】
ｐｃｃｃｓ４６ｗ２７ｋ２（配列番号６）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号２０）の手動により最適化された整列は、Ｅ．ｇｕｎｎｉｉからのＣＣＲタンパク質配列ＥｇＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｔ１０７３５）、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍからのＴａＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ０８１０７）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）からのＬｅＣＣＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＹ４１８８０）及びジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からのＳｔＣＣＲ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ７１７６１）（配列番号３４、３５、３６及び３７）を用いて実施した。この整列は、ＣｃＣＣＲ２タンパク質（配列番号６）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＣＲ、ＴａＣＣＲ、ＬｅＣＣＲ及びＳｔＣＣＲ１（配列番号３４、３５、３６及び３７）とそれぞれ７７．８％、６１．４％、８７．７％、８８．６％の同一性を共有することを示し（図３）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナモイルＣｏＡレダクターゼとしてのｐｃｃｃｓ４６ｗ２７ｋ２の最初の注釈を裏付ける。
【０１２３】
実施例４
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）をコードするコーヒー属ｃＤＮＡクローンの単離及び特性評価
コーヒーのシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡを発見するために、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いるＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌ「ユニジーン」セット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として、生化学的に特徴付けされたＣＡＤタンパク質Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉ  ＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５（配列番号３８）、Ｇｏｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）のタンパク質配列を用いた。Ｅ．ｇｕｎｎｉｉのＣＡＤタンパク質配列による第１の検索は、１２個のユニジーン、すなわち、＃１１９６９６（ｅ値＝５ｅ−７４）、＃１２５０１９（ｅ値＝２ｅ−７１）、＃１１９４５７（ｅ値＝３ｅ−６９）、＃１２４０２６（ｅ値＝６ｅ−５３）、＃１２２１１０（ｅ値＝１ｅ−４７）、＃１２９５８１（ｅ値＝５ｅ−４２）、＃１２２８９７（ｅ値＝２ｅ−３６）、＃１３２２０６（ｅ値＝３ｅ−３２）、＃１２９２８５（ｅ値＝２ｅ−２８）、＃１２２８５１（ｅ値＝３ｅ−２７）、＃１２１９５８（ｅ値＝ｅ−２３）及び＃１２６６００（ｅ値＝８ｅ−２０）を検出した。これらのユニジーンは、比較的高レベルの相同性を示した。
ＮＣＢＩ  Ｎｏｎ＿Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｋに対するこれらの１２個のＤＮＡ配列のブラスト（ＮｅｓｔｌｅＢＬＡＳＴ）検索は、ＣＡＤタンパク質をコードしない５つのユニジーンを排除した。ユニジーン＃１２４０２６、＃１２９５８１及び＃１２１９５８による検索は、それらがシンナモイルＣｏＡレダクターゼを潜在的にコードすることを示した。ユニジーン＃１２２８９７による検索は、それがジヒドロフラボノール４レダクターゼを潜在的にコードすることを示した。ユニジーン＃１２２８５１による検索は、それがアントシアニンレダクターゼを潜在的にコードすることを示した。
【０１２４】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＡＤ１ａｐ（部分ＯＲＦ）。ＣＡＤの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１１９６９６（ｐｃｃｃｓ１８ｗ７ｌ２１）の５’末端を表すｃＤＮＡを、１８週粒ライブラリー（開花後１８週）から単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｓ１８ｗ７ｌ２１で得られた部分配列は、長さが８４３ｂｐであり、部分ＯＲＦ配列をコードする。位置２３７のヌクレオチドＣ及び位置２３８のＡは挿入配列のようであり、その理由は、この配列が相同タンパク質からの配列に合致しないからであり、それらは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に相同配列を有しないキメラタンパク質配列を生成する、ＯＲＦのシフトを発生させる。
【０１２５】
ｐｃｃｃｓ１８ｗ７ｌ２１の部分ＯＲＦ（ＣＡ挿入配列が削除されている）は、長さが５１６ｂｐであり、ＣｃＣＡＤ１ａｐ（配列番号７）と名付けた。推測された部分タンパク質配列（配列番号２１）は、１８．９４ｋＤａの予測分子量を有する１７１個のアミノ酸のポリペプチドを示す。
【０１２６】
