(57)【要約】  この発明は、液中の検体の、表面に結合されたプローブへの結合を、実時間で測定する方法、およびシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体のマイクロアレイ上のプローブへの結合を、実時間で測定することよりなる方法。
【請求項２】
以下のステップよりなる方法：
(a) 複数の異なる検体よりなる流体体積を、複数の異なるプローブよりなる固体基板と接触させること、ここで、該プローブは、特定的に検体に結合することができる；かつ、
(b) 信号を、該流体体積が前記基板と接触している間に、多数の時点で測定すること、ここで、該多数の時点で測定された信号は、該検体のプローブとの結合の量と相関されることができる。
【請求項３】
請求項２記載の方法であって、さらに、(c) 多数の時点で測定された信号を用いて検体の前記流体体積中での濃度を決定すること、よりなる。 
【請求項４】
請求項２記載の方法において、時間とともにの信号の変化は、該プローブに結合された検体の量と相関している。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、前記信号は、電気化学的、電気的、機械的、磁気的、音響的、または、電磁的な信号である。
【請求項６】
請求項２記載の方法において、前記信号は、蛍光発光、吸収、またはルミネッセンスよりなる電磁的な信号である。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記検体は、消失する一部よりなり、かつ、複数時点で測定された前記電磁的信号は、少なくとも部分的に、蛍光発光の消失に相関する。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記消失された蛍光発光は、前記プローブに結合された蛍光の一部に、少なくとも部分的によるものである。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、前記消失された蛍光発光は、前記固体基板に結合された蛍光の一部に、少なくとも部分的によるものであり、ここで、このような蛍光の一部は、前記プローブに共有結合されていない。
【請求項１０】
請求項２記載の方法において、前記多数の時点で測定された光学信号は、少なくとも部分的に、蛍光共鳴エネルギー移転（FRET）によるものである。
【請求項１１】
請求項２記載の方法において、前記異なるプローブは、前記固体基板上で、異なるアドレス可能な位置に位置している。
【請求項１２】
請求項２記載の方法において、少なくとも、約３、４、５、１０、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００のプローブがある。
【請求項１３】
請求項２記載の方法において、前記固体基板は、１つ、または、それ以上のビーズよりなる。
【請求項１４】
請求項２記載の方法において、前記検体、および／または、前記プローブは、核酸、または核酸類似体、たんぱく質、炭水化物、または、脂質、の化学スピーシーズよりなる。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記検体、および前記プローブは、同じタイプの化学スピーシーズよりなる。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法において、前記検体、および前記プローブは、おのおの、異なるタイプの化学スピーシーズよりなる。
【請求項１７】
請求項２記載の方法において、前記検体、および前記プローブは、核酸または核酸類似体よりなる。
【請求項１８】
請求項２記載の方法において、前記プローブは、 タンパク質よりなる。
【請求項１９】
請求項１４記載の方法において、
前記プローブは、抗体、または酵素よりなる。
【請求項２０】
請求項２記載の方法において、前記少なくとも２つの時点は、その信号に対応する検体のプローブへの結合の量が、飽和の５０％より小さい時点で測定される。
【請求項２１】
請求項２記載の方法において、２つ、またはそれ以上の時点は、前記流体体積が１つの温度にあるとき、測定され、かつ、２つ、またはそれ以上の時点は、前記流体体積が第２の温度にあるとき、測定される。
【請求項２２】
請求項２記載の方法において、２つ、またはそれ以上の時点は、前記流体体積における検体が１つの濃度にあるとき、測定され、かつ、２つ、またはそれ以上の時点は、前記流体体積が第２の濃度にあるとき、測定される。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記検体の濃度は、時点のセット間で豊富化される。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、前記検体の濃度は、時点のセット間で希釈化される。
【請求項２５】
請求項１１記載の方法において、前記固体基板は、また、制御スポットよりなる。
【請求項２６】
請求項６記載の方法であって、異なる励起、および／または、放射スペクトルを持つ、多数の蛍光発光スピーシーズよりなる。
【請求項２７】
請求項２記載の方法であって、さらに、プローブの、２つ、または、それ以上の検体との結合を、決定すること、これは、信号、および時間に対応する結合データを、該２つ、またはそれ以上の検体のおのおのの結合データへの貢献を決定するアルゴリズムに従うものとさせること、よりなる。
【請求項２８】
請求項７記載の方法において、前記プローブは、蛍光を発する一部よりなり、かつ、該プローブの最初の表面濃度は、蛍光発光を測定することにより決定される。
【請求項２９】
請求項２記載の方法において、
(i) 前記検体は、消失剤によりラベルされた核酸分子よりなり；
(ii) 前記プローブは、核酸分子よりなり；
(iii) 前記基板は、実質的にプレーナであって、かつ、該基板上の異なるアドレスにある離散的な位置のアレイよりなり、ここで、該位置は、それらに、異なるプローブ、および信号を生成する蛍光を発するラベルを取り付けており、ここで、該蛍光を発するラベルは、該プルーブに対して十分近傍にあり、これにより、該位置での検体とプローブ間の混成は、FRET、および／または、信号の消失を、生ずる。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、前記蛍光を発するラベルは、前記プローブを介して、前記表面に取り付けられている。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法において、前記蛍光を発するラベルは、前記プローブに、非共有結合により取り付けられている。
【請求項３２】
請求項２９記載の方法において、前記蛍光を発するラベルは、前記プローブを介して、前記表面に取り付けられていない。
【請求項３３】
請求項２９記載の方法において、さらに、時間とともに、信号の変化の動力学に基き、流体における検体の濃度を決定すること、よりなる。
【請求項３４】
請求項２記載の方法において、前記流体体積は、さらに、消失剤でラベルされた競争者分子よりなり、ここで、前記競争者分子は、プローブとの結合につき、検体と競争する。
【請求項３５】
検体分子とプローブ分子のアレイとの間の結合を検出する方法において、以下のことよりなる：
(a) 検体分子を、プローブ分子のアレイでインキュベートすること、ここで、検体分子とプローブ分子との間の結合は、該アレイからの信号の変化を生じる、および、
(b)  インキュベーションの間に、アレイからの信号を、時間とともに測定すること。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法において、前記目標分子とプローブ分子との間の結合は、アレイからの信号の減少を生ずる。
【請求項３７】
請求項３５の方法において、前記目標分子とプローブ分子との間の結合は、アレイからの信号の増加を生ずる。
【請求項３８】
以下のものよりなるシステム：
(a) (i) 表面を有する固体サポート、および、(ii) 複数の異なるプローブ を持つデバイス、ここで、該異なるプローブは、該表面に不動化されている、
(b) 検体よりなる流体体積、ここで、該流体体積は、固体サポートと接触している、かつ、
(c) 流体体積が固体サポートと接触している間に、マイクロアレイ上の複数のスポットのおのおのよりの複数時点で測定された信号を検出する手段よりなる検出器アセンブリ。
【請求項３９】
請求項３８記載のシステムにおいて、前記検出器で検出された多数時点で測定された信号は、検体のプローブへの結合と相関され得る。
【請求項４０】
請求項８記載のシステムにおいて、さらに、以下のものを備える：
(d) 固体サポート、および／または、流体体積の温度を制御するアセンブリ。
【請求項４１】
請求項３８のシステムにおいて、前記異なるプローブは、異なるアドレス可能な位置で不動化されている。
【請求項４２】
請求項３８のシステムにおいて、さらに、以下を備える：
(e) データを、獲得する、および、ストアするためのデータ獲得システム、および、(f)  信号を解析するための計算システム。
【請求項４３】
請求項３８のシステムにおいて、  前記複数の検出器は、トランスデューサーのアレイよりなる。
【請求項４４】
請求項３８記載のシステムにおいて、前記トランスデューサーのアレイは、電気化学的、電気的、機械的、磁気的、音響的、または、光学的信号を、測定することができる。
【請求項４５】
請求項４３記載のシステムにおいて、前記固体基板は、トランスデューサーのアレイと接触している。
【請求項４６】
請求項４３記載のシステムにおいて、前記トランスデューサーアレイは、固体基板から離れている。
【請求項４７】
請求項４３記載のシステムにおいて、１つ、またはそれ以上のトランスデューサーは、アドレス可能位置に対応する。
【請求項４８】
請求項４４記載のシステムにおいて、前記トランスデューサーアレイは、固体基板に光学的に結合された光学トランスデューサーアレイである。
【請求項４９】
請求項４８記載のシステムにおいて、光学トランスデューサーアレイは、固体基板に、１つ、またはそれ以上のレンズを介して光学的に結合されている。
【請求項５０】
請求項３８記載のシステムであって、複数の結合レートを同時に測定することができるものである。
【請求項５１】
請求項５０記載のシステムにおいて、前記複数の結合レートは、複数の検体の濃度を決定するために、使用される。
【請求項５２】
請求項３８記載のシステムにおいて、前記検出器により検出される信号は、電気化学的、電気的、機械的、磁気的、音響的、または、光学的信号よりなる。
【請求項５３】
請求項５２記載のシステムにおいて、前記信号は、サイクリック電圧測定、インピーダンススペクトロスコピー、または、表面プラズマ共鳴に使用される。
【請求項５４】
請求項５２記載のシステムにおいて、前記信号は、光学信号である。
【請求項５５】
請求項５４記載のシステムにおいて、前記信号は、蛍光発光、吸収、または、ルミネセンスからのものである。
【請求項５６】
請求項５５記載のシステムにおいて、前記検体の結合に関連する多数時点で測定された信号は、すくなくとも部分的に、蛍光発光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）によるものである。
【請求項５７】
請求項５５記載のシステムにおいて、前記検体の結合に関連する多数時点で測定された信号は、すくなくとも部分的に、蛍光発光信号の消失によるものである。
【請求項５８】
請求項５７記載のシステムにおいて、前記多数時点で測定された信号は、すくなくとも部分的に、消失部分よりなる検体と、蛍光発光部分よりなるプローブとの間の相互作用によるものである。
【請求項５９】
請求項５８記載のシステムにおいて、前記光学信号よりなる部分は、プローブ検体に結合されている。
【請求項６０】
請求項５８記載のシステムにおいて、前記光学信号よりなる部分は、基板に結合されている。
【請求項６１】
システムであって、以下のものよりなる：
a． マイクロアレイを結合させる手段、および、マイクロアレイの表面上でアッセイを行う手段よりなるアッセイアセンブリ；および、
b． マイクロアレイ上の複数のスポットのおのおのからの多数時点で測定された信号を、アッセイを行っている間に検出する検出アセンブリ。
【請求項６２】
請求項６１に記載のシステムにおいて、前記アッセイを行う手段は、マイクロアレイの表面が、コンパートメントの床、および、試薬および検体をコンパートメントに供給する手段よりなるコンパートメントを与える手段よりなる。
【請求項６３】
以下のものよりなるデバイス：
表面、および複数の異なるプローブを有する固体基板、ここで、
(a) 異なるプローブは、異なるアドレス位置の表面に不動化されている、
(b) アドレス可能位置は、表面に結合された光学信号部分よりなる、
(c) 光学信号部分は、直接プローブに結合されていない、
(d) 光学信号部分からの光学信号は、検体のプローブへの結合に基き、変化することが可能である。
【請求項６４】
請求項６３記載のデバイスにおいて、前記光学信号部分は、ダイ、ルミネッセント部分、または、蛍光発光部分よりなる。
【請求項６５】
ソフトウェアであって、以下のものよりなる：
(a) マイクロアレイ上の複数の既知の位置のおのおのでの、多数時点で測定された信号についての情報をアクセスするコンピュータ読み取り可能なコード、ここで、信号強度は、検体分子と、既知の位置でマイクロアレイに取り付けられたプローブ分子との間の結合イベントの数の関数である。
【請求項６６】
請求項６５記載のソフトウェアであって、以下のものよりなる： 
(b) 結合が飽和に達したとき予測される結合イベントの数を決定する情報を用いるアルゴリズムを実行するコード。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年６月５日に出願された、米国仮特許出願第６０／８１１，０６４号および、２００６年８月２４日に出願された、米国仮特許出願第６０／８４０，０６０号の優先権を主張する、これらの出願の内容は、参照により、その全体が、ここに組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アフィニティベースのバイオセンサは、ある生体分子（認識プローブ）の選択的拘束、および相互作用を行って、特定の目標検体を、生体学的サンプル内において検出する。該バイオセンサプラットフオーム、および、それらの平行な、かつ、マイクロアレイとして最小化されたバージョンは、プローブ−目標複合物の特定的な結合を行って、検出可能な信号、これは、目標の存在、および考えられ得るところでのそれらの豊富さ、に相関する、を生成することである。このようなシステムの本質的な構成要素は、信号−生成物理化学トランスデューサおよび読み出し装置内に集積され、または、これと密に関連している分子認識層を含む。
【０００３】
目標−特定的信号を生成するために、サンプル体積中の目標検体は、一般に、最初に、前記認識層と衝突する必要があり、プローブと相互作用し、正しいプローブと接合し、かつ、究極的に形質導入プロセスを行う。代表的なバイオセンサ設定（たとえば、水溶性生体学的バッファ）における検体の動きは、移動拡散がその多くを占め、これは、微視的観点からすれば、確率的質量移送プロセスである（各検体分子につき、ランダムウォークとモデルされる）。したがって、検体のプローブとの衝突は、確率論的プロセスとなる。さらに、化学結合形成の量子−機械的性質のために、プローブと検体分子との間の相互作用は、また、確率的であり、これにより、さらに、バイオセンサおよびマイクロアレイにおける測定データの不確実性、および雑音腐敗を生ずることとなる。われわれは、このような現象を、検出システムにおける本質的な雑音と見るが、これは、測定がノイズレスであるときにも、避けることのできない不確実性を結果として生ずる。このような本質的な雑音は、それは、分子レベル相互作用の確率論的な性質をその起源とするものであるため、本質的に不可避のものである。その例は、マイクロアレイにおけるポアソンノイズ源、および、イメージセンサ検出ショットノイズを含む。
【０００４】
本質的ノイズのほかに、他の非理想的な性質は、また、マイクロアレイ実験により得られた信号を腐敗させる。このような現象の例は、プローブ濃度変動、サンプル準備組織的エラー、および、プローブ飽和を含む。われわれは、組織的エラーを、意図された検出手続きからの不所望の変動と定義する。もし、これらのエラーが、正確に評価されれば、理論的には、それらは、実験後データ処理により補償することができる。
【０００５】
遺伝子発現マイクロアレイは、広く使われているマイクロアレイプラットフォームである。これらのシステムは、数千の遺伝子の発現レベルを同時に測定し、ライフサイエンスリサーチにおける、質量的に−並列な、アフィニティベースの検出プラットフォームを、与える。不運にも、各実験における本質的な雑音ソース、および組織的エラーの両方を起源とする不確実性は、興味のある生物学的プロセスの重要な特徴のいくつかを、ぼんやりしたものとする。マイクロアレイにおける発現レベルの不確実性 (全体的測定エラー)は、以前に述べたように、検出プロセスの確率的な特徴を、サンプル抽出およびｍＲＮＡ純化からハイブリダイゼーションおよび蛍光強度測定へのすべてと中を、その期限とするものである。現在のところ、予測された値の正確性、および信号−対雑音比（ＳＮＲ）を、増大するよう試みる種々の技術がある。それでもやはり、これらの技術は、しばしば、比較的方法、冗長なスポット、または、信頼性のないデータおよび異常値を排除することにより信頼可能なゾーンを導入する数学的アルゴリズムに依拠している。利用される方法と独立して、ＳＮＲがのようなアプローチにおいて改善されることのできる程度は、まだ、本質的なマイクロアレイノイズ、および組織的エラーにより、制限され得る。
【０００６】
マイクロアレイにおける非特定的な結合から生じる干渉信号は、一般に、“干渉信号”と言われる。慣習的にマイクロアレイ解析においては、背景信号、およびそれらの変動は、すべて、なんらの信号内容のない腐敗性ノイズと考慮される。ユーザは、しばしば、副最適的な、まだ広く採用されているアプローチを実行する。この技術は、背景に鑑みた、信号強度に対する信頼性のある閾値レベルを定義し、これは、該信号を、重要性のない（閾値以下の）ものと、重要性のある（閾値以上の）のレジーム）ものとに、有効に分割する。この特定的なアプローチは、どこでも一定であるグローバルな背景信号があるときのみ、理論的に有効であり、かつ、最適である。実際のマイクロアレイ実験においては、この仮定は、背景、および変動レベルは、スポット間で変わるので有効ではない可能性がある。局所背景減算方法を用いるときでも、与えられたマイクロアレイプローブスポットの直近にある背景信号は、実際、該スポット内からの背景信号と同じではないので、強度データは、副最適的に処理される。該背景減算の主要な結果は、使用される方法にかかわらず、最小検出可能レベル（ＭＤＬ）が必要より高い、ということである。比解析アプローチにおいては、低レベル信号は基本的に切り捨てられるので、それは、また、より多くのエラーに貢献する。これらの効果の両方は、今度は、マイクロアレイ検出ダイナミックレンジを減少させ得る。
【０００７】
測定結果内のすべての不確実性の他に、マイクロアレイ、および、すべての本質的にアフィニティベースのバイオセンサシステムにおいては、１つの主要な問題があり、かつ、それは、必要なインキュベーションタイム（ＤＮＡマイクロアレイのための混成時間）である。マイクロアレイ実験におけるインキュベーション動力学は、検体拡散の関数であるので、反応チャンバーサイズ、すべての検体のスピーシーズの温度および結合動力学、ばかりでなく、未知の検体濃度、システムの設定時間は、きわめて複雑で、予想不可能である。すべてのこれらの質問は、ある範囲まで実験的にアドレスされ得るが、それらは、まだ、マイクロアレイ技術における主要な障害であり、プラットフォームープラットフォーム不一致が、それらによって生じ得る。
【０００８】
従来の蛍光発光ベースのマイクロアレイ、および他の外因性レポーターベース（ラベルベース）のバイオセンサーアレイにおいては、獲得された検体の検出は、通常、インキュベーションステップの後に行われる。いくらかの場合には、適切な蛍光発光による、かつレポーター強度測定が、該インキュベーション液内の浮いている（結合されていない）ラベルされたスピーシーズ、その信号は獲得された目標からの目標−特定信号を圧倒し得る、の大きい濃度の存在において妥協されている。該インキュベーションが停止され、液がアレイの表面から除去されたときは、洗浄の副作用がしばしば起こり、それは、データの解析をより挑戦的にさせる。このように、多数検体の結合する特徴の高品質測定を同時に得ることが可能であり、かつ、液中のそれら検体の量を決定することのできる、アフィニティベースセンサの必要が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，０４８，６９０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０８３，７６３号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１１０，４２６号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００７／００６５８１８号
【特許文献５】米国特許出願第２００７／００７７６０９号
【発明の概要】
【００１０】
発明のサマリー
本発明の１つの側面は、マイクロアレイ上の検体のプローブへの結合を、リアルタイムで測定することよりなる方法である。１つの実施形態において、該方法は、複数の異なる検体よりなる流体体積を、複数の異なるプローブよりなる固体基板に接触させるステップ、ここで、該プローブは、該検体と特定的に結合することができる、および、該流体体積が、該基板と接触しているときの多数の時点で信号を測定するステップ、ここで、該多数の時点で測定された信号は、該検体のプローブとの結合の量と相関することができる、よりなる。該方法の１つの実施形態は、さらに、多数の時点で測定された信号を用いて、該流体体積中の検体の濃度を決定することよりなる。いくつかの実施形態において、信号の時間とともにの変化は、該プローブに限定される検体の量と相関する。
【００１１】
いくらかの実施形態において、信号は、電気化学的、電気的、機械的、磁気的、音響的、または、電磁的な信号である。いくらかの実施形態において、信号は、蛍光発光、吸収、またはルミネッセンスよりなる電磁信号である。いくつかの実施形態において、検体は、消失する一部よりなり、かつ、複数時点で測定された電磁的信号は、少なくとも部分的に、蛍光発光の消失に相関する。いくらかの実施形態において、消失された蛍光発光は、プローブに結合された蛍光の一部に、少なくとも部分的によるものである。いくらかの実施形態において、消失された蛍光発光は、固体基板に結合された蛍光の一部に、少なくとも部分的によるものであり、ここで、このような蛍光の一部は、プルーブに共有結合されたものではない。いくらかの実施形態において、消失された蛍光発光は、プローブに共有結合されていない、蛍光の一部に、少なくとも部分的によるものである。いくらかの実施形態において、多数の時点で測定された光学信号は、少なくとも部分的に、蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）によるものである。
