(57)【要約】代謝症候群および２型糖尿病の治療に有用な植物学に基づいた組成物および方法が開示される。グルコースおよびインスリンを調節する同定された薬物の活性を増大させる手段のための組成物、キットおよび方法が更に開示される。
2009518429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療方法であって、該方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含む組成物を被験体に投与することを含み、該植物産物が、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油（Davana oil）、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネル（Oleoresin fennel）およびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物である、上記方法。
【請求項２】
インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療のための組成物であって、該組成物は治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含み、該植物産物が、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネルおよびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物である、上記組成物。
【請求項３】
インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療方法であって、該方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを被験体に投与することを含み、
ａ．該植物産物が、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であり；
ｂ．該アカシア由来の植物産物が、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；および
ｃ．該ホップに由来する植物産物が、プレニルフラボノイド（prenylflavonoid）、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲン（prenylnaringen）および８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される、上記方法。
【請求項４】
インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療のための組成物であって、該組成物は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを含み、
ａ．該植物産物が、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であり；
ｂ．該アカシア由来の植物産物が、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；および
ｃ．該ホップに由来する植物産物が、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される、上記組成物。
【請求項５】
インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療に使用するキットであって、該キットは、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを含み、
ａ．該植物産物が、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であり；
ｂ．該アカシア由来の植物産物が、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；および
ｃ．該ホップに由来する植物産物が、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される、上記キット。
【請求項６】
インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療のための脂肪細胞修飾のための方法であって、該方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含む組成物を被験体に投与することを含み、該植物産物が、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であって、
ａ．該アカシア由来の植物産物が、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；および
ｂ．該ホップに由来する植物産物が、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される、上記方法。
【請求項７】
インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療のための脂肪細胞修飾のための組成物であって、該組成物は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含み、該植物産物が、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であって、
ａ．該アカシア由来の植物産物が、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；および
ｂ．該ホップに由来する植物産物が、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される、上記組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は２００５年１２月９日に出願の米国仮出願第６０／７４８，９０７号に対して優先権を主張する。本出願は、２００３年１０月２０日に出願の米国出願第１０／６８９，８５６号の一部継続出願であって、これは２００３年６月１８日に出願された米国出願第１０／４６４，４１０号の一部継続出願であり、これは２００３年３月２６日に出願の米国出願第１０／４００，２９３号の一部継続出願および２００３年３月２６日に出願の米国出願第１０／４０１，２８３号の一部継続出願であり、これらの両方とも２００３年２月２５日に出願の仮出願第６０／４５０，２３７号および２００２年１０月２１日に出願の仮出願第６０／４２０，３８３号に対する特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張するものであって；ならびに本出願は、２００３年６月１８日に出願の米国特許出第１０／４６４，８３４号の一部継続出願であって、これは２００３年３月２６日に出願の米国特許出願第１０／４００，２９３号の一部継続出願および２００３年３月２６日に出願の米国特許出願第１０／４０１，２８３号の一部継続出願であり、これらの両方とも２００３年２月２５日に出願の仮出願第６０／４５０，２３７号および２００２年１０月２１日に出願の仮出願第６０／４２０，３８３号に対する特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張するものである。本出願はまた、２００１年６月２０日に出願の米国出願第０９／８８５，７２１号の一部継続出願でもある。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、炎症性障害および代謝障害、特にインスリン抵抗性症候群、糖尿病、肥満、体重増加、心臓血管疾患および癌の予防および治療のための植物化合物および抽出物を含む化合物、組成物、キットおよび方法を提供する。更に具体的には、本発明は、脂肪細胞の生理機能を修飾してインスリン感受性を高めるためにかかる組成物を用いる抗炎症の医薬組成物および治療方法に関する。
【関連技術の説明】
【０００３】
研究によって、無調節な炎症プロセスは、代謝症候群、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、異脂肪血症、リポジストロフィーおよび心臓血管疾患を包含する多くの一般的な（prevalent）慢性疾患の病因に関連づけられている。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）およびプラスミノーゲン活性化因子抑制因子−１（ＰＡＩ−１）の血漿中濃度の増加は、慢性炎症の特性であるが、これらの病理の全てにおいて様々な程度で認められる［Dandona, P.ら、Inflammation: the link between insulin resistance, obesity and diabetes. Trends Immunol. 25(1):407, (2004); Dandona, P. Endothelium, inflammation, and diabetes. Curr Diab Rep 2(4):311-315, (2002)］。従って、抗炎症を目的とした治療法は、これらの症状に対する治療的または一時的な利益をもたらす可能性を有する。
【０００４】
インスリン抵抗性は慢性的炎症性の状態であることが現在よく認められている。炎症メディエーターや炎症性メディエーターと糖尿病の状態との間の相互関係については、１型糖尿病であるか２型糖尿病であるかにかかわらず、かなり以前から指摘されている。例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵臓膵島細胞内またはその周辺の初期炎症反応または細胞浸潤を特徴とする［Gepts, W. Pathologic anatomy of the pancreas in juvenile diabetes mellitus. Diabetes 14:619-633, (1965)；Koliopanos, A.ら、Cyclooxygenase 2 expression in chronic pancreatitis: Correlation with stage of the disease and diabetes mellitus. Digestion 64:240-247, (2001)も参照；およびLuo, C.ら、Cellular distribution and contribution of cyclooxygenase (COX)-2 to diabetogenesis in NOD mouse. Cell Tissue Res. 310:169-175, (2002)］。
【０００５】
更に、Helmerssonらは、男性高齢者の２型糖尿病が、プロスタグランジン形成の増加により示されるＣＯＸ介在炎症と関連することを示した。糖尿病の男性に認められるサイトカイン介在急性期タンパク質の高値は、肥満と空腹時インスリンの増加とに関連すると思われる。これらの結果は、慢性炎症の出現が糖尿病の病因における早朝のプロセスであるという現在の考え方を示している［Helmersson, J.ら、Association of type 2 diabetes with cyclooxygenase-mediated inflammation and oxidative stress in an elderly population. Circulation 109:1729-1734, (2004)］。
【０００６】
シクロオキシゲナーゼ酵素は、アラキドン酸をプロスタグランジンに変換する際における重要なステップに触媒作用を及ぼすものであって、また、急性炎症および慢性炎症の重要なメディエーターであるとも考えられる。例えば、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２は慢性膵炎において過剰発現するが、それはその疾患進行に関与するものである［Schlosser, W.ら、Cyclooxygenase-2 is overexpressed in chronic pancreatitis. Pancreas 25(1):26-30, (2002)］。更に、ＣＯＸ−２の阻害は、ストレプトゾトシン投与マウスにおけるＩＤＤＭを予防することが示されており[Tabatabai, T.ら、COX-2 inhibition prevents insulin-dependent diabetes in low-dose streptozotocin treated mice. Biochem. And Biophys. Res. Comm. 273:699-704, (2000)］、そしてＩＬ−１βやＴＮＦ−αやＩＦＮ−γ等の他のサイトカインと共に、膵島炎症および糖尿病におけるサイトカイン誘導性β細胞機能障害に関与することが示されている［Heitmeier, M.R.ら、Role of cyclooxygenase-2 in cytokine-induced β-cell dysfunction and damage by isolated rat and human islets. J. Bio. Chem. 279(51):53145-53151, (2004)；およびMcDaniel, M.L.ら、Cytokines and nitric oxide in islet inflammation and diabetes. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 211:24-32, (1996)］。
【０００７】
Corbettらは、チロシンキナーゼ阻害剤によってヒト膵島細胞におけるｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現のＩＬ−１β誘導、ＴＮＦ−α誘導およびＩＦＮ−γ誘導が予防されることを示し、更に膵島炎症を通じて放出されるサイトカインがＩＤＤＭにおけるβ細胞破壊に関与しているかもしれないということを示唆している［Corbett, J.A.ら、Tyrosine kinase inhibitors prevent cytokine-induced expression of iNOS and COX-2 by human islets. Am J Physiol. 270(6 Pt 1):C1581-7, (June 1996)］。ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γがＮＦ−κＢの制御下にある限り、ＮＦ−κＢの発現を調節する方法は、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現および活性の調節を介して、糖尿病に対する有益効果を有すると考えることができる。炎症および糖尿病の概要としては、Tak, P.P.およびFirestein, G.S. [NF-κB: a key role in inflammatory diseases. J. Clin. Invest. 107:7-11, (2001)またはYuan, M.ら、Reversal of obesity- and diet-induced insulin resistance with salicylates or targeted disruption of Iκκβ. Science 293:1673-1677, (2001)]を参照のこと。
【０００８】
既に述べたように、ＣＯＸ酵素は、アラキドン酸代謝およびプロスタグランジン合成に非常に関与しており、プロスタグランジン合成を阻害する薬物により糖処理が改善し得ることがかなり以前から知られている。Robertsonらは、ａ）プロスタグランジンＥ１によるインスリン分泌のインビボでの阻害、ｂ）糖尿病におけるインスリン分泌不全および炭水化物不耐症におけるプロスタグランジンＥ２の役割、およびｃ）ＣＯＸ−２が膵島プロスタグランジン合成において優位であることを示している［Robertson, R.P.ら、Inhibition of in vivo insulin secretion by prostaglandin E1. J. Clin. Invest. 54:310-315, (1974)；Robertson, R.P.およびChen, M. A role for prostaglandin E in defective insulin secretion and carbohydrate intolerance in diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 60:747-753, (1977)；およびRobertson, R.P. Dominance of cyclooxygenase-2 in the regulation of pancreatic islet prostaglandin synthesis. Diabetes 47:1379-1383, (1998)］。更に、Litherlandらは、ＩＤＤＭにおける抗原提示細胞の欠陥は、異常なプロスタグランジン合成酵素−２の発現によって定義される［Litherland, S.A.ら、Aberrant prostaglandin synthase 2 expression defines an antigen-presenting cell defect for insulin-dependent diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104:515-523, (1999)］。
【０００９】
高インスリン血症およびインスリン作用は、高血圧、低ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド血症、腹部肥満および耐糖能の変化の一般的な先行因子として最初は提唱されたが、更にこれらの異常は、１９９０年代後半には冠性心疾患の発症に関連づけられた。
【００１０】
これらの代謝症状に関する炎症および脂肪細胞の相互作用の考え方は、１９９３年のHotamisligilらの独創性に富んだ刊行物に端を発しており、それは、脂肪細胞が炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を構成的に発現し、肥満動物（ｏｂ／ｏｂマウス、ｄＢ／ｄＢマウスおよびｆａ／ｆａツッカーラット）の脂肪細胞におけるＴＮＦαの発現が顕著に増加することを示した。更に、可溶性ＴＮＦα受容体によるＴＮＦαの中和は、これらの動物におけるインスリン抵抗性の低下につながる［Hotamisligil G.S.ら、Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science 259:87-91, (1993)］。これらの知見によって、炎症誘発性サイトカインの発現および血漿中濃度の増加とインスリン抵抗性との関連が示される。
【００１１】
１９９３年以降進展した臨床的および実験的なデータによって、インスリン非感受性や肥満を包含する代謝症候群の全ての主要構成要素が、ＴＮＦαやインターロイキン−６（ＩＬ−６）やＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）やプラスミノーゲン活性化因子抑制因子−１（ＰＡＩ−１）等の炎症誘発性サイトカインの血漿中濃度の増加を特徴とする炎症性の症状と関連していることが示唆される［Yudkin, J.S.ら、C-reactive protein in healthy subjects: associations with obesity, insulin resistance, and endothelial dysfunction: a potential role for cytokines originating from adipose tissue? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:972-978, (1999)；Mohamed-Ali, V.ら、Subcutaneous adipose tissue releases interleukin-6, but not tumor necrosis factor-a, in vivo. Endocrinol. Metab. 82:4196-4200, (1997)；Lundgren, C.H.ら、Elaboration of type-1 plasminogen activator inhibitor from adipocytes. A potential pathogenetic link between obesity and cardiovascular disease. Circulation 93:106-110, (1996)］。臨床的には、ヒト脂肪組織がＴＮＦαを構成的に発現し、体重減少後に発現が低下することが示されている［Kern, P.A.ら、The expression of tumor necrosis factor in human adipose tissue. Regulation by obesity, weight loss, and relationship to lipoprotein lipase. J. Clin. Invest. 95:2111-2119, (1995)］。
【００１２】
糖尿病の有病率は、肥満とほとんど平行して増加してきており、米国ではこの２０年で２倍になっている。何人かの専門家は、米国における肥満は流行病であると述べた。どんな場合でも、個体群の年齢が上昇すると、肥満率が時間と共に増加するものと考えられる。心臓血管疾患と肥満および糖尿病との間に相関関係があるように、肥満と糖尿病との相関関係は明らかである。非肥満の２型糖尿病患者は、非肥満の非糖尿病の人よりも心臓血管疾患を患う可能性が高く；肥満で非糖尿病の人は、非肥満の糖尿病患者より心臓血管疾患のリスクが更に高い。従って、炎症に加えて、心臓血管疾患と、肥満および糖尿病の両方との間に因果関係が明らかにある。
【００１３】
脂肪組織は食物摂取、エネルギー消費および一連の代謝プロセスの調節における重要な役割を有する生物活性ペプチドを多く産生する内分泌器官として働くということが、現在一般に認められている。脂肪組織は、集合的にアディポカインと称される生理活性ペプチドを多く分泌する。それらの分泌機能を通じて、脂肪細胞は、幾つかの生理的プロセス（図１）に影響し得る複合ネットワークの中心となるものである。脂肪細胞塊の変化を伴うアディポカイン産生の調節異常は、肥満の代謝性および心血管系の合併症に関係してきた。肥満の個体において、アンギオテンシノーゲンおよびＰＡＩ−１の分泌の増加は高血圧および線維素溶解障害に有利に働くが、アシル活性化タンパク質（ＡＳＰ）、ＴＮＦα、ＩＬ−６またはレジスチンの過剰産生は筋肉および肝臓におけるインスリン作用を悪化させる。レプチンは、エネルギー収支を調節し、インスリン活性化効果を働かせる。これらの有益効果は、レプチン抵抗のため、肥満においては低下する。アディポネクチンは、筋肉および肝臓のインスリン効果を増大させ、抗アテローム発生効果を働かせる。更に、アディポネクチンは、循環レベルが肥満状態において減少する唯一の既知のアディポカインである。チアゾリジンジオン抗糖尿病薬は血漿アディポネクチンを増加させるものであって、これにより、アディポカインを標的とする薬理学がインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、糖尿病および肥満における心臓血管疾患を制御する有望な治療手段になるという見解が支持される（図２）［Guerre-Millo, M. Adipose tissue and adipokines: for better or worse. Diabetes Metabolism 30:13-19, (2004)］。
【００１４】
インスリン抵抗性および／または高インスリン血症は、代謝症候群において発現する他の異常な代謝性および心血管系の危険因子の原因であると仮定されている（図３）。これらの危険因子は、（１）中心性肥満（内蔵脂肪増加を含む）；（２）特徴的な異脂肪血症（血漿トリグリセリドの上昇、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の低値、および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール粒子パターンの低密度化を含む）；（３）増加した血漿フィブリノゲンおよびプラスミノーゲン活性化因子抑制因子−１で構成される凝血促進状態；（４）収縮期血圧および拡張期血圧の上昇；（５）高尿酸血症；および（６）ミクロアルブミン尿症として確認されている［Lebovitz, H.E.およびBanerji, M.A. Insulin resistance and its treatment by thiazolidinediones. Recent Prog Horm Res. 56:265-94, (2001)］。
【００１５】
インスリン抵抗性の治療の１つの方法としては、経口血糖降下剤を用いることによるものがある。経口血糖降下剤は、作用機序に基づいて異なる６種類に分類され得る：（１）肝臓におけるグルコース産生を低下させるビグアナイド（例えばメトホルミン）；（２）スルホニル尿素（例えば、グリピジド、グリブリドおよびグリメピリド）ならびに（３）膵臓インスリン分泌を増加させる非スルホニル尿素（例えばレパグリニドやナテグリニド）；（４）腸の炭水化物吸収を遅延させるα−グルコシダーゼ阻害剤（唯一市販されているのはアカルボース）；（５）筋肉および脂肪における脂肪細胞の脂肪酸取り込みおよびグルコース取り込みを増大させるチアゾリジンジオン、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン（剤）；および（６）抗炎症薬（例えばアスピリン（グルコース制御を改善するのに必要なレベルと関連した毒性があるため使用しない））［Scheen, A.J. Drug treatment of non-insulin-dependent diabetes mellitus in the 1990s. Achievements and future developments. Drugs 54(3):355-368, (Sep 1997)；Scheen, A.J. and Lefebvre, P.J. Antihyperglycaemic agents. Drug interactions of clinical importance. Drug Saf; 12(1):32-45, (Jan 1995)；Inzucchi, S.E. Oral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetes: scientific review. JAMA. 287(3):360-372, (Jan 16, 2002)；およびGao, Z.ら、Aspirin inhibits serine phosphorylation of insulin receptor substrate 1 in tumor necrosis factor-treated cells through targeting multiple serine kinases. J. Bio. Chem. 278(27):24944-24950, (2003)］。
【００１６】
一部の例外を除いて、入手し得る抗糖尿病薬は、グルコース濃度を低下させることに一様に効果的である。それらの抗糖尿病薬においては、作用機序が異なるため、心血管系のリスクおよび副作用プロファイルに対するそれらの効果について示される代謝効果が異なると思われる。メトホルミンは、体重減少に関連した（または体重に影響がない）現在のところ唯一の薬物であり；それは、最も広く処方される唯一の血糖上昇薬となっており、特にその使用に禁忌のない肥満患者における最もよい第一選択剤であると一般に考えられている。
【００１７】
しかし、適当な血糖を維持することが長期間無効となることは、薬物選択とは無関係に頻繁に見られることである。例えば、スルホニルウレアについては、二次無効率は毎年最高１０％である。この関連の高血糖の増悪は、多くの場合、多薬療法の使用を必然的に伴う；即ち、診断後３年間でおよそ半分の患者が１種超の医薬品を必要とし、９年以内にこれは全ての患者の７５％に増加する［Turner, R.C., Cull, C.A., Frighi, V.およびHolman, R.R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281(21):2005-2012, (Jun 2, 1999)］。そのうえ、併用療法の使用にもかかわらず、医師は一般に血糖コントロールの標的に達しない［Zinman, B. PPARgamma agonists in type 2 diabetes: how far have we come in preventing the inevitable? A review of the metabolic effects of rosiglitazone. Diabetes Obes Metab. 3 Suppl 1:34-43, (Aug 2001)］。
【００１８】
ＮＩＤＤＭの発現率の増加ならびに適切な血糖の維持の治療無効率の統計量によって、ＮＩＤＤＭの治療における新規な方法ならびにその合併症は、重要な公衆衛生学の優先すべき事項であることが示される。食事や規則的な運動や体重コントロールによって、インスリン抵抗性の病因の改善ならびに抗糖尿病薬の有効性の増大に効果があることが立証されているが、大多数の人は食事の改善および運動を避け、単剤療法はＮＩＤＤＭにおいて発現する無数の代謝不均衡の適切な制御に最終的に無効となることが予想される。ＮＩＤＤＭの途方もないコストを考慮して、人間の苦しみと金銭的な資力の両方の観点から、治療を補助するために更なる剤を有することは非常に望ましいと思われる［McCarty, M.F. Nutraceutical resources for diabetes prevention--an update. Med Hypotheses. 64(1):151-158, (2005)；McCarty, M.F. Toward practical prevention of type 2 diabetes. Med Hypotheses. 54(5):786-793, (May 2000)］。
【００１９】
糖尿病や肥満や心臓血管疾患に加えて、他の症状は、炎症性の病状として現在認識されている。それらの症状としては、（１）消化器官の疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎および胃炎）；（２）増殖性疾患（例えば、良性腫瘍、ポリープ、遺伝性ポリポーシス症候群、大腸癌、直腸癌、乳癌、前立腺癌および胃癌）；および（３）消化器官の潰瘍性疾患、および（４）心血管系の病状（狭心症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症または心筋梗塞の後遺症、老年認知症および脳血管疾患が包含される）が挙げられる。従って、インスリン感受性を向上させる有効な抗炎症薬に基づいた方法は、上記炎症性障害の内の１つ以上の治療、予防または発症の遅延に有用であることが期待されている。植物に基づく抗炎症化合物および抽出物は、一時的または予防的な治療法のためのまだ活用されていない原料になる。
【００２０】
例えば古代ヒンズー教徒医術等の民間の生薬療法は、多くの治癒特性を数多くの変化に富む植物化合物および抽出物の使用に帰し、それらに起因すると考えてきた。現在の研究は、これらの主張の多くが確固たる事実に基づいたものであることを示している。かかる２種の植物原料は、ホップ（カラハナソウ属のメンバー）およびアカシア（植物学的なアカシア属のメンバー）である。
【００２１】
ホップは、ビールに苦味をもたらす醸造者の技術においてかなり以前から知られているものであるが、その使用によるものとされる多くの健康に及ぼす有益性を有してきた。かかる有益性としては、抗酸化剤活性、抗炎症効果、抗癌活性等が挙げられる。例えば、Gerhauser, C. Beer constituents as potential cancer chemopreventative agents. Eur. J. of Cancer, 41(13):1941-54, (2005)を参照のこと。
【００２２】
アカシア属は、マメ科の属の樹木であり低木である。アカシア属には、マメ科オジギソウ亜科に属する１０００以上の種が包含される。アカシア属は、中央および南アメリカ、アフリカ、アジアの一部、ならびにオーストラリア（固有種の数が最大）の熱帯および亜熱帯地域において、世界中に分布する。アカシア属は、主に乾燥した不毛な地域に出現するものであって、そこでは多くの場合森林が開放的なとげのある潅木の性質を帯びている。
【００２３】
アセンヤクノキは、消毒性および収斂性の性質を有すると考えられている。調製物は、通常アルコール溶液（チンキ剤）の形態であり、それは、内服、含嗽水における使用、または口内の炎症組織上への直接塗布が可能である。伝統医薬は、以下の適応症に対する経口的使用を補助するものである：咽頭痛、歯肉炎、大腸炎、下痢、出血、糖尿病、皮膚病、癌、歯痛および口内の炎症。Singh［Singh, K.N.ら、Hypoglycaemic activity of Acacia catechu, Acacia suma, and Albizzia odoratissima seed diets in normal albino rats. Ind. J. Med. Res 64:754-757, (1976)］は、これらのアカシア属の植物の種子の食事における低血糖活性は、正常ラットにおいて認められたが、アロキサン誘導糖尿病ラットには認められなかったことを明らかにしている。しかしSinghは、種子の肉以外の植物の部分、例えば樹皮または心材か、もしくは植物材料抽出物のいずれが、正常または糖尿病のいずれかの被験体に任意の低血糖活性を有するのかについては、教示もしないし、取り組みもしていない。
【００２４】
カテキューは、世界の一部地域において避妊薬として経口的に使用される。カテキューは、局所的に、皮膚病、痔核、外傷に対して使用して出血を止め、そして損傷の手当てに使用される。カテキューは、歯肉炎、口内炎、咽頭炎および口腔内潰瘍用の含嗽水および含嗽薬に含まれてきた。食品および飲料において、それは着香剤として使用される。しかし、アセンヤクノキはあまり研究されておらず、潜在的な医薬的活性化合物の完全な範囲または同定に関しては、ほとんど知られていない。
【００２５】
アラビアゴムモドキ（Acacia nilotica）の種子の莢または樹皮の水溶性の点滴は、胃腸障害に対する民間療法において使用されてきたが、微粉状にされた種子や莢は、口の傷に対して、または梅毒性潰瘍の瘢痕形成を促進するために塗布されてきた［Amos, S., The pharmacological effects of an aqueous extract from Acacia nilotica seeds. Phytother. Res. 13:683-685, (1999), ならびにAl-Mustafa, Z.H.およびDafallah, A.A. A study on the toxicology of Acacia nilotica. Am. J. Clin. Med. 28(1):23-29, (2000)］。そして、アカシア属の種は、その称するところによれば、抗糖尿病性の性質を有する唯一の植物ではない。
【００２６】
