(57)【要約】本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２により産生される活性な色素タンパク質を産生および精製する方法を提供する。色素タンパク質は、医薬組成物の開発、および癌または細菌感染などの疾患の治療に有用である。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、アポタンパク質と９員エンジインを含む発色団の非共有結合複合体である。本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の新規なアイソフォームおよびその新規なアイソフォームを含む色素タンパク質を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素タンパク質を生産する放線菌、臭化物およびヨウ化物から選択されるハロゲン化物、ならびにプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ−６１、プルラコール（Ｐｌｕｒａｃｏｌ）Ｐ２０００（ポリプロピレングリコール）およびアンタロックス（Ａｎｔａｒｏｘ）１７−Ｒ２から選択される界面活性剤を含む発酵培養物。
【請求項２】
前記放線菌が、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２である、請求項１に記載の発酵培養物。
【請求項３】
前記界面活性剤が、プルロニックＬ−６１である、請求項１に記載の発酵培養物。
【請求項４】
前記放線菌がＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２であり、前記界面活性剤がプルロニックＬ−６１である、請求項１に記載の発酵培養物。
【請求項５】
プルロニックＬ−６１が、約０．１〜１０ｇｍ／Ｌの量で存在する、請求項１〜４のいずれか１項以上に記載の発酵培養物。
【請求項６】
プルロニックＬ−６１が、約５ｇｍ／Ｌで存在する、請求項１〜４のいずれか１項以上に記載の発酵培養物。
【請求項７】
前記ハロゲン化物が、約１〜１５ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜６のいずれか１項以上に記載の発酵培養物。
【請求項８】
前記ハロゲン化物が、約３〜５ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜６のいずれか１項以上に記載の発酵培養物。
【請求項９】
臭化物およびヨウ化物から選択されるハロゲン化物、ならびにプルロニックＬ−６１、プルラコールＰ２０００（ポリプロピレングリコール）およびアンタロックス１７−Ｒ２から選択される界面活性剤を含む培地中でＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２を発酵させることを含む色素タンパク質を生産する方法。
【請求項１０】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質を精製する方法であって、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質を含む流体を得ること、および該流体と、
（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックス、
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス、
（ｃ）サイズ排除クロマトグラフィーマトリックス
の１以上とを接触させること、
および精製した色素タンパク質を回収することを含む方法。
【請求項１１】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質を精製する方法であって、（ａ）該Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質を含む流体を得ること、（ｂ）該流体と陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスとを接触させること、（ｃ）該流体と疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスとを接触させること、（ｄ）該流体とサイズ排除クロマトグラフィーマトリックスとを接触させること、および（ｅ）精製した色素タンパク質を回収することを含む方法。
【請求項１２】
前記色素タンパク質は、タンパク質全体を基準にして約８０％以上の純度で回収される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記色素タンパク質は、タンパク質全体を基準にして約９０％以上の純度で回収される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、ＤＥＡＥセファロースである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックスは、フェニルセファロースである、請求項１１または１２に記載の方法。前記サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスは、約３×１０３〜約７×１０５の分離範囲を有する、請求項１１、１２、または１３に記載の方法。
【請求項１６】
下記の式：
【化１】
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を有する精製された発色団。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発色団を含む精製された色素タンパク質。
【請求項１８】
請求項１６に記載の精製された発色団を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の精製された色素タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項９、１０または１１に記載の方法によって得ることができる精製された色素タンパク質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本願は、本明細書中に記載される核酸およびアミノ酸配列を定める配列表を含む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２により産生される活性な色素タンパク質を産生および精製する方法を提供する。色素タンパク質は、医薬組成物の開発、および癌または細菌感染などの疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓのメンバーにより産生される強力な細胞毒性ポリケチドの一種であるエンジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）は、癌の治療に用いられてきた。エンジイン薬物の典型的な作用形態は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ開裂を介する。ＤＮＡ開裂は、エンジイン環のバーグマン型環芳香族化により生成されたジラジカルによるデオキシリボース糖骨格からの水素引き抜き反応により誘導される。現在、癌の臨床治療用に２つのエンジインが承認されている：ＣＤ３３モノクローナル抗体と結合したカリケアマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、米国）およびポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸）結合ネオカルチノスタチン（日本）。
【０００４】
エンジイン天然産物は、２つのサブカテゴリーに分類することができる。第１のサブクラスは、ビシクロ［７，３，０］ドデカジイン（すなわち、９員）エンジインコアまたはその前駆体によって特徴付けられ、第２のサブクラスは、ビシクロ［７，３，１］トリデカジイン（すなわち、１０員）エンジインコアによって特徴付けられる。９員エンジインの例としては、ネオカルチノスタチン、Ｃ−１０２７、ケダルシジン、マクロモマイシン、Ｎ１９９９Ａ２およびマデュロペプチンが挙げられる。１０員サブクラスの例としては、カリケアマイシン、エスペラマイシン、ダイネミシンおよびナメナマイシンが挙げられる。９員と１０員のエンジインを区別する更なる特徴は、Ｎ１９９９Ａ２を除いて、全ての９員エンジインがエンジイン−タンパク質複合体として産生され、エンジイン発色団が、非共有結合により不活性アポタンパク質に結合することである。このため、９員エンジインは、多くの場合、色素タンパク質と呼ばれる。アポタンパク質は、不安定な９員エンジイン発色団を安定させ、標的とする細胞毒性発色団をクロマチンに送達する重要な役割を果たすと考えられている。
【０００５】
いくつかのアポタンパク質のアミノ酸配列は、アポタンパク質を直接配列決定するかまたはクローン化ＤＮＡ配列からアミノ酸を推定することにより決定されている。現在までに同定されているアポタンパク質は、小さな酸性タンパク質（１０８〜１１４個のアミノ酸、ａａ）であり、これらはプレアポタンパク質から３２〜３４ａａのアミノ末端リーダーペプチドを除去して生成される。２つの色素タンパク質（ネオカルチノスタチンおよびＣ−１０２７）の生合成経路が、クローニングされ、配列決定されている。これらの場合、アポタンパク質をコードする遺伝子は、関連する発色団の生合成に必要な遺伝子でクラスター化された。
【０００６】
色素タンパク質複合体のアポタンパク質成分は、薬物特性の指令変化の魅力的な標的を提示する。例えば、アポタンパク質アミノ酸または核酸配列が見つかった場合、部位特異的突然変異誘発法などの確立された分子生物学的技術を用いて、アポタンパク質の発色団結合モチーフを変更し、その天然型発色団をより強くまたは弱く結合する、合理的に変化したアポタンパク質を作成することができる。さらに、このようなアポタンパク質への変化により、例えば、毒性が減少した色素タンパク質または効力もしくは安定性が増加した発色団をもたらすことができる。また、アポタンパク質を全体的に操作することにより、結合特異性が大きく変化したアポタンパク質、すなわち、エンジイン発色団とは大きく異なる分子の標的薬物送達手段として機能する能力を得ることが可能である。同様に、エンジイン発色団は改変の標的である。発色団を変更させる１つの方法は、その生合成に関与する遺伝子を操作することである。
【０００７】
従って、新規な色素タンパク質、ならびに遺伝子およびそれらの合成に関与するタンパク質の分離および特性付けが必要とされている。さらに、色素タンパク質を効率的に産生し、精製する方法が望まれている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、陸生放線菌であるＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）により産生された新規な非常に強力な抗癌色素タンパク質に関する。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、アポタンパク質と９員エンジインを含む発色団の非共有結合複合体である。本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の新規なアイソフォームおよびその新規なアイソフォームを含む色素タンパク質を提供する。特に、本発明は、下記の構造：
【０００９】
【化２】
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および
【００１０】
【化３】
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を有する発色団を含む活性名色素タンパク質を提供する。
【００１１】
構造［１］および［２］は、別名、それぞれ発色団−ｂおよび発色団−ｃと呼ばれる。
【００１２】
別の局面では、本発明は、改善された色素タンパク質収率をもたらす発酵プロセスを提供する。発酵プロセスは、色素タンパク質産生を最大にし、色素タンパク質の不安定性および分解を最少にするように調合される培地を組み込む。
【００１３】
別の局面では、本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を精製する方法を提供する。大規模発酵から色素タンパク質を得るのに適切な測定可能な精製法を開示する。また、色素タンパク質のアイソフォームを分離する方法も開示する。
【００１４】
本発明は、実質的に純粋な形態のＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質およびアポタンパク質、ならびに色素タンパク質を含む医薬組成物、および色素タンパク質を投与する方法を提供する。ある種の色素タンパク質のアイソフォームは、癌性細胞および腫瘍の治療に有用であることが示されている。
【００１５】
本発明は、さらに、生物活性を変更したＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質（アポタンパク質および発色団種を含む）の変異体を産生し、精製する方法を提供する。このような変異アポタンパク質は、変化した発色団結合特性、変化した標的特異性、またはそれらの組み合わせを有することができる。
【００１６】
本発明は、大量のアポタンパク質および発色団の産生を提供することは理解される。さらに、本発明は、エンジイン関連化合物を産生することができる他の生物の同定、または例えば、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２などのエンジイン関連化合物を産生することができる生物における色素タンパク質の合成に関与する遺伝子の同定をもたらすことができることは承認される。さらに、本発明は、例えば、毒性が減少し、効力が増加し、または安定性が増加したアポタンパク質の改変バージョンの産生を提供することは承認される。また、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の操作は、変化した結合特性、すなわち、２１Ｇ７９２エンジイン発色団とは異なった発色団の標的化された薬物送達ビヒクルとして機能する能力を有するアポタンパク質へと導くことができることは理解される。最後に、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を含む医薬組成物を開発し、細菌感染または癌性増殖を有する哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができることは承認される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
エンジイン抗生物質は、一般に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属、およびＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属を含むがこれらに限定されないＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に属する種々の生物により産生される。本発明は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ，１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌ．，６１０６４）に寄託されたＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２により産生される新規な色素タンパク質に関する。これらの寄託物は、ブダペスト条約による条件に基づいて作成された。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２には、受入番号ＮＲＲＬ３０７７８が与えられている。このような現在知られている生物のうち、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２は、ＡＴＣＣ３９１４４として寄託されたＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ株（米国特許第４，５４６，０８４号）と最も類似していると思われる。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列によって評価されるように、これらの株は、近縁種または近縁亜種である。
【００１８】
本発明は、新規な色素タンパク質および発色団を提供する。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２は複数の関連する発色団を産生することが発見された。発色団は、個別に、アポタンパク質と複合体を作り、複数の関連した色素タンパク質を形成する。したがって、本発明は、図６に示されるように、発色団−ｂ、発色団−ｃ、および発色団−ｄを提供する。少なくとも発色団−ｂおよび発色団−ｃは、抗腫瘍活性および抗菌活性を有する。
【００１９】
本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２を発酵および培養するための方法を提供する。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の培養は、多様な液体培地で行なうことができる。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の産生に有用な培地には、デキストリン、ショ糖、糖蜜、グリセロールなどの同化可能な炭素源；タンパク質、タンパク質加水分解物、ポリペプチド、アミノ酸、コーンスティーブリカーなどの同化可能な窒素源；ならびにカリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、塩化物などの無機陰イオンおよび陽イオンが含まれる。ボロン、モリブデン、銅などの微量元素は、多くの場合、上記培地の他の組成の構成要素の不純物として供給される。例えば、通常の窒素源マルトン（Ｍａｒｔｏｎｅ）Ｊ−１には、鉄、マグネシウム、および他の微量金属が含まれる。
【００２０】
ある種のハロゲン化物塩の介在が改善された増殖および色素タンパク質産生における有意な増加をもたらすことが見つかった。以前には、ヨウ化物塩の含有の有益な効果が、ヨウ素含有発色団の産生について観察されたが、ヨウ素を含まないＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の産生に対するハロゲン化物の効果は期待されなかった。また、臭化物の介在は、改善された増殖および色素タンパク質収率をもたらした。しかしながら、塩化物イオンの量の変化では明らかな効果はなかった。
【００２１】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の培養では、糖蜜および加水分解スターチなどのグルコースを含む複合糖質を用いることができる。大規模発酵に関しては、一貫性のある結果に到達するために、規定の炭素源を含む培地を用いることが望ましい。グルコースに加えて、試験管発酵における増殖および色素タンパク質産生を支持する有用な炭素源には、ショ糖およびマルトリン（ｍａｌｔｒｉｎ）も含まれる。良好な色素タンパク質収率を支持しない炭素源には、マルトース、ラクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、グリセロール、大豆油、および綿実油が含まれる。大規模発酵において、グルコースは、好ましい炭素源である。グルコース、ショ糖、およびフルクトースを含む大規模発酵では、（たとえショ糖が試験管発酵で同化可能であるとしても）グルコースだけが発酵過程で利用された。
【００２２】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２に対する有用な窒素源はペプトンである。しかしながら、非動物性由来の窒素源は、一般に、医薬品の生産には望まれる。種々の非動物性窒素源が試験され、このうち、マルコール・マルトン（Ｍａｒｃｏｒ  Ｍａｒｔｏｎｅ）Ｊ−１が特に良好な結果を与えた（実施例を参照されたい）。同程度の収率を与える他の好ましい非動物性窒素源には、マルコール・マルトンＪ−１、マルコール・ビーン・ペプトン（Ｍａｒｃｏｒ  Ｂｅａｎ  Ｐｅｐｔｏｎｅ）、アンバーファーム（Ａｍｂｅｒｆｅｒｍ）４４１５、ハイ・ソイ・ティー（Ｈｙ  Ｓｏｙ  Ｔ）が挙げられる。有用ではあるが低収率を与え得る非動物性窒素源の他の例には、アンバーファーム４０００、アンバーファーム４０１５、コーン加水分解物、小麦加水分解物（ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＃ＷＧＥ８０Ｍ）、およびファルマデジア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）が挙げられる。窒素源が、大豆加水分解物（ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＃ＳＥ５０ＭＡＦ）または７５％大豆加水分解物と２５％小麦加水分解物の混合物のときには生成物は検出されなかった。
【００２３】
生物活性なタンパク質含有産物を得るためには、発酵培地に分泌または放出されるタンパク質を分解するストレスを避けることが重要である。大規模発酵では、一般に、機械的な撹拌または混合、およびスパージャーによる空気（または酸素）の導入を伴い、良好な収率を得るためには注意深い消泡剤の選択が必要である。本発明によれば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ−６１、プルラコール（Ｐｌｕｒａｃｏｌ）Ｐ２０００（ポリプロピレングリコール）およびアンタロックス（Ａｎｔａｒｏｘ）１７−Ｒ２界面活性剤は、アポタンパク質と生物活性分子との混合物の産生に有用であることが確認されている。界面活性剤は、特に、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２、ケダルシジン、およびＣ−１０２７などのエンジイン含有色素タンパク質に有用である。試験された界面活性剤の中で、プルロニックＬ−６１は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の最大収率をもたらした。また、色素タンパク質は、プルラコールＰ２０００（ポリプロピレングリコール）およびアンタロックス１７−Ｒ２を用いても産生されるが、量は減少していた。ほとんど色素タンパク質を得られない界面活性剤は、プルロニックＬ−３１、プルロニックＬ−８１、プルロニックＬ−１０１、クレロール（Ｃｌｅｒｏｌ）ＦＢＡ  ５１５Ｂ、クレロールＦＢＡ  ２６５、クレロールＦＢＡ  ９７５−ＵＳ、クレロール５０７４、およびアンタロックスＢＬ−２１４であった。
【００２４】
本発明の特定の態様では、発酵培地は、８．７５ｇ／Ｌグルコース・一水和物、０．０１ｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、０．０２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、２．０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム（ミシシッピ（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ）（商標)ライム（Ｌｉｍｅ））、４．０ｇ／Ｌマルコール・マルトンＪ−１、２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム・３水和物、０．５ｇ／Ｌヨウ化カリウム、および０．５ｇ／ＬプルロニックＬ−６１を含む。
【００２５】
本発明の別の態様では、発酵培地は、８．７５ｇ／Ｌグルコース・一水和物、０．０１ｇ／Ｌ硫酸鉄、０．０２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、２．０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ（商標）Ｌｉｍｅ）、４．０ｇ／Ｌマルコー・マルトンＪ−１、２ｇ／Ｌ酢酸ナトリウム・３水和物、０．５ｇ／Ｌ臭化ナトリウム、および０．５ｇ／ＬプルロニックＬ−６１を含む。
【００２６】
また、本発明は、実質的に純粋なタンパク質およびポリペプチドを提供する。用語「実施的に純粋な」とは、本明細書中で使用するとき、所定のポリペプチドに関して、ポリペプチドが他の生物学的な高分子を実質的に含まないことを意味する。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、または約９９％純粋である。純度は、当該技術分野において知られている任意の適切な標準的方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定可能である。実質的に純粋なタンパク質には、アポタンパク質とエンジイン発色団の複合体である、実質的に純粋な色素タンパク質が含まれることは承認される。
【００２７】
