(57)【要約】  本発明はファージ提示型ポリペプチドの翻訳後修飾に関する。これらの提示型ポリペプチドは適切な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切な直交ｔＲＮＡ種を含むｉｎ  ｖｉｖｏ直交翻訳系を使用することにより、ファージ提示型融合ポリペプチドの選択された位置に組込まれた少なくとも１種の非天然アミノ酸（例えばｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン等のアリール−アジドアミノ酸又はパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン等のアルキニルアミノ酸）を含む。これらの非天然アミノ酸はアジド−アルキン［３＋２］シクロ付加反応やスタウディンガー修飾等の翻訳後修飾のターゲットに利用できるという利点がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを含むファージであって、前記ポリペプチドが少なくとも１個の翻訳後修飾アリール−アジド非天然アミノ酸残基を含み、前記翻訳後修飾アリール−アジド非天然アミノ酸残基がスタウディンガーライゲーション反応により生成される前記ファージ。
【請求項２】
前記ファージが生存可能である請求項１に記載のファージ。
【請求項３】
前記ファージが繊維状ファージである請求項１に記載のファージ。
【請求項４】
前記ファージがＭ１３に由来するファージである請求項１に記載のファージ。
【請求項５】
前記ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項１に記載のファージ。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドが部位特異的プロテアーゼにより特異的に開裂可能なペプチドリンカープロテアーゼ認識配列を含む請求項５に記載のファージ。
【請求項７】
前記部位特異的プロテアーゼが第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、カリクレイン、トロンビン、第ＸＩＩａ因子、コラゲナーゼ及びエンテロキナーゼから選択される請求項６に記載のファージ。
【請求項８】
前記アリール−アジド非天然アミノ酸残基がパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基である請求項１に記載のファージ。
【請求項９】
前記ファージが固体支持体に固定化されている請求項１に記載のファージ。
【請求項１０】
請求項１に記載の複数のファージ。
【請求項１１】
複数の異なるポリペプチドを提示する請求項１に記載の複数のファージ。
【請求項１２】
前記複数のファージがファージディスプレイライブラリーを含む請求項１１に記載の複数のファージ。
【請求項１３】
前記ファージが精製又は単離されている請求項１に記載のファージ。
【請求項１４】
翻訳後修飾ファージの作製方法であって、
（ａ）少なくとも１個のアリール−アジド非天然アミノ酸残基を組込んだポリペプチドを含むファージを提供する段階と；
（ｂ）前記非天然アミノ酸残基がスタウディンガーライゲーション反応を含む共有結合的修飾を受ける条件下で前記ファージを反応させることにより、翻訳後修飾ファージを作製する段階を含む前記方法。
【請求項１５】
前記方法により作製された前記翻訳後修飾ファージが生存可能である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１個のアリール−アジド非天然アミノ酸残基がパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記提供段階が、
（ｉ）Ａ）前記ファージをコードする核酸分子（但し、前記核酸分子は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドサブ配列を含み、前記ポリヌクレオチドサブ配列は少なくとも１個のセレクターコドンを含む）と；
Ｂ）前記宿主細胞で直交性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードする核酸分子と；
Ｃ）前記宿主細胞で直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードする核酸分子（但し、前記Ｏ−ＲＳは前記宿主細胞で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、前記セレクターコドンは前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される）と；
Ｄ）アリール−アジド非天然アミノ酸を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階と；
（ｉｉ）前記宿主細胞を培養することにより、前記ポリヌクレオチドサブ配列によりコードされるポリペプチドを生成し、翻訳中にセレクターコドンに応答して前記アリール−アジド非天然アミノ酸を前記ポリペプチドに組込むと共に、前記ポリヌクレオチドサブ配列によりコードされるポリペプチドを含むファージを作製し、前記アリール−アジド非天然アミノ酸を前記ポリペプチドに組込む段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記提供段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記提供段階がＯ−ＲＳをコードする核酸分子を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階を含み、前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記提供段階がＯ−ＲＳをコードする核酸分子を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階を含み、前記Ｏ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記提供段階がＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸分子を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階を含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドを含む生存可能なファージであって、前記ポリペプチドが少なくとも１個の翻訳後修飾非天然アミノ酸残基を含む前記ファージ。
【請求項２３】
前記翻訳後修飾非天然アミノ酸残基がアリール−アジド非天然アミノ酸残基である請求項２２に記載の生存可能なファージ。
【請求項２４】
前記翻訳後修飾非天然アミノ酸残基がパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基である請求項２２に記載の生存可能なファージ。
【請求項２５】
前記翻訳後修飾非天然アミノ酸残基がスタウディンガーライゲーション反応により生成される請求項２２に記載の生存可能なファージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／７２６，１３７号（出願日２００５年１０月１２日）及び米国仮特許出願第６０／７３７，６２２号（出願日２００５年１１月１６日）の優先権と特典を主張し、言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明はエネルギー省助成番号ＥＲ４６０５１及び国立衛生研究所助成番号ＧＭ５６５２８として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は蛋白質化学、例えば翻訳生化学の分野に関する。本発明はバクテリオファージを作製するための組成物と方法に関し、前記ファージは選択的共有結合的翻訳後修飾のターゲットとして利用可能な非天然アミノ酸をもつ提示型ポリペプチドを含むことにより、翻訳後修飾ファージを構成する。
【背景技術】
【０００４】
蛋白質構造及び機能の研究は従来、天然アミノ酸の反応基を使用して利用可能な反応化学に依存している。残念ながら、細菌からヒトに至る全公知生物は同一の２０種の標準アミノ酸をコードする（稀な例外としてセレノシステイン（例えばＡ．Ｂｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５１５−２０参照）とピロリジン（例えばＧ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４５９−６２参照）も挙げられる）。Ｒ基のこの限られた選択は蛋白質構造及び機能の研究に制約となり、研究は天然アミノ酸の化学的性質により制限されている。
【０００５】
天然アミノ酸数の制限に伴い、蛋白質の他の全アミノ酸を除く高度に標的化された翻訳後蛋白質修飾の実現性も制限される。当分野で現在使用されている大半の修飾反応は蛋白質アミノ酸側鎖の天然求核性残基を標的とする求核性反応パートナーと求電子性反応パートナーの間の共有結合形成、例えばα−ハロケトンとヒスチジン又はシステイン側鎖の反応を利用している。これらの場合の選択性は蛋白質の求核性残基の数とアクセシビリティにより決定される。残念ながら、天然蛋白質は反応部位の配置が不良であったり（例えば接近しにくい）、反応ターゲットを複数含む（例えばリジン、ヒスチジン及びシステイン残基）ことが多いため、修飾反応の選択性が低く、求核／求電子試薬による高度に標的化された蛋白質修飾は困難になる。更に、修飾部位は一般にリジン、ヒスチジン及びシステインの天然求核性側鎖に限定される。他の部位の修飾は困難又は不可能である。
【０００６】
蛋白質を合成物質及びプローブで選択的に修飾し、蛋白質を表面に共有的に結合する代替アプローチが試みられている。これらのアプローチとしては半合成法（Ｍｕｉｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，７２，２４９−２８９）、システイン及びリジン残基を選択的に標識する求電子試薬の使用（Ｃｈｉｌｋｏｔｉら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９４，５，５０４−５０７；Ｒｏｓｅｎｄａｈｌら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６，２００−２０７）、更には、化学的にアミノアシル化したｔＲＮＡを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成による反応性側鎖をもつアミノ酸の選択的蛋白質導入（Ｂａｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，８０１３−８０１４；Ｅｌｌｍａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９１，２０２，３０１−３３６）が挙げられる。これらのアプローチには夫々ターゲット特異性の欠如又は他の非実用性の問題がある。
【０００７】
既存遺伝子レパートリーの制限を克服するための１つのストラテジーは顕著な化学的性質をもつアミノ酸を遺伝コードに付加する方法である。このアプローチは宿主細胞（例えば真正細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生合成機構を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に付加するために直交ｔＲＮＡと対応する新規直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用することにより実現可能であることが分かっている。このアプローチは各種文献に記載されており、例えばＣｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：９６４−９６７；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：８８８２−８８８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：７５６６−７５７１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２）ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ，４４（１）：３４−６６（２００５）；及びＸｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８（２００５）が挙げられる。国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；及び国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）も参照。
【０００８】
ファージディスプレイ技術は柔軟で広く利用されている技術であり、多様な生物学分野で利用されている。例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：３９１−４１０（１９９７）；Ｓｉｄｈｕ，Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １８：５７−６３（２００１）；Ｒｏｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｋｏｗｓｋｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：８７−９３  （１９９９）；及びＷｉｌｌａｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０：８３７−８５４（２００２）参照。例えば、ファージディスプレイは大きなポリペプチドライブラリーから高親和性のリガンドと受容体を単離するために非常に有用であることが分かっている。大きなライブラリーを組換え法により容易に作製することができ、反復集積によりライブラリーメンバーを増幅することができ、ＤＮＡシーケンシングにより一次構造を決定できるという利点がある。しかし、蛋白質一般と同様に、ファージ提示型ペプチドライブラリーも２０種の標準アミノ酸構成要素に限定されるため、翻訳後修飾のターゲットとして利用可能な官能基が制限される。更に、ファージ提示型ポリペプチドの翻訳後修飾法は、修飾反応が蛋白質活性とファージ生存性を維持する生理的に適合可能な条件を使用するので、一層困難になる（Ｌｅｉｅｕｘ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（１９９８）ＴＩＢＴＥＣＨ，１６：５０６）。
【０００９】
ファージディスプレイの利用範囲を拡張しようとして、Ｎｏｒｅｎらは天然セレノシステインオパールサプレッサーｔＲＮＡを使用してファージ提示型ペプチドにセレノシステインを組込んだ（Ｓａｎｄｍａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：９６０−９６１）。Ｒｏｂｅｒｔｓらは化学的にアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（Ｎｏｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１８２−１８８）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍＲＮＡディスプレイ（Ｌｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（２００２）１２４：９９７２）を併用して他の非天然アミノ酸を含むペプチドライブラリーにこのアプローチを一般化しようと試みた。しかし、多数のこのようなｔＲＮＡの作製は非現実的であり、ｔＲＮＡは化学量論的に消費される。
【００１０】
蛋白質構造及び機能を改変及び研究する目的で、提示型ポリペプチドに組込んだ非天然アミノ酸をファージに提示しながら選択的に翻訳後修飾のターゲットとして利用できるように、ファージ提示型ポリペプチドに非天然アミノ酸を組込むための新規ストラテジーが当分野で必要とされている。ファージ提示型蛋白質を高度に選択的に修飾し、更に修飾反応後にファージ生存性を維持する生理的条件下でファージ提示型蛋白質の修飾を可能にする蛋白質修飾反応のための新規ストラテジーの開発が当分野で必要とされている。ファージ提示型蛋白質で高度に特異的な標的蛋白質修飾（例えば、ポリペプチド中の天然アミノ酸が交差反応又は副反応を全く受けないような修飾）を行うための新規方法が当分野で必要とされている。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
【特許文献１】ＷＯ２００２／０８６０７５
【特許文献２】ＷＯ２００２／０８５９２３
【特許文献３】ＷＯ２００４／０９４５９３
【特許文献４】ＷＯ２００５／０１９４１５
【特許文献５】ＷＯ２００５／００７８７０
【特許文献６】ＷＯ２００５／００７６２４
【特許文献７】ＷＯ２００６／０３４３３２
【非特許文献１】Ａ．Ｂｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５１５−２０
【非特許文献２】Ｇ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４５９−６２
【非特許文献３】Ｍｕｉｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，７２，２４９−２８９
【非特許文献４】Ｃｈｉｌｋｏｔｉら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９４，５，５０４−５０７
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｄａｈｌら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６，２００−２０７
【非特許文献６】Ｂａｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，８０１３−８０１４
【非特許文献７】Ｅｌｌｍａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９１，２０２，３０１−３３６
【非特許文献８】Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：９６４−９６７
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：８８８２−８８８７
【非特許文献１０】Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：７５６６−７５７１
【非特許文献１１】Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００
【非特許文献１２】Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７
【非特許文献１３】Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７
【非特許文献１４】Ｃｈｉｎら，（２００２）ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０
【非特許文献１６】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ，４４（１）：３４−６６（２００５）
【非特許文献１７】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８（２００５）
【非特許文献１８】Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：３９１−４１０（１９９７）
【非特許文献１９】Ｓｉｄｈｕ，Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １８：５７−６３（２００１）
【非特許文献２０】Ｒｏｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｋｏｗｓｋｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：８７−９３  （１９９９）
【非特許文献２１】Ｗｉｌｌａｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０：８３７−８５４（２００２）
【非特許文献２２】Ｌｅｉｅｕｘ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（１９９８）ＴＩＢＴＥＣＨ，１６：５０６
【非特許文献２３】Ｓａｎｄｍａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：９６０−９６１
【非特許文献２４】Ｎｏｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１８２−１８８
【非特許文献２５】Ｌｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（２００２）１２４：９９７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
蛋白質（例えばファージ提示型蛋白質）を高度に選択的に修飾する化学反応が必要とされている。蛋白質の選択的修飾に当分野で現在使用されている大半の反応は選択性が低く、天然アミノ酸残基に限定されている。本発明はこれらの問題の解決方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は組換えファージ発現試薬と共働するように直交翻訳系を操作することにより、ファージ提示型蛋白質に非天然アミノ酸をプログラム下で部位特異的に生合成的に組込むためのシステムを提供する。本発明はファージ提示型蛋白質に組込んだこれらの非天然アミノ酸残基をその後、標的修飾するための方法を提供する。本発明は新規組成物（例えば各種翻訳後修飾を含むファージ）と翻訳後修飾ファージの新規作製方法を提供する。
【００１３】
本発明で提供されるファージ作製システムは、ファージ提示型ポリペプチドに非天然アミノ酸を選択的に組込み、その後、非天然アミノ酸残基の選択的修飾を使用してこれらのポリペプチドを修飾するために大腸菌宿主細胞を使用する直交翻訳系を利用する。ファージ提示型ポリペプチドに組込んだ非天然アミノ酸残基を修飾するための各種化学反応（例えば［３＋２］シクロ付加反応やスタウディンガーライゲーション）を実証する。非天然アミノ酸ターゲットを介してファージ提示型蛋白質に結合する材料の種類は特に限定されず、任意所望物質とすることができる。
【００１４】
本発明は提示型融合ポリペプチドをもつファージを提供し、ポリペプチドは少なくとも１個の翻訳後修飾非天然アミノ酸残基を含む。提示型ポリペプチドでは各種反応性非天然アミノ酸を使用することができる。例えば、非天然アミノ酸はアリール−アジド非天然アミノ酸（例えばパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）又はアルキニル非天然アルキン（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン）とすることができる。ファージは繊維状ファージ（例えばＭ１３由来ファージ）とすることができる。
【００１５】
提示型ポリペプチドは一般にファージキャプシド蛋白質（又はその一部もしくは変異体）と該当アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。所定態様では、融合ポリペプチドは部位特異的プロテアーゼ（例えば第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、カリクレイン、トロンビン、第ＸＩＩａ因子、コラゲナーゼ及びエンテロキナーゼ）により特異的に開裂可能なペプチドリンカープロテアーゼ認識配列を含むように設計される。
【００１６】
非天然アミノ酸をもつファージ提示型ポリペプチドの修飾には各種修飾反応が利用される。例えば、（トリアゾール結合を生じる）アジド−アルキン［３＋２］シクロ付加反応やスタウディンガーライゲーション反応を使用することができる。アリール−アジド及びアルキニル非天然アミノ酸のユニークな反応化学により、これらを組込んだファージ提示型蛋白質は極めて高い選択性で修飾することができる。場合により、非天然アミノ酸反応基はｉｎ  ｖｉｖｏ系に対して完全に異質であるため、反応選択性を改善できるという利点がある。スタウディンガー反応を使用すると、ウイルス感染性を維持できるという利点がある。
【００１７】
本発明の修飾ファージは場合により固体支持体に固定化することができる。所定態様では、ファージはファージポリペプチドライブラリーを含み、複数のポリペプチドがファージにより発現される。この複数のファージも本発明の特徴である。本発明のファージは精製又は単離することができる。
【００１８】
他の態様では、本発明は上記翻訳後修飾ファージの作製方法を提供する。一般に、これらの方法は、（ａ）アリール−アジド非天然アミノ酸残基（例えばパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）又はアルキニル非天然アミノ酸残基（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン）である少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を組込んだ提示型ポリペプチドを含むファージを提供する段階と；（ｂ）非天然アミノ酸残基が共有結合的修飾を受ける条件下でファージを反応させることにより、翻訳後修飾ファージを作製する段階を含む。これらの修飾反応はアジド−アルキン［３＋２］シクロ付加反応又はスタウディンガーライゲーション反応を使用することができる。スタウディンガー修飾反応を使用する場合には、得られる修飾ファージは生存可能なビリオンとなる。
【００１９】