別の植物、即ちツルレイシ（苦瓜）は、主に糖尿病の代替療法として使用される。ウリ科のメンバーであるその植物は、アマゾン川流域やアフリカやアジアやカリブ海や南アメリカの一部等の熱帯で成長する。苦瓜には、アジア、アフリカおよびラテンアメリカにおいて血糖降下剤としての使用の長い歴史があり、そこではその植物エキスは植物性インスリンと呼ばれてきた。興味が持たれる他の植物としては、アフリカキュウリ（African cucumber）、ツルレイシ、苦瓜（balsambirne）、ツルレイシ、バルサム（balsamo）、ベータモモルカリン（betamomorcharin）、コロシントウリ、bitter cucumber、ゴーヤ（bitter gourd）、ニガウリ（bittergurke）、carilla gourd、チャランチン（charantin）、chinli-chih、cundeamor、kakara、kuguazi、k'u-kua、lai margoseが挙げられる。４つの臨床試験で、苦瓜のジュース、果物および乾燥粉末に中程度の血糖低下作用があることが判明した。インビトロにおける動物およびいくつかのヒトの研究からのデータにより、苦瓜およびその粗抽出の一部には中程度の血糖低下作用があることが示唆される。しかし、これらの臨床試験はわずかなものであり、無作為割付けも二重盲検化もされなかった。報告された苦瓜の副作用としては、小児における低血糖昏睡および痙攣、マウスにおける受胎能の低下、ソラマメ中毒症様症候群（favism-like syndrome）、動物におけるγ−グルタミルトランスフェラーゼおよびアルカリホスファターゼの値の増加、および頭痛が挙げられる［Basch, E.ら、Bitter melon (Momordica chanantia): A review of efficacy and safety. Am J Health-Syst Pharm 60:356-359, (2003)］。従って、投与量を減少させつつ苦瓜の臨床的有効性を高める組成物または方法は、２型糖尿病または代謝症候群の治療に有用であろう。
【００２７】
アロエベラは、熱傷から便秘にわたる多種多様な医学的症状に対して奨励されてきた。限られた臨床研究と組み合わせて発表された動物における研究によって、アロエベラの経口投与が、糖尿病患者の血糖の低下ならびに高脂血症患者の血液脂質値の低下のための有用な補助的手段であるかもしれないということが示唆される［Eshun, K. Aloe vera: a valuable ingredient for the food, pharmaceutical and cosmetic industries--a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 44(2):91-96, (2004)］。しかし、経口または局所的なアロエベラの臨床的有効性は、現在のところ十分に定義されていない。結局、糖尿病または代謝症候群におけるアロエベラの最も効果的な使用は、他の材料との併用であるかもしれない。
【００２８】
ゲルマクレンＡおよびゲルマクレンＤは、多種多様な植物に見られるセスキテルペンであって、抗潰瘍、抗炎症、抗真菌および抗バクテリア活性を示すものである。現在に至るまで、これらの化合物が低血糖性またはインスリン活性化の性質を示すということを証明した研究はない。
【００２９】
ヨーロッパキイチゴ種子油（ラズベリー）は、γ−トコフェロール（ビタミンＥの最も活性の形態）に加えてリノール酸、リノレン酸およびパルミチン酸を包含している効力のある抗酸化剤の優れた食事源である。限定されたインビトロの研究によって、それには抗炎症性があることが示されている。ヨーロッパキイチゴ種子油の天然トコフェロールの含有量は非常に高く、それは酸化ストレスの予防を補助し得る。
【００３０】
ワサビ（ワサビ・ジャポニカ）は、毎日の食材のスパイスとして使用される。イソチオシアン酸アリル（ＡＩＴ）は、効力のあるワサビ成分であって、おろし金による調製後に植物酵素によって形成される。ＡＩＴは食中毒の細菌および菌類の増殖に対する阻害作用を示すことが知られている。ワサビの根および葉のいくつかの機能特性については、インビトロで検討されてきた。ワサビは、ペルオキシダーゼ活性を示し、抗酸化およびスーパーオキシドを消去する効能も示した。ワサビの抗変異原活性は、２−アミノ−３，８−ジメチルイミダゾ［４，５−ｆ］キノキサリン（焼魚や焼肉における周知の突然変異誘発物質／発癌物質）に対して認められた。それはまた、抗突然変異誘発物質であると同定された（−）−（Ｒ）−７−メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネートによるエイムス試験において、３−クロロ−４−ジクロロメチル−５−ヒドロキシ−２（５Ｈ）−フラノン（ＭＸ）のＨｉｓ＋復帰突然変異体のコロニーを減少させた。これらのデータによって、ワサビが人間の健康を維持するための効力のある機能的食料源であり得るということが示唆される。
【００３１】
ダバナ油（Davana oil）は、ダバナ（Artemisia pallens）の風乾された地上部から得られる。その薬草は、ビャクダンが成育する南インドの同じ地域で成育する。その匂いは、刺激が強く、刺すようで、強い青臭さがあり、微かに甘い芳香性のしつこさを伴った強烈な薬草の匂いである。主に香水産業で使用されるが、その精油には、抗細菌性および抗菌性がある。その油は、種々のテルペノイドおよびゲルマクラノリド（４，５β−エポキシ−１０α−ヒドロキシ−１−エン−３−オン−トランス−ゲルマクラン−６α，１２−オリドおよび４，５β−エポキシ−１０α−ヒドロキシ−１−エン−３−オン−トランス−ゲルマクラン−６α，１２−オリド）を含有する［Pujar, P.P.ら、A new germacranolide from Artemisia pallens Fitoterapia 71:590-592, (2000)］。
【００３２】
バコパモンニエラ（ＢＭ）は、従来の古代ヒンズー教徒医薬であるが、記憶向上、抗炎症、鎮痛、解熱、鎮静および抗てんかんの剤として何世紀もの間使用されてきた。その植物、植物抽出物、および単離されたバコシド（bacoside）Ａ３（３β，１６β，２３Ｒ）−１６，２３：１６，３０−ジエポキシ−２０−ヒドロキシダンマル（hydroxydammar）−２４−エン−３―イル−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシル−（１−２）−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−３））−β−Ｄ−グルコピラノシド）（主要な有効成分）は、神経薬理学的効果について検討され、向知性作用を認める多くの報告がある。更に、研究者は、ＢＭ調製物／抽出物の抗炎症効果、強心効果および他の薬理効果を評価してきた。
【００３３】
オレオレジンフェンネル（Oleoresin fennel）は、フェンネル（ウイキョウの種子）から蒸留される精油であって、医薬用着香剤として使用され、以前は駆風薬として使用された。最も優れた品種のフェンネルは、４〜５パーセントの精油（比重：０．９６０〜０．９３０）を産出するもので、その主成分は、アネトール（１−メトキシ−４−プロペニルベンゼン、５０〜６０パーセント）およびフェンコン（１，３，３−トリメチル−２−ノルカンファノン（norcamphanone）、１８〜２２パーセント）である。フェンコンは、刺激的で、樟脳様の異臭味を有する無色の液体であって、それが存在すると、市販の油の多くに不愉快な苦味を付与するものである。これが油の薬効成分に物質的に寄与すると主張されてきた。それ故、適当な割合のフェンコンを含有するようなフェンネルの種類だけが、医薬的使用に適切である。また、フェンネルの油には、ｄ−ピネン、フェランドリン（phellandrine）、アニス酸およびアニスアルデヒドも存在する。リモネンが成分として存在することもある。
【００３４】
センテラアジアティカは、創傷治癒および抗加齢の性質を有する植物である。アジチコシド（２α，３β，２３−トリヒドロキシ−ウルス−１２−エン−２８−酸（ｓａｅｕｒｅ）（Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−６）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステル）は、センテラアジアティカなる植物に由来し、創傷治癒活性を有することが知られており、ここで、治癒活性の向上はコラーゲン形成および血管新生の増加によるものと考えられてきた。
【００３５】
数千年間もインドセンダン（Azadirachta indica）の有益な性質がインドにおいて認められてきた。それは、おそらくその国の最も有用な伝統的植物である。インドセンダンは、その多様な有用性のため、驚異木として、「普遍的に」受け入れられた。インドセンダンに基づく７００を超える植物性生薬は、アーユルベーダ、シッダ、ユナーニ（Unani）、アムチ（Amchi）および他の地域的な健康上の慣習において明らかにされており；１６０を越える地域的な慣行が、その国のさまざまな地域で知られており、そこではインドセンダンが各種の人間の病気または障害を治癒または治療する際の重要または唯一の成分を形成するものとなっている。水溶性の葉抽出物はストレプトゾトシン誘導糖尿病における高血糖を低下させることが示されているが、この効果は、おそらくフラボノイド（クエルセチン）の存在によるものである。インドセンダンの葉抽出物はまた、糖代謝におけるエピネフリンの効果を遮断し、糖尿病ラットおよび正常ラットの一部において末梢グルコース利用率を低下させることが報告されている；これは、その植物が抗高血糖性である可能性を示している。正常およびアロキサン誘導糖尿病のウサギにおけるインドセンダンの葉の抽出物および種子油の血糖低下作用もまた、報告されている。しかし、その効果は糖尿病の動物の方がより顕著であり、その動物においては、アロキサン誘導糖尿病発現後４週間の投与により血糖値が有意に低下した。その血糖低下作用は、スルホニル尿素グリベンクラミドの場合と同等であることが判明した。インドセンダンの葉抽出物または種子油投与による前処置をアロキサン投与の２週前に開始し、それによって、対照糖尿病動物と比較して血糖値の上昇が部分的に予防された。これらの結果によって、インドセンダンが糖尿病における血糖値のコントロールに有益であり得るか、もしくはその疾患の発症の予防または遅延にも有用であり得るということが示唆される［reviewed in Brahmachari, G. Neem--an omnipotent plant: a retrospection. Chembiochem. 5(4):408-421, (Apr 2, 2004)］。しかし、長期投与により不明の効果を有するあり余る程の植物化学物質をインドセンダンが含有することから、明確な材料との併用によってインドセンダンの投与量を減少させることが有益であろう。
【００３６】
ウコンの根茎から単離される黄色の色素を含む分画物は、ジシンナモイルメタン基に属するクルクミノイドを含有する。クルクミノイドは、３〜５パーセントの程度まで存在する。クルクミノイドは、最も重要な活性成分と考えらており、ウコンの生物活性の原因となるものと考えられている。その主要活性は抗炎症であるが、クルクミノイドは、抗酸化、抗アレルギー性、創傷治癒、鎮痙、抗細菌性、抗真菌および抗腫瘍の活性も有することが報告されている。クルクミンは、１８１５年に単離され、１９１０年に構造が明確にされた。ウコンから単離される他のクルクミノイドとしては、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、クルクミンのシス−トランス幾何異性体、およびシクロクルクミンが挙げられる。クルクミノイドは、クルクマキサントリーザ（Curcuma xanthorrhiza）やガジュツ等のウコンに加えて、他の植物において見出され得る。
【００３７】
クルクミノイドは、その抗炎症作用によってよく知られている。ターメリック（tumeric）は、古代ヒンズー教徒医術において使用された最も古い抗炎症剤の内の１種である。クルクミノイドの抗炎症作用は、カラゲニン、綿玉、ホルムアルデヒド、および肉芽嚢等の化学的または物理的な刺激物等の炎症性反応モデルにおいて評価されている。ウコンの根茎のエタノール抽出物によって、２型糖尿病ＫＫ−Ａ（ｙ）マウスの血糖値の増加は有意に抑制された。インビトロの評価において、前記抽出物は、用量依存的方法でヒト脂肪細胞分化を活性化し、ＧＡＬ４−ＰＰＡＲ−γキメラアッセイにおいてヒトペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）−γリガンド結合活性を示した。前記抽出物の主成分は、クルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミンおよびａｒ−ツルメロンとして同定され、これらもＰＰＡＲ−γリガンド−結合活性を有していた［Kuroda, M., Mimaki, Y.ら、Hypoglycemic effects of turmeric (Curcuma longa L. Rhizomes) on genetically diabetic KK-Ay mice. Biol Pharm Bull 28(5):937-939, (2005)］。
【００３８】
しかし、クルクミノイドの長期間投与は、アスピリンおよびアスピリン様抗炎症剤の場合と同様のクルクミノイドのプロスタグランジン産生に対する作用による胃の苦痛感および刺激の原因となることがある。従って、相助作用的に機能を果たしてインスリン活性を増加させる他の血糖降下剤とのクルクミノイドの併用によって、クルクミノイドの投与量を減少させることが望ましいであろう。
【００３９】
共役リノール酸（ＣＬＡ）は、約２０の密接に関連した脂肪酸異性体からなる非必須脂肪酸である。ＣＬＡとは、共役ジエン性オクタデカジエン酸（dienoic octadecadienoate）（１８：２）の位置異性体および立体異性体として存在する一群の多価不飽和脂肪酸を指す。ＣＬＡは、２つの異性体、即ち、筋成長の改善の原因となると思われる９、１１異性体、および主に脂質生成（脂肪組織内の脂肪の貯蔵）を予防する１０、１２異性体となる。店舗で販売される大部分の補助剤は、両方の異性体の５０／５０の混合物を含有する。
【００４０】
各種の抗酸化特性および抗腫瘍特性がＣＬＡにはあると考えられてきた。しかしながら、人体組織の中の抗炎症薬濃度は、経口摂取では達成され得ないと考えられる。ヒトにおけるＣＬＡについての多くの研究は、体脂肪、特に腹部脂肪の減少傾向、血清総脂質の変化、および全身のグルコース取り込みの低下を含む。食事におけるＣＬＡ補充は、安全であることを示し、いかなる副作用もないと思われる。体脂肪塊を減少させる最大応答は、１日量３．４ｇで達成された。しかし、ヒトにおける幾つかの研究によって、ＣＬＡの高用量に起因するインスリン感受性の低下が示されている。インスリン作用を低下させないＣＬＡの併用が望ましいであろう。更に、ＣＬＡの有用性を骨粗鬆症等の他の慢性炎症性疾患に拡張し得るＣＬＡの併用も望ましいであろう。
【００４１】
近年の糖尿病治療の進歩にもかかわらず、糖尿病ならびに糖尿病関連の症状および障害（例えばインスリン抵抗性や代謝性シンドロームＸ）の治療および予防のための組成物の要求は依然としてある。肥満の発現率の上述の上昇に伴って、肥満の治療および予防のための組成物および方法も必要である。心臓血管疾患の予防および治療（アテローム性動脈硬化症の予防および治療が包含される）に有効な組成物および方法の要求もある。更に、主に炎症性の症状が想定され得る複数の症状が認められる場合、多くの障害に関連する炎症の治療および予防に有用な組成物および方法の要求がある。最後に、その活性の他に糖尿病ならびに糖尿病関連の症状および障害の現在の第一選択治療法の有効性を増大させ得るか、その相乗作用を示し得るか、さもなければそれを拡張し得る化合物を特定する差し迫った必要がある。本発明は、これらの要求を満たすものであり、そして関連の利益を提供するものでもある。
【発明の要旨】
【００４２】
本発明は、被験体における脂肪細胞の生理機能を修飾する方法であって、被験体に植物の化合物または抽出物あるいはその医薬的に許容し得る塩または混合物を投与することを含む方法を提供するものである。本発明は更に、幾つかの植物の化合物および抽出物、好ましくはアカシアまたはホップに由来するものが、脂肪細胞の脂質生成を増大させるという予想外の発見に関する。好ましい態様は、植物化合物単独かその混合物のいずれかを用いる脂肪細胞の脂質生成を高める組成物および方法を提供するものである。本発明の組成物および方法はまた、高インスリン濃度の存在下でまたは炎症性の状態において脂肪細胞からアディポネクチンの分泌を増加させることができる。更に、糖尿病ならびに糖尿病関連の症状および障害の治療に現在使用される多くの医薬品の活性と相乗作用を示し得、そしてそれを増大させ得る方法、キットおよび組成物が開示される。
【００４３】
本発明の第１の態様は、必要とする被験体のインスリン関連障害を治療するための脂肪細胞修飾の方法を開示するものである。これらの方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含む組成物を被験体に投与することを含むものであって、ここで、該植物産物は、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネルおよびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物である。
【００４４】
別の一態様は、必要とする被験体のインスリン関連障害の治療のための脂肪細胞修飾のための組成物に関する。使用される組成物は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含むものであって、ここで該植物産物は、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネルおよびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物である。
【００４５】
本発明の更なる一態様は、かかる治療を必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療のための脂肪細胞修飾の方法を開示するものであって、ここで該方法は被験体に治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含む組成物で治療することを含み、ここで該植物産物はアカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物である。
【００４６】
別の一態様において、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療のための脂肪細胞修飾のための組成物が開示される。ここで該組成物は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含み、ここで該植物産物は、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であり、ここで該アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキ（Accacia catechu）またはアラビアゴムモドキ（Acacia nilotica）に由来し；およびホップに由来する該植物産物は、プレニルフラボノイド（prenylflavonoid）、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲン（prenylnaringen）および８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【００４７】
本発明の更なる一態様は、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療方法に関し、ここで該方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを被験体に投与することを含む。
【００４８】
別の一態様は、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療のための組成物を開示するものである。これらの組成物は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを含み、ここで該植物産物は、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であり、ここで該アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；およびホップに由来する該植物産物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【００４９】
必要とする被験体のインスリン関連障害の治療に使用されるキットが、別の一態様において開示される。本明細書に開示されるキットは、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを含み、ここで該植物産物は、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であり；ここで該アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；およびここで該ホップに由来する植物産物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【００５０】
本発明の別の一態様は、インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療のための脂肪細胞修飾の方法であって、該方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含む組成物を投与することを含み、ここで該植物産物は、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であって、ここで該アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；およびここで該ホップに由来する植物産物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【００５１】
更に別の一態様において、インスリン関連疾患の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連疾患の治療のための脂肪細胞修飾のための組成物が開示される。この組成物は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含み、ここで該植物産物は、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物であって、ここで該アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来し；およびここで該ホップに由来する植物産物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
［発明の詳細な説明］
【００５２】
本発明は、被験体における脂肪細胞の生理機能を修飾する方法、化合物、組成物およびキットを提供する。前記組成物、化合物および方法は、被験体に植物化合物または抽出物あるいはその医薬的に許容し得る塩または混合物を投与することを含む。本発明は、幾つかの植物の化合物および抽出物、好ましくはアカシアまたはホップに由来するものが、脂肪細胞の脂質生成を増大させるという予想外の発見に関する。好ましい態様は、植物化合物単独かその混合物のいずれかを用いる脂肪細胞の脂質生成を高める組成物および方法を提供するものである。本発明の組成物および方法はまた、高インスリン濃度の存在下または炎症性の状態において脂肪細胞からアディポネクチンの分泌を増加させることができる。更に、糖尿病の治療に使用される多くの医薬品の活性と相乗作用を示し得、そしてそれを増大させ得る方法、キットおよび組成物が開示される。
【００５３】
特許、公表された出願、および本明細書で参照される科学文献は、当業者の知識を確立するものであって、あたかも具体的かつ個別に示され参照により組み込まれているかのように、本明細書において同程度に完全に参照により組み込まれている。本明細書の任意の引用文献と、本明細書の具体的な教示との間に矛盾がある場合は、後者を優先して解消するものとする。同様に、本技術分野で理解されている語またはフレーズの定義と、本明細書で具体的に教示されるものとしての語またはフレーズの定義との間に矛盾がある場合は、後者を優先して解消するものとする。
【００５４】
本明細書で用いられる技術的および科学的な用語は、特に定義されない限り、本発明が関係する当業者によって共通に理解される意味を有する。参照は、当業者に知られている各種の体系および資料について本明細書においてなされる。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理が記載される標準的参考図書としては、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)；Kaufmanら、Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995)；McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991). Standard reference works setting forth the general principles of pharmacology include Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed., McGraw Hill Companies Inc., New York (2001)が挙げられる。
【００５５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈により明確に規定されない限り、単数形は複数の指示物を包含する。本明細書で用いられる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が明確に規定されない限り、それらが指す用語の複数形をも具体的に包含する。さらに、本明細書で用いられる場合、具体的に指示されない限り、「または」という語は、「いずれか／または」の「排他的」意味ではなく、「および／または」の「包括的」意味において用いられる。「約（about）」という用語は、本明細書に用いられて「近似的に（approximately）」、「〜の辺りで（in the region of）」、「およそ（roughly）」、または「〜前後の(around)」を意味する。「約（about）」という用語は、数値範囲と共に用いられる場合、記載された数値の上下に境界を拡張することによってその範囲を加減する。一般に、「約（about）」という用語は、本明細書に用いられて、記載された値を上下２０％の変動値だけ修飾する。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、変数の数値の範囲の説明は、本発明がその範囲内の値のいずれかに等しい変数によって実施され得るということを意味することを意図するものである。従って、本質的に不連続な変数について、その変数は、その範囲の両端を含む数値範囲の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数について、その変数は、その範囲の両端を含む数値範囲の任意の実数値に等しくなり得る。例えば、０と２の間に値を有するとして記載される変数は、本質的に不連続な変数については０、１または２であり得、本質的に連続的な変数については０．０、０．１、０．０１、０．００１または任意の他の実数値であり得る。
【００５７】
参照は、以下、本発明の特定の態様で詳細になされる。本発明はこれらの特定の態様と共に記載されるが、本発明をかかる特定の態様に限定することを意図するものではないことが理解されよう。逆に、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神と範囲内に含まれ得るような変形、改変および等価物をカバーすることが意図される。以下の説明では、本発明の詳細な理解をもたらすために、数多くの具体的な詳細が記載される。本発明は、これらの具体的な詳細の一部や全てがない状態で実施することができる。他の例において、本発明を不必要に不明瞭にしないために、既知のプロセス操作を詳細に記載しなかった。
【００５８】
本発明を実施する際には、当業者に知られている任意の適切な材料および／または方法を利用することができる。しかし、好ましい材料および方法が記載される。以下の記述および実施例で参照される材料や試薬などは、特に明記しない限り市販の原料から入手できる。
【００５９】
本発明の第１の態様は、必要とする被験体のインスリン関連障害の治療方法を開示するものであって、この方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含む組成物を被験体に投与することを含むものであって、ここで、該植物産物は、アカシア、ホップ、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネルおよびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物である。
【００６０】
この態様の幾つかの側面において、脂肪細胞の前記修飾は、アディポネクチンの改善された分泌であるが、他の側面においては、前記修飾は脂肪細胞の生理機能の修飾である。
この態様の側面において、前記インスリン関連障害は、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満および体重増加からなる群から選択される。
【００６１】
更に他の側面において、アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来する。アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来するそれらの側面において、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの産物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、心材粉末ならびにアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物からなる群から選択される。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物であるそれらの側面において、前記抽出物は、酸性、アルカリ性、極性溶媒、非極性溶媒および胃液の抽出物から選択される。
【００６２】
この態様の幾つかの方法において、使用される前記組成物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択されるホップに由来する植物産物を含む。
【００６３】
幾つかの側面において、前記方法は、第１成分としてアカシア、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネルおよびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物を含み、かつ第２成分としてホップに由来する化合物または抽出物を含む組成物を用いるものであって、ここで第２成分に対する第１成分の比は約０．０１：１０〜約１０：１である。さらに他の側面において、第２成分に対する第１成分の比によって脂肪細胞修飾の相乗活性が規定される。
【００６４】
この態様の他の側面において、前記組成物は医薬的に許容し得る賦形剤を更に含み、ここで前記医薬的に許容し得る賦形剤は、コーティング、等張性の吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤および乳化剤からなる群から選択される。更なる側面において、組成物は、抗酸化剤、ビタミン剤、ミネラル、タンパク質、脂肪および炭水化物からなる群から選択される１種以上のメンバーを更に含む。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「脂肪細胞の修飾」は、治療前の細胞の状態からの細胞の物理的または生理化学的な機能の変化を意味する。物理的または生理化学的な機能的変化の非限定的な例としては、天然由来の分泌産物の分泌率または量の変化、新規な産物の導入、産生および分泌、選択化合物の分泌の抑止、あるいは細胞の形態および機能の物理的変化が挙げられ、それらには膜透過性または厚みの変化、細胞表面受容体数または結合効率の修飾、あるいは新規な細胞表面受容体の導入および発現が包含され得る。本発明の方法は、被験体における脂肪細胞の生理機能の修飾を提供する。脂質生成を高めるか、またはアディポネクチン分泌を増加させる脂肪細胞の生理機能の修飾は、それ自体望ましいことであるが、脂肪細胞の生理機能の修飾が他の有益な効果を有することができるということは認識されよう。本組成物はまた、炎症反応を低下させ、それによって患部組織の治癒を促進するか、もしくは更なるその損傷を予防する。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「治療」は、本発明による治療が行われない個体の徴候よりも、本発明の化合物が投与された個体の徴候を低減、予防および／または逆転させることを意味する。専門家によって、本明細書に記載した化合物、組成物および方法が、後の治療を決定する熟練した専門家（医師または獣医師）による継続的な臨床評価に付随して用いられるものであることが理解されよう。かかる評価は、特定の投与量（投与様式等）を増加させるべきか、減少させるべきか、もしくは継続させるべきかを評価する際に助けになり、そして情報を与えるものである。
【００６７】
「インスリン関連障害」とは、インスリンへの応答が疾患の原因となるか、もしくは疾患または症状の進行または抑制に関係したものである疾患または症状をいう。インスリン関連障害の代表例としては、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、多嚢胞性卵巣疾患、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満、体重増加、炎症性疾患、消化器官の疾患、狭心症、心筋梗塞、狭心症または心筋梗塞の後遺症、老年認知症および脳血管性痴呆等が挙げられるが、限定されるものではない。Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th Ed., McGraw Hill Companies Inc., New York (1994)を参照のこと。炎症性の症状の例としては、消化器官の疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、消化器官の良性腫瘍、消化器のポリープ、遺伝性ポリポーシス症候群、大腸癌、直腸癌、胃癌および消化器官の潰瘍性疾患）、狭心症、心筋梗塞、狭心症または心筋梗塞の後遺症、老年認知症、脳血管性痴呆、免疫疾患および一般的な癌等が挙げられるが、限定されるものではない。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「糖尿病合併症」どしては、網膜症、筋肉梗塞、特発性骨増殖症および骨喪失、足部潰瘍、ニューロパシー、動脈硬化症、胸部および肺実質の呼吸器自律性ニューロパシーおよび構造的障害、左室肥大、心血管の病的状態、腎機能の進行性喪失、および貧血が挙げられるが、限定されるものではない。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、「高脂血症」とは、総コレステロール（＞２００ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬコレステロール（＞１３０ｍｇ／ｄＬ）またはトリグリセリド（＞１５０ｍｇ／ｄＬ）の高血清中濃度または低ＨＤＬコレステロール（＜４０ｍｇ／ｄＬ）によって判然とする疾病特徴的症状をいう。更に、本明細書で用いられる場合、「脂肪」という用語は血清および脂肪のトリグリセリド分を指し、そして「トリグリセリド」は脂肪酸のトリアシルグリセロールエステルを指す。
