(57)【要約】癌細胞由来のタンパク質ＥＧＦＲ、ＥＲＣＣ１、ＲＲＭ１、チミジル酸合成酵素またはβ−チューブリンは、血液試料から癌細胞を濃縮し、その後、濃縮された癌細胞に対して、上記のタンパク質を検出できるイムノアッセイを行うことにより、血液試料中で検出される。ＥＧＦＲを過剰発現する癌患者は、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブまたはゲフィチニブのような抗ＥＧＦＲ薬剤を用いて処置される。本発明は、上記の方法により、ＥＧＦＲを過剰発現していると同定された患者に抗癌剤を投与する工程を含む、抗ＥＧＦＲ薬剤での処置から利益を得る可能性がある癌患者を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中の癌細胞由来のタンパク質をアッセイする方法であって、該血液試料から該癌細胞を濃縮し、その後、該濃縮された癌細胞に対して、該濃縮された癌細胞由来のタンパク質を検出できるイムノアッセイを行う工程を含み、
該イムノアッセイが、血液１ミリリットルあたり１００個の該癌細胞からタンパク質を検出できるか、または１６０ピコグラムの該タンパク質を検出できることにより定義される感度を有し、
該タンパク質が、上皮成長因子受容体、除去修復交差相補群１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニットＭ１、チミジル酸合成酵素、およびβ−チューブリンからなる群より選択され、
該イムノアッセイが、該血液試料中の癌細胞に存在するタンパク質の分子数に比例するシグナルを生じる、
方法。
【請求項２】
血液試料中の癌細胞からタンパク質の発現を検出する方法であって、該血液試料から該癌細胞を単離し、その後、該単離された癌細胞から抽出物を作製し、その後、該抽出物に対して、該タンパク質を検出できるイムノアッセイを行う工程を含み、陽性のイムノアッセイの結果が該癌細胞中のタンパク質の存在を示し、
該タンパク質が上皮成長因子受容体であり、
該イムノアッセイが、血液１ミリリットルあたり１００個の癌細胞から該タンパク質を検出できるか、または１６０ピコグラムのタンパク質を検出できることにより定義される感度を有する、
方法。
【請求項３】
前記イムノアッセイが、血液１ミリリットルあたり３０個の癌細胞から前記タンパク質を検出できる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記イムノアッセイが、血液１ミリリットルあたり１０個の癌細胞から前記タンパク質を検出できる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記イムノアッセイが、血液１ミリリットルあたり３個の癌細胞から前記タンパク質を検出できる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記イムノアッセイが、４ピコグラムの前記タンパク質を検出できる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイが、検出に電気化学発光を用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイが、検出に化学発光、蛍光化学発光、蛍光偏光および時間分解蛍光から選択される技術を用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
抗ＥＧＦＲ薬剤での処置から利益を得る可能性がある癌患者を処置する方法であって、該患者の血液試料が請求項１または２に記載の方法で試験して陽性である該患者に、抗ＥＧＦＲ薬剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブおよびゲフィチニブからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、個別化癌療法の分野における進歩を可能にする感度が高いイムノアッセイを得る、重要かついまだに対処されていない医療上の必要性を扱うものである。癌のための個別化医療の一般的な概念は、最近の総説の主題である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。癌のための個別化医療のアプローチは、療法の最善の方向を決定するために、患者の腫瘍中のタンパク質または遺伝子を特徴付けることである。例えば、タンパク質またはｍＲＮＡレベルでのある遺伝子または遺伝子パターンの発現により、種々のクラスの抗癌剤に対する感受性または耐性を予測することができる。患者の腫瘍での発現に基づいて、療法について薬剤を選択し、またはその特定の患者における薬剤の使用を却下することができる。表１は、その過剰発現がある癌薬剤の耐性または感受性のいずれかに関連するタンパク質のいくつかを列挙するものである。
【０００２】
表１．その過剰発現がある薬剤の耐性または感受性に関連するタンパク質。
【０００３】
【表１】
2009534667.tif 000002
この分野における進歩に対する主要な障害は、このようなタンパク質の過剰発現を決定する簡便で迅速、かつ客観的なアッセイが存在していないことである。本発明は、この問題を扱う。
【０００４】
