(57)【要約】本発明は、１以上の免疫共刺激ポリペプチドで細胞表面、例えば、腫瘍細胞表面をin vivoで操作するための方法および組成物を提供する。本方法、組成物および操作された細胞は、例えば、該細胞に対する免疫応答を刺激するのに有用である。操作される細胞表面が腫瘍細胞表面であるとき、本方法、組成物および操作された細胞は、癌に対する患者の免疫応答を改善する上で、および、腫瘍サイズを縮小し、腫瘍増殖を阻害する上で有用である。
2009518427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞の表面を操作する方法であって、該細胞を含む個体に、
ａ）結合対の第１メンバーと細胞の表面に結合する分子とを含む二官能性分子；
ｂ）第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分；および随意に、
ｃ）第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第２免疫共刺激部分
を投与することを含み、
その際、第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドは、結合対の第１メンバーと結合対の第２メンバーとの間の結合を介して細胞表面に提示され、
第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記方法。
【請求項２】
細胞表面が腫瘍細胞表面である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結合対の第１メンバーを含む二官能性分子を腫瘍内注射により投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１および随意の第２免疫共刺激部分の少なくとも１つを腫瘍内注射により投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
随意の第２免疫共刺激部分を投与し、第１および第２免疫共刺激部分を実質的に同時に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
随意の第２免疫共刺激部分を投与し、第１および第２免疫共刺激部分を異なる日に逐次投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
初めに第１または第２免疫共刺激部分を提示する細胞の少なくとも約５％が、注射から約２日後に第１または第２免疫共刺激部分を引き続き提示する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
結合対の第１メンバーがビオチンを含み、結合対の第２メンバーがコアストレプトアビジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
随意の第２免疫共刺激部分を投与し、第１および第２免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第３免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む、第３免疫共刺激部分を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１、第２および第３免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも２つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
第１、第２および第３免疫共刺激ポリペプチドが、LIGHT、CD80、および4-1BBLである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
第１、第２および第３免疫共刺激部分の少なくとも１つは、第１、第２および第３免疫共刺激部分の他の少なくとも１つとは異なる経路により投与する、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
第１、第２および第３免疫共刺激部分の各々を同じ経路により投与する、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
第１、第２および第３免疫共刺激部分を単一組成物の成分として投与する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含む第１融合タンパク質、および
第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の同じメンバーとを含む第２融合タンパク質を含み、
その際、上記免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、組成物。
【請求項１７】
第１および第２免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
結合対のメンバーがコアストレプトアビジンを含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１９】
融合タンパク質の少なくとも１つが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列を含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項２０】
LIGHTと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質、CD80と結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質、および4-1BBLと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項２１】
結合対の前記メンバーがコアストレプトアビジンを含む、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含む第１融合タンパク質を含む第１組成物、および
第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の同じメンバーとを含む第２融合タンパク質を含む第２組成物を含み、
その際、免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、組合せ。
【請求項２３】
第１および第２免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項19に記載の組合せ。
【請求項２４】
結合対の前記メンバーがストレプトアビジンを含む、請求項22に記載の組合せ。
【請求項２５】
融合タンパク質の少なくとも１つが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列を含む、請求項22に記載の組合せ。
【請求項２６】
LIGHTと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物、CD80と結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物、および4-1BBLと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物を含む、請求項22に記載の組合せ。
【請求項２７】
腫瘍のサイズを縮小するかまたは腫瘍増殖を阻害する方法であって、
ａ）結合対の第１メンバーと上記腫瘍の腫瘍細胞表面に結合する分子とを含む二官能性分子；
ｂ）第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分；および随意に、
ｃ）第２免疫共刺激ポリペプチドと前記結合対の第２メンバーとを含む第２免疫共刺激部分を、腫瘍を含む個体に投与することを含み、
その際、第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドは、前記結合対の第１メンバーと前記結合対の第２メンバーとの間の結合を介して腫瘍細胞表面に提示され、
第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記方法。
【請求項２８】
免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞の表面を操作する方法であって、
ａ）結合対の第１メンバーと細胞の表面に結合する分子とを含む二官能性分子；および
ｂ）免疫共刺激分子と前記結合対の第２メンバーとを含む免疫共刺激部分
に細胞表面を接触させることを含み、
その際、免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択され、
免疫共刺激ポリペプチドは、前記結合対の第１メンバーと前記結合対の第２メンバーとの間の結合を介して細胞表面に提示される、
上記方法。
【請求項２９】
in vitroで実施する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
in vivoで実施する、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
結合対の第１メンバーがビオチンを含み、結合対の第２メンバーがアビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
ストレプトアビジンがコアストレプトアビジンである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含むキメラタンパク質であって、免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記キメラタンパク質。
【請求項３４】
結合対のメンバーが、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項33に記載のキメラタンパク質。
【請求項３５】
ストレプトアビジンがコアストレプトアビジンである、請求項34記載のキメラタンパク質。
【請求項３６】
免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含むキメラタンパク質であって、免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記キメラタンパク質と、
薬学的に許容される担体
とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本願は、次の米国仮特許出願：60/748,177（出願日2005年12月8日）；60/771,179（出願日2006年２月６日）；60/799,643（出願日2006年５月12日）；および60/863,173（出願日2006年10月27日）の出願日の利益を請求する。尚、前記出願は各々、その全文を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、細胞に対する免疫応答を刺激する目的で、細胞表面に１以上の外来免疫刺激分子を提示させることにより、該細胞表面をin vivoで操作する方法に関する。また、このような操作を実施するための組成物も提供する。
【背景技術】
【０００３】
免疫欠損を特徴とする、あるいは、より攻撃的な免疫応答により消散が可能な疾患および症状に対処すべく、宿主の免疫応答を増強するためのアプローチが多数記載されている。このような疾患または症状の一例として、癌が挙げられる。腫瘍は、突然変異した、もしくは過剰／異常発現した自己タンパク質、または癌ウイルス由来のタンパク質のいずれかである腫瘍関連抗原を発現するため、免疫系によって標的化される。癌の発症は、Ｔ細胞が媒介する適応免疫の免疫監視役の欠損によって起こると考えられている。
【０００４】
一般に、外科手術、化学療法および放射線療法による癌治療法が用いられているが、これらのアプローチは、腫瘍特異性に欠け、有害な副作用を招き、しかも満足のゆく臨床応答に満たないと認められている。従って、正常な細胞に有意な有害作用を及ぼすことなく標的癌細胞に対して免疫応答を特異的に向けることによって癌に対する免疫応答を増強する方法は、従来の癌治療法を超える明らかな利点をもたらすであろう。
【０００５】
癌由来の抗原を含む癌ワクチンは、特異性、安全性、効能が見込まれ、しかも、癌の再発を予防しうる免疫系の長期記憶により、特に注目を集めている。しかし、このアプローチは、癌細胞が特定の抗原をそれ以上発現しなくなる、および／または腫瘍が免疫応答を抑制または寛容化できる場合には損なわれる場合がある。
【０００６】
腫瘍細胞は潜在的にあらゆる腫瘍関連抗原を発現することができ、従って、有効な治療のための多様な免疫応答を活性化することができるため、目的の免疫分子を発現させるための自己由来の腫瘍細胞の遺伝子操作に基づくワクチンは魅力的な癌治療法である。例えば、CD80を発現する遺伝子的に改変された腫瘍細胞は活発な抗腫瘍免疫応答を誘導し、高い治療効果を有することが報告されている。非特許文献1及び2、さらに非特許文献3及び4を参照されたい。遺伝子ワクチンは、腫瘍進行の過程で発達し得る様々な免疫回避機構、例えば、抗原シフトおよび免疫優性エピトープに対する寛容に感度が低いと考えられる。これまで提案されてきた自己由来腫瘍細胞を用いたワクチンは、一般に、腫瘍の除去手術、目的の免疫分子を発現させるための腫瘍のex vivo遺伝子操作、およびワクチン接種による患者への操作細胞の再導入を必要とする。このアプローチには複数の障害があり、そのようなものとして、ワクチンを調製するのに相当な腫瘍塊を必要とすること、一次腫瘍細胞の遺伝子操作に伴う困難性、ならびに遺伝子療法に基づくアプローチのためのワクチン調製には極めて長い時間（数週間から数ヶ月）がかかることなどが挙げられる。
【非特許文献１】Ramarathinamら、1994, J. Exp. Med., 179:1205-14
【非特許文献２】TownsendおよびAllison, Science, 259:368-70
【非特許文献３】Lane, 1997, Ann. N.Y. Acad. Sci., 815:392-400
【非特許文献４】Van Goolら、1996, Immunol. Rev., 153:47-83
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、概して、細胞表面、例えば、腫瘍細胞表面のin vivo操作を実施する方法、該in vivo操作（engineering）を実施するための組成物、ならびに操作された細胞表面に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態によれば、本発明は、免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞の表面を操作する方法を提供する。本方法は、（ａ）結合対の第１メンバーと細胞の表面に結合する分子とを含む二官能性分子、および（ｂ）免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分に、細胞表面を接触させることを含む。本方法によれば、結合対の第１および第２メンバー間の結合を介して、免疫共刺激ポリペプチドが細胞表面に提示される。一実施形態によれば、本方法はin vitroで実施する。別の実施形態によれば、本方法はin vivoで実施する。
【０００９】
一実施形態では、細胞表面は腫瘍細胞表面である。別の実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択する。
【００１０】
さらに別の実施形態では、結合対の第１メンバーはビオチンを含み、結合対の第２メンバーはアビジンまたはストレプトアビジン、例えば、コアストレプトアビジンを含む。一実施形態では、二官能性分子は、スルホ-NHS-LC-ビオチンを含む。
【００１１】
別の実施形態によれば、本発明は、免疫共刺激と、結合対のメンバー（例：アビジンまたはストレプトアビジン、例えば、コアストレプトアビジン）とを含むキメラタンパク質を提供する。一実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択する。本発明はまた、キメラタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
別の実施形態によれば、本発明は、１以上の免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞の表面を操作する方法を提供する。本方法は、（ａ）結合対の第１メンバーと細胞の表層に結合する分子とを含む二官能性分子；（ｂ）第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分；および随意に（ｃ）第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第２免疫共刺激部分を個体に投与することを含む。本方法によれば、結合対の第１および第２メンバー間の結合を介して、第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドが細胞表面上に提示される。
【００１３】
一実施形態では、細胞表面は腫瘍細胞表面である。別の実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択する。別の実施形態では、第１および第２免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、結合対の第１メンバーはビオチンを含み、結合対の第２メンバーはアビジンまたはストレプトアビジン、例えば、コアストレプトアビジンを含む。一実施形態では、二官能性分子は、スルホ-NHS-LC-ビオチンを含む。
【００１５】
一実施形態では、結合対の第１メンバーを腫瘍内注射により投与する。別の実施形態では、第１および第２免疫共刺激部分の少なくとも１つを腫瘍内注射により、または結合対の第１メンバーと同じまたは別の経路により投与する。
【００１６】
別の実施形態では、投与した第１または第２免疫共刺激部分に対し初めに陽性であった細胞の少なくとも約５％が注射から約２日後も陽性を維持する。
【００１７】
本発明の別の態様は、第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含む、第１融合タンパク質、および第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の同じメンバーとを含む、第２融合タンパク質、を含む組成物を提供する。一実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択する。別の実施形態では、第１および第２免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択する。
【００１８】
本発明の別の態様は、第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含む第１融合タンパク質を含む第１組成物、および第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の同じメンバーとを含む第２融合タンパク質を含む第２組成物、を含む組合せを提供する。一実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択する。別の実施形態では、第１および第２免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択する。