【００７０】
本明細書で用いられる場合、「高インスリン血症」および「高血糖」という用語は、空腹時インスリン濃度＞１７ＩＵ／ｍＬおよび空腹時グルコース＞１２５ｍｇ／ｄＬを意味する。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、「インスリン感受性」という用語は、インスリンに応答してグルコースを吸収する細胞、組織、臓器または全身の能力を意味する。インビボの文脈で用いられる場合、「インスリン感受性」は、血流からグルコースを吸収する生物体の能力を意味する。インスリン感受性の改善は、それ故、目標変動範囲内で血糖値を維持する生物体の能力の改善をもたらす。従って、インスリン感受性の改善はまた、高血糖の発現率の低下ももたらし得る。インスリン感受性の改善によって、糖尿病やシンドロームＸや糖尿病合併症等の各種代謝症状の発症の治療、予防または遅延も可能になる。食事における糖の代謝処理の改善のために、インスリン感受性の改善によって、高脂血症および肥満の発症の治療、予防または遅延も可能になる。更に、インスリン感受性の改善によって、種々の炎症性の症状、例えば、消化器官の疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、膵炎、胃炎、消化器官の良性腫瘍、消化器のポリープ、遺伝性ポリポーシス症候群、大腸癌、直腸癌、胃癌および消化器官の潰瘍性疾患）、狭心症、心筋梗塞、狭心症または心筋梗塞の後遺症、老年認知症、脳血管性痴呆、免疫疾患および一般的な癌の治療、予防または発症の遅延が可能になる。
【００７２】
次いで、インスリン感受性の改善に関して、被験体は、インスリン抵抗性と診断された動物またはヒト、あるいはインスリン抵抗性のリスクがあると判定された肥満または高齢の動物またはヒト等の動物またはヒトであってよい。一般的な臨床医は、インスリン抵抗性を診断することが可能であろうし、被験体の健康歴の分析によって被験体にインスリン抵抗性のリスクがあるかどうかを判定することが可能であろう。
【００７３】
本発明の方法は、本発明の方法の有益性を享受することができる任意の被験体に用いることが意図される。従って、本発明によれば、「被験体」には、ヒトならびにヒト以外の被験体（特に、家畜化された動物）が包含される。本発明の化合物が投与される被験体は特定の外傷状態を患わないで済むことが理解されよう。実際、本発明の化合物は、いかなる徴候発現の前にも予防的に投与してよい。「治療的」、「治療上」およびこれらの用語の置換えは、治療的、一時的ならびに予防的な使用を包含するために用いられる。
【００７４】
本明細書で用いられる場合、「分泌の改善」は、語が指示する化合物の分泌速度または分泌量の少なくとも３％の増加を意味する。本発明は更に、被験体の血漿アディポネクチン濃度を改善する方法であって、被験体における脂肪細胞からアディポネクチン分泌を増加させるのに十分な量の化合物または組成物を被験体に投与することを含む方法を提供するものである。
【００７５】
一般に、血漿アディポネクチンの増加は、糖代謝の改善をもたらすインスリン感受性の改善、血液脂質プロファイルの改善、および炎症誘発性アディポカイン分泌の減少をもたらす。炎症誘発性アディポカイン分泌の減少は、全身性の炎症および炎症関連障害（例えば、糖尿病合併症、肥満、消化器官の炎症性疾患、消化器官の増殖性疾患、消化器官の潰瘍性疾患、狭心症、心筋梗塞、狭心症の後遺症、心筋梗塞の後遺症、老年認知症、脳血管性痴呆、免疫疾患および癌）の低下につながる［Guerre-Millo, M. Adipose tissue and adipokines: for better or worse. Diabetes Metabolism 30:13-19, (2004)］。
【００７６】
本発明の第２の態様は、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療のための脂肪細胞修飾のための組成物を提供するものである。これらの組成物は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含むものであって、ここで前記植物産物は、アカシア、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネルおよびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物である。
【００７７】
本発明の本態様の幾つかの側面において、前記組成物は、アディポネクチンの分泌の改善ための脂肪細胞修飾に有用であるか、もしくは他の側面においては、脂肪細胞の生理機能の修飾に有用である。
【００７８】
本態様の更なる側面において、前記組成物は、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満および体重増加からなる群から選択されるインスリン関連障害を治療するために用いられる。
【００７９】
更なる他の側面において、前記アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来する。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来するそれらの側面において、前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの産物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、心材粉末ならびにアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物からなる群から選択される。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物であるそれらの側面において、前記抽出物は、酸性、アルカリ性、極性溶媒、非極性溶媒および胃液の抽出物から選択される。
【００８０】
この態様の他の側面において、組成物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択されるホップに由来する植物産物を更に含む。ホップの化学の詳細な考察のために、参照により本明細書に完全に組み込まれる。Verzele, M.およびDe Keukeleire, D., Developments in Food Science 27: Chemistry and Analysis of Hop and Beer Bitter Acids, Elsevier Science Pub. Co., 1991, New York, USAを参照のこと。本明細書で用いられる場合、「Ｒｈｏ」は、それらの還元イソアルファ酸を意味し、ここで前記還元とは、４−メチル−３−ペンテノイルの側鎖のカルボニル基の還元である。
【００８１】
更に他の側面において、前記化合物は、第１成分としてアカシア、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＤ、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、ダバナ油、バコパモンニエラ、オレオレジンフェンネルおよびセンテラアジアティカからなる群に由来する化合物または抽出物を含み、かつ第２成分としてホップに由来する化合物または抽出物を含むものであって、ここで第２成分に対する第１成分の比は約０．０１：１０〜約１０：１である。他の側面において、第２成分に対する第１成分の比によって脂肪細胞の修飾の相乗活性が規定される。
【００８２】
この態様の組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を更に含み、ここで前記医薬的に許容し得る賦形剤は、コーティング、等張性の吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤および乳化剤からなる群から選択される。更なる組成物は、抗酸化剤、ビタミン剤、ミネラル、タンパク質、脂肪および炭水化物からなる群から選択される１種以上のメンバーを更に含む。
【００８３】
「治療上有効量」という用語は、要求される治療上の結果を達成するのに効果的な投与量における治療を意味するために用いられる。更に、本発明の１種以上の化合物を微調整および／または投与することによって、もしくは別の化合物と共に本発明の化合物を投与することによって、治療上有効量の本発明の化合物を増減することができるということは、当業者によって理解されよう。例えば、Meiner, C.L., "Clinical Trials: Design, Conduct, and Analysis," Monographs in Epidemiology and Biostatistics, Vol. 8 Oxford University Press, USA (1986)を参照のこと。本発明は、それ故、所定の哺乳類に特有の個別の切迫した事情に合わせて投与／治療を調整する方法を提供するものである。以下の実施例では図示されるように、治療上有効量は、例えば、実験的に相対的に少ない量で開始し、次いで有益効果の同時に判定しつつ段階的に増加させることによって容易に決定することができる。
【００８４】
「医薬的に許容し得る」という用語は、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないという意味で用いられる。
本明細書で用いられる場合、「植物産物」という用語は、完全で未改質の植物またはその部分、植物から単離された化合物、あるいは原料植物材料の抽出物または流出物を意味するために用いられる。
【００８５】
本明細書で用いられる場合、「化合物」は、その化学構造、化学名または慣用名によって識別することができる。化学構造と化学物質または慣用名とが矛盾する場合、化学構造が化合物の同一性に対して決定力がある。本明細書に記載される化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を含むことができ、従って、二重結合異性体（即ち幾何異性体）、鏡像異性体またはジアステレオマー等の立体異性体として存在することができる。従って、本明細書において表される化学構造は、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、鏡像異性的に純粋またはジアステレオマー的に純粋）ならびに鏡像異性体と立体異性体との混合物を含む図示または同定された化合物の全ての可能な鏡像異性体および立体異性体を包含する。当業者に周知の分離手法またはキラル合成手法を用いて、鏡像異性体と立体異性体との混合物をそれらの成分の鏡像異性体または立体異性体に分解することができる。前記化合物はまた、エノール形、ケト形およびそれらの混合物を含む幾つかの互変異性型で存在することもできる。従って、本明細書で表される化学構造は、図示または同定された化合物の全ての可能な互変異性型を包含する。また、記載される化合物は、１個以上の原子の原子質量が従来自然界で見られた原子質量とは異なる同位元素的に標式化された化合物を包含する。本発明の化合物に組み込まれ得る同位元素の例としては、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、非溶媒和の形態、水和形態を含む溶媒和の形態、およびＮ−酸化物として存在することができる。一般に、化合物は、水和、溶媒和またはＮ−酸化物であってよい。特定の化合物は、複数の結晶質または非晶質の形態で存在することができる。また、前記化合物の同属種、類似体、加水分解産物、代謝物ならびに前駆体またはプロドラッグは、本発明の範囲内において考えられる。一般に、全ての物理的形態は、本明細書において考えられる使用において等価であって、本発明の範囲内であることが意図される。
【００８６】
本発明による化合物は、塩であってよい。特に、前記化合物の医薬的に許容し得る塩類が考えられる。本発明の「医薬的に許容し得る塩」は、本発明の化合物と、前記化合物で塩（例えば、マグネシウム塩（本明細書では「Ｍｇ」または「Ｍａｇ」で表される））を形成する酸または塩基との組み合わせであって、治療条件下で被験体が許容するものである。一般に、本発明の化合物の医薬的に許容し得る塩は、１以上の治療係数（最小治療有効量に対する最小中毒量の比）を有する。当業者によって、最小治療有効量が被験体や適応症によって異なるものであり、従ってそれに応じて調整されるということが認識されるであろう。
【００８７】
「抽出物」という用語は、（１）植物を溶媒に曝露すること、（２）溶媒を植物産物から分離すること、および（３）溶媒を除去することによって生じる固体成分を意味する。
本明細書で用いる場合、「溶媒」という用語は、植物材料から固体成分を抽出するのに必要な特性を備えている水性または有機液体を意味する。溶媒の例としては、極性が低下する順に、水、水蒸気、過熱水、グリセリン、エチレングリコール、メタノール、ジエチレングリコール、エタノール、酢酸、１−プロパノール、１−ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｔ−ブチルアルコール、アセトン、２−ブタノン、塩化メチレン、クロロホルム、ダイグライム、ジメトキシエタン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルｔ−ブチルエーテル、エーテル、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、四塩化炭素、ヘプタン、ヘキサン、ペンタン、オクタノール、シクロヘキサン、超臨界ＣＯ２、液体ＣＯ２、液体Ｎ２またはこのような材料の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、「ＣＯ２抽出物」という用語は、植物産物を液体ＣＯ２または超臨界ＣＯ２の調製物に曝露し、その後ＣＯ２を除去することにより生じる固体成分を意味する。
【００８９】
本明細書で用いられる「アカシア」という用語は、マメ科樹木およびアカシア属の低木の任意のメンバーを意味する。好ましくは、アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来する。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、「ホップ」または「ホップ（複数）」とは、微生物作用を予防してビールに特徴的な苦味を付与するために醸造業で使用される、苦味のあるアロマ系オイルを含有するカラハナソウ属の植物球果をいう。より好ましくは、使用するホップは、カラハナソウに由来する。
【００９１】
本発明に記載の化合物は、希釈剤や賦形剤等の既知の医薬的に許容し得る担体のいずれかを伴う医薬的に許容し得るビヒクル中で必要に応じて調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990 and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, 1995参照）。本発明の組成物を生成する際に用いられる医薬的に許容し得る担体／ビヒクルの種類は、哺乳類に対する組成物の投与様式によって変化するものであるが、一般的に医薬的に許容し得る担体は、生理的に不活性であり、かつ無毒性である。本発明に記載の組成物の製剤は、本発明の化合物の１種超を含有してよく、同様に治療すべき徴候／症状の治療に有用な他の任意の薬理活性成分を含有してよい。
【００９２】
本発明の化合物は、当業者に公知の調製方法を用いて、医薬的に許容し得るビヒクルにおいて提供される。本発明の組成物は、標準的な経路によって投与することができる。本発明の組成物としては、経口、吸入、直腸、眼（硝子体内または前房内（intracameral）等）、経鼻、局所（口腔内および舌下等）膣内、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内および気管内等）に適切なものが挙げられる。更に、所定の化合物の持続的放出のために、本技術分野の標準系統的分類に従ってポリマーを添加してよい。
【００９３】
疾患または症状の治療に用いる組成物が医薬品グレードの化合物を使用し、その組成物が医薬的に許容し得る担体を更に含むということは、本発明の範囲内において考えられる。本発明のこれらの組成物を、投与経路と治療すべき疾患や患者との両方に適切な投与単位形態で調製してよいということは、更に考えられる。前記組成物は、薬学の本技術分野で周知の方法のいずれかによって調製される投与単位形態で都合よく示すことができる。全ての方法は、１種以上の助剤成分を構成するビヒクルとの会合体に活性成分を導くステップを含む。一般に、前記組成物は、液状ビヒクルまたは微粉固体ビヒクルまたは両方との会合体に均一かつ密接に活性成分を導き、次いで、必要に応じて、前記産物を所望の組成物に形成することによって調製される。
【００９４】
「用量単位」という用語は、単一投与、即ち、それ自体またはその混合物のいずれかとしての活性成分を固体または液体の賦形薬材料と共に含む物理的かつ化学的に安定な単位投与量のままで、患者に投与が可能で、かつ取り扱いと充填とが容易にできる単回投与を意味すると理解される。
【００９５】
経口投与に適切な組成物は、カプセル剤、小袋、錠剤、ソフトゲル剤または口内錠として別個の単位の形態であってよく、それらの各々は所定量の活性成分を、粉末または顆粒の形態；水性液体または非水液体中の溶液または懸濁液の形態（例えばエタノールまたはグリセロール）；または水中油型乳剤または油中水型乳剤の形態で含む。このような油は、食用油（例えば、綿実油、ゴマ油、椰子油または落花生油等）であってよい。水性懸濁剤用の適切な分散剤または懸濁化剤としては、合成ゴムまたは天然ゴム（例えば、トラガカントゴム、アルギン酸エステル、アラビアゴム、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、メチルセルロースおよびポリビニルピロリドン）が挙げられる。前記活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストの形態でも投与してよい。
【００９６】
経皮的組成物は、硬膏剤、マイクロ構造アレイ（極微針と呼称される場合もある）、イオン導入（低電圧電流を用いて皮膚に荷電性薬物を導入する）、エレクトロポレーション（高電圧の短い電気パルスを用いて皮膚内に一時的に水性の孔を形成する）、超音波導入（sonophoresis）（低周波超音波エネルギーを用いて角質層を破壊する）および熱エネルギー（熱を用いて皮膚をより浸透しやすくし、薬物分子のエネルギーを増加させる）の形態またはポリマーの貼付剤を介してよい。
【００９７】
眼の投与に適切な組成物は、活性成分の滅菌水性調製物の形態であってよく、それは微結晶形態、例えば水性の微結晶性の懸濁液の形態であってよい。リポソーム組成物または生分解性ポリマー系を用いて眼の投与用の活性成分を提示することもできる。
【００９８】
局所投与または眼の投与に適切な組成物としては、液体または半流動体の調製物（例えば、塗布剤、ローション剤、ゲル剤ならびに水中油型乳剤または油中水型乳剤（例えば、クリーム、軟膏またはペースト；あるいは滴剤等の溶液または懸濁液））が挙げられる。
【００９９】
上記の組成物の他に、本発明の組成物は、デポ製剤として調製してもよい。このような長時間作用型組成物は、注入（例えば、皮下、腹腔内または筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、前記活性成分は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば医薬的に許容し得る油中の乳剤）あるいはイオン交換樹脂と共に調製してよい。
【０１００】
本発明に記載の全身治療のために、１日量が０．００１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００２〜２０ｍｇ／ｋｇ哺乳類体重、例えば０．００３〜１０ｍｇ／ｋｇの化合物または抽出物が投与され、それは０．２〜１４０００ｍｇの活性成分の成人のヒトにおける１日量に相当する。皮膚科疾患の局所治療においては、０．１〜７５０ｍｇ／ｇ、好ましくは０．１〜５００ｍｇ／ｇの化合物または抽出物を含有する軟膏、クリームまたはローション剤を投与してよい。眼科用軟膏の局所的使用のために、０．１〜７５０ｍｇ／ｇ、好ましくは０．１〜５００ｍｇ／ｇの化合物または抽出物を含む滴剤またはゲル剤が投与される。経口組成物は、用量単位当たり０．０５〜２５０ｍｇ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇの化合物または抽出物を含有する好ましくは錠剤、カプセル剤または滴剤として調製される。
【０１０１】
本発明の化合物は、単独あるいは各々または他の化合物との併用で一般に都合のよい組成物中において投与される。以下の典型的な組成物の実施例は一例に過ぎず、本発明の範囲を限定することが意図されるものではない。以下の組成物において、「活性成分」は、本発明の化合物を意味する。
【０１０２】
組成物１：ゼラチンカプセル−硬質ゼラチンカプセルは、以下の成分量（ｍｇ／カプセル）を使用して調製される。（１）活性成分：０．１５〜１０００、（２）デンプン、ＮＦ：０〜６５０、（３）デンプン流動性粉末：０〜５０、（４）３５０センチストーク・シリコーン油：０〜１５。
【０１０３】
錠剤組成物は、下記の成分を用いて調製される。
組成物２：錠剤−成分量（ｍｇ／錠剤）−（１）活性成分：０．２５〜５００、微結晶性セルロース：２００〜６５０、ヒュームド二酸化ケイ素：１０〜６５０、ステアリン酸：５〜１５。前記成分を混合および圧縮して錠剤を形成する。
【０１０４】
あるいは、各々０．２５〜５００ｍｇの活性成分を含有する錠剤を以下の通りに形成する。
組成物３：錠剤成分量（ｍｇ／錠剤）−（１）活性成分：０．２５〜５００、（２）デンプン・セルロース：４５、（３）微結晶性ポリビニルピロリドン（水の１０％溶液として、）：３５、（４）カルボキシルメチルセルロースナトリウム：４．５（５）ステアリン酸マグネシウム：０．５（６）タルク：１。前記活性成分、デンプンおよびセルロースをＮｏ．４５メッシュのＵ．Ｓ．篩に通して完全に混合する。次いでＮｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．篩を通して生じる粉末に、ポリビニルピロリドンの溶液を混合する。そして生じた顆粒を５０〜６０℃で乾燥し、次いでＮｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．篩に通す。次いで、事前にＮｏ．６０Ｕ．Ｓ．篩に通した澱粉グリコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクを前記顆粒に添加し、混合後、錠剤機で圧縮して錠剤を得る。
【０１０５】
５ｍＬの投与量につき各々０．２５〜５００ｍｇの活性成分を含有する懸濁液を以下の通りに作製する。
組成物４：懸濁液成分量（ｍｇ／５ｍＬ）−（１）活性成分：０．２５〜５００ｍｇ、（２）カルボキシルメチルセルロースナトリウム：５０ｍｇ、（３）シロップ剤（１．２５ｍｇ安息香酸溶液）：０．１０ｍＬ、（４）香料（所要量）、着色剤（所要量）、（５）精製水：５ｍＬになるまで。
【０１０６】
前記活性成分をＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．篩に通し、次いでカルボキシルメチルセルロースナトリウムおよびシロップ剤と混合して平滑なペーストを形成する。安息香酸溶液、香料および着色剤を前記水の一部で希釈し、次いで撹拌しながら添加する。次いで十分な水を添加して必要量を得る。
【０１０７】
以下の成分を含有するエアゾール溶液を調製する。
組成物５：エアゾール成分量（重量部）−（１）活性成分：０．２５、（２）エタノール：２５．７５、（３）噴射剤２２（クロロジフルオロメタン）：７０．００。前記活性成分をエタノールと混合し、次いでその混合物を噴射剤２２の一部に添加し、３０℃まで冷却し、充填装置に移す。次いで必要量をステンレススチールの容器に入れて残りの噴射剤で希釈する。次いでバルブユニットを容器に取り付ける。
【０１０８】
坐剤を以下の通りに調製する。
組成物６：坐剤−成分量（ｍｇ／坐剤）−（１）活性成分：２５０、（２）飽和脂肪酸グリセリド：２，０００。
【０１０９】
活性成分をＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．篩に通し、必要最低限の熱を用いて事前に融解した飽和脂肪酸グリセリド中に懸濁する。次いでその混合物を名目容量２ｇの坐剤型に注入し、次いで冷却する。
【０１１０】
静脈内組成物を以下の通りに調製する。
組成物７：静脈注射用溶液−成分量−（１）１％エタノール中に溶解した活性成分（２）２０ｍｇのIntralipid（登録商標）乳剤：１，０００ｍＬ。
【０１１１】
上記の成分の溶液を毎分約１ｍＬの速度で患者に静脈内に投与する。
上記の活性成分は、複数の剤の併用であってもよい。
本発明の一態様は、インスリン関連障害の治療を必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療のための脂肪細胞修飾の方法を提供するものであって、該方法は、被験体に治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含む組成物を投与することを含み、ここで該植物産物はアカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物である。
【０１１２】
本態様の幾つかの側面において、前記脂肪細胞修飾はアディポネクチンの分泌の改善であるが、一方で他の側面においては、前記修飾は脂肪細胞の生理機能の修飾である。
この態様の側面において、前記インスリン関連障害は、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満および体重増加からなる群から選択される。
【０１１３】
更に他の側面において、前記アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来する。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来するそれらの側面において、前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの産物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、心材粉末ならびにアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物からなる群から選択される。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物であるそれらの側面において、前記抽出物は、酸性、アルカリ性、極性溶媒、非極性溶媒および胃液の抽出物から選択される。
【０１１４】
この態様の幾つかの方法において、使用される前記組成物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択されるホップに由来する植物産物を含む。
【０１１５】
更に他の側面において、前記用いられる組成物は、第１成分としてアカシアに由来する化合物または抽出物を含み、かつ第２成分としてホップに由来する化合物または抽出物を含む。別の側面において、第２成分に対する第１成分の比は約０．０１：１０〜約１０：１である。さらに他の側面において、第２成分に対する第１成分の比によって脂肪細胞修飾の相乗活性が規定される。
【０１１６】
この態様の幾つかの方法において、前記用いられる組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を更に含み、ここで前記医薬的に許容し得る賦形剤は、コーティング、等張性の吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤および乳化剤からなる群から選択される。更なる他の側面において、前記組成物は、抗酸化剤、ビタミン剤、ミネラル、タンパク質、脂肪および炭水化物からなる群から選択される１種以上のメンバーを更に含む。
【０１１７】
この態様の他の方法において、前記用いられる組成物は、苦瓜またはアロエベラの抽出物またはクルクミノイド化合物を更に含む。
本発明の別の一態様は、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療のための脂肪細胞修飾のための組成物を開示する。これらの組成物は治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物を含み、ここで該植物産物はアカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物である。幾つかの側面において、前記脂肪細胞修飾は、アディポネクチンの分泌の改善もしくは脂肪細胞の生理機能の修飾である。
【０１１８】
他の側面において、前記インスリン関連障害は、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満および体重増加からなる群から選択される。
【０１１９】
本態様の幾つかの組成物において、前記アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来するものであって、ここで前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの産物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、心材粉末ならびにアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物からなる群から選択される。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物であるそれらの側面において、前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物は、酸性、アルカリ性、極性溶媒、非極性溶媒および胃液の抽出物から選択される。
【０１２０】
更なる側面の組成物において、ホップに由来する植物産物は、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【０１２１】
更にほかの方法において、前記組成物は、第１成分としてアカシアに由来する化合物または抽出物を含み、かつ第２成分としてホップに由来する化合物または抽出物を含む。他の組成物において、第２成分に対する第１成分の比は約０．０１：１０〜約１０：１であるが、一方で更に他の側面においては、第２成分に対する第１成分の比によって脂肪細胞修飾の相乗活性が規定される。
【０１２２】
本態様の組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を更に含み、ここで前記医薬的に許容し得る賦形剤は、コーティング、等張性の吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤および乳化剤からなる群から選択される。更なる組成物は、抗酸化剤、ビタミン剤、ミネラル、タンパク質、脂肪および炭水化物からなる群から選択される１種以上のメンバーを更に含んでよい。
【０１２３】
この態様の他の組成物は、苦瓜またはアロエベラの抽出物またはクルクミノイド化合物を更に含む。
別の一態様において、本発明は、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療方法を開示するものであって、かかる方法は、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを被験体に投与することを含む。幾つかの側面において、前記インスリン関連障害は、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満および体重増加からなる群から選択される。
【０１２４】
更に他の側面において、前記アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来する。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来するそれらの側面において、前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの産物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、心材粉末ならびにアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物からなる群から選択される。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物であるそれらの側面において、前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物は、酸性、アルカリ性、極性溶媒、非極性溶媒および胃液の抽出物から選択される。
【０１２５】
本態様の幾つかの側面において、前記植物産物は、ホップに由来し、そしてプレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【０１２６】
本態様の方法において、インスリンのレベルを調節するための薬物は、ビグアナイド、スルホニル尿素、非スルホニル尿素、α−グルコシダーゼ阻害剤およびチアゾリジンジオンからなる群から選択されるが、一方で特定の側面において、インスリンレベルを調節するための薬物は、メトホルミン、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、ロシグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンからなる群から選択される。
【０１２７】
好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はメトホルミンである。他の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はトログリタゾンである。更に別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はピオグリタゾンである。別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はロシグリタゾンである。
【０１２８】
更に好ましい側面において、前記植物産物は還元イソアルファ酸であり、前記インスリンレベルを調節するための薬物はメトホルミン、トログリタゾン、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンである。
【０１２９】
本態様の幾つかの方法において、前記植物産物および前記インスリンレベルを調節するための薬物は、逐次的または同時に与えられる。幾つかの側面において、前記植物産物および前記インスリンレベルを調節するための薬物は、別個の薬物形態または単一の組成物として同時に与えられる。更に他の側面において、前記植物産物および前記インスリンレベルを調節するための薬物は、キットにおいてある。
【０１３０】
本明細書で用いられる場合、「インスリンのレベルまたは感受性の調節」という用語は、インスリンレベルを特定の値に維持する手段、もしくはインスリンのレベルあるいは内因性インスリンまたは外因性インスリンに対する反応の所望の変化（増加または減少のいずれか）を誘導する手段を指す。
【０１３１】
本明細書で用いられる場合、「逐次的および同時に」という用語は、本発明の化合物と、治療的に有効な時間窓内におけるインスリンレベルを調節するための薬物との併用投与を指す。
【０１３２】
