(57)【要約】  ヒアルロン酸及び治療剤を含有する新規の薬物送達システム（ＤＤＳ）について述べる。この治療剤は、６−アミノ−ヒアルロン酸に直接又はリンカーを介して、結合され、薬物又はリンカーと、６−アミノ−ヒアルロン酸との結合は、アミド結合により、達成される。本発明によるＤＤＳに用いるのに好適な治療剤は、抗炎症剤、抗生剤、抗腫瘍剤である。好適なリンカーは、コハク酸、アミノ酸に結合したコハク酸、ペプチドに結合したコハク酸である。ＤＤＳは、安定であり、副産物及び不純物による所望しない反応がなく、薬理的有効性が高い。
2009544749.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸及びひとつの治療剤を有する薬物送達システムであって、前記治療剤は、アミド結合により、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ６位において、共有的に結合されており、治療剤とヒアルロン酸との間の結合は、直接又はリンカーを介してもよいことを特徴とする薬物送達システム。
【請求項２】
前記治療剤は、少なくとも一つのカルボキシル基、又は少なくとも一つのアミノ基、又は少なくとも一つの水酸基を有することを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項３】
前記治療剤は、少なくとも一つのカルボキシル基を有し、
前記治療剤とヒアルロン酸とのアミド結合は、直接的であることを特徴とする請求項２に記載のＤＤＳ。
【請求項４】
前記治療剤は、少なくとも一つのアミノ基、又は少なくとも一つの水酸基を有し、
前記治療剤とヒアルロン酸とのアミド結合は、リンカーを介していることを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項５】
前記治療剤は、鎮痛剤、降圧剤、麻酔剤、利尿剤、気管支拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、コリン作動性剤、ＣＮＳ剤、エストロゲン、免疫刺激剤、免疫抑制剤、脂向性剤、抗不安剤、抗潰瘍剤、不整脈治療剤、抗狭心症剤、抗生剤、抗炎症剤、抗ウィルス剤、抗塞栓剤、血管拡張剤、解熱剤、抗うつ剤、抗精神病剤、抗腫瘍剤、粘液溶解剤、麻薬拮抗剤、ホルモン、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、乾癬治療剤、抗増殖剤及び抗生剤から選択されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項６】
前記治療剤は、抗炎症剤、抗生剤及び抗腫瘍剤から選択されることを特徴とする請求項５に記載のＤＤＳ。
【請求項７】
前記治療剤は、カンプトテシン、イブプロフェン、メトトレキサート、タキソール、セファゾリン、ナプロキセン、リジノプリル、ペニシリンＧ、ナリジクス酸、コレスタン又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項８】
前記リンカーは、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸に結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、及びペプチドに結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸から選択され、且つアミノ基又はチオール基で可能に置換されていることを特徴とする請求項１乃至２及び４乃至７のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項９】
前記リンカーは、コハク酸、アミノ酸に結合されたコハク酸、又はペプチドに結合されたコハク酸から選択されることを特徴とする請求項８に記載のＤＤＳ。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸の第２級水酸基は、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ２Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯＲであってｎが１〜４でありＲがＣ１〜Ｃ１０のアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３であるものからなる群から選択された基を形成するように、誘導体化されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項１１】
前記ヒアルロン酸のカルボキシル基は、フリーの酸の形態であり、又はアルカリ金属、アルカリ土類金属若しくは遷移金属で塩化されていることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項１２】
医薬組成物への請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳの使用。
【請求項１３】
医薬的に許容な賦形剤及び／又は希釈剤と混ぜ合わせた、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳを有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
注入可能な形態であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
６−アミノヒアルロン酸と−ＣＯＯＨを有する治療剤又はリンカーとのアミド結合を形成することを含み、
リンカーを用いる場合、治療剤とリンカーとを結合するステップ
をさらに有することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳの調製方法。
【請求項１６】
前記６−アミノヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位におけるＣ６位に存在する水酸基を、アミノ基に置換することにより、ヒアルロン酸から得られることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記置換は、前記Ｃ６位を適当な離脱基で活性化し、その後、濃アンモニア、又はアジ化ナトリウム及び還元剤で処理することにより、行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記離脱基は、スルホン酸塩、リン酸塩（トリフェニルリン酸塩）、シアン化物（ＣＮ−）、亜硝酸塩（ＮＯ２−）、ハロゲン、クロロ、硫酸塩、ハロゲン硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン亜硝酸塩、クロロサルファイトから選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃ６位を活性化するのに使用される剤は、アルキル−又はアリール−スルフォニルハライドであり、
前記の活性化は、有機塩基又は無機塩基の存在下で行われることを特徴とする請求項１７乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃ６位を活性化するのに使用される試薬は、メチルスルフォニルクロライド又はトルエン−ｐ−スルフォニル−クロライドであり、
前記有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の薬物送達システム（ＤＤＳ）に係り、ヒアルロン酸が、ポリマーの特定の位置で、直接又はリンカーを介したアミド結合により、治療剤に結合される。
【背景技術】
【０００２】
癌治療などの異なる種類の治療に直面する問題は：（ａ）小分子（抗癌性薬物）が、本質的に主として疎水性であり、従って、水に対する溶解性が低く、従って、その生物学的特性が損なわれていること；及び（ｂ）特定の組織又は細胞に対する選択性が十分でないこと；である。例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ）は、水に不溶性であり、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）の木から得られる光学的に活性なアルカロイドである。２０（Ｓ）−カンプトテシン及びそのアナログは、細胞障害性剤であって、ＤＮＡのホスホジエステル骨格においてトポイソメラーゼＩで誘導した一本鎖を安定化し、追放（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）を阻止することにより作用すると考えられている。このことにより、修復されない場合にアポトーシスを惹起する複製中の二本鎖ＤＮＡが生じることとなる。２０（Ｓ）−カンプトテシンは、ヒト癌細胞株及びｉｎ  ｖｉｖｏの動物の異種移植片に対して優れた抗癌作用を示す。水への不溶性に加えて、薬理的に重要なラクトン環は、ヒト血漿中で不安定であり、開環したヒドロキシ酸として主として存在し、アルブミンにより捕捉され、薬物を不活性化する。カンプトテシンの主要な制約は、不安定な薬物標的複合体を形成すること及びラクトン環の不安定性である。三成分の複合体の可逆性及びＤＮＡ複製中の致死的な領域の形成に基づいて、薬物に対する長期的な曝露を伴った好適な細胞障害効果が期待されている。数種のカンプトテシン（ＣＰＴ）アナログは、臨床開発が進められているが、有望な臨床的役割にもかかわらず、利用可能なＣＰＴアナログの全体的な治療効果は、中程度のものである；治療指数を最適化する多くの取り組みが評価されてきている。研究者らは、新規の化合物を調製することによりこれらの問題を解決しようとしている。トポテカン及びイリノテカンは、溶解性を向上するように官能基を導入することにより、この化合物の活性なラクトン体の非経口的な投与を促進するように設計された合成アナログである。これらは、いまや、複数の新生物の化学療法的管理において確立された成分である。トポテカンは、卵巣癌及び小細胞性肺癌について既に処置された患者において、良好な活性を有し、これらの疾病において二次的治療として米国で使用されることが現在承認されている。イリノテカンは、生物学的に活性な代謝物である７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン（ＳＮ３８）に酵素的に変換されるプロドラッグである。進行性の結腸直腸癌の患者への一次的な治療としてフルオロピリミジンと組み合わせて使用され、又は５−フルオロウラシルを基礎とした化学療法が失敗した後の単一的な薬物としての最適な治療である。複数の追加的なカンプトテシンアナログは、臨床開発の複数の段階にあり、例えば、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、メシル酸エキサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）及びカレニテシン（ｋａｒｅｎｉｔｅｃｉｎ）が挙げられる。しかしながら、これらの化合物には、特定の組織又は細胞受容体への標的化には適しないなどの欠点がある。
【０００３】
薬物の有効性を最適化する試みにおいて、可能な戦略としては、分子構造を化学的に改変することが含まれ得る。一つの戦略は、薬物を水溶性のポリマー材料に共有的に結合することである。カンプトテシンなどの疎水性の薬物分子をコンジュゲートするのに、複数のポリマーが使用されており、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）−パクリタキセル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−カンプトテシン（非特許文献１）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）−カンプトテシン（非特許文献２）、ポリ（Ｎ−ヒドロキシプロピルメチルアクリルアミド）−ＨＡ−ドキソルビシン、カルボキシメチルデキストラン−カンプトテシン（非特許文献３）、シクロデキストリン及びＣＰＴ（非特許文献４）が挙げられる。しかしながら、斯かる戦略は、所望の部位への標的化を行い得ない；いくつかの場合、ポリマーは、その化学的性質のため、又は化学的改変に起因した元の／本来の標的化能の欠如のため、標的を全く認識しない。事実、元のポリマーの機能的及び生物学的特性は、化学的改変が維持に本質的な置換基を含む場合、容易に消失する可能性がある。
【０００４】
パクリタキセル（ＴＸＬ）は、抗白血病及び抗腫瘍剤である。タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒａｖｉｆｏｌｉａ）の木の皮から最初に単離され、幅広い腫瘍に対して高い活性を示し、転移性乳癌、難治性卵巣癌及びその他の悪性腫瘍の処置に臨床的に使用されてきた。ＴＸＬは、元の形態では、水に対する溶解性が非常に低い高度に疎水性の薬物である。ＴＸＬの持続的な投与により、急速静注やより早い注入率よりも、高い臨床的効果を示す。溶解性の問題を克服し、持続的な投与による臨床効果を促進するため、ＴＸＬは、アセチルベンゾイルクロライドを用いた親薬物のエステル化を介して、利用可能なケトン基を導入し、その後、アシルヒドラジドを含有する一連のマレイミドとの反応により、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートされている（非特許文献５）。また、ＴＸＬは、溶解性の問題を克服し、腫瘍細胞に標的化するため、ヒアルロン酸（以下、ＨＡとも称する。）とコンジュゲートされてもいる。その合成戦略は、ＨＡのグルクロン酸残基のカルボキシル基において薬物をコンジュゲートすることを包含し、ＴＸＬを、無水コハク酸で続いて処理し、ＴＸＬ−ヘミコハク酸を活性化し、ＨＡのカルボキシル基をアジピン酸ジヒドラジドで機能化し、その後、２つの中間体を反応して、ＨＡ−タキソールコンジュゲートを与える。このコンジュゲートは、ヒアルロン酸受容体を発現することが知られているヒトガン細胞株（乳房、結腸及び卵巣）に対して選択的な毒性を示した；マウス線維芽細胞株に対しては、同濃度で毒性を示さなかった（非特許文献６）。しかしながら、これらの誘導体は、ポリマーの異なる位置において無制限に誘導体化され、元の化学的規則性が消失してしまう。
【０００５】
ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）は、生物的活性及び標的化能を欠く；一方、ＨＡは、薬物を疾病部位へと標的化する能力のため、その他のポリマーに対して利点を示す。抗癌性ポリマー薬物は、受動的な機構であるＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）モジュールにより、又は細胞表面の受容体間の特定の相互作用を用いた活性な標的化により、癌部位を通過する。ＨＡは、ＥＰＲモジュールを介して動作可能であるばかりでなく、人体において認識されている複数の細胞受容体を有しており、特定のプロテオグリカンなどのその他の構造と相互作用し得る。異なる受容体のうち、ＣＤ４４が挙げられる。ヒアルロン酸と蛋白性受容体（例えば、ＣＤ４４）との間の相互作用の検討で明らかになったように、ヒアルロン酸の負に帯電したカルボキシル基と蛋白質の負に帯電した塩基性アミノ酸との間で結合が生じる（非特許文献７）。また、フリーのカルボキシル基は、ヒアルロン酸のプロテオグリカンとの相互作用に必要である（非特許文献８）。従って、ヒアルロン酸のカルボキシル基及び水酸基の完全性は、細胞構造の認識及び結合に非常に重要である；これらの置換基の部分的な置換により、これらの蛋白性の巨大分子との効果的な結合が可能ではなくなる。また、これらのカルボキシル基及び水酸基は、高分子の適当な立体構造の形成にも重要である。受容体ＣＤ４４についてよく知られているように、多くの腫瘍のタイプでこれを過剰発現している。ＣＤ４４ＨＡ受容体を発現する細胞株において、誘導体化されたＨＡのエンドサイトーシスが示されている。蛍光標識したＨＡ−タキソールコンジュゲートは、ＨＡ受容体を過剰発現することが知られているヒトガン細胞株に対して選択的な毒性を示す。ＨＡに対する肝臓の受容体（ＨＡＲＬＥＣ）の存在が示唆するように、薬物を肝組織に標的化するキャリア分子として用いられ得る。ＨＡは、マウスにおいて、結腸腺癌からの肝転移が示されている。
【０００６】
メトトレキサートファミリーに属する薬物による、Ｃ６の位置に置換されたヒアルロン酸の誘導体の調製が既に述べられている（特許文献１）。これらのＤＤＳは、ヒアルロン酸と、薬物との間のエステル基の存在を特徴とするものであって、異なる生物学的環境における薬物放出及び安定性の特別な特徴を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開０１／６８１０５号パンフレット
【特許文献２】国際公開９９／１８１３３号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｗｉｎｓｋｙ  ＥＫら著、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００３年、２１巻、１号、ｐ．１４８−１５７
【非特許文献２】Ｓｉｎｇｅｒ  ＪＷら著、Ａｎｎ．Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２０００年、９２２巻、ｐ．１３６−１５０
【非特許文献３】ＣＭＤ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、１１巻、ｐ．１６５０−１６５７
【非特許文献４】Ｃｈｅｎｇ  Ｊ著、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２００３年、１４巻、ｐ．１００７−１０１７
【非特許文献５】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ＰＣＡら著、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００３年、１３巻、ｐ．３５５
【非特許文献６】Ｌｕｏ，Ｙ．及びＰｒｅｓｔｗｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．著、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９９９年、１０巻、ｐ．７５５−７６３
【非特許文献７】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３年、２２巻、ｐ．２５７−２６４
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９７７年、１６７巻、ｐ．７１１
【非特許文献９】Ｆｒｉｎｇｕｅｌｌｉ著、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、６８巻、ｐ．７０４１−７０４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ヒアルロン酸及び治療剤を含有するＤＤＳであって、治療剤が、直接又はリンカーを介してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基のＣ６の位置にアミノ基を有するヒアルロン酸誘導体に結合されていることを特徴とする；このアミノ基は、ＨＡのこの位置にもともと存在する水酸基を置き換える。この誘導体は、「６−アミノ−ヒアルロン酸」又は略して「６−ＮＨ２−ＨＡ」若しくは「ＨＡ−６−ＮＨ２」と称する；において、その他の６位の誘導体化されたヒアルロン酸について、等価な用語の使用方法を用い、ＮＨ２は、関連する置換基で置き換えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
６−ＮＨ２−ＨＡの治療剤（又はリンカー）との結合は、一方で６−ＮＨ２−ＨＡ基の６−アミノ基であり他方で治療剤（又はリンカー）に存在する適当なＣＯＯＨ基を包含するアミド結合により達成される。リンカーが存在する場合、治療剤は、共有結合により、リンカーにさらに結合される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】６−ＮＨ２−ＨＡの合成。ＨＡ→６−Ｃｌ−ＨＡ；ＨＡ−６−Ｍｓ→６−ＮＨ２−ＨＡ。条件：ａ）Ｘ＝Ｃｌ：ＭｓＣｌ、ＤＭＦ、Δ；Ｘ＝ＯＭｓ：ＭｓＣｌ、ＤＭＦ、ＤＩＥＡ、−１０℃；ｂ）水溶性ＮＨ４ＯＨ、Δ；ｃ）Ｘ＝Ｃｌ：ＮａＮ３、ＤＭＳＯ、１８−クラウン−６、Δ；Ｘ＝ＯＭｓ；ＮａＮ３、水、Δ；ｄ）ＮＨ４ＣＯＯＨ、水、Ｐｄ／Ｃ、室温。
【図２】ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴの合成。ＣＰＴ→ＣＰＴ−ヘミコハク酸→ＨＡ−６−ＮＨ−コハク酸−２０−Ｏ−ＣＰＴ。
【図３】ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−２’−Ｏ−ＴＸＬの合成。ＴＸＬ→ＴＸＬ−ヘミコハク酸→ＨＡ−６−ＮＨ−コハク酸−２’−Ｏ−ＴＸＬ。
