(57)【要約】  生物活性である多タンパク質複合体を単離かつ使用する方法が提供される。その複合体は、１種または複数種の対象タンパク質（例えば、受容体、イオンチャネル等）と、ホスファターゼ、キナーゼおよびシナプス後密度成分などの関連する足場タンパク質とを含有する。変性剤を含有せず、多タンパク質複合体を単離するために使用することができるバッファー、生物活性多タンパク質複合体を含有するタンパク質アレイも提供される。このタンパク質アレイは、例えばハイスループットスクリーニングアッセイに使用することができる。
2009532680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数種の対象タンパク質と、
１種または複数種の足場タンパク質と、
を含む、生物活性を維持する状態の生体外の単離多タンパク質複合体。
【請求項２】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、多量体である、請求項１に記載の単離多タンパク質複合体。
【請求項３】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、受容体およびイオンチャネルからなる群から選択される、請求項１に記載の単離多タンパク質複合体。
【請求項４】
前記の１種または複数種の足場タンパク質が、ホスファターゼ、キナーゼ、およびシナプス後密度構成成分からなる群から選択される、請求項１に記載の単離多タンパク質複合体。
【請求項５】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体である、請求項１に記載の単離多タンパク質複合体。
【請求項６】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、γ−アミノ酪酸受容体である、請求項１に記載の単離多タンパク質複合体。
【請求項７】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、α−７ニコチン性アセチルコリン受容体である、請求項１に記載の単離多タンパク質複合体。
【請求項８】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル−ＨＣＮ４である、請求項１に記載の単離多タンパク質複合体。
【請求項９】
基体；
前記基体と結合された１種または複数種の単離多タンパク質複合体；
を含むアレイであって、
前記の１種または複数種の単離多タンパク質複合体が、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含み、かつ前記の１種または複数種の単離多タンパク質複合体が生物活性である、アレイ。
【請求項１０】
前記の１種または複数種の単離多タンパク質複合体が、前記基体に結合された抗体を介して前記基体上に固定化され、前記抗体が、前記の１種または複数種の対象タンパク質に特異的である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、多量体である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１２】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、受容体およびイオンチャネルからなる群から選択される、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記の１種または複数種の足場タンパク質が、ホスファターゼ、キナーゼ、およびシナプス後密度構成成分からなる群から選択される、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、γ−アミノ酪酸受容体である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、α−７ニコチン性アセチルコリン受容体である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１７】
前記の１種または複数種の対象タンパク質が、環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル−ＨＣＮ４である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１８】
前記基体が、マルチウェルプレートである、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記単離多タンパク質複合体が、ハイスループットスクリーニングに適した手法で前記基体と結合される、請求項９に記載のアレイ。
【請求項２０】
生物活性を維持する状態で生体外で単離多タンパク質複合体を提供する段階であって、前記多タンパク質複合体が、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含む段階；
前記単離多タンパク質複合体を１種または複数種の物質にさらす段階；
前記の１種または複数種の物質に対する、前記多タンパク質複合体の生物活性または化学反応性の有無を検出する段階；
を含む、生物活性または化学反応性をアッセイする方法。
【請求項２１】
前記提供段階が、溶液または懸濁液中の前記単離多タンパク質複合体で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記提供段階が、基体と結合された前記単離多タンパク質複合体で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離多タンパク質複合体が、ハイスループットスクリーニングに適した手法で前記基体と結合される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出段階によって、以下の：化学発光、表面プラズモン共鳴、リン光、蛍光、および紫外・可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）特性のうちの少なくとも１つの変化が検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物活性が、リン酸化の変化およびタンパク質間相互作用の変化からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
多タンパク質複合体が生物活性を維持する状態で生体外で存在するように、生体試料から多タンパク質複合体を単離する段階；
を含む、生物活性または化学反応性のアッセイを準備する方法であって、前記多タンパク質複合体が、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含む、方法。
【請求項２７】
前記単離段階で、
１種または複数種の非変性洗剤、
１種または複数種の還元剤、
１種または複数種の緩衝剤、
１種または複数種のキレート剤、
１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤、
を含む組成物が用いられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２％β−メルカプトエタノール、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含み、かつｐＨ約７．５を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生物活性を保持する状態の生体外の単離多タンパク質複合体であって、前記単離多タンパク質複合体が、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含み、前記単離多タンパク質複合体が非変性バッファー中に存在する、単離多タンパク質複合体；
反応バッファー；
ブロッキングバッファー；
使用説明書；
を含むキット。
【請求項３０】
前記単離多タンパク質複合体が、基体上に固定化される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記単離多タンパク質複合体が、溶解状態である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記単離多タンパク質複合体に選択的に結合する抗体をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記抗体が、検出可能な標識に結合される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記の検出可能な標識が、蛍光色素である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記抗体に結合するための検出可能な標識をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、生物活性である多タンパク質複合体を単離かつ使用する方法に関する。特に、本発明は、生物活性状態の多タンパク質複合体を単離するために使用されるバッファー、およびかかるバッファーを使用して単離される生物活性多タンパク質複合体を含有するタンパク質アレイ、ならびにハイスループットスクリーニングアッセイでのその使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー会社は、治療能力を有するリード化合物を同定するために、スクリーニング方法および技術を益々頼りにしている。かかる方法は一般に、核酸およびタンパク質などの生物学的に関連性のある固定化分子の使用を要する。核酸を操作する技術は、一部、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の相対的な単純性およびそれらが受けるハイブリダイゼーション反応のためにかなり開発されている。それと対照的に、タンパク質アレイの開発は、タンパク質−リガンド相互作用が複雑であるため、はるかに難しい。
【０００３】
いくつかの因子がこの複雑性の一因となっている。タンパク質を構成する２０種（共通）のアミノ酸はそれぞれ固有であり、大きく異なる化学的性質を有する。したがって、それぞれがその特有のアミノ酸組成を有する個々のタンパク質も、互いに大きく異なり、大きく異なる生物活性を示す。さらに、直線一次構造に加えて、天然「折り畳み」タンパク質は、適切な機能に必要である、特有の二次（時に三次および四次）立体構造要素を有する。この天然構造の維持は一部、周囲の環境（例えば、ｐＨ、温度、培地の親水性／疎水性等）に依存する。さらに、その特有の活性を発揮するために、タンパク質は、他の生体分子と接触していなければならない場合が多い。例えば、多くのタンパク質には、活性であるために、種々の補助因子、活性化因子、および／または他のタンパク質（例えば、足場タンパク質）の存在が必要である。したがって、適切なタンパク質の機能に必要な、生体内と同様な条件の生体外での再現は、非常に難しい。
【０００４】
それにもかかわらず、ある範囲の用途用の多くのタンパク質アレイをベースとする製品が売り出されている。多くのタンパク質（またはポリペプチドまたはペプチド）が表面上に固定され、かつ可溶性タンパク質との特異的相互作用（例えば、生体試験試料において）が検出される、いわゆる相互作用タンパク質アレイの開発において、進歩が遂げられている。固定化タンパク質と可溶性タンパク質とのかかる相互作用は、生体内で細胞または生物体液中で起こる生化学的現象を模倣するように意図される。しかしながら、かかるバイオチップで得られたデータの生理学的関連性は疑わしい。細胞環境において、生化学反応は、反応物が適切に並列している（例えば、細胞内コンパートメントにおいて、細胞表面上で、等）場合のみ起こる。バイオチップの表面上に集合する生体分子は実際に、生体内で共局在する場合もあるし、しない場合もあり、逆に生体内で集合する生体分子は、バイオチップの表面で適切に結合する場合もあるし、しない場合もある。
【０００５】
