(57)【要約】  本発明は、生物学的試料中におけるある種の腫瘍関連キナーゼポリペプチドの存在を決定する方法と、哺乳動物の腫瘍の診断及び治療に有用な組成物に関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のポリペプチドであって、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの有無を決定する方法であって、
上記ポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は低分子に上記生物学的試料を暴露し、上記生物学的試料中の前記ポリペプチドに対する該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は低分子の結合を決定することを含む方法。
【請求項２】
生物学的試料が、増加したレベルの上記ポリペプチドの発現が疑われる細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が癌細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記抗体、ｓｉＲＮＡ、オリゴペプチド又は低分子が検出可能に標識されている請求項２に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法において、上記哺乳動物から得られた組織細胞の試験生物学的試料中と同一組織由来の既知の正常細胞のコントロール生物学的試料中において、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含み、コントロール生物学的試料と比較したときの試験生物学的試料中における上記ポリペプチドのより高い発現レベルが、試験生物学的試料が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示している方法。
【請求項６】
腫瘍がメラノーマである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
癌がＴＡＳＫ１２１（配列番号３）変異を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
変異がＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ（配列番号５）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出する工程が、免疫組織化学解析で抗体を用いることを含む請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
上記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出する工程が、インサイツハイブリダイゼーション又はＲＴ-ＰＣＲ解析でオリゴヌクレオチドを用いることを含む請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法において、上記哺乳動物から得られた組織細胞の試験生物学的試料を、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は低分子に接触させ、抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は低分子と試験生物学的試料中のポリペプチドの間の複合体の形成を検出し、該複合体の形成が哺乳動物における腫瘍の存在を示している方法。
【請求項１２】
抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は低分子が検出可能に標識されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組織細胞の試験生物学的試料が、メラノーマに罹っていることが疑われる個体から得られたものである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
メラノーマがＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ（配列番号５）変異を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの、該ポリペプチドを含むことが疑われる生物学的試料中における有無を決定する方法であって、
核酸に結合するＲＮＡｉに上記生物学的試料を暴露し、上記生物学的試料中の前記ポリペプチドの有無を決定することを含む方法。
【請求項１６】
前記生物学的試料が前記ポリペプチドを過剰発現することが疑われる細胞を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が癌細胞である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＴＡＳＫ抗体（Ａｂ）と薬剤部分（Ｄ）を含み、抗ＴＡＳＫ抗体がリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合する抗体薬剤コンジュゲート化合物であって、式Ｉ
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ                    Ｉ
（ここで、ｐは１から８である）を有し、抗ＴＡＳＫ抗体が、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する抗体薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項１９】
薬剤部分Ｄが、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、及びカリケアマイシンから選択される請求項１８に記載の抗体薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の抗体薬剤コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２１】
腫瘍細胞又は癌細胞を死滅させ又はその増殖を阻害する方法において、腫瘍細胞又は癌細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するのに有効な量の、請求項１８に記載の抗体薬剤コンジュゲート化合物又はその薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物で腫瘍細胞又は癌細胞を治療することを含む方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の抗体薬剤コンジュゲート化合物と、薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤の製剤を患者に投与することを含む癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
米国特許法施行規則第１．５３条第ｂ項に従って出願されたこの非仮出願は、出典明示により全内容を援用する２００５年１２月７日出願の米国仮出願第６０／７４８０６３合に基づく米国特許法第１１９条第ｅ項の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物における遺伝子発現を調節するのに有用な物質と、同目的に対してその物質を使用する方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
悪性腫瘍（癌）は、米国においては心臓疾患に続く第２の主要な死亡原因である（Boringら, CA Cancel J. Clin., 43: 7(1993)）。癌は、正常な組織に由来し、増殖し腫瘤を形成する異常な又は新生物細胞の数の増加、かかる新生物腫瘍細胞の隣接組織への浸潤、血液又はリンパ系を経て局所のリンパ節へ、また転移と呼ばれるプロセスを経て遠隔部位に最終的には拡散する悪性細胞の生成により特徴付けられる。癌の状態では、細胞は正常細胞が増殖しない条件下で増殖する。癌は、様々な程度の侵襲性及び攻撃性によって特徴付けられる広範な形態で現れる。
【０００４】
癌の治療に効果的な細胞標的を発見すべく、研究者は、一又は複数の正常な非癌牲細胞と比較し、特定のタイプの癌細胞で特に過剰発現するポリペプチドを同定しようとしてきた。このような腫瘍関連細胞ポリペプチドの同定は、抗体に基づく治療により癌細胞を特異的に標的として破壊する能力のもとになる。この点に関し、抗体に基づく治療が、ある種の癌の治療に非常に効果的であることが証明されていることが留意される。例えば、ハーセプチン（登録商標）とリツキサン（登録商標）（双方ともジェネンテック社, サウスサンフランシスコ, カリフォルニア）は、それぞれ乳癌及び非ホジキンリンパ腫を治療するのに成功裏に用いられてきた抗体である。より具体的には、ハーセプチン（登録商標）は、ヒト上皮増殖因子レセプター２（ＨＥＲ２）癌原遺伝子の細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ誘導ヒト化モノクローナル抗体である。ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は原発性乳癌の２５−３０％で見られる。リツキサン（登録商標）は、正常及び悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。
【０００５】
シグナル伝達経路、細胞分裂周期及びプログラム細胞死を制御するキナーゼ類は細胞調節にとって重要である。これらの重要なキナーゼ類の過剰発現又は活性化変異は細胞調節を乱し腫瘍形成に至らしめうる。全ての既知癌遺伝子の２０パーセントがプロテインキナーゼ類である。適切なシグナル伝達経路を同定し、これらの癌遺伝子キナーゼ類を特異的に阻害する薬剤を開発することが、しばらくの間、癌研究の主要な目標であった。ハイスループットスクリーニングにより、触媒性アデノシン三リン酸結合部位との競合、基質結合の阻害、又は基質自体の修飾のように異なった阻害形態の低分子が同定されている。ある種の化合物が単一のキナーゼに対して高度に特異的である一方、他のものは類似の結合構造を持つ幾つかのキナーゼ類を阻害しうる（Busseら, Semin. Oncol. 28:47-55 (2001)）。例えば、チロシンキナーゼＢｃｒ-ＡｂＩは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の原因因子として同定されている。低分子のメシル酸イマチニブ(グリベックＴＭ-Novartis Pharmaceuticals Corp, East Hanover, NJ)がＣＭＬの治療に対して最近承認されており、シグナル伝達経路のキナーゼ成分の処置が癌の治療に効果的であることが実証されている(Griffin J. Semin. Oncol. 28:3-8 (2001))。
【０００６】
Ｒａｆセリン／スレオニンキナーゼ類はＲａｓの下流エフェクター分子である(Mercerら, Biochem. Biophys. Acta 1653:25-40 (2003))。ＲａｆファミリーはＡ-Ｒａｆ、Ｂ-Ｒａｆ及びＣ-Ｒａｆからなり、三つの保存領域内に高度の相同性を有している。これらの領域の二つはＲａｓ結合ドメインとＧＴＰ複合化Ｒａｓと相互作用するシステインリッチドメインである(Vojtekら, Cell 74:205-14 (1993))。ＲａｆとＲａｓが結合すると、Ｒａｆは細胞膜に補充され、Ｒａｆ触媒性ドメインの阻害が軽減され、Ｂ-Ｒａｆの活性化ドメイン内の特定部位のリン酸化に至り、よって分子の活性化に至る。これに対して、Ａ-ＲａｆとＣ-Ｒａｆは触媒ドメインの外側の更なるリン酸化を必要とする。Ｂ-Ｒａｆのこの別個の単純な活性化機構はそれをＭＥＫのような経路における下流標的の重要な調節因子にする。Ｂ-Ｒａｆノックアウトマウスでは、ＭＥＫ活性化が乱されるが、この結果は、Ａ-Ｒａｆ又はＣ-Ｒａｆの何れかを欠く細胞では見られない。（Pritchardら, Mol. Cell Bio. 24:5937-5952 (2004)；Mercerら, Oncogene 21:347-355 (2002)；Wellbrockら, Nature Rev. 5 875-885 (2004)）。
【０００７】
癌におけるＢ-Ｒａｆの発生率は、悪性メラノーマ（２７％−７０％）、乳頭様甲状腺癌（３６％−５３％）、結腸直腸癌（５％−２２％）及び漿液性卵巣癌（約３０％）において最も高いことが報告されている（Garnettら, Cancer Cell 6:313-319 (2004)）。メラノーマの発生率は最近の１０年間に着実に増加している。合衆国では、およそ６００００の新症例がメラノーマと毎年診断され、推定７７００名の患者が２００５年にメラノーマで死亡している(American Cancer Society, 2005)。疾患の早期発見の改善にもかかわらず、悪性メラノーマは伝統的な癌治療法に高度に耐性があり、その進行を安定化させ又は遅らせることができる効果的な治療法の開発に対して未だ達成されていない顕著な医療的必要性が存在している（Thompsonら, Lancet 365:687-701(2005)）。例えば、メラノーマは免疫系による攻撃を受けやすい場合があるが、高用量のインターフェロン治療には大きな副作用があり、低用量のインターフェロンを用いるアジュバント療法は無再発性又は全生存の何れにも影響を有することは一貫しては示されていない（Hancockら, J Clin Oncol 22:53-61 (2004)）。メラノーマの治療における希望の最近の指針は、体細胞ＢＲＡＦ変異が非定型色素性母斑及び初期段階メラノーマにおいて非常に高頻度で生じるという知見であった（Daviesら, Nature 417:949-54. (2002)）Mercerら, Biochim Biophys Acta 1653:25-40 (2003)）。これらのＢＲＡＦ変異のほぼ９０％が、キナーゼの活性化セグメントにおいてＶａｌ６００Ｇｌｕ（Ｖ６００Ｅ）アミノ酸置換を生じるエクソン１５のＴ１７９９Ａトランスバージョンである（Wanら, Cell 116:855-67 (2004) Wellbrockら, Nat Rev Mol Cell Biol 5:875-85. (2004)）。この変異は、正常なＢＲＡＦ活性化の間に生じ、恒常的キナーゼ活性に至るＴ５９９及びＳ６０２リン酸化の必要性を不要にする。
【０００８】
ＢＲＡＦはＭＥＫ１／２及び細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）の活性化を誘発する（Mercerら, Biochim Biophys Acta 1653:25-40 (2003)）。細胞増殖、浸潤、生存及び血管新生を含む腫瘍形成に関連した多数の細胞性応答を含む７０を越えるＥＲＫ１／２基質が記載されている（Lewisら, Adv Cancer Res 74:49-139 (1998)）。ＥＲＫ１／２の機能及びシグナル伝達は広く研究されているが、ＥＲＫ３／ＭＡＰＫ６を含む他のＥＲＫファミリーメンバーについてはあまり知られていない（Bogoyevitchら, Cell Signal 16:1345-54 (2004)）。ＥＲＫ３は、ＥＲＫ１とそのキナーゼドメインにおいて〜５０％の同一性を共有している９７ｋＤａのタンパク質である（Boultonら, Cell 65:663-75 (1991)）（Turgeonら, Biochem J. 346 Pt 1:169-75 2000）。ＥＲＫ３はキナーゼ活性と適合性があると考えられるが、推定のインビボ基質はなお議論の余地がある（Schumacherら, Embo J 23:4770-9 (2004)）。
【０００９】
ＥＲＫ３は、それを他のＥＲＫファミリーメンバーから区別する二つの顕著な生化学的特徴をキナーゼドメイン内に有する。先ず、ＥＲＫ３は、ＭＡＰＫ活性化及び基質結合に必須である他のＥＲＫファミリーメンバーに見出される基準のＴｈｒ-Ｘａａ-Ｔｙｒリン酸化モチーフの代わりにＳｅｒ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ配列を含んでいる。更に、典型的なプロテインキナーゼのＣ末端ローブを安定化させるＡｌａ-Ｐｒｏ-Ｇｌｕ活性化ループモチーフがまたＥＲＫ３で保存されていない（Hanksら, Faseb J 9:576-96 (1995)）。ＥＲＫ３のリン酸化媒介調節は現在はよく理解されていないが、更なるレベルのＥＲＫ３調節への洞察が、プロテアソーム阻害剤での処置後に発現が増加した遺伝子のマイクロアレイスクリーニングでのこのキナーゼの同定から続いた（Zimmermannら, J Biol Chem 276:10759-66 2001)）。更なる研究は、ＥＲＫ３タンパク質がユビキチン-プロテアソーム経路によって迅速に分解することを示しており、これはＥＲＫ３レベルのインビボでの調節のための重要な機序であると思われる（Coulombeら, Mol Cell Biol 24:6140-50 (2004)）。ＥＲＫ３結合対のＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ-５はまたＥＲＫ３の内因性レベルを安定化させることが示されている（Schumacherら, Embo J 23:4770-9 (2004)）。併せて考えると、これは、ＥＲＫ３の生物学的活性が、転写物／タンパク質合成の制御及び安定性を通じてその細胞の存在量によって大きく調節されることを示している。
【００１０】
ＢＲＡＦ-Ｖ６００Ｅを発現する細胞におけるＢＲＡＦ特異的転写をマイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングによって研究した（Hoeflichら(2006) Intl. Jour. of Oncology 29:839-849）。細胞外シグナル制御キナーゼ-３及びＭＡＰＫファミリーメンバー（ＥＲＫ３／ＭＡＰＫ６）はＢＲＡＦシグナル伝達に応答して高度に発現される。
生物学及び医学におけるＢＲＡＦシグナル伝達経路の重要性が分かると、癌遺伝子ＢＲＡＦによって誘発される下流シグナル伝達及び遺伝子発現の変化が特徴付けられる。網羅的マイクロアレイプロファイリング及び分子ネットワーク解析と結合させた誘導性ＢＲＡＦ細胞株を使用して、ＢＲＡＦ-ＭＥＫ１／２-ＥＲＫ１／２経路の新規標的を同定した。すなわち、ＥＲＫ３は、活性化ＢＲＡＦミスセンス変異を持つ腫瘍中において増加するＢＲＡＦの転写標的として示されている。哺乳動物の癌治療法の進歩にもかかわらず、腫瘍細胞増殖を診断可能な薬剤に対して大きな必要性がある。従って、診断用標的を同定することが本発明の目的である。
【００１１】
（発明の概要）
本発明の一側面は、生物学的試料中の腫瘍関連キナーゼ(TUMOR-ASSOCIATED KINASE)（ＴＡＳＫ）ポリペプチドであって、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの有無を決定する方法であって、
上記ポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は低分子に上記生物学的試料を暴露し、上記生物学的試料中の前記ポリペプチドに対する該抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は低分子の結合を決定することを含む方法である。
【００１２】
本発明の他の側面は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法において、上記哺乳動物から得られた組織細胞の試験生物学的試料中と同一組織由来の既知の正常細胞のコントロール生物学的試料中において、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含み、コントロール生物学的試料と比較したときの試験生物学的試料中における上記ポリペプチドのより高い発現レベルが、試験生物学的試料が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示している方法である。
【００１３】
本発明の他の側面は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法において、上記哺乳動物から得られた組織細胞の試験生物学的試料を、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド又は低分子に接触させ、抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は低分子と試験生物学的試料中のポリペプチドの間の複合体形成を検出し、複合体の形成が哺乳動物における腫瘍の存在を示している方法である。
【００１４】
本発明の他の側面は、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの、該ポリペプチドを含むことが疑われる生物学的試料中における有無を決定する方法であって、
核酸に結合するＲＮＡｉに上記生物学的試料を暴露し、上記生物学的試料中の前記ポリペプチドの有無を決定することを含む方法である。
【００１５】
本発明の他の側面は、抗ＴＡＳＫ抗体（Ａｂ）と薬剤部分（Ｄ）を含み、抗ＴＡＳＫ抗体がリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合する抗体薬剤コンジュゲート化合物であって、式Ｉ
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ                    Ｉ
（ここで、ｐは１から８である）を有し、抗ＴＡＳＫ抗体が、
（ａ）図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列；又は
（ｂ）図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する抗体薬剤コンジュゲート化合物である。
本発明の更なる実施態様は本明細書を読むと当業者には明らかであろう。
【００１６】
（例示的実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される「ＴＡＳＫポリペプチド」及び「ＴＡＳＫ」という用語は、ここに記載する特定のポリペプチド配列である腫瘍関連キナーゼ(TUMOR-ASSOCIATED KINASE)を意味する。「数字」なる語が、ここで使用される実際の数字標記として提供される「ＴＡＳＫ／数字ポリペプチド」及び「ＴＡＳＫ／数字」には、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体及び天然配列ポリペプチドとポリペプチド変異体の断片（ここで更に定義される）が含まれる。ここで記載されるＴＡＳＫポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成方法によって調製されてもよい。「ＴＡＳＫポリペプチド」という用語は、ここに開示される各個々のＴＡＳＫ／数字ポリペプチドを指す。「ＴＡＳＫポリペプチド」を指すこの明細書中の全ての開示は、各ポリペプチドを個々に指すのと同時にまとめて指す。例えば、調製、精製、誘導、抗体の形成、ＴＡＳＫ ＲＮＡｉの形成、ＴＡＳＫ結合低分子の形成、投与、含有する組成物、疾患の治療等の記載は、本発明の各ポリペプチドのそれぞれに関している。「ＴＡＳＫポリペプチド」という用語はまたここに開示したＴＡＳＫ／数字ポリペプチドの変異体を含む。
【００１７】
「天然配列ＴＡＳＫポリペプチド」には、天然由来の対応するＴＡＳＫポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列ＴＡＳＫポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により産生することもできる。「天然配列ＴＡＳＫポリペプチド」という用語には、特に、特定のＴＡＳＫポリペプチドの自然に生じる切断型、ポリペプチドの自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のある実施態様では、ここに開示される天然配列ＴＡＳＫポリペプチドは、添付の図面に示される完全長アミノ酸配列を含む成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドン（示される場合）は図中に太字及び下線で示す。添付図に「Ｎ」で示す核酸残基は、任意の核酸残基である。しかし、添付の図面に開示したＴＡＳＫポリペプチドは、図中においてアミノ酸位置１としてここに標記されるメチオニン残基で始まるように示されるが、図中におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＴＡＳＫポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし、可能でもある。
【００１８】
ここで同定したＴＡＳＫポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＴＡＳＫポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより、達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559にユーザー用書類と共に提出され、米国著作権登録第TXU510087号として登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社,サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、例えばデジタルＵＮＩＸ（登録商標）V4.0Dでの使用のためにはコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
【００１９】
アミノ酸配列比較のためにALIGN-2を用いる場合は、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのプログラムのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表１及び２が、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＴＡＳＫ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を実証するもので、「ＴＡＳＫ」が対象となる仮のＴＡＳＫ(TUMOR-ASSOCIATED KINASE)ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となるＴＡＳＫポリペプチドが比較されているアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」が各々異なった仮のアミノ酸残基を表す。特に断らない限りは、ここで使用する全ての％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2比較コンピュータプログラムを用いた直ぐ前の節に記載されたようにして得られる。
【００２０】
「ＴＡＳＫ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＴＡＳＫ変異体核酸配列」は、ここで定義される、ＴＡＳＫポリペプチド、例えば活性なＴＡＳＫポリペプチドをコードし、ここに開示される完全長天然配列ＴＡＳＫポリペプチド配列、又は（完全長ＴＡＳＫポリペプチドの完全なコード配列の一部分のみを表す核酸によってコードされたもののような）ここに開示する完全長ＴＡＳＫポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常は、ＴＡＳＫ変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する完全長天然配列ＴＡＳＫポリペプチド配列、又はここに開示する完全長ＴＡＳＫポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は天然ヌクレオチド配列を包含しない。
【００２１】
通常は、ＴＡＳＫ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈において「約」なる用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【００２２】
ここで同定されるＴＡＳＫコード核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＴＡＳＫ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、そのソースコードは米国著作権庁,ワシントン D.C.、20559にユーザー用書類と共に提出され、米国著作権登録第TXU510087号として登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社,サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、例えばデジタルUNIX（登録商標）V4.0Dでの使用にはコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２３】
核酸配列比較にALIGN-2が用いられる場合、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチドである。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表３及び４は「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＴＡＳＫ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示し、ここで、「ＴＡＳＫ−ＤＮＡ」は対象となる仮のＴＡＳＫコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＴＡＳＫ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮のヌクレオチドを表す。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直ぐ前の節に示したようにALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００２４】
表１
ＴＡＳＫ          ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（長さ＝１５アミノ酸）
比較タンパク質    ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹ（長さ＝１２アミノ酸）
％アミノ酸配列同一性＝（ALIGN-2によって決定した二つのポリペプチド配列間の一致する同一アミノ酸残基の数）を（TASKポリペプチドのアミノ酸残基全数）で割る＝
５割る１５＝３３．３％
【００２５】
表２
ＴＡＳＫ          ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（長さ＝１０アミノ酸）
比較タンパク質    ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＺＺＹＺ（長さ＝１５アミノ酸）
％アミノ酸配列同一性＝（ALIGN-2によって決定した二つのポリペプチド配列間の一致する同一アミノ酸残基の数）を（TASKポリペプチドのアミノ酸残基全数）で割る＝
５割る１０＝５０％
【００２６】
表３
ＴＡＳＫ-ＤＮＡ   ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（長さ＝１４ヌクレオチド）
比較ＤＮＡ        ＮＮＮＮＮＮＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ（長さ＝１６ヌクレオチド）
％核酸配列同一性＝（ALIGN-2によって決定した二つの核酸配列間の一致する同一ヌクレオチドの数）を（TASK-DNA核酸配列のヌクレオチドの全数）で割る＝
６割る１４＝４２．９％
【００２７】
表４
ＴＡＳＫ-ＤＮＡ   ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（長さ＝１２ヌクレオチド）
比較ＤＮＡ        ＮＮＮＮＬＬＬＶＶ（長さ＝９ヌクレオチド）
％核酸配列同一性＝（ALIGN-2によって決定した二つの核酸配列間の一致する同一ヌクレオチドの数）を（TASK-DNA核酸配列のヌクレオチドの全数）で割る＝
４割る１２＝３３．３％
【００２８】
