(57)【要約】  本発明は、生体外および生体内での哺乳動物細胞、特にヒトの皮膚細胞およびヒトの皮膚に対する加齢の悪影響を打ち消すための方法および組成物と、６，９−二置換プリン誘導体を含有する組成物を投与することによる、哺乳動物における過剰増殖および関連する皮膚疾患の処置とを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の加齢の悪影響を緩和するための方法であって、哺乳動物細胞に、ある量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、前記６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩
【化１】
2009543799.tif 000018
（式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、およびメトキシ置換ベンジルであり；Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニル、または２−テトラヒドロフラニルである）であり、前記量は、哺乳動物細胞の加齢の悪影響を緩和するのに有効であることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｒ6は、フルフリル、またはメトキシ置換フルフリルであり、Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ6はフルフリルであり、Ｒ9は２−テトラヒドロピラニルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記量は、約０．０５から約１０％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記量は、約０．０５から約１０％であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記量は、約０．０５から約１０％であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記量は、約０．１から約２％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記量は、約０．１から約２％であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記量は、約０．１から約２％であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物の皮膚疾患または皮膚状態を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物の皮膚細胞に、有効量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、前記６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩
【化２】
2009543799.tif 000019
（式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、またはメトキシ置換ベンジルであり；Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニル、または２−テトラヒドロフラニルである）であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
哺乳動物の炎症状態を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物の細胞に、有効量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、前記６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩
【化３】
2009543799.tif 000020
（式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、またはメトキシ置換ベンジルであり；Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニル、または２−テトラヒドロフラニルである）であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞の加齢の悪影響を緩和するための方法であって、哺乳動物細胞に、ある量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、前記６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩
【化４】
2009543799.tif 000021
であり、前記量は、哺乳動物細胞の加齢の悪影響を緩和するのに有効であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記量は、約０．０５から約１０％であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記量は、約０．１から約２％であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物細胞は、ヒト皮膚細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞は、ヒト皮膚細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物細胞は、ヒト皮膚細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトの皮膚に対する加齢の悪影響を緩和するための方法であって、ヒトの皮膚に、ある量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、前記６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩
【化５】
2009543799.tif 000022
であり、前記量は、ヒトの皮膚の加齢の悪影響を緩和するのに有効であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記量は、約０．０５から約１０％であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記量は、約０．１から約２％であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００６年７月１０日に出願した米国特許仮出願第６０／８０６８７１号明細書の優先権を主張する、２００７年７月９日に出願した米国特許出願第１１／７７４６５２号明細書の継続出願である。
【０００２】
本発明は、生体外および生体内で、特にヒトの皮膚細胞を含めた哺乳動物細胞に対する加齢の悪影響を打ち消すための方法および組成物、ならびに６，９−二置換プリン誘導体を含有する組成物を投与することによる、哺乳動物での過剰増殖および関連する皮膚疾患の処置を提供する。
【背景技術】
【０００３】
細胞加齢または細胞老化は、外因性成長因子に対して細胞が応答することができないということも含めた、増殖潜在性または能力の年齢に依存した損失を伴う形態学的変化によって明らかとなる、正常な非形質転換細胞の普遍的特性である。細胞老化の現象を説明する様々な理論が提示されてきた。実験的証拠は、増殖潜在性または能力の年齢に依存した損失が、遺伝的プログラムと相関関係があり得ることを示唆している（例えば、非特許文献１および２参照）。この証拠は、静止期細胞老化表現型が増殖表現型より優位であること（例えば、非特許文献３および４参照）、および幼若細胞との癒合の前に、ヘテロ二核相の若い核内でのＤＮＡ合成を阻害するのに、老化細胞でのタンパク質合成を必要とすること（例えば、非特許文献５および６参照）を実証する、生体外でのヒト線維芽細胞を用いた細胞融合の研究を含む。また、幼若線維芽細胞への老化線維芽細胞ｍＲＮＡの微量注入は、幼若細胞がＤＮＡを合成する能力を阻害し（例えば、非特許文献７参照）、幼若細胞が細胞周期のＳ期に入るのを阻害する（例えば、非特許文献８参照）。さらに、ユニークｍＲＮＡ種が、生体外で老化線維芽細胞において増幅する（例えば、非特許文献９、１０、１１、および１２参照）。改変された遺伝的プログラムが老化ヒト線維芽細胞内に存在することが示唆されており、これは、転写レベルでｃ−ｆｏｓ発現の抑制を伴うものである（例えば、非特許文献１３参照）。このように、幼若細胞と古い細胞との間には、遺伝型および表現型の相違があると思われる。
【０００４】
近年、六置換アミノプリンには、著しい生化学的意義があると推定されている。このタイプのいくつかの化合物は、植物の成長を促進させ、「サイトカイニン」と呼ばれる成長調節因子の群に属する（例えば、非特許文献１４参照）。植物組織培養での細胞分裂の誘導に基づくバイオアッセイでは、最も活性なサイトカイニン化合物が、天然に生ずるサイトカイニン、トランス−ゼアチン（６−（（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エニルアミノ）プリン、例えば、非特許文献１５参照）である。ゼアチンに密接に関係するサイトカイニンは、可溶性ＲＮＡ中に塩基として生ずる（例えば、非特許文献１６参照）。酵母、植物、および動物のセリンおよびチロシンＲＮＡでは、サイトカイニンがアンチコドンに隣接している。哺乳動物細胞培養物の成長は、サイトカイニン活性を有する特定のＮ6−置換アデノシンによって阻害される（例えば、非特許文献１７参照）。茎の部分、挿し葉、および発育期のブドウでは、６−ベンジルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（ＢＰＡ）は、サイトカイニン６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）よりも大きな成長を惹起することが報告されている。組織培養アッセイおよびいくつかの園芸種では、ＢＰＡがより活性であることも示されている（例えば、非特許文献１８参照）。
【０００５】
さらに、ある６−（置換アミノ）プリン（キネチンおよびゼアチンを含む）は、著しい抗加齢およびその他の性質を有することが示されており、ヒトの皮膚および／またはヒトの皮膚細胞を含めた哺乳動物細胞の処置に有用であることが見出されている。そのような組成物を局所的に適用することによって、皮膚の審美的外観が改善され、そのような組成物は、皮膚および関連した疾患または状態の処置に使用することもできた。重要なことは、これらの６−（置換アミノ）プリンが、使用される量では成長速度および処理される哺乳動物細胞の全増殖能を実質的に増大させないことである。例えば、特許文献１（１９９４年１２月６日）および特許文献２（１９９７年２月１１日）（皮膚の審美的外観の改善）；特許文献３（１９９７年３月２５日）（培養物中の哺乳動物細胞の加齢を正常に伴う、低速または遅延の形態学的変化）；ならびに特許文献４（１９９１年６月４日）および特許文献５（１９９２年１１月１７日）（特定の過剰増殖性皮膚疾患の治療）を参照されたい。ここに列挙した特許のすべてを、参照により本明細書に組み込む。ヒトの皮膚に対する６−（置換アミノ）プリンの抗加齢作用も、培養されたヒト線維芽細胞において、ＲａｔｔａｎおよびＣｌａｒｋによって実証され（例えば、非特許文献１９参照）、キネチン（Ｎ６−フルフリル−アデニン）の存在によって発症が遅れ、細胞の連続継代に関連づけられた多くの形態学的および生化学的特性の程度が低下した。加齢細胞において正常な細胞機能を維持する際のそのような６−（置換アミノ）プリンの有効性は、それらを加齢皮膚の活力保持に使用するという根拠をもたらす。つい最近になって、Ｇｅｒａｌｄ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ博士によりカリフォルニア大学アーバイン校で実施された臨床研究は（例えば、非特許文献２０参照）、濃度が０．００５から０．１０％に及ぶ局所キネチン製品（Ｋｉｎｅｒａｓｅ（登録商標））が、軽度から中程度の光損傷を受けた顔面皮膚の外観を改善したことを示した。１２および２４週間後の処置は、医師および被験者の両方が評価した場合、ベースラインに比べ、皮膚のきめの外観、しみだらけの過剰な色素沈着、および細かいしわに著しい改善がもたらされた。処置は、経表皮水損失の低下によって評価されるように、皮膚障壁機能に改善がもたらされた。
【０００６】
細胞加齢の過程を予防し、逆転させ、または遅くすることは、いくらかの有意で実用的な結果をもたらす可能性のある、永続的な、しかしとらえどころのない生物科学の目標であった。ヒトの皮膚またはその他の器官で細胞の加齢を予防することは、構造的および機能的一体性と審美的一体性の保存にも関連すると考えられる。幼若細胞の特性を保持するように培養細胞を処理できれば、培養物中のそのような細胞による価値ある生成物の生成が改善され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５３７１０８９号明細書
【特許文献２】米国特許第５６０２１３９号明細書
【特許文献３】米国特許第５６１４４０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５０２１４２２号明細書
【特許文献５】米国特許第５１６４３９４号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Smith et al., Mech. Age. Dev. 13, 387 (1980)
【非特許文献２】Kirkwood et al., Theor. Biol. 53, 481 (1975)
【非特許文献３】Pereira-Smith et al., Somatic Cell Genet. 8, 731 (1982)
【非特許文献４】Norwood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1, 223 (1974)
【非特許文献５】Burmer et al., Exp. Cell Res. 145, 708 (1983)
【非特許文献６】Drescher-Lincoln et al., Exp. Cell Res. 153, 208 (1984)
【非特許文献７】Lumpkin et al., Science 232, 393 (1986)
【非特許文献８】Lumpkin et al., Exp. Cell Res. 160, 544 (1985)
【非特許文献９】Wellinger et al., J. Cell Biol., 34, 203 (1986)
【非特許文献１０】Flemming et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4099 (1988)
【非特許文献１１】West et al., Exp. Cell Res. 184, 138 (1989)
【非特許文献１２】Giordano, Exp. Cell Res. 185, 399 (1989)
【非特許文献１３】Seshadri et al., Science 247, 205 (1990)
【非特許文献１４】Letham, Ann. Rev. Plant. Physiol. 18, 349 (1967)
【非特許文献１５】Letham, Planta 74, 228 (1967)
【非特許文献１６】Skoog et al., Science 154, 1354 (1966)
【非特許文献１７】Grace et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 8, 23 (1967)
【非特許文献１８】Werbrouck et al., Physiol. Plant 98, 291 (1996)