ＥｇＣＡＤ（３２７ａａ）（配列番号３８）の完全なタンパク質配列との整列に基づき、ＣｃＣＡＤ１ａｐタンパク質（配列番号２１）は、Ｎ末端の１５６個のアミノ酸にわたって欠落していると仮定した。ｐｃｃｃｓ１８ｗ７ｌ２１（配列番号７）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号２１）の手動により最適化された整列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉからのＣＡＤタンパク質配列ＥｇＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５）、タバコからのＮｔＣＡＤ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５６）及びタバコからのＮｔＣＡＤ１−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５５）（配列番号３８、３９及び４０）で実施した。この整列は、ＣｃＣＡＤ１ａｐタンパク質（配列番号７）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＡＤ、ＮｔＣＡＤ１及びＮｔＣＡＤ１−１（配列番号３８、３９及び４０）とそれぞれ４２．３％及び４０．６％及び４０．１％の同一性を共有することを示し（図４）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしてのｐｃｃｃｓ１８ｗ７ｌ２１の最初の注釈を裏付ける。
【０１２７】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＡＤ１ｂ（完全なＯＲＦ）。ＣＡＤの完全ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２９２８５（ｐｃｃｃｌ２９ｅ１０）の５’末端を表すｃＤＮＡを葉のライブラリーから単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｌ２９ｅ１０で得られた配列は、長さが１４５７ｂｐであり、完全ＯＲＦ配列をコードする。ｐｃｃｃｌ２９ｅ１０とｐｃｃｃｓ１８ｗ７ｌ２１との間の核酸整列は、その２つが、それらの重複する領域で９８．４％の同一性（タンパク質レベルで９５．９％）を有することを証明し、２つのクローンは対立遺伝子であることを示す。ｐｃｃｃｌ２９ｅ１０の完全ＯＲＦは、長さが９７５ｂｐであり、ＣｃＣＡＤ１ｂ（配列番号８）と名付けた。推測されたタンパク質配列（配列番号２２）は、３２４個のアミノ酸のタンパク質であり、３５．５３ｋＤａの予測分子量を有する。
【０１２８】
ｐｃｃｃｌ２９ｅ１０によってコードされる推測されたタンパク質配列の手動により最適化された整列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉからのＣＡＤタンパク質配列ＥｇＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５）、タバコからのＮｔＣＡＤ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５６）及びタバコからのＮｔＣＡＤ１−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５５）（配列番号３８、３９及び４０）で実施した。この整列は、ＣｃＣＡＤ１ｂタンパク質（配列番号２２）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＡＤ、ＮｔＣＡＤ１及びＮｔＣＡＤ１−１（配列番号３８、３９及び４０）とそれぞれ７８．２％、７６．１％及び７７．１％の同一性を共有することを示し（図４）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしてのｐｃｃｃｌ２９ｅ１０の最初の注釈を裏付ける。
【０１２９】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＡＤ２（完全ＯＲＦ）。ＣＡＤの完全ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２５０１９（ｐｃｃｃｓ４６ｗ１２ｇ１６）の５’末端を表すｃＤＮＡを、４６週粒ライブラリー（開花後４６週）から単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｓ４６ｗ１２ｇ１６（配列番号９）で得られた配列は、長さが１５２１ｂｐであり、完全ＯＲＦ配列をコードする。ｐｃｃｃｓ４６ｗ１２ｇ１６の完全ＯＲＦは、長さが９８１ｂｐであり、ＣｃＣＡＤ２（配列番号９）と名付けた。推測されたタンパク質配列（配列番号２３）は、３６．０８ｋＤａの予測分子量を有する、３２６個のアミノ酸のタンパク質を示す。
【０１３０】
ｐｃｃｃｓ４６ｗ１２ｇ１６（配列番号９）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号９）の手動により最適化された整列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉからのＣＡＤタンパク質配列ＥｇＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５）、タバコからのＮｔＣＡＤ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５６）及びタバコからのＮｔＣＡＤ１−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５５）（配列番号３８、３９及び４０）で実施した。この整列は、ＣｃＣＡＤ２タンパク質（配列番号２３）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＡＤ、ＮｔＣＡＤ１及びＮｔＣＡＤ１−１（配列番号３８、３９及び４０）とそれぞれ６１．３％、６０．１％及び５６．５％の同一性を共有することを示し（図４）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしてのｐｃｃｃｓ４６ｗ１２ｇ１６の最初の注釈を裏付ける。
