(57)【要約】Ｂｍｉ−１を用いて星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物および方法を開示する。脱分化した神経幹細胞は、星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を有する。
2009528050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物。
【請求項２】
Ｂｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、Ｂｍｉ−１タンパク質を発現するベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｂｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、Ｂｍｉ−１タンパク質を発現するウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記脱分化した神経幹細胞が、星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
星状細胞をＢｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法。
【請求項６】
前記脱分化した神経幹細胞が、星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、（i）星状細胞を培地で培養する段階と、（ii）前記星状細胞を前記Ｂｍｉ−１タンパク質または前記核酸で処理する段階と、（iii）星状細胞を神経幹細胞への脱分化に誘導する段階とを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（i）段階で星状培養を培養する培地が、ｂＦＧＦを含む培地である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項５の方法で生産された神経幹細胞。
【請求項１０】
請求項５の方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞に分化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
神経幹細胞（Neural stem cells：ＮＳＣｓ）は、神経系に存在する前駆細胞（progenitor cell）のサブタイプであって、星状細胞、希突起膠細胞およびニューロンへの分化能を持っている。中枢神経系（Central nervous system：ＣＮＳ）と抹消神経系（peripheral nervous system：ＰＮＳ）から分離してマルチセルラーニューロスフェア（Multicellular neurospheres）を作ることができ、この細胞がそれぞれの条件でグリアリニージ（glial lineage）とニューラルリニージ（neural lineage）に分化する（Sally Temple et al. 2001）。このような神経幹細胞は、難治病の治療に応用されて現在細胞治療の一つの方法として研究されており、倫理的な問題が殆どない成体幹細胞であるから多く研究されている実情である。最近、脱分化に関連した研究が行われている状況で成体幹細胞の重要性がさらに強調されている。このような成体幹細胞は、胚芽幹細胞より得易いが、実際適用するには未だ難しい部分が多い。また、別の人の成体幹細胞を使用するときには免疫拒否反応という問題も提起されるおそれがある。よって、自分の細胞を用いて脱分化を誘導する場合、現在提起されている問題を解決することができる。このような趣旨で、既に分化の進んだ細胞を用いて脱分化を誘導することが重要である。現在、細胞融合（Cell fusion）や核移植（Nuclear transfer）などの方法を用いて脱分化を誘導する研究が進行中にある。別の方法を用いたグループとして、Ａｌｅｘｉｓ Ｊ（Lancet 2004）は、皮膚から分離した細胞を神経幹細胞培養条件で培養したときに神経幹細胞の特性を持っていると報告した。また、Ｔｏｒｕ Ｋ．（Genes & Development 2004）は、希突起膠細胞前駆体（oligodendrocyte precursors）を神経幹細胞に脱分化させたことを報告した。このグループは、これに関連した論文を２０００年から研究して発表し、２００４年の論文では各分化段階で遺伝子の発現がクロマチン再構築（chromatin remodeling）とヒストン修飾（histone modification）に関連していると報告した。
【０００２】
〔背景技術〕
本研究では、既存の様々な方法の問題点を解決し、さらに使用に適した方法を確立しようとした。ＮＳＣｓの特性を調節している転写因子の中から一つを選別し、過発現を誘導して神経幹細胞への分化を研究した。われわれの選別したｐｏｌｙｃｏｍｂグループのＢｍｉ−１遺伝子は、ヒストン修飾と細胞周期調節因子を調節しているタンパク質の一つである（Jan W. et al. 1999）。ｃｄｋｎ２ａ／ＩＮＫ４Ａ ｌｏｃｕｓは、Ｂｍｉ−１遺伝子のターゲットとして知られており、Ｂｍｉ−１遺伝子は、このようなターゲット遺伝子を転写過程で抑制する作用を果たすと知られている。最近、Ｂｍｉ−１遺伝子は、神経幹細胞で発現されており、神経幹細胞の自己再生の維持に作用していることが報告された（Anna V. M et al. 2003, 2005, In-Kyung Park et al. 2004）。
【０００３】
このような背景の下に、本発明者らは、既に分化したマウス星状細胞にＢｍｉ−１遺伝子を過発現させると、自己再生能と星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞への分化能を持つ神経幹細胞様の細胞に脱分化できることを確認し、本発明を完成した。
【０００４】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、Ｂｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸からなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物を提供することにある。
【０００５】
本発明の他の目的は、星状細胞をＢｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の別の目的は、前記方法で生産された神経幹細胞を提供することにある。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンおよび希突起膠細胞に分化させる方法を提供することにある。
