(57)【要約】  本明細書中には、被験体が、疼痛感受性の変化、急性または慢性痛を発症するリスクの変化を有するかどうかを決定するため、またはテトラヒドロビオプテリン(BH4)関連障害もしくはその傾向を診断するための方法が開示されている。これらの方法は、疼痛感受性の変化および急性または慢性痛を発症するリスクの変化と関連しているGCH1およびKCNS1対立遺伝子変異の発見、およびGCH1「疼痛保護性ハプロタイプ」が処置した白血球においてBH4合成の上方制御の低下と関連しているという発見に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するための方法であって、該被験体由来の生物学的サンプル中のGTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)核酸における対立遺伝子変異の存在または不存在を決定するステップを含み、該対立遺伝子変異が、疼痛感受性、急性または慢性疼痛の発症、またはBH4関連障害の発症と相関している、上記方法。
【請求項２】
GCH1対立遺伝子変異が、ヒト染色体14q22.1〜14q22.2内に位置するハプロタイプブロック中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
GCH1対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項２に記載の方法: rs6572984, rs17128017, rs10151500, rs10136966, rs841, rs987, rs17253577, rs11624963, rs752688, rs7493025, rs2004633, rs7493033, rs17253584, rs10139369, rs10150825, rs11848732, rs17253591, rs10143089, rs13329045, rs10131232, rs10133662, rs10133941, rs13329058, rs9672037, rs7161034, rs7140523, rs11626298, rs17128021, rs10129528, rs4411417, rs2878168, rs11461307, rs7153186, rs7153566, rs7155099, rs11444305, rs11439363, rs7155309, rs1952437, rs8007201, rs11412107, rs12587434, rs17128028, rs12589758, rs2878169, rs28532361, rs12879111, rs10129468, rs11620796, rs2149483, rs7147200, rs4462519, rs9671371, rs9671850, rs9671455, rs28481447, rs12884925, rs8010282, rs8010689, rs8011751, rs7156475, rs17128033, rs28643468, rs2183084, rs10137881, rs2878170, rs12323905, rs10138301, rs12323579, rs10138429, rs12323582, rs7141433, rs7141483, rs7141319, rs2183083, rs2183082, rs2183081, rs7492600, rs8009470, rs10144581, rs12323758, rs10145097, rs13368101, rs10134163, rs13367062, rs4402455, rs7493427, rs10311834, rs9743836, rs4363780, rs7493265, rs10312723, rs4363781, rs7493266, rs10312724, rs11627767, rs11850691, rs11627828, rs11626155, rs2878171, rs10220344, rs10782424, rs3965763, rs10146709, rs10146658, rs10147430, rs17128050, rs12147422, rs28477407, rs10143025, rs10133449, rs10133650, rs3945570, rs28757745, rs28542181, rs7155501, rs3825610, rs3783637, rs3783638, rs3783639, rs3825611, rs11158026, rs11158027, rs10873086, rs11626210, rs8004445, rs8004018, rs8010461, rs9805909, rs8009759, rs10444720, rs4901549, rs3783640, rs10136545, rs10139282, rs8020798, rs10498471, rs28417208, rs11845055, rs10498472, rs998259, rs8011712, rs11312854, rs11410453, rs10782425, rs10149080, rs17128052, rs8003903, rs10645822, rs10132356, rs13366912, rs12885400, rs7147286, rs7147040, rs7147201, rs17832263, rs10133661, rs3783641, rs3783642, rs12432756, rs10134429, rs10598935, rs10545051, rs17128057, rs8016730, rs8017210, rs11844799, rs12883072, rs10131633, rs10131563, rs10149945, rs8019791, rs8019824, rs8018688, rs10138594, rs10141456, rs9972204, rs2149482, rs28413055, rs2183080, rs28458175, およびrs1753589。
【請求項４】
対立遺伝子変異がGCH1遺伝子のプロモーター中または調節領域中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
GCH1対立遺伝子変異が、位置C.-9610のAまたは位置C.343+8900のTを含むか、または位置C.-9610のAおよび位置C.343+8900のTを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
GCH1対立遺伝子変異が、GCH1配列の位置C.-9610のA、位置C.-4289のC、位置C.343+26のG、位置C.343+8900のT、位置C.343+10374のT、位置C.343+14008のG、位置C.343+18373のC、位置C.344-11861のA、位置C.344-4721のC、位置C.454-2181のA、位置C.509+1551のC、位置C.509+5836のG、位置C.627-708のA、位置C.*3932のG、および位置C.*4279のGを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
BH4関連障害が心血管疾患または神経系疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、虚血性再潅流傷害、心肥大、高血圧症、血管炎、心筋梗塞、または心筋症である、請求項７の方法。
【請求項９】
神経系疾患が、うつ病、神経変性疾患、運動障害、または自律神経障害である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
核酸サンプルが1コピーまたは複数コピーの対立遺伝子変異を含むかどうかを決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
急性痛が、機械的疼痛、熱感痛(heat pain)、冷感痛(cold pain)、虚血性疼痛、または化学的誘発疼痛のうち1つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
疼痛が、末梢または中枢神経因性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛関連疼痛、関節炎性疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心症痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張型頭痛、産科的疼痛、婦人科的疼痛、または化学療法誘発疼痛である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対立遺伝子変異の存在または不存在を核酸配列決定によって決定するか、またはPCR解析によって決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
被験体に投与される鎮痛剤の投薬または選択を決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
鎮痛剤を用いる臨床試験に被験体を含めるかどうかを決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
被験体に対して外科的処置を実行するかどうかを決定するため、被験体に神経毒治療を行うかどうかを決定するため、または麻酔法を選択するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
外科的処置が神経損傷、または神経損傷の処置を伴う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
保険リスク解析の一部として、または仕事割り当ての選択として、被験体における疼痛発症の可能性を判定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、または急性もしくは慢性痛を発症するリスクを診断するための方法であって、該被験体由来の生物学的サンプル中の、カリウム電位開口型チャネル、遅延整流、サブファミリーS、メンバー1 (KCNS1)核酸における対立遺伝子変異の存在または不存在を決定するステップを含み、該対立遺伝子変異が、疼痛感受性または急性もしくは慢性痛の発症と相関している、上記方法。
【請求項２１】
対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項２０の方法: rs6124683, rs4499491, rs8118000, rs6124684, rs6124685, rs12480253, rs6124686, rs6124687, rs6031988, rs6065785, rs1054136, rs17341034, rs6031989, rs7264544, rs734784, rs6104003, rs6104004, rs11699337, rs6017486, rs962550, rs7261171, rs6104005, rs13043825, rs7360359, rs8192648, rs6073642, rs6130749, rs6073643, rs6104006, rs6031990, rs8122867, rs8123330, およびrs3213543。
【請求項２２】
対立遺伝子変異がKCNS1配列の位置43,157,041のAを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
KCNS1対立遺伝子変異がKCNS1配列の位置43,155,431のG、位置43,157,041のA、および位置43,160,569のCを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するための方法であって、
(a) 該被験体由来の細胞を含む生物学的サンプルを、該細胞中のサイクリックAMPのレベルを増加させるか、リポ多糖(LPS)を含むか、または炎症性サイトカインを含む組成物と接触させるステップ; および
(b) 該サンプル中のGTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)の発現または活性を測定するステップ、を含み、
ここで、該発現または活性が、ベースライン値と比較されて、該患者が疼痛感受性の変化を有するかどうかを示すか、または該被験者において急性もしくは慢性痛を発症するかまたはBH4関連障害を発症するリスクの診断に役立つ、上記方法。
【請求項２５】
GCH1発現または活性の減少が疼痛感受性の減少または急性もしくは慢性痛を発症するリスクの低下を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
GCH1活性の測定が細胞中のネオプテリンまたはビオプテリンレベルの測定を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が白血球である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物がホスホジエステラーゼインヒビターまたはアデニルシクラーゼアクチベーターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
アデニルシクラーゼアクチベーターがフォルスコリンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットであって、
(a) GCH1遺伝子中の対立遺伝子変異を含む配列を増幅するためのプライマーセット; および
(b) 使用説明書
を含むキット。
【請求項３１】
GCH1対立遺伝子変異が、ヒト染色体14q22.1〜14q22.2内に位置するハプロタイプブロック中に存在する、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
GCH1対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項３１に記載のキット: rs6572984, rs17128017, rs10151500, rs10136966, rs841, rs987, rs17253577, rs11624963, rs752688, rs7493025, rs2004633, rs7493033, rs17253584, rs10139369, rs10150825, rs11848732, rs17253591, rs10143089, rs13329045, rs10131232, rs10133662, rs10133941, rs13329058, rs9672037, rs7161034, rs7140523, rs11626298, rs17128021, rs10129528, rs4411417, rs2878168, rs11461307, rs7153186, rs7153566, rs7155099, rs11444305, rs11439363, rs7155309, rs1952437, rs8007201, rs11412107, rs12587434, rs17128028, rs12589758, rs2878169, rs28532361, rs12879111, rs10129468, rs11620796, rs2149483, rs7147200, rs4462519, rs9671371, rs9671850, rs9671455, rs28481447, rs12884925, rs8010282, rs8010689, rs8011751, rs7156475, rs17128033, rs28643468, rs2183084, rs10137881, rs2878170, rs12323905, rs10138301, rs12323579, rs10138429, rs12323582, rs7141433, rs7141483, rs7141319, rs2183083, rs2183082, rs2183081, rs7492600, rs8009470, rs10144581, rs12323758, rs10145097, rs13368101, rs10134163, rs13367062, rs4402455, rs7493427, rs10311834, rs9743836, rs4363780, rs7493265, rs10312723, rs4363781, rs7493266, rs10312724, rs11627767, rs11850691, rs11627828, rs11626155, rs2878171, rs10220344, rs10782424, rs3965763, rs10146709, rs10146658, rs10147430, rs17128050, rs12147422, rs28477407, rs10143025, rs10133449, rs10133650, rs3945570, rs28757745, rs28542181, rs7155501, rs3825610, rs3783637, rs3783638, rs3783639, rs3825611, rs11158026, rs11158027, rs10873086, rs11626210, rs8004445, rs8004018, rs8010461, rs9805909, rs8009759, rs10444720, rs4901549, rs3783640, rs10136545, rs10139282, rs8020798, rs10498471, rs28417208, rs11845055, rs10498472, rs998259, rs8011712, rs11312854, rs11410453, rs10782425, rs10149080, rs17128052, rs8003903, rs10645822, rs10132356, rs13366912, rs12885400, rs7147286, rs7147040, rs7147201, rs17832263, rs10133661, rs3783641, rs3783642, rs12432756, rs10134429, rs10598935, rs10545051, rs17128057, rs8016730, rs8017210, rs11844799, rs12883072, rs10131633, rs10131563, rs10149945, rs8019791, rs8019824, rs8018688, rs10138594, rs10141456, rs9972204, rs2149482, rs28413055, rs2183080, rs28458175, およびrs1753589。
【請求項３３】
GCH1対立遺伝子変異が、GCH1配列の位置C.-9610のA、位置C.-4289のC、位置C.343+26のG、位置C.343+8900のT、位置C.343+10374のT、位置C.343+14008のG、位置C.343+18373のC、位置C.344-11861のA、位置C.344-4721のC、位置C.454-2181のA、位置C.509+1551のC、位置C.509+5836のG、位置C.627-708のA、位置C.*3932のG、および位置C.*4279のGを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
対立遺伝子変異がGCH1遺伝子のプロモーター領域中または調節領域中に存在する、請求項３０に記載のキット。
【請求項３５】
BH4関連障害が心血管疾患または神経系疾患である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３６】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、または急性もしくは慢性痛を発症するリスクを診断するためのキットであって、
(a) KCNS1遺伝子中の対立遺伝子変異を含む配列を増幅するためのプライマーセット; および
(b) 使用説明書
を含むキット。
【請求項３７】
KCNS1対立遺伝子変異が、ヒト染色体20q12内に位置するハプロタイプブロック中に存在する、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項３６のキット: rs6124683, rs4499491, rs8118000, rs6124684, rs6124685, rs12480253, rs6124686, rs6124687, rs6031988, rs6065785, rs1054136, rs17341034, rs6031989, rs7264544, rs734784, rs6104003, rs6104004, rs11699337, rs6017486, rs962550, rs7261171, rs6104005, rs13043825, rs7360359, rs8192648, rs6073642, rs6130749, rs6073643, rs6104006, rs6031990, rs8122867, rs8123330, およびrs3213543。
【請求項３９】
