(57)【要約】【課題】従来技術の欠点を回避する態様で、宿主細胞の内部にＤＮＡ配列及び（又は）外来性遺伝子物質を挿入する方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、エピソーマルベクターを用いてＤＮＡ配列又は外来性遺伝子を動物精子細胞へ伝達するための方法に関するものである。また、本発明は、遺伝子学的に修飾された個体の生成のために「精子媒介遺伝子伝達（ＳＭＧＴ）」技術を使用する方法に関するものである。
2009511010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列及び（又は）外来性遺伝子を動物細胞へ伝達する方法であって、下記の順に実施される、
エピソーマルタイプのベクター、又は宿主に伝達されて宿主中で発現させられる少なくとも一つのヌクレオチド配列及び（又は）対象の遺伝子配列を有するミニクロモソームを提供する工程と、
生体雄性生殖細胞を提供する工程と、
ベクターの前記細胞との結合を許容し前記雄性生殖細胞の核へのそれのエントリーを随意に許容するように前記エピソーマルベクターで処理された前記生体雄性生殖細胞を培養する工程を含んでいる、ヌクレオチド配列及び（又は）外来性遺伝子を動物細胞へ伝達する方法。
【請求項２】
前記エピソーマルベクターが、少なくとも一つの核骨格／マトリックス固定領域（Ｓ／ＭＡＲ）と少なくとも一つのウイルス性原核生物複製オリジン及び（又は）真核生物複製オリジン（ＯＲＩ）を含んだ安定したエピソーマル複製ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｓ／ＭＡＲ領域が、哺乳綱オリジン、好ましくはヒトオリジンの領域で、８００ｂｐの最小限の長さを有している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｓ／ＭＡＲ領域が、プラスミドｐＴＺ−Ｅ２０からの２．０ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして又はポリリンカー部位において得られる１．７Ｓ／ＭＡＲフラグメントとして隔離されたヒトβインターフェロン遺伝子の５’領域から選択されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オリジンが、ＥＢＶ−ＯＲＩ，ＢＰＶ−ＯＲＩ及びＳＶ４０−ＯＲＩから選択されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターが、プロモーター，オペレーター，ターミネーター及びリボソーム結合部位配列の如き遺伝子エレメントの一つ又はそれ以上を含んでいる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが、特に途中で作用する場合に、何らかのウイルス性プロテインをエンコードしている何らかのヌクレオチド配列から遊離している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターが、一つ又はそれ以上の抗生物質抵抗性遺伝子を更に含んでいる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、代謝的に調節された、構成的細胞周期種，構成的組織種又は誘導プロモーター又はエンハンサーを更に含んでいる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターによって担持された対象遺伝子が、治療に関係するプロテインをエンコードしている遺伝子である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターが、トランスフェクションベクターと関連させられる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが、リポソーマルキャリアの内部に含められている、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターが、核酸結合プロテインによって前記キャリアに結合されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キャリアが、宿主細胞へのエントリー容易性を増進させるために、ヒスチジンを含んだポリペプチドを含んでいる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターが、環状プラスミドｐＥＰＩ−１であり、または、ｐＥＰＩ−ＲＳＶ，ｐＤｉＭＡＲ，ｐＴｅｔＭＡＲ及びｐＭＡＲＳを含むそれの派生物から選択されている、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
雄性生殖細胞を提供する前記工程が、採取時に全体の少なくとも７０％の運動能パーセントを有する精子細胞を選択することと、６５％以上の運動能パーセントを維持させるように精液を続いて除去することを含んでいる、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
精子細胞を選択する前記工程が、射出精液から精子細胞を採取する第一の工程と、その精子細胞の％運動能を同定する第二の工程とを含んでいる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
精子細胞を採取する前記工程が、３７℃に予め暖められた無菌コンテナー中の第二の射精フラクションの３０〜４０％を収集することを含んでいる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記精液除去工程が、
ａ）射出精液サンプルを希釈するために、同射出精液サンプルを適切な洗浄媒体に接触させることと、
ｂ）前記サンプルを前記洗浄媒体から分離させることと、
ｃ）前記サンプルを前記洗浄媒体に再び接触させることと、
ｄ）前記サンプルを前記洗浄媒体から再び分離させることを含んでいる、請求項１７，１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程ａ）に続いて、希釈されたサンプルを３〜１０分間培養する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程ｂ）を、４００ｇと１０００ｇの間の速度で、３分と２０分の間の時間、１６℃と３８℃の間の温度で、遠心分離によって実施する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記洗浄媒体が、濃度が５６ｍＭと６９ｍＭの間であるグルコースと、濃度が３１ｍＭと３７ｍＭの間であるクエン酸ナトリウムと、濃度が１１ｍＭと１４ｍＭの間であるＥＤＴＡと、濃度が１４ｍＭと１７ｍＭの間であるクエン酸と、濃度が４８ｍＭと５９ｍＭとの間であるトリズマ塩基を含んだ組成物であり、最終的なオスモラリティーが、典型的には２００ｍＯｓと３２０ｍＯｓの間で、ｐＨが、６．６〜７．５に調節されている、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記洗浄媒体が、殺菌され、使用前に予め温められている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記洗浄媒体が、カルシウムを含んでいない、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記洗浄媒体が、濃度が１ｇ／ｌと３０ｇ／ｌの間であるプロテインソースを更に含んでいる、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記洗浄媒体のｐＨが６．８の値に調節されている、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項１７〜２８の何れかに従って処理された非ヒト精子細胞へ請求項２〜１６の何れかによるエピソーマルプラスミドベクターを吸収させるための方法であって、適切な媒体において前記ベクターを前記細胞と接触させる工程を含んでいる方法。
【請求項２９】
少なくとも１×１０６精子細胞／ｍｌを、３０分と４時間の間の時間、１７℃と３８℃の間の温度で、請求項２２〜２８の何れかにより、媒体中で１０−２ｕｇから１００ｕｇのエピソーマルベクターで培養する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
遺伝子学的に修飾された非ヒト個体を生成するための方法であって、
ｉ）請求項２８又は２９に従って修飾された精子細胞を、卵子細胞に受精させるために前記卵子細胞に接触させる工程と、
ｉｉ）受精によってもたらされた接合体を遺伝子学的に修飾された個体への発達を許容する条件下に維持させる工程を含んでいる、遺伝子学的に修飾された非ヒト個体を生成するための方法。
【請求項３１】