より特定的には、未修飾ファージを提供する段階は、（ｉ）（Ａ）ファージをコードする核酸分子（但し、該当融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド部分は少なくとも１個のセレクターコドンを含む）と；（Ｂ）前記宿主細胞で直交性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードする核酸分子と；（Ｃ）宿主細胞で直交性のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードする核酸分子（但し、Ｏ−ＲＳは宿主細胞でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、前記セレクターコドンはＯ−ｔＲＮＡにより認識される）と；Ｄ）アリール−アジド又はアルキニル非天然アミノ酸を含む真正細菌宿主細胞を提供する段階と；（ｉｉ）宿主細胞を培養することにより、前記ポリヌクレオチドサブ配列によりコードされるポリペプチドを生成し、翻訳中にセレクターコドンに応答してアリール−アジド又はアルキニル非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むと共に、前記ポリヌクレオチドサブ配列によりコードされるポリペプチドを含むファージを作製し、アリール−アジド又はアルキニル非天然アミノ酸を前記ポリペプチドに組込む段階を含む。所定側面では、大腸菌宿主細胞も提供する。
【００２０】
上記方法で使用される直交ｔＲＮＡ及びシンテターゼは特に限定されない。所定態様では、宿主細胞はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導されるＯ−ＲＳをコードする核酸分子を含む。所定態様では、使用されるＯ−ｔＲＮＡはアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。
【００２１】
更に他の態様では、ファージを翻訳後修飾のターゲットとするために他の非天然アミノ酸も使用できると考えられ、非天然アミノ酸はサプレッサーｔＲＮＡと突然変異体シンテターゼを含む直交翻訳系を使用することによりファージに組込まれる。
【００２２】
所定側面では、少なくとも１個の翻訳後修飾非天然アミノ酸残基を組込んだポリペプチドを含む任意ファージが本発明のファージであり、少なくとも１個の非天然アミノ酸は標的共有結合的修飾を可能にする。所定側面では、ファージは翻訳後修飾後に生存可能である。このようにファージに組込むことができる反応性アミノ酸としては、パラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、メタ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、パラ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、パラ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、パラ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン及びパラ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。
【００２３】
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「ポリヌクレオチド」と言う場合には実際問題としてそのポリヌクレオチドの多数のコピーを含む。
【００２４】
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００２５】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
【００２６】
直交チロシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交チロシルｔＲＮＡ（チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するチロシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）図１又は２にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）図１又は２にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。チロシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより夫々チロシン又はロイシン以外のアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
【００２７】
直交チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシル−Ｏ−ＲＳがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは図１又は２にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である（例えば配列番号４〜１０参照）。例えば、Ｏ−ＲＳは図１のチロシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は図１のＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００２８】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は相補的であると言うこともできる。
【００２９】
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３０】
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３１】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００３２】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
【００３３】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００３４】
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の方法を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたない陽性対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性陽性対照マーカー構築物が所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外は陽性対照マーカーが発現される環境条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「陰性」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精密化することができる。この陰性対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
【００３５】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００３６】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは、例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
【００３７】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、本発明では非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを利用する。
【００３８】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか、あるいは特定分子もしくは生物を使用するか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に記載するような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００３９】
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、該当形質をもたない細胞からこの形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別するマーカーを意味する。
【００４０】
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）選択性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
【００４１】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系のターゲット成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
【００４２】
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は真核生物界に属する生物を意味する。真核生物はその構成が一般に多細胞であり（但し、例えば酵母のように多細胞でないものもある）、膜結合核と他の膜結合オルガネラが存在し、遺伝物質が線状であり（即ち染色体が線状）、オペロンが存在せず、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在し、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に原核生物から区別できる。真核生物としては例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００４３】
原核生物：本明細書で使用する「原核生物」なる用語はモネラ界（原核生物界とも言う）に属する生物を意味する。原核生物はその構成が単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核生物から区別できる。原核生物は真正細菌及び古細菌亜界を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコプラズマをモネラ界の別々の分類にする場合もある。
【００４４】
細菌：本明細書で使用する「細菌」及び「真正細菌」なる用語は「古細菌」から区別できる原核生物を意味する。同様に、古細菌は真正細菌から区別できる原核生物を意味する。真正細菌と古細菌は多数の形態学的及び生化学的基準により区別することができる。例えば、リボソームＲＮＡ配列の相違、ＲＮＡポリメラーゼ構造、イントロンの有無、抗生物質感受性、細胞壁ペプチドグリカン及び他の細胞壁成分の有無、膜脂質構造の分岐の有無、並びにヒストン及びヒストン様蛋白質の有無を使用して生物を真正細菌又は古細菌に分類する。
【００４５】
真正細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。古細菌の例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍが挙げられる。
【００４６】
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ翻訳成分（例えば保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳ）を意味する。例えば、Ｏ−ＲＳ、又はこのＯ−ＲＳの保存変異体はコグネイトＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＮ−アセチルガラクトサミン部分を含むアミノ酸）でアミノアシル化する。この例では、Ｏ−ＲＳと保存変異体Ｏ−ＲＳは同一アミノ酸配列をもたない。保存変異体はこの保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
【００４７】
所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含む。所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含むと共に、更にＯ−ＲＳ生理活性を維持し、例えば保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも１０％を維持し、あるいは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％を維持する。所定の好ましい態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生理活性の少なくとも５０％を維持する。保存変異体Ｏ−ＲＳの保存アミノ酸置換はアミノ酸結合ポケットを含むＯ−ＲＳの任意ドメインに生じることができる。
【００４８】
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、例えば栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
【００４９】
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
【００５０】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【００５１】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
【００５２】
アジド：本明細書で使用する「アジド」なる用語は一般に炭素原子と結合しており、一般構造：
Ｒ−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−
をもつ化学基−Ｎ３を意味する。
【００５３】
例えば、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（図３，構造２）はアジド部分を含む。また、アジド色素はアジド置換基をもつ色素分子である（例えば図１６のアジド色素１０及び１１参照）。「アジド」なる用語はアジド基を含む化合物（例えば、ベンジルアジド、ナトリウムアジド等）を意味する。アリール−アジドはアジド部分を含む芳香族分子であり、例えば非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンはアリール−アジドである。
【００５４】
アルキン：本明細書で使用する「アルキン」（「アセチレン」と言う場合もある）なる用語は２個の炭素原子間に三重結合を含み、一般構造：
Ｃ≡Ｃ−Ｒ
（式中、Ｒは任意原子又は構造である）をもつ化学構造を意味する。置換基として使用する場合には、アルキン部分を「アルキニル」基と言う。アルキニル炭素原子はｓｐ２結合しており、２個の他の原子のみと結合を形成し、これらの結合の一方は単結合であり、第２の結合は三重結合である。例えば、アミノ酸パラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰＲＯ−Ｐｈｅ）はアルキニル基を含む。図１５、構造９参照。アルキニル置換基は自然界ではアミノ酸に認められないので、全アルキニルアミノ酸は非天然アミノ酸である。更に、図５、構造６はアルキン修飾フルオレセイン色素の化学構造を示す。
【００５５】
ポリペプチド：ポリペプチドは必ずしもそうでなくてもよいが、一般に共有ペプチド結合により結合した任意長のアミノ酸（天然又は非天然又はその組み合わせ）の任意オリゴマーである。ポリペプチドは任意起源に由来することができ、例えば天然に存在するポリペプチド、組換え分子遺伝技術により作製されたポリペプチド、細胞もしくは翻訳系に由来するポリペプチド、又は無細胞合成手段により作製されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドはそのアミノ酸配列（例えばその成分アミノ酸の一次構造）により特徴付けられる。本明細書で使用するポリペプチドのアミノ酸配列は全長配列に限定されず、部分配列でも完全配列でもよい。更に、ポリペプチドは特定生理活性の有無により限定されない。本明細書で使用する「蛋白質」なる用語はポリペプチドと同義である。「ペプチド」なる用語は限定されないが、例えば２〜２５アミノ酸長の小ポリペプチドを意味する。
【００５６】
翻訳後修飾：本明細書で使用する翻訳後修飾とは翻訳と同時又はポリペプチドが完全に翻訳された後に細胞内又は無細胞系内で行うことができるポリペプチドの修飾である。翻訳後修飾は天然にｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができ、多くの場合には天然ポリペプチドが生物学的に活性であるために必要である。多様な翻訳後修飾（例えばグリコシル化及び／又はリン酸化）がｉｎ  ｖｉｖｏで存在することが知られており、一般には細胞内蛋白質等の内在細胞成分により調節される。ポリペプチドは複数種の翻訳後修飾を受けることができ、修飾はポリペプチド分子内の任意位置で実施できる。
【００５７】
公知翻訳後修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオシド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミルストイル化、酸化、蛋白分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡによる蛋白質へのアミノ酸付加（例えばアルギン酸化）及びユビキチン化が挙げられる。このような修飾は当業者に周知であり、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｗｏｌｄ，Ｆ．，“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，”ｉｎ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｃ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３），ｐｐ．１−１２；Ｓｅｉｆｔｅｒら，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）、及びＲａｔｔａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｄ，６６３：４８−６２（１９９２）等の科学文献に非常に詳細に記載されている。
【００５８】
固体支持体：本明細書で使用する「固体支持体」なる用語はポリペプチド（又は例えばポリペプチドを含むファージ）の合成、結合又は固定化を直接又は間接的に可能にするように官能化することができる実質的に固定配置の材料マトリックスを意味する。「固体支持体」なる用語は「樹脂」又は「固相」等の用語も含む。固体支持体はポリマー（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、及びポリアクリルアミド等の有機ポリマー、並びにそのコポリマー及びグラフト）から構成することができる。固体支持体はガラス、シリカ、シリコン、微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、又は適切な任意金属等の無機物でもよい。本明細書に記載するものに加え、「固体支持体」なる用語は任意型のコーティング又は他の任意型の二次処理を施した任意固体支持体（例えばラングミュア・ブロジェットフィルム、自己組織化単層（ＳＡＭ）、ゾルゲル等）も含むものとする。
【００５９】
アレー：本明細書で使用する「アレー」又は「マイクロアレー」とは例えば固体支持体上及び／又は容器配列中に存在するエレメント（例えばファージ提示型ポリペプチド）の配列である。アレーは特定空間物理的関係をもつ物理的エレメントと考えられることが非常に多いが、本発明は直接的空間構成をもたない「論理」アレーも利用することができる。例えば、コンピューターシステムを使用して物理的に異なる成分中又は成分上に位置する１又は数個の該当成分の位置を追跡することができる。コンピューターシステムはアレーメンバーの物理的位置の「ルックアップ」テーブルを提供することにより論理アレーを形成する。従って、アレーのメンバーを特定及び位置決定することができる限り、運動中の成分でも論理アレーを構成することができる。これは例えば本発明のアレーが流動マイクロスケールシステムに存在する場合や、１個以上のマイクロタイタートレーに存在する場合に該当する。
【００６０】
所定アレーフォーマットを「チップ」又は「バイオチップ」と言う場合がある。アレーは低密度数（例えば２〜約１０）、中密度数（例えば約１００以上）、又は高密度数（例えば１０００以上）のアドレス可能位置を含むことができる。一般に、チップアレーフォーマットは作製、操作、配置、堆積、試薬導入、検出、及び保存し易いように、幾何学的に規則的な形状である。但し、不規則な形状でもよい。典型的な１フォーマットでは、アレーはアレー上のメンバーセットの各位置間の間隔を均等にした行列フォーマットで構成される。あるいは、処理又はサンプリングを均等にするために位置を一まとめにするか、混合するか、又は均質にブレンドしてもよい。アレーは試薬の高スループット操作、ロボット送達、マスキング、又はサンプリングのために各位置に空間的にアドレス可能となるように構成された複数のアドレス可能位置を含むことができる。アレーは任意特定手段による検出又は定量を容易にするように構成することもでき、このような手段としては限定されないが、レーザー光走査、共焦点光又は偏光集光、ＣＣＤ検出、及び化学発光が挙げられる。本明細書に記載する「アレー」フォーマットとしては限定されないが、アレー（即ち複数チップのアレー）、マイクロチップ、マイクロアレー、シングルチップに組み立てたマイクロアレー、マイクロウェルプレートに結合した生体分子のアレー、又は該当システムで使用するのに適した他の任意フォーマットが挙げられる。
【００６１】
共有結合：本明細書で使用する共有結合とは原子間に共有電子を含む結合である。共有結合は「化学結合」と同義である。非共有結合は共有結合以外の任意結合である。非共有結合の１例はイオン結合である。イオン結合は逆電荷の化学部分間の引力である。イオン結合では、電子は共有されず、均等に移動しないため、電荷分布が不均等になり、正／負電荷引力が生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
ファージ提示型蛋白質を高度に選択的に修飾するための化学反応が必要とされている。蛋白質活性とファージ生存性を維持するために生理的に適合可能な条件下で作用することができるこのような修飾反応も必要とされている。蛋白質（例えばファージ提示型蛋白質）の選択的修飾に当分野で現在使用されている大半の反応はアミノ酸側鎖の天然求核性残基を標的とする求核性反応パートナーと求電子性反応パートナーの間の共有結合形成を利用している。これらの場合の選択性は蛋白質の求核性残基の数とアクセシビリティにより決定される。残念ながら、天然蛋白質は反応部位の配置が不良であったり（例えば接近しにくい）、反応ターゲットを複数含む（例えばリジン、ヒスチジン及びシステイン残基）ことが多いため、修飾反応の選択性が低く、求核／求電子試薬による高度に標的化された蛋白質修飾は困難になる。更に、修飾部位は一般にリジン、ヒスチジン及びシステインの天然求核性側鎖に限定される。他の部位の修飾は困難又は不可能である。
【００６３】
本発明はこれらの問題の解決方法を提供する。本発明は組換えファージ発現試薬と共働するように直交翻訳系を操作することにより、ファージ提示型蛋白質に新規性質をもつ非天然アミノ酸をプログラム下で部位特異的に生合成的に組込むためのシステムを提供する。本発明はファージ提示型蛋白質に組込んだこれらの非天然アミノ酸残基をその後、標的修飾するための方法を提供する。本明細書では、新規組成物（例えば各種翻訳後修飾を含むファージ）と翻訳後修飾ファージの新規作製方法について記載する。
【００６４】
本発明により提供されるファージ作製システムは、ファージ提示型ポリペプチドに非天然アミノ酸を選択的に組込み、その後、非天然アミノ酸残基の選択的修飾を使用してこれらのポリペプチドを修飾するために大腸菌宿主細胞を使用する直交翻訳系を利用する。ファージ提示型ポリペプチドに組込んだ非天然アミノ酸残基を修飾するための各種化学反応（例えば［３＋２］シクロ付加反応やスタウディンガーライゲーション）が考えられ、本明細書で実証する。
【００６５】
本発明で利用される直交翻訳系はセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡと、大腸菌宿主細胞で直交ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む。該当ファージ提示型蛋白質への非天然アミノ酸の組込みは任意所望位置にセレクターコドンを含むように該当蛋白質をコードするポリヌクレオチドを組換えて非天然アミノ酸の組込みを指示することにより、任意所望位置で行われるようにプログラムすることができる。
【００６６】
本明細書ではファージ提示型ポリペプチドへの多数の非天然アミノ酸の組込みについて記載する。これらのアミノ酸としてはＯ−メチル−チロシン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン及び３−（２−ナフチル）アラニンが挙げられる。アリール−アジドアミノ酸（例えばパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）が特異的且つ位置選択的翻訳後修飾の魅力的なターゲットである。アルキニル基を含む非天然アミノ酸（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン）も翻訳後修飾のターゲットとしてファージ提示型ポリペプチドで利用できると考えられる。本発明の所定態様では、ファージ提示型ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の翻訳後修飾はファージ生存性を維持する比較的温和な生理的に適合可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ反応条件を使用して実施される。
【００６７】
アリール−アジド及びアルキニル非天然アミノ酸のユニークな反応化学により、これらのアミノ酸を組込んだファージ提示型蛋白質は極めて高い選択性で修飾することができる。場合により、非天然アミノ酸反応基はｉｎ  ｖｉｖｏ系に対して完全に異質であるため、反応選択性を改善できるという利点がある。
【００６８】
非天然アミノ酸ターゲットを介してファージ提示型蛋白質に結合する材料の種類は特に限定されず、任意所望物質とすることができ、例えば色素、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（例えばポリエチレングリコール誘導体）、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、ビーズ、第２（又は第３以下）の蛋白質又はポリペプチド、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。本明細書ではコンジュゲート材料として修飾フルオレセイン又はダンシルフルオロフォア色素の実験使用について記載する。しかし、本発明はこれらのコンジュゲート材料の使用に限定されず、例えば上記のもの等の多様な結合可能な材料が考えられる。
