(57)【要約】  本発明は、前庭水管拡大症候群に関連するＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ部位突然変異を体外で特定する際に用いられるプライマーの製造方法に関する。当該製造方法は、以下の工程を含む：ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２突然変異部位Ａ→Ｇに基づいて、ＩＶＳ７−２部位（Ａ→Ｇ）を含むその上流および下流１〜１３塩基の領域内に任意の塩基置換変異を一つ導入してプライマー対を設計することにより、増幅生成物の中からＩＶＳ７−２野生型Ａ部位と変異型Ｇとを同定できる新たな制限酵素切断部位を得られる。本発明は、さらに上記の製造方法で製造されたプライマー、このプライマーを含むキット又は試薬又は類似製品、及びこのプライマーを用いて前庭水管拡大症候群のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ部位を含む突然変異を体外で特定する方法に関する。
2009528036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前庭水管拡大症候群のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇの突然変異を体外で特定するプライマー対の製造方法であって、
配列番号１に示すＰＤＳ遺伝子の第７、第８エクソンの配列及び両エクソン間の第７イントロンの配列に基づいて、生物ソフトウェアを利用又は利用せずに、配列番号１の配列の２５２位のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異部位を含む配列の増幅に用いるフォワード・プライマー及びリバース・プライマーを設計する工程を含み、
プライマー対は、この突然変異部位の上流および下流１〜１３塩基のうちの一つの塩基を置換して変異させることにより、増幅生成物の中からＩＶＳ７−２野生型Ａ部位と変異型Ｇとを同定しうる新たな制限酵素切断部位を得ることができることを特徴とする、
プライマー対の製造方法。
【請求項２】
ＰＤＳ遺伝子増幅テンプレートに対して、フォワード・プライマーの３’末端の２位にＴ−Ｃの人為的突然変異を導入することにより、増幅生成物の中で配列番号２に示す新たな制限酵素切断部位ＨｐａIIを得ることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー対の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法で製造したプライマー対であって、製造されたプライマー対のフォワード・プライマー又はリバース・プライマーの長さは、１０〜４０塩基、好ましくは１５〜３５塩基、より好ましくは１８〜３２塩基の範囲内であることを特徴とする、プライマー対。
【請求項４】
フォワード・プライマーは、配列番号３に示す配列を有し、かつ３’末端の２位にＴ−Ｃの人為的な突然変異を導入され、
リバース・プライマーは、配列番号４に示す配列を有し、
前記プライマー対は、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異部位に新たな制限酵素部位ＨｐａIIを導入することを特徴とする、
請求項３に記載のプライマー対。
【請求項５】
前庭水管拡大症候群のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を体外で特定するキット又は類似製品の製造における請求項３又は４に記載のプライマー対の使用。
【請求項６】
前庭水管拡大症候群のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ部位の突然変異を体外で特定する際に用いられる請求項３又は４に記載のプライマー対を含むキット／類似製品であって、
（１）ＰＣＲ増幅反応試薬；
（２）１：１の比で混合された請求項３又は４に記載のフォワード・プライマー及びリバース・プライマー；
（３）新たな制限酵素及びそれに対応する緩衝溶液；
（４）陽性対照サンプル及び陰性対照サンプル；及び、必要に応じて、
（５）使用説明書；
を含むことを特徴とする、キット／類似製品。
【請求項７】
血液サンプルからＤＮＡを抽出するために用いる試薬又はキットを含むことを特徴とする、請求項６に記載のキット／類似製品。
【請求項８】
血液サンプルからＤＮＡを抽出するために用いられる試薬又はキットは、主な成分がキレックス（Chelex）であるＤＮＡ溶解液の溶液Ｉを含む、足底血液サンプルのＤＮＡを抽出するために用いるＩ型のキット又は試薬；或いは末梢血サンプルからＤＮＡを抽出するために用いられる試薬を含むII型のキット又は試薬を含むことを特徴とする、請求項７に記載のキット／類似製品。
【請求項９】
前庭水管拡大症候群性難聴のＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を体外で特定する方法であって、
（１）請求項１又は２に記載の製造方法でプライマー対を製造し、サンプルのＰＣＲ増幅を行う、或いは請求項３又は４に記載のプライマー対を直接使用してサンプルの増幅を行う、或いは請求項６〜８のいずれかに記載のキット／類似製品を直接使用して野生型及び変異型のサンプルの増幅を行うことにより、同じ長さの断片の生成物を得る工程；
（２）プライマー対により増幅生成物の中に導入した新たな制限酵素部位に応じて、当該制限酵素を用いて増幅生成物に制限酵素切断を行う工程；
