(57)【要約】多型性と依存症との間の相関性を明らかにする。依存症の診断法、予測法、および治療法を提供する。依存症の診断、予測および治療のためのシステムおよびキットを提供する。さらに依存症モジュレーターを識別する方法を提供する。一つの実施形態において、本発明は、ニコチン依存症と種々の多型性対立遺伝子との間に存在するいくつかの新たな遺伝的相関を明らかにし、影響を受けやすい個体を早期に発見するための基準を提供するとともに、ニコチン依存症およびそれに関連する疾患の分子細胞レベルでの理解を進歩させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別する方法であって、
該生物または生物学的サンプルにおいて、多型またはそれに密接に連鎖する遺伝子座を検出する工程であって、該多型は、表１の多型から選択される、ここで、該多型は依存症の表現型と関連がある工程、および
該多型を該表現型に相関付ける工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記生物が哺乳動物であるか、または前記生物学的サンプルが哺乳動物に由来するものである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記生物がヒトの患者であるか、または前記生物学的サンプルがヒトの患者に由来するものである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記検出する工程が、前記多型、前記連鎖する遺伝子座、またはそれらに結合する配列を増幅する工程、および得られたアンプリコンを検出する工程を包含する、請求項１の方法。
【請求項５】
前記増幅する工程が、
（ａ）増幅プライマーまたは増幅プライマー対を、前記生物または生物学的サンプルから単離された核酸の鋳型と混合する工程であって、、該プライマーまたはプライマー対は、該多型または該連鎖する遺伝子座に隣接する領域、あるいは該多型または該連鎖する遺伝子座を含む領域に対して、相補的または部分的に相補的であり、かつ、該核酸の鋳型上でポリメラーゼにより核酸の重合を開始させることができるものである、工程；および
（ｂ）ポリメラーゼおよび該鋳型の核酸を含むＤＮＡ重合反応において該プライマーまたはプライマー対を伸長させて前記アンプリコンを生成させる工程
を包含する、請求項４の方法。
【請求項６】
前記アンプリコンは、該アンプリコンをアレイにハイブリダイズさせること、該アンプリコンを制限酵素で消化すること、またはリアルタイムＰＣＲ解析の１つ以上を含む方法により検出される、請求項４の方法。
【請求項７】
前記アンプリコンを部分的にまたは完全に配列決定する工程を包含する、請求項４の方法。
【請求項８】
前記増幅する工程は、前記生物または生物学的サンプルから単離された核酸を鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＰＴ−ＰＣＲ）、またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を行うことを備える、請求項４の方法。
【請求項９】
前記多型がＳＮＰである、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記多型が、表１に列挙されるものからなる群から選択される対立遺伝子を含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記密接に連鎖する遺伝子座は、前記多型から５ｃＭ以下のところにある、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記多型を相関付ける工程は、該多型の対立遺伝子と表現型との相関関係を含むルックアップテーブルを参照することを含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別する方法であって、
該生物または生物学的サンプルにおいて、表１から選択される多型に対して８０％を超える共分離相関を示す多型、またはそれに密接に連鎖する遺伝子座を検出する工程であって、該多型は、表１から選択される該多型は依存症の表現型と関連がある、工程；および
該多型を該表現型に相関付ける工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記多型が、表１から選択される多型に対して、少なくとも約８５％の共分離相関、少なくとも９０％の共分離相関、少なくとも９１％の共分離相関、少なくとも９２％の共分離相関、少なくとも９３％の共分離相関、少なくとも９４％の共分離相関、少なくとも９５％の共分離相関、少なくとも９６％の共分離相関、少なくとも９７％の共分離相関、少なくとも９８％の共分離相関、少なくとも９９％の共分離相関、少なくとも９９．５％の共分離相関、少なくとも９９．７５％の共分離相関、または少なくとも９９．９０％以上の共分離相関を示す、請求項１３の方法。
【請求項１５】
依存症の表現型の、可能性のあるモジュレーターを識別する方法であって、
可能性があると推定されるモジュレーターを、表１の多型と密接に関連する遺伝子または遺伝子産物と接触させる工程、および
該可能性があると推定されるモジュレーターの該遺伝子または遺伝子産物への作用についてモニターすることにより、該可能性があると推定されるモジュレーターが該遺伝子または遺伝子産物を調節しかつそれにより依存症の表現型の可能性のあるモジュレーターとなるかどうかを判定する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
依存症の表現型のモジュレーターを識別する方法であって、
請求項１５による依存症の表現型の可能性のあるモジュレーターを対象に投与する工程、および
依存症の表現型の低下または防止について、該対象をモニターすることにより、依存症の表現型のモジュレーターを識別する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記遺伝子または遺伝子産物は、表１に列挙されるものから選択される多型を含む、請求項１５または１６の方法。
【請求項１８】
作用は、
（ａ）前記モジュレーターの存在下で、前記遺伝子または遺伝子産物の発現が増加または減少すること、
（ｂ）該モジュレーターの存在下で、該遺伝子産物の活性が増加または減少すること、および
（ｃ）該モジュレーターの存在下で、該遺伝子または遺伝子産物の発現パターンが変化すること
から選択される、請求項１５または１６の方法。
【請求項１９】
依存症の表現型を治療するためのキットであって、
請求項１５の方法によって識別された可能性のあるモジュレーターおよび／または請求項１６に記載のモジュレーターと、該表現型の治療のために患者に該モジュレーターおよび／または可能性のあるモジュレーターを投与するための説明書とを備える、キット。
【請求項２０】
生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別するためのシステムであって、
（ａ）表１の多型から選択される、１種以上の多型の少なくとも１つの対立遺伝子またはそれに連鎖する遺伝子座を検出するよう構成された一式のマーカープローブおよび／またはプライマー、
（ｂ）該一式のマーカープローブおよび／またはプライマーからの１種以上のシグナル出力、あるいは該一式のマーカープローブおよび／またはプライマーから生産されるアンプリコンからの１種以上のシグナル出力を検出するよう構成され、それにより、該対立遺伝子が存在するかしないかを判定する検出器、および
（ｃ）該対立遺伝子の存在または不在を、予測される表現型と相関付けるシステムの指示
を備える、システム。
【請求項２１】
前記一式のマーカープローブおよび／またはプライマーが表１のヌクレオチド配列を有する、請求項２０のシステム。
【請求項２２】
前記検出器が１種以上の発光を検出し、該発光は、該対立遺伝子の存在または不在を示す、請求項２０のシステム。
【請求項２３】
前記指示が、前記対立遺伝子の存在または不在と前記表現型との相関付けを含む少なくとも１つのルックアップテーブルを備える、請求項２０のシステム。
【請求項２４】
前記システムがサンプルを含む、請求項２０のシステム。
【請求項２５】
前記サンプルが、ゲノムＤＮＡ、増幅されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または増幅されたＲＮＡを含む、請求項２４のシステム。
【請求項２６】
前記サンプルが哺乳動物に由来するものである、請求項２４のシステム。
【請求項２７】
生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別する方法であって、
該生物または生物学的サンプルにおいて、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３、およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０、およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型から選択される多型またはそれに密接に連鎖する遺伝子座を検出する工程を包含し、該多型は依存症の表現型と関連がある、工程；および
該多型を該表現型に相関付ける工程
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記多型が、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３、およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０、およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型からなる群から選択される対立遺伝子を含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別する方法であって、
該生物または生物学的サンプルにおいて、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３、およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０、およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型から選択される多型に対して８０％を超える共分離相関を示す多型、またはそれに密接に連鎖する遺伝子座を検出する工程であって、そのように選択された該多型は、依存症の表現型と関連がある、工程；および
該多型を該表現型に相関付ける工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
依存症の表現型の、可能性のあるモジュレーターを識別する方法であって、
可能性があると推定されるモジュレーターを、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３、およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０、およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型と密接に関連する遺伝子または遺伝子産物と接触させる工程、および
該可能性があると推定されるモジュレーターの該遺伝子または遺伝子産物への作用についてモニターすることにより、該可能性があると推定されるモジュレーターが該遺伝子または遺伝子産物を調節しかつそれにより依存症の表現型の可能性のあるモジュレーターとなるかどうかを判定する工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
依存症の表現型のモジュレーターを識別する方法であって、
請求項３０に記載の依存症の表現型の可能性のあるモジュレーターを対象に投与する工程、および
依存症の表現型の低下または防止について、該対象をモニターすることにより、依存症の表現型のモジュレーターを識別する工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記遺伝子または遺伝子産物が、表２１に列挙されたものから選択される多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３、およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０、およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型を含む、請求項３０または３１の方法。
【請求項３３】
生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別するためのシステムであって、
（ａ）表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３、およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０、およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型から選択される１種以上の多型の少なくとも１つの対立遺伝子またはそれに連鎖する遺伝子座を検出するよう構成された一式のマーカープローブおよび／またはプライマー、
（ｂ）該一式のマーカープローブおよび／またはプライマーからの１種以上のシグナル出力あるいは該一式のマーカープローブおよび／またはプライマーから生産されるアンプリコンからの１種以上のシグナル出力を検出するよう構成され、それにより、該対立遺伝子が存在するかしないかを判定する検出器、および
（ｃ）該対立遺伝子の存在または不在を予測される表現型と相関付けるシステムの指示
を備える、システム。
【請求項３４】
該一式のマーカープローブおよび／またはプライマーが、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３、およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０、およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型のヌクレオチド配列を含む、請求項３３のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年３月１日に出願された米国特許出願第６０／７７８，５９７号、２００６年６月６日に出願された米国特許出願第６０／８１１，３１８号の利益を請求し、それぞれは、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（国際出願の請求）
本段落は、すべてのＰＣＴ指定国の下で本願を国際出願として受理することを請求するものである。
【０００３】
（政府の権利の表明）
本発明は、ＮＩＨ契約番号ＨＨＳＮ２７１２００４７７４７１Ｃの下、政府の援助によりなされたものである。また、本研究の一部は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＮＩＨ助成番号ＣＡ８９３９２、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  ＡｂｕｓｅからのＮＩＨ助成番号ＤＡ１２８５４およびＤＡ０１５１２９、ならびにＮＩＤＡからの契約番号Ｎ０１ＤＡ−０−７０７９により援助されている。したがって、米国政府は、本発明について所定の権利を有する。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、依存症の診断、予後および治療の分野におけるものである。本発明は、多型と依存症との相関付けに関するとともに、依存症の診断、予後および治療のためのシステムおよびキット、ならびに依存症のモジュレーターを識別する方法に関する。
【０００５】
（図面）
この引用により、本願は、表１を含む以下の図２６の内容を全て組み込んでいるものとする。
【０００６】
【表１】
2009528063.tif 000002
図２６の内容は以下のとおりである。
【０００７】
ＴｏｐＳＮＰ．ｔｘｔ：この図は、本文書とともに提出する本願の明細書で表１と称される表を含むものであり、それは、本明細書に記載する実施例（例えば、実施例１、２、３など）においてニコチン依存症との関連が見出されたＳＮＰについての情報を含むものである。したがって、ある実施形態は配列に関連するものと考えることができる。
【０００８】
上述した表において、最初の行は、列の名称とともにある見出し行である。列は以下のとおりである。
１．ＳＮＰ  ＩＤ：Ｐｅｒｌｅｇｅｎの内部ＳＮＰ識別子
２．ｒｅｆｓｎｐ  ＩＤ：各変異に対するｄｂＳＮＰ（ＮＣＢＩ）からのＳＮＰ識別番号。これは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにおけるｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＮＣＢＩにより設定かつ維持されているｄｂＳＮＰデータベースに従う参照番号である。
３．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＡＳＥＳ  Ｐ：全てのサンプルに対する症例の対立遺伝子頻度
４．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＮＲＬＳ  Ｐ：全てのサンプルに対する対照の対立遺伝子頻度
５．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ．ＤＥＬＴＡ  Ｐ：全てのサンプルに対するデルタ対立遺伝子頻度
６．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＡＬＬ  ＲＡＴＥ：全てのサンプルに対するコールレート
７．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ．ＨＷＥ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ  ＣＴＲＬＳ：対照に対するハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）ｐ値
８．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ．ＧＣ  ＴＲＥＮＤ  ＳＣＯＲＥ  Ｐ：全てのサンプルに対するゲノムの対照により補正された傾向スコアのｐ値
９．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ．ＴＲＥＮＤ  ＳＣＯＲＥ  ＦＷＥＲ：全てのサンプルに対して候補遺伝子の傾向スコアから算出されたファミリーワイズエラー率（ｆａｍｉｌｙｗｉｓｅ  ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅ（ＦＷＥＲ））
１０．ｎｄａ０１  ａｌｌ  ｒｅｓｕｌｔ  ｓｅｘ  ｓｔｒａｔ．ＴＲＥＮＤ  ＳＣＯＲＥ  Ｐ  ＳＥＸ  ＳＴＲＡＴ：全てのサンプルに対する、性別により階層化された傾向スコアのｐ値
１１．ｎｄａ０１  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔ．ＡＬＬ  ＧＬＭ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ：全てのサンプルに対する、症例／対照ＡＮＯＶＡｐ値についてのロジスティック回帰
１２．ｎｄａ０１  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔ．ＡＬＬ  ＬＭ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ：全てのサンプルに対する、ＦＴＮＤスコアのＡＮＯＶＡｐ値についての線形回帰
１３．ｎｄａ０１  ｉｇ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＡＳＥＳ  Ｐ：プールされたサンプルに対する症例の対立遺伝子頻度
１４．ｎｄａ０１  ｉｇ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＴＲＬＳ  Ｐ：プールされたサンプルに対する対照の対立遺伝子頻度
１５．ｎｄａ０１  ｉｇ  ｒｅｓｕｌｔ．ＤＥＬＴＡ  Ｐ：プールされたサンプルに対するデルタ対立遺伝子頻度
１６．ｎｄａ０１  ｉｇ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＡＬＬ  ＲＡＴＥ：プールされたサンプルのコールレート
１７．ｎｄａ０１  ｉｇ  ｒｅｓｕｌｔ．ＨＷＥ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ  ＣＴＲＬＳ：プールされたサンプルにおける対照に対するＨＷＥｐ値
１８．ｎｄａ０１  ｉｇ  ｒｅｓｕｌｔ．ＴＲＥＮＤ  ＳＣＯＲＥ  Ｐ：プールされたサンプルに対する傾向スコアの未補正ｐ値
１９．ｎｄａ０１  ｉｇ  ｒｅｓｕｌｔ  ｓｅｘ  ｓｔｒａｔ．ＴＲＥＮＤ  ＳＣＯＲＥ  Ｐ  ＳＥＸ  ＳＴＲＡＴ：プールされたサンプルに対する、性別により階層化された傾向スコアのｐ値
２０．ｎｄａ０１  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔ．ＩＧ  ＧＬＭ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ：プールされたサンプルに対する、症例／対照ＡＮＯＶＡｐ値についてのロジスティック回帰
２１．ｎｄａ０１  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔ．ＩＧ  ＬＭ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ：プールされたサンプルに対する、ＦＴＮＤスコアのＡＮＯＶＡｐ値についての線形回帰
２２．ｎｄａ０１  ｒｅｐ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＡＳＥＳ  Ｐ：検証サンプルに対する症例の対立遺伝子頻度
２３．ｎｄａ０１  ｒｅｐ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＴＲＬＳ  Ｐ：検証サンプルに対する対照の対立遺伝子頻度
２４．ｎｄａ０１  ｒｅｐ  ｒｅｓｕｌｔ．ＤＥＬＴＡ  Ｐ：検証サンプルに対するデルタ対立遺伝子頻度
２５．ｎｄａ０１  ｒｅｐ  ｒｅｓｕｌｔ．ＣＡＬＬ  ＲＡＴＥ：検証サンプルのコールレート
２６．ｎｄａ０１  ｒｅｐ  ｒｅｓｕｌｔ．ＨＷＥ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ  ＣＴＲＬＳ：検証サンプルにおける対照に対するＨＷＥｐ値
２７．ｎｄａ０１  ｒｅｐ  ｒｅｓｕｌｔ．ＧＣ  ＴＲＥＮＤ  ＳＣＯＲＥ  Ｐ：検証サンプルに対するゲノムの対照により補正された傾向スコアのｐ値
２８．ｎｄａ０１  ｒｅｐ  ｒｅｓｕｌｔ  ｓｅｘ  ｓｔｒａｔ．ＴＲＥＮＤ  ＳＣＯＲＥ  Ｐ  ＳＥＸ  ＳＴＲＡＴ：検証サンプルに対する、性別により階層化された傾向スコアのｐ値
２９．ｎｄａ０１  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔ．ＲＥＰ  ＧＬＭ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ：検証サンプルに対する、症例／対照ＡＮＯＶＡｐ値についてのロジスティック回帰
３０．ｎｄａ０１  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔ．ＲＥＰ  ＬＭ  Ｐ  ＶＡＬＵＥ：検証サンプルに対する、ＦＴＮＤスコアのＡＮＯＶＡｐ値についての線形回帰
３１．ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ  ＩＤ：ＳＮＰがヒトゲノムのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３５においてマップされる染色体
３２．ｃｏｎｔｉｇ：ＳＮＰがヒトゲノムのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３５においてマップされるコンティグ
３３．ＰＯＳＩＴＩＯＮ：ＳＮＰがマップされる染色体上の位置
３４．ｇｅｎｅ  ｎａｍｅ：ＳＮＰがマップされる近くまたはその中の遺伝子についての遺伝子記号
３５．ｇｅｎｅ  ｈｙｐｅｒｌｉｎｋ：表示される遺伝子は、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＥデータベースに見出すことができる。
３６．ＨＩＴ  ＴＹＰＥ：遺伝子に対してＳＮＰがどこに位置するか（例えば、上流、下流、イントロン、エキソンなど）
３７．ＳＹＮＯＮＹＭＯＵＳ：遺伝子配列においてＳＮＰ対立遺伝子が同義的変化（「ｙｅｓ」）を生じさせるか非同義的変化（「ｎｏ」）を生じさせるか
３８．ｉｓ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｉｏｎ：１（ＳＮＰが候補遺伝子領域のＳＮＰから選択される場合）、０（ＳＮＰがプールされたＳＮＰの解析から選択される場合）
３９．ｃｏｍｍｅｎｔｓ：ＳＮＰに関する追加のコメント
【背景技術】
【０００９】
（発明の背景）
罹病率、死亡率および社会に対する経済コストの点から見ると、ニコチン依存症の影響は非常に大きい。タバコによって毎年４３００００人を超える米国国民が死亡しており、これは、アルコール、コカイン、ヘロイン、殺人、自殺、自動車事故、火災、およびＡＩＤＳによる死亡者を合わせたものより多い。タバコの使用は、米国において、予防可能な死亡原因のトップに位置する。
【００１０】
経済的には、米国全体で毎年８００億ドルの医療費が喫煙に起因すると見られている。しかし、このコストは全体の社会コストをかなり下回っている。というのも、それは、喫煙が関係する火災によるやけどの治療、タバコを吸う母親の出産時低体重児に対する周産期医療、および間接喫煙が原因の疾患に係る医療のコストを含んでいないからである。総合すれば、喫煙の直接的および間接的コストは、１年あたり１３８０億ドルになると見積もられる。
【００１１】
ニコチンは、タバコ製品（例えば、紙巻きタバコ、葉巻、パイプおよび無煙タバコ製品（例えば、かぎタバコおよびかみタバコ））からの煙に存在する数千の化学物質の１つである。ニコチンは、最も頻繁に使用される嗜癖性薬物の１つである。１８００年代初頭に最初に特定されたニコチンは、タバコの主成分であり、脳に作用し、また脳や身体に複雑で時に予測できない多くの作用を及ぼすことが示されてきた。
【００１２】
依存症は、健康に悪い結果をもたらす場合でも、薬物を欲しがりかつ使用することをやめられないことを特徴とする。紙巻きタバコを吸う人の大部分が、タバコを有害だと認識しており、その使用を減らしたり止めたりしたいと表明するが、止めることを真剣に試みて成功する人は１年にほぼ３５００万人のうち７％未満である。いくつかの因子が、最初の使用、そして最終的に依存症を左右する因子として働いている。例えば、非常に入手しやすいこと、タバコの使用に対する法的社会的規制が少ないこと、そして、タバコ会社による巧妙なマーケティングや広告手法などである。
【００１３】
研究により、快感を制御する脳回路（いわゆる、報酬経路）中のドーパミンのレベルがニコチンによってどのように高くなるかが明らかにされており、ニコチンへの嗜癖性向にとってそのことがまず重要である。また、ニコチンの薬物動態特性が、その乱用の可能性を高めることも明らかにされている。紙巻きタバコを吸うと、脳に急速にニコチンが行き渡り、そのレベルは吸入の１０秒以内にピークに達する。ニコチンのこの急性な作用は、数分で消失するため、喫煙者は、その快感作用を維持するためその日のあいだ頻繁に服用を続けることになり、やめられなくなる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、ニコチン依存症と種々の多型性対立遺伝子との間に存在するいくつかの新たな遺伝的相関を明らかにするものであり、影響を受けやすい個体を早期に発見するための基準を提供するとともに、ニコチン依存症およびそれに関連する疾患の分子細胞レベルでの理解を進歩させるものである。本発明のそれらの特徴およびその他の特徴は、以下の記載によって明らかにされている。
【００１５】
よって、本発明は、種々の多型と依存症の表現型（例えば、ニコチン依存症へのなりやすさ）との間のこれまでに知られていない相関付けを提供するものである。したがって、それらの多型（またはそれに連鎖する遺伝子座）を検出することにより、ニコチン依存症および関連疾患にかかる危険性がある患者を識別するための確実で正確な方法およびシステムが提供される。さらに、それらの多型を識別することにより、依存症の表現型のモジュレーターを識別するための高スループットな方法およびシステムが提供される。表１はその多型を記載するものである。また多型を記載するものとして、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型がある。
【００１６】
したがって、第１の態様において、生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別する方法が提供される。この方法は、生物または生物学的サンプルにおいて、遺伝子の多型またはそれに密接に連鎖する遺伝子座における多型を検出することを含む。遺伝子の具体例には、表１に列挙するものがあり、そこにおいて、多型は、１つの依存症の表現型と関連するものである。同様に、ある依存症の表現型に関連する多型を識別するため、表１の多型の検出またはそれに密接に連鎖する遺伝子座の検出を採用することができる。いずれにしても、該当する多型の存在をある依存症の表現型と関連付け、それにより、該当する依存症の表現型を識別する。依存症に関連する表現型のいずれかが、ある依存症の表現型を構成するものとなり得る。例えば、表現型には、ニコチン依存症になりやすい性質などが含まれ得る。また、そのような態様は、多型が、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型である場合を含む。
【００１７】
生物または生物学的サンプルは、哺乳動物または哺乳動物に由来するものとすることができる。例えば、生物は、ヒトの患者とすることができ、また、生物学的サンプルは、ヒトの患者に由来するもの（血液、リンパ液、皮膚、組織、唾液、それらに由来する一次細胞培養物または二次細胞培養物など）とすることができる。
【００１８】
多型を検出することは、多型またはそれに関連する配列を増幅すること、および得られるアンプリコンを検出することを含み得る。例えば、多型を増幅することは、増幅プライマーまたは増幅プライマー対を、生物または生物学的サンプルから単離された核酸の鋳型と混合することを含み得る。プライマーまたはプライマー対は、典型的に、該当する遺伝子または他の多型の少なくとも一部に対して、あるいは、それに隣接する配列に対して、相補的または部分的に相補的であり、かつ、該核酸の鋳型上でポリメラーゼにより核酸の重合を開始させることができるものである。また、増幅は、ポリメラーゼおよび鋳型の核酸を用いるＤＮＡ重合反応においてプライマーまたはプライマー対を伸長させてアンプリコンを生成させることを含み得る。アンプリコンは、該アンプリコンをアレイにハイブリダイズさせること、該アンプリコンを制限酵素で消化すること、リアルタイムＰＣＲ解析、アンプリコンの配列決定などによって検出することができる。必要に応じて、増幅は、生物または生物学的サンプルから単離された核酸を鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＰＴ−ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を行うことを含み得る。必要に応じて、増幅は、全ゲノム増幅（例えば、ＵＳＳＮ  １１／１７３３０９（２００５年６月３０日出願、表題「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ」に記載されるもの）を行うことを含み得る。他の方式には、アレル特異的ハイブリダイゼーション、単一ヌクレオチド伸長などが含まれ得る。
【００１９】
多型は任意の検出可能な多型（例えば、ＳＮＰ）とすることができる。例えば、対立遺伝子は、表１に示すもののいずれかとすることができる。対立遺伝子は、１つ以上の依存症の表現型と正の相関を示すものであってもよいし、負の相関を示すものであってもよい。それぞれの具体例が表１に示される。さらなる具体例には、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型が含まれる。
【００２０】
表１に列挙する遺伝子に密接に連鎖する多型、および／または表１の任意の多型を、依存症の表現型のマーカーとして使用することができる。そのような密接に連鎖するマーカーは、対象とする遺伝子または他の多型（例えば、表１の対立遺伝子マーカー遺伝子座）から典型的に約２０ｃＭ以下（例えば、１５ｃＭ以下、多くの場合１０ｃＭ以下、特定の好ましい実施形態において５ｃＭ以下）のところにある。勿論この連鎖マーカーは、表１の遺伝子またはマーカー遺伝子座から５ｃＭより近いところ（例えば、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１ｃＭ以下のところ）にあってもよい。一般に、連鎖（または関連性）がより近ければ近いほど、連鎖マーカーは、遺伝子または所定のマーカー遺伝子座（または関連）の対立遺伝子についてより予測可能である。またここで、必要に応じて他の多型を使用してもよく、そのような多型には、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型がある。
【００２１】
１つの典型的な実施形態において、多型の相関付けは、多型の対立遺伝子と表現型との相関関係で構成されるルックアップテーブルを参照することにより行われる。このテーブルは、例えば、該当する相関関係の情報を含む文書または電子データベースとすることができる。１つの態様において、データベースは、重相関を含みかつ重相関関係を同時に考慮する多次元データベースとすることができる。ルックアップテーブルにアクセスすることは、テーブルの参照により相関情報を引き出すことを含むことができ、あるいは、より複雑な統計解析（例えば、主成分分析（ＰＣＡ）、相関情報を追跡かつ／または更新する発見的アルゴリズム（例えば、ニューラルネットワーク）、隠れマルコフモデリングなど）を含むことができる。
【００２２】
相関情報は、感受性（例えば、患者の依存症（例えば、ニコチン依存症）に対する感受性（患者の依存症（例えば、ニコチン依存症））および予後（例えば、患者の遺伝子型からみて通常の禁煙手法が有効である可能性）を判定するのに有用である。
【００２３】
また、例えば、本明細書に開示するマーカーを識別するためのプローブ（例えば、検出される対立遺伝子を依存症の表現型（例えば、依存症になりやすい性質）と相関付けるための説明書とともに適当な容器に包装される）を備えるキットも、本発明の特徴である。
【００２４】
さらなる態様において、依存症の表現型のモジュレーターを識別する方法が提供される。この方法は、遺伝子または遺伝子産物（例えば、表１に列挙したものに対応する遺伝子産物および／または表１にある任意の遺伝子産物、ならびに／あるいはそれらの遺伝子産物のいずれかに対応する遺伝子）を可能性のあるモジュレーターと接触させることを含む。可能性のあるモジュレーターの該遺伝子または遺伝子産物への作用を検出することにより、該可能性のあるモジュレーターが依存症の表現型を調節するかどうかを判定する。対立遺伝子、遺伝子、マーカーなどについて上述した特徴のすべてを、この方法に同様に適用することができる。また、そのような方法には、多型（例えば、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型）が含まれる。
【００２５】
スクリーニングを行う対象とすることができる作用には、（ａ）該モジュレーターの存在下で、表１にある任意の遺伝子および／またはそれらの遺伝子がコードする任意のタンパク質の発現が増加または減少すること、（ｂ）該モジュレーターの存在下で、表１にある任意の遺伝子および／またはそれらの遺伝子がコードする任意のタンパク質の発現のタイミングまたは位置が変化すること、（ｃ）該モジュレーターの存在下で、表１にある任意の遺伝子がコードする任意の遺伝子産物の任意の活性が変化すること、ならびに／あるいは（ｄ）該モジュレーターの存在下で、表１にある遺伝子がコードするタンパク質の局在化が変化することがある。またここで、多型には、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型が含まれ得る。
【００２６】
また、本発明は、依存症の表現型を治療するためのキットを含む。１つの態様において、該キットは、上記方法によって識別されたモジュレーターと、該依存症の表現型の治療にあたり患者に化合物を投与するための説明書とを備える。
【００２７】
さらなる態様において、生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別するためのシステムが提供される。そのようなシステムは、例えば、依存症の表現型に関連する、１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子または連鎖する遺伝子座を検出するよう構成された一式のマーカープローブおよび／またはプライマーを含み、ここで該遺伝子は、表１の任意の遺伝子を含むものであるか、または表１の任意の遺伝子産物をコードするものである。典型的に、該一式のマーカープローブまたはプライマーは、表１のヌクレオチド配列またはそれに密接に連鎖する対立遺伝子を含むまたは検出するものとすることができる。また該システムは、典型的に、該一式のマーカープローブおよび／またはプライマーからの１種以上のシグナル出力または該一式のマーカープローブおよび／またはプライマーから生産されるアンプリコンからの１種以上のシグナル出力を検出するよう構成された検出器を備え、それにより、該対立遺伝子が存在するかしないかを判定する。該対立遺伝子の存在または不在を予測される依存症の表現型と相関付け、それにより、生物またはそれに由来する生物学的サンプルについて依存症の表現型を識別するためのシステムの指示も該システムの特徴である。その指示には、１種以上の対立遺伝子の存在または不在と依存症の表現型との相関付けを含む少なくとも１つのルックアップテーブルが含まれ得る。該システムはサンプルをさらに含むことができる。該サンプルは、典型的に哺乳動物に由来するものであり、例えば、ゲノムＤＮＡ、増幅されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または増幅されたＲＮＡを含む。また、ここで該システムは、表２１の多型、α５ニコチン受容体遺伝子の多型ｒｓ１６９６９９６８、もしくは図２２に示すようなものまたは図２２に示すようなものを含む任意のハプロタイプと連鎖不平衡にある多型、表１７の多型、表１８の多型、表１８のＮＲＸＮ１の多型、表１８のＶＰＳ１３Ａの多型、ＶＰＳ１３Ａの多型、ＴＲＰＣ７の多型、ＣＴＮＮＡ３の多型、ＣＬＣＡ１の多型、表６の多型、ＣＨＲＮＢ３および／またはＣＨＲＮＡ３の多型、ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、ＫＣＮＪ６、ＣＨＲＮＡ５、ＧＡＢＲＡ４、ＣＨＲＮＡ３およびＰＩＰ５Ｋ２Ａから選択される遺伝子の多型、ｒｓ６４７４４１３、ｒｓ１０９５８７２６、ｒｓ５７８７６６、ｒｓ６５１７４４２、ｒｓ１６９６９９６８、ｒｓ３７６２６１１、ｒｓ１０５１７３０およびｒｓ１０５０８６４９から選択される多型、または表９の多型を含むことができる。
【００２８】
当然のことながら、上述した方法、システム、およびキットはすべて、種々の組み合わせでともに使用することができ、また、方法の特徴は、システムおよびキットに反映させることができ、またその逆もしかりである。
【００２９】
本特許または出願のファイルには、着色された図面が少なくとも１つ含まれる。着色された図面を含む本特許または特許出願の写しは、請求および必要な手数料の支払いにより、特許庁から入手することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（詳細な説明）
本発明は、表１にある多型または表１にある遺伝子または遺伝子座に隣接する多型と依存症の表現型との相関付けを提供する。したがって、これらの遺伝子座、遺伝子または遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質産物）における特定の多型を検出することにより、依存症（例えば、ニコチン依存症）などを有するまたはそのおそれがある患者を識別するための方法が提供される。対立遺伝子を検出しかつ依存症の表現型と相関付けるシステム（例えば、上記方法を実施するシステム）も本発明の特徴である。さらに、これらの多型の識別は、依存症の表現型のモジュレーターを識別するための高スループットのシステムおよび方法をもたらす。
【００３１】
本発明の態様をより明瞭に示すため以下の定義を提供する。これらの定義は、他のいかなる関連出願もしくは特許または非関連出願もしくは特許にも帰属するものではない。
【００３２】
定義
当然のことながら、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、種々の態様をとることができるものである。また当然のことながら、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態の記述のみを目的とするものであり、限定を目的とするものではない。本明細書および添付の請求の範囲で使用する単数形の用語および単数形（例えば、「１つの」「その」（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、必要に応じて、対応する複数形をも包含するものである。したがって、例えば、「プローブ（１つ（１種）のプローブ）」の記述は、必要に応じて、複数のプローブ分子を包含するものであり、同様に、文脈に応じて、用語「核酸（１つ（１種）の核酸）」の使用は、必要に応じて、実際には、その核酸分子の多くの複製物を包含するものである。遺伝子またはタンパク質の文字による表記は、文脈に応じて、その遺伝子形、そのＲＮＡ形、および／またはそのタンパク質形を意味し得る。当業者は、本明細書に示す配列、既知の配列および遺伝子コードを参照することにより、該当する生物学的分子の核酸形とアミノ酸形を結びつけることが十分に可能である。
【００３３】
特に断らない限り、核酸は左から右に５’から３’の方向に記載する。本明細書に記載する数字の範囲は、当該範囲を規定する数字を含むものであり、また規定される範囲内の各整数または任意の整数でない数を包含する。特に断らない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解すると同様の意味を有するものである。好ましい材料および方法を本明細書に記載するが、本明細書に記載されるものに類似するまたはそれと均等な任意の方法および材料を本発明の試験の実施に使用することができる。本発明を説明し、特許請求の範囲を記載するにあたり、下記の定義に従って、以下の用語を使用する。
【００３４】
「表現型」は、個体または個体群において見ることができる形質または形質の集まりである。形質は量的なもの（量的形質（ＱＴＬ））でも質的なものでもよい。例えば、依存症に対する感受性は、本明細書に記載する方法、組成物、およびシステムによってモニターすることができる表現型である。
【００３５】
