(57)【要約】血液試料から内皮細胞を濃縮した後、その濃縮した内皮細胞に対して、その内皮細胞により発現した抗原を検出することができるイムノアッセイを行うことにより、血液試料中の内皮細胞を検出する。前記イムノアッセイは、血液１ミリリットル当たり３００個の内皮細胞から発現した抗原を検出することができる。前記方法は、成熟循環内皮細胞または循環内皮前駆細胞をアッセイするために使用することができる。本発明は、血液試料中の循環内皮細胞（ｍＣＥＣおよび／またはＣＥＰ）のレベルを定量化するのに十分な感度を有するイムノアッセイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中の内皮細胞をアッセイする方法であって、該血液試料から該内皮細胞を濃縮した後、該濃縮した内皮細胞に対して、該内皮細胞により発現した抗原を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、
該イムノアッセイが、血液１ミリリットル当たり３００個の内皮細胞から該抗原を検出することができることによってか、または１６０ピコグラムの抗原タンパク質から該抗原を検出することができることによって定義される感度を有し、
該イムノアッセイが、該血液試料中に存在する内皮細胞数に比例してシグナルを発生する、
方法。
【請求項２】
血液試料中の内皮細胞に対して内皮細胞抗原をアッセイする方法であって、該血液試料から該内皮細胞を濃縮した後、該濃縮した内皮細胞に対して、該内皮細胞により発現した抗原を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、
該イムノアッセイが、血液１ミリリットル当たり３００個の内皮細胞から該抗原を検出することができることによってか、または１６０ピコグラムの抗原タンパク質から該抗原を検出することができることによって定義された感度を有し、
該イムノアッセイが、該内皮細胞上の該抗原の量に比例してシグナルを発生する、
方法。
【請求項３】
前記イムノアッセイが、血液１ミリリットル当たり１５０個の内皮細胞から前記抗原を検出することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記イムノアッセイが、血液１ミリリットル当たり３０個の内皮細胞から前記抗原を検出することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記イムノアッセイが、４ピコグラムの抗原タンパク質から前記抗原を検出することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記イムノアッセイが、１ピコグラムの抗原タンパク質から前記抗原を検出することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記内皮細胞が、成熟循環内皮細胞および循環内皮前駆細胞からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記内皮細胞が成熟循環内皮細胞であり、前記抗原がＣＤ１４６およびｖＷＦからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記内皮細胞が循環内皮前駆細胞であり、前記抗原がＶＥＧＦＲ−２およびＣＤ１３３からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記イムノアッセイが検出に電気化学発光を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記イムノアッセイが、検出に化学発光、蛍光化学発光、蛍光偏光、および時間分解蛍光から選択される技法を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記イムノアッセイが無傷の内皮細胞に対して行われ、前記抗原の細胞外ドメインに選択的に結合する抗体を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記イムノアッセイ前に前記濃縮した内皮細胞を溶解する工程をさらに含み、該イムノアッセイが該細胞溶解産物に対して行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記イムノアッセイが前記抗原に対するポリクローナル抗体を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記イムノアッセイが前記抗原に対するモノクローナル抗体を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記内皮細胞に選択的に結合することができる免疫磁気ビーズに前記血液を接触させることにより、該内皮細胞が濃縮される、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
循環内皮細胞には、骨髄由来の循環内皮前駆細胞（ＣＥＰ）と成熟循環内皮細胞（ｍＣＥＣ）の２つの異なる群がある（非特許文献１；さらなる背景については、非特許文献２；非特許文献３を参照）。循環内皮細胞の測定は、血管新生阻害剤の生物活性の代理マーカーとしての機能を果たし、このような癌療法が有益となる患者を選択するのに使用される（非特許文献１）。例えば、高レベルのＶＥＧＦＲを発現するＣＥＰ患者は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）などのＶＥＧＦＲ阻害剤による治療に最適な候補者である。また、レベルの増大が病勢進行を示すため、ｍＣＥＣ測定は癌に有用である（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００２】
しかし、「現在のところ、これらの［血管新生阻害］剤の臨床試験は、生物学的効果を測定し、最も有益となる患者を予測する代理マーカーがないために実施できない状況である」とされている（非特許文献６）。したがって、抗血管新生療法が有益となる癌患者を予測する試験が必要とされている。
【０００３】
循環内皮細胞は、心臓血管系の医学分野で重要な予後因子である。低レベルのＣＥＰは、心血管事象の危険性が高いことを示している（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。心血管事象の危険性がある患者をより適切に予測する試験が必要とされている。心筋梗塞（ＭＩ）の疑いがある患者では、高レベルのＣＥＰが、最近ＭＩを発症したことを示す。したがって、患者が心筋梗塞を発症した疑いがある場合に、どの患者が心筋梗塞を発症したかを予測するより優れた試験が必要とされている。
【０００４】
既刊文献で使用されている、ＣＥＰおよびｍＣＥＣを定量化する手法は、「難事」であると記載されている（非特許文献３）フローサイトメトリー（非特許文献８）を使用することが多い。これは、自動化に容易に適用できない、厄介で時間のかかる手法である。フローサイトメトリーなどに関するその他の問題として、フローサイトメトリーでは背景染色が高い点がある。一般的に、フローサイトメトリーでは、分析した細胞の０．１〜０．５％で非特異性染色が見られるが、これは多すぎるため、わずか０．０００１％にもなり得る所望の循環内皮細胞群の検出や計数を遮断してしまうことになる（非特許文献３）。過度のデータ記憶容量も、フローサイトメトリーによるまれな事象の分析に関連する問題である（非特許文献３）。文献で使用されている別のＣＥＰ測定方法は、コロニー計数法によるものである（非特許文献７）。この方法は、フローサイトメトリーよりも時間を要し、実行に１週間を超える時間を要する（非特許文献７）。したがって、本発明の方法は、循環内皮細胞の迅速な評価を可能にし、かつフローサイトメトリーによるまれな事象の分析に固有の問題（背景問題、過度のデータ記憶容量）を回避するという点で、本分野における飛躍的な進歩である。
