(57)【要約】本明細書には、天然に存在する内因性生体化合物（Ｒ）−（＋）αリポ酸のメトホルミン塩である式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物を含有する医薬組成物、および式（Ｉ）の化合物による糖尿病または糖尿病性合併症の治療方法が記載されている。本発明の化合物および組成物は、高度に水溶性であり、好ましくは経口投与によって患者に投与されたときメトホルミンＲ−（＋）リポエートの高血中濃度を提供することができる。本発明は、メトホルミンＲ−（＋）−リポエートであり、その任意の多形体、溶媒和物、および水和物を含むことが意図されている式Ｉの構造を有する化合物に関する。
2009541220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メトホルミンＲ−（＋）リポエートである式Ｉの構造を有する化合物、または薬学的に許容できるその溶媒和物もしくは水和物。
【化２】
2009541220.tif 000005
【請求項２】
単結晶Ｘ線回折により測定され、図１に描かれている結晶性固体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
図２に描かれている粉末Ｘ線回折図を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
メトホルミンの薬学的に許容できる塩およびＲ−（＋）リポ酸または薬学的に許容できるその塩を含む混合物。
【請求項５】
メトホルミンの前記薬学的に許容できる塩が、塩酸メトホルミンである、請求項４に記載の混合物。
【請求項６】
Ｒ−（＋）リポ酸ナトリウムを含む、請求項４に記載の混合物。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載の化合物および薬学的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項４に記載の混合物および薬学的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
キットであって、
ａ）メトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートを含む単位剤形またはメトホルミンの薬学的に許容できる塩およびＲ−（＋）−リポ酸または薬学的に許容できるその塩の組合せを含む単位剤形、
ｂ）該キットの使用方法についての取扱説明書、および
ｃ）該単位剤形を保持するための少なくとも１つの容器
を含むキット。
【請求項１０】
哺乳動物における糖尿病を治療する方法であって、請求項１または２に記載の化合物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
哺乳動物における糖尿病を治療する方法であって、前記哺乳動物に請求項４に記載の混合物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
哺乳動物における糖尿病性合併症を治療する方法であって、請求項１または２に記載の化合物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記糖尿病性合併症が、腎症、神経障害、網膜症、白内障、心筋症および心臓組織虚血から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物における糖尿病性合併症を治療する方法であって、前記哺乳動物に請求項４に記載の混合物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
前記糖尿病性合併症が、腎症、神経障害、網膜症、白内障、心筋症および心臓組織虚血から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
糖尿病組織中のグルタチオン濃度を回復するための方法であって、請求項１または２に記載の化合物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
糖尿病組織中の乳酸およびピルビン酸濃度を調節するための方法であって、請求項１または２に記載の化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
メトホルミンＲ−（＋）リポエートを製造するための方法であって、
ａ）適当なメトホルミン塩からメトホルミンの遊離塩基を新たに調製するステップ、および
ｂ）該新たに調製したメトホルミンの遊離塩基をＲ−（＋）リポ酸と約１℃と約４０℃の間の温度で反応させるステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
真性糖尿病は、世界的に流行しており、世界保健機関による予測によれば、２０３０年までに糖尿病患者の数の激増がある。腎障害、神経障害、網膜症、および心血管系の合併症を含む長期の糖尿病の合併症を旨く処理することは環境衛生予算に深刻な影響があるために、これは不吉な予測である。糖尿病の顕著な特徴は、慢性的に上昇する血糖値である。異常に上昇した血糖値は、主要な糖尿病性組織におけるグルタチオンレベルに対する悪影響を有することもまた知られている。その上、増大した酸化的ストレスおよび増加した活性酸素種が、高血糖性状態下では関係する。
【０００２】
インスリンの早期の発見およびそれのその後の糖尿病の治療における広範な使用、ならびにその後のスルホニル尿素類、およびチアゾリデンジオン類、例えばトログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）またはピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）などの経口血糖降下薬としての発見および使用にもかかわらず、糖尿病の治療は、決して満足できないままである。
【０００３】
インスリンの使用は通常は自己注射により１日に複数回の投与を必要とする。インスリンの適切な投与量の決定には尿または血液中の糖の頻繁な推定を必要とする。インスリンの過剰な投与量は、血糖の軽度の異常から昏睡、またはさらに死に至るまでの結果を伴う低血糖症を引き起こす。インスリン非依存性真性糖尿病（ＩＩ型糖尿病、ＮＩＤＤＭ）の治療は、通常は、ダイエット、運動、経口血糖降下薬例えばチアゾリデンジオン類、および、より重症の場合はインスリンの組合せからなる。しかしながら、臨床的に利用できる血糖降下薬は、それらの使用を制限する副作用を有するか、または薬剤が特定の患者には有効でないこともあり得る。インスリン依存性真性糖尿病（Ｉ型）の場合は、インスリン投与が通常は治療の主要なコースを構成する。
【０００４】
メトホルミンは、糖尿病の治療処置に対して米国食品薬品局により認可されている既知の化合物である。該化合物およびその製剤ならびに使用は、例えば、特許文献１に開示されている。メトホルミンは、２型糖尿病の治療において経口で有効である。メトホルミン（Ｎ，Ｎ−ジメチルイミドジカルボンイミド酸ジアミド）は、その塩酸塩、１，１−ジメチルビグアニド塩酸塩の形で米国において現在販売されているビグアニド抗高血糖治療薬である。
【０００５】
