(57)【要約】本明細書に記載する態様は、ウイルスの型、亜型および／または株を検出および／または診断するための方法、組成物、および装置を提供する。具体的な態様において、ウイルスはインフルエンザウイルスである。該装置は、インフルエンザの型、亜型、または株の広範囲にわたるアレイにおいて、1つまたは複数の標的遺伝子の核酸配列の少なくとも一部分を結合することができるオリゴヌクレオチドに結合するために設計された捕獲プローブが付着したマイクロアレイを含んでいてもよい。該組成物は、インフルエンザウイルスの診断および／または検出に使用するための、捕獲プローブ、標的配列および／またはタグ付き標識プローブとして、単離された核酸を含んでもよい。2009523451.tif 000013
2009523451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを含む複数の捕獲プローブを含むアレイであって、該捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、アレイ。
【請求項２】
捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザの型に結合することができる、請求項1に記載のアレイ。
【請求項３】
捕獲プローブが、1つまたは複数のA型インフルエンザの亜型または株に結合することができる、請求項1に記載のアレイ。
【請求項４】
複数の捕獲プローブが、固体基板の表面に結合される、請求項1に記載のアレイ。
【請求項５】
固体基板の表面に結合される100またはそれ以下の捕獲プローブを含む、請求項4に記載のアレイ。
【請求項６】
固体基板が、ガラス、プラスチック、シリコン被覆基板、高分子被覆基板、粒子、ビーズ、微粒子、マイクロビーズ、ディップスティック（dipstick）、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項4に記載のアレイ。
【請求項７】
固体基板の表面に結合される陽性対照プローブをさらに含むアレイであって、該陽性対照プローブが、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合する捕獲プローブの複合体を形成するために十分な条件を示すことができる、請求項4に記載のアレイ。
【請求項８】
マイクロアレイである、請求項1に記載のアレイ。
【請求項９】
マイクロアレイが、1つより多い標的遺伝子に由来する多重特性アレイである、請求項8に記載のアレイ。
【請求項１０】
捕獲プローブが、A型インフルエンザH3N2、A型インフルエンザH1N1、A型インフルエンザH5N1、A型インフルエンザH7N7、A型インフルエンザH9N2、A型インフルエンザH3N8、A型インフルエンザH1N2、A型インフルエンザH3N3、A型インフルエンザH3、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるインフルエンザ株に結合することができる、請求項1に記載のアレイ。
【請求項１１】
核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドが、単一の標的遺伝子セグメントに由来する、請求項1に記載のアレイ。
【請求項１２】
捕獲プローブが、表3、表4に列記される配列、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載のアレイ。
【請求項１３】
捕獲プローブのそれぞれが、独立して約10〜約100ヌクレオチド（nt）長である、請求項1に記載のアレイ。
【請求項１４】
アレイを形成するために複数の捕獲プローブを固体基板表面に付着させる段階を含む、インフルエンザウイルスの存在を検出するためのアレイを作製する方法であって、該捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、方法。
【請求項１５】
捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザの型に結合することができる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
捕獲プローブが、1つまたは複数のA型インフルエンザの亜型または株に結合することができる、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
陽性対照プローブを固体基板の表面に結合する段階をさらに含む方法であって、該陽性対照プローブが、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合する捕獲プローブの複合体を形成するために十分な条件を示すことができる、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
捕獲プローブが、赤血球凝集素（HA遺伝子セグメント）、ノイラミニダーゼ（NA遺伝子セグメント）、基質タンパク質（M遺伝子セグメント）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
捕獲プローブが、M遺伝子セグメントの核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、試料中のインフルエンザを検出するための方法：
（a）テストアレイを作製するために、試料を複数の捕獲プローブのアレイに接触させる段階であって、試料が1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドを含む場合、テストアレイが捕獲プローブ‐試料複合体を含む、段階；および
（b）標識化されたアレイを作製するために、テストアレイを1つまたは複数の検出プローブに接触させる段階であって、テストアレイが捕獲プローブ‐試料複合体を含む場合、標識化されたアレイが、標的‐プローブ複合体を含み、かつ、標的‐プローブ複合体の存在が、試料中のインフルエンザウイルスの存在を示す、段階。
【請求項２１】
アレイが、インフルエンザウイルスの少なくとも1つの型、亜型、または株の1つまたは複数の標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含む複数の捕獲プローブを含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
試料中のインフルエンザウイルスの存在が、標的‐プローブ複合体のプローブにより生成される信号を検出することにより判定される、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
標的‐プローブ複合体により生成される信号が、試料中に存在するインフルエンザの型、亜型、または株によって異なるパターンを生成する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザの型に結合することができる、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
捕獲プローブが、1つまたは複数のA型インフルエンザの亜型または株に結合することができる、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
固体基板の表面に結合される陽性対照プローブをさらに含む方法であって、該陽性対照プローブが、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合する捕獲プローブの複合体を形成するために十分な条件を示すことができる、請求項20に記載の方法。
【請求項２７】
固体基板の表面に結合される陰性対照プローブをさらに含む方法であって、該陰性対照プローブが、インフルエンザウイルスに結合し、かつ陰性対照プローブに結合しないという捕獲標識プローブの特異性を示すために十分な条件を示すことができる、請求項20に記載の方法。
【請求項２８】
標的遺伝子が、赤血球凝集素（HA遺伝子セグメント）、ノイラミニダーゼ（NA遺伝子セグメント）、基質タンパク質（M遺伝子セグメント）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項２９】
試料が、鼻咽頭洗浄液、喀痰、眼スワブ、呼吸器スワブ、咽頭スワブ、鼻腔スワブ、鼻腔粘液、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液、粘液、血液、尿、組織、唾液、気体試料、エアフィルタ試料、表面付随試料、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項３０】
試料中のインフルエンザの存在を12時間またはそれ以内に同定する段階をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドを含む複数の捕獲プローブを含むアレイであって、該捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの単一の標的遺伝子セグメントの核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、アレイ。
【請求項３２】
捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザの型に結合することができる、請求項31に記載のアレイ。
【請求項３３】
捕獲プローブが、1つまたは複数のA型インフルエンザの亜型または株に結合することができる、請求項31に記載のアレイ。
【請求項３４】
捕獲プローブが、M遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
単一の標的遺伝子セグメントの核酸配列または相補的な核酸配列の一部分が、インフルエンザの型、亜型、または株のための保存配列領域を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３６】
（a）固体基板の表面に結合される複数の捕獲プローブのアレイであって、該捕獲プローブが、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、アレイ；および
（b）信号を生成することができ、かつ、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、1つまたは複数のタグ付き標識プローブ
を含む、キット。
【請求項３７】
固体基板の表面に結合される陽性対照プローブをさらに含むキットであって、該陽性対照プローブが、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合する捕獲プローブ複合体を形成するために十分な条件を示すことができる、請求項36に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、35U.S.C.§119（e）に基づく2006年1月18日出願の米国特許仮出願第60/759，670号および2006年3月21日出願の米国特許仮出願第60/784，751号の恩典を主張するものであり、参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本明細書に記載する態様は、インフルエンザの検出および鑑別診断のための組成物、方法、および装置に関連する。一部の態様において、A、BおよびCなどのインフルエンザの型は互いに識別され得る。特定の態様において、A型インフルエンザの亜型は互いに識別され得る。具体的な一態様において、A型インフルエンザの様々な株は互いに識別され得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インフルエンザは、A、B、およびC型の3つの属を有するオルソミクソウイルスである。型は核タンパク質の抗原性によって識別される。A型およびB型は、臨床的に最も有意であり、軽度から重度の呼吸器疾患を引き起こす。B型インフルエンザはヒトのウイルスであり、動物宿主には存在しないと思われる。A型ウイルスは、ヒトおよび動物集団に存在し、トリおよびブタ宿主の数が顕著である。AおよびB型インフルエンザは、それぞれ8つのセグメントからなるマイナス鎖の一本鎖RNAを含む。またA型ウイルスは、赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）の2つのウイルス表面糖タンパク質に基づいて抗原亜型に分けることもできる。現在、15個のHA亜型（H1〜H15まで指定）および9個のNA亜型（N1〜N9）が同定されており、それらはすべて野生の水鳥に見ることができる。1933年に始めてウイルスが分離されて以来、135通りあるHAとNAの可能な組み合わせのうち、4つのみ（H1N1、H1N2、H2N2、およびH3N2）がヒト集団において広く循環してきた。現在、ヒト集団において循環しているA型インフルエンザに最も多く見られる2つの亜型はH3N2およびH1N1である。
【０００４】
ウイルス表面の抗原性部位にわずかな変化をもたらす遺伝子浮動により、新種のA型インフルエンザ株が出現する。そのため、ヒト集団は毎年インフルエンザ感染の流行を経験する可能性がある。より急激な遺伝子変化は、抗原不連続変異（HAおよび／またはNAの亜型における変化）を引き起こし、感受性集団に急速にまん延する能力を有する新しい亜型を生む結果となり得る。1918年に流行したA型インフルエンザウイルスはH1N1亜型ウイルスであり、それまでヒト集団において優勢であったA型ウイルス（血清考古学から推定すると、おそらくH3N8）に取って代わることとなった。抗原不連続変異は、2つの異なる亜型が同じ細胞に感染した時に起こる遺伝子再集合から発生する可能性が最も高い。ウイルスの遺伝情報は、8つに分かれたセグメントに格納されているため、2つの異なるウイルス（トリA型およびヒトA型など）を複製している細胞内に、新しいウイルス粒子をパッケージすることは、それぞれの親ウイルスからの遺伝子が混在したウイルスを生み出すことになる。これは、1957年（H2N2）および1968（H3N2）年の大流行の原因となったウイルスに見られたトリ様表面糖タンパク質（およびいくつかの内在する非糖タンパク質遺伝子）と同じ機構であると推察される。最近、世界中でH1N2の遺伝子再集合が見られたことで分かるように、この表面抗原の遺伝子再集合は、現在進行中の可能性なのである。
【０００５】
亜型は、抗原の性質に対して非交差反応性を有するほど十分に分化しているため、1つの亜型（H1N1など）に感染することが、別の亜型（H3N2など）に対する免疫を持つことにはならない。この交差反応性の欠如が、免疫学的に脆弱な集団の間に新種の亜型を広め、世界的な大流行を引き起こすのである。密接な接触を持った集団においては、特に急速に広まる。ひいては、新しい亜型または以前に同定された循環株の出現が、一般の公衆衛生、特に防御準備において、深刻な結果を招く恐れがある。
【０００６】
比較的まれではあるが、ヒト以外のA型インフルエンザ株が、本来の保有動物からヒトに移ることがあり得る。一例を挙げると、1997年、多くの死亡者を出した香港鳥インフルエンザの大発生は、当時、現地の家禽集団に流行した伝染病であるA型インフルエンザウイルスH5N1によるものであった。このウイルスに感染していたことが分かっていた18人の患者のうち、6人が死亡した。
【０００７】
例年のA型インフルエンザウイルス感染は、世界中で毎年500，000〜1，000，000人の死亡者を出して人命に著しい影響を及ぼすとともに、感染の間、直接的および間接的に生産性を低下させるため、経済的な影響をも及ぼしている。中でも最も懸念されるのが、自然の、および操作された遺伝子変化を遂げ、集団内に急速に広がり死亡者を続出させることの可能なウイルス出現につながる恐れのある、A型インフルエンザウイルスの能力である。
【０００８】
インフルエンザの歴史において最も劇的な事象は、一般的に「スペイン風邪」と呼ばれる、1918〜1919年の世界的な大流行であった。1年のうちに、2，000〜4，000万人の人々がインフルエンザによって死亡し、世界の人口の1/5が感染したと推定されている。スペイン風邪の原因となったウイルスは、もともと若くて健康な成人を死に至らせるという能力を筆頭に、いくつかの理由から他には類を見ないものであった。実際、1918〜1919年の間に、米陸軍の80％がこのインフルエンザ感染により死亡したため、第一次世界大戦の終り頃に米軍は大打撃を受けた。主に空気感染から容易に伝染する病原体であるため、また、ウイルスが新種の形態へと遺伝子的に改変する危険性があることからも、A型インフルエンザは深刻な生物兵器防御の問題を意味している。
【０００９】
汎発性インフルエンザの株、またはその他の病原性もしくは非病原性ウイルス出現の可能性に対する、最近の社会的および科学的関心は、これらのウイルスについて、例えば型や亜型などを迅速に検出および同定する方法を必要としている。米国内および世界中で、ウイルスがヒト、トリ、および動物の健康に与える影響を管理および監視するために、改良されたインフルエンザウイルスの遺伝的診断法の必要性がある。
【発明の開示】
【００１０】
概要
本明細書に記載する態様は、ウイルスの存在を検出および／または診断するための方法、組成物、および装置を提供する。ある態様において、方法、組成物、および装置は、インフルエンザウイルスの存在の検出および／または診断を提供する。その他の態様において、該検出および／または診断は、試料中に存在するインフルエンザウイルスの型、亜型および／または株を同定することにまでおよんでもよい。
【００１１】
一部の態様において企図する試料は、鼻咽頭洗浄液、喀痰、呼吸器スワブ、咽頭スワブ、気管吸引液、気管支肺胞洗浄液、粘液、唾液、またはそれらの組み合わせなど、インフルエンザウイルスを有する疑いのある対象からのあらゆる試料を含んでもよいが、それらに限定されない。本明細書において企図するその他の試料は、気体試料、エアフィルタ試料、表面付随試料、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。本明細書において企図する対象は、ヒト、トリ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類、およびブタを含むことができるが、それらに限定されない。
【００１２】
一態様は、固体基板の表面に結合される複数の捕獲プローブを含むアレイ（FluChipまたはMChipなど）、または溶液中に懸濁させた複数の捕獲プローブを含むアレイに関連する。これらの態様に従って、捕獲プローブは、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる。例示的な一方法において、アレイは、固体基板の表面に結合される、または溶液中に懸濁させた、複数の捕獲プローブを含むことができ、そこで該捕獲プローブは、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの単一の標的遺伝子セグメントの核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる。核酸配列の少なくとも一部分は、単一の標的遺伝子または複数の標的遺伝子の保存領域を含むことができる。ある態様において、捕獲プローブは、インフルエンザウイルスの型、亜型、または株のRNA分子に結合し、固定化することができる。また、アレイは、固体基板の表面に結合される陽性および／または陰性対照をさらに含むことができる。これらの対照は、特定のウイルスを結合するためのアレイの条件を確認するために使用することができる。該アレイは、マイクロアレイまたは複数チャネルのマイクロアレイであってもよい。