【図４】ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ。
【図５】ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−ｇｌｙ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴ。
【図６】ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−ＭＴＸ。
【図７】ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−ＩＢＰ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
置換の程度、つまり、治療剤又はリンカーとのアミノ結合に関連するＨＡの６−ＮＨ２基の割合は、アミド形成反応に使用される治療剤／リンカーの量に依存して、可変である。従って、置換の度合いは、容易に制御され、異なる治療目的に有用な、異なる薬物の負荷のレベルを有するＤＤＳをもたらす。
【００１３】
本発明によるＤＤＳに含まれる「ヒアルロン酸」（又は「ＨＡ」）は、二糖の繰り返し単位からなるポリマーであって、Ｄ−グルクロン酸及びβ（１→３）グリコシド結合により結合された２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）からなる；Ｄ−グルクロン酸残基は、酸の形態であっても、塩の形態であってもよい。各繰り返し単位は、直鎖のポリマーを形成するβ（１→４）グリコシド結合により、隣の繰り返し単位に結合される。ヒアルロン酸は、１０，０００〜１００万、さらに好ましくは１０，０００〜５００，０００の平均分子量を好ましく有する。用語「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」は、フリーの酸、及びアルカリ金属（好ましくはＮａ又はＫ）、アルカリ土類金属（好ましくはＣａ又はＭｇ）、遷移金属（好ましくは、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｏ、Ａｇ）で塩化された形態を包含する。また、用語「ヒアルロン酸」／「ＨＡ」は、その誘導体をも包含し、その一つ以上の第二級水酸基は、誘導体化され、例えば、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ２Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯＲであってｎが１〜４でありＲがＣ１〜Ｃ１０のアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３であるものから選択される置換基を形成する。
【００１４】
治療剤（フリーの状態を意味する。即ち、本発明によるＤＤＳに関与する前のもの）は、少なくとも一つのカルボキシル基又は少なくとも一つのアミノ基又は少なくとも一つの水酸基を有する。
【００１５】
治療剤が少なくとも一つのカルボキシル基を有する場合、治療剤と６−ＮＨ２−ＨＡとの間のアミド結合は、リンカーを使用せず、直接的な結合であることが好ましい。
【００１６】
治療剤が少なくとも一つのアミノ基又は少なくとも一つの水酸基を有する場合、薬物は、リンカーを介して６−ＮＨ２−ＨＡに好ましく結合される。
【００１７】
治療剤の属する薬理的なクラスについて、制限はない。例えば、鎮痛剤、降圧剤、麻酔剤、利尿剤、気管支拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、コリン作動性剤、ＣＮＳ剤、エストロゲン、免疫刺激剤、免疫抑制剤、脂向性剤（ｌｉｐｏｔｒｏｐｉｃ）、抗不安剤、抗潰瘍剤、不整脈治療剤、抗狭心症剤、抗生剤、抗炎症剤、抗ウィルス剤、抗塞栓剤（ｔｈｒｏｍｂｏｌｉｔｉｃ）、血管拡張剤、解熱剤、抗うつ剤、抗精神病剤、抗腫瘍剤、粘液溶解剤、麻薬拮抗剤、ホルモン、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、乾癬治療剤、抗増殖剤及び抗生剤から選択されてもよい。なかでも、抗炎症剤、抗生剤、抗腫瘍剤、特に、抗腫瘍剤が好ましい。適当な治療剤の例としては、カンプトテシン、イブプロフェン、メトトレキサート、タキソール、セファゾリン、ナプロキセン、リジノプリル（ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）、ペニシリンＧ、ナリジクス酸、コレスタン及びこれらの誘導体が挙げられる。
【００１８】
リンカー（フリーの状態のものを意味する。すなわち、本発明によるＤＤＳに関与する前のもの）は、６−ＮＨ２−ＨＡを結合するため、少なくとも一つのカルボキシル基を常に有する；また、治療剤を結合するのに有用な少なくとも一つのその他の置換基を有し、例えば、アミノ基、チオール基、さらなるカルボキシル基などが挙げられる。
【００１９】
適当なリンカーは、例えば、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物又は脂肪芳香族化合物（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸に結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、ペプチドに結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸が挙げられる。
【００２０】
リンカーの役割は、存在する場合、ヒアルロン酸と治療剤との間のアーム又はスペーサーを生じさせることである。リンカーは、一方の側で、アミド結合を介した６−ＮＨ２−ＨＡを結合し、他方の側で、可能な共有結合を介して治療剤を結合する。
【００２１】
リンカーが、アミノ酸又はペプチドに結合されたジカルボン酸である場合、ＨＡとの間でアミド結合を形成するカルボキシル基は、ジカルボン酸のフリーの酸基であってもよいし、アミノ酸又はペプチドのそれであってもよい。
【００２２】
好ましいリンカーは、コハク酸、アミノ酸に結合されたコハク酸、又はペプチドに結合されたコハク酸である。
【００２３】
本発明による好ましいアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン、リジン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選択される。本発明による好ましいペプチドは、上記のアミノ酸の異なる組合せからなるペプチドであり、又は一つの種類のアミノ酸からなるものであり、好ましくは、ジ−、トリ−又はテトラ−ペプチドである。
【００２４】
実験部で示すように、本発明によるＤＤＳ類は、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のＣ６の位置に、直接又はリンカーによりアミド結合で結合された治療剤が存在することを特徴とする。ＨＡのその他の置換基は、薬物との化学結合に関与しない。このことが意味するのは、ヒアルロン酸に存在する第二級水酸基及びカルボキシル基の両方が薬物の置換されていない状態であり、且つ本発明によるＤＤＳが、元のＨＡに見出されるものに近い、多糖類に存在する機能性を保持することである。従って、これらのフリーな機能性は、ＣＤ４４などの受容体やプロテオグリカンなどのその他の構造との相互作用に完全（１００％）で利用可能である。
【００２５】
本発明によるＤＤＳ類は、安定であり、実用的な医薬用途に有害である可能性のある副産物又は不純物による所望しない反応がない。
【００２６】
これらのＤＤＳ類の調製により、治療剤の薬理的有効性を保持する医薬化合物を得ることが可能である。従って、ＤＤＳにおける特定の治療剤に反応する全ての病態の処置に首尾よく使用され得る。同時に、いくつかの細胞又は組織に対する高い親和性を示したり、生物学的利用能の点で異なる特性を提供したりなど、治療剤単独で観察されなかったいくつかの特性を示すことが可能である。
【００２７】
従って、本発明のさらなる態様は、各治療剤に適した病態の処置用の医薬の製造における上記ＤＤＳ類の使用である。
【００２８】
また、本発明の態様は、医薬的に許容な賦形剤及び／又は希釈剤と混和した本発明によるＤＤＳを含有する医薬組成物である。医薬組成物は、液体又は固形であってもよい；経口、非経口、局所、関節内のそれぞれの投与経路で投与されてもよい。ＤＤＳの全身的な投与は、静脈内、末梢血管内、筋肉内及び皮下のそれぞれの投与経路で行い得る。特に興味あるのは、本発明によるＤＤＳ類を含有する注射可能な医薬組成物である。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、上記のＤＤＳの調製方法である。この方法は、６−ＮＨ２−ＨＡと、治療剤（又はリンカー）に存在するカルボキシル基との間のアミド結合を形成することを含む；リンカーを使用する場合は、この方法は、薬物をリンカーに結合するステップをも含み、後者は、アミドを形成するステップを行う前又は後に、無関係に行われる。
【００３０】
６−ＮＨ２−ＨＡは、ＨＡのＮ−アセチルグルコサミン残基のＣ６位へのアミノ基の位置選択的導入により、ＨＡから取得され得る。好適な方法は、以下に例示する通りである。
【００３１】
ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ６位の水酸基を、離脱基で置換し、６−活性化−ＨＡを得るステップと；
ｂ）６−活性化−ＨＡを、６−ＮＨ２−ＨＡに変換するステップと；
ｃ）６−ＮＨ２−ＨＡを回収するステップと；
である。
【００３２】
ステップａ）において、離脱基は、例えば、スルホン酸塩、リン酸塩（トリフェニルリン酸塩）、シアン化物（ＣＮ−）、亜硝酸塩（ＮＯ２−）、ハロゲン（好ましくは、クロロ）、硫酸塩、ハロゲン硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン亜硝酸塩（クロロサルファイト）から選択されてもよい。
【００３３】
好適な離脱基は、ハロゲンである。ハロゲン化は、例えば、本願と同一の名義人による特許文献１及び２に述べられている方法により行われてもよい。離脱基がクロロである場合、位置選択的な塩素化は、下記の方法に従って好ましく行われる。メタンスルフォニルクロライドを有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｖｉｌｓｍｅｉｒ試薬）などの塩素化試薬を、塩の形態（ナトリウム塩、又はＴＢＡ、ピリジン若しくはｓｙｍ−コリジンなどの有機塩基塩）のＨＡの溶液又は懸濁液、好ましくは、塩の形態のものを有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に、−２０℃〜−１０℃の範囲、好ましくは−１０℃の温度で添加する。反応温度は、２時間かけて−１０℃から４０〜６５℃、好ましくは６０℃に昇温する。塩素化反応は、その後、４０℃〜６５℃の温度、好ましくは、６０℃で、１０〜２４時間、好ましくは１６時間、行う。反応は、ｐＨ８となるように飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で処理し、その後、ｐＨ９となるようにＮａＯＨ水溶液で処理することで完了する；このステップにより、ＨＡ分子の第二級水酸基における反応中に形成されたギ酸エステル基を除去することが可能となる。その後、反応混合物を、希ＨＣｌを添加して中和する。所望の６−クロロ−ヒアルロン酸は、その後、標準的な技術により、回収される。
【００３４】
その他の好ましい離脱基は、アルキル−又はアリール硫酸塩などの硫酸塩であり、６−硫酸化ＨＡを与える；スルホン酸塩のうち、メタンスルフォン酸が好ましい。位置選択的な硫酸化は、硫酸化試薬として、アルキル−又はアリール−ハライド、好ましくはクロライドを用いて、有機塩基又は無機塩基、好ましくは有機塩基の存在下で行われる。アルキル−又はアリール−スルホニルハライドは、好ましくは、メチルスルホニル（メシル）、トルエン−ｐ−スルホニル（トシル）、トリフィル、トリミシル、トリプシル、１，１−スルホニルイミダゾールから選択されてもよい。有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンなどの異なる有機アミンから好ましく選択される。
【００３５】
溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドからなる群から選択される。一般的なスルホニル化方法は、以下の通りである。塩基、好ましくは有機塩基を、窒素還流下、攪拌しながら、塩の形態、好ましくは有機塩基塩のＨＡの懸濁液又は溶液に添加する。その後、アルキル−又はアリール−スルホニルクロライドを有する適当な溶媒、好ましくは上記と同様の溶媒を、滴下で添加する。２〜９０分（好ましくは４５〜７５分）の範囲の時間の後、ＮａＨＣＯ３を添加して反応を停止し、ＨＡの第二級水酸基において反応中に形成されたギ酸エステル基を除去する。その後、約１０〜２０時間、好ましくは１８時間、反応を継続する。反応産物（６−硫酸化ＨＡ）は、沈殿や乾燥などの公知の技術により溶液から直接回収されるか、回収前に、溶液を処理して、ＨＡ−６−硫酸塩：ＴＢＡなどの適当な塩の形態の６−硫酸化ＨＡを得る方法で、処理される。
【００３６】
ステップｂ）によると、Ｃ６位における離脱基は、置き換えられ、中間体である６−ＮＨ２−ＨＡ化合物を与える。ステップｂ）は、６−活性化ＨＡを、高温（例えば、４０〜７０℃、好ましくは６０〜８０℃）において、２〜５０時間、濃アンモニアで処理することで、行われてもよく、これにより、６−ＮＨ２−ＨＡが得られる。特に、離脱基がクロロである場合、６−アミノ−ＨＡは、必要な置換度に応じて、ＤＭＳＯを用いて又は用いずに、濃アンモニア（２５％）を用い、８０℃で７〜４８時間、無機塩又は有機塩、好ましくはナトリウム塩又はテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩としての６−Ｃｌ−ＨＡを処理することで、調製される。代替的に、離脱基がメシル酸である場合、中間体である６−アミノ−ＨＡは、濃アンモニア（２５％）を用い、６０℃で１８時間、無機塩又は有機塩、好ましくはナトリウム塩又はテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩としての６−メシル酸−ＨＡを処理することで、調製される。
【００３７】
また、６−ＮＨ２−ＨＡ中間体の合成は、アジドアニオンにより、６−Ｃｌ−ＨＡの塩素の置換、又は６−ＯＭｓ−ＨＡにおけるメシル酸の置換、及びその後の還元により、段階的に行われてもよい。６−Ｃｌ−ＨＡは、より強い条件を必要とし、斯かる置換は、ジメチルスルホキシド中で行われ、クラウンエーテルを使用して、アジドの求核性を促進する。６−ＯＭｓ−ＨＡは、溶媒として水を用い求核剤としてアジ化ナトリウムを用いて完全に変換される高い反応性を示す。また、還元段階は、水中で行われ、塩の変換が必要ない。水系条件でのアジドの還元には、複数の方法が使用可能であって、例えば、ジチオスレイトールを有する生理的な緩衝液、硫化水素を有する含水ピリジン、亜鉛及び塩化アンモニウムを有する水／アルコールの混合物、銅塩及びボロハイドライドナトリウムを有する水、水中での接触水素化などが挙げられる。硫黄を有する化合物は、第二選択物としてみなされ、好適な方法は、二価の銅塩及びボロハイドライドナトリウムを有する水及び従来の接触水素化の使用を必要とし（非特許文献９）、水素ドナーとしてギ酸アンモニウム及び触媒としてＰｄ／Ｃを用いて、水中で行われる。また、肯定的なカイザーテスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）を提供するが、精製段階で問題が発生する可能性があるので、亜鉛及び塩化アンモニウムを用いた還元を使用してもよい。
【００３８】
ステップｃ）は、当業者に公知の技術により行われる。
【００３９】
ステップａ）〜ｃ）を含む方法の一部は、位置特異的であって、即ち、ＨＡのＣ６位の第一級水酸基のみを置換することにより、行われる；その他の水酸基は、置換されない。
【００４０】
６−ＮＨ２−ＨＡと治療剤（又はリンカー）との間のアミドを形成するステップは、実験部に例示する通り、この反応の標準的な反応条件下で行われる。リンカーを使用する場合、治療剤は、６−ＮＨ２−ＨＡを用いたアミド形成ステップの前又は後、好ましくは前に、リンカーに結合されてもよい。
【００４１】
アミド形成ステップの前にリンカーが治療剤に結合される場合、後者は、本発明の最終的なＤＤＳをもって終了し、ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−リンカー−治療剤の構造を有する。
【００４２】
アミド形成ステップの後にリンカーが治療剤に結合される場合、後者は、ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−リンカーの中間体化合物をもって終了し、その後、治療剤と反応して、ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−リンカー−治療剤の構造を有する最終的なＤＤＳを得る。
【００４３】
リンカーを使用しない場合、アミド形成ステップは、ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−治療剤の構造を有する最終的なＤＤＳをもって終了する。
【００４４】
リンカーと治療剤との間の結合の種類は限定的ではなく、共有結合を形成する適当な化学反応により得てもよく、斯かる結合の例としては、エステル、エーテル、二級／三級アミンが挙げられる。
【００４５】
特に、リンカーが水酸基を有し、且つリンカーがカルボキシル基（アミド結合に関与するものに加えて）を有する場合、治療剤−リンカー結合は、エステル型であることが便利である：従って、水酸基の機能を有する治療剤（例えば、カンプトテシン、タキソール）は、剤−リンカーモノエステル（ヘミコハク酸）を含有する塩素化有機溶媒（例えば、塩化メチレン）中で、リンカー（例えば、コハク酸）で処理される；得られるモノエステルは、活性化され（例えば、周囲温度において、Ｎ−ヒドロキシサクシニイミド（ＮＨＳ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）を有するＤＭＳＯを用いるなど、）、６−ＮＨ２−ＨＡと反応され、本発明のＤＤＳが得られる。
【００４６】
他の実施例において、治療剤が水酸基を有し且つリンカーがアミノ酸又はペプチドを含む場合、治療剤は：（ｉ）アミン又は（ｉｉ）上記のアミノ酸／ペプチドのカルボキシル基に結合されてもよい；この方法において、酵素的又はｐＨで補助した加水分解のいずれかにより補助した細胞性薬物放出を達成することができる。
【００４７】
上記の（ｉ）において、水酸基を有する治療剤（例えば、カンプトテシン、ＣＰＴ）を窒素が保護されたアミノ酸／ペプチド（例えば、Ｃｂｚ−グリシン−ＯＨ）で処理することにより結合を達成してもよく、アミノ基を再生した後対応するエステル誘導体が得られる。その後、フリーのＮＨ２基を有する産物を、Ｃ２〜Ｃ２０のジカルボン酸で処理して、対応するモノエステルを得る。治療剤−リンカーモノエステルは、その後、６−ＮＨ２−ＨＡで処理されて、最終的なＤＤＳを与える。
【００４８】
上記の（ｉｉ）において、反応の流れは、下記のものを含む：水酸基を有する治療剤（例えば、カンプトテシン、ＣＰＴ）を、Ｃ２〜Ｃ２０のジカルボン酸（例えば、コハク酸）と反応させて、対応するモノエステル（例えば、ヘミコハク酸）を得るステップ；モノエステルは、その後、カルボキシル基が保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）又はペプチドで処理される；保護基を除去し６−ＮＨ２−ＨＡで処理した後、最終的なＤＤＳが得られる。
【００４９】
治療剤がカルボキシル基を有する場合、リンカーを用いることなく、アミド結合を介して、６−ＮＨ２−ＨＡのＣ６位の窒素原子に直接結合されてもよく、ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−治療剤の構造を有する最終的なＤＤＳを得る。
【００５０】
カルボキシル基を有する治療剤の例としては、抗腫瘍剤であるメトトレキサート、又は抗炎症剤であるイブプロフェンが挙げられる。これらの治療剤は、リンカーを介して６−ＮＨ２−ＨＡに結合されてもよい。この場合、６−ＮＨ２−ＨＡのＣ６位の窒素原子と、リンカーのカルボキシル基との間で最初にアミド結合が形成される；このようにして得たＨＡ−６−ＮＨＣＯ−リンカーの化合物は、その後、治療剤と反応され、最終的なＤＤＳが得られる。
【００５１】
本発明における反応条件は、穏やかなものであり、安定で実用的な医薬用途に有害である可能性がある所望しない副産物や不純物を有しない最終的なＤＤＳを得ることができる。
