(57)【要約】  急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護は、抗‐インフルエンザワクチンと一緒にアジュバントまたは免疫‐刺激因子としての、ｄｓＲＮＡを使用することによって促進される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護を促進する方法であって、免疫性‐誘発量の抗ウイルスワクチンとアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡを一緒に、保護を必要としている対象に調和よく組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項２】
抗ウイルスワクチンがアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡと組み合わせて投与される、急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護を促進する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護を促進する方法であって、免疫性‐誘発量の抗ウイルスワクチンとアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡを混合して一緒に、保護を必要としている対象に実質的に同時に、または連続して投与することを含む、方法。
【請求項４】
ウイルス粒子構造の突然変異による変化または分子再配列により明らかな抗原性連続変異または不連続変異に付随するウイルス‐誘発病変からトリインフルエンザウイルスに感受性のある動物または動物細胞を保護する方法であって、抗トリインフルエンザワクチンへの暴露前、暴露中、または暴露後に、動物または動物細胞をミスマッチｄｓＲＮＡに暴露することを含む、方法。
【請求項５】
急性または慢性トリインフルエンザ感染に対するワクチン保護を促進する方法であって、免疫性‐誘発量のトリインフルエンザ以外の抗ウイルスワクチンとアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡを一緒に、保護を必要としている対象に調和よく組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の急性または慢性トリインフルエンザ感染に対するワクチン保護を促進する方法であって、免疫性‐誘発量のトリインフルエンザ以外の抗ウイルスワクチンをアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡと組み合わせて、または混合して、保護を必要としている対象に投与することを含む、方法。
【請求項７】
トリインフルエンザウイルスに感受性のある動物または動物細胞を保護する方法であって、抗トリインフルエンザワクチン以外のインフルエンザワクチンへの暴露前、暴露中、または暴露後に、該動物または動物細胞をミスマッチｄｓＲＮＡに暴露することを含む、方法。
【請求項８】
インフルエンザワクチンが標準季節性三価インフルエンザワクチンを含む、請求項１および２に記載の方法。
【請求項９】
ｄｓＲＮＡが付加的にＲＮＡ‐安定化ポリマーと複合体を形成する、請求項１、２、３、５、６および７に記載の方法。
【請求項１０】
安定化ポリマーがリシンまたはセルロースである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔0001〕急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護は、抗インフルエンザワクチンと一緒にアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡを使用することによって促進される。
【背景技術】
【０００２】
〔0002〕アジュバントは、ヒトを含む動物を保護するための免疫化においてワクチンを促進するために使用されてきた。効率がよく、効果的なアジュバントを確認することはしばしば困難な仕事である。
【０００３】
〔0003〕インフルエンザウイルスに対する保護のためのワクチンはとりわけ関心が持たれ、ベトナムおよび香港株を含むトリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１（ｂｉｒｄ  ｆｌｕ）が現在関心の的である。インフルエンザウイルスに対する不活性化ワクチンは血清抗体を誘導するために非経口的に、そしてまた、インフルエンザウイルスに対する粘膜免疫性を提供するために鼻粘膜に投与されてきた。
【０００４】