「併用投与」は実質的に同時の投与（０．５時間未満前、０．５時間未満後または両方）、標的剤の約０．５〜約２４時間前の投与、またはその両方、即ち少なくとも０．５時間前に与えられる植物産物またはインスリンレベルを調節するための薬物の１回以上の投与、および代替剤の実質的に同時（両方同時か、直前または直後かのいずれか）に与えられる１回の投与を包含する。更に、「併用投与」は、代替剤の投与後２４時間以内に前記植物または薬物の１回超の投与量を投与することを包含するものであって、換言すれば、代替剤の投与毎の前またはそれと共に前記植物またはインスリンレベルを調節するための薬物を再度投与する必要はないが、治療の過程で断続的に投与してもさしつかえない。
【０１３３】
本明細書で用いられる場合、「治療的に有効な時間窓」とは、必要とする被験体に対する本発明の化合物の投与によって有害作用または徴候が減少または取り除かれる時間間隔を意味する。好ましい態様において、本発明の化合物は、有害作用または徴候に近接して投与することができる。
【０１３４】
本発明の更なる態様は、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療のための脂肪細胞修飾のための組成物を提供するものであって、ここでその組成物は治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物とを被験体に投与することを含む。本態様の特定の他の側面において、前記インスリン関連障害は、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満および体重増加からなる群から選択される。
【０１３５】
幾つかの側面において、前記植物産物は、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物である。更に他の側面において、前記アカシアに由来する植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来するものであって、前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの産物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、心材粉末ならびにアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物からなる群から選択される。これらの側面において、前記アカシア由来の植物産物はアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物であって、前記抽出物は、酸性、アルカリ性、極性溶媒、非極性溶媒および胃液の抽出物から選択される。
【０１３６】
本態様の他の側面において、前記植物産物はホップに由来し、そして、プレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【０１３７】
更に他の側面の組成物において、インスリンのレベルを調節するための薬物は、ビグアナイド、スルホニル尿素、非スルホニル尿素、α−グルコシダーゼ阻害剤およびチアゾリジンジオンからなる群から選択される。他の側面において、前記インスリンレベルを調節するための薬物は、メトホルミン、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、ロシグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンからなる群から選択される。
【０１３８】
好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はメトホルミンである。別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はトログリタゾンである。更に別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はピオグリタゾンである。別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はロシグリタゾンである。
【０１３９】
更に好ましい側面において、前記植物産物は還元イソアルファ酸であり、前記インスリンレベルを調節するための薬物はメトホルミン、トログリタゾン、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンである。
【０１４０】
本態様の組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を更に含み、ここで前記医薬的に許容し得る賦形剤は、コーティング、等張性の吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤および乳化剤からなる群から選択される。更なる組成物は、抗酸化剤、ビタミン剤、ミネラル、タンパク質、脂肪および炭水化物からなる群から選択される１種以上のメンバーを更に含んでよい。
【０１４１】
本発明は、必要とする被験体におけるインスリン関連障害の治療に用いるキットについて更に考察する。前記キットは、治療上有効量の医薬的に許容し得る植物産物と、被験体のインスリンのレベルまたは感受性を調節するための薬物と含む。幾つかの側面においては、キットの成分を用いてインスリン関連障害を治療し、ここで前記インスリン関連障害は、糖尿病、糖尿病合併症、インスリン感受性、高血糖、異脂肪血症、インスリン抵抗性、代謝症候群、肥満および体重増加からなる群から選択される。前記キットは、キットの構成要素の使用に関する説明書を更に含む。
【０１４２】
本態様の幾つかの側面において、前記キットの植物産物は、アカシアまたはホップに由来する化合物または抽出物である。更に他の側面において、前記アカシア由来の植物産物は、アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来する。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキに由来するそれらの側面において、前記アセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの産物は、ゴム樹脂、樹皮粉末、心材粉末ならびにアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物からなる群から選択される。前記アカシア由来の植物産物がアセンヤクノキまたはアラビアゴムモドキの抽出物であるそれらの側面において、前記抽出物は、酸性、アルカリ性、極性溶媒、非極性溶媒および胃液の抽出物から選択される。
【０１４３】
本態様の幾つかの側面において、前記キットの植物産物は、ホップに由来し、そしてプレニルフラボノイド、カルコン、還元イソアルファ酸、ジヒドロイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、イソキサントフモール、６−プレニルナリンゲンおよび８−プレニルナリンゲニンからなる群から選択される。
【０１４４】
他の側面において、前記キットにおいてインスリンのレベルを調節するための薬物は、ビグアナイド、スルホニル尿素、非スルホニル尿素、α−グルコシダーゼ阻害剤およびチアゾリジンジオンからなる群から選択される。他の側面において、インスリンレベルを調節するための薬物は、メトホルミン、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、ロシグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンからなる群から選択される。
【０１４５】
好ましい側面において、前記キットの植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はメトホルミンである。別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はトログリタゾンである。更に別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はピオグリタゾンである。別の好ましい側面において、前記植物産物はアカシアに由来し、前記インスリンレベルを調節するための薬物はロシグリタゾンである。
【０１４６】
更に好ましい側面において、前記キットの植物産物は還元イソアルファ酸であり、前記インスリンレベルを調節するための薬物はメトホルミン、トログリタゾン、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンである。
【０１４７】
前記キットに用いられる組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を更に含み、ここで前記医薬的に許容し得る賦形剤は、コーティング、等張性の吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤および乳化剤からなる群から選択される。更なる組成物は、抗酸化剤、ビタミン剤、ミネラル、タンパク質、脂肪および炭水化物からなる群から選択される１種以上のメンバーを更に含んでよい。
【０１４８】
幾つかの側面において、前記キットの植物産物および前記インスリンレベルを調節するための薬物は、逐次的または同時に与えられる。幾つかの側面において、前記植物産物および前記インスリンレベルを調節するための薬物は、別個の薬物形態または単一の組成物として同時に与えられる。
【０１４９】
本明細書で用いられる場合、「ＣＬＡ異性体」という用語は、同じ炭素数１８のポリ不飽和の化学構造を有する脂肪酸（またはアルコール）を意味する。ＣＬＡの場合、各異性体は、炭素数１８の必須ポリ不飽和脂肪酸のリノール酸（１８：２ｎ−６）に由来し、そしてそれは炭素数９および１２で２個のシス二重結合を有する。ＣＬＡ異性体もまた、２個の二重結合を有するが、それらは炭素数７〜１３で相互に隣接するかもしくは共役し、シスまたはトランスであり得る。
【０１５０】
「共役化合物」という用語は、単結合および炭素−炭素二重結合が交互に見られるような少なくとも３個の連続的な炭素−炭素結合を有する炭化水素である部分を少なくとも１個有する化合物を意味する。従って、前記化合物は、−ＨＣ＝ＣＨ−Ｈ２Ｃ＝ＣＨのサブユニットを含むものである。共役化合物の２つの好ましいカテゴリは、脂肪酸および脂肪アルコールである。これらのジ不飽和化合物またはポリ不飽和化合物は、炭素数および不飽和数が同じである対応する天然由来の化合物の慣用名を使用して称されるという点に留意する必要がある。このような天然由来の化合物はその炭素―炭素二重結合の配置によって必ずしも共役しないが、本発明においては、それらの化合物の共役形態のみが考慮されることが理解されよう；即ち、二重結合の配置は、−Ｃ＝Ｃ−Ｃ＝Ｃなる構造を含むものとする。炭素原子数が４、５、６または７と少ない化合物が考えられるが、好ましい共役化合物は８、９、１０、１２、１４、１６個またはそれ以上の炭素原子を有し、炭素原子数が３２、３０、２８または２６個を越えないことが好ましい。
【０１５１】
本明細書で用いられる「共役脂肪酸」または「共役脂肪アルコール」というフレーズには、脂肪酸および脂肪アルコールならびに他のポリ不飽和化合物の異性体も包含されるということに留意する必要がある。適切な共役脂肪酸としては、リノール酸、リノレン酸、γリノレン酸、アラキドン酸、ミード酸、ステアリドン酸、α−エレオステアリン酸、エレオステアリン酸、ピノレン酸、ドコサテトラエン酸、９、１２−オクタデカジエン酸、オクタデカトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸ならびに他の全てのジ不飽和脂肪酸およびポリ不飽和脂肪酸の共役形態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい一態様において、共役脂肪酸は、トリグリセリドの形態のＣＬＡである。
【０１５２】
本明細書で用いられる場合、「共役脂肪アルコール」というフレーズとしては、リノリルアルコール（linoleic alcohol）、リノリルアルコール（linolenic alcohol）、γリノレニルアルコール（gamma linolenic alcohol）、アラキドニルアルコール（arachidonic alcohol）、ミードアルコール（mead alcohol）、ステアリドニルアルコール（stearidonic alcohol）、αエレオステアリルアルコール（alpha-eleostearic alcohol）、エレオステアリルアルコール（eleostearic alcohol）、ピノレニルアルコール（pinolenic alcohol）、ドコサジエノイルアルコール（docosadienic alcohol）、ドコサテトラエノイルアルコール（docosatetraenoic alcohol）、オクタデカジエノイルアルコール（octadecadienoic alcohol）、オクタデカトリエノイルアルコール（octadecatrienoic alcohol）、エイコサテトラエノイルアルコール（eicosatetraenoic alcohol）、エイコサペンタエノイルアルコール（eicosapentaenoic alcohol）、ドコサヘキサエノイルアルコール（docosahexaenoic alcohol）、ドコサペンタエノイルアルコール（docosapentaenoic alcohol）ならびに他の全てのジ不飽和脂肪アルコールおよび多価不飽和脂肪アルコールの共役形態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ただし、本発明は、１個以上の二重結合がシス異性体になるアルコールおよび酸、ならびに１個以上の二重結合がトランス異性体になるアルコールおよび酸を含む。場合によっては、全ての二重結合がシスであり、一方で全てがトランスであり、さらに他の場合は、シスとトランスが混合した化合物である。
【０１５３】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を更に示すことを意図しており、全く制限的ではない。当業者は、ルーチン試験を用いるだけで、本明細書に記載される特定の物質および手順に相当する数多くの均等物を認めるか、もしくは確認することが可能であろう。
【０１５４】
実施例
実施例１
ＬＰＳ刺激マウスマクロファージモデルにおける抗炎症作用についてのホップ誘導体、選択植物化学物質および植物抽出物のスクリーニング
モデル：マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７は、検査薬の抗炎症活性の評価における確立されたモデルである。細菌性リポ多糖によるＲＡＷ２６４．７細胞の刺激は、ＣＯＸ−２の発現とＰＧＥ２の産生とを誘導する。ＰＧＥ２合成の阻害は、検査薬の抗炎症作用の基準として用いられる。
【０１５５】
装置：本実施例で使用した装置としては、OHAS Model番号E01140分析天秤、Forma Model番号F1214生物学的安全性キャビネット（マリエッタ、オハイオ州）、０．１〜１００μＬを供給する各種ピペット（VWR、ロチェスター、ニューヨーク州）、細胞手動計数器（VWR Catalog番号23609-102, ロチェスター、ニューヨーク州）、Forma Model番号F3210 ＣＯ２インキュベーター（マリエッタ、オハイオ州）、血球計算器（Hausser Model番号1492、ホーシャム、ペンシルベニア州）、Leica Model番号DM IL倒立顕微鏡（ウェッツラー、ドイツ）、PURELAB Plus Water Polishing System （U.S. Filter、ローウェル、マサチューセッツ州）、４℃冷蔵庫（Forma Model番号F3775、マリエッタ、オハイオ州）、ボルテックスミキサー（VWR Catalog番号33994―306、ロチェスター、ニューヨーク州）および３７℃水浴（Shel Lab Model番号1203、コーネリアス、オレゴン州）がある。
【０１５６】
化学物質および試薬：細菌性リポ多糖（ＬＰＳ；Ｂ大腸菌０５５：Ｂ５）は、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。熱不活性化ウシ胎児血清（FBS-HI Cat.番号35-011CV）およびDulbecoのEagle培地の改良物（DMEM Cat番号10-013CV）は、Mediatech社（ハーンドン、バージニア州））から購入した。ホップ分画物（１）Alpha Hop（１％アルファ酸；ＡＡ）、（２）Aromahop OE（１０％ベータ酸および２％異性化アルファ酸）、（３）Isohop（異性化アルファ酸；ＩＡＡ）、（４）ベータ酸溶液（ベータ酸；ＢＡ）、（５）Hexahop Gold（ヘキサヒドロ異性化アルファ酸；ＨＨＩＡＡ）、（６）Redihop（還元異性化アルファ酸；ＲＩＡＡ）、（７）Tetrahop（テトラヒドロイソアルファ酸；ＴＨＩＡＡ）および（８）ホップかすをBetatech Hops Products（ワシントンＤ．Ｃ．、米国）から入手した。ホップかすを等容量の無水エタノールで２回抽出した。濃厚な茶色の残留物のみが残るまでエタノールを４０℃の加熱により除去した。この残留物を、ＲＡＷ２６４．７細胞を試験するためにＤＭＳＯに溶解した。ホップ誘導体の完全な内容を表１に示す。
【０１５７】
【表１】
2009518429.tif 000003
【０１５８】
クエルセチン、オレアノール酸、ガランギン、ゲニステイン、アピゲニン、ルテオリン、ケンペロール、レズベラトロル、モリン、ミリセチン、ナリンゲニン、カテキン、フィゼチンおよびルチンはSigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。ショウガ、アカシア試料番号４９０９抽出物、ローズマリ、カイエンペッパー、クルクミン、イプリフラボン、レモンビオフラボノイドおよびセサミンは、Metagenics社（ギグハーバー、ワシントン州）から供給された市販の試料である。ベルベリンは、Garden State Nutritionals社（ウェスト・コールドウェル、ニュージャージー州）から購入した。特に明記しない限り、全ての標準試薬は、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。
【０１５９】
細胞培養：ＲＡＷ２６４．７細胞を米国菌培養収集所（Catalog番号TIB-71、マナッサス、バージニア州）から入手し、DulbecoのEagle培地の改良物（DMEM、Mediatech社、ハーンドン、バージニア州））中で増殖させ、次いで対数増殖期に維持した。５０ｍＬの熱不活性ＦＢＳおよび５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを１本の５００ｍＬのＤＭＥＭに添加し、次いで４℃で保存することによって、ＤＭＥＭ増殖培地を作製した。増殖培地を使用前に水浴中で３７℃に温めた。
【０１６０】
実験のＤａｙ１に、９６ウェル組織培養において１ウェルにつき８×１０４個の細胞で０．２ｍＬの増殖培地中で対数増殖期のＲＡＷ２６４．７細胞を平板培養した。Ｄａｙ１の終わりに（平板培養の６〜８時間後）、各ウェルから１００のμＬの増殖培地を除去して１００μＬの新しい培地と取り替えた。
【０１６１】
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の発現を誘導するために用いられた１．０ｍｇ／ｍＬのＬＰＳの原液は、１ｍＬのＤＭＳＯ中に１．０ｍｇのＬＰＳを溶解することによって調製された。それを溶解するまでボルテックスし、４℃で保存した。使用前にそれを室温または３７℃の水浴中で融解した。
【０１６２】
実験のＤａｙ２に、試験材料をＤＭＳＯ中に１０００倍の原液として調製した。１．７ｍＬのマイクロチューブ内に、ＦＢＳを含まない１ｍＬのＤＭＥＭを、０．０５、０．１０、０．５および１．０μｇ／ｍＬまたは１．５、３．０、６．０および１２μｇ／ｍＬの試験濃度で添加した。１ｍＬの前記ＦＢＳを含まない培地に前記試験材料の２μＬの１０００倍ＤＭＳＯ原液を添加した。前記チューブには２倍に濃縮した終濃度の試験材料を入れ、そのチューブをインキュベーターに１０分間入れて３７℃で平衡化した。
【０１６３】
ＣＯＸ−２関連ＰＧＥ２合成のために、Ｄａｙ１で調製された細胞板の各ウェルから１００μＬの培地を除去し、２倍の終濃度で平衡化した１００μＬの試験化合物と取り替えた。次いで細胞を９０分間培養した。２０μＬのＬＰＳを刺激すべき細胞の各ウェルに添加して１μｇＬＰＳ／ｍＬの終濃度を達成し、次いで細胞を１８時間培養した。ＰＧＥ２の定量化のための培地の試料採取の前に、細胞の外観を観察し、生存度を視覚的に評価した。化合物のいずれにおいてもテストされた最高濃度で明らかな毒性は認められなかった。次いで、培地に放出されるＰＧＥ２の測定用の清浄なマイクロチューブ内へ２５μＬの上澄み培地を各ウェルから移した。
【０１６４】
ＰＧＥ２アッセイ：ＰＧＥ２の定量化用の市販の非放射性の手順（Caymen Chemical, Ann Arbor, MI）を用い、製造業者の推奨手順を変更せずに用いた。概略説明すると、２５μＬの培地をＰＧＥ２標準試料の連続希釈と共に適当な量のアセチルコリンエステラーゼ標識トレーサーおよびＰＧＥ２抗血清と混合し、次いで１８時間室温で培養した。ウェルを空にして洗浄緩衝液で洗浄後、アセチルコリンエステラーゼ用基質を含む２００μＬのエルマン試薬を添加した。低速の振盪機において前記反応を室温で１時間維持し、４１５ｎｍにおける吸光度をBio-Tek Instruments社（Model番号Elx800、ウィヌースキ、ヴァーモント州）ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。ＰＧＥ２濃度は１ｍＬ当たりのピコグラムで表した。このアッセイのための製造業者の仕様書においては、イントラアッセイ変動係数は１０％未満、ＰＧＤ２とＰＧＦ２との交差反応性は１％未満、および直線性は１０〜１０００ｐｇｍＬ−１の範囲を超える。
【０１６５】
算出：ＰＧＥ２合成についての半抑制濃度（ＩＣ５０）はCalcuSyn（BIOSOFT社、ファーガソン、ミズーリ州)を用いて算出した。各試験材料または陽性対照における４濃度の内の最低のものを計算用に使用した。この統計パッケージは、T.C ChouおよびP. Talalay が説明しているMedian Effect法［Chou, T.C.およびP. Talalay. Quantitative analysis of dose-effect relationships; the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55, (1984)］（参照により本明細書に組み込まれている）を用いて多剤用量−効果の算出を実行する。異なる３日に実験を３回繰り返した。各処置の阻害率を別個の３回の実験で平均化し、次いでそれを用いて報告される半抑制濃度を算出した。
【０１６６】
半抑制濃度を４つの任意のカテゴリに分類した：（１）ＩＣ５０値が０．３μｇ／ｍＬ以内で０．１である剤について最高の抗炎症反応；（２）ＩＣ５０値が０．７μｇ／ｍＬ以内で１．０である剤について高い抗炎症反応；（３）ＩＣ５０値が２〜７μｇ／ｍＬである剤について中程度の抗炎症反応；および（４）ＩＣ５０値が１２μｇ／ｍＬ超である剤について低い抗炎症反応、即ちテストされる最高濃度。
【０１６７】
結果：全体として、ホップ誘導体は、最も効力のある天然の抗炎症剤であった（表２）。ホップ誘導体の半抑制濃度（ＩＣ５０）は、Ｒｈｏイソアルファ酸の０．０８μｇ／ｍＬからAroma hopの１．６μｇ／ｍＬの範囲であった。ホップ誘導体だけが最高の相対的抗炎症性効能に分類され；これらには、Ｒｈｏイソアルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ＣＯ２ホップ抽出物、アルファ酸およびヘキサヒドロイソアルファ酸が包含された。高い抗炎症作用を示すと分類された薬剤には、ホップ（ベータ酸）、クエルセチン、ホップかすＣＯ２／エタノール抽出物、ショウガ、アカシア試料番号４９０９抽出物、オレアノール酸、ローズマリ、ガランギン、ホップ（Aromahop油）およびゲニステインが包含された。中程度の抗炎症作用は、カイエンペッパー、アピゲニン、クルクミン、ベルベリン、ルテオリン、ケンペロール、レズベラトロルおよびイプリフラボンが示した。他の全ての試験材料は、ＩＣ５０値が１２μｇ／ｍＬを超える低い抗炎症作用を有するものとして分類された。
【０１６８】
【表２】
2009518429.tif 000004
【０１６９】
実施例２
ホップ化合物および誘導体によって刺激された、および刺激されないマウスのマクロファージにおけるＰＧＥ２合成の阻害
本実施例の目的は、マウスのマクロファージモデルにおいてホップ誘導体がＰＧＥ２のＣＯＸ−１合成に対して選択的にＰＧＥ２のＣＯＸ−２合成を阻害する程度を評価することであった。実施例１で説明したようなＲＡＷ２６４．７細胞株を、本実施例においても使用した。装置、化学物質および試薬、ＰＧＥ２アッセイおよび算出は、実施例１で説明した場合と同様であった。
【０１７０】
試験材料：表１で説明したようなホップ誘導体を用いた。ＣＯＸ−１選択的アスピリンおよびＣＯＸ−２選択的セレコキシブを陽性対照として使用した。アスピリンは、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手し、セレコキシブの市販の製剤（Celebrex（登録商標）、Searle社、シカゴ、イリノイ州）を使用した。
【０１７１】
細胞培養および試験材料での処置：米国菌培養収集所（マナッサス、バージニア州）からＲＡＷ２６４．７細胞（ＴＩＢ−７１）を入手し、実施例１で説明したように継代培養した。ＣＯＸ−２関連ＰＧＥ２合成のために、Ｄａｙ１で調製された細胞板の各ウェルから１００μＬの培地を除去し、２倍の終濃度で平衡化した１００μＬの試験化合物と取り替えた。次いで細胞を９０分間培養した。２０μＬのＬＰＳを刺激すべき細胞の各ウェルに添加して１μｇＬＰＳ／ｍＬの終濃度を達成し、次いで細胞を４時間培養した。その細胞を５μＭアラキドン酸で更に１５分間培養した。培地に放出されるＰＧＥ２の測定用の清浄なマイクロチューブ内へ２５μＬの上澄み培地を各ウェルから移した。
【０１７２】
ＣＯＸ−１関連ＰＧＥ２合成のために、Ｄａｙ１で調製された細胞板の各ウェルから１００μＬの培地を除去し、２倍の終濃度で平衡化した１００μＬの試験化合物と取り替えた。次いで細胞を９０分間培養した。次に、ＬＰＳ刺激の代わりに、その細胞を１００μＭアラキドン酸で更に１５分間培養した。培地に放出されるＰＧＥ２の測定用の清浄なマイクロチューブ内へ２５μＬの上澄み培地を各ウェルから移した。
【０１７３】
細胞の外観を観察し、生存度を実施例１と同様に測定した。化合物のいずれにおいてもテストされた最高濃度で明らかな毒性は認められなかった。培地に放出されるＰＧＥ２の測定用の清浄なマイクロチューブ内へ２５μＬの上澄み培地を各ウェルから移した。ＰＧＥ２を測定し、実施例１で前述したように報告された。実施例１で説明したようにＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１の両方からのＰＧＥ２合成のための半抑制濃度（ＩＣ５０）を算出した。
【０１７４】
結果：アスピリンおよびセレコキシブ陽性対照は、このモデル系においてそれぞれのシクロオキシゲナーゼ選択性を示した（表３）。アスピリンはＣＯＸ−１に対して約１０００倍選択的であったが、一方セレコキシブはＣＯＸ−２に対して１１４倍選択的であった。全てのホップ材料はＣＯＸ−２選択的であり、Ｒｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸はそれぞれ最高のＣＯＸ−２選択性、即ち３６３倍および１３８倍のＣＯＸ−２選択性を示した。他の原料に由来する天然物について、低半抑制濃度と結びついた高ＣＯＸ−２選択性は以前には報告されていない。残りのホップ誘導体の内、Aromahop油だけがかろうじて３倍のＣＯＸ−２選択性を示した。臨床的有効性にインビトロデータを外挿するには、５倍以上のＣＯＸ−２選択性によって臨床的に重要な胃粘膜保護の可能性が示されるということが一般に仮定される。この基準の下で、ベータ酸、ＣＯ２ホップ抽出物、ホップかすＣＯ２／エタノール、テトラヒドロイソアルファ酸およびヘキサヒドロイソアルファ酸は、潜在的に臨床的に関連したＣＯＸ−２選択性を示した。
【０１７５】
【表３】
2009518429.tif 000005
【０１７６】
実施例３
ＬＰＳ刺激Ｒａｗ２６４．７細胞における還元異性化アルファ酸または異性化アルファ酸による直接的なＰＧＥ２阻害の欠如
本研究の目的は、ホップ誘導体のＲｈｏイソアルファ酸および異性化アルファ酸が炎症のＲＡＷ２６４．７細胞モデルにおけるＣＯＸ−２介在ＰＧＥ２生合成の直接的阻害剤としてそれぞれ機能を果たす能力を評価することである。実施例１で説明したように、ＲＡＷ２６４．７細胞株が本実施例で使用された。装置、化学物質と試薬、ＰＧＥ２アッセイ及び算出は実施例１において述べた通りである。
【０１７７】
試験材料：表１で説明したようなホップ誘導体のＲｈｏイソアルファ酸および異性化アルファ酸を用いた。アスピリン（ＣＯＸ−１選択的陽性対照）は、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。
【０１７８】
細胞培養および試験材料での処置：米国菌培養収集所（マナッサス、バージニア州）からＲＡＷ２６４．７細胞（ＴＩＢ−７１）を入手し、実施例１で説明したように継代培養した。５％ＣＯ２による３７℃のインキュベーションを一晩行った後、増殖培地を吸引して、ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含まない２００μＬのＤＭＥＭと取り替えた。ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳで刺激し、次いで一晩培養してＣＯＸ−２発現を誘導した。ＬＰＳ刺激の１８時間後に試験材料を添加し、その６０分後にカルシウムイオノホアＡ２３１８７を添加した。２５０倍原液としてのＤＭＳＯ中に試験材料を溶解した。４μＬのこの２５０倍原液試験材料調製物を１ｍＬのＤＭＥＭに添加し、次いで２００μＬのこの溶液を試験材料の各用量につき８つのウェルに添加した。３０分後に上澄み培地をＰＧＥ２測定のために試料採取した。実施例１にて説明したように２つの別個の実験における少なくとも４つの濃度から半抑制濃度を計算した。
【０１７９】
ＰＧＥ２の測定：実施例１のように、ＰＧＥ２の定量化用の市販の非放射性の手順（Caymen Chemical, Ann Arbor, MI）を用い、製造業者の推奨手順を変更せずに用いた。
細胞生存度：ＰＧＥ２アッセイ用培地の試料採取の前または直後に細胞の顕微鏡検査を行うことによって細胞生存度を評価した。テストされた濃度のいずれにおいても明らかな細胞死は認められなかった。
【０１８０】
算出：CalcuSyn（BIOSOFT社、ファーガソン、ミズーリ州）を使用して、４つの濃度（０．１０、１．０、１０および１００μｇ／ｍＬ）を用いて用量反応曲線を導き、９５％信頼区間における培地阻止濃度（ＩＣ５０）を計算する。
【０１８１】
結果： ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２産生のＬＰＳ刺激は、非刺激細胞の場合と比べて１．４倍から２．１倍であった。アスピリン陽性対照において計算されたＩＣ５０値は８．７μｇ／ｍＬ（９５％ＣＬ＝３．９〜１９）であり、これは、直接的なＣＯＸ−２阻害についての公表値が１．４〜５０μｇ／ｍＬの範囲であることと［Warner, T.D.ら、Nonsteroidal drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo-oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: A full in vitro analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:7563-7568, (1999)］、Ａ５４９細胞株におけるこの研究機関の実績データが３．２μｇ／ｍＬ（９５％ＣＬ＝０．５５〜１９）であることとに一致している。
【０１８２】
ＬＰＳによるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２誘導の後に添加する際、ＲＩＡＡおよびＩＡＡの両方によってＰＧＥ２の適度な用量関連阻害のみが生じた。試験材料の濃度が１０００倍増加することにより、それぞれ１４％および１０％の阻害の増加がＲＩＡＡおよびＩＡＡにおいて認められた。用量反応勾配が緩やかであることにより、ＩＣ５０値は、ＲＩＡＡ（３６ｍｇ／ｍＬ）およびＩＡＡ（＞１０００ｍｇ／ｍＬ）についてｍｇ／ｍＬの範囲となった（表４）。３ログユニットの投与量にわたる反応において認められた変化が最小限であったことによって、この細胞に基づくアッセイにおいて認められたホップ誘導体のＰＧＥ２阻害作用が細胞に対する二次的な作用であり得、ＣＯＸ−２酵素活性の直接的な阻害ではないことが示唆された。
【０１８３】
図４Ａおよび４Ｂは、ＲＩＡＡおよびＩＡＡについてそれぞれ実施例１からの用量反応データを白色の棒で示すもので、本実施例からの用量反応データは灰色の棒で示す。一連の添加の効果は明確に認められ、それによってＲＩＡＡおよびＩＡＡが直接的なＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないという推論が支持される。
【０１８４】
実施例１〜３から、（１）ホップ材料は、インビトロでＰＧＥ２生合成を阻害するその能力による評価としてテストされた中で最も活性が高く、抗炎症性である天然物であり；（２）ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、ＣＯＸ−２誘導に関する阻害のそのパターンに基いた直接的なＣＯＸ−２酵素阻害剤であるとは思われない；および（３）ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、ＣＯＸ−２酵素阻害ではなく、ＣＯＸ−２発現の阻害に基づくと思われるＣＯＸ−２への選択性を有する、と思われる。この選択性は、セレコキシブ（その選択性が特異的酵素阻害に基づく）とは異なる。
【０１８５】
【表４】
2009518429.tif 000006
【０１８６】
実施例４
ホップ化合物および誘導体は、Ａ５４９肺上皮細胞における直接的なシクロオキシゲナーゼ酵素阻害剤ではない
化学物質：本実施例で使用されるホップおよびホップ誘導体は、すでに実施例１に記載されたものである。他の全ての化学物質は、実施例１および２で説明されたような供給元から入手された。
【０１８７】
装置、ＰＧＥ２アッセイおよび算出は、実施例１で説明された通りである。
細胞：Ａ５４９（ヒト肺上皮）細胞を、米国菌培養収集所（マナッサス、バージニア州）から入手し、供給元の説明書に従って継代培養した。５０単位ペニシリン／ｍＬ、５０μｇストレプトマイシン／ｍＬ、５ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび５ｍＭのＬ−グルタミンと共に１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、５％ＣＯ２により３７℃で細胞をルーチン培養した。実験日に、指数的に増殖する細胞を採集して、無血清ＲＰＭＩ１６４０により洗浄した。
【０１８８】
９６ウェル組織培養プレートにおける１ウェルにつき０．２ｍＬの増殖培地中で、１ウェルにつき８×１０４細胞で、対数増殖期のＡ５４９細胞を平板培養した。その後、試験化合物によるＰＧＥ２阻害の測定のために、Warnerらの手順［Nonsteroid drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo- oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: a full in vitro analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 7563-7568, (1999)］（別名、ＷＨＭＡ−ＣＯＸ−２プロトコル）を変更せずに実施した。概略説明すると、Ａ５４９細胞の平板培養の２４時間後にインターロイキン−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加してＣＯＸ−２の発現を誘導した。２４時間後にその細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。その後、ＤＭＳＯおよび無血清ＲＰＭＩに溶解した試験材料をウェルに添加して２５、５．０、０．５および０．０５μｇ／ｍＬの終濃度を達成した。各濃縮を二重で実施した。試験ウェルに含まれるものと等容量のＤＭＳＯを対照ウェルに添加した。６０分後に、Ａ２３１８７（５０μＭ）をそのウェルに添加してアラキドン酸を放出した。３０分後に２５μＬの培地をＰＧＥ２測定のためにそのウェルから試料採取した。
