(57)【要約】本発明は肝細胞増殖因子に対するヒト化中和性モノクローナル抗体、これを含む医薬組成物およびこのような医薬組成物の患者への投与を含む処置法に関する。このｍＡｂは、ＨＧＦの受容体ｃＭｅｔへの結合、Ｍａｄｉａｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞のような細胞類の分散の誘発、Ｍｖ１Ｌｕミンクｌｕｎｋ上皮細胞および／または肝細胞および／またはＨＵＶＥＣの増殖の誘発、および血管新生促進を含むＨＧＦの生物学的活性の少なくとも一つ、より好ましくは数種またはすべてを阻害する。
2009532378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合し、これを中和するヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）。
【請求項２】
ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂである請求項１記載のｍＡｂ。
【請求項３】
ＨＧＦとＭｅｔとの結合を少なくとも５０％阻害する請求項２記載のｍＡｂ。
【請求項４】
Ｍｖ１Ｌｕ細胞のＨＧＦ誘導性増殖を阻害する請求項２記載のｍＡｂ。
【請求項５】
ＨＧＦの全ての生物学的活性を中和する請求項２記載のｍＡｂ。
【請求項６】
マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する請求項２記載のｍＡｂ。
【請求項７】
マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を完全に阻害する請求項６記載のｍＡｂ。
【請求項８】
重鎖可変領域が図２ＡのＨｕＬ２Ｇ７と標識された配列を有するヒト化ｍＡｂ。
【請求項９】
最初のアミノ酸がＧｌｎに置換されていること以外は、図２ＡのＨｕＬ２Ｇ７と標識されたアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域を含むヒト化ｍＡｂ。
【請求項１０】
図２ＢのＨｕＬ２Ｇ７と標識されたアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域をさらに含む請求項８記載のヒト化ｍＡｂ。
【請求項１１】
図２ＡのＨｕＬ２Ｇ７と標識されたアミノ酸配列および図２ＢのＨｕＬ２Ｇ７と標識されたアミノ酸配列のそれぞれに少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖および重鎖可変領域を含むヒト化ｍＡｂ。
【請求項１２】
軽鎖および重鎖可変領域の配列が請求項１０記載のｍＡｂのそれらに少なくとも９５％同一である請求項１１記載のヒト化ｍＡｂ。
【請求項１３】
Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ９４、Ｌ３およびＬ６０からなる群から選択される少なくとも１つの位置がマウスＬ２Ｇ７のＫａｂａｔナンバリングによる対応する位置に存在するアミノ酸によって占められている、請求項１１または請求項１２記載のヒト化ｍＡｂ。
【請求項１４】
前記群から選択される少なくとも３つの位置がマウスＬ２Ｇ７抗体におけるＫａｂａｔナンバリングによる対応する位置に存在するアミノ酸によって占められている、請求項１１または請求項１２記載のヒト化ＭＡｂ。
【請求項１５】
前記群の全ての位置がマウスＬ２Ｇ７抗体におけるＫａｂａｔナンバリングによる対応する位置に存在するアミノ酸によって占められている、請求項１１または請求項１２記載のヒト化ＭＡｂ。
【請求項１６】
さらに位置Ｈ１がＧｌｕによって占められている、請求項１５記載のヒト化ｍＡｂ。
【請求項１７】
（ＩｇＧ１、κ）アイソタイプである請求項１０記載のヒト化ｍＡｂ。
【請求項１８】
ＨＧＦの生物学的活性をＬ２Ｇ７と同様に中和する請求項２記載のヒト化ｍＡｂ。
【請求項１９】
ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に結合し、これを中和するヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であって、前記ヒト化抗体はヒト化重鎖および軽鎖を含み、前記ヒト化重鎖はＬ２Ｇ７由来のＣＤＲと、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ９４からなる群から選択されるヒト重鎖可変領域フレームワークの少なくとも１つの位置が前記Ｌ２Ｇ７重鎖の対応する位置を占めるアミノ酸によって占められるという条件で、ヒト重鎖可変領域フレームワークとを含み；前記ヒト化軽鎖はＬ２Ｇ７由来のＣＤＲと、Ｌ３およびＬ６０からなる群から選択される少なくとも１つの位置が前記Ｌ２Ｇ７軽鎖の対応する位置を占めるアミノ酸によって占められるという条件で、ヒト軽鎖可変領域フレームワークとを含む、前記ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２０】
Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１およびＨ９４からなる群の全てのアミノ酸が前記Ｌ２Ｇ７重鎖の対応する位置を占めるアミノ酸によって占められ、Ｌ３およびＬ６０からなる群から選択される各位置が前記Ｌ２Ｇ７軽鎖の対応する位置を占めるアミノ酸によって占められている、請求項１９記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
さらに位置Ｈ１がＧｌｕによって占められている、請求項１９記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかの項に記載のｍＡｂを産生する細胞株。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれかの項に記載のｍＡｂを含む医薬組成物。
【請求項２４】
患者の癌を処置する方法であって、請求項１〜２１のいずれかの項に記載のｍＡｂを含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む前記方法。
【請求項２５】
前記癌が膠芽細胞腫である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
医薬品の製造のための、請求項１〜２１のいずれかの項に記載のｍＡｂの使用。
【請求項２７】
癌を処置するための請求項２６の使用。
【請求項２８】
前記癌が膠芽細胞腫である請求項２６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年４月１日に出願されたＵＳＳＮ６０／７８８，２４３号の本出願である。ＵＳＳＮ６０／７８８，２４３号は、その全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
特許に係る政府の権利に関する記載
本出願に記載される研究は、一部は国立衛生研究所からの寄金２Ｒ４４ＣＡ１０１２８３−０２によって行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は一般に、新規の生物製剤を開発するための、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と組換えＤＮＡ技術との組み合わせに関し、より詳細に述べれば、例えば肝細胞成長因子に結合し、それらを中和するヒトモノクローナル抗体の作製に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は間葉系幹細胞によって産生される多機能ヘテロダイマーポリペプチドである。ＨＧＦは血管新生、形態形成および細胞遊走（ｍｏｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、並びに種々の細胞型の増殖および分散を刺激することがわかっている（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：６２９，１９９２；Ｚａｒｎｅｇａｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９：１１７７，１９９５；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｂａ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：１９８，１９９７；Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｇｈｅｒａｒｄｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４０４，１９９８；Ｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１１１１，２００１）。ＨＧＦの多面発現活性はその受容体、ガン原遺伝子によってコードされる経膜的チロシンキナーゼｃＭｅｔによって仲介される。ＨＧＦおよびその受容体ｃ−Ｍｅｔは、種々の正常細胞機能の調節に加えて、腫瘍の発生、侵襲および転移に関係することが判明している（Ｊｅｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７４：５０５，１９９６；Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ａｎｄ  Ｔｒｕｓｏｌｉｎｏ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：８５７，２００２）。ＨＧＦ／ｃＭｅｔは肺、結腸、直腸、胃、腎臓、卵巣、皮膚、多発性骨髄腫および甲状腺組織に由来する腫瘍を含む種々のヒト充実性腫瘍に同時発現し、過剰発現することが多い（Ｐｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４９：３２３，１９９１；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：５９３，１９８８；Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２２９，１９９３；Ｄｅｒｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９９：１４０５，２００２）。ＨＧＦはオートクライン（Ｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７３１，１９９４；Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５３９１，１９９７）およびパラクリン成長因子（Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２２９，１９９３）として、およびこれらの腫瘍に対する抗アポトーシスレギュレータ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４７２５７，２００１）として作用する。
