(57)【要約】  本開示内容は、正味のアニオン電荷を低減するように改変された核酸構築物に関する。いくつかの態様において、この構築物は、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含む。本開示内容はまた、かかる構築物の作製及び使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のアニオン電荷を低減するホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を１以上の位置に含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメイン、並びに
b）上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインに機能的に連結された膜輸送機能を有する少なくとも１つの導入ドメイン
を含む、核酸構築物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、カチオン荷電ドメインである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、タンパク質導入ドメイン（PTD）である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記核酸構築物の総電荷が、非保護オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対して、中性又は正荷電である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、一般式：
R-X-又はQ-X-
〔式中、
Xは、O、S又はNR1であり、R1は、H、メチル、エチル、S-ピバロイルチオエタノール、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環であり；
Rは、以下：
R2
（R2は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１】
2009543783.tif 000064
（R3は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A1及びA2は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化２】
2009543783.tif 000065
（R4は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A3及びA4は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化３】
2009543783.tif 000066
（R5は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A5は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X1及びX2は、各々独立に、O、S又はNR7であり、R7は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化４】
2009543783.tif 000067
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA6は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化５】
2009543783.tif 000068
（Q2は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A8及びA9 は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化６】
2009543783.tif 000069
（Q3は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A10及びA11は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化７】
2009543783.tif 000070
（Q4は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A12は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X5及びX6は、各々独立に、O、S又はNR9であり、R9は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化８】
2009543783.tif 000071
（Q5は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A13及びA14は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X7及びX8は、各々独立に、O、S又はNR10であり、R10は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択される。〕
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、MeO-、EtO-、iPrO、
【化９】
2009543783.tif 000072
からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、以下：
【化１０】
2009543783.tif 000073
からなる群より選択される構造を含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項８】
リンカーを介して前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基に結合されてRNB保護基を形成する、塩基性置換、グアニジニウム、アミン又は尿素基をさらに含む、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記RNB保護基が、以下：
【化１１】
2009543783.tif 000074
からなる群より選択される構造を含む、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのタンパク質導入ドメインが、ヘルペスウイルスVP22ドメインを含むポリペプチド、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）TATドメインを含むポリペプチド、アンテナペディアタンパク質のホメオドメイン（Antp HD）ドメインを含むポリペプチド、N末端カチオン性プリオンタンパク質ドメイン、ポリアルギニン、及びそれらの機能的断片からなる群より選択される、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインが、dsRNA又はsiRNAを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸構築物及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のアニオン電荷を低減する、又は該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のカチオン電荷を供給する、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を１以上の位置に含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
【請求項１４】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、一般式：
R-X-又はQ-X-
〔式中、
Xは、O、S又はNR1であり、R1は、H、メチル、エチル、S-ピバロイルチオエタノール、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環であり；
Rは、以下：
R2
（R2は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１２】
2009543783.tif 000075
（R3は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A1及びA2は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１３】
2009543783.tif 000076
（R4は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A3及びA4は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１４】
2009543783.tif 000077
（R5は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A5は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X1及びX2は、各々独立に、O、S又はNR7であり、R7は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１５】
2009543783.tif 000078
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA6は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
式中、X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化１６】
2009543783.tif 000079
（Q2は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A8及びA9 は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１７】
2009543783.tif 000080
（Q3は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A10及びA11は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１８】
2009543783.tif 000081
（Q4は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A12は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X5及びX6は、各々独立に、O、S又はNR9であり、R9は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１９】
2009543783.tif 000082
（Q5は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A13及びA14は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X7及びX8は、各々独立に、O、S又はNR10であり、R10は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択される。〕
を有する、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、MeO-、EtO-、iPrO、
【化２０】
2009543783.tif 000083
からなる群より選択される、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、以下：
【化２１】
2009543783.tif 000084
からなる群より選択される構造を含む、請求項14に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
リンカーを介して前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基に結合されてRNB保護基を形成する、塩基性置換、グアニジニウム、アミン又は尿素基を含む、請求項14に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記RNB保護基が、以下：
【化２２】
2009543783.tif 000085
からなる群より選択される構造を含む、請求項17に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに機能的に連結されたターゲティングドメインをさらに含む、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
前記ターゲティング部分が、細胞表面タンパク質に結合する抗体である、請求項19に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
前記ターゲティングドメインが、細胞表面受容体の受容体リガンドを含む、請求項19に記載の核酸構築物。
【請求項２２】
カチオン荷電ポリペプチド又はペプチドをさらに含む、請求項13に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
前記カチオン荷電ポリペプチド又はペプチドが、タンパク質導入ドメインを含む、請求項22に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
請求項13〜23のいずれか一項に記載の核酸構築物及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
１以上のタンパク質導入ドメインを請求項13に記載の核酸構築物に連結させるステップを含む方法。
【請求項２６】
前記１以上のタンパク質導入ドメインが、2〜5つのタンパク質導入ドメインを含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記１以上のタンパク質導入ドメインが、3つのタンパク質導入ドメインを含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質導入ドメインを実質的に精製するステップ；
オリゴヌクレオチドを合成するステップ；
該オリゴヌクレオチドのアニオン電荷をホスホトリエステル基で電荷中和するステップ；
該オリゴヌクレオチドを１以上のタンパク質導入ドメインに連結させるステップ
を含む、核酸構築物の作製方法。
【請求項２９】
細胞を、請求項1又は13に記載の核酸構築物と接触させるステップを含む、細胞のトランスフェクト方法。
【請求項３０】
前記接触ステップがin vivoである、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸構築物が、アンチセンス分子を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
疾患又は障害の治療方法であって、請求項1又は13に記載の核酸構築物を被験者に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが治療用又は診断用分子を含む、上記方法。
【請求項３３】
R1が、メチル、エチル又はS-ピバロイルチオエタノールである、請求項５又は14に記載の核酸構築物。
【請求項３４】
ヌクレオチド上に存在する前記ホスホトリエステル及び／又はホスホチオエート保護基が、2'-W（式中、Wは、H、F、OH、O-Me、又はO-アキルである）を含む、請求項34に記載の核酸構築物。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、2つ以上の導入ドメインを含む、請求項10に記載の核酸構築物。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの導入ドメインが、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインの5’末端、3’末端又は両末端に、可逆的又は不可逆的に結合される、請求項１又は35に記載の核酸構築物。
【請求項３７】
前記2'-Wが-OHである、請求項に記載の核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、2006年7月12日に提出された米国特許仮出願第60/830,572号（その開示は参照により本明細書に組み入れられるものとする）の優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞を形質導入するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリアニオン系オリゴマーは、簡単に細胞膜を通過して拡散するものではない。培養細胞に関しては、この問題を解決するために、アニオン性オリゴヌクレオチドと組み合わせてカチオン性脂質が一般的に使用されて、取り込みが補助されている。残念ながら、この複合体は一般的に細胞に対して傷害性であり、これは生存細胞のトランスフェクションを行うためにカチオン性脂質の暴露時間及び濃度の両方を注意深く制御する必要があることを意味している。
【０００４】
種々の組換えウイルスベクター及びエレクトロポレーションを用いてin vitro及びin vivoの両方での細胞への核酸送達が行われている。このような技術は、遺伝子発現をノックアウトすることにより又は遺伝子治療用の遺伝的構築物を提供することによって、種々の疾患及び障害を治療しようとしている。
【０００５】
mRNAを選択的に分解する細胞機構としてのRNA干渉（RNAi）の発見により、細胞培養物中での細胞表現型の標的化された操作と、指向性治療剤の開発の可能性の両方が可能になる（Behlke, Mol. Ther. 13, 644-670, 2006; Xieら、Drug Discov. Today 11, 67-73, 2006）。短鎖干渉RNA（siRNA）は、そのサイズおよび負（アニオン）荷電性質に起因して、細胞表現型の操作の大きな可能性を有するが、siRNAは細胞に侵入する能力を持たない巨大分子である。実際、siRNAは、一般的にはサイズを500Da未満に限定する膜拡散性分子の細胞送達に関してLipinskiの「5つの規則（Rule of 5s）」の25倍過剰である。結果として、送達ビヒクルまたはトランスフェクション剤の非存在下では、裸のsiRNAは、ミリモル濃度でも細胞に侵入しない（Barquineroら、Gene Ther. 11 Suppl 1, S3-9, 2004）。siRNA送達の問題を解決するために、siRNAを濃縮し、かつ細胞膜に穴を開けるカチオン性脂質の使用に大きな注目が注がれてきた。トランスフェクション試薬は、広く用いられているが、多くの細胞型、特に、初代細胞および造血細胞系（TおよびB細胞、マクロファージ）への効率的な送達を達成することができない。さらに、リポフェクション試薬は、しばしば、腫瘍細胞における軽度なものから初代細胞における高度なものまで、様々な程度の細胞傷害性をもたらす。
【０００６】
DNAを濃縮するプロタミンとの抗体融合体（Songら、Nat. Biotechnol. 23, 709-717, 2005）および受容体標的化RNAアプタマーとのsiRNA融合体（McNamaraら、Nat. Biotechnol. 24, 1005-1015, 2006）を用いる最近の細胞指向性標的化手法は、選択細胞にsiRNAを送達する能力を与える。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、マスキングされた（masked）オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを生体細胞に送達するための方法及び組成物を提供する。低減したアニオン荷電の、中性の及びカチオン荷電のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、単独で又は形質導入分子とコンジュゲートさせて、アニオン荷電の核酸分子よりも良好に細胞膜を通過（traverse）する。保護／電荷中和基を含む、一過性に保護されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、カチオン性ペプチドがコンジュゲートした中性ホスホトリエステルベースのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び正荷電のホスホトリエステルオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）は、自動化アミダイト法により合成することができる。これらの化合物は、エンドサイトーシス又はマクロピノサイトーシス機構によって生体細胞のサイトゾルへ侵入することができる。一態様において、ホスホトリエステル保護／中和基は、細胞内環境に暴露された場合に、酵素活性により又は受動的細胞内法（例えば細胞内高濃度のグルタチオン）により除去されて、RNAi応答を誘発することができるホスホジエステルオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを生じるように設計される。従って、本開示は、治療薬、診断薬及び研究用ツールとして有用なオリゴヌクレオチドプロドラッグを提供する。
【０００８】