２型糖尿病における異なる治療法についての多施設無作為化試験（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ））（非特許文献１）によれば、メトホルミン治療は、経費が節約され、生活の質で調整した推定寿命を増した。ＵＫＰＤＳにおいて、メトホルミンによる初期治療にランダムに選ばれた体重過多で肥満の患者は、心筋梗塞および糖尿病関連の死亡の著しい減少を経験した。メトホルミンは、体重増加を促進せず、いくつかの心血管系危険因子に対して有益な効果を有する。従って、メトホルミンは、２型糖尿病の殆どの患者に対する最適な薬として広く認識されている。しかしながら、多くの糖尿病患者が、メトホルミンに対する抵抗性を生じる。
【０００６】
αリポ酸は、チオクト酸、１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸、１，２−ジトラン−３−バレリアン酸、６，８−チオクト酸、５−［３−（１，２−ジチオラニル）］−ペンタン酸、δ−［３−（１，２−ジチアシクロペンチル）］ペンタン酸、アセテート置換因子、ピルビン酸酸化因子などを含むさまざまな名前を有する。αリポ酸は、不斉炭素原子を有しており、通常はそのＲ鏡像異性体およびＳ鏡像異性体のラセミ混合物の形で、特に栄養補助食品中で使用される。すべての公開された臨床試験は、糖尿病患者におけるものを含めて、これまでは、ラセミαリポ酸で行われてきた。
【０００７】
以後リポ酸と呼ぶαリポ酸は、抗酸化物質であり、活性酸素種（ＲＯＳ）のスカベンジャーである。それは金属をキレート化し、内因性抗酸化物質を再循環させる。リポ酸は、一重項酸素、Ｈ２Ｏ２、ヒドロキシル基、ＮＯ、およびＯＮＯＯ−を捕捉することができる。リポ酸の還元された形、ジヒドロリポ酸は、さらにＯ２、およびペルオキシ基を捕捉することができる。リポ酸は、また、いくつかの二価のカチオン、例えば、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｐｂ２＋をキレート化することができる。それ故、リポ酸は、Ｃｕ２＋によるＨ２Ｏ２のアスコルベート誘発生成を阻止することができる。リポ酸は、グルタチオン（ＧＳＨ）およびビタミンＣ等の内因性抗酸化物質を再循環させることができる。ＧＳＨは、組織を酸化的ストレスから保護する。リポ酸は、また、糖尿病患者における乳酸およびピルビン酸の循環血漿中濃度に影響を及ぼすことができる。Ｅｓｔｒａｄａら、（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９６年、４５巻、１７９８〜１８０４頁）は、リポ酸はＧＬＵＴトランスポーターおよびグルコース取り込みを誘発し、これはリポ酸が同様にインスリンシグナル経路を刺激する可能性のあることを示すことを報告している。リポ酸の投与は、虚血再灌流傷害モデルに含まれる酸化的ストレスモデルに活性があることが示されている。その上、リポ酸は、チレドキシン（ｔｈｉｒｅｄｏｘｉｎ）のレドックス制御因子およびＮＦ−κＢ転写因子として機能することができる。本明細書に記載の態様の多くは、非特許文献２のＳｍｉｔｈらによる概説に含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第３，１７４，９０１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、２００５年、４８巻、８６８〜８７７頁
【非特許文献２】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、１１巻、１１３５〜１１４６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、メトホルミンＲ−（＋）−リポエートの化学組成ならびに糖尿病および白内障、心筋症、腎症、神経障害、網膜症などの糖尿病性合併症を治療するための方法について説明する。本発明の化合物および組成物は、高度に水溶性であり、好ましくは経口投与によって患者に投与されたときメトホルミンＲ−（＋）リポエートの高血中濃度を提供することができる。
【００１１】
本発明は、メトホルミンＲ−（＋）−リポエートであり、その任意の多形体、溶媒和物、および水和物を含むことが意図されている下に示す式Ｉの構造を有する化合物に関する。
【００１２】
【化１】
2009541220.tif 000003
特定の上記実施形態において、式Ｉの化合物は、Ｒ−（＋）−リポエートであり、メトホルミンＳ−（−）−リポエートを実質的に含まない。特定の上記実施形態において、式Ｉの化合物が含むメトホルミンＳ（−）−リポエートは、５％未満、２％未満、１％未満、またはさらに０．５％未満である。
【００１３】
１態様において、本発明は、結晶性形状をしたメトホルミンＳ−（−）−リポエートおよびメトホルミンＳ−（−）−リポエートから実質的に分離された結晶性メトホルミンＲ−（＋）−リポエートを製造する方法に関する。特定の実施形態において、上記方法は、ａ）適当なメトホルミン塩からメトホルミンの遊離塩基を新たに調製するステップ、およびｂ）該新たに調製したメトホルミンの遊離塩基をＲ−（＋）リポ酸と約１℃と約４０℃の間の温度で反応させるステップを含む。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明は、式Ｉの化合物および薬学的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤を含む本発明の医薬組成物に関する。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明は、多様な結晶形態をしたメトホルミンＲ−（＋）リポエートに関する。１つの上記の多様な形態は、図２に描かれているように、粉末Ｘ線回折スペクトルにおいて、高い相対強度を有するピークに対して基本的に次の角度２θを示す。
【００１６】
【表１】
2009541220.tif 000004
特定の実施形態において、本発明は、メトホルミンまたは薬学的に許容できるその塩（例えば、塩酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩）および実質的に（Ｓ）−（−）−リポ酸を含まないＲ−（＋）−リポ酸または薬学的に許容できるその塩を含む混合物に関する。特定の実施形態において、本発明は、薬学的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤をさらに含む本発明の医薬組成物に関する。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、真性糖尿病（例えば、２型糖尿病）および糖尿病性合併症のいずれかに罹っている患者の本明細書に記載の化合物または組成物を投与することを含む治療の方法に関する。本発明の特定の態様は、真性糖尿病（例えば、２型糖尿病）および糖尿病性合併症の治療において使用するための本発明の医薬製剤の製造に関する。特定の実施形態において、本発明は、糖尿病（例えば、２型糖尿病）または糖尿病性合併症の治療における本発明の化合物または組成物の溶媒和物または水和物の使用に関する。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明の化合物または組成物は、糖尿病、または以下に限定はされないが、高血圧症；腎症（糸球体硬化、アルブミン尿）、網膜症（微細動脈瘤、血管硬化、瞳孔浮腫、増殖性網膜症）、白内障、細動脈硬化症（末梢性循環器系統の病気）および末梢神経障害（多発神経炎）を含む微小血管障害；冠疾患、心筋虚血、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、心筋梗塞、および末梢血管疾患（間欠性跛行）を含む大血管障害およびアテローム性動脈硬化症、ならびにこれから罹るかもしれない糖尿病性の白内障および糖尿病性血管新生緑内障を含む糖尿病性合併症の治療に使用することができる。