【００１３】
その他の態様は、インフルエンザウイルスの検出および／または診断に使用するための装置（「FluChip（商標）」装置など）に関連していてもよい。FluChip（商標）装置は、1つまたは複数の標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、1つまたは複数の付着した捕獲プローブを有するマイクロアレイを含んでいてもよい。好ましい態様において、FluChip（商標）装置は、かかる配列を55以上含んでいてもよい。FluChip（商標）装置に付着した捕獲プローブは、インフルエンザウイルスの1つまたは複数の型、亜型および／または株の核酸配列とハイブリダイズするように設計されてもよい。
【００１４】
ある態様において、インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザH3N2、A型インフルエンザH1N1、およびA型鳥インフルエンザH5N1からなる群より選択される。
【００１５】
一部の態様は、1つまたは複数のB型インフルエンザの株の標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むことができるが、それらに限定されない、オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。これらの態様に従って、インフルエンザの型、亜型、または株は、互いに識別され得る。また、本明細書において企図するあらゆるアレイは、表3、表4、表5に列記される配列、またはその組みあわせから選択される捕獲プローブを含むことができる。また、本明細書において意味する捕獲および標識プローブは交換可能であり、従って捕獲、標識、またはその組み合わせとして列記される配列は、アレイを作成するために使用することができる。ある態様において、該アレイは、固体基板の表面に結合される100またはそれ以下の捕獲プローブ（および／または標識配列）を含む。
【００１６】
ある態様において、アレイは固体基板に結合することができる。これらの態様に従って、固体形態は、ガラス、プラスチック、シリコン被覆基板、高分子被覆基板、粒子、ビーズ、微粒子、マイクロビーズ、ディップスティック（dipstick）、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、およびそれらの組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。具体的な一態様において、固体基板に連結された捕獲プローブは、それぞれ独立して、長さ約5〜約200ヌクレオチド（nt）、長さ約10〜約150nt、長さ約25〜約100nt、または長さ約10〜約75ntである。
【００１７】
一態様は、アレイを形成するために複数の捕獲プローブを固体基板表面に付着させる方法に関連し、その捕獲プローブは、1つまたは複数の系統のインフルエンザの型、亜型、または株の標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むヌクレオチドに結合することができる。本明細書において企図するオリゴヌクレオチドは、赤血球凝集素（HA遺伝子セグメント）、ノイラミニダーゼ（NA遺伝子セグメント）、基質タンパク質（M遺伝子セグメント）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される標的遺伝子の、核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むことができる。具体的な一態様において、本明細書において企図するヌクレオチドは、HA遺伝子の核酸配列の少なくとも一部分を含むことができる。別の具体的な態様において、本明細書において企図するオリゴヌクレオチドは、M遺伝子の核酸配列の少なくとも一部分を含むことができる。
【００１８】
また、本明細書における態様は、試料中のインフルエンザを検出する方法に関連する。該方法には、（a）テストアレイを作製するために、試料を複数の捕獲プローブのアレイに接触させる段階であって、試料が1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドを含む場合、テストアレイは、捕獲プローブ‐試料複合体を含む段階と、（b）標識化されたアレイを作製するために、テストアレイを1つまたは複数の検出プローブに接触させる段階であって、テストアレイが捕獲プローブ‐試料複合体を含む場合、標識化されたアレイは、標的‐プローブ複合体を含み、標的‐プローブ複合体の存在が、試料中のインフルエンザウイルスの存在を示す段階とを有する、試料中のインフルエンザを検出するための方法を含む。これらの方法に従って、アレイは、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含む、複数の捕獲プローブを含むことができる。ある態様において、試料中のインフルエンザウイルスの存在は、標的‐プローブ複合体のプローブにより生成される信号を検出することにより判定される。その他の態様において、標的‐プローブ複合体により生成される信号は、試料中に存在するインフルエンザの型、亜型、または株によって異なるパターンを生成する。ある実施例において、捕獲プローブは、1つまたは複数のインフルエンザの型および／または1つまたは複数のA型インフルエンザの亜型または株に結合することができる。ある実施例において、標的遺伝子は、赤血球凝集素（HA遺伝子セグメント）、ノイラミニダーゼ（NA遺伝子セグメント）、基質タンパク質（M遺伝子セグメント）、およびそれらの組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。
【００１９】
ある態様において、48時間以内、36時間以内、24時間以内、あるいはより具体的には12時間以内に、試料中のインフルエンザウイルスを検出することに関連する。
【００２０】
別の態様は、1つまたは複数のインフルエンザの型または株の標的遺伝子の核酸配列の少なくとも一部分のオリゴヌクレオチドを含むことができる標識プローブに関連する。ある実施例において、標識プローブは、1つまたは複数のインフルエンザの型、亜型、または株の標的遺伝子の核酸配列の少なくとも一部分に結合することができる。
【００２１】
本明細書における例示的な一方法は、本明細書に開示される装置を用いて、対象においてインフルエンザを診断することに関連する。本方法に従って、対象におけるインフルエンザ感染の重症度の診断も本明細書において企図する。一実施例において、対象から試料を入手し、その試料を本明細書において開示する装置に暴露し、インフルエンザの存在または程度を評価することができる。ある態様において、インフルエンザウイルスの株を評価することが可能であり、この評価に基づいて対象の治療を行うことができることを企図する。また、本明細書において開示されるあらゆる装置は、集団内にインフルエンザが大流行した場合、感染集団の検疫または隔離などの最適なアプローチを決定するために、小人数または多人数集団における感染を評価するために使用することができることも企図する。
【００２２】
さらなる態様は、本明細書において開示する態様を実施するためのキットを含むことができる。1つの例示的なキットは、（a）固体基板の表面に結合される複数の捕獲プローブのアレイであって、該捕獲プローブは、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができるアレイと、（b）1つまたは複数のタグ化付き標識プローブであって、該タグ付き標識プローブは、信号を生成することができ、標識プローブは、1つまたは複数のインフルエンザウイルスの標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドに結合することができる、1つまたは複数のタグ付き標識プローブと、を含むことができるが、それらに限定されない。1つの具体的なキットにおいて、アレイは陽性および／または陰性の対照を含んでいてもよく、その対照はアレイの結合条件を示すことができる。
【００２３】
当業者は、方法および装置は、具体的なインフルエンザウイルスの型、亜型および／または株を同定する用途のための具体的な態様に関して記載されているが、それらは他の種類のウイルス検出および／または診断にも使用できることを理解すると考えられる。
【００２４】
例示的態様の説明
定義
本明細書で別段に定義されない用語は、明白で普通の意味により使用される。
【００２５】
本明細書で使用される限り、「a」または「an」は、1つまたは1つより多い項目を意味する場合がある。
【００２６】
「配列変化」は、インフルエンザウイルスの異なる株、型または亜型間の所与の遺伝子配列に観察される変化など、核酸配列における任意の変化である。配列変化は、挿入、欠失、置換、突然変異および単一ヌクレオチド多型を含む場合があるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
「捕獲」プローブまたは配列は、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドで複合体を形成することができる核酸配列である。複合体を形成することは、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、結合する、または関連することを含むことができる。特定の実施例において、核酸配列は、任意の核酸分子、例えば、RNA、DNAまたはそれらの組み合わせである可能性がある。注記：特定の態様における捕獲および標識プローブまたは配列は、置き替え可能である。
【００２８】
「標識」プローブまたは配列は、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドで複合体を形成することができる核酸配列である。複合体を形成することは、標的遺伝子の核酸配列または相補的な核酸配列の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、結合する、または関連することを含むことができる。さらに、「標識」プローブは、信号を生成することができる。特定の態様において、「標識」プローブまたは配列は、例えば、蛍光性、リン光性、酵素性，放射性またはその他のタグ部分の付着によって、検出可能に標識化される場合がある。あるいは、標識プローブまたは配列は、検出可能なタグ部分に結合するように設計される1つまたは複数の官能基を含有する場合がある。注記：特定の態様における捕獲および標識配列は、置き替え可能である。
【００２９】
インフルエンザの診断
病原性および遺伝性の実際の遺伝的な根拠は、どちらかといえば、HAおよびNAの血清学的反応性とほぼ関係がない場合があるとはいえ、A型インフルエンザウイルスを特徴付けるための本方法は、表現型（例えば、抗原性）情報に依存する。1997年に香港の家禽での発生に関与するH5N1ウイルスの高病原性は、主としてH5HAの強化された開裂性に起因したという証拠はあるが、以前に発生した同様の開裂性H5HAを有するウイルスは、ヒトの疾病を引き起こさなかったので、これ単独では、ヒトに感染する能力を説明できない。これら1997年のH5N1ウイルスが、ヒトに感染できた理由は、今もなお調査の対象である。1997年の発生からのヒトH5N1分離体を使用して、マウスでの過去の研究は、これらのウイルスの宿主域および／または病原性の一因となる可能性のある4つの遺伝子での異なる5つのアミノ酸を解明した。従って、表現型アッセイは、新しい株の潜在病原性を測定するための十分な情報を提供しない。
【００３０】
インフルエンザウイルスの従来の特徴付けは、ウイルス培養が、多くの場合、より詳細な特徴付けを必要とする、赤血球凝集素-抑制血清学試験に関与する。これらのアプローチは、困難であり、多大な時間を必要とする。さらに、現在の迅速インフルエンザ試験のすべては、比較的反応性に欠け、少なくともいくつかの偽陰性報告を引き起こす。
【００３１】
機能的ゲノミクスおよびマイクロチッププラットホーム
急速なゲノム配列決定および膨大なゲノムデータベースの出現で、無数の方法により遺伝情報を利用することが現在では可能である。最も有望な技術のうちの1つは、オリゴヌクレオチドアレイである。より一般的にはDNAマイクロアレイまたはDNAチップと称される、オリゴヌクレオチドアレイの一般的構造は、光学的に平面上の点の明確なアレイであり、それぞれは、比較的短いDNA鎖の層を含有する（例えば、Schena，ed.，“DNA  Microarrays  A  Practical  Approach，”Oxoford  University  Press；Marshall  et  al.（1998）Nat.Biotechnol.16：27-31、それぞれは参照することによって本明細書に組み込まれる）。アレイを作製するための最も一般的に使用される2つの技術のうち、一方は、フォトリソグラフィ（例えば、Affymetrix）に基づき、他方は、ロボット操縦のインクジェット（スポットボット）技術（例えば、Arrayit.com）である。マイクロアレイを作製するためのその他の方法も知られており、かかる既知の任意の方法は、本明細書で使用される場合がある。一般的に、アレイの所与の点内に配置されるオリゴヌクレオチド（捕獲プローブ）は、標的遺伝子の核酸または相補的な核酸の少なくとも一部に結合するように選択される。水性の試料は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、アレイと接触して設置される。その後、アレイを十分に洗浄し、非特異性の吸着種をすべて除去する。標的配列が捕獲されたかどうか判定するために、アレイは、例えば、標的配列の非占有部分に相補的な蛍光性的に標識化されたオリゴヌクレオチド配列を加えることによって「発展させる」。その後、マイクロアレイは、アレイの像を出力する、マイクロアレイ読み取り器またはスキャナを使用して「読み取られる」。強い蛍光性を示す点は、その特定の標的配列に陽性である。
【００３２】
DNAチップ技術は、遺伝子発現分析における広範な使用を発見し、現在では、診断の分野でDNAチップのいくつかの実証が行われている。
【００３３】
A型インフルエンザ株の分別検出のためのDNAマイクロアレイ
一実施例において、「FluChip（商標）」装置は、個人がA型インフルエンザなどのウイルスに感染しているかどうかに関する情報を提供し、加えてウイルスの型および亜型の両方の特徴付けを提供することができる。FluChip（商標）装置を使用するインフルエンザの存在のための分析は、現況の当技術分野の方法論を使用した約4日と比較すると、約11時間を要する。本装置は、いくつかの遺伝子に方向付けられる約55の配列を必要とする。FluChip（商標）アッセイの特定の一態様は、1つより多い遺伝子、すなわちMセグメント、HAセグメントおよびNAセグメントの増幅を利用する。本出願は、「DNA  Microarray  Analysis  as  a  Diagnostic  for  Current  and  Emerging  Strains  of  Influenza  A」の名称で、2006年1月18日に出願され、本明細書において参照することによってその全体が組み込まれる。
【００３４】
特定の態様は、今までウイルスアッセイ、すなわちインフルエンザの型、亜型および株を同定するためのアッセイに優るいくつかの利点を有する。一態様において、本明細書に開示するチップアッセイは、ウイルスの多くの遺伝子または単一の遺伝子標的を標的することができる。FluChip（商標）装置内で使用されるようなマルチプレックスPCRは、複数の遺伝子を標的にする。一態様において、本明細書に開示するアレイは、MChip（商標）装置などの単一の遺伝子セグメントを標的にすることができる。本明細書に開示するアレイでは、分析のための応答時間は迅速である。例えば、試料中のウイルス標的の存在または非存在の分析のための応答時間は、11時間以下で行うことができる。特定の態様において、試料中のウイルス標的の存在または非存在の分析は、7時間以下で行うことができる。さらに特定の態様において、試料中のウイルス標的の存在または非存在の分析は、5時間以下で行うことができる。さらに、本明細書に開示する病原性または非病原性ウイルス検出のチップアッセイは、ウイルス（例えば、A型インフルエンザH1N1のMセグメント）の特定の型、亜型または株の標的遺伝子の存在または非存在を同定するために、100またはそれ以下の配列、好ましくは15〜60の配列、より好ましくは15〜30の配列、さらにより好ましくは15未満の配列であってもよい。これらの態様によると、試料中のウイルスの特定の型、亜型または株の存在または非存在の同定は、ウイルスを示す標的遺伝子の検出のために、約100またはそれ以下のヌクレオチドを必要とする場合がある。特定の一態様において、試料中のウイルスの特定の型、亜型または株の存在または非存在の同定は、ウイルスを示す標的遺伝子の検出のために、約50以下のヌクレオチドを必要とする場合がある。例えば、長さで約10〜30のヌクレオチドの5〜15の配列は、試料中のウイルスの遺伝子セグメントの存在または非存在の同定のためのチップを作製するために使用されることがある。これらの態様によると、当業者は、ウイルス生物を示す単一の遺伝子の検出のために作製される配列の多くは、重複を有する場合があることを理解する。
【００３５】
インフルエンザ株を分析するDNAマイクロアレイを使用するための重要な考慮事項は、ウイルスのゲノム（例えば、インフルエンザゲノム）のどんな遺伝子を標的にするかを同定することである。例えば、それぞれの型のインフルエンザ（A、B、およびC）は、複数の亜型によって特徴付けられる。亜型は、HA（赤血球凝集素）およびNA（ノイラミニダーゼ）遺伝子に存在する配列に起因して発現するタンパク質を参照する。それぞれのウイルスは、型および亜型（例えば、A/H1N1）によって同定される。さらに、ウイルスは、特定の株と同定することができる。マイクロアレイに配置される配列は、好ましくは、インフルエンザ種々の型、亜型または株間で区別される必要がある。さらに、インフルエンザウイルスは、極めて迅速に突然変異する。従って、マイクロアレイに配置される配列は、好ましくは、インフルエンザの迅速な突然変異率を考慮に入れる必要がある。
【００３６】