「依存症の表現型」は、依存症を発症しやすい素因を示す表現型、または、個体において依存症への高い感受性を示す表現型である。依存症の素因を示す表現型は、例えば、所定の環境条件下で一般的な個体群の構成員よりも、個体において依存症を生じる可能性がより高いことを示す。依存症の表現型には、例えば、依存症（例えば、ニコチン依存症または他の物質（例えば、コカイン、ヘロイン、アルコール、メタンフェタミン類など）に対する依存症）が存在すること、依存症の病歴があること、依存症になりやすいこと、または依存症に対する耐性が低いことが含まれる。また、依存症の表現型には、上記表現型のいずれかに対する治療（予防的なものであるか否かを問わず）への反応（有効な反応のみならず副作用も含む）も含まれる。
【００３６】
「多型」は、可変的な遺伝子座であり、すなわち、個体群の中で、多型であるヌクレオチド配列は、１つより多い種類またはアレル（対立遺伝子）を有する。用語「対立遺伝子（アレル）」は、特定の遺伝子座で生じるまたはコードする２種以上の異なるヌクレオチド配列の１つ、または、そのような遺伝子座がコードする２種以上の異なるポリヌクレオチド配列の１つを指す。例えば、第１の対立遺伝子が１つの染色体上で生じ得る場合、第２の対立遺伝子はもう１つの相同染色体上で生じる（例えば、１つのヘテロ接合個体の異なる染色体に対して生じるように、あるいは、個体群において、異なるホモ接合個体またはヘテロ接合個体間で生じるように）。多型の一例には「一塩基多型（ＳＮＰ）」がある。これは、ゲノムにおける単一のヌクレオチド位置での多型である（特定の位置のヌクレオチドは、個体間または個体群間で変わる）。
【００３７】
対立遺伝子が形質と関連があり、かつ該対立遺伝子の存在が、該対立遺伝子を有する個体において形質または特性の形態が生じることの指標となる場合、該対立遺伝子は該形質と「正」の相関関係にある。対立遺伝子が形質と関連があり、かつ該対立遺伝子の存在が、該対立遺伝子を有する個体において該形質または特性の形態が生じないことの指標となる場合、該対立遺伝子は該形質と「負」の相関関係にある。
【００３８】
マーカーの多型または対立遺伝子が、特定の表現型と統計的に関連があり得る（肯定的にまたは否定的に）場合、該マーカーの多型または対立遺伝子は、特定の表現型（依存症感受性など）と「相関付け」される。この相関は、実際の原因を示すものであるとしばしば推測されるが、そうである必要はなく、表現型の基礎となる形質について遺伝子座への単純な遺伝的結びつき（関連）があれば、十分である。
【００３９】
「有利な対立遺伝子」は、望ましい表現型（例えば、依存症に対する耐性）と正の相関関係にある遺伝子座の対立遺伝子、または望ましくない表現型と負の相関関係にある対立遺伝子（例えば、依存症の素因と負の相関関係にある対立遺伝子）である。連鎖マーカーの有利な対立遺伝子は、有利な対立遺伝子とともに分離するマーカー対立遺伝子である。染色体セグメントの有利な対立遺伝子形は、望ましい表現型と正の相関関係にあるヌクレオチド配列を含む染色体セグメントまたは染色体セグメント上に物理的に位置する１つ以上の遺伝子座において望ましくない表現型と負の相関関係にある染色体セグメントである。
【００４０】
「不利な対立遺伝子」は、望ましい表現型と負の相関関係にある特定の遺伝子座の対立遺伝子または望ましくない表現型と正の相関関係（例えば、依存症感受性と正の相関関係）にある特定の遺伝子座の対立遺伝子である。連鎖マーカーの不利な対立遺伝子は、不利な対立遺伝子とともに分離するマーカー対立遺伝子である。染色体セグメントの不利な対立遺伝子形は、望ましい表現型と負の相関関係にあるヌクレオチドを含む染色体セグメント、または、染色体セグメント上に物理的に位置する１つ以上の遺伝子座において望ましくない表現型と正の相関関係にある染色体セグメントである。
【００４１】
「対立遺伝子頻度」は、個体、系統または系統群の中で、ある遺伝子座に存在する対立遺伝子の頻度（比率または百分率）を指す。例えば、対立遺伝子「Ａ」について、遺伝子型「ＡＡ」、「Ａａ」または「ａａ」の二倍体の個体は、それぞれ、１．０、０．５または０．０の対立遺伝子頻度を有する。系統または個体群からの個体のサンプルの対立遺伝子頻度を平均することにより、系統または個体群における対立遺伝子頻度を推定することができる。同様に、個体群を構成する系統の対立遺伝子頻度を平均することにより、系統群における対立遺伝子頻度を算出することができる。
【００４２】
個体が所定の遺伝子座において１種の対立遺伝子しか有していない場合、該個体は「ホモ接合」である（例えば、二倍体の個体は、２つの相同染色体のそれぞれにつき、ある遺伝子座において同じ対立遺伝子のコピーを有する）。所定の遺伝子座に１種より多い対立遺伝子が存在する場合、個体は「ヘテロ接合」である（例えば、二倍体の個体は、２種の異なる対立遺伝子のそれぞれのコピーを１つずつ有する）。用語「等質性」は、ある群の構成員が、１つ以上の特定の遺伝子座において同じ遺伝子型を有することを示すものである。一方、用語「異質性」は、群の個体同士の間で、１つ以上の特定の遺伝子座において遺伝子型が異なることを示すのに使用される。
【００４３】
「遺伝子座（座位）」は染色体における位置または領域である。例えば、多型の遺伝子座は、多型の核酸、決定因子、遺伝子またはマーカーが存在する位置または領域である。さらなる具体例において、「遺伝子座」は、ある特定の遺伝子が存在し得るある種のゲノムにおける特定の染色体部位である。同様に、用語「量的形質座位」すなわち「ＱＴＬ」は、発現に示差的に作用する少なくとも２種の対立遺伝子を有する遺伝子座、または少なくとも１つの遺伝的背景（例えば、少なくとも１つの血統の群または子孫）において、量的または継続的な表現型の形質のバリエーションを変える少なくとも２種の対立遺伝子を有する遺伝子座を指す。
【００４４】
「マーカー」、「分子マーカー」または「マーカー核酸」は、ある遺伝子座または連鎖する遺伝子座を識別する場合に、参照部位として使用されるヌクレオチド配列またはそのコード産物（例えば、タンパク質）を指す。マーカーは、ゲノムのヌクレオチド配列に由来するもの、発現されたヌクレオチド配列に由来するもの（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどに由来するもの）、またはコードされるポリペプチドに由来するものとすることができる。また、この用語は、マーカー配列に相補的な核酸配列またはマーカー配列に隣接する核酸配列（例えば、マーカー配列を増幅させることができるプライマー対またはプローブとして利用される核酸）も指す。「マーカープローブ」は、マーカー遺伝子座の存在を明らかにするため使用できる核酸配列または核酸分子（例えば、マーカー遺伝子座の配列に相補的な核酸プローブ）である。溶液中で特異的にハイブリダイズするとき（例えば、ワトソン−クリック塩基対合則に従って）、核酸同士は「相補的」である。「マーカー遺伝子座」は、第２の連鎖する遺伝子座（例えば、ある表現型の形質について、個体群のバリエーションをコードする、または個体群のバリエーションに寄与する、連鎖遺伝子座または相関遺伝子座）の存在を追跡するのに使用できる遺伝子座である。例えば、マーカー遺伝子座は、ある１つの遺伝子座（例えば、ＱＴＬ）における複数の対立遺伝子（マーカー遺伝子座に遺伝的または物理的に連鎖する）の分離をモニターするのに使用できる。したがって、「マーカー対立遺伝子」あるいは「マーカー遺伝子座の対立遺伝子」は、マーカー遺伝子座について多型である個体群のマーカー遺伝子座に存在する複数の多型ヌクレオチド配列の１つである。１つの態様において、本発明は、対象とする表現型（例えば、依存症感受性／依存症耐性）と相関するマーカー遺伝子座を提供する。識別されたマーカーのそれぞれは、該当する表現型に寄与する遺伝要素（例えば、ＱＴＬ）に対して、物理的かつ遺伝的に極めて近いところにある（その結果、物理的および／または遺伝的に連鎖する）と考えられる。個体群の構成員間における遺伝的多型に対応するマーカーは、当該技術においてよく確立されている方法により検出することができる。それらには、例えば、ＰＣＲに基づく配列特異的増幅法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の検出、アイソザイムマーカーの検出、アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）の検出、単一ヌクレオチド伸長の検出、ゲノムの増幅された可変配列の検出、自立的配列複製の検出、単純配列反復（ＳＳＲ）の検出、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出、または増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）の検出がある。
【００４５】
「遺伝子地図」は、所定の種において１つ以上の染色体（または連鎖群）上にある遺伝子座の中の遺伝子のつながり（または結合）の関係を記載したもので、一般的にダイアグラムまたは表の形式で表される。「マッピング」は、遺伝マーカー、マーカーに対して分かれる個体群、および組み換え頻度の標準的な遺伝法則を利用して、遺伝子座の結合関係を規定するプロセスである。「地図位置」は、所定の種において特定のマーカーが存在し得る連鎖する遺伝マーカーに対し遺伝子地図上で指定された位置である。用語「染色体セグメント」は、単一の染色体上に存在するゲノムＤＮＡの連続した線状の範囲を指す。同様に、「ハプロタイプ」は、個体または個体群の遺伝可能な物質に存在する一式の遺伝子座である（この一式は、連続したものでも連続していないものでもよい）。本発明において、複数の遺伝要素（例えば、ここに示す１種以上の対立遺伝子および１種以上の連鎖するマーカー対立遺伝子）は、染色体セグメント内に位置することができ、したがって、遺伝的に連鎖し、特定の遺伝子組み換え距離は、２０センチモルガン（ｃＭ）以下、例えば、１５ｃＭ以下、多くの場合、１０ｃＭ以下、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５または０．１ｃＭ以下である。すなわち、単一の染色体セグメント内にある２つの密接に連鎖する遺伝要素は、約２０％以下、例えば、約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１％以下の頻度で、減数分裂において、互いに組み換えが起こる。
【００４６】
「遺伝子組み換え頻度」は、２つの遺伝子座間で起こる組み換え事象の頻度である。組み換え頻度は、減数分裂において、複数のマーカーおよび／または形質の分離を追跡することにより観測することができる。本発明において、該当する複数の遺伝子座が関連性のため同じ連鎖群の一部であり、かつ連鎖不平衡にある場合、１つのマーカー遺伝子座は、もう１つのマーカー遺伝子座またはいくつかの他の遺伝子座（例えば、依存症感受性遺伝子座）と「関連」する。複数の遺伝子座がランダムに分離する場合よりもより頻繁にマーカー遺伝子座および連鎖する遺伝子座がともに子孫において見られる場合、このことが生じている。同様に、マーカー遺伝子座が形質と連鎖不平衡にある場合、マーカー遺伝子座は形質と関連し得る（例えば、マーカー遺伝子座は、所定の形質（依存症耐性または依存症感受性）と「関連」し得る。用語「連鎖不平衡」は、複数の遺伝子座または形質（またはその両方）の分離がランダムではないことを指す。いずれにせよ、連鎖不平衡が意味するところによれば、該当する複数の遺伝子座は、ランダムな頻度より高い頻度でともに分離するよう、染色体長に沿って十分に物理的に近接した範囲内に存在する（共分離性の形質の場合、形質の基礎となる複数の遺伝子座は、互いに十分近接している）。連鎖する複数の遺伝子座は、５０％より高い確率、例えば、約５１％〜約１００％の確率で共分離する。減数分裂の際、相同染色体対間の組み換えが、高い頻度で２つの遺伝子座間において起こらないように（例えば、密接に連鎖する複数の遺伝子座が、約８０％以上の確率、より好ましくは約８５％以上の確率、さらに好ましくは９０％以上の確率、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７５％または９９．９０％以上の確率で、共分離するように）、該２つの遺伝子座は接近した位置にあることが有利である。
【００４７】
本明細書における用語「密接に連鎖する」は、２つの連鎖する遺伝子座（例えば、ＳＮＰ（例えば、ここで表１において特定される１つ）と第２の連鎖する対立遺伝子）の間で組み換えが起こる確率が約２０％以下であることを意味する。言い換えれば、密接に（または緊密に）連鎖する複数の遺伝子座は、８０％以上の確率で共分離する。標的とする遺伝子座（例えば、依存症のＱＴＬ、あるいは、単に、その他の依存症マーカー遺伝子座）と密接に連鎖するマーカー遺伝子座は、本発明において特に有用である。マーカーが標的とする遺伝子座により密接に連鎖すればするほど、該マーカーは標的とする遺伝子座のよりよい指標となる。したがって、一実施形態において、緊密に連鎖する複数の遺伝子座（例えば、マーカー遺伝子座ともう１つの遺伝子座）が示す遺伝子座間の組み換え頻度は、約２０％以下、例えば、１５％以下、１０％以下、好ましくは約９％以下、より好ましくは約８％以下、さらに好ましくは約７％以下、さらに好ましくは約６％以下、さらに好ましくは約５％以下、さらに好ましくは約４％以下、さらに好ましくは約３％以下、さらに好ましくは約２％以下である。非常に好ましい実施形態において、該当する複数の遺伝子座（例えば、マーカー遺伝子座と標的とする遺伝子座（例えば、ＱＴＬ））が示す組み換え頻度は、約１％以下、例えば、０．７５％以下、より好ましくは約０．５％以下、さらに好ましくは約０．２５％以下、さらに好ましくは約０．１％以下である。また、２つの遺伝子座は、それらの間で起こる組み換えの組み換えの頻度が約２０％未満、例えば、１５％未満、より好ましくは１０％未満（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１％以下）であるような距離で同じ染色体に位置する場合、互いに「近接する（接近している）」と呼ばれる。２つの連鎖する遺伝要素間の関係（例えば、ある形質に寄与する遺伝要素と近接するマーカーとの間の関係）について言及するとき、「相引」相連鎖は、その形質の遺伝子座にある「有利な」対立遺伝子が、それぞれの連鎖するマーカー遺伝子座の「有利な」対立遺伝子と同じ染色体鎖上で物理的に関連している状態を意味する。相引相において、両方の有利な対立遺伝子は、その染色体鎖を引き継いだ子孫によって、ともに引き継がれる。「相反」相連鎖では、対象とする遺伝子座（例えば、依存症感受性のＱＴＬ）にある「有利な」対立遺伝子は、近接するマーカー遺伝子座にある「不利な」対立遺伝子と同じ染色体鎖上で物理的に関連し、そして２つの「有利な」対立遺伝子は、一緒に引き継がれることがない（すなわち、２つの遺伝子座は、互いに「相が一致しない」）。
【００４８】
核酸に関連する用語「増幅」は、選択した核酸（または、その転写形）のさらなる複製物を生成させる任意のプロセスである。典型的な増幅法には、ポリメラーゼに基づく種々の複製法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および全ゲノム増幅）、リガーゼによる方法（例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））、ならびにＲＮＡポリメラーゼに基づく増幅法（例えば、転写によるもの）がある。「アンプリコン」は、増幅された核酸であり、例えば、鋳型核酸を任意の可能な増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、転写など）により増幅して得られる核酸である。
【００４９】
「ゲノム核酸」は、細胞における遺伝可能な核酸と配列が一致する核酸である。一般的な具体例には、核のゲノムＤＮＡおよびそのアンプリコンがある。ゲノム核酸は、スプライスされたＲＮＡや対応するｃＤＮＡと異なる場合がある。というのも、スプライスされたＲＮＡまたはｃＤＮＡは、例えば、スプライシング機構によって加工されイントロンが除かれているからである。ゲノム核酸は、非転写配列（例えば、染色体構造配列、プロモーター領域、エンハンサー領域など）および／または非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでもよい。一方、スプライスされたＲＮＡ／ｃＤＮＡは、通常、非転写配列やイントロンを有していない。「鋳型ゲノム核酸」は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼによる増幅反応（例えば、ＰＣＲ）、全ゲノム増幅、リガーゼによる増幅反応（例えば、ＬＣＲ）、転写反応など）において鋳型として働くゲノム核酸である。
【００５０】
「外因性核酸」は、配列、ゲノム位置、またはそれら両方について、特定の系（例えば、生殖質、細胞、個体など）に本来あるものではない核酸を指す。ここで使用する用語「外因性」または「異種の」（ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用されるような）は、典型的に、生物学的系（例えば、細胞、個体など）に人為的に供給されており、そのような特定の生物学的系に本来あるものではない分子を指す。これらの用語は、該当する物質が天然に存在する供給源以外の供給源に由来することを示し、あるいは、天然ではない構造、天然ではない遺伝子の位置、天然ではない成分の配列を有する分子を指すことができる。
【００５１】
用語「導入」は、異種または外因性の核酸を細胞に移すことに言及するとき、任意の方法を用いて核酸を細胞に組み込むことを指す。該用語は、「トランスフェクション」、「トランスフォーメーション（形質転換）」および「形質導入（トランスダクション）」のような核酸導入法を包含する。
【００５２】
ここで使用する用語「ベクター」は、１つまたは複数の核酸セグメントを細胞に移すポリヌクレオチドまたは他の分子に関して使用される。用語「媒介物」は「ベクター」と同義なものとして使用されることがある。ベクターは、ベクターの維持を担う部分およびその意図する使用を可能にする部分（例えば、複製に必要な配列、薬剤耐性または抗生物質耐性を付与する遺伝子、多重クローニング部位、クローン化遺伝子の発現を可能にする機能的に結合されたプロモーター／エンハンサー要素など）を含んでもよい。多くの場合、ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物のウイルスに由来するものである。「クローニングベクター」または「シャトルベクター」または「サブクローニングベクター」は、サブクローニング工程を容易にする機能的に結合された部位（例えば、多重制限エンドヌクレアーゼ部位を含む多重クローニング部位）を含む。
【００５３】
本明細書で使用する用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物体においてコード配列の発現を促進する機能的に結合されたポリヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、細菌発現ベクターや哺乳動物細胞発現ベクター）を指す。原核生物において発現を促進するポリヌクレオチド配列には、典型的に例えば、プロモーター、オペレーター（必要に応じて）、およびリボソーム結合部位（多くの場合、他の配列とともに）がある。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナルおよびポリアデニル化シグナル、ならびに他の配列（一般的に原核生物が使用するものとは異なる）を使用することができる。１つの任意の実施形態において、本明細書に示す遺伝子座に相当する遺伝子を、発現ベクターにクローニングして発現させ、その遺伝子産物を、モジュレーターの識別のため、本明細書に示す方法およびシステムに使用する。
【００５４】
ある特定の核酸が所定の核酸に「由来する」ものであるとき、該特定の核酸は該所定の核酸の配列を用いて構築されたものであるか、あるいは、該特定の核酸は該所定の核酸を用いて構築されたものである。
【００５５】
「遺伝子」は、１種以上の発現される分子（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を合わせてコードするゲノム中の１つ以上のヌクレオチド配列である。遺伝子は、ＲＮＡに転写されるコード配列を含むことができ（ＲＮＡは、その後、ポリペプチド配列に翻訳され得る）、また、遺伝子の複製または発現を支援する関連の構造配列や調節配列を含むことができる。本発明において、対象とする遺伝子は、表１の遺伝子座を含むものであるか、または、表１の遺伝子座に密接に連鎖するものを含む。
【００５６】
「遺伝子型」は、１つ以上の遺伝子座における個体（または個体の群）の遺伝子構成である。遺伝子型は、個体の１つ以上の既知の遺伝子座の対立遺伝子によって決まり、典型的に、その親から受け継いだ対立遺伝子の編集によって決まってくる。「ハプロタイプ」は、１本鎖ＤＮＡ上の複数の遺伝子座における個体の遺伝子型である。典型的に、ハプロタイプとして示される複数の遺伝子座は、物理的かつ遺伝的に連鎖している（すなわち、同じ染色体鎖上にある）。
【００５７】
「一式」のマーカーまたはプローブは、共通する目的（例えば、特定の表現型（例えば、依存症耐性または依存症感受性）を有する個体を識別すること）に使用される複数のマーカーまたはプローブの集まりまたは群、あるいは、それらから得られるデータの集まりまたは群を指す。多くの場合、複数のマーカーまたはプローブに対応するデータ、またはそれらの使用から得られるデータは、電子媒体に記録される。一式の構成要素のそれぞれが、特定の目的に関して有用性を有しており、また、該一式から選択される個々のマーカーや、複数のマーカーのいくつかを含むがすべてを含むものではないサブセットから選択される個々のマーカーもまた、特定の目的を達成するのに有効である。
【００５８】
「ルックアップテーブル」は、一式のデータをもう一式のデータと関連付ける表、あるいは、一式以上のデータを該データから妥当な予測結果に関連付ける表である。例えば、ルックアップテーブルは、対立遺伝子のデータと、１つ以上の所定の対立遺伝子を有する個体が示す可能性が高い予測形質とを相関付けたものを含むことができる。これらのテーブルは、多次元とすることができ、また、典型的に多次元であり、例えば、形質予測において、複数の対立遺伝子を同時に考慮し、そして必要に応じて、他の因子（例えば、遺伝的背景）をさらに考慮することができる。
【００５９】
「コンピューターが読取り可能な媒体」は、入手可能なまたは特注のインタフェースを使用するコンピューターによって利用できる情報記録媒体である。具体例には、メモリー（例えば、ＲＯＭまたはＲＡＭ、フラッシュメモリーなど）、光学記録媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）、磁気記録媒体（例えば、コンピューターハードドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクなど）、パンチカード、およびその他の市販の多くのものがある。情報は、対象とするシステムとコンピューターとの間で伝達することができ、情報の記録または記録された情報の利用のため、コンピューターからコンピューター読取り可能な媒体に、または、コンピューター読取り可能な媒体からコンピューターに伝達することができる。この伝達は、電気的な伝達とすることができ、あるいは、他の利用可能な方法（例えば、ＩＲリンク、ワイヤレス接続など）によって行うことができる。
【００６０】
「システムの指示」は、システムによって部分的または完全に実行することができる一連の指示である。典型的に、一連の指示は、システムのソフトウェアとして存在する。
【００６１】
「翻訳産物」は、核酸の翻訳の結果としてもたらされる産物（典型的にポリペプチド）である。「転写産物」は、核酸（例えば、ＤＮＡ）の転写の結果としてもたらされる産物（例えば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含んでもよい）、あるいは、例えば、触媒作用のあるまたは生物学的に活性なＲＮＡ）である。
【００６２】
「アレイ」は要素の集合体である。該集合体は、空間的に秩序があるもの（「パターン化されたアレイ」）でもよいし、無秩序なもの（「ランダムなパターンの」アレイ）でもよい。アレイは、１つ以上の機能的要素（例えば、プローブ領域またはマイクロアレイ）を形成してもよいし、含んでもよい。また、アレイは機能的でなくともよい。
【００６３】
本明細書で使用する用語「ＳＮＰ」または「一塩基多型」は、個体間の遺伝的変異（例えば、入手可能な生物体のＤＮＡにおける単一の窒素含有塩基について）を指す。本明細書で使用する「ＳＮＰ類」はＳＮＰの複数形である。当然のことながら、本明細書でＤＮＡについて言及する場合、そのような言及は、ＤＮＡの派生物（例えば、アンプリコン、そのＲＮＡ転写物など）を含み得る。
【００６４】
概説
本発明は、表１の多型（および該多型の含む遺伝子または該多型に近接する遺伝子）と１つ以上の依存症の表現型（例えば、依存症の素因）との間の新規な相関を含むものである。これらの遺伝子または遺伝子産物における特定の対立遺伝子、または、これらの遺伝子または遺伝子産物に連鎖する特定の対立遺伝子は、該当する対立遺伝子を有する個体が依存症または依存症の表現型を発症する可能性（尤度）を予測可能にする。したがって、任意の可能な方法によるこれらの対立遺伝子の検出は、診断の目的（例えば、依存症の表現型の早期検出、依存症の表現型に対する感受性の診断、依存症の表現型を示す患者の予後）に使用することができ、また、依存症の表現型を示す患者または依存症の表現型を発症する危険性がある患者について適切な治療法または予防法を決定するのに使用することができる。
【００６５】
また、表１の多型、遺伝子、または遺伝子産物が依存症の表現型と相関するという認識は、依存症疾患の潜在的なモジュレーターをスクリーニングするための基盤を提供するものである。表１の多型に対応する任意の遺伝子またはコードタンパク質の活性のモジュレーターは、依存症の表現型に対して作用があると予想される。したがって、スクリーニングの方法、スクリーニングのための系などは本発明の特徴である。また、それらのスクリーニング法によって特定されるモジュレーターも本発明の特徴である。
【００６６】
依存症の表現型の診断および治療のためのキットも本発明の特徴であり、該キットは、例えば、該当する対立遺伝子を識別するプローブ、包装材料および該当する対立遺伝子の検出を依存症の表現型と相関付けるための説明書を備える。また、該キットは、依存症の表現型のモジュレーターおよび／または通常の方法を用いて患者を治療するための説明書をさらに備えることができる。
【００６７】
依存症の素因を識別する方法
上述したとおり、本発明は、表１の特定の遺伝子または他の遺伝子座が依存症の表現型と関連するという発見によるものである。したがって、該当する表現型と正または負の相関関係にあるマーカー（例えば、表１中のＳＮＰ類またはそれに密接に連鎖する遺伝子座）を検出することによって、個体または個体群がその表現型を有する可能性があるかどうかを判定することができる。このことにより、依存症の表現型（例えば、ニコチン依存症など）を発症する危険性がある患者を識別するための早期検出の選択肢が増え、場合によって、依存症の表現型の実際の発症を、例えば、早期予防措置を取ることにより、予防することが可能になる。さらに、疾患について分子的根拠があるという知見は、患者の予後の判定を助ける（例えば、依存症の通常の治療法に患者が反応する可能性がどれだけあるかを示すことにより）。また、疾患の治療は、患者が示す分子的障害がどのような種類であるかに基づいて、ねらいを定めることができる。
【００６８】
さらに、ここに示す種々のマーカーを使用することにより、特定の依存症の表現型を患者がわずらっているかどうかまたは発症するかどうかを判定するための既存の診断法に確実性が付加される。リスク評価、診断、予後およびテラノスティックのためマーカーを使用する具体的方法については、例えば、ＵＳＳＮ  １０／９５６２２４（２００４年９月３０日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」およびＰＣＴ出願番号ＵＳ２００５／００７３７５（２００５年３月３日、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照されたい。
【００６９】
個体または個体群が１種以上の依存症の表現型を有する可能性があるかどうかを判定することは、さらなるリスク層化をもたらす他の検定と組み合わせて、該当する表現型と正または負の相関関係にあるマーカー（例えば、表１のＳＮＰ類またはそれに密接に連鎖する遺伝子座）を検出することを含んでもよい。（例えば、遺伝子型を表現型と組み合わせて使用する方法（例えば、ＵＳＳＮ  １１／０４３６８９（２００５年１月２４日出願）、表題「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ」参照）。
【００７０】
該当する対立遺伝子を検出するための検出方法は、任意の利用可能な方法（例えば、増幅技法）を含むことができる。例えば、検出は、多型またはそれに関連する配列を増幅すること、および得られたアンプリコンを検出することを含むことができる。この検出は、生物体または生物学的サンプルから単離された核酸鋳型（例えば、ＳＮＰまたは他の多型を含む）と増幅プライマーまたは増幅プライマー対とを混合することを含むことができ、例えば、そこにおいて、該プライマーまたはプライマー対は、当該遺伝子または緊密に連鎖する多型の少なくとも一部に相補的または部分的に相補的であるか、または、当該遺伝子または緊密に連鎖する多型に近接する配列に相補的または部分的に相補的である。典型的に、プライマーは、核酸鋳型上でポリメラーゼにより核酸の重合を開始させることができるものである。プライマーまたはプライマー対は、例えば、ポリメラーゼおよび鋳型核酸を含むＤＮＡ重合反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において、伸長させられ、アンプリコンを生成させる。アンプリコンは、任意の可能な検出法（例えば、配列決定、アンプリコンのアレイへのハイブリダイゼーション（またはアンプリコンをアレイに付着させて、プローブをそれにハイブリダイズさせること）、アンプリコンを制限酵素により消化すること（例えば、ＲＦＬＰ）、リアルタイムＰＣＲ解析、単一ヌクレオチド伸長、アレル特異的ハイブリダイゼーションなど）により検出される。
【００７１】
検出された多型と形質との相関付けは、対立遺伝子と表現型との関係を割り出すことができる任意の方法により行うことができる。最も典型的には、それらの方法は、多型の対立遺伝子と表現型との相関付けを含むルックアップテーブルを参照することを備える。該テーブルは、複合的な対立遺伝子−表現型の関係に対するデータを含むことができ、また、複合的な対立遺伝子−表現型の関係の付加効果または高次効果を考慮することができる（例えば、統計的手段（例えば、主成分分析、発見的アルゴリズムなど）を使用することによって）。
【００７２】
これらの方法に関し、以下の解説は、まず、マーカーと対立遺伝子がどのように連鎖するか、そして、この現象が、依存症の表現型を識別する方法においてどのように利用されるかについて注目し、次いで、マーカーの検出方法に注目する。その後のさらなる章は、データ解析について解説する。
【００７３】
マーカー、連鎖および対立遺伝子
伝統的な連鎖解析（関連分析）において、染色体上の遺伝子の物理的関係を直接知る必要はなかった。メンデルの第１法則は、組み合わされる複数の形質の因子が分離されているということである。このことは、二倍体の形質の対立遺伝子は２つの配偶子に分かれ、その後異なる子孫に分かれることを意味する。古典的な連鎖解析は、異なる形質の共分離の相対的頻度を統計的に記述したものと考えることができる。連鎖解析は、複数の形質が一緒に分離する頻度に基づいてどのように形質を分類するかについてうまく特徴付けられた記述構成となっている。すなわち、もし２つの非対立遺伝子の形質がランダムな頻度よりも高い頻度でともに遺伝するならば、それらは「連鎖する」と呼ばれる。複数の形質が合わせて引き継がれる頻度は、それらの形質がいかに緊密に連鎖するかの第一の尺度となる。すなわち、高い頻度で一緒に遺伝する形質は、低い頻度（しかし、ランダムな頻度より高い）で一緒に遺伝する形質よりもより密接に連鎖している。複数の形質は連鎖する。というのも、それらの形質の基礎となる遺伝子は、同じ染色体上で互いに近接して存在するからである。染色体上に存在する複数の遺伝子は、より離れていればいるほど、一緒に分離する可能性は低くなる。というのも、相同染色体の組み換えが減数分裂の際に起こるからである。したがって、染色体上に存在する複数の遺伝子は、より離れていればいるほど、減数分裂において組み換え事象が起こりやすくなり、その結果、２つの遺伝子は、子孫に別々に分離する。
【００７４】
連鎖（または関連性）の一般的な尺度は、複数の形質が共分離する頻度である。これは、共分離の百分率（組み換え頻度）として、一般的にセンチモルガン（ｃＭ）で表される。センチモルガン（ｃＭ）は、実際上、組み換え頻度の逆数単位である。ｃＭは、先駆的遺伝学者Ｔｈｏｍａｓ  Ｈｕｎｔ  Ｍｏｒｇａｎにちなんで名付けられたもので、遺伝的組み換え頻度の尺度の単位である。１ｃＭは、１世代での組み換えによって１つの遺伝子座にある形質がもう１つの遺伝子座にある形質から分離される確率が１％であることを示す（これは、それらの形質が９９％の確率で一緒に分離することを意味する）。染色体の距離は、形質間で組み換え事象が起こる頻度とほぼ比例するため、組み換え頻度とほぼ相関する物理的距離がある。例えば、ヒトにおいて、１ｃＭは、平均して、約１００万塩基対（１Ｍｂｐ）に相当する。
【００７５】
マーカー遺伝子座は、それ自体形質であり、分離に際しマーカー遺伝子座を追跡することによる標準的な連鎖解析に従って評価することができる。したがって、本発明に関し、１ｃＭは、１世代での組み換えによって１つのマーカー遺伝子座がもう１つのマーカー遺伝子座から分離される確率が１％であることを示す（もう１つの遺伝子座は、任意の他の形質、例えば、もう１つのマーカー遺伝子座、あるいは、依存症のＱＴＬをコードするもう１つの形質の遺伝子座であり得る）。本明細書でマーカー（例えば、表１に列挙したもの）は、依存症と相関し得る。このことは、マーカーが、形質自体の予測因子として利用できる依存症のＱＴＬを含んでいるか、または、形質自体の予測因子として利用できる依存症のＱＴＬに十分近接していることを意味する。このことは、病気の診断にとって非常に有用である。
【００７６】
以上から明らかなとおり、対象とする形質の遺伝子座に連鎖する任意のマーカー（例えば、この場合、ＱＴＬまたは依存症について識別された連鎖マーカー遺伝子座（例えば、表１にあるような））をそのような形質のマーカーとして利用することができる。したがって、表１に示すマーカーに加えて、表１に掲げたマーカーに密接に連鎖する他のマーカーも、表１に示すマーカー対立遺伝子の存在（したがって、さらに該当する表現型の形質）を予測するのに有用であり得る。そのような連鎖マーカーは、所定の遺伝子座に十分に近接しているため所定の遺伝子座との組み換え頻度が低い場合、特に有用である。本発明において、そのような密接に連鎖するマーカーは本発明の特徴の１つである。密接に連鎖する遺伝子座は、所定のマーカーに対して、約２０％以下の組み換え頻度を示す（所定のマーカーは、所定のマーカーの２０ｃＭ以内にある）。言い換えれば、密接に連鎖する複数の遺伝子座は、少なくとも８０％の確率で共分離する。組み換え頻度は、１０％以下、例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２５％または０．１％以下がより好ましい。１つの典型的な実施形態において、密接に連鎖する複数の遺伝子座は、互いに５ｃＭ以下の範囲内にある。
【００７７】
当業者に明らかなとおり、組み換え頻度（そして、結果的に地図位置）は、使用する地図（および該地図上にあるマーカー）によって変わり得る。表１に示すマーカーに密接に連鎖する（例えば、約２０ｃＭ以内、より好ましくは約１０ｃＭ以内の）さらなるマーカーは、依存症素因のＱＴＬを識別するのに容易に用いることができる。
【００７８】
マーカー遺伝子座は、マーカーの対象となっている標的遺伝子座（例えば、依存症の表現型のＱＴＬ、あるいは、単に、そのようなＱＴＬにそれ自体連鎖する他のマーカー遺伝子座）に密接に連鎖する場合、本発明において特に有用である。表現型の形質をコードするかまたは表現型の形質に作用する標的遺伝子座に、マーカーがより密接に連鎖すればするほど、該マーカーは、標的遺伝子座のよりよい指標となる（標的遺伝子座とマーカーとの間の交差頻度が低くなるため）。したがって、一実施形態において、密接に連鎖する複数の遺伝子座（例えば、マーカー遺伝子座ともう１つの遺伝子座（例えば、表１の所定のマーカー遺伝子座と、さらなるもう１つの遺伝子座））が示す遺伝子座間の交差頻度は、約２０％以下、例えば、１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは約９％以下、さらに好ましくは約８％以下、さらに好ましくは約７％以下、さらに好ましくは約６％以下、さらに好ましくは約５％以下、さらに好ましくは約４％以下、さらに好ましくは約３％以下、さらに好ましくは約２％以下である。非常に好ましい実施形態において、該当する複数の遺伝子座（例えば、マーカー遺伝子座と標的遺伝子座（例えば、ＱＴＬ））が示す組み換え頻度は、約１％以下、例えば、０．７５％以下、より好ましくは約０．５％以下、さらに好ましくは約０．２５％以下、約０．１％以下である。したがって、それらの遺伝子座の間の距離は、約２０ｃＭ、１９ｃＭ、１８ｃＭ、１７ｃＭ、１６ｃＭ、１５ｃＭ、１４ｃＭ、１３ｃＭ、１２ｃＭ、１１ｃＭ、１０ｃＭ、９ｃＭ、８ｃＭ、７ｃＭ、６ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．７５ｃＭ、０．５ｃＭ、０．２５ｃＭまたは０．１ｃＭ以下である。言い換えれば、２つの遺伝子座間で起こる組み換え頻度が２０％未満（例えば、約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％以下）であるような距離で２つの遺伝子座が同じ染色体に位置する場合、それらは互いに「近接する」と呼ばれる。１つの態様において、複数の連鎖マーカーは、互いに１００ｋｂ（これは、局所組み換え率に応じて、ヒトで約０．１ｃＭに相当する）以内にあり、例えば、５０ｋｂ以内、さらには２０ｋｂ以下の範囲内にある。
【００７９】
２つの遺伝要素間の関係（例えば、依存症に寄与する遺伝要素と近接するマーカーとの間の関係）について言及するとき、「相引」相連鎖は、その遺伝子座にある「有利な」対立遺伝子が、それぞれの連鎖するマーカー遺伝子座の「有利な」対立遺伝子と同じ染色体鎖上で物理的に関連している状態を意味する。相引相において、両方の有利な対立遺伝子は、その染色体鎖を引き継いだ子孫によって、ともに引き継がれる。「相反」相連鎖では、対象とする遺伝子座（例えば、依存症のＱＴＬ）にある「有利な」対立遺伝子は、近接するマーカー遺伝子座にある「不利な」対立遺伝子と物理的に連鎖し、そして２つの「有利な」対立遺伝子は、一緒に引き継がれることがない（すなわち、２つの遺伝子座は、互いに「相が一致しない」）。
【００８０】
ゲノムにおいて、また、対応する発現された核酸およびポリペプチドにおいて、ＳＮＰおよび他の多型を追跡することに加え、表１の遺伝子産物について、個体間または個体群間で、ｍＲＮＡまたはタンパク質形のいずれかの発現レベルが異なることが、依存症に相関する場合がある。したがって、本発明のマーカーは、例えば、ゲノムの遺伝子座、転写された核酸、スプライスされた核酸、発現されたタンパク質、転写された核酸のレベル、スプライスされた核酸のレベル、および発現されたタンパク質のレベルのいずれかを含むことができる。
【００８１】
マーカー増幅法
マーカー（例えば、マーカー遺伝子座）を増幅するための増幅プライマー、およびそのようなマーカーを検出するための適当なプローブまたは複合的なマーカー対立遺伝子についてサンプルの遺伝子型を検出するための適当なプローブは、本発明の特徴の１つである。表１には、増幅のための特定の遺伝子座が示されるとともに、そのようなプライマーの設計において（必要に応じて既知のフランキング配列とともに）当業者が容易に利用できるアンプリコン配列が示される。例えば、ロングレンジＰＣＲのためのプライマー選択は、米国特許第６８９８５３１号（２００５年５月２４日発行、表題「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐａｉｒｓ」）およびＵＳＳＮ１０／２３６４８０（２００２年９月５日出願）に記載されており、ショートレンジＰＣＲのためのプライマー選択は、ＵＳＳＮ１０／３４１８３２（２００３年１月１４日出願）に記載されており、また、プライマー選択についての手引きが提供されている。また、プライマー設計のため、公的に入手可能なプログラム（例えば、「Ｏｌｉｇｏ」）もある。そのような入手可能なプライマー選択設計ソフトウェア、公的に入手可能なヒトゲノム配列および表１に示す多型位置により、当業者は、本発明のＳＮＰ類を増幅するためのプライマーを設計することができる。さらに明らかなとおり、ＳＮＰを含む核酸（例えば、ＳＮＰを含むアンプリコン）の検出に使用する精密なプローブは、さまざまであり得、例えば、検出すべきマーカーのアンプリコンの領域を識別できる任意のプローブを、本発明と組み合わせて用いることができる。さらに、検出プローブの構成も、当然のことながら、さまざまであり得る。したがって、本発明は、本明細書に記載される配列に限定されるものではない。
【００８２】
実際明らかなとおり、増幅は、マーカー検出の必要条件ではない。例えば、ゲノムＤＮＡのサンプルについてサザンブロットを単に行うことにより、増幅していないゲノムＤＮＡを直接検出することができる。サザンブロット法、標準的な増幅法（ＰＣＲ、ＬＣＲなど）、およびその他の多くの核酸検出法が、十分に確立されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２年補足）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）、およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）に示されている。
【００８３】
また、例えば、生成物への組み込み（アンプリコンへの標識ヌクレオチドの組み込み）により該当する増幅プライマーを修飾することで生成物の情報を検出するリアルタイム増幅反応を行うことにより、あるいは、増幅していない前駆体と比較して、アンプリコンの分子旋光度の変化を（例えば、蛍光偏光法により）モニターすることにより、別々の異なる検出プローブを、増幅／検出法で省略することができる。
【００８４】
典型的に、分子マーカーは、当該技術で利用可能な任意の確立された方法により検出される。そのような方法には、アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、単一ヌクレオチド伸長、アレイハイブリダイゼーション（ＡＳＨを含んでもよい）、あるいは一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するための他の方法、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）検出、増幅可変配列検出、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）検出、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）検出、自立的配列複製検出、単純配列反復（ＳＳＲ）検出、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）検出、アイソザイムマーカー検出、ノーザン解析（ここでは発現レベルがマーカーとして使用される）、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの定量的増幅などがあるが、これらに限定されるものではない。本願の図面および表に示す具体例としてのマーカーは、ＳＮＰマーカーであるが、依存症の表現型と相関する連鎖遺伝子座を識別するため、上述した種類のマーカーのいずれを本発明において使用してもよい。