【００１９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物または組成物は、肥満（中心性／腹部肥満）、インスリン抵抗性症候群、インスリン過剰症、心臓代謝症候群（完全な２型糖尿病を来たす高い危険性）、多嚢胞性卵巣症候群（無排卵、アンドロゲン過剰症、および多毛症を含む）、活性酸素種（ＲＯＳ）および炎症過程を伴う神経変性疾患（パーキンソン、アルツハイマー）、ＨＩＶリポジストロフィー（高トリグリセリド血症を含む代謝の変調）、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、白内障、高血糖症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化症、組織虚血、特に心筋虚血、心虚血、糖尿病性心筋症、微小血管障害、大血管障害、および心筋梗塞の治療のために使用することができる。
【００２０】
特定の態様において、本発明は、キットであって、ａ）メトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートを含む単位剤形またはメトホルミンの薬学的に許容できる塩およびＲ−（＋）−リポ酸または薬学的に許容できるその塩の組合せを含む単位剤形、ｂ）該キット使用法ついての説明書、およびｃ）該単位剤形を保持するための少なくとも１つの容器を含むキットに関する。
【００２１】
特定の上記実施形態において、該キットは、糖尿病および／または糖尿病の合併症の患者の治療用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例７に記載のメトホルミンＲ−（＋）−リポエートの結晶構造を示す図である。
【図２】実施例７に記載のメトホルミンＲ−（＋）−リポエートの粉末Ｘ線回折スペクトルを示す図である。
【図３】実施例７に記載のメトホルミンＲ−（＋）−リポエートの１Ｈ  ＮＭＲを示す図である。
【図４】実施例７に記載のメトホルミンＲ−（＋）−リポエートの１３Ｃ  ＮＭＲを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち少なくとも１つ）を表すために使用されている。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００２４】
用語「障害」および「疾患」は、包括的に使用され、身体の任意の部分、臓器またはシステム（またはそれらの任意の組合せ）の正常な構造または機能からの何らかの逸脱を意味する。具体的な疾患は、生物学的、化学的および物理的変化を含む特有の症状および徴候によって現され、多くの場合、人口統計学的、環境的、職業的、遺伝的および治療歴的要因を含むがこれらには限定されないさまざまなその他の要因と関係がある。特定の特徴的徴候、症状、および関係要因は、重要な診断情報をもたらすためにいろいろな方法によって定量化することができる。
【００２５】
用語「〜を含む」は、本明細書ではその意味で使用され、語句「〜を含むがこれらに限定されない」と互換的に使用される。
【００２６】
本明細書で使用される「説明書（類）」は、組み立て、製剤、またはキットもしくは包装した医薬品の使用に関連する関係のある材料あるいは手順を説明する製品ラベルおよび／または書類を意味する。これらの材料は、以下の、基礎的な情報、後に続くステップまたは手順、成分のリスト、提案されている投与量、可能性のある副作用に関する注意、薬物の投与に対する指示、技術支援、任意のその他の関連書類の任意の組合せなどが含まれ得る。
【００２７】
用語「または」は、本明細書ではその意味で使用され、文脈がはっきりとそうでないことを示していない限り用語「および／または」と互換的に使用される。
【００２８】
「患者」または「被検者」は、治療を必要としている好ましくはヒト等の哺乳動物であるが、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、乳牛、ヒツジ、ブタ、ウマなど）または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。
【００２９】
用語「阻止」は技術的に認識されており、局所再発（例えば疼痛）等の状態、癌等の疾患、心不全等の複合症候群または任意のその他の病状との関連で使用される場合に技術的に汎用されていて、組成物の投与を含み、それは該組成物を受けない被検者と比較して被検者における病状の徴候の頻度を減少させるかまたは発現を遅らせることである。従って、例えば癌の阻止とは、例えば統計的におよび／または臨床的に有意な量で、未処置のコントロール集団と比較して予防的治療を受けている患者の集団における検出可能な癌性増殖の数を減少させること、および／または未処置のコントロール集団と対比して処置をした集団における検出可能な癌性増殖の出現を遅らせることを含む。感染の阻止とは、例えば、未処置のコントロール集団と対比して処置をした集団における感染の診断の数を減少させることおよび／または未処置のコントロール集団と対比して処置をした集団における感染の症状の発現を遅らせることを含む。疼痛の阻止とは、例えば、未処置のコントロール集団と対比して処置をした集団における被検者によって経験される痛覚の大きさを減少させること、または別法では遅らせることを含む。
【００３０】
本明細書で使用される用語「溶媒和物」とは、適当な溶媒の分子が結晶格子中に組み込まれている式Ｉの化合物、または薬学的に許容できる式Ｉの化合物の塩を意味する。適当な溶媒は、投与される用量において生理学的に許容できるものである。適当な溶媒の例は、エタノール、水などである。水が溶媒であるとき、その分子は「水和物」と呼ばれる。
【００３１】
用語「障害に対する治療を必要とする被検者」は、その障害を有すると診断されたか、その障害を発現しそうと診断されたか、またはその障害を有する疑いがあると診断された被検者である。
【００３２】
本明細書で使用される「〜を実質的に含まない」とは、例えば、示された化合物を少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は含まない組成物または化合物のことである。例えば、メトホルミンＳ−（−）−α−リポエートから実質的に分離されているメトホルミンＲ−（＋）−α−リポエートとは、メトホルミンＲ−（＋）−α−リポエートがメトホルミンα−リポエートの全体量の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を構成している（例えば、残りはメトホルミンＳ−（−）−α−リポエートである）組成物を表すものであり得る。