【００６９】
ファージディスプレイ
ファージディスプレイ技術は多様な生物学分野で広く利用されるようになった技術である。ファージディスプレイは特にペプチド（即ちポリペプチド）ライブラリースクリーニングプロトコールで利用されている。各種用途としては、親和性選択（例えば標的受容体選択）、エピトープマッビング及びミミッキング、新規受容体及び天然リガンドの同定、薬剤発見、ワクチン開発及び診断のためのエピトープ発見、並びにＤＮＡ結合性蛋白質の研究が挙げられる。ファージディスプレイ技術で利用される多数のプロトコール、試薬及び変異体ファージゲノム（及び変異体ファージ遺伝子）について記載した各種資料が入手可能である。例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：３９１−４１０（１９９７）；Ｓｉｄｈｕ，Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １８：５７−６３（２００１）；Ｒｏｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｋｏｗｓｋｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：８７−９３（１９９９）；及びＷｉｌｌａｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０：８３７−８５４（２００２）参照。
【００７０】
本明細書に記載する実験では繊維状Ｍ１３ＫＥファージシステム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用する。Ｍ１３ＫＥはファージディスプレイ用途でＮ末端ｐＩＩＩ融合体としてペプチドの発現用に設計されたＭ１３ｍｐ１９の誘導体である（Ｚｗｉｃｋら（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：８７−９７）。Ｍ１３ＫＥで構築されるライブラリーは５価である（即ち成熟ビリオンにおけるｐＩＩＩの全５個のコピーが融合ペプチドをもつ）。親Ｍ１３ｍｐ１９に比較して、ｐＩＩＩリーダーペプチダー開裂部位の両側にＡｃｃ６５  Ｉ／ＫｐｎＩ及びＥａｇＩ部位が導入され、多重クローニング部位（ＭＣＳ）のＡｃｃ６５  Ｉ／ＫｐｎＩ部位が欠失している。ランダムペプチドライブラリーをコードする合成オリゴヌクレオチドとｐＩＩＩリーダー配列の一部に伸長プライマーをアニールし、ＤＮＡポリメラーゼで伸長し、Ａｃｃ６５  Ｉ及びＥａｇＩで消化することによりファージ提示型ランダムペプチドライブラリーを構築する（Ｎｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｎｏｒｅｎ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：１６９−１７８）。得られた開裂２本鎖を同一酵素で消化しておいたＭ１３ＫＥに導入する。
【００７１】
本明細書に記載する実施例ではＭ１３ＫＥファージシステムを使用するが、本発明はこの特定システムに限定されない。実際に、本発明の組成物及び方法で同様に利用可能な代替ファージディスプレイ試薬及びプロトコールが当業者に自明である。これらの代替試薬及びプロトコールは本発明の範囲から逸脱せず、本発明に含まれる。
【００７２】
一般に、該当ポリペプチドのディスプレイはファージキャプシド（コート）蛋白質、又はキャプシド蛋白質のフラグメント、突然変異体もしくは他の変異体とポリペプチドを融合することにより実施される。これらのキャプシド蛋白質としてはｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ及びｐＩＸが挙げられる。（限定しないが）本発明を実証する目的で、本明細書の実施例ではファージｐＩＩＩコート蛋白質アミノ酸配列を含むファージ提示型融合ポリペプチドの作製について記載する。本発明は該当融合蛋白質を提示するためにｐＩＩＩポリペプチド配列の使用に限定されない。
【００７３】
所定のファージシステムでは、融合した蛋白質部分の開裂及び／又は遊離を助長するようにリンカープロテアーゼ認識シグナル配列をコート融合ポリペプチドに組込むことができる。多様なプロテアーゼシグナル配列が公知であり、限定されないが、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、カリクレイン、トロンビン、第ＸＩＩａ因子、コラゲナーゼ及びエンテロキナーゼが挙げられる。本発明では適切な任意プロテアーゼ認識シグナル及び対応するプロテアーゼを使用することができる。
【００７４】
同様に、（限定しないが）本発明を実証するために、本明細書ではストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）を含むモデルファージ提示型融合蛋白質に後で翻訳後修飾される非天然アミノ酸部分を組込むことができることを立証する。非天然アミノ酸の組込みはこのようなモデル蛋白質に限定されない。本明細書の開示から自明の通り、任意所与該当ファージ提示型蛋白質への非天然アミノ酸の組込みは治療及び研究目的用の多様な蛋白質に有利である。
【００７５】
本発明は更に翻訳後修飾される少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを含むファージを提供し、ファージは精製又は単離されている。例えば、ファージはＰＥＧ沈殿及び／又は遠心により精製及び／又は単離することができる。実施例３参照。その他のファージ沈殿及び精製／単離技術も当分野で公知であり、例えば免疫アフィニティー等のアフィニティー精製を使用できる。
【００７６】
ファージディスプレイライブラリー及びアレー
翻訳後修飾される非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドのファージディスプレイは様々な用途がある。ファージ提示型ポリペプチドの使用については多様な資料に記載されており、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：３９１−４１０（１９９７）が挙げられる。
【００７７】
所定態様では、翻訳後修飾される非天然アミノ酸を組込んだファージ提示型ポリペプチドは（いずれも少なくとも１個の非天然アミノ酸を組込んだ）コードされる同一又は異なるポリペプチド、又は同一ポリペプチドの変異体を含む複数のファージのメンバーである。ファージが異なるポリペプチド配列を提示する所定態様では、提示されるポリペプチドはライブラリー（例えば該当コーディング配列のランダム突然変異体ライブラリー）を含む。
【００７８】
翻訳後修飾される非天然アミノ酸を組込んだファージ提示型ポリペプチドがライブラリーを構成する場合には、提示されるポリペプチド候補のプールから所望ポリペプチド種（又は前記ポリペプチド種をコードする核酸）を選択するために一般に選択段階が適用される。選択は使用者により定義される何らかの基準による「適合性」の高いサブ集団が得られるようにファージ提示型ポリペプチドの初期集団を選抜除去することから構成することができる。殆どの場合には、第１ラウンドの選択に入力されるライブラリーは非常に大きな初期数であり、選択されたサブ集団は初期集団の一部であり、適合性の高いクローンが過剰に発現している。この集団はサブ集団の個々のファージが新規増幅ストックで増幅されるように、新たな細菌宿主細胞に感染させることにより「増幅」することができる。その後、更に適合性の高い出発ペプチドのサブセットが得られるように、増幅した集団を別のラウンドの選択に付すことができる。
【００７９】
一般に、主要な選択パラメーターは２つあり、多くの場合には選択効率を増すようにある程度まで操作することができる。第１に、ストリンジェンシーは適合性の高いポリペプチドが適合性の低いペプチドよりも好ましい程度であり、第２に、収率は選択後に生存している所与適合性の粒子の割合である。選択の最終目的は通常では最良適合性のペプチドを単離することである。しかし、最良適合性ポリペプチドの選択は妥当な収率を得るのに適したストリンジェンシーとバランスをとる必要がある。ストリンジェンシーの設定が高過ぎるならば、特定的に選択されたファージの収率は不特定的に単離されたファージのバックグラウンドを下回り、高適合性の選別能は失われる。
【００８０】
ファージ提示型ポリペプチド集団に加えられる最も一般的な選択圧の１つはターゲット受容体に対する親和性である。親和性選択は通常では生化学で広く使用されている標準アフィニティー精製技術を多少改変することにより実施される。従って、例えば、受容体を固体支持体に固定化し、固定化した受容体の上にファージ混合物を通す。ライブラリーのファージ提示型ポリペプチドのごく少数が受容体と結合し、表面又はマトリックスに捕捉され、未結合ファージを洗い流すことができる。最後に、受容体−ペプチド相互作用を解離させる溶液で結合したファージを溶出させると、受容体結合性クローンの集積したファージの「溶出液」集団が得られる。溶出したファージは依然として感染性であり、新たな細菌宿主細胞に感染させるだけで増殖し、別ラウンドの親和性選択への入力として利用可能な「増幅」溶出液が得られる。最終溶出液からのファージクローンを増殖させ、個々に特性決定する。ターゲット受容体との結合に関与するペプチドのアミノ酸配列はウイルスＤＮＡ中の対応するコーディング配列を確認するだけで決定される。
【００８１】
ファージ提示型ポリペプチドはターゲット受容体に対する親和性以外の適合性基準に基づいて選択することもできる。例えば、所望生理活性（例えば酵素活性、酵素活性の改善、又は所定物質もしくはリプレッサーに対する耐性を示す活性）に基づいて提示型ポリペプチドライブラリーをもつファージを選択することができる。
【００８２】
これらのファージ選択スキームの変形は多数のものがあり、当業者に公知である。更に、多数の刊行物がファージライブラリースクリーニング法を主題にしている。
【００８３】
所定態様では、非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを提示するファージを適切な支持体に固定化することができる。この側面では、ファージ提示型ポリペプチドに組込まれる非天然アミノ酸は場合により、例えば［３＋２］シクロ付加反応又はスタウディンガーライゲーション反応を使用して固定化相とカップリングを形成するための反応性部分として使用することができる。
【００８４】
ファージ（又はファージライブラリー）を固定化することができる固体支持体の種類は限定されない。例えば、ポリスチレン皿、不透水性プラスチックビーズ、ナイロン又はニトロセルロース膜、常磁性ビーズ及び透水性ビーズアガロースゲル等の固体支持体にファージを固定することができる。所定態様では、固定化ファージは何らかの特定関係に配置され、即ちアレーを形成する。固体支持体と結合を形成するための非天然アミノ酸の使用と、固体支持体フォーマット又はアレーについては、例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」に記載されている。
【００８５】
直交翻訳系成分
本発明の所定側面では、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（図３，構造２参照）を該当ファージ提示型ポリペプチドに組込む。ファージ提示型ポリペプチドに組込むと、この非天然アミノ酸はファージ提示型ポリペプチドの翻訳後修飾のために［３＋２］シクロ付加反応及びスタウディンガー修飾反応の化学ターゲットとして利用することができる。
【００８６】
本明細書にはこの非天然アミノ酸を組込むための直交成分を記載する。図１は直交サプレッサーｔＲＮＡにｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを負荷した後に、翻訳中にセレクターコドンに応答してｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込む７種の突然変異体Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ種（配列番号４〜１０参照）を示す。本発明で利用される直交サプレッサーｔＲＮＡを配列番号１に示す。
【００８７】
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込むのに適したｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼもＣｈｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（２００２）１２４：９０２６−９０２７；及び国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されており、各々言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。更に、従来技術及び本明細書の開示は配列を特に指定しない他の直交ｔＲＮＡ及び直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの合成の手引きも提供する。
【００８８】
本発明の他の側面では、同様に翻訳後修飾のターゲットとして利用できるように、該当ファージ提示型ポリペプチドに非天然アルキニルアミノ酸を組込む。例えば、非天然アルキニルアミノ酸パラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰＲＯ−Ｐｈｅ；図１５の構造９参照）がこの目的に利用される。アルキニルアミノ酸は［３＋２］シクロ付加反応のターゲットとして利用することができる。この非天然アミノ酸を組込むための直交成分は例えばＤｅｉｔｅｒｓら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４（２００５）及び国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月３０日）に記載されている。
【００８９】
［３＋２］シクロ付加反応
（例えばアリール−アジドアミノ酸又はアルキニルアミノ酸の）非天然アミノ酸側鎖を該当ファージ提示型蛋白質に組込んだ後、フイスゲン［３＋２］シクロ付加反応により特異的且つ位置選択的に修飾することができる（Ｐａｄｗａ，Ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；［Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｅｄ．］Ｐｅｒｇａｍｏｎ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１，Ｖｏｌ．４，ｐ  １０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｉｎ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，［Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｅｄ．］Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；ｐ  １−１７６参照）。アジド部分がアルキニル部分と反応する［３＋２］シクロ付加反応の一般反応化学を図１５に示す。この反応は不可逆的であり、トリアゾール結合を形成する。
【００９０】
図１５に示すように、［３＋２］シクロ付加反応でアジド又はアルキニル置換基と結合するＲ基は特に限定されない。所定側面では、アジド基はファージ提示型ポリペプチドに組込まれるアリール−アジド非天然アミノ酸（例えばｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）の一部を形成する（実施例４参照）。この構成では、アルキニル部分を試薬（例えば図５，構造６に示すアルキニル修飾フルオレセイン色素）と結合した後、ファージ提示型ポリペプチドと反応させ、翻訳後修飾ファージが得られる。アルキニル基と結合するＲ基の種類は特に限定されない。
【００９１】
［３＋２］シクロ付加反応の逆の構成も利用することができる。この場合には、アルキニル基はファージ提示型ポリペプチドに組込まれるアルキニル非天然アミノ酸（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（図１５，構造９参照）の一部である。この構成では、アジド部分を試薬（例えば図１６，構造１０及び１１に示すアジド修飾ダンシル及びフルオレセイン色素）と結合した後、ファージ提示型ポリペプチドと反応させ、翻訳後修飾ファージが得られる。アジド基と結合するＲ基の種類は特に限定されない。
【００９２】
アルキニル及びアジド基の化学は蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ存在する内在官能基の化学に対して完全に異質であるという利点がある。［３＋２］シクロ付加反応が水性媒体中で銅（Ｉ）の存在下に室温（生体サンプルを修飾するために十分な温和な条件）にて実施される場合には、反応は完全に位置選択的に進行し（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ，４１：２５９６）、例えば直交翻訳系を利用してアルキニル又はアジド官能基を導入したファージ提示型蛋白質を選択的に修飾するために使用することができる（Ｄｅｉｔｅｒｓら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２５：１１７８２；Ｗａｎｇら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２５：３１９２；Ｌｉｎｋ  ａｎｄ  Ｔｉｒｒｅｌｌ（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２５：１１１６４）。この方法は求核置換ではなくシクロ付加を利用するので、蛋白質を非常に高い選択性で修飾することができる。この反応は触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に加えることにより優れた位置選択性（１，４＞１，５）で水性条件下に室温で実施できるという利点がある（Ｔｏｒｎｏｅら，（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：３０５７−３０６４；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ，４１：２５９６−２５９９）。
【００９３】
（限定しないが）本発明を実証する目的で、本明細書の実施例ではアジド又はアルキニル部分で修飾し、［３＋２］シクロ付加反応で使用することが可能なダンシル及びフルオレセイン色素の使用について記載する。しかし、当業者に自明の通り、本発明は［３＋２］シクロ付加反応におけるこれらの修飾色素の使用に限定されない。実際に、この化学はアジド又はアルキニル部分で修飾できる任意分子によるファージ提示型ポリペプチドの翻訳後修飾（従って、ファージの翻訳後修飾）を可能にする。当業者であれば、任意該当特定分子のアジド又はアルキニル誘導体を容易に合成することができる。例えば、アジド化合物の合成方法について記載した多数の教科書及びプロトコールが入手可能である。一般資料としては、Ｐａｔａｉ，Ｓａｕｌ，“Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｚｉｄｏ  ｇｒｏｕｐ”ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９７１参照。
【００９４】
他の側面では、本発明はアルキニル含有ファージ提示型ポリペプチドとの［３＋２］シクロ付加結合反応用としてポリエチレングリコールのアジド誘導体（アジド−ＰＥＧ）を使用することによりＰＥＧ化ファージ提示型ポリペプチドを作製するための組成物及び方法を提供する。アジドポリエチレングリコールの一般構造は、
Ｎ３−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−ＣＨ２ＯＲ
であり、式中、ＲはＨ又はＣＨ３であり、ｎは例えば５０〜１０，０００、７５〜５，０００、１００〜２，０００、１００〜１，０００等の整数である。本発明の各種態様では、アジドポリエチレングリコールは例えば約５，０００〜約１００，０００Ｄａ（即ち約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ）、約２０，０００〜約５０，０００Ｄａ、約２０，０００〜約１０，０００Ｄａ（例えば２０，０００Ｄａ）等の分子量をもつ。アジドポリエチレングリコールの合成技術は当業者に周知である。例えば、求電子基（例えば臭化物やＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含むポリエチレングリコール分子とアジド基を含む求核分子（例えばナトリウムアジドや３−アジドプロピルアミン）を反応させ、アジドポリエチレングリコールを生成することができる。
【００９５】
アジド−ＰＥＧはトリアゾール結合を介してアルキニル含有ファージ提示型蛋白質とバイオコンジュゲートしたときに本発明で利用される。蛋白系治療薬のポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）は多くの場合に蛋白質の薬物動態学的及び薬力学的性質を改善することができ、従って、効力を改善し、投与頻度を最小限にすることができる。蛋白治療薬のＰＥＧ化の各種利点は例えばＤｅｉｔｅｒｓら，“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １４：５７４３−５７４５（２００４）に記載及び例証されている。
【００９６】
また、更にエステル結合を含む非天然アルキニルアミノ酸を組込んだファージ提示型ポリペプチドの作製に付随する他の利点も考えられる。例えば、エステル結合をもつアルキニルアミノ酸を使用することにより作製したＰＥＧ化ポリペプチドはエステル結合のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ鹸化によりポリペプチドをゆっくりと遊離させることができる。また、アジド−ＰＥＧ分子の代わりにポリマー支持体（アジド樹脂）を使用すると、蛋白質アフィニティー精製が可能になる。トリアゾール共有結合は非常に強力な洗浄段階を可能にし、エステルアルキニルアミノ酸を使用すると、塩基処理によりファージ提示型蛋白質を遊離させることができる。特筆すべき点として、このようなアフィニティー精製スキームは精製のために該当蛋白質に人工タグ（例えばヘキサヒスチジン）やエピトープの存在が不要になる。使用する非天然アミノ酸によっては、開裂段階後に本質的に野生型（天然）のポリペプチドをアフィニティー樹脂から遊離させることができる。
【００９７】
エステル結合をもつ非天然アルキニルアミノ酸を合成し、蛋白質に組込むことができる。例えば、国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）のエステル結合アルキニルアミノ酸参照。［３＋２］シクロ付加によるバイオコンジュゲーション後、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ鹸化によりエステル結合を開裂することができ、例えばＰＥＧ化ファージ提示型蛋白質からペプチド部分をゆっくりと遊離させることができる。
【００９８】
他の側面では、本発明はファージ提示型ポリペプチドに組込まれるアジド−含有非天然アミノ酸との［３＋２］シクロ付加結合反応用としてポリエチレングリコールのアルキニル誘導体（アルキニル−ＰＥＧ）を使用することによりＰＥＧ化ファージ提示型ポリペプチドを作製するための組成物及び方法を提供する。
【００９９】
スタウディンガー反応
スタウディンガーライゲーションは細胞系及びｉｎ  ｖｉｖｏ系の両者で細胞表面炭水化物を選択的に修飾するために従来使用されている（Ｓａｘｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，２００７−２０１０；Ｐｒｅｓｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００４，４３０，８７３−８７７）。反応は水性条件下で優れた収率で進行し、アジド部分に高度に選択的である。スタウディンガーライゲーションはメチオニン残基に置換したアジドホモアラニンを含む蛋白質を選択的に修飾するためにも使用されている（Ｋｉｉｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２，１０１，７５６６−７５７１）。しかし、蛋白質とプロテオーム全体における各メチオニン残基は多くの場合には天然アミノ酸と競合してアジドホモアラニンで置換されるので、このスタウディンガーライゲーションアプローチの選択性は本質的に限定されている。
【０１００】
本発明は翻訳後修飾ファージの作製方法を提供し、ファージはアリール−アジド非天然アミノ酸（例えばｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）を組込んだ提示型ポリペプチドを含む。その後、スタウディンガーライゲーション反応を使用して非天然アミノ酸を効率的且つ特異的に修飾し、翻訳後修飾ファージを作製する。図１０は（ファージＰｈ−Ａｚからの）ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基を組込んだファージ提示型ポリペプチドと２種の異なる分光プローブホスフィン分子（構造７及び８）のスタウディンガーライゲーション反応を示す。この方法については実施例６に詳細に説明する。
【０１０１】
（限定しないが）本発明を実証する目的で、本明細書の実施例ではスタウディンガーライゲーション反応用として適切に修飾した２種の分光プローブの使用について記載する。しかし、当業者に自明の通り、本発明はスタウディンガー反応におけるこれらの修飾ホスフィン分子の使用に限定されない。スタウディンガー反応化学は適切に修飾できる任意分子によるファージ提示型ポリペプチドの翻訳後修飾（従って、ファージの翻訳後修飾）を可能にする。当業者であれば、結合用として任意該当特定分子の適切な誘導体を容易に合成することができる。
【０１０２】
直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術
