(57)【要約】  本発明は、腫瘍の治療に有用である組成物、その様な組成物の製造方法、及びその様な組成物の使用方法に関する。本発明は、また、Ｃｏｒｅ１タンパク質及び／又は他のミトコンドリア呼吸複合体ＩＩＩタンパク質の活性の阻害剤をアッセイする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）複合体ＩＩＩタンパク質の活性を阻害する阻害剤、及び（Ｂ）担体を含む組成物。
【請求項２】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
阻害剤が複合体ＩＩＩタンパク質の発現を阻害するアンチセンス核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
阻害剤が複合体ＩＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸をコードする核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
核酸がプロモーター領域を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
核酸がベクターに含まれる、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
阻害剤が複合体ＩＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
阻害剤が複合体ＩＩＩタンパク質に結合し、且つその活性を低下させることができる抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
阻害剤が複合体ＩＩＩタンパク質に結合し、且つその活性を低下させることができる抗体をコードする核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
核酸がプロモーターを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸がベクターに含まれる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
阻害剤が複合体ＩＩＩタンパク質の発現を低下させることができるリボザイムである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
阻害剤が複合体ＩＩＩタンパク質の発現を低下させることができるリボザイムをコードする核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
核酸がプロモーターを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
核酸がベクターに含まれる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
構成メンバーがＴＲＡＩＬである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
構成メンバーがＦａｓリガンドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
患者の腫瘍を治療する方法であって、複合体ＩＩＩタンパク質の活性を阻害する阻害剤及び担体を含む組成物を該患者に投与する処置を含む方法。
【請求項２０】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーの活性を阻害する阻害剤を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
構成メンバーがＴＲＡＩＬである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
構成メンバーがＦａｓリガンドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーの投与をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
構成メンバーがＴＲＡＩＬである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
構成メンバーがＦａｓリガンドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
複合体ＩＩＩタンパク質の活性を阻害する阻害剤及び担体を含む組成物を製造する方法であって、該阻害剤を該担体と混合することを含む方法。
【請求項２８】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
複合体ＩＩＩタンパク質の活性を阻害する阻害剤、担体及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーを含む組成物を製造する方法であって、該阻害剤、該担体及び該構成メンバーを混合することを含む方法。
【請求項３０】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
化合物が複合体ＩＩＩタンパク質のＴＮＦ抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、複合体ＩＩＩタンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させ、かつ化合物と接触させている細胞（Ａ）の生存率と、同様に該複合体ＩＩＩタンパク質を発現する同じ細胞株由来の細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーを存在させないで生育させ、かつ化合物と接触させている、細胞（Ｂ）の生存率を比較することを含む方法。
【請求項３２】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞がＨＣＴ１１６細胞株由来であり、Ｃｏｒｅ１タンパク質をコードする外因性の導入遺伝子でトランスフェクションされている細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
導入遺伝子がヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞がＨＣＴ１１６細胞株由来であり、Ｃｏｒｅ１タンパク質の一部をコードする外来導入遺伝子がトランスフェクションされている細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーがＴＲＡＩＬである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
化合物が複合体ＩＩＩタンパク質のＴＮＦ抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、
（Ａ）化合物を、上記タンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させている細胞と、所定の時間接触させること；
（Ｂ）化合物を、そのタンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーを存在させないで生育させている上記と同じ細胞株由来の細胞と、所定の時間接触させること；および
（Ｃ）上記（Ｂ）由来の細胞の生存率を上記（Ａ）由来の細胞の生存率と比較すること；を含む方法。
【請求項３８】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
化合物が複合体ＩＩＩタンパク質の活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、
（Ａ）細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させること；
（Ｂ）同じ細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーを存在させないで生育させること；
（Ｃ）化合物を、上記（Ａ）の細胞と接触させること；
（Ｄ）化合物を、上記（Ｂ）の細胞と接触させること；および、
（Ｅ）所定の時間後、上記（Ｂ）の細胞の生存率を上記（Ａ）の細胞の生存率と比較すること；
を含む方法。
【請求項４０】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
化合物が複合体ＩＩＩタンパク質のＴＮＦ抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、該タンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバー及び化合物の両者と接触させている細胞の生存率を、該タンパク質を発現する同じ細胞株由来の細胞で、化合物と接触させたがＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーと接触させない細胞の生存率を、比較することを含む方法。
【請求項４２】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
化合物が複合体ＩＩＩタンパク質のＴＮＦ抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、
（Ａ）細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバー及び化合物と接触させること；
（Ｂ）同じ細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、化合物と接触させるがＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーと接触させないこと；および
（Ｃ）上記（Ｂ）由来の細胞の生存率を上記（Ａ）由来の細胞の生存率と比較すること；を含む方法。
【請求項４４】
複合体ＩＩＩタンパク質がＣｏｒｅ１である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腫瘍は、悪性又は良性の組織の異常増殖である。良性腫瘍は局所でのみ増殖するのに対して、悪性腫瘍は他の組織に拡散する。
【０００２】
癌は遺伝的疾患である。アポトーシスに抵抗する能力は、癌細胞の特徴である。多くの遺伝子損傷は、がん細胞にプログラム細胞死（アポトーシス）に対する抵抗性をもたらすことが知られている。アポトーシスの間に、カスパーゼと呼ばれる酵素が細胞破壊のプロセスを実行する。イニシエーター・カスパーゼが、不活性なエフェクター・カスパーゼ前駆体を切断して活性化させる。活性化されたエフェクター・カスパーゼは、次に細胞内のタンパク質を切断し始める。正常な組織では、アポトーシスの速度は、組織内の細胞増殖速度と均衡が保たれ、従って、組織の成長は調節される。もしも細胞のアポトーシスのプロセスが妨げられると、細胞は分裂し続け、その結果として無制御の組織増殖につながる。
【０００３】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、腫瘍治療のための有望な治療用薬剤である。ＴＲＡＩＬは、強力なアポトーシス誘導剤のＴＮＦ及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）が含まれる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの一員である。ＴＲＡＩＬは、広範なヒト腫瘍及び癌細胞株に急速なアポトーシスを誘導するだけでなく、正常細胞及び組織に対して殆ど毒性を示さないという理由で、特に興味が持たれる。
