(57)【要約】ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびコレステロールを含む脂質粒子を提供する。また、前記脂質粒子を含み、当該脂質粒子とペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質等の治療薬が会合している組成物を提供する。これらの組成物において、治療薬は低減された免疫原性および／または増大した循環時間を有する。これらの組成物は、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質の治療的投与のために使用されることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびコレステロールを含む脂質粒子であって、
ＰＣのＰＩに対する比率が７０：３０から３０：７０の間であり、且つコレステロールがＰＣおよびＰＩを合わせたものの１から３３％の間で存在し、
前記粒子のサイズは４０から１４０ｎｍの間である、脂質粒子。
【請求項２】
ＰＣのＰＩに対する比率が６０：４０から４０：６０の間である請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
ＰＣのＰＩに対する比率が５５：４５から４５：５５の間である請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
ＰＣのＰＩに対する比率が５０：５０であり、且つコレステロールはＰＣおよびＰＩを合わせたものの５−１５％の間である請求項３に記載の粒子。
【請求項５】
ＰＣおよびＰＩの各アシル鎖が独立して１２個から２２個の炭素原子を有し、且つ飽和または不飽和である請求項１に記載の粒子。
【請求項６】
粒子が凍結乾燥形態で存在する請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
ＰＩが大豆ＰＩであり、そしてＰＣが卵ＰＣである請求項１に記載の粒子。
【請求項８】
請求項１に記載の脂質粒子を含み、且つ、当該脂質粒子と会合した一以上の治療薬をさらに含む組成物であって、前記治療薬はペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり、当該治療薬の免疫原性が低下している組成物。
【請求項９】
治療薬が血液凝固カスケードに関与するタンパク質である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
治療薬が第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、ウィルブランド因子（ｖＷＦ）およびフォンヘルデブラント因子（ｖＨＦ）からなる群から選択される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
治療薬が組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチンアルファ、ＶＥＧ−Ｆ、トロンボポエチンおよびリゾチームからなる群から選択される請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
脂質粒子の少なくとも５０％が１４０ｎｍ以下のサイズである請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
脂質粒子の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％が１４０ｎｍ以下のサイズである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
脂質粒子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が４０から１００ｎｍの間のサイズである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
脂質粒子のサイズが８０ｎｍから１００ｎｍの間である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質からなる群から選択される治療薬の免疫原性を低下させる方法であって
ａ）ＰＣ、ＰＩおよびコレステロールを含む多重膜ベシクルを定寸装置を通して押し出して１４０ｎｍ未満の脂質粒子を形成することにより請求項１に記載の脂質粒子を調製する工程；ならびに
ｂ）治療薬を工程ａ）で調製された脂質粒子と混合し、治療薬の免疫原性を低下させる工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
疾病状態の処置において、治療的に有利な効果を有する外来分子の投与を伴う治療的介入がしばしば行われる。しかしながら、かかる投与はしばしば身体の免疫応答の活性化の結果である望ましくない副作用を招き得る。治療薬の投与に続く抗体の形成は重篤な臨床誘発をもたらす。抗体は治療用分子の活性を無効にし、そして／または薬物動態を改変させ得る。
【０００２】
これは特にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のような抗原性の強い分子を投与する場合に関係する。かかるポリペプチドの多くは治療用分子として日常的に使用される。例えば第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は内在性の凝固経路において必須の補助因子である。ＦＶＩＩＩの欠損または機能障害は血友病Ａとして特徴付けられる出血性障害を招く。組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）または血漿由来ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）での補充療法は出血エピソードを制御するための一般的な方法である。ＦＶＩＩＩは６個のドメイン（Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）を含む多ドメイン糖タンパク質である。血漿への分泌の前に、ＦＶＩＩＩはタンパク質溶解性切断に供され、１７０以下から３００ｋＤａ以下の範囲の分子量を有するヘテロ二量体の作成に至る。Ｂドメインレベルでの複数のタンパク質溶解部位の存在は、ＦＶＩＩＩ調製の高度な異種性の原因である。ＦＶＩＩＩの最も大きなドメイン（９０８個のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の全数の４０％以下）であるにもかかわらず、Ｂドメインは補助因子凝固活性に必須の機能を全く欠いている。Ｂドメインの欠失はｐｄＦＶＩＩＩ（例えば−１７０ｋＤａ）の最短形態に相当する、あまり異種性でない、遺伝子操作されたｒＦＶＩＩＩに至る。Ｂドメイン欠失ｒＦＶＩＩＩ（ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ）はｒＦＶＩＩＩよりも高い特異活性を特徴とし、そして血友病の治療に使用することもできる。
【０００３】
別の治療用分子は第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）である。これは外因性凝固カスケードの活性化において重要な役割を果たすトリプシン様セリンプロテアーゼである。ＦＶＩＩａはＡｒｇ１５２およびＩｌｅ１５３の間の活性化切断の後の第ＶＩＩ因子の触媒性の弱い形態である。循環性ＦＶＩＩａは外傷時に、血管の外側で見出されるそのアロステリック調節因子である組織因子（ＴＦ）と複合体を形成した場合に有効な触媒になる。ＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体はさらに凝血の引き金となる少量のトロンビンの作成を誘起する。第ＶＩＩａ因子は交代凝固因子である第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子に対して阻止抗体を発達させた血友病ＡおよびＢ患者における制御不能な出血を米国食品医薬品局により承認されている。組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒＨｕ−ＦＶＩＩａ）の静脈内投与はその他の代替治療計画よりも副作用が少ないために、および血漿由来ＦＶＩＩａの調製の困難を回避するために導入されている。しかしながらＦＶＩＩａは循環半減期が短く望ましい効果を達成するためには繰り返しボーラス注射を必要とすることが問題になり得る。