【０００８】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。
【０００９】
図１は免疫細胞化学法（Immunocytochemistry）によってＢｍｉ−１遺伝子のターゲット遺伝子であるｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１９Ａｒｆの過発現を確認した結果を示す。
【００１０】
図２は脱分化の誘導を示すもので、Ａはｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅ形成を、Ｂはｓｐｈｅｒｅ形成を示す（ｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されることを意味し、ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを星状細胞培養条件でアタッチさせてから１２時間後に安定になったとき、神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されることを意味する）。
【００１１】
図３は神経幹細胞マーカーの発現を免疫細胞化学法によって考察した結果である。Ａ〜Ｃは神経幹細胞（Neural stem cell）を、Ｄ〜Ｆは神経幹細胞様の細胞（Neural stem cell-like cell）を示す。
【００１２】
図４は神経幹細胞特異的マーカーの発現を半定量（Semi-quantitative）ＰＣＲ増幅によって考察した結果である（Ａｓｔ：星状細胞、ＮＳＣ：神経幹細胞、Ａｓｔ−Ｂｍｉ−１：星状細胞＋Ｂｍｉ−１、ＮＳＣＬＣ：神経幹細胞様の細胞）。
【００１３】
図５は神経細胞様細胞のインビトロ分化を誘導したときに星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞にそれぞれ分化することを示す。Ａ〜Ｃは神経幹細胞を、Ｄ〜Ｇは神経幹細胞様の細胞を示す。
【００１４】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、Ｂｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸からなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する組成物に関する。
【００１５】
本発明において、用語「神経幹細胞様の細胞（neural stem cell-like cell）」とは、ニューロン、星状細胞、希突起膠細胞などの細胞に分化できる多能性幹細胞（multipotent stem cell）であって、体細胞の脱分化に起源した神経幹細胞である。本発明において、神経幹細胞様の細胞は神経幹細胞として記述されることもある。
【００１６】
本発明は、星状細胞でＢｍｉ−１を過発現させる場合、既に分化した細胞タイプの星状細胞が、多分化能を有する神経幹細胞様の細胞に脱分化することを開示する。
【００１７】
本発明のＢｍｉ−１は、タンパク質、またはそのタンパク質をコードする核酸の形で提供される。
【００１８】
本発明の組成物に使用されるＢｍｉ−１は、ヒト、馬、羊、豚、山羊、駱駝、レイヨウ、犬などの動物に由来した全てのＢｍｉ−１を含む。また、神経細胞の脱分化に使用される本発明のＢｍｉ−１タンパク質は、その野生型のアミノ酸配列を持つタンパク質だけでなく、Ｂｍｉ−１タンパク質の変異体を含む。
【００１９】
用語「Ｂｍｉ−１タンパク質の変異体」は、Ｂｍｉ−１の天然アミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的もしくは保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を有するタンパク質を意味する。前記変異体は、天然タンパク質と同一の生物学的活性を示す機能的等価物であってもよく、必要に応じてタンパク質の物理化学的性質が変形された変異体であってもよい。好ましくは、前記変異体は物理、化学的環境に対する構造的安定性または生理学的活性が増大した変異体である。
【００２０】
好ましくは、Ｂｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の形で提供される。
【００２１】
Ｂｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、野生型または前述したような変異体型のＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、少なくとも一つの塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異でき、天然から分離されるか或いは化学的合成法を用いて製造できる。
【００２２】
前述したＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子からなる単鎖または二重鎖であってもよい。
【００２３】
一つの好適な様態において、Ｂｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｂｍｉ−１タンパク質を発現するベクターとしての組成物である。
【００２４】
本発明において、用語「ベクター」とは、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現することが可能な発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００２５】
本発明において、用語「作動可能に連結された」とは、一般な機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的のタンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組み換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野における公知の遺伝子組み換え技術を用いて実現することができ、部位特異的ＤＮＡ切断および連結は、当該技術分野で一般に知られている酵素などを用いて実現することができる。
【００２６】
本発明のベクターは、プロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどの発現調節要素の他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に調節できる。ベクターのプロモータは構成的または誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合には複製起源を含む。ベクターは、自己複製し、或いは宿主ＤＮＡに統合できる。