本開示はさらに、ペプチドRNA/DNAハイブリッドプロドラッグであって、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの骨格に沿って生理学的条件下で負荷電状態で通常は見出されるリン酸（ホスフェート）が非イオン性電荷中性ホスホトリエステルとして一過性に保護されているプロドラッグを提供する。一態様において、電荷中和ホスホトリエステル基は、任意の数の異なるリン酸保護基（例えば、S-ピバロイルチオエタノール（SPTE）基）の付加によって形成される。別の実施形態において、リン酸骨格は、酵素的に不安定なリンカー（RNB）を介して正電荷を含む生体可逆的なR基（例えばグアニジウム基）によって保護されて、正味のカチオン特性を構築物に付与する。オリゴヌクレオチドのリン酸骨格への正電荷の合成的付加により又はペプチド結合により、正味の正電荷を有する本開示のオリゴヌクレオチドプロドラッグによって、細胞膜透過が可能になる。
【０００９】
本開示は、a）オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のアニオン電荷を低減するホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメイン、並びにb）上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインに機能的に連結された膜輸送機能を有する導入ドメインを含む、核酸構築物を提供する。別の態様において、前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、一般式：
R-X-又はQ-X-
〔式中、
Xは、O、S又はNR1であり、R1は、H、メチル、エチル、S-ピバロイルチオエタノール、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環であり；
Rは、以下：
R2
（R2は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１】
2009543783.tif 000002
【００１０】
（R3は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A1及びA2は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化２】
2009543783.tif 000003
【００１１】
（R4は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A3及びA4は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化３】
2009543783.tif 000004
【００１２】
（R5は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A5は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X1及びX2は、各々独立に、O、S又はNR7であり、R7は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化４】
2009543783.tif 000005
【００１３】
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA6は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化５】
2009543783.tif 000006
【００１４】
（Q2は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A8及びA9 は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化６】
2009543783.tif 000007
【００１５】
（Q3は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A10及びA11は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化７】
2009543783.tif 000008
【００１６】
（Q4は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A12は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X5及びX6は、各々独立に、O、S又はNR9であり、R9は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化８】
2009543783.tif 000009
【００１７】
（Q5は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A13及びA14は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X7及びX8は、各々独立に、O、S又はNR10であり、R10は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択される。〕
を有する。別の態様において、前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、MeO-、EtO-、iPrO、
【化９】
2009543783.tif 000010
【００１８】
からなる群より選択される。
【００１９】
本開示はまた、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のアニオン電荷を低減する、又は該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド骨格の正味のカチオン電荷を供給する、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、核酸構築物を提供する。一態様において、前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、一般式：
R-X-又はQ-X-
〔式中、
Xは、O、S又はNR1であり、R1は、H、メチル、エチル、S-ピバロイルチオエタノール、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環であり；
Rは、以下：
R2
（R2は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１０】
2009543783.tif 000011
【００２０】
（R3は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A1及びA2は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１１】
2009543783.tif 000012
【００２１】
（R4は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A3及びA4は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１２】
2009543783.tif 000013
【００２２】
（R5は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A5は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X1及びX2は、各々独立に、O、S又はNR7であり、R7は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１３】
2009543783.tif 000014
【００２３】
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA6は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
式中、X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化１４】
2009543783.tif 000015
【００２４】
（Q2は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A8及びA9 は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１５】
2009543783.tif 000016
【００２５】
（Q3は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A10及びA11は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化１６】
2009543783.tif 000017
【００２６】
（Q4は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A12は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X5及びX6は、各々独立に、O、S又はNR9であり、R9は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１７】
2009543783.tif 000018
【００２７】
（Q5は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A13及びA14は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X7及びX8は、各々独立に、O、S又はNR10であり、R10は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択される。〕
を有する。別の態様において、前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、MeO-、EtO-、iPrO、
【化１８】
2009543783.tif 000019
【００２８】
からなる群より選択される。
【００２９】
本開示はまた、本明細書に記載の核酸構築物を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
本開示は、１以上のタンパク質導入ドメインを前記核酸構築物に連結させるステップを含む方法を記載する。一態様において、１以上のタンパク質導入ドメインは、2〜5つのタンパク質導入ドメインを含む。
【００３１】
本開示はまた、タンパク質導入ドメインを実質的に精製するステップ；オリゴヌクレオチドを合成するステップ；該オリゴヌクレオチドのアニオン電荷をホスホトリエステル基で電荷中和するステップ；該オリゴヌクレオチドを１以上のタンパク質導入ドメインに連結させるステップを含む、核酸構築物の作製方法を提供する。
【００３２】
また、細胞を本開示の核酸構築物と接触させるステップを含む、細胞のトランスフェクト方法を提供する。接触ステップは、in vivoであってもよいし又はin vitroであってもよい。核酸構築物は、アンチセンス分子を含んでもよい。
【００３３】
本開示はまた、疾患又は障害の治療方法であって、本開示の核酸構築物を被験者に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが治療用又は診断用分子を含む、上記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】TAT及びアニオン荷電オリゴヌクレオチドの相互作用を示す。ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を欠損する、TAT結合オリゴヌクレオチドは、カチオン電荷が中和された複合体を形成する。
【図２】電荷中和オリゴヌクレオチドがマクロピノサイトーシスを刺激することを説明する。
【図３】ホスホトリエステル保護及びオリゴヌクレオチド取り込み過程での電荷中和の一般的スキームを示す。
【図４−１】PTDがコンジュゲートされた保護オリゴヌクレオチド及び可逆的脱保護の一実施形態を示す。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基の式の一実施形態を示す。
【図６】本開示のヌクレオシドホスホロアミダイト合成経路を示す。
【図７】可逆的電荷中和のための還元反応を説明する。
【図８】アニオン荷電核酸のRNBホスホトリエステル保護及び脱保護を説明する。
【図９】DTG保護ウラシルのDTT還元のクロマトグラフィを示す。
【図１０】DTG-ウリジンホスホロアミダイトの酸化還元感受性を示す。
【図１１】DTG-ウリジンホスホロアミダイトとジ-TBSウリジンとの二量体カップリング反応を示す。
【図１２】野生型ホスホジエステル、メチルホスホトリエステル又はSPTE-ホスホトリエステルを有する2’フッ化物挿入を含有するポリウリジンオリゴ（配列番号22）の合成を示す。この図は、2’-フルオロ（F）を有するホスホトリエステル基を含有するRNAオリゴヌクレオチドを合成できることを示す。尿素変性条件下でゲル分析を行い、続いてエチジウムブロマイド染色を行った（右パネル）。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｄは、ホスホトリエステル修飾を含む二本鎖siRNA（配列番号23〜24）の合成を示す。Ａ：野生型ホスホジエステル及びホスホトリエステル基、メチル及びSPTEの構造は可逆的であるが、イソプロピル基は可逆的ではなく、対照として機能する。
【図１３Ｂ】Ｂ：表示した野生型、メチル、イソプロピル又はSPTEホスホトリエステルのいずれかを含む6個のDNAチミジン挿入を有して合成された、野生型センス（S）鎖（パネルの上の線）及びアンチセンス（AS）鎖（ガイド鎖ともいう）（パネルの下の線）を示すeGFP siRNAの配列。
【図１３Ｃ】Ｃ：表示したホスホトリエステル修飾を含む全長アンチセンス（AS）オリゴヌクレオチドの一本鎖RNA合成。尿素変性条件下でゲル分析を行い、続いてエチジウムブロマイド染色を行った。
【図１３Ｄ】Ｄ：ホスホトリエステル修飾を含む合成二本鎖の二本鎖RNA分析。センス（S）鎖（上の線）は野生型RNAである。アンチセンス（AS）鎖（下の線）は、表示する6×野生型DNAチミジン（AS-6T）、6×メチル-ホスホトリエステルチミジン（AS-Met6T）、6×イソプロピル-ホスホトリエステルチミジン（AS-Iso6T）、6×SPTE-ホスホトリエステルチミジン（AS-SPTE6T）を含む。非変性条件下でゲル分析を行い、続いてエチジウムブロマイド染色を行った。このデータは、ホスホトリエステル修飾を含む安定な全長siRNAを作製できることを示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、GFPレポーターRNA干渉（RNAi）応答の分析を示す。Ａ：eGFPを安定に発現するレポーターH1299細胞の、表示するsiRNA二本鎖による処理後のフローサイトメトリ（FACS）。50nMの表示siRNA及びLipofectamine 2000を用いて4時間かけて細胞をトランスフェクトし、続いて24時間にFACSによりGFP発現について分析した。未処理対照細胞は、高レベルのGFP発現を示した。非可逆的S/AS-Iso6T RNAのトランスフェクションではGFP発現に変化は示されず、このことは、6×イソプロピルホスホトリエステル基の継続した存在によるRNAi応答の誘導の阻止又は失敗を示している。この観察結果は、RNAi応答の誘導には、ホスホトリエステルのホスホジエステルへの反転（分解）が必要であることを示す。重要なことに、S/AS-Met6T又はS/AS-SPTE6T siRNAのいずれかのトランスフェクションにより、それぞれ有意なRNAi応答が誘導され、これは野生型対照A/AS-6T（灰色）RNAi応答に近かった。これらの観察結果は、アンチセンス（ガイド）鎖上のホスホジエステルの使用、そして可逆的Met6T及びSPTE6Tホスホトリエステル基がRNAi機構に加えられる前に細胞内で分解する能力を示す。Ｂ：種々の濃度でのRNAi効率を示すＡからの所定のsiRNAの用量曲線。GFPレポーター発現H1299細胞を、siRNA及びLipofectamine 2000を用いて4時間かけて処理した。RNAi効率は、トランスフェクションの24時間後にFACSにより分析した。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｂは、電荷中和dsDNAのPTD媒介送達を示す。Ａ：各鎖に15×電荷中性メチル-ホスホトリエステル（15N）を含み、センス（S）鎖の5'末端にチオール架橋モチーフとアンチセンス（AS）鎖の5'末端にCy3色素標識を含むdsDNAを、表示のように2×TAT PTD（左のパネル）又は3×TAT-PTD（右のパネル）のいずれかと化学的に架橋し、dsDNA分子として精製し、4時間にわたり細胞に添加し、トリプシン処理し、洗浄後、フローサイトメトリ（FACS）によってCy3標識を利用してsiRNA取り込みを分析した。dsDNAは、2×又は3×PTDペプチドとジスルフィド結合を介してコンジュゲートした場合（2×/3×PTD-S-S-15N/15N-Cy3）にのみ取り込まれたのに対し、ペプチドがdsDNAに付加されたがコンジュゲートされていない対照（2×/3×PTD＋15N/15N-Cy3）は、細胞に取り込まれない。
【図１５Ｂ】Ｂ：表示したようにFACSによるH1299細胞の4時間処理後の上記からのPTD-dsDNA-Cy3オリゴコンジュゲートの用量曲線グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「a」、「and」および「the」は、本文が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「a PTD」に対する参照は、複数のそのようなPTDを含み、「the cell」に対する参照は、当業者には公知の１個以上の細胞に対する参照などを含む。
【００３６】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するまたは等価な方法および材料を、開示される方法の実施および組成物中で用いることができるが、方法、装置および材料の例を本明細書に記載する。
【００３７】
上記で、およびその本文を通して考察された刊行物は、本出願の出願日前にその開示について単に提供しているだけである。本明細書に記載のものは、本発明者らが以前の開示という理由でそのような開示に先行する権利を与えられないことを許諾するものと解釈されるべきではない。
【００３８】
特定の生体活性薬（bioactive agent）を細胞の内部に送達する能力には、細胞膜によって課される生体利用能の制限のため問題がある。細胞の形質膜は、障壁を形成することにより、分子の細胞内取込みを、十分に非極性であり約500ダルトンよりも小さいサイズのものに限定する。タンパク質の細胞内在化（cellular internalization）を増強するための以前の努力は、タンパク質を受容体リガンドに融合させること（Ngら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:10706-11, 2002）またはそれらをケージドリポソーム担体中にパッケージングすること（Abu-Amerら、J. Biol. Chem. 276: 30499-503, 2001）に焦点を当ててきた。しかしながら、これらの技術では、乏しい細胞取込みやエンドサイトーシス経路への細胞内隔離をもたらすことが多い。
【００３９】
siRNAの送達は、それらのアニオン電荷及び約14,000ダルトンという大きなサイズのために、ヒトを含む哺乳動物では大きな課題である。タンパク質導入ドメインによるin vivoでsiRNAを送達する能力によって、多くの疾患の治療可能性が広がる。本開示は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに付随する電荷を「保護」することにより、核酸分子の細胞取り込みを促進及び改善するための方法及び組成物を提供する。
【００４０】
治療可能性を有する他の高度に荷電した核酸分子も同じ送達の障壁に直面する。例えば、RNAアプタマーは、タンパク質に結合し、それを封鎖し、阻害する高い能力を有するが、10,000ダルトンを超え、高度に荷電している場合には、そのままでは細胞に侵入する能力がないか又は制限される。本開示の方法及び組成物によって、RNAアプタマー、siRNA及びDNAベクターの細胞内送達が可能となる。
【００４１】
従って、ヒト疾患を選択的に治療するために特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの配列の可能性は、有用なオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド（siRNAs、RNAアプタマー、DNAベクターを含む）を被験体及び細胞に送達することによってより効果的となりうる。本開示は、かかるRNAi構築物が送達困難又は送達不能となる大きさ及び電荷の制限を克服するものである。核酸（例えばdsRNA）上のアニオン電荷を可逆的に中和することによって、本開示に係るホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含む構築物は、核酸をin vitro及びin vivoで細胞に送達することができる。
【００４２】
本開示は、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含む核酸構築物を提供する。該構築物はさらに、細胞形質導入及び細胞モジュレートに有用な組成物を含んでもよい。かかる組成物としては、膜輸送機能を含む形質導入部分ドメインが挙げられ、これはまたさらに核酸上のアニオン電荷を可逆的に中和するのに十分な核酸結合ドメインを含んでもよい。