【実施例】
【００５２】
本発明について、下記の非限定的な例により、示す。
【００５３】
実験部
使用する略語
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＴＢＡ：テトラブチルアンモニウム
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルフォキシド
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＰＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＭｅＯＨ：メタノール
ＥｔＯＨ：エタノール
ＣＰＴ：カンプトテシン
ＭＴＸ：メトトレキサート
ＴＸＬ：タキソール
ＥＤＣ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド
Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
【００５４】
６−Ｃｌ−ＨＡ、６−ＯＭｓ−ＨＡ及び６−ＮＨ２−ＨＡの構造並びに一般式ＨＡ−６−ＮＨ−アシル、ＨＡ−６−Ｏ−アシル及びＨＡ−Ｏ−アシルの全ての誘導体の構造は、ＮＭＲにより支持されたものである。１Ｈ  ＮＭＲ、１Ｈ  ＤＯＳＹ、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＨＳＱＣのスペクトルにより、ＨＡ−６−ＮＨ−アシル型の全てのＤＤＳに関する６−デオキシ−６−アミノ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ６位の薬物の共有結合を確認した。
【００５５】
ＮＭＲスペクトルは、ＨＡ誘導体及びその他の特定の中間体を有するＤ２Ｏについて、ｚ軸に沿った線形勾配を装着したＶａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ５００の分光計及びＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ２００の分光計で取得した。
【００５６】
他に記しない場合、ＭＷ２００００のヒアルロン酸を出発材料として用いた。
【００５７】
ヒアルロン酸のＴＢＡ塩は、イオン交換により調製した。簡潔には、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０樹脂を、過剰量の２０％水酸化テトラアンモニウム溶液で２４時間処理し、その後、水で洗浄した。ＨＡを有する水の溶液（５％）を、その後、２４時間、樹脂と緩徐に混合した。濾過、濃縮及び凍結乾燥により、プロトンＮＭＲにより確認した化学量論的なＴＢＡ含量のＨＡ  ＴＢＡ塩を与えた。
【００５８】
例１
６−Ｃｌ−ＨＡにおける塩素含量のＮＭＲによる同定は、定量的パルスシーケンスを用いて、１３Ｃ  ＮＭＲの６０．５ｐｐｍ（ＣＨ２ＯＨ）におけるピーク対４４．０ｐｐｍ（ＣＨ２Ｃｌ）におけるピークの積分により、行った。
【００５９】
例２
ＨＡ−６−メシル酸におけるメシル酸含量のＮＭＲによる同定は、３．１０÷３．３２ｐｐｍの範囲のピーク（ＨＡ鎖の１Ｈ及びメシル酸の３Ｈ）対１．９５ｐｐｍにおけるピーク（ＨＡ鎖の３Ｈ）の積分により行った。Ｃ６位に関する選択性は、１３Ｃ  ＮＭＲ及びＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトルにより、確認した：第二級メシル酸は、検出されなかった。
【００６０】
例３
６−ＮＨ２−ＨＡにおけるアミン含量のＮＭＲによる同定は、定量的パルスシーケンスを用いて、１３Ｃ  ＮＭＲにおける６０．５ｐｐｍのピーク（ＣＨ２ＯＨ）、４４．０ｐｐｍのピーク（６−ＮＨ２−ＨＡを６−Ｃｌ−ＨＡから調製した場合にのみ存在する左側のＣＨ２Ｃｌ）及び４０．５ｐｐｍのピーク（ＣＨ２ＮＨ２）の積分により行った。
【００６１】
例４
６−Ｎ３−ＨＡ化合物におけるアジド含量の同定は、１３Ｃ  ＮＭＲにより、６０．５ｐｐｍにおけるＣＨ２−ＯＨのシグナル対５１ｐｐｍにおけるＣＨ２−Ｎ３のシグナルの積分により、行った。
【００６２】
例５
ＤＤＳにおけるＣＰＴ含量の同定は、水含量の同定用の熱重量分析と、フリー又は結合したＣＰＴの同定用のＨＰＬＣ法とを組み合わせて、行った。
【００６３】
ＤＤＳにおける熱重量的な水含量に関する分析パラメーターは、下記の通りである。
【００６４】
熱重量的平衡      ＴＧＡパーキンエルマー
雰囲気            窒素
ガス流量          炉流量：２５ｍＬ／分；平衡流量：５０ｍＬ／分
温度範囲          ５０〜２５０℃
温度走査率        １０℃／分
【００６５】
フリーのカンプトテシンを同定するため、コンジュゲートの１：１の比率の水／メタノール溶液を注入した。カンプトテシンの全量は、加水分解後に同定した。加水分解は、攪拌下、０．１Ｍの水酸化ナトリウム中、２時間行った。その後、カンプトテシンの沈殿を防止するため、一定のメタノールを有するサンプルを添加し、最終的に５０％のメタノール濃度（注入前の濃度）のものを得、その後、１ＭのＨＣｌ溶液で中和し、ｐＨ２．５の２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液を最終的に添加し、最終容量とした。カンプトテシンの全量からフリーのカンプトテシンの量を差分することで、結合したカンプトテシンの量を得た。
【００６６】
ＤＤＳにおけるＣＰＴのＨＰＬＣによる同定に関する分析パラメーターは、下記の通りである。
【００６７】
クロマトグラフィーのシステム    Ａｇｉｌｅｎｔ社製１１００シリーズ
カラムセット：                  カラム名：
メルク社製Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ−１８ｅ
カラムサイズ：１００×４．６０ｍｍ
温度：４０℃
ガードカラム：                  ガードカラム
メルク社製
Ｇｕａｒｄ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ＲＰ−１８ｅ
ガードカラムの寸法：５×４．６ｍｍ
温度：４０℃
溶離液Ａ：                      メタノール
溶離液Ｂ：                      ２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ２．５）
移動相のグラジエント            ０分  ３５％  Ａ＋６５％  Ｂ
１５分  ５５％  Ａ＋４５％  Ｂ
２０分  ５５％  Ａ＋４５％  Ｂ
流率：                          １ｍＬ／分
検出器：                        ＵＶ−ＶＩＳ（λ＝３７０  ｎｍ）
蛍光光度計
（励起波長λ＝３８０ｎｍ
発光波長λ＝４４０ｎｍ）
実施時間：                      ２０分
注入量：                        １０μＬ
【００６８】
例６．重量平均分子量（Ｍｗ）の同定
ヒアルロン酸ＤＤＳの分子量は、ＨＰ−ＳＥＣ（サイズ排除高速クロマトグラフィー）により同定した。分析条件は、下記の通りである。Ｒｈｅｏｄｙｎｅ社製注入器９１２５を装着したクロマトグラフ：ＨＰＬＣポンプ９８０−ＰＵ（日本分光社製シリアル番号Ｂ３９０１３２５）；カラム：ＴＳＫ  ＰＷｘｌ（東ソ  バイオサイエンス）Ｇ６０００＋Ｇ５０００＋Ｇ３０００  ６、１０、１３μｍの粒子径；温度４０℃；移動相：ＮａＣｌ０．１５Ｍ＋０．０１％ＮａＮ３；流率：０．８ｍＬ／分；検出器：ＭＡＬＬＳ（ＷＹＡＴＴ  ＤＡＷＮ  ＥＯＳ−ＷＹＡＴＴ、米国）、λ＝６９０ｎｍ（ｄｎ／ｄｃ＝０．１６７ｍＬ／ｇ）、ＵＶ分光検出器８７５−ＵＶ（日本分光社製シリアル番号Ｄ３６９３９１６）、λ＝３０５ｎｍ；干渉屈折率ＯＰＴＩＬＡＢ  ＲＥＸ（ＷＹＡＴＴ、米国）；λ＝６９０ｎｍ、感度：１２８倍；温度：３５℃；注入量：１００μＬ、実施時間：６０分。
【００６９】
分析対象のサンプルを、０．９％のＮａＣｌの溶液に約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、１２時間、攪拌下で保持した。その後、０．４５μｍの多孔性フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｍｉｎｉｓａｒｔ社製ＲＣ２５  １７７９５Ｑ）で溶液を濾過し、最終的にクロマトグラフに注入した。分析により、Ｍｗ（重量平均分子量）、Ｍｎ（数平均分子量）及びＰＩ（多分散性）の測定が可能となる。ポリマーサンプル溶液の濃度は、屈折率の積分により、調節した。
【００７０】
例７．６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩の調製
５０ｇのヒアルロナンナトリウム塩を、窒素下、９００ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁し、２０℃で機械的に攪拌した。その後、懸濁液を−１０℃に冷却し、９７ｍＬの塩化メタンスルフォニルを３０分かけて添加した。−１０℃でさらに３０分後、２０℃に昇温した。１時間後、６０℃に徐々に（１時間かけて）昇温し、１８．５時間の間、攪拌を続けた。その後、反応混合物を、激しく攪拌しながら、氷及び炭酸ナトリウム溶液（４Ｌ、初期ｐＨ１１）の混合液に添加し、必要な場合、１．５ＭのＮａＯＨを添加してｐＨ約９に保持した。得た茶色の懸濁液（最終容量６Ｌ）を、室温において、ｐＨ９．５で約４８時間攪拌したところ、澄明な溶液が形成された。これを濾過して、固形物を除去し、その後、限外濾過した（１０ｋＤａのカットオフメンブレン）。得た溶液を、ロータリーエバポレーターを用いて約１Ｌの最終容量に濃縮し、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固形物として、３４．９ｇの６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩を得た（ＤＳ  ６６％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲにより同定）。
【００７１】
１３Ｃ  ＮＭＲ  ｐｐｍ：２２．６，４４．０，５４．４，６０．７，６８．６，６９．３，７２．６，７３．８，７４．１，７５．５，７６．３，８０．１，８０．９，８２．３，１０１．０，１０３．４，１７４．０，１７４．１，１７５．０。
【００７２】
例８．６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩の調製
例７と同様の方法に従って、５０ｇのヒアルロナンナトリウム塩から出発し、６０℃の加熱状態を１２時間保持して、灰色がかった白色の固体として、３３．５ｇの６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩を得た（ＤＳ  ３８％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲにより同定）。
【００７３】
例９．６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩の調製
例７と同様の方法に従って、５０ｇのヒアルロナンナトリウム塩から出発し、６０℃の加熱状態を７時間保持して、灰色がかった白色の固体として、３３．１ｇの６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩を得た（ＤＳ  １６％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲにより同定）。
【００７４】
例１０．６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩の調製
例７と同様の方法に従って、５０ｇのヒアルロナンナトリウム塩から出発し、６０℃の加熱状態を５時間保持して、灰色がかった白色の固体として、３２．４ｇの６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩を得た（ＤＳ  ８％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲにより同定）。
【００７５】
例１１．６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ナトリウム塩（６−ＯＭｓ−ＨＡ）の調製
２０．０３ｇ（３２．３ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩を有する５００ｍＬのＤＭＦの溶液に、窒素下、攪拌しながら、−１０℃で４．８６ｍＬ（２８．４ミリモル）のＤＩＥＡを添加した。その後、ＭｓＣｌ（１００１μＬ；１２．９ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を−１０℃で１時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｌ）を反応混合物に添加して、反応を停止し、水で最終容量３Ｌとした（得たｐＨ：９）；一昼夜攪拌を行った。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥し、１１．１２ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲにより同定した全メシル酸のＤＳ  １２．３％モル／モル。
【００７６】
例１２．６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ナトリウム塩（６−ＯＭｓ−ＨＡ）の調製
１．００ｇ（１．６１ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩を有する４０ｍＬのＤＭＦの溶液に、窒素下、攪拌しながら、−１０℃で３８１μＬ（２．２４ミリモル）のＤＩＥＡを添加した。その後、ＭｓＣｌ（７９μＬ；１．０１ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を−１０℃で１時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）を反応混合物に添加して、反応を停止し、水で最終容量２００ｍＬとした（得たｐＨ：９）；一昼夜攪拌を行った。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥し、５８８ｍｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲにより同定した全メシル酸のＤＳ  １５％モル／モル。
【００７７】
例１３．６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ナトリウム塩（６−ＯＭｓ−ＨＡ）の調製
４２．２ｇ（６８．１ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩を有する１．００ＬのＤＭＦの溶液に、窒素下、攪拌しながら、−１０℃で２５．６ｍＬ（１４９．８ミリモル）のＤＩＥＡを添加した。その後、ＭｓＣｌ（５．２９ｍＬ；６８．１ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を−１０℃で１時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２Ｌ）を反応混合物に添加して、反応を停止し、水で最終容量５．５Ｌとした（得たｐＨ：９）；一昼夜攪拌を行った。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥し、２６．０ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲにより同定した全メシル酸のＤＳ  １８％モル／モル。
【００７８】
例１４．６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ナトリウム塩（６−ＯＭｓ−ＨＡ）の調製
２０．０ｇ（３２．３ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩を有する５００ｍＬのＤＭＦの溶液に、窒素下、攪拌しながら、−１０℃で９．１２ｍＬ（５３．３ミリモル）のＤＩＥＡを添加した。その後、ＭｓＣｌ（３．７６ｍＬ；４８．４ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を−１０℃で１時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｌ）を反応混合物に添加して、反応を停止し、水で最終容量３Ｌとした（得たｐＨ：９）；一昼夜攪拌を行った。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥し、１１．１２ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲにより同定した全メシル酸のＤＳ  ３０％モル／モル。
【００７９】
例１５．６−Ｏ−メタンスルフォニルヒアルロン酸ナトリウム塩（６−ＯＭｓ−ＨＡ）の調製
２０．０ｇ（３２．３ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩を有する５００ｍＬのＤＭＦの溶液に、窒素下、攪拌しながら、−１０℃で９．１２ｍＬ（５３．３ミリモル）のＤＩＥＡを添加した。その後、ＭｓＣｌ（３．７６ｍＬ；４８．４ミリモル）を滴下で添加し、得た混合物を−１０℃で１時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｌ）を反応混合物に添加して、反応を停止し、水で最終容量３Ｌとした（得たｐＨ：９）；一昼夜攪拌を行った。得た溶液を限外濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。溶液を凍結乾燥し、１１．１２ｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲにより同定した全メシル酸のＤＳ  ３０％モル／モル。
【００８０】
例１６．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例７の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応器中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で２１時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩５．４３ｇを得た（ＤＳ  ３３％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。ＭＷ：１７２２０、Ｐ．Ｉ．１．８。
【００８１】
１３Ｃ  ＮＭＲ  ｐｐｍ（ＴＢＡシグナルは含まれず）：２２．６，４０．５，４４．０，５４．４，６０．７，６８．６，６９．３，７０．５，７２．０，７２．６，７３．８，７５．５，７６．３，７８．２，８０．１，８０．９，８２．３，９９．７，１０１．０，１０３．４，１７４．０，１７４．１，１７５．０。
【００８２】
例１７．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例７の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応器中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で４０時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩４．３４ｇを得た（ＤＳ  ４２％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００８３】
例１８．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例７の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で４８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩４．０５ｇを得た（ＤＳ  ５０％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００８４】
例１９．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例８の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で２２時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩６．５１ｇを得た（ＤＳ  ２０％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。ＭＷ：１５４１０、Ｐ．Ｉ．１．５。