【００８５】
マーカー検出のための具体的手法
本発明は、依存症の表現型のＱＴＬを含むまたは依存症の表現型のＱＴＬに連鎖する分子マーカーを提供する。該マーカーは、疾病素因の診断、予後、治療などに使用される。本発明は、該マーカーを検出する特定の方法に限定されるものではない。
【００８６】
個体群の構成員間の遺伝的多型に対応するマーカーは、当該技術において十分に確立された多くの方法（例えば、ＰＣＲによる配列特異的増幅、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、アイソザイムマーカー、ノーザン解析、アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、アレイによるハイブリダイゼーション、ゲノムの増幅可変配列、自立的配列複製、単純配列反復（ＳＳＲ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、または増幅断片長多型（ＡＦＬＰ））により検出することができる。１つのさらなる実施形態において、分子マーカーが存在するかしないかは、単に、多型マーカー領域のヌクレオチド配列決定によって判定することができる。これらの方法はいずれも、高スループット解析に容易に適合させることができる。
【００８７】
遺伝子マーカーを検出するためのいくつかの方法は、該遺伝子マーカーに相当する核酸（例えば、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて生成させた増幅核酸）へのプローブのハイブリダイゼーションを利用する。ハイブリダイゼーションの方式（例えば、溶液相、固体相、混合相、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（原位置ハイブリダイゼーション）アッセイがあるが、これらに限定されない）は、対立遺伝子の検出に有用である。核酸ハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋや、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＡｕｓｕｂｅｌにある。
【００８８】
例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）は、例えば、制限酵素で消化したゲノムＤＮＡに、検出すべき核酸のサブフラグメント（または、サブフラグメントに相当する合成オリゴヌクレオチド）であるプローブをハイブリダイズさせることにより、検出される。制限酵素は、異なる個体または個体群において少なくとも２種類の対応する（すなわち、多型の）長さを有する制限酵素断片をもたらすよう、選択される。マーカーの各対立遺伝子に対して有益な断片を生成させる１種以上の制限酵素を決定することは、当該技術においてよく知られた簡単な手順である。適当なマトリクス（例えば、寒天またはポリアクリルアミド）中での長さによる分離および膜（例えば、ニトロセルロース、ナイロンなど）への転写の後、標的へのプローブの平衡結合をもたらす条件下で、標識プローブをハイブリダイズさせ、次いで、過剰なプローブを洗浄によって除去する。
【００８９】
マーカー遺伝子座に対する核酸プローブは、クローニングまたは合成により得ることができる。任意の適当な標識を、本発明のプローブとともに用いることができる。核酸プローブとともに使用するのに適した検出可能な標識には、例えば、分光手段、放射性同位元素手段、光化学手段、生化学手段、免疫化学手段、電気的手段、光学手段または化学手段によって検出可能な任意の合成物がある。有用な標識には、標識ストレプトアビジン抱合体で染色するビオチン、磁気ビーズ、蛍光色素、放射性標識、酵素および比色標識がある。その他の標識には、蛍光体、化学発光剤および酵素で標識される抗体に結合するリガンドがある。プローブは、放射性標識されたＰＣＲプライマーを構成することもできる。このプライマーは、放射性標識されたアンプリコンの生成に使用される。核酸を標識するための標識法および対応する検出法は、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）で見ることができる。マーカー検出法に関してさらに詳細を以下に示す。
【００９０】
増幅に基づく検出方法
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＬＣＲは、対象とする核酸（例えば、マーカー遺伝子座を含むもの）を増幅するための増幅法および増幅検出法として特に広く用いられている。これらのおよびその他の増幅法の使用に関する詳細は、種々の標準的な教科書（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、およびＢｅｒｇｅｒがある）のいずれにおいても見ることができる。また、多くの入手できる生物学の教科書に、ＰＣＲおよび関連する増幅法について詳細な解説がある。当業者に明らかなとおり、ほとんどすべてのＲＮＡを、制限酵素消化、ＰＣＲ増幅、ならびに逆転写酵素およびポリメラーゼを用いる配列決定（「逆転写−ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」）に適する二本鎖ＤＮＡに変換することができる（上記Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒを参照）。また、これらの方法は、ｍＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡを定量的に増幅するのに用いることができ、例えば、個体において表１の遺伝子または遺伝子産物に対応するｍＲＮＡの発現レベルを示すことができる。個体間、家族間、系統間、および／または個体群間でのこれらの遺伝子の発現レベルの相違は、依存症の表現型のマーカーとして利用することができる。
【００９１】
リアルタイム増幅／検出法
１つの態様において、本明細書に記載される増幅混合物に対し、例えば、分子指標またはＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して、リアルタイムＰＣＲまたはＬＣＲを行う。分子指標（ＭＢ）は、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡであり、これは、適当なハイブリダイゼーション条件下で自己ハイブリダイズし、ステム・アンド・ループ構造を形成する。ＭＢは、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡの末端に標識および消光体を有している。したがって、分子内ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、標識は、典型的に消光体により消光させられる（または、その蛍光が少なくとも変化する）。ＭＢが分子内ハイブリダイゼーションを発揮しない条件下では（例えば、標的核酸に結合する場合（例えば、増幅中、アンプリコンのある領域に結合する場合））、ＭＢの標識は消光させられない。ＭＢを調製し使用する標準的な方法についての詳細は、文献にある通り十分に確立しており、そしてＭＢは、多くの試薬業者から入手できる。例えば、以下も参照されたい。Ｌｅｏｎｅら（１９９５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＡＳＢＡ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２１５０−２１５５、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（１９９６）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８、ＢｌｏｋおよびＫｒａｍｅｒ（１９９７）「Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ」Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １１：１８７−１９４、Ｈｓｕｉｈら（１９９７）「Ｎｏｖｅｌ，ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３４：５０１−５０７、Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら（１９９８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｌｅｌｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８−１２２９、Ｓｏｋｏｌら（１９９８）「Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ：ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１５３８−１１５４３、Ｔｙａｇｉら（１９９８）「Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９−５３、Ｂｏｎｎｅｔら（１９９９）「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６１７１−６１７６、Ｆａｎｇら（１９９９）「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕ���ａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｆｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：２９２１−２９２２、Ｍａｒｒａｓら（１９９９）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ」Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１４：１５１−１５６、ならびにＶｅｔら（１９９９）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６３９４−６３９９。ＭＢの構成および使用に関するさらなる詳細は、例えば、以下の特許文献にさらに示されている。Ｔｙａｇｉらに対する米国特許第５９２５５１７号（１９９９年７月２０日、表題「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｄｕａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ，ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」、Ｔｙａｇｉらに対する米国特許第６１５００９７号（２０００年１１月２１日、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ  ａｎｄ  ａｓｓａｙｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ」、およびＴｙａｇｉらに対する米国特許第６０３７１３０号（２０００年３月１４日、表題「Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｈｉｆｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」）。
【００９２】
二重標識された蛍光性オリゴヌクレオチドプローブ（一般的にＴａｑＭａｎ（商標）プローブと呼ばれる）を使用するＰＣＲ検出および増幅も、本発明に従って行うことができる。これらのプローブは、２つの異なる蛍光色素で標識された短い（例えば、２０〜２５塩基）オリゴデオキシヌクレオチドからなる。各プローブの５’末端にはレポーター色素が存在し、各プローブの３’末端には消光色素が存在する。オリゴヌクレオチドプローブ配列は、ＰＣＲアンプリコンに存在する内部標的配列に相補的である。プローブがそのままの状態にある場合、２つの蛍光団の間でエネルギー移動が起こり、レポーターからの発光はＦＲＥＴによる消光体によって消光される。ＰＣＲの伸長段階において、プローブは、反応に使用されるポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、オリゴヌクレオチド−消光体からレポーターを放出し、レポーター発光の強度を増加させる。かくして、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、標識と消光体を有するオリゴヌクレオチドであるが、その標識は、増幅に使用されるポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ作用によって増幅中に放出される。これは、合成中に、増幅のリアルタイム測定をもたらす。種々のＴａｑＭａｎ（商標）試薬が市販されており、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙの事業本部）から市販されており、さらに、種々の専門業者（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ブラックホール消光プローブ））からも市販されている。さらに二重標識プローブ法に関する詳細は、例えば、ＷＯ９２／０２６３８に示される。
【００９３】
他の類似する方法には、例えば、米国特許第６１７４６７０号に記載される「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）」方式を用いる、２つの隣接してハイブリダイズされたプローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動がある。
【００９４】
アレイによるマーカー検出
アレイによる検出は、市販のアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、カリフォルニア州）や他の製造業者からの）を用いて行うことができる。核酸アレイの操作に関する総説には、Ｓａｐｏｌｓｋｙら（１９９９）「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：１８７−１９２、Ｌｏｃｋｈａｒｔ（１９９８）「Ｍｕｔａｎｔ  ｙｅａｓｔ  ｏｎ  ｄｒｕｇｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１２３５−１２３６、Ｆｏｄｏｒ（１９９７）「Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ」ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：Ａ８７９、Ｆｏｄｏｒ（１９９７）「Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：３９３−３９５、およびＣｈｅｅら（１９９６）「Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：６１０−６１４がある。アレイによる検出は、それが本質的に高スループット性であるため、サンプル中の本発明による識別マーカーにとって好ましい方法である。
【００９５】
種々のプローブアレイが、文献に記載されており、本明細書に示す表現型に相関付けすることができるマーカーの検出に、本発明に従って用いることができる。例えば、ＤＮＡプローブアレイチップまたはより大きなＤＮＡプローブアレイウェハ（あるいは、該ウェハを分割することにより個々のチップが得られる）が本発明の一実施形態において用いられる。ＤＮＡプローブアレイウェハは、一般的に、ＤＮＡプローブ（ＤＮＡの短いセグメント）の高密度アレイがその上に配置されたガラスウェハからなる。ウェハのそれぞれは、例えば、約６０００万のＤＮＡプローブを保持することができ、それらは、より長いサンプルＤＮＡ配列（例えば、対象とするマーカーを含む個体または個体群に由来するもの）を認識するのに使用される。ガラスウェハ上の一連のＤＮＡプローブによるサンプルＤＮＡの認識は、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより行われる。ＤＮＡサンプルがＤＮＡプローブのアレイにハイブリダイズするとき、該サンプルは、サンプルＤＮＡ配列に相補的なプローブに結合する。どのプローブに個体のサンプルＤＮＡがより強くハイブリダイズしたかを測定することによって、核酸の既知の配列が該サンプルに存在するか否かを決定することができ、それにより、核酸中にマーカーが存在するかどうかが決定される。例えば、ＳＮＰの識別のため、そして、１種以上のＳＮＰについてサンプルの遺伝子型を特定するため、単一ヌクレオチドの識別を可能にするようハイブリダイゼーション条件を調節することにより、この方法をＡＳＨの実施に使用することができる。
【００９６】
対立遺伝子情報を得るためＤＮＡプローブアレイを用いる手法は、以下の一般的な工程を伴う。ＤＮＡプローブアレイの設計と製造、サンプルの調製、サンプルＤＮＡのアレイへのハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション事象の検出、および配列決定のためのデータ解析。好ましいウェハは、経済性および高品質を達成するため半導体製造を応用した工程により製造され、例えば、カリフォルニア州サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃから入手できる。
【００９７】
例えば、プローブアレイは、光制御化学合成法により製造することができ、該方法は、固相化学合成と半導体工業で利用されているフォトリソグラフィーによる製作技法とを組み合わせている。一連のフォトリソグラフィーマスクを用いてチップの露光部位を定め、次いで、所定の化学合成工程を行うことにより、この方法は、各プローブがアレイの所定の位置にある、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを構築する。多数のプローブアレイを、１つの大きなガラスウェハ上に同時に合成することができる。この並列プロセスは、再現性を高め、スケールメリットを得るのに役立つ。
【００９８】
一旦製造されると、ＤＮＡプローブアレイは、対象とするマーカーについて、その存在および／または発現レベルに関するデータを得るため使用することができる。ＤＮＡサンプルは、標準的な生化学的手法により、ビオチンおよび／または蛍光レポーター基で標識してもよい。標識されたサンプルは、アレイとともにインキュベートし、サンプルの断片が、アレイ上の相補配列に結合（すなわち、ハイブリダイズ）する。アレイは、ハイブリダイゼーションパターンを生成させるため、洗浄かつ／または染色することができる。次いで、アレイをスキャンし、蛍光レポーター基からの発光により、ハイブリダイゼーションのパターンを検出する。これらの手順に関してさらなる詳細は、後の実施例にある。アレイ上にある各プローブの正体と位置がわかっているので、アレイに付与したサンプル中のＤＮＡ配列の性質を調べることができる。これらのアレイを、遺伝子型を決定する実験に使用する場合、それらを遺伝子型判定アレイと呼ぶ場合がある。
【００９９】
分析すべき核酸サンプルは、単離され、増幅され、そして、典型的にビオチンおよび／または蛍光レポーター基で標識される。次いで、標識された核酸サンプルは、流体工学ステーションおよびハイブリダイゼーションオーブンを用いて、アレイとともにインキュベートされる。アレイは、検出方法に応じて適宜、洗浄し、かつ染色または対比染色することができる。ハイブリダイゼーション、洗浄および染色の後、アレイは、スキャナーに挿入され、そこでハイブリダイゼーションのパターンが検出される。ハイブリダイゼーションのデータは、すでに標識核酸に組み込まれている（そして、プローブアレイに結合された）蛍光レポーター基からの発光として集められる。標識された核酸に最も明確に整合するプローブは、ミスマッチを有するものよりも強いシグナルを発生させる。アレイ上にある各プローブの配列および位置がわかっているため、相補性により、プローブに付与された核酸サンプルが何であるか明らかにすることができる。
【０１００】
１つの実施形態において、２つのＤＮＡサンプルを、識別可能に標識し、一連の設計された遺伝子型判定アレイとハイブリダイズさせることができる。この方法では、２組のデータを、同じ物理的アレイから得ることができる。使用できる標識には、サイクローム、フルオレセイン、またはビオチン（ハイブリダイゼーションの後、フィコエリトリン−ストレプトアビジンで染色される）があるが、これらに限定されるものではない。２色標識は、米国特許第６３４２３５５号に記載されており、その内容はこの引用により本明細書にそっくり記載されたものとする。各アレイは、両方の標識からのシグナルが同時に検出されるようスキャンすることができ、あるいは、各シグナルを別々に検出するように２回スキャンすることができる。
【０１０１】
マーカーが存在するかどうか試験される個体のそれぞれについて、すべてのマーカーに対し、強度データがスキャナーによって集められる。測定された強度は、ある特定の個体についてサンプル中に存在する特定のマーカーの量（ゲノムの核酸が分析されるか発現された核酸が分析されるかどうかに応じて、個体に存在する対立遺伝子の発現レベルおよび／または複製物の数）を示す尺度となる。これは、個体が対象とするマーカーに対してホモ接合であるかヘテロ接合であるかを決定するのに利用することができる。強度データは、種々の強度について対応するマーカー情報をもたらすよう、処理される。
【０１０２】
増幅可変配列、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ、ＡＳＨ、ＳＮＰおよびアイソザイムマーカーについてのさらなる詳細
増幅可変配列は、同じ種の構成員間で核酸残基の可変性が高いゲノムの増幅された配列を指す。すべての生物体が可変性のゲノム配列を有しており、また、それぞれの生物体（クローン（例えば、クローン細胞）を除いて）は異なる組の可変配列を有する。一旦明らかになれば、特定の可変配列が存在するかどうかということは、表現型の形質を予測するのに利用することができる。ゲノムからのＤＮＡは、ＤＮＡの可変領域に隣接するプライマーを用いた増幅の鋳型として働くことが好ましい。可変配列は、増幅され、その後、配列決定される。
【０１０３】
一方、自立的配列複製を、遺伝子マーカーの識別に用いてもよい。自立的配列複製は、レトロウイルス複製に必要な３種類の酵素活性（（１）逆転写酵素、（２）リボヌクレアーゼＨ、および（３）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）を用いることにより実質的に等温の条件下でインビトロにおいて指数関数的に複製される標的核酸配列を用いた核酸増幅法を指す（Ｇａｕｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１８７４）。ｃＤＮＡ中間産物によるレトロウイルスのＲＮＡ複製法を模倣することにより、この反応は、本来の目的物のｃＤＮＡ複製物およびＲＮＡ複製物を蓄積させる。
【０１０４】
増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）も遺伝子マーカーとして用いることができる（Ｖｏｓら（１９９５）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：４４０７）。用語「増幅断片長多型」は、制限エンドヌクレアーゼによる切断の前または後に増幅される選択された制限断片を指す。増幅工程により、特定の制限断片を容易に検出することができる。ＡＦＬＰは、より多くの数の多型マーカーの検出を可能にするもので、遺伝子地図作成に利用されてきた（Ｂｅｃｋｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４９：６５、およびＭｅｋｓｅｍら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４９：７４）。
【０１０５】
アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）を、本発明の遺伝子マーカーを識別するため使用することができる。ＡＳＨ技術は、短い一本鎖オリゴヌクレオチドプローブが完全に相補的な一本鎖標的核酸に安定してアニーリングすることに基づく。検出は、該プローブに付与される同位体または非同位体の標識を介して行うことができる。
【０１０６】
各多型について、２種以上の異なるＡＳＨプローブが、多型ヌクレオチドの部分を除いて同じＤＮＡ配列を有するように設計される。各プローブは、１つの対立遺伝子配列と厳密な相同性を有するようになるため、プローブ領域によって、既知の等価な対立遺伝子の配列をすべて識別することができる。各プローブは標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。適当なプローブ設計とハイブリダイゼーション条件を用いれば、プローブと標的ＤＮＡとの間の単一塩基ミスマッチによってハイブリダイゼーションは阻止される。このようにして、等価なプローブのうち１つのみが、１つの対立遺伝子に対してホモ接合または同種である標的サンプルにハイブリダイズするようになる。２つの対立遺伝子に対してヘテロ接合または異種であるサンプルは、２つの等価なプローブの両方にハイブリダイズするようになる。
【０１０７】
ＡＳＨマーカーは、優性マーカーとして使用され、そこにおいて、１つのみの対立遺伝子が存在するかしないかは、たった１つのプローブによるハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションの欠如により判定される。等価な対立遺伝子は、ハイブリダイゼーションの欠如により推測することができる。ＡＳＨプローブおよび標的分子は、必要に応じてＲＮＡまたはＤＮＡとすることができる。標的分子は、プローブに相補的な配列を超える任意の長さのヌクレオチドである。該プローブは、ＤＮＡの標的のいずれかの鎖にハイブリダイズするように設計される。プローブは、種々のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件などに適合するよう、サイズに幅がある。
【０１０８】
ＰＣＲは、低濃度で比較的少量の核酸からＡＳＨのための標的配列を増幅するのを可能にする。それを行わない場合、ゲノムＤＮＡからの標的配列は、限定エンドヌクレアーゼで消化され、ゲル電気泳動によってサイズが分けられる。ハイブリダイゼーションは、典型的に、膜の表面に結合された標的配列に対して行うが、一方、米国特許第５４６８６１３号に記載されるとおり、ＡＳＨプローブを膜に結合させてもよい。
【０１０９】
１つの実施形態において、ＡＳＨのデータは、ゲノムＤＮＡからの核酸断片（アンプリコン）をＰＣＲにより増幅し、アンプリコン標的ＤＮＡをドットブロット方式で膜に転写し、該アンプリコン標的に標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズし、そしてオートラジオグラフィーによってハイブリダイゼーションドットを観察することにより、得られる。
【０１１０】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチドの塩基が異なる共通配列からなるマーカーである。典型的に、この差は、ＳＮＰを含むアンプリコンが、例えば、アクリルアミドゲル上で、異なるパターンで移動することにより、検出される。しかし、検出の別の態様、例えば、ハイブリダイゼーション（例えば、ＡＳＨまたはＲＦＬＰ解析）も適当である。
【０１１１】
アイソザイムマーカーは、例えば、本明細書に示すマーカーに連鎖するアイソザイムマーカーを追跡するため、遺伝子マーカーとして用いることができる。アイソザイムは、そのアミノ酸が互いに異なる（したがって、その核酸配列が互いに異なる）酵素の多重形である。いくつかのアイソザイムは、若干異なるサブユニットを有する多量体型酵素である。他のアイソザイムは、多量体型または単量体型のいずれかであるが、プロ酵素がアミノ酸配列の異なる部位で切断されたものである。アイソザイムは、タンパク質レベルで、特徴付けされ、分析することができる。一方、核酸レベルで異なるアイソザイムを測定してもよい。そのような場合、本明細書に記載する核酸に基づく方法のいずれかを、アイソザイムマーカーの分析に使用することができる。
【０１１２】
核酸増幅に関するさらなる詳細
上述したように、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲおよびＬＣＲ）は、当該技術において周知であり、対象とする核酸（例えば、マーカー遺伝子座を含む核酸）を増幅かつ／または検出するため、本発明に適用することができる。当業者がそのようなインビトロの方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、およびその他のＲＮＡポリメラーゼによる手法（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む）を行うのに十分な技術の具体例は、上述した文献、例えば、Ｉｎｎｉｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、およびＢｅｒｇｅｒに示されている。また、さらなる詳細が以下に存在する。Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４６８３２０２号、Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３，８１−９４、Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３、Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４、Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５，１８２６、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７−１０８０、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２９１−２９４、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４，５６０、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９，１１７、ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４。ＰＣＲにより大きな核酸を増幅する改良された方法は、ポジショナル・クローニングに有用であるが、そのような方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４およびその引用文献にまとめられており、そこにおいて、最大４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成されている。ロングレンジＰＣＲの方法は、例えば、米国特許第６８９８５３１号（２００５年５月２４日発行、表題「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐａｉｒｓ）、米国特許出願番号１０／２３６４８０（２００２年９月９日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、および米国特許第６７４０５１０号（２００４年５月２５日発行、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」）に開示されている。また、ＵＳＳＮ１０／３４１８３２（２００３年１月１４日出願）には、ショートレンジＰＣＲを行うためのプライマー採取法に関する詳細が示されている。
【０１１３】
タンパク質発現産物の検出
タンパク質（表１に示す遺伝子によってコードされたものなど）は、本明細書における対象の表現型に相関付けされるマーカーを含むものを含む、核酸によってコードされる。ＲＮＡへの、タンパク質への、ＤＮＡの発現（転写および／または翻訳）を含む、分子生物学の基本的なパラダイムの記述に関して、Ａｌｂｅｒｔｓら（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、Ｔｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．、ＩＳＢＮ：０８１５３３２１８１（「Ａｌｂｅｒｔｓ」）、およびＬｏｄｉｓｈら（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版、Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ、ＩＳＢＮ：０７１６７３７０６Ｘ（Ｌｏｄｉｓｈ」）を参照されたい。したがって、表１中の遺伝子に相当するタンパク質は、例えば、個体または個体群間で異なるタンパク質イソタイプを検出することによって、またはそのような対象のタンパク質（例えば、表１中の遺伝子の遺伝子産物）の異なる存在レベル、不在レベルまたは発現レベルを検出することによって、マーカーとして検出可能である。
【０１１４】
さまざまなタンパク質検出方法が既知であり、マーカーを区別するために使用可能である。上記した種々の参考文献に加えて、さまざまなタンパク質操作および検出方法が、当該技術においてよく知られている。例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第３版）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、およびそれらに引用された参考文献にて列挙されたものが挙げられる。タンパク質精製および検出方法に関するさらなる詳細を、Ｓａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）において見ることができる。
【０１１５】
多くのタンパク質を同時に検出する「プロテオミクスの」検出方法が説明されている。これらの方法には、種々の多次元電気泳動法（例えば、２−ｄゲル電気泳動法）、質量分析に基づく方法（例えば、ＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーなど）または表面プラズモン共鳴法が含まれ得る。例えば、ＭＡＬＤＩにおいて、通常、サンプルを適切なマトリックスと混合し、プローブの表面に配置し、レーザー吸着／イオン化によって試験する。ＭＡＬＤＩの技術が、当該技術においてよく知られている。例えば、米国特許第５０４５６９４号（Ｂｅａｖｉｓら）、米国特許第５２０２５６１号（Ｇｌｅｉｓｓｍａｎｎら）および米国特許第６１１１２５１号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ）を参照されたい。同様に、ＳＥＬＤＩについて、第一分液を固体支持体結合（例えば、基質結合）吸着剤に接触させる。典型的に、基質は気体相イオンスペクトロメーターとの照合可能な関係に配置され得るプローブ（例えば、バイオチップ）である。ＳＥＬＤＩはまた、よく知られた技術であり、診断プロテオミクスに適用されている。例えば、Ｉｓｓａｑら（２００３）「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：１４９Ａ−１５５Ａを参照されたい。
【０１１６】
一般的に、上記方法は、異なる形態（対立遺伝子）のタンパク質を検出するため、および／または個体、系統群、系列、個体群などの間の（対立遺伝子差によるものであり得る）異なる発現レベルのタンパク質を検出するために使用され得る。環境因子に関して制御した場合、コードされた差次的に発現したタンパク質がそれ自身と同一である場合でさえも、発現レベルにおける差違により、対象の遺伝子に対するＱＴＬにおける異なる対立遺伝子の指標であり得る。これは、例えば、非コード領域（例えば、遺伝子発現を制御するプロモーターまたはエンハンサーなどの領域）における、多数の対立遺伝子形態の遺伝子が存在する場合に起こる。したがって、差次的発現レベルの検出は、対立遺伝子の差違の検出の方法として使用され得る。
【０１１７】
本発明の他の様態において、依存症の表現型と関連した核酸と不平衡に連結して、または依存症の表現型と関連した核酸の制御下で、依存症の表現型と関連した核酸を含む遺伝子は、差次的な対立遺伝子の発現を表してもよい。本発明で使用する「差次的対立遺伝子発現」は、細胞に存在する単一の遺伝子の多数の対立遺伝子の対立遺伝子発現における、定量的および定性的差違の両方を意味する。したがって、差次的対立遺伝子発現を表す遺伝子は、同一の細胞／組織における別の対立遺伝子と比較して、異なる時点またはレベルで発現される１つの対立遺伝子を持ち得る。例えば、依存症の表現型と関連した対立遺伝子は、依存症の表現型と関連しない対立遺伝子より高レベルまたは低レベルで、両方の対立遺伝子が同一の対立遺伝子であり、かつ同一の細胞／組織に存在するにもかかわらず、発現されてもよい。差次的対立遺伝子発現および解析方法が、米国特許第１０／４３８１８４号（２００３年５月１３日出願）および米国特許第１０／８４５３１６号（２００４年５月１２出願）（両方の表題「Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ」）に詳細に開示されている。依存症の表現型と関連した、１つ以上の核酸、あるいはその断片、誘導体、多型、変異体または相補体の差次的対立遺伝子発現パターンの検出は、依存症の表現型に対する感受性／耐性に関する予後および診断である。同様に、依存症の表現型に関連した、１つ以上の核酸、あるいはその断片、誘導体、多型、変異体または相補体の差次的対立遺伝子発現パターンの検出は、依存症の表現型ならびに／または依存症の治療結果の予後および診断である。
【０１１８】
スクリーニングに適切なマーカーの型に関するさらなる詳細
本明細書で表現型に対する相関に関してスクリーニングされる生物学的マーカーは、スクリーニングによって検出可能なマーカーの型のいずれか（例えば、遺伝子マーカー（例えば、遺伝子座の対立遺伝子変異体（例えば、ＳＮＰなどで）、発現マーカー（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の存在または量）など）であり得る。
【０１１９】
ヒト供給源に由来する核酸が、疾患診断および臨床適用に関連したマーカーの検出に特に関係があるが、本発明の方法において増殖、転写、翻訳および／または検出される対象の核酸は、本質的に任意の核酸であり得る。多くの核酸およびアミノ酸（核酸配列を逆翻訳を介して由来し得る）は利用可能であり、表１の遺伝子／タンパク質に関するものを含む。既知の核酸に対する共通の配列の保管場所には、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＮＣＢＩが含まれる。他の保管場所を、インターネットを検索することによって、容易に判定し得る。増幅、転写、翻訳および／または検出される核酸は、ＲＮＡ（例えば、増幅がＲＴ−ＰＣＲまたはＬＣＲ、Ｖａｎ−Ｇｅｌｄｅｒ  Ｅｂｅｒｗｉｎｅ反応またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡを含む場合）またはＤＮＡ（例えば、増幅ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、あるいはその任意の類似体（例えば、対象のサンプルが人工核酸を含むか、あるいは人工核酸を誘導または合成するために利用される場合、合成核酸またはその類似体の検出のため）であり得る。個体または個体群間の核酸配列または発現レベルにおける任意のバリエーションを、マーカー、例えば、変異、多型、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、イソタイプ、ＲＮＡまたはタンパク質の発現などとして検出することができる。依存症の表現型に相関しうるマーカーとして、配列、発現レベルまたは遺伝子コピー数におけるバリエーションを検出することができる。
【０１２０】
例えば、本発明の方法は、対象のマーカー核酸に関して、患者に由来したサンプル、例えば、患者由来の体液（血液、唾液、尿など）、組織および／または排泄物をスクリーニングすることにおいて有用である。したがって、適切な核酸を含む対象の本質的に任意の組織であり得るように、本発明の方法によって、大便、痰、唾液、血液、リンパ液、涙、汗、尿、膣分泌物、射精液などを、核酸に対して容易にスクリーニングする。これらのサンプルは典型的に、インフォームド・コンセントに従い、標準の医学研究室の方法によって患者から採取される。
【０１２１】
マーカーを含む核酸の増幅および／または検出の前に、核酸を任意の利用可能な方法、例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（２００２年を通して補完される）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）において教義されたものにより、サンプルから任意に精製する。また、多量のキットが、細胞または他のサンプルからの核酸の精製のために市販されている（例えば、両方ともファルマシア  バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からのＥａｓｙＰｒｅｐ（登録）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録）、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡｐｒｅｐ（登録）を参照されたい）。あるいは、サンプルは簡単に、例えば、分液化および／または希釈の後、直接増殖または検出され得る。
【０１２２】
マーカーの例としては、多型、一塩基多型、サンプル中に１つ以上の核酸が存在すること、サンプル中に１つ以上の核酸が存在しないこと、１つ以上のゲノムＤＮＡ配列が存在すること、１つ以上のゲノムＤＮＡが存在しないこと、１つ以上のｍＲＮＡが存在すること、１つ以上のｍＲＮＡが存在しないこと、１つ以上のｍＲＮＡの発現レベル、１つ以上のタンパク質が存在すること、１つ以上のタンパク質の発現レベル、および／または先のいずれかにに由来したデータまたはそれらの組み合せを挙げることができる。本質的に、任意の数のマーカーを、利用可能な方法を用いて、例えば、高密度、高スループットマーカーマッピングを提供するアレイ技術を用いて、検出することができる。したがって、少なくとも約１０、１００、１０００、１００００、または１０００００以上の遺伝マーカーを、同時にまたは連続様式で（あるいは、それらを組み合せて）、第一および／第二個体群において、関連する表現型に対する相関に関して、試験することができる。また、マーカーの組み合せが望ましく試験され得、例えば、表現型に相関付けされる個体群において、遺伝子の組み合せまたは発現パターンの組み合せを識別する。
【０１２３】
述べたように、検出されるべき生物学的マーカーは、任意の検出可能な生物学的成分であり得る。一般に、検出されたマーカーは、遺伝マーカー（例えば、ゲノムＤＮＡに存在するＤＮＡ配列マーカーまたはその発現産物）および（遺伝的にコードされた因子、環境因子またはその両方を反映し得る）発現マーカーを含む。マーカーが発現マーカーである場合、該方法は、（例えば、１つ以上の発現されるマーカー、例えば、一組の発現されるマーカーのうち）第一個体または個体群に対する第一発現プロファイルを検出すること、および第一発現プロファイルを、第二個体または個体群に対する第二発現プロファイルと比較することを含み得る。本例では、特定の表現型に（複数の）発現マーカーを相関付けさせることにより、対象の表現型と第一または第二発現プロファイルを相関付けさせることを含み得る。