他の実施態様では、ＴＡＳＫ変異体ポリヌクレオチドは、ＴＡＳＫポリペプチドをコードし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示した完全長ＴＡＳＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができる核酸分子である。ＴＡＳＫ変異体ポリペプチドは、ＴＡＳＫ変異体ポリヌクレオチドによってコードされるものであり得る。
ここで開示する様々なＴＡＳＫポリペプチドを記載するために使用される場合、「単離」は、その自然環境の成分から同定され、分離され、及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある種の実施態様では、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離されたポリペプチドには、ＴＡＳＫポリペプチドの自然環境の少なくとも一成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２９】
「単離された」ＴＡＳＫポリペプチドをコードする核酸又は他のポリペプチドコード核酸は、同定され、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。よって、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然の細胞中に存在する特異的なポリペプチドをコードする核酸分子とは区別される。しかし、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常は発現する細胞に含まれるポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に適したコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合」している。
【００３０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、容易に決定でき、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
【００３１】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度にストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、ついで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェントな洗浄を用いるものによって特定される。
【００３２】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているようにして特定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、ついで１×ＳＳＣ中約３７−５０℃でのフィルターの洗浄という条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは分かるであろう。
【００３３】
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然の又は天然に生じるＴＡＳＫの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＴＡＳＫポリペプチドの型を意味し、ここで、「生物学的」活性とは、天然の又は天然に生じるＴＡＳＫが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘導する能力以外の、天然の又は天然に生じるＴＡＳＫによって引き起こされる生物学的機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫学的」活性とは、天然の又は天然に生じるＴＡＳＫが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘導する能力を意味する。
【００３４】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治癒的処置及び予防的又は防護的療法の双方を意味し、その目的は、対象の病的症状又は疾患を防ぐか又は遅延（小さく）させることである。治療を必要とする者には、疾患に罹りやすい者並びに疾患に既に罹っている者、又は疾患が予防されるべき者を含む。本発明の方法に従ってＲＮＡｉ又は低分子の治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数について観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、患者又は哺乳動物は、ＴＡＳＫポリペプチド発現癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：癌細胞の数の減少又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速又は停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の緩和；罹患率及び死亡率の減少、及び生活の質問題の改善。ＲＮＡｉが存在する癌細胞の成長を防ぎ及び／又は死滅させることができる程度では、それは細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性であり得る。これらの兆候又は症状の低減はまた患者が感じることができる。
【００３５】
疾患における成功裏の治療及び改善を評価するための上記パラメーターは、医師にとってよく知られている常套的手順によって容易に測定可能である。癌治療では、有効性は、例えば、腫瘍増殖停止時間（ＴＴＰ）の評価及び／又は奏効率（ＲＲ）の決定によって測定することができる。転移は、病期決定試験によって、及び骨への広がりを決定するための骨スキャン及びカルシュウムレベル及び他の酵素の試験によって、決定することができる。ＣＴスキャンはまた該領域の骨盤及びリンパ節への広がりを探索することで行うことができる。胸部Ｘ線と既知の方法による肝臓酵素レベルの測定を、それぞれ肺及び肝臓への転移を調べるために用いる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
より局所化した癌である膀胱癌に対しては、疾患の進行を確かめる方法には、膀胱鏡検査による尿細胞評価、尿中に存在する血液のモニタリング、超音波断層撮影又は静脈性腎盂像、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による尿路上皮性路の可視化が含まれる。遠隔転移の存在は、腹部のＣＴ、胸部Ｘ線、又は骨格の放射性核種画像診断によって評価することができる。
【００３６】
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処置である。
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。例えば、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）と任意の順序での連続投与を含む。
【００３７】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、これらは、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体はｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標)、ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICS(登録商標)が含まれる。
【００３８】
「固相」又は「固体支持体」とは、本発明の抗体、ｓｉＲＮＡ、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド又はＴＡＳＫ結合低分子が接着又は結合できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例には、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド類、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーン類で形成されたものが含まれる。ある実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は別々の粒子の不連続な固相も含む（米国特許第４２７５１４９号）。
「リポソーム」は、哺乳動物へのＲＮＡｉの輸送に有用な種々のタイプの脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
【００３９】
「低」分子又は「低」有機分子とは、約５００ダルトン以下の分子量を持つとここで定義される。
ここに開示するＲＮＡｉの「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量である。「有効量」は、述べた目的に関連して、用量設定によって、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体、ポリペプチド、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ ｓｉＲＮＡ、ＴＡＳＫ結合低分子又は他の薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬剤は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、又は停止）させ；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速、又は停止）させ；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に伴う一又は複数の症状をある程度まで緩和しうる。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬剤が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させることができる程度において、それは、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性でありうる。
【００４０】
抗ＴＡＳＫ抗体、ＴＡＳＫポリペプチド、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ ｓｉＲＮＡ又はＴＡＳＫ結合低分子の「増殖阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための抗ＴＡＳＫ抗体、ＴＡＳＫポリペプチド、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ ｓｉＲＮＡ又はＴＡＳＫ結合有機分子の「増殖阻害量」は、経験的かつ常套的な形で決定することができる。
抗ＴＡＳＫ抗体、ＴＡＳＫポリペプチド、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ ｓｉＲＮＡ又はＴＡＳＫ結合有機分子の「細胞毒性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞増殖の阻害の目的のための抗ＴＡＳＫ抗体、ＴＡＳＫポリペプチド、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ ｓｉＲＮＡ又はＴＡＳＫ結合有機分子の「細胞毒性量」は、経験的かつ常套的な形で決定することができる。
【００４１】
「干渉ＲＮＡ」又はＲＮＡｉは標的遺伝子の発現を減少させる１０から５０ヌクレオチド長のＲＮＡであり、ストランド部分が十分に相補的である（例えば標的遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性を有している）。
「低分子干渉ＲＮＡ」又はｓｉＲＮＡは標的遺伝子の発現を減少させる１０から５０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ二重鎖であり、第一のストランド部分が十分に相補的である（例えば標的遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性を有している）。
「ヘアピン」なる用語は７〜２０ヌクレオチドのループＲＮＡ構造を意味する。
「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」又はｓｈＲＮＡは標的遺伝子の発現を減少させる１０から５０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡストランド部分が十分に相補的である（例えば標的遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性を有している）。
【００４２】
「ＴＡＳＫ干渉ＲＮＡ」又は「ＴＡＳＫ ＲＮＡｉ」はＴＡＳＫ核酸に結合し又は特異的にハイブリダイズし、その発現を減少させる。これは、ＴＡＳＫ分子の発現が、ＲＮＡｉが存在しないコントロールにおけるＴＡＳＫ分子の発現と比較して、ＲＮＡｉが存在していると低いことを意味している。ＴＡＳＫ ＲＮＡｉは既知の方法を使用して同定し、合成しうる（Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003),国際公開第２００３０５６０１２号及び国際公開第２００３０６４６２１号）。
例えばＴＡＳＫポリペプチド標的のような対象核酸に「結合する」ＲＮＡｉは、ＲＮＡｉが該抗原を発現する細胞又は組織を標的とする場合に診断用及び／又は治療用薬剤として有用であるように十分な親和性をもって標的配列に結合し、他の標的配列と有意には交差反応しないものである。そのような実施態様では、「非標的」配列に対するＲＮＡｉの結合の度合いは、ハイブリダイゼーションにより決定して、その特定の標的タンパク質へのＲＮＡｉの結合の約１０％未満である。ＲＮＡｉの結合に関して、特定の核酸に「特異的に結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的である」なる用語は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般には結合活性を有していない類似の構造の分子であるコントロール分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば過剰の非標識標的と類似したコントロール分子との競合によって決定することができる。この場合、プローブへの標識標的の結合が過剰の未標識標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が示される。
【００４３】
「ＴＡＳＫポリペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する」ＲＮＡｉ又は他の低分子又は「増殖阻害」オリゴペプチド、ＲＮＡｉ又は他の低分子は、適切なＴＡＳＫポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞の測定可能な増殖阻害を生じるものである。例示的な増殖阻害性抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ＲＮＡｉ又は低分子は、適切なコントロールと比較して２０％以上、約２０％から約５０％以上（例えば約５０％から約１００％）ＴＡＳＫ発現腫瘍細胞の増殖を阻害し、ここで、コントロールは、典型的には試験されているオリゴペプチド、ＲＮＡｉ又は他の低分子で処置していない腫瘍細胞である。腫瘍細胞のインビボでの増殖阻害は、以下の実験実施例に記載したような様々な方法で決定することができる。
【００４４】
「アポトーシスを誘導する」オリゴペプチド、ＲＮＡｉ又は他の低分子は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞（アポトーシス体）の形成によって決定されるプログラム細胞死を誘導するものである。細胞は通常はＴＡＳＫポリペプチドを過剰発現するものである。細胞は腫瘍細胞、例えば前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、大腸、又は膀胱細胞でありうる。アポトーシスに伴う細胞性事象を評価するために様々な方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転位置はアネキシン結合によって測定することができる；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーを介して評価することができる；及びＤＮＡ断片化を伴う核／クロマチン凝縮は低二倍体細胞中の増加によって評価することができる。アポトーシスを誘導するＲＮＡｉ又は他の低分子は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞に対して、約２から５０倍、約５から５０倍、約１０から５０倍のアネキシン結合の誘導を生じるものでありうる。
【００４５】
「抗体」なる用語は最も広い意味で使用され、例えば、単一の抗ＴＡＳＫモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗ＴＡＳＫ抗体物質、ポリクローナル抗体、一本鎖抗ＴＡＳＫ抗体、及び所望する生物学的又は免疫学的活性を示す限りは抗ＴＡＳＫ抗体の断片（下記を参照）を特に包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）なる用語は、ここでの抗体と相互に置換え可能に用いられる。
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。例示的な実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定して、９５重量％以上まで、また９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツ抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００４６】
基本４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本ヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２−５を含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。各Ｌ鎖は一つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により相互に結合する。各Ｈ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。各Ｈ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。各Ｌ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, 8版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr及びTristram G. Parslow(編), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 71頁及び6章を参照のこと。
【００４７】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。更にγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβシート配置をとり、３つの高頻度可変領域により連結された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域と共に極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の関与を示す。
【００４８】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性の原因となる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、ＶＬにおいては、およそ残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高度可変ループ」からの残基(すなわち、ＶＬにおいては、およそ残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、最初にKohlerら, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって、細菌、真核細胞動物又は植物細胞から作ることができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClacksonら, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksら, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４９】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)を参照)。ここで関心あるキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば旧世界ザル、Ape(ヒトニザル)等)から由来する可変ドメイン抗原-結合配列及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズした(primatized)」抗体を含む。
「無傷」の抗体は、抗原結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、無傷の抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；線形抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００５０】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
【００５１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
【００５２】
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５−１０残基)を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体であり、そこでは２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)においてより十分に記載されている。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
【００５３】
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗ヒトＩｇＥ抗体は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８以下、約１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上にて定義した種々の型の抗体の何れかであることが可能だが、ヒト化又はヒト抗体でありうる。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（すなわち、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５４】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ様悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、メラノーマ、扁平細胞癌(例えば扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric)又は腹部(stomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、脳、並びに頭頸部癌、及び関連した転移が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は何らかの度合いの異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【００５５】
「細胞死を誘導する」ＲＮＡｉ、オリゴペプチド又は他の低分子は、生存可能な細胞を生育不能にするものである。細胞は、ＴＡＳＫポリペプチドを発現するもの、あるいは、同じ組織型の正常細胞と比較してＴＡＳＫポリペプチドを過剰発現するものである。細胞は癌細胞、例えば、メラノーマ、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロ細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性障害（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を識別するために、補体及び免疫エフェクター細胞の無い状態で確かめてもよい。従って、細胞死に関するアッセイは、熱不活化血清（すなわち、補体の不存在下）を用いて、免疫エフェクター細胞が無い状態でおこなってもよい。オリゴペプチド、ＲＮＡｉ又は他の低分子が細胞死を誘導するか否かを確かめるために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Mooreら Cytotechnology 17: 1-11(1995)）又は７ＡＡＤの取り込みによって評価した膜整合性の損失を、未処理細胞と相対して評価することができる。細胞死誘導ＲＮＡｉ、オリゴペプチド又は他の低分子は、ＢＴ４７４細胞でのＰＩ取込みアッセイでＰＩ取込みを誘導するものでありうる。
【００５６】
「ＴＡＳＫ発現細胞」は、内因性又は形質移入されたＴＡＳＫポリペプチドを発現する細胞である。「ＴＡＳＫ発現癌」は、ＴＡＳＫポリペプチドを過剰発現する細胞を含む癌である。「ＴＡＳＫ発現癌」は、場合によっては、ＲＮＡｉ、オリゴペプチド又は他の低分子がそれに結合することができ、癌に関して治療的効果を有するように、十分なレベルのＴＡＳＫポリペプチドを生成する。他の実施態様では、「ＴＡＳＫ発現癌」は、場合によっては、ＴＡＳＫ ＲＮＡｉがそれに結合することができ、癌に対して治療的効果を有しうるように十分なレベルのＴＡＳＫ遺伝子を発現する。ＴＡＳＫポリペプチドを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、顕著により高いレベルのそのＴＡＳＫポリペプチドを有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅又は増大した転写又は翻訳によって生じ得る。ＴＡＳＫポリペプチド過剰発現は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞中に存在するＴＡＳＫタンパク質の増大したレベルを評価することによって決定されうる（例えば、ＴＡＳＫポリペプチドをコードする単離された核酸から、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる単離ＴＡＳＫポリペプチドに対して調製した抗ＴＡＳＫ抗体を用いた免疫組織化学アッセイを介して；ＦＡＣＳ分析など）。あるいは、又は付加的に、例えば、ＴＡＳＫコード核酸又はその相補鎖と一致する核酸ベースプローブを使用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開の国際公開９８／４５４７９を参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）を介して、細胞中のＴＡＳＫポリペプチドコード核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定することができる。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイが、熟練技術者に利用可能である。例えば、患者の体の中にある細胞を、例えば、放射性同位元素のような検出可能な標識で標識していてもよい抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合が、例えば、放射能の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって、評価することができる。
【００５７】
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識化」抗体、オリゴペプチド又は他の低分子を作製するために、抗体、オリゴペプチド又は他の低分子に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよいし（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒しうる。
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素）、化学治療薬、例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／変異体を含む低分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、及び下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むものである。他の細胞毒性薬を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００５８】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞、特にＴＡＳＫ発現癌細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期におけるＴＡＳＫ発現細胞の割合を有意に減少させるものでありうる。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakamiら, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン-プーラン・ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー・スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキシサイクリン」はテトラサイクリンファミリーの抗生物質のメンバーである。ドキシサイクリンの完全な化学名は、１-ジメチルアミノ-２,４ａ,５,７,１２-ペンタヒドロキシ-１１-メチル-４,６-ジオキソ-１,４ａ,１１,１１ａ,１２,１２ａ-ヘキサヒドロテトラセン-３-カルボキサミドである。ドキシサイクリンはＴｅｔＲに結合し、ＴｅｔＯのＴｅｔＲ阻害を軽減する。
【００５９】
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の上位概念の用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１ａ、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる場合、サイトカインなる用語には、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的パッケージを慣習的に含めた指示書を指す。
【００６０】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
ある実施態様では、本発明は腫瘍関連キナーゼ(TUMOR-ASSOCIATED KINASE)ポリペプチド（「ＴＡＳＫ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。他の側面では、本発明は、キナーゼドメインが不活性化されたか、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であるＴＡＳＫを提供する。従って、ここに記載したＴＡＳＫポリペプチドの触媒的に不活性な形態が考慮される。
単離された核酸分子は、（ａ）ここで開示されるアミノ酸配列を有する完全長ＴＡＳＫポリペプチド、又はここに開示される完全長ＴＡＳＫポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定まった断片をコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含みうる。
【００６１】
