(57)【要約】  遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ）に関連した多型を同定する方法が記載される。ＳＰＧに関連した多型は受容体発現促進タンパク質１（ＲＥＥＰ１）遺伝子に特定の変異体を含む。ＳＰＧの診断方法についても記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ）に関連した遺伝子多型の存在または不在について個体を評価する方法であって、前記個体に由来する試験試料での受容体発現促進タンパク質１（ＲＥＥＰ１）遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在について評価するステップを含み、ここで少なくとも１つの突然変異の存在が遺伝性痙性対麻痺に関連した遺伝子多型の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記個体に由来する前記試験試料がゲノムＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノムＤＮＡが２番染色体または２ｐ１２を含むその断片を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験試料を評価するステップが前記ＲＥＥＰ１遺伝子の全部または断片を増幅するステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試験試料を評価するステップが直接配列分析を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記突然変異が、ヌクレオチド５６でのＣ→Ｇの単一塩基の転換（５６Ｃ→Ｇ）、ヌクレオチド５９でのＣ→Ａの単一塩基の転位（５９Ｃ→Ａ）、ヌクレオチド１８２−２でのＧ→Ａの転位（１８２−２Ｇ→Ａ）、ヌクレオチド１９３の単一塩基の欠失（１９３ｄｅｌＴ）、ヌクレオチド２２３の単一塩基の欠失（２２３ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５０７の単一塩基の欠失（５０７ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５２６の単一塩基の欠失（５２６ｄｅｌＧ）、６０６＋１４での３’−ＵＴＲにおけるＣ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋１４Ｃ→Ｔ）、６０６＋４３での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋４３Ｇ→Ｔ）、および６０６＋５０での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ａの単一塩基の転位  ５９Ｃ→Ａ（６０６＋５０Ｇ→Ａ）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
個体における遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ）を診断する方法であって、前記個体に由来する試験試料での前記受容体発現促進タンパク質１（ＲＥＥＰ１）遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在について評価するステップを含み、ここで少なくとも１つの突然変異の存在が遺伝性痙性対麻痺の存在を示す、方法。
【請求項８】
前記個体に由来する前記試験試料がゲノムＤＮＡを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノムＤＮＡが２番染色体または２ｐ１２を含むその断片を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験試料を評価するステップが前記ＲＥＥＰ１遺伝子の全部または断片を増幅するステップを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験試料を評価するステップが直接配列分析を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異が、ヌクレオチド５６でのＣ→Ｇの単一塩基の転換（５６Ｃ→Ｇ）、ヌクレオチド５９でのＣ→Ａの単一塩基の転位（５９Ｃ→Ａ）、ヌクレオチド１８２−２でのＧ→Ａの転位（１８２−２Ｇ→Ａ）、ヌクレオチド１９３の単一塩基の欠失（１９３ｄｅｌＴ）、ヌクレオチド２２３の単一塩基の欠失（２２３ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５０７の単一塩基の欠失（５０７ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５２６の単一塩基の欠失（５２６ｄｅｌＧ）、６０６＋１４での３’−ＵＴＲにおけるＣ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋１４Ｃ→Ｔ）、６０６＋４３での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋４３Ｇ→Ｔ）、および６０６＋５０での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ａの単一塩基の転位  ５９Ｃ→Ａ（６０６＋５０Ｇ→Ａ）からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は２００６年３月３０日出願の米国仮特許出願第６０／７８８，４５０号明細書の優先権を主張するものである。上記出願の教示内容全体は参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
（政府の支援）