【００４３】
例えば、アニオン性核酸（例えばRNA分子）のホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を用いた電荷中和は取り込みを促進する。電荷中和アニオン性核酸がPTDに結合している実施形態においては、アニオン荷電核酸の電荷中和によりカチオン性PTDが遊離して膜を透過し、並びにコンジュゲートの凝集を防止する。PTDの露出した自由カチオン電荷は次に、細胞表面と効率的に相互作用し、マクロピノサイトーシスを誘導し、マクロピノソームから細胞質へとエスケープすることができる。ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、細胞内にある場合には、細胞内プロセス、例えばジスルフィド結合の還元又はエステル加水分解によって除去されることができ、細胞質内での構築物からの除去が可能となる。核酸構築物（例えばdsRNAを含む）は、続いてダイサー（Dicer）、すなわちRNAse III様リボヌクレアーゼによって加水分解を受け、それにより標的遺伝子を封じるsiRNAを放出することができる。
【００４４】
本明細書に提供するデータは、１以上の除去可能な（例えば可逆的に結合された）ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基の核酸への付加が、細胞形質導入を効率的に促進することができることを示す。配列の組成に関わらず任意の核酸をホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基で修飾することができる。
【００４５】
本開示は、いくつかの実施形態において、細胞膜透過並びにエキソ及びエンドヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を増強する化学的及び生物物理学的特性に寄与する、１以上の生体可逆的保護基を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを提供する。本開示はさらに、生体可逆的保護オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの合成のためのアミダイト試薬を提供する。またさらに、これらの保護基は合成過程において安定である。
【００４６】
本開示の１以上の生体可逆的保護基を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、プロ-オリゴヌクレオチド又はプロ-ポリヌクレオチドと称する場合もある。本開示の実施形態において、プロ-オリゴヌクレオチドは、細胞脂質二重層透過能、並びにin vivoにおけるエキソ及びエンドヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を改善することができる。細胞内において、生体可逆的保護基は、細胞サイトゾルにおいて、還元条件、酵素活性（例えば内因性カルボキシエスタラーゼ）などによって除去されて、特定の内因性核酸にハイブリダイズ可能な及び／又はそれに対するアフィニティを有する生体活性オリゴヌクレオチド化合物を生じる。
【００４７】
ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、遺伝子又はRNAメッセンジャーに属する標的配列の相補配列の合成DNA若しくはRNA又は混合分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に用いることができ、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該遺伝子又はRNAメッセンジャーの発現が阻止又は下方制御されるように特異的に設計されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的メッセンジャーRNA配列に対して、あるいは標的DNA配列に対して向かうようにされており、それらに相補的な核酸にハイブリダイズする。従って、これらの分子は遺伝子発現を効率的に阻止又は下方制御する。
【００４８】
保護オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドはまた、特定の二連続（bicatenary）DNA領域（ホモプリン/ホモピリミジン配列、又はプリン/ピリミジンが豊富な配列）に対して向かうようになっており、それゆえ三重らせんを形成するものであってもよい。三重らせんの、特定の配列における形成は、得られるオリゴヌクレオチドが反応性官能基を有するように作製されている場合には、遺伝子発現を調節若しくはそうでなければ制御する、及び／又は特異的な核酸部位に導入される不可逆的な損傷を促進するタンパク質因子の相互作用を阻止することができる。
【００４９】
本明細書においては、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの細胞への送達を促進するために用いることができる核酸構築物、及びかかる構築物の製造方法を提供する。一実施形態において、核酸構築物は、核酸（RNA及び／又はDNAなど）に付随するホスホジエステルアニオン電荷を中和するための１以上のホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含む。この保護基は、細胞内部に存在すると、細胞内プロセス（ジスルフィド結合還元、エステル加水分解又は他の酵素媒介プロセスを含む）によって構築物から除去されうる。他の実施形態において、１以上のホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含む核酸構築物は、タンパク質導入ドメイン（PTD）などの１以上の導入ドメインをさらに含む。例えば、PTDは、核酸構築物を含むオリゴヌクレオチド（例えばRNA又はDNA）と、例えば遊離チオール基を介してその5'及び／又は3'末端に、直接コンジュゲートすることができる。例えば、PTDは、生体感受性かつ可逆的な方法で、例えばジスルフィド結合により、構築物に連結することができる。この手法は、任意の長さのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに適用することができ、RNA（例えばsiRNA、RNAアプタマー）又はDNAの細胞内への送達を可能にしうる。
【００５０】
別の実施形態において、核酸構築物は、可逆的保護基に連結された、塩基性基、例えばグアニジウム基（頭部基アルギニン、PTDの活性成分に類似している）を含んでもよく、それによりPTDの必要性が限定される。
【００５１】
従って、本明細書においては、細胞膜を横切った核酸配列の送達のための、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含むように合成された核酸構築物を提供する。構築物はまた、例えば、１以上の導入ドメイン及び／又は塩基性基を含む保護基を含んでもよい。核酸構築物のオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドは、細胞内に存在する場合には、還元的環境に基づいて、加水分解又は他の酵素活性により、非保護／野生型オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドに戻る。
【００５２】
単離された核酸構築物は、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含む分子又は化合物と会合したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指す。例えば、核酸構築物としては、限定されるものではないが、細胞による取り込みを促進するために、水素結合、電荷会合、共有結合などによりアニオン電荷低減基（複数でもよい）又は分子（複数でもよい）と会合したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが挙げられる。本開示の核酸構築物におけるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと会合することができるアニオン電荷低減分子の例としては、融合ポリペプチド又はペプチド、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドの正味のアニオン電荷を低減する化学部分、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００５３】
本明細書で提供する核酸構築物の用途としては、癌、ウイルス感染、遺伝的疾患の選択的治療、研究のための核酸送達などがある。
【００５４】
ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドという用語は一般に、非修飾RNA若しくはDNA、又は修飾RNA若しくはDNAである、あらゆるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。従って、例えば本明細書で用いるオリゴヌクレオチドとは、とりわけ、一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖の、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA及びRNAを含むハイブリッド分子を指す。よって、オリゴヌクレオチドは、siRNA、アンチセンス分子、リボザイムなどを含みうる。
【００５５】
さらに、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、RNA若しくはDNA又はRNA及びDNAの両方を含む三本鎖領域を含む。このような領域の鎖は、同じ分子に又は異なる分子に由来するものとすることができる。この領域は、１以上の分子の全てを含むことができるが、より典型的にはいくつかの分子のある領域のみを含む。
【００５６】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、１以上の修飾塩基を含む、上述したようなDNA又はRNAを含む。従って、通常ではない塩基（イノシンなど）又は修飾塩基（トリチル化塩基など）を含む骨格を有するDNA又はRNAは、本明細書で用いられる用語としてのポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
本開示の一態様は、アニオン電荷が低減したオリゴヌクレオチドを含み、ホスホジエステル及び／若しくはホスホチオエート保護基又は電荷中和基を含む、核酸構築物を包含する。しかしながら、構築物はさらに導入ドメイン及び／又は核酸結合ドメインを含んでもよい。これらの手法は、核酸構築物（例えばホスホジエステル保護基を含むsiRNA）とタンパク質導入ドメイン（PTD）との間又はPCTと二本鎖RNA結合ドメイン（DRBD）（例えばTAT-DRBD）融合タンパク質との間にジスルフィド結合（又はエステル結合など）を操作することによって、さらに、結合アビディティ、取り込み、アニオン電荷低減を増大させ、及び／又はカチオン電荷を増大することを含みうる。複合体は、（in vitro又はin vivoで）細胞によって取り込まれた後、還元され（例えばジスルフィド還元により）、細胞内部で放出される。
【００５８】
本明細書において用いるアニオン電荷中和分子又は基とは、それが会合しているオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの全体の正味アニオン電荷を低減することができる分子又は化学基を指す。本明細書に記載するホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基はアニオン電荷中和基である。ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、可逆的であってもよいし又は非可逆的であってもよい。１以上のアニオン電荷中和分子又は基は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと会合して、それぞれ独立して、構築物のアニオン電荷の低減及び／又はカチオン電荷の増大に寄与しうる。例えば、１以上のホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、オリゴヌクレオチド、及び１以上のカチオン性導入ドメイン（例えばPTD）と会合した「保護オリゴヌクレオチド」と会合することができ、それによりホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基及び／又はPTDのないオリゴヌクレオチドと比較して、構築物の全体の正味アニオン電荷が低減するか、構築物の全体の正味電荷が中性となるか、構築物の全体の正味電荷がカチオン性となる。
【００５９】
本開示は、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基、並びにかかるホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、一般式：
R-X-又はQ-X-
〔式中、
Xは、O、S又はNR1であり、R1は、H、メチル、エチル、S-ピバロイルチオエタノール、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環であり；
Rは、以下：
R2
（R2は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化１９】
2009543783.tif 000020
【００６０】
（R3は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A1及びA2は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化２０】
2009543783.tif 000021
【００６１】
（R4は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A3及びA4は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化２１】
2009543783.tif 000022
【００６２】
（R5は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A5は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X1及びX2は、各々独立に、O、S又はNR7であり、R7は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化２２】
2009543783.tif 000023
【００６３】
（R6は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、置換複素環、ハロ、シアノ、又はニトロであり、
A6及びA6は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X3及びX4は、各々独立に、O、S又はNR8であり、R8は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択され；
Qは、以下：
Q1
（Q1は、10以上のpKaを有する塩基性基である）と、
【化２３】
2009543783.tif 000024
【００６４】
（Q2は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A8及びA9 は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化２４】
2009543783.tif 000025
【００６５】
（Q3は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A10及びA11は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖である）と、
【化２５】
2009543783.tif 000026
【００６６】
（Q4は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A12は、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X5及びX6は、各々独立に、O、S又はNR9であり、R9は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と、
【化２６】
2009543783.tif 000027
【００６７】
（Q5は、10以上のpKaを有する塩基性基であり、
A13及びA14は、各々独立に、1〜7個の原子からなる鎖、又は置換された1〜7個の原子からなる鎖であり、
X7及びX8は、各々独立に、O、S又はNR10であり、R10は、H、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、複素環、又は置換複素環である）と
からなる群より選択される。〕
を有する。
【００６８】
別の実施形態において、前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、MeO-、EtO-、iPrO、
【化２７】
2009543783.tif 000028
【００６９】
からなる群より選択される。
【００７０】
また別の実施形態において、前記ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基は、以下からなる群より選択される構造を含む：
【化２８】
2009543783.tif 000029
【００７１】
別の実施形態において、RNB保護基は、以下からなる群より選択される構造を含む：
【化２９】
2009543783.tif 000030
【００７２】
アルキル基は、直鎖状、分岐状、および環状のアルキル基を包含する。アルキル基は、1〜20個の炭素原子を有するものを包含する。アルキル基は、1〜3個の炭素原子を有する小さいアルキル基を包含する。アルキル基は、4〜10個の炭素原子を有する中程度の長さのアルキル基を包含する。アルキル基は、10個超の炭素原子を有する長いアルキル基、特には10〜20個の炭素原子を有するものを包含する。環状アルキル基は、１個以上の環を有するものを包含する。環状アルキル基は、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10員の炭素環を有するもの、特には3、4、5、6、もしくは7員の環を有するものを包含する。環状アルキル基中の炭素環は、アルキル基をも有しうる。環状アルキル基は、二環式および三環式のアルキル基を包含しうる。アルキル基は、場合により、置換アルキル基を包含する。置換アルキル基は、とくに、アリール基（場合により、これも置換されていてもよい）で置換されたものを包含する。特定のアルキル基としては、メチル基、エチル基、n-プロピル基、iso-プロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、s-ブチル基、t-ブチル基、シクロブチル基、n-ペンチル基、分岐状ペンチル基、シクロペンチル基、n-ヘキシル基、分岐状ヘキシル基、およびシクロヘキシル基が挙げられる（これらはすべて、場合により置換されていてもよい）。
【００７３】
アルケニル基は、直鎖状、分岐状、および環状のアルケニル基を包含する。アルケニル基は、1、2個、もしくはそれ以上の二重結合を有するものまたは二重結合のうちの2個以上が共役二重結合であるものを包含する。アルケニル基は、2〜20個の炭素原子を有するものを包含する。アルケニル基は、2〜3個の炭素原子を有する小さいアルケニル基を包含する。アルケニル基は、4〜10個の炭素原子を有する中程度の長さのアルケニル基を包含する。アルケニル基は、10個超の炭素原子を有する長いアルケニル基、特には10〜20個の炭素原子を有するものを包含する。環状アルケニル基は、1個以上の環を有するものを包含する。環状アルケニル基は、二重結合が環中または環に結合されたアルケニル基中に存在するものを包含する。環状アルケニル基は、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10員の炭素環を有するもの、特には3、4、5、6、もしくは7員の環を有するものを包含する。環状アルケニル基中の炭素環は、アルキル基をも有しうる。環状アルケニル基は、二環式および三環式のアルケニル基を包含しうる。アルケニル基は、場合により置換されていてもよい。置換アルケニル基は、とくに、アルキル基またはアリール基（場合により、これらの基も置換されていてもよい）で置換されたものを包含する。特定のアルケニル基としては、エテニル、プロパ-1-エニル、プロパ-2-エニル、シクロプロパ-1-エニル、ブタ-1-エニル、ブタ-2-エニル、シクロブタ-1-エニル、シクロブタ-2-エニル、ペンタ-1-エニル、ペンタ-2-エニル、分岐状ペンテニル、シクロペンタ-1-エニル、ヘキサ-1-エニル、分岐状ヘキセニル、シクロヘキセニルが挙げられる（これらはすべて、場合により置換されていてもよい）。
【００７４】