（３）ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を含む増幅生成物には新たな制限酵素切断部位が存在するため、酵素切断後に複数の断片が得られたか、ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を含まない増幅生成物には新たな制限酵素切断部位が存在しないため、切断後は１本の断片のみが得られたかを、酵素切断した生成物を電気泳動により分析する工程；及び
（４）酵素切断電気泳動の結果に基づいて、検体サンプルに前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異が存在するか否かを特定する工程；
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記プライマー対は、配列番号３に示すフォワード・プライマー及び配列番号４に示すリバース・プライマーであり；
前記新たな制限酵素はＨｐａIIであり；
前記同じ長さの断片の増幅生成物は１１４塩基対の増幅生成物であり；
前記ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を含む増幅生成物においては、酵素切断された後、８３〜８５塩基対及び２９〜３１塩基対の二組の断片が得られるのに対し、前記ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を含まない増幅生成物においては、酵素切断された後、依然として１１４塩基対の断片１本であることを特徴とする、
請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子突然変異を体外で特定するために用いられるプライマーの製造方法に関し、具体的には、前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子中のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を特定するプライマーの製造方法を提供する。本発明は、さらに当該製造方法により製造したプライマー及びプライマーを含むキット、および前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子中のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を体外で特定するための当該プライマー又はキットの使用も提供する。
【背景技術】
【０００２】
新生児の難聴発症率は１〜３／１０００である。難聴をもたらす原因は多いが、半数以上の児童期難聴は遺伝性の難聴であって、発症率は１／８００〜１／１０００（王錦玲、「前庭水管拡大症候群と波動性聴力喪失」、听力学及言語疾病雑誌、2003、11(2)：81-84）であり、重要な類型として、ＰＤＳ遺伝子（Pendred's syndrome gene）の突然変異によって引き起こされる前庭水管拡大症候群が挙げられる。１９７８年、Valvassori及びClemisは３７００例の側頭骨連続的断層撮影において５０例の前庭水管の拡大を発見し、これを「前庭水管拡大」と命名し、また臨床的に感音性難聴などの病状を伴うものを「前庭水管拡大症候群（ＬＶＡＳ：Large Vestlbular Aqueduct Syndrome）」と称した。この疾病は、出生時には聴覚が正常であるか、あるいは軽度から中、重度の聴力損失がある可能性がある。多数の患者は初期には良好な言語能力を備えるが、次第に聴覚が低下する。聴覚低下の誘因の多くは頭部の外傷、頭蓋内圧の上昇、感冒などである。また、ベッドからの落下、子供の遊び中や運動中の軽度の衝突なども明らかな聴覚低下をもたらす可能性があるため、早期発見及び適切な生活管理の実施により難聴の発症や進行を防ぐ事ができ、この疾病を予防することができる（汪吉宝、「前庭水管拡大症候群」、中華耳鼻咽喉科雑誌、2002、37：398-400）。
【０００３】
近年、海外の多くの研究によって前庭水管拡大症候群がＰＤＳ遺伝子の突然変異と密接な関係を持つことが明らかになった（Campbell C, Cucci RA, Green GE, et al. Pendred Syndrome, DFNB4 and PDS----identification for eight novel mutations and phenotype-genotype correlations. Human mutation, 2001,17:403-411； Scott DA, Wang R, Kreman, et al. Functional differences of the PDS gene product are associated with phenotypic variation in patients with Pendredsyndrome and non-syndromic hearing loss(DFNB4). Human Molecular Genetics,2000, 9:1709-1715）。ＰＤＳ（ＳＬＣ２６Ａ４：Solute carrier family）遺伝子は２１個のエクソンを含み、オープンリーディングフレームは２３４３ｂｐであり、７８０個のアミノ酸からなるタンパク質ペンドリン（Pendrin）をコーディングする。ペンドリンは主に疎水性アミノ酸からなり、イオントランスポーターに属し、研究によればその機能は主にヨウ素／塩素のイオン輸送に関係する。ほとんどすべてのＰＤＳ遺伝子の突然変異による難聴の遺伝型は常染色体劣性遺伝方式である。即ち、両親がキャリアの場合、１／４の子女には両親の突然変異したＰＤＳ遺伝子二つが遺伝して発症するが（劣性ホモ接合体）、２／４の子女には父親又は母親の突然変異したＰＤＳ遺伝子一つが遺伝してキャリアになり（発症しない優性へテロ接合体）、また１／４の子女には両親の正常なＰＤＳ遺伝子二つが遺伝してＰＤＳ遺伝子野生型個体になる（優性ホモ接合体）。