【非特許文献１９】Rattan and Clark, Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 665-672 (1994)
【非特許文献２０】Dr. Gerald Weinstein, Cosmetic Dermatology 15, 29-32 (2003)
【非特許文献２１】Robins et al., J. Am. Chem. Soc. 83, 2574 (1961)
【非特許文献２２】Lewis et al., J. Org. Chem.; 26; 1961; 3837
【非特許文献２３】Ames et al., Mutation Research, 31, 347-364 (1975)
【非特許文献２４】Maron et al., Mutation Research, 113, 173-215 (1983)
【非特許文献２５】Bagley et al., Alternative Methods in Toxicology, Vol. 6 in Progress in In Vitro Toxicology, 131-138 (1988)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
６−（置換アミノ）プリン、特にキネチンおよびゼアチンは、著しい抗加齢およびその他の性質を有するが、追加の成長調節因子、分化、および／または抗老化化合物をもたらすことが望ましいと考えられる。そのような化合物は、現在使用されている６−（置換アミノ）プリンよりも改善された選択性および効率（即ち、少ない毒性および／またはより有効である）を有する場合、特に望ましいと考えられる。本発明は、そのような改善された抗加齢化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記の一般式の６，９−二置換プリン誘導体、および医薬品として許容されるそれらの塩を対象とする。
【００１１】
【化１】
2009543799.tif 000002
【００１２】
式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、およびメトキシ置換ベンジルであり；Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニルまたは２−テトラヒドロフラニルである。メトキシ置換フルフリル基には、例えば、３−メトキシフルフリル、４−メトキシフルフリル、および５−メトキシフルフリルが含まれる。メトキシ置換フェニル基には、例えば、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、および２，３，５−トリメトキシフェニルが含まれる。メトキシ置換ベンジル基には、例えば、２−メトキシベンジル、３−メトキシベンジル、４−メトキシベンジル、２，３−ジメトキシベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２，５−ジメトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、３，５−ジメトキシベンジル、２，３，４−トリメトキシベンジル、および２，３，５−トリメトキシベンジルが含まれる。好ましい６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式を有する、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（Ｎ６−フルフリル−９−（２−テトラヒドロピラニル）アデニンまたはピラニルキネチンとも呼ばれる）である。
【００１３】
【化２】
2009543799.tif 000003
【００１４】
これらの６，９−二置換プリン誘導体は、抗老化、抗炎症、および／または免疫抑制性を有することがわかった。
【００１５】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、加齢および老化を阻害し、ケラチノサイトや線維芽細胞などの哺乳動物表皮細胞の審美的外観を改善し、かつ／またはケラチノサイトや線維芽細胞などの哺乳動物表皮細胞における加齢の悪影響を緩和するための、化粧品組成物として有用である。これらは、加齢および老化を阻害し、かつ／またはヒト表皮細胞および／またはヒトの皮膚の審美的外観を改善するための、化粧品組成物として特に有用である。このように本発明は、哺乳動物細胞の加齢の悪影響を緩和するための方法を提供し、前記方法は、哺乳動物細胞に、有効量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、該６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩であり、式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、およびメトキシ置換ベンジルであり、Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニルまたは２−テトラヒドロフラニルである。
【００１６】
【化３】
2009543799.tif 000004
【００１７】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、過剰増殖性皮膚疾患を含めた特定の皮膚疾患の処置にも有用である。これらの６，９−二置換プリン誘導体を含有する組成物は、例えば、狼瘡、アレルギー性湿疹、中毒性湿疹、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、乳頭腫、ボーエン病、脂漏性角化症、光線性角化症、基底細胞および扁平上皮癌などの皮膚状態を処置するのに使用することができる。このように、本発明は、哺乳動物細胞における皮膚疾患を処置するための方法も提供し、前記方法は、そのような処置が必要な哺乳動物細胞に、有効量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、該６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩であり、式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、およびメトキシ置換ベンジルであり、Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニルまたは２−テトラヒドロフラニルである。
【００１８】
【化４】
2009543799.tif 000005
【００１９】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、炎症に関連した状態を処置するのにも有用である。そのような炎症関連状態には、例えば、炎症、病変（例えば、その治癒を加速させる）、炎症から生ずる疼痛およびその他の免疫学的応答（例えば、その軽減をもたらす）、および／または治療中の炎症皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、色素沈着過剰、および単純ヘルペス病変など）が含まれる。このように、本発明は、哺乳動物細胞の炎症状態を処置するための方法も提供し、前記方法は、そのような処置が必要な哺乳動物細胞に、有効量の６，９−二置換プリン誘導体を適用するステップを含み、該６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式のもの、または医薬品として許容されるそれらの塩であり、式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、およびメトキシ置換ベンジルであり、Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニルまたは２−テトラヒドロフラニルである。
【００２０】
【化５】
2009543799.tif 000006
【００２１】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、上式の遊離化合物の形で組成物中に、または医薬品として許容されるそれらの塩として使用してもよい。医薬品として許容される塩は、例えば、アルカリ金属、アンモニウム、またはアミンと形成してもよい。誘導体またはそれらの塩は、ラセミ体混合物または光学的に活性な異性体の形をとってもよく、これらは酸との付加塩の形をとってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、下記の一般式を有し、式中、Ｒ6は、フルフリル、メトキシ置換フルフリル、フェニル、メトキシ置換フェニル、およびメトキシ置換ベンジルであり、Ｒ9は、２−テトラヒドロピラニルまたは２−テトラヒドロフラニルである。
【００２３】
【化６】
2009543799.tif 000007
【００２４】
メトキシ置換フルフリル基には、例えば、３−メトキシフルフリル、４−メトキシフルフリル、および５−メトキシフルフリルが含まれる。メトキシ置換フェニル基には、例えば、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、および２，３，５−トリメトキシフェニルが含まれる。メトキシ置換ベンジル基には、例えば、２−メトキシベンジル、３−メトキシベンジル、４−メトキシベンジル、２，３−ジメトキシベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２，５−ジメトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、３，５−ジメトキシベンジル、２，３，４−トリメトキシベンジル、および２，３，５−トリメトキシベンジルが含まれる。好ましい６，９−二置換プリン誘導体は、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンである。これらの６，９−二置換プリン誘導体は、ヒト細胞も含めた哺乳動物細胞と接触したときに、抗老化、抗炎症、および／または炎症抑制性を有することが見出された。
【００２５】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、加齢および老化を阻害しかつ／またはケラチノサイトや線維芽細胞などの哺乳動物表皮細胞の審美的外観を改善するための、化粧品組成物として有用である。これらは特に、加齢および老化を阻害しかつ／またはヒト表皮細胞および／またはヒト皮膚の審美的外観を改善するための、化粧品組成物として有用である。
【００２６】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、過剰増殖性皮膚疾患を含めた（しかしこれらに限定するものではない）特定の皮膚疾患または状態を処置するのにも有用である。これらの６，９−二置換プリン誘導体を含有する組成物は、例えば、狼瘡、アレルギー性湿疹、中毒性湿疹、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、乳頭腫、ボーエン病、脂漏性角化症、光線性角化症、基底細胞および扁平上皮癌、にきび、および紅斑などを処置するのに使用することができる。
【００２７】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、炎症を処置し、病変の治癒を加速させ、炎症から生ずる疼痛またはその他の免疫学的応答の軽減をもたらし、かつ／または炎症性皮膚疾患または状態（例えば、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、色素沈着過剰、単純ヘルペス病変、および紅斑など）を処置するのにも有用である。
【００２８】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、上式の遊離化合物の形で組成物中にまたは医薬品として許容されるそれらの塩として使用してもよく、そのような６，９−二置換プリン誘導体を単体で、またはその混合物で使用してもよい。医薬品として許容される塩は、例えば、アルカリ金属、アンモニウム、またはアミンと形成してもよい。それらの塩の誘導体は、ラセミ体混合物または光学的に活性な異性体の形をとってもよく、これらは酸との付加塩の形をとってもよい。
【００２９】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、一般に、対象とする細胞（例えば、ヒトの皮膚）に施用するのに適した担体組成物中に、意図される用途に適した量で含有される。そのような組成物には、例えば、化粧品および医薬品組成物が含まれる。一般に、そのような組成物は、活性成分を約０．００５から約２０％、好ましくは約０．０５から約１０％、より好ましくは約０．１から約２％含む。組成物、特に化粧品および医薬品組成物は、溶液、クリーム、エアロゾル、乳液、ローション、ゲル、プラスター、湿布、シャンプー、口紅、軟膏、ペースト、泡、チンキ、およびスプレーなどの形をとることができる。組成物の形は、その意図される用途に適している限り、重要ではない。
【００３０】
本明細書で提供された化合物の投与に適切な、化粧品および医薬品担体またはビヒクルには、特定の投与形態に適切であることが当業者に知られているような、任意の担体が含まれる。さらに、化合物は、医薬品としてただひとつの活性成分として組成物中に配合してもよく、またはその他の活性成分と組み合わせてもよい。活性化合物は、処置された個人に対して重篤な毒性効果をもたらさない状態で、処置上および／または審美的に有用な効果を発揮するように十分な量で、担体中に含まれる。有効濃度は、組織培養および無毛マウスまたはその他の適切な動物モデルを含めた生体外および生体内の系を使用して、化合物を試験することによって経験的に決定することができる。治療上および／または審美的に有用な効果には、限定するものではないが、哺乳動物細胞、特にヒト細胞、さらにより特別にはヒト皮膚細胞の、加齢に関連した病状または有害な審美的効果を、遅延させ、低速化し、予防し、逆転させ、低減し、またその他の有益な手法で変更することが含まれる。そのような審美的効果には、例えば、加齢または日光／風に曝されることによって既に損傷を受けたヒトの皮膚の外観を改善し、そのような損傷が、損傷を受けていない皮膚に生ずるのを最初に防止し（または低速化し）、かつ／またはそのような追加の損傷が、既に損傷を受けた皮膚に生ずるのを防止する（または低速化する）ことを含めることができる。そのような治療効果には、例えば、病状によって既に損傷を受けたヒトの皮膚の状態を改善し、そのような病状が生ずるのを第一に防止し（または低速化し）、かつ／または追加のそのような病状が再発するのを防止（または低速化）することを含めることができる。
【００３１】
組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、排出率、投薬計画、および投与される量、ならびに当業者に知られているその他の因子に依存することになる。典型的には、治療上および／または審美的に有効な投薬は、少なくとも約０．００５％、好ましくは少なくとも約０．０５、より好ましくは少なくとも約０．１％の濃度の活性化合物を、治療組織に送達すべきである。活性成分は、一度に投与してもよく、または時間的な間隔を空けて投与されるように、いくつかのより少ない用量に分割してもよい。正確な投薬量および処置期間は、処置される組織と相関関係があり、知られている試験プロトコルを使用してまたは生体内もしくは生体外試験データからの外挿によって、経験的に決定できることが理解される。濃度および投薬量の値は、処置される個人の年齢によって変化してもよいことに留意されたい。任意の特定の対象に関し、特定の投薬計画は、個人の要求および組成物の投与を管理しまたは監督する人物の専門的判断に応じて経時的に調節すべきであること、および本明細書で先に記述された濃度範囲が単なる例示であり、特許請求の範囲に記載された組成物の範囲または実施を限定するものではないことが、さらに理解されよう。
