(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチド組成物およびタンパク質間相互作用を修飾するためのその治療的使用に関する。具体的には、本発明は、例えばハンチントン病（ＨＤ）タンパク質凝集体といった、疾患を引き起こすタンパク質凝集体を崩壊させるグアニジンを豊富に含むオリゴヌクレオチドの使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５から５０のヌクレオチドを有するアプタマーオリゴヌクレオチドを含んでいる単離ポリヌクレオチド組成物であって、該ヌクレオチドの少なくとも４０％がグアノシン残基であり、そして該オリゴヌクレオチドはタンパク凝集を抑制することができる、単離ポリヌクレオチド組成物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが安定したＧカルテット構造を形成することができる、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが１６から３０のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが少なくとも７５％のグアノシンヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、または７のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが、１つ以上の転写調節核酸配列に操作可能に結合されるか、または核酸ベクターまたはプラスミド、あるいはその組み合わせの中に配置される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが、宿主細胞中にさらに含まれている、請求項６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体、賦形剤、アジュバント、陽イオン、脂質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化合物、薬剤、生理活性物質、またはその組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
ポリペプチドが抗体である、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ヌクレオチドの少なくとも４０％がグアノシンヌクレオチドである１５から５０のヌクレオチドを有するアプタマーオリゴヌクレオチド、および少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体、賦形剤、アジュバント、陽イオン、脂質、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化合物、薬剤、生理活性物質またはその組み合わせを含む、治療用ポリヌクレオチド組成物。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが安定なＧカルテット構造を形成することができる、請求項１０に記載の治療用ポリヌクレオチド組成物。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが少なくとも７５％のグアノシンヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の治療用ポリヌクレオチド組成物。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、または７のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の治療用ポリヌクレオチド組成物。
【請求項１４】
タンパク質凝集体形成を抑制または軽減する方法であって、
少なくとも４０％のヌクレオチドがグアノシンヌクレオチドである１５から５０のヌクレオチドを有するアプタマーオリゴヌクレオチドを提供すること：
タンパク質またはタンパク質凝集体を形成する凝集体を提供すること；および
該タンパク質またはタンパク質凝集体を、タンパク質凝集を抑制または軽減する程度に十分な有効量の該オリゴヌクレオチドに接触させること、
を含む方法。
【請求項１５】
タンパク質の凝集に関連する個体における症状を治療または予防するための方法であって、ヌクレオチドの少なくとも４０％がグアノシンヌクレオチドである１５から５０のヌクレオチドを有するアプタマーオリゴヌクレオチドを提供する過程；および有効量の該オリゴヌクレオチドを、それを必要とする個体に投与する過程、を含む方法。
【請求項１６】
症状が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、プリオン病およびポリグルタミン病から成る群より選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが１８から２４のヌクレオチドを含んでおり、該ヌクレオチドの少なくとも９５％がグアノシンヌクレオチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドはＧカルテット構造を形成し、ハンチンチンタンパク質（Ｈｔｔ）の凝集を抑制することができる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許の相互参照
【０００２】
本出願書は、３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）の下で、その開示内容はその全体を参照することにより本願に組み込まれる、「ハンチントン病の治療のための新規治療としてのＧに富むポリヌクレオチド」と題された、２００５年１０月６日に出願された米国仮出願第６０／７２４，０８５号の利益を要求するものである。
【０００３】
配列リストを参照することによる組み込み
本出願は、その全体において参照することにより、これとともに出願される配列リスト、および配列リストの同一ＣＲＦを組み込む。ＣＲＦは、２００６年１０月４日作成、ＯＳ：ＭＳ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰ、ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ３．３、サイズ：６ＫＢ、ファイル「ＧＲＯ＿Ｋｍｉｅｃ．ｔｘｔ」内の配列番号１〜７の核酸配列を含む。本出願書において、本願書類とともに提出される配列表に含まれる情報は、コンピュータ可読形式で含まれる配列情報と同一である。
【０００４】
本発明は、オリゴヌクレオチド組成物およびタンパク質間相互作用を修飾するためのその使用の方法に関する。具体的には、本発明は、例えばハンチントン病（ＨＤ）タンパク質凝集体といった、疾患を引き起こすタンパク質凝集体を崩壊させるグアニジンを豊富に含むオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ＨＤタンパク質の、エクソン１内のＮ末端における、ＣＡＧ反復（ポリグルタミン−ポリＱ）の伸長によって引き起こされる、遺伝性常染色体性優性遺伝病である。ＨＤは、神経組織の変成を特徴とし、初めは変異ＨＤタンパク質のミスフォールドから発生するタンパク質凝集の進行によるものと思われる。近年の研究は、変異Ｈｔｔがタンパク質凝集を核とし、多数の正常な細胞機能を妨害する可能性があることを示唆している。
【０００６】
ポリグルタミン伸長の程度は症状の重症度およびその発現と相関する一方で、疾患の病理学および神経細胞死は、タンパク質のミスフォールドおよびタンパク質凝集と関連していると考えられる。このような凝集体は通常、細胞核内で見られるが、細胞質内でも見られる可能性がある。タンパク質凝集体は、過程中に目に見えている中間体を伴う複雑な生化学過程を介して発現する。病原性範囲内のポリＱ鎖はタンパク質不溶性を誘発するが、病因とならない長さのＨｔｔは測定される程度の溶解性を維持する。
【０００７】
凝集体毒性の仮説と一致して、凝集体形成の抑制は、Ｒ６／２マウスモデルにおけるＨＤの進行に対して有益な効果があることが示されている。細胞毒性においてポリＱ凝集体がかかわっていることを見ると、それが新規治療法の標的となることを正当化する。ポリＱ凝集体の分子構造の周囲の詳細の不足にもかかわらず、それらの形成を抑制する化合物に対する高生産性スクリーニングは、一部有望な結果をもたらしている。コンゴレッドおよびクリオキノールを含む複数の化合物は、Ｒ６／２マウスにおいて凝集過程を抑制することが報告されているが、それらの神経毒性のため、それに対する熱意がそがれている。よって、最小限の毒性にて有効性を示す分子を同定するステップは、ＨＤ治療法の探索において検討すべき重要なこととなるべきである。
【０００８】
合成ＯＤＮ（ＯＤＮ）は、このような要件の一部を満たす試薬のモデル部類を提供する。ＯＤＮは、費用効率の高い方法により高純度量で生成される合成高分子であり、ＯＤＮ合成を取りまく技術は、この１０年間で劇的に進歩している。近年、Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４；２４（２）：２５７−６７）は、特定分類のＯＤＮが凝集を抑制することが可能であると示した。このような群のうちの１つは、以前にタンパク質機能を阻害するアプタマーとして使用されてきたＧに富むＯＤＮ（ＧＲＯ）である。具体的には、ＧＲＯはＳＴＡＴ３に直接結合し、二量化を可能にするタンパク質の領域と相互作用することが示されており、別の例では、ＧＲＯは、ＨＩＶインテグラーゼと相互作用することによって、宿主染色体へのＨＩＶの一体化を阻害することが示されている。いずれの場合においても、ＧＲＯは、環状立体構造に組み立てられる、４つの隣接するＧ塩基の関連から発生するＧカルテットとして知られる構造を形成する。これらの構造は、ｖｏｎ  Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ水素結合、および塩基のスタッキング相互作用によって、安定される。これらの分子は、それらが機能的に重要なタンパク質ドメインと生産的に相互作用できるようにする、とてもコンパクトな構造を呈する。
【０００９】
凝集体形成を阻害する治療法の開発への重点の大部分は、細胞封入体が存在するＨＤ病原性を関連付ける大量のデータに由来する。しかし、インビトロおよびインビボ研究からの最近の証拠は、Ｈｔｔ封入体は細胞に対して毒性がなかったり、または神経変性を引き起こしたりしない場合があることを示唆している。実際に、Ｈａｙｄｅｎらは、挙動または生存能力に対してＨｔｔ封入体の長期的影響を示さない興奮性マウスモデルを作成している。封入体は神経保護的であり、それを排除することによって実際に神経毒性の可能性を増加できるということは事実かもしれない。
【００１０】
ハンチントン病は、その溶解性を変更し、凝集を誘発するハンチンチン（Ｈｔｔ）タンパク質内のポリ（Ｑ）鎖の長さの増加によって引き起こされる。凝集は、核生成および伸長という２つの一般段階において発生し、どちらかの段階を阻害するように作られている薬剤が、潜在的な治療と考えられている。
【００１１】
Ｈｔｔの細胞内凝集体は、長い間、神経変性障害であるハンチントン病の表現型の証拠と考えられてきた。しかし、そのような封入体の出現がどのように疾患の病原性に関連するのかは明らかでない。多くのモデルシステムが、凝集を抑制することが可能な治療薬をふるいに掛けるように設計されている。これらの検定の一部は、融合タンパク質凝集の抑制、Ｈｔｔの断片を含むタンパク質（ここではＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎ）、およびしばしばｅＧＦＰである、マーカー／レポータータンパク質を測定する。この融合タンパク質のＨｔｔ成分は、拡張ポリＱ伸長を担持する。
【００１２】
そのため、ＨＤに対する治療法を見出す取り組みは、変異Ｈｔｔ凝集鎖を崩壊または阻害する薬剤に焦点を当ててきた。
【００１３】
Ｇに富むＤＮＡおよびＲＮＡは、Ｇカルテットとして知られる分子間および分子内四重鎖構造を形成することが、当技術分野では周知である。各Ｇ塩基がその隣接Ｇ塩基とともに２つのＨ結合を作る、環状Ｈｏｏｇｓｔｅｎ  Ｈ結合配置に４つのＧ塩基が関連付けられると、Ｇカルテットが形成される。最終的に、Ｇカルテットは互いの上に積み重なり、四分子らせん構造を生じさせる。このようなＧカルテットの安定性は、Ｋ＋およびＮａ＋などの一価の陽イオンの存在、存在するＧに富むＯＤＮの濃度、および使用されているＧに富むＯＤＮの配列を含む、複数の因子に関連している。
【００１４】
多くのＧに富むＯＤＮ（ＧＲＯ）は、有意な細胞シグナル伝達因子を表している。同定されたＧＲＯは、いくつかの細胞機能および種々の疾患に関わっている。特に、特定ＧＲＯが癌細胞株に加えられると、有効な抗増殖作用を示す（Ｂａｔｅｓら， Ｇに富むＯＤＮの抗増殖作用はタンパク質と相関関係がある（Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｇ−ｒｉｃｈ  ＯＤＮｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２６３６９−２６３７７（１９９９）；Ｘｕら， Ｇに富むＯＤＮによるDNA複製の抑制および合成期の細胞周期の停止（ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ  ｐｈａｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ｂｙ  Ｇ−ｒｉｃｈ  ＯＤＮｓ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６、４３３２１−４３２３０（２００１）；Ｄａｐｉｃら，Ｇカルテットを生成する骨格および糖の修飾を伴うＯＤＮの 抗増殖作用（Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ＯＤＮｓ  ｗｉｔｈ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｓｕｇａｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１、３６７６−３６８５（２００２））。具体的には、ＧＲＯによる腫瘍細胞の治療は、ＤＮＡ複製を直接妨害することによって、細胞周期の進行を抑制し、それに対して、正常皮膚細胞は同じＧＲＯで治療されると細胞周期に最小崩壊を呈するのにとどまったことが報告されている（Ｘｕら）。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、特定のオリゴヌクレオチドは、疾患の病理学と関連しているタンパク質凝集体を崩壊することができるという、驚くべき予期しない発見に基づく。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、そのような疾患の治療および予防における治療薬として使用することが可能であり、疾患およびその基礎となる生理学的起源の研究にも役立つことが可能である。特に、本発明は、グアノシンを豊富に含むオリゴヌクレオチド組成物、およびタンパク質凝集体およびそれらの有害な影響を抑制に関連する使用方法に関する。
【００１６】
例えば、塩析、および等電沈殿といった、自然状態でタンパク質の凝集を引き起こす因子が知られているが、タンパク質凝集の症例の大部分は、タンパク質の部分的に折り畳まれた、または「折り畳まれていない」中間状態の分子間の会合に関する。根本的な理由はおそらく、部分的におり込まれた中間体が 疎水性パッチを有することであり、その疎水性パッチは、通常はぎっしりと詰まって自然状態となるが、また分子間で相互作用して凝集体を形成し得るということであろう。タンパク質凝集が原因となるか、または随伴した症状であり、かつ本発明が治療および／または予防に有用である疾患には、ダウン症候群、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびウシ海綿状脳炎（ＢＳＥ）およびクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などのプリオン病、嚢胞性線維症、および例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）および数種の脊髄小脳失調（ＳＣＡ）といった、いわゆるポリグルタミン病（表１）が含まれ、神経変性の領域に対応する領域内の細胞内封入体も有する。
【００１７】
表１  ポリグルタミン病の概要
【表１】
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【００１８】
特定の態様では、本発明は、約１５から約５０のヌクレオチドを含有し、かつ少なくとも４０％のグアノシンヌクレオチドを有する、単離オリゴヌクレオチド組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号１〜７のオリゴヌクレオチドを含む。これらのグアノシンを豊富に含むオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）は、例えば、ＧＲＯが平行または逆平行構造で整列するＧカルテット構造といった、高次凝集体を形成することが示されている。（その全体を参照することにより本願に組み込まれる、Ｂｉｙａｎｉ  ａｎｄ  Ｎｉｓｉｇａｋｉ，Ｇｅｎｅ  ３６４：１３０−３８（２００５）を参照）。いかなる特定の理論にも限定されないが、発明者は、本発明のＧＲＯの高次構造がその有効性の仲立ちをする、つまり、例えば疾患に関連したポリグルタミンタンパク質といったタンパク質の凝集を抑制すると仮定している。しかし、本発明のＧＲＯは、上記に示すように、その他の疾患に関連したタンパク質の凝集を抑制するために広く使用することもできる。従って、別の側面では、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｇカルテット構造を含む。好ましい実施形態では、本発明の単離オリゴヌクレオチドは、１８〜２４のヌクレオチドから成り、少なくとも９５％のグアノシンヌクレオチドを有する。
【００１９】
他の態様では、本発明の単離ＧＲＯは、その簡便なクローン作成、増幅、および／または転写のためのベクターまたはプラスミド核酸内に配置される。さらに他の態様では、本発明の単離ＧＲＯは、１つ以上の転写調節核酸配列に操作可能に結合される。さらに別の側面では、単離ＧＲＯは、ベクターまたはプラスミド核酸内に配置され、１つ以上の転写調節核酸配列に操作可能に連結される。
【００２０】