【０００４】
ＴＲＡＩＬは、通常は体内の多くの組織によって発現されるが、腫瘍の治療期間中に外来的に投与することができる。可溶性の活性型ＴＲＡＩＬを固形腫瘍を担持するマウスに注射することにより、アポトーシスが誘導され、腫瘍進行が抑制され、そして生存率が改善された。また、ＴＲＡＩＬと種々の化学療法剤を用いた併用療法が腫瘍の退縮をさらに増強しうることの証拠が存在する。
【０００５】
ＴＲＡＩＬは、腫瘍及び癌細胞株の死受容体であるＤＲ４及びＤＲ５に結合し、急速且つ特異的にアポトーシスを誘導する。ＴＲＡＩＬの死受容体への結合は、細胞の種類によって、外因性又は内因性若しくは両者のアポトーシス経路を誘導する。両者の経路において、ＴＲＡＩＬはその受容体への結合によって、イニシエーター・カスパーゼ８をリクルートして活性化するアダプター・タンパク質ＦＡＤＤ（死ドメインを有するＦａｓ関連タンパク質）のための結合部位を創り出す。いくつかの細胞では、カスパーゼ８は外因性アポトーシス経路を活性化し、アポトーシスを誘導するのに十分なエフェクター・カスパーゼ３、６及び７の活性化に直接導く。ＴＲＡＩＬは、また、カスパーゼ８の活性化がミトコンドリアの関与するアポトーシス及びアポトソームの形成を開始させる本来の経路によって、アポトーシスを誘導することもできる。カスパーゼ８は、Ｂｃｌ−２阻害性ＢＨ３−ドメイン含有タンパク質（Ｂｉｄ）を切断し、短縮したＢｉｄの細胞質からミトコンドリア外膜への転移を引き起こし、Ｂａｘ及びＢａｋのオリゴマー化を誘導する。Ｂａｘ（Ｂｃｌ−２関連Ｘタンパク質）及びＢａｋ（Ｂｃｌ−２アンタゴニスト／キラー１）によって形成される孔は、ミトコンドリア膜分極を失わせてシトクロムＣを放出させ、細胞のミトコンドリアの代謝障害をもたらす。細胞質内のシトクロムＣは、次にカスパーゼ９と相互作用し下流のエフェクター・カスパーゼ３、６及び７を活性化させる。
【０００６】
しかし、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーを用いる治療には、様々な腫瘍細胞はＴＲＡＩＬを含めたＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーによって誘導されるアポトーシスに抵抗性であるという点で幾つかの制限がある。本発明は、その様な制限に対処するものである。
【背景技術】
【０００７】
体内に存在する一定の分子は、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの活性を抑制するような形で機能できることが知られている（その様な化合物を本明細書では「ＴＮＦ抑制物質」と呼ぶ）。例えば、細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質（ｃ−ＦＬＩＰ）、Ｂａｘ阻害剤１及びＢｃｌ−ＸLは、ＴＲＡＩＬのアポトーシス活性を抑制することが報告されている（非特許文献１）。さらに、遺伝子のＡＫＴ及びＭＩＲＳＡも同様にＴＲＡＩＬのアポトーシス活性を抑制することが報告されている。例えば、非特許文献２を参照されたい。
【０００８】
さらに、ＴＮＦ抑制物質の活性を阻害する生体分子は、ＴＲＡＩＬのアポトーシス活性を改善する形で細胞を感受性にするように働くことが知られている。例えば、遺伝子ＡＫＴ及びＭＩＲＳＡを標的にするｓｉＲＮＡを細胞に投与すると、ＴＲＡＩＬのアポトーシス活性に対して細胞を敏感にさせることが示されている。例えば、非特許文献２を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Burns, T.F. and W.S. El-Deiry, J. Biol. Chem., 276: 37879-37886 (2001)
【非特許文献２】Aza-Blanc et al., Molecular Cell, 12: 627-637 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＴＲＡＩＬのアポトーシス活性もまた改善するように機能する手段の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（Ａ）複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の活性を阻害する阻害剤；及び（Ｂ）担体、を含む組成物に関する。
【００１２】
また、本発明は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の活性を阻害する阻害剤及び担体を含む組成物を製造するための方法であって、上記阻害剤と上記担体を混合することを含む方法に関する。
【００１３】
別の側面では、本発明は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の活性を阻害する阻害剤、担体、及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーを含む組成物を製造するための方法であって、上記阻害剤、上記担体及び上記構成メンバーを混合することを含む方法に関する。
【００１４】
本発明の更なる側面は、化合物が複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性の阻害剤か否かを測定するためのアッセイを行う方法であって、複合体ＩＩＩタンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させ、かつ上記化合物と接触させている細胞の生存率を、同様に上記複合体ＩＩＩタンパク質を発現する同じ細胞株由来の細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの非存在下で生育させ、かつ上記化合物と接触させている細胞の生存率を比較することを含む方法に関する。
【００１５】
本発明の更なる別の側面は、化合物が、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性の阻害剤か否かを測定するためのアッセイを行う方法であって、その化合物を、上記タンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させている細胞と、所定の時間接触させること；その化合物を、そのタンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの非存在下で生育させている上記と同じ細胞株由来の細胞と、所定の時間接触させること；そして細胞の生存率を比較すること、を含む方法に関する。
【００１６】
本発明のなお更なる側面は、化合物が、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の活性の阻害剤か否かを測定するためのアッセイを行う方法であって、細胞株由来でそのタンパク質を発現する細胞を、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させること；同じ細胞株由来でそのタンパク質を発現する細胞を、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーの非存在下で生育させること；及び化合物をその細胞と接触させること；そして、所定の時間後、細胞の生存率を比較すること、を含む方法に関する。
【００１７】
本発明のさらにもう１つの側面は、化合物が、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性の阻害剤か否かを測定するためのアッセイを行う方法であって、上記タンパク質を発現する細胞で、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバー及び化合物の両者と接触させている細胞の生存率を、そのタンパク質を発現する同じ細胞株由来の細胞で、化合物と接触させるがＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーとは接触させない細胞の生存率と比較することを含む、方法に関する。
【００１８】
本発明のさらにもう１つの側面は、化合物が複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性の阻害剤か否かを測定するためのアッセイを行う方法であって、細胞株由来でそのタンパク質を発現する細胞を、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバー及び上記化合物と接触させること；同じ細胞株由来でそのタンパク質を発現する細胞を、化合物と接触させるがＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバーとは接触させないこと；そして細胞の生存率を比較すること、を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する抵抗性を与える遺伝子のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法を説明するフローチャートである。概略図は、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する抵抗性のマウスＥ１４ｃＤＮＡライブラリーの遺伝子スクリーニングを示す。ＴＲＡＩＬ抵抗性細胞由来のｃＤＮＡは、単離し、配列を決定して確認した。
【図１Ｂ】マウスＵＱＣＲＣ１（Ｃｏｒｅ１）ｃＤＮＡの部分的アミノ酸配列を、完全長のヒトＵＱＣＲＣ１のｃＤＮＡと対比して示す。両者とも、ミトコンドリア局在配列（ＭＬＳ）を含む。
【図１Ｃ】種々の腫瘍組織におけるＣｏｒｅ１の過剰発現レベルを示す表である（Ascentaデータベースからのデータ）。
【図２Ａ】ドミナントネガティブ型ＦＡＤＤ（ｄｎＦＡＤＤ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は部分Ｃｏｒｅ１を発現するＨＣＴ１１６細胞であって、ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍＬ又は５０ｎｇ／ｍＬ）で処理された、又はＴＲＡＩＬによる処理の無い（０ｎｇ／ｍＬ）細胞の生存率（アネキシンＶ陰性である細胞のパーセントで測定して）を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】ドミナントネガティブＦＡＤＤ（ｄｎＦＡＤＤ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は部分的Ｃｏｒｅ１を発現するＨＣＴ１１６細胞であって、ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍＬ又は５０ｎｇ／ｍＬ）で処理された、又はＴＲＡＩＬによる処理の無い（０ｎｇ／ｍＬ）細胞の生存率（細胞内の分極したミトコンドリアのパーセントで測定して）を示す棒グラフである。
【図２Ｃ】黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は完全長のヒトＣｏｒｅ１（ＦＬ）を発現する安定した細胞株から調製した細胞質画分及びミトコンドリア画分について、Ｃｏｒｅ１、ＣＯＸ１（ミトコンドリア・マーカー）、及びＳＯＤ１（細胞質マーカー）に対する抗体を用いて行ったウェスタンブロットである。