本発明の新規組成物及び方法の理解は直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に関連する活性を理解することにより容易になる。直交ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術については例えば、国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３、ＷＯ２００２／０８６０７５、ＷＯ２０４／０９４５９、ＷＯ２００５／０１９４１５、ＷＯ２００５／００７８７０及びＷＯ２００５／００７６２４に記載されている。言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。
【０１０３】
付加的な反応性非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼ及びｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切なｔＲＮＡを含む新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡをただ１種の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは更に一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されない。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種の内在シンテターゼのいずれによってもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
【０１０４】
本発明は非天然アミノ酸を組込んだファージ提示型ポリペプチドを提供し、非天然アミノ酸（従って、ファージ）は翻訳後修飾される。ファージ提示型蛋白質への非天然アミノ酸の組込みは大腸菌における蛋白質への非天然アミノ酸の遺伝コーディングに直交対を適応させることにより実施され、直交成分は宿主細胞の翻訳機構の内在大腸菌成分と交差反応しないが、所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン（例えば、アンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答して蛋白質に組込む。本発明により提供される直交成分としては、真正細菌宿主細胞で直交対として機能するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサーが挙げられる。この系では、突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはサプレッサーｔＲＮＡを夫々の非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、２０種の標準アミノ酸のいずれでもアミノアシル化しない。
【０１０５】
本発明は非天然アミノ酸を組込んだファージ提示型ポリペプチドを提供し、非天然アミノ酸（従って、ファージ）は翻訳後修飾され、更に本発明はその作製方法を提供する。これらの方法は非天然アミノ酸をファージ提示型蛋白質に組込むために使用することができる直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を利用する。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸（例えば図３又は図１５に示す非天然アミノ酸）の例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの組込みを媒介することができる。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、その非天然アミノ酸をポリペプチドのこの位置に組込む。一般に、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡをただ１種の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（又は負荷）する。
【０１０６】
非天然アミノ酸をファージ提示型蛋白質に部位特異的に組込むことができると、これらの蛋白質の翻訳後修飾を可能にすることにより蛋白質の研究を助長できると共に、新規性質をもつ蛋白質の組換えが可能になる。例えば、１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の発現は特異的標識による蛋白質の試験を容易にし、酵素の触媒機能を改変し、生理活性を改善又は基質に対する交差反応性を低減し、蛋白質を他の蛋白質、小分子又は生体分子と架橋し、蛋白質分解を低減又は排除し、（例えば、導入した反応部位のペグ化又は他の修飾により）蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を改善すること等が可能になる。
【０１０７】
直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びその対
１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系は広く記載されており、例えば国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）が挙げられる。これらの各出願は言及によりその開示内容全体を本明細書に組込む。言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｄｅｉｔｅｒｓら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４（２００５）；Ｃｈｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，９０２６−９０２７；及び国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月３０日）も参照。
【０１０８】
このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸を含む細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳを含む。本発明は個々の成分も提供する。
【０１０９】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下では核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを該当非天然アミノ酸でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の望ましい側面では、細胞は付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンが異なるセレクターコドンを特異的に認識することができる。
【０１１０】
本発明の所定態様では、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞又は酵母細胞）が提供され、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と併用することができる。
【０１１１】
１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
【０１１２】
上記のように、本発明は場合により２種以上の非天然アミノ酸をファージ提示型ポリペプチドに組込むことができるように、細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対を含むことができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン（例えばオパールコドン、４塩基コドン等）を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
【０１１３】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための１つのストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
【０１１４】
直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
【０１１５】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非天然アミノ酸の組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
【０１１６】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【０１１７】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例は本明細書の配列表に記載する。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表、実施例及び図面も参照。更に、本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。Ｏ−ＲＳ  ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。塩基に付加修飾を加えてもよい。
【０１１８】
本発明は本明細書に記載する特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたない分子が挙げられる（更に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい）。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【０１１９】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の「直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」のセクションも参照。
【０１２０】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は公知である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは例えば配列番号１の代表的Ｏ−ｔＲＮＡの部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
【０１２１】
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Ｄアームもしくはループ、可変ループ、ＴΦＣアームもしくはループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域、又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡに付加配列を付加する段階を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性等を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
【０１２２】
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物に対して直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を分析に使用することができる。１例では、大腸菌で使用するための潜在的直交翻訳成分を選択するためには、真正細菌生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。
【０１２３】
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
【０１２４】
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ））をコードするポリヌクレオチドの（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）非必須位置等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
【０１２５】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドン（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス（例えば終止）又はフレームシフト突然変異）のｉｎ  ｖｉｖｏ抑圧に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観測される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
【０１２６】
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交性であるとき）には、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
【０１２７】
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡを含む細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡが両者選択後に生存している。
【０１２８】
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
【０１２９】
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の１側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
【０１３０】
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングを使用することもできる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーを使用することができる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９０：１０４４４−８も参照。
【０１３１】
組換え直交ｔＲＮＡのその他の作製方法も例えば国際出願公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）“Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ，”  ＰＮＡＳ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ，”ＰＮＡＳ  １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
【０１３２】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明で利用されるＯ−ＲＳはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列表と実施例（例えば、図２及び配列番号４〜７参照）に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、有用なＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表及び実施例参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【０１３３】
Ｏ−ｔＲＮＡと併用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（例えばＯ−ＲＳ）の同定方法は公知である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は本明細書に記載するような当分野で公知の技術により測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識非天然アミノ酸）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用する効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
【０１３４】
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化はレポーターを直交翻訳成分と併用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」も参照。
【０１３５】
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種の標準アミノ酸のいずれをも負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発（例えばＤＮＡシャフリング又は他の再帰的突然変異誘発法）に付すことができる。
【０１３６】
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングする。
【０１３７】
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の所定側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
【０１３８】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳの作製方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
【０１３９】
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細については国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」に記載されている。言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。
【０１４０】
資源及び宿主生物
本発明で利用される直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物（又は生物組み合わせ）に由来することができる。直交対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。所定側面では、直交成分は真正細菌宿主系で使用するために古細菌遺伝子（即ち古細菌）に由来する。
【０１４１】
例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは古細菌生物、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物又は生物組み合わせ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの資源として使用することができる。
【０１４２】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
【０１４３】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するためにｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニング、及び／又は細胞（例えば真正細菌細胞）で使用することができる。使用される真正細菌細胞は限定されないが、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等である。本発明の翻訳成分を含む真正細菌細胞の組成物も本発明の特徴である。
【０１４４】
別の種で使用するためにある種のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングする方法については、国際出願公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」（出願日２００４年４月１６日）も参照。
【０１４５】
所定側面では、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するためにｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニング、及び／又は細胞（例えば真核細胞）で使用することができる。使用する真核細胞は限定されず、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の適切な任意酵母細胞を使用することができる。本発明の翻訳成分を含む真核細胞の組成物も本発明の特徴である。
【０１４６】
（例えば、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を含む）直交翻訳系は非天然アミノ酸をもつ蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明の直交翻訳系は無傷の生存可能な宿主細胞を必要とするものではない。例えば、直交翻訳系は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を使用することは確立した技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸をもつ蛋白質を生産するようにこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を応用することは十分に本発明の範囲に含まれる。
【０１４７】
セレクターコドン
直交翻訳系のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、４個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
【０１４８】
１態様では、本方法は細胞で翻訳後修飾のターゲットであるファージ提示型ポリペプチドに非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより非天然アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら，（１９８８），“５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで併用すると、非天然アミノ酸は終止コドンに応答して組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドが得られる。本発明の１態様では、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンＵＡＧ及び／又はオパールコドンＵＧＡである。１例では、セレクターコドンとしてＵＡＧとＵＧＡの両者を使用する遺伝コードは存在度が最も高い終結シグナルであるオーカーナンセンスコドンＵＡＡを保存しながら２２種のアミノ酸をコードすることができる。
【０１４９】
非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、付加化合物、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤も加えてもよい。
【０１５０】
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばＫｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ  ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【０１５１】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
【０１５２】
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、４塩基ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。４塩基コドンは各種直交系でセレクターコドンとして使用されている。例えば、ＷＯ２００５／０１９４１５；ＷＯ２００５／００７８７０；及びＷＯ２００５／００７６２４参照。言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。下記実施例ではアンバーセレクターコドンを使用しているが、４塩基Ｏ−ｔＲＮＡと各種非天然アミノ酸Ｏ−ＲＳについて従来記載されている突然変異と同様の突然変異を含むように改変したシンテターゼを使用するように下記実施例を変更することにより、４塩基以上のコドンも使用することができる。
【０１５３】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
【０１５４】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝子アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、トリプレットコドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）“Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２に記載されている。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連刊行物は以下に挙げる。
【０１５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１５６】
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
【０１５７】
非天然アミノ酸
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
2009511053.tif 000002
により表される。
【０１５８】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のα−アミノ酸以外の天然化合物でもよい。
【０１５９】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
【０１６０】