患者の腫瘍組織中のタンパク質の発現をアッセイする１つのアプローチは、ホルマリン固定腫瘍組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を用いることである。しかし、Ｍａｎｎら（２００５年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ２２巻：５１４８〜５４頁）により指摘されるように、このようなアプローチは時間がかかり、組織がどのように処理されたかによって紛らわしい結果をしばしば与えうる。「Ｂａｃｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｒａｗｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ」という表題の論文の中で、Ｈｅｎｓｏｎ，  Ｄ．Ｅ．（２００５年、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ９７巻：１７９６〜７頁）は、多くの変数（検体の貯蔵、固定の期間、固定剤の種類および組織の処理条件）およびそれらのそれぞれに関連する問題がある中では、ＩＨＣ試験を適切に制御するのは困難であり、全ての実験室にとって、「［これらの制御を］受容して維持するのは、実現困難である」ことを示している。
【非特許文献１】Ｚｏｏｎ  ＫＣ、２００４年、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐａｔｈｏｌ．３２巻（補遺１）：１〜２頁
【非特許文献２】ＭａｃＧｒｅｇｏｒ  ＪＴ、２００４年、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐａｔｈｏｌ．  ３２巻（補遺１）：９９〜１０５頁
【非特許文献３】Ｃａｒｒ  ＫＭら、２００４年Ｈｕｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１巻：１３４〜４０頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、血液試料から癌細胞を濃縮し、その後、濃縮された癌細胞に対して、濃縮された癌細胞からタンパク質を検出できるイムノアッセイを行う工程を含む、血液試料中の癌細胞由来のタンパク質をアッセイする方法を提供する。イムノアッセイは、血液１ミリリットルあたり１００個の癌細胞からタンパク質を検出できる。あるいは、イムノアッセイは、１６０ピコグラムのタンパク質を検出できる。タンパク質は、上皮成長因子受容体（リン酸化されたＥＧＦＲを含む）、除去修復交差相補群１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニットＭ１、チミジル酸合成酵素、およびβ−チューブリンからなる群より選択される。イムノアッセイは、血液試料中の癌細胞に存在するタンパク質の分子数に比例するシグナルを生じる。
【０００６】
本発明は、血液試料から癌細胞を単離し、その後、単離された癌細胞から抽出物を作製し、その後、その抽出物に対して、タンパク質を検出できるイムノアッセイを行う工程を含み、陽性のイムノアッセイの結果が癌細胞中のタンパク質の存在を示す、血液試料中の癌細胞からタンパク質の発現を検出する方法であって、そのタンパク質が上皮成長因子受容体であり、イムノアッセイが血液１ミリリットルあたり１００個の癌細胞からタンパク質を検出できる方法を提供する。あるいは、イムノアッセイは、１６０ピコグラムのタンパク質を検出できる。
【０００７】
本発明は、上記の方法により、ＥＧＦＲを過剰発現していると同定された患者に抗癌剤を投与する工程を含む、抗ＥＧＦＲ薬剤での処置から利益を得る可能性がある癌患者を処置する方法を提供する。
【０００８】
記載される検出およびアッセイの方法は、簡便で、迅速、かつ客観的である。簡便：本発明で概説されるアプローチは、生検材料を必要としない。患者の血液試料を、循環している腫瘍細胞中のあるタンパク質の発現について、直接分析できる。迅速：ＩＨＣに比較して、本発明のイムノアッセイは、組織片を回収し、その組織片を脱パラフィン処理し、スライドを切断し、染色を行って解釈する必要が回避される。代わりに、迅速なイムノアッセイを用いる。客観的：本発明のイムノアッセイを用いると、ＩＨＣのような主観的な評点が回避される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書で用いる場合、移行部の用語「含む」は、制限がない。この用語を用いる請求項は、その請求項に記載されるものの他に、要素を含みうる。つまり、例えば、請求項は、記載された要素またはその等価物が存在する限りは、そこに具体的に記載されない他のステップも含む方法と読み取ることができる。
略語：
ＣＴＣ：循環腫瘍細胞
ＥＧＦＲ：上皮成長因子受容体ＥＲＣＣ１：除去修復交差相補群１
ＥＣＬ：電気化学発光
ＩＨＣ：免疫組織化学
ホスホＥＧＦＲ：リン酸化されたＥＧＦＲ
ＲＲＭ１：リボヌクレオチド還元酵素サブユニットＭ１
ＴＳ：チミジル酸合成酵素
本明細書で用いる場合、用語「抗ＥＧＦＲ薬剤」とは、抗体を含み、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の小分子阻害剤を含む、ＥＧＦＲを標的にする抗癌剤のことである（概説として、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ  Ｆ、２００５年、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ１巻：２２１〜２３４頁；およびＭａｃａｒｕｌｌａ  Ｔら、２００６年、Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ  ２９巻：９９〜１０５頁）を参照されたい）。抗ＥＧＦＲ薬剤は、限定されないが、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブおよびゲフィチニブを含む。
【００１０】