アリール基は、1個以上の5もしくは6員の芳香環または複素芳香環を有する基を包含する。アリール基は、1個以上の縮合芳香環を含有しうる。複素芳香環は、環中に1個以上のN、O、またはS原子を含みうる。複素芳香環は、1、2、もしくは3個のNを有するもの、1もしくは2個のOを有するもの、または1もしくは2個のSを有するものを包含しうる。アリール基は、場合により置換されていてもよい。置換アリール基は、とくに、アルキル基またはアルケニル基（場合により、これらの基も置換されていてもよい）で置換されたものを包含する。特定のアリール基としては、フェニル基、ビフェニル基、ピリジニル基、およびナフチル基が挙げられる（これらはすべて、場合により置換されていてもよい）。
【００７５】
アリールアルキル基は、1個以上のアリール基で置換されたアルキル基である（ただし、アルキル基は、場合により追加の置換基を有していてもよく、アリール基は、場合により置換されていてもよい）。特定のアルキルアリール基は、フェニル置換アルキル基、たとえば、フェニルメチル基である。
【００７６】
アルキルアリール基は、1個以上のアルキル基で置換されたアリール基である（ただし、アルキル基は、場合により追加の置換基を有していてもよく、アリール基は、場合により置換されていてもよい）。特定のアルキルアリール基は、メチルフェニルのようなアルキル置換フェニル基である。
【００７７】
R1〜R5の2個以上が一緒になって形成されうる環は、場合により置換されていてもよいシクロアルキル基、場合により置換されていてもよいシクロアルケニル基または芳香族基でありうる。環は、3、4、5、6、7個、もしくはそれ以上の炭素を含有しうる。環は、芳香環中の1、2、もしくは3個の炭素がN、O、またはSで置き換えられた複素芳香環でありうる。環は、環中の1個以上のCH2基がO、N、NH、またはSで置き換えられたヘテロアルキルまたはヘテロアルケニルでありうる。
【００７８】
アルキル基、アルケニル基、およびアリール基のいずれについてもそれらに場合により存在していてもよい置換は、次の置換基：ハロゲン、--CN基、--COOR基、--OR基、--COR基、--OCOOR基、--CON(R) 2基、--OCON(R) 2基、--N(R) 2基、--NO2基、--SR基、--SO2R基、--SO2N(R) 2基、または--SOR基のうちの1つ以上による置換を包含する。アルキル基に場合により存在していてもよい置換は、1個以上のアルケニル基、アリール基、またはその両方による置換を包含する（ただし、アルケニル基またはアリール基は、場合により置換されていてもよい）。アルケニル基に場合により存在していてもよい置換は、1個以上のアルキル基、アリール基、またはその両方による置換を包含する（ただし、アルキル基またはアリール基は、場合により置換されていてもよい）。アリール基に場合により存在していてもよい置換は、1個以上のアルキル基、アルケニル基、またはその両方によるアリール環の置換を包含する（ただし、アルキル基またはアルケニル基は、場合により置換されていてもよい）。
【００７９】
アルキル基、アルケニル基、およびアリール基に場合により存在していてもよい置換基は、とくに
--COOR〔式中、Rは、水素またはアルキル基もしくはアリール基であり、より具体的には、Rは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、またはフェニル基である（ただし、これらはすべて、場合により置換されていてもよい）〕、
--COR〔式中、Rは、水素またはアルキル基もしくはアリール基であり、より具体的には、Rは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、またはフェニル基である（ただし、これらの基はすべて、場合により置換されていてもよい）〕、
--CON(R)2〔式中、各Rは、互いに他のRと独立して、水素またはアルキル基もしくはアリール基であり、より具体的には、Rは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、またはフェニル基であり（ただし、これらの基はすべて、場合により置換されていてもよい）、RおよびRは、1個以上の二重結合を含有していてもよい環を形成しうる〕、
--OCON(R)2〔式中、各Rは、互いに他のRと独立して、水素またはアルキル基もしくはアリール基であり、より具体的には、Rは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、またはフェニル基であり（ただし、これらの基はすべて、場合により置換されていてもよい）、RおよびRは、1個以上の二重結合を含有していてもよい環を形成しうる〕、
--N(R)2〔式中、各Rは、互いに他のRと独立して、水素、またはアルキル基、アシル基、もしくはアリール基であり、より具体的には、Rは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、もしくはフェニル基、またはアセチル基であり（ただし、これらはすべて、場合により置換されていてもよい）、あるいはRおよびRは、1個以上の二重結合を含有していてもよい環を形成しうる〕、
--SR、--SO2R、または--SOR〔式中、Rは、アルキル基またはアリール基であり、より具体的には、Rは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、フェニル基であり（ただし、これらはすべて、場合により置換されていてもよい）、--SRの場合、Rは、水素でありうる〕、
--OCOOR〔式中、Rは、アルキル基またはアリール基である〕、
--SO2N(R)2〔式中、Rは、水素、アルキル基、またはアリール基であり、RおよびRは、環を形成しうる〕、
--OR〔式中、R＝H、アルキル、アリール、またはアシル、たとえば、Rは、--OCOR*｛ここで、R*は、水素またはアルキル基もしくはアリール基であり、より具体的には、R*は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、またはフェニル基である（ただし、これらの基はすべて、場合により置換されていてもよい）｝を生成するアシルでありうる〕
を包含する。
【００８０】
特定の置換アルキル基としては、ハロアルキル基、具体的にはトリハロメチル基、より具体的にはトリフルオロメチル基が挙げられる。特定の置換アリール基としては、モノハロ置換、ジハロ置換、トリハロ置換、テトラハロ置換、およびペンタハロ置換されたフェニル基、モノハロ置換、ジハロ置換、トリハロ置換、テトラハロ置換、ペンタハロ置換、ヘキサハロ置換、およびヘプタハロ置換されたナフタレン基、3もしくは4-ハロ置換フェニル基、3もしくは4-アルキル置換フェニル基、3もしくは4-アルコキシ置換フェニル基、3もしくは4-RCO置換フェニル基、5もしくは6−ハロ置換ナフタレン基が挙げられる。より具体的には、置換アリール基としては、アセチルフェニル基、特には4-アセチルフェニル基、フルオロフェニル基、特には3-フルオロフェニル基および4-フルオロフェニル基、クロロフェニル基、特には3-クロロフェニル基および4-クロロフェニル基、メチルフェニル基、特には4-メチルフェニル基、ならびにメトキシフェニル基、特には4-メトキシフェニル基が挙げられる。
【００８１】
可逆的ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基に連結された塩基性含有基（例えばグアニジウム基）の使用は、核酸送達のために使用されてはいなかった。また、細胞膜を横切った核酸構築物の送達のための、保護基を有するdsRNAの使用及び／又は電荷中和基を含むオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドにコンジュゲートされたPTDの使用も想定されていなかった。
【００８２】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがPTDに連結されている場合には、アニオン荷電のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの電荷中和により、カチオン荷電のPTDが遊離して、細胞表面と生産的に相互作用し、またコンジュゲートの凝集が防止される。例えば、露出したカチオン荷電PTDは細胞表面と相互作用し、マクロピノサイトーシスを誘導する。オリゴヌクレオチドは細胞質へと放出される。保護基は、細胞内にある場合には、細胞内プロセス、例えば還元酵素、酸化酵素、還元剤、酸化剤又はエステラーゼなどにより切断され、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを脱保護し、核酸がその天然構造へと戻るようにする。
【００８３】
本明細書で用いる核酸ドメインとは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメインと相互互換的に用いられ、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えばリボザイム、アンチセンス分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）でありうる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは一般的にホスホジエステル結合を含有するが、場合によっては、別の骨格（例えば、ホスホロアミダイト、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又はO-メチルホスホロアミダイト結合）（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照）、並びにペプチド核酸骨格及び結合を有していてもよい核酸類似体を含む。他の類似核酸としては、陽性骨格、非イオン性骨格及び非リボース骨格、例えば米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、並びにチャプター6及び7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook編に記載されたものなどを有するものが挙げられる。１以上の炭素環式糖類を含有する核酸もまた核酸の一定義に含まれる。リボース-リン酸骨格の修飾は、様々な理由のため、例えば生理学的環境下におけるかかる分子の安定性及び半減期を増大するため、に行うことができる。オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの用語には天然核酸と類似体の混合物が包含され、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、及び天然核酸と類似体の混合物を作製することができる。さらに、RNN、RNB、DNA、及びRNAのハイブリッドを用いることもできる。オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの用語にはdsDNA、ssDNA、dsRNA、siRNAが包含される。
【００８４】
ポリヌクレオチドとは、任意の数の共有結合したヌクレオチドモノマー（DNA及びRNA分子などの核酸分子であって、一本鎖、二本鎖及び三本鎖のかかる分子を含む）から構成されるポリマー化合物を指し、「オリゴヌクレオチド」と一般的に呼ばれるポリヌクレオチド群を包含することを明らかに意図している。ここでオリゴヌクレオチドは、典型的には、比較的少数（約30以下、例えば約5〜10、10〜20又は20〜30）のヌクレオチド要素を有するものとして区別される。
【００８５】
本明細書において用いる「siRNA」という用語は、「短鎖干渉RNA」の略語であり、「小干渉RNA」又は「サイレンシングRNA」としても知られることがあり、真核生物において転写後の配列特異的遺伝子サイレンシングを引き起こすRNA干渉（RNAi）経路に関与する、約19〜25ヌクレオチド長の二本鎖リボ核酸分子のクラスを指す。
【００８６】
「dsRNA」という用語は、「二本鎖RNA」の略語であり、本明細書においては、2本の相補的RNAを有し、少なくとも約26ヌクレオチド長、より典型的には少なくとも約50〜約100ヌクレオチド長である点でsiRNAとは区別される、リボ核酸分子を指すために用いられる。
【００８７】
上述したように、核酸は、DNA（ゲノム及びcDNAの両方）、RNA、又はハイブリッド（核酸がデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、及び塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソサイトシン、イソグアニンなどの組合せを含みうる）でありうる。本明細書で用いる「ヌクレオシド」という用語には、ヌクレオチド及びヌクレオシド、並びにヌクレオチド類似体、及び修飾ヌクレオシド（アミノ修飾ヌクレオシドなど）が含まれる。さらに、「ヌクレオシド」には、非天然の類似構造が含まれる。従って、例えばそれぞれ塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、本明細書においてヌクレオシドという。
【００８８】
本明細書に記載する核酸構築物の核酸ドメインは、任意の特定の配列に限定されるものではない。診断、治療及び研究に有用なあらゆる数のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを本開示の方法及び組成物に用いることができる。当業者はオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの様々な供与源を利用可能である。例えば、ゲノムの断片を単離して、単離されたポリヌクレオチドを、本開示に従ってホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を用いて全体の正味アニオン電荷を低減するために修飾することができるし、あるいは、それを、例えば当技術分野で公知の核酸合成技術を利用した、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの伸張のための供与源として用いることもできる。
【００８９】
オリゴヌクレオチドを調製するためのホスホロアミダイト化学の実施は、M. Caruthers及びS. Beaucageの出版などから公知である。米国特許第4,458,066号、同第4,500,707号、同第5,132,418号、同第4,415,732号、同第4,668,777号、同第4,973,679号、同第5,278,302号、同第5,153,319号、同第5,218,103号、同第5,268,464号、同第5,000,307号、同第5,319,079号、同第4,659,774号、同第4,672,110号、同第4,517,338号、同第4,725,677号及び再発行34,069号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）には、オリゴヌクレオチド合成方法が記載されている。さらに、ホスホロアミダイト化学の実施は、Beaucage及びIyerにより、Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311及びBeaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194、又はそれに引用される参照文献（全て参照により本明細書に組み入れられる）において体系的に概説されている。
【００９０】
核酸合成装置は市販されており、その使用は、当業者には、所望と考えられる合理的な長さのほぼあらゆるオリゴヌクレオチドを作製するのに有効であると一般的に理解されている。
【００９１】
ホスホロアミダイト化学の実施において、図中でDMTと略して記載されている有用な5’OH糖ブロッキング基は、トリチル、モノメトキシトリチル（momomethoxytrityl）、ジメトキシトリチル及びトリメトキシトリチル、特にはジメトキシトリチル（DMTr）である。ホスホロアミダイト化学の実施において、有用なホスファイト活性化基、すなわちNR2は、ジアルキル置換窒素基及び窒素複素環である。１つの手法には、ジ-イソプロピルアミノ活性化基の使用が含まれる。
【００９２】
種々のヌクレオシド単位を本開示のアミダイトとして活性化し、本開示のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに組み込むことができる。これらには、デオキシヌクレオチド（すなわち上記構造におけるWがHである）、リボヌクレオチド（ある実施形態ではWがF、すなわち上記構造におけるWがOHである）、2'-アルコキシヌクレオチド（すなわち上記構造におけるWがO-アルキルである）、又は置換2'-O-アルキルヌクレオチド（すなわち上記構造におけるWが置換-O-アルキルである）が含まれる。2'-O-アルキルヌクレオチドは、米国特許第5,466,786号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。特に有用な置換2'-O-アルキル基であるメトキシエトキシ基は、Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504（これも参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００９３】
オリゴヌクレオチドは、Mermade-6固相自動化オリゴヌクレオチド合成装置、又は任意の一般的に利用可能な自動化オリゴヌクレオチド合成装置により合成することができる。例えば、M. Caruthers, Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression., pp. 7-24, J. S. Cohen編（CRC Press, Inc. Boca Raton, Fla., 1989）、又はOligonucleotide synthesis, a practical approach, M. J. Gait編, IRL Press, 1984；"Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", F. Eckstein編, IRL Press, 1991に記載されているトリエステル、ホスホロアミダイト、又は水素ホスホネートカップリング化学をこれらの合成装置で用いて、所望のオリゴヌクレオチドを得る。Beaucage試薬（例えば、Journal of American Chemical Society, 1990, 112, 1253-1255に記載されている）、又は硫黄元素（Beaucage et al., Tetrahedron Letters,1981, 22, 1859-1862に記載されている）を、ホスホロアミダイト又は水素ホスホネート化学と共に用いて、置換されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを得る。例えば、本明細書で言及する保護基を含む試薬を、保護が望まれる多数の用途で用いることができる。そのような用途としては、限定されるものではないが、固相及び液相の両方の、オリゴ-合成、ポリヌクレオチド合成などが挙げられる。本開示はまた、本明細書に開示する保護基を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシド類似体を得るためのヌクレオシド及びヌクレオチド類似体の使用を想定する。従って、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド及びデオキシヌクレオチドという用語には一般に、本明細書に記載されるものなどの類似体が含まれる。これらの類似体は、天然ヌクレオシド又はヌクレオチドと共通するある程度の構造的特徴を有して、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシド配列に組み込まれた場合に、溶液中で天然オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる、分子である。典型的には、これらの類似体は、天然ヌクレオシド及びヌクレオチドから、塩基、リボース又はホスホジエステル部分の置き換え及び／又は修飾により、誘導される。この変化は、相補核酸配列とのハイブリッド形成を安定化若しくは不安定化するために、又はハイブリダイゼーションの特異性を所望の程度に増強するために、個々に適したように行うことができる。
【００９４】
例えば、オリゴヌクレオチドに組み込むためのヌクレオシドのリボース又は塩基に、場合により、リボースの2'-O基におけるメチル、プロピル若しくはアリル基、又は該2'-O基の代わりのフルオロ基、又はリボヌクレオシド塩基のブロモ基などの構造的基が付加されてもよい。ホスホロアミダイト化学と共に使用するために、様々なアミダイト試薬が市販されており、例えば2'-デオキシアミダイト、2'-O-メチルアミダイト及び2'-O-ヒドロキシルアミダイトがある。このような合成のための他の任意の手段を用いることも可能である。オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の技能の範囲内である。他のオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート及びアルキル化誘導体などを調製するための類似の技法を使用することも周知である。類似の技術、及び市販の修飾アミダイト、及び制御多孔質ガラス（CPG）製品、例えばビオチン、Cy3、フルオレセイン、アクリジン若しくはソラーレン修飾アミダイト及び／又はCPG（Glen Research, Sterling Va.から入手可能）などを使用して、蛍光標識、ビオチニル化又は他のコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを合成することも周知である。
【００９５】