【０１２４】
プローブ／プライマー合成法
一般に、プローブ、プライマー、分子ビーコン、ＰＮＡ、ＬＡＮ（ロックされた核酸）などを含むオリゴヌクレオチドを作製するための合成方法がよく知られている。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：６１５９−６１６８に記述されたように、市販の自動合成器を用いて、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．、２２（２０）：１８５９−１８６２に記述された固相ホスホラミダイト  トリエステル法に従い、化学的に合成することができる。変性オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをまた当業者に既知の種々の商業的供給業者より注文することができる。多くのオリゴ合成サービスの商業的提供業者が存在するため、広く利用可能な技術である。任意の核酸を、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）など多数の種々の商業的供給業者のいずれかから特別注文することができる。同様に、ＰＮＡも、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎｃ．（ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．など多数の種々の供給業者から特別注文することができる。
【０１２５】
コンピュータでのマーカー検出
いくつかの実施形態において、コンピュータでの方法は、対象のマーカー遺伝子座を検出するために使用することができる。例えば、対象のマーカー遺伝子座を含む核酸の配列をコンピュータに保存することができる。望むマーカー遺伝子座配列またはその相同物を、例えば、ＢＬＡＳＴのような簡単に利用可能なプログラムにおいて、さらに簡単なワードプロセッサーにより提供されるような、適切な核酸検索アルゴリズムを用いて判定することができる。全ヒトゲノムを配列決定することにより、配列情報は、マーカー領域、隣接核酸などを判定するために利用することができる。
【０１２６】
マーカー検出のための増幅プライマー
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の分子マーカーを好適なＰＣＲに基づく検出方法を用いて検出する、ここで、ＰＣＲアンプリコンのサイズまたは配列がマーカー（例えば、特定のマーカー対立遺伝子）が存在しないか、または存在する指標である。これらの種類の方法において、ＰＣＲプライマーは、多型マーカー領域に隣接する保存領域にハイブリダイズされる。
【０１２７】
本発明とともに使用されるべき好適なプライマーが任意の公的な方法を用いて設計され得ることは、理解されるであろう。本発明は、任意の特定のプライマーまたはプライマー対に限定される意図はない。例えば、プライマーは、例えば、公的に利用可能な配列情報を考慮して、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（登録商標）などの、任意の好適なソフトウェアプログラムを用いて、設計され得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本発明のプライマーは、任意の好適な手段（例えば、非放射性蛍光タグを用いる）により放射標識または標識され、任意に追加の標識化段階または可視化段階なしに、増幅反応に続いて異なるサイズのアンプリコンの迅速な可視化を可能にする。いくつかの実施形態において、プライマーは標識化されず、アンプリコンが、サイズ分解、例えば、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動に続いて、可視化される。いくつかの実施形態において、サイズ分解に続くＰＣＲアンプリコンの臭化エチジウム染色により、異なるサイズのアンプリコンの可視化を可能にする。
【０１２９】
本発明のプライマーは、任意の特定のサイズのアンプリコンを生成することに限定される意図はない。例えば、本明細書のマーカー遺伝子座および対立遺伝子を増幅させるために使用するプライマーは、関連する遺伝子座の全領域を増幅することに限定されない。プライマーは、任意の好適な長さのアンプリコンを生成することができる。いくつかの実施形態において、マーカー増幅は、少なくとも長さ２０ヌクレオチドのアンプリコンを、または少なくとも長さ５０ヌクレオチド、または少なくとも長さ１００ヌクレオチド、または少なくとも長さ２００ヌクレオチドのアンプリコンを産生する。
【０１３０】
ポジショナル・クローニングのためのマーカーの検出
いくつかの実施形態において、核酸プローブをマーカー配列を含む核酸を検出するために使用する。そのようなプローブは、例えば、マーカーヌクレオチド配列に連結したヌクレオチド配列を単離するポジショナル・クローニングにおいて使用され得る。本発明の核酸プローブが、任意の特定のサイズに限定される意図はない。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、少なくとも長さ２０ヌクレオチド、または少なくとも長さ５０ヌクレオチド、または少なくとも長さ１００ヌクレオチド、または少なくとも長さ２００ヌクレオチドである。
【０１３１】
ハイブリダイズしたプローブを、検出されるべき標識によって、オートラジオグラフィー、フルオログラフィーまたは他の同様の検出技術を用いて検出する。特定のハイブリダイゼーションプロトコールの例が、当該技術において広く利用可能であり、例えば、Ｂｅｒｇｅｒ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ（すべて本明細書内に記述）を参照されたい。
【０１３２】
トランスジェニック細胞の生成
本発明はまた、本発明に従って識別されたＱＴＬに対応する核酸で形質転換される細胞を提供する。例えば、そのような核酸には、染色体の間隔（例えば、ゲノム断片）、依存症の表現型に対するＱＴＬに対応するまたは連結する遺伝子をコードするＯＲＦおよび／またはｃＤＮＡが含まれる。さらに、本発明は、依存症の表現型に影響を与えるポリペプチドの産生を提供する。これは、例えば、依存症を予防、予測または治療するのに、トランスジェニック細胞の生成に有用である。これらの細胞は、関連する表現型に影響を与える定義された遺伝子を有する、商業的に有用な細胞株を提供し、それによって、表現型の可能性のあるモジュレーターをスクリーニングするためのプラットフォームおよび対象の各遺伝子に対する活性機構への基礎研究を提供する。さらに、遺伝子治療は、個体またはその個体群に望まれる遺伝子を導入するために利用することができる。そのような遺伝子治療を、個体によって生じる障害に対する治療を提供するために使用してもよく、リスクのある個体におけるそのような障害の進行を防止するために、予防的方法として使用してもよい。ノックアウトマウスなどのノックアウト動物を、本明細書において記述した遺伝子のいずれかに関して生成することができ、遺伝子の表現型的作用をさらに判定することができる。同様に、組み換えマウスまたは他の動物を、例えば、本明細書の任意の天然の遺伝子のノックアウト、およびヒト（または他の種）遺伝子の動物内への（相同組み換えを介した）導入によって、ヒト疾患のためのモデルとして使用し得る。次に、異種ヒト遺伝子および遺伝子産物のモジュレーターの作用を、結果として得られるインビボモデル動物系においてモニターすることができる。
【０１３３】
核酸のクローニングおよび操作、ならびにコードされたポリペプチドの産生に関する分子生物学的技術を記述する一般テキストには、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年以降通して補完される）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が含まれる。これらのテキストは、変異導入、ベクターの利用、プロモーター、およびそれに関連した、他の関連トピック、例えば、対象の核酸（例えば、遺伝子、マーカー遺伝子座、マーカープローブ、マーカー遺伝子座と分離するＱＴＬなど）を含むクローンの生成について記述している。
【０１３４】
例えば、クローニングベクター、シャトルベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクター（例えば、ＱＴＬに由来するまたは関連したＯＲＦを含む発現ベクターなどのベクター）を用いて、宿主細胞を、遺伝学的に操作する（例えば、形質導入、トランスフェクト、形質転換など）。そのようなベクターは、例えば、プラスミド、ファージミド、アグロバクテリウム、ウイルス、裸のポリヌクレオチド（直鎖または環状）、または共役ポリヌクレオチドの形態である。ベクターを、とりわけ繁殖および拡大の目的のために、細菌に導入することができる。核酸導入方法に関するさらなる詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌ、上記において見ることができる。本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法は、本発明に対して重要ではなく、本発明が、宿主細胞に外来遺伝的物質を導入するのための、任意の特定の方法に限定される意図はない。したがって、例えば、細胞またはプロトプラストへの核酸の効果的な導入を提供する本明細書で提供された方法を限定はしないが含む、任意に好適な方法を使用することができ、本発明での利用が見られる。
【０１３５】
操作された宿主細胞を、例えば、プロモーターを活性化すること、または形質導入物を選択することなどの活性に対して適切なように変性した、従来の栄養培地中で培養することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌ、上記すべてに加えて、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（２００４）（「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）などの利用可能な市販文献が、さらなる詳細を提供する。
【０１３６】
ノックアウト動物およびトランスジェニックの作製
トランスジェニック動物は、遺伝子機能を研究するため、および推定遺伝子または遺伝子産物モジュレーターを試験するために有用なツールである。本明細書のヒト（または他の選択された種）遺伝子を、研究室動物の内在性遺伝子の場所に導入することができ、それによって簡単に操作および研究された研究室動物におけるヒト（または他の、例えば、家畜）遺伝子または遺伝子産物の機能を研究することが可能になる。
【０１３７】
異なる動物において相同遺伝子間のモジュレーターに対する応答に関する正確な対応が常には存在せず、このことによって、研究室動物における対象のヒトまたは他の種を研究するための能力がとりわけ有用になることが理解されるであろう。同様の遺伝的操作を組織培養液において実施することができるが、本来の生物との関連での遺伝子および遺伝子産物の交互作用が、単純な細胞に基づくスクリーニングアッセイにおいて達成され得る遺伝子および遺伝子産物の、より複雑でかつ生理学的に関連する図面を提供する。したがって、本発明の１つの特徴は、対象の異種遺伝子（例えば、図１中の遺伝子）を含むトランスジェニック動物の生成である。
【０１３８】
一般に、そのようなトランスジェニック動物は、単純に、１つ以上のその動物の細胞に人工的に導入された適切な遺伝子（または部分的遺伝子、例えば、プロモーターに連結したコード配列を含む）を有する動物である。これは、２つの方法のうちの１つでもっとも一般に実施される。第一に、ＤＮＡを受精卵の前核に注入することによって、ランダムにＤＮＡを組み込むことができる。この場合、ＤＮＡは、ゲノムの任意の場所に組み込まれる。本アプローチにおいて、注入したＤＮＡと宿主ゲノムとの間に相同性は必要ない。第二に、（異種）ＤＮＡを胚幹（ＥＳ）細胞に導入すること、および異種ＤＮＡが細胞ゲノムの相同配列との相同的組み換えを受けた細胞に関して選択することによって、標的挿入を達成することができる。典型的に、異種ＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間の数キロ塩基の相同性が存在し、正の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）が形質導入物の選択を提供するために、異種ＤＮＡに含まれる。さらに、負の選択可能マーカー（例えば、バルナーゼのなどの「毒性」遺伝子）を、非相同組み換え（ランダム挿入）によって挿入されたＤＮＡを有する細胞に対して選択するために使用することができる。
【０１３９】
ＤＮＡの標的挿入の１つの共通の利用は、ノックアウトマウスを作製することである。典型的に、相同組み換えを使用して、破壊されることを望む遺伝子の必須エクソン（例えば、第一コードエクソン）に構成性プロモーターによって駆動された選択可能な遺伝子を挿入する。これを達成するために、選択可能なマーカーを所望する挿入部分の周辺のゲノム配列と一致する長いＤＮＡストレッチに隣接させる。本構築物を一旦ＥＳ細胞にエレクトロポレーションすると、細胞の固有の機構が相同組み換えを実施する。非相同組み換えによってＤＮＡを組み込むＥＳ細胞に対して選択することを可能にするために、組み換えを受けることを意図する領域外の負に選択可能な遺伝子を含むことが、構築物を標的とするために一般的である（典型的に、遺伝子を、ゲノム相同性の２つの領域のより短い方に隣接してクローン化する）。ゲノム相同性の領域外に存在するＤＮＡが、相同組み換えの間に失われるため、相同組み換えを受ける細胞は選択されない。一方、ＤＮＡのランダム組み込みを受ける細胞は頻繁に選択され得る。負の選択のために一般に利用される遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子であり、これは、薬物ガンシクロビルに対する選択性を与える。
【０１４０】
正の選択および負の選択に続いて、必要に応じ、ＥＳ細胞クローンを、正確なゲノム遺伝子座への構造物の挿入に関してスクリーニングする。典型的には、サザンブロット上で、またはＰＣＲ増幅に続いて通常見られるバンドが、相同組み換えが起こるときに予想されるサイズのバンドによって置換されるように、標的構造物を設定する。ＥＳ細胞が二倍体であるため、１つの対立遺伝子のみが組み換え事象によって変化される。したがって、適切な標的化が起こった場合に、野生型および標的対立遺伝子の両方を表すバンドが通常見られる。
【０１４１】
標的挿入に利用される胚幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞（早期マウス胚）の内部細胞塊に由来する。これらの細胞は多能性であり、これらが任意の型の組織に発達可能であることを意味している。
【０１４２】
一旦正のＥＳクローンを増殖させ、凍結させると、トランスジェニック動物の産生を開始し得る。雌ドナーを交配し、胚盤胞を採取し、種々のＥＳ細胞を各胚盤胞に注入する。ついで、胚盤胞を各レシピエントの子宮角に移植する。適切なドナー株を選択することによって、キメラ子孫（すなわち、組織のいくつかの画分がトランスジェニックＥＳ細胞に由来するもの）の検出は、髪の毛および／または眼の色を観察することのように単純であり得る。トランスジェニックＥＳ細胞が、生殖細胞系統（精子または卵）に関与しない場合、トランス遺伝子は子孫に受け継がれない。
【０１４３】
表現型へのマーカーの相関
本発明の１つの様態は、表１に示す多型と依存症の表現型との間の相関の記述である。これらの相関の理解が、本発明において使用され得、個体またはサンプルが有すると決定される一組の多型、および表示されることがあり得る表現型に関する情報を相関付けする。さらに、１つ以上の異なる遺伝子における対立遺伝子の組み合せに関する、より高い順位の相関をまた、表現型に対する相関に関して評価することができる。
【０１４４】
これらの相関は、対立遺伝子および表現型、または対立遺伝子の組み合せと表現型の組み合せとの間の関係を判定することができる任意の方法によって実施され得る。例えば、表１中の１つ以上の遺伝子または遺伝子座における対立遺伝子は、１つ以上の依存症の表現型と相関付けされ得る。より典型的に、これらの方法には、多型の対立遺伝子と表現型との間の相関を含むルックアップテーブルを参照することが含まれる。該テーブルには、多数の対立遺伝子−表現型の関係に対するデータが含まれ、例えば、主成分分析、発見的アルゴリズムなどの統計学的ツールを介して、多数の対立遺伝子−表現型の関係の相加的または他のより高い順位の効果を考慮することができる。
【０１４５】
マーカーの表現型への相関には場合によっては、相関に関する１つ以上の統計学的試験を実施することが含まれる。多くの統計学的試験が既知であり、ほとんどのものは解析の簡便さのために、コンピュータを利用したものである。表現型の特徴と生物学的マーカーとの間の関係／相関を決定するさまざまな統計学的方法が既知であり、本発明に適用可能である。本トピックに対する導入に関して、Ｈａｒｔｌ（１９８１）Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ  ＩＳＢＮ：０−０８７８９３−２７１−２を参照されたい。さまざまな適切な統計学的モデルが、ＬｙｎｃｈおよびＷａｌｓｈ（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔｓ、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＭＡ  ＩＳＢＮ  ０−８７８９３−４８１−２に記述されている。これらのモデルは、例えば、遺伝子型および表現型の値間の相関を提供すること、表現型の遺伝子座の影響を特性化すること、環境と遺伝子型との間の関係を明らかにすること、遺伝子の優性または浸透度を決定すること、母体または他のエピジェネティックな効果を決定すること、（主成分分析または「ＰＣＡ」を介して）解析中の主成分を識別することなどができる。これらのテキストにおいて引用された参考文献は、マーカーと表現型とを相関付けさせるための、統計学的モデルにおける、考慮可能なさらなる詳細を提供する。
【０１４６】
相関を決定するための標準の統計学的方法に加えて、遺伝的アルゴリズムの利用などのパターン認識とトレーニングによって相関を決定する他の方法を使用し、マーカーと表現型との間の相関を決定することができる。これは、多数の対立遺伝子と多数の表現型との間のより高い順位の相関を判定する場合、とりわけ有用である。説明するために、神経ネットワークアプローチを、遺伝的情報と表現型結果との間の相関を決定する、構造−機能データスペースモデルの発見的開発のために、遺伝的アルゴリズム型プログラミングに連結し得る。例えば、ＮＮＵＧＡ（Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）が、（例えば、神経ネットワークおよび遺伝的アルゴリズムを連結する、ワールドワイドウェブ、ｃｓ．ｂｇｕ．ａｃ．ｉｌ／〜ｏｍｒｉ／ＮＮＵＧＡにて）利用可能なプログラムである。神経ネットワークに対する導入は、例えば、Ｋｅｖｉｎ  Ｇｕｒｎｅｙ、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ、ＵＣＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）において、およびワールドワイドウェブ、ｓｈｅｆ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ／ｇｕｒｎｅｙ／ｎｏｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ上で見ることができる。さらなる有用な神経ネットワークの参考文献には、遺伝的アルゴリズムに関して上述したもの、および、例えば、Ｂｉｓｈｏｐ、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、およびＲｉｐｌｅｙら、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）が含まれる。特定の統計学的解析を含む例示的データ組を示す２つの表が、付録１において見られる。特に、表１は、依存症に関連した遺伝子座を同定するために設計された、関係研究に関するデータを示し、表２は、種々の依存症の表現型を、「ケースステータス」、すなわち少なくとも１つの依存症の発生と相関させる関係研究からのデータを示す。これらのデータは、さらに以下で議論する。
【０１４７】
相関、主成分分析、神経ネットワークモデリングなどを用いるおよび確立するためのデータ解析適用を理解することにおいて有用であるさらなる参考文献には、例えば、Ｈｉｎｃｈｌｉｆｆ、Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９６）、ＧｉｂａｓおよびＪａｍｂｅｃｋ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｋｉｌｌｓ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ（２００１）、Ｐｅｖｚｎｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）、Ｄｕｒｂｉｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、ならびにＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（２０００）が含まれる。
【０１４８】
いずれの場合でも、本質的に任意の統計学的試験を、標準のプログラミング法によって、または例えば、上述されたもの、および、例えば、多変数データ解析、インタラクティブな視覚化、変数選択、神経ネットワーク＆統計学的モデリングなどのための遺伝的アルゴリズムに適用可能である、（例えば、Ｐａｒｔｅｋ  Ｐｒｏ  ２０００  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを提供する）パーターン認識のためのソフトウェアを提供する、例えば、Ｐａｒｕｔｅｃｋ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ；ｗｗｗ．ｐａｒｔｅｃｋ．ｃｏｍ）から市販されているものを含む、そのような統計学的解析を実施する、種々の「既製の」ソフトウェアパッケージのいずれかを用いることによって、コンピュータを組み込んだモデルに適用可能である。例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）マップマップスカッタープロットおよびバイプロット、Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｃａｌｉｎｇ（ＭＤＳ）Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｃａｌｉｎｇ（ＭＤＳ）マップスカッタープロット、スタープロットなどによって、関係を解析することができる。相関解析を実施するための利用可能なソフトウェアには、ＳＡＳ、ＲおよびＭａｔｈＬａｂが含まれる。
【０１４９】
多型または発現パターンいずれかの、（複数の）マーカーを、種々の遺伝的解析のいずれかのために利用することができる。例えば、一旦マーカーが識別されると、本場合のように、これらを関係研究のための多数の異なるアッセイにおいて利用することができる。例えば、これらのマーカーの問い合わせを行うマイクロアレイのために、プローブを設計することができる。他の例示的アッセイには、例えば、Ｔａｑｍａｎアッセイおよび上記の分子ビーコンアッセイ、ならびに従来のＰＣＲおよび／または配列決定技術が含まれる。一旦マーカーが個体群中で識別されると（例えば、ＳＮＰが遺伝子型判定されると）、多重関係研究のために、情報を使用してもよい。そのような利用は、さらなる解析のために後日評価されてもよいデータベースにおいてマーカーおよび表現型の情報の保存によって促進されてもよい。
【０１５０】
関係研究に関するさらなる詳細が、米国特許第６９６９５８９号（２００５年１１月２９日発行、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」）、米国特許第６８９７０２５号（２００５年５月２４日発行、表題「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」）、ＵＳＳＮ  １０／２８６４１７（２００２年１０月３１日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」）、ＵＳＳＮ  １０／７６８７８８（２００４年１月３０日出願、表題「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」）、ＵＳＳＮ  １０／４４７６８５（２００３年５月２８日出願、表題「Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」）、ＵＳＳＮ  １０／９７０７６１（２００４年１０月２０日出願、表題「Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」）、ＵＳＳＮ  １０／９５６２２４（２００４年９月３０日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」）、およびＵＳＳＮ  ６０／７２２３５７（２００５年９月３０日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」）において見ることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、マーカーデータを利用して、マーカーと表現型との間の相関を示すために、関係研究を実施する。これは、対象の表現型を有する個体（すなわち、対象の表現型を示す個体または個体群）におけるマーカー特性を決定すること、およびこれらの個体におけるマーカーの対立遺伝子頻度または他の特徴（発現レベルなど）を個体の対照群における対立遺伝子頻度または他の特徴と比較することによって達成し得る。そのようなマーカー決定は、ゲノム−ワイドベースで実施するか、またはゲノムの特定の領域（例えば、対象のハプロタイプブロック）に焦点を当てることができる。１つの実施形態において、表１中の遺伝子または遺伝子座に連結しているマーカーを、１つ以上の特異的な表現型に対する相関に関して評価する。
【０１５２】
本明細書で記述した本発明の方法の他の実施形態に加えて、さらに、方法によって、表現型の「詳細な分析」が可能になる。すなわち、特定の表現型が、２つ以上の異なる遺伝的基礎からの結果となり得る。例えば、１つの個体における感受性表現型が、表１中の遺伝子において、「欠陥」（または単に特定の対立遺伝子−例えば、所定の環境における個体において、表現型が望ましいか、または望ましくないのかいずれか、感受性表現型がコンテキスト依存であることに関する「欠陥」）の結果であり得る。一方、異なる個体における同一の基礎表現型が、表１中の多数の遺伝子において、多数の「欠陥」の結果であり得る。したがって、多数のマーカーのスキャニング（例えば、ゲノム中でのような、またはハプロタイプブロックスキャニング）によって、同様の（または目盛り付き）表現型に対する、種々の遺伝的基礎の詳細な分析が可能になる。１つの様態において、同一の臨床的表現型を有する２人の患者が治療に対して異なる応答をうける、異なる遺伝的プロファイルを有するので、そのような詳細な解析によって、より個人化された治療を可能にする。したがって、それらの遺伝子型の解析を含む、個体の診断を、適切な治療レジメを決定するために使用することができる。例えば、所定の表現型（例えば、依存症の病歴）、および表１中の１つ以上のＳＮＰ、またはそれに密接に連鎖した１つ以上のＳＮＰで特定の遺伝子型を有する第一組の個体は、（例えば、「薬物Ｘ」の投与を含む）ある医学的治療に対して非常に効果的な応答があり、一方で、同様の表現型を有するが、表１の１つ以上のＳＮＰで異なる遺伝子型を有する第二組の個体は、治療に対する応答において、陰性の副作用（例えば、不眠症、体重増加、鬱など）を変わりに経験する。本発明のマーカーを関係解析に使用して、治療の前に、第一組における個体および第二組における個体を区別してもよく、それにより、治療から効果を得る可能性のある患者を治療することができ、他の治療に対して副作用を経験する可能性のあるものを識別することができる。これらの方法は、さらに詳細に、例えば、ＵＳＳＮ  １０／９５６２２４（２００４年９月３０日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」）、およびＰＣＴ明細書番号第ＵＳ２００５／００７３７５号（２００５年３月３日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」）において、議論されている。
【０１５３】
上述したように、関係研究を実施する１つの方法は、対象の表現型を有する個体（「症例群」）におけるマーカーの対立遺伝子頻度（または発現レベル）を、個体の対照群における対立遺伝子頻度と比較することである。１つの方法において、情報ＳＮＰを使用して、ＳＮＰハプロタイプパターン比較を実施する（「情報ＳＮＰ」は、１つのＳＮＰまたはゲノムまたはハプロタイプパターンを、他のＳＮＰ、ゲノムまたはハプロタイプパターンと区別する傾向にある、ゲノムまたはハプロタイプブロックにおける１つのＳＮＰまたは（１つより大きい）ＳＮＰのサブセットなどの、遺伝的ＳＮＰマーカーである）。情報ＳＮＰを用いるアプローチは、各個体のゲノムのすべての３０億塩基を読み込む、または検出される必要があるサンプル個体群からの情報ＳＮＰのみで発見され得る、３００〜４００万の共通ＳＮＰを読み込む代わりのために、当該技術において既知の他の全ゲノムスキャニングまたは遺伝子型判定に対して利点を有する。これらの特定の、情報ＳＮＰを読み込むことによって、統計学的に正確な関係データを、上述したように、特定の実験の個体群から抽出することを可能にするのに十分な情報を提供する。
【０１５４】
したがって、遺伝的関係を決定するための１つの方法の実施形態において、情報ＳＮＰの対立遺伝子頻度を、表現型を表示しない対照個体群のゲノムに関して決定する。情報ＳＮＰの対立遺伝子頻度はまた、表現型を表示しる個体群のゲノムに関して決定される。情報ＳＮＰの対立遺伝子頻度を比較する。対立遺伝子頻度の比較は、例えば、各個体群における各情報ＳＮＰの位置に対立遺伝子頻度（対立遺伝子の総数で割られる個体群における特定の対立遺伝子の事例の数）を測定し、これらの対立遺伝子頻度を比較することによって、実施され得る。対照中の対立遺伝子の発生頻度対事例個体群／群間の差を示す情報ＳＮＰを解析のために選別する。一旦情報ＳＮＰが選択されると、情報ＳＮＰを含む（複数の）ＳＮＰハロタイプブロックが同定され、順に、表現型と相関する対象のゲノム領域を識別する。ゲノム領域は、例えば、薬物発見標的としてまたは診断マーカーとしての利用のため、当該技術において既知の遺伝的または任意の生物学的方法によって解析され得る。
【０１５５】
本発明の他の実施様態において、ハロタイプブロックおよびパターンへのＳＮＰのグループ化よりはむしろ、またはそれに加えて、連鎖不平衡（ＬＤ）マッピングを利用して、関係研究における利用のためにＳＮＰをグループ化する。互いに近接近したＳＮＰがしばしば、強く相関付けされるが、この相関構造またはＬＤは複雑であり、ゲノムの１つの領域から他の領域まで変化し、異なる個体群間でも変化する。連結したＳＮＰを含む「ＬＤビン」を同定した後、これらのＳＮＰがＬＤビン中の他のＳＮＰの遺伝子型の予測であるため、各ＬＤから１つのみまたは数個のＳＮＰを読み込むこと（例えば、遺伝子型判定すること）によって、さらなる個体の配列を決定することができる。ハロタイプパターンに基づく方法に関して、そのような予測ＳＮＰは「情報ＳＮＰ」と呼ばれる。ＬＤのパターンの決定および利用のための方法は、例えば、Ｈｉｎｄｓら（２００５）「Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  ＤＮＡ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｒｅｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：１０７２−１０７０において提供される。
依存症の表現型を識別するためのシステム
以上の相関を実施するためのシステムはまた、本発明の１つの特徴でもある。典型的に、システムには、予想される表現型を有する対立遺伝子（直接的にまたは、例えば、発現レベルを介してのいずれかで検出される）の存在または存在しないことを相関付けるシステムの指示が含まれる。システムの指示は、対立遺伝子と関連する表現型との間の相関を含むデータベースと、対立遺伝子配列または発現レベルに関する検出された情報を比較することができる。上述したように、このデータベースは多次元であり得、それによって対立遺伝子および関連する表現型の組み合せ間のより高次の次元の関係を含む。これらの関係を、任意の数のルックアップテーブル中に保存し、例えば、スプレッドシート（例えば、Ｅｘｃｅｌ（商標）スプレッドシート）またはＡｃｃｅｓｓ（商標）、ＳＱＬ（商標）、Ｏｒａｃｌｅ（商標）、Ｐａｒａｄｏｘ（商標）、または類似のデータベースなどのデータベースの形態をとり得る。システムには、例えば、自動化またはユーザーインターフェースを介して、対立遺伝子検出情報に関するサンプル特異的な情報を入力するための、そしてルックアップテーブルと情報を比較するための条件が含まれる。
【０１５６】
場合によって、システムの指示にはまた、任意の検出した対立遺伝子情報と関連した診断情報、例えば、関連する対立遺伝子を有する対象が特定の表現型を有するという診断を受け入れるソフトウェアが含まれ得る。このソフトウェアは、そのように入力された関連を用いて、実際は発見的であり、システムによるルックアップテーブルの正確さおよび／またはルックアップテーブルの解釈を改善することができる。神経ネットワーク、Ｍａｒｋｏｖモデリング、および他の統計学的解析を含むさまざまなそのようなアプローチが上述されている。
【０１５７】
本発明は、１つ以上の検出可能な遺伝的マーカー（例えば、１つ以上の生物分子プローブ、検出因子、流体ハンドラーなどを含む１つ以上のアレイ）を検出するためのデータ獲得モジュールを提供する。そのようなデータ獲得モジュールの生物分子プローブには、生物学的マーカー、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、アプタマー、抗体などを検出するために適切である任意のものが含まれ得る。これらには、例えば、サンプルを獲得するため、サンプルを希釈または分液するため、マーカー物質（例えば、核酸またはタンパク質）を精製するため、マーカー核酸を増幅させるため、増幅したマーカー核酸を検出するためなどのために、サンプルハンドラー（例えば、流体ハンドラー）、ロボット、マイクロ流体システム、核酸またはタンパク質精製モジュール、アレイ（例えば、核酸アレイ）、検出器、サーマルサイクラーまたはこれらの組み合せが含まれる。
【０１５８】
例えば、本明細書のシステムに組み込まれることが可能な自動装置を使用し、例えば、選択された刺激に対する応答して、遺伝子の発現レベル（Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８）、「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ  Ａｒｒａｙｓ  Ｐｕｔ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｏｔ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：３９６−３９９）、高スループットＤＮＡ遺伝子型判定（Ｚｈａｎｇら（１９９９）「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  Ｂｌｏｏｄ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：１１３８−１１４５）など多くのものを含む種々の生物学的現象を評価する。同様に、混合実験、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ配列決定などを実施するための統合システムがまた利用可能である。例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８）「Ｃｏｍｉｎｇ  Ｓｏｏｎ：ｔｈｅ  Ｐｏｃｋｅｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：３９９−４０１を参照されたい。さまざまな自動システム成分は、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）から入手可能であり、これは、典型的に、例えば、ロボットおよび流体取り扱いモジュールを含む、種々のＺｙｍａｔｅシステムを利用している。同様に、例えば、マイクロタイタートレイ操作のために、種々の研究室システムにおいて使用される、共通のＯＲＣＡ（登録商標）ロボットはまた、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）から市販されている。同様に、本発明におけるシステム成分として使用され得る市販されているマイクロ粒子システムには、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものが含まれる。さらに、特許および技術的文献には、マイクロ粒子システムの多数の例が含まれ、これには、自動液体取り扱いのためのマイクロウェルプレートと直接調和可能であるものが含まれる。
【０１５９】
種々の液体取り扱いおよび／またはアレイ配置のいずれかを、本明細書のシステムにおいて使用することができる。本明細書のシステムにおいて使用のための１つの共通のフォーマットは、マイクロタイタープレートであり、アレイまたは液体ハンドラーがマイクロタイタートレイを含む。そのようなトレイは市販されており、トレイあたり種々のウェルサイズおよびウェル数、ならびにアッセイまたはアレイ成分の結合に対する、種々の官能化された表面のいずれかで、注文することができる。共通トレイには、広範９６ウェルプレートが含まれ、３８４および１５３６ウェルプレートもまた一般的に使用される。そのようなトレイ中でサンプルを処理することができ、すべての処理段階が、トレイ中で実施される。サンプルをまた、マイクロ流体装置またはマイクロタイターおよびマイクロ流体装置の組み合せにて処理することができる。
【０１６０】
液体相アレイに加えて、成分を固体相アレイに保存するか、または固体相アレイ上で解析することができる。これらのアレイは、空間的にアクセス可能なパターン（例えば、行および列のグリッド）に、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）、ポリマーまたはセラミック表面、ガラスまたは変性シリカ表面、金属表面などの固体基質へ物質を固定化する。成分は、例えば、ハイブリダイゼーションによって、（例えば、ピペットまたは他の流体取り扱い要素を用いて）局所再水和および流体輸送によって、またはアレイを破棄し、アレイ上の対象の部位を切り出すことによって、評価され得る。
【０１６１】
システムにはまた、本明細書で述べたアプローチのいずれかを用いて、対立遺伝子情報を検出するために使用される検出装置が含まれる。例えば、リアルタイムＰＣＲ産物を検出するために配置された検出器（例えば、蛍光検出器などの光検出器）またはアレイリーダーが、システムに組み込まれ得る。例えば、検出器は、対象の対立遺伝子を含むハイブリダイゼーションまたは増幅反応からの光発光を検出するように配置可能であり、ここで光発光は、対立遺伝子が存在することまたは存在しないことの指標である。場合によって、上述したシステムの指示を含むコンピュータと検出器との間の動作可能な連結が提供され、これによって、例えば、データベース情報を保存し、および／またはシステムの指示を実行し、検出された対立遺伝子の特異的な情報を、ルックアップテーブルと比較することができるコンピュータへ、検出された対立遺伝子の特異的な情報を自動的に入力することが可能になる。
【０１６２】
検出器によって検出される情報を生成するために使用されるプローブはまた、アンプリコンを検出するプローブを利用するための任意の他のハードウェアまたはソフトウェアとともに、システムに組み込まれ得る。これらには、サーマルサイクラー要素（例えば、プローブによって検出され得る対立遺伝子のＰＣＲまたはＬＣＲ増幅を実施するため）、プローブがアレイされ、および／またはハイブリダイズされるアレイなどが含まれ得る。サンプルを処理するために上述した流体取り扱い要素を、サンプル物質（例えば、検出されるべき鋳型核酸および／またはタンパク質）、プライマー、プローブ、アンプコンなどを、互いに接触させるように移動させるために使用することができる。例えば、システムは、１つ以上の遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子、または遺伝子が表１における多型をコードする（例えば、表１に列挙した遺伝子において）表現型と関連した連結した遺伝子座を検出するために配置した、一組のマーカープローブまたはプライマーを含んでもよい。検出器モジュールは、マーカー、プローブまたはプライマー、あるいはマーカープローブまたはプライマーの組から産生されたアンプリコンからの、１つ以上のシグナル出力を検出するために配置され、それによって、対立遺伝子が存在することまたは存在しないことを判定する。
【０１６３】
解析されるべきサンプルは場合によって、システムの一部であり、またはそれより分離したものとして考慮可能である。サンプルは、場合によって、本明細書で述べたように、例えば、ゲノムＤＮＡ、増幅されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたｃＤＮＡ、ＲＮＡ、増幅されたＲＮＡ、タンパク質などを含む。１つの様態において、サンプルは、ヒト患者などの哺乳動物に由来する。
【０１６４】
場合によって、ユーザーと接触するためのシステム成分が提供される。例えば、システムには、コンピュータ実装システムの指示を観察するためのユーザーが見ることが可能なディスプレイ、ユーザーコマンドを入力し、システムを起動するためのユーザー入力装置（例えば、キーボードまたはマウスなどのポインティング  デバイス）が含まれ得る。典型的には、対象のシステムは、コンピュータを含み、ここでは、種々のコンピュータ実装システムの指示が、コンピュータソフトウェアに埋め込まれ、例えば、コンピュータ読み取り可能メディアに保存される。
【０１６５】
ワードプロセッシングソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ（商標）またはＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（商標））、およびデータベースソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標）、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ（商標）などのスプレッドシートソフトウェア、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ（商標）またはＳｅｑｕｅｌ（商標）、Ｏｒａｃｌｅ（商標）、Ｐａｒａｄｏｘ（商標）などのデータベースプログラム）などの標準のデスクトップアプリケーションを、本発明の対立遺伝子、または対立遺伝子と表現型との間の関係に相当する文字列を入力することによって、本発明に適合可能である。例えば、システムは、例えば、ユーザーインターフェース（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃｈｉｎｔｏｓｈまたはＬＩＮＵＸシステムなどの標準のオペレーティングシステムにおけるＧＵＩ）との組み合せで使用され、例えば、文字列を操作する、適切な文字列情報を有するソフトウェアを含み得る。ＢＬＡＳＴなどの特定化された配列アライメントプログラムをまた、例えば、多数の対立遺伝子を識別し、関連付けるために、核酸またはタンパク質（または相当する文字列）のアライメントのために、本発明のシステムに組み込むことが可能である。
【０１６６】
述べたように、システムには、適切なデータベースおよび本発明の対立遺伝子配列または相関を有するコンピュータが含まれ得る。配列を並べるためのソフトウェアおよび本発明の配列のいずれかを含むソフトウェアシステムに入力されたデータセットは、本発明の特徴であり得る。コンピュータは、例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌｘ８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップ互換ＤＯＳ（商標）、ＯＳ２（商標）  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＮＴ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９８、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）２０００、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＭＥまたはＬＩＮＵＸベース機械、ＭＡＣＨＩＮＴＯＳＨ（商標）、Ｐｏｗｅｒ  ＰＣまたはＵＮＩＸ（登録商標）ベース（例えば、ＳＵＮ（商標）ワークステーションまたはＬＩＮＵＸベース機械）、または他の市販されている、当業者に既知である一般的なコンピュータであり得る。配列を入力し、並べ、または操作するためのソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮが利用可能であり、またはＶｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）などの標準のプログラミング言語を用いて、当業者によって簡単に構築される。
【０１６７】
モジュレーターを識別するための方法
依存症の素因などを識別するための種々の診断および予後マーカーを提供することに加えて、本発明はまた、依存症の表現型のモジュレーターを識別する方法も提供する。本方法において、可能性のあるモジュレーターを、表１中の遺伝子座に相当する関連するタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸に接触させる。遺伝子または遺伝子産物における可能性のあるモジュレーターの作用を検出し、それによって、可能性のあるモジュレーターが、表現型に関して存在している分子基礎を調節するどうかを判定する。
【０１６８】
さらに、本方法には、例えば、１つ以上の推定モジュレーターを、関連する表現型を提示する個体に投与すること、および推定モジュレーターが、例えば、臨床試験または治療において、個体における表現型を調節するかどうかを決定することが含まれ得る。言い換えれば、これにより推定モジュレーターが臨床的に有用かどうかを決定する。
【０１６９】
モジュレーターによって接触した遺伝子または遺伝子産物には、本明細書で述べた任意の対立遺伝子形態が含まれる。望まない表現型に正に相関する対立遺伝子形態、遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかは、モジュレータースクリーニングのために好ましい標的である。
【０１７０】
選択可能なの対象の作用には、（ａ）モジュレーターの存在下で、表１中の遺伝子または遺伝子産物の発現が増加または減少すること、（ｂ）発現のタイミングまたは位置が変化すること、あるいは表１中の遺伝子および／またはＲＮＡまたはそのタンパク質産物の発現パターンが変化すること、（ｃ）該モジュレーターの存在下で、表１中の遺伝子の遺伝子産物の活性を増加または減少すること、あるいは（ｄ）該モジュレーターの存在下で、局在化が変化すること、または表１の遺伝子座によってコードされたＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現パターンが変化することが含まれ得る。
【０１７１】
モジュレータースクリーンの正確なフォーマットはもちろん、（複数の）検出される効果および利用可能な機器に応じて、変化し得る。ノザン解析、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはアレイに基づく検出フォーマットを、上述した遺伝子の発現レベルまたはパターンを区別するために、使用することができる。タンパク質の発現レベルはまた、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ解析、抗体ハイブリダイゼーション、ＢＩＡｃｏｒｅなどの利用可能な方法を用いて、検出され得る。これらの方法のいずれかを、可能性のあるモジュレーターからの結果である表１の遺伝子座あるいはそこでコードされているＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルにおける変化を区別するために使用することができる。
【０１７２】
したがって、表１の遺伝子、および／またはそこでコードされているＲＮＡおよびタンパク質の可能性のあるモジュレーターを、活性または発現のためにスクリーニングしてもよい。例えば、可能性のあるモジュレーター（小分子、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ）、有機分子、無機分子、タンパク質、ホルモン、転写因子など）を、対象の対立遺伝子、および表１にある遺伝子座に相当する遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質の活性または発現（または両方）における作用を含む細胞に接触させることができる。例えば、表１の遺伝子ののいずれかの発現を、例えば、ノザン解析または定量的（場合によって、リアルタイム）ＲＴ−ＰＣＲを介して、可能性のある発現モジュレーターの適用の前後で検出することができる。同様に、種々の遺伝子のプロモーター領域（例えば、一般的に、転写の開始部位の領域中の配列、例えば、開始部位の５ＫＢ以内、例えば、１ＫＢ以下、例えば、開始部位の５００ＢＰまたは２５０ＢＰまたは１００ＢＰ以内）を、レポーター構造物（ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは任意の他の利用可能なプロモーター）に連結可能であり、可能性のあるモジュレーターによる、発現活性調節に関して同様に試験することができる。いずれの場合でも、アッセイは、高スループット様式で、例えば、自動流体取り扱いおよび／または検出システムを用いて、連続または平行様式で実施可能である。同様に、活性モジュレーターを、検出される活性が、活性モジュレーター、発現調節または両方の結果であるかどうかに限らず、本明細書の任意の活性検出方法を用いて、可能性あるモジュレーターを適切な細胞に接触させることによって試験可能である。これらのアッセイは、インビトロで細胞に基づくものであり、または対象の遺伝子を含むノックアウトトランスジェニックマウスなどの研究室動物について実施されるモジュレーター活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１７３】
モジュレーター活性検出を検出するためのバイオセンサーはまた、本発明の１つの特徴である。これらには、１つ以上の遺伝子または産物の活性を測定するまたは提示する用見出しにつながる表１の遺伝子座に相当する遺伝子または遺伝子産物を含む、装置またはシステムが含まれる。したがって、上記アッセイ成分のいずれかを適切なアッセイ成分を読み出しに動作可能につなげることによって、バイオセンサーとして配置することができる。読み出しは、光学的（例えば、細胞マーカーまたは細胞生存を検出するため）、電気的（例えば、ＦＥＴ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または種々のその他のいずれかに連結した）、分光学的などであり得、ユーザーが見ることが可能なディスプレイ（例えば、ＣＲＴまたは光学観察ステーション）を任意に含み得る。バイオセンサーは、例えば、推定モジュレーター活性の自動高スループット解析のために、本発明のタンパク質に対する推定モジュレーターの接触を指向するロボットまたは他の自動化、例えば、マイクロ流体システムに連結され得る。本発明のバイオセンサーとともに利用するようになされ得る多種多様な自動化システムが市販されている。例えば、自動化システムは、例えば、選択された刺激に応答して、遺伝子の発現レベルを含むさまざまな生物学的現象を評価するために作製されている（Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８）「Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ  Ａｒｒａｙｓ  Ｐｕｔ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｏｔ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：３９６−３９９）。研究室のシステムではまた、種々の自動化研究室方法のための基礎容器要素として利用される、マイクロタイタートレイまたは他のチップトレイなどのアレイを含む、試薬保存システムへまたはそれから物質を輸送するために、例えば、繰り返し流体取り扱い操作（例えば、ピペッティング）を実施することができる。同様に、システムは、例えば、マイクロタイタートレイを操作し、温度、光または空気への暴露などの種々の環境条件を制御する。多くのそのような自動化システムが市販されており、上述したものを含み、本明細書で記述されている。これらには、種々のＺｙｍａｔｅシステム、ＯＲＣＡ（登録商標）ロボット、マイクロ流体装置などが含まれる。例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡによるＬａｂＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ装置（登録商標）高スループット  スクリーニング  システム（ＨＴＳ）は、モジュレーター活性に関してスクリーニングするために、本発明での使用に適合している。
【０１７４】
一般に、タンパク質発現レベルおよび活性を検出するための方法およびセンサーが入週可能であり、これらには、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈｔ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；およびＳａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を含む、種々の以上の参考文献において教義されたものが含まれる。多くのタンパク質を同時に検出する、「プロテオミクス」検出方法が記述されており、種々の多次元電気泳動法（例えば、第２ゲル電気泳動）、質量分析に基づく方法（例えば、ＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレーなど）または表面プラズモン共鳴法を含み、上述されている。また、これらは、タンパク質活性および／または発現レベルをトラックするために使用することができる。
【０１７５】
同様に、核酸発現レベル（例えば、ｍＲＮＡ）を、ノザン解析、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどを含む、任意の利用可能な方法を用いて検出することができる。これらの方法を通して当業者を導くのに十分な参考文献は簡単に入手可能であり、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒを含む。
【０１７６】
全動物アッセイもまた使用され、例えば、細胞に基づく現象、表示された動物の表現型における変化などにおける作用をモニターすることによって、細胞または全動物（例えば、トランスジェニックノックアウトマウス）についてモジュレーターの作用を評価することができる。
【０１７７】
発現および／または活性における作用に関してスクリーニングされるべき、可能性のあるモジュレーターライブラリーが入手可能である。これらのライブラリーはランダムであり得るか、または標的され得る。例えば、モジュレーターライブラリーを、例えば、表１の遺伝子のいずれかの発現における作用に関してスクリーニングしてもよい。
【０１７８】
標的ライブラリーには、組み合せライブラリーを生成するために、足場または構築ブロックを選択する任意の形態の論理的設計技術を用いて設計されたものが含まれる。これらの技術には、生物等比体積形質転換、標的特異的特権化構造などでのモーフィングを含む、標的集中ライブラリーの設計および組み合せ合成のための多数の方法が含まれる。一般に、表１の遺伝子または遺伝子産物の構造に関する情報が利用可能な場合、おそらく、結合パートナーを、例えば、柔軟性のあるドッキングアプローチなどを用いて設計可能である。同様に、ランダムライブラリーが、種々の基本的化学足場に対して存在する。いずれの場合においても、化学ライブラリーに対する数千の足場および構築ブロックが利用可能であり、ペプチド、核酸、炭化水素および他の骨格を有するものが含まれる。市販されているライブラリーおよびライブラリー設計サービスには、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｆｆｙｍｅｔｏｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ、Ｎｕｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）など多くによって提供されるものが含まれる。
【０１７９】
依存症の表現型の治療のためのキットには、上述したように識別されたモジュレーター、および依存症を予防または治療するために、患者に化合物を投与するための指示が含まれ得る。
【０１８０】
細胞レスキューと治療的投与
１つの様態において、本発明には、１つ以上の表１の外来遺伝子、またはその遺伝子産物（したがって、対象の関連表現型、例えば、依存症感受性または耐性などを有する）の機能において欠陥がある細胞のレスキューが含まれる。これは、遺伝子の新規コピー（または関連タンパク質を発現している異種核酸）、すなわち望まれる対立遺伝子を有する遺伝子を細胞に導入することによって、単純に達成し得る。欠陥遺伝子を（例えば、キメラ形成法を介して）修復するための相同組み換えなどの、他のアプローチもまた実施可能である。任意の事象において、機能のレスキューを、例えば、本明細書で言及したアッセイのいずれかにおいて、測定可能である。実際、本方法を、表１の任意の遺伝子またはその遺伝子産物の発現または活性に関して、インビトロで細胞をスクリーニングする一般法として使用することができる。したがって、機能のインビトロでのレスキューは、上述した多数のインビトロスクリーニング法に関して有用である。レスキューされる細胞には、（患者由来の初代または二代細胞培養液、ならびによく確立された細胞の培養液を含む）培養液中の細胞が含まれ得る。細胞を患者から単離する場合、これは、関連の表現型が存在する患者において、どの遺伝子または遺伝子産物が欠陥であるかを確立することにおいて、さらなる診断的有用性を有する。
【０１８１】
他の様態において、細胞レスキューは、例えば、欠陥を修正するために、患者、例えば、ヒトにおいて発生する。したがって、本発明の１つの様態は、欠陥を修正するための遺伝子治療である。これらの適用において、本発明の核酸を、適切な遺伝子治療ベクターに場合によってクローン化し、（および／あるいは裸の核酸またはリポソーム共役核酸として単純に伝達して）、ついで、場合によって適切な担体または輸送試薬と組み合せて、輸送する。タンパク質をまた、直接輸送することができる。しかし、核酸の輸送が典型的に、安定な発現が望まれる適用において好まれる。同様に、本明細書における方法によって識別された任意の欠陥のモジュレーターを、治療的に使用することができる。
【０１８２】
投与のための組成物は、例えば、治療的に有効な量のモジュレーター、遺伝子治療ベクターまたは他の関連の核酸、および薬理学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。そのような担体または賦形剤は、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよび／またはこれらの組み合せを含む。処方は、投与の様式に適合するように作製される。一般に、局所使用のために遺伝子治療ベクターを投与する方法が、当該技術においてよく知られており、本発明の核酸の投与に適用され得る。
【０１８３】
１つ以上の本発明のモジュレーターまたは遺伝子治療核酸を含む治療的組成物を場合によって、当該技術においてよく知られている方法に従い、１つ以上の疾患の適切なインビトロおよび／またはインビボ動物モデルで試験し、作用、組織代謝を確認し、用量を推定する。特に、用量をまず、処方の活性、安定性または他の好適な測定によって決定し得る。
【０１８４】
投与は、分子を細胞と最大に接触するように誘導するために通常利用される任意の経路によってである。モジュレーターおよび／または関連配列（例えば、表１の任意の遺伝子）をコードしている核酸を、場合によって１つ以上の薬理学的に許容可能な担体とともに、任意の好適な様式で投与することができる。本発明に関するそのような核酸の患者への投与の好適な方法が利用可能であり、１つ以上の経路を特定の組成物を投与するために利用可能であるけれども、特定の経路がしばしば、他の経路よりも、より迅速で、より効果的な活性または反応を提供する。
【０１８５】
薬理学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用した特定の方法によって部分的に決定される。したがって、多種多様な好適な本発明の薬理学的組成物の好適な処方が存在する。組成物は、限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下または膣投与を含む、多数の経路によって投与可能である。組成物は、リポソーム（例えば、局所）を介して、または裸のＤＮＡまたはウイルスベクターの局所伝達を介して投与され得る。そのような投与経路および好ましい処方は一般に、当業者に公知である。
【０１８６】
単独または他の好適な成分と組み合せて、組成物を、吸入を介して投与されるべきエアゾル処方で形成することも可能である（すなわち、ネブライザー処方することも可能である）。エアゾル処方を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧許容可能な高圧ガス内に配置することができる。例えば、関節内（関節内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路などによって、非経口投与のために好適な処方には、水性および非水性、等張性無菌注射溶液が含まれ、これには、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および処方を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質、および試薬を懸濁することを含み得る水性および非水性無菌懸濁液、可溶化剤、濃化剤、安定剤および保存剤が含まれ得る。パッケージ化された核酸の処方は、アンプルおよびバイアルなどのユニット投与または多投与密封容器中で存在され得る。
【０１８７】
本発明に関して、患者に投与する用量は、長時間、患者において、有益な予防的および／または治療的応答に影響を与えるのに十分である。用量は、特定のベクターの効果、または他の処方、および発現するポリペプチドまたは他の遺伝子産物の活性、安定性または血清半減期、患者の状態、ならびに治療されるべき患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における、特定のベクター、処方などの投与に付随しておこる任意の副作用の存在、性質および程度によって決定される。疾患（例えば、依存症）の治療において投与されるべきベクターまたは処方の有効量の決定において、医者は、局所発現、または循環血漿レベル、処方毒性、関連疾患の進行および／または関連する場合、ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質に対する抗体の産生を評価する。例えば、７０キログラムの患者に投与される用量は、典型的には、関連する組成物の活性の変化または血清半減期に適合した、現在使用されている治療タンパク質の用量などと等価の範囲内である。本発明のベクターは、任意の既知の従来の治療による治療条件を補足可能である。
【０１８８】
投与のために、本発明の処方は、関連ある処方のＬＤ−５０および／あるいは質量または局所伝達領域に適用されるような、種々の濃度での本発明のベクターの任意の副作用の観察、および患者の総合的な健康によって決定される。投与は、単一または分割用量を介して達成され得る。
【０１８９】
治療を受けている患者が、熱、悪寒または筋肉痛を発達させる場合、その患者には、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の痛み／熱制御薬物が与えられる。熱、筋肉痛および悪寒などの、組成物に対する反応を経験する患者は、アスピリン、アセトアミノフェン、または、例えば、ジフェニルドラミンいずれかで、さらなる注入の３０分前に前投与する。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミンに直ぐに応答しない、さらに重度の悪寒および筋肉痛のために使用する。治療は、反応の重篤度に応じて、遅くされるか、または中断される。
【実施例】
【０１９０】
以下の実施例を具体的説明のため示すが、それらは特許請求の範囲を限定するものではない。当業者に明らかなとおり、種々の必須ではないパラメータが存在し、それらは本発明の技術的範囲内で変更することができる。
【０１９１】
実施例１：依存症マーカーの識別法
序論：一般的な遺伝的変異の識別
本研究の目的は、依存症の遺伝子マーカーと決定因子を明らかにすることであった。公衆衛生にとって重要な応用分野が、依存症のマーカー対立遺伝子を明らかにすることにある。遺伝的変異が多くの遺伝子座によるものである場合、個々のリスクは、感受性遺伝子座において引き継がれている高リスク対立遺伝子の数に応じて、大きく異なってくる。あまり大きくないリスクを与える一般的な遺伝的変異は、個々に、集団のレベルで重要な影響を及ぼす。依存症のリスクと相関性があると認められる遺伝子を、関連する個々のリスクの評価に利用することができる（例えば、ＵＳＳＮ１０／９５６２２４（２００４年９月３０日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」）およびＰＣＴ出願番号ＵＳ２００５／００７３７５（２００５年３月３日出願、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」参照）。このリスク評価の実際の結果が重要である。また、介入のために実施可能なメカニズムが変異から明らかな場合、このことは目標とする予防に対して新たな可能性をもたらす。
【０１９２】
それらの実用的な成果に加えて、依存症感受性の遺伝子座および遺伝子を特定することは、依存症ならびに他の関連する疾患および障害（例えば、ニコチン依存症など）の発症メカニズムを明らかにするのに役立つ。既知の候補を越えて全ゲノム調査にまで広げることは、全体として新規なメカニズムが明らかになるという大きな利点がある。またそれらのメカニズムは、新規な治療ターゲットをもたらす。
【０１９３】
最終的に、感受性遺伝子の知見によって、遺伝子およびそれらの組み合わせた危険因子の作用を、例えば、本明細書に記載するコホートを用いて解析することにより、ライフスタイル危険因子の作用を明らかにすることができる。
【０１９４】
研究デザイン
一般的な低リスクの対立遺伝子を特定するのに効率的な手法は、症例／対照解析である。依存症に関連する変異は、遺伝的背景に相当する対照よりも症例において有意に高い頻度でそれが起こることにより、特定された。この解析において、変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【０１９５】
症例−対照関連解析法は、これまで「候補遺伝子」に基づいて用いられてきた。しかし、候補遺伝子の手法には深刻な限界があった。それは、遅くしかも比較的高価であり、検定される各遺伝子に対してＳＮＰに基づきＳＮＰに行われる発展途上のアッセイに左右される。それは、候補遺伝子に対しても、その有効範囲が不完全であり、特に、多くの場合、潜在的な調節変異を見過ごしてしまう。またそれは、疾患の生物学の目下の知見に制約される。一方、本解析に使用されたゲノム規模での調査は、前もって機能や位置の知見がなくても、作用のある一般的な変異を特定する能力を有していた。
【０１９６】
本解析では、約２４０万の一塩基多型（ＳＮＰ）に対し、４８２の「症例」（ファガストロームニコチン依存度テスト（ＦＴＮＤ）のスコアが３以上であったニコチン常用者（タバコ常用者））と４６６の「対照」（ＦＴＮＡスコアが０であったニコチン常用者）を用いて、プール遺伝子型判定法を行った。部分的にプール遺伝子型判定法の結果に基づき、同じ症例と対照の組において、個々の遺伝子型判定のため、４４４５４個を選び、さらに５６８の症例と４１３の対照を選んだ。個々の遺伝子型判定の後に見出された正の相関関係を表１に示す。
【０１９７】
サンプルの採集、処理、およびＳＮＰ遺伝子型判定のための実験の設定
簡単に説明すると、実験の設定は以下のとおりであった。患者すべてがインフォームドコンセントの用紙を読み、それに署名した後、患者のサンプルを本解析に用いた。すべてのサンプルにバーコードをつけ、患者の情報を収集基地の電子データベースに入力した。サンプルは、１つ１つそれを採取した患者と結びつけ、そして各サンプル容器は、１つ１つ識別できるようにした。バーコードを付けたサンプルを、遺伝子型を決定する実験室に送り、実験室内で、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、アルトリンガム、英国）を用いてサンプルを追跡した。全ゲノムの増幅を、サンプルＤＮＡに対して行い、その後、それらのサンプルを、ＰＣＲにかけ、上述したように、統合的かつ／または個別的な遺伝子型判定法に供した。遺伝子型は、データベースに送られ、各対象についての表現型データを関連付けられた。対照の遺伝子型を、品質管理工程として、ハーディ・ワインベルグ平衡からの逸脱について調べた。
【０１９８】
調査デザイン
解析は以下の段階に編成された。
【０１９９】
段階１：約２４０万のＳＮＰ一式すべてを、プール遺伝子型判定法を用いて、４８２の依存症の症例と４６６の対照で解析した。
【０２００】
段階２：４４４５４のＳＮＰ一式（例えば、プール遺伝子型判定において、依存症の症例と対照との間で、有意な頻度の差を示したもの）を、元の症例と対照において評価し、さらに、５６８の依存症の症例と４１３の対照において評価した。約４０００のＳＮＰが、ニコチン依存症の表現型と関連していると認められた。それらのＳＮＰを表１に列挙する。
【０２０１】
調査デザインの根拠
この段階的な計画は、リスクに対する作用を適度にしてＳＮＰ類の検出能力を高く維持しながら、必要な遺伝子型判定量を最小限に抑えるよう、選択した。すべてのＳＮＰについてすべてのサンプルの遺伝子型を決定するよりも、そのような段階的計画が非常に効率的であることは、計算から明らかであった（Ｓａｔａｇｏｐａｎ  ＪＭら（２００２）「Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅｄ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ−ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ」Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ５８：１６３−１７０）。
【０２０２】
スキャン・クオリティ・コントロール
サンプルはそれぞれ、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイにタイル状に配列された約２４０万のＳＮＰからなるゲノム規模のプラットフォームにおいて、個々に遺伝子型が決定された。各サンプルのスキャンには、標準的な品質基準（高いコールレート、ＳＮＰとの重なりについてマイクロアレイ全体にわたるコール（呼び出し）の高い整合性、およびその他の尺度を含む）が使用された。良質のデータがこのようにして得られた。
【０２０３】
個々の遺伝子型の記録
特注の個別遺伝子型判定（ＩＧ）チップ上に含まれるＳＮＰの大部分は、プールされた遺伝子型から選択されたものである一方、その他のＳＮＰは、候補となる遺伝子領域をカバーするために、そして、他の所定の理由から、追加されたものであった。また、個体群の構成の評価とゲノム対照の補正を支援するため、チップ上に、さらに３１１の層別ＳＮＰおよび相当数のＱＣ  ＳＮＰを配列した。表２は、排他性の高いものから順に異なるカテゴリーにあるＳＮＰの数をまとめたものである（すなわち、あるＳＮＰが、すでに所定のカテゴリーより上のカテゴリーのいずれかに含まれる場合、それは所定のカテゴリーのものとして数えておらず、ＳＮＰが重複して数えられないようにしている）。多くの選択基準をＳＮＰのこの組み合せに適用し、３５６７３の信頼できるＳＮＰの組み合せが得られた。それらは、その遺伝子型とともに記録された。
【０２０４】
表２
【０２０５】
【表２】
2009528063.tif 000003
表３は、プール遺伝子型判定（ＰＧ）サンプル（１／０はＹ（そうである）／Ｎ（そうでない））と複製サンプル（個々に遺伝子型を決定したが、プール遺伝子型判定に供していない別のサンプル）との間のサンプル数の内訳と、症例−対照の状態と、性別を示している。
【０２０６】
表３
【０２０７】
【表３】
2009528063.tif 000004
傾向スコア解析
ＰＧサンプル（ラウンド１）および複製サンプルについて、さらにその組み合せについて、それぞれ別々に傾向スコアを算出した。以下は、アーミテージ（Ａｒｍｉｔａｇｅ）の傾向スコアχ２を計算する方法の概要を示している。
【０２０８】
【化１】
2009528063.tif 000005
式中、Δｐは症例と対照との間で認められる対立遺伝子頻度の差であり、ｐ１は任意の指定された「１」対立遺伝子の母集団全体の有病率であり、Ｐ１１は対立遺伝子「１」の２つのコピーを有するサンプルの割合であり、ｎＣおよびｎＴはそれぞれ症例のサンプル数と対照のサンプル数である。
【０２０９】
ＧＣ補正
ＧＣ補正を用いて傾向スコアを補正した。ラウンド１のサンプルと全セットのサンプルの両方について、ＧＣ補正を、ＱＣ  ＳＮＰおよび層別ＳＮＰ（プール調査および候補遺伝子領域とは別に選択されたもの）の組み合せに対して計算により行った。したがって、これらのＳＮＰは、ラウンド１およびサンプルの全セットにおいてＧＣ補正の不偏推定値を与えるものである。複製サンプルについては、すべてのＳＮＰをＧＣ推定に使用した。そのような多数のＳＮＰにより、回帰の利用が可能になり、対立遺伝子頻度差の推定値の信頼性が異なるＳＮＰ間に、ＧＣ補正をより良くいきわたらせることができる。ＳＮＰの対立遺伝子頻度差の信頼性は、フィルターにかけられた遺伝子型とフィルターにかけられていない遺伝子型から算出された症例と対照との間の対立遺伝子頻度差デルタの絶対値から推定された。フィルターにかけられていない遺伝子型とフィルターにかけられた遺伝子型との間で対立遺伝子頻度差デルタが大きければ大きいほど、遺伝子型のフィルタリングによって生じるフィルターにかけられた遺伝子型における対立遺伝子頻度差のひずみの可能性が大きくなる。対立遺伝子頻度差デルタに対する傾向スコア値の回帰は、対数リンクおよびガンマ分布を用いて行った。この手順により、症例と対照との間のデルタ対立遺伝子頻度の信頼性に基づいてＳＮＰ間のＧＣ補正から求められる指数をより良く分配することができる。したがって、回帰により、ＳＮＰのデルタから算出される各ＳＮＰに特異的なＧＣ補正が得られた。
【０２１０】
伴性ＳＮＰについては、サンプル中に男性が存在するため、ＧＣ補正の分散増幅因子λを、少ないほうの数の染色体について補正した。
【０２１１】
【化２】
2009528063.tif 000006
式中、
【０２１２】
【化３】
2009528063.tif 000007
また式中、ｎＣ，Ｆ、ｎＣ，Ｍ、ｎＴ，Ｆ、ｎＴ，Ｍはそれぞれ女性の症例の数、男性の症例の数、女性の対照の数、および男性の対照の数である。λｃｏｒｒ，Ｘおよびλｃｏｒｒ，Ｙは、染色体Ｘ伴性ＳＮＰについての補正されたλ、および、染色体Ｙ伴性ＳＮＰについての補正されたλである。
【０２１３】
結果
適用された検定
ラウンド１のサンプルから得られたＧＣ補正の分散増幅因子は０．８８１であった。したがって、傾向スコアおよびそのｐ値にＧＣ補正を適用しなかった。
【０２１４】
複製サンプルから得られたＧＣ補正の分散増幅因子は１．０７０であったが、個々のＧＣ補正分散増幅因子を、上述した回帰の手順を用いて算出した。対立遺伝子頻度差のデルタに対する対数リンクおよびガンマ分布を用いた傾向スコア値の回帰により、正の傾きが確かに得られた。このことは、予想どおり、フィルターにかけられていない遺伝子型とフィルターにかけられた遺伝子型から算出される対立遺伝子頻度差デルタが大きければ大きいほど、傾向スコアがより上昇する傾向にあることを示している。上述したとおり、サンプル中に男性が存在するため、これらのＧＣ補正分散増幅因子を、伴性ＳＮＰについてのより少ないほうの数の染色体に対してさらに補正した。
【０２１５】
全サンプルのセットから得られたＧＣ補正の分散増幅因子は１．０２６であった。分散増幅因子を推定するＳＮＰの数が限られていたため、各傾向スコアを分散増幅因子によって効果的に除算するよりロバストな補正法を使用した。
【０２１６】
線形回帰およびロジスティック回帰を用いてもう１組のｐ値を算出した。表現型との関連性の有意性について異なる複数のモデルを評価した。種々の複雑モデルにより、異なる共変量を算入することの有意性を評価した。
【０２１７】
【表４】
2009528063.tif 000008
ＡＮＯＶＡのｐ値が示すところによれば、性別と地域のみが有意な表現型の差異を説明している。関連性の大部分が地域３および４に起因することが判明した。性別と地域の有意性は、異なる性と地域との間で症例と対照が不均一に分布することから予測される。性別および地域をモデルに含めることにより、遺伝子型とそれらの共変量のいずれかとの相関の程度だけ、遺伝子型と表現型の関連の可能性が低くなる。遺伝子型の関連性を検出する能力を下げるいくつかのランダムな相関が存在するかもしれないが、それらは大きな影響を及ぼさないはずである。また、モデルは、性と遺伝子型との交互作用を含んでいた。というのも、遺伝子型の効果は、異なる性に対して異なる傾きを有する可能性がある（すなわち、関連の強さは、２つの性の間で異なる可能性がある）と考えられるからである。したがって、両ロジスティック回帰を用いて（２値の症例・対照割り当てを用いて）以下のモデルを当てはめ、そして定量的ＦＴＮＤの形質を線形回帰（表現型〜性＋因子（地域）＋遺伝子型＋性：遺伝子型）を用いて当てはめた。
【０２１８】
図１〜６のＱ−Ｑプロットは、予想された帰無分布によく当てはまる統計分布が回帰によって確かに得られることを示している。ラウンド１のセットのサンプルと全セットのサンプルの両方に対する統計は、帰無分布することが予想される層別ＳＮＰとＱＣ  ＳＮＰのみからとられた。
【０２１９】
候補遺伝子領域の解析
４９０１のＣＧ  ＳＮＰと３９の特別に追加したＳＮＰからなる候補遺伝子領域を、我々の解説に示すように、別々に解析した。この領域から、４２２２の信頼できるＳＮＰが得られた。４２２２の検定されたＳＮＰに対してボンフェロニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）により補正された０．０５のレベルにおいて（これは、１．２ｅ−５の未補正ｐ値に対応する）、候補遺伝子領域中のＳＮＰは、厳密な有意性を示さなかった。しかし、８つのＳＮＰは、線形回帰からｅ−５の範囲でｐ値を示し、２つのＳＮＰは、ロジスティック回帰からｅ−５の範囲でｐ値を有している。またボンフェロニ補正は、独立した検定の有効数を低くするＬＤの領域があるため、有意になりにくすぎるようである。
【０２２０】
偽発見率（ＦＤＲ）ｑ値を、候補遺伝子領域について、ストーリー（Ｓｔｏｒｅｙ）法をそれぞれ用いて算出した。全セットのサンプルの傾向スコアから得られたｐ値と線形回帰およびロジスティック回帰からのｐ値から得られたｐ値の両方を用いて、ＦＤＲのｑ値を算出した。候補遺伝子領域中上位６つのＳＮＰは、ロジスティック回帰＜１０％から算出したｑ値を有しており、５９１のＳＮＰは、＜５０％のｑ値を有している。図７のグラフは、そのロジスティック回帰ｐ値による順序付けられたセットのＳＮＰにおけるＦＤＲ  ｑ値を示している。最初の６００のＳＮＰを拡大した部分を図８に示す。
【０２２１】
線形回帰により、ＦＤＲ  ｑ値＜１０％である１５のＳＮＰと、ＦＤＲ  ｑ値＜５０％である２３４のＳＮＰが得られた。図９および図１０のグラフは、その順序付けられた分布を示しており、図１０は、最初の３００のＳＮＰの拡大した部分を示している。
【０２２２】
プールされたＳＮＰの解析
プールされたＳＮＰから、３１１６２の信頼できるＳＮＰが得られた。ラウンド１のＩＧまたは全セットのサンプルからのロジスティック回帰または線形回帰のいずれからも、ＳＮＰはゲノム規模の有意なｐ値を示さなかった。また、ＰＧからのＳＮＰ数のみについてｐ値を補正した複製サンプルのセットにおいてもＳＮＰは有意でなかった（ｐ＜０．０５／３１１６２）。
【０２２３】
症例と対照との間のラウンド１対立遺伝子頻度差と、複製対立遺伝子頻度差との符号一致を調べることにより、ラウンド１の傾向スコアｐ値によって分類される上位のＳＮＰにおいて、幾分より高い符号一致が認められている。図１１は、２１のＳＮＰのスライドウィンドウに対する符号一致を示している。最初の約２０のＳＮＰは、図１１に示すように、デルタ対立遺伝子頻度の符号について平均より高い一致を確かに示している。２１の試行のうち１９の一致をもたらす二項分布からのｐ値が１．０４ｅ−５であるため、この一致は非常に有意である。したがって、２１の最も有意なＳＮＰからなる最初のビン（ｂｉｎ）が偶然に１９の一致を有する確立は１．０４ｅ−５である。しかし、この一致は、図１２に示すように、プロットのウィンドウサイズが１０１になると急に悪くなる。このプロットから、最初の約７５〜１００のＳＮＰは、ラウンド１と複製との間の一致がまだ多いようである。
【０２２４】
プールされたＳＮＰ、およびＰＧに使用されたサンプルについて、ＦＤＲを算出することはできない。というのも、該ＳＮＰはＰＧから選択されるものであり、したがって、表現型と関連がないＰＧサンプル間のなんらかの集団差を示すＳＮＰが、ここで同様に選択されるからである。したがって、該ＳＮＰは、そのセットのサンプルに見られる小さなｐ値が多いと予想される。しかし、ＳＮＰ選択に加わらなかった複製サンプルについてそのような予想はなく、したがって、ＦＤＲを、そのセットから算出することができる。線形回帰のｐ値とロジスティック回帰のｐ値の両方から算出されるＦＤＲのｑ値は、むしろ大きな値を有しており、線形回帰がもたらす最小のｑ値は０．５７であり、ロジスティック回帰がもたらす最小のｑ値は０．４３である。
【０２２５】
実施例２：依存症マーカー
表１に示すＳＮＰのセットは、この解析による個々の遺伝子型判定に基づいて、ニコチン依存症のリスクと関連性があると認められたものである。所定のｄｂＳＮＰｒｓＩＤ番号に対する配列は、インターネットによりｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／において明らかにされている。位置は、ヒトゲノムのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３５を指す。症例および対照における対立遺伝子頻度は、ＳＮＰの任意に指定された参照対立遺伝子の頻度を指す。
【０２２６】
ＳＮＰは、以下の基準に従って選択した。１）コールレート＞８０％、２）症例および対照におけるＨＷＥのｐ値＞１ｅ−１５、３）症例または対照においてＨＷＥのｑ値が１ｅ−４〜１ｅ−１５の間にあるＳＮＰは目視検査し、良好でないＳＮＰは排除した。４）男性と女性の間で一定の差を示す３つのＳＮＰを排除した。２つのカテゴリー（プール調査からのものまたは候補遺伝子領域の範囲に対して選択されたもの）において、ロジスティック回帰ＡＮＯＶＡ検定（性別およびＤＮＡ採集地域の影響を排除した後、遺伝子型の関連について検定）に基づき、ＳＮＰは上位のＳＮＰとして選択された。表１の縦列は、概して、解析の個々の遺伝子型判定段階を指しており、上記で詳細に説明したものである。
【０２２７】
実施例３：α５ｎＡＣｈＲ遺伝子におけるアミノ酸置換はニコチン依存のリスクに影響する
ニコチン受容体遺伝子ＣＨＲＮＡ５における非同義ＳＮＰは、ニコチン依存と関連することが明らかになったとともに、劣性遺伝様式によって２倍のリスク増加を引き起こす。
【０２２８】
ニコチン依存は、世界の予防可能な主たる死因の１つである。ニコチン依存のリスクに影響する遺伝的変異を見出すため、３００を超える候補遺伝子を、遺伝子型判定のターゲットにし、３７１３の一塩基多型（ＳＮＰ）を、１０５０の症例と８７９の対照において解析した。ファガストロームニコチン依存度テスト（ＦＴＮＤ）を、依存症を評価するため使用し、そこにおいて、症例は、４以上のＦＴＮＤを有することが必要であるとした。対照の基準は厳格であった。対照の被験者は、１００本以上のタバコをこれまでに吸ったことがなければならず、さらに、最も喫煙が頻繁な時期のＦＴＮＤが０であった。偽発見率を制御することによる多重検定についての補正の後、いくつかのコリン作動性ニコチン受容体（ｎＡＣｈＲ）遺伝子が、上位シグナルを占めることとなった。最も強い関連は、ＣＨＲＮＢ３（β３ニコチン受容体サブユニット遺伝子）に相当するＳＮＰからのものであった（ｐ＝９．４×１０−５）。生物学的には、リスク変異について最も有力な証拠は、α５ニコチン受容体サブユニット遺伝子ＣＨＲＮＡ５における非同義ＳＮＰに由来するものであった（ｐ＝６．４×１０−４）。このＳＮＰは、劣性遺伝様式の証拠を示し、喫煙に一旦さらされるとニコチン依存症を発症するリスクが２倍に増加する個体をもたらすものであった。上位シグナルにおける他の遺伝子には、ＫＣＮＪ６およびＧＡＢＲＡ４があった。この実施例は、ニコチン依存の最も有力で広範な解析の１つであり、複製の調査により必要に応じて確認することができる新規なリスク遺伝子座を見出したものである。
【０２２９】