【図２Ｄ】黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は完全長のヒトＣｏｒｅ１（ＦＬ）を発現するＨＣＴ１１６細胞であって、ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍＬ又は５０ｎｇ／ｍＬ）で処理された、又はＴＲＡＩＬによる処理の無い（０ｎｇ／ｍＬ）細胞の生存率（アネキシンＶ陰性である細胞のパーセントで測定して）を示す棒グラフである。
【図３Ａ】黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は完全長のヒトＣｏｒｅ１（ＦＬ）を発現する安定したＨＣＴ１１６細胞株であって、ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理された、又はＴＲＡＩＬによる処理の無い何れかの細胞から調製した画分について、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ３、及びチューブリンに対する抗体を用いて行ったウェスタンブロットである（ローディングコントロールとして、ブロットを剥ぎ取りチューブリンに対する抗体で再検出した）。
【図３Ｂ】黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又はＣｏｒｅ１の何れかを発現する細胞であって、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理された、又はＴＲＡＩＬによる処理の無い（０ｎｇ／ｍＬ）細胞内に存在するシトクロムＣの量を示す棒グラフである。細胞溶解液中のシトクロムＣの量は、ＥＬＩＳＡによって定量した。
【図３Ｃ】処理無し又はＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）又はＦａｓＬ（１６ｎｇ／ｍＬ）による処理、の何れかを受けている、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又はＣｏｒｅ１を発現する細胞の生存率を示す棒グラフである。細胞生存率は、Cell Titer Blueを使用してアッセイした。
【図３Ｄ】処理無し又はカンプトテシン（２００ｎＭ）、タキソテール（１０ｎＭ）若しくはＤＭＳＯによる処理の何れかを受けた、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又は完全長のヒトＣｏｒｅ１を発現する細胞の生存率を示す棒グラフである。細胞生存率は、Cell Titer Blueを使用してアッセイした。
【図４Ａ】リポフェクトアミン単独（コントロール細胞）、Ｎｕｌｌ  ｓｉＲＮＡ（３．７５ｎＭ）又はＣｏｒｅ１  ｓｉＲＮＡ（３．７５ｎＭ）と７２時間インキュベーションしたＨＣＴ１１６の野生型細胞から調製した画分について、Ｃｏｒｅ１及びチューブリンに対する抗体を用いて行ったウェスタンブロットである（ローディングコントロールとして、ブロットを剥ぎ取りチューブリンに対する抗体で再検出した）。
【図４Ｂ】図４Ａに記載した各細胞におけるＣｏｒｅ１の発現レベルを示す棒グラフである。
【図４Ｃ】前もってリポフェクトアミン単独、Ｎｕｌｌ  ｓｉＲＮＡ、又はＣｏｒｅ１  ｓｉＲＮＡで処理し、続いて増加した濃度のＴＲＡＩＬで処理した細胞の生存率を示すグラフである。
【図５Ａ】ヒトＵＱＣＲＣ１ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号１）を示す。
【図５Ｂ】ヒトＣｏｒｅ１のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体ＩＩＩの構成メンバーであるタンパク質のＴＮＦ抑制活性を阻害する阻害剤の使用に関係する。便宜上、その様なタンパク質を、本明細書では「複合体ＩＩＩ」タンパク質と呼ぶ。本発明は、複合体ＩＩＩと会合（is associated with）している形態のタンパク質、並びに複合体ＩＩＩと会合していない形態、例えば単離した（insolated）形態のタンパク質に適用できる。本発明の実施態様では、複合体ＩＩＩタンパク質はＣｏｒｅ１である。
【００２１】
本発明の組成物は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性を阻害する阻害剤の薬学的に有効な量を含む。基本的に、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性を阻害することが出来る如何なる化合物も、本発明の実施に使用することができる。本発明の実施に使用できる化合物の例としては、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードする遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸；複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸をコードする核酸；複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードする遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ；その様なｓｉＲＮＡをコードする核酸；複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１に結合可能な、及びその活性を低下可能な抗体；複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１に結合可能な、及びそのＴＮＦ抑制活性を低下可能な抗体をコードする核酸；複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の発現を低下させることができるリボザイム；複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の発現を低下させることができるリボザイムをコードする核酸；及び複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性を低下させることが出来る低分子化合物、が挙げられる。
【００２２】
阻害剤は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性を阻害するのに有効な濃度で、組成物内に存在する。当業者は、有効な濃度は使用する特定の阻害剤及びその量並びに組成物内の他の成分の性質によって変化することを考慮して、これを決定することができる。ガイドラインとして、たいていの適用は、組成物の約０．０１質量％から約１５質量％の量の阻害剤の使用を含むと考えられる。幾つかの実施態様では、阻害剤は、組成物の約０．０１質量％から約１０質量％の量で、又は組成物の約０．１質量％から約５質量％の量で存在する。
【００２３】
アンチセンス核酸が阻害剤として使用される実施態様では、そのアンチセンス核酸は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の少なくとも一部とハイブリダイズし、それによりそのタンパク質の発現を阻害する。アンチセンス核酸は、また、その一次転写産物のスプライシングを阻害することによって、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードする遺伝子の発現を減少させるものであってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡ又はリボ核酸（ＲＮＡ）若しくは両者を含んでもよい。どのような長さのアンチセンス配列でも、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の発現を阻害できるものならば、本発明の実施には適している。好ましくは、アンチセンス配列は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施態様では、アンチセンス核酸はオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
アンチセンス核酸は、欧州特許第１４０３０８号に記載されているように、例えば、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードする核酸の全部又は一部分の逆方向への発現によって、合成的に製造することができる。Ｃｏｒｅ１をコードする核酸の配列は、図５Ａに提供されている。合成アンチセンス核酸の製造及び使用は、国際特許出願公開第９２／１５６８０号に一般的に記載されている。
【００２５】
アンチセンス核酸は、例えば安定性及び／又は選択性を改善するために、化学的に修飾されてもよい。例えば、そういう修飾の１つには、ホスホジエステル結合の遊離の酸素を置換してホスホロチオエート結合を創るためのイオウ基の使用が含まれる。ホスホロチオエート・アンチセンス核酸は、水溶性、ポリアニオン性であり、そして内因性ヌクレアーゼ抵抗性である。また、ホスホロアミダイト及びポリアミド（ペプチド）結合を有するアンチセンス核酸も合成することができる。その様な核酸は、一般にヌクレアーゼ分解に対して非常に抵抗性である。さらに、アンチセンス核酸の安定性を増強させ、標的部位へのアンチセンス核酸の結合を促進させるために、糖部分の２’炭素及びピリミジンの５位の炭素（Ｃ−５）に化学基を付加することができる。修飾としては、２’デオキシ、Ｏ−ペントキシ、Ｏ−プロポキシ、Ｏ−メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオエート、修飾塩基、並びに当業者が知る他の修飾が挙げられる。
【００２６】
アンチセンス核酸は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードする核酸の発現を阻害するために有効な濃度で組成物中に存在する。
【００２７】
アンチセンス核酸をコードする核酸が阻害剤として用いられる実施態様では、その核酸は、上記の種類のアンチセンス核酸をコードするものである。その核酸は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の発現を阻害するのに有効な量のアンチセンス核酸を発現するための有効な濃度で、組成物中に存在する。
【００２８】
ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）が阻害剤として用いられる実施態様では、ｓｉＲＮＡは、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードするｍＲＮＡの一部分とハイブリダイズし、ｍＲＮＡの発現を認識して阻害するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の中に組み込まれ得る。ｓｉＲＮＡは、タンパク質をコードする核酸の発現を阻害するのに有効な濃度で、組成物中に存在する。
【００２９】
本発明の別の実施態様では、上記のｓｉＲＮＡをコードする核酸は、阻害剤として使用してもよい。
【００３０】
抗体が阻害剤として用いられる実施態様では、抗体はＣｏｒｅ１に結合し、そのＴＮＦ抑制活性を阻害するものである。例えば、抗体は、モノクローナル若しくはポリクローナル、キメラ、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、又はＦａｂ若しくはＦｖの発現ライブラリー産物であってもよい。
【００３１】