その他の態様では、本発明は、本発明の単離ＧＲＯを含む宿主細胞に関する。特定の実施形態では、宿主細胞は、本発明のＧＲＯ配列に操作可能に連結する１つ以上の転写調節核酸配列を含む、ベクターまたはプラスミド核酸をさらに含む。ベクターまたはプラスミド核酸は、例えば、真核または原核クローン作成、増幅、または転写に適切となり得る。ベクターまたはプラスミド核酸はまた、宿主細胞のゲノムに安定的に取り込まれるか、またはエピソームに保持されることも可能である。
【００２１】
別の側面では、本発明は、タンパク質の凝集を抑制および／または軽減するための方法に関する。他の態様では、本発明は、ハンチントン病、または脊髄小脳失調を引き起こすものなどの、ポリグルタミンタンパク質の凝集を抑制または軽減するための方法に関する。これらの側面のいかなる実施形態においても、本発明は、タンパク質凝集体を形成することができるタンパク質、またはタンパク質凝集体を、有効量の本発明のＧＲＯに接触させることを含み、結果としてタンパク質凝集体形成の抑制、タンパク質凝集の軽減、および／またはタンパク質凝集体からの成分の解離をもたらす。
【００２２】
他の態様では、本発明は、タンパク質凝集の有害な影響に関連する個人における疾患または症状を治療および／または予防するための方法に関する。特定の実施形態では、本発明の方法は、医薬的に許容し得る形で、有効量の単離ＧＲＯを、それを必要とする個人に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本発明の単離ＧＲＯは、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、アジュバント、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化合物、薬剤、生理活性物質、またはその組み合わせと一緒に投与される。そのため、別の側面では、本発明は、少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体、賦形剤、アジュバント、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化合物、薬剤、生理活性物質、またはその組み合わせと一緒に、医薬的に許容し得る形で本発明の単離ＧＲＯを含む、治療用組成物に関する。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の治療用ＧＲＯは、１つ以上の化学成分に複合、結合、または連結され、例えば、バイオアベイラビリティ、半減期、有効性、および／または標的を改善および／または修飾する。この実施形態の特定の態様では、ＧＲＯは、例えば、カチオン性分子、塩またはイオン、脂質、グリセリド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、例えばフェノール化合物といったその他の化合物、およびその組み合わせとともに、共有結合的または非共有結合に、複合または結合することができる。特定の態様では、本発明は、例えば抗体といった、ポリペプチドに連結した本発明のＧＲＯに関する。特定の実施形態では、抗体は、目的とする目的のタンパク質またはタンパク質凝集体に特異的であるため、ＧＲＯをタンパク質および／またはタンパク質凝集体に対して標的にする。
【００２４】
本発明の治療用ＧＲＯは、例えば、腸内、静脈内、動脈内、非経口、局所、経皮、経鼻など、当業者によって認識される任意の適切な投与法によって投与することが可能である。また、治療薬は、当業者にとって現在周知である、または周知となる、例えば、液体、凍結乾燥粉末、ゲル、錠剤、放出制御カプセルなど、任意の医薬的に許容し得る形とすることができる。
【００２５】
本発明の組成物、方法、および過程と関連する付加的な有利な特徴および機能性は、本願で提示される図面、ならびに下記の詳細な説明より明白となるであろう。本発明の背景を解明するため、さらに、ある場合には、特に実践について追加詳細を提供するために本願で使用される出版物およびその他の資料は、参照することにより組み込まれ、便宜上、添付の参考文献に一覧化されている。
【００２６】
図面の簡単な説明
図１は、Ｗａｎｇら（２００５）より得られた生化学モデルスクリーニング検定の図であり、生化学／免疫ブロット分析に関与するステップを図示している。融合タンパク質ＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎ（２０μｇ／ｍｌ）は、トロンビン（０．５単位／μｇタンパク質）と３０分間混合し、混合物は遠心分離して凝集タンパク質を除去した。可溶性タンパク質は、９６ウェルプレート内でＯＤＮと混合し、室温（ＲＴ）で２４時間インキュベートした。ＳＤＳは、２％の最終濃度になるように加え、混合物は９９℃で５時間加熱した。０．２２ミクロンのアセテートセルロース膜フィルタを通したろ過の後に、抗体（ＨＰ１）およびＥＣＬによる免疫ブロット法で、凝集Ｑ５８−Ｈｔｎ断片の検出が続いた。定量は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔプログラムを使用して行った。ブロットは、陽性および陰性両方の結果を示し、黒い点が欠けている場所は、凝集がＯＤＮによって抑制されたことを示す。
【００２７】
図２（Ａ）は、Ｇカルテット構造（配列番号：１および２）を形成する２つのＧに富むＯＤＮのＤＮＡ配列である。（Ｂ）は、凝集に対するＴ４０２１６（配列番号：２）およびＴ３０９２３（配列番号：１）の活性のドットブロット分析である。ゼロ（０）時間対照はタンパク質の添加直後に停止した反応、２４時間反応はＯＤＮがない状態で実施され、２４時間のインキュベーション後に停止した反応、コンゴレッドはコンゴレッド（１０μＭ）の添加後２４時間の凝集のレベルを表す。
【００２８】
図３は、ＧＲＯによる凝集抑制を描く棒グラフである。ここでは、Ｔ４０２１６（配列番号：２）およびＴ３０９２３（配列番号：１）およびコンゴレッドを使用する。データは、（Ｂ）で示されるように５つの独立した反応から表され、各点について標準偏差と共に表わされる。＊は、テューキーの事後試験による一元配置のＡＮＯＶＡによって決定された、コンゴレッド（対照）と比較しての有意性がｐ＜０．０５であることを意味する。
【００２９】
図４は、変異Ｈｔｔ断片の凝集に対する、ＨＤＧ２０（配列番号：３）活性のドットブロット分析である。２０塩基単調グアノシンＯＤＮである、ＨＤＧ２０は、指示された濃度において、図１（凡例参照）で概説される検定において試験した。反応は２４時間にわたって繰り返し４回実施され、４つの独立した実験からの代表的なブロットを示す。０時間はゼロの時間で停止した反応混合物を表わし、２４時間はＯＤＮが欠けている対照反応を表わす。（差し込み図）ＨＤＧ２０（２０μＭまたは４０μＭ）を含むフィルタ結合反応からの非結合画分は、図１に対する凡例で説明されるように、ドットブロット紙におき、乾燥して処理した。
【００３０】
図５は、変異Ｈｔｔ断片凝集の抑制における、様々な単調２０−ｍｅｒ  ＯＤＮの特異性のドットブロット分析である。様々な単調２０−ｍｅｒは、図１で概説される検定において阻害活性を試験した。ＨＤＣはあらゆるＣを伴う２０−ｍｅｒ（配列番号：８）を表わし、ＨＤＡはあらゆるＡを伴う２０−ｍｅｒ（配列番号：９）を表わし、ＨＤＴ（配列番号：１０）はあらゆるＴを伴う２０−ｍｅｒを表わし、ＨＤＧ、あらゆるＧを伴う２０−ｍｅｒ（配列番号：３）を表わす。４つの独立した実験を繰り返し実施し、このブロットは、全ての結果のうちもっとも代表的なものである。０時間はゼロ時点で停止した反応を表わし、２４時間は２４時間後に停止したＯＤＮが欠けている反応を表わし、コンゴレッドは１０μＭのコンゴレッドによる２４時間のインキュベーションを表わす。
【００３１】
図６は、単調２０−ｍｅｒを試験するために実施されたブロットを描く棒グラフである。平均凝集レベルは５つの独立した実験を標準偏差および平均値（系列１）で示している。＊は、テューキーの事後試験による一元配置のＡＮＯＶＡによって決定された、コンゴレッド（対照）と比較して有意性がｐ＜０．０５であることを意味する。
【００３２】
図７は、ＨＤＡ（配列番号：９）およびＨＤＧ（配列番号：３）のＣＤ分光分析結果である。２４℃での１０ｍＭのＫＣｌ中の、１５μＭのＨＤＧ（太い実線）、１５μＭのＴ３０９２３（配列番号：１）（細い実線）、および１５μＭのＨＤＧ（点線）のＣＤスペクトルである。
【００３３】
図８は、ｐｃＤＮＡ３．１−７２Ｈｔｔｅｘｏｎ１−ｅＧＦＰ（ｐ７２Ｑ）というプラスミドで導入されたＨＥＫ２９３細胞における凝集の抑制を示す、明暗視野顕微鏡画像を提供する。白色光下または暗視野内で撮影されたＨＥＫ２９３、ｐ７２Ｑによって生成された凝集体形成、およびｐ７２Ｑと同時に加えられたコンゴレッド（０．２μＭまたは１μＭ）による凝集の抑制を含む、一連の対照反応である。
【００３４】
図９は、指示された濃度においてｐ７２Ｑで同時遺伝子導入されたＨＤＡ（遺伝子ＩＤ番号：９）を示す暗視野顕微鏡画像を提供し、細胞は暗視野内で４８時間後に撮影された。
【００３５】
図１０は、指示された濃度においてｐ７２Ｑで同時遺伝子導入されたＨＤＧ（遺伝子ＩＤ番号：３）を示す暗視野顕微鏡画像を提供し、細胞は暗視野内で４８時間後に撮影された。
【００３６】
図１１は、ｐ７２Ｑで同時遺伝子導入されたＨＤＧ（遺伝子ＩＤ番号：３）を示す暗視野顕微鏡画像を提供し、細胞は暗視野下で４８時間後に撮影された。左上パネルは、ＯＤＮがない反応を表す。
【００３７】
図１２は、図１で概説される検定において阻害活性を試験したチミン修飾を有する様々な２０−ｍｅｒのドットブロット分析である。ＨＤＴ（遺伝子ＩＤ番号：１０）はあらゆるＴを伴う２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ（遺伝子ＩＤ番号：３）はあらゆるＧを伴う２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／７（遺伝子ＩＤ番号：７）は７番目ごとのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／４（遺伝子ＩＤ番号：６）は４番目ごとのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／３（遺伝子ＩＤ番号：５）は３番目ごとのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／２（遺伝子ＩＤ番号：２）は１つおきのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒである。０時間はゼロ時点で停止した反応、２４時間はＯＤＮが欠けている反応および２４時間で停止した反応、コンゴレッドはコンゴレッド（１０μＭ）による２４時間のインキュベーションである。
【００３８】
図１３は、様々なＯＤＮによる変異Ｈｔｔ断片凝集の抑制のＦＡＣＳ測定分析である。ＨＥＫ２９３細胞は、指示された濃度でｐｃＤＮＡ３．１−７２Ｈｔｔｅｘｏｎ１−ｅＧＦＰ（ｐ７２Ｑ）および特定のＯＤＮ（ＨＤＡ（配列番号：９）、ＨＤＧ（配列番号：３））によって遺伝子導入され、凝集の程度が４８時間後にＦＡＣＳによって測定された。（Ａ）はプラスミドなし（ｐ７２Ｑ）、（Ｂ）はｐ７２ＱのみでＯＤＮなし、（Ｃ）はｐ７２Ｑおよび１μＭのＨＤＡ、（Ｄ）はｐ７２Ｑおよび２．５μＭのＨＤＡ、（Ｅ）はｐ７２Ｑおよび１μＭのＨＤＧ、（Ｆ）はｐ７２Ｑおよび２．５μＭのＨＤＧである。全てのＯＤＮは、細胞培養反応における最終濃度である。緑色蛍光の規模はＸ軸上で測定する一方で、その程度の蛍光を示す細胞の数は、Ｙ軸上に表される。
【００３９】
図１４は、様々な濃度のＨＤＧ（配列番号：３）により遺伝子導入されたＰＣ１２細胞の生存能力を示す線グラフである。ＰＣ１２細胞株であるＨｔｔ１４Ａ２．６は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００中で様々な量のＨＤＧで遺伝子導入した。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存能力検定を使用して、時間の関数としての各治療の生存能力を分析した。１つの対照は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を含むがＯＤＮがない偽導入細胞であるが、ここで提示される無治療対照は、ＯＤＮまたはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのどちらも受け取っていない細胞を示す。統計は、各時点における全サンプルについての２７の発光読み取りに対する標準偏差を使用して行った。
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、特定のオリゴヌクレオチドがタンパク質凝集を抑制することができるという驚くべき予期しない発見に基づく。本発明は、研究および治療目的に有用なオリゴヌクレオチド組成物を含む。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボヌクレオチド、およびリボ核酸、およびその多量体型を概して参照し、かつそれと代替でき、一本鎖または二本鎖型を含む。また、明確に限定されない限り、「ヌクレオチド」という用語は、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）といった参照核酸として、同様の結合特性を有する既知の天然ヌクレオチド類似体を含む。また、特定のヌクレオチドまたは核酸配列は、相補配列、および明確に指示される配列を含む。核酸という用語は、「遺伝子」、「ＤＮＡ」、「ｃＤＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」、「ＲＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「ヌクレオチド」などの用語に対しての総称である。４つのヌクレオチド塩基は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびアデニンである。ヌクレオチドは、ペントース糖、プリンまたはピリミジン塩基、およびリン酸基（つまり、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、およびチミジン）から成る。
【００４２】
本願で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一連の連鎖ヌクレオチド残基を参照する。短いヌクレオチド配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づくか、またはそれから作られていてもよく、特定の細胞または組織中の、同一、類似、または相補ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確定、または明確にするために使用される。オリゴヌクレオチドは、長さが約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さが約１５ｎｔから３０ｎｔである核酸配列を含む。本発明の特定の実施形態では、長さが１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１２の少なくとも６つの隣接ヌクレオチドをさらに含む。
【００４３】
本願で使用されるように、「ＧＲＯ」、「アプタマーＧＲＯ」、および「Ｇに富むオリゴヌクレオチド」という用語は、代替可能に使用される。アプタマーオリゴヌクレオチド分子は、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織、および有機体などの特定標的分子を結合する。アプタマーは、抗体と同様の分子認識特性を提供するため、生物工学的および治療的応用に対する有用性を提供する。その特徴的な認識に加えて、アプタマーは、試験管内で完全に設計することが可能で、化学合成によって容易に生成され、望ましい貯蔵特性を持ち、かつ治療的応用において免疫原性をほとんど発現させないか、または全く発現させないので、抗体を越える利点を提供する。
【００４４】
オリゴヌクレオチドは化学的に合成することができ、プローブとして使用することもできる。任意の所望な配列のオリゴヌクレオチドを合成するために、核酸合成装置が利用可能である。特定のオリゴヌクレオチド類似体はまた、反応物質および反応条件を修飾することによって、容易に合成することもできる。例えば、チオリン酸およびメチルホスホン酸オリゴヌクレオチドは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成することができる。
【００４５】
相補核酸に対するオリゴヌクレオチドの結合親和力は、ハイブリッド複合体の融解温度（ＴＭ）を決定することによって評価することができる。ＴＭは、ハイブリッド複合体の核酸鎖を分離するために必要とされる温度の測定値である。ＴＭは、ハイブリダイゼーションの程度および強度を評価するためにハイブリッド複合体のＵＶスペクトルを使用することによって、測定することができる。ハイブリダイゼーション中、核酸のＵＶ吸収を軽減する塩基の積み重ねが発生する。ＵＶ吸収、および鎖分離中に発生するＵＶ吸収の結果として生じる増加を監視することによって、相補体に対する核酸のハイブリダイゼーション親和性を評価することができる。
【００４６】
ハイブリッド複合物の構造および安定性は、当業者に周知のＮＭＲ手法を使用して、さらに評価することができる。
【００４７】
自然に発生するオリゴヌクレオチドと同じ機能性を達成する、多種多様のヌクレオチド類似体が存在する。オリゴヌクレオチド類似体を生成するために使用することが可能である、ほぼ無限の種々の修飾を説明する幅広い文献がある。リン酸塩、糖、および／または塩基部分は、化学基および／または結合の導入／除去によって、変更および／または置換することができる。多くのオリゴヌクレオチド類似体には、自然に発生するオリゴヌクレオチドよりも優れた特性がある。そのような優れた特性は、ハイブリッド親和性および／または分解への耐性の増加を含むが、それに限定されない。
【００４８】
「核酸鋳型」、または「親核酸」は、後のステップまたは過程に対する鋳型の役割を果たした核酸を指す。よって、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、前記ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、前記増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、全て遺伝子から派生し、そのような派生産物の検出は、サンプル内の元の遺伝子および／または遺伝子転写物が存在する、および／または豊富であることを示す。
【００４９】