本発明の態様では、色素タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって、発酵培地またはＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の抽出物から精製される。この方法は、色素タンパク質の有効濃度を提供し、（他の不純物のうち）発酵中に産生される望ましくない色素の大部分を除去する。一態様では、陰イオン交換樹脂は、ＤＥＡＥセファロースＦＦである。色素タンパク質を含むクロマトグラフィー装填物は、ｐＨ８．３に調整され、陰イオン交換樹脂に適用される。色素タンパク質種は、移動相のイオン強度を増加させることによって溶出される。特定の態様では、色素タンパク質は、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ段階勾配を用いて溶出され、大部分の活性物質は、最初の２カラム容積で回収される。装填体積およびカラムサイズに依存して、浄化した発酵ブロスから色素タンパク質を精製する場合、その濃度は１０倍を超え得る。
【００２８】
本発明の別の態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される。この精製法は、色素タンパク質とアポタンパク質とを分離し、他のタンパク質および非タンパク質成分を除去し、色素タンパク質の有効濃度を許容する。この固体支持体は、任意の有機、無機または複合材料、多孔性、超多孔性または非多孔性であってもよく、これは、例えば、ポリ（アルケングリコール類）（ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（エチレングリコール））、アルカン類、アルケン類、アルキン類、アリール類、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルまたは支持体に疎水性を与える他の分子を用いて誘導かされるクロマトグラフィーに適合している。特定の例では、フェニルセファロースＨＰは、約ｐＨ８．２で用いられ、色素タンパク質は、１００ｍＭ  ＮａＣｌまでの勾配で溶出される。
【００２９】
マトリックス（例えば、陰イオン交換、疎水性相互作用）への色素タンパク質の結合に依存する分別は、多くの場合、カラムを用いて行われるが、代わりにバッチプロセスで行うことができる。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーに代わる方法として、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ａ５０などの適切な陰イオン交換体への色素タンパク質種のバッチプロセス結合を用いることができる。バッチプロセスでは、色素タンパク質を含む溶液（例えば、保存用に、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３の追加の５０分の１容積によって緩衝化された浄化した発酵ブロス）は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３で平衡化されたセファデックスＡ５０スラリーに対する、室温で一晩撹拌して吸着させたバッチである。この溶液が浄化した発酵ブロスである場合、セファデックスＡ５０と浄化した発酵ブロスの有用な体積比は１：１５である。完全な結合の測定に応じて、セファデックスは、ろ過によって回収され、例えば、１２体積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３を用いて洗浄される。色素タンパク質種は、３０分撹拌後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．３を用いてバッチ様式で溶出される。次に、ろ過物は、次の精製工程に適している結合条件に調整される。例えば、次の工程がフェニルセファロースＨＰに結合する場合、フェニルセファロースＨＰに対する結合条件は、１．５Ｍ濃度まで固体の硫酸アンモニウムを添加し、０．４５μｍろ過によって得ることができる。
【００３０】
本発明の更なる態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、高分子量および低分子量のタンパク質成分を除去するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーは、分子量によって種を分離するためのサイズ排除樹脂を用いる。他の手段には、限定されないが、適切な排除メンブレンを用いた限外ろ過および疎水性技術が含まれる。適切なマトリックスには、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００、スーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｓ−３００、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）、トリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）、アクリルアミド、セファデックスまたは所望サイズ範囲に試料を分別することができる、当業者に知られている同様の樹脂が含まれる。ゲルろ過は、約２℃〜約２５℃の温度で行うことができる。適切なバッファーは、約０．１〜約１．０Ｍの塩、好ましくはＮａＣｌを約７〜約８．５のｐＨで含む。一態様では、クロマトグラフィーマトリックスの分離範囲は、約３×１０３の下限を有する。別の態様では、クロマトグラフィーマトリックスの分離範囲は、約１０６の上限を有する。本発明の特定の態様では、サイズ排除マトリックスは、約３×１０３〜約７×１０５の分離範囲を有するスーパーデックス７５である。分離マトリックスがスーパーデックス７５である場合、色素タンパク質調製物は、ｐＨ８．２で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて分離することができる。当業者は、特定のマトリックスとともに使用されるバッファーを最適化することができる。回収した色素タンパク質を含む分画は、所望の通り、例えば、収率を最大にするかまたは不純物を最少にするようにプールすることができる。
【００３１】
好ましい態様では、２以上の精製法を連続して用いる。色素タンパク質の濃縮は、各精製工程において、カラム容積（ＣＶ）およびプールされる溶出されたＣＶの数に依存して達成可能である。あるいはまたはさらに、色素タンパク質は、当該技術分野において知られている他の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、微小濃縮などによって濃縮することができる。
【００３２】
本発明によれば、１以上の色素タンパク質種を単離または精製することができる。本発明の態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２は、色素タンパク質収率のために選択される発酵条件を用いて増殖される。典型的には、色素タンパク質種は、上記で概説したような３工程プロセスによって精製される。色素タンパク質種は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離可能である。提供される実施例では、フェニルセファロースクロマトグラフィーにより２つの色素タンパク質（３つの色素タンパク質を含む）ピークを得た。さらに、アポタンパク質の相対量は減少した。
【００３３】
色素タンパク質の成分および発色団生合成経路の成分、またはそれらの成分の前駆体（すなわち、プレアポタンパク質）は、色素タンパク質生合成遺伝子クラスターと呼ばれる隣接する一連の読み取り枠（ｏｒｆ）（複数）によりコードされる。したがって、本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質生合成遺伝子クラスターのｏｒｆをコードする単離された核酸（表１を参照されたい）、またはそれらの発現された（すなわち、処理された）断片（例えば、アポタンパク質；配列番号１５０）を提供する。一態様では、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、または配列番号１５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。好ましい態様では、該核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、または配列番号１４９のヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸が相補配列を含むことは承認される。
表１
２１Ｇ７９２色素タンパク質遺伝子クラスターの読み取り枠
【００３４】
【表１Ａ】
2009541331.tif 000005
【００３５】
【表１Ｂ】
2009541331.tif 000006
【００３６】
【表１Ｃ】
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【００３７】
【表１Ｄ】
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【００３８】
【表１Ｅ】
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本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、または配列番号１４９に特異的にハイブリダイズする（または特異的に結合する）核酸を提供する。また、核酸コードの縮退がなかったら、前述した配列に特異的に結合するであろう核酸も企図される。該核酸は、完全なタンパク質（例えば、完全なｏｒｆ）またはそれらの断片をコードするために十分な長さを有するものであり得る。また、修飾されたタンパク質をコードする核酸も含まれる。タンパク質修飾の例としては、限定されないが、抗体、抗体断片、受容体リガンドなどの標的分子との融合が挙げられる。
【００３９】
前記核酸は、プローブおよびプライマーをさらに含む。ある種の態様では、プローブまたはプライマーは変性していてもよい。さらに、それらの用途に従って、プローブおよびプライマーは一本鎖または二本鎖であってもよい。プローブおよびプライマーは、例えば、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１８個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含み、本発明のブライマーを用いて生成され得るＰＣＲ増幅産物をさらに含む。
【００４０】
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、プローブがその標的部分配列と選択的にハイブリダイズし、他の配列とのハイブリダイゼーションはより少ないかまたは全くない条件をいう。また、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件は配列依存的であり、異なる環境パラメータにおいては異なることも理解される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が得られるように、ハイブリダイゼーションおよび洗浄液容量ならびに温度を調整することは当該技術分野において周知である。ストリンジェンシーは、用いられているプローブのサイズおよびヌクレオチド含有量などのパラメータに依存する。一般的な説明および例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、および他の文献を参照されたい。核酸のハイブリダイゼーションに関する別のガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に見出される。
【００４１】
好ましいストリンジェントな条件は、プローブに約９０％を超える相補的である配列にプローブがハイブリダイゼーションできるが、約７０％未満相補的である配列にはハイブリダイゼーションできないものである。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。
【００４２】
サザンまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、ハイブリダイゼーションを一晩実施して４２℃で１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルムアミドが挙げられる。非常にストリンジェントな洗浄条件の例としては、約１５分間７２℃の０．１５Ｍ  ＮａＣｌが挙げられる。ストリンジェントな洗浄条件の例としては、１５分間６５℃の０．２倍のＳＳＣ洗浄が挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９を参照されたい）。多くの場合、高ストリンジェントな洗浄の前に低ストリンジェントな洗浄を行い、バックグラウンドプローブシグナルを除去する。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖に対する中程度のストリンジェントな洗浄の例としては、１５分間４５℃の１倍のＳＳＣが挙げられる。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖に対する低ストリンジェントな洗浄の例としては、１５分間４０℃の４〜６倍のＳＳＣが挙げられる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関係のないプローブについて観察したものよりも２倍（以上）であるシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を指示する。
【００４３】
コードするポリペプチドが実質的に同一である場合、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸はなお実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードによって許される最大のコドン縮退を用いて核酸のコピーを生成する場合に起こる。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、または配列番号１４９またはそれらの断片であって、長さが少なくとも約５０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００個のヌクレオチドである断片と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一であるヌクレオチドの配列を含む。
【００４４】
また、本発明は、発色団遺伝子クラスターによってコードされる１以上のタンパク質を産生する方法に関する。このようなタンパク質は、宿主細胞内に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、または配列番号１４９を含む１以上の核酸を発現させることによって産生されてもよい。例えば、前述の核酸の１以上は、核酸を調節管理して発現に影響を与えるように操作可能に連結し、宿主細胞内での発現のためにベクターに組み込むようにすることができる。本発明の一態様では、アポタンパク質またはプレアポタンパク質が産生される。
【００４５】
本発明において有用な管理要素は、オペレーター配列およびリボソーム結合部位を任意に含むプロモータを含む。また、宿主細胞の増殖に関して、アポタンパク質またはプレアポタンパク質の発現の調節を可能にするような他の調節配列が望ましい場合がある。調節配列は当業者に知られ、例として、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子を発現させたり、発現させないようにするものが挙げられる。また、他のタイプの調節要素が、ベクター、例えばエンハンサー配列に存在してもよい。種々の発現ベクターが当該技術分野において知られ、例えば、コスミド、ＰＩ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣがある。
【００４６】
また、選択可能なマーカーは、組換え発現ベクターに含むようにすることができる。形質転換細胞株の選択に有用であり、一般に、形質転換細胞を適切な選択培地で培養する場合に、発現によりそれらの細胞に選択可能な表現型を与える遺伝子を含む種々のマーカーが知られている。このようなマーカーは、例えば、プラスミドに抗生物質耐性または感受性を与える遺伝子を含む。
【００４７】
上述したベクターは、タンパク質発現に適した任意の原核または真核細胞に挿入することができる。宿主細胞には、限定されないが、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｎｏｎｏｍｕｒｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどが含まれる。宿主細胞としては、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａなどのエンジインを自然に発現する種または株（例えば、細菌株）が好ましい（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，１７９０−２；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，２４５２−６３を参照されたい）。一態様では、タンパク質がＥ．ｃｏｌｉにおいて発現される。発現産物の回収は、当業者に周知の標準的な方法に従って行なうことができる。したがって、例えば、タンパク質は、単離を容易にする有用なタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）を用いて発現させることができる。他の標準的なタンパク質精製技術は適切であり当業者に周知である（例えば、Ｑｕａｄｒｉら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１５８５−９５；Ｎａｋａｎｏら，１９９２，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３２，３１３−２１を参照されたい）。色素タンパク質遺伝子クラスター全体が発現される場合、色素タンパク質を回収することができる。発現のためにある種のｏｒｆを選択することによって、色素タンパク質に関連する化合物を産生することができる。例えば、ｏｒｆ２３の発現によってプレアポタンパク質を産生することができる。
【００４８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、もしくは配列番号１４９またはそれらの断片を含む核酸分子をプローブとして用いてもよい。このようなプローブは、本発明の核酸の同定に有用である。下記の実施例に記載の方法と同様の方法を含む任意の適切な方法によりヌクレオチド配列をプローブとして用いてもよい。本明細書中において記載するように、ｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ（ＤＨ）プローブを用いて、アポタンパク質または他の発色団に関連するタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子クラスターを有する可能性があるＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２ゲノムＤＮＡのコスミドクローンを同定した。同様に、本発明の核酸を用いて、他の生物において、アポタンパク質および発色団に関連するタンパク質、特に、９員環エンジイン発色団をコードするｏｒｆを同定することができる。このような生物は、一般に、例えば、真菌、バチルス、シュードモナス、粘液細菌およびシアノバクテリアなどの二次代謝産物を産生する生物を含む。好ましくは、該核酸を用いて、限定されないが、アクチノミセス属、ストレプトミセス属またはミクロモノスポラ属の生物を含む放線菌目（Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａ：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ（登録商標）  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）の生物の遺伝子を同定する。より好ましくは、該核酸を用いて、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種および亜種の遺伝子を同定する。
【００４９】
また、本発明は、実施的に純粋なタンパク質およびポリペプチドを提供する。用語「実施的に純粋な」とは、本明細書中で使用するとき、所定のポリペプチドに関して、ポリペプチドが他の生物学的な高分子を実質的に含まないことを意味する。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％純粋である。純度は、当該技術分野において知られている任意の適切な標準的方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定することができる。実質的に純粋なタンパク質には、アポタンパク質がエンジイン分子と複合化する色素タンパク質を含むことは承認される。このような結合は、例えば、水素結合等の共有または非共有結合により行なうことができる。
【００５０】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質遺伝子クラスターのｏｒｆによってコードされるものを含む。好ましい態様では、該タンパク質およびポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、または配列番号１５０を含むものである。特定の好ましい態様では、該タンパク質は、２１Ｇ７９２プレアポタンパク質（配列番号６４）またはアポタンパク質（配列番号１５０）である（図７）。２１Ｇ７９２プレアポタンパク質およびアポタンパク質のアミノ酸組成を表２に示す。
表２
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質のアミノ酸組成
【００５１】
【表２Ａ】
2009541331.tif 000010
【００５２】
【表２Ｂ】
2009541331.tif 000011
また、本発明のタンパク質またはポリペプチドが、前述の好ましいタンパク質およびポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するものをさらに含むことは承認される。本明細書中においては、実質的に同じアミノ酸配列は、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−８に従ったＦＡＳＴＡ検索法により測定した場合、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、または配列番号１５０と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一である配列を含む配列であると定義される。
【００５３】
このようなタンパク質は、特に、保存アミノ酸置換がある場合には、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２と同様の活性を有する。保存アミノ酸置換は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの断片の１以上のアミノ酸を変更することによるアミノ酸組成の変化として定義される。この置換は、一般に同様の特性（例えば、酸性、塩基性、芳香族性、サイズ、正荷電もしくは負荷電、極性、非極性）を有するアミノ酸の置換であり、関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の性質（例えば、電荷、等電点、親和性、親和力、配座、溶解性）または活性を実質的に変更しない。典型的な保存置換は、以下のアミノ酸の群内で選択され、この群には、限定されないが、
（１）疎水性：メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；
（２）親水性：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（３）酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（４）塩基性：ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）；
（５）芳香族性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
（６）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ
が含まれる。したがって、また、本発明は、特に、アミノ酸置換が保存置換である場合、アミノ酸配列が配列番号６４または配列番号１５０と実質的に同じである２１Ｇ７９２アポタンパク質と同様のアミノ酸組成を有するアポタンパク質およびポリペプチドも包含する。
【００５４】
本発明は、例えば、１以上の無作為または標的変異、欠失、または挿入の導入により、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質遺伝子クラスターの１以上のｏｒｆに変更を与える。このようにして、該発色団、アポタンパク質、またはそれらの両方を修飾して、例えば、毒性の減少、効力の増加、または安定性の増加を示す色素タンパク質を作成してもよい。ある種のエンジイン発色団は、該発色団に特異的な部位でＤＮＡを開裂させることが認識される。さらに、種々の色素タンパク質は、ヒストンに対する固有のタンパク質分解活性を有する。したがって、また、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質および／または発色団の操作によっても特異性が変化した色素タンパク質を提供することができる。あるいは、アポタンパク質を修飾して、最適な活性分子のための担体または送達ビヒクルとすることができる。また、本発明は、別の生体分子と連結することが可能な修飾されたＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団またはアポタンパク質／発色団複合体も提供する。一態様では、該生体分子は、発色団または色素タンパク質を特異的に標的とすることを可能にする。このような生体分子は、例えば、細胞表面分子または受容体のための抗体または他のリガンドとすることができる。