〔0004〕アラム（ａｌｕｍ）、スクワレンエマルション（ＭＦ５９，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、およびフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ  ａｄｊｕａｎｔ）のような、いくつかのアジュバントが公知である。最近、合成ｄｓＲＮＡポリリボイノシン  ポリリボシトルジル酸またはポリ（Ｉ：Ｃ）が不活性化インフルエンザウイルスワクチンにとってのアジュバントまたは免疫刺激因子として提案されている；Ｉｃｈｉｎｏｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ  ２００５，ｐ．２９１０−２９１９を参照されたい。
【発明の開示】
【０００５】
〔0005〕免疫性‐誘発量の抗ウイルスワクチンとアジュバントとしてのｄｓＲＮＡを一緒に、保護を必要としている対象に調和よく組み合わせて投与することを含む、急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護を促進する方法が開示される。また、免疫性‐誘発量の抗インフルエンザワクチンをアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡと組み合わせて保護を必要としている対象に投与することを含む、急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護を促進する方法が開示される。
【０００６】
〔0006〕本発明は、免疫性‐誘発量の抗ウイルスワクチンとアジュバントまたは免疫‐刺激因子としてのｄｓＲＮＡを混合して一緒に、保護を必要としている対象に、実質的に同時に、または連続して投与することを含む、急性または慢性ウイルス感染に対するワクチン保護を促進する方法を含む。
【０００７】
〔0007〕本発明はまた、（ウイルス粒子構造の再配列により明らかな）抗原性連続変異および不連続変異の両方、ならびにゲノム再配列に付随するウイルス‐誘発病変から、トリインフルエンザ感染に感受性のある、ヒトを含む動物を保護する方法を含む。
【０００８】
〔0008〕本発明は、さらに、合成し、特に設計された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）をワクチンと一緒に、または連帯して、患者に調和よく組み合わせて投与することによる、インフルエンザウイルスに対する免疫化を高める方法を含む。好ましいｄｓＲＮＡはＡｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）であり、これは、ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘＢＩＯＰＨＡＲＭＡ，１６１７  ＪＦＫ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ＵＳＡから入手可能な、合成の、特別に設計された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、他の二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）の免疫刺激および抗ウイルス特性を保持するが、非常に低下した毒性を提示する。他のｄｓＲＮＡと同様に、Ａｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）は、自然免疫を含む、宿主防御機構を刺激することができる。Ａｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）は、２′，５′‐オリゴアデニレートシンセターゼ／ＲＮアーゼＬおよびタンパク質キナーゼ経路を含む、多様なｄｓＲＮＡ‐依存的細胞内抗ウイルス防御機構を刺激する能力を有する。
【０００９】
〔0009〕本発明の文脈では、“調和よく組み合わせた（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）”使用によって意味することは、独立して、（ｉ）一緒の投与、すなわちワクチンとｄｓＲＮＡの実質的に同時の投与、または連続した投与、または（ｉｉ）ワクチンおよびｄｓＲＮＡを、付加的な薬剤的に受容できる賦形剤および／またはベヒクルに加えて、組み合わせて配合した一つの組成物の投与、のいずれかである。
【００１０】
〔0010〕ミスマッチｄｓＲＮＡは一般式ｒＩｎ・ｒ（Ｃ１２Ｕ）ｎからなるものであってもよい。この式および以後の他の式において、ｒ＝リボである。本発明における使用のための他のミスマッチｄｓＲＮＡは、ｍが４〜２９までの値を有する整数であるポリ（Ｃｍ、Ｕ）およびポリ（ＣｍＧ）から選択されるヌクレオチド共重合体（copolynucleotide）を基本とし、そして、ポリリボイノシン酸およびポリリボシチジル酸からなる複合体のミスマッチ類似体であり、それらはｒＩｎ・ｒＣｎを改変し、ポリリボシチジレート（ｒＣｍ）鎖に沿って非対合塩基（ウラシルまたはグアニン）を組み込むことにより形成される。