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの補助金Ｐ０１  ＮＳ２６６３０により全体的または部分的な支援を受けた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ）は進行性の下肢痙縮、反射過敏（ｈｙｐｅｒｒｅｆｌｅｘｉａ）、および不全麻痺によって臨床的に特徴づけられる神経変性疾患群である。ＳＰＧは常染色体優性、常染色体劣性、またはＸ染色体連鎖劣性の様式で遺伝されうるものであり、その大部分は常染色体優性ＳＰＧの様相を呈する（フィンク  Ｊ．Ｋ．（Ｆｉｎｋ，Ｊ．Ｋ．）およびヘデラ  Ｐ．（Ｈｅｄｅｒａ，Ｐ．）、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９（３）：３０１−９頁（１９９９年）；タラクセン  Ｃ．Ｍ．（Ｔａｌｌａｋｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４（４）：４５７−６３頁（２００１年））。１１の異なる染色体遺伝子座が常染色体優性ＳＰＧにおいて同定されている（レイド  Ｅ．（Ｒｅｉｄ，Ｅ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４０、８１−８６頁（２００３年）；オルラッキオ  Ａ．（Ｏｒｌａｃｃｈｉｏ，Ａ．）ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８、４２３−４２９頁（２００５年））。常染色体優性ＳＰＧの根底にあるスパスチン（ｓｐａｓｔｉｎ）（ハザン  Ｊ．（Ｈａｚａｎ，Ｊ．）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２９６−３０３頁（１９９９年））；アトラスチン（ａｔｌａｓｔｉｎ）（チャオ  Ｘ．（Ｚｈａｏ，Ｘ．）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３２６−３３１頁（２００１年））；ＨＳＰ６０（ハンセン  Ｊ．Ｊ．（Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｊ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７０：１３２８−１３３２頁（２００２年））；ＫＩＦ５Ａ（レイド  Ｅ．（Ｒｅｉｄ，Ｅ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７１：１１８９−１１９４頁（２００２年））；およびＢＳＣＬ２（ヒルトゥネン  Ｍ．（Ｈｉｌｔｕｎｅｎ，Ｍ．）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔ．２５０：６９−７１頁（１９９８年））という５つの遺伝子が発見されている。さらなる遺伝的異質性が示唆されている（アシュレイ−コッホ  Ａ．（Ａｓｈｌｅｙ−Ｋｏｃｈ，Ａ．）ら、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．３：９１−９７頁（２００１年））。ＳＰＧの変異体を相互に区別するための手段が依然として必要とされている。
【０００４】
（発明の要約）
本発明は、個体における遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ）に関連した遺伝子多型の存在または不在について評価する方法に関する。本発明の方法においては、個体に由来する試験試料が受容体発現促進タンパク質１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（ＲＥＥＰ１）遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在について評価される。試験試料の評価が、ＲＥＥＰ１遺伝子の全部または断片の増幅および／または直接配列分析を含みうる標準的方法によって実行可能である。試験試料は、ゲノムＤＮＡ（例えば２番染色体または２ｐ１２を含むその断片を含むゲノムＤＮＡ）などの核酸を含む。例えば、目的の突然変異は、ヌクレオチド５６でのＣ→Ｇの単一塩基の転換、ヌクレオチド５９でのＣ→Ａの単一塩基の転位、ヌクレオチド１８２−２でのＧ→Ａの転位、ヌクレオチド１９３の単一塩基の欠失（１９３ｄｅｌＴ）、ヌクレオチド２２３の単一塩基の欠失（２２３ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５０７の単一塩基の欠失（５０７ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５２６での単一塩基の欠失（５２６ｄｅｌＧ）、６０６＋１４での３’−ＵＴＲにおけるＣ→Ｔの単一塩基の転位、６０６＋４３での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ｔの単一塩基の転位、または６０６＋５０での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ａの単一塩基の転位からなる群から選択されうる。ＲＥＥＰ１遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在が遺伝性痙性対麻痺に関連した遺伝子多型の存在を示す。
【０００５】
さらに、本発明の方法は、上記のように、個体に由来する試験試料での個体のＲＥＥＰ１遺伝子における少なくとも１つの突然変異の存在について評価することによって個体における遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ）を診断する方法を含む。ＲＥＥＰ１遺伝子における突然変異の存在は遺伝性痙性対麻痺を示す。本発明は、さらに本発明の方法において有用なキットに関する。
【０００６】
本発明の方法は、遺伝性痙性対麻痺の特定のタイプを他のタイプと区別するとともに疾患に罹患した人を同定するための簡単な手段を提供する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、個体における遺伝性痙性対麻痺（ＳＰＧ）に関連した遺伝子多型の存在または不在について評価する方法および個体におけるＳＰＧを診断する方法、ならびに個体におけるＳＰＧに対する保因状態について評価する方法を提供する。本明細書中に記載のように、本出願人はＳＰＧに関連した受容体発現促進タンパク質１（ＲＥＥＰ１）遺伝子における特定の目的の突然変異を同定している。本明細書中に記載のＲＥＥＰ１遺伝子における突然変異は、ＲＥＥＰ１遺伝子の核酸配列における改変（例えば、欠失、挿入、または転位）である。ＲＥＥＰ１の配列における突然変異の位置がｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列との関連で数えられる、すなわち改変されたヌクレオチドの数えられた位置はｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列におけるそのヌクレオチドの数である。ＲＥＥＰ１遺伝子に関連したｍＲＮＡ配列は、２００４年１１月２６日提出のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ５６２２３９において示される（配列表において配列番号１として示される）。目的の突然変異は、以下の改変、すなわちヌクレオチド５６でのＣ→Ｇの単一塩基の転換、ヌクレオチド５９でのＣ→Ａの単一塩基の転位、ヌクレオチド１８２−２でのＧ→Ａの転位、ヌクレオチド１９３の単一塩基の欠失（１９３ｄｅｌＴ）、ヌクレオチド２２３の単一塩基の欠失（２２３ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５０７の単一塩基の欠失（５０７ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５２６の単一塩基の欠失（５２６ｄｅｌＧ）、６０６＋１４での３’−ＵＴＲにおけるＣ→Ｔの単一塩基の転位、６０６＋４３での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ｔの単一塩基の転位、または６０６＋５０での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ａの単一塩基の転位を含む。
