(57)【要約】  本発明は、細胞性分泌プロセスを阻害又は抑制する方法を含む。より具体的には、本発明は、炎症性細胞の顆粒からの炎症性メディエーターの放出に関連する機構を阻害することにより、炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を阻害するか又は低下させることに関する。この点において、本発明は、炎症性細胞の小胞からの炎症性メディエーターの分泌を含む疾患における薬理学的介入のためのいくつかの新規の細胞内標的を例証する細胞内シグナル伝達機構を開示する。本発明において開示されるようなＭＡＮＳペプチドのペプチド断片及びその変異体はこのような方法において有用である。
2009544737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）を有するアミノ酸配列；及び
（ｃ）（ａ）で定義される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量を対象の組織及び／又は体液に投与することを含む、対象の組織及び／又は体液中の少なくとも１つの炎症性細胞における顆粒からの少なくとも１つの炎症性メディエーターの放出を阻害する方法（ここで、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、場合によっては独立に化学的に修飾され、ペプチドのＮ末端アミノ酸は、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５から２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸でのアシル化により独立に化学的に修飾されるか、又は化学的に修飾されず、ただし、そのアミノ酸配列が、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１４の不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５から２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸のみでのアシル化による参照配列の配列ＧＡＱＦで始まる場合は前記ペプチドはアシル化により修飾されるか、又は化学的に修飾されず、ここで、前記ペプチドは、医薬的に許容可能な担体と場合によっては組み合わされ、前記少なくとも１つのペプチド非存在下で起こる炎症性細胞の同じタイプの少なくとも１つからの炎症性メディエーターの放出と比較して少なくとも１つの炎症性細胞からの前記炎症性メディエーターの放出を低下させるために治療的に有効な炎症性メディエーター放出低下量である。）。
【請求項２】
前記ペプチドがαＮ末端アミノ酸においてアセチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基からなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、アセチル−ペプチド１０６（配列番号１０６）からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、少なくとも４個の連続アミノ酸残基からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、少なくとも６個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、αＮ末端アミノ酸においてミリストイル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、αＣ末端アミノ酸においてアンモニアでアミド化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、（ａ）のアミノ酸配列を含み、（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸が、参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）のアミノ酸位置２から２１から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、αＮ末端アミノ酸においてミリストイル化又はアセチル化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、αＣ末端アミノ酸においてアンモニアでアミド化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
炎症性メディエーターの放出の前記低下が、前記対象において前記炎症性細胞から炎症性メディエーターを放出する機構を遮断又は阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
医薬組成物を形成するために、前記ペプチドが、医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１から請求項１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性細胞が白血球である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記炎症性細胞が顆粒球である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症性細胞が、好中球、好塩基球、好酸球及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記炎症性細胞が、単球又はマクロファージである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記炎症性メディエーターが、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］、リゾチーム、グランザイム、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、走化因子、サイトカイン、アラキドン酸の代謝産物、デフェンシン、殺菌性透化亢進タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−硫酸、プロテイナーゼ３、ラクトフェリン、コラゲナーゼ、補体活性化因子、補体受容体、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球−走化因子、ヒスタミナーゼ、ビタミンＢ１２結合タンパク質、ゲラチナーゼ、プラスミノゲン活性化因子、β−Ｄ−グルクロニダーゼ及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記炎症性メディエーターが、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドの前記有効な炎症性メディエーター放出低下量が、ペプチドの非存在下で少なくとも１つの炎症性細胞から放出される量と比較した場合に、約１％から約９９％、少なくとも１つの炎症性細胞から放出される炎症性メディエーターの量を低下させる、ペプチドの脱顆粒阻害量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドの前記有効な炎症性メディエーター放出低下量が、ペプチドの非存在下で少なくとも１つの炎症性細胞から放出される量と比較した場合に、約５−５０％から約９９％、少なくとも１つの炎症性細胞から放出される炎症性メディエーターの量を低下させる、ペプチドの脱顆粒阻害量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が呼吸器疾患に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記呼吸器疾患が、喘息、慢性気管支炎、ＣＯＰＤ及び嚢胞性線維症からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物が、ヒト、イヌ、ウマ及びネコからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺内投与、鼻腔投与及び経口投与からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記肺内投与がエアロゾルを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記エアロゾルが、乾燥粉末吸入器、定量吸入器又は噴霧器から生成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗生物質、抗ウイルス化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症化合物及び免疫調整剤からなる群から選択される第二の分子を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、疼痛症候群及びそれらの組み合わせからなる群から選択される疾患に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記皮膚疾患が、酒さ、湿疹、乾癬及び重度にきびからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が関節炎に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一である（ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１及び２５２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドが、αＮ末端アミノ酸においてアセチル化されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドが、αＮ末端アミノ酸においてミリストイル化されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドが、αＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）を有するアミノ酸配列；及び
（ｃ）（ａ）で定義される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ペプチド（ここで、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、場合によっては独立に化学的に修飾され、ペプチドのＮ末端アミノ酸は、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５から２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸でのアシル化により独立に化学的に修飾されるか、又は化学的に修飾されず、ただし、そのアミノ酸配列が、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１４の不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５から２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸のみでのアシル化による参照配列の配列ＧＡＱＦで始まる場合は前記ペプチドはアシル化により修飾されるか、又は前記ペプチドは化学的に修飾されず、ここで、前記ペプチドは、医薬的に許容可能な担体と場合によっては組み合わされ、前記少なくとも１つのペプチド非存在下で起こる炎症性細胞の同じタイプの少なくとも１つからの炎症性メディエーターの放出と比較して少なくとも１つの炎症性細胞からの前記炎症性メディエーターの放出を低下させるために治療的に有効な炎症性メディエーター放出低下量である。）。
【請求項３９】
αＮ末端アミノ酸においてアセチル化されている、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４０】
少なくとも１０個の連続アミノ酸残基からなる、請求項３９に記載のペプチド。
【請求項４１】
アセチル−ペプチド１０６（配列番号１０６）からなる、請求項４０に記載のペプチド。
【請求項４２】
前記ペプチドが、少なくとも４個の連続アミノ酸残基からなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも６個の連続アミノ酸残基からなる、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４４】
αＮ末端アミノ酸においてミリストイル化されている、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４５】
αＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化されている、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４６】
（ａ）のアミノ酸配列を含み、（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸が、参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）のアミノ酸位置２から２１から選択される、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４７】
αＮ末端アミノ酸においてミリストイル化されている、請求項４６に記載のペプチド。
【請求項４８】
αＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化されている、請求項４６に記載のペプチド。
【請求項４９】
（ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一である（ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１及び２５２からなる群から選択される、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項５０】
前記ペプチドが、αＮ末端アミノ酸においてアセチル化されている、請求項４９に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記ペプチドが、αＮ末端アミノ酸においてミリストイル化されている、請求項４９に記載のペプチド。
【請求項５２】
前記ペプチドが、αＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化されている、請求項４９に記載のペプチド。
【請求項５３】
請求項３８から請求項５２の何れか１項に記載の単離ペプチドと賦形剤とを含む組成物。
【請求項５４】
請求項３８から請求項５２の何れか１項に記載の単離ペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項５５】
無菌であるか、滅菌可能であるか又は滅菌済みである、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
請求項３８から請求項５２の何れか１項に記載の少なくとも１つの単離ペプチドを含むキット。
【請求項５７】
前記ペプチドの前記投与が、前記対象における少なくとも１つの粘液分泌細胞又は組織からのＭＡＲＣＫＳに関連する粘液過剰分泌を低下させ、これにより、対象における過剰分泌が、前記ペプチドの前記投与がない場合に起こるものと比較して低下する、請求項１から請求項３７の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、米国仮出願第６０／８３３，２３９号明細書（２００６年７月２６日提出）（参照によりその全体を組み込む。）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、炎症の際の炎症性細胞からの炎症のメディエーターの刺激放出を減弱（抑制又は低下）させるための、ペプチド又はペプチド組成物及びその使用の方法に関する。本発明はまた、炎症性細胞からの炎症性メディエーターの分泌を制御する細胞内シグナル伝達機構を調節するための、これらのペプチド又はペプチド組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症性白血球は、細胞内で分離され、細胞質の膜結合顆粒に貯蔵される多くの炎症性メディエーターを合成する。このようなメディエーターの例には、以下に限定されないが、好中球におけるミエロペルオキシダーゼ［ＭＰＯ］（例えば、Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ、Ｃｏｗｌａｎｄ  ＪＢ．Ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７；８９：３５０３−３５２１参照）、好酸球における好酸球ペルオキシダーゼ［ＥＰＯ］及び主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］（例えば、Ｇｌｅｉｃｈ  Ｇ  Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３参照）、単球／マクロファージにおけるリゾチーム（例えば、Ｈｏｆｆ  Ｔ、Ｓｐｅｎｃｋｅｒ  Ｔ、Ｅｍｍｅｎｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ａ．、Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ  Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；及びＢａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ、Ｓａｅｚ  Ｙ、Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０参照）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞毒性リンパ球におけるグランザイム（例えば、Ｂｏｃｈａｎ  ＭＲ、Ｇｏｅｂｅｌ  ＷＳ、Ｂｒａｈｍｉ  Ｚ．Ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｔｉｃ  ａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；１６４：２３４−２３９；Ｇｏｎｇ  ＪＨ．、Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８；Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ、Ｔａｍ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３；及びＴａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０参照）が含まれる。このようなメディエーターは、損傷部位で放出��れ、肺及びその他の部位などの、炎症及び組織修復に関与する。白血球は、エキソサイトーシス機構を介してこれらの顆粒を放出することが知られている（例えば、Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ、Ｍｏｒｇａｎ  Ａ．Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２；及びＬｏｇａｎ  ＭＲ、Ｏｄｅｍｕｙｉｗａ  ＳＯ、Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２参照）が、しかし、エキソサイトーシスプロセスに関与する制御分子及び特異的経路は完全には説明されていない。
【０００４】
いくつかの外因性刺激により、タンパク質キナーゼＣの活性化及び続くリン酸化事象を含む経路を介して、白血球の脱顆粒を引き起こすことができる（例えば、Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ、Ｍｏｒｇａｎ  Ａ．Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２；Ｌｏｇａｎ  ＭＲ、Ｏｄｅｍｕｙｉｗａ  ＳＯ、Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２；Ｓｍｏｌｅｎ  ＪＥ、Ｓａｎｄｂｏｒｇ  ＲＲ．Ｃａ２＋−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａ２＋，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９０；１０５２：１３３−１４２；Ｎｉｅｓｓｅｎ  ＨＷ、Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ  ＡＪ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９４；１２２３：２６７−２７３；及びＮａｕｃｌｅｒ  Ｃ、Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ  Ｓ、Ｓｕｎｄｌｅｒ  Ｒ．、Ｔａｐｐｅｒ  Ｈ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２００２；７１：７０１−７１０参照）。
【０００５】
ＭＡＲＣＫＳタンパク質（本明細書中で使用する場合、ＭＡＲＣＫＳは「ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質」を意味する。）は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のユビキタスなリン酸化標的であり、白血球で高発現される（例えば、Ａｄｅｒｅｍ  ＡＡ、Ａｌｂｅｒｔ  ＫＡ、Ｋｅｕｍ  ＭＭ、Ｗａｎｇ  ＪＫ、Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  Ｐ、Ｃｏｈｎ  ＺＡ．Ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｔｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３６２−３６４；Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ、Ｒｏｓｅｎ  Ａ、Ｎａｉｍ  ＡＣ、Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：３２０−３２２；及びＨａｒｔｗｉｇ  ＪＨ、Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ、Ｒｏｓｅｎ  Ａ、Ｊａｎｍｅｙ  ＰＡ、Ｎａｉｍ  ＡＣ、Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．ＭＡＲＣＫＳ  ｉｓ  ａｎ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２参照。）。ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、呼吸気道に並ぶ杯細胞によるムチンのエキソサイトーシス分泌のプロセスに機構的に関与する（例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：４０９８２−４０９９０；及びＳｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４；１０：１９３−１９６参照）。ＭＡＲＣＫＳは、アミノ酸配列のＮ末端（即ち位置１）にあるグリシンのαアミノ位でのＭＡＲＣＫＳタンパク質アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸においてアミド結合を介してミリストイル化される。気道上皮細胞において、ＭＡＲＣＫＳのミリストイル化Ｎ末端領域は、分泌プロセスに不可欠であると思われる。ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端とは、ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）を含有するＭＡＮＳペプチド（これはＬ−アミノ酸である。）を意味する。さらに、本明細書中で開示されるＭＡＮＳペプチドのペプチド断片もまた好ましくはＬ−アミノ酸から構成される。この機構は、ＭＡＲＣＫＳ、ミリストイル化タンパク質の細胞内顆粒の膜への結合に関与すると思われる。
【０００６】
ＭＡＲＣＫＳのＮ末端からのＮ末端ミリストイル化ペプチドは、ムチン分泌及び杯細胞のムチン顆粒膜へのＭＡＲＣＫＳの結合の両方を阻止することが分かっている（例えば、Ｓｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４；１０：１９３−１９６参照）。このペプチドは、アミド結合を介してミリストイル化されており、ミリストイル化α−Ｎ末端配列（ＭＡＮＳ）として知られ；即ち、ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端グリシンで始まるＭＡＲＣＫＳタンパク質の２４アミノ酸を含有する。Ｖｅｒｇｅｒｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８、３３０；５−１１も、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端グリシン残基が、ミリストイルＣｏＡ：タンパク質Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）により触媒される反応を介してミリストイル化されることを開示する。
【０００７】
喘息、ＣＯＰＤ及び慢性気管支炎などの炎症性疾患において；嚢胞性線維症などの遺伝病において；アレルギー状態（アトピー、アレルギー性炎症）において；気管支拡張症において；及び肺炎、鼻炎、インフルエンザ又は一般的風邪、関節炎又は自己免疫疾患などの、多くの急性、感染性呼吸器疾患において、炎症性細胞は、通常、炎症性疾患状態が関与する損傷又は感染部位で、特にこのような疾患に罹患する患者の呼吸通路又は気道で見られるか又はそこに移動する。これらの炎症性細胞は、これらの細胞から放出される炎症性メディエーターにより生じる組織損傷を介して疾患の病因に大きく関与し得る。この慢性炎症を介したこのような組織損傷又は破壊の一例は、好中球から放出されるメディエーター（例えばミエロペルオキシダーゼ［ＭＰＯ］）が気道上皮組織の落屑を誘発する嚢胞性線維症患者において起こる。
【０００８】
およそ８２ｋＤのタンパク質であるＭＡＲＣＫＳには、３ヵ所の進化的保存領域（Ａｄｅｒｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３６２−３６４；Ｔｈｅｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：３２０−３２２；Ｈａｒｔｗｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２；Ｓｅｙｋｏｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１８７９７−１８８０２）：即ち、Ｎ末端、リン酸化ドメイン部位（又はＰＳＤ）及びマルチプルホモロジー２（ＭＨ２）ドメインがある。ヒトＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡ及びタンパク質が知られており、Ｈａｒｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６：１４３９９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６８９５６）によって、またＳａｋａｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９２、１４：１７５によっても報告されている。これらの配列はまた、国際公開第００／５００６２号（参照によりその全体を組み込む。）でも与えられている。アミド結合を介してＮ末端グリシン残基に連結されたミリスチン酸部分を有する２４アミノ酸残基を含むＮ末端、α−アミノ酸配列は、細胞における膜（Ｓｅｙｋｏｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ１９９６；２７１：１８７９７−１８８０２）及びおそらくカルモジュリン（Ｍａｔｓｕｂａｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２００３；２７８：４８８９８−４８９０２）へのＭＡＲＣＫＳの結合に関与する。この２４アミノ酸配列はＭＡＮＳペプチドとして知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第００／５００６２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ、Ｃｏｗｌａｎｄ  ＪＢ．Ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７；８９：３５０３−３５２１
【非特許文献２】Ｇｌｅｉｃｈ  Ｇ  Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３
【非特許文献３】Ｈｏｆｆ  Ｔ、Ｓｐｅｎｃｋｅｒ  Ｔ、Ｅｍｍｅｎｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ａ．、Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ  Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２
【非特許文献４】Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ、Ｓａｅｚ  Ｙ、Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０
【非特許文献５】Ｂｏｃｈａｎ  ＭＲ、Ｇｏｅｂｅｌ  ＷＳ、Ｂｒａｈｍｉ  Ｚ．Ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｔｉｃ  ａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；１６４：２３４−２３９；
【非特許文献６】Ｇｏｎｇ  ＪＨ．、Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８
【非特許文献７】Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ、Ｔａｍ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３
【非特許文献８】Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０
【非特許文献９】Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ、Ｍｏｒｇａｎ  Ａ．Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２
【非特許文献１０】Ｌｏｇａｎ  ＭＲ、Ｏｄｅｍｕｙｉｗａ  ＳＯ、Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２
【非特許文献１１】Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ、Ｍｏｒｇａｎ  Ａ．Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２；Ｌｏｇａｎ  ＭＲ、Ｏｄｅｍｕｙｉｗａ  ＳＯ、Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２；Ｓｍｏｌｅｎ  ＪＥ、Ｓａｎｄｂｏｒｇ  ＲＲ．Ｃａ２＋−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａ２＋，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９０；１０５２：１３３−１４２；Ｎｉｅｓｓｅｎ  ＨＷ、Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ  ＡＪ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９４；１２２３：２６７−２７３；及びＮａｕｃｌｅｒ  Ｃ、Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ  Ｓ、Ｓｕｎｄｌｅｒ  Ｒ．、Ｔａｐｐｅｒ  Ｈ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２００２；７１：７０１−７１０
【非特許文献１２】Ａｄｅｒｅｍ  ＡＡ、Ａｌｂｅｒｔ  ＫＡ、Ｋｅｕｍ  ＭＭ、Ｗａｎｇ  ＪＫ、Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  Ｐ、Ｃｏｈｎ  ＺＡ．Ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｔｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３６２−３６４；Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ、Ｒｏｓｅｎ  Ａ、Ｎａｉｍ  ＡＣ、Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：３２０−３２２
【非特許文献１３】Ｈａｒｔｗｉｇ  ＪＨ、Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ、Ｒｏｓｅｎ  Ａ、Ｊａｎｍｅｙ  ＰＡ、Ｎａｉｍ  ＡＣ、Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．ＭＡＲＣＫＳ  ｉｓ  ａｎ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２
【非特許文献１４】Ｌｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：４０９８２−４０９９０
【非特許文献１５】Ｓｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４；１０：１９３−１９６参照）。
【非特許文献１６】Ｖｅｒｇｅｒｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８、３３０；５−１１
【非特許文献１７】Ａｄｅｒｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３６２−３６４；
【非特許文献１８】Ｔｈｅｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：３２０−３２２；
【非特許文献１９】Ｈａｒｔｗｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２；
【非特許文献２０】Ｓｅｙｋｏｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１８７９７−１８８０２
【非特許文献２１】Ｈａｒｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６：１４３９９
【非特許文献２２】Ｓａｋａｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９２、１４：１７５
【非特許文献２３】Ｓｅｙｋｏｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ１９９６；２７１：１８７９７−１８８０２
【非特許文献２４】Ｍａｔｓｕｂａｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２００３；２７８：４８８９８−４８９０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
浸潤白血球の顆粒からの炎症性メディエーターの放出におけるＭＡＲＣＫＳタンパク質の関与は、喘息、ＣＯＰＤ及び嚢胞性線維症などの、気道炎症を特徴とする肺疾患を含む、全組織及び器官における疾患に関連する。しかし、気道における炎症及び粘液分泌は、２つの個別で独立したプロセスである（Ｌｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：４０９８２−４０９９０；Ｓｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００４；１０：１９３−１９６）。炎症性細胞により放出されるメディエーターを含む多くの因子により粘液産生及び分泌が誘発され得る一方、過剰な粘液が炎症を引き起こす直接的な関係は分かっていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のある態様において、ＭＡＮＳペプチドは、炎症性白血球において炎症性メディエーター顆粒又は小胞の放出の速度及び／又は量を低下させることに関与し得る。
【００１３】
別の態様において、ＭＡＲＣＫＳ  Ｎ末端由来、特に２４アミノ酸Ｎ末端配列由来のペプチド、即ち、位置１にグリシンを有するＭＡＲＣＫＳのＮ末端１−２４アミノ酸配列内由来の活性連続ペプチド断片、ならびにこのような断片のＮ末端アミド（このような断片のＮ末端酢酸アミドなど）、及び／又は、ならびに、このような断片のＣ末端アミド（アンモニアのＣ末端アミドなど）は、炎症性白血球からの炎症性メディエーターの放出の速度及び／又は量を阻害又は低下させることができる。放出におけるこのような阻害又は低下は、炎症性白血球からの炎症性メディエーターのＭＡＲＣＫＳ−関連放出の阻害を含む。
【００１４】
別の態様において、ＭＡＲＣＫＳ  Ｎ末端由来、特に１から２４アミノ酸Ｎ末端配列由来のペプチド、即ち、位置１にグリシンを有するＭＡＲＣＫＳのＮ末端１から２４アミノ酸配列内由来の活性連続ペプチド断片、ならびにこのような断片のＮ末端アミド（このような断片のＮ末端酢酸アミドなど）、ならびにこのような断片のＣ末端アミド（アンモニアのＣ末端アミドなど）は、炎症性白血球における脱顆粒のプロセスを阻害することによって、本発明において本明細書中で同定されるものなどの炎症性メディエーターの放出速度及び／又は放出量を抑制し得る。
【００１５】
別の態様において、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片及び本明細書中に記載のような断片の活性アミドは、このような炎症性細胞における、このような炎症のメディエーターを含有する顆粒又は小胞からの、炎症のメディエーターのＭＡＲＣＫＳ関連放出を減弱（減少又は低下）させるために、炎症性細胞での膜結合に対してネイティブＭＡＲＣＫＳタンパク質と競合し得る。
【００１６】
ホルボールエステル誘導性のＰＫＣの活性化に反応して特異的顆粒内容物を分泌する白血球細胞型及びモデル細胞型は、インビトロでの本発明のペプチド及び本発明の置換ペプチド（例えば、α−Ｎ−アミド、Ｃ末端アミド及びエステル）の有効性を示すために有用である。
【００１７】