【００５５】
例えば、変化したＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質をコードする核酸を発現ベクターおよび宿主細胞に挿入し、該宿主細胞をアポタンパク質の発現に適した条件下で培養し、当該アポタンパク質を宿主細胞または培地から回収することができる。好ましくは、宿主細胞は、変化したアポタンパク質と複合体を形成することができるエンジイン発色団または他の分子を産生することが可能である。このような細胞の例としては、放線菌目の生物を産生する種々の抗生物質、特に、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａおよびストレプトミセスなどの生物を産生するエンジインが挙げられる。宿主細胞は、大腸菌および酵母などの共通宿主をさらに含む。もちろん、上記変化したアポタンパク質を、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２において発現することができる。１つの態様では、上記変化したアポタンパク質を宿主細胞において過剰発現する。いずれかの他の内在性アポタンパク質が宿主細胞に存在する場合、変化したアポタンパク質をより高いレベルで発現し、他のアポタンパク質を過小発現するか、または標識を用いて該変化したアポタンパク質を発現し、このような精製を容易にする。好ましい態様では、変化したアポタンパク質をコードする核酸は、相同組み替えにより、内在性アポタンパク質遺伝子と置換される。次に、このようにして、変化したアポタンパク質を、エンジインまたは他の分子、例えば、活性剤との複合体において単離し、そのような複合体を、例えば、癌細胞株に対してスクリーニングして、生物活性を決定することができる。
【００５６】
さらに別の態様では、ａ）変化したアポタンパク質を宿主細胞において発現し、エンジインまたは他の分子と複合化することなく回収し、ｂ）次に、変化したアポタンパク質を種々のエンジインまたは他の分子に曝し、ｃ）条件に合った技術を用いて、アポタンパク質が該エンジインまたは他の分子と複合体を形成するかどうかを決定し、場合によりｄ）生物活性に関して、該複合体をスクリーニングする。さらに別の態様では、変化したアポタンパク質を宿主細胞において発現し、エンジインまたは他の分子と複合化することなく回収し、次に、変化したアポタンパク質を種々のエンジインまたは他の分子に曝し、生物活性に関して、該複合体をスクリーニングする。
【００５７】
別の例では、修飾発色団生合成経路をコードする核酸を発現する。
【００５８】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２生合成クラスターから発現されたポリペプチドの機能は、ＯＲＦ配列と既知のタンパク質および配列モチーフとを比較することにより推定することができる。（表３）
表３
２１Ｇ７９２色素タンパク質遺伝子クラスターのＯＲＦについて推定された機能
【００５９】
【表３Ａ】
2009541331.tif 000012
【００６０】
【表３Ｂ】
2009541331.tif 000013
【００６１】
【表３Ｃ】
2009541331.tif 000014
【００６２】
【表３Ｄ】
2009541331.tif 000015
【００６３】
【表３Ｅ】
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【００６４】
【表３Ｆ】
2009541331.tif 000017
【００６５】
【表３Ｇ】
2009541331.tif 000018
【００６６】
【表３Ｈ】
2009541331.tif 000019
【００６７】
【表３Ｉ】
2009541331.tif 000020
【００６８】
【表３Ｊ】
2009541331.tif 000021
【００６９】
【表３Ｋ】
2009541331.tif 000022
【００７０】
【表３Ｌ】
2009541331.tif 000023
それらの機能と一致させて、集中的生合成経路が、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインの合成のために提供される。複合体の４つの主要成分（エンジインコア、マヅロサミン、２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸、および３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−プロパン酸）が別々に産生され、集合的に最終の生物活性産物を形成する。
【００７１】
３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパン酸部分の生合成。エンジインの３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロピオン酸由来部分（図９）を産生させるために、まず、チロシンをｏｒｆ１８の遺伝子産物によってβ−チロシンに変換する。Ｏｒｆ１８は、いくつかのヒスチジンおよびフェニルアラニンアンモニアリアーゼと高い類似性を示すが、β−チロシンからβ−チロシンへの変換を触媒するＣ−１０２７生合成経路のＳｇｃＣ４との類似性が最も高い（７３％の同一性、８４％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１１７０−７３、Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，１１５９４−５）。次に、β−チロシンをｏｒｆ１７遺伝子産物のアデニル化（Ａ）ドメインによって、アミノアシルアデニレートとして活性化し、隣接するペプチジル担体タンパク質（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰＣＰ）上のホスホパンテテイニル補欠分子群のスルフィドリル基に伝達し、β−チロシニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７を形成する。Ｏｒｆ１７は、多様な非リボソームペプチドシンテターゼ（ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＮＲＰＳ）と類似する。推定されたアミノ酸配列の配列分析に基づいて、Ｏｒｆ１７は、３つの機能ドメイン、縮合（Ｃ）ドメイン、Ａドメイン、およびＰＣＰドメインを含む（図１０）。ＫｏｎｚおよびＭａｒａｈｉｅｌ，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，Ｒ３９−Ｒ４７を参照されたい。Ａドメインの基質特異性コードをＡ４Ａドメイン構造モチーフとＡ５Ａドメイン構造モチーフとの間の領域から抽出し、特異性コードＤＰＣＱＶＭＶＩＡＫ（表４）を示した。また、表４は、Ｃ１０２７生合成クラスター由来のＳｇｃＣ１（Ｃｈａｌｌｉｓら，２０００，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，２１１−２４）およびグラミシジン生合成クラスター由来のＧｒｓＡ（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，６，４９３−５０５）の基質および基質特異性コードも示す。
表４
アデニル化ドメイン基質特異性コードの比較
【００７２】
【表４】
2009541331.tif 000024
Ｏｒｆ１７は、Ｃ−１０２７生合成クラスター由来のＳｇｃＣ１に最も類似している（４１％の同一性、４９％の類似性）。ＩＩ型非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）をコードするＳｇｃＣ１は、孤立Ａドメインから成る。この酵素のインビトロ特徴付けでは、単一のＰＣＰドメインから成るＩＩ型ＮＰＲＳであるＳｇｃＣ２上に載せる前に、β−チロシンを特異的に活性化することが示されている。（Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５）。ＳｇｃＣ１およびＯｒｆ１７の基質特異性コードの比較により、該コードが著しく類似していることは明らかである（Ｏｒｆ１７のＤＰＣＱＶＭＶＩＡＫとＳｇｃＣ１のＤＰＡＱＬＭＬＩＡＫ）。両方の酵素が同じ基質を活性化するため、この類似性は驚くべきことではない。興味深いことに、ｏｒｆ１７の終止コドンは、ｏｒｆ１８の初めと３ｂｐ重複しており、これら２つの遺伝子の発現が翻訳共役している可能性があることを示している。ｏｒｆ１８が同時に発現してβ−チロシンを供給することなくｏｒｆ１７が発現することにより、その意図される基質を供給することなくＯｒｆ１７遺伝子産物が産生されるため、これらの遺伝子の発現を調節することは予想外のことではない。
【００７３】
一度チオエステル結合によりＯｒｆ１７のＰＣＰ上に載せられると、次に、β−チロシニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７は、Ｏｒｆ１５によってメチル化され、３−アミノ−３−（４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７を生じる。Ｏｒｆ１５は、多くのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性Ｏ−メチルトランスフェラーゼと高い類似性を示し、ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼ（モチーフＩ−ＶＶＤＶＧＴＦＴＧ、配列番号１６６；モチーフ２−ＰＡＡＤＬＶＦＬ、配列番号１６７；モチーフ３−ＬＬＲＰＧＧＬＬＶＡ、配列番号１６８）に共通する３つの配列モチーフを有する。ＫａｇａｎおよびＣｌａｒｋｅ，（１９９４）Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１０，４１７−４２７。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインは単一のＯ−メチル基を有するため、Ｏｒｆ１５が、この反応を触媒する可能性が最も高い酵素である。続いて、この酵素につながれた中間体は、Ｏｒｆ３９によってヒドロキシル化され、３−アミノ−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７をもたらす。ＢｌａｓｔＰ分析は、Ｏｒｆ３９が、フェノール性基質のヒドロキシル化に関与する多くのヒドロキシラーゼに類似するヒドロキシラーゼであることを示す。これは、インビトロで塩素化□−チロシニル−Ｓ−ＰＣＰ中間体をヒドロキシル化することが分かっているＣ−１０２７生合成クラスターのＳｇｃＣに際立って類似している（７３％の同一性、８２％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２；Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５）。ヒドロキシル化に続いて、ｏｒｆ１９遺伝子産物が芳香族環のＣ−２位置を塩素化して、３−アミノ−３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７をもたらす。Ｏｒｆ１９は、二次代謝に関与するいくつかのアルキルハリダーゼと相同であり、最も顕著には、ＰＣＰ結合β−チロシンの塩素化を行なうことが分かっているＣ−１０２７生合成クラスター由来のＳｇｃＣ３である（５８％の同一性、７０％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２；Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５）。
【００７４】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインに組み込まれたβ−チロシン誘導体は、アミノ基の代わりにヒドロキシル基を持つため、酸化的脱アミノ反応により、３−アミノ−３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７中間体のアミノ基をＯｒｆ２１と置き換えることが予想できる。ＢｌａｓｔＰ分析により、Ｏｒｆ２１がいくつかの推定ＦＡＤおよびＮＡＤＰＨ依存性モノオキシゲナーゼ／ヒドロキシラーゼとの類似性を示すことが明らかになり、ドメイン分析により、多くのモノオキシゲナーゼに共通のＦＡＤ結合ドメインを含むことが示される。このドメインはアミノ酸オキシダーゼに共通しており、酸化的脱アミノ反応が十分に裏付けされているため、Ｏｒｆ２１はこの形質転換を行なう有力な候補である。しかしながら、ＦＡＤおよびＮＡＤＰＨ依存性モノオキシゲナーゼ／ヒドロキシラーゼに類似するＯｒｆ４２を含むこの反応を潜在的に触媒し得る候補が他にもいくつか存在することに留意することが重要である。さらに、Ｐ４５０ヒドロキシラーゼに類似する２つのＯｒｆ（Ｏｒｆ２５およびＯｒｆ２７）が生合成クラスターに存在し、Ｐ４５０ヒドロキシラーゼも酸化的脱アミノ反応に関係しているため、これらの酵素のうちの１つもこの工程を触媒する可能性がある。（Ｌｉら，２０００，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２，４０８７−９５）酸化的脱アミノ反応に続いて、Ｏｒｆ２１または他の候補酵素のうちの１つにより導入されると思われるケトンの還元が発生する可能性がある。このような反応を触媒できることが最も明白な酵素は、ポリケチド生合成で用いられるものに類似するケトレダクターゼである。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスターの検査では、ケトレダクターゼのような酵素との類似性を示すいかなる酵素も同定されなかった。必要な還元を触媒する可能性がある未知の機能を有するいくつかの酵素がクラスターに存在するか、または酸化的脱アミノ反応の触媒に関与する酵素も還元反応を触媒する可能性がある。あるいは、現在の生合成経路外でコードされた酵素が、予想される還元を触媒し得る。ケト還元に続いて、チロシン誘導体３−（２−クロロ−３−ヒドキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７がＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン複合体に組み込まれる。このＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインの成分の最終産物への組み込みについては以下で検討する。
【００７５】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の３−（２−クロロ−３−ヒドキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル成分またはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００７６】
マヅロサミン部分の生合成。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成経路の分析により、マヅロサミン（４−アミノ−４−デオキシ−３−Ｃ−メチル−β−リボピラノース）生合成に関与する５つの遺伝子が同定された（図１１）。全てのデオキシ糖と同様に、マヅロサミン（ＭＤＡ）生合成における第１の工程は、グルコース−ｄＮＤＰシンターゼによるＤ−グルコース−１−リン酸塩（Ｇ−Ｉ−Ｐ）の活性化である。Ｔｒｅｆｚｅｒら，１９９９，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１６，２８３−９９。いくつかのグルコース−ｄＮＤＰシンターゼと相同であるＯｒｆ４３は、Ｇ−１−Ｐの活性化に関与する。これは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース内のタンパク質に対するＯｒｆ４３の配列相同性に基づいて、ｄＴＤＰまたはｄＵＤＰ−グルコースの形成を触媒すると思われる。
【００７７】
次に、ｄＮＤＰ−糖デヒドロゲナーゼと相同性が高い酵素であるＯｒｆ３７は、第一級アルコールを酸化させ、ｄＮＤＰ−Ｄ−グルクロン酸を産生する。次に、予想されるｄＮＤＰ−グルクロン酸デカルボイクスラーゼであるＯｒｆ３８は、ｄＮＤＰ−Ｄ−グルクロン酸をｄＮＤＰ−キシロースに変換する。ｏｒｆ３８から増幅された断片をプローブとして用い、マヅロサミンの生合成が４，６−デオキシグルコース中間体を含むｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼを伴い得るという予測に基づいてＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスターを含む第１のコスミドを同定した（実施例を参照されたい）。しかしながら、ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼおよびＴＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼアミノ酸配列とＯｒｆ３８の配列の比較では、Ｄｅｃｋｅｒらによりグルコース−４，６−デヒドラターゼ遺伝子を増幅するために用いるＰＣＲプライマーの設計に用いられた同類アミノ酸モチーフもＯｒｆ３８およびグルクロン酸デカルボキシラーゼ配列中に存在することが示される（図１２）。（Ｄｅｃｋｅｒら，１９９４，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．，１４１，１９５−２０１）。結果として、これらのプライマーを用いてグルクロン酸デカルボキシラーゼが増幅されたことは驚くべきことではない。さらに、ｏｒｆ３７の終止コドンがｏｒｆ３８の開始コドンと重複しており、これらのｏｒｆが翻訳共役している可能性があることに留意されたい。
【００７８】
ｄＮＤＰ−グルクロン酸の脱カルボキシル化に続いて、ｄＮＤＰ−Ｄ−キシロースのＣ−３ヒドロキシルが、Ｏｒｆ４９によってエピマー化され、ｄＮＤＰ−Ｌ−キシロースを産生する。Ｏｒｆ４９は、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ（受入番号ＡＡＺ５５２７３．１）由来の未同定タンパク質に最も類似し、その次に最も密接な関係がある同族体は、オビエドマイシンの生合成に関与するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １１８９１由来の推定ＮＤＰ−糖エピメラーゼであるｏｖｍＸである（４０％の同一性、５３％の類似性）。（Ｌｏｍｂｏら，２００４，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ５，１１８１−７）。
【００７９】
エピマー化に続いて、ｏｒｆ４０の遺伝子産物は、ｄＮＤＰ−Ｌ−キシロースの３位炭素をメチル化する。Ｏｒｆ４０は、多数のＮＤＰ−ヘキソースＣ−メチルトランスフェラーゼと有意な類似性を示し、多様なＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼに共通する３つの配列モチーフ（モチーフ１−ＩＶＥＩＧＣＮＤＧ、配列番号１６９；モチーフ２−ＧＰＡＤＶＬＹＧ、配列番号１７０；モチーフ３−ＬＬＫＰＤＧＩＦＶＦ、配列番号１７１）を有する。（ＫａｇａｎおよびＣｌａｒｋｅ，１９９４，Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１０，４１７−２７）。結果として、Ｏｒｆ４０は、このメチル化を行なうと予想される。他のＣ−メチル化がＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインの２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−安息香酸（ＨＤＢＡ）部分の生合成において発生し、Ｃ−メチルトランスフェラーゼは、そのメチル化（Ｏｒｆ３３）を触媒すると予想され、ＨＤＢＡ炭素骨格の生成に関与するポリケチドシンターゼとともに小さなオペロンを形成すると思われ、結果として、Ｏｒｆ４０はその形質転換には加わらないと予想される。
【００８０】
次に、メチル化ｄＮＴＰ−糖は、Ｃ−４がアミノ基転移してｄＮＴＰ−マヅロサミンを形成する。この反応は、Ｄ−ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅの形成においてデオキシ糖中間体のＣ−４アミノ基転移を行なうことが分かっているスピノシン生合成クラスター由来のＳｐｎＲとの相同性が高い（５５％の同一性、６８％の類似性）Ｏｒｆ３６により触媒されると思われる。（Ｚｈａｏら，２００５，ＪＡＣＳ，１２７，７６９２−３）Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインのマヅロサミン成分の最終産物への組み込みについては下記で検討する。
【００８１】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインのＭＤＡ成分またはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００８２】
２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−安息香酸部分の生合成。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインの２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸（ＨＤＢＡ）成分は、２つの遺伝子産物、反復Ｉ型ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）であるＯｒｆ３２、およびＳＡＭ依存性Ｃ−メチルトランスフェラーゼであるＯｒｆ３３により合成される可能性が最も高い（図１３）。最近まで、芳香族ポリケチドの生合成についての細菌の理論的枠組みは、反復ＩＩ型ＰＫＳを必要としていた。（Ｓｈｅｎら，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７，２８５−９５）Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスターの検査では、ＩＩ型ＰＫＳと相同する遺伝子の存在は明らかにされなかった。しかしながら、Ｏｒｆ３２は、ネオカルチノスタチンのナフトエ酸部分の産生に関与する反復Ｉ型ＰＫＳであるＮｃｓＢに高い類似性を示し（４７％の同一性、５９％の類似性）、真菌を元にするいくつかの６−メチルサリチル酸シンターゼにも高い類似性を示した。（Ｌｉｕら，２００５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２９３−３０２）Ｏｒｆ３２は、ケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、ケトレダクターゼ（ＫＲ）およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）を含むタイプＩのＰＫＳに共通する５つのドメインから成る。これは、繰返し型デアルボキシラーゼ縮合を行い、その後にＣ−４の選択的ケト還元および脱水、ならびにＣ−２のケト還元を行なうことにより、１つのアセチル補酵素Ａ（ｃｏＡ）および３つのマロニルｃｏＡから直鎖テトラケチドの形成を触媒する。次いで、新生テトラケチド中間体は、非酵素分子内アルドール縮合により、環化６−メチルサリチル（６ＭＳＡ）酸中間体を形成する。
【００８３】
その後、ｏｒｆ３３の遺伝子産物は、６ＭＳＡ中間体のＣ−３位置をメチル化してＨＤＢＡを形成する。Ｏｒｆ３３は、Ｎ−、Ｃ−およびＯ−メチルトランスフェラーゼを含む多種多様のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼに類似する。その分類と一致させて、Ｏｒｆ３３は、多種多様のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼに共通する３つの配列モチーフを有する（モチーフ１−ＶＬＤＬＧＧＧＤＧ、配列番号１７２；モチーフ２−ＤＧＣＤＡＩＬＹ、配列番号１７３；モチーフ３−ＡＬＰＥＧＧＶＣＶＶ、配列番号１７４）。（ＫａｇａｎおよびＣｌａｒｋｅ，１９９４）生合成クラスターに存在する他のメチルトランスフェラーゼがこの反応を触媒する可能性があり、Ｏｒｆ３３は、Ｏｒｆ３２のすぐ上流に位置し、ＨＤＢＡの産生に充てられる小さなオペロンの一部であるため、結果として、この反応を起こす可能性が最も高い酵素である。ＰＫＳからの環化ポリケチドの放出には、多くのポリケチドの場合と同様にチオエステラーゼは必要としない。むしろ、それは、６−メチルサリチル酸生合成について報告されているものに似たケテン経路を介して放出される。ＳｐｅｎｃｅｒおよびＪｏｒｄａｎ，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８８，８３９−８４６。
【００８４】