本明細書で用いる場合、用語「白金薬剤」とは、抗癌特性を有する白金含有化合物のことである（最近の概説として、Ｆａｒｒｎｅｌｌ  ＮＰ、２００４年、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ３１巻（６号補遺１４）：１〜９頁）Ｃｏｓａｅｒｔ  ＪおよびＱｕｏｉｘ  Ｅ、２００２年、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ８７巻：８２５〜３３頁；Ｄｅｓｏｉｚｅ  ＢおよびＭａｄｏｕｌｅｔ  Ｃ、２００２年、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ４２巻：３１７〜２５頁を参照されたい）。白金薬剤は、限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンおよびネダプラチンを含む。
【００１１】
本明細書で用いる場合、用語「タキサン」とは、パクリタキセルおよび関連化合物のことである（Ａｂａｌ  Ｍら、２００４年、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ３巻：１９３〜２０３頁；Ｆｅｒｌｉｎｉ  Ｃら、２００３年、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ３巻：１３３〜８頁；およびＡｇｒａｗａｌ  ＮＲら、２００３年、Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ５巻：８９〜９８頁を参照されたい）。タキサンは、限定されないが、パクリタキセルおよびドセタキセルを含む。
【００１２】
本明細書で用いる場合、用語「ビンカアルカロイド」とは、ビノレルビン、ならびにビンブラスチンおよびビンクリスチンのような関連化合物のことである（概説として、Ｃｈａｎ、１９９８年、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ１８巻：１３０４〜７頁；Ｚｈｏｕ  Ｘ．−Ｊ．およびＲａｈｍａｎｉ  Ｒ．、１９９２年、Ｄｒｕｇｓ、４４巻、補遺４、１〜１６頁を参照されたい）。
【００１３】
本発明は、血液試料中の循環癌細胞中のタンパク質（ＥＧＦＲ、ＥＲＣＣ１、ＲＲＭ１、ＴＳおよびβ−チューブリンからなる）のレベルを定量するのに十分に感度が高い方法を提供し、ある抗癌療法（限定されないが、ＥＧＦＲを標的にする療法；白金薬剤；ゲムシタビン；５−ＦＵおよびラルチレキセド；タキサン；およびビンカアルカロイドを含む）から利益を得る可能性があるこれらの癌患者を同定する方法を提供する。血液試料を試験して、このような療法から利益が得られるさらなる患者を同定する簡便、高感度かつ迅速な手段は、癌治療の分野において、重要な進歩となる。以下に記載するように、電気化学発光（ＥＣＬ）検出を用いるような循環癌細胞中のこれらの癌タンパク質を検出する迅速で高感度な免疫学的アッセイは、このことを達成するために好ましい手段である。
【００１４】
本発明は、血液から循環癌細胞を単離するために用いられる手順の高い特異性を、ＥＣＬのようなある免疫学に基づくアッセイの高い感度と組み合わせることに基づく。循環癌細胞は、まず、濃縮される。用語「癌細胞を濃縮する」とは、非癌細胞に対する癌細胞の割合を増加させる任意の処理ステップの実行のことである。濃縮のある好ましい方法は、血液から循環癌細胞を単離して精製することにより免疫磁性ビーズを用いる。別の好ましい濃縮方法は、Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＢＤ  ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ  ＣＰＴチューブでの全血試料の回収、および遠心分離（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの推奨する手順による）による濃縮された癌細胞を含有する末梢血単核細胞画分の取得からなる。別の好ましい癌細胞の濃縮方法は、全血試料の回収、その後の赤血球細胞の溶解からなる。
【００１５】
本発明の検出方法のある実施形態において、免疫学的アッセイの感度レベルは、アッセイが、血液１ミリリットルあたり１００細胞以下、より好ましくは血液１ミリリットルあたり３０細胞以下、より好ましくは血液１ミリリットルあたり１０細胞以下、より好ましくは血液１ミリリットルあたり３細胞以下、最も好ましくは血液１ミリリットルあたり１細胞以下の濃度で血液に加えた場合に、癌細胞からタンパク質を検出できるようなものである。検出されうるタンパク質の量で感度が定義される本発明の実施形態において、アッセイは、６４ピコグラムのタンパク質、より好ましくは１６ピコグラムのタンパク質、より好ましくは４ピコグラムのタンパク質、さらにより好ましくは１ピコグラムのタンパク質を検出できる。
【００１６】
癌、特に乳癌の患者から血液の試料（通常、約８〜２０ｍｌの範囲）を採取する。以下に詳述するステップを含む。
【００１７】
１．赤血球の除去
２．正常白血球をさらに枯渇させるための任意のネガティブ選択。好ましい実施形態はこのステップを含む。
【００１８】
３．循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のポジティブ選択
４．腫瘍細胞タンパク質の抽出
５．ＣＴＣに対する腫瘍細胞タンパク質の定量
１．赤血球の除去