あるいは、ｄｓＲＮＡはポリリボイノシン酸（ｒＩｎ）のリボシル骨格を改変することにより、たとえば２′‐Ｏ‐メチルリボシル残基を含むことにより、ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ）ｄｓＲＮＡから得てもよい。ミスマッチはリシンセルロースのようなＲＮＡ‐安定化ポリマーと複合体を形成してもよい。これらのｒＩｎ・ｒＣｎのミスマッチ類似体のなかで好ましいものは、一般式ｒＩｎ・ｒ（Ｃ１１〜１４、Ｕ）ｎ、またはｒＩｎ・ｒ（Ｃ２９、Ｇ）ｎからなるものであり、Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｔｓ‘ｏにより米国特許第４，１３０，６４１号および４，０２４，２２２号に記載され、その開示は参照として本明細書に援用される。そのなかに記載されたｄｓＲＮＡは本発明に従った使用に適切である。
【００１１】
〔0011〕本発明における使用のためのミスマッチｄｓＲＮＡの他の例は以下のものを含む：
ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ４、Ｕ）
ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ７、Ｕ）
ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ１３、Ｕ）
ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ２２、Ｕ）
ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ２０、Ｇ）および
ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃｐ・２３、Ｇ＞ｐ）
〔0012〕あるいは、ｄｓＲＮＡはマッチした型であってもよく、それゆえポリウリジル酸と複合体を形成したポリアデニル酸（ポリＡ・ポリＵ）が同じように使用されてもよい。
【００１２】
〔0013〕本発明の別の側面は、適切なワクチンとｄｓＲＮＡの相乗的組み合わせを使用することによる、現在または将来利用可能なワクチン予防療法に感受性のある急性および慢性ウイルス感染の治療であり、そのような感染には、たとえばＨＩＶ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）およびトリインフルエンザを含むインフルエンザが挙げられる。
【００１３】
〔0014〕本発明は後述の実施例および図面においてさらに説明され、例証される。
〔0021〕図面において使用される用語は以下の通りである：
【００１４】
【表１】
2009518410.tif 000002
【実施例１】
【００１５】
〔0033〕トリインフルエンザ株間の相互保護
〔0034〕この研究はＩｃｈｉｎｏｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ，２００５，２９１０〜２９１９ページの方法でマウスにおいて行われ、今回は２種の異なるトリインフルエンザウイルス株、ベトナムおよび香港、ならびにワクチンと組み合わせて、または単独で、先に記載のｄｓＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｇｅｎを使用した。結果は図１および２に示す。
【００１６】
〔0035〕鼻腔洗浄液で検出された抗体に由来する初めのパネルでは、鼻腔内投与された場合、（Ａ／ＶＮ）ワクチンだけの使用は抗体産生に正の結果を提供したが、Ａｍｐｌｉｇｅｎと共に投与された場合、ワクチンだけを使用した結果に比べ、２倍以上の高い結果を生じた。Ａｍｐｌｉｇｅｎだけを使用した場合、ＩｇＡ抗体は検出されなかった。皮下経路は鼻粘膜にＩｇＡ抗体を全く生じなかった。
【００１７】
〔0036〕これに比べて、鼻腔内投与後の血清中では限定された数のＩｇＧ抗体しか産生されなかったが、皮下投与に由来する血清中では著しく多い量が得られた。しかも、ワクチンプラスＡｍｐｌｉｇｅｎの組み合わせはワクチンだけよりもより顕著な結果を生じた。
【００１８】
〔0037〕次に動物はトリインフルエンザベトナム株へのチャレンジに供され、意義深いことには、チャレンジを受け、鼻腔内経路によって投与されたワクチンとＡｍｐｌｉｇｅｎの組み合わせを与えられた動物の鼻腔洗浄液中にはウイルスが全く検出されなかったが、鼻腔内投与によるワクチンだけ、Ａｍｐｌｉｇｅｎだけ、および皮下投与されたワクチンとＡｍｐｌｉｇｅｎの組み合わせを使用することにより種々の量のウイルスが検出された。
【００１９】
〔0038〕鼻粘膜および他の粘膜は侵入／感染の典型的な場所であり、顕著な予防または軽減のための利点を提供すると考えられているため、そのような場所でトリインフルエンザウイルスに対する抗体を産生することが望ましい。
【実施例２】
【００２０】
〔0039〕季節性インフルエンザワクチンとＨ５Ｎ１間の交差保護