単離された核酸分子は、（ａ）ここで開示される完全長ＴＡＳＫポリペプチドｃＤＮＡのコード化配列、又はここに開示される完全長ＴＡＳＫポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定まった断片のコード配列、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含みうる。
単離された核酸分子は、ここに開示されるヒトタンパク質ｃＤＮＡの何れかの完全長コード配列によってコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含みうる。この点において、「完全長コード配列」なる用語は、（添付図において開始コドンと停止コドンの間にしばしば示される）ｃＤＮＡのＴＡＳＫポリペプチドコードヌクレオチド配列を意味する。
【００６２】
本発明の他の実施態様は、（ａ）ここで開示される完全長アミノ酸配列を有するＴＡＳＫポリペプチド、又はここで開示される完全長ＴＡＳＫポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定まった断片をコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズする単離された核酸分子に関する。この点に関して、本発明の実施態様は、例えば、診断用プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとして有用なハイブリダイゼーションプローブとして、あるいは完全長ＴＡＳＫポリペプチドの断片のコード化のための用途を見出し得る、ここに開示される完全長ＴＡＳＫポリペプチドコード配列の断片に関する。このような核酸断片は、通常は少なくとも約５のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈において「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。ＴＡＳＫポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、よく知られた多くの配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してＴＡＳＫポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＴＡＳＫポリペプチドコードヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することによって、常套的に決定しうることが留意される。そのようなＴＡＳＫポリペプチドコードヌクレオチド配列の新規な断片の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＴＡＳＫポリペプチド断片で、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド又はＴＡＳＫポリペプチドに結合する他の低分子に対する結合部位を含んでなるＴＡＳＫポリペプチド断片である。
【００６３】
本発明の他の実施態様は、上記において同定した単離された核酸配列の何れかによりコードされる単離されたＴＡＳＫポリペプチドを提供する。
本発明の他の実施態様は、ここに開示される完全長アミノ酸配列を有するＴＡＳＫポリペプチド、又はここに開示される完全長ＴＡＳＫポリペプチドアミノ酸配列のその他の具体的に定まった断片によってコードされているアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＴポリペプチドに関する。
本発明の他の実施態様は、ここに開示されているヒトタンパク質ｃＤＮＡの何れかによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＳＫポリペプチドに関する。
【００６４】
本発明の他の実施態様は、単離されたＴＡＳＫポリペプチドを提供する。これを製造する方法もまたここに記載され、該方法には、ＴＡＳＫポリペプチドの発現に適した条件下で適切なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からＴＡＳＫポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の実施態様は、ここに記載されたポリペプチドの何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞は哺乳動物細胞、大腸菌又は酵母でありうる。
本発明の他の実施態様は、ここに記載のＴＡＳＫ核酸、ここに記載のキメラＴＡＳＫ核酸、又はＴＡＳＫ阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を含んでなる物質に関する。
本発明の他の実施態様は、容器及び容器内に収容された物質を含む製造品に関し、ここで、その物質には、（ａ）ここに記載のＴＡＳＫ核酸、（ｂ）ここに記載のキメラＴＡＳＫ核酸、又は（ｃ）ＴＡＳＫ ＲＮＡｉと、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）を送達させることができるベクターを含みうる。製造品は、更に場合によっては、腫瘍の治療的処置又は診断的検出のための該物質の使用に言及する、容器に添付したラベル、又は容器内に含まれるパッケージ挿入物を含みうる。
【００６５】
本発明の他の実施態様は、（ａ）ここに記載のＴＡＳＫ核酸、（ｂ）ここに記載のキメラＴＡＳＫ核酸、（ｃ）ＴＡＳＫ ＲＮＡｉと、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）を送達させることができるベクターの、ＴＡＳＫ核酸、キメラＴＡＳＫ核酸、ＴＡＳＫ ＲＮＡｉと、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）を送達させることができるベクターに応答性である症状の治療に有用な医薬の調製における使用に関する。
本発明の他の実施態様は、ＴＡＳＫポリペプチドを発現する癌細胞を死滅させる方法に関し、該方法は、ＴＡＳＫ核酸に結合するＲＮＡｉに癌細胞を接触させ、癌細胞の死を生じさせることを含む。
本発明の他の実施態様は、癌細胞の増殖がＴＡＳＫポリペプチドの増殖増強効果に少なくとも部分的に依存する癌細胞の増殖を阻害する方法に関し、該方法は、ＴＡＳＫ核酸を、ＴＡＳＫ核酸に結合するＲＮＡｉと接触させ、それによってＴＡＳＫポリペプチドの増殖増強活性をアンタゴナイズし、順に癌細胞の増殖を阻害する。癌細胞の増殖は完全に阻害されうる。
【００６６】
本発明の他の実施態様は哺乳動物におけるＴＡＳＫポリペプチド発現腫瘍を治療的に処置する方法に関し、該方法は、ＴＡＳＫ核酸に結合するＲＮＡｉの治療的有効量を哺乳動物に投与し、それによって腫瘍の効果的な治療的処置を行うものである。
本発明の他の実施態様は哺乳動物における腫瘍であって、その増殖がＴＡＳＫポリペプチドの増殖増強効果に少なくとも部分的に依存する腫瘍を治療的に処置する方法に関し、該方法は、ＴＡＳＫ核酸に結合するＲＮＡｉの治療的有効量を哺乳動物に投与し、それによって上記ＴＡＳＫポリペプチドの増殖増強活性をアンタゴナイズし、腫瘍の効果的な治療的処置を行うものである。
本発明の他の実施態様は、ＴＡＳＫポリペプチドの変化した又は増加した発現あるいは活性を伴う細胞増殖性疾患を治療し又は予防する方法に関する。例示的な方法は、ＴＡＳＫポリペプチドのアンタゴニストの治療的有効量をそのような治療を必要とする患者に投与することを含む。細胞増殖性疾患は癌であり得、ＴＡＳＫポリペプチドのアンタゴニストはＴＡＳＫ ＲＮＡｉであり得る。細胞増殖性疾患の効果的な治療又は予防は、ＴＡＳＫ核酸ポリペプチドを発現する細胞を直接死滅させ又はその増殖を阻害し、又はＴＡＳＫポリペプチドの細胞増殖活性をアンタゴナイズすることによる結果でありうる。
本発明の他の実施態様は、ＴＡＳＫ核酸を含むことが疑われる生物学的試料中におけるＴＡＳＫ核酸の有無を決定する方法に関し、該方法は、ＴＡＳＫ核酸に結合するＲＮＡｉに生物学的試料を暴露し、生物学的試料中のＴＡＳＫ核酸へのＲＮＡｉの結合性を決定し、かかる結合性の有無が生物学的試料中のＴＡＳＫポリペプチドの有無を示すものである。場合によっては、生物学的試料はＴＡＳＫポリペプチドを発現することが疑われる細胞（癌細胞であり得る）を含みうる。該方法で用いられるＴＡＳＫ結合ＲＮＡｉは、場合によっては検出可能に標識され、固形担体に結合等されている。
【００６７】
本発明の他の実施態様は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）上記哺乳動物から得た組織細胞の試験生物学的試料中と、（ｂ）同じ組織由来の既知の正常細胞のコントロール生物学的試料中の、ＴＡＳＫポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含み、コントロール試料と比較した、試験試料中のＴＡＳＫポリペプチドのより高いレベルの発現が、試験試料が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示すものである。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）上記哺乳動物から得た組織細胞の試験生物学的試料中と、（ｂ）同じ組織由来の既知の正常細胞のコントロール生物学的試料中において、抗体を用いて、ＴＡＳＫポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含み、コントロール試料と比較した、試験試料中のＴＡＳＫポリペプチドのより高いレベルの発現が、試験試料が得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示すものである。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関し、該方法は、（ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料をＴＡＳＫ核酸に結合するＲＮＡｉに接触させ、（ｂ）試験試料中におけるＲＮＡｉとＴＡＳＫポリペプチドの間の複合体形成を検出し、複合体の形成が哺乳動物における腫瘍の存在を示すものである。場合によっては、用いられるＲＮＡｉは検出可能に標識され、固形担体に結合等され、及び／又は組織細胞の試験試料は癌性腫瘍を持つことが疑われる個体から得られる。
【００６８】
本発明の他の実施態様は、上述し又は以下に記載するポリペプチドの任意のものに特異的に結合し、又はハイブリダイズする抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又は抗ＴＡＳＫポリペプチド抗体のその各抗原エピトープへの結合を競合的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、場合によっては、例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン、抗生物質、放射性同位元素、核酸分解酵素等を含む毒素のような増殖阻害剤又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートされうる。本発明の抗体は場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞において産生され得、それらが結合する細胞の死を誘導しうる。診断目的では、本発明の抗体は検出可能に標識され、固形担体に結合等されうる。特定の態様では、抗体は組織試料中のＴＡＳＫポリペプチドの発現レベルを決定するために使用することができる。
本発明の他の実施態様は、１０から５０ヌクレオチド長の単離された低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）二本鎖に関し、ここで、第一ストランドの部分は対象のＴＡＳＫ核酸に十分に相補性（例えば少なくとも８０％の同一性を有する）であり、ＴＡＳＫポリペプチドの発現を抑制又は「ノックダウン」する。
【００６９】
本発明の他の実施態様は、低分子のスクリーニング方法に関し、該方法は、（ａ）標的遺伝子に対するＲＮＡｉに試験試料を接触させ、（ｂ）ＲＮＡｉサイレンス標的遺伝子の活性又は発現の減少を、低分子に接触させた場合の標的遺伝子の活性又は発現の減少と比較することを含む。
本発明の他の実施態様は、１０から５０ヌクレオチド長の単離された低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）二本鎖に関し、ここで、第一ストランドの部分は対象のＴＡＳＫ核酸に十分に相補性（例えば少なくとも８０％の同一性を有する）であり、ＴＡＳＫポリペプチドの発現を抑制又は「ノックダウン」する。
本発明の他の実施態様は、ＲＮＡループ構造又はＲＮＡヘアピンによって作用可能に結合されうるＲＮＡの第一及び第二ストランドに関する。このＲＮＡループ構造は５から５０ヌクレオチド長でありうる。特定の実施態様では、複数のＴＡＳＫ遺伝子のノックダウンに対して複数のヘアピンが考えられる。
本発明は、他のＴＡＳＫ遺伝子に応答して癌においてアップレギュレーションされる新規に同定したＴＡＳＫ遺伝子の同定を含み、該新規に同定したＴＡＳＫ遺伝子は癌の診断に使用することができる。
【００７０】
Ａ．抗ＴＡＳＫ抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療及び／又は診断薬としての用途が見出され得る抗ＴＡＳＫ抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。抗ＴＡＳＫ抗体には、完全長又はインタクトな抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、免疫複合体、及びその機能的断片が含まれる。融合抗体においては、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合している。抗ＴＡＳＫ抗体はＦｃ領域を修飾して所望のエフェクター機能をもたらすようにすることができる。ここのセクションで更に詳細に検討するように、適切なＦｃ領域があれば、細胞表面に結合した裸の抗体は、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介するか又は補体依存性細胞傷害における補体の補充、あるいは何らかの他の機構によって、細胞傷害を誘導し得る。あるいは、エフェクター機能をなくしたり又は減少させ、副作用又は治療合併症を最小にすることが望まれる場合には、ある種の他のＦｃ領域を使用することができる。
【００７１】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連抗原とアジュバントの複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射により、動物において産生されうる。免疫されるべき種において免疫原性であるタンパク質に関連抗原（特に合成ペプチドが用いられる場合）を結合させることは有用でありうる。例えば、該抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を用いて結合させることができる。
【００７２】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)；Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生に対して開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。ハイブリドーマ細胞が生育している培地について、抗原に対するモノクローナル抗体の産生を検定する。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定しうる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【００７３】
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554(1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記述している。続く刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の産生(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列を非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部と融合させることによって、修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを産生させることができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代えることができるか、又は抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００７４】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗ＴＡＳＫ抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体を更に含みうる。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００７５】
ヒト化は本質的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施されうる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から一又は複数のアミノ酸残基がそこに導入されたものである。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取り出される。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基と場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を作製する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Simsら, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaら, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００７６】
抗体は、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化されうる。親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体は調製されうる。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能である。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これらのディスプレイを見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性の増加といった所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗ＴＡＳＫ抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を産生するために、場合によっては一又は複数の細胞傷害剤と結合されていてもよい抗体断片、例えばＦａｂでありうる。あるいは、ヒト化抗体はインタクトな抗体、例えばインタクトＩｇＧ１抗体でありうる。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を産生することができる。例えば、現在では、免疫化されると、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えばマウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの、かかる生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggemanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５５９１６６９号；同第５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照のこと。
【００７７】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産生させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレームを一致させて、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子の何れかでクローン化し、ファージ粒子表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択によって、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、該ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣する。ファージディスプレイは、例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)において概説されている多様な形式で行うことができる。Ｖ-遺伝子セグメントの幾つかの供給源を、ファージディスプレイに対して使用することができる。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構成することができ、抗原の多様なアレイ(自己抗原を含む)に対する抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。米国特許第５５６５３３２号及び同第５５７３９０５号も参照のこと。
上で検討したように、ヒト抗体はインビトロで活性化されたＢ細胞により産生することもできる(米国特許第５５６７６１０号及び同第５２２９２７５号)。
【００７８】
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも抗体断片を用いることに利点がある。より小さなサイズの断片は迅速なクリアランスを可能とし、固形腫瘍への接近の改良につながりうる。
抗体断片を産生するための様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、全て大腸菌で発現させ分泌させることができ、よって、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むインビボ半減期が増したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の産生のための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されうる。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００７９】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＴＡＳＫタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＴＡＳＫ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＴＡＳＫアームは、ＴＡＳＫ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＴＡＳＫを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＴＡＳＫ結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる（国際公開第９６／１６６７３号；米国特許第５８３７２３４号；国際公開第９８／０２４６３号；米国特許第５８２１３３７号）。
【００８０】
完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインとでありうる。第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)は、融合物の少なくとも一つに存在する、軽鎖の結合に必要な部位を含みうる。免疫グロブリン重鎖の融合物と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００８１】
この手法の例示的な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。
二重特異性抗体は、Sureshら, Methods in Enzymology 121:210(1986)；米国特許第５７３１１６８号；米国特許第４６７６９８０号；国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００３７３号；欧州特許第０３０８９号；米国特許第４６７６９８０号；Brennanら, Science 229:81 (1985)；Shalabyら, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)；Kostelnyら, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)；Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)；Gruberら, J. Immunol., 152:5368 (1994)；Tuttら, J. Immunol. 147:60 (1991))。
【００８２】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号）提案されている。該抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【００８３】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域にアミノ末端が結合した３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、多価抗体は３から約８、例えば４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも一つのポリペプチド鎖(例えば２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の一つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ-ＣＨ１-フレキシブルリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を含みうる。ここでの多価抗体は、例えば、少なくとも２つ(例えば４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含みうる。ここで多価抗体は、例えば約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含みうる。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によってはＣＬドメインを更に含む。
【００８４】
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を誘導することにより達成されうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。このようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)中にサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合、「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００８５】
９．イムノコンジュゲート（抗体薬コンジュゲート）
他の側面では、本発明は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞傷害性薬物（薬剤部分）にコンジュゲートした抗体を含むイムノコンジュゲート又は抗体薬コンジュゲートを提供する。
抗ＴＡＳＫ抗体-薬剤コンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイドの何れかの生物学的活性を有意に消失させることなく抗ＴＡＳＫ抗体を薬剤部分に化学的に結合させることによって調製することができる。
【００８６】
癌の治療において細胞傷害性薬物又は細胞増殖阻害薬を局所送達するために抗体-薬剤コンジュゲートを使用すること（Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号）により、腫瘍への薬剤部分の標的送達と、そこでの細胞内蓄積が可能になり、これら未コンジュゲート薬剤の全身投与が、正常細胞並びに排除することが求められている腫瘍細胞に対して許容できないレベルの毒性をもたらしうる（Baldwinら, (1986) Lancet pp.(Mar. 15, 1986):603-05；Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら(編), pp. 475-506）。最小の毒性で最大の効果が求められる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の双方がこれらの方策において有用であると報告されている（Rowlandら, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87）。これらの方法に使用される薬剤には、 Drugs used in these methods include ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、及びビンデシンが含まれる（上掲のRowlandら, (1986)）。抗体-毒素コンジュゲートに使用される毒素には、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、低分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791）、メイタンシノイド類（欧州特許出願公開第１３９１２１３号；Liuら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、及びカリケアマイシン(Lodeら(1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら(1993) Cancer Res. 53:3336-3342）が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって細胞傷害性及び細胞増殖阻害性効果を奏しうる。ある種の細胞傷害性薬物は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に不活性か活性が少なくなる傾向にある。
【００８７】
本発明の抗体は任意の治療薬剤、つまり薬剤部分とコンジュゲートさせることができ、その薬剤部分は抗体に共有結合させることができる。
抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物の例示的実施態様は、抗ＴＡＳＫ抗体（Ａｂ）と薬剤部分（Ｄ）を含み、ここで、抗ＴＡＳＫ抗体はＤにリンカー部分（Ｌ）によって結合しており；該物質は式Ｉを有する：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ                  Ｉ
ここで、ｐは１から約８である。
薬剤が抗体にコンジュゲートされていない場合、薬剤は細胞傷害又は細胞増殖阻害効果を有している。よって、薬剤部分の生物学的活性は抗ＴＡＳＫ抗体へのコンジュゲーションによって調節される。本発明の抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は腫瘍組織に細胞傷害性薬剤の有効用量を選択的に送達し、より大きい選択性、つまりより低い有効用量が達成されうる。
「リンカー」（Ｌ）は、一又は複数の薬剤部分（Ｄ）と抗体ユニット（Ａｂ）を結合させて式Ｉの抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために使用することができる二官能性又は多官能性部分である。抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は薬剤と抗体に結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して簡便に調製することができる。抗ＴＡＳＫ抗体（Ａｂ）のシステインチオール又はリジンアミノがリンカー試薬、薬剤部分又は薬剤-リンカー中間体の官能基と結合を形成し得る。