【００３２】
皮膚の処置では、６，９−二置換プリン誘導体が医薬品としてまたは化粧品として許容可能な担体と混合される、皮膚への局所または局部施用のための化粧品または医薬品組成物として化合物を配合してもよい。組成物は、ゲル、クリーム、ローション、固体、溶液、懸濁液、およびエアロゾルなどの形で提供してもよい。ヒトの皮膚を処置するための組成物は、局所施用を目的として、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、溶液、固体ベース、または無毒性で皮膚科において許容されることが当技術分野で知られているビヒクル中に、約０．００５から約２０％の間、好ましくは約０．０５から約１０％、より好ましくは約０．１から約２％の間の有効濃度範囲の６，９−二置換プリン誘導体と共に、配合される。ヒトの皮膚に使用される組成物中に溶解し、懸濁し、分散し、またはその他の方法で混合された６，９−二置換プリン誘導体の濃度または重量の分率（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、加齢の悪影響が低減し、逆転し、または遅延するように有効濃度で、一般には少なくとも約０．００５％、好ましくは少なくとも約０．０５％、好ましくは少なくとも約０．１％で、６，９−二置換プリン誘導体が皮膚の活性細胞（例えば、線維芽細胞）に送達されるものになる。上限は、細胞分裂の速度または細胞の全増殖能が実質的に増大しないように、特に処置した細胞または組織が、癌性または前癌性変化に典型的ないかなる徴候も、または病巣の発症など、その他の審美的に望ましくないいかなる変化も示さないように、調節すべきである。上限は、約２０％までにすることができるが、下限（１０％、２％、またはさらに１％など）は、抗加齢作用がそのような低い率で顕著であり、また細胞分裂の速度または全増殖能の望ましくない増大の危険性が最小限に抑えられるので、一般に好ましい。一般に、皮膚の水和を助ける皮膚軟化または潤滑ビヒクルは、皮膚を乾燥させるエタノールなどの揮発性ビヒクルよりも好ましい。
【００３３】
ヒトの皮膚に使用される組成物を調製するための、適切なベースまたはビヒクルは、ワセリン、ワセリンおよび揮発性シリコーン、ラノリン、コールドクリーム（ＵＳＰ）、および親水性軟膏（ＵＳＰ）である。乳化され、懸濁され、またはその他の方法で適切な軟膏またはクリームベースと混合されるなど、局所施用のために配合された、有効量の１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体を含有する組成物を調製することができる。
【００３４】
許容されるビヒクルの選択は、６，９−二置換プリン誘導体が投与される方法によって大部分が決定される。そのような方法には、局所投与が含まれる。局所施用に適切な、製薬学的におよび皮膚化学的に許容されるビヒクルには、ローション、クリーム、溶液、懸濁液、ゲル、および固体などでの使用に適したものが含まれる。一般に、ビヒクルは、本質的に有機物であっても、または水性エマルジョンであっても、どちらでもよく、その中に６，９−二置換プリン誘導体を分散させ、懸濁させ、または溶解することが可能である。ビヒクルには、例えば、製薬学的に許容される皮膚軟化剤、皮膚吸収強化剤、ＵＶ保護剤、抗酸化剤、緩衝剤、着色剤、香料、乳化剤、充填剤、増粘剤、および溶媒などを含めてもよい。
【００３５】
そのような形態の、より詳細なリストおよび記述（これらに限定するものではない）は、下記の通りである。
【００３６】
（１）ローション。ローションは、有効濃度の１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体を含有する。有効濃度は、好ましくは６，９−二置換プリン誘導体を約０．０５から約１０％の濃度で、皮膚の活性細胞、特に真皮内の線維芽細胞に送達するのに有効である。ローションは、約１から約５０％、好ましくは約３から約１５％の皮膚軟化剤、と、その残分としての水、適切な緩衝剤、Ｃ2もしくはＣ3アルコール、または水もしくは緩衝剤もしくはアルコールの混合物を含有してもよい。ヒトの皮膚に施用するのに適切であるとして当業者に知られている任意の皮膚軟化剤を使用してもよい。これらには、限定するものではないが下記のものが含まれる。
【００３７】
（ａ）鉱油、ワセリン、パラフィン、セレシン、オゾケライト、微結晶性ワックス、ポリエチレン、およびパーハイドロスクアレンを含む（がこれらに限定されない）、炭化水素油およびワックス。
【００３８】
（ｂ）ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、水溶性およびアルコール可溶性シリコーン−グリコールコポリマーを含む（がこれらに限定されない）シリコーン油。
【００３９】
（ｃ）植物、動物、および海産源から得られるものを含む、トリグリセリド脂肪および油。その例には、（これらに限定されないが）ヒマシ油、ベニバナ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、タラ肝油、アーモンド油、アボカド油、ヤシ油、ゴマ油、および大豆油が含まれる。
【００４０】
（ｄ）アセチル化モノグリセリドを含む（がこれらに限定されない）アセトグリセリド。
【００４１】
（ｅ）エトキシル化グリセリルモノステアレートなどを含む（がこれらに限定されない）エトキシル化グリセリド。
【００４２】
（ｆ）１０から２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルキルエステル。脂肪酸のメチル、イソプロピル、およびブチルエステルが、本明細書では有用である。その例には、（これらに限定されないが）ラウリン酸ヘキシル、ラウリン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、オレイン酸イソデシル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸デシル、イソステアリン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソヘキシル、アジピン酸ジヘキシルデシル、セバシン酸ジイソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、および乳酸セチルが含まれる。
【００４３】
（ｇ）１０から２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルケニルエステル。その例には、（これらに限定されないが）ミリスチン酸オレイル、ステアリン酸オレイル、およびオレイン酸オレイルが含まれる。
【００４４】
（ｈ）９から２２個の炭素原子を有する脂肪酸。適切な例には、（これらに限定されないが）ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキドン酸、ベヘン酸、およびエルカ酸が含まれる。
【００４５】
（ｉ）ラウリル、ミリスチル、セチル、ヘキサデシル、ステアリル、イソステアリル、ヒドロキシステアリル、オレイル、リシノレイル、ベヘニル、エルシル、および２−オクチルドデシルアルコールを含む（がこれらに限定されない）１０から２２個の炭素原子を有する脂肪アルコール。
【００４６】
（ｊ）１から５０個のエチレンオキシド基または１から５０個のプロピレンオキシド基またはこれらの混合物が結合されているラウリル、セチル、ステアリル、イソステアリル、オレイル、およびコレステロールアルコールなど（がこれらに限定されない）１０から２０個の炭素原子のエトキシル化脂肪アルコールを含む（がこれらに限定されない）脂肪アルコールエーテル。
【００４７】
（ｋ）エトキシル化脂肪アルコールの脂肪酸エステルを含む（がこれらに限定されない）エーテル−エステル。
【００４８】
（ｌ）ラノリン、ラノリン油、ラノリンワックス、ラノリンアルコール、ラノリン脂肪酸、ラノリン酸イソプロピル、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化コレステロール、プロポキシル化ラノリンアルコール、アセチル化ラノリン、アセチル化ラノリンアルコール、リノール酸ラノリンアルコール、リシノール酸ラノリンアルコール、リシノール酸ラノリンアルコールのアセテート、エトキシル化アルコール−エステルのアセテート、ラノリンの水素化分解物、エトキシル化水素化ラノリン、エトキシル化ソルビトールラノリンならびに、液体および半固体ラノリン吸収塩基を含む（がこれらに限定されない）ラノリンおよび誘導体。
【００４９】
（ｍ）プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（Ｍ．Ｗ．２０００〜４０００）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレングリコール、グリセロール、エトキシル化グリセロール、プロポキシル化グリセロール、ソルビトール、エトキシル化ソルビトール、ヒドロキシプロピルソルビトール、ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２００〜６０００）、メトキシポリエチレングリコール３５０、メトキシポリエチレングリコール５５０、メトキシポリエチレングリコール７５０、メトキシポリエチレングリコール２０００、メトキシポリエチレングリコール５０００、ポリ［エチレンオキシド］ホモポリマー（Ｍ．Ｗ．１０００００〜５００００００）、ポリアルキレングリコールおよび誘導体、ヘキシレングリコール（２−メチル−２，４−ペンタンジオール）、１，３−ブチレングリコール、１，２，６−ヘキサントリオール、エトヘキサジオールＵＳＰ（２−エチル−１，３−ヘキサンジオール）、Ｃ15〜Ｃ16ビシナルグリコール、ならびにトリメチロールプロパンのポリオキシプロピレン誘導体を含む（がこれらに限定されない）多価アルコールおよびポリエーテル誘導体。
【００５０】
（ｎ）エチレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ジエチレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２００〜６０００）、モノおよびジ脂肪エステル、プロピレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリプロピレングリコール２０００モノオレエート、ポリプロピレングリコール２０００モノステアレート、エトキシル化プロピレングリコールモノステアレート、グリセリルモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリグリセロールポリ脂肪酸エステル、エトキシル化グリセリルモノステアレート、１，３−ブチレングリコールモノステアレート、１，３−ブチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレンポリオール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含む（がこれらに限定されない）多価アルコールエステル。
【００５１】
（ｏ）蜜蝋、鯨蝋、ミリスチン酸ミリスチル、およびステアリン酸ステアリル、ならびに蜜蝋誘導体であって、これらに限定されないが、エーテル−エステルの混合物を形成する、蜜蝋と様々なエチレンオキシド含量を有するエトキシル化ソルビトールの反応生成物であるポリオキシエチレンソルビトール蜜蝋を含む蜜蝋誘導体を含む（がこれらに限定されない）ワックスエステル。
【００５２】
（ｐ）カルナバおよびカンデリラ蝋を含む（がこれらに限定されない）植物蝋。
【００５３】
（ｑ）レシチンおよび誘導体を含む（がこれらに限定されない）リン脂質。
【００５４】
（ｒ）コレステロールおよびコレステロール脂肪酸エステルを含む（がこれらに限定されない）ステロール。
【００５５】
（ｓ）脂肪酸アミド、エトキシル化脂肪酸アミド、および固体脂肪酸アルカノールアミドを含む（がこれらに限定されない）アミド。
【００５６】
ローションは、乳化剤を約１から約１０％、より好ましくは約２から約５％含有してもよい。乳化剤は、非イオン性、陰イオン性、または陽イオン性にすることができる。満足のいく非イオン性乳化剤の例には、（これらに限定するものではないが）１０から２０個の炭素原子を有する脂肪アルコール、２から２０モルのエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドと縮合した１０から２０個の炭素原子を有する脂肪アルコール、２から２０モルのエチレンオキシドと縮合したアルキル鎖中に６から１２個の炭素原子を有するアルキルフェノール、エチレンオキシドのモノおよびジ脂肪酸エステル、脂肪酸部分が１０から２０個の炭素原子を含有するエチレングリコールのモノおよびジ脂肪酸エステル、ジエチレングリコール、分子量が２００から６０００のポリエチレングリコール、分子量が２００から３０００のプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、ソルビタン、ポリオキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチレンソルビタン、ならびに親水性ワックスエステルが含まれる。適切な陰イオン性乳化剤には、（これらに限定するものではないが）脂肪酸石けん、例えばナトリウム、カリウム、およびトリエタノールアミン石けんであって、脂肪酸部分が１０から２０個の炭素原子を含有するものが含まれる。その他の適切な陰イオン性乳化剤には、（これらに限定するものではないが）アルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムアルキルスルフェート、アルキルアリールスルフェート、およびアルキルエトキシエーテルスルホネートであって、アルキル部分に１０から３０個の炭素原子を有するものが含まれる。アルキルエトキシエーテルスルホネートは、１から５０個のエチレンオキシド単位を含有する。満足のいく陽イオン性乳化剤は、第四級アンモニウム、モルホリニウム、およびピリジニウム化合物である。先の段落に記述された皮膚軟化剤のいくつかも、乳化特性を有する。皮膚軟化剤などを含有するローションが配合される場合、組成物中に含めることができるが、追加の乳化剤は必要ではない。
【００５７】
ローションの残りの部分は、一般に、水またはＣ2もしくはＣ3アルコール、または水およびアルコールの混合物である。ローションは、構成成分のすべてを一緒に、単に混合することによって配合することができる。好ましくは、６，９−二置換プリン誘導体を、混合物中に溶解し、懸濁し、またはその他の方法で均一に分散させる。
【００５８】
そのようなローションの、その他の従来の構成成分を含めてもよい。そのような１種の添加剤は、組成物の約１から約１０％の濃度の増粘剤である。適切な増粘剤の例には、これらに限定するものではないが、架橋カルボキシポリメチレンポリマー、エチルセルロース、ポリエチレングリコール、トラガカントガム、カラヤガム、キサンタンガムおよびベントナイト、ヒドロキシルエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが含まれる。
【００５９】
ローションとしてヒトの顔面皮膚への適用に適した組成物の、１つの好ましい例は、モノステアリン酸グリセロール１０部、セチルアルコール１０部、鯨蝋３０部、Ｔｗｅｅｎ  ２０（モノステアリン酸ソルビタンのポリオキシアルキレン誘導体）１０部、Ｓｐａｎ  ２０（モノラウリン酸ソルビタン）１０部、グリセリン１２．５部、および水１００部を混合することによって調製されたベース中に、本発明の６，９−二置換プリン誘導体（好ましくはピラニルキネチン）を約０．５から約１０％含有する。
【００６０】