細胞シグナル伝達に関与するものなど、大型多タンパク質複合体を扱う場合、この問題は特に重大である。大型多タンパク質複合体となる、受容体およびシグナル伝達タンパク質のアセンブリは、細胞シグナル伝達の一般的なメカニズム（review, Pawson and Scott, 1997参照）、およびリン酸化、グリコシル化などのプロセスとして明らかになっており、タンパク質間相互作用は、受容体機能の主要な制御因子であるとみなされる。多くの細胞プロセスにおけるその重要性から、かかる複合体を単離かつ使用する方法は、大変必要とされている。残念ながら、かかるタンパク質複合体の免疫沈降に通常使用されるバッファーは一般に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、および／または受容体自体の活性、もしくは受容体の周囲にあり、かつ生体内で受容体と相互作用するタンパク質、例えばキナーゼおよびホスファターゼなどの活性を変化させることができる他の洗剤を含有する。
【０００６】
今まで、先行技術では、生物活性状態で多タンパク質複合体を確実に単離する方法を提供することは不成功に終わっていた。今まで、先行技術では、複合体におけるタンパク質間の生体内での結合が維持される、固定化された生物活性多タンパク質複合体のアレイを提供することも不成功に終わっていた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、機能性生物活性多タンパク質複合体の抽出、単離、および使用の方法を提供する。かかる多タンパク質複合体は、その足場または支持タンパク質（例えば、ホスファターゼ、キナーゼ、シナプス後密度構成成分、アンカータンパク質、シャペロンおよびアダプタータンパク質等）と共に、対象の少なくとも１種類の主要なタンパク質（例えば、イオンチャネル、受容体等）の両方を含む。本明細書において説明されるように、本発明の方法により単離される生物活性多タンパク質複合体は、生体外でうまく固定化することができ、診断および試験に使用することができる。重要なことには、単離された固定化多タンパク質複合体で起こる生化学的現象が、脳スライスおよび心臓組織で起こる現象を忠実に模倣することが証明された。かかる固定化複合体は、タンパク質およびハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アレイ、研究および創薬の他の手段を構築するために使用することができる。
【０００８】
その生物活性を保持する状態で生体外で単離多タンパク質複合体を提供することが本発明の目的である。この複合体は、１種または複数種の対象タンパク質および１種または複数種の足場タンパク質を含む。一実施形態において、対象タンパク質は多量体であり、対象タンパク質は、例えば受容体またはイオンチャネルであることができる。足場タンパク質は、例えば、ホスファターゼ、キナーゼ、およびシナプス後密度構成成分であることができる。一実施形態において、対象タンパク質は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体である。他の実施形態において、対象タンパク質は、γ−アミノ酪酸受容体である。他の実施形態において、対象タンパク質は、α−７ニコチン性アセチルコリン受容体である。さらに他の実施形態において、対象タンパク質は、環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル−ＨＣＮ４である。
【０００９】
本発明は、基体；基体と結合した１種または複数種の単離多タンパク質複合体；を含むアレイも提供する。その１種または複数種の単離多タンパク質複合体は、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含み、かつその１種または複数種の単離多タンパク質複合体は生物活性である。本発明の一実施形態において、１種または複数種の単離多タンパク質複合体は、基体に結合した抗体によって基体上に固定化され、その抗体は、複合体の構成成分、例えば対象タンパク質のサブユニットに対して特異的である（またはそれに選択的に結合する）。一実施形態において、対象タンパク質は多量体であり、対象タンパク質は、例えば受容体またはイオンチャネルであることができる。足場タンパク質は、例えば、ホスファターゼ、キナーゼ、およびシナプス後密度構成成分であることができる。一実施形態において、対象タンパク質は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体である。他の実施形態において、対象タンパク質は、γ−アミノ酪酸受容体である。他の実施形態において、対象タンパク質は、α−７ニコチン性アセチルコリン受容体である。さらに他の実施形態において、対象タンパク質は、環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル−ＨＣＮ４である。一実施形態において、アレイはマルチウェルプレートである。さらに他の実施形態において、単離多タンパク質複合体は、ハイスループットスクリーニングに適した手法で基体と結合される。
【００１０】
本発明はさらに、生物活性または化学反応性をアッセイする方法を提供する。この方法は：１）生物活性を保持する状態で生体外で単離多タンパク質複合体を提供する段階であって、その多タンパク質複合体が、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含む段階；２）その単離多タンパク質複合体を１種または複数種の物質にさらす段階；３）その１種または複数種の物質に対する、多タンパク質複合体の生物活性または化学反応性の有無を検出する段階；を含む。一実施形態において、その提供段階は、溶液または懸濁液中の単離多タンパク質複合体で行われる。他の実施形態において、提供段階は、基体と結合された単離多タンパク質複合体で行われる。単離多タンパク質複合体は、ハイスループットスクリーニングに適した手法で基体と結合されることができる。検出段階では、以下の：化学発光、表面プラズモン共鳴、リン光、蛍光、および紫外・可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）特性のうちの少なくとも１つにおける変化が検出される。一実施形態において、生物活性は、リン酸化における変化である。他の実施形態において、生物活性は、タンパク質間相互作用における変化である。
【００１１】
本発明はさらに、生物活性または化学反応性のアッセイを準備する方法を提供する。この方法は、多タンパク質複合体がその生物活性を保持する状態で生体外で存在するように、生体試料から多タンパク質複合体を単離する段階を含む。多タンパク質複合体は、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含む。本発明の一実施形態において、単離段階では、１種または複数種の非変性洗剤、１種または複数種の還元剤、１種または複数種の緩衝剤、１種または複数種のキレート剤、および１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤を含む組成物が用いられる。一実施形態において、その組成物は、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２％ β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニルを含み、ｐＨ約７．５を有する。
【００１２】
本発明はさらに、１）その生物活性を保持する状態の生体外での単離多タンパク質複合体であって、その単離多タンパク質複合体が、１種または複数種の対象タンパク質と、１種または複数種の足場タンパク質とを含み、単離多タンパク質複合体が非変性バッファー中に存在する、単離多タンパク質複合体；２）反応バッファー；３）ブロッキングバッファー；４）使用説明書；を含むキットを提供する。その単離多タンパク質複合体は、基体上に固定化されてもよいし、または溶解状態であってもよい。一実施形態において、このキットはさらに、受容体サブユニットのリン酸化残基、受容体サブユニット自体、および／または複合体における他のタンパク質を検出するための抗体を含む。その抗体は、蛍光色素などの検出可能な標識に結合される。代替方法としては、キットの最終使用者によって抗体に結合される、検出可能な標識を提供することができる。
【００１３】
本発明の好ましい実施例の詳細な説明
本発明は、機能性、生物活性多タンパク質複合体を抽出および単離する方法、ならびにそれを生体外で使用する方法を提供する。このような生体外での使用中、複合体は、その天然状態（native）を保ち、足場タンパク質との生体内での結合を保つ条件下で、単離および維持されることから、その生物活性を保持する。したがって、このように単離されたタンパク質複合体の状態は、生体内でのタンパク質複合体の状態によく似ている。かかる多タンパク質複合体は一般に、生体内で対象タンパク質と結合される１種または複数種の足場または支持タンパク質と共に、少なくとも１種類の主要なまたは主な対象タンパク質を含む。対象タンパク質は、単一または複数のサブユニット（複数のサブユニットは同一または異なり得る）で構成され、同一または異なり得る１種または複数種の足場タンパク質と結合することができる。以下にさらに詳細に説明されるように、タンパク質アレイは、複合体を固定化することによって作製することができ、かかるアレイは、様々な目的に、例えばＨＴＳ、診断、研究等に使用される。
【００１４】
過去には、タンパク質の可溶化／免疫沈降に使用されるバッファーは、特に膜と結合されたタンパク質に使用されるバッファーは一般に、ＳＤＳ、デオキシコール酸ナトリウムまたは他の洗剤、およびキナーゼおよびホスファターゼの阻害剤も含有した。かかる洗剤は、対象タンパク質および対象タンパク質を囲むいわゆる足場タンパク質（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、構造支持タンパク質、シナプス後密度構成成分等）を変性させ、かつ／またはそれらの活性を変化させ得る。対照的に、本発明の方法で使用される可溶化／免疫沈降バッファーは特に、対象タンパク質およびそれが結合した足場タンパク質を解離、変性および／または不活性化することなく可溶化するように配合される。その結果として、その生体内での特性を保持するインタクトな多タンパク質複合体が得られる。かかる複合体は、活性化、不活性化、リン酸化／脱リン酸化、グリコシル化／脱グリコシル化、タンパク質間相互作用、リガンド結合、複合体内での相互作用等の生理学的に関連する特性を示す。一般に、対象タンパク質（１種または複数種）は完全長タンパク質である。
【００１５】
本発明の新規な可溶化／免疫沈降バッファーについて、重要な特徴は、１）このバッファーは、変性剤を含有しない、つまり実質的に非変性のバッファーであること；２）複合体の構成成分である、キナーゼおよびホスファターゼがその活性を保持するように、キナーゼおよびホスファターゼ阻害を防ぐ作用物質（agent）を含有することである。「実質的に非変性」という用語は、バッファーが、複合体に存在するタンパク質または酵素の機能活性を不可逆的に実質的に低下させないことを意味する。すなわち、バッファー中のタンパク質の可溶化は、機能活性の約７５％を超える、または好ましくは約５０％を超える、またはさらに好ましくは約４０、３０、２０、１０％を超える、または５％でさえも超える不可逆的低下を引き起こさない。最も好ましくは、バッファーにタンパク質を曝露することによって、機能活性の低下は全く起こらない。
【００１６】
実質的に非変性の可溶化／免疫沈降バッファーの一般的な組成は、以下の通りである：
１．全（合計）重量／体積％約０．００１％〜約１０％、好ましくは約０．５％〜約５％、最も好ましくは約０．１〜約１％（約０．１％が好ましい濃度である）の１種または複数種の非変性洗剤。
【００１７】
