(57)【要約】  （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；（ｃ）全長にわたり（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、を含む薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｃ）  全長にわたり（ａ）又は（ｂ）の前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、
を含む薬学的組成物。
【請求項２】
虚血状態の治療又は予防のため及び／又は組織工学処理を受けている患者の治療のための薬学的組成物の調製を目的とする、
（ａ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｃ）  全長にわたり（ａ）又は（ｂ）の前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、
の使用。
【請求項３】
前記ポリペプチドが少なくとも８０％の配列同一性を示す、請求項１（ｃ）に記載の薬学的組成物又は請求項２（ｃ）に記載の使用。
【請求項４】
前記ポリペプチドが少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項１（ｃ）に記載の薬学的組成物又は請求項２（ｃ）に記載の使用。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１に示された配列を有する、請求項１、３又は４に記載の薬学的組成物又は請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列がベクター内に含まれている、請求項１又は３〜５のいずれか一項に記載の薬学的組成物又は請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ベクターがリポソーム中に含まれている、請求項６に記載の薬学的組成物又は使用。
【請求項８】
前記ベクターがアデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター又はレンチウィルスベクターである、請求項６に記載の薬学的組成物又は使用。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、治療すべき患者から得た細胞内へとトランスフェクトされている、請求項１又は３〜６のいずれか一項に記載の薬学的組成物、又は請求項２〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記虚血状態が、動脈損傷、動脈変性、動脈閉塞又は動脈再閉塞の結果である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記虚血状態が、アテローム性動脈硬化症、狭心症、梗塞症、心臓発作、卒中、腎梗塞、高血圧症、創傷、末梢虚血性血管疾患、骨折及び切迫流産から選択されている、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
患っている器官又は身体部分が心臓、脳、腎臓、四肢及び血管から選択されている、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬学的組成物が、単独活性作用物質として前記ヌクレオチド配列及び／又は前記ポリペプチドを含む、請求項１又は３〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物又は請求項２〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が１つ以上の血管新生成長因子をさらに含む、請求項１又は３〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物又は請求項２〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記血管新生成長因子がＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択されている、請求項１４に記載の薬学的組成物又は使用。
【請求項１６】
前記薬学的組成物がステントを含む、請求項１、３〜９のいずれか一項又は１３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物、又は請求項２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
（ａ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）  配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；
（ｃ）  全長にわたり（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、
を組織と接触させるステップを含む試験管内又は生体外の組織工学処理方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチドの生物活性のモジュレータを同定する方法において、
（ａ）  前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドと試験化合物を接触させるステップ；及び
（ｂ）  前記試験化合物の存在下の生物活性と前記試験化合物の不在下の生物活性とを比較するステップ、
を含み、モジュレータの存在下とその不在下の前記生物活性が異なっている、方法。
【請求項１９】
前記モジュレータが活性化因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物活性が前記ポリヌクレオチドの発現及び／又は動脈形成の刺激である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法によって同定される又は獲得できる抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；（ｃ）全長にわたり（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つの前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、を含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書においては、特許出願及びメーカーのマニュアルを含む数多くの文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許要件に関係するものとは考えられていないが、その全体が本明細書に参照により援用されている。
【０００３】
潜在するアテローム性動脈硬化症の合併症としての動脈の閉塞は、世界中で主要な死亡原因となっている。以前は先進国に限られていたが、グローバル化の影響で現在では新興国そして第３世界の国々がほぼ同等に、心臓、脳、腎臓及び四肢の循環に影響を及ぼす動脈変性及び閉塞の臓器レベルの徴候に悩まされている。これを患う集団のうち、疾病の最初の徴候時点で死亡する人は少数にすぎないことから、長く費用のかかる苦しみが結果としてもたらされる。
【０００４】
アテローム性動脈硬化症は予防でき、徴候が現れた時点で治療可能である。しかしながら、予防というのは、数多くの人々が、苦労して手に入れたステータスシンボルと自ら認めるライフスタイルを放棄しなければならなくなる可能性があることを意味している。西欧諸国では、「ヘルシーな地中海式の食生活」を有する国でさえ肥満が大幅に増えているという事実が、推奨されるライフスタイルの変化がほぼ無益であることの好例である。
【０００５】
薬物療法は、血中コレステロール値を低減させる上で有効であり得るが、心臓発作を免がれるのは治療を受けた集団のわずか２５％にすぎない。
【０００６】
心臓手術及びカテーテルベースの動脈再疎通は非常に有効であるが非常に高価で、特にステントベースの療法はなおも閉塞を再発する傾向にある。
【０００７】
血管新生成長因子は、高い希望をかきたてたが、臨床試験は非常に失望させるものであった。成長因子は、毛細血管の成長を刺激するものとして知られているが、毛細血管は、閉塞した動脈に置き換わることができない。
【０００８】
新しい幹細胞に基づく療法は、今のところ大きな議論の余地があり、最近のスカンジナビアの臨床研究では、それが急性心筋梗塞患者において不活性であることが示された。
【０００９】
人類の進化の間、特に直立歩行及び走駆する必要性が生じた時点で、脚の創傷の治ゆ及び損傷を受けた脚の動脈の置換が救命事項となり、そこで、側副循環の樹立、大動脈の閉塞の場合の「バイパス」脈管の形成という動脈再生のための特殊な機序が開発され、今なお我々はその恩恵を享受している。我々が現在「動脈形成」と呼んでいるこのプロセスは、動脈系全体の中で作用するが、四肢の場合ほどには開発されていない。
【００１０】
すでに１９７０年代において、動脈閉塞により既存の小さいバイパス脈管が活性化されて非常に速い速度で成長することが示されてきた（シャーパー（Ｓｃｈａｐｅｒ）ら、（１９７２年）、シャーパー（１９７１年））。すなわち、動脈閉塞が突然にではなく漸進的に進行したことを条件として、１週間以内でこれらのバイパス脈管は、実験動物の体内において心臓に正常な血流を供給することができた。四肢動脈は、急性的に閉塞を起こす可能性があるが、再び（ゆっくりと）歩くことができるためには約１週間がかかると考えられている。バイパス拡張プロセスは細胞分裂による。
【００１１】
小さいバイパス脈管は、その直径を２０倍、そしてその組織質量を５０倍増大させ得る。成長プロセスは、骨髄、主として単球から、ただしＴ−リンパ球からも、ヘルパー細胞を補充する。これらの細胞は、はるかに大きい新しい脈管のためのスペースを作り出すため古い血管構造を破壊するために必要である。
【００１２】
発明者らは先に、成長を開始させる最も重要な物理的力が流体せん断応力すなわち、流れる血液が血管の内部ライニング、内皮に対して加える粘性抵抗である、ということを発見した（ピップ（Ｐｉｐｐ）ら、（２００４年））。ピップら、（２００４年）は、高い流体せん断応力をもつモデルシステムを作り上げるために動静脈（ＡＶ）シャントを使用した。流体せん断応力は、血流速度を増大させそれと共に粘性抵抗を増大させる閉塞の下流側の血管床内の血圧減少のため、動脈閉塞直後はより高くなっている。しかしながら、バイパス脈管が成長し始めると、流体せん断応力は、半径の３乗に反比例することから、再度降下する。その結果として、バイパス脈管の成長は、理想的な適応に達する前に停止する。このことが、自然なバイパス脈管の概念の制限となってきた。その上、ピップら（２００４年）は、自らの報告書で、ＡＶシャントアプローチが、既存の虚血状態を増大させる可能性があるため、治療目的に応用できる確率は低いと結論づけている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