【０００８】
この発見の結果として、現在、個体におけるＳＰＧに関連した遺伝子多型の存在について評価するための方法ならびに個体におけるＳＰＧを診断するための方法が利用可能である。本発明の方法においては、個体に由来する試験試料でのＲＥＥＰ１遺伝子における１つ以上の多型の存在について評価される（本明細書中では「目的の多型」または「ＳＰＧに関連した多型」とも称される）。個体はヒト個体であり、任意の人種ならびに胎児、幼児、年少者、青年、および成人を含む任意の年齢でありうる。情報の確認が望ましい場合、代表的な個体は、過去にＳＰＧに罹患していると診断されたことがない者およびＳＰＧに罹患している危険性があると判断されている者、ならびに最初にＳＰＧに罹患していると診断されている者を含む。
【０００９】
試験試料は、個体に由来する、ＲＥＥＰ１遺伝子またはＲＥＥＰ１遺伝子の断片、ＲＥＥＰ１  ｍＲＮＡまたはＲＥＥＰ１  ｍＲＮＡの断片、ＲＥＥＰ１  ｃＤＮＡまたはＲＥＥＰ１  ｃＤＮＡの断片を含む核酸を含有する試料である。本明細書で用いられる「断片」という用語は、遺伝子の一部、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡがＲＥＥＰ１の断片と同定するのに十分な長さをもつポリヌクレオチドであることを示し、代表的な実施形態では断片がＲＥＥＰ１遺伝子の１つ以上のエクソンを含み、別の代表的な実施形態では断片がＲＥＥＰ１遺伝子のエクソンの一部を含む。断片は、ＲＥＥＰ１遺伝子のイントロン／エクソン接合部および／または５’−ＵＴＲもしくは３’−ＵＴＲも含みうる。
【００１０】
試験試料は、個体に由来する生物学的試料から調製される。生物学的試料は、ゲノムＤＮＡ（例えば染色体核酸）またはＲＮＡを有する任意の供給源に由来する試料、例えば血液試料、羊水の試料、脳脊髄液の試料、または皮膚、筋肉、口腔もしくは結膜粘膜、胎盤、胃腸管もしくは他の器官に由来する組織試料でありうる。胎児の細胞または組織に由来する核酸の生物学的試料が適切な方法、例えば羊水穿刺または絨毛膜標本採取（直接または培養）により採取可能である。特定の実施形態では、２番染色体またはその断片（例えば２ｐ１２を含む断片またはＲＥＥＰ１遺伝子の１つ以上のエクソンを含む断片）を含むゲノムＤＮＡを含有する生物学的試料が用いられる。試験試料として生物学的試料が使用可能である、あるいは生物学的試料を処理して核酸または核酸のコピー（例えばＲＥＥＰ１遺伝子を含む核酸のコピー）へのアクセスを高めることが可能であり、次いで処理された生物学的試料は試験試料として使用可能である。例えば、一実施形態では、ｃＤＮＡが本方法での使用を意図してｍＲＮＡを含む生物学的試料から調製される。あるいはまたはそれに加え、必要に応じ増幅方法を用い、目的の多型の存在または不在についての評価における試験試料としての使用を意図して、生物学的試料中のＲＥＥＰ１遺伝子の全部または断片を含む核酸を増幅することが可能である。例えば、代表的な実施形態では、ＲＥＥＰ１遺伝子の各エクソンの増幅が可能である。
【００１１】
試験試料は、ＲＥＥＰ１遺伝子における１つ以上の目的の突然変異（目的の多型）が個体のＲＥＥＰ１遺伝子に存在するか否かを判定するように評価される。一般に、目的の多型の検出が試験試料中で目的の多型を有する核酸の存在または不在を判定することにより実行可能である。多型は、ＲＥＥＰ１遺伝子における変化、例えばフレームシフトをもたらす単一のヌクレオチドまたは２つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失；コードアミノ酸における変化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチドの変化；早期（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）停止コドンの生成をもたらす少なくとも１つのヌクレオチドの変化；ヌクレオチドによってコードされた１つ以上のアミノ酸の欠失をもたらす数個のヌクレオチドの欠失；遺伝子のコード配列の中断をもたらす、同等でない組換えまたは遺伝子変換などによる１つもしくは数個のヌクレオチドの挿入；遺伝子の全部または一部の複製；遺伝子の全部または一部の転位；または遺伝子の全部または一部の再配列でありうる。２つ以上のかかる変化は単一の遺伝子に存在しうる。かかる配列変化は、ＲＥＥＰ１遺伝子によってコードされるポリペプチドにおいて差異を生じさせる。例えば、差異がフレームシフト変化である場合、フレームシフトはコードされたアミノ酸における変化をもたらし、および／または早期停止コドンの生成をもたらし、末端が切断されたポリペプチドの生成を誘発する可能性がある。あるいは、疾患または症状に関連した多型あるいはＲＥＥＰ１遺伝子に関連した疾患または症状に対する感受性が、１つ以上のヌクレオチドにおける同義の改変（すなわちＲＥＥＰ１遺伝子によってコードされるポリペプチドにおける変化をもたらすことのない改変）でありうる。かかる多型は、スプライシング部位を改変するか、ｍＲＮＡの安定性または輸送に作用するか、またはそれとは別に遺伝子の転写または翻訳に作用する可能性がある。上記の変化または改変のいずれかを有するＲＥＥＰ１遺伝子については、本明細書中で「改変されたＲＥＥＰ１遺伝子」と称される。
【００１２】
第１の方法では、ハイブリダイゼーション方法、例えばサザン分析、ノーザン分析、またはインサイチュハイブリダイゼーションが用いられうる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、アウスベル  Ｆ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）（すべての補遺を含む）を参照）。例えば、目的の多型の存在は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡにおける核酸の核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって示されうる。本明細書で用いられる「核酸プローブ」がＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブであり、核酸プローブは本明細書中に記載のように、少なくとも１つの目的の多型を有しうる。プローブは、例えば遺伝子、遺伝子断片（例えば１つ以上のエクソン）、遺伝子、プローブまたはプライマーなどを含むベクターでありうる。