バッファーで使用される代表的な非変性洗剤としては、限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および他のＰｌｕｒｏｎｉｃ洗剤（エチレンオキシドとプロピレンオキシドのトリブロックコポリマー）；ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘファミリー）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−ＣＦ、Ｌｕｂｒｏｌ ＷＸ、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ９６およびＢｒｉｊ９８（Ｂｒｉｊファミリー）、コール酸塩、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトサイド、オクチルβ−グルコシド、オクチルβ−チオグルコピラノシド、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、Ｔｗｅｅｎ、ｎ−ドデシルａ−Ｄ−マルトサイド、チロキサポール、トリエチレングリコールモノオクチルエーテルおよびファミリー、テトラエチレンペンタミンペンタヒドロクロリドおよびファミリー、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、スクロース、モノラウリン酸スクロース、モノデカン酸スクロース、Ｓｐａｎ（登録商標）、サポニン、Ｐｒｉｌ（登録商標）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミンおよびファミリー、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）エチレングリコールモノオクチルエーテルおよびファミリー、ジギトニン、およびabrf.org/ ABRFNews/1997/December 1997/dec97detergentのウェブサイトで参照される洗剤等の様々な非イオン洗剤／界面活性剤が挙げられる。
【００１８】
２．全重量体積％約０．０５〜５％、好ましくは約０．５〜約２．５％、最も好ましくは約１％の１種または複数種の還元剤。
【００１９】
バッファーで使用される代表的な還元剤としては、限定されないが、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、グルタチオン等が挙げられる。
【００２０】
３．範囲約６．５〜約８．５、好ましくは約７〜約８、最も好ましくは約７．５のｐＨを維持する１種または複数種の緩衝剤。緩衝剤の総（合計）濃度は一般に、約１〜５００ｍＭ、好ましくは約５〜約１００ｍＭ、さらに好ましくは約１０〜約７５ｍＭの範囲であり、約１０、２０、３０、４０および５０ｍＭが最も好ましい濃度である。
【００２１】
バッファーで使用される代表的な緩衝剤としては、限定されないが、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）；様々なリン酸含有バッファー；ＲＩＰＡ（ラジオイムノ沈降アッセイ）、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＭＥＳ（４−モルホリンエタンスルホン酸）、２−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、種々の糖（例えば、複合体をインタクトに維持するのを助けるためにショ糖が使用される）等が挙げられる。
【００２２】
４．それぞれが、濃度約０．１〜５０ｍＭ、好ましくは約１〜約１０ｍＭ、最も好ましくは約５ｍＭで存在する、１種または複数種のキレート剤。
バッファーで使用される代表的なキレート剤としては、限定されないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＨＥＤＴＡ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸三ナトリウム塩）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、２，２’−ビピリジル、ジメルカプトプロパノール、サリチル酸、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）等が挙げられる。
【００２３】
５．範囲約０．１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜約５０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５〜約２５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌの量で存在する、プロテアーゼ阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤の「カクテル」。任意に、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などの特異的なプロテアーゼ阻害剤も、一般に濃度約０．１〜１０ｍＭ、好ましくは約０．５〜約５ｍＭ、最も好ましくは約１ｍＭの成分であることができる。
【００２４】
バッファーで使用される代表的なプロテアーゼ阻害剤としては、限定されないが、市販されているもの（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル（セットＩ〜ＶＩＩＩ）、Ｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販のＰｒｏｔｅＣＥＡＳＥＴＭ等）など、プロテアーゼ阻害剤の「カクテル」が挙げられる。さらに、個々のプロテアーゼ阻害剤もまた含まれる。その例としては、限定されないが、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アマスタチン、Ｅ−６４、アンチパイン、エラスタチナール、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン、ベンズアミジン、１，１０‐フェナントロリン、キモスタチン、ホスホラミドン、３，４−ジクロロイソクマリン、ＴＬＣＫ（Ｎ−α−トシル−Ｌ−リシル−クロロメチルケトン）、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）、ＴＰＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニル−クロロメチルケトン）等が挙げられる。
【００２５】
例示的な１つの非変性可溶化／免疫沈降バッファーの組成は以下の通りである：
０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．２％ β−メルカプトエタノール、
５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５ｍＭ ＥＤＴＡ、
５ｍＭ ＥＧＴＡ
プロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｍｇ／ｍｌ
１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（プロテアーゼ阻害剤）
【００２６】
本発明のバッファーを使用して、多種多様なタンパク質を単離することができる。「単離」とは、生体内位置または環境からヒトの介入によって除去されていること、つまり、生体源（biological source）から除去されていること、かつ本明細書に記載の手順で使用される生体外状態へと、臨床技術を用いて操作されていることを意味する。場合によっては、生体源／環境は、自然な環境（native mileau）、例えば、タンパク質複合体が自然発生する部位（例えば、生物の組織、血清、血液、尿、卵子等）であるだろう。クローン化または遺伝子操作された多タンパク質複合体については、その源は、複合体を産生する組換え生物または細胞である。さらに他の場合には、タンパク質複合体の源は、遺伝子操作されている、またはされていない培養細胞である。正確な生体源または起源の環境にかかわらず、生物活性多タンパク質複合体は、源から分離、除去または採取され、本明細書に記載のように操作かつ使用される。単離多タンパク質複合体は、複合体の活性またはその使用目的を損なうことなく、様々な他の物質（例えば、塩、イオン、バッファー成分、外来細胞物質等）を含有し得る。
【００２７】
かかるタンパク質は、単一のサブユニット（モノマー、単量体）または複数のサブユニット（マルチマー、多量体）のいずれかで構成される。本発明は特に、多量体タンパク質、さらに特には、生体膜に存在する多量体タンパク質、最も特には、その生物活性を発揮するために足場タンパク質に依存する多量体タンパク質の単離に有用である。本発明の方法によって単離することができるタンパク質のカテゴリーの例としては、限定されないが、膜貫通型受容体タンパク質（例えば、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン作動性受容体、ＧＡＢＡ Ｂ受容体、アンギオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、グルカゴン受容体、代謝調節型グルタミン酸受容体、ヒスタミン受容体、嗅覚受容体、オピオイド受容体、ロドプシン（光受容体）、セクレチン受容体、３型を除くセロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、カルシウム感受受容体、ケモカイン受容体等のＧタンパク質共役受容体；エリスロポエチン受容体、インスリン受容体、Ｅｐｈ受容体、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）受容体等の受容体型チロシンキナーゼ；ＧＣ−Ａ ＆ ＧＣ−Ｂ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の受容体等のグアニリルシクラーゼ受容体；ステロイドホルモン受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイド受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、ＩＰ３受容体等の細胞内受容体；ニコチン性アセチルコリン受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ−Ａ、ＧＡＢＡ−Ｃ受容体（ＧＡＢＡ＝γ−アミノ酪酸）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）受容体、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソオキサゾール−４−プロピオン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体、ＡＭＰＡＲ、またはキスカル酸受容体としても知られる）、カイニン酸受容体、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ３）受容体等のイオンチャネルタンパク質；が挙げられる。様々なリンタンパク質、つまり、チロシン、セリンもしくはトレオニン、またはその３つのいずれかの組み合わせであることができる、少なくとも１つの残基が潜在的にリン酸化され得るポリペプチドもまた含まれる。リン酸化は、構成的に起こる、または誘導される。
【００２８】
「足場タンパク質」とは、対象タンパク質と結合し、かつ対象タンパク質がその生体内生物活性を発揮するために必要とされる、様々な支持タンパク質を意味する。かかる足場タンパク質がなくともタンパク質はその生物活性をある程度まで発揮することができるが、一般に、その活性は減弱され、タンパク質の実際の生理学的に関連する活性を正確に反映しない。足場タンパク質は、多種多様な機能を果たし、かつ／またはタンパク質の役割を支える。例えば、足場タンパク質は、構造上の支えを提供し、例えばその活性部位のタンパク質を隔離し、タンパク質はその立体コンフォメーション等を達成および／または維持することができる。その代わりとして、足場タンパク質は、タンパク質の化学修飾、例えば、そのタンパク質の性質に応じて、タンパク質を活性化または不活性化し得る、リン酸化／脱リン酸化および／またはグリコシル化／脱グリコシル化反応を触媒することによって、タンパク質の生物活性を調整することができる。かかる足場タンパク質の例としては、限定されないが、様々なホスファターゼ、キナーゼ、シナプス後密度構成成分、シャペロニンなどのシャペロンタンパク質、アンカータンパク質、アダプタータンパク質、タンパク質モジュール、ドッキングタンパク質等が挙げられる。足場タンパク質の更なる例としては、限定されないが、Ｓｔｅｒｉｌｅ ５（Ｓｔｅ ５）およびＡＫＡＰ７９アンカータンパク質、アダプタータンパク質の１４−３−３ファミリー、アクチン等が挙げられる。足場タンパク質は、共有結合または非共有結合（例えば、水素またはイオン結合による）などのいくつかの手段によって、対象タンパク質と（または対象タンパク質の１つまたは複数のサブユニットと）直接結合することができる。その代わりとして、足場タンパク質は、そのタンパク質と直接接触する、１つまたは複数の他の足場タンパク質を介して間接的に結合することができる。