Ｏｒｆ３２からの放出に続いて、ＨＤＢＡが、ｏｒｆ３１の遺伝子産物によりアリールアデニレートとして活性化される。Ｏｒｆ３１は、多数のアリール酸ＡＭＰリガーゼに類似する。これらのタイプの酵素の最も研究された例は、親鉄剤生合成の調査によるものである。多くの親鉄剤の場合、サリチル酸塩または２’、３’−ジヒドロキシベンゾエートなどのアリール酸は、親鉄剤の非リボソームペプチドコアのアセンブリにおける第１の工程としてアデニル化される（ＣｒｏｓａおよびＷａｌｓｈ，２００２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６，２２３−４９を検討のために参照されたい）。アリール酸をアデニレートとして活性化することに加えて、これらの酵素はまた、いわゆるアリール担体タンパク質（ＡｒＣＰ）のホスホパンテテイニル補欠分子群のスルフィドリル基にアリール酸を転移する。親鉄剤バチルスバクチン（ｂａｃｉｌｌｉｂａｃｔｉｎ）の生合成に関与する２’，３’−ジヒドロキシベンゾエート−ＡＭＰリガーゼ（ＤｈｂＥ）の結晶構造と、ＮＰＲＳ  ＧｒｓＡアデニル化ドメインおよび蛍ルシフェラーゼを含む他のアデニル化酵素の結晶構造との比較により、アリール酸活性化ドメインがアミノ酸活性化ドメインには存在しない特徴的配列を含むことが明らかになった。（Ｍａｙら，２００２，ＰＮＡＳ９９，１２１２０−５）。ＤｈｂＥでは、通常アミノ酸活性化ドメイン（ＹｘＦＤｘＳ）に存在するいわゆるコアＡ４モチーフが配列モチーフＨＮＹＰＬＳＳＰＧに置き換えられる。アミノ酸活性化ドメインでは、不変Ａｓｐ残基がアミノ酸基質の□−アミノ基を安定させ、アリール酸活性化ドメインでは、Ａｓｐ残基は、ＤＨＢＡまたはサリチル酸の２’−ヒドロキシル基と水素結合する同類中性Ａｓｎに置き換えられる。（Ｍａｙら，２００２）。ＨＤＢＡは２’−ヒドロキシルを有するため、Ｏｒｆ３１がアリール酸活性化Ａ４モチーフを有することが予想される。Ｏｒｆ３１配列の検査により、アリール酸を活性化する酵素と整合するモチーフＨＮＦＰＬＡＳＰＧ（配列番号１７５）が明らかになった（図１４）。
【００８５】
ＮＲＰＳアミノ酸活性化ドメイン（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，４９３−５０５；Ｃｈａｌｌｉｓら，２０００，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，２１１−２４）に関しては、Ａ４コアモチーフとＡ５コアモチーフとの間の領域からアリール酸活性化ドメインの基質特異性コードを抽出することができる。（Ｍａｙら，２００２）。表５は、Ｏｒｆ３１基質特異性コードと、下記の二次代謝産物の生合成に関与する他のアリール酸活性化ドメインの基質特異性コードとの比較を示す：ヴァージニアマイシン（ＶｉｓＢ、受入番号ＢＡＢ８３６７２）、プリスチナマイシン（ＳｎｂＡ、受入番号ＣＡＡ６７１４０）、ミコバクチン（ＭｂｔＡ、受入番号ＣＡＢ０３７５９）、エルシニアバクチン（ＹｂｔＥ、受入番号ＡＡＣ６９５９１）、ピオケリン（ＰｃｈＤ、受入番号ＡＡＤ５５７９９）、ネオカルチノスタチン（ＮｃｓＢ２、受入番号ＡＡＭ７７９８７）、ビブリオバクチン（ＶｉｂＥ、受入番号Ｏ０７８９９）、バルニバクチン（Ｖｖａ１３０１、受入番号ＢＡＣ９７３２７）、バチルスバクチン（ＤｈｂＥ、受入番号ＡＡＣ４４６３２）、およびミクソケリン（ＭｘｃＥ、受入番号ＡＦ２９９３３６）。ＧｒｓＡフェニルアラニン活性化アデニル化ドメインに準じて位置番号を付している（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，１９９９）。２’，３’−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）とサリチル酸の活性化の区別に関与すると提示されている残基をアスタリスクで特定している。Ｏｒｆ３１で見られる位置と対応する各位置の残基は、灰色の影を付けている。ＨＰＡ、３−ヒドロキシピコリン酸。
【００８６】
Ｏｒｆ３１基質特異性コードと他のアリール酸活性化酵素および３−ヒドロキシピコリン酸を活性化する２つの酵素のコードとの比較により、Ｏｒｆ３１がサリチル酸またはＨＤＢＡのいずれかを活性化することが示される。（表５）。
表５
アリール酸活性化ドメイン基質特異性コードに比較
【００８７】
【表５Ａ】
2009541331.tif 000025
【００８８】
【表５Ｂ】
2009541331.tif 000026
サリチル酸またはＨＤＢＡの活性化後、Ｏｒｆ３１は、ｏｒｆ１６によってコードされるＡｒＣＰに結合したホスホパンテテイニル補欠分子群のスルフィドリル基への活性化アリール酸の転移を触媒する。Ｏｒｆ１６は、二次代謝に関与する多くのＰＣＰおよびＡｒＣＰに類似する（約３０〜４０％同一）小さなタンパク質（９５ａａ）であり、不変セリン残基（ＧＴＦＦＱＬＲＧＱＳＩ；配列番号１７６）を含む特徴的な４’−ホスホパンテイン付着モチーフを有する。ＡｒＣＰへの付着の後、下記で検討されるように、サリチル酸塩誘導体は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン複合体への組み込みに期待される。
【００８９】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成スキームを設計し、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸成分またはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００９０】
エンジインコア生合成。少なくとも１４個の遺伝子が、図１５に概略を示すＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインコア生合成におけるそれらの役割をサポートするように機能することが推定されるＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスター内で同定された。Ｏｒｆ５は、ネオカルチノスタチン（ＮｃｓＥ）、Ｃ−１０２７（ＳｇｃＥ）およびカリケアマイシン（ＣａｌＥ８）の生合成に関与するエンジインＰＫＳとの全体的な配列相同性を示す反復Ｉ型ＰＫＳをコードする。（Ｌｉｕら，２００５；Ｌｉｕら，２００２；Ａｈｌｅｒｔら，２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１１７３−７６）。先に同定したエンジインＰＫＳと同様に、Ｏｒｆ５は、６個のドメイン：ＫＳ、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲ、ＤＨ、およびいわゆる「末端ドメイン」（ＴＤ）からなる（図１６）。ＴＤは、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの相同性を示す。結果として、ＴＤは、翻訳後にＡＣＰ活性部位セリンを４’−ホスホバンテテインで修飾することにより、エンジインＰＫＳの自動活性化を触媒すると見られている。（Ｚａｚｏｐｏｌｏｕｓら，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１，１８７−９０）。Ｏｒｆ５は、１つのアセチルｃｏＡおよび７つのマロニルｃｏＡから新生直鎖ポリ不飽和ポリケチド中間体を繰り返し産生すると予想される。直鎖中間体は、Ｏｒｆ５から放出され、および／または全てのエンジイン生合成クラスターに見られるチオエステラーゼタンパク質群との類似性を示すＯｒｆ６により環化されると考えられる。上記参照。このタンパク質群は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種株ＣＢＳ−３の４−ヒドロキシベンゾイルｃｏＡチオエステラーゼとの相同性に基づいて、チオエステラーゼとして機能すると予測される。上記参照。
【００９１】
ポリケチド中間体は、いくつかの遺伝子産物（Ｏｒｆ１−４、７、８、１１、１２、１４）によりさらに処理され、エンジインコアを与える（図１５）。これらの遺伝子産物は、エンジイン生合成クラスターでの保存性が高い。Ｏｒｆ５および６に加えて、Ｏｒｆ１−４の同族体が現在までに研究されてきた全てのエンジイン生合成経路に見られ（上記参照）、Ｏｒｆ７、８、１１、１２および１４の同族体は、９員エンジインＣ−１０２７およびネオカルチノスタチン生合成クラスターと共通する（Ｌｉｕら，２００５；Ｌｉｕら，２００２）。Ｏｒｆ１−４、１１および１４は、機能が公知のいずれのタンパク質とも相同性を有さないが、Ｏｒｆ７、８および１２は、種々のオキシドレラクターゼと似ている。興味深いことに、ｏｒｆ１１およびｏｒｆ１２と同様に、ｏｒｆ２−８は翻訳共役されていると思われるため（例えば、ｏｒｆ２の終止コドンはｏｒｆ３の開始コドンと重複し、ｏｒｆ３の終止コドンは開始コドンまたはｏｒｆ４と重複する、など）、これらの遺伝子の大半の発現は共調整することができる。
【００９２】
エンジインコア（図１５）は、エンジインコアのＣ１３〜Ｃ１４エポキシドからの末端アミドの産生に関与していると思われる少なくとも３つの遺伝子産物、Ｏｒｆ３０、Ｏｒｆ４１およびＯｒｆ２４によりさらに修飾される。ｏｒｆ３０は、予想されるエポキシドヒドロラーゼをコードし、ｏｒｆ４１は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードし、ｏｒｆ２４は、アミノトランスフェラーゼをコードする。その後、完全に修飾されたエンジインコア部分は他の発色団成分で覆われて、活性代謝体を産生する。
【００９３】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団のエンジインコアまたはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００９４】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団のアセンブリ（図１７）。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジインの生合成は、分子複合体の個々の成分のアセンブリについて集中的方法を必要とするエンジイン生合成の現在の理論的枠組みに従う。（Ｌｉｕら，２００５；Ｌｉｕら，２００２；Ａｈｌｅｒｔら，２００２）。各成分の産生に続いて、それら成分がエンジインコアに体系的に結合し、最終的に図１７において概略を示すような最終分子を得る。エンジインコアの３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル部分への付着は、Ｏｒｆ１７の縮合ドメインにより触媒されていると思われる。Ｏｒｆ１７によるこの反応の触媒作用は、通常、ＮＲＰＳの縮合ドメインに起因する一般的なペプチド結合形成活性と整合する。エーテル結合形成を介して３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル部分の芳香族環をエンジインコアに付着するために用いられるメカニズムは不明であるが、Ｃ５〜Ｃ６エポキシドの開環と同時に起こり、および／またはＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスター内に含まれるＰ４５０またはモノオキシゲナーゼをコードするｏｒｆのうちの１以上に関連し得る。マヅロサミン部分は、Ｏ−グリコシド結合を介してエンジインコアと結合する。天然物生合成に関与する多種多様のグリコシルトランスフェラーゼとの配列類似性が高いｏｒｆ２９の遺伝子産物は、この伝達を触媒する。Ｏｒｆ２９は、Ｃ−１０２７エンジインコアのグリコシル化を触媒すると考えられているＣ−１０２７生合成経路からのＳｇｃＡ６と最も類似している（４３％の同一性、５７％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２）。最後に、タイプＩのＮＰＲＳ縮合ドメインであるＯｒｆ２０は、非リボソームペプチド生合成でのペプチド結合形成に似た反応において、Ｏｒｆ１６のホスホパテテインの腕からマヅロサミンのアミノ基にＨＤＢＡ部分を伝達する。
【００９５】
これをモデルとして用いて、当業者は、他の多くの合成スキームを設計し、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団、特に発色団−ｂおよび発色団−ｃ、ならびにこれらの発色団の誘導体を産生することができる。
【００９６】
本発明は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団生合成成分を含む新規な生合成経路であって、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の変異体が産生されるように１以上の成分が突然変異しているか、または異なるエンジイン発色団の生合成経路からの成分で置換もしくは付加されている経路を提供する。標準的な分子遺伝子技術を用いて、先に示したような個々のｏｒｆまたはｏｒｆの組み合わせを操作して、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団および／または色素タンパク質の新規な生物活性類似体を産生することができる。１つの好ましい態様では、新規な発色団は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質と同時発現する。別の態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の変異体と同時発現する。さらに別の態様では、新規な発色団は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の変異体と同時発現する。
【００９７】
本発明の一態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２におけるｏｒｆ１５の不活性化により、通常は当該分子のβ−チロシニル部分に見られるＯ−メチルが欠失した類似体が産生される。（例えば、図１０参照）この変化により、Ｏ−メチルの代わりにヒドロキシル基が残る（下記のＲ１参照）。ヒドロキシル基置換を行なう理由の１つは、標準的な合成化学技術による類似体のさらなる化学誘導体化のための化学的な手かがりとしてそれを用いることである。同様に、ｏｒｆ１９によりコードされたハロゲナーゼの不活性化によりＰＣＰ結合β−チロシンの塩素化を防ぎ、その結果、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９類似体からＣｌがなくなる（下記のＲ２参照）。下記のＲ３基は、通常、ＣＨ３であり、ｄＮＤＰ−Ｌ−キシロースの３−炭素をメチル化するｏｒｆ４０の産物の不活性化によりＨに変化させることができる。
【００９８】
【化４】
2009541331.tif 000027
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団のＲ４基は、
【００９９】
【化５】
2009541331.tif 000028
（Ｒ５と示す）であり、ここでＲ５は、アミド窒素で糖部分と連結する。ｏｒｆ３２の不活性化により、ＨＤＢＡ部分が欠失したエンジイン類似体が産生され（例えば、図１３、１７を参照されたい）、またはｏｒｆ２０の不活性化の結果、Ｒ５がＮＨ２により置換される。さらに、Ｒ４部分は修飾されてもよい。例えば、
【０１００】
【化６】
2009541331.tif 000029
（Ｒ６と示す）は、ｏｒｆ３３を不活性化することにより得られる。
【０１０１】
別の態様では、ｏｒｆ３２は上述のように不活性化され、突然変異体を用いて、ＨＤＢＡ部分が他のアリール酸に置き換えられたＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン類似体のライブラリーを作成する。アリール酸は、ｏｒｆ３２突然変異体に各種の天然アリール酸、Ｎ−アセチルシステアミン連結
アリール酸、またはメチルチオグリコレート等、他のチオエステル担体と連結したアリール酸を発酵ブロスに与えることにより導入される（例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，３６７−９を参照されたい）。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２分子複合体への成分の添加に関与する各ｏｒｆを単独または他のｏｒｆと組み合わせて突然変異させて、生物学的試験のための大規模なＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン類似体のライブラリーを作成することができる。
【０１０２】
よって、本発明は、下記の式を有する化合物を提供する：
【０１０３】
【化７】
2009541331.tif 000030
式中、Ｒ１はＯＨまたはＯＣＨ３であり；Ｒ２はＣｌまたはＨであり；Ｒ３はＣＨ３またはＨであり；Ｒ４はＮＨ２、Ｒ５、およびＲ６から選択される。さらに、特定の天然アリール酸、Ｎ−アセチルシステアミン連結アリール酸、またはメチルチオグリコレート等の他のチオエステル担体に連結したアリール酸を付加した発酵ブロスで突然変異体ｏｒｆ３２を培養することにより、エンジイン類似体を産生することができ、ここで、Ｒ４は、
【０１０４】
【化８】
2009541331.tif 000031
または
【０１０５】
【化９】
2009541331.tif 000032
であり、
式中、Ｒ１’はＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、Ｃ３Ｈ７、またはＮＯ２であり；Ｒ２’はＨ、ＣＨ２、ＮＨ２、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、ＮＯ２、ＯＣ２Ｈ５、またはＮＣ２Ｈ６であり；Ｒ３’はＨ、ＣＨ３、Ｃｌ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、Ｆ、ＣＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、ＯＣ２Ｈ５、またはＮＯ２であり；Ｒ４’はＯＨまたはＯＣＨ３である。
【０１０６】
他の態様では、異なる二次代謝経路からの１以上のｏｒｆをＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２に導入することができる。選択されたｏｒｆを、相同組換えにより、または例えば、ファージのｉｎｔ／ａｔｔＰ機能（例えば、ｐＳＥＴ１５２または同様のベクター）により媒介された部位特異的組込により、宿主染色体に導入することができる。あるいは、選択されたｏｒｆを自己複製ベクター上に導入することができる。一度発現すると、遺伝子産物は、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団を修飾し続ける。例えば、Ｃ−１０２７生合成遺伝子クラスター由来のｓｇｃＡ、ｓｇｃＡ１、ｓｇｃＡ２、ｓｇｃＡ３、ｓｇｃＡ４、ｓｇｃＡ５およびｓｇｃＡ６を、１つ以上のマヅロサミン生合成ｏｒｆが不活性であるＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２株に導入し、マヅロサミンの代わりにＣ−１０２７デオキシアミノ糖またはその誘導体を含むＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２エンジイン類似体を産生することが可能である。
【０１０７】
本発明はまた、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質生合成クラスターから他の二次代謝産物を産生する微生物に遺伝子を導入して、その生物により産生された同種の二次代謝産物を修飾することを可能にする。例えば、異なるエンジイン発色団（例えば、Ｃ−１０２７発色団）の類似体は、その発色団の生合成経路を発現する宿主であって、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質生合成経路から１以上の成分が置換または付加された宿主を提供することにより産生される。
【０１０８】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の類似体を作ることに加えて、負の調節因子を不活性化し、正の調節因子の発現レベルまたは遺伝子コピー数を増加することにより発酵タイターを増加することもできる。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに含まれる配列との相同性に基づいて推定転写調節因子と同定された少なくとも８個のｏｒｆ（ｏｒｆ９、１０、４６、５０、５２、５５、６２および６３）を含む。これらの調節因子の機能を体系的にテストして、どの調節因子が正の調節因子であり、どれが負の調節因子であるかを特定することができる。それらの結果に基づいて、これらの遺伝子のうちの１つ以上を合理的に変形し、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の発酵タイターを増加することができる。
【０１０９】
典型的には、有毒な二次代謝産物を産生する生物は、その産生する生物に自己耐性を与える１以上の遺伝子を有する。これらの遺伝子の産物は、通常、有毒な代謝体を化学的に修飾、隔離または輸送することにより耐性を与える。ある場合には、該代謝体の標的は、本質的に、当該代謝体に対する感受性が低いかまたは当該標的を修飾して当該代謝体に対する感受性を低くする。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、自己耐性に関与している可能性がある遺伝子産物を産生する少なくとも２つのｏｒｆを含む。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２複合体のアポタンパク質成分をコードするｏｒｆ２３は、活性発色団を隔離することにより上記産生する生物のＤＮＡを発色団による開裂から保護することに関与していると思われる。ｏｒｆ２２の遺伝子産物は、多くの膜貫通排出タンパク質と同様のタンパク質をコードし、Ｃ−１０２７発色団−アポタンパク質複合体の排出ポンプとして作用すると考えられているＣ−１０２７生合成経路からのＳｇｃＢに最も類似する（Ｌｉｕら（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２９３−３０２）。ｏｒｆ２２およびｏｒｆ２３を用いることにより、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質に潜在的に耐性を与えることができる。１つの態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２生合成経路を異種発現するように選択された細胞にこれらのｏｒｆを導入することにより、その細胞が高度なＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を産生することを可能にし、その有毒作用に対する免疫を有するようにすることができる。別の態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の生体内転換のために選択されたドナー細胞にこれらのｏｒｆを導入することができる。このような細胞は、それ以外の場合では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の極度の毒性により生体内転換が発生する前に殺傷される。
【０１１０】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２生合成クラスター全体、または選択された部分は、細菌等の異種宿主中で発現することができる。有用な細菌の例としては、例えば、ストレプトミセス属、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属、Ｎｏｎｏｍｕｒｅａ属、ミクロモノスポラ属、エシェリキア属、およびシュードモナス属のメンバーが挙げられる。（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒら，２００１；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００４参照）該生合成クラスターはまた、酵母等の真核宿主中でも異種発現することができる。一態様では、該Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、高度な二次代謝産物の産生のためにすでに修飾された生物中で有利に発現されることにより、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の産生レベルを、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２を用いて通常達成することができるレベルよりも上げることができる。（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，４８０−８を参照されたい）。別の態様では、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質類似体の生成を促進するために、上記Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、特に遺伝子操作を受けやすい生物中で有利に発現される（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７，１４１−７；Ｂｉｎｎｉｅら，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，３１５−２０を参照されたい）。