【０１３１】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＡＤ３（完全ＯＲＦ）。ＣＡＤの完全ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１１９４５７（ｐｃｃｃｐ１２ｉ２０）の５’末端を表すｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、部分的に配列決定した。許可されたＥＳＴ  Ｔｏｕｒデータバンクで実施した第２の検索は、すでに完全に配列決定されていたＴｏｕｒバンク内の同じクローンＡ５−６０２を示した。ｐＡ５−６０２で得られた配列は、長さが１３０９ｂｐであり、完全ＯＲＦ配列をコードする。ｐＡ５−６０２の完全ＯＲＦは、長さが９８１ｂｐであり、ＣｃＣＡＤ３（配列番号１０）と名付けた。推測されたタンパク質配列（配列番号２４）は、３５．７４ｋＤａの予測分子量を有する、３２６個のアミノ酸のタンパク質である。
【０１３２】
ｐＡ５−６０２によってコードされる推測されたタンパク質配列の手動により最適化された整列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉからのＣＡＤタンパク質（配列番号２４）配列ＥｇＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５）（配列番号３８）、タバコからのＮｔＣＡＤ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５６）（配列番号３９）及びタバコからのＮｔＣＡＤ１−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５５）（配列番号４０）で実施した。この整列は、ＣｃＣＡＤ３タンパク質（配列番号２４）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＡＤ、ＮｔＣＡＤ１及びＮｔＣＡＤ１−１（配列番号３８、３９及び４０）とそれぞれ６２．８％、６０．１％及び５７．１％の同一性を共有することを示し（図４）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしてのｐＡ５−６０２の最初の注釈を裏付ける。
【０１３３】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＡＤ４ｐ（部分ＯＲＦ）。ＣＡＤの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２２１１０（ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｊ２３）の５’末端を表すｃＤＮＡを、３０週粒ライブラリー（開花後３０週）から単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｊ２３で今日までに得られた配列は、長さが７１６ｂｐであり、部分ＯＲＦ配列をコードする。ＮＣＢＩ＿Ｎｏｎ＿Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｋに対するブラストは、配列の位置３０９で１２０ｂｐの欠失を明らかにした。欠失は、ＯＲＦのシフトを起こさせ、結果として、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中にホモログを有しないキメラタンパク質配列を生成する。
【０１３４】
ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｊ２３の部分ＯＲＦ（位置３０９にＮが挿入されている）は、長さが５５４ｂｐであり、ＣｃＣＡＤ４ｐ（配列番号１１）と名付けた。推測された部分タンパク質配列（配列番号２５）は、１８３個のアミノ酸のポリペプチドであり、２０．４６ｋＤａの予測分子量を有する。ＥｇＣＡＤ（３２７ａａ）（配列番号３８）の完全なタンパク質配列との整列に基づき、ＣｃＣＡＤ４ｐタンパク質（配列番号２５）は、Ｎ末端の１０８個のアミノ酸にわたって欠落していると仮定した。ｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｊ２３（配列番号１１）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号２５）の手動により最適化された整列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉからのＣＡＤタンパク質配列ＥｇＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５）（配列番号３８）、タバコからのＮｔＣＡＤ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５６）（配列番号３９）及びタバコからのＮｔＣＡＤ１−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５５）（配列番号４０）で実施した。この整列は、ＣｃＣＡＤ４ｐタンパク質（配列番号２５）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＡＤ、ＮｔＣＡＤ１及びＮｔＣＡＤ１−１（配列番号３８、３９及び４０）とそれぞれ３１．６％、３１．６％及び２９．８％の同一性を共有することを示し（図４）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしてのｐｃｃｃｓ３０ｗ３３ｊ２３の最初の注釈を裏付ける。
【０１３５】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＡＤ５ｐ（部分ＯＲＦ）。ＣＡＤの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１３２２０６（ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１１ｃ３）の５’末端を表すｃＤＮＡを、２２週全桜桃ライブラリー（開花後２２週）から単離し、５’末端を部分的に配列決定した。ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１１ｃ３配列で得られた配列は、長さが７４４ｂｐであり、部分ＯＲＦ配列をコードする。ＮＣＢＩ＿Ｎｏｎ＿Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｋに対するブラストは、部分配列の位置５３９から末端にかけてのイントロンを明らかにした。ＯＲＦ内のイントロンの存在は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中にホモログを有しないキメラタンパク質配列を生成させる。