「遺伝子」という用語は、所与のＲＮＡまたはタンパク質の発現と関連する核酸の任意の断片を広範囲に指す。よって、遺伝子は、発現したＲＮＡ（典型的にポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域、およびしばしば、その発現に必要とされる調節塩基配列を含む。遺伝子は、関心源からのクローン作成、あるいは既知または予測配列からの合成を含む様々な起源から得ることが可能であり、特別に設計されたパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。
【００５０】
「組み換え」核酸は、インビトロまたは人工（自然発生ではないことを意味する）過程によって、または２つ以上の核酸の組み換えによって生成される任意の核酸である。本願で参照される組み換え核酸は、当業者であれば認識するであろうが、本発明の範囲を制限することを目的とせず、任意のグアノシンを豊富に含むオリゴヌクレオチドの使用を検討する。核酸修飾は、部位特異的突然変異、シャッフリング、エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、サブクローニング、メチル化、アセチル化、化学修飾、および関連手法によって得られるものを含む。
【００５１】
突然変異生成、ＰＣＲ、クローン作成などを含む、本発明の実践に有用な分子生物学的手法の説明は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、酵素学における分子クローン技術および手法のガイド（ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ），  １５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，分子クローニング−実験室の手引き（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＯＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）（第二版），１−３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９および、分子生物学における現在の手順（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ），Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ  ＡｕｓｕｂｅｌおよびＭｕｌｌｉｓら，米国特許番号４，６８３，２０２（１９８７）；ＰＣＲ手順、手法と応用の手引き（ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）（Ｉｎｎｉｓら編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６‐４７；Ｓａｋａｍｏｔｏら，基質として４−ピコリンを受け入れるトルエンジオキシゲナーゼの実験室での進化（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｔｏ  ａｃｃｅｐｔ  ４−ｐｉｃｏｌｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：３８８２−３８８７（２００１）；Ｌｕｅｎｇら，修飾ポリメラーゼを用いた定義されたＤＮＡ断片の無作為変異生成の方法（Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：Ｊ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  １（１）：１１−１５（１９８９）。
【００５２】
「宿主細胞」は、外因性核酸、異種核酸を運ぶために使用される場合がある、または異種核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現する細胞を含む。宿主細胞は、天然（非組み換え）型の細胞中にない遺伝子、人工的手段によって遺伝子が組み換えられて細胞内に再導入される天然型の細胞中にある遺伝子、または細胞から核酸を除去せずに人工的に修飾された細胞に対して内因性である核酸を含む細胞、を含み得る。
【００５３】
「類似の程度」または「同一性」という用語は、２つ以上の核酸配列との関連において、ＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、または当業者に利用可能なその他のアルゴリズムなどの配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定されるような、最大対応について比較および整列された場合、同一または同種であり、かつ同一の特定割合の核酸を有する、２つ以上の配列または部分配列を参照する。配列比較または相同性判定に対して、典型的に１つの配列は、試験配列が比較される参照配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、部分配列座標が指定され、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。そして配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対して試験配列の配列同一性パーセントを計算する。相同性のその他の判定は、厳しい条件下での核酸のハイブリダイぜーションを含む。「ハイブリダイズする」という語句は、配列が複合混合物（例えば総細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合を含む、厳しい条件下での特定の核酸配列のみに対して、分子の結合、二本鎖化またはハイブリダイゼーションを参照する。
【００５４】
核酸「オペロン」は、機能的な関係にある、つまり、例えばプロモーター、エンハンサー、終結シグナル、またはコード配列の転写を増進させるなら別の遺伝子といった、その他の核酸と操作可能に結合する遺伝子を含む。
【００５５】
本願で使用されるように、「ＧＲＯ」は概して、グアノシン（またはグアニン）を豊富に含むオリゴヌクレオチドを示す。
【００５６】
本願で使用されるように、「ＨＤＧ」は、完全にグアノシン（Ｇ）ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを示す（配列番号３を参照）。
【００５７】
本願で使用されるように、「ＨＤＡ」は、完全にアデノシン（Ａ）ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを示す（配列番号９を参照）。
【００５８】
本願で使用されるように、「ＨＤＣ」は、完全にシチジン（Ｃ）ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを示す（配列番号８を参照）。
【００５９】
本願で使用されるように、「ＨＤＴ」は、完全にチミジン（Ｔ）ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを示す（配列番号１０を参照）。
【００６０】
本願で使用されるように、「ＯＤＮ」は概して、ヌクレオチドの任意の組み合わせを含む、長さｎの合成オリゴヌクレオチドを示す。
【００６１】
「誘導体」は、修飾によって直接、または部分置換によって天然化合物から形成される修飾核酸である。「類似体」は、天然化合物と同様であるが同一ではない構造を持つ、例えば、特定の化合物または側鎖に関してそれとは異なる、核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、合成であるか、または異なる進化上の起源から由来することができ、野生型と比較して同様または反対の代謝活性を有することができる。
【００６２】
誘導体および類似体は、全長または全長以外であってよい。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体あるいは類似体は、種々の実施形態において、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列よりも、あるいは整列が当技術分野で周知のコンピュータ相同性プログラムによって行われる整列された配列と比較した場合、またはその符号化核酸が、高度に厳しい条件下、中度に厳しい条件下、または低度に厳しい条件下で本発明のタンパク質をコードする配列の補体にハイブリダイズすることができる、少なくとも約３０％、４５％、７０％、８０％、または９５％同一性（好ましい同一性は８０〜９５％）で、本発明の核酸またはタンパク質と略同種である領域を含む分子を含むが、それに限定されない。Ａｕｓｕｂｅｌら，分子生物学における最新の手順（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３、を参照のこと。核酸誘導体および修飾は、遺伝子置換、部位特異的突然変異、欠失、挿入、組み換え、修復、シャッフリング、エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、サブクローニング、および関連手法を含む。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明は、例えば、配列番号１〜１２の単離したアプタマーＧＲＯといった、単離ポリヌクレオチド配列を含む。「単離核酸配列」は、それが由来する有機体の自然発生ゲノム中で直接隣接する（一方は５’端で、もう一方は３’端で）コード配列のいずれかと直接隣接していないポリヌクレオチドを意味する。よって該用語は、例えば、ベクターに、複製型プラスミドまたはウイルスに自動的に、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる、あるいはその他の配列から独立して別個の分子（例えばａ  ｃＤＮＡ）として存在する、組み換えＤＮＡを含む。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの変形態様であってもよい。
【００６４】
本発明は、グアノシン（Ｇ）を豊富に含むオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）は有効なアプタマーを形成し、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）と関連するハンチンチンタンパク質ポリグルタミンタンパク質の凝集といった、タンパク質凝集の効果的な阻害物質であるという所見に関する。それゆえ、本発明の単離ＧＲＯには治療可能性があり、例えばハンチントン病といった、タンパク質凝集の有害な影響に起因する疾患および症状の患者に対する治療として、使用することが可能である。いかなるの特定の理論によっても制限されないが、発明者は、本発明のＧＲＯにより観察される有益な効果は、凝集過程の抑制または遅延に起因することができることを仮定する。アプタマー活性を有する本発明のＧＲＯは、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄小脳失調、およびプリオン病といった、その他のアミロイドまたは神経変性病においても有益である可能性がある。さらに、本発明のＧＲＯは、様々なモデルシステムにおける細胞凝集体と毒性の関係を調べるために使用することが可能である。
【００６５】
したがって、一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド組成物は、約１５から約５０のヌクレオチドを有し、かつ少なくとも４０％のグアノシンヌクレオチドを有する、単離アプタマーオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１２のオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｇカルテット構造を形成することができる。
【００６６】
Ｇに富むＤＮＡおよびＲＮＡは、Ｇカルテットと呼ばれる、分子間または分子内四重鎖構造を形成する能力がある（ＢｉｙａｎｉおよびＮｉｓｈｉｇａｋｉ，Ｇｅｎｅ  ３６４：１３０−３８（２００５）を参照）。Ｇカルテットは、環状Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ  Ｈ結合平行または逆平行配置への４つのＧ塩基の関連から発生し、各Ｇ塩基はその隣接Ｇ塩基（Ｎ１とＯ６、およびＮ２とＮ７）とともに２つの水素結合を作る。Ｇカルテットは互いの上に積み重なって四分子らせん構造を生じさせる。Ｇカルテット構造の安定性は、一価の陽イオンの存在、存在するＧに富むオリゴヌクレオチドの濃度、および研究対象となっているＧに富むオリゴヌクレオチドの配列といった、いくつかの因子に左右される。Ｇ八量体内で相互作用する最適サイズのカリウムは、Ｇカルテット構造の形成を大いに促進し、その安定性を増大させる。Ｇカルテットオリゴデオキシヌクレオチド（ＧＱ−ＯＤＮ）は、テロメア活性の修飾、ヒトトロンビンの抑制、ＨＩＶ感染、ＨＩＶ−１インテグラーゼ活性、ヒト核トポイソメラーゼ１活性、およびインビトロのＤＮＡ複製を含む、いくつかの生物学的過程において重要な役割を果たすことが示唆されている。Ｓｔａｔ３活性化の構造および機構に基づいて、Ｇカルテットを形成するオリゴヌクレオチドは最近、癌細胞中のＳｔａｔ３活性を遮断するように開発された。
【００６７】
どの特定ヌクレオチド配列がＧカルテット構造を結果としてもたらすかを規定する厳重な規則はないが、例えばＧＧＴＴＮといった、グアノシンリピートのある反復とともに通常形成することが可能である。よって、グアノシンが平行または逆平行位置決めを介して接触できる限り、オリゴヌクレオチドは、Ｇカルテット構造などの高次構造を形成することが可能である。それゆえ、本発明のアプタマーオリゴヌクレオチドの配列は、オリゴヌクレオチドが約１５から約５０のヌクレオチドを含有し、少なくとも４０％のグアノシンヌクレオチドを含む限り、あらゆる方法で変化し得る。好ましい実施形態では、アプタマーオリゴヌクレオチドは、Ｇカルテット構造を形成する、特定の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１２のアプタマーオリゴヌクレオチドを含む。
【００６８】
いかなる特定の理論にも限定されないが、発明者は、本発明のアプタマーＧＲＯの高次構造はその有効性の仲立ちをする、つまり、例えば疾病関連ポリグルタミンタンパク質といった、タンパク質の凝集を抑制すると仮定する。しかし、本発明のアプタマーＧＲＯは概して、前述のように、その他の疾病関連タンパク質の凝集を抑制するために使用できる可能性がある。好ましい実施形態では、本発明の単離アプタマーオリゴヌクレオチドは、１８〜２４のヌクレオチドを含有し、少なくとも９５％のグアノシンヌクレオチドを有する。特に好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３のＧＲＯを含む。生化学的分析を初期スクリーニングに用いることによって、配列番号３は、Ｈｔｔ凝集を抑制した。本発明の単調Ｇ−ＯＤＮは、変異Ｈｔｔ断片融合遺伝子を過剰発現するＰＣ１２細胞において、細胞生存を改善することもできた。
【００６９】
本願で説明される実施形態のいずれにおいても、本発明のアプタマーＧＲＯは、１つ以上の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチド合成の最中または後に組み込むことが可能であり、核酸塩基、糖成分、および／またはリン酸基の修飾を含む。
【００７０】
リン酸ジエステル成分類似体。自然発生リン酸ジエステル基幹に対する多数の類似体が、オリゴヌクレオチド設計において使用されている。チオリン酸、ジチオリン酸、およびメチルホスホン酸は、既知の化学的方法を使用して容易に合成される。新規のヌクレオチド結合は、手動で合成して二量体を形成することが可能であり、該二量体は後に自動合成を介してオリゴヌクレオチドに導入されるため、潜在的な基幹修飾の範囲は、合成化学と同じくらいに広い。例えば、オリゴヌクレオチドは、チオエーテル、カルバメート、炭酸塩、アセトアミド酸、またはカルボキシメチルエステルとともに、そのヌクレオチド間リン酸残基において置換または修飾することができる。
【００７１】
自然発生リン酸ジエステル成分と違って、多くのリン酸ジエステル類似体は、キラル中心を有する。例えば、チオリン酸、メチルホスホン酸、ホスホアミダイド、およびアルキルリン酸トリエステルには、全てキラル中心がある。当業者であれば、キラル中心を有するその他多数のリン酸ジエステル類似体を認識するであろう。ハイブリダイゼーションにおける原子の空間的配置の重要性により、リン酸ジエステル類似体の原子の空間的配置は、その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性に影響を及ぼし得る。
【００７２】
ほとんどのリン酸ジエステル基幹類似体は、より高いエンドヌクレアーゼ消化に対する耐性を呈する。ある実施形態では、チオリン酸、メチルホスホン酸、ホスホイミデート、および／またはリン酸トリエステルを使用して、ヌクレアーゼ耐性の増進を達成する。分解に対する耐性の増加は、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’端のキャッピングによっても達成することができる。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’端キャッピングは、５’−−５’および／または３’−−３’末端逆結合を介する。
【００７３】
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは、リン酸ジエステルオリゴデオキシヌクレオチドの比較的ヌクレアーゼ耐性な水溶性類似体である。これらの分子はラセミ化合物であるが、なおもそのＲＮＡ対象によくハイブリダイズする。Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら．（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．５２：３６５  ３８４。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、立体規則性、立体不規則性、または立体無作為性とすることができる。立体規則性チオリン酸は、リン酸ジエステル結合またはチオリン酸ジエステル結合の全てが同方向に偏光するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。各結合中の各リンは、ＳＰまたはＲＰジアステレオマとすることができる。
【００７４】
