(57)【要約】  高等植物中でタンパク質のＮ−グリコシル化パターンを変化させる方法を提供する。その方法は、植物中でα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）及びβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の発現の阻害をもたらす組換え構築物を植物中に導入するステップを含む。これらの構築物を使用してこれらの酵素の両方、及びそのアイソフォームの発現を阻害又は抑制すると、有利には、植物の成長及び発達に影響せずに「ヒト化」Ｎ−グリコシル化パターンを有する内因性の異種タンパク質が産生する。このタンパク質Ｎ−グリコシル化パターンを有する、安定に形質転換された高等植物を提供する。実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、Ｇ０グライコフォームについて実質的に同種である、モノクローナル抗体組成物を含めた糖タンパク質組成物も提供する。
2009523432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変化したＮ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現するように安定に形質転換されているトランスジェニック高等植物であって、前記変化したＮ−グリコシル化パターンが、α１，３−フコース及びβ１，２−キシロース残基と、前記糖タンパク質のＮ−グリカンとの結合の低下を特徴とするトランスジェニック高等植物。
【請求項２】
Ｎ−グリカンにフコース及びキシロース残基がない、請求項１に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項３】
変化したＮ−グリコシル化パターンを有する哺乳動物糖タンパク質を産生する能力を有する、請求項１又は２に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項４】
糖タンパク質が、所望のモノクローナル抗体である、請求項３に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項５】
モノクローナル抗体の変化したＮ−グリコシル化パターンによって、前記モノクローナル抗体が、ＦｃγＲIIIに対する結合親和性の増大、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増大、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性の低下、又はその任意の組合せを示す、請求項４に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項６】
変化したＮ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現するウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒であって、前記変化したＮ−グリコシル化パターンが、α１，３−フコース残基、β１，２−キシロース残基、又はα１，３−フコース残基とβ１，２−キシロース残基の両方と、前記糖タンパク質のＮ−グリカンとの結合の低下を特徴とするウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項７】
Ｎ−グリカンにフコース残基がなく、キシロース残基がなく、又は前記フコース及びキシロース残基がない、請求項６に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項８】
所望の哺乳動物糖タンパク質を産生する能力を有する、請求項６又は請求項７に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項９】
糖タンパク質が、所望のモノクローナル抗体である、請求項８に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項１０】
モノクローナル抗体の変化したＮ−グリコシル化パターンによって、前記モノクローナル抗体が、ＦｃγＲIIIに対する結合親和性の増大、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増大、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性の低下、又はその任意の組合せを示す、請求項９に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれかに記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒により産生された糖タンパク質を含む組成物。
【請求項１２】
Ｎ−グリカンにフコース及びキシロース残基がない、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
糖タンパク質が、Ｇ０グリカン種と対応する単一の主たるピークの存在を特徴とするＮ−グリコシル化プロファイルを有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
糖タンパク質が、所望のモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのＮ−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
（ａ）前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で少なくとも１つのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）の発現又は機能を阻害するステップであって、前記ＦｕｃＴが配列番号３で示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、
（ｂ）前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
ＦｕｃＴが配列番号３で示す配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＦｕｃＴが配列番号３で示すアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＦｕｃＴの発現又は機能が、
（ａ）ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記ＦｕｃＴの発現又は機能を阻害する方法、
（ｂ）ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記ＦｕｃＴをコードする方法、及び
（ｃ）ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記ＦｕｃＴをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）の発現又は機能を阻害することができる第１ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記第１ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
（ｂ）配列番号２で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
（ｃ）前記項目（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（ｄ）前記項目（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも７５個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１ヌクレオチド配列が、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）配列番号１又は配列番号２の約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含むＦｕｃＴ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記第１ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記ＦｕｃＴ順方向断片との十分な相補性を有するＦｕｃＴ逆方向断片と
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＦｕｃＴ逆方向断片が、ＦｕｃＴ順方向断片の相補体、又は前記ＦｕｃＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＦｕｃＴ順方向断片が配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２５５〜９８５を含み、スペーサー配列がイントロンを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で少なくとも１つのβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の発現又は機能を阻害するステップをさらに含み、前記ＸｙｌｔＴが配列番号６又は配列番号２１で示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ＸｙｌＴが配列番号６又は配列番号２１で示す配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＸｙｌＴが配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＸｙｌＴの発現又は機能が、
（ａ）ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害する方法、
（ｂ）ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記ＸｙｌＴをコードする方法、及び
（ｃ）ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記ＸｙｌＴをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号４、配列番号１９で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
（ｂ）配列番号５、配列番号２０で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
（ｃ）前記項目（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（ｄ）前記項目（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも７５個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２０の約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含むＸｙｌＴ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記ＸｙｌＴ順方向断片との十分な相補性を有するＸｙｌＴ逆方向断片と
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＸｙｌＴ逆方向断片が、ＸｙｌＴ順方向断片の相補体、又は前記ＸｙｌＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）ＸｙｌＴ順方向断片が配列番号４のヌクレオチド（ｎｔ）３１８〜１０５２を含み、スペーサー配列がイントロンである、又は
（ｂ）ＸｙｌＴ順方向断片が配列番号１９のｎｔ１〜７３４を含み、前記スペーサー配列がイントロンである、
請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくはノジュール中でＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物を前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入し、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
融合ポリヌクレオチドが、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）（ｉ）ＦｕｃＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む第１断片と、
（ii）ＸｙｌＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む第２断片と
を順不同で含むキメラ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１断片が、配列番号１の約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含み、第２断片が、配列番号４又は配列番号１９の約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）キメラ順方向断片が配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２５４〜８５５及び配列番号４のｎｔ３１８〜９４３を含み、スペーサー配列がイントロンである、又は
（ｂ）キメラ順方向断片が配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２５４〜８５５及び配列番号１９のｎｔ１〜６２６を含み、前記スペーサー配列がイントロンである、
請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３８】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのＮ−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
（ａ）前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で少なくとも１つのβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の発現又は機能を阻害するステップであって、前記ＸｙｌｔＴが配列番号６又は配列番号２１で示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、
（ｂ）前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
ＸｙｌＴが配列番号６又は配列番号２１で示す配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＸｙｌＴが配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＸｙｌＴの発現又は機能が、
（ａ）ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害する方法、
（ｂ）ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記ＸｙｌＴをコードする方法、及び
（ｃ）ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記ＸｙｌＴをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号４、配列番号１９で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
（ｂ）配列番号５、配列番号２０で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
（ｃ）前記項目（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（ｄ）前記項目（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも７５個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２１の約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含むＸｙｌＴ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００ヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記ＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記ＸｙｌＴ順方向断片との十分な相補性を有するＸｙｌＴ逆方向断片と
を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＸｙｌＴ逆方向断片が、ＸｙｌＴ順方向断片の相補体、又は前記ＸｙｌＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）ＸｙｌＴ順方向断片が配列番号４のヌクレオチド（ｎｔ）３１８〜１０５２を含み、スペーサー配列がイントロンである、又は
（ｂ）ＸｙｌＴ順方向断片が配列番号１９のｎｔ１〜７３４を含み、前記スペーサー配列がイントロンである、
請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
異種ポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項１５〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
植物中でα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）の発現又は機能を阻害することができる第１ヌクレオチド配列と、植物中でβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の発現又は機能を阻害することができる第２ヌクレオチド配列とを含むヌクレオチド構築物であって、前記第１ヌクレオチド配列及び前記第２ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する少なくとも１つのプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項５１】
第１ヌクレオチド配列が第１プロモーターと作動的に連結し、第２ヌクレオチド配列が第２プロモーターと作動的に連結している、請求項５０に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５２】
ＦｕｃＴが、
（ａ）配列番号３で示すアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号３で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがＦｕｃＴ活性を有する、請求項５１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５３】
第１ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
（ｂ）配列番号２で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
（ｃ）前記項目（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（ｄ）前記項目（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも７５個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項５２に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５４】
第１ヌクレオチド配列が、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）配列番号１又は配列番号２の約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含むＦｕｃＴ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記第１ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記ＦｕｃＴ順方向断片との十分な相補性を有するＦｕｃＴ逆方向断片と
を含む、請求項５２に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５５】
ＦｕｃＴ逆方向断片が、ＦｕｃＴ順方向断片の相補体、又は前記ＦｕｃＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５４に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５６】
ＦｕｃＴ順方向断片が配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２５５〜９８５を含む、請求項５４又は５５に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５７】
第１ヌクレオチド配列のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項５４〜５６のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５８】
ＸｙｌＴが、
（ａ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがＸｙｌＴ活性を有する、請求項５２〜５７のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項５９】
第２ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号４若しくは配列番号１９で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
（ｂ）配列番号５若しくは配列番号２０で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
（ｃ）前記項目（ａ）又は（ｂ）の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
（ｄ）前記項目（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも７５個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項５８に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６０】
第２ヌクレオチド配列が、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２０の約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含むＸｙｌＴ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記第２ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記ＸｙｌＴ順方向断片との十分な相補性を有するＸｙｌＴ逆方向断片と
を含む、請求項５８に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６１】
ＸｙｌＴ逆方向断片が、ＸｙｌＴ順方向断片の相補体、又は前記ＸｙｌＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６０に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６２】
ＸｙｌＴ順方向断片が配列番号４のヌクレオチド（ｎｔ）３１８〜１０５２又は配列番号１９のｎｔ１〜７３４を含む、請求項６０又は６１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６３】
第２ヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項６０〜６２のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６４】
植物中でα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）及びβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項６５】
ＦｕｃＴが、
（ａ）配列番号３で示すアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号３で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがＦｕｃＴ活性を有する、請求項６４に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６６】
ＸｙｌＴが、
（ａ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがＸｙｌＴ活性を有する、請求項６４又は６５に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６７】
融合ポリヌクレオチドが、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）（ｉ）ＦｕｃＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む第１断片と、
（ii）ＸｙｌＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む第２断片と
を含むキメラ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含む、請求項６４〜６６のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６８】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６７に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項６９】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項６７又は６８に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７０】
第１断片が、配列番号１の約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含み、第２断片が、配列番号４又は配列番号１９の約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項６７に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７１】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７０に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７２】
キメラ順方向断片が、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２５４〜８５５及び配列番号４のｎｔ３１８〜９４３、又は
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２５４〜８５５及び配列番号１９のｎｔ１〜６２６
を含む、請求項７０又は７１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７３】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項７０〜７２のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７４】
融合ポリヌクレオチドが、５’から３’の方向で作動的に連結した
（ａ）（ｉ）ＸｙｌＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む第１断片と、
（ii）ＦｕｃＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む第２断片と
を含むキメラ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含む、請求項６４〜６６のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７５】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７４に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７６】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項７４又は７５に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７７】
第１断片が、配列番号４又は配列番号１９の約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含み、第２断片が、配列番号１の約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約６５０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項７４に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７８】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項７７に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項７９】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項７７又は請求項７８に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８０】
植物中でα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）の発現又は機能を阻害することができる第１ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第１ポリヌクレオチド配列が、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）前記ＦｕｃＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含むＦｕｃＴ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記第１ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記ＦｕｃＴ順方向断片との十分な相補性を有するＦｕｃＴ逆方向断片と
を含み、
前記第１ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項８１】
ＦｕｃＴ逆方向断片が、ＦｕｃＴ順方向断片の相補体、又は前記ＦｕｃＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８０に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８２】
第１ポリヌクレオチドのスペーサー配列がイントロンを含む、請求項８０又は８１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８３】
ＦｕｃＴが、
（ａ）配列番号３で示すアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号３で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがＦｕｃＴ活性を有する、請求項８０に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８４】
ＦｕｃＴ順方向断片が、配列番号１又は配列番号２の約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含む、請求項８３に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８５】
ＦｕｃＴ逆方向断片が、ＦｕｃＴ順方向断片の相補体、又は前記ＦｕｃＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８４に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８６】
ＦｕｃＴ順方向断片が配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）２５５〜９８５を含む、請求項８４又は８５に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８７】
第１ポリヌクレオチド配列のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項８４〜８６のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項８８】
植物中でβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の発現又は機能を阻害することができる第１ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第１ポリヌクレオチド配列が、５’から３’の方向に作動的に連結した
（ａ）前記ＸｙｌＴをコードするポリヌクレオチドの約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含むＸｙｌＴ順方向断片と、
（ｂ）約２００〜約７００ヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
（ｃ）ヘアピンＲＮＡ構造を形成することができるＲＮＡ分子として前記第１ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記ＸｙｌＴ順方向断片との十分な相補性を有するＸｙｌＴ逆方向断片と
を含み、
前記第１ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項８９】
ＸｙｌＴ逆方向断片が、ＸｙｌＴ順方向断片の相補体、又は前記ＸｙｌＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８８に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９０】
第１ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項８８又は８９に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９１】
ＸｙｌＴが、
（ａ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列、及び
（ｂ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがＸｙｌＴ活性を有する、請求項８８に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９２】
ＸｙｌＴ順方向断片が、配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２０の約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する約５００〜約８００個の連続したヌクレオチドを含む、請求項９１に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９３】
ＸｙｌＴ逆方向断片が、ＸｙｌＴ順方向断片の相補体、又は前記ＸｙｌＴ順方向断片の相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９２に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９４】
ＸｙｌＴ順方向断片が配列番号４のヌクレオチドｎｔ３１８〜１０５２又は配列番号１９のｎｔ１〜７３４を含む、請求項９２又は９３に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９５】
第１ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項９２〜９４のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９６】
所望のポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含み、前記所望のポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項５０〜９５のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９７】
所望のポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項９６に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９８】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項９７に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項９９】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項９７に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１００】
請求項５０〜９９のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項１０１】
そのゲノム中に安定に組み込まれた請求項５０〜９９のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含む植物又は植物細胞。
【請求項１０２】
植物が単子葉類であるか、又は植物細胞が単子葉類に由来する、請求項１０１に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１０３】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項１０２に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１０４】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項１０３に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１０５】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項１０４に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１０６】
植物が双子葉類であるか、又は植物細胞が双子葉類に由来する、請求項１０１に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１０７】
高等植物を安定に形質転換して、変化したＮ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項５０〜９５のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項１０８】
高等植物が、少なくとも１つの所望の異種ポリペプチドを発現する植物宿主である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
所望の異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチド又は生物学的に活性のあるその変異体である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
高等植物を安定に形質転換して、変化したＮ−グリコシル化パターンを有する、所望の異種ポリペプチドを発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項９６〜９９のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項１１３】
Ｎ−グリコシル化パターンが、α１，３−フコース残基と、異種ポリペプチドと結合したＮ−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
Ｎ−グリコシル化パターンが、β１，２−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したＮ−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
Ｎ−グリコシル化パターンが、α１，３−フコース残基及びβ１，２−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したＮ−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
高等植物中で異種哺乳動物糖タンパク質を産生する方法であって、前記異種哺乳動物糖タンパク質では、前記高等植物中で産生されたときに、α１，３−フコース及びβ１，２−キシロース残基と、前記糖タンパク質のＮ−グリカンとの結合が低下し、
（ａ）前記糖タンパク質として翻訳後プロセシングされる哺乳動物ポリペプチドをコードする配列、及び請求項５０〜７９のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むポリヌクレオチドとを含む発現カセットを前記植物中に導入するステップと、
（ｂ）前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１１７】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
高等植物が単子葉類である、請求項１０７〜１１８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２０】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
高等植物が双子葉類である、請求項１０７〜１１８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２４】
高等植物中で産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法であって、前記植物中に請求項５０〜９９のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップと、前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップとを含む方法。
【請求項１２５】
糖タンパク質が内因性糖タンパク質である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
糖タンパク質が異種糖タンパク質である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
異種糖タンパク質が哺乳動物糖タンパク質である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
哺乳動物糖タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
哺乳動物糖タンパク質が、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
高等植物が単子葉類である、請求項１２４〜１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３１】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
Ｎ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の生産をスケールアップしても維持され、生産スケールが少なくとも６，５００倍に増大する、請求項１３１〜１３３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３５】
Ｎ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を行っても維持される、請求項１３１〜１３４のいずれかに記載の方法。
【請求項１３６】
Ｎ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を少なくとも８カ月行っても維持される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
高等植物が双子葉類である、請求項１２４〜１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３８】
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１又は配列番号２で示すヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２０で示すヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号３、配列番号６、又は配列番号２１で示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１又は配列番号２で示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２０で示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列、又はその相補体、
（ｇ）配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２０の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列及びその相補体、
（ｈ）配列番号３で示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがＦｕｃＴ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉ）配列番号６又は配列番号２１で示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがＸｙｌＴ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、並びに
（ｊ）前記項目（ａ）〜（ｉ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の相補体
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３９】
請求項１３８に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項１４０】
ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項１３９に記載の発現カセット。
【請求項１４１】
請求項１４０に記載の発現カセットを含む植物又は植物細胞。
【請求項１４２】
植物が単子葉類であるか、又は植物細胞が単子葉類に由来する、請求項１４１に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１４３】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項１４２に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１４４】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項１４３に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１４５】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項１４４に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１４６】
植物が双子葉類であるか、又は植物細胞が双子葉類に由来する、請求項１４１に記載の植物又は植物細胞。
【請求項１４７】
ポリヌクレオチドが植物又は植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれている、請求項１４１〜１４６のいずれかに記載の植物又は植物細胞。
【請求項１４８】
単離されたポリペプチドであって、
（ａ）配列番号３で示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）活性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがＦｕｃＴ活性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６又は配列番号２１で示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）活性を有するアミノ酸配列、及び
（ｆ）配列番号６又は配列番号２１の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがＸｙｌＴ活性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１４９】
請求項１１６〜１３７のいずれかに記載の方法に従って産生された糖タンパク質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の分子生物学の分野に、より具体的には植物中での組換え哺乳動物タンパク質産生の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの植物種が、薬学的な関心のある哺乳動物タンパク質の「分子農業」における使用の標的となっている。これらの植物発現系は、生物学的に活性のある哺乳動物タンパク質の低コスト生産をもたらし、迅速かつ経済的なスケールアップを容易に行うことができる（Ma et al. (2003) Nat. Rev. Genet. 4:794-805；Raskin et al. (2002) Trends Biotechnol. 20:522-531）。多数の哺乳動物及び植物タンパク質は、適切な折り畳み、構築、及び機能のために翻訳後プロセシングを必要とする。これらの修飾のうち、グリコシル化パターンの違いは、薬学的に使用するための高品質組換え哺乳動物タンパク質を産生する植物発現系の実現可能性に対する課題をもたらす。
【０００３】
ペプチドが小胞体（ＥＲ，endoplasmic reticulum）及びゴルジ細胞内区画を介して移動するとき、糖残基鎖又はグリカンが結合し、最終的に糖タンパク質が形成される。糖鎖とペプチドの結合は、４つのタンパク質アミノ酸：アスパラギン、セリン、スレオニン及びヒドロキシリシンのうち１つのみとの化学結合の形成によって起こる。この結合パターンに基づいて、糖タンパク質における２つの基本的な型の糖残基鎖：ペプチド上のアスパラギン残基と結合するＮ−グリコシド結合糖鎖（Ｎ−結合グリカン又はＮ−グリカンとも称される）；並びにペプチド上のセリン、スレオニン及びヒドロキシリシン残基と結合するＯ−グリコシド結合糖鎖が認められている。
【０００４】
Ｎ−グリコシド結合糖鎖、又はＮ−グリカンは、様々な構造を有する（例えば、Takahashi, ed. (1989) Biochemical Experimentation Method 23 -Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Gakujutsu Shuppan Center)を参照）が、共通するオリゴマンノシドコアを共有する（図２９Ａを参照）。Ｎ−グリカンの形成に至るグリコシル化経路における最初のステップは植物及び動物で保存されている。しかし、複合Ｎ−グリカン形成に関与する最後のステップは異なる（Lerouge et al. (1998) Plant Mo. Biol. 38:31-48；Steinkellner and Strasser (2003) Ann. Plant Rev.9:181-192）。植物は、哺乳動物で観察されるものと類似した、２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ，N-acetylglucosamine）残基を有するコアを有する複合Ｎ−グリカンの付いた糖タンパク質を産生する。しかし、植物糖タンパク質では、このコアは、ヒトでは生じないβ１，２−結合キシロース残基（コアキシロース）、Lewisaエピトープ、及び哺乳動物などでのα１，６−結合コアフコースの代わりとなるα１，３−結合フコース（コアα［１，３］−フコース）に取って代わる（例えば、総説についてはLerouge et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:31-48を参照）（図２９Ｂも参照）。報告によると、α（１，３）−フコースもβ（１，２）−キシロース残基も、少なくとも部分的には、哺乳動物における植物糖タンパク質の免疫原性に関与する（例えば、Ree et al. (2000) J. Biol. Chem. 15:11451-11458；Bardor et al. (2003) Glycobiol. 13:427-434；Garcia-Casado et al. (1996) Glycobiol. 6:471-477を参照）。したがって、植物中で組換えにより産生された哺乳動物糖タンパク質に由来するこれらの潜在的にアレルゲン性のある糖残基の除去によって、ヒトを治療するための医薬品としてこれらのタンパク質を使用することについての懸念が克服されるはずである。
【０００５】
組換えにより産生されたいくつかの糖タンパク質が現在治療薬として役割を果たし又は臨床試験中である。例として、インターフェロン（ＩＦＮ，interferon）、エリスロポエチン（ＥＰＯ，erythropoietin）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ，tissue plasminogen activator）、アンチトロンビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，granulocyte-macrophage colony stimulating factor）、及び治療用モノクローナル抗体（ｍＡＢ，monoclonal antibody）がある。糖タンパク質のＮ−グリカン構造のオリゴ糖構成成分は、その治療効果、並びにその物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、薬物動態、免疫系との相互作用、及び比生物活性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、Jenkins et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:975-981を参照されたい。
【非特許文献１】Ma et al. (2003) Nat. Rev. Genet. 4:794-805
【非特許文献２】Raskin et al. (2002) Trends Biotechnol. 20:522-531
【非特許文献３】Takahashi, ed. (1989) Biochemical Experimentation Method 23 -Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Gakujutsu Shuppan Center)
【非特許文献４】Lerouge et al. (1998) Plant Mo.Biol. 38:31-48
【非特許文献５】Steinkellner and Strasser (2003) Ann. Plant Rev.9:181-192
【非特許文献６】Ree et al. (2000) J. Biol. Chem. 15:11451-11458
【非特許文献７】Bardor et al. (2003) Glycobiol. 13:427-434
【非特許文献８】Garcia-Casado et al. (1996) Glycobiol. 6:471-477
【非特許文献９】Jenkins et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:975-981
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
植物発現系でグリコシル化パターンを変化させ、特に真核生物のコア構造の植物特異的グリコシル化を阻害し、有利にはグリコシル化パターンがヒト化された組換え哺乳動物タンパク質を産生する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
高等植物中でタンパク質のＮ−グリコシル化パターンを変化させる方法を提供する。その方法は、植物中でα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ，α1,3-fucosyltransferase）及びβ１２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ，β1,2-xylosyltransferase）の発現の阻害をもたらす少なくとも１つの組換えヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換するステップを含む。これらの構築物を使用してこれらの酵素の一方又は両方、及びそのアイソフォームの発現を阻害又は抑制すると、有利には、植物の成長及び発達に影響せずに「ヒト化」Ｎ−グリコシル化パターンを有する内因性の異種タンパク質が発現する。このタンパク質Ｎ−グリコシル化パターンを有する、安定に形質転換された高等植物を提供する。いくつかの実施形態では、植物は、エンドウマメ、アルファルファやタバコなどの双子葉類のメンバーである作物である；他の実施形態では、植物は、イネやトウモロコシなどの単子葉類である作物である。さらに他の実施形態では、植物はウキクサ科のメンバー、例えばレムナ（Lemna）種である。
【０００８】
本発明のトランスジェニック植物は、哺乳動物宿主のものとより類似したＮ−グリコシル化パターンを有する組換え哺乳動物タンパク質を産生する能力を有する。したがって、いくつかの実施形態では、組換えにより産生された哺乳動物タンパク質は、植物特異的α（１，３）−フコース及びβ（１，２）−キシロース残基の結合が低下した複合Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質である。他の実施形態では、組換えにより産生されたこれらの糖タンパク質は、これらの植物特異的な残基がない複合Ｎ−グリカンを含む。さらに他の実施形態では、組換えにより産生されたこれらの糖タンパク質は、糖タンパク質内で（複数の）アスパラギングリコシル化部位と結合した単一のグリカン種としてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、組換えにより産生された糖タンパク質はモノクローナル抗体である。このように、本発明は、増大したエフェクター機能を有するモノクローナル抗体を含めて、対象とする標的タンパク質と特異的に結合するグリカン最適化モノクローナル抗体を産生することができるトランスジェニック植物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、組換えにより産生されたグリカン最適化モノクローナル抗体は、α（１，３）−結合フコース残基の結合が低下し、それによってこれらの抗体のＡＤＣＣ活性が増大した複合Ｎ−グリカンを含む。他の実施形態では、組換えにより産生されたモノクローナル抗体は、これらの植物特異的フコース残基がない複合Ｎ−結合グリカンを含む。このように、本発明は、完全な抗体の少なくとも９０％以上が単一のグライコフォーム、より具体的にはＧ０グライコフォームで表されるモノクローナル抗体組成物の産生をもたらす。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、組換えにより産生されたモノクローナル抗体は増大したエフェクター機能を有し、ＡＤＣＣ活性が増大しかつ／又はＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性の比が増大している。いくつかのこれらの実施形態では、組換えにより産生されたモノクローナル抗体は低下したＣＤＣ活性を有し、それにより、有利には、投与後のＣＤＣ活性化と関係する有害な副作用の潜在性を低減することができる。有利には、その増大したエフェクター機能が、それを低濃度で頻度を少なくして投与することができ、それによって抗体毒性及び／又は抗体寛容の発生についての潜在性が低下することを意味するので、これらのグリカン最適化モノクローナル抗体を使用して現在の投与経路及び現在の治療法を変化させることができる。さらに、その向上したエフェクター機能により、他の組換え宿主系で産生された対応するモノクローナル抗体での治療に以前は耐性又は不応性であった臨床徴候を治療する新たな手法が得られる。
【００１０】
本発明の方法を実施するための組成物を提供する。組成物は、コウキクサ（Lemna minor）α１，３−フコシルトランスフェラーゼ及びβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ、並びにその変異体及び断片をコードする新規の単離ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む。これら２つのタンパク質の発現、又はその変異体の発現を標的とする組換えヌクレオチド構築物も提供し、これらの組換え構築物を含む植物細胞、植物組織、植物、及び種子も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に、本発明の全部ではなく一部の実施形態を示す添付図面を参照しながら、本発明を下記でより詳しく説明する。実際、これらの発明は多数の異なる形態で具体化することができ、本明細書で示す実施形態に限定されると解釈すべきでない；むしろ、これらの実施形態は、この開示が適用可能な法上の要求を満たすように提供される。同じ数字は、全体を通じて同じ構成要素を指す。
【００１２】
本明細書で示す本発明の多数の改変及び他の実施形態が、上記の記載及び関係する図面で提示される教示の利益を有する、これらの発明が属する分野の技術者には思い浮かぶであろう。したがって、本発明が、開示された特定の実施形態に限定されず、改変及び他の実施形態が、添付した特許請求の範囲に含まれることが意図されることを理解されたい。特定の用語を本明細書で使用するが、それは、一般的かつ記述的な意味でのみ使用され、限定の目的では使用されない。
【００１３】
本発明は、植物、特に対象とする組換えタンパク質の発現系として働く植物中で産生された同種及び異種ポリペプチドのＮ−グリコシル化パターンを変化させるための組成物及び方法を提供する。その方法は、植物中でα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）及びβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の発現を阻害することができる１つ又は複数の配列を含むヌクレオチド構築物の使用を含む。本発明の方法を実施する際に使用する組成物、及び向上したエフェクター機能を有するグリカン最適化モノクローナル抗体を含めた実質的に同種の糖タンパク質プロファイルを有する糖タンパク質を含む組成物をも提供する。
