(57)【要約】  本発明は、個体における常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）の発症を検出または予測するため、ＡＤＰＫＤに関連性があると判定されているＰＫＤ１および／またはＰＫＤ２遺伝子における新規な変異を検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）の発症を検出または予測する方法であって、前記個体から得られた核酸試料中の配列番号１または配列番号７のヌクレオチド配列を有するＰＫＤ１遺伝子内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在を検出するステップを含み、ここで前記１つまたは複数の変化は、配列番号１のヌクレオチド位置５５９〜５６３でのＴＴＴＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１１２４でのＣＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９１でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９７でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置５３６５でのＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６６６６でのＧの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６８８１でのＡの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置８７１３でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９１３４でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置９５３６での５ヌクレオチドの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３９でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置４８３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４５１７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７００６でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８２６７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８６３９でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置２０１６８でのＧからＡへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３１０２５でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３３４１５でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５０８〜５１６でのＣＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１８４８〜１８５０でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置８８９２〜８９００でのＣＣＡＡＣＴＣＣＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９９０５〜９９０７でのＡＡＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１００７０〜１００７２でのＣＴＣの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１２５９７〜１２５９９でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３８５でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１４７０でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４２６２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８８５５でのＴからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１７９４でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６０３６でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置２０４２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３３５１でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７５６でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５７９３でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７０７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０１８７でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７１１６でのＣからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０３１１でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７５５４でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７７５７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８０６７でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８１３８でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８５０９でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１００９６でのＣからＡへの変化、および配列番号１のヌクレオチド位置１２６５８でのＣからＴへの変化からなる群から選択され、
ここで前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の検出は前記個体がＡＤＰＫＤを有するかまたはＡＤＰＫＤを発症することになることを示す、方法。
【請求項２】
請求項１に挙げられる前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化以外の少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化も配列番号１および配列番号４からなる群から選択される配列内で検出され、ここで前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化はＡＤＰＫＤに関連性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列内での前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在が、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、変性高性能液体クロマトグラフィーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法により検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化のＰＫＤ１遺伝子産物に対する効果を、前記ＰＫＤ１遺伝子産物の発現および前記ＰＫＤ１遺伝子産物の切断からなる群から選択される少なくとも１つの活性についてアッセイすることにより評価するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
個体における常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）の発症を検出または予測する方法であって、前記個体から得られた核酸試料中の配列番号４のヌクレオチド配列を有するＰＫＤ２遺伝子内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在を検出するステップを含み、ここで前記１つまたは複数の変化は、配列番号４のヌクレオチド位置２２２６でのＡの挿入、配列番号４のヌクレオチド位置２４２２〜２４２３でのＡＧの欠失、配列番号４のヌクレオチド位置２６８０でのＣからＴへの変化、ＩＶＳ７−１Ｇ＞Ａ、ＩＶＳ８＋５Ｇ＞Ａ、配列番号４のヌクレオチド位置３７４〜３７６でのＴＧＧの欠失および配列番号４のヌクレオチド位置１８７６〜１８８１でのＴＴＣの欠失からなる群から選択され、ここで前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の検出は、前記個体がＡＤＰＫＤを有するかまたはＡＤＰＫＤを発症することになることを示す、方法。
【請求項６】
請求項５に挙げられる前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化以外の少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化も配列番号１および配列番号４からなる群から選択される配列内で検出され、ここで前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化はＡＤＰＫＤに関連性がある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸配列内での前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在が、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、変性高性能液体クロマトグラフィーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法により検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化のＰＫＤ２遺伝子産物に対する効果を、前記ＰＫＤ２遺伝子産物の発現についてアッセイすることにより評価するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
個体における変異ＰＫＤ遺伝子の存在または不在を検出する方法であって、
ａ）前記個体から核酸試料を得るステップと；
ｂ）前記個体のＰＫＤ１またはＰＫＤ２遺伝子内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在または不在を検出するステップを含み、ここで前記１つまたは複数の変化は、配列番号１のヌクレオチド位置５５９〜５６３でのＴＴＴＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１１２４でのＣＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９１でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９７でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置５３６５でのＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６６６６でのＧの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６８８１でのＡの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置８７１３でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９１３４でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置９５３６での５ヌクレオチドの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３９でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置４８３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４５１７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７００６でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８２６７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８６３９でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置２０１６８でのＧからＡへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３１０２５でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３３４１５でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５０８〜５１６でのＣＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１８４８〜１８５０でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置８８９２〜８９００でのＣＣＡＡＣＴＣＣＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