【０００４】
本発明者らによる前庭水管拡大症の中国人２９症例の研究において、２６症例で異なるＰＤＳ遺伝子突然変異が認められ、その中の１９症例がＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異であった。このことはＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異が前庭水管拡大症候群性難聴の重要な病因であることを示す。内モンゴル自治区赤峰市の難聴学生６３人のＰＤＳ遺伝子検出において、ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇホモ接合突然変異が５例、ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ接合突然変異が４例発見され、変異率は１４.２８％であった。この９例の患者は、もし早期に発見されれば、適時かつ適切な生活管理の実施によって外傷を防止し聴覚を保護することにより、聾唖者となることを避けることが可能であった。中国人健常者１００名に対するスクリーニングでＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ接合体当然変異が１例発見されたことにより、中国人健常者の中ではこの突然変異保有率は約１％と推定される。
【０００５】
本発明者らの研究によれば、ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇは中国の前庭水管拡大症患者の中で最も有力な遺伝子変異であり、高い発症率を有するが、ＰＤＳ遺伝子の塩基配列においては、ＩＶＳ７−２遺伝子部位のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異と野生型配列とを同定する適切な酵素切断部位がないため、通常は配列解析によってこの区域の突然変異を同定しているのみである。配列解析は遺伝子診断の標準的な方法であるものの、コストが高く、高価な設備を必要とするほかに、操作が複雑で高い技術が必要となり、時間的、人的なコストも高いことから、スクリーニングや普及に適していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、現在、前庭水管拡大症候群性難聴のＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異に対して幅広いスクリーニング及び迅速な診断を行うための、簡便な技術が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の原理に基づいて実施される：前庭水管拡大症候群性難聴を引き起こす変異ＰＤＳ遺伝子の突然変異部位（即ち配列番号１の配列中で２５２位のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ）で、生物ソフトウェアを利用又は利用せずに、特別なプライマーを設計し、人為的にＰＣＲによってＰＤＳ遺伝子にＩＶＳ７−２部位を含む新たな制限酵素部位を導入し、また被検サンプルのＰＣＲ生成物に対する制限酵素による切断の結果によって、前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異の検出結果を正確に取得する。
【０００８】
従って、本発明の第一の目的は、体外で前庭水管拡大症候群性難聴を含むＩＶＳ７−２突然変異部位Ａ→Ｇ突然変異を特定するプライマーの製造方法を提供することであって、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異部位（第７イントロンのブロック内で、ＰＤＳ ＩＶＳ７−２部位、即ち配列番号１の配列中の２５２位で、ＰＤＳ ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異、即ちこの部位の塩基Ａが突然変異で塩基Ｇに置き換わっており、この突然変異は重要なスプライス部位の突然変異であって、転写時に第８エクソンを消失させうる）に基づいて、生物ソフトウェアを使用し又は使用せず、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２部位を増幅するプライマーを設計するが、当該プライマーはＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ部位を含むその上流および下流の１〜１３塩基のうちの一つの塩基を置換して突然変異を導入することにより、ＩＶＳ７−２野生型（Ａ部位）と変異型（Ｇ）とを同定できる新たな制限酵素切断部位を取得することができる。
【０００９】
商品化された既知の最短の制限酵素認識部位は４塩基（例えばＣｖｉＪＩ、認識部位はRGCY）、最長の制限酵素認識部位は１３〜１４塩基（例えばＳｆｉＩは１３塩基、ＳｔｙＳＱＩは１４塩基）であるため、ＩＶＳ７−２部位（Ａ→Ｇ）を含むその上流および下流の１〜１３塩基のうちの一つの塩基を置換して突然変異を導入することが出来るプライマーは、いずれも本発明に適用することが可能である。従って、上記上流および下流の１〜１３個の塩基領域は、好ましくは１〜１０個の塩基、より好ましくは１〜８個の塩基、さらに好ましくは２〜６個の塩基、最も好ましくは２〜４個の塩基である。