【０１３６】
ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１１ｃ３の部分ＯＲＦ（イントロンが削除されている）は、長さが２５８ｂｐであり、ＣｃＣＡＤ５ｐ（配列番号１２）と名付けた。推測された部分タンパク質配列（配列番号２６）は、８６個のアミノ酸であり、９．２８ｋＤａの予測分子量を有する。ＥｇＣＡＤ（３２７ａａ）（配列番号３８）の完全なタンパク質配列との整列に基づき、ＣｃＣＡＤ５ｐタンパク質（配列番号２６）は、Ｃ末端の２４１個のアミノ酸にわたって欠落していると仮定した。ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１１ｃ３によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号２６）の手動により最適化された整列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉからのＣＡＤタンパク質配列ＥｇＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５）（配列番号３８）、タバコからのＮｔＣＡＤ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５６）（配列番号３９）及びタバコからのＮｔＣＡＤ１−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５５）（配列番号４０）で実施した。この整列は、ＣｃＣＡＤ５ｐタンパク質（配列番号２６）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＡＤ、ＮｔＣＡＤ１及びＮｔＣＡＤ１−１（配列番号３８、３９及び４０）とそれぞれ７８．７％、７９．８％及び７６．４％の同一性を共有することを示し（図４）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしてのｐｃｃｃｗｃ２２ｗ１１ｃ３の最初の注釈を裏付ける。
【０１３７】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＣＡＤ６ｐ（部分ＯＲＦ）。ＣＡＤの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２６６００（ｐｃｃｃｐ６ｊ１８）の５’末端を表すｃＤＮＡを果皮ライブラリーから単離し、５’末端を部分的に配列決定した。ｐｃｃｃｐ６ｊ１８配列で得られた配列は、長さが６９７ｂｐであり、部分ＯＲＦ配列をコードする。ｐｃｃｃｐ６ｊ１８の部分ＯＲＦは、長さが６６４ｂｐであり、ＣｃＣＡＤ６ｐ（配列番号１３）と名付けた。推測された部分タンパク質配列（配列番号２７）は、２２１個のアミノ酸のポリペプチドであり、２４．１４ｋＤａの予測分子量を有する。
【０１３８】
ＥｇＣＡＤ（３２７ａａ）（配列番号３８）の完全なタンパク質配列との整列に基づき、ＣｃＣＡＤ６ｐタンパク質（配列番号１３）は、Ｃ末端の１０６個のアミノ酸にわたって欠落していると仮定した。ｐｃｃｃｐ６ｊ１８（配列番号１３）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号２７）の手動により最適化された整列は、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉからのＣＡＤタンパク質配列ＥｇＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６１２７５）（配列番号３８）、タバコからのＮｔＣＡＤ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５６）（配列番号３９）及びタバコからのＮｔＣＡＤ１−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＸ１５９５５）（配列番号４０）で実施した。この整列は、ＣｃＣＡＤ６ｐタンパク質（配列番号２７）が、上のタンパク質配列ＥｇＣＡＤ、ＮｔＣＡＤ１及びＮｔＣＡＤ１−１（配列番号３８、３９及び４０）とそれぞれ６８．０％、６７．１％及び６２．７％の同一性を共有することを示し（図４）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしてのｐｃｃｃｐ６ｊ１８の最初の注釈を裏付ける。
【０１３９】
実施例５
フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）をコードするＣｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ｃＤＮＡクローンの単離及び特性評価
コーヒーのフェルラ酸５−ヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡを発見するために、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いるＮｅｓｔｌｅ／Ｃｏｒｎｅｌｌユニジーンセット５に対するＢＬＡＳＴ検索のためのクエリー配列として、生化学的に特徴付けされたＦ５Ｈタンパク質シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｆ５Ｈ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１１５８０（配列番号４１）、Ｒｕｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）のタンパク質配列を用いた。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ配列での第１の検索は、比較的高レベルの相同性を示す４つのユニジーン、＃１２０５９７（ｅ値＝２ｅ−９１）、＃１２５１２０（ｅ値＝１ｅ−９０）、＃１２４８０６（ｅ値＝２ｅ−６８）及び＃１２８８０６（ｅ値＝７ｅ−６５）を発見した。
【０１４０】