９９０５〜９９０７でのＡＡＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１００７０〜１００７２でのＣＴＣの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１２５９７〜１２５９９でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３８５でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１４７０でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４２６２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８８５５でのＴからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１７９４でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６０３６でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置２０４２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３３５１でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７５６でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５７９３でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７０７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０１８７でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７１１６でのＣからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０３１１でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７５５４でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７７５７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８０６７でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８１３８でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８５０９でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１００９６でのＣからＡへの変化および配列番号１のヌクレオチド位置１２６５８でのＣからＴへの変化、配列番号４のヌクレオチド位置２２２６でのＡの挿入、配列番号４のヌクレオチド位置２４２２〜２４２３でのＡＧの欠失、配列番号４のヌクレオチド位置２６８０でのＣからＴへの変化、ＩＶＳ７−１Ｇ＞Ａ、ＩＶＳ８＋５Ｇ＞Ａ、配列番号４のヌクレオチド位置３７４〜３７６でのＴＧＧの欠失、および配列番号４のヌクレオチド位置１８７６〜１８８１でのＴＴＣの欠失からなる群から選択され、
ここで前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の検出は変異ＰＫＤ遺伝子について示す、方法。
【請求項１０】
前記個体の前記ＰＫＤ１またはＰＫＤ２遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在が、前記個体が常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）を有するかまたはＡＤＰＫＤを発症しうることを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸配列内での前記１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在または不在が、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、変性高性能液体クロマトグラフィーおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法により検出される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／８３２，７８０号明細書の優先権を主張するものである。上記出願の教示内容全体は参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、部分的にはスペイン科学技術省（Ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｏ  ｄｅ  Ｃｉｅｎｃｉａ  ｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ）のＢｅｃａｓ  ＦＰＩ  ｄｅ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ（スペイン）ならびに国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の助成金Ｒ０１ＤＫ７０６１７、Ｐ５０−ＤＫ５７３２５およびＲ３７ＤＫ４８００６により支援を受けた。政府は本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）は、ヒトにおいて６００〜１０００個体当たり約１個体が罹患する極めて一般的な遺伝性疾患である（ガボウ  Ｐ．Ａ．（Ｇａｂｏｗ  Ｐ．Ａ．）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２９（５）：３３２−３４２頁、１９９３年）。この疾患は腎嚢胞の年齢依存性の成長として特徴づけられ、典型的には末期腎疾患（ＥＳＲＤ）が中年期に続発する。その代わりにまたはそれに加え、ＡＤＰＫＤは、肝臓および脾臓を含む他の器官における嚢胞、ならびに胃腸、心血管、および筋骨格の異常を含みうる（ガボウ  Ｐ．Ａ．（Ｇａｂｏｗ  Ｐ．Ａ．）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２９（５）：３３２−３４２頁、１９９３年；ガボウ  Ｐ．（Ｇａｂｏｗ  Ｐ．）ら、Ａｄｖ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １８：１９−３２頁、１９８９年）。１型ＡＤＰＫＤおよび２型ＡＤＰＫＤのいずれも、あらゆる範囲の腎性および腎外性の徴候が共通するが、２型ＡＤＰＫＤは１型ＡＤＰＫＤに対して発症が遅延するようである。高血圧、血尿および尿管感染を含む、ＡＤＰＫＤで認められる共通の表現型合併症は、２型患者では臨床的に軽度なようである。
【０００４】
ＡＤＰＫＤの症例の約８５パーセントは、染色体１６上に位置するＰＫＤ１遺伝子［ＭＩＭ６０１３１３］における変異により引き起こされる一方、残りは染色体４上に位置するＰＫＤ２遺伝子［ＭＩＭ１７３９１０］の変異によるものである（ピーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ）ら、Ｃｏｎｔｒｉｂ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ９７：１２８−１３９頁、１９９２年；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｃｅｌｌ、７７（６）：８８１−８９４頁、１９９４年；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｃｅｌｌ  ８１（２）：２８９−２９８頁、１９９５年；ヒュー  Ｊ．（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｊ．）ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １０（２）：１５１−１６０頁、１９９５年；モチズキ  Ｔ．（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｔ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２（５２６６）：１３３９−１３４２頁、１９９６年）。しかし、ＡＤＰＫＤに対する遺伝子試験は、ＤＮＡ診断の観点で独特の一連の課題を提起している。特にＰＫＤ１の分析は、遺伝子の５’部分（エクソン１〜３４）が染色体１６上の他の場所の（２％未満の発散で）少なくとも５つの極めて相同性の高いコピー内で複製されることから複雑になっている（ヒュー  Ｊ．（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｊ．）ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １０（２）：１５１−１６０頁、１９９５年）。ＰＫＤ１変異体の分析がさらに複雑であり、ＰＫＤ１が潜在的に病原性のないＤＮＡ変異を高頻度に有することから、検出される各変化の性質が検証される必要がある。入れ子ＰＣＲ技術を介してスクリーニングされた大きい産物を増幅するための遺伝子特異的なプライマーの使用、入れ子ＰＣＲ産物における変異についてスクリーニングするための変性高性能液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、およびＰＫＤ１コード配列全体の直接配列決定を含むいくつかの技術を用い、ＰＫＤ１遺伝子における変異が検出されている（ワトニック  Ｔ．Ｊ．（Ｗａｔｎｉｃｋ  Ｔ．Ｊ．）ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６（９）：１４７３−１４８１頁、１９９７年；ワトニック  Ｔ．Ｊ．（Ｗａｔｎｉｃｋ  Ｔ．Ｊ．）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２（２）：２４７−２５１頁、１９９８年；ワトニック  Ｔ．（Ｗａｔｎｉｃｋ  Ｔ．）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５（６）：１５６１−１５７１頁、１９９９年；ファクデーキッチャロエン  Ｂ．（Ｐｈａｋｄｅｅｋｉｔｃｈａｒｏｅｎ  Ｂ．）ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５８（４）：１４００−１４１２頁、２０００年；ファクデーキッチャロエン  Ｂ．（Ｐｈａｋｄｅｅｋｉｔｃｈａｒｏｅｎ  Ｂ．）ら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １２：９５５−９６３頁、２００１年；トーマス  Ｒ．（Ｔｈｏｍａｓ  Ｒ．）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５（１）：３９−４９頁、１９９９年；ペリコット  Ｒ．Ａ．（Ｐｅｒｉｃｈｏｔ  Ｒ．Ａ．）、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １０５（３）：２３１−２３９頁、１９９９年；ペリコット  Ｒ．（Ｐｅｒｉｃｈｏｔ  Ｒ．）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ８（５）：３５３−３５９頁、２０００年；アフザル  Ａ．Ｒ．（Ａｆｚａｌ  Ａ．Ｒ．）ら、Ｇｅｎｅｔ  ４（４）：３６５−３７０頁；ロゼッティ  ���．（Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  Ｓ．）ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１（９３７６）：２１９６−２２０１頁、２００３年；ロゼッティ  Ｓ．（Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  Ｓ．）ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６１：１５８８−１５９９頁、２００２年；ロゼッティ  Ｓ．（Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  Ｓ．）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６８（１）：４６−６３頁、２００１年、イノウエ  Ｓ．（Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．）ら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １９（６）：６２２−６２８頁、２００２年；バーテイ  Ｓ．（Ｂｕｒｔｅｙ  Ｓ．）ら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ３９（６）：４２２−４２９頁、２００２年；ミゾグチ  Ｍ．（Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  Ｍ．）ら、Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ４６（９）：５１１−５１７頁、２００１年；チャン  Ｄ．Ｙ．（Ｚｈａｎｇ  Ｄ．Ｙ．）ら、中華医学遺伝学雑誌（Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｙｉ  Ｃｈｕａｎ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ）２１（３）：２１１−２１４頁、２００４年）。しかし、これらの方法の一部は定期的な臨床試料分析にとって費用効果的でない場合があり、かつ／またはそれらの変異検出率は確立されていないかまたは不十分である。例えば、ＰＫＤ１またはＰＫＤ２のいずれかにおいて同定されている変異のホットスポットが全く存在しないことから、ＰＫＤ１およびＰＫＤ２のコード領域全体の直接ＤＮＡ配列決定が必要であると考えられる。ＰＫＤ１およびＰＫＤ２におけるいくつかの病原性変異が同定されているが、既知の変異があらゆるＡＤＰＫＤを有する個体を説明するわけではない。したがって、疾患を正確に診断しかつ治療するため、ＡＤＰＫＤに関連性があるＰＫＤ１またはＰＫＤ２の他の変異を同定することが依然として求められている。