本発明の化合物及び組成物による膜結合炎症性メディエーターの放出の減弱は、ヒト白血球細胞株を用いて示すことができる。例えば、ヒト血液から単離された好中球は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の放出の減弱又は阻害を示すために使用することができる。ヒト前骨髄球細胞株ＨＬ−６０クローン１５は、本発明の化合物及び組成物による好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）の放出の減弱又は放出もしくは分泌の阻害を示すために使用することができる（例えば、Ｆｉｓｃｈｋｏｆｆ  ＳＡ．Ｇｒａｄｅｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｔｙ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬ−６０  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｕｎｄｅｒ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  １９８８；１２：６７９−６８６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＦ、Ａｃｋｅｒｍａｎ  ＳＪ  、Ｔｅｎｅｎ  ＤＧ．Ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｍｏｌｅｄｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８９；１７０：１６３−１７６；Ｔｉｆｆａｎｙ  ＨＬ、Ｌｉ  Ｆ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＦ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９５；５８：４９−５４；及びＢａｄｅｗａ  ＡＰ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＣＥ、Ｈｅｉｍａｎ  ＡＳ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｏｔａｘｉｎ、ｅｏｔａｘｉｎ−２  ａｎｄ  ｅｏｔａｘｉｎ−３  ｏｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００２；２２７：６４５−６５１参照）。単球白血球細胞株Ｕ９３７は、本発明の化合物及び組成物によるリゾチームの放出の減弱又は放出もしくは分泌の阻害を示すために使用することができる（例えば、Ｈｏｆｆ  Ｔ、Ｓｐｅｎｃｋｅｒ  Ｔ、Ｅｍｍｅｎｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ａ．、Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ  Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ、Ｓａｅｚ  Ｙ、Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０；及びＳｕｎｄｓｔｒｏｍ  Ｃ、Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｋ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｕ−９３７）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９７６；１７：５６５−５７７参照）。リンパ球ナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２は、本発明の化合物及び組成物によるグランザイムの放出の減弱又は阻害を示すために使用することができる（例えば、Ｇｏｎｇ  ＪＨ．、Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８；Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ、Ｔａｍ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３；及びＴａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０参照）。本明細書中に記載のものなどの炎症のメディエーターの放出を阻害又は減弱するためのインビトロ法において、各細胞型を一連の濃度にわたる本発明のペプチド化合物又はペプチド組成物と予備温置し、次いでホルボールエステルなどの炎症性メディエーター放出刺激剤によりこれらの細胞を温置する。放出されるメディエーターの濃度の分光光度計での読み取りなどにおいて、ペプチド化合物又はペプチド組成物の非存在下でのメディエーターの放出と比較した場合の、炎症のメディエーターの放出の阻害％を調べる。
【００１８】
本発明のペプチドにおける相対的アミノ酸配列位置の重要性を示すために、ＭＡＮＳでの配列順に関して、ＭＡＲＣＫＳタンパク質Ｎ末端領域の２４アミノ酸配列（即ち、ＭＡＮＳ−ミリストイル化α−Ｎ末端配列ペプチド）と同一であるペプチドによる、放出炎症性メディエーター量を阻害又は低下させる相対的能力を、ＭＡＮＳに存在する同じ２４アミノ酸残基（しかし、無作為な順番で並んでいる。）（即ち、ＲＮＳペプチド、あるいは、「無作為Ｎ末端配列ペプチド」と呼ばれる。）を含有するペプチドによる、放出炎症性メディエーター量を阻害又は低下させる能力と比較した。調べた各細胞型において、ＭＡＮＳペプチド（しかしＲＮＳペプチドではない。）は、０．５−３．０時間の時間経過にわたり、濃度依存的に炎症性メディエーターの放出を減弱させた。これらの結果から、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、特にそのＮ末端領域及びとりわけその２４アミノ酸残基Ｎ末端領域で見られる順序である本発明のペプチドにおける相対的アミノ酸配列のポジショニングが、白血球脱顆粒の阻害に関する少なくとも１つの細胞内経路に関与することが示唆される。
【００１９】
本発明は、２４アミノ酸ペプチド配列に対する新規の使用及びαＮ末端アセチル化ペプチド配列、ミリストイル化ポリペプチド（ＭＡＮＳペプチドとしても知られる。）及びその活性断片に関する（この活性断片は、ＭＡＮＳペプチドアミノ酸配列の４から２３の連続アミノ酸残基を有するペプチドの群から選択することができ、この断片は、これらが配列番号１の位置１でＮ末端グリシンで始まらない場合、Ｎ末端ミリストイル化され得るか、又は、Ｎ末端アセチル化及び／又はＮＨ２基でのＣ末端アミド化を含む、Ｃ２からＣ１２のアシル基でＮ末端アシル化され得る。）。
【００２０】
本発明はまた、ＭＡＲＣＫＳ関連細胞性分泌プロセス、特に炎症性細胞からの炎症性メディエーターのＭＡＲＣＫＳ関連放出を含むものを遮断するための新規方法にも関し、この刺激性の経路は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）基質ＭＡＲＣＫＳタンパク質及び細胞内小胞又は顆粒からの内容物の放出を含む。
【００２１】
本発明は、少なくとも１つの炎症性細胞からの少なくとも１つの炎症性メディエーターのエキソサイトーシス放出を阻害する方法に関し、この方法は、ＭＡＮＳペプチド及び本明細書中に記載のその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド（この少なくとも１つのペプチドの非存在化で起こる炎症性細胞の同じタイプからの炎症性メディエーターの放出と比較して、炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を低下させるのに有効な量である。）と、少なくとも１つの炎症性細胞（この細胞は、細胞内側の小胞内に含有される少なくとも１つの炎症性メディエーターを含む。）を接触させることを含む。
【００２２】
本発明は、対象の組織又は体液（これは、細胞内側の小胞内に含有される少なくとも１つの炎症性メディエーターを含む少なくとも１つの炎症性細胞を含む。）において少なくとも１つの炎症性細胞からの少なくとも１つの炎症性メディエーターの放出を阻害する方法にさらに関し、この方法は、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの非存在化で起こる炎症性細胞の同じタイプの少なくとも１つからの炎症性メディエーターの放出と比較して、その少なくとも１つの炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を低下させるのに治療的に有効な量でＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量を、対象の組織及び／又は体液へ投与することを含む。とりわけ、炎症性メディエーターの放出の阻害は、炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を阻止又は低下させることを含む。
【００２３】
とりわけ、本発明は、ＭＡＮＳペプチド（即ちＮ−ミリストイル−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１））又はその活性断片を含む医薬組成物の治療的有効量の投与を含む、対象において炎症を低下させる方法を含む。この活性断片は、少なくとも４個、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸長である。本明細書中で使用する場合、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の「活性断片」は、炎症性メディエーターのＭＡＲＣＫＳタンパク質−介在性放出など、ＭＡＲＣＫＳタンパク質介在性放出に影響を及ぼす（阻害又は低下）ものである。活性断片は、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶ（配列番号２）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡ（配列番号４）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡ（配列番号７）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥ（配列番号１１）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧ（配列番号１６）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰ（配列番号２２）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲ（配列番号２９）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥ（配列番号３７）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡ（配列番号４６）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡ（配列番号５６）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡ（配列番号６７）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥ（配列番号７９）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧ（配列番号９２）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６）；ＧＡＱＦＳＫＴＡＡ（配列番号１２１）；ＧＡＱＦＳＫＴＡ（配列番号１３７）；ＧＡＱＦＳＫＴ（配列番号１５４）；ＧＡＱＦＳＫ（配列番号１７２）；ＧＡＱＦＳ（配列番号１９１）及びＧＡＱＦ（配列番号２１１）からなる群から選択することができる。これらのペプチドは、Ｎ末端アミノ酸においてミリストイル部分を含有する代わりに、化学部分を含有しないか又はＮ末端アミノ酸において非ミリストイル化学部分を含有し、及び／又はＣ末端アミノ酸における化学部分を含有し、これは、本明細書中に記載のようなＮ末端アセチル基及び／又はＣ末端アミド基などである。ＭＡＮＳペプチド及びそのＮ末端ミリストイル化断片における疎水性Ｎ末端ミリストイル部分の存在によって、原形質膜とのその適合性及びおそらく原形質膜に対する透過性を向上させることができ、おそらく、ペプチドを細胞に取り込ませることができる。膜脂質二重層へのミリストイル基の疎水性挿入により、脂質との分配係数又は見かけの結合定数を１０４Ｍ−１以下にするか、又は約８ｋｃａｌ／ｍｏｌの単位ギブズ自由結合エネルギーを与えることができる（例えば、Ｐｅｉｔｚｓｃｈ、Ｒ．Ｍ．及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、Ｓ．１９９３、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｐｅｒｔｉｎｅｎｃｅ  ｔｏ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１０４３６−１０４４３参照）が、これは、少なくとも部分的に、細胞の原形質膜へのＭＡＮＳペプチド及びミリストイル化ＭＡＮＳペプチド断片の分配を可能にするのに十分であり、一方、ＭＡＮＳペプチド（ミリストイル化されている。）内及びミリストイル化ＭＡＮＳペプチド断片内でのさらなる官能基及びそれらの相互作用によって、その相対的膜透過性が高められ得る。この断片はそれぞれ、それらの個々の構造の代表である分配係数及び膜親和性を示すことができる。この断片は、固相ペプチド合成によってなど当技術分野で公知のペプチド合成の方法により調製し（例えば、Ｃｈａｎ、Ｗｅｎｇ  Ｃ．及びＷｈｉｔｅ、Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．編、Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；及びＬｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｐ．ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９７）に記載の方法を参照）、高圧液体クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の方法によって精製することができる。適切な分子量のピークをそれぞれ示す質量分析により、各ペプチドの分子量を確認することができる。本明細書中で開示される実施例において記載される手段を用いて、不必要な実験を行わず、この開示の方法における個々のペプチド及び個々のペプチドの組み合わせの有効性（例えば、ペプチドの２つの組み合わせ、ペプチドの３つの組み合わせ、ペプチドの４つの組み合わせ）を容易に調べることができる。好ましい組み合わせには、ペプチドの２つの組み合わせが含まれ、これらのペプチドの好ましいモル比は５０：５０（即ち１：１）から９９．９９から０．０１であり得、この比は、本明細書中で開示される実施例において記載される手段を用いて容易に求めることができる。
【００２４】
好ましくは、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片は、炎症を阻止するのに有用な医薬組成物に含有される。本発明はまた、対象において炎症性メディエーターを阻害するＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を含む化合物の治療的有効量の投与を含む、対象において細胞性分泌プロセスを阻害する方法も含む。この投与は、通常、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺内投与、吸入及び鼻腔又は経口投与からなる群から選択され、この場合、肺内投与は通常、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量吸入器又は噴霧器の何れかを含む。
【００２５】
ヒト又は動物での使用のための、ＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む組成物の投与（ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の医薬組成物など）は、炎症性顆粒球細胞が存在するか又は炎症性顆粒球細胞が侵入する組織面と接触する組織又は体液含有層中又は上の少なくとも部位に、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を提供し、このようにして、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片が炎症性顆粒球細胞に接触することができるようになる。ある態様において、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の非存在下で起こる炎症量を低下させるために、炎症の最初の発症もしくは最初の検出時又はヒトもしくは動物による炎症の最初の感知時又はヒトもしくは動物による炎症レベルの変化の最初の感知時に、このような組成物の投与を行い得る。別の態様において、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の非存在下で起こるさらなる炎症の量を低下させるために、ヒトもしくは動物における組織の炎症の進行中に投与を行い得る。臨床評価により投与量及び頻度を決定することができ、これは、疾患又は炎症の源及び関与する組織の程度、及び患者の年齢ならびに患者の体格の関数であり得るが、一方で、医薬組成物の投与は、医薬組成物の最初の投与から３から８時間後、好ましくは６から８時間後、反復することができると予想される。
【００２６】
本発明はまた、炎症性メディエーターのＭＡＲＣＫＳ関連放出を阻害する化合物の治療的有効量の投与を含む、対象において炎症を低下させる方法も含み、これにより、前記治療なしで起こるものと比較して対象における少なくとも１つの炎症性メディエーターの放出が低下する。本明細書中で使用する場合、「低下する」とは、通常、炎症の影響の軽減を意味する。好ましくは、炎症性メディエーターの放出が、開示される方法により阻害又は阻止される。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、ＭＡＲＣＫＳ関連の炎症性メディエーターの放出を阻害する化合物の治療的有効量を投与することを含む、対象において炎症を低下させる方法を含み、これにより、前記治療なしで起こるものと比較して、対象における炎症が低下する。本発明はまた、炎症部位において炎症性メディエーターを阻害するのに有効なＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の治療的有効量の投与を含む、対象において炎症を低下させるか又は阻害する方法も開示する。「阻害する」という用語は、炎症性メディエーター分泌量の低下を意味する。「完全に阻害する」という用語は、炎症性メディエーター分泌量を０に低下させることを意味する。重ねて、上述のように、活性断片は、少なくとも４及び好ましくは少なくとも６個のアミノ酸長である。「エキソサイトーシスプロセス」という用語は、エキソサイトーシス、即ち、小胞（この小胞は細胞内にある。）に含有される物質が、小胞の細胞外膜との小胞膜融合により細胞から放出される、細胞からの分泌又は排出のプロセスを意味する。「脱顆粒」とは、細胞性顆粒内容物の放出を意味する。「脱顆粒阻害」という用語は、炎症性細胞の顆粒内に含有される炎症性メディエーターの放出の低下を意味する。このようにして、ＭＡＮＳペプチド及び／又はその活性断片の脱顆粒阻害量は、同じペプチドの非存在下での放出と比較して、顆粒に含有される炎症性メディエーターの放出を低下させるのに十分であるこれらのペプチドの量である。
【００２８】
参照ペプチド、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）において、参照ペプチドのＮ末端位置で、Ｇは位置１であり；位置１のＧに隣接するのは位置２のＡであり；位置２のＡに隣接するのは位置３のＱであり；位置３のＱに隣接するのは位置４のＦであり；位置４のＦに隣接するのは位置５のＳであり；位置５のＳに隣接するのは位置６のＫであり；位置６のＫに隣接するのは位置７のＴであり；位置７のＴに隣接するのは位置８のＡであり；位置８のＡに隣接するのは位置９のＡであり；位置９のＡに隣接するのは位置１０のＫであり；位置１０のＫに隣接するのは位置１１のＧであり；位置１１のＧに隣接するのは位置１２のＥであり；位置１２のＥに隣接するのは位置１３のＡであり；位置１３のＡに隣接するのは位置１４のＡであり；位置１４のＡに隣接するのは位置１５のＡであり；位置１５のＡに隣接するのは位置１６のＥであり；位置１６のＥに隣接するのは位置１７のＲであり；位置１７のＲに隣接するのは位置１８のＰであり；位置１８のＰに隣接するのは位置１９のＧであり；位置１９のＧに隣接するのは位置２０のＥであり；位置２０のＥに隣接するのは位置２１のＡであり；位置２１のＡに隣接するのは位置２２のＡであり；位置２２のＡに隣接するのは位置２３のＶであり；位置２３のＶに隣接するのは位置２４のＡであり、位置２４は参照ペプチドのＣ末端位置である。
【００２９】
参照ペプチドの「変異型」又は参照ペプチドの４から２３アミノ酸セグメントの変異型は、それぞれ参照ペプチド又は参照ペプチドセグメントのアミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸位置において、それぞれ参照ペプチドのアミノ酸配列又は参照ペプチドのセグメントのアミノ酸配列と異なるが、ムチン又は粘液抑制活性を保持し、この活性は、通常、参照ペプチド又はセグメントの活性のそれぞれ０．１から１０倍、好ましくは参照ペプチド又はセグメントの活性のそれぞれ０．２から６倍、より好ましくは参照ペプチド又はセグメントの活性のそれぞれ０．３から５倍である、アミノ酸配列を有するペプチドである。参照アミノ酸配列の「変異型」又は参照アミノ酸配列の４から２３アミノ酸セグメントの変異型は、それぞれ参照アミノ酸配列又は参照アミノ酸配列のセグメントと少なくとも１個のアミノ酸で異なるが、参照アミノ酸配列によってコードされるペプチド又はセグメントのムチン又は粘液抑制活性をそれぞれ保持し、この活性が、通常、参照配列のペプチド又はセグメントの活性のそれぞれ０．１から１０倍、好ましくは参照配列のペプチド又はセグメントの活性のそれぞれ０．２から６倍、より好ましくは参照配列のペプチド又はセグメントの活性のそれぞれ０．３から５倍である、ペプチドのアミノ酸配列を有する。置換変異型ペプチド又は置換変異型アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列内の１以上のアミノ酸置換によって参照ペプチド又は参照アミノ酸配列と異なり得；欠失変異型ペプチド又は欠失変異型アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列内の１以上のアミノ酸欠失によって参照ペプチド又は参照アミノ酸配列と異なり得；付加変異型ペプチド又は付加変異型アミノ酸配列は、参照配列内の１以上のアミノ酸の付加によって参照ペプチド配列又は参照アミノ酸配列と異なり得る。変異型ペプチド又は変異型アミノ酸配列は、参照配列内の１以上のアミノ酸の置換（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸の置換）から生じ得るか、又は参照配列内の１以上のアミノ酸の欠失（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸の欠失）から生じ得るか、又は参照配列内の１以上のアミノ酸の付加（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸の付加）から生じ得る。置換変異型の４から２３のアミノ酸ペプチドセグメント又は置換変異型の４から２３アミノ酸セグメント配列は、参照アミノ酸セグメント配列内の１以上のアミノ酸置換によって参照４から２３アミノ酸ペプチドセグメント又は参照４から２３アミノ酸セグメント配列と異なり得；欠失変異型の４から２３アミノ酸ペプチドセグメント又は４から２２アミノ酸の欠失変異型アミノ酸セグメント配列は、参照アミノ酸セグメント配列内の１以上のアミノ酸欠失によって５から２３参照ペプチドセグメント又は５から２３アミノ酸の参照アミノ酸セグメント配列と異なり得る；及び４から２３アミノ酸の付加変異型ペプチド又は４から２３アミノ酸の付加変異型アミノ酸配列は、参照配列内の１以上のアミノ酸付加によって４から２２アミノ酸の参照ペプチド配列又は４から２２アミノ酸の参照アミノ酸配列と異なり得る。４から２３アミノ酸の変異型ペプチド又は４から２３アミノ酸の変異型アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の４から２３アミノ酸セグメント内の１以上のアミノ酸の置換（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸の置換）から生じ得るか、又はそれぞれより大きな参照アミノ酸配列内の１以上のアミノ酸の欠失（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸の欠失）から生じ得るか、又はそれぞれより小さな参照アミノ酸配列内の１以上のアミノ酸の付加（例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸の付加）から生じ得るか、又はこれらの組合せから生じ得る。好ましくは、変異型ペプチド又はアミノ酸配列は、１０個未満のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加によって；より好ましくは８個未満のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加によって；さらにより好ましくは６個未満のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加によって；さらにより好ましくは５個未満のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加によって；さらに一層好ましくは４個未満のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加によって、それぞれ参照ペプチドと又は参照ペプチドのセグメントと又は参照アミノ酸配列と又は参照アミノ酸配列のセグメントと異なる。最も好ましくは、変異型アミノ酸配列は、１又は２又は３個のアミノ酸で参照ペプチド又はセグメントアミノ酸配列と異なる。
【００３０】
「配列同一性」とは、２つのペプチドのアミノ酸配列に関して、同一アミノ酸を有する位置の数を、２つの配列の短い方の配列内のアミノ酸の数で除した数を意味する。
【００３１】
「実質的に同一」とは、２つのペプチドのアミノ酸配列の比較又は２つのペプチドセグメント（例えば参照ペプチドアミノ酸配列のセグメント）のアミノ酸配列の比較に関して、ペプチド又はペプチドのセグメントのアミノ酸配列が少なくとも７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有することを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「ペプチド」という用語は、ペプチドならびにペプチドの医薬的に許容可能な塩を含む。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「単離」ペプチドは、天然においてこれに付随する細胞成分（例えば核酸及びその他のペプチド）から、精製、組み換え合成又は化学合成によって、分離されたか又は実質的に分離された天然のペプチドを意味し、同様に、細胞成分、生体物質、化学的前駆体又はその他の化学物質から精製されたか又は実質的に精製された、非天然の組み換え合成又は化学合成ペプチドも包含する。
【００３４】
以下の３文字及び１文字アミノ酸略記を本文全体を通して使用する。アラニン：（Ａｌａ）Ａ；アルギニン：（Ａｒｇ）Ｒ；アスパラギン：（Ａｓｎ）Ｎ；アスパラギン酸：（Ａｓｐ）Ｄ；システイン：（Ｃｙｓ）Ｃ；グルタミン：（Ｇｌｎ）Ｑ；グルタミン酸：（Ｇｌｕ）Ｅ；グリシン：（Ｇｌｙ）Ｇ；ヒスチジン：（Ｈｉｓ）Ｈ；イソロイシン：（Ｉｌｅ）Ｉ；ロイシン：（Ｌｅｕ）Ｌ；リシン：（Ｌｙｓ）Ｋ；メチオニン：（Ｍｅｔ）Ｍ；フェニルアラニン： （Ｐｈｅ）Ｆ；プロリン：（Ｐｒｏ）Ｐ；セリン：（Ｓｅｒ）Ｓ；スレオニン：（Ｔｈｒ）Ｔ；トリプトファン：（Ｔｒｐ）Ｗ；チロシン：（Ｔｙｒ）Ｙ；バリン：（Ｖａｌ）Ｖ。本明細書中で有用なアミノ酸のさらなる３文字表記には、括弧内の、ヒドロキシプロリンに対する（Ｈｙｐ）、ノルロイシンに対する（Ｎｌｅ）、オルニチンに対する（Ｏｒｎ）、ピログルタミン酸に対する（Ｐｙｒ）及びサルコシンに対する（Ｓａｒ）が含まれる。慣例により、ペプチドのアミノ末端（又はＮ末端）は、ペプチドの記載されるアミノ酸配列の左端に現れ、カルボキシ末端（又はＣ末端）は、記載されるアミノ酸配列の右端に現れる。ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド内のペプチドアミド結合によって共有結合されているアミノ酸を表わすために１文字記号で表記することができる。
【００３５】
ＭＡＮＳペプチドの活性断片は、炎症性メディエーターにより引き起こされる動物の組織における炎症を予防するか又は炎症量を低下させる上で有用であり得る。ＭＡＮＳペプチドの活性断片はまた、炎症性メディエーターにより生じるか又は引き起こされる動物の組織損傷を予防するか又はその量を低下させる上でも有用であり得る。ＭＡＮＳペプチドの活性断片は、ＭＡＮＳペプチド（配列番号１）の少なくとも４個の連続アミノ酸及び２３個以下の連続アミノ酸から構成される。本発明の文脈内で、「活性断片」という用語は、炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を予防するか又は低下させることができる、ＭＡＮＳペプチドのそれらの断片を包含するものとする。この活性断片による炎症性メディエーターの放出の低下とは、ＭＡＮＳペプチドなどの参照ペプチドと比較して、少なくとも５％から少なくとも９９％の低下の範囲であり得る。
【００３６】
表１は、１文字略記形式でのアミノ酸配列のリスト及びそれぞれの対応するペプチド番号及び配列番号を含有する。参照ペプチドアミノ酸配列（ＭＡＮＳペプチド）をペプチド１として挙げる。参照アミノ酸配列の４から２３の連続アミノ酸のアミノ酸配列を有する本発明のペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド２３２としてのＭＡＮＳペプチドのアミノ酸を含む無作為Ｎ末端配列（ＲＮＳ）のアミノ酸配列と共に、ペプチド２から２３１として挙げる。本明細書中で述べる本発明のペプチドのアミノ酸配列の代表的変異型アミノ酸配列も、ペプチド２３３から２４５及び２４７から２５１として列挙する。この列挙する変異型ペプチドは、ペプチドの限定群ではなく、本発明の変異型ペプチドの単なる代表例として提示するものである。また、本発明のペプチドの代表的逆アミノ酸配列（ペプチド２４２６）及び代表的無作為アミノ酸配列（ペプチド２３２）も提示する。表中の逆及び無作為アミノ酸配列は、本発明を代表するものではない。
【００３７】
表１は、本発明のペプチド及びそれらの個々のアミノ酸配列及び対応する配列番号のリストを含有する。
【００３８】
【表１】
2009544737.tif 000003
2009544737.tif 000004
2009544737.tif 000005
2009544737.tif 000006
2009544737.tif 000007
2009544737.tif 000008
【００３９】
表１に列挙されるペプチドのアミノ酸配列は化学的に修飾され得る。例えば表１に列挙されるペプチドのアミノ酸配列が、カルボン酸とアミドを形成するようにＮ末端アミンで化学的に修飾される場合、生じるペプチドは、本明細書中で、ハイフンによってペプチド番号に連結される、接頭辞としてのカルボン酸に対する識別名の組合せによって呼ばれることがある。例えば一例としてペプチド７９に関して、Ｎ末端ミリストイル化ペプチド７９は、本明細書中で、「ミリストイル化−ペプチド７９」又は「ｍｙｒ−ペプチド７９」と呼ばれ得ることがあり；Ｎ末端アセチル化ペプチド７９は、本明細書中で、「アセチル−ペプチド７９」又は「Ａｃ−ペプチド７９」と呼ばれ得ることがある。ペプチド７９の環状型は、「環状−ペプチド７９」又は「ｃｙｃ−ペプチド７９」と呼ばれ得る。また、例えば表１に列挙されるペプチドのアミノ酸配列がＣ末端カルボキシル基で、例えばアンモニアなどのアミンによってＣ末端アミドを形成するように化学的に修飾される場合、生じるペプチドは、本明細書中で、ハイフンによってペプチド番号に連結される、接尾辞としてのアミン残基に対する識別名の組合せによって呼ばれることがある。このようにして、例えばペプチド７９のＣ末端アミドは、「ペプチド−ＮＨ２」と呼ばれ得る場合がある。ペプチド（例えばペプチド７９）のＮ末端アミンが、例えばミリストイル基によって化学的に修飾され、Ｃ末端カルボキシル基が、上記のようにアミドを形成するように例えばアンモニア基によって化学的に修飾される場合、生じるペプチドは、接頭辞及び接尾辞の両表記法を用いて、「ｍｙｒ−ペプチド７９−ＮＨ２」と呼ばれ得ることがある。
【００４０】
本発明は、ＭＡＮＳペプチド（即ちＭＡＮＳペプチドはミリストイル−ペプチド１であり、ＭＡＮＳペプチドの参照２４アミノ酸配列がペプチド１である）のアミノ酸に関連するアミノ酸配列を備えた２４個未満のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドを含む。本発明のペプチドは、２４個未満のアミノ酸を含有するアミノ酸配列からなり、８から１４個、１０から１２個、９から１４個、９から１３個、１０から１３個、１０から１４個、少なくとも９個、少なくとも１０個などのアミノ酸からなり得る。ペプチドは、通常は直鎖であるが、環状ペプチドでもあり得る。さらに、ペプチドは単離ペプチドであり得る。
【００４１】
ペプチド１（配列番号１）、参照２４アミノ酸配列に関して、参照アミノ酸配列の２３連続アミノ酸のセグメントは、本明細書中で、２３マーと呼ばれることがある。同様に、参照配列の２２連続アミノ酸のセグメントは、本明細書中で、２２マーと呼ばれることがあり；２１個のアミノ酸配列は２１マー；２０個のアミノ酸配列は２０マー；１９個のアミノ酸配列は１９マー；１８個のアミノ酸配列は１８マー；１７個のアミノ酸配列は１７マー；１６個のアミノ酸配列は１６マー；１５個のアミノ酸配列は１５マー；１４個のアミノ酸配列は１４マー；１３個のアミノ酸配列は１３マー；１２個のアミノ酸配列は１２マー；１１個のアミノ酸配列は１１マー；１０個のアミノ酸配列は１０マー；９個のアミノ酸配列は９マー；８個のアミノ酸配列は８マー；７個のアミノ酸配列は７マー；６個のアミノ酸配列は６マー；５個のアミノ酸配列は５マー；４個のアミノ酸配列は４マーと呼ばれることがある。ある態様において、それ自体ペプチドである（本明細書中で、Ｈ２Ｎ−ペプチド−ＣＯＯＨと表示されることがある。）、これらの「４から２３マー」アミノ酸配列の何れかは、例えば化学的修飾によって、独立に化学的に修飾され得、この化学的修飾は、（ｉ）例えばＣ１又は好ましくはＣ２（酢酸）−Ｃ２２カルボン酸などによる、Ｎ末端アミン基（Ｈ２Ｎ−ペプチド−）でのアミド形成；（ｉｉ）例えばアンモニア又はＣ１−Ｃ２２の一級又は二級アミンなどによる、Ｃ末端カルボキシル基（−ペプチド−ＣＯＯＨ）でのアミド形成；及び（ｉｉｉ）これらの組合せ、からなる群から選択され得る。
ペプチドは、（ａ）参照配列、ペプチド１の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列と実質的に類似の配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型（ここで変異型は、置換変異型、欠失変異型、付加変異型及びこれらの組合せからなる群から選択される。）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、ペプチドは、（ａ）参照配列、ペプチド１の８から１４個の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）で定義される配列と実質的に同一のアミノ酸配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型（ここで、変異型は、置換変異型、欠失変異型、付加変異型及びこれらの組合せからなる群から選択される。）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。さらにその他の実施形態において、ペプチドは、（ａ）参照配列、ペプチド１の１０から１２個の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）で定義される配列と実質的に同一のアミノ酸配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型（ここで、変異型は、置換変異型、欠失変異型、付加変異型及びこれらの組合せからなる群から選択される。）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、ペプチドは、参照配列、ペプチド１の少なくとも９個、少なくとも１０個、９から１４個、９から１３個、１０から１３個、１０から１４個などの連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；これと実質的に同一のアミノ酸配列；又はこの変異型を有し、ここで変異型は、置換変異型、欠失変異型、付加変異型及びこれらの組合せからなる群から選択される。以下でさらに説明するように、ペプチドのアミノ酸の１以上（例えばＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸）は、場合によっては独立に化学的に修飾され得；ある実施形態において、ペプチドの１以上のアミノ酸が化学的に修飾され、一方で、その他の実施形態において、ペプチドのアミノ酸の何れも化学的に修飾されない。ある態様において、好ましい修飾は、ペプチド又はペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸のアミン（−ＮＨ２）基で起こり得る（このアミン基は、Ｎ末端位置ではなくペプチド配列の内部に存在する場合、ペプチドアミド結合を形成する）。別の態様において、好ましい修飾は、ペプチド又はペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸のカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基で起こり得る（このカルボキシ基は、Ｃ末端位置ではなくペプチド配列の内部に存在する場合、ペプチドアミド結合を形成する）。別の態様において、好ましい修飾は、Ｎ末端アミン（−ＮＨ２）基及びＣ末端カルボキシ（−ＣＯＯＨ）基の両方で起こり得る。
【００４２】
ある実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列は、参照配列ペプチド１のＮ末端アミノ酸から始まる。例えばペプチドは、（ａ）参照配列ペプチド１の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列（ただし、アミノ酸配列は参照配列のＮ末端アミノ酸から始まる。）（即ちペプチド２、ペプチド４、ペプチド７、ペプチド１１、ペプチド１６、ペプチド２２、ペプチド２９、ペプチド３７、ペプチド４６、ペプチド５６、ペプチド６７、ペプチド７９、ペプチド９２、ペプチド１０６、ペプチド１２１、ペプチド１３７、ペプチド１５４、ペプチド１７２、ペプチド１９１又はペプチド２１１）；（ｂ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列と実質的に同様の配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。これらのペプチドは、化学部分を含有しないか又はミリストイル基以外のＮ−末端グリシンにおいて化学部分を含有する。好ましくは、この化学部分は、アセチル基又はアルキル基など、アミド結合の形態での、アシル基である。
【００４３】
その他の実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列は参照配列ペプチド１のＣ末端アミノ酸で終了する。例えばペプチドは、（ａ）参照配列ペプチド１の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列（ただし、アミノ酸配列は参照配列のＣ末端アミノ酸で終了する。）（即ちペプチド３、ペプチド６、ペプチド１０、ペプチド１５、ペプチド２１、ペプチド２８、ペプチド３６、ペプチド４５、ペプチド５５、ペプチド６６、ペプチド７８、ペプチド９１、ペプチド１０５、ペプチド１２０、ペプチド１３６、ペプチド１５３、ペプチド１７１、ペプチド１９０、ペプチド２１０又はペプチド２３１）；（ｂ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列と実質的に同様の配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
