(57)【要約】リン酸バイオセンサーが開示され、これは、リン酸結合の際の蛍光共鳴エネルギー転移の検出および測定を可能とするドナーおよび蛍光部分に結合したリン酸結合ドメインを含む。かかるバイオセンサーは、生細胞におけるリン酸代謝のリアルタイムモニタリングに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸蛍光指標をコードする単離核酸であって、指標が: 
リン酸結合タンパク質部分; 
リン酸結合タンパク質部分に共有結合したドナー蛍光タンパク質部分; および、
リン酸結合タンパク質部分に共有結合したアクセプター蛍光タンパク質部分; 
を含み、ここで、ドナー部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)が、ドナー部分が励起され、リン酸がリン酸結合タンパク質部分に結合すると変化する、単離核酸。
【請求項２】
ドナーおよびアクセプター部分が該リン酸結合タンパク質部分に遺伝子上で融合している請求項 1の単離核酸。
【請求項３】
ドナーおよびアクセプター部分が該リン酸結合タンパク質部分の末端に遺伝子上で融合している請求項 2の単離核酸。
【請求項４】
ドナーおよびアクセプター部分の一方または両方が該リン酸結合タンパク質部分の内部部位に遺伝子上で融合している請求項 2の単離核酸。
【請求項５】
該リン酸結合タンパク質部分が細菌ペリプラズム結合タンパク質 (PBP) 部分である請求項 1の単離核酸。
【請求項６】
該 PBPが細菌 phoS 遺伝子の産物である請求項 1の単離核酸。
【請求項７】
該リン酸結合タンパク質部分が好熱性微生物由来である請求項 1の単離核酸。
【請求項８】
該好熱性微生物が高度好熱菌または中度好熱菌である請求項 7の単離核酸。
【請求項９】
該微生物がシネココッカスの好熱性種である請求項 7の単離核酸。
【請求項１０】
該リン酸結合タンパク質がシネココッカス由来のPiBPである請求項 9の単離核酸。
【請求項１１】
該リン酸結合タンパク質部分が配列番号1の配列を含む請求項 10の単離核酸。
【請求項１２】
該ドナー蛍光タンパク質部分がGFP、CFP、BFP、YFP、dsRED、CoralHue ミドリイシ・シアン (MiCy)および単量体 CoralHue クサビラ・オレンジ (mKO)からなる群から選択される請求項 1の単離核酸。
【請求項１３】
該アクセプター蛍光タンパク質部分がGFP、CFP、BFP、YFP、dsRED、CoralHue ミドリイシ・シアン (MiCy)および単量体 CoralHue クサビラ・オレンジ (mKO)からなる群から選択される請求項 1の単離核酸。
【請求項１４】
該ドナー蛍光タンパク質部分がCFPであり、該アクセプター蛍光タンパク質部分がYFP Venusである請求項 1の単離核酸。
【請求項１５】
さらに少なくとも１つのリンカー部分を含む請求項 1の単離核酸。
【請求項１６】
該リン酸結合タンパク質部分、該ドナー蛍光部分、該アクセプター蛍光部分および/または該少なくとも１つのリンカーにおける１以上のアミノ酸の欠失、挿入または突然変異をさらに含む請求項 15の単離核酸。
【請求項１７】
該リン酸蛍光指標がリン酸に対する親和性の上昇または低下を示す請求項 16の単離核酸。
【請求項１８】
該リン酸蛍光指標が最大 FRET 比変化の上昇を示す請求項 16の単離核酸。
【請求項１９】
請求項 1の核酸を発現する細胞。
【請求項２０】
リン酸蛍光センサーが該細胞の細胞質ゾルにおいて発現する請求項 19の細胞。
【請求項２１】
リン酸蛍光センサーが該細胞の表面上に発現する請求項 19の細胞。
【請求項２２】
リン酸蛍光センサーが該細胞の核に発現する請求項 19の細胞。
【請求項２３】
原核生物である請求項 19の細胞。
【請求項２４】
真核細胞である請求項 19の細胞。
【請求項２５】
酵母細胞である請求項 24の細胞。
【請求項２６】
動物細胞である請求項 24の細胞。
【請求項２７】
請求項 1の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項 27のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
原核細胞において機能するのに適している請求項 27の発現ベクター。
【請求項３０】
真核細胞において機能するのに適している請求項 27の発現ベクター。
【請求項３１】
請求項 1の核酸を発現するトランスジェニック動物。
【請求項３２】
線虫である請求項 31のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
請求項 1の核酸によってコードされるリン酸結合蛍光指標。
【請求項３４】
以下の工程を含む細胞のサンプルにおけるリン酸レベルの変化を検出する方法: 
(a) 請求項 1の核酸を発現する細胞を提供する工程;および、
(b)該ドナー蛍光タンパク質部分と該アクセプター蛍光タンパク質部分との間のFRETの変化を検出する工程、
ここで、該ドナー部分と該アクセプター部分との間のFRETの変化が細胞のサンプルにおけるリン酸レベルの変化を示す。
【請求項３５】
FRETを測定する工程が、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定することを含む請求項 34の方法。
【請求項３６】
FRETを測定する工程が、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光を測定すること、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定すること、および、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光とアクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光との比を計算することを含む請求項 34の方法。
【請求項３７】
FRET を測定する工程がドナー部分の励起状態寿命を測定することを含む請求項 34の方法。
【請求項３８】
該細胞のサンプルがインビボに含まれている請求項 34の方法。
【請求項３９】
該細胞のサンプルがインビトロに含まれている請求項 34の方法。
【請求項４０】
以下の工程を含む、リン酸のその受容体との結合を調節する化合物を同定する方法: 
(a)請求項 1の核酸を発現する細胞と１以上の被験化合物とをリン酸の存在下で接触させる工程; および、
(b) 該接触させる工程の後に該ドナー蛍光ドメインと該アクセプター蛍光ドメインとの間のFRETを測定する工程、
ここで、該接触させる工程の後のFRETの上昇または低下が、該被験化合物がリン酸結合を調節する化合物であることを示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者:  Wolf B. Frommer、Hong Gu、Sylvie Lalonde、Loron L. Loger, Sakiko Okumoto, Anne-Marie Sharff, Arthur Grossman, Jens Kossmann and Ivor Jacobsen
発明の分野
本発明は一般に、リン酸バイオセンサーの構築および蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を用いるリン酸レベルの変化の測定および検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願との相互参照
本出願は、仮出願第60/643,576号、仮出願第60/658,141号、仮出願第60/658,142号および仮出願第60/657,702号、PCT出願 [代理人整理番号056100-5055、“Sucrose Biosensers and Methods of Using the Same”]、およびPCT出願 [代理人整理番号056100-5054、“Methods of Reducing Repeat-Induced Silencing of Transgene Expression and Improved Fluorescent Biosensors”]に関連し、これらはその内容全体を引用により本明細書に含める。
【０００３】
政府支援の記載
本研究は人間生体メカニズム解明計画助成金番号RGP0041/2004Cにより支援された。政府は本発明についての一定の権利を有しうる。
【０００４】
発明の背景
本明細書中のすべての出版物および特許は、あたかも各々の出版物および特許出願が引用により含まれることを意図して具体的かつ個別に示されるのと同程度に、引用により含まれる。