【０００５】
ＨＧＦはプラスミノゲンおよび血液凝固のその他の酵素類に類似の配列および構造を有する１０２ｋＤａ蛋白である（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４４０，１９８９；Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２２９，１９９３）。ヒトＨＧＦは７２８アミノ酸前駆体（ｐｒｅｐｒｏＨＧＦ）として合成される。それは細胞内分解を受けて不活性の単鎖型（ｐｒｏＨＧＦ）になる（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４４０，１９８９；Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：１７８３，１９９４）。細胞外に分泌されると、ｐｒｏＨＧＦは分解し、α−サブユニットとβ−サブユニットからなる生物学的に活性なジスルフィド結合ヘテロダイマー分子を生成する（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４４０，１９８９；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４８２５，１９９２）。α−サブユニットはＮ−末端ヘアピンドメインと４個のクリングルドメインとからなる４４０残基を含む（グリコシル化で６９ｋＤａ）。β−サブユニットは２３４残基を含み（３４ｋＤａ）、蛋白分解活性を欠いたセリンプロテアーゼ様ドメインを有する。ＨＧＦは２つのユニークな細胞特異的結合部位：ｃＭｅｔ受容体に対する高親和性（Ｋｄ＝２×１０−１０Ｍ）結合部位およびヘパリン硫酸プロテオグリカン類（ＨＳＰＧ）に対する低親和性結合部位（Ｋｄ＝１０−９Ｍ）を有し、これらは細胞表面および細胞外基質に存在する（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：５０１，１９９１；Ｂａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：１０９，１９９４；Ｓａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：９４５７，１９９７）。
【０００６】
ｃＭｅｔ受容体はクラスＩＶプロテインチロシンキナーゼ受容体ファミリーの一メンバーである。全長ｃＭｅｔ遺伝子がクローン化され、ｃＭｅｔ癌原遺伝子として確認された（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：２９，１９８４；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６３７９，１９８７）。ＮＫ２（α−サブユニットのＮ−末端と最初の２つのクリングルドメインとを含むプロテイン）は、ｃＭｅｔに結合するには十分であり、運動のためのシグナルカスケードを活性化するが、マイトジェニック反応のためには全長プロテインが必要である（Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：２２９，１９９３）。ＨＳＰＧは、ＨＧＦのＮ末端と相互作用することによってＨＧＦに結合する。
【０００７】
ＨＧＦ／ｃＭｅｔは腫瘍発生、侵襲、転移、アポトーシスの調節および血管新生のような癌発生における種々の局面に重要な役割を演ずることが報告されている。有効なアンタゴニスト分子、例えばＮＫ１（Ｎ−末端ドメインとクリングルドメイン１；Ｌｏｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１７１４５，１９９３）、ＮＫ２（Ｎ末端ドメインとクリングルドメイン１および２；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１３８２，１９９１）およびＮＫ４（Ｎ−末端ドメインと４つのクリングルドメイン；Ｋｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６７３７，２０００）のような短縮ＨＧＦプロテイン類、抗ｃＭｅｔ  ｍＡｂ（Ｄｏｄｇｅ，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｅｒｓｉｔｙ，１９９８）および抗ＨＧＦ  ｍＡｂ（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：７４４３，２００１；これは参照によって本明細書に組み込まれる。）を得るために数種類のアプローチが研究されている。
【０００８】
ＮＫ１およびＮＫ２はＨＧＦとその受容体との結合に効果的に拮抗できるが、報告によると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは所望の純粋なアンタゴニスト活性よりもむしろ部分的アゴニスト活性を有する（Ｃｉｏｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１３１１０，１９９６；Ｓｃｈｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３３：７０９，１９９６）。より最近になってＫｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６７３７，２０００は、ヌードマウスモデルにおいてＮＫ４の連続注入によってネズミ肺腫瘍ＬＬＣの一次性増殖および転移を部分的に阻害できると報告した。しかし一次性腫瘍の部分的増殖阻害をおこすためにはＮＫ４を連続投与しなければならなかったという事実から、おそらくＮＫ４分子の半減期が短く、および／または効力が不足していると思われる。
【０００９】
Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：７４４３，２００１はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＧＦの分散活性の阻止能力に基づいて選択した３種類の抗ＨＧＦｍＡｂ類のカクテルの投与が、異種移植ヌードマウスモデルにおいてヒト腫瘍の増殖を阻止できることを報告した。彼らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＧＦの生物活性を阻止するには、ＨＧＦ上の３つの異なる結合部位を認識する３つのｍＡｂが必要であり、２つのｍＡｂがＨＧＦとｃＭｅｔとの結合を阻止し、１つのｍＡｂがＨＧＦとヘパリンとの結合を阻止すると仮定した。
【００１０】
最近、ＨＧＦに個々に結合し中和するヒトｍＡｂがトランスジェニックマウス技術を用いて開発されたことが報告された（特許文献１および非特許文献１、これらの各々は全ての目的のために参考として本明細書に組み込まれる）。しかし、これらのうち少なくとも２．１２．１ｍＡｂは腫瘍異種移植モデルにおいて最も効き目がありそうであったにもかかわらず、血管新生を阻止しなかった。血管新生を含むＨＧＦのあらゆる被検生物学的活性を中和するマウスｍＡｂ  Ｌ２Ｇ７が開発された（２００４年８月１３日に出願された特許出願ＵＳＳＮ１０／９１７，９１５および非特許文献２、これらの各々は全ての目的のために参考として本明細書に組み込まれる）。
【００１１】
このように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＧＦの生物学的活性をブロックするヒト化モノクローナル抗体が必要である。本発明はこの要求、およびその他の要求を満たす。
【特許文献１】国際公開第２００５／０１７１０７号パンフレット
【非特許文献１】Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１７２１，２００６
【非特許文献２】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：１２９２，２００６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の要旨