【００１９】
別の実施形態によれば、本発明は、腫瘍のサイズを縮小するかまたは腫瘍増殖を阻害する方法を提供し、該方法は、（ａ）結合対の第１メンバーと腫瘍の腫瘍細胞表面に結合する分子とを含む二官能性分子；（ｂ）第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分；および随意に（ｃ）第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第２免疫共刺激部分を個体に投与することを含む。この実施形態によれば、結合対の第１および第２メンバー間の結合を介して、第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドが腫瘍細胞表面上に提示される。
【００２０】
一実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択する。別の実施形態では、第１および第２免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択する。
【００２１】
一実施形態では、結合対の第１メンバーはビオチンを含み、結合対の第２メンバーはアビジンまたはストレプトアビジン、例えば、コアストレプトアビジンを含む。一実施形態では、二官能性分子は、スルホ-NHS-LC-ビオチンを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
詳細な説明
本発明は、１以上の免疫共刺激ポリペプチドで細胞表面（例えば、腫瘍細胞表面）をin vivoで操作するための方法および組成物を提供する。本方法、組成物および操作された細胞は、例えば、細胞に対する免疫応答を刺激する上で有用である。操作された細胞表面が、腫瘍細胞表面である場合、本方法、組成物および操作された細胞は、癌に対する患者の免疫応答を刺激するのに有用であり、これによって治療利益を提供する。従って、本発明は癌免疫治療方法をさらに提供し、このような方法には、腫瘍サイズを縮小する方法、および腫瘍細胞の増殖を阻害する方法などが含まれる。
【００２３】
特定の理論に束縛されるわけではないが、本明細書に記載するようにin vivoで操作された腫瘍細胞は、増強されたAPC機能を獲得すると考えられる。このアプローチにより、１以上の免疫共刺激ポリペプチドをＴ細胞に提示するように操作された腫瘍細胞による抗原の直接提示は、Ｔ細胞の活性化、分化、および腫瘍微小環境内でのエフェクター機能の獲得をもたらし、クラスＩ経路を介した外来抗原の有効でない提示や、腫瘍部位への抗原活性化Ｔ細胞のトラフィッキングなど、他のアプローチが直面する様々な制限を無効にすることができる。
【００２４】
２以上の免疫共刺激ポリペプチドを提示するin vivoで操作された腫瘍細胞の使用は、ナイーブおよびメモリーＴ細胞に腫瘍関連抗原の全アレイを提示し、これにより有効な治療のための多様な免疫応答を活性化するというさらなる利点（単一の腫瘍抗原ワクチンと比較して）を有する。このような多様な活性化により、上記腫瘍ワクチンは、免疫優性エピトープを提示する単一の腫瘍抗原ワクチンで起こりうるアネルギーまたはクローン欠失による寛容を解決することができる。
【００２５】
１以上、または２以上の免疫共刺激ポリペプチド、例えば、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILのうちの少なくとも１つ、またはCD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lの少なくとも２つ、を提示するように腫瘍をin vivoで操作することで、腫瘍細胞およびＴ細胞の表面での受容体−リガンド相互作用が増強される。これらの相互作用は、際限なく持続する必要はない。このように、本明細書に記載のように達成される腫瘍細胞表面での免疫共刺激ポリペプチドの一過性の提示が、腫瘍細胞に対する患者の免疫応答を増強し、有効な免疫療法を提供すると考えられる。
【００２６】
本発明において、以下の用語は下記のような定義を有する。
【００２７】
本明細書で用いる「１つの（aまたはan）」は、ただ１つを意味すると特に記載されない限り１以上を意味する。
【００２８】
本発明で用いる「投与」は、患者に物質を与える好適な手段の全てを包含する。一般的経路として、経口、舌下、経粘膜、経皮、直腸、膣、皮下、筋内、静脈内、動脈内、鞘内、カテーテル経由、インプラント経由などが挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物を腫瘍付近、もしくは腫瘍に直接投与するが、これは、例えば、腫瘍への直接注射、または、例えば、腫瘍が血液の腫瘍である場合には、血液への注射により実施する。
【００２９】
本明細書において使用される「抗原」は限定されない。抗原としては、免疫応答を誘導するタンパク質、脂質、糖、核酸、化学的部分、およびその他の部分が挙げられる。抗原には、例えば、環状化したまたは脂質に結合したタンパク質も含まれ、これらはグリコシル化またはメチル化等により改変されてもされなくてもよい。感染因子または疾患に関連する抗原には、感染因子の一部である抗原、例えば、エンベロープタンパク質、キャプシドタンパク質、表面タンパク質、毒素、細胞壁、抗原脂質などが含まれる。その他に、宿主の存在下でのみ発現し得る抗原もある。いくつかの実施形態では、他の好適な抗原として、宿主の抗原が含まれ、例えば、感染症または疾患のマーカーとして誘導、改変、もしくは過剰発現されるものが挙げられる。感染因子、感染症、症状または疾患に由来するかまたはこれらに関連する抗原はすべて本発明での使用に適している。また、全長タンパク質の抗原部分を含むペプチド、例えば、免疫原性エピトープのように、免疫応答を誘導するタンパク質の一部分を含むペプチドも、本発明の「抗原」としての使用に好適である。例えば、好適な抗原として、免疫応答を誘導する合成ペプチドなどが挙げられる。
【００３０】
「結合対」とは、様々な分子力（例えば、イオン、共有、疎水性、ファンデルワールス、および水素結合を含む）のいずれかにより互いに相互作用することにより、上記対が互いに特異的に結合する特性を有する２つの分子を意味する。特異的結合とは、結合対メンバーが、別の分子に結合しない条件下で互いに結合を呈示することを意味する。結合対の例としては、ビオチン−アビジン、ホルモン−受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、IgG−プロテインＡ、抗原−抗体などが挙げられる。
【００３１】
「細胞表面」は当分野における通常の意味で用いられ、従って、タンパク質およびその他の分子による結合に利用可能な細胞の外側を含む。
【００３２】
「操作（された）細胞表層」とは、免疫共刺激ポリペプチドのような外来分子を細胞表層に結合することにより操作された細胞表面を意味する。外来分子の細胞表面への結合は、共有結合、水素結合、受容体−リガンド相互作用、および抗体−抗原相互作用など、当分野で公知のあらゆる手段により実施することができる。
【００３３】
「改変（された）細胞表面」とは、外来分子が結合した細胞表面を意味する。
【００３４】
本明細書で用いる「患者」とは、あらゆる脊椎動物を包含し、例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、トリ、イヌ、ネコおよび霊長類などの種が挙げられる。一実施形態では、患者はヒトである。当業者であれば、特定の種に関して述べる特定の免疫共刺激分子、シグナル伝達分子、細胞マーカー、細胞型、感染因子などが、別の種でも対応する類似体を有する場合があること、また、このような類似体、ならびに対応のおよび関連の種におけるそれらの使用も本発明に含まれることを認識するだろう。
【００３５】
本明細書で用いる「腫瘍」は、固形または非固形腫瘍（例えば、白血病）；前癌病変および良性腫瘍から癌性、悪性および転移性腫瘍まで、腫瘍発生の様々な段階を包含する。
【００３６】
概して言えば、１以上の免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞表面をin vitroまたはin vivoで操作するが、これは、（ａ）結合対の第１メンバーと細胞に二官能性分子を結合させる部分とを含む二官能性分子；（ｂ）第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分；および随意に（ｃ）第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第２免疫共刺激部分を、細胞表面に接触させるか、または該細胞を有する個体に投与することを含む方法により実施する。第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドは、結合対の第１および第２メンバー間の結合を介して細胞表面上に提示される。本発明の具体的な一態様では、細胞表面は、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILのうち少なくとも１つ、または、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lのうち少なくとも２つを提示するように操作する。
【００３７】
本発明によれば、各々が免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む、複数の免疫共刺激部分を投与することにより、２、３、４、５、もしくはそれ以上の免疫共刺激ポリペプチドの組合せで細胞表面を操作することができる。２以上の免疫共刺激ポリペプチドの組合せで細胞を操作することにより、本発明は、単一の免疫共刺激ポリペプチドのみが提示される場合と比較して、優れた治療利益を達成する。さらに、細胞の機能を損なうことなく、複数の免疫共刺激ポリペプチドで細胞表面を操作することができると考えられる。それでもやはり、本発明は、１つの免疫共刺激ポリペプチド、例えば、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILで細胞を操作する実施形態も含む。
【００３８】
免疫共刺激ポリペプチド
当分野で公知の様々な免疫共刺激ポリペプチドまたはその免疫共刺激断片のいずれを用いて細胞表面をin vivoで操作することができる。「免疫共刺激ポリペプチド」とは、病原体または腫瘍に対する個体の免疫応答を高めるポリペプチドを意味する。免疫共刺激ポリペプチドの例として限定するものではないが以下のものが挙げられる：LIGHT、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、B7-H2 ICOS、CD94（KP43）、CD40L（CD154）、ICAM-1（CD54）、ICAM-2、ICAM-3、SLAM（CD150）、HAS（CD24）、4-1BB（CDw137）、4-1BBL（CDw137L）、OX40L、CD28、CD40（BP50）、CD25（IL-2Rα）、リンホトキシン（LTαまたはLTβ）、TNF、Fas-L、GITR（活性化誘導性TNRF）、GITRリガンド、CD11a（αLインテグリン）、CD11b（αMインテグリン）、L-セレクチン（CD62L）、CD69（超早期活性化抗原）、およびCD70(CD27L)。例えば、WattsおよびDeBenedette, 1999, Curr. Opin. Immunol., 11:286-93を参照されたい。本明細書において「全長」と記載しない限り、免疫共刺激ポリペプチドと称するものは、全長ポリペプチド、および免疫共刺激機能を示すその断片または一部分を包含し、そのようなものとして、限定するわけではないが、以下に具体的に記載する断片および一部分が挙げられる。従って、例えば、4-1BBLポリペプチドと称するとき、免疫共刺激機能を示す全長4-1BBLの断片または一部分を含むポリペプチド（例えば、4-1BBLの細胞外ドメインまたは全長4-1BBLタンパク質）を意味する。
【００３９】
代表的な核酸配列およびコード免疫共刺激ポリペプチドの例として、以下のGenBank登録番号で示されるものが挙げられる：AB029155（マウスLIGHT）；NM_172014（ヒトTNFSF14 mRNA転写産物変異体２）；NM_003807（ヒトTNFSF14 mRNA転写産物変異体１）；NM_005191（ヒトCD80 mRNA）；NM_009855（マウスCD80 mRNA）；NM_214087 イノシシ（Sus scrofa） CD80 mRNA）；NM_009404（マウスTnfsf9 mRNA）；NM_003811（ヒトTNFSF9 mRNA）；NM_181384（ドブネズミ（Rattus norvegicus）Tnfsf9 mRNA）；BAA88559（マウスLIGHTタンパク質）；Q9QYH9（マウスTNFSF14 膜結合タンパク質および可溶性タンパク質）；AAH18058（ヒトTNFSF14タンパク質）；NP_005182（ヒトCD80タンパク質）；NP_033985（マウスCD80タンパク質）；NP_037058 （ドブネズミCD80タンパク質）；NP_003802（ヒトTNFSF9タンパク質）；NP_033430（マウスTNFSF9タンパク質）；NP_852049（ドブネズミTNFSF9タンパク質）；NM_012967（ドブネズミICAM-1 mRNA）；X69711（ヒトICAM-1 mRNA）；X52264（マウスICAM-1 mRNA）；X69819（ヒトICAM-3 mRNA）；AF296283（マウスICAM-4 mRNA）；NM_021181（ヒトSLAMF7 mRNA）；NM_033438（ヒトSLAMF9 mRNA）；NM_029612（マウスSLAMF9 mRNA）；NM_144539（マウスSLAMF7 mRNA）；L13944（マウスCD18遺伝子）；X53586（ヒトインテグリンα6 mRNA）；X68742（ヒトインテグリンαmRNA）；J04145（ヒト好中球接着受容体α-MサブユニットmRNA）；AJ246000（ヒト白血球接着受容体、L-セレクチンmRNA）；AY367061（ヒトL-セレクチンmRNA、部分cds）；Y13636（マウスCD70 mRNA）；NM_001252（ヒトTNFSF7 mRNA）；BC000725（ヒトTNFSF7 mRNA（cDNAクローンMGC：1597 IMAGE:3506629）、完全cds）；X69397（ヒトCD24遺伝子および完全CDS）；NM_013230（ヒトCD24 mRNA）；NM_012752（ドブネズミCD24 mRNA）；Y00137（マウス腫瘍壊死因子β（リンホトキシン）遺伝子）；X02911（ヒト腫瘍壊死因子β（リンホトキシン）遺伝子）；D00102（ヒトヒトリンホトキシンmRNA、完全CDS）；X01393（ヒトリンホトキシンmRNA）；ならびにA06316（ヒトリンホトキシンmRNA）。同じまたは別の免疫共刺激ポリペプチドをコードする他の核酸配列および／または共刺激ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、一般に利用可能なGenBankデータベース（例えば、World Wide Web（ncbi.nlm.nih.gov）上で利用可能）を検索することにより見いだすことができる。
【００４０】
共刺激ポリペプチドは、ナイーブＴ細胞と抗原提示細胞との間の自然相互作用に関与し、その結果、それらの相互活性化が起こり、様々な細胞表面リガンドおよび受容体、ならびに免疫応答の開始、維持および長期記憶に寄与する可溶性タンパク質の発現が促進される。ナイーブＴ細胞の初期活性化には、少なくとも３つのシグナルが必要である。シグナル１は、Ｔ細胞受容体（TCR）と、プロフェショナルAPC、例えば、樹状細胞（DC）の表面上の主要組織適合複合体（MHC）により提示されるノミナル（nominal）ペプチドとの相互作用により生じる。シグナル２は、数個の異なる分子により媒介されると考えられ、持続的免疫応答に重要である。シグナル３は、活性化Ｔ細胞およびAPCにより合成されるサイトカインを介して伝達され、エフェクター免疫応答の維持に重要である。
【００４１】
腫瘍は免疫媒介破壊を回避するための多様な対抗機構を発達させている。このような対抗機構として、以下のものが挙げられる：（i）シグナル１の欠失、これはMHC／腫瘍抗原二分子複合体の腫瘍細胞上での非効率的な提示、このシグナルの伝達欠損、および／または主要組織適合複合体のホモログであるMICの発現により起こる場合があり、NKG2阻害性受容体を発現するNK細胞を阻害する）；（ii）腫瘍細胞上の共刺激分子の欠失、または共阻害性分子の腫瘍発現によって起こりうるシグナル２の非存在；（iii）例えば、抗炎症分子の分泌、腫瘍反応性Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導、アポトーシスによるエフェクターＴ細胞の物理的排除、またはTregの誘導、による免疫応答の腫瘍媒介抑制；ならびに（iv）腫瘍間質による免疫性の調節。これら対抗機構の多くは、特に、大きな腫瘍組織量を有する患者において、同時に作動する。
【００４２】
CD80（B7.1、CD28LG、LAB7としても知られる）とCD86（B7.2、CD28LG2、LAB72としても知られる）は共刺激ポリペプチドの例であり、いずれも、Ｔ細胞が発現したCD28／CTLA4共受容体に結合する。CD80は288個のアミノ酸を含む（33048 Da）。Freemanら、J. Immunol. 143 (8), 2714-2722（1989）を参照。ヒトB7.1の全アミノ酸配列は、Swiss-Protデータベースにおいて登録番号P33681で見いだすことができる。B7.1は、分泌シグナルを形成する残基１〜34と、潜在的細胞外ドメインを形成する残基35〜242と、潜在的膜貫通ドメインを形成する残基243〜263と、潜在的細胞質ドメインを形成する残基264〜288とを含むＩ型糖タンパク質である。従って、その分泌シグナル配列を含まない成熟B7.1分子は、アミノ酸35〜288を呈示する。B7.1をコードするヒトヌクレオチド配列は、GenBank登録番号NM_005191に見いだすことができる。
【００４３】
B7.1のコグネイト（cognate）受容体CD28に結合することができるB7.1の残基35〜242またはその断片を、本発明で使用する結合対メンバーとの融合物として結合または発現させることができる。例えば、図２Ａおよび２Ｂは、ヒトB7.1（CD80）の細胞外ドメインとコアストレプトアビジンとを含むキメラタンパク質のヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【００４４】
B7.2は329個のアミノ酸（37696 Da）を含む。Freemanら、Science 262（5135）、909-911（1993）を参照。ヒトB7.2の全アミノ酸配列は、Swiss-Protデータベースにおいて登録番号P42081に見いだすことができる。B7.2は、分泌シグナルを形成する残基１〜23と、潜在的細胞外ドメインを形成する残基24〜247と、潜在的膜貫通ドメインを形成する残基248〜268と、潜在的細胞質ドメインを形成する残基269〜329とを含むＩ型糖タンパク質である。従って、その分泌シグナル配列を含まない成熟B7.2分子は、アミノ酸24〜329を呈示する。B7.2をコードするヒトヌクレオチド配列は、GenBank登録番号NM_175862に見いだすことができる。
【００４５】