【００８８】
本発明のＡＤＣ又はＡＤＣの細胞内代謝物のバイオアベイラビリティは、ＡＤＣの薬剤部分を含む薬剤化合物と比較すると、哺乳動物において改善されうる。またＡＤＣ又はＡＤＣの細胞内代謝物のバイオアベイラビリティは、薬剤部分を有していないＡＤＣの類似体と比較すると、哺乳動物において改善される。
抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬剤部分（Ｄ）には、細胞傷害又は細胞増殖阻害効果を有している任意の化合物、部分又は基が含まれる。薬剤部分には、（ｉ）微小チューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又はＤＮＡ介入物として機能しうる化学療法剤；（ｉｉ）酵素的に機能しうるタンパク質毒素；及び（ｉｉｉ）放射性同位元素が含まれる。
【００８９】
例示的な薬剤部分には、限定するものではないが、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテシン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシン及び他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、及びその立体異性体、アイソスター、類似体又は誘導体が含まれる。
使用することができる酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンＡ鎖（Vitettaら(1987)Science, 238:1098）、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテシン類(tricothecenes)が含まれる（国際公開第９３／２１２３２号）。様々な放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の産生のために利用できる。例には、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが含まれる。
【００９０】
抗体と一又は複数の低分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド類、ドラスタチン類、オーリスタチン類、トリコテシン、及びＣＣ１０６５、及び毒素活性を有するこれら毒素の誘導体のコンジュゲートがまたここで考えられる。
メイタンシノイド類は、チューブリン重合を阻害することによって作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同第４２４８８７０号；同第４２５６７４６号；同第４２６０６０８号；同第４２６５８１４号；同第４２９４７５７号；同第４３０７０１６号；同第４３０８２６８号；同第４３０８２６９号；同第４３０９４２８号；同第４３１３９４６号；同第４３１５９２９号；同第４３１７８２１号；同第４３２２３４８号；同第４３３１５９８号；同第４３６１６５０号；同第４３６４８６６号；同第４４２４２１９号；同第４４５０２５４号；同第４３６２６６３号；及び同第４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに援用される。ＡＤＣにおけるメイタンシノイド薬剤部分の例示的実施態様には、ＤＭ１、ＤＭ３、及びＤＭ４（米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号；国際公開第２００５／０３７９９２号；米国特許第５２０８０２０号）が含まれる。その治療係数を改善する試みで、メイタンシン及びメイタンシノイド類は、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせられている（米国特許第５２０８０２０号；同第５４１６０６４号；欧州特許第０４２５２３５号；Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)）。
【００９１】
式Ｉの抗体-薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬剤部分（Ｄ）にはまたドラスタチン類とそのペプチド性類似体及び誘導体、オーリスタチン類（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号）が含まれる。ドラスタチン類及びオーリスタチン類は微小管動態、ＧＴＰ加水分解、及び核及び細胞分裂に干渉し（Woykeら(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584）、抗癌（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Pettitら(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)）を有していることが示されている。様々な形態のドラスタチン又はオーリスタチン薬剤部分は、ペプチド性薬剤部分のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端を通して抗体に共有結合されうる（国際公開第０２／０８８１７２号；Doroninaら(2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784；Franciscoら(2003) Blood 102(4):1458-1465）。
薬剤部分には、ドラスタチン類、オーリスタチン類（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号；同第５７６７２３７号；同第６１２４４３１号）、及びその類似体及び誘導体が含まれる。ドラスタチン類及びオーリスタチン類は微小管動態、ＧＴＰ加水分解、及び核及び細胞分裂に干渉し（Woykeら(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584）、抗癌（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Pettitら(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)）を有していることが示されている。ドラスタチン又はオーリスタチン薬剤部分は、ペプチド性薬剤部分のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端を通して抗体に共有結合されうる（国際公開第０２／０８８１７２号）。
【００９２】
例示的オーリスタチン実施態様には、国際公開第２００５／０８１７１１号；２００４年３月２８日に提示されたSenterら, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623に開示されたＮ末端結合モノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦが含まれ、その各開示は出典明示によりその全体が明示的に援用される。
薬剤部分にはカリケアマイシン及びその類似体及び誘導体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡの切断を生じ得る。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号；同第５７１４５８６号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７０７０１号；同第５７７０７１０号；同第５７７３００１号；同第５８７７２９６号を参照のこと。使用することができるカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１が含まれる（Hinmanら Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lodeら Cancer Research 58:2925-2928 (1998)）。
【００９３】
本発明の抗ＴＡＳＫ抗体にコンジュゲートさせることができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同第５７７０７１０号に記載され、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として知られている薬剤ファミリー、並びにエスペラミシン(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
本発明は、抗体と核分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮエース)との間で形成されるイムノコンジュゲートを更に考察する。
腫瘍の選択的破壊のため、抗体は高い放射性の原子を含みうる。放射性コンジュゲート抗ＴＡＳＫ抗体の産生のために様々な放射性同位体が利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)画像法(磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られている)のためのスピン標識、例えば再びヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である（国際公開第９４／１１０２６号）。
【００９４】
放射性又は他の標識は、既知の方法でコンジュゲート中に導入される。例えば、ペプチドは生合成されうるか、又は水素に代えて例えばフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学アミノ酸合成法により合成されうる。例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１のような標識は、ペプチドのシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合され得る。IODOGEN法(Frakerら(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)はヨウ素-１２３の導入に使用することができる。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)は他の方法を詳細に記載している。
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング「リンカー」試薬、例えばスクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラートＳＭＣＣ、ＢＭＰＥＯ、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)（Carlssonら, Biochem. J. 173:723-737 [1978]）、Ｎ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート（ＳＰＰ）、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、２,６-ジイソシアン酸トルエン)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。
【００９５】
一側面では、リンカーは、抗体上に存在している求核システイン又はリジンに反応性である求電子基を持つ反応性部位を有している。抗体のシステインチオールはリンカー上の求電子基と反応性であり、リンカーと共有結合を形成する。有用な求電子基には、限定されないが、スクシンイミド、マレイミド及びハロアセトアミド基が含まれる。抗体は、Klussmanら(2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773の７６６頁のコンジュゲーション法に従って、リンカー試薬又は薬剤-リンカー中間体、求電子官能基、例えばマレイミド又はα-ハロカルボニルと反応する。
他の実施態様では、リンカーは、分岐した多官能性リンカー部分を介して抗体に一を越える薬剤部分を共有結合させるための樹状タイプのリンカーでありうる（Sunら(2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sunら(2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768；King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990）。樹状リンカーは、抗体に対する薬剤のモル比、つまり負荷を増加させることができ、これはＡＤＣの効力に関連する。よって、システイン操作抗体が反応性システインチオール基を一つのみ担持している場合、複数の薬剤部分を樹状リンカーを介して結合させることができる。
【００９６】
リンカーは、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド又はドデカペプチドユニットのようなアミノ酸残基を含みうる。アミノ酸ユニットを含むアミノ酸残基には、天然に生じるもの、並びに少数のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンが含まれる。リンカーのアミノ酸ユニットは、腫瘍関連プロテアーゼを含む一又は複数の酵素によって酵素的に切断されて、薬剤部分（-Ｄ）を放出し得、該部分は一実施態様では放出時にインビボでプロトン化されて薬剤（Ｄ）をもたらす。有用な-Ｗｗ-ユニットは、例えば腫瘍関連プロテアーゼのような特定の酵素による酵素的切断に対するその選択性について設計され最適化され得る。一実施態様では、-Ｗｗ-ユニットは、その切断がカテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼによって触媒されるものである。例示的なジペプチドには、バリン-シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が含まれる。
リンカーはまたｐ-アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）のような自壊的ユニットを含みうる。
【００９７】
他の実施態様では、リンカーは、抗体上に存在している求電子基に反応性である求核基を持つ反応性官能基を有している。抗体上の有用な求電子基には、限定されないが、アルデヒド及びケトンカルボニル基が含まれる。リンカーの求電子基のヘテロ原子は抗体上の求電子基と反応することができ、抗体ユニットと共有結合を形成する。リンカー上の有用な求核基には、限定しないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジドが含まれる。抗体上の求電子基はリンカーへの結合のために簡便な部位を提供する。
他の実施態様では、リンカーは、溶解度又は反応性を調節する基で置換されてもよい。例えば、スルホネート（-ＳＯ３−）又はアンモニウムのような荷電置換基は試薬の水溶解度を増大させ、ＡＤＣの調製に用いられる合成経路に応じて、抗体又は薬剤部分とのリンカー試薬のカップリング反応を容易にし、あるいはＡｂ−Ｌ（抗体-リンカー中間体）とＤ、又はＤ−Ｌ（薬剤-リンカー中間体）とＡｂのカップリング反応を容易にする。
【００９８】
本発明の化合物は、限定するものではないが、リンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−(４−ビニルスルホン)ベンゾアート）を用い、ビス−マレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ(ＰＥＯ)３、及びＢＭ(ＰＥＯ)４を含んで調製されるＡＤＣを明示的に考慮し、これらは、Pierce Biotechnology社, Customer Service Department, P.O. Box 117, Rockford, IL. 61105 U.S.A, U.S.A 1-800-874-3723, International +815-968-0747から商業的に入手できる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照のこと。ビス-マレイミド試薬により、連続的な又は同時の形で、チオール含有薬剤部分、標識、又はリンカー中間体へのシステイン操作抗体のチオール基の結合が可能になる。システイン操作抗体、薬剤部分、標識又はリンカー中間体のチオール基と反応性であるマレイミド以外の他の官能基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、及びイソチオシアネートが含まれる。
【００９９】
有用なリンカー試薬は、また、他の商業的供給源、例えばMolecular Biosciences社(Boulder, CO)を経由して得ることができ、あるいはTokiら(2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872；Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355；Frischら(1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186；米国特許第６２１４３４５号；国際公開第０２／０８８１７２号；米国特許出願公開第２００３１３０１８９号；同第２００３０９６７４３号；国際公開第０３／０２６５７７号；国際公開第０３／０４３５８３号；及び国際公開第０４／０３２８２８号に記載された手順に従って合成できる。
式ＩのＡＤＣは、(１) リンカー試薬と抗ＴＡＳＫ抗体のシステイン基を反応させて、共有結合を介して抗体-リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成し、ついで活性化された薬剤部分Ｄと反応させる；及び(２)リンカー試薬と薬剤部分の求核基を反応させて、共有結合を介して薬剤-リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成し、ついでシステイン操作抗体のシステイン基と反応させることを含む、有機化学反応、条件及び試薬を用いて、幾つかの経路によって調製されうる。コンジュゲーション法（１）及び（２）を、様々なシステイン操作抗体、薬剤部分、及びリンカーと共に用いて、式Ｉの抗体-薬剤コンジュゲートを調製することができる。
【０１００】
抗体システインチオール基は、求核性で、反応して、（ｉ）活性エステル類、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステル(ハロホルメート)、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばアロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基；及び（ｉｖ）スルフィド交換を介するピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含むリンカー試薬及び薬剤-リンカー中間体上の求電子基と共有結合を形成することができる。薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、反応してリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が含まれる。
あるいは、抗ＴＡＳＫ抗体及び細胞傷害性薬物を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成法によって作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、又はコンジュゲートの所望の性質を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されたコンジュゲートの二つの部分をコードするそれぞれの領域を含みうるものである。
また他の実施態様では、抗体は、抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与する腫瘍プレターゲティングに使用するために「レセプター」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲートさせることができ、投与後、循環系から除去剤を使用して未結合コンジュゲートを除去し、ついで、細胞傷害性薬物（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートさせられる「リガンド」（例えばアビジン）が投与される。
【０１０１】
本発明の抗体は、反応性官能基を通して抗体に共有結合され得る任意の標識部分とコンジュゲートされうる（Singhら(2002) Anal. Biochem. 304:147-15；Harlow E.及びLane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2版 CRC Press, Boca Raton, FL）。結合された標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供し；（ｉｉ）第二の標識と相互作用して第一又は第二の標識によってもたらされる検出可能なシグナルを改変し、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移)を付与し；（ｉｉｉ）抗原又はリガンドとの相互作用を安定化させ又は結合親和性を増加させ；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、又は他の物理的パラメータによって、移動度、例えば電気泳動移動度又は細胞透過性に影響を及ぼし、又は（ｖ）捕獲部分を提供して、リガンド親和性、抗体／抗原結合性、又はイオン性錯体形成するように機能しうる。
【０１０２】
標識抗体は診断アッセイにおいて、例えば特定の細胞、組織、又は血清中の対象抗原の発現を検出するために有用でありうる。診断用途では、抗体は典型的には検出可能な部分で標識される。一般に次の範疇にグループ分けすることができる数多くの標識を利用できる：
（ａ）放射性同位元素（放射性核種）、例えば３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、又は２１３Ｂｉ。放射性同位元素標識抗体はレセプターを標的とした画像処理実験において有用である。抗体は、Current Protocols in Immunology, 1及び2巻, Coligenら編 Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs.(1991)に記載された技術を使用して、放射性同位元素金属に結合し、キレートし又は錯体化等する配位子試薬で標識することができ、該試薬はシステインチオール、リジンアミン、又はセリン、スレオニン又はチロシンヒドロキシルのような抗体の反応性求核体と反応性である。金属イオンを錯体化しうるキレート配位子には、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ及びＴＥＴＡ(Macrocyclics, Dallas, TX)が含まれる。放射性核種は本発明の抗体-薬剤コンジュゲートとの錯体化を介して標的とされ得る(Wuら(2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146)。
【０１０３】
画像処理実験のための抗体標識として適切な金属-キレート錯体は次のものに開示されている：米国特許第５３４２６０６号；同第５４２８１５５号；同第５３１６７５７号；同第５４８０９９０号；同第５４６２７２５号；同第５４２８１３９号；同第５３８５８９３号；同第５７３９２９４号；同第５７５０６６０号；同第５８３４４５６号；Hnatowichら(1983) J. Immunol. Methods 65:147-157；Mearesら(1984) Anal. Biochem. 142:68-78；Mirzadehら(1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65；Mearesら(1990) J. Cancer 1990, Suppl. 10:21-26；Izardら(1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350；Nikulaら(1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90；Cameraら(1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62；Kukisら(1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110；Verelら(2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670；Cameraら(1994) J. Nucl. Med. 21:640-646；Rueggら(1990) Cancer Res. 50:4221-4226；Verelら(2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670；Leeら(2001) Cancer Res. 61:4474-4482；Mitchellら(2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112；Kobayashiら(1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111；Miedererら(2004) J. Nucl. Med. 45:129-137；DeNardoら(1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90；Blendら(2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363；Nikulaら(1999) J. Nucl. Med. 40:166-76；Kobayashiら(1998) J. Nucl. Med. 39:829-36；Mardirossianら(1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74；Roselliら(1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20。
【０１０４】
（ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート剤（ユーロピウムキレート剤）、ＦＩＴＣ、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシフルオレセインを含むフルオレセインタイプ；ＴＡＭＲＡを含むローダミンタイプ；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；及びそれらの類似体。蛍光標識は上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を使用して抗体にコンジュゲートできる。蛍光染料及び蛍光標識試薬には、Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)及びPierce Biotechnology社(Rockford, IL)から市販されているものが含まれる。
【０１０５】
（ｃ）様々な酵素-基質標識が利用でき又は開示されている（米国特許第４２７５１４９号）。酵素は、様々な技術を使用して測定することができる発色基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し得、その変化は分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させることもある。蛍光変化を定量する技術は上述した。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、ついで（例えば化学発光計を用いて）測定可能な光を放出し、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素を抗体にコンジュゲートさせる技術は、O'Sullivan等(1981), "Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzym. (J. Langone及びH. Van Vunakis編）Academic press, New York, 73: 147-166に記載されている。
【０１０６】
酵素-基質の組み合わせの例は、例えば以下を含む：
(ｉ)基質として過酸化水素を用いるセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ここで、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
(ｉｉ)発色基質としてパラ-ニトロフェニルホスフェートを用いるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；
(iii)発色基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼを用いるβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）。
数多くの他の酵素-基質の組み合わせが利用可能である。一般的な概説は、米国特許第４２７５１４９号及び同第４３１８９８０号を参照。
標識は抗体に間接的にコンジュゲートされうる。例えば、抗体にビオチンをコンジュゲートし、上記３つの範疇の標識の任意のものにアビジン又はストレプトアビジンをコンジュゲートし、又はその逆が可能である。ビオチンはストレプトアビジンに選択的に結合し、よってこの間接的な方式で抗体に標識をコンジュゲートさせることができる。あるいは、ポリペプチド変異体との標識の間接的コンジュゲーションを達成するために、ポリペプチド変異体に小さなハプテン（例えばジゴキシン）をコンジュゲートさせ、上記した異なる型の標識を抗ハプテンポリペプチド変異体（例えば抗ジゴキシン抗体）にコンジュゲートさせる。よってポリペプチド変異体との標識の間接的コンジュゲーションが達成できる(Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego)。
【０１０７】
本発明のポリペプチド変異体は任意の既知のアッセイ法、例えばＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイで用いられうる（Zola,(1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press,Inc.)。
検出標識は、結合又は認識事象を局在化し、可視化し、定量するのに有用でありうる。本発明の標識抗体は細胞表面レセプターを検出することができる。検出可能に標識された抗体の他の用途は、ビーズを蛍光標識抗体とコンジュゲートさせ、リガンドの結合の際の蛍光シグナルを検出することを含むビーズベースの免疫捕捉法である。同様の結合検出法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果を利用して抗体-抗原相互作用を測定し検出する。
蛍光染料及び化学発光染料のような検出標識（Briggsら(1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058）は検出可能なシグナルをもたらし、抗体の標識に一般に適用可能であり、次の性質を有している：（ｉ） 標識抗体は、少量の抗体が無細胞及び細胞ベースアッセイの双方において高感度に検出できるように低いバックグラウンドの非常に高いシグナルを作り出すべきであり；（ｉｉ）標識抗体は、有意な光退色なしに、蛍光シグナルを観察でき、モニターでき、記録できるように光安定であるべきである。膜又は細胞表面、特に生細胞への標識抗体の細胞表面結合を含む用途に対しては、（ｉｉｉ）標識は、有効なコンジュゲート濃度と検出感度を達成すべく良好な水溶解性を有しており、（ｉｖ）細胞の正常な代謝過程を乱したり早期の細胞死を引き起こしたりしないように生細胞に非毒性である。
【０１０８】