一実施形態において、本発明はヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対するヒト化中和ｍＡｂを提供する。このｍＡｂは、ＨＧＦの受容体ｃＭｅｔへの結合、Ｍａｄｉａｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞のような細胞類の分散の誘発、Ｍｖ１Ｌｕミンクｌｕｎｋ上皮細胞および／または肝細胞および／またはＨＵＶＥＣの増殖の誘発、および血管新生促進を含むＨＧＦの生物学的活性の少なくとも一つ、より好ましくは数種またはすべてを阻害する。好ましいヒト化抗ＨＧＦｍＡｂは、マウスのヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害し、最も好ましくは完全に阻害する。好ましい実施形態において、ヒト化ｍＡｂはヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂである。特に好ましい実施形態において、ｍＡｂの重鎖および軽鎖可変領域は図２Ａおよび図２ＢにおいてＨｕＬ２Ｇ７と標識された行にそれぞれ示される諸配列、またはそれらに少なくとも９０％以上一致する諸配列を有する。また別の実施形態において、本発明はヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に結合し、これを中和するヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化重鎖および軽鎖を含むヒト化抗体を提供する。ヒト化重鎖は、Ｌ２Ｇ７由来のＣＤＲと、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ９４からなる群から選択されるヒト重鎖可変領域フレームワーク中の少なくとも１つの位置がＬ２Ｇ７重鎖の対応する位置を占めるアミノ酸によって占められるという条件でヒト重鎖可変領域フレームワークとを含む。ヒト化軽鎖は、Ｌ２Ｇ７由来のＣＤＲと、Ｌ３およびＬ６０からなる群から選択される少なくとも１つの位置が、Ｌ２Ｇ７軽鎖の対応する位置を占めるアミノ酸によって占められるという条件でヒト軽鎖可変領域フレームワークとを含む。
【００１３】
このようなヒト化抗体を産生する細胞株も提供される。別の実施形態においては、ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂを含む医薬組成物も提供される。第三の実施形態においては上記医薬組成物を患者（一般的にはヒト患者）に投与し、癌またはその他の疾患を処置する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明はヒト化中和性抗ＨＧＦモノクローナル抗体類、それらを含む医薬組成物類、および疾患を処置するためのそれらの使用法を提供する。
【００１５】
１．抗体
抗体は、入り組んだ内部構造を有する非常に大きい複雑な分子である（分子量約１５０，０００または約１３２０のアミノ酸）。天然の抗体分子は同一の２対のポリペプチド鎖を含み、各対は１本の軽鎖と１本の重鎖を有する；したがって抗体の基礎的構造単位はテトラマーである。各軽鎖および重鎖は各自２つの領域：標的抗原に結合することに関係する可変（“Ｖ”）部、および免疫系のその他のコンポーネントと相互作用する定常（“Ｃ”）部とからなる。軽鎖および重鎖可変領域は三次元空間において一緒に折り畳まれ、抗原（例えば、細胞表面上の受容体）に結合する可変領域を形成する。各軽鎖または重鎖可変領域内には相補性決定領域（“ＣＤＲ”）と呼ばれる３つの短いセグメント（平均１０個のアミノ酸長）がある。抗体の可変ドメインにある６個のＣＤＲ（軽鎖からの３個と重鎖からの３個）は三次元空間で一緒に折り畳まれ、標的抗原に結合する実際の抗体結合部位を形成する。これらＣＤＲの位置および長さは正確に決定されている。Ｋａｂａｔ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３，１９８７を参照されたい。これは参考として本明細書に組み込まれる。ＣＤＲに含まれない可変領域の部分はフレームワークと呼ばれ、ＣＤＲの周囲を形成する。各鎖において３個のＣＤＲと４個のフレームワーク部分とは次のような順序で組み込まれている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００１６】
免疫グロブリンの成熟した重鎖および軽鎖の可変領域からのアミノ酸はそれぞれＨｘおよびＬｘとして表される。ここでｘは前掲のＫａｂａｔのスキームによるアミノ酸の位置を示す数字である。Ｋａｂａｔは各サブグループの抗体について多くのアミノ酸配列を列挙し、コンセンサス配列を形成するサブグループ内の各残基の位置について最も一般的にあらわれるアミノ酸を列挙している。Ｋａｂａｔは列挙した配列中のアミノ酸に残基ナンバーを割り当てる方法を用い、残基ナンバーを割り当てるこの方法はこの分野における標準となった。保存されたアミノ酸を参照して問題の抗体をＫａｂａｔのコンセンサス配列の一つと整列させることによって、Ｋａｂａｔのスキームは彼の概論に含まれないその他の抗体にも拡大できる。Ｋａｂａｔのナンバリング系を使用して、異なる抗体における同等の位置のアミノ酸を容易に同定できる。例えばヒト抗体のＬ５０位置のアミノ酸はマウス抗体のアミノ酸位置Ｌ５０と同等の位置を占める。その上、Ｋａｂａｔのナンバリング系を使用して、ある抗体配列の各アミノ酸を同じＫａｂａｔナンバーを有するその他の配列中のアミノ酸と整列させることによって、任意の２つの抗体配列を特異的に整列させ、例えばパーセント同一性などを確認することができる。整列後、対象の抗体領域（例えば重鎖または軽鎖の全体的成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較する場合、対象抗体領域と参照抗体領域との間の配列同一性のパーセントは、ギャップを数えずに、対象および参照抗体領域両方の同じアミノ酸によって占有される位置の数を、２領域の整列した位置の総数で割って、１００を掛けてパーセンテージに変換して得られる。
【００１７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は抗体の単一分子種であり、したがって動物（齧歯類、ウサギまたはヤギなど）に抗原を注射し、その動物から血清を採取することによって生成されるポリクローナル抗体を含まない。ヒト化抗体は、マウス抗体（“ドナー抗体”、これはラット、ハムスターまたはその他の類似種でもよい）由来のＣＤＲをヒト抗体（アクセプタ抗体）にグラフトした遺伝子工学的（モノクローナル）抗体である。ヒト化抗体はマウス抗体からの完全でないＣＤＲでも作ることができる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２）。最も一般的には、ドナー抗体から得られ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７によって定義された最初の重鎖超可変ループＨ１もヒト化抗体に移入される。こうしてヒト化抗体はドナー抗体由来のＣＤＲと、ヒト抗体からの可変領域フレームワークおよび定常部とを有する抗体である。軽鎖および重鎖アクセプタフレームワークは同じまたは異なるヒト抗体からのものでよく、各々２つ以上のヒト抗体フレームワークの複合体でもよい；またはヒトフレームワーク類のセットのコンセンサス配列（例えば前掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．によって定義されたようなヒト抗体類のサブグループ）、すなわちそのセットにおいて各位置に最も一般的にあらわれるアミノ酸を有する配列でよい。さらに、高い結合特性を保持するために、２つの付加的構造要素の少なくとも１つを用いることができる。Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号を参照されたい；これらの各々は参考として本明細書に組み込まれる。これらはヒト化抗体の構造の詳細な説明を提供する。
【００１８】
第一の構造要素において、多くの公知のヒト抗体類のなかからアクセプタ抗体を適切に選択することによって、ヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークが、ドナー抗体の重鎖可変領域のフレームワークと高度な配列同一性（少なくとも６５％）を有するように選択される。第二の構造要素において、ヒト化抗体を構成するにあたって、ヒトアクセプタ抗体のフレームワーク（ＣＤＲの外側）の選択されたアミノ酸が、指定された規則にしたがって、ドナー抗体からの対応するアミノ酸に置換される。特に、そのフレームワークにおいて置換されるアミノ酸は、それらがＣＤＲと相互作用する能力に基づいて選択されるのが一般的である。例えば、置換されるアミノ酸類はドナー抗体配列中のＣＤＲに隣接していてもよいし、または三次元空間において測定したときにヒト化抗体中のＣＤＲから４−６オングストロームの範囲内にあるようにしてもよい。
【００１９】
他方、ヒト化ｍＡｂは必ず非ヒト化ドナーｍＡｂで始まるから、ヒト化ｍＡｂは、可変領域をコードする核酸をヒトから単離し、それらをファージディスプレー法を用いて選択することによって（例えばＤｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／００１０４７；Ｗｉｎｔｅｒ，ＷＯ９２／２０７９１；およびＷｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３：９２，１９９８を参照）、またはトランスジェニックマウスを使用することによって（例えばＬｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ＷＯ９１／１０７４１、およびＢｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ２００５／０２７１０７Ａ２）作られる実質的ヒトｍＡｂを包含しない。
【００２０】
ｍＡｂのエピトープは該ｍＡｂが結合する抗原の領域である。２つの抗体が、各々もう一方の抗体が抗原と結合するのを競合的に阻止（ブロック）する場合、それら２つの抗体は同じエピトープまたはオーバーラップエピトープに結合する。すなわち、競合的結合アッセイにおいて測定して、１×、５×、１０×、２０×または１００×過剰のある抗体は、もう一方の抗体の結合を少なくとも５０％、より好ましくは７５％、９０％、または９９％も阻害する（例えばＪｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照）。或いは、一方の抗体の結合を減少させまたは排除するよう抗原に生じさせたアミノ酸突然変異の全てがもう一方の抗体の結合を減少または排除するならば、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少させまたは排除するアミノ酸突然変異の一部がもう一方の抗体の結合を減少させまたは排除するならば、２つの抗体はオーバーラッピングエピトープを有する。