【０００４】
加えて多くのその他のタンパク質が治療薬として使用される。これにはエリスロポエチン、ＶＥＧ−Ｆ、その他の血液凝固タンパク質、ホルモン（例えばインスリンおよび成長ホルモン）等が含まれる。免疫系によるプロセシングを阻止し、そしてまた循環時間を延長する（投与の回数を減らす）ことができる戦略がタンパク質の有効性を改善するであろう。したがって治療薬の分野では、タンパク質の免疫原性を少なくし、循環時間または有効性に有意に影響することのない処方の開発が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は薬剤の免疫原性が低下し、そしてその循環時間が増大するような治療薬を含む組成物を提供する。組成物はホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールおよびコレステロールを含む脂質粒子（本明細書では脂質構造体とも称される）を含む。送達組成物（delivery compositions）を形成するためにペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質のような治療薬を脂質粒子と会合させることができる。
【０００６】
これらの組成物では、治療薬は免疫原性の低下および長い循環時間を示す。
【０００７】
種々の実施態様では、第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、リゾチームおよびエリスロポエチンのようなタンパク質をそこに会合させている脂質粒子が開示される。
明細書において、ＰＩを含む脂質粒子と会合した治療薬は時に治療薬−ＰＩと称される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は治療薬を送達するための低免疫原性および長時間循環性脂質処方のための方法および組成物を提供する。処方（製剤）はホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびコレステロールを含む脂質構造体と会合した治療薬を含む。治療薬はペプチド（一般的に５０個以下のアミノ酸）、ポリペプチド（一般的に１００個以下のアミノ酸）またはタンパク質（１００個のアミノ酸より大きい）でよい。
【０００９】
任意の特定の理論に縛られることは意図しないが、低免疫原性および／またはより長い循環時間は少なくともある程度、独特な構造を有する脂質粒子のためであると考えられる。高い拡大率の下で見られるように、本発明の脂質粒子はリポソームラメラ（liposomal lamellarity）に典型的なドーナツ様構造を有していないと思われる。相当数の脂質粒子はディスク様構造を示し（実施例２参照）、それは水容量の低下に寄与し、それにより電子顕微鏡写真における低コントラストを提供する。したがってその形態は、おそらくは脂質構造および組織の改変、ならびに内部水容量の低下のために、リポソームのものとは異なるようである。脂質構造および組織をさらに調査するために、プローブとしてラウルダン（Ｌａｕｒｄａｎ）を使用して蛍光研究を実施した。プローブは界面領域を区分化し、そしてその発光は水分子の存在および動力学ならびにリポソームのラメラ構造（層状構造）を感知できる。本発明のラウルダン標識脂質粒子に関して、およびまたリポソームに関して蛍光発光スペクトルを獲得し、後者は対照として提供された。ゲルから液体結晶相に転移するリポソームに関して、４４０ｎｍから４９０ｎｍの最大発光の赤色シフトが観察される（図１）。組成物に基づいて、液体結晶相に相当する発光スペクトルが予期される。しかしながら本発明のラウルダン標識脂質粒子はゲル様でも液体結晶様でもないスペクトルを示した。故にデータにより、おそらくはこの粒子の水濃度および動力学が改変されているために、この粒子のラメラ組織がリポソームのものと異なることが示される。不連続デキストラン勾配で実施された遠心研究により、リポソームよりも容易に浮遊する粒子が示された。故に本発明の脂質構造体は典型的なリポソームと比較して、改変された脂質組織および動力学、内部水容量、頭部基付近の水濃度および／または動力学を有すると思われる。加えて粒子はラメラリポソームよりも軽いかもしれない。
【００１０】
脂質粒子におけるタンパク質の会合効率およびＰＩを含む脂質粒子と会合したタンパク質の免疫原性の低下は、ＰＩがＰＳ、ＰＡまたはＰＧと置き換えられた類似の組成物に関するものよりも大きかった。ＰＩ、ＰＳ、ＰＡおよびＰＧは全て陰イオン性リン脂質であるので、ＰＩを使用することにより得られた有利性は驚くべきものであった。さらに試験したタンパク質の一つであるＦＶＩＩＩはＰＩよりもＰＳにより貪欲に結合することが知られているので、ＰＩ含有脂質構造体に関するＦＶＩＩＩの会合効率がＰＳ含有リポソームに関するものよりも高かったことは驚くべきことであった。
【００１１】
本発明はまた脂質構造体を調製するための方法をも提供する。適当なバッファー中適切なモル比のＰＣ、ＰＩおよびコレステロールを使用する薄い脂質フィルムの水和により脂質構造体を調製することができる。脂質をクロロホルムに溶解し、そして溶媒を乾燥させる。得られた多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を高圧下、望ましい大きさのフィルター（定寸装置：sizing device）を通して押し出して本発明の脂質構造体が得られる。粒子が細網内皮系（ＲＥＳ）で濾去されずに、免疫系反応に利用できるようになるために、脂質粒子径は１４０ｎｍ未満（顕微鏡写真および動的光散乱測定値から計算されるように）にすべきであるのが一般的に好ましい。故に少なくとも５０％の粒子を１４０ｎｍ未満にするのが好ましい。さらに好ましくは、粒子は１２０ｎｍ未満、そしてなおさらに好ましくは４０ｎｍと１００ｎｍの間であるべきである。種々の実施態様では、５０、６０、７０、８０および９０％の粒子が１４０ｎｍ未満であり、そしてさらに好ましくは４０ｎｍと１００ｎｍの間である。
【００１２】
タンパク質を脂質構造体と会合させるために、適当なバッファー中のタンパク質を脂質構造体に加える。次いで密度勾配遠心法のような日常的な遠心方法により遊離タンパク質を脂質構造体から分離する。種々の実施態様では、タンパク質の脂質粒子との会合効率は少なくとも３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０および９５％である。望ましくは、会合した治療薬を伴う脂質粒子を将来使用するために凍結乾燥することができる。
【００１３】
一つの実施態様では、タンパク質との会合の前に本発明の脂質構造体を凍結乾燥し、そして保存することができる。必要な場合、使用前に脂質構造体を再構成し、そして次にタンパク質を脂質構造体と会合させるタンパク質との組み合わせのために使用することができる。
【００１４】
本発明を、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのような治療薬と、脂質構造体との会合のために使用することができる。広い生化学的特性を有するタンパク質およびペプチドを粒子に負荷することができる。タンパク質は中性または（負または正に）荷電していてよい。かかるタンパク質には第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｖ因子（ＦＶ）および  フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、フォンヘルデブラント因子（von Heldebrant Factor）、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチンアルファ、ＶＥＧ−Ｆ、トロンボポエチン、リゾチーム等を含む血液凝固カスケードに関与するタンパク質が含まれる。
【００１５】
ＰＣの対ＰＩ対コレステロール比率は３０：７０：１から７０：３０：３３までの間でよい。故にＰＣのＰＩに対する比率は３０：７０から７０：３０の間で変化し得る。一つの実施態様では、それは４０：６０から６０：４０の間であり、そして別の実施態様では４５：５５から５５：４５の間である。別の実施態様では、それは５０：５０である。３３％よりも高いコレステロール比率（ＰＣおよびＰＩを合わせたもののパーセンテージ）で形成された構造は安定性を欠くので、コレステロールは１％と３３％の間である。一つの実施態様では、コレステロールは５−１５％である。