本発明の標識抗体は、生物医学及び分子イメージングの様々な方法及び技術、例えば、（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）；（ｉｉ）ＭｉｃｒｏＣＴ（コンピューター断層撮影法）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）；（ｉｖ）ＰＥＴ（ポシトロン放出断層撮影法）Chenら(2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49；（ｖ）バイオルミネセンス；（ｖｉ）蛍光；及び（ｖｉｉ）超音波による、イメージングバイオマーカー及びプローブとして有用である。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識された抗体が動物又はヒト患者に投与され、抗体が局在化する体の中の部位の写真が撮られる画像処理法である（米国特許第６５２８６２４号）。イメージングバイオマーカーは、正常な生物学的過程、病原性過程、又は治療介入に対する薬理学的反応の指標として客観的に測定され評価されうる。バイオマーカーには幾つかのタイプがありうる。タイプ０は疾患の自然経過マーカーであり、既知の臨床インデックス、例えば関節リウマチにおける滑膜炎症のＭＲＩ評価と長期的に相関する；タイプＩマーカーは、たとえ機序に臨床的結果が伴わなくとも、作用機序に従って介入の効果を捕捉する；タイプＩＩマーカーは、サロゲートエンドポイントとして機能し、バイオマーカーの変化又はバイオマーカーからのシグナルが臨床的有用性を予測し、例えばＣＴによる関節リウマチの測定した骨びらんのような標的の応答を「検証」する。よって、イメージングバイオマーカーは、（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）標的タンパク質への治療剤の結合、つまり選択性、及び（ｉｉｉ）クリアランス及び半減期薬物動態データについて薬力学的(ＰＤ)治療上方を提供することができる。研究室ベースのバイオマーカーに対するインビボイメージングバイオマーカーの利点は、非侵襲性の処置、数量化可能、全身評価、反復投薬及び評価、つまり複数時点、及び前臨床（小動物）から臨床（ヒト）結果への潜在的に伝達性の効果を含む。幾つかの応用では、バイオイメージングは前臨床治験における動物実験に取って代わり又はその数を最小にする。
【０１０９】
放射性核種イメージング標識には、放射性核種、例えば３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、又は２１３Ｂｉが含まれる。放射性核種金属イオンはＤＯＴＡのようなキレートリンカーで錯体化され得る。ＤＯＴＡ-マレイミド（４-マレイミドブチラミドベンジル-ＤＯＴＡ)のようなリンカー試薬は、Axworthyら(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)の手順に従って、イソプロピルクロロホルメート(Aldrich)で活性化された４-マレイミド酪酸(Fluka)とのアミノベンジル-ＤＯＴＡの反応によって調製することができる。ＤＯＴＡ-マレイミド試薬は抗体の遊離のシステインアミノ酸と反応し、抗体上に金属錯体化配位子をもたらす(Lewisら(1998) Bioconj. Chem. 9:72-86）。ＤＯＴＡ-ＮＨＳ（１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７,１０-四酢酸モノ(N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)のようなキレートリンカー標識試薬は市販されている(Macrocyclics, Dallas, TX)。放射性核種標識抗体でのレセプター標的の画像化は、腫瘍組織中の抗体の進行性蓄積を検出し定量することにより経路活性化のマーカーを提供しうる(Albertら(1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210)。コンジュゲートした放射-金属はリソソーム分解後に細胞内に残りうる。
ペプチド標識法はよく知られている。Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazerら(1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work及びE. Work編) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L.及びNoyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, I及びII巻, CRC Press, New York；Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche編, Walter DeGryter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)；De Leon-Rodriguezら(2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155；Lewisら(2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324；Liら(2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115；Mierら(2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237を参照のこと。
【０１１０】
十分に近接した蛍光レポーターとクエンチャーの二つの部分で標識されたペプチド及びタンパク質は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を受ける。レポーター基は典型的には、ある波長の光によって励起され、アクセプター又はクエンチャー基にエネルギーを移送する蛍光染料であり、最大明度での発光のために適切なストークスシフトが伴う。蛍光染料には、広がった芳香性を持つ分子、例えばフルオレセイン及びローダミン、及びその誘導体が含まれる。蛍光レポーターはインタクトなペプチド中のクエンチャー部分によって部分的に又は有意にクエンチされうる。ペプチダーゼ又はプロテアーゼによるペプチドの切断の際に、検出可能な蛍光の増加が測定されうる（Knight, C. (1995) “Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”, Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34）。
本発明の標識抗体は、アフィニティー精製剤として使用することができる。このプロセスでは、標識抗体は、セファデックス樹脂又は濾紙のような固相に固定される。固定化抗体は、精製される抗原を含む生物学的試料に接触させられ、その後、固定化されたポリペプチド変異体に結合した精製される抗原を除いて生物学的試料中の実質的に全ての材料を取り除く適切な溶媒で担体を洗浄する。最後に、担体を、ｐＨ５．０のグリシンバッファーのような別の適切な溶媒で洗浄し、これがポリペプチド変異体から抗原を放出させる。
【０１１１】
標識試薬は、典型的には、（ｉ）標識抗体を形成するために抗体の反応性求核基と直接的に、（ｉｉ）リンカー-標識中間体を形成するためにリンカー試薬と、あるいは（ｉｉｉ）標識抗体を形成するためにリンカー抗体と、反応しうる反応性官能基を担持している。標識試薬の反応性官能基には、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２,６-ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、及びホスホラミダイトが含まれるが、他の官能基もまた使用することができる。
例示的な反応性官能基は、検出可能な標識、例えばビオチン又は蛍光染料のカルボキシル末端置換基のＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。標識のＮＨＳエステルは予め形成、単離、精製、及び／又は特徴付けでき、あるいはインサイツで形成され、抗体の求核基と反応させられうる。典型的には、標識のカルボキシル型は、カルボジイミド試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、又はウロニウム試薬、例えばＴＳＴＵ（Ｏ-(Ｎ-スクシンイミジル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＢＴＵ（Ｏ-ベンゾトリアゾール-１-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、又はＨＡＴＵ（Ｏ-(７-アザベンゾトリアゾール-１-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、アクチベーター、例えば１-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、及びＮ-ヒドロキシスクシンイミドの所定の組合せと反応させて標識のＮＨＳエステルを生じさせて、活性化される。ある場合には、標識と抗体は、標識のインサイツ活性化と、抗体との反応で一工程で標識-抗体コンジュゲートを形成することによりカップリングされうる。他の活性化及びカップリング試薬には、ＴＢＴＵ（２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾ-１-イル)-１-１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ,Ｎ',Ｎ",Ｎ"'-テトラメチルウロニウム２-フルオロ-ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール-１-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＥＥＤＱ（２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロ-キノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（１-(メシチレン-２-スルホニル)-３-ニトロ-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール、及びアリールスルホニルハロゲン化物、例えば塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニルが含まれる。
【０１１２】
１１．免疫リポソーム
ここで開示されている抗ＴＡＳＫ抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；米国特許第４４８５０４５号及び同第４５４４５４５号；及び国際公開第９７／３８７３１号に記載された方法により調製することができる。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に含まれる。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照のこと。
【０１１３】
Ｂ．ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド
本発明のＴＡＳＫ結合オリゴペプチドはここで記載されるＴＡＳＫポリペプチドに特異的に結合するか又はハイブリダイズするオリゴペプチドである。ＴＡＳＫ結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製し精製することができる。ＴＡＳＫ結合オリゴペプチドは、通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載されるＴＡＳＫポリペプチドに対して特異的に結合し、又はハイブリダイズし得る。ＴＡＳＫ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなく同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合可能なオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第８４／０３５０６号及び国際公開第８４／０３５６４号；Geysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysenら, Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysenら, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofsら, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.ら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.ら (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.ら (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。
【０１１４】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるライブラリーのメンバーを同定することを可能にする一つのよく知られた技術である。ファージディスプレイは、変異体ポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示される技術である（Scott, J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムにクローニングされたｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを、標的分子に高い親和性で結合する配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.ら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624；Marks,J.D.ら (1991), J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.ら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラリーのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて何百万ものポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【０１１５】
殆どのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（国際公開第９５／３４６８３号；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren, Z-J.ら (1998) Gene 215:439；Zhu, Z. (1997) CAN 33:534；Jiang, J.ら (1997) can 128:44380; Ren, Z-J.ら (1997) CAN 127:215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833; Efimov, V.P.ら(1995) Virus Genes 10:173）及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith,G.P.及びScott,J.K. (1993) Methods in Enzymology,217, 228-257；米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応装置が開発されており（国際公開第９８／１４２７７号）、ファージディスプレイライブラリーは二分子相互作用（国際公開第９８／２０１６９号；国際公開第９８／２０１５９号）及び拘束性へリックスペプチドの特性（国際公開第９８／２００３６号）を分析し制御するために使用されている。国際公開第９７／３５１９６号は、リガンドが標的分子に結合しうる一の溶液と、親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液にファージディスプレイライブラリーを接触させて、結合リガンドを選択的に単離する親和性リガンドの単離方法を記載している。国際公開第９７／４６２５１号は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、ついで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載している。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用もまた報告されている（Liら, (1998) Mol Biotech., 9:187）。国際公開第９７／４７３１４号は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法は国際公開第９７／０９４４６号に記載されている。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及び国際公開第９８／１５８３３号に記載されている。
【０１１６】
ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニング方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載されている。
ＴＡＳＫペプチドはまた誘導系を通して発現されうる。本発明は誘導性選択可能ベクター系のｐＨＵＳＨ-ＰｒｏＥｘを提供する。ｐＨＵＳＨ-ＰｒｏＥｘはまた活性なウイルス粒子に収容することができる。ｐＨＵＳＨ-ＰｒｏＥｘの有用性は、それを本発明のＴＡＳＫオリゴペプチド又はＴＡＳＫポリペプチドの有用な断片と組合せ、ＴＡＳＫポリペプチド又はその断片が細胞増殖に対して奏する効果を阻害するような形でＴＡＳＫ断片又はＴＡＳＫオリゴペプチドを発現させることによって、見出すことができる。
【０１１７】
Ｃ．ＴＡＳＫ結合低分子
ＴＡＳＫ結合低分子は、ここに記載されるＴＡＳＫポリペプチドに特異的に結合し又はハイブリダイズするここに定義されるオリゴペプチド又は抗体以外である。ＴＡＳＫ結合低分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第００／００８２３号及び国際公開第００／３９５８５号を参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。ＴＡＳＫ結合低分子は通常は約５００ダルトンの大きさであり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、ここに記載されるＴＡＳＫポリペプチドに特異的に結合し又はハイブリダイズ可能なこのような低分子は、ポリペプチド標的に結合可能な分子について低分子ライブラリーを検索することにより（国際公開第００／００８２３号及び国際公開第００／３９５８５号）、過度の実験をすることなく同定されうる。ＴＡＳＫ結合低分子は、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホネート、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【０１１８】
Ｄ．所望の性質を有するＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ結合低分子及びＴＡＳＫ ＲＮＡｉのスクリーニング
ＴＡＳＫポリペプチドに結合する抗体、ＲＮＡｉ及び低分子を作製する技術を、上に記載した。所望される所定の生物学的特性を有する抗体、ＲＮＡｉ又は他の低分子を更に選択しうる。
本発明のＲＮＡｉ又は他の低分子の増殖阻害効果は、例えば、内因的又はＴＡＳＫ遺伝子によるトランスフェクション後の何れかでＴＡＳＫポリペプチドを発現する細胞を用いる方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＴＡＳＫ形質移入細胞は、数日間（例えば、２−７）、種々の濃度の本発明のＴＡＳＫ ＲＮＡｉ又は他の低分子で処理し、クリスタルバイオレット又はＭＴＴで染色し、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定するその他の方法は、本発明のＴＡＳＫ ＲＮＡｉ又はＴＡＳＫ結合低分子の存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取込みを比較することによる。処理後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能量をシンチレーションカウンターで定量する。適切なポジティブコントロールには、細胞株の増殖を阻害することが知られている増殖阻害抗体で選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの腫瘍細胞の増殖阻害は、様々な方法で決定することができ、例えば腫瘍細胞は、ＴＡＳＫポリペプチドを過剰発現しうる。ＴＡＳＫ ＲＮＡｉ又はＴＡＳＫ結合低分子は、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、約３０−１００％、及び約５０−１００％又は７０−１００％のＴＡＳＫ発現腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害しうる。
【０１１９】
細胞死を誘導するＴＡＳＫ ＲＮＡｉ又はＴＡＳＫ結合低分子を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いをコントロールと比較して評価することができる。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で実施され得る。ＴＡＳＫポリペプチド発現腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切なＴＡＳＫ ＲＮＡｉ又はＴＡＳＫ結合低分子を含む培地でインキュベートする。細胞をおよそ３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。ついで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を入れる。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析することができる。ＰＩ取込みによって測定して統計的に有意なレベルの細胞死を誘導するＴＡＳＫ ＲＮＡｉ又はＴＡＳＫ結合低分子は、細胞死誘導ＴＡＳＫ ＲＮＡｉ又はＴＡＳＫ結合低分子として選択することができる。
関心のある抗体が結合したＴＡＳＫポリペプチド上のエピトープに結合するオリゴペプチド又は他の低分子をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane(1988)に記載されているもののような常套的な交差ブロッキングアッセイを実施することができる。試験オリゴペプチド又は他の低分子が既知の抗ＴＡＳＫ抗体と同じ部位又はエピトープに結合するかどうかを決定するためにこのアッセイを用いることができる。
【０１２０】
Ｅ．完全長ＴＡＳＫポリペプチド
本発明は、また、本出願でＴＡＳＫポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例で更に詳細に開示するように、様々なＴＡＳＫポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（部分及び完全長）が同定され単離された。
以下の実施例に開示するように、様々なｃＤＮＡクローンが記載されている。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定することができる。ここに記載したＴＡＳＫポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【０１２１】
Ｆ．ＴＡＳＫポリペプチド変異体
ここに記載した完全長天然配列ＴＡＳＫポリペプチドに加えて、ＴＡＳＫポリペプチド変異体を調製することができると考えられる。ＴＡＳＫポリペプチド変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望のポリペプチドを合成することによって調製することができる。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのＴＡＳＫポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうる。
ここに記載したＴＡＳＫポリペプチドの変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針の何れかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列ポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を生じる、ポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入でありうる。場合によっては、変異は、ＴＡＳＫポリペプチドのドメインの一又は複数における、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、ＴＡＳＫポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出されうる。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、つまり保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【０１２２】
ＴＡＳＫポリペプチド断片がここで提供される。かかる断片は、例えば完全長天然タンパク質と比較した場合に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。ある断片は、ＴＡＳＫポリペプチドの所望の生物学的活性にとって必修ではないアミノ酸残基を欠く。
ＴＡＳＫポリペプチド断片は、多くの一般的技術の任意のものによって調製することができる。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替アプローチ法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによって、ポリペプチド断片を作製することが含まれる。更に他の適切な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。ＴＡＳＫポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＴＡＳＫポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１２３】
特定の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の表題で表５に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表５に例示的置換と名前を付け、又は以下にアミノ酸分類を参照して更に記載される、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【０１２４】
表５
元の残基     例示的置換                  好ましい置換
Ala(A)       val; Leu; ile                val
Arg(R)       lys; gln; asn                lys
Asn(N)       gln; his; lys; arg           gln
Asp(D)       glu                          glu
Cys(C)       ser                          ser
Gln(Q)       asn                          asn
Glu(E)       asp                          asp
Gly(G)       pro; ala                     ala
His(H)       asn; gln; lys; arg           arg
Ile(I)       leu; val; met; ala; phe;
ノルロイシン                 leu
Leu(L)       ノルロイシン; ile; val;
met; ala; phe                ile
Lys(K)       arg; gln; asn                arg
Met(M)       leu; phe; ile                leu
Phe(F)       leu; val; ile; ala; tyr      leu
Pro(P)       ala                          ala
Ser(S)       thr                          thr
Thr(T)       ser                          ser
Trp(W)       tyr; phe                     tyr
Tyr(Y)       trp; phe; thr; ser           phe
Val(V)       ile; leu; met; phe;
ala; ノルロイシン            leu            
【０１２５】
ＴＡＳＫポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族性：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのような置換残基は、保存的置換部位、又は残りの（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986)；Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発（Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）又は他の知られた技術を、クローニングしたＤＮＡに実施して、ＴＡＳＫポリペプチド変異体ＤＮＡを作成することができる。
【０１２６】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するためにスキャニングアミノ酸分析を用いることができる。例示的なスキャニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインが含まれる。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の例示的なスキャニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であり、それは埋もれた位置及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
ＴＡＳＫポリペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、一般にセリンと置換されうる。逆に、ＴＡＳＫポリペプチドに、その安定性を向上させるためにシステイン結合を加えうる。
【０１２７】
Ｇ．抗ＴＡＳＫ抗体及びＴＡＳＫポリペプチドの修飾
ＴＡＳＫポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つのタイプには、ＴＡＳＫポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＴＡＳＫポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えばＴＡＳＫポリペプチドを、ＴＡＳＫ低分子の精製方法で用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用である。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１２８】