遺伝子学的に修飾された非ヒト個体であって、その個体の生殖細胞と体細胞が、請求項２〜１６の何れかに記載の、安定したエピソーマル発現ベクター又はミニクロモソームを含んでいる、遺伝子学的に修飾された非ヒト個体。
【請求項３２】
哺乳動物である、請求項３１に記載の遺伝子学的に修飾された非ヒト個体。
【請求項３３】
ブタである、請求項３２に記載の遺伝子学的に修飾された非ヒト個体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞へのＤＮＡ配列及び（又は）外来性遺伝子の伝達方法に関し、特に、精子細胞へのヌクレオチド配列の伝達方法に関するものである。更に、本発明は、遺伝子組換え動物又は遺伝子学的に修飾された個体（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）を作り出すために、卵子細胞を受精させるべく修飾された精子細胞を使用する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え動物又は遺伝子学的に修飾された個体、即ち、外来性ＤＮＡの永久的な導入によってゲノムが修飾された個体を作り出すことは、例えば、遺伝子調節研究、治療目的及び家畜類の生産にとって益々重要になってきている。特に、或る動物は、病原体に対する耐性を有する乳製品を増やすために、新薬の開発における実験的使用のために又は異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のために作り出すことができる。
【０００３】
然しながら、今のところ、そのような動物を作り出すことは、非常に複雑であり、問題がある。
【０００４】
例えば、異種移植は、様々な種に属する個体から採取される細胞，組織及び器官の移植に関係する生物工学及び医学の特別な部門に属する。この部門は、近年知られるようになったが、移植された器官の拒絶に関連する問題があるため、実際の応用において重大な困難に遭遇する。実際に、レシピエントの肉体の免疫系が、移植された器官を外来のものであると認識し、外来性器官の所謂拒絶に至る一連の反応をし始めることが知られている。
【０００５】
臨床異種移植の目的は、拒絶の問題を回避するという条件の下で、ヒトの病に犯されている器官を動物から採取した器官と取り替えることにある。
【０００６】
この問題を、上述したような別の目的のための動物生産に関連する問題と共に解決するために、遺伝子組換え動物、より正確に言えば、ゲノムに通常存在しない特定の遺伝子配列を担持するように遺伝子学に修飾された動物を作り出すことが提案されている。換言すると、拒絶に関連する上述した問題を回避するのに役立つ、プロテインの発現をエンコードするＤＮＡ配列を或る目標動物のＤＮＡに挿入するための試みがある。
【０００７】
一般に、動物細胞に外来性ＤＮＡを挿入するために最も普通に用いられている技術は、接合体の雄性前核に外来性ＤＮＡを顕微注射するというものである。この技術は、マウスにおける成功が証明されているけれども、異種移植及びその他の生物工学にとって非常に有益なブタのような家畜類に関してはなんらの成功も示していない。
【０００８】
Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等は、精子細胞が外来性ＤＮＡと結合してそれを内部に取り込む（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓｅ）（ＤＮＡ吸収）能力を持っているという発見に基づいて、精子細胞自身の遺伝物質のみならず、当該外来性ＤＮＡをも伝達するために精子細胞をベクターに形質変換させるという「精子媒介遺伝子伝達（Ｓｐｅｒｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＳＭＧＴ））」として知られている、遺伝子組換え動物を生産するための代替法を提案している（１９８９年、細胞  ５７，７１７−７２３）。
【０００９】
有益なことに、他の遺伝子導入技術と比較して、上述した方法は、顕微注射器又は顕微操作器のような高価な装置を必要とせず、更に、顕微注射のようなデリケートな操作を必要とせず且つ専門的な技術スタッフを介在させることも必要としない。更に、ＳＭＧＴ法は、不定の割合で接合体に積極的に挿入され発現される遺伝子を有する様々な遺伝子組換え動物に関して、それ自体広く有効であることを示している（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐ．  ａｎｄ  Ｄｅｖ．  ６４：２８４−２９１，２００３年）。
【００１０】
更に、例えば、ブタにおけるように、或る場合に顕微注射によって外来性遺伝子を子孫に頻繁に伝達することは、満足の行く結果を生み出していない。加えて、外来性ＤＮＡは宿主ＤＮＡに無作為に付着して、その結果、時々、ブロックエイジ（ｂｌｏｃｋａｇｅ）又は機能遺伝子の変形した転写に至ることが分かっている。実際に、外来性ＤＮＡ配列の挿入は、全く無作為な態様での宿主ＤＮＡとの組換えによって生じ、それにより、機能遺伝子配列の内部に挿入され、それ故、それの転写を完全に変更させてしまう。更に、ＤＮＡ分子のための組込みベクターは、所謂「遺伝子サイレンシング」現象を受けること、即ち、宿主ゲノムへ挿入した遺伝子の転写及び発現が認められないことが分かっている。
【００１１】
特に、宿主ＤＮＡの変形した転写の問題を未然に防止しようとする試みにおいては、挿入のためのＤＮＡ配列又はそのＤＮＡを含んでいるプラスミドベクターを極めて慎重に設計することが必要であり、ともかく、外来性ＤＮＡが宿主ＤＮＡのどの部位に挿入されてもよいかを予測することができない場合がかなり高い確率で常に存在し、それが一旦伝達されると、外来性ＤＮＡの宿主ＤＮＡへの挿入の結果に対する重要性を予測することができない。
【発明の開示】
【００１２】
従って、本発明の主な課題は、上述した欠点を回避する態様で、宿主細胞の内部にＤＮＡ配列及び（又は）外来性遺伝子物質を挿入する方法を提供することにある。
【００１３】
この課題は、請求項１に記載の方法に従って、宿主遺伝子物質に干渉しない態様で且つ卵子細胞及び変化していない派生胚細胞に伝達されるような態様で、外来性遺伝子物質を宿主に、同様に、雄性生殖細胞へ挿入する方法によって解決される。
【００１４】
従って、本発明の第一の目的は、雄性宿主生殖細胞へ外来性ＤＮＡを安全且つ確実に挿入するための方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の第二の目的は、本発明の第一の目的に従って得ることの可能な精子細胞を用いることを含む、卵子細胞の受精方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の第三の目的は、本発明の第二の目的による受精方法を含む、遺伝子学的に修飾された個体を作り出す方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の更なる利点及び特徴については、単に例示的なものであって本発明を何ら限定するものではない好ましい実施形態について添付図面を参照して説明した以下の記載を参照することにより明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の基本的な考えは、宿主ＤＮＡの複製及び発現に関して完全に自律的であるように外来性ＤＮＡの対応の発現及び複製を確保するために、或るＤＮＡプラスミドベクターの複製及び発現能力及び特性を利用することにある。
【００１９】
そのような能力及び特性は、宿主ＤＮＡに組み込まれていなくて、それ故、上述した欠点を引き起こさない自律・自己複製環状ＤＮＡ構造のなにものでもないエピソーマルベクター（ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）中において観察される。
【００２０】
従って、本発明による方法は、
エピソーマルタイプのベクター又は宿主に伝達されて発現させられなければならない少なくとも一つのヌクレオチド配列及び（又は）対象の遺伝子配列を有するミニクロモソームを提供する工程と、
生体雄性生殖細胞を提供する工程と、
ベクターの結合を許容し前記雄性生殖細胞の核へのそれのエントリーを随意許容するように、前記エピソーマルベクターで処理された前記生体雄性生殖細胞を培養する工程を含んでいる。
［エピソーマルベクターの特性］
【００２１】
エピソーマルベクターは、一般にウイルス性又は非ウイルス性であってよく、宿主細胞ゲノムに組み込まれないで宿主細胞周期中に自己複製することができ且つ宿主自体の娘世代に分離するという利点を有する。
【００２２】