対立遺伝子変異がKCNS1配列の位置43,157,041のAを含むか、または対立遺伝子変異が、KCNS1配列の位置43,155,431のG、位置43,157,041のA、および位置43,160,569のCを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットであって、
(a) 細胞中のサイクリックAMPレベルを増加させるための物質、LPS、または炎症性サイトカイン;
(b) GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1) mRNA配列にハイブリダイゼーションさせるための第一プライマー; および
(c) 使用説明書
を含むキット。
【請求項４１】
前記物質がアデニルシクラーゼアクチベーターまたはホスホジエステラーゼインヒビターである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記物質がフォルスコリンである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
第二プライマーをさらに含み、その場合、第一および第二プライマーはGCH1 mRNA配列の少なくとも一部分の増幅に使用することが可能である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットであって、
(a) 細胞中のサイクリックAMPレベルを増加させるための物質、LPS、または炎症性サイトカイン;
(b) GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)に特異的な抗体; および
(c) 使用説明書
を含むキット。
【請求項４５】
前記物質がアデニルシクラーゼアクチベーターまたはホスホジエステラーゼインヒビターである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記物質がフォルスコリンである、請求項４５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
神経系に対するいかなる明らかな組織損傷または病変をも伴わない臨床疼痛症状(炎症性および神経因性疼痛が含まれる)および疼痛過敏性症候群は、末梢および中枢神経系で作動する多様な神経生物学的機構に起因する。ある機構は特定の疾患原因に特有であり、他の機構は複数の疼痛症候群に共通である。ある機構は一時的であり、ある機構は不可逆的である(Scholz and Woolf, Nat Neurosci 5:1062-1067 (2002))。これらには、一次感覚ニューロンの興奮性および閾値の変化、脊髄におけるシナプスプロセシングの変化、阻害性介在ニューロンの損失、および脊髄に対する脳幹促進性および阻害性入力の改変が含まれる。これらのニューロン活性の変化は、新規遺伝子転写、翻訳後修飾、イオンチャネルおよび受容体輸送の変化、ミクログリアの活性化、神経免疫相互作用、およびニューロンのアポトーシスに起因する(Marchand et al., Nat Rev Neurosci 6:521-32 (2005); Woolf et al., Science 288:1765-1769 (2000); Tsuda et al., Trends Neurosci 28:101-107 (2005); Hunt and Mantyh, Nat Rev Neurosci 2:83-91 (2001); Scholz et al., J Neurosci 25:7317-7323 (2005))。自発痛、通常は無害な刺激に反応した疼痛(異痛症)、および侵害刺激に対する過剰な応答(痛覚過敏)として現れる疼痛過敏性は、臨床疼痛の主要な特徴であり、個体によっては、初期損傷が回復した後に長く持続することがある。
【０００２】
近交系げっ歯類系統およびヒト双子における複数の研究で、慢性痛を発症するリスクが遺伝的に決定されうることが示唆されている(Mogil et al., Pain 80:67-82 (1999); Diatchenko et al., Hum Mol Genet 14:135-43 (2005); Norbury et al., 11th World Congress on Pain, Sydney, Australia Abstract (2005); Fillingim et al., J Pain 6:159-67 (2005); Zondervan et al., Behav Genet 35:177-88 (2005); MacGregor et al., Arthritis Rheum 51:160-7 (2004))。しかし、本発明以前には、特定の個体において高められた疼痛感受性を持続させる不適応プロセス(maladaptive processes)を存続させるものが何であるかは十分に理解されていなかった。疼痛応答についての信頼性のある予測材料も入手可能でなかった。
【発明の開示】
【０００３】
発明の要旨
本発明は、疼痛感受性を予測するため、GCH1およびKCNS1遺伝子中の疼痛保護性対立遺伝子変異の同定に基づいて急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、または、GCH1遺伝子中の対立遺伝子（アレル）変異の同定に基づいて哺乳類被験体におけるテトラヒドロビオプテリン(BH4)関連障害を発症する高いリスクが診断されるリスクを診断するための、方法およびキットを提供する。
【０００４】
特定の一態様では、本発明は、哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害(例えば心血管疾患または本明細書中に記載の任意のBH4関連障害)を発症するリスクを診断するための方法であって、該被験体由来の生物学的サンプル中のGTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)核酸における対立遺伝子変異の存在または不存在を決定するステップを含み、ここで該対立遺伝子変異が、疼痛感受性、急性または慢性痛の発症、またはBH4関連障害と相関している、上記方法を特徴とする。GCH1対立遺伝子変異は、ヒト染色体14q22.1-14q22.2内に位置するハプロタイプブロック中に存在しうる(例えば、表１に列挙されるSNPからなる群から選択されるSNPを含む対立遺伝子変異または、位置C.-9610のA、位置C.343+8900のT、もしくはその両者、を含む対立遺伝子変異)。所与の実施形態では、該対立遺伝子変異は、GCH1配列の位置C.-9610のA、位置C.-4289のC、位置C.343+26のG、位置C.343+8900のT、位置C.343+10374のT、位置C.343+14008のG、位置C.343+18373のC、位置C.344-11861のA、位置C.344-4721のC、位置C.454-2181のA、位置C.509+1551のC、位置C.509+5836のG、位置C.627-708のA、位置C.*3932のG、および位置C.*4279のGを含みうる(位置は、図１１Ａに示されるGCH1遺伝子のコーディングエキソンに対する位置である)。該対立遺伝子変異は、GCH1遺伝子の調節領域(例えば、プロモーター領域、5'調節領域、3'調節領域、エンハンサーエレメント、もしくはサプレッサーエレメント)中、コード領域内(例えばイントロン中またはエキソン中)に存在するか、またはその任意の組み合わせで存在しうる。該心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、虚血性再潅流傷害、心肥大、高血圧症、血管炎、心筋梗塞、または心筋症でありうる。
【表１】
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【０００５】
別の態様では、本発明は、哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するか、または急性もしくは慢性痛を発症するリスクを診断するための方法であって、該被験体由来の生物学的サンプル中の、カリウム電位開口型チャネル、遅延整流、サブファミリーS、メンバー1 (KCNS1)核酸における対立遺伝子変異の存在または不存在を決定するステップを含み、ここで該対立遺伝子変異が、疼痛感受性または急性もしくは慢性痛の発症と相関している、上記方法を特徴とする。KCNS1対立遺伝子変異は、ヒト染色体20q12内に位置するハプロタイプブロック中に存在し、KCNS1タンパク質の活性、発現、ヘテロ多量体化(heteromultimerization)、または輸送における変化(例えば増加または減少)を引き起こしうる。該対立遺伝子変異は、KCNS1遺伝子の調節領域(例えば、プロモーター領域、5'調節領域、3'調節領域、エンハンサーエレメント、またはサプレッサーエレメント)中、コード領域内(例えばイントロンまたはエキソン中)、またはその任意の組み合わせ中に存在しうる。該対立遺伝子変異は、表２に列挙されるSNPからなる群から選択されるSNPを含むかまたはKCNS1配列の位置43,157,041のAを含みうる(例えば、位置43,155,431のG、位置43,157,041のA、および位置43,160,569のCを含む)(位置はSNPブラウザソフトウェアおよびPanther Classification System公共データベース（2005年11月）から得られる位置である)。
【表２】
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【０００６】
いずれの上記態様でも、本方法は、核酸サンプルが1コピーまたは複数コピーの該対立遺伝子変異を含むかどうかを決定するステップを含んでよい。急性痛は、機械的疼痛、熱感痛(heat pain)、冷感痛(cold pain)、虚血性疼痛、または化学誘発疼痛の1つ以上であってよい。疼痛は、末梢または中枢神経因性疼痛、炎症性疼痛、頭痛 (例えば片頭痛関連疼痛)、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋肉痛関連疼痛、関節炎性疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸の疼痛、筋肉痛、狭心症痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張型頭痛、産科または婦人科的疼痛、または化学療法誘発疼痛であってもよい。哺乳類はヒトであってよい。
【０００７】
対立遺伝子変異の存在または不存在は、核酸配列決定またはPCR解析によって決定してよい。さらに、本方法を使用して、該被験体に投与される鎮痛剤または麻酔剤の投薬または選択を; 鎮痛剤を用いる臨床試験に該被験体を含めるかどうかを; 該被験体に対して外科的処置(例えば、神経損傷または神経損傷の処置を伴う外科的処置)を実行するかどうかを; または該被験体に神経毒治療を行うかどうかを、決定してよい。さらに、本方法を使用して、保険リスク解析の一部として、または仕事割り当ての基準として、被験体における疼痛発症の可能性を判定してよい。本方法は、例えば、本明細書中に記載のものを始めとする疼痛またはGCH1と関係する別の障害を用いる臨床試験においてコントロール群と実験群間の統計学的有意差を確立するための基礎として、臨床試験と組み合わせて用いてもよい。
【０００８】
いずれの上記態様でも、表１および２の対立遺伝子変異は、被験体の疼痛プロファイルを予測するために利用しうる例示的なSNPであり; 1以上のSNPの代替的な選択を使用して疼痛保護性表現型を同定してもよく、かつこれらの1以上のSNPは、本明細書中で詳細に記載されるゲノム領域を超えて拡張してよい。SNPに加えて、他のタイプの遺伝的変異(例えば、可変数縦列反復配列(variable number tandem repeats)(VNTR)、または短縦列反復配列(short tandem repeats)(STR))を本発明の方法において使用してよい。そのような配列は公共データベースまたは商用データベースから得ることができる。新規SNPは、遺伝子領域の再配列決定によって同定してよく; そのような新規SNPもまた、本発明の方法において使用してよい。
【０００９】
本発明の方法は、任意の遺伝子型決定アッセイ、例えば本明細書中に記載のアッセイを使用して実施してよい。本方法は、さらに、疼痛を発症するリスクに影響することが知られているかまたはそのように同定される追加の遺伝子(例えばCOMT)中の多型についての遺伝子型決定と組み合わせてよい。
【００１０】
本発明の方法では、ヒト遺伝子型、ハプロタイプ、またはディプロタイプ(diplotypes)を同定するための任意の遺伝子型決定法を用いてよい。広範囲の方法が当技術分野において公知であり、該方法には、化学アッセイ(例えば、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ伸長、オリゴヌクレオチドライゲーション、酵素切断、フラップエンドヌクレアーゼ識別)および検出法(例えば、蛍光、比色、化学発光、および質量分析)が含まれる。特定の方法が本明細書中で記載される。望ましくは、遺伝子型決定法は、頑健で、高感度かつ特異的で、高速で、多重およびハイスループット解析に適し、かつ妥当なコストの方法である。
【００１１】
第3の態様では、本発明は、哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するための方法を特徴とする。本方法は、(a) 該被験体由来の細胞(例えば、平滑筋細胞、内皮細胞、血管細胞、リンパ球、または白血球)を含む生物学的サンプルを、十分な量の、(i) 細胞中のサイクリックAMPのレベルを増加させる組成物(例えば、ホスホジエステラーゼインヒビター、アデニルシクラーゼアクチベーター、例えばフォルスコリン、またはcAMP、本明細書中に記載のもの等のアナログ)、(ii) リポ多糖(LPS)を含む組成物、または(iii) 炎症性サイトカイン(例えば、腫瘍壊死因子α、インターロイキン-1β、およびインターフェロン-γ)を含む組成物と接触させるステップ; および(b) サンプル中のGTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)の発現または活性を測定するステップを含み、ここで、該発現または活性のレベルは、ベースライン値と比較されて、該患者が疼痛感受性の変化(例えば増加または減少)を有するかどうかを示すか、または該被験体において急性もしくは慢性痛を発症するかまたはBH4関連障害を発症するリスクの診断に役立つものである。GCH1の発現または活性がベースライン値と比較して減少すれば、疼痛感受性の減少または急性もしくは慢性痛を発症するリスクの減少が示される。GCH1の発現は、細胞中のGCH1 mRNAまたはGCH1タンパク質レベルを決定することによって測定しうる。GCH1の活性は、細胞中の、ネオプテリン(neopterin)、ビオプテリン、またはBH4レベルを決定することによって測定しうる。
【００１２】
第4の態様では、本発明は、哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症する傾向を診断するためのキットであって、GCH1遺伝子中の対立遺伝子変異を含む配列を増幅するためのプライマーセット（1セットのプライマー）、および使用説明書を含むキットを特徴とする。GCH1対立遺伝子変異は、ヒト染色体14q22.1-14q22.2内に位置するハプロタイプブロック中に存在しうる(例えば、GCH1対立遺伝子変異は、表１に列挙されるSNPからなる群から選択されるSNPを含むか、またはGCH1対立遺伝子変異は、位置C.-9610のA、位置C.343+8900のT、またはその両者を含みうる)。特定の実施形態では、該対立遺伝子変異は、GCH1配列の位置C.-9610のA、位置C.-4289のC、位置C.343+26のG、位置C.343+8900のT、位置C.343+10374のT、位置C.343+14008のG、位置C.343+18373のC、位置C.344-11861のA、位置C.344-4721のC、位置C.454-2181のA、位置C.509+1551のC、位置C.509+5836のG、位置C.627-708のA、位置C.*3932のG、および位置C.*4279のGを含みうる(位置は、図１１Ａに示されるGCH1遺伝子中のエキソンに対する位置である)。該対立遺伝子変異は、GCH1遺伝子のプロモーター領域中、コード領域内(例えばイントロンまたはエキソン中)、5'もしくは3'調節領域中に存在するか、またはその任意の組み合わせにおいて存在しうる。
【００１３】
第5の態様では、本発明は、哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、または急性もしくは慢性痛を発症するリスクを診断するためのキットであって、KCNS1遺伝子中の対立遺伝子変異を含む配列を増幅するためのプライマーセット（1セットのプライマー）および使用説明書を含むキットを特徴とする。KCNS1対立遺伝子変異は、ヒト染色体20q12内に位置するハプロタイプブロック中に存在しうる。KCNS1対立遺伝子変異は、KCNS1タンパク質の活性、発現、ヘテロ多量体化、またはその輸送における変化(例えば減少)を引き起こしうる。該対立遺伝子変異は、表２中のSNPからなる群から選択されるSNPを含むかまたはKCNS1配列の位置43,157,041のAを含みうる(例えば、位置43,155,431のG、位置43,157,041のA、および位置43,160,569のC)(位置はSNPブラウザソフトウェアおよびPanther Classification System公共データベース(2005年11月)から得られる位置である)。
【００１４】
第6の態様では、本発明は、哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットを特徴とする。該キットは、(i) 細胞中のサイクリックAMPレベルを増加させるための物質、(ii) LPS、または(iii) 炎症性サイトカイン(例えば本明細書中に記載のもの); GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)に特異的な抗体; GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1) mRNA配列にハイブリダイゼーションさせるための第一プライマー; および使用説明書を含む。該キットは、さらに、第二プライマーを含んでよく、その場合、第一および第二プライマーはGCH1 mRNA配列の少なくとも一部分を増幅するために使用することが可能である。
【００１５】
第7の態様では、本発明は、哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットを特徴とする。該キットは、(i) 細胞中のサイクリックAMPレベルを増加させるための物質、(ii) LPS、または(iii) 炎症性サイトカイン(例えば本明細書中に記載のもの); GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)に特異的な抗体; および使用説明書を含む。
【００１６】
本発明の第6または第7の態様では、上記物質は、アデニルシクラーゼアクチベーター(例えばフォルスコリン)、ホスホジエステラーゼインヒビター、または本明細書中に記載の任意の物質であってよい。
【００１７】
本明細書中で使用される「疼痛感受性」とは、通常は有痛性でない刺激に応答する痛みの感覚および有痛性刺激に対する過剰の、または延長された応答を含む痛覚の閾値、持続時間または強度を意味する。
【００１８】
「生物学的サンプル」とは、組織生検、細胞、体液(例えば、血液、血清、血漿、精液、尿、唾液、羊水、または脳脊髄液)または患者もしくは被験体から取得される他の検体を意味する。
【００１９】
「増加」とは、コントロール値またはベースラインレベルと比較して少なくとも3%の正の変化があることを意味する。増加は、コントロール値と比較して少なくとも5%、10%、20%、30%、50%、75%、100%、150%、200%、500%、1,000%であってよい。
【００２０】
「減少」とは、コントロール値またはベースラインレベルと比較して少なくとも3%の負の変化があることを意味する。減少は、コントロール値と比較して少なくとも5%、10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または99%、または100%でさえあってよい。
【００２１】
「対立遺伝子変異(allelic variant)」または「多型」とは、ある生物種の一部の個体において存在するが、該種の他の個体においては存在しないゲノムのセグメントを意味する。対立遺伝子変異は、該遺伝子のエキソン、イントロン、またはコード領域中または該遺伝子の発現を制御する配列中に見出すことができる。
【００２２】
「ベースライン値」とは、実験値が比較されるべき値を意味する。アッセイに応じて、ベースライン値はポジティブコントロール(例えば疼痛保護性ハプロタイプを有することが知られている個体由来)でありうる。特定の場合では、個体集団(例えば、ランダムに選択される個体、または特定の遺伝的バックグラウンド、例えば0、1または2コピーのGCH1疼痛保護性ハプロタイプを有するかもしくは欠いている選択された個体)の平均からベースライン値を算出することが望ましい。当業者であれば、どのベースライン値が所望の比較に適切であるか、およびそのようなベースライン値の算出方法は分かるであろう。本発明の方法において使用するための典型的なベースライン値およびそのような値を決定するための手段が本明細書中に記載されている。