【００１０】
本発明の目的は、さらに、コンピュータのプライマー設計ソフトウェアを利用して上記のプライマーの設計を実行する方法を提供する。利用するソフトウェアには下記のソフトウェアを含むが、これに限られない：Genetool Liteプログラム（米国Biotools社が提供するソフトウェア）、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNASTAR、DNAtool、proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等。
【００１１】
本発明の第二の目的は、上記の方法により製造される、フォワード・プライマー（Ｆ１）及びリバース・プライマー（Ｒ１）を含むプライマーを提供することである。そのプライマーの長さは１０〜４０ｂｐの範囲であり、好ましくは１５〜３５ｂｐ、より好ましくは１８〜３２ｂｐである。
【００１２】
また、本発明の目的は、さらに、上記の方法により製造される具体的なプライマー配列を提供することである。そのプライマー配列には、長さ３０ｂｐのフォワード・プライマー配列（配列番号３）、５’TGGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCC３’、但し３’末端の２位に人為的なＴ−Ｃ突然変異を導入する、及び長さ２０ｂｐのリバース・プライマー配列（配列番号４），５’CCCTTGGGATGGATTTAACA３’を含む。
【００１３】
本発明の第三の目的は、上記のプライマーを含み、かつ、前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ突然変異遺伝子を体外で特定するキット又は類似製品を提供することである。当該キット又は類似製品には、ＰＣＲ増幅反応試薬と、１：１で混合された上記フォワード・プライマー及びリバース・プライマーと、新たな制限酵素及びそれに対応する緩衝溶液と、陽性対照サンプル及び陰性対照サンプルと、使用説明書とが含まれる。上記キット又は類似製品の主な機能は、全部の試薬を小さいケースに統合して、キット又は類似製品の試薬に基づいて核酸断片の増幅や酵素切断同定が順番に行われることである。
【００１４】
上記のキット又は類似製品には、さらに、血液サンプルのＤＮＡを抽出するキット又は試薬を含めることも可能である。これらのキット又は試薬は、血液サンプルのＤＮＡを抽出する試薬を除いては、その他の組成は同一である。Ｉ型キット又は試薬には、足底血液サンプルのＤＮＡを抽出するために用いられるＤＮＡ溶解液の溶液Ｉを含み、その主な成分はキレックス（Chelex）（５％キレックス，０．１％ ＳＤＳ，１％ ＮＰ４０，１％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ＡＢＩ社製品）であり、II型キット又は試薬には、末梢血液サンプルのＤＮＡを抽出するキット（上海華舜生物工程有限公司）が含まれる。
【００１５】
本発明の目的は、さらに、
１、必要に応じて、足底血液又は末梢血液サンプルのＤＮＡを抽出する試薬又はキット；
２、ｄＮＴＰや１０×ＰＣＲ緩衝溶液、Ｍｇ＋＋、三次蒸留水、Ｔａｑ酵素などを含むＰＣＲ増幅反応試薬；
３、１：１で混合されたフォワード・プライマー（配列番号３）及びリバース・プライマー（配列番号４）；
４、制限酵素ＨｐａII及びそれに対応する緩衝溶液；
５、陽性対照サンプル及び陰性対照サンプル；及び
６、使用説明書
を含む、新たな制限酵素部位ＨｐａII導入のためのキットを提供する。
【００１６】
本発明の第四の目的は、前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を体外で特定する方法を提供することである。当該方法は以下の工程を含む：上記のプライマーの製造方法によってＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２を増幅するために用いられるプライマーを設計し、そのプライマーはＩＶＳ７−２部位（Ａ→Ｇ）を含むその上流および下流の１〜１３塩基のうちの１個の塩基を置換して変異を導入し、それによってＩＶＳ７−２野生型（Ａ部位）と変異型（Ｇ）とを同定できる新たな制限酵素切断部位を取得できる；或いは、上記の方法で製造したプライマーを直接利用し、或いは上記のキット／類似製品を直接利用して、上記のプライマーを用いて検体サンプルを増幅し、フォワード・プライマーの３’末端付近と増幅テンプレートとの間に１個の部位特異的突然変異が存在するものの、フォワード・プライマー及びリバース・プライマーのＰＣＲ効率には影響しないため、野生型及び変異型のサンプルにおいて同じ長さの増幅生成物を得る事が出来る；上記の新たな制限酵素を用いて増幅生成物に対して酵素切断同定を行い、その中で野生型サンプルの増幅断片には突然変異した新たな制限酵素切断部位が含まれないため新たな制限酵素によって酵素切断されないが、変異型サンプルの増幅生成物には新たな酵素切断部位が含まれるため酵素切断され、それによってＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２のＡ→Ｇ突然変異のサンプルを同定出来る。
【００１７】