世界保健機構は、現在の傾向が続くと、タバコ関連疾患による年間の死亡者数は、２０００年の５００万人から２０２０年には１０００万人に倍増すると推定している（１、２）。ニコチン（タバコに存在する天然のアルカロイド）は、アセチルコリンによく似ており、コリン作動性ニコチン受容体類（ｎＡＣｈＲｓ）に結合するニコチンの能力が、ニコチン依存（タバコ依存症への感受性）の分子的基礎となっている（ＭＩＭ１８８８９０）。慢性的にニコチンにさらされると、長く続く行動変化や生理的変化が生じる。そのような変化には、シナプスの強さの増加、遺伝子発現の変化、およびｎＡＣｈＲのアップレキュレーションが含まれる（３）。ｎＡＣｈＲ類は、中枢神経系全体で発現されるが、ニコチンの中毒作用は、中脳皮質ドーパミン（ＤＡ）経路を介して生じると考えられている（４）。グルタメート、ドーパミン、およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）系での交互作用が、ニコチンの強化効果に重要であると考えられている（３、５）。紙巻きタバコは、世界中で使用されているタバコの圧倒的に多い形態であり（６）、遺伝的要因は、ニコチン依存の原因にとって重要であり、その推定遺伝率は４４％〜６０％である（７）。
【０２３０】
関連性調査によって喫煙行動に影響する感受性遺伝子座を特定する努力においては、症例−対照の計画と家族に基づく計画の両方による候補遺伝子の手法が利用されてきた。喫煙に影響し得るいくつかの候補遺伝子が研究されており、その中には、ニコチン受容体（８〜１０）、ニコチン代謝遺伝子（１１〜１３）、ドーパミン系受容体（１４〜１７）、
ＧＡＢＡ受容体（１８）、ならびにその他の神経伝達物質および受容体（１９〜２１）が含まれる。候補遺伝子において連鎖の知見および関連性の知見の中では、ほとんど一致がないようである（２２で論評されている）。これまでの一ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）の論文は、Ｂｉｅｒｕら（２３）によるものであり、それは、本実施例の解析と平行して行われたものであり、同じ症例−対照のサンプルを使用している。
【０２３１】
本実施例の方法は、症例−対照の計画を用いてニコチン依存と関連する変異を検出するため、ＳＮＰ遺伝子型判定について、広範な組み合せの候補遺伝子をターゲットとするものである。遺伝子型判定のため３００を超える遺伝子をターゲットとし、約４０００のＳＮＰを準備する計画を用いた。それらは、依存症に関係する生物学的経路の一部として知られているニコチン受容体、ドーパミン作動性受容体、およびγ−アミノ酪酸受容体をコードする遺伝子ファミリーを含むものであった。本方法は、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）（実施例４およびＢｉｅｒｕｔ（２３）参照）とともに行った。両解析に使用されたのは、ヨーロッパ系の人の症例および対照の大きなサンプルであった。１０５０のニコチン依存の症例を、非依存性の喫煙者である８７９人からなる独自の対照サンプルと対比した。サンプルのサイズおよび厳格な対照の基準は、ニコチン依存に影響する変異を検出する能力が十分であればよいが、既知の候補遺伝子の適用範囲は、多重検定の複雑な課題に対処するため、大胆かつ細心の注意を要する。偽発見率（ＦＤＲ）は、多重検定の効果を限定し（２３、２４）、そして関連性の上位ＦＤＲ制御リストについて記録するため、利用される。
【０２３２】
実施例３の結果
実施例の候補遺伝子のリストは、最初４４８を数え、そしてカテゴリー「Ａ」と「Ｂ」に分けられた。５５のカテゴリー「Ａ」の遺伝子はすべて、ＳＮＰ遺伝子型判定のターゲットとした一方、残り３９３のカテゴリー「Ｂ」の遺伝子すべてをターゲットにする簡単な方法はないため、平行して行ったＧＷＡＳ（Ｂｉｅｒｕｔ（２３）および実施例４参照）のプール遺伝子型判定の結果に従い、ＳＮＰ遺伝子型判定について優先順位をつけた。表５は、候補遺伝子におけるプール遺伝子型判定の結果をまとめて示している。ＳＮＰの選択に考慮された３９３のカテゴリー「Ｂ」の遺伝子のうち２９６を、候補遺伝子解析において、個々の遺伝子型判定のターゲットにした。それらは、式１（下記参照）に規定するように、最も低い補正最小ｐ値を用いて選択され、そこにおいて、カットオフはほぼｐ≦０．９５であった。これらの候補遺伝子中４３０９のＳＮＰが個々に遺伝子型判定され、そして、品質管理（ＱＣ）フィルタリングの後、３７１３のＳＮＰを関連性について検定した。５２のカテゴリー「Ａ」遺伝子について５１５のＳＮＰが検定され、２９６のカテゴリー「Ｂ」遺伝子について３１９８のＳＮＰが検定された。
【０２３３】
表５
【０２３４】
【表５】
2009528063.tif 000009
表５は、平行して行われたゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）からの候補遺伝子におけるプール遺伝子型判定の結果を示している。合計２１７７７１８のＳＮＰが品質管理（ＱＣ）基準を通過し、関連性について検定された。結果は、ＳＮＰ選択について、カテゴリーＢの遺伝子をランク付けするのに用いられた。「検定された遺伝子」および「検定されたＳＮＰ」の欄は、それらの遺伝子の中で、ＱＣに合格し、関連性について検定された遺伝子の数およびＳＮＰの数を示している。遺伝子の中でプール遺伝子型判定において関連性につき検定されたすべてのＳＮＰに対する最小ｐ値は、式（１）に従い検定数について補正されたものである。ａ：平均±標準偏差
表６は、ニコチン依存に対する上位の関連で、重み付けされたＦＤＲが４０％未満のものを示している。ＦＤＲを推定する際、カテゴリー「Ａ」遺伝子からのＳＮＰは、カテゴリー「Ｂ」遺伝子よりも１０倍大きく重み付けされた。シグナルは、ロジスティック回帰において基本モデルに遺伝子型の項と遺伝子型と性との交互作用の項を加える第一自由度２のｐ値によって選別された。機能「ＦＰ」が付与されたＳＮＰは、転写領域の±１０ｋｂとして表示の目的で規定された遺伝子のフットプリント内のものである。ＬＤ  ＢＩＮと表示されたものは、フットプリント外のものであり、エキソンに近いＳＮＰを有するＬＤ内のものについて遺伝子型判定のため選択されたものである。括弧内の遺伝子は、それに対して該当するＳＮＰが選択された候補遺伝子である。「ＬＤビンＩＤ」の欄は、ＬＤビンを特定しており、同じＬＤビンＩＤを有するＳＮＰは、単一の関連シグナルを効果的にもたらす。これは、「Ｍｉｎ（ｒ２）」の欄において、当該ビン中の他のＳＮＰと標識との間で、最小相関を記録している。ランクは、３７１３の遺伝子型判定されたＳＮＰのすべてにおいて、一次ｐ値により決定している。すべての対立遺伝子は、プラス鎖から報告された。症例ｐと対照ｑにおけるリスク対立遺伝子（対照よりも症例において頻度が高い対立遺伝子）の頻度は、ｐ／ｑの表記法で記録されている。
【０２３５】
【表６−１】
2009528063.tif 000010
【０２３６】
【表６−２】
2009528063.tif 000011
ａ：非乗法モデルについて有意な証拠がある（表８（ＬＤビンあたり１つのＳＮＰを示す）参照）。ｂ：性−特異的リスクについて有意な証拠がある（表９（ＬＤビンあたり１ＳＮＰを示す）参照）。ｃ：少ない対立遺伝子の非常に低い頻度
表７は、上位シグナルのＳＮＰ（すなわち、表６に示されるＳＮＰ）を有するカテゴリー「Ａ」遺伝子すべてとカテゴリー「Ｂ」遺伝子のいくつかを詳細に示している。「検定されたＳＮＰ」の欄は、関連について検定されたＳＮＰの数を示しており、「上位シグナルのＳＮＰ」の欄は、表６に示されるＳＮＰを指している。いくつかのＳＮＰは、特に２つの遺伝子が互いに近い場合、同義遺伝子に相当し、したがって、それらの２つの欄に表されるＳＮＰについては、遺伝子に重なりがある。本発明で上位シグナルのＳＮＰを有する遺伝子は、太字で示されている。
【０２３７】
【表７−１】
2009528063.tif 000012
【０２３８】
【表７−２】
2009528063.tif 000013
候補遺伝子に対する個々の遺伝子型判定において、一次関連解析による１０の最小ｐ値は、９．３６×１０−５〜１．２２×１０−３の範囲であった。ＦＤＲが４０％未満であるＳＮＰが３９あった。これは、約２４の真のシグナルが存在することを示している（表５および６ならびに図１３）。それらの上位３９のシグナルは、ニコチン受容体遺伝子によって占められていた（図１４および１５）。上位５のＦＤＲ値は、遺伝子ＣＨＲＮＢ３、ＣＨＲＮＡ３、およびＣＨＲＮＡ５に対応するもので、０．０５６〜０．１６６の範囲にあった。最良の証拠は、これら５つのシグナル中４つが、真の関連によるもので、変量効果によるものでなかったということである。並べ替えＦＤＲ推定は、概ねそのＦＤＲと同じであり、差はせいぜい０．０２であり、ｒｓ６４７４４１３のＳＮＰにおける最小並べ替えＦＤＲは０．０７であった。各連鎖不平衡（ＬＤ）ビンから１つのＳＮＰを選択した後、それら３９のＳＮＰのうち３つが、非乗法モデルの有意な証拠を示した（表８）。また、いくつかのＳＮＰは、有意な性と遺伝子型との交互作用を有することがわかった（表９、さらに、性×遺伝子型のｐ値および性−特異的オッズ比を示す表６からのＳＮＰすべてを一覧にした表１４を参照）。図１３は、候補遺伝子関連解析の結果を示す。−ｌｏｇ１０（ｐ）変換を用い、一次解析からのｐ値を、イデオグラムの下、各染色体に対してプロットしている。一番下の軸はｐ＝１であり、一番上の軸はｐ＝１０−３である。カテゴリー「Ａ」遺伝子は赤色でプロットの下に示され、カテゴリー「Ｂ」遺伝子は、カテゴリー「Ａ」遺伝子の下に青色で示されている。染色体８と１５（図１４でさらに詳しく示される）は、赤で強調されている。図１５は、ニコチン受容体遺伝子の（Ａ）ＣＨＲＮＢ３−ＣＨＲＮＡ６クラスターおよび（Ｂ）ＣＨＲＮＡ５−ＣＨＲＮＡ３−ＣＨＲＮＢ４クラスターにおけるマーカー間の連鎖不平衡（ＬＤ）を示す。
【０２３９】
β３ニコチン受容体サブユニット遺伝子ＣＨＲＮＢ３（染色体８に位置する）は、解析から、２つの最も強いシグナルをもたらすものであった（ｒｓ６４７４４１３およびｒｓ１０９５８７２６（図１４Ａ））。これら２つのＳＮＰは、１つのシグナルを効果的にもたらしていた。というのも、それらは、ｒ２補正≧０．９９で非常に高いＬＤにあったからである。それらはともに推定５’プロモーター領域にあり、ｒｓ６４７４４１３のＳＮＰは最初の５’プロモーターの２Ｋｂ以内にあり、ｒｓ１０９５８７２６のＳＮＰはさらに１５Ｋｂ上流にある。ＣＨＲＮＢ３にある２つの他のＳＮＰ（ｒｓ４９５３およびｒｓ４９５２）も、上位シグナルの中にある。これらは、エキソン５中の同義ＳＮＰであり、ＣＨＲＮＢ３に対して唯一知られているコードＳＮＰである（ｄｂＳＮＰ  ｂｕｉｌｄ  １２５、インターネットｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ）。また、これらは、その遺伝子型が完全に相関付けられたため、１つのシグナルに相当する。図１４は、上位の関連シグナルについて詳細な結果を示している。（Ａ）上位の２シグナルは、染色体８上のＣＨＲＮＢ３ニコチン受容体遺伝子の近くである。（Ｂ）非同義ＳＮＰのｒｓ１６９６９９６８およびニコチン受容体遺伝子のＣＨＲＮＡ５−ＣＨＲＮＡ３−ＣＨＲＮＢ４クラスターは、染色体１５上にある。表６に示されるＳＮＰは、ｄｂＳＮＰのｒｓＩＤで表示されている。「最も保存されているＵＣＳＣ」の欄（インターネット上でｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ、Ｍａｙ  ２００４  ｂｕｉｌｄ、表「ｐｈａｓｔＣｏｎｓＥｌｅｍｅｎｔｓ１７ｗａｙ」において）は、ヒトと他の種（マウス、ラット、およびニワトリを含む）との間で保存されている領域を強調している。最大保存スコアは１０００である。一次ｐ値は、−ｌｏｇ（ｐ）変換を用いて赤でプロットされている。「ＬＤビン」の欄は、「ＳＮＰ」の欄からのＳＮＰのＬＤビンへの分配を示しており、そこにおいてすべてのＳＮＰは、タグＳＮＰによる対照と症例の両方において、ｒ２≧０．８を有する。ＳＮＰが２つより多いビンのみが示され、ビンは、ＳＮＰの数Ｎ、ビンにおける他のＳＮＰとのタグの最小ｒ２、ビンにおける対立遺伝子頻度の範囲、およびタグＳＮＰで、アノテーションされている。（Ｃ）凡例はカラーのスキームを示している。
【０２４０】
上位シグナルの中で次の群のＳＮＰは、染色体１５上のニコチン受容体遺伝子のＣＨＲＮＡ５−ＣＨＲＮＡ３−ＣＨＲＮＢ４クラスター中にある（図１４Ｂ）。３番目に有意なシグナルは、ＣＨＲＮＡ３（α３ニコチン受容体サブユニット遺伝子）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にあるＳＮＰ（ｒｓ５７８７７６）であった（図１４Ｂ）。ＣＨＲＮＡ３から約５Ｋｂ下流は、４番目に強いシグナルｒｓ１６９６９９６８（ＣＨＲＮＡ５（α５ニコチン受容体サブユニット遺伝子）のエキソン５にある非同義コードＳＮＰ）である。このＳＮＰは、ｒｓ１０５１７３０（ＣＨＲＮＡ３中の同義コードＳＮＰ）とともに非常に強いＬＤにあり、ｒ２相関≧０．９９である。
【０２４１】
最も興味深いシグナルは、ＣＨＲＮＡ５中の非同義ＳＮＰであるｒｓ１６９６９９６８であると考えられる。上述したが、これは、ＣＨＲＮＡ３遺伝子中のＳＮＰと完全に相関する（図１４Ｂ）。ｒｓ１６９６９９６８の対立遺伝子Ａは、症例で３８％の頻度、対照で３２％の頻度を有する。このＳＮＰについて、劣性様式遺伝の説得力のある証拠が存在する（表８）。コピーをもたないのと比べて、Ａ対立遺伝子のコピーを１つまたは２つ有することに対するオッズ比は、それぞれ１．１（９５％ＣＩ０．９〜１．４）と１．９（９５％ＣＩ１．４〜２．６）であった。すなわち、他の遺伝子型を有する人に比べて、ＡＡ遺伝子型を有する人は、ほぼ２倍、ニコチン依存の症状を有する可能性が高い。表８は、乗法遺伝モデルからの有意な乖離を示すＳＮＰを示している。最小一次ｐ値を有するＳＮＰを、表１０の各ＬＤビンから選択した。乗法ｐ値は、式（３）におけるヘテロ接合の項Ｈの有意性に対する自由度１の検定によるものである。本発明者らはｐ＜０．０５であるＳＮＰのみを示している。後ろ２つの欄は、遺伝子型間での相対リスクについて、オッズ比と９５％信頼区間を示している。ｒｓ１６９６９９６８のＳＮＰは、明らかに劣性様式に従っており、そこにおいて、Ａ対立遺伝子のコピーを２つ有する個体は、０または１つのコピーを有するものに比べて、２倍近くニコチン依存の症状を有する可能性が高い。
【０２４２】
【表８】
2009528063.tif 000014
実施例３の考察
喫煙によるニコチン依存症は、年間３００万人を越える死亡の原因であり、世界中で予防可能な死亡原因のトップになっている（１）。２００３年、米国では、大人の２１．６％が喫煙者であり、男性の２４％、女性の１９％が喫煙者であった（２６）。これまでの関連解析は、狭く絞られた候補遺伝子解析に限られていた。この候補遺伝子解析は、より広範なものであり、１０５０のニコチン依存の症例と８７９の非依存性喫煙者（ここで対照群の規定は特に厳格であった）において、３４８の候補に対し、３７１３のＳＮＰを遺伝子型判定した。
【０２４３】
上位のＦＤＲ制御による知見は、ニコチン受容体遺伝子によって占められていた。α５ニコチン受容体サブユニットおよびβ３ニコチン受容体サブユニットについての正の相関の知見は、新規である。ニコチン受容体およびニコチン依存について、ヒトの遺伝学的および生物学的研究の大部分は、α４サブユニットおよびβ２サブユニットに集中していた。というのも、それらは、高親和性の受容体で同時に生じ、脳において広く発現されるからである（２７）。しかし、マウスの研究により、ドーパミン放出を媒介するα４β２含有受容体のうちかなりの部分が、α５を同様に含んでいることが明らかにされている（２８）。このことは、ニコチン依存の感受性においてα５が重要な役割を果たしているという本証拠と整合する。さらに、脳のα４β２受容体において、α５またはβ３サブユニットは、筋肉のβ１に対応する５量体において、第５の位置をとることができる。α５およびβ３のいずれも結合部位の形成に加わっているとは考えられないが、それらは、チャネル特性に作用し、アゴニストの効果を左右することができる。というのも、それらは、活性化および脱感作に伴う構造変化に関係しているからである（２７）。
【０２４４】
ニコチン依存の危険因子を示す最も説得力のある証拠は、ＣＨＲＮＡ５における非同義ＳＮＰのｒｓ１６９６９９６８によるものである。このＳＮＰは、アミノ酸３９８のアスパラギン（Ｇ対立遺伝子によりコードされる）からアスパラギン酸（Ａによりコードされる、リスク対立遺伝子）への変化を生じさせ、それは、α５サブユニットの第２細胞内ループにおいてアミノ酸電荷の変化をもたらす（２９）。このリスク対立遺伝子は、劣性様式で作用しているようであり、その様式で、Ａ対立遺伝子についてホモ接合である個体は、ニコチン依存になるリスクが２倍になる。α５サブユニットはこれまで詳細に研究されておらず、この多型の機能的効果を報告したものは知られていない。一方、注目すべきことに、α４ｎＡＣｈＲサブユニットの対応する細胞内ループにおける非同義の電荷を変化させる多型は、ニコチンへの暴露に対してマウスのｎＡＣｈＲ機能を変化させることがわかっている（３０〜３３）。この変異は、ヨーロッパ系の個体群では一般的（Ａ対立遺伝子の対立遺伝子頻度は約４２％）であるが、アジアまたはアフリカ系の個体群では一般的でない（＜５％、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐプロジェクトからのデータ、インターネット上ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇにて）。
【０２４５】
また上位３９のＦＤＲ制御シグナルの中には、遺伝子ＫＣＮＪ６（ａ．ｋ．ａ．ＧＩＲＫ２）およびＧＡＢＲＡ４も存在する。ｐ値が０．００１未満であるＳＮＰを有するもので、ニコチン受容体以外には、これらの遺伝子しかなかった。ＫＣＮＪ６は、内向き整流性カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）ファミリーの遺伝子に属する。ＧＩＲＫは、多くの神経伝達物質受容体とシナプス伝達の調節との間の一般的な連携をもたらす（３４）。ＧＡＢＡは、哺乳動物の中枢神経系において、重要な抑制性神経伝達物質であり、ニコチンの強化作用にとって不可欠なものである（３、５）。遺伝子型によるリスクが女性よりも男性においてかなり高いという有意な証拠が明らかになった（表９）。そこにおいて、男性のオッズ比は２．２であった（９５％ＣＩ１．４〜３．３）。
【０２４６】
他のニコチン受容体でこれまでに報告された知見は、最も有意な知見には含まれていなかった。ＣＨＲＮＡ４のこれまでの研究において、アフリカ系アメリカ人種のＳＮＰであるｒｓ２２３６１９６およびｒｓ３７８７１３７、ヨーロッパ系アメリカ人種のｒｓ２２７３５０４およびｒｓ１０４４３９６が、名目上ニコチン依存の尺度と関連があると報告されたが、多重検定補正の後、アフリカ系アメリカ人のｒｓ２２３６１９６のみが残った（９）。またＣＨＲＮＡ４中のｒｓ１０４４３９６およびｒｓ１０４４３９７が、アジア系男性喫煙者の家系サンプルにおいて、ＦＴＮＤスコアとニコチン依存の性質の両方に関連した（８）。ヨーロッパ系のこのサンプルにおいて、ＣＨＲＮＡ４に対し、ｒｓ２２７３５０４を除いて上記ＳＮＰを含む１１のＳＮＰを検定した。ｒｓ２２７３５０４はストリンジェント品質管理基準を満たさなかった。１１のＳＮＰすべてを通じて最も低い一次ｐ値は、ｒｓ２２３６１９６に対する０．０２６であった（スタディ−ワイドランク＝１３２）。この特定の結果は、このＳＮＰの上述した特定の以前の知見からすると、単に１つの試験として考えることができ、したがって、再現性についてほどほどの証拠を示すものである。以前に報告された残りの４つのＳＮＰは、解析の結果、０．８より大きなｐ値を示した。これらの結果の相違は、部分的に、それぞれのサンプルの人種の違いによる可能性がある。
【０２４７】
イスラエル人の女性の喫煙の開始とニコチン依存の重症度についての最近の研究（１０）では、１１のニコチン受容体サブユニット遺伝子における３９のＳＮＰが解析された。また、その単一ＳＮＰ解析では、α４中のＳＮＰ（ｒｓ２２３６１９６、ｒｓ１０４４３９６およびｒｓ１０４４３９７を含む）に対する関連は検出されなかった一方、α７、α９、β２、およびβ３サブユニットにおいて名目上の関連が見出された。その研究には、β３サブユニットの同じＳＮＰは含まれておらず、この実施例のニコチン受容体遺伝子において４つの最も強い相関を備えるα５−α３−β４クラスターも含まれていなかった。その研究では、本発明の５番目にランクされるニコチン受容体（ＳＮＰのｒｓ１０５１７３０）が確かに解析され、「高」ニコチン依存被験者と「低」ニコチン依存被験者を比較して、示唆的な０．０８のｐ値が、本研究よりかなり小さなサンプルで明らかにされた。
【０２４８】
本研究は、ＧＡＢＡＢ受容体ＧＡＢＢＲ２（ａ．ｋ．ａ．ＧＡＢＡＢＲ２、ＧＡＢＡＢ２、およびＧＰＲ５１）のβ２サブユニットについて、Ｂｅｕｔｅｎと共同研究者（１８）により報告された関連性の知見を裏付けることができなかった。ＧＡＢＢＲ２中の３２のＳＮＰ（Ｂｅｕｔｅｎと共同研究者（１８）により報告された５つのＳＮＰを含む）を、遺伝子型判定し、そのうち３つが、その解析において少なくとも１つの検定により、ヨーロッパ系アメリカ人で最も有意であった。この解析における一次ｐ値は、３２のＳＮＰすべてに対して０．０７より大きく、以前に報告された５つのＳＮＰに対して０．３より大きかった。
【０２４９】
同様に、ＤＤＣ遺伝子について遺伝子型判定された３１のＳＮＰの一次検定では、名目上の関連について証拠は見出されなかった。３１のＳＮＰには、ヨーロッパ系アメリカ人において有意であると以前に報告された（３５）ＳＮＰが含まれている。遺伝子ＢＤＮＦをカバーする１１のＳＮＰのうち、３つ（ｒｓ６２６５、ｒｓ２０３０３２４、ｒｓ７９３４１６５）は以前にヨーロッパ系アメリカ人男性において関連ありと報告されている（２１）。これらの３つは、本サンプルにおいて有意でなかった（それぞれ一次ｐ＝０．８６、０．０８８および０．１２）。また残りの８つのＳＮＰで最も低い一次ｐ値は０．０２であった。これは、当該遺伝子をカバーする６つのＬＤビンについての補正に耐えるものではない。留意すべきことに、本一次検定はｌｏｇ−加法モデルを使用する一方、これまでの報告は、時に他のモデルで、その最も強い結果を見出している（例えば、劣性、優性）。しかし、これらの以前に報告された関連性に関し、ｌｏｇ−加法モデルから脱却するための試験では、代わりの遺伝様式下で改善がもたらされる証拠はなかった。
【０２５０】
この実施例における一次関連解析は、基本予測因子（性および地域）に遺伝子型と遺伝子型と性との交互作用の項を加える自由度２の検定であった。この手法は、性別に有意に影響される関連の検出を確実にするのに役立つ。不利な点は、自由度の追加により、有意でない性の交互作用との関連が、全体的に有意性が低いと見られるようになることである。
【０２５１】
ここに示す対照は、高度に選択されたものであり、ニコチン依存への感受性に対して「防御されている」とも考えることが可能なものであるため、結果の判定は、解析からの関連シグナルがリスク効果よりもむしろ防御を実際に意味し得る可能性を考慮する必要がある。ＳＮＰ間におけるオッズ比の比較を容易にするため、頻度の高い対立遺伝子を、これらのデータを記録するための症例において、表記法として用いた。このことを、特定の変異がニコチン依存のリスクにどのように影響するかの結論として考えるべきでない。変異がリスクを変化させるメカニズムを正確に知ることは、機能的研究によってのみ可能になる。
【０２５２】
米国人のみのサンプルを使用して相関についてさらなる検定を行い、７９７の症例と８１３の対照からなるこのサブセットにおいて第一の結論が依然として維持されるかどうか調べた（２５３の症例と６６の対照を有するオーストラリア人のサンプル単独は、関連に対する検定を行うには小さすぎる）。「地域」の項を除外したこと以外、全サンプルの場合と同じロジスティック回帰法を用いた。関連について２つの検定間におけるｐ値のスピアマンの順位相関係数は０．８７であった。表１５は、上位の相関のリスト（表６）にある３９のＳＮＰについて、米国のみの解析の結果を示しており、最初の順位とＦＤＲフィルタリングとともに、米国サンプルの結果を並べて示している。表１６は、米国サンプルのみを用いて完全にやり直し、ｐ値によって順位付け、ＦＤＲ＜４０％によってフィルターにかけ、そしてＬＤビンを算出した結果を示している。この場合、最初の組の上位シグナル（表６）におけるＳＮＰのうち３０／３９（７７％）が、米国のみの解析における上位シグナルのリスト（表１６）に入っていた。その中には、遺伝子ＣＨＲＮＡ５およびＣＨＲＮＢ３（最初の解析による上位の遺伝子）が含まれている。したがって、結果の順位にいくらかの変化があったが、米国のサブサンプルに対して解析を行っても、ニコチン受容体ＣＨＲＮＢ３およびＣＨＲＮＡ５に対する相関についての最初の結論はそのままである。
【０２５３】
候補遺伝子解析の仲間として、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を平行して行った（以下およびＢｉｅｒｕｔ（２３）参照）。２段階のデザインでヒトゲノム全体にわたって約２４０万のＳＮＰの遺伝子型判定を行った。該２段階のデザインは、サンプルの一部でプール遺伝子型判定を開始し、その後、上位４００００シグナルについてサンプル全体の個々の遺伝子型判定を行った。ＧＷＡＳからの２１番目に強いシグナルは、ＣＨＲＮＢ３（候補遺伝子解析でシグナルが最も強かった遺伝子）の最初の５’プロモーターの３Ｋｂ上流にあるＳＮＰによるものであった。このシグナルは、ｒｓ１３２７７２５４のＳＮＰ（ＧＷＡＳに対してのみ遺伝子型判定され、候補遺伝子解析に対しては遺伝子型判定されていない）から得られたものであり、６．５２×１０−５のｐ値を有した。２つの異なる解析デザインでのこの合致は、この遺伝子でのシグナルが変量効果ではないことをさらに支持している。
【０２５４】
結論として、いくつかの遺伝的変異が、候補遺伝子においてニコチン依存と関連することが明らかになった。候補遺伝子の大部分はニコチン受容体遺伝子である。関係するＳＮＰの１つは、いくつかの生物学的に意味のある因果関係を有しており、喫煙行動への影響について特に有望な候補となっている。これらの変異は、遺伝的リスクの潜在的な原因として考えるべきである。さらに再現性を調べるため、またニコチン摂取に対する反応の薬理遺伝学およびニコチン依存の治療への反応の薬理遺伝学におけるその役割について詳細を明らかにするため、本願の研究に加えてさらなる調査を企画している。
【０２５５】
実施例３の材料と方法
被験者
すべての被験者（表１０）を、進行中の２つの研究から選択した。Ｔｈｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ（米国）は、米国内の３つの都市部から被験者を募り、Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（オーストラリア）の研究は、オーストラリアでヨーロッパ系の被験者を集めた。両研究とも、コミュニティを基本とする募集を行い、等価な判定を行った。これまで１００本以上の紙巻きタバコを吸ったことがあるという基準を用いて喫煙者であると認定した被験者を、ＦＴＮＤ調査票を使用してより詳細に質問した。米国のサンプルは、セントルイス、デトロイト、ミネアポリスの地域で登録し、そこにおいて、コミュニティに基づく被験者の電話スクリーニングにより、被験者が症例の基準（現在のＦＴＮＤ≧４）または対照の状態の基準を満たしているかどうか調べた。オーストラリアのサンプルについて研究の参加者は、オーストラリアのＱｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにおいて登録され、そこにおいて、喫煙の情報がある合計約１２５００の家族に対し、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｔｗｉｎ  Ｐａｎｅｌ（オーストラリア双子登録名簿）の２つのコホートから家族が特定された（これら２つのコホートの年長の方の配偶者を含む）。オーストラリアのサンプルの祖先は、アングロ−ケルトおよび北ヨーロッパ人が大部分である。両研究はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓにより承認され、すべての被験者から参加についてインフォームド・コンセントを得た。血液サンプルを、各被験者からＤＮＡ分析のため採集し、両研究のための表現型および遺伝の電子データとともに、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｕｓｅ（ＮＩＤＡ）Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ（ここは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのガイドラインに従って研究データの共用を管理している）に提出した。
【０２５６】
症例の被験者は、紙巻きタバコを最も頻繁に吸っている期間中、ファガストロームニコチン依存度テスト（ＦＴＮＤ）（３６）のスコアが４以上である必要があった（可能な最大スコアは１０）。これは、ニコチン依存を決める一般的な基準である。対照の被験者は、これまでに１００本以上の紙巻きタバコをすっている必要があり、しかもニコチン依存の症状を示していないことが必要である。そのような被験者は、最も喫煙が頻繁な期間中のＦＴＮＤスコアが０であった。喫煙の顕著な履歴を有する対照を選択することによって、ニコチン依存に特異的な遺伝子効果を調べることができる。Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｔｗｉｎ  Ｐａｎｅｌｓからの追加データは、対照の状態のこの認定をサポートするものである（次の実施例および（２３）参照）。米国の研究では、スクリーニングプロセスにおいて喫煙者であると認定された（それまで１００本以上の紙巻きタバコを吸ったことがある）１５０８６の被験者のサンプルを使用し、「ニコチン依存」症（ＦＴＮＤが４以上）の率が４６．４％であり、「ニコチン依存でない喫煙」（ＦＴＮＤ＝０）の率が２０．１％であった。
【０２５７】
候補遺伝子の選択
候補遺伝子の選択基準は、これまでに知られている生物学、ニコチン依存と他の表現型との相関、ならびにニコチン依存および関連する形質の遺伝に関する報告に基づくものであった。ＮＩＤＡ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（インターネット上ｚｏｒｋ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｎｉｄａ）の研究者からなる専門委員会が、ニコチンおよび他の物質依存の研究における専門知識をもって、遺伝子をノミネートした。それらには、ニコチンに応答する古典的な遺伝子（例えば、ニコチン受容体）、および依存症プロセスに関係する他の遺伝子が含まれていた。
【０２５８】
全体で４４８の遺伝子をＳＮＰ遺伝子型判定のため考慮した。それらの遺伝子を２つのカテゴリー「Ａ」および「Ｂ」に分けた。カテゴリー「Ａ」の遺伝子（ニコチン受容体およびドーパミン作動性受容体を含む）は、関連の事前確率がより高いものとして考慮され、遺伝子型判定のターゲットとして確実なものであった。研究計画は約４０００の一塩基多型（ＳＮＰ）を個々に遺伝子型判定することを考慮に入れたため、一旦「Ａ」遺伝子が十分にカバーされると、カテゴリー「Ｂ」遺伝子は、適当なＳＮＰの範囲を受け入れるには多すぎるものであった。そこで、平行して行ったＧＷＡＳ解析（下記および（２３））によるプール遺伝子型判定の結果を用いて、カテゴリー「Ｂ」遺伝子に優先順位をつけた。ニコチン依存との関連について有力な証拠を示す遺伝子を、適用範囲に対し優先した。ある遺伝子は他の遺伝子より大きく、したがって、より多いＳＮＰを受け入れる余地がある。したがって、そのような遺伝子は、行われる検定の数が増えるため、より有意になる可能性がある。したがって、多重検定に対する補正を以下のとおり行った。「Ｂ」リストにある所定の候補遺伝子について、ｐｍｉｎを、遺伝子中の遺伝子型判定されたすべてのＳＮＰに対しＧＷＡＳの段階Ｉのプール遺伝子型判定において得られた最小ｐ値とし、Ｎを検定されたＳＮＰの数とすると、補正最少ｐ値ｐｃｏｒｒは、以下の式を用いて計算される。
【０２５９】
【化４】
2009528063.tif 000015
任意の染色体領域においてＳＮＰの約５０％が、高い連鎖不平衡（ＬＤ）（３７）にあるため、（Ｎ＋１）／２を指数として用いた。これらの補正最小ｐ値によりカテゴリー「Ｂ」遺伝子をランク付け、そして蓄積がなくなるまで、ランク付けされたリストの上位からＳＮＰを選択した。
【０２６０】
ＳＮＰ選択
対立遺伝子頻度にかかわらず、エキソン内のＳＮＰはすべて選択され、また、ヨーロッパ系アメリカ人のマイナー対立遺伝子頻度が４％以上であるアノテーションされた遺伝子プロモーターの±２ｋｂ内にあるＳＮＰもすべて選択された。次いで、候補遺伝子のエキソンにまたがるヨーロッパ系アメリカ人のＬＤビンすべてについてタグＳＮＰを選択し、３以上のＳＮＰを有する各ビンについてＳＮＰは２つであった。これらの基準を満たすＳＮＰは、平行して行われるプール解析（下記および（２３））で個々の遺伝子型判定のため選択されたものからまず選ばれ、そして、他のＳＮＰについて利用可能な余地があるならば、物理的領域をできるだけ均一にカバーするよう、選ばれた。さらに、ニコチン依存と関連があると文献に報告されている特定のＳＮＰを含めた（８、９、１８、３４）。
【０２６１】
プール遺伝子型判定
プール遺伝子型判定の説明については下記およびＢｉｅｒｕｔ（２３）を参照。
【０２６２】
個々の遺伝子型判定
個々の遺伝子型判定について、候補遺伝子から選択されたＳＮＰ、さらに品質管理ＳＮＰを解析するため、特注の高密度オリゴヌクレオチドアレイを設計した。ガラス基板上で合成した２４の２５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブにより、各ＳＮＰを解析した。２４の特徴は、順方向鎖および参照鎖上にあるＳＮＰ参照対立遺伝子およびＳＮＰ代替対立遺伝子の区域を解析する６つの特徴の４組からなる。各対立遺伝子および鎖は、２５ｍｅｒの範囲内にあるＳＮＰの位置を示す５つのオフセット値（−２、−１、０、１、２）によって表され、０は１３番目の塩基にあることを示す。オフセット０で、４組が配列され、それは、参照ＳＮＰ対立遺伝子および代替ＳＮＰ対立遺伝子へのパーフェクトマッチと、ミスマッチプローブである残り２つのヌクレオチドへのパーフェクトマッチを含む。可能な場合、ミスマッチの特徴は、プリンパーフェクトマッチヌクレオチドに対するプリンヌクレオチド置換およびピリミジンパーフェクトマッチヌクレオチドに対するピリミジンヌクレオチド置換として選択された。したがって、各鎖および対立遺伝子の配列は、５つのパーフェクトマッチプローブと１つのミスマッチを含む６つの特徴からなるものであった。
【０２６３】
個々の遺伝子型の精選
ＳＮＰおよび遺伝子型の品質を記載する１５の入力メトリックからコンパイルされた、遺伝子型判定の品質のための教師付き予測アルゴリズムを用いて、個々の遺伝子型を精選した。遺伝子型判定の品質メトリックは、パールジェン（Ｐｅｒｌｅｇｅｎ）プラットホームと外側の遺伝子型判定プラットホーム（すなわち非パールジェンＨａｐＭａｐプロジェクト遺伝子型）との間で不一致コール（不一致呼び出し）を有する確率と相関する。パールジェン遺伝子型とＨａｐＭａｐプロジェクト遺伝子型との間で一致するデータの独立したデータ一式を用いて、１０のブートストラップ集合回帰ツリーからなる系を調整した。次いで、調整した予測因子を用いて、このデータセットにおける遺伝子型のそれぞれについて、遺伝子型判定の品質を予測した（精選に関してさらなる情報は下記を参照）。
【０２６４】
母集団の層別解析
母集団の層別による誤判定を回避するため、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥソフトウェア（３９）を用いて解析を行った。このプログラムは、ゲノムにわたって選択されたマーカーを用いてマルコフ連鎖モンテカルロサンプリング法により、遺伝的に類似する個体の部分母集団を特定する。２８９の高パフォーマンスＳＮＰに対する遺伝子型データを、１９２９のサンプルすべてにわたって解析した。この解析により、母集団の混合を支持する証拠がないことがわかった。
【０２６５】
遺伝子関連解析
種々の表現型の予測力を検定するＡＮＯＶＡ解析は、性別および地域（米国またはオーストラリア）が最もインフォーマティブであったことを示す一方、年齢や他の人口統計的変量は、さらなる有意な形質の相違を説明するものではなかった（表１１）。解析の一次的方法は、ロジスティック回帰に基づいた。ｐを症例となる確率とする場合、線形ロジスティックモデルは、以下の形をとる。
【０２６６】
【化５】
2009528063.tif 000016
式中、αは切片係数であり、ｇは、男または女に対してそれぞれ０または１で符号化される性別であり、ｓは、米国またはオーストラリアに対してそれぞれ０または１で符号化される地域である。変数Ｇは、遺伝子型を表し、リスク対立遺伝子（対照より症例においてより一般的な対立遺伝子として規定される）のコピー数として符号化される。式（２）によれば、遺伝子型に起因するリスクは、加法的スケールではなくｌｏｇ−線形スケール（乗法的スケール）を用いてモデル化されている。オッズ比に対する信頼区間および係数についての最尤推定値を、ＳＡＳソフトウェアパッケージ（４０）を用いて算出した。
【０２６７】
基本モデルの予測因子は性別と地域であった。次いで、基本モデルに遺伝子型および性と遺伝子型との交互作用を加えることにより予測力が有意に増加するかどうか、検定し、そして、得られた自由度２のカイ二乗統計量を用いて、対応するｐ値によりＳＮＰをランク付けした。表１２は、係数についてオッズ比に対する式を示している。
【０２６８】
これらの一次解析の後、上位にランク付けされたＳＮＰを、優性遺伝または劣性遺伝の様式の有意な証拠について、さらに解析する。これは、以下の形のロジスティック回帰を用いて行った。
【０２６９】
【化６−１】
2009528063.tif 000017
式中、Ｈは、ヘテロ接合に対して１であり、それ以外の場合０である。Ｈが有意な場合、遺伝効果はｌｏｇ−線形モデルから有意に外れていると解釈される。次いで、優性および劣性のモデルに対するオッズ比を、表１３に示すとおり算出した。
【０２７０】
連鎖不平衡
コンピュータプログラムＨａｐｌｏｖｉｅｗ（バーション３．２、インターネット上ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍｐｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ）（４１）に組み込まれたとおりのＥＭアルゴリズムを使用し、１Ｍｂウィンドウ内のＳＮＰ対すべてについて、症例および対照別々に、推定ｒ２相関を行った。ＬＤの最終的な尺度は、２つのサンプルからの最小ｒ２である。Ｈｉｎｄｓら（３８）およびＣａｒｌｓｏｎら（４２）のアルゴリズムに従って、ＳＮＰをビン（ｂｉｎ）にグループ化し、ここで、すべてのビンは、ビン中のすべてのＳＮＰとともに「ｍｉｎ（ｒ２）≧０．８を満たすタグＳＮＰ」を少なくとも１つ含んでいる。そのようなＬＤビンからの関連シグナルの群は、実質的に１つのシグナルとしてみることができる。
【０２７１】
多重検定に対する補正
多重検定を説明するため、偽発見率（ＦＤＲ）を見積もり（２４、２５）、記録されたシグナル中の偽陽性の割合を制御した。カテゴリー「Ａ」は、関連の事前確率がより高いものとして考えられたため、Ｒｏｅｄｅｒら（４３）の勧告に従い、カテゴリー「Ａ」遺伝子ＳＮＰを適度の１０倍大きく重み付けした。したがって、カテゴリー「Ｂ」遺伝子は、ＦＤＲフィルタリングされた上位シグナルのリストに含まれるためには、より強い関連シグルを有する必要がある。各ｐ値に対し、重み付けされたｐ値（ｐｗ）は、次式を用いて算出された。
【０２７２】
【化６−２】
2009528063.tif 000018
式中、ｗは、重みの平均が１（これは「Ａ」遺伝子および「Ｂ」遺伝子に対して選択されるＳＮＰの数に依存する）となるよう規定された。すべての重み付けされたｐ値（ｐｗ０）に対し、ｑｗ＜ｑｗ０であるすべてのＳＮＰの中でＦＤＲが高々ｑｗ０程度である特性を有するｑ値（ｑｗ０）を算出した（２５、４４）。これは、コンピュータプログラムＱＶＡＬＵＥ（バージョン１．１、インターネット上ｆａｃｕｌｔｙ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｊｓｔｏｒｅｙ／ｑｖａｌｕｅ）（４５）を用いて行った。ＦＤＲの推定値は、ｑ値に基づいている。
【０２７３】
ＦＤＲを推定するこの方法は、ＬＤを考慮していない。したがって、多重検定について補正し、統計的有意性を評価する手段として、「Ａ」および「Ｂ」遺伝子について重み付けされたｐ値および並べ替えを用いて、ＦＤＲを推定した。これは、ＬＤ構造を保存する。症例−対照の状態を１０００回ランダムに並べ替え、関連について並べ替えたデータを検定することにより、これを行った。ランダムな並べ替え（そこにおいて重みはＦＤＲ推定値の場合と同じである）においてより有意な加重ｐ値が生じる回数を数えることにより、もとのデータからのｐ値の有意性を評価した。
【０２７４】
実施例３についての補足材料
ＤＮＡ調製
ＰｕｒａＧｅｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍを用いるＡｕｔｏＰｕｒｅ  ＬＳ自動ＤＮＡ抽出装置（ＧＥＮＴＲＡ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において、全血およびＥＢＶ形質転換細胞株からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡのイソプロパノール沈澱および１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中の再懸濁によるＷＢＣ溶解段階にＲＮアーゼを加えた。ＤＵ−６４０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）において２６０ｎｍで光学密度（ＯＤ）によりＤＮＡを定量した。ＯＤ２６０／２８０吸光度比は１．８〜２．０であった。ＤＮＡを等分し、遺伝子型判定実験室に配給するまで−８０℃で凍結保存した。
【０２７５】
個々の遺伝子型精選
対照と代替対立遺伝子の特徴のセットの両方について独立して一致を計算し、次いで、２つの値のうち最大をとった。順方向鎖および逆方向鎖の特徴のセット両方に対する各オフセットにおける各対立遺伝子について、最も明白な特徴に注目した。順方向鎖および逆方向鎖にわたるオフセットの全数に対する、パーフェクトマッチの特徴が最も明白な回数の比として、特定の対立遺伝子についての一致を計算した。２４の特徴のＳＮＰタイリングにおいて、各対立遺伝子は、６つの特徴（５つのオフセットと順方向鎖および逆方向鎖に沿って５つのパーフェクトマッチプローブと１つのミスマッチとともに分配される）により表される。すべてのオフセットおよび両鎖に対してパーフェクトマッチの特徴がミスマッチの特徴より明らかであった場合、対立遺伝子Ｘについての回数をＮＸＰＭとすると、以下のとおりである。
【０２７６】
【化７】
2009528063.tif 000019
一致率＜０．９のＳＮＰの特徴のセットを、さらなる評価からはずした。
【０２７７】
下付き文字で表される鎖および所定の対立遺伝子についてのパーフェクトマッチの強度のトリム平均をＩ（商標）とする。算術平均を算出する前に、トリム平均は、２４特徴配列（タイリング）において５つのパーフェクトマッチ強度から最高と最低の強度を無視する。ミスマッチ強度の平均をＩＭとする。各対立遺伝子および鎖についてミスマッチは１つしかないため、トリミングは行わない。次いで、シグナル対バックグランド比（シグナル／バックグランド）を、パーフェクトマッチ特徴強度のトリム平均から算出されたシグナルのサイズと、ミスマッチ特徴強度の平均から算出されたバックグランドのサイズとの比として規定する。シグナルおよびバックグランドは以下のとおり算出される。
【０２７８】
【化８】
2009528063.tif 000020