（２）クリーム。クリームは、１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体を有効量含有するように配合される。有効濃度は、典型的には、皮膚の活性細胞、特に真皮中の線維芽細胞に対して、治療組織に対して約０．５から約１０％の間で６，９−二置換プリン誘導体を送達するのに有効な量である。クリームは、皮膚軟化剤も約５から約５０％、好ましくは約１０から約２５％含有し、その残りは、水または等張緩衝液などのその他の適切な無毒性担体である。ローションに関して既に述べられた皮膚軟化剤は、クリーム組成物にも使用することができる。クリームは、上述のような適切な乳化剤を含有してもよい。乳化剤は、約３から約５０％、好ましくは約５から約２０％の濃度で組成物中に含まれる。
【００６１】
（３）溶液および懸濁液。溶液は、典型的には、皮膚の活性細胞、特に真皮の線維芽細胞に対して約０．５から約１０％の間で６，９−二置換プリン誘導体を送達するのに有効な量である、１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体を有効量含有するように配合され、その残りは、水、適切な有機溶媒もしくはその他の適切な溶媒、または緩衝液である。溶媒または溶媒系の一部として有用な適切な有機材料は、下記の通りであり、即ち、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（Ｍ．Ｗ．２００〜６００）、ポリプロピレングリコール（Ｍ．Ｗ．４２５〜２０２５）、グリセリン、ソルビトールエステル、１，２，６−ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、酒石酸ジエチル、ブタンジオール、およびこれらの混合物である。そのような溶媒系は、水を含有してもよい。
【００６２】
溶液または懸濁液として配合されるこれらの化合物は、皮膚に適用してもよく、またはエアロゾルとして配合してもよく、スプレーとして皮膚に適用してもよい。エアロゾル組成物は、さらに、約２５から約８０％、好ましくは約３０から約５０％の適切な噴射剤を含有する。そのような噴射剤の例は、塩素化、フッ素化、およびクロロフッ素化された低分子量炭化水素である。亜酸化窒素、二酸化炭素、ブタン、およびプロパンも、噴射剤ガスとして使用される。これらの噴射剤は、当技術分野で理解されているように、容器の内容物を噴射するのに適した量および圧力下で使用される。
【００６３】
（４）ゲル。ゲル組成物は、適切な増粘剤を前述の溶液または懸濁液組成物に対して単に混合することによって、配合することができる。適切な増粘剤の例は、ローションに関して先に記述している。
【００６４】
ゲル化組成物は、典型的には、皮膚の活性細胞、特に真皮の線維芽細胞に対して約０．０５から約１０％の間で６，９−二置換プリン誘導体を送達するのに有効な量である、１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体を有効量含有し、前述の有機溶媒を約５から約７５％、好ましくは約１０から約５０％、増粘剤を約０．５から約２０％、好ましくは約１から約１０％含有し、残りは水またはその他の水性担体である。
【００６５】
（５）固体。固体形態の組成物は、唇または身体のその他の部分への適用を目的とした、スティック型の組成物として配合してもよい。そのような組成物は、１種または複数の有効量の６，９−二置換プリン誘導体を含有する。その量は、典型的には、皮膚の活性細胞、特に真皮の線維芽細胞に対して、約０．０５から約１０％の間で６，９−二置換プリン誘導体を送達するのに有効な量である。また、該固体は、約５０から約９８％、好ましくは約６０から約９０％の前述の皮膚軟化剤を含有する。この組成物は、さらに、約１から約２０％、好ましくは約５から約１５％の適切な増粘剤を、ならびに望みに応じてまたは必要に応じて、乳化剤および水または緩衝液を含有することができる。ローションに関して先に述べた増粘剤は、固体形態の組成物中に適切に用いられる。
【００６６】
皮膚に適用するための組成物に、所望の安定性、香り、もしくは色、または太陽からの化学線を遮蔽するなどその他の望ましい性質を提供することが当技術分野で知られている、メチルパラベンまたはエチルパラベンを含めた防腐剤、香料、または染料などのその他の成分を、局所またはその他の適用を目的としたこれらのタイプの組成物のいずれかに、用いてもよい。
【００６７】
組成物は、６，９−二置換プリン誘導体以外の、レチノイド、キネチン、および／またはゼアチンなど、その他の年齢的悪影響の改善活性成分を含んでもよいが、細胞分裂誘導性を増強しまたは誘発するオーキシンなどの成分を含むべきではない。好ましい組成物は、唯一の年齢的悪影響の改善成分として、１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体を含有する。
【００６８】
ヒトの皮膚に使用される組成物は、好ましくは、１日に１回または所望の結果を得るために必要に応じてより頻繁に、処置が求められる皮膚領域に適用してもよい。精密な処置計画は、処置される個人に左右され、処方および特に処置される個人の年齢に左右されることが経験的に確認できることが理解される。任意の計画は、実質的に有害なまたは持続した望ましくない副作用なしに、所望の華麗改善効果が達成される限り、許容される。
【００６９】
ヒトの皮膚を処置するための方法は、無期限に、一般には人が皮膚の加齢の悪影響の改善の享受を望む限り、上記にて論じたように、ヒトの皮膚の処置に適した本発明の組成物を、好ましくは毎日皮膚に適用することによって実施される。組成物を皮膚に１日１回適用することは、有益な効果（例えば、皮膚の基底細胞層の線維芽細胞の、年齢に関係した形態変化を遅延させること）が皮膚表面で明らかになり始める前に、人の年齢、組成物が適用される皮膚の状態、および組成物中の６，９−二置換プリン誘導体の濃度に応じて、少なくとも約１カ月、さらには少なくとも約１年まで必要となるはずである。６，９−二置換プリン誘導体の適用を中止した場合、この方法によって改善された加齢作用は、そのうち再び確実になる可能性がある。
【００７０】
ヒトの皮膚の線維芽細胞（または、ケラチノサイトなどのその他の活性細胞）の場合、この方法は、生理学的に許容されたクリーム、軟膏、ローション、ゲル、溶液、香料、固体、または皮膚の外面へ適用するためのその他の適切な形として配合された組成物を、皮膚の外面に適用することによって実施され、この組成物は、真皮の活性細胞（例えば、線維芽細胞）に対する加齢の悪影響を改善するのに有効な有効濃度を、皮膚の真皮に送達するのに有効な濃度で、１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体を含有するものである。処置された皮膚は、処置されていない皮膚よりもゆっくりと老化し、かつ／またはしわおよび／もしくはたるみの減少またはその他の年齢の審美的指標に見られるように、処置前よりも外観が若くなる。そのような濃度は、典型的には約０．０５から約１０％である（好ましくは、約０．１から約２％）。実験的に決定することができる正確な濃度は、担体または送達ビヒクル、および組成物が皮膚の表面に存在する形と相関関係がある。
【００７１】
本発明は、細胞の老化および上述の病状を処置するための方法、ならびに哺乳動物細胞、特にヒト細胞（より特別にはヒト皮膚細胞）の加齢の悪影響を改善するための方法にも関する。本発明の１種または複数の６，９−二置換プリン誘導体は、上述の組成物の形で、かつ上述の有効量で、予防的にまたは治療的に投与することができる。
【００７２】
本明細書で使用される、哺乳動物細胞の加齢の悪影響の改善は、通常は正常な哺乳動物細胞において生体外でまたは生体内で加齢と共に生ずる形態学的変化の発生が、低速化し、逆転し、かつ／または遅延することを意味する。加齢の悪影響には、遺伝子発現およびタンパク質生合成における年齢に関連した変化も含まれる。本明細書で言及される改善効果は、処置される細胞の成長速度または全増殖能を実質的に増大させることなく実現される。
【００７３】
生体外および／または生体内細胞に対する影響も含む、細胞に対する加齢の悪影響の改善は、通常は細胞の加齢と共に生ずる年齢に関連した形態学的および表現型変化の発症の、遅延または逆転として検出することができる。これらの変化は、より古い細胞が外因性成長因子に応答できないこと、および／または古い細胞で見出された自己蛍光が高いレベルであることなど、組織培養細胞で検出された変化を含む。細胞が老化するにつれ、細胞は、年齢に依存した増殖能力の損失を示す。古い培養線維芽細胞は、扁平なおよび不規則な形態、異常に大きいサイズ、まばらな成長、培養基質の単位面積当たりの低い細胞収率、かなりの割合の多核化細胞、トリプシン処理の難しさ、集密に成長できないこと、および／または培地における細片の生成が高い率であることを含めた、多くの年齢に関連した特徴を示す。幼若細胞は、古い細胞よりも、成長因子に対して高い応答性と、ＤＮＡおよびタンパク質合成の速い速度を示す。ヒトを含めた若い哺乳動物の、組織培養における線維芽細胞は、健康で清浄に見え、規則的で長く細いスピンドル形の形態を保有し、培養基質状で集密になった後アレイに稠密に充填され、互いに成長し過ぎず、１つの核以外をほとんど持たず、培地中には細片をほとんど生成しない。年齢に関連した生体内変化には、皮膚の審美的外観にも関連し、組織の構造的および機能的一体性の変化にも関連した、しわ、ライン、たるんだ皮膚、変色、しみ、硬化、および／または黄ばんだ外観の、発生またはこれらの数もしくは深さの増大などの、哺乳動物組織の変化が含まれる。本発明の組成物は、年齢に関連した変化および加齢に密接に関連してはいないと考えられる変化（例えば、にきび、紅斑、および発赤など）も含め、全体的な外観および皮膚の状態を改善するのに有効である。本発明の目的で、加齢に密接に関連しないと考えられまたは加齢とは無関係であると考えられるそのような変化は、年齢に関連した変化に含まれるものとする。
【００７４】
本発明の方法は、その他の治療的または審美的方法（特に、ヒトの皮膚の処置に関連したもの）と組み合わせて使用することができる。このように本発明は、例えば、レーザまたはその他の光をベースにした処置または装置を組み合わせて使用することができる。
【００７５】
本明細書で使用される、線維芽細胞などの正常な細胞の全増殖能は、細胞の有限な増殖能の尺度であり、そのような細胞の培養が、培養の成長を中止する前に受け得る細胞数の倍加の全回数を指し、細胞を得たドナーの年齢と相関関係がある。胎生組織から得られた細胞は、成体組織から得られた細胞よりも、培養において高い増殖能を示す。
【００７６】
本明細書で使用される成長速度または増殖速度は、細胞が分裂する速度の尺度である。当業者により認められる１つの単位は、倍加時間の逆数である。正常細胞の培養物の寿命の終わりに、培養成長の停止が非常に素早く生じ、わずか数回の倍加で、幼若細胞に特徴的な正常値付近から０に低下する。
【００７７】
本明細書で使用される、成長速度または全増殖能の実質的な変化は、細胞分裂の速度または細胞倍加の回数を、細胞および組織の中で正常な変動範囲内の量を超えて変化させることを意味する。特に、成長速度または全増殖能は、処理された細胞が不死化するようにまたは悪性形質転換を受けるように変化しない。生体内で処理された処理済み細胞の場合、処理された組織は実質的に、サイズ、厚さを変化させず、または前癌状態もしくは癌性の細胞を発症させない。成長速度および全増殖能を評価するための方法は、当業者に知られている。本明細書に例示されるものを含めた任意のそのような方法は、成長速度または全増殖能の変化を評価するのに使用してもよい。
【００７８】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、一般に、対応する６−クロロ−９−置換プリンから、適切なアミンとの反応によって調製することができる。
【００７９】
【化７】
2009543799.tif 000008
【００８０】
本発明の好ましい６，９−二置換プリン誘導体を調製するのに使用することができる６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンは、６−クロロプリンおよび３，４−ジヒドロピランから、文献に従い（例えば、非特許文献２１参照）ｐ−トルエンスルホン酸を使用して合成することができる。非置換またはメトキシ置換ベンジルアミンから開始することにより、市販されていない（そうでなければＳｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍを介して得られる）フェニルアラニンおよびフルフリルアミンを、適切な金属触媒の存在下で対応するアルデヒドから調製することができる。６−クロロ−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリンは、ｐ−トルエンスルホン酸を使用して、６−クロロプリンおよび３，４−ジヒドロフランから合成することができる。
【実施例】
【００８１】
下記の実施例は、単なる例示の目的で含まれ、本発明の範囲を限定するものではない。他に指示しない限り、すべての濃度および比などは重量に基づく。本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【００８２】
（実施例１）
この実施例は、６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。６−クロロプリン（６０ｇ、３８８ｍｍｏｌ）およびトシル酸一水和物（１ｇ）を酢酸エチル（７５０ｍｌ）に加えた混合物を、５０℃で激しく攪拌した。３，４−ジヒドロピラン（４０ｍｌ、４３８ｍｍｏｌ）を１滴ずつ、３０分間にわたって添加し、反応温度を５５〜６０℃の間に維持した（例えば、非特許文献２１参照）。溶液をさらに１時間攪拌し、その間に室温まで冷却させた。濃アンモニア水（３５ｍｌ）を添加し、溶液を５分間攪拌した。均質な暗緑色溶液を、引き続き２×２００ｍｌの水で抽出した。黄色の酢酸エチル抽出物を、硫酸ナトリウム上で一晩乾燥し、−２０℃で冷却した。生じた黄色固体を、再び３７℃で五酸化リン上で真空乾燥した。収量：６６．９ｇ（７２．２％）。ＭＳ（ＥＳ）：［Ｍ＋Ｈ］+＝２３９（１００）。
【００８３】
（実施例２）
この実施例も、６−クロロ−９−（２−テトラヒドロフラニル）−プリンの調製を示す。６−クロロプリン（５０ｇ、３２３ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（２．５ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２００ｍｌ）に加えた混合物を、室温で激しく攪拌した。２，３−ジヒドロフラン（３７．５ｇ、５３５ｍｍｏｌ）を１滴ずつ、３０分間にわたって添加した。溶液をさらに１時間攪拌し、その間に、６−クロロプリンを完全に溶解した（例えば、非特許文献２２参照）。その後、１：１のモル比で水と混合したアンモニア水（１５０ｍｌ）を添加した。次いで均質な暗黄色溶液を、２×１００ｍｌの水で抽出した。黄色の酢酸エチル抽出物を、硫酸ナトリウム上で一晩乾燥させた。次いで溶液を濾過し、蒸発させた。真空蒸発後、粗製の黄色の油を、３７℃で五酸化リン上で真空乾燥した。黄色の粗製生成物を、石油エーテルから再結晶させた。収率：８０％、黄色固体。融点：９２〜９５℃。ＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル、１：２（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９７％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 2.05sep (1H, J = 6.8Hz); 2.22sep (1H, J = 6.8Hz); 2.48m (2H); 3.95q (1H, J = 7.4Hz); 4.20qq (1H, Ja = 7.4Hz, Jb = 1.9Hz); 6.40m (1H); 8.78s (1H); 8.80s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 225 (100).