【００２９】
本発明の一部の実施形態において、プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼが、足場タンパク質として特に興味深い。
【００３０】
プロテインキナーゼは、他のタンパク質を修飾する酵素である。キナーゼの化学的活性は、ＡＴＰからリン酸基を除去し、遊離ヒドロキシル基を有する３つのアミノ酸のうちの１つにそれを共有結合することを要する。大部分のキナーゼはセリンとトレオニンの両方に作用し、他のキナーゼはチロシンに作用し、いくつか（二重特異性キナーゼ）は３つすべてに作用する。
【００３１】
セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼは、リン酸供与体としてＡＴＰまたは他のヌクレオチドを用いる、タンパク質のセリンまたはトレオニン残基のリン酸化を触媒する酵素のグループである。セリン／トレオニンプロテインキナーゼは、セリンまたはトレオニン（同様な側鎖を有する）のＯＨ基をリン酸化する。セリン／トレオニンプロテインキナーゼの例としては、限定されないが、Ａｋｔ１／ＰＫＢａ、アクチビン様キナーゼ受容体−４（ＡＬＫ４）、ＡＲＫ５、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）、Ａｕｒｏｒａ、ＢｒＳＫ１、カルモジュリン、ＣａＭキナーゼ、カゼインキナーゼ、ｃｄｋ、Ｃｏｔ１、細胞死関連プロテインキナーゼ（death associated protein kinase）（ＤＡＰＫ）、ダブルコルチンおよびＣａＭキナーゼ様２（ＤＣＡＭＫＬ２）、筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、ＤＡＰキナーゼ関連アポトーシス誘導プロテインキナーゼ（ＤＲＡＫ）、ＥＦ−２キナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）、ホメオドメイン相互作用プロテインキナーゼ（ＨＩＰＫ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＨＳＰ２７、ＩＢキナーゼまたはＩＫＫ、ＩＬ−１受容体関連Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ（ＩＲＡＫ）、インスリン関連受容体（ＩＲＲ）、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ／ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）、ＬＩＭキナーゼ、ＬＫＢ１、リンパ球指向キナーゼ（lymphocyte oriented kinase）（ＬＯＫ）、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）、リナーゼ／Ｅｒｋ、微小管親和性調節キナーゼ（microtube affinity regulating kinase）（ＭＡＲＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）、マイトジェン活性化プロテイン／ＥＲＫキナーゼキナーゼ（ＭＥＫＫ）、母体−胎芽（maternal embryonic）ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）、ｍｉｓｓｈａｐｅｎ／ＮＩＫ関連キナーゼ（ＭＩＮＫ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）、混合系統（mixed lineage）キナーゼ（ＭＬＫ）、Ｍｎｋ２、筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連Ｃｄｃ４２結合キナーゼ（ＭＲＣＫ）、マイトジェンおよびストレス活性化プロテインキナーゼ（ＭＳＫ）、筋特異的セリンキナーゼ（ＭＳＳＫ）、哺乳類Ｓｔｅ２０様プロテインキナーゼ（ＭＳＴ）、ＮＩＭＡ関連キナーゼ（ＮＥＫ）、ｎｅｍｏ様キナーゼ（ＮＬＫ）、ｐ３８／ｓストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）、ＰＡＫ、ＰＡＲ、ＰＡＳドメイン含有セリン／トレオニンキナーゼ（ＰＡＳＫ）、３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ（ＰＤＫ）、ホスホリラーゼキナーゼ、Ｐｉｍ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＤ、ＰＫＧ、ＰＫＲ、ＰＫＲアガロースなどのプロテインキナーゼ（ＰＫ）、活性、ｐ３８関連／活性化プロテインキナーゼ（ＰＲＡＫ）、プロテインキナーゼＸ（ＰＲＫＸ）、受容体相互作用セリン／トレオニンキナーゼ（ＲＩＰＫ）、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＫ／ＲＯＣＫ）、Ｓ６キナーゼ、塩誘導性キナーゼ（ＳＩＫ）、セリン・アルギニンプロテインキナーゼ（ＳＲＰＫ）、（ＴＧＦβ）活性化キナーゼ（ＴＡＫ１）、無数アミノ酸プロテインキナーゼ（Thousand and One Amino Acid Protein Kinase）（ＴＡＯ）、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）、精巣特異的セリンキナーゼ−１（ＴＳＳＫ１��、Ｗｅｅｌ、ＺＩＰＫ等が挙げられる。
【００３２】
チロシン特異的プロテインキナーゼは、チロシンアミノ酸残基をリン酸化し、かつシグナル伝達に使用される。チロシン特異的プロテインキナーゼは、主に成長因子受容体として、かつ成長因子からの下流シグナル伝達において作用する。チロシン特異的プロテインキナーゼの例としては、限定されないが、Ａｂ１、未分化リンパ腫キナーゼ、Ａ１ｋ、活性、Ａｒｇ、Ａｘｌ、Ｂｌｋ、Ｂｍｘ、Ｂｒｋ、Ｃｓｋ、Ｄｄｒ、ＤＹＲＫ、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびＥＧＦ受容体、Ｅｐｈ、ｅｒｂＢ／ＨＥＲ、Ｆｅｒ、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）およびＦＧＦ受容体、Ｆｇｒ、Ｆｌｔ、Ｆｍｓ／コロニー刺激因子（ＣＳＦ）−１受容体、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ホメオドメイン相互作用プロテインキナーゼ（ＨＩＰＫ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）およびＩＧＦ受容体、インスリンおよびインスリン受容体、Ｉｔｋ、ＪＡＫ受容体、Ｋｉｔ（Ｖ６５４Ａ）、Ｔ細胞活性化に関連するリンカー（ＬＡＴ）、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、Ｍｅｒ、Ｍｅｔ、ＭｕＳＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびＰＤＧＦ受容体、ＰＴＫ５、Ｐｙｋ２、Ｒｅｔ、Ｒｏｎ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ、Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、Ｔｉｅ／ＴＥＫ、Ｔｒｋ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびＶＥＧＦ受容体、ＫＤＲ、Ｙｅｓ、ＺＡＰ−７０等が挙げられる。
【００３３】
二重特異性プロテインキナーゼは、チロシン、セリンおよびトレオニンのアミノ酸残基をリン酸化し、一般にシグナル伝達で使用される。二重特異性プロテインキナーゼの例としては、限定されないが、ＣＬＫ３、ＤＹＲＫ、ＭＥＫ等が挙げられる。
【００３４】
タンパク質ホスファターゼは、その基質を脱リン酸化する酵素であり；つまり、リン酸モノエステルをリン酸イオンおよび遊離ヒドロキシル基を有する分子に加水分解する。ホスファターゼは、その基質特異性に基づいて細分することができる。チロシン特異的ホスファターゼとしては、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）、ｐｈｏｓｐｈａｃａｎ、ＳＨＰ／ＳＨＰＴＰ、および線条体強化（striatum enriched)ホスファターゼ（ＳＴＥＰ）が挙げられる。セリン／トレオニン特異的ホスファターゼとしては、ＰＰ１（α、β、γｌ、γ２）、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ（ＡＫＡカルシニューリン）、ＰＰ２Ｃ、ＰＰＰ、およびＰＰ５が挙げられる。
【００３５】
二重特異性ホスファターゼは、チロシン残基およびセリン／トレオニン残基の両方を脱リン酸化する能力を有する。二重特異性ホスファターゼの例としては、ワクシニアＨ１関連（ＶＨＲ）ホスファターゼが挙げられる。
【００３６】
本発明の方法は一般に、対象タンパク質の生体源を同定することによって行われる。生体源は、タンパク質の適切な源、例えば、組織、細胞、血液、血清、酵母または細菌、真菌などの微生物、植物、ラン藻類等である。さらに、タンパク質複合体は、遺伝子操作され、かつ細胞、酵母等において発現された複合体であることができる。本発明のバッファーおよび方法を使用し、当業者に公知の標準タンパク質単離技術を用いて、タンパク質複合体を単離、濃縮、免疫沈降、かつ／または「プルダウン」および精製する。本明細書において「抽出」、「単離」および「精製」という用語は、区別なく使用され、生体外での使用に適している状態でタンパク質複合体を得ることに関わる段階を意味する。用いられる技術は、タンパク質を含有する組織、細胞等を得る段階、その組織／細胞を本発明のバッファーでホモジナイズする段階、および例えば、遠心分離、濾過、硫酸ナトリウム沈殿によって、サイズ排除クロマトグラフィー（つまり、ゲル濾過またはゲル浸透クロマトグラフィー）等によって複合体を一部精製する段階などのかかる段階を含み得る。代替方法としては、リガンドに差次的に結合させることによって、例えば非特異的または特異的に対象タンパク質に結合する様々な実体（entity）にさらすことによって、対象タンパク質を精製（またはさらに精製）することができる。かかる実体としては、限定されないが、抗体（モノクローナルとポリクローナル両方）、基質、阻害剤、補助因子、金属、種々の荷電基（例えば、陰イオンおよび陽イオンクロマトグラフィー）等が挙げられる。かかる方法は、当業者には公知であり、複合体の生物活性を保つために本発明の保護バッファーが使用される限り、本発明の生物活性多タンパク質複合体の単離において、あらゆる適切な方法または方法の組み合わせを使用することができる。本発明の好ましい実施形態において、複合体は、対象タンパク質の一部に特異的な抗体を使用して、免疫沈降によって単離される。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであることができ、タンパク質のいずれかの部分に特異的である。例えば、マルチサブユニットタンパク質の場合には、抗体は、サブユニットのいずれかに、または複数のサブユニットにでさえ向けられる。さらに、複数のタイプの抗体を用いることができ、例えば、異なるサブユニットに特異的な抗体の混合物を使用することができる。共免疫沈降とは、対象タンパク質をその足場タンパク質と共に免疫沈降させること、例えば受容体またはイオンチャネルタンパク質をそのキナーゼおよび／またはホスファターゼと共に免疫沈降させることを説明するために使用される用語である。