ポリクローナル抗体は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の抗原性フラグメント、又は完全なタンパク質に対して調製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、Mishell, B. B., et al., Selected Methods in Cellular Immunology, (W.H. Freeman, ed.) San Francisco (1980)の方法を用いて製造してもよい。本発明のモノクローナル抗体は、抗体に対する免疫応答が開始すること（mounting）から宿主を防ぐために「ヒト化」されてもよい。「ヒト化抗体」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び／又は軽鎖及び／又は重鎖の可変領域フレームワークの他の部分は非ヒト免疫グロブリン由来であり、分子の残りの部分は１つ又はそれ以上のヒト免疫グロブリン由来のものである。ヒト化抗体としては、また、ドナー若しくは受容体の非修飾軽鎖若しくはキメラ軽鎖が会合したヒト化重鎖、又はその逆の場合も同じ、によって特徴付けられる抗体が挙げられる。抗体のヒト化は、業界に知られる方法によって達成することができる（例えば、G.E. Mark and E.A. Padlan, “Chapter 4. Humanization of Monoclonal Antibodies”, The Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113, Springer-Verlag, New York, 1994を参照）。トランスジェニック動物を、ヒト化抗体を発現させるために使ってもよい。
【００３２】
抗体は、一本鎖抗体であってもよい。業界で知られる一本鎖抗体を生産するための技術は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１に対する一本鎖抗体の生産に適合させることができる。
【００３３】
抗体は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の活性を阻害するために有効な濃度で組成物中に存在する。
【００３４】
抗体をコードする核酸が阻害剤として用いられる実施態様では、その核酸は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１と結合してその活性を阻害する抗体をコードするものである。核酸は、タンパク質の活性を阻害するのに効果的な抗体の量を発現するための有効な濃度で、組成物中に存在する。
【００３５】
リボザイム（リボ核酸酵素）が阻害剤として用いられる実施態様では、そのリボザイムは、触媒ドメイン及び基質結合ドメインの両者を含むものである。基質結合ドメインは、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部分とハイブリダイズするものである。触媒ドメインは、ｍＲＮＡを切断できるものである。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様では、リボザイムはハンマーヘッド・モチーフに形成される。他の形態としては、ヘアピン・モチーフ、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン若しくはＲｎａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連した）・モチーフ、又はＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフが挙げられる。ハンマーヘッド・モチーフは、Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8: 183 (1992) に記載されている。ヘアピン・モチーフは、Hampel and Tritz Biochemistry, 28: 4929 (1989)、及び Hampel et al., Nucleic Acids Res., 18: 299 (1990) に記載されている。デルタ肝炎ウイルス・モチーフは、Perrotta and Been, Biochemistry, 31: 16 (1992) に記載され、ＲｎａｓｅＰ・モチーフは、Guerrier-Takada et al., Cell, 35: 849 (1983) に記載され、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイム・モチーフは、Collins に記載され（Saville and Collins, Cell, 61: 685-696 (1990); Saville and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8826-8830 (1991); Collins and Olive, Biochemistry, 32, 2795-2799 (1993)) 、グループＩイントロン・モチーフは、Cech et al.の米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。
【００３７】
リボザイムを調製する１つの典型的な方法は、転写後に標的のＣｏｒｅ１ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列が隣接したリボザイム触媒ドメイン（〜２０ヌクレオチド）を有する、オリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成することである。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、基質結合配列をプライマーとして用いて増幅される。増幅産物は、真核細胞発現ベクター中にクローニングされる。本発明のリボザイムは、適切なＤＮＡベクターから真核細胞内で発現させることができる。必要により、リボザイムの活性は、第２のリボザイムで一次転写産物からそれを放出させて、増加させてもよい（Ohkawa et al.,
Nucleic Acids Symp. Ser., 27: 15-6 (1992); Taira et al., Nucleic Acids Res., 19: 5125-30 (1991); Ventura et al., Nucleic Acids Res., 21, 3249-55 (1993) ）。
【００３８】
リボザイムは、組成物中に、複合体ＩＩＩタンパク質、例えば、Ｃｏｒｅ１をコードする核酸の発現を阻害するのに有効な濃度で存在する。
【００３９】
リボザイムをコードする核酸が阻害剤として用いられる実施態様では、その核酸は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズして切断することができるリボザイムをコードするものである。核酸は、そのタンパク質の発現を阻害する量のリボザイムを産生するのに有効な濃度で、組成物中に存在する。これは、通常の当業者によって決定される。
【００４０】
複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の活性を阻害する低分子化合物が用いられる実施態様では、その化合物は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩの機能を阻害することによって、例えば前述のタンパク質の活性を阻害することによって、細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して敏感にさせるものである。低分子化合物は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１の活性を阻害するのに有効な濃度で、又は腫瘍細胞上のＴＲＡＩＬの作用を、それらの細胞中の複合体ＩＩＩタンパク質の活性と無関係に増強させるのに有効な濃度で、組成物中に存在する。
【００４１】
低分子化合物をコードする核酸が用いられる実施態様では、その核酸は、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性を阻害する低分子化合物をコードするものである。核酸は、そのタンパク質の活性を阻害する量の前述の化合物を産生するのに有効な濃度で、組成物中に存在する。これは、通常の当業者によって決定される。
【００４２】
複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性を阻害するために使用される、アンチセンス核酸又はタンパク質、例えば抗体、リボザイム、又は低分子化合物をコードする核酸の使用を含む上記の実施態様では、その核酸は、核酸のコード部分の発現を調節する１つ又はそれ以上の調節領域を含んでもよい。適切な調節領域又は領域類の選択は型どおりのことであり、通常の当業者のレベルの範囲内である。調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー等が挙げられる。
【００４３】
本発明において使用されるプロモーターには、構成的プロモーター及び調節（誘導性）プロモーターの両者が含まれる。本発明を実施するために有用なプロモーターの例は、偏在性プロモーター（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）；中間径フィラメントプロモーター（例えば、デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）；治療遺伝子プロモーター（例えば、ＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子）；及び組織特異的プロモーター（例えば、平滑筋細胞のアクチンプロモーター、又は血管内皮細胞に活性なＦｌｔ及びＦｌｋプロモーター）である。
【００４４】
組織特異的プロモーターとしては、組織特異性を示す転写調節領域が挙げられ、例えば、膵腺房細胞に活性があるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞に活性があるインスリン遺伝子調節領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）；リンパ球様細胞に活性がある免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444）；精巣、胸部、リンパ及び肥満細胞に活性があるマウス乳癌ウイルス調節領域（Leder et al., 1986, Cell 45:485-495）；肝臓に活性があるアルブミン遺伝子調節領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276）；肝臓に活性があるα−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58）；肝臓に活性があるα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel., 1:161-171）；骨髄性細胞に活性があるβ−グロビン遺伝子調節領域（Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94）；脳の乏突起膠細胞に活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712）；骨格筋に活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）；及び視床下部に活性があるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域（Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378）が含まれる。