B7.2のコグネイト受容体CD28に結合することができるB7.2の残基24〜247またはその断片を、本発明で使用する結合対メンバーとの融合物として結合または発現させることができる。例えば、図５Ａおよび５Ｂは、ヒトB7.2（CD86）の細胞外ドメインとコアストレプトアビジンとを含むキメラタンパク質のヌクレオチド（配列番号８）およびアミノ酸（配列番号９）配列を示す。
【００４６】
B7.2は通常、休止Ｂ細胞には発現されず、末梢血液単球（PBC）およびDCに低いレベルで発現される。しかし、その発現は、活性化後、Ｂ細胞、ならびにマクロファージおよびDCのようなその他のAPCでアップレギュレートされる。対照的に、CD86は、PBCおよびDCに構成的に発現され、Ｂ細胞ではより迅速にアップレギュレートされる。APC上のMHC／ペプチド複合体とのＴ細胞受容体（TCR）相互作用により、Ｔ細胞上のCD28とCD80／86の同時結合が可能になり、これによって脂質キナーゼホスファチジルイノシトール3-キナーゼのチロシンリン酸化が起こり、次にはこれが一連の細胞内事象を開始し、その結果、Il-2遺伝子発現、細胞増殖、およびエフェクター機能への分化が誘導される。シグナル２は、抗アポトーシス遺伝子（例えば、Bcl-xL）の調節を通じた細胞死の阻止により、生産的免疫応答をさらに高めることができる。本明細書に記載するようにCD80および／またはCD86を提示するようにin vivoで操作された腫瘍細胞は、活発な抗腫瘍免疫応答を誘導する能力を有するため、強力な治療効果がある。
【００４７】
本明細書に記載するin vivoでの細胞表面操作に有用な好ましい免疫共刺激ポリペプチドの別の例として、4-1BBのリガンド（4-1BBL）およびLIGHTのリガンドが挙げられる。免疫活性化の初期段階後、「二次」受容体／リガンド対、例えば、4-1BBL／4-1BBおよびLIGHT／HVEMは、Ｔ細胞およびAPCの表面でアップレギュレートされるようになる。これらの受容体／リガンド対は、初期活性化後事象の維持、免疫ホメオスタシス、および免疫記憶の発生に関与している。
【００４８】
4-1BBL（4-BB-L、4-BBリガンド、TNFSF9、ILAリガンドとしても知られる）は254個のアミノ酸（26624 Da）を含む。Aldersonら、Eur J Immunol. 1994 Sep;24(9):2219-27を参照。ヒト4-1BBLの全アミノ酸配列は、Swiss-Protデータベースにおいて登録番号P41273に見いだすことができる。4-1BBLは、潜在的細胞質ドメインを形成する残基１〜28と、単一の推定膜貫通ドメインを形成する残基29〜49と、潜在的細胞外ドメインを形成する残基50〜254と、ポリ−Leuストレッチを呈示する残基35〜41とを含むII型糖タンパク質である。4-1BBLをコードするヒトヌクレオチド配列は、GenBank登録番号NM_003811に見いだすことができる。
【００４９】
4-1BBLは、活性化から２〜３日後、活性化抗原提示細胞（例えば、活性化Ｂ細胞、マクロファージ、およびDCなど）により発現される。4-1BBLは、腫瘍に対するさらに強力な免疫応答のために、Ｔ細胞（CD8+Ｔ細胞およびDCなど）を活性化することができる。4-1BBLの受容体である4-1BB（CD137としても知られる）は、活性化CD4+およびCD8+Ｔ細胞の表面上、ナチュラルキラー細胞、単球および休止DC上に発現される。4-1BBLのコグネイト受容体4-1BBに結合することができる4-1BBLの残基50〜254またはその断片を、本発明で使用する結合対メンバーとの融合物として結合または発現させることができる。例えば、図３ＡおよびＢは、CSAマウス4-1BBL融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（配列番号５および６）。図４は、ヒト4-1BBLの細胞外ドメインとコアストレプトアビジンとを含むキメラタンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号７）。
【００５０】
本方法の利点の１つは、4-1BBLを提示するようにin vivoで操作された細胞（例えば、腫瘍細胞など）が、Ｔ細胞上の4-1BBコグネイト受容体を活性化するため、いくつかの重要な免疫刺激作用をもたらすことである。その作用の１つとして、CD28‐非依存的様式でのCD8+Ｔ細胞へのシグナル２の伝達が挙げられ、これはＴ細胞を刺激してサイトカインを産生させ、増殖させて、エフェクター機能を獲得させる。4-1BB／4-1BBL相互作用の別の作用として、サイトカインの合成および放出を引き起こす単球およびDCの活性化が挙げられる。4-1BBシグナル伝達のさらに別の作用としては、活性化誘導細胞死（AICD）を阻止することによるＴ細胞生存の促進および長期免疫記憶の確立である。4-1BB／4-1BBL相互作用のさらに別の作用として、腫瘍根絶に重要な１型エフェクターＴ細胞に作用する、Ｔ細胞、DCおよびマクロファージからの１型サイトカイン、例えば、IL-2、IFN-γ、およびTNF-αの選択的産生がある。このようなＴ細胞には、CD4+CD25+Ｔ調節（Treg）細胞が含まれるが、該細胞は4-1BB受容体を構成的に発現する。本方法のさらに別の利点は、4-1BBLを提示するように操作された細胞（例えば、腫瘍細胞など）が、例えば、腫瘍に対するさらに強力な免疫応答のために、Ｔ細胞、特にCD8+Ｔ細胞およびDCを活性化できることである。
【００５１】
LIGHTポリペプチド（TNFS14、HVEM-L、LTg、TR2としても知られる）は、リンホトキシンと相同であるTNFスーパーファミリーメンバーである。Mauriら、Immunity 8 (1), 21-30（1998）を参照。ヒトLIGHTの全アミノ酸配列は、Swiss-Protデータベースにおいて登録番号O43557に見いだすことができる。LIGHTは240個のアミノ酸を含み（26351 Da）、潜在的細胞質ドメインを形成する残基１〜37と、単一の推定膜貫通ドメインを形成する残基38〜58と、潜在的細胞外ドメインを形成する残基59〜240とを含むII型糖タンパク質である。切断部位は残基82〜83を含む。LIGHTをコードするヒトヌクレオチド配列は、GenBank登録番号NM_172014に見いだすことができる。
【００５２】
LIGHTのコグネイト受容体HVEM、LTβRもしくはTR6に結合することができるLIGHTの残基59〜240またはその断片は、本発明で使用する結合対メンバーとの融合物として結合または発現させることができる。例えば、図１Ａおよび１Ｂは、コアストレプトアビジンとマウスLIGHTの細胞外ドメインとを含むキメラタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００５３】
LIGHTは主として活性化Ｔ細胞、NK細胞、および未成熟樹状細胞上に発現され、免疫応答の様々な側面を調節する働きをする。LIGHTは膜結合タンパク質として合成されるが、その細胞表面発現はいくつかの翻訳後機構により調節される。LIGHTはその発現から数分以内にマトリックスメタロプロテイナーゼにより細胞表面から切断され、可溶性分子として蓄積する（イソ型１；概して残基83〜240を呈示する；Swiss-Prot O43557-1）。細胞表面細胞質セグメントはイソ型２（Swiss-Prot O43557-2）を呈示する。さらには、様々な細胞型が小胞内にLIGHTを貯蔵し、多様な生理学的刺激による活性化時にそれらを排出する。LIGHTの可溶性形態の役割は十分に明らかにされていないが、負のフィードバックループとして働き、HVEMおよびLTβRについての競合により膜結合形態の機能を阻害すると考えられる。
【００５４】
LIGHTは、異なる３つの受容体：（１）T細胞上のヘルペスウイルス侵入仲介因子（HVEM）、（２）主に上皮および間質細胞上で発現されるLTβR、および（３）様々な細胞上の可溶性おとり受容体３と相互作用する。これらの相互作用は、LIGHTに様々な機能を賦与する。間質細胞上のLTβRとの相互作用は、各種サイトカイン／ケモカインの産生、リンパ節（LN）器官形成、および二次リンパ系構造の回復に関連する。これに対し、リンパ球上のHVEM受容体とLIGHTの相互作用により、サイトカインの活性化および産生が起こるが、その中でIFN-γおよびGM-CSFが優位を占める。これに関して、LIGHT／HVEM軸（axis）は、腫瘍根絶に重要な役割を果たすTh1型応答の活性化に関連する共刺激シグナルを送達するようである。
【００５５】
LIGHTはリンパ器官形成およびTh1型応答の発生に一定の役割を果たす。例えば、Yangら、2002, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 16:206-10；Schneiderら、2004, Immunol. Rev., 202:49-66を参照されたい。
【００５６】
LIGHTの効果はin vitroおよびin vivo両方で様々な腫瘍モデルにおいて認められている。LIGHTを発現する単純ヘルペスウイルスアンプリコンにより伝達される慢性リンパ性白血病細胞は、混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を増強すると報告されている。MDA-MB-231ヒト乳癌細胞上でのLIGHTの過剰発現は、腫瘍増殖を抑制することがわかっている。様々な癌細胞株にLIGHTをトランスフェクトすることにより、これら細胞におけるICAM-1発現が刺激される。ICAM-1の存在は、腫瘍細胞における抗腫瘍活性を生み出すのに有効なシグナル伝達を可能にするため、有益であると考えられる。Ｔ細胞活性化以外に、LIGHTのもう一つの重要な機能は、LTβRを介してシグナルを伝達できることであり、これは、ケモカイン発現の誘導を通じて媒介される二次リンパ系構造の発達、ならびに間質細胞における接着分子の発達に重要な役割を果たす。間質細胞上のLTβRとLIGHTとの相互作用はCCL21の発現を調節するが、これによって、リンパ系組織へのナイーブＴ細胞のホーミングが制御される。
【００５７】
LIGHTを提示するように腫瘍細胞を操作する本発明の実施形態の利点の１つとして、LIGHTがリンパ器官形成を刺激し、Th1型応答の発生を支持することができる点が挙げられる。もう一つの利点としては、LIGHTが腫瘍に対する免疫応答を刺激し、腫瘍間質を活性化してこれらの応答をさらに増強できる点が挙げられる。
【００５８】
間質は、腫瘍部位へのリンパ球浸潤を阻止する物理的障壁として働く。間質はまた、腫瘍微小環境内でのリンパ球活性化も阻害する。これは、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルの欠如および／または間質繊維芽細胞および腫瘍細胞の両方により合成および分泌される様々な免疫阻害性可溶性媒介因子（例えば、TGF-βおよびIL-10）の存在によると考えられる。間質は、腫瘍細胞を腫瘍部位に閉じ込め、これによって腫瘍細胞が局所リンパ節にトラフィッキングするのを阻止することにより、免疫学的無視を促進する。
【００５９】
腫瘍間質細胞はまた、LTβRのような各種免疫受容体も発現するため、これらは、本発明に従って抗腫瘍免疫の増強に利用することができる。
【００６０】
OX40Lは、樹状細胞およびその他のAPCにより発現され、活性化Ｔ細胞上に存在するOX40に結合する。OX40Lは、183個のアミノ酸を含む（21950 Da）。Miuraら、Mol. Cell. Biol. 11:1313-1325（1991）を参照。OX40Lの全アミノ酸配列は、Swiss-Protデータベースにおいて登録番号P23510で見いだすことができる。OX40Lは、残基１〜23に細胞質ドメインを、残基24〜50に膜貫通ドメインを、そして残基51〜183に細胞外ドメインを含むII型糖タンパク質である。OX40Lのヌクレオチド配列は3510 bpであり、コード配列は157〜708である（GenBank登録番号NM_003326.2参照）。OX40Lのコグネイト受容体OX40に結合することができるOX40Lの残基51〜183、またはその断片は、本発明で使用する結合対メンバーとのＣ末端融合物として結合または発現させることができる。
【００６１】
CD40Lは、活性化Ｔ細胞により発現され、タンパク質分解プロセシングにより膜形態から誘導される細胞外可溶性形態としても存在する。CD40L（a.k.a. TNFSF5）は、261個のアミノ酸（29350 Da）を含む。Villingerら、Immunogenetics 53:315-328（2001）を参照。CD40Lの全アミノ酸配列は、登録番号Q9BDN3で見いだすことができる。CD40Lは、残基１〜22で細胞質ドメインを、残基23〜43で膜貫通ドメインを、そして残基44〜261で細胞外ドメインを含むII型糖タンパク質である。CD40Lのヌクレオチド配列は1834 bpであり、コード配列は73〜858である（GenBank登録番号NM_000074参照）。CD40Lのコグネイト受容体CD40に結合することができるCD40Lの残基44〜261、またはその断片は、本発明で使用する結合対メンバーとのＮ末端融合物として結合または発現させることができる。
【００６２】
PD-L1は、活性化ＴおよびＢ細胞、樹状細胞、ケラチノサイトおよび単球上に発現される。PD-L1（a.k.a. B7-H；B7H1；PDL1；PDCD1L1）は290個のアミノ酸を含む（33275 Da）。Dongら、Nat. Med. 5: 1365-1369（1999）を参照。PD-L1の全アミノ酸配列は、Swiss-Protデータベースにおいて登録番号Q9NZQ7に見いだすことができる。PD-L1は、290個のアミノ酸を含み、そのうちＮ末端の18アミノ酸がシグナル配列を呈示する。細胞外ドメインはアミノ酸19〜238に位置し、膜貫通ドメインは残基239〜259に位置し、そして細胞質ドメインは残基260〜290に位置する。PD-L1（1553 bp）のヌクレオチド配列は公開データベース（GenBank登録番号NM_014143参照）（コード配列は53-925）から入手可能である。PD-L1のイソ型は選択的プライシングにより存在する。PD-L1のコグネイト受容体PDCD1に結合することができるPD-L1の細胞外ドメインまたはその断片は、本発明で使用する結合対メンバーとのＮ末端融合物として結合または発現させることができる。
【００６３】
GL50イソ型１は広範に発現され（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、骨格筋、骨髄、結腸、卵巣、前立腺、精巣、リンパ節、白血球、脾臓、胸腺および扁桃）；GL50イソ型２（swissprot O75144）はリンパ節、白血球および脾臓において、また、活性化単球および樹状細胞上で発現される。GL50（a.k.a. B7-H2；B7H2；B7RP-1；B7RP1；ICOS-L；ICOSLG；KIAA0653；およびLICOS）は290個のアミノ酸（33275 Da）を含む。Wangら、Blood 96:2808-2813 (2000)を参照。GL50の全アミノ酸配列は、Swiss-Protデータベースにおいて登録番号O75144で見いだすことができる。GL50は、302個のアミノ酸を含み、そのうちＮ末端の18アミノ酸がシグナル配列を呈示する。細胞外ドメインはアミノ酸19〜256に位置し、膜貫通ドメインは残基257〜277に位置し、そして細胞質ドメインは残基278〜302に位置する。GL50のヌクレオチド配列（3239 bp）は公開データベース（GenBank登録番号NM_015259参照）（コード領域は135〜1043）で入手可能である。GL50のイソ型は選択的プライシングにより存在する。GL50のコグネイト受容体ICOSに結合することができるGL50の細胞外ドメインまたはその断片は、本発明で使用する結合対メンバーとのＮ末端融合物として結合または発現させることができる。
【００６４】
他の免疫共刺激ポリペプチドを本発明で用いることができる。例えば、US 2003/0219419（その全内容を参照により本明細書にすべて組み込むものとする）は、本発明において有用なIL-2-CSA融合タンパク質、およびCSA-CD40L融合タンパク質を記載している。
【００６５】
表１に様々な共刺激分子およびその受容体をまとめて示す。
【表１】
2009518427.tif 000003
【００６６】
要約すると、本発明において有用な免疫共刺激ポリペプチドの例として以下のものが挙げられる。
【表２】
2009518427.tif 000004
【表３】
2009518427.tif 000005
【表４Ａ】
2009518427.tif 000006
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【表４Ｂ】
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免疫共刺激ポリペプチドの提示
本明細書に記載のようにin vitroまたはin vivoで操作した細胞、例えば、腫瘍細胞上に１以上の免疫共刺激ポリペプチドを提示させることができる。ポリペプチドの組合せを用いる場合には、様々な免疫機構が機能するように、用いる特定の組合せを選択することができる。本発明により意図される特定の組合せの例として、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lのうち２つ以上を含む組合せが挙げられる。
【００６７】
本発明の具体的な一態様では、上記組合せは、4-1BBLまたはLIGHTのうち少なくとも1つ、例えば、4-1BBLおよびLIGHT、ならびに、4-1BBL、LIGHTおよびCD80を含む。特定の理論に束縛されるわけではないが、このような特定の組合せの免疫共刺激分子を提示するように作製された細胞（例えば、腫瘍細胞）は、以下に挙げる作用の１以上を有すると考えられる：（i）腫瘍細胞上に提示されたLIGHTは、腫瘍中の間質細胞上のLTβRに結合することにより、間質細胞を活性化し、各種のリンパ球特異的ケモカインを分泌させる；（ii）放出されたリンホカインはナイーブＴ細胞およびDCを腫瘍部位に補充する；（iii）補充されたＴ細胞およびDCは、操作された腫瘍細胞上のLIGHT、CD80、および4-1BBLと、Ｔ細胞およびDC（4-1BB）上に発現されたそれぞれの受容体、HVEM（第２LIGHT受容体）、CD28、および4-1BBとの結合により、腫瘍微小環境内で活性化されることになる。上記およびその他の作用により、治療に関連する強力な全身性抗腫瘍免疫がもたらされる。
【００６８】
具体的な一実施形態によれば、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lのうち１つ以上、例えば、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lのうち２つ以上の組合せで、細胞（例えば、腫瘍細胞）を操作する。具体的な一実施形態では、腫瘍細胞のような細胞をLIGHT、CD80、および4-1BBLの各々で操作する。これらの実施形態は、前述したすべての利点をもたらし、免疫活性化を標的化するだけではなく、腫瘍間質をモジュレートして免疫応答も増強する特有のアプローチを提供する。従って、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lのうち２つ以上の組合せで、細胞（例えば、腫瘍細胞）をin vivoで操作することにより、例えば、腫瘍を擬似的な二次リンパ系構造に変換して、有効な腫瘍内および全身性抗腫瘍免疫応答を生じさせる可能性を与え、これによって既存の腫瘍を根絶し、再発に対して保護することができる。