本明細書において、個々の遺伝子（1000超）のための多数のインフルエンザ配列を取ることを可能し、インフルエンザの型および亜型の両方で同定を可能にするそれぞれの遺伝子内で領域を同定する一連の手順を発展させた。既報のデータ（Influenza  Sequence  Database（ISD）at  the  Los  Alamos  National  Laboratory  www.flu.lanl.govから）、および未発表、独自の配列データベース（CDCインフルエンザ配列データベース）の両方から成る配列を使用した。この過程は、前から存在するプログラム、加えてこの任務のために特に開発されたプログラム、さらにとりわけ、プログラム「ConFind」（Smagala  et  al.，“ConFind：a  robust  tool  for  conserved  sequence  identification，”Bioinformatics  Advance  Access、2005年10月20日発表、参照することにより本明細書に組み込まれる）の両方の使用に関与した。特定のワークフローでこれらのプログラムを使用することは、A型インフルエンザを亜型分類するために使用することも可能なHおよびN遺伝子の領域の迅速で効率的な同定をもたらした。これまでに発見されたように、インフルエンザ（A型またはB型）の明確な型分類を提供するM（基質）遺伝子の領域が同定された。
【００３７】
一態様において、ウイルスを示す単一の標的遺伝子は、アレイ装置を設計するために使用される場合がある。本態様によると、アレイ装置は、この標的遺伝子の核酸配列または相補的核酸の少なくとも一部分を結合することができる特異的オリゴヌクレオチドを作製することによって製造することができる。本明細書に詳述される一態様は、単一の遺伝子（例えば、A型インフルエンザのMセグメント）が、試料中のA型インフルエンザの存在を同定するために使用される場合があることを発見した。思いがけなく、高度に保存された内部遺伝子、M遺伝子は、ウイルスの型、亜型または株間の区別をするために使用される場合がある。例えば、A型インフルエンザウイルスのMセグメント遺伝子などの単一の標的遺伝子セグメントは、ウイルスの特異的亜型の存在または非存在を同定するために使用されることがある。本明細書で説明する例示的な一方法は、Mセグメント遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドを含むアレイは、試料内のA型インフルエンザの亜型H1N1、H3N2、およびH5N1を区別することを発見した。
【００３８】
一態様において、Mセグメントは、基質遺伝子の役割、および基質タンパク質と表面糖タンパク質との相互作用を調査することによって、抗原性亜型情報を提供するために使用することができる。A型インフルエンザのMセグメントは、M1およびM2タンパク質の両方をコード化する。M1は、ビリオン内で最も豊富なタンパク質であり、ウイルスエンベロープの内側を形成する。M1は、HA、NA、およびM2とウイルスコアとの間の橋の役割をする。M1は、リボ核タンパク質の運搬、ウイルス集合、および出芽を含み、ウイルスのライフサイクルのおいて多くの段階に関与する。M2は、プロトン選択的イオンチャネルの機能を果たすウイルスエンベロープの微量成分である。ウイルス膜とエンドソーム膜との融合の後の酸性エンドソームの内側で、M2イオンチャネルは、リボ核タンパク質を脱殻するために必要な低pH環境を開始し促進する。
【００３９】
一側面において、標的遺伝子は選択され、標的遺伝子の特定の配列は、DNAマイクロアレイでのオリゴヌクレオチドの作製および配置のために選ばれる。例えば、アレイは、A型インフルエンザのM遺伝子の分析のために設計された。本実施例において、15の異なるMセグメント配列をマイクロアレイに位置付けた。その後、適切なプローブ配列（捕獲および標識）は、保存された領域から設計された（方法の項を参照）。すべてのウイルス亜型との広範の反応性か、または所与のウイルス亜型または宿主種のための高度な比反応性を生むために選択される配列からオリゴヌクレオチドを設計した。それらを設計するために使用したデータベース内の可能性があるプローブ配列とすべての配列間での不一致の数をコンピュータ的に評価することによって、予想反応性を判定した。A型インフルエンザM遺伝子を特に同定し、亜型のA型インフルエンザを区別するために、これらのオリゴヌクレオチドを設計した。Mセグメントは、免疫系を避けるために選択圧下にないとはいえ、表面糖タンパク質とMセグメントとの機能的相互作用は、文書で十分に立証されており、最近の証拠は、共進化を明確に強調している。
【００４０】
例示的な一方法において、インフルエンザの型および亜型を同定するために、以下の手順を使用した。
（1）逆転写酵素-PCRを使用して、ウイルスのRNAを増幅する。
（2）T7RNAポリメラーゼを使用して、cDNAを大量のRNAに変換する。
（3）塩基触媒加水分解を使用して、RNAを断片化する。
（4）特異的標識-オリゴヌクレオチドの混合物を断片化したRNAに加えるたった1つの標識オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイが捕獲するために設計されるそれぞれの領域に結合される。
（5）断片化されたインフルエンザRNAと標識オリゴとの混合物をマイクロアレイ上に配置し、ハイブリダイゼーションが発生するようにする。
（6）未結合のいかなるRNA/DNAも洗い流す。
（7）走査型レーザー蛍光光度計を使用して分析する。
【００４１】
以下の実施例の項に詳細な手順を説明する。例示的な一研究において、既知の亜型のウイルス分離体を試験した。亜型のそれぞれの試料を同定するために、本明細書に開示する方法を使用した。実施例において、本明細書に開示する装置は、現状の手順より非常に短時間でインフルエンザウイルスの型および亜型を精密に提供する（例えば、表7および表8を参照）。
【００４２】
その他の態様において、その他のウイルスが、標的にされることがあるA型インフルエンザのMセグメントに類似した内部非免疫原性タンパク質を有し、捕獲および標識配列が作製される場合があることが企図される。これらの捕獲および標的配列から、マイクロアレイチップは、試料中のウイルスの型、亜型または株を同定するために作り出される場合がある。これらの態様によると、その他のウイルスは、マイナスセンス、一本鎖、分節RNAウイルスを含むことがある。特定の一態様において、マイナスセンス、一本鎖、分節RNAウイルスは、オルトミクソウイルス科のウイルスを含む場合がある。オルトミクソウイルス科のウイルスには、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス（Thogotovirus）、およびイサウイルス（Isavirus）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
その他の態様において、マイクロアレイ上のMセグメント配列に観察される独自のパターンは、未知のA型インフルエンザウイルスの同定のための診断テストとして使用される可能性もある。本態様によると、未知のウイルスに由来するマイクロアレイは、簡略化階層的クラスタ分析か、またはニューラルネットワークなどのより進歩的な方法を使用して、「検証」セットまたは制御セットに対して評価されることも可能である（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、Filmore，D.Gene  expression  learned.Mod.Drug.Disc.7,47-49（2004）.；Hanai,T.＆Honda,H.Application  of  knowledge  information  processing  methods  to  biochemical  engineering,biomedical  and  bioinformatics  fields.Adv.Biochem.Eng.Biotech.91,51-73（2004）参照）。
【００４４】
人工のニューラルネットワーク
人工のニューラルネットワーク（ANN）またはより一般的には単にニューラルネットワーク（NN）は、計算へのコネクショニストアプローチに基づく情報処理のための数学モデルまたは計算モデルを使用する人工ニューロンの相互接続群である。大抵の場合、ANNは、ネットワークを経て流れる外部または内部情報に基づき、その構造を変化する適応システムである。特定の態様において、ANNは、本明細書に開示するアレイを作製するために、標的遺伝子内の標的遺伝子および配列を選択するために使用することができる。ANNの使用の詳細な例については、実施例の項を参照されたい。例示的な一態様において、チップアレイ、すなわち、MChip（商標）アレイ作製の際に役立つ配列を分析し、引き出すためにANNを使用した。その他の態様において、ANNは、階層的クラスタ分析法（上記および実施例の項に説明する）を使用する代わりに、または併用して使用することができる。
【００４５】
一部のその他の態様において、ウイルスの特定の株、型または亜型を示すウイルス関連の配列を検出するために使用される装置は、マイクロアレイシステム、バイオセンサシステム、ゲルシステム、浸漬装置システム、迅速試験ストリップシステム、携帯用スキャナシステム、またはマイクロビーズ系システムを含むことがあるが、これらに限定されるものではない。これらの態様によると、標的タンパク質の領域の核酸または相補的な核酸配列の一部を結合することができる捕獲プローブおよび／または標識プローブオリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に開示する複数の標的遺伝子セグメント、Mセグメント配列）は同定され、合成されることがある。後に、これらのオリゴヌクレオチドは、試料中の標的配列の存在の分析に適合性のあるアレイシステムを作製するために使用することができる。これらの態様によると、例えば、ディップスティック、固体表面、ゲルまたはビーズシステムに関連する捕獲プローブ配列を有する、ディップスティック、固体表面、ゲルまたはビーズシステムは、試料内の疑わしいウイルスの株、型または亜型を示す特異的ウイルスタンパク配列の存在を分析するために使用される場合がある。
【００４６】
本明細書の態様のいずれかに開示するアレイは、固体表面に結合されるか、または溶液中で懸濁されるアレイを含むことができることが企図される。つまり、一実施例において、アレイは、当技術分野で既知の手段によって、マイクロビーズなどのビーズに付着させることができる。マイクロビーズアレイは、例えば、化学的にエッチングされた像繊維束の遠位末端に捕獲プローブ結合したマイクロスフェア（例えば、直径3μm）を取り込むことによって作製することができる。特定の態様において、当該の試料は、光ファイバーアレイに暴露させることができ、次いで、標識プローブなどの第2のプローブが、光ファイバーアレイへの結合を検出するために使用されることがある（例えば、www.illumina.com参照）。さらに、インフルエンザの単一の遺伝子標的は、これらのアレイを作製するために使用してもよく、またはマルチプレックスマイクロアレイのための複数の遺伝子標的は、インフルエンザの複数の遺伝子標的を標的にするために使用することができる。その他のアレイの例は、当技術分野で既知の毛細血管ビーズアレイを含む場合がある（例えば、Kohara  et  al  Nucleic  Acids  Research,2002,Vol.30,No.16  e870参照）。その他の例は、分子指標を含む場合がある。分子指標は、多くの場合リアルタイムPCRアッセイで使用される二重標識プローブである。一実施例において、流体アレイシステムは、マイクロスフェア共役分子指標、および溶液中の非標識核酸の特異的、マルチプレックス検出のための流動血球計算器を使用することが企図される。この例示的なシステムにおいて、分子指標は、連結（例えば、ビオチン-ストレプトアビジン連結）を使用して、マイクロスフェアに共役することができる。特定の実施例において、1つまたは複数のフルオロフォアの色、合成制御配列において異なる大きさおよび分子指標のビーズは、本明細書に開示する1つまたは複数の標的遺伝子の核酸または相補的核酸の少なくとも一部分に由来するオリゴヌクレオチドを使用して、試料中のインフルエンザの存在を検出するために使用することができる（例えば、Horejsh  et  al,Nucleic  Acids  Res.2005；33（2）：e13参照）。
【００４７】
キット
さらなる態様において、上述の方法のためのキットを企図する。一態様において、キットは、ポイントオブケアの用途を有し、例えば、キットは、疑わしいウイルス発生の現場で使用するために携帯性を有する場合がある。その他の態様において、ウイルス（病原性または非病原性ウイルスなど）検出するキットを企図する。その他の態様において、ウイルス誘発の感染の発現を有する、または疑いがある対象からの試料の分析のためのキットを企図する。さらに特定の態様において、インフルエンザ誘発の感染の発現を有する、または疑いがある対象からの試料の分析のためのキットを企図する。本態様によると、キットは、ウイルスの型、亜型または株を評価するために使用されることがある。
【００４８】
キットは、携帯用のアッセイのための適切な容器内のチップアレイシステムなどのアレイシステムを含んでもよい。さらに、キットは、例えば、ヘルスケア提供者によるヘルスケア施設内で、試料を迅速に分析することができる浸漬棒または浸漬紙などの棒または特殊な紙を含んでもよい。その他の態様において、キットは、ヘルスケア施設外の指定された場所で使用するための携帯用キットであってもよい。
【００４９】
キットのうちのいずれかの容器の手段は、一般に、検査薬が、好ましくはおよび／または適切にアリコートされることがある、少なくとも1つの水薬瓶、試験管、フラスコ、瓶、注射器またはその他の容器の手段を含む。さらに、本明細書のキットは、陽性対照および／または陰性対照などの適切な対照試料などの結果を比較する手段を含む場合がある。適切な陽性対照は、既知のウイルス型、亜型または株の試料を含む場合がある。
【００５０】
核酸
種々の態様において、分離核酸は、対象内のインフルエンザウイルスの型、亜型、またはさらには株を検出するための分析および／またはそれの診断のために使用される場合がある。分離核酸は、ゲノムRNAまたは相補的DNA（cDNA）に由来する場合がある。その他の態様において、化学的または酵素的に合成したDNAなど分離核酸は、捕獲プローブ、プライマーおよび／または標識化検出オリゴヌクレオチドに役立つ場合がある。
【００５１】
「核酸」には、一本鎖および二本鎖分子、加えてDNA、RNA、化学修飾した核酸および核酸類似体が含まれる。核酸は、全長タンパク質コードまたは調節遺伝要素次第により、長さで3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1750、約2000あるいはそれ以上のヌクレオチド残基から成ることが企図される。
【００５２】
核酸の構成
分離核酸は、当技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、標準組換え法、合成的技法、またはそれらの組み合わせを使用して作製してもよい。一部の態様において、核酸は、クローン、増幅、または別の方法では構成される場合がある。
【００５３】
核酸は、ウイルス配列に関連した型、亜型または株に加えて、都合良く配列を含む場合がある。例えば、1つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位を含む複数のクローニング部位を加えてもよい。核酸は、核酸のクローニングのために、ベクター、アダプター、またはリンカーに付着させてもよい。さらなる配列は、機能を最適化するために、核酸の分離に役立つために、または核酸の細胞への導入を改善するために、かかるクローニングおよび配列に加えてもよい。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当技術分野で周知である。
【００５４】
核酸を構成するための組換え法
分離核酸は、当技術分野で既知のクローニング方法論をいくつでも使用して、細菌、ウイルスまたはその他の発生源から取得してもよい。一部の態様において、ストリンジェントな条件下で、選択的に核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、ウイルス配列を同定するために使用される。核酸ライブラリーの構成のための方法は既知であり、かかる既知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Ausubel,etal.,Eds.,Greene  Publishing  and  Wiley-lnterscience,New  York（1995）；Sambrook,et  al.,Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual,2nd  Ed.,Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Vols.1-3（1989）；Methods  in  Enzymology,Vol.152,Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques,Berger  and  Kimmel,Eds.,San  Diego：Academic  Press,Inc.（1987）参照。
【００５５】
核酸スクリーニングおよび分離
ウイルスのRNAまたはcDNAは、表1に開示するものなど、1つまたは複数の配列に基づき、プローブを使用して同定されている当該の遺伝要素の存在をスクリーニングされる場合がある。ハイブリダイゼーションの様々な程度のストリンジェンシーをアッセイで用いてもよい。ハイブリダイゼーションのための条件が、さらにストリンジェントになるにつれて、二本鎖形成が生じるためにプローブと標的とのより大きな程度の相補性があるに違いない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、pHおよび／またはホルムアミドなどの部分的変性溶媒の存在によって制御される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、最大50％の範囲内および約50％のホルムアミドの濃度を変更することによって、都合良く変化する。検出可能な結合に必要な相補性（配列同定）の程度は、ハイブリダイゼーション培地および／または洗浄培地のストリンジェンシーより変化することができる。特定の態様において、相補性の程度は、最適に約100パーセントであってもよいが、その他の態様において、インフルエンザRNAでの配列変異は、条件に応じて、結果的に100％未満の相補性、90％未満の相補性プローブ、80％未満の相補性プローブ、70％未満の相補性プローブ、またはそれ以下となる場合がある。特定の実施例において、プライマーは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄培地を緩和することによって補われる場合がある。
【００５６】