【００４４】
その他の実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列は、参照配列ペプチド１（配列番号１）のＮ末端アミノ酸で始まらず、参照配列ペプチド１の２位のアミノ酸から始まり２１位のアミノ酸までである。例えばペプチドは、（ａ）参照配列ペプチド１の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列（ただし、アミノ酸配列は参照配列の位置２から位置２１までの何らかのアミノ酸で始まる。）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。これらのペプチドは、４から２３連続アミノ酸長であり得、参照配列（ペプチド１）の中央のペプチドであり得；（ｂ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列と実質的に同様の配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型であり得る。これらのペプチドを表１又は２で開示する。これらのペプチドは、共有結合化学部分を全く含有し得ないか又はアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端グリシンからの、又はこれと同等の、Ｎ末端グリシンではないＮ−末端アミノ酸において化学部分を含有し得る。好ましくは、この化学部分は、アミド結合の形態において、アセチル基又はミリストイル基などのアシル基又はアルキル基である。
【００４５】
哺乳動物においてムチン過剰分泌を阻害するために本発明において有用であり、哺乳動物においてムチン過剰分泌の量を低下させるために有用であり、ムチン過剰分泌の阻害の方法及びムチン過剰分泌の低下の方法において有用であるペプチドアミノ酸配列は、本発明の単離ペプチドのアミノ酸配列及び、Ｎ末端及び／又はＣ末端で化学的に修飾された基を場合によっては含有するペプチドのアミノ酸配列を含み、この場合、ペプチドアミノ酸配列は、２３マー（即ち２３個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド２；及びペプチド３；２２マー（即ち２２個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド４；ペプチド５；及びペプチド６；２１マー（即ち２１個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド７；ペプチド８；ペプチド９；及びペプチド１０；２０マー（即ち２０個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１１；ペプチド１２；ペプチド１３；ペプチド１４；及びペプチド１５；１９マー（即ち１９個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１６；ペプチド１７；ペプチド１８；ペプチド１９；ペプチド２０；及びペプチド２１；１８マー（即ち１８個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド２２；ペプチド２３；ペプチド２５；ペプチド２６；ペプチド２７；及びペプチド２８；１７マー（即ち１７個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド２９；ペプチド３０；ペプチド３１；ペプチド３２；ペプチド３３；ペプチド３４；ペプチド３５；及びペプチド３６；１６マー（即ち１６個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド３７；ペプチド３８；ペプチド３９；ペプチド４０；ペプチド４１；ペプチド４２；ペプチド４３；ペプチド４４；及びペプチド４５；１５マー（即ち１５個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド４６；ペプチド４７；ペプチド４８；ペプチド４９；ペプチド５０；ペプチド５１；ペプチド５２；ペプチド５３；ペプチド５４；及びペプチド５５；１４マー（即ち１４個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド５６；ペプチド５７；ペプチド５８；ペプチド５９；ペプチド６０；ペプチド６１；ペプチド６２；ペプチド６３；ペプチド６４；ペプチド６５；及びペプチド６６；１３マー（即ち１３個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド６７；ペプチド６８；ペプチド６９；ペプチド７０；ペプチド７１；ペプチド７２；ペプチド７３；ペプチド７４；ペプチド７５；ペプチド７６；ペプチド７７；及びペプチド７８；１２マー（即ち１２個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド７９；ペプチド８０；ペプチド８１；ペプチド８２；ペプチド８３；ペプチド８４；ペプチド８５；ペプチド８６；ペプチド８７；ペプチド８８；ペプチド８９；ペプチド９０；及びペプチド９１；１１マー（即ち１１個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド９２；ペプチド９３；ペプチド９４；ペプチド９５；ペプチド９６；ペプチド９７；ペプチド９８；ペプチド９９；ペプチド１００；ペプチド１０１；ペプチド１０２；ペプチド１０３；ペプチド１０４；及びペプチド１０５；１０マー（即ち１０個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１０６；ペプチド１０７；ペプチド１０８；ペプチド１０９；ペプチド１１０；ペプチド１１１；ペプチド１１２；ペプチド１１３；ペプチド１１４；ペプチド１１５；ペプチド１１６；ペプチド１１７；ペプチド１１８；ペプチド１１９；及びペプチド１２０；９マー（即ち９個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１２１；ペプチド１２２；ペプチド１２３；ペプチド１２４；ペプチド１２５；ペプチド１２６；ペプチド１２７；ペプチド１２８；ペプチド１２９；ペプチド１３０；ペプチド１３１；ペプチド１３２；ペプチド１３３；ペプチド１３４；ペプチド１３５；及びペプチド１３６；８マー（即ち８のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１３７；ペプチド１３８；ペプチド１３９；ペプチド１４０；ペプチド１４１；ペプチド１４２；ペプチド１４３；ペプチド１４４；ペプチド１４５；ペプチド１４６；ペプチド１４７；ペプチド１４８；ペプチド１４９；ペプチド１５０；ペプチド１５１；ペプチド１５２；及びペプチド１５３；７マー（即ち７個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１５４；ペプチド１５５；ペプチド１５６；ペプチド１５７；ペプチド１５８；ペプチド１５９；ペプチド１６０；ペプチド１６１；ペプチド１６２；ペプチド１６３；ペプチド１６４；ペプチド１６５；ペプチド１６６；ペプチド１６７；ペプチド１６８；ペプチド１６９；ペプチド１７０；及びペプチド１７１；６マー（即ち６個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１７２；ペプチド１７３；ペプチド１７４；ペプチド１７５；ペプチド１７６；ペプチド１７７；ペプチド１７８；ペプチド１７９；ペプチド１８０；ペプチド１８１；ペプチド１８２；ペプチド１８３；ペプチド１８４；ペプチド１８５；ペプチド１８６；ペプチド１８７；ペプチド１８８；ペプチド１８９；及びペプチド１９０；５マー（即ち５個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド１９１；ペプチド１９２；ペプチド１９３；ペプチド１９４；ペプチド１９５；ペプチド１９６；ペプチド１９７；ペプチド１９８；ペプチド１９９；ペプチド２００；ペプチド２０１；ペプチド２０２；ペプチド２０３；ペプチド２０４；ペプチド２０５；ペプチド２０６；ペプチド２０７；ペプチド２０８；ペプチド２０９；及びペプチド２１０；及び４マー（即ち４個のアミノ酸配列を有するペプチド）：ペプチド２１１；ペプチド２１２；ペプチド２１３；ペプチド２１４；ペプチド２１５；ペプチド２１６；ペプチド２１７；ペプチド２１８；ペプチド２１９；ペプチド２２０；ペプチド２２１；ペプチド２２２；ペプチド２２３；ペプチド２２４；ペプチド２２５；ペプチド２２６；ペプチド２２７；ペプチド２２８；ペプチド２２９；ペプチド２３０；及びペプチド２３１からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の単離ペプチド及びＮ末端及び／又はＣ末端で化学的に修飾されたペプチドの好ましいアミノ酸配列は、２３マー：ペプチド２；及びペプチド３；２２マー：ペプチド４；ペプチド５；及びペプチド６；２１マー：ペプチド７；ペプチド８；ペプチド９；及びペプチド１０；２０マー：ペプチド１１；ペプチド１２；ペプチド１３；ペプチド１４；及びペプチド１５；１９マー：ペプチド１６；ペプチド１７；ペプチド１８；ペプチド１９；ペプチド２０；及びペプチド２１；１８マー：ペプチド２２；ペプチド２３；ペプチド２４；ペプチド２５；ペプチド２６；ペプチド２７；及びペプチド２８；１７マー：ペプチド２９；ペプチド３０；ペプチド３１；ペプチド３２；ペプチド３３；ペプチド３４；ペプチド３５；及びペプチド３６；１６マー：ペプチド３７；ペプチド３８；ペプチド３９；ペプチド４０；ペプチド４１；ペプチド４２；ペプチド４３；ペプチド４４；及びペプチド４５；１５マー：ペプチド４６；ペプチド４７；ペプチド４８；ペプチド４９；ペプチド５０；ペプチド５１；ペプチド５２；ペプチド５３；及びペプチド５４；１４マー：ペプチド５６；ペプチド５７；ペプチド５８；ペプチド５９；ペプチド６０；ペプチド６１；ペプチド６２；ペプチド６３；及びペプチド６４；１３マー：ペプチド６７；ペプチド６８；ペプチド６９；ペプチド７０；ペプチド７１；ペプチド７２；ペプチド７３；ペプチド７４；及びペプチド７５；１２マー：ペプチド７９；ペプチド８０；ペプチド８１；ペプチド８２；ペプチド８３；ペプチド８４；ペプチド８５；ペプチド８６；及びペプチド８７；１１マー：ペプチド９２；ペプチド９３；ペプチド９４；ペプチド９５；ペプチド９６；ペプチド９７；ペプチド９８；ペプチド９９；及びペプチド１００；１０マー：ペプチド１０６；ペプチド１０７；ペプチド１０８；ペプチド１０９；ペプチド１１０；ペプチド１１１；ペプチド１１２；ペプチド１１３；及びペプチド１１４；９マー：ペプチド１２２；ペプチド１２３；ペプチド１２４；ペプチド１２５；ペプチド１２６；ペプチド１２７；ペプチド１２８；及びペプチド１２９；８マー：ペプチド１３９；ペプチド１４０；ペプチド１４１；ペプチド１４２；ペプチド１４３；ペプチド１４４；及びペプチド１４５；７マー：ペプチド１５７；ペプチド１５８；ペプチド１５９；ペプチド１６０；ペプチド１６１；及びペプチド１６２；６マー：ペプチド１７６；ペプチド１７７；ペプチド１７８；ペプチド１７９；ペプチド及び１８０；５マー：ペプチド１９６；ペプチド１９７；ペプチド１９８；及びペプチド１９９；及び４マー：ペプチド２１７；及びペプチド２１９からなる群から選択される。
【００４７】
本発明の単離ペプチド及びＮ末端及び／又はＣ末端で化学的に修飾されたペプチドのより好ましいアミノ酸配列は、２３マー：ペプチド２；及びペプチド３；２２マー：ペプチド４；ペプチド５；及びペプチド６；２１マー：ペプチド７；ペプチド８；ペプチド９；及びペプチド１０；２０マー：ペプチド１１；ペプチド１２；ペプチド１３；ペプチド１４；及びペプチド１５；１９マー：ペプチド１６；ペプチド１７；ペプチド１８；ペプチド１９；ペプチド２０；及びペプチド２１；１８マー：ペプチド２２；ペプチド２３；ペプチド２４；ペプチド２５；ペプチド２６；ペプチド２７；及びペプチド２８；１７マー：ペプチド２９；ペプチド３０；ペプチド３１；ペプチド３２；ペプチド３３；ペプチド３４；ペプチド３５；及びペプチド３６；１６マー：ペプチド３７；ペプチド３８；ペプチド３９；ペプチド４０；ペプチド４１；ペプチド４２；ペプチド４３；ペプチド４４；及びペプチド４５；１５マー：ペプチド４６；ペプチド ４７；ペプチド４８；ペプチド４９；ペプチド５０；ペプチド５１；ペプチド５２；ペプチド５３；及びペプチド５４；１４マー：ペプチド５６；ペプチド５７；ペプチド５８；ペプチド５９；ペプチド６０；ペプチド６１；ペプチド６２；ペプチド６３；及びペプチド６４；１３マー：ペプチド６７；ペプチド６８；ペプチド６９；ペプチド７０；ペプチド７１；ペプチド７２；ペプチド７３；ペプチド７４；ペプチド８０；ペプチド８１；ペプチド８２；ペプチド８３；ペプチド８４；ペプチド８５；ペプチド８６；及びペプチド８７；１１マー：ペプチド９２；ペプチド９３；ペプチド９４；ペプチド９５；ペプチド９６；ペプチド９７；ペプチド９８；ペプチド９９；及びペプチド１００；１０マー：ペプチド１０６；ペプチド１０８；ペプチド１０９；ペプチド１１０；ペプチド１１１；ペプチド１１２；ペプチド１１３；及びペプチド１１４；９マー：ペプチド１２４；ペプチド１２５；ペプチド１２６；ペプチド１２７；ペプチド１２８；及びペプチド１２９；８マー：ペプチド１４１；ペプチド１４２；ペプチド１４３；ペプチド１４４；及びペプチド１４５；７マー：ペプチド１５９；ペプチド１６０；ペプチド１６１；及びペプチド１６２；６マー：ペプチド１７８；ペプチド１７９；及びペプチド１８０；５マー：ペプチド１９８；及びペプチド１９９；４マー：ペプチド２１９からなる群から選択される。
【００４８】
さらにその他の実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列は、参照配列ペプチド１のペプチド２１９におけるように連続残基Ａ、Ｋ、Ｇ及びＥを含む。例えばペプチドは、（ａ）参照配列ペプチド１の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列（ただし、ペプチドのアミノ酸配列は、参照ペプチド１のペプチド２１９におけるように連続残基Ａ、Ｋ、Ｇ及びＥを含む（例えばペプチド２１９、ペプチド４５、ペプチド７９、ペプチド６７、ペプチド８０など）。）；（ｂ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列と実質的に同様の配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
【００４９】
参照ペプチドアミノ酸配列、ペプチド１のアミノ酸配列ＡＫＧＥを含有するペプチドセグメントの例には、（ａ）２３マー：ペプチド２；及びペプチド３；２２マー：ペプチド４；ペプチド５；及びペプチド６；１１マー：ペプチド７；ペプチド８；ペプチド９；及びペプチド１０；２０マー：ペプチド１１；ペプチド１２；ペプチド１３；ペプチド１４；及びペプチド１５；１９マー：ペプチド１６；ペプチド１７；ペプチド１８；ペプチド１９；ペプチド２０；及びペプチド２１；１８マー：ペプチド２２；ペプチド２３；ペプチド２４；ペプチド２５；ペプチド２６；ペプチド２７；及びペプチド２８；１７マー：ペプチド２９；ペプチド３０；ペプチド３１；ペプチド３２；ペプチド３３；ペプチド３４；ペプチド３５；及びペプチド３６；１６マー：ペプチド３７；ペプチド３８；ペプチド３９；ペプチド４０；ペプチド４１；ペプチド４２；ペプチド４３；ペプチド４４；及びペプチド４５；１５マー：ペプチド４６；ペプチド４７；ペプチド４８；ペプチド４９；ペプチド５０；ペプチド５１；ペプチド５２；ペプチド５３；及びペプチド５４；１４マー：ペプチド５６；ペプチド５７；ペプチド５８；ペプチド５９；ペプチド６０；ペプチド６１；ペプチド６２；ペプチド６３；及びペプチド６４；１３マー：ペプチド６７；ペプチド６８；ペプチド６９；ペプチド７０；ペプチド７１；ペプチド７２；ペプチド７３；ペプチド７４；及びペプチド７５；１２マー：ペプチド７９；ペプチド８０；ペプチド８１；ペプチド８２；ペプチド８３；ペプチド８４；ペプチド８５；ペプチド８６；及びペプチド８７；１１マー：ペプチド９３；ペプチド９４；ペプチド９５；ペプチド９６；ペプチド９７；ペプチド９８；ペプチド９９；及びペプチド１００；１０マー：ペプチド１０８；ペプチド１０９；ペプチド１１０；ペプチド１１１；ペプチド１１２；ペプチド１１３；及びペプチド１１４；９マー：ペプチド１２４；ペプチド１２５；ペプチド１２６；ペプチド１２７；ペプチド１２８；及びペプチド１２９；８マー：ペプチド１４１；ペプチド１４２；ペプチド１４３；ペプチド１４４；及びペプチド１４５；７マー：ペプチド１５９；ペプチド１６０；ペプチド１６１；及びペプチド１６２；６マー：ペプチド１７８；ペプチド１７９；及びペプチド１８０；５マー：ペプチド１９８；及びペプチド１９９；及び４マー：ペプチド２１９；（ｂ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列と実質的に同様の配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型、が含まれる（ここで、変異型は、置換変異型、欠失変異型、付加変異型及びこれらの組合せからなる群から選択され、セグメントは、４から２３の連続アミノ酸を含むか又は４から２３の連続アミノ酸からなる。）。
【００５０】
別の実施形態において、好ましいペプチド配列は、（ａ）参照配列、ペプチド１の１０から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列と実質的に同様の配列；及び（ｃ）（ａ）で定義されるアミノ酸配列の変異型、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、この場合、変異型は、置換変異型、欠失変異型、付加変異型及びこれらの組合せからなる群から選択され、好ましいアミノ酸配列には、２３マー：ペプチド２；２２マー：ペプチド４；２１マー：ペプチド７；２０マー：ペプチド１１；１９マー：ペプチド１６；１８マー：ペプチド２２；１７マー：ペプチド２９；１６マー：ペプチド３７；１５マー：ペプチド４６；１４マー：ペプチド５６；１３マー：ペプチド６７；１２マー：ペプチド７９；１１マー：ペプチド９２；１０マー：ペプチド１０６が含まれる。
【００５１】
さらなる実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列は、参照配列ペプチド１のＮ末端アミノ酸から始まり、参照配列ペプチド１のペプチド２１９におけるように連続残基Ａ、Ｋ、Ｇ及びＥを含み、一方、その他の実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列は、参照配列ペプチド１のＣ末端アミノ酸で終了し、参照配列ペプチド１のペプチド２１９におけるように連続残基Ａ、Ｋ、Ｇ及びＥを含む。
【００５２】
ペプチドは、参照アミノ酸配列に関して、１以上のアミノ酸欠失、置換及び／又は付加を含み得る。好ましくは、置換は保存的アミノ酸置換であり得るか、又は置換は非保存的アミノ酸置換であり得る。ある実施形態において、参照アミノ酸配列と実質的に同一であるか又は参照アミノ酸配列の変異型であるアミノ酸配列を有するペプチドを含むペプチドは、参照アミノ酸配列の対応する連続アミノ酸と比較して欠失又は付加を有さないが、保存的又は非保存的置換を有し得る。本発明のペプチドにおいて参照アミノ酸配列に施し得るアミノ酸置換には、、以下のものが含まれる（これらに限定されない。）：アラニン（Ａ）は、リシン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）又はイソロイシン（Ｉ）で置換され得；グルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）で置換され得；グリシン（Ｇ）はプロリン（Ｐ）で置換され得；リシン（Ｋ）は、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換され得；フェニルアラニン（Ｆ）は、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）又はアラニン（ａ）で置換され得；プロリン（Ｐ）はグリシン（Ｇ）で置換され得；グルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換され得；アルギニン（Ｒ）は、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換され得；セリン（Ｓ）はスレオニンで置換され得；スレオニン（Ｔ）はセリン（Ｓ）で置換され得；バリン（Ｖ）は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）で置換され得る。例えば、本発明のペプチドにおいて参照アミノ酸配列に施し得る置換には、フェニルアラニン（Ｆ）をアラニン（Ａ）で（例えば参照アミノ酸配列のアミノ酸位置４において）、グルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）で（例えば参照アミノ酸配列のアミノ酸位置３において）、アラニン（Ａ）をリシン（Ｋ）で（例えば参照アミノ酸配列のアミノ酸位置２及び／又は８において）及び／又はスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）で（例えば参照アミノ酸配列のアミノ酸位置７において）置換することが含まれる。
【００５３】
参照アミノ酸配列に関して本発明のペプチド（非修飾ペプチドならびに、例えばアミド形成などによるＮ末端及び／又はＣ末端修飾によって化学的に修飾されているペプチドを含む。）のアミノ酸配列中に置換が含まれる場合、ペプチドのアミノ酸配列と参照アミノ酸配列の間には好ましくは少なくとも８０％の配列同一性がある。５から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して１個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約９６％（即ち〜９５．７％）の配列同一性を有する。１０から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して１個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約９０％から約９６％（即ち〜９５．７％）の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して１個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約９５％から約９６％（即ち〜９５．７％）の配列同一性を有する。１０から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して２個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約９２％（即ち〜９１．３％）の配列同一性を有する。１６から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して２個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８７．５％から約９２％（即ち〜９１．３％）の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して２個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約９０％から約９２％（即ち〜９１．３％）の配列同一性を有する。１５から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して３個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約８７％の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して３個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８５％から約８７％の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照アミノ酸配列に関して４個のアミノ酸置換を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約８３％（即ち〜８２．６％）の配列同一性を有する。
【００５４】
本発明のペプチドにおいて、参照ペプチド（２４マーである）の連続アミノ酸に関して、参照２４アミノ酸配列から選択される連続２３アミノ酸配列（２３マー）における１個のアミノ酸の置換によって、２３マーが同一である参照ペプチドにおけるアミノ酸セグメントと９５．６５％（又は〜９６％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、前記２３マー中の２、３、４及び５個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９１．３０％（又は〜９１％）、８６．９６％（又は〜８７％）、８２．６１％（又は〜８３％）及び７８．２７％（又は〜７８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、２２マー中の１、２、３、４及び５個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９５．４５％（又は〜９５％）、９０．９１％（又は〜９１％）、８６．３６％（又は〜８６％）、８１．８２％（又は〜８２％）及び７７．２７％（又は〜約７７％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、２１マー中の１、２、３、４及び５個のアミノ酸の置換は、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９５．２４％（又は〜９５％）、９０．４８％（又は〜９１％）、８５．７１％（又は〜８６％）、８０．９５％（又は〜８１％）及び７６．１９％（又は〜７６％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、２０マー中の１、２、３、４及び５個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９５．００％（９５％）、９０．００％（９０％）、８５．００％（８５％）、８０．００％（８０％）及び７５．００％（７５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１９マー中の１、２、３及び４個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９４．７４％（〜９５％）、８９．４７％（〜８９％）、８４．２１％（〜８４％）及び７８．９５％（〜７９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１８マー中の１、２、３及び４個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９４．４４％（〜９４％）、８８．８９％（〜８９％）、８３．３３％（〜８３％）及び７７．７８％（〜７８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１７マー中の１、２、３及び４個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９４．１２％（〜約９４％）、８８．２３％（〜８８％）、８２．３５％（〜８２％）及び７６．４７％（〜７６％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１６マー中の１、２、３及び４個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９３．７５％（〜９４％）、８７．５０％（〜８８％）、８１．２５％（〜８１％）及び７５．００％（〜７５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１５マー中の１、２及び３個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９３．３３％（〜９３％）、８６．６７％（〜８７％）及び８０．００％（８０％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１４マー中の１、２及び３個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９２．８６％（〜９３％）、８５．７１％（〜８６％）及び７８．５７％（７９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１３マー中の１、２及び３個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９２．３１％（〜９２％）、８４．６２％（〜８５％）及び７６．９２％（〜７７％））の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１２マー中の１、２及び３個のアミノ酸の置換により、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９１．６７％（〜９２％）、８３．３３％（〜８３％）及び７５．００％（７５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１１マー中の１及び２個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９０．９１％（〜９１％）及び８１．８２％（〜８２％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、１０マー中の１及び２個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ９０．００％（９０％）及び８０．００％（８０％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、９マー中の１及び２個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ８８．８９％（〜８９％）及び７７．７８％（〜７８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、８マー中の１及び２個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドアミノ酸配列とそれぞれ８７．５０％（〜８８％）及び７５．００％（７５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。同様に、７マー、６マー、５マー及び４マー中の１個のアミノ酸の置換によって、参照ペプチドとそれぞれ８５．７１％（〜８６％）、８３．３３％（〜８３．３％）、８０．００％（８０％）及び７５．００％（７５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を備えたペプチドが得られる。本発明の好ましいアミノ酸配列は、参照配列におけるアミノ酸配列と８０％を超える配列同一性、より好ましくは参照配列におけるアミノ酸配列と８１％から９６％の配列同一性、より好ましくは参照配列におけるアミノ酸配列と８０％から９６％の配列同一性を有する。好ましいアミノ酸配列は、場合によっては、アミド結合によってＣ２−Ｃ２２直鎖脂肪族カルボン酸部分、より好ましくはＣ２−Ｃ１６直鎖脂肪族カルボン酸部分、最も好ましくはＣ２又はＣ１６直鎖脂肪族カルボン酸部分に、末端ペプチドアミノ基でＮ末端化学結合され得、場合によっては、アミド結合によってアンモニアなどのアミン又はＣ１−Ｃ１６直鎖脂肪族一級アミンなどの一級又は二級アミンに末端ペプチドカルボキシル基でＣ末端化学結合され得る。
【００５５】
１２マーであるペプチド７９の置換変異型の例には、例えば、ペプチド７９の位置３のＱがペプチド２３８中でＥによって置換された、ペプチド２３８；ペプチド７９の位置２のＡがペプチド２３３中でＫによって置換された、ペプチド２３３；ペプチド７９の位置８のＡがペプチド２３４中でＫによって置換された、ペプチド２３４；ペプチド７９の位置２と位置８のＡがペプチド２３５中でＫによって置換された、ペプチド２３５；ペプチド７９の位置４のＦがペプチド２３７中でＡによって置換された、ペプチド２３７；ペプチド７９の位置１０のＫがペプチド２３９中でＡによって置換された、ペプチド２３９；ペプチド７９の位置１１のＧがペプチド２４０中でＡによって置換された、ペプチド２４０；及びペプチド７９の位置１２のＥがペプチド２４１中でＡによって置換された、ペプチド２４１が含まれる。
【００５６】
１０マーであるペプチド１０６の置換変異型の例には、例えばペプチド１０６の位置４のＦがペプチド２３６中でＡによって置換された、ペプチド２３６；ペプチド１０６の位置１のＧがペプチド２４２中でＡによって置換された、ペプチド２４２；ペプチド１０６の位置３のＱがペプチド２４３中でＡによって置換された、ペプチド２４３；ペプチド１０６の位置５のＳがペプチド２４４中でＡによって置換された、ペプチド２４４；ペプチド１０６の位置６のＫがペプチド２４５中でＡによって置換された、ペプチド２４５；ペプチド１０６の位置７のＴがペプチド２４７中でＡによって置換された、ペプチド２４７；ペプチド１０６の位置１０のＫがペプチド２４８中でＡによって置換された、ペプチド２４８；ペプチド１０６の位置６及び位置１０のＫがペプチド２４９中でＡによりそれぞれ置換された、ペプチド２４９が含まれる。
【００５７】
８マーであるペプチド１３７の置換変異型の例には、例えばペプチド１３７の位置４のＦがペプチド２５０中でＡによって置換された、ペプチド２５０が含まれる。
【００５８】
４マーであるペプチド２１９の置換変異型の例には、例えばペプチド２１９の位置２のＫがペプチド２５１中でＡによって置換された、ペプチド２５１が含まれる。
【００５９】
本明細書中で述べるような置換変異型ペプチドは、単離ペプチドの形態又は、例えばミリストイルアミド、アセチルアミド及び明細書中で述べるものなどのＮ末端アミド、及び例えばアンモニアで形成されるアミドなどのＣ末端アミド、及びＮ末端アミドとＣ末端アミドの両方など、化学修飾ペプチドの形態であり得る。
【００６０】
参照アミノ酸配列に関して本発明のペプチドのアミノ酸配列に欠失が含まれる場合、好ましくはペプチドのアミノ酸配列と参照アミノ酸配列との間に少なくとも８０％の配列同一性を有する。５から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して１個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約９６％（即ち〜９５．７％）の配列同一性を有する。１０から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して１個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約９０％から約９６％（即ち〜９５．７％）の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して１個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と９５％から約９６％（即ち〜９５．７％）の配列同一性を有する。１０から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して２個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約９２％（即ち〜９１．３％）の配列同一性を有する。１６から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して２個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８７．５％から約９２％（即ち〜９１．３％）の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して２個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約９０％から約９２％（即ち〜９１．３％）の配列同一性を有する。１５から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して３個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約８７％の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して３個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８５％から約８７％の配列同一性を有する。２０から２３個のアミノ酸を有し、参照ペプチドに関して４個のアミノ酸欠失を含むペプチドは、参照アミノ酸配列と約８０％から約８３％（即ち〜８２．６％）の配列同一性を有する。
【００６１】
上述のように、ペプチドのアミノ酸の１以上はまた、化学的に修飾され得る。当技術分野で公知の何らかの方法を用いて、当技術分野で公知の何らかのアミノ酸修飾を、ペプチドのアミノ酸に対して施し得る。
【００６２】
ある実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端アミノ酸は修飾され得る。例えば、ペプチドのαＮ末端アミノ酸は、αＮ末端（Ｎ末端）アミノ（α−Ｈ２Ｎ−）基においてアルキル化、アミド化又はアシル化され得、例えば、ペプチドのＣ末端アミノ酸は、Ｃ末端カルボキシル（−ＣＯＯＨ）基においてアミド化又はエステル化され得る。例えば、Ｎ末端アミノ基は、アセチル基（即ちＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−）又はミリストイル基（この両者ともここで好ましい基である。）を含むアミドを形成するために何らかのアシル又は脂肪アシル基を含むようにアシル化によって修飾され得る。ある実施形態において、Ｎ末端アミノ基は、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは１から１５個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル基である。）を有するアシル基を含むように修飾され得るか、又は、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１（式中、Ｒ１は、１から１５個の炭素原子を有する直鎖アルキル基である。）を有するアシル基を含むように修飾され得る。Ｎ−アミドはまた、ホルムアミド（Ｒ＝Ｈ）でもあり得る。ペプチドのＣ末端アミノ酸も化学的に修飾され得る。例えば、Ｃ末端アミノ酸のＣ末端カルボキシル基は、カルボキシル基の代わりにカルボキサミド基に変換することにより（即ちアミド化）、化学的に修飾され得る。ある実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端アミノ酸は化学的に修飾されない。ある実施形態において、Ｎ末端基が修飾され、Ｃ末端基は修飾されない。ある実施形態において、Ｎ末端及びＣ末端基の両方が修飾される。
【００６３】
以下のものからなる群から選択される酸とともにＮ末端アミドを形成させるために、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基において、ペプチドがアシル化され得る：
（ｉ−ａ）直鎖、分枝（Ｃ３を上回るもの）であり得るか又は環（Ｃ３を上回るもの）を含み得る、Ｃ２（アセチル）からＣ１３脂肪族（飽和又は場合によっては不飽和）カルボン酸（例えば酢酸（好ましい基である。）との、プロパン酸、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸との、Ｎ−末端アミド）；
（ｉ−ｂ）直鎖、分枝状であり得るか又は環を含み得る、飽和Ｃ１４脂肪族カルボン酸；