【００１２】
いくらかの実施形態において、異なるプローブは、固体基板上で、異なるアドレス可能な位置に位置している。いくらかの実施形態において、少なくとも、約３、４、５、１０、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００のプローブがある。いくらかの実施形態において、固体基板は、１つ、または、それ以上のビーズよりなる。
【００１３】
いくらかの実施形態において、該検体、および／または、プローブは、核酸、または核酸類似体、たんぱく質、炭水化物、または、脂質、の化学スピーシーズよりなる。いくらかの実施形態において、検体、およびプローブは、同じタイプの化学スピーシーズよりなる。いくらかの実施形態において、検体、およびプローブは、おのおの、異なるタイプの化学スピーシーズである。いくらかの実施形態において、検体、およびプローブは、核酸、または核酸類似体よりなる。いくらかの実施形態において、プローブは、たんぱく質よりなり、これは、いくらかの場合には、抗体、または酵素よりなる。
【００１４】
いくらかの実施形態において、少なくとも２つの時点は、その信号に対応する検体のプローブへの結合の量が、飽和の５０％より小さい時点で、測定される。
【００１５】
いくらかの実施形態において、２つ、またはそれ以上の時点は、流体体積が１つの温度にあるとき、測定され、かつ、２つ、またはそれ以上の時点は、流体体積が第２の温度にあるとき、測定される。いくらかの実施形態においては、２つ、またはそれ以上の時点は、流体体積における検体が１つの濃度にあるとき測定され、かつ、２つ、またはそれ以上の時点は、流体体積が第２の濃度にあるとき、測定される。いくらかの実施形態においては、検体の濃度は、時点のセット間で豊富化される。いくらかの実施形態においては、検体の濃度は、時点のセット間で希釈化される。
【００１６】
いくらかの実施形態においては、固体基板は、また、制御スポットよりなる。
【００１７】
いくらかの実施形態においては、方法は、異なる励起、および／または、放射スペクトルを持つ、多数蛍光発光体スピーシーズの使用よりなる。いくらかの実施形態において、方法は、異なる消失特性を持つ多数消失スピーシーズの使用よりなる。
【００１８】
いくらかの実施形態において、方法は、さらに、プローブの、２つ、または、それ以上の検体との結合を決定すること、これは、信号、および時間に対応する結合データを、２つ、またはそれ以上の検体のおのおのの、結合データへの貢献を決定するアルゴリズムに従うものとさせること、よりなる。いくらかの実施形態において、プローブは、蛍光を発する一部よりなり、かつ、プローブの最初の表面濃度は、蛍光発光を測定することにより決定される。
【００１９】
本発明の１つの側面は、クレーム２の方法、そこでは、(i) 検体は、消失剤によりラベルされた核酸分子よりなり、(ii) プローブは、核酸分子よりなり、(iii) 基板は、実質的にプレーナであって、かつ、基板上の異なるアドレスにある離散的な位置のアレイよりなり、ここで、位置は、それらに、異なるプローブ、および信号を生成する蛍光を発するラベルを取り付けており、ここで、蛍光を発するラベルは、プルーブに対して十分近傍にあり、これにより、位置での検体とプローブ間の混成は、ＦＲＥＴ、および／または、信号の消失を、生ずる。いくらかの実施形態において、蛍光を発するラベルは、プローブを介して、表面に取り付けられている。いくらかの実施形態において、蛍光を発するラベルは、プローブに対し、非共有結合で取り付けられている。いくらかの実施形態において、蛍光を発するラベルは、プローブを介して、表面に取り付けられてはいない。いくらかの実施形態において、流体における検体の濃度は、信号の時間とともに信号の変化の動力学に基づき、決定される。
【００２０】
本発明の方法のいくらかの実施形態において、流体体積は、さらに、消失剤によりラベルされた競争者分子を有し、ここで、競争者分子は、プローブと結合するための検体と競争する。
【００２１】
本発明の１つの側面は、(a) 検体分子を、プローブ分子のアレイとインキュベートすること、ここで、検体分子とプローブ分子との間を結合することは、アレイからの信号の変化を生じる、および、(b) インキュベーションの間に、アレイからの信号を時間とともに測定すること、よりなる、検体分子と、プローブ分子のアレイとの間の結合を検出する方法である。いくらかの実施形態において、目標分子とプローブ分子との間を結合することは、アレイからの信号の増大を生ずる。
【００２２】
本発明の１つの側面は、検体分子とプローブとの間の結合を、(a) ドナー消失剤ペアの消失剤よりなる検体を、固体基板の表面上に不動化されたプローブで、検体がプローブに結合することのできる条件で、インキュベートすること、ここで、ドナー消失剤のペアは、不動化されたプローブからある距離で、表面上に不動化されており、かつこれにより、検体とプローブとの間の距離は、ドナーからの信号を消失し、かつここで、ドナーは、不動化されたプローブに直接結合されてはおらず、および、(b) 信号を測定すること、よりなり、検出する方法である。いくらかの実施形態において、方法は、複数の異なる検体分子を、基板の表面上の、異なるアドレス可能な位置に不動化された複数の異なるプローブで、インキュベートすることよりなる。
【００２３】
本発明の１つの側面は、(a) (i) 表面を持つ固体サポート、および、(ii) 複数の異なるプローブ、ここで、異なるプローブは、表面に不動化されている、(b) 検体よりなる流体体積、ここで、流体体積は、固体サポートと接触している、かつ、(c) 前記マイクロアレイ上の複数のスポットのおのおのからの、多数時点で測定された信号を検出する手段よりなる検出器アセンブリ、一方、流体体積は、固体サポートと接触している。いくらかの実施形態において、検出器により検出された多数時点で測定された信号は、検体のプローブに対する結合と相関されることができる。
【００２４】
いくらかの実施形態において、システムは、さらに、(d) 固体サポートの温度を、および／または、流体体積を、制御するアセンブリよりなる。いくらかの実施形態において、異なるプローブは、異なるアドレス可能位置において不動化されている。
【００２５】
いくらかの実施形態において、システムは、さらに、(e) データを獲得し、貯蔵するための、データ獲得システム、および、(f) 信号を解析するための計算システムを、含む。いくらかの実施形態において、複数の検出器は、トランスデューサーアレイよりなる。いくらかの実施形態において、トランスデューサーアレイは、電気化学的、電気的、機械的、磁気的、音響的、または、光学的信号を、測定することができる。いくらかの実施形態において、固定基板は、トランスデューサーアレイと接触している。いくらかの実施形態において、トラスデューサーアレイは、固定基板から離れて配置されている。いくらかの実施形態において、1つ、またはそれ以上のトランスデューサーは、アドレス可能な位置に対応する。いくらかの実施形態において、トランスデューサーアレイは、固体基板に光学的に結合される光学的トランスデューサーアレイである。いくらかの実施形態において、光学的トランスデューサーアレイは、1つ、またはそれ以上のレンズを介して、固体基板に光学的に結合される。
【００２６】
いくらかの実施形態において、システムは、複数の結合レートを同時に測定することができる。いくつかの実施形態において、複数の結合レートは、複数の検体の濃度を決定するために用いられる。
【００２７】
いくらかの実施形態において、検出器により検出された信号は、電気化学的、電気的、機械的、磁気的、音響的、または、光学的な信号である。いくらかの実施形態において、信号は、サイクリック電圧測定系、インピーダンススペクトロスコピー、または、表面プラズマ共鳴システムから生成される。いくらかの実施形態において、信号は、光学信号である。いくらかの実施形態において、信号は、蛍光発光、吸収、または、ルミネッセンスよりくる。いくらかの実施形態において、検体の結合に相関する、多数時点で測定された信号は、少なくとも部分的に、蛍光発光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）によるものである。いくらかの実施形態において、検体の結合に相関する、多数時点で測定された信号は、少なくとも部分的に、蛍光信号の消失によるものである。いくつかの実施形態において、多数時点で測定された信号は、少なくとも部分的に、消失する一部よりなる検体と、蛍光発光する一部よりなるプローブとの間の相互作用によるものである。いくらかの実施形態において、光学信号よりなる一部は、プローブ分子に、共有結合的に結合される。いくらかの実施形態において、光学信号よりなる一部は、プローブ分子に、共有結合的にでなく、結合される。いくらかの実施形態において、光学信号よりなる一部は、もう１つの分子を介して、該プローブ分子に結合される。いくらかの実施形態において、光学信号よりなる一部は、基板に結合される。
【００２８】
本発明の１つの側面は、以下のものよりなるシステムである：マイクロアレイを結合させる手段、および、マイクロアレイの表面上でアッセイを行う手段よりなるアッセイアセンブリ；および、マイクロアレイ上の複数のスポットのおのおのから、アッセイの遂行の間に、多数の時点で測定された信号を検出する手段よりなる検出器アセンブリ。いくらかの実施形態において、アッセイを行う手段は、マイクロアレイの表面がコンパートメントの床よりなる、該コンパートメントを与える手段、および、該コンパートメント内に反応剤および検体を分配する手段よりなる。
【００２９】
本発明の１つの側面は、以下のものよりなるデバイスである：表面、および、複数の異なるプローブを有する、ここで、異なるプローブは、異なるアドレス可能な位置で、表面に不動化されており、アドレス可能な位置は、表面に結合された光学信号の一部よりなり、光学信号の一部は、直接、プローブには結合されておらず、かつ、光学信号の一部からの光学信号は、検体のプローブに対する結合に依存して変化することが可能である。いくらかの実施形態において、光学信号の一部は、ダイ、または、ルミネッセントの一部、または、蛍光発光の一部である。
【００３０】
本発明の１つの側面は、以下のものよりなるソフトウェアよりなる：(a) マイクロアレイ上の複数の公知の場所のおのおので、複数時点で測定された信号についての情報を、アクセスする、ここで、信号強度は、検体と既知の場所でマイクロアレイに取り付けられたプローブ分子との結合イベントの数の関数である、コンピュータ読み取り可能なコード。いくつかの実施形態において、ソフトウェアは、さらに、以下のものよりなる：(b) 結合が飽和に達する前の結合イベントの予想される数、液における検体分子の存在、および数、および、混成の存在を決定するのに、該情報を用いるアルゴリズムを実行するコード。該アルゴリズムは、さらに、獲得したデータの対する混成の影響を抑圧することができる。
【００３１】
参照による組み込み
本明細書において言われる、すべての刊行物、および、特許出願は、おのおのの個々の刊行物、または特許出願が、特定的に、かつ、個々に、参照により組み入れられると示されるのと同じ範囲にまで、参照により、ここに組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本発明の新規な特徴は、添付のクレームにより、特に打ち立てられる。本発明の特徴、および利点のよりよい理解は、図式的な実施形態、そこにおいては、本発明の原理が利用され、その添付図面は、以下のとおりである、を打ち立てる以下の詳細な説明を参照して得られるであろう：
【図１】図１は、獲得するプローブが、インキュベーションフェーズにおける目標検体を獲得するために使用され、かつ、検出がインキュベーションの完了の後にドライフェーズにおいて行われる、アフィニティベースのバイオセンサにおける、従来の検出手続を示す。
【図２】図２は、インキュベーションを時間ｔ1 時間で完了したのちの、従来の検出、およびそレート関連する不確実性を示す。
【図３】図３は、本発明のリアルタイムマイクロアレイシステムにおいて、数多くの獲得された検体の多数測定を、インキュベーションシステムを停止する必要なしに、行うことができることを示す。
【図４】図４は、従来のＤＮＡアレート関連するエラーのブロック図である。
【図５】図５は、本発明の核酸ベース実時間マイクロアレイシステムで、そこでは、プローブは、蛍光発光する一部を持つとラベルされているものを示す。
【図６】図６は、本発明の核酸ベース実時間マイクロアレイシステムで、そこでは、プローブが蛍光一部を持つとラベルされており、検体が消失剤を持つとラベルされており、かつ、種々のスポット上の蛍光強度は、特に、プローブに結合されている検体の量を測定するのに用いることができる、ものを示す。
【図７】図７は、本発明の実時間マイクロアレイシステムのブロック図を示す。
【図８】図８は、ＢＨＱ２の消失剤がラベルされたcＤＮＡ分子が、蛍光発光レーザースキャンマイクロスコープを用いて検出された、実時間マイクロアレイシステムの例を示す。
【図９】図９は、該検出システムが、獲得するスポットの直近にあるセンサアレイよりなる、実時間マイクロアレイシステムを示す。
【図１０】図１０は、本発明による６Ｘ６ＤＮＡマイクロアレイのレイアウトを示す。
【図１１】図１１は、制御目標検体がシステムに加えられる、マイクロアレイ実験の実時間測定のいくつかの例を示す。
【図１２】図１２は、おのおの、同様のオリゴヌクレオチドを持つ４つの異なるスポットのためのデータを、おのおの示す。該目標ＤＮＡ検体は、時間ゼロで該システム内に導入され、消失（信号の削減）が、結合が起こるときのみに起こる。
【図１３】図１３は、おのおの、同様のオリゴヌクレオチドを持つ４つの異なるスポットのためのデータを、おのおの示す。該目標ＤＮＡ検体は、時間ゼロで該システム内に導入され、消失（信号の削減）が、結合が起こるときのみに起こる。
【図１４】図１４は、おのおの、同様のオリゴヌクレオチドを持つ４つの異なるスポットのためのデータを、おのおの示す。該目標ＤＮＡ検体は、時間ゼロで該システム内に導入され、消失（信号の削減）が、結合が起こるときのみに起こる。
【図１５】図１５は、おのおの、同様のオリゴヌクレオチドを持つ４つの異なるスポットのためのデータを、おのおの示す。該目標ＤＮＡ検体は、時間ゼロで該システム内に導入され、消失（信号の削減）が、結合が起こるときのみに起こる。
【図１６】図１６は、目標検体（検体２）が、マイクロアレイに２ｎｇで、および０．２nｇで、適用される、２つの実時間実験の間に測定された信号を示す。
【図１７】図１７は、実時間オリゴヌクレオチドアレイにおいて測定された信号対時間、およびデータのアルゴリズムへのフィット、ここで、目標の８０ｎｇ／５０μｌが、該アレイに適用される、を示す。
【図１８】図１８は、実時間のオリゴヌクレオチドドアレイにおいて測定された信号対時間、およびデータのアルゴリズムへのフィット、ここで、目標の１６ｎｇ／５０μｌがアレイに適用される、を示す。
【図１９】図１９は、クロス混成の３次大きさにわたる抑圧の電位を示す、シミュレーションの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な記述
導入
ここで記述された、方法、デバイス、およびシステムは、マイクロアレイ、および、平行アフィニティベースバイオセンサ目標結合イベントの実時間測定に関する。ここで記述された、該方法、およびシステムは、実時間マイクロアレイシステム（ＲＴ−μアレイ）システムと言うことができる。該多数結合イベントの実時間測定は、多数スピーシーズについての、結合特性、または検体濃度の正確な、かつ感受的な決定を同時に行うことを許す。本発明の１つの側面は、目標−プローブ結合イベントの実時間検出による、サンプル内の目標検体の豊富さの評価である。ある実施形態においては、ＲＴ−μアレイ検出システムは、目標検体の濃度を、単一の、および／または、複数のスポットにおける獲得された検体の結合レート、および／または、平衡濃度を、解析することにより測定する。ＲＴ-μアレイのいくらかの応用は、ゲノミクス、およびプロテオミクス、特に、ＤＮＡおよびたんぱく質マイクロアレイ、の分野内に入る。RT−μアレイシステムの従来のマイクロアレイプラットフォームに対する利点のいくらかは、それらのより高い検出ダイナミックレンジ、より低い最小検出レベル（ＭＤＬ）、構造安定性、アレイ製造システムエラーに対するより低い感度、検体結合変動、およびバイオケミカル雑音、ばかりでなく、従来のマイクロアレイに要求される洗浄ステップの回避、にある。
【００３４】
本発明の１つの側面は、検体の、表面上の複数のプローブに対する結合を、“実時間”で測定する方法である。本発明のプローブと検体の結合のモニタリング、測定、または観察に関してここで用いられるように、用語“実時間”は、結合反応の状況を、その反応が遷移液フェーズまたは生化学平衡状態のいずれかにて起きている間に、測定することを言う。実時間測定は、反応が固定された後に行われる測定に対して、モニターされた、測定された、または、観察された結合イベントと、同時生起的に行われる。このように、“実時間”アッセイ、または測定は、蛍光発光のような、測定された、かつ定量化された結果を含むのみでなく、これを、種々の時点、すなわち、時間、分、秒、ミリ秒、ナノ秒，等で、表現する。“実時間”は、信号を一定の期間にわたって特徴付けるために。複数の読み取りを行うことよりなる、動力学的信号生成の生成の検出を、含む。たとえば、実時間測定は、プローブに結合された検体の量の増加、または減少のレートを決定することを、含むことができる。
【００３５】
該測定は、複数のプローブ、および検体で実時間で行われる。本発明は、相互に特定的に結合するプローブおよび検体を測定するのに役立つ。特に相互に結合する、プローブと検体のペアは、特定の結合するペアでありえる。
【００３６】
本発明の方法、およびシステムは、同じ溶液内の、多数の特定的な結合ペアの結合を測定するために用いることができる。本発明の１つの実施形態において、特定の結合ペアのメンバーである複数のプローブは、表面に取り付けられ、かつ、この表面は、該特定の結合ペアの他のメンバーよりなる複数の検体の結合の動力学を測定するのに用いられる。
【００３７】
本発明の１つの側面は、検体とプローブ間の結合を測定し、従来のマイクロアレイにおいて存在し、かつ検体−プローブ結合情報の質を劣化させる雑音を、低下させ、いくらかの場合には削減し、かつ、測定する方法である。従来のマイクロアレイおよびアフィニティベースセンサのほとんどにおいて、該アッセイ手続の検出およびインキュベーションフェーズは、異なる時間に実行される。図１に示されるように、従来の検出は、スキャニング、及び／または、イメージング技術が、獲得された目標をアクセスするために用いられるポイントで、ドライフェーズにて行われる。
【００３８】
以下の解析は、従来のマイクロアレイ解析技術に本質的な問題、および、本発明の実時間マイクロアレイシステムの結合測定の品質を改善するにおける利点を、説明する。ｘ（ｔ）を、与えられた時間ｔでの、マイクロアレイ、および／またはアフィニティベースのバイオセンサの与えられたスポットにおける、獲得された検体の全数とする。さらに、／ｘ（ｔ）を、インキュベーションプロセスが生化学的平衡に達したときの、ｘ（ｔ）の予測された値とする。代表的なマイクロアレイ手順は、／ｘ（ｔ）を予測すること、かつ、その値を、該サンプル内の検体濃度を示すものとして用いることに焦点が当てられている；実際、ほとんどのデータ解析技術は、それらの結果を、／ｘ（ｔ）に基づき導き出す。それでもやはり、もしわれわれが、獲得された検体の数を、時間ｔ1に平衡状態において測定すれば、任意の与えられたマイクロアレイスポットにつき、ｘ（ｔ1）≠／ｘ（ｔ）が、成り立つ。これは、該システムの本質的な生化学的雑音、および他の不確実性によるものである。この現象は、図２に描かれており、そこでは、該マイクロアレイの各スポットにおける獲得された検体の数は、生化学的平衡においてさえも時間とともに変動する。したがって、時間ｔ1に行われた単一の測定は、これは、従来のマイクロアレイ実験が与えるものであるが、本質的に検体結合のランダムプロセスの単一点をサンプルする。
【００３９】
今、われわれが、ｘ（ｔ）を、インキュベーション、および検体結合反応を停止する必要なく、実時間で、複数回測定することができる場合を考える。このプラットフォームは、これをわれわれは、実時間マイクロアレイ（ＲＴ−μアレイ）と呼ぶが、従来方法に対して、多くの利点を持つ。ＲＴ−μアレイのいくらかの実施形態においては、該結合の動力学を、観察することができる。それゆえ、人は、該システムが生物体化学的平衡に達したか否かをテストすることができる。他の実施形態においては、ｘ（ｔ）の多数サンプルが測定され(図３参照)、かつ、異なる平均化技術、および／または、予測アルゴリズムを、／ｘ（ｔ）、および他のｘ（ｔ）のプロセス特徴を予測するのに用いることができる。
【００４０】
図４は、従来のＤＮＡマイクロアレイに関連するエラーのブロック図を示す。これらは、３つの段階に分類される：プレ−混成（ステップ１、および２）、混成（ステップ３）、ポスト−混成（ステップ４および５）。プリ−混成エラーは、サンプル純化変動、および、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに反転転写するにおける、該ｃＤＮＡの相補的なヴィトロ転写されたＲＮＡを生成するにおける、およびまたは、検体をラベルする(ステップ１)におけるエラーおよび変動から、かつ、アレイ上の非均一なプローブスポッティングおよびまたは合成(ステップ２)から生ずるエラーから、生ずる。混成エラーは、本質的な生化学的なノイズ同様の目的物へのクロス−混成、およびプローブ飽和(ステップ３)から生ずる。ポスト−混成エラーは、洗浄副作用、イメージ獲得エラー(ステップ４)、および副最適検出(ステップ５)を含む。これらのもっとも臨界的なものは、プローブ密度変動(ステップ２)、プローブ飽和、およびクロス−混成(ステップ３)、および、洗浄副作用(ステップ４)である。
【００４１】
本発明の方法、およびシステムは、サンプル準備(ステップ１)のためのものを除いて、上記すべてのエラーを補償することができる。プローブ密度変動は、インキュベーションの前に測定されることができ、それゆえ、ポスト−処理(ステップ５)において、計量されることができ、インキュベーションノイズは、以前に述べたように、（たった１つよりむしろ）多くのサンプルをとることにより減少することができ、プローブ飽和は、反応レートから目的物濃度を予測することにより避けることができ、最後に、洗浄は、一緒に、避けられる。
【００４２】
本発明の１つの側面は、複数の検体の、従来のマイクロアレイで得られたより以上のより高いダイナミックレンジを持つ複数のプローブへの結合を測定する方法である。本発明のいくらかの実施形態において、該ダイナミックレンジは、大きさの、３、４、５またはそれ以上のオーダーである。
【００４３】
方法