先行技術において記述された方法の制限を考慮すると、本発明の基礎をなす問題は、動脈形成を刺激するための代替的な又は改良型の手段及び方法を提供することにあった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴う前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；（ｃ）全長にわたり（ａ）又は（ｂ）の前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドの前記配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つの前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、を含む薬学的組成物に関する。
【００１５】
本書で使用する「動脈形成性」という用語は、「動脈形成の原因となる」又は「動脈形成に対し刺激効果を有する」という意味をもつ。
【００１６】
本書で使用する「動脈形成」という用語は、既存の側副動脈管からの動脈の発達に関係する。「側副動脈管」という用語は、人体又は動物の体の所与の部分の中の主要動脈管と比べて二次的な又は下位の動脈管を指す。「二次的な」及び「下位の」という用語は、とりわけ、側副動脈管の直径及び側副動脈管を通る流速（単位時間あたりの血液量）に関係する。動脈形成のプロセスは、体の前記部分の中の主要動脈管への前記側副動脈管のうちの１本以上のものの転換を導く。該転換は、直径の増大と同時に血流速度の増大を含む。直径の増加は、２、３、４、５、１０又は２０倍以上であり得る。付随して、脈管の組織質量は５、１０、２０又は５０倍以上増大する。その結果として、転換された側副動脈管は、損傷を受けた又は機能していない動脈管の代用として役立つことができる。換言すると、動脈形成はバイパス脈管の形成を導く。
【００１７】
本発明による動脈形成活性は、血行動態計測及び死後血管造影法といった血管造影法を含めた、当該技術分野において既知であり（シャーパーら（１９６９年）、シャーパーら（１９７１年）、パシクら（Ｐａｓｙｋ）（１９８２年）、シャーパーら（１９７６年））本明細書に含まれている実施例で記述される通りの方法により検定することができる。
【００１８】
血行動態計測は、最大側副コンダクタンスの決定を可能にする。「最大側副コンダクタンス」という用語は、側副循環の最大能力を指す。該測定値は、例えば右頸動脈内での全身血圧測定、及び／又は例えば両伏在動脈内での末梢血圧測定を含んでいてよい。同調して、両腸骨動脈内で増大するアデノシン濃度（体重１ｋｇにつき毎分１００〜６００μｇ）での後肢血流を（例えばウサギモデル系）において検出してもよい。
【００１９】
死後血管造影法は次のように実施可能である（実施例はウサギモデル系に関するものである）：すなわち、安楽死させたウサギの後肢にゼラチン−バリウムベースの造影剤をかん流させる。バルト−（Ｂａｌｔｅａｕ）ラジオグラフィ装置の中で後肢の血管造影図を撮る。大腿深在動脈及び大腿回旋動脈から下行膝動脈及び大腿尾動脈に至る血管造影法で目に見える側副動脈が計数される。
【００２０】
本明細書で使用されている「動脈の」という用語は、「１本の又は複数の動脈に関する」という意味をもつ。あらゆるタイプの動脈が想定される。「動脈」という用語には大動脈（及び、上行大動脈、下行大動脈、胸部大動脈、腹部大動脈といったその一部分）、肺動脈、頸動脈（外頸動脈及び内頸動脈）、脳動脈、鎖骨下動脈、腋窩動脈、上腕動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、内腸骨動脈、肝動脈、腸骨動脈、大腿動脈、膝窩動脈、前及び後腔骨動脈及び足背動脈、が含まれる。
【００２１】
「動脈形成」という用語は、「血管新生」とは区別されるものとする。血管新生は、以前に動脈管が全く存在しなかったか比較的少数しか存在しなかった領域における新しい動脈管の形成に関連している。従って、血管新生は、比較的小さい動脈管から大きい動脈管への転換を指す「動脈形成」とは異なっている。
【００２２】
配列番号２の配列は、ヒトＡＢＲＡタンパク質の配列である。ＡＢＲＡという記号は「アクチン結合Ｒｈｏ活性化タンパク質（ａｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｈｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」を表わす。以前に使用された別名はＳＴＡＲＳである。ＳＴＡＲＳは「Ｒｈｏ依存性シグナリングの横紋筋活性化因子（ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｒｈｏ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）」を表わす。本発明に関しては、ＡＢＲＡ及びＳＴＡＲＳという名称は互換的に使用されている。配列は例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）が維持しているＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース内に、ＮＰ＿６３１９０５というデータベースアセッション番号で見出すことができる。配列番号２の配列は、この特許出願の提出日においてデータベース入力ＮＰ＿６３１９０５内に提供されている配列と同一である。データベース入力ＮＰ＿６３１９０５内で提供されている配列は正しいものであることが前提とされているものの、前記配列が正しくないものであることが判明した場合には、本発明の目的でこの配列の任意の訂正版が意図的に想定されるという点を指摘しておきたい。
【００２３】
アライ（Ａｒａｉ）ら（２００２年）は、心筋及び骨格筋細胞の中で特定的に発現される新規の進化的に保存されたアクチン結合タンパク質としてＳＴＡＲＳを記述している。アライら（２００２年）によると、ＳＴＡＲＳは筋節のＩ−帯及びトランスフェクションを受けた細胞内のアクチンフィラメントに結合し、ここでＲｈｏ−シグナリング事象を活性化する。
【００２４】
２００５年に、同じグループが、ミオカルジン関連転写因子（ＭＲＴＦ）の核転座を誘発することによってＳＴＡＲＳが血清応答因子（ＳＲＦ）を活性化することを示した（カワハラら（２００５年））。著者らは、ＳＴＡＲＳが筋特異的機序に関与しているという結論を下している。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチドならびにポリリボヌクレオチドを含むものとして理解される。換言すると全ての形態のＤＮＡ、例えばゲノミックＤＮＡ及びｃＤＮＡ及びＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びゲノミックＲＮＡ（例えばＲＮＡウィルスの場合）が包含される。
【００２６】
（ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号２に示されたアミノ酸配列のフラグメントを含むか又はこのフラグメントからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。当該技術分野においては、機能的ポリペプチドを分割させて未改変又は実質的に未改変の機能をもつフラグメントを生成し得る、ということは周知である。かかる分割には、所与の数のＮ−及び／又はＣ−末端アミノ酸の除去が含まれる可能性がある。付加的に又は代替的には、得られるポリペプチドが動脈形成活性を有することを条件として、数多くの内部（非末端）アミノ酸を除去することができる。末端及び／又は中間領域から除去されるべきアミノ酸の前記数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個又はそれを上回るものであり得る。１〜５０の間の他の任意の数も意図的に想定される。特に任意の保存された機能的ドメインの配列及び境界又は配列番号２の配列内の部分配列を保存するアミノ酸の除去が、特に想定される。かかるドメインを決定するための手段及び方法は、当該技術分野において周知であり、実験手段及び生物情報学手段を含む。実験手段には、欠失突然変異体の系統的生成、及び当該技術分野において既知であり本明細書に含まれる実施例で記述されているような（以上と本明細書に含まれている実施例３を参照のこと）動脈形成活性についての検定におけるそれらの査定、が含まれる。生物情報学的手段にはデータベース検索が含まれる。適切なデータベースとしては、タンパク質配列データベースが含まれる。この場合、有意なヒットの多数の配列アラインメントは、ドメイン境界を表わし、ここでドメインは、配列の残りの部分に比べて高い配列保存レベルを示す部分配列で構成されている。さらなる適切なデータベースとしては、サンガーインスティチュート（Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、英国（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ）により維持されているＰｆａｍといったような保存されたタンパク質ドメインの統計的モデルのデータベースが含まれる。
【００２７】
（ｃ）のポリヌクレオチドは、（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む。当該技術分野においては、核酸分子及びポリヌクレオチドでのハイブリダイゼーション実験をいかに実施するかは周知である。すなわち、当業者であれば、本発明に従ってどのハイブリダイゼーション条件を使用しなければならないかがわかっている。かかるハイブリダイゼーション条件については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎ．Ｙ．又はヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）、ＳＪ．、ヘイムス（Ｈａｍｅｓ）、Ｄ．、「ＲＮＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）、第１巻及び２巻といったような標準的な教本を参照されたい。
【００２８】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」というのは、例えば４×ＳＳＣ（６００ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのクエン酸ナトリウム）中における６５℃で一晩のインキュベーションとそれに続く０．１×ＳＳＣ中における６５℃で１時間の洗浄を含む条件を意味する。代替的には、ハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌのせん断した変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における４２℃で一晩のインキュベーションとそれに続く、０．１×ＳＳＣ中における約６５℃でのフィルタ洗浄を含み得る。前記ハイブリダイゼーション条件は、当業者には、「ハイブリダイゼーション用の高ストリンジェント条件」としても知られている。同様に考慮されているのは、さらに低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（「ハイブリダイゼーション用の低ストリンジェント条件」）で（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリッド形成する（ｃ）に従ったポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーション及びシグナル検出のストリンジェンシーの変更は、主として、ホルムアミド濃度（ホルムアミド濃度が低くなるとストリンジェンシーは低くなる）；塩の条件又は温度を操作することを通して達成される。例えば、比較的ストリンジェンシーの低い条件には、４×ＳＳＣ中において５０℃で一晩のインキュベーション又は６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ；０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４；０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子遮断ＤＮＡを含む溶液中における３７℃で一晩のインキュベーションとそれに続く１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳを用いた５０℃での洗浄が含まれる。さらに、より一層低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントハイブリダイゼーションの後に行なわれる洗浄をより高い塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）で行なうことができる。上述の条件の変動が、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグランドを抑制するために用いられる代替的遮断薬の封入及び／又は置換を通して達成しうるものであるという点に留意されたい。標準的な遮断試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、そして市販の独自開発の処方物が含まれる。特異的遮断試薬の封入には、相容性の問題のため、上述のハイブリダイゼーション条件の修正が必要となるかもしれない。