【００１６】
タンパク質の脂質構造体との会合は、タンパク質の脂質に対するモル比が１：２００（タンパク質：脂質）から１：３００００（タンパク質：脂質）の間であるようにできる。一つの実施態様では、それは約１：１００００（タンパク質：脂質）である。その他の実施態様では、比率は約１：２０００または１：４０００である。
【００１７】
リン脂質ＰＣおよびＰＩは２本のアシル鎖を有する。グリセロールバックボーンに結合するアシル鎖の長さは１２から２２個の炭素原子の長さで変化する。アシル鎖は飽和または不飽和でよく、そして長さは同一であっても異なっていてもよい。１２から２２個の炭素原子の飽和および不飽和アシル鎖のいくつかの非限定例を表１Ａおよび１Ｂに示す：
【００１８】
【表１】
2009532371.tif 000002
【００１９】
ＰＣに結合するアシル鎖は好ましくは１２から２２である。これらは飽和または不飽和でよく、そして同一または異なる長さでよい。ＰＩに結合するアシル鎖は１２から２２で形成されてよく、そして飽和または不飽和でよい。ＰＣおよびＰＩの鎖は同一または異なる長さでよい。
【００２０】
ＰＣおよびＰＩを天然および合成の双方の種々の供給源から入手することができる。例えば大豆ＰＩおよび卵ＰＣは市販により入手可能である。加えて、合成ＰＣおよびＰＩもまた市販により入手可能である。
【００２１】
静脈内、筋肉内、腹腔内、粘膜、皮下、経皮、皮内、経口等のような任意の標準的な経路により組成物を送達することができる。
【００２２】
本発明を以下の実施例により記載する。それは説明を意図し、いかなる制限をも意図しない。
【００２３】
実施例１
この実施例は脂質粒子の調製について記載する。
材料：アルブミン不含全長ｒＦＶＩＩＩ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｇｌｅｎｄａｌｅ、カリフォルニア州）を抗原として使用した。Ａｄｖａｔｅは西ニューヨーク血友病財団から寄贈された。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および大豆ホスファチジルイノシトール（Ｓｏｙ  ＰＩ）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバスター、アラバマ州）から購入した。コレステロール、ＩｇＧ不含ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびジエタノールアミンをＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ヤギ抗マウスＩｇおよび抗ラットＩｇ、アルカリ性ホスファターゼ抱合体をＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（バーミングハム、アラバマ州）から入手した。ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩をＰｉｅｒｃｅ（ロックフォード、イリノイ州）から購入した。モノクローナル抗体ＥＳＨ４、ＥＳＨ５およびＥＳＨ８をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社（グリニッチ、コネチカット州）から購入した。モノクローナル抗体Ｎ７７２１０ＭをＢｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（サコ、メイン州）から購入した。正常凝固対照血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿をＴｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィックローカウンティー、アイルランド）から購入した。ＤｉａＰｈａｒｍａ  Ｇｒｏｕｐ（ウェストチェスター、オハイオ州）のＣｏａｍａｔｉｃ第ＶＩＩＩ因子キットを使用して血漿試料中のｒＦＶＩＩＩ活性を測定した。
【００２４】
ｒＦＶＩＩＩ−ＰＩ脂質粒子の調製：
トリスバッファー（ＴＢ）（２５ｍＭトリスおよび３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０）を用いる適切なモル比のＤＭＰＣ、大豆ＰＩおよびコレステロール（５０：５０：５）の薄い脂質フィルムの水和により粒子を調製した。必要量の脂質をキマックス（ｋｉｍａｘ）管中でクロロホルムに溶解し、そしてＢｕｃｈｉ−Ｒ２００ロータエバポレーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州）を用いて溶媒を乾燥させた。脂質分散物をボルテックスにより、３７℃で２０分間混合して多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を形成した。得られたＭＬＶを高圧押出機（Ｍｉｃｏ社、ミドルトン、ウィスコンシン州）中２５０ｐｓｉ以下の圧力で孔径８０ｎｍの二重ポリカーボネート膜（ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ  Ｌａｂｓｔｏｒｅ、ミネトンカ、ミネソタ州）を通して押し出し、そして次に０．２２μｍ  ＭｉｌｌｅｘＴＭ−ＧＰフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を通して滅菌濾過した。リン酸塩アッセイを用いてリン脂質濃度を推定した。Ｎｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＷ３８０粒子径分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）を用いて粒子径をモニタリングした。３７℃で脂質粒子にタンパク質を添加し、そしてこの過程の間にＴＢ中のＣａ２＋イオン濃度を５ｍＭ  ＣａＣｌ２から０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２に低下させて、最適な脂質−Ｃａ２＋相互作用を確実にし、そして脂質相変化を可能にした。特記しない限り、全実験に関して、タンパク質の脂質に対する比率を１：１００００に維持した。
【００２５】
ｒＦＶＩＩＩ−ＰＩからの遊離ｒＦＶＩＩＩの分離：
不連続デキストラン密度勾配遠心技術を用いて脂質粒子から遊離タンパク質を分離した。手短にいえば、５ｍｌポリプロピレン遠心管中でインキュベートしたｒＦＶＩＩＩ−ＰＩ混合物０．５ｍｌを２０（重量／容量）％デキストラン（Ｃａ＋２不含ＴＢ中）１．０ｍｌと混合した。次いで１０（重量／容量）％デキストラン３ｍｌ、続いてＣａ＋２不含ＴＢ０．５ｍｌを混合物の上部に注意深く添加した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５０．１ローター中４５０００ｒｐｍで、４℃で３０分間遠心した後、結合タンパク質および遊離脂質粒子はデキストラン帯の上部まで浮遊し、非結合ｒＦＶＩＩＩは勾配の底部に留まる。一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを用いてｒＦＶＩＩＩ−ＰＩのタンパク質会合効率を推定した。この手順により会合効率７２±９％を生じ、これはホスファチジルセリン（ＰＳ）含有リポソームで観察されたもの（４５±１６．８％）よりも非常に高い（Ｐｕｒｏｈｉｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６１７：３１−３８（２００３）、Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ６７：５７−７１（１９９２））。
【００２６】
実施例２
この実施例は、実施例１で調製された脂質構造体の特徴付けについて記載する。フォームバールコーティングしたグリッド上で空気乾燥し、そして２％酢酸ウラニルでおよそ１分間ネガティブ染色することにより顕微鏡分析用の脂質分散試料を調製した。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ５００  ＴＥＭを使用し、７５ｋＶで操作して試料を写真撮影した。Ａｇｆａ  Ｄｕｏｓｃａｎ  Ｔ１２００スキャナを用いて陰画を３００ｄｐｉでスキャンした。透過型電子顕微鏡研究を用いて測定された粒子の形態は以下を示した。粒子径はほぼ１００ｎｍであり、動的光散乱研究と合致することが見出された（データは示していない）。顕微鏡写真の分析により、リポソームラメラに典型的なドーナツ様構造は観察されず、代わりにディスク様構造の粒子が示され（図２ａ）、そしてリポソームと区別される、高いモル％のＦＶＩＩＩを収容できる独特な脂質組織を形成することが可能である。