【０１８９】
細胞生存度を視覚的に評価し、明らかな毒性は、いずれの化合物についてテストされた最高濃度においても認められなかった。上澄み培地のＰＧＥ２を測定し、実施例１で前述したように報告した。実施例１で前述したようにＰＧＥ２合成における半抑制濃度（ＩＣ５０）を算出した。
【０１９０】
結果：テストされた用量では、実験プロトコルにおいてホップ抽出物または誘導体のいずれかにおける半有効濃度を得ることができなかった。試験化合物の添加前にＣＯＸ−２発現の刺激がプロトコルには必要であることから、試験材料によってＰＧＥ２合成を阻害することができないということは、作用機序によってＣＯＸ−２アイソザイムの発現は阻害されるが、活性は直接には阻害されないということを意味する。なんらかの直接阻害がＷＨＭＡ−ＣＯＸ−２プロトコルを使用して認められたが、この手順は、ホップ化合物またはホップ化合物の誘導体の抗炎症性の評価には不適切であると思われる。
【０１９１】
実施例５
ホップ誘導体は、Ａ５４９肺上皮細胞におけるＰＧＥ２生合成のダニダストアレルゲンの活性化を阻害する
化学物質：本実施例で使用されたホップおよびホップ誘導体（１）Alpha Hop（１％アルファ酸；ＡＡ）、（２）Aromahop OE（１０％ベータ酸および２％異性化アルファ酸）、（３）Isohop（異性化アルファ酸；ＩＡＡ）、（４）ベータ酸溶液（ベータ酸；ＢＡ）、（５）Hexahop Gold（ヘキサヒドロ異性化アルファ酸；ＨＨＩＡＡ）、（６）Redihop（還元異性化アルファ酸；ＲＩＡＡ）および（７）Tetrahop（テトラヒドロイソアルファ酸；ＴＨＩＡＡ）は、実施例１で既に述べた。他の全ての化学物質については、実施例１および２で説明したように供給業者から入手した。終濃度が１０μｇ／ｍＬの試験材料を添加して６０分後にダニダストアレルゲンを添加した。
【０１９２】
装置、ＰＧＥ２アッセイおよび算出は、実施例１で説明した通りであった。
ダニダストアレルゲンの単離：コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)は、アメリカイエコナダニ（American house dust mite）のことである。コナヒョウヒダニには、ピュリナ・ラブ・チャウ（Purina Lab Chow）（Ralston Purina社、セントルイス、ミズーリ州）とFleischmann's顆粒化乾燥酵母（Standard Brands社、ニューヨーク、ニューヨーク州）とを１：１の比率で室温および７５％の湿度で摂取させた。生きているダニを培養容器から吸引し、そのダニを培地から移し、凍結により死滅させ、次いで０％の湿度で乾燥保存した。ダニダストのアレルゲン性成分を周囲温度で水によって抽出した。１５ｍＬの円錘形遠心管（ＶＷＲ社、ロチェスター、ニューヨーク州）内の５ｍＬの水（１：１０ｗ／ｖ）に５００ｍｇのダニ粉末を添加し、１分間振りまぜて周囲温度で一晩放置した。翌日、０．２μｍの使い捨て注射器フィルター（Nalgene社、ロチェスター、ニューヨーク州）を使用して水相を濾過した。濾過液をダニダストアレルゲンと呼び、Ａ５４９肺上皮細胞におけるＰＧＥ２生合成の誘導の試験に用いた。
【０１９３】
細胞培養および処置：ヒト気管上皮細胞株（Ａ５４９（米国菌培養収集所、ベセズダ、メリーランド州））を培養し、次いで実施例４にて前述したように処理した。ダニアレルゲンを培養培地に添加して１０００ｎｇ／ｍＬの終濃度を達成した。１８時間後に、培地をＰＧＥ２測定のために試料採取した。
【０１９４】
結果：表５は、ダニダストアレルゲンによって刺激されたＡ５４９肺細胞におけるＰＧＥ２生合成のホップ誘導体による阻害の程度を表す。テストされた全てのホップ誘導体はダニダストアレルゲンの刺激効果を有意に阻害することができた。
【０１９５】
【表５】
2009518429.tif 000007
【０１９６】
本実施例は、ホップ誘導体がＡ５４９肺細胞におけるダニダストアレルゲンのＰＧＥ２刺激効果を阻害することが可能であることを示す。
【０１９７】
実施例６
ホップ（カラハナソウ）に由来するアルファ酸の誘導体による５−リポキシゲナーゼ活性の阻害
試験材料および試薬：ホップ（カラハナソウ）から単離または誘導された分画物の標準化された（表１参照）水溶液をBetaTech社（ワシントンＤＣ）から入手した。その溶液をＤＭＳＯ中に希釈して１ｍｇ／ｍＬの参照化合物を含有させた。必要に応じて、１２０００×ｇで５分間の遠心分離によって試料を浄化した。試験として、ＤＭＳＯ中で連続希釈を行った。Cayman社から入手したLipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit（LISAK）（番号７６０７００、シカゴ、イリノイ州）を使用してリポキシゲナーゼ活性に対する試験材料の効果を評価した。そのキットには、大豆１５−リポキシゲナーゼ（番号６０７００）およびリノール酸が含まれた。ジャガイモ５−リポキシゲナーゼ（番号６０４０１）を別途Cayman社から購入した。陽性対照化合物には、コーヒー酸（Cayman社、番号７０６０２）、Trolox（Sigma社、２３８８１３）およびRev 5901（Sigma社、Ｒ５５２３）が含まれており；これらは商業的に入手可能な最も高い純度のものであった。Boswellin（ＲＭ０７７８１）はMetagenics社（ギグハーバー、ワシントン州）から入手した。
【０１９８】
アッセイ：製造業者のプロトコルに従って５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）アッセイおよび算出を行った。概略説明すると、ＬＩＳＡＫバイアル番号１の内容物を９部のＨＰＬＣグレード水で希釈して終濃度０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を得ることによってアッセイ緩衝液を調製した。最終反応速度が約１０ｎｍｏｌ ｍｉｎ−１ ｍＬ−１となるように５−ＬＯＸをアッセイ緩衝液中に希釈した。
【０１９９】
２５ｍＬのリノール酸のエタノール溶液（ＬＩＳＡＫバイアル番号６）を２５ｍＬの０．１Ｍ ＫＯＨ（ＬＩＳＡＫバイアル番号７）に添加し、次いで９５０ｍＬのＨＰＬＣグレード水で希釈することによって基質溶液を調製した。最終基質濃度は１ｍＭであった。
【０２００】
９０ｍＬの希釈酵素（または反応ブランク用アッセイ緩衝液）、１０ｍＬのアッセイ緩衝液ならびに１０ｍＬの試験阻害剤またはＤＭＳＯからなる反応混合物に１０ｍＬのリノール酸を添加することによって５−ＬＯＸ反応を開始した。室温で５分後、等量のＬＩＳＡＫバイアル２および３を混合することによって調製された１００ｍＬのＬＩＳＡＫ ｃｈｒｏｍａｇｅｎ（登録商標）を添加することで反応を中止した。吸光度パッケージ（Perkin Elmer番号１４２０〜０４２、番号１４２０〜１１５；ボストン、マサチューセッツ州）を備えたVictor（登録商標）Multilabel Counterにおける４９２ｎｍ（８ｎｍの帯域幅）のフィルターによって吸光度を測定した。反応速度は、以下の通りに測定された。
【０２０１】
DA min-1 = (Abs rx - Abs enzme blank)/ 5分
nmol min-1 ml-1 = DA min-1/ 9.47 mM-1
ここで、吸光係数は、０．３ｃｍ２マイクロタイターウェルにおける２１０ｍＬの量で形成される光路長について補正されている。
【０２０２】
算出：CalcuSyn（BIOSOFT社、ファーガソン、ミズーリ州）を使用して用量反応曲線を作成した。各試験材料または陽性対照の少なくとも４つの濃度を計算のために用いた。
結果：結果から、ホップに由来する化学修飾をほどこした酸がジャガイモ５−ＬＯＸの活性を阻害することが示された（表６）。予想外であったが、天然のアルファ酸とベータ酸のどちらもテストされた最高の濃度では酵素に影響を及ぼさなかったが、還元および／または異性化アルファ酸は、効力のある陽性対照Triloxと一致した５ｍｇ／ｍＬの低さの濃度での阻害において効果があることを示した。明らかな有効性の順で、Isohop（２５％ｗ／ｗイソアルファ酸からなる）およびHexaHop Goldは、５μｇ／ｍＬの濃度で酵素阻害に最も有効であった。RedihopおよびTetrahopは、やや効果が少なかったが、１０μｇ／ｍＬの濃度で実質的な阻害を示した。
【０２０３】
【表６】
2009518429.tif 000008
【０２０４】
成分の順位は表７で提供される。ＩＣ２５値は、CalcuSyn社のMedian Effect Modelを用いて算出された。この方法で順位をつけると、Hexahop Gold、Tetrahop GoldおよびIsohopがほとんど同じで、それぞれＩＣ２５＝１６、１８および２３μｇ／ｍＬで、ＩＣ２５が３０μｇ／ｍＬのRedihopがその後に続く。
【０２０５】
これらの予想外の結果によって、５−ＬＯＸの活動亢進を特徴とする炎症状態と関連した無数の疾患の治療にホップ苦味酸のこれらの誘導体が有用であることが示唆される。
【０２０６】
【表７】
2009518429.tif 000009
【０２０７】
実施例７
還元イソアルファ酸による直接的ＣＯＸ−２阻害の欠如
本実施例の目的は、マグネシウムで還元したイソアルファ酸がＣＯＸ−２酵素活性の直接的な阻害剤として働き得るのかどうかを決定することである。
【０２０８】
材料：試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製し、次いで−２０℃で保存した。Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州）からＬＰＳを購入した。ＭｇＲＩＡＡはMetagenics社（サンクレメンテ、カリフォルニア州）から供給されたものであり、そして市販のセレコキシブ製剤（Celebrex（登録商標）、Searle社、シカゴ、イリノイ州）を使用した。
【０２０９】
細胞培養：ATCC（マナッサス、バージニア州）からマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株を購入し、その説明書に従って維持した。１ウェル当たり８×１０４個の細胞密度で９６ウエルプレートで細胞を継代培養し、約２日間で９０％集密に到達させた。その細胞培地にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ単独を添加し、次いで１２時間インキュベーションした。その培地をウェルから除去し、ＤＭＳＯおよび無血清ＲＰＭＩに溶解した試験化合物を含むＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）をそのウェルに添加して、２０、５．０、１．０および０．１μｇ／ｍＬのＭｇＲＩＡＡの終濃度ならびに１００、１０、１および０．１ｎｇ／ｍＬのセレコキシブの終濃度を達成した。各濃縮を８回繰り返した。試験化合物によるインキュベーションを１時間行った後、その細胞培地を除去してＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を含む試験化合物を含む新しい培地と取り替え、次いで１時間インキュベーションした。ウェルから培地を除去し、ＰＧＥ２合成についてその培地を解析した。ＰＧＥ２アッセイ：ＰＧＥ２の定量化用の市販の非放射性の手順（Caymen Chemical, Ann Arbor, MI）を用いた。試料をＥＩＡ緩衝液中に１０倍で希釈し、製造業者の推奨手順を変更せずに用いた。ＰＧＥ２濃度を１ｍＬ当たりのピコグラムとして表した。このアッセイのための製造業者の仕様書においては、同一アッセイ内(intra-assay)変動係数は１０％未満、ＰＧＤ２とＰＧＦ２との交差反応性は１％未満、および直線性は１０〜１０００ｐｇｍＬ−１の範囲を超える。
【０２１０】
ＣＯＸ−２特異的阻害剤であるセレコキシブは用量依存的にＣＯＸ−２介在ＰＧＥ２合成を阻害したが（１００、１０、１および０．１ｎｇ／ｍＬ）、一方でＭｇＲＩＡＡについては有意なＰＧＥ２阻害は認められなかった。このデータから、ＭｇＲＩＡＡはセレコキシブ等の直接的ＣＯＸ−２酵素阻害剤ではないことが示唆される（図５）。
【０２１１】
実施例８
ＭｇＲＩＡＡによるｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２タンパク質発現の阻害
ＭｇＲＩＡＡで処置してＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞由来の細胞抽出物をウエスタンブロットによってｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２タンパク質についてアッセイした。
【０２１２】
材料：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で試験化合物を調製し、次いで−２０℃で保存した。ＭｇＲＩＡＡは、Metagenics社（サンクレメンテ、カリフォルニア州）から供給された。Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州）からパルテノライド（parthenolide）を購入した。EMD Biosciences社（サンディエゴ、カリフォルニア州）からＰＩ３Ｋ阻害剤ＷｏｒｔｍａｎｎｉｎおよびＬＹ２９４００２を購入した。ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳに対して作製された抗体をCayman Chemical社（アナーバー、ミシガン州）から購入した。ＧＡＰＤＨに対して作製された抗体をNovus Biological社（リトルトン、コロラド州）から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した二次抗体をAmersham Biosciences社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から購入した。
【０２１３】
細胞培養：ＡＴＣＣ社（マナッサス、バージニア州）からマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株を購入し、その説明書に従ってその細胞株を維持した。１ウェル当たり３×１０５個の細胞密度で２４ウエルプレートで細胞の増殖および継代培養を行い、約２日間で９０％集密に到達させた。ＤＭＳＯの終濃度が０．４％の無血清培地中の細胞に試験化合物を添加した。試験化合物によるインキュベーションを１時間行った後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）またはリン酸緩衝生理食塩水のみを細胞ウェルに添加し、次いでインキュベーションを指示された時間行った。
【０２１４】
ウェスタンブロット法：Buffer E（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１％のトリトンＸ−１００；１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム；５μｇ／ｍＬのアプロチニン；１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ；５μｇ／ｍＬのロイペプチン；１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド）中で細胞抽出物を調製した。概略説明すると、冷たいＰＢＳで細胞を２回洗浄し、Buffer Eを添加した。清浄なチューブ内に細胞をこすり取り、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上澄液を完全な細胞抽出物として採取した。あらかじめ成形した４％〜２０％のTris-HCl Criterionゲル（BioRad社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）で、前部の移行染料がゲルの一番下から５ｍｍに達するまで細胞抽出物（５０μｇ）を電気泳動にかけた。BioRad社（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）の半湿式法システムを用いて、そのタンパク質をニトロセルロース膜へ移した。その膜を洗浄し、次いで５％のドライミルク粉末により室温で１時間ブロッキングした。一次抗体によるインキュベーションと、その後の二次抗体によるインキュベーションとを、室温で各々１時間行った。等容量のルミノール／増強剤溶液と安定過酸化物溶液のインキュベーションを室温で５分間行うことによって、Pierce Biotechnology社（ロックフォード、イリノイ州）から入手したSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrateを用いて化学発光を行った。冷却CCD Kodak（登録商標；ロチェスター、ニューヨーク州）ＩＳ１０００イメージングシステムを使用してウエスタンブロットの画像を取り込んだ。デンシトメトリーは、Kodak（登録商標）ソフトウェアを使用して実行された。
【０２１５】
ウエスタンブロット検出を用いてＣＯＸ−２およびｉＮＯＳタンパク質の発現率を評価した。ＬＰＳによる２０時間の刺激後、ＣＯＸ−２の発現が認められた。ＤＭＳＯの溶媒対照と比較して、ＭｇＲＩＡＡによるＣＯＸ−２タンパク質発現は５５％低下したことが認められた（図６）。特異的ＮＦ−ｋＢ阻害剤であるパルテノライドはタンパク質発現を２２．５％阻害したが、一方でＰＩ３−キナーゼ阻害剤はＣＯＸ−２発現を約４７％増大させた（図６）。更に、ＭｇＲＩＡＡによって、ＬＰＳによる２０時間の刺激後にｉＮＯＳタンパク質発現が７３％低下したことが認められた（図７）。
【０２１６】
実施例９
ＮＦ−κＢ核転座およびＤＮＡ結合
ＤＮＡに対するＮＦ−κＢ結合について、ＭｇＲＩＡＡでの処置とＬＰＳによる４時間の刺激とが行われたＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞核抽出物をアッセイした。
【０２１７】
材料：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に試験化合物を調製して、−２０℃で保存した。ＭｇＲＩＡＡは、Metagenics社（サンクレメンテ、カリフォルニア州）から供給された。Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州）からパルテノライド（ＮＦ−ｋＢ活性化用特異的阻害剤）を購入した。EMD Biosciences社（サンディエゴ、カリフォルニア州）からＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２を購入した。
【０２１８】
細胞培養：ATCC（マナッサス、バージニア州）からマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株を購入し、その説明書に従って維持した。１ウェル当たり１．５×１０６個の細胞密度で６ウエルプレートで細胞を継代培養し、約２日間で９０％集密に到達させた。終濃度が０．４％ＤＭＳＯで無血清培地中の細胞に、試験化合物（ＭｇＲＩＡＡ（５５および１４μｇ／ｍＬ）、パルテノライド（８０μＭ）およびＬＹ２９４００２（２５μＭ）を添加した。試験化合物による１時間のインキュベーション後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ単独を細胞培地に添加し、次いでインキュベーションを更に４時間継続した。
【０２１９】
ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ結合：実質的にDignamら［Nucl Acids Res 11:1475-1489, (1983)］に記載されたように細胞核抽出物を調製した。概略説明すると、冷たいＰＢＳで細胞を２回洗浄し、次いでBuffer A（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのＫＣｌ；０．１％のＮＰ−４０；５μｇ／ｍＬのアプロチニン；１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ；５μｇ／ｍＬのロイペプチン；１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド）を添加して１５分間の氷上に置いた。清浄なチューブ内に細胞をこすり取り、凍結／融解の処理を３サイクル行った。１０，０００の×ｇの遠心分離を４℃で５分間行った後の上澄液層が細胞質の分画物であった。残留する沈殿物をBuffer C（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１．５ｍＭのＫＣｌ；４２０ｍＭのＫＣｌ；２５％のグリセロール；０．２ＭのＥＤＴＡ；５μｇ／ｍＬのアプロチニン；１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ；５μｇ／ｍＬのロイペプチン；１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド）中で再懸濁し、次いで氷上に１５分間置いた。１０，０００×ｇの遠心分離を４℃で５分間行った後の細胞核抽出物分画物を上澄液層として採集した。細胞核抽出物のＮＦ−ｋＢ ＤＮＡ結合は、製造業者の説明書に従ってActive Motif社（カールズバッド、カリフォルニア州）のＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ−κＢキットを使用して評価された。図８に示すように、ＴｒａｎｓＡＭキットによって９６ウェルフォーマットの中でコンセンサス配列に対して結合するＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットが検出された。タンパク質濃度を測定し（Bio-Rad assay）、次いで１０μｇの核タンパク質抽出物を二重でアッセイした。
【０２２０】
細胞核抽出物（１０μｇ）の解析を二重で実施し、その結果を図９にグラフで示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）による刺激によって、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合が２倍増加した。ＬＹ２９４００２（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）での処置によって、前の文献報告から予想されたように、ＮＦ−κＢ結合が適度に減少した。パルテノライドによってもまた、予想された通りにＮＦ−κＢ結合が有意に減少した。ＭｇＲＩＡＡにおいてＮＦ−κＢ結合の大幅な減少が認められた。その効果は、用量反応の方法で認められた。ＮＦ−κＢ結合の減少によって、ＣＯＸ−２やｉＮＯＳやＴＮＦα等の標的遺伝子の転写活性化が低下し得る。
【０２２１】
その結果によって、ＭｇＤＨＩＡＡにおいて認められたＮＦ−κＢ結合の減少によりＣＯＸ−２タンパク質発現が低下し、これは最終的にＰＧＥ２産生の低下につながるということが示唆される。
【０２２２】
実施例１０
アカシア樹皮の水抽出液のジメチルスルホキシド可溶性分画物によって誘発される３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂質生成の増加
モデル：
３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いて脂肪細胞分化および脂肪生成に対する化合物の潜在的影響を検討した。この細胞株によって、脂肪細胞への分化を調節するものから切り離して、前脂肪細胞の複製を調節する刺激および機序を検討することが可能になり［Fasshauer, M., Klein, J., Neumann, S., Eszlinger, M.およびPaschke, R. Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes. Biochem Biophys Res Commun, 290: 1084-1089, (2002)；Li, Y.およびLazar, M. A. Differential gene regulation by PPARgamma agonist and constitutively active PPARgamma2. Mol Endocrinol, 16: 1040-1048, (2002)］、ならびに検査薬のインスリン活性化能力およびトリグリセリド低下能力を検討することが可能になる［Raz, I., Eldor, R., Cernea, S.およびShafrir, E. Diabetes: insulin resistance and derangements in lipid metabolism. Cure through intervention in fat transport and storage. Diabetes Metab Res Rev, 21: 3-14, (2005)］。
【０２２３】
前脂肪細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞は線維芽細胞の外観を有する。その細胞は、融合性単層を形成するまで培養組織において複製し、その後、細胞−細胞接触によってＧｏ／Ｇ１増殖の停止が起こる。脂肪細胞への３Ｔ３−Ｌ１細胞の終末分化は、集密前および集密後の前脂肪細胞の増殖に依存する。その後３−イソブチル−１−メチルキサンタン（デキサメタゾン）および高用量のインスリン（ＭＤＩ）で２日間刺激することによって、これらの細胞が集密後に有糸分裂クローン増殖することが促進され、細胞周期を出て、脂肪細胞特異的遺伝子の発現が開始される。分化の誘導の約５日後に、特徴的な脂質を含む脂肪細胞の表現型を９０％超の細胞が示す。３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド合成を評価することによって、検査薬のインスリン活性化能力の有効なモデルが提供される。
【０２２４】
脂肪細胞の脂質取り込みを促進する剤がインスリン感受性を改善するということは逆説的に見える。この矛盾を説明しようとして、幾つかの仮説が提案されてきた。研究支援を得ることを継続する１つの根拠は、「脂肪酸盗み(fatty acid steal)」の概念、あるいはグルコース取り込みに付随する改善を伴う筋肉における脂肪酸の相対的欠乏の原因となる血漿からの脂肪細胞への脂肪酸の組込みである［Martin, G., K. Schoonjansら、PPARgamma activators improve glucose homeostasis by stimulating fatty acid uptake in the adipocytes. Atherosclerosis 137 Suppl: S75-80, (1998)］。チアゾリジンジオン（例えばトログリタゾンやピオグリタゾン）は、脂肪酸の脂肪分解または血漿へ放出のインスリン抑制を大きくする脂肪細胞における脂質生成活性を選択的に刺激することが示されている［Yamauchi, T., J. Kamonら、The mechanisms by which both heterozygous peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) deficiency and PPARgamma agonist improve insulin resistance. J Biol Chem 276(44): 41245-54, (2001)；Oakes, N. D., P. G. Thalenら、Thiazolidinediones increase plasma-adipose tissue FFA exchange capacity and enhance insulin-mediated control of systemic FFA availability. Diabetes 50(5): 1158-65, (2001)］。この作用により、他の組織に有効な遊離脂肪酸が減少する［Yang, W. S., W. J. Leeら、Weight reduction increases plasma levels of an adipose-derived anti-inflammatory protein, adiponectin. J Clin Endocrinol Metab 86(8): 3815-9, (2001)］。従って、チアゾリジンジオン処置の結果として、筋肉や肝臓における遊離脂肪酸のインスリン脱感作効果が低下する。これらのインビトロにおける結果は、臨床的に確認されている［Boden, G. Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM. Diabetes 46(1): 3-10, (1997)；Stumvoll, M. and H. U. Haring Glitazones: clinical effects and molecular mechanisms. Ann Med 34(3): 217-24, (2002)］。
【０２２５】
試験材料：トログリタゾン、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシン、オイルレッドＯおよびインスリンは、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。試験材料は、アカシア（ＡｃＥ）試料番号４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物から作製した暗褐色の粉末であり、Bayir Chemicals（Ｎｏ．６８、South Cross Road、Basavanagudi、インド）から入手した。この抽出物は、少なくとも２０％のアペカテキン(apecatechin)を含むよう標準化された。本実施例で使用したバッチ番号Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析による測定で２０．８％のアペカテキンを含有していた。ペニシリン、ストレプトマイシン、Dulbecoの改良Eagle培地（DMEM）はMediatech社（ハーンドン、バージニア州）から入手し、１０％ＦＢＳ−ＨＩ（ウシ胎児血清（熱によって不活性化））はMediatech社およびHyclone社（ローガン、ユタ州）から入手した。特に示されない限り、他の全ての標準試薬はSigma社から購入された。
【０２２６】
細胞培養および処置：米国菌培養収集所（マナッサス、バージニア州）からマウスの繊維芽細胞株３Ｔ３−Ｌ１を購入し、その供給業者からの説明書に従って継代培養した。実験前に、５０単位ペニシリン／ｍＬおよび５０μｇストレプトマイシン／ｍＬを添加した１０％ＦＢＳ−ＨＩを含有するＤＭＥＭ中で細胞を培養し、実験的準備の前に対数増殖期で維持した。５％ＣＯ２の湿気を与えられた３７℃のインキュベーターにおいて細胞を増殖させた。集密前の培地の成分には、（１）４．５ｇグルコース／Ｌを含有する１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ；（２）５０Ｕ／ｍＬのペニシリン；および（３）５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが含まれる。５００ｍＬのＤＭＥＭに５０ｍＬの熱不活性ＦＢＳおよび５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを添加することによって増殖培地を作製した。この培地を４℃で保存した。使用前に、その培地を水浴中で３７℃に暖めた。
【０２２７】
２４ウェルプレートにおいて６×１０４個／ｃｍ２の細胞の初期密度で３Ｔ３−Ｔ１細胞を播種した。２日間、細胞を増殖させて集密に達した。集密後、分化培地の添加によって細胞を脂肪細胞に分化させた；この培地は、（１）１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）；（２）０．５ｍＭのメチルイソブチルキサンチン；（３）０．５μＭのデキサメタゾン；および（４）１０μｇ／ｍＬのインスリン（ＭＤＩ培地）からなるものであった。３日後、その培地を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中の１０μｇ／ｍＬのインスリンからなる分化後の培地に変更した。
【０２２８】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中にＡｃＥを部分的に溶解し、次いで培養培地に添加して、分化のＤａｙ０および成熟期（Ｄａｙ６または７）にわたって５０μｇ／ｍＬの濃度を達成する。新しい培地を添加した場合はいつでも、新しい試験材料も添加した。ＤＭＳＯは、その極性と、それが水性細胞培養培地と相溶性であることとについて選択された。陽性対照として、インドメタシンおよびトログリタゾンをそれぞれ添加して５．０μｇ／ｍＬおよび４．４μｇ／ｍＬの終濃度を達成した。分化した、Ｄａｙ６／Ｄａｙ７の３Ｔ３−Ｌ１細胞を、０．３６％のオイルレッドＯまたは０．００１％のBODIPYで染色した。試験材料による細胞の分化および処置のための完全な手順については、図１０に図式的に概説される。
【０２２９】
オイルレッドＯ染色：KasturiおよびJoshiの方法［Kasturi, R.およびJoshi, V. C. Hormonal regulation of stearoyl coenzyme A desaturase activity and lipogenesis during adipose conversion of 3T3-L1 cells. J Biol Chem, 257: 12224-12230, 1982］に従って、Ｄａｙ６／Ｄａｙ７の分化３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド含有量について、オイルレッドＯにより評価した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Mediatech社）で単層細胞を洗浄し、１０％のホルムアルデヒドで１０分間固定した。３部の０．６％オイルレッドＯ／イソプロパノール原液と２部の水とのオイルレッドＯ作用溶液で固定細胞を１時間染色し、次いで余分な染色を水で一度洗浄した。その結果生じる染色油滴を、イソプロパノールを含む細胞から抽出し、次いで５４０ｎｍの吸光光度法により定量した（MEL312e BIO-KINETICS READER, Bio-Tek Instruments、ウィヌースキ、ヴァーモント州）。試験材料および陽性対照（インドメタシンおよびトログリタゾン）の結果について、溶媒対照の５４０ｎｍの吸光度と比較して示した。
【０２３０】