核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシーな条件は、当技術分野で周知である。例えば、条件は、約50℃から約70℃の温度で、約0.02Mから約0.15M  NaClによって提供されるように、低塩および／または高温条件を有する場合がある。その他の例示的な条件は、以下の実施例で開示する。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸の長さ、標的配列長さおよびヌクレオチド含有量、核酸の電荷組成によって、およびホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたはハイブリダイゼーション混合物内のその他の溶媒の存在または濃度によって、ある程度判定することが理解される。核酸は、標的配列に完全に相補的である場合があるか、または1つまたは複数の不一致を示す場合がある。
【００５７】
核酸増幅
さらに、当該の核酸は、様々な既知の増幅技術を使用して、増幅される場合がある。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術は、ウイルスのRNAまたはcDNAから直接的に標的配列を増幅するために使用してもよい。さらに、PCRおよびその他の生体外での増幅方法は、例えば、核酸配列のクローンを作るために、試料中の標的核酸の存在を検出するための、配列を決定するための、またはその他の目的のためのプローブとして使用する核酸を作製するために、有用である場合がある。核酸増幅のための使用の技術の例は、Berger,Sambrook,およびAusubel,加えてMullis  et  al.,U.S.Pat.No.4,683,202（1987）；ならびにPCR  Protocols  A  Guide  to  Methods  and  Applications,Innis  et.al.,Eds.,Academic  Press  Inc.,San  Diego,Calif.（1990）に見られる。PCR系のスクリーニング方法を開示している。例えば、Wilfinger  et  al.BioTechniques,22（3）：481-486（1997）参照。
【００５８】
核酸を構成するための合成法
分離核酸は、Narang  et  al.,Meth.Enzymol.68：90-99（1979）のホスホトリエステル法；Brown  et  al.,Meth.Enzymol.68：109-151（1979）のホスホジエステル法；Beaucage  et  al.,Tetra.Lett.22：859-1862（1981）のジエチルホスホアミダイト法；Needham-VanDevanter  et  al.,Nucleic  Acids  Res.,12：6159-6168（1984）にあるような自動合成器を使用した、BeaucageおよびCaruthers,Tetra.Letts.22（20）：1859-1862（1981）の固相ホスホアミダイトトリエステル法などの方法による、または米国特許第4,458,066号の固形支持法による直接化学合成によって調製してもよい。一般に、化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する。相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、または鋳型としての一本鎖を使用した、DNAポリメラーゼとのポリメリゼーションによって、これを二本鎖DNAに変換してもよい。DNAの化学合成は、約100またはそれ以下の塩基の配列に用いるのが最良であるが、より長い配列は、より短い配列の連結反応によって取得してもよい。
【００５９】
核酸の共有結合修飾
様々な架橋剤、アルキル化剤およびラジカル発生種は、核酸を結合、標識、検出および／または開裂するために使用される場合がある。さらに、一本鎖標的ヌクレオチド配列に相補的なアルキル化剤を使用して、標的ヌクレオチドとの共有結合架橋を使用することができる。ソラレンによって媒介される一本鎖オリゴヌクレオチドとの光活性化架橋結合を使用することができる。さらに、一本鎖オリゴヌクレオチドと架橋するアルキル化剤としてのN4,N4-エタノシトシンの使用を開示してきた。核酸を結合、検出、標識および／または開裂するための種々の化合物は、当技術分野では既知である。
【００６０】
核酸標識
種々の態様において、タグ核酸は、1つまたは複数の検出可能な標識で標識化し、マイクロチップの表面上の捕獲プローブに結合される標的核酸配列の同定を容易にする。例えば、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、酵素タグ、抗体、化学発光、電子発光、親和性標識など、多くの異なる標識を使用してもよい。当業者は、これらおよび本明細書で言及されないその他の標識部分が使用できることが分かると考えられる。酵素タグの例には、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼが含まれる。比色分析指示基質は、かかる酵素と用いられ、ヒトの目に可視的な検出手段または分光光度法で提供することができる。化学発光標識の周知の例は、ルシフェリン／ルシフェラーゼの組み合わせである。
【００６１】
好ましい態様において、標識は、蛍光性、リン光性、または化学発光標識である場合がある。例示的な光検出可能な標識は、Alexa350、Alexa430、AMCA、アミノアクリジン、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2'、7'-ジメトキシフルオレセイン、5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、6-カルボキシローダミン、6-カルボキシテトラメチルアミノ、カスケードブルー、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、ダンシルクロリド、フルオレセイン、HEX、6-JOE、NBD（7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール）、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット、クレシルブル-バイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラ-アミノ安息香酸、エリトロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプタート、ユーロピアムトリスバイピリジンジアミン、ユーロピアムクリプタートまたはキレート、ジアミン、ジシアニン、ラホーヤブルー染料、アロピコシアニン（allopycocyanin）、アロコシアニン（allococyanin）B、フィコシアニンC、フィコシアニンR、チアミン、フィコエリトロシアニン（phycoerythrocyanin）、フィコエリトリンR、REG、ローダミングリ-ン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ROX、TAMRA、TET、TRIT（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッドから構成される群から選択してもよい。これらおよびその他の標識は、Molecular  Probes（Eugene,OR）などの販売元から入手可能である。
【００６２】
実施例
種々の態様を説明するために、以下の実施例を挙げる。以下の実施例に開示する技術は、特許請求する方法、組成、および装置の実践において十分に機能することが発見された技術を表すことを、当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示の観点から、開示する特定の態様に多くの変更を行ってもよく、それでもやはり本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するはずである。
【００６３】
材料および方法
実施／プログラム特定の態様において、配列を視覚化するために、BioEditソフトウェアパッケージ（v.7.0.4.1）を使用した（Hall,1999）。可能な限り、BioEditインターフェース内の付属アプリケーションとして、その他のプログラムを起動した。Clustal  W（v.1.4）（Thompson  et  al.,1994）を使用して、複数の配列アラインメントを行った。系統樹を作り出すためにDNADIST（v.3.5c  in  PHYLIP  v.3.6）を使用した。系統樹を表示し、操作するために、TreeView（Win32,v.1.6.6）（Page,1996）およびMEGA3（v.3.0）（Kumar  et  al.,20004）を使用した。これらの既存のプログラムに加えて、以下の示すように、多くのPythonスクリプトを作成し実施した。ソフトウェアは、www.colorado.edu/chemistry/RGHP/software/でのGNU一般公有使用許諾を受けて利用可能である。
・label_tree.は、系統樹の視覚化および再分割を容易にするために、一意的な整数を有する.dnd  file（系統樹）におけるそれぞれのノードを標識化する。
・dnd2fa.は、.dnd（またはNewick.nwk）ファイル内の情報を、配列情報を含むFASTAファイルに変換する。
・fa2fa.は、一方のFASTAファイルのコンテンツを他方から減じ、残りの配列を含むファイルを出力させる。
・ConFind.は、特定のデータセット内の保存された領域を同定する（Smagala  et  al.,2005）。
・find_oligos.は、最低GC含有量、融解温度、およびシャノンエントロピーの要件が満たされるまで、保存された領域に沿って反復して歩くことによって、適切な捕獲および標識配列のすべてを選ぶ。
・pick_oligos.は、長さ、シャノンエントロピー、および融解温度に基づき、「find_oligos」から可能性のある捕獲および標識プローブの出力をランク付けし、オリゴのヌクレオチド位置がその他の捕獲-標識の対と重複していないというペナルティが最も低いオリゴ対を選ぶ。
【００６４】
データベース多数のインフルエンザウイルスのための配列情報は、例えば、公的に利用可能な、Los  Alamos  National  Laboratories（www.flu.lanl.gov/）［Macken  et  al.,2001］でのデータベース、およびCenters  for  Diseases  Control  and  Preventionin  Atlanta,GAが管理するデータベースから検出することができる。BLAST（Basic  Local  Alignment  Search  Tool）に使用される1つのデータベースでは、EST（Expressed  Sequence  Tags）データベースから取得されるヒトゲノム配列情報、およびインフルエンザのような病気を引き起こすいくつかの生物に関する配列情報を含む、同定された配列が作り出された。生物の例には、NCBI非冗長データベース（ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/）からのB型およびC型インフルエンザ、パラミクソウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、炭疽菌、コロナウイルス、アデノウイルス、レジオネラ菌、クラミジア肺炎菌、肺炎マイコプラズマおよび肺炎連鎖球菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。それぞれの捕獲および標識プローブの上部の鎖のみが、このデータベースに対してBLASTを使用した。デフォルト設定により、BLASTは、上部および下部の鎖を使用し、すなわち、配列およびその逆は、データベース内の配列の類似点のために検索を補完する。例えば、非インフルエンザ配列に結合またはハイブリダイズすることができる、10000より低いE値を有する個々の配列は、「ヒット」であると見なした。
【００６５】
一実験的アプローチ
例示的な一方法は、実施例1で使用されるマイクロアレイ上で増幅RNAの捕獲および標識プローブを作製するための実験的アプローチに関係する。つまり、捕獲プローブは、固体基板上で固定化し、ハイブリダイゼーションの間に標的RNAを結合する。本実施例において、捕獲された標的は、捕獲プローブに結合され、標的は、さらなるフルオロフォア共役オリゴヌクレオチド（例えば、標識プローブ）を使用して検出される。ハイブリダイゼーションおよび厳密な洗浄の後、5μm解像度にて、レーザーを基にした（532nm励起）蛍光性スキャナでマイクロアレイをスキャンする。
【００６６】
配列選択およびFluChip-55（商標）マイクロアレイ設計
実施例1に説明する方法論を使用して、インフルエンザ特異的捕獲および標識配列を選択した。FluChip（商標）装置での分析のために、計103の捕獲-標識の対を選択した。その他のいかなる核酸も非存在の状態で、室温で2時間、標識のインキュベーションにより、標準ハイブリダイゼーション緩衝液内で、捕獲配列に対する標識配列の直接ハイブリダイゼーションに由来する偽陽性信号の可能性を調査した。対応する標識プローブ、および増刷されたアレイとともに、アレイレイアウトから、標識プローブとの交差反応を示すと見なされた捕獲プローブを除去した。ウイルスのRNAが非存在の状態で、マイクロアレイが偽陽性を示さなくなるまで、この過程を反復した。
【００６７】
得られたアレイは、55の捕獲プローブ、および対応する標識プローブを含んだ（表3参照）。最終版は、A型インフルエンザ／HA遺伝子に対しては20の捕獲標識プローブ対、A/NAに対しては19、A/MPに対しては7、インフルエンザB/MP遺伝子に対しては2、B/NPに対しては4、および、B/HAに対しては3を含んだ。CDCによって提供された分離体からのウイルスのRNAの盲検試験のために使用されたアレイレイアウトを図5に示す。それぞれの捕獲プローブを3通りに点をつけた。それぞれのアレイでの陽性対照として、溶液内で相補的な蛍光標識化された配列を有する単一の捕獲プローブを使用した。陽性対照は、ハイブリダイゼーション条件が適切であるかどうかの直接指示だけでなく、見やすくするための空間マーカーの役割をする。
【００６８】
マイクロアレイスライド作製
本実施例において、本明細書に報告されたすべての研究のために使用された基質はアルデヒドで修飾されたガラス顕微鏡用スライド（Cel  Accociates  Inc.,Pearland,TX）であった。オリゴに点をつける技術に関するさらなる詳細が報告されている。その他の実施例において、3×SSC（1×SSC：150mM  NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）、50mMリン酸ナトリウムおよび0.005％サルコシンを含むスポッティング緩衝液中で10μMの濃度においてスライドの上で、5'-アミノ-C6-修飾捕獲配列（Operon  Biotechnologies,Inc.,Huntsville,AL）に点をつけた。固体コアピンおよび点の間の550μmのピッチを有する、Genetix  OmniGrid（Genetix,Boston,MA）マイクロアレイスポッターを使用した。予備試験研究のために、MicroGrid  II  Compactアレイヤー（Genomic  Solutions  Inc.,AnnArbor,MI）上で、同一の条件下で、さらなるスライドを印刷した。点つけの後、スライドを相対湿度100％下で一晩保存し、後に使用するまで-20℃で密封容器に保存した。
【００６９】
試料
CDCは、FluChip-55マイクロアレイの盲検試験のために72の試料を提供した。その後、試料セットは、3つの陰性対照を含むことが明らかになり、2つは水の試料および1つはウシ血清アルブミンを含むものであった。管理目的のために、独立した陰性（水）を試料セットに加えた。提供されたウイルス分離体は、ヒト、トリ、ウマ、イヌ、およびブタ種からの試料を表した。咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、気管吸引液または気管支肺胞洗浄液を含む、一連の技術によって最初の試料を得た。孵化卵か、またはMDCK細胞でウイルスを増殖させた。
【００７０】
一実施例において、RNeasyキット（Qiagen,Valencia,CA）により、尿膜腔液または細胞培養浮遊物から直接ゲノムRNAを抽出した。赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ遺伝子の配列決定によって、CDCでウイルス型および亜型を事前判定した。96のウエルプレートに未知のものとして試料を提供し、後に、プレートのウエル番号（例えば、横列A、縦列1からの試料A1）によって同定した。試験の第1期間を盲目的に実施し、試料の型または亜型は不明であった。結果の初期分析の後、再現性の評価のために、完全な試料セットを独立して再度処理した。
【００７１】
RNA増幅鋳型
PCR生成物を使用する、逆転写（RT）、続いてPCR、さらに続いて流出転写を使用して、それぞれの分離体からのウイルスのRNAを増幅させた。前述したように、SZA＋か、またはSZB＋「ユニバーサル」インフルエンザプライマーを使用して、SuperScript  II  Reverse  Transcriptase（例えば、Invitrogen  Corp.,Carlsbad,CA）により、逆転写を行った。MP、HAおよびNA遺伝子を増幅させるために、既に開示したプライマーの最適濃度を使用して、A型インフルエンザのためのPCRを行った（表3参照）。本実施例において、PCR条件は、94℃で2分、次いで2サイクルの94℃で30秒、50℃で30秒、および72℃で2分、続いて1サイクル当たり5秒をインクリメントする、35サイクルの94℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で90秒、ならびに72℃で10分であった。PCR生成物は、増幅を評価するために、臭化エチジウムが着色した1％のアガロースゲルで視覚化した。B型インフルエンザ特異的プライマーにより、アガロースゲルで有るか無しかの可視的生成物を示した試料を続いて増幅させた。
【００７２】
B型インフルエンザのHA遺伝子を増幅させるために、2つの新規プライマーを使用した（表3）。B型増幅のために使用したPCR条件は、94℃で2分、30のサイクルの94℃で1分、50℃で2分、および72℃で3分、ならびに最終的に72℃で10分であった。RT-PCRの間に使用された5'PCRプライマーは、T7RNAポリメラーゼ（Invitrogen  Corp.,Carlsbad,CA）による流出転写を可能にするプロモータ部位を含んだ。粗転写RNAを必要になるまで-20℃で保存した。
【００７３】
RNA定量化
Qiagen  RNeasyミニキット（Qiagen,Valencia,CA）による清浄化の間の試料損失の量を判定するために、既知濃度を有するRNAの溶液を使用した。RNeasyキットを使用して、転写ウイルスのRNAを精製し、260nm（A260）での光学的吸収の測定によって定量化した。粗転写生成物におけるRNAの濃度を逆算した。転写反応は、平均300μg/mlのRNAを生成した。