【０００５】
ＣＥＰおよびｍＣＥＣは、０．０１％〜０．０００１％と推定される血液中の単核細胞の微小画分を表す（非特許文献３）。これらの細胞は生体の血管新生活性や血管形成活性に関する洞察をもたらすことから、末梢血中のこれらの細胞を計数することが医学的に重要である。血管新生は腫瘍増殖に重要であることが明らかにされており、新規の抗血管新生療法（承認薬のベバシズマブなど）は腫瘍増殖を遅らせるまたは予防するのに使用されている。血管新生および血管形成はまた、鎌状赤血球病、血管炎および肺高血圧症をはじめとする癌以外のその他多くの疾患でも有害である（非特許文献３）。対照的に、冠動脈疾患では、血管形成または血管再生が心臓組織への血流を改善するのに望ましい。
【非特許文献１】Ｂｅａｕｄｒｙら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，１１：３５１４
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００５，３５３：１０５５−１０５７
【非特許文献３】Ｋｈａｎ  ＳＳ，２００４；Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ６４Ｂ：１−８
【非特許文献４】Ｍａｎｃｕｓｏ  Ｐら，２００１，Ｂｌｏｏｄ  ９７：３６５８−６１
【非特許文献５】Ｂｅｅｒｅｐｏｏｔ  ＬＶら，２００４，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５：１３９−４５
【非特許文献６】Ｄａｖｉｓ  ＤＷ，ら，２００３，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：８−１４
【非特許文献７】Ｈｉｌｌ  ＪＭら，２００３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：５９３−６００
【非特許文献８】Ｗｅｒｎｅｒ  Ｎ，ら，２００５，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３：９９９−１００７
【非特許文献９】Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｌｕｃｋｅ  Ｃら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５，１１１：２９８１−８７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、血液試料中の内皮細胞をアッセイする方法であって、血液試料から内皮細胞を濃縮した後、濃縮した内皮細胞に対して、血液試料１ｍＬ当たり３００個の内皮細胞により発現した抗原を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含む、方法を提供する。あるいは、前記アッセイは１６０ピコグラムの抗原タンパク質から抗原を検出することができる。
【０００７】
本発明は、血液試料中の内皮細胞上に存在する内皮細胞抗原をアッセイする方法であって、血液試料から内皮細胞を濃縮した後、濃縮した内皮細胞に対して、内皮細胞により発現した抗原を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、前記イムノアッセイが、血液１ミリリットル当たり３００個の内皮細胞から抗原を検出することができることによってか、または１６０ピコグラムの抗原タンパク質から抗原を検出することができることによって定義される感度を有し、前記イムノアッセイが内皮細胞上の抗原量（すなわち抗原数）に比例してシグナルを発生する、方法を提供する。
【０００８】
本発明は、血液試料中の循環内皮細胞（ｍＣＥＣおよび／またはＣＥＰ）のレベルを定量化するのに十分な感度を有するイムノアッセイを提供する。前記イムノアッセイは、種々の疾患（例えば、癌、鎌状赤血球病、血管炎、糖尿病、肺高血圧症および心血管疾患）の危険性が高い患者を特定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本明細書で使用される、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という移行語はオープンエンドな語である。本用語を使用する請求項は、当該請求項に列挙される要素に加えて、他の要素も含むことができる。したがって、例えば、本特許請求の範囲では、列挙される要素またはその等価物が存在する限り、特許請求の範囲で具体的に列挙されない他の手順も含む方法が記載されている。
【００１０】
本明細書で使用される、試料から所与の種類の細胞を「濃縮する」こととは、前記試料中の他の種類の細胞からこのような細胞を精製または部分精製することを意味する。
略語：
ｍＣＥＣ：成熟循環内皮細胞
ＣＥＰ：循環内皮前駆細胞
ＥＣＬ：電気化学発光
ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯静脈内皮細胞
ＭＩ：心筋梗塞
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子
ＶＥＧＦＲ２：血管内皮増殖因子受容体２型
ＣＥＰは以下のマーカーの存在により区別することができる（Ｋｈａｎら，２００４；Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ，２００５，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３：１０５５−７）。
・ＣＤ１３３（ｍＣＥＣに存在しない）
・ＶＥＧＦＲ−２（血管細胞接着分子１；ＫＤＲとも呼ばれる）
・ＣＤ３４
・ＣＤ４５の欠失およびＣＤ３の欠失
ｍＣＥＣは以下のマーカーの存在により区別することができる。
・ＣＤ１４６（ＣＥＰに存在しない）
・フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）
・ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１とも呼ばれる：血小板内皮細胞接着分子１）
・ＣＤ４５の欠失およびＣＤ３の欠失（これは活性化Ｔ細胞がＣＤ１４６を発現できるため重要である；Ｋｈａｎら，２００４）。
【００１１】
本発明は血液試料中の循環内皮細胞（ｍＣＥＣおよび／またはＣＥＰ）のレベルを定量化するのに十分な感度を有するイムノアッセイを提供する。前記イムノアッセイは、種々の疾患（例えば、癌、鎌状赤血球疾患、血管炎、糖尿病、肺高血圧症および心血管疾患）の危険性が高い患者を特定する方法を提供する。予防策を講じるには、本発明で提供される、血液試料を試験してこのような患者を特定するための便利で、感度がきわめて高く、迅速な方法がきわめて望ましい。電気化学発光（ＥＣＬ）検出の使用は、これを達成するのに好ましい方法である。