【００８４】
（実施例３）
この実施例は、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。フルフリルアミン（１００ｇ、９１ｍｌ、１０３０ｍｍｏｌ）に、６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（１２６．９ｍｍｏｌ）３０．３ｇを添加した。固体を、徹底的に混合することによって完全に溶解した。均質な溶液を９０℃で６０分間加熱し、その後、室温まで冷却した。無色の結晶性塩酸フルフリルアミンが即座に堆積し、これを濾別した。残された濾液を真空蒸発させた。イソオクタン（６００ｍｌ）を黄色の油に添加し、徹底的に振盪させ、室温で放置した。生成物が、約１時間かけてゆっくりと結晶化した。白色固体の沈殿物を濾別し、エチルエーテル（５０ｍｌ）で洗浄し、一晩空気乾燥させて溶媒を除去した。粗製生成物をメタノール中で再結晶させた。収量：２４．４ｇ（８１．５２ｍｍｏｌ、６４．２％）。融点：１４４〜１４５℃で急峻、分解なし。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール（９５：５（ｖ：ｖ）））：単一スポット（Ｒｆ＝０．３５）。ＴＬＣ（クロロホルム）：単一スポット（Ｒｆ＝０．３４）。ＨＰＬＣ純度：９９＋％。元素分析％（予測値／実測値）：Ｃ＝６０．１９／６０．１４、Ｈ＝５．７２／５．７０、Ｎ＝２３．４０／２３．３０。
【００８５】
（実施例４）
この実施例はまた、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリンの調製を示す。ｎ−プロパノール１００ｍｌ中に入れたフルフリルアミン（１４５６ｍｇ、１５ｍｍｏｌ）に、６−クロロ−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリン（２２４７ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．６ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）を添加した。固体を、徹底的に攪拌することによって完全に溶解させた。均質な溶液を３時間、１００℃で加熱し、その後、室温に冷却した。真空蒸発後、得られた材料を水（１００ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（１００ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続き５０ｍｌのジエチルエーテルで洗浄した。白色の粗製生成物を、メタノール中で再結晶させた。収率：８５％、白色固体。融点：１２８〜１２９℃。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：メタノール、８：２（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９９％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 2.02sep (1H, J = 6.8Hz); 2.22sep (1H, J = 6.8Hz); 2.42m (2H); 3.91q (1H, J = 7.4Hz); 4.14q (1H, J = 7.4Hz); 4.70bs (2H); 6.23dd (1H, Ja = 3.2Hz, Jb = 0.9Hz); 6.26m (1H); 6.36t (1H, J = 2.4Hz); 7.53m (1H); 8.19bs (1H); 8.24s (1H); 8.27s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 286 (100).
【００８６】
（実施例５）
この実施例は、６−（４−メトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。１０ｍｍｏｌの６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された）、１２ｍｍｏｌの４−メトキシベンジルアミン、およびトリエチルアミン５ｍｌの混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水で処理し、酢酸エチル中に抽出した。酢酸エチル相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、蒸発させ、残渣を引き続きジエチルエーテル３０ｍｌで洗浄した。固体残渣を濾別し、粗製生成物をメタノールから再結晶させた。収率：８０％、白色固体。融点：１３７〜１３８℃。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：メタノール（８：２（ｖ：ｖ）））：単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 1.55m (2H); 1.68m (1H); 1.93m (2H); 2.26qq (Ja = 11.0Hz, Jb = 4.3Hz); 3.64qq (1H, Ja = 11.0Hz, Jb = 4.3Hz); 3.70s (3H); 4.00d (1H, J = 11.0Hz); 4.65s (2H); 5.63dd (1H, Ja = 11.0Hz, Jb = 2.2Hz); 6.85d (2H, J = 8.8Hz); 7.28d (2H, J = 8.8Hz); 8.23s (1H); 8.29bs (1H); 8.34s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 340 (100).
【００８７】
（実施例６）
この実施例は、６−（２−メトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（２３８７ｇ、１０ｍｍｏｌ）、２−メトキシベンジルアミン（１４７０ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）、および５ｍｌのトリエチルアミン（３５ｍｍｏｌ）の混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。固体を、徹底的に混合しながら完全に溶解した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水（１００ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（１００ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続きペトロールエーテル５０ｍｌで洗浄した。白色粗製生成物をメタノール中で再結晶させた。収率：９０％、白色固体。融点：１０６〜１０８℃。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：メタノール、（８：２（ｖ：ｖ）））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 1.56m (2H); 1.71 m (1H); 1.94m (2H); 2.27qq (1H, Ja = 12.3Hz, Jb = 3.8Hz); 3.67m (1H); 3.83s (3H); 4.20m (1H); 4.71 bs (2H); 5.64dd (1H, Ja = 11.3Hz, Jb = 1.9Hz); 6.83tt (1H, Ja = 7.4Hz, Jb = 0.9Hz); 6.97dd (1H, Ja = 8.2Hz, Jb = 0.7Hz); 7.14d (1H, J = 7.3Hz); 7.20tt (1H, Ja = 7.8Hz, Jb = 1.7Hz); 8.09s (1H); 8.21s (1H); 8.36s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 340 (100).
【００８８】
（実施例７）
この実施例は、６−（４−メトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリンの調製を示す。（６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された）６−クロロ−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリン１０ｍｍｏｌ、４−メトキシベンジルアミン１２ｍｍｏｌ、およびトリエチルアミン５ｍｌの混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、結果的に得られた材料を水で処理し、酢酸エチル中に抽出した。酢酸エチル相を蒸発させ、残渣を引き続きジエチルエーテル３０ｍｌで洗浄した。固体残渣を濾別し、粗製生成物をメタノールから結晶化した。収率：８０％、白色固体。融点：１８２〜１８３℃。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：メタノール（８：２（ｖ：ｖ）））：単一スポット。ＨＰＬＣ純度＞９８％。1H NMR (400MHz, DMSO): 2.02sxt (1H, J = 7.4Hz); 2.21sxt (1H, J = 7.4Hz); 2.44m (2H); 3.72s (3H); 3.90q (1H, J = 7.4Hz); 4.15q (J = 7.4Hz); 4.67s (H); 6.28ｍ (1H); 6.86d (2H, J = 8.7Hz); 7.31d (2H, J = 8.7Hz); 8.1bs (1H); 8.19s (1H); 8.29s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 326 (100).
【００８９】
（実施例８）
この実施例は、６−（２−メトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリンの調製を示す。（６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された）６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン２２４７ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）、２−メトキシベンジルアミン（１４７０ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン５ｍｌ（３５ｍｍｏｌ）の混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。固体を徹底的に混合することにより完全に溶解した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水（１００ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（１００ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続きヘキサン５０ｍｌで洗浄した。白色粗製生成物をメタノール中で再結晶させた。収率：９０％、白色固体。融点：９７〜９９℃。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：メタノール、８：２（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 2.02m (1H); 2.21sep (1H, J = 6.8Hz); 2.43m (2H); 3.83s (3H); 3.91q (1H, J = 7.4Hz); 4.14q (1H, J = 7.4Hz); 4.68bs (2H); 6.26m (1H); 6.83tt (1H, Ja = 7.4Hz, Jb = 0.9Hz); 6.98dd (1H, Ja = 8.2Hz, Jb = 0.7Hz); 7.12d (1H, J = 7.3Hz); 7.20tt (1H, Ja = 7.8Hz, Jb = 1.7Hz); 8.05bs (1H); 8.18s (1H); 8.27s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 326 (100).
【００９０】
（実施例９）
この実施例は、６−（３−メトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）−プリン１０ｍｍｏｌ、３−メトキシベンジルアミン１２ｍｍｏｌ、およびトリエチルアミン５ｍｌの混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水で処理し、酢酸エチル中に抽出した。酢酸エチル相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、引き続き蒸発させた。油状の残渣をｎ−ヘキサン３０ｍｌで処理したとき、白色粉末生成物が形成された。粗製生成物をメタノールから結晶化した。収率：７０％、白色固体。融点：１３４〜１３５℃。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ（８５：１５（ｖ：ｖ）））：単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９９％。1H NMR (400MHz, DMSO): 1.56m (2H); 1.70m (1H), 1.94m (2H); 2.30qq (1H, Ja = 11.0, Jb = 4.3Hz); 3.67tt (1H, Ja = 11.0Hz, Jb = 4.3Hz); 3.83s (3H); 4.00d (1H, J = 11Hz); 4.71s (2H); 5.64dd (1H, Ja = 11.0Hz, Jb = 4.3Hz); 6.83t (1H, J = 7.7Hz); 6.97d (1H, J = 7.7Hz); 7.14d (J = 7.7Hz); 7.20tt (1H, Ja = 7.7Hz, Jb = 1.5Hz); 8.09bs (1H); 8.21s (1H); 8.36s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 340 (100).
【００９１】
（実施例１０）
この実施例は、６−（４−メトキシフェニルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。（６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された）６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン２３８７ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）、４−メトキシフェニルアミン（１８０３ｍｇ、１５ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルアミン５ｍｌ（３５ｍｍｏｌ）の混合物を、ｎ−プロパノール（１００ｍｌ）中で５時間還流した。固体を徹底的に混合して完全に溶解した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水（５０ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（５０ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続きペトロールエーテル５０ｍｌで洗浄した。収率：９０％、白色固体。融点：１５０〜１５１℃。ＴＬＣ（酢酸エチル：トルエン、３：１（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 1.59m (2H); 1.73m (1H); 1.97m (2H); 2.31qq (1H, Ja = 12.3Hz, Jb = 3.8Hz); 3.69m (1H); 4.02m (1H); 5.68dd (1H, Ja = 11.3Hz, Jb = 1.9Hz); 6.91d (1H, J = 9.0Hz); 7.78d (1H, J = 9.0Hz); 8.34s (1H); 8.47s (1H); 9.72s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 326 (100).