【００２９】
（ｃ）に従ったポリヌクレオチドはさらに、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドを含み、ここで、前記ポリペプチドは、全長にわたり（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を示し、前記ポリペプチドは動脈形成活性を有する。
【００３０】
２つのヌクレオチド又はタンパク質配列は、当該技術分野において既知の適切なコンピュータプログラムを用いて電子的に整列させることができる。かかるプログラムは、ＢＬＡＳＴ（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．第２１５号、４０３〜４１０頁）、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（アルトシュル及びギッシュ（Ｇｉｓｈ）（１９９６年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２６６号、４６０〜４８０頁）といったようなその変形形態、ＦＡＳＴＡ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）及びリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５号、２４４４〜２４４８頁）又はスミス・ウォーターマンアルゴリズム（ＳＳＥＡＲＣＨ、スミス（Ｓｍｉｔｈ）及びウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（１９８１年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１４７号、１９５〜１９７頁）の実装を含む。これらのプログラムは、対配列アラインメントを提供することに加えて、配列同一性レベル（通常は同一性パーセント単位）及び偶然によるアラインメントの発生の確率（Ｐ−値）をも報告する。ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ヒギンズら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２２号、４６７３〜４６８０頁）といったようなプログラムを用いて、３つ以上の配列を整列させることができる。
【００３１】
前記ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。その結果、前記ポリペプチドは、融合タンパク質であるポリペプチドを含む。以上で定義されているようなＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳ配列又はフラグメント又は変異体でない前記融合タンパク質の成分は、修飾／増強された安定性、修飾／増強された溶解度及び／又は１つ以上の特異的細胞型をターゲティングする能力といったような所望の特性を付与するアミノ酸配列を含んでいる。例えば、細胞表面マーカーに特異的な抗体を伴うか又は抗原認識フラグメントを伴う融合タンパク質が想定されている。
【００３２】
本発明の薬学的組成物中に含まれているポリペプチドには、１つ以上のアミノ酸が、動脈形成活性を維持する一方で化学的修飾を受けているポリペプチドが含まれる。
【００３３】
薬学的組成物は、個々の患者の臨床的条件、薬学的組成物の送出部位、投与方法、投与計画及び医師にとっては既知のその他の要因を考慮に入れて、すぐれた医療実践と一貫性ある形で処方され投薬される。本明細書における薬学的組成物の「有効量」は、かくしてこのような考慮事項によって決定される。
【００３４】
当業者であれば、個体に投与される薬学的組成物の有効量が、なかでもその化合物の性質により左右されるということはわかっている。例えば、前記化合物がポリペプチド又はタンパク質である場合、一回用量あたりの非経口投与される薬学的組成物の薬学的総有効量は、患者の体重１ｋｇあたり一日約１μｇから１０ｍｇのタンパク質の範囲内にあるが、上述のとおり、これは治療上の裁量に付される。より好ましくは、この用量は、１日１ｋｇあたり少なくとも０．０１ｍｇのタンパク質であり、最も好ましくは人間について、１日１ｋｇあたり約０．０１〜１ｍｇの間である。連続的に与えられた場合、薬学的組成物は標準的には、一日１〜４回の注射によってか又は例えばミニポンプを用いた連続的皮下輸液によって、約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時の用量率で投与される。静脈内バッグ溶液を用いることもできる。変化を観察するのに必要な治療の長さ、及び応答が発生するための治療後間隔は、所望の効果に応じて変動すると思われる。当業者にとっては周知である従来のテストにより、特定の量を決定することができる。
【００３５】
本発明の薬学的組成物は、経口投与、直腸投与、非経口投与、のう内投与、膣内投与、腹腔内投与、局所投与（粉末、軟こう、点滴又は経皮貼布によるもののような）、口腔投与又は経口又は経鼻スプレーとして投与され得る。
【００３６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な担体を含む。「薬学的に受容可能」というのは、任意のタイプの非毒性固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材料又は処方助剤のことである。本明細書で使用する「非経口」という用語は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下、及び関節内注射及び輸液を含む投与様式を意味する。
【００３７】
薬学的組成物は同様に、持続放出システムによっても適切に投与される。持続放出組成物の適切な例としては、フィルム又はマイクロカプセルなどの造形品の形をした半透過性重合体マトリクスが含まれる。持続放出マトリクスとしては、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタメート共重合体（シドマン（Ｓｉｄｍａｎ）、Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、第２２号：５４７〜５５６頁（１９８３年））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．第１５号：１６７〜２７７頁（１９８１年）、及びＲ．ランガー、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．第１２号：９８〜１０５頁（１９８２年））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．ランガーら、上掲書）、又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）が含まれる。持続放出薬学的組成物には同様に、リポソームに取込まれた化合物も含まれる。薬学的組成物を含有するリポソームはそれ自体既知の方法によって調製される：すなわち、独国特許第３，２１８，１２１号明細書；エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、第８２号：３６８８〜３６９２頁（１９８５年）；ファン（Ｈｗａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、第７７号：４０３０〜４０３４頁（１９８０年）；欧州特許第５２，３２２号明細書；欧州特許第３６，６７６号明細書；欧州特許第８８，０４６号明細書；欧州特許第１４３，９４９号明細書；欧州特許第１４２，６４１号明細書；日本特許出願第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書及び欧州特許第１０２，３２４号明細書。リポソームは通常、脂質含有率が約３０ｍｏｌパーセント超のコレステロールであり、選択された割合が最適な療法のために調整されている、小さい（約２００〜８００オングストロームの）単層タイプのものである。
【００３８】
非経口投与のためには、薬学的組成物は一般に、薬学的に受容可能な担体すなわち、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり処方物のその他の成分と相容性のある担体とそれを、単位投薬量注射可能形態（溶液、懸濁液又はエマルジョン）で所望の純度で混合することによって処方される。
【００３９】
一般的には、処方物は、薬学的組成物の構成要素を均等にかつ緊密に液体担体又は細かく分割された固体担体又はその両方と接触させることにより、調製される。その後、必要とあらば、生成物は所望の処方物へと造形される。好ましくは、担体は非経口担体であり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。かかる担体ビヒクルの例としては、水、食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液が含まれる。不揮発性油及びオレイン酸エチルといったような非水性ビヒクルも又、リポソームと同様に本明細書では有用である。担体は、適切には等張性及び化学安定性を増強する物質といったような添加物をわずかな量で含有する。かかる材料は、レシピエントにとって、用いられる投薬量及び濃度で非毒性であり、ホスフェート、シトレート、スクシネート、酢酸及びその他の有機酸又はその塩といったような緩衝液、アスコルビン酸といったような酸化防止剤；低分子量（約１０未満の残基）の（ポリ）ペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンといったようなタンパク質；ポリビニルピロリドンといったような親水性重合体；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニンといったようなアミノ酸；セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、２糖類及びその他の糖質；ＥＤＴＡといったようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールといったような糖アルコール；ナトリウムといったような対イオン及び／又はポリソルベート、ポロキサマー又はＰＥＧといったような非イオン界面活性剤、を含む。