本発明の１つの側面は、検体のマイクロアレイ上のプローブへの結合を、測定することよりなる方法である。１つの実施形態において、該方法は、以下のステップよりなる：複数の異なる検体よりなる流体体積を、複数の異なるプローブを備える固体基板に接触させること、ここで、プローブは検体と特定的に結合することができる；かつ、該流体体積が基板と接触している間に多数時点で信号を測定すること、ここで、複数時点で測定された信号は、検体のプローブとの結合の量と相関されることができる。該方法の１つの実施形態は、さらに、多数の時点で測定された該信号を用いて流体体積内の１つの検体の濃度を決定すること、よりなる。
【００４４】
１つの実施形態において、該方法は、プローブアレイの使用、そこにおいては、各アドレス可能な位置は検体の結合に際し消失可能である信号を発する、を含む。たとえば、消失可能な一部（たとえば、蛍光発光する一部）は、該アレイ上のプローブに、または、それに近接する物理的近傍に取り付けられる。このようなアレイの表面は、たとえば、マイクロスコープ、および光検出器（たとえば、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳイメージセンサ）を用いて検出されることのできる各アドレス可能な位置から信号を発するであろう。サンプルにおける検体は、消失可能な一部からの信号を消失させることのできる消失剤の一部でタグされている。該消失剤が、それ自身光信号を発しないときは、該アレイからの信号と干渉する、該流体からの信号はない。これは、アレイ表面でのノイズを減少させる。検体と基板に結合されたプローブとの間の結合反応の過程の間に、各アドレス可能な位置における信号は消失される。各アドレス可能な位置における信号は、たとえば、アレイ表面上に焦点を当てられたＣＣＤカメラにより、実時間で測定される。任意の位置における信号が、結合、および消失の結果として変化すると、該変化は測定される。これらの時間にわたる測定は、該反応の動力学の決定を許し、これは次に、該サンプル内の検体の濃度の決定を許す。
【００４５】
あるいは、もし、該検体が、蛍光発光ラベルのような発光リポーターでラベルされると、ラベルされた検体分子の結合から生ずるアレイの表面の信号は、該検出器を、該アレイ表面に適切に焦点合わせすることにより、検出されることができ、これにより、液内の信号からのノイズを最小化する。
【００４６】
もう１つの実施形態において、該プローブは、ＣＭＯＳセンサアレイのような、センサよりなるアレイの表面に取り付けられており、これは、該プローブ上の結合イベントの結果として変化する電気信号を生成する。これはまた、アレイ上の複数の信号の実時間測定を与える（Hassibi and Lee IEEE Sensors journal, 6-6, pp 1380-1388, 2006, and Hassibi, A "Integrated Microarrays," Ph D Thesis Stanford University, 2005）。
【００４７】
したがって、本発明の方法は、固体サポート上のプローブアレイ上の複数の結合イベントの実時間測定を許す。
検体、および、プローブ
【００４８】
ここで使用される、用語“プローブ”、および“検体”は、液内において互いに結合する分子スピーシーズに言及する。単一のプローブ、または単一の検体は、一般に、１つの化学スピーシーズである。すなわち、単一の検体、またはプローブは、多くの個々の分子よりなる。いくらかの場合において、プローブ、または検体は、実質的に同一である１セットの分子であり得る。いくらかの場合において、プローブ、または検体は、そのすべてが実質的に同じ結合領域を持つであろう１グループの分子であり得る。１つの“プローブ”、または、“検体”は、互いに結合する、たとえばリセプター／リガンドペア、あるいは核酸の混成ペアを含む、任意のペアの分子であり得る。本発明のプローブは、固体表面に結合される。該検体は液内にあり、かつ、目標物あるいは目標物検体とも言われ得る。このように、プローブと検体は、相互交換可能に任意の結合ペアの異なるメンバーであり得るが、いくらかの場合には、一方、あるいは他方が、プローブ、または検体であるのがより有利であり、たとえば、該分子が、より容易に表面に結合される場合には、その分子が、プローブであるのが有利であり、または、分子が、問題の溶液内でより可溶である場合には、該分子は検体であるのが、有利であり得る。
【００４９】
該プローブ、または検体は、任意のタイプの化学スピーシーズであることができる。該プローブ、または検体は、一般に、核酸、たんぱく質、炭水化物、脂質または、小分子、等の、生体分子である。相互に結合するプローブ、および検体は、おのおの、同じ、または異なるタイプのスピーシーズであることができる。該検体、またはプローブは、もう１つのタイプの分子に結合されることができ、かつ異なる分子よりなることができる。たとえば、ある検体は、たんぱく質炭水化物複合物、あるいはたんぱく質に接続された核酸であることができる。プローブ−検体ペアは、リセプター−リガンドペアであることができる。化学スピーシーズが、大きく、あるいは多数の分子要素からなるところでは、プローブ、または検体は、結合することの可能な分子の一部であることができ、あるいは全体として、分子であることができる。本発明で調査されることのできる検体の例は、セル膜リセプターのためのアゴニストおよびアンタゴニスト、トキシンおよびヴェノム、ヴァイラルエピトープ、ホルモン（たとえば、オピエート、ステロイド等、）、ホルモンリセプター、ペプチド、酵素、酵素基板、基板類似物、遷移状態類似物、共同因子、薬、たんぱく質、抗体、および、ハイブリッド化している核酸を含むが、これに限るものではない。
【００５０】
用語“プローブ”は、ここで、基板に取り付けられた結合スピーシーズのメンバーを、言及するのに用いられる。たとえば、該プローブは、スポットされたアレイを作るよう、堆積された生体物質；および、合成され、堆積され、または、位置され、他の現在の、または未来の技術にしたがったアレイを形成する材料、よりなる。これにより、これらの技術のいずれかに従って形成されたマイクロアレイは、一般に、かつ、集合的に、以後便宜のために、“プローブアレイ”と呼ぶ。さらに、用語“プローブ”は、アレイの形に不動化されたプローブには限定されない。むしろ、ここで記述された機能、および方法は、他の並列なアッセイデバイスに関しても用いられ得る。たとえば、これらの機能、および方法は、ビーズ、光ファイバ、または他の基板、またはメディア上で、または内で、不動化されたプローブを特定するプローブセット同定子に関して、適用されることができる。本発明の種々のプローブアレイの構成は、以下に、より詳細に記述される。
【００５１】
いくらかの実施形態において、該プローブ、または、検体は、ポリヌクレオチドよりなる。ここで、使用される、用語“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、“核酸”、および、“核酸分子”は、任意の長さのヌクレオチド、あるいは、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、または、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ)、のポリマー形態、を含む。この用語は、分子の主要構造のみを、言及する。このように、該用語は、３重、２重、または、１重ストランドされたＤＮＡ、ばかりでなく、３重、２重、または、１重ストランドされたＲＮＡ、を含む。それは、また、メチレーションによる、および／または、キャッピングによる、等の、修整、および、ポリヌクレオチドの修整されていない形態、を含む。より特定的には、用語“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、“核酸”、および、“核酸分子”は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ピュリン、または、ピリミディンベースの、Ｎ−、または、Ｃ−グリコサイドである、任意の他のタイプのポリヌクレオチドを含む。本発明のヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステルボンドを含むであろう、ただし、いくらかの場合には、以下に記述されるように、核酸類似物、それは、たとえば、ホスホルアミド（Beaucage et al , Tetrahedron 49(10) 1925 (1993) and U S Pat No 5,644,048)、ホスホロジチエート(Briu et al , J Am Chem Soc 11 1 2321 (1989)）、０−メチルホスホロアミド結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, Oxford University Press 参照）、および、ペプティド核酸バックボーンおよびリンケージ（Carlsson et al , Nature 380 207 (1996) 参照）よりなる、交互のバックボーンを持つものが含まれる。他の類似した核酸は、正のバックボーンをもつもの（Denpcy et al , Proc Natl Acad Sci USA 92 6097 (1995) ）、イオン化されていないバックボーンを持つもの（US Pat Nos 5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141、および4,469,863；Kiedrowshi et al , Angew Chem Intl Ed English 30 423 (1991)；Letsinger et al , J Am Chem Soc 110 4470 (1988)；Letsmger et al , Nucleoside & Nucleotide 13 1597 (1994)；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed Y S Sanghui and P Dan Cook; Mesmaeker et al , Bioorganic & Medicinal Chem Left 4 395 (1994)；Jeffs et al , J Biomolecular NMR 34 17 (1994)； Tetrahedron Left 37 743 (1996);および、US Pat Nos 5,235,033、および5,034,506, および、Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed Y S Sanghui and P Dan Cook に記述されているものを含む、リボースされていないバックボーンを持つもの、を含む。１つ、またはそれ以上の、カルボサイクリック砂糖を含む核酸は、また、核酸の定義の中に含まれる（Jenkins et al , Chem Soc Rev (1995) ppl69-176, 参照）。これらの、リボースホスフェートバックボーンの修整は、ラベルの付加を容易にするために、あるいは、生理環境におけるこのような分子の安定性、および、半減期（half-life)を増大するために、なされる。
【００５２】
本発明のいくらかの実施形態において、オルゴヌクレオチドが、使用される。ここで使用される、“オリゴヌクレオチド”は、長さが２から１０００ヌクレオチドにわたる、より特定的には、長さが２から５００ヌクレオチドにわたる単一ストランドの核酸、である。いくらかの実施形態においては、それは、約１０から１００ヌクレオチドであり、かつ、いくらかの実施形態においては、約２０から５０ヌクレオチドである。
【００５３】
本発明のいくらかの実施形態、たとえば、発現解析においては、本発明は、サンプル内の、核酸濃度を測定することに向けられている。いくらかの場合には、核酸濃度、または、異なるサンプル間の核酸濃度の差は、遺伝子、または複数遺伝子、の転写レベル、または、転写レベルの差を、反映する。これらの場合において、遺伝子、または複数遺伝子、のｍＲＮＡトランスクリプトよりなる核酸サンプルを、あるいは、ｍＲＮＡトランスクリプトより導出される核酸を、与えることが望ましい。ここで使用されるように、ｍＲＮＡトランスクリプトより導出される核酸は、その合成のために、ｍＲＮＡトランスクリプト、または、その一部列は、究極的に、テンプレートとして働いた。このように、ｍＲＮＡより反転転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡより転写されたｃＲＮＡ、該ｃＤＮＡより増幅されたＤＮＡ、該増幅されたＤＮＡより転写されたＲＮＡ、等、は、ｍＲＮＡトランスクリプトより導出されており、このように導出されたプロダクトの検出は、サンプル内の原トランスクリプトの存在、および／または、豊富さを示すものである。このように、適切なサンプルは、遺伝子、または複数遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプト、ｍＲＮＡより反転転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡより転写されたｃＲＮＡ、遺伝子より増幅されたＤＮＡ、該増幅されたＤＮＡより転写されたＲＮＡ、等、を含む。
【００５４】
いくらかの実施形態において、サンプル内の、１つ、またはそれ以上の、遺伝子の転写レベル（かつ、したがって、発現レベル）を定量化することが望ましいところでは、該核酸サンプルは、該遺伝子、または複数遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトの濃度、または、該ｍＲＮＡトランスクリプトから導出された核酸の濃度が、その遺伝子の転写レベル（かつ、それゆえ、発現レベル）に比例している。同様に、混成信号強度は、混成された核酸の量に比例しているのが好ましい。該比例性は、相対的に厳密である（たとえば、転写レートが２倍であれば、該サンプル核酸プールにおけるｍＲＮＡトランスクリプトの２倍を生じ、かつ、混成信号の２倍を生じる）ことが好ましいが、当業者は、該比例性より緩和されたものであってよく、かつ非線形であってすらよい、ことを理解するであろう。このように、たとえば、目標ｍＲＮＡの濃度の５倍の差は、混成強度の３倍から６倍の差を生ずるアッセイは、ほとんどの目的に対して十分である。より正確な定量化が要求されるところでは、ここで記述されるサンプル準備、および混成において導入される変動を訂正するよう、適切な制御を走らせることができる。さらに、“標準” 目標ｍＲＮＡの直列希釈化を、当業者に知られた公知の方法による校正カーブを準備するために用いることができる。もちろん、トランスクリプトの存在、または不存在の、または、核酸濃度の大きな変化の、簡単な検出が望まれるところでは、熟慮した制御、または校正は、必要ではない。
【００５５】
最も単純な実施形態において、このような核酸サンプルは、ｍＲＮＡ、または、１つの、孤立された、および／または、他の方法で生化学サンプルから導出された、全ｃＤＮＡ,である。ここで使用される、用語“生化学サンプル”は、有機物質から、または、有機物質の構成要素（たとえば、セル）から得られるサンプルを言及する。該サンプルは、任意の生化学組織、または流体であることができる。しばしば、該サンプルは、患者から得られる“臨床サンプル”であるであろう。このようなサンプルは、唾液、血液、血液細胞（たとえば、白血球）、組織または細針生検試料、尿、腹水、および胸膜液、あるいはそれらからの組織を含むが、これらに限定されない。生化学サンプルは、また、履歴的目的で、採取された冷凍断片等の、組織の断片を含むことができる。
【００５６】
核酸（ゲノムＤＮＡでも、ｍＲＮＡでも）は、当業者に知られた、多くの方法のうちの任意のものにより、サンプルから、孤立されることができる。当業者は、遺伝子のコピーの数が、検出されるべきところでは、ジェノミックＤＮＡは、好ましくは、孤立されることを、理解するであろう。逆に、遺伝子、または複数遺伝子、の発現レベルが、検出されるべきところでは、好ましくは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、孤立される。
【００５７】
全ｍＲＮＡ を分離する方法は、当業者によく知られている。たとえば、核酸の分離と純化の方法は、Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993) and Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993) に、詳細に、記述されている。
【００５８】
しばしば、核酸サンプルは、混成の前に増幅することが望ましい。当業者は、どのような増幅方法でも用いることができ、もし、定量的結果が望ましいのであれば、増幅された核酸の相対的周波数を維持する、または制御する方法を用いるよう、注意を払わなければならないことを、理解するであろう。
【００５９】
いくらかの実施形態において、該プローブ、または検体は、ポリペプチドよりなることができる。ここで使用されるように、用語“ポリペプチド”は、アミノ酸のポリマーを言い、該プロダクトの特定の長さをは言わない；これにより、ペプチド、オリゴペプチド、および、たんぱく質は、ポリペプチドの定義の中に入る。この用語は、また、該ポリペプチの発現後修整、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を、言わない、または、排除しない。“ペプチド”は、約５０以上でないアミノ酸のポリペプチドのことをいい、一方、用語“プロテイン”は、より長いポリペプチド、たとえば、３次元構造を持つもの、を言う。アミノ酸の１つ、またはそれ以上の類似物（たとえば、自然でないアミノ酸、等、を含む）を含む自然でない、ポリペプチドは、また、ポリペプチドは、置き換えられたリンケージばかりでなく、技術において知られている他の修整を、自然に起こるものも、自然でなく起こるものも持つことができるので、本発明において、用いることができる。ポリペプチド、およびたんぱく質は、特定の結合特性を持つことができる。たとえば、酵素は、特に、基板と結合する領域を持つことができ、かつ／または、酵素サブユニットの結合のような、他のたんぱく質に結合する領域を持つことができる。大変特殊な結合特性を持つことのできる、抗体は、また、ポリペプチドである。
【００６０】
いくらかの実施形態において、該プローブ、および／または、検体は、多糖のような、炭水化物よりなり得る。ここで使用される多糖は、実験公式、(ＣＨ2Ｏ)n、ここで、ｎは、代表的に３より大きい整数である、を持つ、ポリヒドロキシアルデヒド、または、ケトン、またはその誘導体である、炭水化物を言及する。単糖類、または、単純な糖類は、単一の、ポリヒドロキシアルデヒド、または、ケトン単位よりなる。単糖類は、リボース、２−デオキシリボース、ブドウ糖、マンノース、キシロース、ガラクトース、フコース、果糖などを含むが、これらに限定されない。二糖類は、グリコシド結合によって接合された２つの単糖ユニットを含む。二糖類は、例えば、蔗糖、乳糖、麦芽糖、セロビオース、等を含む。オリゴ糖は、代表的に、グリコシド結合に接合された２から１０の単糖単位を含む。多糖（グリカン）は、代表的に１０以上のそのような単位を含み、へパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの多糖類誘導体、等の分子を含むが、これに限定されない。用語“砂糖”は、一般に、モノ−、ジ−、または、オリゴ糖を、言及する。単糖類は、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトシル−Ｎ−アセチルグルコサミン、N−アセチルノイラミン酸（シアル酸）により、置き替えられ得る。単糖類は、また、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの糖類の一部としての、より大きい構成部分として存在し得る。
【００６１】
いくらかの実施形態において、該プローブ、および／または、検体は、小分子である。一般に、小分子は、たとえば、バイオチン、またはディゴキシゲニンの有機分子であろう、しかし、いくらかの場合には、該検体は、たとえば、リチウム、ナトリウム、第２鉄、第１鉄等の、無機イオンであることができる。小分子は、また、無機の、および有機の構成要素の両方を持つ、有機金属化合物でもあることができる。
固体基板上のプローブ
【００６２】
本発明の方法のために、プローブは、固体基板に取り付けられている。該固体基板は、生化学的、非生化学的、有機の、無機の、または、これらの任意のものの結合であることができ、粒子、ストランド、浸透剤、ゲル、シート、チューブ、球、容器、キャピラリー、パッド、スライス、膜、プレート、スライド、半導体集積チップ等として存在する。固体基板は、好ましく平坦であり、しかし交互の表面形状を取る。たとえば、固体基板は、その上に合成、または堆積が行われる、隆起された、または凹の領域を含むことができる。いくらかの実施形態において、固体基板は、適切な光吸収特性を与えるよう選択されるであろう。たとえば、基板は、ポリマー化されたラングミュアブロジェット膜、機能化されたガラスである、Ｓｉ,Ｇｅ,ＧａＡｓ,ＧａＰ,ＳｉＯ2,ＳｉＮ4、修飾されたシリコン、または、種々のゲル、または、(ポリ)テトラフルオロエチレン、(ポリ)ビリニデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリカーボネート、または、それらの結合、等の、種々のポリマーの任意の１つ、であることができる。この固体サポート、および該固体サポートを取り付けるために用いられる化学は、以下に詳細に記述される。
【００６３】
該基板は、同質の固体であり、かつ／または、該獲得するプローブが、そのある距離内に制限された、および／または、不動化されたものである、獲得するプローブよりずっと大きい不動の質量であることができる。基板の質量は、一般に、獲得するプローブの質量より少なくとも１００倍である。ある実施形態においては、基板の表面は、０．１ｎｍから１００ｎｍの荒さを持つ平面状のものであり、しかし、代表的に、１ｎｍと１０ｎｍの間である。他の実施形態においては、基板の表面は、非平面状であることができる。非平面状基板の例は、球状磁気ビーズ、球状ガラスビーズ、および、固体金属、および／または、半導体、および／または、誘電体粒子である。
【００６４】
本発明の方法のために、複数のプローブは、該固体基板上の、１つのアドレス可能領域内、および／または、多数アドレス可能領域内に、位置することができる。いくらかの実施形態において、該固体基板は、プローブでアドレス可能な、約２、３、４、５、６、または７−１０、１０−５０、５０−１００、５００−１，０００、１，０００−５，０００、５，０００−１０，０００、１０，０００−５０，０００、５０，０００−１００，０００、１００，０００−５００，０００、５００，０００−１，０００，０００、または、１，０００，０００以上のアドレス可能領域を持つ。
【００６５】
いくらかの実施形態において、たとえば、該スポットへの結合を用いて、非特定的結合を予測し訂正することにより、該スポットへの結合を測定の質を増大させるために、制御スポットとして作用するよう、プローブを含まないアドレス可能領域を持つことは、また、役に立つことである。
検体／プローブ結合
【００６６】
本発明の方法は、多数のプローブ、および検体の結合特性を、実時間で測定することに向けられている。該方法は、特に、相互に特定的に結合するプローブ、および検体の結合を、特徴付けるのに特に役立つ方法である。ここで使用されるように、プローブは、特定的な検体に、もし、それが、それがサンプル内の他の物質に結合するよりより高いアフィニティーでその検体に結合すれば、“特定的に結合する”。
【００６７】
本発明におけるプローブと検体との間の結合は、液内において起こる。通常、プローブ、および検体は、生体分子であり、液は、水溶液である。水溶液は、溶媒と溶質とよりなる液であり、ここで、溶媒は、ほとんどが水からなる。本発明の方法は、しかしながら、プローブと検体との間の結合が起こることができ、かつ、観察され得る任意のタイプの液において、使用されることができる。
【００６８】
分子認識アッセイは、一般に、２つのタイプの分子間で結合イベントを検出することを、含む。結合の強度は、“アフィニティー”と言うことができる。生化学分子間のアフィニティーは、非−共有結合分子間相互作用、たとえば、水素結合、疎水性相互作用、静電的相互作用、および、ヴァンデルワールス力を含む、により影響される。マルチプレクスされた結合実験において、ここで、熟慮されたもののように、複数の検体、およびプローブが、含まれる。たとえば、該実験は、複数の異なる核酸分子間の、または異なるたんぱく質間の結合をテストすることを含む。このような実験において、検体は、好ましくは、それらが、それに対してより大きいアフィニティーを持つプローブに結合するであろう。これにより、特定のプローブが結合イベントにおいて含まれていることを決定することは、該サンプル内の該プローブに対して十分のアフィニティーを持つ検体の存在が、使用されている検出システムの検出のしきい値を満たすことを、示す。人は、結合するパートナーの同定を、プローブと検体との間の結合の特定性、および強さに基づき決定することができるであろう。
【００６９】
結合は、リセプター−リガンド、酵素−基板、抗体−抗原、または、混成相互作用であることができる。プローブ／検体結合ペア、または、検体／プローブ結合ペアは、核酸−核酸、たとえば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡであることができる。プローブ／検体結合ペア、または、検体／プローブ結合ペアは、核酸、および、ポリペプチド、配列特定的ＤＮＡ結合たんぱく質、たとえば、ＤＮＡ／ポリペプチド、および、ＲＮＡ／ポリペプチド、であることができる。該プローブ／検体結合ペア、または、検体／プローブ結合ペアは、任意の核酸、および、小分子、たとえば、ＲＮＡ／小分子、ＤＮＡ／小分子であることができる。該プローブ／検体結合ペア、または、検体／プローブ結合ペアは、任意の核酸、および、シーケンス−特定的ＤＮＡまたはＲＮＡ認識を行うことのできる、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ結合リガンド（ポリアミド、等）であることができる。該プローブ／検体結合ペア、または、検体／プローブ結合ペアは、たんぱく質および小分子、または、小分子およびたんぱく質、たとえば、酵素または抗体、および小分子であることができる。
【００７０】
該プローブ／検体結合ペア、または、検体／プローブ結合ペアは、炭水化物およびたんぱく質、または、たんぱく質および炭水化物、炭水化物および炭水化物、炭水化物および脂質、または、脂質および炭水化物、脂質およびたんぱく質、または、たんぱく質および脂質、脂質および脂質、であることができる。
【００７１】
該プローブ／検体結合ペアは、自然酵素および抗体、および、合成結合化合物、等の、自然結合化合物よりなることができる。プローブ／検体結合ペア、または、検体／プローブ結合ペアは、合成たんぱく質結合リガンドおよびたんぱく質、または、たんぱく質および合成結合リガンド、合成炭水化物結合リガンドおよび炭水化物、または、炭水化物および合成炭水化物結合リガンド、合成脂質結合リガンドおよび脂質、または、脂質および合成脂質結合リガンドであることができる。
核酸システム
【００７２】
本発明の１つの特に、有用な側面は、検体とプローブとの間の特定的な混成、ここで、両者は核酸よりなる、を含む。
【００７３】
ここで、使用されるように、“オリヌクレオチドプローブ”は、１つ、またはそれ以上のタイプの化学結合を通して、通常は、相補的ベースペア化を通して、通常は、水素結合形成を通して、相補的シーケンスの目標核酸に結合することのできるオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドプローブは、自然の（たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、または、Ｔ）、または、修整されたベース（７−デアザグアノシン、イソシン、等）を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドプローブにおけるベースは、それが、混成を妨害しない限りは、ホスホディースター結合以外のリンケージにより結合されることができる。これにより、オリゴヌクレオチドプローブは、構成ベースが、ホスホディースター結合以外のペプチド結合により結合されるペプチド酸であることができる。該オリゴヌクレオチドプローブは、また、ロックされた核酸（ＬＮＡ）よりなることができ、該ＬＮＡは、しばしば、アクセス不能なＲＮＡと言われるが、修整されたＲＮＡヌクレオチドである。該ＬＮＡヌレレオチドのリボース部分は、２’炭素と、４’炭素を接続する余分なブリッジにより修整される。ブリッジは、３’端構造形成、これは、しばしば、ＤＮＡ、またはＲＮＡのA−フォームにおいて見つけられる、におけるリボースを、”ロックする“。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡベースと混合されることができる。このようなオリゴマーは、商業的に利用可能である。該ロックされたリボース形成は、ベース積み立て、および、背骨プリ組織化を向上させることができ、オリゴヌクレオチドの熱的安定性（融点温度）を増大させることができる。
【００７４】
用語“核酸検体”、または、“目標核酸”、または、“目標”は、核酸（しばしば、生化学サンプルから導かれ、かつしたがって、サンプル核酸とも言われる）であって、それに、オリゴヌクレオチドプローブが特定的にハイブリダイズするものを、言及する。目標核酸が、本質的に、任意の核酸ソース（たとえば、化学合成、増幅反応、法医学的サンプル、等を含むが、これらに限定されない）から導出されることができることは、認識されている。１つ、またはそれ以上の目標核酸の存在、または不存在が、検出されるべきであるか、１つ、またはそれ以上の核酸の量が、定量化されるべきであるかの、いずれかである。好ましく、検出される目標核酸は、それらが、それに対して特定的に結合する(ハイブリダイズする)対応するプローブの核酸シーケンスに相補的であるヌクレオチドシーケンスを持つ。用語目標核酸は、プローブが、それに対して特定的にハイブリダイズするより大きい核酸の特定のサブシーケンスを、または、その豊富さ（集中）、および／または、発現レベルを検出することが望まれている、全体シーケンス（たとえば、遺伝子、またはｍＲＮＡ）を、言及することができる。使用における相違は、文脈から明らかであろう。
【００７５】
本発明において、目標核酸に対するオリゴヌクレオチドプローブの特定的なハイブリダイゼーションは、実時間で、測定することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に、特定のヌクレオチドシーケンスと厳密な条件の下で、たとえ、そのシーケンスが複合混合物の中に存在していても、ハイブリダイズし、結合、または多重化する。用語“厳密な条件”は、プローブが、好ましくは、その目標サブシーケンスにハイブリダイズするであろう、かつ、他のシーケンスには、より少ない程度まで、あるいは全然ハイブリダイズしないであろう、条件を言及する。
【００７６】
核酸システムのために、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、目標シーケンス、および、本発明のプローブのハイブリダイズ化が、起こるよう、核酸目標シーケンスに相補的であるように設計される。この相補性は、完全である必要はない；目標シーケンスと本発明の単一ストランドされた核酸との間のハイブリダイズ化と干渉するであろう任意の数のベースペア不整合があってよい。しかしながら、もし、突然変異の数が、そんなに大きく、ハイブリダイズ化条件の最小の厳しさの下でも、ハイブリダイズ化が起きないときは、該シーケンスは、相補的な目標シーケンスではない。このように、核酸検体に対して、実質的に相補的でないオリゴヌクレオチドは、通常の反応条件の下では、ハイブリダイズしないであろう。
【００７７】
本発明の方法は、このように、たとえば、液内の核酸検体のシーケンス同定を、検体の公知のプローブとの結合を測定することにより決定するよう用いることができる。シーケンス同定は、２つの最適に並べられたシーケンス、またはサブシーケンスを、比較窓、またはスパンにわたって比較する、ここで、ポリヌクレオチドシーケンスの、比較窓における部分は、該２つのシーケンスの最適な配列のための（付加、または削除を、構成しない）参照シーケンスと比較して、任意に、付加、または削除（すなわち、ギャップ）を構成する。そのパーセンテージは、同一のサブユニット（たとえば、核酸ベース、または、アミノ酸残り）が、両シーケンスにおいて起こる位置の数を決定して、整合された位置の数を導き出し、整合した位置の数を比較窓内の位置の全数により割り算し、かつ、該結果に１００をかけて、シーケンス同定のパーセントを引き出すことにより、計算される。
【００７８】
核酸に適用されたときの、本発明の方法は、(1) たとえば、数千の遺伝子について同時に発現レベルをモニターすることを含む、ｍＲＮＡまたは遺伝子発現プロファイリングを含む、種々の応用について使用することができるが、これらに限定されない。これらの結果は、医療処置、病気、および開発段階の研究、等、多くの領域に関連する。たとえば、マイクロアレイは、病気の、および、通常のセル、における、；(2) 大きい遺伝子の再配列の評価を含む、相対比較的のゲノム混成（アレイＣＧＨ）； (3) ゲノム人口における一塩基多型（ＳＮＰ’ｓ）を同定するＳＮＰ検出アレイ； および、ＣｈＩＰ-ｏｎ-ｃｈｉｐ技術を用いて、ゲノムを貫通してのたんぱく質結合サイト占有を決定することを含む、クロマチン免疫沈降（ｃｈＩＰ）研究、による、遺伝子発現を比較することにより、病気の遺伝子を同定するのに用いることができる。
【００７９】
本発明は、核酸スピーシーズ間の結合の差に対し大変感受性の高いものであり、いくらかの場合には、単一ベースペア不整合にまで選別することを、許す。そして、本発明は、複数結合イベントの同時測定を許すので、いくらかのスピーシーズを同時に解析することができる、ここで、おのおのは、意図的に異なる度合だけ不整合とされている。これをするために、そのシーケンスが、特定の目標シーケンスに完全に相補的ではないように、熟慮して選択されたプローブである、“不整合制御”または“不整合プローブ”を、たとえば、発現アレイにおいて使用することができる。あるアレイにおけるミスマッチ（ＭＭ）制御について、たとえば、同じ特定的目標シーケンスに完全に相補的である、対応する完全マッチ（ＰＭ）プローブが存在する。“ジェネリック”（たとえば、ランダムな、任意の、偶然の、等）アレイにおいては、目標核酸は未知であるので、完全な整合、または不整合プローブを前もって決定し、設計し、選択することはできない。この場合、プローブは、プローブの各ペアが、１つ、またはそれ以上のあらかじめ選択されたヌクレオチドが異なるペアとして、与えられる。これにより、ペア内のプローブのどれが完全整合であるかがあらかじめ知られているので、いつ、１つのプローブが、特定的に特定の目標シーケンスにハイブリダイズするとき、該ペアの他のプローブは、その目標シーケンスのための不整合制御として作用するであろう。完全整合、および不整合プローブをペアとして設ける必要はないが、しかし、特定のあらかじめ選択されたヌクレオチドにおいて相互に異なる大きい集合（たとえば、３，４，５または、それ以上）のプローブとして、設けられるべきである。該不整合は、該不整合プローブにおけるどこにおいても位置することができ、端での不整合は、端での不整合があると、目標シーケンスの混成を妨げにくいので、より好ましくない。特に好ましい実施形態においては、該不整合は、テスト混成条件の下で、該目標シーケンスとの２重化を最も非安定にするよう、該プローブの中心に、またはその近くに、位置している。特定の好ましい実施形態においては、完全な整合は、単一の中央に位置したヌクレオチドにおける不整合制御と異なる。
【００８０】
当業者により、厳密性のような液の特徴の制御が、本発明を用いて検体−プローブペアの結合特性を、または、核酸検体（目標核酸）の濃度を測定するにおいて、重要であることが理解されるであろう。高、中間、低厳密性条件を含む、種々の混成条件を、本発明において用いることができる； たとえば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, および、Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al, 参照によりここに組み入れられる、参照）。厳格性条件は、シーケンス依存性であり、異なる状況において異なるであろう。より長いシーケンスは、より高い温度で特定的にハイブリダイズする。核酸の混成に対する広範なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) に見られる。いくらかの実施形態において、より高い厳密条件が用いられる。他の実施形態においては、より低い厳密混成条件；たとえば、中間の、またはより低い厳密条件、が技術において知られているように用いられる； 上記ManiatisおよびAusubel 参照、および、上記Tijssen参照。該混成条件は、また、技術において知られているように、イオン性の背骨、すなわち、ＰＮＡが用いられているとき、変化する。
【００８１】
厳密条件は、シーケンス依存性があり、かつ、異なる状況において異なるであろう。より長いシーケンスは、特定的に、より高い温度でハイブリダイズしようとする。一般に、厳密条件は、ある定義されたイオン性の強度、およびｐＨでの、特定のシーケンスについての、熱的融点（Ｔm）より低い約５℃に、選択されることができる。該Ｔmは、該目標シーケンスに相補的であるプローブの５０％が、平衡状態にある目標シーケンスにハイブリダイズする（定義されたイオン性強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）温度である。（目標検体シーケンスは、一般に余分に存在するので、Ｔmで、プローブの５０％が平衡状態にある。）代表的に、厳密条件は、短いプローブ（たとえば、１０から５０ヌクレオチド）について、塩の濃度が、ｐＨ７.０〜８．３で、少なくとも約０．０１から１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または、他の塩）であり、温度は、少なくとも約３０℃である、というものである。厳密条件は、また、ホルムアルデヒド等の脱安定化剤の付加により、達成されることができる。
【００８２】
いくらかの実施形態において、プローブ、および または検体は、抗体よりなることができる。ここで使用されたように、用語“抗体”は、免疫グロブリン分子、または、特定の分子、ここで、抗原と言う、に特定的に結合する能力を持つ、免疫グロブリン分子、または、免疫グロブリン分子の断片、を言う。抗体は、アッセイにおいて使用されるリセプターに特有の抗リセプター抗体であることができる。このように、該抗体は、抗原としてのリセプターに、特定的に結合することができる。抗体、およびそれらの製造は、イミューノグラフィーの分野においてよく知られている。抗体は、たとえば、ハイブリドーマ細胞線により、免疫付与によりポリクローナル抗体反応を引き出すよう、あるいは、抗体を符号化する、再結合性ＤＮＡ発現ベクトルにより変形された再結合ホストセルにより、再生されることができる。抗体は、任意のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＯｇＤ、ＩｇＭ）、および、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、Ｆａｃｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆｄ、ＶH、およびＶLを含む、活性断片の免疫グロブリン分子を含むが、これに限定されない。抗体は、単一チェイン抗体、キメラ抗体、突然変異体、溶融タンパク質、人間化された抗体、および、任意の他の、要求された特定性を持つ抗体認識サイトよりなる免疫グロブリン分子の修整された形状を、含むが、それに限定されない。
【００８３】
抗体フラグメント、および、他の修整されたフォームを含む抗体の準備は、たとえば、 "Immunochemistry in Practice," Johnstone and Thorpe, Eds., Blackwell Science, Cambridge, Mass., 1996; "Antibody Engineering," 2 sup.nd edition, C. Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, New York, 1995; "Immunoassay", E. P. Diamandis and T. K. Christopoulos, Eds., Academic Press, Inc., San Diego, 1996; "Handbook of Experimental Immunology," Herzenberg et al., Eds, Blackwell Science, Cambridge, Mass., 1996; および、"Current Protocols in Molecular Biology" F. M. Ausubel et al., Eds., Greene Pub. Associates and Wiley Interscience, 1987 に記述されており、これらの開示は、ここに、組み入れられる。広い種々の範囲の抗体は、また、商業的に利用可能である。
【００８４】
いくらかの実施形態においては、プローブ、および検体は、２つのたんぱく質よりなる。たんぱく質−たんぱく質相互作用は、２つ、またはそれ以上のたんぱく質が、相互に関連することを可能にする。多くの数の非共有結合は、２つのたんぱく質表面が、正確に整合するとき、該たんぱく質間でできあがることが可能であり、かつ、これらの結合は、認識の特定性を説明する。たんぱく質−たんぱく質相互作用は、たとえば、酵素サブ単位の、；多たんぱく質酵素複合体の、または、分子機械の、アセンブリ内に、；酵素−基板反応内に；抗原−抗体反応内に；リボゾーム、フィラメント、およびウィルスの超分子構造を形成するにおいて；輸送において；および、セル上のリセプターの成長因子およびホルモンとの相互作用内に、含まれている。発ガン遺伝子のプロダクトは、たんぱく質−たんぱく質相互作用を通しての腫瘍性形質変化を、起こすことができる。たとえば、いくらかの発ガン遺伝子は、そのセル状の目標たんぱく質上の酵素活動が、ガンの状態を導くたんぱく質キナーゼを符号化する。たんぱく質−たんぱく質相互作用のもう１つの例は、ウィルスが、該表面上のポリペプチドリセプタを認識することにより、セルに感染するときに起きる。いくらかの場合には、炭素−炭素相互作用は、たんぱく質修整に依存し得る。たとえば、ヒストンたんぱく質は、異なる化学タグ（燐酸化、または、メチル化）を持つ異なる位置で修整されることができ、かつ、修整それ自身は、他のたんぱく質（たとえば、クロマチン再モデル化している、かつ、関連するたんぱく質）による認識において、要求される、あるいは、含まれる。
結合する動力学
【００８５】
本発明の１つの側面は、液における、多数プローブ、および、検体の結合を特徴づける結合動力学の測定の使用である。ここで、使用される“結合する動力学”は、検体のプローブに対する結合が結合する反応において起きるレートを、言う。ここで用いられる“結合する反応”は、プローブと検体との間の反応を、言う。いくらかの場合には、結合する反応は、多数検体とプローブの同時に起こる結合する反応を、言い、かつ、他の場合には、用語、結合する反応は、単一プローブと単一検体との間の反応を、言う。該意味は、使用の文脈から明らかであろう。動力学の測定は、プローブに結合する検体の量として、表現され得る。結合する動力学は、結合の強度、検体の濃度、検体の競争的結合、プローブの濃度、または、クロス混成の存在、および、量、等の、プローブ−検体結合の特徴についての情報を、与えることができる。
【００８６】
結合動力学を決定するために、多数時点での信号が決定されなければならない。少なくとも２つの時点での信号が、要求される。多くの場合において、２点以上の情報が、動力学情報の質を改善するために、望まれる。いくらかの実施形態において、約２−１０、１０−５０、５０−１００、１００−２００、２００−４００、４００−８００、８００−１６００、１６００−３２００、３２００−６４００，６４００−１３０００、または、１３０００以上の時点が、測定される。当業者は、与えられた実験について有効な数を決定することができる。たとえば、２、３の点が得られるところでは、結合イベントについての情報の質は、低くあり得るが、しかし、データ点の数が大変高いところでは、データの質は、大変高くあり得、しかし、データの処理、蓄積、および、操作は、煩雑であり得る。
【００８７】
信号が測定される周波数は、結合反応の動力学、またはモニターされている反応に依存するであろう。測定の周波数がより低くなると、測定間の時間はより長くなる。結合反応を特徴付ける１つの方法は、検体の半分が結合される時点（ｔ1/2）に、言及することである。本発明の結合反応は、ミリ秒のオーダー上から時間のオーダー上までの時間（ｔ1/2）を、持つことができ、これにより、測定の周波数は、広い範囲にわたり変わることができる。この測定間の時間は、一般に、結合反応の時間に対して平均的ではないであろう。いくらかの実施形態において、測定間の短い時間は、反応の開始時点でつくることができ、かつ、測定間の時間は、反応の終点に向かい長くすることができる。本発明の１つの利点は、広い範囲の結合レートを測定する能力である。測定の高い初期周波数は、より高い結合を持つ早い結合反応の特徴化を許し、測定のより低い周波数は、より遅い結合反応の特徴化を許す。たとえば、点は、最初、マイクロ秒のオーダー上の点間の時間で測定され、そののち、約１ミリ秒ののちに、点は、ミリ秒のオーダー上の点間の時点で測定されることができ、そののち、約１秒後に、時点は、秒のオーダー上の点間の時点で測定されることができる。任意の機能は、測定周波数の時間とともにの変化を、傾斜させるのに使用することができる。いくらかの場合において、以下に記述されるように、厳密さ、または、温度の変化のような反応条件の変化は、反応の間になされてよく、そののちに、測定の周波数を、反応条件の変化により変化するであろう反応のレートを測定するよう、変化させることが望ましいであろう。