ＮＣＢＩ  Ｎｏｎ＿Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｎｋに対するこれらの４個のＤＮＡ配列のブラスト（ＮｅｓｔｌｅＢＬＡＳＴ）は、Ｆ５Ｈタンパク質をコードしない３つのユニジーンを排除した。ユニジーン＃１２０５９７及び＃１２５１２０による検索は、それらがシンナモイルＣｏＡレダクターゼを潜在的にコードすることを示した。ユニジーン＃１２２８９７による検索は、それがチトクロームＰ４５０型のタンパク質を潜在的にコードすることを示した。ユニジーン＃１２４８０６による検索は、それが、潜在的にチトクロームＰ４５０型タンパク質様のヒドロキシラーゼをコードすることを示したので、さらに詳しく調査した。
【０１４１】
Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＣｃＦ５Ｈｐ（部分ＯＲＦ）。Ｆ５Ｈの部分ＯＲＦを潜在的にコードするユニジーン＃１２８８０６（ｐｃｃｃｌ１８ｊ３）の５’末端を表すｃＤＮＡを葉のライブラリーから単離し、完全に配列決定した。ｐｃｃｃｌ１８ｊ３の挿入断片は、長さが９３４ｂｐであり、６５４ｂｐの部分ＯＲＦ配列をコード化することがわかり、それはＣｃＦ５Ｈｐ（配列番号１４）と名付けた。推測されたタンパク質配列（配列番号２８）は、２４．８３ｋＤａの予測分子量を有する、２１７個のアミノ酸のタンパク質を示す。
【０１４２】
ｐｃｃｃｌ１８ｊ３（配列番号１４）によってコードされる推測されたタンパク質配列（配列番号２８）の手動により最適化された整列は、シロイヌナズナからのＦ５Ｈタンパク質配列ＡｔＦ５Ｈ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１１５８０）（配列番号４１）、及びトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）からのＬｅＦ５Ｈ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ３７４３３）（配列番号４２）で実施した。この整列は、ＣｃＦ５Ｈｐタンパク質（配列番号２８）が、上のタンパク質配列ＡｔＦ５Ｈ及びＬｅＦ５Ｈ（配列番号４１及び４２）の重複領域とそれぞれ５３％及び５０％の同一性を共有することを示し（図５）、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａフェルラ酸−５−ヒドロキシラーゼとしてのｐｃｃｃｌ１８ｊ３の最初の注釈を裏付ける。
【０１４３】
実施例６
リグニン遺伝子の発現
特定のユニジーンと関連するＥＳＴの数は、各ライブラリー（各組織）での、関連遺伝子の発現レベルの推定値を与える。したがって、上で述べたリグニン遺伝子の異なるユニジーンの中のＥＳＴの数の調査は、これらの遺伝子の発現の広い概要を与えることができる。本明細書で述べる全てのユニジーン、及びこれらのユニジーンの各ライブラリーにおけるＥＳＴの数を表１に提供する。
【０１４４】
【表２】
2009511062.tif 000003
【０１４５】
参考文献:
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【０１４６】
本発明は、上で記載され、例示される実施形態に限定されず、添付の請求項の範囲内での変形形態及び修正が可能である。
【０１４７】
配列表:
【表３】
2009511062.tif 000004
【０１４８】
【表４】
2009511062.tif 000005
【０１４９】
【表５】
2009511062.tif 000006
【０１５０】
【表６】
2009511062.tif 000007
【０１５１】
【表７】
2009511062.tif 000008
【０１５２】
【表８】
2009511062.tif 000009
【０１５３】
【表９】
2009511062.tif 000010
【０１５４】
【表１０】
2009511062.tif 000011
【０１５５】
【表１１】
2009511062.tif 000012
【０１５６】
【表１２】
2009511062.tif 000013
【０１５７】
【表１３】
2009511062.tif 000014
【０１５８】
【表１４】
2009511062.tif 000015
【０１５９】
【表１５】
2009511062.tif 000016
【０１６０】
【表１６】
2009511062.tif 000017
【０１６１】
【表１７】
2009511062.tif 000018
【０１６２】
本発明は、上で記載され、例示される実施形態に限定されず、添付の請求項の範囲内での変形形態及び修正が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】モノリグノール生合成経路を示す図。植物リグニン経路のこの表示は、Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４に従う。４ＣＬ、４−ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡリガーゼ；ＣＡＤ；シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ；ＣＣＲ、シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ、ＣＯＭＴＩ、カフェー／５−ヒドロキシフェルラ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ；Ｆ５Ｈ、フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ；ＳＡＤ、シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ。