【００３３】
用語「例えば〜など」は、本明細書ではその意味で使用され、語句「例えば〜であるがこれらに限定されない」と互換的に使用される。
【００３４】
本明細書で使用される用語の薬剤の「十分量」または「有効量」とは、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量であり、それ故、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、癌細胞の増殖を阻止する薬剤を投与する状況において、薬剤の有効量とは、例えば、その薬剤の投与をしないで得られる反応と比較して癌細胞増殖の減少を達成する十分な量である。
【００３５】
治療の主たる方法についての化合物の「治療有効量」とは、望ましい用量の一部として（哺乳動物、好ましくはヒトに）投与したとき、治療すべき障害もしくは状態に対する臨床的許容基準または美容目的に従って、例えば任意の医療に適用できる妥当な利点／リスク比で、症状を緩和するか、状態を改善するか、または疾病状態の発現を遅らせる製剤中の化合物（１つ以上）の量を意味する。
【００３６】
本明細書で使用される用語「治療」とは、病状（例えば運動障害）が臨床的許容基準（１つ以上）に準じて改善される程度までその病状に対抗することを意味する。例えば、「運動障害を治療する」とは、患者の運動障害を改善するか特定の運動障害の症状を緩和し、その改善および緩和を臨床的に許容される標準検査（例えば、患者自己評価スケール）および／または経験的テスト（例えば、ＰＥＴスキャン）により評価することを意味する。
【００３７】
「単位剤形」は、治療薬の製剤を含む不連続単位として本明細書では定義する。適当な単位剤形の例としては、錠剤、カプセル剤またはゲルキャップ剤が挙げられる。
【００３８】
特定の態様において、式Ｉの化合物は、結晶性であり、９５％を超え、９８％を超え、好ましくは９９％を超える純度を有する。特定の実施形態において、以後多形体Ａとして示す結晶性形状の式Ｉの化合物は、純度、熱力学的安定性を含む安定性および空気中の水分に対する耐性（吸湿性）、ならびに／またはバイオアベイラビリティを含む有利な特性を有する。さらに、多形体Ａは、有利な取り扱い適性を有しており、例えばそれは、医薬製剤中に有利に組み込むことができる。
【００３９】
式Ｉの化合物、すなわちメトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートは、以下のように、メトホルミン塩（例えば、塩酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩など）およびリポ酸を適当な不活性溶媒中に溶解することによって調製することができる。特定の実施形態において、この反応のための適当な溶媒は、メタノールである。メトホルミンの薬学的に許容できる塩を遊離塩基の代わりに使用する場合、メトホルミンの遊離塩基を形成するために塩基を加える。適当な塩基としては、アルカリおよびアルカリ金属水酸化物、アルカリおよびアルカリ金属炭酸塩ならびに重炭酸塩、ならびに第三級アミンが挙げられる。また樹脂塩基も挙げられる。塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、トリエチルアミン、Ｎ−メチルイソプロピルアミン、およびイオン交換樹脂アンバーリスト（ａｍｂｅｒｌｙｓｔ）Ａ２６（ＯＨ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４０】
該反応混合物は、約周囲温度から使用されている溶媒の約還流温度で、約２時間から約６時間、好ましくは周囲温度で約２時間撹拌することができる。式Ｉの塩は、次に、反応混合物から当業者には周知の方法によって単離し、適当な溶媒または溶媒の混合物から再結晶させることができる。アルコール類、好ましくはメタノールが、再結晶に対して好ましい溶媒である。
【００４１】
本発明の式Ｉの化合物の水和物および溶媒和物も含まれる。通常の技量の化学者および薬学科学者であれば、本発明の式Ｉの化合物が固体状態のさまざまな多形形状で存在し得ることもまた認めるであろう。
【００４２】
塩酸メトホルミンは、例えば、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１９２２年、１２１巻、１７９０頁に開示されているようにして調製することができる。
【００４３】
リポ酸は、市販されており、その合成は、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８６年、１４０８頁に報告されている。
【００４４】
本発明は、メトホルミン−Ｒ−（＋）−リポエートを投与するステップを含む糖尿病および糖尿病性合併症を治療する方法に関する。一般に、本発明の方法の実施においては、メトホルミン−Ｒ−（＋）−リポエートについての有効量は、単回または分割投与で、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約６０ｍｇ／ｋｇ／日または約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、単回または分割投与で、５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。メトホルミンとリポ酸の組合せが使用される場合、メトホルミンの用量は、３ｍｇ／ｋｇ／日〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、リポ酸の用量は、５ｍｇ／ｋｇ／日〜約７０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００４５】
そのようなものとして、本明細書に開示されているこれらの方法は、必要に応じて医学的治療（急性）および／または予防的（阻止）投与の両方を含む。投与される化合物の量およびタイミングは、勿論、治療される患者、苦痛の過酷さ、投与の様式および処方する医師の判断に依存する。従って、患者毎に変化するために、上で示した投与量は、ガイドラインであり、医師は、その医師が患者にとって適切であると考える治療を達成するために、その薬剤の用量設定をすることができる。必要な治療の程度を考える段階で、その医師は、患者の年齢、先在疾患の存在、ならびに他の疾患の存在等のさまざまな要因をバランスさせなければならない。
【００４６】
治療組成物
本発明の組成物は、メトホルミン−Ｒ−（＋）−リポエートの薬学的に有効な量ならびに許容できる担体および／または賦形剤を含む組成物として、患者に投与することができる。薬学的に許容できる担体としては、生理学的に適合性の任意の溶媒、分散媒、またはコーティングが挙げられる。その担体は、静脈内、筋肉内、経口、腹腔内、皮内、経皮、局所、または皮下投与に適することが望ましい。さらに、本発明の活性組成物は、鼻腔内に投与するか、肛門座剤としてまたは「フラッシュ」処方（すなわち、薬物が水を使用する必要なく口の中で溶解することを可能にする）を用いて投与することができる。その上、本発明の活性組成物は、治療が必要な患者に放出制御剤形によって投与することができる。
【００４７】