【００１４】
定義：
「ポリペプチド」とは、任意の単量体又は多量体タンパク質又はペプチドを指す。
【００１５】
「生物学的に活性のあるポリペプチド」とは、生物学的状況で正常ではポリペプチドに起因する１つ若しくは複数の生物学的機能又は一連の活性を発揮する能力を有するポリペプチドを指す。当業者なら、「生物学的に活性のある」という用語には、タンパク質が、工業的若しくは化学的工程での、又は治療薬、ワクチン、若しくは診断試薬としての使用に重要である十分な活性を有する限り、天然のタンパク質と比較して生物活性が変化した（例えば抑制又は亢進された）ポリペプチドが含まれることを理解するであろう。生物活性は、当技術分野で利用可能な任意の方法によって決定することができる。例えば、インターフェロンファミリータンパク質のメンバーの生物活性は、インターフェロン特異的抗体とその相互作用、ウイルス感染に対する耐性を増大させるその能力、又はインターフェロンが制御する遺伝子標的の転写を調節するその能力を含めたいくつかの方法のいずれかによって決定することができる。同様に、モノクローナル抗体の生物活性は、それだけに限らないが、結合特異性及びエフェクター機能を測定するアッセイを含めたいくつかの方法のいずれかによって、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ，antibody-dependent cellular cytotoxicity）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ，complement-dependent cytotoxicity）活性についてのアッセイを使用して決定することができる。
【００１６】
「宿主細胞」とは、本発明の異種核酸配列を含む細胞を意味する。本発明の核酸配列、並びにその断片及び変異体を、対象とする任意の細胞中に導入することができるが、特に対象となるのは植物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、植物宿主細胞は、組換えタンパク質の発現用の宿主、例えば、本明細書の下記で述べる、対象とする組換え哺乳動物タンパク質産生用の植物発現系として働く植物の細胞である。
【００１７】
「対象とする異種ポリペプチド」とは、本来宿主細胞によって発現されないポリペプチドを意味する。逆に、「同種ポリペプチド」とは、宿主の細胞内で天然に産生するポリペプチドを意味する。翻訳後Ｎ−グリコシル化を受ける異種及び同種ポリペプチドは、本明細書において、異種又は同種糖タンパク質と称する。本発明の方法によれば、異種と同種のどちらの糖タンパク質のＮ−グリコシル化パターンも、これらの糖タンパク質が、哺乳動物宿主を用いて観察されるものとより類似したＮ−グリコシル化パターンを有するように植物宿主の細胞内で変化する。
【００１８】
対象とする例示的な異種ポリペプチド及び異種ヌクレオチド配列には、それだけに限らないが、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ（glucoronidase）、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンギオスタチン、レプチン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固因子、例えば第VII因子、第VIII因子、第IX因子及び活性化プロテインＣ、α１−アンチトリプシン、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆａｂ断片、単鎖抗体、サイトカイン、受容体、ホルモン、ヒトワクチン、動物ワクチン、ペプチドや血清アルブミンなど、哺乳動物ポリペプチドをコードする配列がある。
【００１９】
本発明の目的で、「Ｎ−グリカン」、「Ｎ−結合グリカン」、及び「グリカン」という用語は互換的に使用され、Ｎ−結合オリゴ糖、例えば、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素と結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基によって結合し又はしていたものを指す。糖タンパク質上で優勢な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ，N-acetylgalactosamine）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、及びシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ，neuraminic acid））である。糖基のプロセシングは、ＥＲの内腔中で同時に行われ、Ｎ−結合糖タンパク質についてはゴルジ装置中で継続する。
【００２０】
複合Ｎ−グリカンの「オリゴマンノシドコア構造」又は「トリマンノースコア構造」とは、図２９Ａで示すコア構造を意味し、コアは、糖タンパク質のアスパラギン残基と結合した３つのマンノース（Ｍａｎ，mannose）及び２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）単糖残基を含む。アスパラギン残基は一般に、保存されているペプチド配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ内にあり、Ｘｘｘは、プロリン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸を除いた任意の残基である。その後のグリコシル化ステップから、最終の複合Ｎ−グリカン構造が得られる。トリマンノースコア構造は、本明細書において「Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２」と表す。
【００２１】
糖タンパク質と結合したＮ−グリカンは、トリマンノースコア構造に付加された末梢の糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、及びシアル酸）を含むいくつかの分枝（アンテナ）に関して異なる。Ｎ−グリカンは通常、その分枝の成分に従って分類される（例えば、複合型、高マンノース型、又はハイブリッド型）。「複合」型Ｎ−グリカンは通常、「トリマンノース」コアの１，３マンノース腕と結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及び１，６マンノース腕と結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。１つのＧｌｃＮＡｃが各マンノース腕と結合する場合、そのＮ−結合グリカンの種は、本明細書において「ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２」又は「ＧｎＧｎ」と表す。ＧｌｃＮＡｃが１つだけ結合する場合、そのＮ−グリカン種は本明細書において「ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２」と表し、ＧｌｃＮＡｃは、１，３マンノース腕（本明細書において「ＭＧｎ」と表す）又は１，６マンノース腕（本明細書において「ＧｎＭ」と表す）と結合している（図３０を参照）。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）又はＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）糖残基を含んでもよく、その残基は、シアル酸又は誘導体（例えば、「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す）で修飾してもよい。ガラクトース糖残基が各マンノース腕上で各ＧｌｃＮＡｃと結合する場合、そのＮ−結合グリカンの種は、本明細書において「Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２」と表す。複合Ｎ−グリカンはまた、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有してもよい。複合Ｎ−グリカンはまた、しばしば「多重アンテナグリカン」と称される、「トリマンノースコア」上の複数のアンテナを有してもよい。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５つ以上のマンノース残基を有する。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノース腕の末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、トリマンノースコアの１，６マンノース腕上に０以上のマンノースを有する。
【００２２】
「Ｇ０グリカン」及び「Ｇ０グリカン構造」及び「Ｇ０グリカン種」という用語は互換的に使用され、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する複合Ｎ−結合グリカンを意味するものとし、末端シアル酸（ＮｅｕＡｃ）又は末端ガラクトース（Ｇａｌ）糖残基は存在しない。Ｇ０グリカンが、トリマンノースコア構造と結合したフコース（「Ｆｕｃ」）残基を含む場合、それは、本明細書において「Ｇ０Ｆ３グリカン」（植物特異的α１，３−結合フコース残基を有する）又は「Ｇ０Ｆ６グリカン」（哺乳動物α１，６−結合フコース残基を有する）と称される。植物では、トリマンノースコア構造と結合した植物特異的β１，２−結合キシロース残基を含むＧ０グリカンは、本明細書において「Ｇ０Ｘグリカン」と称され、トリマンノースコア構造と結合した植物特異的β１，２−結合キシロース残基と植物特異的α１，３−結合フコース残基をどちらも含むＧ０グリカンは、本明細書において「Ｇ０ＸＦ３グリカン」と称される。
【００２３】
「Ｇ１グリカン」及び「Ｇ１グリカン構造」及び「Ｇ１グリカン種」という用語は互換的に使用され、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する複合Ｎ−結合グリカンを意味するものとし、１つの末端ガラクトース（Ｇａｌ）残基が１，３マンノース又は１，６マンノース腕と結合し、末端シアル酸は存在しない。「Ｇ２グリカン」及び「Ｇ２グリカン構造」及び「Ｇ２グリカン種」という用語は互換的に使用され、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する複合Ｎ−結合グリカンを意味するものとし、末端ガラクトース（Ｇａｌ）残基が１，３マンノース腕及び１，６マンノース腕と結合し、末端シアル酸は存在しない。
【００２４】
本明細書において「グライコフォーム」という用語は、特定の１つ又は複数の炭水化物構造を含有する糖タンパク質を指す。したがって、例えば、「Ｇ０グライコフォーム」とは、そのグリコシル化部位と結合したＧ０グリカン種しか含まない糖タンパク質を指す。複数のグリコシル化部位を有する糖タンパク質が各グリコシル化部位と結合した同じグリカン種を有することもでき、又は異なるグリコシル化部位と結合した異なるグリカン種を有することもできることが認められている。このように、異なるパターンのグリカン結合から異なるグライコフォームの糖タンパク質が得られる。
【００２５】
「グリコシル化プロファイル」という用語は、糖タンパク質組成物又は糖タンパク質産物から酵素的に又は化学的に遊離させ、次いでその炭水化物構造について、例えばＬＣ−ＨＰＬＣ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳなどを使用して分析した代表的なＮ−グリカン種の特徴的な「フィンガープリント」を意味するものとする。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Current Analytical Chemistry, Vol. 1, No. 1 (2005), pp. 28-57の総説を参照されたい。
【００２６】
糖タンパク質組成物又は糖タンパク質産物についてのグリコシル化プロファイルとの関連で「実質的に同種の」、「実質的に均一な」、及び「実質的な同種性」という用語は互換的に使用され、プロファイル内の総Ｎ−グリカン種の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％が、１つの所望のＮ−グリカン種によって表され、微量の前駆Ｎ−グリカンがプロファイル中に現れるグリコシル化プロファイルを意味するものとする。「微量」とは、グリコシル化プロファイル中に存在する任意の所与の前駆Ｎ−グリカン種が、プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、わずか０．５％未満又はわずか０．１％未満しか存在しないことを意味する。「前駆」Ｎ−グリカン種は、不完全なプロセシングを受けているＮ−グリカン種を意味する。本発明の糖タンパク質組成物又は糖タンパク質産物中に微量で存在し、したがってそのグリコシル化プロファイル中に現れる前駆Ｎ−グリカン種の例は、上記に記載のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＭＧｎ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，３マンノース腕と結合している）、及びＧｎＭ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，６マンノース腕と結合している）前駆Ｎ−グリカン種である。
【００２７】
したがって、例えば、糖タンパク質産物又は組成物内の所望のＮ−グリカン種がＧ０である場合、その産物又は組成物についての実質的に同種のグリコシル化プロファイルは、その産物又は組成物についてのグリコシル化プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グリカン種によって表され、微量の前駆Ｎ−グリカン種がグリコシル化プロファイル中に現れるものとなる。そのような組成物では、そのグリコシル化プロファイル中に現れる代表的な前駆Ｎ−グリカン種は、上記に記載のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＭＧｎ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，３マンノース腕と結合している）、及びＧｎＭ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，６マンノース腕と結合している）前駆Ｎ−グリカン種となる。
【００２８】
糖タンパク質組成物又は糖タンパク質産物との関連で「実質的に同種の」、「実質的に均一な」、及び「実質的な同種性」という用語は互換的に使用され、その産物又は組成物中に存在する糖タンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％が１つの所望のグライコフォームによって表され、微量の前駆グライコフォーム又は所望されないグライコフォームが組成物中に存在する糖タンパク質産物又は糖タンパク質組成物を意味するものとする。「微量」とは、糖タンパク質産物又は組成物中に存在する任意の所与の前駆グライコフォーム又は所望されないグライコフォームが、総糖タンパク質の５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、わずか０．５％未満又はわずか０．１％未満しか存在しないことを意味する。「前駆」グライコフォームとは、少なくとも１つのグリコシル化部位がグリコシル化されておらず、若しくは所望のＮ−グリカン種の前駆体に相当するＮ−グリカン種によって占有されているグライコフォーム、又は所望のグライコフォームと比べて１つ若しくは複数のさらなるグリコシル化部位が存在し、それが所望のＮ−グリカン種若しくは所望されないＮ−グリカン種によって占有されている（すなわちそれと結合している）グライコフォームを意味する。
【００２９】
したがって、例えば、Ｇ０グライコフォームを含む実質的に同種の糖タンパク質組成物又は産物は、その産物又は組成物中に存在する糖タンパク質の少なくとも８０％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グライコフォームによって表され、予測されるすべてのグリコシル化部位がＧ０グリカン種によって占有され、微量の前駆グライコフォーム又は所望されないグライコフォームがその組成物中に存在する組成物又は産物である。そのような組成物では、代表的な前駆グライコフォームは、グリコシル化部位が占有されていないものとなり、所望されない例示的なグライコフォームは、そのグリコシル化部位と結合したＧ０グリカン及びＧ０Ｘ又はＧ０ＸＦ３グリカン種の混合物を有するグライコフォームとなる。
【００３０】
「抗体」という用語はその最も広い意味で使用され、完全に構築された抗体、抗原と結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）、及び上記を含む組換えペプチドを包含する。抗体は、本発明の方法及び組成物によって企図される多数の糖タンパク質の１つに相当する。抗体の誘導体も本発明によって企図される。誘導体には、イムノグロブリン、又はＣＨ２ドメインを有するＦｃ領域などのその部分を含む融合タンパク質がある。
【００３１】
本明細書において「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を占める個々の抗体は、少量存在する可能性がある、天然に存在する可能な突然変異を除いて同一である。
【００３２】
「天然抗体」及び「天然イムノグロブリン」は通常、２つの同じ軽（Ｌ，light）鎖及び２つの同じ重（Ｈ，heavy）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なるイムノグロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋をも有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を、その他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の境界を形成すると考えられる。
【００３３】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で広範囲に異なることを指し、特定の各抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性においてそれが使用される。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖のどちらの可変ドメインにもある相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determining region）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク（ＦＲ，framework）領域と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、４つのＦＲ領域をそれぞれ含み、その領域は広くβシートの配置をとり、３つのＣＤＲと連結し、それによりβシート構造と連結し、またある場合にはその構造の一部を形成するループが形成される。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって密接に結合し、他の鎖に由来するＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al. (1991) NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669を参照）。
【００３４】
定常ドメインは、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ，Fc receptor）結合、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与、オプソニン化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ活性）の惹起やマスト細胞脱顆粒などの様々なエフェクター機能を示す。
【００３５】
「抗体断片」は、完全な抗体の部分、好ましくは完全な抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体（Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062）；単鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多特異性抗体がある。抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同じ抗原結合断片、及びその名前が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片が生じる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原の架橋結合を行うことができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００３６】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小限の抗体断片である。２本の鎖のＦｖ種では、この領域は、密接に非共有結合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単一の鎖のＦｖ種では、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が２本の鎖のＦｖ種におけるものと類似した「二量体」構造の中で結合できるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合することができる。この配置の中で、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位を確定する。まとめると、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識しそれと結合する能力を有する。
【００３７】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をも含有する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での少数の残基の付加によりＦａｂ’と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインの（複数の）システイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元はＦａｂ’断片の間にヒンジシステインを有するその断片の対として得られた。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３８】
任意の脊椎動物種由来の抗体（イムノグロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の１つに割り当てることができる。
【００３９】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、イムノグロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。ヒトイムノグロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分割することができる。異なるクラスのイムノグロブリンと対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。異なるクラスのイムノグロブリンのサブユニット構造及び三次元立体構造は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を媒介する。
【００４０】
イムノグロブリンは、２つの各重鎖のＦｃ領域の保存されているＮ−結合グリコシル化を有する。したがって、例えば、ＩｇＧ型のイムノグロブリンは、アスパラギン２９７（Ａｓｎ−２９７，asparagine 297）でＮ−結合オリゴ糖を有するグリコシル化ＣＨ２ドメインを有する。これら２つのグリコシル化部位のそれぞれに結合した特定のＮ−グリカン種、及びイムノグロブリン組成物内で両方の部位がグリコシル化されている程度に応じて、異なるグライコフォームのイムノグロブリンが存在する。
【００４１】
異種ポリペプチドの発現に関して、本明細書において「対象とするヌクレオチド配列」とは、宿主、特に植物宿主で、例えば、双子葉植物及び単子葉植物のメンバーを含めた高等植物中での発現を意図する異種ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド配列を指す。例えば、治療用（例えば、獣医学的又は医学的使用のための）又は免疫原性（例えば、ワクチン接種用の）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、形質転換された植物宿主、例えばウキクサを使用して、本発明に従って発現させることができる。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドに本発明を限定するものではない。当業者なら、ポリヌクレオチドが、リボヌクレオチド並びにリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組合せを含み得ることを認識するであろう。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドには、天然に存在する分子と合成類似体の両方が含まれる。本発明のポリヌクレオチドはまた、それだけに限らないが、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムループ構造などを含めたすべての形態の配列をも包含する。
【００４３】
本明細書において「阻害する（inhibit）」、「阻害（inhibition）」、及び「阻害している（inhibiting）」という用語は、標的遺伝子産物の発現又は機能の完全な阻止までの、発現又は機能の任意の相対的な減衰を含めて、標的遺伝子産物の発現又は機能の任意の低下を指す。遺伝子産物との関連で、本明細書において「発現」という用語は、遺伝子産物の転写及び／又は翻訳及び／又は構築を含めて、その遺伝子産物の生合成を指す。標的遺伝子産物（すなわち、対象とする遺伝子産物）の発現又は機能の阻害は、任意の２つの植物間での比較、例えば、対応する野生型植物中での標的遺伝子産物の発現又は機能に対する遺伝子改変植物中での標的遺伝子産物の発現又は機能との関連のものでよい。或いは、標的遺伝子産物の発現又は機能の阻害は、同じ植物内又は植物間での植物細胞、細胞小器官、器官、組織、又は植物部分の間の比較との関連のものでもよく、同じ植物内又は植物間での発達段階又は時間的段階の間の比較を含む。転写若しくは翻訳レベルで標的遺伝子産物の発現を下方制御し、又は標的遺伝子産物の機能活性を下方制御する任意の方法又は組成物を使用して、標的遺伝子産物の発現又は機能の阻害を実現することができる。
【００４４】
「阻害性配列」という用語は、標的遺伝子産物の発現を、例えば、転写若しくは翻訳のレベルで阻害することができ、又は標的遺伝子産物の機能を阻害することができる任意のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を包含する。阻害性配列の例としては、それだけに限らないが、完全長ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列、切断ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の断片、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の変異体、センス方向ヌクレオチド配列、アンチセンス方向ヌクレオチド配列、センス又はアンチセンス方向ヌクレオチド配列の相補体、ヌクレオチド配列の逆方向領域、ヌクレオチド配列のヘアピン、二本鎖ヌクレオチド配列、一本鎖ヌクレオチド配列、その組合せなどがある。「ポリヌクレオチド配列」という用語には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾核酸、核酸類似体、その組合せなどの配列が含まれる。
【００４５】
阻害性配列には、直接的に（すなわち、転写を必要としない）又は間接的に（すなわち、転写又は転写及び翻訳を必要とする）標的遺伝子産物の発現を阻害するヌクレオチド配列が含まれることが認められている。例えば、阻害性ポリヌクレオチドは、植物細胞、組織、又は器官中に導入されたとき、対象とする標的遺伝子産物の発現を一過性であるが直接的に抑制する、化学合成され又はインビトロで産生された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，small interfering RNA）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，micro RNA）であるヌクレオチド配列を含んでよい。或いは、阻害性ポリヌクレオチドは、センス方向ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ，double-stranded RNA）、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ，hairpin RNA）、イントロン含有ｈｐＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの、対象とする遺伝子産物の発現を抑制するように設計された阻害性ヌクレオチド分子をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。さらに他の実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、その翻訳により、対象とする標的遺伝子産物の発現又は機能を阻害するポリペプチドが得られるｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。このように、阻害性ポリヌクレオチドが、ポリペプチドに対する阻害性ヌクレオチド分子又はｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む場合、コード配列は、植物細胞中での発現を促進するプロモーターと作動的に連結し、その結果、コードされた阻害性ヌクレオチド分子又はｍＲＮＡを発現させることができる。
【００４６】
阻害性配列は、本明細書において標的遺伝子産物の名で称される。したがって、例えば、「α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）阻害性配列」とは、ＦｕｃＴの発現を、例えば、転写及び／若しくは翻訳のレベルで阻害することができ、又はＦｕｃＴの機能を阻害することができる阻害性配列を指す。同様に、「β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）阻害性配列」とは、ＸｙｌＴの発現を転写及び／若しくは翻訳のレベルで阻害することができ、又はＸｙｌＴの機能を阻害することができる阻害性配列を指す。ポリヌクレオチド阻害性配列との関連で「阻害することができる」という語句が使用されるとき、それは、阻害性配列自体が阻害効果を発揮し、又は阻害性配列が阻害性ヌクレオチド分子（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド）をコードし、若しくは阻害性ポリペプチド（すなわち、標的遺伝子産物の発現又は機能を阻害するポリペプチド）をコードする場合、その転写（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする阻害性配列の場合）若しくはその転写及び翻訳（阻害性ポリペプチドをコードする阻害性配列の場合）後、その転写若しくは翻訳産物がそれぞれ標的遺伝子産物に対して阻害効果を発揮する（すなわち、標的遺伝子産物の発現又は機能を阻害する）ことを意味するものとする。
【００４７】
ポリヌクレオチド、例えば対象とするヌクレオチド構築物との関連で「導入している（introducing）」という用語は、ポリヌクレオチドが植物の細胞の内部に到達できるように、植物にポリヌクレオチドを提供することを意味するものとする。複数のポリヌクレオチドを導入する場合、これらのポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド構築物の一部として、又は別々のヌクレオチド構築物として提供することができ、同じ又は異なる形質転換ベクター上に位置付けることができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象の中で、別々の形質転換事象の中で、又は、例えば植物中で、育種プロトコールの一部として対象とする宿主細胞中に導入することができる。本発明の方法は、（複数の）ポリヌクレオチドが植物の少なくとも１つの細胞の内部に到達できる、１つ又は複数のポリヌクレオチドを植物中に導入する特定の方法のみに依存しない。ポリヌクレオチドを植物中に導入する方法は、それだけに限らないが、一過性形質転換方法、安定形質転換方法、及びウイルスが媒介する方法を含めて、当技術分野で知られている。
【００４８】
ポリヌクレオチドとの関連で「一過性形質転換」とは、ポリヌクレオチドが動物中に導入され、植物のゲノムとは一体化しないことを意味するものとする。
【００４９】
植物中に導入されたポリヌクレオチドとの関連で「安定に導入する（stably introducing）」又は「安定に導入された（stably introduced）」とは、導入されたポリヌクレオチドが植物ゲノム中に安定に組み込まれ、したがって、植物がそのポリヌクレオチドで安定に形質転換されていることを意味する。
【００５０】
「安定形質転換」又は「安定に形質転換された（stably transformed）」とは、植物中に導入されたポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載のヌクレオチド構築物が、植物のゲノムと一体化し、その子孫によって、より具体的には、複数の連続した世代の子孫によって受け継がれることが可能であることを意味するものとする。いくつかの実施形態では、連続した世代には、栄養生殖により（すなわち無性生殖）、例えば、クローン増殖で産生された子孫が含まれる。他の実施形態では、連続した世代には、有性生殖を介して産生された子孫が含まれる。本明細書に記載のＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの発現を阻害することができる少なくとも１つのヌクレオチド構築物で「安定に形質転換された」高等植物宿主とは、そのゲノム中に組み込まれた（複数の）ヌクレオチド構築物を有し、無性又は有性生殖を介して子孫を産生することができ、そのゲノム中に安定に組み込まれた（複数の）阻害性ヌクレオチド構築物も含む高等植物宿主を指し、したがって、その子孫も、α１，３−フコース及び／又はβ１，２−キシロース残基と、その中で産生された同種及び異種糖タンパク質のＮ−グリカンとの結合の低下を特徴とする変化したＮ−グリコシル化パターンを有する所望の表現型を示す。
【００５１】
本明細書において、「植物」という用語は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、及びその子孫への言及を含む。トランスジェニック植物の部分は、本発明の範囲内で、本発明のＤＮＡ分子で予め形質転換されたトランスジェニック植物又はその子孫に由来し、したがって少なくとも一部はトランスジェニック細胞からなる、例えば、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚並びに花、胚珠、茎、果実、葉、根、根端などを含むことを理解されたい。本明細書において、「植物細胞」という用語には、それだけに限らないが、種子、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、茎頂、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子の細胞が含まれる。
【００５２】
本発明の方法で使用することができる植物の種類は、一般に、単子葉植物（単子葉類）も双子葉植物（双子葉類）も含めて、形質転換技術を行いやすい高等植物の種類と同程度に幅広い。双子葉類の例としては、それだけに限らないが、ダイズ及びアルファルファを含めたマメ、タバコ、ジャガイモ、トマトなどがある。単子葉類の例としては、それだけに限らないが、トウモロコシ、イネ、エンバク、オオムギ、コムギ、ウキクサ科のメンバー、イネ科草本などがある。「下等植物」とは、シダ、トクサ、ヒカゲノカズラ、コケ、ゼニゴケ、ツノゴケ、藻類、例えば紅藻、褐藻、及び緑藻、シダ植物の配偶体、胞子体などを含めた隠花植物を指す。いくつかの実施形態では、対象とする植物は、ウキクサ科のメンバーの植物である。
【００５３】
「ウキクサ（duckweed）」という用語は、ウキクサ（Lemnaceae）科のメンバーを指す。この科は現在、下記の通り５つの属及び３８種のウキクサに分けられる：レムナ属（ナンゴクアオウキクサ（L. aequinoctialis）、Ｌ．ジスペルマ（L. disperma）、Ｌ．エクアドリエンシス（L. ecuadoriensis）、イボウキクサ（L. gibba）、ムラサキコウキクサ（L. japonica）、コウキクサ（L. minor）、ヒナウキクサ（L. miniscula）、Ｌ．オブスキュラ（L. obscura）、アオウキクサ（L. perpusilla）、Ｌ．テネラ（L. tenera）、ヒンジモ（L. trisulca）、キタグニコウキクサ（L. turionifera）、チリウキクサ（L. valdiviana））；スピロデラ（Spirodela）属（Ｓ．インターメディア（S. intermedia）、ウキクサ（S. polyrrhiza）、ヒメウキクサ（S. punctata））；ウォルフィア（Wolffia）属（Ｗａ．アングスタ（Wa. angusta）、ミジンコウキクサ（Wa. arrhiza）、Ｗａ．オーストラリーナ（Wa. australina）、Ｗａ．ボレアリス（Wa. borealis）、Ｗａ．ブラジリエンシス（Wa. brasiliensis）、Ｗａ．コロンビアーナ（Wa. columbiana）、Ｗａ．エロンガータ（Wa. elongata）、ミジンコウキクサ（Wa. globosa）、Ｗａ．マイクロスコーピカ（Wa. microscopica）、Ｗａ．ネグレクタ（Wa. neglecta））；ウォルフィエラ（Wolfiella）属（Ｗｌ．カウダータ（Wl. caudata）、Ｗｌ．デンティキュラータ（Wl. denticulata）、Ｗｌ．グラディアータ（Wl. gladiata）、Ｗｌ．ヒアリナ（Wl. hyalina）、Ｗｌ．リングラタ（Wl. lingulata）、Ｗｌ．レプンダ（Wl. repunda）、Ｗｌ．ロタンダ（Wl. rotunda）、及びＷｌ．ネオトロピカ（Wl. neotropica)）及びランドルティア属（ヒメウキクサ（L. punctata））。ウキクサの任意の他の属又は種が存在すれば、それも本発明の態様となる。レムナ種は、Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae-A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stit ung Rubel, Zurich)に記載の分類スキームを使用して分類することができる。
【００５４】
本明細書において「ウキクサ根粒（nodule）」という用語は、細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％が分化細胞であるウキクサ細胞を含むウキクサ組織を指す。本明細書において「分化細胞」とは、非分化細胞又は他の組織型で認められる細胞とそれを区別する少なくとも１つの表現型上の特徴（例えば、特有の細胞形態又はマーカー核酸若しくはタンパク質の発現）を有する細胞である。本明細書に記載するウキクサ根粒培養物の分化細胞は、その隣接する細胞壁で融合した相互連結細胞のタイル状の平滑面を形成し、その面は組織全体にわたって散在する葉状体原基へと組織化され始めた根粒を有する。根粒培養物の組織の表面は、原形質連絡を介して互いに連結した表皮細胞を有する。ウキクサ科のメンバーはクローン増殖によって繁殖し、したがってクローン性に増殖する植物を代表するものである。
【００５５】
本明細書において「ウキクサ優先的コドン」とは、ウキクサでのコドン使用頻度が１７％を超えるコドンを指す。
【００５６】
本明細書において「レムナ優先的コドン」とは、レムナ属でのコドン使用頻度が１７％を超えるコドンを指す。
【００５７】
「イボウキクサ優先的コドン」とは、イボウキクサでのコドン使用頻度が１７％を超えるコドンを指し、イボウキクサでのコドン使用頻度はCodon Usage Database（GenBank Release 113,0；http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species= Lemna+gibba+[gbpln]）から得られた。
【００５８】
「翻訳開始コドン」とは、対象とするヌクレオチド配列から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するコドンを指す。
【００５９】
本明細書において「翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列」とは、転写開始コドンの直接５’側にある３つのヌクレオチドの同一性を指す。
【００６０】
本明細書において「分泌」とは、宿主植物細胞の原形質膜と細胞壁両方を横切ってのポリペプチドの移行を指す。
【００６１】
ヌクレオチド配列に関して、本明細書において「作動的に連結した」とは、互いに機能的な関係の中に配置された複数のヌクレオチド配列を指す。一般に、作動的に連結したＤＮＡ配列は連続し、２つのタンパク質コード領域を連結することが必要である場合には読み枠内にある。
【００６２】
単離ポリヌクレオチド及びポリペプチド
本発明は、植物Ｎ−結合グリカン（「Ｎ−グリカン」とも称される）のさらなる修飾に関与する単離ポリヌクレオチド及びポリペプチド、特にウキクサ科のメンバーであるコウキクサで同定されたα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）及びβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体及び断片を提供する。これらのタンパク質を発現する植物中でこれらのタンパク質の一方若しくは両方、又は生物学的に活性のあるその変異体の発現を阻害すると、有利には、α１，３−フコース及びβ１，２−キシロース残基と糖タンパク質Ｎ−グリカンの結合が低下したＮ−グリコシル化パターンが得られる。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書で開示されている方法により、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの発現が完全に阻害され、Ｎ−結合グリカンにα１，３−フコース及びβ１，２−キシロース残基がない、植物内で産生される糖タンパク質のＮ−グリコシル化パターンが得られる。
【００６３】
コウキクサアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）の５’及び３’−ＵＴＲを含めた完全長ｃＤＮＡ配列を図１で示す；配列番号１も参照されたい（オープンリーディングフレームは配列番号２で示す）。それによってコードされる予測アミノ酸配列を配列番号３で示す。コウキクサＦｕｃＴ遺伝子の少なくとも２つのアイソフォームが同定されており、そのアイソフォーム間の類似性は約９０％である。コードされたタンパク質は、他の高等植物に由来する他のＦｕｃＴといくらかの類似性を有する。図２を参照されたい。例えば、コウキクサＦｕｃＴ配列は、図２に示すシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）とおよそ５０．１％の配列同一性を有する。
【００６４】
コウキクサβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の５’及び３’−ＵＴＲを含めた完全長ｃＤＮＡ配列（アイソフォーム＃１）を図３で示す；配列番号４も参照されたい（ＯＲＦは配列番号５で示す）。それによってコードされる予測アミノ酸配列を配列番号６に示す。コウキクサＸｙｌＴ遺伝子の少なくとも２つのアイソフォームが同定されており、そのアイソフォーム間の類似性は約９０％である。コードされたタンパク質は、他の高等植物に由来する他のＸｙｌＴといくらかの類似性を有する。図４を参照されたい。例えば、コウキクサＸｙｌＴは、図４に示すシロイヌナズナとおよそ５６．４％の配列同一性を有する。コウキクサβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の３’−ＵＴＲを含めた部分長ｃＤＮＡ配列（アイソフォーム＃２）を図３１で示す；配列番号１９も参照されたい（ＯＲＦは配列番号２０で示す）。それによってコードされる予測アミノ酸配列を配列番号２１に示す。図３２に示すアラインメントから認められるように、部分長ＸｙｌＴアイソフォーム＃２は、完全長ＸｙｌＴアイソフォーム＃１の対応する領域と高い配列同一性を有する。
【００６５】
本発明は、単離され又は実質的に精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質組成物を包含する。「単離された」若しくは「精製された」ポリヌクレオチド若しくはタンパク質、又は生物学的に活性のあるその部分は、その天然に存在する環境下で認められるように通常はポリヌクレオチド若しくはタンパク質を伴い又はそれと相互作用する構成成分を実質的に又は本質的に含まない。したがって単離又は精製ポリヌクレオチド又はタンパク質は、他の細胞性物質、若しくは組換え技術によって産生されたときは培地を実質的に含まず、又は化学合成されたときは化学物質前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ中で天然にポリヌクレオチドに隣接する配列（すなわち、ポリヌクレオチドの５’及び３’末端に位置する配列）（最適にはタンパク質コード配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で天然にポリヌクレオチドに隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有してよい。細胞性物質を実質的に含まないタンパク質には、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本発明のタンパク質又は生物学的に活性のあるその部分を組換えにより産生するとき、最適には、培地は、化学物質前駆体又は対象とするタンパク質でない化学物質が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満となる。
【００６６】
コウキクサＦｕｃＴ遺伝子のコード配列を、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ，nucleotide）２４３〜１７１５及び配列番号２で示し、コードされたＦｕｃＴポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に示す。コウキクサＸｙｌＴアイソフォーム＃１遺伝子のコード配列を、配列番号４のヌクレオチド６３〜１５９２及び配列番号５で示し、コードされたＸｙｌＴポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に示す。部分長コウキクサＸｙｌＴアイソフォーム＃２遺伝子のコード配列を配列番号１９のヌクレオチド１〜１２７６及び配列番号２０で示し、コードされた部分長ＸｙｌＴポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【００６７】
具体的には、本発明は、配列番号３、６、及び２１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチド、例えば配列番号１、２、４、５、１９、及び２０に示すものによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにその断片及び変異体をさらに提供する。これらのヌクレオチド配列の相補体を含む核酸分子も提供する。コードされたＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの過剰発現のために、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ遺伝子のコード配列を発現させることができることが認められている。しかし、これらのタンパク質の発現を抑制又は阻害する目的で、配列番号１、２、４、５、１９、及び２０のそれぞれのヌクレオチド配列を使用して、それぞれのＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴタンパク質の発現を抑制するための構築物が設計される。したがって、ＦｕｃＴタンパク質の抑制との関連で、ポリヌクレオチドとは、ＦｕｃＴコード配列、及び発現したときにＦｕｃＴ遺伝子の発現を、例えば本明細書の下記で述べる直接的又は間接的抑制を介して抑制又は阻害するポリヌクレオチドを指す。同様に、ＸｙｌＴタンパク質の抑制又は阻害との関連で、ポリヌクレオチドとは、ＸｙｌＴコード配列、及び発現したときにＸｙｌＴ遺伝子の発現を、例えば本明細書の下記で述べる直接的又は間接的抑制を介して抑制又は阻害するポリヌクレオチドを指す。
【００６８】
開示されたポリヌクレオチド及びそれによってコードされるタンパク質の断片及び変異体も本発明によって包含される。「断片」とは、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴポリヌクレオチドの部分又はそれによってコードされるＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴアミノ酸配列の部分を意味する。ポリヌクレオチドの断片は、天然タンパク質の生物活性を保持し、したがって、本明細書の他の箇所で述べるように、ＦｕｃＴ活性又はＸｙｌＴ活性を有するタンパク質の断片をコードしてよい。或いは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なポリヌクレオチドの断片は一般に、生物活性を保持する断片タンパク質をコードしない。ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリヌクレオチドの断片を使用して、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴポリペプチドの発現を抑制するための阻害性配列を設計することもできる。したがって、例えば、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約６５０ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約７５０ヌクレオチド、約８００ヌクレオチドから、最大で本発明のタンパク質をコードする完全長ポリヌクレオチドまででよい。
【００６９】
本発明のＦｕｃＴタンパク質の生物学的に活性のある部分をコードするＦｕｃＴポリヌクレオチドの断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７５、５００個の連続したアミノ酸、又は最大で本発明の完全長ＦｕｃＴタンパク質中に存在する総数のアミノ酸（例えば、配列番号３の５０９アミノ酸）をコードする。本発明の完全長ＸｙｌＴタンパク質の生物学的に活性のある部分をコードするＸｙｌＴポリヌクレオチドの断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７５個の連続したアミノ酸、又は最大で本発明の完全長ＸｙｌＴタンパク質中に存在する総数のアミノ酸（例えば、配列番号３の４９０アミノ酸）をコードする。本発明の部分長ＸｙｌＴタンパク質の生物学的に活性のある部分をコードするＸｙｌＴポリヌクレオチドの断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個の連続したアミノ酸、又は最大で本発明の部分長ＸｙｌＴタンパク質中に存在する総数のアミノ酸（例えば、配列番号２１の４９０アミノ酸）をコードする。
【００７０】
したがって、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリヌクレオチドの断片は、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質の生物学的に活性のある部分をそれぞれコードしてもよく、或いは、それは、ハイブリダイゼーションプローブ若しくはＰＣＲプライマーとして使用することもでき、又は下記で開示されている方法を用いて抑制のための阻害性配列を設計するのに使用することもできる断片でもよい。ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質の生物学的に活性のある部分は、本発明のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリヌクレオチドの１つの部分をそれぞれ単離し、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質のコードされた部分を（例えば、インビトロでの組換え発現により）発現させ、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質のコードされた部分の活性を評価することによって調製することができる。ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチドは、少なくとも１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、若しくは１４５０個の連続したヌクレオチド、又は最大で本明細書で開示されているＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴポリヌクレオチド中に存在する数のヌクレオチド（例えば、配列番号１、２、４、５、１９、及び２０のそれぞれ１８６５、１４７３、１８６０、１５３０、１２８２、又は１２７５ヌクレオチド）を含む。
【００７１】
「変異体」とは、実質的に類似した配列を意味するものとする。ポリヌクレオチドでは、変異体は、天然ポリヌクレオチド内の１つ若しくは複数の部位における１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失及び／若しくは付加、並びに／又は天然ポリヌクレオチド中の１つ若しくは複数の部位における１つ若しくは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書において、「天然」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列をそれぞれ含む。ポリヌクレオチドでは、保存的変異体には、遺伝コードの縮重のために、本発明のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。これらのような天然に存在する対立遺伝子変異体は、周知の分子生物学技術を使用して、例えば、下記で概略を述べるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）及びハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができる。変異体ポリヌクレオチドには、例えば部位特異的突然変異生成を使用することによって得られたが、依然として本発明のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質をコードするものなどの合成誘導ポリヌクレオチドも含まれる。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１９、又は配列番号２０、その断片、及びこれらの配列の相補体）の変異体は、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラム及びパラメーターによって決定される配列同一性を有する。
【００７２】
本発明の特定のポリヌクレオチド（すなわち、基準ポリヌクレオチド）の変異体は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの間のパーセント配列同一性の比較によって評価することもできる。したがって、例えば、配列番号３、配列番号６、又は配列番号２１のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリペプチドとそれぞれ所与のパーセント配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが開示される。本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラム及びパラメーターを使用して、任意の２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性を計算することができる。本発明の任意の所与の対のポリヌクレオチドを、それらがコードする２つのポリペプチドによって共有されるパーセント配列同一性の比較によって評価する場合、その２つのコードされたポリペプチド間のパーセント配列同一性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性である。
【００７３】
「変異体」タンパク質は、天然タンパク質中の１つ若しくは複数の部位における１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び／又は天然タンパク質中の１つ若しくは複数の部位における１つ若しくは複数のアミノ酸の置換により天然タンパク質から誘導されたタンパク質を意味するものとする。本発明によって包含される様々なタンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物活性を、すなわち本明細書に記載の植物中の糖タンパク質Ｎ−グリカンとα１，３−結合フコース残基を結合する酵素活性（ＦｕｃＴの活性）又はβ１，２−結合キシロース残基を結合する酵素活性（ＸｙｌＴの活性）を所有し続ける。そのような変異体は、例えば、遺伝的多型性又はヒトの操作から生じ得る。本発明の天然ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質の生物学的に活性のある変異体は、天然タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラム及びパラメーターによって決定される配列同一性を有する。本発明のタンパク質の生物学的に活性のある変異体は、わずか１〜１５個のアミノ酸残基、６〜１０個、わずか５個、わずか４、３、２個や１個などのわずか１〜１０個のアミノ酸残基でもそのタンパク質と異なる可能性がある。
【００７４】
アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含めた様々な形で本発明のタンパク質を変化させることができる。そのような操作の方法は当技術分野で一般に知られている。例えば、ＤＮＡ中での突然変異によって、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴタンパク質のアミノ酸配列変異体及び断片を調製することができる。突然変異生成及びポリヌクレオチド変化の方法は当技術分野で周知である。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492；Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382；米国特許第４，８７３，１９２号；Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)及びその中で引用されている参照文献を参照されたい。対象とするタンパク質の生物活性に影響を及ぼさない適当なアミノ酸置換に関する手引きは、参照により本明細書に組み込まれているDayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington,  D.C.)のモデル中に認めることができる。１つのアミノ酸を類似した特性を有する他のものと交換するような保存的置換が最適となり得る。
【００７５】
したがって、本発明のポリヌクレオチドには、天然に存在するＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ配列と突然変異型の両方が含まれる。同様に、本発明のタンパク質は、天然に存在するＦｕｃＴ及びＸｙｌＴタンパク質とその変異及び改変型の両方を包含する。そのような変異体は、所望の活性を所有し続ける。したがって、機能的タンパク質の発現が所望される場合、発現したタンパク質は、所望のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ活性を、すなわち本明細書に記載の植物中の糖タンパク質Ｎ−グリカンとα１，３−結合フコース残基を結合する酵素活性（ＦｕｃＴの活性）又はβ１，２−結合キシロース残基を結合する酵素活性（ＸｙｌＴの活性）を所有する。目的がＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴポリペプチドの発現又は機能の阻害である場合、変異体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの所望の活性は、それぞれのＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴポリペプチドの発現又は機能を阻害する活性である。明らかに、機能的ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ変異体の発現が所望される場合、変異体をコードするＤＮＡ中でなされる突然変異は、読み枠の外にその配列が位置してはならず、最適には、二次ｍＲＮＡ構造を生じさせる可能性がある相補性領域を形成しない。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照されたい。
【００７６】
機能的タンパク質が所望される場合、本明細書で包含されるタンパク質の配列の欠失、挿入、及び置換が、タンパク質の特徴の根本的な変化を生じさせることは予想されない。しかし、その置換、欠失、又は挿入の正確な効果を、それを行うより先に予測することが難しいとき、当業者なら、本明細書の下記の実験の節に記載するＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ活性をモニターするアッセイを含めた日常的なスクリーニングアッセイによって効果が評価されることを理解するであろう。
【００７７】
変異体ポリヌクレオチド及びタンパク質はまた、ＤＮＡシャッフリングなど突然変異及び組換えの手順から誘導された配列及びタンパク質をも包含する。そのような手順で、１つ又は複数の異なるＦｕｃＴ又はＸｙｌＴコード配列を操作して、所望の特性を所有する新たなＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質を作製することができる。このように、実質的な配列同一性を有し、インビトロ又はインビボで相同組換えを行うことができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から組換えポリヌクレオチドのライブラリーが得られる。例えば、この手法を使用して、本発明のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子と、他の既知のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子の間で所望のドメインをコードする配列モチーフをそれぞれシャッフリングして、所望の特性が向上したタンパク質をコードする新たな遺伝子を得ることができる。そのようなＤＮＡシャッフリングの戦略は当技術分野で知られている。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751；Stemmer (1994) Nature 370:389-391；Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438；Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347；Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509；Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291；並びに米国特許第５，６０５，７９３号及び第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００７８】