限定されないが、密度に基づく分離（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＢＤ  ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ  ＣＰＴチューブへの血液の直接の回収）、その後の遠心分離のような）およびＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ  ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｇｅｎｔｒａ、ミネアポリス）、ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤＩＳ）、ＩＭＭＵＮＯＬＹＳＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＯＰＴＩＬＹＳＥ  Ｂ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、およびＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、メリーランド州ロックビル）のような市販の溶解緩衝液を含む、赤血球を除去するための種々の方法が利用可能である。
【００１９】
好ましい方法は、抗凝固剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸）とともにＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブを用いる。これらのチューブは、正しい遠心分離（スイングアウトバケツローターで１，１００×ｇにて１０分間）の際に、赤血球および好中球の除去を可能にする物質を含む。遠心分離の後に、チューブに底部には赤血球（赤血球）および好中球の細胞沈殿物が含まれる。細胞沈殿物の上方にはゲルバリアがあり、ゲルバリアの上方には、腫瘍細胞、リンパ球および単球が血漿の底にバンドとして存在する。腫瘍細胞、リンパ球および単球は、次いで、ゲルバリアの上方の頂部から容易に回収できる。この方法は、赤血球だけでなく好中球も除去するので、好ましい。
２．正常白血球をさらに枯渇させるためのネガティブ選択。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態は、腫瘍細胞の単離のためのネガティブ選択ステップを用いる。ネガティブ選択は、白血球、特にリンパ球および単球のさらなる枯渇を可能にする。このステップは、白血球抗原、特に共通白血球抗原であるＣＤ４５と、グリコホリンＡのような赤血球抗原との両方に対して二重特異的である抗体の使用を含む。このような二重特異性抗体の商業的に入手可能なカクテルは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（Ｒｏｓｅｔｔｅｓｅｐカタログ＃１５１２７および＃１５１６７）から入手可能である。このカクテルは、グリコホリンＡ、およびヒト造血細胞上の種々の細胞表面抗原（ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｂ）に対する二重特異性抗体を含む。これらの二重特異性抗体の１または複数種を、血液回収前にＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブに加える。好ましい実施形態において、１種より多い白血球関連ＣＤ分子に対する二重特異性抗体のカクテルを用いる。血液をＣＰＴ  ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブに導入するときに、二重特異性抗体は、それぞれが白血球と多数の赤血球とからなるイムノロゼットを形成する。これらのイムノロゼットは、赤血球のものに近似する密度を有し、遠心分離したときに、赤血球沈殿物中に見出され、よって、細胞沈殿物およびゲルバリアの上方に見出される腫瘍細胞画分から、白血球がさらに除去される。血漿中の腫瘍細胞を含む画分を、さらなる処理のために回収する。
３．循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のためのポジティブ選択
ＣＴＣを単離する好ましい方法は、免疫磁性ビーズを用いる。循環癌細胞の単離の他の方法は、ろ過（Ｖｏｎａ  Ｇら、２０００年、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０００年１５６巻：５７〜６３頁）を含む。好ましい実施形態において、免疫磁性ビーズは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、サイトケラチン−１９のようなサイトケラチンのような癌細胞の表面上で選択的に見出される抗原に対する抗体、特にサイトケラチンと他の表面マーカー、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、膀胱腫瘍抗原、ＣＡ１９．９、ＣＡ１２５、ＣＤ１３８（シンデカン−１）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＡＵＡ１、ＴＡＣＳＴＤ１およびガレクチン−３；ならびに（ｂ）白血病またはリンパ腫細胞の場合：ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、Ｂ２２０、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＸＣＲ４；ならびにｃ）癌幹細胞の場合：ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ９０、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４、ＣＸＣＲ４、ＡＢＣＧ２およびＥＳＡに対する抗体のカクテルを有する。免疫磁性ビーズは、種々のサイズ（５０ミクロンから２００ｎｍ未満）であってよく、ＥｐＣＡＭに対する抗体を有するＤＹＮＡＬビーズ（＞１．５ミクロンから約５０ミクロン）（商業的に入手可能である）を含む。本発明の実施形態において、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＥｐＣＡＭポジティブ選択カクテルおよびＥａｓｙＳｅｐ（商標）磁性ナノ粒子（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、前のステップからの血漿中の腫瘍細胞の画分に加える。次いで、磁石を用いて、腫瘍細胞を残りの物質から分離し、腫瘍細胞を水溶液で洗浄する。