【００３７】
一旦、抽出および単離されたら、生物活性多タンパク質複合体は様々な方法で使用することができる。一般に、複合体は、診断およびスクリーニングアッセイに用いられるだろう。この技術は、基礎分子生物学および生化学研究、血清プロファイリング、タンパク質存在量の決定、疾患バイオマーカーの同定、免疫および毒物応答プロファイリング、および創薬標的スクリーニングに関して大きな可能性を持っている。複合体の状態は、その生物活性が維持される状態である。例えば、複合体は、溶解状態で使用することができるし、または基体に結合させることができる。本発明の好ましい実施形態において、複合体は、基体表面に結合された抗体を使用した免疫沈降反応によって、基体表面上に固定化される。この実施形態において、この抗体は、複合体の精製およびその固定化の両方をもたらす役割を果たす。
【００３８】
図１Ａ−Ｄは、対象タンパク質が、細胞膜中に存在する四量体イオンチャネルである、本発明の実施形態を図示する。図１Ａは、ホスファターゼ、プロテインキナーゼ、および他の足場タンパク質と結合した膜内に包埋されたイオンチャネルタンパク質を示す。図１Ｂは、本発明のバッファーを使用した組織または細胞の可溶化を示す。図１Ｃの最下部のパネルは、溶解状態の多タンパク質複合体を表し；精製のこの段階では、組織の他のタンパク質および成分が存在するだろう。図１Ｃの最上部のパネルは、対象タンパク質の受容体サブユニットに特異的な抗体が結合される、基体の表面を示す。複合体を含有する溶液を固定化された抗体と接触させると、サブユニットを介して抗体は複合体を捕捉し、多タンパク質複合体全体（すべてのサブユニットを有する対象タンパク質＋足場タンパク質）が基体上に固定化される。
【００３９】
図１は、平らな基体上への複合体の固定化を図示する（そうである必要はない）。基体（「固体担体」または「担体」とも呼ばれる）とは、不溶性マトリックスを意味し、硬質または半硬質表面を任意に有し得る。かかる基体は、いずれかの有用な形状、例えばビーズ、ペレット、ディスク、チップ、皿、マルチウェルプレート、ウエハー、ワイヤー、フィラメント、チューブ、可撓性ストリップ、糸状構造、またはこれらのいずれかの組み合わせ等の形状であることができ、適切な材料、例えばガラス、プラスチック、種々のポリマー、金属（例えば、金、白金、銀、銅、アルミニウム）、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化タンタル、酸化チタン、インジウム酸化スズ、酸化マグネシウム、石英、シリカおよびその組み合わせ等で構成される。さらに、その表面は、より大きな構築物の部分であり、例えば、平らな表面は、当技術分野で公知の９６、３８４または１５３６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェルまたはへこみの底面である。さらに、複合体の固定化は、図示されるものよりもさらに複雑であってもよく、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、二次抗体、磁気機能（magnetic feature）等が、固定化方法の一部を形成し得る。複合体が基体上に保持される限り、かつ保持手段が認め得るほど複合体の生物活性を妨げない限り、多タンパク質複合体を固定化する方法を用いることができる。本発明で用いることができる固定化用基体としては、限定されないが、ガラス、スライド、ビーズ、膜（例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）およびニトロセルロース）の表面、種々のポリマーの表面、シリコン表面等が挙げられる。
【００４０】
固定化されていようと、溶解状態で遊離していようと、本発明の単離多タンパク質複合体は、生理学的に関連するその特有の生物活性を保持する、または示す。「その生物活性を保持する」とは、タンパク質複合体によって示される活性のレベルが、生体内にある場合の多タンパク質複合体の生物活性の少なくとも約５０〜１００％（またはそれ以上）、好ましくは約７５〜１００％（またはそれ以上）であることを意味する。生体内活性のレベルが分からない複合体については、それらが、公知の方法によって検出可能なレベルで、生体内で行う生化学反応を生体外で行うことができるという点から、単に「生物活性」と述べられる。その代わりとして、反応性の標準測定値が当技術分野で確立されているが、今まで複合体において測定されていなかったタンパク質については、本発明の多タンパク質複合体は一般に、以前に確立された標準活性の約５０〜１００％、または好ましくは７５〜１００％、またはさらには１００％を超える活性を示すであろうが、場合によって、複合体の活性レベルは実際には、それより低いことがある。これは、本明細書に記載の多タンパク質複合体の活性が、それらがその天然状態、生体内環境にある場合の複合体の活性にさらによく似ているからである。当業者は、タンパク質活性の測定の開発および標準化に精通している。
【００４１】
固定化された、または溶解状態で遊離している、本発明の多タンパク質複合体の活性は、当業者に公知の多種多様な技術のいずれかによって測定することができる。その例としては、限定されないが、蛍光、化学発光、放射能、比色分析、質量分析、表面プラズモン共鳴、レポーター酵素、親和性リガンド、複合体の異なる状態に選択的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体（例えば、リン酸化残基またはリン酸化されていない残基に選択的に結合する抗体）、ラジオイムノアッセイ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、質量分析による検出と組み合わされた二次元電気泳動ゲル分離（２−ＤＰＡＧＥ）、質量分析による検出と組み合わされた液体クロマトグラフィー分離等が挙げられる。その開示内容全体が参照により組み込まれる、Bandaraらによる米国特許第６，８７５，６１８号には、これらのおよび他の方法のいくつかが記述されている。特に、蛍光検出は現在、創薬およびハイスループットスクリーニングで使用される大部分のアッセイの基礎である（Lakowicz, 1999; Asian et al., 2005）。近年、蛍光を基礎とする検出技術および自動化技術の進歩によって、９６ウェルから３８４および１５３６ウェルＨＴＳアッセイへのアッセイの小型化が促進されている。このように、本発明の好ましい実施形態において、免疫蛍光法が検出方法として使用される。かかる技術は、例えばタンパク質のリン酸化状態の変化、または高次構造変化、またはリガンドの結合から生じる変化を検出するために使用される。
【００４２】
次に、本発明の好ましい実施形態は、生物活性多タンパク質複合体が、ハイスループットスクリーニングアッセイに適した基体上に固定化される、タンパク質アレイである。「ハイスループット」とは、所定のプロセス、方法またはアッセイ等において大量の試料を処理する能力を意味する。好ましい実施形態において、ハイスループットプロセスは、コンピューターソフトウェアによって、または手動で、または両方によって任意に制御される、自動化された機械で行われる。かかるアレイは、１種類の多タンパク質複合体を収容することができ、例えば、すべての複合体は、特定のイオンチャネルなど１種類の対象タンパク質を含む。その代わりとして、複数種の複合体が固定化される、混合またはハイブリッド・アレイもまた企図される。さらに、他の種類の分子も混合アレイに含まれることができる。多タンパク質複合体が生物活性が損なわれない限り、有用な分子のあらゆる組み合わせがアレイ上に存在することができる。かかるアッセイは、何百または何千の多タンパク質複合体を含み得る。
【００４３】
かかるアレイは、複合体の候補修飾因子、例えば受容体複合体の翻訳後修飾の修飾因子の小規模または大規模な検出に使用することができる。「翻訳後修飾」とは、その最初の翻訳後に天然ポリペプチド配列に加えられる、いずれかの変化／修飾を意味する。その例としては、限定されないが、リン酸化／脱リン酸化、グリコシル化／脱グリコシル化、プレニル化、ミリストイル化、パルミトイル化、限定消化、不可逆的なコンフォメーション変化、メチル化、アセチル化、アミノ酸側鎖またはアミノまたはカルボキシ末端の修飾、酸化の変化、ジスルフィド結合の形成、種々のタンパク質間相互作用等が挙げられる。候補修飾因子（例えば、活性化因子または阻害因子）の作用は、例えばセリン、トレオニンおよび／またはチロシンリン酸化のレベルの変化、および／または受容体サブユニット間のタンパク質間相互作用および／または受容体サブユニットと他のタンパク質とのタンパク質間相互作用のレベルの変化を測定することによって、検出することができる。本発明を用いて、この結合が受容体活性の変化を生じるかどうかにかかわらず、サブユニットまたは複合体の他のタンパク質に結合する作用物質についてスクリーニングすることもできる；かかる作用物質は、分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のリガンド等である。かかるアッセイは、創薬ツールとして、かつ受容体複合体調節の複雑なメカニズムにおける各足場タンパク質の役割を理解するための、かつ多タンパク質複合体内の受容体調節のための新規な標的を同定するための研究ツールとしても有用である。かかるアッセイを行う間、多タンパク質複合体の生物活性をその成分が減弱しない限り、適切な緩衝系を使用することができる。
したがって、複合体を用いて、対象タンパク質の生物活性または化学活性の多種多様な候補修飾因子のいずれもスクリーニングすることができ、例えばタンパク質の結合部位に合うように設計された小分子、タンパク質の潜在的な活性化因子または阻害因子（可逆または不可逆のいずれか）、他のタンパク質；他のタンパク質複合体；ポリペプチドおよびペプチド；核酸；脂質；多糖；化学物質；種々の天然物；種々の補助因子；酵素基質等を含み得る、種々の特異的および非特異的リガンドをスクリーニングすることができる。本発明の生物活性多タンパク質複合体を用いて、いずれの対象化合物もスクリーニングすることができる。検出される例示的な活性としては、限定されないが、キナーゼ活性、プロテアーゼ活性、ホスファターゼ活性、グリコシダーゼ活性、アセチラーゼ活性、化学基移動酵素活性、コンフォメーションおよび／または折りたたみの変化；種々の翻訳後修飾等が挙げられる。
【００４４】
さらに、活性以外の複合体の特性もまた対象であることができ、様々な公知の技術、例えば円偏光二色性、示差走査熱量測定、等温滴定熱量測定、核磁気共鳴、種々の分光技術等を用いて測定される。これらの場合には、複合体はおそらく、固定化状態ではなく溶解状態で維持されると思われる。
【００４５】
本発明は、本明細書に記載の方法を行うためのキット（１つまたは複数）も提供する。かかるキットは、非変性可溶化／免疫沈降バッファー中の単離タンパク質複合体を含む。タンパク質は、固定化されていてもよいし、または溶解状態で遊離していてもよい。キットは、反応およびブロッキングバッファーなどの他のバッファーも含み得る。複合体に選択的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、例えば、それがリン酸化されている場合に複合体におけるタンパク質に選択的に結合する抗体、それがリン酸化されていない場合でさえ、タンパク質自体に選択的に結合する抗体もまた含まれ得る。抗体に結合させることができる蛍光色素などの検出可能な標識もまた、キットに備えられる。その代わりとして、抗体は、かかる検出可能な標識に既に結合した状態で提供されることができる。キットの使用説明書もまた含まれる。
【００４６】
本発明の実施は、次の実施例でさらに説明される。
【実施例】
【００４７】
実施例１．生物活性Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体タンパク質複合体の単離および固定化
略語：ＮＭＤＡＲ，Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体；ＰＫＡ，プロテインキナーゼＡ；ＳＯＶ，オルトバナジン酸ナトリウム；ＰＫＣ，プロテインキナーゼＣ；ＰＴＫ，タンパク質チロシンキナーゼ；ＰＴＰ，タンパク質チロシンホスファターゼ；ＳＦＫ，ｓｒｃファミリーキナーゼ，ＰＳＤ−９５，シナプス後密度９５；ＰＰ，セリン／トレオニンホスファターゼ