数学的アルゴリズムを使用して、配列の比較並びに２つの配列間でのパーセント同一性及びパーセント類似性の決定を行うことができる。好ましい実施形態では、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.accelrys.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453のアルゴリズムを使用して、ＢＬＯＳＳＵＭ６２行列又はＰＡＭ２５０行列、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップの重み及び１、２、３、４、５、又は６の長さの重みを使用して、２つのアミノ酸配列間でのパーセント同一性を決定する。さらに他の好ましい実施形態では、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照）並びに４０、５０、６０、７０、又は８０のギャップの重み及び１、２、３、４、５、又は６の長さの重みを使用して、２つのヌクレオチド配列間でのパーセント同一性を決定する。特に好ましい組のパラメーター（及び分子が本発明の配列同一性の限度の範囲内にあるかどうかを決定するのに何のパラメーターを適用すべきかについて実施者がはっきり分からない場合に使用すべきパラメーター）は、ギャップの重みを６０、長さの重みを３にしてＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用することである。
【００７９】
ＡＬＩＧＮプログラム（第２．０版）に組み込まれている、Meyers and Miller (1989) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを使用して、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間でのパーセント同一性を決定することもできる。
【００８０】
２つの核酸分子が密接に関係することを示唆する代替の指標は、ストリンジェントな条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズすることである。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境的パラメーター下で異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、定められたイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融解点（Ｔｍ，thermal melting point）より約５℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、５０％の標的配列が、完全に整合するプローブとハイブリダイズする（定められたイオン強度及びｐＨ下での）温度である。核酸ハイブリダイゼーションの条件及び厳密性の計算は、例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)及びTijssen (1993) Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY,  NY)中に記載されている。
【００８１】
本発明の目的で、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間の不整合が２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、より正確に定義付けるために、特定のレベルの厳密性に分解することができる。したがって、本明細書において、「中程度のストリジェンシー」の条件とは、配列の不整合が２５％を超える分子がハイブリダイズしない条件であり、「中間のストリジェンシー」の条件とは、不整合が１５％を超える分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリジェンシー」の条件とは、不整合が１０％を超える配列がハイブリダイズしない条件である。「非常に高いストリジェンシー」の条件とは、不整合が６％を超える配列がハイブリダイズしない条件である。
【００８２】
他の生物、より具体的には他の植物種中の対応する相同配列を単離するためのプローブとして、本発明のＦｕｃＴ及びＸｙｌＴポリヌクレオチドを使用することができる。このように、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、本発明の配列に対するその配列相同性に基づいてそのような配列を同定することができる。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)及びInnis et al. (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)を参照されたい。本発明のＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴポリヌクレオチド全体（すなわち、ＦｕｃＴでは配列番号１及び２；配列番号６のＸｙｌＴアイソフォーム＃１では配列番号４及び５；並びに配列番号２１のＸｙｌＴアイソフォーム＃２では配列番号１９及び２０）又はその断片及び変異体に対するその配列同一性に基づいて単離されたポリヌクレオチド配列は、本発明によって包含される。
【００８３】
ＰＣＲ法では、所望の任意の生物から抽出されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するＰＣＲ反応で使用するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲの既知の方法として、それだけに限らないが、対のプライマー、入れ子型プライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的に不整合なプライマーなどを使用する方法がある。ＰＣＲプライマーの設計及びＰＣＲクローン化の方法は当技術分野で一般に知られ、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  New York)で開示されている。Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)；Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)；及びInnis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)も参照されたい。
【００８４】
ハイブリダイゼーション法では、所望の他の生物に由来するクローン化ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ断片の集団（すなわち、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリー）中に存在する、他の対応するポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするプローブとして、全部又は一部の既知のヌクレオチド配列を使用することができる。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、又は他のオリゴヌクレオチドでよく、３２Ｐなどの検出可能な基又は任意の他の検出可能なマーカーでそれを標識することができる。所望のヌクレオチド配列、例えば、本発明のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリヌクレオチドに基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによってハイブリダイゼーション用プローブを作製することができる。既知のヌクレオチド又はコードされたアミノ酸配列中の保存されているヌクレオチド又はアミノ酸残基に基づいて設計された縮重プライマーをさらに使用することができる。ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーを構築し、ハイブリダイゼーションプローブを調製する方法は当技術分野で一般に知られ、参照により本明細書に組み込まれている、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  New York)で開示されている。
【００８５】
例えば、他のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴヌクレオチド及びメッセンジャーＲＮＡと選択的にハイブリダイズするプローブとして、全部又は一部の特異的な既知のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリヌクレオチド配列を使用することができる。様々な条件下で特異的なハイブリダイゼーションを実現するために、そのようなプローブは、独特であり、好ましくは長さが少なくとも約１０ヌクレオチド、より最適には長さが少なくとも約２０ヌクレオチドである配列を含む。所望の生物に由来する他の対応するＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴヌクレオチド配列を単離するのに、又は生物中でのＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴコード配列の存在を決定する診断アッセイとして、この技術を使用することができる。ハイブリダイゼーション技術は、プレートに播いたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング（プラーク又はコロニー；例えば、Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)を参照）を含む。
【００８６】
したがって、天然のＦｕｃＴ及びＸｙｌＴポリヌクレオチド並びにその断片及び変異体に加えて、本発明の単離ポリヌクレオチドはまた、本発明のＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴポリヌクレオチド又はその変異体から得られた全体又は部分的な配列とのハイブリダイゼーションにより他の生物から同定及び単離された相同なＤＮＡ配列をも包含する。当技術分野で一般に知られている技術に従って、他のＤＮＡ配列が本明細書で開示されているＤＮＡ配列とハイブリダイズすることを可能にする条件を決定することができる。例えば、本明細書の上記で述べた中程度の、中間の、高い、又は非常に高い厳密性の種々の条件下で、そのような配列のハイブリダイゼーションを実施することができる。
【００８７】
本発明の方法
本発明は、高等植物中で、特に、組換えタンパク質、特に薬学的な関心のある組換え哺乳動物タンパク質産生用の宿主として働く高等植物中でタンパク質のグリコシル化パターンを変化させる方法を対象とする。その方法は、哺乳動物で認められるものとより酷似したＮ−グリコシル化パターンを有する組換えタンパク質を産生することができる高等植物の産生に使用される。本発明の組成物は、その内因性（すなわち、同種）タンパク質及び組換えにより産生された異種タンパク質の変化したＮ−グリコシル化パターンを含むように安定に形質転換された高等植物を含む。いくつかの実施形態では、高等植物は、α１，３−フコース残基と、その中で産生された同種及び異種糖タンパク質のＮ−グリカンとの植物特異的結合が低下するように変化させたグリコシル化機構を有していない対照植物中で産生したｍＡｂと比べて亢進されたＡＤＣＣ活性を有する哺乳動物タンパク質に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生するトランスジェニック植物である。
【００８８】
本発明の方法は、高等植物中の複合糖タンパク質の産生に関与する一方又は両方の酵素の発現の抑制（すなわち、阻害）を標的とする。特に対象となるのは、フコシルトランスフェラーゼ又はその１つ若しくは複数のアイソフォームの抑制、キシロシルトランスフェラーゼ又はその１つ若しくは複数のアイソフォームの抑制、或いはこの両方のタンパク質及びその１つ又は複数のアイソフォームの発現の抑制である。フコシルトランスフェラーゼ及び／又はキシロシルトランスフェラーゼ並びにその１つ又は複数のアイソフォームの抑制が一過性に実現できることが認められている。或いは、フコシルトランスフェラーゼ及び／又はキシロシルトランスフェラーゼの発現を安定に抑制することによって、哺乳動物で、より具体的にはヒトで認められるものとより酷似したＮ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する能力を世代から世代へと無性生殖的又は有性生殖的に引き継ぐトランスジェニック高等植物を産生することができる。有利には、これによって、植物β１，２−結合キシロース残基及び／又はα１，３−結合フコース残基と糖タンパク質Ｎ−グリカンの結合が低下した組換え哺乳動物タンパク質が産生される。
【００８９】
植物、例えば、双子葉植物又は単子葉植物、例えばウキクサ植物中での一方、又は有利には両方のこれらのタンパク質の阻害は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して実施することができる。このように、ＦｕｃＴ、ＸｙｌＴ、又はその組合せの阻害性配列を含むポリヌクレオチドを、対象とする宿主細胞中に導入する。一過性の抑制では、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ阻害性配列は、宿主細胞中に導入されたとき、これらの（複数の）標的遺伝子産物の発現を抑制することによりＦｕｃＴ、ＸｙｌＴ、又はその組合せを一過性であるが直接的に阻害する、化学合成され又はインビトロで産生された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）でよい。
【００９０】
或いは、ＦｕｃＴ、ＸｙｌＴ、又はその組合せの発現の安定的抑制が、本明細書の上記で述べたように望ましい。したがって、いくつかの実施形態では、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現を阻害するポリヌクレオチドを発現する発現カセットで植物細胞を形質転換することによって、本発明のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリペプチドの活性を低下又は消失させる。そのポリヌクレオチドは、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴメッセンジャーＲＮＡの転写又は翻訳を防止することによって直接的に、或いはＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方をコードする遺伝子の転写又は翻訳を阻害するポリペプチドをコードすることによって間接的に、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現を阻害することができる。植物中での遺伝子の発現を阻害し又は消失させる方法は当技術分野で周知であり、任意のそのような方法を本発明で使用してＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現を阻害することができる。
【００９１】
したがって、いくつかの実施形態では、センス方向ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）、イントロン含有ｈｐＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの、対象とするＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ遺伝子産物の発現を抑制するように設計された阻害性ヌクレオチド分子をコードする配列を含む、発現カセットなどのヌクレオチド構築物を植物中に導入することによってＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴタンパク質の発現を阻害することができる。他の実施形態では、ヌクレオチド構築物、例えば発現カセットは、その翻訳により、対象とするＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ遺伝子産物の発現又は機能を阻害する、対象とするポリペプチドが得られるｍＲＮＡをコードする配列を含んでよい。ヌクレオチド構築物が、対象とするポリペプチドに対する阻害性ヌクレオチド分子又はｍＲＮＡをコードする配列を含む場合、その配列は、植物細胞中での発現を促進するプロモーターと作動的に連結し、その結果、コードされた阻害性ヌクレオチド分子又はｍＲＮＡを発現させることができる。
【００９２】
本発明によれば、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴのタンパク質レベルが、そのＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの発現を阻害するように遺伝子改変され又は突然変異が誘発していない植物中の同じＦｕｃＴ又はＸｙｌＴのタンパク質レベルより統計上低い場合にＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子の発現が阻害される。本発明の特定の実施形態では、本発明に従って改変された植物中でのＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方のタンパク質レベルは、突然変異体でなく、又はそのＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又はＦｕｃＴとＸｙｌＴ両方の発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物中の同じＦｕｃＴ又はＸｙｌＴのタンパク質レベルの９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、又は５％未満である。ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現レベルは、例えば、植物細胞又は植物中で発現されたＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方のレベルについてアッセイを行うことによって直接的に、或いは、例えば、植物中でのβ１，２−キシロース及び／又はα１，３−フコース残基と糖タンパク質Ｎ−グリカンの結合の低下として又は消失としても観察される、表現型レベルでのトランスジェニック植物における効果を観察することによって、すなわちトランスジェニック植物分析によって間接的に測定することができる。
【００９３】
本発明の他の実施形態では、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の活性を阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットで植物細胞を形質転換することによって、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の活性を低下又は消失させる。本発明によれば、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性が、そのＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性を阻害するように遺伝子改変されていない植物中の同じＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性より統計上低い場合にＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性が阻害される。本発明の特定の実施形態では、本発明に従って改変された植物中でのＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性は、そのＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物中の同じＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性の９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、又は５％未満である。本発明によれば、本明細書の他の箇所に記載のアッセイ法によって活性が検出できない場合にＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性が「消失する」。
【００９４】
他の実施形態では、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴをコードする遺伝子、又はこの両方の遺伝子を破壊することによって、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の活性を低下又は消失させることができる。本発明は、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ遺伝子の突然変異、又は両方の遺伝子の突然変異を有する突然変異誘発植物、特にウキクサ科のメンバーである植物を包含し、その突然変異は、ＦｕｃＴ及び／若しくはＸｙｌＴ遺伝子の発現を低下させ、又はコードされたＦｕｃＴ及び／若しくはＸｙｌＴの活性を阻害する。
【００９５】
本発明の方法には、それだけに限らないが、アンチセンス抑制、センス抑制、ＲＮＡ干渉、特異的欠失又は突然変異、ドミナントネガティブ戦略などを含めて、高等植物の細胞中でＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの活性又はレベルを低下又は消失させることについて当技術分野で知られている任意の方法又は機構が関与し得る。したがって、本明細書で開示されている方法及び組成物は、任意の作用機構又は理論に限定されず、対象とする高等植物の細胞中でＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの発現又は機能を阻害し、それによって植物中で産生される内因性及び異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化パターンを変化させる任意の方法を含む。
【００９６】
例えば、いくつかの実施形態では、ＦｕｃＴ阻害性配列若しくはＸｙｌＴ阻害性配列（又は両方）がセンス方向で発現し、センス方向転写物が、この酵素の一方又は両方の発現の同時抑制を引き起こす。或いは、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ阻害性配列（例えば、完全長配列、切断配列、配列の断片、その組合せなど）をアンチセンス方向で発現させることもでき、それによって、アンチセンス機構により内因性ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの発現又は機能が阻害される。
【００９７】
さらに他の実施形態では、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの１つ又は複数の阻害性配列は、センス配列とアンチセンス配列をどちらも含むヘアピンＲＮＡとして発現される。ヘアピン構造を含む実施形態では、ループ構造は、例えば、配列番号１又は２のＦｕｃＴポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／又は翻訳領域や、配列番号４、５、１９又は２０のＸｙｌＴポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／又は翻訳領域など、抑制する遺伝子の５’非翻訳及び／又は翻訳領域を含む任意の適切なヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ヘアピンとして発現されるＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ阻害性配列は、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴヌクレオチド配列の逆方向領域によってコードされる。さらに他の実施形態では、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ阻害性配列は二本鎖ＲＮＡとして発現され、一方のＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ阻害性配列がセンス方向で発現され、他方の相補性配列がアンチセンス方向で発現される。ＦｕｃＴヌクレオチド配列、ＸｙｌＴヌクレオチド配列、又はその組合せを含む二本鎖ＲＮＡ、ヘアピン構造、及びその組合せは、ＲＮＡ干渉、同時抑制、アンチセンス機構、その任意の組合せにより、又はＦｕｃＴ及び／若しくはＸｙｌＴの発現若しくは機能の阻害を引き起こす任意の他の機構により機能することができる。
【００９８】
したがって、多数の方法を使用して、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又はこの両方のタンパク質、及びその任意のアイソフォームの活性を低下又は消失させることができる。「アイソフォーム」とは、対象とするＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質の天然に存在するタンパク質変異体を意味し、その変異体は異なる遺伝子によってコードされる。一般に、対象とする特定のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質のアイソフォームは、対象とするＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。複数の方法を使用して、単一の植物ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ、及びそのアイソフォームの活性を低下又は消失させることができる。植物ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性を低下又は消失させる方法の非限定的な例を下記に示す。
【００９９】
ポリヌクレオチドに基づく方法：
本発明のいくつかの実施形態では、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現を阻害するポリヌクレオチドを発現することができる発現カセットで植物細胞を形質転換する。本明細書において「発現」という用語は、遺伝子産物の転写及び／又は翻訳を含めた遺伝子産物の生合成を指す。例えば、本発明の目的で、少なくとも１つのＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現を阻害するポリヌクレオチドを発現することができる発現カセットは、少なくとも１つのＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の転写及び／又は翻訳を阻害するＲＮＡ分子を産生することができる発現カセットである。ＤＮＡ分子からのタンパク質又はポリペプチドの「発現」又は「産生」とは、タンパク質又はポリペプチドを産生するコード配列の転写及び翻訳を指し、一方、ＲＮＡ分子からのタンパク質又はポリペプチドの「発現」又は「産生」とは、タンパク質又はポリペプチドを産生するＲＮＡコード配列の翻訳を指す。
【０１００】
ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現を阻害するポリヌクレオチドの例を下記に示す。
【０１０１】
センス抑制／同時抑制（sense suppression/cosuppression）
本発明のいくつかの実施形態では、センス抑制又は同時抑制によってＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現の阻害を得ることができる。同時抑制では、「センス」方向でＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方をコードするメッセンジャーＲＮＡの全部又は一部と対応するＲＮＡ分子を発現するように発現カセットを設計する。ＲＮＡ分子の過剰発現によって、天然遺伝子の発現を低下させることができる。したがって、同時抑制発現カセットで形質転換した複数の植物系統をスクリーニングして、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ発現の最大の阻害を示すものを同定する。
【０１０２】
同時抑制に使用するポリヌクレオチドは、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴをコードする配列の全部若しくは一部、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ転写物の５’及び／若しくは３’非翻訳領域の全部若しくは一部、又はコード配列とＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴをコードする転写物の非翻訳領域の両方の全部若しくは一部と対応し得る。ポリヌクレオチドがＦｕｃＴ又はＸｙｌＴタンパク質のコード領域の全部又は一部を含むいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンを除去するように発現カセットを設計し、その結果タンパク質産物が転写されなくなる。
【０１０３】
同時抑制を使用して植物遺伝子の発現を阻害して、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質のタンパク質レベルが検出できない植物を産生することができる。例えば、Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417-1432を参照されたい。同時抑制を使用して、同じ植物中の複数のタンパク質の発現を阻害することもできる。例えば、米国特許第５，９４２，６５７号を参照されたい。同時抑制を使用して植物中の内因性遺伝子の発現を阻害する方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Flavell et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3490-3496；Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973；Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938；Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417-1432；Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731；Yu et al. (2003) Phytochemistry 63:753-763；並びに米国特許第５，０３４，３２３号、第５，２８３，１８４号、及び第５，９４２，６５７号に記載されている。発現カセット中で、センス配列に対して３’、ポリアデニル化シグナルの５’の位置にポリｄＴ領域を含めることによって同時抑制の効率を高めることができる。参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開第２００２００４８８１４号を参照されたい。通常、そのようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写物の配列と実質的な配列同一性、最適には約６５％を超える配列同一性、より最適には約８５％を超える配列同一性、最も最適には約９５％を超える配列同一性を有する。参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，２８３，１８４号及び第５，０３４，３２３号を参照されたい。
【０１０４】
アンチセンス抑制
本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス抑制によってＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現の阻害を得ることができる。アンチセンス抑制では、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴをコードするメッセンジャーＲＮＡの全部又は一部と相補的なＲＮＡ分子を発現するように発現カセットを設計する。アンチセンスＲＮＡ分子の過剰発現によって、天然遺伝子の発現を低下させることができる。したがって、アンチセンス抑制発現カセットで形質転換した複数の植物系統をスクリーニングして、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ発現の最大の阻害を示すものを同定する。
【０１０５】
アンチセンス抑制で使用するポリヌクレオチドは、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴをコードする配列の相補体の全部若しくは一部、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ転写物の５’及び／若しくは３’非翻訳領域の相補体の全部若しくは一部、又はコード配列とＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴをコードする転写物の非翻訳領域の両方の相補体の全部若しくは一部と対応し得る。さらに、アンチセンスポリヌクレオチドは、標的配列と完全に相補的（すなわち標的配列の相補体との同一性が１００％）でもよく、又は部分的に相補的（すなわち標的配列の相補体との同一性が１００％未満）でもよい。アンチセンス抑制を使用して、同じ植物中の複数のタンパク質の発現を阻害することができる。例えば、米国特許第５，９４２，６５７号を参照されたい。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分を使用して、標的遺伝子の発現を妨害することができる。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００、４００、４５０、５００、５５０又はそれ以上の配列を使用することができる。アンチセンス抑制を使用して植物中の内因性遺伝子の発現を阻害する方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743並びに米国特許第５，７５９，８２９号及び第５，９４２，６５７号に記載されている。発現カセット中で、アンチセンス配列に対して３’、ポリアデニル化シグナルの５’の位置にポリｄＴ領域を含めることによってアンチセンス抑制の効率を高めることができる。参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開第２００２００４８８１４号を参照されたい。
【０１０６】
二本鎖ＲＮＡ干渉
本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉によってＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現の阻害を得ることができる。ｄｓＲＮＡ干渉では、同時抑制について上記に記載したもののようなセンスＲＮＡ分子、及びセンスＲＮＡ分子と完全に又は部分的に相補的なアンチセンスＲＮＡ分子を同じ細胞中で発現させ、その結果、対応する内因性メッセンジャーＲＮＡの発現が阻害される。
【０１０７】
センス及びアンチセンス分子の発現は、センス配列とアンチセンス配列をどちらも含むように発現カセットを設計することによって実現することができる。或いは、センス及びアンチセンス配列について別々の発現カセットを使用することもできる。次いで、１つ又は複数のｄｓＲＮＡ干渉発現カセットで形質転換した複数の植物系統をスクリーニングして、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ発現の最大の阻害を示す植物系統を同定する。ｄｓＲＮＡ干渉を使用して内因性植物遺伝子の発現を阻害する方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:13959-13964、Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743、並びにＷＯ９９／４９０２９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／６１６３１、及びＷＯ００／４９０３５に記載されている。
【０１０８】
ヘアピンＲＮＡ干渉及びイントロン含有ヘアピンＲＮＡ干渉
本発明のいくつかの実施形態では、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉又はイントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ，intron-containing hairpin RNA）干渉によってＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現の阻害を得ることができる。これらの方法は、内因性遺伝子の発現を阻害する効率が非常によい。Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38及びその中で引用されている参照文献を参照されたい。
【０１０９】
ｈｐＲＮＡ干渉では、それ自体とハイブリダイズして、一本鎖ループ領域及び塩基対ステムを含むヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子を発現するように発現カセットを設計する。塩基対ステム領域は、その発現を阻害する遺伝子をコードする内因性メッセンジャーＲＮＡの全部又は一部と対応するセンス配列、及びセンス配列と完全に又は部分的に相補的なアンチセンス配列を含む。したがって、分子の塩基対ステム領域は一般にＲＮＡ干渉の特異性を決定する。ｈｐＲＮＡ分子は内因性遺伝子の発現を阻害する効率が非常によく、それが誘導するＲＮＡ干渉は、その後の世代の植物によって受け継がれる。例えば、Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990；Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731；及びWaterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38を参照されたい。ｈｐＲＮＡ干渉を使用して遺伝子の発現を阻害又は抑制する方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990；Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731；Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38；Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7、及び米国特許公開第２００３０１７５９６５号に記載されている。インビボで遺伝子発現を抑制するｈｐＲＮＡ構築物の効率についての一過性アッセイは、参照により本明細書に組み込まれている、Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140に記載されている。
【０１１０】
ｉｈｐＲＮＡでは、干渉分子は、ｈｐＲＮＡと同じ一般構造を有するが、ＲＮＡ分子は、ｉｈｐＲＮＡが発現する細胞中でスプライスすることができるイントロンをさらに含む。イントロンの使用によって、スプライシング後のヘアピンＲＮＡ分子中のループのサイズが最小限となり、これによって干渉の効率が高まる。例えば、Smith et al. (2000) Nature 407:319-320を参照されたい。実際、Smith et al.は、ｉｈｐＲＮＡ媒介干渉を使用して内因性遺伝子発現の１００％の抑制を示している。ｉｈｐＲＮＡ干渉を使用して内因性植物遺伝子の発現を阻害する方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Smith et al. (2000) Nature 407:319-320；Wesley et al. (2001) Plant J. 27:581-590；Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150；Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38；Helliwell and Waterhouse (2003) Methods 30:289-295、及び米国特許公開第２００３０１８０９４５号に記載されている。
【０１１１】
ｈｐＲＮＡ干渉用発現カセットはまた、センス配列及びアンチセンス配列が内因性ＲＮＡと対応しないように設計することもできる。この実施形態では、センス及びアンチセンス配列は、標的遺伝子の内因性メッセンジャーＲＮＡの全部又は一部と対応するヌクレオチド配列を含むループ配列に隣接する。したがって、ループ領域がＲＮＡ干渉の特異性を決定する。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ０２／００９０４を参照されたい。
【０１１２】
ヘアピンの逆方向反復が、発現抑制する遺伝子のプロモーター領域と配列同一性を有するｈｐＲＮＡ構築物の使用を介して、転写遺伝子発現抑制（ＴＧＳ，Transcriptional gene silencing）を行うことができる。ｈｐＲＮＡをプロセシングして、相同なプロモーター領域と相互作用することができる低分子ＲＮＡにすると、分解又はメチル化を誘発して発現抑制をもたらすことができる（Aufsatz et al. (2002) PNAS 99 (Suppl. 4):16499-16506；Mette et al. (2000) EMBO J 19(19):5194-5201）。
【０１１３】
ヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子を発現するように設計された発現カセットを、本明細書においてＲＮＡｉ発現カセットと称する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ発現カセットは、図２８で概略を示す戦略に従って設計する。そのような実施形態では、ＲＮＡｉ発現カセットは、個々のＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ遺伝子の発現を抑制する（すなわち各カセットが単一遺伝子ノックアウトをもたらす）ように設計することもでき、又はＦｕｃＴとＸｙｌＴの遺伝子の発現をどちらも抑制する（すなわち、単一のＲＮＡｉ発現カセットがこの両方の遺伝子の発現を抑制する阻害性分子を発現する）ように設計することもできる。ＲＮＡｉ発現カセットがＦｕｃＴとＸｙｌＴの遺伝子の発現をどちらも抑制する場合、それを本明細書において「キメラ」ＲＮＡｉ発現カセットと称する。本明細書の下記で述べるように、大きなｈｐＲＮＡ構造、或いは低分子ｈｐＲＮＡ構造を発現するように、単一遺伝子及びキメラＲＮＡｉ発現カセットを設計することができる。
【０１１４】
したがって、いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡ転写物と十分な相同性を有する大きなｈｐＲＮＡ構造を発現して、ＦｕｃＴとＸｙｌＴの一方又は両方の転写後遺伝子発現抑制をもたらすようにＲＮＡｉ発現カセットを設計する。大きなｈｐＲＮＡ構造では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター、約５００〜約８００ヌクレオチド（ｎｔ）のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴのセンス鎖をそれぞれ含むＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子配列の順方向断片(forward fragment)、本明細書の下記で述べる約１００〜約７００ｎｔの任意の配列を含むスペーサー配列、及びそれぞれの（すなわち、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ）順方向断片と相補的なアンチセンス配列を含む、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子配列の逆方向断片(reverse fragment)を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。したがって、例えば、順方向断片がヌクレオチド「...acttg...」によって表される場合、対応する逆方向断片は、ヌクレオチド「...caagt...」によって表され、そのようなＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖は、下記の配列：「５’−...acttg...nnnn...caagt...−３’」を含み、「nnnn」はスペーサー配列を表す。
【０１１５】
順方向断片は、標的ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ遺伝子配列のセンス鎖の対応する部分と１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでもよく、又は選択的に、発現抑制する標的ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ遺伝子のセンス鎖の対応する部分と少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含んでもよいことが認められている。同様に、逆方向断片は、順方向断片の相補体と１００％の配列同一性を有する必要がなく、むしろ、阻害性ＲＮＡ分子が発現したときに順方向断片及び逆方向断片と対応する転写領域がハイブリダイズしてｈｐＲＮＡ構造の塩基対ステム（すなわち、二本鎖部分）を形成するように、長さ及び順方向断片配列との相補性が十分でなければならないことが認められている。「十分な長さ」とは、順方向断片の長さの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％であり、より頻繁には、順方向断片の長さの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である長さを意味する。「十分な相補性」とは、逆方向断片の配列が、逆方向断片とハイブリダイズしてｈｐＲＮＡ構造の塩基対ステムを形成する順方向断片の部分の相補体と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有することを意味する。したがって、いくつかの実施形態では、逆方向断片は順方向断片の相補体（すなわち、アンチセンス型）である。
【０１１６】
そのようなＲＮＡｉ発現カセットを設計する際に、順方向断片、スペーサー配列、及び逆方向断片の長さは、ｈｐＲＮＡ構築物をコードするポリヌクレオチドの合計の長さが約６５０〜約２５００ｎｔ、約７５０〜約２５００ｎｔ、約７５０〜約２４００ｎｔ、約１０００〜約２４００ｎｔ、約１２００〜約２３００ｎｔ、約１２５０〜約２１００ｎｔ、又は約１５００〜約１８００となるように選択する。いくつかの実施形態では、発現したヘアピン構築物の合計の長さは、約６５０ｎｔ、約７００ｎｔ、約７５０ｎｔ、約８００ｎｔ、約８５０ｎｔ、約９００ｎｔ、約９５０ｎｔ、約１０００ｎｔ、約１０５０ｎｔ、約１１００ｎｔ、約１１５０ｎｔ、約１２００ｎｔ、約１２５０ｎｔ、約１３００ｎｔ、約１３５０ｎｔ、約１４００ｎｔ、約１４５０ｎｔ、約１５００ｎｔ、約１５５０ｎｔ、約１６００ｎｔ、約１６５０ｎｔ、約１７００ｎｔ、約１７５０ｎｔ、約１８００ｎｔ、約１８５０ｎｔ、約１９００ｎｔ、約１９５０ｎｔ、約２０００ｎｔ、約２０５０ｎｔ、約２１００ｎｔ、約２１５０ｎｔ、約２２００ｎｔ、約２２５０ｎｔ、約２３００ｎｔ、又は約６５０ｎｔ〜約２３００ｎｔの任意の長さである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、順方向断片は、約５００〜約８００ｎｔ、例えば、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、又は８００ｎｔのＦｕｃＴ又はＸｙｌＴのセンス鎖、例えば、配列番号１若しくは２（ＦｕｃＴ）又は配列番号４、５、１９、若しくは２０（ＸｙｌＴ）で示すセンス鎖を含み、スペーサー配列は、約１００〜約７００ｎｔ、例えば、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、又は７００ｎｔの下記で述べる任意の配列を含み、逆方向断片は、順方向断片配列のアンチセンス鎖、又は十分な長さ及び順方向断片配列との十分な相補性を有する配列を含む。
【０１１８】
スペーサー配列は、スペーサー領域と対応する発現した阻害性ＲＮＡ分子の部分が自己ハイブリダイズせず、したがってヘアピンＲＮＡ構造のループを形成しないように、標的遺伝子、すなわちＦｕｃＴ又はＸｙｌＴとの相同性が不十分であり、それ自体との相同性が不十分である任意の配列でよい。いくつかの実施形態では、スペーサー配列はイントロンを含み、したがって、発現した阻害性ＲＮＡ分子は本明細書の上記で述べたｉｈｐＲＮＡを形成する。他の実施形態では、スペーサー配列は、発現抑制するＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子のセンス鎖の部分、例えば、配列番号１若しくは２（ＦｕｃＴ）又は配列番号４、５、１９、若しくは２０（ＸｙｌＴ）で示すセンス鎖の部分、特に順方向断片配列のすぐ下流にあるセンス鎖の部分を含む。
【０１１９】
作動的に連結したプロモーターは、本明細書の下記で開示するプロモーターの１つを含めて、対象とする植物内で作動的に連結した阻害性ポリヌクレオチドの発現をもたらす、対象とする任意のプロモーターでよい。制御領域は、それだけに限らないが、５’リーダー配列、及び本明細書の下記で論じる植物イントロンを加えた５’リーダー配列を含めて、阻害性ポリヌクレオチドの発現を亢進するさらなる制御エレメントを含んでよい。
【０１２０】
一実施形態では、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチド、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号１若しくは配列番号２の配列と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号１若しくは配列番号２の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＦｕｃＴポリペプチドの発現を抑制するように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計する。このように、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；配列番号１のｎｔ２５５〜９８５を含むＦｕｃＴ遺伝子配列の順方向断片；上記で述べた任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；及び配列番号１のｎｔ２５５〜９８５の相補体（すなわちアンチセンス型）を含むＦｕｃＴ遺伝子配列の逆方向断片を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。そのような一実施形態では、スペーサー配列は、配列番号１のｎｔ９８６〜１４４４によって表され、ｈｐＲＮＡ構造のコード配列と対応するＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖のその部分の全長は１９１８ｎｔである。このＲＮＡｉ発現カセット、例えば、図８に示すベクターを含むヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換すると、ｈｐＲＮＡ構造が発現する植物の植物細胞内でのＦｕｃＴの発現が有効に阻害される。一実施形態では、所望の植物はウキクサ科のメンバー、例えばウキクサのメンバーであり、植物は図８に示すベクターで安定に形質転換されている。
【０１２１】
本発明の他の実施形態では、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチド、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号４、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の配列と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号４、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＸｙｌＴポリペプチドの発現を抑制するように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計する。このように、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；配列番号４のｎｔ３１８〜１０５２を含むＸｙｌＴ遺伝子配列の順方向断片；上記で述べた任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；及び配列番号４のｎｔ３１８〜１０５２の相補体（すなわちアンチセンス型）を含むＸｙｌＴ遺伝子配列の逆方向断片を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。そのような一実施形態では、スペーサー配列は、配列番号４のｎｔ１０５３〜１５９９によって表され、ｈｐＲＮＡ構造のコード配列と対応するＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖のその部分の全長は２０１５ｎｔである。このＲＮＡｉ発現カセット、例えば、図９に示すベクターを含むヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換すると、ｈｐＲＮＡ構造が発現する植物の植物細胞内でのＦｕｃＴの発現が有効に阻害される。一実施形態では、対象とする植物はウキクサ科のメンバー、例えばウキクサのメンバーであり、植物は図９に示すベクターで安定に形質転換されている。
【０１２２】
他の実施形態では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；配列番号１９のｎｔ１〜７３４を含むＸｙｌＴ遺伝子配列の順方向断片；上記で述べた任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；及び配列番号１９のｎｔ１〜７３４の相補体（すなわちアンチセンス型）を含むＸｙｌＴ遺伝子配列の逆方向断片を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。そのような一実施形態では、スペーサー配列は、配列番号１９のｎｔ７３５〜１２８２によって表され、ｈｐＲＮＡ構造のコード配列と対応するＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖のその部分の全長は２０１５ｎｔである。このＲＮＡｉ発現カセット、例えば、図９に示すベクターを含むヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換すると、ｈｐＲＮＡ構造が発現する植物の植物細胞内でのＦｕｃＴの発現が有効に阻害される。一実施形態では、対象とする植物はウキクサ科のメンバー、例えばウキクサのメンバーであり、植物は図９に示すベクターで安定に形質転換されている。
【０１２３】
さらに他の実施形態では、アンチセンス配列及びセンス配列が反対の方向となるように、大きなｈｐＲＮＡ構造を設計することができる。このように、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター、アンチセンス方向の完全長ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子配列、及びセンス方向の配列の３’側半分を含むＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子配列の順方向断片を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する（図２８、設計１を参照）。この型の構築物では、配列の３’側半分はｈｐＲＮＡの塩基対（すなわち二本鎖）ステムを形成し、配列の５’側半分はスペーサー配列として働く。任意の理論又は機構に拘泥するものではないが、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ配列の３’領域は５’領域と比較して異なる植物種間で比較的保存されているので、この構築物のｈｐＲＮＡの二本鎖領域が形成されるようにこの領域を選択する。
【０１２４】
そのような一実施形態では、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチド、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号１若しくは配列番号２の配列と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号１若しくは配列番号２の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＦｕｃＴポリペプチドの発現を抑制するように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計する。このように、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；アンチセンス方向の配列番号１のヌクレオチド１〜１８６５、及びセンス方向の配列番号１のヌクレオチド９５０〜１８６５を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。このＲＮＡｉ発現カセットを含むヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換すると、ｈｐＲＮＡ構造が発現する植物の植物細胞内でのＦｕｃＴの発現が有効に阻害される。一実施形態では、所望の植物はウキクサ科のメンバー、例えばウキクサのメンバーである。
【０１２５】
他のそのような実施形態では、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチド、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号４、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の配列と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＸｙｌＴポリペプチドの発現を抑制するように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計する。このように、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター、アンチセンス方向の配列番号４のヌクレオチド１〜１８６０、及びセンス方向の配列番号４のヌクレオチド９５０〜１８６０を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。このＲＮＡｉ発現カセットを含むヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換すると、ｈｐＲＮＡ構造が発現する植物の植物細胞内でのＸｙｌＴの発現が有効に阻害される。一実施形態では、所望の植物はウキクサ科のメンバー、例えばウキクサのメンバーである。
【０１２６】
他のそのような実施形態では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター、アンチセンス方向の配列番号１９のヌクレオチド１〜１２８２、及びセンス方向の配列番号１９のヌクレオチド６５２〜１２８２を含むように、ＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。このＲＮＡｉ発現カセットを含むヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換すると、ｈｐＲＮＡ構造が発現する植物の植物細胞内でのＸｙｌＴの発現が有効に阻害される。一実施形態では、所望の植物はウキクサ科のメンバー、例えばウキクサのメンバーである。
【０１２７】
ＦｕｃＴとＸｙｌＴの両方のタンパク質の抑制が所望される場合、それは、単一の形質転換事象で植物中にこれらの単一遺伝子ＲＮＡｉ発現カセットを導入することによって、例えば、これらの単一遺伝子ＲＮＡｉ発現カセットを単一の形質転換ベクター、例えば図１１に示すものと類似したベクター内で構築することによって、又は別々の同時形質転換事象として、例えば、これらの単一遺伝子ＲＮＡｉ発現カセットを２つの形質転換ベクター、例えば図８及び９に示すものと類似したベクター内で構築することによって、本明細書の他の箇所で開示されている形質転換方法を含むがそれだけに限らない、当技術分野で知られている任意の適切な形質転換方法を使用して実現することができる。
【０１２８】
或いは、ＦｕｃＴとＸｙｌＴの両方のタンパク質の抑制は、対象とする高等植物中に本明細書の上記で述べたキメラＲＮＡｉ発現カセットを導入することによって実現することもできる。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；約５００〜約６５０ヌクレオチド（ｎｔ）のＦｕｃＴのセンス鎖及び約５００〜約６５０ｎｔのＸｙｌＴのセンス鎖を含み、ＦｕｃＴ配列及びＸｙｌＴ配列の順序がどちらでもよいキメラ順方向断片；任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；並びにそれぞれのキメラ順方向断片と相補的なアンチセンス配列を含むキメラ順方向断片の逆方向断片を含むように、キメラＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。
【０１２９】
個々のＲＮＡｉ発現カセットについて前記で述べたように、キメラ順方向配列内にある個々のＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ配列は、標的ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ遺伝子配列それぞれのセンス鎖の対応する部分と１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでもよく、又は選択的に、発現抑制する標的ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ遺伝子のセンス鎖の対応する部分と少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくは少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含んでもよいことが認められている。同様に、逆方向断片は、キメラ順方向断片の相補体と１００％の配列同一性を有する必要がなく、むしろ、阻害性ＲＮＡ分子が発現したときにキメラ順方向断片及び逆方向断片と対応する転写領域がハイブリダイズしてｈｐＲＮＡ構造の塩基対ステム（すなわち、二本鎖部分）を形成するように、長さ及び本明細書の上記で定義したキメラ順方向断片配列との相補性が十分でなければならないことが認められている。そのようなキメラＲＮＡｉ発現カセットを設計する際に、順方向断片、スペーサー配列、及び逆方向断片の長さは、ｈｐＲＮＡ構築物をコードするポリヌクレオチドの合計の長さが約１２００〜約３３００ｎｔ、約１２５０〜約３３００ｎｔ、約１３００〜約３３００ｎｔ、約１３５０〜約３３００ｎｔ、約１４００〜約３３００ｎｔ、約１４５０ｎｔ〜約３３００ｎｔ、約１５００〜約３３００ｎｔ、約２２００〜約３１００ｎｔ、約２２５０〜約２８００ｎｔ、又は約２５００〜約２７００ｎｔとなるように選択する。いくつかの実施形態では、発現したヘアピン構築物の合計の長さは、約１２００ｎｔ、約１２５０ｎｔ、約１３００ｎｔ、約１３５０ｎｔ、約１４００ｎｔ、約１４５０ｎｔ、約１５００ｎｔ、約１８００ｎｔ、約２２００ｎｔ、約２２５０ｎｔ、約２３００ｎｔ、約２３５０ｎｔ、約２４００ｎｔ、約２４５０ｎｔ、約２５００ｎｔ、約２５５０ｎｔ、約２６００ｎｔ、約２６５０ｎｔ、約２７００ｎｔ、約２７５０ｎｔ、約２８００ｎｔ、約２８５０ｎｔ、約２９００ｎｔ、約２９５０ｎｔ、約３０００ｎｔ、約３０５０ｎｔ、約３１００ｎｔ、約３１５０ｎｔ、約３２００ｎｔ、約３２５０ｎｔ、約３３００ｎｔ、又は約１２００ｎｔ〜約３３００ｎｔの任意の長さである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、キメラ順方向断片は、約５００〜約６５０ｎｔ、例えば、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、又は６５０ｎｔのＦｕｃＴのセンス鎖、例えば、配列番号１又は２で示すセンス鎖、及び約５００〜約６５０ｎｔ、例えば、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、又は６５０ｎｔのＸｙｌＴのセンス鎖、例えば、配列番号４、５、１９、又は２０で示すセンス鎖を含み、そのＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ配列はどの順序で融合してもよく、スペーサー配列は、約１００〜約７００ｎｔ、例えば、１００、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、又は７００ｎｔの対象とする任意の配列を含み、逆方向断片は、キメラ順方向断片配列のアンチセンス鎖、又は十分な長さ及びキメラ順方向断片配列との十分な相補性を有する配列を含む。