【００２７】
実施例３
この実施例はｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ−ＰＩの蛍光分析について記載する。ｒＦＶＩＩＩの三次構造に及ぼすＰＩの影響を、２８０ｎｍまたは２６５ｎｍのいずれかでの試料の励起により測定し、そして３００−４００ｎｍの範囲の波長で発光をモニタリングした。ＰＴＩ−Ｑｕａｎｔａｍａｓｔｅｒ蛍光分光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ローレンスビル、ニュージャージー州）でスペクトルを獲得した。タンパク質濃度は５μｇ／ｍｌであり、そしてスリット幅を４ｎｍに設定した。この粒子に負荷されたＦＶＩＩＩの蛍光発光スペクトルは遊離タンパク質と比較して最大発光の青色シフトを示し、これはＦＶＩＩＩが疎水性環境に置かれていることを示唆している（図２ｂ）。この観察は、蛍光特性の変化が観察されなかった（Ｐｕｒｏｈｉｔら、２００３）ＰＳ含有リポソームと会合したＦＶＩＩＩに関して観察された蛍光スペクトルと対照的であり、そして結晶学的および生物物理学的研究に基づいて提示される分子モデルに合致する。ＦＶＩＩＩはＣ２ドメインのＣ末端領域（２３０３−２３３２）を介してのみＰＳ含有リポソームと会合し、そして分子の残りはバルク水に接近可能である（Ｐｕｒｏｈｉｔら、２００３）。しかしながらＦＶＩＩＩ−ＰＩ微粒子では、ＦＶＩＩＩの分子表面のほとんどが脂質粒子の疎水性アシル鎖領域に埋没している、および／または、ＰＩ粒子に対し、そのタンパク質は脂質界面での水濃度がより少ない脂質−水界面に位置する可能性がある。
【００２８】
実施例４
この実施例はサンドイッチＥＬＩＳＡおよびｒＦＶＩＩＩ−ＰＩ会合に関与するｒＦＶＩＩＩエピトープの検出について記載する。ＰＩと会合したｒＦＶＩＩＩエピトープを測定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。手短にいえば、Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレートを炭酸塩バッファー（０．２Ｍ、ｐＨ９．６）中の適切な濃度の捕捉モノクローナル抗体で、４℃で一晩コーティングした。次いでプレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳ（２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０５（重量／容量）％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして次に１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中で調製）で、室温で２時間遮断した。０．５μｇ／ｍｌの種々の希釈のｒＦＶＩＩＩ−ＰＩ（１：０、１：５０００、１００００、および５００００）または遮断バッファー中のＰＩ含有リポソーム１００μｌを３７℃  で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そして次に遮断バッファー中１：１０００希釈のヤギ抗ラットＩｇ−アルカリ性ホスファターゼ抱合体を含有する１：５００希釈のラットポリクローナル抗体１００μｌと共に室温で１時間インキュベートした。最後の洗浄の後、ジエタノールアミンバッファー（１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液２００μｌを添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。３Ｎ  ＮａＯＨ１００μｌを添加して反応を停止させた。プレートリーダーを用いて４０５ｎｍで光学密度を測定した。
【００２９】
ＰＩと会合した分子表面部分を調査するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ研究を実施した（図２ｃおよび２ｄ）。この実施例の理論的根拠は、脂質粒子と会合したドメインは遮蔽され、そしてそれ故にモノクローナル抗体結合に利用できないということである。したがって、サンドイッチＥＬＩＳＡはバルク水性区画に接近可能なタンパク質表面に対する洞察を提供する間接的な定量的方法である。種々の抗体の結合親和性の差異を説明するために、ＰＩ不在下でのＦＶＩＩＩの結合を１００％に正規化し、そしてＰＩ存在下での抗体結合の低下を、ＰＩ結合に関与するＦＶＩＩＩのドメインとして解釈した。ホスファチジルコリン（ＰＣ）ベシクルにおけるＦＶＩＩＩの会合効率がほぼ１０±４％であるので、ＰＣベシクル（ＰＣ小胞）を陰性対照として使用した（Ｐｕｒｏｈｉｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６１７：３１−３８（２００３））。結晶学的および生物物理学的／生化学的研究に基づいてＰＳリポソームをＣ２ドメイン抗体の結合に関する陽性対照として使用した。２３０３−２３３２を伴うＣ２ドメインのＣ末端領域は脂質結合に関与し、そしてＡ２ドメインはリポソーム表面からさらに離れていることが示されている（Ｓｔｏｉｌｏｖａ−ＭｃＰｈｉｅら、Ｂｌｏｏｄ  ９９：１２１５−１２２３（２００２））。この分子トポロジーに基づいて、Ｃ２およびＡ２ドメインは空間的に十分に隔てられており、そしてＣ２ドメインの脂質結合領域のみがリポソーム会合により抗体結合から遮蔽され得る（Ｐｕｒｏｈｉｔら（２００３）、Ｓｔｏｉｌｏｖａ−ＭｃＰｈｉｅら（２００２））。ＰＳ含有リポソームに結合するＦＶＩＩＩのこの分子モデルに基づいて、Ｃ２およびＡ２ドメインに対して指向するモノクローナル抗体を選択した。その結果により、ＰＩに接触しているＦＶＩＩＩの分子表面はＰＳに関して観察されたものとは異なることが示された。ＰＣリポソームでは、抗体結合における脂質濃度依存性変化は観察されず、それはＦＶＩＩＩとＰＣとの間の特異的結合がないことを示しており、一方ＰＳベシクルに関しては、脂質結合ドメイン（ＥＳＨ４）に対して指向する抗体に関してのみ脂質濃度依存性変化が観察され、それは結晶学研究に基づいて提示されたモデルに合致する。しかしながらＦＶＩＩＩ−ＰＩに関しては、この研究において使用された全てのモノクローナル抗体が結合の低下を示し、そしてＰＩ濃度に依存した（図２ｄ）。その結果は、Ｃ２およびＡ２ドメインの双方が、おそらくは立体障害のために、抗体結合できるほど近づけないか、および／またはＦＶＩＩＩ分子の実質的な表面部分がＰＩ粒子に埋没していることを示した。
【００３０】
実施例５
この実施例はｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ−ＰＩのＣＤ分析について記載する。ｄ−１０カンファースルホン酸で較正されたＪＡＳＣＯ−７１５分光偏光計でＣＤスペクトルを獲得した。タンパク質の脂質に対する比率は、用いられたタンパク質濃度が２０μｇ／ｍｌ（９８．６ＩＵ／ｍｌ）である時１対２５００であった。１０ｍｍ石英キュベットを使用して２５５から２０８ｎｍの範囲にわたって二次構造分析に関するスペクトルが得られた。加熱速度６０℃／時を用いて２０から８０℃で、２１５ｎｍでの楕円率をモニタリングすることによりｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ−ＰＩの熱変性を測定した。脂質粒子の存在による光散乱効果を前述のように補正した（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １７：３４４−３５０（２０００））。
【００３１】
ＣＤ研究により、タンパク質のＣＤスペクトルはＰＩ会合により変化しなかったので、かかる分子トポロジーはタンパク質の二次構造を改変しないことが示された（図２ｅ）。しばしば熱アンフォールディングを使用して固有の安定性を調査する。ＰＩナノ粒子と会合したＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩに関して観察されたものよりわずかに高いＴｍを有してより浅い溶融を示し、それはＦＶＩＩＩのＰＩとの会合がＦＶＩＩＩの固有の安定性を高めることを示している（図２ｆ）。