【００２３】
「BH4関連障害」とは、BH4の発現、濃度、または活性の増加または減少によって引き起こされる任意の疾患または症状を意味する。そのような障害には、内皮細胞機能に関連する任意の疾患、例えば心血管疾患が含まれ、その心血管疾患には、アテローム性動脈硬化症、虚血性再潅流傷害、心肥大、血管炎、高血圧症(例えば全身性高血圧症または肺高血圧症)、心筋梗塞、および心筋症が含まれる。BH4関連障害を発症するリスクの増加は、座りがちな生活様式、高血圧症、高コレステロール血症、糖尿病、または慢性喫煙を有する個体と関連がある。BH4は、一酸化窒素、5-HT、ドーパミン、およびノルエピネフリン生産に関与し、これらの神経伝達物質が関与する、特に心血管系および神経系の、任意の疾患または障害がBH4関連障害という用語に包含される。例えば、GCH1ハプロタイプは、CVS疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心筋梗塞、または心筋症)ならびに疼痛以外の神経系疾患を発症するリスクに関するマーカーでありうる。ゆえにBH4関連障害には、糖尿病、うつ病、神経変性疾患(例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症)、統合失調症、カルチノイド心疾患、および自律神経障害、または筋失調症が含まれる。
【００２４】
痛みの強度および慢性化または持続性の予測指標としてのGCH1およびKCNS1多型の使用は、治療法の決定を補助するために使用することができる強力なツールであり、それには、医療処置（例えば神経損傷または神経損傷を伴うかまたは治療する外科手術、癌またはHIV感染の神経毒治療）のリスク便益比(risk-benefit ratio)の見積もりが含まれる。さらに、そのような診断法を使用して、急性または慢性痛を発症するリスクが高い患者に対する積極的鎮痛療法、または外科手術において神経に対する損傷を回避するための積極的鎮痛療法の必要性を判定してよい。本方法を、心血管疾患を含めた内皮細胞機能に関連する障害を発症する高いリスクに患者がさらされているかどうかを判定するために用いてもよい。臨床試験設計において、例えば鎮痛剤または鎮痛処置を用いるかまたは試験する試験に被験体を含めるかどうかを決定するために、本方法を利用してもよい。さらに、例えば保険産業において痛みまたは治療に対する被験体の応答に関するリスク解析プロファイルの一部として、または被験体が不適切な疼痛応答を発症する可能性の(例えば現在の雇用者もしくは可能性としての雇用者または保険会社による)判定のために、本発明を使用してよい。
【００２５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、2つの遺伝子、GCH1およびKCNS1中のハプロタイプの同定に基づいて、疼痛に対する感受性の変化、急性または慢性痛の発症しやすさの変化を有する患者を診断するため、または、GCH1中のハプロタイプに基づいてBH4関連障害を発症する傾向を有する患者を診断するための方法を特徴とする。これらのハプロタイプは、疼痛感受性、急性または持続痛発症、または異常な疼痛増幅の診断に役立ちうる。BH4合成において重要な酵素をコードする遺伝子であるGCH1を、末梢神経損傷に応答して転写物が上方制御される3つの遺伝子の群から同定した。GCH1ハプロタイプの存在は、外科的椎間板切除術後の持続性の根性痛に対して保護性であり、かつ実験的な疼痛に対する感受性の減少と関連していることが見出された。さらに、本発明者らは、疼痛保護性GCH1ハプロタイプを有する個体由来の白血球が、フォルスコリンチャレンジに応じて、GCH1発現および活性の減少を示すことを観察した。このことは、すなわち該ハプロタイプが機能的に重要であることが示される。GCH1の構成的レベルは、疼痛保護性GCH1ハプロタイプを有する個体において正常であったが、チャレンジに応答してGCH1 mRNA、タンパク質および活性の誘導が減少した。この理由により、このハプロタイプが、BH4関連障害、例えば内皮細胞機能と関わる疾患または心血管系疾患(例えば、虚血性再潅流傷害、心肥大、血管炎、および全身性高血圧症および肺高血圧症)または神経系疾患を発症するリスクの変化(例えば増加または減少)と関連しているかもしれないと本発明者らは考える。
【００２７】
第二の遺伝子KCNS1は、同様に、疼痛感受性および慢性痛と相関し、したがって本発明の診断マーカーとして同様に使用できるハプロタイプマーカーを有すると同定された。これらの遺伝子は、末梢神経因性疼痛: spared nerve injury (SNI)、慢性絞扼神経損傷(CCI)、および脊髄神経結紮モデル(SNL)の3モデルでのラットDRGにおける経時的(3〜40日間)に調節される遺伝子および、共通の代謝経路、シグナル伝達経路、または生合成経路に属する遺伝子の両者に関して、マイクロアレイを使用して、探索することによって同定された。BH4合成経路の3種の酵素のうちの2種であるGCH1およびSRについての転写物が、これらのモデルにおいて、BH4再利用酵素QDPRと同様に、上方制御されることが見出された。このスクリーニングで同定された別の遺伝子はカリウムチャネルKCNS1であり、KCNS1は末梢神経因性疼痛の全3モデルでのDRGにおいて下方制御された。
【実施例１】
【００２８】
GCH1疼痛保護性ハプロタイプ
疼痛へのBH4合成の関与
下記のように酵素補助因子BH4を合成または再利用する酵素は、末梢神経損傷に応答して感覚ニューロンにおいて上方制御される。この経路は末梢性炎症によっても活性化される。BH4合成酵素のうちの2種を独立して阻害することによるBH4合成の阻止は、急性および確立された神経因性疼痛を減少させ、炎症性疼痛を妨げるか、または減少させる。逆に、BH4を投与すると、未処置の動物において疼痛が生じ、神経損傷または炎症を有する動物において疼痛感受性が増加する。ゆえに、BH4合成酵素は疼痛感受性の主要な制御因子であり、BH4は本来的に備わっている疼痛発生因子であるかもしれない。
【００２９】
BH4はいくつかの主要な酵素の必須の補助因子であり; その不存在下では、基質の存在下であっても、反応は生じない。したがってBH4レベルは厳格に調節する必要がある。GTPシクロヒドロラーゼまたはセピアプテリン還元酵素遺伝子のコード領域中の機能喪失型突然変異に起因するBH4生産の不存在または実質的減少は、アミン伝達物質の減少または不存在に起因して重篤な神経学的問題を引き起こす(Segawa et al., Ann Neurol 54(Suppl 6):S32-45 (2003); Neville et al., Brain 128:2291-2296 (2005))。特に下流の酵素も同様に上方制御される場合には、アミンおよび一酸化窒素合成の増加によるBH4レベルの上昇もまた有害でありうる。神経損傷の3日後、同側DRG中の神経型トリプトファンヒドロキシラーゼおよび神経型一酸化窒素合成酵素の上方制御が生じる。これは、以前の研究(Figure 1; Luo et al., J Neurosci 19:9201-9208 (1999))の結果を支持し、セロトニンおよび一酸化窒素の過剰生産が、BH4によって誘発される疼痛を媒介するかもしれないことを示唆する。生理的条件下で、BH4は、GTPシクロヒドロラーゼフィードバックタンパク質(GFRP)に結合することによって、その生産を負に調節する。該タンパク質はGTPシクロヒドロラーゼ活性を阻害する。GFRPは、GTPシクロヒドロラーゼと異なり、神経損傷後に上方制御されない(データは示していない)。BH4は、化学量論的過剰のGFRP中に存在すると、GTPシクロヒドロラーゼに対して効率的フィードバック阻害を発揮しない。その結果、DRGニューロン中に過剰のBH4が蓄積し、そして疼痛感受性を誘発または増強しうる。
【００３０】
BH4レベルの上昇は、DRGニューロン中で発現されるBH4依存性酵素の活性化を引き起こし、該ニューロンからのBH4の放出を引き起こし(Choi et al., Mol Pharmacol 58:633-40 (2000))、次いでそれは隣接細胞(例えば神経細胞または非神経細胞)に作用してそれらの酵素活性を調節するか、または補助因子に依存しない作用を発揮しうる(Koshimura et al., J Neurochem 63:649-654 (1994); Mataga et al., Brain Res 551:64-71 (1991); Ohue et al., Brain Res 607:255-260 (1993))。後角ニューロンの興奮性またはシナプス効率に対するBH4の直接の影響は観察されなかった。BH4は急速(<30分)に疼痛を生じさせるため、疼痛関連の影響には、長い反応時間(latency)の変化、例えば転写の変化、ミクログリアの活性化(Tsuda et al., Trends Neurosci 28:101-107 (2005))、または神経細胞死の誘発(Scholz et al., J Neurosci 25:7317-7323 (2005))を伴わない可能性が高い。同様に、GTPシクロヒドロラーゼインヒビターであるDAHPは、鎮痛作用を急速に発生させ、かつ反復投与時に有効であり続ける(下記参照)ので、BH4が過剰に存在し続けることは慢性痛に関するその役割に必要とされうる。下記ホルマリン試験、末梢性炎症、および複数のモデルの神経因性疼痛におけるDAHPの効力は、これらの多様なモデルに共通の機構を示す。可能性の1つは使用依存性の後角ニューロンの中枢性感作(central sensitization)であり(Woolf, C. J., Nature 306:686-688 (1983))、それは、ホルマリン、炎症性、および神経因性疼痛モデルに共通である。熱感痛の反復刺激から生じる疼痛に対する下記の「疼痛保護性」GCH1ハプロタイプの効果は、この考えを支持する。ヒトにおけるこの実験的な疼痛モデルは中枢の興奮性の変化による寄与を受けると思われるからである(Price et al., Pain 59:165-174 (1994); Eide, P. K., Eur J Pain 4:5-15 (2000); Maixner et al., Pain 76:71-81 (1998); Vierck et al., J Neurophysiol 78:992-1002 (1997))。それにもかかわらず、DAHPはホルマリン試験の第一相においても作用し、GCH1ハプロタイプはヒトにおいて侵害刺激に対する即時型応答を変化させる。ゆえに、BH4は急性侵害刺激に対する感受性に寄与すると思われる。
【００３１】
SNI 7日後、DRGにおいて一酸化窒素レベルが増加し、NOの過剰生産が、BH4によって誘発される疼痛に寄与することが示唆される。疼痛を生じさせるNOの影響には、おそらく、標的タンパク質の直接ニトロシル化(Hara et al., Nat Cell Biol 7:665-674 (2005))、NMDA受容体活性のモジュレーション(Lipton et al., Nature 364:626-632 (1993))、および／またはグアニリルシクラーゼ-cGMP-PKG経路の活性化(Tegeder et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:3253-3257 (2004); Lewin et al., Nat Neurosci 2:18-23 (1999))が関与し、グルタミン酸作動性伝達の増加を生じさせる(Huang et al., Mol Pharmacol 64:521-532 (2003))。これを支持するように、GTPシクロヒドロラーゼの阻害はBH4およびNOの両者の増加を妨げ、NOS阻害はSNI後の機械的および冷感異痛を減少させる。BH4は、ニューロンから放出されると、パラクリンならびにオートクリン様式で作用し(Choi et al., Mol Pharmacol 58:633-640 (2000))、酵素活性を増加させ、かつ補助因子に非依存性の影響を生じさせうる(Koshimura et al., J Neurochem 63:649-654 (1994); Shiraki et al., Biochem Biophys Res Commun 221:181-185 (1996))。後者を考慮して、本発明者らは、BH4が、一酸化窒素合成によって部分的に媒介される培養成体DRGニューロンにおける短い反応時間のカルシウム流入を生じさせることを見出した。神経型トリプトファンヒドロキシラーゼmRNAはSNI後にDRGニューロンにおいて上方制御されたが、この組織においてセロトニンレベルは検出限界より低いままであった。脊髄では、下行性の阻害性および興奮性線維においてセロトニンが発現される。しかし、DAHP処置は、脊髄および脳幹においてセロトニン濃度をあまり減少させず(データは示していない)、または強制水泳試験を変化させなかった(図８Ｄおよび下記参照のこと)。このモデルの不安および抑うつ性行動はセロトニンレベルの変化に感受性である(Mague et al., J Pharmacol Exp Ther 305:323-330 (2003))。ゆえに本発明者らは、セロトニン生産の変化が、疼痛感受性の、BH4媒介性の増加に寄与しないと考える。BH4は急速に疼痛を生じさせるため、これらの即時の影響には、転写の変化、ミクログリアの活性化(Tsuda et al., Trends Neurosci 28:101-107 (2005))、または神経細胞死の誘発(Scholz et al., J Neurosci 25:7317-7323 (2005))が関与しない可能性が高い。さらに、ホルマリン試験、末梢性炎症、および複数のモデルの神経因性疼痛におけるDAHPの効力は、多様な疼痛症状において共通のBH4依存的機構を示す。
【００３２】
ヒトの疼痛におけるBH4の潜在的役割を評価するために、本発明者らは、律速BH4合成酵素であるGCH1中の多型が特定の疼痛表現型と関連しているかどうかを分析した。ヒトにおいて、GTPシクロヒドロラーゼ(Hagenah et al., Neurology 64:908-911 (2005))またはセピアプテリン還元酵素遺伝子のコード領域中のまれなミスセンス、ナンセンス、欠失、または挿入突然変異に起因して、BH4が不存在であるか、または実質的に減少している場合、アミン伝達物質の不存在に起因してドーパ反応性筋失調症および他の重篤な神経学的問題が生じる(Ichinose et al., Nat Genet 8:236-242 (1994); Bonafe et al., Am J Hum Genet 69:269-277 (2001))。疼痛知覚がこれらのまれな突然変異によって影響を受けるかどうかは知られていない。本発明者らの疼痛保護性ハプロタイプに関するホモ接合体はいかなる神経系疾患をも有さなかった。したがって本発明者らは、疼痛保護性ハプロタイプが、GTPシクロヒドロラーゼ生産または機能に関する軽度の機能障害を引き起こす調節部位中の変異を体現していると推測した。これを支持するように、GTPシクロヒドロラーゼの構成性発現およびBH4生産は、疼痛保護性ハプロタイプの保有者および非保有者の細胞において等価であることが見出された。しかし、フォルスコリンによって誘発される上方制御は疼痛保護性ハプロタイプの保有者において有意に減少した。ゆえに本発明者らは、GCH1転写を媒介する位置がエキソン-1の5'側であり大きい20 kbイントロン-1内のエレメントを含むと考える。その理由は、疼痛保護性ハプロタイプ中にのみ見出されるSNPが、それぞれ、GCH1の推定プロモーター領域中(C.-9610G>A)およびイントロン-1中(C.343+8900A>T)に位置するからである。これらのSNPは、cAMP依存性転写因子によって媒介されるシグナルに対する転写効率を改変しうる。神経損傷または持続した侵害受容器刺激によってDRG中で何百もの転写物が調節され、かつ多数の化学物質および生体分子が実験環境において疼痛挙動に影響するが、ヒトにおいて疼痛感受性をモジュレートする遺伝子は、従来、少数しか同定されていない(Zubieta et al., Science 299:1240-1243 (2003); Mogil et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:4867-4872 (2003))。GCH1に関する現在の知見は、最初にヒト集団の全体にわたって再現された知見の1つである。
【００３３】
ここで、必須の酵素補助因子BH4のレベルの変化は疼痛系の感受性を改変し、律速BH4生成酵素であるGTPシクロヒドロラーゼの遺伝子中の一塩基多型は健康なヒトの侵害刺激に対する応答および患者の持続性神経因性疼痛の発症しやすさをともに変化させる。GCH1中の疼痛保護性ハプロタイプは、筋失調症の徴候を伴わずに持続痛を発症するリスクの減少と関連しているため、GTPシクロヒドロラーゼの誘導のみをターゲティングすることによって、または再利用経路をインタクトのままにすることによって、DRG中の、構成的BH4ではなく新規BH4の過剰合成を減少させうる治療ストラテジーは、慢性痛の確立または維持を妨げるための手段を提供しうる。さらに、疼痛の強度および慢性についての予測指標の同定は、個々の患者が慢性痛を発症するリスクを評価するための有用なツールである。実験的疼痛および持続痛の両者に対する疼痛保護性ハプロタイプの効果、および炎症性および神経因性疼痛の両者に関するBH4の関与は、急性の実験的疼痛に対する感受性が外科手術後および最終的には慢性痛の予測指標になる理由を説明しうる(Bisgaard et al., Pain 90:261-269 (2001); Bisgaard et al., Scand J Gastroenterol 40:1358-1364 (2005))。
【００３４】
BH4合成と慢性痛の関連性の同定
共通の代謝経路、シグナル伝達経路、または生合成経路に属する遺伝子に関して坐骨神経損傷後に後根神経節(DRG)中で調節される数百の遺伝子を探索することによって、BH4合成と慢性痛の関連性を同定した(Costigan et al., BMC Neurosci 3:16 (2002))。これらの遺伝子は慢性神経因性疼痛の生成に関与する。調節される酵素は、第一の律速ステップを触媒するGTPシクロヒドロラーゼおよび、6-ピロボイル-テトラヒドロプテリンからテトラヒドロビオプテリンへの最終変換を実行するセピアプテリン還元酵素である(図２Ａ〜２Ｇ)。
【００３５】
BH4は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンヒドロキシラーゼならびに一酸化窒素合成酵素の必須の補助因子である。その有効性は、酵素および基質レベルとともに、カテコールアミン、セロトニン、および一酸化窒素合成およびフェニルアラニン代謝に関して重要である(Kobayashi et al., J Pharmacol Exp Ther 256:773-9 (1991); Khoo et al., Circulation (2005); Cho et al., J Neurosci 19:878-89 (1999); Thony et al., Biochem J 347(Pt 1):1-16 (2000))。脳における先天性BH4欠乏を引き起こすGTPシクロヒドロラーゼまたはセピアプテリン還元酵素中の突然変異は、モノアミン神経伝達物質欠乏に関連する徴候を特徴とし、ドーパ反応性運動障害、精神医学的障害、および認知障害を生じさせる(Segawa et al., Ann Neurol 54(Suppl 6):S32-45 (2003); Neville et al., Brain 28(Pt 10):2291-2296 (2005))。BH4の生産はGTPシクロヒドロラーゼ転写および活性によって厳密に調節される(Frank et al., J Invest Dermatol 111:1058-1064 (1998); Bauer et al., J Neurochem 82:1300-1310 (2002))。リン酸化(Hesslinger et al., J Biol Chem 273:21616-21622 (1998))、フェニルアラニンによるフィードフォワード活性化(Maita et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:1212-1217 (2002))、およびBH4によるフィードバック阻害は、いずれもGTPシクロヒドロラーゼフィードバック調節タンパク質(GFRP)と協調して作用し(Maita et al., J Biol Chem 279:51534-51540 (2004))、すべてがGTPシクロヒドロラーゼ活性を調節する。モノアミン神経伝達物質欠乏を引き起こすGTPシクロヒドロラーゼまたはセピアプテリン還元酵素中の突然変異は、ドーパ反応性運動障害、精神医学的障害および認知障害を生じさせる(Ichinose et al., Nat Genet 8:236-242 (1994); Bonafe et al., Am J Hum Genet 69:269-277 (2001))。モノアミンおよび一酸化窒素合成に関するこの補助因子の絶対的な必要性、および神経系におけるこれらの神経伝達物質の極めて重要な役割を考慮すると、BH4レベルの増加はニューロンのシグナル伝達に対して重大な影響を有しうる。本明細書中に記載のように、BH4レベルは神経因性および炎症性疼痛に関して重要であり、GTPシクロヒドロラーゼの遺伝子多型は、BH4生産の減少に起因して、ヒトにおける疼痛感受性および慢性の減少と関連している。
【００３６】
テトラヒドロビオプテリン合成酵素の上方制御