【０１１１】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質生合成経路の全てまたは一部をコードする組換えＤＮＡを伝達するために有用な様々な方法が当該技術分野で知られている。種々の宿主においてこのようなＤＮＡを伝達および発現するために用いることができる広範な宿主域を有するプラスミドが入手可能である（例えば、ストレプトミセス用のｐＩＪ１０１（Ｋｉｅｓｅｒら，１９８２、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８５：２２３−８）、アクチノミセス用のｐＪＲＤ２１５（Ｙｅｕｎｇら，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４１７３−６））。このようなベクターを伝達するための方法には、共役、電気穿孔法およびプロトプラスト形質転換が含まれる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中での複製およびＥ．ｃｏｌｉからストレプトミセス等のグラム陽性細菌種への接合伝達が可能なシャトルベクターも用いることができる（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒら，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−５；Ｋｉｅｓｅｒら，２０００，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｉｉｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）。
【０１１２】
色素タンパク質を含む医薬組成物であって、色素タンパク質が本発明のアポタンパク質および発色団の複合体を含み、好ましくは、当該発色団がＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２により産生される医薬組成物を調製することが望ましい場合がある。好ましくは、該ポリペプチドは、非共有結合により発色団に結合する。一般に、医薬組成物の調製には、本質的にピロゲンおよびヒトまたは動物に有害な任意の他の不純物を有さない医薬組成物の調整を伴う。適切なバッファーを用いて複合体を安定にし、標的細胞による取り込みを許容することも望ましい場合がある。
【０１１３】
本発明の水性組成物は、医薬的に許容される担体または水培地中でさらに分散した色素タンパク質を有効量含む。このような組成物は植菌とも呼ばれる。「医薬的または薬理学的に許容される」という文言は、動物またはヒトに適切に投与した際に、副作用、アレルギーまたは他の有害反応を生じない組成物を指す。
【０１１４】
本明細書中で使用するとき、「医薬的に許容される担体」には、任意および全ての溶剤、分散培地、被覆剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質に対するこのような培地および薬剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の培地または薬剤が上記色素タンパク質に適さない場合を除いて、治療用組成物にいてそれを用いることが企図される。抗菌または抗腫瘍薬剤を含む補助的な活性成分も前記組成物に組み込んでもよい。
【０１１５】
本発明の１つの態様では、本発明の発色団は、細胞により、例えば、飲作用によって取り込まれる。他の態様では、上記発色団は、特定の細胞または細胞タイプの標的となるように修飾される。このような一態様では、色素タンパク質を、モノクローナル抗体または他のタンパク性担体を標的構成単位として用いるポリマーまたは複合体の形態で、標的組織に送達させてもよい。種々のポリマー系および抗体複合体送達システムが知られ、自然発生的なＣ−１０２７エンジインを伴う化学療法方針において現在利用されている。本発明では、色素タンパク質を、例えば、化学的に修飾して、治療、特には、化学療法に有用なポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸）−接合色素タンパク質を形成してもよい。（例えば、ＭａｅｄａおよびＫｏｎｎｏ，１９９７，Ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ：ｔｈｅ  Ｐａｓｔ，Ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ，Ｈ．Ｍａｅｄａ，Ｋ．Ｅｄｏ，Ｎ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２７−２６７を参照されたい）。
【０１１６】
疎水性および親水性セグメントの両方を含むポリマーミセルは、化学療法薬剤の治療指数を増大するために最近開発された新たな薬物送達システムである（Ｙｏｋｏｙａｍａら，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１６９３−７００；Ｋａｂａｎｏｖら，１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５８：３４３−５）。ミセルの大きさを調節して浸透性および保持（ＥＰＦ）効果を向上させることで、ミセル粒子が正常な組織においてよりも腫瘍組織においてより血管に浸透できるようにすることができる（Ｍａｅｄａ，２００１，Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．４１：１８９−２０７）。これにより、腫瘍組織における薬物分布を有利なものにすることができるため、インビボでの有効性が増大すると期待される。上記２１Ｇ７９２色素タンパク質をブロック共重合体溶液と混合することにより、特別に設計されたミセルに非共有結合的に組み込むことができる。結果得られた薬物の代謝的安定性を有意に増大させることができ（Ｙｏｋｏｙａｍａら，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３２２９−３６）、これは、癌化学療法における２１Ｇ７９２色素タンパク質の送達に潜在的に有利である。
【０１１７】
色素タンパク質（すなわち、アポタンパク質または発色団）は、細胞または病原体への送達のために、化学的リンカーまたは他の関連する方法を用いて、タンパク質に複合化することができる。２１Ｇ７９２色素タンパク質中の発色団をアジ化ナトリウムおよび第２級アミンと反応させて一連の誘導体を生じている。これらの誘導体は、Ｃ−５に、天然の発色団中のヒドロキシル基と置き換わるアジドまたは第２級アミノ基を含む。一方の末端にアミノ基を有し、他端にカルボキシル基を有するリンカーを用いてモノクローナル抗体および発色団を接続し、標的薬物の送達のための発色団−抗体複合体を形成することができる。上記Ｃ−５ヒドロキシル基と置き換わるリンカーのアミノ基は、腫瘍組織においてより酸性度が高い条件下で上記複合体を加水分解して発色団に戻すように設計される。例示的な連結を図３０に示す。
【０１１８】
さらに、色素タンパク質をモノクローナル抗体と複合化して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）−色素タンパク質複合体を形成してもよい。抗原に対して高い親和性を有し、好ましくは悪性細胞の表面の抗原決定基に対する特異性を有するする抗体は、標的部分として自然な選択である。抗体により媒介される色素タンパク質の腫瘍細胞への特異的送達は、それらの抗腫瘍効果を単に増大させるだけでなく、正常な組織による標的以外の取り込みを防ぐことにより、治療指数を増大させることが期待される。本発明において用いられ得るこのような抗体担体の例としては、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの生物学的に活性な断片、およびそれらの遺伝子または酵素が操作された対応物が挙げられる。好ましくは、そのような抗体は、癌等の増殖性疾患における標的細胞および／または組織上で発現された細胞表面抗原に向けられる。抗ＣＤ３３モノクローナル抗体は、このアプローチに有用なＭａｂの例示であり、急性骨髄性白血病の患者の状況を含む様々な状況において、色素タンパク質を癌性組織に到達させ得る。（例えば、Ｓｉｅｖｅｒｓら，１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９３，３６７８−８４を参照されたい）有用なモノクローナル抗体複合体の別の例としては、例えば、抗ＣＤ２２モノクローナルタンパク質がＢ細胞リンパ腫を標的とする送達のためにエンジインと接合されるＰＣＴ国際公開第ＷＯ０３／０２９６２３号に記載のものが挙げられる。前述したように、いくつかのＭＡｂ−Ｃ−１０２７複合体は、有望な抗癌剤として評価段階にある。（Ｂｒｕｋｎｅｒ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ＆Ｍｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ２，３４４）。抗体担体以外の他のタンパク性担体は、ホルモン、成長因子、抗体の模倣体、およびそれらの遺伝子または酵素が操作された対応物を含み、以下において単独でまたはまとめて「担体」と呼ぶ。担体の本質的特性は、その不要な細胞に関連する抗原または受容体を認識して結合した後に内在化する能力である。本発明に適用可能な担体の例としては、全体として本明細書中に援用される米国特許第５，０５３，３９４号および同第５，７７３，００１号に開示されるものが挙げられる。本発明での使用が好ましい担体は、抗体および抗体の模倣体である。
【０１１９】
多数の非免疫グロブリンタンパク質の骨組みが、抗体の特異性を有する抗原エピトープに結合する抗体の模倣体を生成するために用いられている。（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／３４７８４号）。例えば、免疫グロブリン群に関連する「ミニボディ」骨組みが、３つのβ鎖をモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインから取り除くことにより設計されている（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：９−２４）。このタンパク質は６１残基を含み、２つの超可変ループを提示するために用いることができる。これら２つのループはランダム化され、抗原結合のために選ばれた産物であるが、今までのところ、この枠組みは、溶解性の問題のため実用性が幾分限られていると思われる。ループを表示するために用いられる他の枠組みは、テンダミスタット（哺乳動物のα−アミラーゼを特異的に阻害し、２つのジスルフィド結合により、７４残基、６鎖ベータシートサンドイッチをまとめて保持したタンパク質）である（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌおよびＨｏｅｓｓ，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−７０）。この骨組みは、３つのループを含むが、ランダム化の可能性に関しては、現在まで、それらのループのうちの２つについてしか調べられていない。
【０１２０】
他のタンパク質を枠組みとしてテストし、αへリックス表面上のランダム化した残基（Ｎｏｒｄら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，７７２−７；Ｎｏｒｄら，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８，６０１−８）、アルファイルへリックス束内のαへリックス間のループ（ＫｕおよびＳｃｈｕｌｔｚ，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，６５５２−６）、および小型のプロテアーゼ阻害剤などのジスルフィド架橋により拘束されたループ（Ｍａｒｋｌａｎｄら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，８０４５−５７；Ｍａｒｋｌａｎｄら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，８０５８−６７；ＲｏｔｔｇｅｎおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９５，Ｇｅｎｅ  １６４，２４３−５０；Ｗａｎｇら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１２２５０−６）を表示するために用いられている。
【０１２１】
標的分子および色素タンパク質は、化学的架橋によってまたは組換えＤＮＡ技術の適用等による遺伝子融合を介して共有結合的に関連付けられてもよい。後者のアプローチでは、アポタンパク質は、そのＣ末端またはＮ末端を、細胞を標的とするタンパク質分子のＮ末端またはＣ末端に融合させてもよい。細胞を標的とする分子が抗体である場合、アポタンパク質のＣ末端は、当該抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端と融合させることが好ましい。化学的架橋のために、いくつかの共通タンパク質−抗体リンカーは、琥珀酸エステルと他のジカルボン酸、グルタルアルデヒドと他のジアルデヒドである。そのようなリンカーは他にも当該技術分野において周知である。
【０１２２】
治療用組成物の溶液を界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合した水で調製してもよい。また、分散物をグリセロール、ポリエチレングリコール液、それらの混合物、およびオイルで調製してもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含む。
【０１２３】
本発明の治療用組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注入可能な組成形態で有利に投与される；また、注入の前に液体で溶解または懸濁するために適した固形を調製してもよい。これらの調製物はまた乳化してもよい。このような目的のための典型的な組成物は、医薬的に許容可能な担体を含む。例えば、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水１ミリリットルにつき、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは最大で約１００ｍｇのヒト血清アルブミンを含んでもよい。他の医薬的に許容される担体は、水性溶液、塩を含む非毒性賦形剤、防腐剤、緩衝剤等を含む。
【０１２４】
非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルがある。水性担体には、水、アルコール／水性溶液、食塩水、ナトリウム塩化物などの非経口剤、リンゲルデキストロースなどが含まれる。静脈内投与剤には、流体および栄養補充剤が含まれる。防腐剤には、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスが含まれる。医薬組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに応じて調節される。
【０１２５】
経口投与にはさらなる製剤が適切である。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの典型的な賦形剤が含まれる。前記組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態を取る。経路が局所的である場合、前記形態はクリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）またはスプレーであってもよい。
【０１２６】
本発明の治療用組成物は、伝統的な医薬調製物を含んでもよい。本発明に従った治療用組成物の投与は、その経路が標的組織にとって有効である限り、任意の一般的経路を介して行なわれる。これには、経口投与、経鼻投与、口腔投与、直腸投与、膣内投与または局所投与が含まれる。局所投与は、化学療法により誘発された脱毛症または他の皮膚過剰増殖性疾患を防ぐ皮膚癌の治療に特に有利である。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋内、腹腔内または静脈注射である。このような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、緩衝剤または他の賦形剤を含む医薬的に許容可能な組成物として投与される。肺疾患の治療については、好ましい経路は、エアロゾールによる肺への送達である。エアロゾールの量は、約０．０１ｍｌと０．５ｍｌの間である。同様に、結腸関連の疾患の治療に好ましい方法は浣腸である。浣腸の量は、約１ｍｌと１００ｍｌの間である。
【０１２７】
治療用組成物の有効量は、意図する目的に基づいて決定される。「単位用量」または「投与量」という用語は、被検者における使用に適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路および治療計画に関して上述したような所望の応答を生じるように算出された所定量の治療用組成物を含む。治療回数および単位用量の両方に応じた投与量は、保護が所望されるものに依存する。
【０１２８】
また、治療用組成物の正確な量も医師の判断に依存し、各個人に特有のものである。用量に影響する要因には、患者の物理的および臨床状態、投与経路、意図する治療の目的（症状の緩和対治癒）ならびに特定の治療用物質の効力、安定度および毒性が含まれる。
【０１２９】
本出願の全体で、様々の刊行物は、括弧内の名称またはナンバーによって参照される。全体としてこれらの刊行物の開示は、本出願が関連する当該技術分野の状況をより十分に説明するために本明細書中に参照により援用される。
【実施例】
【０１３０】
本明細書に開示されている本発明の原理の改変は当業者によってなされてもよいことは理解および期待されるべきであり、このような変更は本発明の範囲に含まれるものであることが意図される。
【０１３１】
下記の本発明の実施例は、本発明をさらに例示するために記載され、決して本発明を制限するものとして解釈してはならない。
【０１３２】
実施例１
色素タンパク質およびアポタンパク質の単離および特徴付け
実施例１−種子培養
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２は、ＡＴＣＣ培地１７２（デキストロース１％、可溶性スターチ２％、酵母エキス０．５％、およびＮ−ＺアミンタイプＡ０．５％、ＣａＣＯ３０．１％  ｐＨ７．３）において７２時間増殖させた細胞から調製された冷凍全細胞（冷凍栄養菌糸、ＦＶＭ）として保存された。グリセロールが２０％になるまで添加し、前記細胞を−１５０℃で冷凍した。
【０１３３】
１．０％デキストロース；２．０％可溶性スターチ；０．５％酵母エキス；０．５％Ｎ−ＺアミンタイプＡ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）；および０．１％ＣａＣＯ３を含む、ｐＨが６．９である種培地を調製した。２５ｍｍ×１５０ｍｍのガラス培養試験管、７ｍｌの種培地および２つのガラスビーズに、ＡＴＣＣ寒天培地＃１７２（ＡＴＣＣ  Ｍｅｄｉａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，初版，１９８４年）上で培養したＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の細胞を植菌した。この寒天培養培地からの十分な接種材料を用いて、７２時間成長させた後に混濁種を得た。２インチ長のジャイロ・ロータリーシェイカーを用いて、第１種の試験管を２８℃、２５０ｒｐｍで７２時間インキュベートした。次に、第１種（約１４％接種材料）を用いて、５０ｍｌの培地＃１７２を含む２５０ｍｌの三角フラスコに植菌した。ジャイロ・ロータリーシェイカー（２”ストローク）を用いて、これら第２種フラスコを２８℃、２５０ｒｐｍで４８時間インキュベートした。
【０１３４】
実施例２
実施例２−発酵
２．０％ショ糖；０．５％糖蜜；０．５％ＣａＣＯ３；０．２％ペプトン；０．００２％硫酸マグネシウム−７Ｈ２Ｏ；０．００１％硫酸鉄−７Ｈ２０；０．０５％臭化ナトリウム；および０．２％酢酸ナトリウムを含む、ｐＨが６．９である発酵産生培地を調製した。５０ｍｌの発酵産生培地をそれぞれ含む６０個の２５０ｍｌの三角フラスコを用意し、２ｍｌ（４．０％）の第２種発酵で植菌し、ジャイロ・ロータリーシェイカー（２”ストローク）を用いて２８℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。次に、記載されるように、発酵をおよそ７２〜９６時間続けて、更なる処理のために回収した。
【０１３５】
合わせたブロス全部（６０×５０ｍｌ）を３８００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次に、上清を凍結乾燥し、残留粉末を少量（例えば、３００ｍｌ）のＨ２Ｏに懸濁した。その後、この褐色溶液を、暗所にて４℃のＨ２Ｏに６ＬのセファデックスＧ７５を含むガラスカラムに装填した。４０ｍｌの画分を各々回収し、生化学的誘導アッセイ（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ：ＢＩＡ）で試験した。次に、最も濃い（ｐｏｔｅｎｔ）画分を合わせ（１５画分、全体で６００ｍｌ）、凍結乾燥した。次いで、この灰色粉末をＨ２Ｏ（４ｍｌ）に溶解し、ＨＰＬＣによって分析すると、２つの主要なピークを含んでおり、１つがアポタンパク質に対応し、他が色素タンパク質に対応していた。
【０１３６】
上記の溶液をＴｏｓｏＨａａｓ  ＤＥＡＥ  ５ＰＷカラム（１３ｕｍ粒径、２１．５ｍｍ×１５ｃｍのサイズ）上で、４ｍｌ／分の流速のバッファーシステム（３０分間は一定の０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いた０〜０．５Ｍの直線勾配ＮａＣｌ）を用いて、調製用ＨＰＬＣクロマトグラフィーに供した。アポタンパク質および色素タンパク質のそれぞれのピークを回収し、ピアス・ダイアリシス・カセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）（７０００ＭＷＣＯ）を用いて脱塩し、凍結乾燥した。次に、得られたアポタンパク質および色素タンパク質の粉末を同じ調製用ＨＰＬＣ条件で再精製し、脱塩し、および凍結乾燥した。色素タンパク質（灰色粉末、１０．５ｍｇ）およびアポタンパク質（白色の粉末、１９．８ｍｇ）の最終産物を分析用ＨＰＬＣによって分析した（それぞれ、図１および図３）。色素タンパク質およびアポタンパク質の紫外線吸収（ＵＶ）スペクトルを図２および図４に示す。
【０１３７】
アポタンパク質の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって１２．９２４０９ｋＤａであると測定された。ＭＡＬＤＩスベクトルを図５に示す。
【０１３８】
実施例３
実施例３−接種材料
１リットルの無菌接種材料培地を、下記の成分：５．０ｇ／Ｌフィトン（ＢＢＬ）、５．０ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｂａｃｔｏ）、４０ｇ／Ｌ可溶性スターチ、２０ｇ／Ｌグルコース、１．２８ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０２５Ｍ  ＭＯＰＳを用いて、パリロット規模の発酵のために調製した。約１ｍＬの種培養を無菌フラスコに移し、その後、シェーカーに置き、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。フラスコの内容物全部を４８〜７２時間のインキュベーション後に発酵槽に移した。
【０１３９】
実施例４
実施例４−パイロット規模の発酵
色素タンパク質発酵は、生産菌として、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種菌２１Ｇ７９２を用いて、１００Ｌのパイロット発酵槽中で行った。下記の培地：グルコース・一水和物、２．７５ｇ／Ｌ；硫酸鉄・７水和物、０．０１ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム・７水和物、０．０２ｇ／Ｌ；炭酸カルシウム（ミシシッピ（商標）ライム）、２．０ｇ／Ｌ；マルコー・マルトンＪ−１、４．０ｇ／Ｌ；酢酸ナトリウム・３水和物、２ｇ／Ｌ；ヨウ化カリウム、０．５ｇ／Ｌ；プルロニックＬ−６１、０．５ｇ／Ｌは、純粋で６５Ｌまで調製された。培養液のｐＨは、硫酸を用いて７．０に調整した。次に、この培地を滅菌し、発酵温度まで冷却し、その後、追加量のグルコース・一水和物（約６ｇ／Ｌ）および１リットルの接種材料を発酵槽に移した。
【０１４０】
発酵温度は、適切な値（３０℃）に調節され、細胞増殖および生産を支持し、適切な撹拌、圧力、および給気で行われ、飽和値の２０％を超える溶存酸素を維持した。この実施例では、発酵を２５０ｒｐｍ、５ｐｓｉｇ、および３０ｌｐｍに調節した。
【０１４１】
バッチを第４日目に集菌した。色素タンパク質の濃度は、集菌時には１５２ｍｇ／Ｌであった。集菌したマッシュ（ｍａｓｈ）は、１Ｌの遠心分子ボトルを受け入れる遠心分離機による遠心分離によって浄化した。用いた遠心分離条件は、７０００ｒｐｍ、２０℃、および２０分／サイクルであった。上清は、更に生産物を回収するために集めた。
【０１４２】
実施例５