【００７４】
RNA断片化およびハイブリダイゼーション
説明したようにマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションに先立ち、転写RNAを断片化した。（Mehlmann,M.et  al.“Optimization  of  fragmentation  conditions  for  microarray  analysis  of  viral  RNA,”Anal  Biochem.2005  Dec.15；347（2）：316-23.Epub  2005  Oct  17、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる）。つまり、1μlの5×断片化緩衝液（200mMのトリスセテート、500mMの酢酸カリウム、150mMの酢酸マグネシウム、pH8.4）および4μlの転写RNAを75℃で25分間インキュベートした。その後、試料を氷上に置き、15μlの急冷／ハイブリダイゼーション緩衝液を最終濃度の4×SSPE（1×SSPE：150mMのNaCl、10mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7.0）、30mMのEDTA、2.5×Denhardtの溶液、30％脱イオンホルムアミド、およびそれぞれ200mMの適切な5'修飾Quasar（登録商標）570「標識」配列（Biosearch  Technologies,Novato,CA）に加えた。
【００７５】
ハイブリダイゼーションのために使用したスライドは、0.1％のSDS/4×SSC、4×SSC、ddH2O、最後にほぼ沸騰した水のそれぞれで5分間連続的に予洗し、使用するまで脱水した。室温で2時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの後、スライドは、0.1％のSDS/2×SSC、0.1％SDS/0.2×SSC、0.2×SSCのそれぞれで5分間洗浄し、脱水を行う前にddH2Oで簡単にすすいだ。
【００７６】
マイクロアレイ画像化および分析
532nmの検出、それぞれに60％および700Vのレーザー出力およびPMT感度、さらに5μmの解像度を有する、Bio-Rad  VersArrayスキャナ（Bio-Rad  Laboratories,Hercules,CA）を使用して、ハイブリダイズされた試料をスキャンした。Photoshop（Adobe,SanJose,CA）を使用して、像コントラストを最適化した。像のサブセットで定量的評価を行ったとはいえ、像の明瞭さを考えると、分析は、目視検査によって行った。対照条件：5つのボランティアのそれぞれは、マイクロアレイレイアウト（図5のように）が提供され、ぞれぞれの像の型および亜型を割り当てるように求められた。実験の最初の期間、加えて複製期間の両方のための盲検試験として、分析段階を実施した。結果の項により詳細に説明するように、ウイルス同定のための総体的なアッセイおよびFluChip（商標）装置のための統計的評価を得るために、ボランティアの結果を結集させた。
【００７７】
検出のマイクロアレイ上限（LOD）
MPRNAのハイブリダイゼーションの後、像の定量的評価のために、3を超えるバックグラウンドにおける雑音に対する蛍光信号（マイナスバックグラウンド）に比率によって定義されるLODを判定した。つまり、RT-PCRおよび上述の条件を使用したT7-転写によるMP特異的プライマーによって、試料D2を増幅させた。MPRNAの希釈系列を作り出し、断片化し、ハイブリダイズした。上述のように像をスキャンし、VersArray  Analyzer  Software（BioRad  Laboratories,Hercules,CA/Media  Cybernetics,Silver  Spring,MD）で処理した。
【００７８】
実施例1：型、亜型および／または株の検出および同定のためのインフルエンザウイルス標的配列の選択
例示的な一方法は、インフルエンザウイルスのゲノムにおける保護の領域を同定するために、大きなデータベースを分析するための効率的な方法を開示する。保護のこれらの領域から、異なるウイルス型と亜型とを識別することができる捕獲および標識配列を選択した。該方法の特性には、データ整理のための系統樹の使用、およびインフルエンザウイルスの広域スペクトルを表すための比較的少数の捕獲および標識プローブの選択が含まれる。選択された配列の詳細な実験的評価を以下に説明する。
【００７９】
図1は、2段階の二段階ハイブリダイゼーション過程を使用して、ウイルスのRNAの捕獲および検出を方向付けるために使用される一方法を表す。一側面において、本明細書に企図されるアレイを設計するために切望される配列情報を取得することに関して、いくつかの困難が存在する。多くのウイルス標的付属物を特異的亜型に結合することができる、限定された数の捕獲プローブを使用することは望ましい。これは、捕獲プローブが、既知の配列を有する、単一の特定の遺伝子に由来する遺伝子発現の試験に直面するものとは状況が異なる。
【００８０】
次に、インフルエンザは、高突然変異率を有するRNAのウイルスである。ウイルスが突然変異するにつれて、ある時点で時間内に判定された保護の領域は、変化する可能性が高い。高突然変異率は、現在利用可能な当該のデータセットを簡略的、機能的アレイを含む、核酸配列の少なくとも一部分に結合することができる一連のオリゴヌクレオチドに減少させるための迅速で信頼性のある方法を必要とする。
【００８１】
その結果、配列情報を有する、公的に利用可能な多くのデータベースが存在する。現に、National  Institutes  of  Healthは、National  Institute  for  Allergic  and  Infectious  Disease  Influenza  Genome  Sequencing  Projectにこれまでに資金を供給しており、何千ものインフルエンザウイルスの完全な配列の迅速な利用の可能性を目指している（例えば、www.niaid.nih.gov/dmid/genomes/mscs/default.htm#influenza参照）。かかるデータベースは継続的に増大するので、それらから所望の情報を抽出する系統的方法が必要となる。
【００８２】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイのためのプローブの設計は、最近の再検討の対象となってきており、（Russell,2003；Tomiuk  and  Hofmann,2001）およびいくつかのソフトウェアツールは、マイクロアレイプローブを設計するために開発されてきた。例えば、OligoWiz（Wernersson  and  Nielsen,2005；Nielsenetal.,2003）は、特異性、融解温度、転写内に位置、複雑性および自己アニーリング能力の5つの異なるパラメータを考慮に入れることによって、可能性のあるプローブを検索するプログラムである。ユーザーは、これらのパラメータのそれぞれに対して重さを割り当て、合計得点が計算される。プログラムは、最高得点を有するオリゴヌクレオチドを選出する。さらに、マイクロアレイオリゴ選択のために特に設計されていないが、とりわけ大規模の配列決定の目的のために、プライマーを検出し、最適化するために使用される、その他のプログラムが利用可能である。
【００８３】
上述のものなど、最新の利用可能な配列選択ツールの目的は、単一の生物内で、単一の遺伝子を標的にするプライマーまたはプローブを検出することである。一般に、実験のための配列は、標的に対する特異性、ハイブリダイゼーション条件における類似性、クロスハイブリダイズする能力がないこと、および配列セットによる当該の遺伝子の「範囲」に基づき選ばれる。
【００８４】
インフルエンザウイルスの型分類および亜型分類については、捕獲および標識プローブが、特異的ウイルス株の単一の遺伝子のみを標的にせず、同じ亜型の多くのウイルスを標的にするはずであるので、目的は、要求がより厳しい。かかる捕獲および標識配列を設計するために、一連のウイルス株からの配列は、複数のウイルスを標的にすることができる領域を同定するために、調査されなければならない。
【００８５】
PROFILES,Rodrigues  et  al.（1992）を使用することは、コンセンサス配列を作り出すことによって、またこのコンセンサス配列とのヌクレオチの差異を示す配列の数を記録することによって、口蹄疫ウイルスからの整列した配列のための「相同プロファイル」を計算した。配列間での類似点または差異を視覚化するためにこれらのプロファイルを使用し、次いで、「相同プロファイル」を単に検査することによって、プライマー対を手作業で選んだ。
【００８６】
Primer  Premier（PREMIER  Biosoft  International,Palo  Alto,CA）は、所与のセットの配列のためのプライマーおよびマイクロアレイ配列を設計するための既存の市販用プログラムの例である。多くの場合、不完全で非重複的な領域を含む、インフルエンザなど、非常に突然変異しやすいウイルスのための大規模なデータベースに対する、アプリケーションにおける制限的な要件は、セット内のすべての配列が、特異的なヌクレオチドの範囲全体にデータを含む必要があることである。対照的に、セットの一部分のみが不完全な領域を含む場合でさえ、保存された領域が同定されるように、本明細書に提示する方法は、より堅調である。
【００８７】
PRIME（Gibbsetal.,1998）は、一連の配列の調査に対して、最も類似した既存のプログラムである。整列したセットの配列を発端に、GPRIMEは、「不明確コンセンサス」を使用して、データセット内の特異的長さの相同領域を検出する。Gibbs  et  al.（1998）によって説明される用途において、冗長値、融解温度（Tm）、ギャップ、および可能性のある二次構造を調査することによって、相同領域を手作業で選択した。標的ゲノムのための特異性を判定するためのFASTA検索を使用して、選んだ配列とEMBLデータベースとを比較した。さらに、PCRプライマーが、2つのデータセットからのコンセンサス配列間の差異を指摘することによって、データの2つのサブセット間の区別する可能性もある配列領域を同定するツールを概説した。ウイルス症状を示す蘭の葉から抽出したRNAとの別個のRT-PCR反応を準備する能力に関して、選んだ配列を試験した。非常に限定的なデータセットに適用され、マイクロアレイの用途のために使用されなかったとはいえ、これらのプログラムは、診断的用途のための捕獲オリゴヌクレオチドの選択に対する、より系統的なアプローチの構想を取り入れる。
【００８８】
捕獲と標識との対の効率的な同定のために本明細書で説明する方法は、一連の整列した配列から始める。しかしながら、GPRIMEによって使用される限定的なデータセットと対照的に、本試験における個々の遺伝子に特異的なデータベースは、最大1000あるいはそれ以上の配列を含んだ。「過半数コンセンサス」を使用して、特定のシャノンエントロピーの要件を満たしている最小長の保存された領域を検出した。本明細書で説明する方法は、アレイプローブ、加えてPCR実験のためのプライマーを設計するために使用することができる。
【００８９】
本試験は、大規模なデータベースを採掘するためのアルゴリズムを発展させ、マイクロアレイ上で広範囲の異なるインフルエンザウイルスの型分類および亜型分類を可能にする潜在的な捕獲および標識配列を検出する。以下の実施例2に説明するように、マイクロアレイアッセイは、マイクロアレイ表面上での短い（約25-mer）「捕獲」DNAオリゴヌクレオチドの固定化、捕獲配列に対するインフルエンザRNAのハイブリダイゼーション、および標的RNAの第2の領域に対するフルオロフォア共役「標識」DNAオリゴヌクレオチド（約25-mer）のハイブリダイゼーションによる検出から成った。さらに、捕獲プローブが、相補的標識プローブに直接アニールしたいくつかの陽性対照の点は、見やすいようにマイクロアレイ設計に含まれた（図1）。
【００９０】
確定した一連の基準を満たすように、捕獲および標識配列を設計した。
-配列は、標的遺伝子セグメントに特異的であり、その他の捕獲および標識配列との交差反応を示さなかった。
-可能な限り多くの異なるインフルエンザウイルスの型分類および亜型分類を可能にするために、広範囲のインフルエンザウイルスにわたり配列を保存した。
-それぞれの捕獲および標識プローブは、長さで16と25ntとの間であった（これらの長さは、十分に高い融解温度および十分な特異性をもたらす）。Chandler  et  al.（2003）が説明した理由のために、捕獲および標識プローブは、互いに隣接し、たった1つのヌクレオチドによって隔てられた。長さで少なくとも45ntの保存された領域は、これらの制限内で捕獲および標識配列を可能にした。
【００９１】
方法開発-保存された領域の検出
図2に示すフローチャートは、当該の特定のデータベースのために保存された領域を検出する全体的な過程を説明する。利用可能なすべての配列から、特異的遺伝子および亜型（例えば、A型インフルエンザ、HA遺伝子、H1亜型）のみから成る配列を含む遺伝子特異的なデータベースを作成し、FASTA（配列整列パッケージ）フォーマット（図2、段階1）に変換した。特定の場合では、作成された遺伝子に特異的なデータベースは、開始年の明細書によって、特に、大いに循環し、結果的に頻繁に配列されるウイルス亜型によって限定された。遺伝子に特異的なデータベースが作成されると、ClustalW（step2）v.1.4（Thompson  et  al.,1994）を使用して、複数の配列整列は、データセットで行われた。ブートストラップ＝1000およびktuple＝4を有するFASTアルゴリズムを使用して、複数の整列が行われた。さらに、近隣結合系統樹を作り出した。最大尤度および最節約法を使用した、より厳密な系統樹が可能であるが、データベースのサイズが大きく、より厳密な方法を適用する際に必要な計算時間が長いために、近隣結合アルゴリズムが選ばれた。系統樹のノードは、該樹を後に分割する際に役立つように任意に番号付けされた。
【００９２】
保存された領域（CONserved  regions  FINDer）の検出器（図2の段階4で「ConFind」と称される）を組織内で作成し、BioEditでの「Find  Conserved  Regions」オプションのモデルとした。利用可能なこのソフトウェアのすべての記述は、他の所でも見ることができる（Smagala  et  al.,2005）。BioEditでの「Find  Conserved  Regions」は、すべての配列が、特定のヌクレオチド範囲のわたりデータを含むことを要求する。つまり、「ConFind」は、含まれた配列の一部分のみが、特定の位置で配列情報を含む場合でさえも、保存された領域を検出できるように作成された。
【００９３】
このプログラムは、BioEditインターフェースで起動し、値は、保存された領域の最小長、塩基当たりのシャノンエントロピーの最大許容ビット、このシャノンエントロピーの要件に対する許容例外の数、およびその位置の保護が考慮されるための位置に必要な配列の最小数に対して定めることができる。45ntの最小長、塩基当たりのシャノンエントロピーの0.2許容ビット（2つの許容例外を有する）、および最低限10の配列に対して、デフォルト値を定めた。これらの要件のストリンジェンシー（段階3）は、特定の状況に応じて、程度の差はあるが保存された領域の選択を可能にするために頻繁に変化する。
【００９４】
「ConFind」は、図2の段階4で言及したように、デフォルトのストリンジェンシー要件を使用して、遺伝子に特異的なデータベースに適用した。保存された領域が検出された場合は、図2の段階6で言及したように、最初の配列情報、保存された領域の位置、および位置シャノンエントロピーに関する情報をファイルするための出力した。保存された領域が検出されない場合は、ストリンジェンシーを緩め、該手順を反復した。多くの場合、非常に緩んだストリンジェンシー要件を適用した場合でさえ、インフルエンザウイルスの遺伝的変異性は、遺伝子に特異的なデータベース全体に対して保存された領域の同定を阻止した（時に、1000以上の配列を含む）。その後、保護のさらなる領域を検出する目的で、段階10および段階11に示すように、系統樹を調査し、より小さなサブツリーに分割した。場合によっては、例えば、ウイルスの年齢、地理的領域、宿主生物など、配列の「差異」または「類似性」を判定するために、多くの異なる基準を設定する可能性もあるので、この過程は自動化しなかった。
【００９５】
この分析の検出力は、過程が非常に目標が明確であり、異なる所望の最終目標は、系統樹の異なる分解をもたらす場合があるという事実にある。段階3での順次入力として使用するために、サブツリー（配列情報を含まないNewickツリー形式において）をメインツリーから抽出し、FASTA形式（段階12）に変換した。目標のうちの1つが、限定された一連の捕獲および標識配列を有する、多くの「異なる」インフルエンザウイルスを捕獲することであるので、系統樹は、最初は、必要であったように少数のサブセットに分解された。保存された領域が、調査された遺伝子に特異的なデータベース内の配列を適切の表すと見られたら、捕獲および標識配列を選択した。
【００９６】
方法開発-保存された領域からの捕獲および標識配列の選択
多くのインフルエンザウイルス内の配列の「保護」が、重要な基準であるとはいえ、二次構造融解温度、G/C含有量および長さを含み、捕獲-標識の対の選択を最適化するために、いくつかのその他の基準を設定した。最初に、特定の基準のすべてを反映する「コア」（以下に説明する）に基づき、A型インフルエンザHA亜型1、3、A/NA亜型1および2ならびにA/MPを表す28の捕獲／標識配列を手作業で選択した。その後、非常に多くの対のセットを選択するために、所定の選択手順を自動化した。
【００９７】
自動配列選択については、単一の保存された領域内で可能性のあるすべての捕獲-標識の対の同定を可能にするさらなるプログラム（「find_oligos」）を作成した。図3に概説するように、アルゴリズムは、位置1で始まり、保存された領域に沿って反復して歩き、1つのヌクレオチドによって隔てられた配列の対を検索する。さらなる要件は、それぞれの配列が16と25ntとの間である長さ、50℃の標識および捕獲配列の両方のための逆相補に対するアニーリングのための最低融解温度（Tmと一致）、MFOLD（Zuker  et  al.,1999）によって判定するような最も高い確実性の二次構造のための35℃の最高融解温度、および30〜70％の間のGC含有量である。それぞれの配列に対して長さの範囲が16〜25ntであるために、長さが異なるいくつかの対は、それぞれの開始位置で検出される可能性もある。いくつかの対が検出される場合は、保護が最高の対、すなわち、最高シャノンエントロピー得点が最低の対を選んだ。いくつかの可能性のある捕獲-標識の対が、この開始位置でまだ残る場合は、最長のものが選ばれた（図3、段階2）。以下の規則により、同定された可能性のある捕獲-標識の対（図3、段階3）をランク付けするために、さらなるプログラム「pick_oligos」を作成した。