１つの典型的な薬学的に許容できる担体は、生理食塩水である。他の薬学的に許容できる担体およびそれらの処方は、周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．社、イーストン、ペンシルベニア州、１９９０年）に大まかに記載されている。さまざまな薬学的に許容できる賦形剤が、当技術分野では周知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第４版、Ｒｏｗｅら編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ社、ワシントン市）中に見出すことができる。該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、カプセル、錠剤として、またはその他の適当な形で処方することができる。本発明の医薬組成物は、好ましくは、デリバリー時に無菌で非発熱性であり、製造および貯蔵条件下で好ましくは安定である。
【００４８】
本発明の組成物および薬学的に許容できる担体、ビヒクルまたは希釈剤を組み合わせることによって形成される医薬組成物は、錠剤、粉剤、トローチ剤、シロップ剤、および注射剤のいずれをも含むさまざまな剤形で投与される。これらの医薬組成物は、香味料、結合剤、および／または賦形剤等の成分をさらに含むことができる。経口投与のために、錠剤は、さまざまな賦形剤（例えば、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウム）および／またはさまざまな崩壊剤（例えば、デンプン、アルギン酸および特定の複合シリケート）を結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチンおよびアカシア）と共に含むことができる。さらに錠剤を製造するためには平滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク）を使用することができる。組成物は、また、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中に入れて調製することもできる。このための好ましい材料としては、ラクトースすなわち乳糖および高分子量のポリエチレングリコール類が挙げられる。経口投与に対して水性懸濁剤またはエリキシル剤が望ましい場合は、その中の必須の活性成分は、甘味料または香味料、有色物質または染料、および必要に応じて乳化剤または懸濁剤を、希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンと共に混合することができる。
【００４９】
本発明の化合物または組成物は、非経口でまたは腹腔内に投与することもできる。遊離塩基または薬学的に許容できる塩または溶媒和物としての本発明の化合物の溶液は、水中でヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適当に混合して調製することができる。分散液は、また、アルコールを含むか含まないグリセロール、液体ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用の状況の下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための保存料を含有する。当業者であれば、適当な製剤を如何にして調製するかを多分知っていよう。適当な製剤の選択および調製のための標準的な手順および成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年−第１８版）および１９９９年に出版された米国薬局方：  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  （ＵＳＰ  ２４  ＮＦ１９）  に記載されている。
【００５０】
注射可能な使用に適する医薬形態としては、無菌の水溶液または水性分散液および無菌の注射溶液または分散液の即時調製用の無菌の粉末が挙げられる。すべての場合において、その形は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性がある程度に流動性でなければならない。
【００５１】
該製剤としては、メトホルミンＲ−（＋）−α−リポエートを、以下に限定されないが、約２００ｍｇ〜約２０００ｍｇ、好ましくは約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、５００、７５０、８５０、または１０００ｍｇ含有する錠剤が挙げられる。
【００５２】
一般に、本発明の組成物は、経口または非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下または髄内）で投与することができるが、また一方、任意のその他の投与の経路が考えられる。局所投与も、例えば、患者が胃腸障害に罹っている場合あるいは投薬が、主治医が判断して、組織または臓器の表面に適用されるのがベストの場合は必要であり得る。
【００５３】
口腔投与に対して本発明の組成物は、通常の様式で処方された錠剤またはトローチ剤の形をとることができる。
【００５４】
経皮（例えば、局所）投与のためには、希薄な無菌の水溶液または部分的に水性の溶液（通常は０．１％〜５％濃度）、さもなければ上記の点滴製剤に似たものを調製する。
【００５５】
上記のように、メトホルミンとリポ酸は別々に投与することができ、その結果本発明は、組合せのまたは別々のキットの形の医薬組成物も含む。メトホルミンとリポ酸とを別々に投与する場合、投与は、同時または連続的であり得、任意の順序であり得る。投与が連続的である特定の実施形態において、それらは、例えば、互いに、１日、１２時間、６時間、４時間、２時間、１時間、３０分、１０分、またはさらに５分以内に投与することができる。
【００５６】
キットは、分割したビンまたは分割したホイルパケット等の単位剤形を含む容器を含む。一般的には、該キットは化合物の投与についての指示を含む。キットの形態は、成分が好ましくは異なる剤形で投与されるか（例えば、経口または非経口）、異なる投与間隔で投与される場合、あるいは処方する医師による組合せの個々の成分の用量設定が必要である場合に特に好都合である。
【００５７】
そのようなキットの別の例は、ブリスター包装である。ブリスター包装は、包装産業においては周知であり、医薬単位剤形（錠剤、カプセル剤など）の包装に広く使用されている。ブリスター包装は、一般に、好ましくは透明なプラスチック材料のホイルに覆われた比較的硬い材料のシートからなる。包装過程の間にそのプラスチックホイル中に凹部が形成される。その凹部は、包装すべき錠剤またはカプセル剤の大きさと形状を有する。次に、錠剤またはカプセル剤がその凹部に入れられ比較的硬い材料のシートを凹部が形成された方向とは反対側のホイルの面でプラスチックホイルに接してシールする。その結果、その錠剤またはカプセル剤は、プラスチックホイルとシートの間の凹部内に密封される。好ましくは、そのシートの強度は、その凹部に手で圧力を加えることによってその凹部の場所のシートに開口部が形成され、そのブリスター包装から錠剤またはカプセル剤を取り出すことができるようなものである。錠剤またはカプセルは、そのとき前記開口部から取り出すことができる。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態について説明する。実施例１〜６は、メトホルミン−Ｒ−（＋）−リポエートを調製するための手順について記載する。実施例１〜６の生成物は、次に実施例７の手順に従い、添付の特性（図１〜４）を有するメトホルミン−Ｒ−（＋）−リポエートの結晶性形状を提供する。