【００４０】
治療的投与のために用いるべき薬学的組成物の構成要素は無菌でなくてはならない。無菌性は、除菌膜（例えば０．２ミクロン膜）を通したろ過により容易に達成される。薬学的組成物の治療的構成要素は、一般に、無菌の点検口をもつ容器、例えば皮下注射針で穿孔できるストッパを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルの中に入れられる。
【００４１】
薬学的組成物の構成要素は通常は、水溶液として又は復元するようになっている凍結乾燥された処方物として、密封されたアンプル又はバイアルなどの一回又は複数回用量のコンテナに入って保管されることになる。凍結乾燥された処方物の一例としては、１０ｍｌのバイアルに５ｍｌの除菌済みの１％（ｗ／ｖ）水溶液が充填され、結果として得られる混合物が凍結乾燥される。輸液溶液は、静菌性の注射用蒸留水を用いて凍結乾燥された化合物を復元することによって調製される。
【００４２】
本発明者らは驚くべきことに、ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳが動脈形成のマスター調節因子として機能することを発見した（実施例４〜９及び図５、６、７、１０、１１、１２、１３及び１４を参照のこと）。本発明の以上で再考されている先行技術が一貫して骨格筋及び心筋特異的な機序におけるＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳの関与を報告していることから見て、これは予想外のことである。
【００４３】
本発明はさらに、虚血状態の治療又は予防のため及び／又は組織工学処理を受けている患者の治療のための薬学的組成物の調製を目的とする、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴う前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；（ｃ）全長にわたり（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの前記配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、の使用に関する。
【００４４】
「虚血性」という用語は、「虚血を患っている」ことを意味し、ここで「虚血」というのは、例えば、組織内の低酸素症を導く不適切な血液流又は動脈血液供給の閉塞に起因する低酸素状態を指す。本発明による好ましい虚血状態について以下でさらに詳述する。
【００４５】
「組織工学処理」という用語は、組織の機能を回復、維持又は改善する生物学的代用品の開発を表わす。組織工学処理の目的としては、臨床的利用のための機能的代替組織の生産が含まれる。組織工学処理は生体内で行なうことができる。すなわち、組織は患者の体内で工学処理されるか又は成長させられる。組織工学処理の経過の間に、血液供給の不足が頻繁に発生することが知られている（ルールー（Ｌ’ｈｅｕｎｅｕｘ）ら（２００６年））。その結果、組織工学処理を受けている又は工学処理された組織を受入れる患者は、工学処理されるべき領域内で動脈形成の刺激を必要とすることになる。工学処理すべき好ましい組織としては、動脈を含めた血管が含まれる。代替的には、以下でさらに詳述する通り、組織工学処理は試験管内又は生体外で行なわれ得る。
【００４６】
本発明による薬学的組成物又は使用の好ましい実施形態おいては、前記ポリペプチドは少なくとも８０％の配列同一性を示す。本発明による薬学的組成物又は使用のさらなる好ましい実施形態においては、前記ポリペプチドは少なくとも９０％の配列同一性を示す。
【００４７】
本発明による薬学的組成物又は使用のさらなる好ましい実施形態においては、前記ヌクレオチド配列は配列番号１に示された配列を有する。
【００４８】
配列番号１の配列はヒトＡＢＲＡタンパク質のためのｍＲＮＡの配列である。配列は、例えば、データベースアセッション番号ＮＭ＿１３９１６６として、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が維持しているＥｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベース中に見出すことができる。配列番号１の配列は、この特許出願の提出日においてデータベース入力ＮＭ＿１３９１６６内に提供されている配列と同一である。データベース入力ＮＭ＿１３９１６６内で提供されている配列が正しいものであることを前提としているものの、前記配列が正しくないものであることが判明した場合には、本発明の目的でこの配列の任意の訂正版が意図的に想定されるという点を指摘しておきたい。
【００４９】
同じく本発明の範囲内に含まれているのは、遺伝子コードの縮重の結果として配列番号１で示された配列とは異なるポリヌクレオチドである。すなわち、想定されているポリヌクレオチドは、配列が配列番号１に示された配列と異なっているものの、配列番号１に示されている配列と同様にポリペプチドをコードする。
【００５０】
本発明による薬学的組成物又は使用のさらなる好ましい実施形態においては、前記ヌクレオチド配列は１つのベクター内に含まれている。
【００５１】
本発明のベクターは、例えば従来遺伝子工学において使用されているプラスミド、コスミド、ウィルス、バクテリオファージ又はその他のベクターであってよく、適切な宿主細胞内で及び適切な条件下で前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子といったようなさらなる遺伝子を含み得る。
【００５２】
さらに、本発明のベクターは、本発明のヌクレオチド配列に加えて、適切な宿主内のコーディング領域の適当な発現を可能にする発現制御要素を含む。かかる制御要素は、当業者にとって既知であり、これには、プロモータ、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクター内にインサートを導入するための翻訳及び挿入部位が含まれ得る。好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、真核細胞又は原核細胞内の発現を可能にする前記発現制御配列に対し機能的に連結されている。
【００５３】
分子生物学の当業者には数多くの適切なベクターが知られており、その選択は、所望の機能に左右され、従来遺伝子工学において使用されているプラスミド、コスミド、ウィルス、バクテリオファージ及びその他のベクターを含む。さまざまなプラスミド及びベクターを構築するために、当業者にとって周知の方法を使用することができる；例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（１９８９年）、前掲書同一頁、及びアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、（１９９４年）で記述されている技術を参照されたい。代替的には、本発明のヌクレオチド配列及びベクターを、標的細胞への送出のためにリポソームへと再構築させることができる。かくして、本発明に従うと、特定のポリペプチド／タンパク質の発現が必要とされる場合、発現ベクター内に関連する配列をトランスファすることができる。標準的なクローニングベクターとしては、ｐＢｓｃｐｔ  ｓｋ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＧＢＴ９が含まれる。標準的な発現ベクターとしては、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐ１３ＣＡＴが含まれる。
【００５４】
「制御配列」又は「制御要素」という用語は、連結されているコーディング配列の発現をもたらすのに必要とされる調節ＤＮＡ配列を意味する。かかる制御配列の性質は、宿主生体に応じて異なる。原核生物においては、制御配列は一般にプロモータ、リボソーム結合部位及びターミネータを含む。真核生物においては、一般に制御配列は、プロモータ、ターミネータそして一部のケースでは、エンハンサ、トランス活性化因子又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低限、その存在が発現にとって必要である全ての構成要素を含むように意図されており、付加的な有利な構成要素も含み得る。
【００５５】
「機能的に連結された」という用語は、そのように記述された構成要素が、その意図された要領でそれらが機能できるようにする関係にあるような並置を意味する。コーディング配列に「機能的に連結された」制御配列は、その制御配列と相容性ある条件下でコーディング配列の発現が達成されるような形で連結される。制御配列がプロモータである場合、当業者にとって、好ましくは２本鎖核酸が使用されるということは明白である。
【００５６】
本発明のベクターは好ましくは、発現ベクターである。「発現ベクター」というのは、選択された宿主細胞を形質転換するのに使用可能でありかつ選択された宿主の中でコーディング配列の発現を提供する構成体である。発現ベクターは例えば、クローニングベクター、バイナリベクター又は組込み型ベクターであり得る。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核細胞及び／又は真核細胞内での発現を保証する調節要素は、当業者にとって周知である。真核細胞の場合には、調節要素は、通常、転写の開始を保証するプロモータそして任意には転写の終結及び写しの安定化を確保するポリ−Ａシグナルを含む。原核宿主細胞内での発現を可能にする考えられるモジュレータには、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＰＬ、Ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモータが含まれ、真核宿主細胞内の発現を可能にする調節要素の例は、酵母内のＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモータ又は哺乳動物及びその他の動物の細胞中のＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモータ（ラウス肉腫ウィルス）、ＣＭＶ−エンハンサ、ＳＶ４０−エンハンサ又はグロビンイントロンである。これに関連して、当該技術分野においては、Ｏｋａｙａｍａ−ＢｅｒｇｃＤＮＡ発現ベクター−ｐｃＤＶ１（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）といったような適切な発現ベクターが知られている。使用可能である代替的な発現系は、昆虫系である。このような１つの系においては、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫内で外来性遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。本発明のポリヌクレオチドのコーディング配列は、ポリヘドリン遺伝子といったウィルスの可欠領域内にクローニングされ、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれてよい。前記コーディング配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性となり、外皮タンパク質が欠如した組換え型ウィルスが産生される。組換え型ウィルスはこのとき、Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫を感染させるのに用いられ、これらの中で本発明のタンパク質が発現される（スミス、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、第４６号（１９８３年）、５８４頁；エンゲルハート（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１号（１９９４年）、３２２４〜３２２７頁）。