【００９２】
（実施例１１）
この実施例は、６−（３−メトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリンの調製を示す。（６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された）６−クロロ−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリン１０ｍｍｏｌ、３−メトキシベンジルアミン１２ｍｍｏｌ、およびトリエチルアミン５ｍｌの混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水で処理し、酢酸エチル中に抽出した。酢酸エチル相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を引き続きｎ−ヘキサン３０ｍｌで洗浄した。白色粉末固体を濾別し、粗製生成物をメタノールから結晶化した。数時間後、純粋な透明結晶が得られた。収率８０％、白色固体。融点：８７〜８８℃。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：メタノール（８：２（ｖ：ｖ）））：単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H NMR (400MHz, DMSO): 2.02sxt (1H, J = 7.4Hz); 2.22sxt (1H, J = 7.4Hz); 2.45m (2H); 3.84s (3H); 3.91q (1H, J = 7.4Hz); 4.14q (1H, J = 7.4Hz); 4.68s (2H); 6.26m (1H); 6.83t (1H, J = 7.7Hz); 6.98d (1H, J = 7.7Hz); 7.11d (1H, J = 7.7Hz); 7.20t (1H, J = 7.7Hz); 8.06bs (1H); 8.17s (1H); 8.27s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 326 (100).
【００９３】
（実施例１２）
この実施例は、６−（２，５−ジメトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン２３８７ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）、２，５−ジメトキシベンジルアミン（２００６ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３５ｍｍｏｌ）５ｍｌの混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。固体を、徹底的に混合して完全に溶解した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水（１００ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（１００ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続きジエチルエーテル５０ｍｌで洗浄した。白色固体を濾別し、真空乾燥した。収率：９５％、白色固体。融点：１５０〜１５２℃。ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、１：２（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 1.56m (2H); 1.70m (1H); 1.94m (2H); 2.27qq (1H, Ja = 12.3Hz, Jb = 3.8Hz); 3.60s (3H); 3.70s (3H); 3.66m (1H); 3.78s (3H); 4.00m (1H); 4.68bs (2H); 5.64dd (1H, Ja = 11.2Hz, Jb = 2.0Hz); 6.75m (2H); 6.89dd (1H, Ja = 9.2Hz, Jb = 1.9Hz); 8.10bs (1H); 8.21s (1H); 8.36s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 370 (100).
【００９４】
（実施例１３）
この実施例は、６−（２，５−ジメトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリンの調製を示す。（６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された）６−クロロ−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリン２２４７ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）、２，５−ジメトキシベンジアミン（２００６ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン５ｍｌ（３５ｍｍｏｌ）の混合物を、ｎ−プロパノール中で３時間還流した。固体を徹底的に混合することにより完全に溶解した。ｎ−プロパノールの真空蒸発後、得られた材料を水（１００ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（１００ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続きジエチルエーテル５０ｍｌで洗浄した。白色粗製生成物をメタノール中で再結晶させた。収率：９０％、白色固体。融点：１０３〜１０４℃。ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、１：２（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 2.02m (1H); 2.21sep (1H, J = 6.8Hz); 2.43m (2H); 3.60s (3H); 3.78s (3H); 3.91q (1H, J = 7.4Hz); 4.14q (1H, J = 7.4Hz); 4.65bs (2H); 6.26m (1H); 6.74m (2H); 6.90d (1H, J = 8.8Hz); 8.10bs (1H); 8.18s (1H); 8.28s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 356 (100).
【００９５】
（実施例１４）
この実施例は、６−（２，３，４−トリメトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの調製を示す。６−クロロ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン２３８７ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）、塩酸２，３，４−トリメトキシベンジアミン（２７９９ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン８ｍｌ（５７ｍｍｏｌ）の混合物を、ｎ−ブタノール（４５ｍｌ）中で３時間還流した。固体を徹底的に混合することにより完全に溶解した。ｎ−ブタノールの真空蒸発後、得られた材料を水（５０ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（５０ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続きジエチルエーテル３０ｍｌで洗浄した。白色固体を濾別し、メタノールから再結晶させた。収率：９０％、白色固体。融点：１４２〜１４３℃。ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、１：２（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 1.57m (2H); 1.72m (1H); 1.95m (2H); 2.27qq (1H, Ja = 12.3Hz, Jb = 3.8Hz); 3.67m (1H); 3.73s (3H); 3.75s (3H); 3.84s (3H); 4.00m (1H); 4.66bs (2H); 5.63dd (1H, Ja = 11.3Hz, Jb = 1.9Hz); 6.69d (1H, J = 8.7Hz); 6.91d (1H, J = 8.7Hz); 8.04bs (1H); 8.20s (1H); 8.34s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 400 (100).
【００９６】
（実施例１５）
この実施例は、６−（２，３，４−トリメトキシベンジルアミノ）−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリンの調製を示す。（６−クロロプリン１５４６ｍｇから調製された）６−クロロ−９−（２−テトラヒドロフラニル）プリン２２４７ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）、塩酸２，３，４−トリメトキシベンジルアミン（２７９９ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン８ｍｌ（５７ｍｍｏｌ）の混合物を、ｎ−ブタノール中で３時間還流した。固体を徹底的に混合することにより完全に溶解した。ｎ−ブタノールの真空蒸発後、得られた材料を水（５０ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（５０ｍｌ）に抽出した。酢酸エチル抽出物を蒸発させ、残渣を引き続きヘキサン５０ｍｌで洗浄した。白色の粗製生成物をメタノール中で再結晶させた。収率：９０％、白色固体。融点：１４０〜１４１℃。ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、１：２（ｖ：ｖ））、単一スポット。ＨＰＬＣ純度：＞９８％。1H-NMR (400MHz, DMSO): 2.02sep (1H, J = 6.8Hz); 2.22sep (1H, J = 6.8Hz); 2.44m (2H); 3.73s (3H); 3.75s (3H); 3.84s (3H); 3.91q (1H, J = 7.4Hz); 4.13q (1H, J = 7.4Hz); 4.65bs (2H); 6.26m (1H); 6.70d (1H, J = 8.6Hz); 6.90d (1H, J = 8.6Hz); 8.03bs (1H); 8.19s (1H); 8.26s (1H). MS (ES): [M+H]+ = 386 (100).
【００９７】
（実施例１６）
培養したヒト皮膚線維芽細胞に対する６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの影響についての、いくつかの短期的予備研究が実施された。初期研究では、培養物中のヒト皮膚線維芽細胞への６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（４０から４００μＭ）の添加が行われた。培養フラスコの表面に対する細胞の結合のパーセンテージは、処理から６時間後に影響を受けなかった。この実施例で報告された残りの実験では、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンを培地に直接添加し、それと同時に細胞を播いた。
【００９８】
広範な濃度（０．０１から５００μＭ）について、処理から３日後の培養ヒト皮膚線維芽細胞の生存に対する６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの影響を決定するために試験をした。１から２００μＭの間の濃度では、細胞成長および生存にわずかな刺激があった可能性がある。６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンでの細胞の処理により、毒性またはその他の悪影響がないことが明らかであった。
【００９９】
幼若なヒト線維芽細胞の短期成長に対する６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（０から４００μＭ）の影響についても、評価した。細胞成長は、未処理のサンプルと、４０、８０、および２００μＭの６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンで処理したサンプルと同様であった。約４００μＭの処理レベルでは、細胞の成長がわずかに低下した可能性がある。６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンで処理した細胞および未処理の細胞における、アポトーシスおよびβ−ガラクトシダーゼ染色の程度を決定するために、同様の実験を実施した。様々な用量の６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンで処理されたヒト線維芽細胞の、アポトーシスまたは早期の加齢の誘発については、何も示唆されなかった。
【０１００】
老化細胞に対する６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの影響についても、調査した。同数の老化細胞を、個別の複数のフラスコに播き、次いで種々の濃度の６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（０から４００μＭ）で処理した。細胞のトリプシン処理および再懸濁後に、クールター計数器を使用して、処理から７および１４日後に細胞数を測定した。７日後に悪影響は観察されなかった。処理から１４日後、２００μｍ以上の６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンを有する老化細胞の生存に対し、わずかな悪影響があった可能性がある。より低い濃度では、悪影響は観察されなかったが、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンで処理した老化細胞の細胞数が、わずかに増加した可能性がある。
【０１０１】
寿命が９５％超である後期継代老化細胞も、種々の濃度の６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（０から２００μＭ）で処理して、年齢に関連した変化について評価した。アクチン染色パターンを３日後に調査した。６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンによる処理は、一般に、重合パターンからそれほど重合していないフィラメントパターンへと、アクチン染色パターンを変化させた。アクチン染色の、程度の低い重合および拡散パターンは、一般に、ヒト線維芽細胞の若年期の特徴に関連している。このように、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンは、老化細胞でのアクチン組織化の年齢に関連した変化のいくつかを、逆戻りさせるようである。
【０１０２】