上記の方法において、前記上流および下流の１〜１３個の塩基領域は、好ましくは１〜１０個の塩基、より好ましくは１〜８個の塩基、さらに好ましくは２〜６個の塩基、最も好ましくは２〜４個の塩基である。
【００１８】
上記の方法において、さらに、コンピュータのプライマー設計ソフトウェアを利用して上記のプライマーを設計する方法を含めることも可能である。利用するソフトウェアには下記のソフトウェアを含むが、これに限られない：Genetool Liteプログラム（米国Biotools社が提供するソフトウェア）、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNAtool、Proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等。
【００１９】
本発明の目的は、さらに、ＰＤＳ遺伝子に対する新たな制限酵素部位ＨｐａIIの導入に関する特定の方法を提供することである。当該方法は以下の工程を含む：ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２部位を増幅するために用いられるプライマー対（配列番号３，４）を設計し、当該プライマーはＩＶＳ７−２部位（Ａ→Ｇ）を含むその上流および下流の２〜４塩基のうちの一個の塩基を置換して変異を導入することによって、ＩＶＳ７−２の野生型(Ａ部位)と変異型(Ｇ)の同定が出来る新たな制限酵素切断部位ＨｐａIIを得ることができる；必要に応じて被検サンプルのＤＮＡを抽出して増幅テンプレートを取得する；上記のプライマー対（配列番号３，４）を用いて増幅テンプレートに対してＰＣＲ増幅を実施する；野生型及びＰＤＳ ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異サンプルはいずれも増幅されて１１４ｂｐの増幅断片を形成することができ、実際のアガロースゲル電気泳動で１００ｂｐ以上の明晰なバンドが認められることが実証されることにより、フォワード・プライマー（配列番号３）３’末端の２番目の塩基とテンプレートとのミスマッチはＰＣＲ効果に影響を与えない事が証明される；ＰＣＲ生成物に対してＨｐａII酵素切断を行った場合、ＰＣＲ生成物にはＰＤＳ ＩＶＳ７−２部位を含み、テンプレートがＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ変異型であれば、１１４ｂｐのＰＣＲ生成物にＨｐａII酵素切断部位が存在するため、ＨｐａII酵素切断後に８３〜８５ｂｐ及び２９〜３１ｂｐの２組の断片を得られるが、テンプレートがＩＶＳ７−２野生型であれば、１１４ｂｐのＰＣＲ生成物にＨｐａII酵素切断部位が存在しないため、ＨｐａIIによって切断されず、酵素切断後も依然として１１４ｂｐの断片１本のみである；酵素切断電気泳動の結果、検体サンプル中に前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異が存在するか否かを特定することができる。
【００２０】
上記の新たな制限酵素のＨｐａII部位を特定する方法において、そのプライマー対の設計は、Genetool Liteプログラム（米国Biotools社が提供するソフトウェア）、Vector NTI、Oligo、Genestar、DNAMAN、DNAtool、Proteintool、Enzyme、pDRAW、Primer3、Primer5、Seq Convertor、DNAassist等のコンピュータのプライマー設計ソフトウェアによって完成することができる。
【００２１】
上記の新たな制限酵素のＨｐａII部位の特定に関する方法において、サンプルＤＮＡの抽出及びＰＣＲ、酵素切断は、プライマー対（配列番号３又は４）及び新たな制限酵素のＨｐａII部位に関するキット又は試薬によって完成することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異の検出方法を用いると、既存の技術による検出方法（配列解析法）と比較して以下の利点がある：
本発明の制限酵素を用いた酵素切断法は、操作工程が簡単で、所要時間は４時間である；用いる試薬は通常用いられる生物化学試薬であってコストが低く、用いるＰＣＲ装置及び電気泳動設備も、ともに分子生物実験室及び検査実験室の標準設備である。これらの特徴はＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異のスクリーニング及び前庭水管拡大症予防を全国規模で実施するために便利な条件を提供することにより、前庭水管拡大症候群患者の難聴の発症を抜本的に減らすことができる。これに対し、配列解析法は配列測定装置（シーケンサー）を必要とし、操作は技術的に複雑で、検出に３〜７日間必要となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に記載する参考となる実施例を参照することにより、本発明をより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は事例に過ぎず、いかなる形式によっても本発明を限定するものではない。他の説明がない限り、本発明の実施例には本分野の従来の分子生物学及び細胞生物学、ＰＣＲ増幅、突然変異技術などを使用する。これらは当業者にとって周知の技術であり、文献にも詳しく説明されている。例えば、Sambrook and Russell "Molecular Cloning：A Laboratory Manual" (2001)；Cloning：A Practical Approach，"Volumes I and II(D.N.Glover， ed.，1985)"；T.A Brown  "Genome" BIOS Scientific Publishers Limited.等を参照。