（ｉ−ｃ）直鎖、分枝状であり得るか又は環を含み得る、不飽和Ｃ１４脂肪族カルボン酸；
（ｉ−ｄ）直鎖、分枝状であり得るか又は環を含み得る、Ｃ１５からＣ２４脂肪族（飽和又は場合によっては不飽和）カルボン酸（例えばテトラデカン酸（ミリスチン酸、これは好ましい基である。）、ヘキサデカン酸、９−ヘキサデセン酸、オクタデカン酸、９−オクタデセン酸、１１−オクタデセン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、６，９，１２−オクタデカトリエン酸、エイコサン酸、９−エイコセン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、ドコサン酸、１３−ドコセン酸、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸、テトラコサン酸など）；
（ｉｉ）トリフルオロ酢酸；
（ｉｉｉ）安息香酸；及び
（ｉｖ−ａ）脂肪族アルキルスルホンアミドを形成するＣ１−Ｃ１２脂肪族アルキルスルホン酸（ここで、スルホン酸のＣ１−Ｃ１２脂肪族アルキル炭素鎖構造は、上述した脂肪族アルキルカルボン酸における脂肪族アルキルカルボン酸鎖の構造に類似する。）。例えば、ペプチドは、（Ｃ１−Ｃ１１）−アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＨと表わされるカルボン酸基を用いて、カルボン酸基の活性化による脱水結合を通して（Ｃ１−Ｃ１１）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ペプチドと表わされるアミドを形成するようにアシル化され得る。同様に、スルホンアミドは、（Ｃ１−Ｃ１２）−アルキル−Ｓ（Ｏ２）−ＮＨ−ペプチドと表わされるスルホンアミドを形成するように、スルホン酸種（（Ｃ１−Ｃ１２）−アルキル−Ｓ（Ｏ２）−Ｘ（例えば、式中、Ｘはハロゲン又はＯＣＨ３又はその他の適合性脱離基である。）と表わされる。）を、Ｎ末端アミノ基と反応させることによって形成され得る。
【００６４】
（ｉｖ−ｂ）脂肪族アルキルスルホンアミドを形成するＣ１４−Ｃ２４脂肪族アルキルスルホン酸（ここで、スルホン酸のＣ１４−Ｃ２４脂肪族アルキル炭素鎖構造は、上述の脂肪族アルキルカルボン酸における脂肪族アルキルカルボン酸鎖の構造に類似する。）からなる群から選択される酸とＮ−末端アミドを形成するようにＮ末端アミノ酸のアミノ基でアシル化され得る。例えばペプチドは、（Ｃ１３−Ｃ２３）−アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＨと表わされるカルボン酸基を用いて、カルボン酸基の活性化による脱水結合を通して（Ｃ１３−Ｃ２３）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ペプチドと表わされるアミドを形成するようにアシル化され得る。同様に、スルホンアミドは、（Ｃ１４−Ｃ２４）−アルキル−Ｓ（Ｏ２）−ＮＨ−ペプチドと表わされるスルホンアミドを形成するように、スルホン酸種（（Ｃ１４−Ｃ２４）−アルキル−Ｓ（Ｏ２）−Ｘ（例えば、式中、Ｘはハロゲン又はＯＣＨ３又はその他の適合性脱離基である。）と表わされる。）をＮ末端アミノ基と反応させることによって形成され得る。
【００６５】
別の例として、Ｎ末端アミノ酸のＮ末端アミノ基は、Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキル基でアルキル化され得る（この脂肪族アルキル基の構造は上述したとおりである。）。アルキル化は、例えば、脂肪族アルキルハロゲン化物又は脂肪族アルキルスルホン酸エステル（メシレート、トシレートなど）を用いて、好ましくは一級アルキルハロゲン化物又は一級アルキルスルホン酸エステルを用いて実施され得る。Ｎ末端アミノ酸はまた、アセチル基（即ちＣ（Ｏ）ＣＨ３、これは好ましい基である。）、ミリストイル基（これは好ましい基である。）、ブタノイル基、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、テトラデカノイル基、ヘキサデカノイル基、９−ヘキサデセノイル基、オクタデカノイル基、９−オクタデセノイル基、１１−オクタデセノイル基、９，１２−オクタデカジエノイル基、９，１２，１５−オクタデカトリエノイル基、６，９，１２−オクタデカトリエノイル基、エイコサノイル基、９−エイコセノイル基、５，８，１１，１４−エイコサテトラエノイル基、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエノイル基、ドコサノイル基、１３−ドコセノイル基、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエノイル基、テトラコサノイル基（アミド結合によってペプチドの末端アミノ基に共有結合している。）を含むアミドとして何らかのアシル又は脂肪族アシル脂肪アシル基を含むように末端アミノで修飾され得る。
【００６６】
本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基も化学的に修飾され得る。例えば、Ｃ末端アミノ酸は、アンモニアのアミド（好ましい基である。）；Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキルアミン、好ましくは直鎖脂肪族アルキルアミンのアミド；ヒドロキシル置換Ｃ２−Ｃ１２脂肪族アルキルアミンのアミド；直鎖２−（Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキル）オキシエチルアミン基のアミド；及びω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エチルアミン基（ω−メトキシ−ＰＥＧ−α−アミン基又はω−メトキシ−（ポリエチレングリコール）アミン基とも呼ばれる。）（式中、ｎは０から１０である。）のアミドなどのアミド基を形成するために、ペプチドのＣ末端カルボン酸基とアミンの反応によって化学的に修飾され得る。ペプチドのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基はまた、Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキルアルコールのエステル及び２−（ω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ）−エタノール（ＭＰＥＧ）基（式中、ｎは０から１０である。）のエステルからなる群から選択されるエステルの形態でもあり得る。ある態様において、ＰＥＧエステル、ＭＰＥＧエステル、ＰＥＧアミド、ＭＰＥＧアミドなどのポリエチレングリコール成分は、好ましくは、約５００から４０，０００ダルトン、より好ましくは１０００から２５，０００ダルトン、最も好ましくは約１０００から約１０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００６７】
式、ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって表わされ得るペプチド上のＣ末端カルボン酸基はまた、アンモニア又は一級もしくは二級アミン、好ましくは、アンモニア又は一級アミンとの反応を促進するために、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル、３−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−４−オキソ−ベンゾ−トリアゾン（ＯＤｈｂｔ）エステルなどの活性化形態への変換によってアミド化され得、好ましくは、一方で、ペプチドにおける何らかのその他の反応基が、ベンジルエステル、ｔ−ブチルエステル、フェニルエステルなどの、ペプチド合成、特にペプチド固相合成の技術分野において周知の合成化学的に適合性の保護基によって保護されている。得られるペプチドアミドは、式、ペプチド−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ３Ｒ４（アミドはペプチドのＣ末端に位置する。）（式中、Ｒ３及びＲ４は、水素；上述の、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、シクロプロピルメチル、ヘキシル、ドデシルなどのＣ１−Ｃ１２アルキル及び、場合によってはより高い、例えばテトラデシルなどのＣ１４−Ｃ２４及び上述のものなどからなる群から独立して選択される。）によって表わされ得る。
【００６８】
Ｃ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸はまた、２−ヒドロキシエチルアミン、４−ヒドロキシブチルアミン及び１２−ヒドロキシドデシルアミンなどのヒドロキシル置換Ｃ２−Ｃ１２脂肪族アルキルアミン（ヒドロキシル基はアミンの窒素原子ではなく炭素原子に結合している。）のアミドに変換され得る。
【００６９】
Ｃ末端カルボン酸はまた、ヒドロキシル基が、上述のようなＣ２−Ｃ１２脂肪族カルボン酸とエステルを形成するようにアシル化され得る、ヒドロキシル置換Ｃ２−Ｃ１２脂肪族アルキルアミンのアミドに変換され得る。好ましくは、式、ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＮＲ５Ｒ６によって表わされるペプチドのＣ末端のペプチドアミドにおいて、Ｒ５は水素であり、Ｒ６は、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル及びヒドロキシル置換Ｃ２−Ｃ１２アルキルからなる群から選択される。
【００７０】
Ｃ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸は、直鎖２−（Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキル）オキシエチルアミンのアミドに変換され得る。このようなアミドは、例えば、直鎖Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキルエタノールを与える、２−クロロエタノールを含むジグリム中の水素化カリウムと直鎖Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルコールの反応によって調製して、直鎖Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキルエタノールを得ることができ、これをアルデヒドに酸化し、次にアミンへと還元的アミノ化することによって（例えばアンモニアを用いて）、又はハロゲン化アルキルに変換し（例えば塩化チオニルを用いて）、次にアンモニアなどのアミンで処理することによって、アミンに変換することができる。
【００７１】
Ｃ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸は、直鎖ＰＥＧ−アミンのアミドに変換され得る（例えば、ω−メトキシ−ＰＥＧ−α−アミンなどのω−ヒドロキシ−ＰＥＧ−α−アミン；ω−（Ｃ１−Ｃ１２）−ＰＥＧ−α−アミン、即ちＭＰＥＧ−アミン）。ある態様において、ポリエチレングリコール又はＰＥＧ成分は、好ましくは、約５００から４０，０００ダルトン、より好ましくは１０００から２５，０００ダルトン、最も好ましくは約１０００から約１０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００７２】
Ｃ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基はまた、ω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エチルアミン（式中、ｎは０から１０であり、これは、例えば、上述のようなアミンにアルコールを変換することにより、対応するω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エタノールから調製することができる。）アミドに変換され得る。
【００７３】
別の実施形態において、Ｃ末端カルボキシルは、式、ペプチド−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７は水素であり、Ｒ８は、直鎖２−（Ｃ２−Ｃ１２脂肪族アルキル）オキシエチル基（式中、Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキル部分は上述したとおりであり、メトキシエチル（即ちＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−）、２−ドデシルオキシエチルなどのような基を含む。）であるか；又はＲ７は水素であり、Ｒ８は、ω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ−エチル基である。（式中、ポリ（エチレンオキシ）部分のｎは、２−メトキシエチル（即ちＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−）、ω−メトキシエトキシエチル（即ちＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−）からＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１０−ＣＨ２ＣＨ２−までのように、０から１０である。））によって表わされるアミドに変換され得る。
【００７４】
ペプチドのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基はまた、Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキルアルコールのエステル、上述したようなアルコールの脂肪族アルキル部分の形態でもあり得る。ペプチドのＣ末端アミノ酸のＣ末端カルボン酸基はまた、酸化エチレンの化学量論量（化学量論量はｎの大きさに依存する。）とナトリウム２−メトキシエタノレートのような２−メトキシエタノールの反応から調製され得る、２−（ω−メトキシ−ポリ（エチレンオキシ）ｎ）−エタノール基（式中、ｎは０から１０である。）のエステルの形態でもあり得る。
【００７５】
ペプチドのアミノ酸の側鎖も化学的に修飾され得る。例えば、フェニルアラニン又はチロシンにおけるフェニル基は、次のものからなる群から選択される置換基で置換され得る。
【００７６】
メチル（好ましい。）、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、シクロプロピル、２−メチルシクロプロピル、シクロヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコサニル、ドコサニル、テトラコサニル、９−ヘキサデセニル、９−オクタデセニル、１１−オクタデセニル、９，１２−オクタデカジエニル、９，１２，１５−オクタデカトリエニル、６，９，１２−オクタデカトリエニル、９−エイコセニル、５，８，１１，１４−エイコサテトラエニル、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエニル、１３−ドコセニル及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエニルなどのＣ１−Ｃ２４脂肪族アルキル基（即ち直鎖又は分枝状及び／又は飽和又は不飽和及び／又は環状基）；
不飽和の部位から離れた少なくとも１個の炭素原子においてヒドロキシル基で置換されたＣ１−Ｃ１２脂肪族アルキル基（ヒドロキシアルキル基の例は、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシドデシルなどを含む。）；
酢酸、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、９−ヘキサデセン酸、オクタデカン酸、９−オクタデセン酸、１１−オクタデセン酸、９，１２−オクタデカジエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、６，９，１２−オクタデカトリエン酸、エイコサン酸、９−エイコセン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、ドコサン酸、１３−ドコセン酸、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸、テトラコサン酸などの酸、コハク酸などのジカルボン酸、又は乳酸などのヒドロキシ酸のＣ２−Ｃ２５脂肪族カルボキシル基でエステル化されているヒドロキシル基で置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基（ここで、エステル置換基の炭素原子の総数は３から２５である。）；
フルオロ−、クロロ−、ブロモ−及びヨード−などのハロゲン；ニトロ−；
ＮＨ２、メチルアミノ、ジメチルアミノなどのアミノ−；トリフルオロメチル−；
カルボキシル（−ＣＯＯＨ）；
メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、シクロプロピルオキシ、２−メトキシシクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシ、オクチルオキシ、デシルオキシ、ドデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、エイコサニルオキシ、ドコサニルオキシ、テトラコサニルオキシ、９−ヘキサデセニルオキシ、９−オクタデセニルオキシ、１１−オクタデセニルオキシ、９，１２−オクタデカジエニルオキシ、９，１２，１５−オクタデカトリエニルオキシ、６，９，１２−オクタデカトリエニルオキシ、９−エイコセニルオキシ、５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルオキシ、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエニルオキシ、１３−ドコセニルオキシ及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエニルオキシなどのＣ１−Ｃ２４アルコキシ（チロシンのアルキル化によって形成され得るものなど）；及び
２−ヒドロキシエチルオキシなどのＣ２−Ｃ１２ヒドロキシアルキルオキシ及び上述のようなカルボン酸又はトリフルオロ酢酸とのそのエステル。
【００７７】
セリンヒドロキシル基は、
上述のようなＣ２−Ｃ１２脂肪族カルボン酸基；
トリフルオロ酢酸基；
及び安息香酸基
からなる群から選択される置換基でエステル化され得る。
【００７８】
リシン内のεアミノ基は、例えば、上述のような、Ｃ２−Ｃ１２脂肪族カルボン酸基（例えば、酸塩化物、無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル、３−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−４−オキソ−ベンゾ−トリアゾン（ＯＤｈｂｔ）エステルなどのカルボン酸の化学的活性化形態とアミンの反応による。）、又は安息香酸基、又はアミノ酸基とのアミド形成によって、化学的に修飾され得る。さらに、リシン内のεアミノ基は、１又は２個のＣ１−Ｃ４脂肪族アルキル基でのアルキル化によって化学的に修飾され得る。
【００７９】
グルタミン酸内のカルボン酸基は、アンモニア；メチルアミンを含むＣ１−Ｃ１２一級脂肪族アルキルアミン（このアルキル部分は上述したとおりである）；又はアミノ酸のアミノ基などのアミンとのアミドの形成によって修飾され得る。
【００８０】
グルタミン酸内のカルボン酸基は、上述のＣ１−Ｃ１２脂肪族ヒドロキシアルキル基とのエステル、好ましくは、メタノール、エタノール、プロパン−１−オール、ｎ−ドデカノール及び上述したものなどの、Ｃ１−Ｃ１２脂肪族アルキルの第一級アルコールとのエステルの形成によって修飾され得る。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明は、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量を対象の組織及び／又は体液へ投与することを含む、対象の組織及び／又は体液における少なくとも１つの炎症性細胞での顆粒からの少なくとも１つの炎症メディエーターの放出を阻害する方法を含む：
（ａ）参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）を有するアミノ酸配列；及び
（ｃ）（ａ）で定義される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列（ここで、このペプチドのＣ末端アミノ酸は、場合によっては独立に化学的に修飾され、このペプチドのＮ末端アミノ酸は、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１４飽和（ミリスチン酸）又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５から２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸でのアシル化により独立に化学的に修飾されるか、又は化学的に修飾されておらず、ただし、そのアミノ酸配列が、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１４不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５から２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸のみでのアシル化による参照配列の配列ＧＡＱＦで始まる場合は前記ペプチドはアシル化により修飾されるか、又は化学的に修飾されず、ここで、前記ペプチドは、前記少なくとも１つのペプチド非存在下で起こる炎症性細胞の同じタイプの少なくとも１つからの前記炎症性メディエーターの放出と比較して少なくとも１つの炎症性細胞からの前記炎症性メディエーターの放出を低下させるために治療的に有効な炎症性メディエーター放出低下量で、医薬的に許容可能な担体と場合によっては組合わされる。
【００８２】
本方法は、好ましくは、αＮ末端アミノ酸においてアセチル化され得るペプチドを使用する。このペプチドは、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基からなり得、好ましくは、アセチル−ペプチド１０６（配列番号１０６）により包含される。
【００８３】
本方法はまた、少なくとも４個の連続アミノ酸残基及びより好ましくは、少なくとも６個の連続アミノ酸残基からなるペプチドも使用する。さらに、このペプチドは、αＮ末端アミノ酸でミリストイル化され得る。本方法はまた、αＣ末端アミノ酸でアンモニアによりアミド化され得るペプチドも利用し得る。
【００８４】
さらなる実施形態における方法は、（ａ）参照配列の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むペプチドを利用する（ここで、（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸は、参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）のアミノ酸位置２から２１から選択される。）。さらに、これらのペプチドは、αＮ末端アミノ酸においてミリストイル化され得、またαＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化され得る。
【００８５】
本発明による投与の方法は、前記対象において炎症性細胞から炎症性メディエーターを放出する機構を遮断又は阻害することとして、炎症性メディエーターの放出の低下を定義する。
【００８６】
投与の方法は、医薬組成物を生成させるために、医薬的に許容可能な担体と開示ペプチドを組み入れるか又は混合することを含む。
【００８７】
本発明の投与の方法は、前記少なくとも１つのペプチドの非存在下で起こる同じタイプの炎症性細胞の少なくとも１つからの炎症性メディエーターの放出と比較して、この少なくとも１つの炎症性細胞からの前記炎症性メディエーターの放出を低下させるための、少なくとも１つの前記炎症性メディエーター放出低下量を放出する。前記対象における炎症性細胞は、白血球、顆粒球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ又はその組み合わせであり得る。
【００８８】
少なくとも１つの炎症性細胞の少なくとも１つの顆粒から放出される炎症性メディエーターは、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］、リゾチーム、グランザイム、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、走化因子、サイトカイン、アラキドン酸の代謝産物、デフェンシン、殺菌性透化亢進タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−硫酸、プロテイナーゼ３、ラクトフェリン、コラゲナーゼ、補体活性化因子、補体受容体、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球−走化因子、ヒスタミナーゼ、ビタミンＢ１２結合タンパク質、ゲラチナーゼ、プラスミノゲン活性化因子、β−Ｄ−グルクロニダーゼ及びその組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、炎症性メディエーターは、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム及びその組み合わせからなる群から選択される。
【００８９】
前記ペプチドの前記有効な炎症性メディエーター放出低下量は、ペプチドの非存在下で少なくとも１つの炎症性細胞から放出される量と比較して、約１％から約９９％又は好ましくは約５−５０％から約９９％、少なくとも１つの炎症性細胞から放出される炎症性メディエーターの量を低下させるペプチドの脱顆粒阻害量を含む、請求項１３に記載の方法。
【００９０】
本発明の方法は、呼吸器疾患に罹患している対象の治療に有用である。この呼吸器疾患は、喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び嚢胞性線維症であり得る。本発明により治療することができる対象は好ましくは哺乳動物（ヒト、イヌ、ウマ及びネコなど）である。
【００９１】
本発明のペプチドの投与方法は、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺内投与、鼻腔投与及び経口投与による。より好ましくは、肺内投与はエアロゾルを含み、これは、乾燥粉末吸入器、定量吸入器又は噴霧器から生成され得る。さらに、対象への投与は、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症化合物及び免疫調整剤からなる群から選択される第二の分子の投与をさらに含み得る。
【００９２】
本方法はまた、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、疼痛症候群及びそれらの組み合わせからなる群から選択される疾患に罹患している対象の治療にも有用である。とりわけ、腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される。本方法により治療可能である皮膚疾患には、酒さ、湿疹、乾癬及び重度にきびが含まれる。さらに、関節炎に罹患している対象も本発明により治療し得る。
【００９３】
ある実施形態における本発明は、参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）の４から２３の連続アミノ酸を有する（ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むペプチドの投与を包含する。これらのペプチドは、好ましくは、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１及び２５２からなる群から選択される。これらのペプチドは、さらに、αＮ末端アミノ酸においてアセチル化されるか又はαＮ末端アミノ酸においてミリストイル化され、場合によってはαＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化され得る。
【００９４】
本発明の方法はまた、本明細書中に記載のとおりの本発明のペプチドの投与により、対象において粘液過剰分泌を低下させるために、また、対象において少なくとも１つの粘液分泌細胞又は組織からのＭＡＲＣＫＳ関連粘液過剰分泌を低下させるためにも有用であり、これにより、前記ペプチドの前記投与がない場合に起こるものと比較して、対象における粘液過剰分泌が低下する。
【００９５】
本発明は、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ペプチドに関する：
（ａ）参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）を有するアミノ酸配列；及び
（ｃ）（ａ）で定義される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列
（ここで、このペプチドのＣ末端アミノ酸は場合によっては独立に化学的に修飾されており、このペプチドのＮ末端アミノ酸は、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和の脂肪族カルボン酸、Ｃ１４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５からＣ２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸でのアシル化によって独立に化学的に修飾されるか又は化学的に修飾されず、ただし、前記ペプチドは、Ｃ２からＣ１３の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１４の不飽和脂肪族カルボン酸、Ｃ１５からＣ２４の飽和又は不飽和脂肪族カルボン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択されるカルボン酸でのみのアシル化によって、そのアミノ酸配列が参照配列のＧＡＱＦで始まる場合にアシル化により修飾されるか、又は化学的に修飾されず、前記ペプチドは、前記少なくとも１つのペプチド非存在下で生じる炎症性細胞の同じタイプの少なくとも１つからの炎症性メディエーターの放出と比較して少なくとも１つの炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を低下させるために治療的に有効な炎症性メディエーター放出低下量で、医薬的に許容可能な担体と場合によっては組合わせられる。）。
【００９６】
単離ペプチドは、αＮ末端アミノ酸でアセチル化され得る。本単離ペプチドは少なくとも１０個の連続アミノ酸残基からなり、好ましくは、アセチル−ペプチド１０６（配列番号１０６）からなる単離ペプチドである。
【００９７】
さらなる実施形態において、本ペプチドは、少なくとも４個の連続アミノ酸残基からなるか又はペプチドは少なくとも６個の連続アミノ酸残基からなる。
【００９８】
本ペプチドはまた、αＮ末端アミノ酸でミリストイル化され得、及び／又はペプチドは、αＣ末端アミノ酸でアンモニアによりアミド化され得る。
【００９９】
単離ペプチドは、上述の（ａ）のアミノ酸配列、（ａ）参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）の４から２３の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列をさらに含み得；この場合、（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸は、参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）のアミノ酸位置２から２１から選択される。このペプチドは、さらにαＮ末端アミノ酸においてミリストイル化もしくはアセチル化され得るか、又は場合によってはαＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化され得る。
【０１００】
さらなる実施形態における単離ペプチドおいて、アミノ酸配列は、参照配列、ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）の４から２３の連続アミノ酸を有する（ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一である。これらのペプチドは、好ましくは、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１及び２５２からなる群から選択される。これらのペプチドは、さらに、αＮ末端アミノ酸においてアセチル化され得るか又はαＮ末端アミノ酸においてミリストイル化され、場合によってはαＣ末端アミノ酸においてアンモニアによりアミド化され得る。（ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一である（ｃ）のアミノ酸配列は、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１及び２５２からなる群から選択される。
【０１０１】
本発明はまた、上記段落において及び本明細書中で記載のとおりの単離ペプチドと、賦形剤と、を含む組成物も包含する。本発明はまた、上記段落において及び本明細書中で記載のとおりの単離ペプチドと、医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物も包含する。本医薬組成物は、さらに、好ましくは、無菌、滅菌可能又は滅菌済みであり得る。これらのペプチドは、投与に有用な薬剤とともにキットに含有され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、ＰＫＣ依存性リン酸化が、原形質膜から細胞質にＭＡＲＣＫＳを放出させることを示す。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、ＰＰ２Ａを活性化することにより、ＰＫＧがＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を誘導することを示す。
【図３】図３は、ＰＰ２Ａがムチン分泌経路の必須成分であることを示す棒グラフを示す。
【図４】図４は、ＭＡＲＣＫＳが細胞質においてアクチン及びミオシンと会合することを示すゲルである。
【図５】図５は、好中球においてＭＰＯ分泌を調節するシグナル伝達機構を示す。
【図６】図６は、ＭＡＮＳペプチドがイヌ単離好中球からのミロペルオキシダーゼ分泌を阻止する能力を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＭＡＮＳペプチドがヒト単離好中球からのミロペルオキシダーゼ分泌を阻止する能力を示す棒グラフである。
【図８】図８は、ＬＰＳ刺激ヒト好中球からのＭＰＯ分泌の微増をＰＭＡが刺激し、この増加が８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでの同時刺激によって濃度依存的に促進されることを示す棒グラフである。
【図９】図９は、ＰＭＡでの同時刺激が濃度依存的に起こるまで、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激が、ＬＰＳ刺激ヒト好中球からのＭＰＯ分泌にあまり影響しないことを示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、ＬＰＳ刺激イヌ好中球からのＭＰＯ分泌の微増をＰＭＡが刺激し、この増加が８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでの同時刺激によって濃度依存的に促進されることを示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＰＭＡでの同時刺激が濃度依存的に起こるまで、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰシミュレーションが、ＬＰＳ刺激イヌ好中球からのＭＰＯ分泌にあまり影響しないことを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでの同時刺激が、ＬＰＳ刺激イヌ好中球からの最大ＭＰＯ分泌に必要であることを示す棒グラフである。  発明の詳細な説明  添付の図面を参照しながら、本明細書中で以後、本発明をより詳細に説明するが、ここで、本発明の好ましい実施形態を説明する。しかし、本発明は、様々な形態で含まれ得るものであり、本明細書中に記載の実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が完全であり、当業者に対して本発明の範囲を完全に伝えるものであるように与えられる。
【０１０３】
別段の断りがない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明の属する技術分野の熟練者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で言及する、刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は全て、それらの全体において参照により組み込まれる。本発明の何らかの態様を述べるための「ａ」又は「ａｎ」という語の使用は、１以上を指すと解釈されたい。
【０１０４】
本発明は、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの非存在化で起こる炎症性細胞の同じタイプからの炎症性メディエーターの放出と比較して炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を低下させるのに有効な量の、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの炎症性細胞（この細胞は、細胞内側の小胞内に含有される少なくとも１つの炎症性メディエーターを含む。）を接触させることを含む、少なくとも１つの炎症性細胞からの少なくとも１つの炎症性メディエーターのエキソサイトーシス放出を阻害する方法に関する。
【０１０５】
本発明はさらに、ＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの非存在化で起こる炎症性細胞の同じタイプの少なくとも１つからの炎症性メディエーターの放出と比較してこの少なくとも１つの炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を低下させるために治療的に有効な量でＭＡＮＳペプチド及びその活性断片からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物の治療的有効量を、対象の組織及び／又は体液（これは、細胞内側の小胞内に含有される少なくとも１つの炎症性メディエーターを含む少なくとも１つの炎症性細胞を含む。）に投与することを含む、対象の組織又は体液における少なくとも１つの炎症性細胞からの少なくとも１つの炎症性メディエーターの放出を阻害する方法に関する。とりわけ、炎症性メディエーターの放出を低下させることは、炎症性細胞から炎症性メディエーターを放出する機構を阻止又は阻害することを含む。
【０１０６】
本発明は、細胞内部の小胞内に含有される少なくとも１つの炎症性メディエーターを含有する対象の組織又は体液に含有され得る何らかの既知の炎症性細胞との、上記及び本願を通じて記載するペプチドの接触及び／又は投与に関する。炎症性細胞は、好ましくは、白血球、より好ましくは顆粒球であり、これは、好中球、好塩基球、好酸球又はその組み合わせにさらに分類され得る。本方法で接触させる炎症性細胞は単球／マクロファージでもあり得る。
【０１０７】