【発明の概要】
【０００５】
ＡＤＰＫＤに関連したＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子におけるいくつかの新規なヌクレオチド配列変化が同定されている。ＰＫＤ１およびＰＫＤ２における変異が遺伝子の直接配列決定により見出され、変異の病原性が様々な分析およびアルゴリズムの併用により判定された。病原性があるものとして同定されたＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子における変異を用い、個体におけるＡＤＰＫＤの発症の検出および／または予測が可能である。これは、ＡＤＰＫＤにおける遺伝子の診断的分析および予後分析において臨床的に重要である。
【０００６】
したがって、本発明は、個体におけるＡＤＰＫＤの発症を検出または予測する方法に関する。一態様では、本発明は、個体における常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）の発症を検出または予測する方法であって、前記個体から得られる核酸試料中に配列番号１または配列番号７のヌクレオチド配列を有するＰＫＤ１遺伝子内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在を検出するステップを含む方法に関し、ここで前記１つまたは複数の変化は、配列番号１のヌクレオチド位置５５９〜５６３でのＴＴＴＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１１２４でのＣＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９１でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９７でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置５３６５でのＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６６６６でのＧの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６８８１でのＡの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置８７１３でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９１３４でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置９５３６での５ヌクレオチドの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３９でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置４８３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４５１７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７００６でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８２６７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８６３９でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置２０１６８でのＧからＡへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３１０２５でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３３４１５でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５０８〜５１６でのＣＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１８４８〜１８５０でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置８８９２〜８９００でのＣＣＡＡＣＴＣＣＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９９０５〜９９０７でのＡＡＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１００７０〜１００７２でのＣＴＣの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１２５９７〜１２５９９でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３８５でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１４７０でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４２６２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８８５５でのＴからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１７９４でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６０３６でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置２０４２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３３５１でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７５６でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５７９３でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７０７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０１８７でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７１１６でのＣからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０３１１でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７５５４でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７７５７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８０６７でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８１３８でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８５０９でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１００９６でのＣからＡへの変化、および配列番号１のヌクレオチド位置１２６５８でのＣからＴへの変化からなる群から選択される。列挙されたヌクレオチド配列の変化のうちの１つまたは複数の検出は、個体がＡＤＰＫＤを有するかまたはＡＤＰＫＤを発症することになることを示す。一実施形態では、上で挙げられた１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化以外の少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化は配列番号１および／または配列番号４においても検出され、ここでさらに検出される少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化はＡＤＰＫＤに関連性がある。別の態様では、１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化は、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＨＰＬＣまたはそれらの組み合わせにより検出される。
【０００７】
本発明は、個体における常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）の発症を検出または予測する方法であって、前記個体から得られる核酸試料中に配列番号４のヌクレオチド配列を有するＰＫＤ２遺伝子内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在を検出するステップを含む方法にも関し、ここで前記１つまたは複数の変化は、配列番号４のヌクレオチド位置２２２６でのＡの挿入、配列番号４のヌクレオチド位置２４２２〜２４２３でのＡＧの欠失、配列番号４のヌクレオチド位置２６８０でのＣからＴへの変化、ＩＶＳ７−１Ｇ＞Ａ、ＩＶＳ８＋５Ｇ＞Ａ、配列番号４のヌクレオチド位置３７４〜３７６でのＴＧＧの欠失および配列番号４のヌクレオチド位置１８７６〜１８８１でのＴＴＣの欠失からなる群から選択され、ここで１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の検出は、個体がＡＤＰＫＤを有するかまたはＡＤＰＫＤを発症することになることを示す。一実施形態では、上で挙げられた１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化以外の少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化は配列番号１および／または配列番号４においても検出され、ここでさらに検出される少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化はＡＤＰＫＤに関連性がある。さらに別の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化は、配列決定、ＰＣＲ、ＤＨＰＬＣまたはそれらの組み合わせにより検出される。
【０００８】
本発明は、さらに個体における変異ＰＫＤ遺伝子の存在または不在を検出するための方法であって、個体から核酸試料を得るステップと、個体のＰＫＤ１またはＰＫＤ２遺伝子内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在または不在を検出するステップとを含む方法に関し、ここで１つまたは複数の変化は、配列番号１のヌクレオチド位置５５９〜５６３でのＴＴＴＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１１２４でのＣＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９１でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置２２９７でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置５３６５でのＴの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６６６６でのＧの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置６８８１でのＡの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置８７１３でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９１３４でのＡ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置９５３６での５ヌクレオチドの挿入、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３９でのＴの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置４８３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４５１７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７００６でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８２６７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８６３９でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置２０１６８でのＧからＡへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３１０２５でのＧからＴへの変化、配列番号７のヌクレオチド位置３３４１５でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５０８〜５１６でのＣＡＡの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１８４８〜１８５０でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置８８９２〜８９００でのＣＣＡＡＣＴＣＣＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置９９０５〜９９０７でのＡＡＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１００７０〜１００７２でのＣＴＣの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１２５９７〜１２５９９でのＴＧＧの欠失、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３８５でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１４７０でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４２６２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８８５５でのＴからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１７９４でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６０３６でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置２０４２でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３３５１でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７５６でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置５７９３でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置６７０７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０１８７でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７１１６でのＣからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０３１１でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７５５４でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７７５７でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８０６７でのＴからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８１３８でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８５０９でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１００９６でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１２６５８でのＣからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７４７６でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３５２７でのＣからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１９４７でのＣからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３３１２でのＡからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４３９１でのＣからＧへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１１０４０でのＴからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置８４０でのＧからＴへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置７１９７でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置３５１でのＧからＣへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置４７５７でのＧからＡへの変化、配列番号１のヌクレオチド位置１０２３でのＡからＣへの変化、配列番号４のヌクレオチド位置２２２６でのＡの挿入、配列番号４のヌクレオチド位置２４２２〜２４２３でのＡＧの欠失、配列番号４のヌクレオチド位置２６８０でのＣからＴへの変化、ＩＶＳ７−１Ｇ＞Ａ、ＩＶＳ８＋５Ｇ＞Ａ、配列番号４のヌクレオチド位置３７４〜３７６でのＴＧＧの欠失、配列番号４のヌクレオチド位置１８７６〜１８８１でのＴＴＣの欠失、および配列番号４のヌクレオチド位置６３４でのＧからＡへの変化からなる群から選択され、ここで１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の検出は変異ＰＫＤ遺伝子について示唆する。一実施形態では、個体のＰＫＤ１またはＰＫＤ２遺伝子内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在または不在は、個体がＡＤＰＫＤを有することを示す。別の実施形態では、ＰＫＤ１またはＰＫＤ２の核酸配列内での１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在または不在は、配列決定、ＰＣＲおよび／またはＤＨＰＬＣにより検出される。
【０００９】
ＡＤＰＫＤに関連性がある変異の同定は、決定的な診断情報を提供し、個体の血縁において標的化されたＰＫＤ遺伝子分析を用いたカウンセリングおよびプランニングを意図して発症前に安価に評価することが可能になり、予想される生存する血縁の腎臓提供者における試験やその後の提供に対するより確実な受け入れまたは拒絶が可能になる。ＡＤＰＫＤにおける発症前試験は、ＡＤＰＫＤ家系からの生存する腎臓提供者の評価だけでなく、疾患経過の早期（例えば嚢腫性疾患が視認される前）での使用、家族計画、超音波イメージングが正確かつ／もしくは十分でない場合の若年個体（例えば３０歳未満の個体）または臨床的により軽度な疾患であるＰＫＤ２関連のＡＤＰＫＤを有する家系に対するＡＤＰＫＤの検出に適応されうる、新しい作用物質による治療における早期検出において特に関連しうる。さらに臨床医は、診断が確定的でない非定型嚢腫性疾患を有する患者に出会う場合がある。したがって、本発明の方法は、ＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子内で同定された新規な病原性変異を用い、既存のＡＤＰＫＤの診断および管理における支援を改善するのに役立ち、かつ／または個体におけるＡＤＰＫＤの発症の可能性を予測する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ−Ｅ】図1A〜Eは、ＰＫＤ１コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３３２４３）（配列番号１）を示す。
【図２Ａ−Ｂ】図2A〜Bは、ＰＫＤ２コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ００４８５９−ＡＦ００４８７３）（配列番号４）を示す。
【図３Ａ−Ｔ】図３A〜Tは、本発明の一実施形態に記載の野生型ＰＫＤ１  ｃＤＮＡコード配列を示す。エクソンとＰＣＲ産物の接合がヌクレオチド配列上に示され、アミノ酸が各コドンの中央の下部に位置づけられる。
【図４Ａ−Ｄ】図4A〜Dは、本発明の一実施形態に記載の野生型ＰＫＤ２  ｃＤＮＡコード配列を示す。エクソンとＰＣＲ産物の接合がヌクレオチド配列上に示され、アミノ酸が各コドンの中央の下部に位置づけられる。
【図５】図5は、ＰＫＤ１リピートおよびＣ−レクチンドメインに作用するミスセンス変異を図示する。コンセンサス配列を破壊する変化は赤色（黒色の網掛け）であり、破壊することのない変化は黄色（薄い網掛け）である。コンセンサス配列コードは、１（脂肪族）、ａ（芳香族性）、ｃ（帯電性）、ｓ（小さい残基）、ｐ（極性残基）、ｂ（大きい残基）、ｈ（疎水性）であり、大文字は対応するアミノ酸コドンを表す。示されるミスセンス変化が潜在的に病原性がある場合のＰＫＤリピート（５Ｂ）およびＣ−レクチンドメイン（５Ｃ）のリボンダイヤグラムを示す。
【図６】図6は、示される各アミノ酸置換のＭ（ミスセンス）またはＰ（多型）の位置を伴うＰＫＤ１変異ポリペプチドの概略図ならびに各変異タンパク質における完全長のフラッグ−タグ化ＰＫＤ１コンストラクトおよび任意の切断産物のウエスタンブロットの写真を図示する。ＦＬ：完全長、ＮＴＦ：ＰＫＤ１のＮ末端切断断片、ＣＴＦ；ＰＫＤ１のＣ末端切断断片。
【図７Ａ−Ｂ】図7A〜Bは、同定されたすべてのＰＫＤ１（５Ａ）およびＰＫＤ２（５Ｂ）の変異を図示する概略図である。番号１〜１１３は表８における変異の識別子を示す。
【図８Ａ−Ｂ】図8A〜Bは、ポリシスチン−１（ＰＣ−１）（８Ａ）およびポリシスチン−２（ＰＣ−２）（８Ｂ）の概略図である。病原性（クラスＩおよびクラスＩＩ、実施例を参照）変異の位置が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＰＫＤ遺伝子は、染色体位置１６ｐ１３．３（ＰＫＤ１）または染色体位置４ｑ２１〜２３（ＰＫＤ２）にマッピングされたゲノムＤＮＡ配列であり、ＰＫＤ１およびＰＫＤ２タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ分子を生じさせる。ＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子は、配列番号１および配列番号４の配列を各々含み、それらはイントロンおよび推定上の調節配列を含む。ＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子配列は、多数の他の遺伝子のように、個体間で比較される場合、遺伝子発現または遺伝子産物の発現および／もしくは機能に作用することのない配列変異を示す。
【００１２】
ＰＫＤ１遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３９８９１、配列番号７）は、染色体１６（１６ｐ１３．３）上の約５４ｋｂのゲノムＤＮＡの範囲に及び、１４ｋｂ  ｍＲＮＡの転写の元となる４６のエクソンに分かれる１２，９０６塩基対のコード配列を有する。ＰＫＤ１のタンパク質産物、ポリシスチン−１（ＰＣ−１）（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ３７５７６、配列番号３）は予測される質量が４６０ｋＤａの４３０３個のアミノ酸のタンパク質であり、細胞膜で多タンパク質複合体を形成しかつ細胞−細胞および細胞−マトリックスシグナル調節において機能すると考えられる（アーノルド  Ｔ．（Ａｒｎｏｕｌｄ  Ｔ．）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７３：６０１３−６０１８頁、１９９２年；パーネル  Ｓ．Ｃ．（Ｐａｒｎｅｌｌ  Ｓ．Ｃ．）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：１９５６６−１９５７２頁、２００２年；ブニア  Ａ．Ｋ．（Ｂｈｕｎｉａ  Ａ．Ｋ．）ら、Ｃｅｌｌ、１０９：１５７−１６８頁、２００２年；ナウリ  Ｓ．Ｍ．（Ｎａｕｌｉ  Ｓ．Ｍ．）ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３３：１２９−１３７頁、２００３年）。約７５％のＰＫＤ１遺伝子は複製され、その相同コピーと約９７％の同一性を共有する。反復領域は、最初から３４のエクソンを有する遺伝子の５０ｋｂ（５’）部分を包含する。エクソン３５〜４６を有する遺伝子の３’末端の５．７ｋｂのみがＰＫＤ１に固有である。ＰＫＤ１遺伝子の別の注目すべき特徴は、ヒトゲノム内で最長といわれる２．５ｋｂ長のイントロン２１におけるポリピリミジン管（ｔｒａｃｔ）である。
【００１３】
ＰＫＤ２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ００４８５９（エクソン１）〜ＡＦ００４８７３（エクソン１５）、配列番号４を参照）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ５０９２８も参照）は、６８ｋｂのゲノムＤＮＡの範囲に及び、染色体４上に位置する（４ｑ２１〜２３）。ＰＫＤ２は、１５エクソンを有し、約１１０ｋＤａの９６８個のアミノ酸のタンパク質産物、ポリシスチン−２（ＰＣ−２）の生成元である５．４ｋｂの転写産物（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００２９７を参照）をコードする（配列番号６）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ００２８８も参照）。ポリシスチン−２は、ＰＣ−１のカルボキシ末端と相互作用することが示されており、ＰＣ−１との複合体における陽イオンチャネルとして機能する（ゴンザレス−ペレット  Ｓ．（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｒｅｔｔ  Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１８２−１１８７頁、２０００年；ヴァシレブ  Ｐ．Ｍ．（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  Ｐ．Ｍ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８２：３４１−３５０頁、２００１年；コウレン  Ｐ．（Ｋｏｕｌｅｎ  Ｐ．）ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：１９１−１９７頁、２００２年；ハナオカ  Ｋ．（Ｈａｎａｏｋａ  Ｋ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９９０−９９４頁、２０００年）。ＰＫＤ２は、ＰＫＤ１と異なり単一コピー遺伝子であることから、その分析ははるかにより容易なものになる。ＰＫＤ遺伝子の概要については表１を参照のこと。ＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子、遺伝子およびタンパク質の変化ならびにそれらを検出する方法についてのさらなる考察が、米国特許出願公開第２００６／０２４６５０４号明細書、米国特許出願公開第２００３／０００８２８８号明細書、国際公開第２００２／００６５２９号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／０１７３９９号明細書、米国特許第７，０８３，９１５号明細書、米国特許第６，０３１，０８８号明細書、米国特許第６，２２８，５９１号明細書、米国特許出願公開第２００７／０１６６７５５号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１００８９８号明細書、米国特許第６，９１６，６１９号明細書、米国特許第６，６５６，６８１号明細書、米国特許第６，４８５，９６０号明細書、米国特許第６，３８０，３６０号明細書および国際公開第１９９５／０１８２２５号パンフレット（すべては参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