【００１２】
本発明は、血液から循環内皮細胞を単離するのに使用する方法の高い特異性と、ＥＣＬなどの特定の免疫学的アッセイの高感度とを組み合わせることに基づく。循環内皮細胞は最初に免疫磁気ビーズを使用して濃縮される。
【００１３】
本発明の検出方法の一実施形態において、免疫学的アッセイは、血液１ミリリットル当たり３００個、より好ましくは１５０個、より好ましくは１００個、より好ましくは３０個、最も好ましくは１０個の内皮細胞から抗原を検出することができるようなものである。
【００１４】
以下は、内皮細胞を濃縮する方法の好ましい実施形態である。
【００１５】
患者から血液試料（通常約８〜２０ｍＬ）を採取する。
１．赤血球の除去。
２．正常な白血球をさらに枯渇させる任意の陰性選択。好ましい実施形態はこの手順を含む。
３．循環内皮細胞（ｍＣＥＣまたはＣＥＰ）の陽性選択。
４．循環ｍＣＥＣまたはＣＥＰに由来する１つ以上の抗原に対するイムノアッセイを使用したｍＣＥＣまたはＣＥＰの検出および定量化
１．赤血球の除去。
【００１６】
赤血球を除去するためには、密度に基づく分離（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブへの直接の血液採取の後、遠心分離）のほか、ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ  ＲＢＣ溶解バッファー（Ｇｅｎｔｒａ、米国ミネソタ州ミネアポリス）、ＦＡＣＳ溶解液（ＢＤＩＳ）、ＩＭＭＵＮＯＬＹＳＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＯＰＴＩＬＹＳＥ  Ｂ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、およびＡＣＫ溶解バッファー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、米国メリーランド州ロックビル）などの市販の溶解バッファーを使用した分離を含むがこれらに限定されない種々の方法が利用可能である。
【００１７】
好ましい方法では、抗凝固剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸塩）を有するＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブが使用される。これらのチューブは、適切な遠心分離（１，１００ｘｇで１０分間、スウィングアウトバケットローター）時に赤血球や好中球の除去を可能にする原料を含む。遠心分離後に、チューブの底部には赤血球や好中球の細胞ペレットができる。この細胞ペレットの上にはゲルバリアであり、さらにこのゲルバリアの上には、血漿底部の帯状部として腫瘍細胞、リンパ球および単球がある。その後、これらの腫瘍細胞、リンパ球および単球は、ゲルバリアの上の最上部から容易に採取することができる。本方法は、赤血球だけでなく好中球も除去することから好ましい方法である。
２．正常な白血球をさらに枯渇させるための陰性選択。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態は、内皮細胞の単離に陰性選択手順を使用する。陰性選択とは、不要な細胞を選択的に除去することである。陰性選択により、白血球、特にリンパ球および単球をさらに枯渇させることができる。１つの手法として、ＣＤ４５および／またはＣＤ３などの１つ以上の白血球抗原に対する抗体が付着した磁気ビーズを使用する手法がある。好ましい実施形態においては、白血球に対する複数の抗体が使用される。これらの磁気ビーズを血液試料に添加し、これらの磁気ビーズを磁石で取り除くことにより、白血球由来の試料がさらに枯渇され、内皮細胞が濃縮される。陰性選択の別の手法には、白血球抗原、特に一般的な白血球抗原であるＣＤ４５、ならびにグリコフォリンＡなどの赤血球抗原の両方に対して二重特異性を有する抗体の使用が含まれる。血液採取前に、１つ以上のこれらの二重特異性抗体をＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブに添加する。好ましい実施形態においては、複数の白血球関連ＣＤ分子に対する二重特異性抗体のカクテルが使用される。血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブに導入すると、二重特異性抗体は、それぞれが白血球と多くの赤血球とからなる免疫ロゼットを形成する。これらの免疫ロゼットは、赤血球の密度とほぼ同じ密度を有しており、遠心分離時に赤血球ペレット中に存在し、それによって細胞ペレットやゲルバリアの上にある腫瘍細胞画分から白血球をさらに除去する。血漿中に腫瘍細胞を有する画分は、さらなる処理のために採取される。
３．循環内皮細胞（ｍＣＥＣまたはＣＥＰ）の陽性選択。
【００１９】
循環内皮細胞を単離する好ましい方法では、免疫磁気ビーズが使用される。循環細胞を単離する他の方法には、濾過が含まれる（Ｖｏｎａ  Ｇら，２０００，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０００  １５６：５７−６３）。好ましい実施形態において、免疫磁気ビーズは、内皮細胞の表面に選択的に認められる抗原に対する抗体を有する。例としては、ａ）ＣＥＰの場合：ＣＤ１３３、ＶＥＧＦＲ−２およびＣＤ３４；ｂ）ｍＣＥＣの場合：ＣＤ１４６、ｖＷＦおよびＣＤ３１が含まれるが、これらに限定されない。これらの抗原の１つに対する抗体を有する免疫磁気ビーズが使用される。免疫磁気ビーズは種々のサイズ（５０ミクロン〜２００ｎｍ未満）となる場合があり、これらのビーズにはＤＹＮＡＬビーズ（１．５ミクロン超〜約５０ミクロン）が含まれる。本発明の一実施形態においては、上述の抗体の一つを有する、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）陰性選択カクテルおよびＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）磁性ナノ粒子（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、前の手順で得た内皮細胞を有する画分に添加する。次いで、磁石を使用して残りの原料から内皮を濃縮または単離し、これらの内皮細胞を水溶液で洗浄する。
４．循環ｍＣＥＣｓまたはＣＥＰに由来する１つ以上の抗原に対するイムノアッセイを使用した、ｍＣＥＣまたはＣＥＰの検出および定量化。
【００２０】