【０００５】
本出願の出願日に先立ち、本明細書中で考察される出版物は、あくまでそれらの開示を目的として提供される。本明細書においては、先行発明に照らして本発明にかかる出版物に先行する権利が与えられないことの承認として解釈されるべき点は全くない。
【０００６】
リン酸 (Pi)はすべての生物にとって必須の多量養素である。それは細胞におけるほとんどの代謝およびシグナル伝達現象に関与しており、多数の細胞内区画に存在している。それは、核酸、リン脂質およびATP中の構造要素として、エネルギー移動に関与する代謝産物として、シグナル伝達カスケードにおける成分として、そして酵素および代謝工程の制御において、様々な基本的な生物学的機能を果たしている。
【０００７】
アデノシン三リン酸 (ATP) は、細胞における主要な「エネルギー通貨」である。ATPからアデノシン二リン酸 (ADP) ＋ Piへの加水分解により細胞における可算のエネルギー要求工程の燃料となるエネルギーが遊離する。実際、ATPは(グルコース 6-リン酸を生じる)グルコースのリン酸化に必要であり、これはグルコースが解糖系に入るのを可能とする。グルコース 6-リン酸１分子の完全な好気的酸化により30-36 分子のATPが生じる。それゆえ、Piは重要な代謝産物かつ必須の栄養分であり、この分子の濃度は顕著に細胞成長および代謝を変化させることが出来る。したがって、リン酸の細胞内分布および様々なリン酸濃度下での恒常性についてほとんど知られていないということは驚くべきである。
【０００８】
直接的に生細胞内のリン酸レベルを測定可能とするためには、リン酸についてのナノセンサーを得るのが有用であろう。リン酸センサーは創薬および薬物スクリーニングの良好な手段であろう。リン酸レベルの応答は、化学物質、代謝現象、輸送工程、およびシグナル伝達工程に応答してリアルタイムで測定することが出来よう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
最近、ハエジゴクの様に２つの葉(lobe)が基質結合に際して閉じる、多数の細菌ペリプラズム結合タンパク質(PBP)が、代謝産物ナノセンサーの足場としての使用に成功している (Fehr, M., Frommer, W.B., and Lalonde, S. (2002) Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99, 9846-9851; Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M.W., and Frommer, W.B. (2003) In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. J. Biol. Chem. 278, 19127-19133; Lager, I., Fehr, M., Frommer, W.B., and Lalonde, S. (2003) Development of a fluorescent nanosensor for ribose. FEBS Lett 553, 85-89)。今まで開発されてきたPBP ナノセンサーはI型ペリプラズム結合タンパク質を用いて構築されており、ここで、タンパク質のN-およびC- 末端に結合しているフルオロフォアは２つの異なる葉に位置している。
【００１０】
様々なグラム陰性細菌から単離されたリン酸に対するPBP(PiBP)が存在する。例えば、pstS 遺伝子の生成物であるPiBPの合成が、細胞増殖がPi 入手可能性が低いことにより制限されている場合に大腸菌において誘導される。しかし、今までのナノセンサーに用いられてきたI型 PBPと異なり、ペリプラズムリン酸結合タンパク質はII型 PBPに分類され、そのN-およびC- 末端がタンパク質の同じ葉(lobe)に位置する(Tam, R., and Saier, M. H. (1993) Microbiol Rev 57(2), 320-346; Fukami-Kobayashi, K., Tateno, Y., and Nishikawa, K. (1999) J Mol Biol 286(1), 279-290)。リン酸結合タンパク質の結晶構造が研究され、PiBPのモデル化された構造もまた 、N-およびC-末端領域の両方の割当が不明であるにもかかわらず、II型 立体配置を示唆している(Hirshberg, M., Henrick, K., Haire, L. L., Vasisht, N., Brune, M., Corrie, J. E. T., and Webb, M. R. (1998) Biochemistry-Us 37(29), 10381-10385; Ledvina, P. S., Tsai, A. L., Wang, Z. M., Koehl, E., and Quiocho, F. A. (1998) Protein Sci 7(12), 2550-2559)。さらに、リン酸は蛍光をクエンチし、リン酸センサーの分析は潜在的にそれによる問題を有する。それゆえ、リン酸 PBP センサーをI型 PBP センサーに用いられてきた戦略を用いて作ることが可能かどうかは不明であった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明者らは驚くべきことに、ペリプラズムリン酸結合タンパク質がリン酸のためのバイオセンサーの構築に用いることが出来ることを見いだした。本発明はしたがって、生細胞におけるリン酸濃度の変化を検出および測定するのに利用可能なリン酸バイオセンサーを提供する。具体的には、本発明は、リン酸蛍光指標をコードする単離核酸を提供し、該指標は、リン酸結合タンパク質部分、リン酸結合タンパク質部分に共有結合したドナー蛍光タンパク質部分、およびリン酸結合タンパク質部分に共有結合したアクセプター蛍光タンパク質部分を含み、ここでドナー部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET) が、ドナー部分が励起され、リン酸がリン酸結合タンパク質部分に結合すると変化する。本発明の核酸を含む、発現ベクターを含むベクター、および宿主細胞も提供され、核酸によってコードされるバイオセンサータンパク質も提供される。かかる核酸、ベクター、宿主細胞およびタンパク質は、リン酸結合およびリン酸レベルの変化の検出方法ならびにリン酸結合またはリン酸媒介活性を調節する化合物の同定方法において利用できる。
【００１２】
図面の簡単な説明
図 1は、シネココッカス(Synechococcus) PiBPの予測構造およびタンパク質構造および結合部位の両方の上での大腸菌 PiBP (PDB 1a40)とのアラインメントを示す。 (A) 3D-JIGSAW サーバーにより予測され Deepviewによりプロットされたリン酸結合タンパク質構造。基質であるリン酸は明るく、C-およびN- 末端は暗い。 (B)予測タンパク質構造と大腸菌の結晶構造とのアラインメント。(C) 結合部位のアラインメント。唯一の相違は、FLIPPiにおけるGlu70 と大腸菌におけるThr10である。
【００１３】
図 2は、BL21(DE3)goldから精製されたナノセンサーのインビトロ基質誘導FRET変化のグラフを示す。(A)リン酸溶液で滴定された(titrated) FLIPPi-WT。(B) FLIPPi-260nについてのリン酸滴定(titration)曲線。適合曲線は非線形回帰により得られる。
【００１４】
図 3は、 FLIPPi 親和性突然変異体のインビトロ基質誘導FRET変化を示すグラフである。 適合曲線は非線形回帰により得た。
【００１５】
図 4は、親和性突然変異体についての結合特異性アッセイの結果を示すグラフを含む。すべてのセンサーを、硫酸、硝酸、リン酸、ピロリン酸およびATPの溶液で滴定した。 (A) FLIPPi-30m。(B) FLIPPi-200μ。(C) FLIPPi-5μ。(D) FLIPPi-4μ。(E) 対照としてのFLIPglu-600μ。
【００１６】
図 5は、親和性突然変異体についてのさらなる結合特異性アッセイの結果を示すグラフを含む。FLIPPi センサーをグリセロール-1-リン酸およびグルコース-6-リン酸溶液で滴定した。 (A)グリセロール-1-リン酸による滴定。(B)グルコース-6-リン酸による滴定。
【００１７】
図 6は、10 μM、50 μM および 100 μM リン酸灌流に応答してのCHO 細胞におけるFLIPPi-30m ナノセンサーのFRET 比変化を示す。各リン酸灌流は 2分であり、リン酸非含有改変Tyrode’ 塩類溶液により3分の洗浄をその後に行った。箱中の数字は用いたリン酸溶液の濃度を示す。