本発明は、炎症性細胞の小胞内に含有される炎症性メディエーターの放出を低下させることに関し、これらの炎症性メディエーターは、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム、ヒスタミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、走化因子、サイトカイン、アラキドン酸代謝産物、デフェンシン、殺菌性透化亢進タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−硫酸、プロテイナーゼ３、ラクトフェリン、コラゲナーゼ、補体活性化因子、補体受容体、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球−走化因子、ヒスタミナーゼ、ビタミンＢ１２結合タンパク質、ゲラチナーゼ、プラスミノゲン活性化因子、β−Ｄ−グルクロニダーゼ及びその組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、これらの炎症性メディエーターは、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、リゾチーム、グランザイム及びその組み合わせからなる群から選択される。
【０１０８】
本発明は、本ペプチドの有効量を炎症性細胞と接触させるが、この場合、有効量は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の非存在下で少なくとも１つの炎症性細胞から放出される量と比較して、この少なくとも１つの炎症性細胞から放出される炎症性メディエーターの量を約１％から約９９％低下させる、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量として定義される。この量はまた、有効な炎症性メディエーター放出低下量としても知られる。より好ましくは、接触させるペプチドの有効量は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の非存在下で少なくとも１つの炎症性細胞から放出される量と比較して、この少なくとも１つの炎症性細胞から放出される炎症性メディエーターの量を約５−５０％から約９９％低下させる、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量を含む。
【０１０９】
本発明は、ある実施形態において、治療的有効量でＭＡＮＳペプチド及びその活性断片を含む少なくとも１つのペプチドの、対象（この対象は、呼吸器疾患（好ましくは、喘息、慢性気管支炎又はＣＯＰＤ）に罹患している。）の組織又は体液への投与に関する。さらなる実施形態において、この対象は、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、疼痛症候群及びそれらの組み合わせに罹患しているものであり得る。腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病又は過敏性腸症候群であり得る。対象は、皮膚疾患、例えば、酒さ、湿疹、乾癬又は重度にきびなど、に罹患しているものであり得る。対象は、関節炎、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデスなど、に罹患しているものでもあり得る。嚢胞性線維症に罹患している対象もまた、本方法及びペプチドによって治療され得る。本方法は、好ましくは、哺乳動物など、及び好ましくは、ヒト、イヌ、ウマ及びネコなどの対象の治療に有用である。
【０１１０】
対象の治療の方法は、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺内投与、鼻腔投与又は経口投与を含む、ＭＡＮＳペプチド又は本明細書中に記載の活性断片を含む１以上のペプチドの投与による。とりわけ、肺内投与は、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量吸入器及び噴霧器の群から選択される。さらに、開示される方法は、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症化合物及び免疫調整剤からなる群から選択される第二の分子の対象への投与をさらに含み得る。
【０１１１】
ある態様において、本発明は、医薬組成物を投与する方法に関する。この医薬組成物は、既知の化合物の治療的有効量と、医薬的に許容可能な担体と、を含む。「治療的有効」量は、本明細書中で使用する場合、対象が示す症状を軽減するのに十分な化合物の量である。この治療的有効量は、患者の年齢及び身体状態、治療を受ける患者の状態の重症度、治療期間、何らかの同時治療の性質、使用する医薬的に許容可能な担体及び当業者の知識及び技能内の類似因子により変化する。医薬的に許容可能な担体は、好ましくは、錠剤又はカプセルなどの固形投与形態である。経口投与のための液体製剤もまた使用され得、シロップ又は懸濁液の形態で調製され得る（例えば、活性成分、糖及びエタノール、水、グリセロール及びプロピレングリコールの混合物を含有する溶液）。必要に応じて、このような液体製剤は、１以上の次のもの：着色剤、香味剤及びサッカリン、を含み得る。さらに、カルボキシメチルセルロースなどの濃厚化剤もまた、その他の許容可能な担体、当技術分野で公知の選択物と同様に使用し得る。
【０１１２】
上述のように、本発明は、細胞性分泌プロセス、特に炎症性細胞から炎症性メディエーターを放出するものを制御するための方法に関する。本明細書中で使用する場合、「制御する」という用語は、阻止する、阻害する、減少させる、低下させる、増加させる、促進する又は刺激することを意味する。多くの細胞性分泌プロセスは、細胞内の膜結合小胞又は細顆粒からの内容物の放出を含む。膜結合小胞又は顆粒は、細胞内粒子として定義され、これは第一に小胞（又は細胞内部の小胞）であり、これは分泌され得る貯蔵物質を含有する。炎症性細胞に含有されるものなど、これらの小胞の内容物の中には、多数の哺乳動物組織における様々な病理に関与することが分かっているものがある。これらの分泌の影響の中には、炎症の際に以前に健康であった組織の損傷を含むと思われるものがある。本発明は、合成ペプチドを用いて細胞内分泌経路において重要な特異的分子を標的とすることにより、炎症性細胞において見出されるものを含む、何らかの膜結合小胞からの分泌を阻止する手段を提供する。このアプローチは、ヒト及び動物における幅広い過剰分泌及び炎症状態の治療に対して治療的に重要であり得る。
【０１１３】
とりわけ、本発明は、細胞の細胞質内の１以上の顆粒又は小胞における炎症性メディエーターを含有する炎症性細胞を標的とする。ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片から選択される１以上のペプチド（この全てを本明細書中で詳述する。）と細胞を接触させる。好ましくは、炎症性細胞との本ペプチドの接触は、特異的な組織又は組織内の体液にこれらの炎症性細胞が存在する疾患に罹患している対象への投与を介するものである。本ペプチドの投与又は細胞との本ペプチドの接触時に、本ペプチドは、炎症性メディエーターを含有する細胞内顆粒又は小胞の膜へのネイティブＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合と競合的に競合し、競合的に阻害する。炎症性細胞の小胞へのＭＡＲＣＫＳタンパク質の結合を阻止する結果、これらの細胞のこれらの小胞は、通常は細胞からの炎症性メディエーターのそれらの内容物をエキソサイトーシスにより放出するように刺激が与えられた場合に移動するので、細胞の原形質膜に移動しない。このように、本発明の方法は、細胞の原形質膜への移動を阻害し、つまり、炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を低下させる。炎症性細胞からのメディエーターの放出速度及び放出量の両方が、炎症性細胞に投与され、これと接触させられるペプチドの濃度に依存するので、時間とともにこの細胞から放出される炎症性メディエーター量が低下する。
【０１１４】
本発明のある有益性は、これが、ユニークな抗炎症療法と粘液分泌の直接阻止を含む治療を組み合わせ得ることである。免疫系の全般的抑制に影響を及ぼす現在の抗炎症療法を上回る本発明の有益性は、本ペプチドが、炎症性細胞から分泌される細胞内成分のみの分泌を阻止すると思われることである。このように、炎症性メディエーターの阻害を行っても、免疫系の多くの態様が機能するはずである。
【０１１５】
本発明の化合物は、細胞からの炎症性メディエーター放出を制御、即ち阻止し得る。この炎症性メディエーターの放出の阻害は、様々な疾患、例えば、炎症を含む疾患及び病的状態を予防及び治療するための魅力的な手段である。このように、本発明の化合物は、このような状態の治療に有用であり得る。これらは、気道疾患及び慢性炎症性疾患（以下に限定されないが、骨関節炎、多発性硬化症、ギランバレー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病及び全身性エリテマトーデスを含む。）を包含する。本発明の化合物もまた、様々な感染物質への反応など、前炎症性メディエーター及び酵素の高レベルの活性が関与するその他の疾患及び、関節リウマチ、毒性ショック症候群、糖尿病及び炎症性腸疾患などの自己免疫の多くの疾患を治療するためにも使用することができる。
【０１１６】
本ペプチドの使用及び本発明の方法は、本ペプチドの抗炎症性活性をその粘液分泌阻止能力と組み合わせる治療とともに炎症に対抗するための治療を含む。本ペプチドの、炎症及び粘液分泌の両方の阻止能力により治療され得る疾患には、以下に限定されないが、炎症性腸疾患、消化器疾患（即ち、胆嚢の炎症、メネトリエ病）及び炎症性気道疾患が含まれる。
【０１１７】
その他の前炎症性メディエーターは、炎症又は損傷部位への好中球の流入に関連する様々な疾患状態と関連付けられている。抗体を遮断することは、急性炎症における好中球が関与する組織損傷に対する有用な治療であることが示されている（Ｈａｒａｄａら、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ  ２、４８２）。炎症性メディエーターを放出し得る好中球以外の細胞には、その他の白血球、例えば、好塩基球、好酸球、単球及びリンパ球が含まれ、これらの細胞からの分泌に治療が向けられ得る。好中球、好酸球及び好塩基球は、顆粒球の各タイプ、即ち、その細胞質中に顆粒を有する白血球である。白血球は、細胞質顆粒中にパッケージ化され貯蔵される多くの炎症性メディエーターを合成する。これらのメディエーターの中でも、例えば、好中球中のミエロペルオキシダーゼ［ＭＰＯ］（Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  Ｎ、Ｃｏｗｌａｎｄ  ＪＢ．Ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７；８９：３５０３−３５２１）、好酸球中の好酸球ペルオキシダーゼ［ＥＰＯ］及び主要塩基性タンパク質［ＭＢＰ］（Ｇｌｅｉｃｈ  Ｇ  Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３）、単球／マクロファージ中のリゾチーム（Ｈｏｆｆ  Ｔ、Ｓｐｅｎｃｋｅｒ  Ｔ、Ｅｍｍｅｎｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ａ．、Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ  Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ、Ｓａｅｚ  Ｙ、Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞毒性リンパ球中のグランザイム（Ｂｏｃｈａｎ  ＭＲ、Ｇｏｅｂｅｌ  ＷＳ、Ｂｒａｈｍｉ  Ｚ．Ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｔｉｃ  ａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；１６４：２３４−２３９；Ｇｏｎｇ  Ｊ  Ｈ．、Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８；Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ、Ｔａｍ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘ��ｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９-３８３；及びＴａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０７−１０）が挙げられる。
【０１１８】
これらの細胞が損傷又は疾患組織部位へ浸潤する結果、これらのメディエーターは、損傷部位で放出され得、肺及びその他部位などで、炎症及び修復に関与し得る。白血球は、エキソサイトーシス機構を介してこれらの顆粒を放出する（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ  ＲＤ、Ｍｏｒｇａｎ  Ａ．Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２；Ｌｏｇａｎ  ＭＲ、Ｏｄｅｍｕｙｉｗａ  ＳＯ、Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２）。
【０１１９】
マスト細胞（通常は血流中を循環しない。）及び好塩基球は、ヒスタミンなどの予め形成された炎症性（アナフィラキシー）メディエーター；ヘパリン及びコンドロイチン硫酸塩などのプロテオグリカン；トリプターゼ、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン−Ｇ様プロテアーゼなどのプロテアーゼ；走化因子、サイトカイン及びアラキドン酸の代謝産物（脈管構造、平滑筋、結合組織、粘液腺及び炎症性細胞において作用する。）を貯蔵し、細胞活性化時に放出することができる分泌細胞質顆粒を含有する。
【０１２０】
多形核白血球（ＰＭＮ）としても知られる好中球は、循環白血球全体の５０から６０％を占める。好中球は、感染又は損傷部位での身体の生理的バリアに浸透する、細菌、真菌、原生動物、ウイルス、ウイルス感染細胞などの感染物質ならびに腫瘍細胞に対して作用する。好中球は、６段階の形態形成段階：骨髄芽球、前骨髄芽球、骨髄球、後骨髄球、非分節（桿状核）好中球及び分節（機能的活性）好中球を通じて成熟する。
【０１２１】
好中球において、炎症性メディエーターは、一次（アズール親和性）、二次（特異的）及び三次（ゲラチナーゼ）顆粒において、ならびに分泌小胞において貯蔵される。多くの炎症のメディエーターの中でも、一次（アズール親和性）顆粒は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、リゾチーム、デフェンシン、殺菌性透化亢進タンパク質（ＢＰＩ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２、コンドロイチン−４−硫酸及びプロテイナーゼ３（例えば、Ｈａｒｔｗｉｇ  ＪＨ、Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ、Ｒｏｓｅｎ  Ａ、Ｊａｎｍｅｙ  ＰＡ．Ｎａｉｍ  ＡＣ、Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．ＭＡＲＣＫＳ  ｉｓ  ａｎ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：６１８−６２２参照）を含有し；二次（特異的）顆粒は、リゾチーム、ラクトフェリン、コラゲナーゼ、補体活性化因子、ホスホリパーゼＡ２、補体受容体、例えば、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｎ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）受容体、ラミニン受容体、チトクロムｂ５５８、単球−走化因子、ヒスタミナーゼ及びビタミンＢ１２結合タンパク質を含有し；小型貯蔵顆粒は、ゲラチナーゼ、プラスミノゲン活性化因子、カテプシンＢ、カテプシンＤ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ及びチトクロムｂ５５８−を含有する。
【０１２２】
好中球顆粒は、抗細菌又は細胞毒性物質、中性プロテイナーゼ、酸性ヒドロラーゼ及び細胞質膜受容体のプールを含有する。アズール親和性顆粒構成因子の中でも、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、過酸化水素の次亜塩素酸への変換において不可欠な酵素である。過酸化水素及びハロゲン化補助因子と一緒に、これは、白血球−ミエロペルオキシダーゼ系の有効な殺菌及び細胞毒性機構を形成する。
【０１２３】
アズール親和性顆粒タンパク質の３０−５０％を構成するデフェンシンは、幅広い細菌、真菌及び一部のウイルスに対する細胞毒性がある小型の（分子量＜４０００）強力な抗細菌ペプチドである。これらの毒性は、その他のチャネル形成タンパク質（パーフォリン）と同様である標的細胞の膜透過性によるものであり得る。
【０１２４】
細菌透過性向上（ＢＰＩ）タンパク質は、パーフォリンのメンバーである。これは、グラム陰性細菌に対して高い毒性があるが、グラム陽性細菌もしくは真菌に対して毒性はなく、また、エンドトキシン、グラム陰性細菌細胞エンベロープの毒性リポ多糖成分を中和することもできる。
【０１２５】
ラクトフェリン封鎖剤は鉄を遊離させ、これにより、殺菌プロセスを生き延び、リゾチームへの細菌透過性を向上させる摂取微生物の増殖を妨げる。
【０１２６】
エラスターゼ及びカテプシンＧなどのセリンプロテアーゼは、細菌細胞エンベロープにおいてタンパク質を加水分解する。顆粒球エラスターゼの基質には、コラーゲン架橋及びプロテオグリカン、ならびに血管のエラスチン成分、靭帯及び軟骨が含まれる。カテプシンＤは、軟骨プロテオグリカンを切断し、ここで、顆粒球コラゲナーゼは、Ｉ型の切断において活性であり、骨、軟骨及び腱由来のＩＩＩ型コラーゲンに対しては活性の程度は低い。コラーゲン分解産物は、好中球、単球及び繊維芽細胞に対する走化性活性を有する。
【０１２７】
ライソゾーム性プロテアーゼの組織破壊性の制御には、α２−マクログロブリン及びα１−抗プロテアーゼなどのプロテアーゼ阻害剤が介在する。これらの抗プロテアーゼは、血清及び滑液中に存在する。これらは、プロテアーゼの活性部位に結合しこれを覆い隠すことにより、機能し得る。プロテアーゼ−抗プロテアーゼの不均衡は、気腫の病因に重要であり得る。
【０１２８】
アズール親和性顆粒は、主に、細胞内環境（食胞リソソーム空胞）で機能し、これらは、微生物の殺菌及び分解に関与する。好中球特異的顆粒は、細胞外にその内容物を放出し易く、炎症を開始することにおいて重要な役割を有する。特異的顆粒は、チトクロムｂ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼの成分、超酸化物の産生に関与する酵素）、補体断片ｉＣ３ｂ（ＣＲ３、ＣＲ４）に対する、ラミニンに対する受容体及びホルミルメチオニル−ペプチド化学誘引物質を含む、様々な原形質膜成分の細胞内の貯蔵場所である。その他のものに加えて、プラスミン形成及びＣ５ａからＣ５の切断に関与する、ヒスタミン、ビタミン結合タンパク質及びプラスミノゲン活性化因子の分解に関連するヒスタミナーゼがある。
【０１２９】
炎症における好中球顆粒の重要性は、顆粒が先天的に異常である数例の患者の研究から明らかである。チェディアック−東症候群の患者は、炎症性反応の確立速度に顕著な異常があり、ライソゾーム顆粒が異常に大きい。特異的顆粒欠損の先天性症候群は、非常にまれな疾患であり、炎症性反応の低下及び皮膚及び深部組織の重篤な細菌感染を特徴とする。
【０１３０】
これらの顆粒のエキソサイトーシス分泌を制御する機構は部分的にしか分かっていないが、そのプロセスにおけるいくつかの重要な分子が同定されており、それには、細胞内Ｃａ２＋過渡電流（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０；８７：９４７２−９４７６；Ｂｌａｃｋｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９０；２６６：１９５−２００）、Ｇタンパク質、チロシン及びタンパク質キナーゼ（ＰＫ、特にＰＫＣ）（Ｓｍｏｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９０；１０５２：１３３−１４２；Ｎｉｅｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９９４；１２２３：２６７−２７３；Ｎａｕｃｌｅｒら、Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎら、Ｃｈｅｓｔ  ２００２；１２１；１４２−１５０）、Ｒａｃ２（Ａｂｄｅｌ−Ｌａｔｉｆら、Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：８３２−８３９；Ｌａｃｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：２６７０−２６７９）及び様々なＳＮＡＲＥ’ｓ、ＳＮＡＰ’ｓ及びＶＡＭＰ’ｓ（Ｓｏｌｌｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９３；３６２：３１８−３２４；Ｌａｃｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００５；１０７：３５８−３７６）が含まれる。
【０１３１】
ＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド結合タンパク質受容体）タンパク質は、ＳＮＡＲＥモチーフと呼ばれるアルファ−へリックスコイルド−コイルドメインを特徴とする膜結合タンパク質のファミリーである（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：９４２−９６０（２００３））。これらのタンパク質は、小胞又は標的膜でのその局在化に基づき、ｖ−ＳＮＡＲＥ及びｔ−ＳＮＡＲＥとして分類され；別の分類スキームでは、ＳＮＡＲＥモチーフの中心において保存されているアルギニン又はグルタミン残基に基づくように、Ｒ−ＳＮＡＲＥ及びＱ−ＳＮＡＲＥと定義される。ＳＮＡＲＥは、分泌及びエンドサイトーシス輸送経路の別個の膜区画に局在し、細胞内の膜融合プロセスの特異性に関与する。ｔ−ＳＮＡＲＥドメインは、コイルド−コイルのねじれがある４−へリックス束からなる。ＳＮＡＲＥモチーフは、２つの膜の融合に関与する。ＳＮＡＲＥモチーフは４つのクラス：シンタキシン１ａ（ｔ−ＳＮＡＲＥ）、ＶＡＭＰ−２（ｖ−ＳＮＡＲＥ）及びＳＮＡＰ-２５のＮ−及びＣ末端ＳＮＡＲＥモチーフの相同物に分類される。各クラスからの１つのメンバーが相互作用し、ＳＮＡＲＥ複合体を形成し得る。ＳＮＡＲＥモチーフは、神経伝達物質放出に必要とされるシンタキシン１ａ（Ｌｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８４７０−８４７９（２０００））及びエンドソーム輸送小胞において見出されるシンタキシン６（Ｍｉｓｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：９１８４−９１８９（２００２））などのある種のシンタキシンファミリーメンバーのＮ末端ドメインにおいて見られる。
【０１３２】
ＳＮＡＰ−２５（シナプトソーム結合タンパク質２５ｋＤａ）タンパク質は、ＳＮＡＲＥ複合体の構成成分であり、これにより、膜融合の特異性が生じ、シナプス小胞及び原形質膜を結集させる堅い複合体（ＳＮＡＲＥ又はコア複合体）を形成することにより、直接融合を実行する。ＳＮＡＲＥは、コイルドコイルを形成する傾向が高く、カルボキシ末端膜貫通領域に先行することが多い、ＳＮＡＲＥモチーフとして知られる６０残基の配列を特徴とするタンパク質の大きなファミリーを構成する。シナプスコア複合体は、孤立時は構造化されていないが、集合して平行な４−へリックス束を形成する、４個のＳＮＡＲＥモチーフ（ＳＮＡＰ-２５から２個及びシナプトブレビン及びシンタキシン１から各１個）により形成される。コア複合体の結晶構造から、へリックス束のねじれが強く、その表面ならびに内部疎水性残基の層においていくつかの塩橋を含有することが明らかになっている。複合体の中心の極性層は、３個のグルタミン（ＳＮＡＰ−２５から２個及びシンタキシン１から１個）及び１個のアルギニン（シナプトブレビンから）により形成される（Ｒｉｚｏら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：６４１−６５３（２００２））。ＳＮＡＰ−２５ファミリーのメンバーは、膜結合のためにパルミトイル化され得るシステイン残基のクラスターを含有する（Ｒｉｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４４０８−２４４１４（１９９３））。
【０１３３】
好中球の主要な役割は、感染性物質を食菌し、分解することである。これらはまた、適応（特異的）免疫反応の開始前に、一部の微生物の増殖を制限する。好中球は宿主防御に不可欠ではあるが、これらは、多くの慢性炎症状態の病因において、及び虚血再灌流傷害においても関連付けられている。炎症性部位から取り出した体液において、好中球起源の加水分解酵素及び酸化的に不活性化されたプロテアーゼ阻害剤を検出することができる。正常な条件下で、好中球は、宿主組織に対して損傷を与えずに感染部位に移動し得る。しかし、宿主組織に対する望ましくない損傷が生じ得ることがある。この損傷は、いくつかの独立機構を通じて生じ得る。これらは、組織再構築の第一段階としての、移動中の未熟な活性化、一部の微生物の殺菌中の毒性産物の細胞外への放出、感染又は損傷宿主細胞及び破片の除去を含み得るが、そうでなければ、急性炎症反応を終結させることができない。虚血再灌流傷害には、罹患組織への好中球の流入及び続く活性化が関与する。これは、損傷宿主細胞から放出される物質により、又は、キサンチンオキシダーゼを通じた超酸化物生成の結果として、誘発され得る。
【０１３４】
正常な状態下で、血液は、正常な、刺激を受けた、活性化された、及び使用済みの、好中球の混合物を含有し得る。炎症性部位において、主に活性化された、及び使用済みの好中球が存在する。活性化好中球は、活性酸素中間体（ＲＯＩ）の生成を促進している。呼吸バーストが向上している好中球のサブ集団が、急性細菌感染に罹患しているヒト及び成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の患者の血液中で検出されている。これは好中球パラドックスの一例である。活性化好中球から放出される酸化物及び加水分解酵素により生じる肺及び関連組織の損傷へ好中球が大量に流入するので、好中球はこの状態の病因に関連づけられてきた。ＡＲＤＳが悪化するにつれて起こる好中球殺菌活性の障害は、炎症性産物により局所的に誘発される、宿主の一部における防御反応であり得る。
【０１３５】
熱傷の急性期にも好中球活性化が関与し、これに続き、様々な好中球機能が全般的に損なわれる。滑液中での免疫複合体による好中球の活性化は、関節リウマチの病因に関与する。好中球の慢性的活性化によってまた腫瘍成長も始まり得るが、これは、好中球により生成される一部のＲＯＩがＤＮＡに損傷を与え、プロテアーゼが腫瘍細胞の移動を促進するからである。重度熱傷の患者において、細菌感染の発症と、抗体及び補体受容体に対して陽性である好中球の割合及び絶対数の低下との間に相関があることが分かっている。好中球起源の酸化物はまた、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を酸化することも分かっており、これらは、特異的なスカベンジャー受容体を通じてマクロファージの原形質膜に対してより効率的に結合する。マクロファージによるこれらの酸化ＬＤＬの取り込みにより、アテローム性動脈硬化が引き起こされ得る。さらに、本態性高血圧、ホジキン病、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス及び敗血症の患者において、刺激を受けた好中球が見出されており、この場合刺激は、循環ＴＮＦ−α（カケクチン）が高濃度であることと相関する。
【０１３６】
抗酸化及び抗プロテアーゼスクリーンがつぶされる場合、宿主組織に対する加水分解性の損傷及び、その結果、慢性炎症状態が起こり得る。抗プロテアーゼ欠損は、気腫の病因に関与すると考えられる。多くの抗プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＥＲＰＩＮ）ファミリーのメンバーである。循環中に抗プロテアーゼが豊富にある場合、これらの大きなタンパク質は、選択的に炎症部位で排出され得るが、これは、好中球がその標的に接着するからである。酸化ストレスによって、細胞外抗プロテアーゼの濃度が放出プロテアーゼを阻害するのに必要なレベル未満に低下することにより組織損傷が引き起こされ得る。塩素化酸化物及び過酸化水素は、エラスターゼの内在性阻害剤である、α１−プロテアーゼ阻害剤及びα２−マクログロブリンなどの抗プロテアーゼを不活性化し得るが、抗プロテアーゼのさらなる不活性化に関与する、コラゲナーゼ及びゲラチナーゼなどの潜在性メタロプロテアーゼを同時に活性化する。
【０１３７】
好中球の細胞質構成因子はまた、全身性血管炎及び糸球体腎炎の発生に密接に関与する、特異的抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）の形成の原因でもあり得る。ＡＮＣＡは、好中球のアズール親和性又は一次顆粒中で主に見出される酵素に対する抗体である。ＡＮＣＡには３種類のタイプがあり、これらは、通常のエタノール固定好中球における間接的免疫蛍光法によりそれらが生成するパターンによって区別することができる。びまん性微小顆粒細胞質蛍光（ｃＡＮＣＡ）は、一般にウェゲナー肉芽種で見られ、時として顕微鏡的多発性動脈炎及びチャーグストラウス症候群において、時として半月体形成性及び分節性壊死性糸球体腎炎で見られる。標的抗原は通常プロテイナーゼ３である。顕微鏡的多発性動脈炎及び糸球体腎炎の多くの場合、核周辺蛍光（ｐＡＮＣＡ）が見られる。これらの抗体は、ミエロペルオキシダーゼに対するものであることが多いが、その他の標的としては、エラスターゼ、カテプシンＧ、ラクトフェリン、リゾチーム及びβ−Ｄ−グルクロニダーゼが挙げられる。「不定型」ＡＮＣＡと呼ばれる第三のグループには、好中球核蛍光及びいくつかの異常な細胞質パターンが見られ、一方、標的抗原のうち２−３では共通のｐＡＮＣＡがあり、その他は同定されていない。ｐＡＮＣＡはまた、クローン病の３分の１の患者でも見出される。関節リウマチ及びＳＬＥにおけるＡＮＣＡの報告事例は非常に多様であるが、そのパターンは主にｐＡＮＣＡ及び不定型ＡＮＣＡである。
【０１３８】
好酸球は、最終的に、主に粘膜下組織に存在し、アレルギー疾患を含む特異的な免疫反応部位に動員される最終段階白血球に分化する。好酸球細胞質は、電子が密集した結晶核及び部分的に透過性のマトリクスのある大きな長円体の顆粒を含有する。これらの大きな一次晶質顆粒に加え、より小さく（小顆粒）、結晶核がない別の顆粒タイプがある。好酸球の大きな特異的顆粒は、少なくとも４つの個別の陽イオン性タンパク質を含有し、これらのタンパク質は、宿主細胞及び微生物標的で一連の生物学的影響を及ぼす：主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、好酸球陽イオン性タンパク質（ＥＣＰ）、好酸球由来神経毒（ＥＤＮ）及び好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）。好塩基球は、ＥＤＮ、ＥＣＰ及びＥＰＯの検出可能量とともに、好酸球の約４分の１の主要塩基性タンパク質を含有する。少量のＥＤＮ及びＥＣも好中球で見られる（Ｇｌｅｉｃｈ  Ｇ  Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３）。ＭＢＰは、酵素活性を欠くと思われるが、脂質膜と相互作用してそれらのかく乱を引き起こすことによってその毒性活性を発揮し得る、陽イオン性の高いポリペプチドである。ＭＢＰ及びＥＰＯの両者とも、Ｍ２ムスカリン性受容体へ結合するアゴニストの選択的アロステリック阻害剤として作用し得る。これらのタンパク質は、Ｍ２受容体機能不全に関与し得、喘息において迷走神経介在性気管支収縮を促進し得る。ＥＤＮは、特異的に、ニューロンのミエリンコートに損傷を与え得る。ヒスタミナーゼ及び様々な加水分解性リソソーム酵素もまた好酸球の大きな特異的顆粒に存在する。好酸球の小顆粒中の酵素の中でも、アリールスルファターゼ、酸性ホスファターゼ及び９２ｋＤａメタロプロテイナーゼ、ゲラチナーゼが挙げられる。好酸球は、好酸球に対する潜在的な自己分泌増殖因子活性のあるもの及び急性及び慢性炎症反応において潜在的役割のあるものを含むサイトカインを産生し得る。３種類のサイトカイン：顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３及びＩＬ−５が、好酸球に対して増殖因子活性を有する。急性及び慢性炎症反応において活性を有し得るヒト好酸球により産生されるその他のサイトカインには、ＩＬ−１−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及び両形質転換増殖因子、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βが含まれる。
【０１３９】
好酸球は、ＭＢＰ、好酸球陽イオン性タンパク質、ＥＰＯ及び好酸球由来神経毒を含有する晶質顆粒を含有する（Ｇｌｅｉｃｈ、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１０５：６５１−６６３）。ＥＰＯの分泌を調べるために、ヒト前骨髄球細胞株、ＨＬ−６０クローン１５を使用することができる。この細胞株は、２ヵ月間、高ｐＨにおいて増殖させたＨＬ−６０のクローンから樹立され（Ｆｉｓｃｈｋｏｆｆ、Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  １９８８；１２：６７９−６８６）、次いで、好酸球特異的顆粒タンパク質の発現を含む末梢血好酸球の多くの特徴を示すように細胞を分化させるために酪酸で処理された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８９；１７０：１６３−１７６；Ｔｉｆｆａｎｙら、、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９５；５８：４９−５４；Ｂａｄｅｗａら、Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００２；２２７：６４５−６５１）。
【０１４０】
好酸球は、過敏性反応に、特に２種類の脂質炎症性メディエーター、ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）及び血小板活性化因子（ＰＡＦ）を通じて関与し得る。両メディエーターとも、気道平滑筋を収縮させ、粘液分泌を促進し、血管浸透性を変化させ、好酸球及び好中球浸潤を誘発する。これらの好酸球由来メディエーターの直接的活性に加えて、ＭＢＰは、好塩基球及びマスト細胞からのヒスタミンの放出を刺激し得、ＭＢＰは、マスト細胞からのＥＰＯの放出を刺激し得る。好酸球は、特異的脂質メディエーターの局所的ソースとなり得、同時に、マスト細胞及び好塩基球からのメディエーターの放出を誘発し得る。好酸球顆粒内容物は、好中球顆粒と同様の刺激（例えば、オプソニン化粒子の食作用の間及び走化因子による。）後に放出される。好中球リソソーム酵素は、主に、ファゴリソソームに飲み込まれる物質において作用し、一方、好酸球顆粒内容物は、主に、寄生虫及び炎症性メディエーターなどの細胞外標的構造において作用する。
【０１４１】
単球及びマクロファージ発生は骨髄で起こり、次の段階：幹細胞；前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）；単芽球；前単球；骨髄中の単球；末梢血中の単球；及び組織中マクロファージを経る。骨髄における単球分化は急速に進行する（１．５から３日間）。分化中、顆粒は単球細胞質中で見られ、これらは、少なくとも２つのタイプの好中球に分割され得る。しかし、これらは、その好中球対応物（アズール親和性及び特異的顆粒）よりも少なく小さい。これらの酵素性内容物は同様である。
【０１４２】
単球／マクロファージの顆粒結合性酵素には、リゾチーム、酸性ホスファターゼ及びβ−グルクロニダーゼが含まれる。インビボ試験に対するモデルとして、Ｕ９３７細胞からのリゾチーム分泌が使用された。この細胞株は、ヒト組織球性リンパ腫由来であり、ＰＭＡなどの様々なアゴニストによって活性化することができる単球細胞株として使用されてきた（Ｈｏｆｆら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；Ｂａｌｂｏａら、、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９７６；１７：５６５−５７７）。
【０１４３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞毒性リンパ球は、パーフォリン、細孔形成タンパク質及びグランザイム、リンパ球特異的セリンプロテアーゼを含む強力な細胞毒性顆粒を含有する。例えば、ＮＫ−９２細胞株は、急速進行性非ホジキンリンパ腫患者から樹立されたＩＬ−２−依存性のヒト株である（Ｇｏｎｇ  ＪＨ．、Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８）。ＮＫ−９２細胞は、幅広い悪性細胞を標的とするパーフォリン−グランザイム細胞溶解経路に関与する分子を高レベルで発現する（Ｇｏｎｇら、下記参照及びＭａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ、Ｔａｒｎ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３）。
【０１４４】
グランザイムは、細胞毒性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞内で細胞質顆粒により放出される外因性セリンプロテアーゼである。グランザイムは、ウイルス感染細胞内でアポトーシスを誘導し得、このようにしてそれらを破壊する。
【０１４５】
顆粒球（又は白血球）からの炎症のメディエーター（炎症性メディエーター）の細胞外への放出及び顆粒球（又は白血球）からの複数の炎症のメディエーター（炎症性メディエーター）の細胞外への放出を本明細書中で脱顆粒と呼ぶことがある。好ましい実施形態において、炎症のメディエーターの放出は、顆粒球又は白血球の内部に存在する顆粒からの前記メディエーターの放出を含む。炎症性メディエーターの放出は、好ましくは、これらの顆粒からの炎症性メディエーターの放出である。
【０１４６】
ＴＮＦαなどの前炎症性物質（炎症刺激物質）による刺激時に、好中球及びマクロファージは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のその合成を劇的に増加させ：ＴＮＦα又はリポ多糖（ＬＰＳ）の何れかに反応して好中球により形成される新しいタンパク質の９０％ほどがＭＡＲＣＫＳである（Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ、Ｒｏｓｅｎ  Ａ、Ｎａｒｉｎ  ＡＣ、Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０；８７：５６０３−５６０７）。このように、ＭＡＲＣＫＳは、好中球及びマクロファージなどの顆粒含有細胞が、アゴニスト、特にＰＫＣを活性化することにより働くもの、によって刺激された際、続く炎症性メディエーターの放出において重要な役割を有し得る（Ｂｕｒｇｏｙｎｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００３；８３：５８１−６３２；Ｌｏｇａｎら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：９２３−９３２；Ｓｍｏｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９０；１０５２：１３３−１４２；Ｎｉｅｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９９４；１２２３：２６７−２７３；Ｎａｕｃｌｅｒら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２００２；７１：７０１−７１０）。