好ましい実施形態において、これらの単離または濃縮されたｍＣＥＣｓまたはＣＥＰはアッセイの前に溶解され、先に使用した磁気ビーズが磁石により除去される。溶解には、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ［Ｍ−ＰＥＲ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製品番号７８５０１、米国イリノイ州ロックフォールド）］、およびＳｉｇｍａ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ［Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（登録商標）−Ｍ（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ  ２９７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州セントルイス  ６３１０３）］を含むがこれらに特定されない、市販の細胞溶解試薬を使用することができる。溶解後に、測定するｍＣＥＣまたはＣＥＰ抗原とともに溶解産物の上清を残したまま遠心分離することによって細胞残骸が除去される。
【００２１】
次いで、アッセイ中の抗原に結合する抗体を使用した高感度サンドイッチイムノアッセイを使用することにより、ｍＣＥＣまたはＣＥＰに特異的な抗原の検出を行うことができる。好ましくは少なくとも１つのポリクローナル抗体、最も好ましくは２つのポリクローナル抗体をはじめとする種々の抗体をイムノアッセイに使用することができる。本発明の好ましい実施形態においては、１つの抗体がビオチンと結合した後、ＥＲに対する２つ目の抗体が検出分子で標識される。電気化学発光（ＥＣＬ）を使用したより好ましい実施形態において、前記検出分子はルテニウムである。ルテニウムを抗体に結合させるのに十分有用な方法を提供する公知の文献は豊富に存在する（例えば、Ｌｅｅら，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ２００１，６５：１−９）。次いで、溶解産物の上清を２つの抗体と混合し、短時間インキュベートした後、トリプロピルアミンを含有する溶液中で、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを添加する。電位を印加し、標的抗原（ＥＲ）が存在する状況下で、ルテニウム標識が励起され、ＥＣＬ検知器（ＯＲＩＧＥＮ分析器、あるいはＢＩＯＶＥＲＩＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）のＭ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４のような市販の機器など）を使用して光が発光され、検出される。ＥＣＬシグナルは、最初の血液試料中のｍＣＥＣおよびＣＥＰの数に比例する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に基づいて使用されるイムノアッセイは、以下の組み合わせの１つを使用することができる。
１．内皮抗原に対する２組のポリクローナル抗体（最も好ましい実施形態）。
２．内皮抗原に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体。
３．内皮抗原に対する２つのモノクローナル抗体。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、内皮細胞の濃縮または単離に使用される抗原標的は、サンドイッチイムノアッセイの抗原標的と異なる。これらの２つの抗原標的は抗原対を形成し、これらの抗原対の例には以下が含まれる。
【００２４】
【化１−１】
2009534666.tif 000002
【００２５】
【化１−２】
2009534666.tif 000003
例えば、ｍＣＥＣを検出するための好ましい実施形態は、濃縮または単離のためにｖＷＦに対する抗体を有するビーズを使用した後、サンドイッチイムノアッセイによる検出のためにＣＤ１４６に対する１対の抗体を使用する方法である。ＣＥＰを検出するための好ましい実施形態は、濃縮または単離のためにＣＤ１３３に対する抗体を有するビーズを使用した後、サンドイッチイムノアッセイによる検出のためにＶＥＧＦＲ−２に対する１対の抗体を使用する方法である。ＣＥＰを検出するための別の好ましい実施形態は、濃縮または単離のためにＣＤ３４に対する抗体を有するビーズを使用した後、サンドイッチイムノアッセイによる検出のためにＶＥＧＦＲ−２に対する１対の抗体を使用する方法である。
【００２６】
本発明のイムノアッセイは、これまでに開発された内皮細胞抗原のいずれのイムノアッセイよりも高速であり、有意に高い感度を有する。本発明のイムノアッセイは、血液１ｍＬ当たり３００個の循環ｍＣＥＣｓまたはＣＥＰ、より好ましくは血液１ｍＬ当たり１５０個の循環ｍＣＥＣまたはＣＥＰ、より好ましくは血液１ｍＬ当たり１００個の循環ｍＣＥＣまたはＣＥＰ、より好ましくは血液１ｍＬ当たり３０個の循環ｍＣＥＣまたはＣＥＰ、最も好ましくは血液１ｍＬ当たり１０個のｍＣＥＣまたはＣＥＰから抗原を検出することができる。本発明の実施形態において、前記アッセイは、４ピコグラムの抗原性タンパク質から抗原を検出することができ、より好ましくは、前記アッセイは１ピコグラムの抗原性タンパク質から抗原を検出することができる。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、本発明のイムノアッセイは、血液試料中の内皮細胞をアッセイする方法であって、血液試料から内皮細胞を濃縮した後、濃縮した内皮細胞に対して、内皮細胞により発現したＶＥＧＦＲ２を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、前記イムノアッセイが３００個のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から、より好ましくは１５０個のＨＵＶＥＣから、より好ましくは１００個のＨＵＶＥＣから、より好ましくは３０個のＨＵＶＥＣから、最も好ましくは１０個のＨＵＶＥＣからＶＥＧＦＲ２を検出することができる、方法からなる。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、本発明のイムノアッセイは、血液試料中の内皮細胞をアッセイする方法であって、血液試料から内皮細胞を濃縮した後、濃縮した内皮細胞に対して、内皮細胞により発現したＶＥＧＦＲ２を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、前記イムノアッセイが４ピコグラムのＶＥＧＦＲ２を、より好ましくは１ピコグラムのＶＥＧＦＲ２を、より好ましくは０．３ピコグラムのＶＥＧＦＲ２を、最も好ましくは０．１ピコグラム以上のＶＥＧＦＲ２を検出することができる、方法からなる。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、本発明のイムノアッセイは、血液試料中の内皮細胞に対して内皮細胞抗原をアッセイする方法であって、血液試料から内皮細胞を濃縮した後、濃縮した内皮細胞に対して、内皮細胞により発現した抗原を検出することができるイムノアッセイを行う工程を含み、前記イムノアッセイが血液１ミリリットル当たり３００個の内皮細胞から、より好ましくは血液１ミリリットル当たり１５０個の内皮細胞から、より好ましくは血液１ミリリットル当たり１００個の内皮細胞から、より好ましくは血液１ミリリットル当たり３０個の内皮細胞から、最も好ましくは血液１ミリリットル当たり１０個の内皮細胞から抗原を検出することができる、方法からなる。
【００３０】
電気化学発光の他に、本出願に必要となる高感度をもたらすことができる他のイムノアッセイには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