本明細書に記載するホスホトリエステル中和／保護基は核酸ドメインのアニオン電荷の中和に有用であるが、保護核酸ドメインに連結されたさらなるカチオン荷電の部分を用いて、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの取り込みをさらに促進することができる。最近の、真核細胞の形質膜を効率的に通過することができるいくつかのタンパク質の発見により、ペプチド導入ドメインが誘導されたタンパク質の新規クラスが同定された。
【００９６】
いくつかのタンパク質導入ドメイン／ペプチドが当技術分野で公知であり、トランスドメイン（例えばカーゴ分子）に連結された異種分子の取り込みを促進することが示されている。このような導入ドメインは、マクロピノサイトーシスと称するプロセスを介した取り込みを促進する。マクロピノサイトーシスは、全ての細胞が行う、非選択的形態のエンドサイトーシスである。
【００９７】
これらのタンパク質のうち、最も特性評価されているものは、ショウジョウバエホメオタンパク質アンテナペディア転写タンパク質（AntHD）（Joliotら、New Biol. 3: 1121-34, 1991; Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1864-8, 1991; Le Rouxら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9120-4, 1993）、単純ヘルペスウイルス構造タンパク質VP22（ElliottおよびO'Hare, Cell 88: 223-33, 1997）、HIV-1転写活性化因子TATタンパク質（GreenおよびLoewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988; FrankelおよびPabo, Cell 55: 1189-1193, 1988）、より最近では、プリオンタンパク質のカチオン性N末端ドメインである。これらのタンパク質は形質膜を通過することができるだけでなく、酵素β-ガラクトシダーゼなどの他のタンパク質の結合はこれらの複合体の細胞取込みを刺激するのに十分であった。そのようなキメラタンパク質は、細胞質および核内で生体活性形態で存在する。このプロセスの特性評価により、これらの融合ポリペプチドの取込みが迅速であり、受容体非依存的に、数分以内に起こることが多いことが示された。さらに、これらのタンパク質の形質導入は、細胞型により影響されないようであり、明らかな傷害性を示さずに培養物中で100％の細胞を効率的に形質導入することができる（Nagaharaら、Nat. Med. 4: 1449-52, 1998）。全長タンパク質に加えて、タンパク質導入ドメインをも用いて、DNA（Abu-Amer、上掲）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Astriab-Fisherら、Pharm. Res, 19: 744-54, 2002）、小分子（Polyakovら、Bioconjug. Chem. 11: 762-71, 2000）およびさらに無機40ナノメーター鉄粒子（Doddら、J. Immunol. Methods 256: 89-105, 2001; Wunderbaldingerら、Bioconjug. Chem. 13: 264-8, 2002; Lewinら、Nat. Biotechnol. 18: 410-4, 2000; Josephsonら、Bioconjug., Chem. 10: 186-91, 1999）の細胞内取込みを誘導することができたが、これはこのプロセスに対する明らかなサイズ制限が存在しないことを示唆している。導入ドメインを用いる効果的な形質導入は、部分的には、PTD-カーゴ構築物上の全体の分子の電荷によって制限される。
【００９８】
タンパク質導入ドメイン（PTD）と異種分子（例えば、ポリヌクレオチド、小分子、またはタンパク質）との融合体は、濃度依存的に、様々な細胞中へのそれらの形質導入を引き起こすのに十分である。さらに、タンパク質送達のためのこの技術は、DNAおよび薬剤に基づく技術に関連する多くの問題を回避するようである。
【００９９】
PTDは、典型的には天然ではカチオン性である。これらのカチオン性タンパク質導入ドメインは、それらと共に、それらの連結されたカーゴを担持する脂質ラフトエンドソーム中を通過し、エンドソーム小胞の破壊によりそれらのカーゴを細胞質中に放出する。PTDの例としては、AntHD、TAT、VP22、カチオン性プリオンタンパク質ドメイン、ポリ-Arg、AGRKKRRQRRR（配列番号15）、YARKARRQARR（配列番号16）、YARAAARQARA（配列番号17）、YARAARRAARR（配列番号18）、YARAARRAARA（配列番号19）、YARRRRRRRRR（配列番号20）、YAAARRRRRRR（配列番号21）、並びにそれらの機能的断片及び変異体が挙げられる。本開示は、一態様において、TATおよびポリ-ArgなどのPTDの使用を、電荷中和核酸と組合せる方法及び組成物を提供する。電荷中和（charge neutralized）とは、核酸（例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）のアニオン電荷が、ホスホジエステル及び／若しくはホスホチオエート保護基、又はホスホジエステル及び／若しくはホスホチオエート保護基と核酸上のアニオン電荷を中和することができる結合ドメイン（すなわち、「カーゴ」ドメイン）の不在下における同じ核酸よりも、低減している、中和されている又はよりカチオン性であることを意味する。
【０１００】
一般的には、本開示の核酸構築物の導入ドメインは、融合分子を導入するか、または融合分子の導入を助けることができるほぼ任意の合成または天然アミノ酸配列であってよい。典型的には、導入ドメインはカチオン荷電である。例えば、形質導入は、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含む核酸構築物、並びにホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのN末端またはC末端に結合された、HIV TATタンパク質またはその断片などのタンパク質配列の使用によって、本発明に従って達成することができる。いくつかの態様において、核酸は、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含み、また核酸結合ドメイン（例えばDRBD）を含んでもよい。タンパク質導入ドメインは、例えば、アンテナペディアホメオドメインもしくはHSV VP22配列、プリオンタンパク質のN末端断片またはその好適な導入断片（当技術分野で公知のものなど）である。
【０１０１】
PTDの種類およびサイズを、所望の導入の程度などのいくつかのパラメーターにより導くことができる。PTDは少なくとも約20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％、98％、99％又は100％の細胞を形質導入することができる。典型的には、形質導入された細胞の割合として表される形質導入効率を、いくつかの従来の方法により決定することができる。
【０１０２】
PTDは、細胞中で少なくともピコモル量の融合分子を支持する細胞の進入速度および退出速度（それぞれk1およびk2と呼ばれることもある）を示すであろう。PTDおよび任意のカーゴの進入および退出速度を、検出可能に標識された融合分子を用いる標準的な動力学的分析により容易に決定するか、または少なくとも近似することができる。典型的には、進入速度と退出速度の比率は、約5〜約100の範囲にあり、最大約1000であるであろう。
【０１０３】
一態様においては、本開示の方法および組成物において有用なPTDは、実質的なα-ヘリックス構造を特徴とするペプチドを含む。PTDが有意なα-ヘリックス構造を示す場合、形質導入が最適化されることが発見された。別の実施形態においては、PTDは前記ペプチドの少なくとも一方の面に沿って実質的に整列された塩基性アミノ酸残基を含有する配列を含む。本開示のPTDドメインは、天然のペプチドまたは合成ペプチドであってよい。
【０１０４】
本開示の一実施形態においては、PTDは、らせん状円筒の下にアルギニン（Arg）残基を有する強力なα-ヘリックス構造を含むアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態においては、PTDドメインは、以下の一般式：B1-X1-X2-X3-B2-X4-X5-B3（配列番号1）（式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立に、同じまたは異なっていてもよい塩基性アミノ酸であり；X1、X2、X3、X4およびX5はそれぞれ独立に、同じまたは異なっていてもよいα-ヘリックスを強化するアミノ酸である）により表されるペプチドを含む。別の実施形態においては、PTDドメインは、以下の一般式：B1-X1-X2-B2-B3-X3-X4-B4（配列番号2）（式中、B1、B2およびB3はそれぞれ独立に、同じまたは異なっていてもよい塩基性アミノ酸であり；X1、X2、X3およびX4はそれぞれ独立に、同じまたは異なっていてもよいα-ヘリックスを強化するアミノ酸である）により表される。
【０１０５】
さらに、PTDドメインは、塩基性残基、例えば、リジン（Lys）またはアルギニン（Arg）を含み、「ねじれ」を該ドメインに導入するのに十分な少なくとも1個のプロリン（Pro）残基をさらに含んでもよい。そのようなドメインの例としては、プリオンの導入ドメインが挙げられる。例えば、そのようなペプチドは、KKRPKPG（配列番号3）を含む。
【０１０６】
一実施形態においては、前記ドメインは、以下の配列：X-X-R-X-(P/X)-(B/X)-B-(P/X)-X-B-(B-X)（配列番号4）（式中、Xはアラニンなどの任意のα-ヘリックスを促進する残基であり；P/Xはプロリンまたは以前に定義されたXであり；Bは塩基性アミノ酸残基、例えば、アルギニン（Arg）またはリジン（Lys）であり；Rはアルギニン（Arg）であり、B/XはBまたは上記で定義されたXである）により表されるペプチドである。
【０１０７】
別の実施形態においては、PTDはカチオン性であり、7〜10個のアミノ酸からなり、式K-X1-R-X2-X1（式中、X1はRまたはKであり、X2は任意のアミノ酸である）（配列番号5）を有する。そのようなペプチドの例は、RKKRRQRRR（配列番号6）を含む。
【０１０８】
さらなる導入ドメインとしては、TATの少なくともアミノ酸49〜56から最大でほぼ全長のTAT配列（例えば、配列番号7を参照）を含むTAT断片が挙げられる。TAT断片は、該断片のα-ヘリックス構造性を増加させるのに十分な1個以上のアミノ酸変化を含んでもよい。いくつかの例においては、導入されるアミノ酸変化は、認識されるα-ヘリックスを強化するアミノ酸を付加することを含むであろう。あるいは、このアミノ酸変化は、TAT断片から1個以上のアミノ酸を除去することを含み、α-ヘリックスの形成または安定性を阻害するであろう。より具体的な実施形態においては、TAT断片は、α-ヘリックス強化アミノ酸による少なくとも1個のアミノ酸置換を含むであろう。典型的には、TAT断片又は他のPTDを、標準的なペプチド合成技術により作製することができるが、いくつかの場合においては組換えDNA手法を用いることができる。
【０１０９】
本開示の核酸構築物において用いることができるさらなる導入タンパク質（PTD）としては、TATの49〜56配列中の少なくとも2個の塩基性アミノ酸が、TAT断片の少なくとも一方の面に沿って実質的に整列されるように該配列を改変したTAT断片が挙げられる。例示的なTAT断片は、置換が、前記断片の少なくとも一方の面に沿って49〜56配列の塩基性アミノ酸残基を整列させる、TATの少なくともアミノ酸49〜56（典型的にはTAT 49〜56配列）における少なくとも1個の特殊なアミノ酸置換を含む。
【０１１０】
別の導入タンパク質としては、TATの49〜56配列がαヘリックス強化アミノ酸による少なくとも１つの置換を含むTAT断片が挙げられる。一実施形態において、TAT断片中の少なくとも2個の塩基性アミノ酸残基が、そのTAT断片の少なくとも一方の面に沿って実質的に整列するように、前記置換を選択する。より具体的な実施形態においては、TAT49〜56配列中の少なくとも2個の塩基性アミノ酸残基が、その配列の少なくとも一方の面に沿って実質的に整列するように、前記置換を選択する。
【０１１１】
また、キメラPTDドメインも含まれる。そのようなキメラ導入タンパク質は、少なくとも2種の異なる導入タンパク質の一部を含む。例えば、キメラ導入タンパク質は、例えば、一方はHIV-1に由来し、他方はHIV-2に由来するか、または一方はプリオンタンパク質に由来し、一方はHIVに由来する、2種の異なるTAT断片を融合することにより形成させることができる。
【０１１２】
PTDは、任意の数の他の分子（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む）と連結又は融合することができる。あるいは、核酸構築物又はPTDは、他の分子成分（核酸結合ドメイン、ターゲティング部分などを含む）と結合してもよい。例えば、2個以上のPTD（例えば1〜5個、2〜4個、典型的には3個）を、連続して又は１以上の他のドメイン（例えば核酸ドメイン又はペプチドリンカー）で離して、連結することができる。核酸結合ドメインは、アニオン電荷を低減して、PTDドメインのカチオン電荷が形質導入／細胞膜を横断するのに十分になることによって、核酸（例えば保護基を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）を含む融合構築物の取り込みを促進することができる。PTDを、ホスホジエステル及び／又はホスホチオエート保護基を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを融合させることができ、またさらに核酸結合ドメインと連結させてもよいことが理解されよう。RNA結合タンパク質（例えばDRBD）の例としては、ヒストン、RDE-4タンパク質、またはプロタミンが挙げられる。さらなるdsRNA結合タンパク質（および括弧中のそれらのアクセッション番号）としては、PKR（AAA36409, AAA61926, Q03963）、TRBP（P97473, AAA36765）、PACT（AAC25672, AAA49947, NP609646）、Staufen（AAD17531, AAF98119, AAD17529, P25159）、NFAR1（AF167569）、NFAR2（AF167570, AAF31446, AAC71052, AAA19960, AAA19961, AAG22859）、SPNR（AAK20832, AAF59924, A57284）、RHA（CAA71668, AAC05725, AAF57297）、NREBP（AAK07692, AAF23120, AAF54409, T33856）、カナダプチン（AAK29177, AAB88191, AAF55582, NP499172, NP198700, BAB19354）、HYL1（NP563850）、下偏成長葉（CAC05659, BAB00641）、ADAR1（AAB97118, P55266, AAK16102, AAB51687, AF051275）、ADAR2（P78563, P51400, AAK17102, AAF63702）、ADAR3（AAF78094, AAB41862, AAF76894）、TENR（XP059592, CAA59168）、RNaseIII（AAF80558, AAF59169, Z81070Q02555/S55784, PO5797）、およびDicer（BAA78691, AF408401, AAF56056, S44849, AAF03534, Q9884）、RDE-4（AY071926）, FLJ20399（NP060273, BAB26260）、CG1434（AAF48360, EAA12065, CAA21662）、CG13139（XP059208, XP143416, XP110450, AAF52926, EEA14824）、DGCRK6（BAB83032, XP110167）、CG1800（AAF57175, EAA08039）、FLJ20036（AAH22270, XP134159）、MRP-L45（BAB14234, XP129893）、CG2109（AAF52025）、CG12493（NP647927）、CG10630（AAF50777）、CG17686（AAD50502）、T22A3.5（CAB03384）ならびにアクセッション番号EAA14308が挙げられる。
【０１１３】
注記されるように、本明細書に開示される構築物の２以上の成分、例えば、PTD、核酸結合ドメイン、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドドメイン、ならびにペプチドリンカーを、該構築物が、それが意図される（例えば、十分にカチオン性であるか又はアニオン電荷が低減した）機能を有するという条件で、ほとんど任意の様式で構成することができる。構築物は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドドメイン（例えば、治療用もしくは診断用のDNA、RNA、siRNAなど）に直接的または間接的に連結された1個以上のPTDを含む融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質を含みうる。いくつかのドメインの各々を直接的に連結するか、またはリンカーペプチドにより分離することができる。前記ドメインは、任意の順番で存在することができる。さらに、融合ポリペプチドは、例えば、該融合ポリペプチドの同定および／または精製を容易にするためのタグ、例えば、6×HISタグを含んでもよい。
【０１１４】
本開示の融合ポリペプチドおよび方法において用いることができるペプチドリンカーは、典型的には、最大で約20または30個のアミノ酸、一般的には最大で10または15個のアミノ酸を含み、さらには約1〜5個のアミノ酸を含むことがより多い。一般的には、リンカー配列は、単一の固定したコンフォメーション中に融合分子を保持しないように、自由度がある。リンカー配列は、例えば、核酸結合ドメインおよび／または核酸ドメインからPTDドメインの間隔を空けることができる。例えば、ペプチドリンカー配列を、タンパク質導入ドメインと核酸ドメインの間に配置し、例えば、分子的自由度を提供することができる。リンカー部分の長さを、PTDドメイン融合構築物を含むポリペプチドの生物学的活性を最適化するように選択し、過度の実験を行うことなく経験的に決定することができる。このリンカー部分は、核酸結合ドメインが核酸と自由に相互作用するか、またはその逆をできるように十分に長く、かつ十分に自由度があるべきである。リンカー部分の例は、--Gly--Gly--、GGGGS（配列番号8）、(GGGGS)N（配列番号9）、GKSSGSGSESKS（配列番号10）、GSTSGSGKSSEGKG（配列番号11）、GSTSGSGKSSEGSGSTKG（配列番号12）、GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号13）、またはEGKSSGSGSESKEF（配列番号14）である。連結部分は、例えば、Hustonら、Proc. Nat'l Acad. Sci 85:5879, 1988; Whitlowら、Protein Engineering 6:989, 1993; およびNewtonら、Biochemistry 35:545, 1996に記載されている。他の好適なペプチドリンカーは、参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号に記載のものである。
【０１１５】
本開示の方法、組成物、および融合ポリペプチドは、in vitro及びin vivoの両方で、細胞による核酸分子の取込みの増強および放出を提供する。
【０１１６】
用語「治療薬」は、一般的な意味で用いられ、治療薬、予防薬、および代替薬を含む。治療用分子の例としては、限定されるものではないが、細胞周期制御剤；サイクリンG1およびサイクリンD1遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドなどの、サイクリンタンパク質を阻害する薬剤；切断されて、例えば、上皮増殖因子（EGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、エリスロポエチン、G-CSF、GM-CSF、TGF-α、TGF-β、および線維芽細胞増殖因子などの特異的増殖因子に対するsiRNA分子を提供することができるdsRNA；限定されるものではないが、インターロイキン1〜13および腫瘍壊死因子などのサイトカイン；抗凝固剤、抗血小板剤；TNF受容体ドメインなどが挙げられる。
【０１１７】
そのような方法および組成物を用いて、様々な疾患および障害を治療することができる。例えば、腫瘍細胞の増殖を、抗腫瘍siRNAの送達の際に阻害、抑制、または破壊することができる。
【０１１８】
従って、本開示は、いずれかの特定の導入ドメイン又はオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドに限定されないことが理解されるだろう。任意のアニオン荷電の核酸（例えばdsRNA、siRNAなど）を本開示の方法を用いて送達することができる。
【０１１９】