実施例５−パイロット規模の発酵
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種菌２１Ｇ７９２を用いた色素タンパク質発酵は、下記の培地：グルコース・一水和物、８．７５ｇ／Ｌ；硫酸鉄・７水和物、０．０１ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム・７水和物、０．０２ｇ／Ｌ；炭酸カルシウム（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ（商標）Ｌｉｍｅ）、２．０ｇ／Ｌ；マルコー・マルトンＪ−１、４．０ｇ／Ｌ；酢酸ナトリウム・３水和物、２ｇ／Ｌ；ヨウ化カリウム、０．５ｇ／Ｌ；プルロニックＬ−６１、０．５ｇ／Ｌ中で行った。このバッチを７０時間で回収し、約６０ｍｇ／Ｌの色素タンパク質を生産した。
実施例６
実施例６−色素タンパク質アッセイ
このアッセイ法は、発酵ブロスのＵＶ吸収成分から色素タンパク質を分離し、色素およびアポタンパク質形態を解析する。機器は、２９９６ＰＤＡ検出器、ミレニアム・クロマトグラフィーコントロールおよび分析用ソフトウェアを装備したウォーターズ・アライアンス（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ）２６９５である。カラムは、ＴＯＳＯＨ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＳＵＰＥＬＣＯから提供されるＴＳＫフェニル５ＰＷ  粒径１０μｍ  ７．５×７．５ｍｍである。移動相は、Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８〜８．３、Ｂ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．８〜８．３である。作動時間は、流速１ｍＬ／分で３０分である。検出は、２３０ｎｍであり、４．８ｎｍバンド幅で２００〜４００ｎｍの範囲でスペクトルを回収する。勾配溶出は、０〜３分の１００％Ａ保持、３〜２３分の１００％Ｂまでの直線、２３〜２４分の１００％Ａまでの直線、２４〜３０分までの１００％Ａ保持としてプログラムされる。注入量は、１００μＬ以下である。経過途中の試料は、０．４５μｍでろ過する以外は、さらに浄化せずに適用される。色素タンパク質およびアポタンパク質のピークは、参照の標準的な保持時間およびスペクトルと比較することによって同定される。色素タンパク質については１８分、アポタンパク質については２０分の保持時間が典型的である。積分された色素タンパク質ピークの定量は、下記：
ｍｇ／ｍＬ色素タンパク質＝希釈因子＊（成分領域μＶ秒×７．５５×１０−６μｇ／μＶ＊秒）／注入量μｌ）
の通りに行う。
【０１４３】
実施例７
実施例７−色素タンパク質アッセイ
このアッセイ法は、分子サイズに基づいて、発酵ブロスおよび他の汚染タンパク質の他のＵＶ吸収成分から色素タンパク質を分離する。色素タンパク質およびアポタンパク質は、共溶出を形成する。機器は、２９９６ＰＤＡ検出器、ミレニアム・クロマトグラフィーコントロールおよび分析用ソフトウェアを装備したウォーターズ・アライアンス２６９５である。カラムは、ＢｉｏＲａｄから提供されるＢｉｏＳｉｌ  ＳＥＣ  １２５、７．８×３００ｍｍである。移動相は、Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８〜８．３である。検出は、２３０ｎｍであり、４．８ｎｍバンド幅で２００〜４００ｎｍの範囲でスペクトルを回収する。作動時間は、流速１ｍＬ／分で２０分である。溶出は、定組成（ｉｏｓｏｃｒａｔｉｃ）である。注入量は、１００μＬ以下である。経過途中の試料は、０．４５μｍでろ過する以外は、さらに浄化せずに適用される。色素タンパク質ピークは、参照の標準的な保持時間およびスペクトルと比較することによって同定される。色素タンパク質については７．８分の保持時間が典型的である。積分された色素タンパク質ピークの定量は、下記：
ｍｇ／ｍＬ色素タンパク質＝希釈因子＊（成分領域μＶ秒×７．５５×１０−６μｇ／μＶ＊秒）／注入量μｌ）
の通りに行う。
【０１４４】
実施例８
実施例８−生化学的誘導アッセイ
生化学的誘導アッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＲ５１３−８０のＳＯＳ応答を誘導するＤＮＡ損傷剤を同定する。ＢＲ５１３−８０は、λＰＬプロモータおよびｌａｃＺ遺伝子の翻訳融合を含む。λＰＬプロモータは、ＤＮＡ損傷剤への曝露後のＳＯＳ応答の一部として活性化され、β−ガラクトシダーゼの合成を導く。β−ガラクトシダーゼ活性は、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ塩と反応して、赤／紫色を生じさせる６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＮＧ）の開裂によって検出される。
【０１４５】
固形培地の基底層は、ＬＢＥ（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ／Ｌ、酵母エキス  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ  ５ｍＬ／Ｌ）、または１５ｇ／Ｌ寒天、０．２％グルコース、および１／１２５に希釈した「Ｅ」溶液を含む同等物を用いて調製される。（「Ｅ」溶液は、５ｇ硫酸マグネシウム・７水和物、５０ｇクエン酸・一水和物、２５０ｇ二塩基性リン酸カリウム、および８７．５ｇリン酸アンモニウムナトリウムをこの順番で１Ｌの脱イオン化Ｈ２Ｏに希釈させたものを含む。）約１７０ｍｌの基底層培地をＮｕｎｃ  ＢｉｏＡｓｓａｙプレートごとに用い、または５０ｍＬを１５０ｍｍペトリディッシュごとに用いる。
【０１４６】
ＢＲ５１３−８０の一晩培養物をＬＢＥブロスまたは同等物で１：２０に希釈し、希釈した培養物の吸光度を６００ｎｍで測定する。希釈していない培養物の吸光度を算出し、培養物の体積（ｍＬ）を得るために５．７をこの値で割り、４０ｍＬ軟寒天当たりの接種材料として用いる。典型的には、この体積は約０．９〜１．３ｍＬである。算出した培地体積を軟寒天中で混ぜ、基底層（Ｎｕｎｃ  ＢｉｏＡｓｓａｙプレート当たり４０ｍｌ、１５０ｍｍペトリディッシュ当たり２０ｍＬ）全面に均一に注ぎ、少なくとも１０〜１５分間凝固させるようにする。
【０１４７】
アッセイすべき試料および標準は、軟寒天の表面に直接重層して１０μＬのアリコートで適用される。有用な標準には、ブレオマイシンが１０、５、２．５、および０．３１μｇ／ｍＬで、カリケアマイシンγ１が１０００、１００、１０、１および０．１ｎｇ／ｍＬで含まれる。アッセイプレートは、約３７℃でおよそ３時間インキュベートされ、ＳＯＳ応答を誘導する。
【０１４８】
色素／基質重層は、８７ｍｇのファースト・ブルー（Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ）ＲＲ塩および１３ｍｇのＢＮＧを２ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、４０ｍＬの溶解した１％軟寒天と混合することによって調製される。インキュベーション時間後、４０ｍＬの色素／基質混合物（１５０ｍｍディッシュについては２０ｍＬ）をＢＩＡプレートの表面全体に均一に注ぎ、凝固させる。誘導応答を室温で１５〜２０分後であるかまたは約３７℃で１０分後にスコアにする。
【０１４９】
下記は、採点基準を例示する：４＋  円形  ２０−２５ｍｍ  赤／紫色の誘導ゾーン、透明な中心領域の有無；３＋  円形  １５−２０ｍｍ  赤／紫色の誘導ゾーン、透明な中心領域の有無；２＋  １０−１５ｍｍ  赤／紫色の誘導ゾーン、透明な中心領域の有無；１＋  淡い赤色のゾーン、透明な中心領域の有無；Ｔ  毒性ゾーン（細菌が死滅した透明領域および色の変化なし）；Ｎ／Ｒ  赤／紫色の誘導ゾーンなし；透明な毒性ゾーンなし
実施例９
実施例９−色素タンパク質の精製
この実施例は、およそ９０％純粋なＢＩＡ活性色素タンパク質を単離するための測定可能な精製プロセスを提供する。このプロセスによって単離された化合物をＳＤＳ−ゲル電気詠動移動、ＵＶスペクトル、並びにサイズ排除および疎水性相互作用分析用カラムの両方を用いるＨＰＬＣ保持時間により分析した。発酵条件は、色素タンパク質生産のために最適化しなかった。
【０１５０】
浄化した発酵ブロスの３５０ｍＬから色素タンパク質は、ＤＥＡＥセファロースＦＦイオン交換クロマトグラフィー、フェニルセファロースＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびスーパーデックス７５サイズ排除クロマトグラフィーからなる測定可能な３工程手順を用いて精製された。それぞれ約６１、６９および８２％の工程収率は、結果として全体で色素タンパク質の３０％のプロセス回収をもたらし、約９０％純粋であり、この材料の残部は不活性なアポタンパク質である。
【０１５１】
ＤＥＡＥセファロースＦＦ陰イオン交換−クロマトグラフィー装填物は、３６０ｍＬの浄化したブロスに７ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３の添加によって調製された。次に、この装填物は、５カラム容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３で平衡にした５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥセファロースＦＦカラムに流速１０ｍＬ／分で適用された。吸光度を２３０、２８０および３１０ｎｍでモニターした。カラムの流出物を単一分画として回収した。吸光度が基準に達するまで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３を用いてカラムを洗浄した。色素タンパク質種は、１０ＣＶ（２ＣＶの５分画として回収した；表６、Ｄ１〜Ｄ５を参照されたい）において０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３に移動相を進めることによって溶出させた。第２溶出段階は、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３を用いて行い、カラムを洗浄した。図１８は溶出プロフィールを示す。
【０１５２】
フェニルセファロースＨＰクロマトグラフィー−クロマトグラフィー装填物は、１０．６ｇの硫酸アンモニウムを第１段階の保存溶出物４７．５ｍＬに添加して調製し、硫酸アンモニウムの濃度を１．５Ｍにした。装填物の体積（硫酸アンモニウムを添加後）を算出すると５３．７ｍＬであった。装填物のｐＨは、硫酸アンモニウムを添加後に、１ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３を用いて７．８から８．０６に上昇させた。透明な茶色の溶液は、０．４５μｍのナイロンシリンジフィルター（２．３ｃｍ径）を通過させて簡単にろ過し、５２．７ｍＬを５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐフェニルセファロースＨＰカラムに５ｍＬ／分で適用した。カラムを５ＣＶの１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２で予め平衡にした。吸光度を２３０、２８０および３１０ｎｍでモニターした。色素タンパク質のアポタンパク質から分離が、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２に対して、２０ＣＶの直線勾配溶出全体で起こる。単一のＣＶ分画を勾配を通して回収し、ＵＶ吸収による色素タンパク質ピークとして選ばれた２つの分画（表６ではＰ９〜Ｐ１０で示される）を貯めた。色素タンパク質は、アポタンパク質の前に溶出し、２つのピークは２ＣＶによって分離されている。図１９は、溶出プロフィールを示す。
【０１５３】
スーパーデックス７５クロマトグラフィー−硫酸アンモニウムを９．５ｍｌのフェニルセファロースプールに添加し、８０％の濃度（５６０ｇ固体／１Ｌのフェニルセファロースプール）にした。硫酸アンモニウム添加後に形成した沈殿物を１インチ径の０．４５μｍナイロンシリンジフィルター上に捕捉し、１ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．２を用いて固体の抽出を繰り返すことによって回収した。抽出物の０．８ｍＬ部分は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ２００ｍＭ  ＮａＣｌに平衡にしたスーパーデックス７５カラムに適用し、回収した１ｍＬ分画を用いて、１．５ＣＶ全体で溶出させた。吸光度は、流速０．５ｍＬ／分で２３０、２８０および３１０ｎｍでモニターされた。色素タンパク質プール（３ｍｌ）を３つの分画として選択し、表６ではＳ６〜Ｓ８として示した。図２０は、溶出プロフィールを示す。
表６
パイロット規模の発酵ブロスからの色素タンパク質およびアポタンパク質の収量
【０１５４】
【表６Ａ】
2009541331.tif 000033
【０１５５】
【表６Ｂ】
2009541331.tif 000034
表７
色素タンパク質の経過途中の回収率
【０１５６】
【表７】
2009541331.tif 000035
各精製段階でおよび全過程で回収した色素タンパク質の量を表７に示す。最終純度は、分画Ｓ６に関する２つのＨＰＬＣ技術（フェニル５ＰＷおよびＢｉｏＳｉｌ  ＳＥＣ１２５）によって評価された（図２０）。結果を図２１および２２に示し、色素タンパク質調製物には１０％のアポタンパク質を含んでいる。また、各段階での純度は、クーマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示される（図２３および２４）。１本のバンドが最終プールについて観察される（図２４、レーン３）。
実施例１０
実施例１０−発色団類の分離および構造解明
ハロゲン化物を含む、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２の発酵培養物を調製した。色素タンパク質は、順次適用およびＤＥＡＥセファロースＦＦ、フェニルセファロースＦＦ、およびスーパーデックス７５クロマトグラフィーカラムから活性分画の回収によって、浄化した発酵ブロスから得た。活性分画ピークＡおよびＢへの色素タンパク質ならびに不活性なアポタンパク質ピークの分離は、１．５Ｍ硫酸アンモニウムからできている結合バッファーおよび０．１Ｍ  ＮａＣｌのプログラムされた２０ＣＶ勾配終了を用いてフェニルセファロース工程中にもたらされた（図２５）。３つのピークはクロマトグラフで同定され（図２５）、各ピークに対応する分画をプールした。各分画に存在するエンジイン発色団は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４  ３００Ａ  ４．６×２５０ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いた逆相クロマトグラフィーによって分析された。この方法は、色素タンパク質溶液のアポタンパク質担体成分からアセトニトリル有機変性剤を用いたエンジインのインライン抽出に依存している（図２６）。ピークＡは、２つの発色団種（発色団−ｃおよび発色団−ｄ）を生じ、一方、ピークＢは、単一の発色団種（発色団−ｂ）を生じた。
【０１５７】
３つの発色団種の全てが単離され、それらのＨＲＭＳおよびＮＭＲデータを回収した。推定構造は、さらに、高分解能ＭＳ／ＭＳ断片化データによって確かめられた。（図６）。発色団−ｃおよび−ｄは、可能性としては、ジラジカルへのシクロ芳香族化、続くプロトン化および脱水和（水の喪失）に起因する発色団−ｂの分解産物である。発色団−ｃおよび−ｄが、単離中に生産される加工物でないことを確かめるために、粗活性画分混合物のＬＣ−ＮＭＲも行った。ＬＣ−ＮＭＲからのＮＭＲデータは、推定構造と一致している。
実施例１１
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２遺伝子クラスター
実施例１１−Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質のＤＮＡ単離および配列決定
Ｈｏｐｗｏｏｄら（１９８５），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｏｒｗｉｃｈ：Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに記載の手順を改良して、ゲノムＤＮＡをＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２から単離した。１０ｍｌのＭＹＭ培地（４ｇ／ｌマルトース、４ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌ麦芽エキス、ｐＨ７．０）および２〜６ｍｍガラスビーズを含む２５ｍｍ×１５０ｍｍの種試験管におよそ１ｍｌの凍結菌糸体グリセロールストックを植菌した。この培養物を２８℃、２００ｒｐｍで５日間増殖した。次に、これらの細胞を３０００ｘｇで１０分間遠心分離によりぺレット化した。上清を捨て、ペレットを５ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを含む３００μｌのＴ５０−Ｅ２０（Ｔｒｉｓ５０ｍＭ−ＥＤＴＡ−２０ｍＭ）に懸濁し、３７℃で１時間、１５分毎に穏やかに混合しながらインキュベートした。その後、５０μｌの１０％ＳＤＳを添加し、試料を完全に混合した。次に、８５μｌの５ｍＭ  ＮａＣｌを添加し、試料を再度完全に混合した。次いで、試料を４００μｌフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０／４９／１）を用いて抽出した。試料を完全にボルテックスした後、１０，０００ｘｇで２０分間室温で遠心分離した。遠心分離後、水相を取り出し、新しい微小遠心管に入れた。等体積の室温イソプロパノールを試料に添加し、反転により完全に混合した。試料を室温で５分間放置した。次に、試料を１２，０００ｘｇで３０分間、４℃で遠心分離した。イソプロパノールを試験管から注意深く注ぎ出し、ＤＮＡペレットを１ｍｌの低７０％エタノールでリンスした。氷中に５分間放置した後、７０％エタノールを試験管から注ぎ出し、ＤＮＡを１０分間、空気乾燥させた。ＤＮＡを０．３ｍｌの滅菌水に溶解させた。ＤＮＡの完全性および濃度は、アガロースゲル電気泳動によって評価された。
【０１５８】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；プラスミドおよび小規模コスミドＤＮＡ調製：製造者の仕様書に従って、キアプレップ・スピン・ミニプレップキット（Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，カリフォルニア州ヴァレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ），米国）を用いて、プラスミドＤＮＡおよび小規模コスミドＤＮＡ調製を行なった。コスミド：製造者の仕様書に従って、キアゲン・ラージ・コンストラクトキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，カリフォルニア州ヴァレンシア，米国）を用いてコスミドＤＮＡを単離した。
【０１５９】
製造者の仕様書に従って、ｐＷＥＢコスミド・クローニングキット（Ｃｏｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），米国）を用いてＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２ゲノムライブラリーを構築した。一般的なライブラリー構築の手順は以下の通りである。１０μｇのゲノムＤＮＡをハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ＨＰＬＣ／ＧＣシリンジを通過させて、３０〜４５ｋｂの断片に無作為に分断した。分断後、該キットに含まれる末端修復酵素の混合物を用いて、断片化したＤＮＡの末端修復し、平滑末端にした断片を生成した。次に、直鎖Ｔ７  ＤＮＡ（約４０Ｋｂ）を用いて１％低融点アガロースゲル上で、分子量マーカーとして機能するように、分断および末端修復したＤＮＡを分離した。Ｔ７  ＤＮＡとほぼ等しいサイズのゲノムＤＮＡをゲルから切り取り、このＤＮＡをアガロースから溶離した。次いで、精製したＤＮＡをｐＷＥＢベクターに連結した。連結後、ｐＷＥＢコスミド・クローニングキットに提供されるマックスプラックス・ラムダ・パッケージング・エクストラクツ（ＭａｘＰｌａｘ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ）を用いて、該連結挿入ＤＮＡをラムダファージ粒子にパッケージ化した。次に、ファージ抽出物のタイターを測定し、１ミリリッター当たりのコロニー形成単位を決定した。ファージ抽出物のタイターを決定後、適量の抽出物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＰＩ１００宿主細胞を感染させ、感染した細胞は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ寒天プレートに置き、プレート当たりおよそ２００コロニーの細胞密度を得た。
【０１６０】
ライブラリースクリーニング戦略および方法；ｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼプローブ生成。一般に、特定の抗生物質を産生する必要がある遺伝子は、産生する生物のゲノムにおいてクラスター化される。さらに、アポタンパク質遺伝子を対応する発色団の生合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子でクラスター化する必要がある（Ｌｉｕら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１７０−３）。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２により産生された発色団は、エンジインコアに結合するアミノ糖４−アミノ−４−デオキシ−３−Ｃ−メチル−β−リボピラノースを含む。ｄＮＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ（ＤＨ）は、この糖の生合成の一工程を触媒するが期待されるため、ＤＨプローブを用いて生合成クラスターを単離した。
【０１６１】
ＤＨプローブを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２のゲノムＤＮＡ由来のＤＨ遺伝子断片を増幅した。期待される約５００ｂｐのＤＨ遺伝子断片（デヒドラ１：５’−ＣＳＧＧＳＧＳＳＧＣＳＧＧＳＴＴＣＡＴＳＧＧ（配列番号１５２）およびデヒドラ２：５’−ＧＧＧＷＲＣＴＧＧＹＲＳＧＧＳＣＣＧＴＡＧＴＴＧ（配列番号１５３））のためのプライマーは、Ｄｅｃｋｅｒら，１９９６，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４１，１９５−２０１に記載されるものと同一であった。ジャンプスタート（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ）ＲＥＤＴａｑレディー・ミックス（Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ）ＰＣＲリアクション・ミックス（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ，ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を製造者の仕様書に従って用いてＰＣＲを実施した。これらのプライマーは、０．５μＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ勾配サーモサイクラーで行なった。開始の変性温度は、４分間９６℃であった。その後の３０サイクルは次の通りであった：変性温度９６℃（４５秒）、アニーリング温度６６℃（４５秒）、伸長温度７２℃（３分）。最後に、最終伸長温度は１０分間７２℃であった。
【０１６２】
トポ（ＴＯＰＯ）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を製造者が推奨するとおりに用いて、約５００ｂｐのアンプリコンをｐＣＲ２．１にクローニングした。クローニング反応物の一部（２．５μｌ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，カリフォルニア州カールズバッド）を形質転換し、その後、組換えクローンの青／白スクリーニングを容易にするために、それらを５０μｇ／ｍｌカナマイシン、４０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌおよび０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ  Ａｇａｒ上に置いた。２０個の白コロニーを採取して、それらのプラスミドＤＮＡを単離した。これらのクローンの配列決定により、２種のＤＨ遺伝子断片がクローン化されたことが明らかになった。推定されるアミノ酸配列の比較により、１つのＤＨ断片（プラスミドｐ３４５９８に含まれる）がカリケアマイシン生合成に関与するＤＨに最も類似していることが明らかになった。カリケアマイシン構造は２つのアミノ糖を含むため、ｐ３４５９８に含まれるＤＨ断片もアミノ糖の産生に関与している可能性があり、そのため、色素タンパク質遺伝子クラスターのプローブとして選ばれることが予測された。