【００２１】
２．ヒト化中和性抗ＨＧＦ抗体
ＨＧＦに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（すなわち抗ＨＧＦｍＡｂ）は、その結合がＨＧＦの１つ以上の生物学的活性を部分的または完全に阻止するならば（すなわちｍＡｂを単一剤として使用する場合）、ＨＧＦを中和する、または中和しつつあると言われる。中和性抗体が阻害する可能性のあるＨＧＦの生物学的特性のなかには、ＨＧＦがそのｃＭｅｔ受容体に結合する能力、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞のようなある種の細胞株の分散をおこすＨＧＦの能力；肝細胞、Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞および種々のヒト腫瘍細胞を含むある種の細胞の増殖を刺激する（すなわちマイトジェニックとなる）ＨＧＦの能力；または例えばヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖または管形成の刺激によって測定するか、またはニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）に適用した際の血管誘導によって測定した血管新生を刺激するＨＧＦの能力である。本発明の抗体類は好ましくはヒトＨＧＦに、すなわちＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｄ９０３３４を有する配列によってコードされるプロテインに結合する。
【００２２】
本発明のヒト化中和性ｍＡｂは、実施例に記載の方法または当業者に公知の方法によってアッセイした際に、例えば０．０１、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０、または５０μｇ／ｍｌの濃度でＨＧＦの生物学的機能（例えば増殖または分散を刺激する）を少なくとも約５０％、より好ましくは７５％、より好ましくは９０％または９５％、または９９％も、最も好ましくはほぼ１００％（実質的に完全に）阻害する。一般的には、使用するＨＧＦ量が生物学的活性を完全に刺激するのに丁度十分であるかまたは０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、３または１０μｇ／ｍｌである場合の阻害程度を測定する。抗体対ＨＧＦのモル比が０．１×、０．５×、１×、２×、３×、５×または１０×であるときに、少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、または９５％の、または実質的に完全な阻害に達するのがより好ましい。ｍＡｂが、上に列挙した生物学的活性の一つだけではなく、幾つかを中和するのが最も好ましい；本明細書中では、抗ＨＧＦｍＡｂがＨＧＦの全ての生物学的活性を中和することを“完全に中和する”と言い、そのようなｍＡｂが最も好ましい。本発明のｍＡｂは特異的にＨＧＦに結合するのが好ましい、すなわちそれらは線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような、ＨＧＦに関連するプロテインには結合しないかまたは遥かに低い程度にしか結合しないのが好ましい。本発明のｍＡｂは一般的にはＨＧＦに対して少なくとも１０７Ｍ−１の結合親和性（Ｋａ）を有し、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上または１０１０Ｍ−１以上もの結合親和性を有する。
【００２３】
本発明のヒト化ｍＡｂは天然テトラマー型（２軽鎖および２重鎖）の抗ＨＧＦ抗体を含み、公知のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥおよびそれらのサブタイプすなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のいずれかとすることができ、カッパまたはラムダ軽鎖を含んでもよい。本発明のｍＡｂはＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のような抗体断片；二価性ハイブリッド抗体（例えばＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５，１９８７）、単鎖抗体（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９，１９８８；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３，１９８８）；および変化した定常部を有する抗体類（例えば米国特許第５，６２４，８２１号）も含む。上記ｍＡｂのＣＤＲは動物（例えばマウス、ラット、ハムスターまたはニワトリ）由来のものであるか、または遺伝子工学によるものでもよい。齧歯類ｍＡｂは、当業者には公知の標準的方法、例えば適切なアジュバントに加えたＨＧＦでｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．または足蹠に多数回免疫し、その後脾臓またはリンパ節細胞を抽出し、適切な不死化細胞株と融合させ、その後ＨＧＦに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するなどの方法によって作られる。
【００２４】
本発明はマウスＬ２Ｇ７ｍＡｂのヒト化型を提供する。マウスＬ２Ｇ７ｍＡｂの成熟重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。図示のように、Ｌ２Ｇ７ｍＡｂのヒト化型は上記配列からのＣＤＲアミノ酸の大部分または全部をヒト可変領域フレームワーク（単一、複合体またはコンセンサス配列ヒトフレームワーク類を含む）内に包含する。例えばあるヒト化抗体は、Ｌ２Ｇ７重鎖からの３つの完全ＣＤＲおよび軽鎖からの３つの完全ＣＤＲを含む。その他のヒト化抗体はＬ２Ｇ７重鎖からの少なくとも１つの完全ＣＤＲおよびＬ２Ｇ７軽鎖からの少なくとも１つの完全ＣＤＲを含む。あるヒト化抗体は、いくつかの残基がＬ２Ｇ７の対応するＣＤＲからのものであり、他の残基が、ヒト抗体のＣＤＲからのもの、より好ましくはそのＣＤＲを含む可変領域フレームワークを供給する同じヒト抗体のＣＤＲからのものである、というＣＤＲを少なくとも１つは含む。
【００２５】
本発明の幾つかのヒト化抗体において、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ９４、Ｌ３およびＬ６０の群から選択された少なくとも１、３、５またはすべての位置は、マウスＬ２Ｇ７抗体におけるＫａｂａｔナンバリングによる対応する位置に存在するアミノ酸によって占められる。実施例に用いられるヒトアクセプタ可変領域フレームワークにおいて、これらの位置のすべてはマウスＬ２Ｇ７抗体の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なるヒト残基によって占められる。このように、この群から選択された全てのまたは大部分の位置が置換されることが好ましい。その他のヒト可変領域フレームワークを用いる場合、これらの位置の幾つかは、ヒト可変領域フレームワークでもマウスＬ２Ｇ７抗体でも同一であるアミノ酸によって占められることも可能である。よって、そのような位置では置換は行わず、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号の法則にしたがって、その他の位置、すなわちヒト可変領域フレームワークとマウスＬ２Ｇ７抗体との間で異なる位置で置換を行う。ヒト可変領域フレームワークの選択に関係なく、上記の群に特定されたもの以外に、別のアミノ酸の置換も以下に述べるように可能である。しかし、ヒト化抗体の重鎖可変領域フレームワークも軽鎖可変領域フレームワークも、アクセプタヒト可変領域フレームワーク（上に述べたようにヒトコンセンサス可変領域フレームワークおよび複合ヒト可変領域フレームワークを含む）に存在しない残基の生成に通ずる１０または１２より多い置換は含まないのが一般的である。
【００２６】
本発明のヒト化抗体に存在する定常部はいずれも、天然のヒト定常部に比較して１０より多くない、より好ましくは２以下の置換を有するヒト定常部、または実質的にこのような定常部である。以下に述べるように、幾つかの置換は抗体の半減期および／またはＦｃγＲｎに対するその親和性の増加に有益である。その他の置換、一般には保存的置換は、以下に述べるように事実上影響を与えない。
【００２７】
Ｌ２Ｇ７の典型的ヒト化型は、図２Ａおよび２Ｂにそれぞれ示される配列を有する成熟重鎖および軽鎖可変領域を含む。ヒト化Ｌ２Ｇ７のその他の好ましい型は、これらの配列に一致する配列を少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％有する（上記Ｋａｂａｔナンバリングによって整列させた場合）成熟重鎖および軽鎖可変領域を含み、および／または少数の（一般的には５または１０個以下のアミノ酸を含む）機能的に重要でない置換、欠失および／または挿入によって上記のものとは異なっている。例えば、重鎖の最初のアミノ酸はＧｌｕまたはＧｌｎのどちらでもよい。このような置換は通常は保存的であり、あるアミノ酸を化学的に類似したもので置換することになる。アミノ酸置換を保存または非保存として分類する目的で、アミノ酸を次のようにグループ化できる：グループＩ（疎水性側鎖）：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；グループＶ（連鎖配向に影響を与える残基）：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的置換は同じグループ内のアミノ酸同士の置換を含む置換である。図２Ａおよび２Ｂの可変領域に関する置換は、実施例に述べるようにＣＤＲとの相互作用によってマウスＬ２Ｇ７からのアミノ酸類が含まれていた以下の位置、すなわちＨ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ９４、Ｌ３およびＬ６０の位置では避けるのが好ましい。置換は可変領域フレームワークの位置に起きるのが好ましいが、ＣＤＲ領域で置換を生じさせることもできる。ＣＤＲ領域が置換される場合、ヒト抗体、好ましくはアクセプタ可変領域フレームワークを供給するヒト抗体と同じものの対応部位（Ｋａｂａｔナンバリング）にあるアミノ酸でマウスアミノ酸を置換するのが好ましい。