ａ）Ｌｉｕ  Ｙら，２００３（Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ６６：５１２−７）に記載のような化学発光。
ｂ）Ｙｕ  Ｈら，２０００（Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  １４：８２９−４０）に記載のような蛍光化学発光（ＦＣＬ）
ｃ）蛍光偏光イムノアッセイ（Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ，１９８８  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １１２：７７５−９を参照）。
ｄ）時間分解蛍光イムノアッセイ（Ｂｕｔｃｈｅｒ  Ｈら，２００３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７２：２４７−５６；Ｓｏｕｋｋａら，２００１，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７：１２６９−７８；Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ，１９８８  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １１２：７７５−９）。
【００３１】
この感度により、本発明に基づく方法は、疾患（癌、鎌状赤血球疾患、血管炎、肺高血圧症、糖尿病および心血管疾患を含むがこれらに限定されない）の増大の危険性がある患者、ならびにこのような疾患または疾患の悪化を予防する予防策が有益となる可能性がある患者を特定する。
【００３２】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるが、以下の実施例は本明細書に記載の本発明を例示するものであり、制限するものではない。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
患者が来院したら、凝固を予防するために血液試料をチューブに採取する。ｍＣＥＣを単離した後、溶解バッファーを使用して溶解する。ｍＣＥＣおよびビオチン化抗体に対する（ｍＣＥＣ由来抗原にも対する）抗原に対するルテニウム標識抗体を、トリプロピルアミン溶液およびアビジンが付着した磁気ビーズとともに添加する。電流を印加し、市販品（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）などのＥＣＬ検出装置を使用して、電気化学発光（ＥＣＬ）を検出する。シグナルは、循環血液中に存在する１ｍＬ当たりのｍＣＥＣ量に比例する。
【００３４】
（実施例２）
方法は実施例１と同じであるが、ｍＣＥＣは、ｖＷＦに対する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して単離または濃縮する。Ｓｉｇｍａ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ［Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（登録商標）−Ｍ（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ  ２９７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州セントルイス６３１０３）］を使用して、これらの細胞を溶解する。細胞残骸を除去する前に５分間激しくボルテックシングして、製造元の推奨通りに細胞溶解を行う。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（モデル５４１５Ｃ）で３０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離を行うことにより、細胞溶解産物から細胞残骸を除去する。磁性粒子をさらに枯渇させるために磁石を使用する。ＣＤ−１４６に対するルテニウム標識抗体およびＣＤ−１４６に対するビオチン化抗体を溶解産物に添加した後、磁性ストレプトアビジンビーズおよびトリプロピルアミン含有溶液に添加する。電流を印加し、市販品（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などのＥＣＬ検出装置を使用して、電気化学発光（ＥＣＬ）を検出する。このシグナルはｍＣＥＣ量に比例しており、ｍＣＥＣ数は、このシグナルを陽性対照試料のシグナルと比較することにより予測することができる。
【００３５】
（実施例３）
方法は実施例２と同じであるが、ＣＥＰ数が測定され、ＣＥＰの単離または濃縮に使用される磁気ビーズは、ｖＷＦではなくＣＤ１３３に対する抗体でコーティングされ、サンドイッチＥＣＬイムノアッセイは、ＣＤ−１４６ではなくＶＥＧＦＲ−２に対する抗体を使用する。
【００３６】
（実施例４）
以下のアッセイバッファーを精製する：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の０．５％のＴｗｅｅｎ−２０および０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
【００３７】
まず、ＣＤ１４６に対する抗体をビオチン化および非ビオチン化の両方の形態で得る。抗体のビオチン化は当該技術分野で周知であり、溶液中または固相中で行うことができる（Ｓｔｒａｃｈａｎ  Ｅら，２００４，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １７：２６８−７６）。ルテニウム標識（「ＴＡＧ標識」）は以下の通りに行う。
・ＤＭＳＯ中で、ルテニウム標識（ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳエステル、カタログ番号１１００３４；ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）１．５μｇ／μＬを精製する。
・抗体５００μＬの場合はＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを１８．８μＬ添加し、ポリクローナル抗体２００μＬの場合はＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを３．８μＬ添加する。いずれの場合も、溶液を１時間インキュベートし、２Ｍのグリシン２０μＬを添加することにより反応を停止する。
・ＰＢＳ（０．０８％のアジ化ナトリウムを含有）（溶出にも使用する）で事前に平衡化したＰＤ−１０ゲル濾過カラムを使用して、各反応混合物中の非結合ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳエステルを除去する。各標識抗体について、各画分中のタンパク質濃度をタンパク質アッセイにより測定し、タンパク質含有量の多い画分を次の実施例で使用する。
【００３８】
ＣＤ１４６に対するルテニウム標識抗体およびＣＤ１４６に対するビオチン化抗体は、本実施例において以後「ＴＡＧ−ｐＡｂ」および「ビオチン−ｐＡｂ」と呼ぶ。
【００３９】