【００４５】
本発明を実施するために使用できる他のプロモーターとしては、例えば分裂細胞で優先的に活性化されるプロモーター、刺激に反応するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン調節転写モジュレーター、サイトメガロウイルス前初期、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン、ＳＶ−４０、Ｅ１ａ、及びＭＬＰプロモーターが挙げられる。テトラサイクリン調節転写モジュレーター及びＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターは、国際特許出願公開第９６／０１３１３号、及び米国特許第５，１６８，０６２号及び同第５，３８５，８３９号に記載されている。
【００４６】
本発明の実施態様において、組成物はベクターを含み、このベクターはさらに上記の核酸を含有する。ベクターは、核酸を細胞内に移動させる任意の手段である。用語「ベクター」は、核酸を細胞内に導入するためのウイルス及び非ウイルスの両者の手段を含む。非ウイルス・ベクターとしては、例えばプラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、及び生体高分子が挙げられる。ウイルス・ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノ髄伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクニシア、単純ヘルペス、エプスタイン・バー及びアデノウイルス・ベクターが挙げられる。核酸に加えて、ベクターもまた、選択、測定、及び核酸導入結果（どの組織へ転移したか、発現の持続時間など）の監視に有用な、１つ又はそれ以上の選択可能なマーカーを含んでもよい。
【００４７】
ウイルス・ベクターの使用に関して、それは複製欠損であってもよい。即ち、それは標的細胞において複製することが出来ない。一般に、複製欠損ウイルス・ベクターのゲノムは、感染細胞におけるウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域を欠いている。それらの領域は、当業者が知る何れかの技術で排除する（全部若しくは部分的に）、又は機能できなくすることができる。これらの技術には、全欠損、置換（他の配列による、特に挿入核酸による）、部分的な欠損、又は必須領域（複製のための）への１個又はそれ以上の塩基の付加が含まれる。その様な技術は、インビトロで（単離したＤＮＡで）又はその場で（in situ）元の状態のままで、遺伝子操作の技術を用いて、又は突然変誘発物質による処理によって行うことができる。好ましくは、複製欠損ウイルスが、ウイルス粒子をキャプシドで形成するために必要なゲノムの配列を保持していることである。
【００４８】
レトロウイルスの使用に関して、それらは分裂細胞に感染する組み込みウイルスである。レトロウイルス・ゲノムには、２つのＬＴＲ、キャプシド化配列、及び３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）が含まれる。組み換え型レトロウイルス・ベクターの構築は、例えば欧州特許第４５３２４２号及び同第１７８２２０号、並びにBernstein et al., Genet. Eng., 7: 235 (1985) 及びMcCormick, BioTechnology, 3: 689 (1985) に記載されている。組み換え型レトロウイルス・ベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を一般に全体又は部分的に欠失させ、興味ある異種の核酸配列で置き換える。これらのベクターは、ＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、及びフレンドウイルスなどの異なる種類のレトロウイルスから構築することができる。レンチウイルス・ベクター系も、また、本発明の実施に使用してもよい。レンチウイルス・ゲノムは、全てのレトロウイルスに典型的な、５’から３’に構築された３本の構造遺伝子（ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ）を含む９，０００から１０，０００塩基対のプラス鎖ポリアデニル化ＲＮＡである。レンチウイルス系についての広範な概説は、Fields Virology, Second Edition, Volume 2, Chapter 55, “Lentiviruses,” pp. 1571-1589, Raven Press, New York, 1990 を参照されたい。
【００４９】
一般に、本発明の核酸を含む組み換えレトロウイルスを構築するためには、ＬＴＲ、キャプシド化配列及びコード配列を含むプラスミドが構築される。この構築物は、プラスミドに欠損しているレトロウイルスの機能を同様に（in trans）供給できるパッケージング細胞株にトランスフェクションするために使われる。一般に、パッケージング細胞株は、従って、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現することができる。その様なパッケージング細胞株の、特に細胞株ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ（国際特許公開公報第９０／０２８０６号）及びＧＰ＋ｅｎｖＡＭ−１２細胞株（国際特許公開公報第８９／０７１５０号）は、先行技術に記載されている。また、組み換えレトロウイルス・ベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の修飾並びにｇａｇ遺伝子の一部分を含んでもよい大きなキャプシド化配列を含むことができる（Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639）。組み換えレトロウイルス・ベクターは、通常の技術を有する当業者が知る標準的な技術で精製される。
【００５０】
アデノ髄伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用に関して、それらは比較的小型のＤＮＡウイルスであり、感染する細胞のゲノム内に、安定に且つ部位特異的な様式で組み込むことができる。それらは、広範なスペクトルの細胞に、細胞増殖、形態又は分化に対する影響を誘導することなく感染することができ、そしてヒトの病理には関与していない様に見える。ＡＡＶのゲノムは、クローニングされ、配列の決定及び特徴付けがなされている。それは、おおよそ４７００塩基を包含し、それぞれの末端にウイルスの複製の起点として働くおおよそ１４５塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含む。ゲノムの残りの部分は、キャプシド化機能を担う２つの本質的な領域：ウイルス複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含むゲノムの左側の部分；ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含むゲノムの右側の部分、に分けられる。
【００５１】
インビトロ及びインビボで遺伝子を転移させるためのＡＡＶ由来のベクターの使用については記載がある（国際特許出願公開第９１／１８０８８号及び同第９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号及び同第５，１３９，９４１号；並びに欧州特許第４８８５２８号を参照）。これらの刊行物には、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が欠失され、興味ある遺伝子で置き換えられた様々なＡＡＶ起源の構築物、及びこれらの構築物の、インビトロで（培養細胞内に）又はインビボで（直接生物内に）興味ある遺伝子を転移させるための使用が記載されている。本発明で使用される複製欠損組み換えＡＡＶは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が隣接した興味ある核酸配列を含むプラスミド及びＡＡＶキャプシド化遺伝子を有するプラスミド（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を、ヒトヘルパー・ウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞株中にコトランスフェクション（cotransfecting）することによって調製することができる。生産されたＡＡＶ組み換え体は、次に標準的な技術で精製される。
【００５２】
１つの好ましい実施態様では、本発明で使用されるベクターは、アデノウイルス・ベクターである。アデノウイルスは、多様な細胞種に核酸を効率良く送達するように修飾することができる真核生物ＤＮＡウイルスである。
【００５３】
様々な血清型のアデノウイルスが存在する。本発明の実施に使用するための好適な血清型は、ヒトアデノウイルス２型又は５型（Ａｄ２若しくはＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルスである（国際特許出願公開第９４／２６９１４号を参照）。動物起源のアデノウイルスとしては、例えば、イヌ科、ウシ属、ネズミ科（例：Ｍａｖ１、 Beard et al., Virology 75: 81 (1990)）、ヒツジ、ブタ、鳥類、及びサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが挙げられる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌ科アデノウイルスであり、より好ましくは、ＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、マンハッタン又はＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ  ＲＶ−８００））である。
【００５４】
好ましくは、複製欠損アデノウイルス・ベクターは、ＩＴＲ、キャプシド化配列、及び興味ある核酸を含む。さらにより好ましくは、少なくとも、そのアデノウイルス・ベクターのＥ１領域は機能しないことである。Ｅ１領域の欠失は、好ましくは、Ａｄ５アデノウイルスの配列の４５５番から３３２９番のヌクレオチドまで広がる。また、他の領域、特にＥ３領域（国際特許出願公開第９５／０２６９７号を参照）；Ｅ２領域（国際特許出願公開第９４／２８９３８号を参照）；Ｅ４領域（国際特許出願公開第９４／２８１５２号、同第９４／１２６４９号及び同第９５／０２６９７号を参照）、又は後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のどれか、は修飾されていてもよい。
【００５５】
好ましい実施態様では、アデノウイルス・ベクターは、Ｅ１及びＥ４領域に欠失を有する。別の好ましい実施態様では、アデノウイルス・ベクターは、Ｅ１領域に欠失を有し、そこにＥ４領域及び興味ある核酸をコードする配列が挿入される（フランス特許第９４  １３３５５号を参照）。
【００５６】