【０１６３】
コロニーハイブリダイゼーション：ｐ３４５９８ＤＨ断片を用いたコロニーハイブリダイゼーションで、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２ゲノムライブラリーをスクリーニングした。ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）に記載されるように、組換えコロニーＤＮＡをＮｙｔｒａｎ  ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅナイロン膜ディスク（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，ニューハンプシャー州キーン（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ））に移した。ＰＣＲおよびプライマー（デヒドラ１およびデヒドラ２）を用いてｐ３４５９８の挿入部分を増幅してＤＨプローブを調製した。この増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、５３０ｂｐ断片をアガロースから単離した。次に、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを製造者の仕様書（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））に従って用いて、この断片を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）で標識した。ＤＮＡ試料が固相化されたナイロンメンブレンを６×ＳＳＣで洗浄し、次に、予め温めた（６５℃）プリハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ／５×デンハート試薬／０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性分断ニシン精子ＤＮＡ）を含むハイブリダイゼーションボトルに入れ、２時間「プレハイブリダイズ」した。その後、変性プローブを添加し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを続けた。翌日、上記メンブレンを、一度、予め温めた（６５℃）２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（洗浄液１）を用いて１時間洗浄し、さらに、一度、予め温めた（６５℃）１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（洗浄液２）を用いて１時間洗浄した。次に、このナイロンメンブレンをサランラップに包み、コダック（Ｋｏｄａｋ）Ｘ−ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに４時間露光した。この露光したフィルムをコダックＸ−ｏｍａｔ  ２０００Ａプロセッサーを用いて現像した。２２個のコロニーがプローブにハイブリダイズしたことが分かった。これらのコロニーを採取して、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａブロスで増殖させた。この培養物からコスミドＤＮＡを精製し、Ｎｏｔ  Ｉで切断した。制限消化物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅ１１（２００１）に記載されるように、ＤＮＡをＮｙｔｒａｎ  ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅナイロンメンブレンに移した。コロニーハイブリダイゼーションで用いた条件と同じ条件で、ｐ３４５９８インサートを再度プローブとして用いてこのメンブレンを探査した。９個のコスミドがプローブに明確にハイブリダイズした。このプローブにハイブリダイズしたコスミドおよび適切なサイズの断片は次の通りであった：２１ｇＢ：１５〜２０ｋｂ、２１ｇＣ：１５〜２０ｋｂ、２１ｇＤ：８〜１２ｋｂ、２１ｇＦ：１５〜２０ｋｂ、２１ｇＧ：３〜４ｋｂ、２１ｇＩ：１．２〜２．５ｋｂ、２１ｇＫ：１５〜２０ｋｂ、２１ｇＬ：２．５〜３ｋｂ、２１ｇＶ：２〜２．５ｋｂ。
【０１６４】
アポタンパク質特異的オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション：エドマンタンパク質配列決定を用いて、アポタンパク質の最初の３８個のアミノ酸残基であるＮ末端ＤＴＶＴＶＮＹＤＤＶＧＹＰＳＤＩＡＶＴＩＤＡＰＡＴＡＧＶＧＤＴＡＴＦＥＶＳＶ（配列番号１５４））を決定した。どのコスミドがアポタンパク質遺伝子配列を含むのかを確実に特定するために、アポタンパク質Ｎ末端の３８個のアミノ酸（ａａ）配列の４〜１２番目の残基に基づく変性オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション実験を行なった。具体的には、このオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＡＣＳＧＴＳＡＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＴＳＧＧＮＴＡＣ（配列番号１５５）であった。
【０１６５】
ＤＨプローブにハイブリダイズしたコスミドをＮｏｔ  Ｉで消化し、ナイトラン・スーパーチャージ（Ｎｙｔｒａｎ  ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅ）ナイロンメンブレンに移した。キナーゼマックス５’−エンド−ラベリングキット（ＫｉｎａｓｅＭａｘ  ５’Ｅｎｄ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）を製造者（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））の推奨する通りに用いて、このオリゴヌクレオチドを［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）で末端標識した。製造者の使用説明書（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，テキサス州オースティン）に従ってヌクアウェイ・スピン・カラムキット（ＮｕｃＡｗａｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｋｉｔ）を用いて、組み込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの分断変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液で、ＤＮＡ担持ナイロンメンブレンを３時間５０℃で「プレハイブリダイズ」した。この工程に続いて、プレハイブリダイゼーション溶液を６×ＳＳＣ、０．５％リン酸ナトリウム、１×デンハート試薬および１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを含む７ｍｌの予め温めた（５０℃）ハイブリダイゼーション溶液と交換した。標識したプローブをこの溶液に添加し、ハイブリダイゼーションを５０℃で２２時間インキュベートした。次に、そのハイブリダイゼーション溶液を捨て、メンブレンを２０ｍｌの室温ＴＭＡＣＬ洗浄バッファー（３Ｍ  ＴＭＡＣＬ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２％ＳＤＳ）で簡単にリンスした。次に、さらに５０ｍｌの予め温めた（６７℃）ＴＭＡＣＬ洗浄バッファーを用いて５５分間６７℃で洗浄した。最終の洗浄として、５０ｍｌの予め温めた（５０℃）洗浄液１を用いて１０分間５０℃でメンブレンを洗浄した。次いで、メンブレンをサランラップに包み、コダックＸ−ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに２４時間露光した。
【０１６６】
コスミド２１ｇＤ、２１ｇＧおよび２１ｇＫがプローブにハイブリダイズした。２１ｇＤおよび２１ｇＫのＤＮＡを含むレーンで約４．５ｋｂのシグナルを観察し、２１ｇＧのＤＮＡを含むレーンで、約５．２ｋｂのシグナルを観察した。このハイブリダイゼーションの結果を確認するために、２１ｇＤコスミドＤＮＡをアポタンパク質の９８ｂｐ断片を増幅するように設計されたテンプレートおよび変性ＰＣＲプライマーとして用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲプライマーＣＰ−ＦＷＤ３（５’−ＡＣＳＧＴＳＡＡＹＴＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ；配列番号１５６）およびＣＰ−ＲＥＶ４（５’−ＡＣＹＴＣＲＡＡＳＧＴＳＧＣＳＧＴＲＴＣ；配列番号１５７）は、アポタンパク質の３６ａａ配列から推定された逆方向翻訳されたＤＮＡ配列を用いて設計された。ジャンプスタートＲＥＤＴａｑレディー・ミックスＰＣＲリアクション・ミックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ，ミズーリ州セントルイス）を製造者の仕様書に従って用いてＰＣＲを行なった。これらのプライマーは２．０μＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ勾配サーモサイクラーで行なった。開始の変性温度は、４分間９６℃であった。その次の５サイクルは次の通りであった：変性温度９６℃（４５秒）、アニーリング温度４０℃（４５秒）、伸長温度７２℃（２分）。次の３０サイクルは以下の通りであった：変性温度９６℃（３０秒）、アニーリング温度５５．７〜７２．０℃（４５秒；範囲内で８つの温度をテストした）、伸長温度７２℃（２分）。最後に、最終伸長温度は１０分間７２℃であった。これらの条件でいくつかのバンドが生成された；しかしながら、５５．７℃、５８．６℃および６１．４℃のアニーリング温度を用いると、およそ１００ｂｐの強いバンドが生成された。トポＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，カリフォルニア州カールズバッド）を製造者が推奨する通りに用いて、約１００ｂｐのアンプリコンをｐＣＲ２．１にクローニングした。クローニング反応物の一部（２．５μＬ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，カリフォルニア州カールズバッド）を形質転換し、その後、組換えクローンの青／白スクリーニングを容易にするために、それらを５０μｇ／ｍｌカナマイシン、４０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌおよび０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ  Ａｇａｒ上に置いた。１０個の白コロニーを採取して、それらのプラスミドＤＮＡを単離した。これらのクローンの配列決定により、４個のクローン（ｐ３５５４６、ｐ３５５４７、ｐ３５５５０、ｐ３５５５４）は、推定されるアミノ酸配列が３６ａａアポタンパク質断片の配列と正確に一致するＤＮＡに含まれていることが明らかになり、これにより、アポタンパク質をコードする遺伝子がコスミド２１ｇＤに含まれていることが確認された。
【０１６７】
コスミド２１ｇＤにおける完全なアポタンパク質ＤＮＡ配列の解明。アポタンパク質をコードする遺伝子の全配列を決定するために、上記で増幅した９８ｂｐのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列から配列決定プライマーを設計した。コスミド２１ｇＤをテンプレートとして用いる初回の配列決定には次のプライマーを用いた：ＡｐｏＳｅｑＣｏｄｅ１：５’−ＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＣＧＧＡＣＡＴＣＧ（配列番号１５８）；ＡｐｏＳｅｑＣｏｄｅ２：５’−ＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＧ（配列番号１５９）；ＡｐｏＳｅｑＣｏｍｐ１：５’−ＣＣＧＧＣＧＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＣＡＣ（配列番号１６０）；ＡｐｏＳｅｑＣｏｍｐ２：５’−ＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣ（配列番号１６１）。
【０１６８】
初回目の配列決定では、約１４４０ｂｐの配列を生成した。コドン選択プログラムを用いて、小さな４９８ｂｐ読み取り枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を同定した。このｏｒｆの推定されたアミノ酸配列と、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の部分アミノ酸配列（エドマンタンパク質配列決定法により決定）とを比較し、これらの２つのアミノ酸配列が同一であったため、このＯＲＦがアポタンパク質をコードすることが確認された。さらに、推定されたアミノ酸配列の分子量１２９２６Ｄａは、高解像度ＭＡＬＤＩ  ＭＳにより決定されたアポタンパク質の分子量１２９２４．０９と良好に一致していた。また、アポタンパク質のＤＮＡ配列は、さらに、アポタンパク質をコードするｏｒｆ（ａｓｅＡと示す）の側面に配置したプライマーを用いた両方のＤＮＡ株の広範囲な配列決定によって確認した。
【０１６９】
リーダーペプチドおよびアポタンパク質を含むプレアポタンパク質の推定されたアミノ酸配列は、配列番号６４に提供される。プレアポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６３に提供される。アポタンパク質の推定されたアミノ酸配列は、配列番号１５０に提供される。アポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４９に提供される。最後に、プレアポタンパク質のＤＮＡ配列、対応するアミノ酸配列、推定された上流のリボソーム結合部位、およびリーダーペプチドとアポタンパク質との間の境界部位を記載する図を図７に提供する。
実施例１２
実施例１２−Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の生合成クラスターの残りのＤＮＡ単離および配列決定
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質遺伝子クラスターの遠位配列の同定。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質遺伝子クラスターのコスミド２１ｇＤに存在する部分に隣接する配列を下記に記載するように同定した。コスミド２１ｇＤとともに、これらの配列が、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の生合成クラスター全体、すなわち、色素タンパク質のアセンブルに関与する遺伝子を実質的に構成する考えられる。読み取り枠の位置は表１に特定している。ＧｅｎＢａｎｋ配列寄託物を比較することで、コードされたタンパク質の機能が推定された（表３）。読み取り枠の構成を図８に示している。
【０１７０】
まず、プライマー２１ｇＤｐｒ１ＦＷＤ（５’−ＧＣＴＣＧＴＣＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣ；配列番号１６２）および２１ｇＤｐｒ１ＲＥＶ（５’−ＧＡＣＴＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＴＣＴＣ；配列番号１６３）を用いて、タイプＩＩのペプチドシンテターゼ縮合ドメイン（ｏｒｆ２０；図７）の一部を含むコスミドの端部の９０４ｂｐ断片を増幅することによりコスミド２１ｇＤからプローブを生成した。ＰＣＲ増幅は、製造者の推奨に従って５％ＤＭＳＯを含むＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて行なった。プライマーは、０．５ｍＭの濃度で用いた。コスミド２１ｇＤはテンプレートＤＮＡとして用いた。サイクル条件は次の通りであった：９６℃、２分間を１サイクル、次に、９６℃、１分間、６１．２℃、１分間、および７２℃、２分間を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間を１サイクル。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ反応を調べ、９０４ｂｐのバンドを先に記載したようにアガロースから溶離した。４，６−デヒドラターゼプローブについて先に記載したように、９０４ｂｐのアンプリコンを用いてＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２ゲノムコスミドライブラリーを調べた。このプローブにハイブリダイズした３８個のコロニーを培養し（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａブロス）、コスミドＤＮＡを精製した。ｐＷＥＢベクターに含まれる配列決定プライマー部位を用いて、精製されたコスミドの末端配列を決定した。ＤＮＡ配列の分析では、１つのコスミド（４１４１７）がコスミド２１ｇＤと１１８４ｂｐ重複することが示された。その後、コスミド４１４１７の全体について配列を決定し、読み取り枠を同定し、コードされたタンパク質の機能を推定した。
【０１７１】
（コスミド２１ｇＤを同定するために用いた）ｐ３４５９８でクローニングされた推定ｄＮＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ断片にハイブリダイズした先に同定されているコスミドをスクリーニングしてコスミド２１ｇＤの他端から遠位にある生合成クラスターの部分を同定した。これらのコスミドは、コスミド２１ｇＤの５’末端の１０４３ｂｐ産物（産物は、完全な生合成クラスターの７０，５７２〜７１，６１４番目のヌクレオチドに対応する）を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いてスクリーニングした。プライマー２１ｇＤｅｎｄＦＷＤ（５’−ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＡＧＧ；配列番号１６４）および２１ｇＤｅｎｄＲＥＶ（５’−ＣＡＣＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＴＣ；配列番号１６５）を用いて各コスミドをスクリーニングしたが、標準的な２５μｌのＰＣＲ反応物（ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔポリメラーゼ；Ｎｏｖａｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），米国）において、０．５μＭの各プライマーとともに、１０〜１００ｎｇの各コスミドをテンプレートとして用いた。期待される１０４３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅を支持するコスミドは、コスミド２１ｇＢおよび２１ｇＣだけであった。これらコスミドの末端配列決定により、コスミド２１ｇＢがコスミド２１ｇＤと１７，４１１ヌクレオチド重複し、コスミド２１ｇＣはコスミド２１ｇＤと２２，７９６ヌクレオチド重複していることが明らかになった。コスミド２１ｇＢは、知られているクラスター配列との重複がより少なく、それにより、コスミド２１ｇＣよりも配列伸長が長くなる可能性がより高いことを示したため、配列決定用に選ばれた。配列決定により、コスミド２１ｇＢが、１８，４４２ｂｐの配列伸長を示した３３，１３３ｂｐの挿入部分を含んでおり、塩基対の総数が９０，５７３に決定されることが明らかになった（図８）。前述同様に、コスミドを配列決定し、読み取り枠を同定し、コードされたタンパク質の機能を推定した。
実施例１３
２１Ｇ７９２色素タンパク質の生物学的特性
実施例１３−インビトロ抗腫瘍活性
ｐ５３／ｐ２１チェックポイントにより、ゲノムの完全性を監視し、ＤＮＡが損傷した場合に細胞周期の進行を阻害する。ｐ２１遺伝子の欠失によるチェックポイントが分裂すると、結果的に、ＤＮＡ損傷に応じて阻止できなくなり、最終的にはアポトーシスによる細胞死に繋がる。このチェックポイントが無くなることは癌細胞の特徴であるため、一対の細胞株（ｐ２１＋／＋）が損傷していないｐ２１遺伝子有し、１つのメンバー（ｐ２１−／−）がｐ２１遺伝子に欠失を有する同系統の細胞株の対を用いて、ｐ２１が欠損した細胞においてアポトーシスを選択的に誘発する分子を同定することにより、潜在的な抗腫瘍化合物についてスクリーニングすることができる。
【０１７２】
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を同系統の細胞株の対（ｐ２１＋／＋およびｐ２１−／−）に添加した。表８に示すように、色素タンパク質は、ｐ２１−／−細胞に非常に選択的であり、これは、ｐ２１＋／＋細胞に対して、ＩＣ５０が１３倍高いためである。また、表９に示すように、色素タンパク質は、ヒト腫瘍細胞株パネルにおいて優れた効力を示し、これは、ＩＣ５０が１〜４７ｎｇ／ｍｌの範囲にあるためである。しかしながら、アポタンパク質だけは不活性であった。
表８
Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質に対するＰ２１−／−細胞の感受性
【０１７３】
【表８】
2009541331.tif 000036
表９
ヒト腫瘍細胞株に対するＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の効力
【０１７４】
【表９】
2009541331.tif 000037
実施例１４
実施例１４−色素タンパク質により誘導されるＤＮＡ損傷
Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手したＣＯＭＥＴアッセイを用いてＤＮＡ損傷を検出した。ＨＣＴ１１６  ｐ２１＋／＋および−／−細胞を種々の量の２１Ｇ７９２色素タンパク質およびミトザントロンに晒した。図２７に示すように、色素タンパク質により誘導される用量依存的なＤＮＡ鎖崩壊は、ｐ２１が豊富な細胞およびｐ２１が欠損した細胞の両方において、＞１００ｎｇ／ｍｌの濃度で発生する。
【０１７５】
実施例１５
実施例１５−色素タンパク質により誘導されるＤＮＡ開裂
超らせんφＸ１７４  ＤＮＡを、種々の濃度の２１Ｇ７９２色素タンパク質でインキュベートし、ゲル電気泳動で分析した。色素タンパク質が一本鎖崩壊および二本差鎖崩壊を誘導し、その反応が２４時間継続し続け、カリケアマイシンとは異なり、ＤＮＡ開裂に還元剤（ジチオスレイトール、ＤＴＴ）が必要とされないことが観察された。ゲル電気泳動を図２８に示す。ニックとはＤＮＡの一本鎖崩壊を意味し、線状とは二本鎖切断を意味する。
【０１７６】
実施例１６
実施例１６−色素タンパク質によるヒストンＨ１の消化
色素タンパク質エンジインがヒストンを開裂することは先に示したが（Ｚｅｉｎら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，８００９−１２；Ｚｅｉｎら，１９９５，Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  ２，４５１−５；Ｚｅｉｎら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４，１１５９１−７）、この活性については議論の余地があるが（Ｈｅｙｄら，２０００，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２，１８１２−８）、アポタンパク質のタンパク質分解活性によるものと考えられていた。種々の濃度の色素タンパク質を用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、３７℃で一晩ヒストンＨ１をインキュベートした。（図２９）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なった後に、ゲルコード・ブルー（ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ，イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））によりゲルを染色してヒストンの消化を評価した。ヒストンＨ１の消化は、ＤＮＡの添加により阻害されが、これは、ＤＮＡ開裂に必要なメカニズム（例えば、フリーラジカルに基づくメカニズム）と同じメカニズムがタンパク質の消化にも関与していることを示す。これに合わせて、フリーラジカルスカベンジャー、３０ｍＭのグルタチオンまたはＮ−アセチルシステイン（図示せず）の添加により、ヒストンの消化が阻害されたが、プロテアーゼ阻害剤を加えても阻害されなかった。タンパク質を含まないエンジインであるカリケアマイシンは、ヒストンＨ１を開裂しなかったが、これは、この活性には、無傷の発色団−タンパク質複合体が必要であることを示している。
実施例１７
実施例１７−色素タンパク質による消化の特異性