本開示で用いられるポリペプチド（例えば融合ポリペプチドの特定のドメイン又は全長融合ポリペプチドに関して）は、アミノ酸のL-光学異性体もしくはD-光学異性体、または両方の組合せを含むものであってよい。本開示において用いることができるポリペプチドとしては、糖タンパク質、レトロインベルソ（retro-inverso）ポリペプチド、D-アミノ酸改変ポリペプチドなどの改変された配列が含まれる。ポリペプチドは、天然のタンパク質、ならびに組換えまたは合成により合成されたものを含む。「断片」は、ポリペプチドの一部である。「断片」という用語は、少なくとも１つの有用なエピトープ又は機能的ドメインを示すポリペプチドの一部を指す。「機能的断片」という用語は、ポリペプチドの活性を保持するポリペプチドの断片を指す。例えば、PTDの機能的断片は、形質導入活性を保持する断片を含む。生物学的に機能的な断片は、例えば、抗体分子に結合することができるエピトープと同程度に小さいポリペプチド断片から、特徴的な誘導に関与するかまたは細胞内の表現型変化をプログラムすることができる大きいポリペプチドまで、サイズは様々である。「エピトープ」は、抗原との接触に応答して生成される免疫グロブリンと結合することができるポリペプチドの領域である。
【０１２０】
いくつかの実施形態においては、レトロインベルソペプチドを用いる。「レトロインベルソ」とは、1個以上のアミノ酸におけるアミノ-カルボキシ転置ならびに鏡像異性変化（すなわち、左旋光性（L）から右旋光性（D））を意味する。本開示のポリペプチドは、例えば、該アミノ酸配列のアミノ-カルボキシ転置、1個以上のD-アミノ酸を含むアミノ-カルボキシ転置、および1個以上のD-アミノ酸を含む非転置配列を包含する。安定であり、生体活性を保持するレトロインベルソペプチド模倣物質を、Brugidouら（Biochem. Biophys. Res. Comm. 214(2): 685-693, 1995）およびChorevら（Trends Biotechnol. 13(10): 438-445, 1995）により記載のように考案することができる。
【０１２１】
別の態様においては、本開示は、PTDドメインと核酸結合ドメイン（例えばDRBD）と核酸分子を含む融合ポリペプチドを製造する方法であって、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で増殖させ、該融合ポリペプチドを回収することによる方法を提供する。本開示の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、原核または真核発現系における発現のためのプロモーターと機能的に連結することができる。例えば、そのようなポリヌクレオチドを、発現ベクター中に組み込んで、融合構築物を作製することができる。
【０１２２】
従って、本開示はまた、本開示の融合タンパク質構築物をコードするポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドは、１以上のPTDドメイン、及び／又は核酸結合ドメイン（例えばDRBD）をコードする配列を含む。該ポリヌクレオチドはまた、PTD及び／又は核酸結合ドメインの１以上を分離させるリンカードメインをコードするものであってもよい。一態様において、２以上のPTDドメインを含む融合ポリペプチドを作製し、続いて電荷低減／保護オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと連結させる。
【０１２３】
本開示のポリヌクレオチドの送達は、当業者に公知の様々な方法を用いて該ポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって行うことができる。例えば、かかるポリヌクレオチドを含む構築物を、コロイド分散系を利用して細胞内に送達することができる。あるいは、ポリヌクレオチド構築物を、適当なベクターに組み込む（すなわちクローニング）することも可能である。発現の目的で、本開示の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに挿入することができる。用語「組換え発現ベクター」とは、本開示の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入又は組み込むことによって操作することができる、プラスミド、ウイルスまたは当技術分野で公知の他のビヒクルを指す。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子を含む。このような用途に好適なベクターとしては、限定されるものではないが、、細菌における発現のためのT7に基づく発現ベクター（Rosenberg et al., Gene, 56:125, 1987）、哺乳動物細胞における発現のためのpMSXND発現ベクター（Lee and Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521, 1988）、昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクター、植物における発現のためのカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、及びタバコモザイクウイルス（TMV）などが挙げられる。
【０１２４】
使用するベクターに応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどのいくつかの好適な転写及び翻訳エレメント（調節配列）のうち任意のものを発現ベクターにおいて用いることができる（例えばBitter et al., Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987参照）。これらのエレメントは当業者に周知である。
【０１２５】
「機能的に連結された」または「機能的に結合された」という用語は、それぞれ独立した生物学的機能を有する２つ又は別個のドメインの化学的又は物理的カップリングを広く意味するものとして本明細書において互換的に用いられる。例えば、機能的に連結されたとは、調節配列と、その調節配列によって調節されるポリヌクレオチドとの機能的結合を指す。別の態様において、機能的に連結されたとは、核酸ドメインと導入ドメインの各ドメインが適当な条件下で独立した生物学的活性を保持するような、核酸ドメインと導入ドメインとの会合を指す。さらに機能的に連結されたとは、融合ポリペプチドのコードされる各ドメインが読み取り枠をあわせて（in-frame）連結されて所望のポリペプチド配列を生じることができるようにドメイン間を連結することを指す。
【０１２６】
酵母においては、構成性または誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターを用いることができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2、Ausubelら(編)、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Grantら、「酵母のための発現および選択ベクター（Expression and Secretion Vectors for Yeast）」、Methods in Enzymology, Wu & Grossman（編), Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986;「酵母における激しい異種性遺伝子発現（Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast）」、Methods in Enzymology, Berger & Kimmel(編), Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684, 1987;ならびにThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathernら(編)、Cold Spring Harbor Press, Vols. IおよびII, 1982を参照）。ADHもしくはLEU2などの構成性酵母プロモーター、またはGALなどの誘導性プロモーターを用いることができる（「酵母におけるクローニング（Cloning in Yeast）」、Ch. 3, R. Rothstein: DNA Cloning Vol.11, A Practical Approach, DM Glover(編), IRL Press, Wash., D.C., 1986）。あるいは、外来DNA配列の酵母染色体への組込みを促進するベクターを用いることができる。
【０１２７】
発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することができる。「形質転換」とは、細胞に対して外因性のポリヌクレオチドの組み込み後に細胞内に誘導される永久的な遺伝的変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞の場合、永久的な遺伝的変化は、一般的にポリヌクレオチドの細胞ゲノムへの導入によって達成される。「形質転換細胞」又は「組換え宿主細胞」とは、本開示の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが分子生物技術によって導入された細胞（又はその子孫）を意味する。宿主細胞の形質転換は、当業者には公知の慣用技術によって行うことができる。宿主が原核生物（大腸菌など）の場合には、指数的増殖期後に回収した細胞からポリヌクレオチド取り込みが可能なコンピテントセルを調製し、続いて当技術分野で公知の手法によりCaCl2法で処理する。あるいは、MgCl2又はRbClを用いてもよい。形質転換は、宿主細胞のプロトプラスト形成後に又はエレクトロポレーションにより行うこともできる。
【０１２８】
本開示の融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの原核生物における発現によって産生することができる。これらとしては、限定されるものではないが、本開示の融合ポリペプチドをコードする組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌が挙げられる。大腸菌において構築物を大規模に発現させることができる。細菌からの精製は、ニッケル-キレートクロマトグラフィによる１ステップ精製のためのタグを配列に含ませると簡略化される。従って、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドの単離を簡略化するためのタグも含みうる。例えば、6個のヒスチジン残基の、ポリヒスチジンタグを融合ポリペプチドのアミノ末端に組み込むことができる。ポリヒスチジンタグによって、ニッケル-キレートクロマトグラフィによる単一ステップにおいてタンパク質を簡便に単離することが可能となる。本開示の融合ポリペプチドはまた、タンパク質回収の補助となる切断部位を含有するように操作してもよく、この切断部位は、上述したようなリンカー部分の一部であってもよい。所望のペプチドリンカーをコードするDNA配列を、PTDをコードするポリヌクレオチド又はその断片とそれに続く核酸結合ドメインの間に、同じリーディングフレーム内に、挿入することができる。PTDはまた、所望の核酸（例えばdsRNA、DNA、siRNAなど）に、任意の好適な慣用技術を用いて連結してもよい。例えば、リンカーをコードする化学合成オリゴヌクレオチドを、2つのコードポリヌクレオチドの間に連結することができる。特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、リンカーで分離されている2〜4の別個のドメイン（例えば、１以上のPTDドメイン及び１以上の核酸ドメイン）を含む融合ポリペプチドをコードしうる。いくつかの実施形態において、複数のPTDを含む融合ポリペプチドは、精製後に、ホスホジエステル及び／若しくはホスホチオエート保護基又は他のアニオン電荷低減基を含むオリゴヌクレオチドと会合又は連結する。
【０１２９】
宿主細胞が真核細胞である場合には、リン酸カルシウム共沈法、一般的な機械的手法、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、又はウイルスベクターなどのDNAトランスフェクト法を用いることができる。真核細胞はまた、本開示のPTD-融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、選択可能な表現型をコードする第2のポリヌクレオチド分子（単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子など）とを共トランスフェクトすることも可能である。別の方法は、真核生物ウイルスベクター、例えばシミアンウイルス40（SV40）又はウシパピローマウイルスを使用して、真核細胞に一過性に感染又は形質転換させ、融合ポリペプチドを発現させる（例えば、Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman編, 1982を参照）。
【０１３０】
真核系、典型的には哺乳動物発現系により、発現される哺乳動物タンパク質の適切な翻訳後修飾を起こすことができる。一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、リン酸化、および融合産物の有利な分泌のための細胞機構を有する真核細胞を、本開示のPTD-融合ポリペプチドの発現のための宿主細胞として用いることができる。そのような宿主細胞系としては、限定されるものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293、およびWI38が挙げられる。
【０１３１】
組換えタンパク質の長期間の高収率な産生のためには、安定な発現を用いる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、好適な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）と、選択マーカーにより制御される本開示の融合ポリペプチドをコードするcDNAを用いて、宿主細胞を形質転換することができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択性（例えばサイトトキシン耐性による選択性）を付与し、これにより細胞は安定にプラスミドを染色体に組込み、増殖してフォーカスを形成し、次いで、細胞系中にクローニングし、増殖させることができる。例えば、外来DNAの導入後、遺伝子操作された細胞を富化された培地中で1〜2日間増殖させた後、選択培地に切り替えることができる。いくつかの選択系を用いることができる。例えば限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、Cell, 11:223, 1977）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、Cell, 22:817, 1980）遺伝子を、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567, 1980；O'Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:1527, 1981）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Colberre-Garapinら、J. Mol. Biol., 150:1, 1981）；およびヒグロマイシン遺伝子に対する耐性を付与するhygro（Santerreら、Gene, 30:147, 1984）のための選択の基礎として用いることができる。さらなる選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisD（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8047, 1988）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を付与するODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue L., Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory(編)、1987）が記載されている。
【０１３２】
微生物又は真核生物により発現させた本開示のPTD融合ポリペプチドの単離及び精製のための技術は、任意の慣用的な手段、例えば、分取クロマトグラフィ分離および免疫学的分離（モノクローナルもしくはポリクローナル抗体または抗原を用いるものなど）により行うことができる。
【０１３３】
本開示の融合ポリペプチドは、いくつかの疾患および障害の治療および／または診断のためのアニオン荷電の核酸分子（例えば、dsRNA、siRNA、DNA、アンチセンス、リボザイムなど）の送達にとって有用である。例えば、前記融合ポリペプチドであって、保護されたオリゴ又はポリヌクレオチドが、細胞増殖を誘導する遺伝子を標的化するのに単独で又はPTDと一緒に細胞膜を透過するように可逆的に改変されているものを、細胞増殖性障害の治療において用いることができる。PTDドメインは、核酸構築物の全体の正味カチオン電荷を増大させるか、又は全体の正味アニオン電荷を低減させて、細胞による取り込みを促進する。かくして、前記構築物は、細胞増殖性障害を有する細胞の治療にとって有用である。同様に、本開示の構築物を用いて、炎症性疾患および障害、感染症、血管疾患および障害などを治療することができる。
【０１３４】
一態様において、本開示の構築物は、代わりに又はPTDに加えて、ターゲティングドメインを含んでもよい。ターゲティングドメインは、類似した（cognate）結合ドメインを発現する特定の細胞型に構築物を向かわせるのに有用な、受容体、受容体リガンド、又は抗体でありうる。
【０１３５】
典型的には、本開示の構築物を、製薬上許容される担体と共に製剤化することができるが、融合ポリペプチドを、医薬組成物として、単独で投与してもよい。
【０１３６】
本開示に係る医薬組成物を、担体、賦形剤、および添加物または補助剤を用いて被験体に投与するのに好適な形態で、本開示の融合ポリペプチドを含むように調製することができる。多く用いられる担体または補助剤としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖類、タルク、乳汁タンパク質、ゼラチン、スターチ、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油および野菜油、ポリエチレングリコール、ならびに蒸留水、アルコール、グリセロール、および多価アルコールなどの溶媒が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補給剤が挙げられる。保存剤としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスが挙げられる。他の製薬上許容される担体としては、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、Easton:  Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975)、およびThe National Formulary XIV.、第14版、Washington:  American Pharmaceutical Association (1975)(その内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載のような水性溶液、非毒性賦形剤、例えば、塩、保存剤、緩衝剤などが挙げられる。前記医薬組成物の種々の成分のpHおよび正確な濃度は、当業界における日常的な技術に従って調整する。GoodmanおよびGilmanのThe Pharmacological Basis for Therapeutics (第7版)を参照されたい。
【０１３７】
本開示に係る医薬組成物を、局所的または全身的に投与することができる。「治療上有効量」とは、疾患もしくは障害の症候を防止、治癒、または少なくとも部分的に止める（例えば、細胞増殖を阻害する）のに必要な、本開示に係る融合ポリペプチドの量を意味する。この使用に有効な量は、勿論、疾患の重篤度ならびに被験体の体重および全身状態に依存するであろう。典型的には、in vitroで用いられる用量は、医薬組成物のin situでの投与にとって有用な量における有用なガイダンスを提供し、動物モデルを用いて、特定の障害の治療のための有効量を決定することができる。様々な検討材料が、例えば、Langer, Science, 249: 1527, (1990); Gilmanら(編) (1990)（それぞれ参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
【０１３８】
本明細書で用いられる「治療上有効量を投与すること」とは、本開示の医薬組成物が、その意図される治療機能を実行可能にする、被験体に該組成物を与えるかまたは適用する方法を含むと意図される。治療上有効量は、被験体における感染の程度、個体の年齢、性別、および体重などの因子に応じて変化するであろう。投薬計画を調整して、最適な治療応答を提供することができる。例えば、数回に分割された用量を毎日投与するか、または緊急の治療状況により指示されるように、該用量を比例的に減少させることができる。
【０１３９】
医薬組成物を、注入（例えば、皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与などの都合の良い様式で投与することができる。投与経路に応じて、医薬組成物を、酵素、酸、および該医薬組成物を不活化し得る他の天然条件の作用から、該医薬組成物を保護するための材料でコーティングすることができる。医薬組成物を、非経口的または腹腔内に投与することもできる。分散液を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物、ならびに油中で調製することもできる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含んでもよい。