L4/5 DRG中の経時的なGTPシクロヒドロラーゼおよびセピアプテリン還元酵素の発現を、末梢神経因性疼痛の3モデル: (i) spared nerve injury (SNI) (Decosterd and Woolf, Pain 87:149-58 (2000))、(ii) 慢性絞扼神経損傷(CCI) (Bennett and Xie, Pain 33:87-107 (1988))、および(iii) 脊髄神経結紮モデル(SNL) (Kim and Chung, Pain 50:355-63 (1992))において研究した。さらに、足底内(intraplantar)完全フロイントアジュバント(CFA)足炎症モデルにおける発現を研究した。これらのモデルは、長続きする疼痛感受性の高まりを生じさせ、それには、機械的および冷感異痛ならびに機械的および熱の痛覚過敏が含まれる。GTPシクロヒドロラーゼおよびセピアプテリン還元酵素転写物は全3神経損傷モデルでの腰部(L4/5) DRGにおいて上方制御され(SNI 図２Ａ、CCIおよびSNL 図３Ａ〜３Ｄ)、セピアプテリン還元酵素mRNAもまた、CFAによって誘発される足炎症後のDRG中で増加した(図３Ｅ)。さらに、神経損傷後に、BH4をその酸化産物であるビオプテリンおよびジヒドロビオプテリンから再利用する酵素であるジヒドロプテリジン還元酵素(DHPR)の小幅な上方制御が観察された。DRGニューロン中の3酵素の転写物の上方制御をSNIモデルにおけるin situハイブリダイゼーションによって確認した(図２Ｃ)。GTPシクロヒドロラーゼmRNAの誘導は、タンパク質発現(図２Ｄ; 図４Ａ〜４Ｇ)および活性(図２Ｅ)の増加を伴った。それは、合成カスケードの第一中間代謝物ジヒドロネオプテリン三リン酸の不活性代謝産物であるネオプテリンのレベルの増加によって示される(Rebelo et al., J Mol Biol 326:503-516 (2003)) (図２Ｅ)。ネオプテリンへの転換は、通常、該中間体の蓄積および最終産物BH4の過剰生産を妨げる。しかし、神経損傷後、該経路の上方制御および活性化はBH4レベルの顕著な増加を生じさせた。それは、その安定な酸化産物であるビオプテリンの増加によって示される(図２Ｆ)。GTPシクロヒドロラーゼmRNAおよび損傷によって誘発される核の転写因子ATF-3の併用in situハイブリダイゼーションおよび免疫染色(Tsujino et al., Mol Cell Neurosci 15:170-182 (2000))では、GTPシクロヒドロラーゼが、有髄および無髄軸索を有する(図５)損傷ニューロンでのみ上方制御される(図２Ｇ)ことが示された。特に、GTPシクロヒドロラーゼmRNAおよび損傷によって誘発される核の転写因子ATF-3の二重標識(Tsujino et al., Mol Cell Neurosci 15:170-182 (2000))によって、GTPシクロヒドロラーゼを上方制御するニューロンの97±3%がATF-3陽性であることが示された(図２Ｇ)。SNI 7日後、L5 DRGニューロンの核の65±13%はATF-3を発現し、軸索損傷を有する細胞の割合を反映する(Decosterd et al., Pain 87:149-158 (2000))。これらのうち75±4%はGTPシクロヒドロラーゼmRNAを上方制御する。CFA後に上方制御されないが、CFAによって誘発される足炎症においてDRG中でGTPシクロヒドロラーゼ活性およびBH4生産が、神経損傷後より低い程度ではあるが、増加した(図６Ｃおよび６Ｄ)。
【００３７】
BH4合成をブロックすることによる神経因性および炎症性疼痛の阻害
観察されたBH4合成の増加が神経因性および炎症性疼痛に寄与するかどうかを試験するために、末梢神経因性疼痛の3モデルおよびCFAによって誘発される足炎症におけるBH4合成酵素のインヒビターの影響を分析した。典型的なGTPシクロヒドロラーゼインヒビターである2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシピリミジン(DAHP)を、GTPシクロヒドロラーゼ活性をブロックするために使用した(Kolinsky and Gross, J Biol Chem 279:40677-40682 (2004); Yoneyama et al., Arch Biochem Biophys 388:67-73 (2001); Xie et al., J Biol Chem 273:21091-21098 (1998))。DAHPは、BH4と同様に、GTPシクロヒドロラーゼとそのフィードバック調節タンパク質GFRPの界面で特異的に結合し、GTPシクロヒドロラーゼ活性をブロックする阻害性複合体を形成する(Maita et al., J Biol Chem 279:51534-51540 (2004))。DHAPは効力が低いが、特異的なインヒビターである。DAHPのわずかな改変は、DAHPのこの阻害活性を喪失させ(Yoneyama et al., Arch Biochem Biophys 388:67-73 (2001))、DAHPがいずれかのBH4依存性酵素と直接相互作用することを妨げる。
【００３８】
疼痛過敏性が存在する時点である坐骨神経損傷(SNIモデル)の4日後に一回量のDAHP (180 mg/kg i.p.)を注射すると、60分以内に機械的および冷感疼痛過敏性が回復する(図７Ａ)。DAHPの抗侵害受容性効果はその血漿濃度およびCSF濃度の時間経過と平行し(図７Ｄ)、インビトロで決定されるGTPシクロヒドロラーゼ阻害に関するIC50範囲(100〜300μM)内である(Kolinsky and Gross, J Biol Chem 279:40677-40682 (2004); Xie et al., J Biol Chem 273:21091-21098 (1998))。この用量でのDAHP処置は、神経損傷によって誘発されるネオプテリンの増加を完全に妨げ(図２Ｅ)、かつ損傷DRGにおけるビオプテリンレベルを有意に減少させる(図２Ｆ)。ビオプテリンレベルはDAHP処置後に損傷前のベースラインに回復しなかった。その理由は、BH4の、その酸化産物からの再利用がDAHPによって阻害されないからである。それにもかかわらず、BH4の新規合成の阻害およびBH4過剰の減少は神経因性疼痛を有意に減少させる(図７Ａ〜７Ｃ)。外科手術前のベースライン値への回復の程度として測定されるDAHPの相対的効力は、本発明者らがSNIモデルにおいて測定したモルヒネ、ガバペンチン、アミトリプチリン、およびカルバマゼピンの、無鎮静作用の(non-sedating)用量の効力を超える(Decosterd et al., Anesth Analg 99:457-463 (2004))。DAHPは、すべての3つの神経因性疼痛モデルにおいて機械的および冷感異痛の用量依存的減少を生じさせる(SNIに関して図７Ａ〜７Ｃ、CCIおよびSNLに関して図３Ｂおよび３Ｄ)。同様に、くも膜下腔内DAHP (250μg/kg/h; 全身性用量の1/30th)はSNI後の機械的および冷感異痛を減少させる(図８Ａ〜８Ｃ)。さらに、疼痛過敏性が2週間より長期間確立されている場合に、DAHPは、SNI外科手術の17日後に最初に投与されると、疼痛過敏性を減少させる(図７Ｃ)。DAHPを反復して毎日投与すると、継続的に鎮痛作用を生じさせ、活性の明らかな損失はない(図７Ｂおよび７Ｃ)。全般的健康、体重、歩行、または活動性に対する、急性の一回または毎日の処置の悪影響は観察されなかった。これは、上昇したBH4レベルの減少が、異常な神経機能を生じさせることなく、疼痛を減少させることができることを示す。
【００３９】
DAHP (180 mg/kg i.p.)は、未処置の動物における足引っ込め(paw withdrawal)の機械的閾値または放射熱によって誘発される足引っ込め時間を変化させず(図７Ｅおよび７Ｆ)、かつ体重、活動性、または強制水泳試験におけるパフォーマンスに対して影響を有さなかった(図８Ｄ)。CFAの後足注射によって生じた炎症はDRG中のGTPシクロヒドロラーゼmRNA発現を増加させなかった(図３Ｅ)。しかし、足底内CFAはGTPシクロヒドロラーゼ酵素活性の有意な増加を引き起こし、L4/5 DRG中のネオプテリン(図６Ｃ)およびビオプテリン(図６Ｄ)の増加を伴った。しかし該処置は、炎症の発症前(図６Ａ)および足底内CFA注射の24時間後(図６Ｂ)に投与された両場合に、炎症した後足の、CFAによって誘発される熱の痛覚過敏を実際に減少させ(図６Ａおよび６Ｂ)、かつ、DRG中のネオプテリンおよびビオプテリンレベルを正常化した(図６Ｃおよび６Ｄ)。くも膜下腔内DAHP (図８Ａ〜８Ｃ; 全身性用量の1/30)を用いて類似の効力が達成される。DAHP投与は、炎症によって誘発されるネオプテリン増加を完全に妨げ、かつ、同側L4/L5 DRGにおいて上昇したビオプテリンレベルを有意に減少させる(図６Ｃおよび６Ｄ)。DAHP (180 mg/kg i.p.)処置はまた、ホルマリン試験の第一相および第二相において尻込み行動を有意に減少させ、それは、それぞれ、脊髄における急性痛覚および活動依存的中枢性感作を示す(図６Ｅ)。この抗侵害受容性効果は、ホルマリン注射の2時間後に認められる脊髄の同側後角中のcFos免疫反応性ニューロン数の有意な減少を伴う(図６Ｆおよび６Ｇ)。後角ニューロンにおけるc-Fosの誘導は侵害受容性シナプスプロセシングの有用な代理マーカーであり、この知見は、BH4レベルの減少が中枢性疼痛経路の第一要素でシナプス伝達を減少させることを示す。
【００４０】
セピアプテリン還元酵素をブロックすることによる疼痛の阻害
DAHPの鎮痛効果がBH4合成の減少に起因することを実証するために、セピアプテリン還元酵素のインヒビターであるN-アセチル-セロトニン(NAS)の影響をさらに試験した(Milstien and Kaufman, Biochem Biophys Res Commun 115:888-893 (1983))。NAS (100μg/kg/hr)は、明らかな副作用を伴うことなく、SNI後の、神経損傷によって誘発される機械的および冷感異痛を有意に減少させる(図９Ａおよび９Ｂ)。足炎症誘発前に一回量のNAS (50 mg/kg i.p.)を腹腔内注射すると、CFA足炎症モデルにおいて熱の痛覚過敏が有意に減少する(図９Ｃ)。NASはまた、SNI後のL4/5 DRG中のトータルビオプテリンレベルを有意に減少させ、それはBH4合成の阻害を示す(図９Ｄ)。
【００４１】
テトラヒドロビオプテリンによる疼痛過敏性の誘発
未処置の動物においてBH4が疼痛感受性を増強するかどうかを決定するために、本発明者らは、その活性なエナンチオマーである(6R)-5,6,7,8-テトラヒドロビオプテリンジヒドロクロライドをくも膜下腔内に注射した(1μg/μl、10μl)。6R-BH4は、侵害性放射熱に応答する高速かつ長期間の増加を引き起こす(図９Ｅ)。くも膜下腔内に注射されたBH4はまた、さらに、SNIによって誘発された両神経損傷後の疼痛感受性を増加させる(図９Ｆおよび９Ｇ)。BH4は、さらに、CFAの5日後にくも膜下腔内に注射された場合に、熱感痛の感受性を増加させた(図９Ｈ)。これは、BH4の過剰生産が疼痛感受性を高めることを示す。しかし、単離された成体ラット脊髄スライスに浴適用された6R-BH4は、AMPA受容体によって媒介される微小興奮性シナプス後電流または表在性後角ニューロンの内向き直流(direct inward currents)の頻度または振幅の変化を生じさせず(6R-BH4 10μM n = 6; 20μM n = 2; データは示していない)、それはグルタミン酸放出または応答性を増加させないことを示す。不活性代謝産物であるネオプテリンのくも膜下腔内投与(1μg/μl、10μl i.t.)は有意な影響を有さなかった(図９Ｉ)。
【００４２】
可能性のある機構
BH4の有効性は、NO合成酵素ならびにチロシンおよびトリプトファンヒドロキシラーゼの活性を調節する。したがって、その疼痛生成効果はこれらの酵素の過剰活性によって媒介されうる。SNI後、同側DRG中の神経型トリプトファンヒドロキシラーゼおよび神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)は上方制御されるが(図１０Ａ)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、内皮型または誘導型NOSの変化はなく、またはチロシンヒドロキシラーゼは減少する(図１０Ｂ)。DRG中の神経型トリプトファンヒドロキシラーゼの上方制御にもかかわらず、未処置およびSNI動物由来のDRG中のセロトニンレベルは定量限界未満であった(データは示していない)。nNOSの上方制御は、7日目の時点でL4/5 DRG中の一酸化窒素レベルの増加を伴い(図１０Ｃ)、それはDAHP処置によって妨げられた。NOSインヒビターであるL-NAME (25 mg/kg i.p.)は、SNI 4日後に検査された、SNIによって誘発される機械的および冷感異痛を減少させた(図１０Ｄ)。したがってDAHPの抗侵害受容性効果は、少なくとも部分的に、過剰NO生産を妨げることによって媒介されうる。
【００４３】
可能性のある機構をさらに分析するために、本発明者らは培養成体ラットDRGニューロンを用いるカルシウムイメージングを使用した。6R-BH4 (0.3〜10μM)は67%の記録細胞中の細胞内カルシウムレベルを用量依存的に増加させた(n = 95; 図１０Ｅ)。BH4は数秒以内にカルシウムを上昇させ、この上昇は、カルシウムを含まない潅流液によって撤廃された。それはカルシウム流入の増加を示す(n = 12)。NO放出物質DEA-NONOate (50μM)は類似の[Ca2+]Iの増加を生じさせ、それもまた、カルシウム流入によって媒介された(n = 32)。NOSインヒビターであるL-NAMEは、BH4の影響を47±4%減少させた(n = 29、p < 0.01; 図１０Ｆ)。それはBH4が排他的ではないが部分的にNOSを通じて作用することを示唆する。
【００４４】
単離された成体ラット脊髄スライスに浴適用された6R-BH4は、AMPA受容体によって媒介される微小興奮性シナプス後電流または表在性後角ニューロンにおける生成内向き直流の頻度または振幅を変化させなかった(6R-BH4 10μM n = 6; 20μM n = 2; データは示していない)。それはBH4が、一酸化窒素と対照的に(Pan et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:15423-15428 (1996))、グルタミン酸作動性伝達を増加させないことを示す。
【００４５】
ヒトにおけるGTPシクロヒドロラーゼの疼痛保護性ハプロタイプ
次いで本発明者らは、GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)、セピアプテリン還元酵素(SPR)、またはジヒドロプテリジン還元酵素(QDPR)をコードする遺伝子中の多型がヒト患者における特異な疼痛表現型に関連しているかどうかを決定した。椎間円板ヘルニア形成によって引き起こされた持続性腰根痛の外科的椎間板切除についての前向き観察研究の参加者である168人の白人成人からDNAを集めた(Atlas et al., Spine 21:1777-1786 (1996); Chang et al., J Am Geriatr Soc 53:785-792 (2005))。分析前に、単一の主要エンドポイントである、手術後初年度中の持続性の脚の疼痛を神経因性疼痛の反映として指定した。第二のエンドポイントは、外科手術によって提供される鎮痛の規模に関して調整された、手術後初年度中の不安および抑うつのレベルの変化であった。5'エキソヌクレアーゼ法(Shi et al., Biologicals 27:241-52 (1999))を使用して、前記参加者から、GCH1全体にわたって均等の間隔に並んでいる15個の一塩基多型(SNP)(図１１Ａおよび１３Ａ; 表３Ａ)、SPR中の3個のSNP (図１２Ａおよび１３Ｂ; 表３Ｂ)およびQDPR中の11個のSNP (図１２Ｂおよび１３Ｃ、表３Ｃ)を遺伝子型決定した。GCH1中の5個のSNP (図１１Ａ)は、主要転帰として事前に指定された、手術後初年度中の低スコアの持続性の脚の疼痛と有意に関連していた。GCH1およびSPRは、それぞれ遺伝子全体に及ぶ、サイズが72 kbおよび14 kbの単一の保存されたハプロタイプブロックを有し(図１３Ａおよび１３Ｂ)、一方、QDPRは少なくとも2つのハプロブロックを有する(図１３Ｃ)。GCH1中の5個のSNP (図１１Ａ)は低スコアの脚の疼痛と有意に関連していたが、SPRまたはQDPR (図１２Ａおよび１２Ｂ; 図１３Ｂおよび１３Ｃ)中のSNPはいずれも低スコアの脚の疼痛と関連していなかった。GCH1ハプロタイプは162/168患者中で決定することができた。ハプロタイプ解析(図１１Ａ)では、15.4%の集団頻度を有する1個のGCH1ハプロタイプが同定され、それは低スコアの持続性の脚の疼痛と高度に関連していた(p = 0.009)。図１４Ａは、代表的な、安静時の脚の疼痛の頻度に関する経時的な生の疼痛スコア(疼痛zスコアを算出するために使用される4変数のうちの1つ)を示す。1年のアンケートに記入した147人の患者において、外科手術の1年後に脚の疼痛が悪化したか、不変であったか、または少しだけ改善したと報告した患者の数は、2コピーの該保護性ハプロタイプを有する患者のうちの0/4 (0%)、1コピーを有する患者をうちの4/41 (10%)、およびこのハプロタイプのコピーを有さない患者のうちの22/102 (22%)であった(図１１Ｂ)。ハプロタイプの比較では、低い疼痛スコアと有意に関連しているSNPのうちの2個(C.-9610G>AおよびC.343+8900A>T)が該疼痛保護性ハプロタイプに特有であることが示される(図１１Ａ)。これらのデータは、GTPシクロヒドロラーゼハプロタイプがヒトにおける疼痛慢性化についての予測指標であることを示し; したがって、患者におけるGTPシクロヒドロラーゼハプロタイプの同定を使用して、該患者において慢性痛の発症しやすさに変化があるかどうかを判定することができる。
【表３】
2009518035.tif 000007
【００４６】
次いで本発明者らは、健康なボランティアの、独立した2コホートにおいても、この「疼痛保護性ハプロタイプ」が、熱感痛、虚血性疼痛、および圧痛の感受性の減少と関連しているかどうかを調査した(下記方法および表４を参照のこと)。2コピーの「疼痛保護性ハプロタイプ」を保有する個体は機械的疼痛に対する感受性が有意に低く、かつ熱感痛および虚血性疼痛に対する感受性が低い傾向がある(図１４Ｂ)。1コホートでは、このディプロタイプを有する個体(n = 4)が熱感痛の時間的加重の有意な減少を示した(図１５)。この知見は第二のコホートでは再現されなかった。該ハプロタイプに関するヘテロ接合体はまた、このハプロタイプのコピーを有さない場合と比較して、疼痛感受性が低い傾向があり、かつ熱感痛に対する時間的加重の減少を示す傾向がある(図１４Ｂおよび１５)。これらのデータは、GTPシクロヒドロラーゼが、さらに、ヒトにおける急性痛感受性の制御因子であることを示す。
【００４７】
下記表４は、健康なボランティアの、独立した2コホートにおける「疼痛保護性ハプロタイプ」のコピー数と、熱、機械的、および虚血性疼痛の関連性を示す。一方のコホートをUniversity of North Carolina at Chapel Hill (UNC)で調査し、第二のコホートをUniversity of Florida (UF)で調査した。各個体の疼痛測定値を0の平均および1の標準偏差を用いる単位正規偏差(zスコア)に標準化した。「疼痛保護性ハプロタイプ」Xを保有しなかった被験体を0/0としてグループ分けし、1コピーのXハプロタイプを保有する被験体をX/0としてグループ分けし、2コピーのXハプロタイプを保有する被験体をX/Xとしてグループ分けした。各コホートおよび複合コホートに関する独立した関連研究分析を記載する。
【表４】
2009518035.tif 000008
【００４８】
白血球研究
GCH1 mRNAおよびタンパク質発現およびBH4合成を、腰根痛研究に参加した患者の、EBVで不死化された白血球において分析した(Atlas et al., Spine 21:1777-1786 (1996); Chang et al., J Am Geriatr Soc 53:785-792 (2005))。GCH1のベースライン発現(mRNAおよびタンパク質)およびBH4レベルは、該ハプロタイプの保有者と非保有者間で有意には異なっていなかった。GCH1転写は、近位プロモーター中に位置する調節エレメントを通じて作用するcAMPに応答して増加するため(Hirayama et al., J Neurochem 79:576-587 (2001); Kapatos et al., J Biol Chem 275:5947-5957 (2000))、細胞をフォルスコリン(10μM、12 h)で刺激して、アデニルシクラーゼ活性を増加させた。フォルスコリンは、該疼痛保護性ハプロタイプのコピーを有さない患者のGCH1 mRNA (図１４Ｃ)、タンパク質(図１４Ｄ)およびBH4生産(図１４Ｅ)を増加させた。フォルスコリンによるGCH1転写物の上方制御は、1または2コピーの該疼痛保護性ハプロタイプを有する白血球において有意に減少した(図１４Ｃ)。非保有者とは対照的に、WBC中のGCH1タンパク質レベル(図１４Ｄ)およびWBC培養上清中のビオプテリン濃度(図１４Ｅ)はホモ接合性ハプロタイプ保有者においてベースライン未満に低下した。それは該ハプロタイプがタンパク質の安定性を改変することを示唆する。ヘテロ接合性保有者の細胞は中間表現型を有した(図１４Ｄおよび１４Ｅ)。本発明者らは、さらに、健康なホモ接合性0/0およびX/Xボランティアの全血中のビオプテリンを分析した。ベースラインビオプテリンレベルは、該ハプロタイプのホモ接合性保有者において、非保有者と比較して、わずかに高かった。フォルスコリン処置(10μM、24 h)後に、ビオプテリンは、該ハプロタイプのホモ接合性保有者での20%と比較して、非保有者では約60%増加した(図１４Ｆ)。WBCと全血の間の差異(低下レベル対増加の減少)は、赤血球におけるQDPRを経由するBH4再利用に起因しうる。