【００８５】
例２０．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例８の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で３８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩５．９０ｇを得た（ＤＳ  ２５％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。ＭＷ：１６３７０、Ｐ．Ｉ．１．６。
【００８６】
例２１．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例９の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で２２時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩６．４３ｇを得た（ＤＳ  １３％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。ＭＷ：１４４２０、Ｐ．Ｉ．１．４。
【００８７】
例２２．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例９の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で７時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩５．９５ｇを得た（ＤＳ  ４％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。ＭＷ：１３９６０、Ｐ．Ｉ．１．４。
【００８８】
例２３．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例１０の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で７時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩６．２２ｇを得た（ＤＳ  ２％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。ＭＷ：１３６８０、Ｐ．Ｉ．１．４。
【００８９】
例２４．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例１５の６−ＯＭｓ−ＨＡ１００ｍｇを、密閉可能なフラスコ中で３ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。溶液を６０℃で１８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１３２ｍｇを得た（ＤＳ  ３０％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００９０】
１３Ｃ  ＮＭＲ  ｐｐｍ（ＴＢＡのシグナルは含まれず）：２２．３，４０．５，５３．９，６０．４，６８．１，６９．８，７１．０，７１．８，７２．４，７４．７，７７．２，７９．５，８２．０，９９．５，１００．８，１０３．０，１７３．０，１７３．９，１７４．３。
【００９１】
例２５．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例１４の６−ＯＭｓ−ＨＡ１０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応器中で２００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を６０℃で１８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。ＨＣｌ溶液で中和し、且つ限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１２．８ｇを得た（ＤＳ  ２０％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００９２】
例２６．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例１３の６−ＯＭｓ−ＨＡ１０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応器中で２００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を６０℃で１８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。ＨＣｌ溶液で中和し、且つ限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１２．６ｇを得た（ＤＳ  １２％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００９３】
例２７．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例１２の６−ＯＭｓ−ＨＡ５００ｇを、密閉可能なフラスコ中で１５ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。溶液を密閉し、６０℃で１８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。ＨＣｌ溶液で中和し、且つ限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩６２８ｍｇを得た（ＤＳ  ８％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００９４】
例２８．６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩の調製
例１１の６−ＯＭｓ−ＨＡ１０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応器中で２００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、６０℃で１８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。ＨＣｌ溶液で中和し、且つ限外濾過した後、溶液を、ＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理した。その後、凍結乾燥して、白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１２．９ｇを得た（ＤＳ  ６％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００９５】
例２９．６−ＮＨ２−ＨＡのナトリウム塩の調製
例１５の６−ＯＭｓ−ＨＡ１００ｍｇを、密閉可能なフラスコ中で３ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。溶液を６０℃で１８時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。溶液を、０．５ｍＬの飽和塩化ナトリウムで処理し、３０分間攪拌した。その後、透析を行い、凍結乾燥して、白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのナトリウム塩９２ｍｇを得た（ＤＳ  ３０％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【００９６】
例３０．６−Ｎ３−ＨＡのナトリウム塩の調製
例８の６−Ｃｌ−ＨＡナトリウム塩１．００ｇ（２．３８ミリモル）を、水に溶解し且つＴＢＡを負荷したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−１２０で処理することにより、対応するＴＢＡ塩に変換した。得た溶液を凍結乾燥して、１．５３ｇの６−Ｃｌ−ＨＡのＴＢＡ塩を得た。この固体を、３０ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、５．０ｇのアジ化ナトリウム及び１．０ｇの１８−クラウン−６を添加し、８０℃に加熱し、その後、２４時間攪拌した。混合物を、水に投入し、得た溶液を限外濾過し、凍結乾燥して、８２０ｍｇの固形物を得た。アジドにおけるＤＳは、１３Ｃ  ＮＭＲにより３０％であった。
【００９７】
例３１．６−Ｎ３−ＨＡのナトリウム塩の調製
例１４の６−ＯＭｓ−ＨＡナトリウム塩２００ｍｇ（０．５ミリモル）を、４ｍＬの水に溶解した。１．２０ｇのアジ化ナトリウムを添加し、溶液を８０℃で１６時間攪拌した。水に対する透析と、凍結乾燥とを行い、１８０ｍｇの白色の固体を得た。アジドにおけるＤＳは、１３Ｃ  ＮＭＲにより１５％であった。プロトンＮＭＲにより、残存するメシル酸は、観察されなかった。
【００９８】
例３２．６−Ｎ３−ＨＡのナトリウム塩の調製
例２０の６−ＯＭｓ−ＨＡナトリウム塩２．０ｇ（４．８ミリモル）を、４０ｍＬの水に溶解した。１０．０ｇのアジ化ナトリウムを添加し、溶液を８０℃で１６時間攪拌した。水に対する透析と、凍結乾燥とを行い、１．６５ｇの白色の固体を得た。アジドにおけるＤＳは、１３Ｃ  ＮＭＲにより１０％であった。プロトンＮＭＲにより、残存するメシル酸は、観察されなかった。
【００９９】
例３３．６−ＮＨ２−ＨＡナトリウム塩の調製
例３２の６−Ｎ３−ＨＡのナトリウム塩１５０ｍｇ（０．３７ミリモル）及び１６ｍｇ（０．１ミリモル）のＣｕＳＯ４を有する３ｍＬの水の溶液に、０℃で攪拌しながら、３８ｍｇ（１．０ミリモル）のＮａＢＨ４を部分毎に添加した。初期にガスの発生が観察され、黒色の混合物が形成された。１時間後、混合物を濃ＮＨ４ＯＨで処理してｐＨを１０とし、セライトにより濾過した。得た溶液を１ＮのＨＣｌを用いて酸性化してｐＨ９としたところ、黒色の沈殿物が形成され、これを、短いセライトパッドを用いて濾過した。得た溶液を、水に対して透析し、凍結乾燥して、１３５ｍｇの白色の固体を得た。アミノ基のＤＳは、１３Ｃ  ＮＭＲにより１０％であり、残存するアジドは、観察されなかった。
【０１００】
例３３．６−ＮＨ２−ＨＡナトリウム塩の調製
例３２の６−Ｎ３−ＨＡのナトリウム塩２００ｍｇ（０．５０ミリモル）及び１２０ｍｇのギ酸アンモニウムを有する４ｍＬの水の溶液を、複数の窒素／吸引サイクルにより空気からパージした。その後、窒素下、４０ｍｇの５％Ｐｄ／Ｃを添加し、混合物を、室温で１８時間攪拌した。その後、セライトの短いパッドで濾過し、水に対して透析し、凍結乾燥して、１８４ｍｇの白色の固体を得た。アミノ基のＤＳは、１３Ｃ  ＮＭＲにより１０％であり、残存するアジドは、観察されなかった。
【０１０１】
例３４．ＣＰＴ−２０−ヘミコハク酸
２．９８ｇ（１７．１ミリモル）のモノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル及び１．４０ｇ（１１．５ミリモル）のｐ−ジメチルアミノ−ピリジンを有する２００ｍＬのジクロロメタンの溶液に、室温で攪拌しながら、２．６８ｍＬ（１７．３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミド及び３．００ｇ（８．６２ミリモル）のＣＰＴを添加した。一昼夜攪拌した後、得た懸濁液を、８０ｍＬのジクロロメタンで希釈して、溶液を得、これを、０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾固した。その後、濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。残渣を１００ｍＬのＭｅＯＨで結晶化し、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、トリフルオロ酢酸を有する４０％ｖ／ｖのジクロロメタンの溶液５０ｍＬで処理し、室温で１時間載置した後、得た緑色の溶液を、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。残渣を１００ｍＬのＭｅＯＨで結晶化し、濾過し、ＭｅＯＨ及びジエチルエーテルで洗浄した。真空下で乾燥した後、３．６７ｇ（８．１９ミリモル、９５％）の淡黄色の固形物を得た。
【０１０２】
例３５．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴナトリウム塩
例３４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸５６ｍｇ（０．１２４ミリモル）及び１７．３ｍｇ（０．１５０ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する３ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、１９μＬ（０．１２４ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２０の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩７７ｍｇ（０．１２４ミリモル）を添加し、５時間、攪拌を続けた。その後、０．１５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、１０ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、１０ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、６０ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、２５％モル／モルであった。
【０１０３】
例３６．ＨＡのＴＢＡ塩と、活性化したＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸との反応
例３４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸５６ｍｇ（０．１２４ミリモル）及び１７．３ｍｇ（０．１５０ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する３ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、１９μＬ（０．１２４ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、７７ｍｇ（０．１２４ミリモル）のＨＡのＴＢＡ塩を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、０．１５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、１０ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、１０ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、４８ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、０％モル／モルであった。
【０１０４】
例３７．例３５のＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴのＮＭＲによる構造確認
例３５のＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴのＤ２Ｏにおけるプロトンスペクトルは、非常に広範なシグナルパターンを示し、結合したＣＰＴ−ヘミコハク酸に起因する可能性のあるものである。ＤＯＳＹで計測したスペクトルにより、新規のシグナルが、ヒアルロナン鎖に結合された種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に属することが確認された。５．５ｐｐｍと５．８ｐｐｍとの間に存在する２つのダブレットは、ＣＰＴのラクトンに起因する可能性のあるものであり、結合したＣＰＴに属するその他のシグナルについて正確に積分したものである。ＨＳＱＣスペクトルにより、このことを確認し、ＣＰＴ−ヘミコハク酸の全てのシグナル及びポリマー上で新規に形成されたアミド性６−ＣＨ２のシグナルの同定を完了した。
【０１０５】
結合したＣＰＴの定量により、１Ｈ  ＮＭＲにより２５％モル／モルであると算出された。ＤＳは、ＮＭＲ管に２ｍｇの固体ＬｉＯＨ一水和物を添加することで、確認した。数分後、新規のプロトンスペクトルが得られ、コンジュゲートに由来するＣＰＴの加水分解が完全であることを示した；ＣＰＴの開環型のリチウム塩のシグナルは、ＨＡに対して積分され、ＤＳは、２５％モル／モルであった。このスペクトルにおいて、コハク酸鎖のシグナルは、２つのメチレン基について、２つの異なる化学シフトで２つのブロードなマルチプレットとして観察され、このことは、コハク酸がポリマーに未だ結合されていることを示すものである；このことをＤＯＳＹで計測したスペクトルで確認し、ｐＨ１３で一週間後、ヘミコハク酸がポリマーに結合されていることがＮＭＲにより示された。
【０１０６】
出発物質である例２０の６−ＮＨ２−ＨＡにおいて、アミンのＤＳは、１３Ｃ  ＮＭＲにより２５％モル／モルと算出され、ＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴのＨＳＱＣスペクトルからは、６−ＣＨ２ＮＨ２がポリマー上に残存していないことが確認された。
【０１０７】
これらの実験が示すように、ＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸は、コンジュゲーションを行うステップにおいて、アミド結合を介して、６−ＮＨ２−ＨＡのアミンに排他的に結合する；このことは、生のＨＡのＴＢＡ塩を用いて結合したＣＰＴが見出されなかったという独立した反応（例３６）により、確認された。
【０１０８】
さらに、結合したＣＰＴは、ラクトン型（プロトン及び炭素の化学シフトにより、且つプロトンの積分により）として存在する；比較として、ＣＰＴのスペクトルを塩基性水中で取得し、ここで、ＣＰＴは、開環したラクトンのカルボン酸塩として溶解性を有する。この場合、開環したラクトンのプロトン及び炭素の化学シフトは、明らかに異なる。
【０１０９】
最後に、開環したＣＰＴの１Ｄ及び２Ｄスペクトル（塩基性のＨ２Ｏで取得し、水抑制技術（ｗａｔｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いたもの）は、加水分解したコンジュゲートのスペクトルと重ね合わせ可能であって、このことは、活性化及びコンジュゲーションの反応中、ＣＰＴが完全に保存されていたことを示すものである。
【０１１０】
例３８．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴのナトリウム塩
例３４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸１．０３ｇ（２．３０ミリモル）及び３１８ｍｇ（２．７６ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する３０ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、３５６μＬ（２．３０ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２０の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．５０ｇ（２．３０ミリモル）を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、３．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、１００ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、１００ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１．０１ｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、２５％モル／モルであった。ＨＰＬＣによるＣＰＴにおけるＤＳは、１３％ｗ／ｗであった。
【０１１１】
例３９．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴナトリウム塩