老化ヒト皮膚線維芽細胞も、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（０から４００μＭ）で処理し、年齢に関連した変化の逆戻りについて評価した。処理から７および３０日後の細胞の外観には、顕著な相違があった。処理済み細胞は、一般に、処理から３０日後に、より薄くなりかつ何列かに配列されるようになる点で、より若く見えた。より高い濃度（２００および４００μＭ）であっても、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンで処理された細胞は、未処理の細胞よりも小さくなるようにかつ細胞内細片が少なくなるように見えた。
【０１０３】
これらの研究に基づけば、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンは、幼若および老化ヒト皮膚線維芽細胞によって十分に許容され、老化細胞のアクチンパターンおよび形態の、比較的若い特徴への逆戻りに関しては、好ましい影響をもたらすようである。
【０１０４】
（実施例１７）
本発明のいくつかの６，９−二置換プリン誘導体の生体外細胞毒活性を、カルセインＡＭと組織学的に異なりかつ種の由来が様々な細胞系のパネルとを用いたマイクロタイターアッセイを使用して決定した；キネチンも、対照として試験をした。代謝的に活性な細胞のみがカルセインＡＭ（カルセインのテトラアセトキシメチルエステル）を切断するので、カルセインの細胞内濃度は、培養物中の生きている細胞の数に対応する。
【０１０５】
下記の細胞系：ヒト骨肉腫（ＨＯＳ）；乳癌ＭＣＦ−７；ヒト骨髄性白血病Ｋ−５６２；およびマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を使用した。細胞を、Ｎｕｎｃ／Ｃｏｒｎｉｎｇ  ８０ｃｍ2プラスチック組織培養フラスコ内に保持し、細胞培地（５ｇ／ｌグルコース、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清、および重炭酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）で培養した。
【０１０６】
細胞懸濁液を調製し、特定の細胞型および期待される標的細胞密度（細胞成長特性に基づいて、ウェル当たり２５００〜３００００個の細胞）に応じて希釈し、９６／ウェルマイクロタイタープレートにピペット（８０μｌ）で添加した。接種を、３７℃でかつ５％ＣＯ2で２４時間にわたりプレインキュベートして、安定化させた。意図される試験濃度の４倍希釈物を、時間０で一定分量２０μｌでそのマイクロタイタープレートのウェルに添加した。試験化合物は、一般に、６つの４倍希釈物で評価した。本発明の研究で使用された最高ウェル濃度は、１６６．７μＭであった。すべてのサンプルについて、３回試験をした。細胞と試験化合物のインキュベーションは、５％ＣＯ2雰囲気中および１００％の湿度で、３７℃で７２時間行った。インキュベーション時間の終わりに、カルセインＡＭを最終濃度１μｇ／ｍｌまで添加し、１時間インキュベートした。蛍光強度（ＦＩ）を、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ  ＦＩＡ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（英国）で測定した。細胞生存（ＧＩ50）を、下記の方程式：ＧＩ50＝（ＦＩ化合物曝露ウェル／平均ＦＩ対照ウェル）／（平均ＦＩ対照ウェル−平均ＦＩブランク）×１００％を使用して計算した。ＧＩ50値、即ち細胞の５０％が死に至る薬物濃度は、得られた用量応答曲線から計算した。
【０１０７】
下記の結果が得られた。
【０１０８】
【表１】
2009543799.tif 000009
【０１０９】
本発明の６，９−二置換プリン誘導体は、１６６．７μＭまでの濃度で、細胞に対して最小限の毒性がありまたは毒性がまったくないことを示し、したがって、化粧品の適用分野に適している。
【０１１０】
（実施例１８）
ヒト二倍体線維芽細胞に対する、本発明の６，９−二置換プリン誘導体のいくつかの生体外細胞毒活性を、９６ウェルプレート用に最適化した標準的なＭＴＴアッセイによって測定した。アッセイは、生細胞のミトコンドリアによるＭＴＴの代謝的変換の生成物の分光光度測定に基づく。
【０１１１】
中期継代でのヒト包皮線維芽細胞（細胞系ＢＪ）を、７５ｃｍ2プラスチック組織培養フラスコに保持し、細胞培地（５ｇ／ｌグルコース、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清、および重炭酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）で培養した。
【０１１２】
９６ウェルプレートのウェル１個当たり、約５０００個の細胞を播いた。２４時間後、細胞培地を、試験化合物を含有する細胞培地に換えた。試験化合物を、６つの２倍希釈物で評価した。本発明の研究に使用される最高濃度は、通常、２００μＭであった。培地中の溶解度に限りのある化合物の場合、最高濃度を調節した。すべての試験化合物について、５回試験をした。試験化合物を含む細胞を、５％ＣＯ2雰囲気中および１００％の湿度で、３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、培地を、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する細胞培地に換え、細胞をさらに３時間インキュベートした。形成されたホルマザンをＤＭＳＯによって可溶化し、５７０ｎｍでの吸光度を測定した。試験化合物が細胞のＭＴＴ還元活性を阻害する能力を、ＩＣ＝（Ａ化合物曝露ウェル−平均Ａブランク）／（平均Ａ対照ウェル−平均Ａブランク）×１００％として計算した。ＩＣ10、即ちＭＴＴ還元活性に１０％の低下を引き起こす薬物濃度は、得られた用量応答曲線から計算した。
【０１１３】
下記の結果が得られた。
【０１１４】
【表２】
2009543799.tif 000010
【０１１５】
本発明の、試験をした６，９−二置換プリン誘導体は、広範な濃度でミトコンドリア活性および細胞生存率に対して悪影響を示さず、したがって、化粧品の適用分野に適している。
【０１１６】
（実施例１９）
本発明の６，９−二置換プリン誘導体のいくつかによる老化の阻害が決定された。また、キネチンも対照として評価した。ヒト二倍体線維芽細胞（様々な継代レベルのＨＣＡ細胞：２５継代−ＨＣＡ２５と呼ぶ；４５継代−ＨＣＡ４５と呼ぶ；および８０継代−ＨＣＡ８０と呼ぶ）を、β−ガラクトシダーゼ活性のために染色した。細胞培養に使用された培地を除去し、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドをＰＢＳに溶かしたものからなる固定液２〜３ｍｌ中に固定した。細胞を、室温で５分間インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、フェリシアン化カリウム（５ｍＭ）、フェロシアン化カリウム（５ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（２ｍＭ）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（１ｍｇ／ｍｌ）をクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に含む溶液２〜３ｍｌ中で、引き続き３７℃で（ＣＯ2なし）１から１６時間インキュベートした。試験化合物（約５０μＭ）を、各継代で培地に添加した。このインキュベーション時間の後、Ｘ−ｇａｌが切断されたことを示す青色細胞（陽性老化細胞）の存在を検出するために、細胞サンプルを観察した。この実験では、基質に対するβ−ガラクトシダーゼの動作により、老化細胞のみが青色に染色された。
【０１１７】
結果を以下に示す。
【０１１８】
【表３】
2009543799.tif 000011
【０１１９】
６，９−二置換プリン誘導体は、一般に、８０継代後に老化細胞をより低いレベルに保持する際、キネチンよりも効果的であった。
【０１２０】
（実施例２０）
本発明の６，９−二置換プリン誘導体のいくつかの抗炎症活性を測定し；キネチンも、対照として評価した。ラットＣ６グリオーマ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１０７）を、ハムのＦ１０／最小必須培地（１：１  ｖ／ｖ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％（ｖ／ｖ）最小必須培地ビタミン（１００×）、１％（ｖ／ｖ）最小必須培地非必須アミノ酸（１００×）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、および３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを含有する無血清既知組成培地の単層中で培養した。インキュベーションは、湿った雰囲気中で、３７℃で行った。アッセイは、２．５×１０5細胞／ｃｍ2の密度で、対数増殖期に行った。細胞内ｃＡＭＰ合成は、５ｍＭの（−）−イソプロテレノールの添加によって誘導された。様々な量の試験化合物を、（−）−イソプロテレノールと同時に添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、培地を除去し、ｃＡＭＰの細胞量を、Ａｍｅｒｓｈａｍ製ｃＡＭＰ−酵素免疫アッセイキットを使用して測定した。Ｉ50値は、用量依存曲線から２回測定した。
【０１２１】
下記の結果が得られた。
【０１２２】
【表４】
2009543799.tif 000012
【０１２３】
６，９−二置換プリン誘導体は、抗炎症活性であることが実証された。キネチンは、試験プロトコルにおいて不活性であった。
【０１２４】
（実施例２１）
６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの安全性に関するいくつかの試験は、従来受け入れられてきたプロトコルおよび手順を使用して実施された。これらの研究の結果を本明細書にまとめる。
【０１２５】
エームス試験。試験は、溶媒としてのＤＭＳＯおよび用量レベルが２．５、５．０、１５、５０、５００、１５００、および５０００μｇ／プレートの６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンを使用して実施した（例えば、非特許文献２３および２４参照）。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ヒスチジン栄養要求体ＴＡ９８およびＴＡ１００を、Ａｒｏｃｌｏｒ誘導ラット肝Ｓ９の存在下でまたは存在しない状態で使用した場合、試験をしたレベルでは６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンに関して肯定的な変異原性応答は観察されなかった。
【０１２６】
生体外染色体異常スクリーニングアッセイ。６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンについて、Ａｃｒｏｃｌｏｒ誘導Ｓ９活性化系が存在しない状態および存在する状態の両方で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して染色体異常スクリーニングアッセイで試験をし、その染色体異常誘発能を評価した。ＤＭＳＯを溶媒として使用し、用量は０．２７２から２７２μｇ／ｍｌに及んだ。６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンで処理したサンプルの、構造的または数値的な異常を有する細胞のパーセンテージは、溶媒対照サンプルの場合よりも著しく増加しなかった。この研究に基づき、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンは、ＣＨＯ細胞における構造的および数値的染色体異常の誘導に関して陰性であると結論付けた。
【０１２７】
絨毛尿膜血管アッセイ。眼球刺激に対する６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの能力を、非特許文献２５に記載されている手順を使用して評価した。１４日間インキュベートした白色レグホーンの卵の絨毛尿膜に、試験化合物４０μｌ（および蒸留水に溶かした３種のより低い濃度のもの）を投与し、次いでさらに約３０分間インキュベートし、その時に、絨毛尿膜に関して、血管出血、毛細管注入、および／またはゴースト血管の存在について試験をした。ＲＣ50値（処理した卵の５０％に陽性反応をもたらす濃度から計算された）は１０５％であった。このアッセイの条件下、１％未満のＲＣ50値は刺激性であると見なされる可能性があるのに対し、３％超のＲＣ50値は、非刺激性と見なされる可能性がある。したがって、このアッセイに基づけば、試験化合物は非刺激性であることがわかった。
【０１２８】
表皮ＭＴＴ生死判別アッセイ。ＭａｔＴｅｋ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥｐｉＤｅｒｍ（商標）系（ヒト表皮の多層の高度に分化したモデルを形成するように培養された、正常なヒト由来の表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）からなる）を使用することにより、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンを非刺激性として分類することができるであろうと決定された。
【０１２９】
急性経口毒性。メスのウィスターラットに、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンを２０００ｍｇ／ｋｇ経口投与し、次いで投与から１／２、１、２、３、および４時間後、さらにその後、１４日間にわたって１日１回、毒性および薬理効果について観察し；研究後にＣＯ2を使用して、すべての動物を人道的に犠牲にし、全体的な病状について検査をした。すべての動物は経口投与で生き残り、この研究中の体重変化は正常であり、剖検結果は正常であった。
【０１３０】
ヒト反復感作パッチ試験。約０．１％の６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンを含有する試験ゲル（約０．２ｍｌ）を、２ｃｍ平方の閉塞パッチ上に置き、これを各被験者の背中に置き、２４時間放置した。この手順を、同じ領域で９回の適用が行われるまで、毎週月曜日、水曜日、および金曜日に繰り返した（誘導期）。この領域について、新たな適用が行われる前に毎回検査をした。９個のパッチが除去されてから１０〜１４日後、チャレンジパッチ（チャレンジ期）を背中の新たな領域に置き、次いでそれから２４および７２時間後に反応性に関する試験をした。皮膚応答は、６ポイントスケールを基にした（０＝効果の証拠なし；＋＝かろうじて認められる；１＝軽度；２＝中程度；３＝著しい；および４＝重度）。
【０１３１】
５２名の被験者について、誘導およびチャレンジ期を終了させた（被験者当たり合計１０回の適用）。この研究を終了した被験者の中で、ただ１人の被験者は、チャレンジ期での適用後にかろうじて認められるという評価（＋）であり（２４時間でのみ；７２時間で試験をしたときは、効果の証拠がなかった）；この１つの観察された応答は、事実上刺激性またはアレルギー性の証拠であると見なさなかった。その他のすべての被験者は、誘導またはチャレンジ期の間、刺激の証拠をまったく示さなかった（即ち、スケール上では０）。ヒト被験者における誘導性アレルギー接触皮膚炎またはその他の刺激の証拠は、観察されなかった。
【０１３２】
（実施例２２）