【０１４７】
本発明のある態様において、対象の炎症部位（この炎症部位は、対象の炎症部位における、疾患、状態、外傷、異物又はその組み合わせの侵入開始の結果によるものである。）への本明細書中に記載のＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の脱顆粒阻害量の投与は、炎症部位で浸潤白血球から放出される炎症のメディエーターの量を低下させ得る（この場合、この白血球は好ましくは顆粒球である。）。ＭＡＮＳペプチド及び／又は少なくとも１つのその活性断片の投与は、炎症部位に浸潤している顆粒球などの白血球から放出される炎症のメディエーター量を低下させ得る。ＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量又はその活性断片の脱顆粒阻害量は、その部位に浸潤している炎症性細胞に含有される顆粒からの炎症性メディエーターのエキソサイトーシス放出を低下させるか又は阻害するのに十分である。ＭＡＮＳペプチド非存在下及び／又はその活性断片非存在下での、ほぼ同時に放出又は産生される炎症のメディエーターのレベル又は量又は濃度に対する、細胞（白血球又は顆粒球又はその他の炎症性細胞）からの炎症のメディエーターの放出の阻害の％（即ち低下の％）の比較によって、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の投与後に脱顆粒阻害効率を調べる。さらに、熟練した臨床医は、十分な又は治療的な有効量のＭＡＮＳペプチド及び／又はその活性断片が投与されたか否かを決定するために、その疾患の指標として知られる炎症の症状及びパラメータを測定することによって、組織部位における炎症が低下しているか否かを調べることができる。十分な脱顆粒阻害量とは、炎症部位において顆粒球から放出される炎症メディエーター低下の％を生じさせる量であり、この％は、同じ条件下でＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の非存在下で試験した場合に前記顆粒球から放出される前記炎症メディエーターの量の、約１％から約９９％、好ましくは５％から約９９％、より好ましくは約１０％から約９９％、さらにより好ましくは約２５％から９９％及びさらにより好ましくは約５０％から約９９％である。
【０１４８】
本発明のある態様において、動物における炎症性刺激の部位（この炎症刺激部位は、炎症刺激物質の炎症刺激量のその部位への投与により生成させた。）へのＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量の投与は、前記炎症刺激物質の同一の炎症刺激量の存在下で、ＭＡＮＳペプチド非存在下で顆粒球から放出される炎症性メディエーターの量の、約１％から約９９％、好ましくは５％から約９９％、より好ましくは約１０％から約９９％、さらにより好ましくは約２５％から９９％及びさらにより好ましくは約５０％から約９９％、顆粒球（この顆粒球は、前記炎症刺激物質により前記炎症刺激部位で刺激を受けている。）から放出される炎症性メディエーターの量を低下させることができる。
【０１４９】
本発明の別の態様において、動物における炎症刺激部位（この炎症刺激部位は、炎症刺激物質の炎症刺激量のその部位への投与により生成させた。）へのＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量の投与は、前記炎症刺激物質の同一の炎症刺激量の存在下で、ＭＡＮＳペプチド非存在下で顆粒球から放出される炎症性メディエーターの量の１００％、顆粒球（この顆粒球は、炎症刺激部位において炎症刺激物質により刺激を受けている。）から放出される炎症性メディエーターの量を低下させることができる。
【０１５０】
本明細書中のインビトロ実施例で使用される炎症刺激物質の例は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）である。単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ−１）は、その結果、ヒスタミン放出を引き起こす好塩基球の脱顆粒において、Ｃ５ａとほぼ同程度有効であり、ＩＬ−８よりもはるかに強力である。ヒスタミン放出は、ケモカイン（即ち化学誘引性サイトカイン）、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１での刺激後に起こり得る。
【０１５１】
好ましい実施形態において、炎症刺激部位に存在するＭＡＲＣＫＳペプチドの基底濃度に関して、動物における炎症刺激部位に投与されるＭＡＮＳペプチドの脱顆粒阻害量は、この炎症刺激部位のＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１，０００，０００倍、好ましくはこの炎症刺激部位のＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１００，０００倍、より好ましくはこの炎症刺激部位のＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１０，０００倍、さらにより好ましくはこの炎症刺激部位のＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１，０００倍、さらにより好ましくはこの炎症刺激部位のＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１００倍、さらにより好ましくはこの炎症刺激部位のＭＡＲＣＫＳペプチドの濃度の約１倍から約１０倍を含む。
【０１５２】
好ましい実施形態において、顆粒球は、動物、好ましくはヒトの気道上又は気道中に存在し、ＭＡＮＳペプチドは、ＭＡＮＳペプチドを含む医薬組成物、例えば、ＭＡＮＳペプチド及び水溶液を含む医薬組成物（この組成物は、エアロゾルの形態で投与される。）又は乾燥粉末形態のＭＡＮＳペプチドを含む医薬組成物（この組成物は、乾燥粉末吸入器を用いて投与される。）の吸入によるものなどの吸入により投与される。例えば、液滴、スプレー及び噴霧器など、吸入による溶液又は粉末の投与に対して当技術分野で公知のその他の方法及び装置が有用であり得る。
【０１５３】
ある実施形態において、本発明のペプチドが、基礎分泌機能を含む、生理学的に重要な分泌プロセスを阻止し得ることが可能である。発明者らは本発明の何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、このような基礎分泌を制御する機構は、刺激を受けた分泌を制御する機構とは異なると考えられる。あるいは、基礎分泌機構は、刺激を受けた分泌よりも、必要とするＭＡＲＣＫＳタンパク質が少ないものであり得る。ＭＡＲＣＫＳ介在分泌を阻止するための全療法が全てのＭＡＲＣＫＳ機能を排除し得ないので、基礎分泌は保持され得る。
【０１５４】
本明細書中で使用する場合、「ＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列」という用語は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、遺伝子のＤＮＡ配列、何らかの転写されたＲＮＡ配列、プレ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ転写産物のＲＮＡ配列及びタンパク質に結合したＤＮＡもしくはＲＮＡを含む、ＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードする遺伝子由来の何らかのヌクレオチド配列を指す。
【０１５５】
ＭＡＲＣＫＳ阻止ペプチドの正確な送達によって、重要な分泌プロセスを阻止する、何らかの潜在的な制限をも克服し得る。このような物質を呼吸管に送達することは、吸入製剤により容易に達成されるはずである。これらの物質は炎症性腸疾患を治療する上で有用であり得るので、浣腸又は座薬を介した直腸／結腸／腸管への阻止物質の送達を想定し得る。炎症が起こっている関節への関節内注入又は経皮送達を用いることで、局所的な炎症性細胞からの分泌を制限することによって、関節炎又は自己免疫疾患の患者の症状が緩和され得る。神経終末周囲の領域への注入によって、ある種の神経伝達物質の分泌が阻害され得、重度の疼痛又は無制御の筋肉痙攣の伝達が遮断される。炎症性皮膚疾患の治療のためのペプチドの送達は、当技術分野で公知の様々な局所製剤を用いて容易に達成されるはずである。
【０１５６】
細胞質においてＭＡＲＣＫＳはアクチン及びミオシンと相互作用すると考えられており、従って、細胞収縮装置へ顆粒を繋ぎ止めることができ、このようにして、その後の顆粒の移動及びエキソサイトーシスに介在し得る。好中球からの炎症性メディエーターＭＰＯの分泌は、ＰＫＣ及びＰＫＧ両方の活性化により最大化することもできる。ＭＡＲＣＫＳは、炎症性細胞における膜結合区画からの分泌（即ち好中球からのＭＰＯの分泌）を調整するこれらの２種類のタンパク質キナーゼの作用を調節する収束点となる可能性がある。
【０１５７】
本発明は、イヌ又はヒト好中球からの炎症性メディエーターＭＰＯの分泌が、ＰＫＣ及びＰＫＧ両方の同時活性化によって促進され、一方、何れかのキナーゼのみの活性化では最大分泌反応を誘導するのに不十分であったことを示す。ＰＭＡのみに対する分泌反応の促進は、本明細書中で示されるようにＮＨＢＥ細胞及び好中球で示されているが、その反応の規模は、ラット杯様細胞株において、その他のものにより観察されるものよりも著しく小さかった。Ａｂｄｕｌｌａｈら、上述参照。さらに、ｃＧＭＰ類似体が培養ハムスター気管上皮細胞から顕著なムチン分泌を誘導し得たことが以前報告されたが（Ｆｉｓｈｅｒら、上述）、この反応が曝露８時間まで有意なレベルに到達しなかったということに留意すべきである。このような長い遅延時間のある分泌反応は、直接的効果ではないと思われ、おそらく、前もって形成され貯蔵されている細胞質顆粒の放出とは異なり、デノボタンパク質合成を含むと思われる。
【０１５８】
上述のように、本発明は、製剤処方において使用され得る。ある種の実施形態において、製剤は、経口投与に適切であり得る固形医薬組成物中に存在する。本発明による固形組成物は、形成され得及び賦形剤と混合され得、及び／又は賦形剤により希釈され得る。固形組成物はまた、担体（例えば、カプセル、サシェ、錠剤、紙又はその他の容器の形態であり得る。）内に封入され得る。賦形剤が希釈剤である場合、これは、本組成物に対する、ビヒクル、担体又は媒体として働く、固体、半固体又は液体物質であり得る。
【０１５９】
様々な適切な賦形剤が当業者に理解され、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、１９：２４０４−２４０６（２０００）（２４０４から２４０６頁はそれらの全体において本明細書中に組み込まれる。）で見出すことができる。適切な賦形剤の例には、以下に限定されないが、デンプン、アラビアゴム、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、メタクリレート、シェラック、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ及びメチルセルロースが含まれる。製剤はさらに、滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油など）；湿潤剤；乳化及び懸濁剤；保存料（ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピルなど）；甘味料；又は香味剤を含み得る。ポリオール、緩衝液及び不活性充てん剤もまた使用し得る。ポリオールの例には、以下に限定されないが、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、マルトース、グルコース、ラクトース、デキストロースなどが含まれる。適切な緩衝液には、以下に限定されないが、リン酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸緩衝液などが含まれる。使用し得るその他の不活性充てん剤には、当技術分野で公知のもの及び様々な投与形態の製造に有用なものが含まれる。必要に応じて、固形剤は、増量剤及び／又は造粒剤などのその他の成分を含み得る。本発明の製剤は、当技術分野で周知の手順を用いることによる患者への投与後、活性成分を急速放出、持続放出又は遅延放出するように処方し得る。
【０１６０】
経口投与のための錠剤を形成するために、直接圧縮プロセスにより、本発明の組成物を調製し得る。このプロセスにおいて、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体又はゼラチン及びこれらの混合物などの固形の粉砕担体と、ならびに、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及びポリエチレングリコールワックスなどの減摩剤と、活性薬物成分を混合し得る。次に、適切な穿孔機付きの機器を用いて、この混合物を錠剤へと圧縮し、所望の錠剤サイズとするために押し抜き得る。この機器の操作パラメータは、当業者により選択され得る。あるいは、経口投与のための錠剤は湿式造粒プロセスにより形成され得る。賦形剤及び／又は希釈剤と活性薬物成分を混合し得る。固形物質を所望の粒子サイズに粉砕するか又はふるいにかけ得る。結合剤をこの薬物に添加し得る。適切な溶媒中で、この結合剤を懸濁及び均一化し得る。活性成分及び補助剤もまた結合剤溶液と混合し得る。得られた乾燥混合物を溶液で均一に湿らせる。湿らせることにより、通常、粒子はわずかに凝集し、所望のサイズのステンレス鋼ふるいを通じて、得られた塊を圧縮する。次に、所望の粒子サイズ及び堅さを得るのに必要な定められた時間、制御乾燥ユニットで混合物を乾燥させる。粉末を除去するために、乾燥させた混合物の顆粒をふるいにかける。この混合物に、崩壊剤、減摩剤及び／又は付着防止剤を添加し得る。最後に、適切な穿孔機付きの機器を用いて混合物を錠剤に圧縮し、所望の錠剤サイズとするために押し抜く。この機器の操作パラメータは、当業者により選択され得る。
【０１６１】
被覆錠剤が望ましい場合、上述の調製コアを糖又はセルロースポリマー（これらは、アラビアゴム、ゼラチン、タルク、二酸化チタンを含有し得る。）の濃縮溶液又は揮発性有機溶媒又は溶媒の混合液中で溶解されたラッカーで被覆し得る。異なる活性化合物を有するか、又は存在する活性化合物の量が異なる錠剤を区別するために、この被覆物に、様々な色素を添加し得る。特定の実施形態において、腸溶性コート層を含む１以上の層により囲まれるコア中に活性成分が存在し得る。
【０１６２】
軟ゼラチンカプセルは、カプセルが活性成分及び植物油の混合物を含有するように調製され得る。硬ゼラチンカプセルは、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロース誘導体及び／又はゼラチンなどの固形の粉砕担体と組み合わせた活性成分の顆粒を含有し得る。
【０１６３】
経口投与のための液体製剤は、シロップ又は懸濁液の形態で使用及び調製され得る（例えば、活性成分、糖及びエタノールの混合物、水、グリセロール及びプロピレングリコールを含有する溶液）。必要に応じて、このような液体製剤は、次のもの：着色剤、香味剤及びサッカリンの１以上を含み得る。さらに、カルボキシメチルセルロースなどの濃厚化剤もまた使用し得る。
【０１６４】
上記医薬品を非経口投与のために使用しようとする場合、このような製剤は、本発明の組成物を含む、滅菌水性注射溶液、非水性注射溶液又は両方を含み得る。水性注射溶液を調製する場合、本組成物は、水溶性の医薬的に許容可能な塩として存在し得る。非経口製剤は、抗酸化剤、緩衝液、抗菌剤及び、意図する受容者の血液とその製剤を等張にする溶質を含有し得る。水性及び非水性滅菌懸濁液は、懸濁剤及び濃厚化剤を含み得る。本製剤は、単位投与又は反復投与容器、例えば密封アンプル及びバイアル中で与えられ得る。即時調整注射溶液及び懸濁液は、既に述べた種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【０１６５】
本組成物はまた、局所投与（例えば皮膚クリーム）に適切であり得るように処方し得る。これらの製剤は、当業者にとって公知の様々な賦形剤を含有し得る。適切な賦形剤には、以下に限定されないが、セチルエステルワックス、セチルアルコール、白ろう、モノステアリン酸グリセリン、プロピレングリコール、モノステアリン酸、ステアリン酸メチル、ベンジルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、鉱油、水、カルボマー、エチルアルコール、アクリル酸系接着剤、ポリイソブチレン接着剤及びシリコーン接着剤が含まれ得る。
【０１６６】
好ましい実施形態において、ペプチド断片を表２で開示するが、これらは、少なくとも４から２３アミノ酸残基長であり、ＭＡＮＳペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有し、このペプチドのＮ末端アミノ酸は、ＭＡＮＳペプチド配列（配列番号１）の位置２から２１から選択される。より好ましいペプチド断片長は、少なくとも６アミノ酸から２３アミノ酸である。好ましくは、これらのペプチドは、αＮ末端アミノ酸においてアシル化され、より好ましくは、これらのペプチドは、αＮ末端アミノ酸位置においてミリストイル化される。
【０１６７】
【表２】
2009544737.tif 000009
2009544737.tif 000010
2009544737.tif 000011
2009544737.tif 000012
2009544737.tif 000013
2009544737.tif 000014
【０１６８】
図５で示されるように、ＭＡＲＣＫＳはＰＫＣによりリン酸化され、結果的に、膜から細胞質に移動させられる。ここで、ＰＫＧは、ＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を誘導すると思われる（図２Ａ、レーン４及び図２Ｂ）。この脱リン酸化は、ＰＫＧ阻害剤Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰにより覆され（図２Ａ、レーン５）、これにより、脱リン酸化が特異的にＰＫＧ依存性であったことが示された。図２において、［３２Ｐ］オルトリン酸塩によりＮＨＢＥ細胞を標識し、次いで、指定の薬物に曝露した。免疫沈降アッセイにより、治療への反応におけるＭＡＲＣＫＳリン酸化を評価した。図２Ａにおいて、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰはＰＭＡにより誘発されたＭＡＲＣＫＳリン酸化を覆し、この８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの効果は、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（ＰＫＧ阻害剤）又はオカダ酸（ＰＰ１／２Ａ阻害剤）により阻止することができた。図２Ｂに対して、続く８−Ｂｒ−ｃＧＭＰへの細胞の曝露により、ＭＡＲＣＫＳのＰＭＡ誘導性リン酸化が覆された。レーン１、溶媒のみで８分間；レーン２、１００ｎＭ  ＰＭＡで３分間；レーン３、１００ｎＭ  ＰＭＡで３分間、次いで１μＭ  ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで５分間；レーン４、１００ｎＭ  ＰＭＡで８分間；レーン５、溶媒のみで３分間、次いで１００ｎＭ  ＰＭＡ＋１μＭ  ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで５分間。図２Ｃにおいて、濃度依存的にホストリエシンによって８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ誘導性ＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化が減弱された。
【０１６９】
ＰＫＧは、タンパク質ホスファターゼの活性化を介してＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化するために作用すると考えられている。図２Ａ（レーン６）で示されるように、５００ｎＭのオカダ酸（ＰＰ１及びＰＰ２Ａの両方を阻害し得る濃度）は、ＭＡＲＣＫＳのＰＫＧ誘導性脱リン酸化を阻止したが、このことから、ＰＰ１及び／又はＰＰ２Ａを活性化することにより、ＰＫＧにより脱リン酸化が起こったことが示唆される。ホストリエシン及びホスファターゼ活性の直接アッセイによるさらなる研究から、ＰＫＧによってＰＰ２Ａのみが活性化され、ＭＡＲＣＫＳからのリン酸基の除去に関与することが示された（図２Ｃ）。図３で示されるように、オカダ酸又はホストリエシンの何れも、ＭＡＲＣＫＳのＰＫＧ誘導性リン酸化を阻害した濃度で、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ又はＵＴＰにより誘導されたムチン分泌を減弱させたと思われる。図３は、ＰＰ２Ａがムチン分泌経路の不可欠な成分であることを示すことを支持する。ホストリエシン、オカダ酸の指定濃度（５００ｎＭ）又は溶媒のみと１５分間ＮＨＢＥ細胞を予備温置し、次いで、ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ）で１５分間又はＵＴＰ（１００μＭ）で２時間刺激した。分泌されたムチンをＥＬＩＳＡにより測定した。平均±Ｓ．Ｅ．としてデータを示す（各点でｎ＝６）が、ここで＊は、溶媒対照と有意差があることを表し（ｐ＜０．０５）；†はＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激と有意差があることを表し（ｐ＜０．０５）；‡はＵＴＰ刺激と有意差があることを表す（ｐ＜０．０５）。このようにして、ＰＫＧにより活性化されるＰＰ２ＡによるＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化は、ムチン顆粒エキソサイトーシスに導くシグナル伝達経路の不可欠な要素であると思われる。
【０１７０】
ＭＡＲＣＫＳがムチン分泌とキナーゼ活性を結び付ける分子事象を明らかにするために、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化に対する反応におけるＭＡＲＣＫＳのリン酸化を詳しく調べた。図１Ａで示されるように、ＮＨＢＥ細胞でのＭＡＲＣＫＳリン酸化において顕著な増加（３−４倍）を誘導したと思われるＰＭＡ（１００ｎＭ）及びこのリン酸化は、ＰＫＣ阻害剤カルホスチンＣ（５００ｎＭ）により減弱された。リン酸化されると、原形質膜から細胞質にＭＡＲＣＫＳが移動させられた（図１Ｂ）。とりわけ、図１Ａは、ＰＫＣの活性化の結果、ＮＨＢＥ細胞においてＭＡＲＣＫＳリン酸化が起こることを示す。［３２Ｐ］オルトリン酸塩により２時間、細胞を標識し、次いで、刺激剤及び／又は阻害剤に曝露した。記載のように、免疫沈降により、治療への反応におけるＭＡＲＣＫＳリン酸化を評価した。レーン１、溶媒対照；レーン２、ビヒクル、０．１％Ｍｅ．ｓｕｂ．２ＳＯ；レーン３、１００ｎＭ  ４α−ＰＭＡ；レーン４、１００ｎＭ  ＰＭＡ；レーン５、１００ｎＭ  ＰＭＡ＋５００ｎＭ  カルホスチンＣ；レーン６、５００ｎＭ  カルホスチンＣ。図１Ｂは、リン酸化されたＭＡＲＣＫＳが原形質膜から細胞質に移動させられることを示す。３２Ｐ−標識細胞をＰＭＡ（１００ｎＭ）又は溶媒のみに５分間曝露し、次いで膜及び細胞質分画を単離した。８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μＭ、ムチン分泌を誘発するのに必要な別のキナーゼ活性事象）によるＰＫＧの活性化によって、ＭＡＲＣＫＳリン酸化に導かれないが、実際、反対の効果が観察された：ＰＭＡにより誘導されたＭＡＲＣＫＳリン酸化が８−Ｂｒ−ｃＧＭＰにより覆された（図２Ａ）。この８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの影響は、ＰＫＣ活性の抑制によるものではなく、これは、細胞へ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを続いて添加することによりＰＭＡ誘導性リン酸化を覆すことができたからである（図２Ｂ）。従って、ＰＫＧ活性化の結果、ＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化が起こると思われる。
【０１７１】
さらなる研究から、ＰＫＧ誘導性ＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化が、５００ｎＭ  オカダ酸、タンパク質ホスファターゼ（１型及び／又は２Ａ（ＰＰ１／２Ａ））阻害剤により阻止されたことが分かった（図２Ａ、レーン６）。従って、脱リン酸化にＰＰ１及び／又はＰＰ２Ａが介在すると思われた。関与するタンパク質ホスファターゼのサブタイプを定義するために、ＰＰ２Ａの新規の、より特異的な阻害剤、ホストリエシン（ＩＣ５０＝３．２ｎＭ）をさらなるリン酸化実験において使用した。
【０１７２】
図２Ｃで示されるように、ホストリエシンは、濃度依存的（１−５００ｎＭ）にＰＫＧ誘導性ＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化を阻害したが、このことから、ＰＫＧがＰＰ２Ａの活性化を介して脱リン酸化を誘導したことが示唆される。ＮＨＢＥ細胞におけるＰＫＧによるＰＰ２Ａのさらなる活性化を確認するために、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰに細胞を曝露した後、細胞質ＰＰ１及びＰＰ２Ａ活性を調べた。０．１．ｍｕ．Ｍという低い８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ濃度で、ＰＰ２Ａ活性がおよそ３倍上昇し（０．１から０．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質、ｐ＜０．０１）、一方、ＰＰ１活性は不変であった。このデータから、ＰＫＧによってＰＰ２Ａが活性され得、ＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化に関与することが示される。従って、このＰＰ２Ａ活性は、ムチン分泌を起こすのに重要であると思われる；ＰＫＧ誘導性ＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化がオカダ酸又はホストリエシンにより阻止された場合、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化又はＵＴＰ刺激に対する分泌反応が改善された（図３）。
【０１７３】
細胞質においてＭＡＲＣＫＳはアクチン及びミオシンと会合する。
【０１７４】
図４は、細胞質においてＭＡＲＣＫＳが２つのその他のタンパク質（約２００及び約４０ｋＤａ）と会合し得ることを示す放射性標識免疫沈降アッセイを表す。図４において、ＮＨＢＥ細胞を［３Ｈ］ロイシン及び［３Ｈ］プロリンで一晩標識し、膜及び細胞質分画を「実験手順」下で記載のように調製した。非免疫対照抗体（６Ｆ６）で単離分画を予め透明化した。次に、細胞質を２つの分画に等分し、それぞれ抗ＭＡＲＣＫＳ抗体２Ｆ１２（レーン２）及び非免疫対照抗体６Ｆ６（レーン３）を用いた、１０μＭサイトカラシンＤ（Ｂｉｏｍｏｌ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｐａ）の存在下で行う免疫沈降に対して使用した。膜分画中のＭＡＲＣＫＳタンパク質も、抗体２Ｆ１２（レーン１）を用いた免疫沈降により評価した。８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により沈降タンパク質複合体を分離し、高感度オートラジオグラフィーにより視覚化した。ＭＡＲＣＫＳは、それぞれ約２００及び約４０ｋＤａの分子量の２つの細胞質タンパク質と会合すると思われた。これらの２つのＭＡＲＣＫＳ会合タンパク質をゲルから切り出し、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法／内部配列決定（タンパク質／ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎ．Ｙ．）により分析した。インターネットプログラムＰｒｏＦｏｕｎｄ及びＭＳ−Ｆｉｔを介してタンパク質データベースを検索するために、得られたペプチド質量及び配列データを使用した。この結果から、これらがそれぞれミオシン（重鎖、非筋肉型Ａ）及びアクチンであることが示される。マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法／内部配列分析から、これらの２つのＭＡＲＣＫＳ会合タンパク質がそれぞれミオシン（重鎖、非筋肉型Ａ）及びアクチンであることが示される。
【０１７５】
これらの研究から、気道ムチン顆粒のエキソサイトーシス分泌を調整し、同時に生理的プロセスにおけるＭＡＲＣＫＳの特異的生物学的機能を示す最初の直接的証拠と考えられるものを提供する、シグナル伝達機構に対する新しい範例が示唆される。ＭＡＲＣＫＳは、ヒト気道上皮細胞においてムチン顆粒放出を制御する重要なメディエーター分子として働く。気道ムチン分泌の誘発は、ＰＫＣ及びＰＫＧの二重活性化及び相乗的作用を必要とすると考えられる。活性化ＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、その結果、原形質膜の内面から細胞質へとＭＡＲＣＫＳが移動する。同様に、ＰＫＧの活性化がＰＰ２Ａを活性化し、これは、細胞質においてＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化する。ＭＡＲＣＫＳの膜結合能は、そのリン酸化状態に依存するので、この脱リン酸化により、ＭＡＲＣＫＳがその膜結合能を回復し得、ＭＡＲＣＫＳを細胞質ムチン顆粒の膜に結合することができるようになり得る。細胞質においてアクチン及びミオシンと相互作用することによっても（図４）、ＭＡＲＣＫＳは、細胞収縮装置に顆粒を繋ぎ止め得、細胞周囲への顆粒移動及び続くエキソサイトーシス放出を媒介する。ＭＡＲＣＫＳの幅広い分布から、この機構又は同様の機構が、正常又は病的状態で、様々な細胞型において膜結合顆粒の分泌を制御し得る可能性が示唆される。
【０１７６】
図５で示されるように、ＭＡＲＣＫＳは、そのＮ末端ドメインにおいて顆粒膜と相互作用し、そのＰＳＤ部位でアクチン繊維と結合し、それにより移動及びエキソサイトーシスのために顆粒を収縮細胞骨格に繋ぎ止めることで、分子リンカーとして機能し得る。図５は、ムチン分泌促進物質が気道上皮（杯）細胞と相互作用し、２種類の別個のタンパク質キナーゼ、ＰＫＣ及びＰＫＧを活性化することを示す、考え得る機構を示す。活性化されたＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、これにより、ＭＡＲＣＫＳが原形質膜から細胞質に移動し、一方、ＰＫＧは、一酸化窒素（ＮＯ）→ＧＣ−Ｓ→ｃＧＭＰ→ＰＫＧ経路を介して活性化され、順に、細胞質ＰＰ２Ａが活性化され、これがＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化する。この脱リン酸化により、顆粒膜へのＭＡＲＣＫＳの結合が安定化される。さらに、ＭＡＲＣＫＳはまた、アクチン及びミオシンとも相互作用し、これにより、続く移動及びエキソサイトーシス性の炎症性メディエーター（ＭＰＯなど）の放出のための細胞収縮装置に顆粒が連結される。ＭＡＲＣＫＳが細胞質に放出された後、ＭＡＲＣＫＳの顆粒への結合はまた、特異的標的タンパク質又はＭＡＲＣＫＳのＮ末端ドメインが関与するいくつかのその他のタンパク質−タンパク質相互作用の形態によっても導かれ得る。何れにせよ、ＭＡＮＳペプチド又は少なくとも４アミノ酸を含むその活性断片は、ムチン顆粒の膜へのＭＡＲＣＫＳの標的化を競合的に阻害するために作用し、これにより、分泌が阻止される。
【０１７７】
本発明はまた、何らかの細胞エキソサイトーシス分泌プロセス、特に炎症性細胞内に含有される顆粒から炎症性メディエーターを放出するもの（この刺激経路はタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）基質ＭＡＲＣＫＳタンパク質及び膜結合小胞からの内容物の放出を含む。）、を阻止するための新規方法にも関する。具体的に、発明者らは、ヒト（図６）又はイヌ（図７）好中球からの炎症性メディエーターミロペルオキシダーゼの刺激放出がＭＡＮＳペプチドにより濃度依存的に阻止され得ることを示した。具体的に、図６は、１００μＭ  ＰＭＡ及び１０．ｍｕ．Ｍ  ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでミロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を分泌させるために刺激された単離好中球を示す。１００μＭ  ＭＡＮＳペプチドは、対照レベルまでＭＰＯ分泌を低下させた（＊＝ｐ＜０．０５）。１０μＭ  ＭＡＮＳは、ＭＰＯ分泌をわずかに低下させた。対照ペプチド（ＲＮＳ）１０又は１００μＭはＭＰＯ分泌において影響はない。図７において、１００ｎＭ  ＰＭＡ及び１０μＭ  ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰでミロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を分泌させるために単離好中球を刺激した。１００μＭ  ＭＡＮＳペプチドは、対照レベルまでＭＰＯ分泌を低下させた（＊＝ｐ＜０．０５）。１０μＭ  ＭＡＮＳは、ＭＰＯ分泌をわずかに低下させた。対照ペプチド（ＲＮＳ）１０又は１００μＭはＭＰＯ分泌に影響はない。このようにして、何らかの組織における浸潤炎症性細胞から分泌される炎症性のメディエーターの放出を阻止するために、本ペプチドを治療的に使用し得る。これらの放出メディエーターの多くは、様々な慢性炎症性疾患（即ち呼吸器疾患（喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤなど）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む。）、自己免疫疾患、皮膚疾患（酒さ、湿疹；及び重度にきびなど）、関節炎及び疼痛症候群（関節リウマチ及び線維筋痛など））で観察される広範囲に及ぶ組織損傷に関与する。本発明は、関節炎、慢性気管支炎、ＣＯＰＤ及び嚢胞性線維症などの疾患を治療するために有用であり得る。本発明は、従って、ヒト及び動物疾患の両方において、特に、ウマ、イヌ、ネコ及びその他の家庭のペットに関係する疾患において、治療のために有用である。
【０１７８】
図８−１２は、ヒト及びイヌ両方に対するＭＰＯ分泌を示す。これらの全実験において、図面で示されるように、刺激物を添加する前に、１ｘ１０−６Ｍの濃度のＬＰＳで、３７℃にて１０分間、単離好中球を刺激した。ＬＰＳは、細胞が分泌促進物質に反応できるように細胞を刺激する。
【０１７９】
ある実施形態において、本発明は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、対象において炎症を制御する方法を開示する。この実施形態のある態様において、ＭＡＮＳタンパク質の前記活性断片は、少なくとも４個及び好ましくは６個のアミノ酸を含む。別の態様において、前記炎症は、呼吸器疾患、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患及び疼痛症候群により引き起こされる。別の態様において、前記呼吸器疾患は、喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選択される。別の態様において、前記腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される。別の態様において、前記皮膚疾患は、酒さ、湿疹、乾癬及び重度にきびからなる群から選択される。別の態様において、前記炎症は、関節炎又は嚢胞性線維症により引き起こされる。別の態様において、前記対象は哺乳動物である。さらに、別の態様において、前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ウマ及びネコからなる群から選択される。別の態様において、前記投与段階は、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺内投与、鼻腔投与、吸入及び経口投与からなる群から選択される。別の態様において、前記肺内投与は、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量吸入器及び噴霧器の群から選択される。
【０１８０】
別の実施形態において、本発明は、対象において炎症性メディエーターを制御するＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を含む少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、対象において細胞性分泌プロセスを制御するための方法を開示する。この実施形態のある態様において、ＭＡＮＳタンパク質の前記活性断片は、少なくとも４個及び好ましくは６個のアミノ酸を含む。別の態様において、細胞性分泌プロセスの前記制御は、細胞性分泌プロセスを阻止又は低下させることである。別の態様において、前記炎症性メディエーターは、呼吸器疾患、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患及び疼痛症候群により引き起こされる。別の態様において、前記呼吸器疾患は、喘息、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選択される。別の態様において、前記腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群からなる群から選択される。別の態様において、前記皮膚疾患は、酒さ、湿疹、乾癬及び重度にきびからなる群から選択される。別の態様において、前記炎症メディエーターは、関節炎又は嚢胞性線維症により生じる。別の態様において、前記対象は哺乳動物である。別の態様において、前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ウマ及びネコからなる群から選択される。別の態様において、前記投与段階は、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺内投与、鼻腔投与、吸入及び経口投与からなる群から選択される。別の態様において、前記肺内投与は、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、定量吸入器及び噴霧器の群から選択される。
【０１８１】
別の実施形態において、本発明は、ＭＡＲＣ  ＫＳ関連の炎症性メディエーターの放出を阻害する化合物の治療的有効量を投与することを含む、対象において炎症を軽減する方法を開示し、これにより、前記治療なしで起こるものと比較して、対象における炎症性メディエーターの放出が低下する。この実施形態のある態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の少なくとも１つの活性断片である。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも４及び好ましくは６アミノ酸長である。別の態様において、前記化合物は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片である。別の態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のコード配列又はその活性断片に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも４及び好ましくは６アミノ酸長である。
【０１８２】