【０１３１】
単一遺伝子ＲＮＡｉ発現カセットについて前記で述べたように、スペーサー配列は、スペーサー領域と対応する発現した阻害性ＲＮＡ分子の部分が自己ハイブリダイズせず、したがってｈｐＲＮＡ構造のループを形成しないように、標的遺伝子、すなわちＦｕｃＴ又はＸｙｌＴとの相同性が不十分であり、それ自体との相同性が不十分である任意の配列でよい。いくつかの実施形態では、スペーサー配列はイントロンを含み、したがって、発現した阻害性ＲＮＡ分子は本明細書の上記で述べたｉｈｐＲＮＡを形成する。他の実施形態では、スペーサー配列は、発現抑制するＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子のセンス鎖の部分、例えば、配列番号１若しくは２（ＦｕｃＴ）又は配列番号４、５、１９、若しくは２０（ＸｙｌＴ）で示すセンス鎖の部分を含む。一実施形態では、キメラ順方向断片は、その順序で融合したＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ配列を含み、スペーサー配列は、キメラ順方向断片内に含有されるＸｙｌＴ配列のすぐ下流にあるＸｙｌＴセンス鎖の部分を含む。他の実施形態では、キメラ順方向断片は、その順序で融合したＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ配列を含み、スペーサー配列は、キメラ順方向断片内に含有されるＦｕｃＴ配列のすぐ下流にあるＦｕｃＴセンス鎖の部分を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチド、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号１若しくは配列番号２の配列と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号１若しくは配列番号２の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＦｕｃＴポリペプチドの発現を抑制し、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチド、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号４、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の配列と少なくとも７５％の配列同一性、例えば、配列番号４、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列によってコードされるＸｙｌＴポリペプチドの発現を抑制するように、キメラＲＮＡｉ発現カセットを設計する。これらの実施形態のいくつかでは、配列番号１又は配列番号２のｎｔ７００〜ｎｔ１４００と対応するようにキメラ順方向断片内のＦｕｃＴ配列を選択し、かつ／或いは配列番号４又は配列番号５のｎｔ７００〜ｎｔ１４００、又は配列番号１９若しくは２０のｎｔ３８３〜ｎｔ１０８３と対応するようにキメラ順方向断片内のＸｙｌＴ配列を選択する。理論に拘泥するものではないが、（特にＦｕｃＴについて）この領域が異なる植物種間で比較的保存されており、したがって潜在的に良好な標的であると考えられる。
【０１３３】
他の実施形態では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；配列番号１のｎｔ２５４〜８５５（ＦｕｃＴ配列）及び配列番号４のｎｔ３１８〜９４３（ＸｌｙＴ配列）を含むキメラ順方向断片；上記で述べた任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；並びにキメラ順方向断片の相補体（すなわちアンチセンス型）を含む、すなわち配列番号４のｎｔ３１８〜９４３の相補体及び配列番号１のｎｔ２５４〜８５５の相補体を含む逆方向断片を含むように、キメラＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。特定の実施形態では、このキメラＲＮＡｉ発現カセット内のスペーサー配列は、配列番号４のｎｔ９４４〜１４４３によって表され、ｈｐＲＮＡ構造のコード配列と対応するＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖のその部分の全長は２９５６ｎｔである。
【０１３４】
他のそのような実施形態では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；配列番号４のｎｔ３１８〜９４３（ＸｌｙＴ配列）及び配列番号１のｎｔ２５４〜８５５（ＦｕｃＴ配列）を含むキメラ順方向断片；上記で述べた任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；並びにキメラ順方向断片の相補体（すなわちアンチセンス型）を含む、すなわち配列番号１のｎｔ２５４〜８５５の相補体及び配列番号４のｎｔ３１８〜９４３の相補体を含む逆方向断片を含むように、キメラＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。特定の実施形態では、このキメラＲＮＡｉ発現カセット内のスペーサー配列は、配列番号１のｎｔ８５６〜１３５５によって表され、ｈｐＲＮＡ構造のコード配列と対応するＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖のその部分の全長は２９５６ｎｔである。
【０１３５】
さらに他の実施形態では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；配列番号１のｎｔ２５４〜８５５（ＦｕｃＴ配列）及び配列番号１９のｎｔ１〜６２６（ＸｌｙＴ配列）を含むキメラ順方向断片；上記で述べた任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；並びにキメラ順方向断片の相補体（すなわちアンチセンス型）を含む、すなわち配列番号１９のｎｔ１〜６２６の相補体及び配列番号１のｎｔ２５４〜８５５の相補体を含む逆方向断片を含むように、キメラＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。特定の実施形態では、このキメラＲＮＡｉ発現カセット内のスペーサー配列は、配列番号１９のｎｔ６２７〜１１２６によって表され、ｈｐＲＮＡ構造のコード配列と対応するＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖のその部分の全長は２９５６ｎｔである。
【０１３６】
他のそのような実施形態では、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：対象とするプロモーター；配列番号１９のｎｔ１〜６２６（ＸｌｙＴ配列）及び配列番号１のｎｔ２５４〜８５５（ＦｕｃＴ配列）を含むキメラ順方向断片；上記で述べた任意の配列の約１００〜約７００ｎｔを含むスペーサー配列；並びにキメラ順方向断片の相補体（すなわちアンチセンス型）を含む、すなわち配列番号１のｎｔ２５４〜８５５の相補体及び配列番号１９のｎｔ１〜６２６の相補体を含む逆方向断片を含むように、キメラＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖を設計する。特定の実施形態では、このキメラＲＮＡｉ発現カセット内のスペーサー配列は、配列番号１のｎｔ８５６〜１３５５によって表され、ｈｐＲＮＡ構造のコード配列と対応するＲＮＡｉ発現カセットのセンス鎖のその部分の全長は２９５６ｎｔである。
【０１３７】
本明細書に記載のキメラＲＮＡｉ発現カセットを含むヌクレオチド構築物で植物を安定に形質転換すると、例えば、図１０に示すベクターで安定な形質転換を行うと、ｈｐＲＮＡ構造が発現する植物の植物細胞内でのＦｕｃＴとＸｙｌＴの発現がどちらも有効に阻害される。一実施形態では、所望の植物はウキクサ科のメンバー、例えばウキクサのメンバーであり、植物は図１０に示すベクターで安定に形質転換されている。
【０１３８】
少なくとも２つのこれらのキメラＲＮＡｉ発現カセットで植物を安定に形質転換して、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴタンパク質の任意のアイソフォームの発現抑制を含めたこれらのタンパク質の非常に効率のよい遺伝子発現抑制をもたらすことができることが認められている。例えば、図２８の「考えられる設計２」で示す２つの位置付けを参照されたい。このように、キメラ順方向断片がその順序で融合したＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ配列を含み、スペーサー配列がキメラ順方向断片内に含有されるＸｙｌＴ配列のすぐ下流にあるＸｙｌＴセンス鎖の部分を含む第１のキメラＲＮＡｉ発現カセット、並びにキメラ順方向断片がその順序で融合したＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ配列を含み、スペーサー配列がキメラ順方向断片内に含有されるＦｕｃＴ配列のすぐ下流にあるＦｕｃＴセンス鎖の部分を含む第２のキメラＲＮＡｉ発現カセットで植物を安定に形質転換することができる。
【０１３９】
大きなｈｐＲＮＡ構造又は大きなｉｈｐＲＮＡ構造をコードする任意のＲＮＡｉ発現カセット内にある作動的に連結したプロモーターは、本明細書の下記で開示するプロモーターの１つを含めて、対象とする植物内で作動的に連結した阻害性ポリヌクレオチドの発現をもたらす、対象とする任意のプロモーターでよい。制御領域は、それだけに限らないが、５’リーダー配列、及び本明細書の下記で論じる植物イントロンを加えた５’リーダー配列を含めて、阻害性ポリヌクレオチドの発現を亢進するさらなる制御エレメントを含んでよい。
【０１４０】
さらに他の実施形態では、約２００個以下の塩基対を含む塩基対ステム領域を有する小さなｈｐＲＮＡ構造の発現をもたらすようにＲＮＡｉ発現カセットを設計することができる。好ましくは、小さなｈｐＲＮＡ構造の発現は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターによって促進される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願第２００４０２３１０１６号を参照されたい。
【０１４１】
このように、転写されたＤＮＡ領域が、センス及びアンチセンスヌクレオチド領域を含むＲＮＡ分子をコードし、そのセンスヌクレオチド配列が、対象とする遺伝子から転写されたＲＮＡに由来する約１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する約１９個の連続したヌクレオチドを含み、そのアンチセンスヌクレオチド配列が、センス配列の約１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する約１９個の連続したヌクレオチドを含むように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計する。ＲＮＡ分子のセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列は、長さ約１９〜約２００ヌクレオチド、或いは約２１〜約９０又は１００ヌクレオチド、或いは約４０〜約５０ヌクレオチドのＲＮＡの塩基対（すなわち二本鎖）ステム領域を形成することができるはずである。しかし、ＲＮＡ分子の塩基対ステム領域の長さは、長さ約３０、約６０、約７０又は約８０ヌクレオチドでもよい。ＲＮＡ分子の塩基対ステム領域が１９ヌクレオチドより大きい場合、そのセンス鎖が対象とする標的ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリヌクレオチドの１９個の連続したヌクレオチドと「同一」（１個の不整合は許容する）である約１９ヌクレオチドの少なくとも１つの二本鎖領域（センス領域とアンチセンス領域の間に約１個の不整合が存在してよい）が存在することだけが要求される。この型のＲＮＡｉ発現カセットの転写ＤＮＡ領域は、センスコードヌクレオチド領域とアンチセンスコードヌクレオチド領域の間に位置するスペーサー配列を含んでよい。スペーサー配列は、標的ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリヌクレオチドと関係せず、長さが３〜約１００ヌクレオチド、或いは約６〜約４０ヌクレオチドでよい。この型のＲＮＡｉ発現カセットはまた、ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識される転写停止配列をも含み、その配列はオリゴｄＴストレッチであり、カセットのアンチセンスコードヌクレオチド領域の下流に位置する。「オリゴｄＴストレッチ」とは、一続きの連続したＴ残基である。それは、少なくとも４個のＴ残基を含むべきであるが、明らかに、より多くのＴ残基を含有してよい。
【０１４２】
短いｈｐＲＮＡを設計する際に、ＲＮＡｉ発現カセットのｈｐＲＮＡコード部分内に含まれる、標的とする遺伝子配列の断片（すなわち、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子配列の断片）及び任意のスペーサー配列は、ＧＣに富む配列、特に３つ連続したＧ／Ｃを有するものを回避し、ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識される転写停止配列として働く一連の「ＴＴＴＴ．．．」のような４つ以上の連続したＴ又はＡの発生を回避するように選択されることが認められている。
【０１４３】
したがって、短いｈｐＲＮＡでの遺伝子発現抑制が所望される場合、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：本明細書の下記で定義する植物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーター；センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片であって、センスヌクレオチド配列が、対象とするＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子のセンス鎖に由来する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンスヌクレオチド配列が、センス配列の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含み、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列が、長さ約１９〜約２００ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを形成することができるＤＮＡ断片；並びに少なくとも４個の連続したＴ残基を含むオリゴｄＴストレッチを含むように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計することができる。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態では、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチド、配列番号３のＦｕｃＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号１若しくは配列番号２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によってコードされるＦｕｃＴポリペプチドの発現を抑制する小さなｈｐＲＮＡを発現するようにＲＮＡｉ発現カセットを設計する。このように、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：本明細書の下記で定義する植物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーター；センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片であって、センスヌクレオチド配列が、配列番号１の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンスヌクレオチド配列が、センス配列の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含み、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列が、長さ約１９〜約２００ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを形成することができるＤＮＡ断片；並びに少なくとも４個の連続したＴ残基を含むオリゴｄＴストレッチを含むように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計することができる。
【０１４５】
本発明の他の実施形態では、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチド、配列番号６若しくは配列番号２１のＸｙｌＴポリペプチドの生物学的に活性のある変異体、又は配列番号４、配列番号５、配列番号１９、若しくは配列番号２０の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によってコードされるＸｙｌＴポリペプチドの発現を抑制する小さなｈｐＲＮＡを発現するようにＲＮＡｉ発現カセットを設計する。このように、５’から３’の方向で下記の作動的に連結したエレメント：本明細書の下記で定義する植物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーター；センス及びアンチセンスヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片であって、センスヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンスヌクレオチド配列が、センス配列の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と約９０％〜約１００％の配列同一性を有する少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含み、センス及びアンチセンスヌクレオチド配列が、長さ約１９〜約２００ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを形成することができるＤＮＡ断片；並びに少なくとも４個の連続したＴ残基を含むオリゴｄＴストレッチを含むように、ＲＮＡｉ発現カセットを設計することができる。
【０１４６】
単位複製配列媒介干渉
単位複製配列発現カセットは、標的遺伝子の全部又は一部を含有するが一般には天然ウイルスの遺伝子の全部を含有するわけではない植物ウイルス由来配列を含む。発現カセットの転写産物中に存在するウイルス配列は、転写産物がそれ独自の複製を誘導することを可能にする。単位複製配列によって産生された転写物は、標的配列（すなわち、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方のメッセンジャーＲＮＡ）に対してセンスである可能性もあり、又はアンチセンスである可能性もある。単位複製配列を使用して内因性植物遺伝子の発現を阻害する方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Angell and Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684、Angell and Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362、及び米国特許第６，６４６，８０５号に記載されている。
【０１４７】
リボザイム
いくつかの実施形態では、本発明の発現カセットによって発現されるポリヌクレオチドは触媒ＲＮＡであり、或いはＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方のメッセンジャーＲＮＡに特異的なリボザイム活性を有する。したがって、そのポリヌクレオチドは、内因性メッセンジャーＲＮＡの分解を引き起こし、その結果、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現が低下する。この方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。
【０１４８】
低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ
本発明のいくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子の発現によるＲＮＡ干渉によってＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の発現の阻害を得ることができる。ｍｉＲＮＡは、約２２個のリボヌクレオチドからなる制御性作用物質である。ｍｉＲＮＡは、内因性遺伝子の発現を阻害する効率が非常によい。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263を参照されたい。
【０１４９】
ｍｉＲＮＡ干渉では、内因性ｍｉＲＮＡ遺伝子をモデルとしたＲＮＡ分子を発現するように発現カセットを設計する。ｍｉＲＮＡ遺伝子は、他の内因性遺伝子（標的遺伝子）と相補的な２２ヌクレオチドの配列を含有するヘアピン構造を形成するＲＮＡをコードする。ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ発現の抑制では、２２ヌクレオチドの配列は、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ転写物の配列から選択され、センス方向の２２ヌクレオチドの前記ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ配列、及びセンス配列と相補的な２１ヌクレオチドの対応するアンチセンス配列を含有する。ｍｉＲＮＡ分子は内因性遺伝子の発現を阻害する効率が非常によく、それが誘導するＲＮＡ干渉は、その後の世代の植物によって受け継がれる。
【０１５０】
遺伝子発現のポリペプチドに基づく阻害
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方をコードする遺伝子と結合し、その結果遺伝子の発現が低下するジンクフィンガータンパク質をコードする。特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質はＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子の制御領域と結合する。他の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質はＦｕｃＴ又はＸｙｌＴをコードするメッセンジャーＲＮＡと結合し、その翻訳を防止する。ジンクフィンガータンパク質による標的となる部位を選択する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に記載され、ジンクフィンガータンパク質を使用して植物中の遺伝子の発現を阻害する方法は、例えば、米国特許公開第２００３００３７３５５号に記載され、これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５１】
タンパク質活性のポリペプチドに基づく阻害
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＦｕｃＴ又はＸｙｌＴと結合し、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性を低下させる抗体をコードする。他の実施形態では、抗体の結合により、細胞の品質調節機構による抗体とＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの複合体の代謝回転が高まる。植物細胞中での抗体の発現、並びに植物細胞中のタンパク質に対する抗体の発現及び結合による分子経路の阻害は当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Conrad and Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36を参照されたい。
【０１５２】
遺伝子破壊
本発明のいくつかの実施形態では、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方をコードする遺伝子を破壊することによってＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の活性を低下又は消失させることができる。ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方をコードする遺伝子は、当技術分野で知られている任意の方法によって破壊することができる。例えば、一実施形態では、トランスポゾンタギングによって遺伝子を破壊する。他の実施形態では、ランダム又は標的突然変異生成を使用して植物に突然変異を誘発させ、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの活性が低下している植物を選択することによって遺伝子を破壊する。
【０１５３】
トランスポゾンタギング
本発明の一実施形態では、トランスポゾンタギングを使用して、ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方の活性を低下又は消失させる。トランスポゾンタギングは、内因性ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子内にトランスポゾンを挿入して、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの発現を低下又は消失させるステップを含む。本発明によれば、「ＦｕｃＴ」又は「ＸｙｌＴ」遺伝子は、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴをそれぞれコードする遺伝子を意味するものとする。
【０１５４】
この実施形態では、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴをコードする遺伝子の制御領域又はコード領域内にトランスポゾンを挿入することによってＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの発現を低下又は消失させる。ＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ又は両方のエキソン、イントロン、５’若しくは３’非翻訳配列、プロモーター、又は任意の他の制御配列内にあるトランスポゾンを使用して、コードされたＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの発現及び／又は活性を低下又は消失させることができる。
【０１５５】
植物中の特定の遺伝子のトランスポゾンタギングの方法は当技術分野で周知である。例えば、Maes et al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96；Dharmapuri and Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59；Meissner et al. (2000) Plant J. 22:265-274；Phogat et al. (2000) J. Biosci. 25:57-63；Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107；Gai et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96；Fitzmaurice et al. (1999) Genetics 153:1919-1928を参照されたい。さらに、選択された遺伝子中のＭｕ挿入を選択するＴＵＳＣ法（TUSC process）は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Bensen et al. (1995) Plant Cell 7:75-84；Mena et al. (1996) Science 274:1537-1540に記載されている。
【０１５６】
本発明は、ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの活性を低下又は消失させるさらなる方法を包含する。植物中のゲノムヌクレオチド配列を変化又は突然変異させる他の方法の例は当技術分野で知られ、その例には、それだけに限らないが、ＲＮＡ：ＤＮＡベクター、ＲＮＡ：ＤＮＡ突然変異ベクター、ＲＮＡ：ＤＮＡ修復ベクター、混合二重鎖オリゴヌクレオチド、自己相補性ＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチド、及び組換えオリゴ核酸塩基の使用がある。そのようなベクター及び使用方法は当技術分野で知られている。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５６５，３５０号、第５，７３１，１８１号、第５，７５６，３２５号、第５，７６０，０１２号、第５，７９５，９７２号及び第５，８７１，９８４号を参照されたい。それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ９８／４９３５０、ＷＯ９９／０７８６５、ＷＯ９９／２５８２１、及びBeetham et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA96:8774-8778も参照されたい。
【０１５７】
したがって、任意の上記の方法により対象とする高等植物中でのＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの発現の阻害を行って、その植物内で産生される内因性の異種糖タンパク質が、β１，２−結合キシロース残基及び／又はα１，３−結合フコース残基の量が低下した複合Ｎ−グリカンを含むように、この糖タンパク質のＮ−グリコシル化パターンを変化させることができる。β１，２−結合キシロース残基及び／又はα１，３−結合フコース残基と糖タンパク質Ｎ−グリカンの結合が低下する程度は、それぞれのＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ酵素の発現の阻害の程度によって左右される。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＸｙｌＴ発現を標的とする本明細書に記載の方法を使用して安定に形質転換された植物宿主中で産生された組換え糖タンパク質は、ＸｙｌＴ酵素及びそのアイソフォームの発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物宿主中で産生された糖タンパク質のそれぞれのＮ−結合グリカン中に存在する５０％未満、４０％未満、３０％未満のβ１，２−結合キシロース残基を含むＮ−結合グリカンを有する。他の実施形態では、これらの組換え糖タンパク質は、ＸｙｌＴ酵素及びそのアイソフォームの発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物宿主中で産生された糖タンパク質のそれぞれのＮ−結合グリカン中に存在する２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満のβ１，２−結合キシロース残基を含むＮ−結合グリカンを有する。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、植物内で産生された組換え糖タンパク質が、β１，２−結合キシロース残基がないＮ−結合グリカンを有するような、安定に形質転換された植物内でのＸｙｌＴ遺伝子及びその任意のアイソフォームの完全な発現抑制をもたらす。
【０１５９】
同様に、植物宿主がＦｕｃＴ発現を標的とする本明細書に記載の方法を使用して安定に形質転換されている場合、植物中で産生された組換え糖タンパク質は、ＦｕｃＴ酵素及びそのアイソフォームの発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物宿主中で産生された糖タンパク質のそれぞれのＮ−結合グリカン中に存在する５０％未満、４０％未満、３０％未満のα１，３−結合フコース残基を含むＮ−結合グリカンを有する。他の実施形態では、これらの組換え糖タンパク質は、ＦｕｃＴ酵素及びそのアイソフォームの発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物宿主中で産生された糖タンパク質のそれぞれのＮ−結合グリカン中に存在する２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満のα１，３−結合フコース残基を含むＮ−結合グリカンを有する。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、植物内で産生された組換え糖タンパク質が、α１，３−結合フコース残基がないＮ−結合グリカンを有するような、安定に形質転換された植物内でのＦｕｃＴ遺伝子及びその任意のアイソフォームの完全な発現抑制をもたらす。
【０１６０】
植物宿主がＸｙｌＴとＦｕｃＴの両酵素及びその任意のアイソフォームの発現を標的とする本明細書に記載の方法を使用して安定に形質転換されている場合、植物中で産生された組換え糖タンパク質は、ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ酵素並びにそのアイソフォームの発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物宿主中で産生された糖タンパク質のそれぞれのＮ−結合グリカン中に存在する５０％未満、４０％未満、３０％未満のβ１，２−結合キシロース残基、及び５０％未満、４０％未満、３０％未満のα１，３−結合フコース残基を含むＮ−結合グリカンを有する。他の実施形態では、これらの組換え糖タンパク質は、ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ酵素並びにそのアイソフォームの発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物宿主中で産生された糖タンパク質のそれぞれのＮ−結合グリカン中に存在する２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満のβ１，２−結合キシロース残基、及び２５％、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満のα１，３−結合フコース残基を含むＮ−結合グリカンを有する。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、植物内で産生された組換え糖タンパク質が、β１，２−結合キシロース残基及びα１，３−結合フコース残基がないＮ−結合グリカンを有するような、安定に形質転換された植物内でのＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ遺伝子並びにその任意のアイソフォームの完全な発現抑制をもたらす。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＸｙｌＴとＦｕｃＴの両酵素及びその任意のアイソフォームの発現を標的とする本明細書に記載の方法を使用して安定に形質転換されている植物宿主は、Ｎ−結合グリカンが実質的に同種の組換え糖タンパク質を産生することができる。「実質的に同種の」とは、グリコシル化プロファイルが所望のＮ−グリカン種、より具体的にはＧ０グリカン種と対応する単一の主要なピークの存在を反映し、前記糖タンパク質上に存在する少なくとも９０％のＮ−グリカン構造がＧ０グリカン種のものであることを意味する。
【０１６２】
グリコシル化プロファイルとも称される糖タンパク質のＮ−グリコシル化パターンの変化をモニターする方法は当技術分野で周知であり、その方法には、それだけに限らないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ，matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight）質量分析、例えば本明細書の下記の実施例３で開示する改変ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイを使用する分析、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ，liquid chromatograph mass spectrometry）、ガスクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高濃度ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核磁気共鳴分光法、並びにキャピラリー電気泳動及びキャピラリーゲル電気泳動、蛍光標識並びに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，high-performance liquid chromatography）及びＱＴＯＦによる検出などがある。このように、本発明の安定に形質転換された植物中でのＸｙｌＴ及び／又はＦｕｃＴの発現又は機能の阻害によるＮ−グリコシル化パターンの変化は、安定に形質転換された植物から得られた試料（例えば、葉組織試料）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による総Ｎ−グリカン分析にかけ、ＸｙｌＴ及び／又はＦｕｃＴの発現又は機能を阻害するように遺伝子改変されていない対照植物に由来する同等の試料で得られた結果とその結果を比較することによってモニターすることができる。Ｎ−グリカン中のキシロース及び／又はフコース残基の量の低下は、それぞれのピークの大きさの低下によってモニターすることができる。例えば、Strasser et al. (2004) FEBS Letters 561:132-136を参照されたい。
【０１６３】
同様に、当業者に周知の標準的な技術を使用して、組換えにより産生された任意の所与の糖タンパク質のグリコシル化プロファイルが容易に決定される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Morelle and Michalski (2005) Curr. Anal. Chem. 1:29-57で提供される総説を参照されたい。したがって、結合した特定のＮ−結合グリカン構造の比について、植物宿主を含めた宿主生物中で組換えにより産生された糖タンパク質を分析することができる。このように、組換えにより産生された単離糖タンパク質を含む試料を酵素又は化学反応にかけて、糖タンパク質に由来する個々のグリカン構造を遊離させることができる。この脱グリコシル化ステップの後、本明細書の上記に記載した任意の分析アッセイを使用して、グリコシル化プロファイルの分析を実施することができる。
【０１６４】
組換えにより産生された糖タンパク質産物は通常、部位の占有の程度が様々であるグリコシル化部位で様々なモル量の１個〜数十個の異なるグリカンを有する多様な集団のグライコフォームとして存在する。糖タンパク質に応じて、異なるグライコフォームは異なる機能プロファイルをもたらし得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、Ｎ−グリカンが完全な糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを決定することが望ましい。上記で述べ、かつ本明細書の下記の実施例中にある質量分析法を含めて、完全な糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを決定する当技術分野で既知の任意の技術を使用することができる。
【０１６５】
本明細書で示すようにフコシルトランスフェラーゼ及び／又はキシロシルトランスフェラーゼの発現又は機能を一過性又は安定に低下又は消失させることによって、これらの酵素の発現又は機能が変化していない（すなわち、植物が天然の又は野生型のグリコシル化機構を有する）ときにこの植物により産生される糖タンパク質で正常に観察されるものと比べて異種性が低下したＮ−グリコシル化プロファイルを有する糖タンパク質を産生する能力を有するトランスジェニック高等植物を産生することができる。本明細書の上記に記載の１つ又は複数の方法を使用してこれらの酵素の一方又は両方の発現又は機能を安定に低下又は消失させた場合、トランスジェニック植物により産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下は、無性生殖又は有性生殖を伴うものを含めて、植物世代から植物世代へと維持することができ、培養条件を越えて、生産をスケールアップしても維持することができる。
【０１６６】
このように、本発明は、高等植物、例えば、双子葉植物又は単子葉植物、例えばウキクサ植物中で産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法を提供する。その方法は、フコシルトランスフェラーゼ及び／又はキシロシルトランスフェラーゼの発現又は機能が植物内で低下又は消失するように、本明細書に記載のヌクレオチド構築物を植物中に導入するステップを含む。本発明のいくつかの実施形態では、高等植物中で産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法は、本明細書の上記に記載の少なくとも１つのヌクレオチド構築物を、対象とする高等植物中に導入するステップを含み、（複数の）ヌクレオチド構築物は、例えば、本明細書の上記に記載の１つ又は複数の方法を使用した、植物中でのフコシルトランスフェラーゼ及び／又はキシロシルトランスフェラーゼの発現の抑制をもたらす。
【０１６７】
「Ｎ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下」とは、Ｎ−グリコシル化プロファイルが、プロファイル中に現れる別個のＮ−グリカン種の総数の低下を特徴とすることを意味する。したがって、例えば、天然の又は野生型のグリコシル化機構を有する（したがってフコシルトランスフェラーゼ及びキシロシルトランスフェラーゼの発現を低下又は消失させるように遺伝子改変されていない）高等植物により産生された糖タンパク質が、５個のＮ−グリカン種の混合物の存在を特徴とするＮ−グリコシル化プロファイルを有する糖タンパク質を産生する場合、本発明の方法を使用して、Ｎ−グリコシル化プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の数を低下させることができる。このように、その高等植物が、本明細書で示すように、フコシルトランスフェラーゼ及び／又はキシロシルトランスフェラーゼの発現又は機能を低下又は消失させるように遺伝子改変されているとき、この糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルは、プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の数の低下、例えば、５個未満のＮ−グリカン種、例えば４、３、若しくは２個のＮ−グリカン種の混合物を特徴とし、又は単一のＮ−グリカン種をも特徴とする。Ｎ−グリコシル化の異種性が、そのプロファイルが単一の優勢なＮ−グリカン種の存在を特徴とするように低下する場合、Ｎ−グリコシル化プロファイルは、そのＮ−グリカン種について実質的に同種となる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、高等植物中で産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法によって、Ｇ０グリカン種について実質的に同種のＮ−グリコシル化プロファイルを有する糖タンパク質が産生される。そのような実施形態では、高等植物中で産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法によって、実質的に同種のＮ−グリコシル化プロファイルを有する糖タンパク質が産生され、糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グリカン種によって表される。これらの実施形態では、本明細書の他の箇所で述べたように、微量の前駆Ｎ−グリカン種がＮ−グリコシル化プロファイル中に現れてもよく、グリコシル化プロファイル中に存在する任意の所与の前駆Ｎ−グリカン種は、プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、わずか０．５％未満又はわずか０．１％未満しか存在しない。
【０１６９】
糖タンパク質は、対象とする内因性糖タンパク質でもよく、又は対象とする高等植物によって産生された異種糖タンパク質、例えば、例えば本明細書の他の箇所に記載の糖タンパク質を含めた哺乳動物糖タンパク質でもよい。いくつかの実施形態では、糖タンパク質はモノクローナル抗体である。他の実施形態では、糖タンパク質は、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミノーゲン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される。
【０１７０】
本発明の方法を使用して、生産のスケールアップを伴うトランスジェニック植物中で産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイル内での異種性の低下を維持することができ、したがって、植物は、そのＮ−グリコシル化プロファイルが、プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の数の低下を特徴とするように、糖タンパク質を産生し続ける。「生産のスケールアップ」又は「生産スケールの増大」とは、対象とするタンパク質、この場合は対象とする糖タンパク質の産生に使用される培養系（すなわち植物を培養する培養容器（culture vessel又はculture container））内に存在する植物の生物量の増大を意味する。したがって、生産のスケールアップは、例えば、研究目的に適したスケールからパイロット生産に適したスケールまで、さらには最大で対象とするタンパク質の商業的生産に適したスケールまで生産をスケールアップするときに行われる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック高等植物は、糖タンパク質の組換え産生用の宿主として働く単子葉植物、例えば、ウキクサ植物であり、組換えにより産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下は生産スケールが増大しても維持され、その生産スケールは、最初の開始生物量の少なくとも３００倍、少なくとも５００倍、少なくとも７００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも１，５００倍、又はそれ以上増大している。これらの実施形態のいくつかでは、トランスジェニック高等植物は、対象とする糖タンパク質を組換えにより産生するウキクサ植物であり、Ｎ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下は、生産スケールが増大しても維持され、その生産スケールは、最初の開始生物量の少なくとも２，０００倍、少なくとも３，０００倍、少なくとも４，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも６，０００倍、少なくとも６，５００倍、又はそれ以上増大している。そのような一実施形態では、高等植物は、対象とする糖タンパク質を組換えにより産生するウキクサ植物であり、その糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下は、生産スケールが増大しても維持され、その生産スケールは、最初の開始生物量の少なくとも７，０００倍、８，０００倍、９，０００倍、１０，０００倍、１２，５００倍、１５，０００倍、１７，５００倍、２０，０００倍、２３，０００倍、２６，０００倍、又はそれ以上増大している。
【０１７２】
さらに、連続的クローン培養によって対象とするトランスジェニック植物を維持するとき、得られたトランスジェニック系統は、Ｎ−グリコシル化プロファイル内の異種性の低下を示す糖タンパク質を産生し続ける。連続的クローン培養は、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して実現することができる。いくつかの実施形態では、連続的クローン培養は、植物培養物の１つ又は複数の部分試料を定期的に採取し、その（複数の）部分試料を新鮮培地に移しさらに培養することによって実現することができる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、連続的クローン培養によって維持されたトランスジェニック植物系統は、フコシルトランスフェラーゼ及び／又はキシロシルトランスフェラーゼの発現又は機能を低下又は消失させるように遺伝子改変されているウキクサトランスジェニック植物系統である。このように、トランスジェニック植物系統中で産生された糖タンパク質のＮ−グリコシル化プロファイルの異種性の低下は、トランスジェニック植物系統の連続的クローン培養で少なくとも８カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも２．５年、少なくとも３年、少なくとも３．５年、少なくとも４年、少なくとも４．５年、少なくとも５年、又はそれ以上維持され、トランスジェニック植物系統が維持される限り維持することができる。
【０１７３】
異種ポリペプチド及び糖タンパク質
本明細書に記載の方法を使用して、変化したＮ−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように安定に形質転換されている高等植物、特に薬学的に使用する組換えタンパク質の発現系として働く高等植物を、対象とする任意の組換えタンパク質を産生するように遺伝子改変することができる。組換えタンパク質が、翻訳後グリコシル化が適用可能なものである場合、本発明の方法は、有利には、哺乳動物宿主のパターンをより密接に反映するＮ−グリコシル化パターン、特に「ヒト化」されたグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する手段を提供する。対象とする組換えタンパク質の例には、それだけに限らないが、インスリン、成長ホルモン、プラスミノーゲン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンギオスタチン、レプチン、モノクローナル抗体及びその断片、サイトカイン、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固因子、例えば第VII因子、第VIII因子、第IX因子及び活性化プロテインＣ、α１−アンチトリプシン、受容体、ホルモン、ヒトワクチン、動物ワクチン、ペプチド、並びに血清アルブミンがある。さらに、本発明のトランスジェニック高等植物は、Ｇ０グリカン種について実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、Ｇ０グライコフォームについて実質的に同種であることを特徴とする糖タンパク質産物を産生することができる。有利には、これによって、産生の一貫性も高く、これらの糖タンパク質組成物の産生と関係する化学物質、製造、及び管理（ＣＭＣ，chemical, manufacturing, and control）リスクも低い植物宿主系が得られる。
【０１７４】
本発明の方法に従って産生された糖タンパク質組成物は、薬学的に許容される担体を含む組成物中に含有されてもよい。そのような組成物は、糖タンパク質での治療が治療的利益をもたらす疾患又は障害について対象を治療する方法で有用である。このように、本発明の方法に従って安定に形質転換された植物、例えばウキクサ植物中で産生された糖タンパク質を、それを必要とする対象に投与することができる。
【０１７５】
本発明の糖タンパク質組成物は、Ｇ０グリカン構造のものが優勢であるＮ−結合グリカンを含む。このように、本発明は、本明細書の上記で定義した「実質的に同種の」又は「実質的に均一な」又は「実質的な同種性」を有するグリコシル化プロファイルを有する糖タンパク質組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、糖タンパク質組成物は、Ｇ０グリカン種について実質的に同種であり、したがって実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、組成物のグリコシル化プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グリカン種によって表され、グリコシル化プロファイル中に現れる微量の前駆Ｎ−グリカン種、すなわちグリコシル化プロファイル中に存在する任意の所与の前駆Ｎ−グリカン種が、プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、わずか０．５％未満又はわずか０．１％未満しか存在しない。そのような組成物では、そのグリコシル化プロファイル中に現れる代表的な前駆Ｎ−グリカン種は、上記に記載のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＭＧｎ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，３マンノース腕と結合している）、及びＧｎＭ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，６マンノース腕と結合している）前駆Ｎ−グリカン種となり、これらのＮ−グリカン種のうち任意の単一のものが存在してもよく、又は任意の組合せのものが存在してもよい。
【０１７６】
このように、本発明は、本明細書の上記で定義した「実質的に同種の」若しくは「実質的に均一な」糖タンパク質組成物、又は「実質的な同種性」を有する糖タンパク質組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、実質的に同種の糖タンパク質組成物を提供し、その組成物中に存在する糖タンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グライコフォームによって表され、予測されるすべてのグリコシル化部位がＧ０グリカン種によって占有され、微量の前駆グライコフォーム又は所望されないグライコフォームが組成物中に存在し、すなわち、前駆グライコフォームが、組成物内に存在する総グライコフォームの５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、又はわずか０．５％未満、又はわずか０．１％未満しか存在しない。そのような組成物では、代表的な前駆グライコフォームは、グリコシル化部位が占有されていないものとなり、所望されない例示的なグライコフォームは、そのグリコシル化部位と結合したＧ０グリカン及びＧ０Ｘ又はＧ０ＸＦ３グリカン種の混合物を有するグライコフォームとなる。
【０１７７】
本発明のいくつかの実施形態では、植物宿主は、対象とする哺乳動物タンパク質、特に対象とするヒトタンパク質と特異的に結合する抗体の発現をもたらす１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む。したがって、一態様では、本発明は、高等植物中で、Ｎ−結合グリカン内のβ１，２−結合キシロース残基及びα１，３−結合フコース残基の量の低下を反映するＮ−グリコシル化パターンを有するモノクローナル抗体を産生する方法、並びに本明細書で示すように遺伝子改変された植物宿主を使用して産生された組換えモノクローナル抗体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、対象とする植物宿主はウキクサ科のメンバーである。
【０１７８】
モノクローナル抗体は、それだけに限らないが、癌及び自己免疫性又は炎症性の構成成分を有する疾患を含めたヒト疾患を治療する治療用作用物質としてますます使用されている。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、King (1999) Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 2:110-17；Vaswani and Hamilton(1998) Ann. Allergy Asthma Immunol. 81:105-19；及びHolliger and Hoogenboom, Nat. Biotechnology 16:1015-16を参照されたい。これらの抗体のいくつか、例えば受容体又はリガンドと結合してリガンドと受容体の相互作用を防止する抗体はもっぱら抗原結合から生じる治療効果を有するが、他の抗体は、治療上活性となるために、標的細胞を死滅させる免疫系の動員などのエフェクター機能を必要とする。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Clynes et al. (2000) Nat. Med. 6:443-46；Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:652-56、及びAnderson et al. (1997) Biochem. Soc. Trans. 25:705-8を参照されたい。
【０１７９】
抗体の抗原認識活性及びエフェクター機能は抗体分子の異なる部分に存在する。抗体のＦａｂ’部分は抗原認識活性をもたらすが、Ｆｃ部分は、貪食細胞（マクロファージ及び好中球）、ナチュラルキラー細胞、及びマスト細胞を含めたアクセサリーエフェクター細胞の活性化などのエフェクター機能をもたらす。抗体はＦｃ領域を介して細胞と結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エータ受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含めて、異なるクラスの抗体に特異的ないくつかのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上での抗体とＦｃ受容体の結合は、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、又はＡＤＣＣと呼ばれる）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の惹起、炎症メディエーターの放出、並びにイムノグロブリン産生の調節を含めたいくつかの重要かつ多様な生体応答を誘発する。抗体のエフェクター機能についてアッセイを行う方法は当技術分野で周知であり、それには、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、及びアポトーシスについてアッセイを行うものがある。例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれている、Subbramanian et al. (2002) J. Clin. Microbiol. 40:2141-2146；Ahman et al. (1994) J. Immunol. Methods 36:243-254；Brezicka et al. (2000) Cancer Immunol. Immunother. 49:235-242；Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol. Methods 202:163-171；Prang et al. (2005) British J. Cancer 92:342-349；Shan et al. (1998) Blood 92:3756-3771；Ghetie et al. (2001) Blood 97:1392-1398；及びMathas et al. (2000) Cancer Research 60:7170-7176を参照されたい。
【０１８０】
抗体分子のＦｃ部分のグリコシル化の状態が、抗体がエフェクター機能を有するかどうかを決定する際に重要な役割を果たすことが当技術分野で知られている。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Tao and Morrison (1987) J. Immunol. 143:2595-601；Wright and Morrison (1997) Trends in Biotech. 15:26-32；Wright and Morrison (1998) J. Immunol. 160:3393-402；Mimura et al. (2000) Mol. Immunol. 37:697-706；Jefferis and Lund (2002) Immunol. Lett. 82:57-65；Krapp et al. (2003) J. Mol. Biol. 325:979-89；及びJefferis (2005) Biotechnol. Prog. 21:11-16を参照されたい。組換えにより産生された抗体のグリコシル化は、使用した発現系に応じて様々となる。例えば、Raju et al. (2000) Glycobiology 10:477-86；Wright and Morrison (1997) Trends in Biotech. 15:26-32を参照されたい。さらに、哺乳動物が産生するモノクローナル抗体のＮ−グリコシル化パターンを変化させてα（１，６）−結合コアフコース残基を減少又は除去した場合、モノクローナル抗体は、エフェクター機能の増大、特にＡＤＣＣ活性の増大を示す。例えば、米国特許第６，９４６，２９２号を参照されたい。哺乳動物が産生するモノクローナル抗体のいくつかでは、Ｎ−グリコシル化パターンを変化させて１，３及び／又は１，６マンノース腕と結合したβ（１，４）−ガラクトース残基を減少又は除去した場合、ＡＤＣＣ活性を含めた抗体の他の機能活性を変化させずに、抗原を有する標的細胞に対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の活性化を低下させることができる。例えば、Boyd et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1311-1318を参照されたい。
【０１８１】