【００１８】
図 7は、様々な種のPiBP タンパク質の間の関係を示すPAUPにより作成した系統樹を示す。
【００１９】
図 8は、結合したフルオロフォアからの物質の欠失を含む短くした FLIPPi-WT ナノセンサーの欠失および構造を示す図である。
【００２０】
発明の詳細な説明
以下の説明は、本発明の理解において有用でありうる情報を含む。本明細書中に提供される情報のいずれかが先行技術であるかまたは今回特許請求される発明に関連していること、あるいは具体的もしくは暗黙的に参照される任意の出版物が先行技術であることは承認されたことではない。
【００２１】
本発明の他の目的、利点および特徴は、当業者にとっては本明細書中に提供される明細書および図面をレビューする際に明白なものになる。したがって、本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載から明白なものになる。
【００２２】
ペリプラズムリン酸結合タンパク質 (PiBP)
Piのグラム陰性細菌への取り込みは、このアニオンの、ペリプラズムに局在するPi-結合 タンパク質 (PiBP)との結合により開始する。糖類、オキシアニオン、アミノ酸およびオリゴペプチドの取り込みにおいて機能することが知られている類似の結合タンパク質は20以上存在する。pstS遺伝子の産物であるPiBPの合成は、細胞増殖が低いPi入手可能性によって制限されている場合に大腸菌において誘導される。PiBPは一塩基 (H2PO4-)および二塩基 (HPO42-) リン酸の両方に対する特異的結合を示し(Wang, Z. M., Choudhary, A., Ledvina, P. S., and Quiocho, F. A. (1994) J Biol Chem 269(40), 25091-25094)、そのKd は0.8 nMである (Medveczky, N., and Rosenberg, H. (1970) Biochim Biophys Acta 211(2), 158)。解離速度定数はpH 7.0 および低イオン強度において21 s-1である (Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., and Webb, M. R. (1994) Biochemistry-Us 33(27), 8262-8271)。
【００２３】
PiBPは可動性ヒンジを作るペプチドセグメントによって連結される２つの球状ドメインからなる(Ledvina, P. S., Yao, N. H., Choudhary, A., and Quiocho, F. A. (1996) P Natl Acad Sci USA 93(13), 6786-6791)。Piの非存在下においては、球状ドメインは離れており、可溶性代謝産物と接近可能な裂け目（cleft）を露出している。タンパク質の立体構造変化はPiが結合すると起こり、その際、球状ドメインは互いに近接し、Piの結合は、Piと裂け目（cleft）のアミノ酸との水素結合の結果、より強くなり(Luecke, H., and Quiocho, F. A. (1990) Nature 347(6291), 402-406)、結合ポケットは溶媒環境と接近不可能となる。上記のように、PiBPはII型 PBPとして分類されており、そのN-およびC-末端はタンパク質の同じ葉(lobe)に位置している。
【００２４】
PiBP DNA 配列は、公共データベース、例えば、NCBI ウェブサイトから得ることが出来るし、あるいは当該技術分野で周知の技術を用いて目的のあらゆるグラム陰性細菌からクローニングすることができる。ラン藻は好熱性および超好熱性細菌とともにPiBP 配列のよいソースである。というのはこれら細菌から単離されたタンパク質は、極限温度、pH または化学物質へ曝露されるなどの条件下で高い安定性を示すからである。その内容全体を引用により本明細書に含める出願番号 60/658,142を参照されたい。PAUPによって作成した、様々な種のPiBP 配列間の関係を示す系統樹を図 7に示す。
【００２５】
例えば、本発明を例証するために、シグナル配列を有さない予測成熟タンパク質をコードする切断型(truncated)PiBP(タンパク質受入 NP_415188)を、イエローストーン国立公園の温泉から単離したシネココッカスの好熱性株からPCRにより増幅した。プライマー、 5’- ATTGGTACCGTAGGATTTCTAACAGCG -3’ (配列番号1)および5’  ATAGGTACCGTTAACGGTGATGGAATC  3’ (配列番号2)を用いてゲノムDNAから増幅した配列は、配列番号3の配列を有し、シグナル配列を含む。シネココッカス菌種(sp.) PiBPの配列は、大腸菌のPiBP (pstSによりコードされる: PDB 1a40)と36.9%同一であり (De Lorimier, R. M., Smith, J. J., Dwyer, M. A., Looger, L. L., Sali, K. M., Paavola, C. D., Rizk, S. S., Sadigov, S., Conrad, D. W., Loew, L., and Hellinga, H. W. (2002) Protein Sci 11(11), 2655-2675)、これら２つのタンパク質は非常によく似た推定三次構造を有する (図 1参照)。
【００２６】
バイオセンサー
本発明は蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を用いてリン酸濃度の変化を検出および測定するためのリン酸バイオセンサーを提供する。「リン酸」という用語は一塩基 (H2PO4-)および二塩基 (HPO42-) リン酸の両方ならびに、受容体が存在するその他のあらゆる形態のリン酸を含む。
【００２７】
具体的には、本発明はリン酸結合蛍光指標をコードする単離核酸およびそれによってコードされるリン酸蛍光指標を提供する。一つの態様は、とりわけ、リン酸結合蛍光指標をコードする単離核酸であって、指標が、リン酸結合タンパク質部分、リン酸結合タンパク質部分に共有結合したドナー蛍光タンパク質部分およびリン酸結合タンパク質部分に共有結合したアクセプター蛍光タンパク質部分を含み、ここで、ドナー部分とアクセプター部分との間のFRETがドナー部分が励起され、リン酸がリン酸結合タンパク質部分に結合すると変化する、単離核酸である。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「共有結合している」とは、ドナーおよびアクセプター蛍光部分がリガンド結合タンパク質部分に化学結合を介して、例えば、該リガンド結合タンパク質部分における選択されたアミノ酸に結合していることを意味する。共有結合しているとは、また、ドナーおよびアクセプター部分がリガンド結合タンパク質部分に、リガンド結合タンパク質部分がドナーおよびアクセプター部分を含む融合タンパク質として発現するように遺伝子上で融合していることも意味する。本明細書に記載するように、ドナーおよびアクセプター部分は、ドナー部分とアクセプター部分との間のFRETが、ドナー部分が励起され、リン酸がリン酸結合タンパク質部分に結合すると変化する限り、リン酸結合部分の末端に融合していてもよいし、リン酸結合部分の内部部位に融合していてもよい。
【００２９】
好ましいリン酸結合タンパク質部分は、とりわけ、配列番号4の配列を有するシネココッカス PiBP タンパク質からのリン酸結合タンパク質部分である。リン酸結合領域をコードするPiBP DNA 配列のいずれの部分も本発明の核酸において用いることが出来る。PiBP またはその他の生物、例えば、好熱性および超好熱性生物を含むグラム陰性細菌からのそのあらゆるホモログのリン酸結合部分が、本明細書に記載するベクターにクローニングでき、開示されるアッセイにしたがって活性をスクリーニングすることが出来る。
【００３０】