好適な何れの技術も、複製欠損組み換えアデノウイルスの調製のために使用することができる。典型的な技術は、Levrero et al., Gene 101:195 (1991)；欧州特許第１８５  ５７３号；及びGraham, EMBO J., 3: 2917 (1984) に記載されている。特に、アデノウイルスと、とりわけ興味ある核酸を担持するプラスミド間の相同組み換えによって、アデノウイルスを調製することができる。相同組み換えは、適切な細胞株に該アデノウイルスとプラスミドとをコトランスフェクションした後で達成される。使用される細胞株は、好ましくは、（ｉ）該要素によって形質転換でき、（ｉｉ）複製欠損アデノウイルスのゲノムの一部を、好ましくは再結合の危険を回避するために組込み型で補完することができる配列を含むべきである。使用できる細胞株の例は、そのゲノム内に組み込まれたＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左側の部分（１２％）を含むヒト胎児腎臓細胞株２９３（Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977) を参照）、及び国際特許出願公開第９４／２６９１４号及び同第９５／０２６０７号に記載されたような、Ｅ１及びＥ４の機能を補完できる細胞株である。組み換えアデノウイルスは、当業者がよく知っている標準の分子生物学的技術を用いて回収し精製される。
【００５７】
いくつかの非ウイルス系が業界で使用されており、核酸の細胞内導入を促進させることができる。
【００５８】
核酸は、リポフェクチンによって、例えばリポソームを使用して、細胞内に導入することができる。陽イオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル化を促進し、同様に、負に荷電した細胞膜との融合を促進することができる（Felgner and Ringold, Nature 337:387-388 (1989)）。特に、核酸の転移に有用な脂質化合物及び組成物は、国際特許出願公開第９５／１８８６３号及び同第９６／１７８２３号、及び米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外来遺伝子をインビボで特定の器官に導入するためのリポフェクチンの使用は、いくつかの実用上の利点を有する。特異的な細胞に対するリポソームの分子標的は、利点の一領域として象徴的である。特定の細胞種への配向的トランスフェクション（directing transfection）は、細胞の不均質性のある組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳において特に有利となる。標的にする目的で、脂質を他の分子に化学的に連結させてもよい。標的のペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体、又は非ペプチド分子をリポソームに化学的に連結させることができる
【００５９】
他の分子の、例えば、陽イオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許出願公開第９５／２１９３１号を参照）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許出願公開第９６／２５５０８号を参照）、及び陽イオン性ポリマー（例えば、国際特許出願公開第９５／２１９３１号を参照）も、また、インビボで核酸のトランスフェクションを達成するために有用である。
【００６０】
裸の核酸ベクター（nacked nucleic acid vector）として細胞に核酸を導入することも同様に可能である（米国特許第５，６９３，６２２号；同第５，５８９，４６６号；及び同第５，５８０，８５号を参照）。遺伝子治療のための裸の核酸ベクターは、業界で知られる、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター・トランスポーターの使用などの方法によって、所望の宿主細胞内に導入することができる（例えば、Wilson et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992)；Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988)； Hartmut et al., カナダ特許第２，０１２，３１１号； Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991) を参照）。受容体介在のＤＮＡ配送手段も同様に使用できる（Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)）。
【００６１】
本発明は、本発明の阻害剤及び担体を含む組成物を提供する。担体は、阻害剤が、活性のある形態、例えば生物学的活性を形態で維持されるものである。例えば、核酸は、複製し、伝達事項を翻訳し、相補的な核酸とハイブリダイゼーションすることができ；ベクターは、標的細胞にトランスフェクションすることができ；抗体は、Ｃｏｒｅ１に結合することができる形態である。一般に、その様な担体は、塩イオンを含む、例えばＴｒｉｓ、リン酸、又はＨＥＰＥＳ緩衝液などの、水性の緩衝液になる。通常、塩イオン濃度は、生理学的なレベルと同じである。ガイドラインとして、ほとんどの適用には、組成物の４０から約９８質量％の量の担体の使用が含まれると考えられる。幾つかの実施態様では、担体は、組成物の約５０から９８質量％の量で存在する。
【００６２】
組成物は、また、安定剤、保存剤、及び他の賦形剤を含んでもよい。
【００６３】
本発明の組成物は、経口及び非経口的手段（例えば、局所的、鼻腔内、皮下、及び眼内の経路）による投与用に製剤化することができる。非経口投与には、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射又は注入技術が含まれることになっている。組成物は、よく知られた非毒性の生理学的に許容される担体、補助剤及びビヒクルを必要に応じて含む投与単位製剤で、非経口的に投与することができる。
【００６４】
好ましい無菌の注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される担体中の阻害剤の溶液又は懸濁液であり得る。薬学的に許容される担体の例には、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、等張生理食塩水（例えば、リン酸二水素ナトリウム又はリン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム、又はそれらの塩の混合物）、リンゲル液、Ｄ−グルコース、水、滅菌水、グリセリン、エタノール、及びそれらの組み合わせがある。１，３−ブタンジオール及び滅菌不揮発性油は、溶媒又は懸濁用媒体として便利に使用される。合成のモノ又はジグリセリドを含めて、無菌の不揮発性油はどれでも使用することができる。オレイン酸のような脂肪酸も、また、注射剤の調製に用いられている。
【００６５】
担体は、また、阻害剤を吸収するスポンジとして作用し得る親水性ポリアクリル酸ポリマーのような生体適合性又は非細胞毒性（ホモ又はヘテロ）ポリマーの何れかから調製されるハイドロゲルであってもよい。その様なポリマーは、例えば、国際特許出願公開第９３／０８８４５号に記載されている。ハイドロゲルは、治療しようとする組織の表面に直接置くことができる。
【００６６】
本発明の別の好ましい実施態様としては、本発明による核酸を含む複製欠損組み換えウイルスを含浸させた、ポロキサマーを担体として含む医薬組成物がある。好ましいポロキサマーは、Poloxamer 407であり、それは市販品で（BASF, Parsippany, NJ）、非毒性の生体適合性のポリオールである。ポロキサマーは、粘性は低いが、本質的にハイドロゲルと同じ利点を有する。
【００６７】
本発明は、本発明の組成物の有効量をヒト又は他の動物に投与することを含む治療方法を提供する。組成物の有効量は、年齢、治療しようとする状態の種類及び重症度、体重、望ましい治療期間、投与方法、及び他のパラメータによって変動する。有効量は、医師又は他の資格のある医学専門家によって決定される。
【００６８】
本発明は、また、化合物が、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１のＴＮＦ抑制活性の阻害剤として機能できるかどうかを測定するための、化合物のアッセイ方法を提供する。アッセイでは、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１を発現し、生来ＴＮＦ誘導アポトーシスに抵抗性であることが知られている細胞であって、ＴＮＦスーパーファミリーの構成メンバー（以下、「ＴＮＦ」）及び化合物の両者と接触している細胞の生存率を、同じ細胞株由来であり、同様にそのタンパク質を発現する細胞であって、化合物と接触しているがＴＮＦと接触していない、コントロール細胞の生存率と比較する。生存率は、細胞の代謝能力（従って、生存率）を、色素のレサズリンを、分光光度計を使用して検出できる強い蛍光を発する形態のレゾルフィンに還元する能力によって測定するCell Titer Blue Assayを用いて測定することができる。
【００６９】
化合物が、ＴＮＦと接触している細胞及びコントロール細胞の両者の生存率を有意に低下させる場合、化合物の活性はＴＮＦと関連していないものとされ、その化合物は興味ある化合物とはされない。化合物が、ＴＮＦと接触している細胞の生存率を有意に低下させるがコントロール細胞の生存率を低下させない場合、その細胞株は前もってＴＮＦに抵抗性であることが知られているので、それは細胞をＴＮＦのアポトーシス活性に対して感受性にするものであるとされる。細胞は複合体ＩＩＩタンパク質を発現しているので、アッセイした化合物は、複合体ＩＩＩタンパク質のＴＮＦ抑制活性を阻害することによって作用すると推論される。
【００７０】
ＴＲＡＩＬ及びアッセイした化合物と接触した細胞の生存率が、コントロール細胞の生存率と比較して少なくとも約３０％より低い生存率しか有さない場合、化合物は細胞の生存率を有意に低下させると考えられる。
【００７１】
本発明の１つの実施態様では、複合体ＩＩＩタンパク質、例えばＣｏｒｅ１を発現し、生来ＴＮＦ誘導アポトーシスに対して抵抗性であることが知られる細胞株由来の細胞を、ＴＮＦの存在下で、例えば２４時間生育させ、そして次にアッセイする化合物と接触させる。同じ細胞株由来のコントロール細胞は、ＴＮＦの非存在下で同じ時間生育させ、同じ化合物と接触させる。次に細胞の生存率を測定して比較する。
【００７２】
本質的に、生来ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して抵抗性であることが知られており、興味ある複合体ＩＩＩタンパク質を発現する、又は例えばそのタンパク質を発現する導入遺伝子をトランスフェクションすることによってそのタンパク質を発現するように修飾されている如何なる細胞株も、このアッセイを行うために使用することができる。その様な細胞株の例は、Ｃｏｒｅ１を安定的に発現するように遺伝子操作されているＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞株である。Ｃｏｒｅ１導入遺伝子は、例えば、この分野で使用される標準的なレンチウイルス、レトロウイルス又はアデノウイルス系の発現ベクターを利用したＨＣＴ１１６細胞の感染によって、導入することができる。本発明は、また、ＴＮＦのアポトーシス誘導活性を抑制する能力を与えるタンパク質の一部分を発現する限り、細胞は完全長のタンパク質を発現する必要が無いことを意図している。従って、細胞は、複合体ＩＩＩタンパク質のその様な一部をコードする核酸だけを含めばよく、又は含むように修飾すればよい。
【００７３】