好ましくは、安定したエピソーマル複製を備えたベクターが用いられ、そのベクターは、（段落［００２３］に記述したところに従って隔離され、特徴付けられた）Ｓ／ＭＡＲとして知られている核骨格／マトリックスを固定させて哺乳綱細胞においてベクターの複製のオリジンとして機能するための少なくとも一つの領域を含んでいる。そのようなベクターの或るバージョンは、ウイルスＳＶ４０から派生してベクターの自律複製を確実にする極小のオリジンをも含んでいる。この等級のエピソーマルベクターの複製のためにはＳ／ＭＡＲが存在すれば十分であるので、その極小のオリジンは不要であることが結果的に実証された。とにかく、ベクターは、バクテリア大腸菌におけるベクターの複製のための複製の原核生物オリジン（ＯＲＩ）及び（又は）ウイルスの及び（又は）真核生物の複製オリジンを含んでいてもよい。このタイプのベクターについては、例えば、Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋ等によって説明されている（核酸研究、１９９９年、Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２，  ４２６−４２８）。
【００２３】
Ｓ／ＭＡＲ領域は、真核生物の染色体の染色質を、離散性ドメイン（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｄｏｍａｉｎ）に、特に、ループドメイン（ｌｏｏｐ  ｄｏｍａｉｎ）として知られている位相幾何学的に接続されたドメインに細分させることのできる核酸配列によって代表される（Ｌｕｄｅｒｕｓ，Ｍｅ等、１９９４年、分子細胞生物学、１４，  ６２９７−６３０５）。そのドメインは、核マトリックス又は核骨格において特に累積する配列と境を接している。Ｓ／ＭＡＲとして知られているこれらの配列は、一般に、長さが数百の塩基対で、アデノシン及びチミンが豊富である（約７０％）。後述する発明にとっての好ましいＳ／ＭＡＲ配列は、哺乳類のオリジンのＳ／ＭＡＲ配列、より好ましくは、ヒトのオリジンのＳ／ＭＡＲ配列である。これらのＳ／ＭＡＲ配列は、標準的な手順によって隔離される（Ｋｒａｗｅｔｚ，Ｓ．Ａ．，Ｄｒａｇｈｉｃｉ，Ｓ．，Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，  Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｇ．Ｃ．：核マトリックス付着領域のシリコ、ウエット−ベンチ同一化において（Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ａｎｄ  ｗｅｔ−ｂｅｎｃｈ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００４年，４３９−４５８）。それらの構造については、その特性が明らかにされている（Ｇｏｅｔｚｅ，Ｓ．，Ｇｌｕｃｈ，Ａ．，Ｂｅｎｈａｍ，Ｃ．，Ｂｏｄｅ，Ｊ．：インターフェロンクラスターにおける不安定にされたＤＮＡ領域のコンピュータによる試験管内分析（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒ）。機能的ドメインを予測することの可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ）。生化学  ４２，１５４−１６６，２００３年）。その配列の最小長さは、約８００ｂｐである（Ｊｅｎｋｅ等、ＰＮＡＳ）。例えば、特に好ましい配列を、プラスミドｐＴＺ−Ｅ２０からの２．０ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして（Ｂｏｄｅ等、１９９２  科学  ２５５，１９５−１９７）又はＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩでの切出しによってポリリンカー部位において得られる１．７Ｓ／ＭＡＲフラグメントとして、隔離されたヒトインターフェロンβ遺伝子の５’領域から選択した。
【００２４】
複製ＯＲＩ部位のオリジンの配列については、それは、原核生物，真核生物及びウイルスにおける複製開始のための部位の配列を意味する。
【００２５】
更に、使用されるベクターは、発現ベクター、即ち、一つ又はそれ以上のプロテイン又はペプチドをエンコードする遺伝子が特定の遺伝子調節配列のコントロール下にあるベクターである。そのベクターは、プロモーター，オペレーター，ターミネーター及び正確な転写と翻訳のためのリボソーム結合部位をも備えている。好ましくは、ベクターは、何らかのタイプの細胞トランスフォーメーション又は発現に起因する免疫応答を避けるために、トランス作用複製因子、特にウイルス性の因子のための何らかのヌクレオチド配列を含まないように設計された。
【００２６】
更に、ベクターは、何らかのウイルス性プロテイン、特に、例えば、腫瘍インデューサー及び不死化因子として作用することのできる公知のＳＶ４０ウイルス「ラージＴ抗原」の如き、途中で複製因子として作用することの可能なプロテインをエンコードしている何らかのヌクレチド配列を含んでいないのが好ましい。
【００２７】
複製部位のオリジン（ＯＲＩ）は、ＥＢＶ−ＯＲＩ，ＢＰＶ−ＯＲＩ又は特にＳＶ４０−ＯＲＩとしてウイルス性複製部位、好ましくは、真核生物細胞における増殖のために用いられる複製オリジン部位より得たオリジンから選択することができる。明らかに、当業者は、特定の条件又は要望に従って複製部位の複数のオリジンを挿入するようベクターを修飾することができる。
【００２８】
本発明において用いられるエピソーマルベクターは、一つ又はそれ以上の抗生物質抵抗性遺伝子を更に含んでいる。それらの機能によって、選択することが可能になり、取り扱われる細胞のトランスフェクション又はトランスフォーメーションが起きているか否かをチェックすることが許容される。最も普通に用いられている抗生物質の中で、一例として、カナマイシン，ジェネティシン，ゲンタマイシン，アンピシリン，テトラサイクリン，ストレプトマイシン，スペクチノマイシン，ナリジクス酸，リファンピシン，クロラムフェニコール及びゼオシンを挙げることができる。
【００２９】
特に好ましいタイプの開始ベクターは、ｐＧＦＰ−Ｃ１（ＣｌｏｎｔｅｃｈＵＫ，Ｌｔｄ．）（図１）であり、そこにおいては、複製のＳＶ４０  ＯＲＩオリジンと、段落［００２３］において説明したように隔離され且つ同段落で説明したような特徴を有して２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとしてプラスミドｐＴＸ−Ｅ２０から隔離されたヒトインターフェロンβ遺伝子から得た核骨格／マトリックス固定領域（Ｓ／ＭＡＲ）配列とが挿入されている（図２）。結果的に生じたプラスミドｐＥＰＩ−１の制限酵素地図が図３に示されている（Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋ等、核酸研究、１９９９年、Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．２、４２６−４２８；Ｇｌｏｖｅｒ等、２００５年３月にオンラインで公開された自然観察遺伝学）。
【００３０】
更に、本発明により使用することのできるｐＥＰＩ−１のその他の好ましい派生物は、Ｊｅｎｋｅ等によって公開されたｐＥＰＩ−ＲＳＶ，ｐＤｉＭＡＲ，ｐＴｅｔＭＡＲ及びｐＭＡＲによって代表される（転写単位に連結される核骨格／マトリックス付着領域モジュールは、哺乳綱のエピソームの複製及び維持のために十分である。方法、ＰＮＡＳ、２００４年８月３日、Ｖｏｌ．１０１、Ｎｏ．３１）。
【００３１】
対象のプラスミドを確保するために、市販のプラスミドｐＧＦＰ−Ｃ１又はその他の相似の開始プラスミドに対してなされる修飾は、当業界において広く知られた分子生物学技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９８２年、分子クローニング、ア  ラボラトリー  マニュアル、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー、コールド  スプリング、ニューヨーク）に従って実施したことを茲に指摘する。その分子生物学技術は広く知られているので、茲で更に詳しく述べないこととする。
【００３２】
更に、本発明のベクターは、代謝的に調節される構成的細胞周期種、構成的組織種を含む５’末端に挿入される好適なプロモーター，誘導プロモーター又はエンハンサーによって代表されるプロモーターエレメントを含んでいてもよい。
【００３３】
エピソーマルベクターに挿入することができる対象とされる遺伝子は、例えば、遺伝子ｈＤＡＦ（ヒト崩壊促進因子）のような、治療に関係するプロテインをエンコードしている遺伝子又は研究目的のために或る宿主状態を発達させる遺伝子を含んでいる。
【００３４】
上述したエピソーマルベクターは、コアジュバント（ｃｏａｄｊｕｖａｎｔ），スタビライザー及びトランスフェクションを促進させる物質と共同した精子細胞へのトランスフェクションのためにも用いることができる。更に、エピソーマルベクターと組み合わせて用いた時にトランスフェクションを促進させるトランスフェクションベクターとして知られている特殊なベクターを用いることができる。