本明細書で示すように、そのグリコシル化機構を変化させるように安定に形質転換されているウキクサなどの高等植物宿主によって、抗原認識活性を有し、いくつかの実施形態では向上したエフェクター機能を有する抗体を産生することができる。したがって、本発明は、向上したエフェクター機能を有するモノクローナル抗体を含めた組換えモノクローナル抗体を産生する方法を提供し、その抗体は、その中で産生される内因性の異種糖タンパク質のＮ−グリコシル化パターンが変化し、その結果、これらの糖タンパク質が、そのＮ−グリカンと結合した植物特異的β１，２−結合キシロース残基及び／又はα１，３−結合フコース残基の量の低下を示す植物内で、組換えにより産生される。そのＮ−グリカンと結合した抗体のα１，３−結合フコース残基の量が低下した場合、その抗体は、ＦｕｃＴの発現又は機能を阻害するように遺伝子改変されていない対照植物中で産生された抗体と比べてＡＤＣＣ活性が増大している可能性がある。
【０１８２】
エフェクター機能を有し、いくつかの実施形態では向上したエフェクター機能を有する組換えモノクローナル抗体も包含され、その抗体は、配列番号３のＦｕｃＴ及び／又は配列番号６のＸｙｌＴ並びにその任意のアイソフォーム、例えば（配列番号２０によってコードされる）配列番号２１で示す配列を含むＸｙｌＴアイソフォーム＃２の発現又は機能を阻害するように遺伝子改変されているウキクサ発現系中で産生される。したがって、いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の組換え産生用の宿主として働く植物は、例えば、ゲノム内に安定に組み込まれた、上記に記載のＸｙｌＴ  ＲＮＡｉ発現カセット及び／又はＦｕｃＴ  ＲＮＡｉ発現カセットを含む、本明細書の他の箇所で述べたウキクサのメンバー、例えばレムナ植物である。このように、本発明は、哺乳動物宿主発現系で認められるものとより酷似したＮ−グリコシル化パターンを有し、向上したエフェクター機能を有する組換えモノクローナル抗体を産生する方法を提供し、その方法は、グリコシル化機構を変化させるように遺伝子改変され、その結果組換えにより産生されたモノクローナル抗体が植物β１，２−結合キシロース残基及び／又はα１，３−結合フコース残基とそのＮ−グリカンの結合の低下を示すウキクサ植物、又はウキクサ細胞若しくはウキクサ根粒中で１つ又は複数の鎖の抗体を発現させるステップと、モノクローナル抗体の発現に適した条件下でウキクサ植物、又はウキクサ細胞若しくはウキクサ根粒を培養するステップを含む。
【０１８３】
したがって、本発明は、抗体が、Ｇ０グリカン構造のものが優勢であるＮ−結合グリカンを含む新規の抗体組成物を提供する。このように、本発明は、本明細書の上記で定義した「実質的に同種の」又は「実質的に均一な」又は「実質的な同種性」を有するグリコシル化プロファイルを有する抗体組成物、例えばモノクローナル抗体組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、抗体組成物は、Ｇ０グリカン種について実質的に同種であり、したがって実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、組成物のグリコシル化プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グリカン種によって表され、グリコシル化プロファイル中に現れる微量の前駆Ｎ−グリカン種、すなわちグリコシル化プロファイル中に存在する任意の所与の前駆Ｎ−グリカン種が、プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、わずか０．５％未満又はわずか０．１％未満しか存在しない。そのような組成物では、そのグリコシル化プロファイル中に現れる代表的な前駆Ｎ−グリカン種は、例えば、上記に記載のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＭＧｎ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，３マンノース腕と結合している）、及びＧｎＭ（ＧｌｃＮａｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ここでＧｌｃＮａｃ１は１，６マンノース腕と結合している）前駆Ｎ−グリカン種となり、これらのＮ−グリカン種のうち任意の単一のものが存在してもよく、又は任意の組合せのものが存在してもよい。
【０１８４】
そのような一実施形態では、モノクローナル抗体組成物は、実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、組成物のグリコシル化プロファイル中に現れるＮ−グリカン種の総量の９５．８％がＧ０グリカン種（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）によって表され、下記の前駆Ｎ−グリカン種：Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（０．６７％）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（１．６％）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（１．２％）、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（０．２１％）、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２（０．３０％）、及びＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．２８％）がグリコシル化プロファイル中に現れる。これは、同じモノクローナル抗体が発現するが、ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴの発現を阻害するようにウキクサ植物のグリコシル化機構が遺伝子改変されていない「野生型」ウキクサ植物発現系から得られたモノクローナル抗体組成物と比較することができる。そのような「野生型」に由来するモノクローナル抗体組成物は、より異種のグリコシル化プロファイルを有し、そのプロファイルは２つの優勢なＮ−グリカン種、すなわちＧ０ＸＦ３及びＧ０Ｘを特徴とし、いくつかの前駆Ｎ−グリカン種が微量で表される。そのような一実施形態では、「野生型」に由来するモノクローナル抗体組成物は、下記のＮ−グリカン種：Ｇ０（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）（８．４％）；Ｇ０Ｘ（ＧｌｃＮＡｃ２［Ｘｙｌ］Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）（１７．２％）；Ｇ０ＸＦ３（ＧｌｃＮＡｃ２［Ｘｙｌ］Ｍａｎ３［Ｆｕｃ］ＧｌｃＮＡｃ２）（６７．４％）；Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（０．２６％）；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（０．４０％）；（Ｘｙｌ）Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２（０．７６％）；ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２（２．１％）；ＧｌｃＮＡｃ（Ｘｙｌ）Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２（１．４％）；Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（０．２１％）；Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２（０．６３％）；Ｇａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２（Ｘｙｌ）Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２（０．２６％）；Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（０．６１％）；及びＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（０．４０％）がその中に表されるグリコシル化プロファイルを有する。
【０１８５】
このように、本発明は、本明細書の上記で定義した「実質的に同種の」若しくは「実質的に均一な」抗体組成物、又は「実質的な同種性」を有する抗体組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、実質的に同種の抗体組成物、例えばモノクローナル抗体組成物を提供し、その組成物中に存在する抗体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グライコフォームによって表され、予測されるすべてのグリコシル化部位（例えば、ＩｇＧ型抗体の重鎖のＣＨ２ドメインの各Ａｓｎ−２９７残基）がＧ０グリカン種によって占有され、微量の前駆グライコフォームが組成物中に存在する。そのような一実施形態では、前駆グライコフォームは、一方の重鎖のＣＨ２ドメインがＡｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがグリコシル化されていないＦｃ領域を有する抗体；一方の重鎖のＣＨ２ドメインがＡｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがＡｓｎ２９７と結合したＧｎＭ又はＭＧｎ前駆グリカンを有するＦｃ領域を有する抗体；及び各ＣＨ２ドメイン上のＡｓｎ２９７グリコシル化部位がＧ０グリカン種と結合し、第３のグリカン種がｍＡｂ構造内のさらなるグリコシル化部位と結合したＦｃ領域を有する抗体からなる群から選択され、微量のこれらの前駆グライコフォームが存在し、すなわち、前駆グライコフォームが、抗体組成物内に存在する総グライコフォームの５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、又はわずか０．５％未満、若しくは０．１％未満しか表さない。
【０１８６】
組成物中に存在する抗体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グライコフォームによって表される、本発明の実質的に同種の抗体組成物は、「グリカン最適化抗体」に相当する。「グリカン最適化抗体」とは、Ｇ０グライコフォームについて実質的に同種であるようなグリコシル化パターンで本発明の抗体が遺伝子工学により作製されていることを意味し、それによって、向上したＦｃエフェクター機能を有する抗体が得られる。「向上したＦｃエフェクター機能」とは、これらの抗体のＡＤＣＣ活性が、産生工程の結果としてより異種のグリコシル化プロファイルを有する同じ配列の抗体（すなわち、同じアミノ酸配列を有する抗体）と比べて増大していることを意味する。したがって、例えば、ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現を阻害するように遺伝子改変されていない哺乳動物宿主発現系、例えばＣＨＯ細胞中で、昆虫宿主細胞中で、酵母細胞中で、又は他の植物宿主発現系中で産生された抗体は、より異種のグリコシル化プロファイルを、したがってグライコフォームの混合物を有する傾向があり、それは抗体産物の全体的なエフェクター機能に影響を及ぼす可能性がある。本発明の抗体組成物のＧ０グライコフォームは、有利には、フコース残基が存在しないことと関連してＡＤＣＣ活性が増大した抗体組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＣＣ活性は、異種のグリコシル化プロファイルを有する（すなわち、抗体組成物中に主要なグライコフォームとして複数のグライコフォームを有する）同じ配列の抗体と比較して２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、５００倍、又は１０００倍も増大する。さらに、Ｇ０グライコフォームは、Ｇ２グライコフォームを有する抗体中に存在する末端Ｇａｌ残基を欠く。したがって、優勢にＧ０グライコフォームを有する本発明の実質的に同種の抗体組成物はＡＤＣＣ／ＣＤＣ比が増大している。さらに、優勢にＧ０グライコフォームを有する本発明の実質的に同種の抗体組成物は、ＦｃγＲIII、例えばＦｃγＲIIIａとの結合が増大し、その結合親和性は、異種のグリコシル化プロファイルを、したがってグライコフォームの混合物を有する同じ配列の抗体で観察される親和性の約２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、最大で１００倍に増大する。腫瘍学的疾患及び自己免疫疾患では、Ｆｃ受容体、例えばＦｃγＲIIIに対する結合親和性が増大した治療用抗体は効果の増大、及び治療に対する応答の向上と強く相関している。
【０１８７】
本発明のいくつかの実施形態では、優勢にＧ０グライコフォームを有する本発明の実質的に同種の抗体組成物は、異種のグリコシル化プロファイルを、したがってグライコフォームの混合物を有する同じ配列の抗体組成物で観察される活性と比較したとき、ＣＤＣ活性が変化している。例えば、そのような一実施形態では、本発明の実質的に同種の抗体組成物は、優勢にＧ０グライコフォームを有し、異種のグリコシル化プロファイルを、したがってグライコフォームの混合物を有する同じ配列の抗体で観察される活性と比較したとき、ＣＤＣ活性が低下している。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、優勢にＧ０グライコフォームを有し、異種のグリコシル化プロファイルを有する同じ配列の抗体組成物と比較したとき、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％も低下したＣＤＣ活性を有する実質的に同種の抗体組成物を提供する。これらの実施形態のいくつかでは、優勢にＧ０グライコフォームを有し、ＣＤＣ活性が低下した実質的に同種の抗体組成物はさらに、異種のグリコシル化プロファイルを有する同じ配列の抗体組成物と比較したときにＡＤＣＣ活性が増大していることを特徴とする。
【０１８８】
任意の理論又は作用機構に拘泥するものではないが、有利には、上記に記載のようにＣＤＣ活性が低下し、ＡＤＣＣ活性が類似又は増大している本発明の実質的に同種のＧ０グライコフォーム抗体組成物は、その投与後の補体活性化と関係する可能性がある潜在的な有害副作用を低減しながら、標的細胞に対する細胞傷害性の増大をもたらすことができる。これらの有害な副作用の潜在性を低減することによって、有利には、優勢にＧ０グライコフォームを有する実質的に同種の抗体組成物を速い注入速度で投与することができ、それによって任意の所与の投与における投与時間が減り、かつ／又は認められている場合には最初の濃度を高くして投与することができ、補体活性化と関係する有害な副作用を誘発する懸念が小さくなる。
【０１８９】
例えば、補体活性化は、キメラ抗ＣＤ−２０モノクローナル抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８（IDEC Pharmaceuticals Corp.社製、カリフォルニア州San Diego；商品名Rituxan（登録商標）で市販され、リツキシマブとも称される）での治療の中程度〜重度の初回投与副作用の病原性において中心的な役割を果たす。例えば、van der Kolk et al. (2001) British J. Haematol. 115:807-811を参照されたい。Rituxan（登録商標）製品内のリツキシマブ抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ，Chinese hamster ovary）細胞内で発現され、したがって、抗体組成物は、異種のグリコシル化プロファイル（すなわち、グライコフォームの混合物）を含む。リツキシマブのＣＤＣ活性は、ガラクトース含量と相関することが示されている。このように、ガラクトース残基の数が重鎖１モル当たり０から２モルに増大するにつれて、ＣＤＣ活性のレベルは、重鎖１モル当たりガラクトース１モルを有する抗体で観察される最大値の８０％（重鎖のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７と結合したＮ−グリカンの１，３及び１，６マンノース腕からすべてのβ（１，４）−ガラクトース残基を除去するようにβ−ガラクトシダーゼで処理）から１５０％（確実にβ（１，４）−ガラクトース残基がＡｓｎ２９７部位と結合したＮ−グリカンの１，３と１，６両方のマンノース腕と結合するようにＵＤＰガラクトシルトランスフェラーゼで処理）に増大する（ワールドワイドウェブ上で利用可能なウェブサイトfda.gov/Cder/biologics/review/ritugen112697のIDEC BLA 97-0260を参照）。リツキシマブと同じ配列を有し、優勢にＧ０グライコフォームを有する抗ＣＤ２０抗体を含む実質的に同種の抗ＣＤ２０抗体組成物は、有利には、ＣＤＣ活性が低下し、それによって、抗体組成物が異種のグリコシル化プロファイル（すなわち、グライコフォームの混合物）を含むときに抗体投与後の補体活性化と通常関係する有害な副作用の潜在性が低減するはずである。
【０１９０】
したがって、ＣＤＣ活性が低下し、ＡＤＣＣ活性が同じであり又は増大した本発明の実質的に同種のＧ０グライコフォーム抗体組成物は、有利には、異種のグリコシル化プロファイル（すなわち、グライコフォームの混合物）を含む同じ配列の抗体組成物の投与後の補体活性化と通常関係する有害な副作用に起因する合併症によって、１つ又は複数の患者集団にとってこれまで不適であり、得策でなく、又は無効であった治療的適用で使用することができる。そのような副作用には、それだけに限らないが、例えば、発熱及び／又は悪寒、悪心、呼吸困難、紅潮などを含めた抗体の初回及び／又は急速投与と関係する可能性がある中程度〜重度の副作用がある。例えば、van der Kolk et al. (2001) British J. Haematol. 115:807-811及びその中で引用されている参照文献；Winkler et al. (1999) Blood 94:2217-2224を参照されたい。このように、本発明は、抗体、例えばモノクローナル抗体の投与後の補体活性化と関係する１つ又は複数の有害な副作用を低減する方法を提供し、その方法は、本明細書の上記で定義した、すなわち組成物中に存在する抗体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％がＧ０グライコフォームによって表され、微量の前駆グライコフォームが組成物中に存在する、実質的に同種の抗体組成物として抗体を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、組成物中に存在する抗体の少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％がＧ０グライコフォームによって表され、微量の前駆グライコフォームが組成物中に存在する。
【０１９１】
そのＦｃエフェクター機能が増大した結果、優勢にＧ０グライコフォームを有する本発明の実質的に同種の抗体組成物は、改良された新たな投与経路の機会、例えば、既知の治療用抗体について考えられる投与経路を、注入及び静脈内投与を越えた他の投与経路まで、例えば皮下投与まで拡張する機会をもたらす。さらに、その効力が増大した結果、本発明の抗体組成物は、低濃度で投与し、又は少ない体積で投与し、低頻度で投与することができる。投与する抗体組成物の体積が少なくなると、モノクローナル抗体での注入反応から生じる有害事象が体積と関係する場合に特に有利である。また、本発明の抗体組成物の効力が増大すると、より異種のグライコフォーム抗体組成物での抗体療法に反応しない可能性があった既存のｍＡｂ標的について新たな臨床適応も広がり、これまで未開発のｍＡｂ標的を再び取り上げることもできる。
【０１９２】
本発明の方法に従って産生されたモノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体を含む組成物中に含有されてもよい。そのような組成物は、ＦｕｃＴ発現が阻害の対象となっている場合に、エフェクター機能を有し、いくつかの実施形態では向上したエフェクター機能を有する抗体を必要とする対象を治療する方法で有用である。このように、本発明の方法に従って安定に形質転換された植物、例えばウキクサ植物中で産生されたモノクローナル抗体を、それを必要とする対象に投与することができる。
【０１９３】
本発明の方法に従って遺伝子改変された植物宿主内で任意の抗体を産生することができる。一実施形態では、抗体は治療用抗体である。抗体はいくつかの障害の治療について認可されており、多数のさらなる治療用抗体が開発中である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Brekke and Sandlie (2003) Nat. Rev. Drug. Discov. 2(3):240を参照されたい。本発明の方法によって発現することができる治療用抗体の例としては、それだけに限らないが、ＣＤ３抗原を標的とする抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ（登録商標）３）；抗血小板ｇｐIIｂ／IIIａ抗体（例えば、ReoPro（登録商標）として流通しているアブシキシマブ（以前はｃ７Ｅ３  Ｆａｂとして知られている））；抗ＥｐＣＡＭ抗体（例えば、Panorex（登録商標））；ＣＤ２０抗原を標的とする抗ＣＤ２０抗体（例えば、Rituxan（登録商標）として流通しているリツキシマブ；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７３６，１３７号を参照）；抗ＩＬ−２受容体（例えば、Zenapax（登録商標）、Simulect（登録商標））；抗ＥＲＢＢ２（例えば、Herceptin（登録商標）として流通しているトラスツズマブ；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，１６５，４６４号を参照）；抗ＴＮＦ−α（例えば、Remicade（登録商標）として流通しているインフリキシマブ）、抗Ｆタンパク質（例えば、Synagis（登録商標））；ＣＤ３０抗原を標的とする抗ＣＤ３０抗体（例えば、Borchmann et al. (2003) Blood 102:3737-3742及び本明細書の下記の実施例６に記載の５Ｆ１１抗体を参照し、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ０３／０５９２８２及び米国特許出願公開第２００４／０００６２１５号も参照されたい；ＡＣ１０抗ＣＤ３０抗体のキメラ型であるWahl et al. (2002) Cancer Res. 62:3736-3742に記載のＳＧＮ−３０抗体を参照し、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００４００１８１９４号及び米国特許第７，０９０，８４３号も参照されたい）；ＣＤ３３抗原を標的とする抗ＣＤ３３抗体（例えば、Mylotarg（登録商標）；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７３３，００１号を参照）；ＣＤ５２抗原を標的とする抗ＣＤ５２抗体（例えば、Campath（登録商標）として流通しているアレムツズマブ；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，８４６，５３４号を参照）；抗ＣＤ２０（例えば、Zevalin（登録商標））；抗ＩｇＥ  Ｆｃ（例えば、Xolair（登録商標）で販売されているオマリズマブ）；抗ＶＥＧＦ（例えば、Avastin（登録商標）として流通しているベバシズマブ；参照により本明細書に組み込まれているPresta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-9を参照）；抗ＥＧＦ−Ｒ（例えば、Erbitux（登録商標）として流通しているセツキシマブ）；抗ＣＤ１１ａ（例えば、Raptiva（登録商標）で流通しているエファリズマブ）、抗ＩＬ−８；抗Ｃ５；抗ＴＮＦ−α（例えば、Humira（登録商標）として流通しているアダリムマブ）；抗ＴＧＦ−β２；抗ＩＬ２受容体（例えば、ダクリズマブ（Zenapax）及びバシリキシマブ（Simulect））；抗α−４−インテグリン；抗ＣＤ４；抗ＣＤ２；抗ＣＤ１９（例えば、ＭＴ１０３二重特異性抗体）；ＣＤ２２抗原を標的とする抗ＣＤ２２抗体（例えば、モノクローナル抗体ＢＬ−２２）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ���３抗原を標的とする抗ＣＤ２３抗体（例えば、ＩＤＥＣ−１５２）；ＣＤ８０抗原を標的とする抗ＣＤ８０抗体（例えば、ＩＤＥＣ−１１４）；悪性Ｂ細胞上のＣＤ３８抗原を標的とする抗ＣＤ３８抗体；マクロファージコロニー刺激因子を標的とするα−Ｍ−ＣＳＦ抗体；多発性骨髄腫で過剰発現する核内因子カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ，receptor activator of nuclear factor-kappaB）及びそのリガンド（ＲＡＮＫＬ）を標的とする抗体；悪性Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原を標的とする抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＳＧＮ−４０）；いくつかの固形腫瘍及び造血系由来腫瘍上で発現する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１，tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 1）（例えば、アゴニストヒトモノクローナル抗体ＨＧＳ−ＥＴＲ１）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２を標的とする抗体；抗ＨＢＶ抗体；又は抗ＭＨＣクラスII抗体がある。これらの抗体の多く、例えば、Herceptin（登録商標）、Rituxan（登録商標）、Mylotarg（登録商標）、及びCampath（登録商標）は、機能するのにＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣのどちらかのエフェクター活性を必要とすることが知られている。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書で示すように、そのグリコシル化機構を変化させるように遺伝子改変されている植物宿主、例えばウキクサは、生物学的に活性のあるα−２ｂ−インターフェロン、例えばヒトα−２ｂ−インターフェロン前駆体（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＡＡＢ５９４０２）若しくは成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロン（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＡＡＢ９４０２のアミノ酸２４〜１８８）又は生物学的に活性のあるその変異体を発現することができる。ヒトα−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性のある変異体の例は当技術分野で知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、切断型のα−２ｂ−インターフェロンを開示しているＷＯ２００５／０３５７６７；欧州特許ＥＰ２１１１４８Ｂ１：並びに米国特許第４，７４８，２３３号、第４，８０１，６８５号、第４，８１６，５６６号、第４，９７３，４７９号、第４，９７５，２７６号、第５，０８９，４００号、第５，０９８，７０３号、第５，２３１，１７６号、及び第５，８６９，２９３号を参照されたい。他の実施形態では、植物宿主、例えばウキクサは、生物学的に活性のある成熟ヒト成長ホルモンを、それに付随するシグナルペプチドを伴った又は伴わない状態で発現することができる。植物宿主はまた、ヒト成長ホルモンの生物学的に活性のある変異体を発現することもできる。例えば、ウキクサ発現系を使用した生物学的に活性のあるポリペプチドの発現を対象とするＷＯ０２／１０４１４を参照されたい。
【０１９５】
さらに他の実施形態では、植物宿主、例えばウキクサは、プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、又は生物学的に活性のあるその変異体を発現することができる。植物宿主中で発現されるプラスミノーゲン又はマイクロプラスミノーゲンは、どんな哺乳動物供給源に由来してもよい。いくつかの実施形態では、プラスミノーゲン又はマイクロプラスミノーゲンはヒト又はブタに由来する。例えば、ウキクサ発現系を使用したこれらのタンパク質の発現を対象とするＷＯ２００５／０７８１０９を参照されたい。
【０１９６】
これらの異種ポリペプチドの「生物学的に活性のある変異体」とは、天然タンパク質のＮ末端及び／若しくはＣ末端に対する１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失（いわゆる切断）若しくは付加；天然タンパク質の１つ若しくは複数の部位での１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失若しくは付加；又は天然タンパク質の１つ若しくは複数の部位での１つ若しくは複数のアミノ酸の置換により天然ポリペプチドから誘導されたポリペプチドを意味する。本発明によって包含される対象の異種ポリペプチドの変異体は、天然ポリペプチドの生物活性を保持する。
【０１９７】
例えば、α−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性のある変異体は、ウイルス感染に対する耐性を高める能力、又はα−２ｂ−インターフェロンによって制御される遺伝子標的の転写を調節する能力を含めた天然α−２ｂ−インターフェロンの所望の生物活性を所有し続ける。そのような生物学的に活性のある変異体は、例えば、遺伝的多型性又はヒトの操作から生じ得る。対象とする異種タンパク質の生物学的に活性のある変異体は、対象とする異種タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、一般には少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する。したがって、例えば、天然α−２ｂ−インターフェロンの生物学的に活性のある変異体は、ヒトα−２ｂ−インターフェロン前駆体（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＡＡＢ５９４０２）又は成熟ヒトα−２ｂ−インターフェロン（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＡＡＢ９４０２のアミノ酸２４〜１８８）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、一般には少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、配列同一性は、本明細書の上記で特定したパラメーターを使用して決定する。したがって、対象とする天然異種タンパク質の生物学的に活性のある変異体は、わずか１〜１５個のアミノ酸残基、６〜１０個、わずか５個、わずか４、３、２個や１個などのわずか１〜１０個のアミノ酸残基でもそのタンパク質と異なる可能性がある。
【０１９８】
一実施形態では、本明細書で示すように、そのグリコシル化機構を変化させるように遺伝子改変されている植物宿主は、安定に形質転換されたウキクサ植物又はウキクサ細胞又はウキクサ根粒であり、それは、コスト若しくは物流上の制約、又はその両方のために既存の遺伝子発現系では有効に商業生産することができない生物学的に活性のあるポリペプチドを発現する。例えば、いくつかのタンパク質は、そのタンパク質が細胞生存能、細胞増殖、又は哺乳動物細胞中でのタンパク質構築に干渉するので、哺乳動物系中で発現させることができない。そのようなタンパク質には、それだけに限らないが、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３、アンギオスタチン、及びレプチンがある。有利には、本発明を使用して、哺乳動物制御タンパク質を産生することができる；高等植物と哺乳動物の間の進化距離が大きいことを考えると、これらのタンパク質がウキクサ中で制御過程に干渉する可能性は低い。トランスジェニックウキクサを使用して、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）、ヘモグロビンやコラーゲンなどの大量のタンパク質を産生することもでき、これは、既存の発現系の産生能力に挑戦するものである。
【０１９９】
最後に、哺乳動物系よりはるかに簡単に、生物学的に活性のある多量体タンパク質（例えば、モノクローナル抗体、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキシダーゼやコラーゲンなど）を産生するように高等植物系を工学的に作製することができる。ウキクサ中で生物学的に活性のある多量体タンパク質を産生する例示的な一手法では、すべてのポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子を含有する発現ベクターを使用する。例えば、During et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:281及びvan Engelen et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1701を参照されたい。ＸｙｌＴ及び／又はＦｕｃＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセットをそのようなベクター中に導入することができる。次いで、弾道的照射（ballistic bombardment）やアグロバクテリウム媒介形質転換などの任意の既知の形質転換法を使用してこのベクターをウキクサ細胞中に導入する。この方法の結果、多量体タンパク質を構築するのに必要なすべてのポリペプチド、並びに糖タンパク質のＮ−グリカンのグリコシル化パターンを変化させるＸｙｌＴ及び／又はＦｕｃＴ阻害性配列を発現するクローン細胞系統が得られる。したがって、いくつかの実施形態では、形質転換されたウキクサは、モノクローナル抗体又はＦａｂ’抗体断片の重鎖及び軽鎖をコードする１つ又は複数の発現ベクター、並びにＸｙｌＴ及び／又はＦｕｃＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセットを含有し、発現した重鎖及び軽鎖からウキクサ植物中でモノクローナル抗体又は抗体断片が構築される。
【０２００】
この手法に対する変法では、単一の遺伝子構築物を作製し、これらの構築物に由来するＤＮＡを一緒に混合し、次いで弾道的照射又はアグロバクテリウム媒介形質転換を使用してこのＤＮＡの混合物を植物細胞中に送達する。さらなる変法として、一部又は全部のベクターが多量体タンパク質の複数のサブユニットをコードしてよい（すなわち、その結果多量体タンパク質中のサブユニットの数より交配するウキクサクローンが少なくなる）。代替の実施形態では、各ウキクサクローンは、そのグリコシル化機構を変化させ、多量体タンパク質の少なくとも１つのサブユニットを発現するように遺伝子改変され、各サブユニットを分泌するウキクサクローンを一緒に培養し、様々な分泌サブユニットから培地中で多量体タンパク質が構築される。ある場合には、例えば工業的若しくは化学的工程のために、又は診断上、治療上、若しくはワクチン接種の目的のために、形質転換されたウキクサ植物又はウキクサ根粒培養物中で多量体タンパク質の全部より少ないサブユニットを産生することが、又は単一のタンパク質サブユニットしか産生しないことが望ましい可能性がある。
【０２０１】
本発明のいくつかの実施形態では、対象とするトランスジェニック植物宿主は、例えば、Ｇ０グリカン構造のものが優勢であるＮ−結合グリカンを含む糖タンパク質を含めた本明細書に記載の糖タンパク質の「高発現体（high expressor）」である。「高発現体」とは、本明細書に記載の糖タンパク質を作製するように工学的に作製されているトランスジェニック植物宿主が、対象とする糖タンパク質がトランスジェニック植物宿主中で産生される総可溶性タンパク質の少なくとも５％又はそれ以上となるようなレベルで対象とする糖タンパク質を産生できることを意味する。いくつかの実施形態では、「高発現体」は、対象とする糖タンパク質がトランスジェニック植物宿主中で産生される総可溶性タンパク質の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％又はそれ以上となるように本明細書に記載の糖タンパク質を作製するように工学的に作製されているトランスジェニック植物宿主である。したがって、例えば、一実施形態では、トランスジェニック植物宿主は、ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴの発現を阻害するように改変されているウキクサであり、トランスジェニックウキクサは、本明細書に記載の糖タンパク質の高発現体である。これらの実施形態のいくつかでは、トランスジェニックウキクサは、本明細書の上記に記載の優勢なＧ０グライコフォームを有するグリカン最適化モノクローナル抗体の高発現体である。さらに他の実施形態では、トランスジェニックウキクサは、グリカン最適化モノクローナル抗体を発現し、その結果、この糖タンパク質が、総可溶性タンパク質の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％又はそれ以上となる。
【０２０２】
糖タンパク質のさらなるヒト化
いくつかの実施形態では、本発明の糖タンパク質が、１，３及び／又は１，６マンノース腕と結合した末端β（１，４）−ガラクトース残基を有する複合Ｎ−グリカンを含むことが望ましい可能性がある。理論に拘泥するものではないが、これらの末端ガラクトース残基は、糖タンパク質の治療的機能及び／又は薬物動態活性に寄与する可能性がある。本発明の方法を当技術分野で知られている他の方法と一対にして、糖タンパク質と結合したＮ−グリカンが１つ又は複数の末端ガラクトース残基を有する、すなわち、１つ又は複数のＮ−グリカンがＧ１又はＧ２グリカン種によって表されるように本発明の糖タンパク質をさらに修飾できることが認められている。このように、本明細書に記載のモノクローナル抗体を含めた本発明の糖タンパク質組成物を、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ酵素を使用して酵素的に修飾して、Ｇ１について、好ましくはＧ２グリカン種について実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有する糖タンパク質を得ることができる。例えば、実質的にすべてのＮ−結合グリカン種がＧ２型のものである糖タンパク質を得るための基質糖タンパク質のガラクトシルトランスフェラーゼ修飾を教示する、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００４／０１９１２５６号を参照されたい。このように、ガラクトシルトランスフェラーゼ及び金属塩の存在下で、対象とする糖タンパク質を活性化ガラクトースと反応させることができる。ガラクトシルトランスフェラーゼは、哺乳動物β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ，galactosyltransferase）、例えばヒトＧａｌＴでよく、活性化ガラクトースは、例えばＵＤＰ−ガラクトースでよい。
【０２０３】
或いは、本明細書で示すようにＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ発現が抑制された本発明のトランスジェニック植物を、それがガラクトシルトランスフェラーゼを発現し、末端ガラクトース残基をその中で産生された内因性の異種糖タンパク質のＮ−グリカンと効率よく結合させるように、そのグリコシル化機構においてさらに改変することができる。このように、ガラクトシルトランスフェラーゼの発現をもたらすヌクレオチド構築物、例えば発現カセットを導入することによって、本発明のトランスジェニック植物をさらに改変することができる。ガラクトシルトランスフェラーゼは、哺乳動物β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、例えばヒトＧａｌＴ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，９９８，２６７号を参照）、又は第１のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、キシロシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグリコシルトランスフェラーゼやフコシルトランスフェラーゼなどの植物グリコシルトランスフェラーゼ）の細胞質尾部−膜貫通−ステム領域の少なくとも一部及び第２のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、例えばヒトＧａｌＴ）の触媒領域の少なくとも一部を含むハイブリッドＧａｌＴ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＷＯ０３／０７８６３７を参照）でよい。植物、例えばウキクサ中でＸｙｌＴ及びＦｕｃＴの発現を抑制し、この植物、例えばウキクサ中でＧａｌＴ、例えばヒトＧａｌＴ、又はＧａｌＴの、例えばヒトＧａｌＴの触媒ドメインの一部を含むハイブリッド酵素の発現をもたらすことによって、それと結合したＮ−結合グリカンの、植物特異的キシロース及び植物特異的フコース残基との結合が低下する、変化したグリコシル化パターンを有し、末端ガラクトース残基（すなわちＧ２グリカン種）を含む、内因性でもあり異種でもある糖タンパク質を産生するトランスジェニック植物を得ることができる。このように、本発明のトランスジェニック植物から、Ｇ２グリカン種について実質的に同種のプロファイルを有し、かつ／又はＧ２グライコフォームについて実質的に同種である糖タンパク質を得ることができる。
【０２０４】
他の実施形態では、本発明の糖タンパク質のグリコシル化パターンをさらに改変することが望ましい可能性があり、それと結合したＮ−結合グリカンは、１，３及び１，６マンノース腕と結合した一方又は両方のガラクトース残基と結合した末端シアル酸残基をさらに含む。（複数の）末端シアル酸残基の付加は、一部の治療用タンパク質の持続的な安定性を、またある場合には機能を必要とすることがある。
【０２０５】
トランスジェニック植物系によっては、糖タンパク質の天然のシアリル化が起こることがある。したがって、培養シロイヌナズナ（Arabidopsis）、タバコ、及びウマゴヤシ（Medicago）培養細胞がシアリル化糖タンパク質を合成するという文献での報告がある（Shah et al. (2003) Nat. Biotech. 21(12):1470-1471；Joshi and Lopez (2005) Curr. Opin. Plant Biol. 8(2):223-226）。より最近では、日本のイネが活性なシアリルトランスフェラーゼ様タンパク質を発現することが報告された（Takashima et al. (2006) J. Biochem. (Tokyo) 139(2):279-287）。したがって、植物が、糖タンパク質をシアリル化するのに必要な機構を有するという直交的な報告が現在存在する。
【０２０６】
それと結合したＮ−結合グリカンが、１，３及び１，６マンノース腕と結合した一方又は両方のガラクトース残基と結合した末端シアル酸残基をさらに含む、本発明の糖タンパク質のグリコシル化パターンのさらなる改変が所望される場合、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えばヒトβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼを発現し、シアリルトランスフェラーゼを発現又は過剰発現するように、本発明のトランスジェニック植物を改変することができる。したがって、例えば、α−２，３−及び／又はα−２，６−シアリルトランスフェラーゼなどのシアリルトランスフェラーゼを発現するように、トランスジェニック植物をさらに改変することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、ＷＯ２００４／０７１１７７；及びWee et al. (1998) Plant Cell 10:1759-1768を参照されたい。或いは、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えばヒトβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼを発現し、植物宿主のシアル酸経路中で欠損している任意の他の酵素を発現するように、本発明のトランスジェニック植物を改変することもできる。特定の植物宿主、例えばウキクサが、天然の又は組換えにより産生された糖タンパク質上にシアル酸含有Ｎ−グリカンを天然に発現するかどうかを最初に調べた後に、使用する（複数の）戦略を決定することができる。例えば、トランスジェニック植物宿主、特にβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するように工学的に作製されたトランスジェニック植物宿主内で産生された糖タンパク質のＮ−グリカン上に末端シアル酸残基が存在するかどうか証拠がない場合、これらの一方又は両方の戦略を使用して、対象とするトランスジェニック植物宿主内で産生された糖タンパク質のＮ−グリカンの末端シアリル化を実現することができる。
【０２０７】
或いは、Ｇ２グリカン種又はＧ２グライコフォームについて実質的に同種である本発明の糖タンパク質組成物は、インビトロでの酵素的プロセシングによって改変することもできる；例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００３００４００３７号を参照されたい。
【０２０８】
本発明のトランスジェニック植物中で産生された一部の糖タンパク質では、それと結合したＮ−グリカン種のトリマンノースコア構造（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）と結合した哺乳動物α１−６フコース残基を有することが望ましい可能性があることも認められている。そのような実施形態では、当技術分野で知られている糖鎖工学の方法を使用して、α１−６フコシルトランスフェラーゼ、例えば、ヒトα１−６フコシルトランスフェラーゼを発現するように本発明のトランスジェニック植物をさらに遺伝子改変することができる。
【０２０９】
本明細書で例示及び記載されている植物宿主細胞を含めた、対象とする任意の宿主細胞を工学的に作製することによって、本発明の糖タンパク質組成物を産生できることが認められている。このように、植物宿主に加えて、動物、昆虫、細菌細胞などを含めた他のタンパク質発現宿主系を使用して、本発明による糖タンパク質組成物を産生することができる。そのようなタンパク質発現宿主系は、優勢なグライコフォームを発現するように工学的に作製し、又は選択することもでき、或いは、優勢なグリカン構造を有する糖タンパク質を天然に産生する可能性もある。優勢なグライコフォームを有する糖タンパク質を産生する、工学的に作製されたタンパク質発現宿主系の例としては、遺伝子ノックアウト／突然変異（Shields et al. (2002) JBC 277:26733-26740）；遺伝子操作（Umana et al. (1999) Nature Biotech. 17:176-180）；又は両方の組合せがある。或いは、例えばニワトリ、ヒト、及びウシでは、特定の細胞が優勢なグライコフォームを天然に発現する（Raju et al. (2000) Glycobiology 10:477-486）。したがって、本発明に従って１つの特定のグリカン構造を優勢に有するモノクローナル抗体などのイムノグロブリンを含めた糖タンパク質、又は組成物の発現は、多数の宿主系の少なくとも１つを選択することによって、当業者により得ることができる。糖タンパク質の産生について当技術分野で認められる、さらなる発現宿主系には、ＣＨＯ細胞（例えば、ＷＯ９９２２７６４Ａ１及びＷＯ０３／０３５８３５Ａ１を参照）；ハイブリドーマ細胞（Trebak et al. (1999) J. Immunol. Methods 230:59-70）；昆虫細胞（Hsu et al. (1997) JBC 272:9062-970）がある。さらなる植物宿主系に関しては、ＷＯ０４／０７４４９９Ａ２も参照されたい。
【０２１０】
本発明の方法に従って産生された糖タンパク質を、それが組換えにより産生された宿主細胞から回収して、単離又は精製された形でそれを得ることができる。このように、当技術分野で知られている任意の従来の手段を使用して、組換えにより産生された本発明の糖タンパク質を宿主細胞から単離し、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、透析、溶媒−溶媒の抽出などによってそれを精製する。したがって、本発明はまた、モノクローナル抗体組成物を含めた精製糖タンパク質をも提供し、その糖タンパク質は実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、Ｇ０グライコフォームについて実質的に同種である。本明細書の上記で述べたように、これらの精製糖タンパク質は宿主の細胞性物質を実質的に含まず、それには、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満の混入タンパク質を有する糖タンパク質の調製物が含まれる。いくつかの実施形態では、これらの精製糖タンパク質は、（乾燥重量で）少なくとも０．００１％、０．００５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は最大で約３０％の混入タンパク質を含んでよい。さらに、本明細書の上記で述べたように、組換えにより産生された本発明の精製糖タンパク質にとって、最適には、培地は、精製糖タンパク質調製物内の化学物質前駆体又は対象とするタンパク質でない化学物質が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満となる。したがって、いくつかの実施形態では、これらの精製糖タンパク質内の培地構成成分は、精製糖タンパク質調製物内の化学物質前駆体又は対象とするタンパク質でない化学物質が（乾燥重量で）少なくとも０．００１％、０．００５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は最大で約３０％となる。いくつかの実施形態では、単離及び精製の結果、混入宿主タンパク質を含まず、培地構成成分を含まず、かつ／又は混入宿主タンパク質と培地構成成分をどちらも含まない精製糖タンパク質が回収される。
【０２１１】
したがって、いくつかの実施形態では、タンパク質発現宿主系は植物、例えばウキクサであり、植物宿主から得られた精製糖タンパク質は、糖タンパク質の調製物が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満の混入植物タンパク質を有する実施形態を含めて、植物細胞性物質を実質的に含まない。他の実施形態では、植物培地は、精製糖タンパク質調製物内の化学物質前駆体又は対象とするタンパク質でない化学物質が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満となる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、植物宿主から得られたこれらの精製糖タンパク質は、（乾燥重量で）少なくとも０．００１％、０．００５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は最大で約３０％の混入植物タンパク質を含んでよい。他の実施形態では、これらの精製糖タンパク質内の植物培地構成成分は、精製糖タンパク質内の化学物質前駆体又は対象とするタンパク質でない化学物質が（乾燥重量で）少なくとも０．００１％、０．００５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は最大で約３０％となる。いくつかの実施形態では、植物宿主からの単離及び精製の結果、混入植物タンパク質を含まず、植物培地構成成分を含まず、かつ／又は混入植物タンパク質と植物培地構成成分をどちらも含まない精製糖タンパク質が回収される。
【０２１３】
発現カセット
本発明によれば、発現カセット内に含有される対象のポリヌクレオチドでの形質転換によって、安定に形質転換された高等植物、例えば、安定に形質転換されたウキクサが得られる。目的に応じて、対象とするポリヌクレオチドは、対象とするＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリペプチド、例えば、配列番号３（ＦｕｃＴ）若しくは配列番号６又は２１（ＸｙｌＴ）で示すポリペプチド、又はその変異体をコードし、それによって、細胞、例えば植物細胞中でこれらのポリペプチドが発現されるものでもよく、或いは細胞、例えば対象とする植物細胞中に安定に導入されたときにＦｕｃＴ又はＸｙｌＴポリペプチドの発現又は機能を阻害することができるＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチドでもよい。
【０２１４】
したがって、いくつかの実施形態では、配列番号１及び２（ＦｕｃＴ）と配列番号４、５、１９、及び２０（ＸｙｌＴ）で示すもの、並びにその断片及び変異体を含めた本発明のＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴポリヌクレオチドを使用して、本明細書の上記で定義したＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセットを構築する。そのような発現カセットを、対象とする植物又は植物細胞中に安定に導入すると、配列番号３（ＦｕｃＴ）及び配列番号６又は２１（ＸｙｌＴ）で示すもの、並びにその変異体を含めた本発明のＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴポリペプチドの発現又は機能を阻害し、それによって、発現カセットで安定に形質転換された植物又は植物細胞内で内因性の異種糖タンパク質のＮ−グリカンのグリコシル化パターンを変化させることができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセットで安定に形質転換された植物又は植物細胞はまた、対象とする異種ポリペプチド、例えば、本明細書の上記で述べた薬学的な関心のある哺乳動物タンパク質を含めた、対象とする哺乳動物タンパク質の発現をもたらす発現カセットでも安定に形質転換されている。対象とする異種ポリペプチドの発現をもたらす発現カセットは、植物中に導入する同じポリヌクレオチド上に（例えば、同じ形質転換ベクター上に）、又は対象とする植物若しくは植物細胞中に導入する異なるポリヌクレオチド上に（例えば、異なる形質転換ベクター上に）、同時に又は異なる時間に、同じ又は異なる導入方法によって、例えば同じ又は異なる形質転換方法によって提供することができる。
【０２１６】
本発明の発現カセットは、対象とするポリヌクレオチド、すなわち本発明のＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＦｕｃＴ及び／若しくはＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチド、又は対象とする異種ポリペプチド、例えば哺乳動物タンパク質をコードするポリヌクレオチドと連結した転写開始領域（例えば、プロモーター）を少なくとも含む発現調節エレメントを含む。そのような発現カセットは、プロモーター及び他の発現調節エレメントの転写制御下にある、対象とする１つ又は複数のポリヌクレオチド（例えば、対象とする１つのポリヌクレオチド、対象とする２つのポリヌクレオチドなど）を挿入するための複数の制限部位とともに提供される。本発明の特定の実施形態では、移入するポリヌクレオチドは２つ以上の発現カセットを含有し、その各カセットは、対象とする少なくとも１つのポリヌクレオチドをコードする。
【０２１７】
「発現調節エレメント」とは、通常はＴＡＴＡボックスを含み、ＲＮＡポリメラーゼII、又はいくつかの実施形態ではＲＮＡポリメラーゼIIIを誘導して、適当な転写開始部位で特定のコード配列のＲＮＡ合成を開始するＤＮＡの制御領域を意味する。発現調節エレメントは、一般にＴＡＴＡボックスに対して上流又は５’側に位置し、転写開始速度に影響を及ぼす（例えば、それを亢進する）他の認識配列をさらに含んでよい。さらに、発現調節エレメントは、一般にＴＡＴＡボックスに対して下流又は３’側に位置し、転写開始速度に影響を及ぼす（例えば、それを亢進する）配列をさらに含んでよい。
【０２１８】
転写開始領域（例えば、プロモーター）は、宿主にとって天然若しくは同種、又は外来若しくは異種のものでもよく、或いは天然の配列又は合成配列でもよい。外来とは、転写開始領域が、転写開始領域を導入する野生型宿主中に認められないことを意味する。「機能的プロモーター」とは、対象とするタンパク質をコードする配列と作動的に連結したとき、プロモーターが、コードされたタンパク質の発現（すなわち、転写及び翻訳）を促進でき、又は阻害性ヌクレオチド分子（例えば、ヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡポリヌクレオチドなど）をコードする阻害性配列と作動的に連結したとき、プロモーターが、阻害性ヌクレオチド分子が発現されるように、作動的に連結した阻害性配列の転写を開始できることを意味する。プロモーターは、所望される結果に基づいて選択することができる。したがって、本発明の発現カセットは、構成的、組織優先的、又は植物中で発現させるための他のプロモーターを含んでよい。
【０２１９】
本明細書において、キメラ遺伝子は、コード配列にとって異種である転写開始領域と作動的に連結したコード配列を含む。
【０２２０】
本発明に従って、細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物、及び植物のプロモーターを含めた、当技術分野で知られている任意の適切なプロモーターを使用することができる。例えば、ウキクサプロモーターを含めた植物プロモーターを使用することができる。例示的なプロモーターには、それだけに限らないが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、オピンシンセターゼプロモーター（例えば、ｎｏｓ、ｍａｓ、ｏｃｓなど）、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロースビスリン酸（ＲｕｂＰ，ribulose bisphosphate）カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、及びアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターがある。ウキクサＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターは、当技術分野で知られている（Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:49）。それだけに限らないが、サトイモモザイクウイルス、クロレラウイルス（例えば、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼプロモーター；Mitra et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:85）、トマト黄化壊疽ウイルス、タバコ茎えそウイルス、タバコ壊死ウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス、キュウリモザイクウイルス、ラッカセイスタンプウイルス（peanut stump virus）、アルファルファモザイクウイルス、サトウキビバシリフォームバドナウイルスなどから単離されたプロモーターを含めて、植物、好ましくはウキクサに感染するウイルスに由来する他のプロモーターも適切である。
【０２２１】
他の適切な発現調節エレメントは、本出願の権利者が所有し同時係属する、２００６年１月１７日に出願され、米国特許出願第６０／７５９，３０８号、代理人整理番号０４０９８９／２４３６５６を割り当てられた"Expression Control Elements from the Lemnaceae Family"という名称の仮出願中に開示され、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。この同時係属する出願中に開示されている発現調節エレメントは、ウキクサ科のいくつかのメンバーのユビキチン遺伝子から単離され、したがって「ウキクサユビキチン調節エレメント」と称される。本出願の配列番号７は、５’ＵＴＲを加えたプロモーター（ヌクレオチド１〜１６２５）もイントロン（ヌクレオチド１６２６〜２１６０）も含めた、完全長コウキクサユビキチン発現調節エレメントを示す。配列番号８は、５’ＵＴＲを加えたプロモーター（ヌクレオチド１〜１０４１）もイントロン（ヌクレオチド１０４２〜２０２１）も含めた、完全長ウキクサ（Spirodella polyrrhiza）ユビキチン発現調節エレメントを示す。配列番号９は、５’ＵＴＲを加えたプロモーター（ヌクレオチド１〜９６４）もイントロン（ヌクレオチド９６５〜２０６８）も含めた、完全長ナンゴクアオウキクサユビキチン発現調節エレメントを示す。配列番号１０は、コウキクサユビキチン発現調節エレメントの５’ＵＴＲ部分を加えたプロモーター（本明細書において「ＬｍＵｂｑプロモーター」と称する）を示す。配列番号１１は、ウキクサ（S. polyrrhiza）ユビキチン発現調節エレメントの５’ＵＴＲ部分を加えたプロモーター（本明細書において「ＳｐＵｂｑプロモーター」と称する）を示す。配列番号１２は、ナンゴクアオウキクサユビキチン発現調節エレメントの５’ＵＴＲ部分を加えたプロモーター（本明細書において「ＬａＵｂｑプロモーター」と称する）を示す。配列番号１３は、コウキクサユビキチン発現調節エレメントのイントロン部分（本明細書において「ＬｍＵｂｑイントロン」と称する）を示す。配列番号１４は、ウキクサ（S. polyrrhiza）ユビキチン発現調節エレメントのイントロン部分（本明細書において「ＳｐＵｂｑイントロン」と称する）を示す。配列番号１５は、ナンゴクアオウキクサユビキチン発現調節エレメントのイントロン部分（本明細書において「ＬａＵｂｑイントロン」と称する）を示す。配列番号１０〜１２で示す５’ＵＴＲ配列を加えた個々のプロモーター、並びに生物学的に活性のあるその変異体及び断片を使用して、植物中で対象とする作動的に連結したヌクレオチド配列の転写を制御できることが認められている。同様に、配列番号１３〜１５で示す１つ又は複数のイントロン配列、及び生物学的に活性のあるその変異体又は断片を、配列番号１０、１１、又は１２で示すプロモーターを含めた、対象とするプロモーターと作動的に連結して、そのプロモーターと作動的に連結したヌクレオチド配列の発現を亢進することができる。
【０２２２】
開示されている発現調節エレメントの断片及び変異体を発現カセット内で使用して、対象とする作動的に連結したポリヌクレオチドの発現を促進することもできる。「発現調節エレメントの断片」とは、配列番号７〜９で示す発現調節エレメントのいずれか１つの部分など、完全長発現調節エレメントの部分を意味する。発現調節エレメントの断片は生物活性を保持し、したがって対象とする作動的に連結したポリヌクレオチドの発現を開始又は亢進することができる断片を包含する。したがって、例えば、本明細書で開示されている発現調節エレメント全体より短いものを利用して、対象とする作動的に連結したポリヌクレオチドの発現を促進することができる。発現調節エレメントのそのような断片の非限定的な具体例として、（本明細書の上記に記載の）配列番号１０〜１２のいずれか１つで示すヌクレオチド配列、並びに配列番号７のヌクレオチド１２８８〜２１６０（ＬｍＵｂｑ切断型プロモーター第１）や配列番号１のヌクレオチド１１３２〜２１６０（ＬｍＵｂｑ切断型プロモーター第２）などのコウキクサユビキチン発現調節エレメント（配列番号７）の５’切断物がある。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許出願第６０／７５９，３０８号を割り当てられた、同時係属する仮出願を参照されたい。
【０２２３】
そのような断片のヌクレオチドは通常、特定の発現調節エレメントのＴＡＴＡ認識配列を含む。そのような断片は、制限酵素を使用して、天然に存在する本明細書で開示された発現調節エレメントを切断することにより；発現調節エレメントＤＮＡ配列の天然に存在する配列からヌクレオチド配列を合成することにより得ることもでき、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術の使用を介して得ることもできる。具体的には、Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350、及び Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York)を参照されたい。