【００５７】
好ましい実施形態においては、前記ベクターはリポソーム内に含まれる。ポリヌクレオチドのリポソーム媒介型トランスファは、当該技術分野において周知である（以上参照）。
【００５８】
もう１つの好ましい実施形態においては、前記ベクターは、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルスベクター又はレンチウィルスベクターである。アデノ随伴ウィルスベクター及びレンチウィルスベクターは患者が最近アデノウィルスによる感染を受けた場合に、特に好適である。このような場合には、前記アデノウィルスに向けられた抗体の存在は、アデノウィルスベクターを用いた療法の成功を妨げるかもしれない。
【００５９】
より好ましい実施形態においては、ベクターを含む前記薬学的組成物は、治療すべき脈管内に挿入すべきカテーテルを用いて送出されるべきである。
【００６０】
もう１つのさらに好ましい実施形態においては、ポリペプチドを含む前記薬学的組成物は、治療すべき部位における又はこの部位の近くでの注射により投与されることになる。
【００６１】
さらなる好ましい実施形態においては、前記ヌクレオチド配列は、治療すべき患者から得られた細胞内にトランスフェクトされた。好ましくは、前記細胞は、治療すべき患者の抹消静脈から得られた血球である。患者から得た細胞を、トランスフェクションに先立って試験管内で培養し増殖させることができる。獲得しトランスフェクトすべき好ましい細胞は、末梢血の単球である。単球はウィルスベクターによる感染の可能性があり、有利なホーミング特性を示す。より具体的には、単球は、成長する側副脈管に付着する能力をもつ（シャーパー（Ｓｃｈａｐｅｒ）ら（１９７６年）、国際公開第００／６００５４号パンフレット）。トランスフェクションの時点で、細胞は患者の体内に再度導入されることになる。再導入は側副脈管内又はその近くでの注射により行なうことができる。代替的には、単純な静脈内注射を実施することができる。この場合、Ｍａｃ−１ｃＤＮＡでの同時トランスフェクションが好ましい。トランスフェクションを受けた細胞内のＭａｃ−１遺伝子の発現により、トランスフェクションを受けた細胞が側副脈管内のドッキング部位に結合することが保証される。
【００６２】
本発明による使用のさらなる好ましい実施形態においては、前記虚血状態は、動脈損傷、動脈変性、動脈閉塞又は動脈再閉塞の結果である。
【００６３】
好ましくは、前記虚血状態は、アテローム性動脈硬化症、狭心症、梗塞症、心臓発作、卒中、腎梗塞、高血圧症、創傷、末梢虚血性血管疾患、骨折及び切迫流産から選択されている。創傷には、動脈病巣が関与する創傷が含まれる。同様に想定されているその他の虚血状態としては、糖尿病又は喫煙から発生した虚血状態が含まれる。
【００６４】
本発明による使用のさらなる好ましい実施形態においては、患っている器官又は身体部分は心臓、脳、腎臓、四肢及び血管から選択されている。血管には、動脈と静脈が含まれる。
【００６５】
さらなる好ましい実施形態においては、前記薬学的組成物は、単独活性作用物質として前記ヌクレオチド配列及び／又は前記ポリペプチドを含む。
【００６６】
もう１つの好ましい実施形態は、薬学的組成物が１つ以上の血管新生成長因子をさらに含んでいる、使用及び薬学的組成物に関する。血管新生成長因子は、当該技術分野において血管新生の刺激物質としてのその役割において記述されており、前述のように、動脈形成と全く異なるものと考えられるべきである。実施例３及び図３で例証されているように、本発明者らは、血管新生成長因子が動脈形成に対しても刺激効果を示すことを立証することができた。血管新生成長因子はＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳポリヌクレオチド又はポリペプチドに匹敵する効果を惹起することができないと予想されているものの、前記ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドとそれらを同時投与することで動脈形成に対する刺激効果がさらに増強されるものと予想される。
【００６７】
好ましくは、前記血管新生成長因子は、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦからなる群から選択されている。
【００６８】
本発明の薬学的組成物又は使用のさらなる好ましい実施形態においては、前記薬学的組成物はステントを含む。「ステント」という用語は、当該技術分野において周知であり、拡張型ワイヤメッシュ及び、身体の中空構造内に挿入されてそれを開放状態に保つ中空孔あきチューブを含む。前記中空構造としては、血管が含まれ、血管自体には動脈が含まれる。ステントを含む本発明の薬学的組成物は、主要実施形態のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドでコーティングされたステントであってよい。（ステント自体を除いた）本発明の薬学的組成物のあらゆる構成成分が、本発明によるステントのコーティング層内に含まれていてよい。
【００６９】
本発明はさらに、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；（ｃ）全長にわたり（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの配列と少なくとも７０％の配列同一性を示しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこの配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが動脈形成活性を有する、ポリヌクレオチド；及び／又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、を組織と接触させるステップを含む、試験管内又は生体外の再生医療方法に関する。この実施形態は、再生医療の分野に関係し、ヒト又は動物の体外での組織の成長及び／又は修飾に関する。以上で指摘した通り、組織の工学処理中に、血液供給制限状態が発生し得る。その結果として、組織内の動脈形成の刺激が望ましい。工学処理すべき好ましい組織は、動脈を含めた血管である。
【００７０】
本発明のもう１つの主題は、請求項１に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチドの生物活性のモジュレータを同定する方法において、（ａ）前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドと試験化合物を接触させるステップ；及び（ｂ）前記試験化合物の存在下の生物活性と前記試験化合物の不在下の生物活性とを比較するステップを含み、モジュレータの存在下とその不在下の生物活性が異なっている方法にある。この実施形態は、モジュレータとして作用する化合物のためのスクリーニング方法に関する。ステップ（ａ）は、試験化合物が前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドと物理的かつ／又は機能的に相互作用できる条件で実施される。適切な条件は、試験化合物により左右される。当業者であれば、例えばポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む緩衝溶液、試験化合物及び必要とあらば前記ポリヌクレオチド又はポリペプチド及び／又は前記試験化合物の機能又は完全性にとって必要な任意のさらなる因子を含むこのような適切な条件を充分認識している。
【００７１】
好ましくは、前記方法は、ハイスループットフォーマットで実施される。ハイスループット検定は、生化学検定か、細胞検定か又はその他の検定であるかとは無関係に、一般にマイクロタイタープレートのウェルの中で実施でき、ここで各々のプレートは９６、３８４又は１５３６個のウェルを含むことができる。周囲温度以外の温度でのインキュベーション及び試験化合物と検定混合物の接触を含むプレートの取扱いは、好ましくはピペット操作デバイスを含む１つ以上のコンピュータ制御型ロボットシステムによって行なわれる。大規模な試験化合物ライブラリをスクリーニングしかつ／又はスクリーニングを短時間で実施しなければならない場合、各ウェルに対して、例えば１０、２０、３０、４０、５０又は１００の試験化合物の混合物を加えることができる。ウェルが生物活性を示す場合、前記試験化合物混合物をデコンボリューションに付して、前記混合物中の前記活性を発生させる１つ以上の試験化合物を同定することができる。
【００７２】
好ましくは、前記モジュレータは活性化因子である。本発明による「活性化因子」という用語は、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの生物活性を１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％、さらに好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％、さらに一層好ましくは２００％、５００％、１０００％又はそれ以上だけ増大させる試験化合物を表わしている。好ましくは、前記生物活性は、前記ポリヌクレオチド及び／又は動脈形成の刺激の発現である。
【００７３】
好ましい一実施形態においては、本方法は、ステップ（ａ）の後でかつステップ（ｂ）の前に、（ａ’）前記試験化合物が前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドに結合するか否かを判定するさらなるステップを含む。ステップ（ａ’）内の試験化合物の結合の判定は、結合するテスト分子だけで機能／活性検定を実施するに先立ち結合するテスト分子を同定するために使用し得るあらゆる結合検定、好ましくは生物物理学的結合検定に関する。適切な生物物理学的結合検定は、当該技術分野において公知であり、螢光偏光（ＦＰ）検定、螢光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）検定及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検定を含む。ステップ（ａ’）は、前記結合検定が、機能検定に比べてハイスループットの可能性の高いものである場合に、特に有利である。好ましくは、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドに対する結合親和力を示す試験化合物のみが、試験化合物の存在下及び不在下での生物活性を比較するステップ（ｂ）に補給される。
【００７４】