本発明では図３及び図１５に示す非天然アミノ酸が特に重要である。例えば、これらの非天然アミノ酸としては限定されないが、アリール−アジドアミノ酸（例えばパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）とアルキニルアミノ酸（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン）が挙げられる。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のＬ及びＤエナンチオマーのどちらも利用できる。
【０１６１】
これらのアリール−アジド及びアルキニル非天然アミノ酸に加え、例えばアリール−アジド又はアルキニル非天然アミノ酸を組込むために直交対と適切な第２のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対を併用して他の非天然アミノ酸を同時に該当ファージ提示型ポリペプチドに組込むことができる。多数のこのような付加非天然アミノ酸と適切な直交対系が公知である。本明細書の引用文献参照。
【０１６２】
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
【０１６３】
別の側面では、本発明は下式ＩＶ：
【化２】
2009511053.tif 000003
により表される一般構造をもつ非天然アミノ酸を提供する。
【０１６４】
この構造をもつ非天然アミノ酸は一般にＲ１が２０種の天然アミノ酸の１種で使用される置換基（例えば、チロシン又はフェニルアラニン）であり、Ｒ２が置換基である任意構造である。従って、この種のアミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
【０１６５】
図３及び１５に示す非天然アミノ酸等の新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化３】
2009511053.tif 000004
の構造により表されるような修飾主鎖構造も含み、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１６６】
所定側面では、本発明はＬ配置の非天然アミノ酸を利用する。しかし、本発明はＬ配置非天然アミノ酸の使用に限定されない。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のＤエナンチオマーも利用できると考えられる。
【０１６７】
チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリンアミノ酸、７−ヒドロキシ−クマリンアミノ酸、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。更に、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。直交翻訳系を使用して組込むことができる各種非天然アミノ酸の構造は公知である。各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込む本明細書の引用文献も参照。
【０１６８】
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｄｄ，（１９４９）“Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ（１９５９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇら（１９８８）“Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ），”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙら（１９９１）“Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ，”��．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）“Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照。
【０１６９】
非天然アミノ酸の細胞取込み
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，”ＰＮＡＳ  ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
【０１７０】
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１７１】
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）」として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダムに突然変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ）」ＷＯ００／４６３４４参照。
【０１７２】
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１７３】
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路組換え技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路組換えアプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
【０１７４】
使用する方法に関係なく、一般に本発明の組換え生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞内量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞内資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を組換え、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
【０１７５】
本発明で利用される直交成分
本発明は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを提示するファージを提供し、非天然アミノ酸（従ってファージ）は翻訳後修飾される。本発明は修飾ファージの作製方法も提供する。
【０１７６】
ファージ提示型蛋白質への非天然アミノ酸の組込みは大腸菌における蛋白質への非天然アミノ酸の遺伝コーディングに直交対を適応させることにより実施され、直交成分は宿主細胞の翻訳機構の内在大腸菌成分と交差反応しないが、所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン（例えば、アンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答して蛋白質に組込む。本発明で利用される直交成分としては、大腸菌等の真正細菌宿主細胞で直交対として機能するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサーが挙げられる。この系では、突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはサプレッサーｔＲＮＡを夫々の非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、２０種の標準アミノ酸のいずれでもアミノアシル化しない。
【０１７７】
本発明では直交成分の作製方法を利用し、これらの方法はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のファージ提示型ポリペプチドに非天然アミノ酸（例えば図３及び図１５に示す非天然アミノ酸）を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで組込む。例えば、本発明では直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を利用する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために使用することができ、ポリペプチドはファージディスプレイシステムに組込まれた後に翻訳後修飾される。
【０１７８】
本発明で利用される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）としては、ファージディスプレイシステムで特異的且つ選択的に翻訳後修飾することが可能なアミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する任意Ｏ−ＲＳが挙げられる。これらのアミノ酸としては、限定されないが、アリール−アジドアミノ酸（例えばパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）と、アルキニルアミノ酸（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン）が挙げられる。例えば、本発明は少なくとも１個の翻訳後修飾非天然アミノ酸残基を組込んだポリペプチドを提示させたファージを提供し、アミノ酸は選択的に修飾することができる。このようなアミノ酸としては限定されないが、ケト部分をもつアミノ酸が挙げられ、例えば、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、メタ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン及びパラ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる（例えばＷａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，７００：５６−６１及びＬｉｕら，（２００３）ＪＡＣＳ  １２５（７）：１７０２−１７０３参照）。反応性化学部分をもつ他の非天然アミノ酸も直交翻訳系によりファージに組込むことができ、このような非天然アミノ酸は修飾の選択的ターゲットである。これらの系は例えばパラ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、パラ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン及びパラ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを組込むことができる（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９２１０、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＳ）」参照）。
【０１７９】
翻訳後修飾することができる非天然アミノ酸に関するその他の情報については、例えば、各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＣｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００３）３０１：９６４−９６７；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：８８８２−８８８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：７５６６−７５７１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２）ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８  （２００５）；及びＤｅｉｔｅｒｓら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４  （２００５）に記載されている非天然アミノ酸直交システム参照。
【０１８０】
国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９２１０、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＳ）」に記載されている非天然アミノ酸直交システムも参照。
【０１８１】
所定態様では、本発明で利用されるＯ−ＲＳは内在ｔＲＮＡよりもＯ−ｔＲＮＡを優先的に非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと同一非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。
【０１８２】
本発明は更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を利用し、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１）に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上である。所定側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
【０１８３】
本発明は翻訳系と、ファージ作製をプログラムするヌクレオチド配列を含む細胞（例えば大腸菌）を利用し、翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、ファージ提示型ポリペプチドへのその組込み後に翻訳後修飾することができる非天然アミノ酸を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡよりもＯ−ｔＲＮＡを優先的に非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【０１８４】
更に本発明では各種ポリヌクレオチドを利用する。これらのポリヌクレオチドとしては、Ｏ−ＲＳをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明で利用されるポリヌクレオチドとしては更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も挙げられる。本発明ではポリヌクレオチドを含むベクターも利用する。例えば、ベクターとしてはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法は公知であり、本発明で利用される。本明細書の開示とその引用文献参照。
【０１８５】
核酸及びポリペプチド配列と変異体
本明細書に記載するように、本発明では例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチドによりコードされる夫々のアミノ酸配列を利用する。本明細書の開示は本発明で利用されるポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の例を記載及び参照する。しかし、当然のことながら、本発明は本明細書に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ多数の関連配列（例えば、本明細書に開示するＯ−ＲＳの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド）も提供する。
【０１８６】
本発明で利用されるポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。本発明で利用されるポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する（但し１００％は一致しない）人工ポリヌクレオチドも含む。
【０１８７】
所定態様では、本発明で利用されるベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）は本発明で利用されるポリヌクレオチドを含む。所定態様では、ベクターは発現ベクターである。他の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。他の態様では、細胞は本発明で利用されるポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【０１８８】
同様に当業者に自明の通り、本発明では開示配列の多数の変異体も利用される。例えば、本発明では機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も利用される。本発明では少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も利用される。
【０１８９】
保存変異
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
【０１９０】
特定核酸配列の「保存変異体」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異体」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０１９１】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
【表１】
2009511053.tif 000005
【０１９２】
核酸ハイブリダイゼーション
本明細書に記載する核酸の保存変異体を含めて本発明で利用される核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明で利用される核酸を識別する好ましい１方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で本明細書に記載又は参照する核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明で利用される。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は少数のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０１９３】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも５０％の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１９４】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載されており、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）と、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１９５】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１９６】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０１９７】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１９８】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１９９】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０２００】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
【０２０１】
ユニークサブ配列
所定側面では、本発明は本明細書に開示又は参照するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を利用する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０２０２】
同様に、本発明は本明細書に開示又は参照するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを利用する。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０２０３】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定される。
【０２０４】
配列比較、一致度及び相同度
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０２０５】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０２０６】
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【０２０７】
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０２０８】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）参照）により実施することができる。
【０２０９】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトから公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０２１０】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
【０２１１】
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、更に例えば非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
【０２１２】
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、各種突然変異誘発法を本発明と併用することができる。これらの方法としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリングもしくは他の再帰的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）に基づいて突然変異誘発を誘導することができる。
【０２１３】
本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクターや発現ベクター等のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０２１４】
大腸菌でアンバー終止コドン（ＵＡＧ）に応答して非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むための非常に効率的で万能の単一プラスミドシステムが開発された。新規システムでは、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡｔｙｒ（ＣＵＡ）とチロシルｔＲＮＡシンテターゼの対は大半の大腸菌発現ベクターと適合可能な単一プラスミドでコードされる。最適二次構造とｔＲＮＡプロセシングのためにｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のモノシストロンｔＲＮＡオペロンが構築された。シンテターゼのｇｌｎＳプロモーターの突然変異体を導入すると、抑圧効率と忠実度の両者が有意に増加した。抑圧効率の増加はｔＲＮＡ遺伝子の多重コピーとシンテターゼの特異的突然変異（Ｄ２８６Ｒ）によっても得られた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０（６）：４２５−４３２［２００３］）。最適化システムの汎用性は蛋白質機能及び構造の研究におけるそのユニークな有用性が従来認められている数種の異なる非天然アミノ酸が非常に効率的且つ正確に組込まれることによっても実証された。
【０２１５】
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出）、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）、及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の企業等の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０２１６】
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。例えば細胞単離及び培養（例えば後期核酸単離）に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
【０２１７】
該当蛋白質及びポリペプチド
翻訳後修飾される特定位置に非天然アミノ酸（アリール−アジドアミノ酸又はアルキニルアミノ酸）を組込んだ提示型融合蛋白質を含むファージの作製方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、（例えば大腸菌細胞で作製した）ファージ構築物と、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質（キャプシド融合蛋白質）をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階を含み、細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。こうして大腸菌で作製されたファージはセレクターコドンに対応する位置に非天然アミノ酸をもつ提示型融合蛋白質を含む。その後、非天然アミノ酸が共有結合的修飾を受ける条件下で前記ファージを反応させることにより、翻訳後修飾ファージを作製する。
【０２１８】
所定態様では、Ｏ−ＲＳは発現系において内在ｔＲＮＡよりもコグネイトＯ−ｔＲＮＡのアミノアシル化を優先する。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【０２１９】
所定態様では、適切なプロテアーゼと、ファージ提示型融合蛋白質に組込まれたプロテアーゼ認識配列を使用して、ファージ提示型翻訳後修飾融合蛋白質を開裂することができる。この開裂の結果、ファージキャプシドから該当蛋白質又はその一部を遊離させることができる。所定態様では、該当蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。
【０２２０】