糖成分類似体。オリゴヌクレオチド類似体は、糖部分を修飾および／置換することによって生成することができる。オリゴヌクレオチドの糖部分は、１つ以上の置換基の添加によって修飾することができる。例えば、糖成部分のうちの１つ以上は、アミノアルキルアミノ、アラアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノアルキルアミノ、Ｏ、Ｈ、アルキル、ポリアルキルアミノ、置換シリル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＯＭｅ、ＳＯ２Ｍｅ、ＯＮＯ２、ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＣＨ、ＯＣＣＨＯ、アリル、Ｏ−アリル、ＮＯ２、Ｎ３、およびＮＨ２、といった置換基の１つ以上を含むことができる。
【００７５】
リボース糖の２’位置の修飾は、多くの例において、分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を増加させることが示されている。例えば、糖の２’位置は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｆ、ＣＮ、ＣＦ３、アリル、Ｏ−アリル、ＯＣＦ３、Ｓ−アルキル、ＳＯＭｅ、ＳＯ２Ｍｅ、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、またはＯＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＣＨから成る群のうちの１つを含むように修飾することができ、その場合アルキルは直鎖、分岐、飽和、または不飽和とすることができる。
【００７６】
また、オリゴヌクレオチドは、リボースまたはヘキソース（つまり、グルコース、ガラクトース）となるように、その１つ以上の糖を修飾および／または置換することができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾糖を有することができる。糖は修飾して、蛍光標識などのその他の化学物質に結合するための１つ以上のリンカーを含むことができる。ある実施形態では、糖は１つ以上のアミノアルキルオキシリンカーに結合する。別の実施形態では、糖は１つ以上のアルキルアミノリンカーを含む。アミノアルキルオキシおよびアルキルアミノリンカーは、そのアミノ基を通して、ビオチン、コール酸、フルオレセイン、またはその他の化学部分に付着することができる。
【００７７】
塩基部分類似体。また、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基のうちの１つ以上を置換または修飾することができる。さらに、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルに加えて、イノシン、デオキシイノシン、ヒポキサンチンなどのその他の塩基を使用してもよい。また、イソテリックプリン２’デオキシ−フラノシド類似体、２’デオキシネブラリンまたは２’デオキシキサントシン、またはその他のプリンまたはピリミジン類似体を使用してもよい。塩基および塩基類似体を慎重に選択することによって、オリゴヌクレオチドの結合特性を微調整することができる。例えば、イノシンを使用してハイブリダイゼーション特異性を軽減することができる一方で、ジアミノプリンを使用してハイブリダイゼーション特異性を増加させることができる。
【００７８】
アデニンおよびグアニンは、Ｎ３、Ｎ７、Ｎ９、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ８位置において修飾され、なおもその水素結合能力を維持することができる。シトシン、チミン、およびウラシルは、Ｎ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６位置において修飾され、なおもその水素結合能力を維持することができる。
【００７９】
一部の塩基類似体には、自然発生塩基とは異なる水素結合属性がある。例えば、２−アミノ−２’−ｄＡは、チミン（Ｔ）に対して、通常の２つの代わりに、３つの水素結合を形成する。二本鎖の安定性を増加させることが示されている塩基類似体の例は、５−フルオロ−２’−ｄＵ、５−ブロモ−２’−ｄＵ、５−メチル−２’−ｄｃ、５−プロピニル−２’−ｄＣ、５−プロピニル−２’−ｄＵ、２−アミノ−２’−ｄＡ、７−デアザグアノシン、およびＮ２−イミダゾイルプロピル−２’−ｄＧを含むが、それに限定されない。
【００８０】
ペンダント基。「ペンダント基」は、オリゴヌクレオチドに結合することができる。ペンダント基は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの増加、標的核酸の分解の増進、およびハイブリダイゼーション親和性の増加を含むがそれに限定されない、種々の目的を果たす。ペンダント基は、オリゴヌクレオチドの任意の部分に結合することが可能であり、一般的に、オリゴヌクレオチド鎖の端に結合される。ペンダント基の例は、アクリジン誘導体（つまり、２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノアクリジン）；ソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン、およびアジドプロフラビンなどの架橋剤；ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）、ｏ−フェナントロリン−Ｃｕ（Ｉ）、およびポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）などの金属錯体、アルキル化部分、アミノ−１−ヘキサノールブドウ球菌ヌクレアーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼなどのヌクレアーゼ、末端トランスフェラーゼ、抗体酵素、コレステリル部分、脂肪親和性担体、ペプチド複合体、長鎖アルコール、リン酸エステル、アミノ、メルカプト基、フェノール基、放射性マーカー、染料などの非放射性マーカー、およびポリリシン、またはその他のポリアミンを含むが、それに限定されない。
【００８１】
一実施形態では、本発明のアプタマーオリゴヌクレオチドは、炭水化物、硫酸化糖質、またはグリカンに接合する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。複合体は、選択的オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドにそれらを共有結合することによって、そうでなければ非特異のＤＮＡ結合に特異性を導入する方法とみなすことができる。
【００８２】
細胞取り込み。細胞取り込みを増進するために、オリゴヌクレオチドは、担体または脂質と組み合わせて投与することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、陽イオン性脂質と組み合わせて投与することができる。陽イオン性脂質の例は、リポフェクチン、ｄｏｔｍａ、ｄｏｐｅ、ＤＭＲＩＥ、およびＤＰＰＥＳを含むが、それに限定されない。オリゴヌクレオチド取り込みは、トランスフェリンおよびコレステリルなどの化学部分にオリゴヌクレオチドを接合することによっても、増加することができる。また、オリゴヌクレオチドは、特定の化学基をオリゴヌクレオチドに結合することによって、特定の細胞小器官を標的とすることができる。例えば、オリゴヌクレオチドを適切な多数のマンノース残基に結合することによって、オリゴヌクレオチドは肝臓を標的とする。
【００８３】
オリゴヌクレオチドの細胞取り込みおよび局在は、標識オリゴヌクレオチドを使用することによって監視することができる。標識の方法は、放射性および蛍光標識を含むが、それに限定されない。蛍光標オリゴオリゴヌクレオチドは、蛍光顕微鏡検査法またはフローサイトメトリを使用して監視することができる。
【００８４】
ヌクレオチドの効率的な細胞取り込みは確立されている。例えば、２０塩基配列チオリン酸（ＰＳ）オリゴヌクレオチドが、マウスの腹部に腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）注入された場合である。オリゴヌクレオチドは、腎臓、肝臓、および脳に蓄積した。鎖延長オリゴヌクレオチドも観察された。Ａｒｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７０７９  ７０８３。ＰＳ２７−オリゴヌクレオチドをラットに静脈内投与すると、初期Ｔ１／２（血漿からの通過）は２３分であり、一方で総体内クリアランスのＴ１／２ベータは、３３．９時間であった。消失の長期のベータ半減期から、その投与が低頻度で、なおも有効な治療組織濃度を維持する可能性があることを明示する。Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｐ．（１９９１）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５３１。
【００８５】
本発明の別の側面は、例えば、配列番号１〜１２をコードする核酸、またはその便利なクローン作成、増幅、および／または転写のためのその誘導体といった、本発明のアプタマーＧＲＯを含むベクターに関する。本願で使用されるように、「ベクター」という用語は、「操作可能に結合された」別の核酸を運ぶことができる核酸分子を示す。ある種類のベクターは、付加的ＤＮＡ断片を連結することが可能な環状二本鎖ＤＮＡ環を指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、付加的ＤＮＡ断片がウイルスゲノムに連結することが可能である、ウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムと統合され、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが動作可能なように結合される配列の転写を検出することができる。そのようなベクターは、本願では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において使用できる発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。プラスミドが最も一般的に使用される形のベクターであるため、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、代替可能に使用される。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）、および同等の機能を果たす人工染色体などの、そのようなその他の形の発現ベクターを含むことを目的としている。
【００８６】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に最適な形の本発明の核酸を供え、このことは、組み換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節塩基配列を含む、つまり転写される核酸配列に動作可能なように結合されることを意味する。組み換え発現ベクター内では、「操作可能に結合される」とは、ヌクレオチド配列の転写および／または発現を可能にするように（例えば、インビトロ転写／翻訳システム、またはベクターが宿主細胞に導入される際の宿主細胞において）、目的のヌクレオチド配列が調節塩基配列に結合されることを意味することを意図  している。
【００８７】
「調節塩基配列」は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。そのような調節塩基配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，遺伝子発現技術：酵素学における方法（ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に説明されている。調節塩基配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節塩基配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、転写のレベル、および／または望まれるタンパク質の発現などの因子に左右され得ることは、当業者によって十分に理解されるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入することが可能であり、それによって、本願で説明されるように核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを産生する。本発明の組み換え発現ベクターは、原核または原核細胞における転写および／または発現に対して設計することが可能である。例えば、大腸菌などの細菌性細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳類細胞における転写および／または発現である。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，遺伝子発現技術：酵素学における方法（ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ（１９９０）でさらに説明されている。あるいは、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節塩基配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および／または翻訳することが可能である。
【００８８】
別の実施形態では、組み換えベクターは、好ましくは特定の細胞型においてアプタマーＧＲＯの転写を指示することができる（例えば、組織特異性調節要素が核酸を発現するために使用される）。組織特異性調節要素は、当技術分野で周知である。適切な組織特異的プロモーターの限定されない例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異性、Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９年．ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔら，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター、ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および哺乳類腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州公開公報第２６４，１６６）を含む。発生学的に調節されているプロモーター、例えば、マウスホメオボックスプロモーター（ＫａｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５３７−５４６）、およびアルファフェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。
【００８９】
その他の態様では、本発明は、本発明の単離アプタマーＧＲＯを含む宿主細胞に関する。特定の実施形態では、宿主細胞は、本発明のアプタマーＧＲＯ配列と操作可能に結合される１つ以上の転写調節核酸配列を含む、ベクター、プラスミド、または人工染色体を含む。ベクターまたはプラスミド核酸は、例えば、真核または原核クローン作成、増幅、または転写に適切となり得る。他の実施形態では、本発明は、単ポリヌクレオチド鎖として隣接して結合される、複数のアプタマーＧＲＯ配列を含む。なお他の実施形態では、本発明は、ベクターの核酸配列と隣接して結合され、かつ操作可能に結合あれる、複数のアプタマーＧＲＯを含む核酸ベクターを含む。
【００９０】
「宿主細胞」という用語は、異種核酸を運ぶために使用される場合がある、または異種核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現する細胞を含む。宿主細胞は、天然（非組み換え）型の細胞中にない遺伝子、人工的手段によって遺伝子が組み換えられて細胞内に再導入される天然型の細胞中にある遺伝子、または細胞から核酸を除去せずに人工的に組み換えられた細胞に対して内因性である核酸を含むことが可能である。宿主細胞は真核性または原核性となり得る。例えば、細菌細胞は、核酸配列を運ぶ、またはクローン化するため、あるいはポリペプチドを発現するために使用することができる。最近の培養に必要な一般的な増殖条件は、ＢＥＲＧＹの系統的細菌学の手引き（ＢＥＲＧＹ‘Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ編，ＷｉｌｌａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ／Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４）などのテキストに載っている。「宿主細胞」は、内因性遺伝子またはプロモーター、あるいは両方が組み換えられて本発明のアプタマーＧＲＯを生成するものともなり得る。
【００９１】
別の側面では、本発明は、タンパク質の凝集を抑制および／または軽減するための方法に関する。他の態様では、本発明は、ハンチントン病、または脊髄小脳失調を引き起こすもののような、ポリグルタミンタンパク質の凝集を抑制または軽減するための方法に関する。これらの側面の任意の実施形態では、本発明は、タンパク質凝集体形成の抑制、タンパク質凝集の軽減、および／またはタンパク質凝集体からの構成要素の解離を結果としてもたらすように、タンパク質凝集体を形成することができるタンパク質またはタンパク質凝集体を、有効量の本発明のＧＲＯに接触させるステップを含む。
【００９２】
本願で開示されるプラスミドは、市販で、無制限に公式利用可能であるか、または周知の公表された手順の日常的応用によって、利用可能なプラスミドから構成することが可能である。多くのプラスミドおよびその他のクローン作成および発現ベクターは周知で容易に利用可能であるか、または当業者は、使用に適切なその他のプラスミドをいくらでも容易に構成することができる。このようなベクターは、適切な宿主細胞に変更し、宿主細胞ベクター系を形成することができる。適切な宿主は、バクテリアなどの細菌、酵母、昆虫または哺乳類有機体、または細胞株を含む。適切な細菌の例は、大腸菌および枯草菌を含む。好ましい酵母ベクターは、ｐＲＳ４２６−Ｇａｌである。適切な酵母の例は、サッカロミセスおよびピチア属である。適切な両生類細胞は、アフリカツメガエル細胞である。昆虫細胞株に対する適切なベクターは、バキュロウイルスベクターを含む。マウス、ラット、またはヒト細胞は、好ましい哺乳類細胞である。