PiBPの天然の種変異体も、測定可能なリン酸結合機能を維持する、部位特異的突然変異、欠失または挿入を含む人工操作された変異体に加えて用いることが出来る。本発明の核酸コンストラクトにおける使用に好適な変異体核酸配列は、PiBPの遺伝子配列に対して好ましくは少なくとも 30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、または99%の類似性または同一性を有する。適切な変異核酸配列はまた、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でPiBPの遺伝子にハイブリダイズしうる。高度にストリンジェントな条件は当該技術分野で既知であり、例えばManiatis et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2d Edition、1989、およびShort Protocols in Molecular Biology、ed. Ausubel、et al.（双方とも本明細書において引用により含まれる）を参照のこと。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、かつ異なる環境下で異なることになる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)（引用により本明細書中に含まれる）において見出される。一般にストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、ｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、（標的配列がＴｍで過剰に存在し、プローブの５０％が平衡時に占有される際に）標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）、ならびに温度が短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃という条件となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって得られる場合がある。
【００３１】
開示されたナノセンサーにより測定可能なリガンド濃度の範囲を拡大するために、本発明の好ましい人工変異体が、リガンドに対する低い親和性を示すように設計される場合がある。リガンドに対する結合親和性の低下または増大を示すさらなる人工変異体は、ランダムまたは部位特異的変異誘発および他の既知の変異誘発技術によって構築され、本明細書に記載のベクターにクローニングされ、活性について開示されたアッセイに従いスクリーニングされうる。開示されたバイオセンサーの結合特異性はまた、バイオセンサーによって認識されるリガンドを改変するように変異誘発によって改変されうる。例えば、Looger et al.、Nature、423 (6936): 185-190を参照のこと。硫酸およびリン酸 PBPの類似性により、硫酸結合タンパク質から部位特異的突然変異誘発を用いてリン酸結合タンパク質を作ることも可能であり得る。
【００３２】
本発明のセンサーを、ドナーおよびアクセプター蛍光部分に共有結合または融合したリン酸結合部分および１以上のさらなるタンパク質結合部分を有するように設計して、活性が２以上のリガンドによって制御されるアロステリック酵素を作ることが出来る。２以上のリガンドに対する二重特異性を含むアロステリック酵素は当該技術分野において記載されており、本明細書に記載するFRET バイオセンサーの構築に用いることが出来る(Guntas and Ostermeier、2004、J. Mol. Biol. 336(1): 263-73)。
【００３３】
本発明の単離された核酸は、FRETにおけるドナーおよびアクセプター部分として協働可能なあらゆる適切なドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質部分を組み込んでいてもよい。好ましいドナーおよびアクセプター部分は、GFP（緑色蛍光タンパク質）、CFP（シアン蛍光タンパク質）、BFP（青色蛍光タンパク質）、YFP（黄色蛍光タンパク質）、およびこれらの増強された変異体よりなる群から選択され、ここでは特に好ましい実施形態が、ドナー/アクセプター対CFP/YFP Venus（これは改善されたｐＨ耐性および成熟期間を有するYFPの変異体である）（Nagai, T., Ibata, K., Park, E.S., Kubota, M., Mikoshiba, K., and Miyawaki, A. (2002)  A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90）によって提供される。それ以外として、より高いｐＨ安定性およびより大きいスペクトル分離を有するMiCy/mKO対が挙げられる（Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H, Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 2004 381:307-12）。さらに、ドナーまたはアクセプターとして適するものに、ディスコソマ（Discosoma）種に由来する天然DsRed、別属に由来するDsRedのオルソログ、または最適化された特性を有する天然DsRedの変異体（例えば、K83M変異体またはDsRed2（Clontechから入手可能））が挙げられる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分を選択する場合に考慮すべき基準は、例えば米国特許第6,197,928号（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に開示のように当該技術分野で既知である。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「変異体」という用語は、少なくとも 約 30%、40%、50%、60%、70%、より好ましくは少なくとも 75%の同一性、例えば少なくとも 80%、90%、95%またはそれを超える同一性をネイティブな蛍光分子に対して有しているポリペプチドをいう。多くのかかる変異体が当該技術分野において知られており、あるいはネイティブな蛍光分子のランダムまたは指向性突然変異誘発によって容易に作ることが出来る(例えば、Fradkov et al.、FEBS Lett. 479:127-130 (2000)参照)。 
【００３５】
本発明者らは、最近、バイオセンサーのフルオロフォアが類似または関連配列のストレッチを含む場合、遺伝子サイレンシングが特定の細胞内および特に生物全体内でのバイオセンサーの発現に不利に作用しうることを発見している。かかる場合には、フルオロフォアの核酸配列が修飾されてもコード化されたアミノ酸配列は変化しないように、フルオロフォアのコーディング配列を各フルオロフォアのコドンの１つもしくは複数の縮重またはゆらぎ位置で修飾することが可能である。あるいはフルオロフォアの機能に不利に作用しない、１つもしくは複数の保存的置換もまた取り込まれる場合がある。PCT出願［代理人整理番号第056100-5054号、Methods of Reducing Repeat-Induced Silencing of Transgene Expression and Improved Fluorescent Biosensors］（その全体が引用により本明細書中に含まれる）を参照のこと。
【００３６】
FRET のための発光量子ドット (QD) (Clapp et al.、2005、J. Am. Chem. Soc. 127(4): 1242-50)、色素を使用することも可能であり、例えばこれらに限定されないが、TOTO色素（Laib and Seeger、2004、J Fluoresc. 14(2):187-91）、Cy3およびCy5（Churchman et al.、2005、Proc Natl Acad Sci U S A. 102(5): 1419-23）、テキサスレッド（Texas Red）、フルオレセイン、およびテトラメチルローダミン（TAMRA）（Unruh et al.、Photochem Photobiol. 2004 Oct）、AlexaFluor 488、ならびに蛍光タグ（例えば、Hoffman et al., 2005, Nat. Methods 2(3): 171-76を参照）が挙げられる。
【００３７】
本発明は、本明細書に記載のバイオセンサーポリペプチドをコード化する単離核酸分子を含むベクターをさらに提供する。例示的なベクターは、バクテリオファージ、バキュロウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにコスミドまたはプラスミドなど、細菌あるいは細菌の配列と他の生物由来の配列の組み合わせに由来するベクターを含む。かかるベクターは、バイオセンサーをコードする核酸配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む発現ベクターを含む。ベクターは、大腸菌(E.coli)もしくは他の細菌などの原核細胞内、または動物細胞または植物細胞を含む真核細胞内での機能に適合されうる。例えば、本発明のベクターは、一般に、対象とする宿主細胞に適合する複製起点、対象とする宿主細胞に適合する１つもしくは複数の選択可能なマーカーおよび１つもしくは複数のマルチクローニングサイトなどの要素を含むことになる。ベクター内に含めることを意図した特定の要素の選択は、例えば誘導または調節可能なプロモーター、ベクターの所望のコピー数、所望の選択系などの使用を通じ、対象とする宿主細胞、インサートのサイズ、挿入配列の調節された発現が望ましいか否かなどの因子に依存することになる。異なる用途における宿主細胞とベクターの間の適合性を保証することに関連する因子は、当該技術分野で周知である。