ＢＯＤＩＰＹ染色：細胞の中性および非極性の脂質の定量化のために、４，４−ジフルオロ−１，３，５，７，８−ペンタ−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（BODIPY 493/503；Molecular Probes、ユージン、オレゴン州）を使用した。概略説明すると、培地を除去し、次いで細胞を非滅菌ＰＢＳで一度洗浄した。１ｍＬのＤＭＳＯ（１，０００μｇ ＢＯＤＩＰＹ／ｍＬ）中に１ｍｇのＢＯＤＩＰＹを溶解させることによって１０００倍のＢＯＤＩＰＹ／ＤＭＳＯ原液を作製した。次いで、作用溶液におけるＢＯＤＩＰＹの終濃度を０．０１μｇ／μＬにするために、１０μＬの原液を９９０μＬのＰＢＳに添加することによってＢＯＤＩＰＹ作用溶液を作製した。１００μＬのこの作用溶液（１μｇのＢＯＤＩＰＹ）を９６ウェルのミクロタイタープレートの各ウェルに添加した。周囲温度でオービタルシェーカー（DS-500、VWR Scientific Products、サウスプレインフィールド、ニュージャージー州）に置いて１５分後、細胞を１００μＬのＰＢＳで洗浄し、その後細胞内へのＢＯＤＩＰＹの取り込みについての分光蛍光分析測定の読み取りのために１００μＬのＰＢＳを添加した。ＢＯＤＩＰＹ蛍光の定量化のために、４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの発光で設定されたPackard Fluorocount分光蛍光計（Model番号BF10000、Meridan、コネティカット州）を使用した。溶媒対照の蛍光と比較して、試験材料、インドメタシンおよびトログリタゾンについての結果を報告した。
【０２３１】
全ての中性および非極性の脂質のＢＯＤＩＰＹ定量化と、Ｄａｙ７の３Ｔ３−Ｌ１細胞中のトリグリセリド含有量のオイルレッドＯ測定との間の関係のカイ二乗分析によって、ｐ＜０．００１およびオッズ比４．６４で、２つの方法の間に有意な関係が示された。
【０２３２】
統計計算および解釈：ＡｃＥおよびインドメタシンを少なくとも３回繰り返してアッセイした。溶媒およびトログリタゾン対照についても、８回繰り返した。非極性の脂質の組込みについては、溶媒対照中の完全に分化した細胞の非極性の脂質の蓄積と比較して示した。陽性反応は、溶媒対照のそれぞれの９５％信頼区間の上限値（片側、Excel；Microsoft、レドモンド、ワシントン州）を超えるオイルレッドＯまたはＢＯＤＩＰＹ染色によって評価された脂質蓄積の増加として定義された。ＡｃＥは、更に溶媒反応に関してトログリタゾン陽性対照と同等またはそれ以上の脂肪生成の増加を特徴とし；この評価にはExcelのスチューデントｔ検定の機能を用いた。
【０２３３】
結果：陽性対照のインドメタシンおよびトログリタゾンは、３Ｔ３−Ｌ１細胞において同程度に脂質生成を誘導した（図１１）。予想外なことに、ＡｃＥによって、陽性対照のインドメタシンとトログリタゾンのいずれよりも大きな脂肪生成反応が生じた。
【０２３４】
３Ｔ３−Ｌ１細胞（水性アカシア試料番号４９０９抽出物のジメチルスルホキシド可溶性成分）において示された脂質生成の可能性によって、インスリンに対して非感受性の徴候または症候を示すヒトまたは他の動物におけるインスリン感受性を増加させる可能性が示される。
【０２３５】
実施例１１
アカシアの水抽出液のジメチルスルホキシド可溶性分画物によって誘発されるインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチン分泌の増加
モデル：この実験には実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
試験材料：トログリタゾンをCayman Chemical社（アナーバー、ミシガン州）から購入し、一方でメチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾンおよびインスリンをSigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。試験材料は、アカシア（ＡｃＥ）試料番号４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物から作製した暗褐色の粉末であり、Bayir Chemicals（Ｎｏ．６８、South Cross Road、Basavanagudi、インド）から入手した。この抽出物は、少なくとも２０％のアペカテキンを含むよう標準化された。本実施例で使用したバッチ番号Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析による測定で２０．８％のアペカテキンを含有していた。ペニシリン、ストレプトマイシン、Dulbecoの改良Eagle培地（DMEM）はMediatech社（ハーンドン、バージニア州）から入手し、１０％ＦＢＳ−ＨＩ（ウシ胎児血清（熱によって不活性化））はMediatech社およびHyclone社（ローガン、ユタ州）から入手した。特に示されない限り、他の全ての標準試薬はSigma社から購入された。
【０２３６】
細胞培養および処置：実施例１０で説明したように、マウス繊維芽細胞株３Ｔ３−Ｌ１の培養を行ってＤａｙ６に分化した脂肪細胞を産生した。９６ウエルプレートの１×１０４個／ｃｍ２の初期細胞密度で３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種した。２日間細胞を増殖させて集密に達した。集密後、分化培地を添加することにより細胞を脂肪細胞に分化させた；この培地は、（１）１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）；（２）０．５ｍＭメチルイソブチルキサンチン；（３）０．５μＭデキサメタゾン；および（４）１０μｇ／ｍＬのインスリン（ＭＤＩ培地）からなるものであった。Ｄａｙ３からＤａｙ５まで、その培地は、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に１０μｇ／ｍＬのインスリンからなる分化後の培地に変更された。
【０２３７】
Fasshauerら、[Fasshauerら、Hormonal regulation of adiponectin gene expression in 3T3-L1 adipocytes. BBRC 290:1084-1089, (2002)]に記載された手順を一部修正したものを利用してインスリン抵抗性、成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞に対するアカシアの効果を評価した。概略説明すると、Ｄａｙ６に、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する無血清培地中で細胞を３時間維持し、次いで１μｇ／ｍＬのインスリンに加えて溶媒、あるいはインスリンに加えて試験材料で処置した。トログリタゾンをジメチルスルホキシド中に溶解し、次いで添加して５、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬの濃度を達成した。アカシア抽出物は、５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍＬでテストされた。２４時間後、アディポネクチン測定のために上澄み培地を試料採取した。試験材料による細胞の分化および細胞への処置についての完全な手順は、図１２で図式的に概説される。
【０２３８】
アディポネクチンアッセイ： Mouse Adiponectin Quantikine（登録商標）Immunoassayキットを変更せずに使用して、培地に分泌されるアディポネクチンを定量した（R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州）。製造業者によってもたらされた情報が示すところによれば、マウス細胞培地中にスパイクされたアディポネクチンの回収率の平均値は１０３％で、検出可能なアディポネクチン濃度の最低値は０．００１〜０．００７ｎｇ／ｍＬの範囲であった。
【０２３９】
統計計算および解釈：全てのアッセイを二重で実施した。統計解析として、アディポネクチン分泌に対するアカシアの効果を、溶媒対照と比較して計算した。投与量間の差は、多重比較についての補正なしのスチューデントのｔ検定を使用して求められ；第１種の誤差の見かけ上５％の確率が選択された。
【０２４０】
見かけ上のミカエリス定数および最大反応速度を求めるためのHofsteeの方法［Hofstee, B.H. Non-inverted versus inverted plots in enzyme kinetics. Nature 184:1296-1298, (1959)］を一部修正したものを利用して試験材料の効能を推定した。｛相対アディポネクチン分泌／［濃度］｝を独立変数ｖ／［Ｓ］に代入し、｛相対アディポネクチン分泌｝を変数｛ｖ｝に代入することによって、関係式：ｙ＝ｍｘ＋ｂを導いた。対照溶媒を基準とした最大アディポネクチン分泌をｙ切片から推定し、一方で最大の半分の半減のアディポネクチン分泌に必要な試験材料の濃度をその傾きの負の値から計算した。
【０２４１】
結果：陽性対照のトログリタゾンについてテストされた全ての濃度について、アディポネクチン分泌は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞の溶媒対照と比較して、２．４４倍の最大刺激で２．５μｇ／ｍＬに高まった（図１３）。５０μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬの濃度のアカシアについては、それぞれ溶媒対照と比較してアディポネクチン分泌が１．７６倍および１．７０倍増加した。アカシアのこれらの濃度のいずれも、トログリタゾンで認められた最大アディポネクチン分泌には等しくなかったが、トログリタゾンの濃度１．２５μｇ／ｍＬおよび０．６２５μｇ／ｍＬと同等であった。
【０２４２】
改良Hofsteeプロットから導かれた最大アディポネクチン分泌の推定によって、最大の半分の刺激に必要な濃度の差が大きいアディポネクチン分泌の同等の相対的増加が示された。トログリタゾンおよびアセンヤクノキについてｙ切片から推定した最大アディポネクチン分泌は、それぞれ溶媒対照と比較して２．２９倍および１．８８倍であった。しかしながら、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞における最大の半分のアディポネクチン分泌の刺激に必要な濃度は、トログリタゾンについては０．０８５μｇ／ｍＬ、アカシアについては５．３８μｇ／ｍＬであった。アペカテキン含有率の最小値が２０％における計算においては、アカシアに関するこの後者の数字は約１．０μｇ／ｍＬになった。
【０２４３】
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞においてアディポネクチン分泌を高めるその能力に基いて、アカシアおよび／またはアペカテキンは、血漿アディポネクチン濃度を低下させる臨床病理学に好ましい効果を有するものと考えることができる。
【０２４４】
実施例１２
アカシアの水抽出液のジメチルスルホキシド可溶性分画物によって誘発されるＴＮＦαで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチン分泌の増加
モデル：この実験には実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０２４５】
試験材料：
インドメタシン、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾンおよびインスリンをSigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。試験材料は、アカシア（ＡｃＥ）試料番号４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物から作製した暗褐色の粉末であり、Bayir Chemicals（Ｎｏ．６８、South Cross Road、Basavanagudi、インド）から入手した。この抽出物は、少なくとも２０％のアペカテキンを含むよう標準化された。本実施例で使用したバッチ番号Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析による測定で２０．８％のアペカテキンを含有していた。ペニシリン、ストレプトマイシン、Dulbecoの改良Eagle培地（DMEM）はMediatech社（ハーンドン、バージニア州）から入手し、１０％ＦＢＳ−ＨＩ（ウシ胎児血清）はMediatech社およびHyclone社（ローガン、ユタ州）から入手した。特に示されない限り、他の全ての標準試薬はSigma社から購入された。
【０２４６】
細胞培養および処置：実施例１０で説明したように、マウス繊維芽細胞株３Ｔ３−Ｌ１の培養を行ってＤａｙ３に分化した脂肪細胞を産生した。９６ウエルプレートの１×１０４個／ｃｍ２の初期細胞密度で３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種した。２日間細胞を増殖させて集密に達した。集密後、分化培地を添加することにより細胞を脂肪細胞に分化させた；この培地は、（１）１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（高グルコース）；（２）０．５ｍＭメチルイソブチルキサンチン；（３）０．５μＭデキサメタゾン；および（４）１０μｇ／ｍＬのインスリン（ＭＤＩ培地）からなるものであった。Ｄａｙ３からＤａｙ５まで、その培地は、ＤＭＥＭ中に１０％ＦＢＳからなる分化後の培地に変更された。Ｄａｙ５に、インドメタシンまたはアカシア抽出物を含むまたは含まない１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に１０、２または０．５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαを含有する試験培地に、その培地を変更した。インドメタシンをジメチルスルホキシド中に溶解し、次いで添加して５、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬの濃度を達成した。そのアカシア抽出物を、５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍＬでテストした。Ｄａｙ６に、アディポネクチン測定のために上澄み培地を試料採取した。試験材料による細胞の分化および細胞の処置についての完全な手順は、図１４で図式的に概説される。
【０２４７】
アディポネクチンアッセイ： Mouse Adiponectin Quantikine（登録商標）Immunoassayキットを変更せずに使用して、培地に分泌されるアディポネクチンを定量した（R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州）。製造業者によってもたらされた情報が示すところによれば、マウス細胞培地中にスパイクされたアディポネクチンの回収率の平均値は１０３％で、検出可能なアディポネクチン濃度の最低値は０．００１〜０．００７ｎｇ／ｍＬの範囲であった。
【０２４８】
統計計算および解釈：全てのアッセイを二重で実施した。統計解析として、アディポネクチン分泌に対するインドメタシンまたはアセンヤクノキの効果を、溶媒対照と比較して計算した。投与量および検査薬の間の差は、多重比較についての補正なしのスチューデントのｔ検定を使用して求められ；第１種の誤差の見かけ上５％の確率が選択された。
【０２４９】
結果：ＴＮＦαは、１０ｎｇ／ｍＬおよび２ｎｇ／ｍＬの濃度の成熟３Ｔ３―Ｌ１細胞における溶媒対照と比較して、アディポネクチン分泌をそれぞれ６５％および２９％有意に（ｐ＜０．０５）低下させ、０．５ｎｇ／ｍＬでアディポネクチン分泌に対する明らかな効果を有さなかった（図１５）。１０ｎｇ／ｍＬおよび２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで、インドメタシンは、ＴＮＦα単独と比較して、テストされた全ての投与量でアディポネクチン分泌を高めたが（ｐ＜０．０５）、アディポネクチン分泌を溶媒対照のレベルに戻すことはできなかった。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαの存在下におけるアカシアでの処置によって、インドメタシンの場合と比較して、アディポネクチンの増加は、減少するとはいえ同等となった。アセンヤクノキおよびインドメタシンの間のアディポネクチン刺激の差は、増加させる４つの用量において、それぞれ１４、２０、３２および４１％であった。投与量間の多重度がインドメタシンおよびアカシアについて同一であったことから、これらの結果によって、ＴＮＦαが超生理学的濃度である場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞へのアディポネクチン分泌の回復について、インドメタシンの効能はアカシアの活性物質より大きかったことが示される。
【０２５０】
３Ｔ３−Ｌ１細胞へ２ｎｇのＴＮＦαおよびアカシアで処置をすることによって、ＴＮＦα単独と比較して、６．２５、２５および５０μｇ／ｍＬで有意（ｐ＜０．０５）なアディポネクチン分泌の増加が生じた。しかし、１０ｎｇのＴＮＦα／ｍＬとは異なり、アカシアおよびインドメタシンの間の差はほとんどなく、明らかに投与量に関連がなく、テストされた全４つの濃度について平均は５．５％であった。インドメタシンによる観察において、アカシアにおけるアディポネクチン分泌は、溶媒対照で認められるレベルに戻らなかった。
【０２５１】
０．５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαにおいて、インドメタシンは、２．５μｇ／ｍＬおよび５．０μｇ／ｍＬの濃度で有意（ｐ＜０．０５）なアディポネクチン分泌の用量依存的な減少を引き起こした。興味深いことには、インドメタシンと異なり、アセンヤクノキは、５０μｇ／ｍＬでＴＮＦαおよび溶媒の両方で処置をした３Ｔ３―Ｌ１脂肪細胞と比較してアディポネクチン分泌を増加させた。従って、生理学的レベルに近いＴＮＦαの濃度において、アセンヤクノキは、ＴＮＦαおよび溶媒対照の両方よりもアディポネクチン分泌を高め、そして意外にもインドメタシンよりも優れていた。
【０２５２】
ＴＮＦαで処置された３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるアディポネクチン分泌を高めるその能力に基けば、アセンヤクノキおよび／またはアペカテキンは、ＴＮＦαのレベルが上昇して血漿アディポネクチン濃度が低下する全ての臨床病理学に好ましい効果があると考えられよう。
【０２５３】
実施例１３
種々の市販のアカシア試料は３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける脂質生成を増大させる
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。使用された全ての化学物質および手順は、オイルレッドＯアッセイのみを実施してアセンヤクノキで誘導した細胞トリグリセリドの含有量を評価したこと以外は実施例１０で説明した通りであった。アセンヤクノキ試料番号５６６９はNatural Remedies（364, 2nd Floor, 16th Main, 4th T Block Bangalore, Karnataka 560041、インド)から入手し；ならびに試料番号４９０９、５６６７および５６６８はBayir Chemicals（No. 10, Doddanna Industrial Estate, Penya II Stage, Bangalore, 560091 Karnataka、インド）から入手した。アラビアゴムモドキ試料番号５６３９、５６４０および５６５９は、KDN-Vita International社（121 Stryker Lane, Units 4 & 6 Hillsborough、ニュージャージー州、08844）から購入した。試料５６４０は樹皮として、試料５６６７はゴム樹脂として、および試料５６６９は心材粉末として記載されたものである。全ての他の試料は、指示されない限り、アセンヤクノキの樹皮の登録商標のメタノール抽出物として記載された。
【０２５４】
結果：検討される全てのアカシア試料によって、陽性の脂質生成反応が生じた（図１６）。最も高い脂質生成反応が達成された試料は、５６６９（心材粉末；１．２７）、５６５９（メタノール抽出物；１．３１）、５６４０（ＤＭＳＯ抽出物；１．２９）および４９０９（メタノール抽出物；１．３１）であった。
【０２５５】
本実施例によって、インシュリン作用の増大を補助する脂肪細胞の生理機能の優れた改良が可能となるアセンヤクノキ中の複数の化合物の存在が更に示される。
【０２５６】
実施例１４
種々の市販のアカシア試料はＴＮＦα−３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるアディポネクチン分泌を増大させる
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。標準的化学物質を使用し、細胞の処理を実施例１０および１２で説明したように実施した。しかし、ＴＮＦαで３Ｔ３―Ｌ１脂肪細胞を処置することは、その細胞が２ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαにだけ曝露されたという点が実施例１２と異なった。実施例１２で詳述したアディポネクチンについて、Ｄａｙ６に培養上澄み培地をアッセイした。アカシア試料番号４９０９、５６３９、５６５９、５６６７、５６６８、５６４０および５６６９の調製は、実施例１３で説明した通りであった。
【０２５７】
結果：２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαによって３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアディポネクチン分泌は溶媒対照よりも２７％減少したが、一方で１．２５μｇ／ｍＬのインドメタシンによってアディポネクチン分泌はＴＮＦα溶媒対照より１１％最大限に増大した（表８）。アカシア試料番号５５５９だけは、テストされた４つの投与量のいずれにおいてもアディポネクチン分泌を増加させることができなかった。アカシアの他の全ての調製物によって、アディポネクチン分泌の最大の増加は同様となり、その範囲は１０〜１５％であった。しかし、各種アカシア調製物によって最大のアディポネクチン分泌が誘発される濃度に関しては、差が認められた。最も効力のある調製物は、１２．５μｇ／ｍＬで達成されるアディポネクチン刺激の最大刺激を伴う番号５６４０であり、続いて２５μｇ／ｍＬの番号４９０９および番号５６６８、最後に５０μｇ／ｍＬの番号５６３９、番号５６６７および番号５６６９であった。
【０２５８】
【表８】
2009518429.tif 000010
【０２５９】
１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαによって３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のアディポネクチン分泌が溶媒対照より５４％減少したが、一方で５．０μｇ／ｍＬのインドメタシンによってアディポネクチン分泌はＴＮＦα溶媒対照より６７％最大限に上昇した（表９）。トログリタゾンによって、テストされた最低投与量の０．６２５μｇ／ｍＬでアディポネクチン分泌は５１％最大限に増加した。アカシア調製物番号５５５９によって、２５μｇ／ｍＬで有意な増加（ｐ＜０．０５）が１２％と最も低くなった。アカシアの他の全ての調製物によって、アディポネクチン分泌の増加は最大となり、その範囲は１７〜４１％であった。最も効力のある調製物は番号４９０９および番号５６６９であり、そのアディポネクチン分泌の増加はＴＮＦα溶媒対照に対してそれぞれ４１％および４０％であった。
【０２６０】
【表９】
2009518429.tif 000011
【０２６１】
代謝症候群のこの第２のモデルにおいてアカシアの種々の試料または調製物が類似の反応を誘発するということが認められ、それによって、インスリン作用の増大を補助する脂肪細胞の生理機能の優れた改良が可能となるアカシアにおける複数の化合物の存在が更に示される。
【０２６２】
実施例１５
ＴＮＦα／３Ｔ３―Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるアディポネクチン分泌の増加が可能となるアセンヤクノキからの極性および非極性の溶媒抽出物の化合物
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。用いた標準的化学物質は、実施例１０および１２で説明した通りであった。実施例１２で説明したような１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処置した。実施例１２で詳述したように、Ｄａｙ６にアディポネクチンについて培養上澄み培地をアッセイした。
【０２６３】
試験材料：微速度の標準動力ドリルを使用した５／８インチの金属ドリルビットによって、アセンヤクノキの試料番号５６６９の心材の大きなチップ（各チップの重量は５〜１０グラム）を低速で穿孔した。木屑を乳鉢に集め、次いで液体Ｎ２下で凍結しながら微粉に粉砕した。この粉末を２５０ミクロンの篩にかけて約１０ｇの微細な易流動性粉末とした。
【０２６４】
【表１０】
2009518429.tif 000012
【０２６５】
この粉末を６つのガラスのアンバーバイアル（１５０ｍｇ／バイアル）に分注し、次いで表１０にリストが示される２ｍＬの溶媒で約１０時間４０℃で抽出した。この抽出後、心材／溶媒懸濁液を遠心分離（５８００×ｇ、１０分）に供した。遠心分離からの上澄み分画物を０．４５ミクロンのＰＴＦＥ注射器フィルターで濾過して別々のアンバーガラスバイアル内に入れた。これらの試料の各々を真空内で濃縮した。表２に示すように、ＤＭＳＯはアセンヤクノキの心材から最も多くの材料を抽出し、クロロホルムが抽出したものは最少であった。全ての抽出物試料は、５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍＬでテストされた。
【０２６６】
ピオグリタゾンは、Actos（登録商標；Takeda Pharmaceuticals、リンカンシア、イリノイ州）として市販されている原料から４５ｍｇのピオグリタゾン・テーブル（pioglitazone tables）として入手した。その錠剤を微粉に粉砕して、次いで５．０、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬのピオグリタゾンでテストした。インドメタシンも更なる陽性対照として含まれた。
【０２６７】
結果：両方の陽性対照（ピオグリタゾンおよびインドメタシン）は、ＴＮＦαの存在下で脂肪細胞によるアディポネクチン分泌をそれぞれ１１５％および９４％増加させた（図１７）。最適なピオグリタゾンおよびインドメタシンの濃度は、それぞれ１．２５μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬであった。アセンヤクノキ試料番号５６６９の全ての抽出物は、ＴＮＦαでの処置よりもアディポネクチン分泌を増加させた。その抽出物の中で、ＤＭＳＯ抽出物が、６．２５μｇ／ｍＬの抽出物で認められた最大の活性を有するアディポネクチン分泌の最も効力のある誘導物質であった。この結果は、様々な極性の広範囲にわたる材料を抽出するＤＭＳＯの能力に起因するかもしれない。図１７の考察によって、水抽出物（極性化合物）およびクロロホルム抽出物（非極性化合物）は、ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるアディポネクチン分泌を増加させる能力に差がほとんどなかったことが示された。これらの抽出物が類似の化合物を含んだということは可能性が低い。本実施例によって、極性の異なる溶媒の、炎症誘発性刺激がある場合において脂肪細胞からのアディポネクチン分泌を増加させることが可能な化合物をアセンヤクノキ心材から抽出する能力が示される。
【０２６８】
実施例１６
アセンヤクノキの酸性および塩基性の分画物はＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいてアディポネクチン分泌を増加させることができる
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。用いた標準的化学物質は、実施例１０および１２で説明した通りであった。実施例１２で説明したような１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処置した。実施例１２で詳述したように、Ｄａｙ６にアディポネクチンについて培養上澄み培地をアッセイした。
【０２６９】
試験材料：アセンヤクノキ試料番号５６６９を以下の手順に従って抽出した：アルカリ性イソプロピルアルコール溶液（イソプロパノール中に１％（ｖ／ｖ）１．５Ｎ ＮａＯＨ）を５０ｍＬのFalcon（登録商標）チューブ内の約５０ｍｇの乾燥アセンヤクノキ心材粉末（番号５６６９）に添加した。次いで試料を少しの間混合し、３０分間音波破砕し、次いで残留する固体成分をペレットに１時間遠心分離した。次いでその上澄み液を０．４５ミクロンの濾紙で濾過した。使用するアルカリ性イソプロパノールのｐＨは８．０であったが、一方で採集した液体のｐＨは７．０であった。クリアな、濾過された液体の一部を真空内で乾燥状態とし、そしてそれは白色固体となった。この試料を乾燥アルカリ性抽出物と呼称した。
【０２７０】
残留ペレット状材料を、赤い溶液である酸性イソプロピルアルコール溶液（イソプロパノール中に１％（ｖ／ｖ）の１０％ＨＣｌ）に入れた。そのペレット材料が液体中に十分に分散するまでその試料を混合し、次いで３０分間遠心分離して再び残留固形物をペレット化した。０．４５ミクロンの濾紙で淡黄色の上澄み液を通過した。採集した液体のｐＨは３．０であり、試料のｐＨを８〜９にまで上げる際に赤褐色の析出物（乾燥析出物）が形成されたことが分かった。その析出物を採集して乾燥し、赤褐色の固形物が得られた。その上澄み液を０．４５ミクロンのフィルターに再び通していかなる残留析出物も除去した；この液体は濃い黄色であった。この残留液体を乾燥状態とし、それは結果として固体の茶色の試料となるもので、乾燥酸性抽出物と呼称された。３つの分画物の回収率について、表１１にリストを示した。全ての試験材料は５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍＬでアッセイされたが、一方でピオグリタゾンの陽性対照は５．０、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬでテストされた。
【０２７１】
【表１１】
2009518429.tif 000013
【０２７２】
結果：ＴＮＦαは、溶媒対照と比較してアディポネクチン分泌を４６％減少させた。ピオグリタゾンによるアディポネクチン分泌の回復の最大値は、１．２５μｇ／ｍＬで認められるＴＮＦα処置の１．４７倍であった（表１２）。試験材料の中で、乾燥沈殿剤だけは、ＴＮＦαのみの対照よりアディポネクチン分泌を有意に増加させることができなかった。酸性抽出物および心材粉末（出発材料）はＴＮＦαの存在下でアディポネクチン分泌を増加させる能力にほとんど差がなかったが、一方でアルカリ性抽出物は５０μｇ／ｍＬの最高投与量のみでアディポネクチン分泌を増加させた。
【０２７３】
【表１２】
2009518429.tif 000014
【０２７４】
実施例１７
アカシアの水抽出液のジメチルスルホキシド可溶性分画物によるＴＮＦαで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのインターロイキン６の分泌の減少
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、宿主防御、急性相反応、免疫応答、神経細胞の機能、血液生成および代謝症候群において重要な役割を果たす多機能サイトカインである。それは、種々の正常で形質転換されたリンパ系および非リンパ系の細胞（例えば脂肪細胞）によって発現するものである。ＩＬ―６の産生は、数多くのシグナル（例えば、分裂刺激または抗原刺激、リポポリサッカライド、カルシウムイオノホア、サイトカインおよびウイルス）によってアップレギュレートされる［Hibi, M., Nakajima, K., Hirano T. IL-6 cytokine family and signal transduction: a model of the cytokine system. J Mol Med. 74(1): 1-12, (Jan 1996)］。細菌感染症およびウイルス感染症、外傷、自己免疫疾患、悪性腫瘍および代謝症候群を含む多くの病的状態において、血清レベルの上昇が認められている［Arner, P. Insulin resistance in type 2 diabetes -- role of the adipokines. Curr Mol Med.;5(3): 333-9, (May 2005)］。
【０２７５】
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。用いた標準的化学物質は、実施例１０および１２で説明した通りであった。実施例１２で説明したような１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαで３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処置した。実施例１２で詳述したように、Ｄａｙ６にアディポネクチンについて培養上澄み培地をアッセイした。
【０２７６】
試験材料：インドメタシン、メチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾンおよびインスリンは、Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。試験材料は、アカシア（ＡｃＥ）試料番号４９０９のゴム樹脂の５０：５０（ｖ／ｖ）水／アルコール抽出物から作製した暗褐色の粉末であり、Bayir Chemicals（Ｎｏ．６８、South Cross Road、Basavanagudi、インド）から入手した。この抽出物は、少なくとも２０％のアペカテキン(apecatechin)を含むよう標準化された。本実施例で使用したバッチ番号Ａ Ｃａｔ／２３０４は、ＵＶ分析による測定で２０．８％のアペカテキンを含有していた。ペニシリン、ストレプトマイシン、Dulbecoの改良Eagle培地（DMEM）はMediatech社（ハーンドン、バージニア州）から入手し、１０％ＦＢＳ−ＨＩ（ウシ胎児血清）はMediatech社およびHyclone社（ローガン、ユタ州）から入手した。特に示されない限り、他の全ての標準試薬はSigma社から購入された。
【０２７７】
インターロイキン６アッセイ：Quantikine（登録商標）Mouse IL-6 Immunoassayキット（R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州）を変更せずに用いて、培地中に分泌されるＩＬ−６を定量した。製造業者によってもたらされた情報が示すところによれば、マウス細胞培地中にスパイクされたＩＬ−６の回収率の平均値は１：２の希釈で９９％であり、検出可能なＩＬ−６濃度の最低値は１．３〜１．８ｐｇ／ｍＬの範囲であった。全ての上澄み培地試料は、希釈せずにアッセイされた。
【０２７８】
統計計算および解釈：全てのアッセイを二重で実施した。統計解析として、アディポネクチンまたはＩＬ−６の分泌に対するアカシアの効果を、溶媒対照と比較して計算した。投与量間の差は、多重比較についての補正なしのスチューデントのｔ検定を使用して求められ；第１種の誤差（片側）の見かけ上５％の確率が選択された。
【０２７９】
結果：前の実施例に示すように、ＴＮＦαはアディポネクチン分泌を激減させたが、一方でインドメタシンおよびアセンヤクノキの抽出物はＴＮＦαの存在下でアディポネクチン分泌を増加させた。インドメタシン陽性対照とアセンヤクノキ抽出物の両方ともアディポネクチン分泌の用量関連増加を示したが、どちらの材料のアディポネクチン濃度も、ＴＮＦαなしのジメチルスルホキシド対照に認められた濃度に戻らなかった（表１３）。アセンヤクノキの抽出物はＴＮＦαの存在下でＩＬ−６分泌の効力のある用量関連阻害を示したが、一方でインドメタシンは抗炎症効果を示さなかった。
【０２８０】