４．腫瘍細胞タンパク質の抽出
次のステップにおいて、濃縮または精製された腫瘍細胞は、次いで、細胞溶解およびＣＴＣタンパク質の抽出への準備ができている。限定されないが、
Ｐｉｅｒｃｅ溶解緩衝液［Ｍ−ＰＥＲ（登録商標）抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、イリノイ州ロックフォードの製品番号７８５０１）］およびＳｉｇｍａ溶解緩衝液［Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）−Ｍ（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ２９７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、ミズーリ州６３１０３セントルイス）］
のような商業的に入手可能な種々のキットを用いる。
【００２１】
溶解の後に、細胞破片を遠心分離により除去して、測定される抗原を含む溶解上清が残る。
【００２２】
好ましい実施形態において、ＳｉｇｍａまたはＰｉｅｒｃｅのキットを用いる。
５．ＣＴＣでの腫瘍細胞タンパク質の定量
検出および定量を、次いで、アッセイされるタンパク質に結合する抗体を用いる高感度サンドイッチイムノアッセイを用いることにより達成する。表１は、本発明においてアッセイされうるタンパク質を列挙する。種々の抗体をイムノアッセイに用いることができ、少なくとも１種のポリクローナル抗体を用いることが好ましく、２種のポリクローナル抗体を用いることが最も好ましい。
【００２３】
それぞれのタンパク質の検出は、分析されるタンパク質に対する抗体の２つの組を用いるサンドイッチイムノアッセイを用いることにより達成される。電気化学発光を用いる好ましい実施形態において、一方の抗体はビオチンに結合し、他方はルテニウム検出分子に結合している。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、タンパク質に対する抗体は、ビオチンに結合し、タンパク質に対する第２抗体は検出分子で標識されている。電気化学発光（ＥＣＬ）の場合、検出分子はルテニウムである。ルテニウムを抗体に結合するための十分に有用な方法についての豊富な文献が、公に存在する（例えばＬｅｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ２００１年、６５巻：１〜９頁）。細胞溶解物の上清を、２種の抗体と混合し、短くインキュベートし、その後、トリプロピルアミンを含有する溶液中のストレプトアビジン被覆磁性ビーズを加える。電位を負荷し、かつ標的抗原が存在する下では、ルテニウム標識が励起され、光が放射され、ＥＣＬ検出装置（例えばＯＲＩＧＥＮアナライザ、あるいはＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ゲーサーズバーグのＭ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４またはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナ州インディアナポリスのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０もしくはＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０のような商業的に入手可能な装置）を用いて検出される。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従って利用されるイムノアッセイは、以下の抗体の組合せの１つを用いることができる（具体的なタンパク質に対する抗体の例について表２を参照されたい）
１．タンパク質に対するポリクローナル抗体の２つの組（最も好ましい実施形態）
２．タンパク質に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体
３．タンパク質に対する２つのモノクローナル抗体
表２．抗体の例
【００２６】
【表２】
2009534667.tif 000003
本発明のイムノアッセイは、癌でないヒト有志由来の血液１ｍｌあたりに加えた１００個以下の癌細胞、好ましくは血液１ｍｌあたり３０個以下の細胞からタンパク質発現を検出できる。
【００２７】
電気化学発光の他に、この用途に要求される高い感度を得ることができる他のイムノアッセイは、限定されないが、
ａ）Ｌｉｕ  Ｙら、２００３年（Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ６６巻：５１２〜７頁）により記載されるような化学発光
ｂ）Ｙｕ  Ｈら、２０００年（Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ１４巻：８２９〜４０頁）により記載されるような蛍光化学発光（ＦＣＬ）
ｃ）蛍光偏光イムノアッセイ（Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ、１９８８年Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ１１２巻：７７５〜９頁を参照されたい）