【００５９】
（実施例１）：メトホルミンＲ−（＋）−リポエートの調製
ステップ１．１  メトホルミンの遊離塩基の調製：
アンバーリストＡ２６（ＯＨ）イオン交換樹脂（６０ｇ）を、脱イオン水で３回とメタノール中２％（ｖ／ｖ）の脱イオン水で２回洗浄した。その樹脂を直径２．５ｃｍのガラスのカラムに詰めた（充填カラムの高さは２０ｃｍであった）。そのカラムにさらに３００ｍＬのメタノール中２％（ｖ／ｖ）の脱イオン水を流した。塩酸メトホルミン（６．５ｇ）を１８０ｍＬのメタノール中２％（ｖ／ｖ）の脱イオン水に溶解し、そのイオン交換カラムを通して溶離した。そのカラムを２００ｍＬのメタノール中２％（ｖ／ｖ）の脱イオン水によりさらに洗浄した。合わせた溶離液を減圧下で濃縮して白色粉末を得た。その粉末をアセトンに溶解し、セライトにより濾過し、メトホルミンの遊離塩基を含有するその溶離液を減圧下で濃縮した。
【００６０】
または
アンバーリストＡ２６（ＯＨ）イオン交換樹脂（６０．０９７）を、ビーカー中で６０ｍＬの脱イオン水と混合し、１時間浸した。そのビーカーの内容物を、カラムに移した（高さ＝２５ｃｍ）。その充填カラムに１００ｍＬの脱イオン水を約２５ｍＬ／分の速度で流した（溶離した溶媒はほとんど無色であり、ｐＨは、約６〜７である）。そのカラムに脱イオン水を流した（２×１００ｍＬ、溶離した溶媒が無色となり、ｐＨ＝約５になるまで）。塩酸メトホルミン（６．５１５ｇ）を、脱イオン水５０ｍＬに溶解し（溶液のｐＨは、約７〜８である）、カラムに適用した。そのカラムを脱イオン水で溶離液が中性になるまで溶離した。その溶離液を減圧下５５℃で濃縮してオフホワイトの固体を得た。その固体をアセトン（３００ｍＬ）に溶解し、濾過して濾液を蒸発させ、白色固体粉末形態のメトホルミンの遊離塩基を得た。
【００６１】
ステップ１．２．メトホルミンＲ−（＋）−リポエートの調製
メトホルミン（その遊離塩基の形のもの５０ｇ）を１Ｌの丸底フラスコにセットし、そこに７９．８４ｇの結晶性の（Ｒ）−（＋）−リポ酸を加えた。ＨＰＬＣグレードのメタノール（７５０ｍＬ）をそのフラスコに加え、その混合物をそれが溶液になるまで２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターにより減圧下４０℃で除去した。得られた個体を水（７５０ｍＬ）中に懸濁させ、完全に溶解するまで撹拌した。得られた溶液を２つの３２５ｍＬのフラスコに移し、４８時間凍結乾燥させて１２９．８４ｇ（１００％）の黄白色粉末を得た。得られた黄色粉末（２．０ｇ）を２０ｍＬの温かいメタノールに溶解し、撹拌しながらこれにアセトニトリルを滴下して加え、溶液が濁るまで撹拌した。撹拌を止め、その混合物を室温で４８時間放置し、高度に水溶性のメトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートの大きな黄色の針状結晶を生じた；融点１３４〜１３６℃、［α］Ｄ２５＝＋３５．６２°、Ｃ１２Ｈ２５Ｎ５Ｏ２Ｓ２計算値Ｃ４２．９９、Ｈ７．４６、Ｎ２０．８９、Ｓ１９．１０、実測値Ｃ４３．１３、Ｈ７．６０、Ｎ２０．７２、Ｓ１８．９９。
【００６２】
（実施例２）：アセトン中でのメトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートの調製
上記のステップ１．１で調製したメトホルミン（遊離塩基）を、７０ｍＬのアセトンに溶解した。（Ｒ）−（＋）−リポ酸を１０ｍＬのアセトンに溶解した。その２つの溶液を一緒にして１０分間撹拌した。得られた沈殿を濾過し、固形残渣を真空下で乾燥してメトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートを得た（収率９５％）。
【００６３】
（実施例３）：アセトニトリル中でのメトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートの調製
上記のステップ１．１で調製したメトホルミン（遊離塩基）を、５０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。（Ｒ）−（＋）−リポ酸を２０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。その２つの溶液を一緒にして１０分間撹拌した。得られた沈殿を濾過し、固形残渣を真空下で乾燥してメトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートを得た（収率９５％）。
【００６４】
（実施例４）：メトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートの調製
ナトリウムメトキシド（０．３１ｇ）を、メタノール（２ｍＬ）に溶解し、この溶液に塩酸メトホルミン（１ｇ）を撹拌しながら加えた。その撹拌をさらに１０分間続けた。アセトン（４０ｍＬ）を次に加え、２０分間撹拌し、その混合物を濾過した。メトホルミンをその遊離塩基の形で含有するその濾液に一定の撹拌をしながらＲ−（＋）リポ酸（１５ｍＬのアセトンに溶解した１．２５ｇ）を滴下して加えると、黄白色固体の沈殿が生じた。その混合物を、さらに２０分間撹拌し、濾過した。その淡黄色の固体をアセトン（３０ｍＬ）で洗浄し、濾過して乾燥し、メトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートを生じた；融点１４８〜１５０℃、［α］Ｄ２０＝＋６７．７°（ｃ＝１、水）、Ｃ１２Ｈ２５Ｎ５Ｏ２Ｓ２計算値Ｃ４２．９９、Ｈ７．４６、Ｎ２０．８９、Ｓ１９．１０、実測値Ｃ４３．０９、Ｈ７．６２、Ｎ２０．８４、Ｓ１９．２３。
【００６５】
（実施例５）：メトホルミン（Ｒ）−（＋）−リポエートの調製
メタノール（４００ｍＬ）中の塩酸メトホルミン（１０．０６ｇ）の懸濁液に、水（５ｍＬ）に溶解した水酸化ナトリウム（２．２３ｇ）を一定の撹拌をしながら加えた。その溶液をさらに２０分間撹拌し、次に濃縮してオフホワイトの固体を得た。その固体をアセトン（５００ｍＬ）で洗浄し、濾過し、その濾液にアセトン（２５０ｍＬ）中の（Ｒ）−（＋）リポ酸（１２．５ｇ）を一定の撹拌をしながら滴下して加えた。リポ酸の添加中にメトホルミンＲ−（＋）リポエートが沈殿した。その混合物をさらに２０分間混合した。沈殿したメトホルミンＲ−（＋）−リポエートを次に濾過した。その固体をアセトン中で１０分間撹拌して洗浄し、濾過、乾燥して、メトホルミンＲ−（＋）−リポエートを得た。
【００６６】
（実施例６）：
アセトン（１００ｍＬ）中のメトホルミンの遊離塩基２．５ｇの溶液に、アセトン（３５ｍＬ）中の（Ｒ）−（＋）リポ酸（４．３ｇ）の溶液を撹拌しながら滴下して加えた。黄白色の沈殿が形成され、その混合物をさらに３０分間撹拌する。その沈殿を濾過し、アセトン中に再懸濁させて１０分間撹拌した。それを次に濾過し、乾燥してメトホルミンＲ−（＋）−リポエートを得た。
【００６７】