【００１４】
【表１】
2009544314.tif 000002
【００１５】
ＰＫＤ遺伝子の分析
対象由来の試料から得られるゲノムＤＮＡは、１つまたは複数のＰＫＤに特異的な増幅産物（例えば長距離ＰＫＤ増幅産物）を生成するための鋳型として用いられうる。ＤＮＡ試験は、（例えば連鎖研究において家系員が用いられうる場合）単離された個体に対して遺伝子情報を提供する可能性を有することから有利である。変異が正常なハプロタイプ上でかつ／または他のアミノ酸を切断する変異との組み合わせで検出されていることから、個体におけるＰＫＤ遺伝子の両コピーであれば、分析／配列決定により真の遺伝子変異が同定されるはずである。
【００１６】
試料は、標的核酸（例えばＰＫＤ遺伝子を含む核酸）を有する自然環境から単離される生物学的材料でありうるとともに、精製または単離された核酸からなりうるかまたは標的核酸を含有する組織試料、体液試料、または細胞試料などの生物学的試料を含有しうる。組織試料の収集は、個体の組織由来の培養されたヒト細胞のインビトロでの収集あるいは例えば採血、脊椎穿刺、組織塗抹または組織生検によりインビボで対象から直接サンプリングする任意の手段も含む。場合により、組織試料は、抗凍結剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、またはプロパンジオール−スクロースの存在下での、分析可能な条件、例えば迅速な凍結、または制御された凍結レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）の下で試料の核酸を保護する周知の保存手段により分析前に保存されうる。組織試料はまた、分析のための増幅を目的として保存前または保存後にプールされうる。いくつかの実施形態では、試料は２種以上の異なる個体に由来するＤＮＡ、組織または細胞を含有する。別の実施形態では、ＰＫＤ遺伝子の分析に必要な試料の量は試料のタイプに依存し（例えば血液については５ミリリットル超）、この量は当業者により評価されるのが最もよい。好ましくは、無菌技術を用いてこれらの試料を得ることによりその汚染を回避する。
【００１７】
ゲノムＤＮＡを特定の試料から単離する方法は、周知であり、日常的なものである（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、１９８９年を参照）。特定の実施形態では、ゲノムＰＫＤ  ＤＮＡの増幅は、例えばＰＫＤ遺伝子のエクソンおよびイントロンの分析が可能であることを含め、ｃＤＮＡの増幅プロセス全体にわたって利点を有する。このようにして、ＰＫＤ遺伝子のイントロンまたはエクソン配列のいずれかに関連性がある目的の標的配列が増幅されかつ特徴づけられうる。目的の標的配列は、ＰＫＤ関連障害または疾患（例えばＡＤＰＫＤ）に相関する変化を含むヌクレオチド配列の変化を有するかまたは有すると考えられるＰＫＤ遺伝子の任意の配列または遺伝子座である。
【００１８】
ＰＫＤ遺伝子内での変異は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、自己持続配列複製、転写増幅系、Ｑ−βレプリカーゼ、または任意の他の核酸増幅方法を含む増幅とその後の増幅産物の検出により検出可能である。したがって、一実施形態では、全血から抽出されるゲノムＤＮＡは、ＰＫＤ１全体が複製された領域を包含する８つのセグメントの長距離増幅による極めて特異的なＰＫＤ１遺伝子の増幅における鋳型としての役割を果たす。特異的な長距離増幅により、本来であれば分析が困難になるＰＫＤ１相同体の誤った増幅が阻止される。これらのＰＫＤ１相同体は、ＰＫＤ１に密接な関連性があるが、発現されたＰＫＤ１遺伝子産物をコードすることのない配列である。実際、ＰＫＤ１遺伝子の分析は、主に、染色体１６（１６ｐｌ３．１）沿いのＰＫＤ１に隣接してマッピングされた、ＰＫＤ１遺伝子に相同性が高いコピーが少なくとも３つ存在することから、遺伝分析に対して感度は高くなかった。これらのＰＫＤ１遺伝子相同体の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００２０３９、ＡＣ０１０４８８、ＡＣ０４０１５８、ＡＦ３２０５９３およびＡＦ３２０５９４（これら各々は参照により本明細書中に援用される）に含まれる。染色体位置１６ｐ１３．１または４ｑ２１〜２３にマッピングされたかかる相同体の数例が、同定されかつ配列決定されている。ＰＫＤ１相同体は、真のＰＫＤ遺伝子に対して９５％を超える配列同一性を共有しうる。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）増幅が、先行する増幅反応における増幅産物を鋳型として用いて実施される。好ましくは、入れ子増幅反応は、先行するＰＣＲ反応からのＰＣＲ増幅産物を鋳型として用いる入れ子ＰＣＲである。プライマーのアニーリング温度の最適化に加えて「入れ子」増幅を用いることで、ＰＫＤに特異的な増幅アッセイの特異性および感受性の増大が可能である。例えば、入れ子ＰＣＲを含む方法は、２つの連続ＰＣＲ反応を含みうる。少なくとも１つのＰＫＤに特異的なプライマー（例えば、ＰＫＤに特異的なプライマーと対照プライマーまたは２つのＰＫＤに特異的なプライマー）を含む第１のプライマー対を用いるＰＣＲの複数のサイクル（例えば１０〜４０もしくは１０〜３０もしくは１０〜２０サイクル）後、１回目の反応における少量の一定分量（例えば、５０μｌの反応における１μｌ）が、第１の対の内部にあるかまたはその間で入れ子構造をした配列にアニールする、少なくとも１つのＰＫＤに特異的なプライマー（例えば、ＰＫＤに特異的なプライマーと対照プライマーまたは２つのＰＫＤに特異的なプライマー）を含む新しいプライマーセットを用いたＰＣＲ反応の複数のサイクル（例えば１０〜４０もしくは１０〜３０もしくは１０〜２０サイクル）を含む２回目における鋳型の役割を果たす。
【００２０】
特定の実施形態では、上記の８つの長距離ＰＣＲ産物は、４３の入れ子ＰＣＲ反応における鋳型としての役割を果たし、ＰＫＤ１遺伝子のエクソン１〜３４をカバーする。ＰＫＤ１遺伝子に固有領域（エクソン３５〜４６）およびＰＫＤ２遺伝子全体は、２８の追加の遺伝子セグメントとしてゲノムＤＮＡから増幅される。入れ子ＰＣＲ法を用い、増幅が奏功した鋳型はＰＫＤ特異性に対して２回選択される。単一のプライマー対の機能が自然に失われる場合、入れ子ＰＣＲの使用により、種特異的な産物の収量や、ひいてはアッセイの感受性も大幅に増大する可能性がある。
【００２１】
プライマーを設計しかつＰＣＲを実施するための方法は当該技術分野で既知である（「分子生物学  最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、上記を参照）。プライマーを選択するための一般的基準は、長距離ＰＣＲと入れ子ＰＣＲの双方におけるプライマーに適用される。入れ子ＰＣＲにおけるプライマーに関しては、両方の入れ子プライマーであれば、第１のプライマー対の内側の（例えばその内部の）配列および少なくとも１つの入れ子プライマーにアニールする必要がある。ＰＫＤ１相同体の意図されない増幅を排除するいくつかのＰＫＤ１に特異的なプライマーが開発されている（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００３／０００８２８８号明細書を参照）。「ＰＫＤに特異的な」プライマーが特定のストリンジェントな条件下で（イントロンおよびエクソンを含む）ＰＫＤ遺伝子内部の配列にアニールする核酸配列となる場合、他のかかるプライマーの設計が可能である。ＰＫＤに特異的なプライマーは、特定のストリンジェントな条件下で、真に発現されたＰＫＤ１遺伝子内に存在する固有部位にアニールし、ＰＫＤ１相同体または他の配列にアニールすることがない。したがって、ＰＫＤに特異的なプライマーは、これらの固有のＰＫＤ部位を用いて設計可能である。固有部位の長さは、数個のヌクレオチドから数千個のヌクレオチドまで変化しうる。同定されている大部分の固有部位は、１００個以下のヌクレオチド、例えば、５０個以下のヌクレオチド、または３０個以下のヌクレオチドを含む。ＰＫＤに特異的なプライマーを用いる増幅により増幅反応の特異性が高まり、ＰＫＤ相同体から増幅された副産物の量が減少する。プライマーは１０〜６０ヌクレオチド長、例えば１８〜５２ヌクレオチド長でありうる。
【００２２】
７１のＰＣＲ産物が双方向に配列決定されることで、ヌクレオチド配列の変化が検出される。特定の実施形態では、すべてのＰＣＲプライマーがタグ（例えばＭ１３フォワードおよびリバースプライマー配列）を含むことで、同じプライマーを用いた全断片の双方向の配列決定が可能になる。ＤＮＡを配列決定する方法は当該技術分野で周知であり、プライマー位置および／または断片長に依存する。例えば、一実施形態では、配列決定はＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターの化学反応後にＡＢＩ  ３７３０キャピラリーシーケンサー上での電気泳動を用いて実施される。本発明のヌクレオチドの変化をＰＫＤ配列内で検出し、既に発症しているかまたは発症しうるＡＤＰＫＤの評価が可能である。同定される新規な変化は、疾患関連変異、例えばフレームシフトまたはナンセンス変異または変異のないスプライス部位の変化として臨床的に解釈されうる。良性の多型であれば、サイレントまたは保存的ミスセンス変異、イントロン変異体および同義語コドンの変化を含むことになる。
【００２３】
ＰＫＤ遺伝子内での配列の変化は、変性高性能液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を用いても検出可能である。ＤＨＰＬＣを用い、（変異の存在から生じる）ヘテロ二本鎖と同じ塩基対長を有するホモ二本鎖を分離することにより、配列変異体が検出されている。この分離は、ヘテロ二本鎖がホモ二本鎖よりも低い融解温度（Ｔｍ）を有するという事実に基づく。ＤＨＰＬＣでは、特定の条件下でわずか１塩基対だけ異なるヘテロ二本鎖の分離が可能である。「ヘテロ二本鎖部位分離温度」または「中間温度」または「Ｔｍ」は、１つまたは複数の塩基対がヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片内の塩基対ミスマッチの部位で変性する、すなわち分離する温度を意味するように本明細書中で定義される。ＤＨＰＬＣが塩基対ミスマッチの部位で部分的に変性する温度、すなわちヘテロ二本鎖を変性するのに十分な温度で実施される場合、ホモ二本鎖は、同じ塩基対長を有するヘテロ二本鎖から分離され、かつ様々な方法（例えばゲル電気泳動）によって検出されうる。ＤＨＰＬＣを用い、異なる塩基対長を有する二本鎖を分離することも可能である。
【００２４】
同定されたＰＫＤヌクレオチドの変化の評価
ＰＫＤにおける極めて多数の新規なヌクレオチドの変化が同定されている（表４〜７を参照）。次いで、これらの配列の変化を評価することで病原性があるか否かが判定され、この結果、改変されたＰＫＤ遺伝子産物（例えばタンパク質、ポリペプチド）が得られた。「ヌクレオチド配列の変化」または「ヌクレオチドの変化」または「変異」は、正常なＰＫＤ遺伝子（例えば配列番号１、配列番号７または配列番号４）に対する、１つまたは複数の置換（転位またはトランスバージョン）、欠失（遺伝子座の欠失を含む）、挿入（複製を含む）、転座、逆位および／または他の修飾を含むヌクレオチド配列の修飾を示す。したがって、ＰＫＤ１またはＰＫＤ２ヌクレオチド配列（例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ）におけるヌクレオチドの改変／変化は、欠失、挿入、置換または逆位でありうるか、またはＰＫＤポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドのリーディングフレームにおいて全く変化が存在しないようなサイレントでありうる。病原性変異は、アミノ酸の変化（例えば、サイレントでないかまたは非保存性の変化）をもたらし、かつ／または停止コドンをヌクレオチド配列に導入するかまたはＰＫＤ１またはＰＫＤ２ヌクレオチド配列の転写または翻訳に関与するヌクレオチド配列を変化させる核酸の変化であり、例えばＰＫＤ１またはＰＫＤ２遺伝子転写産物のｍＲＮＡへの改変されたスプライシングをもたらす変化である（図７Ａおよび７Ｂを参照）。「アミノ酸の変化」は、正常なＰＫＤアミノ酸配列（例えば配列番号３または配列番号６）に対する、置換、フレームシフト、欠失、切断および挿入、および／または他の修飾を含むアミノ酸修飾を示す。したがって、ＰＫＤ遺伝子配列内での変異は、切断されたＰＫＤポリペプチドの発現またはＰＫＤポリペプチドの発現の完全な低下までももたらしうる。
【００２５】