ｄ）時間分解蛍光イムノアッセイ（Ｂｕｔｃｈｅｒ  Ｈら、２００３年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２７２巻：２４７〜５６頁；Ｓｏｕｋｋａら、２００１年、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ４７巻：１２６９〜７８頁；Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ、１９８８年Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ１１２巻：７７５〜９頁）
を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、アッセイにおいて用いられる循環腫瘍細胞の相対量が評価される。このことにより、細胞あたりの全タンパク質の割合を得ることが可能になり、細胞あたりのタンパク質のレベルが高い、中程度および低い癌細胞の対照標準と比較できる。これは、好ましい実施形態である。なぜなら、このことにより、発現が高いレベルである少数のＣＴＣから得られる模倣シグナルをもたらす可能性がある、低レベルのタンパク質発現を有する多くのＣＴＣが存在する擬陽性の状態が排除されるからである。この実施形態において、フローサイトメトリー分析、溶解細胞からの全ＤＮＡまたはヒストンのようなＤＮＡ関連抗原の定量（二倍体細胞あたり６ｐｇのＤＮＡが存在する）、β−アクチンのようなハウスキーピング遺伝子の生成物の定量、および濁度または吸光度測定を含む種々のアプローチを用いて相対的細胞数を評価できる。
【００２９】
その感度のために、本発明による方法は、特定の抗癌治療により利益を得るかまたは得ない可能性がある癌患者を同定するために有用である。
【００３０】
本発明は、本明細書に記載される発明を説明するが限定しない以下の実施例を参照にして、よりよく理解される。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
癌患者がオフィスを訪問し、血液試料をチューブに採取して凝固を防ぐ。Ｐｉｅｒｃｅ溶解緩衝液およびＳｉｇｍａ溶解緩衝液のような商業的に入手可能なキットを用いて、癌細胞を単離して、タンパク質を抽出する。ＥＧＦＲに対するルテニウム標識ウサギポリクローナル抗体と、ビオチン標識ポリクローナル抗体（これもＥＧＦＲに対する）とを加え、その後、アビジンが付着した磁性ビーズの懸濁物、次いでトリプロピルアミン含有溶液を加える。電流を印加し、電気化学発光（ＥＣＬ）を、商業的に入手可能なもの（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のようなＥＣＬ検出装置を用いて検出する。シグナルは、循環腫瘍細胞で見出されるＥＧＦＲの量に比例する。
【００３２】
（実施例２）
抗体がＥＲＣＣ１に対する以外は、実施例１と同様の方法である。
【００３３】
（実施例３）
抗体がＲＲＭ１に対する以外は、実施例１と同様の方法である。
【００３４】
（実施例４）
抗体がＴＳに対する以外は、実施例１と同様の方法である。
【００３５】
（実施例５）
抗体がβ−チューブリンに対する以外は、実施例１と同様の方法である。
【００３６】
（実施例６）
この実施例において、電気化学発光を用いるサンドイッチイムノアッセイを用いて癌細胞からＥＧＦＲを検出する感度を調べる。
【００３７】
ＰＢＳアッセイ緩衝液を調製する。
・アッセイ緩衝液  ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
抗ＥＧＦＲポリクローナル抗体を、まず、ビオチン標識（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＢＡＦ２３１）および非ビオチン標識（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＡＦ２３１）の形のもので得る。非ビオチン標識ポリクローナル抗体は、以下のようにしてルテニウム標識する（「ＴＡＧ標識」）。
・１．５μｇ／μｌのルテニウム標識（ＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳエステル、カタログ＃１１００３４；ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）をＤＭＳＯ中で調製する。
・５００μｌの抗体について、１８．８μｌのＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを加え、２００μｌのポリクローナル抗体について、３．８μｌのＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳを加える。それぞれの場合において、溶液を１時間インキュベートし、反応を、２０μｌの２Ｍグリシンの添加により停止する。
・各反応混合液中の結合していないＢＶ−ＴＡＧ−ＮＨＳエステルを、溶出にも用いるＰＢＳ（０．０８％アジ化ナトリウムを含む）を用いて予め平衡化したＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除去する。それぞれの標識抗体について、各画分のタンパク質濃度をタンパク質アッセイにより決定し、高タンパク質含量の画分を、続く実施例に用いる。
【００３８】
ルテニウム標識ポリクローナル抗体およびビオチン標識ポリクローナル抗体は、この実施例において、以下、「ＴＡＧ−ｐＡｂ」および「ビオチン−ｐＡｂ」という。
【００３９】