翻訳後修飾される特定位置に非天然アミノ酸（例えばアリール−アジドアミノ酸又はアルキニルアミノ酸）を組込んだ提示型融合蛋白質を含むファージも本発明の特徴である。ファージは細胞（例えば大腸菌細胞）で作製される。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対も細胞に含まれ、宿主細胞の翻訳機構を利用し、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を融合蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込み、ファージに提示させる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ系が翻訳後修飾可能な多様な非天然アミノ酸を組込むように宿主細胞で機能できることは公知である。例えば、各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込むＣｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：９６４−９６７；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：８８８２−８８８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：７５６６−７５７１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２）ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８（２００５）；及びＤｅｉｔｅｒｓら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４（２００５）参照。
【０２２１】
各々言及によりその開示内容全体を本明細書に組込む国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９２１０、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＳ）」に記載されている非天然アミノ酸直交システムも参照。
【０２２２】
非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット、ラベル又は反応基の組込み等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を適応させるために実施することができる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有結合的）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）“Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。（例えば［３＋２］シクロ付加反応又はスタウディンガーライゲーション修飾により）選択的に翻訳後修飾可能な非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は反応パートナーと結合可能な任意所望官能基を含むように組換えることができる。ファージ提示型ポリペプチドに組込んだ非天然アミノ酸残基と共有結合する適切な反応性部分を含むという点さえ満足するならば、反応パートナーの種類は限定されない。
【０２２３】
所定側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種のファージ提示型蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだ１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個が非天然アミノ酸であるファージ提示型蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０２２４】
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸を組込んだほぼ任意ファージ提示型蛋白質（又はその部分）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を作製することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を適応させることにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０２２５】
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ並びに他の多数の蛋白質が挙げられる。
【０２２６】
本明細書に記載するファージ提示型蛋白質に非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ組込み及び修飾するための組成物及び方法を使用して作製することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【０２２７】
本発明の蛋白質（例えば１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としてはサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物等の生理活性蛋白質が挙げられ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０２２８】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０２２９】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓカタログ）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
【０２３０】
他の各種蛋白質も本発明の組成物と方法を使用して１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。
【０２３１】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
【０２３２】
所定態様では、該当修飾ファージ提示型蛋白質（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
【０２３３】
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば非天然アミノ酸を組込むための１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１種以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上の非天然アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンを含む任意核酸も含む。
【０２３４】
翻訳後修飾非天然アミノ酸を組込んだファージ提示型蛋白質を作製するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼを発現する１種以上のベクター、及び修飾すべき蛋白質をコードするベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
【０２３５】
免疫反応性によるポリペプチドの定義
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含むポリペプチド）を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【０２３６】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で作製することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細は国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０３５６０５、発明の名称「糖蛋白質合成（ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」；及びＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」に記載されている。
【０２３７】
光調節及びフォトケージング
本発明は翻訳後修飾される少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを提示させたファージを提供する。翻訳後修飾の結果、任意所望部分をキャプシド融合ポリペプチド（従ってファージ）に結合することができる。所定態様では、非天然アミノ酸に結合したコンジュゲート部分を光調節することにより、光調節型修飾非天然アミノ酸を作製することができる。
【０２３８】
例えば酵素、受容体、イオンチャネル等の活性を直接調節するか、又は各種シグナル伝達分子の細胞内濃度を調節することにより、光調節型アミノ酸（例えばフォトクロミック、光分解性、光異性化可能等）を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。例えばＳｈｉｇｅｒｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，２００１，９１：８５；Ｃｕｒｌｅｙら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，１９９９，８２：３４７；Ｃｕｒｌｅｙら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．，１９９９，３：８４；“Ｃａｇｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｇ．，Ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９８，Ｖ．２９１；Ａｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，５５：７５５＋；及びＢｏｃｈｅｔら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  １，２００２，１２５参照。本発明の各種態様では、組成物と方法は光調節型アミノ酸を含む。。
【０２３９】
「光調節型アミノ酸」は一般に例えば感光性アミノ酸である。光調節型アミノ酸は一般に所定方法で光（例えばＵＶ、ＩＲ等）により制御されるアミノ酸である。従って、例えば、生理活性をもつペプチドに光調節型アミノ酸を組込むならば、照射によりアミノ酸を改変することにより、ペプチドの生理活性を変化させることができる。光調節型アミノ酸には、「フォトケージドアミノ酸」、「感光性アミノ酸」、「フォトレービルアミノ酸」、「光異性化可能なアミノ酸」等も含まれる。ケージドアミノ酸やケージドペプチド等の「ケージド種」は大きな部分（例えば分子）の内側にトラップされ、特定照射を受けると遊離する種である。例えばＡｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，５５：７５５−７８４参照。アミノ酸の「ケージング」基は（例えばターゲット分子との相互作用を通常は安定化させる結合を切断するか、特定側鎖の疎水性又はイオン特性を変化させるか、あるいは立体障害等により）分子（例えばこのようなアミノ酸を含むペプチド）内の生理活性を阻害又は隠蔽することができる。「光異性化可能な」アミノ酸は露光により異性体に転換することができる。このようなアミノ酸の各種異性体が組込まれると、蛋白質の他の側鎖と異なる相互作用を生じることができる。こうして光調節型アミノ酸はそれらが組込まれたペプチドの生理活性を（活性化、部分活性化、不活化、部分不活化、変形活性化等により）制御することができる。光調節型アミノ酸及び分子の詳細な定義と例についてはＡｄａｍｓ前出と本セクションの他の引用文献参照。
【０２４０】
多数の光調節型アミノ酸が当業者に公知であり、多数のものが市販されている。光調節分子をアミノ酸と結合及び／又は会合する方法も公知である。このような光調節型アミノ酸一般は本発明の各種態様に利用可能である。当然のことながら、考えられる多数の光調節部分（例えばフォトケージング基等）と多数の光調節型アミノ酸を本明細書に列挙しているが、これらの例は限定的であるとみなすべきではない。従って、本発明は本明細書に具体的に記載しない光調節部分及び光調節型アミノ酸にも利用可能である。
【０２４１】
上記のように、光調節型アミノ酸を作製するために場合により多数の方法が適用可能である。例えば、光調節型アミノ酸（例えばフォトケージドアミノ酸）はそのα−アミノ基をＢＯＣ（ブチルカルボニル）等の化合物で保護し、α−カルボキシル基をｔ−ブチルエステル等の化合物で保護することにより作製することができる。このような保護後にクロロギ酸２−ニトロベンジル、臭化α−カルボキシル２−ニトロベンジルメチルエステル、又は２−ニトロベンジルジアゾエタン等の反応形の２−ニトロベンジル等のフォトレービルケージング基とアミノ酸側鎖を反応させることができる。フォトレービルケージ基を付加した後に標準手順により保護基を除去することができる。例えばＵＳＰＮ５，９９８，５８０参照。
【０２４２】
別の例として、クロロギ酸２−ニトロベンジルを使用してリジン残基をケージングし、ε−リジンアミノ基を修飾し、正電荷を除去することもできる。あるいは、α−カルボキシ２−ニトロベンジルオキシカルボニルケージング基の使用により（このようなリジンをもつ）ペプチドに負電荷を導入することによりリジンをケージングすることもできる。更に、ホスホアミノ酸又はホスホペプチドを１（２−ニトロベンジル）ジアゾエタンで処理することによりホスホセリンとホスホスレオニンをケージングすることができる。例えばＷａｌｋｅｒら，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７２：２８８−３０１，１９８９参照。例えばセリン、スレオニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸及びグルタミン酸等の他の多数のアミノ酸も容易に標準ケージング化学に適用可能である。例えばＷｉｌｃｏｘら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：１５８５−１５８９，１９９０参照。この場合も当然のことながら、特定光調節型（アミノ酸及び／又は光調節型アミノ酸に変換可能なもの）の列挙は必ずしも限定的とみなすべきではない。
【０２４３】
アミノ酸残基は他の方法で光調節型（例えば感光性又はフォトレービル）にすることもできる。例えば、特定アミノ酸残基をもつペプチド主鎖が放射線照射により開裂するような所定アミノ酸残基を作製することができる。例えば、フォトレービルグリシンである２−ニトロフェニルグリシンはこのように機能することができる。例えばＤａｖｉｓら，１９７３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１６：１０４３−１０４５参照。２−ニトロフェニルグリシンを組込んだペプチドに放射線を照射すると、２−ニトロフェニルグリシンのα炭素とα−アミノ基の間のペプチド主鎖は開裂する。２−ニトロベンジル基をα炭素とα−アミノ基の間に挿入するならば、グリシン以外のアミノ酸にもこのような開裂ストラテジーを一般に適用することができる。
【０２４４】
このような基を他の分子（例えばアミノ酸）と共有結合させるために使用される多数の光調節基（例えばケージング基）と多数の反応性化合物が当分野で周知である。光調節（例えばフォトレービル、ケージング）基の例としては限定されないが、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ニトロインドリン；Ｎ−アシル−７−ニトロインドリン；フェナシル；ヒドロキシフェナシル；臭素化７−ヒドロキシクマリン−４−イルメチル（例えばＢｈｃ）；ベンゾインエステル；ジメトキシベンゾイン；メタフェノール；２−ニトロベンジル；１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）；４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）；α−カルボキシ−２−ニトロベンジル（ＣＮＢ）；１−（２−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）；５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）；（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシ）カルボニル；（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシ）カルボニル；デオキシベンゾイニル等が挙げられる。例えばＵＳＰＮ５，６３５，６０８（Ｈａｕｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｅ）（１９９７年６月３日）、発明の名称「α−カルボキシケージド化合物（α−ｃａｒｂｏｘｙ  ｃａｇｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」Ｎｅｕｒｏ  １９，４６５（１９９７）；Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０８．３，８０１（１９９８）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８  Ｓｅｐ，８５（１７）：６５７１−５；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７  Ｆｅｂ  １４，２７２（７）：４１７２−８；Ｎｅｕｒｏｎ  ２０，６１９−６２４，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２８：２００１：３１７−３２５；Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９２，１９９８：９３６−９４１；Ｐａｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．“Ｃａｇｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０５：８１−８５（１９９７）；Ｐｅｔｔｉｔら（１９９７）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｕｎｃａｇｉｎｇ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｎｅｕｒｏｎ  １９：４６５−４７１；Ｆｕｒｕｔａら（１９９９）“Ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ  ７−ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌｍｅｔｈｙｌｓ：ｎｏｖｅｌ  ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｕｓｅｆｕｌ  ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｐｈｏｔｏｎ  ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６（４）：１１９３−１２００；Ｚｏｕら“Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｃａｇｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｒｅｏｎｉｎｅ”Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：８２２０−８２２９；Ｚｏｕら“Ｃａｇｅｄ  Ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００１）４０：３０４９−３０５１；Ｃｏｎｒａｄ  ＩＩら“���−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎａｃｙｌ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ：Ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｅｘｃｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｐｈｏｔｏｒｅｌｅａｓｅ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：９３４６−９３４７；Ｃｏｎｒａｄ  ＩＩら“Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ  １０：Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  π，π＊  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２０００）２：１５４５−１５４７；Ｇｉｖｅｎｓら“Ａ  Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ  ９：ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎａｃｙｌ  ａｓ  ａ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  Ｐｈｏｔｏｒｅｍｏｖａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：２６８７−２６９７；Ｂｉｓｈｏｐら“４０−Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−２，２０−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ（Ａｂｃ）ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｗｉｔｈｉｎ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２０００）５６：４６２９−４６３８；Ｃｈｉｎｇら“Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ａｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｅｔｈｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｌｙｔｉｃ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｌａｓｅｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ／Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｂｏｕｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）７：５２５−８；ＢｉｏＰｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ又はＷｅｂ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ、並びに本明細書の引用文献参照。各種分子のケージング用の多数の化合物、キット等が例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。その他の情報は例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１（１９８６）及びＣｏｒｒｉｅ，Ｊ．Ｅ．Ｔ．ａｎｄ  Ｔｒｅｎｔｈａｍ，Ｄ．Ｒ．（１９９３）Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｗｉｔｃｈｅｓ，ｅｄ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｈ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２４３−３０５に記載されている。適切な感光性ケージング基の例としては限定されないが、２−ニトロベンジル、ベンゾインエステル、Ｎ−アシル−７−ニトロインドリン、メタフェノール、及びフェナシルが挙げられる。
【０２４５】
所定態様では、光調節（例えばケージング）基は第２の結合部分と結合することができる第１の結合部分を場合により含むことができる。例えば、市販ケージドホスホロアミダイト［１−Ｎ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−（６−ビオチンアミドカプロアミドメチル）−１−（２−ニトロフェニル）−エチル］−２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．製品ＰＣ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅ）はフォトレービル基とビオチン（第１の結合部分）を含む。従って、第２の結合部分（例えばストレプトアビジン又はアビジン）をケージング基と結合することができ、その嵩とケージング効力を増すことができる。所定態様では、ケージド成分は第１の結合部分を各々含む２個以上のケージング基を含み、第２の結合部分は２個以上の第１の結合部分と同時に結合することができる。例えば、ケージド成分は少なくとも２個のビオチン化ケージング基を含むことができ、ストレプトアビジンが複数のケージド成分分子上の複数のビオチン部分と結合し、ケージド成分は相互に結合して大きな網状構造となる。ビオチンを前記成分と結合するフォトレービル基が開裂すると、網状構造は解離する。
【０２４６】