【００２７】
ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクターなどを含む。好ましくは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えばＨＩＶ（Human immunodeficiency virus）、ＭＬＶ（Murine leukemia virus）、ＡＳＬＶ（Avian sarcoma/leukosis）、ＳＮＶ（Spleen necrosis virus）、ＲＳＶ（Rous sarcoma virus）、ＭＭＴＶ（Mouse mammary tumor virus）などのレトロウイルス、アデノウイルス（Adenovirus）、アデノ関連ウイルス（Adeno-associated virus）、ヘルペスシンプレックスウイルス（Herpes simplex virus）などに由来したベクターを含むが、これに限定されない。本発明の具体的な様態では、ＭＬＶ基盤ウイルスベクター（Moloney leukemia virus based virus vector）として、ピューロマイシンに対する選別マーカーを含むｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターを用いた。
【００２８】
Ｂｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、当該分野における公知の方法、例えばベクター形態のネイキッドＤＮＡとして細胞内に伝達し（Wolff et al. Science,  247:1465-8, 1990: Wolff et al. J. Cell Sci. 103:1249-59, 1992）、或いはリポソーム（Liposome）、陽イオン性高分子（Cationic polymer）などを用いて細胞内に伝達することができる。リポソームは、遺伝子伝達のためにＤＯＴＭＡやＤＯＴＡＰなどの陽イオン性リン脂質を混合して製造したリン脂質膜であって、陽イオン性のリポソームと陰イオン性の核酸とを一定の割合で混合すると、核酸−リポソーム複合体が形成される。
【００２９】
別の好適な様態として、Ｂｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｂｍｉ−１タンパク質を発現するウイルスとしての組成物である。
【００３０】
本発明において、用語「ウイルス」とは、Ｂｍｉ−１タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターをパッケージング細胞に形質転換および感染させて製作した、Ｂｍｉ−１を発現するウイルスを意味する。
【００３１】
本発明のＢｍｉ−１タンパク質を発現するウイルスの製造に使用できるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびヘルペスシンプレックスウイルスを含み、これに限定されない。好ましくは、レトロウイルスである。本発明の具体的な実施では、ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏベクターにＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター（ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ Ｂｍｉ−１）をパッケージング細胞としてのＰＴ６７細胞に形質転換し、Ｂｍｉ−１タンパク質を発現するウイルスを製造した。
【００３２】
別の様態として、本発明は、Ｂｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階を含んでなる、星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する方法に関する。
【００３３】
より具体的に、前記方法は、（i）星状細胞を培地で培養する段階と、（ii）前記培養物をＢｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で処理する段階と、（iii）星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導する段階とを含む。
【００３４】
前記方法の（i）段階で星状細胞を培養する培地は、当該分野で神経幹細胞の培養に通常用いられる培地を全て含む。培養に使用される培地は、一般に、炭素源、窒素源および微量元素の成分を含む。また、培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生剤を含むことができる。好ましくは、ｂＦＧＦを含む培地である。
【００３５】
前記方法の（ii）段階で処理されるＢｍｉ−１タンパク質、またはＢｍｉ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、前述したとおりである。
【００３６】
別の様態として、本発明は、前記方法で製造された神経幹細胞に関する。
【００３７】
本発明の脱分化方法で製造された神経幹細胞は、神経幹細胞特異的なマーカーである、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２が神経幹細胞と同じ水準で発現し、一般な神経幹細胞と同一の分化能を有することを確認した。
【００３８】
別の様態として、本発明は、前記方法で生産された神経幹細胞を星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞に分化させる方法に関する。
【００３９】
本発明の組成物と方法によって製造された神経幹細胞の分化を、当該分野における通常の星状細胞、ニューロンまたは希突起膠細胞分化条件で誘導する場合、それぞれの細胞への分化が誘導されることを各細胞特異的なマーカーの発現で確認することができた。
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ところが、これらの実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００４１】
（実施例１：研究方法）
１．マウス星状細胞とマウス神経幹細胞の培養