Ａ４３１癌腫癌細胞（ＡＴＣＣから、バージニア州マナッサス）を、ＡＴＣＣが推奨する条件で６ウェル組織培養プレートにて成長させ、ＰＢＳで２回洗浄し、一定量を、血球計数器を用いて計数する。これらの細胞を、Ｓｉｇｍａ溶解緩衝液［Ｓｉｇｍａ  ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）−Ｍ（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｃ２９７８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、ミズーリ州６３１０３セントルイス）］を用いて溶解する。細胞溶解は、細胞破片の除去の前に５分間の激しいボルテックスを追加して、製造業者の推奨に従って行う。細胞破片を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（モデル５４１５Ｃ）で１４，０００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離により、細胞溶解物から除去する。
【００４０】
電気化学発光アッセイを、以下のようにして行う。
・それぞれのウェルに、連続的に、細胞溶解物上清を加え（１ウェルあたりの溶解物の量は、３〜１００細胞から抽出したものから変動する。抽出物を含まない対照ウェルも用いる）、次いで、５０μｌ／ウェルのＴＡＧ−ＡｂおよびＢｉｏｔｉｎ−Ａｂの混合物（例えばそれぞれ０．５〜２μｇ／ｍｌの濃度；ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈）を、９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートのウェルに加え、一定の振盪を行いながら（例えば２時間）室温にてインキュベートする。
・２５μｌ中の１０μｇの磁性ストレプトアビジンビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン、カタログ＃１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）をそれぞれのウェルに加え、一定の振盪を行いながら（例えば３０分間）インキュベートする。
・ＰＢＳアッセイ緩衝液をそれぞれのウェルに加えて、１ウェルあたり２５０μｌの最終容量にする。全ての条件を、少なくとも２連のウェルで試験する。９６ウェルプレートを、次いで、Ｍ８  Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）アナライザ（カタログ番号３１０８００、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を用いて、電気化学発光について分析する。
【００４１】
このイムノアッセイを用いて、少なくとも１０個のＡ４３１癌腫細胞由来のＥＧＦＲが、バックグラウンドよりも高いシグナルで検出できる。
【００４２】
（実施例７）
この実施例では、電気化学発光を用いるサンドイッチイムノアッセイを用いて組換えＥＧＦＲを検出する感度を調べた。
【００４３】
ＰＢＳアッセイ緩衝液を調製した。
・アッセイ緩衝液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）中の０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
標準希釈液を調製した。
・標準希釈液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
抗ＥＧＦＲポリクローナル抗体を、まず、ビオチン標識（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＢＡＦ２３１）および非ビオチン標識（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＡＦ２３１）の形のもので得た。非ビオチン標識ポリクローナル抗体は、ＬｏｒｅｎｃｅおよびＬｕ（ＷＯ２００６／０４１９５９Ａ２）の方法に従ってルテニウム標識する（「ＴＡＧ標識」）。
【００４４】
ルテニウム標識ポリクローナル抗体およびビオチン標識ポリクローナル抗体は、この実施例において、以下、「ＴＡＧ−ｐＡｂ」および「ビオチン−ｐＡｂ」という。
【００４５】
組換えＥＧＦＲタンパク質を、ＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質（ヒトＩｇＧのＦｃ領域にリンカー基を介して融合している細胞外ドメインからなるキメラタンパク質；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃３４４−ＥＲ）の形で得た。
【００４６】
電気化学発光アッセイを、以下のようにして行った。
・標準物質を、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２、０．３５％  ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む）で希釈して、５０μｇ／ｍＬのストック溶液を得た。
・標準物質を、１ウェルあたり２５μＬを用いたときに１６００、１６０、１６および４ｐｇ／ウェルとなるように標準希釈液で希釈した。９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートの各ウェルに（１ウェルあたり２５μＬの標準物質を含む）、５０μｌ／ウェルのＴＡＧ−Ａｂおよびビオチン−Ａｂの混合物（例えば添加前に５０μｌ中に１．０μｇ／ｍｌの濃度）を加え、得られた溶液を、一定の振盪を行いながら（例えば２時間）室温にてインキュベートした。
・２５μｌ中の１０μｇの磁性ストレプトアビジンビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン、カタログ＃１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）をそれぞれのウェルに加え、一定の振盪を行いながら（例えば３０分間）インキュベートした。