【００８８】
いくらかの実施形態において、プローブは、実質的に、結合反応の初期においては、検体を、それに、結合させるものではなく、そののち、プローブは、該検体を含む液に露出され、かつ、検体は、結合を始め、時間とともにより多く検体がプローブに結合する。いくらかの場合には、反応は、飽和、結合しようとするすべての検体が結合した点、に達するであろう。一般に、飽和は、反応が定常状態に達したときに、起こるであろう。定常状態では、与えられた時間の間に、新しい検体が結合されるのとちょうど同じだけの、検体が開放される（オンレートとオフレートが、等しい）。いくらかの場合には、検体のオフレートは、本質的にゼロである、大変強い結合では、飽和は、プローブに結合することのできる実質的にすべての検体が結合したであろうとき、起きるであろう。これにより、結合動力学と相関することのできる信号の変化を、時間とともに測定することが望ましいが、時間とともに変化しない信号の測定は、また、実時間実験の文脈での情報を与え、かつ、また、本発明においては、有用であり得る。たとえば、いくらかの場合には、信号の変化の不存在は、飽和のレベルを示すであろう。他の場合には、信号の変化の不存在は、反応の速度が、測定される時間の変化に対して大変遅いことを示すことができる。このように、信号が時間とともに変化するところ、および、信号が時間とともに変化しないところ、の両方で、結合イベントを実時間で測定することは、本発明の有益な側面である。
【００８９】
本発明の方法の１つの側面は、結合する動力学の測定から検体の濃度を測定することである。検体結合レートは、濃度依存性のあるものであるので、われわれは、サンプル内の検体の豊富さを、結合レートを用いて予測することができる。
【００９０】
いくらかの実施形態において、検体の濃度は、混成プロセスの動力学に関係する方程式により決定することができる。たとえば、混成の前のアレイ上の特定スポットでのプローブの数が、Ｐ0により与えられるとする。特定の目標が、プローブサイトに結合する確率は、以下により、与えられる；
Prob(binding) = k- Prob ( target and probe in close proximity -  Prob ( probe is free),
【００９１】
ここで、
2009540299.tif 000002
プローブと、目標間の結合に依存し、本質的に、温度、インキュベーション条件、およびプローブ密度の関数である。ここで、第１の確率は、利用可能な目標分子の数に比例し、ここで、第２の確率は、
2009540299.tif 000003
となる。
【００９２】
ここで、Ｐ(ｔ)は、時間ｔでの利用可能なプローブの数であり、すなわち、それらは、任意の目標に、まだ結合されてはいない。もし、われわれが、前方、および後方目標／検体結合反応レートを、それぞれ、Ｋ+、および、Ｋ-により示せば、われわれは、利用可能なプローブ濃度Ｐ(ｔ) について、以下の微分方程式を書くことができる：
2009540299.tif 000004
【００９３】
ここで、Ｃは、液におけるもともとの目標量であり、Ｃ−（Ｐ0 −Ｐ(t)） は、時間ｔでの、利用可能な目標密度を表す。上記は、閉じた形で解くことのできるリカッチ微分方程式である。しかしながら、そのようにする代わりに、ｔの小さい値に対しては、
2009540299.tif 000005
であり、したがって、該微分方程式は、
2009540299.tif 000006
のようになる。
【００９４】
これは、時定数  τ＝Ｐ0／Ｋ+Ｃを持つ、一次線形微分方程式である。したがって、目標密度は、Ｐ(t)の反応レート（または、時定数）から、決定することができる。言い換えると、異なる時点でのＰ(t)の多くのサンプル測定を用い、かつ、それらを、カーブ
2009540299.tif 000007
にフィットさせることにより、われわれは、目標濃度Cを予測することが、可能となる。この場合、反応レート（または、時定数の逆数）は、目標濃度に比例し、かつ、プローブ密度に逆比例し、実験において見られた何か、である。
【００９５】
人は、また、P(t) の定常状態値、すなわち、P∞より、C を予測するよう試みることができる。これは、P∞についての２次方程式を導くもともとのリカッチ方程式において、ｄＰ(t)／ｄｔ＝０と、設定することにより、見つけることができる。いくつかの簡単な場合においては、この２次方程式に対する解は、かなり簡単化されることができる。
【００９６】
目標濃度が低いとき； この場合、われわれは、Ｐ0≫Ｃ、と予測することができ、したがって、われわれは、
Ｐ∞ = Ｐ0 − Ｃ
を、得ることができる。
【００９７】
すなわち、利用可能なプローブにおける差は、目標濃度にほぼ等しい。
【００９８】
目標濃度が高いとき； この場合、われわれは、Ｐ0≪Ｃ と予測することができ、したがって、われわれは、
2009540299.tif 000008
を、得ることができる。
【００９９】
この場合、残りのプローブの数は、目標濃度に、逆比例している。これは、プローブ飽和に対応するもので、これは、一般に、反応のはじめに近い反応レートに基づきＣを決定するのと同じように、良いＣの決定方法ではない。
【０１００】
本発明の１つの側面は、反応の始まりに近いレートを測定することにより、検体のプローブに対する結合を決定することである。Cのより信頼性のある予測を与えるのに加えて、反応の始まりに近い測定は、飽和からの結合を測定するのに必要な時間に対して、検体の結合を測定するのに要する時間を短くすることができる。本発明のいくらかの実施形態においては、結合は、飽和時の結合される検体の量に比較して、検体の、約、第１の、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４，１８、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０パーセントより小さい時間の間、測定される。いくらかの実施形態においては、結合動力学は、検体の第１の約２０％が結合するより少ない時間内に、決定される。いくらかの実施形態においては、結合動力学は、検体が結合する、約、第１の、１−２％より少ない時間内に、決定される。
結合する実験の間の変化する条件
【０１０１】
本発明の方法の１つの側面は、結合実験の間に条件を変更するステップである。終点のみが決定されている従来のマイクロアレイにおいては、ただひとつのセットの結合条件のみが、テストされ得る。本発明の方法においては、同じ結合実験の間に、多数のセットの結合条件を開発するために、結合条件を変化させることができる。変化される条件は、たとえば、検体のプローブへの結合レートに影響を与える任意の条件であることができる。変化される条件は、たとえば、温度、ｐＨ、厳密性、検体濃度、イオン強度、電界、または、競争的な結合化合物の付加、であり得る。
【０１０２】
いくらかの実施形態において、変化される条件は、結合、または、混成の条件を変化させる。同じ結合する媒体における、多数検体のプローブへの結合を、本発明におけるように測定するとき、結合の動力学は、異なる検体−プローブ結合について、広く変化し得る。結合レート条件は、たとえば、温度、濃度、イオン性強度、ｐＨを変えることにより、あるいは、電気的ポテンシャルを印加することにより、変化させることができる。異なる検体のための結合レートは、いくらかの場合には、多くの大きさのオーダーだけ、変化することができ、１つの結合実験において、すべての検体の結合を測定することを、困難、かつ、時間を消費するものとしている。このレート条件を変更する能力は、異なるレートで結合する多数検体についての結合の測定を、たとえば、実験の初期部分を、急速に結合する検体が容易に測定されるよう、より遅いレート条件で行い、その後、レート条件を、よりゆっくりと結合する検体が容易に測定されるように、上げることにより、改善するのに用いることができる。結合実験の間に、結合レートを変更する、たとえば、結合レート条件を用いて結合動力学の初期部分を測定し、そののち、結合レート条件を増大して、単一検体についての結合動動力学の後の部分を測定する、たとえば、飽和レベルを打ち立てるようにするこの方法は、また、液内の単一検体、または単一セットの検体のよりよい特徴のために、用いられることができる。当業者により、このレート条件を変更する方法は、検体濃度の測定、および/または、時間の節約、等の、測定の改善された質の両方を、生ずることができることが理解されるであろう。現在の方法では、たとえば、結合の動力学を、測定し、そののち、より弱い結合スピーシーズの結合レートを増大するよう、条件を変更することにより、結合実験の時間を、終点結合方法を用いて同じ質の情報を得るのに必要な時間に対して、約１０％、２０％、５０％、７５％より大きいだけ、あるいは、２、４、８、１０、５０、１００、１０００、または１０００よりより大きい因子だけ、減少させることができる。
【０１０３】
いくらかの実施形態において、変化される条件は、厳密性である。上記したように、該厳密性は、温度、イオン強度、および、ホルムアルデヒド等の化合物の付加を含む多くの因子により、これを変更することができる。本発明のいくつかの実施形態においては、媒体は、結合反応のはじめにある厳密性にあり、かつ、後の点において、媒体の厳密性は変化される。この方法は、異なる検体、またはセットの検体が、異なる混成特徴をもつ場合に用いられることができ、たとえば、１つのセットの検体の、高い厳密性での結合の測定を許し、そののち、同じ媒体内のもう１つのセットの検体の結合の、同じ結合実験の一部としてのより低い厳密性での測定を、許すものである。この方法は、また、単一検体のための結合の特徴のために、たとえば、結合反応の初期部分で、高い厳密性で結合を測定し、そののち、厳密性を下げ、該結合反応の後の部分を測定することにより、用いることができる。厳密性を変更する能力は、また、結合検体が結合していない状態となる条件を作るよう用いられることができ、たとえば、ある厳密性で結合の動力学の測定を許し、これに続き、厳密性を上げての、検体の液内への開放の測定が行われる。この方法は、また、検体のプローブへの結合が、多数回測定されることを、たとえば、検体の結合の動力学を、１つのセットの厳密性条件の下で測定し、厳密性を、たとえば、該厳密性を上げることにより、検体を開放するよう変更し、そののち、厳密性条件を、ふたたび変更することにより、たとえば、厳密性を下げることにより、検体の結合の動力学を、次の時間に測定することにより許すものである。このように、結合反応の間に厳密性を変更する能力は、同じセットのプローブと検体との、任意の数の、結合する、または非結合の、反応の測定を許す。
【０１０４】
本発明の方法のいくらかの実施形態においては、電気的ポテンシャルは、結合反応の間に流体体積に適用され、媒体の厳密性を電気的に変化させる。いくらかの実施形態においては、システムは、電気的刺激を、獲得領域に、該獲得領域の近傍にある電極構造を用いて与える。もし、検体が電気活性スピーシーズ、および/または、イオンであれば、電気的刺激は、検体の静電気力を与えることができる。いくらかの実施形態において、該電気的ポテンシャルは、直流（ＤＣ）である。いくらかの実施形態において、電気的ポテンシャルは、時間変化するものである。いくらかの実施形態において、電気的ポテンシャルは、ＤＣと時間変化する側面の両方を持つ。適用された電位の振幅は、１ｍＶから１０Ｖの間であることができ、しかし、代表的に、１０ｍＶと１００ｍＶの間である。時間変化信号の周波数は、１Ｈｚと１０００ＭＨｚの間であり、しかし、代表的に、１００Ｈｚと１００ｋＨｚの間である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、条件の変化は、競争的結合剤の付加である。たとえば、最初に、サンプルが、特定のプローブに結合する検体を含んで導入されることができる。その検体の結合は、ここで記述されたように、モニターされることができる。そののち、検体の結合の間の任意の時点で、検体のプローブに対する結合と競合する、ある検体を付加することができる。該検体の、該競争的結合剤による置き替えのレートは、そののち、測定されることができ、検体のプローブに対する結合を特徴づけるより多くの情報を、与える。
信号の検出
【０１０６】
本発明の方法のために、検体の複数のプローブへの結合と相関されることのできる信号が、検出される。本発明に適切な信号のタイプは、検体の複数のプローブに結合される量であり得る任意の信号である。適切な信号は、たとえば、電気的、電気化学的、磁気的、機械的、音響的、または、電磁的な（光）信号 を含む。本発明において有用な、検体結合と相関され得る、電気信号の例は、キャパシタンス、および／または、インピーダンスである。たとえば、金属、または、金属クラスターでラベルされた検体は、流体と接触している表面のキャパシタンス、および／または、インピーダンスを変えることができ、表面上のプローブに結合される検体の量が、決定されることを許す。電気的測定は、ＤＣ、０−１０Ｈｚ、１０−１００Ｈｚ、１００−１０００Ｈｚ、１ＫＨｚ−１０ＫＨｚ、１００ＫＨｚ−１ＭＨｚ、１ＭＨｚ−１０ＭＨｚ、１０ＭＨｚ−１００ＭＨｚ、１００ＭＨｚ−１ＧＨｚ、または、１ＧＨｚ以上を含む任意の周波数でなされることができる。いくらかの実施形態においては、インピーダンススペクトロスコピーは、上記で記述された周波数範囲内の任意の周波数範囲について、インピーダンス対周波数を得るものであり、用いることができる。本発明において有用な電気化学信号の例であって、検体結合と相関され得るものは、電流計的な、かつ、電圧計的な、測定、かつ／または、レドックススピーシーズの酸化または還元を、含む。たとえば、検体は、既知のレドックス電位で、酸化または還元反応を行う化合物でラベルされることができ、かつ、該酸化または還元電流は、表面プローブに結合する検体の量と相関されることができる。機械的信号の例は、マイクロエレクトロメカニカル（ＭＥＭＳ）デバイスの使用を、含む。たとえば、検体の、カンチレバー等の小表面特徴の表面上のプローブへの結合は、表面特徴の重量を変更することができ、その振動周波数は、そののち該プローブに結合された検体の量と相関される。一般に、重量が高ければ高いほど、振動周波数はより低い。音響信号の例は、表面音響波（ＳＡＷ）を含み、表面プラズマ共鳴信号を含む。表面音響波（ＳＡＷ）は、いくらかの弾性をもつ材料の表面に沿って進行する音響波で、代表的に、基板の深さとともに指数関数的に減衰する振幅を持つ。ラベルされた、または、ラベルされていない検体の、表面上のプローブへの結合は、ＳＡＷ特性、たとえば、振幅、周波数を、プローブに結合される検体の量と相関されることのできる態様で、変更することができる。表面プラズマ共鳴は、通常、金属／誘電体界面に沿って平行に伝播する表面電磁波である、表面プラズマポラリトンとしても知られている表面プラズマに依存する。波は、金属と外部媒体（たとえば、水）との境界上にあるので、これらの発振は、分子の金属表面への吸収、のような、この境界の任意の変化に大変敏感である。ラベルされた、または、ラベルされていない検体の、表面上に取り付けられたプローブへの結合は、共鳴表面プラズマの周波数を、プローブに結合される検体の量と相関されることのできる態様で、変化させることができる。
【０１０７】
特に、本発明の方法に有用な信号は、電磁波（光）信号である。本発明において有用な光学信号の例は、蛍光発光、ルミネッセンス、および吸収である。ここで用いられるように、用語“電磁的”、または、“電磁波”、および“光”は、相互交換可能に使用される。任意の周波数、および波長の電磁波で、表面上のプローブに結合される検体の量に相関できるものは、γ線、ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線、およびマイクロ波である。いくつかの実施形態は、可視（光）光線、に関して記述されているが、記述は、実施形態をそれらの特定の電磁周波数に限定することを、意図しているものではない。
【０１０８】
本発明の方法について、検体のプローブへの結合に際して、信号は、結合される検体の量に相関する態様で変化するのが望ましい。いくつかのケースにおいて、信号の変化は、信号の強度の変化であろう。いくつかの実施形態において、信号強度は、より多くの検体がプローブに結合されるほど、増大されるであろう。いくつかの実施形態において、信号強度は、より多くの検体がプローブに結合されるほど、減少されるであろう。いくつかの実施形態において、信号強度は、強度の変化ではなく、しかし、検体がプローブに結合されるのと相関し得る任意の他の信号変化であり得る。たとえば、プローブの結合に際しての信号変化は、信号の周波数の変化であり得る。いくらかの実施形態においては、信号周波数は、より多くの検体がプローブに結合されるほど、増大するであろう。いくらかの実施形態においては、信号周波数は、より多くの検体がプローブに結合されるほど、減少するであろう。
【０１０９】
測定される信号は、一般に、固体表面の領域における信号である。いくらかの実施形態において、基板に取り付く部分からの信号は、プローブに結合される検体の量と相関されることができる。いくらかの実施形態において、該液からの信号は、プローブに結合される検体の量と相関されることのできる信号として、使用される。
【０１１０】
本発明の方法のいくらかの実施形態において、ラベルは、検体、および／または、プローブに取り付けられる。任意のラベルは、信号のプローブに結合された検体の量との相関において、使用することができる。当業者により、検体、および／または、プローブ上について使用されるラベルのタイプは、使用されている信号のタイプに依存するであろう、たとえば、上記したように、機械的信号についての濃いラベル、または、電圧測定用の、レドックス活性ラベルである。
【０１１１】
いくらかの実施形態において、プローブに結合される検体の量に相関することができる信号は、より多くの検体が表面上のプローブに結合されるほど、表面のラベルの作り上げられ方による。たとえば、検体が蛍光発光ラベルを持つところでは、より多くの検体がつくほど、蛍光発光信号の強度は、表面上のプローブに結合する検体の量と相関することのできる態様で、増大することができる。いくらかの実施形態においては、プローブに結合する検体の量に相関できる信号は、表面からのラベルの開放による。たとえば、プローブが蛍光発光ラベルを持ち、ラベルが検体のプローブへの結合により液内で開放されるところでは、該表面での蛍光発光強度は、より多くの検体が結合され、より多くの蛍光発光ラベルが開放されるほど、減少するであろう。
【０１１２】
いくらかの実施形態においては、プローブに結合される検体の量に相関できる信号は、プローブへの検体の結合に際しての、表面上のラベルからの信号の変化による。たとえば、蛍光発光ラベルが表面上にあり、かつ、検体が、検体のプローブとの結合に際して、表面蛍光発光ラベルの蛍光発光信号を変化させることができる化合物でラベルされている場合、信号変化は、プローブに結合される検体の量で相関されることができる。いくらかの実施形態において、検体は、消失剤でラベルされており、消失による該表面蛍光発光ラベルからの強度の減少は、プローブに結合された検体の増大した量に相関している。いくらかの実施形態において、検体は、表面上の蛍光発光ラベルとエネルギー移転を行うことができる蛍光発光化合物で、検体蛍光発光ラベルからの蛍光発光の増大、および／または、表面蛍光発光ラベルからの蛍光発光の減少が、プローブに結合される検体の量と相関され得るように、ラベルされている。いくらかの実施形態において、表面蛍光発光ラベルは、プローブに、直接、すなわち、共有結合で結合されている。いくらかの実施形態において、表面蛍光発光ラベルは、表面に結合されており、プローブには結合されておらず、しかし、検体のプローブへの結合が、プローブへの検体の結合量と相関され得る、表面蛍光発光ラベルからの信号の変化を生成するよう、十分な近傍にある。
【０１１３】
いくらかの実施形態において、検体は、ラベルされておらず、かつ、検体の結合特性、および または、濃度は、プローブへの結合について検体と競争する、もう１つのラベルされたスピーシーズによる競争的結合により決定される。たとえば、われわれが、その濃度を決定したい検体Ａ、を持つ液を有し、そのプローブとの結合特性、および、その濃度が既知である、競争的結合スピーシーズＢ、を有するとき、われわれは、本発明を用いて、Ａの濃度を、たとえば、表面上のプローブアレイを用いて、Ｂのプローブへの競争的結合の量を決定することにより、決定することができる。たとえば、該プローブは、蛍光発光するようラベルされた表面に取り付けられており、かつ、Ｂ は、表面蛍光発光の消失のレベルがプローブに結合するＢ の量と相関され得るよう、消失剤によりラベルされている。Ｂのプローブへの結合のレートは、実時間で測定され、かつ、Ａの濃度は、Ａの競争的バインダーとしての特徴を知ることにより、決定される。いくらかの実施形態において、競争的バインダースピーシーズの量は、あらかじめわかっている必要はない。たとえば、結合動力学は、流体体積において測定されることができ、そののち、条件は、Ｂがプローブから開放されるように（たとえば、厳密性を増大することにより）変更することができ、そののち、検体Ａ が付加され、かつ、Ａとの競争の下でＢ の結合が測定される。この例は、媒体の条件を１つの実験の間に変更することができることの利点を、説明する。いくらかの場合には、ＡとＢは同じスピーシーズであることができ、そこでは、Ｂ がラベルされており、かつ、Ｂの量が既知であり、かつ、Ａの量は、Ｂの結合動力学により決定されることができる。いくらかの場合には、ＡとＢは、同じスピーシーズではなく、しかし、プローブとの結合に関して競争的である。この競争的な結合の実時間アッセイは、核酸、抗体、酵素、結合するたんぱく質、炭水化物、および脂質を含む、ここで記述されたすべてのタイプの分子スピーシーズについて、なされることができる。
電磁的信号  −  光学方法
【０１１４】
光学的検出の使用は、本発明の方法を実行する種々の役立つ途を与える。光学的方法は、限定されることなく、吸収、ルミネセンス、および蛍光発光を含む。
【０１１５】