シグナル／バックグランド＜１．５であるＳＮＰの特徴のセットは、さらなる評価からはずした。飽和する特徴の数は、デジタル化した強度数値について可能な最も高い強度に達する特徴の数として算出した。飽和する特徴の数がゼロでないＳＮＰを、さらなる評価からはずした。
【０２７９】
最終的な検定として、ＳＮＰをハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）について検定した。症例または対照のいずれにおいても、正確なＨＷＥのｐ値が１０−１５未満であるＳＮＰを棄却した。ＨＷＥのｐ値が１０−１５〜１０−４であるＳＮＰは、目視検査し、クラスタリングに問題が認められた場合、棄却した。
【０２８０】
表１４は、表６のＳＮＰについて、性−特異的オッズ比と９５％信頼区間を示している。オッズ比は、式（２）における遺伝子型の項Ｇの係数に基づくものであり、Ｇの単位増加ごとのリスクの増加を表す。すなわち、リスクはｌｏｇ−線形モデルに従う（表１２参照）。
【０２８１】
【表１４】
2009528063.tif 000021
表１５は、ニコチン依存との上位の相関を示すものであり、米国サンプルのみに基づく結果とともに、一次解析による結果を並べて示している。表記法は表６の場合と同じである。
【０２８２】
【表１５】
2009528063.tif 000022
表１６は、米国サンプルのみに基づくニコチン依存との上位の相関を示す。米国サンプルについてのｐ値は、「地域」の項を除いた一次解析について同じロジスティック回帰モデルを用いている。米国サンプルにおいて加重ＦＤＲ（重み付けされたＦＤＲ）が４０％未満である結果のみ示している。ビンに使用したＬＤ推定値は、米国サンプルからのものである。表記法は表６の場合と同じである。
【０２８３】
【表１６−１】
2009528063.tif 000023
【０２８４】
【表１６−２】
2009528063.tif 000024
表９：表６のＳＮＰに対する性−特異的オッズ比および９５％信頼区間。性と遺伝子型との交互作用が有意である（ｐ＜０．０５）ＳＮＰのみを示しており、一次ｐ値が最も有意であるＳＮＰを各ＬＤビンから選んだ。オッズ比は、式（２）における遺伝子型の項Ｇの係数に基づくものであり、Ｇの単位増加ごとのリスクの増加を表す。すなわちリスクは、ｌｏｇ−線形モデルに従う（表１２および１３参照）。
【０２８５】
【表９】
2009528063.tif 000025
表１０：サンプルにおける共変量とＦＴＮＤスコアのまとめ。定義により、すべての対照被験者は、ファガストロームニコチン依存度テスト（ＦＴＮＤ）（３４）のスコアが０であった。
【０２８６】
【表１０】
2009528063.tif 000026
表１１：共変量のＡＮＯＶＡ解析。ロジスティック回帰（症例である確率のモデル化）を、示される共変量について行った。χ２統計値は、−２（ΔｌｏｇＬ）（ここでΔｌｏｇＬはロジスティック回帰における尤度の変化である）から得られるものである。変数「地域」は、２つのレベル（すなわち米国およびオーストラリア）を有する。
【０２８７】
【表１１】
2009528063.tif 000027
表１２および表１３：（１２）一次ロジスティック回帰モデルに使用される性の項ｇと遺伝子型の項Ｇの符号化。対立遺伝子ａは、リスク対立遺伝子（対照より症例においてより一般的な対立遺伝子）である。変数Ｇは、リスク対立遺伝子のコピー数として規定され、ｇは、男性または女性に対してそれぞれ０または１である。最後の欄は、ＡＡ遺伝子型と比較した所定の遺伝子型に対する性−特異的オッズ比についての数式を示す。これは、式（２）におけるロジスティック回帰モデルからの直接の結果である。（１３）二次ロジスティック回帰モデルに使用される符号化。オッズ比は式（３）からの直接の結果である。留意すべきことに、優性モデルに対し、２つのオッズ比は等しく、劣性モデルに対し、ａＡについてのオッズ比は１である。
【０２８８】
【表１２】
2009528063.tif 000028
実施例３の参考文献
【０２８９】
【化９】
2009528063.tif 000029
【０２９０】
【化１０】
2009528063.tif 000030
【０２９１】
【化１１】
2009528063.tif 000031
【０２９２】
【化１２】
2009528063.tif 000032
【０２９３】
【化１３】
2009528063.tif 000033
実施例４：ニコチン依存に影響する新規な遺伝子における変異
タバコの使用は、世界的な障害および死亡の主な原因の１つであり、遺伝因子は、ニコチン依存の発症に一部寄与している。天然の変異がニコチン依存の発症に寄与する新規な遺伝子を特定するため、本発明者らは、ニコチン依存の喫煙者を症例として用い、非依存の喫煙者を対照として用い、包括的ゲノムワイド関連解析を行った。効率的で迅速かつ経済的なゲノムの選別を可能にするため、２段階デザインを用いて解析を行った。第１の段階では、２４０万を越えるＳＮＰの遺伝子型判定を、症例および対照のプールにおいて完了させた。第２の段階において、本発明らは、プールされた結果からの症例と対照との間の最も有意な対立遺伝子頻度差に基づき、個々の遺伝子型判定のためのＳＮＰを選択した。個々の遺伝子型判定は、３１９６０の選択されたＳＮＰを用い、１０５０の症例と８７９の対照において行った。一次解析（年齢、性別、遺伝子型、性と遺伝子型との交互作用の共変量を用いるロジスティック回帰モデル）によって、ｐ値が１０−４未満である（最小ｐ値１．５３×１０−６）３５のＳＮＰを特定した。多重検定について補正した後、個々の知見はいずれも統計的に有意でないが、さらなる統計的解析は、この群に真の発見が存在することを支持している。既知の候補遺伝子（β３コリン作動性ニコチン受容体）を特定するとともに、われわれの解析は、いくつかの新規な遺伝子（例えば、ニューレキシン（Ｎｅｕｒｅｘｉｎ）１（ＮＲＸＮ１））を、ニコチン依存の発症においてノミネートしている。
【０２９４】
タバコの使用は、主に紙巻きタバコを吸うことにより、年間約５００万人の死亡の原因となっており、それは、世界中で最も大きい予防可能な死亡原因となっている。ニコチンは、喫煙持続の原因となるタバコ中の成分である。発展途上国でタバコの使用が増加しているため、世界的な死亡者数は２０２０年までに１年あたり１０００万人超に増加するであろう。
【０２９５】
米国では、２００４年現在、２１％の大人が喫煙者であり、男性の２３％、女性の１９％が喫煙している（２）。毎年、約４４００００人が喫煙に関係する病気で死亡している。喫煙の経済的負担はその分大きい。年間のコストは、直接的な医療費が７５０億ドル、生産性の損失が９２０億ドルと見積もられている。米国において紙巻きタバコの普及は、主に喫煙者の禁煙努力が実ることにより、過去３０年にわたって減っている。しかし、喫煙に対する最新治療の限界を強調した１９９０年代半ばからでも、大人が喫煙をやめていく速度はゆっくりとしている。加えて、紙巻きタバコの使用を始める若者は依然として存在し、先月のレポートでは高校生の２１％が紙巻きタバコを吸っている（４）。
【０２９６】
喫煙の行動（喫煙を始めることを含む）、喫煙の持続性（過去の喫煙に対する現在の喫煙）、およびニコチン依存は、家族で集中的に発生し（５）、また大規模な双子の研究は、この集中的発生が遺伝因子を反映していることを示している（６〜１０）。喫煙およびニコチン依存に関係する可能性がある染色体の領域および特定の遺伝的変異を特定するため、これまでの手法は、遺伝的連鎖解析（１１〜１４）および候補遺伝子検定（１５〜１７）を利用してきた。本発明者らは、タバコの喫煙からニコチン依存の発症に至る遷移に寄与する一般的な遺伝的変異を特定するため、血縁でない個人の症例−対照デザインを用いる高密度全ゲノム関連解析を行うことにより、遺伝因子の調査を拡大している。
【０２９７】
実施例４の結果
１０５０のニコチン依存症例と８７９の喫煙する非依存性の対照とからなる最終的なサンプルを、集団層化のため調べ、混合の証拠は認められなかった。品質管理尺度を、個々に遺伝子型判定されるＳＮＰに適用し、３１９６０のＳＮＰが解析のため利用可能であった。
【０２９８】
最も有意な知見を、ｐ値が１０−４未満であるＳＮＰについて表１７に示す。これまでニコチン依存の発症に関係していなかったいくつかの遺伝子を挙げ、その関連機構の仮説を以下に述べる。最も有意な結果は、ｒｓ２８３６８２３（ｐ値＝１．５３×１０−６）で見られた。このＳＮＰは、上位の知見のいくつかと同様、遺伝子間のものである。物理的に遺伝子中にないＳＮＰ、あるいは、既知の転写領域の１０ｋｂ以内にないＳＮＰを、「遺伝子間」のものとした。個々の遺伝子型判定の結果の概要については図１６を参照されたい。図１６では、ゲノムワイド関連のＰ値により、ニコチン依存発症のリスクに影響する遺伝子を細かく調べている。染色体の順に、各ＳＮＰに対して−ｌｏｇ１０（ｐ）がプロットされている。プロット上、ＳＮＰ間の間隔は、物理的な地図上の長さに基づく。横線は、ロジスティック解析に対するＰ値を示している。縦線は染色体の境界を示している。黒四角は、非同義的アミノ酸変化をもたらすＳＮＰを表している。
【０２９９】
本発明者らの研究が密度の高いゲノムワイドな範囲であったため、それらのｐ値の解釈は、多数の統計的検定により複雑になった。約２４０万のＳＮＰが、プールスクリーニング段階で調べられた。ほぼ２０００の被験者を含む大きなサンプルであったが、多重検定に対するボンフェロニ補正の後、ゲノムワイドで有意なｐ値を示すＳＮＰはなかった。しかし、いくつかの独立した系統の証拠により、この上位群のＳＮＰにおいて真の遺伝的関連が認められることが支持された。
【０３００】
本発明者らは、データセット内で真の関連性を示す証拠の尺度として、段階Ｉサンプルにおける上位ＳＮＰ（プール遺伝子型判定に含まれるものでＮ＝９４８）の影響の方向が、段階ＩＩ（Ｎ＝９８１）で付加されたサンプルに対して同じであることを用いた。もしデータにおいて真の関連がなければ、これら２つの組のサンプル間で、影響の方向はランダムな組み合せとなると予想される。しかし、段階Ｉのサンプルにおける上位３５のＳＮＰのうち３０が、さらなる段階ＩＩの組のサンプルにおいて同じ方向の影響を示している。この一致のレベルは、非常に有意であり、偶然一致の仮説を否定することに関し誤判別率を示す二項分布からのｐ値は１．１×１０−５であった。したがって、本発明者らによる上位のＳＮＰは、症例と対照との間の対立遺伝子頻度差の客観性および再現性が高いものである。
【０３０１】
同時に行った候補遺伝子の研究による結果の比較から、真の関連性の存在についてさらなる証拠が得られた（上記およびＳａｃｃｏｎｅ  １８）。β３ニコチン受容体候補遺伝子であるＣＨＲＮＢ３（候補遺伝子の研究において最も有意な知見）も、ゲノムワイド関連解析において特定されたＳＮＰにより識別された。この遺伝子は、ニコチン依存との関連について高い事前確率を有しており、また、ゲノムワイド関連解析において上位に位置する群のＳＮＰから選ばれている上記実施例の候補遺伝子の尤度はいずれも５％未満である。
【０３０２】
症例と対照との間の対立遺伝子頻度差のプール遺伝子型判定による推定値が正確かどうか調べるため、本発明者らは、プール遺伝子型判定の結果と個々の遺伝子型判定の結果との関係を調べた。実際、プール遺伝子型判定により、プール解析に含まれる症例と対照との間の対立遺伝子頻度差がかなり大きいＳＮＰの組が多く選択された。段階Ｉのサンプルのみを使用して個々の遺伝子型からｐ値を算出した場合、小さなｐ値が非常に多かった（図１７ａ参照）。プール遺伝子型判定が全くうまくいかない場合、ｐ値の分布は均一になるはずであり、また、プールが完全に的確である場合、このサンプルサブセットで評価される個々の遺伝子型判定段階において、小さなｐ値のみが存在するはずである。図１７ａに示されるとおり、本発明者らの結果は、これらの極端な状態の間に位置している。また本発明者らは、段階ＩＩに付加されたプール段階にはなかったサンプルのｐ値を調べた。これらの段階ＩＩのサンプルは、症例および対照の集合からの独立したランダムなサンプルであるため、段階Ｉのサンプルと同じ対立遺伝子頻度差を示さないと予測され、そこにおいて、そのような差はサンプリング誤差によるものである。したがって、それらのｐ値は、実際の可能な関連を除いて、均一に分布するはずであり、それは、２つのセットのサンプル間で一貫しているはずである。このことは、図１７ｂに示されている。そのグラフは、かなり均一であり、小さなｐ値がわずかに増加しているだけである。図１７において、パネルＡは、プール遺伝子型判定の段階から選ばれた３１９６０の個々に遺伝子型判定されるＳＮＰからなる段階Ｉサンプルによるｐ値の分布を示している。その分布は、プール遺伝子型判定が、ｐ値の小さいＳＮＰを多くもたらしたことを示している。もし、プール遺伝子型判定と個々の遺伝子型判定との間に相関がなかったら、０〜１で均一な分布が予想される。図１７のパネルＢは、段階ＩＩで付加されたさらなるサンプルからのｐ値の分布を示している。この分布は、かなり均一であり、小さなｐ値がわずかに多いだけである。
【０３０３】
さらに、本発明者らは、プール遺伝子型判定に基づく対立遺伝子頻度の推定値と、個々の遺伝子型判定に基づく対立遺伝子頻度の推定値とを直接比較した。図１８に示すとおり、プール遺伝子型判定および個々の遺伝子型判定の結果による対立遺伝子頻度の推定値の大多数は、対角線に沿っている。症例または対照のサンプルを別々に検査する場合、類似の知見が得られる。本発明者らは、症例のプール遺伝子型判定から推定される対立遺伝子頻度と、段階Ｉによる症例（症例の被験者Ｎ＝４８２）の個々の遺伝子型判定サンプルで算出された対立遺伝子頻度との間で、８７％の相関を算出した。同様に、段階Ｉ（対照の被験者Ｎ＝４６６）からの対照サンプルにおける個々の遺伝子型判定とプール遺伝子型判定の比較において、対立遺伝子頻度の８４％の相関が見られた。本発明者らは、プール（これは、ＳＮＰが個々の遺伝子型判定のため選ばれていたので、無条件に大きい）における症例と対照との間の対立遺伝子頻度差と、個々の遺伝子型判定における症例と対照との間の差を比較した場合に、５８％の相関を認めた。このことは、プール遺伝子型判定の結果と個々の遺伝子型判定の結果との間に高いレベルの一致があることを示している。したがって、個々に遺伝子型判定される症例と対照の被験者において対立遺伝子頻度の差を示すＳＮＰを特定するのに、プール遺伝子型判定はうまくいくものであった。図１８は、段階Ｉのサンプルによるプール遺伝子型判定および個々の遺伝子型判定から得られる対立遺伝子頻度の散布図を示している。
【０３０４】
最後に、本発明者らは、米国とオーストラリアのサンプル間で差があるかどうか調べた。これら２つの母集団による症例と対照との比較は、性別または階層化の結果による有意差を示さなかった。
【０３０５】
実施例４の考察
喫煙は、大きな割合で国民の罹患や死亡の原因となっており、また双子の研究により、ニコチン依存の発症リスクに遺伝因子が実質的に寄与することについて強い証拠が得られている。本研究は、最初の高密度でゲノムワイドな関連解析であり、ニコチン依存に対する一般的な感受性または耐性の遺伝子変異を特定することを目的としている。
【０３０６】
本研究において、いくつかの新たな遺伝子（例えば、ニューレキシン（Ｎｅｕｒｅｘｉｎ）１（ＮＲＸＮ１））を、ニコチン依存発症の潜在的な寄与因子として特定した。ＮＲＸＮ１には少なくとも２つのシグナルがあった。表１８を参照。ＳＮＰのｒｓ１０４９０１６２は、当該遺伝子において遺伝子型判定された他の２つのＳＮＰと弱い相関関係にある（最大ペアワイズ相関は、他の２つのＳＮＰ（これらは互いに強い不平衡にあることが分かった）に対してｒ２＝０．４５である）。興味深いことに、もう１つのニューレキシン遺伝子であるニューレキシン３（ＮＲＸＮ３）は、Ｕｈｌと共同研究者（１９）によるプールゲノムワイド関連解析において、各種薬物の依存症に対する感受性遺伝子として報告されている。さらに、本発明者らの研究において、ＮＲＸＮ３の最も有意なＳＮＰであるｒｓ２２２１２９９は、０．００３４のｐ値を有していた。本発明者らの研究ではＮＲＸＮ３との関連性について実質的にほとんど証拠がなかったが、物質依存について別々に行われた２つの研究がニューレキシン遺伝子との関連について証拠を見出していることは、今後の研究に値する。
【０３０７】
ニューレキシン遺伝子ファミリーは、ニューロンで主に発現され、細胞間交互作用において機能し、正常な神経伝達物質の放出に必要な多型性の細胞表面タンパク質の群である（２０）。ニューレキシンは、ＧＡＢＡ作動性でグルタミン酸作動性のシナプス発生に重要な因子であり、ＧＡＢＡ作動性のシナプス後分化を誘導することが報告されている唯一の既知の因子である。ＮＲＸＮ１およびＮＲＸＮ３は、既知の最も大きなヒト遺伝子の中にあり、それらは、少なくとも２つのプロモーターと、選択的にスプライスされるエキソンを用いて、数千の異なるｍＲＮＡ転写物とタンパク質イソ体を生成させる。ＧＡＢＡ作動性でグルタミン酸作動性のニューロンによるニューレキシンイソ体の特異な発現が、シナプス後特殊化の局所的誘発に寄与しているという仮説が立てられている。薬物依存は、興奮性神経伝達と抑制性神経伝達の相対的な不均衡としてモデル化される（または「脱抑制」に関係する）ため（１）、ニューレキシン遺伝子は、興奮性経路や抑制性経路の間で制御される選択を介した依存の神経生物学に寄与するこれまでになかった有望な候補遺伝子である。これらの遺伝子の生物学的特徴を明らかにすれば、神経発達の役割や神経伝達物質放出および依存の役割が明らかになる可能性がある。
【０３０８】
また本研究は、液胞選別タンパク質ＶＰＳ１３Ａを、ニコチン依存の潜在的な寄与因子として特定した。興味深いことに、喫煙いて別々に行われた３つの遺伝子連鎖解析（１１〜１３）が、この遺伝子に近い染色体９の領域を特定している。この遺伝子は、細胞膜を介するタンパク質の循環を調節するようであり、多数の代替転写物が存在する。ＶＰＳ１３Ａ遺伝子における変異は、進行性の神経変性および有棘赤血球増加症を引き起こす（２２）。今後の研究に値するもう１つの新たな遺伝子は、多量体カルシウムチャネルのサブユニットをコードするＴＲＰＣ７（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ（一過性受容体電位依存性））チャネルである（２３）。動物モデルを利用した最近の研究は、ＴＲＰＣチャネルが運動回路においてニコチンにより誘導される神経細胞活性を機能的に調節できることを示している（２４）。
【０３０９】
その他に上位のＳＮＰによって識別される遺伝子がいくつか存在する。αカテニン遺伝子ＣＴＮＮＡ３は、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害し、またアルツハイマー病群において血漿アミロイドβタンパク質（Ａβ４２）のレベルに影響を及ぼす変異を有する（２５）。しかし、他の報告は、アルツハイマー病との関連性を見出していない（２６）。ＣＬＣＡ１遺伝子は、喘息（２７）および慢性の閉塞性肺疾患（２８）の病因に寄与し得るカルシウム活性化クロライドチャネルをコードする。これらの遺伝子はいずれも、ニコチンの代謝や作用機構との関連が知られていないが、それらは、脳や肺の機能に関与しており、したがって、喫煙行動と依存に対し、生物学的関連性を有するものとして有望である。
【０３１０】
ゲノムワイド関連解析に係るこれらの新たな遺伝子に加え、古典的な候補遺伝子であるβ３ニコチン受容体（ＣＨＲＮＢ３）が上位群に入っている。ニコチン受容体は、シナプスにおいて速いシグナル伝達を媒介するリガンド作動性イオンチャネルのファミリーである。ニコチンは、生理反応を生じさせるこれらの受容体のアゴニスト（作動薬）である。
【０３１１】
一次解析モデルの一部として、異なる性の作用についてＳＮＰを検定した。上位ＳＮＰのいくつかは、男性と女性に対して有意に異なるオッズ比を有していた（表１７）。疫学的データから、依存の発症に対するリスクが性によって有意に異なることが明らかであり、そして、本研究は、別々の遺伝子が、男性と女性において、ニコチン依存の発症に寄与し得ることを示す証拠をもたらしている。一次解析の後、本発明者らは、上位にランクされるＳＮＰをさらに解析して、他の様式の伝達（例えば、劣性または優性のモデル）について証拠があるかどうか調べた。上位群にあるＳＮＰのいずれに対しても、これらのモデルのいずれかについて当てはめの向上を示すものはなかった。
【０３１２】
これら上位の関連ＳＮＰに対する最大作用サイズは、２．５３のオッズ比である。それらの推定値は、多くの多重比較の「ジャックポット作用」のため、真の母集団の値の過大評価である可能性が高い。それらの推定値を補正するため、いくつかの代替的手法が存在するが、それらのデータに対して適用はしていない。作用サイズの推定値は、依存の発症に寄与している適度な作用の同義遺伝子と整合している。
【０３１３】
本ゲノムワイド関連解析は、ニコチン依存の大規模遺伝子調査の第１段階である。本発明者らの解析プランは、最もはっきりと結果を解釈できるよう、先験的に決定された。本発明者らは、分割サンプルの計画を用いるよりむしろ、一次解析として全サンプルを試験するよう意図的に選択を行った。というのも、本発明者らは、真の知見を得るのにそれが最も大きな能力を有すると考えたからである（２９）。
【０３１４】
それらのデータの検査において、他のいくつかの事項を必要に応じて検討してもよい。例えば、喫煙およびニコチンの依存は、他の多くの障害（例えば、アルコール依存および主な抑うつ性障害）と相関する（３０〜３３）。本発明者らのサンプルの予備的解析により、他の疾患のニコチン依存とのそのようなクラスタリングが、本発明者らのサンプルに存在することが確かめられた。さらに、ニコチン依存は、他の尺度（例えば、ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）にあるｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ基準（３４））により規定することができる。以前の研究が示すところによれば、ニコチン依存の異なる尺度同士には相関関係があるが、完全に一致するものではない。というのも、ＦＴＮＤの定義とＤＳＭ−ＩＶの定義は、依存の異なる特徴に着目しているからである（３５）。ＦＴＮＤは、生理的依存に着目する尺度である一方、ＤＳＭ−ＩＶ依存は、依存の認識および行動の局面を含むものである。本発明者らのサンプルにおいて、ＦＴＮＤとＤＳＭ−ＩＶのニコチン依存による分類は異なることが認められ、本発明者らによる症例（ＦＴＮＤ≧４）の７５％がＤＳＭ−ＩＶニコチン依存であり、本発明者らによる対照（ＦＴＮＤ＝０）の２４％がＤＳＭ−ＩＶニコチン依存である。また意図するところによれば、関連性についてのこれらの知見に寄与する個々の特徴のいくつかを明らかにするため、共存する疾患およびニコチン依存の異なる定義を検討することができる。
【０３１５】
要約すると、タバコの使用、特に紙巻きタバコの喫煙を減らすため新たな手法を開発できるよう、ニコチン依存を解明する努力は重要である。ここに記載する系統的なゲノムの調査により、喫煙からニコチン依存に移行する個人のリスクを増加させる新たな遺伝子（例えば、ＮＲＸＮ１）が候補として特定される。それらの遺伝子の遺伝的特徴および生物学的特徴を明らかにすることは、ニコチン依存を裏付ける因果関係の解明に役立ち、また、禁煙のための新たな薬剤開発目標をもたらし得る。またそれらの変異は、概して、常習行為に関係する場合もある。ニコチン依存に対する現在の薬理学的治療は、ごく限られた禁煙の成功をもたらすだけであり、個人の遺伝的背景に合わせて（例えば、本発明により）禁煙を促進する薬剤を作れば、治療効果を顕著に高めることができる。本発明者らの研究は、遺伝的変異の大規模解析を通じて、薬物療法の実施に際し、個人専用の手法を必要に応じて容易にし得る。これから新たなターゲットを研究することができ、そして、それは、この大きな健康への妨げを軽減しかつ喫煙が関係する死亡を減らす改善された治療の選択肢の開発を容易にするのに有望である。
【０３１６】
実施例４の材料と方法
本研究の目的は、喫煙からニコチン依存の発症への進行に寄与している遺伝子を識別することであった。結果として、研究によって、ニコチン依存被験者と、喫煙するが、ニコチン依存を発症させたことがない個体間の表現型対比を試験した。
【０３１７】
被験者
すべての被験者（１０５０の症例および８７９の対照）を、進行中の２つの研究から選択した。Ｔｈｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ、米国系サンプル（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＤｅｔｒｏｉｔおよびＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、およびＮｉｃｏｔｉｎｅ  Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの研究、オーストラリア系、ヨーロッパ系サンプル。米国サンプルを、症例（現在ＦＴＮＤ＞４）または対照の状態としての採用のための有資格を決定するために、コミュニティに基づく被験者の電話スクリーニングにより、採用した。資格取得被験者に、遺伝的研究に参加するように招待した。オーストラリア参加者を、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｔｗｉｎ  Ｐａｎｅｌの家族および配偶者として、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにおいて登録した。
【０３１８】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより両研究は承認され、すべての被験者から参加についてインフォームド・コンセントを得た。血液サンプルを、各被験者からＤＮＡ分析のため採取し、電子表現型データとともに、ＮＩＤＡ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ（ここは、ＮＩＨガイドラインに従って、研究データの共用を管理している）に提出した。すべての被験者は、ヨーロッパ系子孫であると自己を同定した。さらなる人口学詳細に関して、表１９を参照されたい。
【０３１９】
表現型データ
同等の評価を、両サイトで実施した。ファガストロームニコチン依存度テスト（３６）およびＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−ＩＶ（３４）のような種々の異なる基準を用いて、包括的にニコチン依存を評価した、個人インタビューを適用した。
ニコチン依存の症例の定義
本実施例の焦点は、ニコチン依存の遺伝的関係研究のための、非関連個体の症例−対照設計であった。症例を、ニコチン依存の一般に利用される定義、もっとも喫煙をする場合、４またはそれ以上（最大スコア１０）のファガストロームニコチン依存度テスト（ＦＴＮＤ）スコアによって定義した（３６）。米国およびオーストラリアのサンプル間のＦＴＮＤスコアにおいて、優位な差は観察されなかった（平均ＦＴＮＤ：米国の症例６．４３およびオーストラリアの症例６．０６）。
【０３２０】
対照の定義
対照被験者の状態を、（それまで１００本以上の紙巻きタバコを喫煙することによって定義される）喫煙し、まだニコチン依存ではないない（人生ＦＴＮＤ＝０）個体として定義した。歴史的に、１００本以上の紙巻きタバコの喫煙の閾値が、「喫煙者」の定義として、調査研究で利用されてきている。喫煙した対照の選択において、本研究は、ニコチン依存の発症への喫煙からの推移に関連した遺伝的効果に焦点を合わせた。オーストラリア双子登録名簿からのさらなるデータが、対照状態の本指定を支持している。喫煙した一卵性双子間で、Ｈｅａｖｙ  Ｓｍｏｋｉｎｇ  Ｉｎｄｅｘ（ＨＳＩ−ＦＴＮＤの省略バージョン）（３７）を用いて、４以上のスコアとして定義される、ニコチン依存の率が、双生児がＨＩＳスコア０である場合、もっとも低く、タバコの経験があるが、喫煙者になっていない双生児、または１本の紙巻きタバコすら吸ったことのない双生児の場合よりも低い（表２０参照）。
ＤＮＡ調製
ＤＮＡを全血およびＥＢＶ形質転換細胞株から抽出し、分液して、遺伝子型判定実験室に配給するまで−８０℃で凍結保存した。
研究設計
２４０万以上のＳＮＰの効果的で、迅速かつ費用効率の高いスクリーニングを可能にするために、本発明者らは、二段階設計を用いて、全ゲノム関係研究を実施した。
【０３２１】
段階Ｉ−プール遺伝子型判定高密度オリゴヌクレオチド遺伝子型判定アレイ
段階Ｉにおいて、ヨーロッパ子孫の米国およびオーストラリア被験者からの４８２の症例および４６６の対照のＤＮＡサンプルを研究のために選択した。可能性のある母集団の層を試験するために、本発明者らは、２９５の個々の遺伝子型が決定されたＳＮＰを用いて、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ解析（３８）を実施した。選択されたＳＮＰは、おおよそ均一に常染色体にわたって間隔があいており、層別解析のために選択した（３９）。ＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラムが、ゲノムにわたって選択されたマーカーを用いる、マルコフ連鎖モンテカルトサンプリング法により、遺伝的に類似する個体の部分母集団を特定する。集団の混合の証拠はなかった。症例および対照をついで、２４０万の遺伝子型判定のために、プール中に配置し、症例および対照プール間の対立遺伝子頻度の差の推定を決定した。
【０３２２】
プール遺伝子型判定を、８つの症例と８つの対照プールを用いて実施した。ＤＮＡを、Ｐｉｖｏ  Ｇｒｅｅｎを用いて定量した。濃度を標準化し、＜１０％の変動係数内で検証した。およそ６０の個体からの等モル量のＤＮＡを、１６プールのそれぞれ内に配置した。個々のサンプルは、１つのプール内にのみ含まれた。１６のプールを、４９チップ設計にハイブリダイズさせて、全ゲノムにわたって、２４２７３５４のＳＮＰの問い合わせを行った。
プール対立遺伝子頻度推定の決定：
対立遺伝子頻度を、高密度オリゴヌクレオチドアレイから採取した強度を用いて概算した。ＳＮＰの対立遺伝子頻度ｐは、ＤＮＡの総数に対する、参照対立遺伝子をもつＤＮＡの相対量の比であり、０〜１間の値を持ちうる。
【０３２３】
【化１４】
2009528063.tif 000034
式中、ＣＲｅｆおよびＣＡｌｔは、それぞれ参照対立遺伝子と代理対立遺伝子の濃度である。プローブ強度は、ＳＮＰ対立遺伝子の濃度に直接比例し、参照および代理特徴の強度から算出されたｐは、真の対立遺伝子頻度ｐの良好な近似値であった。ｐ値を、ミスマッチ特徴強度のトリム平均から算出されたバックグラウンドの測定を差し引いた後に、パーフェクトマッチ特徴のトリム平均強度から算出した。
【０３２４】
【化１５】
2009528063.tif 000035
式中
【０３２５】
【化１６】
2009528063.tif 000036
ＩＴＭは、下付き文字で表される該対立遺伝子および鎖に対する、パーフェクトマッチまたはミスマッチ強度のトリム平均であった。トリム平均は、５つのパーフェクトマッチ強度から、また計算平均を算出する前の、４０−特徴タイリングにおける５ミスマッチ強度からの、最高および最低の強度を区別した。
【０３２６】
３つの品質制御評価指標を、アレイスキャンにおけるＳＮＰに対する強度の信頼性を評価するために開発した。第一評価指標、一致は、ＳＮＰに対する標的の存在を評価した。第二評価指数、対バックグラウンドシグナル比は、特異的および非特異的結合の量に関連し、パーフェクトマッチおよびミスマッチ特徴の強度から推定された。第三評価指数は、飽和した強度を有する各ＳＮＰティリンクにおける、特徴の数をトラックした。カットオフをすべての３つの評価指標に適用し、通過しなかったＳＮＰ特徴セットを、さらなる評価から棄却した。
【０３２７】
一致は、参照および代理対立遺伝子特徴セット両方に関して独立して算出し、ついで最大値を２つの値からとった。フォワードおよびリバース鎖特徴セット両方に対する各オフセットにおける各対立遺伝子に関して、もっとも明るい特徴の強度を記述した。特定の対立遺伝子に対する一致を、パーフェクトマッチ特徴がもっとも明るかった時間数の、フォワードおよびリバース鎖にわたる、オフセットの総数に対する比として算出した。４０特徴ＳＮＰティリングにおいて、各対立遺伝子を、２０特徴で表し、５オフセットおよびフォワードおよびリバース鎖にそって区別した。ＮｘＰＭが、パーフェクトマッチ特徴が、すべてのオフセットおよび両方の鎖にわたって、ミスマッチ特徴よりも明るかった場合の、対立遺伝子Ｘに対する時間数である場合、
【０３２８】
【化１７】
2009528063.tif 000037
＜０．９の一致を有するＳＮＰ特徴セットを、さらなる評価から棄却した。
【０３２９】
バックグラウンドに対するシグナル比は、パーフェクトマッチ特徴強度のトリム平均値から算出した、シグナルの振幅と、ミスマッチ特徴強度のトリム平均値から算出した、バックグラウンドの振幅間の比であった。シグナルおよびバックグラウンドを、以下のように算出した。
【０３３０】
【化１８】
2009528063.tif 000038
パーフェクトマッチおよびミスマッチョ特徴セット両方に関するトリム平均値強度ＩＴＭを上述したように得た。シグナル／バックグラウンド＜１．５を有するＳＮＰ特徴の組をさらなる評価から棄却した。
【０３３１】
飽和特徴の数を、デジタル化数的強度値に関して可能性のあるもっとも高い強度に達した特徴の数として算出した。＞０の飽和特徴の数を有するＳＮＰを、さらなる評価から棄却した。
【０３３２】
段階ＩＩ  ＳＮＰ選別：
各ＳＮＰの関係を独立して評価するための、経験的ｐ値の計算
修正ｔ検定Ｐ値を、通常ｔ検定Ｐ値に対して同様に算出した。平均症例ｐと平均対照ｐ間の差の試験のために、標準偏差を、チップ設計特異的相加定数によって修正した。相加定数を、各チップ設計に対するｔ検定の変数の係数を最小化することによって得た。低または高偏差を有するＳＮＰが、表現型とより多くまたはより少なく関連する可能性があるという先の証拠が存在しなかったので、この標準偏差相加定数によって、ＳＮＰ選別が、低および高標準偏差にバイアスがかかっていないなかったことが保証された。経験的Ｐ値を、チップ設計上の通過しているＳＮＰの総数において、ランクを割ることによって、各チップ設計に対する修正ｔ検定Ｐ値のランクから算出した。標準偏差の分布に関して、図１９を参照されたい。
【０３３３】
ＳＮＰ選別基準
ＳＮＰを、症例および対照に関する少なくとも２つの通過しているｐ値を持ったＳＮＰから選択した。選択され得たＳＮＰを、ヒトゲノム体型３５上にマッピングし、首尾よく設計されたアッセイを持った。０．０１９６の経験的Ｐ値カットオフをＳＮＰを選別するために利用した。
【０３３４】
段階ＩＩ  個々の遺伝子型判定
個々の遺伝子型判定のために、本発明者らは、プール遺伝子型判定（３９２１３）から選択したＳＮＰと、成層および品質制御ＳＮＰ（２１８９）を含む、４１４０２のＳＮＰの問い合わせを行うために、カスタムアレイを設定した。段階ＩＩにおいて、本発明者らは、１９２９個体（１０５０の症例およびの８７９対照）の最終サンプルサイズに関して、ヨーロッパ子孫の本来の症例および対照サンプル、および追加症例および対照被験者における個体遺伝子型判定を実施した。
【０３３５】
個体遺伝子型を、参照および代理パーフェクトマッチトリム平均強度によって定義された２次元空間中、すべてのＳＮＰスキャンをクラスター化することによって決定した。トリム平均強度を、「プール対立遺伝子頻度推定の決定」の項目中上述したように算出した。遺伝子型クラスタリング手順は、Ｋ平均値と限定多重線形回帰の組み合せとして開発された、繰り返しアルゴリズムであった。各段階におけるＫ平均値が、異なる二倍体遺伝子型を表しているクラスターメンバーシップを再評価した。多重線形回帰が、各クラスター内のｐにおける偏差を最小化し、一方で、回帰直線の共通交差を最適化した。共通交差は、Ｋ−平均値の次の段階に関して、対立遺伝子頻度を適合するために利用した共通バックグラウンドの測定を定義した。Ｋ−平均値および多重線形回帰段階を、クラスターメンバーシップとバックグラウンド推定が変換されるまで、繰り返し適用した。クラスターのもっともよい数を、（３つの可能性のある二倍体遺伝子型の組み合せを示している）１、２および３の可能性のあるクラスター数にわたる、総見込みを最大化することによって選択した。総見込みは、データ見込みとモデル見込みからなった。データ見込みは、クラスター平均値周辺のｐの分布に関する、正常の混合モデルを用いて決定した。モデル見込みは、ホモ接合子参照クラスターに対して、０．８、ヘテロ接合子に対して０．５、ホモ接合子代理クラスターに対して０．２の最適ｐ位置となる、予想されるクラスター位置の前分布を用いて計算した。
【０３３６】
遺伝子型判定品質評価指標を、ＳＮＰと遺伝子型の品質を記述した１５の入力評価指標から、各遺伝子型に対してコンパイルした。遺伝子型判定品質評価指標は、Ｐｅｒｌｅｇｅｎプラットフォームと、外側遺伝子型判定プラットフォーム（すなわち非−Ｐｅｒｌｅｇｅｎ  ＨａｐＭａｐプロジェクト遺伝子型）間の不一致細胞を有する可能性と比例した。１０ブートストラップ凝集回帰ツリーを、Ｐｅｒｌｅｇｅｎ遺伝子型とＨａｐＭａｐプロジェクト遺伝子型間の独立した一致のデータのデータ組を用いて養成した。養成予測をついで、本データ組における各遺伝子型に対する遺伝子型判定品質を予測するために利用した。
【０３３７】
図１９は、異なる基準を用いて選択されたＳＮＰの標準偏差の分布のプロットを示している。プロットは、データｐカットオフが、データｐの高い標準偏差を有するＳＮＰを好ましく選択し、通常ｔ検定が好ましく低い標準偏差を有するＳＮＰを選択し、修正ｔ検定が、すべてのＳＮＰからの標準偏差分布上中心であることを例示している。
ハーディー・ワインバーグ平衡
ハーディー・ワインバーグ平衡（ＨＷＥ）を、症例および対照に関して別々に試験した。症例および対照いずれかにおいて、＜１０−１５のｐ値のレベルで、ＨＷＥに従わないＳＮＰを棄却した。それぞれ症例および対照における、この極端な不均衡の結果排除された８５９および７９７の常染色体ＳＮＰが存在し、これらのＳＮＰの７６５個が、両方の群に共通した。ＨＷＥからのこのレベルの偏差によって、ＳＮＰ遺伝子型判定およびクラスタリングにともなう問題が示唆される。表現型との関連が結果として、ＨＷＥ内ではないＳＮＰとなるので、１０−４〜１０−５の間のＨＷＥ  ｐ値を有するＳＮＰを視覚的に検査し、クラスタリングに関して問題が検出された場合、ＳＮＰをさらなる解析から棄却した。これによって、解析のために３１９６０のＳＮＰが利用可能となった。
【０３３８】
母集団層別
より長いサンプル中の暗号母集団層別による擬陽性結果を避けるために、本発明者らは、２８９のよく実施されているＳＮＰ（３９）に対する遺伝子型データを用いて、１９２９の被験者（３８）の拡張サンプル中で、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ解析を繰り返した。これによって再び、母集団混合の証拠は明らかにならなかった。さらに、段階ＩＩのみのサンプル中の、試験統計値の非膨張Ｑ−Ｑプロットによって、症例被験者の状態と相関した母集団混合の欠如が示されている（図２０）。図２０は、サンプルから産出されたロジスティック回帰ＡＮＯＶＡのＱ−Ｑプロットが、段階ＩＩにおいて、ステージＩサンプルに加えられたことを示している。これらのサンプルが、プール遺伝子型判定から、ＳＮＰ選別のために利用された、ステージＩサンプルの独立であるので、試験統計は、ゼロ分布に広くしたがうことが予想される（２程度の自由を有するカイ二乗分布）。サンプルの組み合わせた組、および本研究にて見られた小さな効果サイズと比較して、本試験のより低いパワーによって、任意の可能性のある結合が、低ｐ値において一緒にクラスター形成することが予想される、それによって、このＱ−Ｑプロットの直線形態が変化する。点線は、予想されるゼロ分布の、９５％点ワイズ確かさを表している。
【０３３９】
共変量解析
個体に関して利用可能な共変量は、性別、年齢、場所（米国またはオーストラリア）およびサンプル（第一または第二）であった。遺伝的解析を実施する前に、データの検証によって、性別および募集場所の共変量が、症例および対照の状態の重要な予測子であり、ロジスティック回帰モデルにおける共変量として利用したことを示唆した。
【０３４０】
遺伝的関係
本発明者らは、本発明者らの結果を解釈し、種々の解析モデルを用いることから、多数の試験の問題を避けるように、演繹的解析戦略を開発した。本発明者らは、真の発見を検出するためにもっとも大きなパワーを持ったことから、第一解析において、総サンプル１９２９の個体を試験することを選択した（２９）。本発明者らの第一単一ＳＮＰ関連解析のために、本発明者らは、明らかな共変量、性別および場所（米国またはオーストラリア）を組み込むためにロジスティック回帰を利用し、２程度の自由度の、標準の尤度比カイ二乗統計を用いて、遺伝子型／性別交互作用タームとともに、遺伝子型の効果を試験した。このアプローチによって、本発明者らは、性別特異的効果を持っているＳＮＰ、ならびにオスおよびメスにおいて、同様の効果を有するＳＮＰを検出可能であった。これらの第一解析のために、本発明者らは、リスク対立遺伝子が、対照での場合より、症例においてより高い頻度を有する対立遺伝子であると定義される、「リスク」対立遺伝子の数（０、１または２）にしたがって、遺伝子型をコードした。このコーディングは、ログスケール上で追加的であり、したがって乗法遺伝モデルに相当した。全モデルを、性別および募集場所のみを含む縮小モデルと比較し、優位さを、２程度の自由度でのカイ二乗検定によって評価した。得られたｐ値を、ＳＮＰをランク付けするために使用した。
【０３４１】
これらの第一解析に続いて、本発明者らは、トップにランクされたＳＮＰを解析して、優性または劣性モデルのような、送信の他のモデルに対して有意な証拠が存在したかどうかを決定した。
【０３４２】
表１７  １次モデルｐ値  ＜０．０００１を有するＳＮＰ。列挙された遺伝子は、ＳＮＰ位置の１０ｋｂ以内である。
【０３４３】
【表１７】
2009528063.tif 000039
表１７についての説明：
＊オスおよびメスに対して、有意に異なるオッズ比
ａ０．８９のｒ２相関を有する２染色体１０  ＳＮＰ
ｂ＞０．８５の最小ペアワイズｒ２相関を有する９染色体１４  ＳＮＰ
ｃ＞０．８５の最小ペアワイズｒ２相関を有する４染色体９  ＳＮＰ
ｄ０．９９のｒ２相関を有する２染色体５  ＳＮＰ（他の２つの染色体５  ＳＮＰは非相関）
ｅ＞０．９５の最小ペアワイズｒ２相関を有する４染色体１１  ＳＮＰ
ｆ１のｒ２相関を有する２染色体８  ＳＮＰ
ｇ０．９１のｒ２相関を有する２染色体２  ＳＮＰ（他の２つの染色体２  ＳＮＰは、＜５０％のペアワイズ相関を有する）
ｈリスク対立遺伝子は、ＳＮＰにわたる効果サイズの比較を促進するために、症例においてより広く行き渡った対立遺伝子を適宜選択する。これは、変数の効果が任意の症例において公知であることをほのめかしてはおらず、他の対立遺伝子は保護的であり得る。さらに、対立遺伝子は、ｄｂＳＮＰにて報告されたものと相補的であり得る（オンラインＳＮＰ情報を参照されたい）。
ｉｒｓ９９９の対立遺伝子頻度は、ｄｂＳＮＰにて報告されたものと比べ、これらのデータ中で非常に異なっている。これは、本研究における本ＳＮＰを正確に遺伝子型判定することが失敗したことを示している可能性がある。
【０３４４】
表１８  遺伝子ＮＲＮＸ１およびＶＰＳ１４Ａにおいて個々に遺伝子型判定された全ＳＮＰ
【０３４５】
【表１８】
2009528063.tif 000040
表１９  症例および対照における、性別、年齢、ＦＴＮＤスコアおよび募集場所の分布
【０３４６】
【表１９】
2009528063.tif 000041
表２０  一卵性双子におけるニコチン依存の有病率
【０３４７】
【表２０】
2009528063.tif 000042
実施例４の参考
【０３４８】
【化１９】
2009528063.tif 000043
【０３４９】
【化２０】
2009528063.tif 000044
【０３５０】
【化２１】
2009528063.tif 000045
【０３５１】
【化２２】