例３４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸１．０３ｇ（２．３０ミリモル）及び４００ｍｇ（３．４８ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する３０ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、３５６μＬ（２．３０ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．５０ｇ（２．３０ミリモル）を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、３．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、１００ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、１００ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、０．９９ｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、１２％モル／モルであった。ＨＰＬＣによるＣＰＴにおけるＤＳは、７％ｗ／ｗであった。
【０１１２】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．００ｇから出発して、６５３ｍｇの白色の固体を得た（ＣＰＴにおけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１１３】
例４０．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴナトリウム塩
例３４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸１．０３ｇ（２．３０ミリモル）及び４００ｍｇ（３．４８ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する３０ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、３５６μＬ（２．３０ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例１６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．５０ｇ（２．３０ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、３．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、１００ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、１００ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１．２６ｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、３３％モル／モルであった。
【０１１４】
例４１．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯ−２０−Ｏ−ＣＰＴナトリウム塩
例３４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸８６７ｍｇ（１．９４ミリモル）及び３３４ｍｇ（２．９０ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する３０ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、３００μＬ（１．９４ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２２の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．５０ｇ（２．３０ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、３．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、１００ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、１００ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、０．９６ｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、３．５％モル／モルであった。ＨＰＬＣによるＣＰＴにおけるＤＳは、２％ｗ／ｗであった。
【０１１５】
また、例２９の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．００ｇから出発して、６４０ｍｇの白色の固体を得た（ＣＰＴにおけるＤＳ  ６％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１１６】
例４２．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨナトリウム塩
例１９の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．５０ｇ（２．３０ミリモル）を有する３０ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、４８１μＬ（３．４５ミリモル）のトリエチルアミン及び３４５ｍｇ（３．４５ミリモル）の無水コハク酸を添加した。室温で一昼夜攪拌した後、３．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨ、１０％の水を有するＥｔＯＨ、ジメチルホルムアミド及び最終的にメタノールで洗浄した。固形物を、１００ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液に溶解し、５分後、３ＮのＨＣｌ溶液でｐＨを８に調節した。溶液を限外濾過し、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、９２２ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるヘミコハク酸におけるＤＳは、２０％モル／モルであった。
【０１１７】
例４３．ＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨＢｏｃ
３．００ｇ（１７．１ミリモル）のＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及び１．４０ｇ（１１．４ミリモル）の４−ジメチルアミノピリジンを有する１００ｍＬのジクロロメタンの溶液に、２．６８ｍＬ（１７．１ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミド及び２．００ｇ（５．７５ミリモル）のＣＰＴを添加した。室温で一昼夜攪拌した後、得た懸濁液を、５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、蒸留した。残渣を最小量のメタノールで結晶化し、濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥して、２．２４ｇ（７８％）の白色の固体を得た。
【０１１８】
例４４．ＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ２・ＴＦＡ
例４３のＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨＢｏｃ１．５０ｇ（２．９７ミリモル）を、トリフルオロ酢酸を有するジクロロメタンの４０％溶液１００ｍＬに溶解した。１時間後、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を、ジエチルエーテルで結晶化し、濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥して、１．５０ｇ（０．２８９ミリモル、９７％）の淡黄色の固体を得た。
【０１１９】
例４５．ＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨ
１７４ｍｇ（１７．３ミリモル）の無水コハク酸、０．５０ｍＬ（２．９ミリモル）のＤＩＥＡ及び４ｍｇ（０．０３ミリモル）のＤＭＡＰを有する５０ｍＬのジクロロメタンの溶液に、窒素下、室温で、例４４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ２・ＴＦＡ７５０ｍｇ（１．４４ミリモル）を添加した。１８時間後、溶液を２５ｍＬのジクロロメタンで希釈し、０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、蒸留した。残渣を最小量のメタノールで結晶化し、濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥して、６５５ｍｇ（１．３０ミリモル、９０％）の白色の固体を得た。
【０１２０】
例４６．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ
例４５のＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨ２５０ｍｇ（０．４９５ミリモル）及び８６ｍｇ（０．７５ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する１０ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、７７μＬ（０．５０ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例３３の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３１０ｍｇ（０．５０ミリモル）を添加し、５時間、攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら４０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、３０ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、４０ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、０．２２ｇ（１００％）の白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、２％モル／モルであり、ＨＰＬＣによるＣＰＴにおけるＤＳは、１．５％ｗ／ｗであった。
【０１２１】
また、例２８の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１００ｍｇから出発して、６０ｍｇの白色の固体を得た（ＣＰＴにおけるＤＳ  ６％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１２２】
例４７．ＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−Ｇｌｙ−ＯＨ
例３４のＣＰＴ−２０−Ｏ−ヘミコハク酸８００ｍｇ（１．７９ミリモル）、５４９μＬ（３．９４ミリモル）のトリエチルアミン及び３４３ｍｇ（１．７９ミリモル）のＥＤＣ塩酸塩を有する８０ｍＬのジクロロメタンの溶液に、３３０ｍｇ（１．９６ミリモル）のＧｌｙ−Ｏ−ｔｅｒｔ−Ｂｕ塩酸塩を添加した。室温で一昼夜攪拌した後、溶液を０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸留した。残渣を、最小量のメタノールで結晶化し、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥して、白色の固体を得た。この固体を、５％ｖ／ｖの水を含有するＴＦＡ２５ｍＬに溶解した。１．５時間後、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をメタノールで結晶化した。濾過、メタノールによる洗浄及び乾燥により、６０１ｍｇ（１．１９ミリモル、６６％）の灰色がかった白色の固体を得た。
【０１２３】
例４８．ＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−Ｇｌｙ−ＮＨ−６−ＨＡ
例４７のＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−Ｇｌｙ−ＯＨ２５０ｍｇ（０．４９５ミリモル）及び１１４ｍｇ（０．９９ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する７ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、７７μＬ（０．５０ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例１９の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を添加し、５時間、攪拌を続けた。その後、０．７ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら３０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を、２５ｍＬのジメチルホルムアミドに懸濁し、３０分間攪拌し、濾過し、ジメチルホルムアミドで１回、ＭｅＯＨで２回洗浄した。フィルター上で乾燥した後、固形物を、３０ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１２０ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、２０％モル／モルであり、ＨＰＬＣによるＣＰＴにおけるＤＳは、１４．０％ｗ／ｗであった。
【０１２４】
また、例２８の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１００ｍｇから出発して、６３ｍｇの白色の固体を得た（ＣＰＴにおけるＤＳ  ６％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））；ＨＰＬＣによるＣＰＴにおけるＤＳ  ４．８２％ｗ／ｗ）。
【０１２５】
例４９．タキソール−２’−ヘミコハク酸
３００ｍｇ（０．３５１ミリモル）のタキソール、４２．２ｍｇ（０．４２２ミリモル）の無水コハク酸及び９ｍｇ（０．０７ミリモル）のＤＭＡＰを有する１０ｍＬの乾燥ピリジンの溶液を、室温で３時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を、最小量のジクロロメタンに溶解し、シリカゲルカラムに負荷した。メタノールを有する酢酸エチル（０％から１００％）を用いた溶出により、３３４ｍｇ（１００％）の純粋なタキソール−２’−ヘミコハク酸を得た。
【０１２６】
例５０．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−２’−Ｏ−ＴＸＬ
例４９のタキソール−２’−ヘミコハク酸３３４ｍｇ（０．３５１ミリモル）及び１１５ｍｇ（１．００ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する１０ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６２μＬ（０．３５ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２３の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２１７ｍｇ（０．３５ミリモル）を添加し、７時間、攪拌を続けた。その後、０．７ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら４０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨ及びＭｅＯＨで洗浄した。固形物を、２５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１３０ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＴＸＬにおけるＤＳは、２％モル／モルであった。
【０１２７】
また、例２８の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１００ｍｇから出発して、６２ｍｇの白色の固体を得た（ＴＸＬにおけるＤＳ  ５％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１２８】
例５１．ＨＡ−６−ＮＨ−ＭＴＸ
３３０ｍｇ（０．７２６ミリモル）のメトトレキサート及び５６ｍｇ（０．４８４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する６ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、７５μＬ（０．４８４ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇ（０．４８４ミリモル）を添加し、４．５時間、攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら３０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨ及び３×ＤＭＦで洗浄した。固形物を、２０ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、２０２ｍｇの黄色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＭＴＸにおけるＤＳは、１３％モル／モルであった。
【０１２９】
また、例２５の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．００ｇから出発して、７０６ｍｇの黄色の固体を得た（ＭＴＸにおけるＤＳ  ２０％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１３０】
例５２．ＨＡ−６−ＮＨ−イブプロフェン
１１０ｍｇ（０．５３２ミリモル）のイブプロフェン及び６１ｍｇ（０．５３２ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する６ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、７５μＬ（０．４８４ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇ（０．４８４ミリモル）を添加し、４．５時間、攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間、攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら３０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを、１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨ及び３×ＤＭＦで洗浄した。固形物を、２０ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１８０ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるイブプロフェンにおけるＤＳは、１３％モル／モルであった。
【０１３１】
また、例２５の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩１．００ｇから出発して、６９０ｍｇの白色の固体を得た（イブプロフェンにおけるＤＳ  ２０％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１３２】
例５３．６−ＮＨ２−ＨＡナトリウム塩の調製
例８の６−Ｃｌ−ＨＡ５．０ｇを、圧力下で反応するのに適した反応器中で１００ｍＬの濃ＮＨ４ＯＨ溶液に溶解した。反応器を密閉し、溶液を８０℃で２２時間加熱し、その後、冷却し、過剰量のアンモニアを真空下で除去した。溶液を１０ｍＬの飽和塩化ナトリウムで処理し、３０分間攪拌した。その後、限外濾過し、凍結乾燥して、灰色がかった白色の固体として、６−ＮＨ２−ＨＡのナトリウム塩３．３５ｇを得た（ＤＳ  ２０％モル／モル、１３Ｃ  ＮＭＲで同定したもの）。