それに対し、多型性変異または変異体は、ＰＫＤタンパク質／ポリペプチドを上記の方法で改変することがない、かつ／または改変すると予想されない、ならびに／あるいはＡＤＰＫＤなどのＰＫＤ関連疾患の徴候または症状と相関することがない核酸の変化である（表８および９を参照）。これらの変異は、例えば、コードされたアミノ酸の変化をもたすことのないヌクレオチド置換、すなわちサイレント変異を含み、ここでは野生型（例えば配列番号１、７または４を参照）と変異体コドンの双方は同じアミノ酸をコードし、それらは疾患の場合に分離することがないものかまたは１群の未罹患個体内で見出されるものである。ＰＫＤポリペプチドの二次構造および耐水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｎａｔｕｒｅ）であればこれらの変異により実質的に変化しないと予想されるため、野生型アミノ酸（例えば配列番号３または６を参照）が類似の特性を有する別のアミノ酸と置換される保存性アミノ酸置換を引き起こす核酸の変化は非病原性の多型性変異でもありうる。一般に、アミノ酸置換の以下の群、すなわち（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが保存的であると考えられる。次いで多型は、ＰＫＤ変異に関しては、（ｉ）アミノ酸を改変すると予測されていない配列変異体；（ｉｉ）少なくとも１個体内でのホモ接合性にて見出されるミスセンス変化；（ｉｉｉ）未知の重要性があるイントロン配列；または（ｉｖ）未知の重要性がある３’ＵＴＲの変化として定義される。したがって、多型性変異であれば、依然として適切に発現されかつ／または完全に機能的であるＰＫＤタンパク質／ポリペプチドをもたらすと予想されることになり、すなわちこれらの変異体であればＡＤＰＫＤに関連性があると予想されないことになる。
【００２６】
ＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子内で同定されたヌクレオチド配列の変化における病原性については多数の方法で評価可能である。変異ＰＫＤヌクレオチド配列と野生型ＰＫＤ配列（配列番号１および４）との比較が可能であり、かつ、核酸配列の変化のアミノ酸コドンに対する効果が評価可能である。例えば、停止コドン（例えばＵＧＡ、ＵＡＡ、ＵＡＧ）またはフレームシフトを生成するヌクレオチド配列の変化は、一般にナンセンスポリペプチドを生成しかつ／または停止コドンも生成するか、あるいはコンセンサスドナー／アクセプタのスプライス部位を改変するヌクレオチド配列の変化であれば、非機能性のＰＫＤタンパク質、切断されたＰＫＤタンパク質を生成するか、またはその発現を完全に失わせることになる。これらの変異であれば病原性があると予想されることから、この変異はＡＤＰＫＤと相関する。
【００２７】
停止コドン、フレームシフトまたはスプライス部位変異をもたらすことのないＰＫＤ核酸配列の変化についても、変異ＰＫＤアミノ酸配列を様々な種由来の野生型ＰＫＤアミノ酸配列と比較し、変化が数種を通じて保存されるアミノ酸残基に作用するか否かを判定することにより評価可能である。特に、アミノ酸の変化（すなわちミスセンス変異）または場合により１つまたは複数のアミノ酸残基の完全な欠失（すなわちインフレーム欠失；表５も参照）の原因となるいくつかの隣接ヌクレオチド残基の欠失（例えば３、６もしくは９ヌクレオチドの欠失）であれば、依然として発現されるＰＫＤポリペプチドが生成されることになる。数種（例えば、ヒト、イヌ、マウス、魚、ショウジョウバエ、線虫など）を通じて保存されるアミノ酸残基の変化または欠失は、「保存された」アミノ酸残基が同一であるかまたは類似の特性を有するものである場合（例えば、ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ）、アミノ酸残基がＰＫＤタンパク質の機能にとって重要／重大であることを明示することになる。したがって、かかるＰＫＤの変異であっても、ＡＤＰＫＤと関連性がありかつ／またはそれを予測するものであることが予想されうる。
【００２８】
さらに、ＰＫＤ核酸配列に対する変化、特にミスセンス変異をもたらすものの予測／評価に利用可能なアルゴリズムもいくつか存在する。これらのアルゴリズムは、例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）／クマー（Ｋｕｍａｒ）マトリックス（ミラー  Ｍ．Ｐ．（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ．Ｐ．）およびクマー  Ｓ．（Ｋｕｍａｒ  Ｓ．）、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０（２１）：２３１９−２３２８頁、２００１年）；「Ｇｒａｎｔｈａｍ’ｓ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｔｒｉｘ；Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／；Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＳＳＰＮＮ）（レーゼ  Ｍ．Ｇ．（Ｒｅｅｓｅ  Ｍ．Ｇ．）ら、Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ４（３）：３１１−３２３頁、１９９７年も参照）、ｈｔｔｐ：／／ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ．ｓｅｑｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ；Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（ＡＳＳＡ）（ナラ  Ｖ．Ｋ．（Ｎａｌｌａ  Ｖ．Ｋ．）ら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２５（４）：３３４−３４２頁、２００５年およびロガン  Ｐ．Ｋ．（Ｒｏｇａｎ  Ｐ．Ｋ．）ら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １２（３）１５３−１７１頁、１９９８年も参照）、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｐｌｉｃｅ．ｃｍｈ．ｅｄｕ／；Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＳＭＡＲＴ）、ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ．ｄｅ；Ｐｆａｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／；ＭＤＲＤ方程式：ｈｔｔｐ：／／ｎｅｐｈｒｏｎ．ｃｏｍ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＭＤＲＤＳＩ．ｃｇｉ；Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ＩＩ（ＰＳＯＲＴ  ＩＩ）（クログ  Ａ．（Ｋｒｏｇｈ  Ａ．）ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：５６７−５８０頁、２００１年も参照）、ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｆｏｒｍ２．ｈｔｍｌ；およびＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｈｅｌｉｃｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ＴＭＨＭＭ）、（グリム  Ｄ．Ｈ．（Ｇｒｉｍｍ  Ｄ．Ｈ．）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３６７８６−３６７９３頁、２００３年も参照）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ．ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／を含む。これらや他のアルゴリズムは、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造、機能およびモチーフの予測による、変異（例えばミスセンス変異）が多型に対する病原性の変化を表すという可能性の判定に役立ちうる。
【００２９】
病原性の有無が定かでないＰＫＤ変異をさらに評価する場合、人種的に多様な非罹患個体の集団に由来する完全な配列情報を含むデータセットによっても容易となりうる。かかる集団に由来する正常または野生型のＰＫＤ１およびＰＫＤ２配列情報であれば、対照集団内での配列変異体の存在または不在を評価しかつ既知の非病原性の配列変異体のスペクトルを拡張するのに同定された新規なＰＫＤ変異との比較にとって有用な対照となる。同定されているＰＫＤ変異に対する比較対象のかかるデータセットを有するのであれば、診断的かつ予後的に、特にＡＤＰＫＤを有する確率が５０％未満である個体（例えばＡＤＰＫＤを有する個体の子孫および／または同胞でない個体）の分析において有利となる。
【００３０】
ＰＫＤ遺伝子内での変異ＰＫＤ遺伝子産物に対する効果は、保有するポリヌクレオチドまたは作成されたポリヌクレオチド（例えば組換えポリヌクレオチド）を発現させて同定された変異を得ることにより評価および／または確認がなされうる。ポリヌクレオチドは変異ＰＫＤポリペプチドまたは組換え核酸分子の一部を含む可能性があり、それは例えば融合ＰＫＤタンパク質（例えばタグ化ＰＫＤタンパク質）をコードしうる。変異ポリヌクレオチドまたは組換え核酸分子はベクターに挿入可能であり、それは発現ベクターでありうるとともにプラスミド、ウイルスなどから誘導可能である。発現ベクターは、一般に、複製の開始点、プロモーター、およびベクターを有する形質転換細胞の表現型選択を可能にする１つまたは複数の遺伝子を有する。使用に適する発現ベクターは当該技術分野で周知であり、例として細菌内での発現用のＴ７に基づく発現ベクター、哺乳類細胞内での発現用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクターまたは昆虫細胞内での発現用のバキュロウイルス由来ベクターなどが挙げられる。ベクターの選択は、ポリヌクレオチド配列のサイズおよび用いられるべき宿主細胞に依存することになる。したがって、本発明の方法において用いられるベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルスなど）、またはその選択された部分（例えばコートタンパク質、スパイク糖タンパク質、キャプシドタンパク質）でありうる。例えば、コスミドおよびファージミドは、これらのベクターが大きいポリヌクレオチドを安定的に伝播可能であることから、典型的には分析または修飾対象の特定の核酸配列が大きい場合に用いられる。コスミドおよびファージミドは、特にＰＫＤポリヌクレオチド（例えば配列番号１）または変異ＰＫＤ１ポリヌクレオチドの発現または操作に適する。
【００３１】
種々の宿主−発現ベクター系は、野生型ＰＫＤポリヌクレオチド配列（例えば配列番号１または配列番号４）、ＰＫＤコード配列（例えば配列番号２または配列番号５）および変異体または変異ＰＫＤ１もしくは変異ＰＫＤ２ポリヌクレオチドを発現するのに用いられうる。特定の実施形態では、ＰＫＤポリヌクレオチドをタグ化することで（例えば、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ビオチン、ストレプトアビジン（streptavadin）、アビジン（avadin）など）、ＰＫＤポリペプチドの暴露後での精製および／または画像化が促進される。かかる宿主−発現系は、目的のヌクレオチド配列の生成とそれに続く精製を媒介する媒体を表し、かつ、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入される場合に、原位置でＰＫＤ変異体またはその変異ポリペプチドもしくはペプチド部分を含むＰＫＤタンパク質を発現しうる細胞も表す。かかる細胞は、限定はされないが、ＰＫＤ１ポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分（野生型、変異体または他の変異体）を有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；ＰＫＤポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分（野生型、変異体または他のＰＫＤ変異体）を有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ））；ＰＫＤポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分（野生型、ＰＫＤ変異体または他の変異体）を有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）で感染されるかまたは変異ＰＫＤポリヌクレオチドもしくはそのオリゴヌクレオチド部分を有する組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を有する組換え発現コンストラクトを内在する哺乳類細胞系（例えばＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、３Ｔ３）などの微生物を含む。ＰＫＤポリヌクレオチドにおけるベクターおよび発現系についてのさらなる考察が、例えば米国特許出願公開第２００３／０００８２８８号明細書中に見出されうる。
【００３２】
例えば、細胞−細胞および細胞−マトリックス接合での細胞表面のシグナル伝達受容体や腎細胞内でのメカノセンサとして機能すると考えられているＰＫＤ１遺伝子産物のポリシスチン−１（ＰＣ−１）は、長いＮ末端細胞外領域および短い細胞質テールを有する１１−膜貫通糖タンパク質である（ボレッタ  Ａ．（Ｂｏｌｅｔｔａ  Ａ．）およびゲルミノ  Ｇ．Ｇ．（Ｇｅｒｍｉｎｏ  Ｇ．Ｇ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３（９）：４８４−４９２頁、２００３年；ハリス  Ｐ．Ｃ．（Ｈａｒｒｉｓ  Ｐ．Ｃ．）およびトレス  Ｖ．Ｅ．（Ｔｏｒｒｅｓ  Ｖ．Ｅ．）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｎｔｅｎｓ  １５（４）：４５６−４６３頁、２００６年；ナウリ  Ｓ．Ｍ．（Ｎａｕｌｉ  Ｓ．Ｍ．）ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３３（２）：１２９−１３７頁、２００３年；ヒュー  Ｊ．（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｊ．）ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １０（２）：１５１−１６０頁、１９９５年）（図８Ａも参照）。ＰＣ１は、目的のいくつかのアミノ酸配列モチーフ（例えば、卵ゼリーの受容体（ＲＥＪ）ドメイン、Ｇ−タンパク質共役受容体タンパク質分解部位（ＧＰＳ）、Ｃ型レクチンドメイン、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、多発性嚢胞腎疾患リピート（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｐｅａｔ）（ＰＫＤ−Ｒ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、コイルドコイルドメイン（ＣＣ））を有する（図４も参照）。ＰＣ−１機能／活性の評価にとって有用な部位は、ＰＣ−１タンパク質が切断を受ける部位のＧＰＳドメインである（チェン  Ｆ．（Ｑｉａｎ  Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９（２６）：１６９８１−１６９８６頁、２００２年）。ＰＣ１のこの部位での切断によりＮ末端断片（ＮＴＦ）およびＣ末端断片（ＣＴＦ）が生成され、この切断は正常なＰＣ−１機能にとって重要である（チェン  Ｆ．（Ｑｉａｎ  Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２４：９９（２６）：１６９８１−１６９８６頁）。したがって、ＰＫＤ１遺伝子産物の発現および切断を用い、同定されたＰＫＤ１の変異、特にミスセンス変異の病原性の評価が可能である。ＰＫＤ１変異体は（例えば発現ベクター内での）作成や上記の方法での（例えば組換え的にタグ化された融合タンパク質としての）発現が可能であり、かつＰＫＤ１変異体産物の切断については（例えば免疫沈降および／またはウエスタンブロット、タグの蛍光、放射活性などにより）アッセイ可能である。