【００１３】
目的の多型の１つ以上を検出するため、試験試料を少なくとも１つの核酸プローブと接触させることによりハイブリダイゼーション試料が形成される。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましいプローブが、ＲＥＥＰ１遺伝子のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズ可能な標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば完全長核酸分子またはその一部、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長であり、かつストリンジェントな条件下で適切なｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでありうる。ハイブリダイゼーション試料は、ＲＥＥＰ１遺伝子のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとの核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを十分に可能にする条件下で維持される。本明細書で用いられる「特異的ハイブリダイゼーション」は、正確なハイブリダイゼーション（例えばミスマッチを全く伴わない）を示す。特異的ハイブリダイゼーションは、上記のように例えば高いストリンジェンシー条件下または中等度のストリンジェンシー条件下で実施可能である。特に好ましい実施形態では、特異的ハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件は高いストリンジェンシーである。
【００１４】
次いで、特異的ハイブリダイゼーションが存在すれば、それが標準的方法を用いて検出される。特異的ハイブリダイゼーションが核酸プローブと試験試料におけるＲＥＥＰ１遺伝子またはｍＲＮＡとの間で生じる場合、核酸プローブに存在する多型も個体のＲＥＥＰ１遺伝子に存在する。この方法では、２つ以上の核酸プローブの同時使用も可能である。核酸プローブのうちのいずれか１つの特異的ハイブリダイゼーションが本明細書中に記載のように目的の多型の存在を示す。
【００１５】
ノーザン分析（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、アウスベル  Ｆ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．）ら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、上記を参照）では、上記のハイブリダイゼーション方法を用い、目的の多型の存在が同定される。ノーザン分析においては、ＲＮＡを含有する試験試料が適切な手段により個体に由来する生物学的試料から調製される。上記のように核酸プローブの個体に由来するＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションが本明細書中に記載のように目的の多型の存在を示す。
【００１６】
核酸プローブの使用の代表例として、例えば米国特許第５，２８８，６１１号明細書および米国特許第４，８５１，３３０号明細書を参照のこと。
【００１７】
あるいは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブが上記のハイブリダイゼーション方法における核酸プローブの代わりに使用可能である。ＰＮＡは、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に結合する有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴもしくはＵ）とともにペプチド様の無機骨格、例えばＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位を有するＤＮＡ模倣体（ｍｉｍｉｃ）である（例えば、ニールセン  Ｐ．Ｅ．（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、５、アメリカ化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１頁（１９９４年）を参照）。ＰＮＡプローブは、本明細書中に記載の目的の多型のうちの１つ以上を含むＲＥＥＰ１遺伝子と特異的にハイブリダイズするように設計可能である。ＰＮＡプローブのＲＥＥＰ１遺伝子とのハイブリダイゼーションは目的の多型の存在を示す。
【００１８】
本発明の別の方法では、ＲＥＥＰ１遺伝子における突然変異または多型が制限部位の創出または除去をもたらす場合、制限消化による突然変異分析を用い、変異ＲＥＥＰ１遺伝子または目的の多型を有するＲＥＥＰ１遺伝子の検出が可能である。個体に由来するゲノムＤＮＡを含有する試料が用いられる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、試料中のＲＥＥＰ１遺伝子の全部または断片（および必要に応じて隣接配列）の増幅が可能である。ＲＦＬＰ分析が記載のように行われる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、上記を参照）。関連ＤＮＡ断片の消化パターンがＲＥＥＰ１遺伝子における多型の存在または不在を示す。
【００１９】
直接配列分析を用い、ＲＥＥＰ１遺伝子における目的の特異的な多型を検出することも可能である。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含有する試料が用いられ、かつＰＣＲまたは他の適切な方法を用い、必要に応じてＲＥＥＰ１遺伝子の全部または断片および／またはその隣接配列の増幅が可能である。ＲＥＥＰ１遺伝子もしくは遺伝子の断片（例えば１つ以上のエクソン）、またはｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡの断片、またはｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片の配列が標準的方法を用いて判定される。遺伝子、遺伝子断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ断片の配列は、必要に応じてＲＥＥＰ１遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡにおける既知の核酸配列と比較される。次いで、目的の多型の存在が同定可能である。