【実施例】
【００２４】
実施例１：難聴患者集団におけるＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２突然変異の検出
１．検出サンプル
難聴患者６６例（いずれも赤峰市聾唖学校の学生）及び聴力正常者１００例を選択し、被験者から末梢全血ＤＮＡを抽出して（キットによる方法、上海華舜生物工程有限公司）検出サンプルとする。純音聴力検出により、すべての難聴患者が中度又は重度の難聴であることを確認した。
【００２５】
２．プライマーの設計
プライマー設計の指針はＰＤＳ ＩＶＳ７−２部位（即ち配列番号１の配列の２５２位）に隣接する２〜４個の塩基に塩基置換を導入して、ＩＶＳ７−２野生型（Ａ）と変異型（Ｇ）を同定出来る新たな制限酵素切断部位を作った。Genetool Liteプログラムを補助的に用いてプライマーを設計した。フォワード・プライマーは長さ３０ｂｐであって、ＰＤＳ ＩＶＳ７−４部位にＴ−Ｃ変異を導入し、リバース・プライマーは２０ｂｐであって、野生型ＰＤＳ遺伝子の順方向配列と完全に相補する。フォワード・プライマー配列（配列番号３）は５’TGGAGTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTCC３’であり、リバース・プライマー配列（配列番号４）は５’CCCTTGGGATGGATTTAACA３’である。野生型及びＰＤＳ ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異サンプルのいずれにおいても、１１４ｂｐの増幅断片を形成することが出来る。ＰＣＲ生成物にはＰＤＳ ＩＶＳ７−２部位を含んでいるため、テンプレートがＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ変異型であれば、１１４ｂｐのＰＣＲ生成物にＨｐａII酵素切断部位が存在し、ＨｐａII酵素切断後に８３〜８５ｂｐ及び２９〜３１ｂｐの２組の断片を得られるが、テンプレートがＰＤＳ ＩＶＳ７−２野生型であれば、１１４ｂｐのＰＣＲ生成物にＨｐａII酵素切断部位が存在しないため、ＨｐａIIによって酵素切断されることはなく、酵素切断後も依然として１１４ｂｐの断片１本のみである。
【００２６】
３．ＰＣＲ増幅反応
上記の設計したフォワード・プライマー及びリバース・プライマーの配列に基づいて、人工合成（所定の配列に基づいて自動核酸合成装置で合成）してフォワード・プライマーＦ及びリバース・プライマーＲを取得し、上記で抽出した検体サンプルの末梢血のＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅反応を実行する。
反応系：
テンプレート                        ５０ｎｇ
プライマーＦ１，Ｒ１        それぞれ５０ｎｇ
１０×ｄＮＴＰ                        ５μｌ
１０×緩衝溶液                        ５μｌ
Ｍｇ＋＋            最終濃度１．５ｍｍｏｌ／ｌ
Ｔａｑ酵素                          １．０ｕ
三次蒸留水を体積が５０μｌとなるまで加える。
【００２７】
反応条件：
９５℃で５分間変性させた後、続いて９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間伸長などの処理を合計３０サイクル行う。最後に７２℃でさらに７分間伸長させる。
２．５％のアガロースゲル電気泳動で生成物を検出する。ＰＣＲ増幅した後、Ｆ１Ｒ１は明晰で１００ｂｐよりやや大きいバンドを得られる。フォワード・プライマー３’側の２番目の塩基とテンプレートとのミスマッチはＰＣＲ効率に全く影響を与えないことが証明される。
【００２８】
４．ＨｐａII酵素切断検出
上記のＰＣＲ生成物はＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２部位を含み、テンプレートがＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ変異型であれば、１１４ｂｐのＰＣＲ生成物にＨｐａII酵素切断部位が存在するため、ＨｐａIIによって酵素切断された後に８３〜８５ｂｐ及び２９〜３１ｂｐの２組のバンドが得られる（ゲル上では８３〜８５ｂｐを示すバンド１本のみが認められる）が、テンプレートがｍｔＤＮＡ野生型であれば、１１４ｂｐのＰＣＲ生成物にＨｐａII酵素切断部位が存在しないため、ＨｐａIIによって切断されることはなく、酵素切断後も依然として１１４ｂｐのバンド１本である。
以下の条件によって、検体サンプルのＰＣＲ増幅生成物のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を検出する。
酵素切断反応系：
ＰＣＲ生成物                １２〜１８μｌ
１０×緩衝溶液                      ３μｌ
ＨｐａII制限酵素                ５〜１０ｕ
ＢＳＡ                          ０．３μｌ
体積が５０μｌになるまで三次蒸留水を加え、３７℃で１時間インキュベートし、２．５％のアガロースゲルで酵素切断反応物を検出する。
【００２９】
５．結果