別の実施形態において、本発明は、炎症性メディエーターのＭＡＲＣＫＳ関連放出を阻害する化合物を含む医薬的に活性のある組成物の治療的有効量を投与することを含む、対象において炎症を軽減する方法を開示し、これにより、前記治療なしで起こるものと比較して、対象における炎症が軽減される。この実施形態のある態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも４及び好ましくは６アミノ酸長である。別の態様において、前記化合物はＭＡＮＳペプチド又はその活性断片である。別の態様において、前記化合物は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のコード配列又はその活性断片に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様において、前記活性断片は、少なくとも４及び好ましくは６アミノ酸長である。本発明は、ＭＡＮＳペプチド又はその活性断片の１以上を含有する組成物及び、炎症性細胞の顆粒又は小胞からの炎症性メディエーターの放出を阻害する治療におけるその使用を包含するものとする。
【０１８３】
別の実施形態において、本発明は、炎症部位で炎症性メディエーターの放出を阻害又は抑制するのに有効なＭＡＮＳペプチド又はその活性断片を含む少なくとも１つのペプチドの治療的有効量を投与することを含む、対象において炎症を軽減又は阻害する方法を開示する。この実施形態のある態様において、前記活性断片は、少なくとも４及び好ましくは６アミノ酸長である。別の態様において、前記炎症性メディエーターは、好中球、好塩基球、好酸球、単球及び白血球からなる群から選択される細胞により産生される。好ましくは、細胞は白血球、より好ましくは顆粒球、さらにより好ましくは、好中球、好塩基球、好酸球又はその組み合わせである。別の態様において、この薬剤は、経口、非経口、空洞、直腸から又は気道を通じて投与される。別の態様において、前記組成物は、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症化合物及び免疫抑制剤からなる群から選択される第二の分子をさらに含む。
【０１８４】
ＭＡＮＳペプチドの活性断片は、表１で開示されるペプチドからなる群から選択され得る。本明細書中で開示されるように、これらのペプチドは、Ｎ末端及び／又はＣ末端アミノ酸において任意の化学部分を含有し得る。
【０１８５】
本発明の別の態様において、表１の本発明で開示されるペプチドの組合せの使用又は投与により、即ち、これらのペプチドの１以上の使用又は投与により、本発明において開示される方法を遂行することができる。好ましくは、本明細書中で開示される方法において１個のペプチドを使用又は投与する。
【０１８６】
ＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端領域と同一のペプチド（このペプチドは、表１で開示されるとおりのＭＡＮＳペプチド断片の群から選択される。）との予備温置によって及び同時温置によって、炎症性刺激物質によるタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化に反応した、好中球、好酸球、単球／マクロファージ及びリンパ球からなる群から選択される細胞における脱顆粒を減弱させることができる。時間経過及び濃度は細胞型によって様々であり得るが、全ての場合において、ＭＡＮＳペプチドがＰＫＣ誘導性脱顆粒を減弱させる。
【０１８７】
本発明を説明してきたが、ここである種の実施例を参照して本発明を説明するが、これは説明のためにのみ本明細書中に含まれるものであり、本発明を限定するものではない。
【０１８８】
実施例
方法及び材料
放射性標識免疫沈降アッセイ−［３２Ｐ］リン酸で標識する場合、０．２％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸不含のダルベッコ改変イーグル培地中で細胞を２時間予備温置し、次いで０．１ｍＣｉ／ｍＬ［３２Ｐ］オルトリン酸（９０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２時間標識した。［３Ｈ］ミリスチン酸又は３Ｈ−アミノ酸で標識する場合、５０μＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］ミリスチン酸（４９Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は０．２ｍＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］ロイシン（１５９Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋０．４ｍＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］プロリン（１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する培地中で細胞を一晩温置した。標識後、刺激剤に５分間細胞を曝露した。阻害剤を使用した場合、刺激前に阻害剤とともに１５分間細胞を予備温置した。この処理の終了時に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ  ベンズアミジン、１０μｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ及び１０μｇ／ｍＬロイペプチンを含有する緩衝液中で細胞を溶解させた。トリクロロ酢酸沈殿及びシンチレーションカウントにより、各培養における放射性標識効率を求め得る。等しいカウント／分を含有する細胞溶解液を用いて、Ｓｐｉｚｚ及びＢｌａｃｋｓｈｅａｒの方法に従い、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の免疫沈降を行った。Ｓｐｉｚｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５５３−５６２（１９９６）。８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、沈降タンパク質を分離し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。抗−ヒトＭＡＲＣＫＳ抗体（２Ｆ１２）及び非免疫対照抗体（６Ｆ６）をこのアッセイで使用した。
【０１８９】
様々な細胞亜分画におけるＭＡＲＣＫＳ又はＭＡＲＣＫＳ結合タンパク質複合体を評価するために、放射性標識及び処理済細胞をホモジェナイズ緩衝液にこすり入れ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭベンズアミジン、１０μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍＬロイペプチン）、次いで、窒素キャビテーションにより破砕した（８００パウンド／平方インチ、４℃で２０分間）。６００ｘｇで１０分間、４℃にて細胞溶解液を遠心し、核及び破砕されなかった細胞を除去した。４００，０００ｘｇで３０分間、４℃にて超遠心することにより、核成分を除去した上清を膜及び細胞質分画に分離した。超音波処理により、溶解緩衝液中で膜ペレットを可溶化した。次に免疫沈降を上述のように行った。
【０１９０】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチド−Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）においてミリストイル化Ｎ末端配列（ＭＡＮＳ）及び無作為Ｎ末端配列（ＲＮＳ）ペプチドの両方が合成され、次いで、これを高圧液体クロマトグラフィー（＞９５％純度）で精製し、質量分析（それぞれ適切な分子量の１つの単一ピークを示す。）により確認した。ＭＡＮＳペプチドは、ＭＡＲＣＫＳの最初の２４アミノ酸と同一の配列から構成された（即ち、膜へのＭＡＲＣＫＳ挿入を媒介するミリストイル化Ｎ末端領域、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１（ここでＭＡはＮ末端ミリストイル鎖である。）。）。対応する対照ペプチド（ＲＮＳ）は、ＭＡＮＳと同じアミノ酸組成を含有したが、無作為な順序、ＭＡ−ＧＴＡＰＡＡＥＧＡＧＡＥＶＫＲＡＳＡＥＡＫＱＡＦ（配列番号２３２）に並べられていた。これらの合成ペプチド中に疎水性ミリスチン酸部分が存在することにより、原形質膜へのそれらの浸透が促進され、ペプチドを細胞に容易に取り込ませることができた。ムチン分泌におけるこれらのペプチドの影響を調べるために、分泌刺激物質添加前に、ペプチドとともに１５分間細胞を予備温置し、次いでムチン分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド−ＭＡＲＣＫＳアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその対応する対照オリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ  ＧｍｂＨ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成された。５μＭアンチセンス又は対照オリゴヌクレオチドで３日間（最初の２４時間は２μｇ／ｍＬリポフェクチン存在下）、ＮＨＢＥ細胞を尖端的に処理した。次に、分泌刺激物質とともに細胞を温置し、ＥＬＩＳＡによりムチン分泌を測定した。処理細胞からトータルＲＮＡ及びタンパク質を単離した。ヒトＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡをプローブとして用いて、従来の手順に従い、ノーザンハイブリッド形成によって、ＭＡＲＣＫＳ  ｍＲＮＡを評価した。精製抗ＭＡＲＣＫＳ  ＩｇＧ１（クローン２Ｆ１２）を一次検出抗体として用いて、ウエスタンブロットにより、ＭＡＲＣＫＳタンパク質レベルを求めた。
【０１９２】
一時的遺伝子移入−ＭＡＲＣＫＳのリン酸化部位ドメイン（ＰＳＤ）は、ＰＫＣ依存性リン酸化部位及びアクチン繊維−結合部位を含有する。ＰＳＤ欠失ＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡを構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応によりＰＳＤ配列（２５アミノ酸をコードする。）に隣接する２つの断片を作製し、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応用に設計したオリゴヌクレオチドプライマーの５’−末端に連結されたＸｈｏＩ部位を通じて連結した。得られた突然変異ｃＤＮＡ及び野生型ＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡをそれぞれ、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）に挿入した。制限消化及びＤＮＡ配列決定によって、単離した組み換えコンストラクトを確認した。
【０１９３】
ＨＢＥ１は、気液界面で培養した場合にムチン分泌が可能な、パピローマウイルスを形質転換したヒト気管支上皮細胞株である。製造者の説明書に従い、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ遺伝子移入剤（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて、ＨＢＥ１細胞の遺伝子移入を行った。簡潔に述べると、気液界面で増殖させた、分化したＨＢＥ１細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、１２ウェル培養プレートに１ｘ１０５細胞／ｃｍ２で再播種した。一晩温置した後、野生型ＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡ、ＰＳＤ−短縮型ＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡ又はベクターＤＮＡを細胞に遺伝子移入した。細胞を４８時間培養して、遺伝子発現できるようにし、次いで、分泌刺激物質に曝露し、ＥＬＩＳＡによりムチン分泌を測定した。ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｌａｃＺプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＤＮＡ比６：１、全部で１μｇＤＮＡ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬に対するＤＮＡの比＝１：２５）の存在下で全ての遺伝子移入を行い、遺伝子移入効率の変化を監視した。結果から、遺伝子移入細胞から単離した細胞溶解液中のβ−ガラクトシダーゼ活性において有意差は示されず、このことから、異なるＤＮＡコンストラクトでも同様の遺伝子移入効率であることが示された（データは示さない。）。
【０１９４】
タンパク質ホスファターゼ活性アッセイ−わずかに改変して当技術分野で公知のように、タンパク質ホスファターゼアッセイ系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いてＰＰ１及びＰＰ２Ａ活性を測定した。Ｈｕａｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  Ｂｉｉｏｌ．  ３９６、２０９−２１５（１９９６）。簡潔に述べると、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ又は培地のみで５分間、ＮＨＢＥ細胞を処理した。次に、細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ベンズアミジン、１０μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍＬロイペプチン）に剥がし入れ、２０秒間４℃にて超音波処理を行うことにより破砕した。細胞溶解液を遠心し、上清をホスファターゼ活性アッセイ用に保存した。基質として３２Ｐ−標識ホスホリラーゼＡを用いて、このアッセイを行った。放出された３２Ｐｉをシンチレーションによりカウントした。各試料のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより求めた。（試料トータルホスファターゼ活性−１ｎＭオカダ酸存在下で残存する活性）として、ＰＰ２Ａ活性を表した。ＰＰ１活性は、１ｎＭ及び１μＭオカダ酸存在下でそれぞれ残存する活性間の差として表した。タンパク質ホスファターゼ活性は、分／ｍｇ総タンパク質あたり放出されたＰｉのｎｍｏｌとして報告した。
【０１９５】
細胞毒性アッセイ−細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼのトータル放出を測定することにより、細胞毒性について、ＮＨＢＥ細胞の処理で使用した全ての試薬を調べた。このアッセイは、製造者の説明書に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｙｔｏｔｏｘ  ９６キットを用いて行った。実験は全て、非細胞毒性濃度の試薬を用いて行った。
【０１９６】
統計解析−ボンフェローニの事後補正（ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）により、一元配置分散分析を用いて、有意性についてデータを解析した。処理間の差はｐ＜０．０５で有意とみなした。
【０１９７】
イヌ血液からのＰＭＮの単離−ＰＭＮの単離に含まれる段階には、１０ｍＬ  ＡＣＤ抗凝固処理血液を回収することが含まれる。次に、５ｍＬを３．５ｍＬ  ＰＭＮ単離溶液の上に重ねるが、この間、ＰＭＮ単離溶液（ＩＭ）が室温（ＲＩ）であるようする。次に、室温にて３０’、５５０ｘｇ、１７００ＲＰＭで血液を遠心した、下の下の白色の帯状部分を１５ｍＬコニカル遠心管（ＣＣＦＴ）に移した。次に、１０％仔ウシ血清（ＰＢＳ）入りの２Ｖ  ＨＥＳＳを添加し、室温にて１０’、４４０ｘｇ、１４００ＲＰＭで遠心した。次いで、５ｍＬ  ＰＢＳ入りＨＥＳＳ中でペレットを再懸濁した。氷冷０．８８％  ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＬを含有する５０ｍＬ  ＣＣＦＴに細胞懸濁液を添加し、２−３回転倒撹拌した。得られた生成物を１０’、８００ｘｇ、２０００ＲＰＭで遠心し、次いで吸引し、ＦＢＳ入りの５ｍＬ  ＨＢＳＳ中で再懸濁した。カウント及びサイトスピンにより調製物を調べたが、好ましくは、全血に対して、細胞数は１０９−１０１１個の間であるべきであり、ＰＭＮに対しては、細胞数は２−４ｘ１０７個の間であるべきである。全般的には、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、「Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ」６４８７−９４（２０００）を参照のこと。
【０１９８】
ＭＰＯ比色酵素アッセイ−サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）を用いて、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中でＭＰＯ活性について試料をアッセイした。簡潔に述べると、個々のマイクロタイターウェル中で、３３ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、０．５６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１１ｍＭ過酸化水素及び０．３６ｍＭ  Ｏ−ジアニシジン二塩酸塩を含有する基質混合液１８０μＬと試料２０μＬを混合する。アッセイ混合液中の最終濃度は：３０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭ過酸化水素及び０．３２ｍＭ  Ｏ−ジアニシジン二塩酸塩である。混合後、アッセイ混合液を室温で５分間温置し、５５０ｎｍで分光光度計を用いてＭＰＯ酵素活性を求めた。試料を二重にアッセイした。
【実施例１】
【０１９９】
炎症性メディエーター分泌実験
ホルボールエステル誘導性のＰＫＣ活性化に反応して特異的顆粒内容物を分泌する４種類の異なる白血球型又はモデルを使用した。ヒト血液から好中球を単離し、これらの細胞によるインビトロのＭＰＯ放出を評価した。市販のヒト白血球細胞株からの膜結合炎症性メディエーターの放出も評価した。ヒト前骨髄球細胞株ＨＬ−６０クローン１５を使用して、ＥＰＯの分泌を評価した（Ｆｉｓｃｈｋｏｆｆ  ＳＡ）。ＨＬ−６０前骨髄球白血病細胞が好酸球に分化する可能性の段階的な上昇が、アルカリ性条件下での培養により誘導された。Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  １９８８；１２：６７９−６８６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＦ、Ａｃｋｅｒｍａｎ  ＳＪ  、Ｔｅｎｅｎ  ＤＧ．Ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８９；１７０：１６３−１７６；Ｔｉｆｆａｎｙ  ＨＬ、Ｌｉ  Ｆ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＦ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９５；５８：４９−５４；Ｂａｄｅｗａ  ＡＰ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＣＥ、Ｈｅｉｍａｎ  ＡＳ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｏｔａｘｉｎ、ｅｏｔａｘｉｎ−２，ａｎｄ  ｅｏｔａｘｉｎ−３  ｏｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００２；２２７：６４５−６５１）。単球白血病細胞株Ｕ９３７を使用して、リゾチームの分泌を評価した（Ｈｏｆｆ  Ｔ、Ｓｐｅｎｃｋｅｒ  Ｔ、Ｅｍｍｅｎｄｏｅｒｆｆｅｒ  Ａ．、Ｇｏｐｐｅｌｔ−Ｓｔｒｕｅｂｅ  Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９２；５２：１７３−１８２；Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ、Ｓａｅｚ  Ｙ、Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ  Ｃ、Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｋ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｏｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｕ−９３７）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９７６；１７：５６５−５７７）。リンパ球ナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２を使用して、グランザイムの放出を評価した（Ｇｏｎｇ  ＪＨ．、Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）  ��ｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９４；８：６５２−６５８；Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ、Ｔａｍ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＮＫ−９２．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１；１０：３６９−３８３；Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０）。全ての場合において、２４アミノ酸ＭＡＲＣＫＳＮ末端（ＭＡＮＳ−ミリストイル化Ｎ末端配列ペプチド；ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号１）、ここでＭＡはアミド結合によりこのペプチドのＮ末端アミンに連結されるミリストイルである。）と同一の合成ペプチドの一連の濃度又は、同じ２４アミノ酸からなるが、ＭＡＮＳペプチド配列と配列同一性が１３％未満である無作為な順序の配列に並べられているミスセンス対照ペプチド（ＲＮＳ：無作為Ｎ末端配列ペプチド；ＭＡ−ＧＴＡＰＡＡＥＧＡＧＡＥＶＫＲＡＳＡＥＡＫＱＡＦ、配列番号２３２）とともに細胞を予備温置した。あるいは、下記表３に列挙される合成短縮型ペプチドの１つで細胞を前処理した。
【０２００】
各細胞型において、ＭＡＮＳ（ＲＮＳではない。）は、濃度依存的に炎症性メディエーターの放出を減弱させる。観察の有用な時間的経過は０．５から３．０時間である。この結果は、白血球脱顆粒を導く細胞内経路に関与するＭＡＲＣＫＳタンパク質のＮ末端領域と一致する。
【０２０１】
ヒト好中球単離−これらの実験は、ヒト実験施設内倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ、ＩＲＢ）により承認された。僅かに改変して、既に述べたようにしてヒト好中球を単離した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｓ、Ｏｋｕｂｏ  Ｙ、Ｈｏｒｉｅ  Ｓ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ５４  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１；９１：６１３−６２２参照）。簡潔に述べると、正常で健康なボランティアからヘパリン処理した静脈血を得て、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｅｌｌｅｇｒｏ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）で１：１の比で希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密度、１．０７７ｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の上に重ね、４００ｇで４℃にて２０分間遠心した。上清及び界面の単核細胞を慎重に取り出し、沈殿物中の赤血球を冷却した蒸留水中で溶解した。単離した顆粒球をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、氷上でＨＢＳＳ中で再懸濁した。実験に使用した好中球の純度は＞９８％で好酸球の混入は＜２％であり、トリパンブルー色素排除試験で調べたところ、生存率は＞９９％であった。
【０２０２】
放出された好中球ＭＰＯ活性の測定−ＭＰＯ放出の測定のために、ＨＢＳＳ中で懸濁した精製ヒト好中球を１５ｍＬ試験管に４ｘ１０６個の細胞／ｍＬで分注し、ＭＡＮＳ、ＲＮＳ又は本発明のペプチドの１つの５０又は１００μＭの何れかとともに３７℃で１０分間予備温置した。次に、１００ｎＭホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で細胞を最長で３時間刺激した。１５ｍＬ試験管中の４ｘ１０６個の細胞／ｍＬの分注精製ヒト好中球（ＨＢＳＳ中で懸濁）を用いて、対照参照物（ＰＭＡ対照参照物）を調製し、試験ペプチドなしで、同じ時間、１００ｎＭホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激した。試験管を氷上に置くことにより反応を停止させ、４００ｇで４℃にて５分間遠心した。
【０２０３】
既に確立された技術に基づき（Ａｂｄｅｌ−Ｌａｔｉｆ  Ｄ、Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｍ、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＤＬ、Ｆｒａｎｃｉｓ  ＧＡ．、Ｄｉｎａｕｅｒ  ＭＣ、Ｌａｃｙ  Ｐ．Ｒａｃ２  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：８３２−８３９）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて、細胞上清中のＭＰＯ活性をアッセイした。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロプレート中で、細胞上清又は標準ヒトＭＰＯ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）５０μＬに、ＴＭＢ基質溶液１００μＬを添加し、次いで、室温にて１５分間温置した。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μＬを添加することにより反応を停止させ、分光光度測定マイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍでの吸収を読み取った（ＶＥＲＳＡ  ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）。
【０２０４】
白血球培養実験
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から、３種類のヒト白血球細胞株、具体的には前骨髄球細胞株ＨＬ−６０クローン１５、単球細胞株Ｕ９３７及びリンパ球ナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２を購入した。１０％熱不活化仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８を添加した、Ｌ−グルタミン入りのＲＰＭＩ  １６４０からなる培地中で、５％ＣＯ２を含有する雰囲気中で、３７℃にて、ＨＬ−６０クローン１５細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６４）を維持した。既に述べたように、５日間、０．５ｍＭ酪酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を含有する上述の培地中で５ｘ１０５個の細胞／ｍＬで細胞を培養することによって、好酸球様表現型への最終分化を引き起こした（Ｔｉｆｆａｎｙ  ＨＬ、Ｌｉ  Ｆ、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＨＦ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １９９５；５８：４９−５４；Ｔｉｆｆａｎｙ  ＨＬ、Ａｌｋｈａｔｉｂ  Ｇ、Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ  Ｃ、Ｂｅｒｇｅｒ  ＥＡ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＰＭ．ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  １  ａｎｄ  ３  ａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−５  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ＨＬ−６０  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１６０：１３８５−１３９２）。１０％ＦＢＳ、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＬ−グルタミン入りのＲＰＭＩ１６４０からなる完全培地中で、５％ＣＯ２の雰囲気中で、３７℃にてＵ９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）を増殖させた。２０％ＦＢＳ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）１００Ｕ／ｍＬ、２−メルカプトエタノール５ｘ１０−５Ｍ、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）中で、５％ＣＯ２を含有する雰囲気中で、３７℃にて、ＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０７）を維持した。Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色細胞の評価によって、細胞形態を判断した。トリパンブルー排除により実験用に回収した細胞の生存率を評価し、生存率＞９５％の細胞集団を使用した。
【０２０５】
脱顆粒アッセイのための細胞の温置
フェノールレッド不含ＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｅｌｌｅｇｒｏ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）中で、ＨＬ−６０クローン１５、Ｕ９３７及びＮＫ−９２細胞を洗浄し、全ての脱顆粒アッセイのために２．５ｘ１０６個の細胞／ｍＬになるように再懸濁した。ＭＡＮＳ、ＲＮＳ又は試験ペプチドの指定濃度とともに、３７℃にて１０分間、１５ｍＬ試験管中の細胞の分注物を予備温置した。次に、最長２時間、ＰＭＡで細胞を刺激した。それぞれＨＬ−６０クローン１５、Ｕ９３７及びＮＫ−９２細胞を用いて、各細胞型について、対照参照物（ＰＭＡ対照参照物）を調製し、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ−１６４０中でこれを洗浄し、２.５ｘ１０６個の細胞／ｍＬになるように再懸濁し、ＰＭＡで、しかし、ＭＡＮＳ、ＲＮＳ又は試験ペプチドなしで、同じ時間、刺激した。試験管を氷上に置くことにより反応を停止させ、４００ｇで４℃にて５分間遠心した。
【０２０６】
好中球からの放出ＭＰＯ及びＵ９３７細胞からの放出リゾチームの測定のために、発明者らは、それぞれヒトＭＰＯ及び卵白オボアルブミンを標準として使用することにより、分泌を定量することができた。ＨＬ−６０クローン１５細胞からの放出ＥＰＯ及びＮＫ−９２細胞からの放出グランザイムに対して、定量のために利用可能な標準物質はなかった。それゆえ、ＥＰＯ及びグランザイムの放出レベル及び細胞内レベル（溶解細胞から）の両方を測定し、放出されたＥＰＯ及びグランザイムを、それぞれに対してトータル（細胞内及び放出）の％として表した。ＨＬ−６０クローン１５細胞における細胞内ＥＰＯ及びＮＫ−９２細胞における細胞内グランザイムを測定するために、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した細胞の適切な分注物を下記のように細胞内顆粒タンパク質の定量のために取っておいた。培養間の変動を最小にするために、全ての処理を対照の％として表した。
【０２０７】
ＨＬ−６０  ＥＰＯ放出の測定
既に確立された技術（Ｌａｃｙ  Ｐ、Ｍａｈｍｕｄｉ−Ａｚｅｒ  Ｓ、Ｂａｂｌｉｔｚ  Ｂ、Ｈａｇｅｎ  ＳＣ、Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  ＪＲ、Ｍａｎ  ＳＦ、Ｍｏｑｂｅｌ  Ｒ．Ｒａｐｉｄ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ  ｓｔｏｒｅｄ  ＲＡＮＴＥＳ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １９９９；９４：２３−３２）に従い、ＴＭＢを用いて、ＨＬ−６０クローン１５細胞により放出されるＥＰＯ活性をアッセイした。このようにして、９６ウェルマイクロプレート中の試料の５０μ（μＬ＝マイクロリットル）にＴＭＢ基質溶液の１００μＬを添加し、室温にて１５ｍｉｎ（ｍｉｎ＝分）温置した。１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μＬを添加することにより反応を停止させ、分光光度測定マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ（ｎｍ＝ナノメーター）にて吸収を読み取った。分泌されたＥＰＯ量は、同数のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解細胞で得られた量を用いて、総内容物の％として表した。
【０２０８】
単球リゾチーム分泌の測定
僅かに改変して、既に記載されるとおり、分光光度アッセイを用いて、Ｕ９３７細胞により分泌されるリゾチームを測定した（Ｂａｌｂｏａ  Ｍ  Ａ、Ｓａｅｚ  Ｙ、Ｂａｌｓｉｎｄｅ  Ｊ．Ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕ９３７  ｐｒｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０：５２７６−５２８０）。このようにして、９６ウェルマイクロプレート中のミクロコッカス・リソデイクチクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）懸濁液（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中の０．３ｍｇ／ｍＬ）１００μＬと試料１００μＬを混合した。４５０ｎｍでの吸収の低下を室温で測定した。ニワトリ卵白リゾチーム（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を標準物質として用いて、検量線を作成した。
【０２０９】
ＮＫ細胞グランザイム分泌の測定
基本的に既に記載されているようにして（Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；１０４：１８３−１９０）、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン  チオベンジルエステル（ＢＬＴ）の加水分解を測定することにより、ＮＫ−９２細胞から分泌されるグランザイムをアッセイした。簡潔に述べると、上清５０μＬを９６ウェルプレートに移し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中のＢＬＴ溶液（０．２ｍＭ  ＢＬＴ；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．及び０．２２ｍＭ  ＤＴＮＢ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）（ｍＭ＝ミリモーラー）１５０μＬを上清に添加した。温置３０分後、室温にて４１０ｎｍでの吸収を読み取った。結果は、同数のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解細胞において得られる量を用いて、総細胞酵素含量の％として表した。
【０２１０】
統計解析
片側ＡＮＯＶＡにより、様々な治療群間の差の統計的有意性を評価した。＜０．０５のＰ値を有意とした。
【０２１１】
ヒト好中球からのＭＰＯ放出の阻害
１００ｎＭ  ＰＭＡ（炎症性メディエーター放出の刺激物質として）は、ＰＭＡ対照参照物において３０分で、対照レベルに対しておよそ３倍、ヒト好中球ＭＰＯ放出を上昇させ、ＭＰＯの放出は、３時間後およそ５−６倍に上昇したことが分かった。３０分で、対照のＭＰＯ活性を１００％として（ＰＭＡなし及びＰＭＡなし＋ＭＡＮＳ、ＲＮＳ又は試験ペプチド）、ＰＭＡ対照参照物のＭＰＯ活性は、約２７５％であり、ＰＭＡ＋５０μＭ  ＭＡＮＳは、約２７５％であり、１００μＭ  ＭＡＮＳは約３０５％であった。このように、ＭＡＮＳペプチドは、３０分で影響は検出されなかった。しかし、１時間までに、ＭＡＮＳのより高い濃度（１００μＭ）で有意な阻害効果（対照の約２６０％）があるか又はＰＭＡ対照参照物レベルに対してＭＰＯ放出が約２５％低下した（これは、対照の約３４０％）。５０μＭ  ＭＡＮＳ試料では、対照の約２９０％又はＰＭＡ対照参照物に対して約１５％の低下が測定された。２時間までに及び３時間持続して、ＭＡＮＳペプチドは、濃度依存的にＭＰＯ活性を有意に低下させた。２時間において、ＰＭＡ対照参照物ＭＰＯ活性は、対照の約５４０％であり、５０μＭ  ＭＡＮＳ（対照の約３７５％）により、ＰＭＡ対照参照物に対してＭＰＯ放出が３０％低下し；１００μＭ  ＭＡＮＳ（対照の約２９５％）によって、ＰＭＡ対照参照物に対してＭＰＯ放出がおよそ４５％低下した。３時間において、ＰＭＡ対照参照物のＭＰＯ活性は、対照の約５６０％であり、５０μＭ  ＭＡＮＳ（対照の約３７５％）によって、ＰＭＡ対照参照物に対してＭＰＯ放出がおよそ３３％低下し；１００μＭ  ＭＡＮＳ（対照の約３２０％）によって、ＰＭＡ対照参照物に対してＭＰＯ放出がおよそ４０％低下した。ＲＮＳペプチドは、何れの時間点又は試験濃度でもＰＭＡ誘導性ＭＰＯ放出に影響を及ぼさなかった。下記の表で与えられるデータは、試験ペプチドの１００μＭ及び１００ｎＭ  ＰＭＡとの２時間温置である。
【０２１２】
ＨＬ−６０細胞からのＥＰＯ放出の阻害
ＨＬ−６０クローン１５細胞の上清におけるＥＰＯ活性は、ＰＭＡ刺激から１時間及び２時間後に有意に促進された。１時間で、対照のＥＰＯ活性を１００％として、ＰＭＡ対照参照物は約１１０％となり；１０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約９５％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＥＰＯ活性が約１５％低下し；５０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約７８％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＥＰＯ活性が約３０％低下し；１００μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約６５％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＥＰＯ活性が約４０％低下した。２時間において、対照のＥＰＯ活性を１００％として、ＰＭＡ対照参照物は約１４５％となり；１０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約１３０％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＥＰＯ活性が約１０％低下し；５０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約７０％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＥＰＯ活性が約５０％低下し；１００μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約７２％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＥＰＯ活性が約５０％低下した。このように、１時間及び２時間の両方で、５０又は１００μＭのＭＡＮＳは、ＥＰＯ放出を有意に減弱させた。ＲＮＳペプチドは、ＰＭＡにより促進されたＥＰＯ放出に何れの時間点又は試験濃度でも影響がなかった。下記の表で与えられるデータは、試験ペプチドの５０μＭ濃度及び１００ｎＭ  ＰＭＡとの２時間温置である。