実施例１から６の生成物は、再結晶によってさらに精製することができる。例えば、水またはメタノール中のメトホルミンＲ−（＋）−リポ酸の溶液にアセトニトリルまたはアセトンをそれが不透明になるまで加え、次にそれを４℃の冷蔵庫に入れると細かい針状結晶が形成される。別法では、例えば、メトホルミンＲ−（＋）リポエートのメタノール中の溶液にテトラヒドロフランまたは酢酸エチルをそれが不透明になるまで加えることができ、または無水エタノール中のメトホルミンＲ−（＋）リポ酸の溶液にｎ−ヘキサンをそれが不透明になるまで加えることができる。精製手順の具体的な例示が実施例７に含まれる。
【００６８】
（実施例７）：
メトホルミンＲ−（＋）−リポエート（２５０ｍｇ）を水（１．２ｍＬ）に溶解した。アセトニトリルを、連続ボルテックスミキサーを用いてこの溶液にゆっくりと加えた。アセトニトリルの添加により最初わずかな濁りを生じたが、ボルテックスすると透明になった。半永続的濁りが現れるまでアセトニトリルを加えたが（約１００ｍＬのアセトニトリル）、それはさらに撹拌すると透明な溶液になる。その溶液を４℃の冷蔵庫内に１０〜１５時間そのまま静置した。細かい針状結晶を濾過し、乾燥して、分析した。融点１５０〜１５２℃；比旋光度：６０〜６５（ｃ＝１水中、２０℃および５８９ｎｍで）；１Ｈ  ＮＭＲ、（図３）；１３Ｃ  ＮＭＲ、（図４）；ＤＳＣ；オンセット１５３．８８℃、ピーク１５６．０３℃；（図１）に描かれている結晶構造（詳細を下に示す）；（図２）に描かれている粉末回折Ｘ線スペクトル（スタート：２．０００°−エンド：４９．９９７−ステップ：０．００５０−ステップ時間：１０．３秒−アノード：Ｃｕ−ＷＬ１：１．５４０６−作成：２３．０５．２００７  １４：３０：３１  運転：スムース０．０８５Ｉ  バックグラウンド０．０００，０．０００Ｉインポート）
メトホルミンＲ−（＋）リポエートに対する結晶データおよび構造精密化
実験式：                      Ｃ８Ｈ１３Ｏ２Ｓ２＋・Ｃ４Ｈ１２Ｎ５−
式量：                        ３３５．４９
温度：                        ２９４（２）Ｋ
波長：                        ０．７１０７３Å
結晶系、空間群：              単斜晶系、Ｐ２１
単位格子寸法：                ａ＝１３．４５９７（１６）Å  α＝９０°
ｂ＝８．９４４２（１１）Å  β＝１０４．５１６（２）°
ｃ＝１４．５３３２（１７）Å  γ＝９０°
体積：                        １６９３．７（４）Å３
Ｚ、計算密度：                ４、１．３１６Ｍｇ／ｍ＾３
吸収係数：                    ０．３２６ｍｍ−１
Ｆ（０００）：                ７２０
結晶の大きさ：                ０．１８×０．１５×０．０６ｍｍ
データ収集のためのθ範囲：    １．４５〜２５．００°
制限指数：                    −１６＜＝ｈ＜＝１６、−１０＜＝ｋ＜＝１０、−１７＜＝１＜＝１７
反射収集／固有：              １６２３７／５９６６［Ｒ（ｉｎｔ）＝０．０４３０］
θ＝２５．００に対する完全性：１００．０％
吸収補正：                    なし
精製方法：                    Ｆ２に対してフルマトリックス最小二乗
データ／阻害因子／パラメータ：５９６６／１４／３７９
Ｆ＾２に対する適合度：        １．０３８
最終Ｒ指数［Ｉ＞２σ（Ｉ）］：Ｒ１＝０．０６９１、ｗＲ２＝０．１５２８
Ｒ指数（全データ）：          Ｒ１＝０．１０３４、ｗＲ２＝０．１６９５
絶対構造パラメータ：          ０．１１（１４）
最大差のピークとホール：      ０．３４２および−０．２８５ｅ．Å−３
試料分析
実施例１〜６の生成物を、ＨＰＬＣ法を用いて純度の分析をしたのでそれを以下に説明する。
【００６９】
デガッサー（Ｇ１３７９Ａ）、バイナリポンプ（Ｇ１３１２Ａ）およびコルコム（ｃｏｌｃｏｍ）（Ｇ１３１６Ａ）ならびにオートサンプラー（Ｇ１３１３Ａ）が装備されているアジレント１１００シリーズＬＣシステム（アジレントテクノロジー社）を用いて、４５℃の温度に維持されたアジレントＥｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、５μｍカラムに対して１５μＬの試料のアリコートを注入した。移動相は、水と水中９５％のアセトニトリルである。その移動相を以下の勾配で０．８ｍＬ／分で供給した：０〜４．０分１００％水、４．０〜１０分１００〜０％水、１０〜１７分０％水、および１７〜１８分０〜１００％水。定量化を、ＰＬ−ＥＬＳ２１００システム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ社）を用いるＥＬＳＤによって成し遂げた。
【００７０】
ＲおよびＳメトホルミンリポエートのキラル純度を、キラル固定相カラム（キラルＡＧＰカラム、Ｃｈｒｏｍｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．社製）を用いてクロマトグラフ的に測定した。そのリポエートを加水分解し、形成されたリポ酸の鏡像体過剰率について分析した。この方法により推測されたメトホルミンＲ−リポエートの純度は、一般に＞９８％であった。
【００７１】
試料調製：２ｍｇのメトホルミンＲ−（＋）−リポエートを、ＨＰＬＣを用いて分析するために１ｍＬの水に溶解した。
【００７２】
クロマトグラフ条件：
装置：ＤＡＤ検出器、バイナリポンプ、自動注入装置、カラムサーモスタットおよび適当なデータ処理装置付きのアジレントＨＰＬＣ。
分析の方法
検出：                    ＤＡＤ、波長：２１０、２２５
カラム：                  キラルＡＧＰ１００×４．０ｍｍ×５μｍ（Ｃｈｒｏｍ  Ｔｅｃｈ  ＬＴＤ社製）
カラム温度：              ２５℃
流速：                    ０．９ｍＬ／分
注入量：                  ２０μＬ
移動相：９％のイソプロパノールを含有する０．０１Ｍのリン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０、リン酸により調整）
リポ酸試料調製：１ｍｇのリポ酸を１ｍＬのメタノールに溶解し、１０ｍＬの移動相で希釈する。
ＩＧ  ＭＤ００９試料調製：１ｍｇのＩＧ  ＭＤ００９を１ｍＬの水に溶解し、１０ｍＬの移動相で希釈する。
【００７３】
（実施例８）：メトホルミン（Ｒ）−（＋）リポエートの生物学的効果を測定するための動物モデル
糖尿病ラットモデル：
この実施例は、心臓および心臓組織の虚血後の障害の治療および予防のための方法をもたらす条件の決定に有用な糖尿病ラットモデルについて記述する。
【００７４】
ウースターのｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで維持されているコロニーからの自然発症糖尿病のＢｉｏ−Ｂｒｅｄ（ＢＢ／Ｗ）ラットをこの調査では使用する。ＢＢ／Ｗラットは、最新の調査に対して選択されており、なぜなら、該ＢＢ／Ｗラットは、自己免疫のヒトインスリン依存の糖尿病（ＩＤＤＭ）の有用なモデルと考えられるためである。ヒトのＩＤＤＭと同様に、自然発症性糖尿病は、青年期の間に、体重減少、高血糖症、低インスリン血症、およびケトン尿症を特徴とする臨床的突発を伴って現れる。ヒトの糖尿病の場合におけるように、網膜、心筋、肝臓、腎臓、骨代謝および末梢神経における病変がすべてＢＢラットにおいてはっきりと立証されており、これはＤｉａｂ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｖ．，、８：９（１９９２年）に記載されている。そのＢＢ／Ｗラットは、月齢３〜４ヶ月であり、３００〜３５０ｇの間の体重である。そのＢＢ／Ｗラットは、高血糖状態に導くように毎日インスリンを受け、単離心臓灌流検査を実施する前の２４時間はそれを中断する。これらのラットは、急性的に糖尿病になったものであり、毎日２．０２±０．０４単位のインスリンを受け、少なくとも１２±３日間は糖尿病である。これらの糖尿病のラットにおける平均血糖値は、３８６±２４ｍｇ／ｄＬである。年齢をマッチさせた非糖尿病のコントロールは９２±１２ｍｇ／ｄＬの平均血糖値を有する。
【００７５】
単離灌流心臓モデル：
この実施例は、本発明の進展に有用な単離したラットの灌流心臓モデルについて記述する。
【００７６】
検査は、一定容積の単離したラットの心臓標本を用いて行う。急性的に糖尿病になったオスのＢＢ／Ｗラットと非糖尿病の年齢をマッチさせた（３〜４ヶ月）コントロールとをヘパリン（１０００ｕ；腹腔内）により事前に処理し、続いてペントバルビタールナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内）により処理する。足の反射のないことにより深い麻酔の達成を確定した後、その心臓を速やかに摘出し、氷で冷やした生理食塩水中に入れる。その静止した心臓を、それらの摘出後２分以内に大動脈中の非再循環モデルで逆行灌流させる。最大左心室圧（ＬＶＤＰ）を圧力トランスジューサーに接続されている高圧管を有する左心室内のラテックス製の風船を用いて測定する。灌流圧を灌流ラインから離れた高圧管を用いて観測する。血行動態計測を４チャンネルのＧｏｕｌｄレコーダーに記録する。そのシステムは、灌流媒体を急速に変化させることを可能にする共通の温度制御以外は別々の人工肺、ポンプおよび気泡トラップを備えた２つの平行する灌流ラインを有する。その心臓は、正確なローラーポンプを用いて灌流する。その灌流液は、ＮａＣｌ  １１８、ＫＣｌ  ４７、ＣａＣｌ２  １２、ＭｇＣｌ２  １２、ＮａＨＣＯ３  ２５（ｍＭ／Ｌで）および基質のグルコース１１ｍＭからなる。その灌流装置は、全状況下で心臓温度を３７°±０．５℃に維持するために灌流液および灌流管の周りの水ジャケットのために加熱バスを使用して温度を厳重に制御する。室温の容器中の酸素を送り込んだ灌流液を、３７℃の蒸留水で取り巻かれている２５フィートの薄肉のシリコーンチューブを通過させ、９５％酸素を飽和させる。その灌流液は、次に水ジャケットした（３７℃）管に入り、水ジャケットした気泡トラップを通って心臓に至る。この前処理は、規定どおり３〜４時間にわたって安定している優れた酸素化を提供する。
【００７７】
ゼロフロー虚血のモデル：
糖尿病コントロール（ＤＣ）、処置した糖尿病（ＤＺ）、正常のコントロール（Ｃ）および処置した正常（ＣＺ）の心臓を、２０分間の正常酸素圧の灌流、続いての２０分間の灌流液の流れが完全に止められるゼロフローの虚血、続いての６０分間の再灌流にかける。心臓は、１マイクロモルのメトホルミンＲ−（＋）−リポエートにより処置する。メトホルミンＲ−（＋）−リポエート処置した糖尿病群（ＤＺ）においては、心臓を正常のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液による１０分間の正常酸素圧の灌流および１マイクロモルのメトホルミンＲ−（＋）−リポエートを含有するＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液による１０分間の正常酸素圧の灌流にかける。
【００７８】
その心臓を、次に、２０分間のゼロフローの虚血に、続いて６０分間の再灌流にかける。再灌流条件のばらつきを避けるために、ＤＣおよびＤＺ心臓は両方とも正常のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液により再灌流する。
【００７９】
低流動性虚血のモデル：
糖尿病コントロール心臓（ＤＣ）を、２０分間の１２．５ｍＬ／分の正常酸素圧の灌流に、続いて灌流の流れを正常な灌流の約１０％である１．２５ｍＬ／分に減速した３０分間の低流動性虚血に、続いて正常な流速（１２．５ｍＬ／分）における３０分間の再灌流にかける。
【００８０】
メトホルミンＲ−（＋）−リポエート処置した糖尿病群または非糖尿病群（ＤＺまたはＣＺ）においては、心臓を正常のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液による１０分間の正常酸素圧の灌流（流速１２．５ｍＬ／分）および１マイクロモルのメトホルミンＲ−（＋）−リポエートを含有するＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液による１０分間の正常酸素圧の灌流にかける。その心臓を、３０分間の低流動性の虚血（流速１．２５ｍＬ／分）および３０分間の正常流速（１２．５ｍＬ／分）での再灌流にかける。
【００８１】
本明細書に開示されている化合物および組成物の糖尿病および糖尿病性合併症に対する効果を測定するための動物モデルは、Ｔｉｒａｂａｓｓｉらにより、ＩＬＡＲ  Ｊｏｕｒｎａｌ、  ２００４年、４５巻、２９２〜３０２頁に概説されている。式Ｉの化合物の抗糖尿病活性は、また、以下の特許、米国特許第４３４０６０５号、第４３４２７７１号、第４３６７２３４号、第４６１７３１２号、第４６８７７７７号および第４７０３０５２号に記載されている手順に従って試験することができる。糖尿病患者における赤血球ＧＳＨレベルは、Ｍｕｒａｋａｍｉらの、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１９８９年、３８巻、７５３〜７５８頁に記載されているところ従って測定することができる。本出願と関係するさらなる参考文献としては、以下の、フランス特許第２７９６５５１号（２００１年１月２６日）および米国特許出願公開第２００３−０２２０３０１号（２００３年１１月２７日）が挙げられる。
【００８２】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態に限定されるものではなく、さまざまな変化および修正を添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく生じさせることができることは理解されたい。
【００８３】
前掲の学術論文、科学的参考文献、および特許公報は、それら全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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