【００２８】
通常、ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂは、カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプである。完全ヒトガンマ−１およびカッパ定常部とそれぞれ結合する図２Ａおよび２Ｂの可変領域を有するＩｇＧ１ｍＡｂはＨｕＬ２Ｇ７と呼ばれている。ＨｕＬ２Ｇ７の完全重鎖および軽鎖はそれぞれ図３Ａおよび３Ｂに示される。ナンバー１によって示される位置で始まるこれら配列の成熟部分だけが実際にＨｕＬ２Ｇ７を構成する。それより前に示されているシグナルペプチド類は抗体の分泌前または分泌中に切断されるからである。
【００２９】
ＨｕＬ２Ｇ７に対して同様な結合特性を保持するＨｕＬ２Ｇ７の変異体については、突然変異の後、上記ファージディスプレー法によって質量選択すれば得られる。変異体は先ず最初に、ＨＧＦに対する特異的結合によって選択され、任意にＨｕＬ２Ｇ７またはマウスＬ２Ｇ７と競合させて選択される。典型的抗体と同じまたは類似の結合特性を有する変異体については、その後、機能的試験を行うことができる。
【００３０】
好ましいヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂは、上述のようにＨＧＦを中和、または完全に中和する。好ましくは測定したＨＧＦの幾つかの、大部分の、または全ての生物学的特性（例えばＭｅｔへの結合、Ｍｖ１ＬｕまたはＨＵＶＥＣ細胞の増殖促進など）に関して、ヒト化ｍＡｂの中和活性は、Ｌ２Ｇ７そのものの中和活性の３倍以内、より好ましくは２倍または１．５倍以内であり、区別不可能（すなわち実験的誤差範囲内）であるのが最も好ましい。すなわち、生物学的特性を同程度に阻害する（例えばＩＣ５０によって測定）ためには、Ｌ２Ｇ７に比較して、ヒト化ｍＡｂがせいぜい３倍、２倍、１．５倍の量または同量必要である。ヒト化ｍＡｂのＨＧＦに対する親和性も、Ｌ２Ｇ７のそれの３倍以内、２倍以内またはＬ２Ｇ７のそれとほとんど区別できないのが好ましい。同様に、異種移植マウスモデル（例えばＵ８７のようなヒトグリオーマ細胞株を用いる）において、ヒト化ｍＡｂはマウスＬ２Ｇ７ｍＡｂの３倍以内、２倍以内またはマウスＬ２Ｇ７ｍＡｂと区別できない程度に腫瘍増殖を阻止するのが好ましい。実際、好ましいことに、ヒト化ｍＡｂをたった４０、２０または１０μｇ用量で１週間に２回投与するだけで、Ｕ８７腫瘍異種移植片の増殖は完全に阻止される。
【００３１】
ヒト化ｍＡｂは当業者に公知の種々の方法によって発現できる。例えば軽鎖および重鎖Ｖ部をコードする遺伝子は、先ず最初にオーバーラッピング・オリゴヌクレオチド類から、または所望遺伝子のあらかじめ作成された変異体のＰＣＲ突然変異誘発によって合成できる。遺伝子コードの縮重があるために、種々のＤＮＡ配列が各抗体のアミノ酸配列をコードする。本出願に記載される抗体類をコードする全てのＤＮＡ配列は明白に本発明に含まれる。一方、ヒト化ｍＡｂ軽鎖および重鎖遺伝子をコードする遺伝子を作り、必要な調節領域、例えばプロモータ類、エンハンサー類、ポリＡ部位などを提供する発現ベクター（例えばインビトロゲンから市販されている）に、Ｃ部と共に挿入された。ＣＭＶプロモータ−エンハンサの使用が好ましい。Ｃ部のための遺伝子は今や広く入手でき、またはヒト抗体産生細胞からのＰＣＲによって容易にクローン化される。軽鎖および重鎖の遺伝子は単一ベクターに一緒に挿入してもよいし、別々のベクターに挿入することもできる。発現ベクター類はその後リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどの当業者に公知の種々の方法を用いて、ＣＨＯまたは２９３のような哺乳類細胞株またはＳｐ２／０およびＮＳ０を含む非生産的骨髄腫および適切な抗生物質選択によって選択された抗体類を発現する細胞にトランスフェクトするとよい。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号を参照されたい。市販のバイオリアクタ中で細胞を増殖させることによってより多量の抗体が生産できる。
【００３２】
発現した本発明のヒト化ｍＡｂは精密濾過法、限外濾過法、プロテインＡまたはＧアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および／または有機色素に基づくその他の型のアフィニティクロマトグラフィーなどの、当業者に公知の標準的方法によって精製できる。医薬用としては少なくとも約９０または９５％の均質性を有する実質的に純粋な抗体類が好ましく、９８％または９９％以上の均質性を有するものが最も好ましい。
【００３３】
３．治療法
好ましい実施形態において本発明は、本明細書に記載のヒト化抗体を含む医薬組成物を提供する。それら抗体の医薬組成物はｍＡｂを生理的に容認される担体中に、任意に賦形剤または安定剤と共に、凍結乾燥または水溶液の形で含む。容認できる担体、賦形剤または安定剤は使用される用量および濃度では受容者にとって無毒であり、一般的には５．０ないし８．０のｐＨ、最も一般的には６．０ないし７．０のｐＨにおいてリン酸塩、クエン酸塩または酢酸塩のような緩衝剤；等張にするために塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩類；抗酸化剤、保存料、低分子量ポリペプチド、プロテイン、ポリソルベート８０のような親水性ポリマー類、アミノ酸類、炭水化物類、キレート剤、糖類および当業者に公知のその他の標準的成分を含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．１９８０を参照されたい）。ｍＡｂは一般的には１−１００ｍｇ／ｍｌの濃度、例えば１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３４】
また別の好ましい実施形態において、本発明は医薬組成物中の例えばＨｕＬ２Ｇ７などのヒト化Ｌ２Ｇ７のようなヒト化抗ＨＧＦｍＡｂを用いて、ある疾患にかかった患者を処置する方法を提供する。医薬組成物中に調製されたｍＡｂは任意の適切な投与経路、特に点滴またはボーラスによる静脈注射による非経口投与、筋肉内投与あるいは皮下投与することができる。静脈内点滴はたった１５分間の投与でもよいが、３０分間または１、２時間、または３時間もかけて投与するのがより一般的である。ｍＡｂは疾患部位（腫瘍など）に直接注射することもできるし、リポソームのような運搬剤中に封入する事もできる。投与量は処置すべき病気を軽減するのに十分な量（治療的有効量）であり、０．１ないし５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１、２、３または４ｍｇ／ｋｇでよいが、１０ｍｇ／ｋｇまたは１５または２０ｍｇ／ｋｇでもよい。固定単位量、例えば５０、１００、２００、５００または１０００ｍｇを投与してもよいし、または投与量を患者の体表面積に基づいて決めることができる、例えば１００ｍｇ／ｍ２など。癌を処置するには通常１ないし８回（例えば１、２、３、４、５、６、７、または８回）投与されるが、１０回、２０回またはそれ以上の投与でもよい。ｍＡｂは例えばｍＡｂの半減期などに応じて、毎日、週２回、週１回、隔週、月１回またはその他の間隔で、１週間、２週間、４週間、８週間、３−６ケ月、またはそれより長く投与できる。慢性投与などの反復的に処置する仕方も可能である。
【００３５】
本発明のヒト化抗ＨＧＦｍＡｂ、例えばＨｕＬ２Ｇ７による治療に特に感受性の高い疾患としては、血管新生を要するか、またはＨＧＦのレベル上昇に関連していると考えられる充実性腫瘍、例えば卵巣癌、乳癌、肺癌（小細胞または非小細胞癌）、大腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、頭部および頸部腫瘍、メラノーマおよび子供または大人の肉腫、および脳腫瘍が含まれる。実際、本発明の方法、特にヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂによる全身治療は、髄膜腫；脳室上衣細胞腫、乏突起神経膠腫および全ての型の神経膠星状細胞腫（低程度、アナプラスティック、および多形性神経膠芽細胞腫または単純神経膠芽細胞腫）を含む神経膠腫；髄芽細胞腫、神経節膠腫、神経髄腫、脊索腫、主として子供に生じる初期神経外胚葉腫などの脳腫瘍の処置に特に適用できる。原発性脳腫瘍（すなわち脳に発生する）および続発性または転移性脳腫瘍の両方とも本発明の方法によって処置できる。本発明の方法による処置に適したその他の疾患は糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、リウマチ性関節炎および乾癬のような不都合な新脈管形成と関連する疾患である。
【００３６】