酵素切断後のゲル電気泳動検出において、６６例の難聴患者のうち５７例において、１００ｂｐより大きいバンド１本のみが認められ、ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異が含まれないことを示している。４例において１００ｂｐより大きいバンド１本及び１００ｂｐより小さいバンド１本が認められ、大きいバンドは小さいバンドよりも明るく、ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇのヘテロ変異体であることを示している。５例に１００ｂｐより小さいバンド１つが認められ、ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇのホモ接合突然変異であることを示している（部分データは図１を参照）。
【００３０】
６．ＨｐａII酵素切断法の信頼性検定
酵素切断検出によってＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇホモ接合突然変異の存在が示された５例のＤＮＡサンプルに対して第７エクソン及び第８エクソンの直接配列検出を行って、ＩＶＳ７−２部位にＡ→Ｇのホモ接合置換が存在することを実証した。酵素切断検出によってＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ変異の存在が示された４例のＤＮＡサンプルに対して第７エクソン及び第８エクソンの直接配列検出を行って、ＩＶＳ７−２部位にＡ→Ｇのヘテロ置換が存在することを実証した。酵素切断検出によってＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異が存在しないことが示された１１例のＤＮＡサンプルに対して第７エクソン及び第８エクソンの直接配列検出を行って、ＩＶＳ７−２部位が正常であることを実証した（図２を参照）。その後、側頭骨ＣＴ検査によってＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異（ホモ接合又はヘテロ接合）した９例のいずれも前庭水管の拡大が認められること、陰性の個体には前庭水管の異常が認められないことを実証した（表１を参照）。
【表１】
2009528036.tif 000003
【００３１】
実施例２：足底血液から抽出したＤＮＡのＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２変異の検出
１．足底血液に適用するＩ型キット（１００人分）は下記の組成を有する：
（１）溶液Ｉ（主な成分は５％のキレックス）２５ｍｌ；
（２）ＰＣＲ試薬（８ｍＭ ｄＮＴＰ １５０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液１ｍｌ、２５ｍＭ Ｍｇ＋＋溶液１ｍｌ、三次蒸留水１ｍｌ×４本、５ｕ／μｌ Ｔａｑ酵素２５μｌ）；
（３）フォワード・プライマーＦ１及びリバース・プライマーＲ１（実施例１と同様）を１：１で混合したもの（濃度は全て１０ｎＭ）計１５０μｌ；
（４）制限酵素ＨｐａII ２０ｕ／μｌ、１１０μｌ及び対応する１０×緩衝液１ｍｌ；
（５）陽性対照サンプル１２５μｌ、陰性対照サンプル１２５μｌ；
（６）使用説明書。
【００３２】
２．被検者
ＣＴ検査で前庭水管の拡大が実証され、かつＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇのホモ接合体突然変異キャリアである患者１例、その患者の聴覚が正常な両親（ともにヘテロ接合体突然変異キャリア）、及びＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ変異がない聴覚正常者２例を被検者とした。
【００３３】
３．検出方法及び結果
本キットの使用説明書に沿って、溶液Ｉ（主な成分は５％のキレックス）を用いて被検者の足底血液ＤＮＡを抽出し、５０ｎｇ取ってテンプレートを作製する。プライマー混合物１００ｎｇ、１０×ｄＮＴＰ ５μｌ及び１０×緩衝液５μｌを添加して、Ｍｇ＋＋の最終濃度を１．５ｍｍｏｌ／Ｌとし、５０μｌになるまで三次蒸留水を加えた後、Ｔａｑ酵素を１．０ｕ加え、９５℃で５分間変性させた後、続いて９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間伸長などの処理を合計３０サイクル行う。最後に７２℃でさらに７分間伸長させる。同様のＰＣＲ反応条件で、キット内のＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ接合体変異の陽性テンプレート及び陰性テンプレートを用いて、同時に陽性及び陰性対照のＰＣＲ反応を実施し、あわせてテンプレートのないＰＣＲブランク対照チューブを準備し、反応後に２．５％アガロースゲル電気泳動で増幅生成物を検出する。その結果、テンプレートのない対照物では増幅生成物は認められず、被検患者、その両親、正常被検者、陽性及び陰性対照サンプルのＰＣＲ生成物はいずれも１１４ｂｐであった。ＰＣＲ生成物に対してＨｐａII酵素切断検出を実行する。酵素切断反応系は３０μｌで、
１０×緩衝液              ３μｌ
１００  ＢＳＡ        ０．３μｌ
ＨｐａII                  ２０ｕ
ＰＣＲ生成物      １２〜１８μｌ
を含む。
【００３４】