【０１４０】
注入可能な使用にとって好適な医薬組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性である場合）または滅菌注入可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための分散液および滅菌粉末が挙げられる。前記組成物は、典型的には、滅菌されており、容易な注射可能性が存在する程度まで液体であるであろう。典型的には、前記組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細胞および菌類などの微生物の混入作用に対抗して保存されるであろう。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、および野菜油を含む溶媒または分散媒体であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止を、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、等張性剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを、前記組成物中で用いる。前記組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることにより、注入可能な組成物の延長された吸収をもたらすことができる。
【０１４１】
必要な量の医薬組成物を、必要な場合には、上記に列挙された成分の1つまたは組合せを含む好適な溶媒中に組み入れた後、滅菌濾過することにより、滅菌注入可能な溶液を調製することができる。一般的には、塩基性分散媒体と、上記に列挙されたものに由来する必要な他の成分とを含む滅菌ビヒクル中に、前記医薬組成物を組み入れることにより、分散液を調製する。
【０１４２】
医薬組成物を、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与することができる。医薬組成物および他の成分を、硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル中に封入し、錠剤に圧縮するか、または被験体の食事中に直接組み入れることもできる。経口治療剤投与のためには、医薬組成物を、賦形剤と共に組み入れ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハースなどの形態で用いることができる。そのような組成物および調製物は、少なくとも1重量％の活性化合物を含むべきである。組成物および調製物の割合は、勿論、変化してもよく、単位の約5重量％〜約80重量％にあるのが都合がよい。
【０１４３】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、以下のもの：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギニン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、ラクトースもしくはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、冬緑油、もしくはチェリー香味料などの香料を含んでもよい。投与単位剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に加えて、それは液体担体を含んでもよい。コーティングとして、またはさもなければ投与単位の物理形態を改変するために、様々な他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤を、シェラック、糖、またはその両方を用いてコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、前記薬剤、甘味料としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、ならびにチェリーもしくはオレンジ香料などの香料を含んでもよい。勿論、任意の投与単位剤形を調製するのに用いられる任意の材料は、製薬上純粋であり、用いる量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、医薬組成物を、徐放性調製物および製剤に組み入れることができる。
【０１４４】
かくして、「製薬上許容される担体」は、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むと意図される。製薬上活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当業界で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が医薬組成物と不適合ではない限り、治療用組成物および治療方法におけるその使用が意図される。補助活性化合物を前記組成物中に組み入れることもできる。
【０１４５】
投与の容易性および用量の均一性のために、単位投与剤形中で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で用いられる「単位投与剤形」とは、治療対象の被験体のために単一用量として適合させた物理的に個別の単位を指し、所定量の医薬組成物を含む各単位を算出して、必要とされる医薬担体と一緒に所望の治療効果をもたらす。本開示の単位投与剤形に関する仕様は、医薬組成物の特徴および達成しようとする特定の治療効果に関連する。
【０１４６】
主要な医薬組成物を、許容される投与単位中、好適な製薬上許容される担体と共に、有効量の、好都合かつ有効な投与のために混合する。補助活性成分を含む組成物の場合、前記成分の通常の用量および投与様式を参照して、投薬量を決定する。
【実施例】
【０１４７】
RNB合成の実施例
【化３０】
2009543783.tif 000031
【０１４８】
塩基性条件下で、クロロギ酸フェニルを塩酸グアニジンに添加する。チラン（thirane）の選択的開環をルイス酸条件下で行うことにより、遊離チオールが得られる。チオール化材料を、ジスルフィド結合によってβメルカプトエタノールに連結させることにより、遊離アルコールが得られる。この遊離アルコールをテトライソプロピルホスホンアミド塩化物と反応させることにより、任意のヌクレオシドアミダイト前駆体の遊離3'OHと反応することができるジアミダイトが得られる。本明細書に記載するように、当分野で公知の技術を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。
【０１４９】
RNNホスホロアミダイト保護
【化３１】
2009543783.tif 000032
【０１５０】
リボ核塩基RNB保護基
【化３２】
2009543783.tif 000033
【０１５１】
アルゴン雰囲気下で反応を実施した。ガラス製品は、すべての無水系において使用する前に、KOH/EtOH塩基浴中で一晩洗浄し、MeOHですすいで、真空下で火力乾燥した。反応は、モレキュラーシーブと共に確実に密閉された市販の溶媒、又はPurification of Laboratory Chemicals第4版に記載のプロトコルを用いて蒸留してモレキュラーシーブと共に保存した溶媒を用いて行った。
【０１５２】
テトラヒドロフラン（THF）をナトリウム金属から蒸留し、ベンゾフェノン、トリエチルアミン（Et3N）、ジ-イソプロピルアミン（DIEA）及びピリジン（py）をナトリウムメタルから蒸留した。ジクロロメタン（CH2Cl2）、メタノール（MeOH）及びトルエンを水素化カルシウムから蒸留した。その他の溶媒及び試薬はすべて、Fisher Chemical Co.、Aldrich Chemical Co.、EMD又はAcros Organicsから購入し、それ以上精製せずに用いた。反応物をドライアイス−アセトン浴により−78℃に冷却した。
【０１５３】
メルク（Merck）グレード60シリカゲル（230〜400メッシュ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィーを実施し、メルク（Merck）60F-254を予めコーティングしたシリカシートを用いて、TLC分析を実施した。TLCプレートの視覚化は、紫外線、硫酸を含むエタノール中のp-アニスアルデヒド、ポリホスホモリブデン酸、及びH2SO4を含むEtOH中の硫酸セリウム、H2SO4を含むEtOH中のニンヒドリン、過マンガン酸カリウム、又はヨウ素を用いて行った。ドライアイスイソプロパノール低温フィンガートラップを備えたビュッヒ（Buchi）回転エバポレータにより溶媒の除去を実施し、H2O吸引器を用いて真空下で濃縮した。P2O5 及びKOHを用いた高真空管路による減圧下で、サンプルをさらに乾燥した。特に記載のない限り、1H NMRスペクトルは、周囲温度でCDCl3又はd6ベンゼン中で、バリアンユニティーイノーバ（Varian Unity Inova）400を用いて取得した。Mestre-Cを用いてJカップリングを視覚化し、測定した。CDCl3中の1H化学シフトは、テトラメチルシランからダウンフィールドしたppm；（δ単位）で記録した。1H NMR分裂パターンは、一重線（s）、二重線（d）、三重線（t）、又は四重線（q）と称する。一次分裂パターンはすべて、プログラムにより解釈される多重線の出現に基づいて割り当てた。容易に解釈できない分裂パターンは、多重線（m）又は（br）と称する。広幅又は多重線分裂パターンが明らかに１つのピークに集中している場合には、範囲ではなく、そのピークの化学シフトを記録した。DMSO-d6における内部標準として2.49での溶媒ピークを用い、また、CD3ODにおける内部標準として3.30での溶媒ピークを用いた。すべての13C NMRの内部標準として溶媒ピークを用いた。NMRスペクトルデータの表を以下：化学シフト、多重性、 カップリング定数及び陽子の数、のように作成する。特に記載のない限り、リン酸標準と比較して31P NMR化学シフトを測定し、d6ベンゼンにおいてスペクトルを獲得した。生成物がラセミ混合物のとき、NMR 13C及び1Hデータは記録されなかった。カリフォルニア大学サンディエゴ校のHHMI Analytical Instrumentation Center（AIC）で質量分光分析を実施した。
【０１５４】
長さ17〜21 ntのオリゴヌクレオチドをMerMade 6自動化DNA/RNA合成装置により合成した。各々5分ずつ3回のカップリング工程中、カップリング試薬としてのエチルチオールテトラゾールと共に、Glen Research Q CPG支持体を用いた。標準的ヨウ素法によりホスフィンをリン酸塩に酸化し、無水フェノキシ酢酸でキャッピングを実施した。MerMade 6合成装置で用いたすべてのアミダイト及び材料は、合成したか、又はEMD、ChemGenes若しくはGlen Researchから購入した。
【化３３】
2009543783.tif 000034
【０１５５】
アルコール合成の実施例（スキームII）
以下に示す立体配置の遊離アルコール又はチオールを調製することにより、修飾アミダイトを合成した。
【化３４】
2009543783.tif 000035
2-((ヒドロキシメチル)ジスルファニル)エチルアセテート
【０１５６】
VI_O19：
攪拌棒を備えたフラスコに2ヒドロキシエチルジスルフィド（1.2ml、10mmol）、イミダゾール（1.23g、10mmol）及びDMFを室温で導入した。塩化アセチル（639.4g、9mmol）をDMFに溶解し、これをシリンジポンプにより上記攪拌溶液に2時間かけて添加した。6時間後、この溶液をEtOAcに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム、ブラインを用いて抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを除去し、得られた油をシリカカラムで分画した。生成物を含む画分をプールし、溶媒を除去することにより、635 mgの無色油が36％で得られた。
【０１５７】
【化３５】
2009543783.tif 000036
((2-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ) エチル)ジスルファニル)メタノール
【０１５８】
VI_139：
攪拌棒を備えたフラスコに、2ヒドロキシエチルジスルフィド（19.17g、160mmol）、イミダゾール（20.7g、304mmol）及びDMF（100ml）を室温で導入した。TBSCl（38.9ml、152mmol）をDMF（60ml）に溶解し、これをシリンジポンプにより上記攪拌溶液に2時間かけて添加した。15時間後、この溶液をEtOAcに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム、ブラインを用いて抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させると、油が得られ、これをシリカカラムにアプライした。生成物を含む画分をプールし、蒸発させることにより、18.8gの薄い琥珀色の油が31％で得られた。(M+H)=268.74。1H NMR (500 MHz、溶媒) δppm 3.92-3.80 (m, 4H)、2.90-2.75 (m, 4H) 、2.50 (s, 1H) 、0.92-0.82 (m, 9H) 、0.05 (m, 6H)。
【０１５９】
【化３６】
2009543783.tif 000037
2-((2-(tert-ブチルジフェニルシリルオキシ)エチル)ジスルファニル)エタノール
【０１６０】
VI_063：
攪拌棒を備えたフラスコに、2ヒドロキシエチルジスルフィド（2.4ml、20mmol）、イミダゾール（5.8g, 85.5mmol）及び20mlのDMFを室温で導入した。TBDPSCl（4.9ml、19mmol）をDMFに溶解し、これをシリンジポンプにより上記攪拌溶液に2時間かけて添加した。15時間後、この溶液をEtOAcに溶解し、抽出した。シリカクロマトグラフィーを実施することにより、1.79gの薄い琥珀色の油が24％で得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.82-7.64 (m, 1H)、7.50-7.38 (m, 1H)、5.32-5.30 (m, 1H)、3.99-3.91 (m, 1H)、3.91-3.84 (m, 1H)、2.93-2.87 (m, 1H)、2.81-2.77 (m, 1H)、2.34-2.31 (m, 1H)、1.13-1.08 (m, 1H)。
【０１６１】
【化３７】
2009543783.tif 000038
S-2-ヒドロキシエチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０１６２】
VI_183：
メルカプトエタノール（10ml、142.6mmol）とトリエチルアミン（19.9ml、142.6mmol）をジクロロメタン275ml中に溶解し、−78℃に冷却した。塩化ピバロイル（17.56ml、142.6mmol）を上記攪拌溶液に滴下した。反応を−78℃で1時間進行させてから、室温まで昇温させ、さらに1時間攪拌した後、150mlの水でクエンチ（反応停止）した。水相を洗浄（3×100 mlのDCM）し、硫酸マグネシウムで乾燥した。定量的転化をTLCにより観察し、粗生成物をヘキサンで希釈した後、短いシリカカラムに流すことにより、19.6gの無色油が85％で得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δppm 3.61 (dd, J = 11.79 Hz, 2H)、3.05 (t, J = 5.46 Hz, 1H)、2.95 (td, J = 12.60, 3.42 Hz, 2H)、1.14 (d, J = 6.18 Hz, 9H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3 δ ppm (207.2, 61.4, 46.3, 31.0, 27.1 ppm。
【０１６３】
【化３８】
2009543783.tif 000039
3-(ヒドロキシメチル)ジヒドロチオフェン-2(3H)-オン
【０１６４】
VI_269：
乾燥THF中のチオブチロラクトン（5.1g、50mmol）をリチウムジイソプロピルアミドの攪拌溶液（−78℃でヘキサン（31.3ml、50mmol）中のジイソプロピルアミン（5.1mg、50.5mmol）とn-ブチルリチウム）に滴下した。得られた溶液を10分攪拌すると同時に、アルゴン流で運搬されるホルムアルデヒド（31.3g）を添加した（ホルムアルデヒドは、p-ホルムアルデヒドを150℃に加熱することにより形成した）。反応を−78℃で2.5時間進行させた。ホルムアルデヒド流を除去し、反応をさらに30分進行させた。（約100mlの）1M HClを−78℃で添加することにより、反応をクエンチした後、室温まで昇温させ、セライト層により濾過した。濾液を酢酸エチルで抽出（5×100ml）し、合わせた有機相を乾燥（Na2SO4）させ、油状になるまで濃縮した。油をクロマトグラフィーで分離することにより、1.1gの単離物が17％で得られた。
【０１６５】
【化３９】
2009543783.tif 000040
N-((2-ヒドロキシエチルチオ)メチル)アセトアミド
【０１６６】
IV_185：
アセトアミド（890mg、10mmol）を室温でTFA（10m）に溶解した。この攪拌溶液にメルカプトエタノール（700mg、10mmol）を滴下した。反応を30分進行させた。TFAを蒸発させ、得られた油を2プロパノール水溶液から再結晶させた。
【０１６７】
ジアミダイト形成の実施例
【化４０】
2009543783.tif 000041
1-ブトキシ-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスフィンジアミン
【０１６８】
VI_173：
攪拌棒を備えたフラスコに、n-ブタノール（190ul、1.0mmol）、トリエチルアミン（418 ul、3mmol）、及びベンゼンを室温で導入した。この攪拌溶液にクロロホスフィン（292mg、1.1mmol）を添加し、反応を2時間進行させた。得られた混合物から溶媒を除去し、トリエチルアミンで前処理したカラムに、この油を直接アプライした。生成物を含む画分を蒸発させることにより、311mgの油が64％で得られた。
【０１６９】
【化４１】
2009543783.tif 000042
1-(3,3-ジメチルブトキシ)- N,N,N',N'-テトライソプロピルホスフィンジアミン
【０１７０】
VI_257：
アルゴン流下で、テトライソプロピルホスホロアミド塩化物（2.0g、7.5mmol）を火力乾燥した攪拌棒付き反応容器に室温で移した。トリエチルアミン（1.05ml、7.5mmol）とベンゼン（7ml）をシリンジにより添加した。シリンジによる2'2'ジメチルブタノール（700mg、6.84mmol）の添加により反応を開始させた。2.5時間の過程にわたり、転化の完了についてTLCにより反応をモニターした。溶媒を混合物から除去し、得られた油をTEA前処理カラムに直接アプライした。生成物を含む画分から溶媒を除去し、得られた油をトルエンと一緒に共蒸発（2回）させた後、ベンゼンから一晩凍結乾燥させることにより、1.6gの無色固体が71％で得られた。
【０１７１】
【化４２】
2009543783.tif 000043
S-2-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０１７２】
VI_253 SPTE：
アルゴン流下で、テトライソプロピルホスホロアミド塩化物（5.0g、18.81mmol）を、火力乾燥した攪拌棒付き反応容器に室温で移した。トリエチルアミン（2.6ml、18.8mmol）とベンゼン（20ml）をシリンジにより添加した。シリンジによるチオエステルVI_183（2.77g、17.1mmol）の添加により反応を開始させた。2.5時間の過程にわたり、転化の完了についてTLCにより反応をモニターした。混合物から溶媒を除去し、得られた油をTEA前処理カラムに直接アプライした。生成物を含む画分から溶媒を除去し、得られた油をトルエンと一緒に共蒸発（2回）させた後、ベンゼンから一晩凍結乾燥することにより、6.08gの無色固体が91％で得られた。31P NMR (162 MHz、d6ベンゼン δ ppm 123.5 ppm。13C NMR (101 MHz, CDCl3 δ ppm 205.2, 63.6, 63.4, 44.7, 44.6, 30.8, 30.7, 27.4, 24.7, 24.6, 24.0, 24.0 ppm。1H NMR (400 MHz、溶媒δ ppm 3.70 (dd, J = 13.46 Hz, 2H)、3.48 (dq, J = 13.44 Hz, 4H)、3.14 (t, J = 6.34 Hz, 2H)、1.25-1.11 (m, 33H)。
【０１７３】
【化４３】
2009543783.tif 000044
N,N,N',N'-テトライソプロピル-11,11-ジメチル-10,10-ジフェニル-2,9-ジオキサ-5,6-ジチア-1-ホスファ-10-シラドデカン-1,1-ジアミン
【０１７４】
VI_167：
ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（2g、7.5mmol）、IV_139（3.02g、7.7 mmol）及びジイソプロピルアミン（2ml、15mmol）を10mlのベンゼン中で反応させた。クロマトグラフィーの実施後、4.0gの油が86％で回収された。