本発明のいくらかの実施形態は、たとえば、ダイによる光吸収を測定することを含む。ダイは、そのダイを運ぶ分子の濃度の測定を許す、与えられた波長範囲内の光を吸収することができる。本発明において、ダイは、検体上で、またはプローブ上で、ラベルとして用いられることができる。ダイの量は、結合動力学を決定するために、表面の結合されるダイの量と相関されることができる。ダイは、たとえば、検体をラベルするために、検体に共有結合されることのできる、小さい有機の、または、有機金属の化合物であることができる。紫外、可視、赤外において吸収を行う、かつ、これらの外において吸収を行う、ダイは、本発明においていることができる。たとえば、赤外についての減衰された全反射（ＡＴＲ）等の方法は、表面測定の感度を増大するのに使用することができる。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態は、ルミネセンスにより生成された光を測定することを含む。ルミネセンスは、広く、化学ルミネセンス、バイオルミネセンス、ホスホレセンス、および、蛍光発光を含む。いくらかの実施形態において、光のフォトンが酸化等の化学反応によりつくられる化学ルミネッセンスを、用いることができる。本発明で有用な化学ルミネセンススピーシーズは、限定されることなく、ルミノール、シャルーム、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、オキサリルクロライド、ピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）、ルシゲニム、を含む。いくらかの実施形態においては、バイオルミネセンスが用いられる。ルミネセンスがバイオルミネセンスであるところでは、励起された状態の作成は、酵素により触媒作用を起こされた反応から引き出される。バイオルミネセンスは、種々の化学ルミネセンス反応システムを通して可視光を発する能力から来ている。バイオルミネセンスは、一般に、３つの主な構成要素を含む：ルシフェリン、ルシフェラーゼ、および分子酸素、である。しかしながら、また、他の構成要素は、また、いくらかの反応において必要であり、カチオン（Ｃａ++、および、Ｍｇ++）、および、共同因子（ＡＴＰ、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ）を、含む。ルシフェラーゼは、基板、ルシフェリンの酸化を触媒作用する酵素であり、非安定な中間体を生成する。光が、非安定な中間体がその基底状態にまで減衰するときに発せられ、オキシルシフェリンを生成する。異なる関係しないタイプのルシフェリンの任意のものを、ここで、コエレンテラジンとして知られる、ルシフェリンを用いる門からのものを含んで、用いることができ、これは、３つのアミノ酸（２つのチロシン、および、１つのフェ二ールアラニン）を、含む。クラゲ等の動物からのフォトタンパク質を、ルシフェリン/ルシフェラーゼシステムの“フォトプロテイン”がカルシウム結合に際し光を発するところで、用いることができる。米国特許出願第２００７／００６５８１８号で開示されたような、かつ、米国特許出願第２００７／００７７６０９号で開示されたバイオルミネセンス共鳴エネルギー移転（ＢＲＥＴ）を含む、他のバイオルミネセントシステムは、本発明において用いることができる。
蛍光系
【０１１７】
本発明の有用な実施形態は蛍光の使用にかかわる。ここに使用されるように、蛍光は分子が光子の放出で電子的に励起された状態から基底状態に緩和する過程を示す。また、ここに使用されるように、用語蛍光は燐光を包含する。一般に、蛍光に関しては、分子は紫外線の、または、可視、あるいは近赤外線の放射で電子的に励起された状態に促進される。次に、励起分子は、光の放出により、基底状態、または、より低位の励起された電子状態に減衰する。発明の方法のための蛍光の利点はその高感度である。蛍光分析は吸収より数桁低い検出の限界を持ち得る。非常に蛍光の強い分子については、１０-10Ｍあるいはそれ以下の検出の限界が可能であり；厳しく制御された状態の下での好ましい場合では、究極限界の検出(単一分子)が達成され得る。
【０１１８】
小分子、蛍光タンパク質、および量子ドットを含む広いさまざまな蛍光分子を本発明において利用できる。有用な蛍光分子(蛍光)は、以下のものを含むが、しかし、これに限定されない：1,5 IAEDANS； 1,8-ANS； 4-メチルウンベリフェロン； 5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン； 5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)； 5-カルボキシナフトフルオレセイン； 5-カルボキシテトラメチルローダミン(5-TAMRA)； 5-FAM(5-カルボキシフルオレセイン)； 5-HAT (ヒドロキシ トリプタミン)； 5-ヒドロキシ トリプタミン(HAT)； 5-ROX(カルボキシ-X-ローダミン)； 5-TAMRA (5-カルボキシテトラメチルローダミン)； 6-カルボキシローダミン 6G； 6-CR 6G； 6-JOE； 7-アミノ-4-メチルクマリン； 7-アミノアクチノマイシン D (7-AAD)； 7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン； 9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン； ABQ； アシッドフクシン； ACMA (9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン)； アクリジンオレンジ； アクリジンレッド； アクリジンイエロー； アクリフラビン； アクリフラビンフュールゲンSITSA； イクオリン(フォトプロテイン)； AFPs--自動蛍光タンパク--(クォンタムバイオテクノロジーズ)； Alexa Fluor 350(登録商標)； Alexa Fluor 430(登録商標)； Alexa Fluor 488(登録商標)； Alexa Fluor 532(登録商標)； Alexa Fluor 546(登録商標)； Alexa Fluor 568(登録商標)； Alexa Fluor 594(登録商標)； Alexa Fluor 633(登録商標)； Alexa Fluor 647(登録商標)； Alexa Fluor 660(登録商標)； Alexa Fluor 680(登録商標)； アリザリンコンプレクソン； アリザリンレッド； アロフィコシアニン(APC)； AMC； AMCA-S； AMCA(アミノメチルクマリン)； AMCA-X； アミノアクチノマイシンD； アミノクマリン； アミノメチルクマリン(AMCA)； アニリン ブルー； アントロシルステアレート； APC (アロフィコシアニン)； APC-Cy7； APTRA-BTC； APTS； アストラゾンブリリアントレッド4G； アストラゾンオレンジ R； アストラゾンレッド6B； アストラゾンイエロー7 GLL； アタブリン； ATTO-TAG(登録商標) CBQCA； ATTO-TAG (登録商標) FQ； オーラミン； オーロホスフィンG； オーロホスフィン； BAO 9 (ビスアミノフェニルオキサジアゾール)； BCECF (高pH)； BCECF (低pH)； ベルベリン硫酸塩； ベータラクタマーゼ； ビマン； ビスベンズアミド； ビスベンズアミド(ヘキスト)； ビス-BTC； ブランコフォアFFG； ブランコフォアSV； BOBO (登録商標)-1； BOBO (登録商標)-3； Bodipy(登録商標)492/515； Bodipy(登録商標)493/503； Bodipy(登録商標)500/510； Bodipy(登録商標)505/515； Bodipy(登録商標)530/550； Bodipy(登録商標)542/563； Bodipy(登録商標)558/568； Bodipy(登録商標)564/570； Bodipy(登録商標)576/589； Bodipy(登録商標)581/591； Bodipy(登録商標)630/650-X； Bodipy(登録商標)650/665-X； Bodipy(登録商標)665/676； Bodipy(登録商標)FI； Bodipy(登録商標)FL ATP； Bodipy(登録商標)FI-セラミド； Bodipy(登録商標)R6G SE； Bodipy(登録商標)TMR； Bodipy(登録商標)TMR-X 複合体； Bodipy(登録商標)TMR-X,SE； Bodipy(登録商標)TR； Bodipy(登録商標)TR ATP； Bodipy(登録商標)TR-X SE； BO-PRO(登録商標)-1； BO-PRO(登録商標)-3； ブリリアントスルフォフラビンFF； BTC； BTC-5N； カルセイン； カルセインブルー； Calcium Crimson(登録商標)； Calcium Green(登録商標)； Calcium Green(登録商標)-1 Ca.sup.2+ Dye； Calcium Green(登録商標)-2 Ca.sup.2+； Calcium Green(登録商標)-5N Ca.sup.2+； Calcium Green(登録商標)-C18 Ca.sup.2+； Calcium Orange(登録商標)； カルコフロールホワイト； カルボキシ-X-ローダミ���(5-ROX)； Cascade Blue(登録商標)； Cascade Yellow(登録商標)； カテコラミン； CCF2 (GeneBlazer(登録商標))； CFDA； クロロフィル； クロモマイシン A； クロモマイシン A； CL-NERF； CMFDA； クマリンファロイジン； C-フィコシアニン； CPM メチルクマリン； CTC； CTC ホルマザン； Cy2(登録商標)； Cy3. 18； Cy3.5(登録商標)； Cy3(登録商標)； Cy5.18； Cy5.5(登録商標)； Cy5(登録商標)； Cy7(登録商標)； サイクリック AMP フルオロセンサ(FiCRhR)； ダブサイル； ダンシル； ダンシルアミン； ダンシルカダベリン； ダンシルクロライド； ダンシルDHPE； ダンシルフルオライド； DAPI； ダポキシル； ダポキシル2； ダポキシル3' DCFDA； DCFH(ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート)； DDAO； DHR(ジヒドロローダミン123)； Di-4-ANEPPS； Di-8-ANEPPS(non-ratio)； DiA(4-Di-16-ASP)； ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH)； DiD-リポフィリックトレーサ； DiD(DiIC18(5))； DIDS； ジヒドロローダミン123(DHR)； Dil(DiIC18(3))； ジニトロフェノール； DiO(DiOC18(3))； DiR； DiR(DiIC18(7))； DM-NERF(高pH)； DNP； ドーパミン； DTAF； DY-630-ＮＨＳ； DY-635-ＮＨＳ； ELF 97； エオシン； エリスロシン； エリスロシンITC； 臭化エチジウム； エチジウムホモ二量体-1(EthD-1)； オイクリシン； EukoLight； 塩化ユウロピウム(III)； EYFP； ファストブルー； FDA； フュールゲン(パラローザニリン)； FIF (ホルムアルデヒド誘導フルオレセンス)； FITC； フラゾオレンジ； フルオ-3； フルオ-4； フルオレセイン(FITC)； フルオレセインジアセテート； フルオロエメラルド； フルオロゴールド(ヒドロキシスチルブアミジン)； フルオロルビー； フルオロX； FM 1-43(登録商標)； FM 4-46； Fura Red(登録商標)(高pH)； Fura Red(登録商標)/フルオ-3； フラ-2； フラ-2/BCECF； ゲナクリルブリリアントレッドB； ゲナクリルブリリアントイエロー1OGF； ゲナクリルピンク3G； ゲナクリルイエロー5GF； GeneBlazer(登録商標)(CCF2)； グロキサン酸； グラニューラブルー； ヘマトポルフィリン； ヘキスト33258； ヘキスト33342； ヘキスト34580； HPTS； ヒドロキシクマリン； ヒドロキシスチルブアミジン(フルオロゴールド)； ヒドロキシトリプタミン； インド-1,高カルシウム； インド-1,低カルシウム； インドジカルボシアニン(DiD)； インドトリカルボシアニン(DiR)； イントラホワイトCf； JC-I； JO-JO-I； JO-プロ-1； レーザープロ； Laurodan； LDS 751(ＤＮＡ)； LDS 751(ＲＮＡ)； リューコファーPAF； リューコファーSF； リューコファーWS； リサミンローダミン； リサミンローダミンB； カルセイン/エチジウムホモ二量体； LOLO-1； LO-プロ-1； ルシファイエロー； リソトラッカーブルー； リソトラッカーブルー−ホワイト； リソトラッカーグリーン； リソトラッカーレッド； リソトラッカーイエロー； リソセンサーブルー； リソセンサーグリーン； リソセンサーイエロー/ブルー； マググリーン； マグダラレッド(フロキシン B)； マグ-フラ レッド； マグ-フラ-2； マグ-フラ-5； マグ-インド-1； マグネシウムグリーン； マグネシウムオレンジ； マラカイトグリーン； マリーナブルー； マキシロンブリリアントフラビン10 GFF； マキシロンブリリアントフラビン8 GFF； メロシアニン； メトキシクマリン； ミトトラッカーグリーンFM； ミトトラッカーオレンジ； ミトトラッカーレッド； ミトラマイシン； モノブロモビマン； モノブロモビマン(mBBr-GSH)； モノクロロビマン； MPS (メチルグリーンピロニンスチルベン)； NBD； NBD アミン； ニールレッド； ニトロベンゾキシアジドール； ノルアドレナリン； ニュークリアファストレッド； ニュークリアイエロー； ニロサンブリリアントフラビンE8G； オレゴングリーン； オレゴングリーン488-X； Oregon Green(登録商標)； Oregon Green(登録商標)488； Oregon Green(登録商標)500； Oregon Green(登録商標)514； パシフィックブルー； パラロサニリン(フュールゲン)； PBFI； PE-Cy5； PE-Cy7； PerCP； PerCP-Cy5.5； PE-テキサスレッド[レッド 613]； フロキシンB(マグダラレッド)； ホルワイトAR； ホルワイトBKL； ホルワイトRev； ホルワイトRPA； ホスフィン3R； ホトレジスト； フィコエリスリンB [PE]； フィコエリスリンR [PE]； PKH26 (シグマ)； PKH67； PMIA； ポントクロームブルーブラック； POPO-1； POPO-3； PO-プロ-1； PO-プロ-3； プリムリン； プロシオンイエロー； ヨウ化プロビジウム(PL)； PyMPO； ピレン； ピロニン；  ピロニンB； ピロザールブリリアントフラビン7GF； QSY 7； キクナリンマスタード； レッド613 [PE-テキサスレッド]； レソルフィン； RH 414； Rhod-2； ローダミン； ローダミン110； ローダミン123； ローダミン5 GLD； ローダミン6G； ローダミンB； ローダミンB 200； ローダミンB エクストラ； ローダミンBB； ローダミンBG； ローダミン グリーン； ローダミン ファリシジン； ローダミン ファロイジン； ローダミン レッド； ローダミンWT； ローズベンガル； R-フィコシアニン； R-フィコエリスリン(PE)； S65A； S65C； S65L； S65T； SBFI； セロトニン； セブロンブリリアントレッド2B； セブロンブリリアントレッド4G； セブロンブリリアントレッドB； セブロンオレンジ； セブロンイエローL； SITS； SITS (プリムリン)； SITS (スチルベンイソチオスルホン酸)； SNAFL カルセイン； SNAFL-1； SNAFL-2； SNARF カルセイン； SNARF1； ソジウムグリーン； スペクトラムアクア； スペクトラムグリーン； スペクトラムオレンジ； スペクトラムレッド； SPQ (6-メトキシ-N-(3-サルフォプロピル) キノリニウム)； スチルベン； スルホローダミン B カン C； スルホローダミンエクストラ； SYTO 11； SYTO 12； SYTO 13； SYTO 14； SYTO 15； SYTO 16； SYTO 17； SYTO 18； SYTO 20； SYTO 21； SYTO 22； SYTO 23； SYTO 24； SYTO 25； SYTO 40； SYTO 41； SYTO 42； SYTO 43； SYTO 44； SYTO 45； SYTO 59； SYTO 60； SYTO 61； SYTO 62； SYTO 63； SYTO 64； SYTO 80； SYTO 81； SYTO 82； SYTO 83； SYTO 84； SYTO 85； SYTOXブルー； SYTOXグリーン； SYTOXオレンジ； テトラサイクリン； テトラメチルローダミン(TRITC)； Texas Red(登録商標)； Texas Red-X(登録商標)複合体； チアジカルボシアニン(DiSC3)； チアジンレッドR； チアゾールオレンジ； チオフラビン5； チオフラビンS； チオフラビンTCN； チオライト； チオゾールオレンジ； チノポールCBS (カルコフロールホワイト)； TMR； TO-プロ-1； TO-プロ-3； TO-プロ-5； TOTO-1； TOTO-3； トリカラー(PE-Cy5)； TRITC テトラメチルローダミンイソチオシアネート； トゥルーブルー； TruRed； ウルトラライト； ウラニンB； ユービテックスSFC； WW 781； X-ローダミン； XRITC, キシレンオレンジ； Y66F； Y66H； Y66W； YO-プロ-1； YO-プロ-3； YOYO-1； YOYO-3； Sybrグリーン； チアゾールオレンジ(インターキレートする染料), あるいはその結合。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態は、Alexa Fluor 350や、Alexa Fluor 405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、および750などの、広いスペクトルをカバーし、共通の励起源の主要な出力波長に整合するAlexa Fluorダイシリーズ(モレキュラープローブス/インビトロジェン社からの)を含む。本発明のいくつかの実施形態は、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7のような、同じく広いスペクトルをカバーする、Cy ダイフルオロフォアシリーズ(GE ヘルスケア社)を含む。本発明のいくつかの実施形態は、Oyster-500、-550、-556、645、650、656などのOysterダイフルオロフォア(デノボバイオラベルズ社)を含む。本発明のいくつかの実施形態は、例えば、DY-415-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XLなどの、418nm(DY-415)から844nm(DY-831)まで及ぶ吸収の最大値を持つ、DYラベルズシリーズ(ダイオミクス社)を含む。本発明のいくつかの実施形態は、ATTO390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740などのATTO蛍光標識(ATTO-TEC GmbH)を含んでいる。本発明のいくつかの実施形態は、CAL Fluorゴールド540、CAL Fluorオレンジ560、クエーサ570、CAL Fluorレッド590、CAL Fluorレッド610、CAL Fluorレッド635、クエーサ670などのCAL Fluorとクエーサダイ(バイオサーチテクノロジー社)を含む。本発明のいくつかの実施形態は、EviTags(エビデントテクノロジー社)のような量子ドット、あるいはQdot525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705、Qdot800などのQdotシリーズ(インビトロジェン社)の量子ドットを含む。本発明のいくつかの実施形態は、フルオレセイン、ローダミン、および/または、藻紅素を含む。
ＦＲＥＴと消光
【０１２０】
発明のいくつかの実施形態では、蛍光共鳴エネルギー移転は、検体のプローブへの結合に相関されうる信号を作り出すのに使用される。ＦＲＥＴはあるフルオロフォアの特性から生じる。ＦＲＥＴにおいて、エネルギーは、フルオロフォアであるドナー分子と、アクセプタ分子の間のおよそ1-10のナノメートルの距離にわたって非放射でパスされる。ドナーは、光子を吸収して、このエネルギーを非放射にアクセプタに移転させる(フォルスター、1949、Z Naturforsch、 A4: 321-327； クレッグ、1992、Methods Enzymol、211：353-388)。その励起、および放射スペクトルがオーバラップする２つのフルオロフォアが近接すると、１つのフルオロフォアの励起は、第２のフルオロフォアにより吸収され、これを刺激する波長で発光せしめ、順次それをして蛍光発光をさせるようにする。第１の(ドナー)フルオロフォアの励起状態エネルギーは、共鳴誘導ダイポール−ダイポール相互作用により、近接する第２の(アクセプタ)フルオロフォアに移転される。結果として、ドナー分子の励起された状態寿命は減少し、その蛍光は消光され、一方、アクセプタ分子の蛍光強度は、高められ、反分極される。ドナーの励起状態エネルギーが非フルオロフォアアクセプタに移転されるとき、ドナーの蛍光は、それに続くアクセプタによる蛍光の放射なしで、消光される。この場合、アクセプタは消光剤として機能する。
【０１２１】
蛍光共鳴エネルギー移転(ＦＲＥＴ)に関与することのできる分子のペアはＦＲＥＴペアと呼ばれる。エネルギー移転が起こるために、ドナーおよびアクセプタ分子は、典型的に、近接していなければならない(最大７−１０ナノメートル)。エネルギー移転の効率は、ドナーおよびアクセプタ分子の間の距離とともに、急激に落ちうる。
【０１２２】
ＦＲＥＴで使用できる分子は、上で説明したフルオロフォアを含み、また、フルオレセイン、５-カルボキシフルオレセイン(ＦＡＭ)、２'７'-ジメトキシ-４'５'-ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン(ＪＯＥ)、ローダミン、６-カルボキシローダミン(Ｒ６Ｇ)、N、N、N'、N'-テトラメチル-６-カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡ)、６-カルボキシ-X-ローダミン(ＲＯＸ)、４- (４'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(ＤＡＢＣＹＬ)、および５-(２'-アミノエチル)アミノナフタレン-１-スルホン酸(ＥＤＡＮＳ)を含む。フルオロフォアがドナーであるかアクセプタであるかは、その励起、および放射スペクトル、およびそれが対にされるフルオロフォアによって定義される。例えば、ＦＡＭは、４８８ｎｍの波長を持つ光によりもっとも効率的に励起され、５００から６５０ｎｍのスペクトルで、かつ５２５ｎｍの放出最大値で、光を出射する。ＦＡＭは、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ(それらのすべてがそれらの励起振最大値５１４ｎｍを持つ)との使用に適切なドナーフルオロフォアである。