材料および方法：
抗体および化学物質：
【００４８】
免疫沈降には、ポリクローナルＮＭＤＡζ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，米国カリフォルニア州サンタクルーズ）を使用した。抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）４Ｇ１０クローンをプローブとするために、Ｓｅｒ８９６での抗ｐｈｏｓｐｈｏＮＲ１（抗ｐＳｅｒ８９６）、Ｓｅｒ８９７での抗ｐｈｏｓｐｈｏＮＲ１（抗ｐＳｅｒ８９７）および抗ＰＳＤ−９５（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，米国ニューヨーク州レークプラシッド）；抗ＮＲ１（Ｂ．Ｄ．Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社，米国カリフォルニア州サンディエゴ）、抗ＮＲ２Ａ、抗ＮＲ２Ｂおよび抗ＮＲ２Ａ／Ｂ（ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂサブユニットの両方を認識する）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国カリフォルニア州テメキュラ）を使用した。Ａｌｅｘａ色素およびＺｅｎｏｎ ＩｇＧ標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社，カリフォルニア州カールズバッド）を蛍光の調査に使用した。薬物をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国カリフォルニア州セントルイス）またはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。黒色または無色のプレコートされたタンパク質Ａ／ＧマルチウェルプレートをＰｉｅｒｃｅ社（米国イリノイ州ロックフォード）から購入した。
【００４９】
プレコート９６ウェルプレート上への多タンパク質複合体の抽出および固定化：
３週齡ＳＤラットから得た皮質組織で実験を行った。動物実験に関する指針（NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）を厳格に遵守してすべての手順を行った。シリンジを用いて、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２％ β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニルを含有する可溶化／免疫沈降バッファー中に、２１日齡のラットから得た皮質組織を可溶化した。組織ホモジネートを遠心分離し（１５，０００ｇ，４℃で１０分間）、不溶性材料を除去した。上清を４０℃に維持し、後に免疫沈降に使用した。活性ＮＭＤＡ受容体複合体の免疫沈降に、タンパク質Ａ／Ｇプレコート９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，イリノイ州ロックフォード）を使用した。プレートを可溶化／免疫沈降バッファーで洗浄し、抽出用バッファー１００μＬ中の抗ＮＲｌ抗体（２０μｇ）を各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベートした後、ウェルを可溶化／免疫沈降バッファーで３回すすぎ、上清１００μＬを各ウェルに添加した。４℃で４時間インキュベートした後、０．２％ β−メルカプトエタノール、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴを含有する反応バッファーでウェルを３回洗浄した。
【００５０】
活性試験：
反応バッファー５０μＬ、ＡＴＰ５００μＭおよび試験される作用物質（agent）を各ウェルに添加した。対照ウェルは、反応バッファー５０μＬのみを、または５００μＭ ＡＴＰの存在下にて含有した。すべての試料を３０℃で１時間インキュベートした。０．５％ ＤＯＣ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳおよび５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（プロテアーゼ阻害剤）、５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭ ＮａＰＰ１、２５ｍＭ グリセロリン酸ナトリウムおよび２μＭ ミクロシスチン−ＬＲを４０℃で含有するブロッキングバッファーをすべての試料に添加することによって、反応を停止させた。試料をブロッキングバッファーで３回すすぎ、ウエスタンブロット法または免疫蛍光法による検出にかけた。
【００５１】
蛍光検出：
蛍光検出実験については、黒色９６ウェルプレートを使用して、蛍光が溢れ出るのを防いだ。薬物処理後、ウェル中の試料をブロックし、ブロッキングバッファーですすぎ、４％パラホルムアルデヒド／４％ショ糖（ＰＦＳ）中で５分間固定化し、ＢＳＡで１０分間ブロックし、すすぎ、室温にて１時間（希釈度１：１００〜１：５００で）一次抗体（１度に３つ）に曝露した。使用前に、Ｚｅｎｏｎ  ＩｇＧ標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ  ４８８（ｅｘ／ｅｍ，４９５／５１９）、５６８（ｅｘ／ｅｍ５７８／６０３）および６４７（ｅｘ／ｅｍ６５０／６６８）と一次抗体を結合させた。インキュベートした後、プレートをＰＢＳで３回すすいだ。適切なフィルターを使用して、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ２３５０蛍光プレートリーダーでマルチウェルプレートを読み取った。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ  ２３００は、多重化読取り能力を持たないため、各抗体に関してプレートをスキャンした。スキャン中の色素の光退色が結果に影響しないようにするために、各実験に対して異なる順序でプレートをスキャンした。
【００５２】
ウエスタンブロット法
薬物処理後、タンパク質複合体を２×ローディングバッファー（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー、および４％β−メルカプトエタノール）５０μｌ中で変性させた。すべての試料をマイクロ遠心チューブに移し、５分間沸騰させ、１分間遠心し、各試料４０μｌを７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。ロードされたゲルを電気泳動し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国カリフォルニア州ハーキューリーズ）から市販のニトロセルロース膜に移す。そのニトロセルロース膜を５％ミルクでブロックし、洗浄し、以下の抗体：抗ｐＴｙｒ（４Ｇ１０）、抗ＮＲ２Ａ／Ｂ、抗ＮＲ１、抗ＰＳＤ−９５のうちの１つと共に希釈度１：１０００で一晩インキュベートした。洗浄後、次いで膜を適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートし、Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ ４４００ＣＦ Ｉｍａｇｅｒを使用して、ＮＥＮ ＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅＴＭ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）からの化学発光試薬によって発光させた。同一のバンドを認識する抗体とのインキュベーションの間、６２．５ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳおよび０．７％β−メルカプトエタノール中で、膜を一度ストリッピングした。
【００５３】
バッファーの組成：
新規な可溶化／免疫沈降バッファーの組成：
０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．２％β−メルカプトエタノール
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
５ｍＭ ＥＤＴＡ
５ｍＭ ＥＧＴＡ
プロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｍｇ／ｍｌ
１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（プロテアーゼ阻害剤）
反応バッファーの組成：
０．２％β−メルカプトエタノール、
２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、
２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、
０．５ｍＭ ＤＴＴ
ブロッキングバッファーの組成：
０．０５％ＤＯＣ
０．１％ＳＤＳ
ｌ％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
５ｍＭ ＥＤＴＡ
５ｍＭ ＥＧＴＡ
プロテアーゼ阻害剤カクテル１０ｍｇ／ｍｌ
１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（プロテアーゼ阻害剤）
５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４
５０ｍＭ ＮａＦ
１０ｍＭ ＮａＰＰ１
２５ｍＭグリセロリン酸ナトリウム
２μＭミクロシスチン−ＬＲ
【００５４】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）複合体は、いくつかの神経変性疾患に関与する。実際には、ＮＭＤＡＲ、グルタミン酸受容体のサブタイプの不適切な活性化によって、過剰なカルシウム流入が生じ、興奮毒性神経細胞死が起こり得る。したがって、ＮＭＤＡＲの遮断は、動物モデルにおいて神経保護的であり（Lee et al., 1999）、中枢神経系におけるＮＭＤＡ関連障害を治療するのに適している。これらの障害としては、限定されないが、虚血、疼痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、癲癇、鬱病、片頭痛、炎症および他の神経変性疾患が挙げられる。臨床試験（参照）においてニューロプロテクター（neuroprotector）としてＮＭＤＡＲアンタゴニストが期待外れだったため、この分野で新しい治療薬が大変必要とされている。ＮＭＤＡＲ単独と異なり、その関連タンパク質およびキナーゼおよびホスファターゼなどの酵素でのＮＭＤＡＲ複合体の薬理学的操作は、ＮＭＤＡＲアンタゴニストの副作用を示すことなくＮＭＤＡＲを調節することができる新規な治療薬を提供することができる。この実施例に示される予備的結果から、免疫蛍光に基づくＨＴＳアッセイとしての９６−ウェルプレート上での機能複合体の単離は実行可能であることが示唆されている。このように、標的としてＮＭＤＡＲ複合体を使用した、神経保護薬を発見するためのハイスループットスクリーニングツールは、製薬産業に重要なツールである。
【００５５】
ＮＭＤＡＲの背景：