〔0040〕実施例１に類似した第２セットの研究を終え、今回は初めにＡｍｐｌｉｇｅｎと組み合わせた不活性化トリインフルエンザウイルスワクチンベトナム株、またはＡｍｐｌｉｇｅｎだけ、またはワクチンだけを使用し、その後異なるトリインフルエンザウイルス香港株でチャレンジした。結果は図２に示す。抗‐Ａ／ＶＮ‐ＩｇＡおよび抗‐Ａ／ＶＮ  ＩｇＧという名称の初めの２つのパネルはチャレンジ前であり、３番目のパネルは香港株によるチャレンジ後であった。結局、チャレンジ後の鼻腔洗浄液のウイルス力価に有益な結果が認められ、最も良い結果は、ベトナム株ワクチンとＡｍｐｌｉｇｅｎの組み合わせを使用し、その後香港株のウイルスでチャレンジすることによって得られた。
【００２１】
〔0041〕これらの結果は、ベトナム株ワクチンで処置され、さらにＡｍｐｌｉｇｅｎを与えられた患者がその後香港株ウイルスでチャレンジされた場合有効性が継続することを示唆し、このことから、ウイルス株を入れ換え、香港ウイルスを使用してワクチンを産生し、その後ベトナム株でチャレンジする場合に類似の結果が発生することが予想される。
【実施例３】
【００２２】
〔0042〕ウイルス抗原節約および増強
〔0043〕この実施例では、実施例２で使用されたものと類似の動物におけるトリインフルエンザ、ベトナム株の投与に関して、ポリ（Ｉ：Ｃ）の影響がどのくらいであるかを確認するために研究が行われた。結果は図６に提示する。対照としての無Ａ／ＶＮ、および無ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む、種々の投与量のトリインフルエンザワクチン（Ａ／ＶＮ）を用い、そして異なった量のポリ（Ｉ：Ｃ）を使用した。１μｇのトリインフルエンザワクチンおよび無ポリ（Ｉ：Ｃ）と、０．１μｇのトリインフルエンザワクチンおよび１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）間の比較がとりわけ興味深い。棒グラフの初めのパネルでは、鼻腔内投与された場合、０．１μｇのＡ／ＶＮと１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）の組み合わせによって、単独で使用した１０倍量のトリインフルエンザワクチンに比較して、より多くの抗体が産生されたことが認められることになる。生存率という表題の最後のパネルはとりわけ重要であり、そこでは、１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）と組み合わせた１／１０のトリインフルエンザワクチンと１０μｇのＡ／ＶＮだけ（無ポリ（Ｉ：Ｃ））の使用は、百分率に基づくと、生存率は数字上同じであった。さらに、トリインフルエンザワクチンが単独で使用された場合の測定可能な値と比較すると、０．１μｇのＡ／ＶＮと１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）の組み合わせにとっての鼻腔洗浄液中のＡ／ＶＮウイルス力価はむしろ測定不能であることに注目されたい。これらのデータから、アジュバントとしてのポリ（Ｉ：Ｃ）の使用が、かなり大きい生存率を達成するために必要なトリインフルエンザワクチンの量を（この実施例において）１／１０に減らしうると結論してもよい。
【００２３】
〔0044〕Ａｍｐｌｉｇｅｎの存在はトリインフルエンザウイルス変異株に対する交差保護能力を有し、それによってトリインフルエンザウイルスの抗原連続変異を軽減するように見える。
【００２４】
〔0045〕抗原連続変異は、ウイルス粒子のゲノム内容における基本的変化に起因する、内部および外部タンパク質、糖タンパク質、糖脂質などのような、ウイルス構造における変化である。ｄｓＲＮＡは、ウイルス回避の現象およびそれに付随した細胞傷害を低下させる。ウイルス回避は、ウイルスまたは細胞内病原体がその宿主範囲を変更するか、間接的に抗ウイルスまたは免疫学的療法への感受性を変更するプロセスである。
【００２５】
〔0046〕本発明は抗原連続変異および不連続変異の両方（ウイルスゲノム材料の突然変異または再配列により生じる）にとって二次的なウイルス‐誘発病変に対して、トリインフルエンザ感染に感受性のあるヒトを含む動物を交差保護する方法を含む。
【００２６】
〔0047〕図３では、７群のマウス、１群につき５匹のマウスが選択された。これらの中の４群は鼻腔内投与または皮下投与のいずれかにより２００５／２００６三価インフルエンザワクチンに暴露された。２１日以内に鼻腔内接種が反復され、１４日以内に、鼻腔内接種を再び終え、全体で１回の初期接種と２回のブースターを行った。
【００２７】