【００４９】
本発明者らはまた、LPSが、フォルスコリンと同様に、該疼痛保護性ハプロタイプを有さない個体と比較して、該疼痛保護性ハプロタイプを有する個体由来の細胞において、より低い程度にGCH1を誘導することを見出した。以前の成果では、LPS、IL-1、TNF、およびインターフェロンガンマでの刺激が、cAMPと同様に、細胞のGTPCHレベルおよび活性を増加させることが示されている。したがって本発明者らは、該疼痛保護性ハプロタイプを保有するか、または減少した疼痛感受性を有する個体由来の細胞が、炎症性サイトカインまたはインターフェロンと接触させた場合に、GCH1のレベル/活性の減少を示すと考える。
【００５０】
テトラヒドロビオプテリン合成は、ラット感覚ニューロンにおいて、軸索損傷および末梢性炎症の両者に応答して増加する。合成カスケード中の連続する2つの酵素を独立に阻害することによってBH4合成の増加をブロックすることにより、神経因性および炎症性疼痛が減少し、また対照的に、BH4の投与は未処置の動物において疼痛を生じさせ、かつ炎症性および神経因性疼痛感受性を高める。さらにまた、GCH1のハプロタイプであって、フォルスコリンのチャレンジに応答するその上方制御を減少させるハプロタイプは持続性の神経因性疼痛に対して保護性であり、かつヒトにおける実験的な疼痛に対する感受性の減少と関連している。したがって本発明者らは、疼痛の生成およびモジュレーションに関与する新規経路および疼痛感受性の遺伝子マーカーをともに同定した。
【００５１】
GTPシクロヒドロラーゼ研究に関する材料および方法
実施例１に記載の結果を得るために以下の材料および方法を使用した。
【００５２】
マイクロアレイハイブリダイゼーション、リアルタイムRT-PCR、スロットブロット
RNAの抽出、Affymetrix RGU34Aチップ上で3組ずつ行うハイブリダイゼーション、およびアレイデータの解析は、報告されている通りであった(Costigan et al., BMC Neurosci 3:16 (2002))。ノーザンスロットブロットでは、トータルRNAをナイロンメンブレンにトランスファーし、32P標識cDNAプローブとハイブリダイズさせ、標準化のためにサイクロフィリンを使用して定量した。Sybrグリーン検出系を使用し、Primer Expressで設計されたプライマーセットを用いて定量的リアルタイムPCRを実施した。特異的PCR産物の増幅をゲル電気泳動で確認した。相対標準曲線法を製造元の使用説明書(Applied Biosystems)にしたがって使用して転写物調節を決定した。
【００５３】
in situハイブリダイゼーション
新鮮な凍結DRGを18μmにカットし、後固定(postfixed)し、アセチル化した。cDNAのインビトロ転写によってリボプローブを取得し、ジゴキシゲニンで標識した(Dig-labelingキット、Roche)。プレハイブリダイゼーションミックス中の200 ng/mlのセンスまたはアンチセンスプローブと切片をハイブリダイズさせ(Blackshaw and Snyder, J Neurosci 17:8083-8092 (1997))、抗Dig-AP (1:1000)とインキュベートし、NBT/BCIP/レバミゾールで展開し、グリセロール/ゼラチンに包埋するか、またはポストin situ免疫染色に付した。一次抗体: ヒツジDig-AP 1:1000 (Roche)、マウスNF200 1:4000 (Sigma)、ウサギATF-3 1:300 (SantaCruz)。FITC標識Griffonia simplicifoliaイソレクチンB4 (Sigma) 1:500。1%ブロッキング試薬(Roche)中でブロッキングおよび抗体インキュベーションを行った。
【００５４】
神経損傷モデル
成体雄性Sprague Dawleyラット(150〜200 g、Charles River Laboratories)を使用した。SNIモデルでは、2分岐の坐骨神経、総腓骨神経および脛骨神経を結紮し、遠心に切片化した。CCIモデルでは、3つのDexon 4/0結紮を用いて坐骨神経を狭窄した。SNLモデルでは、L5脊髄神経をかたく結紮した。すべての外科的処置はイソフルラン麻酔下で行った。ホルマリン試験では、50μlの5%ホルムアルデヒド溶液を後足に注射し、毎分の尻込みを60分までカウントした。完全フロイントアジュバント(CFA) 50μlを後足に注射して足炎症を誘発した。侵害受容性分析はブラインドで行い、動物を部屋および試験ケージに完全に慣らした。機械的異痛は段階的強度モノフィラメントvon Frey毛(0.0174〜20.9グラム、対数目盛)で評価し、冷感異痛はアセトン試験で評価し、熱の痛覚過敏はHargreaves試験で評価した。脊髄カテーテルを通して腹腔内またはくも膜下腔内に薬物(Sigma)を注射し、浸透圧ポンプを注入に使用した。コントロール動物にはビヒクルを投与した。L4/5 DRGおよび脊髄組織を、QRT-PCR、ウエスタンブロッティング、in situハイブリダイゼーションおよび免疫蛍光研究のために処理した。
【００５５】
炎症モデル
ホルマリン試験では、50μlの5%ホルムアルデヒド溶液を一方の後足に注射し、毎分の尻込みを60分までカウントした。ホルマリン注射の2時間後、動物に1x PBS中の4% PFAを潅流し、脊髄を解剖し、cFos免疫染色(ウサギpAb Santa Cruz 1:500)に付した。足炎症に関して、完全フロイントアジュバント(CFA) 50μlを該足に注射した。
【００５６】
侵害受容性行動
動物を完全に慣らし、実験を盲検的に実施した。段階的強度モノフィラメントvon Frey毛(0.0174〜20.9 g)に対する引っ込め反射を誘発するための閾値を測定して、機械的異痛を評価した。冷感異痛を測定するために、一滴のアセトンを後足の足底に適用し、動物が該足をなめるか、振るか、または持ち上げるために使う時間を測定した(Tegeder et al., J Neurosci 24:1637-1645 (2004))。放射熱(8 V、50 Wのランプ)に対する足引っ込め時間によって、熱によって誘発される疼痛を評価した(Ugo Basile)。
【００５７】
薬物処置
DAHPを1:1ポリエチレングリコール(PEG400)および1x PBS、pH 7.4 (15 mg/ml)に溶解し、腹腔内またはくも膜下腔内に投与した(250μg/kg/h; 5μl/h)。すべてのi.t.注射/注入では、脊髄カテーテル(Recathco)を使用し、報告されているように移植した(Kunz et al., Pain 110:409-418 (2004))。注入には浸透圧ポンプ(Alzet)を用いた。ACSF中の6R-BH4をi.t.注射した(10μg、一回の10μl注射)。3%エタノールを含有する1x PBS pH 7.4中のN-アセチル-セロトニンはi.t.注入によって送達した(100μg/kg/h; 5μl/h)。コントロール動物には適切なビヒクルを投与した。すべての薬物はSigma-Aldrichから入手した。
【００５８】
DAHPの血漿およびCSF濃度
DAHPの濃度は、タンデム四重極質量分析計(PE Sciex API 3000; Applied Biosystems)でのLC/MS-MSで決定した。抽出はアセトニトリル沈殿によって行い; クロマトグラフィーによる分離はNucleosil C18 Nautilusカラム(125 x 4 mm I.D.、5μm粒子サイズ、100Å孔サイズ)で実施した。移動相はアセトニトリル:水(80:20%、v/v)、およびギ酸(0.1 %、v/v)であった。流速は0.2 ml/分であり、注入量は5μlであった。DAHPは4.7分で溶出した。質量分析計は、陽イオンモード、5200 V、400℃、補助ガス流6 l/分であった。MRMに関する質量遷移(mass transition)はm/z 127→60であった。AnalystソフトウェアV1.1 (Applied Biosystems)で定量した。10〜4000 ng/mlの較正範囲にわたる変動係数は<5%であった。
【００５９】
白血球の不死化およびフォルスコリン刺激
末梢血リンパ球をEBVトランスフェクションによって不死化した。WBCをRPMI培地中のPHAで刺激し、次いでEBVを加え、細胞を37℃、4.5% CO2、90%相対湿度でインキュベートした。不死化細胞を10μMフォルスコリンで12時間刺激した。
【００６０】
ネオプテリンおよびビオプテリンの組織濃度
ホモジナイズされた組織をヨウ素で酸化し、Oasis MCXカートリッジでプテリジンを抽出した。トータルビオプテリン、ネオプテリン、および内部標準ラムノプテリンの濃度をLC/MS-MSによって決定した。LC分析はNucleosil C8カラムで勾配条件下で行い; MS-MS分析はAPI 4000 Q TRAP 三連四重極質量分析計で行った。ビオプテリンに関してm/z 236→192、ネオプテリンに関してm/z 252→192、ラムノプテリンに関してm/z 265→192の前駆体-生成物イオン遷移(Precursor-to-product ion transitions)をMRMに関して使用した。0.1〜50 ng/mlで線形性であった。すべての測定配列に関する相関係数は少なくとも0.99であった。日中および日間変動性は<10%であった。
【００６１】
電気生理学
成体ラット横断脊髄スライスにおける全細胞パッチクランプによって-70 mVで微小EPSCを記録した(Baba et al., Mol Cell Neurosci 24:818-830 (2003))。fura-2がローディングされた培養成体DRGニューロンにおいて、蛍光定量(ΔF 340/380)によって細胞内[Ca]Iを測定した。6R-BH4 (0.3〜10μM)、DEA-NONOate (50μM)、およびL-NAME (10〜100μM)は、マルチバレル(multibarrel)高速薬物送達系を使用して適用した。
【００６２】
データ解析
データは平均値±SEMである。群あたりの動物数は9〜12匹であった。線形台形法則を使用して「効果対時間」曲線下の面積(AUC)を算出し、スチューデントt検定または単変量分散分析(ANOVA)およびその後の、多重比較に関するボンフェローニアルファ補正を用いるt検定と比較した。すべての他のデータは、反復測定に関する単変量ANOVAまたはANOVAを用いて解析した。すべての検定に関してPは0.05であった。
【００６３】
ヒトの遺伝的研究
本発明者らは、5'エキソヌクレアーゼ法(表６Ａのプライマーセットおよびプローブ)を使用して、15個の一塩基多型(SNP)を遺伝子型決定し、GCH1全体にわたって均等な間隔に区分けした。PHASEソフトウェアを使用して、in-silicoで、GCH1ハプロタイプを同定した。該ソフトウェアは、期待値/最大化(EM)アルゴリズム変法を実行して、集団遺伝子型データからハプロタイプを再構築する。SNP間の連鎖不平衡(D')を使用して、独立していない対立遺伝子を示した(図１３Ａ)。
【００６４】
慢性腰根痛: 疼痛転帰
本発明者らは、持続性腰根痛に関する外科的椎間板切除術の前向き観察研究に参加した168人の白人成人からDNAを集めた(下記表５の人口統計データ)。1990〜1992年の間に、Maineの約半数の現役脊椎外科医は、腰根痛に関する椎間板切除術を必要とする患者を前向き観察研究に登録させた(Atlas et al., Spine 21:1777-1786 (1996))。患者は、手術前に、および手術後3、6、および12か月の時点で、およびその後10年間毎年、アンケートに記入した。疼痛転帰: 脚の疼痛は4項目によって評価し: ここ一週間の「脚の疼痛」の頻度、および「歩行後の脚の疼痛」の頻度を、「まったくなし(0点)」、「非常にまれ(1)」、「数回(2)」、「期間の約半分(3)」、「通常(4)」、「ほとんど常時(5)」、および「常時(6)」として評価した。「疼痛頻度の改善パーセント」スコアは、ベースラインスコアから頻度スコアを減算し、かつベースラインスコアで除算することによって算出した。外科手術後の「脚の疼痛」または「歩行後の脚の疼痛」の改善は、「疼痛が完全に消失(6)」、「非常に改善(5)」、「改善(4)」、「少し改善(3)」、「ほぼ同じ(2)」、「少し悪化(1)」、および「非常に悪化(0)」として評価した。各患者の各変数に関して、本発明者らは、初年度の曲線下面積スコアを算出し、該患者を残りのコホートと比較することによってこのスコアをzスコアに変換した。zスコアは、いくつかの標準偏差としての、最も起こりうる結果μからの実験結果xの発散を示し、z = (x-μ)/σとして算出される。主要疼痛転帰変数は前記4個のzスコアの平均であった。各多型に関する遺伝子型-表現型の関連性は、式: 初年度中の脚の疼痛= a + b (まれな対立遺伝子のコピー数: 0、1、または2) + c (性別) + d (年齢) + e (労働者補償状況) + f (初期登録後の外科手術の遅延) + g (Short-Form 36 (SF-36)全般的健康尺度) +誤差を使用して求めた。
【表５】
2009518035.tif 000009
【００６５】
健康な被験体における実験的な疼痛感受性
健康なボランティアの別個の2コホートにおいて、本発明者らは、熱感痛、虚血性疼痛および機械的疼痛とGCH1ディプロタイプの関連性を分析した。一方のコホートをUniversity of North Carolina at Chapel Hill (UNC)で調査し、第二のコホートをUniversity of Florida (UF)で調査した。関連研究では、腰根痛研究によって規定された「疼痛保護性ハプロタイプ」Xを保有しない384人の被験体を0/0としてグループ分けし、1コピーのXハプロタイプを保有する153人の被験体をX/0としてグループ分けし、2コピーのXハプロタイプを保有する10人の被験体をX/Xとしてグループ分けした。
【００６６】
UNCコホート: このサンプル群は18〜34歳の年齢(平均年齢22.8)の212人の健康な女性から構成された。疼痛知覚を評価するために使用された実験手順はDiatchenko et al., Hum Mol Genet 14:135-143 (2005)に記載の通りである。簡潔に言えば、熱感痛の閾値および耐性(℃)の測定値を3つの解剖検査部位、すなわち腕、頬および足にわたって平均した。側頭筋および咬筋、顎関節および、手関節の腹側表面にわたって圧痛閾値(kg)を評価した。15回の53℃熱パルスを右手の手のひらに適用することによって熱感痛の時間的加重を評価した。有痛性でない温暖の強度を評価するための「0」〜「19」の範囲の値、および熱感痛の強度を評価するための「20」(疼痛閾値)〜「100」(想定しうる最大激痛)の値を使用する言語数値アナログスケールを使用して各パルスの知覚を評価するよう被験者に指示した。駆血帯疼痛手順(submaximal effort tourniquet procedure)を用いて虚血性疼痛の閾値および耐性(秒)を評価した。
【００６７】
UFコホート: このサンプル群は、18〜52歳の年齢(平均年齢24.0)の192人の健康な女性および143人の健康な男性ボランティアから構成された。実験手順はHastie et al. Pain 116:227-237 (2005)に記載の通りである。簡潔に言えば、熱感痛の閾値および耐性(℃)を掌側前腕で評価し、反復する閾値上の熱感痛についての0〜100の評点を2種の温度、49および52℃で評価した。3部位、咬筋および僧帽筋、および尺骨にわたる背側前腕で圧痛閾値(kg)を評価した。駆血帯疼痛手順によって虚血性疼痛の閾値および耐性(秒)を評価した。
【００６８】
2コホート間でデータをまとめるために、所定の疼痛測定に関する各被験体の値を、0の平均および1の標準偏差を用いる単位正規偏差(zスコア)に標準化した。一元配置ANOVAを使用してディプロタイプ群間の差異を決定した。UNCコホートでは、曲線プロファイルの差異に関するディプロタイプの影響(図１５)を、一元配置ANOVAおよびその後の、post-hoc検定に関するボンフェローニ調整を使用して分析した(各ディプロタイプ比較に関してp < 0.001)。
【００６９】
遺伝子型決定法
SNPマーカー: 商用データベース(Celera Discovery System, CDS, July, 2005)から得られたマイナーなアレル(>0.05)の物理的位置および頻度を使用してSNPを選択した。15個のGCH1、3個のSPR、および11個のQDPRのSNPに関して5'ヌクレアーゼアッセイを設計し、非常に正確な様式で遺伝子型決定することができた。ほぼ均等の間隔に並んでいるこれらの一連のマーカーは各遺伝子領域および各遺伝子の4〜6 kb上流および4〜6 kb下流をカバーした。すべてのマーカーの対立遺伝子頻度およびそれぞれの遺伝子中の位置は表３Ａ〜３Ｃに示される通りである。
【００７０】
ゲノムDNA: リンパ芽球様セルラインからゲノムDNAを抽出し、5 ng/μlの濃度に希釈した。2μlアリコートを384ウェルプレート中で乾燥した。
【００７１】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅: アレル特異的蛍光発生プローブを使用する5'ヌクレアーゼ法によって遺伝子型決定を実施した。CDS、July 2005から得られた遺伝子配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブセットを設計した。各遺伝子中の各遺伝子座に関するプライマーおよび検出プローブを下記表６Ａ〜６Ｃに列挙する。
【表６】
2009518035.tif 000010
2009518035.tif 000011
2009518035.tif 000012
【００７２】
反応は、2.25μl TE (Assays On Demand)または2.375μl TE (Assays By Design)、2.5μl PCR Master Mix (ABI, Foster City, CA)、10 ngゲノムDNA、900 nMの各フォワードおよびリバースプライマー、および100 nMの各レポーターおよびクエンチャープローブを含有する5μl容量中で実施した。DNAを50℃で2分間および95℃で10分間インキュベートし、ABI 9700デバイスで92℃(Assays on Demand)または95℃(Assays By Design)で15秒および60℃で1分の40サイクルで増幅した。エンドポイント6-FAMまたはVIC蛍光強度を、それぞれ、508 nmおよび560 nmで測定することによってアレル特異的シグナルを識別し、Sequence Detection V.1.7 (ABI)を使用して遺伝子型を作成した。
【００７３】
各遺伝子座に関してランダムに選択された該サンプルの25%を再度遺伝子型決定することによって遺伝子型決定エラー率を直接決定した。総エラー率は<0.005であった。遺伝子型完了率は0.99であった。
【００７４】
ハプロタイプの推定: ハプロタイプ相--すなわち、直接測定されたSNPアレルが各患者の2染色体中にどのように分布するか--を期待値-最大化(EM)アルゴリズム(SAS/Genetics, Cary, North Carolina, USA)によって推定した。
【実施例２】
【００７５】
KCNS1疼痛保護性ハプロタイプ
慢性痛におけるKCNS1の関与
電位開口型カリウムチャネルは最大かつ最も多様なクラスのイオンチャネルを形成し、興奮性および非興奮性の両細胞に存在する。そのようなチャネルは、概して、静止膜電位を調節し、活動電位の形状および頻度をコントロールする。該カリウム電位開口型チャネル、遅延整流、サブファミリーS、メンバー1 (KCNS1)または電位開口型カリウムチャネル9.1 (KV9.1)遺伝子は、下丘のニューロンを含めた種々のニューロン中で発現されるカリウムチャネルアルファサブユニットをコードする。KCNS1によってコードされるタンパク質は単独では機能的でなく; それは、カリウム電位開口型チャネルタンパク質のShab関連サブファミリーのメンバー1およびメンバー2 (およびおそらく他のメンバー)とヘテロ多量体を形成しうる。この遺伝子はカリウムチャネルファミリーのSサブファミリーに属する。KCNS1は脳において非常に高度に発現されるが、他の組織では検出されない。脳内では、主要嗅球、大脳皮質、海馬体、手綱、外側基底扁桃体核、および小脳において最高発現レベルが見出された。
【００７６】