【００３５】
本発明に係る特定の好ましい実施形態によれば、ＤＮＡｓｅ作用を防ぐバリアのおかげでトランスフェクションのレベルを更に増加させるために、エピソーマルベクターは、キャリア、例えば、リポソームのような製薬タイプのキャリアの内部に含めてもよい。
【００３６】
更に、リポソーム−エピソーマルベクター複合体は、例えば、ＨＭＧ染色体プロテインのような核酸結合プロテイン又は対象となる組み込み遺伝子の発現を増加させるという利点を有するＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ及びＨ３のようなヒストンを含んでいてもよい。
【００３７】
同様に、リポソームに対するベクターの固定をＣ−末端システインを用いて達成しつつ、原形質膜を通過し易くして宿主細胞へのエントリーを増大させるために、ヒスチジンを含んだポリペプチドを使用することができる。
【００３８】
本発明の一実施形態に依れば、エピソーマルプラスミドベクターを用いる代わりに、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることができる。その構造は、宿主細胞内で一定の低いコピー数で複製及び維持可能であるという点において自然染色体と似ているＤＮＡ分子の構造によって象徴される（Ｇｌｏｖｅ等、２００５年３月１０日にオンラインで公開された自然観察遺伝学）。その染色体の一例が、Ｅｂｅｒｓｏｌｅ等によって説明されている（環状アルフォイドインプットＤＮＡからの哺乳類人工染色体形成はテロメア反復を必要としない。Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ  ９，１６２３−１６３１，２０００年）。
【００３９】
ＨＡＣの生成のための特別のアプローチは、哺乳綱の染色体を切断してアルファーサテライトアレイ（Ａｌｐｈａ−ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ａｒｒａｙ）から成る１−１０Ｍｂの有糸分裂上安定したミニクロモソームへダウンさせることを必要とする（Ｆａｒｒ等、テロメア随伴染色体フラグメンテーション、ＥＭＢＯ  Ｊ．を用いたヒトのＸ派生ミニクロモソームの生成、５４４４−５４５４  １９９５年；Ｈｅｌｌｅｒ等、テロメア−ダイレクテッド染色体ブレークエイジによるヒトのＹ染色体から派生したミニクロモソーム、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、７１２５−７１３０、１９９６年）。ＤＮＡアルファーサテライトは、動原体において見られるヌクレオチド対の約１７０ｂｐ反復配列クラスのものである。
［エピソーマルＤＮＡの構造についての説明］
【００４０】
上述した点に従ったベクター製造方法は、プラスミド又はその他の核酸配列から一領域を分離することと、制限酵素によってプラスミドベクターに挿入又はライゲーションすることを含んでいる。より詳述すると、その方法は、オリジナルベクターに複製因子をエンコードしている一つ又はそれ以上の配列を、段落００２３において述べたように隔離され、特徴付けられた少なくとも一つのＳ／ＭＡＲ領域と置換することを含んでいる。この操作は、制限酵素を用いて前記オリジナル領域を切出して、Ｓ／ＭＡＲフラグメントをベクターに挿入する従来の分子生物学技術を用いて実施することができる。
【００４１】
上述したジェネティックエレメント（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）の全ては、当業者に広く知られた分子生物学技術に従ってエピソーマルベクターに挿入することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２年）分子クローニング、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））。
［精子媒介遺伝子伝達（ＳＭＧＴ）の手順についての説明］
【００４２】
上述したエピソーマルベクターが一旦入手されると、雄性生殖細胞がそのベクターを受けて効果的にパスオン（ｐａｓｓ−ｏｎ）するように雄性生殖細胞を最良に調製することが必要である。
【００４３】
その雄性生殖細胞は、精原細胞から始まるそれらの成熟の何れかの時期の間に集めることができる。
【００４４】
好ましくは、本発明に従って用いられる手順は、精子細胞を確保する第一の工程と、確保した全細胞に対する運動能（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を備えた細胞のパーセンテージに基づいて精子細胞を選択する第二の工程を含んでいる。実際に、ＳＭＧＴ手順は、精子サンプルの質とＤＮＡを吸収する能力（ＤＮＡ吸収力（ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ））とによって代表される二つのパラメータを最大限に活用することに基づくものである。特に、精子細胞は、個体から採取した後に少なくとも７０％、精子液を除くために洗浄した後に６５％以上の運動能を示すように適切に選択する。
［サンプルの質］
【００４５】
サンプルの質は、ゼラチン質量でない体積（ｖｏｌｕｍｅ）（＞１００ｍｌ），濃度（＞１×１０６精虫（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）／ｍｌ），何らかの異常な精子細胞の存在（＜２０％）及び確保時における運動能（＞６５％）のような、雄ブタ精子の評価のための標準化されたパラメータを用いて評価した。特に、％運動能は、２００３年、Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等によって著された「Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．６４：２８４−２９１」に記載の手順（精液の質の評価）に従って評価した。
【００４６】
精子細胞を採取し、低い精虫含量の第一の射精フラクションを捨てて、精虫が豊富であるが、低い精液含量の第二の射精フラクションの最初の３０〜４０％より多い又は少ないフラクションを集めることにより精子細胞を分離させた。更に、選択した射出精液を有効的に確保して、予め暖められた無菌コンテナー中で３７℃の温度に維持させることができる。
［ＤＮＡ結合及び吸収能力］
【００４７】
次に、確保したフラクションを、精液を完全に除去するように処理する。特に、この除去工程は、適切な液体を用いた少なくとも洗浄工程によって実施することができ、その洗浄工程は、好ましくは、例えば無菌ガーゼを通すことによって実施される射出精液のゲル部分の除去工程の後に実施する。
【００４８】
精液の除去は、好ましくは、順次実施される次の工程を含んでいる。
ａ）射出精液サンプルを希釈するために、その精液サンプルを適切な洗浄媒体に接触させる工程と、
ｂ）同サンプルを洗浄媒体から分離させる工程と、
ｃ）同サンプルを洗浄媒体に再び接触させる工程と、
ｄ）同サンプルを洗浄媒体から再び分離させる工程。
【００４９】
工程ａ）に続いて、洗浄媒体の作用を促進させるために、希釈されたサンプルを数分間、例えば、３分〜１０分、好ましくは、５分間、培養するのが有益である。
【００５０】
分離工程ｂ）は、当業界において知られた態様で、好ましくは、遠心分離によって実施することができる。遠心分離は、３分と２０分の間、好ましくは、１０分間、４００ｇ〜１０００ｇ、好ましくは、８００ｇで、１６℃と３８℃の間の温度、好ましくは、２５℃の温度で実施することができる。
【００５１】
工程ｂ）により生ずる上清を除去すると、小球形になった精子細胞が所謂洗浄媒体中で再懸濁され、分離工程ｄ）を、工程ｂ）について上述したのと同じ条件下で実施することができる。好ましくは、遠心分離は、１７℃の温度で実施する。
【００５２】
詳述すると、洗浄媒体は、濃度が５６ｍＭと６９ｍＭの間であるグルコースと、濃度が３１ｍＭと３７ｍＭの間であるクエン酸ナトリウムと、濃度が１１ｍＭと１４ｍＭの間であるＥＤＴＡと、濃度が１４ｍＭと１７ｍＭの間であるクエン酸と、濃度が４８ｍＭと５９ｍＭとの間であるトリズマ塩基（Ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ）を含んだ水性組成物であってもよい。その媒体の最終的なオスモラリティー（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）は、典型的には２００ｍＯｓと３２０ｍＯｓの間であるが、ｐＨは、例えばＨＣｌを用いて６．６〜７．５、好ましくは、６．８に調節する。
【００５３】
好ましくは、上述した洗浄媒体は、オートクレーブ中で殺菌し又はマイクロフィルトレーション（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって殺菌し、使用に先立って３７℃の温度に予め暖める。