内皮細胞［Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ニュージャージー州イーストラザフォード０７０７３）のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、カタログ番号ＣＣ−２５１７）］を、製造元の推奨条件通りに６ウェルの組織培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計を使用してアリコートを計数する。Ｓｉｇｍａ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ［Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（登録商標）−Ｍ（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ  ２９７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州セントルイス６３１０３）］を使用して、これらの細胞を溶解する。細胞残骸を除去する前に５分間激しくボルテックシングして、製造元の推奨通りに細胞溶解を行う。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（モデル５４１５Ｃ）で３０分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離を行うことにより、細胞溶解産物から細胞残骸を除去する。
【００４０】
以下の通りに電気化学発光アッセイを行う。
・各ウェルに連続して細胞溶解産物の上清を添加し（１ウェル当たりの溶解産物量は、３０〜１００個のいずれかの数の内皮細胞の抽出物であるかによって異なり、抽出されていない対照ウェルも使用する）、次いで、ＴＡＧ−Ａｂとビオチン−Ａｂの混合物５０μＬ／ウェル（例えば、それぞれ０．５〜２μｇ／ｍＬの濃度；ＰＢＳアッセイバッファーに希釈）を、９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートのウェルに添加し、絶えず振盪させながら室温にてインキュベートする（例えば、２時間）。
・１０μｇ磁性ストレプトアビジンビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、カタログ番号１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を含む２５μＬを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートする（例えば、３０分間）。
・ＰＢＳアッセイバッファーを各ウェルに添加し、１ウェル当たり２５０μＬの最終量を作製する。少なくとも複数のウェルですべての条件を試験する。次いで、Ｍ８  Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（カタログ番号３１０８００、ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、９６ウェルプレートを電気化学発光のために分析する。
【００４１】
本イムノアッセイを使用する場合、ＥＣＬシグナルはＨＵＶＥＣ細胞の数に比例し、ＣＤ１４６は検出可能であり、少なくとも１ウェル当たり１００個のＨＵＶＥＣ細胞のベースラインを上回る。
【００４２】
（実施例５）
本実施例では、電気化学発光によるサンドイッチイムノアッセイを使用して組換えＶＥＧＦＲ２を検出する感度を検査した。
【００４３】
以下のＰＢＳアッセイバッファーを精製した：
・アッセイバッファー：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）中の０．５％の  Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
【００４４】
以下の標準希釈液を精製した：
・標準希釈液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）中の１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
【００４５】
まず、ビオチン化（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＢＡＦ３５７）および非ビオチン化（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＡＦ３５７）の両方の形態で、抗ＶＥＧＦＲ２ポリクローナル抗体を得た。非ビオチン化ポリクローナル抗体は、Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（ＰＣＴ国際特許公開第２００６／０４１９５９  Ａ２号）の方法に基づきルテニウム標識（「ＴＡＧ標識」）されている。ルテニウム標識ポリクローナル抗体およびビオチン化ポリクローナル抗体は、本実施例において以後「ＴＡＧ−ｐＡｂ」および「ビオチン−ｐＡｂ」と呼ぶ。
【００４６】
ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃタンパク質（リンカー基を介してヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合される細胞外ドメインからなるキメラタンパク質；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３５７−ＫＤ）の形態で、組換えＶＥＧＦＲ２タンパク質を得た。
【００４７】
以下の通りに電気化学発光アッセイを行った。
・標準物質をＰＢＳ  １ｍＬ（０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のアジ化ナトリウムによりｐＨ７．２）中で希釈し、原液５０μｇ／ｍＬを形成した。
・標準物質を標準希釈液中で希釈し、１ウェル当たり２５μＬを使用した場合、１６００、１６０、１６および４ｐｇ／ウェルを産生した。９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレート（１ウェル当たり標準物質２５μＬを有する）の各ウェルに、ＴＡＧ−Ａｂとビオチン−Ａｂの混合物５０μＬ／ウェル（例えば、添加前は５０μＬ中１．０μｇ／ｍＬの濃度）を添加し、得られた溶液を絶えず振盪させながら室温にてインキュベートした（２時間）。
・１０μｇの磁性ストレプトアビジンビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、カタログ番号１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を含む２５μＬを各ウェルに添加し、絶えず振盪させながらインキュベートした（３０分間）。
・ＰＢＳアッセイバッファーを各ウェルに添加し、１ウェル当たり２５０μＬの最終量を作製した。少なくとも複数のウェルですべての条件を試験した。次いで、Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、９６ウェルプレートを電気化学発光のために分析した。
【００４８】