【００３２】
実施例６
表２Ａ−２Ｃで示されるようないくつかのバッファー系でタンパク質の会合を実施した。全例でタンパク質の脂質に対する比率は１：１００００であった。次いで密度勾配遠心法により脂質構造体から遊離タンパク質を分離し、そして活性および分光アッセイを用いて各分画と会合したタンパク質を測定した。
【００３３】
表２Ａは様々なバッファー組成物を用いて３７℃で５０％ＤＭＰＣ：５０％ＳＰＩ：５％Ｃｈｏｌ（１００ｎｍ）と会合したｒＦＶＩＩＩのパーセンテージを示す。表２Ｂは様々なバッファー組成物を用いて３７℃で５０％ＤＭＰＣ：５０％ＳＰＩ（１００ｎｍ）と会合したｒＦＶＩＩＩのパーセンテージを示す。表２Ｃ：様々なバッファー組成物を用いて３７℃で５０％ＤＭＰＣ：５０％ＳＰＩ：１５％Ｃｈｏｌ（１００ｎｍ）と会合したｒＦＶＩＩＩのパーセンテージ。
【００３４】
【表２】
2009532371.tif 000003
【００３５】
実施例７
この実施例は免疫原性研究について記載する。すなわちＦＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１６に標的欠失を有する血友病Ａマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の雌雄対を使用した。血友病Ａマウスのコロニーを確立し、そして８−１２週齢の動物をインビボ研究で使用した。マウスの性別は免疫応答に影響力を有さないので、雄および雌双方のマウスを研究に使用した。
【００３６】
遊離ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ−ＰＩの相対免疫原性を血友病Ａマウスにおいて測定した。ＦＶＩＩＩに対する抗体応答パターンは血友病患者において観察されるものに非常に類似するので、このマウスモデルはＦＶＩＩＩの免疫原性を調査するのに適当である。マウス雄８匹および雌１０匹にＦＶＩＩＩ（４００ＩＵ／ｋｇ）１０ＩＵを各々静脈内注射（陰茎静脈を介して）および皮下注射で４回毎週投与した。最後の注射の２週間後に血液試料をクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）バッファー（８５ｍＭクエン酸ナトリウム、１１０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよび７１ｍＭクエン酸）中に１０：１（容量／容量）の比率で心穿刺により収集した。５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して血漿を分離した。遠心後直ぐに試料を−８０℃で保存した。  ＥＬＩＳＡ研究により全力価を測定し、そして前述のようなベセスダアッセイ変法を用いて（ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７３：２４７０２５１（１９９５））阻止力価を測定した。
【００３７】
その結果により、ＰＩは血友病マウスにおける抗体応答を低下させることが示された（図３）。ｒＦＶＩＩＩ−ＰＩで処置された動物は、ｒＦＶＩＩＩ単独で処置された動物と比較して有意に低い全抗体力価を示した（図３ａおよび３ｃ）。ｒＦＶＩＩＩ単独で処置された動物に関する値１３１６７±２０４２（ｎ＝１５）と比較して、皮下経路により与えられたＦＶＩＩＩ−ＰＩに関する力価は２３７９＋５５６（±Ｓ．Ｅ．Ｍ；ｎ＝１０）であった。これらの差異はｐ＜０．０５で有意であった。静脈内注射によりｒＦＶＩＩＩ−ＰＩで処置された動物もまたより低い平均抗体力価を示しており、ＦＶＩＩＩ−ＰＩに関する抗体力価は３３２１±８７４（ｎ＝８）になることが見出され、そしてｒＦＶＩＩＩで処置されたものは４５６９±１０２１（ｎ＝８）の力価を有したが、この差異は有意ではなかった。しかしながら、タンパク質の活性を抑制する阻止力価は皮下および静脈内の双方の経路により与えられたＦＶＩＩＩ−ＰＩに関して有意に低下した（図３ｂおよび３ｄ）。皮下投与に関して、阻止力価は７０％を超えて低下した。ＦＶＩＩＩ単独で静脈内経路により与えられた動物に関して、阻止力価は６７５±７１であり、そしてそれはＦＶＩＩＩ−ＰＩに関しては３８５±８４まで低下し、そしてこの低下は  ｐ＜０．０５で統計的に有意である。これらの結果は合わせて、ＰＩ含有脂質粒子が抗ｒＦＶＩＩＩ抗体力価全体を低下させるのみならず、タンパク質の活性を抑制する抗体の力価をも低下させることを示している。
【００３８】
実施例８
この実施例は薬物動態研究について記載する。ｒＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩ−ＰＩ（１０ＩＵ／２５ｇ）を雄血友病Ａマウスに陰茎静脈を介して単回静脈内ボーラス注射として投与した。注射後０．０８、０．５、１、２、４、８、１６、２４、３６および４８時間後に心穿刺により血液試料をＡＣＤバッファー（１０：１容量／容量）の入ったシリンジに収集した（ｎ＝３マウス／時点）。直ちに遠心により血漿を収集し（５０００ｒｐｍ、５分間、４℃）、そして分析まで−７０℃で保存した。発色アッセイを用いて血漿試料中のｒＦＶＩＩＩの活性を測定した。各時点のｒＦＶＩＩＩ活性の平均値を用いて基本的な薬物動態パラメーター（半減期、ＭＲＴおよび血漿活性曲線下面積）をノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）２０（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）により計算した。０から、活性が測定可能な最後の時点までの血漿活性下面積（ＡＵＣ）対時間曲線を、対数線形台形法により測定した。消失速度定数（ラムダｚ）を最終相濃度の対数線形回帰により推定した。消失半減期（ｔ１／２）をｌｎ２／ラムダｚとして計算し、そしてＭＲＴをＡＵＭＣ／ＡＵＣ（ここでＡＵＭＣは濃度と時間の積対時間の曲線プロット下の面積である）から計算した。
【００３９】
Ｍｉｎｉｔａｂ（Ｍｉｎｉｔａｂ社、ステートカレッジ、ペンシルバニア州）を用いてＡＮＯＶＡによりデータを分析した。スチューデント非依存ｔ検定および一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔｅの事後多重比較検定により統計的な差異（ｐ＜０．０５）を検出した。ＰＫ研究に関しては、反復測定ＡＮＯＶＡを用いて、二つの処置により作成されたプロフィールを比較した。Ｂａｉｌｅｒ−Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ法を用いて二つの処置間の全身暴露における差異を比較した。
【００４０】
ＭＲＴおよびＡＵＣはＦＶＩＩＩに比較してＦＶＩＩＩ−ＰＩに関してより高いことが見出され、そしてまた最終排出相の延長も示された。ＰＩ脂質粒子と会合したＦＶＩＩＩの循環半減期（７．６時間）は遊離ＦＶＩＩＩに関して観察されたもの（２．３時間）よりも長い。ＦＶＩＩＩ−ＰＩ粒子を与えられた動物に関して注射の４８時間後に実質的なタンパク質活性が検出され；対照的にＦＶＩＩＩ単独を投与された動物においては４８時間後に検出可能なＦＶＩＩＩ活性は観察されなかった（図４）。さらにタンパク質活性は、ＰＳ含有リポソームの投与に続く２４時間のみ検出可能であった（データは示していない）。これはＲＥＳによるＰＳリポソームの迅速な取り込みに起因する。しかしながらＰＩの存在下では細胞の取り込みが低下し、そしてＰＩのステルス様特性に合致する。
【００４１】
実施例９
この実施例はｒＦＶＩＩＩおよびトランケートされた（切断）ＦＶＩＩＩ，ＢＤＤｒＦＶＩＩＩに関する会合効率について記載する。ＦＶＩＩＩまたはＢＤＤｒＦＶＩＩＩを有する脂質構造体を上述の方法により調製した。これらのタンパク質に関する会合パーセントを表３に示す。
【００４２】
【表３】
2009532371.tif 000004
【００４３】
上述のように、ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤｒＦＶＩＩＩの双方に関して、ＤＭＰＣ：ＳＰＩ：コレステロール（５０：５０：５）処方はその他の処方よりも最も高い会合効率を示した。コレステロールは血漿中のリポソーム安定性を高めるために処方に含められるのが好ましい。リポソームの大きさおよび会合温度、ならびに脂質濃度の全てが会合において重要な役割を果たす。ＤＭＰＣ：ＳＰＩ：コレステロール（５０：５０：５）処方は驚くべきことに、ＢＤＤｒＦＶＩＩＩがより低い分子量および大きさを有しているにもかかわらず、ＢＤＤｒＦＶＩＩＩよりもｒＦＶＩＩＩに関してより高い会合を有する。Ｂドメイン欠失の結果としての立体構造の変化は、ＰＩ含有脂質粒子に対するＢＤＤｒＦＶＩＩＩ結合親和性の低下の原因となり得る。