【００３８】
本発明での使用を目的とする好ましいベクターは、ドナーおよびアクセプター蛍光分子をコード化する核酸間のリン酸結合ドメインまたは受容体のクローニングを可能にし、ドナーおよびアクセプター蛍光分子に共有結合されたリン酸結合ドメインを含むキメラまたは融合タンパク質の発現をもたらすことになる。例示的なベクターは、Fehr et al. (2002) (Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99, 9846-9851)、（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に開示された細菌のpRSET-FLIP誘導体を含む。融合タンパク質を発現するような正しいフレームで核酸をベクターにクローニングする方法は、当該技術分野で周知である。
【００３９】
本発明のリン酸バイオセンサーは、細胞のいずれの位置で発現させてもよく、例えば、細胞質、細胞表面または細胞内オルガネラ、例えば、核、小胞、ER、液胞等が挙げられる。タンパク質の発現を様々な細胞内区画へと標的化する方法およびベクター成分は当該技術分野において周知であり、バイオセンサーが発現する特定の細胞または生物に応じて選択される。例えば、Okumoto、S.、Looger、L. L.、Micheva、K. D.、Reimer、R. J.、Smith、S. J.、and Frommer、W. B. (2005) P Natl Acad Sci USA 102(24)、8740-8745; Fehr、M.、Lalonde、S.、Ehrhardt、D. W.、and Frommer、W. B. (2004) J Fluoresc 14(5)、603-609、参照。これらはその内容全体を引用により本明細書に含める。
【００４０】
本発明のキメラ核酸は、ドナーとアクセプターの間のFRETにおける変化がリガンド結合時に検出されうるような方法で、ドナーおよびアクセプター蛍光部分のコード配列がリガンド結合ドメインの別の末端に融合されるように構築され得る。蛍光ドメインは、所望により、１つもしくは複数の柔軟なリンカー配列によりリガンド結合ドメインから分離されうる。かかるリンカー部分は、好ましくは約１〜５０アミノ酸残基長、およびより好ましくは約１〜３０アミノ酸残基長である。リンカー部分およびそれらの用途は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第5,998,204号および米国特許第5,981,200号ならびにNewton et al.、Biochemistry 35:545-553 (1996)において記載されている。
【００４１】
あるいは、リンカーまたは本明細書に記載するいずれかのフルオロフォアの短くしたバージョンも利用できる。例えば、その内容全体を引用により本明細書に含める出願番号. 60/658,141に記載のように、本発明者らは３つのモジュールのいずれかのN-またはC-末端部分を欠失させることによりFRET 比変化が上昇しうることを見いだしている。
【００４２】
蛍光部分が末端ではなくバイオセンサー内部の位置から発現および提示されるように、蛍光分子のコード配列の一方もしくは双方をリン酸結合タンパク質のオープンリーディングフレーム内に挿入することも、リン酸結合ドメインの性質および大きさに応じて可能となる。かかるセンサーは、米国特許出願番号60/658,141号（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に概ね記載されている。リン酸結合配列を、タンデム分子間ではなく、単一のフルオロフォアのコード配列、すなわちGFP、YFP、CFP、BFPなどをコード化する配列内に挿入することも可能となる。米国特許第6,469,154号および米国特許第6,783,958号（これら各々はその全体が引用により本明細書中に含まれる）の開示によると、かかるセンサーは、フルオロフォアの活性に影響するタンパク質内部での検出可能な変化をもたらすことにより応答する。
【００４３】
本発明はまた、大腸菌もしくは他の細菌などの原核細胞、または酵母細胞、動物細胞または植物細胞などの真核細胞を含む、本発明のベクターまたは発現ベクターが形質移入された宿主細胞を含む。別の態様では、本発明は、環境的に安定なバイオセンサーの発現をコードする核酸配列の発現に特徴づけられる表現型を有するトランスジェニック非ヒト動物を特徴とする。表現型は、動物の体細胞内および胚細胞内に含有される導入遺伝子によって授けられ、（ａ）リン酸バイオセンサーをコードするDNAコンストラクトを含む導入遺伝子を動物の接合体に導入するステップと、（ｂ）接合体を偽妊娠した動物に移植するステップと、（ｃ）接合体の出産までの発達を可能にするステップと、（ｄ）導入遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック子孫を同定するステップと、により生成されうる。導入遺伝子を胚に導入するステップは、導入遺伝子を含む胚性幹細胞を胚に導入するか、または胚を導入遺伝子を含むレトロウイルスに感染させることにより達成可能である。本発明のトランスジェニック動物は、トランスジェニック線虫（C.elegans)、トランスジェニックマウスおよび他の動物を含む。トランスジェニック植物もまた含まれる。
【００４４】
本発明は、本明細書に記載の特性を有する単離されたリン酸バイオセンサー分子、特に超好熱性および中等度好熱性タンパク質を用いて構築されたリン酸結合蛍光指標も包含する。かかるポリペプチドは、本明細書に記載の核酸コンストラクトを用いて組み換え発現されうるか、または成分ドメインの一部もしくは全部の化学的結合により生成されうる。発現されたポリペプチドを、所望により、当該技術分野で既知の生化学的および／または免疫学的精製方法により、転写−翻訳系において生成しおよび／またはそれから単離するか、あるいは組み換え細胞から産生してもよい。本発明のポリペプチドを、細胞膜抽出物などの脂質二重層、あるいは人工脂質二重層（例えばリポソーム小胞）またはナノ粒子に導入してもよい。
【００４５】
リン酸を検出する方法
本発明の核酸およびタンパク質は、リン酸結合を検出し、かつインビトロと植物または動物内の双方でのリン酸のレベルにおける変化を測定するのに有用である。一実施形態では、本発明は、細胞のサンプル内でのリン酸レベルにおける変化を検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載のリン酸バイオセンサーをコードする核酸を発現する細胞および細胞のサンプルを提供するステップと、（ｂ）ドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分の間のFRETにおける変化を検出するステップと、を含む方法を含み、ここで、ドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分の各々がリン酸の結合ドメインに共有結合されており、ドナー部分とアクセプター部分との間のFRETの変化が、細胞のサンプル中のリン酸レベルの変化を示す。
【００４６】
FRETは、当該技術分野で既知の種々の技術を用いて測定されうる。例えば、FRETを測定するステップは、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定するステップを含みうる。あるいは、FRETを測定するステップは、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光を測定するステップと、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定するステップと、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光とアクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光の比を計算するステップと、を含みうる。FRETを測定するステップは、ドナー部分の励起状態寿命または異方性変化を測定するステップも含みうる（Squire A, Verveer PJ, Rocks O, Bastiaens PI. J Struct Biol. 2004 Jul;147(1):62-9.  Red-edge anisotropy microscopy enables dynamic imaging of homo-FRET between green fluorescent proteins in cells.）。かかる方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第6,197,928号に概ね記載されており、これはその全体が引用により本明細書中に含まれる。