マウス星状細胞（mouse astrocytes）は、Ｅ１３．５日齢の中枢神経系（ＣＮＳ）から分離して適切な培養条件で培養した。分離した細胞をトリプシン（Ｇｉｂｃｏ０．０５％）で処理した後、単細胞に作ってＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）１０％、ペニシリン／ストレプトマイシン１％、Ｌ−グルタミン１％（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ（高グルコース、ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。培養の後、その翌日から培地交換を行い、１〜３継代間の細胞を使用した。対照群として使用された神経幹細胞は、Ｅ１３．５日齢のマウスから分離してインスリン（Ｓｉｇｍａ）、ａｐｏ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、セレニウム（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｎ２）に血清代替物（serum-replacement）としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、ヒト組み換えベイシックＦＧＦおよびヒト組み換えＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を添加して培養した。
【００４２】
２．レトロウイルス媒介感染
ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ  Ｂｍｉ−１（ｐＢａｂｅ ｐｕｒｏ ｖｅｃｔｏｒにヒトＢｍｉ−１（ＮＣＢＩ受託番号Ｌ１３６８９）を挿入して製造）とｐＢａｂｅ ｐｕｒｏをＰＴ６７パッケージングセルライン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした後、ピューロマイシン（３μｇ／ｍＬ）（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅ）で選別した。こうして作られた細胞株が９０％以上になったとき、上澄み液を取って０．４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でフィルターリングして細胞破片（cell debris）を除去した後、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加して１０時間間隔で分離したマウス星状細胞に２回感染させた。その後、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）で選別した。
【００４３】
３．ウエスタンブロット分析
それぞれの細胞をＲＩＰＡバッファとして総細胞抽出物（total cell extract）を得て、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）でタンパク質濃度を測定した後、各５０μｇずつ１０％或いは４〜１２％ｐｒｅｃａｓｔｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行った。ＰＶＤＦメンブレイン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーした後、３〜５％Ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ ＴＢＳＴでブロッキングを行った。ａｎｔｉ−Ｂｍｉ−１（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ａｎｔｉ−ｐ１６ＩＮＫ４Ａ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ａｎｔｉ−ｐ１９ＡＲＦ（Ｎｏｖｏｕｏｕｓ）、α-ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃一晩シェーキングを行った後、ＲＴでＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ、抗ウサギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）で反応させた。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。
【００４４】
それぞれの細胞からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを分離した後、逆転写（ＲＴ）は総ＲＮＡの５００ｎｇ、ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）１２〜１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅII逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを作った。ＲＴ−ＰＣＲは、ｃＤＮＡ１μＬ、それぞれのプライマー１０ｐｍｏｌ、ＰＣＲプレミックス（１Ｕ Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、２５０μＭ ｄＴＮＰｓ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＫＣｌおよび１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２  Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて行った。使用したプライマーは、対照区とそれぞれのマーカーとして用いられるもので、ｍｏｕｓｅ ＧＡＰＤＨ、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２であり、それぞれのプライマー条件に応じてＰＣＲ増幅した。使用したプライマー配列は、次のとおりである。
【００４５】
ｍｏｕｓｅ ＧＡＰＤＨプライマー
順方向プライマー５’−ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１）
逆方向プライマー５’−ＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣ−３’（配列番号２）
ｍｏｕｓｅ ｎｅｓｔｉｎ
順方向プライマー５’−ＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡ−３’（配列番号３）
逆方向プライマー５’−ＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＴＣＡＡ−３’（配列番号４）
ｍｏｕｓｅ ｓｏｘ２
順方向プライマー５’−ＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴＡＧＧＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号５）