細胞を、アッセイする化合物に、ナノモルからマイクロモルの範囲の濃度で、３７℃で２４〜９６時間曝露し、そして細胞の生存率は、市販のアッセイ品、例えば、ＷＳＴ−１、ＭＴＴ、及びカスパーゼ３アッセイ品を用いて測定することができる。細胞周期の進行に及ぼす化合物の影響は、ＦＡＣＳ分析又はこの分野で使用される他の標準的な画像を基にしたアッセイによって測定することができる。記載した化合物を基にした全ての実験は、ＴＲＡＩＬの存在下で低酸素状態が細胞死を増強又は誘導するかを試験するために、低酸素条件（１〜２％酸素）下でも同様に行われる。
【００７４】
細胞を、適切な担体溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）中のＴＲＡＩＬを細胞の入った容器に直接添加することによって、約５０から２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＴＲＡＩＬに曝露し、その存在下で最大約９６時間細胞を培養する。
【００７５】
〔実施例１〕
本実施例は、ＴＲＡＩＬが介在するアポトーシスに対する抵抗にＣｏｒｅ１が関与していることの発見について説明する。
マウスＥ１４ｃＤＮＡライブラリーの機能的な遺伝子スクリーニングは、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに感受性であることが知られる細胞株のＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞株を用いて行った（図１Ａ）。スクリーニングによって、Ｃｏｒｅ１をコードするＵＱＣＲＣ１が、ＴＲＡＩＬ介在アポトーシスに対する抵抗に関与することが確認された。
ＨＣＴ１１６細胞（American Type Culture Collection, Manassas, Virginia）及び２９３ＥＢＮＡパッケージング細胞株（Invitrogen）は、別々に、加熱不活化牛胎児血清（ＦＢＳ）（１０％）及びペニシリン−ストレプトマイシン（１％）（Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。
マウス胎齢１４日のレトロウイルスｃＤＮＡライブラリー（George Daley, MIT, Cambridge, Massachusetts からの寄贈）は、ｐＥＹＫレトロウイルス・ベクターにクローニングし、上記の２９３ＥＢＮＡパッケージング細胞にリポフェクトアミン（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後４８〜７２時間に、上清を採集した。上清は、ポリブレン（polybene）（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、感染の４８時間前に平板培養していた上記のＨＣＴ１１６細胞の感染に使用した。感染後４８時間に、１．０×１０6細胞を１５ｃｍディッシュにプレートし、組み換えヒトＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍＬ）（BioMol, Plymouth Meeting, Pennsylvania）用い、４８時間ごとに新鮮培地及びＴＲＡＩＬを添加して、１０日間処理した。ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに抵抗性の個々のクローンを収穫した。
ゲノムＤＮＡは、細胞を消化緩衝液（ＮａＣｌ（１００ｎＭ）、Ｔｒｉｓ（１０ｍＭ）ｐＨ８、ＥＤＴＡ（２５ｍＭ）、ＳＤＳ（０．５％））に再懸濁し、続いて５０℃で１２時間のプロテイナーゼＫ（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）処理によって、抵抗性クローンから単離した。試料は、フェノール−クロロホルム及びエタノール沈殿によって抽出した。次いで、候補のｃＤＮＡをライブラリー特異的プライマーを用いて増幅させるか、又は回収したレトロウイルス・プラスミドをそのまま別のくり返しスクリーニングに使用した。ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する強い抵抗性を与えることが認められた１つの興味ある候補ｃＤＮＡは、ユビキノールシトクロムＣレダクターゼ・コアサブユニット１（ＵＱＣＲＣ１）のｃＤＮＡであり、それはＣｏｒｅ１をコードする（図１Ｂ）。
【００７６】
〔実施例２〕
ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して保護するＣｏｒｅ１の能力をさらに特徴付けるために、スクリーニングで単離したＵＱＣＲＣ１の部分的なｃＤＮＡを含むｐＥＹＫベクターを、ＨＣＴ１１６細胞に直接感染させるために使用した。ＴＲＡＩＬ受容体からのシグナルを阻害するドミナントネガティブＦＡＤＤ（ｄｎＦＡＤＤ）を発現する細胞を、コントロールとして使用した。細胞は、ＴＲＡＩＬ（０，１０又は５０ｎｇ／ｍＬ）で４８時間処理し、アポトーシスの初期マーカーのアネキシンＶをアッセイした（図２Ａ）。ｄｎＦＡＤＤの発現は、５０ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬで７８％の細胞がアネキシンＶ陰性で、又は非アポトーシスで、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスを阻害した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞では、５０ｎｇ／ｍＬでのアネキシンＶ陰性細胞は僅か２％であり、Ｃｏｒｅ１発現細胞の１４．５％に比較して、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスからの保護は７倍増加していた。これは、部分的なＣｏｒｅ１タンパク質の発現がある程度の保護はするが、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスを完全には阻害しないことを示唆する。
【００７７】
〔実施例３〕
Ｃｏｒｅ１はミトコンドリア呼吸複合体ＩＩＩのサブユニットであるので、Ｃｏｒｅ１の発現が、ミトコンドリア介在アポトーシスの重要な工程であるミトコンドリアの脱分極を保護するかどうかを測定する検討を行った。ＴＲＡＩＬ処理中のミトコンドリア膜電位の変化を、ＪＣ−１  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Molecular Probes）を用いて検討した。ＪＣ−１（５,５’,６,６’−テトラクロロ−１,１’,３,３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニン）は、細胞質内に拡散性の緑色蛍光を有するカチオン性色素である。インタクトで、分極したミトコンドリアに依存する、ミトコンドリアへのＪＣ−１の蓄積は、赤色蛍光凝集体を形成する。上記実施例２に記載した細胞について、赤色蛍光に対する緑色蛍光の比を蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）によって分析した。ＦＡＣは、特異的な細胞表面マーカー（例えば、赤色又は緑色蛍光）に基づいて細胞を選別する方法である。上記の比は、分極したミトコンドリアのパーセントとしてプロットした。
ｄｎＦＡＤＤの発現は、ＴＲＡＩＬの全ての濃度で、ミトコンドリアの脱分極を完全に保護したが、ＧＦＰ発現細胞は、ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ／ｍＬ）で僅か７％の分極ミトコンドリアの残存しか示さなかった。部分的Ｃｏｒｅ１の発現は、３８％の分極ミトコンドリアを示し、ミトコンドリアの脱分極からＧＦＰの５倍以上保護した（図２Ｂ）。従って、Ｃｏｒｅ１は、ミトコンドリアの脱分極に対しても同様に保護する。
【００７８】
〔実施例４〕
部分的Ｃｏｒｅ１タンパク質で観察された保護が、その機能を表わすことを確認するために、完全長のヒトＣｏｒｅ１タンパク質をｐＬｅｎｔｉベクター（ＨＡタグを含む）中にクローニングし、Ｃｏｒｅ１を発現する安定した細胞株を得るための、ＨＣＴ１１６への感染に使用した。コントロール細胞は、同様に、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現するように調製した。完全長Ｃｏｒｅ１のタンパク質発現を確認するため、細胞を均質化してミトコンドリア溶解物及び細胞質溶解物を調製し、Ｃｏｒｅ１に対する抗体でウェスタンブロットを行った（図２Ｃ）。内在性のＣｏｒｅ１は、ＹＦＰ及びＣｏｒｅ１発現細胞の両者のミトコンドリア画分に検出された。外来的に発現されたＣｏｒｅ１はＨＡタグで標識され、高い泳動バンドとしてミトコンドリア画分並びに細胞質画分に検出された。この発現パターンは、ＣＯＸ１（複合体ＩＶサブユニットＩ）がミトコンドリア画分のみに検出されたのに対し、細胞質マーカーであるＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）は、細胞質タンパク質をミトコンドリア画分に検出しないので、ミトコンドリアタンパク質が細胞質画分に混入した結果ではない。完全長Ｃｏｒｅ１がＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して同様に保護するかを測定するために、細胞をＴＲＡＩＬで処理し、アネキシンＶ陽性又は陰性の細胞についてＦＡＣＳ分析によってアポトーシスをアッセイした。Ｃｏｒｅ１発現細胞は、５０ｎｇ／ｍＬでＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して２．５倍の保護を示した（図２Ｄ）。これらのデータは、ＨＣＴ１１６におけるＣｏｒｅ１の発現が、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシス及びミトコンドリアの脱分極に対して保護することを示す。
【００７９】
〔実施例５〕
この実施例は、カスパーゼ８、９及び３の活性に及ぼすＣｏｒｅ１の阻害効果を示す。
ＹＦＰ又はヒト完全長Ｃｏｒｅ１を安定に発現する細胞を、ＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理し、溶解し、そして数種のカスパーゼに対する抗体でウェスタンブロットを行った。カスパーゼの活性化は、完全長のプロカスパーゼの、より小さな活性型への切断によって検出した。ヒト完全長Ｃｏｒｅ１を発現するＨＣＴ１１６は、ＹＦＰ発現細胞に比べて、ＴＲＡＩＬ刺激をすると低いカスパーゼ８活性を示した（図３Ａ）。その上、Ｃｏｒｅ１の発現は同じ様に、カスパーゼ９及び３の両者の活性化を低下させた。従って、Ｃｏｒｅ１の発現は、ＴＲＡＩＬ刺激によるカスパーゼ８、９及び３の完全な活性化を阻害する。
【００８０】
〔実施例６〕
この実施例は、ミトコンドリアからシトクロムＣの放出に及ぼすＣｏｒｅ１の効果を示す。