【００２０】
対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用い、増幅されたオリゴヌクレオチドと対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブとのドットブロットハイブリダイゼーションの利用を通じて目的の多型の存在を検出することも可能である（例えば、サイキ  Ｒ．（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．）ら、（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３２４：１６３−１６６頁を参照）。「対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド」（本明細書中で「対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ」とも称される）は約１０〜５０塩基対、好ましくは約１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドであり、それはＲＥＥＰ１遺伝子と特異的にハイブリダイズしかつ本明細書中に記載の目的の多型を有する。特定の多型に対して特異的である対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが標準的方法を用いて調製可能である（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、上記を参照）。目的の多型を同定するため、ＤＮＡを含有する試料が用いられる。ＰＣＲを用い、ＲＥＥＰ１遺伝子の全部または断片およびその隣接配列を増幅可能である。増幅されたＲＥＥＰ１遺伝子（または遺伝子の断片）を有するＤＮＡは標準的方法を用いてドットブロットされ（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、上記を参照）、ブロットはオリゴヌクレオチドプローブと接触される。次いで、プローブの増幅されたＲＥＥＰ１との特異的ハイブリダイゼーションの存在が検出される。対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの個体に由来するＤＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションが目的の多型の存在を示す。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用い、目的の多型の存在が検出可能である。ＦＲＥＴは１個の蛍光分子の放射が別分子の励起にカップリングされる場合の距離依存性の励起状態相互作用のプロセスである。共鳴エネルギー移動において典型的なアクセプタおよびドナーの対が、４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）および５−［（２−アミノエチルアミノ］ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）からなる。ＥＤＡＮＳは３３６ｎｍの光での照明により励起され、波長４９０ｎｍを有する光子を放射する。ＤＡＢＣＹＬ部分がＥＤＡＮＳの２０オングストローム以内に位置する場合、この光子は効率的に吸収されることになる。ＤＡＢＣＹＬおよびＭＡＮＳは、目的の突然変異の１つの部位に隣接しかつ／またはそれと重なる核酸と頭尾結合でハイブリダイズするように設計された２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブと結合することになる。次いで、融解曲線分析が適用され、変性、冷却、および再加熱のサイクルがオリゴヌクレオチドプローブと混合された試験試料に適用され、蛍光を連続的に監視することでＤＡＢＣＹＬ蛍光における低下またはＥＤＡＮＳ蛍光における増大（消光の低下）が検出される。２つのプローブが互いに近接してハイブリダイズ状態を維持する間、ＦＲＥＴは極めて効率的になる。オリゴヌクレオチドプローブの物理的分離の結果、２つの色素がもはやあまり接近していないことから非効率的なＦＲＥＴがもたらされる。目的の突然変異の存在または不在は、試験試料から得られる蛍光強度特性とＲＥＥＰ１遺伝子における既知の目的の突然変異を含む対照試料の蛍光強度特性との比較により評価可能である。
【００２２】
別の実施形態では、個体に由来する標的核酸配列セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用い、目的の多型が同定可能である。例えば一実施形態では、オリゴヌクレオチドアレイが使用可能である。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的には異なる既知の位置における基質の表面に共役される複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。「Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（商標）」とも記載されるこれらのオリゴヌクレオチドアレイは、一般に当該技術分野、例えば米国特許第５，１４３，８５４号明細書およびＰＣＴ特許出願、国際公開第９０／１５０７０号パンフレットおよび国際公開第９２／１００９２号パンフレットにて記載されている。これらのアレイは、一般にフォトリソグラフィー方法と固相オリゴヌクレオチド合成方法の組み合わせを組み込む、機械的合成方法または光誘導合成方法を用いて生成可能である。フォドー（Ｆｏｄｏｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７７頁（１９９１年）、ピルング（Ｐｉｒｒｕｎｇ）ら、米国特許第５，１４３，８５４号明細書（ＰＣＴ出願番号、国際公開第９０／１５０７０号パンフレットも参照）ならびにフォドー（Ｆｏｄｏｒ）ら、ＰＣＴ出願番号、国際公開第９２／１００９２号パンフレットおよび米国特許第５，４２４，１８６号明細書を参照のこと（これら各々の教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）。機械的合成方法を用いてこれらのアレイを合成するための技術が、例えば米国特許第５，３８４，２６１号明細書（この教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）中に記載されている。
【００２３】