【００４７】
細胞のサンプル中のリン酸の量については、FRETの度合いを測定することにより判定可能である。まずセンサーをサンプル中に導入しなければならない。リン酸濃度における変化については、サンプルと蛍光指標の間の接触後における第１の時間および第２の時間にFRETをモニターし、かつFRETの度合いにおける差異を測定することによって判定可能である。サンプル中のリン酸の量を、例えば滴定により確定された較正曲線を用いて定量可能である。
【００４８】
本発明の方法によって分析されるべき細胞サンプルは、例えば細胞表面上でのリン酸輸送またはシグナル伝達の測定においてはインビボに、またはリン酸の流出が細胞培養において測定されうるインビトロに含有される場合がある。あるいは、細胞または組織由来の流体抽出物はサンプルとして使用される場合があり、それからリン酸が検出または測定される。
【００４９】
本明細書に開示されるようにリン酸レベルを検出するための方法を用い、リン酸濃度およびリン酸変化に関連する活性の調節に使用可能な化合物をスクリーニングおよび同定することが可能である。一実施形態では、特に、本発明は、リン酸結合またはレベルを調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）本明細書に開示されるようにリン酸バイオセンサーを発現する細胞および細胞のサンプルを含む混合物を、１つもしくは複数の試験化合物に接触させるステップと、（ｂ）該接触させるステップ後に、ドナー蛍光ドメインとアクセプター蛍光ドメインの間のFRETを測定するステップと、を含む、方法を含み、ここで該接触させるステップ後のFRETの増大または低下は、該試験化合物がリン酸結合活性またはリン酸レベルを調節する化合物であることを示す。
【００５０】
「調節する」という用語は、この態様において、かかる化合物がリン酸結合活性を上昇または低下させうる、または活性、即ち、リン酸レベルに影響する細胞機能またはシグナル伝達カスケードに影響を与えうるということを意味する。リン酸結合活性を上昇または低下させる化合物は、上記のように異常なリン酸活性または異常な細胞代謝またはシグナル伝達に関連する障害の治療的介入および処置の標的であり得る。細胞機能に関連するリン酸結合活性またはリン酸レベルを上昇または低下させるその他の化合物は、リガンド結合活性に関連する障害の処置のための治療製品へと開発され得る。
【００５１】
有用性
本発明のリン酸センサーは広範な用途に有用であり、例えば、海洋系におけるリン酸レベルをより正確に研究するのに利用できる。かかる測定のための新規なツールが要求されている。というのは海洋生物地球化学的リンサイクルは海洋における炭素流動および多量元素と微量元素との両方の分配と関係しているからである。センサーはインビボで生化学的経路を研究すること、即ち、土壌微生物および真核生物においてリン酸流動を測定することに有用である。代謝はリン酸供給の変動に応答して制御される。というのは、多くの反応はリン酸化と共役しているからである。したがってこのセンサーは、健康および疾患状態におけるリン酸恒常性を特徴づける新規なツールを提供する。それは、ハイスループットスクリーニングにおいてリン酸恒常性に正または負に影響する新規な化学物質の開発のツールとして利用できる。それは細胞の取り込みおよび放出、そしてより重要なことに細胞内区画化を特徴決定するのに利用できる。現在、例えば、肝細胞のERと細胞質ゾルとの間のリン酸の交換は理解されていない。このセンサーは、肝細胞のグルコース代謝、貯蔵および動員相の際のERにおけるリン酸恒常性の研究に利用できる。このセンサーは神経細胞におけるVGLUT トランスポーターにおけるリン酸とグルタミン酸輸送との間の異常な関係を特徴づけるのに利用でき、健康および疾患状態における神経伝達の重要な側面、即ち、グルタミン酸分泌とリン酸取り込みとの関係を解明するのに助けとなり得、したがってグルタミン酸作動性(glutamergic) 伝達に関連するあらゆる疾患と関係があり得る。
【００５２】
生物にとって無機リン酸恒常性の維持は重要である。リン酸の過剰または欠損はいずれも様々な障害を引き起こしうる。腎臓疾患はリン酸欠乏を導き得、その結果、疾患、例えば、 X-連鎖低リン酸血症 (XLH)、常染色体優性低リン血症性くる病 (ADHR)、高カルシウム尿症を伴う遺伝性低リン血症性くる病 (HHRH) および 発癌性低リン血症性骨軟化症 (OHO) が起こる(Tenenhouse and Murer、2003、J. Am. Soc. Nephrol. 14: 240-247)。これは、腎臓が体内の無機リン酸の排出および保持に重要な役割を果たしているからである。生理学的研究により、近位尿細管が腎臓によりろ過されたリン酸のバルクを再吸収することが示されている。近位尿細管におけるリン酸再吸収はリン酸トランスポーターに媒介されている。これらリン酸トランスポーターの機能不全はリン酸再吸収の阻害を導き、それによりリン酸消耗が導かれる。
【００５３】
一方、無機リン酸レベルの上昇は、慢性腎臓疾患患者の死亡の危険を上昇させるシグナルであり得る。最近の研究により、リン酸レベルの上昇は慢性腎臓疾患における死亡リスの上昇と関連していることが示された (Kestenbaum et al. 2005、J. Am. Soc. Nephrol.、16: 520-528)。それゆえ、リン酸レベルの上昇は慢性腎臓疾患における重要な危険信号であると考えることが出来る。リン酸毒性はリン酸を含む下剤または浣腸が高用量で用いられる場合に起こりうる。これらおよびその他のすべての場合について、本発明のセンサーは根底にある欠陥を調べ、治癒をもたらすツールを提供しうる。
【００５４】
リン酸は、多くの微生物と同様に、植物細胞にとっても必須の多量養素である。本発明のセンサーは、圃場における土壌リン酸レベルならびに植物の肥沃状況の測定手段を提供しうる。本発明のセンサーは植物におけるリン酸恒常性の機構の解明において助けとなり、リン酸効率のよりよい改善された作物の設計において助けとなる。
【００５５】
FLIPPiを発現するトランスジェニック生物は、線虫神経細胞におけるカルシウムFRET 指標について実証されているように (Kerr、R.、Lev-Ram、V.、Baird、G.、Vincent、P.、Tsien、R. Y.、and Schafer、W. R. (2000) Neuron 26(3)、583-594)臓器片または生物体におけるリン酸活性を直接的に検出するのに有用であり得る。本発明のリン酸センサーは創薬およびスクリーニングのための良好な手段である。リン酸レベルを、化学物質、代謝現象、輸送工程およびシグナル伝達工程に応答してリアルタイムで測定することが出来る。
【００５６】
以下の実施例は、本発明を説明および例示するために提供される。そのようなものとして、それらが本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、多数の他の実施形態も上文や特許請求の範囲に記載のような本発明の範囲内に含まれることを十分に理解するであろう。
【００５７】
実施例
実施例 1. PiBPのクローニングおよび構造モデリング
細菌 PiBPは、環境に感受性の小さいフルオロフォア色素と結合されると高親和性インビトロ Pi センサーとして機能する(De Lorimier, R. M., Smith, J. J., Dwyer, M. A., Looger, L. L., Sali, K. M., Paavola, C. D., Rizk, S. S., Sadigov, S., Conrad, D. W., Loew, L., and Hellinga, H. W. (2002) Protein Sci 11(11), 2655-2675)。それゆえ、本発明者らはPiの細胞内濃度の変化を報告することが出来る遺伝的にコードされたナノセンサーの構築にこのポリペプチドを用いることを選択した。 好熱性生物からのタンパク質は劣悪な環境条件下で高い安定性を示し、おそらくナノセンサー構築のためのより堅固な骨組みを提供するであろうため (引用により本明細書に含める出願番号60/658,142を参照)、本発明者らはイエローストーン国立公園の温泉から単離したシネココッカスの好熱性株をPiBPのソースとして選択した。 