【０１２３】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＦＲＥＴペアのアクセプタは、ドナーの蛍光を消光するのに使用される。いくつかの場合において、アクセプタは蛍光が皆無かそれに近い。 消光の役に立つＦＲＥＴアクセプタはクエンチャーと呼ばれる。本発明の方法で役に立つクエンチャーは、制限はないが、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ＢＨＱ−１０などのブラックホールクエンチャーダイ(バイオサーチテクノロジー社)；ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、ＱＳＹ３５などのＱＳＹダイ蛍光クエンチャー(モレキュラープローブス/インビトロジェン社からの)、および、例えば、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３、またはＣｙ５などのドナーフルーアとともに使用できる、ダブサイルやダブシル；Ｃｙ５ＱおよびＣｙ７Ｑおよびダークシアニンダイ(ＧＥヘルスケア社) などの他のクエンチャー；ＤＹＱ−６６０やＤＹＱ−６６１などのＤＹ−クエンチャー(ダイオミクス社)； およびＡＴＴＯ ５４０Ｑ、５８０Ｑ、６１２ＱなどのＡＴＴＯ蛍光クエンチャー(ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ)、を含む。
【０１２４】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、検体とプローブの両方が１ＦＲＥＴペアのメンバーであるラベルを持っており、そして、該ラベルは検体がプローブに付くとき、ＦＲＥＴがラベルの間に起こるように、取り付けられており、検体のプローブへの結合に実時間で相関され得る、信号の変化を生じる。信号の変化は、ドナーの強度の減少、および/または、アクセプタの強度の増加でありうる。ＦＲＥＴペアは、ドナーフルオロフォアの放出波長がアクセプタフルオロフォアの放出波長から十分に遠く、信号が独立に測定できるように、選ぶことができる。これは、ドナーからの信号の減少とアクセプタからの信号の増加の両方の同時の測定を許し、それは、結合の測定の品質における改良をもたらすことができる。いくつかの場合において、プローブはドナー−アクセプタペアのドナーであるラベルを持つであろう。 いくつかの場合において、検体はドナー−アクセプタペアのドナーであるラベルを持つであろう。
【０１２５】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、検体は１ＦＲＥＴペアのメンバーである蛍光ラベルを持つであろう、そして、ＦＲＥＴペアの他方のメンバーは表面に付けられるであろう、ここで、表面に付けられたＦＲＥＴペアのメンバーはプローブに共有結合されない。いくつかの場合において、検体はドナー−アクセプタペアのドナーであるラベルを持つであろう。いくつかの場合において、検体はドナー−アクセプタペアのアクセプタであるラベルを持つであろう。いくつかの実施形態において、表面に付けられているＦＲＥＴペアのメンバーは、表面に付けられているオリゴヌクレオチド(表面結合ラベル)に付けられている。ＦＲＥＴペアでラベルされるオリゴヌクレオチドは、具体的に検体に付くように予期されたシーケンスを持たないヌクレオチドシーケンスであり得る。表面結合ラベルの使用は、それぞれの特定の結合プローブをラベルすることなく、アレイの複数の領域のラベリングを許す。 これは、アレイの生産を簡素化して、コストを削減できる。われわれは、表面結合ＦＲＥＴペアは、プローブに共有結合されないが、それらはＦＲＥＴペアの他方のメンバーでラベルされた検体の結合に、信号の変化がプローブに結合された検体の量に相関されることを許すような仕方で、敏感であることができることを見出した。
【０１２６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、検体は消光剤でラベルされ、また、プローブはドナーフルオロフォアでラベルされる。検体は、検体がプローブと結合したとき、プローブ上の蛍光ラベルからの蛍光は消光される、ように消光剤でラベルされる。したがって、実時間で測定された信号は、検体とプローブの結合の量に相関づけられることができ、結合の動力学の測定を可能にさせる。本発明の方法のいくつかの実施形態では、検体は消光剤でラベルされ、かつ、プローブはドナーフルオロフォアでラベルされ、そして、それはそれに共有結合していない。消光剤は、検体がプローブと結合したとき、プローブでの蛍光ラベルからの蛍光は消光されるように、ラベルされる。したがって、リアルタイムで測定された信号は、検体とプローブの結合の量に相関づけられることができ、結合の動力学の測定を可能にさせる。
【０１２７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、検体は消光剤でラベルされ、また、表面はドナーフルオロフォアがプローブに共有結合されないドナーフルオロフォアで(たとえば、表面結合蛍光ラベルで)ラベルされる。消光剤は、検体がプローブと結合すると、プローブでの蛍光ラベルからの蛍光は消光される、ようにラベルされる。したがって、リアルタイムで測定された信号は、検体とプローブの結合の量に相関付けられることができ、結合の反応速度の測定を可能にさせる。
【０１２８】
プローブがフルオロフォアでラベルされるところでは、発明の1つの側面は、検体のプローブへの結合が起きていない状態についての基線信号を効果的に確立するために、結合が起こる前に得られる表面上の蛍光によりラベルされたプローブのイメージの使用である。ラベルされていないプローブがラベルされた検体で扱われ、信号が、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後に測定される、従来のアレイでは、問題の領域におけるアレイ上に実際にどれだけのプローブがあるかを正確に知るのは難しい場合がある。したがって、アレイ製造における違いがデータの品質に影響しうる。本発明では、プローブがフルオロフォアでラベルされるところで、表面上のラベルされたプローブのイメージは、実際に表面にあるプローブの量の測定を提供し、結合測定の品質と信頼性を増加させる。
【０１２９】
発明の方法の1つの典型的な実施形態は、図５、および図６に図示される。図５Ｂは１６個の独自にアドレス可能なスポットを持つ４ｘ４マイクロアレイの平面図を示し、各スポットは結合ＤＮＡプローブを持ち、ここで、該プローブは蛍光ラベルでラベルされている。図５Ｃは、シーケンス(A)の付けられたプローブ、各プローブは蛍光ラベルを持つ、を図示する、スポットの1つの拡大図を示す。図５Ｄは、シーケンス(B)の付けられたプローブ、各プローブは蛍光ラベルを持つ、を図示する、第２のスポットの拡大図を示す。図５Ａは、アレイがハイブリダイゼーション溶液に接触しているのを示す、アレイの側面図を示す。図５は、どの検体もアレイ上のプローブに結合されていない時を表す。
【０１３０】
図６は、ターゲット検体(ターゲット)が消光剤を取り付けた、しばらくの時間のハイブリダイゼーション後の、図５と同じアレイを図示する。図６Ａと６Ｂは、まだハイブリダイゼーション液に接触しているアレイの側面と平面図を示す。図６Ｂのアレイ上の異なるスポットは、異なる光強度を持ち、各スポットでの検体の異なる結合の量、およびしたがって、スポットからの異なる量の蛍光があることを示している。図６Ｃは、少量のターゲット(A)が特定的にプローブ(A)に着き（ハイブリダイズし）、結果としてそれに検体が着くプローブのそれぞれの分子の消光をもたらすのを図示する拡大図を示す。図６Ｄは、より多い量の検体(B)が特定的にプローブ(B)に着き(ハイブリダイズし)、スポット(A)に観測されるより高いレベルの消光をもたらすのを図示する。アレイ上のスポットのおのおのからの信号は、検体とプローブ間の結合反応の間、検体を含む溶液がマイクロアレイの固体表面に接触している間に、様々な時間ポイントで、測定することができ、検体プローブ結合の量の実時間の測定を許し、各場所での動力学の測定を許す。
クロス−混成を、測定すること
【０１３１】
本発明の方法の１つの側面は、実時間結合データ上にアルゴリズムを遂行して、基板上の多数プローブについてクロス−混成を決定する、ステップである。１つの実施形態は、検体−プローブ結合測定の質を、クロス−混成について決定し、訂正することにより、改善することを含む。
【０１３２】
その初期の段階において、プローブ−検体結合動力学は、その時間ドメイン解が、指数関数で与えられた単純な１次微分方程式により記述されることができた。非特定的な結合は、マイクロアレイプラットフォームの正確さに、特に、もし非特定的目標の量が、特定の目標に比較し高ければ、悪い影響を持ち得る。一つの理由は、特定的、および非特定的な目標は、同じプローブに対し競争をし、かつ、たとえ、非特定的結合の確率がずっとより低くても、もし非特定的目標の量がずっと高ければ、影響を持つであろうことである。幸いにも、特定の、および非特定の結合は、結合確率、および目標量が異なる事実のために異なる反応レートを持つ； それゆえ、もし、特定、および非特定の両（すなわち、干渉する）目標が、マイクロアレイ、または並列アフィニティベースバイオセンサ上のプローブに結合すれば、RT−μアレイシステムにより測定された信号は、指数関数の和により
μ(t) ＝Σαj ｅｘｐ(βjｔ)
と表される。
【０１３３】
ここで、Σαj は、プローブスポットの初期強度を与え、βj は、特定（ｊ＝１）、および、非特定（ｊ＝２，３，…）結合についての減衰レートであり、かつ、ここで、αjそれ自身は、反応レート、および、目標密度に依存する。本発明のある実施形態において、われわれは、いわゆるプロニー法、または、その修整の１つを用いる。この方法は、本質的に、信号μ(t) を、もともとの微分方程式の係数によって表現する。これらの係数は、適切な共変動マトリクスの固有値をみつけることにより、計算される。本発明の他の実施形態においては、データの相関マトリックスの特異値分解を用いた代数的特長化が用いられる。本発明のさらなるもう１つの実施形態においては、情報理論的な、またはベイエジアン技術が、非特定的に結合するスピーシーズの存在を検出し、このようなスピーシーズの数を予測し、かつ、それらの量を定量化するのに用いられる。
基本アルゴリズム
【０１３４】
混成プロセスは、一般に、非線形微分方程式を満足する。これを見るために、ｐ(t) を、時間ｔ与えられたスポットでの利用可能なプローブ分子の数、を示すものとし、ｎ(t)を、このスポットに特定的な液内の検体の数、を示すものとする。これにより、もし、検体がプローブ分子の近傍にある確率が、Ｐnear，それが単位時間間隔内に一度近くにあると、それがプローブに結合する確率が、Ｐh，かつ、プルーブ分子に結合する検体が、単位時間間隔内に開放される確率が、Ｐr，であるとすると、そのとき、われわれは
ｐ(ｔ＋δ) − ｐ(ｔ) ＝δ(ｐ0−ｐ(t)) Ｐr−δｐ(t)ｎ(t)ＰnearＰh，
のように記す。
ここで、Ｐ0は、アレイのこのプローブスポット上のプローブ分子の初期数を示す。もし、われわれが、検体分子の全数を、N で示せば、そのとき、
ｎ(ｔ) ＝ Ｎ − Ｐ0 ＋ Ｐ(ｔ)
なのは、明らかである。
δ → ０ として、それゆえ、
2009540299.tif 000009
が、与えられる。
【０１３５】
項を再配列して、われわれは、
2009540299.tif 000010
を得る。
これは、われわれが求めている、非線形方程式である。これは、リカッチ方程式であり、閉じた形で解決されることができる（しかしながら、われわれは、ここではそれをしない）。いずれにせよ、ｐ(t) の軌跡を見ることにより、人は、パラメータＮ、ｐ0，Ｐh,Ｐrについての情報を収集することができる。たとえば、ｐ(t)の定常状態、すなわち、ｐ∞ ＝ ｐ(∞) は、２次方程式
Ｐnear ＰhＰ2∞ ＋ [Ｐr ＋ (Ｎ − Ｐ0) Ｐnear Ｐh] ｐ∞ − Ｐ0Ｐr ＝ ０
を満足し、
かつ、したがって、それを測定すると、問題のパラメーターについての情報を、われわれに与える。
検体濃度を決定すること
【０１３６】
方程式は、検体に結合されたプローブ分子の数でもって書かれると、しばしば、より指示的になる、すなわち、ｑ(ｔ) ＝ ｐ0 − ｐ(ｔ) 。 この場合、われわれは、
2009540299.tif 000011
と書くことができる。
これは、項を並べ替えると、
2009540299.tif 000012
となる。
【０１３７】
混成プロセスの初期の段階において、すなわち、ｑ(t) が、大変小さいとき、われわれは、微分方程式における二次項を無視することができ、かつ、
2009540299.tif 000013
と書くことができる。
【０１３８】
これは、解
2009540299.tif 000014
をもつ。
【０１３９】
上記式は、いくつかの異なる悪影響を持つ；第１は、ｑ(t) の増加率、等価的に、ｐ(t) の増加率は、
2009540299.tif 000015
で、与えられる。
これは、液内の検体の数に比例する。
【０１４０】
第２に、反応比は、また、検体の数の上に情報を持つ。実際、該反応比は、単に、ｑ(t) についての指数関数におけるｔの係数であり、これは、容易に、
ｒｅａｃｔｉｏｎ＿ｒａｔｅ ＝ Ｐr ＋ （Ｎ＋Ｐ0）Ｐnear Ｐh
である、ことがわかる。
【０１４１】
これは、全く、Ｎに対して線形関係ではないが、それでもまだ、検体の数を評価するのに、用いることができる。
【０１４２】
もちろん、人は、Ｎを、初期傾斜、および、反応レートの両方から、結合して、予測できる。特に、しばしば、Ｐrが、大変小さいことは真実であり、他の項に比較し無視することができる。それゆえ、われわれは、
ｒｅａｃｔｉｏｎ＿ｒａｔｅ ＝ （Ｎ＋Ｐ0）Ｐnear Ｐh
を取る。
クロスー混成を決定する、および、抑圧すること
【０１４３】
反応レートを見る他の利点は、人が、クロス−混成を取り扱うこと、かつ、その効果を抑圧することが、可能となることである。以前に述べたように、混成プロセスの初期の段階では、利用可能な分子の数は、あるいは、等価的に、プローブスポットの光強度は、時間とともに指数関数的に減衰する。たとえば、
Ｃk ｅｘｐ(−ｒkｔ) ，
ここで、Ｃkは、乗数であり、ｒkは、実験のパラメータから決定できる反応レートである（混成の確率、検体の数、プローブ分子の数、等、）。特に、（11）から 見られるように、ｒkは、目標検体の数、すなわち、Ｎk において線形である。
【０１４４】
もし、問題の目標の混成に加えて、多くの他の目標が同じプローブスポットに対しクロス−混成すれば、該プローブスポットの光強度は、いくつかの指数関数の和として、減衰するであろう、すなわち、
2009540299.tif 000016
ここで、ｋ ＝ ０ は 所望の目標 に対応し、ｋ ＝ １, …, Ｋ−１は、Ｋ−１個のクロス混成解析に対応する。要点は、異なる検体の反応レートは異なり（異なる検体の数、結合確率、等により）、もし、われわれが、反応レートを(１３)から予測することができれば、われわれは、各異なる検体について、分子の数を、決定することができるであろう。
【０１４５】
ＲＴ−μアレイシステムは、プローブスポットの信号（すなわち、光強度）を、ある時間間隔（すなわち、Δの倍数）で、サンプルし、かつ、これにより、シーケンスを、
2009540299.tif 000017
ｎ ＝ ０，１，…Ｔ−１について、得る。ここで、Ｔは、全サンプル数であり、ν(t) は、測定ノイズを表す。ｕk = Ｅｅｘｐ(−Δｒk) と定義し、われわれは、
2009540299.tif 000018
と、書く。
【０１４６】
ゴールは、(i) Ｋの値を決定すること（すなわち、どれだけ多くの検体が、プローブスポットに結合するか）、(ii) すべてのｋ ＝ １, …, Ｋ−１につき、ペア｛Ｃk,ｕk｝ の値を、予測すること、および、(iii) 各検体の数Ｎkを決定する（ (9) よりＣk が検体数に比例すること、(１１)より 反応レートが、Ｎk において線形であることを、思い起こしてください）こと、である。
【０１４７】
雑音測定において指数関数の数を決定し、個々のレートを予測する問題は、信号処理得における古典的な問題であり、一般に、システム同定といわれる。（この主題に関しては、多くの本、および論文がある）。基本的な考えは、ｙnが、Ｋ個の指数関数の和であるとき、Ｋ次の再帰方程式が、満たされる、ということである、
Ｙn ＋ ｈ1 Ｙn-1 ＋ … ＋ ｈk-1 Ｙn-k+1 ＋ ｈk Ｙn-k ＝ ０
【０１４８】
さらに、Ｕk は、多項式の根である。
Ｈ(ｚ) ＝ ｚk ＋ ｈ1 ｚkn-1 ＋ … ＋ ｈk-1 ｚ + ｈk
【０１４９】
実際、人は、雑音のある信号を観察するので、人は、最初に、測定を行って、いわゆるハンケルマトリックスを形成する。
2009540299.tif 000019
【０１５０】
ｙnが、Ｋ個の指数関数の和であるとき、上記ハンケルマトリックスは、ランクＫを持つ、すなわち、Ｋ個の非ゼロ固有値のみを持つ。ｙnが、雑音性であるとき、標準のプラクティスは、ハンケルマトリックスの特異値を計算し、かつ、Ｋ を、重要な特異値の数として予測する。
【０１５１】
一度、Ｋが決定されると、人は、（Ｔ−Ｋ＋１）ｘ（Ｋ＋１）個のハンケルマトリックスを、形成し、
2009540299.tif 000020
かつ、そののち、(19)の最小の正しい特異ベクトル値により、べクトル（１ ｈ1, … ｈk）t を同定する。
【０１５２】
以前に述べたように、Ｈ（ｚ）の根は、所望のＵkであり、それから、われわれは、レートｒkを決定し、かつ、これにより、目標の量が存在する。上記でアウトラインされたデータを使用することができるが、全最小平方、ＥＳＰＲＩＴ、プロニー法を含むが、これに限定されない、Ｕkを見つける種々の異なる方法を、用いることができる。
【０１５３】
上記で記述したアルゴリズムに加えて、（Petersson et al , Applied Mathematics and Computation, vol 126, no 1, February 2002, pp. 31-61）に概観されている方法を含む、他のアルゴリズムの解を、用いることができる。上記で記述された方法は、特定的に、または、非特定的に結合するスピーシーズの量を定量化する能力を与える。
アレイ
【０１５４】
本発明の１つの側面は、それに取り付けられた複数のプローブを持つ固定表面を持つアレイであり、ここで、該アレイは、検体の複数のプローブへの結合の実時間測定に用いることができる。
【０１５５】
本発明のアレイは、固体基板に取り付けられたプローブを、備える。該固体基板は、生体の、非生体の、有機の、無機の、あるいは、これらのいずれのものの結合、であって、粒子、ストランド、浸透体、ゲル、シート、チューブ、球、容器、キャピラリー、パッド、スライス、膜、プレート、スライド、半導体集積チップ、等として存在するもの、であってよい。該固体基板は、好ましくは、平坦であるが、しかし、代わりの表面形状を取っていてもよい。たとえば、該固体基板は、その上に、合成、または堆積が、行われる隆起した、あるいは、凹状領域を含むことができる。いくらかの実施形態においては、該固体基板は、適切な光吸収特性を与えるよう、選択されることができる。該固体基板は、ポリマー化されたラングミュアブロジェット膜、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ2、ＳｉＮ4、修飾されたシリコン、または、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリカーボネート、等の種々のゲル、またはポリマーの任意の１つ、であることができる。
【０１５６】
該基板は、獲得するプローブよりずっと大きい、同質の固体の、および または、不動の 質量であることができる。基板の質量は、一般に、獲得するプローブの質量より、少なくとも１００倍より大きい。いくらかの実施形態においては、基板の表面は、０．１ｎｍから１００ｎｍ、しかし代表的に、１ｎｍから１０ｎｍ間の荒さを持つ平板状である。他の実施形態においては、基板は、１００nm より大きい荒さを持つ多孔質表面であることができる。他の実施形態においては、基板の表面は、非平面状であることができる。非平面状表面の例は、球状磁気ビーズ、球状ガラスビーズ、および、固体金属、および／または、半導体、および／または、誘電粒子である。
【０１５７】
いくらかの実施形態において、基板は、光学的に透明であり、光が、基板を通って透過するのを許し、かつ、励起、および または検出が、基板を通る光から通るのを、許す。いくらかの実施形態において、基板は、半透明である。いくらかの実施形態において、基板は、反射性であり、光が、プローブを含む表面層を通って通過し、検出器に戻ることを許す。
【０１５８】
いくらかの実施形態において、ガラススライドは、バイオチップを準備するのに使用される。基板（フィルム、または、膜のような）は、また、シリカ、シリコン、プラスチック、金属、合金、アノポル、ポリメリック、および、ナイロンよりなる。基板の表面は、プローブに取り付けられる前に、使用の間の結合を向上するため、または、非特定的結合を禁止するために、化学物質の層により処理することができる。たとえば、ガラススライドは、アミノアクリルシランの、またはアクリルアミド、およびたんぱく質、等のポリマー材料の、コーティング等の自己アセンブルされた単層（SAM）でコートすることができる。種々の商業的に利用可能なスライドは、用いることができる。このようなスライドのいくらかの例は、３D−Link（登録商標）（Surmodics社）、EZ−Rays（登録商標）（Mosaic Technologies社）、Fastslides（登録商標）（Schleider and Schuell社）、 および、Superaldehyde（登録商標）、およびSuperamine（登録商標）（CEL Technologies社）を、含むことができるが、これらに限定されない。
【０１５９】
プローブは、基板の固体表面に共有的に取り付けられることができる（しかし、非共有取り付け方法も、用いることができる）。１つの実施形態において、同様に、基板、コーティング、および取り付け化学物質を、すべての３つのUni-Screen.TM.、ProSscreen.TM.、 NuScreen.TM. デバイスに、用いることができる。もう１つｎ実施形態においては、異なる化学物質が、適用される。
【０１６０】
多くの異なる化学表面修飾子が、基板に、該基板にプローブを取り付けるために、付加することができる。化学表面修飾子の例は、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）グループ、アミン、アルデヒド、エポキシドカルボキシグループ、ヒドロキシグループ、ハイドラザイド、疎水性グループ、膜、マレイミド、ビオチン、ストレプトアビジン、チオールグループ、ニッケルキレート、光反応グループ、ボロングループ、チオエステル、システイン、ジスルファイドグループ、アルキルおよびアシールハライドグループ、グルタチオン、マルトース、アジデス、フォスフェート、および、フォスフィンを、含む。このような化学的に修飾された表面を持つガラススライドは、多くの修整につき、商業的に利用可能である。これらは、容易に、標準の方法を用いて、残りのために準備することができる（Microarray Group Technologies, Mark Schena, Editor, March 2000, Biotechniques Books）。
【０１６１】