【００６９】
結合対
結合対の例としてビオチンとストレプトアビジン（SA）またはアビジンとが挙げられる。また、ビオチンに対する実質的結合活性（例えばそれぞれ天然SAまたはアビジンの結合親和性の少なくとも50％またはそれ以上）を保持するSAまたはアビジン断片を用いてもよい。このような断片として、「コアストレプトアビジン（CSA）」、すなわち、全長ストレプトアビジンポリペプチドのトランケート型があり、これはストレプトアビジン残基13〜138、14〜138、13〜139および14〜139を含みうる。例えば、Pahlerら、J. Biol. Chem. 1987, 262:13933-37を参照。ビオチンとの強力な結合を保持するストレプトアビジンおよびアビジンの上記以外のトランケート型を用いてもよい。例えば、Sanoら、J Biol Chem. 1995 Nov 24, 270(47): 28204-09（コアストレプトアビジン変異体16〜133および14-138を記載）（米国特許第6,022,951号）を参照されたい。また、実質的なビオチン結合活性または増大したビオチン結合活性を保持するストレプトアビジンの突然変異体またはストレプトアビジンのコア形態を用いてもよい。Chilcotiら、Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Feb 28;92(5):1754-8；Reznikら、Nat Biotechnol. 1996 Aug;14(8):1007-11を参照されたい。例えば、免疫原性が低減した突然変異体、例えば、潜在的Ｔ細胞エピトープまたはリンパ球エピトープを除去する部位特異的突然変異導入により突然変異させた突然変異体を用いることができる。Meyerら、Protein Sci. 2001 10: 491-503を参照。同様に、実質的なビオチン結合活性または増大したビオチン結合活性を保持するアビジンの突然変異体およびアビジンのコア形態を用いてもよい。Hillerら、J. Biochem. (1991) 278: 573-85；Livnahら、Proc Natl Acad Sci USA (0: 5076-80) (1993)を参照。便宜上、本記載において、本明細書で用いる用語「アビジン」および「ストレプトアビジン」は、ビオチン結合断片、これら結合対メンバーの突然変異体およびコア形態を包含するものである。アビジンおよびストレプトアビジンは商業的供給者から入手することができる。さらに、ストレプトアビジンおよびアビジンをコードする核酸配列ならびにストレプトアビジンおよびアビジンアミノ酸配列は、例えば、GenBank登録番号X65082；X03591；NM_205320；X05343；Z21611；およびZ21554に見いだすことができる。
【００７０】
本明細書で用いる用語「ビオチン」とは、表面、例えば、細胞表面（腫瘍細胞表面など）に結合することができるビオチン含有部分を含み、例えば、NHS−ビオチンおよびEZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin（Pierce）などが挙げられる。このようなビオチンのタンパク質反応性形態は市販されている。
【００７１】
ビオチンとその結合パートナーであるアビジンまたはストレプトアビジンとの相互作用により、本発明に関して複数の利点がもたらされる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン（1013M-1）およびアビジン（1015M-1）の両方に対して極めて高い親和性を有する。また、ストレプトアビジンまたはアビジンを含む免疫共刺激部分はあらゆるビオチン化細胞、組織、もしくは器官の表面に優先的に局在化することができるため、この実施形態は有利である。免疫共刺激ポリペプチドまたは標的細胞のいずれかの関連機能も損なうことなく、迅速（約２時間未満）かつ効率的（標的細胞の約100％）で、しかも持続的（t1/2＝数日〜数週間）な様式で、所望するレベルの標的化を達成することができる。加えて、ストレプトアビジンおよびアビジンはいずれも、各々がビオチンの４分子に結合する四量体ポリペプチドである。従って、ストレプトアビジンまたはアビジンを含む免疫共刺激部分は四量体およびさらに高次の構造を形成する傾向がある。その結果、これらは、対応する免疫細胞受容体に架橋して、例えば、受容体の凝集により、さらに強力なシグナル伝達を達成することができる。また、細胞機能を損なうことなく、複数の免疫共刺激ポリペプチドで細胞表面を操作することも可能である。
【００７２】
当業者は、他の機構（例：例えば、他の結合部分または化学もしくは遺伝的架橋を用いる他のコンジュゲート方法）を用いて、さらに高次構造の免疫共刺激分子、例えば、二量体、三量体、四量体およびさらに高次の多量体の免疫共刺激分子を含むコンジュゲートを提供することができ、これらも有利な特性を呈示する。このようなコンジュゲートも本発明の範囲に含まれる。
【００７３】
免疫共刺激部分
免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む免疫共刺激部分は、当分野で周知の方法により作製することができる。例えば、ポリペプチドと第２メンバーとを互いに共有結合させる、あるいは、これらを直接またはリンカーを介して互いにコンジュゲートさせることができる。本発明の一実施形態によれば、免疫共刺激部分は、免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む融合タンパク質である。当分野で公知の多数の異なる方法のいずれかにより融合タンパク質を製造することができる。例えば、融合タンパク質の１以上の成分ポリペプチドを化学的に合成する、または周知の組換え核酸技術を用いて作製することができる（本明細書で用いる「核酸」とはRNAまたはDNAを指す）。本発明において有用な核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて取得することができる。様々なPCR方法が、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach 7 Dveksler編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。
【００７４】
一実施形態によれば、免疫共刺激ポリペプチドは、そのＣ末端を介して結合対の第２メンバーのN末端に結合させる。例えば、本発明は、CD80部分がそのＣ末端を介してCSAのN末端に結合した、CD80-CSA融合タンパク質を含む。別の実施形態によれば、免疫共刺激ポリペプチドは、そのＮ末端を介して結合対の第２メンバーのＣ末端に結合させる。例えば、本発明は、CSA部分がそのＣ末端を介して免疫共刺激部分のＮ末端に結合した、CSA-4-1BBL、CSA-LIGHT、CSA-CD40L、およびCSA-OX40L融合タンパク質を含む。免疫共刺激ポリペプチドは、結合対の第２メンバーに直接結合させてもよいし、また、１以上の結合部分（例えば、１以上の結合ポリペプチドなど）を介して結合させてもよい。
【００７５】
免疫共刺激ポリペプチドの断片および／または結合対メンバーの断片を含む核酸およびポリペプチドは、この断片が各全長ポリペプチドの活性を保持する限り、本発明において有用である。従って、免疫共刺激断片はその免疫免疫共刺激活性を保持（例えば、その受容体またはリガンドに結合する能力を保持）し、結合メンバー断片はその結合パートナーに結合する能力を保持していなければならない。断片は、当分野で慣用の方法（以下の実施例に例示するものなど）により、保持された活性についてスクリーニングすることができる。免疫共刺激ポリペプチドの断片の例については前文に記載している。
【００７６】
免疫共刺激部分は、第2結合対メンバーと免疫共刺激ポリペプチドとの間に、ペプチドリンカーのようなリンカーを含んでもよい。リンカーの長さおよび組成は、上記部分の両機能的末端のいずれかの活性を増強するように選択することができる。リンカーは、一般に約３〜約15アミノ酸長、さらに好ましくは約５〜約10アミノ酸長であるが、これより長いまたは短いリンカーを用いてもよいし、あるいは、リンカーを一切用いなくてもよい。これに関して、一本鎖抗体の重鎖と軽鎖とを結合させるのに用いられているようなフレキシブルリンカー（例：(Gly4Ser)3）を用いてもよい。Hustonら、(1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883；米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、第4,956,778号；第5,258,498号、および第5,482,858号を参照されたい。他のリンカーとして、FENDAQAPKSまたはLQNDAQAPKSがある。また、免疫グロブリンFc領域の１以上のドメイン（例えば、CH1、CH2および／またはCH3）をリンカーとして用いてもよい。
【００７７】
また、改変、変更、もしくは突然変異した核酸およびポリペプチドも、それらが各核酸またはポリペプチドの活性を保持している限り、本発明において有用である。例えば、本発明での使用に好適な核酸およびポリペプチド配列は、各核酸またはポリペプチド、すなわち、既知の免疫共刺激ポリペプチドまたは結合対メンバーをコードする核酸に対し、少なくとも約80％以上の配列同一性（少なくとも80％の配列同一性を含む）を有することができる。いくつかの実施形態では、核酸配列またはポリペプチドは、各核酸またはポリペプチドに対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性を有する。
【００７８】
本発明は、同一のアミノ酸をコードする点で「サイレント」である塩基変更を有する核酸（すなわち、縮重核酸配列）を包含する。本発明はまた、保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする核酸、およびそのようなポリペプチドも包含する。保存的アミノ酸置換（例えば、１個の疎水性残基を異なる疎水性残基で置換する）は当分野において周知であり、例えば、点突然変異などにより実施することができる。所与の改変配列、変異体または突然変異体の適切さについては、当分野で公知の受容体結合および／または生物学的スクリーニング方法、例えば、断片に関して前述したものなどを用いて、確認することができる。
【００７９】
本明細書で用いる「配列同一性％」は、アライメントした核酸またはポリペプチド配列において一致する位置の数を決定し、それぞれアライメントしたヌクレオチドまたはアミノ酸の総数で一致位置の数を割った後、100を掛けることにより算出する。一致位置とは、アライメントした配列の同じ位置に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する位置を意味する。アライメントしたヌクレオチドまたはアミノ酸の総数とは、第２配列をアライメントするのに必要なヌクレオチドまたはアミノ酸の最小数を意味し、これは、非相同配列、例えば、目的とする配列のＮ末端またはＣ末端で融合できる配列（すなわち、免疫共刺激ポリペプチドまたは結合対メンバーをコードする配列）とのアライメント（例えば、強制アライメント）は含まない。アライメントしたヌクレオチドまたはアミノ酸の総数は、全コード配列に対応してもよいし、または本明細書に定義する全長配列の断片に対応してもよい。
【００８０】
World Wide Web.（ncbi.nlm.nih.gov）上で入手可能なBLAST（basic local alignment search tool）プログラムに組み込まれているAltschulら（1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402）により記載されたアルゴリズムを用いて、配列をアライメントすることができる。Altschulアルゴリズムを用いて、BLAST検索またはアライメントを実施することにより、核酸分子（「クエリ配列」）と、別の任意の配列またはその部分配列との配列同一性％を決定することができる。BLASTNを用いて、核酸配列をアライメントし、両者の同一性を比較することができ、また、BLASTPを用いて、アミノ酸配列をアライメントし、両者の同一性を比較することができる。BLASTプログラムを使用して治療ポリペプチドをコードする核酸配列と、別の配列との同一性％を計算する場合には、各プログラムのデフォルトパラメーター（ギャップペナルティーのデフォルトを含む）を用いることができる。
【００８１】
サザンもしくはノーザンブロット分析（すなわち、ハイブリダイゼーション）、PCR、またはin situハイブリダイゼーション分析のような方法により、本発明の核酸を検出することができる。典型的には、トランスフェクトした細胞株での免疫細胞化学、あるいは、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、クマシーブルー染色、または特定のポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を用いたウェスタンブロット分析を実施することにより、ポリペプチドを検出する。これらの方法の多くは、Sambrookら（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）に詳細に記載されている。
【００８２】
従来の分子生物学的技術を用いて、免疫共刺激ポリペプチドおよび結合対の第２メンバーをコードする核酸配列を構築物中で互いに機能的に結合させることができる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrookら、2001, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press）またはShort Protocols in Molecular Biology（Ausubelら、2002, 第５版、Current Protocols）を参照されたい。これらの方法に用いるのに好適な構築物は市販されており、当分野で慣用的に使用されている。構築物は、プロモーター配列のような発現に必要なエレメント、エンハンサー配列のような調節エレメント、ならびに核酸配列の発現をモジュレートする応答エレメントおよび／または誘導エレメントなどを含むことができる。本明細書で用いられる「機能的に結合した」とは、（i）核酸の発現を指令または調節するように、該核酸配列に対してプロモーターおよび／または他の調節エレメントが配置されること；および／または（ii）コード配列が「インフレーム」である、すなわち、構築物が、免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む融合タンパク質をコードするように、免疫共刺激ポリペプチドをコードする核酸と、結合対の第２メンバーをコードする核酸とが配置されることを意味する。
【００８３】
当分野で公知の方法により、宿主細胞中で構築物を増殖または発現させて、ポリペプチドを産生させることができる。本明細書で用いる用語「宿主」または「宿主細胞」は、大腸菌（E.coli）のような原核生物だけではなく、酵母、昆虫、植物および動物細胞のような真核細胞も含むものとする。動物細胞としては、例えば、COS細胞およびHeLa細胞などが挙げられる。当業者に一般的に知られる方法のいずれかを用いて、DNA分子（例えば、構築物）で宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることができ、このような方法として、リン酸カルシウムまたは酢酸リチウム沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクションおよび粒子衝撃などが挙げられる。本発明のベクターを含む宿主細胞は、既述したように、ベクターの増殖、核酸（例：DNAまたはRNA）の生産、免疫共刺激ポリペプチドもしくはその断片の発現、または融合タンパク質の発現などの目的に用いることができる。
【００８４】
図１Ａおよび１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ、３Ａおよび３Ｂ、ならびに５Ａおよび５Ｂは、コアストレプトアビジンと免疫共刺激ポリペプチドとを含む免疫共刺激部分をコードする代表的な核酸配列（配列番号１、３、５および８）と、対応するコードアミノ酸配列（配列番号２、４、６および９）を示す。
【００８５】
In vivo細胞表面操作
本発明によれば、免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞をin vivoで操作する。既述のように、これは、結合対の第１メンバーと細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面に結合することができる分子とを含む二官能性分子、および１以上の免疫共刺激部分（各々、結合対の第２メンバーと少なくとも１つの免疫共刺激ポリペプチドとを含む）を個体に投与することにより達成することができる。上記二官能性分子は、該二官能性分子の細胞表面結合部分を介して該二官能性分子が該細胞表面に結合された後、上記結合対の第１メンバーが結合対の第２メンバーに対する親和性を実質的に保持するように設計される。具体的な一実施形態では、二官能性分子は、細胞の表面上のタンパク質にin vivoでコンジュゲートすることができるビオチンの形態、例えば、NHS−ビオチンである。第１メンバーを含む二官能性分子が細胞表面に結合することができる分子としてビオチンを含む場合、以下に例示する方法、またはその他の方法（例えば、WO 02/02751に記載の方法など）によりこれを細胞表面に局在化させることができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、結合対の第１メンバーと細胞表面への結合に関与する二官能性分子の部分との間に、リンカーまたはその他のスペーサーを配置することもある。このようなリンカーの長さおよび組成は、当分野で周知のように、二官能性分子の両末端の活性を最大限にするように選択することができる。
【００８７】
二官能性分子（第１結合対メンバーを含む）と１以上の免疫共刺激部分は、実質的に同時に、または異なる時間で投与することができる。通常、１以上の免疫共刺激部分のいずれかの前に、第１結合対メンバーを投与する。例えば、この時間間隔は、１〜数時間、１〜数日、１週間またはそれ以上まで変動しうる。具体的な一実施形態では、免疫共刺激部分は、二官能性分子の少なくとも16時間後、例えば、約16時間後、約24時間後、約32時間後、約36時間後、もしくは約48時間後に投与する。別の実施形態では、二官能性分子の少なくとも約２時間後、例えば、約２時間後、約４時間後、もしくは約８時間後に投与する。しかし、２つの投与を実質的に同時に実施してもよいし、１以上の免疫共刺激部分を投与した後に第１結合対メンバーを投与してもよい。あるいは、第１結合対メンバーと免疫共刺激部分を単一の組成物として投与してもよい。複数の免疫共刺激部分で操作する場合には、これらの部分を単一の組成物として組合せてもよいし、実質的に同時または逐次（異なる時間で）投与する個別の組成物として投与してもよい。
【００８８】
結合対の第１メンバーおよび／または共刺激部分は、全身または局所的に、例えば、静脈、腹腔もしくは皮下注射により、患者に投与することができる。一実施形態では、腫瘍部位への直接注射により、例えば、腫瘍内注射によって、１以上の組成物を局所投与する。別の実施形態では、異なる経路により１以上の組成物を投与する。例えば、１以上の組成物を局所投与し、１以上を全身投与することができる。
【００８９】