いくつかのK(+)チャネルの開口は、多数のGタンパク質共役受容体(例えば、アルファ(2)-アドレナリン受容体、オピオイド、GABA (B)、ムスカリンM(2)、アデノシンA(1)、セロトニン5-HT(1A)およびカンナビノイド受容体)のアゴニストによって誘発される抗侵害受容において重要な役割を果たす。いくつかの特定タイプのK(+)チャネルは抗侵害受容に関与する。最も広く研究されているのはATP感受性K(+)チャネルである。直接活性化によってK(+)チャネルを開く薬物(例えば神経型K(v)7およびK(ATP)チャネルの開口薬)は急性および慢性痛のモデルにおいて抗侵害受容を生じさせ、したがって、他の神経型K(+)チャネル(例えばK(v)1.4チャネル)が抗侵害受容性効果を有する新規K(+) チャネル開口薬の開発に関する興味深い標的であることが示唆される(Salinas et al., J. Biol. Chem. 272:24371-24379 (1997); Bourinet et al., Curr. Top. Med. Chem. 5:539-46. (2005); Ocana et al., Eur. J. Pharmacol. 500:203-19 (2004))。神経損傷後のK(+)チャネルの減少はニューロンの異所性または自発性発火を発生させるリスクを増加させうる。K(+)チャネル開口の減少はまた、オピエートまたは他の鎮痛剤処置の効力を減少させうる。
【００７７】
BH4合成に関与する遺伝子の同定と類似の様式で、KCNS1遺伝子が慢性痛に関与することを同定した。全3つのモデルの末梢神経因性疼痛において、マイクロアレイを使用して、ラットDRG中の経時的な(3〜40日の)KCNS1転写物の下方制御(図１６Ａ〜１６Ｃ)を観察した。これらの結果をKCNS1 mRNAのin situハイブリダイゼーションによって検証した(図１７Ａ〜１７Ｃ)。
【００７８】
KCNS1は染色体20q12に位置する。従来、KCNS1突然変異または配列変異体は関連研究に使用されていなかった。利用可能な推定の機能的KCNS1変異体を欠くため、本発明者らの慢性痛関連研究では、コード領域中の既知の同義および非同義突然変異(それぞれマーカーナンバー4および5を参照のこと; 図１８、表７)を含む、ハプロタイプ情報提供性に関して選択された一連の遺伝子座を使用して、包括的なハプロタイプベースの分析を実施した。本発明者らは、初めて、KCNS1ハプロタイプ構造を同定し、本発明者らの集団において、十分な密度で均等の間隔に並んでいる一塩基多型(SNP)マーカーのパネルを使用して、疼痛スコアとの関連性を調査した。5'エキソヌクレアーゼ法(Shi et al., Biologicals 27:241-52 (1999))を使用して、トータルで7個のマーカーを遺伝子型決定した。KCNS1は少なくとも2個のハプロタイプブロックを有し、マーカー4および5間のほぼ完全な連鎖不平衡(LD)を有した(図１９)。一回のSNP解析で、該2個のSNPが低スコアの坐骨神経痛と有意に関連していることが示された(表８)。ハプロタイプおよびディプロタイプ解析から、ブロック1中のマーカー3、4、および5の再構築によって、通常のハプロタイプ(頻度> 0.53)、「111またはGTG」が、特に2コピーのこの「低疼痛」保護性ハプロタイプを有する被験体において、低スコアの慢性の脚の疼痛と高度に関連していることを同定した(p < 0.004、表８)。SNP #4中のアレル1 (rs 734784)はアデニンであり、コドンATTに相当し、Ileをコードする。同位置をヌクレオチドGに切り換えると、このコドンがGTTに変化し、該コドンはValをコードする。この変異は疼痛の増加と最も強く関連している。したがって、この変化、SNP #5の変化、または該ハプロタイプと関連している別の未同定の変異はKCNS1の機能に影響しうる。
【表７】
2009518035.tif 000013
【００７９】
【表８】
2009518035.tif 000014
【００８０】
Kv9.1では、イソロイシンをバリンに変化させるSNPがMaineの外科手術後の腰痛患者において0.003で有意であった。
【００８１】
この研究で7個のKCNS1マーカーの5'ヌクレアーゼ遺伝子型決定に使用されたプライマーおよびプローブ配列を表９に示す。
【表９】
2009518035.tif 000015
【実施例３】
【００８２】
疼痛感受性に向かう傾向、急性または慢性痛の発症、またはBH4関連障害を発症する傾向を診断するための方法およびキット
本発明は、GCH1およびKCNS1遺伝子中の対立遺伝子変異およびハプロタイプの発見に基づいて、被験体の、疼痛感受性を診断するため、急性もしくは慢性痛に関する傾向または急性もしくは慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはGCH1遺伝子中の対立遺伝子変異およびハプロタイプの発見に基づいてBH4関連障害を発症するリスクを診断するために有用な方法およびキットを提供する。追加の方法およびキットは、減少した疼痛感受性と関連しているGCH1ハプロタイプが、細胞のサイクリックAMPレベルを増加させる物質であるフォルスコリンでチャレンジされた場合に、白血球中のGCH1発現および活性を減少させるという発見に基づく。
【００８３】
そのような方法およびキットを使用して得られた結果を使用して、例えば、該被験体に投与される鎮痛剤の投薬または選択、鎮痛剤が関与する臨床試験に該被験体を含めるかどうか、該被験体に対して外科的処置を実行するかどうかを決定するか、または麻酔法を選択するか、該被験体に神経毒治療を行うかどうか、または該被験者における疼痛発症の可能性を(例えば、保険リスク解析の一部として、または仕事割り当ての選択として)判定することができる。
【００８４】
さらに、前記方法を実施して得られた結果を臨床試験データとともに使用することができる。医療処置の効力を証明するための最良の基準(gold standard)は、臨床試験において統計学的に有意な結果である。疼痛保護性ハプロタイプの存在または不存在を臨床試験データの解析に組み入れることによって、該試験の実験集団とコントロール群間の統計学的有意差を得ることが可能でありうる。特に、本発明者らは、GCH1およびKCNS1遺伝子型またはハプロタイプが臨床試験内で観察される相違のいくらかを説明しうると考える。特に、本明細書中に記載の遺伝子型またはハプロタイプを、疼痛試験、またはGCH1が関連しているかもしれない他の臨床試験、例えば血管疾患または心的状態の研究の統計解析に含めることができる。
【００８５】
これらの方法およびキットを以下でさらに詳細に説明する。
【００８６】
被験体中の対立遺伝子変異を同定するための方法およびキット
被験体中の対立遺伝子変異を同定するための方法は、疼痛表現型の変化と関連している多型の存在または不存在の特定ならびに多型対立遺伝子の数(例えば、0、1、または2対立遺伝子)の決定を含みうる。本発明のキットは、対立遺伝子変異の存在または不存在を決定するための、ゲノムまたはmRNAの増幅に使用できるプライマー(例えば、2、3、4、8、10、またはそれ以上のプライマー)を含みうる。単一の対立遺伝子変異の存在をこの分析に使用できるが、複数の疼痛保護性対立遺伝子（アレル）(例えば複数の疼痛保護性SNP)の存在が診断のために好ましい。好ましくは、少なくとも4個、より好ましくは少なくとも8、10または12個、最も好ましくは少なくとも15個の疼痛保護性対立遺伝子変異(例えばSNP)を検出し、診断または予測のために使用する。さらに、単一コピーの疼痛保護性対立遺伝子変異またはハプロタイプの存在は疼痛感受性または急性もしくは慢性痛の発症に関する傾向の減少を示すが、2コピーの存在は疼痛感受性または急性もしくは慢性痛傾向の減少をさらに示す。
【００８７】
対立遺伝子変異の検出は任意の核酸解析法によって実施することができる。例えば、被験体から採取されたサンプル由来の、疼痛感受性または急性もしくは慢性痛を発症する傾向の変化と関連している多型(例えばSNP)を含有することが知られているGCH1またはKCNS1遺伝子のゲノム遺伝子座の一部分を配列決定することによって、診断を達成することができる。当技術分野において公知で、かつ本明細書中に記載のこの配列解析は該多型の存在または不存在を示し、それにより該被験体の疼痛感受性および疼痛応答プロファイルが解明される。
【００８８】
配列決定に加えて、対立遺伝子変異およびハプロタイプ解析は、例えば、当技術分野において公知の任意のPCRベースの遺伝子型決定法を使用して達成してもよい。疼痛保護性多型を含有することが知られているGCH1またはKCNS1遺伝子の領域を増幅することが可能な任意のプライマーを利用してよい。GCH1およびKCNS1遺伝子型決定に特に有用なプライマーは、それぞれ、表６Ａおよび９に列挙され、疼痛リスクの変化と相関している対立遺伝子変異は表１および２および図１１Ａに示される。典型的な診断アッセイでは、患者から生物学的サンプルを採取し、(例えば表６Ａまたは８のプライマーを使用して)疼痛保護性多型を含有する領域(例えば表３Ａまたは表８に示される領域)を増幅するためのPCRに付してよい。イントロン領域に存在する多型に関しては、概してゲノムDNAの解析が使用される。多型が遺伝子の転写領域(例えばコード配列またはプロモーター領域中)に存在すれば、mRNAの解析を代わりに利用してよい。該多型の存在または不存在は、該被験体が、疼痛感受性の増加または急性もしくは慢性痛の発症に関するリスクの変化にさらされているかどうかを示す。
【００８９】
本発明において使用してよい他の遺伝子型決定法には、高速かつ高感度のTaqMan 5'エキソヌクレアーゼ法、ならびにミクロスフェアアレイに対するハイブリダイゼーションおよびフローサイトメトリーによる蛍光検出が含まれる。化学アッセイ、例えばアレル特異的ハイブリダイゼーション(ASH)、一塩基鎖伸長(SBCE)、アレル特異的プライマー伸長(ASPE)、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)は、ミクロスフェアアレイとともに実行することができる。蛍光分類技術では、50個までのダイアレルマーカーを単一ウェルで同時に遺伝子型決定することが可能である。典型的には、96ウェルプレートを分析するために1時間未満しか必要とせず、1日あたり何万もの遺伝子型の解析が可能である。
【００９０】
本発明において使用できる遺伝子型解析の追加の方法には、オリゴヌクレオチドライゲーション/PCRアッセイ(OLA/PCR)テクノロジーに基づくSNPlex遺伝子型決定系および多重SNP遺伝子型決定のためのZipChute Mobility Modifierプローブが含まれる。この方法は、高い精度および再現性で、1日あたり200,000を超える遺伝子型解析の実行を可能にする。一具体例では、この方法は、単一の生物学的サンプル中で同時に48個のSNPを同定することを可能にし、15分間にパラレルで4,500個のSNPを検出する能力を有する。上記のすべての方法は典型的な遺伝子型決定法であるが、当技術分野において公知の任意の核酸解析法を本発明において使用してよい。
【００９１】
細胞中のGCH1発現または活性の変化を同定するための方法およびキット
本発明は、被験体が、疼痛に対する感受性の変化、または急性もしくは慢性痛を発症するか、またはBH4関連障害を発症するリスクの変化を有するかどうかを決定するために使用できる方法を特徴とする。特に、本発明は、チャレンジ、例えば細胞のサイクリックAMP (cAMP)レベルを増加させる物質の投与、LPSの投与、炎症性サイトカイン(例えばIL-1、TNF)の投与、またはインターフェロン(例えばインターフェロンガンマ)の投与後に、細胞、例えば白血球中でGCH1発現または活性が変化(例えば増加または減少)しているかどうかを決定するための方法およびキットを特徴とする。cAMPレベルを増加させる任意の物質を本発明の方法において使用してよい。例えば、アデニルシクラーゼアクチベーター(例えばフォルスコリン)、デキサメタゾン、コレラ毒素、cAMPアナログ(例えば、8-ブロモ-サイクリックAMP、8-(4-クロロフェニルチオ)サイクリックAMP、N6,O2'-ジブチリルサイクリックAMP (N6,O2'-dibutyryl cylic AMP))、サイクリックAMPホスホジエステラーゼインヒビター(例えば、3-イソブチル-1-メチルキサンチン、Beretz et al., Cell Mol Life Sci 34:1054-1055, 1978に記載のフラビノイド(flavinoids)、または当技術分野において公知の任意のホスホジエステラーゼインヒビター)、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン(thyrotripin)放出ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、およびエタノール等の物質を使用して、細胞中のcAMPレベルを増加させることができる。
【００９２】
GCH1発現または活性は、例えば、GCH1 mRNA(例えば、マイクロアレイ、QT-PCR、ノーザンブロット分析、または当技術分野において公知の任意の他の方法を使用して)またはGCH1タンパク質(例えば、ウエスタンブロットまたはELISA等の抗体ベースの検出法を使用して)のレベルを測定することによって、アッセイしてよい。GCH1活性は、BH4経路の中間体または生成物、例えばネオプテリン、ビオプテリン、またはBH4を使用して測定することができる。概して、cAMPレベルを増加させる物質(例えばフォルスコリン)で処理された細胞中のGCH1の発現または活性を測定し、そしてベースライン値またはベースライン値群と比較する。したがって、ベースライン値(群)と比較されたGCH1発現または活性の変化は、被験体の疼痛感受性、被験体が急性または慢性痛を発症するリスク、または被験体がBH4関連障害を発症するリスクを示す。
【００９３】
本発明の診断法で使用するためのベースライン値は、いくつかの異なる手段によって確立してよい。一例では、ポジティブコントロールをベースライン値として使用する。ここでは、物質で処置されたGCH1疼痛保護性ハプロタイプを有する個体由来のGCH1発現または活性レベルを測定し、ベースライン値として使用する。ゆえに、ベースライン値と比較された被験体中のGCH1発現または活性の増加(例えば、少なくとも3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、90%、100%、または200%の増加)は、GCH1疼痛保護性ハプロタイプを有する個体と比較された疼痛感受性の増加または急性もしくは慢性痛を発症するか、またはBH4関連障害を発症するリスクの増加を示す。
【００９４】
ベースライン値は、いくつかの個体間でGCH1発現または活性値を平均することによって確立してもよい。例えば、GCH1疼痛保護性ハプロタイプを有する個体(例えば、少なくとも2、5、10、20、50、100、200、または500個体)由来の細胞中のGCH1発現または活性を使用して、ポジティブコントロールに関するベースライン値を確立してよい。ネガティブコントロール値は、個体(例えば、少なくとも2、5、10、20、50、100、200、または500個体)の群、例えば、(a)ランダムに選択された個体または(b) GCH1疼痛保護性ハプロタイプのコピーを欠いていることが知られている個体から、同様に確立してよい。
【００９５】
被験体由来のサンプルを、例えば2または3群の個体から確立された、複数のベースライン値と比較してもよい。例えば、3群の個体(例えば、その各群は、独立して、少なくとも2、5、10、20、50、100、または200個体から構成される)を使用して、3つのベースライン値を確立してよい。このアプローチでは、被験体を、0、1、または2コピーのGCH1疼痛保護性ハプロタイプを有するかどうかに基づいて、3群に分離する。cAMPレベルを増加させる組成物で各個体由来の細胞を処理して、GCH1発現または活性のレベルを測定する。そしてこれらの測定値から、各群のGCH1発現または活性の平均値を算出し、それによって3つのベースライン値を確立することができる。そして、被験体の処理済みサンプルから測定された値を該3つのベースライン値と比較する。したがって、被験体の疼痛感受性、急性または慢性痛を発症するリスク、またはBH4関連障害を発症するリスクを、この比較の基準に基づいて決定することができる。
【００９６】
他の実施形態
本明細書中に記載のすべての特許、特許出願(U.S. Provisional Application No. 60/742,820, filed December 6, 2005を含む)、および刊行物は、独立した各特許、特許出願、または刊行物が、具体的かつ個別に、参照により組み入れられることが指定されている場合と同程度に、参照により本明細書中に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、spared nerve injury (SNI)モデルでの、後根神経節(DRG)における、BH4依存性酵素: フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PheOH)、チロシンヒドロキシラーゼ(TyrOH)、神経型トリプトファンヒドロキシラーゼ(nTrpOH)、および内皮型、誘導型、および神経型一酸化窒素合成酵素(eNOS、iNOS、およびnNOS)のmRNA発現の調節を示す(3日間、n = 3、エラー SEM; ビヒクルに対して*p < 0.05)。
【図２Ａ−Ｇ】図２Ａ〜２Ｈは、神経損傷後のDRGにおけるテトラヒドロビオプテリン合成酵素の調節を示す。図２Ａは、Affymetrix RGU34Aマイクロアレイによって検出される、末梢神経因性疼痛のspared nerve injury (SNI)モデルでのL4/5 DRGにおけるBH4合成経路酵素の上方制御を示す(n = 3、エラー SEM)。単変量ANOVAはGTPシクロヒドロラーゼ(GTPCH)およびセピアプテリン(sepiapterin)還元酵素(SR)の示差発現と一致した(p < 0.001)。ピロボイル-テトラヒドロプテリン(Pyrovoyl-tetrahydropterin)合成酵素(PTPS)は不変であった(データは示していない)。図２ＢはBH4合成経路を示す。図２Ｃは、SNI 7日後のin situハイブリダイゼーションによる、L5 DRGニューロンにおける、GTPCH、SR、およびジヒドロプテリジン還元酵素(DHPR)(キノイドジヒドロプテリジン還元酵素(QDPR)とも称される)のmRNAの増加の実証を示す(スケールバー100μm)。図２Ｄは、SNI後のL4/5 DRGにおけるGTPCHタンパク質発現を示す(n = 3、エラー SEM)。図２Ｅおよび２Ｆは、SNI 7日後の同側および対側L4/5 DRGにおける、それぞれ、ネオプテリンおよびビオプテリンレベルを示す。組織解剖の3時間前に投与されたGTPCHインヒビターである2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシピリミジン(DAHP)(180 mg/kg i.p.の一回量)がネオプテリンおよびビオプテリンを減少させた(n = 6、エラー SEM)。図２Ｇは、SNI 3日後のin situおよびイムノイメージを示し; GTPCH mRNA陽性ニューロンは、損傷した軸索を有するニューロンに関するマーカーである転写因子ATF-3に関しても標識され、すべてのパネルに関して* p < 0.05である。
【図２Ｈ】図２Ａ〜２Ｈは、神経損傷後のDRGにおけるテトラヒドロビオプテリン合成酵素の調節を示す。図２Ｈは、定量的RT-PCRによって検出される、末梢神経因性疼痛のspared nerve injury (SNI)モデルでのL4/5 DRGニューロンにおけるBH4生成酵素の上方制御を示す(n = 4、エラー SEM)。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａ〜３Ｅはマイクロアレイ分析を示す。図３Ａおよび３Ｂは、慢性絞扼神経損傷(chronic constriction injury)モデル(CCI)での、L4/5 DRGにおける、GTPシクロヒドロラーゼ(GTPCH)、セピアプテリン還元酵素(SR)およびジヒドロプテリジン還元酵素(DHPR/QDPR) mRNA発現のAffymetrix マイクロアレイ分析(n = 3、エラー SEM)(GTPCHおよびSRに関してp < 0.05)およびCCI後のGTPシクロヒドロラーゼインヒビターであるDAHPの鎮痛効果を示す。図３Ｃおよび３Ｄは、神経因性疼痛の脊髄神経結紮モデル(SNL)でのマイクロアレイ分析(n = 3、エラー SEM; GTPCHおよびSRに関してp < 0.001、DHPRに関してp = 0.01)およびDAHPの鎮痛効果を示す。DAHP (180 mg/kg i.p.)を指定日に注射した; n = 9〜10、CCIおよびSNLに関してp < 0.05。コントロール動物はビヒクルで処置した。行動上の影響の統計学的比較に効果対時間AUCを使用した。すべてのパネルに関して、エラーはSEMである。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｅはマイクロアレイ分析を示す。図３Ｅは、完全フロイントアジュバント(CFA)(図３Ｅ)によって誘発される足炎症モデルでの、同側腰部DRGにおける、GCH1、SPR、およびQDPR mRNAのマイクロアレイ分析を示す。コントロール動物はビヒクルで処置した。行動上の影響の統計学的比較に効果対時間AUCを使用した。エラーはSEMである。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、坐骨神経切断後のL4/5 DRGにおけるBH4合成経路酵素の上方制御を示す。図４Ａは、Affymetrixマイクロアレイ分析(n = 3、エラー SEM)を示す表である。図４Ｂは、GTPシクロヒドロラーゼ(GTPCH)、セピアプテリン還元酵素(rductase)(SR)、およびジヒドロプテリジン還元酵素(DHPR/QDPR) mRNAの経時的なノーザンブロット解析を示す(n = 3、エラー SD)。図４ＣはGTPシクロヒドロラーゼタンパク質の発現を示す(n = 3、エラー SD)。図４Ｄは坐骨神経切断40日後の持続的なGTPCHタンパク質の上方制御を示す(n = 3、エラー SD)。