【０２２４】
部位特異的突然変異生成から生じるものなどの発現調節エレメントの変異体を本発明の発現カセット中で使用して、対象とする作動的に連結したポリヌクレオチドの発現をもたらすこともできる。「発現調節エレメントの変異体」とは、本明細書で開示されている発現調節エレメント（例えば、配列番号７、９、又は９で示す発現調節エレメント）、又はその断片（例えば、配列番号１０〜１５で示すそれぞれの配列）と実質的な類似性を有する配列を意味する。発現調節エレメントの天然に存在する変異体は、周知の分子生物学的技術を使用して、例えば、上記で概略を述べたＰＣＲ及びハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができる。変異体発現調節エレメントはまた、例えば部位特異的突然変異生成を使用することによって得られるものなどの合成誘導ヌクレオチド配列を含んでもよい。一般に、配列番号７〜１５の変異体を含めた、本明細書で開示されている特定の発現調節エレメントの変異体は、その特定のヌクレオチド配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、一般には少なくとも７５％、８０％、８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％から９５％、９６％、９７％、より好ましくは約９８％、９９％又はそれ以上の、初期設定パラメーターを使用して本明細書の上記に記載の配列アラインメントプログラムにより決定される配列同一性を有する。
【０２２５】
プロモーターを含めた発現調節エレメントを選択して、所望のレベルの制御をもたらすことができる。例えば、ある場合には、構成的な発現をもたらすプロモーター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のマンノピンシンターゼプロモーター）を使用することが有利となる可能性がある。或いは、他の状況では、例えば、異種ポリペプチドの発現が関係する場合、特定の環境刺激に反応して活性化するプロモーター（例えば、熱ショック遺伝子プロモーター、干ばつ誘導性遺伝子プロモーター、病原体誘導性遺伝子プロモーター、創傷誘導性遺伝子プロモーター、及び明／暗誘導性遺伝子プロモーター）又は植物成長制御因子（例えば、アブシジン酸、オーキシン、サイトカイニン、及びジベレリン酸によって誘導される遺伝子由来のプロモーター）を使用することが有利となる可能性もある。さらなる代替手段として、組織特異的発現をもたらすプロモーター（例えば、根、葉、及び花特異的プロモーター）を選択することができる。
【０２２６】
所与のプロモーターの全体的な強度は、上流活性化配列などのシス作用性ヌクレオチド配列の組合せ及び空間的構成によって影響を受け得る。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスオクトピンシンターゼ遺伝子に由来する活性化ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスマンノピンシンターゼプロモーターからの転写を亢進することができる（Gelvinらの米国特許第５，９５５，６４６号を参照）。本発明では、発現カセットは、対象とするヌクレオチド配列の発現を亢進する、プロモーター配列の上流に挿入された活性化ヌクレオチド配列を含んでよい。一実施形態では、発現カセットは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスマンノピンシンターゼ遺伝子に由来するプロモーターと作動的に連結したアグロバクテリウム・ツメファシエンスオクトピンシンターゼ遺伝子に由来する３つの上流活性化配列を含む（参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，９５５，６４６号を参照）。
【０２２７】
発現調節エレメントを使用して、例えば、本明細書の上記に記載のＲＮＡｉ発現カセット内で低分子ｈｐＲＮＡをコードする作動的に連結したＤＮＡ配列の発現を促進する場合、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターを含む発現調節エレメントを使用することが有利となる。本明細書において、「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼIIIのポリメラーゼ作用を介して、関係するＤＮＡ領域の転写を誘導するプロモーターである。これには、５Ｓ  ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、７ＳＬ  ＲＮＡ、Ｕ６ｓｎＲＮＡ及びいくつかの他の低分子安定ＲＮＡをコードする遺伝子があり、その多くはＲＮＡプロセシングに関与する。ＰｏｌIIIによって使用される大部分のプロモーターは、転写領域内で、＋１の下流にある配列エレメントを必要とする。しかし、少数のＰｏｌIII鋳型は、遺伝子内プロモーターエレメントを必要としない。これらは３型プロモーターと称される。「３型ＰｏｌIIIプロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼIIIによって認識され、ＲＮＡポリメラーゼIIIによって正常に転写される領域の上流でＲＮＡポリメラーゼIIIと相互作用するすべてのシス作用性エレメントを含有するプロモーターを意味する。本発明のＲＮＡｉ発現カセット内でそのような３型ＰｏｌIIIプロモーターを構築して、低分子ｈｐＲＮＡ分子をコードする作動的に連結したＤＮＡ配列の発現を促進することができる。
【０２２８】
典型的には、３型ＰｏｌIIIプロモーターはＴＡＴＡボックス（ヒトＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子中の−２５〜−３０に位置する）及び近位配列エレメント（ＰＳＥ，Proximal Sequence element；ヒトＵ６ｓｎＲＮＡ中の−４７〜−６６に位置する）を含有する。それはまた、遠位配列エレメント（ＤＳＥ，Distal Sequence element；ヒトＵ６ｓｎＲＮＡ中の−２１４〜−２４４に位置する）を含有してもよい。３型ＰｏｌIIIプロモーターは、例えば、７ＳＬ  ＲＮＡ、Ｕ３ｓｎＲＮＡ及びＵ６ｓｎＲＮＡをコードする遺伝子に付随して認めることができる。そのような配列は、シロイヌナズナ、イネ、及びトマトから単離されている。例えば、米国特許出願公開第２００４０２３１０１６号に記載の配列番号１〜８を参照されたい。
【０２２９】
３型ＰｏｌIIIプロモーターの他のヌクレオチド配列は、７ＳＬ  ＲＮＡのシロイヌナズナ（A. thaliana）遺伝子ＡＴ７ＳＬ−１（Ｘ７２２２８）、７ＳＬ  ＲＮＡのシロイヌナズナ遺伝子ＡＴ７ＳＬ−２（Ｘ７２２２９）、７ＳＬ  ＲＮＡのシロイヌナズナ遺伝子ＡＴ７ＳＬ−３（ＡＪ２９０４０３）、ホップ（Humulus lupulus）Ｈ１７ＳＬ−１遺伝子（ＡＪ２３６７０６）、ホップＨ１７ＳＬ−２遺伝子（ＡＪ２３６７０４）、ホップＨ１７ＳＬ−３遺伝子（ＡＪ２３６７０５）、ホップＨ１７ＳＬ−４遺伝子（ＡＪ２３６７０３）、シロイヌナズナＵ６−１ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２５２７）、シロイヌナズナＵ６−２６ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２５２８）、シロイヌナズナＵ６−２９ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２５２９）、シロイヌナズナＵ６−１ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２５２７）、トウモロコシ（Zea mays）Ｕ３ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｚ２９６４１）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｚ１７３０１；Ｘ６０５０６；Ｓ８３７４２）、トマトＵ６低分子核内ＲＮＡ遺伝子（Ｘ５１４４７）、シロイヌナズナＵ３ＣｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２６３０）、シロイヌナズナＵ３ＢｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ５２６２９）、イネ（Oryza sativa）Ｕ３ｓｎＲＮＡプロモーター（Ｘ７９６８５）、トマトＵ３低分子核内ＲＮＡ遺伝子（Ｘ１４４１１）、コムギ（Triticum aestivum）Ｕ３ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ６３０６５）、及びコムギＵ６ｓｎＲＮＡ遺伝子（Ｘ６３０６６）の登録下で、ヌクレオチド配列データベース中に認めることができる。
【０２３０】
当技術分野で周知の方法を使用して、トマト、イネ若しくはシロイヌナズナの他の品種、又は他の植物種から他の３型ＰｏｌIIIプロモーターを単離することができる。例えば、Ｕ６ｓｎＲＮＡ、Ｕ３ｓｎＲＮＡ、又は７ＳＬ  ＲＮＡコード配列（そのアクセッション番号によって特定される上記に挙げた配列のいずれか、さらにはソラマメ（Vicia faba）Ｕ６ｓｎＲＮＡコード配列（Ｘ０４７８８）、Ｕ６ｓｎＲＮＡのトウモロコシＤＮＡ（Ｘ５２３１５）や７ＳＬ  ＲＮＡのトウモロコシＤＮＡ（Ｘ１４６６１）など）をプローブとして使用して、そのような植物に由来するゲノムクローンのライブラリーを単離することができ、転写領域の上流配列、好ましくは約３００〜４００ｂｐ上流を単離し、３型ＰｏｌIIIプロモーターとしてそれを使用することができる。或いは、逆ＰＣＲやＴＡＩＬ（商標）−ＰＣＲなどのＰＣＲに基づく技術を使用して、既知の転写領域と隣接するプロモーター配列を含むゲノム配列を単離することもできる。さらに、厳密なハイブリダイゼーション条件下でプローブとして、又はＰＣＲプライマーを生成するための情報供給源として、そのアクセッション番号及び配列番号によって特定される本明細書に記載の３型ＰｏｌIIIプロモーター配列のいずれかを使用して、他の品種又は植物種から対応するプロモーター配列を単離することができる。
【０２３１】
３型ＰｏｌIIIプロモーターは転写領域とともに位置するシス作用性エレメントを必要としないが、それにも関わらず、正常では転写開始部位の下流に位置する配列を本発明のＲＮＡｉ発現カセット中に含めてもよいことは明らかである。さらに、単子葉植物から最初に単離された３型ＰｏｌIIIプロモーターをＲＮＡｉ発現カセット中で有効に使用して、双子葉と単子葉のどちらの植物細胞及び植物中でも標的遺伝子の発現を抑制することができるが、報告によれば、双子葉植物から最初に単離された３型ＰｏｌIIIプロモーターは、双子葉の植物細胞及び植物中でしか有効に使用することができない。さらに、報告によれば、大部分の有効な遺伝子発現抑制は、同じ又は密接に関係する種に由来する３型ＰｏｌIIIプロモーターを含むようにＲＮＡｉ発現カセットを設計したときに得られる。例えば、米国特許出願公開第２００４０２３１０１６号を参照されたい。したがって、対象とする植物が単子葉植物であり、低分子ｈｐＲＮＡ干渉がＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴの発現阻害に選択した方法である場合、好ましくは、３型ＰｏｌIIIプロモーターは、対象とする糖タンパク質のＮ−結合グリカンのグリコシル化パターンを変化させる植物種を含めた他の単子葉植物に由来する。
【０２３２】
したがって、本発明の発現カセットは、５’から３’の転写方向で、転写及び翻訳開始領域、対象とするポリヌクレオチド、例えば、対象とする異種タンパク質をコードする配列、又は発現したときにＦｕｃＴ及び／若しくはＸｙｌＴの発現又は機能を阻害することができるＦｕｃＴ若しくはＸｙｌＴ阻害性配列をコードする配列、並びに植物中で機能する転写及び翻訳終結領域を含む発現調節エレメントを含む。本発明に従って、当技術分野で知られている任意の適切な停止配列を使用することができる。終結領域は、転写開始領域との間で天然のものでもよく、対象とするヌクレオチド配列との間で天然のものでもよく、又は他の供給源に由来するものでもよい。好都合な終結領域は、オクトピンシンセターゼやノパリンシンセターゼ終結領域など、Ａ．ツメファシエンスのＴｉ−プラスミドから入手可能である。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141；Proudfoot (1991) Cell 64:671；Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141；Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261；Munroe et al. (1990) Gene 91:151；Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891；及びJoshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627も参照されたい。さらなる例示的な停止配列は、エンドウマメＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニット停止配列及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ停止配列である。低分子ｈｐＲＮＡ構造を形成するＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチドの発現を促進する３型ＰｏｌIIIプロモーターとともに使用する本明細書の上記で開示されているオリゴｄＴストレッチを含めて、他の適切な停止配列は当業者には明らかであろう。
【０２３３】
或いは、当技術分野で知られている任意の他の適切な発現カセット上に、対象とする（複数の）ポリヌクレオチドを提供することもできる。
【０２３４】
一般に、発現カセットは、形質転換された細胞又は組織を選択するための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＥＯ，neomycin phosphotransferase II）やハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ，hygromycin phosphotransferase）をコードするものなどの抗生物質耐性をコードする遺伝子、並びに除草性化合物に対する耐性を付与する遺伝子がある。除草剤耐性遺伝子は一般に、除草剤に非感受性の改変標的タンパク質、又は作用し得る前に植物中で除草剤を分解若しくは解毒する酵素をコードする。DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513；DeBlock et al. (1989) Plant Physiol. 91:691；Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:833；Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603を参照されたい。例えば、突然変異標的酵素の５−エノールピルビンシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ，5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）及びアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ，acetolactate synthase）をコードする遺伝子を使用して、グリホセート又はスルホニル尿素除草剤に対する耐性が得られている。それぞれの除草剤を解毒するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、又は２，４−ジクロロフェノキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を使用することによって、グルホシネートアンモニウム、ボロモキシニル（boromoxynil）、及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ，2,4-dichlorophenoxyacetate）に対する耐性が得られている。
【０２３５】
本発明の目的では、選択マーカー遺伝子には、それだけに限らないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1）；シアナミドヒドラターゼ（Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4250）；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロピコリン酸シンターゼ（Perl et al. (1993) BioTechnology 11:715）；ｂａｒ遺伝子（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503；Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36:1367）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ；Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ又はＨＹＧ；Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ，dihydrofolate reductase；Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4552）；ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513）；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Andersonらの米国特許第４，７６１，３７３号；Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266）；５−エノールピルビンシキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ；Comai et al. (1985) Nature 317:741）；ハロアリールニトリナーゼ（StalkerらのＷＯ８７／０４１８１）；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220）；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ；Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127）；及び３２ｋＤａ光化学系IIポリペプチド（ｐｓｂＡ；Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346 (1983)）をコードする遺伝子が含まれる。
【０２３６】
ゲンタマイシン（例えば、ａａｃＣ１、Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:202-208）；クロラムフェニコール（Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987）；メトトレキセート（Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209；Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807）；ハイグロマイシン（Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103；Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219；Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807）；ストレプトマイシン（Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131）；ブレオマイシン（Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171）；スルホンアミド（Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio. 15:127）；ブロモキシニル（Stalker et al. (1988) Science 242:419）；２，４−Ｄ（Streber et al. (1989) BioTechnology 7:811）；ホスフィノスリシン（DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard and Chupeau, Transgenic Research 5:131）に対する耐性をコードする遺伝子も含まれる。
【０２３７】
ｂａｒ遺伝子は、ホスフィノスリシン（ＰＰＴ，phosphinothricin）やビアラホスなどのグルホシネート型除草剤に対する除草剤耐性を付与する。上記で述べたように、ベクター構築物中で使用することができる他の選択マーカーには、それだけに限らないが、やはりビアラホス及びホスフィノスリシン耐性のｐａｔ遺伝子、イミダゾリノン耐性のＡＬＳ遺伝子、ハイグロマイシン耐性のＨＰＨ又はＨＹＧ遺伝子、グリホセート耐性のＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、Ｈｃ−毒素に対する耐性のＨｍ１遺伝子、並びに日常的に使用され当業者に知られている他の選択的作用物質がある。Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506；Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314；Yao et al. (1992) Cell 71:63；Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419；Barkley et al. (1980) The Operon 177-220；Hu et al. (1987) Cell 48:555；Brown et al. (1987) Cell 49:603；Figge et al. (1988) Cell 52:713；Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400；Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549；Deuschle et al. (1990) Science 248:480；Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343；Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952；Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072；Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647；Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And Struc. Biol. 10:143；Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591；Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094；Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397；Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547；Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913；Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78；及びGill et al. (1988) Nature 334:721を参照されたい。そのような開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２３８】
選択マーカー遺伝子の上記のリストは限定することを意味するものではない。任意の選択マーカー遺伝子を本発明で使用することができる。
【０２３９】
植物宿主中での発現を亢進するヌクレオチド配列の改変
また対象とする異種タンパク質を発現するように対象とする植物をやはり遺伝子改変する、例えば、トランスジェニック植物宿主が異種タンパク質の組換え産生用の発現系として働く場合、本発明では、対象とする異種タンパク質をコードする発現ポリヌクレオチド配列を改変して、宿主植物中でのその発現を亢進する。したがって、適当な場合には、ポリヌクレオチドを最適化して、形質転換された植物中での発現を増大させることができる。すなわち、発現を高める植物優先的コドンを使用してポリヌクレオチドを合成することができる。宿主優先的コドン使用の論述については、例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11を参照されたい。植物優先的コドンを用いてヌクレオチド配列を合成する方法は、当技術分野で利用可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，３８０，８３１号及び第５，４３６，３９１号；Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15:3324；Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485；並びにMurray et al., (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477を参照されたい。
【０２４０】
本発明のいくつかの実施形態では、植物宿主はウキクサ科のメンバーであり、対象とする異種ポリペプチド、例えば、哺乳動物ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変して、コードされた異種ポリペプチドの発現を亢進する。このように、そのような改変の１つは、ウキクサ優先的コドンを使用した、対象とする異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの合成であり、合成は当業者に知られている任意の方法を使用して実現することができる。優先的コドンは、ウキクサ中で発現されるタンパク質中で最も頻度が高いコドンから決定することができる。例えば、イボウキクサのコドン使用の頻度は、ウェブページ：http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=Lemna+gibba+[gbpln]上に認められ、コウキクサのコドン使用の頻度は、ウェブページhttp://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=Lemna+minor+[gbpln]上及び表１中に認められる。ウキクサ及び他の単子葉類、並びに他の双子葉類中での発現について最適化されている異種遺伝子を本発明の方法で使用できることが認められる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＥＰ０３５９４７２、ＥＰ０３８５９６２、ＷＯ９１／１６４３２；Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324；Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485；及びMurray et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:477などを参照されたい。対象とする異種ポリペプチドをコードする全部若しくは任意の一部のポリヌクレオチドを最適化してもよく、又はそれは合成のものでもよいことがさらに認められる。言い換えると、完全に最適化され又は部分的に最適化された配列を使用することもできる。例えば、コドンの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％がウキクサ優先的コドンでよい。一実施形態では、コドンの９０〜９６％がウキクサ優先的コドンである。対象とする異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコード配列は、イボウキクサ中で少なくとも１７％の頻度で使用されるコドンを含んでよい。一実施形態では、改変ヌクレオチド配列は配列番号１６に示すヒトα−２Ｂ−インターフェロンをコードするヌクレオチド配列であり、その配列は、９３％のウキクサ優先的コドンを含有する。
【０２４１】
【表１】
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【０２４２】
対象とする異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに他の改変を行って、ウキクサを含めた対象の植物宿主中でのその発現を亢進することもできる。この改変には、それだけに限らないが、偽ポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列、及び遺伝子発現にとって有害となる可能性がある他のそのような十分に特徴付けられている配列の除去がある。配列のＧＣ含量を、宿主細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することにより計算される所与の細胞宿主の平均レベルに調整することができる。可能なときには、対象とする異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変して、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避することができる。
【０２４３】
動物と植物における翻訳開始コドンの最適な翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列の間には既知の違いがあり、これらの翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列の組成は、翻訳開始の効率に影響を及ぼす可能性がある。例えば、Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154:89-98；及びJoshi et al. (1997); Plant Mol. Biol. 35:993-1001を参照されたい。本発明では、対象とするポリヌクレオチド、例えば、対象とする異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの翻訳開始コドンの翻訳開始コンテクストヌクレオチド配列を改変して、ウキクサ中での発現を亢進することができる。一実施形態では、対象とするポリヌクレオチドの翻訳開始コドンの直接上流にある３つのヌクレオチドが「ＡＣＣ」となるようにヌクレオチド配列を改変する。第２の実施形態では、これらのヌクレオチドは「ＡＣＡ」である。
【０２４４】
５’リーダー配列の使用によって、ウキクサを含めた宿主植物中での導入遺伝子の発現を亢進することもできる。そのようなリーダー配列は、翻訳を亢進するように作用することができる。翻訳リーダーは当技術分野で知られ、そのリーダーには、それだけに限らないが、ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域；Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6126）；ポチウイルスリーダー、例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス；Allison et al. (1986) Virology 154:9）；ヒトイムノグロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ；Macajak and Sarnow (1991) Nature 353:90）；アルファルファモザイクウイルスの被覆タンパク質ｍＲＮＡに由来する非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ４；Jobling and Gehrke (1987) Nature 325:622）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ；Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56）；ジャガイモエッチウイルスリーダー（Tomashevskaya et al. (1993) J Gen. Virol. 74:2717-2724）；Ｆｅｄ−１  ５’非翻訳領域（Dickey (1992) EMBO J. 11:2311-2317）；ＲｂｃＳ５’非翻訳領域（Silverthorne et al. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15:49-58）；及びトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ；Lommel et al. (1991) Virology 81:382）がある。Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965も参照されたい。トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１，alcohol dehydrogenase 1）遺伝子、トウゴマ（castor bean）カタラーゼ遺伝子、又はシロイヌナズナトリプトファン経路遺伝子ＰＡＴ１由来のイントロン配列を含めた植物イントロン配列を含むリーダー配列が、植物中での翻訳効率を増大させることも示されている（Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200；Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920）。配列番号１３〜１５で示すイントロンからなる群から選択されたウキクサイントロン配列を含むリーダー配列によりウキクサ中での翻訳効率が増大する、同時係属する仮出願の米国特許出願第６０／７５９，３０８号も参照されたい。
【０２４５】
本発明のいくつかの実施形態では、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１；GenBankアクセッション番号Ｘ０４０４９）のヌクレオチド１２２２〜１７７５と対応するヌクレオチド配列、又は配列番号１３、１４、若しくは１５で示すイントロンと対応するヌクレオチド配列を、対象とする異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＦｕｃＴ及び／若しくはＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチドの上流に挿入して、その翻訳の効率を亢進する。他の実施形態では、発現カセットは、イボウキクサリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット５Ｂ遺伝子由来のリーダー（ＲｂｃＳリーダー；Buzby et al. (1990) Plant Cell 2:805-814を参照；本発明の配列番号１６、１７、又は１８も参照）を含有する。
【０２４６】
ほんの一例として、ＲｂｃＳリーダー及びＡＤＨ１イントロンが上流制御配列としてＦｕｃＴ阻害性ポリヌクレオチド（図８）、ＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチド（図９及び１１）を含む発現カセット、キメラＦｕｃＴ／ＸｙｌＴ阻害性分子を含む発現カセット（図１０）、又は異種ポリペプチドであるモノクローナル抗体のＩｇＧ１重鎖（図１２、１３、及び１４）若しくはモノクローナル抗体の軽鎖（図１４）のコード配列を含む発現カセット内に含まれる；ＬｍＵｂｑプロモーター及びＬｍＵｂｑイントロンが上流制御配列としてＦｕｃＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセット（図１１）、又は異種ポリペプチドであるモノクローナル抗体のＩｇＦ１軽鎖のコード配列を含む発現カセット（図１３）内に含まれる；ＳｐＵｂｑプロモーター及びＳｐＵｂｑイントロンが上流制御配列としてＦｕｃＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセット（図１３）、又はキメラＦｕｃＴ／ＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセット（図１２）内に含まれる；ＬａＵｂｑプロモーター及びＬａＵｂｑイントロンが上流制御配列としてＸｙｌＴ阻害性ポリヌクレオチドを含む発現カセット（図１３）中に含まれる、本明細書の図面中に開示されている発現ベクターも参照されたい。
【０２４７】
任意の単一の改変又は改変の任意の考えられる組合せを含めて、上記に記載した、発現を亢進するヌクレオチド配列の改変のいずれかを本発明で使用できることが認められている。植物、例えばウキクサ植物中での「発現を亢進するように改変された」という語句は、本明細書において、これらの改変のいずれか１つ又はいずれかの組合せを含有するポリヌクレオチド配列を指す。
【０２４８】
シグナルペプチド
対象とする異種ポリペプチドが、正常には、又は有利なことに、分泌タンパク質として発現されるものでよいことが認められている。分泌タンパク質は通常、「シグナルペプチド」を含む前駆ポリペプチドから翻訳され、そのペプチドは小胞体（ＥＲ）の膜上で受容体タンパク質と相互作用して、伸びているポリペプチド鎖の、膜を越えて小胞体中に入る移行を誘導することによりそれを細胞から分泌させる。このシグナルペプチドはしばしば前駆ポリペプチドから切断されて、シグナルペプチドを欠く「成熟」ポリペプチドが生じる。本発明の実施形態では、生物学的に活性のあるポリペプチドは、対象とする植物宿主、例えばウキクサ又は他の高等植物中で、培地中へのポリペプチドの分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動的に連結したポリヌクレオチド配列から発現される。（細胞の外側に分泌させるための）小胞体へのタンパク質の移行を標的とする植物シグナルペプチドは当技術分野で知られている。例えば、Lee et alの米国特許第６，０２０，１６９号を参照されたい。本発明では、任意の植物シグナルペプチドを使用して、発現したポリペプチドを標的としてＥＲへと移行させることができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、シロイヌナズナ塩基性エンドキチナーゼシグナルペプチド（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＢＡＡ８２８２３のアミノ酸１４〜３４）、エクステンシンシグナルペプチド（Stiefel et al. (1990) Plant Cell 2:785-793）、イネα−アミラーゼシグナルペプチド（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＡＡＡ３３８８５のアミノ酸１〜３１）、又は改変イネα−アミラーゼシグナル配列（配列番号１７）である。他の実施形態では、シグナルペプチドは分泌ウキクサタンパク質のシグナルペプチドである。
【０２５０】
或いは、哺乳動物シグナルペプチドを使用して、本発明の遺伝子改変植物、例えば、ウキクサ又は対象とする他の高等植物中で発現された組換えポリペプチドを標的としてそれを分泌させることもできる。植物細胞が小胞体を標的とする哺乳動物シグナルペプチドを認識し、このシグナルペプチドが原形質膜だけでなく植物細胞壁をも介するポリペプチドの分泌を誘導できることが示されている。Hiatt et al.の米国特許第５，２０２，４２２号及び第５，６３９，９４７号を参照されたい。本発明の一実施形態では、ポリペプチド分泌を標的とする哺乳動物シグナルペプチドは、ヒトα−２ｂ−インターフェロンシグナルペプチド（ＮＣＢＩタンパク質アクセッション番号ＡＡＢ５９４０２のアミノ酸１〜２３）である。
【０２５１】
一実施形態では、対象とするポリヌクレオチドの上記で開示されている任意の改変又は改変の組合せを利用してシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変して、対象とする植物宿主、例えばウキクサ又は他の高等植物中での発現を亢進する。
【０２５２】
当技術分野で知られている任意の従来の手段によって培地から生物学的に活性のある分泌ポリペプチドを回収し、クロマトグラフィー、電気泳動、透析、溶媒−溶媒の抽出などによってそれを精製することができる。このように、上記で定義した精製ポリペプチドは培地から得ることができる。
【０２５３】
したがって、いくつかの実施形態では、タンパク質発現宿主系は植物、例えば、ウキクサ又は他の高等植物であり、生物学的に活性のある分泌ポリペプチドは本発明の糖タンパク質であり、その糖タンパク質は実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、Ｇ０グライコフォームについて実質的に同種である。そのような実施形態では、植物物質内で残存し得る任意のそのような糖タンパク質を上記に記載のように単離及び精製してもよい。分泌糖タンパク質は、上記で述べた当技術分野の任意の従来の手段を使用して植物培地から得、精製することができる。このように、植物物質から得られた精製糖タンパク質は、植物の細胞性物質を実質的に含まず、それには、糖タンパク質の調製物が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満の混入植物タンパク質を有する実施形態が含まれる。精製糖タンパク質が植物培地から得られる場合、植物培地は、精製糖タンパク質調製物内の化学物質前駆体又は対象とするタンパク質でない化学物質が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満となる。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、植物宿主から得られたこれらの精製糖タンパク質は、（乾燥重量で）少なくとも０．００１％、０．００５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は最大で約３０％の混入植物タンパク質を含んでよい。他の実施形態では、糖タンパク質が植物培地から収集される場合、これらの精製糖タンパク質中の植物培地は、（乾燥重量で）少なくとも０．００１％、０．００５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は最大で約３０％の精製糖タンパク質調製物内の化学物質前駆体又は対象とするタンパク質でない化学物質を含んでよい。いくつかの実施形態では、植物宿主から、また分泌される場合には培地中から単離及び精製された結果、混入植物タンパク質を含まず、植物培地構成成分を含まず、かつ／又は混入植物タンパク質と植物培地構成成分をどちらも含まない精製糖タンパク質が回収される。
【０２５５】
形質転換植物及び形質転換ウキクサ植物及びウキクサ根粒培養物
形質転換のプロトコール、並びに植物中にヌクレオチド配列を導入するプロトコールは、形質転換の標的となる植物又は植物細胞又は根粒の型、すなわち単子葉植物か又は双子葉植物かに応じて様々となり得る。植物又は植物細胞又は根粒中へのヌクレオチド配列の導入に適した方法には、マイクロインジェクション（Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334）、エレクトロポレーション（Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606）、アグロバクテリウム媒介形質転換（どちらも参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，５６３，０５５号及び第５，９８１，８４０号）、直接遺伝子移入（Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722）、弾道的粒子加速（例えば、（それぞれ参照により本明細書に組み込まれている）米国特許第４，９４５，０５０号；第５，８７９，９１８号；第５，８８６，２４４号；及び第５，９３２，７８２号；並びにTomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin)；McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926を参照）がある。従来の形に従って、形質転換されている細胞を増殖させて植物にすることができる。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい。
【０２５６】
本発明で利用される安定に形質転換されたウキクサは、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。一実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，０４０，４９８号で開示されている遺伝子移入方法の１つによって得られる。これらの方法には、対象とするヌクレオチド配列を含む核酸で被覆されたマイクロプロジェクタイル（microprojectile）での弾道的照射による遺伝子移入、エレクトロポレーションによる遺伝子移入、及び対象とするヌクレオチド配列を含むベクターを含むアグロバクテリウムによって媒介される遺伝子移入がある。一実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、Stomp et al.の米国特許第６，０４０，４９８号で開示されている、アグロバクテリウムが媒介する方法のいずれか１つを介して得られる。使用されるアグロバクテリウムは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスである。
【０２５７】
これらの方法で利用される安定に形質転換されたウキクサ植物は正常な形態を示し、有性生殖によって繁殖可能であることが好ましい。好ましくは、本発明の形質転換植物は単一コピーの移入された核酸を有し、移入された核酸はその中で顕著な再配列を有さない。移入された核酸が少ないコピー数（すなわち、形質転換細胞当たりに５コピー以下、或いは３コピー以下、さらに或いは３コピー未満の核酸）で存在するウキクサ植物も好ましい。
【０２５８】
下記の実施例は、限定の目的ではなく例示の目的で提供されるものである。
【０２５９】
実験
小さな水生植物であるレムナは、ヒト病原体を含まない治療用タンパク質の製造について拡大生産可能であり経済的に魅力のある発現基盤であり、規制認可に対して明らかな経路を有する。レムナ発現系（ＬＥＸ系ＳＭ）は、トランスジェニック植物の迅速なクローン増殖、トランスジェニックタンパク質の分泌、高いタンパク質収量、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物培養系に匹敵する封じ込めの容易さを可能にし、操業コスト及び資本コストが低いというさらなる利点を有する（Gasdaska et al. (2003) Bioprocessing J. 50-56）。さらに、この植物発現系は、タンパク質収量が高い（総可溶性タンパク質（ＴＳＰ，total soluble protein）の６〜８％）という利点をもたらす。レムナの高いタンパク質含量及び速い増殖速度（倍加時間３６時間）と相まって、この発現レベルにより、確実であり十分に管理された形で、生物量１ｋｇ当たり＞１ｇのｍＡｂの産生が可能となる。
【０２６０】
下記の実施例は、ｍＡｂのグリコシル化プロファイルのヒト化が、ｍＡｂと、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ及びβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の内因性発現を標的とする干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）構築物の同時発現によってどのように実現されたかを示すものである。得られたｍＡｂは、植物特異的なα１，３−結合フコース及びβ１，２−キシロース糖がない単一の主要なＮ−グリカン種（＞９５％）を含有していた。受容体結合アッセイでは、このグリカン最適化ｍＡｂは、天然のグリコシル化機構を有する野生型レムナ中で産生されたｍＡｂ及びＣＨＯ細胞中で産生されたｍＡｂと比較したとき、エフェクター細胞受容体結合活性の亢進を示した。
［実施例１］
タンパク質のＮ−グリコシル化に関与するコウキクサタンパク質の単離
Ｎ−グリカンが再構築された組換えタンパク質を生成するために、コウキクサ中でのＲＮＡｉ遺伝子発現抑制の標的としてアルファ１−３フコシルトランスフェラーゼ及びβ１−２キシロシルトランスフェラーゼを選択した。ｃＤＮＡ配列決定の試みの初期の結果から、２つ以上のアイソフォームが各標的遺伝子に存在することが示唆された。アイソフォーム間の配列相同性は９０〜９５％であると決定された。両方の標的遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列を回収し特徴付けた。コウキクサα１−３フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）の５’−及び３’−ＵＴＲを含めた完全長ｃＤＮＡ配列を図１で示す；配列番号１も参照されたい（オープンリーディングフレームは配列番号２で示す）。それによってコードされる予測アミノ酸配列を配列番号３で示す。コードされたタンパク質は、他の高等植物に由来する他のＦｕｃＴといくらかの類似性を有する。図２を参照されたい。例えば、コウキクサＦｕｃＴ配列は、図２に示すシロイヌナズナＦｕｃＴとおよそ５０．１％の配列同一性を有する。
【０２６１】
コウキクサβ１−２キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の５’−及び３’−ＵＴＲを含めた完全長ｃＤＮＡ配列（アイソフォーム＃１）を図３で示す；配列番号４も参照されたい（ＯＲＦは配列番号５で示す）。それによってコードされる予測アミノ酸配列を配列番号６で示す。コードされたタンパク質は、他の高等植物に由来する他のＸｙｌＴといくらかの類似性を有する。図４を参照されたい。例えば、コウキクサＸｙｌＴは、図４に示すシロイヌナズナＸｙｌＴとおよそ５６．４％の配列同一性を有する。コウキクサβ１−２キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の３’−ＵＴＲを含めた部分長ｃＤＮＡ配列（アイソフォーム＃２）を図３１で示す；配列番号１９も参照されたい（ＯＲＦは配列番号２０で示す）。それによってコードされる予測アミノ酸配列を配列番号２１に示す。図３２に示すアラインメントから認められるように、部分長ＸｙｌＴアイソフォーム＃２は、完全長ＸｙｌＴアイソフォーム＃１の対応する領域と高い配列同一性を有する。
［実施例２］
コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの発現のＲＮＡｉ阻害
いくつかのＲＮＡｉ戦略をとって、コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴアイソフォームの発現を阻害した。図５〜７、３３、及び３４はこれらの戦略の概略を示すものである。図８〜１３は、これら２つの遺伝子の発現の所望されるノックアウトを実現するために作製された様々な構築物の地図を示す。本明細書の上記に記載の標準的な形質転換プロトコールを使用して、様々なノックアウトＲＮＡｉ構築物を含むいくつかのトランスジェニック系統が得られた。
【０２６２】
本明細書においてｍＡｂＩと称する試験抗体は、天然のグリコシル化機構を有する野生型レムナ中で発現され、ＲＮＡｉ構築物を発現するトランスジェニックレムナ系統はコウキクサＸｙｌＴ及びＦｕｃＴアイソフォームの発現を阻害するように設計された。一般に、レムナ系中でのｍＡｂＩの発現用に３つのバイナリーベクターを構築した。発現ベクターｍＡｂＩ０１は、ｍＡｂＩの重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖をコードするコドン最適化遺伝子を含有し、ベクターｍＡｂＩ０４は、ｍＡｂＩのＨ鎖及びＬ鎖をコードするコドン最適化遺伝子並びにＸｙｌＴとＦｕｃＴ両方のアイソフォームの発現を標的とするキメラＲＮＡｉ構築物を含有し、ベクターｍＡｂＩ０５は、ｍＡｂＩのＨ鎖及びＬ鎖をコードするコドン最適化遺伝子、ＦｕｃＴ遺伝子発現を標的とする単一遺伝子ＲＮＡｉ構築物、並びにＸｙｌＴ遺伝子発現を標的とする単一遺伝子ＲＮＡｉ構築物を含有していた。ｍＡＢＩ０１、ｍＡｂＩ０４、及びｍＡｂＩ０５発現ベクターについて独立したトランスジェニック系統が得られた。
【０２６３】
ｍＡｂＩのＨ鎖及びＬ鎖の最適化遺伝子は、レムナ優先的コドン使用頻度（ＧＣ含量６３％〜６７％）を有し、そのコード配列の５’末端と融合したイネα−アミラーゼシグナル配列（GenBankＭ２４２８６）を含有するように設計した。アグロバクテリウムバイナリーベクター中にクローン化するために制限エンドヌクレアーゼ部位（EcoRI（５’）／SacI（３’）、Ｈ鎖）及び（SalI（５’）／HindIII（３’）、Ｌ鎖）を付加した。
【０２６４】
本明細書の下記に記載する、図１５〜１７中に提示するＸＦ０２のデータ並びに図２２〜２４及び２６中に提示するｍＡｂＩ０４のデータについて、コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴアイソフォームの発現を阻害するＲＮＡｉ戦略では、図３４に示すキメラＲＮＡｉの設計を使用した。本明細書の下記に記載する、図２７中に提示するｍＡｂＩ０５のデータについて、コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴアイソフォームの発現を阻害するＲＮＡｉ戦略では、図５（ＦｕｃＴ  ＲＮＡｉの設計）及び図３３（ＸｙｌＴ  ＲＮＡｉの設計）に示す単一遺伝子ＲＮＡｉの設計の組合せを用いたこれらの遺伝子の二重ノックアウトを使用した。
【０２６５】
最適化ｍＡｂＩのＨ鎖及びＬ鎖、並びに単一遺伝子又はキメラＲＮＡｉ用に、プロモーター、対象とする遺伝子、及びＮｏｓ転写停止配列を含有する独立した発現カセットを作製した。適当な制限部位を有するアグロバクテリウムバイナリーベクターｐＢＭＳＰ３の改変物（Dr. Stan Gelvin, Purdue Universityから入手）中に発現カセットをクローン化した。発現カセットに応じて、イボウキクサ５’ＲｂｃＳリーダーを有する改変キメラオクトピン及びマンノピンシンターゼプロモーターと（ｍＡｂＩ０１、図１４）、又は高発現の構成的コウキクサポリユビキチンプロモーター（ＬｍＵｂｑ）と（ｍＡｂＩ０４、図１２；ｍＡｂＩ０５；図１３）Ｌ鎖を融合させた。イボウキクサ５’ＲｂｃＳリーダーを有する改変キメラオクトピン及びマンノピンシンターゼプロモーターとＨ鎖を融合させた（ｍＡｂＩ０４、ｍＡｂＩ０５、及びｍＡｂＩ０１）。Ｔ７−４中のプラスミドＸＦ０２（plasmid XF02 in T7-4）から得られたキメラＲＮＡｉカセットを、高発現の構成的ウキクサ（Spirodela polyrhiza）ポリユビキチンプロモーター（ＳｐＵｂｑ）と融合させた。ＦｕｃＴ阻害性配列の発現用の単一遺伝子ＲＮＡｉカセットはＳｐＵｂｑプロモーターによって駆動し、ＸｙｌＴ阻害性配列の発現用の単一遺伝子ＲＮＡｉカセットは５’ＵＴＲを加えたナンゴクアオウキクサユビキチンプロモーター（ＬａＵｂｑプロモーター）を含む作動的に連結した発現調節エレメントによって駆動した。Ｈ、Ｌ、及びキメラＲＮＡｉ発現カセットをタンデムの位置で改変ｐＢＭＳＰ３バイナリーベクター中にクローン化し、プラスミドｍＡｂＩ０４を作製した。Ｈ、Ｌ、並びにＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ発現を標的とする単一遺伝子ＲＮＡｉ発現カセットを改変ｐＢＭＳＰ３バイナリーベクター中にクローン化し、プラスミドｍＡｂＩ０５を作製した。Ｈ及びＬ発現カセットを改変ｐＢＭＳＰ３バイナリーベクター中にクローン化し、プラスミドｍＡｂＩ０１を作製した。
【０２６６】
本明細書の上記で述べたように任意の形質転換プロトコールを使用することができるが、いくつかの実施形態では、形質転換プロトコールは下記の通りであった。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８Ｚ７０７という安全化された広宿主域Ｃ５８株（Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969）を使用して、迅速に成長するコウキクサ根粒から、Yamamoto et al. (2001) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37:349-353の手順に従って個々のクローン系統を表すトランスジェニック植物を生成した。トランスジェニックスクリーニングでは、スクロースを含まないＳＨ培地（Schenk and Hildebrandt (1972) Can. J. Botany 50:199-204）を含有する通気型植物栽培容器中で、個々のクローン系統を１５０〜２００μｍｏｌｍ−２ｓ−２で１週間前処置した。次いで、１５〜２０個の前処置した葉状体を、新鮮なＳＨ培地を含有する通気型容器に入れ、２週間成長させた。各系統の組織及び培地試料を凍結し−７０℃で貯蔵した。
【０２６７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイを開発して、コウキクサβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）及びα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）活性を測定した（下記の実施例３）。
【０２６８】
図１５〜１７は、前述のアッセイを使用したＸＦ０２、ｍＡｂII０４、及びｍＡｂＩ０５植物系統の一次スクリーニングデータを表す。このアッセイでは、野生型（ＷＴ，wild-type）は野生型植物中のＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ活性を表し、一方、煮沸野生型（ＢＷＴ，boiled wild-type）は煮沸した植物抽出物中のその活性を表す。煮沸野生型（ＢＷＴ）植物抽出物は、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ活性が失活している植物物質を代表するものである。このデータ組は、各構築物に由来するいくつかの植物系統が野生型植物系統（ＷＴ）と比較して低いレベルのＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ活性を有し、煮沸野生型試料（ＢＷＴ）と同等なレベルの活性を有することを示す。
【０２６９】
具体的には、図１０のＸＦ０２構築物を含むトランスジェニックＲＮＡｉコウキクサ植物系統の一次スクリーニングデータを図１５及び１６に示す。ＸＦ０２構築物は、それぞれのタンパク質の様々なアイソフォームを含めたコウキクサＦｕｃＴとＸｙｌＴのどちらのタンパク質の発現をも標的とするキメラＲＮＡｉ分子を発現する。
【０２７０】
図１７は、図１２のｍＡｂＩ０４構築物及び図１３のｍＡｂＩ０５構築物を含むトランスジェニックＲＮＡｉコウキクサ植物系統の一次スクリーニングデータを示す。
［実施例３］
Ｎ−グリカンのβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）及びα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）活性のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイ
下記の改変ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦアッセイを使用して、上記の実施例２に記載のトランスジェニック植物中のＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ活性を決定した。
【０２７１】
材料
破砕緩衝液：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、０．２５Ｍスクロース、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ
反応緩衝液：０．１Ｍ  Ｍｅｓ，ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１％（ｖ／ｖ）Triton X-100
ウリジン−５’−ジホスホ−Ｄ−キシロース（ＵＤＰ−Ｘｙｌ，URIDINE-5'-DIPHOSPHO-D-XYLOSE）
グアノシン−５’−ジホスホ−Ｌ−フコース（ＧＤＰ−Ｆｕｃ，GUANOSINE-5'-DIPHOSPHO-L-FUCOSE）
Ｎ−アセチルグルコサミン
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ，POLYETHYLENE GLYCOL）混合物１０００〜３０００（１０ｍｇ／ｍＬ  ＰＥＧ１０００、２０００、及び３０００（４：５：６の比）を２ｍｇ／ｍＬヨウ化ナトリウムと４：１で混合）
ヒト［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ（ＧＦＰ，[Glu1]-FIBRINOPEPTIDE B）（１ｐｍｏｌ／μＬ水溶液）
ダブシル化テトラペプチドＮ−グリカンアクセプター（EMD Biosciences社製）
ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸，α-CYANO-4-HYDROXYCINNAMIC ACID）マトリックス（５０％［ｖ／ｖ］アセトニトリル，０．０５％［ｖ／ｖ］トリフルオロ酢酸中に１０ｍｇ）。
【０２７２】
ミクロソーム調製
コウキクサ組織（１００ｍｇ）を、冷破砕緩衝液１ｍＬ中で、５×の速度のビーズミルで４０秒間粉砕した。破砕液を４℃、１，０００ｇで５分間遠心した。上清を取り出しそれを４℃、１８，０００ｇで２時間遠心した。次いで上清を捨てた。ペレットを冷反応緩衝液２０μＬ中に再懸濁し、使用するまでそれを氷上で維持又は−８０℃で貯蔵した。
【０２７３】
反応条件
反応混合物は、１２５ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミン、６．２５ｍＭ  ＵＤＰ−Ｘｙｌ、６．２５ｍＭ  ＧＤＰ−Ｆｕｃ、１２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、及びダブシル化テトラペプチドＮ−グリカンアクセプター１．５ｎｍｏｌを含有する。ミクロソーム（４μＬ）を反応混合物に添加して反応を開始した。反応物を室温で３０分間、３７℃で９０分間インキュベートした。１８，０００ｇで１分間遠心分離し４℃でインキュベートすることによって反応を終結させた。
【０２７４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
各反応物由来の上清の一部（０．５μＬ）をＭＡＬＤＩターゲットプレート上でＣＨＣＡマトリックス０．５μＬと混合し、それを乾燥させた。ＭＡＬＤＩ機器をリフレクトロン陽イオンモードに設定し、ＰＥＧ１０００〜３０００で較正した。０．５ｐｍｏｌ  ＧＦＰをロック質量として使用して、１５００〜２５００Ｄａから混合型のＭＳスペクトル（約２００ショット）が得られた。基準ピーク（ｍ／ｚ＝２２２２．８６５）のイオンカウント数は４００を上回るはずである。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ産物（それぞれｍ／ｚ＝２１９２．８５４及び２２０６．８７０）のイオンカウント数を、基準ピーク及びミクロソーム分画のタンパク質濃度に対して標準化した。
［実施例４］
モノクローナル抗体のグリコシル化プロファイルに対するコウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの発現のＲＮＡｉ阻害の効果