本発明に従い、あらゆる細胞表面を操作することができる。一実施形態では、細胞表面は腫瘍細胞表面である。本発明が有用である代表的な腫瘍細胞として、限定するものではないが癌などが挙げられ、これは、肺、肝臓、乳房、皮膚、膀胱、胃、結腸、膵臓などの各種身体器官のいずれに由来するものでもよい。癌としては、器官または腺で発達する腺癌、扁平上皮に由来する扁平上皮癌が挙げられる。治療が可能なその他の癌として、以下のものが挙げられる：肉腫、例えば、骨肉種または骨原性肉腫（骨）、軟骨肉腫（軟骨）、平滑筋肉腫（平滑筋）、横紋筋肉腫（骨格筋）、中皮肉腫または中皮腫（体腔の内膜）、繊維肉腫（繊維組織）、血管肉腫または血管内皮腫（血管）、脂肪肉腫（脂肪組織）、グリオーマまたは星状細胞腫（脳に存在する神経結合組織）、粘液肉腫（原始胚結合組織）、esenchymousまたは中胚葉性混合腫瘍（混合結合組織型）。これらに加え、骨髄腫、白血病、およびリンパ腫も治療可能である。
【００９０】
様々な実施形態では、特定の腫瘍関連抗原（TAA）に対して免疫応答を誘発させる。特定の腫瘍タイプに関連する多数のTAAが確認されている。このようなものとして、以下のものが挙げられる：ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、サバイビン、MAGE-1、MAGE-3、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、癌胎児抗原、αフェトプロテイン、膵腫瘍胎児抗原、MUC-1、CA 125、CA 15-3、CA 19-9、CA 549、CA 195、前立腺特異抗原；前立腺特異膜抗原、Her2/neu、gp-100、突然変異K-rasタンパク質、突然変異p53、トランケート型表皮成長因子受容体、キメラタンパク質P210BCR-ABL；ヒトパピローマウイルスのE7タンパク質、およびエプスタイン−バーウイルスのEBNA3タンパク質。患者の抗腫瘍免疫応答を生じさせるかまたは増強するために、本発明に従い、上記抗原、その抗原断片、抗原および／または断片の混合物のいずれかを用いることができる。表５に、いくつかのTAAと、このようなTAAに関連する疾患の例を挙げる。
【表５】
2009518427.tif 000011
【００９１】
Ｔ細胞により認識されるその他のヒトTAAは、例えば、Novellinoら、「A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update」 Cancer Immunology and Immunotherapy, 54: 187-207（2005）（参照により本明細書に組み込まれる）に見いだすことができる。これら疾患の動物コレラリー（correllaries）、および他の動物疾患に対応する多数の動物TAAが当分野において公知であり、これらも本発明の範囲に含まれる。
【００９２】
また、ex vivoで操作し、患者に戻した（例えば、局所注射により）細胞表面も、本発明の方法に従い、in vivoで操作することができる。従って、例えば、本明細書に記載のように腫瘍細胞表面を操作するための組成物を投与する個体に、既に記載されるようにex vivoで操作した腫瘍細胞を投与してもよい。WO 02/02751を参照。
【００９３】
以下の実施例に示すように、腫瘍細胞表面などの細胞表面は１週間以上ビオチン化したまま維持することができる。従って、最初のビオチン化および／または最初の操作から最大１週間またはそれ以上まで、細胞表面を免疫共刺激ポリペプチドで操作することができる。例えば、ビオチン化後、１以上の免疫共刺激−ストレプトアビジン融合タンパク質を投与することにより、ビオチンで改変された腫瘍細胞表面上に免疫共刺激ポリペプチドを提示させることができる。次に、所定期間、例えば、数時間〜数日もしくは１週間以上経過後、ビオチンで改変された腫瘍細胞表面上に１以上の免疫共刺激ポリペプチドを提示させる目的で、１以上の免疫共刺激−ストレプトアビジン融合タンパク質（先に投与したものと同じかまたは異なる）を投与することにより、さらなる操作を達成することができる。これに加え、またはこれに代えて、２回目のビオチン化ステップを実施後、１以上の免疫共刺激−ストレプトアビジン融合タンパク質を投与することができる。
【００９４】
同じかまたは異なる免疫共刺激ポリペプチドで逐次操作することにより、治療効果を改善することができる。例えば、免疫応答の初期に作用する免疫共刺激ポリペプチドで、腫瘍細胞表面などの細胞表面を操作した後、免疫応答の後期に作用する免疫共刺激ポリペプチドで操作することができる。逐次投与の時間間隔は、実質的にゼロから、０〜数時間、１日〜数日、１週間またはそれ以上まで変動しうる。
【００９５】
一実施形態では、最初に、構成的受容体に結合する免疫共刺激分子（CD80、LIGHT、およびCD40Lなど）で、腫瘍細胞表面などの細胞表面を操作した後、誘導性受容体に結合する免疫共刺激分子（4-1BBLおよびOX40Lなど）で操作する。例えば、CD80および／またはLIGHTで腫瘍細胞表面を操作してから、例えば、２〜３日またはそれ以上経過後に、4-1BBLで操作する。
【００９６】
以下の表６に構成的および誘導性の共刺激分子の一覧を示す。
【表６】
2009518427.tif 000012
【００９７】
本発明に従い操作した細胞表面は、一時的ではあるが、一過性ではない期間の間、１以上の免疫共刺激ポリペプチドを保持する。例えば、in vivoで操作した細胞表面は、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも４日、少なくとも５日、またはそれ以上の期間の間、１以上の免疫共刺激ポリペプチドを保持しうる。
【００９８】
一実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドについて初めに陽性であった細胞の少なくとも約５％が、投与から約24時間後に陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約24時間後に、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約36時間後に、少なくとも約５％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約48時間後に、少なくとも約５％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約60時間後に、少なくとも約５％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約72時間後に、少なくとも約５％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約４日後に、少なくとも約５％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。
【００９９】
一実施形態では、投与から約５日後に、少なくとも約５％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約５日後に、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。例えば、注射後約５日目に、少なくとも５％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、もしくは少なくとも25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。別の実施形態では、投与から約７日後、または投与から約10日後に、少なくとも約５％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。例えば、注射後７または10日目に、少なくとも５％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、もしくは少なくとも25％の細胞が、投与した免疫共刺激ポリペプチドについて陽性を維持する。
【０１００】
癌免疫療法
本発明はまた、癌免疫療法のための方法、例えば、腫瘍サイズを縮小する方法、および腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。これらの方法によれば、前記のような１以上の免疫共刺激分子で腫瘍細胞表面を操作する。
【０１０１】
免疫療法の効果は、腫瘍細胞増殖および／または腫瘍サイズの低減を判定することにより評価することができる。腫瘍細胞の数は静的ではなく、細胞分裂中の細胞数と、死滅していく（例えば、アポトーシスにより）細胞数の両方を反映している。腫瘍細胞に対する個体の免疫応答を高めれば、細胞の増殖を阻害できると考えられる。本発明で用いる腫瘍細胞の増殖とは、所与の期間（例えば、時間、日、週、もしくは月）にわたる腫瘍細胞数の増加（in vitroまたはin vivoでの）を意味する。腫瘍細胞の増殖の阻害は、腫瘍細胞数の増加速度の低下、腫瘍細胞の完全な消失、または前記低下から前記消失までの間の任意の増殖低下により測定することができる。固形腫瘍のサイズ減少は、腫瘍細胞増殖の阻害を示すものである。
【０１０２】
操作した細胞による免疫刺激の欠失は、腫瘍細胞上に発現したMHC分子とＴ細胞との相互作用を物理的に阻止する免疫共刺激融合タンパク質によるものか、あるいは、細胞表面上に存在する共刺激ポリペプチドの数が最適に満たないことを原因とし得る。当業者は、免疫刺激活性を最適化するために、改変細胞表面に標的化される免疫共刺激ポリペプチドの量を変えることができる。
【０１０３】
組成物およびその組合せ
本発明はまた、本明細書に記載するin vivo操作方法に用いるための組成物および組成物の組合せを提供する。
【０１０４】
例えば、本発明は、免疫共刺激ポリペプチドと結合対メンバーとを含む融合タンパク質を含む、免疫共刺激部分を含む組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１可溶性融合タンパク質を含む組成物を提供する。具体的な一実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、もしくはAPRILを含む。別の実施形態では、免疫共刺激ポリペプチドはCD80またはCD40Lを含む。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１可溶性融合タンパク質、および第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第２可溶性融合タンパク質を含む組成物を提供する。第１または第２免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80もしくはCD40Lであり、結合対の第２メンバーはストレプトアビジンであることができる。一実施形態では、上記組成物は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７および配列番号９からなる群より選択される配列を含む１以上の可溶性融合タンパク質を含む。別の実施形態では、本発明は、LIGHTと結合対の第２メンバーとを含む可溶性融合タンパク質、CD80と結合対の第２メンバーとを含む可溶性融合タンパク質、および4-1BBLと結合対の第２メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物を提供する。また、上記組成物は、細胞表面のin vivo操作を実施するための投与についての説明書と一緒に提供することができる。
【０１０６】
本発明の組成物は、随意に、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体は、組成物のビヒクルとして使用できる物質である。何故なら、このような物質は、不活性であるか、あるいは薬剤として許容され、しかも、投与に関して、活性物質と適合性だからである。薬学的に許容される担体は、希釈剤や防腐剤など、慣用の医薬添加物を含んでもよい。
【０１０７】
本発明はまた、第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１可溶性融合タンパク質を含む第１組成物、および第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第２可溶性融合タンパク質を含む第２組成物、を含む組合せを提供する。一実施形態では、結合対の第２メンバーはストレプトアビジンである。一実施形態では、少なくとも第１または第２免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL（例えば、B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50およびLICOSなど）、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80もしくはCD40Lからなる群より選択される。別の実施形態では、少なくとも第１または第２可溶性融合タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７および配列番号９からなる群より選択される配列を含む。別の実施形態では、上記組合せは、LIGHTと結合対の第２メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物、CD80と結合対の第２メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物、および4-1BBLと結合対の第２メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物、を含む。上記組合せの各組成物は、個別の容器に入れて提供することができる。上記組合せはまた、細胞表面のin vivo操作を実施するための組成物の同時または逐次投与についての説明書と一緒に提供することができる。
【０１０８】
以下の実施例は本発明をさらに詳しく説明するものであり、如何なる点においても本発明の範囲を制限する意図はない。
【実施例】
【０１０９】
実験方法
使用する腫瘍モデルは、A20腫瘍モデルを含み、ルイス肺癌（LLC）細胞株を移植可能なマウス肺固形腫瘍モデルとして用いる。LLCを選択したのは、一部には、肺癌が米国における男女の癌による死亡の主要な原因であるという事実による。LLC固形腫瘍は、マウスにおいて樹立させることができ、例えば、ビオチン部分、次に２つ以上の免疫共刺激−ストレプトアビジン融合タンパク質の組合せを同時または逐次的に腫瘍内注射することにより、免疫共刺激ポリペプチドの提示のためにin vivoで操作することができる。腫瘍を手術により除去し、細胞表面ビオチンおよび免疫共刺激ポリペプチドの存在について分析することによって、免疫共刺激ポリペプチドの組合せで腫瘍細胞がin vivo操作されて、癌に対する患者の免疫応答を改善できることを明らかにする。
【０１１０】
動物．Jackson Laboratories（Bar Harbor、メイン州）から成体の近交系C57BL/6およびBALB/cマウスを購入するか、またはルーイビル大学の動物コロニーにおいて繁殖させる。
【０１１１】
RNA調製．目的とする細胞または組織を回収し、その直後、Trizol（InVitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）でホモジネートする。製造者のプロトコルに従い、全RNAを単離する。純粋なRNAをピロ炭酸ジエチル処理水（RNAse阻害剤を補充）に溶解させ、小アリコートに分配した後、使用まで−70℃で保存する。各RNAアリコートは１回だけ解凍し、不使用部分は廃棄することにより、凍結と解凍の繰返しの結果であるRNAの不安定性に伴う変動を排除する。
【０１１２】
融合タンパク質のクローニングおよび発現．昆虫発現系においてヒトCD80およびマウス4-1BBLをクローンニングし、発現させた。Singhら、2003, Cancer Res., 63:4067-73参照。LIGHTのクローニングのために、マウス脾細胞を10 ng／mL PMAおよび0.5μMイオノマイシンと共に３時間活性化させ、全RNA抽出のためにプロセシングさせる（同上参照）。２mgの全RNAを第１鎖cDNAに変換した後、Yuら、2004, Nat. Immunol., 5:141-9に記載のようにPCRでメタロプロテイナーゼ切断を欠いたLIGHTの細胞外部分に特異的なプライマーを用いて増幅する。配列確認後、標準的分子方法を用いて、ショウジョウバエ（Drosophila）pMT/BiP/V-His発現ベクター（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）においてコアストレプトアビジン（SA）に対しＣ末端でサブクローニングする。
【０１１３】
トランスフェクション．Yolcuら、2002, Immunity, 17:795-808に既に記載されているように、Calcium Phosphate Transfectionキットを用いて、20μｇプラスミドDNAでショウジョウバエ（Drosophila）S2の一過性トランスフェクションを実施する。トランスフェクションから１〜４日後、培地に硫酸銅を500μMの最終濃度まで添加することにより、S2細胞における発現を誘導する。一過性トランスフェクタントについて記載されるのと同様の実験条件下にて、20：１（ベクター：目的物）の比でpCoHYGROベクターとの共トランスフェクションを用いることにより、安定な形質転換体を樹立する。３日後、300μg／mlのハイグロマイシンの存在下で形質転換体を維持し、３〜５日おきに培地を取り替える。次いで、96タイタープレートにおいて0.3細胞／ウェルで安定な形質転換体をクローニングすることにより、高度発現するものを同定する。これらの遺伝子の発現は、ElISA、免疫沈降、およびウェスタンブロットで、6xHis-タグ（QIAGEN、カリフォルニア州バレンシア）に特異的な抗体を用いて判定する。
【０１１４】
組換えタンパク質の精製．組換え融合タンパク質を6-His-タグと一緒に発現させ、これをニッケル−ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（QIAGEN）を用いたラージスケール精製に使用する。手短には、安定な形質転換体を血清無含培地で増殖させ、硫酸銅を用いて24時間誘導させる。培養培地を１：１の比で2X Native Bindingバッファーと混合し、Ni-NTAアガロースビーズを含むカラムにロードする。洗浄バッファー（50 mM NaH2PO4 pH8.0；300 mM NaCl；20 mM イミダゾール）で入念にカラムを洗浄した後、融合タンパク質を溶出バッファー（50 mM NaH2PO4 pH8.0；300 mM NaCl；250 mM イミダゾール）で溶出させる。単離したタンパク質の純度をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定する。Bradfordアッセイを製品説明書（BioRad、カリフォルニア州ハーキュレス）に従って用い、タンパク質濃度を測定する。
【０１１５】
ELISA．A20またはLLC腫瘍間質細胞によるCCL21発現をELISAにより判定する。手短には、腫瘍を再切除し、機械処理により単細胞懸濁液とする。これらの細胞を様々な濃度のCSA-LIGHT（１〜5,000 ng／ml）と一緒に様々な時間（２〜５日）インキュベートする。培養上清を回収し、市販の抗マウスCCL21 Abs（R & D Systems Inc.ミネソタ州ミネアポリス）を用いてCCL21の存在について試験する。Yangら、2004, Clin. Cancer Res., 10:2891-901参照。CSA-LIGHTを含まないかまたはCSA対照タンパク質を含む培養物、およびプレートに結合したLIGHTと一緒にインキュベートした培養物をそれぞれ陰性および陽性の対照として用いる。