【０１３３】
例５４．ＨＡ−６−ＮＨ−（４−ホルミル−ベンゾイル）
６００ｍｇ（４．００ミリモル）の４−カルボキシ−ベンズアルデヒド、５０６ｍｇ（４．４０ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミド及び０．６７ｍＬ（４．８ミリモル）のトリエチルアミンを有する３０ｍＬのＤＣＭの溶液に、７６７ｍｇ（４．００ミリモル）のＥＤＣ塩酸塩を添加した。室温で４時間攪拌した後、溶液を、０．１ＮのＨＣｌ溶液で２回、水で２回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、蒸留乾固して、８４０ｍｇ（９０％）の白色の固体を得た。この固体の５０ｍｇを０．６０ｍＬのＤＭＦに溶解し、例５３の６−ＮＨ２−ＨＡナトリウム塩１００ｍｇを有する５ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）の溶液に添加した。室温で３時間攪拌した後、得た懸濁液を水で１５ｍＬに希釈し、遠心分離して、固形物を除去し、水に対して透析を行い、凍結乾燥して、９２ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによる４−ホルミル−ベンゾイル基のＤＳは、１２％モル／モルであった。
【０１３４】
例５５．ＨＡ−６−ＮＨ−（４−ペンチルアミノメチル−ベンゾイル）
例５４のＨＡ−６−ＮＨ−（４−ホルミル−ベンゾイル）８２ｍｇ（０．２０５ミリモル）を有する３．７ｍＬの０．２ＭのＮａＨＣＯ３溶液の溶液に、２４μＬ（０．２０５ミリモル）のペンチルアミン及び１３ｍｇ（０．２０５ミリモル）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。室温で一昼夜攪拌した後、懸濁液を、水で１１ｍＬに希釈し、遠心分離して固形物を除去し、水に対して透析を行い、凍結乾燥して、７５ｍｇの白色の固形物を得た。プロトンＮＭＲによるアシル基のＤＳは、６％モル／モルであった。
【０１３５】
例５６．ＨＡ−６−ＮＨ−Ａｃ
例１９の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩８０ｍｇ（０．１２９ミリモル）を有する１０ｍＬの無水酢酸の懸濁液に、ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を添加して、溶液を得、これを、室温で１６時間攪拌した。その後、０．５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。３０分間攪拌した後、混合物をＥｔＯＨに投入し、濾過した。固形物を、０．１ＮのＮａＯＨ溶液１０ｍＬに溶解した。１０分後、溶液を中和し、限外濾過し、凍結乾燥して、４５ｍｇの白色の固体を得た（アセチル基におけるＤＳ  ２０％（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１３６】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１２４ｍｇの白色の固体を得た（アセチル基におけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１３７】
例５７．ＨＡ−６−ＮＨ−ピコリノイル
５７ｍｇ（０．４６ミリモル）のピコリン酸を有する１２ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、８０ｍｇ（０．７０ミリモル）のＮＨＳ及び７１μＬ（０．４６ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。室温で１８時間攪拌した後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇ（０．４６ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、１．５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、２５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、濾過した。固形物を、ＥｔＯＨで洗浄し、０．１ＮのＮａＯＨ溶液２０ｍＬに溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を０．１ＮのＨＣｌで中和し、限外濾過し、凍結乾燥して、１８０ｍｇの白色の固体を得た（ピコリノイル基におけるＤＳ  １３％（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１３８】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１１７ｍｇの白色の固体を得た（ピコリノイル基におけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１３９】
例５８．Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−６−ＨＮ−ＨＡ
６７ｍｇ（０．３２３ミリモル）のＣｂｚ−Ｇｌｙ−ＯＨ及び５６ｍｇ（０．４８４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する４ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、５０μＬ（０．３２３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇ（０．３２３ミリモル）を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、０．４０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１３７ｍｇの白色の固体を得た（プロトンＮＭＲによるＣｂｚ−ＧｌｙにおけるＤＳ  １３％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１４０】
例５９．Ｈ２Ｎ−Ｇｌｙ−６−ＨＮ−ＨＡ
例５８のＣｂｚ−Ｇｌｙ−６−ＨＮ−ＨＡ７０ｍｇを、５０ｍｇのギ酸アンモニウムを有する１．５ｍＬの水に溶解した。複数の真空／窒素サイクルにパージした後、溶液を、４０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃ（湿潤状態のもの）に負荷し、その後、室温で１８時間攪拌した。８ｍＬの水で希釈した後、混合物を遠心分離し、固形物を廃棄した。得た黒色の溶液を、セライトの短パットを通過させ、濃縮し、凍結乾燥して、５５ｍｇの灰色がかった白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＧｌｙにおけるＤｓは、１３％モル／モルであった。
【０１４１】
例６０．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−Ｐｈ
例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）及び８４μＬ（０．６０４ミリモル）のトリエチルアミンを有する７ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、４７μＬ（０．４０３ミリモル）の塩化ベンゾイルを添加した。３時間後、溶液を１ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で処理し、３０分間攪拌を続けた。混合物を攪拌しながら２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。その後、溶液を０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１５７ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＢｚにおけるＤＳは、６％モル／モルであった。
【０１４２】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１１０ｍｇの白色の固体を得た（ＢｚにおけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１４３】
例６１．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−（ｏ−アミノ−フェニル）
例１７の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）及び８４μＬ（０．６０４ミリモル）のトリエチルアミンを有する１０ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６６ｍｇ（０．４０３ミリモル）のイサト酸無水物を添加した。１８時間後、溶液を１ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で処理し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの０．１ＮのＮａＯＨ溶液に溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、水に対して透析した。その後、溶液を０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１７５ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるアントラノイルにおけるＤＳは、４０％モル／モルであった。
【０１４４】
また、例２５の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１３４ｍｇの白色の固体を得た（アントラノイルにおけるＤＳ  ２０％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１４５】
例６２．ＨＡ−６−ＮＨＣＯ−ｎＰｒ
３７μＬ（０．４０３ミリモル）のブチル酸及び７０ｍｇ（０．６０４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する２ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６２μＬ（０．４０３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。３時間後、例２０の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を添加し、１６時間攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの０．１ＮのＮａＯＨ溶液に溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、水に対して透析した。その後、溶液を０．２２μｍの細孔径のメンブレンで濾過し、凍結乾燥して、１３１ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるブチロイルにおけるＤＳは、２５％モル／モルであった。
【０１４６】
また、例２５の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１２０ｍｇの白色の固体を得た（ブチロイルにおけるＤＳ  ２０％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１４７】
例６３．ＨＡ−６−ＮＨ−（ＣＯ）−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨＣｂｚ）−ＣＯＯＨ
例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇ（０．４６ミリモル）を有する１２ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、１２８μＬ（０．９２ミリモル）のトリエチルアミン、１１ｍｇ（０．０９ミリモル）のＤＭＡＰ及び１３７ｍｇ（０．５５ミリモル）のＮ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物を添加した。１６時間後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。その後、混合物を、攪拌しながら２５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、濾過した。固形物を、５ｍＬの０．１ＮのＮａＯＨ溶液に溶解した。１０分間後、溶液を中和し、限外濾過し、凍結乾燥して、１１０ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  １３％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１４８】
例６４．５α−コレスタン−３β−オール  ヘミコハク酸
１．００ｇ（２．５ミリモル）の５α−コレスタン−３β−オールを有する５０ｍＬのジクロロメタンの溶液に、窒素下、０℃で攪拌しながら、６７２ｍｇ（３．８ミリモル）のモノｔｅｒｔ−ブチルコハク酸、２３５ｍｇ（１．９ミリモル）のＤＭＡＰ及び９５８ｍｇ（５．０ミリモル）のＥＤＣ塩酸塩を添加した。３０分後、混合物を室温として、１時間攪拌した。その後、溶液を、１０％ｗ／ｖのクエン酸溶液、飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、蒸留乾固した。固形物を、２０ｍＬのトリフルオロ酢酸及び１ｍＬの水を有する混合物で処理し、得た溶液を室温で２時間攪拌した。蒸留乾固して、８３０ｍｇの白色の固体を得た。
【０１４９】
例６５．ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−３β−Ｏ−５α−コレスタン
２５２ｍｇ（０．４６ミリモル）の５α−コレスタン−３β−オール  ヘミコハク酸を有する１２ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、８０ｍｇ（０．７０ミリモル）のＮＨＳ及び７１μＬ（０．４６ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。室温で１８時間攪拌した後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇ（０．４６ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、１．５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、２５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、その後、濾過した。固形物を、ＥｔＯＨで洗浄し、その後、２０ｍＬの０．１ＮのＮａＯＨ溶液に溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を０．１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、限外濾過し、凍結乾燥して、１９７ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  １３％（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１５０】
また、例２８の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１２４ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  ６％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１５１】
例６６．ＨＡ−６−ＮＨ−（Ｎ−Ｃｂｚ−プロリノイル）
１１４ｍｇ（０．４６ミリモル）のＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−プロリンを有する１２ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、８０ｍｇ（０．７０ミリモル）のＮＨＳ及び７１μＬ（０．４６ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。室温で１８時間攪拌した後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇ（０．４６ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、１．５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、２５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、その後、濾過した。固形物を、ＥｔＯＨで洗浄し、その後、２０ｍＬの０．１ＮのＮａＯＨ溶液に溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を０．１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、限外濾過し、凍結乾燥して、１８２ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  １３％（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１５２】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１１３ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  １１％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１５３】
例６７．ＨＡ−６−ＮＨ−（Ｓ）−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２
例１４のＨＡ−６−Ｏ−Ｍｓ２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を有する１０ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６９μＬ（０．４０３ミリモル）のＤＩＥＡ及び２９５ｍｇ（２．０２ミリモル）のＬ−リジンを添加した。溶液を７０℃に加熱し、１８時間攪拌し、その後、冷却し、水に投入し、希ＨＣｌ溶液で中和し、２ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で処理し、限外濾過し、凍結乾燥して、１４０ｍｇの灰色がかった白色の固体を得た（リジンにおけるＤＳ  ３０％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１５４】
例６８．ＨＡ−６−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣｂｚ
例１３の６−ＯＭｓ−ＨＡのＴＢＡ塩１．００ｇ（１．４０ミリモル）及び９３７ｍｇ（４．２ミリモル）Ｃｂｚ−β−アラニンを有する２５ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、２３６ｍｇ（０．７０ミリモル）の無水炭酸セシウムを添加した。その後、混合物を７０℃に加熱し、１８時間攪拌した。その後、冷却し、氷水（１００ｍＬ）に投入した。ｐＨを６．５〜７に調節し、１０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加した。溶液を限外濾過し、凍結乾燥して、５５０ｍｇの白色の固体を得た（Ｃｂｚ−β−アラニンにおけるＤＳ  １８％モル／モル（プロトンＮＭＲによる））。
【０１５５】
例６９．ＨＡ−６−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２
例６８のＨＡ−６−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣｂｚ１００ｍｇ及び１２０ｍｇのギ酸アンモニウムを有する２ｍＬの水の溶液に、複数の真空／窒素サイクルにパージした後、２０ｍｇの１０％のＰｄ／Ｃ（湿潤状態のもの）を添加した。混合物を１８時間攪拌し、その後、遠心分離し、セライトの短パッドで濾過した。限外濾過し、凍結乾燥した後、８０ｍｇの灰色がかった白色の固体を得た。プロトンＮＭＲにより、Ｃｂｚが完全に除去されていることを示した。
【０１５６】