モジュレータを同定する方法のさらに好ましい実施形態においては、前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ポリペプチドは、前記ポリヌクレオチドでのトランスフェクションを受けた細胞の中に含まれている。この実施形態は、細胞スクリーンに関するものである。細胞スクリーン内では、標的分子（前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチド）と物理的に相互作用させることによって、又は代替的に（又は付加的に）前記標的分子と機能的に相互作用させることによって、すなわち前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの生物活性下にあり細胞検定で用いられる細胞内に存在する経路と干渉することによってその調節活性を及ぼすモジュレータを同定することができる。
【００７５】
本発明のモジュレータを同定する方法のもう１つの好ましい実施形態においては、本方法は、（ｃ）薬学的に受容可能担体、賦形剤又は希釈剤を用いて得られた１つ以上のモジュレータを処方するというさらなるステップを含む。
【００７６】
より好ましい実施形態においては、モジュレータ同定方法には、ステップ（ｂ）の後でステップ（ｃ）の前に、（ｂ’）モジュレータの薬理学的特性を最適化するステップが含まれる。
【００７７】
一般にリード化合物と呼ばれるスクリーン中で同定された化合物の薬理学的特性の最適化のための方法は、当該技術分野において公知であり、（ｉ）カルボキシル基のエステル化、又は（ｉｉ）カルボン酸でのヒドロキシ基のエステル化又は（ｉｉｉ）例えばホスフェート、ピロホスフェート又はサルフェート又はヘミスクシネートに対するヒドロキシル基のエステル化又は（ｉｖ）薬学的に受容可能な塩の形成又は（ｖ）薬学的に受容可能錯体の形成、又は（ｖｉ）薬理学的に活性な重合体、又は（ｖｉｉ）親水性部分の導入、又は（ｖｉｉｉ）アロメート又は側鎖上の置換体の導入／交換、置換体パターンの変化、又は（ｉｘ）等比体積又は生物等比体積部分の導入による修飾、又は（ｘ）相同化合物の合成、又は（ｘｉ）分岐側鎖の導入、又は（ｘｉｉ）環状類似体に対するアルキル置換体の転換、又は（ｘｉｉｉ）ケタル、アセタールに対するヒドロキシル基の誘導体化、又は（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートに対するＮ−アセチル化、又は（ｘｖ）マンニッヒ塩基、イミンの合成、又は（ｘｖｉ）ケトン又はアルデヒドから、シッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジン又はそれらの組合せにより、（ｉ）修飾された作用部位、活性スペクトル、器官特異性、及び／又は（ｉｉ）効能の改善、及び／又は（ｉｉｉ）毒性の減少（治療指数の改善）、及び／又は（ｉｖ）副作用の減少、及び／又は（ｖ）修飾された治療作用の開始、効果の持続時間、及び／又は（ｖｉ）修飾された薬物動態パラメータ（再吸収、分配、代謝及び排せつ）、及び／又は（ｖｉｉ）修飾された物理−化学パラメータ（溶解度、吸湿性、色、味、臭い、安定性、状態）、及び／又は（ｖｉｉｉ）一般的特異性、器官／組織特異性の改善、及び／又は（ｉｘ）最適化された応用形態及び経路を達成するようにリード化合物として同定された化合物を修飾する方法を含む。
【００７８】
上述のさまざまなステップは、当該技術分野において一般的に公知である。これらは、定量的構造−活動相関（ＱＳＡＲ）分析（クビニー（Ｋｕｂｉｎｙｉ）、「Ｈａｕｓｃｈ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」、ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９２年）、組合せ生化学、古典的化学その他（例えばホルグラーベ（Ｈｏｌｚｇｒａｂｅ）及びベシュトルド（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ａｐｏｔｈｅｋｅｒ  Ｚｅｉｔｕｎｇ、第１４０号（８）、８１３〜８２３頁、２０００年を参照のこと）を含むか又はこれらに依存している。
【００７９】
本発明は同様に、前記モジュレータ同定方法によって同定される又は入手可能な抗体にも関する。好ましくは前記抗体は、主要実施形態内で定義されたポリペプチドと結合する能力をもつ抗体である。より好ましくは、前記結合は特異的結合である。所与のポリペプチド又はタンパク質に対して抗体を発生させるための方法は、当該技術分野において周知である。
【００８０】
「抗体」という用語は、前記ポリペプチドを特異的に結合させ、又２重特異性抗体、合成抗体、抗体フラグメント例えばＦａｂ、ａＦ（ａｂ２）’、Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントなど又はこれらのうちの任意のものの化学的に修飾された誘導体をも含めた、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体又はそのフラグメントを含む。モノクローナル抗体は、例えば当該技術分野により開発された修飾を伴う免疫化された哺乳動物由来の脾細胞に対するマウス骨髄腫細胞の融合を含む、ケラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６号（１９７５年）、４９５頁、及びガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第７３号（１９８１年）、３頁、中で当初記述された通りの技術により調製可能である。さらに、上述のポリペプチドに対する抗体又はそのフラグメントは、例えばハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年の中で記述されている方法を使用して得ることができる。前記抗体の誘導体がファージ表示技術によって得られる場合、本発明のペプチド又はポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めるために、ＢＩＡコアシステムで利用されているような表面プラズモン共鳴を使用することができる（シーア（Ｓｃｈｉｅｒ）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、第７号（１９９６年）、９７〜１０５頁；マルンボルグ（Ｍａｌｍｂｏｒｇ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１８３号（１９９５年）、７〜１３頁）。キメラ抗体の産生は、例えば国際公開第８９／０９６２２号パンフレットの中で記述されている。本発明に従って利用すべき抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト抗体といったような異種抗体の産生のための一般的原則は、例えば国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットの中で記述されている。本発明に従って利用されるべき抗体又はその対応する免疫グロブリン鎖は、当該技術分野において公知の従来の技術を用いて、例えばアミノ酸欠失、挿入、置換、付加組換え及び／又は当該技術分野において公知の任意のその他の修飾を単独で又は組合わせて用いることによって、さらに修飾可能である。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすＤＮＡ配列内にかかる修飾を導入するための方法は、当業者にとっては周知である；例えばサンブルック（１９８９年）、前掲書同一頁を参照のこと。
【００８１】
「モノクローナル」又は「ポリクローナル抗体」という用語（ハーロウ及びレーン、（１９８８年）、前掲書同一頁を参照）は同様に、その結合特異性を保持又は本質的に保持する前記抗体の誘導体にも関する。かかる抗体の好ましい誘導体は、例えばマウス又はラットの可変領域又はヒト定常領域を含むキメラ抗体である。
【００８２】
「ｓｃＦｖフラグメント」（１本鎖Ｆｖフラグメント）という用語は、当該技術分野において充分理解されており、サイズが小さいこと及びかかるフラグメントを組換えにより産生することができることに起因して好まれる。
【００８３】
本発明に従って使用される抗体に関連した「特異的に結合する」という用語は、抗体などが、類似の構造をもつポリペプチドと交叉反応しないか又は本質的に交叉反応しないということを意味している。調査対象の一連の抗体などの交叉反応性は、例えば、関心対象のポリペプチドならびに多少の差こそあれ（構造的に及び／又は機能的に）密な関係性をもつ数多くのポリペプチドに対する従来の条件（例えばハーロウ及びレーン、（１９８８年）、前掲書同一頁を参照のこと）の下での前記一連の抗体などの結合を査定することによってテストされ得る。関心対象のポリペプチド／タンパク質に結合するものの、好ましくは関心対象のポリペプチドと同じ組織によって発現されるその他のポリペプチドのいずれにも結合しない又は本質的に結合しない抗体のみが、関心対象のポリペプチド／タンパク質に特異的であるとみなされる。
【００８４】
本発明の方法の特に好ましい実施形態においては、前記抗体又は抗体部分は、ヒト抗体又はヒト化抗体であるか又はこれらから誘導されている。
【００８５】
「ヒト化抗体」という用語は、本発明に従うと、ＣＤＲ３といったような可変領域内の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）そして好ましくは６つのＣＤＲ全てが、所望の特異性をもつヒト由来の抗体のＣＤＲにより置き換えられた、非ヒト由来の抗体を意味する。任意には、抗体の非ヒト定常領域は、ヒト抗体の定常領域によって置き換えられている。ヒト化抗体の産生方法は、例えば欧州特許出願第Ａ１０２３９４００号明細書及び国際公開第９０／０７８６１号パンフレットの中で記述されている。
【００８６】
生物活性のモジュレータとして作用する本発明による抗体は、抗体を本発明によるモジュレータ同定方法に付すことによって獲得又は同定可能である。
【００８７】
以下の実施例は本発明を例示するが、限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【００８８】
実施例１
示差的に調節された遺伝子の同定のための一般的アプローチ
慢性的に高い流体せん断応力を達成するために本発明者らは、バイパス流の大部分を収集する閉塞した動脈の遠位断端を、随伴する静脈と外科的に接続させ、側副血流が遠位の高抵抗脈管床に流入する代りに低圧低抵抗の静脈系内に方向転換するという意味で短絡が存在するようにした。このようにして、動脈と静脈の間の大きな圧力勾配のため、常時高い流量が作り出された。側副が成長しても、血流量は脈管の半径の４乗で減少し、せん断応力は脈管の半径の３乗でしか減少しないことから、流体せん断応力は減少しない。
【００８９】
「スーパーバイパス」の追加の組織成長を採取し、ＲＮＡを抽出し、マイクロアレイ分析に付し、そこから何百もの遺伝子がその活性の変化を示した。
【００９０】
実施例２
動物モデル
本発明者らは、流体せん断応力が動脈形成における駆動力であることを実証するため、側副動脈内に持続的流体せん断応力をもつ動物モデルを開発した。
【００９１】
ウサギにおいて動脈形成を誘発するため、本発明者らは、後肢の主要動脈である大腿動脈を結紮した（図１）。次に、本発明者らは、結紮に対し遠位の動脈と付随する静脈の間に直接的接続を確立した。これにより、側副動脈内の圧力減少と流体せん断応力の増加が確立された（図２）。
【００９２】
実施例３