【０１１６】
細胞表面の操作．LLCまたはA20腫瘍細胞を氷冷PBSで洗浄し、５〜15μM EZ-LinkTM Sulfo−NHS-LC-Biotin（Pierce）を含むPBS（pH8.0）中、２ｘ107細胞／mlでインキュベートする（室温、30分）。細胞を入念に洗浄し、４℃にて、100 ng／精製免疫共刺激−ストレプトアビジン融合タンパク質と一緒に１ｘ106細胞／mlで45分インキュベートする。PBSで入念に洗浄した後、細胞を処理してフローサイトメトリー分析に付すことにより、免疫共刺激融合タンパク質で操作された細胞を評価する。このような細胞は、in vitroでの機能試験にも用いる。in vitro試験で使用する前に、細胞を100 Gyで放射線照射する。
【０１１７】
混合リンパ球腫瘍反応物（MLTR）．リンパ節（LN）細胞を目的のマウスから採取し、単細胞懸濁液に処理し、完全混合リンパ球反応（MLR）培地（10 mM HEPES、100 U／mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン、274μM L-アルギニン、および５％プールマウス血清を補充したRPMI-1640）中に再懸濁させ、抗原不一致（antigenic disparties）を有する様々な遺伝子系列由来の放射線照射済（100 Gy）腫瘍細胞に対するレスポンダーとして用いる。インキュベーションから３〜５日後、１μCi／ウェルの[3H]チミジン（NEN Life Sciences Products、マサチューセッツ州ボストン）で、培養期間最後の18時間にわたり培養物をパルスし、細胞増殖の評価のために回収する。未改変細胞および対照CSAタンパク質を修飾（decorated）した細胞を対照として用いる。
【０１１８】
細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）アッセイ．目的とするマウスのLN由来のエフェクター細胞（５ｘ106）を、60 IU／mlのIL-2で補充した完全MLTR中で、同数の放射線照射済（100 Gy）腫瘍細胞（修飾なし）と一緒に５日間培養して作製する。Lympholyte（登録商標）-M（Accurate Chemical and Scientific Corporation、ニューヨーク州ウエストベリー）を用いてエフェクター細胞を回収し、JAMアッセイにおいて様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞に対して用いた。Matzinger, 1991, J. Immunol. Methods, 145:185-92を参照。
【０１１９】
In vivo腫瘍操作および免疫療法．B6またはBALB/cマウスに対し、致死用量（例えば、１ｘ105〜１ｘ106）のLLCまたはA20生細胞をそれぞれ側腹部に皮下投与することによりチャンレジする。腫瘍サイズが直径６〜８mmに達したら、300μlのビオチン、次に、免疫共刺激-ストレプトアビジン融合タンパク質を腫瘍に注射する。対照は、未改変腫瘍、およびCSAタンパク質で改変した腫瘍を含む。腫瘍の直径をカリパス測定により測定し、週３回測定した最長直径の平均および垂直直径±標準誤差として表す。腫瘍サイズが約20 mmの直径に達したらマウスを安楽死させる。
【０１２０】
サイトカイン発現のための競合RT-PCR．目的のサンプルから全RNAを調製し、オリゴ(dT)18を用いた第１鎖cDNA合成のために、20μl反応混合物中で2μgの全RNAを用いる。Mhoyanら、1997, Transplantation, 64:1665-70；Shirwanら、1998, Transplantation, 66:1802-9参照。IL-12、IL-10、およびIFN-γ、TGF-β、CCL21-特異的5’および3’プライマーを用いて、２μlの上記反応混合物を増幅する。PCR条件は、次の通りである；94℃での変性45秒、60℃でのアニーリング60秒、および72℃での伸長90秒を25〜38サイクル。各反応混合物は、各サイトカイン用のプライマー対の配列を有するインサートを含む既知量のプラスミドベクターも含有する。これは、所与のサンプル中のサイトカイン各々についての転写産物のコピー数を推定するための競合的鋳型として役立つ。PCR産物は、１％アガロース中で分画し、EtBr染色により視覚化し、BioRadGelDoc系を用いて分析する。競合物質および試験物質に対応するバンドの強度を濃度測定スキャンにより推定し、これを用いて、全RNA１μg当たりのサイトカイン特異的転写物の総数を推定する。マウスHPRTの発現を用いて、RNAの量を測定し、さらに、様々なサイトカイン分析に用いるcDNAの量を標準化する。cDNAを含まない完全PCR混合物を陰性対照として用いる。
【０１２１】
フローサイトメトリー．免疫共刺激融合タンパク質をその受容体に結合させるため、Lympholyte（登録商標）-M（Accurate Chemical and Scientific Corporation、ニューヨーク州ウエストベリー）を用いて、マウス脾細胞を単離し、様々な濃度（10〜1,000 ng／ml）の融合タンパク質と一緒にインキュベートした後、フローサイトメトリーにおいて、CD4、CD8、およびCD11cに対する抗体と組み合わせて、各分子に対する蛍光標識抗体で染色する。組換えコアSAと一緒にインキュベートした細胞を陰性対照として用いる。一般的には、まず目的の一次および二次抗体を滴定した後、標準的手順を用いたフローサイトメトリーにおいて最適濃度を用いることにより、マルチカラーフローサイトメトリー分析を実施する。例えば、Mhoyanら、1997, Transplantation 64: 1665-70を参照されたい。陰性対照としてイソタイプ適合型抗体を用いる。サンプルはFACS CaliburまたはVantage Sorter（Becton Diskinson）を通過させる。FlowJoまたはCellQuestソフトウエアを用いて分析を実施する。
【０１２２】
統計．カプラン−マイヤー曲線を用いて腫瘍生存に対する実験治療の効果を推定する。異なる群間の生存率の差はログランク検定（一般化Savage/Mantel Cox）を用いて評価する。個々のマウスの群から得た実験データの比較を含む手順は、Ｆ‐検定（２群）またはレーベン検定（複数群）を用いて検定される分散の同等性を有する。分散が等しくない場合には、対数変換を実施する。正規分布したサンプル平均を比較する必要があるときは、スチューデントのｔ−検定（２群）またはノイマン-ケウルス検定（複数群）を用いる。データが正規分布していない場合には、マン−ホイットニーU検定（２群）またはクラスカル−ワオリス検定（複数群）を用いる。統計上の有意性はＰ＜0.05として定義する。
【０１２３】
実施例１：
本実施例の結果から、（１）生理学的条件下で腫瘍および一次細胞を有効にビオチン化することができ、ビオチンが細胞表面上に数週間存続すること；（２）ビオチン化細胞を複数の融合タンパク質で操作することができ、これらの融合タンパク質が、長期間（数日〜数週間）にわたり細胞表面上にin vivoで存続すること；（３）LLCまたはA20腫瘍生細胞の皮下注射により、同系マウスに固形腫瘍が生じることを明らかにする。このデータは、CD80の提示のために腫瘍をin vivoで操作可能であることを示している。
【０１２４】
Ａ．細胞表面改変
Pierce Biotechnology, Inc.（Rockford, IL）製のEZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-ビオチン誘導体を用いて一連の試験を実施することにより、細胞の生存能および機能を損なわないビオチン化条件を確立した。５〜50μＭの範囲のビオチン化はこれらの基準を満たし、外来タンパク質の最適な提示に有効な基準を提供した。Yolcuら、2002、Immunity, 17:795-808。
【０１２５】
in vivoにおける細胞表面上でのビオチン存続の動態を評価するために、ラット脾細胞をin vitroでビオチン化（５〜15μＭ）し、細胞内染料であるカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識し、同系マウスに静脈内注射した。注射後、様々な時点で脾細胞を採取し、ストレプトアビジンアロフィコシアニン（ストレプトアビジンAPC）を用いて、細胞表面上のビオチンの存在についてフローサイトメトリーによりCFSE陽性細胞を分析した。in vivoにおける細胞表面上のビオチンのt1/2は、15日より長いことがわかった。図６；Singhら、2003, Cancer Res., 63:4067-73を参照。
【０１２６】
15μMビオチンで標識し、ConAの非存在下または存在下で様々な時間培養した脾細胞について、細胞膜上のビオチンの存続を評価した。細胞を回収し、ストレプトアビジン反応性ビオチンについてフローサイトメトリーを用いて分析した。ビオチンは、休止（図７Ａ）および増殖（図７Ｂ）脾細胞の場合、それぞれ、t1/2＞20および18日という長い期間、細胞表面上に存在した。20日目には、非分裂細胞の53％がビオチン陽性であったのに対し、分裂細胞では36％しかビオチン陽性と記録されなかった。
【０１２７】
また、大動脈内皮細胞を用いても、同程度のビオチン存続が観察された。内皮細胞のビオチン細胞表面安定性の動態は、初期に推定した７日のt1/2と、その後の20日以上の長いt1/2と、二段階であった（図７Ｃ）。内皮細胞上のビオチンが初期に急速に減少したのは、恐らく分裂希釈に起因するものであり、二段階の時間経過は、細胞増殖と、培養物のコンフルエントに向かう増殖の低下の動態を反映していると考えられる。In vivo試験により、ビオチンは細胞表面に数週間存続することが示された。
【０１２８】
A20細胞を用いてもビオチン存続が証明された。百万個のA20細胞をナイーブBalb/cマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖をモニターし、腫瘍サイズが直径６〜８mmに達したら、様々な用量のビオチン溶液（300μlのPBS中、0.5 mM、１mMおよび５mM）を腫瘍内注射した。ビオチン注射から１日、３日、５日後に、各群につき３匹のマウスを安楽死させた。腫瘍を手術により除去し、機械処理して単細胞懸濁液にした。百万個の細胞をストレプトアビジンAPCで染色し、非ビオチン化腫瘍細胞を陰性対照として用いた。フローサイトメトリーおよびCellQuestソフトウエアを用いて細胞を分析した。PBS300μl当たり0.83 mg のEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin（分子量556.59、Pierce）を溶解させることにより、ビオチン溶液を０日目の新鮮な５mMストックとして調製した。濃度を下げるため、ビオチンストックをPBSで希釈（１：５および１：10）した。
【０１２９】
結果を図13に示すが、この図から、５mMのビオチンで処理した細胞の約66％が５日後もビオチン化を維持していることがわかる。３日目に94％がビオチン化を維持し、7日目には７％がビオチン化を維持していた。0.5 mMのビオチンで処理した細胞の場合、1日目に約86％がビオチン化を維持し、３日目には44％がビオチン化を維持していた。１mMのビオチンで処理した細胞については、1日目に約95％がビオチン化を維持し、３日目には67％がビオチン化を維持し、５日目には27%がビオチン化を維持し、そして７日目には３％がビオチン化を維持していた。
【０１３０】
これらのデータから、第１結合対メンバーとしてビオチンを含む二官能性分子は、in vivoで数週間または数ヶ月細胞表面上に存続しうるため、これを用いて複合体形成し、これにより、細胞表面上に、免疫共刺激ポリペプチドに結合したストレプトアビジンまたはその機能的断片を含む融合タンパク質を長期間にわたって提示できることが明らかになった。
【０１３１】
Ｂ．Ex vivo細胞表面操作
ビオチンでex vivo標識しておいた腫瘍細胞の表面に、免疫共刺激融合タンパク質を共提示させることができる。
【０１３２】
Pierce Biotechnology, Inc.（Rockford, IL）製の15μMのEZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin誘導体をPBS中で用いて、室温で20〜30分間、百万個のLLC細胞をビオチン化した。次に、遠心分離によりビオチンを除去し、細胞を１回洗浄し、新しい別のチューブに移し、１〜２回以上洗浄した後、PBS中で、CD80-CSAおよび4-1BBL-CSA融合タンパク質と100 ng／タンパク質／106細胞で30〜45分間氷上で接触させた。次に、細胞を入念に洗浄し、これら細胞を、30〜45分氷上でインキュベートすることにより、PBS中のCD80および4-1BBLに対する飽和濃度の様々な蛍光色素コンジュゲート型抗体で染色した。次に、細胞をFACS培地で入念に洗浄し、フローサイトメトリー分析に用いた。いずれの融合タンパク質も、同等レベルで腫瘍細胞の表面に共提示された（図８）。提示された融合タンパク質は、特異的抗体による内因性細胞膜タンパク質の検出を有意に改変しなかった。
【０１３３】
A20細胞をビオチン化（５μM）し、CD80-CSAおよび4-1BBL-CSA融合タンパク質と100 ng／タンパク質／106細胞で接触させた後、前記と同様の手順を実施した。いずれの融合タンパク質も同等レベルで腫瘍細胞の表面上に共提示された（図14）。
【０１３４】
Ｃ．Ex vivo操作した腫瘍上でのタンパク質提示のin vivo動態
細胞表面上での外来タンパク質の存続の動態をin vivoで決定した。脾細胞をビオチン（15μM）で改変し、CD80-CSA融合タンパク質（100 ng／１ｘ106細胞）で操作し、CFSEで標識し、同系マウスに静脈内注射した。注射後の様々な日に脾細胞およびLN細胞を採取し、CFSE陽性細胞上の融合タンパク質の存在について分析した。CD80-CSAは、脾細胞の表面に、t1/2＞10日で存続した（図９）。
【０１３５】
これらのデータから、免疫共刺激融合タンパク質で操作した腫瘍細胞は、操作細胞または宿主患者（または試験動物）に検出可能な毒性を全く与えることなく、数週間にわたってin vivoで細胞表面にこれらのタンパク質を保持できることがわかった。
【０１３６】
Ｄ．Ex vivo操作により達成される高い提示レベル
様々なタンパク質濃度に応じた細胞に提示されるCD80-CSA分子の数を推定するため、A20 Bリンパ腫細胞を５μMビオチンでビオチン化し、100μL食塩水中で、CD80（100 ng／106細胞）により4℃で30分操作し、これを２回繰り返した。細胞をフィコエリトリン（PE）コンジュゲート型抗ヒトCD80抗体で染色した。Bangs Laboratories製のQuantum-27 MESFキットを用いて、１細胞当たりのCD80-CSA分子の数を推定した。Cell Quest分析プログラム（Becton Dickinson Biosciences）を用いて、様々なMESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）値（０、727、2737、10110、41738）を有する５つのMESFビーズにより作成した検定曲線に従い、サンプルについてMESFを計算した。各サンプルのデータをMESF値に変換した（図10）。
【０１３７】
細胞表面上のCD80-CSA分子の数とタンパク質の量との間には100ngまで直接相関が認められた。前臨床試験（以下参照）において癌ワクチンに用いたこのタンパク質濃度では、１細胞当たり平均118,000個の分子があり、これは、生理学的条件下での活性化Ｂ細胞またはDC１個当たりの6,000〜12,000個のCD80分子とは対照的なはずである。Bergwelt-Baildonら、2002, Blood, 99:3319-25参照。
【０１３８】
Ｅ．CD80-SA操作細胞により誘導された自己／アロ反応性応答
CD80-CSAが機能的であり、Ｔ細胞免疫応答を生じさせるか否かを試験するために、一次腫瘍細胞と、CD80-SAを提示する樹立腫瘍細胞株とを用いて、MLTRアッセイを実施した。CD80-CSAで操作したヒト腫瘍細胞株（HEC-1-A、子宮内膜癌）は、健康なボランティアからの末梢血液リンパ球において強力な増殖応答を生じさせた。非操作腫瘍細胞、またはS2培養物上清で処理したビオチン化細胞は最小限の増殖応答しか誘発しなかったことから、上記の増殖応答はCD80-CSA特異的であった。観察された増殖応答は、CD4+Ｔ細胞より、CD8+Ｔ細胞により関連していた（図11）。これらデータから、CD80-CSAで操作した腫瘍細胞は、Ｔ細胞増殖を引き起こす有効な共刺激シグナルを発生することがわかる。
【０１３９】
Ｆ．4-1BBL操作による免疫モジュレーション
CD4+およびCD8+Ｔ細胞は、ナイーブC57B/6（H2-Kb）マウスの脾臓およびリンパ節からFACS選別し、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）で染色した。手短には、細胞をPBSで洗浄し、４mlの2.5μM CFSE／１ｘ106細胞中、室温で７分インキュベートした。次に、細胞を２容量のFBS中で１分インキュベートし、PBSで２回洗浄した。A20 Bリンパ腫細胞（H2-Kd）をPBS中で洗浄してから、新しく調製したEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinを用いてPBS中（溶液１ml／50ｘ106細胞）、室温で30分ビオチン化した。PBSで洗浄後、細胞を10,000 cGyで放射線照射した。冷蔵室において、ビオチン化および放射線照射済A20細胞をCSA-4-1BBL(100 ng／１ｘ106細胞)または対照タンパク質CSA（38 ng／１ｘ106細胞）と一緒に５mlチューブ中で30分インキュベートした。細胞を入念に洗浄した後、細胞のいくつかを4-1BBLおよびストレプトアビジンに対する蛍光色素コンジュゲート型抗体で染色することにより修飾を検出するか、または蛍光色素コンジュゲート型ストレプトアビジンで染色することによりビオチン化を検出した。96-ウェルプレートにおいて、CFSE標識の選別CD4+またはCD8+Ｔ細胞（１ｘ105／ウェル）を放射線照射済A20細胞、放射線照射済／ビオチン化A20細胞、または放射線照射済／ビオチン化／修飾A20細胞と一緒に４：１の比で４日間インキュベートした。
【０１４０】
蛍光色素コンジュゲート型抗CD4または抗CD8抗体で細胞を染色した後、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞の増殖を判定した。CSAで修飾した対照（8.6％）と比較して、4-1BBLで修飾したA20細胞（52.6％）に対する活発な増殖応答が認められた（図15）。
【０１４１】
これらのデータから、4-1BBLで細胞を操作するとTeff機能を増強するため、本発明に従って4-1BBLを使用することにより、有効な免疫モジュレーションが達成されることがわかる。
【０１４２】
Ｇ．固形腫瘍のin vivo操作