【００９８】
「優良な」捕獲と標識との対は、高度に保存された（例えば、低シャノンエントロピー）はずであり、非常に突然変異しやすい任意の存在する位置は、別個のオリゴに位置すべきである。ハイブリダイゼーションの安定性を改善するために、より高い融解温度を有する、より長いオリゴが好ましい。表1に概説したように、一連のペナルティを定義することによって、ランク付けを行った。試験データセット上の「pick_oligos」プログラムから生じるランク付けが、熟練の研究者が行う手作業のランク付けの結果と一致するように、ペナルティ値を実験的に選んだ。「pick_oligo」プログラムは、最低のペナルティとの捕獲-標識の対、および選んだ対と順次重複を有する除去された捕獲-標識の対を選んだ（図3、段階4＋5）。可能性のある捕獲-標識の対が残らないようになるまで、この過程を反復した。
【００９９】
（表１）最終的な配列選択のための可能性のある捕獲-標識の対に割り当てられる実験的なペナルティ
2009523451.tif 000003
＊E1およびE2は、調査された捕獲-標識の対内で上位2のシャノンエントロピーである。
【０１００】
安定性については、単一の配列上での2つの可能性のある不一致を有するよりも、2つの別個の配列上での2つの可能性のある不一致を有することが好ましい。
【０１０１】
方法実施
表2に示すように、計4917のインフルエンザ配列を15のより小さな異なる遺伝子に特異的なデータベースに分割し、異なる遺伝子に特異的な亜型（例えば、H1、N1、N3）を表す。非常の大きな数の配列（1000より大きい）を含むデータベースは、一般に、比較的最近のウイルスのみ調査することによって減少させ、インフルエンザの急速な進化的性質を考慮した場合妥当となるようにする。遺伝子に特異的なデータベースを使用して、保存された領域を検出するために「ConFind」を使用し、何も検出されない場合は、後に論じるように、より小さなサブセットにデータベースを分割した。それぞれの遺伝子に特異的なデータベースに対する保存された領域の総数を表2に示す。
【０１０２】
捕獲と標識との対を検出するための提示した方法の独自の側面は、元の遺伝子に特異的なデータベースをいくつかのより小さなサブセットの「分解」である。この「分解」は、まさに問題に特有の任務であった。研究目的に応じて、系統発生的系統、ウイルスの年齢、起点の地理的な領域、宿主種、試料前処理など、多くの異なる基準により、分解を実施することができる。
【０１０３】
インフルエンザマイクロアレイについては、系統発生情報と抗原性とのつながりがあるので、系統発生情報により、それぞれの遺伝子に特異的なデータベースを細分した。一例として、A型インフルエンザのNA遺伝子のN1亜型のツリーの分解を図4に示す。この例において、保存された領域の検出の項で説明したパラメータを使用すると、499N1配列の完全なるセットに対して保存された領域は検出されなかった。系統樹の目視検査は、4つのより小さなサブセットへの論理分解を示唆し、別個に分析された。サブセットAは、16の配列から成り、すべてはH1N1亜型から成り、大部分は、1950年以前にヒトで循環する株であった。
【０１０４】
（表２）最初のインフルエンザ配列データベースの説明、および説明された保存された領域および配列選択法の適用からの結果
2009523451.tif 000004
1表示する年は、含まれた最早年であるが、「すべて」は、利用可能なすべての年からの配列が分析に含まれたことを示す。
【０１０５】
計6の保存された領域が、このサブセットで検出された。サブセットB（156の配列）は、ほんのわずかの例外があったが、ヒトに感染するH1N1亜型の最近の循環ウイルス（最後の10年以内）からの配列を含んだ。このサブセットについては、7つの保存された領域が検出された。サブセットC（51の配列）は、大部分は、1970年代後半から1990年代に、動物で循環するH1N1亜型のインフルエンザウイルスからの配列を含んだ。サブセットCは、サブセットDからの動物N1配列とサブセットBからのヒトN1配列との遷移と見なすことができる。動物とヒトの株との大きな遺伝的多様性のために、当初は、サブセットCに対しては保存された領域は検出されなかった。サブセットDは、最後の8年から276の配列を含み、大部分はH5N1亜型であった。これらのH5N1株は、大部分はトリ種で循環していたが、サブセットDはまた、ヒトが病気にかかる31のトリの株を含んだ。サブセットDに対して、計6の保存された領域が検出された。サブセットBおよびDは両方とも、最近ヒトを感染させたウイルスからの配列情報を含んだので、これらのサブセットは、最初の分解で説明したものと類似する方法でさらに評価した。
【０１０６】
保存された領域が当初は検出されなかったので、サブセットCも同様に、さらに分析した。特定のデータセット内の十分な保存された領域の判定は、配列選択可能での第1の段階に過ぎないが、可変長の保存された領域をもたらした（表2、縦列5）。しかしながら、マイクロアレイアッセイは、1ntのギャップで標的分子にアニールする、固定化捕獲オリゴヌクレオチドおよび別個のフルオロフォアで標識化されたオリゴヌクレオチドを要求し、両方とも長さは約16〜25ntであった。従って、次の段階は、保存された領域内で、すべての適切な捕獲と標識との対を検出ことに関与した。スクリプト「find_oligos」および「pick_oligos」によって、適切な捕獲と標識との対を検出した。保存された領域内の可能性のあるすべての捕獲と標識との対を検出するために「find_oligos」プログラムを使用したが、「pick_oligos」プログラムは、上述のシャノンエントロピー、融解温度、および長さにより、検出された配列をランク付けした。さらに、「pick_oligo」プログラムも同様に、最高（最低）得点を有する捕獲-標識の対を選んだ。
【０１０７】
干渉可能性の評価
インフルエンザを同定するために、標的遺伝子のオリゴヌクレオチドを発生させるための捕獲と標的の配列を選択する際の最終段階は、BLASTを使用して、可能性のあるクロスハイブリダイゼーションを検索することであった。本実施例において、標的RNAハイブリダイゼーション混合物に存在する可能性があり、さらに、偽陽性信号をもたらす、同定された捕獲と標識との対にハイブリダイズする可能性がある、潜在的な干渉種からの配列を含むさらなるデータベースが必要とされた。利用可能なすべてのゲノムに対してBLASTを使用することは非現実的であったので、ヒトのmRNAおよびインフルエンザのような病気を引き起こすその他の微生物からのゲノム、加えてB型およびC型インフルエンザに対するゲノム（材料および方法の項に説明するように）を含む、より小さなデータベースを作成した。2つに段階のハイブリダイゼーションのために、標識配列のいずれかを伴う捕獲配列のうちの1つが、同じ遺伝子にハイブリダイズする場合は、非標的生物からの偽陽性信号のみが、マイクロアレイ上に観察することができる。このようにして、捕獲プローブが、データベース内で遺伝子の少なくとも一部分を「ヒットする」または結合すると見られる場合は、標識プローブも同様に結合したかどうか調べるために、第2の段階の比較を実施した。捕獲および標識配列の両方が、同じ遺伝子をヒットすると見られた場合は、マイクロアレイ上での偽陽性信号の可能性のある発信源として、配列を廃棄した。
【０１０８】
アクセスされたインフルエンザのデータベースのすべてから同定された629の保存された領域から、「find_oligos」および「pick_oligos」プログラムを適用した後、総数447の可能性のある捕獲-標識の対（表1）を選択した。これら447の捕獲-標識の対から、最初の実験評価のために、A型インフルエンザHA亜型1、3および5、A/NA亜型1および2、A/MP、B/MP、B/NPならびにB/HAを表す最高得点を有する75の対を選んだ。手作業で選んだ28の配列と一緒に、計103の捕獲／標識の対を実験的に評価した。本方法によって同定され、実験的に精密化された配列を表3に列記する。表3（欄見出しは「保存された領域」）の太字の標的配列は、特定の好ましい態様で使用するために選択された標的配列を表す。
【０１０９】
実施例2：インフルエンザの型、亜型、および株を診断するためのマイクロアレイ解析
インフルエンザを地球規模で監視することは疾病管理の向上に欠かせないことであり、インフルエンザの世界的な大流行の影響を減少するために特に重要である。高度な監視には、インフルエンザウイルスの株を詳細に解析することができる、迅速、強固、かつ低費用の解析技術が必要である。低密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、高度に多重化されたインフルエンザに対する「シグネチャー」を用いて、多くの望ましい特性を提供する。しかし、インフルエンザウイルスは変異性が高く、そのことが設計上の課題となっている。
【０１１０】
例示的な一方法において、A型インフルエンザウイルスH1N1、H3N2、およびH5N1を比較的迅速に同定するための、インフルエンザマイクロアレイ「FluChip-55（商標）」装置の設計および特性を本明細書に記載する。本実施例において、現在ヒト集団に循環しているAおよびB型インフルエンザウイルス、そして東南アジアで家禽類にはびこるトリA/H5N1ウイルスを、広い適用範囲に渡って網羅するために、小さな1組のオリゴヌクレオチドを選択した。ウイルスRNAの抽出および増幅を含む完全なアッセイを開発し、テストした。
【０１１１】
72のインフルエンザ分離株を用いた例示的な盲検試験において、さまざまなAおよびB型のインフルエンザウイルスのRNAを増幅し、ハイブリダイズしてから蛍光標識して可視化した。合計解析時間は12時間以内であった。2つのアッセイを組み合わせた結果、平均71％の分離株について型分類および亜型分類が行われ、正確な型および部分的な亜型情報13％、正確な型のみ10％、偽陰性5％、および偽陽性1％であった。全体として、アッセイは、およそ95％の分離株について正確な型および／または亜型情報を提供した。不完全な亜型分類が見られた圧倒的大多数の場合において、失敗はマイクロアレイの限界によるものではなく、むしろRNA増殖過程によるものであった。テンプレートRNA増殖のためのプライマー配列および条件の最適化は当該技術分野で既知であり、当業者は通常の実験を通して成し得るものである。
【０１１２】
インフルエンザの株同定に関する最新技術には、通常、ウイルスの分離、培養、およびイムノアッセイによる特徴付けが必要である。培養ウイルスを免疫細胞学的に特徴づけする方法は、ウイルス検出において「最も信頼できる基準」と考えられており、さらなる特徴付けのために大量のウイルスが作製される。残念ながら、本方法では、抗原性テストの前にウイルスを3〜7日培養する必要があり、わずか数個の試料しか同時にテストすることができない。インフルエンザゲノムを増殖するために複数のプライマー対を使用する多重ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）アッセイは、ウイルス同定の感度および速度を向上した。このアプローチにおいてインフルエンザRNAは、相補的なDNA（cDNA）に逆転写（RT）され、次にPCR増殖されてインフルエンザ特異的なプライマーを有する二本鎖DNA（dsDNA）産物になる。しかし、マルチプレックス反応に使用される、適合性のあるプライマーの数に限りがあるため、単一のアッセイで増殖可能な遺伝子の数が制約される。最近開発されたアッセイの多くは、少量のウイルスを極めて少ないウイルス特異的な情報に同定すること、または、追加情報を得るために少ない数のウイルスをスクリーニングするかのどちらかに制限された状態である。
【０１１３】
ある方法において、マルチプレックスは、何千もの異なる核酸配列を同時にスクリーニングするための手段を提供するDNAマイクロアレイ技術が可能である。DNAマイクロアレイは、標的遺伝子のセグメントを結合するために固体表面に固定したオリゴヌクレオチド（捕獲プローブ）を使用する。長い配列は不適当な組み合わせに対する寛容性がより高いため、より長い捕獲プローブを使用することで、遺伝子学的に多様な一連の配列を検出することが可能になる。より短い捕獲配列に基づくオリゴヌクレオチドアレイは、類似する遺伝子配列間でより大きな特異性および識別を達成するための手段として提案されてきている。
【０１１４】
以前に配列選択のために開発されたアルゴリズム（Mehlmann,2005）を用いて、また実施例1に記載されるように、低密度のマイクロアレイは、重要な3つのA型インフルエンザウイルス、およびいくつかのB型インフルエンザウイルスの亜型解析のために、比較的小さい組の捕獲および標識配列（55、「FluChip-55（商標）」装置）を使用するよう設計された。マイクロアレイの徹底した盲検試験の結果を本明細書に記載する。この試験が他と異なる点として、マイクロアレイの設計、標的DNAではなく標的RNAを仕様すること、そしてマイクロアレイをテストするために使用される様々なウイルスが挙げられる。盲検試験はCDCによって提供された72の未知の試料を用いて行われた。試料は、ヒト、トリ、ウマ、イヌ、およびブタを含むいくつかの種から単離した最近のインフルエンザウイルスのRNAを含有していた。また、以前にインフルエンザ陽性と分かったが亜型の情報は提供されなかった9人の患者の試料もマイクロアレイでテストした。
【０１１５】
盲検試験の結果
A/H1N1、A/H3N2およびトリA/H5N1亜型についての代表的な結果を図6に示す。所定の型および亜型の可能な配列すべてが等しい確率で結合するわけではないことに注目されたい。3つのスポットすべてについて、特異的な捕獲配列に対応する陽性の蛍光信号として結合を定義することができる。積分信号およびバックグラウンドの定量値と比較することにより、2を上回る信号／背景比は、目視検査によって容易に識別されると判定された。目視検査の利点は2点ある。結合を判定するための意思決定プロセスにおいて、全体像を迅速に評価できること、そして必要な空間的な登録の検討が容易であるという点である。
【０１１６】
以前に詳述したように、単純で固定された信号／背景比は、ウイルスの存在を示す指標とみなされる結合を表すために存在しなければならない、背景における変動、ハイブリダイゼーションの効率、パターン（所定の列に陽性3つなど）の原因になりにくいため、所定のスポットに対する結合の判定に使用することは適切ではない。究極的には、パターン認識ソフトウェアが自動割り当てに利用されると考えられる。
【０１１７】
視覚的に結合と同定された配列については、相対的な蛍光信号強度の変動が、ウイルスRNAが捕獲および標識化された程度を反映する。所定の亜型に結合するオリゴヌクレオチドのパターンにおける相違が観察された。例えば、H1N1ウイルス（図6A）およびH5N1ウイルス（図6C）のN1捕獲配列上の結合を比較すると、単一の亜型のパターンにおける変動性が明らかである。四角で囲んだN1領域内で、配列1、6、および7はH1N1ウイルスに結合し、5、7、および9はH5N1ウイルスに結合している。マイクロアレイの配列選択アルゴリズムは、所定の系統樹の「枝」に一致する捕獲／標識プローブ対を選択するように設計されていたため、これは予想されたことである。N1など、所定の遺伝子特異的亜型の系統樹の分岐は、宿主種またはウイルスの亜型に特異的な枝をもたらす（一般のヒトH1N1ウイルスからの枝とグループ化され、その枝に発生したトリH5N1のN1配列など）。従って、陽性の割り当ては、特異的な遺伝子（MP、HまたはNなど）のために設計された所定の一連の配列において単一のヒットまたは結合のみを必要とする。誤った割り当て（ヒットまたは結合がN1とN2の両方に割り当てられるなど）は、たとえある程度正確な情報が得られていたとしても、すべて偽陽性として列記された。
【０１１８】
テストした試料の大多数が、明確ではっきりとしたインフルエンザの型および亜型同定を表す像を形成した。5人による目視検査を通して、両方の実験からのマイクロアレイ像を同定に使用した。A型インフルエンザのプライマーを用いて処理した試料の割り当てを図7にまとめた。バーは、所定のカテゴリー内における試料割り当ての割合の平均値を表し、エラーバーは5つの割り当てからの±1標準偏差である。RNA増幅にA型インフルエンザのプライマーのみを用いた割り当てのカテゴリーは、完全かつ正確な（Aまたはマイナス、HおよびN）、正確な型および部分的な亜型（例えばAまたはマイナス、HもしくはNのいずれか、両方以外）、正確な型のみ（例えばAまたはマイナス、HでもNでもない）、偽陰性（情報なし）、および偽陽性（誤った割り当てすべて）であった。図7A〜7Bにまとめられた結果は、ウイルスRNAの増幅および断片化、それに続くハイブリダイゼーション、標識化、およびマイクロアレイの洗浄を含む、完全なアッセイを反映するものであることに注目することが重要である。全般的に低めの信号／背景比の値を示した最初の盲検試験では、64±2％の試料に割り当てが正確に完了した。17±2％の試料から、正確な型分類および部分的な亜型分類の情報が得られた。12±2％の試料からは正確な型分類のみの情報が得られ、亜型に関する情報は得られなかった。偽陰性および偽陽性は、それぞれ5±1および2±1％の試料に観察された。
【０１１９】
複製試験では、全般的に高めの信号／背景比の値の像が得られ、割り当ての完成度がより高いことを反映する結果となった。試料の78±4％の割り当てが完了し正確であった。12±2％の試料に、正確な型分類および部分的な亜型分類の情報が得られた。6±2％の試料から正確な型分類のみの情報が得られ、亜型に関する情報は得られなかった。偽陰性および偽陽性は、それぞれ3±0％および0.3±0.5％の試料に観察された。
【０１２０】
不完全な割り当ての解析。盲検試験と複製試験の結果を合わせると、平均71％の試料が正確かつ完全な同定という結果となった。しかし、残り29％の試料は、不完全な割り当て、または、ごくまれにではあるが、誤った割り当てであった。2つの試験後、失敗を注意深く解析することにより、マイクロアレイの性能に関する見識を得た。72の未知の試料のうち、いくつかはFluChip-55（商標）マイクロアレイで覆われていないウイルスのRNAを含んでいた。例えば、12の試料は、遺伝子特異的なA型インフルエンザの亜型H6,H7,H9、N3、N7、およびN8のRNAを含んでおり、同定を誤った試料の約1/3を占めていた。FluChip（商標）装置の将来版は、より完全に網羅するためにより多くの亜型を含むことになると考えられる。
【０１２１】
増幅の過程を評価するために、各試料のPCR産物をアガロースゲル上で解析した。マルチレーンゲルの代表例を図8に示す。始めの2つの試料C8およびF8は、増殖に成功したMP、NAおよびHA産物を表す陽性対照であり、その後完全に正確なウイルスの同定が可能であった。残りの試料A2〜H8は、1つまたは複数の遺伝子について明らかにミスされた産物を提示した。この場合の「ミスされた」とは、PCR産物濃度がゲルの検出限界濃度（約2ng）を下回ることを意味することに注目することが重要である。試料A2は、「N1」亜型の「A型インフルエンザ」と割り当てられ、HA亜型の同定は行われなかった。試料A2からのPCR産物の解析は、MPおよびNA遺伝子の増幅を示唆したが、観察可能なHA遺伝子の増幅は見られなかった。