【００３３】
ＰＫＤ変異を評価するための上記の方法のうちの１つまたは複数を用い、同定されているＰＫＤ１またはＰＫＤ２遺伝子の変異が良性の多型であるかまたは病原性があるかが判定可能であることから変異がＡＤＰＫＤに関連する可能性があり、次いでそれらを用い、例えば本発明の方法においてＡＤＰＫＤを診断または予測することが可能である。
【００３４】
本発明の方法
病原性があると同定されかつ判定されたＰＫＤ変異が表４〜７に列挙される。これらの変異を本発明の方法において用いると、個体におけるＡＤＰＫＤの発症が検出または予測されるかあるいは個体における変異ＰＫＤ遺伝子の存在または不在が検出される。詳細には、個体から得られる核酸試料中の配列番号１または配列番号７のヌクレオチド配列を有するＰＫＤ１遺伝子内での１つまたは複数の同定されたヌクレオチド配列の変化の存在を検出することにより、ＡＤＰＫＤが検出されるかまたはＡＤＰＫＤの発症が予測される。同様に、ＡＤＰＫＤは、本発明の方法を用い、個体から得られる核酸試料中の配列番号４のヌクレオチド配列を有するＰＫＤ２遺伝子内での１つまたは複数の同定されたヌクレオチド配列の変化の存在を検出することにより、個体において検出または予測されうる。ＡＤＰＫＤに関連性があるＰＫＤ遺伝子内でのいくつかの変異が単一の個体／家系に限って検出されていることから（例えば表７を参照）、上に列挙されていないＰＫＤ１遺伝子（例えば配列番号１または７）および／またはＰＫＤ２遺伝子（配列番号４）におけるこれらの他のヌクレオチド配列の変化（発明の概要および表４〜７を参照）は本発明の方法においても検出可能である。本方法は、上記の１つまたは複数の方法（例えばＤＮＡ単離方法／キット）および／または１つまたは複数の方法（例えば配列決定、ＰＣＲ、ＤＨＰＬＣ）により個体由来の試料（例えば体液、組織、細胞）を得ることによって実施可能である。
【００３５】
さらに、本発明は、上記の方法（例えばＤＮＡ単離方法／キット）により個体由来の核酸試料（例えば、体液、組織または細胞試料）を得ることによって個体における変異ＰＫＤ遺伝子の存在または不在を検出する方法と、１つまたは複数の上記の方法（例えば配列決定、ＰＣＲ、ＤＨＰＬＣなど）の使用によりＰＫＤ１またはＰＫＤ２遺伝子内での１つまたは複数の同定されたヌクレオチド配列の変化の存在または不在を検出する方法に関する。特定の実施形態では、１つまたは複数の同定されたＰＫＤヌクレオチド配列の変化の検出は、個体がＡＤＰＫＤを有するかまたはＡＤＰＫＤを発症することになることを示す。
【実施例】
【００３６】
患者の募集および臨床評価
８２の血縁関係を持たないＡＤＰＫＤ患者を腎臓の外来診療所から募集した。ジョンズ・ホプキンス（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ）の治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ）が試験を承認し、各患者からインフォームドコンセントを得た。ＡＤＰＫＤの診断は、確立された超音波基準（ラヴィン（Ｒａｖｉｎｅ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２：３４３（８９０１）：８２４−７頁、１９９４年に記載）に基づくものであった。詳細な病歴については、各参加者から試験への参加時に得た。コード化した血液試料を各発端者から収集し、変異分析のためにアテナ・ダイアグノスティクス社（Ａｔｈｅｎａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に送った。たいていの場合、定期的な実験室データは標準的な医学的評価の一部として得られた。
【００３７】
試験集団のベースライン特性を表２にまとめる。試験参加者の平均年齢は４６．５歳であった。変異分析の実施時にＥＳＲＤに達したのは２２％に過ぎなかった。ＥＳＲＤに達しなかった参加者における平均糸球体濾過率（ＧＦＲ）は６８ｍｌ／分であった。家族歴は、患者の３４％において未知かまたはＡＤＰＫＤに対して陰性のいずれかであった。
【００３８】
変異分析
患者試料のＤＮＡ配列分析を、過去に詳細な記載がなされ、アテナ・ダイアグノスティクス社（Ａｔｈｅｎａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で最適化された方法を用いて行った（ワトニック  Ｔ．Ｊ．（Ｗａｔｎｉｃｋ  Ｔ．Ｊ．）ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６（９）：１４７３−１４８１頁、１９９７年；ワトニック  Ｔ．Ｊ．（Ｗａｔｎｉｃｋ  Ｔ．Ｊ．）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２（２）：２４７−２５１頁、１９９８年；ワトニック  Ｔ．（Ｗａｔｎｉｃｋ  Ｔ．）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５（６）：１５６１−１５７１頁、１９９９年；ファクデーキッチャロエン  Ｂ．（Ｐｈａｋｄｅｅｋｉｔｃｈａｒｏｅｎ  Ｂ．）ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５８（４）：１４００−１４１２頁、２０００年；ファクデーキッチャロエン  Ｂ．（Ｐｈａｋｄｅｅｋｉｔｃｈａｒｏｅｎ  Ｂ．）ら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １２：９５５−９６３頁、２００１年）（参考文献は全体が本明細書中に援用される）。例えば、ゲノムＤＮＡは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）のジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））または他の適切な抽出方法を用いて全血から得られる。増幅されたＤＮＡ産物は、ＰＫＤ１複製領域全体を包含する８つのセグメントの極めて特異的な長距離ＰＣＲ増幅における鋳型としての役割を果たし、場合により分析が困難となるＰＫＤ１相同体の増幅が阻止された。８つの長距離ＰＣＲ産物が４３の入れ子ＰＣＲ反応における鋳型としての役割を果たす一方、ＰＫＤ１遺伝子および全ＰＫＤ２遺伝子の固有領域が２８の追加の遺伝子セグメントとしてゲノムＤＮＡから増幅された。ＰＣＲプライマーをＭ１３フォワードおよびリバースプライマー配列でタグ化し、同じプライマーを用いる全断片の双方向の配列決定を可能にした。
【００３９】
次いでＰＣＲ産物を、例えばＡＢＩビッグ・ダイ（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ）（商標）ターミネーターの化学反応（バージョン３．１および１．１、プライマー位置および／または断片長に依存）後にＡＢＩ３７３０キャピラリーシーケンサー（コネティカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）のアプレラ・コーポレーション（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））上での電気泳動を用いて双方向に配列決定した。このプロセスは、高度に保存されたエクソン−イントロンスプライス接合を含む、ＰＫＤ１およびＰＫＤ２遺伝子の全コード領域における配列データを提供する。
【００４０】
正常試料の分析
正常集団を、６５歳を超える匿名の試料から選択し、運動失調試験のためにアテナ・ダイアグノスティクス社（Ａｔｈｅｎａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に送った。最低１７１の個体からのＰＣＲ産物を配列決定し、ＰＫＤ１またはＰＫＤ２のいずれかにおける特定の共通の変異体の頻度を判定した。これらの試料については完全なＤＮＡ分析を行わなかった。
【００４１】
切断試験のためのＰＣ−１変異体コンストラクトの生成
ミスセンス変異体を、例えばクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）（商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いて生成した。完全長の野生型ＰＫＤ１  ｃＤＮＡコンストラクトおよびこのコンストラクトのうちの３つ（Ｑ３０１６Ｒ、Ｆ３０６４Ｌ、Ｆ２８５３Ｓ）については過去に記載がなされており（ハナオカ  Ｋ．（Ｈａｎａｏｋａ  Ｋ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９９０−９９４頁、２０００年；チェン  Ｆ．（Ｑｉａｎ  Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２４：９９（２６）：１６９８１−１６９８６頁、２００２年）、その全体が本明細書中に援用される。
【００４２】
切断アッセイ
コンストラクトを、リポフェクタミン・プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ）（商標）（メリーランド州ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いてＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入後、細胞を、氷上、プロテアーゼ阻害剤（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））の存在下で緩衝液［２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、０．５％トリトンＸ−１００］中に１時間溶解した。細胞溶解液をアンチ−フラグ（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ）（登録商標）Ｍ２ビーズのアフィニティゲル・フリーザー−セイフ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ  Ｆｒｅｅｚｅｒ−Ｓａｆｅ）（シグマ（ＳＩＧＭＡ））を用いて免疫沈降（ＩＰ）し、次いでニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）（登録商標）  ３〜８％トリス−アセテートゲル（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  Ｇｅｌ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上に溶解した。ＩＰ産物を、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）（商標）転写膜（ミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ））上にエレクトロブロットし、α−ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）およびＰＣ１に対するα−Ｃ末端（ＣＴ）抗体でプローブした。これらの抗体については過去に記載がなされている（ボレッタ  Ａ．（Ｂｏｌｅｔｔａ  Ａ．）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１２６７−１２７３頁、２０００年；チェン  Ｆ．（Ｑｉａｎ  Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２４：９９（２６）：１６９８１−１６９８６頁、２００２年）。
【００４３】
結果
ＤＮＡ配列の分散分析により３種の変異体を同定した。クラスＩ変異体を、追加情報なしに診断に用いられる、停止コドン、フレームシフトおよびスプライス部位変化を含む、確実に病原性のある配列変異体を有するものとして定義した（表３、４）。クラスＩＩ変異体は、下記に詳述のように様々なアルゴリズムに基づき病原性がある可能性が高いと判定されたインフレーム欠失またはアミノ酸置換を示すものを含んだ。クラスＩＩＩ変異体は、病原性の変化が全く確認されないものを含んだ。
【００４４】
クラスＩ変異体
４２パーセント（Ｎ＝３４）の試験集団が、停止コドン、フレームシフトまたはスプライス部位変化を有した（表３、４）。これらの変化のうち、２４がＰＫＤ１で生じ（全試料の２９％）、かつ１０がＰＫＤ２で生じた（全試料の１２％）。クラスＩ変異体内で見出された変異は、ＰＫＤ１またはＰＫＤ２タンパク質の早発性の切断を生じることから、ＡＤＰＫＤの場合に分離すると予想された。
【００４５】
クラスＩＩ変異体
参加者３０名が、病原性がある可能性が高いとされるインフレーム欠失または少なくとも１つのアミノ酸置換のいずれかを有した（表５および６）。全部で８つの固有のインフレーム欠失（ＰＫＤ１遺伝子で６つとＰＫＤ２遺伝子で２つ）が検出された（表５）。いずれの場合も、欠失がトラフグ（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）（フグ）およびハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）のポリシスチンタンパク質の間で完全または高度に保存された１つまたは複数の残基に作用した。