百万個のA20 Bリンパ腫生細胞をナイーブ同系Balb/cマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍サイズが直径７〜９ｍｍに達したら、PBS中300μLの１mM EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinを腫瘍に注射し、24時間後、150μL PBS中40μgのCD80-CSA融合タンパク質を腫瘍内注射した。腫瘍細胞を回収し、タンパク質注射から24時間後に分析した。ストレプトアビジン-APCによりビオチンレベルを検出し、CD80に対する抗体により融合タンパク質レベルを検出した。未処理の腫瘍およびビオチン化腫瘍由来の細胞をそれぞれビオチンおよびCD80についての陰性対照として用いた。
【０１４３】
ビオチンの注射から48時間後、腫瘍細胞の98％がビオチンについて陽性であり、CD80融合タンパク質の注射から24時間後、81％がCD80について陽性であった（図12）。データは、細胞表面上の別のビオチン部位はSAとの結合に利用可能であることを示す。従って、ビオチンを含む追加の二官能性分子で細胞を処理することなく、同じかまたは異なる免疫共刺激ポリペプチドを含む別の免疫共刺激−ストレプトアビジン融合タンパク質で、細胞表面を逐次操作することができる。
【０１４４】
これらの結果から、免疫共刺激ポリペプチドで腫瘍をin vivoで操作することができ、該免疫共刺激ポリペプチドは腫瘍細胞の表面にin vivoで長期間存続することがわかる。
【０１４５】
同様のプロトコルを実施し、ビオチン化後のCD80-CSA投与のタイミングの影響を評価した。１ｘ106個のA20細胞をナイーブBALB/cマウスの右背側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖をモニターし、カリパスを用いて週３回測定した。腫瘍サイズが平均直径７〜９mmに達したら、300μLの５mM ビオチン溶液（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinのPBS溶液）を腫瘍に注射した。ビオチン注射から２、４、８もしくは16時間後、前記のようにビオチン化を評価し、50μgのCD80-SAを腫瘍内注射により投与した（何匹かのマウスは、陰性対照として処理しないままにした）。CD80-SA注射から16時間後、マウスを安楽死させた。腫瘍を処理して単細胞懸濁液にし、フローサイトメトリーを用いて、CD80に対する抗体により、融合タンパク質レベルを検出した。結果（図16）から、ビオチン投与から16時間後に融合タンパク質を投与したとき、ビオチン投与から８、４および２時間後にそれぞれ得られた49％、31％および10％と比較して、62％のビオチン化細胞が修飾されており、ビオチン化細胞の修飾率が高いことがわかる。
【０１４６】
実施例２
この実施例は、２以上の免疫共刺激ポリペプチド（例えば、LIGHT、CD80、4-1BBL、CD40L、OX40L、PD-L1およびGL50ポリペプチドのうち２つ以上）の組合せを有効かつ持続的に提示させるための、腫瘍表面のin vivoでの操作について説明する。
【０１４７】
Ａ．ビオチン化
腫瘍細胞のin vivoでのビオチン化のための有効なビオチン用量と、このような腫瘍細胞の表面でのビオチン存続の動態を決定することができる。in vivoで有効なレベルのビオチンコンジュゲーションを次のように定義することができる（i）腫瘍細胞の＞50％のビオチン化；（ii）ビオチン化後の５日間、最初にビオチン陽性であった腫瘍細胞の少なくとも50％の表面にビオチンが存続しており、その際、ビオチン陽性細胞の平均蛍光強度が＞70である；および（iii）腫瘍または患者のいずれに対しても検出可能な毒性がない。
【０１４８】
これらの基準を満たすビオチンの用量は、ビオチン化直後に腫瘍細胞１個当たり＞100,000個の免疫共刺激融合タンパク質分子の提示を、およびビオチン化から５日目に細胞1個当たり＞12,000分子の提示を可能にするものでなければならない。後者の数は、活性化APC表面でのCD80の生理学的発現に基づくものである。Bergwelt-Baildonら、2002, Blood, 99:3319-25を参照。
【０１４９】
最初の抗原チャレンジから24〜72時間後にＴ細胞応答（抗腫瘍免疫応答を含む）が起こること、および、有効な抗腫瘍応答を生じさせるのにすべての腫瘍細胞が免疫共刺激分子を発現する必要はないことから、前記のビオチン化基準を本発明に従って用いれば、強力な抗腫瘍免疫応答を達成すると予想される。例えば、５日目に50％がビオチン陽性を維持する腫瘍細胞のパラメーターは、操作された腫瘍細胞表面が、５日の期間を越えても免疫共刺激ポリペプチドを提示し、必要であれば、上記の通り、それ以上ビオチン化することなく、追加の免疫共刺激ポリペプチドで再度操作できることを確実するものと考えられる。
【０１５０】
例えば、100〜200μLの様々な濃度（例：０、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mM）のEX-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotinを腫瘍内に注射した後、腫瘍中でビオチン化の程度を測定することができる（腫瘍サイズによっては、さらに多量の溶液を用いることができる）。次に、注射後の様々な時点で腫瘍を採取し、単細胞懸濁液に調製し、腫瘍細胞、腫瘍浸潤宿主細胞、例えば、Ｔ細胞（CD3）、Ｂ細胞（CD19）、およびDC（CD11c）上のビオチンの存在についてフローサイトメトリー（例えば、SA-APCを用いて）により分析する。
【０１５１】
末梢血液細胞および腫瘍排出（tumor draining）LNも、ビオチン陽性細胞の存在について分析することができ、これらの細胞は、もし存在すれば、ビオチンの漏出、ならびに末梢細胞の修飾および／またはビオチン化細胞の腫瘍から末梢への移動によるものであり得る。生存および腫瘍増殖について患者をそれぞれモニターすることにより、試験したビオチン用量が検出可能な任意の毒性を伴うか否かを判定する。
【０１５２】
ビオチンの用量が増加すると、腫瘍細胞（および腫瘍内に存在する宿主細胞）の表面に提示されるビオチンのレベルも高くなると考えられる。同様に、投与するビオチンの用量が増加すれば、標的化細胞上のビオチン存続の動態も長くなる。ビオチンの細胞表面動態の大部分が、ビオチンがコンジュゲートする細胞表面分子の正常なターンオーバー、および細胞分裂に応じたビオチンの希釈によって調節されると仮定すると、DCのように休止の細胞について観察されるビオチンターンオーバーの動態は、より遅速になるであろう。
【０１５３】
Ｂ．免疫共刺激−CSA融合ポリペプチドの特性決定
以下にさらに詳しく説明するように、免疫共刺激ポリペプチドとストレプトアビジンとを含む融合ポリペプチドを作製し、in vitroで機能的および構造的に特性決定し、大量に精製する。
【０１５４】
免疫共刺激ポリペプチドとCSAとを含む多数の融合ポリペプチドがクローニングおよび発現されている。これらのおよび他の例示的な融合ポリペプチドの配列、ならびにそれらのヌクレオチド配列を図１〜５に記載する。当業者は、前述および後述のものを含む当分野で公知の技術を用いて、このようなポリペプチドを作製することができる。
【０１５５】
活性化（PMAおよびイオノマイシン）マウス脾細胞からLIGHTをクローニングし、DES発現ベクターにおいてコアストレプトアビジンに対しＣ末端に配置する。Yolcuら、2002, Immunity, 17:795-808；Askenasyら、2003, Circulation, 107:41-7；Singhら、2003, Cancer Res., 63:4067-73を参照。Calcium Phosphate Transfectionキットを製品説明書（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）に従って用いて、ショウジョウバエ（Drosophila）S2細胞を20μgのプラスミドDNAでトランスフェクトして、安定な形質転換体を樹立させる。0.5 mM硫酸銅で融合細胞の発現を誘導する。Ni-NTAカラムと6xHis-タグとを用いて、融合タンパク質を大量に精製する。
【０１５６】
マウス4-1BBLおよびLIGHT分子に対する抗体、および上記実施例１に記載したフローサイトメトリーを用いて、精製した融合タンパク質をＴ細胞上のそれぞれの受容体との結合について試験する。Ｔ細胞上で4-1BBの発現は誘導性であり、また、HVEMは構成的に発現される（Granger & Rickert, 2003, Cytokine Growth Factor Rev., 14:289-96）ため、活性化していないままの脾細胞、またはConAで３日間活性化した脾細胞を用いる。Lympholyte（登録商標）-M（Accurate Chemical and Scientific Corporation、ニューヨーク州ウェストベリー）を用いて、活性化および非活性化脾細胞を単離し、様々な濃度（10〜1,000 ng／ml）の融合タンパク質と一緒にインキュベートする。インキュベーション後、それぞれの融合タンパク質に対する蛍光標識抗体、ならびに、様々な細胞表面分子（例えば、CD4およびCD８）に対する抗体の組合せで細胞を染色して、フローサイトメトリー分析に付す。組換えコアSAと一緒にインキュベートした細胞を陰性対照として用いる。
【０１５７】
以下のように、腫瘍繊維芽細胞をin vitroで活性化するLIGHTの能力を動物モデルにおいて試験することができる。手短には、１ｘ105個の同系LLC腫瘍生細胞をB6マウスに皮下接種し、腫瘍が直径15 mmに達したら、手術によりこれを再切除する。腫瘍を機械的に処理して単細胞懸濁液にし、様々な量のLIGHTタンパク質（１〜5,000 ng／ml）の存在下で様々な期間（２〜５時間）培養する。培養物上清を回収し、実施例１に記載のようにELISAによりCCL21ケモカインの存在について試験する。LIGHTを含まないか、またはCSA対照タンパク質を含む培養物、ならびに、プレートに結合したLIGHTとインキュベートした培養物をそれぞれ陰性および陽性対照として用いる。
【０１５８】
LLC細胞の表面に提示される免疫共刺激融合ポリペプチドは、免疫活性化のための共刺激分子として機能する能力について試験することができる。動物モデルでは、LLC細胞はMHCクラスＩ分子をごくわずかに発現するだけで、検出可能なレベルのクラスII抗原または共刺激分子（例えば、LIGHT、CD80、もしくは4-1BBL）を発現し損なう。このように、LLC細胞は同種異系T細胞を刺激することができない。混合リンパ球反応（MLR）アッセイを用いて、融合タンパク質が、腫瘍細胞をプロフェショナルAPCに変換し、生産的Ｔ細胞応答を生じさせるか否かを試験する。手短には、１mlのPBSにおいてEX-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin（５μM）を室温で30分用いて、腫瘍細胞（１×106）をビオチン化する。PBSで数回洗浄した後、個別にまたは種々の組合せで、免疫共刺激−CSA融合ポリペプチド（50〜100 ng／タンパク質／106細胞）と一緒に、４℃で45分インキュベートする。PBSで数回洗浄した後、適切な蛍光色素コンジュゲート型モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより、細胞表面上のキメラ分子の存在を判定する。これらの細胞を100 Gyで放射線照射し、スティミュレーターとして、ナイーブ同系（B6）または同種異系（BALB/c）マウスから採取したリンパ球と共に１：１の比で用いる。培養物を3[H]チミジンで18時間パルスした後、回収して細胞増殖を測定するが、これはDNA組込まれた放射活性により評価する。細胞を培養から３、４、および５日後に回収し、増殖の動態を決定する。対照として、レスポンダーのみ、スティミュレーターのみ、および対照SAで修飾した腫瘍細胞と共インキュベートしたレスポンダーを用いる。
【０１５９】
LIGHT分子を含む融合ポリペプチドは、腫瘍間質細胞を刺激して、CCL21を分泌させることができ、腫瘍細胞の表面に提示されると、有効なＴ細胞増殖応答をin vitroで生じさせることができる。
【０１６０】
Ｃ．共刺激ポリペプチドの組合せによる操作
LIGHT、CD80、4-1BBL、CD40L、OX40L、PD-L1およびGL50のような免疫共刺激ポリペプチドは、一緒に用いて相加的、また潜在的には相乗的様式で機能しうる。これは、２つ以上の免疫共刺激ポリペプチドの組合せで腫瘍細胞を操作したときの方が、１つの免疫共刺激融合ポリペプチドのみが細胞表面に提示されるときより、観察される増殖効果が大きいことを意味する。
【０１６１】
Ｄ．組合せin vivo操作の評価
以下の試験を用いて、in vivo操作した腫瘍細胞の表面上のキメラLIGHT、CD80、4-1BBL、CD40L、OX40L、PD-L1もしくはGL50タンパク質のレベルおよび存続を判定することができる。また、これらの試験を用いて、腫瘍細胞の表面にタンパク質を組合せでおよび／または逐次提示できるか否かを調べること、およびそれらの細胞表面ターンオーバー動態を決定することもできる。
【０１６２】
＞95％の腫瘍細胞を改変し、かつ５日間少なくとも50％の腫瘍細胞上にビオチンを存続させることができるビオチン濃度をin vivo腫瘍操作に用いる。腫瘍微小環境内の遊離ビオチンは、融合タンパク質との結合について細胞表面ビオチンと競合し得るため、ビオチン注射後の様々な時点で、免疫共刺激融合ポリペプチドによる操作を評価する。１mMビオチンによるビオチン化から24時間後の40μgのCD80注射は、＞80％のビオチン陽性細胞にタンパク質を提示させるのに有効であることが観察された。例えば、２つの用量（20および200μg／腫瘍）の免疫共刺激ポリペプチド融合タンパク質を試験して、腫瘍細胞に対するその提示効率に大きな影響を与えることなく該タンパク質を腫瘍に投与することができる、ビオチン化後の最短時間を決定する。残る試験を通じて、ビオチン化後の融合タンパク質の腫瘍内注射にはこの時点を用いる。
【０１６３】
様々な濃度の免疫共刺激融合ポリペプチドを、単独で、組み合わせて、もしくは逐次、ビオチン化腫瘍に注射する。タンパク質注射後の様々な日に腫瘍を回収し、単細胞懸濁液に調製し、各タンパク質に対する蛍光色素コンジュゲート型抗体を用いたマルチカラーフローサイトメトリーにおいて分析する。１群につき７匹のマウスを用いる。生存および腫瘍増殖についてマウスを綿密にモニターする。
【０１６４】
ビオチンが飽和状態にならない限り、融合タンパク質の用量が高ければ高いほど、ビオチン化腫瘍細胞の表面でのタンパク質提示のレベルが高くなり、タンパク質存続の動態も長くなると予想される。ビオチン部位が飽和した時点で、これら２つのパラメーターは水平状態に達する。ビオチンの細胞表面動態の大部分が、ビオチンがコンジュゲートする細胞表面分子の正常なターンオーバーと、細胞分裂に応じたビオチンの希釈により調節されると仮定すると、融合タンパク質レベルは変動することが予想される。加えて、細胞表面ターンオーバーの動態は、本発明者らが以前発表した研究によれば、部分的にタンパク質依存的であると予想される。
【０１６５】
腫瘍縮小は、免疫共刺激タンパク質により誘発される抗腫瘍免疫の結果として観察することができるものであり、これはタンパク質ターンオーバー動態の長期研究および正確な評価を複雑にしうることに留意すべきである。この効果は、３つのタンパク質すべてが同時または逐次、共提示されるとき、増幅すると考えられる。
【０１６６】
Ｅ．In vivo操作腫瘍細胞の治療効果
２つ以上の免疫共刺激ポリペプチド（例えば、LIGHT、CD80、4-1BBL、CD40L、OX40L、PD-L1およびGL50）の組合せでin vivo操作した腫瘍細胞の治療効果を以下のように評価する。
【０１６７】
前述のように、腫瘍内のLIGHT、CD80、4-1BBL、CD40L、OX40L、PD-L1および／またはGL50の共提示は、腫瘍間質を刺激して、腫瘍部位に対するリンパ球の生成に必要な各種ケモカインを分泌させるだけではなく、共刺激シグナルを提供することにより腫瘍浸潤Ｔ細胞を直接活性化することができる競合的APCに腫瘍細胞を変換する。これは、その攻撃的増殖、転移挙動、ならびに最適レベルの共刺激分子の欠失について選択されるLLC固形肺腫瘍モデルを用いて証明することができる。
【０１６８】
複数の免疫学的パラメーターについて、特にCD8+Ｔ細胞、ケモカイン、およびTh1サイトカイン応答を重視してマウスをモニターする。これらの応答は免疫療法の効果と相関するものである。
【０１６９】
癌細胞は、腫瘍回避のために共刺激シグナルを欠失させたり、または操作することが多い。さらに、腫瘍間質は、物理的および免疫学的障壁として働くことにより腫瘍進行に寄与する。しかし、腫瘍間質は、LTβRのような様々な免疫受容体を発現する。腫瘍間質細胞上のLTβRとLIGHTとの結合は、腫瘍間質内の繊維芽細胞を刺激し、CCL21、Mig、およびIP10のような各種ケモカインを合成および分泌させる。腫瘍内のLIGHT、CD80、4-1BBL、CD40L、OX40L、PD-L1および／またはGL50の共提示は腫瘍間質を刺激して、腫瘍部位へのリンパ球の補充に必要な各種ケモカインを分泌させると共に、共刺激シグナルを提供することにより腫瘍浸潤Ｔ細胞を直接活性化することができる競合的APCに腫瘍細胞を変換する。１以上の免疫共刺激ポリペプチドの組合せを用いて腫瘍細胞を操作することにより、腫瘍間質をモジュレートすることができ、また、その免疫抑制機能を免疫刺激機能に変換することができる。
【０１７０】
有効な治療に関連する免疫パラメーターを確認するために機械学的試験を実施する。機械学的試験は（１）CD4、CD8、およびCD25マーカーを用いた腫瘍浸潤Ｔ細胞の表現型分類；および（２）Th1応答のシグネチャーサイトカインとしての腫瘍内IFN-γおよびIL-12、免疫阻害性サイトカインとしてのIL-10およびTGF-β、ならびにCCL21ケモカイン、の分析を含む。
【０１７１】
腫瘍間質細胞上のLTβRとLIGHTの結合の結果、CCL21ケモカインが合成される。手短には、免疫共刺激融合タンパク質でのin vivo操作から数（３、６、９）日後に有効な免疫治療をもたらすタンパク質提示レジメンに供したマウスから腫瘍を再切除し、これを機械処理して単細胞懸濁液にする。細胞の一部を全RNA抽出に用い、残りの細胞をCD4、CD8およびCD25に対する異なる蛍光色素コンジュゲート型抗体で染色し、マルチカラーフローサイトメトリーにおいて分析する。
【０１７２】
上記実施例１に記載したRT-PCRにおいて、サイトカイン特異的プライマーを用い、サイトカイン分析を実施する。加えて、腫瘍細胞に対するCD8+Ｔ細胞細胞傷害性応答を調べる。手短には、免疫治療が成功および失敗したマウスから腫瘍排出LN細胞を個別に回収し、IL-2の存在下で放射線照射済LLC細胞と一緒に５日間インキュベートする。Ficoll勾配を用いてエフェクター細胞を回収し、標準的細胞傷害性アッセイにおいて、様々なエフェクター：標的比でLLC生細胞に対し試験する。Singhら、2003, Cancer Res., 63:4067-73。免疫療法が失敗したマウスからの腫瘍を同様の分析に供する。BALB/ｃからのA20 B細胞リンパ腫細胞を第三者標的（third pary targets）として用いることにより、死滅応答の抗原特異性を判定する。
【０１７３】