炎症誘発性ＩＬ−６に対する抗炎症アディポネクチンの比率の考察は、インドメタシンおよびアセンヤクノキの抽出物の両方の相対的抗炎症作用の用量関連増加が優れたものとなるという結果となった。
【０２８１】
【表１３】
2009518429.tif 000015
【０２８２】
アセンヤクノキ試料番号４９０９は、ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいて二重の消炎作用を示した。アセンヤクノキ抽出物の成分は、ＩＬ−６分泌を減少させると共にアディポネクチン分泌を増加させた。アセンヤクノキの全体的な効果は、ＴＮＦα対照よりも抗炎症が強かった。これらの結果によって、インスリン抵抗性体重増加、肥満、心臓血管疾患および癌を減少させる脂肪細胞生理機能の改善のためのアセンヤクノキの使用が支持される。
【０２８３】
実施例１８
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に由来するアディポネクチン、ＩＬ−６およびレジスチンの分泌に対する水性アカシア抽出物のジメチルスルホキシド可溶性分画物の作用
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。用いた標準的化学物質および統計手順は実施例１０および１１で説明した通りであった。ＩＬ−６を実施例１７で説明したようにアッセイした。
【０２８４】
レジスチンアッセイ：Quantikine（登録商標）Mouse Resistin Immunoassayキット（R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州）を変更せずに用いて、培地中に分泌されるレジスチンの量を定量した。製造業者によってもたらされた情報が示すところによれば、マウス細胞培地中にスパイクされたＩＬ−６の回収率の平均値は１：２の希釈で９９％であり、検出可能なレジスチン濃度の最低値は１．３〜１．８ｐｇ／ｍＬの範囲であった。全ての上澄み培地試料は、アッセイ前に製造業者によって供給された希釈剤培地で１：２０で希釈された。
【０２８５】
統計計算および解釈：全てのアッセイを二重で実施した。統計解析として、アディポネクチンまたはＩＬ−６の分泌に対するアカシアの効果を、溶媒対照と比較して計算した。投与量間の差は、多重比較についての補正なしのスチューデントのｔ検定を使用して求められ；第１種の誤差（片側）の見かけ上５％の確率が選択された。
【０２８６】
結果：トログリタゾンおよびアカシア試料番号４９０９の両方は、高濃度のインスリンの存在下における用量関連の方法でアディポネクチン分泌を増加させた（表１４）。アセンヤクノキは６．２５μｇ／ｍＬのみ（濃度）においてＩＬ−６が減少することによる抗炎症効果を示すが、一方でトログリタゾンは、５．００μｇ／ｍＬおよび１．２５μｇ／ｍＬの濃度で炎症誘発性であったが、その他の２つの濃度では効果がなかった。レジスチン分泌はトログリタゾンによる用量依存的な方法で増加したが；アセンヤクノキは用量依存的方法で同様にレジスチン発現を減少させた。
【０２８７】
実施例１７に示すように、アセンヤクノキ試料番号４９０９はまた、高インスリン血症／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいて二重の消炎作用を示した。アセンヤクノキ抽出物の成分は、ＩＬ−６分泌を減少させると共にアディポネクチン分泌を増加させた。従って、アセンヤクノキの全体的な効果は、高インスリン対照と比較して抗炎症であった。高インスリン濃度の存在下でレジスチン分泌に対するアセンヤクノキの効果は、トログリタゾンと反対であり：トログリタゾンはレジスチン発現を増大させ、その一方でアセンヤクノキは更にレジスチン発現を低下させた。これらのデータによって、アセンヤクノキ抽出物の複合体がＰＰＡＲγ受容体を介して機能しないことが示唆される。これらの結果によって、インスリン抵抗性体重増加、肥満、心臓血管疾患および癌を減少させる脂肪細胞生理機能の改善のためのアセンヤクノキの使用が更に支持される。
【０２８８】
【表１４】
2009518429.tif 000016
【０２８９】
実施例１９
ホップから誘導された植物化学物質による脂肪細胞の脂質生成の増加
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。用いた標準的化学物質および統計手順は実施例１０で説明した通りであった。
【０２９０】
試験材料：このテストに使用するホップの植物化学物質は、表１５に記載されるもので、Betatech Hops Products（ワシントンＤ．Ｃ．、米国）から入手した。
【０２９１】
【表１５】
2009518429.tif 000017
【０２９２】
細胞培養および処置
ホップ化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、添加して分化のＤａｙ０に１０、５、４または２μｇ／ｍＬの濃度を達成し、次いで成熟期（Ｄａｙ６または７）にわたって維持した。ホップかすを５０μｇ／ｍＬでテストした。新しい培地の添加とともに常に新しい試験材料も添加した。ＤＭＳＯは、その極性と、それが水性細胞培養培地と相溶性であるということで選択された。陽性対照として、インドメタシンおよびトログリタゾンをそれぞれ添加して５．０μｇ／ｍＬおよび４．４μｇ／ｍＬの終濃度を達成した。分化した、Ｄａｙ６／Ｄａｙ７の３Ｔ３−Ｌ１細胞を、０．３６％のオイルレッドＯまたは０．００１％のBODIPYで染色した。
【０２９３】
結果：陽性対照のインドメタシンおよびトログリタゾンは、３Ｔ３−Ｌ１細胞において同程度に脂質生成を誘導した（図１８）。予想外なことに、ホップの種類の内の４種によって、陽性対照のインドメタシンおよびトログリタゾンよりも大きな３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂肪生成反応が生じた。これらの４つの種類としては、イソアルファ酸、Ｒｈｏ−イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸およびヘキサヒドロイソアルファ酸が挙げられる。この発見は、ＰＰＡＲγに対する個々のイソフムロンの結合が効力のあるＰＰＡＲγアゴニストのピオグリタゾンの約１／３〜１／４であったという公表された報告に鑑みて驚くべきことである［Yajima, H., Ikeshima, E., Shiraki, M., Kanaya, T., Fujiwara, D., Odai, H., Tsuboyama-Kasaoka, N., Ezaki, O., Oikawa, S., and Kondo, K. Isohumulones, bitter acids derived from hops, activate both peroxisome proliferator-activated receptor alpha and gamma and reduce insulin resistance. J Biol Chem, 279: 33456-33462, (2004)］。
【０２９４】
キサントフモール、アルファ酸およびベータ酸の脂肪生成反応はインドメタシンおよびトログリタゾンと同様であったが、一方でホップかすおよびヘキサヒドロコルプロンは溶媒対照より大きな脂質生成反応を誘発することができなかった。
【０２９５】
３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるそれらの脂肪生成の可能性に基いて、異性化アルファ酸、アルファ酸およびベータ酸ならびにキサントフモール等の、このスタッドの好ましいホップ植物化学物質の種類は、インスリンに対して非感受性の徴候または症候を示すヒトまたは他の動物におけるインスリン感受性を増加させ、かつ血清トリグリセリドを減少させると考えることができる。
【０２９６】
実施例２０
ホップ植物化学物質は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌を増加させる
モデル：本実施例において、実施例１０および１１で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。標準化学物質、ホップ化合物ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、キサントフモール、ヘキサヒドロコルプロン、ホップかすは、それぞれ実施例１１および１９に記載された通りであった。
【０２９７】
細胞培養および処置：細胞を実施例１１で説明したように培養し、次いで実施例３３で説明したようにホップ植物化学物質で処置した。アディポネクチンアッセイおよび統計解釈は実施例１１で説明した通りであった。見かけ上のミカエリス定数および最大反応速度を求めるためのHofsteeの方法を一部修正したものを利用して試験材料の効能を推定した。｛相対アディポネクチン分泌／［濃度］｝を独立変数ｖ／［Ｓ］に代入し、｛相対アディポネクチン分泌｝を変数｛ｖ｝に代入することによって、関係式：ｙ＝ｍｘ＋ｂを導いた。対照溶媒を基準とした最大アディポネクチン分泌をｙ切片から推定し、一方で最大の半分のアディポネクチン分泌に必要な試験材料の濃度をその傾きの負の値から計算した。
【０２９８】
結果：陽性対照のトログリタゾンによって、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞における溶媒対照より２．５μｇ／ｍＬでアディポネクチン分泌が２．４４倍最大限に上昇した
（図１９）。全てのホップ植物化学物質は溶媒対照よりもアディポネクチン分泌を高めることを示し、その中にはトログリタゾンより有意に多くのアディポネクチン分泌を生じさせるイソアルファ酸がある（対照より２．９７倍）。イソアルファ酸、Ｒｈｏイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸およびテトラヒドロイソアルファ酸について、テストされた４つの投与量の内、最大のアディポネクチン分泌は、最高の投与量である５μｇ／ｍＬで認められた。キサントフモール、ホップかすおよびヘキサヒドロコルプロンについて、アディポネクチン分泌の最大の増加は、それぞれ１．２５、２５および１２．５μｇ／ｍＬで認められた。最大の相対的なアディポネクチンの発現は、キサントフモール、Ｒｈｏイソアルファ酸およびホップかすについてはトログリタゾンと同様で、ヘキサヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロコルプロンおよびテトラヒドロイソアルファ酸については、トログリタゾンより低いが対照より高いことが認められた。
【０２９９】
【表１６】
2009518429.tif 000018
【０３００】
表１６に示すように、改良されたHofsteeプロット（図２０）から導かれるアディポネクチン分泌の最大値の推定値によって、先に述べた知見は支持された。アディポネクチン分泌の最大値のｙ切片による推定値は、およそ３つの群に区別される：（１）イソアルファ酸、（２）キサントフモール、Ｒｈｏイソアルファ酸、トログリタゾンおよびホップかすならびに（３）ヘキサヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロコルプロンおよびテトラヒドロイソアルファ酸。インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞の最大の半分のアディポネクチン分泌の刺激に必要な試験材料の濃度は約０．１μｇ／ｍＬであって、トログリタゾン、Ｒｈｏイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸およびヘキサヒドロイソアルファ酸についてほとんど差がなかった。最大の半分のアディポネクチン分泌の０．４９μｇ／ｍＬにおけるイソアルファ酸の濃度は、ほとんど５倍より大きかった。キサントフモールは、０．０３７のμｇ／ｍＬと推定された最大のの半分のアディポネクチン分泌について最小の投与量を示した。推定された最大の半分のアディポネクチン分泌の変数についての最高濃度は、ホップかおよびヘキサヒドロコルプロンにおいて認められ、それぞれ２．８μｇ／ｍＬおよび３．２μｇ／ｍＬであった。
【０３０１】
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞においてアディポネクチン分泌を高めるその能力に基いて、本研究に示される好ましいホップ植物化学物質の種類、即ちイソアルファ酸、Ｒｈｏイソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、ホップかすおよびヘキサヒドロコルプロンは、血漿アディポネクチン濃度を低下させる臨床病理学に好ましい効果を有するものと考えることができる。
【０３０２】
実施例２１
ホップ植物化学物質は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌の増加とインターロイキン６分泌の阻害とによって抗炎症作用を示す
モデル：本実施例において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。アディポネクチンおよびＩＬ−６は、それぞれ実施例１１および１７で記載されたようにアッセイされた。標準化学物質、ホップ化合物ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡ、ＨＨＩＡＡ、キサントフモール、ヘキサヒドロコルプロン、ホップかすは、実施例１１および１９に記載された通りであった。
【０３０３】
統計計算および解釈：全てのアッセイを二重で実施した。統計解析として、アディポネクチンまたはＩＬ−６の分泌に対するホップ誘導体の効果を、溶媒対照と比較して計算した。投与量間の差は、多重比較についての補正なしの分散分析を使用して求められ；第１種の誤差の見かけ上５％の確率が選択された。
【０３０４】
結果：テストされたトログリタゾンおよび全てのホップ誘導体は、高濃度のインスリンの存在下でアディポネクチン分泌を増加させた（表１７）。トログリタゾンは、このモデルにおいてＩＬ−６分泌を減少させなかった。実際、トログリタゾンおよびＨＨＣＬは、ＩＬ−６分泌が増加した２つの濃度を示したが、一方でＴＨＩＡＡおよびホップかすは、最高濃度でＩＬ−６を増加させ、そして他の濃度では効果がなかった。ＩＬ−６分泌に対する他のホップ誘導体の効果は、一般に二相性であった。テストされた最高濃度において、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡおよびＸＮはＩＬ−６分泌を増加させたが；ＩＡＡだけは増加させなかった。ＩＬ−６分泌の著しい減少は、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＴＨＩＡＡおよびＸＮにおいて確認された。
【０３０５】
【表１７】
2009518429.tif 000019
【０３０６】
アディポネクチン／ＩＬ−６比（全体的な抗炎症の有効性の測定基準）は、ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＨＨＩＡおよびＸＮについて強く正であった（＞２．００）。ＴＨＩＡＡ、ＨＨＣＬおよびホップかすは、（低いとはいえ）正のアディポネクチン／ＩＬ−６比を示した。トログリタゾンについては、アディポネクチン／ＩＬ−６比は様々であり、２．５μｇ／ｍＬおよび０．６２５μｇ／ｍＬで強い正の反応で、５．０μｇ／ｍＬまたは１．２５μｇ／ｍＬで効果がなかった。
【０３０７】
高インスリン血症の炎症誘発性効果は、ホップ誘導体ＲＩＡＡ、ＩＡＡ、ＨＨＩＡ、ＴＨＩＡＡ、ＸＮ、ＨＨＣＬおよびホップかすによる脂肪細胞において減じ得る。一般に、ＴＮＦαによって合併症を伴わない高インスリン血症といった高インスリン血症症状において、ホップ誘導体の抗炎症効果はトログリタゾンよりも安定していた。
【０３０８】
実施例２２
ホップ植物化学物質は、ＴＮＦαで処置した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌を増加させる
モデル：本実施例において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。標準化学物質およびホップ化合物ＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡおよびＴＨＩＡＡは、それぞれ実施例１２および１９に記載された通りであった。０．６２５、１．２５、２．５および５．０μｇ／ｍＬの濃度でホップ誘導体をテストした。実施例１１で説明したように、アディポネクチンをアッセイした。
【０３０９】
結果：１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαでＤａｙ５の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を一晩処置することによって、アディポネクチン分泌が顕著に抑制された（図２１）。ホップ誘導体ＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡおよびＴＨＩＡＡの全ては、ＴＮＦα／溶媒対照よりもアディポネクチン分泌を増加させた。線形の用量反応曲線はＲＩＡＡおよびＨＨＩＡＡにおいて認められ、それによって、テストされた最高濃度の５．０μｇ／ｍＬで最大の阻害がもたらされた。ＩＡＡは１．２５μｇ／ｍＬでアディポネクチンの最大の分泌を誘発したが、一方でＴＨＩＡＡは５．０μｇ／ｍＬで最大のアディポネクチン分泌を伴う曲線形の反応を示した。
【０３１０】
超生理学的濃度のＴＮＦαの存在下でホップ誘導体ＩＡＡ、ＲＩＡＡ、ＨＨＩＡＡおよびＴＨＩＡＡの脂肪細胞のアディポネクチン分泌を増加させる能力によって、脂肪細胞の機能が最適状態に及ばない炎症性の症状の予防または治療におけるこれらの化合物の有用性が支持される。
【０３１１】
実施例２３
３Ｔ３―Ｌ１脂肪細胞モデルにおける脂質生成の増加についての植物のスクリーニング
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。使用された標準的化学物質および統計手順は、実施例１０で説明された通りであった。
【０３１２】
試験材料：テストされた植物産物は表１８に記載される。
細胞培養および処置：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に試験材料を溶解し、次いで添加して分化のＤａｙ０に５０μｇ／ｍＬの濃度を達成し、成熟期（Ｄａｙ６または７）にわたって維持した。陽性対照として、インドメタシンおよびトログリタゾンをそれぞれ添加して５．０μｇ／ｍＬおよび４．４μｇ／ｍＬの終濃度を達成した。分化した、Ｄａｙ６／Ｄａｙ７の３Ｔ３−Ｌ１細胞を、０．３６％のオイルレッドＯまたは０．００１％のBODIPYで染色した。
【０３１３】
統計計算および解釈：試験材料およびインドメタシンを少なくとも３回繰り返してアッセイした。溶媒およびトログリタゾン対照についても、８回繰り返した。非極性の脂質の組込みについては、溶媒対照中の完全に分化した細胞の非極性の脂質の蓄積と比較して示した。陽性反応は、溶媒対照のそれぞれの９５％信頼区間の上限値（片側、Excel；Microsoft、レドモンド、ワシントン州）を超えるオイルレッドＯまたはＢＯＤＩＰＹ染色によって評価された脂質蓄積の増加として定義された。
【０３１４】
【表１８】
2009518429.tif 000020
【０３１５】
結果：陽性の対照トログリタゾンおよびインドメタシンは、非極性の脂質の組込みをそれぞれ溶媒対照よりも４３％および３３％増加させた。全ての試験植物産物はまた、５０μｇ／ｍＬまたは２５μｇ／ｍＬのスクリーニング濃度で非極性の脂質の組込みを有意に増加させた。対照の２４５％であるインドセンダンは試験材料の中で最も活性であり、次いで両者とも対照の２２６％であるアロエベラおよびオレオレジンフェンネルが続いた。興味深いことには、アセンヤクノキおよび茶試料は両方とも推定上の活性成分としてフラバンを含有するが、１６６％の溶媒対照におけるアセンヤクノキ試料は、１３３％における茶フラバン試料よりトリグリセリドの組込みの増加に効力があった（表１９）。
【０３１６】
【表１９】
2009518429.tif 000021
【０３１７】
３Ｔ３−Ｌ１モデルで認められたトリグリセリドの組込みの増加は、インスリン感受性を増大させる試験材料の可能性を示したものである。生理学上、脂肪細胞が遊離脂肪酸を血漿から引き離す際、同時に脂肪の喪失が関連の筋組織に認められた。筋組織の脂肪の喪失は、筋肉によるインスリンに対する感受性の増加をもたらす。
【０３１８】
実施例２４
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるアディポネクチン分泌についての植物のスクリーニング
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３１９】
細胞培養および処置：使用される細胞培養手順、標準化学物質、アディポネクチンアッセイおよび統計手順は、実施例１２で説明した通りであった。試験材料であるゲルマクレン、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ、ダバナ油、バコパモンニエラ、センテラアジアティカおよびインドセンダンは、実施例２３で説明した通りであった。５０、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍＬの試験材料での段階的な処置を、ダバナ油およびインドセンダンを除いて全ての試験材料について行った。ダバナ油は２５、１２．５、６．２５および３．１２５μｇ／ｍＬでテストされ、一方でインドセンダンにおける濃度は５０、１０、５および１μｇ／ｍＬであった。陽性対照のピオグリタゾンにおける濃度は、５．０、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬであった。
【０３２０】
結果：ＴＮＦαは、ＤＭＳＯ対照よりも約５０％アディポネクチン分泌を減少させた。ピオグリタゾンは、ＴＮＦαの存在下で、テストされた最低の投与量で４１％アディポネクチン分泌を増加させた。テストされた植物の中で、ダバナ油だけは、ＴＮＦαの存在下で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞によってアディポネクチン分泌を有意に増加させることができなかった。バコパモンニエラはこのアッセイにおいて最も活性なもので、６．２５μｇ／ｍＬにおいてＴＮＦα対照よりアディポネクチン分泌を２２％増加させた（表２０）。
【０３２１】
【表２０】
2009518429.tif 000022
【０３２２】
超生理学的濃度のＴＮＦαの存在下でゲルマクレン、ヨーロッパキイチゴ種子油、ワサビ粉末、バコパモンニエラ、センテラアジアティカおよびインドセンダン葉の抽出物の脂肪細胞アディポネクチン分泌を増加させる能力によって、脂肪細胞の機能が最適状態に及ばない炎症性の症状の予防または治療におけるこれらの植物の抽出物および化合物の有用性が支持される。
【０３２３】
実施例２５
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂質生成およびアディポネクチン分泌を変えるホップ誘導体とのアセンヤクノキ調製物の相乗的相互作用
モデル：この実験において、実施例１０および１２で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３２４】
試験化学物質および処置：使用される標準化学物質は、実施例１０または１２で説明した通りであった。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞には、脂質生成指数を計算するための実施例１０のように分化の前に処置をするか、もしくはアディポネクチン指数を評価するための実施例１２で説明したようにＴＮＦαで処置をした。実施例１３にて説明したようなアセンヤクノキ試料番号５６６９は、実施例２３にて説明したようにホップ誘導体Ｒｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸と共に使用された。アセンヤクノキならびにアカシア：ＲＩＡＡおよびアカシア：ＩＡＡの５：１および１０：１の併用は、５０、１０、５．０および１．０μｇ／ｍＬでテストされた。ＲＩＡＡおよびＩＡＡを５．０、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬで独立してテストした。
【０３２５】
算出：アカシア／ホップの併用の脂質生成反応およびアディポネクチン分泌の予測値の推定ならびに相乗作用の測定を実施例３３で説明されたように実施した。
結果：テストされた全ての併用は、テストされた１つ以上の濃度で脂質生成の相乗作用を示した（表２１）。アカシア：ＲＩＡＡの併用は、アカシア：ＩＡＡの併用よりも一般に活性であり、アカシア：ＲＩＡＡ［５：１］は全ての投与量で相乗作用を示し、アカシア：ＲＩＡＡ［１０：１］は１０μｇ／ｍＬおよび５．０μｇ／ｍＬで相乗的であり、かつテストされたいずれの濃度でも拮抗的でなかった。アカシア：ＩＡＡ［１０：１］の併用もまた、２つの中投与量で相乗的で、かつ拮抗作用を示さなかった。アカシア：ＩＡＡ［５：１］は、５０μｇ／ｍＬの濃度で相乗的であったが、５．０μｇ／ｍＬの投与量で拮抗的であった。
【０３２６】
同様に、全ての併用は、テストされた１つ以上の濃度におけるアディポネクチン分泌の増加に対して相乗作用を示した（表２２）。アカシア：ＩＡＡ［１０：１］は全ての投与量で相乗作用を示したが、一方でアカシア：ＲＩＡＡ［５：１］およびアカシア：ＲＩＡＡ［１０：１］は、３つの投与量で相乗的で、かつ１つの濃度で拮抗的であった。アカシア：ＩＡＡ［５：１］の併用は、１．０μｇ／ｍＬで相乗的で、より高い１０μｇ／ｍＬで拮抗的であった。
【０３２７】
【表２１】
2009518429.tif 000023
【０３２８】
【表２２】
2009518429.tif 000024
【０３２９】
アセンヤクノキおよびホップ誘導体（Ｒｈｏイソアルファ酸またはイソアルファ酸）の併用は、脂肪細胞における脂質の組込みの増加および脂肪細胞からのアディポネクチン分泌の増加に対して、相乗的な併用と、ごくわずかの拮抗的な併用とを示す。
【０３３０】
実施例２６
リポポリサッカライド／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるホップ誘導体の抗炎症作用
モデル：この実験において、実施例１０および１２で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３３１】
試験化学物質および処置：しかし、標準化学物質は実施例１０および１２に説明した通りであったが、１００ｎｇ／ｍＬの細菌性リポポリサッカライド（ＬＰＳ、Sigma社、セントルイス、ミズーリ州）をＤａｙ５にＴＮＦαの代わりに用いた。使用されたホップ誘導体であるＲｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸は、実施例１９で説明した通りであった。非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であるアスピリン、サリチル酸およびイブプロフェンは、Sigma社から入手した。市販のカプセル製剤であるセレコキシブ（Celebrex（登録商標）、G.D. Searle社、シカゴ、イリノイ州）を使用して、活性成分の含有量に基づいて細胞を処置した。ホップ誘導体、イブプロフェンおよびセレコキシブは、５．００、２．５０、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬで処置された。インドメタシン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンは、１０、５．０、１．０および０．５０μｇ／ｍＬでテストされた。アスピリンについての濃度は、１００、５０．０、２５．０および１２．５μｇ／ｍＬであったが、一方でサリチル酸については２００、１００、５０．０および２５．０μｇ／ｍＬであった。ＩＬ−６およびアディポネクチンをアッセイし、次いでＩＬ−６については実施例１７で、アディポネクチンについては実施例１２で既に述べたようにデータを解析して表にした。
【０３３２】
結果：ＬＰＳによって、Ｄａｙ５の脂肪細胞においてＩＬ−６の１２倍の刺激が得られた。全ての検査薬によって、ＬＰＳで刺激された脂肪細胞によりＩＬ−６分泌は様々な程度に減少した。ＩＬ−６の最大阻害およびその最大阻害が認められる濃度は、表２３Ａに示される。処置の中の分散が相対的に大きいため、ＩＬ−６の最大阻害の程度は試験材料の中で異ならなかった。しかし、最大阻害が認められる投与量はかなり異なった。ＩＬ−６阻害の効能の順位としては、イブプロフェン＞ＲＩＡＡ＝ＩＡＡ＞セレコキシブ＞ピオグリタゾン＝インドメタシン＞トログリタゾン＞アスピリン＞サリチル酸であった。質的な基準において、インドメタシン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、イブプロフェンおよびセレコキシブは、テストされた全ての濃度でＩＬ−６分泌を阻害したが、一方でＲＩＡＡ、ＩＡＡおよびアスピリンは最低濃度（データは示されない）でＩＬ−６を有意に阻害しなかった。
【０３３３】
Ｄａｙ５の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＬＰＳでの処置は、ＤＭＳＯ対照よりアディポネクチン分泌を減少させた（表２３Ｂ）。全ての試験化合物によってある程度分泌が阻害されたＩＬ−６阻害と異なり、アスピリン、サリチル酸およびセレコキシブは、テストされた投与量のいずれにおいてもＬＰＳで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌を誘導することができなかった。０．６２５μｇ／ｍＬのトログリタゾン、ＲＩＡＡ、ＩＡＡおよびイブプロフェンについて、それぞれ１５、１７、２０および２２％の最大のアディポネクチン刺激が認められた。効能の順番として次にくるのは、１．２５μｇ／ｍＬで１２％のアディポネクチン刺激であるピオグリタゾンであった。インドメタシンは、２．５０μｇ／ｍＬにおいてアディポネクチン分泌の９％の刺激であって、活性試験材料の中で最低の効能であった。
【０３３４】
ＬＰＳ／３Ｔ３−Ｌ１モデルにおいて、ホップ誘導体であるＲＩＡＡおよびＩＡＡならびにイブプロフェンは、インビボで得られる可能性のある濃度でＩＬ−６分泌を減少させ、かつアディポネクチン分泌を増加させた。チアゾリジンジオンであるトログリタゾンおよびピオグリタゾンは、ホップ誘導体より高い投与量を必要とするＩＬ−６分泌の阻害剤としては効力がより低かったが、アディポネクチン刺激に関してはホップ誘導体と同様であった。ＮＳＡＩＤであるインドメタシン、アスピリン、イブプロフェンおよびセレコキシブについては、マクロファージモデルと脂肪細胞モデルと間に抗炎症作用の整合的な関係は認められなかった。
【０３３５】
【表２３】
2009518429.tif 000025
【０３３６】
【表２４】
2009518429.tif 000026
【０３３７】
実施例２７
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける血糖降下植物と併用するホップ誘導体による脂質生成のインビトロの相乗作用
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。使用された標準的化学物質および統計手順は、それぞれ実施例１０および３３で説明した通りであった。
【０３３８】
試験材料および処置： Sabinsa社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）からクルクミンを入手した。テストされた血糖降下植物産物は、実施例１６の表１２で説明された通りであった。使用されたＲｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸は、実施例１９で説明された通りであった。植物産物は、個別に５０、１０、５．０および１．０μｇ／ｍＬでテストされ、次いで同じ濃度でＲＩＡＡまたはＩＡＡと５：１で併用した。ＲＩＡＡおよびＩＡＡは、実施例３３で説明されたように、脂質生成指数の予測値の算出のために５．０、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬで独立してテストされた。
【０３３９】
結果：ＲＩＡＡおよびＩＡＡは両方とも、テストされた血糖降下植物の内の４種全てと相乗作用を示した（表２４）。苦瓜：ＲＩＡＡおよびＩＡＡの混合物は、テストされた４つの濃度の内の３つで相乗的であった。ホップ誘導体においては、ＲＩＡＡが最低投与量で無効であり、かつ苦瓜：ＩＡＡの併用がテストされた最高濃度で相乗的ではないという点で苦瓜との相乗作用がなくなる投与量が異なっていた。アロエベラ：ホップの併用においていくらか類似の反応が認められ、そこにおいては、アロエベラ：ＲＩＡＡの併用が５．０のμｇ／ｍＬにおいても効果を示さなかったという点のみが異なっていた。インドセンダン：ＲＩＡＡの併用は、１つの濃度（１０μｇ／ｍＬ）で相乗的であり、インドセンダン：ＩＡＡの併用によって、４つの投与量の内の３つで脂質生成が相助作用的に増加した。クルクミン：ＲＩＡＡの混合物は２つの最低投与量で相乗作用を示したが、一方でクルクミン：ＩＡＡの併用は３つの投与量で相乗的であり、かつ最高濃度で強く拮抗的であった。
【０３４０】
苦瓜、アロエベラ、インドセンダンまたはクルクミンとのＲＩＡＡまたはＩＡＡの併用によって、クルクミン：ＩＡＡの混合物の最高濃度のみで認められた拮抗作用を伴う濃度の範囲にわたってインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂質生成が相乗的に増加することが示された。
【０３４１】
【表２５】
2009518429.tif 000027
【０３４２】
実施例２８
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける植物と併用するＲｈｏイソアルファ酸による脂質生成のインビトロの相乗作用
モデル：この実験において、実施例１０および１２で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３４３】
試験化学物質および処置：使用された標準的化学物質は、実施例１で説明された通りであった。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、脂質生成指数を計算するための実施例１０のように分化前に処置された。実施例２４の表１８で説明したように、植物試料は、実施例１９で説明したようなホップ誘導体であるＲｈｏイソアルファ酸と併用された。植物試料であるＲＩＡＡおよび植物：ＲＩＡＡの５：１の併用は、５０、１０、５．０および１．０μｇ／ｍＬでテストされた。ＲＩＡＡは、実施例３３で説明したような脂質生成指数の予測値の算出のために、５．０、２．５、１．２５および０．６２５μｇ／ｍＬで独立してテストされた。
【０３４４】
結果：ＲＩＡＡと各々の植物との併用による相乗作用の結果、トリグリセリドの含有量が増加した。相乗作用は、ワサビの全ての投与量、センテラアジアティカの３つの低用量、ゲルマクレンおよびヨーロッパキイチゴ種子油の２つの高用量、ならびにオレオレジンフェンネルの最高の投与量のみにおいて示された（表２５）。
【０３４５】
ホップ誘導体と植物との間の相乗作用は、広範囲にわたる投与量において認められ、それを用いてインスリンを活性化させる植物の効能を増大させることが可能であった。
【０３４６】
【表２６】
2009518429.tif 000028
【０３４７】
実施例２９
ＴＮＦα／３Ｔ３−１モデルにおけるクルクミンまたはキサントフモールと併用するアセンヤクノキまたはホップ誘導体の相乗作用
モデル：この実験において、実施例１０および１２で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３４８】