【００５４】
本発明の特定の好ましい実施形態に依れば、洗浄媒体が何らかの内在性エンドヌクレアーゼの活性を促進／刺激し、その結果、エピソーマルベクターに有害な影響を及ぼすことを避けるために、洗浄媒体はカルシウムを含んでいない（ｃａｌｃｉｕｍ−ｆｒｅｅ）ことについて銘記すべきである。
【００５５】
更に、洗浄媒体は、濃度が１ｇ／ｌと３０ｇ／ｌの間であるＢＳＡまたは精子細胞の生存のために好適な何らかのその他のプロテインソース（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｕｒｃｅ）を含んでいてもよい。
【００５６】
上述したように、媒体のｐＨは、６．６と７．５の間の値に調節する。ｐＨが６．８の値でＤＮＡの吸収がかなり増大することが観察されたので、ｐＨは６．８であるのが好ましい。
［精子細胞へのエピソーマルベクターの吸収のための手順（ＤＮＡ吸収）］
【００５７】
上述した点に従ってエピソーマルベクターと精子細胞を提供してから実施する後続の工程は、ベクターが細胞と結合してその細胞の核に随意に入って、換言すると、エピソーマルベクターでの精子細胞のトランスフェクションが生ずるようにするために、ベクターを精子細胞と接触させることを含んでいる。
【００５８】
少なくとも１×１０６／ｍｌ、好ましくは、少なくとも１×１０９の最良のベクター「インターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ）」を確保するために、精子細胞を１０−２μｇ〜１００μｇ、好ましくは、５μｇ／１０８精虫／ｍｌのエピソーマルベクターで培養すべきことが分かった。その培養時間は、通常、３０分と４時間の間であり、温度は、１７℃〜３８℃に変化させることができる。
【００５９】
更に、ベクターの添加は、精子細胞の洗浄から６０分以内、より好ましくは、３０分以内に行う。
［遺伝子学的に修飾されたアニマルの生成手順］
【００６０】
この明細書の序盤において述べたように、本発明により形質転換された精子細胞は、この時点で、卵細胞に受精させて、その結果としての接合体が遺伝子学的に修飾された個体に発達するように卵細胞をさせるために用いることができる。その手順は、連続して実施される下記の工程を含んでいる。
ｉ）卵子細胞の受精を可能にするために、上述した方法に従って修飾された精子細胞を卵子細胞に接触させる工程と、
ｉｉ）受精の結果もたらされた接合体を個体の発達を許容するような条件下に維持させる工程。
【００６１】
受精は、好ましくは、例えば腹腔鏡技術（Ｆａｎｔｉｎａｔｉ等、２００５年）のような広く知られた生体内人工精液注入技術によって実施する。
【００６２】
本発明の更なる課題は、生殖細胞及び体細胞が、上述したように安定したエピソーマル発現ベクターを含んでいる、ヒトではない遺伝子学的修飾個体を提供することにある。特に、この個体は、好ましくはブタのような哺乳動物である。
【００６３】
本発明を何ら限定するものではなくて純粋に一例として挙げたに過ぎない、本発明の実施形態について後述する。
［材料及び方法］
［プラスミドベクター］
【００６４】
この実施形態で用いたプラスミドは、ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰ及び市販のプラスミドｐＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＵＫ，Ｌｔｄ．）であり、それからｐＥＰＩベクターを派生させた。双方のプラスミドの地図を、図３及び図１に夫々示した。これら図は、二つのプラスミドが相違していることを示しており、ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰが、段落００２３において記述したように分離して特徴付けられ且つポリリンカー部位におけるヒトインターフェロンβ−遺伝子から得た１．７ｋｂ  Ｓ／ＭＡＲを含み、ｐＧＦＰ−Ｃ１がＧＦＰ遺伝子を含んでいるのに対し、ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰは同じ位置に遺伝子の増強バージョンｅＧＦＰを有している。二つのプラスミドのその他の配列の全ては同一である。それらプラスミドは、大腸菌ノヴァブルー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮｏｖａＢｌｕｅ）（Ｎｏｖａｇｅｎ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））において増幅させた。
［アニマル］
【００６５】
三日間自制した、トレインされたラージホワイト雄ブタ（ｔｒａｉｎｅｄ  Ｌａｒｇｅ  Ｗｈｉｔｅ  ｂｏａｒ）から精液を収集した。ラージホワイトレシピエントである思春期直前の若い雌ブタ（Ｌａｒｇｅ  Ｗｈｉｔｅ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｐｒｅｐｕｂｅｒｔａｌ  ｇｉｌｔ）（９９±１．８０ｋｇ）を過剰排卵させ、ｅＣＧ（１２５０  ＩＵ）（Ｆｏｌｌｉｇｏｎ(商標)、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂ．Ｖ．，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の筋肉内（ｉｍ）注射の６０時間後、ｈＣＧ（７５０ＩＵ）の筋肉内注射によって同調（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅ）させた。排卵は、ｈＣＧ注射後４０〜４４時間必要とされた。子宮−卵管接合部（ｕｔｅｒｏ−ｔｕｂａｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）における外科的な腹腔鏡精液注入（１×１０９ＤＮＡ処理精子／若い雌ブタ（ｇｉｌｔ））を、上述したｈＣＧ注射後に３６時間実施した（Ｆａｎｔｉｎａｔｉ等、２００５年）。アニマルケアー（ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ）及び実験手順は、ローカルガイドライン，ナショナルガイドライン及びヨーロピアンユニオンガイドラインに従った。
[精子の調製]
【００６６】
精液を収集して、上述したように（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等、２００２年；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等、２００３年）、軽微な修飾で、調製した。手短に述べれば、収集直後に、精液を、３７℃に予め暖められたブタ受精媒体（Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｒｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＳＦＭ）（１１．２５ｇのグルコース，１０ｇのクエン酸ナトリウム（２Ｈ２Ｏ），４．７ｇのＥＤＴＡ（２Ｈ２Ｏ），３．２５ｇのクエン酸（Ｈ２Ｏ）及びｐＨ６．８に調節された６．５ｇ／リットルのトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ））で１：１の割合で希釈した。ＳＦＭで精子懸濁液を１：１０の割合で再び希釈し、５０ｍｌファルコンチューブ（５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅ）（Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）において遠心分離させる（１０分間８００ｘｇ）ことにより精液を除去した。洗浄処置を、２０℃に予め暖めた、６ｇ／ｌのＢＳＡフラクションＶで補足されたＳＦＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）（ＳＦＭ／ＢＳＡ）で再び繰り返した。精子細胞を、血球計算チャンバー（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて計算し、２５℃のＳＦＭ／ＢＳＡ中で１×１０８細胞／ｍｌの作業希釈溶液で再懸濁させた。
[精子−ＤＮＡ吸収]
【００６７】