本発明の範囲内に含まれるＴＡＳＫポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更、つまり、天然配列ＴＡＳＫポリペプチドに見出される一又は複数の炭水化物部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を取り除くことによって、又は化学及び／又は酵素的手法でグリコシル化を欠失させることの何れか）、及び／又は天然配列ＴＡＳＫポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を含む。また、修飾には、存在する様々な炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化が含まれる。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるアスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンのトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列の何れかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位を作り出される。Ｏ結合グリコシル化とは、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシルリジンも用いうるが、Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖のうちの一つをヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに結合させることを指す。
【０１２９】
ＴＡＳＫポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変して、それが上記のトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位について）の一又は複数を含むようにすることによって簡便に達成される。この改変は、また、元々のＴＡＳＫポリペプチドの配列へ一又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加、又は置換することによって生成される（Ｏ-結合グリコシル化部位について）。ＴＡＳＫポリペプチドアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、コドンが所望のアミノ酸へ翻訳されるあらかじめ選択した塩基でのＴＡＳＫポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、随意的に改変されうる。
ＴＡＳＫポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。そのような方法は国際公開第８７／０５３３０号；及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＴＡＳＫポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的脱グリコシル化技術（Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)）を含む、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、様々なエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成することができる。
【０１３０】
ＴＡＳＫポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドを種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。またポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Oslo A.編(1980)に開示されている。
また、本発明のＴＡＳＫポリペプチドは、その他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＴＡＳＫポリペプチドを含むキメラ分子が形成されるように修飾されうる。
【０１３１】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合可能なエピトープを提供するタグポリペプチドとＴＡＳＫポリペプチドとの融合体を含む。エピトープタグは、一般的にはＴＡＳＫポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＴＡＳＫポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＴＡＳＫポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体には、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988)）；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］が含まれる。他のタグポリペプチドには、フラッグペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。
他の実施態様では、キメラ分子はＴＡＳＫポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。例示的な実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
【０１３２】
Ｈ．ＴＡＳＫポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、ＴＡＳＫポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＴＡＳＫポリペプチドを生成する方法に関する。他の方法を用いてＴＡＳＫポリペプチドを調製してもよい。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって様々な商業的供給源から生成してもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター市, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示に従って実施してもよい。ＴＡＳＫポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望するＴＡＳＫポリペプチドを生成させてもよい。
【０１３３】
１．ＴＡＳＫポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＴＡＳＫポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＴＡＳＫポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されるｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＴＡＳＫポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＴＡＳＫポリペプチドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は既知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＴＡＳＫポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１３４】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭なプローブとしてオリゴヌクレオチド配列を使用することを含む。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていてもよい。標識化の方法は、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookらに与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定される配列は、GenBankのような公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較されアラインメントされ得る。分子の決まった領域内の又は完全長配列にわたっての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルの何れかでの）配列同一性は、ここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらに記述されているような一般的なプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られうる。
【０１３５】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＴＡＳＫポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び 上掲のSambrookらに見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらに記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９号に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照。
【０１３６】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しうる。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適切である。
【０１３７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＴＡＳＫポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日発行の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピチア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日発行の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日発行の国際公開第９１／００３５７号）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。メチロトロピック(Methylotropic)酵母はここでは適切であり、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１３８】
グリコシル化ＴＡＳＫポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞、Grahamら,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Urlaubら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４、Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Matherら,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、ＴＡＳＫポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０１３９】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＴＡＳＫポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【０１４０】
ＴＡＳＫは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ポリペプチドの一部でありうる。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開第９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１４１】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターを複製可能にする核酸配列を含む。かかる配列は様々な細菌、酵母、及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は殆どのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に対して適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞にベクターをクローニングするのに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
【０１４２】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＴＡＳＫポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubらにより, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingsmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで増殖する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＴＡＳＫポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Changら, Nature, 275:615 (1978)； Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＴＡＳＫポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１４３】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘導性プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＴＡＳＫポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【０１４４】
より高等の真核生物によるＴＡＳＫポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＴＡＳＫポリペプチドコード化配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、例えばプロモーターから５'位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＴＡＳＫポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＴＡＳＫポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０１４５】
４．宿主細胞の培養
本発明のＴＡＳＫポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Hamら, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnesら, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；同第４５６０６５５号；又は同第５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものでありうる。
【０１４６】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、一般的なサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＴＡＳＫポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＴＡＳＫ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１４７】
６．ＴＡＳＫポリペプチドの精製
ＴＡＳＫポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＴＡＳＫポリペプチドは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＴＡＳＫポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された様々なタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製工程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のＴＡＳＫポリペプチドの性質に依存する。
【０１４８】
Ｉ．薬学的製剤
本発明に基づいて使用されるＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ ＲＮＡｉ、ＴＡＳＫ結合低分子及び／又はＴＡＳＫポリペプチドの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つポリペプチド、オリゴペプチド、ＲＮＡｉ又は低分子を凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編. (1980)）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸塩、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（登録商標）、プルロニクス(PLURONICS)（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４９】
ここでの製剤は、また、治療される特定の徴候に対して必要な一つ以上の活性化合物を含んでいてもよい。例えば、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫ ＲＮＡｉ、又はＴＡＳＫ結合低分子に加えて、一つの製剤中に、更なるＲＮＡｉ、例えばＴＡＳＫ核酸上の異なる領域に結合する第二のＴＡＳＫ ＲＮＡｉ、又は特定の癌の増殖に影響を与える成長因子のような何らかの他の標的に対するものを含めることが望ましい。あるいは、又は更に、該組成物は、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を更に含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって有効な量で組み合わせて適切に存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。かかる技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.編(1980)に開示されている。
【０１５０】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能なミクロスフィア）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１５１】
Ｊ．ＴＡＳＫの診断及び治療、抗ＴＡＳＫ抗体、ＴＡＳＫ結合オリゴペプチド、ＴＡＳＫｓｉＲＮＡ及びＴＡＳＫ結合低分子での診断及び治療
癌におけるＴＡＳＫ発現を確かめるために、様々な診断アッセイが利用可能である。一実施態様では、ＴＡＳＫポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包理組織切片をＩＨＣアッセイへ供してよく、次のＴＡＳＫタンパク質染色強度基準に合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ＴＡＳＫポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ＴＡＳＫが過剰発現していないことで特徴付けられうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＴＡＳＫが過剰発現していることで特徴付けられうる。
【０１５２】
あるいは又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包理された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＴＡＳＫ過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
ＴＡＳＫ過剰発現又は増幅は、インビボ診断アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体、オリゴペプチド又は低分子)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
上述のように、本発明の抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド及び低分子には、種々の非治療的用途がある。本発明の抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド及び低分子は、ＴＡＳＫポリペプチドを発現している癌の診断及び病期判定に有用である（例えば、放射性画像法で）。他の細胞の精製の工程として、混合細胞の集団からＴＡＳＫ発現細胞を死滅させて除去するために、抗体、オリゴペプチド及び低分子はまた例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおいて、インビトロでＴＡＳＫポリペプチドの検出及び定量化のために、細胞からＴＡＳＫポリペプチドを精製又は免疫沈降するのに有用である。
【０１５３】
現在、癌の病期に応じて、癌の治療は、次の治療法の一又は組合せを含む：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療。抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ又は低分子による治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望される。本発明の腫瘍を標的とする抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ及び低分子は、疾患の初期診断時及び再発中においてＴＡＳＫ発現癌の緩和に有用である。治療用途に関しては、抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ又は低分子は、単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗血管形成剤、又は放射標識化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせて使用してもよい。抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子による治療は、一般的治療の前又は後の何れかに連続させて、他の形態の一般的治療法と共に実施することができる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。癌を治療又は緩和するための本発明の方法において、上述した化学療法剤の一又は複数による治療と組合せて、癌患者に抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子を投与することができる。特に、パリクタキセルと修飾された誘導体との併用療法が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照)。抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ又は低分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
【０１５４】
特定の一実施態様では、細胞傷害性薬物にコンジュゲートさせた抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子を含有するコンジュゲートを患者に投与する。特定の作用機序によって限定されるものではないが、ＴＡＳＫタンパク質に結合したイムノコンジュゲートは細胞により内部移行し、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性におけるイムノコンジュゲートの治療的効果が向上する。細胞傷害性薬物は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞傷害性薬物の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、低分子又はその毒素コンジュゲートは、既知の方法、例えばボーラス、もしくは所定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。抗体、オリゴペプチド又は低分子の静脈内又は皮下投与が例示的な投与経路である。
他の治療計画を抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間がある何れかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じうる。
また、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗ＴＡＳＫ抗体又は抗体群、オリゴペプチド又は低分子の投与を組合せることが望ましい。
【０１５５】
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なる化学療法剤のカクテル剤の同時投与を含む、抗ＴＡＳＫ抗体(又は抗体群)、オリゴペプチド又は低分子と一又は複数の化学療法剤又は増殖阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン(hydroxyureataxanes)(例えばパクリタキセル及びドキセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
抗体、オリゴペプチド又は低分子は、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェン等の抗エストロゲン化合物；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第６１６８１２号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子(及び場合によってはここに記載した他の薬剤)を患者に投与してもよい。
しばしば、心臓保護剤(治療に関連する心筋の機能不全を防止又は低減するため)又は一又は複数のサイトカインを患者に同時投与することも有益でありうる。上述した治療方法に加えて、抗体、オリゴペプチド又は低分子治療の前、同時又は治療後に、外科的に癌細胞を取り除くか、及び／又は放射線治療を施してもよい。上述した任意の同時投与される薬剤の適切な用量は現在使用されている量であり、抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子と薬剤の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくしてもよい。
【０１５６】
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、既知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体、オリゴペプチド又は低分子の適切な用量は、上記のような治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び過程、抗体、オリゴペプチド又は低分子を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体、オリゴペプチド又は低分子に対する応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体、オリゴペプチド又は低分子は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。抗体、オリゴペプチド又は低分子は静脈注入又は皮下注射により投与されうる。疾患のタイプ及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入の何れであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇから５０ｍｇ(例えば０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を患者への最初の候補投与量とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗ＴＡＳＫ抗体を投与することを含むことができる。しかしながら、他の投薬計画も有用であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで治療を維持する。この治療の進行状態は、一般的な方法及びアッセイ及び医療ベースの基準によって容易にモニターできる。
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を考察する。抗体をコードする核酸の投与は「治療的有効量の抗体を投与する」という表現に包含される。例えば、細胞内抗体の生成のための遺伝子療法の使用に関する１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
【０１５７】
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるためにインビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ治療では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に移植される多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。該技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
例示的なインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Andersonら, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号とそこに引用された参考文献も参照。
【０１５８】
本抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド及び低分子は、哺乳動物におけるＴＡＳＫ発現癌の治療又は一又は複数の癌の徴候の緩和に有用である。このような癌には、前立腺癌、尿道癌、肺癌、乳癌、大腸癌及び卵巣癌、特に前立腺癌腫(prostate adenocarcinoma)、腎細胞癌腫、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺細胞の扁平癌腫、及び胸膜中皮腫が含まれる。癌には、上述したものの何れかの転移性癌が含まれる。抗体、オリゴペプチド又は低分子は、哺乳動物においてＴＡＳＫポリペプチドを発現している癌細胞の少なくとも一部に結合可能である。例示的な実施態様では、抗体、オリゴペプチド又は低分子は、インビボ又はインビトロで細胞のＴＡＳＫポリペプチドに結合して、ＴＡＳＫ発現腫瘍細胞を破壊又は死滅させるか、又はこのような腫瘍細胞の増殖を阻害するのに効果的である。このような抗体には、裸の抗ＴＡＳＫ抗体(いかなる薬剤にもコンジュゲートしていない)が含まれる。細胞傷害性又は細胞増殖阻害性を有する裸の抗体は、細胞傷害性薬物と併用すると、より強く腫瘍細胞を破壊することが可能である。例えば細胞傷害性薬物と抗体をコンジュゲートさせ、以下に記載するようなイムノコンジュゲートを形成させることによって、細胞傷害性を抗ＴＡＳＫ抗体に付与することができる。この細胞傷害性薬物又は増殖阻害剤は、低分子、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、又はそれらの類似体又は誘導体でありうる。
【０１５９】
本発明は、本発明の抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ又は低分子と担体を含有する組成物を含む。癌の治療の目的のために、組成物はそのような治療を必要とする患者に投与することができ、ここで組成物はイムノコンジュゲート又は裸の抗体として存在する一又は複数の抗ＴＡＳＫ抗体を含有し得る。更なる実施態様では、組成物は、他の療法剤、例えば化学療法剤を含む細胞傷害性薬物又は増殖阻害剤とこれらの抗体、オリゴペプチド又は低分子を組合せて含有することもできる。また本発明は、本発明の抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子と担体を含有する製剤も提供する。一実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