特に好ましい実施形態において、例えばＨｕＬ２Ｇ７などのヒト化抗ＨＧＦｍＡｂがその他の抗癌治療と共に（すなわち抗癌治療の前、最中または後に）投与される。例えば、ｍＡｂは、腫瘍学の当業者には公知の化学療法剤、例えばカルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキシプラチン、プロカルバジン、およびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセートおよびヒドロキシウレアのような代謝拮抗物質；植物アルカロイドを含める天然生成物およびブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびタキソール（パクリタキセル）のような抗生物質、またはタキソテレ（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標）のような関連化合物類；テモゾロミドおよびカルムスチン含有グリアデル（Ｇｌｉａｄｅｌ）（登録商標）ウエファーなどの、脳腫瘍のために特に承認された薬剤類；およびイリノテカンおよびグリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標）を含むその他の薬剤類、およびＷＯ２００５／０１７１０７Ａ２（これは参考として本明細書に組み込まれる）に列挙される全ての承認された抗癌剤および実験的抗癌剤などの任意の一種類以上と共に投与できる。ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂと共に投与できるその他の薬剤としては、ＨＥＲ２抗原に対するヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（商標）、ＶＥＧＥに対するアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（商標）またはＥＧＦ受容体に対する抗体などのモノクローナル抗体類、並びに小分子抗血管新生薬またはＥＧＦ受容体拮抗薬のような生物製剤が含まれる。その上ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂは、放射線治療または手術と共に使用できる。
【００３７】
ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂ抗体、例えばＨｕＬ２Ｇ７を含む処置（例えば標準的化学療法）は次の腫瘍（例えば卵巣、胸、肺、膵臓、脳および大腸の腫瘍、特に再発または難治性）にかかった患者の、無憎悪期間中央値または全生存期間を、抗ＨＧＦｍＡｂ以外は同じ処置（例えば化学療法）を受けた患者に比べて、少なくとも３０％または４０％、より好ましくは５０％、６０％ないし７０％、または１００％、またはそれ以上も延長した。それに加えて、またはそれとは別に、抗ＨＧＦｍＡｂを含む処置（例えば標準的化学療法）は次の腫瘍（例えば卵巣、胸、肺、膵臓、脳および大腸の腫瘍、特に再発または難治性の場合）をもつ患者の完全寛解率、部分寛解率、または全奏効率（完全＋部分）を、抗ＨＧＦｍＡｂ以外は同じ処置（例えば化学療法）を受けた患者に比較して、少なくとも３０％または４０％、より好ましくは５０％、６０％ないし７０％、または１００％も高めることができる。神経膠芽細胞腫のような脳腫瘍では、ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂの単独の処置、またはその他の薬剤と組み合わせた処置は、好ましくは、部分的寛解率、完全寛解率または全奏効率を少なくとも５％または１０％、より好ましくは２０％または２５％または３０％、および最も好ましくは４０％、５０％またはそれ以上高める。
【００３８】
標準治療＋ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂ、例えばＨｕＬ２Ｇ７、で処置した患者の無憎悪期間中央値および／または寛解率は、上記のように標準治療だけ（またはプラセボを追加）を受けた患者の対照群に比較して増加したが、その増加は一般的に臨床試験（例えばＩＩ相、ＩＩ／ＩＩＩ相またはＩＩＩ相治験）では、例えばｐ＝０．０５または０．０１または０．００１のレベルのときに統計的に有意となる。完全および部分寛解率は癌の臨床試験において一般的に用いられ、例えば米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）および／または食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が挙げている、または承認している客観的基準によって測定される。
【００３９】
４．その他の方法
本発明のヒト化抗ＨＧＦｍＡｂは、診断的、予測的および実験的方法にも用いられる。それらを用いて腫瘍中および癌患者の血行中のＨＧＦレベルを測定することができ、したがってその腫瘍の処置を追跡し、指針をだすことができる。例えば高レベルのＨＧＦと関連している腫瘍であれば特にヒト化抗ＨＧＦｍＡｂによる処置に反応しやすいであろう。特定の実施形態において、ｍＡｂをＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイに用い、例えば腫瘍生検標本中、または血清中、または細胞培養中のＨＧＦ分泌細胞の培地上澄液中のＨＧＦレベルを測定できる。種々のアッセイにおいて、抗ＨＧＦｍＡｂを蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位体で標識してもよく、ＨＧＦのアッセイを行うために必要なすべての試薬と共にキットの形で提供してもよい。その他の用途では、抗ＨＧＦｍＡｂは例えばアフィニティクロマトグラフィーによってＨＧＦを精製するために用いられる。
【実施例】
【００４０】
１．ヒト化Ｌ２Ｇ７抗体の構造
ＨＧＦのすべての被検生物学的活性を中和するマウス抗ＨＧＦｍＡｂ  Ｌ２Ｇ７の生成はすでに記載されている（２００４年８月１３日に出願されたＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開２００５００１９３２７およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：１２９２，２００６）。Ｌ２Ｇ７をヒト化するための第一工程はその軽鎖および重鎖遺伝子をクローン化することであった。それは本質的にＣｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９、１９９２の方法によって達成された。つまり、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて１０６Ｌ２Ｇ７（ＩｇＧ２ａ、κ）ハイブリドーマ細胞からＲＮＡを作り、その後ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのキットを用いてランダムプライマーで第一のストランドｃＤＮＡを合成し、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））でｄＧ尾部を付加する。重鎖および軽鎖Ｖ部は、それぞれｄＧ尾部にアニーリングするプライマー、重鎖ではＣγ２ａのＮ末端領域にアニーリングするプライマーおよび軽鎖ではＣκのＮ末端領域にアニーリングするプライマーで、ハイフィデリティポリメラーゼＡｃｃｕＰｒｉｍｅＰｆｘ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて、ｃＤＮＡから増幅された。ＰＣＲ反応物から適切なサイズのバンド類をゲル精製し、直接配列決定をするか、またはクローン化してから配列決定した。配列決定は自動シーケンサーでジデオキシ法を用いて行った。単一のｃＤＮＡ配列が重鎖で見いだされた。それを翻訳したものを図１Ａに示す。２つの異なる見かけ上異常でない軽鎖ｃＤＮＡ配列が見いだされたが、単離されたＬ２Ｇ７軽鎖のＮ末端のアミノ酸配列はこれらの鎖の１つだけをあらわした。その翻訳後のアミノ酸配列を図１Ｂに示す。
【００４１】
Ｌ２Ｇ７のキメラ型、続いてヒト化ｍＡｂを発現するために、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９，１９９２に記載される、ヒトＣκおよびＣγ１遺伝子を含む、ｐＶＫおよびｐＶｇ１に類似の発現ベクター類を市販のベクターおよびＤＮＡ断片から構成した。しかし軽鎖ベクターはｇｐｔの代わりにｈｙｇ選択マーカーを有し、重鎖ベクターはＤｈｆｒの代わりにｎｅｏ選択マーカーを有する。クローン化ＶＬおよびＶＨ遺伝子をこれらベクターの適切な部位にサブクローンし、キメラＬ２Ｇ７（ｃｈＬ２Ｇ７）ｍＡｂ軽鎖および重鎖遺伝子のための発現プラスミドを生成した。正しい軽鎖および重鎖Ｖ部がクローン化されていれば、ｃｈＬ２Ｇ７ｍＡｂが生成し、Ｌ２Ｇ７と同様にＨＧＦに結合することが判明した。
【００４２】
ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂを設計するために、一般にはＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，５３０，１０１号および第５．５８５，０８９号の方法にしたがった。Ｌ２Ｇ７  ＶＨおよびＶＬ配列のためのアクセプタ配列として役立つものがないか、ヒト抗体配列のナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））データベースを調べたところ、ヒトＶＨ配列ＡＡＣ１８３２３およびＶκ配列ＢＡＣ０１７２６がそれらに対して特に高いフレームワーク相同性（すなわちシーケンス同一性）をもつことがわかったので、これらの配列がそれぞれ選ばれた。ワールドワイドウェブから得ることができるコンピュータプログラム、Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｄｂｖ／）を用いてＬ２Ｇ７可変ドメインの分子モデルを構成し、それを用いて、ＣＤＲに十分近く、それらと相互作用する可能性のあるＬ２Ｇ７フレームワーク中のアミノ酸類の位置を突き止めた。ヒト化Ｌ２Ｇ７重鎖および軽鎖可変領域を設計するために、マウスＬ２Ｇ７ｍＡｂ由来のＣＤＲを先ず最初に概念的にそれらアクセプタフレームワーク領域にグラフトした。ＣＤＲとの明らかな接触がコンピュータモデルによって示唆され、そのＣＤＲコンフォメーションを維持するために必要であると思われるフレームワーク位置において、元となるヒトフレームワークのアミノ酸の代わりに、マウス抗体からのアミノ酸が用いられた。これは、ＨｕＬ２Ｇ７と呼ばれるヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂの場合、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖残基２９、３０（Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループＨ１内）、４８、６６、６７、７１および９４および軽鎖残基３および６０で行われた。加えて、重鎖のアミノ酸１はＥ（Ｇｌｕ）で置換された。なぜならばこのアミノ酸は抗体プロテインにおいてＱ（Ｇｌｎ）よりも誘導体化されにくいからである。ＨｕＬ２Ｇ７の重鎖および軽鎖のＶ部の配列をそれぞれＬ２Ｇ７およびアクセプタＶ部に対して整列させたものを、図２Ａおよび２Ｂに示す。ＣＤＲおよび置換アミノ酸が強調表示されている。