【０１７５】
【化４４】
2009543783.tif 000045
4-(ジイソプロピルアミノ)-3-イソプロピル-2-メチル-5-オキサ-8,9-ジチア-3-アザ-4-ホスファウンデカン-11-イルベンゾエート
【０１７６】
VI_171：
攪拌棒を備えたフラスコに、2ヒドロキシエチルジスルフィド（910ml、7.6mmol）、トリエチルアミン（3.2ml、22.8mmol）、及びベンゼンを室温で導入した。この攪拌溶液に、塩化ベンゾイル（970ul、8.36mmol）を添加した。ジスルフィドの転化の完了について、TLCにより反応をモニターした。反応物を10mlのエーテルで希釈し、無水条件下で濾過して新しい反応容器に移した。この攪拌溶液に、アルゴン流下でクロロホスフィン（1g、3.76mmol）を添加し、反応をさらに2時間進行させた。溶媒を除去し、得られた油をTEA前処理カラムに直接アプライした。回収した画分から溶媒を除去することにより、648mgの無色油が35％で得られた。
【０１７７】
エラー！  編集フィールドコード（editing field codes）からオブジェクトを作成することはできない。
【０１７８】
V_147：
ヌクレオシド（132.2mg、0.02mmol）とジイソプロピルエチルアミンアミン（105ul、0.6mmol）をDCMで希釈した。この溶液をジクロロメタン（100ul）中の2M三塩化リンの希釈物にゆっくりと滴下した。フラスコに通気針を取り付けた。出発材料の転化の完了をTLCにより観察した。蒸発させることにより反応混合物から溶媒及び過剰三塩化リンを除去した。反応物を無水エーテル中に再懸濁させ、濾過して、アミン塩及び未反応の反応ホスフィンを除去した。エーテルを蒸発させた後、得られた粗固体は、自然分解の問題があるため、本反応系列の次の工程に直接用いた。
【０１７９】
【化４５】
2009543783.tif 000046
1-((2R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン
【０１８０】
VI_179：
ヌクレオシド（1.53g、2.81mmol）とジイソプロピルエチルアミンアミン（1.0ml、5.63mmol）を10mlのジクロロメタンで希釈した。この溶液をジクロロメタン10ml中のクロロアミダイト（997mg、3.75mmol）の希釈物にゆっくりと滴下した。反応を30分進行させ、この時点で、通気針をフラスコ内に設置して、HClがアルゴン流と一緒に逃散するようにした。反応容器をヒートガンで加熱し、通気針を取り外した。出発材料の転化の完了をTLCにより観察した。反応混合物から溶媒を除去し、反応物を無水エーテルに再懸濁させてから、濾過することにより、アミン塩及び未反応のクロロアミダイトを除去した。4時間後に1mlのTEAで反応をクエンチし、蒸発させることにより、油が得られ、1％TEAで前処理したシリカプラグにこの油を直接導入した。生成物を含む画分をプールし、蒸発させることにより、2.86gの淡黄色の固体が85％で得られた。31P NMR (162 MHz, d6ベンゼン) δ ppm 115.1。
【０１８１】
固相合成用ホスホトリエステルアミダイトとしてのヌクレオシド活性化の実施例
ヌクレオシドアミダイトを固相オリゴヌクレオチド合成のカルサー（Caruthers）法に適した方法で調製した。火力乾燥したバイアルに、ヌクレオシドと活性化物質を添加した。この攪拌溶液にホスホロアミダイトを添加し、反応を少なくとも3時間進行させた。溶媒を反応物から除去して、得られた泡状物又は油を、バッファーを流しながらトリエチルアミン前処理シリカカラムに直接アプライした。生成物のみを含む画分をプールし、溶媒を除去した。得られた泡状物をアセトニトリルに溶解し、シリンジ濾過した（0.45um）。アセトニトリルを除去して、得られた泡状物をベンゼンに溶解し、凍結乾燥することにより、微量のトリエチルアミン及び残留水をすべて除去した。アルゴン下でサンプルをガラス容器に密閉し、−20℃で保存した後、自動化オリゴヌクレオシド合成装置で用いた。
【化４６】
2009543783.tif 000047
【０１８２】
いくつかの態様では、合成過程でフェノキシアセタール塩基保護を用いた。他の態様では、切断のためのヒンダード塩基（hindered base）が固体支持体を形成し、光不安定性（photolabile）リンカーを用いていないものを使用した。本発明の利点の1つは、DNA及びRNAヌクレオチドのいずれか又は両方を用いることができることである。
【０１８３】
2'F及び2'2'ジメチルブタノールのリン酸保護を用いた合成経路：
【化４７】
2009543783.tif 000048
(2R,3S,4S,5R)-5-(4-アセトアミド-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-フルオロテトラヒドロフラン-3-イル3,3-ジメチルブチルジイソプロピルホスホロアミダイト
【０１８４】
VI_261：
保護シトシン（840mg、1.43mmol）と2'2'ジメチルホスホロジアミダイトVI_275（498.5mg、1.5mmol）を5.7 mlのジクロロメタンに溶解した。アセトニトリル（5.7 ml）中の0.45Mエチルチオテトラゾールを添加した後、反応が2.5時間で完了したことを見とめた。クロマトグラフィー及び濾過を実施することにより、800 mgの凍結乾燥物が68.4％で得られた。
【０１８５】
【化４８】
2009543783.tif 000049
(2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-4-フルオロテトラヒドロフラン-3-イル3,3-ジメチルブチルジイソプロピルホスホロアミダイト
【０１８６】
VI_261：
保護ウリジン（782mg、1.43mmol）と2'2'ジメチルホスホロジアミダイトVI_275（498.5mg、1.5mmol）を5.7 mlのジクロロメタンに溶解した。アセトニトリル（5.7 ml）中の0.45Mエチルチオテトラゾールを添加した後、反応が2.5時間で完了したことを見とめた。クロマトグラフィー及び濾過を実施することにより、860 mgの凍結乾燥物が77.4％で得られた。
【０１８７】
2'Fメチルホスホロアミダイトへの合成経路：
【化４９】
2009543783.tif 000050
【０１８８】
市販（Carbosynth, R.I. Chemical）の遊離3'OH核酸塩基を、ベンゼン中の塩基性条件下でクロロホスフィンと直接反応させた。
【０１８９】
【化５０】
2009543783.tif 000051
(2R,3S,4S,5R)-5-(4-アセトアミド-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-フルオロテトラヒドロフラン-3-イルメチルジイソプロピルホスホロアミダイト
【０１９０】
VI_245、237：
保護シトシンヌクレオシド（1.0g、1.7mmol）とDIEA（1.42ml、8.2mmol）を火力乾燥バイアルに添加した。この攪拌溶液にホスホンアミド塩化物（1.34g、6.79mmol）を添加し、反応を3時間進行させた。反応物を濃縮して油状にし、これをTEA前処理カラムに直接アプライした。DCM：酢酸エチル：TEAが45：45：10のクロマトグラフィーにより分離を行った。生成物を含む画分を蒸発させた後、アセトニトリル中に移して0.45umフィルタにより濾過した。ベンゼンから凍結乾燥することにより、1.02gの凍結乾燥物が80.4％で得られた。
【０１９１】
【化５１】
2009543783.tif 000052
(2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-4-フルオロテトラヒドロフラン-3-イルメチルジイソプロピルホスホロアミダイト
【０１９２】
VI_251：
保護ウリジンヌクレオシド（2.74g、5.0mmol）とDIEA（4.2ml、24mmol）を火力乾燥バイアルに添加した。この攪拌溶液にホスホンアミド塩化物（3.94g、20.0mmol）を添加し、反応を3時間進行させた。反応物を濃縮して油状にし、これをTEA前処理カラムに直接アプライした。ヘキサン：DCM：酢酸エチル：TEAが45：45：45：10のクロマトグラフィーにより分離を行った。生成物を含む画分を蒸発させた後、アセトニトリル中に移して0.45umフィルタにより濾過した。ベンゼンから凍結乾燥することにより、2.46gの凍結乾燥物が84％で得られた。
【０１９３】
SPTE生体不安定性（biolabile）保護基を用いた合成経路：
【化５２】
2009543783.tif 000053
【０１９４】
【化５３】
2009543783.tif 000054
S-2-(((2R,3R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０１９５】
VI_247：
保護ヌクレオシド（2.07g、3.08mmol）とエチルチオテトラゾール（15.2ml）をDCMで希釈した。この攪拌溶液にホスホロジアミダイトVI_253（1.57g、4.0mmol）を添加し、反応を30分進行させた。粗生成物を飽和重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ、ブラインで洗浄する（洗浄：3×10ml）ことにより、反応をクエンチした。有機相をNaSO4で乾燥し、蒸発させた。ヘキサン：DCM：酢酸エチル：TEAが40：40：20：7.5のクロマトグラフィーにより分離を行った。生成物を含む画分を蒸発させた後、ベンゼン中に移して0.45umフィルタにより濾過し、次にベンゼンからの凍結乾燥を一晩行うことにより、水の完全な除去を確実にした。2.74gの凍結乾燥物が86％で回収された。31P NMR (162 MHz, d6ベンゼン) δ ppm 148.7、148.2。
【０１９６】
【化５４】
2009543783.tif 000055
S-2-(((2R,3R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(6-(2-フェノキシアセトアミド)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０１９７】
VI_267：
5'DMTフェノキシアシルデオキシアデノシン（3.92g、5.7mmol）とエチルチオテトラゾール活性化物質（22.8ml、5.7mmol）を火力乾燥バイアルに添加し、ジクロロメタン（22.8ml）で希釈した。この攪拌溶液にホスホロジアミダイトVI_253（2.36g、6.0mmol）を添加し、反応を3時間進行させた。溶媒を反応容器から除去し、TEA前処理カラムに直接導入した。生成物（Rf=0.5）を含む画分をプールし、蒸発させて油を得た。この油をアセトニトリルに懸濁させ、0.45umシリンジフィルターを用いて濾過し、蒸発させて泡状物としてから、ベンゼンに溶解した後、凍結乾燥することにより、3.98gの無色の凍結乾燥物が71％で得られた。
【０１９８】
2'OTBSホスフィンSPTE保護ヌクレオシド
【化５５】
2009543783.tif 000056
S-2-(((2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(2-フェノキシアセトアミド)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０１９９】
VI_199：
保護ヌクレオシド（2.33g、2.85mmol）とヒドロテトラゾリド（488mg、2.85mmol）をDCMで希釈した。この攪拌溶液にホスホロジアミダイト（1.18g、3.0mmol）を添加し、反応を30分進行させた。粗生成物を飽和重炭酸ナトリウム溶液に注ぎ、ブラインで洗浄する（洗浄：3×10ml）ことにより、反応をクエンチした。有機相をNaSO4で乾燥し、蒸発させた。DCM：酢酸エチル：TEAが45：45：10のクロマトグラフィーにより分離を行った。生成物を含む画分を蒸発させた後、ベンゼン中に移して0.2umフィルタにより濾過し、次にベンゼンからの凍結乾燥を一晩行うことにより、水の完全な除去を確実にした。2.1gの凍結乾燥物が67％で回収された。31P NMR (162 MHz, d6ベンゼン) δ ppm 150.34、148.79。
【０２００】
【化５６】
2009543783.tif 000057
S-2-(((2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-オキソ-2-(2-フェノキシアセトアミド)-1H-プリン-9(6H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０２０１】
VI_201：
保護ヌクレオシド（2.38g、2.85mmol）とヒドロテトラゾリド（448mg、2.85mmol）をDCMで希釈した。この攪拌溶液にホスホロジアミダイトVI_253（1.18g、3mmol）を添加し、反応を30分進行させた。粗生成物を飽和重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ、ブラインで洗浄する（洗浄：3×10ml）ことにより、反応をクエンチした。有機相をNaSO4で乾燥し、蒸発させた。DCM：酢酸エチル：TEAが45：45：10のクロマトグラフィーにより分離を実施した。生成物を含む画分を蒸発させた後、ベンゼン中に移して0.45umフィルタにより濾過し、次にベンゼンからの凍結乾燥を一晩行うことにより、水の完全な除去を確実にした。815mgの凍結乾燥物が25.4％で回収された。31P NMR (162 MHz, d6ベンゼン) δ ppm 149.22、149.15。
【０２０２】
【化５７】
2009543783.tif 000058
S-2-(((2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(2-オキソ-4-(2-フェノキシアセトアミド)ピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０２０３】
VI_207：
保護シトシン（3.77g、4.75mmol）とSPTEホスホロジアミダイトVI_253（1.96g、5.0mmol）を19mlのジクロロメタンに溶解した。アセトニトリル（19ml）中の0.45Mエチルチオテトラゾールを添加した後、反応が2.5時間で完了したことを見とめた。クロマトグラフィー及び濾過を実施することにより、4.3gの凍結乾燥物が83.4％で得られた。31P NMR (162 MHz, d6ベンゼン) δ ppm 150.5、147.6。
【０２０４】
【化５８】
2009543783.tif 000059
S-2-(((2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０２０５】
VI_205：
保護ウリジン（3.42g、5.18mmol）とSPTEホスホロジアミダイトVI_253（2.139g、545mmol）を20.7mlのジクロロメタンに溶解した。アセトニトリル（20.7）中の0.45Mエチルチオテトラゾールを添加した後、反応が2.5時間で完了したことを見とめた。クロマトグラフィー及び濾過を実施することにより、4.7gの凍結乾燥物が95％で得られた。31P NMR (162 MHz, d6ベンゼン) δ ppm 149.9、149.1。
【０２０６】
【化５９】
2009543783.tif 000060
S-2-(((2R,3S,4S,5R)-5-(4-アセトアミド-2-オキソピリジミン-1(2H)-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-フルオロテトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０２０７】
SPTEホスフィン保護基を含む2'Fヌクレオシド：
VI_239：
保護シトシン（2.0g、3.39mmol）とSPTEホスホロジアミダイト（14.02g、3.57mmol）を13.6mlのジクロロメタンに溶解した。アセトニトリル（13.6 ml）中の0.45Mエチルチオテトラゾールを添加した後、反応が2.5時間で完了したことを見とめた。クロマトグラフィー及び濾過を実施することにより、2.22gの凍結乾燥物が74％で得られた。31P NMR (162 MHz, d6ベンゼン) δ ppm 150.3、150.2 ppm。
【０２０８】
【化６０】
2009543783.tif 000061
S-2-(((2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-4-フルオロテトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０２０９】
VI_249：
保護ウリジン（2.08g、3.9mmol）とSPTEホスホロジアミダイト（15.7g、4.0mmol）を15.2mlのジクロロメタンに溶解した。アセトニトリル（15.2 ml）中の0.45Mエチルチオテトラゾールを添加した後、反応が2.5時間で完了したことを見とめた。クロマトグラフィー及び濾過を実施することにより、2.6gの凍結乾燥物が82％で得られた。
【０２１０】
SPTEリン酸保護基を含む2'Oメチル修飾オリゴヌクレオシド：
【化６１】
2009543783.tif 000062
S-2-(((2R,3S,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-4-メトキシテトラヒドロフラン-3-イルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)エチル2,2-ジメチルプロパンチオエート
【０２１１】
VI_243：
5'DMT 2'Oメチルウリジン（1g、1.8mmol）と0.45Mエチルチオールテトラゾール（7.1ml）を、火力乾燥した攪拌棒付きバイアルに添加した。この攪拌溶液に7mlのジクロロメタンとホスホロジアミダイトVI_253（738.1g、1.88mmol）を添加し、反応を3時間進行させた。反応物を粘稠な油に濃縮し、TEA前処理シリカクロマトグラフィにより分離を行った。生成物を含む画分を蒸発させた後、アセトニトリル中に移して0.45umフィルターにより濾過し、次にベンゼンからの凍結乾燥を一晩行うことにより、水及び残留トリエチルアミンの完全な除去を確実にした。1.3gの凍結乾燥物が85.4％で回収された。
【０２１２】
ホスホトリエステルへの別のオリゴヌクレオチド合成後経路：
【化６２】
2009543783.tif 000063
【０２１３】
また、上に挙げた一般構造のメチルホスホネートにより、ヌクレアーゼ抵抗性をさらに付与する中性荷電骨格を有するオリゴヌクレオチドの取得も可能になる。
【０２１４】
以上記載した実施例は、本開示の装置、設備及び方法の実施形態をどのように作製及び使用するかについての完全な開示及び説明を当業者にもたらすために提供されるのであって、本発明者らがその開示内容として考えるものの範囲の限定を意図するわけではない。本開示内容を実施する前記様式の改変は、当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書に記載する特許及び刊行物はすべて、本開示内容が関連する分野における当業者の技術のレベルを示すものである。本開示内容に引用した参照文献はすべて、各参照文献が個々にその全文を参照として包含された場合と同じ範囲まで、参照として含まれるものとする。
【０２１５】
本開示内容の多数の実施形態が記載されている。しかし、本開示内容の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な改変を実施しうることは理解されよう。従って、その他の実施形態も以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
2009543783.tif 000086
2009543783.tif 000087
【図２】
2009543783.tif 000088
2009543783.tif 000089
【図３】
2009543783.tif 000090
2009543783.tif 000091
【図４−１】
2009543783.tif 000092
【図４−２】
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2009543783.tif 000094
【図５】
2009543783.tif 000095
【図６】
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【図７】
2009543783.tif 000097
2009543783.tif 000098
【図８】
2009543783.tif 000099
2009543783.tif 000100
【図９】
2009543783.tif 000101
2009543783.tif 000102
【図１０】
2009543783.tif 000103
2009543783.tif 000104
【図１１】
2009543783.tif 000105
2009543783.tif 000106
【図１２】
2009543783.tif 000107
【図１３Ａ】
2009543783.tif 000108
【図１３Ｂ】
2009543783.tif 000109
【図１３Ｃ】
2009543783.tif 000110
【図１３Ｄ】
2009543783.tif 000111
【図１４】
2009543783.tif 000112
【図１５Ａ】
2009543783.tif 000113
【図１５Ｂ】
2009543783.tif 000114
【配列表】
2009543783000001.app
【国際調査報告】
2009543783.tif 000115