局所的な皮膚の抗加齢治療薬としての、本発明の６，９−二置換プリン誘導体の安全性および効力について、無毛マウスモデル（光加齢の処置を研究するために十分に確立されたモデル）を使用して試験をした。メスＳＫＨ−１無毛マウス（５週齢、２０〜２５ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、フィルタトップケージに個々に収容し、引渡し後５〜７日間順応させた。マウスを、２つの異なる対照群（未処置対照、ビヒクル対照）および処置対照（市販の０．０５％トランスレチノイン酸クリーム）を含めたいくつかの処置群に分けた（ｎ＝６）。水およびマウスの食餌は適宜与えられる。
【０１３３】
実験群（群当たり６匹のマウス）は、下記の処置を含んでいた：（１）未処置対照；（２）ビヒクル対照（ＭｉｌｌＣｒｅｅｋローション）；（３）キネチン（ＭｉｌｌＣｒｅｅｋローション中０．１％）；（４）６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（ＭｉｌｌＣｒｅｅｋローション中０．１％）；および（５）処置対照（０．０５％トランスレチノイン酸クリーム）。様々な治療薬を、毎日（月〜金）３週間にわたって、無毛マウスの背面皮膚（約２ｃｍ×２ｃｍ）に約２０ｍｇの用量で適用した。
【０１３４】
ベースライン（１回目の処置の前）では、毎週、背面皮膚の経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）、皮膚含水量、および皮膚弾性を測定した。これらの局所製剤が表皮細胞増殖に及ぼす可能性ある影響を、細胞増殖の免疫組織化学的マーカーとしてブロモデオキシウリジンを使用して調査した。処置済みおよび対照の皮膚の組織学的検査も使用して、これらの局所製剤の皮膚作用を決定した。
【０１３５】
確立された評価基準を使用して、日々の検査を行ってその部位の紅斑（刺激）の可能性のある出現を評価した。その基準において、グレード０＝応答なし；グレード１＝ごくわずかな発赤；グレード２＝わずかな発赤；グレード３＝中程度の発赤／刺激；グレード４＝重度の発赤／刺激；グレード５＝非常に重度の発赤／刺激；およびグレード６＝壊死であった。
【０１３６】
皮膚含水量および皮膚弾性の測定は、皮膚に対する保湿剤の効果および抗しわ効果を特徴付けるのに使用された、重要な非侵襲的方法である。ＤｅｒｍａＬａｂ（商標）組合せ機器を使用して、皮膚含水量および標的皮膚部位の弾性を、ベースラインおよび週に一度の間隔で測定した。この機器は、皮膚表面に配置された二重プローブを備えており、定量測定をそれぞれのパラメータに関して行い、測定値を一体型コンピュータに記録した。
【０１３７】
すべての動物群に、ブロモデオキシウリジン（１００ｍｇ／ｋｇ）Ｉ．Ｐ．を、最終適用から４時間後に注射した。次いで動物を、３時間後にＣＯ2吸入によって犠牲にし、その後、頸椎脱臼を行った。試験部位を切除し、６ｍｍのパンチ生検試料を、各処置部位および未処置の対照部位から得た。生検試料を、パラフィン包埋および抗ＢｒｄＵ染色のための、４％の中性緩衝ホルマリンが入っている標識バイアルに入れた。パラフィン切片を５μＭの厚さに切断し、ＢｒｄＵ免疫組織化学キット（Ｘ１５４５Ｋ、Ｅｘａｌｐｈａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．製）および標準的な染色プロトコルを使用して染色した。スライドを、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで弱く対比染色し、光学顕微鏡下で、各切片ごとの表皮１ｍｍ当たりのＢｒｄＵ陽性細胞の数を評価した。
【０１３８】
皮膚生検試料は、各処置部位および未処置の対照皮膚から採取した。生検試料を４％の中性緩衝ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色された皮膚切片について、この治療が表皮、真皮、角質層組織に及ぼす影響を決定するために試験をした。生検試料は、炎症細胞に関しても顕微鏡で検査をした。
【０１３９】
皮膚刺激。試験生成物は、３週間の長期治療にも十分に耐え得るものであった。トランスレチノイン酸クリームのみが、処置の１から３週間後に著しい刺激（グレード３）を引き起こした。その他のすべての処置群は、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン治療薬に関してグレード１．５よりも低く、３週間経過するとグレード１よりも下に低下した。
【０１４０】
皮膚含水量。処置対照は、皮膚電導度に著しい低下を示し、したがって、皮膚の含水量は少なかった。これとは対照的に、試験化合物およびビヒクル単独では、皮膚の含水量の漸進的な増加が生じた。３週目には、すべての試験化合物の平均含水量が、ビヒクルまたは未処置対照よりも大きかった。一般に、６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン治療薬は、試験をした化合物の皮膚水分に、最も大きな増加の１つをもたらした。
【０１４１】
皮膚弾性。試験群のいずれかに関する３週間の試験中には、処置群の皮膚弾性に著しい変化は観察されなかった。したがって、処置群の皮膚弾性は、未処置対照およびビヒクルのみの処置群の場合と同等であった。
【０１４２】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）染色。試験化合物が表皮細胞増殖に及ぼす影響を決定するために、表皮のブロモデオキシウリジン染色について測定した。未処置またはビヒクル対照に比べ、試験化合物での表皮ＢｒｄＵ染色に有意な差はなく、試験化合物の場合にはＢｒｄＵ染色にまったく差がなかった。処置対照を処置された組織には、表皮ＢｒｄＵ染色が認められなかったが、真皮内の局所染色領域は、レチノイド誘発性炎症に関連している可能性があった。
【０１４３】
組織生検試料は、処置から３週間後に研究が終了したときに得た。組織学的評価は、すべての試験化合物について、正常な「健康」と思われる皮膚を示した。これとは対照的に、処置対照は、表皮の著しく増大した厚さおよび真皮の炎症性変化を示した。Ｈ＆Ｅ染色生検試料の皮膚区画の厚さを、光学顕微鏡によって測定した。処置から３週間後に測定された表皮、真皮、および角質層の厚さは、ビヒクルおよび未処置対照の場合と同等であった。これとは対照的に、処置対照は、表皮および真皮の厚さの両方を増大させた。
【０１４４】
これらの結果は、審美的外観を改善し、かつ刺激なしに加齢皮膚の活力を保存するのに使用するための６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンの安全性および効力の両方に関する証拠をもたらした。
【０１４５】
（実施例２３）
光損傷を受けた顔面皮膚の臨床的徴候および症状が改善されるよう、１２週間にわたって１日２回適用された、局所６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（０．１０％）の審美的効力および被験者の耐性を決定するために、臨床研究を実施した。軽度から中程度の光損傷を受けた顔面皮膚を有する４０から６５才の４０名の女性ボランティア被験者を、この研究に登録した。３４名の被験者がこの研究に参加し、この研究に参加する被験者の平均年齢は、約５４才であった。被験者には、１日２回（即ち、早朝と、就寝の約１時間前）、１２週間連続して、顔面皮膚全体に試験生成物を適用するよう指導した。また被験者には、日焼け止め剤またはマイルドな清浄剤および着色化粧品の使用以外、他の局所スキンケア製品または薬剤をこの研究中に顔に使用しないよう指導した。試験生成物は、ビヒクルとしてＭｉｌｌＣｒｅｅｋローション中に０．１％の６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリンを含んでいた。
【０１４６】
被験者を、２、４、８、および１２週目に評価した。治療した顔面皮膚について、皮膚加齢の臨床的徴候（例えば、粗く微細なしわ、荒れ、しみだらけの色素沈着過剰）を、研究開始時（ベースライン）ならびに２、４、８、および１２週目に評価した。ベースラインを超えた改善に関する被験者の自己評価（しわ、きめ、しみ、色、および全体的な改善）も得た。さらに、経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）および皮膚水分測定も、すべての被験者の頬に関して行った。
【０１４７】
経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）。ＴＥＷＬは、角質層を通る水蒸気損失の量を指す。ＴＥＷＬ値の増加は、蒸発水分損失（例えば、発汗または蒸発）または皮膚バリア損傷を示唆する。ＴＥＷＬ値の減少は、バリア機能の改善または皮膚表面にバリアが存在することを示唆する。ＴＥＷＬ測定は、中央演算処理装置に接続されたプローブ（湿度および温度センサを含有する）からなるＴＥＷＬメータ（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＆  Ｋｈａｚａｋａ、ケルン、ドイツ）を使用して行った。各被験者ごとに、プローブを両頬の中心に置き、測定を２回行った。
【０１４８】
皮膚水分測定。皮膚の含水量の間接的な測定は、皮膚の電気特性の変化を測定することによって行った。インピーダンスをベースにしたキャパシタンスの測定を、ＮＯＶＡ  ＤＰＭ  ９００３（登録商標）（ＮＯＶＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ、米国）を使用して皮膚上で行った。この機器は、様々な事前に選択された周波数（１ＭＨｚまで）の印加交流電流で測定を行う。キャパシタンスに直接関係する値を任意の単位で決定し、より高い値は、試験部位での水分が高いレベルであることを示すより大きなキャパシタンスを示している。測定は、各試験被験者ごとに、両頬の中心で３回行った。
【０１４９】
被験者の顔面皮膚の専門家評価。ベースライン（０日目）訪問で、研究者は、各被験者の顔について、微細なしわ、粗いしわ、荒れ、しみだらけの色素沈着過剰、およびその他のパラメータを、５ポイントスケール（０＝なし；１＝最小；２＝軽度：３＝中程度；および４＝重度）を使用して評価した。皮膚の光損傷（しわ、荒れ、およびしみだらけの色素沈着過剰）の全体的な重症度は、１０ポイントスケール（０＝なし；１〜３＝軽度；４〜６＝中度；および７〜９＝重度）を使用して評価し、ベースラインでの重症度スコアが６よりも高い被験者は、この研究から除外した。
【０１５０】
続けて訪問するたびに、研究者は、６ポイントスケール（１＝優れた改善；２＝著しい改善；３＝中程度の改善；４＝軽度の改善；５＝改善なし；および６＝悪化）を使用して、ベースラインと比べた全体的な改善について評価した。
【０１５１】
効力に関する被験者の認知。続けて訪問するたびに、被験者に対し、５ポイントスケール（１＝非常に改善された；２＝いくらか改善された；３＝変化なし；４＝いくらか悪化；および５＝非常に悪化）を使用して、ベースラインからの皮膚のきめ、皮膚の色、しみ（即ち、褐斑）、微細なしわの改善、および全体的な改善を評価する自己評価アンケートに記入するよう依頼した。
【０１５２】
結果。すべての被験者に関して平均されかつ平均値として報告された、下記の試験結果が得られた。
【０１５３】
【表５】
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【０１５４】
ＴＥＷＬ値の低下は皮膚バリア機能の改善を示し、ＴＥＷＬ値の上昇は、バリア特性の崩壊を示し得る。皮膚水分の増加は、水分レベルの上昇を間接的に示す。
【０１５５】
全体的な皮膚状態に関する研究者の評価では、５ポイントスケール（０＝なし；１＝最小；２＝軽度；３＝中程度；および４＝重度）を使用して、下記の結果が得られた。
【０１５６】
【表６】
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【０１５７】
上記の表におけるパラメータの負のパーセンテージ変化は、関係あるパラメータの改善を表す。著しい改善は、微細なおよび粗いしわ、荒れ、しみだらけの色素沈着過剰、にきび、および紅斑に関する１つまたは複数の時間での専門家の評価値によって留意された。皮膚の刺激は観察されなかった。
【０１５８】
１０ポイントスケール（０＝なし；１〜３＝軽度；４〜６＝中度；および７〜９＝重度）を使用した、皮膚加齢に関連する審美的外観に基づく全体的な皮膚状態の研究者の評価は、下記の通りであった：４．１０  ベースライン；４．０５  ２週目（ベースラインに対して−１．２２％の変化）；３．５６  ４週目（ベースラインに対して−１５．２３％の変化）；３．２０  ８週目（ベースラインに対して−２４．３２％の変化）；および３．０３  １２週目（ベースラインに対して−２７．９７％）。４、８、および１２週目に示された差は、有意であった（ｐ≦０．００１）。全体的な皮膚状態の負のパーセンテージ変化は、皮膚加齢に関連した審美的外観の改善を表す。
【０１５９】
６ポイントスケール（１＝優れた改善；２＝著しい改善；３＝中程度の改善；４＝わずかな改善；５＝改善なし；および６＝悪化）を使用した、皮膚状態の全体的な改善（ベースラインに対する）に関する研究者の評価は、下記の通りであった：４．９５  ２週目；４．４４  ４週目（２週目のデータに対して−１０．６１％の変化）；４．１１  ８週目（２週目のデータに対して−１６．６７％の変化）；および４．１２  １２週目（２週目のデータに対して−１７．１６％の変化）。４、８、および１２週目に示された差は、有意であった（ｐ≦０．００１）。全体的な改善の負のパーセンテージ変化は、皮膚状態の改善を表す。
【０１６０】
５ポイントスケール（１＝非常に改善された；２＝いくらか改善された；３＝変化なし；４＝いくらか悪化；および５＝非常に悪化）を使用した、研究中の皮膚状態に関する被験者の自己評価の結果は、下記の通りであった。
【０１６１】
【表７】
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【０１６２】
上記の表のパラメータの負のパーセンテージ変化は、関係あるパラメータの改善を表す。被験者は、皮膚のきめ、皮膚の色、しみ、褐斑、および微細なしわに関し、１つまたは複数の時間で著しい改善があることを報告した。さらに被験者は、皮膚の全体的な状態および外観で、８および１２週目に著しい改善があることを報告した。
【０１６３】
全体として、被験者は、専門家の評価および自己評価の両方に基づいて、この研究期間中に全体的な皮膚状態の著しい改善および加齢に関連した悪影響の著しい低減を経験した。皮膚の刺激またはその他の悪影響は、観察されなかった。
【０１６４】
（実施例２４）
この実施例は、実施例２３から得られた、局所適用された６−フルフリルアミノ−９−（２−テトラヒドロピラニル）プリン（０．１０％）の臨床データと、初期の研究からの、局所適用されたキネチン（０．１％）に関して生成された同様の臨床データとを比較する。キネチンに関する初期の臨床試験のプロトコルは、本発明の化合物に関して実施例２３で述べたプロトコルと同様であり、３２名の女性ボランティアが、初期のキネチン研究を終了した。この比較は、双方の研究で評価されたパラメータのいくつかに関する８および１２週目のデータの、皮膚状態に関する専門家の評価および自己評価に基づく。
【０１６５】
専門家の評価に基づく比較は、下記の通りである。
【０１６６】
【表８】
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【０１６７】
被験者の自己評価に基づく比較は、下記の通りである。
【０１６８】
【表９】
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【国際調査報告】
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