【０２１３】
Ｕ９３７細胞からのリゾチーム放出の阻害
Ｕ９３７細胞によるリゾチーム分泌が温置１時間後までにＰＭＳ刺激により増加し、２時間ではさらに増加した。１時間において、対照のＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌を１００％として、ＰＭＡ対照参照物は約２１０％となり；１０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約１７０％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＵ９３７によるリゾチーム分泌が約２０％低下し；５０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約１７０％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＵ９３７によるリゾチーム分泌が約２０％低下し；１００μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約１１５％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＵ９３７によるリゾチーム分泌が約４５％低下した。２時間において、対照のＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌を１００％として、ＰＭＡ対照参照物は約２４０％となり；１０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約１９５％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌が約２０％低下し；５０μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約１８５％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌が約２５％低下し；１００μＭ  ＭＡＮＳを含有する試料は約１４０％となり、ＰＭＡ対照参照物に対してＵ９３７細胞によるリゾチーム分泌が約４０％低下した。このように、ＭＡＮＳ  １００μＭによる刺激から１時間及び２時間の両方で、リゾチーム分泌は有意に減弱したが、ＭＡＮＳの５０又は１０μＭではこれ程は減弱しなかった。ＲＮＳペプチドは、ＰＭＡにより促進されたリゾチーム分泌に何れの時間点又は試験濃度でも影響を及ぼさなかった。下記の表で与えられるデータは、試験ペプチドの５０μＭ濃度及び１００ｎＭ  ＰＭＡとの２時間温置である。
【０２１４】
ＮＫ−９２細胞からのグランザイム放出の阻害
リンパ球ナチュラルキラー細胞株ＮＫ−９２を使用して、グランザイムの放出を評価した（Ｇｏｎｇ  ＪＨ、Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌ  ｌｉｎｅ（ＮＫ−９２）ｗｉｔｈ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ８：６５２−６５８、１９９４；Ｍａｋｉ  Ｇ、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ、Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ、Ｔａｍ  ＹＫ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、ＮＫ−９２．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、１０：３６９−３８３、２００１；Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０４：１８３−１９０、１９８７）。
【０２１５】
ＮＫ細胞グランザイム分泌の測定：基本的に既に記載のようにして（Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ、Ｔｒｅｎｎ  Ｇ、Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ＭＶ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０４：１８３−１９０、１９８７）、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシンチオベンジルエステル（ＢＬＴ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）の加水分解を測定することにより、ＮＫ−９２細胞から分泌されるグランザイムをアッセイした。上清を５０μＬずつ９６ウェルプレートに移し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中のＢＬＴの０．２ｍＭ溶液及び０．２２ｍＭ  ＤＴＮＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）１５０μＬを上清に添加した。温置３０分後、室温にて４１０ｎｍでの吸収を読み取った。結果は、同数のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解細胞において得られる量を用いて、総細胞酵素含量の％として表した。
【０２１６】
ＮＫ−９２細胞からの標準グランザイムが定量に対して利用可能ではないので、発明者らは、グランザイムの放出及び細胞内（溶解細胞より）レベルの両方を測定し、放出されたグランザイムを、それぞれに対して総量（細胞内及び放出）の％として表した。ＮＫ−９２細胞からの細胞内グランザイムを測定するために、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した細胞の適切な分注物を上述のように酵素の定量のために取っておいた。培養間の変動を最小にするために全てのデータを対照の％として表した。下記の表で与えられるデータは、試験ペプチドの５０μＭ濃度及び１００ｎＭ  ＰＭＡとの２時間温置である。
【０２１７】
細胞毒性
ＬＤＨ維持／放出により評価した場合（データは示さない。）（Ｐａｒｋ  Ｊ−Ａ、Ｈｅ  Ｆ、Ｍａｒｔｉｎ  ＬＤ、Ｌｉ  Ｙ、Ａｄｌｅｒ  ＫＢ．Ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｃｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉａ  ＰＫＣδ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ａｍ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００５；１６７：６５１−６６１も参照）、細胞において毒性反応を生じる処理はなかった。
【０２１８】
予備実験において、下記表で与えられる次のペプチドは、ヒト好中球からのＭＰＯ、ＨＬ−６０クローン１５細胞からのＥＰＯ、Ｕ９３７細胞からのリゾチーム及びＮＫ−９２細胞からのグランザイムの放出の個々の％阻害率を示す（ここで、ＭＡ−は、ペプチドのαＮ末端位置でのミリストイル置換基の存在を示し；Ａｃ−は、ペプチドのαＮ末端位置でのアセチル置換基の存在を示し；Ｈは、ペプチドに結合する基がないことを示し；ＮＨ２は、Ｃ末端位置でのアミドの存在を示す。）。複数実験から阻害データの平均を求める。ｐＨ６．５での０．５Ｎ  食塩水中のペプチドの定性的溶解性は、下記表３でｍｇ／ｍＬで表す。Ｎ末端化学部分をミリストイル基から変化させることにより、水性溶媒中で本明細書中で開示するペプチドの溶解度が変化し得る。例えば、ミリストイル基をアセチル基に変化させることにより、その結果、表３で示す水溶性が向上する。
【０２１９】
【表３】
2009544737.tif 000015
2009544737.tif 000016
【実施例２】
【０２２０】
ＭＡＮＳ及び関連ペプチドによるリポ多糖（ＬＰＳ）誘導性の肺の炎症のインビボでの阻害
この実施例は、基本的に、Ｃｏｘ、Ｇ、Ｃｒｏｓｓｌｅｙ、Ｊ．及びＸｉｎｇ、Ｚ．；Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ；Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２３２−２３７、１９９５；Ｈｉｒａｎｏ  Ｓ．、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ  ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ、Ｉｎｄ．Ｈｅａｌｔｈ  ３５：３５３−３５８、１９９７；及びＵｌｉｃｈ  ＴＲ、Ｗａｔｓｏｎ  ＬＲ、Ｙｉｎ  ＳＭ、Ｇｕｏ  ＫＺ、Ｗａｎｇ  Ｐ、Ｔｈａｎｇ  Ｈ及びｄｅｌ  Ｃａｓｔｉｌｌｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１４８５−１４９６、１９９１により記載の方法に従い行った。
【０２２１】
このようにして、体重１５から２０ｇの６から７週齢のＣＤ１雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、ケージあたり５匹の群で収容した。動物には、標準的なげっ歯類の餌及びろ過水を不断供給した。標準的温度（６４から７９°Ｆ）及び３０から７０％の相対湿度で、ＮＩＨ規定のガイドライン下で動物を収容した。
【０２２２】
各群５匹で５群のマウスの処置群を、ＰＢＳで処置してその後ＰＢＳで処置するか、ＰＢＳで処置しその後ＬＰＳで処置するか、（ミリストイル化）ＭＡＮＳペプチドで処置してその後ＬＰＳで処置するか、配列番号１のアセチル化ペプチドで処置してその後ＬＰＳで処置するか又は、配列番号１０６のアセチル化ペプチドで処置してその後ＬＰＳで処置するかの何れかを行った。
【０２２３】
鼻腔内ペプチド滴下前処置：ＬＰＳ誘導性の肺の炎症を阻害又は軽減するその能力についてインビボで評価するべき本発明のペプチドを１ｍＭの濃度になるようにＰＢＳ中で溶解させた。吸入により０．８％イソフルオランで麻酔した動物に対して、続くＬＰＳの滴下前にペプチド溶液の２ｘ１０μＬ鼻腔内ボーラスで１つの鼻孔を３０分間前処理する。
【０２２４】
鼻腔内ＬＰＳ滴下：リポ多糖（ＬＰＳ）エンドトキシン（エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、大腸菌）血清型０１１：Ｂ４由来エンドトキシン；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｓｉｇｍａ製品情報シート、題名：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１１：Ｂ４を参照のこと。）をリン酸緩衝食塩水中で２５００μｇ／ｍＬになるように溶解した。動物をエンドトキシンに曝露するために、０．８％イソフルオランで吸入により麻酔した動物に、２，５００μｇ／ｍＬエンドトキシン溶液の１０μＬ鼻腔内ボーラスを投与した。１０μＬボーラスを１つの鼻孔に投与した。エンドトキシン滴下後、強制呼吸、無気力及び水／餌摂取低下について動物を監視した。
【０２２５】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）：最後の滴下から６時間後、動物を麻酔し（９０ｍｇ／ｋｇネンブタール）、放血により屠殺した。肺を連続して２回、ＰＢＳの１．０ｍＬ分注液で洗浄した。回収したＢＡＬ液を遠心して、続くカウント及び示差分析のために細胞を取り出した。トータルタンパク質、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＬＤＨ及びヘモグロビンの分析のために、回収した洗浄液を使用した。
【０２２６】
分析：ＣＯＢＡＳ  Ｆａｒａ分析装置（ＣＯＢＡＳ  ＦＡＲＡ  ＩＩ自動分析装置；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｃｌａｉｒ、ＮＪ）を用いてＬＤＨ、総タンパク質又はヘモグロビンのレベルについてアッセイするために、ＢＡＬ液の分注液をすぐに使用した。マウス特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃａｎｔｏｎ、Ｍａｓｓ）による続くミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の定量のために、ＢＡＬ液の分注液を−８０℃で凍結した。対照と処置群との間の差を調べるために、標準的技術によりＢＡＬデータを解析した。試験ペプチドによる炎症の阻害又は軽減を示す結果を次の表で与える。
【０２２７】
【表４】
2009544737.tif 000017
【０２２８】
【表５】
2009544737.tif 000018
【０２２９】
【表６】
2009544737.tif 000019
【０２３０】
【表７】
2009544737.tif 000020
【０２３１】
ＰＢＳ／ＰＢＳは、ＰＢＳ対照のみが投与され、走化性好中球移動を刺激するためにＬＰＳエンドトキシンが添加されなかったことを示し；ＰＢＳ／ＬＰＳは、走化性好中球移動を刺激するためにＬＰＳ（エンドトキシン）が添加されたことを示し；ＭＡＮＳ／ＬＰＳは、ＰＢＳ中のＭＡＮＳペプチドでの前処理とそれに続く、好中球移動を誘導するためのＬＰＳ刺激を行ったことを示す。ＬＰＳ処理群における総細胞数中の好中球の％は、ＭＡＮＳペプチドでの処理により、４１．７％から３０．９％に低下し；ペプチドＡｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ、配列番号１での処理により、６５．５％から４１．４７％に低下し；ペプチドＡｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ、配列番号１０６での処理により、２４．４％から３．０％に低下した。ＬＰＳ処理群でのＭＰＯ測定レベルは、ＭＡＮＳペプチドでの処理により、２８．９８ｎｇ／ｍＬから９．４９ｎｇ／ｍＬに低下し；アセチル化配列番号１を有するペプチドでの処理により、３７．９ｎｇ／ｍＬから３０．７９ｎｇ／ｍＬに低下し、アセチル化配列番号１０６を有するペプチドでの処理により、７．１９ｎｇ／ｍＬから１．５０ｎｇ／ｍＬに低下した。
【実施例３】
【０２３２】
オゾン誘発性ＣＯＰＤのマウスモデル
オゾンなどの化学的刺激による酸化ストレスは、慢性閉塞性呼吸器疾患（ＣＯＰＤ）の広く認識されている特性である。Ｒｅｐｉｎｅ  ＪＥ、Ｂａｓｔ  Ａ、Ｌａｎｋｈｏｒｓｔ  Ｉ及びｔｈｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５６：３４１−３５７、１９９７；及びまた、Ｈａｒｋｅｍａ  ＪＲ及びＨｏｔｃｈｋｉｓｓ  ＪＡ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６８：２５１-２６３、１９９３も参照のこと。
【０２３３】
１０週齢Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、ケージあたり５匹の群で、ＮＩＨのガイドライン下で動物を収容した。動物には、標準的なげっ歯類の餌及びろ過水を不断供給した。各群５匹でマウスの３群の処理群をそれぞれケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、次いで、ＰＢＳ単独又はＰＢＳ中の１．０ｍＭ  ＭＡＮＳペプチド溶液又はＰＢＳ中のアセチル化ＭＡＮＳ−断片−ペプチドＡｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（アセチル化配列番号１０６と呼ぶ。）の１．０ｍＭ溶液の何れか２５μＬで気管内投与により前処置した。次に、３０分後、オゾン又は強制大気曝露のための適切な特注チャンバーに動物を入れた。Ｈａｄｄａｄら、１９９５（Ｈａｄｄａｄ  Ｅ−Ｂ、Ｓａｌｍｏｎ  Ｍ、Ｓｕｎ  Ｊ、Ｌｉｕ  Ｓ、Ｄａｓ  Ａ、Ａｄｏｃｋ  Ｉ、Ｂａｒｎｅｓ  ＰＪ及びＣｈｕｎｇ  ＫＦ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３６３：２８５-２８８、１９９５）により記載の方法を僅かに改変して、１−１０ｐｐｍのオゾン濃度で、動物をオゾンに２時間曝露した。Ｂｕｒｔｏｎ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａからのオゾン発生装置モデルＯＬ８０Ｆ／Ｂ  ＯｚｏｎｅＬａｂを用いてオゾンを発生させた。Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｏ３  Ａｎａｌｙｚｅｒ（モデル４００Ｅ、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、ＣＡ）を用いて、オゾン濃度を連続的に監視した。２つのさらなるマウス群（それぞれ前処理なし）を、同じ条件下でオゾンに曝露するか又はオゾン処置群と同様の条件下ではあるがオゾンなしで強制大気に曝露した。曝露後、動物を放血により屠殺し、肺を連続して２回、ＰＢＳの１．０ｍＬ分注液で洗浄した。回収した気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を遠心して、続くカウント及び示差分析のために細胞を除去した。タンパク質及びＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから得たアッセイキット）によるＩＬ−６、ＩＦＮγ及びＫＣ（マウスＩＬ−８類似体）のさらなる分析のために、回収した洗浄液を使用した。
【０２３４】
処置群の関数としてのＢＡＬ液への好中球移動の％阻害率及びＰＢＳ単独で処置した対照群に対する％阻害率を表で与える。
【０２３５】
【表８】
2009544737.tif 000021
【０２３６】
気管内注入前処置及び続くオゾンによる処置の関数として、ＢＡＬ液中のＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍＬ）を次のように得た。ＩＬ−６レベルは、ＭＡＮＳペプチドで前処置し、次いでオゾンに曝露したマウス群においておよそ３６４．５ｐｇ／ｍＬ；アセチル化ＭＡＮＳ−断片−ペプチド、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６）で前処置し、次いでオゾンに曝露したマウス群においておよそ１３０．４ｐｇ／ｍＬ；ＰＢＳで前処置し、オゾンに曝露したマウス群においておよそ１０４１．３ｐｇ／ｍＬ；前処理なしで直接強制空気に曝露したマウス群においておよそ４３．２ｐｇ／ｍＬであることが分かった。
【０２３７】
気管内注入前処置及び続くオゾンによる処置の関数として、ＢＡＬ液中のＫＣ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を次のように得た。ＫＣレベルは、ＭＡＮＳペプチドで前処置し、次いでオゾンに曝露したマウス群においておよそ１８３．６ｐｇ／ｍＬ；アセチル化ＭＡＮＳ−断片−ペプチド、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６）で前処置し、次いでオゾンに曝露したマウス群においておよそ１５９．７ｐｇ／ｍＬ；ＰＢＳで及び前処置し、オゾンに曝露したマウス群においておよそ４６６．６ｐｇ／ｍＬ；前処理なしで直接強制空気に曝露したマウス群においておよそ３６．３ｐｇ／ｍＬであることが分かった。
【０２３８】
気管内注入前処置及び続くオゾンでの処置の関数として、ＢＡＬ液中のＩＦＮγ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を次のように得た。ＩＦＮγレベルは、ＭＡＮＳペプチドで前処置し、次いでオゾンに曝露したマウス群においておよそ７．４ｐｇ／ｍＬ；アセチル化ＭＡＮＳ−断片−ペプチド、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ（配列番号１０６）で前処置し、次いでオゾンに曝露したマウス群においておよそ３．６ｐｇ／ｍＬ；ＰＢＳで前処置し、オゾンに曝露したマウス群においておよそ８．６ｐｇ／ｍＬ；及び直接強制空気に曝露したマウス群においておよそ５．０ｐｇ／ｍＬであることが分かった。
【０２３９】
マウスへのオゾンの投与により、浸潤好中球細胞ならびにＢＡＬ中のＩＬ−６及びＫＣレベルが顕著に上昇した。マウスをＰＢＳで前処置した対照群と比較して、ＭＡＮＳペプチドで前処置した群及びアセチル化ペプチド、Ａｃ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫ、アセチル化配列番号１０６で前処理した群は、それぞれオゾン曝露後、ＢＡＬ液中で好中球細胞浸潤の低下を示した（例えば、ＰＢＳ対照に対して、それぞれ、９３％±１０％及び８１％±１０％）。同時に、ＭＡＮＳペプチド及びアセチル化ペプチドアセチル化配列番号１０６もまた、オゾン曝露後、ＫＣ濃度（例えば、ＰＢＳ対照に対して、それぞれ、６５．８％±１０％及び７１．３％±１０％）及びＩＬ−６レベル（例えば、ＰＢＳ対照に対して、６７．８％±１５％、ＭＡＮＳ及び９１．３％±１５％アセチル化配列番号１０６）を顕著に低下させたが、インターフェロン−γレベルにはあまり影響がなかった。まとめると、これらのデータから、ＭＡＮＳペプチド及びアセチル化配列番号１０６ペプチドは、気道へのオゾン誘発性の好中球移動を顕著に低下させるか又は阻害し、同時に、選択的ケモカイン及びサイトカインを減少させることが分かる。ＭＡＮＳペプチド又はアセチル化ペプチド配列番号１０６で前処置した動物からのＢＡＬ液中のＩＬ−６レベルは、ＰＢＳで前処置したものと比較して、それぞれおよそ６８％及び９１％の阻害率を示した。ＭＡＮＳペプチド又はアセチル化ペプチド配列番号１０６で前処置した動物からのＢＡＬ液中のＫＣレベルもまた、ＰＢＳで前処置したものと比較して、およそ６５％及び７１％の阻害率を示した。
【実施例４】
【０２４０】
慢性気管支炎モデル
手順は、Ｖｏｙｎｏｗ  ＪＡ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＢＭ、Ｍａｌａｒｋｅｙ  ＤＥ、Ｂｕｒｃｈ  ＬＨ、Ｗｏｎｇ  Ｔ、Ｌｏｎｇｐｈｒｅ  Ｍ、Ｈｏ  ＳＢ、Ｆｏｓｔｅｒ  ＷＭ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｅｌａｓｔａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｕｃｕｓ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８７：Ｌ１２９３−Ｌ１３０２、２００４により記載され、マウスにおける慢性気管支炎のモデルを開発するために、これに従った。具体的に、慢性気管支炎の代表的な病理特性である杯細胞過形成は、気道に染み込ませたヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）へのマウスの慢性的な曝露により誘発される。
【０２４１】
雄Ｂａｌｂ／ｃマウスにヒトＮＥを気管内吸入させる。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥなどの供給業者から、全部で３０匹のマウス（体重約２５−３０ｇ）を購入する。１２時間の日周期で餌及び水を不断給餌してマウスを維持する。第１、４及び７日に、口腔咽頭吸入により動物にＮＥを投与する。イソフルオラン（Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＩｓｏＦｌｏ及びＳｔｏｅｌｔｉｎｇからのＯｐｅｎ−Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｇａｓ  Ａｎｅｔｈｅｓｉａ  Ｓｙｓｔｅｍ）での吸入麻酔直後に、上顎切歯により動物を６０°の傾斜板上で吊るし、動物の舌を咽頭口腔部の末端部に伸ばしてヒトＮＥ［５０μｇ（４３．７５単位）／４０μＬ  ＰＢＳ（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ、ＭＯ）の液体体積を送達させる。舌を伸ばすと、動物は嚥下できず、液体体積は呼吸管に吸入される。
【０２４２】
最後のＮＥ曝露から７日後、慢性気管支炎における気道をモデルとする杯細胞過形成が最大となったとき（Ｖｏｙｎｏｗら、２００４参照）、マウス（群あたり５匹）に、ＰＢＳ（対照として）又はＭＡＮＳペプチドの溶液、ＲＮＳペプチドの溶液又はＰＢＳ中で溶解させたアセチル化ペプチド配列番号１０６などのペプチドの溶液の１００μＭの何れか５０μＬを気管内に染み込ませた。１５分後、３分間、およそ６０ｍＭでメタコリンを送達する微粒子エアロゾルを与えるためのＢｕｘｃｏシステム噴霧器を用いて、メタコリンを投与することにより、粘液分泌を引き起こす。メタコリン投与から１５分後、１００％ＣＯ２ガスへの吸入曝露により、マウスを屠殺する。
【０２４３】
組織化学。上述の曝露後、動物からの肺を洗い流して血液を除去し、次いで、食塩水で半分に希釈したＯＣＴ（Ｏｐｔｉｕｍ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ液（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｃｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で膨張させる。この肺をＰＢＳ中の１０％ホルムアルデヒド中に４℃で一晩浸漬し、パラフィンワックスに対して処理を行う。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｍ、Ｖａｒｇａｆｔｉｇ  ＢＢ、Ｍａｒｔｉｎ  ＬＤ、Ｐａｒｋ  ＪＪ、Ｇｒｕｂｅｒ  ＡＤ、Ｌｉ  Ｙ、Ａｄｌｅｒ  ＫＢ、Ａ  ＭＡＲＣＫＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｌｏｃｋｓ  ｍｕｓｃｕｓ  ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０：１９３−１９６、２００４により記載のように、気道においてムチンを染色するために、５μｍ切片を過ヨウ素酸シッフ／ヘマトキシリンで処理する。
【０２４４】
組織学的粘液指標。中枢及び末梢気道の両方を含むＡＢ／ＰＡＳ染色切片において、組織学的粘液指標（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｌ、Ｎｉｕ  Ｎ、Ｔｅｍａｎｎ  Ｕ−Ａ、Ｓｔｏｄｄａｒｄ  Ａ、Ｆｌａｖｅｌｌ  ＲＡ、Ｒａｙ  Ａ、Ｈｏｍｅｒ  ＲＪ及びＣｏｈｎ  Ｌ、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅ−１３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｅ−９、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：５９３−６０２、２００２）を行う。１０ｘ対物レンズでスライドを調べ、デジタルカメラで画像を撮影する。最低４個の代表的横断又は矢状切片断面の気道を動物ごとに画像表示する。気道の完全周囲を視覚化し、画像にそれが含まれ得る気道のみを分析する。肺胞腔において直接開いている気道は含まれない。次の５段階評価システムを用いて、各切片に対する処置条件を知らない実験者が、画像化した各気道におけるＰＡＳ−陽性染色の程度を半定量的に調べる（グレード０、ＰＡＳ染色なし；グレード１、気道上皮の２５％以下がＰＡＳ染色；グレード２、気道上皮の２６−５０％がＰＡＳ染色；グレード３、気道上皮の５１−７５％がＰＡＳ染色；及びグレード４、気道上皮の＞７５％がＰＡＳ染色。この評価システムを使用して、各群に対して粘液指標スコアを計算し、平均±ＳＥとして結果を表す。
【０２４５】
平均±標準誤差として全結果を表す（ｎ＝５匹、それぞれに対して１０−２０枚の切片）。ＳＰＳＳ６．１ソフトウェアを用い、片側ＡＮＯＶＡを用いて、次いでＳｃｈｅｆｆｅ検定により、有意レベルを計算する（＊＝ｐ＜０．０５の閾値のあるデータ間で有意）。
【実施例５】
【０２４６】
インビボアッセイ
次の一連の実験の目的は、ＲＮＳなどの対照ペプチドと比較した、炎症における、炎症部位での局所使用又はｉ．ｖ．注入の何れかによる、インビボ送達後の本発明のペプチドの影響を確立することである。２つのモデルがこの測定のために有用である：（ｉ）マウス空気嚢炎症モデル及び（ｉｉ）マウスチオグリコール酸誘導性腹膜炎モデル。両方とも、好中球が不可欠な役割を有する、特徴がよく分かっている炎症のモデルである。空気嚢モデルは、炎症の短時間経過（およそ４時間）においてペプチドの影響の測定を可能にし、腹膜炎モデルは、炎症のより長い時間経過（およそ２４時間）に関して有用である。
【０２４７】
全体的実験設計：
４つの実験、各モデルに対して２つ、ペプチドのｉ．ｖ．送達を試験するもの及びペプチドの局所送達を試験するもの、は、本願において開示するペプチドの影響を試験するために有用である。各実験は、２つの実験群、非炎症対照（ビヒクルによる処置）及び炎症群（即ち炎症性刺激による処置）からなる。各群を５及び場合によっては６の下位の治療群に分割する（各下位群に対してｎ＝６）。下位の治療群は、例えば：ビヒクル、ＭＡＮＳ、ＲＮＳ、試験ペプチド、場合によっては、配列を混ぜた試験ペプチドのスクランブル配列（このスクランブル配列は「ペプチド−ＳＣＲ」と名付けられる。）を有するペプチド及びデキサメタゾンである。デキサメタゾンを参照抗炎症性物質とする。ｉ．ｖ．注射又は局所滴下に対する適切な用量の選択は、予備的な用量反応実験から決定する。ヒト好中球におけるＭＡＮＳの阻害活性に基づく仮の用量は、ｉ．ｖ．送達に対して１ｍｇ／ｋｇ（１回投与）又は（空気嚢へ又はｉ．ｐ．）局所送達される５０μＭの最終濃度である。ｉ．ｖ．送達のための用量は、２Ｌ／ｋｇの分布容積を想定するように選択される。
【０２４８】
空気嚢炎症モデル
Ｃｌｉｓｈ  ＣＢ、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＪＡ、Ｇｒｏｎｅｒｔ  Ｋ、Ｓｔａｈｌ  ＧＬ、Ｐｅｔａｓｉｓ  ＮＡ、Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ｌｏｃａｌに記載のように、マウス空気嚢における好中球浸潤及び炎症に対するアッセイを行う。安定なアスピリン誘発性リポキシンの局所及び全身性送達により、インビボでの好中球補充が妨げられる。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９９  Ｊｕｌ  ６；９６（１４）：８２４７−５２。このようにして、白色の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週齢）をイソフランで麻酔し、第０及び３日に、滅菌空気３ｍＬを皮下注入することにより、背側空気嚢を膨張させる。第６日に、マウスをイソフランで麻酔する一方、滅菌０．９％食塩水１００μＬ中の尾静脈へのｉ．ｖ．又はＰＢＳ−／−  ９００μＬ中の空気嚢への局所注入（マグネシウム又はカルシウムイオン不含のダルベッコリン酸緩衝食塩水、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）の何れかでのボーラス注射として、ビヒクル、ＭＡＮＳ、ＲＮＳ、試験ペプチド又は場合によってはペプチド−ＳＣＲを送達する。１００μＬ滅菌０．９％食塩水中の０．１ｍｇ／ｋｇとしてｉ．ｖ．で送達されるか又はＰＢＳ−／−  ９００μＬ中の１０μｇとして局所送達されるデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を参照抗炎症性物質とする。滅菌ＰＢＳ  １００μＬ中で溶解させた組み換えマウス腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α、２０ｎｇ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の局所注入により空気嚢における炎症を誘発する。イソフランでマウスを麻酔する一方、最初のＴＮＦ−α注入から４時間後、滅菌ＰＢＳ  ３ｍＬで空気嚢を２回洗浄する。２，０００ｒｐｍで２３℃にて１５分間、吸引物を遠心する。上清を除去し、ＰＢＳ  ５００μＬ中で細胞を懸濁する。炎症性メディエーター濃度（場合によってはＴＮＦα以外）、ＭＰＯ活性及び脂質過酸化反応について上清の分注液をアッセイする。
【０２４９】
血球計算盤を用いて、光学顕微鏡により、細胞懸濁液において総白血球を数える。３０％ＢＳＡ１５０μＬに、再懸濁した吸引細胞（５０μＬ）を添加し、ｃｙｔｏｆｕｇｅを用いることにより、顕微鏡スライド上で２，２００ｒｐｍで４分間遠心する。Ｗｒｉｇｈｔ  Ｇｉｅｍｓａ染色で染色したサイトスピンにおいて示差的な白血球数を調べ、空気嚢滲出物あたりの各白血球の絶対数を計算するために使用する。顕微鏡分析のために、６ｍｍの組織生検パンチ（Ａｃｕ−Ｐｕｎｃｈ、Ａｃｕｄｅｒｍ）により組織を得て、１０％緩衝ホルムアルデヒドで固定する。次に、試料をパラフィン中に包埋し、薄切し、ヘマトキシリン−エオシンで染色する。細胞／ｈｐｆ数を数えることにより、組織切片において好中球を数える。遠位真皮は、炎症空気嚢真皮に対する対照とする。
【０２５０】
浸出物あたりの好中球、単球、好酸球、好塩基球及びリンパ球の総数又は組織の高倍率視野あたりの好中球数として、データを示す。平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として値を報告する。ＡＮＯＶＡにより、移動における何らかの処置の有意性を調べる。Ｐ＜０．０５は有意であるとみなす。
【実施例６】
【０２５１】
炎症を起こした腹膜モデル
雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週齢）を使用し、Ｔｅｄｄｅｒ  ＴＦ、Ｓｔｅｅｂｅｒ  ＤＡ、Ｐｉｚｃｕｅｔａ  Ｐ．Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｈａｖｅ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎｔｏ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｔｅｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９５  Ｊｕｎ  １；１８１（６）：２２５９−６４において記載のようにチオグリコール酸誘発性腹膜炎モデルを遂行する。チオグリコール酸のｉ．ｐ．注射直前に、滅菌０．９％食塩水１００μＬ中で尾静脈へ又は腹膜へＰＢＳ−／−  ９００μＬ中で局所的に、の何れかで、ビヒクル、ＭＡＮＳ、ＲＮＳ、試験ペプチド及び場合によってはペプチド−ＳＣＲをボーラス注射として送達する。１００μＬ滅菌０．９％食塩水中０．１ｍｇ／ｋｇとしてｉ．ｖ．で又はＰＢＳ−／−  ９００μＬ中１０μｇとして局所的にデキサメタゾンを送達し、これを参照抗炎症物質とする。チオグリコール酸溶液（３％ｗｔ／ｖｏｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１ｍＬをマウスに腹腔内注射することにより、炎症を誘発する。炎症誘発から２４時間後、人道的にマウスを安楽死させ、温（３７℃〜）培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＣＳ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ）５ｍＬを腹膜に注入し、次いで、腹部を穏やかに揉む。２，０００ｒｐｍで２３℃にて１５分間、腹部洗浄液の吸引物を遠心する。上清を除去し、細胞をＰＢＳ  ５００μＬ中で懸濁する。ＭＰＯ活性、炎症性メディエーター濃度及び脂質過酸化反応について、上清の分注液をアッセイする。
【０２５２】
血球計算盤を用いて、光学顕微鏡により、細胞懸濁液中で総白血球を数える。３０％ＢＳＡ１５０μＬに、再懸濁した吸引細胞（５０μＬ）を添加し、ｃｙｔｏｆｕｇｅを用いることにより、顕微鏡スライド上で２，２００ｒｐｍで４分間遠心する。Ｗｒｉｇｈｔ  Ｇｉｅｍｓａ染色で染色したサイトスピンにおいて示差的な白血球数を調べ、空気嚢滲出物あたりの各白血球の絶対数を計算するために使用する。
【０２５３】
浸出物あたりの好中球、単球、好酸球、好塩基球及びリンパ球の総数として、データを示す。平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として値を報告する。ＡＮＯＶＡにより、移動における何らかの処置の有意性を調べる。Ｐ＜０．０５は有意であるとみなす。
【０２５４】
脱顆粒
脱顆粒のマーカーとしてミエロペルオキシダーゼを使用する。空気嚢又は腹腔洗浄液から得られた細胞上清中のミエロペルオキシダーゼ活性をアッセイし、ＴＭＢ法を用いて上述のように解析する。
【０２５５】
炎症性メディエーター濃度
市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の説明書に従い、空気嚢及び腹腔洗浄液中のキーとなる前炎症性メディエーター、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＫＣ及びＰＧＥ２の濃度を調べる。
【０２５６】
脂質過酸化反応
Ｆ２−イソプロスタンの濃度は、好中球及びその他の細胞からの活性酸素中間体の放出の結果による酸化損傷の高感度で特異的な目安である（Ｍｉｌｎｅ  ＧＬ、Ｍｕｓｉｅｋ  ＥＳ、Ｍｏｒｒｏｗ  ＪＤ．Ｆ２−ｉｓｏｐｒｏｓｔａｎｅｓ  ａｓ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．２００５  Ｎｏｖ；１０  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１０−２３）。製造者の説明書に従い、市販のＥＬＩＳＡ（８−イソプロスタンＥＩＡ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、空気嚢及び腹腔浸出物において、Ｆ２−イソプロスタン濃度を調べる。
【０２５７】
評価項目
本実験は、炎症性メディエーターの放出の阻害の上記の目安の１以上により、試験ペプチドの局所又は全身送達の何れかが炎症を軽減すれば、成功とみなされる。
【０２５８】
本発明の活性断片ペプチドは、炎症を起こした空気嚢又は腹腔への好中球流入及び炎症を起こした空気嚢又は腹腔での脱顆粒を阻害し、その結果、ＭＰＯ活性を低下させ、脂質過酸化反応を低下させ、炎症性メディエーター産生を低下させる。
【０２５９】
先行する実施例は、本発明の説明であり、これを限定するものとして解釈すべきものではない。本発明は、次の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲と均等なものが本発明に含まれる。
【図１】
2009544737.tif 000022
【図２】
2009544737.tif 000023
【図３】
2009544737.tif 000024
【図４】
2009544737.tif 000025
【図５】
2009544737.tif 000026
【図６】
2009544737.tif 000027
【図７】
2009544737.tif 000028
【図８】
2009544737.tif 000029
【図９】
2009544737.tif 000030
【図１０】
2009544737.tif 000031
【図１１】
2009544737.tif 000032
【図１２】
2009544737.tif 000033
【配列表】
2009544737000001.app
【国際調査報告】
2009544737.tif 000034