本発明の他の側面は、抗ＴＡＳＫ抗体をコードする単離された核酸分子である。Ｈ鎖及びＬ鎖の双方、特に高頻度可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体をコードする鎖、並びに該抗体の変異体、修飾体及びヒト化形態が包含される。
本発明はまた抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物におけるＴＡＳＫポリペプチド発現癌の治療又は癌の一又は複数の徴候を緩和するのに有用な方法を提供する。抗体、オリゴペプチド又は低分子治療組成物は、医師の指示通りに、短い期間(急性)又は慢性的に、又は間欠的に投与することができる。また、ＴＡＳＫポリペプチド発現細胞の増殖を阻害し、該細胞を殺傷する方法も提供される。
【０１６０】
Ｌ．製造品及びキット
本発明は少なくとも一の抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ又は低分子を含むキット及び製造品も提供する。抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ又は低分子を含むキットは、例えばＴＡＳＫ細胞殺傷アッセイ、細胞からのＴＡＳＫポリペプチドの精製又は免疫沈降における用途が見出されている。例えば、ＴＡＳＫの単離及び精製のためには、キットはビーズ(例えばセファロースビース)に結合した抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子を含むことができる。例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおけるインビトロでのＴＡＳＫの検出及び定量化のために、抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含むキットを提供することもできる。検出に有用なこのような抗体、オリゴペプチド又は低分子は、蛍光又は放射標識などの標識が付されうる。
本発明の他の実施態様は、抗ＴＡＳＫ発現癌の治療に有用な材料を含む製造品である。該製造品は容器と容器上に付与又は容器に付随させられるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されうる。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は低分子組成物を投与する際の指示書を更に含む。また、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を更に含みうる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含みうる。
【０１６１】
様々な目的、例えばＴＡＳＫ発現細胞殺傷アッセイ、細胞からのＴＡＳＫポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ＴＡＳＫポリペプチドの単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ又は低分子を含むことが可能である。例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおけるインビトロでのＴＡＳＫポリペプチドの検出及び定量化のために抗体、オリゴペプチド又は低分子を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器上に付与又は付随されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。容器には少なくとも一つの本発明の抗ＴＡＳＫ抗体、オリゴペプチド又は低分子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を含めてもよい。ラベル又パッケージ挿入物は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する指示書を提供しうる。
【０１６２】
Ｍ．ＴＡＳＫポリペプチド及びＴＡＳＫ-ポリペプチドコード核酸の用途
ＴＡＳＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びＤＮＡプローブの生成において、様々な用途を有している。またＴＡＳＫコード核酸は、ここに記載される組換え技術によるＴＡＳＫポリペプチドの調製に有用であり、そのＴＡＳＫポリペプチドは、例えばここで記載の抗ＴＡＳＫ抗体の調製における用途を見出しうる。
完全長天然配列ＴＡＳＫ遺伝子又はその一部は、完全長ＴＡＳＫｃＤＮＡの単離又はここに開示した天然ＴＡＳＫ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のｃＤＮＡ（例えば、ＴＡＳＫの天然に生じる変異体又は他の種由来のＴＡＳＫをコードするもの）の単離のために、ｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０から約５０塩基である。該ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に完全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく天然配列ＴＡＳＫのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導されうる。例えば、スクリーニング法は、ＴＡＳＫ遺伝子のコード領域を既知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む様々な標識で標識されうる。本発明のＴＡＳＫ遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識プローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は以下の実施例において更に詳細に記載する。本出願に開示されている任意のＥＳＴ配列は、ここに開示している方法を利用して、同様にプローブとして用いうる。
【０１６３】
ＴＡＳＫコード化核酸の他の有用な断片には、標的ＴＡＳＫ ｍＲＮＡ（センス）又はＴＡＳＫ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明に係るアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＳＫ ＤＮＡのコード領域の断片を含む。そのような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、又は約１４から３０のヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krolら（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それが、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に包含される。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＳＫタンパク質の発現を阻止するのに用いられ得、そのＴＡＳＫタンパク質は、哺乳動物での癌の誘導を担い得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、例えば国際公開第９１／０６６２９に記載のもの）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（つまり、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１６４】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開第９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。更にまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子導入ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入されうる。一手順では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボの何れかで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。適切なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開第９０／１３６４１号参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第９１／０４７５３号に記載されているように、リガンド結合分子とのコンジュゲートの形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子には、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれる。リガンド結合分子のコンジュゲーションは、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合するか、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲート体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１６５】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第９０／１０４４８号に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、内因性リパーゼにより細胞内で分解されうる。
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般には少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【０１６６】
あるいは、二本鎖ＲＮＡを作製することができる。３０ヌクレオチド長以下の二本鎖ＲＮＡは細胞に導入したときに特定の遺伝子の発現を阻害する。この機序はＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）として知られ、試薬として使用される低分子（３０ヌクレオチド以下）ＲＮＡはｓｉＲＮＡとして知られている。ＴＡＳＫ干渉ＲＮＡは既知の方法（Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12(2003)、国際公開第２００３０５６０１２号及び国際公開第２００３０６４６２１号）を使用して同定することができ、合成されうる。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現の減少が症状又は疾患を軽減する症状において遺伝子発現量を減少させるのに有用である。
プローブをＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＴＡＳＫコード配列の同定のための配列のプールを作成することもまたできる。
また、ＴＡＳＫをコードするヌクレオチド配列は、そのＴＡＳＫをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子解析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖解析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の既知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１６７】
ＴＡＳＫのコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＴＡＳＫがレセプターである場合）、ＴＡＳＫは、結合相互作用に関わっている他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに使用することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。また、このような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、ペプチド又は低分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＴＡＳＫは関連するリガンドの単離に使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＴＡＳＫ又はＴＡＳＫのレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計してもよい。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイを含み、それらアッセイを特に低分子薬剤候補を同定することに適したものにする。考慮される低分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む様々な型式で実施され得る。
【０１６８】
また、ＴＡＳＫ又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物の何れかを産生することに使用でき、これらはついで治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施態様では、ＴＡＳＫをコードするｃＤＮＡは、ＴＡＳＫをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＴＡＳＫをコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等を産生する方法は、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＴＡＳＫ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＴＡＳＫをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＴＡＳＫをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療介入の可能性が示される。
【０１６９】
あるいは、ＴＡＳＫの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＴＡＳＫをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＴＡＳＫをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＴＡＳＫをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＴＡＳＫ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＴＡＳＫをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＴＡＳＫをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＴＡＳＫをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させたり、組み込みをモニターするために使用する選べるマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターには無改変のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)の数キロベースが含まれる［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照］。ベクターを胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152を参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えばＴＡＳＫポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられうる。
【０１７０】
また、ＴＡＳＫポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾することができる。
【０１７１】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。該技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。例示的なインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである（Dzauら, Trends  in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤と共に提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)；及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414(1990)によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照。
ここに記載したＴＡＳＫポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、目下のところ新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各ＴＡＳＫ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
【０１７２】
また、本発明のＴＡＳＫポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングの診断に使用でき、本発明のＴＡＳＫポリペプチドは、他の組織と比較して一つの組織で差次的に発現し、例えば同じ型の正常組織に比較して疾患組織において発現する。ＴＡＳＫ核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のためのプローブ作製のための用途が見出されるであろう。
この発明は、ＴＡＳＫポリペプチド（アゴニスト）を模倣し、又はＴＡＳＫポリペプチド（アンタゴニスト）の効果を防ぐものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされたＴＡＳＫポリペプチドと結合又は複合化し、さもなければコードされているポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用を妨害する化合物、例えば、細胞からのＴＡＳＫポリペプチドの発現を阻害するものを含む化合物を同定するように設計される。そのようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイが含まれ、それらアッセイを特に低分子薬剤候補の同定に適したものにする。
該アッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、及び細胞ベースアッセイを含む様々な形式で行うことができる。
アンタゴニストのための全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているＴＡＳＫポリペプチドと、これら二成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
【０１７３】
結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出されうる。特定の実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＴＡＳＫポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定される。非共有結合は、一般的に固体表面をＴＡＳＫポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＴＡＳＫポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を担持しない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【０１７４】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子によってコードされる特定のＴＡＳＫポリペプチドと結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。更に、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等(Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989)；Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)）に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前記文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１７５】
ここで同定されたＴＡＳＫポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。更に、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールとしてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＴＡＳＫポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物と共に細胞に添加してもよく、ＴＡＳＫポリペプチドの存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＴＡＳＫポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＴＡＳＫポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合ＴＡＳＫポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＴＡＳＫポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセプターに結合したＴＡＳＫポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがＴＡＳＫポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のＴＡＳＫポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラス上で増殖させた形質移入細胞を、標識したＴＡＳＫポリペプチドへ曝露する。ＴＡＳＫポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ解析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１７６】
レセプター同定の代替的方法として、標識したＴＡＳＫポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムに曝す。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施してよい。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＴＡＳＫポリペプチドと共にインキュベートする。ついで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特定の例は、免疫グロブリンとＴＡＳＫポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含む。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、よってＴＡＳＫポリペプチドの作用を競合的に阻害するＴＡＳＫポリペプチドの変異型であってもよい。
【０１７７】
他の潜在的なＴＡＳＫポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法は共に、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＴＡＳＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979)；Cooneyら, Science, 241: 456 (1988)；Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＴＡＳＫポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＴＡＳＫポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上述のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＴＡＳＫポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間の翻訳開始部位から誘導されうる。
【０１７８】
潜在的アンタゴニストは、ＴＡＳＫポリペプチドの活性部位、又は他の関連結合部位に結合し、それによりＴＡＳＫポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する低分子を含む。低分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
ＴＡＳＫ過剰発現又は増幅は、インビボ診断アッセイを使用し、例えば検出される分子に結合し検出可能な標識（例えば放射性同位体又は蛍光標識）でタグが付けられている分子（例えばＲＮＡｉ、オリゴペプチド又は低分子）を投与し、標識の局在化について患者を外部からスキャニングすることによって、評価することができる。
上述のように、本発明のＲＮＡｉ及び低分子は様々な治療的用途を有している。本発明のＲＮＡｉ及び低分子はＴＡＳＫポリペプチド発現癌の診断及び病期判定（例えば放射性画像法）に対して有用でありうる。オリゴペプチド及び低分子は、他の細胞の精製の一工程として、混合細胞の集団からＴＡＳＫ発現細胞を死滅させて除去するために、例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおいて、インビトロでＴＡＳＫポリペプチドの検出及び定量化のために、細胞からＴＡＳＫポリペプチドを精製又は免疫沈降するのに有用である。
【０１７９】
現在、癌の病期に応じて、癌の治療は、次の治療法の一又は組合せを含む：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療。ＲＮＡｉ又は低分子による治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望される。本発明の腫瘍を標的とするＲＮＡｉ及び低分子は、疾患の初期診断時及び再発中においてＴＡＳＫ発現癌の緩和に有用である。治療用途に関しては、ＲＮＡｉ又は低分子は、単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗血管形成剤、又は放射標識化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせて使用してもよい。ＲＮＡｉ又は低分子による治療は、一般的治療の前又は後の何れかに連続させて、他の形態の一般的治療法と共に実施することができる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パクリタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。癌を治療又は緩和するための本発明の方法において、上述した化学療法剤の一又は複数による治療と組合せて、癌患者にＲＮＡｉ又は低分子を投与することができる。特に、パリクタキセルと修飾された誘導体との併用療法が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照)。ＲＮＡｉ又は低分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、ＲＮＡｉ又は低分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
単離されたＴＡＳＫポリペプチドコード核酸は、ここに記載されているものを含む様々な技術を用いて、組換え的にＴＡＳＫポリペプチドを生成するために、ここで用いることが可能である。次に、生成されたＴＡＳＫポリペプチドは、そのような技術を用いて、抗ＴＡＳＫ抗体を生成するために用いることができる。
【０１８０】
ここで同定されるＴＡＳＫポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、様々な疾患の治療のために、薬学的組成物の形態で投与することができる。
ＴＡＳＫポリペプチドは内部移行細胞内抗体でありうる。しかしながら、リポフェクション又はリポソームはまた抗体、又は抗体断片を細胞に送達するために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が使用されうる。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子を設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって産生できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)を参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に一つの活性化合物、例えば互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞傷害性薬物、サイトカイン、化学療法剤、又は増殖阻害剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。このような分子は、適切には、意図する目的に有効な量で組合わせて存在する。
【０１８１】
以下の実施例は例示目的のためのみに提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに援用する。
【０１８２】
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体中で特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【０１８３】
実施例１：ＴＡＳＫ１２１活性化