例７０．ＴＦＡ・Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ
３４８ｍｇ（１．００ミリモル）のＣＰＴを有する２０ｍＬのＤＣＭの懸濁液に、窒素下、室温で攪拌しながら、４８２ｍｇ（１．５ミリモル）のＢｏｃ−ＨＮ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＯＨ、１５８ｍｇ（１．３ミリモル）のＤＭＡＰ及び３０９μＬ（２．０ミリモル）のＤＩＰＣを添加した。１６時間後、得た溶液を、０．１ＮのＨＣｌ溶液及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、蒸留乾固した。固形の残渣を、ＭｅＯＨ／ジエチルエーテルで再結晶して、３５０ｍｇの固体を得た。これを、ＴＦＡを有するＤＣＭの８０％の溶液２０ｍＬに溶解し、室温で２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、少量のジエチルエーテルを用いた同時蒸留により、微量のＴＦＡを除去した。残渣をＭｅＯＨ／ジエチルエーテルで再結晶して、３２０ｍｇの固体を得た。
【０１５７】
例７１．ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ
６０ｍｇ（０．６０ミリモル）の無水コハク酸、１７１μＬ（１．０ミリモル）のＤＩＥＡ及び１２ｍｇ（０．１ミリモル）のＤＭＡＰを有する２０ｍＬのＤＣＭの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、例７０のＴＦＡ・Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ３２０ｍｇ（０．５２ミリモル）を添加した。１６時間後、溶液を２０ｍＬのＤＣＭで希釈し、０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾固した。濾過し、溶媒を蒸留した後、残渣をＭｅＯＨ／ジエチルエーテルで結晶化して、１５０ｍｇの淡黄色の固体を得た。
【０１５８】
例７２．ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＨＮ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ
例７１のＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ７５ｍｇ（０．１０５ミリモル）を有する１ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、１８．２ｍｇ（０．１５８ミリモル）のＮＨＳ及び１６μＬ（０．１０５ミリモル）のＤＩＰＣを添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩７１ｍｇ（０．１１ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、０．１５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、混合物を３０分間攪拌した。その後、６ｍＬのＥｔＯＨを攪拌しながら添加し、混合物を濾過した。固形物をＤＭＦ及びＥｔＯＨで洗浄し、その後、５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析を行った。凍結乾燥して、４５ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、１３％モル／モルであった。
【０１５９】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１２８ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１６０】
例７３．ＴＦＡ・Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ
３４８ｍｇ（１．００ミリモル）のＣＰＴを有する２０ｍＬのＤＣＭの懸濁液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６５３ｍｇ（１．５ミリモル）のＢｏｃ−ＨＮ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ、１５８ｍｇ（１．３ミリモル）のＤＭＡＰ及び３０９μＬ（２．０ミリモル）のＤＩＰＣを添加した。１６時間後、得た溶液を、０．１ＮのＨＣｌ溶液及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、蒸留乾固した。固形の残渣を、ＭｅＯＨ／ジエチルエーテルで結晶化して、４８０ｍｇの固体を得た。これを、ＴＦＡを有するＤＣＭの４０％の溶液５ｍＬに溶解し、室温で２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、少量のジエチルエーテルを用いた同時蒸留により、微量のＴＦＡを除去して、４９２ｍｇの固体の残渣を得た。
【０１６１】
例７４．ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ
例７３のＴＦＡ・Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ４９２ｍｇ（０．６３ミリモル）を有する１０ｍＬのＤＭＦの溶液に、窒素下、０℃で攪拌しながら、１０９ｍｇ（０．６３ミリモル）のモノｔｅｒｔ−ブチルコハク酸、８５ｍｇ（０．６３ミリモル）のＨＯＢｔ、２１６μＬ（１．２６ミリモル）のＤＩＥＡ及び１４６ｍｇ（０．７６ミリモル）のＥＤＣ塩酸塩を添加した。その後、一昼夜かけて反応混合物を室温とした。溶媒を真空下で除去し、残渣を、ＥｔＯＡｃ及び水で分画した。水相を、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせた有機相を、１０％のクエン酸、飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、蒸留乾固した。残渣を、ＴＦＡを有するＤＣＭの４０％溶液５ｍＬに溶解した。２時間後、真空下で溶媒を除去し、少量のジエチルエーテルを用いた同時蒸留により、微量のＴＦＡを除去して、４９０ｍｇの固体を得た。
【０１６２】
例７５．ＨＡ−６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＨＮ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ
例７４のＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−２０−Ｏ−ＣＰＴ４９０ｍｇ（０．６３ミリモル）を有する２０ｍＬのＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、１０８ｍｇ（０．９０ミリモル）のＮＨＳ、１５４μＬ（０．９０ミリモル）のＤＩＥＡ及び１３２ｍｇ（０．７０ミリモル）のＥＤＣ塩酸塩を添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３９０ｍｇ（０．６３ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、２ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。その後、攪拌しながら８０ｍＬのＥｔＯＨを添加し、混合物を濾過した。固形物をＤＭＦ及びＥｔＯＨで洗浄し、１５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。凍結乾燥して、１９４ｍｇの白色の固体を得た（プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳ  １３％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１６３】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇから出発して、２２２ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１６４】
例７６．ＣＰＴ−２０−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＨＮ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−６−ＨＮ−ＨＡ
２８０ｍｇ（１．０ミリモル）のＴＦＡ・Ｈ２Ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕを有する２０ｍＬのＤＭＦの溶液に、窒素下、０℃で攪拌しながら、例３４のＣＰＴヘミコハク酸４５０ｍｇ（１．０ミリモル）、１３５ｍｇ（１．０ミリモル）のＨＯＢｔ、３４２μＬ（２．０ミリモル）のＤＩＥＡ及び２３０ｍｇ（１．２ミリモル）のＥＤＣ塩酸塩を添加した。その後、一昼夜かけて反応混合物を室温とした。溶媒を真空下で除去し、残渣を、ＥｔＯＡｃ及び水で分画した。水相を、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わせた有機相を、１０％のクエン酸、飽和ＮａＨＣＯ３溶液及び塩水で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウム上で乾固し、濾過し、蒸留乾固した。残渣を、ＴＦＡを有するＤＣＭの４０％溶液８ｍＬに溶解した。２時間後、真空下で溶媒を除去し、少量のジエチルエーテルを用いた同時蒸留により、微量のＴＦＡを除去して、固形物を得た。２０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した固形物に、窒素下、室温で攪拌しながら、１７２ｍｇ（１．５ミリモル）のＮＨＳ、１７１μＬ（０．９０ミリモル）のＤＩＥＡ及び１５４μＬ（１．０ミリモル）のＤＩＰＣを添加した。１６時間後、例１９の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩６２０ｍｇ（０．６３ミリモル）を添加し、６時間攪拌を続けた。その後、２ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、混合物を３０分間攪拌した。その後、攪拌しながら１００ｍＬのＥｔＯＨを添加し、混合物を濾過した。固形物をＤＭＦ及びＥｔＯＨで洗浄し、２０ｍＬの水に溶解し、水に対して透析した。凍結乾燥して、４０６ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＣＰＴにおけるＤＳは、２０％モル／モルであった。
【０１６５】
また、例２６の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩３００ｍｇから出発して、２０５ｍｇの白色の固体を得た（アシル体におけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１６６】
例７７．抗増殖活性
ＤＤＳの抗増殖活性について、ＣＰＴに感受的な３つの癌腫（ＨＴ２９：結腸直腸癌腫、Ｈ４６０：肺癌腫、Ｈ４６０Ｍ２：肺転移性癌腫）で同定した。細胞を、９６穴プレートにおいて、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を添加した完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）中、５日間、３７℃、制御した雰囲気（５％ＣＯ２）下、イリノテカン並びに例３８、３９及び４１のＤＤＳ類を用いてインキュベートした；ＤＤＳについて、３〜３０ｎＭ及び０．１〜３０μＭの範囲で参照物と同モルで試験した。
【０１６７】
細胞障害性については、ＭＴＴのテトラゾリウム塩を、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより青色のホルマザンに変換する細胞の代謝能として細胞のバイアビリティーを測定する、ＭＴＴ法により、６日目（処理の５日後）に同定した；青色の色調を、分光光度計を用いて５７０ｎｍで読み取った。以下のＤＤＳ類について、検討した。
【０１６８】
【表１】
2009544749.tif 000003
【０１６９】
本発明のＤＤＳの種々の腫瘍細胞における抗腫瘍効果を、表Ａに示す；これらのＤＤＳの効果を、イリノテカンの効果と比較した。この参照物は、現在治療に用いられているＣＰＴのアナログである；ＣＰＴは、水溶液に不溶性であって、従って、治療に用いることができず、これらの理由により、適当な参照物ではない。
【０１７０】
表Ａは、種々の腫瘍細胞株の細胞増殖を、コントロールの成長の５０％にまで低減するのに必要なＤＤＳ及びイリノテカンの濃度（ＩＣ５０、μＭ）の値を示す。
表Ａ
【０１７１】
【表２】
2009544749.tif 000004
【０１７２】
これらのデータが示すように、本発明のＤＤＳは、非常に高い抗増殖活性を有する。最終的なＤＤＳの調製に用いられる中間化合物である６−ＮＨ２−ＨＡ及びＨＡ−６−ＮＨ−コハク酸もまた、同様の条件で検討したが、細胞障害性を有しなかった。
【０１７３】
例７８．ＨＡ−６−ＮＨ−ナプロキセン
９３ｍｇ（０．４０３ミリモル）のナプロキセン及び７０ｍｇ（０．６０４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する２ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６２μＬ（０．４０３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。３時間後、例１９のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を添加し、１６時間攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を０．１ＮのＮａＯＨ溶液１５ｍＬに溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１２８ｍｇの白色の固体を得た（プロトンＮＭＲによるナプロキセンにおけるＤＳ  ２０％モル／モル）。
【０１７４】
また、例２６のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１２５ｍｇの白色の固体を得た（ナプロキセンにおけるＤＳ  １３％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１７５】
例７９．ＨＡ−６−ＮＨ−リジノプリル
１７８ｍｇ（０．４０３ミリモル）のリジノプリル及び７０ｍｇ（０．６０４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する２ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６２μＬ（０．４０３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。３時間後、例１９のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を添加し、１６時間攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を０．１ＮのＮａＯＨ溶液１５ｍＬに溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１４０ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるリジノプリルにおけるＤＳは、１８％モル／モルであった。
【０１７６】
また、例２６のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１３６ｍｇの白色の固体を得た（リジノプリルにおけるＤＳ  １３％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１７７】
例８０．ＨＡ−６−ＮＨ−ナリジクス酸
９４ｍｇ（０．４０３ミリモル）のナリジクス酸及び７０ｍｇ（０．６０４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する２ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、６２μＬ（０．４０３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。３時間後、例１９のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を添加し、１６時間攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を０．１ＮのＮａＯＨ溶液１５ｍＬに溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１３２ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるナリジクス酸におけるＤＳは、１９％モル／モルであった。
【０１７８】
また、例２６のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１２７ｍｇの白色の固体を得た（ナリジクス酸におけるＤＳ  １２％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１７９】
例８１．ＨＡ−６−ＮＨ−ペニシリンＧ
１４４ｍｇ（０．４０３ミリモル）のペニシリンＧ及び７０ｍｇ（０．６０４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する２ｍＬのジメチルスルフォキシドの混合物に、窒素下、室温で攪拌しながら、６２μＬ（０．４０３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。３時間後、例１９のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を添加し、１６時間攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を０．１ＮのＮａＯＨ溶液１５ｍＬに溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１２６ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるペニシリンＧにおけるＤＳは、１６％モル／モルであった。
【０１８０】
また、例２６のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１１９ｍｇの白色の固体を得た（ペニシリンＧにおけるＤＳ  １１％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１８１】
例８２．ＨＡ−６−ＮＨ−セファゾリン
１９２ｍｇ（０．４０３ミリモル）のセファゾリンナトリウム塩及び７０ｍｇ（０．６０４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する２ｍＬのジメチルスルフォキシドの混合物に、窒素下、室温で攪拌しながら、６２μＬ（０．４０３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。３時間後、例１９のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２５０ｍｇ（０．４０３ミリモル）を添加し、１６時間攪拌を続けた。その後、１．０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を０．１ＮのＮａＯＨ溶液１５ｍＬに溶解した。１０分間攪拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌ溶液で中和し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１２９ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるセファゾリンにおけるＤＳは、１７％モル／モルであった。
【０１８２】
また、例２６のＨＡ−６−ＮＨ２のＴＢＡ塩２００ｍｇから出発して、１２１ｍｇの白色の固体を得た（セファゾリンにおけるＤＳ  １０％モル／モル（１Ｈ  ＮＭＲによる））。
【０１８３】
例８３．ＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｂｚ
１５２ｍｇ（０．３２３ミリモル）のＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＨ及び５６ｍｇ（０．４８４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する４ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、５０μＬ（０．３２３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇ（０．３２３ミリモル）を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、０．４０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１４５ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＣｂｚにおけるＤＳは、１３％モル／モルであった。
【０１８４】
例８４．ＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
例８３のＨＡ−６−ＨＮ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｂｚ１４０ｍｇ（０．３０４ミリモル）を、１００ｍｇ（１．６ミリモル）のギ酸アンモニウムを有する３ｍＬの水に溶解した。複数の真空／窒素サイクルにパージした後、溶液を、１０％のＰｄ／Ｃ（湿潤状態のもの）８０ｍｇに負荷し、その後、室温で１８時間攪拌した。１６ｍＬの水で希釈した後、混合物を遠心分離し、固形物を廃棄した。得た黒色の溶液を、セライトの短パットを通過させ、濃縮し、凍結乾燥して、１１３ｍｇの灰色がかった白色の固体を得、これを、ＴＢＡで活性化したＡｍｂｅｒｌｉｔｅを用いたイオン交換により、対応するＴＢＡ塩に変換した。プロトンＮＭＲによるＰｈｅ−Ｌｅｕ−ＧｌｙにおけるＤｓは、１３％モル／モルであった。
【０１８５】
例８５．ＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＭＴＸ−ＯＨ
１００ｍｇ（０．２２０ミリモル）のＭＴＸ及び３８ｍｇ（０．３３０ミリモル）のＮＨＳを有する５ｍＬの無水ＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、３５μＬ（０．２２０ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例８４のＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２のＴＢＡ塩１５０ｍｇ（０．２２６ミリモル）を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、０．５０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１１０ｍｇの黄色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＭＴＸにおけるＤＳは、１３％モル／モルであった。
【０１８６】
例８６．ＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｂｚ
１１４ｍｇ（０．３２３ミリモル）のＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＨ及び５６ｍｇ（０．４８４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミドを有する４ｍＬのジメチルスルフォキシドの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、５０μＬ（０．３２３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例２１の６−ＮＨ２−ＨＡのＴＢＡ塩２００ｍｇ（０．３２３ミリモル）を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、０．４０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら１５ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１３５ｍｇの白色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＰｈｅ−Ｇｌｙ−ＣｂｚにおけるＤＳは、１３％モル／モルであった。
【０１８７】
例８７：ＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
例８６のＨＡ−６−ＨＮ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｂｚ１３０ｍｇ（０．３０ミリモル）を、９５ｍｇ（１．５ミリモル）のギ酸アンモニウムを有する３ｍＬの水に溶解した。複数の真空／窒素サイクルにパージした後、溶液を、１０％のＰｄ／Ｃ（湿潤状態のもの）８０ｍｇに負荷し、その後、室温で１８時間攪拌した。１６ｍＬの水で希釈した後、混合物を遠心分離し、固形物を廃棄した。得た黒色の溶液を、セライトの短パットを通過させ、濃縮し、凍結乾燥して、１１５ｍｇの灰色がかった白色の固体を得、これを、ＴＢＡで活性化したＡｍｂｅｒｌｉｔｅを用いたイオン交換により、対応するＴＢＡ塩に変換した。プロトンＮＭＲによるＰｈｅ−ＧｌｙにおけるＤｓは、１３％モル／モルであった。
【０１８８】
例８８：ＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＭＴＸ−ＯＨ
１００ｍｇ（０．２２０ミリモル）のＭＴＸ及び３８ｍｇ（０．３３０ミリモル）のＮＨＳを有する５ｍＬの無水ＤＭＳＯの溶液に、窒素下、室温で攪拌しながら、３５μＬ（０．２２０ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドを添加した。１６時間後、例８７のＨＡ−６−ＮＨ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２のＴＢＡ塩１５０ｍｇ（０．２３１ミリモル）を添加し、５時間攪拌を続けた。その後、０．５０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、３０分間攪拌を続けた。混合物を、攪拌しながら２０ｍＬのＥｔＯＨに投入し、得たスラリーを１０分間攪拌し、その後、濾過し、ＥｔＯＨで洗浄した。固形物を１５ｍＬの水に溶解し、水に対して透析を行った。その後、溶液を、０．２２μｍの細孔径のメンブレンを用いて濾過し、凍結乾燥して、１０５ｍｇの黄色の固体を得た。プロトンＮＭＲによるＭＴＸにおけるＤＳは、１３％モル／モルであった。
【図１】
2009544749.tif 000005
【図２】
2009544749.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月2日(2008.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−アミノ−ヒアルロン酸誘導体及びひとつの治療剤を有する薬物送達システムであって、前記治療剤は、直接又はリンカーを介したアミド結合により、前記６−アミノ−ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ６位において、共有的に結合されていることを特徴とする薬物送達システム。
【請求項２】
前記治療剤は、少なくとも一つのカルボキシル基、又は少なくとも一つのアミノ基、又は少なくとも一つの水酸基を有することを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項３】
前記治療剤は、少なくとも一つのカルボキシル基を有し、
前記治療剤とヒアルロン酸とのアミド結合は、直接的であることを特徴とする請求項２に記載のＤＤＳ。
【請求項４】
前記治療剤は、少なくとも一つのアミノ基、又は少なくとも一つの水酸基を有し、
前記治療剤とヒアルロン酸とのアミド結合は、リンカーを介していることを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項５】
前記治療剤は、鎮痛剤、降圧剤、麻酔剤、利尿剤、気管支拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、コリン作動性剤、ＣＮＳ剤、エストロゲン、免疫刺激剤、免疫抑制剤、脂向性剤、抗不安剤、抗潰瘍剤、不整脈治療剤、抗狭心症剤、抗生剤、抗炎症剤、抗ウィルス剤、抗塞栓剤、血管拡張剤、解熱剤、抗うつ剤、抗精神病剤、抗腫瘍剤、粘液溶解剤、麻薬拮抗剤、ホルモン、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、乾癬治療剤、抗増殖剤及び抗生剤から選択されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項６】
前記治療剤は、抗炎症剤、抗生剤及び抗腫瘍剤から選択されることを特徴とする請求項５に記載のＤＤＳ。
【請求項７】
前記治療剤は、カンプトテシン、イブプロフェン、メトトレキサート、タキソール、セファゾリン、ナプロキセン、リジノプリル、ペニシリンＧ、ナリジクス酸、コレスタン又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項８】
前記リンカーは、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸に結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、及びペプチドに結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸から選択され、且つアミノ基又はチオール基で可能に置換されていることを特徴とする請求項１乃至２及び４乃至７のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項９】
前記リンカーは、コハク酸、アミノ酸に結合されたコハク酸、又はペプチドに結合されたコハク酸から選択されることを特徴とする請求項８に記載のＤＤＳ。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸の第２級水酸基は、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ２Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯＲであってｎが１〜４でありＲがＣ１〜Ｃ１０のアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３であるものからなる群から選択された基を形成するように、誘導体化されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項１１】
前記ヒアルロン酸のカルボキシル基は、フリーの酸の形態であり、又はアルカリ金属、アルカリ土類金属若しくは遷移金属で塩化されていることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項１２】
医薬組成物への請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳの使用。
【請求項１３】
医薬的に許容な賦形剤及び／又は希釈剤と混ぜ合わせた、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳを有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
注入可能な形態であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
６−アミノヒアルロン酸と−ＣＯＯＨを有する治療剤又はリンカーとのアミド結合を形成することを含み、
リンカーを用いる場合、治療剤とリンカーとを結合するステップ
をさらに有することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳの調製方法。
【請求項１６】
前記６−アミノヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位におけるＣ６位に存在する水酸基を、アミノ基に置換することにより、ヒアルロン酸から得られることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記置換は、前記Ｃ６位を適当な離脱基で活性化し、その後、濃アンモニア、又はアジ化ナトリウム及び還元剤で処理することにより、行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記離脱基は、スルホン酸塩、リン酸塩（トリフェニルリン酸塩）、シアン化物（ＣＮ−）、亜硝酸塩（ＮＯ２−）、ハロゲン、クロロ、硫酸塩、ハロゲン硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン亜硝酸塩、クロロサルファイトから選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃ６位を活性化するのに使用される剤は、アルキル−又はアリール−スルフォニルハライドであり、
前記の活性化は、有機塩基又は無機塩基の存在下で行われることを特徴とする請求項１７乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃ６位を活性化するのに使用される試薬は、メチルスルフォニルクロライド又はトルエン−ｐ−スルフォニル−クロライドであり、
前記有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月29日(2009.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ６位にＮＨ２基を有する６−アミノ−ヒアルロン酸誘導体及びひとつの治療剤を有する薬物送達システムであって、前記治療剤は、直接又はリンカーを介したアミド結合により、前記６−アミノ−ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＣ６位において、共有的に結合されていることを特徴とする薬物送達システム。
【請求項２】
前記治療剤は、少なくとも一つのカルボキシル基、又は少なくとも一つのアミノ基、又は少なくとも一つの水酸基を有することを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項３】
前記治療剤は、少なくとも一つのカルボキシル基を有し、
前記治療剤とヒアルロン酸とのアミド結合は、直接的であることを特徴とする請求項２に記載のＤＤＳ。
【請求項４】
前記治療剤は、少なくとも一つのアミノ基、又は少なくとも一つの水酸基を有し、
前記治療剤とヒアルロン酸とのアミド結合は、リンカーを介していることを特徴とする請求項１に記載のＤＤＳ。
【請求項５】
前記治療剤は、鎮痛剤、降圧剤、麻酔剤、利尿剤、気管支拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、コリン作動性剤、ＣＮＳ剤、エストロゲン、免疫刺激剤、免疫抑制剤、脂向性剤、抗不安剤、抗潰瘍剤、不整脈治療剤、抗狭心症剤、抗生剤、抗炎症剤、抗ウィルス剤、抗塞栓剤、血管拡張剤、解熱剤、抗うつ剤、抗精神病剤、抗腫瘍剤、粘液溶解剤、麻薬拮抗剤、ホルモン、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、乾癬治療剤、抗増殖剤及び抗生剤から選択されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項６】
前記治療剤は、抗炎症剤、抗生剤及び抗腫瘍剤から選択されることを特徴とする請求項５に記載のＤＤＳ。
【請求項７】
前記治療剤は、カンプトテシン、イブプロフェン、メトトレキサート、タキソール、セファゾリン、ナプロキセン、リジノプリル、ペニシリンＧ、ナリジクス酸、コレスタン又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項８】
前記リンカーは、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、アミノ酸、ペプチド、アミノ酸に結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸、及びペプチドに結合された、直鎖又は分岐の、脂肪族化合物、芳香族化合物、又は脂肪芳香族化合物であるＣ２〜Ｃ２０のジカルボン酸から選択され、且つアミノ基又はチオール基で可能に置換されていることを特徴とする請求項１乃至２及び４乃至７のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項９】
前記リンカーは、コハク酸、アミノ酸に結合されたコハク酸、又はペプチドに結合されたコハク酸から選択されることを特徴とする請求項８に記載のＤＤＳ。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸の第２級水酸基は、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ２Ｈ、−ＯＰＯ３Ｈ２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣＯＲであってｎが１〜４でありＲがＣ１〜Ｃ１０のアルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３であるものからなる群から選択された基を形成するように、誘導体化されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項１１】
前記ヒアルロン酸のカルボキシル基は、フリーの酸の形態であり、又はアルカリ金属、アルカリ土類金属若しくは遷移金属で塩化されていることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＤＤＳ。
【請求項１２】
医薬組成物への請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳの使用。
【請求項１３】
医薬的に許容な賦形剤及び／又は希釈剤と混ぜ合わせた、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳを有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
注入可能な形態であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
６−アミノヒアルロン酸と−ＣＯＯＨを有する治療剤又はリンカーとのアミド結合を形成することを含み、
リンカーを用いる場合、治療剤とリンカーとを結合するステップ
をさらに有することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤＤＳの調製方法。
【請求項１６】
前記６−アミノヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位におけるＣ６位に存在する水酸基を、アミノ基に置換することにより、ヒアルロン酸から得られることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記置換は、前記Ｃ６位を適当な離脱基で活性化し、その後、濃アンモニア、又はアジ化ナトリウム及び還元剤で処理することにより、行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記離脱基は、スルホン酸塩、リン酸塩（トリフェニルリン酸塩）、シアン化物（ＣＮ−）、亜硝酸塩（ＮＯ２−）、ハロゲン、クロロ、硫酸塩、ハロゲン硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン亜硝酸塩、クロロサルファイトから選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃ６位を活性化するのに使用される剤は、アルキル−又はアリール−スルフォニルハライドであり、
前記の活性化は、有機塩基又は無機塩基の存在下で行われることを特徴とする請求項１７乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃ６位を活性化するのに使用される試薬は、メチルスルフォニルクロライド又はトルエン−ｐ−スルフォニル−クロライドであり、
前記有機塩基は、ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
2009544749.tif 000012
2009544749.tif 000013
2009544749.tif 000014