【００４４】
薬物動態研究
雄血友病マウス（２０−２４ｇ、２２−２５週齢）に脂質構造体と会合したｒＢＤＤＦＶＩＩＩ（ＰＩ−ＢＤＤｒＦＶＩＩＩと称される）１０ＩＵ／２５ｇを単回静脈内ボーラス注射として陰茎静脈を介して与えた。投与後０．０８、０．５、１、２、４、８、１６、２４、３６および４８時間に心穿刺により血液試料を収集し（ｎ＝１／時点）、そしてクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）に１０：１（容量／容量）の比率で加えた。５０００ｇ、４℃で５分間遠心して血漿を分離し、そして分析まで−７０℃で保存した。発色アッセイによりタンパク質の活性に関して血漿試料を分析した。次いで各時点で測定されたＢＤＤｒＦＶＩＩＩの活性を利用して基本ＰＫパラメーターを推定した（半減期、ｔ１／２および血漿活性曲線下面積／暴露、ＡＵＡＣ）。
【００４５】
遊離ＢＤＤｒＦＶＩＩＩおよびＰＩ−ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ処方に関するＰＫ正規化ＰＫプロフィール（ｎ＝１）を図５に示す。曲線下面積ＡＵＣ（時×ＩＵ／ｍｌ）または遊離ＢＤＤｒＶＩＩＩは９５５．１であり、そして脂質構造体と会合したＢＤＤＦＶＩＩＩに関しては１０５８．７であった。
【００４６】
実施例１０
この実施例はその他の実施例においてＰＩ含有脂質構造体との比較のために用いられたＰＳ含有リポソームの調製について記載する。最終タンパク質濃度が３μｇ／ｍｌで一定となるような方法で様々な濃度のＯ−ホスホ−Ｌ−セリン（ＯＰＬＳ）またはホスホコリンを含有する溶液とＢＤＤｒＦＶＩＩＩを混合した。ＯＰＬＳまたはホスホコリン濃度は０と１００μＭの間で変動した。各混合物はさらなる分析に供する前に５分間インキュベートする。漸増濃度のリン脂質頭部基の存在下でのＢＤＤｒＦＶＩＩＩの固有の蛍光をＱｕａｎｔａ  Ｍａｓｔｅｒ  ＰＴＩ装置で測定した。励起を２８５ｎｍに設定し、そして最大ピーク（例えば３３０ｎｍ）で発光を記録した。正規化された蛍光（Ｆ／Ｆ０）データを［脂質］に対してプロットし、そして脂質頭部基−ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ相互作用に関する解離定数の決定のために使用した。
【００４７】
ＯＰＬＳおよびＰＣ頭部基の存在下および不在下でのＢＤＤｒＦＶＩＩＩの凝集過程をモニタリングするために、電動偏光プリズムを装着したＱｕａｎｔａ  Ｍａｓｔｅｒ  ＰＴＩ蛍光分光光度計を使用して、試料蛍光異方性を温度の関数として測定した。データを異方性対温度としてプロットし、そしてシグモイド曲線に適合させた。各曲線の屈折点が得られた。
【００４８】
ＯＰＬＳに関する解離定数（Ｋｄ（μＭ））は７０．２であり、そしてホスホコリンに関しては２４．２であった。遊離ＢＤＤｒＦＶＩＩＩに関する屈折点は７１．６であり、ＯＰＬＳリポソーム中のＢＤＤｒＦＶＩＩＩに関しては７９．４であり、そしてホスホコリンリポソーム中のＢＤＤｒＦＶＩＩＩに関しては７２．２であった。
【００４９】
ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ−ＯＰＬＳ複合体の免疫学的特性を研究するために、８から１２週齢の血友病マウスに異なるＢＤＤｒＦＶＩＩＩ処方（遊離ＢＤＤｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤｒＦＶＩＩＩ−ＯＰＬＳ複合体（前述のように調製）であり、［ＯＰＬＳ］＝１０ｍＭ）を含有する注射を４回毎週投与した。各注射のための用量は１０ＩＵ／動物である。最後の注射の２週後に血液試料を収集し、そしてベセスダアッセイ変法を用いて阻止抗体の存在に関して分析した。その結果、ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ−ＯＰＬＳ複合体に関する免疫応答は遊離ＢＤＤｒＦＶＩＩＩと比較して統計的に有意に低下することが示された（ｐ＜０．０５）。
【００５０】
ｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤｒＦＶＩＩＩ−ホスファチジルセリン含有リポソームに関する会合効率を測定した。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）：脳ホスファチジルセリン（ＢＰＳ）リポソーム（モル比７０：３０）。必要とされる量のＤＭＰＣおよびＢＰＳをクロロホルムに溶解した。Ｂｕｃｈｉ−Ｒ２００ロトエバポレーター（ｒｏｔｏｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶媒を除去することにより、ガラス管の壁面に薄い脂質フィルムが形成された。脂質フィルムを３７℃でトリスバッファー（ＴＢ  ２５ｍｍ  トリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ＝７．４）と再水和することによりリポソームを調製した。高圧押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ社）を用いて２００ｐｓｉ以下の圧力で、二重積層された１００ｎｍまたは２００ｎｍのポリカーボネート膜を通してリポソームを８回押し出した。リポソームの粒子径分布をＮｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＷ３８０粒子径分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてモニタリングした。
【００５１】
リポソームタンパク質調製
リポソームの存在下タンパク質を３７℃で３０分間、時折穏やかに旋回しながらインキュベートすることにより、予め形成されたリポソームとタンパク質との会合を実施した。全調製物に関してタンパク質を同一のモル比に維持した（１：１００００）。
【００５２】
予め形成されたタンパク質−リポソーム混合物のＰＥＧ化（PEGylation）
１，２ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（ＤＭＰＣ−ＰＥＧ２０００）または１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の乾燥粉末にリポソーム調製物を添加することにより予め形成されたリポソームのＰＥＧ化を達成した。室温で４５分間インキュベーションを実施した。ＤＭＰＣ−ＰＥＧ２０００の予め形成された脂質二重層への移動を促進するために、ＤＭＰＣ−ＰＥＧ２０００濃度が臨海ミセル濃度を下回った状態を維持するように注意を払った。
【００５３】
リポソーム会合タンパク質からの遊離タンパク質の分離
リポソームと会合したタンパク質の量を推定するために、不連続デキストラン密度勾配での浮遊によりリポソーム会合タンパク質から遊離タンパク質を分離した。手短にいえば、５ｍｌポリプロピレン遠心管中でリポソーム−タンパク質混合物０．５ｍｌを２０（重量／容量）％デキストラン（カルシウム不含トリスバッファー中）１ｍｌと混合し、そして１０（重量／容量）％デキストラン３ｍｌおよびカルシウム不含トリスバッファー０．５ｍｌをリポソーム含有帯に積層した。勾配を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５０．１ローター中４５０００ｒｐｍで３０分間超遠心に供した。リポソームおよびその会合タンパク質はバッファー／１０％デキストラン帯の界面に浮遊し、そして会合していないタンパク質は底部に留まった。一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを用いてリポソームと会合したタンパク質の活性を測定した。結果を表４Ａおよび４Ｂに示す。
【００５４】
【表４】
2009532371.tif 000005
【００５５】
ＢＤＤｒＦＶＩＩＩは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）含有脂質膜に対する結合特性およびその活性を含む、親分子の全ての重要な構造的特徴を保持する。ＢＤＤｒＦＶＩＩＩの会合効率は全長ｒＦＶＩＩＩに関して観察されたものよりも高かった。