【００９３】
組み換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者にとって周知の従来手法によって行うことが可能である。「形質転換」とは、新規ＤＮＡ（つまり、細胞にとって外因性のＤＮＡ）の取り込み後に、細胞内で誘導される永久または一時的遺伝的変化を意味する。細胞が哺乳類細胞である場合、永久遺伝的変化は概して、細胞のゲノム内へのＤＮＡの導入によって達成される。「形質転換細胞」または「宿主細胞」とは、組み換えＤＮＡ手法、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子（つまり、ＩＮＤＹポリペプチド）、またはその断片を用いて、導入される（またはその原型に導入される）細胞（例えば、原核または真核）である。
【００９４】
宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ取り込みが可能なコンピテント細胞は、指数増殖期後に採取され、後に当技術分野で周知の手順によるＣａＣ１２方法によって処理される細胞から作ることが可能である。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することが可能である。形質転換はまた、宿主細胞のプロトプラストの形成後、またはエレクトロポレーションによって、実施することも可能である。
【００９５】
宿主が真核性である場合、ＤＮＡによる導入のそのような方法は、リン酸カルシウム共沈物、マイクロインジェクションなどの従来の機械的手順、エレクトロポレーション、リポソームに入れられたプラスミドの挿入、またはウイルスベクター、ならびに当技術分野で周知のその他のものを含む。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシ乳頭腫ウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用し、真核細胞を一時的に感染または形質転換することである（真核ウイルスベクター（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．，１９８２）。好ましくは、真核宿主は、本願で説明されるように宿主細胞として利用される。真核細胞は、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ）でもよく、またはヒト細胞を含む哺乳類細胞でもよい。
【００９６】
組み換えウイルスまたはウイルス要素を利用して発現を指示する哺乳類細胞系を操作してもよい。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用して、核酸配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分節リーダー配列に、連結することができる。そしてこのキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組み換えによってアデノウイルスに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、領域Ｅ１またはＥ３）内の挿入は、生存能力があり、感染宿主においてポリペプチドを発現することができる組み換えウイルスを結果としてもたらすであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：３６５５−３６５９，１９８４）。
【００９７】
組み換え遺伝子の長期的で高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。ウイルス由来の複製を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能なマーカーによって制御されるアプタマーＧＲＯをコードするｃＤＮＡにより形質転換することが可能である。組み換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に統合して巣を形成するように増殖することを可能にし、それによって次にクローン化し、細胞株内に拡張することが可能である。例えば、外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、強化培地において１日から２日間増殖し、そして選択培地に切り替えることができる。多数の選択系を使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ら，Ｃｅｌｌ  １１：２３３、１９７７）、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８：２０２６，１９６２）、およびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７，１９８０）遺伝子を含むがそれに限定されず、採用することが可能である。
【００９８】
他の態様では、本発明は、タンパク質凝集の有害な影響に関連する個人における疾患または症状を治療および／または予防するための方法に関する。特定の実施形態では、本発明の方法は、医薬的に許容し得る形の有効量の単離ＧＲＯを、それを必要とする個人に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本発明の単離ＧＲＯは、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、アジュバント、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化合物、薬剤、生理活性物質、またはその組み合わせと一緒に投与される。それゆえ、別の側面では、本発明は、少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体、賦形剤、アジュバント、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、化合物、薬剤、生理活性物質、またはその組み合わせとともに、医薬的に許容し得る形の本発明の単離ＧＲＯを含む、治療用組成物に関する。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明の治療ＧＲＯは、１つ以上の化学成分に複合、結合、または接合され、例えば、バイオアベイラビリティ、半減期、有効性、および／または標的を向上および／または修飾する。この実施形態の特定の態様では、ＧＲＯは、例えば、カチオン性分子、塩またはイオン、脂質、グリセリド、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、例えば、フェノール化合物といったその他の化合物、およびその組み合わせに、共有結合的または非共有結合的に、複合または結合することができる。特定の態様では、本発明は、例えば抗体といった、ポリペプチドに接合する本発明のＧＲＯに関する。特定の実施形態では、抗体は、目的のタンパク質またはタンパク質凝集体に対して特異的であり、よってＧＲＯをタンパク質および／またはタンパク質凝集体へ標的にする。
【０１００】
オリゴヌクレオチド療法の有効性も確立している。例えば、ヒトｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡを標的にする２４塩基配列ＰＳオリゴヌクレオチドが、ミニオスモティックポンプを通して、ヒトＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞株を持つｓｃｉｄマウスに注入されると、アンチセンスオリゴヌクレオチドで治療したマウスの平均生存時間は、未治療、または感覚制御で治療した、またはｃ−ｋｉｔプロトオンコジーンｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドで治療したマウスよりも、６から８倍長かった。Ｒａｔａｊｃｚａｋｒ．（１９９２ら）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１１８２３。
【０１０１】
治療的使用および剤形。本発明の核酸およびタンパク質は、代謝異常、糖尿病、肥満、伝染病、拒食症、癌、神経変性障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病（例えば、ＢＳＥおよびＣＪＤ）、脊髄小脳失調、免疫障害、造血障害、および様々な異脂肪血症、肥満と関連する代謝障害、慢性疾患および様々な癌と関連する代謝症候群Ｘおよび消耗病、心筋症、アテローム性動脈硬化、高血圧症、先天的な心臓の欠陥、大動脈弁狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、紅斑性狼瘡、肥満、移植、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、生殖能力、白血病、血友病、過凝固、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対宿主拒絶反応、ＡＩＤＳ、気管支ぜんそく、リウマチおよび変形性関節症、クローン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨異栄養症の治療、およびその他の疾患、障害などの症状を含むが、それに限定されない、種々の障害にかかわる潜在的な予防および治療の応用において有用である。
【０１０２】
本発明の治療用複合物の投与に対する製剤は、滅菌水溶または非水溶液、懸濁液、および乳剤を含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステル類である。水性担体は、食塩水および緩衝化媒質を含む、水、アルコール／水溶液、乳剤、または懸濁液を含む。媒体は、塩化ナトリウム液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、流体および栄養補給物、電解質補給物などを含む、乳酸加リンガー静脈内媒体を含む。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および添加剤を加えてもよい。
【０１０３】
本発明の核酸分子、ポリペプチド、および抗体（本願では「活性化合物」とも呼ばれる）、およびその誘導体、断片、類似体、同族体は、投与に適切な医薬組成物に組み込むことが可能である。そのような組成物は典型的に、核酸分子、タンパク質、または抗体、および医薬的に許容し得る担体を含む。本願で使用されるような、「医薬的に許容し得る担体」は、薬剤投与に適合した、ありとあらゆる溶剤、分散媒、被膜、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図する。適切な担体は、参照することにより本願に組み込まれる、当分野における標準参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎの薬学の最新版で説明されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含むが、それに限定されない。不揮発性油などのリポソームおよび非水性媒体も使用してよい。薬学的活性物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合でない限り、組成物中におけるその使用は考慮される。補助活性化合物もまた、組成物に組み込むことが可能である。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、その意図した投与経路と適合するように形成される。投与経路の例は、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（つまり局所）、経粘膜、腹腔内、および直腸といった、非経口投与を含む。非経口、皮内、または皮下応用に使用される溶液または懸濁液は、注射用蒸留水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶剤などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調整のための薬剤といった構成要素を含むことが可能である。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することが可能である。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、あるいはガラスまたはプラスチック製の複数投与バイアルに入れることが可能である。
【０１０５】
注射可能な使用に適切な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）、あるいは滅菌注射剤または分散剤の即席製剤用の分散剤または滅菌粉末を含む。静脈内投与に対しては、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）あるいは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易に注射針通過し得るある程度の流体であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌または真菌などの微生物の汚染作用が及ばないように保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶剤または分散媒となり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被膜の使用によって、分散の場合に必要粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することが可能である。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの、様々な抗菌および抗真菌剤によって達成することが可能である。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった、吸収を遅延する薬剤を組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１０６】
滅菌注射液は、必要量の活性化合物（例えば、本発明の治療用複合体）を、上記に列挙される成分のうちの１つ、または組み合わせによって適切な溶剤に組み込み、必要に応じて、続いてろ過滅菌を行うことによって、調製することが可能である。概して、分散剤は、活性化合物を、基礎分散媒および上記に列挙されるものからの他の必要成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって、調製される。滅菌注射剤の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は、真空乾燥、および有効成分の粉末と以前に滅菌ろ過されたその溶液からのあらゆる付加的な所望の成分をもたらす凍結乾燥である。
【０１０７】
経口組成物は概して、不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに入れるか、または錠剤に圧縮することが可能である。経口治療用投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と合併し、錠剤、トローチ、またはカプセルの形で使用することが可能である。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体担体をしようして調製することも可能であり、その場合、流体担体内の化合物は経口適用し、すすぎ、吐き出し、または飲み込む。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含むことが可能である。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤、でんぷんまたは乳糖などの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートなどの滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；蔗糖またはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サルチル酸メチル、またはオレンジ香味料などの着香料といった成分、または同様の性質の化合物のいずれをも含むことが可能である。
【０１０８】
経口投与に対しては、薬剤成物は、結合剤（例えば、前ゼラチン化トウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充てん剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモでんぷん、またはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの、医薬的に許容し得る賦形剤による従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルという形をとることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液という形を取ることができるか、または使用前に、水またはその他の適切な媒体とともに調製するための乾燥製品として提供することができる。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル類、エチルアルコール、または分割植物油）、および保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、またはソルビン酸）などの医薬的に許容し得る添加剤による従来の手段によって、調製することができる。製剤はまた、緩衝塩、香味料、着色剤、および甘味剤を適宜含んでもよい。
【０１０９】