一旦オリゴヌクレオチドアレイが調製されると、目的の核酸がアレイとハイブリダイズされ、多型について走査される。ハイブリダイゼーションおよび走査は、一般に本明細書だけでなく、例えば公開されたＰＣＴ出願、国際公開第９２／１００９２号パンフレットおよび国際公開第９５／１１９９５号パンフレット、ならびに米国特許第５，４２４，１８６号明細書（これらの教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）に記載の方法によっても実施される。つまり、１つ以上の予め同定された多型性マーカーを含む標的核酸配列が周知の増幅技術、例えばＰＣＲにより増幅される。典型的にはこれは標的配列の多型から上流および下流の双方の２つの鎖に対して相補的であるプライマー配列の使用を含む。非対称ＰＣＲ技術もまた利用可能である。次いで、一般に標識を取り込む増幅された標的が適切な条件下でアレイとハイブリダイズされる。アレイのハイブリダイゼーションおよび洗浄が完了すると、アレイは走査され、標的配列がハイブリダイズするアレイ上の位置が判定される。走査から得られたハイブリダイゼーションデータは、典型的にはアレイ上の位置の関数としての蛍光強度の形式である。
【００２４】
アレイについては、例えば単一の多型を検出するため、主に単一の検出ブロックに関して記載されるが、複数の検出ブロックを含むことから複数の特異的な多型の分析が可能でありうる。その他の配列では、一般に、様々な最適な条件が標的のアレイとのハイブリダイゼーションの間に使用可能であるように検出ブロックが単一のアレイ内または複数の別々のアレイ内にグループ分けされうることが理解されるであろう。例えば、ゲノム配列においてＡ−Ｔに富むセグメントに該当する多型とは別にＧ−Ｃに富むストレッチに該当する多型の検出を提供することが望ましい場合が多い。これは各状況に応じたハイブリダイゼーション条件の個別の最適化を可能にする。
【００２５】
多型を検出するためのオリゴヌクレオチドアレイの使用に関するさらなる説明については、例えば米国特許第５，８５８，６５９号明細書および米国特許第５，８３７，８３２号明細書において見出されうる（これらの教示内容全体は参照により本明細書中に援用される）。
【００２６】
核酸分析の他の方法を用い、目的の多型の検出が可能である。代表的な方法は、例えば、ダイレクトマニュアルシーケンシング（ｄｉｒｅｃｔ  ｍａｎｕａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１９９１−１９９５頁；サンガー  Ｆ．（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら、（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７頁；ビービス（Ｂｅａｖｉｓ）ら、米国特許第５，２８８，６４４号明細書）；自動蛍光シーケンシング；一本鎖高次構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；締付（ｃｌａｍｐｅｄ）変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（シェフィールド  Ｖ．Ｃ．（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．）ら、（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２３２−２３６頁）、移動度シフト分析（オリタ  Ｍ．（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．）ら、（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２７６６−２７７０頁；ローゼンバウム（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ）およびライスナー（Ｒｅｉｓｓｎｅｒ）、（１９８７年）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１２７５頁；キーン（Ｋｅｅｎ）ら、（１９９１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、７：５頁；制限酵素分析（フラベル（Ｆｌａｖｅｌｌ）ら、（１９７８年）、Ｃｅｌｌ  １５：２５頁；ギーバー（Ｇｅｅｖｅｒ）ら、（１９８１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：５０８１頁）；ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（コットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら、（１９８５年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４３９７−４４０１頁）；ＲＮアーゼ保護アッセイ（マイヤーズ  Ｒ．Ｍ．（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．）ら、（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２頁）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｕｔＳタンパク質など、ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用（例えば米国特許第５，４５９，０３９号明細書を参照）；Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（商標）技術；および／または対立遺伝子に特異的なＰＣＲを含む。
【００２７】
これらの方法を用い、本明細書中に記載のＲＥＥＰ１遺伝子における目的の１つ以上の突然変異の存在について同定可能である。例えば特定の実施形態では、本方法を用い、個体のＲＥＥＰ１遺伝子における目的の１つ以上の多型の存在について評価することが可能である。
【００２８】