【００５８】
シネココッカスからPiBP遺伝子をクローニングするために、シグナル配列を有さない予測成熟タンパク質をコードする切断型PiBP  (タンパク質受入 NP_415188)を、シネココッカスゲノムDNAからプライマー、 5’- ATTGGTACCGTAGGATTTCTAACAGCG-3’ (配列番号1)および5’ATAGGTACCGTTAACGG TGATGGAATC  3’ (配列番号2)を用いてPCRにより増幅した。PCR 断片を pRSET-B (Invitrogen、USA)におけるFLIPmal-25μ (Fehr、M.、Frommer、W. B.、and Lalonde、S. (2002) P Natl Acad Sci USA 99(15)、9846-9851)のKpnI 部位にクローニングし、マルトース結合タンパク質をコードする配列をPiBPをコードする配列と交換した。その結果得られたプラスミドをpRSET-FLIPPi-250nと命名した。
【００５９】
成熟度(maturation proficiency)およびセンサーの性能を (pHおよび塩素イオン耐性に関して)改善するために、pRSET-FLIPPi-250nにおける増強(enhanced)YFPをVenusと称されるYFP 変異体のコード配列と交換した(FLIPPi-WT形成) (配列番号5 (遺伝子)および配列番号6 (タンパク質)) (Nagai、T.、Ibata、K.、Park、E. S.、Kubota、M.、Mikoshiba、K.、and Miyawaki、A. (2002) Nat Biotechnol 20(1)、87-90)。FLIPPiについての親和性突然変異体 (突然変異体 DNA 断片の配列決定によって確証)を部位特異的突然変異誘発により作成し((Kunkel, T. A., Roberts, J. D., and Zakour, R. A. (1987) Methods in Enzymology 154, 367-382)、T22A、S52A、G162AおよびT163A 変異体センサータンパク質を得た。これらのpRSET-FLIPPi コンストラクトを大腸菌 BL21(DE3)Gold (Stratagene、USA)にエレクトロポレーションにより導入し、発現したタンパク質を記載されたように抽出、精製した (Fehr、M.、Frommer、W. B.、and Lalonde、S. (2002) P Natl Acad Sci USA 99(15)、9846-9851)。CHO 細胞の細胞質ゾルにおける発現のために、FLIPPi-5μおよびFLIPPi-30m 配列を含むDNA 断片をpRSET-FLIPPi-5μおよびpRSET-FLIPPi-30mから BamHI/HindIIIによって切り出し、pCDNA3.1 (Invitrogen、USA)にクローニングした。
【００６０】
シネココッカス菌種PiBPの配列を大腸菌のPiBP(pstSによりコードされる: PDB 1a40、同一性 36.9%)とアラインし(De Lorimier, R. M., Smith, J. J., Dwyer, M. A., Looger, L. L., Sali, K. M., Paavola, C. D., Rizk, S. S., Sadigov, S., Conrad, D. W., Loew, L., and Hellinga, H. W. (2002) Protein Sci 11(11), 2655-2675)、推定ペリプラズムリーダー配列を構造予測分析に先立って配列から除いた。シネココッカス菌種PiBP 構造を3D-JIGSAW サーバーに存在する自動化予測アルゴリズムを用いてモデリングした。図 1は、予測ポリペプチド構造 (A)とともに、この構造と大腸菌 PiBPの構造のDeepview v3.7SP5 アラインメント(B)を示す。示された三次構造は大腸菌 PiBPのものと類似しており、センサーコンストラクトのためのしっかりとした基礎を提供するものであった。
【００６１】
実施例 2. ナノセンサーのインビトロ特徴決定
成熟シネココッカス菌種PiBP タンパク質をコードするDNA 断片を上記のようにECFPとVenus 配列との間に融合させた。キメラ遺伝子を大腸菌にて発現させ、タンパク質産物をN-末端 His6タグによりNi2+ アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
【００６２】
Piの精製タンパク質への付加の結果、CFP発光が低下し、Venus 発光が上昇し、FLIPPi-WTと称するキメラセンサーへのPiの結合の結果、操作されたタンパク質上の発色団の距離/配向を変化させる立体構造変化が起こることが示唆された。このセンサーのPiについての結合定数 (Kd)は840 nMでありヒル係数は1.03であると判定され、Medveczky et al. (Medveczky、N.、and Rosenberg、H. (1970) Biochim Biophys Acta 211(2)、158)により大腸菌 PiBPについて報告された800 nM Kdと一致する。図 2Aに示すように、FLIPPi-WTについて観察された最大比変化は0.14である。
【００６３】
FLIPPi-WT ナノセンサーの性質を改変する試みにおいて、9 アミノ酸をCFPのC-末端から欠失させ、1 アミノ酸をVENUSのN-末端から欠失させた。さらに、フルオロフォアとPi-結合ドメインとを結合させるリンカードメインにおける4 アミノ酸も除去した。全部でタンパク質は18 アミノ酸短くなった。これらの欠失および短くしたポリペプチドの構造を図 8に示す。図 3に示すように、FLIPPi-260nmと称する改変タンパク質のPiによる滴定により、CFP 発光上昇およびVenus 発光低下がもたらされ、その結果、FRETがPi-依存的に低下した。Piについての結合定数は260 nMであると判定され、最大比変化は0.13であった。この変化は、元の FLIPPi-WT 融合タンパク質のものと比較してわずかに低下していた。
【００６４】
Pi センサーのダイナミックレンジを拡大するために、部位特異的突然変異誘発を上記のように用いてPi結合ドメインの結合親和性を低下させた。PiBPの結合ポケットに存在するPiは強い水素結合によって定位置に保持される(Luecke、H.、and Quiocho、F. A. (1990) Nature 347(6291)、402-406)。FLIPPi-260nのリガンド-結合ポケットの三次元空間構造を大腸菌 PiBP 結晶構造、PDB 1a40とアラインさせた(Wang、Z. M.、Choudhary、A.、Ledvina、P. S.、and Quiocho、F. A. (1994) J Biol Chem 269(40)、25091-25094; Ledvina、P. S.、Tsai、A. L.、Wang、Z. M.、Koehl、E.、and Quiocho、F. A. (1998) Protein Sci 7(12)、2550-2559)。分析により、FLIPPi-260nのPi 結合部位は大腸菌のものと非常に類似しているが、ただし大腸菌タンパク質の保存されたAsp56はFLIPPi-260nのGlu70に対応することが示された(図 1C)。大腸菌タンパク質のAsp56は一塩基および二塩基 Piの両方の認識において重要な役割を果たしていると考えられる(Wang、Z. M.、Choudhary、A.、Ledvina、P. S.、and Quiocho、F. A. (1994) J Biol Chem 269(40)、25091-25094)。
【００６５】
FLIPPi-260nの5残基を部位特異的突然変異誘発のために選択した。FLIPPi-260n のPi-結合部位に存在すると予測されるアミノ酸の突然変異により、広い範囲の Pi 濃度にわたって感受性のセンサーのセットが得られ、そのPi 結合の際の最大比変化は有意に大きくなっていた(表1参照)。親和性突然変異体はそのPiについてのKdにしたがって、FLIPPi-770n、FLIPPi-4μ、FLIPPi-5μ、FLIPPi-200μ、およびFLIPPi-30mと命名された。これらPiBPのすべてについてのヒル係数は1に近いと判定され、これはMedveczky et al.による報告と一致し、基質結合において協同性が存在しないことを示す(Medveczky、N.、and Rosenberg、H. (1970) Biochim Biophys Acta 211(2)、158)。