本イムノアッセイを使用すると、バックグラウンドを上回るシグナルによって、１ウェル当たりわずか４ｐｇのＶＥＧＦＲ２標準物質を検出することができた（表１）。
【００４９】
表１．ルテニウム標識ポリクローナル抗体（ＴＡＧ−ｐＡｂ）およびビオチン化ポリクローナル抗体（ビオチン−ｐＡｂ）を使用したイムノアッセイによる組換えＶＥＧＦＲ２の電気化学発光（ＥＣＬ）検出
【００５０】
【表１】
2009534666.tif 000004
＊抗原のない対照ウェルの平均シグナルを上回る平均ＥＣＬシグナル。
【００５１】
（実施例６）
本実施例では、組換えＥＧＦＲを検出する感度の測定を繰り返しながら、内皮細胞と非内皮細胞からＶＥＧＦＲ２を検出するためのＶＥＧＦＲ２に対するＥＣＬイムノアッセイの特異性を測定した。方法は実施例５で使用する方法と同じであったが、（１）低量のＶＥＧＦＲ２標準物質の試験を行い、また（２）ＨＵＶＥＣ細胞（ＶＥＧＦＲ２発現の陽性対照細胞）とＫ５６２ヒト白血病（ＶＥＧＦＲ２の陰性対照）からの細胞抽出物の追加分析を行った。
【００５２】
ＨＵＶＥＣ［Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ニュージャージー州イーストラザフォード０７０７３）のカタログ番号ＣＣ−２５１７］を、製造元の推奨条件通りに（ＶＥＧＦを含まない）組織培養で増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計を使用してアリコートを計数した。Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス）を、ＡＴＣＣの推奨条件通りに組織培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計を使用してアリコートを計数した。Ｐｉｅｒｃｅプロテアーゼ阻害剤［カタログ番号７８４１０、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］を有するＰｉｅｒｃｅ  ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ［カタログ番号８９９００、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国イリノイ州ロックフォード］を使用して、製造元の推奨条件通りにＨＵＶＥＣおよびＫ５６２細胞の溶解、および上清の採取を行った。１ウェル当たりの溶解産物の上清量は、３００個、６２５個、２５００個および１０，０００個のいずれかの数の細胞からの抽出物であるかによって異なり、実施例５に記載のイムノアッセイを使用してＶＥＧＦＲ２分析を行った。
【００５３】
ＶＥＧＦＲ２標準物質を使用すると、バックグラウンドを上回るシグナルによって、１ウェル当たりわずか１ｐｇのＥＧＦＲ標準物質を検出することができる（表２）。
【００５４】
表２．ルテニウム標識ポリクローナル抗体（ＴＡＧ−ｐＡｂ）およびビオチン化ポリクローナル抗体（ビオチン−ｐＡｂ）を使用したイムノアッセイによる組換えＶＥＧＦＲ２の電気化学発光（ＥＣＬ）検出。
【００５５】
【表２】
2009534666.tif 000005
＊抗原のない対照ウェルの平均シグナルを上回る平均ＥＣＬシグナル
細胞溶解産物を使用して、本実験の結果を図１および２に示す。図１は、本アッセイのＶＥＧＦＲ２検出能力を最もよく表したデータセットの下端を細胞数の少ないものからグラフで示している。図１は、１ウェル当たり２５００個の細胞までの細胞範囲のデータのみを含んでいる。図２は、全データセット（１ウェル当たり１０，０００個までの細胞）をグラフで示している。
【００５６】
ＶＥＧＦＲ２は検出することができ、本実験における最低量のＨＵＶＥＣ溶解産物を使用したウェル（１ウェル当たり３００個の細胞を添加した溶解産物；図１）を含め、本実験におけるＨＵＶＥＣ細胞の溶解産物のベースラインを上回った。さらに、ＨＵＶＥＣ細胞の溶解産物（ＶＥＧＦＲ２発現の内皮細胞陽性対照）は、１ウェル当たり３００〜１０，０００個の細胞の全試験範囲において、Ｋ５６２細胞の溶解産物（ＶＥＧＦＲ２発現のための陰性対照）よりもＶＥＧＦＲ２のイムノアッセイではるかに多いシグナルを発し、すべてのＫ５６２細胞の溶解産物は陰性であり、ＶＥＧＦＲ２検出結果の高い感度と特異性を示した（図１および図２）。
【００５７】
（実施例７）
本実施例では、ＨＵＶＥＣ内皮細胞からＶＥＧＦＲ２を検出するためのＶＥＧＦＲ２に対するＥＣＬイムノアッセイの感度をさらに検査した。方法は実施例６で使用した方法と同じであったが、より少ない量のＨＵＶＥＣ細胞の細胞抽出物（ＶＥＧＦＲ２発現の陽性対照細胞）を試験した。
【００５８】
ＨＵＶＥＣ内皮細胞の溶解産物を使用すると、バックグラウンドを上回るシグナルによって、１ウェル当たりわずか１５０個のＨＵＶＥＣ細胞の溶解産物を検出することができた（表３）。
【００５９】
表３．ルテニウム標識ポリクローナル抗体（ＴＡＧ−ｐＡｂ）およびビオチン化ポリクローナル抗体（ビオチン−ｐＡｂ）を使用したイムノアッセイによるＨＵＶＥＣ溶解産物のＶＥＧＦＲ２の電気化学発光（ＥＣＬ）検出
【００６０】
【表３】
2009534666.tif 000006
＊抗原のない対照ウェルの平均シグナルを上回る平均ＥＣＬシグナル
（実施例８）
本実施例では、少数のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）について、ＶＥＧＦＲ２に対するイムノアッセイのＥＣＬシグナルを測定した。細胞溶解産物の試験方法は、ヒトＰＢＭＣの溶解産物を使用した点を除いて実施例６と同じ方法を使用した。ヒトＰＢＭＣはＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ（米国オハイオ州クリーブランド；製品番号ＣＴＬ−ＵＰ１）から入手した。実施例７に記載の通りに、ＶＥＧＦＲ２のＥＣＬイムノアッセイで、１５６個、３１３個、６２５個、１２５０個および１５００個のＰＭＢＣの溶解産物を試験した。
【００６１】
結果は図３に示しており、比較のため、ＨＵＶＥＣを使用した実施例６のデータもこのグラフに含まれている。試験したＰＢＭＣの全範囲で、シグナルは少ないかまたはバックグラウンドレベルであった。これらの結果は、試験した最大量（２５００個）のＰＢＭＣでは内皮細胞が認められないと予想される事実と一致していた。背景技術の項目に記載した通り、ＣＥＰおよびｍＣＥＣは、、０．０１％〜０．０００１％と推定される血液中の単核細胞の微小画分を表す（Ｋｈａｎ  ＳＳら，２００４）。本実験の結果から、内皮細胞の濃縮群において少数の汚染ＰＢＭＣが存在しても、このような濃縮した内皮細胞群の内皮細胞抗原の測定を妨げるようなシグナルをこれらの汚染ＰＢＭＣが発生させることはないことが示されている。
【００６２】
（実施例９）