・ＰＢＳアッセイ緩衝液をそれぞれのウェルに加えて、１ウェルあたり２５０μｌの最終容量にした。全ての条件を、少なくとも２連のウェルで試験した。９６ウェルプレートを、次いで、Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４アナライザ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を用いて、電気化学発光について分析した。
【００４７】
このイムノアッセイを用いて、１ウェルあたり４ｐｇほど少ないＥＦＧＲ標準物質を、バックグラウンドよりも高いシグナルで検出できた（表３）。
【００４８】
表３．ルテニウム標識ポリクローナル（ＴＡＧ−ｐＡｂ）およびビオチン標識ポリクローナル抗体（ビオチン−ｐＡｂ）を用いるイムノアッセイによる組換えＥＧＦＲの電気化学発光（ＥＣＬ）検出。
【００４９】
【表３】
2009534667.tif 000004
＊抗原を含まない対照ウェルからの平均シグナルを超える平均ＥＣＬシグナル。
【００５０】
（実施例８）
この実施例では、過剰発現癌細胞に対する非過剰発現癌細胞由来のＥＧＦＲを検出するためのＥＧＦＲに対するＥＣＬイムノアッセイについての特異性を、組換えＥＧＦＲを検出する感度を繰り返して決定することとともに決定した。方法は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌腫細胞（ＥＧＦＲ過剰発現について陽性の対照細胞）およびＺＲ−７５−１乳癌腫細胞（ＥＧＦＲ過剰発現について陰性）由来の細胞抽出物の分析を加えた、実施例７で用いたものであった。
【００５１】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＺＲ−７５−１細胞（ＡＴＣＣから、バージニア州マナッサス）を、ＡＴＣＣが推奨する条件で６ウェル組織培養プレートにて成長させ、ＰＢＳで２回洗浄し、一定量を、血球計数器を用いて計数した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶解および上清の取得は、Ｐｉｅｒｃｅ溶解緩衝液［カタログ＃７８５０１；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード］を、Ｐｉｅｒｃｅプロテアーゼ阻害剤［カタログ＃７８４１０；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］とともに用いて行った。１ウェルあたりの溶解上清の量を、１〜２５０個のＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＺＲ−７５−１細胞からの抽出物で変動させ、実施例７に記載するイムノアッセイを用いてＥＧＦＲについて分析した。
【００５２】
ＥＧＦＲ標準物質を用いて、１ウェルあたり４ｐｇほど少ないＥＧＦＲ標準物質を、再び、バックグラウンドよりも高いシグナルで検出できた（表４）。
【００５３】
表４．ルテニウム標識ポリクローナル（ＴＡＧ−ｐＡｂ）およびビオチン標識ポリクローナル抗体（ビオチン−ｐＡｂ）を用いるイムノアッセイによる組換えＥＧＦＲの電気化学発光（ＥＣＬ）検出。
【００５４】
【表４】
2009534667.tif 000005
＊抗原を含まない対照ウェルの平均シグナルを超える平均ＥＣＬシグナル。
【００５５】
細胞溶解物を用いるこの実験の結果を、図１および２に示す。図１は、低い細胞数からＥＧＦＲを検出するこのアッセイの能力を見るのに最もよいデータのより低い端をグラフで示す。図１は、１ウェルあたり１０個の細胞までの細胞範囲についてのデータのみを含む。図２は、全体のデータの組をグラフで示す（１ウェルあたり２５０個の細胞まで）。
【００５６】
ＥＧＦＲは検出可能であり、この実験におけるＭＤＡ−ＭＢ−４６８溶解物の最少量を用いるこれらのウェル（１ウェルあたり１個の細胞を加えたものの溶解物；図１）を含むこの実験におけるＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の溶解物からのベースラインを超えていた。さらに、ＭＤＡＭＢ−４６８細胞の溶解物（ＥＧＦＲ過剰発現について陽性の対照）は、１ウェルあたり１〜２５０個の細胞の試験した範囲全体にわたってＺＲ−７５−１細胞（ＥＧＦＲ過剰発現について陰性）の溶解物よりも、ＥＧＦＲについてイムノアッセイでかなり高いシグナルを示し、このことは、ＥＧＦＲ検出についての結果の高い特異性を示す（図１および２）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞（ＥＧＦＲ過剰発現についての陽性対照）に対するＺＲ−７５−１（ＥＧＦＲ過剰発現についての陰性対照）の溶解物中のＥＧＦＲのイムノアッセイ検出についてのＥＣＬシグナルの比較を示す図である。１ウェルあたり１、２および１０個の細胞の溶解物を用いたデータを示す。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞（ＥＧＦＲ過剰発現についての陽性対照）に対するＺＲ−７５−１（ＥＧＦＲ過剰発現についての陰性対照）の溶解物中のＥＧＦＲのイムノアッセイ検出についてのＥＣＬシグナルのさらなる比較を示す図である。Ｘ軸の目盛りを増加させて示すために、１ウェルあたり５０および２５０個の細胞の溶解物材料から得られたデータもこのグラフに含めた以外は、図１に示すものと同じ実験のデータをこの図において用いる。
【図１】
2009534667.tif 000006
【図２】
2009534667.tif 000007
【国際調査報告】
2009534667.tif 000008
2009534667.tif 000009