〔0048〕２回目のブースター後２週間目に、マウスはトリインフルエンザＶＮ１１９４（Ｈ５Ｎ１）株によるチャレンジに供され、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗‐Ａ／ＶＮの存在および量、ならびに血清中のＩｇＧ抗体を評価された。結果は、Ａｍｐｌｉｇｅｎの存在下および鼻腔内経路による投与によってだけ、トリインフルエンザベトナム（ＶＮ１１９４）株に対してＡ／ＶＮ  ＩｇＡ抗体が産生されたことを示唆する。ＩｇＧ抗体は鼻腔内投与によりＶＮ１１９４株に対して血清中で産生されたが、ＳＣ投与経路を使用することによって、Ａｍｐｌｉｇｅｎの存在下、または非存在下でも血清抗体が産生された。次にトリインフルエンザウイルスに対するウイルス力価は、鼻腔洗浄液におけるトリインフルエンザＶＮ１１９４（Ｈ５Ｎ１）ウイルスチャレンジ後に評価された。三価季節性ワクチンおよびＡｍｐｌｉｇｅｎアジュバントの両方を与えられたサブセットの場合、ウイルスは効果的に無力化されたが、他の群は測定可能なＡ／ＶＮウイルス量を示した。
【００２８】
〔0049〕図４は、１８日間にわたる評価から、ＶＮ１１９４によるチャレンジを生き延びた唯一の動物群は、０５／０６三価ワクチンプラスＡｍｐｌｉｇｅｎの両方を鼻腔内に与えられた群であったことを示す。血清中に抗体は存在したが、それらはＶＮ１１９４によるチャレンジに対して効果的な保護を全く提供しなかった。しかし、鼻粘膜に存在する抗体は、測定した期間にわたり効果的に感染および死亡を妨げた。この研究において、これらの発見はワクチンアジュバントとしてのＡｍｐｌｉｇｅｎと一緒に鼻腔内投与された三価季節性ワクチンの使用によるトリインフルエンザＨ５Ｎ１株に対する保護を証明するため、意義深い。
【００２９】
〔0050〕図５は、再び０５／０６三価ワクチン、Ａｍｐｌｉｇｅｎの量（ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ａｍｏｕｎｔｓ）および投与経路を示すが、鼻粘膜または血清中のいずれかで測定された季節性三価ワクチンに対して誘発されることになる抗体を測定した直接交差評価を示す。結果は、季節性ワクチンに対する抗体は鼻腔内経路によって投与された三価０５／０６季節性ワクチンとＡｍｐｌｉｇｅｎの両方を与えられた動物だけの鼻粘膜に存在したことを示す。血清中の０５／０６三価ワクチンに対する抗体の検出に関しては、すべての群がある程度上昇した“基線”レベルを有したが、Ａｍｐｌｉｇｅｎと一緒にワクチンが使用された２つの場合に顕著な増加が見られた。
【００３０】
〔0051〕我々の研究はまた、血清中の抗体の存在はトリインフルエンザに対する保護の正確な指標を必ずしも提供せず、いっそう信頼できる指標は鼻粘膜で産生された抗体であることを証明する。
【００３１】
【表２】
2009518410.tif 000003
【００３２】
〔0052〕トリインフルエンザ同時投与研究は霊長類モデルに拡大し、それらの場合、ワクチン接種プラス同時投与したＡｍｐｌｉｇｅｎは十分に耐えられ、有効であった。この研究では、マカク（ｍａｃａｑｕｅ）は、３および２週間離して、３回のＡ／ＶＮプラスＡｍｐｌｉｇｅｎ（Ａ／ベトナム（Ｈ５Ｎ１）９０μｇ／５００ｍｌ、Ａｍｐｌｉｇｅｎ５００μｇ）の投与量のワクチンを接種した。すなわち、初回投与、３週間後に２回目の投与、そして２週間後に３回目の投与を行う。次に、サルは３回目の投与後２週間目に高投与量のＡ／ＶＮ（Ａ／ベトナム（Ｈ５Ｎ１）２．５ｘ１０５ｐｆｕ／２．５ｍｌ（肺）およびＡ／ベトナム（Ｈ５Ｎ１）０．５ｘ１０５ｐｆｕ／０．５ｍｌ（鼻腔内））を気管内および鼻腔内にチャレンジされた。感染した対照動物は速呼吸、咳、体重減少、および局所性浸潤影のある肺炎を発生した。ワクチン接種した動物は症状が無く、疾患から保護され、肺組織は正常に見えた。
【００３３】
〔0053〕本発明は現在最も実用的で、好ましい態様であると考えられるものに関して記載されているが、本発明は開示された態様に限定されるべきではなく、それどころか、添付された特許請求の範囲の意図および範囲内に含まれる、種々の改変および等価な機構を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】〔0015〕実施例１の結果を示す表である。
【図２】〔0016〕実施例２の結果を示す表である。
【図３】〔0017〕三価インフルエンザワクチンを使用した、実施例３の結果を示す表である。
【図４】〔0018〕三価ワクチンプラス鼻腔内投与したＡｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）を使用した、実施例３の結果を示す表である。
【図５】〔0019〕三価季節性インフルエンザワクチンと鼻腔内投与したＡｍｐｌｉｇｅｎ（登録商標）の、実施例３に従った直接クロスアセスメントを示す表である。
【図６】〔0020〕実施例３の結果を示す表である。
【図１】
2009518410.tif 000004
【図２】
2009518410.tif 000005
【図３】
2009518410.tif 000006
【図４】
2009518410.tif 000007
【図５】
2009518410.tif 000008
【図６】
2009518410.tif 000009
【国際調査報告】
2009518410.tif 000010