本発明の特定の一実施形態では、上記のように、試験試料でのＲＥＥＰ１遺伝子における突然変異の存在または不在について評価する方法を用い、個体におけるＳＰＧに関連した遺伝子多型の存在または不在についての評価がなされる。ＲＥＥＰ１遺伝子における突然変異の存在、例えば目的の突然変異の少なくとも１つの存在（例えば、ヌクレオチド５６でのＣ→Ｇの単一塩基の転換（５６Ｃ→Ｇ）、ヌクレオチド５９でのＣ→Ａの単一塩基の転位（５９Ｃ→Ａ）、ヌクレオチド１８２−２でのＧ→Ａの転位（１８２−２Ｇ→Ａ）、ヌクレオチド１９３の単一塩基の欠失（１９３ｄｅｌＴ）、ヌクレオチド２２３の単一塩基の欠失（２２３ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５０７の単一塩基の欠失（５０７ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５２６の単一塩基の欠失（５２６ｄｅｌＧ）、６０６＋１４での３’−ＵＴＲにおけるＣ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋１４Ｃ→Ｔ）、６０６＋４３での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋４３Ｇ→Ｔ）、または６０６＋５０での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ａの単一塩基の転位  ５９Ｃ→Ａ（６０６＋５０Ｇ→Ａ））が、ＳＰＧに関連した遺伝子多型の存在を示す。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、上記のように、試験試料でのＲＥＥＰ１遺伝子における突然変異の存在または不在について評価する方法を用い、個体におけるＳＰＧの診断がなされる。これらの方法では、ＲＥＥＰ１遺伝子における突然変異の存在、例えば少なくとも１つの目的の多型の存在（例えば、ヌクレオチド５６でのＣ→Ｇの単一塩基の転換（５６Ｃ→Ｇ）、ヌクレオチド５９でのＣ→Ａの単一塩基の転位（５９Ｃ→Ａ）、ヌクレオチド１８２−２でのＧ→Ａの転位（１８２−２Ｇ→Ａ）、ヌクレオチド１９３の単一塩基の欠失（１９３ｄｅｌＴ）、ヌクレオチド２２３の単一塩基の欠失（２２３ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５０７の単一塩基の欠失（５０７ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５２６の単一塩基の欠失（５２６ｄｅｌＧ）、６０６＋１４での３’−ＵＴＲにおけるＣ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋１４Ｃ→Ｔ）、６０６＋４３での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋４３Ｇ→Ｔ）、または６０６＋５０での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ａの単一塩基の転位  ５９Ｃ→Ａ（６０６＋５０Ｇ→Ａ））がＳＰＧの存在を示す。
【００３０】
本発明は、本発明の方法にて有用なキット（例えば試薬キット）にも関する。かかるキットは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマー（例えば標識プローブまたはプライマー）、標識分子の検出用試薬、制限酵素（例えばＲＦＬＰ分析用）、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド、ＲＥＥＰ１またはＲＥＥＰ１の断片を含む核酸を増幅するための手段、あるいはＲＥＥＰ１の核酸配列を分析するための手段を含む、本明細書中に記載の方法のいずれかにて有用な要素を含む。例えば、一実施形態では、キットは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（商標）技術などのミクロスフィアに基づく技術を用いる目的の突然変異の分析に有用な要素を含む。本発明の好ましい実施形態では、キットは、目的の突然変異の１つ以上（例えば、ヌクレオチド５６でのＣ→Ｇの単一塩基の転換（５６Ｃ→Ｇ）、ヌクレオチド５９でのＣ→Ａの単一塩基の転位（５９Ｃ→Ａ）、ヌクレオチド１８２−２でのＧ→Ａの転位（１８２−２Ｇ→Ａ）、ヌクレオチド１９３の単一塩基の欠失（１９３ｄｅｌＴ）、ヌクレオチド２２３の単一塩基の欠失（２２３ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５０７の単一塩基の欠失（５０７ｄｅｌＣ）、ヌクレオチド５２６の単一塩基の欠失（５２６ｄｅｌＧ）、６０６＋１４での３’−ＵＴＲにおけるＣ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋１４Ｃ→Ｔ）、６０６＋４３での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ｔの単一塩基の転位（６０６＋４３Ｇ→Ｔ）、または６０６＋５０での３’−ＵＴＲにおけるＧ→Ａの単一塩基の転位  ５９Ｃ→Ａ（６０６＋５０Ｇ→Ａ））を検出するための要素を含む。
【００３１】
本発明は、以下の非限定例においてより詳細に説明される。
【００３２】
（実施例）
家族性痙性対麻痺の根底にある遺伝子の同定
連鎖試験
２つの独立した家系（ＤＵＫ２２９９およびＫＵＫ２０３６）に対し、全ゲノム連鎖スクリーニングを行った。二点および多点連鎖分析をＶＩＴＥＳＳＥソフトウェアパッケージ（オコンネル  Ｊ．Ｒ．（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．）およびウィークス  Ｄ．Ｅ．（Ｗｅｅｋｓ，Ｄ．Ｅ．）、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：４０２−４０８頁（１９９５年））を用いて行い、疾患対立遺伝子頻度を０．００１と仮定した。マーカーの対立遺伝子頻度を家系内の罹患していない配偶者から計算した。分析においては、この疾患の不完全浸透度の理由から「罹患者のみ（ａｆｆｅｃｔｅｄｓ−ｏｎｌｙ）」（低浸透度）のモデルを用いた。スパスチンおよびアトラスチン遺伝子が常染色体優性ＳＰＧにおいて最も高頻度に突然変異することから、これら２種の遺伝子における突然変異を配列決定分析により除外した。ＳＰＧ３Ａ、ＳＰＧ５、ＳＰＧ８、ＳＰＧ１０、ＳＰＧ１２、ＳＰＧ１３、およびＳＰＧ１９染色体遺伝子座に対する連鎖をマイクロサテライトマーカーの分析により特異的に除外した。
【００３３】
新規ＳＰＧ遺伝子座を２番染色体ｐ１２上で同定し、２番染色体ｐ１２候補領域に対する二点ＬＯＤスコアの概要を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2009532028.tif 000002
【００３５】
合わせた二点ＬＯＤスコアはマーカーＤ２Ｓ２９５１で４．７であり、追加のマイクロサテライトマーカーを伴う精巧なマッピングでは領域がＤ２Ｓ１３９とＤ２Ｓ２１８１の間の約９Ｍｂに限定された。マーカーＤ２Ｓ２９５１、Ｄ２Ｓ１３９およびＤ２Ｓ２１８１はＮＣＢＩでのＳＴＳデータベースを通じて利用可能である。マーカーＤ２Ｓ２９５１についてはＵｎｉＳＴＳ１６５０７およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｇ１０３１３を参照し、マーカーＤ２Ｓ１３９についてはＵｎｉＳＴＳ１３７８０または５５５３３およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１６７７７を参照し、マーカーＤ２Ｓ２１８１についてはＵｎｉＳＴＳ３３０２１およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５２４１８を参照のこと。この新しい型はＳＰＧ３１として分類されている。