【図５】図５は、spared nerve injury (SNI; 40〜50%)の3日後にGTPシクロヒドロラーゼ(GTPCH) mRNAを発現している一部のDRGニューロンが神経フィラメント200 (NF200)と共局在したことを示す。NF200は有髄軸索を有する大きいDRGニューロンに関するマーカーである。GTPCH mRNA発現ニューロンは、無髄軸索を有する小さいDRGニューロンのサブセットに関するマーカーであるGriffonia simplicifoliaイソレクチンB4 (IB4)で標識されなかった。矢印はGTPCH転写物およびNF200に関して陽性のニューロンを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｇは、炎症性疼痛およびホルマリン誘発疼痛における、GTPシクロヒドロラーゼインヒビターである2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシ-ピリミジン(DAHP)の効力を示す。図６Ａおよび６Ｂは、DAHP (180 mg/kg i.p.、矢印)を注射すると、それがCFA以前に注射された場合(図６Ａ)およびCFAの24時間後に注射された場合(図６Ｂ)のいずれの場合も、後足への完全フロイントアジュバント(CFA)注射によって誘発された熱痛覚過敏が有意に減少したことを示す(n = 7または9、p < 0.05)。図６Ｃおよび６Ｄは、CFAの24時間後の同側L4/5 DRGにおける、それぞれ、ネオプテリンおよびビオプテリンレベルを示す。組織解剖の3時間前に投与されたDAHP (180 mg/kg i.p.の一回量)はネオプテリンおよびビオプテリンを減少させた(n = 7、エラー SEM)。図６Ｅは、ホルマリン(矢印)より前に注射されたDAHP (180 mg/kg i.p.)が、ホルマリンアッセイの両方の期間で、ホルマリンによって誘発される尻込み行動(flinching behavior)を有意に減少させたことを示す(n = 7、p < 0.05)。図６Ｆおよび６Ｇは同側後角におけるcFOS免疫反応性ニューロン数の減少を示す。すべての図に関して、エラーはSEMである。CFA後の薬物効果の統計学的比較に効果対時間曲線下の面積を使用し、尻込み(flinch)の合計をホルマリン試験に使用した。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは神経因性疼痛のspared nerve injury (SNI)モデルにおけるDAHPの効力および動態を示す。図７Ａは、SNI 4日後のDAHPの注射(180 mg/kg i.p.、矢印)が機械的(von Frey)および冷感異痛を有意に減少させたことを示す(n = 12、p < 0.05)。図７Ｂは、SNIモデルにおいて毎日の反復注射(矢印)を用いた場合の、注射の2〜3時間後に測定された、機械的および冷感異痛に対するDAHPの用量依存的効力を示す(n = 9〜10、p < 0.05)。用量と効果の間の関連性は線形であった(機械的および冷感異痛に関してR = 0.709およびR = 0.754、p < 0.001)。図７Ｃは、神経損傷の17日後に開始されたDAHP (180 mg/kg/d i.p.)治療が機械的および冷感疼痛過敏性の有意な減少を生じさせたことを示す(n = 7、p < 0.05)。図７Ｄは180 mg/kgのi.p.注射後のDAHPの血漿およびCSF濃度の時間経過を示す。図７Ｅおよび７Ｆは、DAHP(180 mg/kg i.p. 矢印)治療により、未処置(naive)の動物における機械的および熱の閾値が変更されなかったことを示す(n = 6、p = 1)。すべての図に関して、エラーはSEMである。行動実験における薬物効果の統計学的比較に効果対時間曲線下の面積を使用した。
【図８】図８Ａ〜８ＤはDAHP注射の効果を示す。図８Ａおよび８Ｂは、神経因性疼痛のSNIモデルにおいて、DAHPの連続的くも膜下腔内注入が機械的および冷感異痛を減少させたことを示す。浸透圧性Alzetポンプに連結された常時埋込型脊髄カテーテルを介してDAHP (250μg/kg/h)を腰髄に送達した。SNI外科手術直後に注入を開始し、14日間、流速5μl/hで継続した(n = 8、p < 0.05)。図８Ｃは、CFAによって誘発された足炎症モデルにおいて、1 mg/kg DAHPの一回のくも膜下腔内注射(矢印)が熱痛覚過敏を減少させたことを示す(n = 9、p < 0.05)。統計学的比較に効果対時間AUCを使用した。図８Ｄは強制水泳試験(Forced Swim Test)におけるDAHPの効果を示す。強制水泳に対する最初の曝露の1時間、19時間および23時間後の時点で、ラット(条件あたりn = 7)に3回の独立したDAHP注射(180 mg/kg、i.p.)を投与した。この一般に使用される処置計画は、ラットにおいて、ヒトにおける抗うつ効果またはプロ抑制効果を有する物質を同定する(Mague et al., J Pharmacol Exp Ther 305:323-330 (2003))。再試験セッション(300秒間の強制水泳)を最初の水泳曝露の24時間後に行い、水シリンダーの側からビデオテープに録画し、処置条件を聞かされていない評価者がスコアリングした。ラットを再試験セッション期間全体にわたって5秒間隔で評価し; 各5秒間隔で顕著な行動を4カテゴリー: 不動、水泳、よじ登り、または潜水の1つに割り当てた。各様式に関してこれらのスコアの合計を示す。すべてのパネルに関して、エラーはSEMである。
【図９Ａ−Ｈ】図９Ａ〜９Ｉは神経損傷および炎症モデルにおけるN-アセチルセロトニン(NAS)およびBH4の効果を示す。図９Ａおよび９Ｂは、SNIモデルにおいてセピアプテリン還元酵素インヒビターであるNAS (100μg/kg/h i.t.注入 14日間)が機械的および冷感異痛を有意に減少させたことを示す(n = 9、p < 0.05)。図９Ｃは、CFAの24時間後に注射されたNAS (50 mg/kg i.p.; 矢印)が熱痛覚過敏を有意に減少させたことを示し(n = 9、p < 0.05)、図９Ｄは、SNI 7日後のDRGにおいてNASがビオプテリンレベルを減少させたことを示す(n = 8、*p < 0.05)。図９Ｅ〜９Ｈは、腰部脊髄カテーテルを使用する6R-BH4のくも膜下腔内注射(10μg、10μl、矢印)が、未処置の動物において熱感痛の感受性を有意に増加させ(n = 6、p < 0.05)、さらにSNI 6日後に機械的(図９Ｆ)および冷感異痛(図９Ｇ)を増加させ、さらにCFAの5日後にi.t.注射された場合に熱感痛の感受性を増加させた(図９Ｈ)ことを示す(n = 6、機械的異痛および熱の痛覚過敏に関してp < 0.05)。冷感異痛の増加は有意でなかった(n = 6、p = 0.15)。すべての図に関して、エラーはSEMである。効果対時間曲線下の面積を統計学的比較に使用した。
【図９Ｉ】図９Ａ〜９Ｉは神経損傷および炎症モデルにおけるN-アセチルセロトニン(NAS)およびBH4の効果を示す。図９Ｉは、BH4合成中に生産される安定な代謝産物であるネオプテリンが、未処置ラットにおいて、i.t.注射(10μg、10μl、矢印)後に、機械的疼痛および熱感痛の感受性に対して効果を有さなかったことを示す。エラーはSEMである。効果対時間曲線下の面積を統計学的比較に使用した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｆは神経損傷後のDRGにおけるBH4依存性酵素の調節を示す。図１０Ａは、定量的RT-PCRによって検出される、末梢神経因性疼痛のspared nerve injury (SNI)モデルでのL4/5 DRGにおける神経型トリプトファンヒドロキシラーゼ(TPH2)および神経型一酸化窒素合成酵素(NOS1)の上方制御を示す(n = 4、エラー SEM)。図１０Ｂは、定量的RT-PCRによって検出される、SNI後のL4/5 DRGにおいてチロシンヒドロキシラーゼ(TH)が下方制御されたこと、ならびに誘導型および内皮型NOS (NOS2、NOS3)およびフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)が変化しなかったことを示す(n = 3、エラー SEM)。図１０Ｃは、一日一回のDAHPでの処置による、SNI 7日後のL4/5 DRGにおける一酸化窒素生産の増加およびNOレベルの正常化を示す(n = 6、エラー SEM)。図１０Ｄは、神経損傷の7日後の、SNIによって誘発された機械的および冷感異痛に対する、NOSインヒビターであるL-NAME (25 mg/kg i.p.)の効果を示す。L-NAMEまたはビヒクルを「0」時点で注射した(n = 7、エラー SEM)。AUCを使用するT検定では、von Freyおよびアセトン応答に関する有意な効果が示された。図１０Ｅは、6R-BH4の適用後の、培養成体ラットDRGニューロンにおける細胞内カルシウムの用量依存的増加を示す。fura-2がローディングされたニューロンにおいて蛍光分析により340対380 nmの吸光度比(ΔF 340/380)として[Ca2+]Iを測定した。青色-緑色-赤色疑似カラー放射測定イメージ(上部パネル)および(*)でマークされたニューロン由来の代表的なΔF340/380トレースは、BH4適用後のΔFの増加を示す。図１０Ｆは、L-NAME (50μM)がBH4媒介性の[Ca2+]Iの増加を有意に減少させたが、DEA-NONOate (NOドナー(50μM))によって誘発された[Ca2+]Iの増加に対して効果を有さなかったことを示す。すべてのパネルに関して、アスタリスク(*)はp < 0.05を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、GTPシクロヒドロラーゼ遺伝子(GCH1)の15個の遺伝子型決定された一塩基多型(SNP)の物理的位置およびハプロタイプ解析を示す。コーディングエキソンはブロックとして示す。SNP位置は、SNPブラウザソフトウェアおよびPanther Classification System公的データベース、August 2005またはEnsembleデータベースv.38、April 2006から得られる。腰椎椎間板切除術後の12か月にわたる脚の疼痛の主要転帰に関して、有意なSNPに関するP値を示す。低い疼痛スコアと有意に関連しているものを星印によって示す(*p < 0.05; 各SNPに関する疼痛スコア)。各ハプロタイプ中の文字はGCH1中の15 SNPの遺伝子型である。頻度 >1%のハプロタイプのみが含まれる。8つのハプロタイプが、研究対象の染色体の94%を占める。各ハプロタイプに関する疼痛スコアは腰椎椎間板切除後の1年にわたる「脚の疼痛」に関する平均Zスコアであり、それは共変量用に調整されていて、各患者における、該患者のSNPアッセイから得られた2つのハプロタイプのアルゴリズムに基づく構築が正しかった確率に関して重み付けがされている。低いスコアほど、少ない痛みに相当する。安静時、歩行後の痛みの頻度、ならびに外科手術後のそれらの改善を評価する4つの質問から該スコアを算出した。ハプロタイプACGTTGCACACGAGG (白で強調表示されている)は、「脚の疼痛」に関して、7つの他のハプロタイプより低い疼痛スコアを有する。p 0.009。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、疼痛スコアに対する、疼痛保護性ハプロタイプのコピー数の影響を示す図表である。ハプロタイプACGTTGCACACGAGGのコピー数と関連して、持続痛のほぼ線形の減少が認められる。ただし4人の患者しかこのハプロタイプに関してホモ接合性を有さなかった。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、それぞれ、SPRおよびQDRP遺伝子構造ならびにSNPマッピングを示す。コーディングエキソンは黒塗りブロックとして示す。物理的位置は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)データベースおよびSNPブラウザプログラム(ABI)、August 2005から得られる。腰椎椎間板切除術後の1年にわたる「脚の疼痛」の主要転帰に関して、各SNPに関するP値を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、それぞれ、SPRおよびQDRP遺伝子構造ならびにSNPマッピングを示す。コーディングエキソンは黒塗りブロックとして示す。物理的位置は、National Center for Biotechnology Information (NCBI)データベースおよびSNPブラウザプログラム(ABI)、August 2005から得られる。腰椎椎間板切除術後の1年にわたる「脚の疼痛」の主要転帰に関して、各SNPに関するP値を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３ＣはGCH1 (図１３Ａ)、SPR (図１３Ｂ)、およびQDPR (図１３Ｃ)のハプロタイプブロック構成を示す。各ボックスは、Haploviewソフトウェア(Whitehead Institute for Biomedical Research, USA)によって生成された、SNPのペア間の連鎖不平衡D'のパーセンテージ(%LD)を示す。D'は色分けされていて、暗色ボックスは遺伝子座ペア間の完全な連鎖不平衡(D' = 1.00)を示す。GCH1およびSPRは、それぞれ、遺伝子全体におよぶ単一のハプロタイプブロックを有し、いくつかのマーカーの低い対立遺伝子頻度に起因してGCH1の連鎖不平衡はいくらか乱れている。QDPRは2つのハプロブロックを有する。図１３Ａはまた、PHASEソフトウェアを使用して、in-silicoで、GCH1ハプロタイプが同定されたことを示す。該ソフトウェアは、期待値/最大化(EM)アルゴリズムの変法を実行して、集団遺伝子型データからハプロタイプを再構築する。追加の解析では、対立遺伝子の非独立性を示すSNP間の連鎖不平衡を評価した。連鎖不平衡をD = pAB - pA・pA (DはcDNA位置AおよびB間の連鎖不平衡の尺度である)として定量した。PABは、第一の位置に対立遺伝子Aを含有し、かつ第二の位置に対立遺伝子Bを含有する配列の頻度を示し、pAおよびpBはそれぞれの対立遺伝子の頻度である。「D」は対立遺伝子頻度に依存するため、Dをその理論的最大値に標準化し、完全な連鎖平衡および不平衡に関して、それぞれ、0〜1の範囲におよぶD'の値を得た。連鎖不平衡を、さらに、2遺伝子座間の2乗相関(squared correlation)を示すr2によって定量した。各ボックスは、HelixTree(登録商標)ソフトウェアによって生成された、SNPのペア間の連鎖不平衡D'を表す。D'はグレースケールで分けられていて、白色ボックスは遺伝子座ペア間の完全な連鎖不平衡(D' = 1.00)を示す。GCH1は、遺伝子全体にまたがる単一のハプロタイプブロックを有し、いくつかのマーカーの低い対立遺伝子頻度に起因してGCH1の連鎖不平衡はいくらか乱れている。
【図１３Ｂ−Ｃ】図１３Ａ〜１３ＣはGCH1 (図１３Ａ)、SPR (図１３Ｂ)、およびQDPR (図１３Ｃ)のハプロタイプブロック構成を示す。他は図１３Ａと同様である。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは種々の試験における疼痛保護性ハプロタイプのコピー数の影響を示す。図１４Ａは安静時の脚の疼痛の頻度に対する疼痛保護性ハプロタイプのコピー数の影響を示す。0/0、X/0、およびX/Xは、それぞれ、0、1、および2コピーのハプロタイプを有する患者を示す。y軸上の数値は、疼痛頻度: 常時(6)、ほとんど常時(5)、通常(4)、約半分の期間(3)、多少の期間(2)、まれ(1)、およびまったくなし(0)に相当する。図１４Ｂは、健康なボランティアにおける実験的な疼痛感受性に対する、疼痛保護性ハプロタイプのコピー数の影響(0/0 n = 384; X/0 n = 153; およびX/X n = 10)を示す(**0/0群と比較してp < 0.01)。図１４Ｃ〜１４Ｆは患者白血球に対するフォルスコリンの影響を示す。図１４Ｃは、0/0個体の刺激されていないレベル(100%)と比較して、フォルスコリン(10μM、12時間)で刺激された、0/0 (n = 7)、X/0 (n = 5)およびX/X (n = 4)腰根痛(lumbar root pain)患者のEBV不死化WBC中のGCH1 mRNA (QRT-PCR)を示す。白色バーは刺激されていない; グレーは刺激後である。図１４Ｄは不死化WBCにおけるGCH1タンパク質発現およびフォルスコリン処置後の変化%を示す。図１４Ｅは、フォルスコリンによって刺激された不死化WBCの上清中のビオプテリンを示し、図１４Ｆは、ベースラインと比較された、健康なボランティア(0/0 n = 11; X/X n = 10)由来のフォルスコリン(10μM、24時間)刺激全血を示す。結果はSEMを伴う平均値を表す。線形回帰分析では、GCH1 mRNA (p < 0.001)、タンパク質(p = 0.037)およびビオプテリン(p = 0.001およびp = 0.002)の、フォルスコリンによって誘発された変化に関する疼痛保護性ハプロタイプのコピー数の有意な影響が示された。
【図１５】図１５は、実験的な疼痛感受性に対する、推定の「疼痛保護性ハプロタイプ」のコピー数の影響を示す。グラフは反復熱刺激に対する時間的加重応答を示す。各値は、各熱(53℃)パルスに関して得られた口頭での数値規模評価(verbal numerical magnitude estimate)の平均値±標準誤差を表す。有痛性でない温熱感覚を0〜19の範囲で評価した。熱感痛感覚を誘発した熱刺激を20 (疼痛閾値)〜100 (想定しうる最大激痛)の範囲で評価した。各値は関連s.e.m.を伴う平均値を表す。一元配置ANOVAおよびその後の、post-hoc検定に関するボンフェローニ調整を使用して、「疼痛保護性ハプロタイプ」のコピー数と熱感痛の時間的加重との関連性を分析した(0/0群およびX/0群に関して、X/X群と比較してp < 0.001)。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、Affymetrix RGU34Aマイクロアレイによって検出された、末梢神経因性疼痛のSNI、CCI、およびSNLモデルにおけるKCNS1の下方制御を示す(n = 3、エラー SEM)。アスタリスク(*)はp < 0.05を示す。
【図１７】図１７Ａ〜１７ＣはラットDRG内のKCNS1 mRNAに関するin situハイブリダイゼーションを示す。KCNS1 mRNAシグナルは、未処置のDRG (図１７Ａ)、SNI 7日後のDRG (図１７Ｂ)、およびCCI 7日後のDRG (図１７Ｃ)において示される。下方制御は大きい直径の細胞において明らかである(スケール100μm)。
【図１８】図１８はKCNS1遺伝子のゲノム領域で同定された突然変異の位置を示し、SNPマッピングを含む。
【図１９】図１９はKCNS1遺伝子のハプロタイプブロック構成を示す。ブロック図に関する詳細は図１３Ａ〜１３Ｃの説明において上に記載される通りである。
【図１】
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【図２Ａ−Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月3日(2007.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するための方法であって、該被験体由来の生物学的サンプル中のGTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)核酸における対立遺伝子変異の存在または不存在を決定するステップを含み、該対立遺伝子変異が、疼痛感受性、急性または慢性疼痛の発症、またはBH4関連障害の発症と相関している、上記方法。
【請求項２】
GCH1対立遺伝子変異が、ヒト染色体14q22.1〜14q22.2内に位置するハプロタイプブロック中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