体積が３０μｌになるまで三次蒸留水を補充し、３７℃で１時間インキュベートする。２．５％アガロースゲル電気泳動法で酵素切断反応物の検出を行い、前庭水管拡大性難聴患者１例の酵素切断生成物において８３〜８５ｂｐのバンドが認められたことは、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇホモ接合体変異であることを示しており、前庭水管拡大性難聴患者の両親及び陽性対照の酵素切断生成物において８３〜８５ｂｐ及び１１４ｂｐのバンドが認められたことは、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ接合体変異であることを示しており、聴覚正常者２例及び陰性対照において１１４ｂｐのバンドのみが認められたことは、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ変異が存在しないことを示している。さらに配列検査を行って、この患者がＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇホモ接合体変異のキャリアであり、その両親がＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ接合体変異のキャリアであるという、キャリアの状態にあることを実証し、聴覚正常者２例がいかなるＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ変異も有していないことを実証する。
【００３５】
実施例３：体外でＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２の突然変異を検出するII型キット及びその使用
本実施例において選択した被検者は実施例２と同様である。被検サンプルが末梢血である事と、キット内の血液サンプルＤＮＡ抽出試薬が市販の末梢血ＤＮＡ抽出試薬であって、当該キットを用いて末梢血ＤＮＡを抽出する事を除いては、キット内のその他の組成及び検出方法は実施例２と同様である。検出の結果は実施例２と全く同じであった。即ち、前庭水管拡大性難聴患者１例の酵素切断生成物において８３〜８５ｂｐのバンドが認められたことは、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇホモ接合体変異であることを示しており、前庭水管拡大性難聴患者の両親及び陽性対照の酵素切断生成物において８３〜８５ｂｐ及び１１４ｂｐのバンドが認められたことは、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ接合体変異であることを示しており、聴覚正常者２例及び陰性対照において１１４ｂｐのバンドのみが認められたことは、ＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ変異が存在しないことを示している。
【００３６】
実施例４：体外でＰＤＳ遺伝子のＩＶＳ７−２突然変異を検定するIII型キット及びその使用
本実施例において選択した被検者は実施例２と同様である。そして被検サンプルが血液サンプルから抽出されたＤＮＡである事と、キット内に血液サンプルのＤＮＡ抽出試薬を含んでいない事を除いては、キット内のその他の組成及び検出方法は実施例２と同様である。検出の結果は実施例２と全く同じであった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は前庭水管拡大症候群性難聴に関連するＰＤＳ遺伝子の突然変異を体外で特定するプライマー及びキットに関する。上記遺伝子変異による前庭水管拡大症候群性難聴を迅速にスクリーニング及び診断し、予防を行って、前庭水管拡大症候群患者の難聴発症頻度を減らすことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＨｐａII酵素切断法でＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇ突然変異を同定するための２．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す図。レーンｂ，ｃ：ＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇヘテロ接合体突然変異患者；レーンｆ，ｏ：ＰＤＳ遺伝子ＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇホモ接合体突然変異患者；レーンａ，ｘ：識別マーカー（１００塩基対間隔）；その他のレーン：正常な野生型個体。
【図２】配列解析により酵素切断結果の正確性を実証する図。左：酵素切断されず、配列解析でもＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇが現れなかった（例えばレーンｄ）；中：酵素切断の結果、２本のバンドが認められ、配列解析によりＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇへテロ接合であることが確認された（レーンｂ，ｃ）；右：酵素切断の結果、バンドが全部切断され、又は小さいバンドが大きいバンドより明るいと認められ、配列解析によりＩＶＳ７−２ Ａ→Ｇホモ接合突然変異であることが確認された（レーンｆ，ｏ）。
【図１】
2009528036.tif 000004
【図２】
2009528036.tif 000005
【配列表】
2009528036000001.app
【国際調査報告】
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