試験化学物質および処置：使用された標準的化学物質は、実施例１０および１２に示した通りであった。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、アディポネクチン指数を評価するための実施例１２で説明したようにＴＮＦαによって刺激された。実施例１３にて説明したようなアセンヤクノキ試料番号５６６９、実施例１９にて説明したようなホップ誘導体（Ｒｈｏイソアルファ酸およびキサントフモール）および実施例２７にて説明したようなクルクミンをこの実験で用いた。アセンヤクノキおよびアカシア：クルクミンの５：１の併用およびアカシア：キサントフモールは、５０、１０、５．０および１．０μｇ／ｍＬでテストされた。ＲＩＡＡならびにクルクミンおよびＸＮとの１：１の併用は、１０、５、１．０および０．５０μｇ／ｍＬでテストされた。
【０３４９】
算出：その併用のアディポネクチン指数の予測値の推定と、相乗作用の測定とを、実施例３３で説明したように実施した。
結果：ＴＮＦαによって、アディポネクチン分泌は、溶媒対照のみの場合の約５０％に減少した。陽性対照のピオグリタゾンによって、アディポネクチン分泌は８０％増加した（表２６）。クルクミンまたはＸＮとのアカシアの併用は、より高い濃度で拮抗的で、より低い濃度で相乗的であることが判明した。同様に、ＲＩＡＡおよびクルクミンは、３つの高用量で拮抗的であったが、最低投与量の１．０μｇ／ｍＬで非常に相乗的であった。２種のホップ誘導体であるＲＩＡＡおよびＸＮは、ＴＮＦαで刺激された３Ｔ３−Ｌ１細胞からのアディポネクチン分泌において相乗作用を示さなかった。
【０３５０】
ＴＮＦαで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においては、アカシアおよびＲＩＡＡの両方がアディポネクチン分泌を相助作用的に増加させるが、一方でアカシアのみがＸＮと相乗作用を示した。
【０３５１】
【表２７】
2009518429.tif 000029
【０３５２】
実施例３０
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおける植物と併用するアセンヤクノキによる脂質生成のインビトロの相乗作用
モデル：この実験において、実施例１０および１２で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３５３】
試験化学物質および処置：使用された標準的化学物質は、実施例１０に示した通りであった。脂質生成指数を計算するための実施例１０のように分化前に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処置した。実施例２４の表１８で説明したような植物試料を、実施例１３で説明したようにアセンヤクノキ試料番号５６６９と併用した。植物試料、アセンヤクノキおよび植物学：アセンヤクノキの１：１の併用を、５０、１０および５．０μｇ／ｍＬでテストした。また、植物試料およびアセンヤクノキを、実施例１３で説明したような脂質生成指数の予測値の算出のためにも５０、１０および５．０μｇ／ｍＬで独立してテストした。
【０３５４】
結果：アセンヤクノキは、ゲルマクレンおよびセンテラアジアティカのいずれかとの併用でトリグリセリドの含有量を相乗作用的に増加させた。相乗作用は、全ての投与量で示された（表２７）。
【０３５５】
アセンヤクノキと植物との間の相乗作用は、広範囲にわたる投与量において認められ、それを用いてインスリンを活性化させる植物の効能を増大させることが可能であった。
【０３５６】
【表２８】
2009518429.tif 000030
【０３５７】
実施例３１
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるホップ誘導体Ｒｈｏイソアルファ酸と併用する共役リノール酸による脂質生成のインビトロの相乗作用
モデル：この実験において、実施例１０および１２で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３５８】
試験化学物質および処置：使用された標準的化学物質は、実施例１０に示した通りであった。脂質生成指数を計算するための実施例１０のように分化前に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処置した。Lipid Nutrition社（Channahon、イリノイ州)から粉末状ＣＬＡを入手し、それをc9t11 t10c12異性体の１：１の混合物として記載した。ＣＬＡおよびＣＬＡ：ＲＩＡＡの５：１の併用は、５０、１０、５．０および１．０μｇ／ｍＬでテストされた。実施例３３で説明されるような脂質生成指数の予測値の算出のために、ＲＩＡＡを１０、１．０および０．１μｇ／ｍＬでテストした。
【０３５９】
結果：ＲＩＡＡは、ＣＬＡと併用してトリグリセリドの含有量を相乗作用的に増加させた。相乗作用は、全ての投与量で示された（表２８）。
ＣＬＡとＲＩＡＡとの間の相乗作用は、広範囲にわたる投与量において認められ、それを用いてインスリンを活性化させるＣＬＡの効能を増大させることが可能であった。
【０３６０】
【表２９】
2009518429.tif 000031
【０３６１】
実施例３２
ホップ植物化学物質は、ＴＮＦαで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＮＦ−ｋＢ活性化を阻害する。
【０３６２】
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
細胞培養および処置：分化後、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を更に４０日間分化後の培地中に維持した。標準化学物質、培地ならびにホップ化合物のＲＩＡＡおよびキサントフモールは、実施例１２および１９で説明した通りであった。ホップ誘導体および陽性対照ピオグリタゾンは、２．５μｇ／ｍＬおよび５．０μｇ／ｍＬの濃度でテストされた。ＴＮＦα処置の１時間前に試験材料を添加し、ＴＮＦα処置の３および２４時間後に細胞核抽出物を調製した。
【０３６３】
ＥＬＩＳＡ：３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、分化後４０日間増殖培地中で維持された。Active Motif社（カールズバッド、カリフォルニア州）のTransAM（登録商標）NF-kBキットを変更せずに使用して核ＮＦ−ｋＢｐ６５を測定した。キットで得られたジャーカット細胞核抽出物は、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＡ（ホルボール、１２−ミリステート、１３アセテート）および０．５μＭカルシウムイオノホアＡ２３１８７を補充した培地中で回収直前に３７℃で２時間培養された細胞に由来するものであった。
【０３６４】
タンパク質アッセイ：Active Motif Fluorescent Protein Quantificantion Kitを使用して核タンパク質を定量した。
統計解析：片側のスチューデントｔ検定を用いて比較を行った。第１種の誤差の確率は見かけ上５％のレベルで設定された。
【０３６５】
結果：ＴＰＡで処置されたジャーカット細胞核抽出物は、キット試薬の十分な能力を示すＮＦ−ｋＢｐ６５の増加の予測値を示した（図２２）。Ｄａｙ４０の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαを３時間（図２２Ａ）または２４時間（図２２Ｂ）で処置することによって、核ＮＦ−ｋＢｐ６５はそれぞれ２．１倍および２．２倍増加した。期待されたように、ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾンは、ＴＮＦαの処置の３時間後または２４時間後のいずれにおいても核ＮＦ−ｋＢｐ６５の量を阻害しなかった。ＮＦ―ｋＢｐ６５の核転座は、ＴＮＦα処置の３時間後に５．０μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬのＲＩＡＡでそれぞれ９．４％および２５％阻害された。２４時間目においては、５．０／ｍＬのＲＩＡＡの処置のみがＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座の有意な（ｐ＜０．０５）阻害を示した。キサントフモールは、５．０μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬでＴＮＦα処置の３時間後にそれぞれ１５．６％および６．９％、ならびに２４時間後に１３．４％および８．０％ＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座を阻害した。
【０３６６】
ＲＩＡＡおよびキサントフモールの両方が示した、ＴＮＦαで処置された成熟インスリン抵抗性脂肪細胞におけるＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座の阻害は、小さなものではあったが、安定していた。この結果は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＮＦ−ｋＢｐ６５の核転座の阻害を示さなかったＰＰＡＲγアゴニストとは異なるものであった。
【０３６７】
実施例３３
アセンヤクノキ抽出物及びメトホルミンは、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるトリグリセリドの組込みを相乗作用的に増加させる。
【０３６８】
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。使用された全ての化学物質および手順は、実施例１０で説明した通りであった。
【０３６９】
試験化学物質および処置：メトホルミンをSigma社（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。分化のＤａｙ０、および成熟期（Ｄａｙ６／７）にわたる２日毎において、試験材料をジメチルスルホキシド中に添加した。陽性対照としてトログリタゾンを添加して４．４μｇ／ｍＬの終濃度を達成した。メトホルミン、アセンヤクノキ試料番号５６６９および１：１のメトホルミン／アカシアの併用は、５０μｇ／ｍＬの試験材料でテストされた。分化３Ｔ３−Ｌ１細胞を０．２％のオイルレッドＯで染色した。その結果生じた染色油液滴をイソプロパノールで溶解し、次いで５３０ｎｍの吸光光度法により定量した。結果は、溶媒対照における完全に分化した細胞の相対的なトリグリセリド含有量として表された。
【０３７０】
算出：メトホルミン／アセンヤクノキ抽出物の脂肪生成効果の予測値の推定は、１／ＬＩ＝Ｘ／ＬＩｘ＋Ｙ／ＬＩｙの関係を用いて行われ、ここでＬＩ＝脂質生成指数、ＸおよびＹは試験混合物における各成分の相対的分画物、およびＸ＋Ｙ＝１であった。推定されたＬＩの平均が、認められた対応分画物の推定値の９５％信頼区間の外にある場合、相乗作用が推定された。併用の効果とその成分の各々の効果との比較を伴う相乗作用の定義は、Berenbaumによって説明された［Berenbaum, M. C. What is synergy? Pharmacol Rev 41(2), 93-141, (1989)］。
【０３７１】
結果：アセンヤクノキ抽出物は非常に脂質生成的であり、それによって、１．３２の脂質生成指数が得られる３２パーセント（図２３）の３Ｔ３−Ｌ１細胞のトリグリセリド含有量の増加がもたらされる。０．７９の脂質生成指数においては、メトホルミン単独は脂質生成的ではなかった。メトホルミン／アセンヤクノキ抽出物の併用においては、脂質生成指数の実測値が１．３５であることが示された。脂質生成指数の予測値が９８である場合、脂質生成指数の実測値が９５％信頼限界の上限値の２％外にある際にはメトホルミン／アセンヤクノキ抽出物は相乗作用を示した。
【０３７２】
３Ｔ３−Ｌ１細胞において示された脂質生成の可能性に基づけば、メトホルミンおよびアセンヤクノキ抽出物の１：１の併用は、臨床用途において相乗作用的に機能するものと考えられるであろう。このような併用は、血漿トリグリセリドの減少やメトホルミンの有効期間の延長等の、メトホルミンによる治療の好ましい利益の範囲の拡大に有用であろう。
【０３７３】
実施例３４
インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるホップ誘導体およびチアゾリジンジオンによる脂質生成のインビトロの相乗作用
モデル：この実験において、実施例１０および１２で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。
【０３７４】
試験化学物質および処置：使用された標準的化学物質は、実施例１０に示した通りであった。脂質生成指数を計算するための実施例１０のように分化前に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を処置した。Cayman Chemicals社（シカゴ、イリノイ州）からトログリタゾンを入手した。ピオグリタゾンは、市販の錠剤製剤（ACTOSER、Takeda Pharmaceuticals、リンカンシア、イリノイ州）として入手された。その錠剤は破砕され、全ての粉末がアッセイに使用された。全ての結果は、活性成分の含有量に基づいて計算された。使用されたホップ誘導体のＲｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸は、実施例１９で説明した通りであった。ＲＩＡＡおよびＩＡＡと併用したトログリタゾンは、４．０μｇ／ｍＬでテストされ、一方でより効力のあるピオグリタゾンは、ＲＩＡＡおよびＩＡＡとの１：１の併用で２．５μｇ／ｍＬでテストされた。実施例３３で説明したような脂質生成指数の予測値の算出のために、全ての材料も独立して４．０μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬでテストした。
【０３７５】
結果：それぞれトログリタゾンまたはピオグリタゾンと４．０μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬでテストされた際、Ｒｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸の両方は、インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおいてチアゾリジンジオンと相乗作用を引き起こしてトリグリセリド合成を増大させた（表２９）。
【０３７６】
ホップ誘導体のＲｈｏイソアルファ酸およびイソアルファ酸は、チアゾリジンジオンのインスリン感作効果を相乗作用的に増大させることができ、それによって、投与量の減少や順調に応答する患者数の増加といった臨床的な利益がもたらされた。
【０３７７】
【表３０】
2009518429.tif 000032
【０３７８】
実施例３５
ＴＮＦα／３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞モデルにおけるＲｈｏイソアルファ酸およびメトホルミンのインビトロの相乗作用
モデル：この実験において、実施例１０で説明したような３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いた。使用された標準的化学物質および脂肪細胞の１０ｎｇのＴＮＦα／ｍＬでの処置は、それぞれ実施例１０および１２に示した通りであった。
【０３７９】
試験材料および細胞への処置：Sigma社（セントルイス、ミズーリ州）からメトホルミンを入手し、Ｒｈｏイソアルファ酸は実施例１９で説明した通りであった。Ｄａｙ５の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に、１μｇ／ｍＬのＲＩＡＡを伴うまたは伴わない５０、１０、５．０または１．０μｇ／ｍＬのメトホルミンを１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαと併用して添加した。実施例１７において詳述されるように、ＩＬ−６について培養上澄み培地をＤａｙ６にアッセイした。ＩＬ−６の阻害に対するメトホルミン：ＲＩＡＡ混合物の作用の予測値の推定は、実施例３３で前述したように実施された。
【０３８０】
結果：ＴＮＦαによって、Ｄａｙ５の脂肪細胞のＩＬ−６分泌は６倍増加した。１μｇ／ｍＬのトログリタゾンは、対照よりも３４％ＩＬ―６分泌を阻害したが、一方で１μｇのＲＩＡＡは対照よりも２４％ＩＬ―６分泌を阻害した（表３０）。１μｇ／ｍＬのＲＩＡＡと併用するメトホルミンは、５０μｇ／ｍＬの濃度で相乗作用を示し、１μｇ／ｍＬの濃度で強い相乗作用を示した。５０μｇ／ｍＬのメトホルミンにおいて、１μｇのＲＩＡＡは混合物において更に１０％の阻害をもたらしたが；一方で１μｇのメトホルミンでは、１μｇのＲＩＡＡはＩＬ−６阻害を３５％増加させた。拮抗作用および作用なしは、それぞれ２つの中投与量におけるメトホルミン：ＲＩＡＡの併用で認められた。
【０３８１】
メトホルミン及びＲｈｏイソアルファ酸の併用は、高濃度および低濃度で相乗作用的に機能してＴＮＦαで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのＩＬ−６分泌を減少させた。
【０３８２】
【表３１】
2009518429.tif 000033
【０３８３】
実施例３６
ＫＫ−Ａｙマウス糖尿病モデルにおけるアラビアゴムモドキおよびホップ誘導体のインビボの血糖降下作用
モデル：平均４０±５グラムの雄性、９週齢のＫＫ−Ａｙ／Ｔａマウスを用いて、空腹時血清グルコースまたはインスリン濃度を低下させる試験材料の可能性を評価した。このマウス株は、１９４０年代に糖尿病のモデルとして発育されたＫＫ株とＡｙ／ａ遺伝子型の株との間のハイブリダイゼーションの所産である。まだ完全に特徴を記述されていないポリジーン突然変異の所産である表現型が認められているが、少なくとも４つの量的形質遺伝子座が同定されている。これらのうちの１つは、レプチン受容体のミスセンス突然変異に関連づけられる。この突然変異にもかかわらず、その受容体は機能を保つが、それは完全には有効でないかもしれない。ＫＫ株によって、インスリンに対する非感受性および耐糖能低下と関連した糖尿病が発現するが、明らかな高血糖は発現しない。Ａｙ突然変異の導入は肥満および高血糖を誘発する。Ａｙ突然変異は、アグーチの遺伝子座に対して５’位に位置するＲａｌｙ遺伝子の１７０ｋｂの欠失であり、Ｒａｌｙプロモーターによってアグーチについての対照が配置される。同型接合の動物は移植前に死ぬ。
【０３８４】
試験材料：実施例１３で説明したようなアラビアゴムモドキ試料番号５６５９ならびに実施例１９にて説明したようなホップ誘導体のＲｈｏイソアルファ酸、イソアルファ酸およびキサントフモールを使用した。アラビアゴムモドキ、ＲＩＡＡおよびＩＡＡを１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与し、一方でＸＮを２０ｍｇ／ｋｇで投与した。更に、ＲＩＡＡ、ＩＡＡおよびＸＮとのアラビアゴムモドキの５：１および１０：１の併用は、１００ｍｇ／ｋｇ／日で調製されて投与された。
【０３８５】
試験手順：試験材料を０．２％のTween-80中における強制飼養によって１群につき５匹の動物に毎日投与した。初回投与前ならびに３回目の投与および最終投与の９０分後に後眼窩洞（retroorbital sinus）から血清を採集した。食後の血清グルコースはムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法によって酵素により測定され、血清インスリンはマウスに特異的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定された。
【０３８６】
データ分析：対照と比較して試験材料が血清グルコースとインスリンのいずれを低下させたのかを評価するために、最初に、各マウスについての投与前の率としての投与前濃度に対して投与後のグルコース値およびインスリン値を正規化した。投与前の率についての臨界値（対照マウスに対する片側、９５％信頼区間の下限値）は、グルコースおよびインスリンの変数の両方について計算された。試験材料の投与前の率の各値は、対照の臨界値と比較された。対照の臨界値より低かった試験材料の投与前の率の値は、対照と有意に異なる（ｐ＜０．０５）と判断された。
【０３８７】
結果：３日間の処理期間中、対照マウスにおいては、食後の血清グルコースは２．６％上昇したが、一方で血清インスリンは６．７％低下した。ロシグリタゾン、アラビアゴムモドキ、ＸＮ：アカシア［１：５］、ＸＮ：アカシア［１：１０］、アカシア：ＲＩＡＡ［５：１］、キサントフモール、アカシア：ＩＡＡ［５：１］、異性化アルファ酸およびＲｈｏイソアルファ酸は全て、対照よりも食後の血清グルコースを低下させたが、血清インスリンには作用しなかった。アカシア：ＲＩＡＡ［１０：１］およびアカシア：ＩＡＡ［１０：１］は、血清グルコースとインスリンのいずれにも作用しなかった（表３１）。
【０３８８】
２型糖尿病のＫＫ−Ａｙマウスモデルにおけるアラビアゴムモドキ試料番号５６５９、キサントフモール、異性化アルファ酸、Ｒｈｏイソアルファ酸およびそれらの各種併用の急速な血糖低下作用によって、高血糖に関連したヒトの疾患の治療における臨床的な有効性のそれらの可能性が支持される。
【０３８９】
【表３２】
2009518429.tif 000034
【０３９０】
実施例３７
糖尿病のｄＢ／ｄＢマウスモデルにおけるアラビアゴムモドキおよびホップ誘導体のインビボの相乗作用
モデル：雄性、C57BLKS/J m+/m+ Leprdb (db/db)マウスを用いて空腹時血清グルコースまたはインスリン濃度を低下させる試験材料の可能性を評価した。マウスのこの株は、機能するレプチン受容体が欠如しているためレプチンに抵抗性がある。血漿インスリンの上昇は１０〜１４日で開始し、血糖値の上昇は４〜８週で開始した。テスト時（９週）に、動物は顕著に５０±５ｇ肥満となり、膵島肥大の所見を示した。
【０３９１】
試験材料：陽性対照のメトホルミンおよびロシグリタゾンは、連続した３日間の各々においてそれぞれ３００ｍｇ／ｋｇ−日および１．０ｍｇ／ｋｇ−日で投与された。アラビアゴムモドキ試料番号５６５９、ホップ誘導体およびそれらの併用は、実施例３６で説明したように投与された。
【０３９２】
試験手順：試験材料を０．２％のTween-80中における強制飼養によって毎日投与した。初回投与前ならびに３回目の投与および最終投与の９０分後に後眼窩洞から血清を採集した。食後の血清グルコースはムタロターゼ／グルコースオキシダーゼ法によって酵素により測定され、血清インスリンはマウスに特異的なＥＬＩＳＡによって測定された。
【０３９３】
結果：陽性対照のメトホルミンおよびロシグリタゾンは、対照よりも血清グルコース濃度およびインスリン濃度の両方を低下させた（表３２）。ＲＩＡＡおよびＸＮだけが、単独の試験材料としての許容し得る結果を示した。ＲＩＡＡは血清インスリンを低下させたが、一方でＸＮは血清グルコースを低下させたがインスリンに対しては作用しなかった。アカシア：ＲＩＡＡ［５：１］は、血清インスリン濃度の低下についてテストされた最も有効な剤であり、それは、ビグアナイド・メトホルミンによる血清インスリンレベルの１７％の低下やチアゾリジンジオン・ロシグリタゾンによる血清インスリンレベルの１５％パーセントの低下に対して、インスリン濃度を２１％低下させた。このアカシア：ＲＩＡＡ［５：１］の併用の反応は、いずれの個々の成分の反応よりも大きく、従って相乗作用の可能性を示した。アラビアゴムモドキ単独は、血清グルコースとインスリンのいずれも低下させることはできなかったが、一方でＲＩＡＡはメトホルミンと同程度に血清インスリンを低下させた。残りの試験材料の中では、アカシア：ＩＡＡ［１０：１］の併用も血清インスリン濃度の低下に効果的であった。
【０３９４】
２型糖尿病のｄＢ／ｄＢマウスモデルにおけるＲｈｏイソアルファ酸による血清インスリンの急速な低下、およびキサントフモールによる血清グルコースの低下によって、インスリン非感受性および高血糖に関連したヒトの疾患の治療における臨床的な有効性のそれらの可能性が支持される。更に、Ｒｈｏイソアルファ酸およびアセンヤクノキの５：１の併用は、ｄＢ／ｄＢマウス糖尿病モデルにおいて相乗的であると思われた。糖尿病の２つの独立した動物モデルおよび３つのインビトロモデルにおけるＲｈｏイソアルファ酸、キサントフモールおよびアカシア：ＲＩＡＡ［５：１］製剤によって示された良い反応によって、血清グルコースの低下またはインスリン感受性の促進を必要とする臨床状況において有用である可能性が支持される。
【０３９５】
【表３３】
2009518429.tif 000035
【０３９６】
これで本発明を完全に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく多くの変更および改変がそれに対して可能であることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３９７】
【図１】エネルギー・ホメオスタシス、インスリン感受性および血管のホメオスタシスにかかわる脂肪分泌因子の有益効果および有害効果を示す。（出典：Guerre-Millo, M. Adipose tissue and adipokines: for better or worse. Diabetes Metabolism 30:13-19, (2004)）。
【図２】脂肪組織内のアディポネクチンのアップレギュレーション（上向きの矢印）またはダウンレギュレーション（下向きの矢印）につながる最も重要な因子および疾病状態の要旨。（Trujillo, M.EおよびScherer, P.E. Adiponectin - journey from an adipocyte secretory protein to biomarker of the metabolic syndrome. Journal of Internal Medicine 257:167-175, (2005)を改作）。
【図３】代謝症候群の病態生理学的要素の関係についての概略図。
【図４】ＣＯＸ−２発現のＬＰＳ刺激の前（白色の棒）または試験材料添加前に一晩行ったＬＰＳ刺激の後（灰色の棒）に添加される場合のＰＧＥ２生合成のＲＩＡＡ［パネルＡ］およびＩＡＡ［パネルＢ］の用量に関連する阻害を示す。
【図５】ＲＡＷ細胞において解析されたＬＰＳ誘導によるＣＯＸ−２が介在するＰＧＥ２産生におけるセレコキシブ［パネルＡ］およびＭｇＲＩＡＡ［パネルＢ］の直接的な酵素阻害の図解。ＰＧＥ２は、ｐｇ／ｍＬで測定および表現された。誤差棒は、標準偏差（ｎ＝８）を表す。
【図６】ＣＯＸ−２タンパク質発現のウエスタンブロット検出を提供する。ＲＡＷ２６４．７細胞は、指示された時間、ＬＰＳによって活性化された。その後、細胞抽出物全体がウエスタンブロットによって視覚化された［パネルＡ］。ＣＯＸ−２およびＧＡＰＤＨのバンドのデンシトメトリーを実施した。グラフ［パネルＢ］は、ＧＡＰＤＨに対するＣＯＸ−２の比率を表す。
【図７】ｉＮＯＳタンパク質発現のウエスタンブロット検出を提供する。ＲＡＷ２６４．７細胞は、指示された時間、ＬＰＳによって活性化された。その後、細胞抽出物全体がウエスタンブロットによって視覚化された［パネルＡ］。ｉＮＯＳおよびＧＡＰＤＨのバンドのデンシトメトリーを実施した。グラフ［パネルＢ］は、ＧＡＰＤＨに対するｉＮＯＳの比率を表す。
【図８】９６ウェルフォーマットを使用するＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ−κＢキットの典型的な概略図。プレートに結合したオリゴヌクレオチドは、ＮＦ−κＢに対するコンセンサス結合部位を含む。一次抗体によって、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットが検出された。
【図９】ＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ−κＢキットによって測定されるＮＦ−κＢの典型的な結合活性を提供する。ＤＮＡ結合の割合は、ＬＰＳ対照（１００％）と比較して算出された。誤差棒は、標準偏差（ｎ＝２）を表す。実施例のセクションに記載したように、ＲＡＷ２６４．７細胞を試験化合物およびＬＰＳで４時間処置した。
【図１０】脂肪細胞を発育および成熟させる際にアカシアの試料番号４９０９の抽出物の脂質生成効果を評価するための典型的な試験手順の概略図。３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いて脂肪細胞の脂肪生成に対する試験化合物の潜在的影響を検討した。
【図１１】溶媒対照を基準とした、アカシア試料番号４９０９の抽出物あるいは陽性対照（インドメタシンおよびトログリタゾン）で処置した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の非極性の脂質の含有量を表すグラフ。誤差棒は９５％の信頼限界（片側）を表す。
【図１２】インスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌の際のアカシア試料番号４９０９の水抽出液のジメチルスルホキシド可溶性分画物の効果を評価するための典型的な試験手順の概略図。
【図１３】３つの用量のトログリタゾンならびにアカシア試料番号４９０９の水抽出液のジメチルスルホキシド可溶性分画物の４つの用量のによって２４時間誘発させたインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞による最大のアディポネクチン分泌を表す典型的な棒グラフ。示される値は、溶媒対照を基準とする割合であり；誤差棒は９５％信頼区間を表す。
【図１４】試験材料と１０ｎｇ、２ｎｇまたは０．５ｎｇのＴＮＦα／ｍＬで処置した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌の際のアカシア試料番号４９０９の水抽出液のジメチルスルホキシド可溶性分画物の効果を評価するための典型的なテストプロトコルの概略図。
【図１５】インドメタシンまたはアカシア試料番号４９０９抽出物によって誘発されるＴＮＦαで処置された成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞によるアディポネクチン分泌を示す典型的な棒グラフ。示される値は、溶媒対照を基準とした割合であり；誤差棒は９５％信頼区間を表す。＊ＴＮＦαの単独処置から有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【図１６】種々の市販の原料に由来するアセンヤクノキおよびアラビアゴムモドキの各種組成物によるインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のトリグリセリド含有量の相対的増加を視覚的に図示する。示される値は、溶媒対照を基準とした割合であり；誤差棒は９５％信頼区間を表す。
【図１７】アセンヤクノキの各種抽出物によって誘発された最大の相対的アディポネクチン分泌の図を視覚的に表す。示される値は、溶媒対照を基準とした割合であり；誤差棒は９５％信頼区間を表す。
【図１８】はホップ化合物あるいは陽性対照（インドメタシンおよびトログリタゾン）で処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の溶媒対照を基準にした脂質含有量を視覚的に表す。３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞モデルを用いて脂肪細胞の脂肪生成に対する試験化合物の潜在的影響を検討した。結果は、対照細胞の非極性の脂質の相対的な含有量として表され；誤差棒は９５％信頼区間を表す。
【図１９】４つのの試験材料の用量によって２４時間誘発させたインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞による最大のアディポネクチン分泌の典型的な棒グラフ。示される値は、溶媒対照を基準とした割合であり；誤差棒は９５％信頼区間を表す。ＩＡＡ＝イソアルファ酸、ＲＩＡＡ＝Ｒｈｏイソアルファ酸、ＨＨＩＡ＝ヘキサヒドロイソアルファ酸およびＴＨＩＡＡ＝テトラヒドロイソアルファ酸。
【図２０】Ｒｈｏイソアルファ酸、イソアルファ酸、テトラヒドロイソアルファ酸、ヘキサヒドロイソアルファ酸、キサントフモール、ホップかす、ヘキサヒドロコルプロン(hexahydrocolupulone)および陽性対照のトログリタゾンについてのホフステープロット(Hofstee plots)を表す。対照溶媒を基準とした最大アディポネクチン分泌をｙ切片から推定し、一方で最大の半分のアディポネクチン分泌に必要な試験材料の濃度をその傾きの負の値から計算した。
【図２１】イソアルファ酸およびＲｈｏイソアルファ酸［パネルＡ］ならびにヘキサヒドロイソアルファ酸およびテトラヒドロイソアルファ酸［パネルＢ］によって誘発されたＴＮＦαを治療された成熟３Ｔ３−Ｌ１細胞による相対的アディポネクチン分泌を表す２つの棒グラフ。示される値は、溶媒対照を基準とした割合であり；誤差棒は９５％信頼区間を表す。＊ＴＮＦαのみの処置から有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【図２２】１０ｎｇのＴＮＦα／ｍＬの添加後３時間［パネルＡ］または２４時間［パネルＢ］のインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞内のＮＦ−ｋＢ核転座を表す。ピオグリタゾン、ＲＩＡＡおよびキサントフモールを５．０μｇ／ｍＬ（黒棒）および２．５μｇ／ｍＬ（横紋状の棒）で添加した。ジャーカット細胞核抽出物は、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＡ（ホルボール、１２−ミリステート、１３アセテート）および０．５μＭカルシウムイオノホアＡ２３１８７（ＣＩ）が補充された培地中で、採収前に２時間、３７℃で培養された細胞に由来する。
【図２３】溶媒、メトホルミンまたはアカシア試料番号５６５９の水抽出液で処置あるいはメトホルミン／アセンヤクノキ抽出物の１：１の併用で処置されたインスリン抵抗性３Ｔ３−Ｌ１細胞の相対的なトリグリセリド含有量を視覚的に示す。結果は、溶媒対照中の完全に分化した細胞の相対的なトリグリセリド含有量として示される。
【図１】
2009518429.tif 000036
【図２】
2009518429.tif 000037
【図３】
2009518429.tif 000038
【図４】
2009518429.tif 000039
【図５】
2009518429.tif 000040
【図６】
2009518429.tif 000041
【図７】
2009518429.tif 000042
【図８】
2009518429.tif 000043
【図９】
2009518429.tif 000044
【図１０】
2009518429.tif 000045
【図１１】
2009518429.tif 000046
【図１２】
2009518429.tif 000047
【図１３】
2009518429.tif 000048
【図１４】
2009518429.tif 000049
【図１５】
2009518429.tif 000050
【図１６】
2009518429.tif 000051
【図１７】
2009518429.tif 000052
【図１８】
2009518429.tif 000053
【図１９】
2009518429.tif 000054
【図２０】
2009518429.tif 000055
【図２１】
2009518429.tif 000056
【図２２】
2009518429.tif 000057
【図２３】
2009518429.tif 000058
【国際調査報告】
2009518429.tif 000059
2009518429.tif 000060
2009518429.tif 000061
2009518429.tif 000062
2009518429.tif 000063
2009518429.tif 000064
2009518429.tif 000065