経口投与用の製剤は、適切に形成し、活性化合物の制御放出を与えることもできる。口腔投与に対して、組成物は、従来の方法で形成される錠剤または、トローチ剤という形をとることができる。吸入による投与に対しては、本発明による使用のための化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスといった、適切な噴射剤の使用を伴って、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形で便利に供給される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、定量を供給するための弁を提供することによって、決定することができる。吸入器または吸引器での使用のためのゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、化合物の混合粉体、および乳糖またはでんぷんなどの適切な粉末ベースを含んで形成することができる。化合物は、例えば、ボーラス注入または連続注入による、注射による非経口投与のために調製することができる。注射用の剤形は、保存料の添加を伴って、例えば、アンプルまたは複数投与容器といった、単位剤形で提示することができる。組成物は、懸濁液、溶液、あるいは油性または水性媒体中の乳剤などの形をとることができ、懸濁化、安定化、および／または分散剤などの製剤を含むことができる。あるいは、有効成分は、使用前に、例えば滅菌された発熱物質を含まない水といった適切な媒体と共に調製するための、粉末形態とすることができる。化合物はまた、例えば、ココアバターまたはその他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含む、坐薬または保持かん腸剤などの直腸組成物に形成することもできる。前述の剤形に加えて、化合物はまた、持効性製剤として形成することもできる。そのような長時間作用型剤形は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉注射によって投与することができる。よって、例えば、化合物は、適切な高分子または疎水性材料（例えば、容認可能な油中の乳剤として）、または交換樹脂で、あるいは例えば難溶性塩として、難溶性誘導体として形成することができる。
【０１１０】
吸入による投与のため、化合物は、例えば、二酸化炭素などのガスといった、適切な高圧ガスを含む加圧容器または分注器、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形で供給される。
【０１１１】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によることも可能である。経粘膜または経皮投与のために、浸透するべき障壁に適切な浸透剤が剤形において使用される。そのような浸透剤は当技術分野で概して周知であり、例えば、経粘膜投与に対して、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐薬の使用を通して達成することが可能である。経皮投与のために、活性化合物は、当技術分野において一般的に知られる、軟膏、鎮静薬、ジェル、またはクリーム中に処方される。
【０１１２】
かかる組成物の調製、ならびに成分の選択の際のガイダンスに関与する原則および検討事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：薬学の科学および実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）  １９版（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；薬剤吸収の向上：概念、可能性、限界、および現在の動向（Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ），Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；および、ペプチドおよびタンパク製剤の送達（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４巻），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．で提供されている。
【０１１３】
また有効成分は、例えば、液滴形成手法によって、または界面重合によって調製される、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）における、またはマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルといったマイクロカプセルに封入することも可能である。インビボ投与に使用される剤形は、滅菌でなければならない。これは、除菌膜を通したろ過によって容易に達成できる。
【０１１４】
持続放出製剤を調製することが可能である。持続放出製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性基質であり、マトリクスは、例えば、膜またはマイクロカプセルといった形態をとる。持続放出基質の例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから成る注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などの重合体は１００日間以上分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。
【０１１５】
一実施形態では、活性化合物は、移植片およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出剤形など、体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体を伴って調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性重合体を使用することが可能である。そのような剤形の調製方法は、当業者にとって明白であろう。材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より商業的に入手することも可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を伴う感染細胞を標的としたリポソームを含む）もまた、医薬的に許容し得る担体として使用することが可能である。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１で説明されるような、当業者に周知の方法に従って調製することが可能である。
【０１１６】
投与の簡略化および用量の均一化のために、用量単位形の経口および非経口組成物を形成することが特に有利である。本願で使用されるような用量単位形は、処置される対象に対する単位用量として適した物理的不連続単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体と関連した所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の既定量を含む。本発明の用量単位形態に対する仕様は、活性化合物および達成される特定の治療効果の独自の特徴、および個人の治療のためのそのような活性化合物を調製する技術分野に固有の制限によって決定付けられ、直接左右される。
【０１１７】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することが可能である。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０を参照）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照）によって、対象に供給される。遺伝子治療ベクターの医薬品は、容認可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことが可能であるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放基質を含むことが可能である。あるいは、例えばレトロウイルスベクターといった完全な遺伝子送達ベクターが、組み換え細胞から損なわれずに産生される場合、医薬品は、遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含むことが可能である。医薬組成物は、投与の説明書と一緒に、容器、パック、または分注器に含むことが可能である。
【０１１８】
薬学的有効量は、症状の改善または遅延を結果としてもたらすのに十分である治療用複合体の量を指す。そのような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に致命的な投与量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において薬学的有効である投与量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準薬学手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現することができる。大きい治療指数を呈する化合物が好まれる。毒性副作用を呈する化合物は使用してもよいが、非感染細胞への潜在的損害を最小限化することによって副作用を軽減するために、そのような化合物を罹患組織の部位へ標的にする送達システムを注意して設計するべきである。細胞培養検定および動物実験より得られるデータは、ヒトにおいて使用するための用量の範囲を策定する際に使用することが可能である。そのような化合物の用量は好ましくは、毒性がほとんどないか、または全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。用量は、採用される投薬形態および利用される投与経路によって、この範囲内で変化することができる。本発明の方法において使用されるいかなる化合物に対しても、薬学的有効量は、細胞培養検定より最初に測定することが可能である。投与量は、細胞培養において決定されるように、ＩＣ５０（つまり、症状の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度を達成するように動物モデルにおいて調製することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用することが可能である。血漿のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【０１１９】
医薬組成物は、１つ以上の生理的に容認可能な担体または賦形剤を使用して、従来の方法で調製することができる。よって、化合物およびその生理的に容認可能な塩および溶剤は、吸入または吸引による投与、あるいは経口、口腔、静脈内、腹腔内、非経口、または直腸投与のために調製することができる。
【０１２０】
また本発明によって開示されるのは、本願で説明される方法、選択の方略、材料、または構成要素のうちのいずれか１つを利用するキットまたはシステムである。本開示による模範的キットは、方法または検定を実施するための説明書、包装材、検定を含む１つ以上の容器、装置またはシステム構成要素などを、任意で付加的に含むであろう。
【０１２１】
付加的側面では、本発明は、複合体を具現化するキットおよび本願で開示される使用方法を提供する。本発明のキットは任意で、（１）本願で説明されるポリペプチドまたは核酸構成要素、（２）本願で説明される方法を実践するため、および／または本願での選択手順を操作するための説明書、（３）１つ以上の検出検定構成要素、（４）核酸またはポリペプチド、その他の核酸類、遺伝子導入植物、動物、細胞などを保持するための容器、および（５）包装材のうちの１つ以上を含む。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態は本願で示されて説明されているが、そのような実施形態は一例として提供されるに過ぎないことが理解されるであろう。多数の変化、変更および置換が、本説明および例を考慮して本発明の精神を逸脱しない範囲で、当業者に思い当たるであろう。従って、添付の請求項は、本発明の精神および範囲内であるとして、そのような変化を対象にすることを意図する。
実施例
【０１２３】
ランダム配列を持つＯＤＮがＨｔｔ凝集体形成を軽減したという当初の観察は、ＨＤ療法におけるＯＤＮの潜在的役割の精査を促進した。我々は、Ｈｔｔ凝集の抑制に対する化合物／分子の迅速なスクリーニングを可能にする生化学／免疫化学分析を利用することを選んだ。この試験では、ＯＤＮ（４０μｍ）は、精製した変異ハンチントンと２４時間混合し、そしてセルロースアセテート膜フィルタ（０．２μｍ）に通過させた。フィルタに残っている凝集体の割合は、一次ＨＤ抗体およびアルカリホスファターゼと接合した二次抗ウサギ抗体を使用した免疫化学によって検出した。これらの実験に含まれたのは、陽性対照のコンゴレッドである。２つのＯＤＮ、ＨＤ３Ｓ／５３（全ＤＮＡ、５３−ｍｅｒ）およびＨＤＲ／２５ＮＳ（全ＲＮＡ、２５−ｍｅｒ）は、有効な阻害物質であることが分かった。基本的に、結果は、ＯＤＮはハンチントン凝集を抑制するために使用することが可能であることを確立した。しかしこれらの分子は、最大で５３塩基のサイズに及び、一部は細胞中で不安定であることが分かり、阻害活性をほとんど示さなかった。この研究は公表されており、論文はその全体において、参照することにより本願に組み込まれる（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏら，修飾一本鎖ＯＤＮは修飾された伸長ポリグルタミンにより誘導された凝集の生成と毒性を抑制する（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＯＤＮｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２５７−２６７（２００４））。ＯＤＮに有力なＨＤ治療薬としての潜在性があると確立し、我々は、特異であるが簡素な配列を伴うＯＤＮのスクリーニングに注意を向けた。起点として、我々は単量配列（全Ｇ、Ｔ、Ｃ、またはＡ）の２０−ｍｅｒを設計し、それらを上記の生化学分析に通した。本願でハンチントン病（ＨＤ）Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣのオリゴヌクレオチドと呼ぶ３つのＯＤＮは、それぞれ、ＨＤＡ（配列番号９）、ＨＤＧ（配列番号３）、ＨＤＴ（配列番号１０）、およびＨＤＣ（配列番号８）である。
【０１２４】
図６に示されるように、ＨＤＡ，ＨＤＣおよびＨＤＴ（配列番号８、９および１０）は、２０μＭ、４０μＭのいずれの生化学分析においても凝集体形成を抑制することができない。際立って対照的に、ＨＤＧ（配列番号３）は、凝集の遮断において著しく効率的であり、活性がコンゴレッドに匹敵していた。いくつかの場合では、凝集体は、フィルタ上に残留せず、その量は、我々が検出できる量以下であった。この結果は何度も（＞１０）繰り返され、強固で再現可能であると判断された。よって、我々は、生化学分析において様々な投与量でその活性を調べることによって、ＨＤに対する有力な治療薬としてのＨＤＧ分子を追求した。図４に示されるように、低レベルのＨＤＧは高レベルの抑制活性を示し、我々の以前の結果を確定した。この用量曲線は、１〜５μＭ濃度により高度に再現可能であり、Ｈｔｔ凝集のほぼ完全な抑制を生じた。我々は、同様のレベルでＨＤＡ、ＨＤＴ、およびＨＤＣによって触媒されたＨｔｔ凝集体抑制を検出することはできなかった。
【０１２５】
濃度が６０μＭを越えた時、我々は小規模だが再現不可能な陽性および陰性の効果を観察した（データ図示せず）。よって、我々はこの系統の実験を終了し、基本的なＧに富むＯＤＮ、ＨＤＧ（配列番号３）に再び焦点を当てた。
【０１２６】
任意の生化学分析において陽性の効果を明示する薬剤は、細胞中のＨｔｔ凝集を抑制することができなければならない。最も多目的で強固な試験システムの１つは、ヒト胚腎臓細胞株である、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を利用する。
【０１２７】
十分に確立された生化学分析を使用して、凝集のＧＲＯ遮断を調べた。分子Ｔ４０２１６（配列番号２）およびＴ３０９２３（配列番号１）、分子間Ｇカルテットを形成することが知られているＧＲＯは、凝集の効果的な阻害物質であることが分かった。これらのＧＲＯの両方とも、中心にＧ残基（カルテット）および最上部および底部にループ領域がある従来のＧカルテット構造を採択する。凝集検定において最高レベルの活性を示す好ましいＨＤＧを含む、本発明のＧＲＯは、安定したＧカルテット構造を採択することも可能であり、ＨＤＧによって採択されるＧカルテット構造の詳細を解明するためのさらなる研究が実施されている。本発明のこの分子は、ＰＣ１２細胞中の神経毒性を予防または遅延する可能性もある。
【０１２８】
実施形態のうちの１つでは、アプタマーＧＲＯであるＨＤＧ（配列番号３）は、２０の塩基を含む単調ＯＤＮの中でも独特である。ＨＤＡ、ＨＤＣ、またはＨＤＴ（配列番号８〜１０）という関連した２０−ｍｅｒのどれも、生化学または細胞に基づいた検定において再現可能な阻害活性を示さない。さらに、ＨＤＧは、１μＭほどの低い濃度で用量反応を示し、かなりのレベルの凝集体軽減を呈する。例えば、ＨＤＧは、Ｑ５８−Ｈｔｎ凝集反応の開始時に加えられると効果的であるが、過程が始まった後に加えられると、それほどではない。いかなる特定理論にも限定されずに、発明者らは、ＨＧＤが、伸長相よりもむしろ凝集の核形成相を遮断することに最も効果的である可能性を推測する。
【０１２９】
ＨＤＧ（配列番号３）もまた、ＨＥＫ２９３細胞中のＨｔｔｅｘｏｎ１−ｅＧＦＰ融合タンパク質の凝集を遮断する際に、極めて活発であることが分かった。このシステムでは、融合タンパク質は発現プラスミドから産生され、ＨＤＧとの同時導入が、用量依存的抑制において緑色蛍光焦点の出現を予防することがわかった。重要なことには、周知の凝集阻害物質であるコンゴレッドが、陽性対照として使用され、ＨＤＧと同様の効果を示した。ＭＴＴ（３，［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）生死判別試験は、ＯＤＮ添加の関数としての細胞増殖に対する細胞毒性または陰性効果を示さない（データ図示せず）。アンチセンスまたは抗遺伝子療法として使用されるＯＤＮは、細胞毒性に関してヒト細胞中で特に不活性であることが分かっているため、この結果は当然である。ＯＤＮを使用した多くの臨床試験が行われており、そのような治療の有効性が疑問視されている一方で、細胞または患者に対する有意な悪影響は観察されなかった。ＯＤＮからの重篤な副作用の欠如は、ＨＤ患者において使用するためのこれらの分子の開発における長所である。例えば、本発明のＧＲＯのＧＲＯ活性に対する有効レベルが、これまでの調合薬に対して使用されるものよりも高い一方で、ＯＤＮはヒトにおいて特に耐容性良好である。本願で提示されるレベルは異例ではなく、５０ｍｇ／ｋｇを越えるレベルが、種々のアンチセンス療法において有効および無毒の両方であることが示されている。標的細胞への送達、または該細胞内への浸透がその他の薬物療法と比べて効率が低くなり得るため、より高い量を必要とする可能性がある。