【００６６】
表1. FLIPPi 親和性突然変異体。インビトロで判定した結合定数。
【表１】
2009511045.tif 000002
aΔRmax、結合タンパク質の非存在および飽和の間の比におけるインビトロ最大変化
b FLIPPi センサーが使用できる濃度範囲。定量範囲は10%飽和と90% 飽和との間の範囲として規定した。
【００６７】
各PiBPは１分子のPiに結合する。FLIPPi-260nのPiBP 部分に置換 S161Aを導入するとFLIPPi-770nが生じ、これはPiについての結合定数が770 nMであり、0.0847〜 5.65 μMの範囲のPiレベルの定量に用いることが出来る。FLIPPi-770nはFLIPPi-260n ポリペプチド (25.9-1260 nMの範囲およびΔRmax=-0.13)と比較して4倍測定範囲が広く、最大比変化が8倍上昇していた(ΔRmax=-1.07)。調べたすべての親和性突然変異体は(表1)最大比変化が8-10倍改善していた。それぞれT163AおよびS52A の置換を担持するFLIPPi-4μおよびFLIPPi-5μは類似の Kd (FLIPPi-4μについて3.9 μM、FLIPPi-5μについて5.1μM)、ΔRmax (-1.34および1.33)、および定量範囲 (0.382〜25.2 μMおよび0.516〜34.0 μM)を有していた。FLIPPi-200μ (G162A 置換)はマイクロモル範囲でのPi 定量化に好適である(252〜1660 μM、Kd=210 μM)。インビボ Pi 濃度のモニターに最良の範囲を有するセンサーはFLIPPi-30mである。このセンサーは一般に細胞内濃度にわたるPi範囲3.08〜169 mMにわたって利用できる。
【００６８】
実施例 3. 基質結合特異性
複雑な混合物(例えば、生細胞の細胞質)中での基質濃度の測定には、その基質に対して高い特異性を有するセンサーが必要である。それゆえ、インビボ適用のためには、それぞれのセンサーの結合特異性を試験する必要がある。
【００６９】
FLIPPi-4μ、FLIPPi-5μ、FLIPPi-200μおよびFLIPPi-30mのFRET 特性を、様々な濃度のPiおよび硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、ATP、ピロリン酸ナトリウムを含む潜在的非特異的基質にてモニターした。FRET アッセイはマイクロタイタープレートで実施し(図 4A-D)、対照としてグルコースセンサー FLIPglu-600μを用いた(Fehr、M.、Lalonde、S.、Lager、I.、Wolff、M. W.、and Frommer、W. B. (2003) J Biol Chem 278(21)、19127-19133)(図 4E)。
【００７０】
FLIPPi-30m、FLIPPi-200μおよび対照 FLIPglu-600μは４つの非特異的基質には結合しなかった。FLIPPi-4μおよびFLIPPi-5μはピロリン酸に応答したが、Piに対するよりも結合定数は低く、これらセンサーは他の３つの基質には応答しなかった。ATPは試験したすべてのFLIPPi センサーに対するクエンチャーのようであり、ピロリン酸はFLIPPi-30m およびFLIPPi-200μに対するさらなるクエンチャーであった。グリセロール-1-リン酸およびグルコース-6-リン酸もFLIPPi-4μ、FLIPPi-5μ、FLIPPi-200μおよびFLIPPi-30mならびに野生型 FLIPPi-260nを用いる特異性試験に用いた(図 5)。結果は、FLIPPi-200μ、FLIPPi-30m はFLIPPi-260nと同様いずれの基質にも応答しないが、これらの基質はFLIPPi-4μおよびFLIPPi-5μについての蛍光発光比に影響を与えることを示した。
【００７１】
実施例 4.ナノセンサーのインビボ特徴決定
FLIPPi センサーのインビボ適用を実証するために、pRSET-FLIPPi-30m およびpRSET-FLIPPi-5μ 配列をpCDNA3.1にクローニングし、CHO 細胞にトランスフェクトした。CHO 細胞をトランスフェクションの後一晩培養し、Pi-充満増殖培地をPiを含まない改変Tyrode塩類溶液と交換することにより16時間 Pi飢餓させた。FLIPPi-30mを発現する細胞を様々な濃度の外部 Piで特定のステップスケジュールにしたがって灌流し (図 6)、蛍光比の変化をモニターした。さらに、各Pi 濃度について一定の蛍光比が達成された後、PiをPi-非含有溶液での灌流により除去した。FLIPPi-5μでトランスフェクトした細胞をそのPi に対する高親和性のために対照として用いた。
【００７２】
どのFLIPPi センサーが発現したかにかかわらず正常培養条件で培養した細胞は、10 mM までのPiによる灌流の際にシグナル変化を示さなかった(データ示さず)。FLIPPi-30mを発現する飢餓させた細胞は10 μM、50 μMおよび100 μM Piを含む溶液に応答し;最高の比変化は100 μM Piについての比変化であった (図 6)。飢餓させた対照細胞は同じ Pi 溶液で灌流した場合VENUS/CFP 比変化を示さなかった。
【００７３】
本明細書中て考察されるすべての出版物、特許および特許出願は、引用により本明細書中に含まれる。本発明がその特定の実施形態に関連して記載されている一方、そのさらなる改良を可能とし、さらに本出願が、一般に本発明の原理に従い、本発明が関係する当該技術分野内での既知のまたは習慣的な実施の枠内に収まり、上記の本質的な特徴に適用可能で、かつ添付の特許請求の範囲の範囲内に従うように、本開示からのかかる逸脱を含む、本発明の任意の変数、使用、または適応を網羅するように意図されることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図 1は、シネココッカス(Synechococcus) PiBPの予測構造およびタンパク質構造および結合部位の両方の上での大腸菌 PiBP (PDB 1a40)とのアラインメントを示す。 (A) 3D-JIGSAW サーバーにより予測され Deepviewによりプロットされたリン酸結合タンパク質構造。基質であるリン酸は明るく、C-およびN- 末端は暗い。 (B)予測タンパク質構造と大腸菌の結晶構造とのアラインメント。(C) 結合部位のアラインメント。唯一の相違は、FLIPPiにおけるGlu70 と大腸菌におけるThr10である。
【図２】図 2は、BL21(DE3)goldから精製されたナノセンサーのインビトロ基質誘導FRET変化のグラフを示す。(A)リン酸溶液で滴定された(titrated) FLIPPi-WT。(B) FLIPPi-260nについてのリン酸滴定(titration)曲線。適合曲線は非線形回帰により得られる。
【図３】図 3は、 FLIPPi 親和性突然変異体のインビトロ基質誘導FRET変化を示すグラフである。 適合曲線は非線形回帰により得た。
【図４】図 4は、親和性突然変異体についての結合特異性アッセイの結果を示すグラフを含む。すべてのセンサーを、硫酸、硝酸、リン酸、ピロリン酸およびATPの溶液で滴定した。 (A) FLIPPi-30m。(B) FLIPPi-200μ。(C) FLIPPi-5μ。(D) FLIPPi-4μ。(E) 対照としてのFLIPglu-600μ。
【図５】図 5は、親和性突然変異体についてのさらなる結合特異性アッセイの結果を示すグラフを含む。FLIPPi センサーをグリセロール-1-リン酸およびグルコース-6-リン酸溶液で滴定した。 (A)グリセロール-1-リン酸による滴定。(B)グルコース-6-リン酸による滴定。
【図６】図 6は、10 μM、50 μM および 100 μM リン酸灌流に応答してのCHO 細胞におけるFLIPPi-30m ナノセンサーのFRET 比変化を示す。各リン酸灌流は 2分であり、リン酸非含有改変Tyrode’s 塩類溶液により3分の洗浄をその後に行った。箱中の数字は用いたリン酸溶液の濃度を示す。
【図７】図 7は、様々な種のPiBP タンパク質の間の関係を示すPAUPにより作成した系統樹を示す。
【図８】図 8は、結合したフルオロフォアからの物質の欠失を含む短くした FLIPPi-WT ナノセンサーの欠失および構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月12日(2008.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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