従来のアニマル繁殖プログラムにおいて用いられている標準のパラメーター（体積，精子濃度，異常精子細胞の存在及び運動能）と、外来性ＤＮＡを取り込む精子細胞の能力とに基づいて予め選択された一匹のトレインされた雄ブタ（ｂｏａｒ）から精子を取った。精子によるＤＮＡの取り込みは、タイムコース実験（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）によって評価した。ニックトランスレーションによって標識された５μｇ  ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰプラスミドＤＮＡとｐＧＦＰ−Ｃ１プラスミドＤＮＡと混合された１×１０８細胞／ｍｌ濃度のＳＦＭ／ＢＳＡ（ｍａｎｉａｔｉｓ）で再懸濁された、洗浄された射出精子細胞（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等、２００３年）に関して液体シンチレーションカウンティングを実施した。様々な温度（１７℃，２０℃，２５℃及び３７℃）で、並行したタイムコース実験（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を実施した。最も適切な精子−ＤＮＡ培養状態を決定するために、増量したＤＮＡ（５０ｎｇ，１００ｎｇ，２００ｎｇ，４００ｎｇ及び８００ｎｇ）を使用した。１×１０６精子細胞を含んだアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を、特定の回数、培養混合物から回収し、１ｍｌのＳＦＭを含んだエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅ）中で希釈させ、マイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で５分間１，２５０ｇで遠心分離させることにより二度洗浄した。
[ＳＭＧＴのための精子／ＤＮＡ取り込み及び腹腔鏡精液注入]
【００６８】
洗浄した精子細胞を１時間１７℃で、非線形ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰベクター（５μｇ  ＤＮＡ／ｍｌ／１０８精虫）で培養した。そのチューブを、精子沈殿を防止するために、２０分毎に逆さにした。培養の最後の２０分は、腹腔鏡精液注入前の１分間加熱（３７℃）して室温（ＲＴ）に維持した（Ｆａｎｔｉｎａｔｉ等、２００５年）。同調させた若い雌ブタ（ｇｉｌｔ）を、子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｈｏｒｎ）毎に、５×１０８のＤＮＡ処理精虫を含んだ５ｍｌアリコートで、腹腔鏡技術によって受精させた。胎児の外科的採取を、妊娠の７０日後に、全身麻酔下で実施した。更なる分析のために、様々な器官の標本を収集した。
[ＲＴ−ＰＣＲ分析]
【００６９】
全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）をティッシュキット（Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ）（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡ，Ｇｅｎｔｒａ）によって抽出した。全ＲＮＡのうち、２μｇをスーパースクリプトＩＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡを、次のプライマー（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）ｐＥＰＩ−１：５’−ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡ−３’（前進（ｆｏｒｗａｒｄ）），５’−ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＣＧ−３’（逆（ｒｅｖｅｒｓｅ））で増幅させた。ＰＣＲ製品を、臭化エチジウムで着色した１．５％のアガロースゲル上で分析した。ＲＴ−ＰＣＲ実験をルーチンコントロール（ｒｏｕｔｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）下においた。用いたプライマーは、４８０Ｋｂフラグメントに増幅した。ゲノムＤＮＡ共増幅（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を阻害するリスクは、事前の逆転写を伴わないＰＣＲ反応をさせることにより阻止した。
[ＤＮＡの調製とサザンブロット分析]
【００７０】
組織片から調製されたＨＩＲＴ抽出物（Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋ、１９９９年）からの染色体外ＤＮＡを隔離して分析した。簡潔に述べると、組織を、ＴＥＮ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ／１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５）とＨＩＲＴ（１．２  ％  ＳＤＳ／２０  ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ  ７．５／２０  ｍＭ  ＥＤＴＡ）との１：１の６ｍｌ混合溶液で溶解させた。２０分後に、組織を氷上でダウンスホモナイズ（ｄｏｕｎｃｅｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）させた。０．１体積のＮａＣｌ  ５  Ｍを加えて、組織を＋４℃で一晩中培養した。サンプルを遠心分離機にかけて（３０分、＋４℃、６０００ｒｐｍ）、上清を回収した。ＤＮＡを先ずフェノールで浄化し、次に、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の溶液とクロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）の溶液とで浄化した。ＤＮＡを、０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５体積のエタノールを加えた後に、−２０℃で一晩中沈殿させた。ＤＮＡを、遠心分離によって回収して、０．１ｘ  ＴＥ（ＴＥ：１  ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５）に再懸濁させた。ダイジェストされてない（ｕｎｄｉｇｅｓｔｅｄ）ＨＩＲＴ抽出ＤＮＡ（２０μｌ）とＢｇｌＩＩでダイジェストされたＨＩＲＴ抽出ＤＮＡ（２０μｌ）を、０．７％アガロースゲル上に小分けして、ナイロン膜へブロット（ｂｌｏｔ）した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５年）。ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰベクターを、３２Ｐ（レディトゥーゴーラベリングキット（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で標識して、プローブ（ｐｒｏｂｅ）として使用した。チャーチバッファー（Ｃｈｕｒｃｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（０．２５  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ７．２／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％  ＢＳＡ／７％  ＳＤＳ）中で、１６時間６５℃でハイブリダイゼーションを実施した。厳格な条件下で、対照胎児（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｅｔｕｓ）からのＤＮＡサンプル中ではハイブリダイゼーションは観察されなかった。
[レスキュー実験（Ｒｅｓｃｕｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）]
【００７１】
Ｈｉｒｔ抽出によって調製されたＤＮＡでの大腸菌のトランスフォーメーションを、ＨＩＲＴ  Ｂ（１９６７年、感染したマウス細胞培養菌からのポリオーマＤＮＡの選択的抽出、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；２６（２）：３６５−３６９）に従って実施した。３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んだアガロースプレート上で培養した後に形質転換されたコロニーを選択した。ＤＮＡを、個体の耐性クローン（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｌｏｎｅ）から隔離して、制限分析した。
[共焦点顕微鏡法]
【００７２】