【０１３０】
本発明のアプタマーＧＲＯは、ＨＤＧ（配列番号３）を含む、ＧＲＯのＧカルテット構造の可能性を決定および確定するために修飾された。一種の逆遺伝子方略を使用して我々は、各７番目のＧがＴと取り替えられたＨＤＧ２０／７（配列番号７）、各３番目のＧがＴと取り替えられたＨＤＧ２０／３（配列番号５）、および１つおきのＧがＴと取り替えられたＨＤＧ２０／２（配列番号４）といった、いくつかの「変異」ＨＤＧを作成した。これらの分子のいずれも、凝集の効果的な阻害物質ではないことが分かった。図１１に提示される結果は、ＨＤＧのＧカルテット構造の重要性を最もはっきりと解説する一方で、Ｔ３０９２３（配列番号１）が、実施例３で提示されるようなＨＥＫ２９３検定において、完全にＨＤＧの代わりになれなかった時にも、この概念に対する支持が得られる。
【０１３１】
ＧＲＯ内に形成されるＧカルテットは、ＳＴＡＴ３などの分子のタンパク質二量化を抑制することも示されている。これらは、高度の精度でＳＴＡＴ３内の特異的領域に結合することによって、その活性を発揮する。変異Ｈｔｔ凝集は、変異タンパク質が会合し始める核形成相によるため、ＨＤＧ（配列番号３）は、凝集（二量化）が始まる際に、核形成と伸長との間の移行を遮断できる可能性がある。あるいは、ＨＤＧは、おそらく毒性断片を産生する天然タンパク質を切断するカスパーゼなどの、病理表現型の発達に関与するその他の酵素を遮断することができる可能性がある。Ｂａｔｅｓらは、高度の特異性をもって様々な癌細胞において、特定のアプタマーＧＲＯがヌクレオリンと結合することが可能であることを示している。このような場合の全てにおいて、細胞タンパク質との直接相互作用が必要とされるであろう。
【０１３２】
上記のように、我々は、Ｇに富むオリゴヌクレオチド、最も好ましくは、約１８〜２５Ｇ残基、より好ましくは２０Ｇ残基の長さであるＨＤＧ（配列番号３）が変異ハンチントンタンパク質における凝集過程を抑制することを示した。ハンチントン凝集を抑制する機能を持つＯＤＮは、次のようなアプタマーＧＲＯを含む。
ＨＤＧ  ５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧ−３’（配列番号３）
ＧＲＯ２６Ｂ  ５’−ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧ−３’（配列番号１１）
ＧＲＯ２９Ａ  ５’−ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧ−３’（配列番号１２）
【０１３３】
その他の態様では、本発明は、タンパク質凝集を抑制する活性ＯＤＮを見つけるためのランダムスクリーニング過程を含む。これらのＧに富むＯＤＮ（ＧＲＯ）はアプタマー活性を有することが知られており、我々は、このアプタマー活性がタンパク質へのＯＤＮの非特異的結合に重要であると考える。ＧＲＯは、そのポリアニオン系ポリアニオン系性質または特異的二次構造により、多数の細胞タンパク質と相互作用することができる。これらのアプタマーＧＲＯは、Ｇカルテットによって安定化される四重構造を形成する。我々は、これらにはタンパク質凝集関連疾患に対する治療可能性があると考える。現在の結果は、アプタマーＧＲＯを含まず、１００％凝集に正規化されている対照と比べて、凝集のレベルが最小限であることを示す。
【０１３４】
本発明は、特定の実施形態を参照して解説および説明されるが、本発明は示された詳細な説明に限定されることを目的としない。むしろ、請求項の同等物の範囲内で、本発明から逸脱することなく、様々な改良を詳細に行うことができる。
【０１３５】
実験例
ＯＤＮの構造の変化。アプタマーＧＲＯ分子であるＨＤＧ（配列番号３）は、長さ２０塩基であり、すべてＧヌクレオチドから成る。よってこれまでのところ強固な活性を示す一方で、我々は、ＨＤＧが最適なベクターであると想定することはできない。よって、我々は、整然とした方法でＨＤＧを変更し、生化学的スクリーニングにおいて変異体を試験した。下記のチャートは、戦略計画およびＨＤＧを識別する理論的根拠を概説する。
【表２】
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【０１３６】
このような変更のそれぞれは、状態のマトリクスを使用して、生物活性について評価されたが、最終的により小さい分子がＢＢＢを浸透させる可能性が高いため、一次判別スクリーニングは長さを伴った（下記参照）。いくつかの短い活性分子が識別されると、Ｇに富む配列へのＴ残基の組み込み、連鎖群、および塩基の化学的性質を含む、その他の修飾を試験した。しかし、基準として、ＨＤＧは検定の全てを通して処理された。最も活性のあるＧＲＯは、タンパク質凝集の開始後にＯＤＮが定期的な間隔で加えられた、添加時期実験において分析した。
【０１３７】
識別された活性ＧＲＯおよび／または関連ＧＲＯは、１０−２μＭ乃至１０２μＭの範囲で様々な用量で再スクリーニングして、ＩＣ５０を作成した。各検定群は、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔソフトウェアを使用してスキャンおよび定量化したブロットにより３回試験した。ＢＢＢの交差におけるその潜在的利点のため、とりわけ関心がむけられたのはＰＮＡ結合を伴うＧＲＯであった。我々は、様々な数のＰＮＡを伴うＧＲＯの合成に焦点を当て、ＰＮＡ（およびＬＮＡ）修飾ＧＲＯの系統的な組織分析を行った。全ての検定に対するベースラインは、陽性および陰性の境界を設定するため、コンゴレッドおよびＩという２つの対照サンプルを使用して確立した。これらの対照サンプルは、以前のスクリーニングで日常的に使用されており、パラメータの確立および検定システムの有効化において極めて強固であることが証明されている。ＩＣ５０は、対数スケール上で％凝集体軽減および濃度（μＭ）をグラフで表すことによって得られた。標準偏差、ＳＥＭ平均値、およびＰ値は、Ｐｒｉｓｍ３．０ソフトウェアからのプログラム、多重比較のために一元配置ＡＮＮＯＶＡおよびテューキーの事後試験をそれぞれ使用して、各点について自動的に計算される。
【０１３８】
阻害活性を示すＧに富むＯＤＮの構造分析：構造／機能の関係。ＧＲＯは、安定した（Ｇカルテット）二次構造に折り重なると考えられている。Ｇカルテットは、隣接グアノシンのＮ１からＯ６の位置とＮ２からＮ７の位置との間に形成され、そのような相互作用は、四分子らせんを生じさせる協調的方法で積み重なる連続するＧに囲まれる。二次構造は、Ｋ＋イオンが豊富な環境を含む有利なイオン条件下で形成するが、その他の一価の陽イオンの存在下で形成することが可能である。重要なことは、ＫＣｌの細胞内濃度は、１４０ｍＭであって、Ｇカルテットアセンブリをもたらす必要最小濃度より明らかにこえる。
【０１３９】
我々は、生化学分析において有意な活性を示した各ＧＲＯの構造を分析した。円偏光二色性を使用して、ｐＨ７で２４℃、１０μのＫＣｌおよび２０ｍＭのＬｉ３ＰＯ４中で１５μＭの濃度におけるＨＤＧ（配列番号３）を含む構造を分析した。使用した分光光度計は、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−５００Ａ分光偏光計であり、モル楕円率（ｄｅｇ．ｃｍ２ｄｍｏｌ−１）におけるデータの取得を可能にした。各ＯＤＮに対して、我々は５〜１０のスキャンを利用し、全てのスキャンを統合して最も確からしい構造プロファイルを決定した。ＧＲＯは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成し、製造によって定量化した。２６４ｎｍおよび２４０ｎｍそれぞれにおける楕円率はＧカルテット構造の特徴を高度に示すため、ＧＲＯは、２４０ｎｍの最小値で、２６４ｎｍにおいて試験した。Ｔ３０９２３（配列番号１）である５’−ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴ−３’、およびＴ４０２１６（配列番号２）である５’−ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴ−３’という、これらの構造を形成することが知られているＯＤＮを陽性対照として使用した。陰性対照については、ＮＳ−ＯＤＮ、５’−ＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣＡ−３’、および長さが２０塩基のポリＡ単量体であるＨＤＡ（配列番号９）という、Ｇカルテットを形成しないことが知られているＯＤＮを利用した。ＧカルテットのＣＤスペクトルプロファイルを生成することによって、その構造をとることが知られているＧＲＯにより、我々は、Ｇカルテット形成の程度とともに凝集検定において強い活性を示す我々のＧＲＯ候補を比較し、相関させることもできた。この情報をあわせて、我々は有効分子の構造のなんらかの基本的な洞察を得ることができた。
【０１４０】
構造／機能分析もまた、ＰＡＧＥを使用して実行した。この検定では、Ｇに富むＯＤＮは、１９％天然アクリルアミドゲル基質を通して電気泳動し、サンプル中の二次構造の程度の視覚化を可能にするプロトコルであるＳＹＢＲゴールドで染色した。そのような手順は、メーカーから入手されるＧＲＯの製剤間で発生する可能性のある潜在的な変化を分析するのに最も有用である。我々はまた、二次構造を増加または減少したレベルの阻害活性と相関させる目的と、活性ＧＲＯの「構造マーカー」を識別するという長期的目標をもって、高レベルの活性を示すＧＲＯを、そうでないものと比較した。二次構造は、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｉｍａｇｅによる染色後、画像化されたゲルから直接、５３２ｎｍ緑色フィルタを使用して検出および定量化した。
【０１４１】
実施例２
ＧＲＯの生化学分析。我々は、凝集の抑制のための化合物／分子の迅速なスクリーニングを可能にする生化学／免疫化学分析を利用することを選んだ。この試験では、ＯＤＮは精製した変異Ｈｔｔ断片と２４時間混合し、その後セルロースアセテート膜フィルタに通過させた。フィルタに残っている凝集体の割合は、一次Ｈｔｔ抗体およびペルオキシダーゼと接合した二次抗ウサギ抗体を使用した免疫化学によって検出した。ＳＤＳ不溶性凝集体からのシグナルをスキャンして定量化した。Ｗａｎｇら（２００５）によって確立されたこの検定の略図を図１に提示する。変異タンパク質の全ての調製において、ＧＳＴ−Ｑ５８Ｈｔｎのトロンビン指向切断は、ＧＲＯの添加前に４５分間続行させた。この切断は、５８のグルタミン残基の鎖を伴うヒトハンチンチンの１７１のアミノ酸から成る末端ポリグルタミン断片を生成する。断片は、ＧＳＴに融合されて精製を可能にする。我々は、Ｗａｎｇらの専門用語であるＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎを用いて、この検定で使用されるタンパク質を設計した。混合物を遠心分離し、すでに形成していた凝集体を除去した。ウェスタンブロット分析から、ＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎの９５％以上がトロンビンによって完全に切断されることを示している。種々の薬剤は、トロンビンによって行われる酵素的切断反応を遮断することが知られているため、このパラメータは我々の研究にとって重要な対照である。
【０１４２】
上記の生化学分析において、２つの周知のＧＲＯを阻害活性について試験した。ＯＤＮ  Ｔ３０９２３（配列番号１）およびＯＤＮ  Ｔ４０２１６（配列番号２）を、ＳＴＡＴ３タンパク質の機能を抑制するためのアプタマーとして使用した。これらの分子の両方ともが、円偏光二色性およびＮＭＲによって、分子内Ｇカルテット構造を有すると判定されており、我々の研究室によっても同様のＣＤスペクトルが見られた（下記参照）。それぞれの配列を図２Ａに示す。Ｔ３０９２３は（ＧＧＧＴ）４を含む１６塩基長であり、一方でＴ４０２１６は、（ＧＧＧＧＧＴ）４を含む２４塩基長である。
【０１４３】
ＧＲＯによる凝集の抑制を分析するために、生化学分析を採用した（図１）。融合タンパク質ＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎを、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍＭのＥＤＴＡの緩衝液中の１０μｇ／ｍｌの濃度のトロンビン（１Ｕ／１μｇタンパク質）により、室温で４５分間インキュベートし、ハンチンチンとＧＳＴとの間を切断した。Ｗａｎｇらによって示されるように、この断片は、ＧＳＴに融合される５８のグルタミン残基の鎖を伴うアミノ末端の１７１のアミノ酸から成る。そしてタンパク質混合は、４℃で３０，０００×ｇにおいて３５分間遠心分離して、すでに形成したあらゆる凝集体を除去した。ＮａＣｌの代わりに１００ｍＭのＫＣｌを伴う上記に詳述される緩衝液中に、０．５〜６０μＭのＧＲＯまたは対照ＧＲＯ、１０μのコンゴレッドを含有するウェル、または何らの処理をも含まないウェルに、タンパク質を加えた。ゼロ時間対照は即時に停止し、室温で２４時間のインキュベーション後に、１０％ＳＤＳ／５０ｍＭの２−メルカプトエタノールを加え、９９℃で５分間加熱することによって停止した。混合物は１Ｘ  ＰＢＳ中で希釈し、そしてＥａｓｙ−Ｔｉｌｔｅｒ  ＥＬＩＦＡシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してセルロースアセテート膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ）を通してろ過し、続いて２％ＳＤＳ洗浄を行った。５％ミルク／１Ｘ  ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎにおける遮断後、膜は特異的抗ハンチンチン抗体（ＨＰ１、１：１，０００希釈）によりインキュベートし、続いてペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ、１：４０，０００希釈）および化学発光試薬（ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるインキュベーションを行った。フィルタに残留した凝集体からのシグナルは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してスキャンして、定量化した。凝集体を、光学密度によって定量化し、統計的な差を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰＳＳ）を使用してテューキーの事後解析による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。有意性は、コンゴレッド（対照）と比較してｐ＜０．０５によって決定した。
【０１４４】
指定されたゼロ時間、２４時間、およびコンゴレッド（図２Ｂ）という３つの対照反応を、各実験に対して繰り返した。ゼロ時間対象は、反応の開始時の凝集の量を示すが、通常は全くない。２４時間対照は、阻害物質が混合物に加えられない場合のＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎ凝集の量を反映する。第３の対照は、前記の組における陽性対照として機能する既知の阻害物質であるコンゴレッドの存在下で形成される凝集の程度を示す。図２Ｂに示されるように、Ｔ４０２１６（配列番号２）およびＴ３０９２３（配列番号１）は両方とも、ＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎ凝集を抑制することができ、Ｔ３０９２３を伴うサンプル中では用量反応が明らかである。図３は、２回行われた５つの実験結果を表し、続いてＩｍａｇｅＱｕａｎｔ分析ソフトウェアを使用して定量を行った。統計学的有意差は、各実験において、各ＧＲＯと２４時間対照との間で観察される。
【０１４５】
この分子がＧカルテットを形成することも可能であるため、凝集に対するＧＲＯの影響は、単調グアノシンＯＤＮ（ＨＤＧ；配列番号３）の活性試験をすすめた。我々は、Ｔ３０９２３（配列番号１）（１６塩基）およびＴ４０２１６（配列番号２）（２４塩基）の妥協的な長さとして２０塩基を選び、ＨＤＧ系を確立した。ＨＤＧの用量範囲を生化学分析で試験すると、凝集Ｇ５８−Ｈｔｎ断片の抑制が容易に観察された（図４）。有意な減少は１μＭで見られ、Ｔ３０９２３またはＴ４０２１６で見られたいずれの抑制レベルよりもずっと低い最終濃度であった。ＨＤＧは、その他の単調ＯＤＮと比べてその阻害活性が独特であることが分かった。Ｈｕａｎｇらは、凝集の阻害物質を含む反応の非結合画分は、主に単調Ｈｔｔ断片から成ることを実証した。ＨＤＧ２０を持つ反応における非結合画分が変異Ｈｔｔ断片を含むことを検証するため、我々はこの画分を捕捉してブロッティング紙上においた。膜を積み重ね、凝集体を検出するために使用される同じ抗体を使用して、単量体を捕らえた。図４の差し込み図に図示されるように、陽性反応が観察され、変異Ｈｔｔ断片の存在を示した。Ａ（ＨＤＡ；配列番号９）、Ｔ（ＨＤＴ；配列番号１０）、またはＣ（ＨＤＣ；配列番号８）の２０−ｍｅｒを２０μＭおよび４０μＭにおいて試験すると、凝集の抑制は観察されなかった（図５）。スキャン後の定量では、その他の単調ＯＤＮのいずれと比べても、ＨＤＧの活性の大きな統計的有意差を認めた（図６）。総合すると、我々の結果は、すべてがＧ残基の２０−ｍｅｒであるＨＤＧは、免疫ブロット分析の結果に基づき、Ｑ５８−Ｈｔｎ断片の凝集の強力な阻害物質であることを示唆している。
【０１４６】
ＣＤは、左右の円偏光の吸収の差を測定し、ＤＮＡらせん構造を調査するために使用することが可能である。Ｇ四重は、逆平行単量体、二量体、または四量体として、または平行四量体として存在することが可能である。従来、逆平行立体構造は、最高２９５ｎｍの陽性楕円率、および最低２６５ｎｍの陰性楕円率によって特徴付けられる。対照的に、平行立体構造は、２６４ｎｍの陽性最高値および２４０ｎｍの陰性最低値によって特徴付けられるが、近年の結果は、逆平行構造が２６４ｎｍのいくつかの最高値および２４０ｎｍの最低値を有することを示している。ＨＤＧ（配列番号３）は、その構造の斜視図を得るために、ＣＤによって特徴付けられた。ＨＤＧは、１０ｍＭのＫＣｌ中の１５μＭで、かつ２４℃で、ＨＤＡ（配列番号９）およびＴ３０９２３（配列番号１）と共に分析した。ＣＤ分光偏光は、２００ｎｍから３２０ｎｍの有効範囲によるＡＶＩＶモデル２０２スペクトロメータを使用して決定した（図７）。ＨＤＡは、２６０ｎｍのより小さい陽性吸光度を伴い、２２０ｎｍの異常な最高吸光度を有する。しかし、Ｔ３０９２３およびＨＤＧは、２６４ｎｍの最高陽性吸光度および２４１ｎｍの陰性最低値を示し、Ｇカルテット構造をとることが知られている分子に密接に適合するはっきりとした特徴である。ＨＤＧは、二量体バスケットＧカルテット立体構造を採択することが知られているＴ３０９２３よりも、ＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎの効果的な阻害物質であり（７を参照）、我々の分析においてＨＤＧの構造がより高い活性な立体構造であることを示唆している。