ｍＡｂＩ０１構築物（図１４を参照）を含む野生型（すなわちＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ発現が抑制されていない）コウキクサ及びｍＡｂＩ０４構築物（図１２を参照）又はｍＡｂＩ０５構築物（図１３を参照）のトランスジェニックコウキクサ系統によって産生されたモノクローナル抗体を、そのＮ−グリコシル化プロファイルについて分析した。下記の手順を使用した。
【０２７５】
レムナからのｍＡｂの精製
５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２で、組織と緩衝液の比を１：８にして、Silverson社製High Shear Mixerを使用して植物組織を破砕した。破砕液を１Ｍクエン酸でｐＨ４．５に酸性化し、それを４℃、７５００×ｇで３０分間遠心分離した。０．２２μｍフィルターに通して上清を濾過し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含有する溶液で平衡化したmAbSelect SuRe樹脂（GE Healthcare社製）上にそれを直接添加した。添加後、カラムをベースラインまで平衡化緩衝液で洗浄し、その後カラム体積の５倍の０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０での中間洗浄を行い、最後に、結合した抗体をカラム体積の１０倍の０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ３．０で溶出した。溶出液を２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基で直ちに中和した。
【０２７６】
Ｎ−結合グリカンの精製
野生型及びＲＮＡｉコウキクサ植物系統由来のプロテインＡ−精製モノクローナル抗体（１ｍｇ）を水に対して大規模に透析し、それを凍結乾燥して乾燥させた。試料を５％（ｖ／ｖ）ギ酸１００μＬ中に再懸濁し、それを０．０５ｍｇ／ｍＬペプシンに入れ、３７℃で１晩インキュベートした。試料を９５℃で１０分間加熱不活性化しそれを乾燥させた。ペプシン消化物を１００μＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０中に再懸濁し、Ｎ−グリコシダーゼＡ１ｍＵとともにそれを３７℃で１晩インキュベートした。４ｃｃのCarbograph SPEカラムを使用して、Packer et al. (1998) Glycoconj. J. 15: 737-747に従って遊離Ｎ−グリカンを単離し、それを乾燥させた。
【０２７７】
乾燥させたＮ−グリカンを、Waters社製Oasis MCXカートリッジを使用してさらに精製した。カラム体積の３倍のメタノールで、その後カラム体積の３倍の５％（ｖ／ｖ）ギ酸で洗浄することによってカラムを調製した。５％（ｖ／ｖ）ギ酸１ｍＬ中に再懸濁したＮ−グリカンを、調製したカラム上に添加した。結合しなかった分画、並びに５％（ｖ／ｖ）ギ酸のカラム体積の２倍のさらなる洗浄液を収集し、それを貯留し乾燥させた。
【０２７８】
２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ，2-aminobenzoic acid）でのオリゴ糖の誘導体化
精製したＮ−グリカン又はマルトオリゴ糖を２−ＡＡで標識し、１ｃｃのWaters社製Oasis HLBカートリッジを使用して、Anumula and Dhume (1998) Glycobiology 8: 685-694に従ってそれを精製した。標識したＮ−グリカン及びマルトオリゴ糖を水５０μＬ中に再懸濁し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及び順相（ＮＰ，normal phase）ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳによってそれを分析した。
【０２７９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
Waters社製MALDI Micro MX（マサチューセッツ州Millford）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを行った。２−ＡＡ標識Ｎ−グリカン（０．５μＬ）を水で適当に希釈し、７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＨＢマトリックス０．５μＬと混合し、それをターゲットプレート上にスポットし、陰性リフレクトロンモードで分析した。
【０２８０】
２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンのＮＰ−ＨＰＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析
２−ＡＡ標識Ｎ−グリカン又はマルトオリゴ糖を８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルに入れ、TSK-Gel Amide-80（２ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ）カラム（Tosoh Biosciences社製、ペンシルベニア州Montgomeryville）を取り付けたWaters社製2695 HPLCシステム上で分離した。ＨＰＬＣシステムを直列に取り付けたWaters社製2475蛍光検出器及びWaters社製Q-TOF API US四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ，quadropole-time of flight）質量分析計（マサチューセッツ州Millford）を使用して、蛍光（２３０ｎｍで励起、４２５ｎｍで放出）によって２−ＡＡ標識炭水化物を検出及び分析した。
【０２８１】
１０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．３（溶媒Ａ）及び１０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．３、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（溶媒Ｂ）を使用して、０．２ｍＬ／分、４０℃で分離を行った。５分間は０％Ａの均一濃度で、その後８分で１０％Ａまで直線的に増大させ、４８分で３０％Ａまで直線的に増大させて試料溶出を実施した。カラムを１００％Ａで１５分間洗浄し、０％Ａで１５分間平衡化した後に次の注入を行った。
【０２８２】
ソース及び脱溶媒温度をそれぞれ１００℃及び３００℃にし、キャピラリー及びコーン電圧をそれぞれ２，１００及び３０Ｖにして、陰イオンモードでＱ−ＴＯＦ分析を行った。示した質量スペクトルは、標識したＮ−グリカン当たり≧５０回の個々の走査を組み合わせた結果である。
【０２８３】
完全なＩｇＧのＲＰ−ＨＰＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析
Poros R1-10カラム（２ｍｍ×３０ｍｍ；Applied Biosystems社製）を取り付けたWaters社製2695 HPLCシステムを使用してプロテインＡ精製ＩｇＧ（５０μｇ）を脱塩した。Waters社製2487二重波長ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）及びWaters社製Q-TOF API USを使用してＩｇＧを検出及び分析した。０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，trifluoroacetic acid；溶媒Ａ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（溶媒Ｂ）を使用して、０．１５ｍＬ／分、６０℃で分離を行った。５分間で３０から５０％Ｂへの直線的増大、５分間で８０％Ｂへの増大を使用して、試料溶出を実施した。溶媒比をさらに４分間８０％Ｂのままにし、その後１００％Ｂで１分間洗浄し３０％Ｂでカラムを１５分間平衡化した後に次を実施した。
【０２８４】
ソース及び脱溶媒温度をそれぞれ１００℃及び３００℃にし、キャピラリー及びコーン電圧をそれぞれ３．０及び６０Ｖにして、陽イオンモードでＱ−ＴＯＦ分析を行った。データは、≧１００回の個々の走査を組み合わせ、MaxEnt 1を使用して親質量スペクトルに対して逆重畳積分を行った結果である。
【０２８５】
Triguero et al. (2005) Plant Biotechnol. J. 3: 449-457；Takahashi et al. (1998) Anal. Biochem. 255: 183-187；Dillon et al. (2004) J. Chromatogr. A. 1053: 299-305も参照されたい。
【０２８６】
結果
図１８は、誘導体化野生型コウキクサモノクローナル抗体Ｎ−グリカンの構造及び分子量を示す。
【０２８７】
図１９は、コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴのＲＮＡｉ発現抑制を行わずにコウキクサ中でｍＡｂＩモノクローナルＩｇＧ１抗体の発現をもたらす（図１５に示す）野生型ｍＡｂＩ０１構築物から、β１，２−結合キシロースを有する種及びβ１，２−結合キシロースとコアα１，３−結合フコース残基をどちらも有する種を含めた３つの主要なＮ−グリカン種を有するＮ−グリコシル化プロファイルが生じることを示す；このプロファイルは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）（図２０）及びＭＡＬＤＩ（図２１）分析で確認される。
【０２８８】
図２２は、ｍＡｂＩ０１構築物（ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの発現抑制なし）を含む野生型コウキクサ系統及び図１２のｍＡｂＩ０４構築物を含む２つのトランスジェニックコウキクサ系統中で産生されたｍＡｂＩの相対量の様々なＮ−グリカン種の重ね合わせを示す。β１，２−結合キシロース又はコアα１，３−結合フコース残基が結合していないＧｎＧｎ（すなわちＧ０）グリカン種が濃縮され、β１，２−結合キシロース又はβ１，２−結合キシロースとコアα１，３−結合フコース残基をどちらも有する種が存在しないことに留意されたい。このプロファイルは、質量分析（ＬＣ−ＭＳ）（図２３）及びＭＡＬＤＩ（図２４）分析で確認される。
【０２８９】
図２５は、ｍＡｂＩ０１構築物を含む野生型コウキクサ（系統２０）中で産生されたｍＡｂＩ組成物の完全な質量分析を示す。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されないとき、組換えにより産生されたｍＡｂＩ組成物は異種であり、少なくとも９つの異なるグライコフォームを含み、Ｇ０ＸＦ３グライコフォームが、存在する優勢な種である。Ｇ０グライコフォームを表す非常に小さなピークに留意されたい。
【０２９０】
図２６は、図１２のｍＡｂＩ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ（系統１５）中で産生されたｍＡｂＩ組成物の完全な質量分析を示す。キメラＲＮＡｉ構築物を使用してＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、完全なｍＡｂＩ組成物はＧ０Ｎ−グリカンについて実質的に同種であり、（ＧｎＭ及びＭＧｎ前駆グリカン種によって表される）前駆Ｎ−グリカンは微量しか存在しない。さらに、ｍＡｂＩ組成物はＧ０グライコフォームについて実質的に同種であり、どちらのグリコシル化部位もＧ０Ｎ−グリカン種によって占有され、３つの小さなピークが微量の前駆グライコフォームを反映している（１つのピークは、一方の重鎖のＣＨ２ドメインが、Ａｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがグリコシル化されていないＦｃ領域を有するｍＡｂＩを示し、他のピークは、一方の重鎖のＣＨ２ドメインが、Ａｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがＡｓｎ２９７と結合したＧｎＭ又はＭＧｎ前駆グリカンを有するＦｃ領域を有するｍＡｂＩを示し、他のピークは、各ＣＨ２ドメイン上のＡｓｎ２９７グリコシル化部位がＧ０グリカン種と結合し、第３のＧ０グリカン種がｍＡｂＩ構造内のさらなるグリコシル化部位と結合したＦｃ領域を有するｍＡｂＩを示す）。
【０２９１】
図２７は、図１３のｍＡｂＩ０５構築物を含むトランスジェニックコウキクサ（系統７２）中で産生されたｍＡｂＩ組成物の完全な質量分析を示す。この構築物を使用してＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、完全なｍＡｂＩ組成物はＧ０Ｎ−グリカンについて実質的に同種であり、（ＧｎＭ及びＭＧｎ前駆グリカン種によって表される）前駆Ｎ−グリカンは微量しか存在しない。さらに、ｍＡｂＩ組成物はＧ０グライコフォームについて実質的に（少なくとも９０％）同種であり、ｍＡｂＩ０４構築物で得られたものと同じ３つの小さなピークが前駆グライコフォームを反映している。
【０２９２】
ｍＡｂＩ０１構築物を含む（すなわちＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現が阻害されない）野生型レムナ系統及びｍＡｂＩ０４又はｍＡｂＩ０５構築物を含む（すなわちＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現が阻害された）トランスジェニックレムナ系統中で産生されたｍＡｂＩの受容体結合活性を、哺乳動物細胞系統（ＣＨＯ及びＳＰ２／０）中で産生されたｍＡｂＩの受容体結合活性と比較した。
【０２９３】
新鮮に単離されたヒトＮＫ細胞上でのＦｃＦｃγＲIIIａとの結合を、様々なｍＡｂＩ産物について評価した。ＣＨＯ由来ｍＡｂＩ及びＳＰ２／０由来ｍＡｂＩについて収集した対照データを図３５に示す。野生型レムナが産生した正常な植物Ｎ−グリカンプロファイルを有するｍＡｂＩについて収集した試験データをｍＡｂＩ０１−１５及びｍａｂＩ０１−２０と称し、そのｍＡｂＩ産物は、α（１，３）−フコース残基を含むＮ−結合グリカンを有する（図３６及び３７を参照）。α１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現を標的とする遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ構築物で得られた最適化Ｎ−グリカンプロファイル（ＯＰＴ）を有するトランスジェニックレムナ由来ｍＡｂＩについて収集した試験データをｍＡｂＩ０５−７２、ｍＡｂＩ０５−７４、ｍＡｂＩ０４−２４、及びｍＡｂＩ０４−１５と称し（図３６及び３７を参照）、そのｍＡｂＩ産物は、α（１，３）−フコース残基がないＮ−結合グリカンを有する。ＩｇＧフコースレベルに感受性であり、ヒトＦｃγＲIIIａの代理として働く受容体である組換えマウスＦｃγＲIVに対するｍＡｂＩ０１−１５、ｍＡｂＩ０１−２０、ｍＡｂＩＳＰ２／０、ｍＡｂＩ０４−１５、ｍＡｂＩ０４−２４、ｍＡｂＩ０５−７２、及びｍＡｂＩ０５−７４の結合効率を比較するデータを図３８に示す。
【０２９４】
これらのデータは、最適化グリカンプロファイル（ＯＰＴ）を有するトランスジェニックレムナ由来ｍＡｂＩ産物が、野生型レムナ由来ｍＡｂＩ産物と比較して、新鮮に単離されたヒトＮＫ細胞上でのＦｃγＲIIIａとの結合の亢進（約２０〜５０倍の亢進）並びに組換えマウスＦｃγＲIVとの結合の亢進（約１０倍の亢進）を示すことを実証するものである。
［実施例６］
受容体結合が向上しＡＤＣＣ活性が増大した抗ＣＤ３０モノクローナル抗体の産生
この実施例では、レムナ中でのヒト抗ＣＤ３０ｍＡｂの発現の概略について述べる。ｍＡｂＩについて上記の実施例で述べたのと同様の形で、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）及びβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）の内因性発現を標的とするＲＮＡｉ構築物との同時発現によって抗ＣＤ３０ｍＡｂグリコシル化の最適化を実現した。ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ発現を抑制するように工学的に作製されたその天然のグリコシル化経路を有するレムナ中でその結果産生された抗ＣＤ３０ｍＡｂは、単一の主要なＮ−グリカン種を含有し、植物特異的Ｎ−グリカンを微量でも含まなかった。Ｎ−グリカンの同種性に加えて、糖鎖最適化抗ＣＤ３０ｍＡｂは、ＣＨＯが発現した抗ＣＤ３０ｍＡｂと比較したとき、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びエフェクター細胞受容体結合活性が亢進していることも示された。
【０２９５】
方法
菌株及び試薬
Novablueコンピテント大腸菌（Escherichia coli）をすべての組換えＤＮＡ作業に使用した（EMD Biosciences社製、カリフォルニア州San Diego）。制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾酵素は、New England Biolabs社から入手した（マサチューセッツ州Ipswich）。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA technologies社から入手した（アイオワ州Coralville）。Waters社製Oasis HLB及びMCXカラム（１ｃｃ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ，dihydroxybenzoic acid）、及びα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）はWaters Corporation社（マサチューセッツ州Milford）のものであった。精製ダブシル化テトラペプチドＧｎＧｎＮ−グリカンアクセプター（ＧｎＧｎ−ダブシル−ペプチド）及びＮ−グリコシダーゼＡはEMD Biosciences社のものであった。Carbograph SPEカラム（４ｃｃ）はGrace Davidson Discovery Sciences社（イリノイ州Deerfield）のものであった。ウリジン−５’−ジホスホ−Ｄ−キシロース（ＵＤＰ−Ｘｙｌ）は、Carbosource Services社（ジョージア州Athens）から購入した。アセトニトリル（Optimaグレード）はFisher Scientific社（ニューヨーク州Summerville）のものであった。酢酸アンモニウムはMP Biochemicals社（カリフォルニア州Irvine）のものであった。マルトオリゴ糖（ＭＤ６−１）はV-Labs Inc.社（カリフォルニア州Covington）のものであった。単糖標準物質はDionex社（カリフォルニア州Sunnyvale）のものであった。ＢＡＴＤＡ（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’’−ジカルボキシレート，bis(acetoxymethyl)2,2':6',2''-terpyridine-6,6''-dicarboxylate）及びユーロピウム溶液はPerkin-Elmer社（マサチューセッツ州Wellesley）のものであった。グアノシン−５’−ジホスホ−Ｌ−フコース（ＧＤＰ−Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）及びすべての他の物質はSigma社（ミズーリ州St. Louis）のものであった。
【０２９６】
ｍＡｂ及びＲＮＡｉ発現ベクターの構築
トランスジェニックMedarex HuMAb-Mouse（登録商標）（Borchmann et al. (2003) Blood 102:3737-3742）に由来する完全にヒトのｍＡｂ１カッパ抗体ＭＤＸ−０６０の重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖可変領域ｃＤＮＡ配列を決定し、チャイニーズハムスター卵巣細胞系統であるＣＨＯ  ＤＧ４４（Urlaub et al. (1986) Cell Mol. Genet. 12:555-566）により、標準的な技術を使用して、完全長ＭＤＸ−０６０ヒトｍＡｂ１カッパ抗体を組換えにより産生した。Ｈ鎖及びＬ鎖の最適化遺伝子は、レムナ優先的コドン使用頻度（ＧＣ含量６３％〜６７％）を有し、そのコード配列の５’末端と融合したイネα−アミラーゼシグナル配列（GenBankＭ２４２８６）を含有するように設計した。アグロバクテリウムバイナリーベクター中にクローン化するために制限エンドヌクレアーゼ部位（EcoRI（５’）／SacI（３’）、Ｈ鎖）及び（SalI（５’）／HindIII（３’）、Ｌ鎖）を付加した。合成遺伝子はPicoscript社（テキサス州Houston）によって構築及び提供された。
【０２９７】
α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ（配列番号２で示すコウキクサＦｕｃＴアイソフォーム＃１のコード配列に基づく；GenBankＤＱ７８９１４５も参照）及びβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（配列番号２０で示すコウキクサＸｙｌＴアイソフォーム＃２、配列番号１９のｎｔ１〜１２７５のコード配列に基づく；GenBankＤＱ７８９１４６も参照）をコードする内因性レムナ遺伝子の発現抑制を標的とするようにキメラヘアピンＲＮＡ（図３４を参照）を設計した。二本鎖ＦｕｃＴ配列の６０２ｂｐ、二本鎖ＸｙｌＴ配列の６２６ｂｐ、及びスペーサー配列の５００ｂｐを有するようにキメラＦｕｃＴ＋ＸｙｌＴヘアピンＲＮＡを設計した。ヘアピンＲＮＡカセットのセンス鎖部分は、ＦｕｃＴ順方向断片（配列番号２のｎｔ１２〜６１３；配列番号１のｎｔ２５４〜８５５と同じ）及びＸｙｌＴ順方向断片（配列番号１９のｎｔ１〜６２６）、スペーサー配列（配列番号１９のｎｔ６２７〜１１２６）を包含する。ヘアピンＲＮＡのアンチセンス鎖部分は、ＸｙｌＴ逆方向断片（配列番号１９のｎｔ１〜６２６のアンチセンス型）及びＦｕｃＴ逆方向断片（配列番号２のｎｔ１２〜６１３又は配列番号１のｎｔ２５４〜８５５のアンチセンス型）を包含する。コウキクサ（８６２７）ｃＤＮＡからＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの順方向及び逆方向遺伝子断片をＰＣＲ増幅し、それをpT7blue（EMD Biosciences社製）中に順次クローン化することによってキメラヘアピンＲＮＡを構築し、Ｔ７−４中のプラスミドＸＦ０２を作製した。ＤＮＡプライマーＢＬＸ６８６（５’−ATGGTCGACTGCTGCTGGTGCTCTCAAC−３’）（配列番号２２）及びＢＬＸ６９０（５’−ATGTCTAGAATGCAGCAGCAAGTGCACC−３’）（配列番号２３）でＦｕｃＴ順方向遺伝子断片を増幅し、末端SalI（５’）及びXbaI（３’）クローン化部位を有する６２０ｂｐの産物が得られた。ＤＮＡプライマーＢＬＸ７００（５’−ATGACTAGTTGCGAAGCCTACTTCGGCAACAGC３’）（配列番号２４）及びＢＬＸ６９４（５’−ATGGGATCCGAATCTCAAGAACAACTGTCG−３’）（配列番号２５）でＸｙｌＴ順方向遺伝子断片を増幅し、末端SpeI（５’）及びBamHI（３’）クローン化部位を有する１１４４ｂｐの産物が得られた。ＤＮＡプライマーＢＬＸ６９５（５’−ATGGGTACCTGCGAAGCCTACTTCGGCAACAGC−３’）（配列番号２６）及びＢＬＸ６９６（５’−ATGGGATCCACTGGCTGGGAGAAGTTCTT−３’）（配列番号２７）でＸｙｌＴ逆方向遺伝子断片を増幅し、末端BamHI（５’）及びKpnI（３’）クローン化部位を有する６４４ｂｐの産物が得られた。ＤＮＡプライマーＢＬＸ６９１（５’−ATGGAGCTCTGCTGCTGGTGCTCTCAAC−３’）（配列番号２８）及びＢＬＸ６９２（５’−ATGGGTACCATGCAGCAGCAAGTGCACC−３’）（配列番号２９）でＦｕｃＴ逆方向遺伝子断片を増幅し、末端KpnI（５’）及びSacI（３’）クローン化部位を有する６２０ｂｐの産物が得られた。
【０２９８】
最適化ＭＤＸ−０６０のＨ鎖及びＬ鎖並びにキメラＲＮＡｉ用に、プロモーター、対象とする遺伝子、及びＮｏｓ転写停止配列を含有する独立した発現カセットを作製した。適当な制限部位を有するアグロバクテリウムバイナリーベクターｐＢＭＳＰ３の改変物（Dr. Stan Gelvin, Purdue Universityから入手）中に発現カセットをクローン化した。イボウキクサ５’ＲｂｃＳリーダーを有する改変キメラオクトピン及びマンノピンシンターゼプロモーターとＨ鎖を融合させた（Gasdaska et al. (2003) Bioprocessing J. 50-56）。高発現の構成的コウキクサポリユビキチンプロモーター（ＬｍＵｂｑ）とＬ鎖を融合させた。Ｔ７−４中のプラスミドＸＦ０２から得られたキメラＲＮＡｉカセットを、高発現の構成的ウキクサ（Spirodela polyrhiza）ポリユビキチンプロモーター（ＳｐＵｂｑ）と融合させた。その３つの発現カセットをタンデムの位置で改変ｐＢＭＳＰ３バイナリーベクター中にクローン化し、プラスミドＭＤＸＡ０４を作製した。
【０２９９】
形質転換及び植物系統スクリーニング
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８Ｚ７０７（Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969）を使用して、迅速に成長するコウキクサ根粒から、Yamamoto et al.の手順（Yamamoto et al. (2001) In Vitro Cell Dev. Biol. 37）に従って個々のクローン系統を表すトランスジェニック植物を生成した。トランスジェニックスクリーニングでは、スクロースを含まないＳＨ培地（Schenk and Hildenbrandt (1972) Can. J. Botany 50:199-204）を含有する通気型植物栽培容器中で、個々のクローン系統を１５０〜２００μｍｏｌｍ−２ｓ−２で１週間前処置した。次いで、１５〜２０個の前処置した葉状体を、新鮮なＳＨ培地を含有する通気型容器に入れ、２週間成長させた。各系統の組織及び培地試料を凍結し−７０℃で貯蔵した。
【０３００】
レムナ中で産生されたｍＡｂのＥＬＩＳＡ分析
FastPrep FP120ビーズミル（Thermo Electron Corporation社製）を使用して、レムナ組織（１００ｍｇ）を破砕した。上清を１μｇ／ｍＬに希釈し、IgG Quantitation ELISAキット（Bethyl Laboratories社製）を使用してアッセイを行った。アッセイでは、マイクロタイタープレートを濃度１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧで被覆し、１：１００，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，horseradish peroxidase）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧによってｍＡｂを検出した。そのＥＬＩＳＡキットとともに供給されるヒト基準ＩｇＧで標準曲線を作成した。ＥＬＩＳＡの感度は７．８ｎｇ／ｍＬであった。すべての試料は二連で分析した。
【０３０１】
レムナミクロソーム膜の調製並びにコアβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ及びα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性のアッセイ
各系統のレムナ組織（１００ｍｇ）を、冷破砕緩衝液（５０ｍＭ  ４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジンエタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ，4-[2-hydroxyethyl]-1-piperazineethanesulfonic acid］，ｐＨ７．５、０．２５Ｍスクロース、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ，ethylenediaminetetraacetic acid］、１ｍＭ  １，４−ジチオスレイトール［ＤＴＴ，dithiothreitol］）１ｍＬ中で、FastPrep FP120ビーズミル（Thermo Electron Corporation社製、マサチューセッツ州Waltham）で４０秒間破砕した。破砕液を４℃、１，０００ｇで５分間遠心分離した。上清を取り出しそれを４℃、１８，０００ｇで９０分間遠心分離した。得られたペレットを冷反応緩衝液（０．１Ｍ  ２−［４−モルホリノ］エタンスルホン酸［Ｍｅｓ，2-[4-morpholino] ethanesulfonic acid］，ｐＨ７．０、０．１％［ｖ／ｖ］Triton X-100、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）２０μＬ中に再懸濁し、使用するまでそれを氷上で維持又は−８０℃で貯蔵した。
【０３０２】
コアβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ及びα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性を、以前の記載の通りに（Leiter et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:21830-21839）１２５ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、６．２５ｍＭ  ＵＤＰ−Ｘｙｌ、６．２５ｍＭ  ＧＤＰ−Ｆｕｃ、１２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、及びＧｎＧｎ−ダブシル−ペプチドアクセプター１．５ｎｍｏｌとともに３７℃で２時間インキュベートすることにより、各ＲＮＡｉ系統から調製したミクロソーム膜４μＬ中で同時に測定した。短い遠心分離を行い４℃でインキュベートすることによって反応を終結させ、陽性リフレクトロンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって産物を分析した。
【０３０３】
ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂの精製
５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２で、Silverson社製高剪断力ミキサーを使用して植物組織を破砕した。破砕液を１Ｍクエン酸でｐＨ４．５に酸性化し、それを４℃、７５００ｇで３０分間遠心分離した。上清のｐＨを２Ｍ  ＴｒｉｓでｐＨ７．２に調整した後、０．２２μｍフィルターを使用して濾過を行った。５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含有する溶液で平衡化したmAbSelect SuRe樹脂（GE Healthcare社製）上にその物質を直接添加した。添加後、カラムをベースラインまで平衡化緩衝液で洗浄し、その後カラム体積の５倍の０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０での中間洗浄を行った。結合した抗体をカラム体積の１０倍の０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ３．０で溶出した。プロテインＡ溶出液を２Ｍ  ２−アミノ−２−［ヒドロキシメチル］−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）で直ちに中和した。凝集物除去のため、プロテインＡ溶出液をｐＨ５．５に調整し、２５ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ５．５で平衡化したセラミックヒドロキシアパタイトＩ型（Bio-Rad社製）カラムにそれを添加した。カラム体積の５倍の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、０．２５Ｍリン酸ナトリウム，ｐＨ５．５を使用して、単一ステップの溶出で抗体を溶出した。Ａ２８０で抗体を含有する分画を貯留し−８０℃で貯蔵した。
【０３０４】
２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液±５％［ｖ／ｖ］２−メルカプトエタノールの添加によって、還元及び非還元条件下で組織抽出物及びプロテインＡ流動試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製した。プロテインＡ溶出液及びヒドロキシアパタイト溶出液試料をタンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、その後２×ＳＤＳ試料緩衝液±５％［ｖ／ｖ］２−メルカプトエタノールを添加した。試料を９５℃で２分間インキュベートした後、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル（Invitrogen社製、カリフォルニア州Carlsbad）を使用して電気泳動を行った。Mark12分子量マーカー（Invitrogen社製）及びＭＤＸ−０６０基準標準物質をゲル上に含めた。ゲルをコロイドブルー染色で染色した。
【０３０５】
Ｎ−結合グリカンの精製
野生型及びＲＮＡｉレムナ植物系統由来のプロテインＡ精製モノクローナル抗体（１ｍｇ）を水に対して大規模に透析し、それを凍結乾燥して乾燥させた。試料を５％（ｖ／ｖ）ギ酸１００μＬ中に再懸濁し、それを０．０５ｍｇ／ｍＬペプシンに入れ、３７℃で１晩インキュベートした。試料を９５℃で１５分間加熱不活性化しそれを乾燥させた。ペプシン消化物を１００μＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０中に再懸濁し、Ｎ−グリコシダーゼＡ１ｍＵとともにそれを３７℃で１晩インキュベートした。４ｃｃのCarbograph SPEカラムを使用して遊離Ｎ−グリカンを単離し（Packer et al. (1998) Glycoconj. J. 19:737-747）、それを乾燥させた。
【０３０６】
乾燥させたＮ−グリカンを、Waters社製Oasis MCXカートリッジを使用してさらに精製した。カラム体積の３倍のメタノールで、その後カラム体積の３倍の５％（ｖ／ｖ）ギ酸で洗浄することによってカラムを調製した。５％（ｖ／ｖ）ギ酸１ｍＬ中に再懸濁したＮ−グリカンを、調製したカラム上に添加した。結合しなかった分画、並びに５％（ｖ／ｖ）ギ酸のカラム体積の２倍のさらなる洗浄液を収集し、それを貯留し乾燥させた。
【０３０７】
２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）でのオリゴ糖の誘導体化
精製したＮ−グリカン又はマルトオリゴ糖を２−ＡＡで標識し、１ｃｃのWaters社製Oasis HLBカートリッジを使用して、Anumula and Dhume, 1998（Anumula and Dhume (1998) Glycobiology 8: 685-694）に従ってそれを精製した。標識したＮ−グリカン及びマルトオリゴ糖を水５０μＬ中に再懸濁し、陰性モードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＮＰ−ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳによってそれを分析した。
【０３０８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
Waters社製MALDI Micro MX（マサチューセッツ州Millford）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを行った。ターゲットプレート上で各反応上清０．５μＬを０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の１０ｍｇ／ｍＬ  ＣＨＣＡ０．５μＬと混合することによって、β−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ／α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応産物の分析を行った。陽性リフレクトロンモードでキシロシル化（［Ｍ＋Ｈ］＋＝２１９２．８５Ｄａ）又はフコシル化（［Ｍ＋Ｈ］＋＝２２０６．８７Ｄａ）ＧｎＧｎ−ダブシル−ペプチド産物を検出した。各試料に由来する２００個の混合型スペクトルのイオンカウント数を、EMD Biosciencesの元のＧｎＧｎ−ダブシル−ペプチド混合物中にある混入物（＜５％）として存在するβ−１，４−ガラクトシル化ＧｎＧｎ−ダブシル−ペプチド（［Ｍ＋Ｈ］＋＝２２２２．８７Ｄａ）のカウント数に対して標準化した。
【０３０９】
２−ＡＡ標識Ｎ−グリカン又はマルトオリゴ糖（０．５μＬ）を水で希釈し、７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の１０ｍｇ／ｍｌ  ＤＨＢマトリックス０．５μＬと混合し、それをターゲットプレート上にスポットし、陰性リフレクトロンモードで分析した。
【０３１０】
２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンのＮＰ−ＨＰＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析
２−ＡＡ標識Ｎ−グリカン又はマルトオリゴ糖を８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルに入れ、TSK-Gel Amide-80（２ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ）カラム（Tosoh Biosciences社製、ペンシルベニア州Montgomeryville）を取り付けたWaters社製2695 HPLCシステム上で分離した。ＨＰＬＣシステムをオンラインで取り付けたWaters社製2475蛍光検出器（２３０ｎｍで励起、４２５ｎｍで放出）及びWaters社製Q-TOF API US四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析計を使用して、２−ＡＡ標識炭水化物を検出及び分析した。
【０３１１】
１０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．３（溶媒Ａ）及び１０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ７．３、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（溶媒Ｂ）を使用して、０．２ｍＬ／分、４０℃で分離を行った。５分間は０％Ａの均一濃度で、その後８分で１０％Ａまで直線的に増大させ、４８分で３０％Ａまで直線的に増大させて試料溶出を実施した。カラムを１００％Ａで１５分間洗浄し、０％Ａで１５分間平衡化した後に次の注入を行った。
【０３１２】
ソース及び脱溶媒温度をそれぞれ１００℃及び３００℃にし、キャピラリー及びコーン電圧をそれぞれ２，１００及び３０Ｖにして、陰イオンモードでＱＴＯＦ分析を行った。示した質量スペクトルは、標識したＮ−グリカン当たり≧４０回の個々の走査を組み合わせた結果である。
【０３１３】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる単糖分析
２Ｎ  ＴＦＡを使用して、ｍＡｂ試料（２００μｇ）に酸加水分解を１００℃で３時間施した。試料を周囲温度で真空遠心分離により乾燥させ、水１５０μＬ中に再溶解した後HPAE-PAD（Dionex社製）により分析を行った。再溶解した試料のアリコート（２５μＬ）を、プレカラムAmino Trap（Dionex社製）の付いたCarboPac PA10カラム（４×２５０ｍｍ）に添加した。EG40溶出液生成装置を使用して、３．５ｍＭ  ＫＯＨの移動相で単糖の分離を行った。単糖標準物質を使用して、単糖ピークの同一性及び相対量を決定した。
【０３１４】
ｍＡｂの熱安定性
MicroCal社製（マサチューセッツ州Northampton）VP-Capillary示差走査熱量測定（ＤＳＣ，differential scanning calorimetry）装置を使用して、糖鎖最適化及び野生型ｍＡｂの熱安定性を決定した。精製ｍＡｂ試料を、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＰＢＳ）中で１晩透析した。ＰＢＳを基準緩衝液として使用して、濃度３００μｇ／ｍＬの試料を走査速度１℃／分で３５℃から９５℃まで加熱することによって熱変性データを収集した。フィードバックとゲインを低く設定した。ベースラインで補正し標準化したデータを、Origin v7.0ソフトウェアを使用して非二状態モデルに適合させた。
【０３１５】
ｍＡｂのＦｃＲ結合活性
表面プラズモン共鳴技術を使用するBIACORE（Biacore AB社製、スウェーデンUppsala）装置を使用して実験を行った。２μｇ／ｍＬのｍＡｂを抗原被覆表面（組換えヒトＣＤ３０）上で捕捉した。６μＭから開始する複数の濃度の、Ｖａｌ１５８とＰｈｅ１５８両方のアロタイプのＦｃＲγIIIａを、捕捉された抗体の上に３分間流動させた。GraphPad Prism (v4.01)ソフトウェアを使用して、ＦｃＲγIIIａの関数としての結合シグナルを一部位結合モデルに適合させてＫＤ値を得た。実験全体を通じてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０、ｐＨ７．４）を使用した。ｍＡｂと緩衝液又はＦｃＲγIIIａとブランク表面の結合を陰性対照として使用した。
【０３１６】
抗原結合親和性のアッセイ
ＣＤ３０を発現するＬ５４０細胞（DSMZ Cell Culture Collection # ACC 72）を抗原陽性細胞として結合のアッセイに使用した。１穴当たり細胞２×１０５個のアリコートを、示した濃度の一次抗体１００μＬとともに４℃で３０分間インキュベートした。２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ，fetal bovine serum）を含むＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、１：５００希釈のヤギ抗ヒトｍＡｂ  ＦＩＴＣ標識二次抗体（Jackson ImmunoResearch社製、ペンシルベニア州West Grove）を１穴当たり１００μＬ添加して、４℃で３０分置いた。２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、FACS Calibur装置（Becton Dickinson社製、ニュージャージー州Franklin Lakes）を使用してフローサイトメトリーによりアッセイを行った。GraphPad Prism 3.0ソフトウェアを利用して、結合曲線からＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂとＬ５４０細胞上のＣＤ３０との結合のＥＣ５０値を決定した。
【０３１７】
ＡＤＣＣアッセイ
標準的なFicoll-Paque分離により、ヘパリン処置全血からヒト末梢血単核エフェクター細胞を精製した。細胞（２×１０６個）を洗浄し、遺伝子型決定用に送った。次いで、残りのエフェクター細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び５０Ｕ／ｍＬヒトＩＬ−２（Research Diagnostics社製、マサチューセッツ州Concord）を含有するRPMI 1640培地中に１ｍＬ当たり細胞１×１０６個に再懸濁し、それを３７℃で１晩インキュベートした。エフェクター細胞を培地で１回洗浄し、使用前に１ｍＬ当たり細胞１×１０７個に再懸濁した。１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び５ｍＭプロベネシドを含有するRPMI 1640培地１ｍＬ当たり細胞１×１０６個のＬ５４０標的細胞を、２０μＭ  ＢＡＴＤＡ（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’’−ジカルボキシレート）で、３７℃で２０分間標識した。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５ｍＭプロベネシドを補充したＰＢＳで標的細胞を３回洗浄し、１ｍＬ当たり細胞１×１０５個に再懸濁し、最終的な標的とエフェクターの比が１：５０となるように９６穴プレート中でエフェクター細胞中にそれを添加した（１穴当たり標的細胞１×１０４個及びエフェクター細胞５×１０５個）。３％（ｖ／ｖ）Lysol中での標的細胞のインキュベーションにより最大遊離を得、細胞培地単独でのインキュベーションにより自発遊離を得た。３７℃で１時間インキュベートした後、上清２０μＬを各穴から回収し、ユーロピウム溶液１８０μＬを含有する穴にそれを添加した。Perkin Elmer社製Fusion Alpha TRFリーダーで、４００μ秒の遅延、並びに３３０／８０、６２０／１０のそれぞれ励起及び放出フィルターを使用して反応を読み取った。１秒当たりのカウント数を抗体濃度の関数としてプロットし、GraphPad Prism 3.0ソフトウェアを使用して非線形回帰Ｓ字形用量反応（可変勾配）によりデータを分析した。パーセント比溶解は、（実験遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発遊離）×１００として計算した。すべての試験においてヒトｍＡｂ１アイソタイプ対照を含め、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂと比較した。他の対照には、ｍＡｂを伴わない標的及びエフェクター細胞、エフェクター細胞を伴わない標的細胞、並びに３％（ｖ／ｖ）Lysol存在下での標的及びエフェクター細胞があった。
【０３１８】
結果
ＬＥＸ系でのＭＤＸ−０６０ｍＡｂの発現
ＭＤＸ−０６０は、ホジキンリンパ腫及び未分化大細胞リンパ腫の治療用に開発された（公式には５Ｆ１１として知られる）抗ＣＤ３０抗体である（Borchmann et al. (2003) Blood 102:3737-3742）。ＬＥＸ系でのＭＤＸ−０６０の発現用に２つのバイナリーベクターを構築した。発現ベクターＭＤＸＡ０１は、ＭＤＸ−０６０の重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖をコードするコドン最適化遺伝子を含有し、一方、ベクターＭＤＸＡ０４は、キメラＦｕｃＴ／ＸｙｌＴ  ＲＮＡｉ遺伝子に加えてＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子を含有していた（図３９）。ＭＤＸＡ０１（１６５系統）とＭＤＸＡ０４（１９５系統）の両方の発現ベクターについて独立したトランスジェニック系統が得られた。簡単にするために、ＭＤＸＡ０１由来ｍＡｂ（野生型のＮ−グリコシル化）、及びＭＤＸＡ０４由来ｍＡｂ（ＦｕｃＴ／ＸｙｌＴ  ＲＮＡｉ構築物を含有）を、下記の論述ではそれぞれＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔと称する。
【０３１９】
ｍＡｂ発現についてＩｇＧ  ＥＬＩＳＡでトランスジェニック植物系統を最初にスクリーニングした。ｍＡｂ発現が高レベルであるＬＥＸＯｐｔ系統について、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ活性のアッセイをさらに行った。大部分の高発現ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ系統のトランスフェラーゼ活性は、陰性対照のレベルまで低減し、このことから、アッセイを行った大部分の系統で有効に発現抑制されたことが示唆される（図４０）。ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ系統は、野生型レムナ植物と比較して形態又は成長上の違いを示さなかった（データは示さず）。
【０３２０】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ、及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂの熱安定性を決定した。３つのｍＡｂはすべて、類似した融解曲線動態（データは示さず）及び融解転移点温度（下記の表２）を示し、このことから、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ  ｍＡｂと比較してレムナが産生するＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂが構造的に完全な状態であることが実証される。非還元（図４１Ａ）及び還元条件（図４１Ｂ）下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ及びＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ系統由来のｍＡｂが類似したタンパク質プロファイルを有し、ｍＡｂがタンパク質抽出物中の主要な構成成分として現れることが示された。
【０３２１】
【表２】
2009523432.tif 000004
【０３２２】
ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ、及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂのＮ−グリカン構造
組換えＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ由来ｍＡｂのＮ−グリカンプロファイルを、陰性リフレクトロンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及び順相（ＮＰ）ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳによって決定した。下記の論述において言及するＮ−グリカンの構造を図５３に示す。
【０３２３】
ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ系統に由来するＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析から、２−ＡＡ標識ＧｎＧｎＦ６（命名法はhttp://www.proglycan.comに由来する）、Ｍａｎ５、ＧｎＡｉｓｏＦ６、及びＡＡＦ６と対応するｍ／ｚ値を有する４つの主要なＮ−グリカンの存在が示唆される（図４２）。ＮＰ−ＨＰＬＣによりＧｎＡｉｓｏＦ６Ｎ−グリカンがその２つのアイソフォーム（α−１，６−Ｍａｎ又はα−１，３−Ｍａｎ腕と結合したＧａｌ）に分離され、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ上で認められる主要なＮ−グリカンの総数が５つとなった（図４３）。各アイソフォームの同一性を確認するのにピークのＭＳ／ＭＳ断片化は行わなかったが、早期のピークの量が高いことから、ＧａｌがこのＮ−グリカンのα−１，６−Ｍａｎ腕と結合していることが示唆された（Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466-3473；Zhu et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1159-1169）。オンライン陰性モードＱＴＯＦ  ＭＳ分析から二重荷電ＧｎＧｎＦ６、Ｍａｎ５、ＧｎＡｉｓｏＦ６（両方のアイソフォーム）、及びＡＡＦ６と対応するｍ／ｚ値が得られ、その値からＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの結果が確認された（下記の表３）。蛍光トレースのピーク積分によって、ＧｎＧｎＦ６、Ｍａｎ５、ＡＧｎＦ６、ＧｎＡＦ６、及びＡＡＦ６がＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ由来の総Ｎ−グリカン構造のそれぞれ５０．８、２．５、２６．１、１０．７及び６．８％を占めることが明らかとなった。残り３．１％のＮ−グリカンは、全体の１．２％を超えるものが構造をなさない、ＧｎＧｎ、ＧｎＭｉｓｏＦ６、ＧｎＭｉｓｏ、及びＭＭの混合物であることが分かった（データは示さず）。
【０３２４】
【表３】
2009523432.tif 000005
【０３２５】
野生型ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析から、ＧｎＧｎＸＦ３、ＧｎＧｎＸ及びＧｎＧｎと対応するｍ／ｚ値を有する３つの主要な種の存在が明らかとなった（図４２）。ＮＰ−ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析から、二重荷電ＧｎＧｎＸＦ３、ＧｎＧｎＸ及びＧｎＧｎと対応するｍ／ｚ値を有する３つの主要な蛍光ピークが示され、そのピークからＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの結果が再度確認された（図４３；表３）。蛍光ピークの積分から、ＧｎＧｎＸＦ３、ＧｎＧｎＸ及びＧｎＧｎがＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂに由来する総Ｎ−グリカンのそれぞれ６７．４、１７．２及び８．４％を占めることが示唆された。残り７％のＮ−グリカンは、全体の２％を超えるものがＮ−グリカンをなさない、ＭＭ、ＧｎＭｉｓｏ、ＭＭＸＦ３、ＧｎＧｎＦ３、ＧｎＭｉｓｏＸＦ３、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｇｎ（ＦＡ）ｉｓｏＸＦ３、Ｍａｎ８及びＭａｎ９の混合物であると決定された。独立に形質転換された２つのＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ系統から単離されたｍＡｂでも同様の結果が認められた（データは示さず）。ここで示されたＬＥＸｍＡｂ上の単純な一連のＮ−グリカンは、糖鎖最適化を行いやすい開始点をもたらす。
【０３２６】
ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂと対照的に、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂ由来のＮ−グリカンは、ＭＡＬＤ−ＴＯＦ  ＭＳ分析でもＮＰ−ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析でも主要なＮ−グリカン種としてＧｎＧｎを有していた（図４２及び４３；表３）。ＧｎＧｎは総Ｎ−グリカンの９５．８％を占め、残り４．２％のＮ−グリカンは、総Ｎ−グリカンの１．２％を超えるものが構造をなさない、ＭＭ、ＧｎＭｉｓｏ、ＧｎＡｉｓｏ、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７及びＭａｎ８であると決定された。フコース（Ｆｕｃ）又はキシロース（Ｘｙｌ）を含有するＬＥＸＯｐｔＮ−グリカンはなかった。これらの結果は、レムナＦｕｃＴ及びＸｙｌＴを標的とするＲＮＡｉ構築物の同時発現の結果、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂ由来のＦｕｃ及びＸｙｌ含有Ｎ−グリカンが完全に消失し、高度に同種のｍＡｂグライコフォームが産生されることを実証するものである。異なる成長スケール（図４２及び４３に示すＮ−グリカンプロファイルを有するＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂを産生した、トランスジェニック系統５２での組織１ｇに対してトランスジェニック系統２２５での組織３００ｇ）で、ＭＤＸＡ０４発現ベクターを含む独立したトランスジェニック系統（系統２２５）から回収されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂでも同じ結果が得られた。Ｎ−グリカンの異種性が培養条件、成長スケール、及び成長期間とともに変化する可能性がある哺乳動物細胞培養系と異なり（Kanda et al. (2006) Biotechnol. Bioeng. 94:680-688）、ＬＥＸＯｐｔｍＡｂで観察されたグリカンの均一性が様々な成長の条件及びスケールで一貫していることが示された。
【０３２７】
ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂのＮ−グリカン上にＦｕｃ又はＸｙｌが存在しないことが、単糖分析によってさらに確認された（下記の表４）。酸加水分解によってＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂから単糖を遊離させ、パルス電流検出（ＰＡＤ，pulsed amperometric detection）と連結した高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ，high performance anion exchange chromatography）によってそれを分析した。Ｍａｎ及びＧｌｃＮＡｃ残基の単糖の比は、ＣＨＯ及び野生型ＬＥＸｍＡｂで類似し、予想された値とよく相関していた。ＬＥＸｍＡｂは、ＣＨＯ由来ｍＡｂと比較したとき、Ｇａｌ及びＦｕｃ含量が有意に低下し、Ｘｙｌが有意に増大していた。レムナ由来ｍＡｂの単糖分析から、Ｆｕｃ及びＸｙｌが野生型ＬＥＸのＮ−グリカン上では存在するが、ＬＥＸＯｐｔｍＡｂ上では検出されないことが明らかとなった。まとめると、これらの結果は、レムナＸｙｌＴ及びＦｕｃＴを標的とするＲＮＡｉ構築物の同時発現の結果、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂ由来のＦｕｃ及びＸｙｌ含有Ｎ−グリカンが消失し、高度に同種のｍＡｂグライコフォームが産生されることを実証するものである。この糖鎖最適化戦略の確実性は、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂを発現する複数の独立した植物系統でも、ＬＥＸ系中で発現される他のｍＡｂ、例えば本明細書の上記の実施例で論じたｍＡｂＩモノクローナル抗体でも確認されている。これらのその後の形質転換では、最大で総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の６％の糖鎖最適化ｍＡｂ発現レベルが得られている。
【０３２８】
【表４】
2009523432.tif 000006
【０３２９】
ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂの機能活性
ＣＤ３０を発現するＬ５４０細胞を使用して、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂの抗原結合特性を決定した。３つすべてのｍＡｂがほとんど同一の結合曲線を示した（図４３）。ＥＣ５０濃度は、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔについてそれぞれ０．１８０μｇ／ｍＬ、０．２２７μｇ／ｍＬ、及び０．１９６μｇ／ｍＬと決定され（図４４）、このことから、３つすべてのｍＡｂの抗原結合が類似していることが示唆された。
【０３３０】
Ｆｃ受容体媒介エフェクター細胞機能は、多数の治療用ｍＡｂのインビボ活性に重要であることが示されている。ＡＤＣＣ活性に関与するＮＫ細胞及びマクロファージ上で発現されるＦｃＲがＦｃγＲIIIａであるので、様々なｍＡｂとこの受容体の結合を比較した。ＣＨＯ、ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂのＦｃＲ結合を、２つの異なるヒトＦｃＲγIIIａアロタイプ（Ｐｈｅ１５８又はＶａｌ１５８）を発現するエフェクター細胞とｍＡｂの平衡結合によって決定した。ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸは、ＣＨＯ由来ｍＡｂと比較してＦｃＲγIIIａＰｈｅ１５８の結合では１．７倍に増大し、ＦｃＲγIIIａＶａｌ１５８の結合では０．４倍に低下し、このことから、ＣＨＯ及びＬＥＸｍＡｂの受容体結合は類似することが実証された。対照的に、ＬＥＸＯｐｔｍＡｂは、ＦｃＲγIIIａＰｈｅ１５８及びＦｃＲγIIIａＶａｌ１５８についてそれぞれＣＨＯｍＡｂより２７及び１５倍高い親和性を有していた（図４５）。これらの結果から、ＬＥＸＯｐｔ系統中でのレムナＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ活性のＲＮＡｉ発現抑制により、ＦｃＲ結合が亢進したｍＡｂが産生されることが示唆された。
【０３３１】
ホモ接合性（ＦｃＲγIIIａＰｈｅ１５８）又はヘテロ接合性（ＦｃＲγIIIａＰｈｅ／Ｖａｌ１５８）ヒトエフェクター細胞及びＢＡＴＤＡ（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’’−ジカルボキシレート）標識Ｌ５４０標的細胞とともにｍＡｂをインキュベートすることによって、ＣＨＯ、ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂのＡＤＣＣ活性を決定した（図４５）。ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂ（３１％）は、ヘテロ接合性ＦｃＲγIIIａＰｈｅ／Ｖａｌ１５８ヒトエフェクター細胞を使用したとき、ＣＨＯｍＡｂ（３１％）と同じ最大パーセント細胞溶解を示し（図４６）、類似したＥＣ５０値を有していた。ＬＥＸｍＡｂの最大パーセント細胞溶解（２７％）は、ホモ接合性ＦｃγＲIIIａＰｈｅ／Ｐｈｅ１５８エフェクター細胞を使用したとき、ＣＨＯｍＡｂ（１５％）と比較してわずかに増大した。重要なことに、ＬＥＸＯｐｔｍＡｂは、供与者の遺伝子型と無関係に、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ及びＬＥＸｍＡｂと比較してＡＤＣＣ活性が有意に増大した。これは、効力と効果の両方の増大によって評価された。ＭＤＸ−０６０  ＬｅｘＯｐｔの最大パーセント溶解はどちらの実験でも４５％であったが、ＥＣ５０値は、ＦｃγＲIIIａＶａｌ／Ｐｈｅ１５８エフェクター細胞ではＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＭＤＸ−０６０  ＣＨＯｍＡｂのそれぞれ３〜５分の１、ＦｃγＲIIIａＰｈｅ／Ｐｈｅ１５８エフェクター細胞では２〜３分の１と低かった。これらの結果は、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂのＦｕｃ及びＸｙｌ含有Ｎ−グリカンの除去によりＡＤＣＣ活性の亢進が生じ、したがってその治療潜在性を向上させることができることを実証するものである。
【０３３２】
ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔの完全なＩｇＧのＲＰ−ＨＰＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ分析
Poros R1-10カラム（２ｍｍ×３０ｍｍ；Applied Biosystems社製）を取り付けたWaters社製2695 HPLCシステムを使用してプロテインＡ精製ＩｇＧ（５０μｇ）を脱塩した。Waters社製2487二重波長ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）及びWaters社製Q-TOF API USを使用してＩｇＧを検出及び分析した。０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；溶媒Ａ）及び０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（溶媒Ｂ）を使用して、０．１５ｍＬ／分、６０℃で分離を行った。５分間で３０から５０％Ｂへの直線的増大、５分間で８０％Ｂへの増大を使用して、試料溶出を実施した。溶媒比をさらに４分間８０％Ｂのままにし、その後１００％Ｂで１分間洗浄し３０％Ｂでカラムを１５分間平衡化した後に次を実施した。
【０３３３】
ソース及び脱溶媒温度をそれぞれ１００℃及び３００℃にし、キャピラリー及びコーン電圧をそれぞれ３．０及び６０Ｖにして、陽イオンモードでＱ−ＴＯＦ分析を行った。データは、≧１００回の個々の走査を組み合わせ、MaxEnt 1を使用して親質量スペクトルに対して逆重畳積分を行った結果である。