本実施例では、濃縮効果を測定した。本実施例では、免疫磁気ビーズを使用して、ＣＤ３４＋細胞の造血細胞試料の濃縮後の細胞からＶＥＧＦＲ２を検出する能力を２回試験した。前述の通り、ＥＰＣは、ＣＤ３４＋およびＶＥＧＦＲ２の両方を発現する。したがって、ＣＤ３４＋の濃縮によって、ＶＥＧＦＲ２発現細胞が濃縮されることが予想される。Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（現在ではＣＤ３４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｋｉｔと呼ばれる）をＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州オーバーン）から入手し、製造元の指示通りに使用した。このキットには、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ３４抗体であるＱＢＥＮＤ／１０に接合するＭｉｃｒｏＢｅａｄが含まれる。ＣＤ３４単離のための開始細胞として、ヒト臍帯血の培養物（Ｃａｍｂｒｅｘ（米国ニュージャージー州イーストラザフォード）、カタログ番号２Ｃ−１０１Ａ）を使用し、以下の増殖因子（すべてＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（米国ニュージャージー州ロッキーヒル）製）を有するＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ）で増殖させた：ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；５０ｎｇ／ｍＬ；カタログ番号１００−２０）、ヒトトロンボポイエチン（２０ｎｇ／ｍＬ；カタログ番号３００−１８）；ヒトインターロイキン−６（２０ｎｇ／ｍＬ；カタログ番号２００−０６）、ヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３；１００ｎｇ／ｍＬ；カタログ番号３００−１９）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ；１００ｎｇ／ｍＬ；カタログ番号３００−０７）。この受容体のリガンド（ＶＥＧＦ）の存在下において細胞を培養することにより得られた１細胞当たりのＶＥＧＦＲ２の発現レベルに対する効果は測定しなかった。
【００６３】
これらのヒト臍帯血培養物２種に由来する最高２５０，０００個の細胞の溶解産物（ＲＩＰＡを使用するか、またはＰｉｅｒｃｅ  Ｍ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号７８５０１の使用を追加して、実施例６と同様に実施）を、実施例５に記載のＥＣＬイムノアッセイを使用して、ＶＥＧＦＲ２発現の分析を行った。
【００６４】
本実験の結果を図４〜図６に示す。図４〜図６のいずれにおいても、ＣＤ３４抗原に対する免疫磁気ビーズを使用した濃縮が、内皮細胞マーカーＶＥＧＦＲ２を発現する細胞の濃縮において大きな成功を収めたことが示されている。このことは細胞溶解産物を生成する方法に関係なく当てはまったものの、抽出に全く同じ細胞群を使用する場合には、ＲＩＰＡバッファーを使用した方がより多いシグナルが得られた（Ｍ−ＰＥＲ溶解バッファーを使用した図４とＲＩＰＡを使用した図５を比較）。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＶＥＧＦＲ２を検出する感度。ＨＵＶＥＣ細胞（ＶＥＧＦＲ２発現の陽性対照である内皮細胞）とＫ５６２（ＶＥＧＦＲ２発現の陰性対照）それぞれの溶解産物中のＶＥＧＦＲ２をイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルの比較を示す。１ウェル当たり３００個、６２５個および２５００個の細胞の溶解産物を使用したデータを示す。
【図２】内皮細胞と非内皮細胞のそれぞれからＶＥＧＦＲ２を検出する感度および特異性。ＨＵＶＥＣ細胞（ＶＥＧＦＲ２発現の陽性対照である内皮細胞）とＫ５６２（ＶＥＧＦＲ２発現の陰性対照）それぞれの溶解産物中のＶＥＧＦＲ２をイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルのさらなる比較を示す。Ｘ軸目盛りの増加を示すために、１ウェル当たり１０，０００個の細胞の溶解産物質から得たデータもこのグラフに含めている点を除けば、図１に示したものと同じ実験のデータを本図にも使用している。
【図３】内皮細胞と非内皮細胞のそれぞれからＶＥＧＦＲ２を検出する特異性。ＨＵＶＥＣ細胞（ＶＥＧＦＲ２発現の陽性対照である内皮細胞）とＰＭＢＣそれぞれの溶解産物中のＶＥＧＦＲ２をイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルの比較を示す。１ウェル当たり２５００個の細胞までの溶解産物を使用したデータを示す。図１および図２に比べると、この図３はＰＢＭＣの追加データを示している。比較のため、図１および図２のＨＵＶＥＣ細胞のデータと同じデータも示している。
【図４】濃縮効果。非濃縮ヒト臍帯血のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物、または抗ＣＤ３４抗体を有する免疫磁気ビーズを使用してＣＤ３４抗原を濃縮した同じ培養物のいずれかの溶解産物中のＶＥＧＦＲ２をイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルの比較。この図では、実施例９に記載のＭ−ＰＥＲ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、細胞を抽出した。フローサイトメトリーを使用したところ、５０００個のＣＤ３４濃縮細胞中に９６０個のＶＥＧＦＲ２陽性細胞が存在すると予想された。
【図５】濃縮効果。非濃縮ヒト臍帯血のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物、または抗ＣＤ３４抗体を有する免疫磁気ビーズを使用してＣＤ３４抗原を濃縮した同じ培養物のいずれかの溶解産物中のＶＥＧＦＲ２をイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルの比較。この図では、実施例９に記載のＲＩＰＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを使用して、細胞を抽出した点を除けば、図４で溶解産物を得るのに使用したのと同じ細胞を使用した。
【図６】濃縮効果。非濃縮ヒト臍帯血のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物、または抗ＣＤ３４抗体を有する免疫磁気ビーズを使用してＣＤ３４抗原を濃縮した同じ培養物のいずれかの溶解産物中のＶＥＧＦＲ２をイムノアッセイにより検出するためのＥＣＬシグナルの比較。この図では、臍帯血のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物に由来する種々の細胞群を使用した。図４と同様に、Ｍ−Ｐｅｒ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、細胞を溶解した。フローサイトメトリーを使用したところ、５０００個のＣＤ３４濃縮細胞中に７００個のＶＥＧＦＲ２陽性細胞が存在すると予想された。
【図１】
2009534666.tif 000007
【図２】
2009534666.tif 000008
【図３】
2009534666.tif 000009
【図４】
2009534666.tif 000010
【図５】
2009534666.tif 000011
【図６】
2009534666.tif 000012
【国際調査報告】
2009534666.tif 000013