【００４３】
本発明は変異ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂも提供する。この変異ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂの成熟重鎖および軽鎖可変領域は、ＣＤＲでも可能であるが、通常はそのフレームワークにおいて、少数（例えば一般的には１、２、３、５または１０以下）の置換、欠失または挿入があるため、ＨｕＬ２Ｇ７の配列とは異なる。具体的には、上記の置換のうちの一部だけをアクセプタフレームワークで生じさせることもできるし、その他の置換（類）を生じさせることもできる。例えばマウスＬ２Ｇ７  ＶＨアミノ酸６９Ｆはアクセプタアミノ酸６９Ｍの代わりになることができる。他方、ＶＨアミノ酸１ＥがＱに代わることもある。実際、ＨｕＬ２Ｇ７のＣＤＲと接触していないフレームワーク残基の多くは、Ｌ２Ｇ７またはその他のマウスまたはヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換に適応することができる。さらに、ＣＤＲと接触していると思われる多くの残基も置換を受け易く、さらにはＣＤＲ内のアミノ酸も置換を受け易い。
【００４４】
変異ヒト化Ｌ２Ｇ７配列に行われる置換は、置換されたＨｕＬ２Ｇ７アミノ酸に関して保存的であることが非常に多い。好ましくはＨｕＬ２Ｇ７の置換（保存的であってもなくても）はヒト化ｍＡｂの結合親和性または効力、すなわちＨＧＦの生物学的活性を中和するその能力に実質的には影響しない（例えば変異ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂの本明細書に記載されるアッセイの幾つかまたは全てにおける効力は、ＨｕＬ２Ｇ７のそれとほぼ同じ、すなわち実験的誤差範囲内である）。好ましくは、成熟した変異軽鎖および重鎖Ｖ部配列は対応するＨｕＬ２Ｇ７成熟軽鎖および重鎖Ｖ部に対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８パーセント一致する。或いは、Ｌ２Ｇ７の抗体可変領域と高い配列同一性を有するその他のヒト抗体可変領域も、ヒト化抗体フレームワーク、特にヒトサブグループＩからのカッパＶ部およびヒトサブグループＩからの重鎖Ｖ部、またはこれらのサブグループのコンセンサス配列を作るのに適している。
【００４５】
以下の実施例において述べる典型的ｍＡｂ  ＨｕＬ２Ｇ７はヒトκおよびγ１定常部を有し、したがってＩｇＧ１である：シグナルペプチド類を含むＨｕＬ２Ｇ７重鎖および軽鎖遺伝子の完全配列を図３Ａおよび図３Ｂに示す。（もちろんシグナルペプチド類は切り離され、ＨｕＬ２Ｇ７の部分にはならない。）一方、当然のことながら、その他の（ＩｇＧ１、κ）アロタイプ類のＩｇＧ１ｍＡｂがＨｕＬ２Ｇ７という呼称に包含される。その他のアイソタイプ（例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）のヒト化ｍＡｂは、ＨｕＬ２Ｇ７可変領域と適切なヒト定常部との結合によって作ることができる。ＨｕＬ２Ｇ７定常部に置換を行い、補体仲介性細胞毒性またはＡＤＣＣのようなエフェクタ機能を弱め、または高め（例えばＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，８３４，５９７号；およびＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：４００５，２００６を参照）、またはヒトでの半減期を長くすることができる（例えばＨｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照）。特に、だが非制限的に、ＩｇＧ定常部の位置２５０のＧｌｎおよび／または位置４２８のＬｅｕに突然変異を有するＨｕＬ２Ｇ７が本発明の実施形態である。
【００４６】
ＨｕＬ２Ｇ７ｍＡｂを設計し、すなわち軽鎖および重鎖のＶ部のアミノ酸配列を選択し、Ｖ部（シグナルペプチドを含む）をコードするＤＮＡ配列を遺伝子コードによって通常通りに選択した；これらの配列は、クローニングのための制限部位およびＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを提供するべく、開始ＡＴＧコドン前のＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣで始まっていた。これらの遺伝子はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．（ピスカタウェイ、ＮＪ）に出して合成してもらった。或いは、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９，１９９２の方法を用いて各Ｖ部遺伝子を合成することができる。つまり、交互になったストランド上の重複オリゴヌクレオチドが２対合成される（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ＤＮＡ合成器）。これらは一緒になって全遺伝子を包含する。これらのオリゴヌクレオチドは１１０ないし１４０塩基長で、１５塩基はオーバーラップしている。二本鎖ＤＮＡ断片類はＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いてオリゴの５’対から、それとは別個に３’対から合成される。５’ＤＮＡ断片はＶ部遺伝子の５’末端と中心とを切断する制限酵素で切り離される。３’ＤＮＡ断片はＶ部遺伝子の中心と３’末端とを切断する制限酵素で切り離される。切り離された各断片は適切なクローニングベクターに挿入され、Ｅ．Ｃｏｌｉに形質転換し、多数の単離体からのＤＮＡのシーケンシングが行われ、完全に正しい配列を有する断片が見いだされる。各遺伝子で、その後３−ｗａｙリゲーションが行われ、正しい５’および３’断片が適切な発現ベクターに挿入され、完全な遺伝子が形成される。その配列は検証されている。
【００４７】
ＨｕＬ２Ｇ７ｍＡｂを生産するために、ヒト腎上皮２９３−Ｆ細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（ＦＳ培地；インビトロジェン）に培養し、１０６細胞／２ｍｌ／マクロウェルでＦＳ培地にて再培養した。ＨｕＬ２Ｇ７軽鎖および重鎖発現ベクターＤＮＡｓ（各１μｇづつ）を３μｌのＦｕｇｅｎｅ６（ロッシュ）と共に、１００μｌのＦＳ培地中で室温で３０分間インキュベートした；次にその混合物をこれらの細胞に加えた。４８時間のインキュベーション後、トランスフェクトされた細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で培養し、ｎｅｏを発現する細胞を選択し、９６ウェル組織培養プレートに撒いた（１００μｌ／ウェル）。約２週間後にはウェルに生育細胞が集密しており、これらのウェルからの培養上澄液についてＨｕＬ２Ｇ７の存在および量をＥＬＩＳＡ法によって試験した。トランスフェクトされた細胞は不均衡な軽鎖および重鎖を分泌するおそれもあるので、完全なＨｕＬ２Ｇ７だけを確実に測定するためにこのＥＬＩＳＡ法では捕捉剤としてヤギ抗ヒトＦｃを、検出試薬としてビオチニル化抗ヒトカッパを用いる。ｃｈＬ２Ｇ７ｍＡｂが同様に発現された。比較的高レベルのＣｈＬ２Ｇ７およびＨｕＬ２Ｇ７を発現する細胞のクローンはＦＳ培地中でそれぞれ拡がり、増殖した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて抗体を培養上清から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を分析した。
【００４８】
２．ＨｕＬ２Ｇ７の特性
ＨｕＬ２Ｇ７の結合親和性をＣｈＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７のそれと比較するために、競合的結合実験を行った。ミクロタイタープレートにＰＢＳ中ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＧαｈＩｇＧ−Ｆｃ）、２μｇ／ｍｌを５０μｌ／ウェルで塗布し、これを一晩、４℃で置き、室温下、２％ＢＳＡで１時間ブロックした。洗浄後、そのプレートを５０μｌ／ウェルのＣｈＬ２Ｇ７ｍＡｂ（２μｇ／ウェル）と共に室温で１時間インキュベートし、その後５０μｌ／ウェルのヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）で１時間洗い、バックグラウンドを減らした。洗浄後、プレートのウェルを個別に、競合物としての種々濃度の精製ＨｕＬ２Ｇ７、ＣｈＬ２Ｇ７またはＬ２Ｇ７の５０μｌ／ウェルと、５０μｌ／ウェルのＨＧＦ−Ｆｌａｇ（１μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、プレート類を５０μｌ／ウェルのＨＲＰ−Ｍ２  抗Ｆｌａｇ  ｍＡｂ（インビトロジェン）と共にインキュベートし、結合したＨＲＰ−抗ＦｌａｇＭ２をテトラメチルベンチジン基質の添加によって検出した。図４は、可溶性ＨＧＦ−Ｆｌａｇとの結合に関してＨｕＬ２Ｇ７、ＣｈＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７がほぼ等しく良好に、プレートに結合したＬ２Ｇ７と競合することを示し、これら３種類のｍＡｂが非常に類似した親和性を有することを示唆する。
【００４９】