ＴＡＳＫ１２１活性化に応答して特異的に調節され、完全な分裂促進刺激の結果としてではない遺伝子を同定するために、ＴＡＳＫ１２１を、過去に記載されたエストロゲンレセプター（ＥＲ）融合タンパク質系（Samuelsら, Mol Cell Biol 13:6241-52 (1993))を使用して条件的に活性化した。野生型及び発癌性ヒトＴＡＳＫ１２１（それぞれＤＴＡＳＫ１２１及びＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅと命名）の触媒ドメインを、Ｇ５２５Ｒ変異が内因性エストロゲンから合成アンタゴニスト４-ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）（Danielianら, Mol Endocrinol 7:232-40 (1993)）へ応答性を切り替えるマウスＥＲホルモン結合ドメインの変異体に融合させた。ＴＡＳＫ１２１融合タンパク質は構成的に発現されるが、４ＯＨの不在下で不活性なコンフォメーションで維持される。ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ又は空ベクターを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞をレトロウイルス感染によって誘導し、幾つかの独立したクローンを、クローン選択バイアスに対して確実にするために特徴付けた。ＴＡＳＫ１２１キナーゼ活性を誘導するための有効用量を決定するために、ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ及びＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００ＥＥＲ細胞を最少培地中で培養し、０−２０００ｎＭの４ＯＨＴで２４時間、刺激した。図７は、４ＯＨＴを用いた処理によるＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ及びＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲの活性化を示す。図７Ａは、４ＯＨＴ刺激に対するＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ及びＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ細胞の用量応答性を示す。ＮＩＨ３Ｔ３ ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ及びＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ細胞は８０％の集密度になるまで増殖させ、０．５％のＦＢＳ、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及びインスリン-トランスフェリン-セレニウム（ＩＴＳ−Ｘ）補填を含む最少培地で一晩培養した後、示した４-ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）濃度で２４時間処理した。ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ及びＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲキメラタンパク質の蓄積と対応するＥＲＫ１／２リン酸化を免疫ブロットによって検出した。ＴＡＳＫ１２１媒介シグナル伝達は、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ及びＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲそれぞれに対して１０及び１００ｎＭの４０ＨＴで最大であった。これは、下流シグナル制御に応答したＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲタンパク質の選択的安定化と高まったＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ ｍＲＮＡの発現の双方の結果であると思われる(Samuelsら, Mol Cell Biol 13:6241-52 (1993))。ＥＲＫ１／２リン酸化の比較から、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲタンパク質は、該細胞系におけるＥＲＫ経路の活性化について、野生型ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲタンパク質よりもおよそ１０倍強力であることが明らかになった。
【０１８４】
図７ＢはＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅの誘導の際の３Ｔ３細胞の形態変換を示している。４ＯＨＴがない場合は、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ細胞は親細胞のものと同様の平坦な非転換形態を示した。４ＯＨＴでＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ細胞を処理すると、細胞性形質転換を示す紡錘状の表現型が生じた。ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ細胞はまたＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ細胞に対して増加した形態変化及び発癌能を示し、２００ｎＭの４ＯＨＴの添加はＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ細胞に対して２４時間以内に屈折性及び紡錘状の表現型を生じた（図７Ｂ）。
ＴＡＳＫ１２１は多くの成長因子及びインテグリンからのシグナルを核に伝達して遺伝子転写を調節すると考えられる。従って、最少培地で培養され、未処理又は５０ｎＭの４ＯＨＴで２４時間処理されてＴＡＳＫ１２１キメラタンパク質を活性化させた無活動のＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ及びコントロール細胞からの遺伝子発現プロファイルを、全ゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイ(例えばAffymetrix社製)を使用して調べた。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施して、処理にわたってプローブセットの各々に対する発現と付随する可変性を推定した。タモキシフェンの効果を除外するために、５０ｎＭの４ＯＨＴで処理したベクター感染３Ｔ３細胞のＲＮＡをコントロール実験として比較した。全部で４５１０１のプローブセットのうち、３１７６プローブが、ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ及びＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ細胞株の双方で４ＯＨＴ処理時に差次的発現を示したが、コントロール感染細胞では示さなかった。スクリーニングで同定される無数の遺伝子が、ＲＡＦ-ＭＥＫ-ＲＫ１／２シグナル伝達の最初期転写標的として確立されている (Schulze, Genes Dev 15:981-94 (2001)), (Schulzeら, Mol Biol Cell 15:3450-63 (2004))。まとめると、これらの実験は、ＴＡＳＫ１２１が発癌の潜在性を有しており、他の遺伝子の転写に影響を及ぼし得ることを示している。
【０１８５】
実施例２：発癌性ＴＡＳＫによる遺伝子のディファレンシャル発現
ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅに応答して差次的に発現した遺伝子の優先順位を付けるために、ジーンオントロジーコンソーシアム(Harrisら, Nucleic Acids Res 32:D258-61 (2004))によって提供された情報を使用してオントロジーを割り当てた。ＴＡＳＫ１２１シグナル伝達に関連する細胞活性の成分であるか、細胞形質転換及び腫瘍形成に寄与することが知られている遺伝子に焦点を当てた。例えば、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ１／２経路に対するポジティブフィードバックシグナル伝達は、上皮増殖因子(ＥＧＦ)ファミリーリガンドの転写におけるＴＡＳＫ１２１依存的増加によって強調された。発現変化は、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）よって確認したところ、β-セルリン（ＢＴＣ）、エピレギュリン（ＥＲＧ）及びヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）に対しておよそ３０−２００倍であった。ＥＧＦファミリーリガンドとは異なり、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の転写において、ＴＡＳＫ１２１活性に応答して、１０倍の増加が観察された。感覚及び運動ニューロンがＢＤＮＦ誘導生存シグナルに応答するのに機能的ＴＡＳＫ１２１が必要とされるＴＡＳＫ１２１欠損マウス胎仔のニューロン表現型が与えられると、この転写フィードバック機構はＴＡＳＫ１２１媒介ニューロン生存ために重要である(Wieseら, Nat Neurosci 4:137-42 (2001))。セマフォリン７ａ及びスリット２の発現が初めて実証された。これらの遺伝子は、体細胞遊走の案内と、腫瘍誘導血管形成の促進の双方において機能する細胞外タンパク質ファミリーのメンバーであり、ＴＡＳＫ１２１活性の増加に応答して高まる(Klagsbrunら, Cytokine Growth Factor Rev 16:535-48 (2005)。更に、インターロイキン（ＩＬ）ファミリーに属する遺伝子は、多面発現性サイトカインＩＬ−１１及びＩＬ−１８それぞれに対するＴＡＳＫ１２１シグナル伝達によってポジティブ及びネガティブの双方に調節され、ＴＡＳＫ１２１に対する免疫調節性機能を実証している。活性化されたマクロファージ、クッパー細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞及びＢ細胞によるその分泌に加えて、 ＩＬ−１８はまた皮膚の上皮細胞、胃腸管、及び気道によっても産生される（Lebel-Binayら, Eur Cytokine Netw 11:15-26 (2000)）。従って、ＩＬ−１８は腫瘍発達に対する宿主の免疫防御に関連している。よって、ＩＬ−１８の生産を制限することによって、発癌性ＴＡＳＫ１２１が宿主免疫系の回避を介して腫瘍増殖の開始と維持を促進しうる。
【０１８６】
免疫、炎症及びアポトーシスを含む多くのプロセスを制御する転写因子である核因子-kB (NF-kB)の活性化を調節するシグナル伝達カスケードの成分をコードする遺伝子の発現に変化があった。この裏付けとして、TASK121V600E変異体は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＩＫＫβ依存的形式でＮＦ-κＢを活性化することが過去に示されている(Ikenoueら, Cancer Res 63:8132-7 (2003))。発現解析は、ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅの誘導がＣＡＲＤ１０ (カスパーゼ動員ドメイン-１０)／ＣＡＲＭＡ３の１５倍の増加を生じたことを実証している。CARD10は、IkBキナーゼ-β(IKK β)の上流で機能するNF-kBカスケードの成分であるＢＣＬ１０を通してNF-kBを活性化することが知られている(Wangら, J Biol Chem 276:21405-9 (2001), Zhouら, Nature 427:167-71 (2004))。BCL10発現自体は、またこの系において TASK121V600E シグナル伝達によって２．１倍上方制御された。これらの結果は、ＴＡＳＫ１２１によるNF-kB活性化の機序を更に定める。
Apo2L/TRAIL (Apo2リガンド/腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド)に結合し、アポトーシスの誘導を防止するＤｃＲ１及びＤｃＲ２「デコイ」レセプターの発現は、ＴＡＳＫ１２１誘導の際にまた高まった。比較すると、構造的に関連する遺伝子のオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）の転写はＢＲＡＦ活性によっては影響を受けないことが示された。正常な細胞はデコイレセプターを発現するが、癌細胞は通常は発現せず、大きなパネルの培養メラノーマ細胞では、デコイレセプターのｍＲＮＡ及びタンパク質がしばしば検出された(Herseyら, Nat Rev Cancer 1:142-50 (2001))。従って、デコイレセプター発現の刺激において、ＴＡＳＫ１２１はＡｐｏ２Ｌ媒介アポトーシスに対するメラノーマのよく記載された耐性に寄与しうる(Herseyら, Nat Rev Cancer 1:142-50 (2001))。
【０１８７】
標準的なマイクロアレイ解析法から明らかではないＴＡＳＫ１２１生物学の重要な面を明らかにするために、ＴＡＳＫ１２１シグナル伝達のゲノムワイド転写プロファイルを、タンパク質-タンパク質相互作用を含む他のタイプのゲノムデータについて調べた(Rhodesら, Nat Genet 37 Suppl:S31-7 (2005), (Calvanoら, Nature 437:1032-7 (2005))。ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ：ＥＲ活性化の際に２倍以上のディファレンシャル発現を示すアフィメトリックスプローブ（０．０１−７１３．６６倍変化範囲を表す）を、Ingenuity Pathway Analysisツールを使用して解析した。３４３の遺伝子は分子ネットワークを作るのに適格であり、１３のモジュールにマッピングした。ＴＡＳＫ１２１応答モジュールの例には、ＪＵＮ及びＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス癌遺伝子相同性（ＦＯＳ）転写因子ファミリーを含むアクチベータープロテイン-１（ＡＰ-１）シグナル伝達ネットワーク、筋細胞分化を阻害し筋形成を拘束する筋原性因子３（ＭＹＯＤ）の阻害、骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＭＹＣ）調節及びエフェクタータンパク質の協調したアップレギュレーション、及びタンパク質異化反応を増強するプロテアソーム（ＰＳＭ）複合体成分の発現の増加が含まれる。これらのＴＡＳＫ１２１関連機能モジュールはまた癌（７６遺伝子）及び生殖系（３４遺伝子）、結合組織（２９遺伝子）、神経系（２６遺伝子）及び血液系（２０）の疾患を含むヒトの疾患に伴う数多くの遺伝子産物を含む。従って、ＴＡＳＫ１２１シグナル伝達は、疾患表現型に至るネットワーク機能不全の特定の側面に対して重要である。まとめると、これらのネットワーク解析はＴＡＳＫ１２１とその標的の我々の理解を更に深め、様々な生物学的過程においてＴＡＳＫ１２１の役割をもたらす。
【０１８８】
実施例３：ＴＡＳＫ１２２はＴＡＳＫ１２１シグナル伝達のための標的である。
マイクロアレイ遺伝子発現データセットは、非定型ＭＡＰＫ、細胞外シグナル調節キナーゼ-３ＴＡＳＫ１２２（配列番号３及び４）のアップレギュレーションを示している。正規化したマイクロアレイシグナル強度で定量した場合、ＴＡＳＫ１２２ ｍＲＮＡレベルは、未処理又はコントロール細胞と比較し発癌ＴＡＳＫ１２１活性に応答して大幅に上昇した（〜１０倍）（図１０）。全体が援用されるHoeflichら(2006) Intl. Jour. of Oncology 29:839-849を参照のこと。これらの結果を更に定量するために、ｍＲＮＡの発現のＴＡＳＫ１２２誘導を、定量的ＰＣＲを使用し、コントロールＲＰＬ１９転写物に対してＴＡＳＫ１２２の比を比較することによって調べた（図８Ａ）。ＴＡＳＫ１２２ ｍＲＮＡの誘導は、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲによる活性化に応答して最も強かったが、野生型ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲもまた９６時間でＴＡＳＫ１２２の転写を有意に増加させた。ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００と野生型ＴＡＳＫ１２１によるＴＡＳＫ１２２の誘導の動態の差は、ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅに伴うキナーゼ活性の上昇に反映されている。ＴＡＳＫ１２２ ｍＲＮＡの発現の上昇もまたタンパク質レベルで明らかであった（図８Ｂ）。集密的以下のＤＴＡＳＫ１２１  Ｖ６００Ｅ-ＥＲ及びコントロール細胞を、エタノール又はエタノール中の５０ｎＭの４ＯＨＴに２−５日間さらし、可溶化液を免疫ブロット法で分析した。細胞を、５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢｒｉｊ-３５、０．１％のデオキシコール酸塩、プロテアーゼ阻害薬(Roche Molecular Biochemicals)及びホスファターゼ阻害薬カクテル(Sigma)を含む改変ＲＩＰＡバッファーに溶解させた。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（４−１２％ゲル）を使用して可溶化液中のタンパク質を分離した。電気泳動後、タンパク質をフッ化ポリビニリデン微孔性メンブレンに電気的に転写し、標準的な手順を使用して免疫検出した。
免疫ブロットは、内因性ＴＡＳＫ１２２の基底の発現が３Ｔ３細胞では検出できず、ＴＡＳＫ１２２タンパク質レベルの増加が、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ誘導後に観察され、４日で最大に達したことを示している（図８Ｂ）。ＴＡＳＫ１２２の存在量は、下流のＥＲＫ１／２キナーゼのリン酸化と相関していた。ＲＡＦアイソフォーム間の生物学的かつ生化学的差異がこのタモキシフェン誘導系を使用して同定されたので、野生型ＴＡＳＫ１２１、ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ及びＲＡＦ１を、ＴＡＳＫ１２２の発現を増加させるその能力について評価した（図８Ｃ）(Pritchardら, Mol Cell Biol 15:6430-42 (1995))。
【０１８９】
ＤＴＡＳＫ１２１-ＥＲ（図８Ｃ、レーン２及び３）、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ-ＥＲ（図８Ｃ、レーン５及び６）及びＤＲＡＦ１-ＥＲ（図８Ｃ、レーン８及び９）の活性化は、ＴＡＳＫ１２２の蓄積を促進し、ＥＲＫ１／２のリン酸化を高めた。触媒活性及びＥＲＫ１／２への下流シグナル伝達の差異は、ＴＡＳＫ１２２を誘導するこれらのキナーゼの相対能力に反映されていた。まとめると、これらの結果は、構成的ＴＡＳＫ１２１シグナル伝達及びＥＲＫ１／２の活性化は、コントロール細胞と比較した場合、ＴＡＳＫ１２２の転写とタンパク質レベルの劇的な上昇を生じていることを示している。
ＴＡＳＫ１２２は迅速にユビキチン依存性分解(Coulombeら, Mol Cell Biol 23:4542-58 (2003))の標的にされるので、細胞株におけるＴＡＳＫ１２２のＴＡＳＫ１２１媒介蓄積へのこの機構の寄与の解析を実施した。内因性ＴＡＳＫ１２２の半減期を、ＢＡＹ４３−９００６でのＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ−ＥＲの薬理学的な阻害後に測定した（Wilhelmら, Cancer Res 64:7099-109 (2004)）。１０μＭのＢＡＹ４３−９００６での処理はＥＲＫ１／２のリン酸化を迅速かつ強力に消失させることが分かった（図８Ｄ、上パネル）。これらの条件下では全ＥＲＫ１／２の存在量の変化は観察されなかった。これに対して、ＴＡＳＫ１２２タンパク質は、ＤＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ：ＥＲ阻害後は高度に不安定で、およそ１５分の半減期であった。シクロヘキシミド処理によりタンパク質合成を阻害しながらＴＡＳＫ１２１シグナル伝達を維持した場合、ＴＡＳＫ１２２分解の同様の動態がまた観察された（図８、下パネル）。これらの結果は、ＴＡＳＫ１２１活性が、ＴＡＳＫ１２２タンパク質のプロテアソーム媒介回転に影響を及ぼすことなくＴＡＳＫ１２２の転写を専ら調節することを示している。
【０１９０】
実施例４：メラノーマにおけるＴＡＳＫ１２２の発現
癌におけるＴＡＳＫ１２２の関連性を確立し、ＴＡＳＫ１２１誘導ＴＡＳＫ１２２転写がＴＡＳＫ１２１-ＥＲ発現系に単に特異的ではないことを確実にするために、ＴＡＳＫ１２１の活性化された対立遺伝子を担持する腫瘍細胞株におけるＴＡＳＫ１２２の発現を調べた。TASK122は、LOX-IMVI(TASK121V600E)、A375(TASK121V600E)、624-MEL(TASK121V600E)、888-MEL(TASK121V600E)及び928-MEL(TASK121V600E)メラノーマ中において、またHCT116(KRASG13D)、及びLS180(KRASG12D)大腸癌細胞中において高度に発現していた（図９Ａ）。TASK121V600E 変異を有する全ての細胞株はTASK122の増加レベルに対してポジティブであった。全体が援用されるHoeflichら(2006) Intl. Jour. of Oncology 29:839-849を参照のこと。
TASK121V600E変異を含む３種の原発性メラノーマについてＴＡＳＫ１２２の存在量についてまたアッセイした。正常な皮膚組織と一致したメラノーマを直ぐに凍結させ、 切片を病理学者が組織学的に検証した。免疫ブロットによって調べた３種のＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅメラノーマの全てにおいて高まったタンパク質レベルが検出された（図９Ｂ）。
ＴＡＳＫ１２１によるＴＡＳＫ１２２の調節はＲＮＡｉノックダウン実験において直接に対象とした。内因性ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ対立遺伝子を含んでいるＡ３７５メラノーマ細胞を、ＴＡＳＫ１２１特異的ｓｈＲＮＡ又はコントロールホタルルシフェラーゼｓｈＲＮＡの何れかを発現するレトロウイルスで感染させた。
この研究で使用されるヘアピンオリゴヌクレオチドは次の通りである：
TASK121 shRNA (センス) 5´-GAT CCC CAG AAT TGG ATC TGG ATC ATT TCA AGA GAA TGA TCC AGA TCC AAT TCT TTT TTT GGA AA-3´  (配列番号７)
TASK121 shRNA-1 (アンチセンス) 5´-AGC TTT TCC AAA AAA AGA ATT GGA TCT GGA TCA TTC TCT TGA AAT GAT CCA GAT CCA ATT CTG GG-3´ (配列番号８)
ルシフェラーゼshRNA (センス) 5´-GAT CCC CCT TAC GCT GAG TAC TTC GAT TCA AGA GAT CGA AGT ACT CAG CGT AAG TTT TTT GGA AA-3´ (配列番号９)
ルシフェラーゼshRNA (アンチセンス) 5´-AGC TTT TCC AAA AAA CTT ACG CTG AGT ACT TCG ATC TCT TGA ATC GAA GTA CTC AGC GTA AGG GG-3´ (配列番号１０)。
【０１９１】
この系において、Ｔｅｔリプレッサータンパク質は改変されたｐｏｌＩＩＩプロモーターに結合して、ｓｈＲＮＡの発現を防止する。しかしながら、テトラサイクリン類似体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）が存在すると、Ｔｅｔリプレッサータンパク質はプロモーターから放出され、ｓｈＲＮＡの転写と内因性ＴＡＳＫ１２１又はルシフェラーゼの発現のノックダウンが生じる。Δ TASK121V600E:ER細胞から得られた結論と一致して、 Dox誘導のshRNA媒介TASK121ノックダウンはＴＡＳＫ１２２レベル及びリン酸化ＥＲＫ１／２の有意な減少を生じる一方、全ＥＲＫ２レベルは変わらないままであった（図９Ｃ）。この結果の特異性は第二のＴＡＳＫ１２１特異的ｓｈＲＮＡを用いて確認されており、これらのデータが、ＴＡＳＫ１２１標的遺伝子の遺伝子サイレンシングから生じるもので、意図されないオフターゲットの転写物から生じるものではないことを裏付けている（図９Ｃ、レーン４）。ルシフェラーゼに対するコントロールｓｈＲＮＡを発現するＡ３７５細胞では、Ｄｏｘの添加はＴＡＳＫ１２２の存在量を変えなかった（図９Ｃ、レーン６）。併せて考えると、これは、ＴＡＳＫ１２２の発現が、内因性の発癌性ＴＡＳＫ１２１の抑制によってメラノーマ細胞において停止され得ることを示している。
ＴＡＳＫ１２２発現に重要なＴＡＳＫ１２１下流シグナルを同定するために実験を実施した。Ａ３７５、９２８−ＭＥＬ、ＣＯＬＯ２０５及びＳＫ２３−ＭＥＬ細胞株をＴＡＳＫ１２１及びＲＡＳ活性化変異について特徴づけ、ＴＡＳＫ１２２発現を、ＭＥＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６(Favataら, J Biol Chem 273:18623-32 (1998))の存在又は不在下で培養した場合のこれらの腫瘍細胞の免疫ブロットによって測定した。１０μＭのＵ０１２６で細胞を処理することによって、ＥＲＫ１／２のリン酸化が減少し、全ＥＲＫ２レベルは影響を受けなかった（図９Ｄ）。ＥＲＫ１／２のリン酸化の阻害はＴＡＳＫ１２２の発現を消滅させた。これに対して、ＴＡＳＫ１２２は、ＴＡＳＫ１２２特異的ｓｉＲＮＡの一過性形質移入を使用して発現停止させ、ＥＲＫ１／２の存在量又は活性化の無変化が検出された（図９Ｅ）。
この実験において使用したＴＡＳＫ１２２特異的ｓｉＲＮＡは次の通りであった：
TASK122 (センス) 5’GUACAGAUCUCCACGUCUUUU 3’(配列番号１１)
TASK122 (アンチセンス) 5’AAGACGUGGAGAUCUGUACUU 3’(配列番号１２)
TASK122 (センス) 5’CUACUGAUGUUGUUGAUAAUU 3’(配列番号１３)
TASK122 (アンチセンス) 5’UUAUCAACAACAUCAGUAGUU 3’(配列番号１４)
【０１９２】
このサイレンシング効果はまたＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２発現をノックダウンしたｓｈＲＮＡ実験によっても確立された。
よって、メラノーマ細胞におけるTASK122の誘導には、MAPK経路成分のＭEK1/2 及びERK1/2に対してＴＡＳＫ１２１の下流シグナル伝達の活性化が必要となる。細胞性ＴＡＳＫ１２２の蓄積はｐ３８ＭＡＰＫ機能に依存することが報告されている(Zimmermannら, J Biol Chem 276:10759-66 (2001))。TASK122発現がＴＡＳＫ１２１に依存性でｐ３８にはそうではないことを示すために、 TASK122レベルを、選択的p38 MAPK阻害剤(SB203580)の存在又は不在下でＡ３７５細胞において分析した (Cuendaら, FEBS Lett 364:229-33 (1995))。SB203580での細胞の処理はこれらの細胞においてＴＡＳＫ１２２を不安定化できなかった（図９Ｆ）。コントロールとして、細胞可溶化物中でのｐ３８ＭＡＰＫ下流シグナル伝達の活性化を、ｐ３８活性の強力なアゴニストであるアニソマイシンを使用して、ｐ３８ＭＡＰＫの直接のキナーゼ基質のリン酸化ＭＡＰＫＡＰＫ２（ＭＫ２）の電気泳動移動度シフトによって評価した。これらの結果は、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達がＴＡＳＫ１２２局在化に影響を及ぼさないことを示す細菌の研究(Seternesら, Embo J 23:4780-91 (2004))と一致した。まとめると、これらの結果はＴＡＳＫ１２２がＴＡＳＫ１２１によって、特にTASK121V600E変異体によって調製され、ＴＡＳＫ１２２に対する抗体又はプローブが、ＴＡＳＫ１２１が役割を果たす任意の腫瘍の診断で有用であることを示す。
【０１９３】
実施例５：ＲＮＡｉによるＴＡＳＫ発現の調節
ＲＮＡｉは、伝統的なアンタゴニスト、例えば低分子又は抗体が機能していない遺伝子発現を調節する実験におけるツールとして有用であることが証明されている(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)及びFire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999))。ＲＮＡｉはその標的ＲＮＡの分解を媒介することによって作用する。しかしながら、それらは通常は３０ヌクレオチド長以下であるため、インターフェロン産生及び宿主細胞タンパク質合成の一般的活動停止を含む細胞の抗ウイルス防御機構を惹起しない。実際には、ＲＮＡｉは合成され、ついでＤＮＡベクター中にクローニングされ得る。そのようなベクターを形質移入し、高レベルでＲＮＡｉを発現させることができる。高レベルのＲＮＡｉの発現は、細胞内に生成されるタンパク質の量を有意に低減させるか、又は「ノックダウン」するのに使用され、よって、タンパク質の発現が、過剰発現か変異体型の発現かの何れかによって、癌のような疾患に関連していると考えられる実験において有用である。ＴＡＳＫは細胞内キナーゼであり、ＴＡＳＫの過剰発現又は変異は癌の発症及び進行に役割を果たしている。従って、ＲＮＡｉは、癌の軽減と、癌におけるＴＡＳＫに対する低分子の効能の測定の双方において、ＴＡＳＫ発現に対する有用なアンタゴニストである。
相補的二本鎖ＲＮＡｉオリゴをＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を使用してｐＨＵＳＨベクター中に挿入する。この実施例で使用するｐＨＵＳＨ系はカナマイシン耐性のＨ１プロモーター駆動ｓｈＲＮＡ発現シャトルプラスミドと、Ｔｅｔ調節ｓｈＲＮＡ発現を可能にするコドン最適化ＴｅｔＲ-ＩＲＥＳ-ピューロマイシンカセットを含むアンピシリン耐性レトロウイルスベクターからなる。ノックダウンベクターは、ｓｈＲＮＡオリゴをシャトルベクター中にクローニングした後、Ｇａｔｅｗａｙ組換え反応(Invitrogen, Carlsbad CA)によってレトロウイルスベクターにｓｈＲＮＡカセットを移すことによって作製される。
【０１９４】
実施例６：腫瘍スクリーニング
ＴＡＳＫポリペプチドに対するアンタゴニストはヌードマウスモデルによってインビボにて決定することができる。細胞株中に高レベルのＴＡＳＫポリペプチドを生じさせるために十分量のＴＡＳＫポリペプチド発現プラスミドを哺乳動物細胞に形質移入することができる。既知数の過剰発現細胞をヌードマウスの脇腹に皮下注射することができる。十分な時間をかけて腫瘍が増殖し、可視でき、測定できる（典型的には２−３ｍｍ直径）ようになったところで、そのマウスを潜在的なＴＡＳＫアンタゴニストで処理することができる。有益な効果が生じたかどうかを決定すべく、腫瘍をバーニアノギスでミリメートル単位で測定し、腫瘍負荷を計算する；腫瘍重量＝（長さ×幅２）／２（Geranら, (1972) Cancer Chemotherapy Rep., 3 1-104）。ヌードマウス腫瘍モデルは、腫瘍増殖速度及び用量依存的な形での可能な抗腫瘍剤による腫瘍増殖速度の減少を評価するための再現性のあるアッセイである。例として、候補プロテインキナーゼＣβ阻害剤である化合物３１７６１５-ＨＣＬはこのモデルを使用して抗腫瘍効果を有していることが見出された（Teicherら, (2002) Can Chemo Pharm 49: 69-77）。
【０１９５】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１Ａ】ＴＡＳＫ１２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、ここで、配列番号：１は「ＤＮＡ３２７６７４」と命名されたクローンである。
【図１Ｂ】ＴＡＳＫ１２２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、ここで、配列番号：１は「ＤＮＡ３２７６７４」と命名されたクローンである。
【図２】図１Ａ−Ｂに示す配列番号１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ＴＡＳＫ１２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、ここで、配列番号３は「ＤＮＡ３３５８０２」と命名されたクローンである。
【図４】図３に示す配列番号３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００ＥｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、ここで、配列番号５は「ＴＡＳＫ１２１Ｖ６００Ｅ」と命名されたクローンである。
【図６】図５に示す配列番号５のコード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図７】４０ＨＴでの処置によるＴＡＳＫ１２１-ＥＲの活性化を示す。
【図８Ａ】ＴＡＳＫ１２１によるＴＡＳＫ１２２の発現の誘導を示す。
【図８Ｂ】ＴＡＳＫ１２１によるＴＡＳＫ１２２の発現の誘導を示す。
【図９Ａ】ＴＡＳＫ１２２の発現の変化がＴＡＳＫ１２１に特異的であることを示す。
【図９Ｂ】ＴＡＳＫ１２２の発現の変化がＴＡＳＫ１２１に特異的であることを示す。
【図１０】発癌性ＴＡＳＫ１２１に応答するマイクロアレイシグナル強度の統計を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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