【図２】ＣｃＣＯＭＴ１、ＣｃＣＯＭＴ２ｐ、ＣｃＣＯＭＴ３ｐ及びＣｃＣＯＭＴ４ｐのタンパク質配列と植物ＣＯＭＴタンパク質配列との整列を示す図。ＣｃＣＯＭＴ遺伝子によってコードされる推定上のタンパク質とＮＣＢＩデータベースで利用できる他のＣＯＭＴタンパク質との整列は、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア内のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを用いてなされた（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）。灰色の印を付けたアミノ酸は、この位置で最も頻繁に認められるアミノ酸に一致する。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は括弧内に示す。ＣｃＣＯＭＴ  ＩＲＤ果実（Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ、ＡＡＮ０３７２７）（配列番号２９）、ＣｃＣＯＭＴ  ＩＲＤ葉（Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ、ＡＡＮ０３７２６）（配列番号３０）、ＭｓＣＯＭＴ（ムラサキウマゴヤシ、ＡＡＢ４６６２３）（配列番号３１）、ＮｔＣＯＭＴ（タバコ、ＡＡＬ９１５０６）（配列番号３２）、及び、ＺｅＣＯＭＴ（ヒャクニチソウ、Ｑ４３２３９）（配列番号３３）。緑色のボックスは、活性部位二量体を示し、黄色のボックスは、触媒残基を示し、ピンクのボックスは、ＳＡＭ結合の保存残基及びモチーフを示し、青色ボックスは、活性部位の基質の結合／位置決め残基を示す。全ての相互作用及び部位は、反応生成物と複合したアルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）ＣＯＭＴの結晶構造で特徴付けされた（Ｚｕｂｉｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【図３】ＣｃＣＣＲ１、ＣｃＣＣＲ２と植物ＣＣＲタンパク質配列とのタンパク質配列整列を示す図。ＣｃＣＣＲ遺伝子によってコードされる推定上のタンパク質とＮＣＢＩデータベースで利用できる他のＣＣＲタンパク質との整列は、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア内のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを用いてなされた。灰色の印を付けたアミノ酸は、この位置で最も頻繁に認められるアミノ酸に一致する。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は括弧内に示す。ＥｇＣＣＲ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉ、Ｔ１０７３５）（配列番号３４）、ＴａＣＣＲ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍｎａ、ＡＡＸ０８１０７）（配列番号３５）、ＬｅＣＣＲ（トマト、ＡＡＹ４１８８０）（配列番号３６）、ＳｔＣＣＲ１（ジャガイモ、ＡＡＮ７１７６１）（配列番号３７）。
【図４】ＣｃＣＡＤ１ａｐ、ＣｃＣＡＤ１ｂ、ＣｃＣＡＤ２、ＣｃＣＡＤ３、ＣｃＣＡＤ４ｐ、ＣｃＣＡＤ５ｐ及びＣｃＣＡＤ６ｐと植物ＣＡＤタンパク質配列とのタンパク質配列整列を示す図。ＣｃＣＡＤ遺伝子によってコードされる推定上のタンパク質とＮＣＢＩデータベースで利用できる他のＣＡＤタンパク質との整列は、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア内のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを用いてなされた。灰色の印を付けたアミノ酸は、この位置で最も頻繁に認められるアミノ酸に一致する。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は括弧内に示す。ＥｇＣＡＤ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉ、ＣＡＡ６１２７５）（配列番号３８）、ＮｔＣＡＤ１（タバコ、ＡＡＸ１５９５６）（配列番号３９）、ＮｔＣＡＤ１−１（タバコ、ＡＡＸ１５９５５）（配列番号４０）。
【図５】ＣｃＦ５Ｈｐと植物ＦＳＨタンパク質配列とのタンパク質配列整列を示す図。ＣｃＦ５Ｈｐ遺伝子によってコードされる推定上のタンパク質とＮＣＢＩデータベースで利用できる他のＦ５Ｈタンパク質との整列は、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア内のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを用いてなされた。灰色の印を付けたアミノ酸は、この位置で最も頻繁に認められるアミノ酸に一致する。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は括弧内に示す。ＡｔＦ５Ｈ（シロイヌナズナ、ＡＡＤ１１５８０）（配列番号４２）、ＬｅＦ５Ｈ（トマト、ＡＡＤ３７４３３）（配列番号４２）。
【図１】
2009511062.tif 000019
【図２−１】
2009511062.tif 000020
【図２−２】
2009511062.tif 000021
【図２−３】
2009511062.tif 000022
【図３−１】
2009511062.tif 000023
【図３−２】
2009511062.tif 000024
【図３−３】
2009511062.tif 000025
【図４−１】
2009511062.tif 000026
【図４−２】
2009511062.tif 000027
【図４−３】
2009511062.tif 000028
【図５−１】
2009511062.tif 000029
【図５−２】
2009511062.tif 000030
【配列表】
2009511062000001.app
【国際調査報告】
2009511062.tif 000031
2009511062.tif 000032
2009511062.tif 000033
2009511062.tif 000034
2009511062.tif 000035
2009511062.tif 000036
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2009511062.tif 000038
2009511062.tif 000039