最大側副コンダクタンス測定値
最大側副コンダクタンス（Ｃｃｍａｘ）の測定に基づいて、側副系の最大容量を定量化するために血行動態計測を実施した。最大側副コンダクタンスの測定方法は、当業者にとって公知であり、明細書中に概略的に記されている通りにかつ、例えばシャーパーら（１９７６年）、パシクら（１９８２年）中で記述されている通りに実施可能である。
【００９３】
特に、終末期実験のためには、動物を再度麻酔し、両腸骨動脈を露出させ、ｍｌ／分単位で血流量を測定するため超音波流量プローブを取付けた。これらを、大腿深動脈すなわち大部分の成長する側副脈管の幹部の近位に位置づけした。小型ＰＥ５０カテーテルを、アデノシンの輸液のため側枝を通して腹大動脈内に前進させた。ｍｍＨｇ単位で全身的動脈圧を測定するため、頸動脈内に流体が充填されたカテーテルを導入した。足の動脈を両方共前処理し、側副網全体にわたって又は無傷の大腿動脈及びその支流に沿って圧力勾配を測定するため、カテーテルを挿入した。中央大動脈圧力が下降し始めるまで増大する濃度でアデノシンを輸液した。これは通常、毎分６００マイクログラム／ｋｇの濃度で行なわれた。圧力及び流量シグナルをＡＤコンバータに供給し、Ｍａｃ  Ｌａｂコンピュータ上にデジタル記録した。最大アデノシン補充流量を、側副網を横断する圧力勾配（ｍｌ／分／ｍｍＨｇ）で除すことで、最大コンダクタンス（Ｃｍａｘ）を計算した。
【００９４】
目的は、未結紮大腿動脈のものに匹敵する最大コンダクタンスに達すること、すなわち、動脈機能の完全な回復に達することであった。本発明者らのシャント実験を確立するまでは、異なる成長因子での処置の後でさえ、完全な回復を達成することは不可能であった。完全な回復に達する（図３）というのは、「スーパーバイパス」を作り上げることができたということを意味する。これらの「スーパーバイパス」は死後血管造影法において目視できる（図４）。
【００９５】
実施例４
示差的発現
分子生物学実験を実施するために、本発明者らは、ラットにおいてシャントモデルを確立しなければならなかった。ラットの血管造影法は、シャント処置がウサギと同じ程度までラットにおいて動脈形成を刺激することを示した。
【００９６】
切開したラットの側副動脈から、全ＲＮＡを単離し、マイクロアレイ分析に付した（ラット全ゲノムアレイ、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）。アップレギュレートされた最高の有意な標的の中で、本発明者らは、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ（アクチン結合Ｒｈｏ活性化タンパク質／Ｒｈｏ依存性シグナリングの横紋活性化因子）に焦点をあてた。定量的ＰＣＲを用いて、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ写しの最高１４倍の増加が、シャント手術の５日後に確認された（図５）。「シャント」側副内のＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓの倍数変化の変動が、その動物において実施されたシャント施術の質及び機能性と相関関係をもつという点に留意されたい。タンパク質レベルについてもＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓのアップレギュレーションを確認するため、本発明者らは、「シャント」及び対照の側副から抽出されたタンパク質のウエスタンブロット分析を実施した（図６）。
【００９７】
Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ転写の経時変化を調査するため、側副動脈からの全ＲＮＡを、シャント施術後の異なる時点で単離し、ｑＲＴ  ＰＣＲ分析に付した（図７）。対照側副（シャント無しの結紮）では転写は３日目にピークに達し、７日目以降消滅するが、「シャント」側副ではＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓは、はるかに高いレベルで転写され、１４日目以降もなおも有意にアップレギュレートした。かくして、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ発現は、シャント手術を受けたラットにおけるせん断応力レベルと密に関係している。
【００９８】
実施例５
過剰発現とノックダウン
Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓが動脈形成における主要な調節因子であることを証明するために、過剰発現及びノックダウンベクターを生成した。Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓを過剰発現するためには、ラットとウサギの読取り枠を別々に、哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３ｎｅｏ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））内にクローニングさせた。Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ写しを削減するため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ媒介型ノックダウンを適用した。これは、ｓｉＲＮＡ転写系（ｐ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｎｅｏ、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）内にＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ標的配列をクローニングさせることによって達成された。これらのベクターをまず最初に、トランスフェクションを受けたＣＯＳ１細胞内でテストした。この細胞型ではＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓのいかなる内因性発現も観察されないことから、両方のベクターで細胞を同時トランスフェクトした。対照としてナンセンスｓｉＲＮＡを使用して、本発明者らは、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ写しの８０％超のノックダウンを導く３つの機能的なｓｉＲＮＡを同定した（図８）。この結果は同様に、ウエスタンブロット分析（図９）により確認され、ここでＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓタンパク質は、抗体の検出限界より低くノックダウンされた。
【００９９】
生体内でのシャントモデル内のＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓノックダウンをテストするために、本発明者らは、組換え型ｓｉＲＮＡアデノウィルスを構築し、シャント処置を受けたラットの局所的側副内ウィルス形質導入を実施した（図１４）。ＡＢＲＡのノックダウンは、シャント処置されたもの（図１４ａ）及び対照のウィルス処置されたラット（ナンセンスｓｉＲＮＡ）（図１４ｃ）と比べて側副形成の減少を導く（図１４ｂ）。
【０１００】
実施例６
ＡＢＲＡ−ＳＴＡＲＳを発現するブタＳＭＣは増殖し、ＥＣは増殖せず
ＭＴＴ細胞増殖検定（ＡＴＣＣ（登録商標））を用いて、本発明者らは、ＡＢＲＡが、単離されたブタ平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖活性を増大させることを示すことができた（図１０ａ）。これとは対照的に、培養中のブタ内皮細胞（ＥＣ）は、ＬａｃＺ対照と比べてＡＢＲＡトランスフェクションの後増殖活性の変化を示さなかった（図１０ｂ）。
【０１０１】
イエローテトラゾリウム（ＭＴＴ；（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、一部には、デヒドロゲナーゼ酵素の作用により代謝活性細胞により還元されて、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨといったような還元性等価物を生成する。結果として得られた細胞内ホルマザンは、分光光度手段により定量化され得、細胞の増殖を明らかにする。
【０１０２】
細胞を９６ウェルの平板上に固定させ、組換え型アデノウィルス（１．１７５×１０７感染単位／ウェル）を用いてＡＢＲＡ及びＬａｃＺでトランスフェクトした。１日目、２日目、そして３日目に、各ウェルに１０μｌのＭＴＴ試薬を付加し、４時間インキュベートした。その後１００μｌの洗浄剤試薬を添加し、２時間室温で暗所にてインキュベートした。吸収度を５７０ｎｍで測定した。
【０１０３】
実施例７
ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳを発現するラットＳＭＣ系列は、増殖の増加を示した。
第２の実験においては、ＤＢ１Ｘ胎児ラットの胸大動脈のＳＭＣから確立した培養Ａ−１０細胞が、ＡＢＲＡ−トランスフェクションに対し細胞増殖の増加をもって密に応答した。
【０１０４】
細胞を２４ウェルの平板（５×１０３／ウェル）上で培養し、組換え型アデノウィルスＡｄ−ＡＢＲＡ及びＡｄ−ＬａｃＺ（３．７５×１０７感染単位／ウェル）を用いてトランスフェクトした。２日目に、１組の当初ＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けた細胞を、組換え型ＡＢＲＡ−アデノウィルス（２．４×１０７感染単位／ウェル）で再度トランスフェクトした。５日間、デュプリケートウェル（ｎ＝４）を採取し、細胞増殖を監視するべく計数した。
【０１０５】
２日後に、ＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けた細胞は倍増した（９２％）増殖速度を示した（図１１）。２日目に再びＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けた細胞は、「通常の」ＡＢＲＡトランスフェクションを受けた細胞に比べて３日目に２１％多い細胞を示し、ＬａｃＺ対照に比べると６０％の細胞数増加を示した。
【０１０６】
実施例８
ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳでのトランスフェクションを受けたＥＣはＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳを分泌する
細胞培養分泌実験において、ブタＳＭＣを、２４ウェルの平板内で培養した。孔サイズ０．４μｍ（ウィルスは膜を通して輸送されない）の細胞培養インサート（ＴｈｉｎＣｅｒｔ（商標）、グレイナー・バイオ・ワン）を用いて、Ａｄ−ＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けたブタＥＣ細胞を各ウェルの上面に平板固定した（図１２ａ）。トランスフェクション後２日目と３日目に増殖活性（ＭＴＴ、細胞増殖検定、ＡＴＣＣ（登録商標））を測定した。
【０１０７】
ブタＳＭＣは、Ａｄ−ＬａｃＺ対照に比べて増殖活性の有意な増加を示す（図１２ｂ）。従って本発明者らは、ＡＢＲＡ自体又はＡＢＲＡにより誘発されたＥＣによる培地内へのパラクリン分泌がＳＭＣの細胞増殖を導く、という結論を下している。
【０１０８】
実施例９
ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳの側副内アデノウィルス遺伝子トランスファが側副コンダクタンスを改善させる
ＡＢＲＡの側副内アデノウィルスベースの遺伝子トランスファを用いて、本発明者らは流体せん断応力（ＦＳＳ）の効果を代替することができた。ウサギにおいて大腿動脈を結紮した後、本発明者らは、結紮された大腿動脈だけで、トランスフェクションを受けていないウサギに比べて最高９０％の側副成長を誘発することができた（図１３参照）。
【０１０９】
結論
慢性的に高い流体せん断応力（ＦＳＳ）を導く動脈−静脈吻合術（シャント）を伴う後肢虚血モデルにおいて、本発明者らは、この物理的力が側副成長を顕著な形で誘発するということを示すことができた。血流量の不足を完全に補償することが初めて可能となった。
【０１１０】
実施例は、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ発現が動脈形成と密に関係していることを実証している。転写レベルならびに発現の経時変化は、側副成長と強く相関し、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓを動脈形成の主要な調節因子にしている。
【０１１１】
培養した細胞を用いた実施例６〜９は、ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳがＳＭＣのためのマイトジェンとして作用し、一方ＥＣは影響を受けず、増殖活性の増大を全く示さない、ということを実証している。一方、ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳ自体又はＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳにより誘発されるＡｄ−ＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けたＥＣのパラクリン機序は、近くのＳＭＣの増殖活性の増加を導くシグナルを形質導入する。
【０１１２】
最後に、本発明者らは、Ａｄ−ＡＢＲＡを用いた側副内遺伝子トランスファが、トランスフェクションを受けず結紮された対照側に比べてウサギの体内での大腿動脈の結紮の後の側副コンダクタンス及び成長を改善させる（９０％）ということを示すことができた。
【０１１３】
一方、ラットのシャントモデルにおけるｓｉＲＮＡを用いたＡＢＲＡノックダウンは、「シャント効果」を完全に無効にし、側副リモデリングは、単純な結紮の対照において見られるものに匹敵していた。
【０１１４】
これまでは、ＡＢＲＡは横紋筋細胞分化に関してしか考慮されていなかった（アライ（Ａｒａｉ）ら、２００２年；クワハラ（Ｋｕｗａｈａｒａ）Ｋら、２００５年）。初めて本発明者らは、ＡＢＲＡが成長する側副内でも高レベルで発現され、増大したＦＦＳにより誘発される側副脈管の成長において決定的な役割を果たすということを示すことができた。シャントモデルは動脈閉塞後の脈管の機能の完全な回復（＞１００％）を導くことから、本発明者らはＡＢＲＡを、血管及び心臓血管疾患に関する薬剤の開発のための最も前途有望な標的の１つとみなしている。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ウサギの後肢における大腿動脈結紮のモデルの概略的例示である。左肢においては、既存の側副動脈を伴う未閉塞の動脈が示されている。右肢では、動脈は閉塞され（結紮）、側副動脈は拡張されて、遠位肢のかん流を確保している（動脈形成）。
【図２】１本の肢の脈管系の拡大部分が示されている。動脈は結紮され（結紮）、側副動脈はこの閉塞を迂回している。結紮より下では、動脈−静脈吻合が準備され、下肢における比較的高い圧力（３０〜４０ｍｍＨｇ）とは対照的に静脈内の圧力が低い（５〜１０ｍｍＨｇ）ため、血液の大部分は側副から出て直接静脈内に流れる。これは、側副動脈内の流体せん断応力と血流量の増加に結びつけられる。
【図３】成長因子で処置された及び動脈−静脈−（ａｖ−）シャントで処置された側副系と対照させた、未閉塞大腿動脈のＣｃｍａｘの％単位で表わした最大側副コンダクタンスの測定結果。結紮されていない大動脈のコンダクタンスに到達するという目標は、対照−結紮内及び成長因子による処置の後には達成されなかった。一週間のシャント処置の後、この目標は達成され、２週間後にそれを上回り、４週間後に、コンダクタンスは未結紮動脈に対比して倍増する。
【図４】異なる処置の後の側副系の死後血管造影写真。Ａ）１週間後のさらなる処置が全く無い動脈の結紮；小さな側副のみが見える（矢印）  Ｂ）１週間後の結紮とシャント処置；より大きい直径をもつ沢山の側副が見える  Ｃ）４週間後のさらなる処置が全く無い結紮；いくつかの側副が見える  Ｄ）４週間の結紮とシャント処置；大量の大きな側副動脈。
【図５】ＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳ（Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ）遺伝子転写；シャント外科手術後５日目のラット対疑似手術を受けた動物におけるＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ  ｍＲＮＡ転写についてのｑＲＴ  ＰＣＲ結果（倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）＝１）。シャントの機能性がＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ転写と相関関係をもつという点に留意されたい。機能性が低い（せん断応力が減少した）シャント２９、１６及び２６は、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ転写の減少も示した。機能性の高いシャント２８及び１８は、高いＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ転写を誘発する。
【図６】Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓタンパク質の発現：シャント処置側副対結紮対照の７日以内でのＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓのウエスタンブロット分析。
【図７】ラットにおけるシャント対結紮のＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ転写の経時変化。Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓの「シャント転写」は、７日前後に３５という倍数変化でピークに達し、１４日後に横ばい状態にならない。結紮の側では、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓ転写は３日前後ですでにピークに達し、７日後は完全に消滅する。
【図８】ＣＯＳ１細胞におけるＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ発現ベクター及びｓｉＲＮアミノ酸Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓベクターの同時トランスフェクション。この細胞型ではＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓの内因性発現が全く存在しないという点に留意されたい。３つのｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ３、７及び１０）で、Ａｂｒａ／Ｓｔａｒｓの８０％超のダウンレギュレーションが達成された。対照として、ＣＯＳ細胞をＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ発現ベクター及びナンセンスｓｉＲＮＡ発現プラスミド（Ｃｏｎｔｒ１及び２）で同時トランスフェクトした。Ｃｏｎｔｒ１及び２のＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓ転写を１００％とみなした。
【図９】トランスフェクションを受けたＣＯＳ１細胞内のＡｂｒａ／ＳｔａｒｓのｓｉＲＮＡ媒介型ノックダウンのウエスタンブロット。２つのテスト対象ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１及び７）は、ウエスタンブロットの検出限界より低いところでタンパク質のノックダウンを媒介する上で機能的である。ラットＡｂｒａ／Ｓｔａｒｓについて開発された抗体も、そのウサギホモログを検出する。
【図１０】ＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けたブタＳＭＣ（ａ）及びＥＣ（ｂ）細胞の増殖活性。細胞増殖活性を監視するために、ＭＴＴ細胞増殖検定（ＡＴＣＣ（登録商標））を使用した。増殖活性は、１日目に比べて５７０ｎｍでの相対的ホルマザン吸収度変化として示されている（*ｐ＜０．０５）。
【図１１】Ａｄ−ＡＢＲＡトランスフェクションを受けたラットＳＭＣ（Ａ−１０）の増殖。細胞を、１日目（ｄ１）に、組換え型アデノウィルスＡｄ−ＡＢＲＡ及びＡｄ−ＬａｃＺ（３．７５×１０７感染単位／ウェル）を用いてトランスフェクトした。２日目（ｄ２）に、１組のＡＢＲＡトランスフェクションを受けた細胞を再度Ａｄ−ＡＢＲＡでトランスフェクトした（Ａｄ−ＡＢＲＡ＋）。
【図１２ａ】ブタのＳＭＣ及びＥＣでの細胞培養分泌実験。Ａｄ−ＡＢＲＡトランスフェクションを受けた細胞をブタＳＭＣ（下）の上に平板固定した（ＴｈｉｎＣｅｒｔ（商標）インサート、孔サイズ０．４μｍ、グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）バイオ・ワン（ｂｉｏ−ｏｎｅ））。分泌された小分子は膜を通して輸送される。
【図１２ｂ】ＳＭＣの増殖活性（ＭＴＴ細胞増殖検定、ＡＴＣＣ（登録商標））をトランスフェクション後２日目と３日目に測定した。
【図１３】結紮された側副系（結紮）、ＡＶシャント処置された側副系（ＡＶ−シャント）及びＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けた側副系（Ａｄ−ＡＢＲＡ）と対比した未閉塞大腿動脈（未結紮）のＣＣｍａｘの％で表わされた最大側副コンダクタンスの測定結果。未結紮大動脈のコンダクタンスに達するという目標は、結紮では達成されなかった。１週間後に、ＡＢＲＡでのトランスフェクションを受けた側副のコンダクタンスはほぼＡＶシャント値に達する。
【図１４】左脚内の動静脈シャントでグレードアップされたラットの後肢虚血モデルにおけるｓｉＲＮＡを用いたＡＢＲＡ／ＳＴＡＲＳのノックダウン。右脚は、単なる結紮で処置されただけであり、個体内対照として役立てた。Ａ．ｓｉＲＮＡ処置無しのシャント。Ｂ．ｓｉＲＮＡ産生トランス遺伝子の局所的アデノウィルストランスフェクションを用いたシャント処置側のＡＢＲＡのノックダウン。側副成長は阻害されており、対照側に匹敵する。Ｃ．ナンセンスｓｉＲＮＡでの側副内トランスフェクション。側副成長はトランスフェクション無しのシャント処置（Ａ）に匹敵している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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