GCH1対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項２に記載の方法: rs6572984, rs17128017, rs10151500, rs10136966, rs841, rs987, rs17253577, rs11624963, rs752688, rs7493025, rs2004633, rs7493033, rs17253584, rs10139369, rs10150825, rs11848732, rs17253591, rs10143089, rs13329045, rs10131232, rs10133662, rs10133941, rs13329058, rs9672037, rs7161034, rs7140523, rs11626298, rs17128021, rs10129528, rs4411417, rs2878168, rs11461307, rs7153186, rs7153566, rs7155099, rs11444305, rs11439363, rs7155309, rs1952437, rs8007201, rs11412107, rs12587434, rs17128028, rs12589758, rs2878169, rs28532361, rs12879111, rs10129468, rs11620796, rs2149483, rs7147200, rs4462519, rs9671371, rs9671850, rs9671455, rs28481447, rs12884925, rs8010282, rs8010689, rs8011751, rs7156475, rs17128033, rs28643468, rs2183084, rs10137881, rs2878170, rs12323905, rs10138301, rs12323579, rs10138429, rs12323582, rs7141433, rs7141483, rs7141319, rs2183083, rs2183082, rs2183081, rs7492600, rs8009470, rs10144581, rs12323758, rs10145097, rs13368101, rs10134163, rs13367062, rs4402455, rs7493427, rs10311834, rs9743836, rs4363780, rs7493265, rs10312723, rs4363781, rs7493266, rs10312724, rs11627767, rs11850691, rs11627828, rs11626155, rs2878171, rs10220344, rs10782424, rs3965763, rs10146709, rs10146658, rs10147430, rs17128050, rs12147422, rs28477407, rs10143025, rs10133449, rs10133650, rs3945570, rs28757745, rs28542181, rs7155501, rs3825610, rs3783637, rs3783638, rs3783639, rs3825611, rs11158026, rs11158027, rs10873086, rs11626210, rs8004445, rs8004018, rs8010461, rs9805909, rs8009759, rs10444720, rs4901549, rs3783640, rs10136545, rs10139282, rs8020798, rs10498471, rs28417208, rs11845055, rs10498472, rs998259, rs8011712, rs11312854, rs11410453, rs10782425, rs10149080, rs17128052, rs8003903, rs10645822, rs10132356, rs13366912, rs12885400, rs7147286, rs7147040, rs7147201, rs17832263, rs10133661, rs3783641, rs3783642, rs12432756, rs10134429, rs10598935, rs10545051, rs17128057, rs8016730, rs8017210, rs11844799, rs12883072, rs10131633, rs10131563, rs10149945, rs8019791, rs8019824, rs8018688, rs10138594, rs10141456, rs9972204, rs2149482, rs28413055, rs2183080, rs28458175, rs1753589, rs8007267およびrs10483639。
【請求項４】
対立遺伝子変異がGCH1遺伝子のプロモーター中または調節領域中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
GCH1対立遺伝子変異が、位置C.-9610のAまたは位置C.343+8900のTを含むか、または位置C.-9610のAおよび位置C.343+8900のTを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
GCH1対立遺伝子変異が、GCH1配列の位置C.-9610のA、位置C.-4289のC、位置C.343+26のG、位置C.343+8900のT、位置C.343+10374のT、位置C.343+14008のG、位置C.343+18373のC、位置C.344-11861のA、位置C.344-4721のC、位置C.454-2181のA、位置C.509+1551のC、位置C.509+5836のG、位置C.627-708のA、位置C.*3932のG、および位置C.*4279のGを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
BH4関連障害が心血管疾患または神経系疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、虚血性再潅流傷害、心肥大、高血圧症、血管炎、心筋梗塞、または心筋症である、請求項７の方法。
【請求項９】
神経系疾患が、うつ病、神経変性疾患、運動障害、または自律神経障害である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
核酸サンプルが1コピーまたは複数コピーの対立遺伝子変異を含むかどうかを決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
急性痛が、機械的疼痛、熱感痛(heat pain)、冷感痛(cold pain)、虚血性疼痛、または化学的誘発疼痛のうち1つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
疼痛が、末梢または中枢神経因性疼痛、炎症性疼痛、片頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛関連疼痛、関節炎性疼痛、骨格痛、関節痛、胃腸痛、筋肉痛、狭心症痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張型頭痛、産科的疼痛、婦人科的疼痛、または化学療法誘発疼痛である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対立遺伝子変異の存在または不存在を核酸配列決定によって決定するか、またはPCR解析によって決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
被験体に投与される鎮痛剤の投薬または選択を決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
鎮痛剤を用いる臨床試験に被験体を含めるかどうかを決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
被験体に対して外科的処置を実行するかどうかを決定するため、被験体に神経毒治療を行うかどうかを決定するため、または麻酔法を選択するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
外科的処置が神経損傷、または神経損傷の処置を伴う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
保険リスク解析の一部として、または仕事割り当ての選択として、被験体における疼痛発症の可能性を判定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、または急性もしくは慢性痛を発症するリスクを診断するための方法であって、該被験体由来の生物学的サンプル中の、カリウム電位開口型チャネル、遅延整流、サブファミリーS、メンバー1 (KCNS1)核酸における対立遺伝子変異の存在または不存在を決定するステップを含み、該対立遺伝子変異が、疼痛感受性または急性もしくは慢性痛の発症と相関している、上記方法。
【請求項２１】
対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項２０の方法: rs6124683, rs4499491, rs8118000, rs6124684, rs6124685, rs12480253, rs6124686, rs6124687, rs6031988, rs6065785, rs1054136, rs17341034, rs6031989, rs7264544, rs734784, rs6104003, rs6104004, rs11699337, rs6017486, rs962550, rs7261171, rs6104005, rs13043825, rs7360359, rs8192648, rs6073642, rs6130749, rs6073643, rs6104006, rs6031990, rs8122867, rs8123330, およびrs3213543。
【請求項２２】
対立遺伝子変異がKCNS1配列の位置43,157,041のAを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
KCNS1対立遺伝子変異がKCNS1配列の位置43,155,431のG、位置43,157,041のA、および位置43,160,569のCを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するための方法であって、  (a) 該被験体由来の細胞を含む生物学的サンプルを、該細胞中のサイクリックAMPのレベルを増加させるか、リポ多糖(LPS)を含むか、または炎症性サイトカインを含む組成物と接触させるステップ; および  (b) 該サンプル中のGTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)の発現または活性を測定するステップ、を含み、ここで、該発現または活性が、ベースライン値と比較されて、該患者が疼痛感受性の変化を有するかどうかを示すか、または該被験者において急性もしくは慢性痛を発症するかまたはBH4関連障害を発症するリスクの診断に役立つ、上記方法。
【請求項２５】
GCH1発現または活性の減少が疼痛感受性の減少または急性もしくは慢性痛を発症するリスクの低下を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
GCH1活性の測定が細胞中のネオプテリンまたはビオプテリンレベルの測定を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が白血球である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物がホスホジエステラーゼインヒビターまたはアデニルシクラーゼアクチベーターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
アデニルシクラーゼアクチベーターがフォルスコリンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットであって、  (a) GCH1遺伝子中の対立遺伝子変異を含む配列を増幅するためのプライマーセット; および  (b) 使用説明書を含むキット。
【請求項３１】
GCH1対立遺伝子変異が、ヒト染色体14q22.1〜14q22.2内に位置するハプロタイプブロック中に存在する、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
GCH1対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項３１に記載のキット: rs6572984, rs17128017, rs10151500, rs10136966, rs841, rs987, rs17253577, rs11624963, rs752688, rs7493025, rs2004633, rs7493033, rs17253584, rs10139369, rs10150825, rs11848732, rs17253591, rs10143089, rs13329045, rs10131232, rs10133662, rs10133941, rs13329058, rs9672037, rs7161034, rs7140523, rs11626298, rs17128021, rs10129528, rs4411417, rs2878168, rs11461307, rs7153186, rs7153566, rs7155099, rs11444305, rs11439363, rs7155309, rs1952437, rs8007201, rs11412107, rs12587434, rs17128028, rs12589758, rs2878169, rs28532361, rs12879111, rs10129468, rs11620796, rs2149483, rs7147200, rs4462519, rs9671371, rs9671850, rs9671455, rs28481447, rs12884925, rs8010282, rs8010689, rs8011751, rs7156475, rs17128033, rs28643468, rs2183084, rs10137881, rs2878170, rs12323905, rs10138301, rs12323579, rs10138429, rs12323582, rs7141433, rs7141483, rs7141319, rs2183083, rs2183082, rs2183081, rs7492600, rs8009470, rs10144581, rs12323758, rs10145097, rs13368101, rs10134163, rs13367062, rs4402455, rs7493427, rs10311834, rs9743836, rs4363780, rs7493265, rs10312723, rs4363781, rs7493266, rs10312724, rs11627767, rs11850691, rs11627828, rs11626155, rs2878171, rs10220344, rs10782424, rs3965763, rs10146709, rs10146658, rs10147430, rs17128050, rs12147422, rs28477407, rs10143025, rs10133449, rs10133650, rs3945570, rs28757745, rs28542181, rs7155501, rs3825610, rs3783637, rs3783638, rs3783639, rs3825611, rs11158026, rs11158027, rs10873086, rs11626210, rs8004445, rs8004018, rs8010461, rs9805909, rs8009759, rs10444720, rs4901549, rs3783640, rs10136545, rs10139282, rs8020798, rs10498471, rs28417208, rs11845055, rs10498472, rs998259, rs8011712, rs11312854, rs11410453, rs10782425, rs10149080, rs17128052, rs8003903, rs10645822, rs10132356, rs13366912, rs12885400, rs7147286, rs7147040, rs7147201, rs17832263, rs10133661, rs3783641, rs3783642, rs12432756, rs10134429, rs10598935, rs10545051, rs17128057, rs8016730, rs8017210, rs11844799, rs12883072, rs10131633, rs10131563, rs10149945, rs8019791, rs8019824, rs8018688, rs10138594, rs10141456, rs9972204, rs2149482, rs28413055, rs2183080, rs28458175, rs1753589, rs8007267およびrs10483639。
【請求項３３】
GCH1対立遺伝子変異が、GCH1配列の位置C.-9610のA、位置C.-4289のC、位置C.343+26のG、位置C.343+8900のT、位置C.343+10374のT、位置C.343+14008のG、位置C.343+18373のC、位置C.344-11861のA、位置C.344-4721のC、位置C.454-2181のA、位置C.509+1551のC、位置C.509+5836のG、位置C.627-708のA、位置C.*3932のG、および位置C.*4279のGを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
対立遺伝子変異がGCH1遺伝子のプロモーター領域中または調節領域中に存在する、請求項３０に記載のキット。
【請求項３５】
BH4関連障害が心血管疾患または神経系疾患である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３６】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、または急性もしくは慢性痛を発症するリスクを診断するためのキットであって、  (a) KCNS1遺伝子中の対立遺伝子変異を含む配列を増幅するためのプライマーセット; および  (b) 使用説明書を含むキット。
【請求項３７】
KCNS1対立遺伝子変異が、ヒト染色体20q12内に位置するハプロタイプブロック中に存在する、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
対立遺伝子変異が、以下のSNPからなる群から選択されるSNPを含む、請求項３６のキット: rs6124683, rs4499491, rs8118000, rs6124684, rs6124685, rs12480253, rs6124686, rs6124687, rs6031988, rs6065785, rs1054136, rs17341034, rs6031989, rs7264544, rs734784, rs6104003, rs6104004, rs11699337, rs6017486, rs962550, rs7261171, rs6104005, rs13043825, rs7360359, rs8192648, rs6073642, rs6130749, rs6073643, rs6104006, rs6031990, rs8122867, rs8123330, およびrs3213543。
【請求項３９】
対立遺伝子変異がKCNS1配列の位置43,157,041のAを含むか、または対立遺伝子変異が、KCNS1配列の位置43,155,431のG、位置43,157,041のA、および位置43,160,569のCを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットであって、  (a) 細胞中のサイクリックAMPレベルを増加させるための物質、LPS、または炎症性サイトカイン;  (b) GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1) mRNA配列にハイブリダイゼーションさせるための第一プライマー; および  (c) 使用説明書を含むキット。
【請求項４１】
前記物質がアデニルシクラーゼアクチベーターまたはホスホジエステラーゼインヒビターである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記物質がフォルスコリンである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
第二プライマーをさらに含み、その場合、第一および第二プライマーはGCH1 mRNA配列の少なくとも一部分の増幅に使用することが可能である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
哺乳類の被験体において、疼痛感受性を予測するため、急性または慢性痛を発症するリスクを診断するため、またはBH4関連障害を発症するリスクを診断するためのキットであって、  (a) 細胞中のサイクリックAMPレベルを増加させるための物質、LPS、または炎症性サイトカイン;  (b) GTPシクロヒドロラーゼ(GCH1)に特異的な抗体; および  (c) 使用説明書を含むキット。
【請求項４５】
前記物質がアデニルシクラーゼアクチベーターまたはホスホジエステラーゼインヒビターである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記物質がフォルスコリンである、請求項４５に記載のキット。
【国際調査報告】
2009518035.tif 000041
2009518035.tif 000042
2009518035.tif 000043