LIGHTのみで腫瘍細胞表面を操作することにより、腫瘍部位へのナイーブＴ細胞およびDCの補充が容易になり、これら細胞の活性化および分化が誘導され、エフェクター機能を獲得すると考えられる。しかし、LIGHT、CD80、および4-1BBLの共提示は、さらに有効な腫瘍免疫治療を提供すると予想される。何故なら、Th1応答の発生においてこれら分子の相乗効果が生じること、および4-1BBLがDCを活性化し、Th1型サイトカインの合成および同化を生じさせることができるためである。さらに、4-1BBLは、長期にわたる防御のためのCD8+Ｔ細胞のエフェクター機能および長期記憶にも寄与することができる。
【０１７４】
腫瘍の完全な根絶には、腫瘍に免疫共刺激ポリペプチドを繰返し導入することが必要な場合もある。これは、ビオチン化から最初の１週間以内に、腫瘍を再度ビオチン化することなく、達成することができる。その後任意の時点で、腫瘍を再度ビオチン化し、次に、融合タンパク質で再度修飾することができる。
【０１７５】
腫瘍根絶の失敗は、融合タンパク質に対する抗体、特に、融合タンパク質のSA部分に対する抗体の誘導によるものであり得る。腫瘍への免疫共刺激-SA融合タンパク質の直接注射は、全身注射と比較して、抗体阻止に対し感度が低いようである。これは、Ｂリンパ腫モデルを用いて既に公表された結果と一致している。CD80分子を提示するようにex vivo操作した腫瘍細胞を効率的腫瘍ワクチンとして用いることができることを明らかにした、Singhら、2003, Cancer Res., 63:4067-73を参照されたい。
【０１７６】
あるいは、ストレプトアビジンの代わりにアビジンを用いて免疫共刺激融合タンパク質を作製することができる。アビジンは、ストレプトアビジンと、タンパク質レベルでは大きな相同性を共有していない。従って、ストレプトアビジンまたはアビジンのいずれかを含む融合タンパク質を置き換え可能に用いて、中和抗体を最小限に抑えることができる。これに加えまたは代わり、前述したように、免疫原性が低減したアビジンおよびストレプトアビジンの改変形態（例えば、リンパ球エピトープの除去により改変された形態）を本発明に従って使用することができる。
【０１７７】
活性化表現型（CD25+）を含む多数の腫瘍内CD4+およびCD8+Ｔ細胞、ならびに高レベルのIFN-γ、IL-12、およびCCL21転写産物が、有効な免疫療法を受けた動物で観察されている。顕著な対照として、治療が失敗した動物は、腫瘍内にごくわずかなリンパ球浸潤しか呈示せず、しかも高レベルのIL-10およびTGF-βを発現すると予想される。同様に、有効な治療は、腫瘍に対する有効なCD8+Ｔ細胞死滅応答を発生させると考えられる。
【０１７８】
本発明について、当業者がこれを作製および使用するのに十分詳細に説明および例示してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な代用、改変および改良が明らかである。本明細書に記載した実施例は、好ましい実施形態の代表的なものであり、例であって、本発明の範囲に関して制限を意図するものではない。本発明における改変およびその他の使用も当業者には想起されるであろう。これらの改変は、本発明の精神に含まれ、請求の範囲に定義される。
【０１７９】
当業者には、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々な代用および改変をここに開示した本発明に実施できることが容易に明らかであろう。
【０１８０】
本明細書に記載した特許および刊行物はすべて、本発明に関する分野の当業者のレベルを示すものである。これらの特許および刊行物はすべて、個々の刊行物が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１８１】
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていないあらゆる要素、制限が存在しなくても好適に実施することができる。従って、例えば、本明細書における各例において、用語「含む」、「から実質的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つと置き換えが可能である。使用してきた用語および表現は、説明の用語として用いたもので、制限のためではなく、このような用語および表現の使用に関して、ここに図示および記載した特徴のあらゆる同等物およびその部分を排除する意図はなく、請求する本発明の範囲内で、多様な改変が可能であることを認識されたい。従って、好ましい実施形態および任意の特徴により本発明を具体的に開示してきたが、ここに開示した概念の改変および変更を当業者は利用してもよく、このような改変および変更が、添付の請求項に定義するような本発明の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
【０１８２】
その他の実施形態は添付の特許請求の範囲に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１Ａ】コアストレプトアビジンとマウスLIGHTタンパク質の細胞外ドメインとを含む融合タンパク質の核酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図１Ｂ】コアストレプトアビジンとマウスLIGHTタンパク質の細胞外ドメインとを含む融合タンパク質のコードアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。コアストレプトアビジン配列に下線を引いた。
【図２Ａ】ヒトCD80の細胞外ドメインとコアストレプトアビジンとを含む融合タンパク質の核酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図２Ｂ】ヒトCD80の細胞外ドメインとコアストレプトアビジンとを含む融合タンパク質のコードアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。コアストレプトアビジン配列に下線を引いた。
【図３Ａ】マウス4-1BBLの細胞外ドメインとコアストレプトアビジンとを含む融合タンパク質の核酸配列（配列番号５）を示す図である。
【図３Ｂ】マウス4-1BBLの細胞外ドメインとコアストレプトアビジンとを含む融合タンパク質のコードアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。コアストレプトアビジン配列に下線を引いた。
【図４】コアストレプトアビジンとヒト4-1BBLの細胞外ドメインとを含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。コアストレプトアビジン配列に下線を引いた。
【図５Ａ】コアストレプトアビジンとヒトB7.2の細胞外ドメインとを含む融合タンパク質の核酸配列（配列番号８）を示す図である。
【図５Ｂ】コアストレプトアビジンとヒトB7.2の細胞外ドメインとを含む融合タンパク質のコードアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。
【図６】フローサイトメトリーにより決定された、in vivoでの細胞表面ビオチンの動態を示す図である。
【図７Ａ】フローサイトメトリーにより決定された、in vitroで培養した脾細胞での細胞表面ビオチンの存続を示す図である。
【図７Ｂ】フローサイトメトリーにより決定された、in vitroで培養した脾細胞での細胞表面ビオチンの存続を示す図である。
【図７Ｃ】フローサイトメトリーにより決定された、in vitroで培養した内皮細胞での細胞表面ビオチンの存続を示す図である。
【図８】操作された細胞により提示された２種類の免疫共刺激ポリペプチド（4-1BBLおよびCD80）の各々のレベルを明らかにする、操作LLC細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図９】操作細胞の静脈内投与後に、免疫共刺激ポリペプチド（CD80）を提示するよう操作したリンパ節細胞および脾細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１０】操作されたA20 Bリンパ腫細胞の表面に提示された免疫共刺激ポリペプチド（CD80）のフローサイトメトリーによる定量を示す図である。
【図１１】CD80を提示するように操作した腫瘍細胞により誘導された増殖応答を示す図である。
【図１２】免疫共刺激ポリペプチドの提示を判定するための腫瘍細胞のフローサイトメトリーを示す図である。腫瘍細胞は、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinを腫瘍に直接投与した後、CD80-CSAを腫瘍内投与しておいたマウスから取得した。
【図１３】様々な濃度のEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinによるビオチン化から１、３、５および７日後の腫瘍細胞上のビオチンの提示を示す図である。
【図１４】操作されたA20 Bリンパ腫細胞の表面での4-1BBLおよびCD80の共提示のフローサイトメトリーによる定量を示す図である。
【図１５】4-1BBLが提示されたA20細胞に対するＴ細胞の増殖をフローサイトメトリーにより示す図である。
【図１６】ビオチン化後の様々な時点でCD80-CSAを腫瘍内投与したときの免疫共刺激ポリペプチドの提示を判定するための腫瘍細胞のフローサイトメトリーを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月18日(2007.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞の表面を操作する方法であって、該細胞を含む個体に、
ａ）結合対の第１メンバーと細胞の表面に結合する分子とを含む二官能性分子；
ｂ）第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分；および随意に、
ｃ）第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第２免疫共刺激部分
を投与することを含み、
その際、第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドは、結合対の第１メンバーと結合対の第２メンバーとの間の結合を介して細胞表面に提示され、
第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記方法。
【請求項２】
細胞表面が腫瘍細胞表面である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結合対の第１メンバーを含む二官能性分子を腫瘍内注射により投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１および随意の第２免疫共刺激部分の少なくとも１つを腫瘍内注射により投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
随意の第２免疫共刺激部分を投与し、第１および第２免疫共刺激部分を実質的に同時に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
随意の第２免疫共刺激部分を投与し、第１および第２免疫共刺激部分を異なる日に逐次投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
初めに第１または第２免疫共刺激部分を提示する細胞の少なくとも約５％が、注射から約２日後に第１または第２免疫共刺激部分を引き続き提示する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
結合対の第１メンバーがビオチンを含み、結合対の第２メンバーがコアストレプトアビジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
随意の第２免疫共刺激部分を投与し、第１および第２免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第３免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む、第３免疫共刺激部分を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１、第２および第３免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも２つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
第１、第２および第３免疫共刺激ポリペプチドが、LIGHT、CD80、および4-1BBLである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
第１、第２および第３免疫共刺激部分の少なくとも１つは、第１、第２および第３免疫共刺激部分の他の少なくとも１つとは異なる経路により投与する、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
第１、第２および第３免疫共刺激部分の各々を同じ経路により投与する、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
第１、第２および第３免疫共刺激部分を単一組成物の成分として投与する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含む第１融合タンパク質、および
第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の同じメンバーとを含む第２融合タンパク質を含み、
その際、上記免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、組成物。
【請求項１７】
第１および第２免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
結合対のメンバーがコアストレプトアビジンを含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１９】
融合タンパク質の少なくとも１つが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列を含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項２０】
LIGHTと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質、CD80と結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質、および4-1BBLと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項２１】
結合対の前記メンバーがコアストレプトアビジンを含む、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含む第１融合タンパク質を含む第１組成物、および
第２免疫共刺激ポリペプチドと結合対の同じメンバーとを含む第２融合タンパク質を含む第２組成物を含み、
その際、免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、組合せ。
【請求項２３】
第１および第２免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80およびCD40Lからなる群より選択される、請求項22に記載の組合せ。
【請求項２４】
結合対の前記メンバーがストレプトアビジンを含む、請求項22に記載の組合せ。
【請求項２５】
融合タンパク質の少なくとも１つが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、および配列番号９からなる群より選択される配列を含む、請求項22に記載の組合せ。
【請求項２６】
LIGHTと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物、CD80と結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物、および4-1BBLと結合対の前記メンバーとを含む可溶性融合タンパク質を含む組成物を含む、請求項22に記載の組合せ。
【請求項２７】
腫瘍のサイズを縮小するかまたは腫瘍増殖を阻害する方法であって、
ａ）結合対の第１メンバーと上記腫瘍の腫瘍細胞表面に結合する分子とを含む二官能性分子；
ｂ）第１免疫共刺激ポリペプチドと結合対の第２メンバーとを含む第１免疫共刺激部分；および随意に、
ｃ）第２免疫共刺激ポリペプチドと前記結合対の第２メンバーとを含む第２免疫共刺激部分を、腫瘍を含む個体に投与することを含み、
その際、第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドは、前記結合対の第１メンバーと前記結合対の第２メンバーとの間の結合を介して腫瘍細胞表面に提示され、
第１および随意の第２免疫共刺激ポリペプチドの少なくとも１つは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記方法。
【請求項２８】
免疫共刺激ポリペプチドを提示するように細胞の表面を操作する方法であって、
ａ）結合対の第１メンバーと細胞の表面に結合する分子とを含む二官能性分子；および
ｂ）免疫共刺激分子と前記結合対の第２メンバーとを含む免疫共刺激部分
に細胞表面を接触させることを含み、
その際、免疫共刺激ポリペプチドは、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択され、
免疫共刺激ポリペプチドは、前記結合対の第１メンバーと前記結合対の第２メンバーとの間の結合を介して細胞表面に提示される、
上記方法。
【請求項２９】
in vitroで実施する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
in vivoで実施する、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
結合対の第１メンバーがビオチンを含み、結合対の第２メンバーがアビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
ストレプトアビジンがコアストレプトアビジンである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含むキメラタンパク質であって、免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記キメラタンパク質。
【請求項３４】
結合対のメンバーが、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項33に記載のキメラタンパク質。
【請求項３５】
ストレプトアビジンがコアストレプトアビジンである、請求項34記載のキメラタンパク質。
【請求項３６】
免疫共刺激ポリペプチドと結合対のメンバーとを含むキメラタンパク質であって、免疫共刺激ポリペプチドが、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、およびAPRILからなる群より選択される、上記キメラタンパク質と、
薬学的に許容される担体
とを含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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