逆方向プライマー５’−ＴＧＣＣＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡ−３’（配列番号６）
【００４６】
４．脱分化の誘導
脱分化は、神経幹細胞の培養条件と同様に培養しながら誘導した。この際、２つの方法を用いて培養した。それらの中の一つは、６ウェルプレートに１×１０５のセルをプレイティングし、１２時間後、インスリン（Ｓｉｇｍａ）、ａｐｏ− トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、セレニウム（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｎ２）に血清代替物（serum-replacement）としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、ヒト組み換えベイシックＦＧＦおよびヒト組み換えＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）が添加された培地に取り替えた後、毎日ｂＦＧＦを処理し、培地を二日おきに取り替えながら培養する方法である。もう一つの方法は、適正培養条件で培養した細胞を、トリプシン化した後、３×１０５ずつ６０ｍｍのバクテリア培養プレートにシーディングしてインスリン（Ｓｉｇｍａ）、ａｐｏ− トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、セレニウム（Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）が含まれているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｎ２）に血清代替物（serum-replacement）としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、ヒト組み換えベイシックＦＧＦおよびヒト組み換えＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）が添加された培地で培養する方法である。
【００４７】
５．免疫細胞化学法によるそれぞれのマーカー確認
Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは、４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ）で１時間４℃で固定した後、２０％スクロースを添加して４℃で一晩シェーキングを行った。その後、ＯＣＴ化合物を用いて８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に低温保存した。８〜１０μｍでセクションした後、染色を行った。１０％正常山羊血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）＋０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）が含まれているＰＢＳでブロッキングを行った後、ａｎｔｉ−ｎｅｓｔｉｎ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ａｎｔｉ−ＣＤ１３３（ＭＡＣＳ）、ａｎｔｉ−Ｓｏｘ２（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃で一晩反応させた後、ＲＴでａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ｃｙ３（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）、ａｎｔｉ−ｇｏａｔ−ｃｙ３（Ｚｙｍｅｄ）で反応させた後、最後にＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて核染色を行った。染色の後、Ｚｅｉｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で確認した。分化した細胞の場合、前述の方法で染色を行った。この際、使用した抗体は、ａｎｔｉ−ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ）、ａｎｔｉ−Ｓ１００β（Ｚｙｍｅｄ）、ａｎｔｉ−β−ｔｕｂｕｌｉｎIII（Ｃｏｖａｎｃｅ）、ａｎｔｉ−Ｍａｐ２ａ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ−ＴＨ（Ｓｉｇｍａ）、ａｎｔｉ−Ｏ４（Ｒ＆Ｄ）、およびａｎｔｉ−ＣＮＰａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）であった。
【００４８】
６．インビトロ分化
ＰＬＯ（poly-L-ornithine）（Ｓｉｇｍａ）とラミニン或いはフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした後、次の分化条件で培養を行った。
【００４９】
星状細胞への分化は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）が含まれているＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、高グルコース）にヒト組み換えｂＦＧＦとＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を添加し、或いはＣＮＴＦ（recombinant rat ciliary neurotrophic factor（upstate））で５〜７日間培養することにより誘導した。
【００５０】
ニューロンへの分化は、血清代替物としてのＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）が含まれているＮ２培養液にヒト組み換えＦＧＦを４日間処理した後、８日間ＦＧＦのない培地で培養することにより誘導した。他の方法では、濃度１〜１０μＭのＲＡ（retinoic acid）（Ｓｉｇｍａ）を添加して７〜１４日間培養することにより、分化を誘導した。別の方法では、濃度１〜１０ＭｍのＶＰＡ（Valproic acid）（Ｓｉｇｍａ）を濃度１〜１０μＭのＲＡ（Ｓｉｇｍａ）と共に添加して７〜１４日間培養することにより、分化を誘導した。
【００５１】