様々な器官のバイオプシーを、ｐＨ７．４の、０．０１Ｍリン酸緩衝塩類（０．０１Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ））中で、２時間４℃で、４％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）で固定し、ＰＢＳ中で、一晩中４℃で徹底的に洗浄し、次に、ＯＣＴマトリックス（ＣｅｌｌＰａｔｈ，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）に埋め込んで、ドライアイスで冷却されたイソペンタン中で迅速に凍らせた。３０μｍのクリオスタット切片をカットし、クロム−みょうばんゼラチン被覆スライド（ｃｈｒｏｍｅ−ａｌｕｍ  ｇｅｌａｔｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｓｌｉｄｅ）上に取り付け、無埃冷却キャビネット中で乾燥させたままにして、ベクターシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で覆ってシールした。スライドを、高解像度デジタルカメラ（Ｃ４７４２−９５，Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）とＨｉＰｉｃソフトウエアー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたツァイス  アキオスコーペ  ２  エピフルオレスセンス  マイクロスコープ（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐｅ  ２  ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。蛍光プロテイン「オアンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）」変異体ＧＦＰ（６０８３−１）の発現を、ＢＰ４５０−４９０励起フィルター（ＢＰ  ４５０−４９０  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）とＦＴ５１０ビームスプリッター（ＦＴ  ５１０  ｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒ）と光路上に配置されたＬＰ５１５エミッションフィルター（ＬＰ  ５１５  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）とにより成る０９ツァイス  フィルター装置（０９  Ｚｅｉｓｓ  Ｆｉｌｔｅｒ  ｓｅｔ）を用いて撮像し、シグナルをグリーンとしてコード化させた。イメージをブライトネス及びコントラストについて調整し、アドービー  フォトショップ（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）（ｖ．  ６．０；Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてプレートとして組み立てた。発現の分析を、コンピュータ支援イメージ分析システム（ＭＣＩＤ  ７．０；Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓ．Ｉｎｃ，Ｃａｎａｄａ）によって実施した。プロテイン発現を分析するために、ＧＦＰシグナルを総数／領域（ｃｏｕｎｔｓ／ａｒｅａ）及び正細胞（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）／カウント領域として測定した。これらの値は、夫々、一定走査領域に関する蛍光ドットの数と、正細胞のパーセンテージを表している。サンプル毎に六つの無作為に選択した切片から平均値を得て、遺伝子学的に修飾されたサンプルと対照サンプルとを比較した。全てのデータを、転送して、シグマ−プロット８．０プログラム（Ｓｉｇｍａ−Ｐｌｏｔ  ８．０  ｐｒｏｇｒａｍ）（ＳＰＳＳ−Ｅｒｋｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて頻度分布ヒストグラム（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）に変換した。遺伝子学的に修飾されたアニマルと対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）とを比較するために、対になったｔ−テスト（ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いた。確率が５％未満（ｐ＜０．０５）であるか又は５％である場合には、誤差は意味のあるものとして許容した。全てのデータを、図６Ｅに描写したように、手段（ｍｅａｎｓ）±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（Ｐ７：１４５±４０；Ｐ１１：１８０±１７；Ｐ１３：１２０±７）として表現した（シグナル／μｍ２）。
[結果]
【００７３】
ドナー選択と精子−ＤＮＡ吸収（Ｓｐｅｒｍ−ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ）
精子ドナーを選択することとＤＮＡ吸収を最大限に活用することは、ＳＭＧＴの好成果を得る上で重要な工程である（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等、２００３年）。精子ドナーとして、ラージホワイト雄ブタ（Ｌａｒｇｅ  Ｗｈｉｔｅ  ｂｏａｒ）を用いた。精液品質を、従来のアニマル繁殖プログラム（方法を参照）において用いられている標準の手順によって評価し、ＤＮＡ吸収を、適切に標識されたｐＥＰＩ−ｅＧＦＰプラスミドとｐＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを用いた液体シンチレーションカウンティングインタイムコース実験（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）によって評価した。図４Ａと図４Ｂは、ニックトランスレーションされた、ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰ環状プラスミド（図４Ａ）とｐＧＦＰ−Ｃ１環状プラスミド（図４Ｂ）の射出されたブタ精子細胞による吸収の時間−経過（ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ）を示している。二つのプラスミドの吸収のキネティックス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は同じであった。双方の場合に、最初の１５〜３０分の間にＤＮＡの殆どの迅速な結合があり、６０分後に停滞状態（ｐｌａｔｅａｕ）になった。選択した雄ブタからの精子細胞のための最良のＤＮＡ培養条件を決定するために、様々なＤＮＡ濃度と温度で並行タイムコース実験を実施した（データは図示せず）。得られた結果は、最適な条件が、１時間、１７℃、１０８精虫／ｍｌのための５μｇのＤＮＡ濃度プラスミドＤＮＡであることを示唆した。選択した雄ブタからの精子細胞は、腹腔鏡精子注入（Ｆａｎｔｉｎａｔｉ等、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、２００５年）によって非ウイルス性エピソーマルベクターｐＥＰＩ−ｅＧＦＰを卵子に伝達するためのベクターとして使用した。器官形成が完全に完了した時に、妊娠の７０日後（妊娠期間の２／３を超える期間）、二匹の雌ブタ（ｓｏｗ）から１８匹の胎児（一方の雌ブタから８匹の胎児、他方の雌ブタから１０匹の胎児）を摘出した。外来性ＤＮＡで培養していない精子によって実施した受精によって更に５匹の胎児（負の対照）を生成した。三度の受精の全てから得られた胎児の腎臓，肝臓，心臓，肺及び筋肉から組織切片を回収し、レポートトランスジーン（ｒｅｐｏｒｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の存在及び発現について調査した。ｐＥＰＩ−ｅＧＦＰベクターは遺伝子学的に修飾したブタの組織中で発現された。ｅＧＦＰレポーター遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価した。全ＲＮＡを、１８匹の全てのアニマルの様々な組織から調製して、ｅＧＦＰ転写産物の存在を調べた。図５Ａと図５Ｂは、胎児Ｐ６，Ｐ７，Ｐ８，Ｐ１１，Ｐ１３，Ｐ２（図５Ａ）の肝臓からのＲＮＡ（図５Ａ）と胎児Ｐ１４，Ｐ１５，Ｐ１６，Ｐ１７，Ｐ１８（図５Ｂ）の筋肉及び心臓からのＲＮＡ（図５Ｂ）とを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析の例を示している。図５Ａ及び図５Ｂ中において、記号Ｍは、分子量のマーカーを示し、記号ＲＴ＋又はＲＴ−は、夫々レトロトランスクリプターゼ酵素（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ）の存在又は不存在におけるレトロトランスクリプション反応（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で予め得られた鋳型上で増幅反応が実施されたことを示し、記号Ｃは、負の対照、即ち、遺伝子学的に修飾されていないアニマル組織を示す。使用したプライマーは、ｅＧＦＰ遺伝子から得て、４８０ｂｐフラグメントに増幅させた。製品は、胎児のオリジンの対照組織から得たＲＮＡを用いたＰＣＲによって増幅しなかった（図５Ａ、レーン（ｌａｎｅ）１，２；図５Ｂ、レーン１，２）。試験した２０匹の胎児のうちの九匹中の少なくとも一つの試験組織中にｅＧＦＰ転写産物が存在していた。一匹の胎児において、分析した全ての組織中にこの転写産物が存在することが実証できたが、他の胎児においては、転写産物は、平均して、試験した組織の１／４と３／４の間存在した。ｅＧＦＰ転写産物は、試験した全ての肝臓の５０％、試験した全ての筋肉の約２７％、試験した全ての心臓の２７％、試験した全ての腎臓の１６％に存在していた。