【０１２２】
別の例E1では、正確なHA亜型の同定は行われたが、NA亜型は「ミスされた」。MP遺伝子は非常に増殖しており、HA遺伝子に対応するバンドがわずかに見えたが、認識可能なNAの産物は観察されなかった。この傾向に対する1つの例外は、試料C9であるA/H3N8ウイルスであり、マイクロアレイ像の解析からHA産物は示唆されたが、H亜型の同定は見られなかった。この場合、HAは明らかに増殖されたが、うまくマイクロアレイにハイブリダイズされなかった。ハイブリダイゼーション失敗の理由として考えられるものを以下に記載する。増殖段階に依存しないマイクロアレイの性能を、ミスした捕獲／標識プローブ（上で詳述したように）およびミスしたRNAの両方を考慮して評価した。補正したマイクロアレイの結果をまとめたものを図7Cおよび7Dに示す。この場合、マイクロアレイそのものが、試料の98％にまで完全かつ精密な情報を提供したことが明らかである。
【０１２３】
偽陽性の解析
図7に表されるように、盲検試験と複製試験の両方に基づき、平均約1％の試料が偽陽性を割り当てられるという結果だった。絶対的には、わずか8つの応答のみが偽陽性として割り当てられた。これは、観察したプライマーで増殖した720以上（72試料×5ボランティア×2試験）のA型インフルエンザの試料像のごくわずかに過ぎない。特に、盲検試験の試料E8は、陰性であるにもかかわらず、5人中4人のボランティアによって「A/H1」であると割り当てられた。しかし、複製試験では、5人のボランティア全員が、E8を陰性であると正確に同定している。最初のE8試料に関する慎重な評価は、干渉の可能性のあるマイクロアレイのアーチファクト（配列のH1領域における小さい異常なスポットの形態、およびMP領域における陽性対照の空間的混合など）を示唆するものであった。同様に、試料E9は、盲検試験で2人のボランティアによって「H1」および「A/H1」と同定されたが、複製試験において5人全員のボランティアから正確に陰性であると同定された。また、試料G9はA/H7N3ウイルスであったが、「A/N1」また「A/H1」であると各々一度ずつ不正確に同定された。異常なスポットの形態および陽性対照のスポットとの空間的混合も、これらの各偽陽性の原因である可能性がある。
【０１２４】
全体として、偽陽性率約1％は、当該分野で既知であるその他多くのインフルエンザ診断試験の性能に匹敵するか、もしくはそれより低いものである。短いオリゴは、ミスマッチ慣用性が低いために高い特異性が得られる一方、溶液中の類似するオリゴヌクレオチドを捕獲する確率が高くなるため、オリゴヌクレオチドアレイを設計する上での懸念となっている。しかし、インフルエンザRNAを、表面に結合した捕獲プローブおよび標識溶液にハイブリダイズすることにより、より高い選択性を得ることができる。従って、以前の同様のオリゴヌクレオチドアレイと比較して、2段階式のハイブリダイゼーションスキームは、偽陽性のヒット数を減少することに役立った可能性がある。
【０１２５】
偽陰性の解析
72の未知の試料を用いた両方の試験から、完全アッセイにより、偽陰性の信号は平均4.0％という結果がもたらされた。偽陰性は、捕獲および／または標識プローブと標的RNAの配列の相補性が低いこと、あるいは非理想的なRNAの近接性によって発生することがある。一本鎖RNAの高度に構造化された性質を考慮すると、近接性の欠如または非理想的な断片化から、マイクロアレイの捕獲および標識配列にうまくハイブリダイゼーションしない可能性も起こり得る。化学的な断片化試薬を使用した場合、RNAの二次構造が、不均一な切断につながる可能性があることが記録されている。採用した方法の塩基触媒によるRNAの断片化が、ゲノムの特定領域中の捕獲および標識プローブとの相互作用を防ぐ位置で選択的にウイルスRNAを切断しており、そのためにマイクロアレイ上の捕獲および／または検出を防いでいるということも考えられる。RNAの構造的特性を減少するために断片化が行われたが（Small  et  al.,2001）、長さ38〜150ntのRNAは、なお有意な構造を有している可能性がある（Mehlmann  et  al.,2005）。
【０１２６】
この可能性を判定するために、一例において、断片化RNAの可能な構造をコンピュータを用いて予想するための方法が取られた。（Mfold、データは表示せず。Mathews  et  al.,1999；Zuker,2003参照のこと）。捕獲／標識ハイブリダイゼーション部位に対応するウイルスRNA領域は、平均37〜50ntの長さであり、最長100ヌクレオチドの長さまで、両端に5ntずつ追加され、10ヌクレオチドごとに連続して増加する。自己会合した断片の融解温度を、マイクロアレイ上のヒットおよび陰性と比較した。分子内温度の高い、自己会合した断片は、捕獲／標識プローブとのハイブリダイゼーションに使用できる可能性が低いため、集中したヒットを生成する数が少なく、反対に、分子内温度の低い断片はハイブリダイゼーションできる可能性が高いので、強いヒットを生成するであろうと予想された。しかし、直接的な相関関係は見られず、RNAの近接性ではなく、配列のミスマッチが、偽陰性の結果をもたらす優勢因子であることを示唆している。全体的な偽陰性の比率は低かったものの（約4％）、配列選択および範囲における改善が、正確な割り当てをさらに強化するはずである。
【０１２７】
B型インフルエンザの解析
予備試験において、RNA増幅の間に、A型インフルエンザに特異的なプライマーを用いて、もし産物がアガロースゲルに見られない場合は、B型インフルエンザのHAプライマーを用いて試料を増殖させるという試みが行われた。盲検試験では、86％±3％のB型インフルエンザの試料が正確に割り当てられ（B型インフルエンザまたは陰性のどちらか）、14％±3％は偽陰性であり、偽陽性は割り当てられなかった。複製試験では、85％±3％が正確に割り当てられ、13％±0％は偽陰性、そして1％±3％は偽陽性であった。絶対的には、5人のボランティアによる21の同定が偽陰性であった。この21のうち、D5、E9およびG6の3つの試料が、すべての偽陰性の原因であった。これらの試料の各PCR産物は染色された時に可視化され、アガロースゲル上で観察された。そのため、これらのウイルスが、本アッセイにおいて、捕獲または標識化される能力を制限する突然変異を含んでいたと仮説を立てた。B型インフルエンザのHA遺伝子のために捕獲プローブを拡張すれば、この問題は解決されると考えられる。B型インフルエンザでは1つの割り当てのみ（75のうち）が偽陽性であった。
【０１２８】
患者試料の解析
FluChip-55（商標）マイクロアレイをさらに解析するために、患者試料を入手した。この試験では、以前にA型インフルエンザ陽性であった9つの試料からのRNAと、3つの未知の試料を、A型インフルエンザプライマーを用いて増殖し、アレイにハイブリタイズした。像の例を図9に示す。得られたマイクロアレイ像は、単離試料から得られた像と質の面で同程度であった。12の試料のうち、4つは正確かつ完全に型分類および亜型分類され（A/H3N2）、1つの試料は正確に型分類（A）および部分的に亜型分類（N2）され、4つは正確に型分類（A）されたが亜型情報は得られず、3つの未知の試料はインフルエンザ陰性であると正確に同定された。これらの結果は、通常の5〜10日の時間規模ではなく、1日以内に得られたものである。
【０１２９】
さらなる態様
本明細書に開示される方法を用いて、トリH7N3、H7N7およびH9N2などの重要なインフルエンザの株を多く網羅するように、FluChip（商標）装置を拡張することができる。ウマインフルエンザや最近イヌに見つかったH3N8などの、種から種へ伝染する新種のウイルスについても言及する。具体的には、FluChip（商標）装置の次版は、より広いMP、そしておそらくはNPの範囲に加えて、H1、H2、H3、H5、H7、H9、N1、N2、N3、N4、N7およびN8の捕獲／標識配列を含む。その他の計画として、RNA増殖段階の簡略化または削除、ハイブリダイゼーション動態の改善、および迅速な像の読み取りのためのパターン認識ソフトウェアの開発が挙げられる。
【０１３０】
確立されたRNA増殖方法とともにFluChip-55（商標）マイクロアレイを用いて、インフルエンザA/H1N1、A/H3N2およびA/H5N1、そしてB型インフルエンザなど当該ウイルスからのRNAを、約11時間型分類および亜型分類した。この試験において、多くの種からの現在のインフルエンザウイルスの分離株を含む72の試料は、平均95％を上回る精密度で完全にまたは部分的に同定された。広範囲のウイルスの同定に成功することは、このマイクロアレイ配列選択の方法をさらに正当化し、精密なウイルス同定を提供するための、低密度（すなわち、低コスト）のマイクロアレイの能力を確立する。
【０１３１】
捕獲配列が見られたパターンは、インフルエンザ亜型を容易に同定できるように設計されたが、当業者は、捕獲プローブの任意のパターンが仕様できることに気づくと考えられる。標的配列の捕獲および標識プローブへの結合は、手動で読み取るか、またはソフトウェアによって判定することができる。インフルエンザの型、亜型または株を同定するための標的結合パターンの解析は、同様に手動で、あるいはソフトウェアによって自動的に行うことができる。
【０１３２】
単一標的遺伝子のストラテジー
方法
配列選択
捕獲および標識プローブの選択には、Mehlmannら（Mehlmann,M.et  al.FluChip（商標）：robust  sequence  selection  method  for  a  diagnostic  microarray.J.Clin.Microbiol.（2006年提出）参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する）の方法を採用した。この例では、LANL（www.flu.lanl.gov）からの公的に入手可能なオンライン配列、およびその他の情報を用いて、A型インフルエンザの様々な亜型のM遺伝子配列を集めた。亜型特異的データベースをH1N1、H1N2、H3N2、H5N1、H3N8およびH9N2について作成した。これらのサブデータベースを、宿主種ごとにさらに分け、ConFindアルゴリズムを用いて保存領域まで掘り下げていった。同定された保存領域は、その後それぞれ長さ16〜25ntの適切な「捕獲」および「標識」配列対を設計するために使用した。約60の可能な配列対を同定した。設計した配列とオリジナルのデータベース中の配列とのミスマッチの数を判定し、すべてのインフルエンザ亜型、または特異的な宿主種もしくは亜型（例えば、すべてのトリウイルス、H3N2ウイルスのみ）のウイルスと広く反応すると予想された配列を選択した。また、前回の実験のために選択された18の捕獲および標識対も、マイクロアレイ上で使用するための適合性を判定するために、最初の試験に含めた。
【０１３３】
交差反応性実験
フルオロフォアを複合した標識配列のみに6回の反復ハイブリダイゼーションを用いて、すべての捕獲および標識対の交差反応性について調べた（標的インフルエンザの存在しない状態で）。それ以外は同一の条件下で実験を行った。マイクロアレイ上の信号が発生した場合は（ここで定義する信号とは、ハイブリダイズしたスライドの過半数における平均値S/N＞3を指す）、捕獲プローブおよび対応する標識プローブを取り外し、それ以上使用しなかった。この配列選択プロセスは、15の有用な捕獲および標識対をもたらす結果となった。
【０１３４】
試料
ヒト、トリ、ウマ、イヌ、およびブタ宿主を代表する、58のA型インフルエンザウイルスの分離株から抽出したRNAが提供された。また、A型インフルエンザ陽性である9つの盲検化した患者の試料（咽頭スワブおよび鼻咽頭スワブ）が提供された。ウイルスは前述したように患者試料から抽出した。
【０１３５】
RNA増幅
上記参照。
【０１３６】
マイクロアレイスライド調製
上記参照。
【０１３７】
RNAの断片化およびハイブリダイゼーション
報告されているように（Mehlmann  et  al.Optimization  of  fragmentation  conditions  for  microarray  analysis  of  viral  RNA.Anal.Biochem.347,316-323（2005）参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する）、転写したRNAをハイブリダイゼーションの前にマイクロアレイ上で断片化した。報告されているように（Townsend  et  al.2006年提出）、室温で2時間ハイブリダイゼーションを行った。
【０１３８】
マイクロアレイの可視化および解析
ハイブリダイズしたスライドを、VersArray  ChipReaderスキャナ（Bio-Rad  Laboratories,Hercules,CA）を用いて、検出波長532nm、レーザー出力60％、PMT感度700V、および解像度5μmで走査した。VersArray  Analyzerソフトウェア、バージョン4.5（Bio-Rad  Laboratories,Hercules,CA）を用いて、蛍光画像を解析した。単一画像における各捕獲プローブの平均原強度を計算した後、最も強度の高い捕獲プローブを100に基準化した。これを取得した各マイクロアレイ像について繰り返し行った。各像の基準化した強度データについて、ユークリッド距離関数および単純群間平均法を用いて、階層的クラスタ分析（Number  Cruncher  Statistical  Systems（NCSS）2004,Kaysville,Utah）を行った。
【０１３９】
捕獲配列が見られたパターンは、インフルエンザの亜型を容易に同定できるように設計されたものだが、どのようなパターンのスポットを捕獲プローブに使用してもよいことを当業者は理解されたい。標的配列の捕獲および標識プローブへの結合は、手動で読み取るか、またはソフトウェアによって判定することができる。インフルエンザの型、亜型または株を同定するための標的結合パターンの解析は、同様に手動で、あるいはソフトウェアによって自動的に行うことができる。
【０１４０】
単一標的遺伝子のストラテジー
実施例3：型、亜型および／または株の検出および同定のための、M遺伝子のインフルエンザウイルス標的配列の選択
例示的な一実験において、異なるインフルエンザウイルスの亜型に、M遺伝子を標的にするために設計された捕獲配列からの信号で明確なパターンが観察された。図10は、インフルエンザの亜型H3N2（A）、H1N1（B）、およびH5N1（C）のM遺伝子配列におけるこれらのパターンを表す。A型インフルエンザに陽性反応を示した58の試料（すべて2003年以降のもの）のうち、18のウイルスがH1N1亜型、26がH3N2亜型、そして8がH5N1亜型のウイルスであった。同一の亜型を有するウイルスはすべて（ほぼ例外なく）、7つの配列において同一の視覚的パターンを呈した。配列1および4は、3つの亜型全部に対して、相対強度の高い信号を生成したことが分かる。配列3および7も幅広い反応性を示したが、相対強度ははるかに低かった。また、配列6はH5N1ウイルスに対して選択的であり（データは記載しないが、他の鳥インフルエンザの亜型と同様である）、ヒトH1N1およびH3N2ウイルスには信号を生成していない。
【０１４１】
別の実施例において、盲検試験における像の簡単な目視検査により、いくつかのウイルス分離株がMセグメントのマイクロアレイにおいて図10に示す典型的なパターンから有意に逸脱したシグネチャーを生成したことが明らかになった。「変わった」シグネチャーの1つは、ヒトに感染したブタH3N2ウイルスに由来することが分かった。別の非典型的なシグネチャーが、実験用に遺伝子再集合させたウイルスに観察された。7つのMセグメント配列のマイクロアレイにおけるシグネチャーは、H1N1ウイルスを示唆したが、HAおよびNA配列はH3N2ウイルスを示した。そのウイルスは、H3N2ウイルスのHAおよびNA遺伝子、またA/プエルトリコ/8/1934（H1N1）の内在遺伝子を含んでいたことが分かった。これらの実施例において、亜型分類は、よく保存された遺伝子セグメントを標的とするために設計された7配列のみを用いて、予想外に行われた。これらの結果は、より徹底したMセグメント同定およびインフルエンザの亜型分類のための検査を促すことになった。パターン認識力を拡張するために、さらに多数のMセグメントプローブ配列を選択した（Mehlmann,M.et  al.FluChip（商標）：robust  sequence  selection  method  for  a  diagnostic  microarray.J.Clin.Microbiol.（2006）参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する）。別の例示的な方法において、使用した配列選択方法は、数多くの類似するインフルエンザウイルスのファミリーの中から保存の領域を同定するという、独自のものであった。適切なプローブ配列（捕獲および標識）を保存領域から設計した（方法を参照のこと）。すべてのウイルス亜型に対して広い反応性を示すように、または、所定のウイルス亜型もしくは宿主種に対して特に特異的な反応性を示すように、プローブ配列を選択した。予想された反応性をコンピュータを用いて、可能なプローブ配列と、設計に使用したデータベース中のすべての配列とのミスマッチ数を評価することにより判定した。
【０１４２】
一実施例において、A型インフルエンザのMセグメントから15のヌクレオチドプローブ配列を選択して、MChip（商標）の塩基として使用した（配列のリストについては表4参照）。CDCから入手した58のA型インフルエンザウイルスの分離株は、H1N1（18）、H3N2（26）、およびH5N1（8）など様々な亜型を代表していたため、それらをマイクロアレイの性能をテストするために使用した（カッコ内の数字は所定の亜型についてテストした分離株の数を表す）。テストした58の試料すべてのM遺伝子セグメントの増殖に成功し、それらすべての試料が、マイクロアレイ上の蛍光信号に陽性を示す結果となった（像を図10に、相対強度の値を表6にまとめた）。マルチプレックスPCRを用いた前回の試験では、1つまたは複数の遺伝子の増殖に失敗したことがアレイ上で偽陰性を生成し、マイクロアレイの性能ではなく、増殖過程における失敗を反映していた（Townsend,M.B.et  al.FluChip（商標）：experimental  evaluation  of  a  diagnostic  influenza  microarray.J.Clin.Microbiol.（2006年提出）参照することにより、そのすべてを本明細書に援用する）。単一遺伝子増殖を使用することで、これらの偽陰性結果を消滅させることができると思われる。
【０１４３】
実施例4：