ケージドポリペプチド（例えば抗体や転写因子等のペプチド基質及び蛋白質を含む）を作製する「従来」方法としては、例えばポリペプチドをケージング化合物と反応させる方法や、ポリペプチドの合成中にケージドアミノ酸を組込む方法がある。例えば米国特許第５，９９８，５８０号（Ｆａｙら）（１９９９年１２月７日）発明の名称「感光性ケージド巨大分子（Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｇｅｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」；Ｋｏｓｓｅｌら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１４７０２−１４７０７；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ（１９９９）４：３３０−３３４；ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１５６８−１５７３；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：８２２０−８２２９；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００１）９１：８５−９２；及びＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２００１）４０：３０４９−３０５１参照。（例えば蛋白質形質導入ドメイン及びセンサー等を結合するための）フォトレービルポリペプチドリンカーは例えば米国特許第５，９９８，５８０号に記載されているもの等のフォトレービルアミノ酸を含むことができる。
【０２４７】
光を照射すると、例えばこのようなアミノ酸を含むペプチドの活性に重要なアミノ酸の側鎖残基を遊離させることができる。更に、所定態様では、ケージ解除したアミノ酸はアミノ酸を含むペプチドのペプチド主鎖を開裂し、従って、例えば環状ペプチドを開環し、別の生物学的性質等をもつ線状ペプチドとすることができる。
【０２４８】
ケージドペプチドの活性化は当業者に公知の任意標準方法により光調節型アミノ酸上の感光性ケージング基の破壊により実施することができる。例えば、感光性アミノ酸は（例えばＵＶ域又は赤外域で発光する）レーザー等の適切な慣用光源に暴露することによりケージ解除又は活性化することができる。本発明で使用するもの等の光調節型アミノ酸と併用するために適用可能な適切な波長及びエネルギーのその他の多数のレーザー並びに適切な適用プロトコール（例えば照射時間等）が当業者に自明である。光調節型ケージドアミノ酸の遊離はこのようなアミノ酸を含むペプチドの制御を可能にする。このような制御は位置と時間の両面で可能である。例えば、集束レーザー照射は他の位置のアミノ酸をケージ解除せずに、ある位置のアミノ酸をケージ解除することができる。
【０２４９】
当業者に自明のとおり、光調節型アミノ酸の活性を評価するためには各種アッセイ（例えば下記実施例に記載するアッセイ）を使用することができる。光調節型アミノ酸を組込んだペプチドを細胞又は組織に導入する前後と、光調節型分子の遊離後に多様な例えば細胞機能、組織機能等をアッセイすることができる。
【０２５０】
本発明の組成物及び方法は多数の側面で利用することができる。例えば、光調節型アミノ酸の遊離又は活性化／不活化／等は標的光照射等により局在化することができるので、（例えばペプチド中の）光調節型アミノ酸は治療用組成物を身体の個別位置に送達することができる。同様に当然のことながら、本発明の方法、構造、及び組成物は光調節型天然アミノ酸（例えば光調節部分を結合／会合した天然アミノ酸）の組込み／使用にも適用可能である。
【０２５１】
酵素（例えばＷｅｓｔｍａｒｋら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５：３４１６−１９及びＨｏｈｓａｋａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６：４１３−４参照）、受容体（例えばＢａｒｔｅｌｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７１，６８：１８２０−３；Ｌｅｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９７７，２６６：３７３−４：Ｃｒｕｚら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０００，１２２：８７７７−８；及びＰｏｌｌｉｔｔら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ，１９９８，３７：２１０４−７参照）、又はイオンチャネル（例えばＬｉｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８：１２２２２−３；Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２：６３６４−７０；及びＢａｎｇｈａｒｔら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，７：１３８１−６参照）の活性を直接調節するか、あるいは各種シグナル伝達分子の細胞内濃度（例えばＡｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３，５５：７５５−８４参照）を調節することにより、フォトクロミック及び光分解性基を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。一般に、このためには蛋白質又は小分子をアゾベンゼン又はニトロベンジル基等の光反応性リガンドで化学的に修飾する必要がある。光反応性アミノ酸を生体で直接蛋白質の規定部位に遺伝的に組込むことができるならば、この技術の範囲は著しく拡大すると思われる。例えばＷｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１４３０６−７参照。
【０２５２】
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、翻訳後修飾される少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ提示型ポリペプチドをもつファージを作製するためのキットが本発明の特徴である。例えば、このようなキットはキットコンポーネントを保持するための容器、修飾ファージを作製するための説明書、ファージゲノム材料を含む核酸、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、非天然アミノ酸（例えばアリール−アジドアミノ酸（例えばパラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）又はアルキニルアミノ酸（例えばパラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン））、非天然アミノ酸の翻訳後修飾用試薬（例えばスタウディンガーライゲーション又は［３＋２］シクロ付加反応用試薬）、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの発現とファージの産生に適した大腸菌宿主細胞株から選択される各種コンポーネントを含むことができる。
【０２５３】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に想到されよう。
【実施例１】
【０２５４】
非天然アミノ酸を組込んだファージ提示型ポリペプチドの作製
本実施例は非天然アミノ酸を組込んだファージ提示型ポリペプチドを作製するための組成物と方法について記載する。先述の通り、多数の非天然アミノ酸の任意のものを良好な効率と高い忠実度で蛋白質に選択的にｉｎ  ｖｉｖｏ導入するために適切な宿主細胞で直交翻訳成分を使用することができる。本明細書に記載するように、非天然アミノ酸構成要素を含むファージ提示型ポリペプチドライブラリー作製の一般アプローチとしてファージディスプレイシステムで使用するようにこれらの直交翻訳成分及び方法を応用することができる。
【０２５５】
Ｍ１３繊維状ファージのｐＩＩＩ蛋白質との融合体として非天然アミノ酸を含むポリペプチドを提示するファージを作製するために、ｐＤＵＬＥ／ＣＭ及びＭ１３ＫＥの２種のプラスミドを使用した。プラスミドｐＤＵＬＥ／ＣＭはｐ１５Ａに由来し、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアンバーサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ（ＭｊｔＲＮＡ）と突然変異体Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ；Ｃｈｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（２００２）２２４：９０２６−９０２７に記載のシンテターゼ変異体クローン番号７；図２及び配列番号１０も参照）を大腸菌で構成的に発現する。この突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳはアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（例えば図１に示す直交ｔＲＮＡ；配列番号１）を所望非天然アミノ酸（例えば図３に示すアミノ酸）でアミノアシル化する。対応する非天然アミノ酸の存在下でｐＤＵＬＥ／ＣＭを含む大腸菌Ｔｏｐ  １０Ｆ’（ＴＴＳ株と言う）を増殖させると、非天然アミノ酸はアンバーコドンＴＡＧにより指定される位置に組込まれる。第２のプラスミドＭ１３ＫＥは５価Ｎ末端ｐＩＩＩディスプレイ用ファージベクターであり、本試験ではｐＩＩＩ融合ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）ＡＧＸＴＬＬＡＨＰＱ（配列番号１１）を提示する誘導体ｐＭ１３ＫＥ−ＳＢＰを使用した。Ｎ末端ＡＧ配列はシグナルペプチドの開裂を助長する。アンバーナンセンスコドンＴＡＧによりコードされる３番目の残基Ｘは組込むべき非天然アミノ酸を表す。ｐＩＩＩ融合蛋白質を非天然アミノ酸の存在下に大腸菌株ＴＴＳで発現させると、ｐＩＩＩ融合体として非天然アミノ酸を含むペプチドを提示する生存可能なファージが得られると思われる。初期ファージストックを作製するために、残基Ｘにグルタミンを組込んだ天然アンバー抑圧株である大腸菌株ＸＬ１−ＢｌｕｅにプラスミドｐＭ１３ＫＥ−ＳＢＰを形質転換した。
【０２５６】
非天然アミノ酸の存在に対するファージプラーク形成の依存性を試験するために、Ｍ１３ＫＥ−ＳＢＰファージとＭ１３ＫＥ野生型ファージを２ｍＭ  ｐ−アセチルフェニルアラニン３の存在下及び不在下で大腸菌株ＴＴＳ／ＲＳ３細胞ローン（ＲＳ３は図３の構造３のｐ−アセチルフェニルアラニンに特異的なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを表す）に撒いた。非天然アミノ酸の存在下では、Ｍ１３ＫＥ−ＳＢＰファージとＭ１３ＫＥ野生型ファージのどちらも３７℃で一晩インキュベーション後に正常寸法のプラークを形成した。他方、非天然アミノ酸の不在下では、Ｍ１３ＫＥ野生型ファージしかプラークを形成しなかった。Ｍ１３ＫＥ−ＳＢＰファージではｐ−アセチルフェニルアラニンの不在下でプラーク形成を観察できなかった。天然グルタミニルアンバーサプレッサー株ＸＬ１−ＢｌｕｅにおけるＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージ収率は２×１０１１プラーク形成単位／ｍｌ培養液（ＰＦＵ／ｍＬ）であった。２ｍＭ  ｐ−アセチルフェニルアラニン３の存在下の大腸菌ＴＴＳ／ＲＳ３におけるＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージの収率はＸＬ１−Ｂｌｕｅにおける産生量と同等であり、ｐ−アセチルフェニルアラニン３の存在に依存性である。この非天然アミノ酸の存在下では、ファージ収率は１．８×１０１１ＰＦＵ／ｍＬであり、この非天然アミノ酸の不在下では、ファージ収率は８１分の１に低下する（図４参照）。大規模ファージ作製では、１０００倍を上回る収率差が得られた。ファージ収率実験は５種の異なる非天然アミノ酸を組込んだ５種の大腸菌ＴＴＳ／ＲＳ細胞株で実施した。これらはＯ−メチルチロシン１、ｐ−アジドフェニルアラニン２、ｐ−アセチルフェニルアラニン３、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン４、及び３−（２−ナフチル）アラニン５であった（図３参照）。非天然アミノ酸の存在に対するファージ収率の同様の依存性が各系で観察され（図４参照）、このファージディスプレイスキームは多数の非天然アミノ酸に汎用性であると思われた。
【実施例２】
【０２５７】
プラスミド構築
本実施例は大腸菌宿主細胞で直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させるために使用したプラスミドの構築について記載する。
【０２５８】
プラスミドｐＤＵＬＥ／ＣＭの構築
アンピシリン耐性マーカーをもつプラスミドｐＤＵＬＥをＢｓｍＩで消化し、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼで処理し、平滑末端を形成した。得られたＤＮＡをＣｌａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製した。下記プライマー：
【表２】
2009511053.tif 000006
を使用してＰＣＲによりプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＮＥＢ）からクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を増幅した。
【０２５９】
ＰＣＲ産物をＣｌａＩで消化し、ｐＤＵＬＥとライゲーションし、ｐＤＵＬＥ／ＣＭを得た。ＴＴＳ細胞株はプラスミドｐＤＵＬＥ／ＣＭをＴｏｐ  １０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換することにより作製した。
【０２６０】
ｐＭ１３ＫＥ−ＳＢＰプラスミドの構築：
ストレプトアビジン結合ペプチドｐＩＩＩ融合体は伸長プライマーＦＴ１２１：５’−ＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣ（配列番号１４）及び鋳型ＦＴ１２６：５’−ＣＡＴＧＴＴＴＣＧＧＣＣＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＴＣＴＡＧＣＣＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧ（配列番号１５）を使用して作製し、ＥａｇＩとＡｃｃ６５  Ｉで消化した。Ｔ４リガーゼを使用してこのフラグメントをプラスミドｐＭ１３ＫＥ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）のＥａｇＩ及びＡｃｃ６５  Ｉ部位間に挿入し、ｐＭ１３ＫＥ−ＳＢＰを得た。ライゲーション産物をＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換し、２０μｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧと２０μｇ／ｍＬ  ＸＧａＩの共存下でＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞ローンを含むＬＢ寒天プレートに撒き、青色ファージプラークを形成させた。
【実施例３】
【０２６１】
ファージ培養及びファージ力価測定プロトコール
本実施例は本明細書で使用するファージ培養及び力価測定の一般方法について記載する。
【０２６２】
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおける一般ファージ作製プロトコール
対数期中期大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅとテトラサイクリン１２μｇ／ｍＬを加えた２×ＹＴ  １０ｍＬにシングルファージプラークを加えた。３７℃で５時間インキュベーション後、培養液を６０００×ｇ、４℃で５分間遠心した。２０容量％  ＰＥＧ緩衝液（２０％  ＰＥＧ  ８０００，２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を加えて上清からファージを沈殿させた。混合物を４℃に一晩維持し、１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。ファージペレットを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５００μＬに溶かし、２０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心して残留細胞破片を除去し、４℃で保存した。
【０２６３】
大腸菌ＴＴＳにおける一般ファージ作製プロトコール
対数期中期ＴＴＳとテトラサイクリン１２μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ及び適当な非天然アミノ酸２ｍＭを加えた２×ＹＴ  １０ｍＬにシングルファージプラークを加えた。その後のプロトコールは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅにおける一般ファージ作製プロトコールと同じである。
【０２６４】
一般プラーク形成及びファージ力価実験
マイクロタイタープレートで１０倍系列希釈後、ＴＴＳ／ＲＳ３細胞ローンを含むＬＢ寒天プレートにＩＰＴＧ  ２０μｇ／ｍＬ、ＸＧａｌ  ２０μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン１２μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、及び対応する非天然アミノ酸２ｍＭを添加し、Ｍ１３ＫＥ野生型及びＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージ各５μｌを撒いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０２６５】
ファージ力価
マイクロタイタープレートで１０倍系列希釈後、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞ローンを含むＬＢ寒天プレートにＩＰＴＧ  ２０μｇ／ｍＬ、ＸＧａｌ  ２０μｇ／ｍＬ、及びテトラサイクリン１２μｇ／ｍＬを添加し、ファージ５μＬを撒いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【実施例４】
【０２６６】
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだファージ提示型ポリペプチドの［３＋２］シクロ付加反応による共有結合
本実施例はｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだファージ提示型ポリペプチドの共有結合的修飾について記載する。この共有結合的修飾では［３＋２］シクロ付加反応を使用してアルキン含有部分をｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンに結合し、ポリペプチドとアルキン含有部分の間にトリアゾール結合を形成する。図１５は［３＋２］シクロ付加反応の一般反応化学を示す。
【０２６７】
２ｍＭ  ｐ−アジドフェニルアラニン２の存在下に大腸菌ＴＴＳ／ＲＳ２でＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージを産生させた。得られたファージを次に高度に特異的なアジド−アルキン［３＋２］シクロ付加（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００２）４１：２５９６−２５９９）により、図５，構造６に示すアルキン修飾フルオレセイン色素（Ｄｅｉｔｅｒｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００３）１２５：１１７８２−１１７８３）と結合した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅで作製したファージを陰性対照として使用した。
【０２６８】
具体的に説明すると、ファージとアルキン修飾フルオレセイン色素６のシクロ付加結合反応は以下のように実施した。ストック溶液（５０μＬ，約１０１１ＰＦＵ）からのファージをＰＥＧにより沈殿させ、１００μＭリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ８．０）９０μＬに溶かした。ファージ溶液にｔｅｒｔ−ブタノール５μＬ、２ｍＭトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２ｍＭトリス（トリアゾリル）アミンリガンド、２ｍＭフルオレセイン色素６及び１ｍＭ  ＣｕＳＯ４を加えた。最終反応容量は１００μＬとした。トリス（トリアゾリル）アミンリガンドを添加すると、ファージは沈殿した。反応混合物を４℃で１６時間インキュベートし、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。報告されている条件［リン酸カリウム緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ８．０）＋補助溶媒として５％  ｔｅｒｔ−ブチルアルコール中、２ｍＭトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２ｍＭトリス（トリアゾリル）アミンリガンド、２ｍＭフルオレセイン色素６及び１ｍＭ  ＣｕＳＯ４］（Ｗａｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００３）１２５：３１９２−３１９３参照）下でファージは完全に沈殿した。ＴＣＥＰをＣｕ線に交換しても改善は得られなかった。希釈した試薬（ＰＢ緩衝液（ｐＨ８．０）中、０．１ｍＭ  ＴＣＥＰ，０．２ｍＭリガンド，０．２ｍＭフルオレセイン色素６及び０．１ｍＭ  ＣｕＳＯ４）を使用すると、沈殿は最小限になった。Ｌｉｎｋ  ａｎｄ  Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００３）１２５：１１１６４−１１１６５参照。
【０２６９】
結合後、反応混合物を透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析に付した（図６参照）。ウェスタン分析では抗フルオレセイン（Ｉ）及び抗ｐＩＩＩ（ＩＩ）一次抗体の両者を使用し、分離した蛋白質種の種類を確認した。具体的には、前段階のシクロ付加反応からの沈殿と濃縮上清の両者を４−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した（半乾燥２０Ｖ，２０分）。膜を１×ＰＢＳ中５％スキムミルクで４℃にて一晩ブロッキングし、抗フルオレセインウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１０００倍希釈液と共に室温で２時間インキュベートした。膜を洗浄した後、抗ウサギマウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）の１０，０００倍希釈液でプローブした。膜をＰＢＳＴ（ＰＢＳ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で６回洗浄し、ＥＣＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で展開し、ホスホイメージャーを使用してスキャンした。抗ｐＩＩＩマウスＩｇＧ（ＭｏＢｉＴｅｃ）を一次抗体として使用して抗ｐＩＩＩウェスタン分析も実施した。抗マウスＡＰコンジュゲートを二次抗体として使用した。
【０２７０】
これらのブロットを展開すると（図６，Ｉ参照）、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ大腸菌で作製したファージ（レーンｂ）とは対照的に、フルオレセインコンジュゲートは２ｍＭ  ｐ−アジドフェニルアラニン２を添加したＴＴＳ／ＲＳ２で作製したファージ（レーンａ）の場合のみにシングルバンドとして検出されることが判明した。種類即ちこのバンドはｐＩＩＩ副次的コート蛋白質であることが抗ｐＩＩＩウェスタンブロット分析により更に確認された（ＩＩ）。これらの結果から明らかなように、非天然アミノ酸は非天然ファージのｐＩＩＩコート蛋白質に特異的に組込まれる。
【実施例５】
【０２７１】
非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだファージ提示型ポリペプチドの生理活性の維持
本実施例ははｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだファージ提示型ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）融合体の生理活性の維持を例証する。ストレプトアビジン結合活性はファージ調製物でアッセイした。
【０２７２】
ｐＩＩＩ蛋白質のＮ末端に提示された突然変異体ストレプトアビジン結合ペプチドが機能的であることを実証するために、ファージ結合酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）を利用した。このシステムでは、２ｍＭ  ｐ−アジドフェニルアラニン２又はｐ−アセチルフェニルアラニン３を夫々添加したＴＴＳ／ＲＳ２及びＴＴＳ／ＲＳ３細胞で作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージを使用した（図７のデータ及び図８の対応するグラフ参照）。ＸＬ１−Ｂｌｕｅで作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージを陽性対照とし、野生型Ｍ１３ＫＥファージを陰性対照とした。
【０２７３】
この分析では、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を１×ＰＢＳ中４％  ＢＳＡ又は１×ＰＢＳ＋１０μＭビオチン中４％  ＢＳＡ  ３００μＬで４℃にて一晩ブロッキングした。洗浄後、Ｍ１３ＫＥファージ（１０１１ＰＦＵ）、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅで作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージ、ＴＴＳ／ＲＳ２又はＴＴＳ／ＲＳ３＋対応する非天然アミノ酸２ｍＭで作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰ  １００μＬを４倍系列でウェルに加えた。室温で２時間インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴ  ２００μＬで３回洗浄し、抗Ｍ１３  ＨＲＰコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１０，０００倍希釈液と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ  ２００μＬで１０回洗浄後、ウェルを安定なペルオキシダーゼ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中のＯＰＤ基質１００μＬで展開した。２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  １００μＬを加えることにより反応を終了した。各ウェルのＯＤ４９２ｎｍをプレートリーダーで記録した（図７参照）。図７に示す表の各点の値は３回の実験の平均である。誤差は１０％未満である。