【００７４】
遺伝子学的に修飾されたと推定される八匹の胎児（Ｐ６〜Ｐ１３）から得た筋肉組織と対照胎児から得た筋肉組織とにおけるｅＧＦＰプロテインの発現を、共焦点顕微鏡検査によって分析した。ｅＧＦＰ発現は、試験した八匹の胎児中の五匹（Ｐ７，Ｐ８，Ｐ１１，Ｐ１３及びＰ６）において実証することができた。ｅＧＦＰプロテイン発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって実証されたように、ｅＧＦＰ転写産物を含んでいることが分かった五匹の全ての胎児中にｅＧＦＰプロテイン発現が認められたが、その他の三匹の胎児中にはｅＧＦＰ転写産物は予め見出せなかった。ｅＧＦＰプロテイン発現のための三匹の正の胎児と三匹の対照胎児を、ｅＧＦＰ発現の量的評価のために選択した。様々なアニマルから得た筋肉組織の組織学的分析は、普通の外観の繊維を示した（図６Ａ）。ｅＧＦＰプロテイン発現は、細胞の６２％と８３％の間の割合で観察することができた（図６Ｂ〜図６Ｄ）。蛍光エミッションの分析は、分離した光の強い蛍光ドットとして現れている（図６Ｂ及び図６Ｄ）、繊維中における蛍光プロテインの離散発現を明らかにしている。プロテイン発現のレベルは、一領域につき蛍光スポットが約１１７個と１７９個の間であるという同じ値範囲内にあったが、全ての胎児において同一ではなかった。対照胎児から取った筋肉組織中には蛍光スポットを検出することができなかった（図６Ａ）。
【００７５】
ｐＥＰＩベクターは、エピソーマル状態に維持させた。ＳＭＧＴによってブタを遺伝子学的に修飾するために用いた非ウイルス性ベクターがエピソームとして胎児中に保持されたか否かを判断するために、Ｈｉｒｔ法（Ｈｉｒｔ，１９６７年）によって、ＤＮＡを三匹の胎児の肝臓組織（Ｐ１１，Ｐ１５），筋肉組織（Ｐ１４）及び腎臓組織（Ｐ１５）から抽出した。ＢｇｌＩＩでダイジェストされ或いはダイジェストされていないＤＮＡサンプルを、アガロースゲル上に小分けし、サザンブロットして、プラスミド全体をプローブとして用いて交配させた。ＤＮＡバンドが試験した全てのサンプルにおいて観察され、ＤＮＡパターンは常に同一であった。ダイジェストされていないＤＮＡサンプルにおいては、ベクターの開環状フォームとスーパーコイル状フォームに夫々対応する二つの異なったバンドが観察され（図７Ａ）、ＢｇｌＩＩでダイジェストされたＤＮＡサンプルにおいては、プラスミドの線形フォームに対応した一つのバンドが観察された。図７Ａにおいて、記号Ｍは、分子量マーカーを示し、記号Ｐは、ＢｇｌＩＩでダイジェストされたプラスミドを示し、数字１と２は、夫々、線形になっている、Ｐ１１サンプル肝臓からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析と、ダイジェストされていない、Ｐ１１サンプル肝臓からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析とに対応し、数字３と４は、夫々、線形になっている、Ｐ１４サンプル筋肉からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析と、ダイジェストされていない、Ｐ１４サンプル筋肉からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析とに対応し、数字５と６は、夫々、線形になっている、Ｐ１４サンプル腎臓からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析と、ダイジェストされていない、Ｐ１４サンプル腎臓からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析とに対応し、数字７と８は、夫々、線形になっている、Ｐ１５サンプル肝臓からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析と、ダイジェストされていない、Ｐ１５サンプル肝臓からＨｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析とに対応している。これらのバンドの強度は非常に弱く、その強度を様々な濃度の隔離されたベクターＤＮＡのハイブリダイゼーションと比較することにより、トランスフェクトされた細胞中に存在するベクターのコピー数が細胞毎に２０コピー未満でなければならないこと（データは図示せず）が判断され、そのコピー数は、このベクターでトランスフェクトされた様々な細胞系統に関して観察した（Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋ，Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ａｔｈａｎａｓｓｉｏｕ）。高分子量のゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションは観察されなかった。Ｈｉｒｔによって抽出されたＤＮＡの分析は、ｐＥＰＩ−ＥＧＦＰプラスミドがエクストラクロモソーマルＤＮＡフラクション（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）に存在していることを暗示している。エピソーマル状態は、それら組織から採取したＨｉｒｔ抽出物から隔離されたＤＮＡで大腸菌を形質転換させるレスキュー実験によって更に確認された。ベクターの低コピー数のためにこのレスキュー実験においては非常に少ないコロニー（３と１０の間）しか得られなかったが、カナマ��シン耐性細菌性コロニーが肝臓サンプル（Ｐ１１，Ｐ１５）及び筋肉サンプル（Ｐ１４）から得られた。これらのクローンから抽出したプラスミドＤＮＡをＢｇｌＩＩでダイジェストさせ又はＢｇｌＩＩとＥｃｏｒＩでダイジェストさせて（ダブル  エンジマティック  ダイジェスチョン（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ））、アガロースゲル上で分析した。全ての場合において、制限パターンは、ｐＥＰＩ−ＥＧＦＰプラスミドのダイジェスチョンにおいて観察された制限パターンと同一だった（図７Ｂ）。図７Ｂにおいて、記号Ｍは分子量マーカーを示し、数字１と２は、夫々、ＢｇｌＩＩで線形にされたｐＥＰＩ−ｅＧＦＰと、ＢｇｌＩＩとＥｃｏｒＩでダイジェストされたｐＥＰＩ−ｅＧＦＰを示し、数字３と４は、夫々、ＢｇｌＩＩで線形にされたＰ１１サンプル肝臓から採取されたコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡと、ＢｇｌＩＩとＥｃｏｒＩでダイジェストされたＰ１１サンプル肝臓から採取されたコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】プラスミドｐＧＦＰ−Ｃ１の概要を示した図である。
【図２】プラスミドｐＴＸ−Ｅ２０の概要を示した図である。
【図３】エピソーマルプラスミドベクターｐＥＰＩ−ｅＧＦＰの概要を示した図である。
【図４Ａ−４Ｂ】ニックトランスレーションされたｐＥＰＩ−ｅＧＦＰ環状プラスミドとｐＧＦＰ−Ｃ１環状プラスミドの吸収についてのタイムコース実験を示した図である。
【図５Ａ−５Ｂ】胎児の肝臓，筋肉及び心臓から採取したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示した図である。
【図６Ａ−６Ｄ】様々な動物から採取した筋肉組織の組織学的分析を示した図である。
【図６Ｅ】一定のスキャンされた領域に関する蛍光ポイントの分布頻度の棒グラフで、いくつかのサンプル中でのＧＦＰ変異体蛍光プロテイン「オワンクラゲ」の発現に関する棒グラフを示した図である。
【図７Ａ−７Ｂ】サザンブロット（図７Ａ）、制限酵素分析（７Ｂ）を受けたハート抽出（Ｈｉｒｔ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｈｉｒｔ，１９６７年））によるエキストラクロモソミックＤＮＡ分析を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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