色素タンパク質によるヒストンの消化の選好順序は、Ｈ１＞Ｈ２Ａ＞Ｈ２Ｂ＞Ｈ３＞Ｈ４である（図３０）。また、色素タンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質などの他の塩基性タンパク質を開裂するが、ウシ血清アルブミンなどの中性／酸性タンパク質は開裂しない。このことは、ヒストン開裂活性に発色団のアポタンパク質成分が必要であることを説明し得る：酸性アポタンパク質は、静電相互作用により、ヒストンおよび他の塩基性タンパク質に発色団を送達し、発色団がフリーラジカルに基づくメカニズムにより塩基性タンパク質を開裂できるようにすることができる。
【０１７７】
実施例１８
実施例１８−色素タンパク質によるＨｅＬａ細胞内のヒストンＨ１の消化
色素タンパク質によるヒストンの消化が無傷な細胞内で発生するかどうかを調べるために、化合物を用いて一晩３７℃でＨｅＬａ細胞をインキュベートした。抗ヒストンＨ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質イムノブロットにより細胞溶解物を分析した。細胞を色素タンパク質でインキュベートした結果、細胞内のヒストンＨ１が減少した（図３１）。ブレオマイシン、別のＤＮＡ損傷剤、またはカリケアマイシンでは効果が見られなかった。これは、色素タンパク質が無傷な細胞内でヒストンを消化できること示している。この活性は、染色質内のヒストンを消化し、ＤＮＡをより開裂し易くすることで抗腫瘍効果に寄与することが可能である。これは色素タンパク質エンジインに固有の活性であると思われる。
【０１７８】
実施例１９
実施例１９−Ｇ１／Ｓチェックポイントの色素タンパク質誘導
ＨＣＴ１１６（ｐ２１＋／＋およびｐ２１−／−）細胞を種々の濃度で色素タンパク質に晒した。図３２Ａに示すように、色素タンパク質に晒した結果、全てのテスト濃度についてｐ５３チェックポイントが活性化した。ｐ２１タンパク質の誘導は、ｐ２１＋／＋細胞にしか見られなかった。Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質によるＤＮＡ損傷チェックポイントの活性化は、ｐ５３タンパク質の転写活性化にとって重要であることが知られているｐ５３内のセリン−１５アミノ酸残基のリン酸化反応を実証することにより確認された（図３２Ｂ）。さらに、ポリＡＤＰリボースホスホリラーゼ（ＰＡＲＰ）の開裂により示されるように、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を用いて処理した場合、アポトーシスの誘導は、ｐ２１＋／＋細胞と比較して、ｐ２１−／−細胞において選択的に観察された（図２３Ｂ）。このことは、ｐ２１−／−細胞のＩＣ５０の値がより低いことと一致する。
【０１７９】
実施例２０
実施例２０−色素タンパク質種の活性
２つの実験では、ピーク「Ａ」（発色団−ｃおよび−ｄを含む色素タンパク質）、ピーク「Ｂ」（発色団−ｂを含む色素タンパク質）および全ての色素タンパク質のアイソフォームの調製物の活性は、ＨＣＴ１１６結腸癌腫細胞および８０Ｓ１４細胞（ＨＣＴ１１６のＰ２１−／−変異体）において測定された。発色団ｃの効力（発色団−ｄは有意な活性はない）は、常に、発色団ｂの効力の約３分の１であった。発色団−ｂと−ｃの両方について、アポタンパク質の誘導は、ｐ２１＋／＋細胞と比較して、ｐ２１−／−細胞において選択的に観察された；表１０を参照されたい。
表１０
色素タンパク質調製物の活性
【０１８０】
【表１０】
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実施例２１
実施例２１−インビボ抗腫瘍活性
ヒト腫瘍細胞株または断片ＬｏＶｏ（結腸癌）；ＨＣＴ１１６（結腸）；ＨＴ２９（結腸）；ＬＯＸ（メラノーマ）；ＨＮ５（頭部および頸部）；およびＰＣ−３（前立腺）を無胸腺（ヌード）マウスの皮下に移植し、腫瘤の形成を可能にした。腫瘍が９０〜２００ｍｇの大きさに達したときに、生理食塩水調節ビヒクルまたは生理食塩水中で作成した種々の濃度のＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質をマウスの静脈内に投与した。マウスは、５日目および９日目に、さらに投与を受け、相対的な腫瘍の成長が観察された。その結果を図３３および図３４のグラフに示す。色素タンパク質を受けたマウスについては、最大８０％の腫瘍成長の阻害が観察された。
【０１８１】
実施例２２
実施例２２−色素タンパク質の毒性
毒性試験により、骨髄抑制を除いて、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質はヌードマウスにおいては良好な耐容性を示すことが示唆されている。具体的には、１、５、および９日目に、生理食塩水調節ビヒクルまたは種々の服用量の色素タンパク質を６匹のヌードマウスの静脈内に投与した。マウスの顕微鏡試験により、色素タンパク質を受けた全てのマウスが骨髄壊死を示し、最大量の色素タンパク質を受けたマウスは最も重い病変を生じることが示された。臨床病理学実験により、最大量の色素タンパク質を受けたマウスは、白血球およびリンパ球の数が最も少なかったことが明らかになった。しかしながら、腸、神経、脊髄、肝臓または注射部位には有害な作用は観察されなかった。顕微鏡所見および臨床病理学的要約を表１１および１２に提供する。
表１１
顕微鏡所見要約
【０１８２】
【表１１】
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表１２
臨床的病理学
【０１８３】
【表１２】
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実施例２３
実施例２３−Ｐ−ＧＰ（ＭＤＲ−１）による色素タンパク質の輸送
ヒトＰＧＰ（ＭＤＲ１）は、細胞膜を横切る多数の薬物を輸送することができるＡＴＰ依存性排出ポンプである。このタンパク質の高発現は、腫瘍の多剤耐性に関連づけられている。表１３に示すように、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、乏しいＭＤＲ１基質であり、臨床的に関連するレベルのＭＤＲ１を発現する細胞（ＫＢ−８−５細胞）は、前記複合体に対する感受性を維持する。とりわけ、タンパク質成分を有さないカリケアマイシンは、ＭＤＲ１にとって良好な基質である。色素タンパク質のタンパク質成分は、ＭＤＲ１によって媒介される薬物流出から発色団を恐らくは保護し、多くの場合、ＭＤＲ１を発現する結腸細胞株において有益な抗腫瘍効果に関与し得る。
表  Ｐ−ＧＰ発現細胞Ｅ１３に対するＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団およびカリケアマイシンのＩＣ５０
【０１８４】
【化１０】
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実施例２４
実施例２４−ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＩＴＣ−タグ化した色素タンパク質の取り込み
色素タンパク質が細胞に入り、その生物活性を働かせるメカニズムを測定するために、製造者の推奨に従って、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ蛍光標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて色素タンパク質に蛍光タグ（ＦＩＴＣ）で標識した。標識時に生物活性の損失は見られなかった。ＨＣＴ１１６結腸癌腫細胞による標識した物質の取り込みを蛍光顕微鏡検査により調べた。最適な細胞の培養時間は３〜６時間であった。標識の大半が細胞質に現れたが、弱い染色も細胞核で観察された（図３５）。核内蓄積は少なかったが、上記複合体の抗力を考慮すると、その量は、生物活性には十分である可能性が高い。
【０１８５】
実施例２５
実施例２５−ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＩＴＣ標識アポタンパク質および色素タンパク質の取り込み
無傷な発色団とアポタンパク質の複合体が細胞侵入および核侵入に必要であるかどうかを決定するために、色素タンパク質およびアポタンパク質をＦＩＴＣで標識した。標識された物質の取り込みを蛍光顕微鏡によって調べた。アポタンパク質および色素タンパク質の両方に関して、取り込みが類似しており（図３６）、これは、細胞侵入が、無傷な発色団−タンパク質複合体には依存していないことを示唆している。
実施例２６
実施例２６−ＦＩＴＣ−タグ化色素タンパク質の取り込み：標識されていない複合体との競合）
色素タンパク質の細胞への侵入が飽和（例えば、細胞表面受容体依存的）プロセスによって媒介されるかどうかを決定するために、１０倍過剰の標識されていない試薬が存在しないまたは存在する場合（それぞれ、無標識色素タンパク質またはアポタンパク質）、ＨＣＴ１１６細胞をＦＩＴＣ標識色素タンパク質（図３７、右パネル）またはアポタンパク質（図３７、左パネル）でインキュベートした。細胞を蛍光顕微鏡（左）またはフローサイトメトリー（右）により分析した。標識の競合は観察されなかったが、これは、標識された物質の取り込みが受容体に媒介されたプロセスでなかったことを示唆している。さらに、フローサイトメトリーヒストグラムで観察された単一の均一ピークは、全ての細胞によって標識された試薬の均等な取り込みを示した。ヒストグラム中の数字は、平均チャネル数（ＦＩＴＣ蛍光）である。
【０１８６】
実施例２７
実施例２７−ＨＣＴ１１６細胞によるＦＩＴＣ−タグ化アポタンパク質の取り込みに対するエネルギー枯渇および微小管破壊の効果
上記の実験は、色素タンパク質の細胞への侵入が受容体によって媒介されたプロセスではないことを示唆している。タンパク質複合体が細胞に入る他の手段は、細胞表面の小胞がくびれて、該細胞の細胞質内で自由なピノソームを形成する飲作用である。飲作用は、機能チューブリン細胞骨格網を必要とするエネルギー依存プロセスであるため、アジ化ナトリウム、エネルギー脱共役剤、およびノコダゾール（チューブリン細胞骨格を破壊する薬剤）の細胞の取り込みに対する効果を調べた。アジ化ナトリウムまたはノコダゾールが存在しないまたは存在する場合に、ＨＣＴ１１６細胞をＦＩＴＣ標識されたアポタンパク質で処理した。これらの処理はともに、標識の取り込みを阻害した（図３８）。ノコダゾールの濃度（１００ｎＭ）が微小管を破壊するに十分であることが示された（右パネル）。これらのデータは、アポタンパク質の取り込みが微小管ネットワークを利用するエネルギー依存性プロセスであることを示唆している。データでは、受容体に媒介されるプロセスが除外されると思われるので、飲作用が関与している可能性が最も高い。
【０１８７】
本出願は、全ての目的に対して、参照により全体として本明細書中に援用される、２００６年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８１５、６９７号に関連する。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質のＨＰＬＣクロマトグラムである。ＨＰＬＣの分析条件は、下記の通りである。カラム：ＴｏｓｏＨａａｓ  ＤＥＡＥ  ５  ＰＷ（粒径１０μｍ、サイズ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）。バッファー：０〜０．５Ｍ直線勾配ＮａＣｌ、一定の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで２５分間、流速０．８ｍｌ／分。
【図２】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質のＵＶスペクトルである。
【図３】２１Ｇ７９２アポタンパク質のＨＰＬＣクロマトグラムである。ＨＰＬＣの分析条件は下記の通りある。カラム：ＶＹＤＡＣタンパク質Ｃ４（３００Ａ、サイズ３．０×１００ｍｍ）。溶媒：Ｈ２Ｏに含まれる１０〜３０％のアセトニトリル、一定の０．０５％ＴＦＡで６分間、２ｍｌ／分。
【図４】２１Ｇ７９２色素タンパク質のＵＶスペクトルである。
【図５】アポタンパク質の分子量測定（ＭＡＬＤＩ−ＭＳで１２．９２４０９ｋＤａ）を示す。
【図６】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団（発色団−ｂ、−ｃ、および−ｄ）の構造を示す。
【図７】２１Ｇ７９２プレアポタンパク質およびアポタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を提示する。推測されるリボソーム結合部位は枠内に示し、リーダーペプチドには下線を引いている。斜線は、リーダーペプチドおよびアポタンパク質の開裂部位を示す。
【図８】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質遺伝子クラスターの読み取り枠を示す。コスミド４１４１７上に位置する遺伝子は、ｏｒｆの矢印上に直線で示している。コスミド２１ｇＤ上に位置するものは、小さな点からなる破線で示しており、コスミド２１ｇＢ上に位置するものについては、大きな点からなる破線で示している。各コスミドの同定に用いるプローブの位置は、黒いバーベル状の印しで示している。ＰｓｔＩ（Ｐ）およびＥｃｏＲＩ（Ｅ）制限部位にはラベルを付している。
【図９】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団のチロシン誘導成分（３−［２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル］−３−ヒドロキシ−プロピオン酸）の合成経路を示す。
【図１０Ａ】ｏｒｆ１７遺伝子産物の構造ドメインを示す。縮合（Ｃ）、アデニル化（Ａ）およびぺプチジル担体タンパク質（ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰＣＰ）ドメインのコアモチーフは、枠内に入れてラベルを付している。ｏｒｆ１７遺伝子産物のＡドメイン基質特異性コードおよびＣ−１０２７生合成経路のＳｇｃＣ４に寄与する残基は、太字にし、下線を引いている。同一の残基には、アスタリスクを付しており、コロンは保存残基を示し、セミコロンは半保存残基を示す。
【図１０Ｂ】ｏｒｆ１７遺伝子産物の構造ドメインを示す。縮合（Ｃ）、アデニル化（Ａ）およびぺプチジル担体タンパク質（ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰＣＰ）ドメインのコアモチーフは、枠内に入れてラベルを付している。ｏｒｆ１７遺伝子産物のＡドメイン基質特異性コードおよびＣ−１０２７生合成経路のＳｇｃＣ４に寄与する残基は、太字にし、下線を引いている。同一の残基には、アスタリスクを付しており、コロンは保存残基を示し、セミコロンは半保存残基を示す。
【図１１】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団のマヅロサミン（４−アミノ−４−デオキシ−３−Ｃ−メチル−β−リボピラノース）成分の合成経路を表す。
【図１２】Ｏｒｆ３８とｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼとのアラインメントを示す。このアラインメントに含まれるグルコース−４，６−デヒドラターゼ配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｅｙａｇａｗａｅｎｓｉｓコンカナマイシンＡ遺伝子クラスター（ＡＡＺ９４３９６）のＯｒｆ５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｒｇｉｌｌａｃｅｕｓミトラマイシン遺伝子クラスター（ＣＡＡ７１８４７）のＭｔｍＥ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓスペクチノマイシン遺伝子クラスター（ＡＡＤ３１７９７）のＳｐｃＥである。上記アラインメントに含まれるグルクロン酸デカルボキシラーゼ配列は、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ（ＢＡＢ４０９６７）のＵｘｓ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＫ７０８８２）のＵｘｓ３、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＫ７０８８０）のＵｘｓ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＫ７０８８１）のＵｘｓ２、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＡＡＫ８５４１０）のＵｘｓ１、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ（ＡＡＫ５９９８１）のＵｘｓ１である。同一の残基には、アスタリスクを付しており、コロンは保存残基を示し、セミコロンは半保存残基を示す。
【図１３】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸成分の合成経路を示す。
【図１４】Ｏｒｆ３１のＡ４およびＡ５コアモチーフ間の領域と１０個のアリール酸ＡＭＰリガーゼのアラインメントを示す。構造上のアンカーには黒色の影を付けている。カルボキシ酸結合ポケットの推測される構成には灰色の影を付けている。ＤＨＢＡの活性とサリチル酸の区別に関与していることが推測されている残基は、番号記号で特定される。同一の残基にはアスタリスクを付し、コロンは保存残基を示し、セミコロンは半保存残基を示す。
【図１５】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団のエンジインコアの生成の生合成経路を示す。
【図１６】ドメイン構成、ならびにＯｒｆ５とＳｇｃＥおよびＮｃｓＥエンジインＰＫＳとの比較を示す。ａａ、アミノ酸；ＫＳ、ケトシンターゼ；ＡＴ、アセチルトランスファーゼ；ＡＣＰ、アシル担体タンパク質；ＫＲ、ケトレダクターゼ；ＤＨ、デヒドラターゼ；ＴＤ、末端ドメイン。
【図１７】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の４つの成分の集合ルートを表す。
【図１８】ＤＥＡＥセファロース陰イオン交換カラムからのＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の溶出プロフィールを示すクロマトグラムである。
【図１９】フェニルセファロースＨＰカラムからのＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の溶出プロフィールを示すクロマトグラムである。
【図２０】スーパーデックス７５サイズ分画カラムからのＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の溶出プロフィールを示す。
【図２１Ａ】スーパーデックス７５分画６のフェニル５ＰＷクロマトグラム（吸光度２３０ｎｍ）（パネルＡ）を示す。
【図２１Ｂ】色素タンパク質およびアポタンパク質ピークについての吸光度スペクトル（パネルＢ）を示す。
【図２２Ａ】スーパーデックス７５分画６のＢｉｏＳｉｌ  ＳＥＣ１２５クロマトグラム（パネルＡ）を示す。
【図２２Ｂ】共溶出した色素タンパク質およびアポタンパク質についての吸光度スペクトル（パネルＢ）を示す。
【図２３】ブロスからの色素タンパク質含有試料および種々の段階の精製からの関連するカラム分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。タンパク質を還元条件下で分離し、染色（クーマシー）した。３１と３６．５ｋＤａの間に移動している顕著なバンドは、色素タンパク質として同定される。レーン１および１８：ＭＷ標準；レーン２：浄化したブロス（ＤＥＡＥ装填）；レーン３：ＤＥＡＥ分画Ｄ３；レーン７：フェニルセファロースプール８；レーン８：フェニルセファロース分画Ｐ９（色素タンパク質）；レーン９：フェニルセファロース分画Ｐ１０（色素タンパク質）；レーン１０：フェニルセファロース分画Ｐ１１；レーン１１：フェニルセファロース分画Ｐ１４（アポタンパク質）；レーン１２：フェニルセファロース分画Ｐ１５（アポタンパク質）；レーン１３：スーパーデックス７５装填（２μｌ）；レーン１４：スーパーデックス分画Ｓ５；レーン１５：スーパーデックス分画Ｓ６；レーン１６：スーパーデックス分画Ｓ７；レーン１７：スーパーデックス分画Ｓ８。
【図２４】陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって連続して精製したＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質（分画Ｓ６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。３７．０と２８．９ｋＤａの間に移動している顕著なバンドは、色素タンパク質として同定される。レーン１および５：ＭＷ標準；レーン２：色素タンパク質の参照標準；レーン３：スーパーデックス７５分画Ｓ６；レーン４：参照標準とスーパーデックス７５分画Ｓ６の混合物。
【図２５】関連した色素タンパク質アイソフォームを含む色素タンパク質の分離を示す。色素タンパク質調製物は、フェニルセファロースＨＰを用いて分離された。ピークＢは、発色団−ｂを含む色素タンパク質−ｂに対応する。ピークＡは、発色団−ｃおよび−ｄを含む色素タンパク質−ｃおよび−ｄを含む。アポタンパク質は、色素タンパク質種とは別に溶出する。
【図２６】フェニルセファロースプール（図２５のピークＡおよびＢ）のエンジイン組成物を示す。
【図２７】２１Ｇ７９２色素タンパク質誘導の用量依存的ＤＮＡ鎖切断が、ｐ２１が豊富なＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞およびｐ２１が欠損したＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞において、＞１００ｎｇ／ｍｌの色素タンパク濃度で発生することを示すグラフである。
【図２８】２１Ｇ７９２色素タンパク質が一本鎖切断および二本鎖切断を誘導し、２４時間以上反応を継続し続け、ＤＮＡ開裂がチオール剤を必要としなかったことを示すＤＮＡ開裂アッセイである。
【図２９】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質によるヒストンＨ１の消化、およびＤＮＡによる阻害を表す。プロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン、およびペプスタチンＡである。アポタンパク質は不活性である。
【図３０】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質による消化に対するヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の相対感度を示す。ミエリン塩基性タンパク質などの塩基性タンパク質は、中性／酸性タンパク質ではないが、これも開裂しやすい。
【図３１】ブレオマイシンおよびカリケアマイシンではなく、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質で治療された細胞内のヒストンＨ１の減少を示す。
【図３２Ａ】ＨＣＴ１１６細胞を種々の濃度で色素タンパク質に曝すことによりｐ５３／ｐ２１チェックポイントの活性が得られることを示すタンパク質イムノブロットである。
【図３２Ｂ】ポリ−ＡＤＰ−リボースホスホリラーゼ（ＰａｒＰ）の開裂でのｐ５３のセリン−１５アミノ酸残基のリン酸化反応を示す。
【図３３】無胸腺（ヌード）マウスにおける、皮下に注射されたＬｏＶｏ（結腸癌）；ＨＣＴ１１６（結腸）；ＨＴ２９（結腸）；ＬＯＸ（メラノーマ）；ＨＮ５（頭部および頸部）；およびＰＣ−３（前立腺）細胞の腫瘍に対する２１Ｇ７９２色素タンパク質のインビボ効力を示す一連のグラフである。
【図３４】無胸腺（ヌード）マウスにおける、皮下に注射されたＬｏＶｏ（結腸癌）；ＨＣＴ１１６（結腸）；ＨＴ２９（結腸）；ＬＯＸ（メラノーマ）；ＨＮ５（頭部および頸部）；およびＰＣ−３（前立腺）細胞の腫瘍に対する２１Ｇ７９２色素タンパク質のインビボ効力を示す一連のグラフである。
【図３５】ＦＩＴＣ標識されたＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質のＨＣＴ１１６細胞による取り込みを示す。
【図３６】ＦＩＴＣ標識されたＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質およびアポタンパク質のＨＣＴ１１６細胞による取り込みを示す。
【図３７】１０倍濃度の非標識色素タンパク質の存在下で、標識Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の取り込みを示す。
【図３８】エネルギー脱共役剤（アジ化ナトリウム）またはチューブリン破壊剤（ノコダゾール）のＨＣＴ１１６細胞によるＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の取り込みに対する効果を示す。
【図３９】Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種２１Ｇ７９２発色団の誘導体に対するモノクローナル抗体の連結を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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