希突起膠細胞への分化は、血清代替物としてのＢ２７が添加されているＮ２培養液にＰＤＧＦ−ＡＡ（platelet derived growth factor-AA）（Ｒ＆Ｄ）、Ｔ３（3,3,5-triiodo-L-thyronine）（Ｓｉｇｍａ）、およびヒト組み換えベイシックＦＧＦとＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を共に添加して２０日間培養することにより誘導した。
【００５２】
前述した条件で培養を行い、それぞれの分化した細胞の形態を観察しながら、それぞれの分化マーカーとして使用される抗体を用いて免疫細胞化学法によって確認した。
【００５３】
（実施例２：研究結果）
既に分化の進んだマウス星状細胞をＥ１３．５日齢から分離し、レトロウイルス導入システム（retroviral transduction system）を用いてＢｍｉ−１遺伝子を過発現させた。ウエスタンブロット分析によって過発現を確認することができ、また、Ｂｍｉ−１遺伝子の目的遺伝子として知られているｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１９Ａｒｆが発現されていないことを確認することができた（図１）。
【００５４】
その後、神経幹細胞の培養条件を用いて脱分化を誘導した。まず、一定の数（１×１０５）の細胞を６ウェルプレートにシーディングした後、１２時間後から神経幹細胞培養条件で培養した結果、培養３〜４日目に神経幹細胞と同じ形態を示すことを観察することができた。また、一定の数（３×１０５）の細胞を６０ｍｍバクテリアプレートに神経幹細胞と同一の培養条件で培養した結果、依然として神経幹細胞と同じ形態を示していることを観察することができた。一方、対照区ベクターであるｐＢａｂｅ ｐｕｒｏが感染した細胞では、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅが形成されていない（図２）。６日目のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを他のディッシュに別途に移した後、培養し続けたときにも、神経幹細胞と同一の形態を示した。Ｂｍｉ−１遺伝子を用いて作られた細胞が自己再生の特性を持っているかを調べるためにｓｕｂｓｐｈｅｒｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを行った結果、単細胞でｓｐｈｅｒｅを形成することを１週間経過後から観察することができた（データを示さず）。
【００５５】
この細胞が神経幹細胞と同一の細胞であるかを確認するために、それぞれのマーカーを用いて免疫細胞化学法を使用した。神経幹細胞で最も多く発現されているマーカーＮｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２を用いて染色した結果、神経幹細胞で発現されているのと同様に神経幹細胞様の細胞でも発現されていた。この際、作られたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅもｃｒｙｏ−ｓｅｃｔｉｏｎして確認した結果、Ｎｅｓｔｉｎ、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ２の発現を確認することができた（図３）。
【００５６】
ＲＴ−ＰＣＲによってもう１回検証した結果、神経幹細胞で発現されている遺伝子としてのＮｅｓｔｉｎとＳｏｘ２がやはり同一の様相でわれわれの作った細胞でも発現されており、神経幹細胞様の細胞を作ったものと判断することができた（図４）。
【００５７】
神経幹細胞様の細胞が神経幹細胞のように分化能力を持つかを確認するために、星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞への分化を前述の方法によって誘導した。分化有無をそれぞれの分化マーカーに特異的な抗体を用いて確認した結果、神経幹細胞のように３つのタイプに分化がなされることを確認することができた。まず、星状細胞への分化はＧＦＡＰとＳ１００の発現によって確認し、ニューロンへの分化はβ−ｔｕｂｕｌｉｎ III（Ｔｕｊ１）とＭａｐ２ａの発現によって確認した。また、希突起膠細胞のマーカーであるＯ４とＣＮＰａｓｅも希突起膠細胞への分化条件を与えたときに発現されていることを確認することができた（図５）。
【００５８】
この研究によって、Ｂｍｉ−１遺伝子は星状細胞の神経幹細胞様細胞への脱分化に関連した重要な遺伝子であり、このように脱分化した神経幹細胞様の細胞は星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞にさらに分化することを確認することができた。
【００５９】
〔産業上の利用可能性〕
前述したように、Ｂｍｉ−１を用いて星状細胞の神経幹細胞への脱分化を誘導することができ、脱分化した神経幹細胞は多様な疾病治療に使用できる。
【００６０】
〔従来の技術の文献情報〕
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】免疫細胞化学法（Immunocytochemistry）によってＢｍｉ−１遺伝子のターゲット遺伝子であるｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１９Ａｒｆの過発現を確認した結果を示す。
【図２】脱分化の誘導を示すもので、Ａはｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅ形成を、Ｂはｓｐｈｅｒｅ形成を示す（ｄｉｒｅｃｔ ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されることを意味し、ｓｐｈｅｒｅはシングルセルを星状細胞培養条件でアタッチさせてから１２時間後に安定になったとき、神経幹細胞培養条件で培養した場合に形成されることを意味する）。
【図３】神経幹細胞マーカーの発現を免疫細胞化学法によって考察した結果である。Ａ〜Ｃは神経幹細胞（Neural stem cell）を、Ｄ〜Ｆは神経幹細胞様の細胞（Neural stem cell-like cell）を示す。
【図４】神経幹細胞特異的マーカーの発現を半定量（Semi-quantitative）ＰＣＲ増幅によって考察した結果である（Ａｓｔ：星状細胞、ＮＳＣ：神経幹細胞、Ａｓｔ−Ｂｍｉ−１：星状細胞＋Ｂｍｉ−１、ＮＳＣＬＣ：神経幹細胞様の細胞）。
【図５】神経細胞様細胞のインビトロ分化を誘導したときに星状細胞、ニューロン、希突起膠細胞にそれぞれ分化することを示す。Ａ〜Ｃは神経幹細胞を、Ｄ〜Ｇは神経幹細胞様の細胞を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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