2009528063.tif 000046
【０３５２】
【化２３】
2009528063.tif 000047
実施例５：ニコチン依存リスクとアルファ５ニコチン性レセプター
タバコ喫煙は、毎年約５００万の死亡に寄与する、主要な公衆衛生の問題である（ＷＨＯ、２０００）。健康に対して悪い効果が知られているにもかかわらず、米国において６５００万人の成人が喫煙し続けており、これらの個体の約半分が、ニコチンに依存している（Ｇｒａｎｔら、２００４）。ニコチンは、喫煙を維持するために関与するタバコ内の成分であり、ニコチンの生理学的効果は、神経ニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲｓ）を介して広く仲介されている。
【０３５３】
本発明者らのグループは最近、その人生で少なくとも１００個のタバコを吸ったが、依存性の症状を発症させなかった喫煙者間の対比に焦点を当てた、ニコチン依存の大規模なゲノム広関連および候補遺伝子研究を完了した（以上およびＢｉｅｒｕｔら、２００７；Ｓａｃｃｏｎｅら、２００７を参照）。この研究設計は、喫煙からニコチン依存への本移行に寄与する遺伝的因子に焦点を当てている。追跡のための説得力のある関係発見は、α５ニコチン性レセプター（ＣＨＲＮＡ５）中のアミノ酸変化となる、遺伝的変異体の同定であった。
【０３５４】
本研究の目的は、α５ニコチン性レセプター中の変異体の、ニコチン依存への遺伝的寄与をさらに同定すること、および本関連の発見が、独立データ組にて再現されるかどうかを試験すること、およびこのアミノ酸の変化が、ニコチン性レセプターの機能的変化となるかどうかを測定すること、であった。
【０３５５】
材料と方法
ヒト遺伝的研究
高率で喫煙し、重度および軽度の喫煙対照群の遺伝的研究を可能にする、２つの独立したデータ組、ＮＩＣＳＮＰ、ニコチン依存の症例および非依存喫煙の対照のシリーズ、およびＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ（ＣＯＧＡ）、アルコール依存性の家族に基づく研究を利用した。
ＮＩＣＳＮＰ
被験者
被験者（１０５０人症例および８７９人対照）を、２つの進行研究より選択した。Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ、米国によるサンプル（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＤｅｔｒｏｉｔおよびＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、およびＮｉｃｏｔｉｎｅ  Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ研究、オーストラリアによる、ヨーロッパ系サンプル。
【０３５６】
Ｉｎｓｔｕｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄが両方の研究を許可し、すべての被験者に、参加するためにインフォームド・コンセントを提供した。血液サンプルを、ＤＮＡ分析のために各被験者から採取し、電気的表現型データーとともに、ＮＩＤＡ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓここは、ＮＩＨガイドラインに従って、研究データの共用を管理している）に提出した。すべての被験者は、ヨーロッパ系子孫であると自己を同定した。
【０３５７】
表現型データ
症例を、ニコチン依存の一般的に利用されている定義、喫煙がもっとも多い場合、４以上のスコアのファガストロームニコチン依存度テスト（ＦＴＮＤ）スコア（最大スコア１０）（Ｈｅａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８１）によって定義した。対照被験者状態を、（人生の間に少なくとも１００のタバコを喫煙したことによって定義された）喫煙をしたが、依存症になっていない（人生ＦＴＮＤ＝０）個体として定義した。
ＳＮＰ遺伝子型判定
ＣＨＲＮＡ５遺伝子中のＳＮＰの問い合わせを行うためのカスタムアレイを選択し、以上でのように、そしてＢｉｅｒｕｔら、２００７およびＳａｃｃｏｎｅら、２００７にて記述されたように、遺伝子型判定した。追加的品質制御測定を、９５％以上の細胞率の特定化で導入した。すべてのＳＮＰのクラスタリングスポットを視覚で調査し、遺伝子型間の識別を確かめた。ハーディー・ワインバーグ平衡（ＨＷＥ）を、症例および対照に対して別々に試験した。
【０３５８】
母集団層別
より長いサンプル中の暗号母集団層別による擬陽性結果を避けるために、本発明者らは、２８９ウェル実施ＳＮＰに対する遺伝子型データを用いて、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ解析を実施した。これによって、集団混合の証拠は明らかにならなかった。
【０３５９】
統計解析
本発明者らの第一単一ＳＮＰ関連解析のために、本発明者らは、明らかな共変量、性別および場所（米国またはオーストラリア）を組み込むためにロジスティック回帰を利用し、２程度の自由度の、標準の尤度比カイ二乗統計を用いて、遺伝子型／性別交互作用タームとともに、遺伝子型の効果を試験した。全モデルを、性別および募集場所のみを含む縮小モデルと比較し、優位さを、２程度の自由度でのカイ二乗検定によって評価した。さらなる詳細に関して、以上、およびＳａｃｃｏｎｅら、２００７を参照されたい。
【０３６０】
ツリースキャン
ツリースキャニングは、関連解析のための進化ツリーに基づく方法であり、遺伝的関連結果の解釈において助けとなりうる。ソフトウェアＰＨＡＳＥを使用して、ＣＨＲＮＡ５をカバーしているＳＮＰに関して、１０５０の症例と８７９の対照における、ハプロタイプ相を推定した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｍら、ＡＪＨＧ．２００３）。ＰＨＡＳＥは、本サンプル中、３３の固有のハプロタイプを推定した。非常にまれなハプロタイプ（０．１％以下の頻度）を除去し、ついでハプロタイプネットワークを、ＴＣＳプログラム（Ｃｌｅｍｅｎｔら、Ｎｏｌ  Ｅｃｏｌ．２０００）中の統計学的節約を用いて試験した。組み換えの有意な証拠を示したハプロタイプをついで除去した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ＡＤら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９２）。得られたネットワークを利用して、ニコチン依存を有するＣＨＲＮＡ５中のハプロタイプの関連を評価した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ＡＲら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００５）。
【０３６１】
アルコール依存症の遺伝における共同研究
サンプル
アルコール依存症の遺伝における共同研究（Ｔｈｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ（ＣＯＧＡ））は、米国内の６のセンター、Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、およびＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓで、家族を募集している、多重サイト研究である（Ｂｅｇｌｅｉｔｅｒら、１９９５；Ｒｅｉｃｈら、１９９８；およびＦｏｒｏｕｄら、２０００）。すべての参加機関の機関審査委員会が研究を許可した。
【０３６２】
アルコール依存の発端者を、入院患者または外来患者の化学的依存性処置プログラムを介して同定した。発端者および彼らの家族に、ポリ−診断器具、Ｓｅｍｉ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ（ＳＳＡＧＡ）インタビューを与えた（Ｂｕｃｈｏｌｚら、１９９４；Ｈｅｓｓｅｌｂｒｏｃｋら、１９９９）。本研究の遺伝相に参加した家族には、発端者と、アルコール依存性に関するＳＤＭ−ＩＩＩＲ基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９８７）および限定的なアルコール依存症に関するＦｅｉｇｈｎｅｒら、（Ｆｅｉｇｈｎｅｒら、１９７２）基準両方に合致した、少なくとも２人の一等親血縁者が含まれた。
【０３６３】
喫煙歴を評価したけれども、ＦＴＮＤは与えられず、そのような同程度のニコチン表現型が発症した。症例状態は、個体が６ヶ月以上、１日に少なくとも１パック喫煙した場合に、習慣的喫煙と定義され（Ｂｉｅｒｕｔら、２００４）、ＦＴＮＤスケールにおいて、３以上の１つのスコアと等しかった。軽度の喫煙表現型は、毎日１０以下しかタバコを喫煙しなかった（少なくとも１ヶ月間毎日、または人生で１００タバコ喫煙した）喫煙者として定義された。喫煙したことがない、または影響を受けたまたは影響を受けない状態に満たなかったものを、解析において表現型的に、「未知」と考えた。
【０３６４】
ＳＮＰ遺伝子型判定
本発明者らは、ＣＯＧＡデータ組の遺伝子型判定のために利用されたＭａｓｓＡｒｒａｙ質量分析技術を用いた。ＰＣＲプライマー、終結混合物、および多重化能力を、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  Ｓｐｅｃｔｒｏ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェアｖ２．００．１７で決定した。標準のＰＣＲ手順を利用して、ＰＣＲ産物を増幅させた。ＰＣＲ産物中のすべての組み込まれていないヌクレオチドを、エビアルカリホスファターゼで不活性化した。ついでプライマー伸長反応を、質量拡張プライマーと適切な終結混合物で実施した。プライマー伸長産物をついで、レジンで清掃し、シリコーンＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐ上にスポットした。チップを質量分析ワークステーション（Ｂｒｕｋｅｒ）でスキャンし、得られた表現型スペクトルを、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  ＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲソフトウェアで解析した。
【０３６５】
すべてのＳＮＰ遺伝子型を、プログラムＰＥＤＣＨＥＣＫ（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｗｅｅｋｓ  １９９８）を用いて、メンデル性遺伝に関して確認した。マーカー対立遺伝子頻度およびヘテロ接合性を、プログラムＵＳＥＲＭ１３（Ｂｏｅｈｎｋｅ  １９９１）を用いて、西洋人とアフリカ系アメリカ人家族にて別々に算出した。９０％以上のコール率およびＨＷＥを、品質制御測定として設定した。
【０３６６】
統計解析
統計解析を、ＳＡＳ／ＳＴＡＴソフトウェア（ＳＡＳ２００３）を用いる一組のＳＡＳ  Ｍａｃｒｏｓを用いて実施して、一般化直線混合モデルに適合させた。本発明者らは、習慣的特性を解析していたので、本発明者らは、表現型ならびに遺伝子型において相関すべき家系内の個体を推定した。すべての個体を、血縁関係をもたないとして処理することで、とくに大家系に関して、データにおけるバイアスが導かれ得る。したがって、本発明者らは、本モデルに対して、ランダム−効果共分散マトリックスとして、推定された習慣性によって荷重をかけた類縁計数を利用した（Ｙｕら、２００６）。表現型間の推定される相関に対する制御に加えて、年齢および性別を解析に加えた。
【０３６７】
ＣＸＨＲＮＡ５遺伝的変異体の機能研究
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ダルベッコ変性イーグル培地（高グルコース、ピルビン酸なし）（ＤＭＥＭ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清および抗生物質／抗真菌剤（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ）中、湿潤、５％ＣＯ２環境において３７℃で維持した。培養試薬は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）いずれかから購入した。
【０３６８】
細胞内カルシウムの測定
細胞内カルシウムのアゴニスト誘発変化を、先に記述された（Ｋａｒａｄｓｈｅｈら、２００４）ように、エクオリンに基づく蛍光アッセイを用いて実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６−ウェルプレート上にまき（１．５×１０６細胞／ウェル）、翌日、ヒトコドン−最適化エクオリンｃＤＮＡ（Ｖｅｒｎｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｔｅｎ  ２００２）、マウスα４およびβ２  ｃＤＮＡｓ、およびＤ３９８がＮ３９８に変異した、野生型マウスα５  ｃＤＮＡ（Ｄ３９８）か、またはマウスα５  ｃＤＮＡいずれかを含むプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＦｕｇｅｎｅ  ＨＤトランスフェクション試薬（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）いずれかを用いて、製造業者によって推奨されたように実施した。トランスフェクションのおよそ４８時間後、培養培地をＤＭＥＭ＋０．１％ウシ胎児血清および２．５μＭ  コエレンテリジン−ｈｃｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に換え、細胞を湿潤５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で３時間インキュベートした。コエレンテリジンインキュベーション後、細胞を培養ディッシュから穏やかに吸引し、２ｍｌチューブに移した。細胞をついで、４℃で５分間、８００ｇでの遠心によってペレット化し、上清をすて、細胞を１×アッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）中に再懸濁させた。細胞の半分をリガンド結合のためにとり、残りの細胞を再びペレット化して、続いて、新鮮な１×アッセイ緩衝液（５００μｌ／サンプル）中に再懸濁させ、アッセイを開始する前に４℃で１時間インキュベートした。サンプルサイズは、各ｎＡＣｈＲ変異体に対してｎ＝１２であった（３つの独立した実験から、変異体あたり１２の別のトランスフェクション）。
【０３６９】
エピバチジン濃度−応答曲線のために、５０μＬの細胞を、９６−ウェルオパール白色プレートの各ウェルに加え、Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖプレートリーダー（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））中に配置した。１秒間ベースライン読み取りに続いて、５０μｌのエピバチジンを各サンプル上に注入し、蛍光をアゴニストの添加直後２０秒間、０．２秒の間隔で記録した。アゴニスト刺激の完了の時点で、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１００μＬの溶液を各ウェル内に注入し、蛍光を０．１ｓ間隔で、５秒間記録した。ウェルあたりの細胞数の差、ならびにトランスフェクション効率およびコエレンテラジンローディングの変化に関して制御するために、アゴニスト応答を、アゴニスト刺激蛍光（Ｌ）に対する最大ピーク値を、総ピーク蛍光値（Ｌｍａｘ）（最大ピークアゴニスト刺激蛍光＋高カルシウムの存在下、細胞溶解から得られる最大ピーク蛍光）によって割ることによって標準化した。
［１２５Ｉ］−エピバチジン結合
膜画分を、５０μｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅとの３７℃における１５分間インキュベーションを、第一遠心の前に実施したことを除いて、膜画分を、先に記述された（Ｍａｒｋｓら、１９９８）ようにサンプルから調製した。［１２５Ｉ］−エピバチジン結合の膜画分への結合を、結合緩衝液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  Ｍｇ２ＳＯ４および２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５）および２００ｐＭ  ［１２５Ｉ］−エピバチジンを含む３０μＬ反応液中、本質的に先に記述された（Ｍａｒｋｓら、１９９８）ように実施した。非特異的結合を、反応液中の１０μＭシチシンの含有によって決定した。リガンド結合を、リガンド枯渇を産出しなかった量のホモジネートで実施した。ホモジネートタンパク質レベルを、Ｌｏｗｒｙ（Ｌｏｗｅｒｙら、１９５１）の方法によって決定した。
【０３７０】
データ解析
エピバチジン誘発応答を、機能的応答（Ｌ／Ｌｍａｘ）を、サンプルウェルあたりのｆｍｏｌのｎＡＣｈＲで割ることによって標準化した。本標準化によって、レセプター値あたりの応答が提供される。濃度応答曲線に関するＥＣ５０および最大応答値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０ソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）における４パラメータロジスティック式を用いて計算した。２つのｎＡＣｈＲ集団に関する濃度応答曲線を、エピバチジン濃度とレセプター変異体に関して、２−ウェイＡＮＯＶＡを用いて評価した。α４β２α５Ｄ３９８およびα４β２α５Ｎ３９８間の最大応答とＥＣ５０値を、スチューデントｔ−検定を用いて比較した。
【０３７１】
結果
単一ＳＮＰ関係
ＮＩＣＳＮＰサンプルにおけるニコチン依存と、ＣＯＧＡサンプル中の習慣的喫煙との、ＣＨＲＮＡ５における２つの独立した遺伝的関係発見の強力な証拠が存在した。結果に関して表２１を参照されたい。もっとも説得力のある発見は、ｒｓ６９６９９６８であり、両方のサンプルにおいてニコチン依存のリスクが増加した（ＮＩＣＳＮＰ中ＯＲ＝１．５６（１．２８−１．９５）ｐ＜０．０００１、ＯＲ＝１．３１（１．１４−１．５４）ｐ＝０，０００１）。本ＳＮＰは、３４〜３５％のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）と一致し、アスパラギン酸（Ｇ）からアスパラギン（Ａ）のアミノ酸変化を明らかにした。
【０３７２】
第二の発見は、ｒｓ６８４５１３にて本遺伝子でみられ、ＮＩＣＳＮＰサンプル中、ニコチン依存を発症させるリスクを減少させた（ＯＲ＝０．７９（０．６６−０．９４））。ＳＮＰ  ｒｓ９０５７３９は、ｒｓ６８４５１３と高い結合不均一性であり（ｒ２＝０．９）、また関係を示した。遺伝子間の関連不均衡に関して図２１。習慣的喫煙と、ＣＯＧＡサンプル中のそれらのＳＮＰの関係の傾向が存在した。
【０３７３】
関係のこれらの発見をさらに調査するために、ＴＲＥＥＳＣＡＮを実施した。ツリースキャンが、２つの主要な枝を同定し、ニコチン依存症との有意な関係を明らかにした（図２２参照）。Ｈ４とＨ５間の枝Ａが、ｒｓ１６９６９９６８におけるアミノ酸変化によって定義される。ＧからＡへの遷移が、ニコチン添加物に対するリスクの増加したハプロタイプ群を定義し、明らかになった枝における関係は非常に強かった（ｐ＝０．０００１）。この効果は、枝Ｅによって定義された効果上で条件付けした場合に残る（ｐ＝０．００４）。第二のハプロタイプグルーピングによって、ニコチン依存症に対するリスクの減少が示された。減少したリスクハプロタイプ群は、ｒｓ１６９６９９６８に対する「ポジティブ」Ｇ対立遺伝子バックグラウンド上であった（ｐ値  ｐ．０１４−ｐ．００７４）。Ａ枝の効果上に条件付けしたのち、出力の欠損によってでありうるけれども、この関係は、もはや有意ではない。したがって、ニコチン依存に寄与しうるα５ニコチン性レセプターにおける２つの遺伝的効果が同定され、リスク変異体で、第二の保護的ハプロタイプ群である、ｒｓ１６９６９９６８でのアミノ酸変化が同定された。
【０３７４】
本発明者らは、バイオインフォマティクスデータベースを用いて、種間でｒｓ１６９６９９６８を試験した（参考文献）。図２３を参照されたい。アミノ酸位置３９８でのアスパラギン酸残基は非常に保存されており、これはさらに、その機能的重要性を示唆している。マイナーな対立遺伝子、多重手段にわたるｒｓ１６９６９９６８のＡ対立遺伝子の分布を評価するために、本発明者らは、本ＳＮＰを、ＨＧＤＰ−ＣＥＰＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ中にタイプし、これには、５２の異なる集団を表している９９５の個体が含まれる（Ｃａｎｎら、２００２）。西洋人集団において、Ａ対立遺伝子は、Ｙａｋｕｔ集団を除いて、２１％〜５０％の範囲であった（ＭＡＦ＝０．０６）。Ａ対立遺伝子は、アフリカ系およびアジア系集団では検出されなかったか、一般的ではない。対立遺伝子頻度の地理的分布に関して図２４を参照されたい。
【０３７５】
Ｄ３９８Ｎ遺伝的多型が、ｎＡＣｈＲ機能を変化させるかどうかを確立するために、細胞内カルシウムにおけるニコチン性アゴニスト誘発変化を、α４β２α５Ｄ３９８またはα４β２α５Ｎ３９８いずれかを異種的に発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から測定した。レセプターレベルを、レセプター数に対するアゴニスト応答を標準化するために各サンプルに関して決定した。ツー−ウェイＡＮＯＶＡは、ニコチンアゴニストエピバチジンに関する濃度応答曲線は、α４β２α５Ｄ３９８およびα４β２α５Ｄ３９８  ｎＡＣｈＲ変異体間で有意に異なった（ｐ＜０．０００１）。レセプターあたりのアゴニストに対する最大応答は、α４β２α５Ｄ３９８  ｎＡＣｈＲ変異体に比べて、α４β２α５Ｎ３９８  ｎＡＣｈＲ変異体に関して、二倍以上高いことがわかった（それぞれ、０．３５６±０．０２２および０．１４７±０．０１、ｐ＜０．０００５）。（図２４）。濃度−応答曲線およびアゴニストに対する最大応答におけるこの差は、それらのＥＣ５０値が異ならなかったので、ｎＡＣｈＲ変異体間のエピバチジンによる活性化に対する感受性のシフトによるものではなかった（α４β２α５Ｄ３９８  ＥＣ５０＝２５．９±１．５ｐＭ、α４β２α５Ｎ３９８  ＥＣ５０＝１９．１±１．４ｐＭ、ｐ＝０．２５）。
【０３７６】
考察
本研究によって、α５ニコチンレセプターにおけるアミノ酸変化が、依存性への遷移の喫煙者のリスクを増加させたこと、およびこの発見が、独立したサンプルにおいて再現されたことが示された。さらに、本アミノ酸変化が結果として、ニコチン性レセプターの機能の変化となる。
【０３７７】
本アミノ酸の変化の頻度は、異なる民族／人種群にわたって変化する。「リスクのある」遺伝子型は、ヨーロッパ子孫の集団において優性に見られ、アジア系およびアフリカ系起源の集団においては、一般的ではないか、または存在しなかった。これらの発見によって、ＳＮＰが、他の集団と比較して、ヨーロッパ起源の集団間のニコチン性依存性に関して、より非常に有意なリスク因子であること、および異なる遺伝的リスク因子が、民族／人種群において、より重要な役割を果たすこと、が示唆されている。
【０３７８】
本アミノ酸変化が、α５レセプター内に存在する領域は、本局所におけるアスパラギ酸で、マウス、ラット、ニワトリ、サルおよびチンパンジーからの種にわたって非常に保存されている。ヒトにおいて、アミノ酸は、アスパラギン酸かアスパラギンかのいずれかである。アスパラギン置換は結果として、インビトロ試験におけるα４β２α５レセプターの応答の増加となり、ニコチン依存の発症のリスクの増加と関連した。
【０３７９】
α５サブユニットは、α４β２レセプターと混合して、線条体中のドーパミン細胞中に発現する四量体レセプターを形成する。脳のこの領域は、依存に関与する利益経路と関連し、依存の発症において、重大な役割を果たす。この収束生物学的データが、ニコチン依存の発症におけるＣＨＲＮＡ５の重要な役割の本発明者らの発見に対するさらなる支持を与える。
【０３８０】
「保護的」変異体である本遺伝子で発生している第二遺伝的変異体の証拠が存在する。本変異体が、どの機能的役割であるかは未知である。これらの関連ＳＮＰが、アルファ３遺伝子中のＳＮＰと強力な連結不均一性であり、それによって機能的な効果が、アルファ３遺伝子内でありうることに注意することが重要でもある。
【０３８１】
要約すると、本実施例によって、機能的な変化となるアルファ５ニコチン性レセプター中のアミノ酸変化に関する強力な証拠が提供され、これは個々の喫煙者から、ニコチンに依存性となる遷移のリスクを増加させる。本変異体は、ヨーロッパ系子孫の集団で一般的であり、ニコチン依存のリスクを増加させ、逆に言えば、先祖の変異体が、喫煙から依存性への遷移を保護する。これらの結果によって、ニコチンに対する薬理学的応答における、アルファ５ニコチン性レセプターの役割が支持され、依存を導き、依存の発症へのさらなる生物学的見識を提供する。
【０３８２】
ＮＩＣＳＮＰにおけるニコチン依存と、ＣＯＧＡにおける習慣的喫煙を有する、ＣＨＲＮＡ５  ＳＮＰのロジスティック回帰解析＊の要約
【０３８３】
【化２４】
2009528063.tif 000048
【０３８４】
【化２５】
2009528063.tif 000049
ＳＮＰ効果は、ＣＯＧＡファミリーにおけるＫＩＮＭＩＸを用いてモデル化した。ＮＩＣＳＮＰおよびＣＯＧＡ下のブランク表入力は、ＳＮＰが、相当するデータ組中で遺伝子型判定されなかったことを示唆している。
１共通の対立遺伝子は、参照対立遺伝子であり、マイナー対立遺伝子はリスク対立遺伝子である。
２ｒｓ３８４１３２４は、ｉｎｄｅｌであり、２２塩基対欠損が参照であり、野生型がリスクである。
【０３８５】
実施例５に対する参考文献
【０３８６】
【化２６】
2009528063.tif 000050
前述の発明が、明確化および理解の目的のために、詳細に記述されてきているが、本開示物を読むことにより、当業者に対して、形態および詳細の種々の変化が、本発明の真の目的に逸脱しないで実施可能であることが明らかになるであろう。例えば、以上で記述されたすべての技術および器具を、種々の組み合せで使用可能である。すべての発行物、特許、特許明細書および／または本明細書で引用された他の文書が、任意の個々の発行物、特許、特許明細書および／または他の文書が、すべての目的のために参考文献によって組み込まれるように個々に示唆されたのと同程度に、すべての目的のために、それらの内容が参考文献によって組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０３８７】
【図１】実施例１におけるラウンドＩのセットに対するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図２】実施例１におけるラウンドＩのセットに対するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図３】実施例１におけるラウンドＩのセットに対するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図４】実施例１におけるラウンドＩのセットに対するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図５】実施例１におけるラウンドＩのセットに対するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図６】実施例１におけるラウンドＩのセットに対するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図７】実施例１によるＳＮＰの順序づけられたセットにおけるＦＤＲｑ値のプロットを示す図である。
【図８】最初の６００のＳＮＰの部分を拡大して示す図である。
【図９】実施例１による順序づけ分布のプロットを示す図である。
【図１０】最初の３００のＳＮＰの部分を拡大して示す図である。
【図１１】実施例１における２１のＳＮＰのスライドウィンドウに対する符号一致を示す図である。
【図１２】実施例１における図１１のウィンドウサイズ１０１での符号一致を示す図である。
【図１３】実施例３における候補遺伝子関連解析の結果を示す図である。
【図１４−１】パネルａ〜ｃは、実施例３における上位の関連シグナルに対する詳細な結果を示す図である。
【図１４−２】パネルａ〜ｃは、実施例３における上位の関連シグナルに対する詳細な結果を示す図である。
【図１５Ａ】パネルａおよびｂは、ニコチン受容体遺伝子の（Ａ）ＣＨＲＮＢ３−ＣＨＲＮＡ６クラスターおよび（Ｂ）ＣＨＲＮＡ５−ＣＨＲＮＡ３−ＣＨＲＮＢ４クラスターにおけるマーカー間の連鎖不平衡（ＬＤ）を示す図である。
【図１５Ｂ】パネルａおよびｂは、ニコチン受容体遺伝子の（Ａ）ＣＨＲＮＢ３−ＣＨＲＮＡ６クラスターおよび（Ｂ）ＣＨＲＮＡ５−ＣＨＲＮＡ３−ＣＨＲＮＢ４クラスターにおけるマーカー間の連鎖不平衡（ＬＤ）を示す図である。
【図１６】ニコチン依存を発症するリスクに影響する遺伝子についてのゲノムワイド関連スキャンのＰ値を示す図である。
【図１７ａ】パネルａは、（Ａ）プール遺伝子型判定段階から選択された３１９６０の個々に遺伝子型判定されるＳＮＰからなる段階Ｉサンプルによるｐ値の分布を示す図であり、パネルｂは、（Ｂ）段階ＩＩで付加されたさらなるサンプルによるｐ値の分布を示す図である。
【図１７ｂ】パネルａは、（Ａ）プール遺伝子型判定段階から選択された３１９６０の個々に遺伝子型判定されるＳＮＰからなる段階Ｉサンプルによるｐ値の分布を示す図であり、パネルｂは、（Ｂ）段階ＩＩで付加されたさらなるサンプルによるｐ値の分布を示す図である。
【図１８】段階Ｉサンプルによるプール遺伝子型判定および個々の遺伝子型判定から得られた対立遺伝子頻度の散布図である。
【図１９】異なる基準を用いて選択されたＳＮＰの標準誤差の分布のプロットを示す図である。
【図２０】段階ＩＩで段階Ｉサンプルに付加されたサンプルよりもたらされるロジスティック回帰ＡＮＯＶＡ逸脱度のＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図２１】ＣＨＲＮＡ５遺伝子中のＳＮＰにおけるＬＤおよびｒ２を示す図である。
【図２２】ＣＨＲＮＡ５についてのハプロタイプ網を示す図である。
【図２３】種間でのα５ニコチン受容体の比較配列解析を示す図である。
【図２４】ｒｓ１６９６９９６８のＡ対立遺伝子の分布を示す図である。
【図２５】ｎＡＣｈＲの機能に影響を及ぼす多型性を示す図である。
【図２６−００１】表１を示すものである。
【図２６−００２】表１を示すものである。
【図２６−００３】表１を示すものである。
【図２６−００４】表１を示すものである。
【図２６−００５】表１を示すものである。
【図２６−００６】表１を示すものである。
【図２６−００７】表１を示すものである。
【図２６−００８】表１を示すものである。
【図２６−００９】表１を示すものである。
【図２６−０１０】表１を示すものである。
【図２６−０１１】表１を示すものである。
【図２６−０１２】表１を示すものである。
【図２６−０１３】表１を示すものである。
【図２６−０１４】表１を示すものである。
【図２６−０１５】表１を示すものである。
【図２６−０１６】表１を示すものである。
【図２６−０１７】表１を示すものである。
【図２６−０１８】表１を示すものである。
【図２６−０１９】表１を示すものである。
【図２６−０２０】表１を示すものである。
【図２６−０２１】表１を示すものである。
【図２６−０２２】表１を示すものである。
【図２６−０２３】表１を示すものである。
【図２６−０２４】表１を示すものである。
【図２６−０２５】表１を示すものである。
【図２６−０２６】表１を示すものである。
【図２６−０２７】表１を示すものである。
【図２６−０２８】表１を示すものである。
【図２６−０２９】表１を示すものである。
【図２６−０３０】表１を示すものである。
【図２６−０３１】表１を示すものである。
【図２６−０３２】表１を示すものである。
【図２６−０３３】表１を示すものである。
【図２６−０３４】表１を示すものである。
【図２６−０３５】表１を示すものである。
【図２６−０３６】表１を示すものである。
【図２６−０３７】表１を示すものである。
【図２６−０３８】表１を示すものである。
【図２６−０３９】表１を示すものである。
【図２６−０４０】表１を示すものである。
【図２６−０４１】表１を示すものである。
【図２６−０４２】表１を示すものである。
【図２６−０４３】表１を示すものである。
【図２６−０４４】表１を示すものである。
【図２６−０４５】表１を示すものである。
【図２６−０４６】表１を示すものである。
【図２６−０４７】表１を示すものである。
【図２６−０４８】表１を示すものである。
【図２６−０４９】表１を示すものである。
【図２６−０５０】表１を示すものである。
【図２６−０５１】表１を示すものである。
【図２６−０５２】表１を示すものである。
【図２６−０５３】表１を示すものである。
【図２６−０５４】表１を示すものである。
【図２６−０５５】表１を示すものである。
【図２６−０５６】表１を示すものである。
【図２６−０５７】表１を示すものである。
【図２６−０５８】表１を示すものである。
【図２６−０５９】表１を示すものである。
【図２６−０６０】表１を示すものである。
【図２６−０６１】表１を示すものである。
【図２６−０６２】表１を示すものである。
【図２６−０６３】表１を示すものである。
【図２６−０６４】表１を示すものである。
【図２６−０６５】表１を示すものである。
【図２６−０６６】表１を示すものである。
【図２６−０６７】表１を示すものである。
【図２６−０６８】表１を示すものである。
【図２６−０６９】表１を示すものである。
【図２６−０７０】表１を示すものである。
【図２６−０７１】表１を示すものである。
【図２６−０７２】表１を示すものである。
【図２６−０７３】表１を示すものである。
【図２６−０７４】表１を示すものである。
【図２６−０７５】表１を示すものである。
【図２６−０７６】表１を示すものである。
【図２６−０７７】表１を示すものである。
【図２６−０７８】表１を示すものである。
【図２６−０７９】表１を示すものである。
【図２６−０８０】表１を示すものである。
【図２６−０８１】表１を示すものである。
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【図２６−０８３】表１を示すものである。
【図２６−０８４】表１を示すものである。
【図２６−０８５】表１を示すものである。
【図２６−０８６】表１を示すものである。
【図２６−０８７】表１を示すものである。
【図２６−０８８】表１を示すものである。
【図２６−０８９】表１を示すものである。
【図２６−０９０】表１を示すものである。
【図２６−０９１】表１を示すものである。
【図２６−０９２】表１を示すものである。
【図２６−０９３】表１を示すものである。
【図２６−０９４】表１を示すものである。
【図２６−０９５】表１を示すものである。
【図２６−０９６】表１を示すものである。
【図２６−０９７】表１を示すものである。
【図２６−０９８】表１を示すものである。
【図２６−０９９】表１を示すものである。
【図２６−１００】表１を示すものである。
【図２６−１０１】表１を示すものである。
【図２６−１０２】表１を示すものである。
【図２６−１０３】表１を示すものである。
【図２６−１０４】表１を示すものである。
【図２６−１０５】表１を示すものである。
【図２６−１０６】表１を示すものである。
【図２６−１０７】表１を示すものである。
【図２６−１０８】表１を示すものである。
【図２６−１０９】表１を示すものである。
【図２６−１１０】表１を示すものである。
【図２６−１１１】表１を示すものである。
【図２６−１１２】表１を示すものである。
【図２６−１１３】表１を示すものである。
【図２６−１１４】表１を示すものである。
【図２６−１１５】表１を示すものである。
【図２６−１１６】表１を示すものである。
【図２６−１１７】表１を示すものである。
【図２６−１１８】表１を示すものである。
【図２６−１１９】表１を示すものである。
【図２６−１２０】表１を示すものである。
【図２６−１２１】表１を示すものである。
【図２６−１２２】表１を示すものである。
【図２６−１２３】表１を示すものである。
【図２６−１２４】表１を示すものである。
【図２６−１２５】表１を示すものである。
【図２６−１２６】表１を示すものである。
【図２６−１２７】表１を示すものである。
【図２６−１２８】表１を示すものである。
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【図２６−１３０】表１を示すものである。
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【図２６−１３４】表１を示すものである。
【図２６−１３５】表１を示すものである。
【図２６−１３６】表１を示すものである。
【図２６−１３７】表１を示すものである。
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【図２６−１３９】表１を示すものである。
【図２６−１４０】表１を示すものである。
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【図２６−１４３】表１を示すものである。
【図２６−１４４】表１を示すものである。
【図２６−１４５】表１を示すものである。
【図２６−１４６】表１を示すものである。
【図２６−１４７】表１を示すものである。
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【図２６−１５０】表１を示すものである。
【図２６−１５１】表１を示すものである。
【図２６−１５２】表１を示すものである。
【図２６−１５３】表１を示すものである。
【図２６−１５４】表１を示すものである。
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【図２６−１５６】表１を示すものである。
【図２６−１５７】表１を示すものである。
【図２６−１５８】表１を示すものである。
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【図２６−１６０】表１を示すものである。
【図２６−１６１】表１を示すものである。
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【図２６−１６３】表１を示すものである。
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【図２６−１６７】表１を示すものである。
【図２６−１６８】表１を示すものである。
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【図２６−１７８】表１を示すものである。
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【図２６−１８０】表１を示すものである。
【図２６−１８１】表１を示すものである。
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【図２６−１８３】表１を示すものである。
【図２６−１８４】表１を示すものである。
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【図２６−１８８】表１を示すものである。
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【図２６−１９０】表１を示すものである。
【図２６−１９１】表１を示すものである。
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【図２６−１９８】表１を示すものである。
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【図２６−２０１】表１を示すものである。
【図２６−２０２】表１を示すものである。
【図２６−２０３】表１を示すものである。
【図２６−２０４】表１を示すものである。
【図２６−２０５】表１を示すものである。
【図２６−２０６】表１を示すものである。
【図２６−２０７】表１を示すものである。
【図２６−２０８】表１を示すものである。
【図２６−２０９】表１を示すものである。
【図２６−２１０】表１を示すものである。
【図２６−２１１】表１を示すものである。
【図２６−２１２】表１を示すものである。
【図２６−２１３】表１を示すものである。
【図２６−２１４】表１を示すものである。
【図２６−２１５】表１を示すものである。
【図２６−２１６】表１を示すものである。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−３７８】
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【図２６−３７９】
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【図２６−３８０】
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【図２６−３８１】
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【図２６−３８２】
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【図２６−３８３】
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【図２６−３８４】
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【図２６−３８５】
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【図２６−３８６】
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【図２６−３８７】
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【図２６−３８８】
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【図２６−３８９】
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【図２６−３９０】
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【図２６−３９１】
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【図２６−３９２】
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【図２６−３９３】
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【図２６−３９４】
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【図２６−３９５】
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【図２６−３９６】
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【国際調査報告】
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