【００３６】
ＳＰＧ３１の根底にある遺伝子のマッピング
突然変異スクリーニングを９種の候補遺伝子（ＣＴＮＮＡ２、ＳＵＣＬＧ１、ＴＧＯＬＮ２、ＭＡＴＡ２Ａ、ＶＡＭＰ８、ＶＡＭＰ５、ＩＭＭＴ、ＶＰＳ２４、およびＲＥＥＰ１）に対して行った。ゲノムＤＮＡを、標準の抽出プロトコルを用い、ＳＰＧ患者および対照者から取得した血液試料全体から単離した。患者においては、ＲＥＥＰ１突然変異スクリーニングを全部で７つのＲＥＥＰ１のコーディングエクソンのイントロンプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって行った。ＰＣＲ産物は５０ｂｐの隣接イントロン配列に及んだ。ＰＣＲ産物の配列決定を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ３．１（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用い、ＡＢＩ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））で行った。ＤＮＡ配列データを収集し、ＡＢＩ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア５．０およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒパッケージ（米国のジーン・コード（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．））を用いて分析した。突然変異が発端者にて検出された場合、疾患を有する観察された配列変化の同時分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）について判定するため、可能であればさらに家系員を分析した。ＲＥＥＰ１コドンの番号付与はＮＣＢＩでの公開されたアミノ酸配列に基づくものであった（例えば、２００４年１１月２６日提出のＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ５６２２３９；２００６年１月２４日更新のＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ９Ｈ９０２を参照）。検出された各突然変異においては、ヨーロッパ家系の３６５の対照試料（７３０の染色体）をスクリーニングした。ＳＰＧ３１患者にて検出されたすべての突然変異がこれらの対照においては存在しなかった。
【００３７】
連鎖家系の双方が遺伝子「受容体発現促進タンパク質１」（ＲＥＥＰ１）において異なるミスセンス突然変異を示した。ＲＥＥＰ１  ｃＤＮＡおよびコードタンパク質が、２００４年１１月２６日提出のＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ５６２２３９において示され、ここでｃＤＮＡは配列表での配列番号１としても示される。ＲＥＥＰ１遺伝子産物は、２つの膜通過ドメイン、（ポリポーシスにおいて欠失された）ＴＢ２／ＤＰ１ドメイン（ＴＢ２−ＤＰ１＿ＨＶＡ２２）、およびＮＣＢＩでの保存されたドメインデータベースから取得されるものとして予測される細胞外Ｃ末端を有する。ＮＣＢＩでの保存されたドメインデータベースにおけるｐｆａｍ０３１３４を参照のこと。
【００３８】
家系ＤＵＫ２２９９は単一のヌクレオチド欠失の５０７ｄｅｌＣ、Ｇｌｙ１６９ｆｓを有し、それはフレームシフトをもたらし、伸張されたタンパク質を生成した。ＫＵＫ２０３６では、エクソン４の高度に保存されたアクセプタ（３’）のスプライスを破壊するように予測されたスプライス部位の突然変異１８２−２Ｇ→Ａが同定された。両方の突然変異がこれら家系における疾患の表現型で同時分離され、３６６名の健常対照（７３２の染色体）において存在しなかった。罹患したアミノ酸残基は異なる種全体で高度に保存され、それらの機能的有意性が強調されている（保存領域を同定するため、異なる種に由来する配列をＥｎｔｒｅｚタンパク質データベースから誘導し、手作業で整列を行った（データは示さず））。
【００３９】
ＳＰＧ３１の頻度
ＳＰＧ３１の根底にあるこの遺伝子の同定により、独立のＳＰＧ発端者における突然変異のスクリーニングが可能になった。小家系からの隔離された症例または発端者のいずれかで、９４のＳＰＧ症例での試料をＲＥＥＰ１での突然変異についてスクリーニングした。これらの個体は任意のスパスチンおよびアトラスチンＳＰＧ遺伝子における突然変異についてスクリーニングされたことはなかった。フレームシフト突然変異；ミスセンス突然変異；およびＲＥＥＰ１の５’−ＵＴＲにおける３つの単一のヌクレオチド変化を含む他のさらなる突然変異を同定した。３６６名の健常対照（７３２の染色体）または４９２名の対照のいずれにおいてもあらゆる突然変異が存在したわけではなかった。１つのフレームシフト突然変異の４２６ｄｅｌＧ、Ｇｌｙ１８１ｆｓがエクソン６において生じ、上記の家系ＤＵＫ２２９９にて観察された場合と同じフレームシフトをもたらした。ミスセンス突然変異の５９Ｃ→Ａ、Ａｌａ２０ＧｌｕがＲＥＥＰ１の保存されたＴＢ２＿ＤＰ１＿ＨＶＡ２２ドメイン内で生じた。ＲＥＥＰ１の５’−ＵＴＲにおける突然変異のような突然変異には常染色体優性疾患の原因となる性質があることが認められている（イシカワ  Ｋ．（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７７：２８０−２９６頁（２００５年））。ＲＥＥＰ１における検出された突然変異の要約を表２に示す。
【００４０】
【表２】
2009532028.tif 000003
【００４１】
要約
実験の結果は、ＵＴＲ突然変異を含み、９６分の６（６．２％）の頻度を示した。ＵＴＲ突然変異を含まない場合、頻度は９６分の４（４．２％）であった。いずれにしても、新規のＳＰＧ遺伝子ＲＥＥＰ１は３番目に知られたＳＰＧ遺伝子を表し、それより優位なものはスパスチン（約４０％）およびアトラスチン（約１０％）のみであった。
【００４２】
本発明がその好ましい実施形態との関連として特に示され記載されている一方、形式および詳細における様々な変更が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくそれらに加えられる場合があることが当業者により理解されるであろう。
【配列表】
2009532028000001.app
【国際調査報告】
2009532028.tif 000004
2009532028.tif 000005