【０３３４】
Triguero et al. (2005) Plant Biotechnol. J. 3: 449-457；Takahashi et al. (1998) Anal. Biochem. 255: 183-187；Dillon et al. (2004) J. Chromatogr. A. 1053: 299-305も参照されたい。
【０３３５】
図４７は、ＭＤＸＡ０１構築物を含む野生型コウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂ組成物の完全な質量分析を示す。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されないとき、組換えにより産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂ組成物は少なくとも７つの異なるグライコフォームを含み、Ｇ０ＸＦ３グライコフォームが、存在する優勢な種である。Ｇ０グライコフォームを表すピークが存在しないことに留意されたい。
【０３３６】
図４８は、ＭＤＸＡ０１構築物を含む野生型コウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂの重鎖のグリカン質量分析を示す。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されないとき、存在する優勢なＮ−グリカン種はＧ０ＸＦ３であり、さらなる主要なピークがＧ０Ｘ種を反映している。Ｇ０グリカン種がわずかに存在することに留意されたい。
【０３３７】
図４９は、ＭＤＸＡ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂ組成物の完全な質量分析を示す。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、完全なｍＡｂ組成物はＧ０Ｎ−グリカンしか含有しない。さらに、組成物はＧ０グライコフォーム（ピーク２）について実質的に同種であり、どちらのグリコシル化部位もＧ０Ｎ−グリカン種によって占有され、２つの小さなピークが微量の前駆グライコフォームを反映している（ピーク１は、一方の重鎖のＣＨ２ドメインが、Ａｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがグリコシル化されていないＦｃ領域を有するｍＡｂを示し、ピーク３は、各ＣＨ２ドメイン上のＡｓｎ２９７グリコシル化部位がＧ０グリカン種と結合し、第３のＧ０グリカン種がｍＡｂ構造内のさらなるグリコシル化部位と結合したＦｃ領域を有するｍＡｂを示す）。
【０３３８】
図５０は、ＭＤＸＡ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂの重鎖のグリカン質量分析を示す。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、重鎖のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７グリコシル化部位と結合した、容易に検出可能な唯一のＮ−グリカン種はＧ０である。
【０３３９】
考察
内因性レムナＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ遺伝子の発現抑制を目的とするＲＮＡｉカセットとの同時発現によってＭＤＸ−０６０の糖鎖最適化を実現した。このＦｕｃＴとＸｙｌＴ両方の遺伝子の同時発現抑制は、単一のＲＮＡｉ転写物を使用して行われた。ＬＥＸＯｐｔｍＡｂ上にＦｕｃ及びＸｙｌが存在しないことを、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂから精製されたＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＮＰ−ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳ及び単糖分析によって確認した。これらの分析は、ミクロソーム膜中でトランスフェラーゼ活性が観察されないことを裏付けるものである。重要なことに、ＬＥＸＯｐｔｍＡｂから遊離したＮ−グリカンの＞９５％が単一の構造のＧｎＧｎであり、このことから、この戦略が同種のＮ−グリカンプロファイルを有するｍＡｂを産生するという付加的利益を有することが示唆された。ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ及びＬＥＸＯｐｔｍＡｂは、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯと比較して、熱安定性及び抗原結合に関して区別できないことが分かった。電気泳動分析では、３つすべてのｍＡｂが類似していることも分かった。実際、検出される唯一の構造上の違いはｍＡｂのＮ−グリカンプロファイル中にあった。
【０３４０】
理論に拘泥するものではないが、単一の主要なＮ−グリカン種を有するｍＡｂを産生するＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ系統の能力は、野生型レムナ中で認められる、より均一なｍＡｂグライコフォーム分布に基づく可能性がある。野生型のタバコ（Fujiyama et al. (2006) J. Biosci. Bioeng. 101:212-218；Elbers et al. (2001) Plant Physiol. 126:1314-1322；Bakker et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98:2899-2904）、アルファルファ（Bardor et al. (2003) Plant Biotechnol. J. 1:451-462）、及びコケ（Koprivova et al. (2003) Plant Bio. 5:582-591）から精製したｍＡｂから遊離したＮ−グリカンは、野生型Ｎ−グリコシル化を有する植物におけるｍＡｂグライコフォームの異種性が５つ（アルファルファ）（Bardor et al. (2003) Plant Biotechnol. J. 1:451-462）〜８つ（タバコ）（Fujiyama et al. (2006) J. Biosci. Bioeng. 101:212-218）の異なる主要な構造となり得ることを示す。ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸは、３つの主要なＮ−グリカン構造（ＧｎＧｎ、ＧｎＧｎＸ及びＧｎＧｎＸＦ３）しか有さない。野生型レムナにより産生されたｍＡｂ上のこの単純な一連のＮ−グリカンは、より糖鎖最適化を行いやすい開始点をもたらすことができ、それによって、他の系で観察されるものより大きな同種性が得られる。
【０３４１】
Ｆｃ受容体媒介エフェクター細胞機能は、多数の治療用ｍＡｂのインビボ活性に重要であることが示されている。この試験では、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ、及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂのＡＤＣＣ活性を比較した。ＡＤＣＣ活性に関与するＮＫ細胞及びマクロファージ上で発現されるＦｃＲがＦｃγＲIIIａであるので、様々なｍＡｂとこの受容体の結合も比較した。上記で論じた結果は、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂと比較してＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂではＦｃγＲIIIａとの結合親和性（１５〜２５倍）及び最大結合（４〜５倍）も増大しＡＤＣＣ活性も亢進することを示す。他の発現系で産生された様々なｍＡｂからα−１，６−結合Ｆｕｃを除去すると、ＦｃＲ結合が増大しＡＤＣＣ機能が亢進することが以前に示されている（Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466-3473；Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Niwa et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:6248-6255）。本明細書で提示した結果から、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂからのα−１，３−結合Ｆｕｃの除去が、ｍＡｂの機能に対してα−１，６−結合Ｆｕｃの除去と同じ効果を有することが示唆される。
【０３４２】
この試験では、残基１５８４１でのＦｃγＲIIIａの天然に存在する２つの多型アイソフォームＶａｌ１５８及びＰｈｅ１５８を評価した。他のＩｇＧ１ｍＡｂで観察されているように（Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740）、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔは、ＦｃγＲIIIａ−Ｐｈｅ１５８と比較してＦｃγＲIIIａ−Ｖａｌ１５８と高い結合親和性を示す。Ｐｈｅ１５８と比べたＶａｌ１５８との結合の違いは、抗ＣＤ２０治療を受けている特定の患者群の臨床的免疫学的応答性を予測するものであることが分かったので（Cartron et al. (2002) Blood 99:754-758；Weng et al. (2003) J. Clin. Oncol. 21:3940-3947；Weng et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:4717-4724）、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔでの結合の増大がどちらのアイソフォームでも観察されたことは重要である。この結合の増大の結果、Ｆｃ機能を必要とする治療に応答する患者が高い百分率となるとの仮説が立てられている。
【０３４３】
ＡＤＣＣ活性の同様の増大も観察された。この試験では、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂは、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯと比較したとき、細胞溶解の増大及びＥＣ５０値の低下、それによる効果及び効力の増大を示した。これは、ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯの最大パーセント溶解を調べ、同じパーセント細胞溶解を生じさせるＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂの濃度を計算することによって決定される、活性の２０倍の増大と対応する。ＦｃγＲIIIａ結合試験と同様に、ＡＤＣＣ活性の増大は、ホモ接合性ＦｃγＲIIIａＰｈｅ／Ｐｈｅ１５８エフェクター細胞供与者でもヘテロ接合性ＦｃγＲIIIａＰｈｅ／Ｖａｌ１５８エフェクター細胞供与者でも観察された。ここで提示した結果から、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂからのα−１，３−結合Ｆｕｃの除去が、ｍＡｂの機能に対してα−１，６−結合Ｆｕｃの除去と同じ効果を有することが示唆される。
【０３４４】
この糖鎖最適化戦略の確実性は、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂを発現する複数の独立したレムナ植物系統でも、レムナ発現系中で発現される他のｍＡｂ（例えば、上記の実施例２〜４を参照）でも実証されている。さらに、野生型レムナ植物と比較して植物の表現型又は成長速度に明らかな違いはない。Ｎ−グリカンの異種性が培養条件、成長スケール、及び成長期間とともに変化する可能性がある哺乳動物細胞培養系と異なり８、ＬＥＸＯｐｔｍＡｂで観察されたグリカンの均一性が様々な成長の条件及びスケールで一貫していることが示された（データは示さず）。
【０３４５】
結論として、ＲＮＡｉ戦略を使用してレムナ発現系中で糖鎖最適化抗ＣＤ３０抗体を産生した。得られたｍＡｂは単一の主要なＮ−グリカン構造からなり、植物特異的なＦｕｃ及びＸｙｌ残基が認められない。さらに、得られた最適化ｍＡｂは、ＣＨＯ由来ｍＡｂと比較してＡＤＣＣ活性及びＦｃγＲIIIａ結合活性が増大している。このＦｕｃＴ＋ＸｙｌＴ遺伝子ノックアウト戦略を有するレムナ発現系中で産生されたｍＡｂ上で得られた同種のグリコシル化プロファイルによって、産生の一貫性が増大したこれらのｍＡｂを発現させることが可能となる。
［実施例７］
コウキクサ中でのグリカン最適化ｍＡｂＩのスケールアップ生産
上記に記載のものと類似した形で、（ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの発現抑制をもたらす）図１２のｍＡｂＩ０４構築物を含むコウキクサトランスジェニック系統２４を生成した。その生成後、クローン培養によってトランスジェニック系統２４を連続的に維持し、植物培養物の部分試料を定期的に新鮮培地に移しさらに培養した。組織１ｇから組織３００ｇ（０．３ｋｇ）への生産のスケールアップ、及び組織６．５ｋｇへのさらなる生産のスケールアップ後に、組換えにより産生されたｍＡｂＩ抗体のＮ−グリコシル化パターンについてこのトランスジェニック系統を分析した。組織６．５ｋｇへと生産をスケールアップする工程は、トランスジェニック系統２４を生成した後およそ８カ月行われた。結果を図５１Ａ（Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析）及び５１Ｂ（Ｎ−グリカンのＨＰＬＣ蛍光分析）に示す。
【０３４６】
ｍＡｂＩ０４構築物を含むトランスジェニック系統２４により産生されたｍＡｂＩ抗体のグリコシル化プロファイルは、組織１ｇから組織０．３ｋｇへと生産をスケールアップし、組織６．５ｋｇへとさらに生産をスケールアップしても同種のままであり、したがってＧｎＧｎ（すなわち、Ｇ０）グリカン種と対応する単一の優勢なピークの存在を特徴とするものであった。したがって、ｍＡｂＩ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ中のグリコシル化プロファイルの同種性は、生産スケールがおよそ６，５００倍に（すなわち１ｇから６．５ｋｇへと）増大しても一貫して維持されていた。さらに、グリコシル化プロファイルの同種性は、その生成から８カ月後もこのトランスジェニック系統中で一貫して維持されていた。
【０３４７】
これらのデータは、ｍＡｂＩ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ中のグリコシル化プロファイルの同種性が、生産スケールが少なくとも６，５００倍増大しても一貫性のあるままであることを実証するものである。さらに、ｍＡｂＩ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ中のグリコシル化プロファイルの同種性は、トランスジェニック系統の生成後少なくとも８カ月維持される。グリコシル化プロファイルの同種性は、生産スケールがさらに増大しても維持されることが予想され、したがって、例えば、生産スケールが６．５ｋｇを越えてさらに４倍増大（例えば、６．５ｋｇから２６ｋｇにスケールアップ）した場合でも維持されることが予想される。グリコシル化プロファイルの同種性はまた、トランスジェニック系統の生成後８カ月をはるかに越えてトランスジェニック系統の連続的クローン培養を行っても維持されることも予想される。
［実施例８］
ｍＡｂＩ０４ＲＮＡｉ構築物のトランスジェニックコウキクサ系統中の内因性糖タンパク質のグリコシル化パターン
Ｌ４０プロテアーゼは、コウキクサ中で産生される代表的な内因性糖タンパク質である。内因性タンパク質のグリコシル化に対するｍＡｂＩ０４ＲＮＡｉ構築物（図１２）の影響を評価するために、ベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーを使用してｍＡｂＩ０４ＲＮＡｉ構築物のトランスジェニックコウキクサ系統からＬ４０タンパク質を単離した。上記に記載した形でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を使用して単離Ｌ４０タンパク質のＮ−グリコシル化パターンを分析した。結果を図５２に示す。
【０３４８】
この分析から認められるように、キメラＲＮＡｉ  ｍＡｂＩ０４構築物を使用してＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ発現を抑制した結果、組換え糖タンパク質で観察されたものと一貫性のある同種のグリコシル化パターンを有する内因性糖タンパク質が生じる。したがって、野生型グリコシル化機構を有するコウキクサから単離されたＬ４０糖タンパク質の異種Ｎ−グリカンプロファイルは、β１，２−結合キシロース残基、又はβ１，２−結合キシロースとコアα１，３−結合フコース残基の両方と結合したＮ−グリカン種の混合物によって表される。対照的に、ｍＡｂＩ０４ＲＮＡｉ構築物のトランスジェニックコウキクサから単離されたＬ４０の同種Ｎ−グリカンプロファイルは、Ｇ０グリカン種と対応する単一の優勢なピークによって表され、β１，２−結合キシロース、又はβ１，２−結合キシロースとコアα１，３−結合フコース残基の両方と結合したＮ−グリカン種が存在しないことを特徴とする。
［実施例９］
ＡＤＣＣ活性が増大した抗ＣＤ２０及び抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体の産生
ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８（IDEC Pharmaceuticals Corp.社製、カリフォルニア州San Diego；商品名Rituxan（登録商標）で市販され、リツキシマブとも称される；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７３６，１３７号を参照）はキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり、ネズミ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＩＤＥＣ−２Ｂ８（Reff et al. (1994) Blood 83:435-445）から単離されたネズミ可変領域の付いたヒトＩｇＧ１及びカッパ定常領域を含有する。リツキシマブは、再発Ｂ細胞低悪性度又は濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ，non-Hodgkin's lymphoma）の治療について認可されている。リツキシマブ（Rituxan（登録商標））として販売されているＣＤ２０抗体は、ＣＨＯ細胞中で組換えにより産生される。このＣＨＯで発現される抗ＣＤ２０抗体のグリコシル化パターンから、グライコフォームの異種混合物が明らかとなっている。
【０３４９】
ヒト化抗ＥＲＢＢ２抗体が商品名Herceptin（登録商標）（Genentech, Inc.社製、カリフォルニア州San Francisco）で市販されている（参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，１６５，４６４号を参照）。この組換えヒト化モノクローナル抗体は、ｐ１８５ＨＥＲ２に高い親和性を有する。広汎転移性乳癌患者での初期の臨床試験から、このモノクローナル抗体がＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞の増殖を阻害できることが実証されている（Baselga et al. (1996) J. Clin. Oncol. 14(3):737-744）。
【０３５０】
上記に記載のｍＡｂＩ０１構築物を使用して野生型グリコシル化パターンを有するレムナ中で、またｍＡｂＩ０４キメラＲＮＡｉ構築物を使用してＦｕｃＴとＸｙｌＴの発現をどちらも抑制するように遺伝子改変されたレムナ中で、リツキシマブ又は抗ＥＲＢＢ２の重鎖及び軽鎖コード配列がこれらの各構築物中でｍＡｂＩのものと置換されたリツキシマブ配列抗体及びHerceptin（登録商標）抗ＥＲＢＢ２配列抗体を組換えにより産生する。重鎖及び軽鎖をコードする配列は、どちらもレムナ優先的コドンでコドンを最適化してもよい。分泌されたリツキシマブ配列ｍＡｂ（すなわち、リツキシマブ抗体のアミノ酸配列を有する）及び抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂ（すなわち、Herceptin（登録商標）抗ＥＲＢＢ２ｍＡｂのアミノ酸配列を有する）を、上記の実施例１で記載したようにグリコシル化パターンについて分析する。
【０３５１】
ｍＡｂＩ０１様構築物を含む野生型レムナ中で産生された完全なリツキシマブ配列ｍＡｂ又は抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂのグリコシル化プロファイルは、複数のグライコフォームと対応する多数のピークを有する異種プロファイルを示す。対照的に、ｍＡｂＩ０４様構築物を含むトランスジェニックレムナ中で産生された完全なリツキシマブ配列ｍＡｂ又は完全な抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂのグリコシル化プロファイルは実質的に同種の糖タンパク質組成を示し、その最も大きなものがＧ０グライコフォームと対応する３つの主要なグライコフォームのピーク、及び微量の前駆グライコフォームと対応する２つの非常に小さなピークを有し、キシロース及びフコース残基が結合していない。
【０３５２】
Ｇ０グライコフォームについて実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有するリツキシマブ配列及び抗ＥＲＢＢ２配列モノクローナル抗体組成物を、ＡＤＣＣ活性、及び新鮮に単離されたヒトＮＫ細胞上でのＦｃγ受容体IIIａ（ＦｃγＲIIIａ）結合について試験する。ｍＡｂＩ０４様構築物を用いて工学的に作製されたコウキクサ系統から産生されたリツキシマブ配列及び抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂは、野生型グリコシル化機構を有する（すなわちＦｕｃＴ又はＸｙｌＴを発現抑制しない）コウキクサ系統から産生されたリツキシマブ配列及び抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂで観察される結合と比べて、フコース残基がないことを考慮して予想される結合の亢進を示す。さらに、結合親和性は、ＣＨＯ細胞系統中で産生された対応するｍＡｂについては少なくとも強い。
【０３５３】
ｍＡｂＩ０４様構築物を用いて工学的に作製されたコウキクサ系統中で産生されたリツキシマブ配列ｍＡｂ及び抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂの実質的に同種のＧ０グライコフォームのＡＤＣＣ活性について、精製ヒト末梢血単核細胞をエフェクター細胞として使用してアッセイを行った（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているShinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(5):3466-3473を参照）。Ｇ０グライコフォームのリツキシマブ配列及び抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂ組成物の活性は、野生型グリコシル化機構を有するコウキクサ系統中で産生され、又はＣＨＯ細胞中で産生されたそれぞれのリツキシマブ配列ｍＡｂ又は抗ＥＲＢＢ２配列ｍＡｂによって示される活性の５０〜１０００倍に向上する。
【０３５４】
ｍＡｂＩ０４様ＲＮＡｉ構築物を用いて工学的に作製されたコウキクサ系統中で産生されたリツキシマブ配列ｍＡｂの実質的に同種のＧ０グライコフォームのＣＤＣ活性について、当技術分野で知られている標準的なアッセイを使用してアッセイを行い（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９号に記載の補体活性化アッセイを参照）、リツキシマブで観察される活性と比較する。無関係の抗体を陰性対照として使用する。１つのそのようなアッセイでは、補体供給源として使用する健常志願者由来の血清を用いて、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ，propidium iodide）排除アッセイを使用して膜透過性の上昇を評価することによって、標的Daudi細胞に対する様々な抗体のＣＤＣ活性を測定する。健常志願者から採血してautosep gel and clot activator vacutainer チューブ（BD Biosciences、ニュージャージー州Rutherford）に入れ、それを室温で３０〜６０分間保持し次いで３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって補体溶解用の血清を調製する。血清を回収し−８０℃で貯蔵する。
【０３５５】
簡潔に述べると、このＣＤＣ活性アッセイでは、Daudi細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ−１％ＢＳＡ中に１ｍｌ当たり細胞１×１０６個に再懸濁する。様々な濃度の実質的に同種のＧ０グライコフォームのリツキシマブ配列ｍＡｂ、リツキシマブ、及び陰性対照ｍＡｂをDaudi細胞に添加し、室温で１０〜１５分間結合させる。その後、補体の供給源である血清を添加して終濃度２０％（ｖ／ｖ）にし、その混合物を３７℃で４５分間インキュベートする。次いで、分析するまで細胞を４℃で維持する。次いで各試料（１５０μｌ）をFACSチューブ中のＰＩ溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）１０μｌに添加する。細胞溶解（ＰＩ陽性細胞の数）について、FACScaliburフローサイトメーターによりその混合物を直ちに評価し、CellQuest proソフトウェア（BD Biosciences、カリフォルニア州Mountain View）を使用して分析する。少なくとも５０００個の事象を分析用に収集し、前方側方散乱（ＦＣＳ，forward sideward scatter）の閾値の調整によって細胞破片を除外する。
【０３５６】
実質的に同種のＧ０グライコフォームのリツキシマブ配列ｍＡｂのＣＤＣ活性は、リツキシマブによって示される活性と比べて低下する。
【０３５７】
本明細書で挙げたすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の技術者のレベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願は、個々の各刊行物又は特許出願が参照により組み込まれていることが明確にかつ個々に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０３５８】
【図１】コウキクサα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）のＤＮＡ（配列番号１；コード配列は配列番号２で示す）及びアミノ酸（配列番号３）配列を示す図である。コード配列を太字で示す。一重下線（−）により示したヌクレオチドは、ＦｕｃＴの発現を阻害するように設計されたＲＮＡｉ発現カセット内のＦｕｃＴ順方向断片（図５を参照）と対応し、二重下線（＝）により示したヌクレオチドは、このＲＮＡｉ発現カセット内のスペーサー配列と対応する。ＲＮＡｉ発現カセットのＦｕｃＴ逆方向断片は、ここに示すＦｕｃＴ順方向断片のアンチセンスである。
【図２Ａ】配列番号３のコウキクサＦｕｃＴと他の高等植物に由来するα１，３−フコシルトランスフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図２Ｂ】配列番号３のコウキクサＦｕｃＴと他の高等植物に由来するα１，３−フコシルトランスフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図２Ｃ】配列番号３のコウキクサＦｕｃＴと他の高等植物に由来するα１，３−フコシルトランスフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図３】コウキクサβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）アイソフォーム＃１のＤＮＡ（配列番号４；コード配列は配列番号５で示す）配列及びコードされたアミノ酸（配列番号６）配列を示す図である。一重下線（−）により示したヌクレオチドは、ＸｙｌＴの発現を阻害するように設計されたＲＮＡｉ発現カセット内のＸｙｌＴ順方向断片（図６を参照）と対応し、二重下線（＝）により示したヌクレオチドは、このＲＮＡｉ発現カセット内のスペーサー配列と対応する。ＲＮＡｉ発現カセットのＸｙｌＴ逆方向断片は、ここに示すＸｙｌＴ順方向断片のアンチセンスである。
【図４Ａ】配列番号６のコウキクサＸｙｌＴと他の高等植物に由来するβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図４Ｂ】配列番号６のコウキクサＸｙｌＴと他の高等植物に由来するβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図４Ｃ】配列番号６のコウキクサＸｙｌＴと他の高等植物に由来するβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図４Ｄ】配列番号６のコウキクサＸｙｌＴと他の高等植物に由来するβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアラインメントを示す図である。
【図５】コウキクサＦｕｃＴの単一遺伝子ＲＮＡｉノックアウトを設計する１つの戦略を示す図である。
【図６】ＸｙｌＴアイソフォーム＃１のＤＮＡ配列に基づいた、コウキクサＸｙｌＴの単一遺伝子ＲＮＡｉノックアウトを設計する１つの戦略を示す図である。
【図７】ＲＮＡｉノックアウトのＸｙｌＴ部分がＸｙｌＴアイソフォーム＃１のＤＮＡ配列に基づいている、コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの二重遺伝子ＲＮＡｉノックアウトを設計する１つの戦略を示す図である。
【図８】コウキクサＦｕｃＴの単一遺伝子ＲＮＡｉノックアウト用に設計されたＲＮＡｉ発現カセットを含むＦｕｃ０２構築物を示す図である。ＦｕｃＴ阻害性配列（ＦｕｃＴ順方向及びＦｕｃＴ逆方向の矢印により示した；図５を参照）の発現は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスマンノピンシンターゼ遺伝子に由来するプロモーター（ＡｍａｓＰｍａｓ）と作動的に連結したアグロバクテリウム・ツメファシエンスオクトピンシンターゼ遺伝子に由来する３つの上流活性化配列（Ａｏｃｓ）を含む、作動的に連結した発現調節エレメント（ＡｏｃｓＡｏｃｓＡｏｃｓＡｍａｓＰｍａｓで示した）によって促進される。ＲｂｃＳリーダー、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットリーダー配列；ＡＤＨ１、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子のイントロン；ｎｏｓ−ｔｅｒ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンセターゼ（ｎｏｓ，nopaline synthetase）転写停止配列。
【図９】コウキクサＸｙｌＴの単一遺伝子ＲＮＡｉノックアウト用に設計されたＲＮＡｉ発現カセットを含むＸｙｌ０２構築物を示す図である。ＸｙｌＴ阻害性配列（ＸｙｌＴ順方向及びＸｙｌＴ逆方向の矢印により示した；図６を参照）の発現は、作動的に連結したＡｏｃｓＡｏｃｓＡｏｃｓＡｍａｓＰｍａｓ発現調節エレメントによって促進される。ＲｂｃＳリーダー、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットリーダー配列；ＡＤＨ１、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子のイントロン；ｎｏｓ−ｔｅｒ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンセターゼ（ｎｏｓ）転写停止配列。
【図１０】コウキクサＦｕｃＴ／ＸｙｌＴの二重遺伝子ＲＮＡｉノックアウト用に設計されたキメラＲＮＡｉ発現カセットを含むＸＦ０２構築物を示す図である。ヘアピンＲＮＡがキメラ配列として発現し（キメラヘアピンＲＮＡ）、２つの遺伝子の断片が一緒に融合され、１つの転写物として発現する。ＦｕｃＴ／ＸｙｌＴ阻害性配列（ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの順方向の矢印並びにＸｙｌＴ及びＦｕｃＴの逆方向の矢印により示した；図７を参照）の発現は、作動的に連結したＡｏｃｓＡｏｃｓＡｏｃｓＡｍａｓＰｍａｓ発現調節エレメントによって促進される。ＲｂｃＳリーダー、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットリーダー配列；ＡＤＨ１、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子のイントロン；ｎｏｓ−ｔｅｒ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンセターゼ（ｎｏｓ）転写停止配列。
【図１１】コウキクサＦｕｃＴ／ＸｙｌＴの二重遺伝子ＲＮＡｉノックアウト用に設計されたＲＮＡｉ発現カセットを含むＸＦ０３構築物を示す図である。カセットは２つのＲＮＡｉヘアピンを発現し、その一方はＦｕｃＴの発現を標的とし、他方はＸｙｌＴの発現を標的とする。ＦｕｃＴ阻害性配列（ＦｕｃＴ順方向及びＦｕｃＴ逆方向の矢印により示した；図５を参照）の発現は、５’ＵＴＲを加えたコウキクサユビキチンプロモーター（ＬｍＵｂｑプロモーター）及びイントロン（ＬｍＵｂｑイントロン）（配列番号７を参照）を含む作動的に連結した発現調節エレメントによって促進される。ＸｙｌＴ阻害性配列（ＸｙｌＴ順方向及びＸｙｌＴ逆方向の矢印により示した；図６を参照）の発現は、作動的に連結したＡｏｃｓＡｏｃｓＡｏｃｓＡｍａｓＰｍａｓ発現調節エレメントによって促進される。ＲｂｃＳリーダー、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットリーダー配列；ＡＤＨ１、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子のイントロン；ｎｏｓ−ｔｅｒ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンセターゼ（ｎｏｓ）転写停止配列。
【図１２】ＩｇＧ１モノクローナル抗体（本明細書においてｍＡｂＩと称する）、並びにコウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの二重遺伝子ノックアウトの同時発現をもたらすｍＡｂＩ０４構築物を示す図であり、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの発現を標的とするキメラヘアピンＲＮＡが発現する。ＦｕｃＴ／ＸｙｌＴ阻害性配列（ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの順方向の矢印並びにＸｙｌＴ及びＦｕｃＴの逆方向の矢印により示した；図７を参照）の発現は、５’ＵＴＲを加えたウキクサ（Spirodella polyrrhiza）ユビキチンプロモーター（ＳｐＵｂｑプロモーター）及びイントロン（ＳｐＵｂｑイントロン）（配列番号８を参照）を含む作動的に連結された発現調節エレメントによって促進される。ＩｇＧ１軽鎖の発現は、５’ＵＴＲを加えたコウキクサユビキチンプロモーター（ＬｍＵｂｑプロモーター）及びイントロン（ＬｍＵｂｑイントロン）を含む作動的に連結した発現調節エレメントによって促進される。ＩｇＧ１重鎖の発現は、作動的に連結したＡｏｃｓＡｏｃｓＡｏｃｓＡｍａｓＰｍａｓ発現調節エレメントによって促進される。ＲｂｃＳリーダー、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットリーダー配列；ＡＤＨ１、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子のイントロン；ｎｏｓ−ｔｅｒ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンセターゼ（ｎｏｓ）転写停止配列。
【図１３】ｍＡｂＩ、並びにコウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの二重ノックアウトの同時発現をもたらすｍＡｂＩ０５構築物を示す図であり、２つのヘアピンＲＮＡが発現し、その一方はＦｕｃＴの発現を標的とし、他方はＸｙｌＴの発現を標的とする。ＦｕｃＴ阻害性配列（ＦｕｃＴ順方向及びＦｕｃＴ逆方向の矢印により示した；図５を参照）の発現は、５’ＵＴＲを加えたウキクサ（S. polyrrhiza）ユビキチンプロモーター（ＳｐＵｂｑプロモーター）及びイントロン（ＳｐＵｂｑイントロン）を含む作動的に連結された発現調節エレメントによって促進される。ＸｙｌＴ阻害性配列（ＸｙｌＴ順方向及びＸｙｌＴ逆方向の矢印により示した；図６を参照）の発現は、５’ＵＴＲを加えたナンゴクアオウキクサユビキチンプロモーター（ＬａＵｂｑプロモーター）及びイントロン（ＬａＵｂｑイントロン）（配列番号９を参照）を含む作動的に連結された発現調節エレメントによって促進される。ＩｇＧ１軽鎖の発現は、５’ＵＴＲを加えたコウキクサユビキチンプロモーター（ＬｍＵｂｑプロモーター）及びイントロン（ＬｍＵｂｑイントロン）を含む作動的に連結した発現調節エレメントによって促進される。ＩｇＧ１重鎖の発現は、作動的に連結したＡｏｃｓＡｏｃｓＡｏｃｓＡｍａｓＰｍａｓ発現調節エレメントによって促進される。ＲｂｃＳリーダー、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットリーダー配列；ＡＤＨ１、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子のイントロン；ｎｏｓ−ｔｅｒ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンセターゼ（ｎｏｓ）転写停止配列。
【図１４】ｍＡｂＩの発現をもたらすｍＡｂＩ０１構築物を示す図であり、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ発現は抑制されない。ＩｇＧ１軽鎖及びＩｇＧ１重鎖の発現は、作動的に連結したＡｏｃｓＡｏｃｓＡｏｃｓＡｍａｓＰｍａｓ発現調節エレメントによってそれぞれ独立に促進される。ＲｂｃＳリーダー、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットリーダー配列；ＡＤＨ１、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子のイントロン；ｎｏｓ−ｔｅｒ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンセターゼ（ｎｏｓ）転写停止配列。ｍＡｂＩ０１は、発現したｍＡｂＩが野生型コウキクサのグリコシル化プロファイルを示すので、「野生型」ｍＡｂＩ０１構築物と称する。
【図１５】図１０のＸＦ０２構築物を含むトランスジェニックＲＮＡｉコウキクサ植物系統の一次スクリーニングデータを示す図である。
【図１６】図１０のＸＦ０２構築物を含むトランスジェニックＲＮＡｉコウキクサ植物系統の一次スクリーニングデータを示す図である。
【図１７】図１２のｍＡｂＩ０４構築物、及び図１３のｍＡｂＩ０５構築物を含むトランスジェニックＲＮＡｉコウキクサ植物系統の一次スクリーニングデータを示す図である。
【図１８】誘導体化野生型コウキクサｍＡｂのＮ−グリカンの構造及び分子量を示す図である。「ＧｎＧｎ」は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン種を表し、Ｇ０Ｎ−グリカン種とも称する。「ＧｎＧｎＸ」は、植物特異的β（１，２）−キシロース残基が結合したＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン種を表す。「ＧｎＧｎＸＦ」は、植物特異的β（１，２）−キシロース残基及び植物特異的α（１，３）−フコース残基が結合したＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン種を表す。
【図１９】コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴのＲＮＡｉ発現抑制を行わずにコウキクサ中でｍＡｂＩモノクローナルＩｇＧ１抗体の発現をもたらす（図１５に示す）野生型ｍＡｂＩ０１構築物から、β１，２−結合キシロースを有する種及びβ１，２−結合キシロースとコアα１，３−結合フコース残基をどちらも有する種を含めた３つの主要なＮ−グリカン種を有するＮ−グリコシル化プロファイルが生じることを示す図である；このプロファイルは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）（図２０）及びＭＡＬＤＩ（図２１）分析で確認される。
【図２０】液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を示す図である。
【図２１】ＭＡＬＤＩ分析を示す図である。
【図２２】ｍＡｂＩ０１構築物（ＦｕｃＴ又はＸｙｌＴの発現抑制なし）を含む野生型コウキクサ系統及び図１２のｍＡｂＩ０４構築物（ｍＡｂＩ、並びにコウキクサＦｕｃＴとＸｙｌＴをどちらも標的とするキメラＲＮＡｉ構築物の同時発現をもたらす）を含む２つのトランスジェニックコウキクサ系統中で産生されたｍＡｂＩの相対量の様々なＮ−グリカン種の重ね合わせを示す図である。β１，２−結合キシロース又はコアα１，３−結合フコース残基が結合していないＧｎＧｎ（すなわちＧ０）グリカン種が濃縮され、β１，２−結合キシロース又はβ１，２−結合キシロースとコアα１，３−結合フコース残基をどちらも有する種が存在しないことに留意されたい。「ＭＧｎ」は、トリマンノースコア構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、１，３マンノース腕と結合した１つのＮ−アセチルグルコサミンを有するＮ−グリカン前駆体を表す。「ＧｎＭ」は、トリマンノースコア構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、１，６マンノース腕と結合した１つのＮ−アセチルグルコサミンを有するＮ−グリカン前駆体を表す。これらのＮ−グリカン前駆体は、試料中に存在する微量の総Ｎ−グリカン種を表す。このプロファイルは、質量分析（ＬＣ−ＭＳ）（図２３）及びＭＡＬＤＩ（図２４）分析で確認される。
【図２３】質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を示す図である。
【図２４】ＭＡＬＤＩ分析を示す図である。
【図２５】ｍＡｂＩ０１構築物を含む野生型コウキクサ（系統２０）中で産生されたｍＡｂＩ組成物の完全な質量分析を示す図である。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されないとき、組換えにより産生されたｍＡｂＩ組成物は異種であり、少なくとも９つの異なるグライコフォームを含み、Ｇ０ＸＦ３グライコフォームが、存在する優勢な種である。Ｇ０グライコフォームを表す非常に小さなピークに留意されたい。
【図２６】図１２のｍＡｂＩ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ（系統１５）中で産生されたｍＡｂＩ組成物の完全な質量分析を示す図である。キメラＲＮＡｉ構築物を使用してＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、完全なｍＡｂＩ組成物はＧ０Ｎ−グリカンについて実質的に同種であり、（ＧｎＭ及びＭＧｎ前駆グリカン種によって表される）前駆Ｎ−グリカンは微量しか存在しない。さらに、ｍＡｂＩ組成物はＧ０グライコフォームについて実質的に同種であり、どちらのグリコシル化部位もＧ０Ｎ−グリカン種によって占有され、３つの小さなピークが微量の前駆グライコフォームを反映している（１つのピークは、一方の重鎖のＣＨ２ドメインが、Ａｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがグリコシル化されていないＦｃ領域を有するｍＡｂＩを示し、他のピークは、一方の重鎖のＣＨ２ドメインが、Ａｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがＡｓｎ２９７と結合したＧｎＭ又はＭＧｎ前駆グリカンを有するＦｃ領域を有するｍＡｂＩを示し、他のピークは、各ＣＨ２ドメイン上のＡｓｎ２９７グリコシル化部位がＧ０グリカン種と結合し、第３のＧ０グリカン種がｍＡｂＩ構造内のさらなるグリコシル化部位と結合したＦｃ領域を有するｍＡｂＩを示す）。
【図２７】図１３のｍＡｂＩ０５構築物を含むトランスジェニックコウキクサ（系統７２）中で産生されたｍＡｂＩ組成物の完全な質量分析を示す図である。この構築物を使用してＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、完全なｍＡｂＩ組成物はＧ０Ｎ−グリカンについて実質的に同種であり、（ＧｎＭ及びＭＧｎ前駆グリカン種によって表される）前駆Ｎ−グリカンは微量しか存在しない。さらに、ｍＡｂＩ組成物はＧ０グライコフォームについて実質的に（少なくとも９０％）同種であり、ｍＡｂＩ０４構築物で得られたものと同じ３つの小さなピークが前駆グライコフォームを反映している。
【図２８】個々のＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ遺伝子の発現を標的とする２つの考えられる設計の概要を示す図である。
【図２９Ａ】植物及び動物中で産生される糖タンパク質の複合Ｎ−グリカンの共通するオリゴマンノシドコア構造を示す図である。哺乳動物では、コア構造は、α結合を介して還元末端でフコースの１位がＮ−アセチルグルコサミンの６位と結合したフコース残基（すなわち、α（１，６）−結合フコース）を含み得る。
【図２９Ｂ】これらのＮ−グリカンに対する植物特異的修飾を示す図である。哺乳動物のＲ基は下記のもののうち１つでよい：（ａ）Ｒ＝ＧｌｃＮＡｃβ（１，２）；（ｂ）Ｒ＝Ｇａｌβ（１，４）−ＧｌｃＮＡｃβ（１，２）；（ｃ）Ｒ＝ＮｅｕＡｃα（２，３）−Ｇａｌβ（１，４）−ＧｌｃＮＡｃβ（１，２）；（ｄ）Ｒ＝ＮｅｕＧｃα（２，３）−Ｇａｌβ（１，４）−ＧｌｃＮＡｃβ（１，２）；及び（ｅ）Ｒ＝Ｇａｌα（１，３）−Ｇａｌβ（１，４）−ＧｌｃＮＡｃβ（１，２）。植物のＲ基は下記のもののうち１つでよい：（ａ）Ｒ＝ヌル；（ｂ）Ｒ＝ＧｌｃＮＡｃβ（１，２）；
【０３５９】
（ｃ）R=Galβ(1,3)-GlcNAcβ(1,2)及び(d)R=Galβ(1,4)-GlcNAcβ(1,2)
|                                |
Fucα(1,4)                        Fucα(1,6)
略語：Ｍａｎ、マンノース；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｘｙｌ、キシロース；Ｆｕｃ、フコース；Ｇａｌ、ガラクトース；ＮｅｕＡｃ、ノイラミン酸（シアル酸）；＊、アスパラギンと結合する糖鎖の還元末端。
【図３０】本明細書で使用される代替の名称とともに、本発明の説明及び特許請求の範囲で言及される糖タンパク質のＮ−結合グリカンのＧ０、Ｇ０Ｘ、及びＧ０ＸＦ３種を示す図である。
【図３１】コウキクサβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）アイソフォーム＃２の部分的ｃＤＮＡ（配列番号１９；コード配列は配列番号２０で示す）配列及びそれによりコードされた部分的アミノ酸（配列番号２１）配列を示す図である。一重下線（−）により示したヌクレオチドは、ＸｙｌＴの発現を阻害するように設計されたＲＮＡｉ発現カセット内のＸｙｌＴ順方向断片（図３３を参照）と対応し、二重下線（＝）により示したヌクレオチドは、このＲＮＡｉ発現カセット内のスペーサー配列と対応する。ＲＮＡｉ発現カセットのＸｙｌＴ逆方向断片は、ここに示すＸｙｌＴ順方向断片のアンチセンスである。
【図３２】配列番号６のコウキクサＸｙｌＴアイソフォーム＃１と配列番号２１のコウキクサ部分長ＸｙｌＴアイソフォーム＃２のアラインメントを示す図である。
【図３３】ＸｙｌＴアイソフォーム＃２の部分的ＤＮＡ配列に基づいた、コウキクサＸｙｌＴの単一遺伝子ＲＮＡｉノックアウトを設計する１つの戦略を示す図である。
【図３４】ＲＮＡｉノックアウトのＸｙｌＴ部分がＸｙｌＴアイソフォーム＃２の部分的ＤＮＡ配列に基づいている、コウキクサＦｕｃＴ及びＸｙｌＴの二重遺伝子ＲＮＡｉノックアウトを設計する１つの戦略を示す図である。
【図３５】新鮮に単離されたヒトＮＫ細胞上でのＦｃγＲIIIａに対する、ＣＨＯ由来及びＳＰ２／０由来ｍＡｂＩ産物の受容体結合活性を示す図である。
【図３６】供与者１から収集された、新鮮に単離されたヒトＮＫ細胞上でのＦｃγＲIIIａに対する、野生型レムナ由来ｍＡｂＩ産物及びトランスジェニックレムナ由来ｍＡｂＩ産物の受容体結合活性を示す図である。
【図３７】供与者２及び３から収集された、新鮮に単離されたヒトＮＫ細胞上でのＦｃγＲIIIａに対する、野生型レムナ由来ｍＡｂＩ産物及びトランスジェニックレムナ由来ｍＡｂＩ産物の受容体結合活性を示す図である。
【図３８】マウスＦｃγＲIVに対するＳｐ２／０由来ｍＡｂＩ産物、野生型レムナ由来ｍＡｂＩ産物、及びトランスジェニックレムナ由来ｍＡｂＩ産物の受容体結合活性を示す図である。
【図３９】レムナ中でのＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ活性のＲＮＡｉ発現抑制用のＭＤＸＡ０４バイナリー発現ベクターの図である。斜線の領域は、完全にヒトのｍＡｂ１カッパ抗体ＭＤＸ−０６０の重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖可変領域遺伝子配列の部分、並びにＦｕｃＴ及びＸｙｌＴをコードする内因性レムナ遺伝子の発現抑制を標的とするように設計されたキメラヘアピンＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を示す。プロモーター：Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３；転写停止配列：Ｔ；選択マーカー：ＳＭ；左境界：ＬＢ；右境界、ＲＢ。野生型レムナ中でＭＤＸ−０６０ｍＡｂを発現させるのに使用したＭＤＸＡ０１発現ベクターは、ヘアピンＲＮＡ領域を含有しなかった。
【図４０】レムナ野生型及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔＲＮＡｉ系統におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す図である。野生型（ＷＴ）及びＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔＲＮＡｉ（系統番号が示されている）植物由来のミクロソーム膜を、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＵＤＰ−Ｘｙｌ及びＧｎＧｎ−ダブシル−ペプチドアクセプターを含有する反応緩衝液の存在下でインキュベートした。各系統に由来するミクロソームによって合成されたフコシル化（白い棒）又はキシロシル化（黒い棒）産物と対応する質量ピークは、陽性リフレクトロンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって測定し、ＷＴ陽性対照に対してパーセントで標準化する。煮沸野生型膜（ＢＷＴ）はバックグラウンドのイオンカウント数を示す。
【図４１Ａ】それぞれ非還元（図４１Ａ）及び還元条件（図４１Ｂ）下での、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ由来の植物抽出物、プロテインＡ又はヒドロキシアパタイト精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＣＨＯ細胞系統から精製したｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ）を陽性対照として使用した。Mark12分子量マーカーをゲル上に含めた。ゲルをコロイドブルー染色で染色した。
【図４１Ｂ】それぞれ非還元（図４１Ａ）及び還元条件（図４１Ｂ）下での、ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ由来の植物抽出物、プロテインＡ又はヒドロキシアパタイト精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＣＨＯ細胞系統から精製したｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ）を陽性対照として使用した。Mark12分子量マーカーをゲル上に含めた。ゲルをコロイドブルー染色で染色した。
【図４２】ＣＨＯ中で発現したＭＤＸ−０６０ｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ）、野生型レムナ中で発現したＭＤＸ−０６０ｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ）、又はＸｙｌＴ／ＦｕｃＴ  ＲＮＡｉ構築物で形質転換したレムナ中で発現したＭＤＸ−０６０ｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ）から遊離した２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンの陰性リフレクトロンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析から得られたスペクトルを示す図である。有意なピークは、対応する質量（［Ｍ−Ｈ］−）によって特定される。＊は、マトリックスのアーチファクトの位置を示す。
【図４３】ＣＨＯ中で発現したＭＤＸ−０６０ｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ）、野生型レムナ中で発現したＭＤＸ−０６０ｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ）、又はＸｙｌＴ／ＦｕｃＴ  ＲＮＡｉ構築物で形質転換したレムナ中で発現したＭＤＸ−０６０ｍＡｂ（ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ）から遊離した２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンのＮＰ−ＨＰＬＣ−ＱＴＯＦ  ＭＳ分析から得られたスペクトルを示す図である。２−ＡＡ標識Ｎ−グリカンを順相クロマトグラフィーにより分離し、蛍光により検出した。各試料の最も量が多いピーク（ａ〜ｉと表示）をオンライン陰性モードＱＴＯＦ  ＭＳにより特徴付け、その対応するＱＴＯＦ質量スペクトル（［Ｍ−２Ｈ］２−）を示す。
【図４４】ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ、ＬＥＸ、又は糖鎖最適化ＬＥＸＯｐｔｍＡｂとＬ５４０細胞上で発現したＣＤ３０との結合のフローサイトメトリー分析によって測定されるＭＤＸ−０６０ｍＡｂのインビトロ活性を示す図である。本明細書の上記の実施例６で概略を述べたように、濃度を増大していく示した抗体とともにＬ５４０細胞をインキュベートした。様々な濃度の使用したｍＡｂに対して幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ，Geo Mean Fluorescence Intensity）をプロットしている。■：ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ；▲：ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ；▼：ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ。
【図４５】糖鎖最適化及び野生型ｍＡｂと２つの異なるヒトＦｃＲγIIIａアロタイプ（Ｖａｌ１５８又はＰｈｅ１５８）の平衡結合を示す図である。ＦｃＲγIIIａの関数としての結合シグナルを一部位結合モデルに適合させた。■：ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ；▲：ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ；▼：ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ。
【図４６】ＣＨＯ、ＬＥＸ（野生型のレムナグリコシル化）又はＬＥＸＯｐｔ（ＲＮＡｉトランスジェニックレムナ）に由来するＭＤＸ−０６０ｍＡｂのＡＤＣＣ活性を示す図である。濃度を増大していく示した抗体の存在下で、ＦｃγＲIIIａＰｈｅ１５８ホモ接合供与者及びＦｃＲγIIIａＰｈｅ／Ｖａｌ１５８ヘテロ接合供与者由来のヒトエフェクター細胞を、ＢＡＴＤＡ標識Ｌ５４０細胞とともに、エフェクター：標的の比を５０：１にしてインキュベートした。各ｍＡｂ濃度でのパーセント比溶解をプロットしている。Ｌ５４０細胞上の抗原を認識しないヒトｍＡｂ１を、すべての実験においてアイソタイプ対照として使用した。GraphPad Prism 3.0ソフトウェアを使用して、ＥＣ５０値（μｇ／ｍＬ）、結合定数及び最大パーセント溶解を計算した。■：ＭＤＸ−０６０  ＣＨＯ；▲：ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸ；▼：ＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔ。
【図４７】ＭＤＸＡ０１構築物を含む野生型コウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂ組成物の完全な質量分析を示す図である。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されないとき、組換えにより産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂ組成物は少なくとも７つの異なるグライコフォームを含み、Ｇ０ＸＦ３グライコフォームが、存在する優勢な種である。Ｇ０グライコフォームを表すピークが存在しないことに留意されたい。
【図４８】ＭＤＸＡ０１構築物を含む野生型コウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸｍＡｂの重鎖のグリカン質量分析を示す図である。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されないとき、存在する優勢なＮ−グリカン種はＧ０ＸＦ３であり、さらなる主要なピークがＧ０Ｘ種を反映している。Ｇ０グリカン種がわずかに存在することに留意されたい。
【図４９】ＭＤＸＡ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂ組成物の完全な質量分析を示す図である。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、完全なｍＡｂ組成物はＧ０Ｎ−グリカンしか含有しない。さらに、組成物はＧ０グライコフォーム（ピーク２）について実質的に同種であり、どちらのグリコシル化部位もＧ０Ｎ−グリカン種によって占有され、２つの小さなピークが微量の前駆グライコフォームを反映している（ピーク１は、一方の重鎖のＣＨ２ドメインが、Ａｓｎ２９７と結合したＧ０グリカン種を有し、他方の重鎖のＣＨ２ドメインがグリコシル化されていないＦｃ領域を有するｍＡｂを示し、ピーク３は、各ＣＨ２ドメイン上のＡｓｎ２９７グリコシル化部位がＧ０グリカン種と結合し、第３のＧ０グリカン種がｍＡｂ構造内のさらなるグリコシル化部位と結合したＦｃ領域を有するｍＡｂを示す）。
【図５０】ＭＤＸＡ０４構築物を含むトランスジェニックコウキクサ中で産生されたＭＤＸ−０６０  ＬＥＸＯｐｔｍＡｂの重鎖のグリカン質量分析を示す図である。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ発現がコウキクサ中で抑制されるとき、重鎖のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７グリコシル化部位と結合した、容易に検出可能な唯一のＮ−グリカン種はＧ０である。
【図５１Ａ】ｍＡｂＩ０４ＲＮＡｉ構築物を含むトランスジェニックコウキクサ（系統２４）中で産生されたｍＡｂＩにより示される同種のグリコシル化プロファイルが、生産をスケールアップしても一貫して観察されたことを示すＭＡＬＤＩ分析（図５１Ａ）及びＨＰＬＣ分析（図５１Ｂ）の図である。このグリコシル化プロファイルは、クローン増殖により８カ月の期間を超えてトランスジェニック系統を連続的に維持しても一貫していた。
【図５１Ｂ】ｍＡｂＩ０４ＲＮＡｉ構築物を含むトランスジェニックコウキクサ（系統２４）中で産生されたｍＡｂＩにより示される同種のグリコシル化プロファイルが、生産をスケールアップしても一貫して観察されたことを示すＭＡＬＤＩ分析（図５１Ａ）及びＨＰＬＣ分析（図５１Ｂ）の図である。このグリコシル化プロファイルは、クローン増殖により８カ月の期間を超えてトランスジェニック系統を連続的に維持しても一貫していた。
【図５２】図１２のキメラＲＮＡｉ  ｍＡｂＩ０４構築物を使用してＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ発現を抑制した結果、組換え糖タンパク質で観察されたものと一貫性のある同種のグリコシル化パターンを有する内因性糖タンパク質が生じることを示す図である。この図では、トリマンノースコア構造と結合したβ１，２−結合キシロース残基を星形の記号で示す。
【図５３】上記の実施例６で記載した複合Ｎ−グリカンの構造を示す図である。Ｍ＝マンノース；Ｇｎ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ａ＝ガラクトース；Ｘ＝キシロース；Ｆ＝フコース。
【図１】
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【図２Ａ】
2009523432.tif 000008
【図２Ｂ】
2009523432.tif 000009
【図２Ｃ】
2009523432.tif 000010
【図３】
2009523432.tif 000011
【図４Ａ】
2009523432.tif 000012
【図４Ｂ】
2009523432.tif 000013
【図４Ｃ】
2009523432.tif 000014
【図４Ｄ】
2009523432.tif 000015
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2009523432.tif 000019
【図９】
2009523432.tif 000020
【図１０】
2009523432.tif 000021
【図１１】
2009523432.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2009523432.tif 000038
【図２８】
2009523432.tif 000039
【図２９Ａ】
2009523432.tif 000040
【図２９Ｂ】
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【図３０】
2009523432.tif 000042
【図３１】
2009523432.tif 000043
【図３２】
2009523432.tif 000044
【図３３】
2009523432.tif 000045
【図３４】
2009523432.tif 000046
【図３５】
2009523432.tif 000047
【図３６】
2009523432.tif 000048
【図３７】
2009523432.tif 000049
【図３８】
2009523432.tif 000050
【図３９】
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【図４０】
2009523432.tif 000052
【図４１Ａ】
2009523432.tif 000053
【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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