【００５６】
ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ−ＰＳ含有リポソームの免疫学的特性もまた試験した。８から１２週齢の血友病マウスにＢＤＤｒＦＶＩＩＩ−ＰＳ含有リポソーム（実施例３に記載されるように調製）１０ＩＵを含有する注射を４回毎週投与した。最後の注射に続く２週間血液試料を収集し、そしてベセスダアッセイ変法を用いて阻止抗体の存在に関して分析した。
【００５７】
実施例１１
この実施例は、比較目的で使用されたＰＳおよびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）含有リポソームと会合したＢＤＤｒＦＶＩＩＩの会合効率について記載する。
【００５８】
リポソーム調製
ＤＭＰＣ：ＢＰＳ：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（モル比７０：１０：２０）を以下に記載するように調製した：必要とされる量のＤＭＰＣ、ＢＰＳおよびＤＯＰＥをクロロホルムに溶解した。Ｂｕｃｈｉ−Ｒ２００ロトエバポレーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶媒を除去することにより、ガラス管の壁面に薄い脂質フィルムが形成された。脂質フィルムを３７℃でトリスバッファー（ＴＢ  ２５ｍｍ  トリス、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ＝７．４）と再水和することによりリポソームを調製した。高圧押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ社）を用いて２００ｐｓｉ以下の圧力で二重積層された１００ｎｍのポリカーボネート膜を通してリポソームを８回押し出した。粒子の粒子径分布をＮｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＷ３８０粒子径分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてモニタリングした。
【００５９】
リポソームタンパク質調製
リポソームの存在下タンパク質を３７℃で３０分間、時折穏やかに旋回しながらインキュベートすることにより、予め形成されたリポソームとタンパク質との会合を達成した。全調製物に関してタンパク質を同一のモル比に維持した（１：１００００）。
【００６０】
予め形成されたタンパク質−リポソーム混合物のＰＥＧ化
１，２ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（ＤＭＰＣ−ＰＥＧ２０００）または１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の乾燥粉末にリポソーム調製物を添加することにより予め形成されたリポソームのＰＥＧ化を達成した。室温で４５分間インキュベーションを実施した。ＤＭＰＣ−ＰＥＧ２０００の、予め形成された脂質二重層への移動を促進するために、ＤＭＰＣ−ＰＥＧ２０００濃度が臨海ミセル濃度を下回った状態を維持するように注意を払った。
【００６１】
リポソーム会合タンパク質からの遊離タンパク質の分離
リポソームと会合したタンパク質の量を推定するために、不連続デキストラン密度勾配での浮遊により、リポソーム会合タンパク質から遊離タンパク質を分離した。手短にいえば、５ｍｌポリプロピレン遠心管中でリポソーム−タンパク質混合物０．５ｍｌを２０（重量／容量）％デキストラン（カルシウム不含トリスバッファー中）１ｍｌと混合し、そして１０（重量／容量）％デキストラン３ｍｌおよびカルシウム不含トリスバッファー０．５ｍｌをリポソーム含有帯に積層した。勾配を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５０．１ローター中４５０００ｒｐｍで３０分間超遠心に供した。リポソームおよびその会合タンパク質はバッファー／１０％デキストラン帯の界面に浮遊し、そして会合していないタンパク質は底部に留まった。一段階活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを用いてリポソームと会合したタンパク質の活性を測定した。結果を表５に示す。
【００６２】
【表５】
2009532371.tif 000006
【００６３】
ＰＳ含有リポソームは細網内皮系（ＲＥＳ）により循環から迅速に排除される。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）はＰＳ含有脂質に対するＦＶＩＩＩの親和性を上昇させる。本実施例では、ＰＳの消費でＰＥが組成物に添加される。ＰＥ濃度の上昇に伴って会合効率が上昇することが見出される（実験番号ＩおよびＩＩを比較）。ＰＥＧの不在下では、ＤＯＰＥの不在下よりもＤＯＰＥ含有粒子に関して会合効率は高くなることが見出される（実験番号ＩＩおよびＩＩＩ）。処方中のＰＳ含量は低下するが、高い会合効率を達成することが、ＢＤＤｒＦＶＩＩＩの薬理学的特性の観点からより有利である。
【００６４】
実施例１２
この実施例はこの方法の別のタンパク質、第ＶＩＩ因子への適用について記載する。この実施例ではＦＶＩＩを含む脂質構造体を調製した。必要とされる量のＤＭＰＣ、ＳＰＩおよびＣｈｏｌ（ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）：大豆ホスファチジルイノシトール（ＳＰＩ）：コレステロール（Ｃｈｏｌ）（モル比５０：５０：５）をクロロホルムに溶解した。Ｂｕｃｈｉ−Ｒ２００ロトエバポレーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶媒を除去することにより、ガラス管の壁面に薄い脂質フィルムが形成された。脂質フィルムを３７℃で２５ｍＭトリスバッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０；カルシウム不含）と再水和することにより脂質粒子（ＬＰ）を調製した。高圧押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ社）を用いて２００ｐｓｉ以下の圧力で二重積層された８０ｎｍのポリカーボネート膜を通してＬＰを２０回押し出した。粒子の粒子径分布をＮｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＷ３８０粒子径分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてモニタリングした。
【００６５】
ＬＰの存在下タンパク質を３７℃で３０分間インキュベートすることにより、タンパク質のＬＰとの会合を達成した。最初の２回の試験の調製に関しては、タンパク質の脂質に対するモル比を維持した（１：１００００）。加えてまた１回の試験はタンパク質：脂質の比率１：２０００を用いて調査した。
【００６６】
ＬＰと会合したタンパク質の量を推定するために、不連続デキストラン密度勾配での浮遊によりＬＰ会合タンパク質から遊離タンパク質を分離した。手短にいえば、５ｍｌポリプロピレン遠心管中でＬＰ−タンパク質混合物０．５ｍｌを２０（重量／容量）％デキストラン（カルシウム不含トリスバッファー中）１ｍｌと混合し、そして１０（重量／容量）％デキストラン３ｍｌおよびカルシウム不含トリスバッファー０．５ｍｌをＬＰ含有帯に積層した。勾配を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５０．１ローター中４５０００ｒｐｍで３０分間超遠心に供した。ＬＰおよびその会合タンパク質はバッファー／１０％デキストラン帯の界面に浮遊し、そして会合していないタンパク質は底部に留まった。分光学的アッセイを用いてＬＰと会合したタンパク質の濃度を測定した。タンパク質：脂質の比率が１：１００００である時の会合パーセントは６３．９±９．６％（ｎ＝３）であり、そしてタンパク質：脂質が１：２０００である時の会合パーセントは４０．１±１．１％（ｎ＝３）であった。
【００６７】
実施例１３