【００４６】
固有のイントロン変異体を有する他の切断性のＰＫＤ変異を全く有しない１０の個体が存在した。予測されたスプライス部位変異のうちの２つがコンセンサススプライスドナー／アクセプタ部位に直接作用することがなく、ＪＨＵ５７３およびＪＨＵ５９５は、８４％のドナースプライス部位でグアニンとして高度に保存された残基に作用するイントロン２４のスプライスドナー部位から５番目の塩基対でイントロン変化を有した（ＩＶＳ２４＋５Ｇ＞Ｃ）。ニューラルネットワーク・スプライスサイト（Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ）予測プログラム（ＳＳＰＮ）およびオートメーテッド・スプライスサイト・アナリシーズ（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ａｎａｌｙｓｅｓ）（ＡＳＳＡ）の双方は、かかる変化があればエクソン２４／イントロン２４の境界でスプライスドナー部位の構造を大きく破壊するものとして、これらの変異体が不適切なスプライシングをもたらすことを予測する。ＪＨＵ１０５は、ＰＫＤ２エクソン８のスプライスドナー部位の末端から５番目の塩基対（すなわち、配列番号５のヌクレオチド残基１９６４から下流のイントロン（イントロン８）へ、左から右に数えて５番目のヌクレオチド塩基）で類似の変化（ＩＶＳ８＋５、Ｇ＞Ａ）を有し、そこでは高度に保存されたグアニン残基がアデニンと置換された。さらに、ＩＶＳ３７−１０Ｃ＞Ａ（ＪＨＵ６０４）がヨーロッパ家系におけるＡＤＰＫＤの場合に分離することが過去に報告された（ボグダノヴァ  Ｍ．（Ｂｏｇｄａｎｏｖａ  Ｍ．）ら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １６（２）：１６６−１７４頁、２０００年）。ＪＨＵ５６２は、スプライス部位に作用するＰＫＤ２の病原性変異、ＩＶＳ７−１Ｇ＞Ａ（すなわち、エクソン８の開始点から上流のイントロン（イントロン７）へ、右から左へ数えて１番目のヌクレオチド残基（例えば配列番号５のヌクレオチド残基１７８３）でのグアニンからアデニンへの変化）も有し、その結果、エクソン７においてアクセプタ部位の欠失がもたらされた。
【００４７】
残りの参加者の大部分は、主にＰＫＤ１においてアミノ酸置換の組み合わせを有した。３つの主な基準を用い、各ミスセンス変異体の病原性を判定した。ヒトポリシスチン−１とフグおよびマウスタンパク質の間での改変された残基の保存について試験した。「完全に保存された」と考えられるアミノ酸は３種全部で同一のものであった一方、類似の特性を有する（すなわち同じクラスに属する）アミノ酸を「高度に保存された」残基とした。さらに、各ミスセンス変異体に対して病原性スコアを、ミスセンス変化が病原性の変化に対する多型を表す相対的可能性を定義するミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびクマー（Ｋｕｍａｒ）のマトリックス（ミラー  Ｍ．Ｐ．（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ．Ｐ．）およびクマー  Ｓ．（Ｋｕｍａｒ  Ｓ．）、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １２（２１）：２３１９−２３２８頁、２００１年）を用いて割り付けた。このアルゴリズムは、（結節硬化症および嚢性線維症を含む）７つの疾患遺伝子を通じてのアミノ酸置換変異の共通の属性を判定するためのグランタム（Ｇｒａｎｔｈａｍ）の化学的差異マトリックスと共役された種間配列比較を用いて開発された。他の研究者らは、この方法を用い、アミノ酸置換の特徴づけに役立てている（シャープ  Ａ．Ｍ．（Ｓｈａｒｐ  Ａ．Ｍ．）ら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４２（４）：３３６−３４９頁、２００５年）。最後に、文献をレビューし、変異体のいずれかが未罹患個体において生じることを他によって報告されたか否かを判断した。１つまたは複数の個体においてホモ接合性で検出されたいくつかのアミノ酸置換（Ｎ＝１３、表９）を多型として分類した。生殖系のＡＤＰＫＤ変異がヘテロ接合性であることから、これらの変化のうちの１つであればおそらくは未罹患の親から継承された野生型対立遺伝子に関連するはずであることになる。
【００４８】
患者でグループ分けされた各アミノ酸置換の分析について、表６にまとめる。アミノ酸置換が完全または高度に保存されたアミノ酸残基で生じる場合やミラーおよびクマーのマトリックスを用いてより高い病原性の可能性を有することも予測される場合、アミノ酸置換を病原性があると見なした（表６、灰色の網掛け）。これらの厳しい基準を用い、患者３０名のうちの２４名が１つまたは複数の病原性のあるアミノ酸置換を有した。これらのミスセンス変化のうちの６つが、Ｃ型レクチン（Ｙ４２０Ｃ、Ｙ５２８Ｃ）またはＰＫＤリピート（Ｓ１０４７Ｌ、Ｒ１３４０Ｗ、Ｒ１３５１Ｗ、Ｔ１８６１Ｉ）のうちの１つのいずれかの構造的決定因を破壊することが予測された（図５Ａおよび５Ｂ）。ミスセンス変化のうちの３つ（Ｑ３０１６Ｒ、Ｅ２７７１Ｋ、Ｆ２８５３Ｓ）が正常なポリシスチン−１の機能にとって重要な特性であるポリシスチン−１の切断を破壊することが過去に示された（図６参照）（チェン  Ｆ．（Ｑｉａｎ  Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２４：９９（２６）：１６９８１−１６９８６頁、２００２年）。
【００４９】
病原性における基準を満たす再発性のＰＫＤ１変異体（Ｒ２２００Ｃ、Ｑ７３９Ｒ、Ｇ２８１４Ｒ、Ｑ２１８２Ｒ、Ｇ２３０９Ｒ、Ｒ１３４０Ｗ）が、７個体において観察され、鎖末端での変異または他の予測された病原性のあるアミノ酸置換のいずれかを内在させた他の個体においても見られた（表４、６および７）。例えば、Ｒ２２００Ｃは患者４名、すなわちＪＨＵ５８４、ＪＨＵ６０６、ＪＨＵ１１１およびＪＨＵ５７３において見られた。後者の２個体は各々、ＰＫＤ１のフレームシフト変異およびスプライス部位変異を有した。この関連性は、これらの変化が多型を表すことを示唆した。ミスセンス変異をさらに特徴づけるため、３４２の正常な染色体を配列決定して多型を同定したところ、小さい（１．４％）が多型の閾値である１％よりも大きい画分でＲ２２００Ｃの配列の変化が見られた。同様に、Ｑ７３９Ｒ（この試験で６．４％）およびＧ２８１４Ｒ（ロゼッティ（Ｒｏｓｓｅｔｔｉ）ら、０．９％）についても未罹患集団のほんの一部で報告されており、各々、多型であるかまたは多型でありうる（トーマス  Ｔ．（Ｔｈｏｍａｓ  Ｔ．）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５（１）：３９−４９頁、１９９９年およびロゼッティ  Ｓ．（Ｒｏｓｓｅｔｔｉ  Ｓ．）ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ６１（５）：１５８８−１５９９頁、２００２年）。
【００５０】
これらの病原性のある再発性の変異体のみを有する（追加的な鎖末端での変異または他の病原性のあるアミノ酸置換を有しない）患者が除外される場合、約２１％の試料（Ｎ＝１７／８２の患者）が病原性のあるＰＫＤ１のミスセンス変異を内在することが予測されることになる。
【００５１】
参加者５名、ＪＨＵ６０２（Ｎ＝２）、ＪＨＵ１００（Ｎ＝３）、ＪＨＵ５８８（Ｎ＝２）、ＪＨＵ４１１（Ｎ＝２）、ＪＨＵ１１４（Ｎ＝２）が、病原性における基準を満たす２つ以上のＰＫＤ１アミノ酸変異を有した。この観察により、シス型のミスセンス変化を組み合わせることでレベルが低下した機能的ＰＫＤ１タンパク質が協働的にもたらされうるという可能性が出てくる（レイテロヴァ  Ｊ．（Ｒｅｉｔｅｒｏｖａ  Ｊ．）ら、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １９（５）：５７３頁、２００２年）。
【００５２】
ＰＫＤ１に対し、患者３７名の中で検出された、鎖末端での変異がないＰＫＤ２のアミノ酸置換は２つに過ぎなかった。１つの変化（ＪＨＵ５５９におけるＭ８００Ｌ、表６）は本系の基準では病原性があると考えられず、ＰＫＤ２の家系における疾患の場合に分離しなかった。第２のＰＫＤ２の置換であるＡ１９０Ｔが患者３名にて見出され、それは正常な３．２％の染色体において同定されたことから同様に病原性における基準を満たさなかった（表６）。
【００５３】
クラスＩＩ変異体の評価においては、インフレーム欠失の検出が病原性についての有用な予測材料であった。ポリシスチン−１の切断の欠如をもたらすアミノ酸置換についても病原性を予測するものであった。
【００５４】
ＰＫＤ−１タンパク質（ポリシスチン−１）およびＰＫＤ−２タンパク質（ポリシスチン−２）におけるクラスＩおよびクラスＩＩのアミノ酸変化を図８中の概略図に示す。
【００５５】
クラスＩＩＩ変異体
試験における対象１８名では決定的な病原性のある配列の変化が見られなかった（表６および９）。これらのうちの９名が多発性嚢胞腎疾患の明確かつ広範な家族歴を有した（表９）。他の９名が嚢胞を伴う拡張した腎臓を有し、これら個体のうちの４名はＤＮＡ試験時に有意な腎機能障害（ＧＦＲ＜４０）を患っていた。
【００５６】
多発性嚢胞腎疾患を有する個体のサブセットにおいて病原性があるかまたは潜在的に病原性がある変化の検出ができないということはいくつかの理由に起因しうる。クラスＩＩＩ試験の場合に個体において変異事象があれば、用いられる方法論によってアッセイされていないイントロンまたは他の調節領域が関与しうる。直接配列決定であれば欠失または複製にも奏功しない可能性があり、それはホモ接合性の正常な配列の領域として見られることになる。あるいは、用いられるストリンジェントな基準では、いくつかのミスセンス変化が実際に病原性があっても良性として同定されている可能性がある。例えば、ＡＤＰＫＤの広範な家族歴を有するＪＨＵ６１７が、ミラー／クマーのマトリックスによって多型である可能性がより高いと判断されたＰＫＤリピート４において固有のロイシンからバリンへの変化を有することが見出された。それに対し、この変化はＰＫＤリピート４の構造を破壊することなく、病原性がある可能性がある（図５Ａおよび５Ｂを参照）。さらにレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）の報告によると、ミスセンス変異体は、予想外にも潜在的なスプライス部位を活性化させ、それにより正常な転写産物のレベルを低下させる可能性がある（レイノルズ  Ｄ．Ｍ．（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｄ．Ｍ．）ら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １０（１１）：２３４２−２３５１頁、１９９９年）。
【００５７】
ミスセンス変化の機能分析
病原性があると予測されたＰＫＤ１アミノ酸置換のサブセットがタンパク質の機能特性を破壊したことを確認するため、完全長の変異体コンストラクトがＨＥＫ２９３細胞内で生成されかつ一時的に発現された。図６は、Ｅ２７７１Ｋ、Ｑ３０１６ＲおよびＦ２８５３Ｓが、３つのさらなるミスセンス変化（Ｒ２６４３Ｃ、Ｒ２７６７ＣおよびＬ２６１９Ｐ）と同様に切断を破壊することを示す。
【００５８】
ＰＫＤ遺伝子における多型および変動性
表４〜７に記載の配列の変化に加え、多数の多型が検出された（表９）（図７Ａおよび７Ｂも参照）。多型は、（ｉ）アミノ酸を改変することが予測されない配列変異体；（ｉｉ）少なくとも患者１名においてホモ接合性で見出されるミスセンス変化；（ｉｉｉ）未知の重要性があるイントロン配列；または（ｉｖ）未知の重要性がある３’ＵＴＲの変化として定義される。
【００５９】
上記の実施例についてのさらなる考察が、Ｍ．Ａ．ガルシア−ゴンザレス（Ｍ．Ａ．Ｇａｒｃｉａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ（２００７年）近刊、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｇｍｅ．２００７．０５．００４（参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
【００６０】
本明細書で引用されるすべての特許、公開された出願および参考文献における教示内容はそれら全体が参照により援用される。
【００６１】
本発明がその実施形態例に関して特に示されかつ記載されている一方、当業者により形態および細部の様々な変化が、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく本明細書中でなされうることが理解されるであろう。
【００６２】
【表２】
2009544314.tif 000003
【００６３】
【表３】
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【００６４】
【表４】
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【００６５】
【表５】
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【００６６】
【表６】
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【００６７】
【表７】
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【００６８】
【表８】
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【００６９】
【表９】
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【００７０】
全参考文献リスト
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図３Ｔ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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