ＹＦＰ又はヒト完全長Ｃｏｒｅ１を安定に発現するＨＣＴ１１６細胞を、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理した。ＹＦＰ又はヒト完全長Ｃｏｒｅ１を発現するコントロール細胞は、ＴＲＡＩＬによる処理をしなかった。その後、細胞を収穫した。浮遊した細胞を含む培地を最初に新しい試験管に除いた。残存する付着細胞は、氷冷したＰＢＳ中で細胞掻器を用いて剥離し、浮遊細胞を含む培地に加えた。細胞は、４℃、１０００×ｇで１０分間遠心してペレットにし、等浸透圧の緩衝液（ショ糖（０．３Ｍ）、Ｔｒｉｓ（１０ｍＭ）ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ錠）に再懸濁させた。氷上で５分間インキュベーションした後、細胞を、約９０％の原形質膜が溶解するまでダウンスホモジナイザーを用いて溶解した。これは、細胞質画分を分離するために行った。細胞溶解の程度は、１０μＬの溶解物をトリパンブルーと混合し、血球計数板上で観測することでモニターした。上清は新しい試験管に移し、４℃、８０００×ｇで１０分間遠心し、ペレット状のミトコンドリアにした。溶解物の濃度は、BioRad DC protein assay (BioRad)又はＢＣＡ法（Pierce, Rockford, Illinois）のいずれかを用いて測定した。シトクロムＣ濃度を定量的に検出するために、溶解物を、Function ELISA cytochrome c kit（Active Motif, Carlsbad, California）を用いてシトクロムＣについてアッセイした（図３Ｂ）。未処理の細胞で、細胞質におけるシトクロムＣの低いベースライン濃度を検出した。ＴＲＡＩＬによる処理によって、ＹＦＰを発現する細胞は、細胞質画分へのシトクロムＣの放出量が１０培増加したが、Ｃｏｒｅ１を発現する細胞のシトクロムＣの放出は僅か半量であった（図３Ｂ）。この検討結果は、Ｃｏｒｅ１の発現が、同様に、ＴＲＡＩＬ処理によってミトコンドリアから細胞質ゾルへ放出されるシトクロムＣの量を減少させることを示唆する。
【００８１】
〔実施例７〕
Ｃｏｒｅ１は、ＴＲＡＩＬによって誘導されたアポトーシスに対して保護したのか又は他の経路によるアポトーシスに対して保護したのかを測定するために、数種の異なるアポトーシス誘導物質で細胞を処理し、細胞の生存率をアッセイした。死受容体を介してシグナルを送るＴＮＦαファミリー構成メンバーでもあるＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、カスパーゼの活性化及びアポトーシスを誘導するために同じアダプター・タンパク質のＦＡＤＤを使用する。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又はヒト完全長Ｃｏｒｅ１を安定に発現する細胞を、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）又はＦａｓＬ（１６ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理した。細胞生存率は、生存能力の指標である細胞の代謝能の測定に指示色素レサズリンの変化を使用するCell-Titer Blue assayを用いてアッセイした。Ｃｏｒｅ１の発現は、ＦａｓＬ誘導のアポトーシスから、ＴＲＡＩＬと同様、約３倍保護した（図３Ｃ）。これは、Ｃｏｒｅ１が、死受容体シグナリングによって誘導されるアポトーシスに対して防御できることを示唆する。
【００８２】
次に、細胞を、非死受容体の経路でアポトーシスを誘導する２種類の化合物で処理した。カンプトテシンはＤＮＡトポイソメラーゼＩを阻害し、最終的にＤＮＡ損傷及び死に至らしめ、一方、タキソテールは微小管解重合の阻害剤であり、細胞分裂を阻止して分裂死に至らしめる。ＹＦＰ又はヒトの完全長Ｃｏｒｅ１を発現する細胞の間で、ジメチルスルホキシド中のカンプトテシン（２００ｎＭ）又はジメチルスルホキシド中のタキソテール（１０ｎＭ）の処理に対して、生存率に違いは見られなかった（図３Ｄ）。これらの結果は、Ｃｏｒｅ１は、ＤＮＡ損傷又は微小管解重合の阻害の何れかによって起こる他の非死受容体介在のアポトーシスに対して保護しないことを示した。これらのデータは、Ｃｏｒｅ１がＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスを調節する役割を演じることを強く示唆しており、Ｃｏｒｅ１がＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して部分的に保護するという観察結果に矛盾しない。
【００８３】
〔実施例８〕
この実施例は、Ｃｏｒｅ１の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの使用について説明する。
内在性のＣｏｒｅ１を含有する（そして、外来性のＣｏｒｅ１を含まない）ＨＣＴ１１６細胞を、トランスフェクションする前に、６ウェルディッシュ当たり１×１０5細胞で、ペニシリン／ストレプトマイシン不含の培地で２４時間平板培養した。細胞に、リポフェクトアミン２０００（Invitrogen）を製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションした。細胞は、リポフェクトアミン単独（コントロール細胞）、ＵＱＣＲＣ１に対するｓｉＲＮＡ（３．７５ｎＭ）（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ）、又は非標的（Ｎｕｌｌ）ｓｉＲＮＡ（３．７５ｎＭ）（Dharmacon, Lafayette, CO）を含むトランスフェクション混合物と７２時間インキュベーションした。タンパク質濃度は、溶解物を調製し、Ｃｏｒｅ１に対する抗体を用いたウェスタンブロットによって測定した（図４Ａ）。ローディングコントロールとして、ブロットを再度剥ぎ取りチューブリンに対する抗体で再検出した。Ｃｏｒｅ１ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、９０％のＣｏｒｅ１タンパク質減少を起こしたが、リポフェクトアミン単独又はＮｕｌｌｓｉＲＮＡの移入は、Ｃｏｒｅ１タンパク質レベルに影響を及ぼさなかった（図４Ｂ）。
【００８４】
上記各グループの細胞は、次に、種々の濃度のＴＲＡＩＬでさらに２４時間処理し、細胞生存率をCell Titer Blue アッセイ（Promega, Madison, Wisconsin）を用いてアッセイした。このアッセイは、細胞の代謝能（従って、その生存率）を色素のレサズリンを強い蛍光を発するレゾルフィンに還元する能力で測定する。Cell Titer Blue試薬（高純度のレサズリンを含む緩衝液）の添加量は、培地の体積の２０％であった。細胞は、３７℃で２〜３時間インキュベーションし、底読み取り蛍光プレートリーダーで５６０ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの蛍光波長を用いてアッセイした。細胞は、３連で培養した。次に細胞は、冷ＰＢＳ（Gibco）で２回洗浄し、１００μＬの氷冷した溶解緩衝液（ＨＥＰＥＳ（５０ｎＭ）ｐＨ７．４、ＮａＣｌ（２５０ｎＭ）、ＥＤＴＡ（２ｎＭ）、TritonX-100（１％）、ＥＤＴＥ不含プロテアーゼ阻害剤（Roche））に溶解した。溶解物は、４℃、３５００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清は、４×ＬＤＳサンプルバッファー（Invitrogen）と混合し、９０℃で１０分間加熱し、そして−２０℃で保存した。アッセイ結果は、図４Ｃに示した。示した結果は、４つの別々の実験の平均である。Ｃｏｒｅ１・ノックダウン細胞の２５ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬでの生存率は、コントロール又はＮｕｌｌトランスフェクション細胞の同濃度での生存率が９０〜９５％であったのと比較して、６０％しか示さなかった（図４Ｃ）。Ｃｏｒｅ１・ノックダウン細胞は、５０ｎｇ／ｍＬで５０％未満の生存率を有していたが、一方Ｎｕｌｌトランスフェクション細胞で５０％の生存率を誘導するためのＴＲＡＩＬの量は２倍を要した。ＮｕｌｌｓｉＲＮＡ単独のトランスフェクションは、リポフェクチン単独よりも、ＴＲＡＩＬに対する感受性に影響を及ぼすように見えるが、このデータはＣｏｒｅ１タンパク質の減少が細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに、特に低濃度で、感受性にすることを明白に示している。これらのデータは、Ｃｏｒｅ１がＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスを調節する役割を担っていることを強く支持する。
【００８５】
〔実施例９〕
この実施例は、化合物がＣｏｒｅ１の活性を阻害するかどうかを測定するためのアッセイについて説明する。
アッセイしようとする化合物は、好適な担体（例えば、ジメチルスルホキシド、エタノール、緩衝化生理食塩水）中の１０μＭの濃度で、Ｃｏｒｅ１ＤＮＡを予め感染させたＨＣＴ１１６細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）に添加した。次に、細胞を、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、適切な濃度のＴＲＡＩＬ（最大で２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で生育させ、２４時間保持した。化合物を、同様に１０μＭの濃度で、Ｃｏｒｅ１ＤＮＡを予め感染させたＨＣＴ１１６細胞に加えた。次に、細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、ＴＲＡＩＬの非存在下（コントロール）で生育させ、２４時間保持した。
【００８６】
次に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、これらの細胞の生存率はＷＳＴ−１アッセイを用いて測定した。ＷＳＴ−１アッセイは、合成基質ＷＳＴの、分光光度計で検出可能な可溶性ホルマザン塩への還元を測定することによって細胞生存率を測定する。Cell Tite Blueアッセイを、ＷＳＴ−１アッセイの代わりに使用してもよい。
【００８７】
化合物が、ＴＲＡＩＬの存在下で生育させた細胞及びＴＲＡＩＬの非存在下で生育させたコントロールの細胞の両者の生存率を有意に低下させる場合、化合物の活性はＴＲＡＩＬとは関連しないものとされ、その化合物は興味ある化合物とはされない。化合物が、ＴＲＡＩＬの存在下で生育させた細胞の生存率を有意に低下させるがコントロール細胞の生存率を低下させない場合、Ｃｏｒｅ１を発現するＨＣＴ１１６細胞は前もってＴＲＡＩＬに抵抗性であることが知られているので、それは細胞をＴＲＡＩＬのアポトーシス活性に対して感受性にするものであるとされる。細胞のＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する抵抗性はＣｏｒｅ１によって引き起こされることが前もって知られているので、アッセイした化合物は、Ｃｏｒｅ１のＴＲＡＩＬ抑制活性を抑制的に作用すると推論される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2009544731.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2009544731.tif 000008
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2009544731.tif 000010
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2009544731.tif 000012
【図４Ａ】
2009544731.tif 000013
【図４Ｂ】
2009544731.tif 000014
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2009544731.tif 000016
【図５Ｂ】
2009544731.tif 000017
【配列表】
2009544731000001.app
【国際調査報告】
2009544731.tif 000018
2009544731.tif 000019
2009544731.tif 000020