ＨＧＦの重要な生物学的活性は、その受容体ｃＭｅｔに対する結合能力である。そこでＨｕＬ２Ｇ７、ＣｈＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７ｍＡｂの、ＨＧＦとＭｅｔとの結合を阻害する能力を比較した。ＭｅｔはＭｅｔ−Ｆｃの形で、ＨＧＦはＨＧＦ−Ｆｌａｇの形で用いた。これらは記載のように調製された（２００４年、８月１３日に出願された米国特許出願第１０／９１７，９１５号、およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：１２９２，２００６）。ミクロタイタープレートに、ＰＢＳに加えた２種類の抗Ｍｅｔ  ｍＡｂ（ギャラクシー・バイオテク（Ｇａｌａｘｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））、それぞれ２μｇ／ｍｌを、５０μｌ／ウェルで塗布し、これを４℃で一晩置き（或いは２μｇ／ｍｌのＧαｈＩｇＧ−Ｆｃを使用してもよい）、室温下、２％ＢＳＡで１時間ブロックした。それらプレートを洗浄後、５０μｌ／ウェルのＭｅｔ−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）を各ウェルに室温で加え、１時間置き、その後５０μｌ／ウェルのヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）によって１時間洗浄し、バックグラウンドを減らした。それらプレートを洗浄後、種々濃度のｍＡｂと共に予めインキュベートしたＨＧＦ−Ｆｌａｇ（０．５μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェル、各ウェルに加え、１時間置いた。洗浄後、それらプレートをＨＲＰ−Ｍ２抗Ｆｌａｇ  ｍＡｂ（インビトロジェン）、５０μｌ／ウェルと共にインキュベートし、結合したＨＲＰ−抗ＦｌａｇＭ２を上記のように基質の添加によって検出した。図５は、ＨｕＬ２Ｇ７、ＣｈＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７がＨＧＦとＭｅｔとの結合を等しく良好に阻害し、したがってこれらのｍＡｂがこのアッセイにおいては非常に類似した活性を有することを示す。
【００５０】
ＨＧＦのもう一つの重要な生物学的活性は、Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞を含むある種の細胞の増殖を刺激する能力である。ＨＧＦのこの活性を中和する能力をＨｕＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７で比較するために、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で増殖したＭｖ１Ｌｕ細胞（２×１０４細胞／１００μＬ／ウェル）を無血清ＤＭＥＭに再懸濁させ、１００μＬ／ウェルのＨＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）  プラス  フォーミング成長因子−β１（１ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ）で刺激してバックグラウンドおよび種々濃度のＨｕＬ２Ｇ７、Ｌ２Ｇ７または無関係な対照ヒト抗体を減らした。細胞増殖レベルはＷＳＴ−１（ロッシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））を加え、１４時間後に測定した。図６はＨｕＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７がこのアッセイでは等しい阻害活性を有することを示している。要するに、ＨｕＬ２Ｇ７は使用した全てのアッセイにおいてＬ２Ｇ７と少なくとも同等の活性を有し、したがって完全に中和する：Ｌ２Ｇ７の活性はヒト化工程においては失われなかった。
【００５１】
３．ＨｕＬ２Ｇ７のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害能力。
【００５２】
Ｌ２Ｇ７ｍＡｂはヌードマウスモデルにおけるＵ８７神経膠腫異種移植片の増殖を完全に阻害することができる（２００４年、８月１３日に出願された米国特許出願第１０／９１７，９１５号、およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：１２９２，２００６）。ＨｕＬ２Ｇ７もこの能力をもつことを証明するために、同じ実験法を用いた。つまり、４−６週齢の雌ＮＩＨ  ＩＩＩ  Ｘｉｄ／Ｂｅｉｇｅ／Ｎｕｄｅマウス（チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に０．１ｍｌのＰＢＳ中に加えた１０７細胞を背中領域に皮下注射した。腫瘍の大きさが約５０ｍｍ３に達したとき、それらマウスを無作為にグループに分け（ｎ＝６／グループ）、容量０．１ｍｌのＰＢＳに加えた４０μｇのＨｕＬ２Ｇ７、Ｌ２Ｇ７または対照ＰＢＳを週２回腹腔内注射した。週に一度、腫瘍体積を二次元の測定（長さ、ａおよび幅、ｂ）によって決定し、体積を＝ａｂ２／２として計算した。図７はこのアッセイにおいてＨｕＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７が腫瘍増殖を区別がつかないほど同様に阻害すること示している。さらにＨｕＬ２Ｇ７の腫瘍異種移植片の増殖阻害能力を明らかにするために、ｍＡｂの４種類の用量、４０μｇ、２０μｇ、１０μｇおよび５μｇを同様な実験に用いた。図８は、１０μｇという極めて低い用量でも週２回の投与で腫瘍増殖を完全に阻害することができ、さらに低い５μｇという用量では、良好に阻害はするが不完全であることを示している。同様に、全身的にＨｕＬ２Ｇ７を投与した場合、それは頭蓋内Ｕ８７異種移植片の増殖を効果的に阻害する。
【００５３】
本発明を現在の好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明を逸脱することなく種々の変更が可能であることは当然である。
【００５４】
記載される全ての出版物、特許および特許出願は、それらを全ての目的のために引用によってそのまま本明細書に組み込む旨が具体的かつ個別に明記されていなくても、全ての目的のために引用によってそのまま本明細書に組み込まれるものである。
【００５５】
Ｌ２Ｇ７ハイブリドーマはブダペスト条約に基づき、２００３年４月２９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１０８にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５１６２として寄託された。この寄託は公認された寄託機関に保管され、突然変異、生育不能または破壊が起きた場合、寄託機関に寄せられたサンプル譲渡の直近の要請から少なくとも５年間、寄託日付後少なくとも３０年間、または関連特許の施行期間中のうちの最も長い期間中であれば取り代えられる。公衆がこれらの細胞を入手する際のすべての制約は、出願による特許の発行時に取消不能で除かれる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】クローン化ｃＤＮＡから翻訳されたＬ２Ｇ７成熟重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列である。ＣＤＲに下線が引いてある。Ｋａｂａｔナンバリング系が使用されている。
【図２】ＨｕＬ２Ｇ７重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）成熟可変領域のアミノ酸配列をＬ２Ｇ７およびアクセプタＶ部と整列させたものを示す。Ｌ２Ｇ７配列においてＣＤＲには下線が引いてある。ＨｕＬ２Ｇ７配列においてマウスＬ２Ｇ７アミノ酸類で置換されたアミノ酸類には下線が引いてあり、最初のアミノ酸Ｈ１Ｅには二重下線が引いてある。Ｋａｂａｔナンバリング系が用いられる。
【図３】ＨｕＬ２Ｇ７重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）全体のアミノ酸配列である。成熟重鎖および軽鎖の最初のアミノ酸（すなわちシグナル配列の切断後）には二重下線が引かれ、ナンバー１の標識が付されている；これらのアミノ酸は成熟Ｖ部の最初のアミノ酸でもある。重鎖において、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の最初のアミノ酸に下線が引かれ、軽鎖ではＣκ領域のアミノ酸に下線が引かれる。
【図４】ＨＧＦとの結合に対するＨｕＬ２Ｇ７、ＣｈＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７の競合的結合アッセイ。
【図５】ＨＧＦとＭｅｔとの結合をブロックするＨｕＬ２Ｇ７、ＣｈＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７の相対的能力。
【図６】Ｍｖ１Ｌｕ細胞のＨＧＦ誘導性増殖を阻害するＨｕＬ２Ｇ７およびＬ２Ｇ７の相対的能力。
【図７】ＮＩＨ  ＩＩＩ  Ｂｅｉｇｅ／Ｎｕｄｅマウス群におけるＵ８７皮下異種移植片の増殖に対するＨｕＬ２Ｇ７またはＬ２Ｇ７  ｍＡｂまたはＰＢＳ対照による処置の効果。矢印は注射開始時を示し、誤差棒は平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。Ｌ２Ｇ７およびＨｕＬ２Ｇ７を示す記号はこの図では重なり、見分けられない。
【図８】ＮＩＨ  ＩＩＩ  Ｂｅｉｇｅ／Ｎｕｄｅマウス群におけるＵ８７皮下異種移植片の増殖に対するＨｕＬ２Ｇ７の４種類の用量レベルの影響。矢印は注射開始時を示し、誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１】
2009532378.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年12月10日(2008.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009532378000001.app
【国際調査報告】
2009532378.tif 000011
2009532378.tif 000012