ＮＭＤＡＲは、複数のサブユニットで構成されるヘテロメリックなアセンブリである；これらは、ＮＲ１サブユニット、４つの異なるＮＲ２サブユニット（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）のファミリーおよび２つのＮＲ３サブユニット（１およびｓ）（Dingledine et al, 1999; Das et al., 1998）を含む。ＮＭＤＡＲは、シナプス後密度タンパク質（ＰＳＤ−９５）を含む、シグナル伝達に関与する７０種を超えるタンパク質と相互作用することが報告されている（Husi et al., 2000）。これらの受容体の機能は、プロテインキナーゼおよびタンパク質ホスファターゼによってそれぞれ仲介される一連のリン酸化プロセスおよび脱リン酸化プロセスによって調節される（Wang and Salter, 1994; Smart, 1997）。ＮＲ１内では、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびｃＡＭＰ依存性ロテインキナーゼ（ＰＫＡ）によるリン酸化が、８９０および８９６番目のセリン残基（Ｓｅｒ８９０およびＳｅｒ８９６）、および８９７番目のセリン（Ｓｅｒ８９７）で起こる（Tingley et al., 1993）。ＮＲ２サブユニットは、ＣａＭキナーゼＩＩ（Gardoni et al., 1998）、ＰＫＡ、ＰＫＣ（Leonard and Hell, 1997; Tingley et al., 1993）、およびタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）（Lau and Huganir, 1995）によってリン酸化される。タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）活性は、ＮＭＤＡＲと共免疫沈降することが証明されており（AIi and Salter, 2001）、内因性ＰＴＰがＮＭＤＡＲ複合体に固有であることが示されている。最近、ＰＴＫ  ＳｒｃおよびＦｙｎ、ＰＫＣ、ＰＫＡおよび受容体ＰＴＰαなど、これらのタンパク質のいくつかが、ＮＭＤＡＲ調節のための標的として同定されている（Wenthold et al., 2003）。さらに、本発明者らは、ＮＭＤＡＲをダウンレギュレートし（Coussens et al., 2000）、かつ神経保護特性を示す（Kawano et al., 2001; Lu et al., 2002）ことが証明されている、ＰＴＰ阻害剤などの化合物が、ＮＭＤＡＲサブユニットの分解を誘導する（Ferrani-Kile and Leslie, 2005）ことを報告している。したがって、ＮＭＤＡＲリン酸化における変化およびサブユニットおよび／または足場タンパク質の間のタンパク質間相互作用における変化によって、この受容体の機能が調節される。
【００５６】
ラットＮＭＤＡＲ対ヒトＮＭＤＡＲ：
この実施例において９６ウェルプレート上に固定化された最終タンパク質複合体は、ラット脳組織に由来する複合体であった。したがって、ヒトとげっ歯類のＮＭＤＡＲ生物学およびシグナル伝達特性の比較が提供される。ＮＭＤＡ受容体チャネルは、ヒトの脳に豊富にあり（Huntley et al. 1994; Scherzer et al. 1998）、グルタミン酸作動性シナプス伝達に関与すると思われる（Urban et al. 1990; Isokawa & Levesque, 1991 ;Masukawa et al. 1991; Hwa & Avoli, 1992; Isokawa et al. 1997）。クローン化ヒトＮＲ１サブユニットは、ラットにおいて発見されるサブユニットと、そのアミノ酸９３８個のうち７個だけ異なる（Karp et al. 1993）。したがって、アフリカツメガエル卵母細胞において発現されるホモメリックなヒトＮＲ１チャネルの一般的な特徴としては、Ｃａ２＋透過性、Ｍｇ２＋による電位依存性ブロック、Ｚｎ２＋による拮抗作用および他の競合的および非競合的アンタゴニスト（Karp et al. 1993; Planells-Cases et al. 1993）が挙げられる。ヒトＮＭＤＡチャネルの生化学的研究では、ポリアミンによるチャネル活性の調節におけるげっ歯類の受容体との類似性（Subramaniam et al. 1994）が説明されており、マウス線維芽細胞に永久的にトランスフェクトされた、ヒトＮＲ１ａ／ＮＲ２ＡおよびＮＲ１ａ／ＮＲ２Ｂサブユニットを含むチャネルは、げっ歯類のその相当物に匹敵する電気生理学的特性を有する。さらに、成人中枢ニューロンにおけるＮＭＤＡチャネルのコンダクタンスは、他の多くの動物種のコンダクタンスと類似している。開口および閉鎖の分布、およびその分布における指数成分の数は、同一方法で作製されたラット神経細胞で観察され、かつ同様な条件下で記録されたものに著しく匹敵する（Kohr et al. 1993; Lieberman & Mody, 1994）。さらに、シナプスおよびシナプス外ＮＭＤＡ受容体の単一チャネル特性が、比較に値すると思われる（Lester et al. 1990; Clark et al. 1997）。したがって、げっ歯類のＮＭＤＡＲ生物学およびシグナル伝達特性は、ヒトの特性と非常に似ていると思われ、ラット脳組織由来のアレイは、ヒトに使用される薬物の発見に大変有用であるだろう。その代わりとして、ＮＭＤＡＲをホモサピエンスから単離し、同じ手法で使用することができる。
【００５７】
上述のようにタンパク質Ａ／Ｇプレコート９６ウェルプレート上で固定化された未処理の脳組織から、ＮＭＤＡＲ複合体を抽出した。ＳＯＶの作用を以下のとおり試験した：固定化された複合体をすすぎ、可溶化／免疫沈降バッファーを反応バッファーと取り替えた。この反応バッファーをすべてのウェルに添加した。対照ウェルは、反応バッファーのみ、または反応バッファーおよびＡＴＰのみを含有した。５ｍＭ ＳＯＶをウェルの残りに添加し、３０℃で１時間インキュベートした。免疫ブロット分析では、反応をブロッキングバッファーで停止し、試料をすすぎ、抗ｐＴｙｒ、抗ＮＲ２Ａ／Ｂ、抗ＮＲ１および抗ＰＳＤ９５抗体を用いて、ウエスタンブロット法にかけた。免疫ブロット法および免疫蛍光法による検出方法を用いて、ＮＭＤＡＲリン酸化の変化、ならびに受容体サブユニット間かつ／または受容体サブユニットと複合体に存在するタンパク質との間のタンパク質間相互作用の変化を評価した。蛍光分析では、阻害剤と共にインキュベートした後、その反応をブロッキングバッファーで停止し、ウェル中の試料をすすぎ、パラホルムアルデヒドで固定し、異なるｅｍ／ｅｘ波長を有するＡｌｅｘａ結合一次抗体（抗ｐＴｙｒ、抗ＮＲ１および抗ＮＲ２Ａ／Ｂ）と共にインキュベートし、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ２３００マルチプレート蛍光リーダーで読み取った。
【００５８】
その結果を図２（免疫ブロット法）および図３（免疫蛍光法）に示す。図から分かるように、両方の分析方法によると、ＳＯＶは、ＮＲ２Ａ／Ｂサブユニットのチロシンリン酸化を増加し、受容体におけるＮＲ２Ａ／ＢおよびＰＳＤ−９５の量を減少させた。これらの結果は、in situで皮質スライスを使用する同様な実験を行ったFerrani-Kile & Leslie (2005)の実験結果と一致する。これらの結果から、本発明の方法により単離かつ固定化されたＭＤＡＲ複合体は生物活性であり、かつ修飾因子（阻害因子および活性化因子）に対するその応答が、ＮＭＤＡＲがin situの脳スライスにおいて試験された場合に観察される応答に類似しており、かつ免疫ブロット法および蛍光法によって検出することができることが実証されている。
【００５９】
実施例２：γ−アミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡ）複合体
ＧＡＢＡは、中枢神経系における抑制性神経伝達物質であり、それは、３つの異なる受容体サブタイプ：ＧＡＢＡＡ、ＧＡＢＡＢ、およびＧＡＢＡＣに結合する。ＧＡＢＡＡ受容体は、脳における高速抑制性（fast inhibitory）シナプス伝達の大部分を担う（Sivilotti and Nistri, 1991;Mody et al., 1994）。ＧＡＢＡＡ受容体は、ヘテロ五量体構造であると考えられ、相同サブユニットで形成される。このように、分子クローニングによって、異なる５つのクラス：α（１−６）、β（１−４）、γ（１−３）、δ、およびρ（１−２）に分けられる、異なるＧＡＢＡＡ受容体サブユニットの多重性がかなり明らかとなっている（Macdonald and Olsen, 1994; Smith and Olsen, 1995）。天然ＧＡＢＡＡ受容体の正確なサブユニット組成および化学量論は現在不明であるが、哺乳動物の脳における天然ＧＡＢＡＡ受容体の最も豊富な集団（population）は、α１β２γ２サブユニットの組み合わせであると考えられている（Benke et al., 1991; McKernan and Whiting, 1996）。ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットのそれぞれが、膜貫通領域を含有する。第３膜貫通領域と第４膜貫通領域の間の推定細胞内ドメインは、種々のプロテインキナーゼによるタンパク質のリン酸化のための非常に多くの潜在的コンセンサス部位を含有する（Macdonaldand Olsen, 1994; McKernan and Whiting, 1996)。以前の研究によって、セリン／トレオニン特異的リン酸化がＧＡＢＡＡ受容体を調節することが証明されている(Browning et al., 1993; Raymond et al., 1993; Levitan, 1994)。さらに、ＣＮＳ神経細胞におけるin situでのチロシン特異的リン酸化によるＧＡＢＡＡ受容体の調節が、Qi Wan et al, (1997)によって研究されている。この研究によって、内因性ＰＴＫは、βサブユニットのチロシンリン酸化を介してＧＡＢＡＡ受容体活性を変化させることができるという証拠が提供された。多くの脳機能および機能不全の仲介におけるＧＡＢＡＡ受容体の顕著な役割を仮定すると、ＧＡＢＡＡ受容体複合体を含有するタンパク質アレイは、広範囲の生理学的および病理学的プロセスの研究に重要である。
【００６０】
単離されたＧＡＢＡ受容体複合体に対するＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用を試験するために、海馬組織を切除し、上述の可溶化／免疫沈降でホモジナイズした。実施例１に記載のように、抗β２／β３抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，米国ニューヨーク州レークプラシッド）を使用して、ＧＡＢＡＡ受容体複合体を免疫沈降させた。固定化複合体をすすぎ、可溶化／免疫沈降バッファーを反応バッファーと取り替えた。反応バッファーをすべてのウェルに添加した。対照ウェルは、反応バッファーのみ、または反応バッファーおよびＡＴＰのみを含有した。５ｍＭ ＳＯＶをウェルの残りに添加し、３０℃で１時間インキュベートした。反応をブロッキングバッファーで停止し、試料をすすぎ、抗ｐＴｙｒおよび抗β２／β３抗体でウエスタンブロット法にかけた。
【００６１】
その結果を図４Ａ〜Ｂに示す。図から分かるように、ＳＯＶは、受容体におけるβ２／β３サブユニットのチロシンリン酸化を増加した。これらの結果は、培養神経細胞において内因性ＰＴＫおよび外来性ＰＴＫ ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃによって、ＧＡＢＡＡ β２／β３サブユニットのチロシン残基をリン酸化することができることを示す実験を行った、Qi Wan et al, (1997)の実験結果と一致する。
これらの結果から、本発明の方法により単離かつ固定されたＧＡＢＡＡ受容体複合体は生物活性であり、修飾因子（阻害因子および活性化因子）に対するその応答は生物学的に関連しており、実験室的標準方法を用いて検出することができることが実証されている。
【００６２】
実施例３：α−７ニコチン性アセチルコリン受容体複合体