一実施例において、いくつかのA型インフルエンザの亜型において多く見られる配列についてマイクロアレイのパターンを調べた。図11は、H1N1、H3N2、およびH5N1ウイルスに観察された典型的なマイクロアレイパターンを表す。また、図11は、異なる相対強度のパターンを呈したものの、3つの亜型すべてに広く反応すると思われる、プローブ配列1、4、5、6、および15を表す。配列9および14は、H5N1ウイルスに特異的であり（図11C参照）、H1N1およびH3N2ウイルスには反応を示さなかった。実験的に観察されたプローブの反応性は、概ね予想される結果と相関関係を示すものであった（表5参照）。パターンの相対強度も、概ねウイルス亜型内で保存された。
【０１４４】
別の実施例において、図12は、図11で示したH1N1、H3N2、およびH5N1亜型以外のウイルスについて、Mセグメントのパターンの例を開示する。まず、図12のパネルを比較すると、3つのパターンはそれぞれ異なることが分かる。次に、図12を図11のパターンと比較すると、それらが典型的なH1N1、H3N2、およびH5N1のパターンとは違うことが明らかである。図12Aは、上述した、H3N2ウイルスのHAおよびNA遺伝子を含む、実験用に遺伝子再集合させたウイルスのパターンを示すが、H1N1ウイルスの内在遺伝子は示していない。より少ない配列を用いた以前の試験では、H1N1ウイルスを示すMパターンとなった。興味深いことに、プローブ配列の数が多いほど、独自のパターンが示され、図11BのH3N2ウイルスにもH1N1ウイルス（図11C）にも絶対的には一致しなくなる。同様に、図12Bに示すヒトに感染したブタH3N2ウイルスのパターンは、図11のヒトH3N2のパターンには一致しない。最後の例は、図12Cに示すトリH9N2ウイルスに観察されたパターンに見られる。これは図11Dに示すH5N1の例と同じトリのウイルスだが、同一のパターンは呈さない。大抵の場合、パターンにおける相違は、あるプローブの信号の有無だけによるものではなく、信号の相対強度の相違によって起こることが多い。
【０１４５】
別の例示的な方法において、マイクロアレイの信号パターンの類似性および相違性を明らかにするために、単純階層的クラスタ分析を採用した。階層的クラスタリングは、遺伝子発現データの分析（参照することにより本明細書に援用する、Blalock,E.M.＆  Editor.A  Beginner's  Guide  to  Microarrays（2003））に広く使用されている。ここでは、系統樹は1組の独立した測定値についての「関連性」を示す。階層的クラスタリングは、近縁関係にあるバクテリアを同定するために設計された診断マイクロアレイ上のパターンを評価するために最近使用されてきている（Francois,P.et  al.Rapid  bacterial  identification  using  evanescent-waveguide  oligonucleotide  microarray  classification.J.Microbiol.Methods  In  Press,Corrected  Proof、2005年10月10日オンラインにて入手可能、参照することにより本明細書に援用する）。この分析において、2つの点をつなぐ水平線の長さが、類似の程度を示す。データセットがより類似している場合は、2つの点の間の水平線の長さがより短くなる。
【０１４６】
別の実施例において、図13Aは、テストを行ったA型インフルエンザ患者58人の各分離株を対象とした、1つのマイクロアレイ実験の階層的クラスタ分析を表す（クラスタ分析に使用した相対強度については表6を参照）。図4Aのクラスタリングの系統樹は、異なるウイルス亜型を明らかにするためにまとめられたものである。濃いグレーの線で示されているのは、同一クラスタに属する、テストを行った全宿主種のH5N1ウイルスである。テストを行ったその他4つのトリ亜型も、ともにグループ化され、ヒトH1N1およびH3N2ウイルスとは概ね異なる。図12Cを参照すると、トリH9N2ウイルス（黒い線）は、トリH5N1ウイルスとは異なる視覚的パターンを示している。この相違は、図13Aのクラスタ分析により確認された。興味深いことに、H9N2ウイルスは、他のトリウイルスのクラスタ中のみに見られ、このクラスタはテストを行った8つのH5N1ウイルスを含むクラスタとは異なるものである。
【０１４７】
一実施例において、図13は、同一のクラスタに発生したヒトH1N1ウイルス（薄いグレー）の1つを除くすべてのウイルスを示し、これらはH1N1ワクチン株にも類似するものである。また、ヒトH3N2（薄いグレーの線）ウイルスは、系統樹において近縁関係を示した。テストを行ったウマH3N8（黒い線）ウイルス2つは、ヒトH3N2ウイルスの間に対になって現れた。H3N2ウイルスに対するそれらの類似性は、類似するウイルスの起源を表す場合もあるが、テストを行うH3N8ウイルスの数に限りがあるため、これを完全に判断することは難しい。図12Aおよび12Bで記載した、実験用に遺伝子再集合させたウイルスH3N2/H1N1およびブタH3N2ウイルスも、他のH3N2ウイルスと緩くクラスタ形成をするが、対としてはグループ外であり、むしろ主なヒトH3N2の枝とは異なるように見える。図12に表されるように、7つのみのプローブ配列を用いた最初の解析は、H1N1ウイルスを含むクラスタに属す、遺伝子再集合ウイルスの信号パターンを示す。ここでは、追加のプローブ配列を使用することで、さらなるパターンの相違が得られ、1934のウイルスからのH1N1のMセグメントを含む遺伝子再集合させたウイルスは、有意にグループ外であった。
【０１４８】
神経回路網
ある実施例において、本明細書に企図するアレイに使用する標的遺伝子配列を選択するために人工神経回路網（ANN）を使用した。ANNは、マイクロアレイデータ解析においてよく使用されるパターン認識ビヒクルであり、以前に癌の種類を診断および予測するためにも使われている。例示的な一方法において、既知の亜型のA型インフルエンザウイルスを用いて、各亜型に関連するアレイパターンを認識するようにMChip  ANNを訓練した。以前にも記載したとおり、「訓練セット」と呼ばれる既知の試料に、基準化した入力データを投入した。訓練セットに既知の出力（例えばウイルスの亜型）を投入することで、ANNソフトウェアは、相対的な蛍光強度のアレイパターンを、特異的な出力（例えばウイルスの亜型）と関連付けることを学習した。訓練セット向けのパターンが確立されると、未知の試料向けのデータを入力として供給した。ANNは、各出力カテゴリーに未知の試料が属した割り当てスコア（0〜1のスケール）を提供した。
【０１４９】
本実施例に従って、16の入力、4の出力（H3N2、H1N1、H5N1、および陰性）を使用し、順方向の加重逆伝搬法を用いてANNを訓練した。1個抜き交差検証法（leave-one-out  cross-validation）を用いて本方法を検証した。58のウイルス分離株からのマイクロアレイの結果（すべてのH3N2、H1N1、およびH5N1試料）、およびA型インフルエンザと分かっている10試料を、「訓練セット」として選択した。訓練した神経回路網を、盲検試験における53の未知試料について亜型を判定するために使用した。未知のH3N2およびH1N1はすべて、鼻腔スワブまたは洗浄により入手した患者試料であった。表7は、53の未知試料に対するANN出力の割り当てスコアを示し、0.75を上回る割り当てスコアはハイライトで示した。ANN解析の完了後、試料を開示した。割り当てスコア＞0.75を正確な同定の最小値として使用し、50/53試料が正確に同定され亜型分類された（A型インフルエンザとして）。偽陽性結果が1件あり、偽陰性結果が2件あった。得られた感度は95％、特異性は92％であった。
【０１５０】
ここで観察されたように、Mセグメントは、ヌクレオチド濃度の高い保存を示し、M1およびM2は、それぞれ1年間で進化率0.83×10-3および1.36×10-3のヌクレオチド置換であった。アミノ酸濃度では、M1は、1930年代から比較的わずかな進化を呈した（0.08×10-3アミノ酸の変化/残基/年）。M1は、ウイルスの生活環の多くの側面において重要な構成要素であるため、このタンパク質の保存程度が高いことも驚くべきことではない。本試験の一側面において、マイクロアレイ上でテストしたすべてのウイルス亜型に広く反応することが判明した5つのプローブ配列のうち4つが、M1コード化領域内のRNAの部分を標的とする配列であることが観察された。
【０１５１】
本明細書では、ウイルスのエンベロープにおけるM1遺伝子の位置は、その他のウイルスのエンベロープタンパク質（HA、NA、およびM2）と相互作用することを示しており、インフルエンザなどのウイルスを亜型分類するために遺伝子を選択する上での主因子である可能性があることを、企図する。プロトタイピング（proteotyping）を用いた最近の系統発生解析で、関連する配列間の、わずかではあるが重要な相違を明らかになった。単一の分岐群内で独自のアミノ酸シグネチャーを同定することにより、HAおよびM遺伝子プロトタイプの対の特異的な例が発見された。この結果は、1つの遺伝子における変化が、他の遺伝子において代償として突然変異の選択を必要とすることを示唆するものである。常に同時に発生するいくつかの遺伝子にプロトタイプが割り当てられることは、遺伝子再集合の間に機能の面で重要な同時分離が起こることを示唆している。また、他の試験では、ヒトインフルエンザの大規模な配列決定の試みにおいて、HAおよびM1の相関的な突然変異が記録されている。このHAおよびM遺伝子セグメントの同時進化の証拠は、本試験において観察された亜型特異的な結合パターンを説明するものである可能性が高い。従って、HAおよびM1と類似して同時進化する他の遺伝子も、ウイルスにおける亜型特異的なマイクロアレイパターンを解析するために重要である可能性がある。
【０１５２】
A/H5N1ウイルスを用いたMChipの妥当性
急速に出現する亜型を正確に同定するためのMchipの可能性をさらに探求するために、様々なA/H5N1ウイルスから抽出したRNAを用いて追加試験が行われた。ヒト、ネコ、および2003〜2006年の様々なトリ感染、ベトナム、インドネシア、ナイジェリア、およびカザフスタンなど多様な地理的な場所を代表する34の異なるA/H5N1試料を調べた。4つのインフルエンザ様疾病（ILI's）、およびいくつかの陰性対照を代表する87の独立したマイクロアレイテストの結果を表8にまとめた。マイクロアレイおよびアッセイは95％の感度および100％の特異性という結果をもたらした。
【０１５３】
（表３）インフルエンザウイルスの同定のための、捕獲、標識、および標的配列
2009523451.tif 000005
2009523451.tif 000006
2009523451.tif 000007
【０１５４】
（表４）本試験で使用したM遺伝子セグメントのプローブ配列
2009523451.tif 000008
【０１５５】
（表５）15のMChipの捕獲および標識プローブ対の反応性、および配列選択に使用されたM遺伝子配列データベース（sw＝ブタ、eq＝ウマ、h＝ヒト、av＝トリ）
2009523451.tif 000009
＊宿主種を以下の省略記号で示す。h＝ヒト、av＝トリ、sw＝ブタ、eq＝ウマ、およびcan＝イヌ。
【０１５６】
（表６）58人の患者の分離株および未知の9試料についてのマイクロアレイ信号の相対強度
2009523451.tif 000010
【０１５７】
（表７）人工神経回路網（ANN）を用いた53試料のA型インフルエンザの亜型判定。各ANN出力の割り当てスコアの値は0〜1の範囲である。試料は番号順に標識化され、0.75を上回る割り当てスコアをすべてハイライトした。チェックマークは、ウイルス型、亜型、または陰性の正解を示し、Xは誤った割り当てを示す。
2009523451.tif 000011
コロラド州公衆衛生環境局（CDPHE）による免疫蛍光アッセイを用いて同定されたHAの部分的な亜型；疾病予防管理センター（CDC）から提供された完全抗原特性；試料47〜53は、陰性対照として組み入れられたインフルエンザ様疾患：SARS（重症急性呼吸器症候群）、hMPV（ヒトメタニューモウイルス）、RSV（呼吸器合胞体ウイルス）、hPIV3（ヒトパラインフルエンザウイルス3型）。
【０１５８】
（表８）人工神経回路網（ANN）を用いた87回のマイクロアレイテスト（34の異なるA/H5N1ウイルス）のA型インフルエンザの亜型判定。各ANN出力の割り当てスコアの値は0〜1の範囲である。試料は番号順に標識化され、0.93を上回る割り当てスコアをすべてハイライトした。チェックマークは、ウイルス亜型の正確な同定を示し、Xは誤った割り当てを示す。ウイルスのRNAはCDCより提供された。
2009523451.tif 000012
試料47〜53は、陰性対照として組み入れられたインフルエンザ様疾患：SARS（重症急性呼吸器症候群）、hMPV（ヒトメタニューモウイルス）、RSV（呼吸器合胞体ウイルス）、hPIV3（ヒトパラインフルエンザウイルス3型）。
【０１５９】
本明細書において開示および請求されるすべての組成物、方法、および装置は、本開示に照らして、必要以上の実験を行うことなく作成および実行することが可能である。組成物、方法、および装置は、好ましい態様に関して記載されてきたが、本発明の概念、主旨、および範囲を逸脱することなく、組成物、方法、および装置、また本明細書に記載される方法の段階または段階の順序に、様々な変形および変更を適用できることは当業者には明白であると考えられる。より具体的には、化学的かつ生理学的に関連するある薬剤を、本明細書に記載される薬剤に代用したとしても、同一または類似する結果が得られるであろうことは明白である。当業者に明白である、かかる類似代替薬剤および変更はすべて、付属の請求項に定義される本発明の主旨、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、特定の態様をさらに明示するために含まれる。該態様は、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、1つまたは複数のこれらの図面を参照することにより、より深く理解することができる。
【図１】陽性対照に使用される直接ハイブリダイゼーション（左手側）、およびウイルスのRNAの検出のための二重捕獲／標識ハイブリダイゼーション過程（右手側）を含み、インフルエンザウイルスアッセイのための設計に対する例示的なスキームを表す。
【図２】インフルエンザウイルスのゲノムの保存された領域を発見するための全体的な過程を概説するフローチャートを表す。
【図３】単一の保存された領域からの適切な捕獲-標識の対を選択する過程のためのフローチャートを表す。
【図４】499A型インフルエンザNA（N1）遺伝子セグメント配列のための近隣結合系統樹を表す。直角の括弧は、それぞれの特定のサブセットに見られる保存された領域の最初の数字とともに該系統樹の最初の区分を示す。
【図５】FluChip-55（商標）装置のレイアウトを表す。「陽性対照」（PC）列の隣に3通りの捕獲配列に点をつけた。基質遺伝子（M）に基づいて、亜型（HAおよびNA）または型（AもしくはB）により試料を分類した。
【図６】（a）A/H1N1、（b）A/H3N2、および（c）A/H5N1の正確な型分類ならびに亜型分類を明示する、典型的なマイクロアレイの結果を表す。濃い点は、強い蛍光信号を表す。上端および左端の点は、陽性対照である。取り囲まれた領域は、見やすいように含めた記号表示により、特異的亜型でのヒットを強調表示する。3通りの点に対する信号における典型的な相対的変動は、10％であった。マイクロアレイでの検出限界は、約0.7ng  RNAであった。
【図７】図7A〜図7Dは、FluChip-55（商標）装置とともに、アッセイ（A型インフルエンザプライマーのみ）を使用して、72の未知の試料分析結果の棒グラフの要約を表す。元の盲検試験（A）および複製試験（B）の両方のために性能を要約している。盲検試験および複製試験のためにそれぞれ（C）および（D）に、欠落した亜型およびRNA増幅の不足のために補正されているマイクロアレイの性能を示す。
【図８】いくつかのインフルエンザ試料のためのPCR生成物を示す、臭化エチジウムが着色した1％のアガロースゲルを表す。増幅遺伝子は右に示すが、フラグメントの大きさは左に記す。
【図９】患者の試料に由来するA型インフルエンザH3N2ウイルスの正確な型分類ならびに亜型分類を示す像を表す。
【図１０】図10A〜図10Dは、陽性対照配列（黒い記号）、および3通りに点をつけられた捕獲配列（白丸）を示す、7Mセグメント配列の一般的なマイクロアレイ（A）の例示的なレイアウトを表す。蛍光画像は、（B）H3N2（26試料）、（C）H1N1（18試料）、および（D）H5N1（8試料）ウイルスのための典型的なパターンを示している。
【図１１】図11A〜図11Dは、（A）に示すように、陽性対照配列（黒い記号）および3通りに点をつけられた捕獲配列（白い記号）を有する15M遺伝子捕獲配列のためのマイクロアレイの例示的なレイアウトを表す。蛍光画像は、ウイルス亜型H3N2（B）、H1N1（C）、およびH5N1（D）のための典型的なパターンを示す。
【図１２】図12A〜図12Cは、図2に示す以外のパターンを示すウイルスのためのマイクロアレイのパターンを強調表示する蛍光画像の例示的な方法を表す。（A）は、H3N2ウイルスからのHAおよびNA、ならびにH1N1ウイルスからの内部遺伝子を含有する実験室の再集合体ウイルスであり、（B）は、ヒトに感染するブタのH3N2ウイルスであり、（C）は、トリのH9N2ウイルスからのものである。
【図１３】図13Aおよび図13Bは、15Mセグメントプローブ配列（A）を使用して、58のマイクロアレイの結果（それぞれのウイルス分離体に対して1つの実験）の階層的クラスタ分析の例示的な方法（詳細は方法の項を参照）を表す。後にH3N2およびH1N1ウイルス（すべてA型インフルエンザ）に暴露させる、24の未知の患者の試料からの結果とともに同様のクラスタ分析を（B）に示す。
【図１】
2009523451.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2009523451.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月17日(2008.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
（表３）インフルエンザウイルスの同定のための、捕獲、標識、および標的配列
2009523451.tif 000027
2009523451.tif 000028
2009523451.tif 000029
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
（表４）本試験で使用したM遺伝子セグメントのプローブ配列
2009523451.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月17日(2008.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009523451000001.app
【国際調査報告】
2009523451.tif 000031
2009523451.tif 000032
2009523451.tif 000033
2009523451.tif 000034