【０２７４】
このデータを図８にグラフで示す。同図から明らかなように、ＴＴＳ／ｐ−アジドフェニルアラニン２及びＴＴＳ／ｐ−アセチルフェニルアラニン３で作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージはＸＬ１−Ｂｌｕｅで作製した陽性対照ファージよりも強くストレプトアビジンと結合する。観察される親和性のこの増加は非天然アミノ酸を組込んだ提示型ペレットの結合親和性又は蛋白分解安定性の増加に起因すると思われる。
【０２７５】
モデルファージ選択実験では、野生型ファージと、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだ突然変異体ＳＢＰをもつファージをストレプトアビジンコートウェルに暴露した後、結合したファージを回収した。溶出後に回収された集積化ファージの力価をストレプトアビジンに対するファージの結合特異性の尺度として使用した。
【０２７６】
具体的には、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ）の２個のウェルを１×ＰＢＳ中４％  ＢＳＡ  ３００μＬで４℃にて一晩ブロッキングした。洗浄後、ストレプトアビジンをコートした別のウェルをＴＴＳ／ＲＳ３で作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰ又はＭ１３ＫＥ野生型ファージの同等数のファージ（各１００μＬ）と共に室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴ  ２００μＬで１０回洗浄した。結合したファージを１０μＭビオチン１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４でプレート固体支持体から溶出させた。入力及び出力ファージの力価を測定した（図９参照）。
【０２７７】
ＴＴＳ／ＲＳ３で作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージの回収率はＭ１３ＫＥ野生型ファージの９×１０３倍である（図９）。これらの実験結果から明らかなように、突然変異体ＳＢＰはファージに提示され、機能的である（即ちストレプトアビジンと特異的に結合する性質を維持する）。
【０２７８】
非天然アミノ酸を組込むようにファージディスプレイを一般化すると、ファージディスプレイ技術の範囲は著しく拡大すると思われる。例えば、非天然アミノ酸をファージ提示型ポリペプチドに組込むと、結合親和性及び特異性を増し、主鎖及び側鎖の配座を制限し、蛋白分解安定性を増すことができる。非天然アミノ酸は非特異的分子の配座の反応部位を提供すると共に、オーファンリガンド又は受容体の同定用光親和性ラベルとして利用することができる。最後に、この方法はリボソーム及び酵母ディスプレイ等の他のディスプレイフォーマットにも適用可能である。
【実施例６】
【０２７９】
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだファージ提示型ポリペプチドのスタウディンガーライゲーション反応による選択的共有結合的修飾
本実施例はｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだファージ提示型ポリペプチドのスタウディンガーライゲーション反応による選択的共有結合的修飾を例証する。本実施例では、実施例１に記載したファージ提示型ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）／ｐＩＩＩ融合蛋白質を図１０に示すようなスタウディンガー反応の基質として使用した。
【０２８０】
実施例１〜３に記載したように、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）ＡＧＸＴＬＬＡＨＰＱ（配列番号１１）をＭ１３繊維状ファージのｐＩＩＩ蛋白質との融合体として５価で提示させたファージディスプレイシステムを作製した。Ｎ末端ＡＧ配列はシグナルペプチドの開裂を助長し、アンバーナンセンスコドンＴＡＧによりコードされる３番目の残基Ｘは組込むべき非天然アミノ酸を表す。（残基Ｘにｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を組込んだＳＢＰをコードする）ファージＰｈ−Ａｚは２ｍＭ  ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２の存在下に大腸菌株ＴＴＳ／ＲＳで良好な効率と高い忠実度で作製された。大腸菌ＴＴＳ／ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ突然変異体アンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ）と、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒにｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を特異的に負荷する突然変異体Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）を構成的に発現するプラスミドを含む。陰性対照として、残基Ｘにグルタミンを組込んだ天然アンバー抑圧株である大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅで別のＳＢＰ提示ファージ（Ｐｈ−Ｑ）を作製した。
【０２８１】
このファージシステムを使用し、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を組込んだファージ提示型ポリペプチドを選択的スタウディンガー修飾の基質として使用できるか否かを試験した。容易に検出できることから、フルオレセイン由来ホスフィン７及び８（図１０の構造参照）をスタウディンガーライゲーション反応に使用した。
【０２８２】
化合物７は文献に記載の手順（Ｓａｘｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，２００７−２０１０；Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００３，１４，６９７−７０１）に従って合成した。化合物８は無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中でジシクロヘキシルカルボジイミド（６２ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）の存在下に周囲温度にて１２時間２−（ジフェニルホスフィノ）フェノール（７４ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）（Ｓｕａｒｅｚら，Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  ２００２，２１，４６１１−４６２１参照）と、５（６）−カルボキシフルオレセイン（１００ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）をカップリング反応させることにより製造し、分取ＴＬＣを使用して精製し、赤色粉末として得た（３ｍｇ，２％）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）：Ｃ３９Ｈ２４Ｏ７Ｐ１［Ｍ−１］−計算値６３５．１２６５；実測値６３５．１２４８。
【０２８３】
図１０のスキームによると、ホスフィン７はファージＰｈ−Ａｚと反応し、アザ−イリド中間体を形成し（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９１９，２，６３５−６４６）、その後、分子内環化し（Ｓａｘｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，２００７−２０１０）、最終的にフルオレセイン標識ファージ産物が得られる。８とＰｈ−Ａｚの結合も同様の反応メカニズムによりトレースレススタウディンガーライゲーションを受け、トリフェニルホスフィンオキシド基を介在せずにフルオレセイン標識ファージが得られると思われる。
【０２８４】
ファージ分子とホスフィン７及び８の結合反応はファージ粒子約１０１１個と１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）中０．０１ｍＭ  ホスフィンを使用してファージＰｈ−Ａｚとトリフェニルホスフィン７及び８の間で実施し、陰性対照としてファージＰｈ−Ｑでも同様の反応を実施した。各ホスフィン反応体のストック（０．５ｍＭ）をＤＭＦで調製し、反応緩衝液で終濃度０．０１ｍＭ及び総容量５０μＬまで希釈した。ライゲーション反応は周囲温度で１６時間振盪下に実施した。その後、反応混合物をＰＢＳで透析し、後続分析に付した。
【０２８５】
ライゲーション反応産物は実施例４に記載したプロトコールを使用してウェスタンブロッティング（図１１参照）により分析した。フルオレセインコンジュゲートは抗フルオレセイン一次抗体（レーン１〜４）を使用すると、Ｐｈ−Ａｚとホスフィン７又は８のライゲーションからのみシングルバンドとして観察され、Ｐｈ−Ｑを使用した対照反応の場合には観察されなかった。このバンドは抗ｐＩＩＩ抗体を分析で使用することによりｐＩＩＩ副次的コート蛋白質として更に同定された（レーン５〜８）。これらの結果はホスフィン７又は８とアジドを組込んだファージペプチドの間の高度の選択性を明示している。
【実施例７】
【０２８６】
ファージ提示型ポリペプチドの選択的スタウディンガー修飾後のファージ生存性の維持
本実施例はｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだファージ提示型ポリペプチドの選択的スタウディンガー修飾後のファージ生存性の維持を例証する。
【０２８７】
スタウディンガーカップリング反応が感染性ファージ粒子の損失を招かないことを示すために、７又は８とのスタウディンガーライゲーションの前後にファージＰｈ−Ａｚの力価を測定することによりファージ生存性を測定した。スタウディンガー反応混合物から観察された生存可能なファージ粒子数は（１．７±１）×１０１１プラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ／ｍＬ）であり、これに対してホスフィン７又は８を含まない対照溶液から測定された値は（２．５±１）×１０１１ＰＦＵ／ｍＬであった。
【実施例８】
【０２８８】
ファージ提示型ポリペプチドのスタウディンガー修飾後のファージ選択
本実施例はファージ提示型ポリペプチドのスタウディンガー修飾後のファージ選択を例証する。この選択では、スタウディンガー修飾が成功した場合のみに存在するコンジュゲートホスフィン７を含むファージを保持するために固定化抗フルオレセイン抗体を利用した。ファージ力価測定からもファージ生存性が判明した。
【０２８９】
モデルファージ選択／集積実験では、予め抗フルオレセイン抗体をコートしておいた別のウェルでホスフィン７とＰｈ−Ａｚ及びＰｈ−Ｑの上記スタウディンガーライゲーションから作製した同等数のファージをインキュベートした。繰返し洗浄後、結合したファージを０．０５％  ＢＳＡ−ＦＩＴＣコンジュゲートで溶出させ、力価を測定した。
【０２９０】
具体的には、抗フルオレセイン抗体（２０μｇ／ｍＬ，２５０μＬ／ウェル）をＮａ２ＣＯ３水溶液（０．１Ｍ，ｐＨ９．６）に加え、イムノプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）の８個のウェルに３７℃で４時間コートした。ウェルを洗浄（３×０．９％  ＮａＣｌ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）し、４℃にてＢＳＡ（０．５％）で一晩ブロッキングした後、ライゲーション反応又は対照溶液からのファージ（１００μＬ）と共に室温で５時間インキュベートした。洗浄後、ファージをＢＳＡ−ＦＩＴＣコンジュゲート（０．０５％）でプレートから溶出させた。回収したファージの力価を測定した。
【０２９１】
入力ファージ力価はＰｈ−Ａｚ：１．０×１０９ＰＦＵ；Ｐｈ−Ｑ：２．０×１０９ＰＦＵであった。出力ファージ力価はＰｈ−Ａｚ：１．２×１０６ＰＦＵ；Ｐｈ−Ｑ：１．０×１０４ＰＦＵであった。Ｐｈ−Ａｚと７のライゲーションに由来するフルオレセイン標識ファージの回収率（０．１２％）はＰｈ−Ｑに由来する対照ファージ（０．００１％）の１２０倍である。
【０２９２】
実施例７及び８からのこれらの結果から明らかなように、スタウディンガーライゲーション反応はファージ生存性に有意影響を与えない。これに対して、末端アルキン基と銅触媒による［３＋２］シクロ付加で反応条件に暴露後にファージＰｈ−Ａｚは生存できないことに留意すべきである。例えばＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１１４，２７０８−２７１１；及びＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，２５９６−２５９９も参照。銅触媒が主に生存性喪失に関与しているが、透析段階中に高濃度ＥＤＴＡを加えてもファージ生存性はさほど改善しないことが判明した。
【実施例９】
【０２９３】
スタウディンガー修飾反応産物の特性決定
スタウディンガーライゲーション産物を更に特性決定し、結合効率を測定するために、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ（配列番号１）とｔＲＮＡにｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を選択的に負荷する突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳ（図１，配列番号４参照）を使用して、残基７にｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を組込んだ代表的Ｚドメイン蛋白質（Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，５６−６１）を大腸菌株で発現させた（Ｗａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９２，４９８−５００；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００５，１１７，３４−６８；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００５，４４，３４−６６；及びＣｈｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，９０２６−９０２７参照）。Ｚドメインポリペプチドの発現に関するその他の一般論についてはＷａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，５６−６１に記載されている。このアジド含有Ｚドメインを精製し、ホスフィン７又は８と結合した。
【０２９４】
この結合反応には、各ホスフィン反応体のストック（１０ｍＭ）をＤＭＦで調製し、突然変異体Ｚドメイン蛋白質（０．１ｍＭ）を加えた反応緩衝液で終濃度１ｍＭ及び総容量１０μＬまで希釈した。ライゲーション反応はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）中で周囲温度にて１６時間振盪下に実施した。その後、反応混合物をＰＤ−１０カラムに通し、水で溶出させ、透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法により分析した。
【０２９５】
ホスフィン７をコンジュゲート部分として使用した場合に観察されたスペクトルの主ピークは予想スタウディンガーライゲーション産物と一致する（図１２参照）。ピークＡはスタウディンガーライゲーション産物：Ｃ３８６Ｈ５５６Ｎ１０７Ｏ１１９Ｓ１Ｐ１（計算値８６６２；実測値８６６４）に帰属される。ピークＢは古典的スタウディンガー反応による還元産物：Ｃ３４４Ｈ５２９Ｎ１０５Ｏ１１０Ｓ１（計算値７９２８；実測値７９２８）に帰属される。Ａ及びＢに対応するマイナーピークａ１及びｂ１は最初のメチオニンを除去した突然変異体Ｚドメイン蛋白質に由来する産物に帰属される。Ａ及びＢに対応するマイナーピークａ２及びｂ２はマトリックス付加物に由来する。アジド含有Ｚドメインは観察できず（＜１％）、反応が高収率で進行したことが確認された。ホスフィン７のスタウディンガーライゲーションでは、結合効率はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルにおけるピークの積分比から＞９０％であると推定される。
【０２９６】
図１３は突然変異体Ｚドメイン蛋白質とホスフィン８のスタウディンガーライゲーションの反応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。ピークＣはトレースレススタウディンガーライゲーション産物：Ｃ３６５Ｈ５３９Ｎ１０５Ｏ１１６Ｓ１（計算値８２８６；実測値８２８６）に帰属される。ピークＤは古典的スタウディンガー反応による還元産物：Ｃ３４４Ｈ５２９Ｎ１０５Ｏ１１０Ｓ１（計算値７９２８；実測値７９２８）に帰属される。ピークＥはアザ−イリド中間体：Ｃ３８３Ｈ５５２Ｎ１０５Ｏ１１７Ｓ１Ｐ１（計算値８５６２；実測値８５６３）に帰属される。Ｃ、Ｄ及びＥに対応するマイナーピークｃ１、ｄ１及びｅ１は最初のメチオニンを除去した突然変異体Ｚドメイン蛋白質に由来する産物に帰属される。Ｃ及びＤに対応するマイナーピークｃ２及びｄ２はマトリックス付加物に由来する。
【０２９７】
ホスフィン７のスタウディンガーライゲーションとは対照的に、ホスフィン８のトレースレススタウディンガーライゲーションは〜５０％に収率が低下した。８の結合効率の低下は恐らく分子内環化段階（Ｓａｘｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３）のライゲーション速度が遅いことと、８のフェノールエステルが加水分解し易いためであると思われる。これらの結果、古典的スタウディンガー反応と同様にアミン産物が生じた（Ｓａｘｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，２００７−２０１０；及びＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９１９，２，６３５−６４６）。
【０２９８】
真正材料によるドーピング実験の結果、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２  Ｚドメイン突然変異体は安定であることが実証された。図１４はｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を組込んだＺドメイン蛋白質とホスフィン７のスタウディンガーライゲーションと、同等量の真正ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２  Ｚドメイン突然変異体によるドーピングからの反応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
【０２９９】
要約すると、同図から明らかなように、フルオレセインで標識したホスフィンとｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を組込んだファージ提示型ペプチド又は突然変異体Ｚドメイン蛋白質のモデルスタウディンガーライゲーションは優れた選択性と効率で生じる。スタウディンガーライゲーションはファージ生存性に影響を与えないので、ライゲーションの完了後に集積を難無く実施することができる。本発明はその機能を変えずに蛋白質を選択的に修飾するために有用な方法を提供し、高度に均質なＰＥＧ化蛋白質、表面固定化蛋白質又は分光もしくはアフィニティー試薬で修飾した蛋白質の作製に有用であると思われる。
【０３００】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０３０１】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献は言及によりその開示内容全体を全目的で組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を言及により全目的で組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１Ａ】本発明で利用されるポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の例を示す。
【図１Ｂ】本発明で利用されるポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の例を示す。
【図２】直交ｔＲＮＡに非天然アミノ酸パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを負荷することが可能なＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のアミノ酸配列の例を示す。
【図３】Ｏ−メチルチロシン（１）、パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（２）、パラ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン（３）、パラ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（４）及び３−（２−ナフチル）アラニン（５）の５種（１〜５）の非天然アミノ酸の構造と対応する名称を示す。
【図４】対応する非天然アミノ酸の存在に対するＭ１３−ＳＢＰファージ収率（ＰＦＵ／ｍＬで表す）の依存性を実証する実験の結果を示す。
【図５】アルキンで修飾したフルオレセイン色素の化学構造（構造６）を示す。
【図６】抗フルオレセイン（Ｉ）又は抗ｐＩＩＩ（ＩＩ）一次抗体を使用するウェスタンブロット分析後の化学発光画像を示し、サンプルはＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージの［３＋２］シクロ付加反応後の反応材料を構成し、ファージはｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２の存在下にＴＴＳ／ＲＳ株で作製したもの（ａ）又はＸＬ１−Ｂｌｕｅで作製したもの（ｂ）である。
【図７】ファージストレプトアビジン結合ＥＬＩＳＡの吸光度値結果を示す。吸光度は４９２ｎｍで測定した。
【図８】図７に示したファージストレプトアビジン結合ＥＬＩＳＡの結果をグラフで示す。（▲）Ｍ１３ＫＥ；（□）３の存在下にＴＴＳ／ＲＳ株で作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージ；（○）２の存在下にＴＴＳ／ＲＳで作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージ；（×）ＸＬ１−Ｂｌｕｅで作製したＭ１３ＫＥ−ＳＢＰファージ。
【図９】ファージ回収の集積係数測定の結果を示す。
【図１０】（ファージＰｈ−Ａｚからの）パラ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン残基を組込んだファージ提示型ポリペプチドとホスフィン７又は８のスタウディンガー結合反応の模式図である。
【図１１】ホスフィン７及び８とのスタウディンガーライゲーション後のファージＰｈ−Ａｚ及びＰｈ−Ｑのウェスタンブロット分析の化学発光画像を示す。この分析では抗フルオレセイン一次抗体（レーン１〜４）又は抗ｐＩＩＩ一次抗体（レーン５〜８）を使用した。
【図１２】ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を組込んだＺドメイン蛋白質とホスフィン７のスタウディンガーライゲーションの反応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。ピークＡ及びＢは夫々結合産物と還元産物に帰属させることができ、マイナーピークａ２、ｂ２、ａ１及びｂ１はＡ及びＢからのマトリックス付加物とメチオニン除去に由来する。
【図１３】ｐＡｚＰｈｅを組込んだＺドメイン蛋白質とホスフィン８のスタウディンガーライゲーションの反応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル分析を示す。
【図１４】ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２を組込んだＺドメイン蛋白質とホスフィン７のスタウディンガーライゲーションと、同等量の真正ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン２  Ｚ−ドメイン突然変異体によるドーピングの反応産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
【図１５】非天然アルキニルアミノ酸パラ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰＲＯ−Ｐｈｅ；ＩＵＰＡＣ命名法では２−アミノ−３−［４−（プロプ−２−イニルオキシ）フェニル］−プロピオン酸とも言う）の化学構造（９）を示す。室温で銅の存在下におけるアジドとアルキンの［３＋２］シクロ付加反応によるトリアゾール構造の不可逆的形成の一般反応化学も示す。
【図１６】２種のアジド官能化色素の化学構造（１０及び１１）を示す。色素１０はダンシルフルオロフォアを含み、色素１１はフルオレセインフルオロフォアを含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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