ニコチン性アセチルコリン受容体は、中枢神経系、骨格筋の末梢神経系および神経筋接合部に存在する。ニコチニコイド（nicotinicoid）受容体ファミリー（Cascio, 2004）内にすべて分類される、ＧＡＢＡＡ受容体、グリシン受容体、およびセロトニン受容体３型と同様に、ニコチン性受容体は、中央の孔周囲に対称に配置された、５つの受容体サブユニットによって形成される。１７のｎＡＣｈＲサブユニットが同定されており、これらは、筋型および神経細胞型サブユニットに分けられる。１７のこれらのサブユニットのうち、α２−α７およびβ２−β４は、ヒトにおいてクローン化されている。筋肉においては、ｎＡＣｈＲは、２つのαサブユニット、β、δおよびγまたはεのいずれかから構成され（Siegel et al., 1999）、神経系においては、ｎＡＣｈＲは、広範囲のサブユニットの組み合わせを有して、より異種性（heterogeneous）である。α−７ｎＡＣｈＲは、リン酸化などの様々な細胞メカニズムによって制御される。カルモジュリン（ＣａＭ）キナーゼＩＩ阻害が、これらの受容体の使用依存性ランダウンを減弱することができるという知見（Liu and Berg, 1999）によって、細胞セリン／トレオニンリン酸化の直接的な役割が実証された。最近、チロシンリン酸化によって受容体機能をかなり迅速に調節することができることが明らかとなっている（Davis et al., 2001 and Cho et al., 2005）。以下の実験では、ＰＴＰ阻害剤ＳＯＶが、単離され、かつ生物活性のα−７ｎＡＣｈＲに対して作用を及ぼすかどうかを評価した。
【００６３】
単離α−７ｎＡＣｈ受容体複合体に対するＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用を試験するために、海馬組織を脳から切除し、いくつか修正を加えて、上述の可溶化／免疫沈降バッファーでホモジナイズした。可溶化バッファーは、実施例１で使用された０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の代わりに０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有した。固定化された複合体をすすぎ、可溶化／免疫沈降バッファーを反応バッファーと取り替えた。この反応バッファーをすべてのウェルに添加した。対照ウェルは、反応バッファーのみ、または反応バッファーおよびＡＴＰのみを含有した。５ｍＭ ＳＯＶをウェルの残りに添加し、３０℃で１時間インキュベートした。反応をブロッキングバッファーで停止し、試料をすすぎ、抗ｐＴｙｒ、抗α７抗体でウエスタンブロット法にかけた。
【００６４】
その結果を図５Ａ〜Ｂに示す。図から分かるように、ＳＯＶは、受容体におけるβ２／β３サブユニットのチロシンリン酸化を増加した。これらの結果は、α−７ｎＡＣｈ受容体を制御するチロシンリン酸化が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞においてゲニステインおよびペルバナデート（pervanadate）によって調節されることを示す実験を行った、Charpentier et al., (2005)の実験結果と一致する。
【００６５】
これらの結果から、本発明の方法により単離かつ固定されたｎＡＣｈＲ受容体複合体は生物活性であり、修飾因子（阻害因子および活性化因子）に対するその応答は生物学的に関連しており、実験室的標準方法を用いて検出することができることが実証されている。
【００６６】
実施例４．環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル−ＨＣＮ４
環状ヌクレオチド作動性イオンチャネルはリガンド作動性であり、リガンド作動性ファミリーよりも、電位作動性イオンチャネルのファミリーと構造が似ている。環状ヌクレオチド作動性チャネルは、哺乳類の嗅覚および視覚システムにおいて特に重要であるが、心臓にも見出される。視覚システムにおいて、ｃＧＭＰ（環状グアノシン一リン酸）作動性チャネルは、網膜光受容体細胞の外膜に見出される。高レベルのｃＧＭＰに応じて、チャネルが開き、正に荷電したイオンが細胞内に流入し、脱分極が起こる。最近、Arinsburgnら(2005)によって、過分極活性化環状ヌクレオチド作動性（ＨＣＮ）チャネルによって生成される場合には、心臓ペースメーカー電流は、ＨＥＫ２９３細胞およびラット心室筋細胞においてＨＣＮ４のリン酸化を介してＳｒｃチロシンキナーゼによって制御されることが報告されている。
【００６７】
ＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用を試験するために、ラット心室を切除し、可溶化／免疫沈降バッファー中でホモジナイズし、実施例１に記載のように抗ＨＣＮ４ポリクローナル抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社，テキサス州サンアントニオ）と共にインキュベートすることによって共免疫沈降にかけた。固定化された複合体をすすぎ、可溶化／免疫沈降バッファーを反応バッファーと取り替えた。この反応バッファーをすべてのウェルに添加した。対照ウェルは、反応バッファーのみ、または反応バッファーおよびＡＴＰのみを含有した。５ｍＭ ＳＯＶをウェルの残りに添加し、３０℃で１時間インキュベートした。反応をブロッキングバッファーで停止し、試料をすすぎ、抗ｐＴｙｒおよび抗ＨＣＮ４抗体を使用して、ウエスタンブロット法および蛍光分析にかけた。
【００６８】
その結果を図６Ａ〜Ｂに示す。図から分かるように、ＳＯＶは、受容体におけるＨＣＮ４サブユニットのチロシンリン酸化を増加した。これらの結果は、ＨＥＫ２９３細胞およびラット心室筋細胞においてＨＣＮ４のチロシンリン酸化を誘導するために、Ｓｒｃチロシンキナーゼを使用する実験を行った、Arinsburgn et al. (2005)の実験結果と一致する。
【００６９】
これらの結果から、本発明の方法により単離かつ固定化されたＨＣＮ４イオンチャネル複合体は生物活性であり、修飾因子（阻害因子および活性化因子）に対するその応答は生物学的に関連しており、実験室的標準方法を用いて検出することができることが実証されている。
【００７０】
概要
これらの研究から、本発明に従って多タンパク質複合体を作製することによって、ＨＴＳアッセイで使用されるタンパク質アレイの開発の実現性が実証されている。生物活性多タンパク質複合体は単離することができ、単離された複合体のリン酸化およびサブユニット相互作用の変化は容易に検出することができる。このことは、かかる調節が起こるのに必要な、キナーゼおよびホスファターゼなどの内因性足場タンパク質が、単離および固定化の間にわたって多タンパク質複合体と結合したままであることを強く示唆している。最後に、生物活性、固定化多タンパク質複合体のリン酸化の変化は、蛍光を使用して、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）分野で広く使用されている形式で検出することができる。
【００７１】
実施例５．ドーパミン受容体の単離および固定化
ドーパミン受容体は、その内因性リガンドとしての神経伝達物質ドーパミンと結合する、代謝調節型Ｇタンパク質共役受容体の一種である。５種類のドーパミン受容体、Ｄ１−Ｄ５が存在する。Ｄ１およびＤ５受容体は、ドーパミン受容体のＤ１様ファミリーのメンバーであるのに対して、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体は、Ｄ２様ファミリーのメンバーである。これらの受容体は、リン酸化およびタンパク質間相互作用によって制御される。
【００７２】
実施例１に記載の方法を用いて、ドーパミン受容体多タンパク質複合体を抽出し、固定化し、分析する。
【００７３】
実施例６．ヒスタミン受容体の単離および固定化
様々な種に存在するＨ３のいくつかのスプライスバリアントと共に、４種類の既知のヒスタミン受容体、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ４が存在する。その受容体のすべてが７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体であるが、Ｈ１およびＨ２は、その活性がＨ３およびＨ４とかなり異なる。Ｈ１は、ホスホイノシトール加水分解を増加し、Ｈ２は胃酸の分泌を促し、Ｈ３はヒスタミンのフィードバック阻害を仲介する。これらの受容体も、リン酸化およびタンパク質間相互作用によって制御される。
【００７４】
実施例１に記載の方法を用いて、ヒスタミン受容体多タンパク質複合体を抽出し、固定化し、分析する。
【００７５】
参考文献
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【００７６】
本発明は、その好ましい実施形態に関して説明されているが、当業者であれば、添付の請求項の範囲および精神内で修正を加えて本発明を実施することができることは理解されよう。したがって、本発明は、上述の実施形態に制限されないが、本明細書に記載の記述の精神および範囲内のそのすべての修正形態および等価物をさらに包含する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】、
【図１Ｂ】、
【図１Ｃ】、
【図１Ｄ】一例としてイオンチャネル受容体複合体を使用した、本発明の単離方法の概略図である。Ａ，細胞膜におけるインタクトな多タンパク質複合体；Ｂ，特別に配合された本発明のバッファー中でのタンパク質複合体の可溶化；Ｃ，最下部のパネル：免疫沈降バッファー中で可溶化された受容体複合体；最上部のパネル：表面に結合された抗サブユニット抗体を有する基体；Ｄ，抗体を介して固定化されたインタクトな多タンパク質複合体を有する基体。ＰＰ＝プロテインホスファターゼ；ＰＫ＝プロテインキナーゼ；ＳＰ＝足場タンパク質；ＲＳ＝受容体サブユニット。
【図２Ａ】、
【図２Ｂ】、
【図２Ｃ】、
【図２Ｄ】単離ＮＭＤＡＲ複合体の生物活性の免疫ブロット法による検出：固定化複合体に対するＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用。Ａ，免疫ブロット。Ｂ〜Ｄは、ｐＴｙｒ対ＮＲ２Ａ／Ｂ（Ｂ）、ＮＲ２Ａ／Ｂ対ＮＲ１（Ｃ）またはＰＳＤ−９５対ＮＲ１（Ｄ）の比として表される免疫ブロットの結果の定量化を示す。これらの結果は、４通りの別々の実験を表す。データは、対照に対する平均（ＳＥＭ）％である（＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１対照対ＳＯＶ）。
【図３Ａ】、
【図３Ｂ】固定化ＮＭＤＡＲ複合体の生物活性の免疫蛍光法による検出：固定化複合体に対するＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用。この結果は、ｐＴｙｒ対ＮＲ２Ａ／Ｂ（Ａ）およびＮＲ２Ａ／Ｂ対ＮＲ１（Ｂ）の比として表される。各値は、４通りの別々の実験を表す。データは、対照に対する平均（ＳＥＭ）％である（＊＊，Ｐ＜０．０１対照対ＳＯＶ）。
【図４Ａ】、
【図４Ｂ】単離ＧＡＢＡＡＲ複合体におけるチロシンリン酸化の刺激：単離ＧＡＢＡ受容体複合体に対するＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用。Ａ，免疫ブロット；Ｂ，免疫ブロットデータの定量化。この結果は、ｐＴｙｒ対β２／β３の比として表される。ブロットは、４通りの別々の実験を表す。データは、平均（ＳＥＭ）正味強度（Net intensity）（＊，Ｐ＜０．０５対照対ＳＯＶ）。
【図５Ａ】、
【図５Ｂ】単離α−７ｎＡＣｈＲ複合体におけるチロシンリン酸化の刺激：固定化複合体に対するＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用。Ａ，免疫ブロット；Ｂ，免疫ブロットデータの定量化。この結果は、ｐＴｙｒ対α−７の比として表される。ブロットは、４通りの別々の実験を表す。データは、平均（ＳＥＭ）正味強度（＊，Ｐ＜０．０５対照対ＳＯＶ）。
【図６Ａ】、
【図６Ｂ】単離ＨＣＮ４Ｒ複合体におけるチロシンリン酸化の刺激：ＰＴＰ阻害剤ＳＯＶの作用。Ａ，免疫ブロット；Ｂ，免疫ブロットデータの定量化。この結果は、ｐＴｙｒ対ＨＣＮ４の比として表される。ブロットは、４通りの別々の実験を表す。データは、対照に対する平均（ＳＥＭ）％である（＊，Ｐ＜０．０５対照対ＳＯＶ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2009532680.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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