【０１４７】
実施例３
ＨＥＫ２９３細胞における凝集体形成の抑制。生化学分析において、ＨＤＧ（配列番号３）がＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎの強力な阻害活性を示したので、我々は細胞に基づいた検定においてこの分子を試験した。ヒト胚腎臓細胞であるＨＥＫ２９３は、１０％ＦＢＳで補われた低グルコースＤＭＥＭにおいて増殖した。細胞は、６ウェルプレート上で０．５〜１×１０６細胞／ウェルにおいて播種した。細胞は、２．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１μｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−７２Ｈｔｔｅｘｏｎ１−ｅＧＦＰ（ｐ７２Ｑ）および１５０〜７５０ｎＭのＧＲＯまたは対照ＯＤＮで導入した。導入後４８時間、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５０顕微鏡を使用して、細胞を見て緑色蛍光焦点の概数を決定した。ｐｃＤＮＡ３．１−７２Ｈｔｔｅｘｏｎ１−ｅＧＦＰ（ｐ７２Ｑ）は、７２コドンのポリＱ反復およびｅＧＦＰ遺伝子を含む、ＨＤ遺伝子の第１エクソンを結合する融合遺伝子を含む構築体である。ハンチンチンのこの断片は、ポリグルタミン伸長の長さ、およびＧＳＴよりもむしろｅＧＦＰに融合することの両方において、ＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎと異なる。ＨＥＫ２９３細胞に導入されると、離散緑色焦点の出現によって反映されるように、遺伝子が発現されて１２時間以内に凝集体が現れる。細胞はまず、白色光の下で撮影し、等しい数の細胞が各治療に対して存在し、代表的なサンプルが示されていることを検証した。そしてｅＧＦＰをプラスミドｐ７２Ｑの有無で画像化した。図８では、緑色蛍光焦点はｐ７２Ｑが存在すると明白であるが、有意な減少が、コンゴレッドも受けた細胞で見られる。重要なことには、凝集体形成の抑制は、低用量のコンゴレッドが存在する場合に部分的にのみ抑制され、用量依存効果を実証する。図９では、ＨＤＡ（配列番号９）がｐ７２Ｑと同時に遺伝子導入された細胞集団であり、ＨＤＡはこれらの細胞中に形成される凝集体の数に対してほとんど影響を及ぼさないように思われる。生化学分析の場合のように（図５）、ＨＤＡは、ＨＥＫ２９３細胞中の凝集体形成を抑制するようには思われない。図１０は、凝集体形成に対するＨＤＧの影響を示す。白色光写真は再び、ＨＤＧには７５０ｎＭ（左上パネル）において細胞または細胞増殖に対して検出可能な毒性効果がないが、ＨＤＧの量が増加する際（下のパネル）凝集の数において、明確な用量効果が見られることを明らかにする。これらの観察は、阻害物質としてＨＤＧを使用する生化学分析において得られる結果を裏付ける。最後に、図１１では、写真のパネルは再度、ＨＤＧは凝集体形成の効果的な阻害物質であるが、Ｔ残基がＨＤＧ  ２０−ｍｅｒの第７および第１４位置（ＨＤＧ２０／７；配列番号７）、ＨＤＧ  ２０−ｍｅｒの２つおきの塩基（ＨＤＧ２０／３；配列番号５）、またはＨＤＧ  ２０−ｍｅｒの１つおきの塩基（ＨＤＧ２０／２；配列番号４）で挿入されると、この陽性活性は有意に減少し得る。これらの結果を立証するため、かつ細胞に基づいた生化学分析間の関係をさらに探索するため、我々は免疫ブロット分析で活性について、ＨＤＧ２０／、ＨＤＧ２０／４、およびＨＤＧ２０／３を個別に分析した（図２Ｂ参照）。これらの結果は、��胞に基づいた分析においてＨＤＧ２０／７、ＨＤＧ２０／３およびＨＤＧ２０／２それぞれについて観察された低レベルの活性を裏付ける（図１２）。細胞に基づいた分析と免疫ブロット分析において得られた結果の間との相関は、ＯＤＮに対して同様の作用形態を明らかにする。我々には、トランスフェクト細胞から単離された凝集体が免疫ブロット分析を経験する時に、細胞に基づいた分析で観察された凝集体の減少が確認できたという予備的証拠がある。
【０１４８】
ＨＤＧ（配列番号３）の付加に対する応答における凝集体の減少は、ＦＡＣＳ分析を使用して、測定値で見ることもできる。再び、ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＤＧ（またはＨＤＡ；配列番号９）を伴う、または伴わないｐ７２Ｑを用いて遺伝子導入し、反応を４８時間続行させた。そして細胞はＦＡＣＳに対して処理し、緑色蛍光について測定した。Ｙ軸は、蛍光の程度または強度を反映する。図１３Ａに図示されるように、背景は図の左端にゲートされているが、ｐ７２Ｑの発現は、プロファイルの右端近くで緑色蛍光の鋭いピークを生じる（図１３Ｂ）。このピークは、高強度ｅＧＦＰ（凝集体）を含む細胞としてＦＡＣＳによって得点付けられる、凝集したＨｔｔ−ｅＧＦＰを示す。図１３および１３Ｄでは、ＨＤＡで処理した細胞のプロファイルが示され、右端のピークにおいて検出できる変化はほとんど観察されない。ＨＤＡの量が１μＭから２．５μＭに増加しても、凝集体の有意な減少は観察されない。対照的に、凝集体を示すピークが用量依存的に減少するにつれ、ＨＤＧで処理した細胞は大きく異なるプロファイルを示す（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。よって、総合すると、データから、ＨＤＧは、プラスミドｐ７２ＱからのＨｔｔ−ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞において凝集形成を抑制することが可能であることが示される。
【０１４９】
最後に、誘導体ＰＣ１２細胞系であるＨｔｔ１４Ａ２．６を使用して、細胞生存性を向上させるＨＤＧの能力を測定した。この神経細胞系は、凝集体形成と関連する生存表現型を研究するための分野における基準として使用される。この分析では、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）に融合される切断型のＨｔｔエクソン１（１０３Ｑ）が、培養にムリステロンを加えることによって、発現を誘発される。誘発後、図１４に示されるように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生死判別試験によって測定されるように、細胞の生存は４８時間と７２時間の間でそれぞれ急速に低下する。漸増用量のＨＤＧ（配列番号３）の追加（０．４〜１．６μｇ／μｌ）は、生存性の低下を止め、あるレベルの神経防護作用を提供するように思われる。これらの差は統計的有意で、これらの結果を確定し、および／またはそれから発展させるために、より大規模な生存研究が進行中である。
【０１５０】
円偏光二色性分光法。１０ｍＭのＫＣｌ中の１５μＭのＯＤＮサンプルの円二色性スペクトルを、Ａｖｉｖモデル２０２スペクトロメーター上で記録した。測定は、０．１ｃｍ経路の長さの水晶キュベット（Ｈｅｌｌｍａ）を使用して、２４℃で実施した。ＣＤスペクトルは、２００から３２０ｎｍまで１ｎｍ間隔で行った２つのスキャンの平均を取り、バッファ単独のものに対応する基礎値を控除することによって得た。スペクトルデータは、１０００分の１の単位で表される。
【０１５１】
ＰＣ１２生死判別試験。Ｇ４１８（０．０５ｍｇ／ｍＬ）およびＺｅｏｃｉｎ（０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による選択下の間に、ラットクロム親和性細胞腫であるＰＣ１２を、１０％ウマ血清および５％ＦＢＳを伴う高グルコースＤＭＥＭにおいて増殖した。この細胞系Ｈｔｔ１４Ａ２．６は、１〜１７のアミノ酸およびｅＧＦＰに融合する１０３のポリグルタミン鎖を含む、切断形の伸張リピートＨttエクソン１タンパク質を発現する。プロモーターをムリステロンにより誘発し、伸長１０３ＣＡＧポリグルタミン（１０３Ｑ）領域を伴うＨｔｔエクソン１の発現を結果としてもたらした。細胞は、２４ウェルプレート上で３×１０４細胞／ウェルにおいて播種し、所望のＨＤＧ濃度により、０．８μｇのＨＤＧ２０対２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の比率で導入した。４時間の処理後、遺伝子導入培地を除去し、培地全体を１時間加え、そして５μＭのムリステロンを使用して細胞を２４時間誘発した。そしてＰｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生死判別試験を使用した。Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００のみを使用した対照細胞は、９６ウェルプレートの少なくとも６ウェルにおいて、２×１０４細胞でカウントおよびプレートに入れた。２４時間でこの対照において使用した同じ量の細胞は、同じ時点および残りの４８および７２時間時点で、次に続く処理で使用した。細胞を再度プレートに入れた後、プロトコルに従って、等しい量の細胞生存基質を各ウェルに加えた。基質が加えられた後、プレートは２分間ロッカーに配置し、１０分間インキュベートした。最後に、プレートは、Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター上で処理ごとに３回読み込み、Ｗａｌｌａｃ  １４２０ソフトウェアを使用して分析した。
参考文献
下記の参考文献は、あらゆる目的でその全体において、参照することにより本願に組み込まれる。
【表３−１】
2009511023.tif 000005
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、Ｗａｎｇら（２００５）より得られた生化学モデルスクリーニング検定の図であり、生化学／免疫ブロット分析に関与するステップを図示している。融合タンパク質ＧＳＴ−Ｑ５８−Ｈｔｎ（２０μｇ／ｍｌ）は、トロンビン（０．５単位／μｇタンパク質）と３０分間混合し、混合物は遠心分離して凝集タンパク質を除去した。可溶性タンパク質は、９６ウェルプレート内でＯＤＮと混合し、室温（ＲＴ）で２４時間インキュベートした。ＳＤＳは、２％の最終濃度になるように加え、混合物は９９℃で５時間加熱した。０．２２ミクロンのアセテートセルロース膜フィルタを通したろ過の後に、抗体（ＨＰ１）およびＥＣＬによる免疫ブロット法で、凝集Ｑ５８−Ｈｔｎ断片の検出が続いた。定量は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔプログラムを使用して行った。ブロットは、陽性および陰性両方の結果を示し、黒い点が欠けている場所は、凝集がＯＤＮによって抑制されたことを示す。
【図２】図２（Ａ）は、Ｇカルテット構造（配列番号：１および２）を形成する２つのＧに富むＯＤＮのＤＮＡ配列である。（Ｂ）は、凝集に対するＴ４０２１６（配列番号：２）およびＴ３０９２３（配列番号：１）の活性のドットブロット分析である。ゼロ（０）時間対照はタンパク質の添加直後に停止した反応、２４時間反応はＯＤＮがない状態で実施され、２４時間のインキュベーション後に停止した反応、コンゴレッドはコンゴレッド（１０μＭ）の添加後２４時間の凝集のレベルを表す。
【図３】図３は、ＧＲＯによる凝集抑制を描く棒グラフである。ここでは、Ｔ４０２１６（配列番号：２）およびＴ３０９２３（配列番号：１）およびコンゴレッドを使用する。データは、（Ｂ）で示されるように５つの独立した反応から表され、各点について標準偏差と共に表わされる。＊は、テューキーの事後試験による一元配置のＡＮＯＶＡによって決定された、コンゴレッド（対照）と比較しての有意性がｐ＜０．０５であることを意味する。
【図４】図４は、変異Ｈｔｔ断片の凝集に対する、ＨＤＧ２０（配列番号：３）活性のドットブロット分析である。２０塩基単調グアノシンＯＤＮである、ＨＤＧ２０は、指示された濃度において、図１（凡例参照）で概説される検定において試験した。反応は２４時間にわたって繰り返し４回実施され、４つの独立した実験からの代表的なブロットを示す。０時間はゼロの時間で停止した反応混合物を表わし、２４時間はＯＤＮが欠けている対照反応を表わす。（差し込み図）ＨＤＧ２０（２０μＭまたは４０μＭ）を含むフィルタ結合反応からの非結合画分は、図１に対する凡例で説明されるように、ドットブロット紙におき、乾燥して処理した。
【図５】図５は、変異Ｈｔｔ断片凝集の抑制における、様々な単調２０−ｍｅｒ  ＯＤＮの特異性のドットブロット分析である。様々な単調２０−ｍｅｒは、図１で概説される検定において阻害活性を試験した。ＨＤＣはあらゆるＣを伴う２０−ｍｅｒ（配列番号：８）を表わし、ＨＤＡはあらゆるＡを伴う２０−ｍｅｒ（配列番号：９）を表わし、ＨＤＴ（配列番号：１０）はあらゆるＴを伴う２０−ｍｅｒを表わし、ＨＤＧ、あらゆるＧを伴う２０−ｍｅｒ（配列番号：３）を表わす。４つの独立した実験を繰り返し実施し、このブロットは、全ての結果のうちもっとも代表的なものである。０時間はゼロ時点で停止した反応を表わし、２４時間は２４時間後に停止したＯＤＮが欠けている反応を表わし、コンゴレッドは１０μＭのコンゴレッドによる２４時間のインキュベーションを表わす。
【図６】図６は、単調２０−ｍｅｒを試験するために実施されたブロットを描く棒グラフである。平均凝集レベルは５つの独立した実験を標準偏差および平均値（系列１）で示している。＊は、テューキーの事後試験による一元配置のＡＮＯＶＡによって決定された、コンゴレッド（対照）と比較して有意性がｐ＜０．０５であることを意味する。
【図７】図７は、ＨＤＡ（配列番号：９）およびＨＤＧ（配列番号：３）のＣＤ分光分析結果である。２４℃での１０ｍＭのＫＣｌ中の、１５μＭのＨＤＧ（太い実線）、１５μＭのＴ３０９２３（配列番号：１）（細い実線）、および１５μＭのＨＤＧ（点線）のＣＤスペクトルである。
【図８】図８は、ｐｃＤＮＡ３．１−７２Ｈｔｔｅｘｏｎ１−ｅＧＦＰ（ｐ７２Ｑ）というプラスミドで導入されたＨＥＫ２９３細胞における凝集の抑制を示す、明暗視野顕微鏡画像を提供する。白色光下または暗視野内で撮影されたＨＥＫ２９３、ｐ７２Ｑによって産生された凝集体形成、およびｐ７２Ｑと同時に加えられたコンゴレッド（０．２μＭまたは１μＭ）による凝集の抑制を含む、一連の対照反応である。
【図９】図９は、指示された濃度においてｐ７２Ｑで同時遺伝子導入されたＨＤＡ（遺伝子ＩＤ番号：９）を示す暗視野顕微鏡画像を提供し、細胞は暗視野内で４８時間後に撮影された。
【図１０】図１０は、指示された濃度においてｐ７２Ｑで同時遺伝子導入されたＨＤＧ（遺伝子ＩＤ番号：３）を示す暗視野顕微鏡画像を提供し、細胞は暗視野内で４８時間後に撮影された。
【図１１】図１１は、ｐ７２Ｑで同時遺伝子導入されたＨＤＧ（遺伝子ＩＤ番号：３）を示す暗視野顕微鏡画像を提供し、細胞は暗視野下で４８時間後に撮影された。左上パネルは、ＯＤＮが欠けている反応を表す。
【図１２】図１２は、図１で概説される検定において阻害活性が試験されたチミン修飾を有する様々な２０−ｍｅｒのドットブロット分析である。ＨＤＴ（遺伝子ＩＤ番号：１０）はあらゆるＴを伴う２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ（遺伝子ＩＤ番号：３）はあらゆるＧを伴う２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／７（遺伝子ＩＤ番号：７）は７番目ごとのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／４（遺伝子ＩＤ番号：６）は４番目ごとのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／３（遺伝子ＩＤ番号：５）は３番目ごとのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒ、ＨＤＧ２０／２（遺伝子ＩＤ番号：２）は１つおきのヌクレオチドがＴと交換される２０−ｍｅｒである。０時間はゼロ時点で停止した反応、２４時間はＯＤＮが欠けている反応および２４時間で停止した反応、コンゴレッドはコンゴレッド（１０μＭ）による２４時間のインキュベーションである。
【図１３】図１３は、様々なＯＤＮによる変異Ｈｔｔ断片凝集の抑制のＦＡＣＳ測定分析である。ＨＥＫ２９３細胞は、指示された濃度でｐｃＤＮＡ３．１−７２Ｈｔｔｅｘｏｎ１−ｅＧＦＰ（ｐ７２Ｑ）および特定のＯＤＮ（ＨＤＡ（配列番号：９）、ＨＤＧ（配列番号：３））によって遺伝子導入され、凝集の程度が４８時間後にＦＡＣＳによって測定された。（Ａ）はプラスミドなし（ｐ７２Ｑ）、（Ｂ）はｐ７２ＱのみでＯＤＮなし、（Ｃ）はｐ７２Ｑおよび１μＭのＨＤＡ、（Ｄ）はｐ７２Ｑおよび２．５μＭのＨＤＡ、（Ｅ）はｐ７２Ｑおよび１μＭのＨＤＧ、（Ｆ）はｐ７２Ｑおよび２．５μＭのＨＤＧである。全てのＯＤＮは、細胞培養反応において最終濃度である。緑色蛍光の規模はＸ軸上で測定する一方で、その程度の蛍光を示す細胞の数は、Ｙ軸上に表される。
【図１４】図１４は、様々な濃度のＨＤＧ（配列番号：３）により遺伝子導入されたＰＣ１２細胞の生存能力を示す線グラフである。ＰＣ１２細胞株であるＨｔｔ１４Ａ２．６は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００中で様々な量のＨＤＧで遺伝子導入した。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存能力検定を使用して、時間の関数としての各治療の生存能力を分析した。１つの対照は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を含むがＯＤＮがない偽導入細胞であるが、ここで提示される無治療対照は、ＯＤＮまたはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのどちらも受け取っていない細胞を示す。統計は、各時点における全サンプルについての２７の発光読み取りに対する標準偏差を使用して行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月24日(2008.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2009511023.tif 000026
2009511023.tif 000027