この実施例はこの方法の別のタンパク質、リゾチームへの適用について記載する。必要とされる量のＤＭＰＣ、ＳＰＩおよびＣｈｏｌ（ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）：大豆ホスファチジルイノシトール（ＳＰＩ）：コレステロール（Ｃｈｏｌ）（モル比５０：５０：５）をクロロホルムに溶解した。Ｂｕｃｈｉ−Ｒ２００ロトエバポレーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶媒を除去することにより、ガラス管の壁面に薄い脂質フィルムが形成された。脂質フィルムを３７℃で２５ｍＭトリスバッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０；カルシウム不含）と再水和することにより脂質粒子（ＬＰ）を調製した。高圧押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ社）を用いて２００ｐｓｉ以下の圧力で二重積層された８０ｎｍのポリカーボネート膜を通してＬＰを２０回押し出した。粒子の粒子径分布をＮｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＷ３８０粒子径分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてモニタリングした。
【００６８】
ＬＰの存在下、リゾチームを３７℃で３０分間インキュベートすることにより、タンパク質のＬＰとの会合を達成した。タンパク質の脂質に対するモル比を１：２０００に維持して調査した。
【００６９】
ＬＰと会合したタンパク質の量を推定するために、不連続デキストラン密度勾配での浮遊によりＬＰ会合タンパク質から遊離タンパク質を分離した。手短にいえば、５ｍｌポリプロピレン遠心管中でＬＰ−タンパク質混合物０．５ｍｌを２０（重量／容量）％デキストラン（カルシウム不含トリスバッファー中）１ｍｌと混合し、そして１０（重量／容量）％デキストラン３ｍｌおよびカルシウム不含トリスバッファー０．５ｍｌをＬＰ含有帯に積層した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５０．１ローター中勾配を４５０００ｒｐｍで３０分間超遠心に供した。ＬＰおよびその会合タンパク質はバッファー／１０％デキストラン帯の界面に浮遊し、そして会合していないタンパク質は底部に留まった。分光学的アッセイを用いてＬＰと会合したタンパク質の濃度を測定した。
【００７０】
【表６】
2009532371.tif 000007
【００７１】
このように調製された粒子は粒子の内側にタンパク質を詰め込み、そして周囲環境から遮蔽する。これは図６に示されるようにアクリルアミドクエンチングデータにより支持される。これはプロテアーゼ分解からタンパク質を遮蔽し得るので、インビボ安定性を提供しうる。
【００７２】
実施例１４
この実施例は別のタンパク質、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の本発明の脂質粒子との会合について記載する。ＤＭＰＣ、ＳＰＩおよびＣｈｏｌ［（ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）：大豆ホスファチジルイノシトール（ＳＰＩ）：コレステロール（Ｃｈｏｌ）（モル比５０：５０：５）］をクロロホルムに溶解した。Ｂｕｃｈｉ−Ｒ２００ロトエバポレーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶媒を除去することにより、ガラス管の壁面に薄い脂質フィルムが形成された。脂質フィルムを３７℃で２５ｍＭトリスバッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０；カルシウム不含）と再水和することにより脂質粒子（ＬＰ）を調製した。高圧押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ社）を用いて２００ｐｓｉ以下の圧力で二重積層された８０ｎｍのポリカーボネート膜を通してＬＰを２０回押し出した。粒子の粒子径分布をＮｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ＣＷ３８０粒子径分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてモニタリングした。
【００７３】
ＬＰの存在下、ＥＰＯを３７℃で３０分間インキュベートすることにより、タンパク質エリスロポエチンのＬＰとの会合を達成した。タンパク質の脂質に対するモル比を１：１００００（３試験）および１：２０００（１試験）に維持した。
【００７４】
ＬＰと会合したタンパク質の量を推定するために、不連続デキストラン密度勾配での浮遊によりＬＰ会合タンパク質から遊離タンパク質を分離した。手短にいえば、５ｍｌポリプロピレン遠心管中でＬＰ−タンパク質混合物０．５ｍｌを２０（重量／容量）％デキストラン（カルシウム不含トリスバッファー中）１ｍｌと混合し、そして１０（重量／容量）％デキストラン３ｍｌおよびカルシウム不含トリスバッファー０．５ｍｌをＬＰ含有帯に積層した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ５０．１ローター中勾配を４５０００ｒｐｍで３０分間超遠心に供した。ＬＰおよびその会合タンパク質はバッファー／１０％デキストラン帯の界面に浮遊し、そして会合していないタンパク質は底部に留まった。分光学的アッセイを用いてＬＰと会合したタンパク質の濃度を測定した。
【００７５】
蛍光分光法により決定されるように会合効率はタンパク質：脂質比率１：１００００に関して７４．９０％、６８．６０％および６８．５０％、ならびにタンパク質：脂質比率１：２０００に関して５１％であった。
【００７６】
本発明を具体的な実施例により記載してきたが、日常的な修飾は当業者には明白であり、そしてかかる修飾は本発明の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】液体もしくはゲルとしてのＰＣ含有リポソーム単独または会合ｒＦＶＩＩＩを伴うＰＩ含有脂質粒子のラウルダン研究の生物物理学的および生化学的特徴を表す。
【図２】ｒＦＶＩＩＩ−ＰＩの生物物理学的および生化学的特徴（ａ）：ｒＦＶＩＩＩ−ＰＩの透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）；（ｂ）：遊離ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ−ＰＩ（１：１００００）の正規化蛍光発光スペクトル；（ｃ）：ｒＦＶＩＩＩ分子における特異的エピトープを標的とするこの研究において利用される捕捉モノクローナル抗体の一覧表；（ｄ）：種々の脂質濃度でのｒＦＶＩＩＩ−ＰＩに対するモノクローナル抗体の結合。対照はタンパク質不含リポソームである；（ｅ）：２０℃で獲得されるＰＩの存在下（１：２５００）および不在下でのｒＦＶＩＩＩの遠紫外ＣＤスペクトル；ならびに（ｆ）：ＰＩの存在下および不在下での温度の関数としてのｒＦＶＩＩＩの楕円率の変化パーセント。
【図３】ｒＦＶＩＩＩの免疫原性に対するホスファチジルイノシトールの効果。（ａ、ｃ）は全抗体力価の平均（水平棒線）を示し、そして個々の（白丸）抗体力価は皮下および静脈内投与の後に各々測定された。（ｂ、ｄ）は阻止力価の平均（水平棒線）を示し、そして個々の（白丸）阻止力価は皮下および静脈内投与の後に各々測定された。
【図４】ｒＦＶＩＩＩの薬物動態に及ぼすホスファチジルイノシトールの影響。遊離ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＶＩＩＩ−ＰＩの静脈内投与の後のｒＦＶＩＩＩ凝血活性の平均血漿濃度。
【図５】ＢＤＤｒＦＶＩＩＩの薬物動態に対するホスファチジルイノシトールの影響。遊離ＢＤＤｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤｒＦＶＩＩＩ−ＰＩの静脈内投与の後のＢＤＤｒＦＶＩＩＩ凝血活性の平均血漿濃度。
【図６】遊離リゾチームおよびＰＩ含有脂質粒子と会合したリゾチームをクエンチングするアクリルアミド。
【図１】
2009532371.tif 000008
【図２】
2009532371.tif 000009
【図３】
2009532371.tif 000010
【図４】
2009532371.tif 000011
【図５】
2009532371.tif 000012
【図６】
2009532371.tif 000013
【国際調査報告】
2009532371.tif 000014