１つの実施形態において、アミンに対して反応性である基板表面が、使用される。この反応の利点は、それが有毒の副産物なしで、早いことである。このような表面の例は、ＮＨＳエステル、アルデヒド、エポキシド、アシールハライド、および、チオエステル、を含む。ほとんどのたんぱく質、ペプチド、グリコペプチド等は、自由アミングループを持ち、これは、このような表面と反応して、それらを、これらの表面に共有結合的にリンクさせる。内部の、または端部のアミングループを持つ核酸プローブは、また、合成されることができ、かつ、商業的に利用可能である（たとえば、IDT、またはOperonより）。このように、核酸は、同様の化学物質を用いて、表面に（たとえば、共有結合的に、または、非共有結合的に）結合されることができる。
【０１６２】
基板表面は、アミンに対して反応的である必要なないが、しかし、多くの基板表面は、コーティングを有するアミン反応性基板に、容易に変換されることができる。コーティングの例は、アミンコーティング（これは、ビス−ＮＨＳクロスリンカー、および、他の試薬と反応できる）、チオールコーティング（これは、マレイミド−ＮＨＳクロスリンカー、等と反応できる）、金コーティング（これは、ＮＨＳ−チオールクロスリンカー、等と反応できる）、ストレプトアビジンコーティング（これは、ビス−ＮＨＳクロスリンカー、マレイミド−ＮＨＳクロスリンカー、バイオチン−ＮＨＳクロスリンカー、等と反応できる）、および、ＢＳＡコーティング（これは、ビス−ＮＨＳクロスリンカー、マレイミド−ＮＨＳクロスリンカー、等と反応できる）、を含む。あるいは、プローブは、基板よりむしろ、特定の化学修飾子と反応し、それらを各表面に反応的にさせることができる。
【０１６３】
多くの他の多数機能クロスリンク剤は、１つの種類の表面を、他に対する化学反応性を変換するのに用いることができる。これらのグループは、２機能性、３機能性、４機能性、等、であることができる。それらは、また、ホモ機能性、または、ヘテロ機能性であることができる。２機能性クロスリンカーの例は、Ｘ−Ｙ−Ｚ、ここで、ＸおよびＺは２つの反応グループであり、Ｙは接続するリンカーである。さらに、もし、ＸおよびＺがＮＨＳエステル等の、同じグループのものであれば、結果として生じるクロスリンカー、ＮＨＳ−Ｙ−ＮＨＳは、ホモ２機能性クロスリンカーであり、アミン表面をアミングループ含有分子と結合するであろう。もし、ＸがＮＨＳエステルで、Ｚがマレイミドグループであれば、結果として生じるリンカー、ＮＨＳ−Ｙ−マレイミドは、ヘテロ２機能性クロスリンカーであり、アミン表面（または、チオール表面）を、チオグループ（または、アミノ−グループ）含有プローブにリンクさせるであろう。多くの異なる機能グループを持つクロスリンカーは、広く利用可能である。このような機能グループの例は、ＮＨＳエステル、チオエステル、アルキルハライド、アシールハライド（たとえば、ヨードアセトアミド）、チオール、アミン、システイン、ヒスチジン、ジ−サルファイド、マレイミド、シス−ジオール、ボロン酸、ヒドロキサム酸、アジド、ヒドラジン、ホスフィン、光反応性グループ（たとえば、アントラキノン、ベンゾフェノン）、アクリルアミド（たとえば、アクリダイト）、アフィニティグループ（たとえば、ビオチン、ストレプトアビジン、マルトース、マルトース結合たんぱく質、グルタチオン、グルタチオン−Ｓ−転移酵素）、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、リン酸塩、疎水性グループ（たとえば、フェニール、コレステロール）、等を、含む。このようなクロスリンカーは、プローブを表面に結合させるために該表面と、またはプローブと、また該両者と、反応せられることができる。
【０１６４】
他の代替物は、アクリダイト、マレイミド、アクリルハライド、および、チオ−エステル表面等の、チオール反応表面を含む。このような表面は、たんぱく質、ペプチド、グリコペプチド等を、（通常存在する）チオグループを介して、共有結合的にリンクさせることができる。ペンダントのチオールグループを含む核酸プローブは、また、容易に合成されることができる。
【０１６５】
あるいは、人は、ガラス表面を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），たとえば、混合された長さのＰＥＧのような分子で、修飾することができる。
【０１６６】
他の表面修飾の方法（たとえば、光結合可能表面、および、熱的にクロスリンク可能な表面、等）は、当業者によく知られている。いくらかの技術は、Mosiac Techonlogies (Waltham. Mass.) Exiqon.TM.(Vedbaek, Denmark), Scheleicher and Schuell (Keene, N H ), Surmodics TM. (St.Paul, Minn.), Xenopore TM (Hawthorne, N.J. ), Pamgene (Netherlands), Eppendorf (Germany), Prolinx (Bothell, Wash ), Spectral Genomics (Houston, Tex.), and Combimatrix TM. Bothell, Wash) からのもの、等、商業的に利用可能である。
【０１６７】
ガラス以外の表面は、また、このような装置に適切である。たとえば、金、シリコン、銅、チタン、および、アルミニウム等の金属表面、シリコンオキサイド、チタンオキサイド、鉄オキサイド、等の金属酸化物、ポリスチレン、およびポリエチレン、等のプラスチック、ゼオライト、および他の材料は、また、使用することができる。デバイスは、また、ＬＥＤ（発光ダイオード）、およびＯＬＥＤ（有機発光ダイオード）表面上に準備することができる。ＬＥＤ、またはＯＬＥＤの例は、プローブアレイのベースで使用することができる。このようなシステムの利点は、それらが結果読み出しの容易な光−電気的手段を与えることである。いくらかの場合において、結果は、裸眼を用いて読み出されることができる。
【０１６８】
プローブは、基板上に、たとえば、修整された表面上に、ソリッドピン、クウィルピン、インクジェットシステム、リングおよびピンシステム、等（米国特許第６，０８３，７６３号，および、６，１１０，４２６号明細書、参照）または、非接触印刷方法（ピエゾ電気、バブルジェット(登録商標)、シリンジ、電気−動的、機械的、または、音響的デバイスを用いる）、を用いる、なんらかのコンタクトモード印刷方法を用いて、堆積されることができる。プローブを基板表面上に、堆積、およ、分布させるデバイスは、たとえば、Packard Instruments社により製造される、技術において知られている多くの方法がある。プローブを基板表面上に堆積させる、たとえば、スポッティングさせる好ましいデバイスは、ソリッドピン、または、クウィルピン（Telechem社/Biorobotics社）を含む。
【０１６９】
本発明のアレイは、また、多孔質アレイ等の３次元アレイである。このようなデバイスは、アレイまたは、アレイフォーマットのアレイにおける１つ、またはそれ以上の多孔質ゲル結合プローブより構成される。あるデバイスは、１つ、またはそれ以上のこのような構造を持つことができ、該構造は、任意の地理的な形状、およびフォームのものであることができる。該構造は、また、垂直に直線的であり、角度がついており、あるいは、ツウィストされていることができる。このように、各デバイスは、（マルチプレクスされた）反応サイトを示す。該デバイスは、反応を、同時に、または、順次に行うのに用いることができる。公知の基板、および化学物質の任意のものが、このようなデバイスを作るのに用いることができる。たとえば、ガラス、シリカ、シリコンウェハ、プラスチック、金属；および、金属合金は、すべて、固体サポートとして用いることができる（たとえば、Stillman B A, Tonkinson J L, Scleicher and Schuell; Biotechniques, 29(3), 630-635, 2000; Rehmna et.al; Mosaic Technologies Inc., Nucleic Acids Research, 27(2), 649-655, 1999 参照）。他の実施形態においては、中間的スピーシーズは、機械的な、および／または、静電的な、および／または、磁気的な力を用いて、基板に不動化されることができる。例は、磁界を持つ磁気ビーズ、静電界を持つガラスビーズである。ビーズベースの方法は、たとえば、Gunderson et al．，Genome Research, 870-877 2004; Michael et al., Anal.Chem. 70, 1242-1248, 1998; Han et al., Nat.Biotechnol, 19, 631-635, 2002； および、Lockhart et al., Nat.Biotechnol. 19, 1122-1123, 2001に記述されている。
【０１７０】
他の実施形態において、マイクロアレイは、プローブの現場合成を通して製造される。この現場合成は、フォスフォアミド化学、および／または、組み合わせ化学を用いて、達成され得る。いくらかの場合には、脱保護ステップは、光脱保護（マスクレスアレイシンセサイザー（MAS）技術 （NimbleGen,； または、Affymetrixによる、フォトリソグラフィープロセス）により遂行される。他の場合には、脱保護は、電気化学的に、（たとえば、コンビマトリクス手続において）達成され得る。本発明のためのマイクロアレイは、また、インクジェット技術（アジレント社）を用いて、製造することができる。
【０１７１】
本発明のアレイについては、複数のプローブは、固体基板上の１つのアドレス可能領域内に、あるいは、多数のアドレス可能領域内に、設けられ得る。いくらかの実施形態において、固定基板は、約、２，３，４，５，６または、７−１０、１０−５０、５０−１００、１００−５００、５００１００００、１０００−５０００、５０００−１００００、１００００−５００００、５０００００−１００００００、または、１００００００以上の、プローブによるアドレス可能領域を、持つ。
【０１７２】
スポットは、大きさが、約１ｎｍから１０ｍｍにわたり、いくらかの実施形態では、約１から１０００ミクロンに、かつさらに、いくらかの実施形態においては、約５から１００ミクロンに、わたる。スポットの密度は、また、該密度が、一般に、いくらかの実施形態において、約１スポット／ｃｍ2あるところでは、いくらかの実施形態において、少なくとも約１００スポット／ｃｍ2であり、かつ、他の実施形態においては、少なくとも約４００スポット／ｃｍ2であり、ここでは、１０６スポット／ｃｍ2または、それ以上と、高いことができる。
【０１７３】
該スポットの形状は、矩形、円形、卵形、または、いずれかの他の任意の形状であることができる。
【０１７４】
本発明の１つの側面は、表面、および、複数の異なるプローブを持つ固体基板よりなるアレイであり、ここで、(a) 異なるプローブは、異なるアドレス可能位置で表面に不動化されており、(b) アドレス可能位置は、表面に結合された光学信号部分よりなり、(c) 光学信号部分は、プローブには直接接続されておらず、かつ、(d) 光学信号部分からの光学信号は、検体のプローブへの結合に際して変化することのできるものである。これらのアレイについて、光学信号部分、たとえば、蛍光発光部分は、直接、表面に結合されており、しかし、プローブに、共有結合的には結合されておらず、かつ、これらの場合には、プローブは、ラベルされている必要はない。蛍光発光部分は、表面に結合されている、あるいは、プローブに、上記した方法の１つにより、その場で合成されることができる。蛍光発光部分は、プローブではない、たとえば、液内の目標検体に相補的ではないシーケンスを持つ、オリゴヌクレオチドに取り付けられることができる。
【０１７５】
１つの実施形態において、基板上の蛍光発光部分（表面結合されたラベル）は、プローブの近傍に、ポスト−プローブ−合成またはポスト−プローブ−堆積方法を介して、設けられることができる。
【０１７６】
いくらかの実施形態において、ラベルは、混成による等、非共有結合の手段により、プローブに結合されることができる。たとえば、本発明のある実施形態においては、マイクロアレイ上のいくらか、あるいはすべてのプローブは、２つの異なるシーケンスセグメント：１つのセグメントは、プローブに特定的で、かつ、与えられた目標検体の検出に特定的である、１つのシーケンスにより構成される、もう１つのセグメントは、マイクロアレイ上のすべて、または多くのプローブに共通の１つのシーケンスである、を含むことができる。これらの２つのシーケンスセグメントは、プローブ上で相互に直近に隣接していることができ、あるいは、リンカーにより離されていることができる。この実施形態において、マイクロアレイは、第１に、共通シーケンスセグメントに相補的であるラベルされたオリゴヌクレオチドにより混成され、これにより、プローブが位置しているスポットまたは特徴が、また今は、蛍光発光ラベルを含む、マイクロアレイを、生ずる。これらの、非共有結合により結合されたラベルは、プローブに、ＦＲＥＴおよび  またはラベルの消失が検体のプローブの特定的部分への結合に際し起きるよう、結合されることができる。この方法は、たとえば、(1) 実時間 プラットフォーム において使用できるマイクロアレイを製造する費用を、低減する、および／または、(2) 実時間プラットフォームにおけるその場で合成されたアレイの使用を可能にすること、により、有利であることができる。ラベルされたヌクレオチドは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドであることができる。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ修整は向上された混成特性を生ずることができるので、有用であることができる（たとえば、あるTm を達成するに必要なシーケンス長を減少させることにより）（Jepsen et al., ，オリゴヌクレオチド、2004; 14(2):130-46）。
システム
【０１７７】
本発明の１つの側面は、以下のものよりなるシステムである：(a) (i) 表面を持つ固体サポート、および、(ii) 複数の異なるプローブ、ここで、異なるプローブは、表面に不動化されている；(b) 検体よりなる流体体積、ここで、流体体積は、固体サポートとコンタクトしている、かつ、(c) 多数時点で測定された、マイクロアレイ上の複数のスポットのおのおのからの信号を、該流体体積は、支持サポートと接触していながら、検出する手段よりなる検出器アセンブリ。
【０１７８】
流体体積は、システム内に、流体体積が支持サポートと接触していることを維持する任意の方法により導入され、保持される。多くの場合において、流体は、チャンバー内に保持される。いくつかの実施形態において、チャンバーは、一方の面において開いており、他の実施形態において、チャンバーは、ほとんど流体を閉じ込めるであろう。いくらかの実施形態において、チャンバーは、１つ、またはそれ以上の材料（通常、流体）を、導入する、および／または、チャンバーから除去するためのポートを持つ。いくつかの実施形態において、チャンバーの一方の側は、ポートがその上に取り付けられている固体表面よりなる。いくつかの実施形態において、チャンバーは、基板と一体となっている。いくつかの実施形態において、チャンバーは、プローブを持つ固体基板が除去可能に取り付けられているサブアセンブリーよりなる。いくつかの実施形態において、流体チャンバーのいくつか、またはすべては、検出器を備えた装置の集積部分である。チャンバーは、検体−プローブ結合により集められた信号が、チャンバーの外で検出され得るように設計され得る。たとえば、チャンバーのすべて、あるいは一部は、光に対して透明であることができ、チャンバーの中、または外での光をして、蛍光色素分子の抽出、および検出を、容易とすることを可能としている。
【０１７９】
検出器アセンブリは、単一の検出器、あるいは、検出器またはトランスデューサーのアレイであることができる。ここで使用されるように、用語 検出器 および トランスデユーサーは、相互交換可能に使用され、かつ、検体−プローブ結合の量に相関可能な信号を検出することのできる構成要素を言う。検出器システムが、トランスデューサーのアレイであるところでは、いくつかの実施形態においては、検出器システムは、固定されたトランスデューサーのアレイであり、ここで、該トランスデューサーアレイ内の１つ、またはそれ以上のトランスデューサーは、該アレイの１つの独立にアドレス可能な領域に対応する。いくつかの実施形態において、検出器またはトランスデューサーのアレイは、与えられた検出器またはトランスデューサー要素が、結合反応の間に異なるアドレス可能領域からの信号を検出するよう、該アレイをスキャンする。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、検出器アレイは、固体基板と接触している。いくつかの実施形態において、検出器は、基板からある距離 離れている。検出器が、基板からある距離 離れているところでは、いくつかの実施形態において、検出器、または検出器アレイは、多数のアドレス可能領域からの信号を測定するために、基板をスキャンすることができる。いくつかの実施形態において、検出器は、基板に光学的に結合された光検出器である。検出器は、たとえば、１つ、またはそれ以上のレンズ、または導波路により、基板に光学的に結合されることができる。
【０１８１】
図９は、検出システムが、獲得するスポットの直近にあるセンサアレイよりなる実時間マイクロアレイの例を示す。この実施形態においては、個々のセンサは、単一の獲得するスポットの結合イベントを、検出する。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、検出器は、空間的に限定された励起をとおして光学的に結合されている。この方法は、基板を、プローブを持つ基板の小さい領域について検出器と光学的に結合するのに、役に立つ。この方法は、１時点では、１つの領域のみが信号をつくることができるので、単一の検出器のみを必要とする。該方法は、スキャンシステムにおいて使用されることができ、かつ、励起が検出のために必要とされるアッセイ、たとえば、蛍光発光スペクトロスコピー、または、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）方法において適用可能である。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、検出器は、焦点平面検出器アレイを用いた撮像をとおして光学的に結合されている。この実施形態において、システムから生成された信号は、焦点検出器アレイ上に、焦点をあわされている。このアプローチは、信号焦点合わせが、レンズおよび他の光学装置を用いて行われ得る光学検出システムについて有用である。これらの実施形態における検出の例は、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）、および電荷転送デバイス（ＣＣＤ）イメージセンサである。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、検出器は、表面撮像をとおして光学的に結合されている：この方法においては、検出器は、獲得領域から生成された信号が、専用の検出器によってのみ観察されるよう、獲得領域の直近におかれている。もし、多数獲得スポットを持つマイクロアレイが使用されれば、多数検出器が使用され、おのおのは、個々のスポット専用となっている。この方法は、電気化学的な、光学的な、および、磁気ベースのバイオセンサにおいて、使用することができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、検出器は、信号結合器を用いた表面撮像を通して光学的に結合される：この方法においては、検出器は、獲得するスポットの近傍には配置されないが、しかし、信号結合器は、獲得領域からの信号を検出器に向けるように使用される。この方法は、一般に、信号結合要素が複数の光導波路である光検出システムにおいて使用される。信号結合要素の例は、ファイバ光学ケーブル、ファイバ光学バンドル、ファイバ光学フェースプレート、および、光パイプを含む。
【０１８６】
本発明の検出機は、結合反応の間に、実時間における多数の時点で信号を獲得することができなくてはならない。いくつかの実施形態においては、検出器は少なくとも２つの信号を、その間隔が約０．１μsecより小さくない少なくとも２つの信号を、測定することができなければならない。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、検出器は、基板での信号を検出する。いくつかの実施形態において、検出器は、液内の信号を検出する。いくつかの実施形態において、検出器は、液内、および基板の、両者での信号を検出する。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、検出器は、電気的、電気化学的、磁気的、機械的、音響的、または、電磁気的（光）信号を、検出することができる。
【０１８９】
検出器が、光学信号を検出することができるところでは、検出器は、たとえば、光多重化チューブ（ＰＭＴ）、ＣＭＯＳセンサ、または、（ＣＤ）センサであることができる。いくつかの実施形態において、検出器は、ファイバ光学センサよりなる。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、検出器を備えるシステムは、同期的な蛍光発光測定、変更された蛍光発光測定、レーザにより引き起こされる蛍光発光、蛍光発光減衰、および、時間解消蛍光発光を含む、感受性蛍光発光測定を行うことができなくてはならない。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、システムは、たとえば、蛍光発光の励起のための光源を備える。光源は、一般に、基板に、たとえば、１つ、またはそれ以上のレンズ、または、導波路で、光学的に結合されている。該光源は、単一波長、たとえば、レーザ、または、波長バンドを、与えることができる。
【０１９２】
図７は、本発明のシステムの構成要素のブロック図である。該システムは、(i) マイクロアレイ、プローブ、検体、および、液よりなる反応チャンバー、 (ii) 加熱、および冷却モデュール、および温度センサ、(iii) 温度制御器、および、(iv) 解析ブロックに接続された検出器、ここで、後者は、計算システムの一部である、よりなる。
【０１９３】
図８は、実時間マイクロアレイシステムの例、そこでは、ＢＨＱ２消失剤ラベルされたｃＤＮＡ分子の実時間結合が、蛍光発光レーザ走査マイクロスコープを用いて検出される、を示す。この例の基板は、透明ガラススライドであり、プローブは、２５ｂｐ  Ｃｙ５ラベルオリゴユークレオティドである。該光源（レーザ）および検出器は、ともに、基板の背面上に配置されている。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、システムは、検出アセンブリをもつ器具、および、計算システムよりなり、ここで、該器具は、サブアセンブリを受け入れることができる。サブアセンブリは、流体体積、および、表面および複数のプローブを持つ固体基板、保持するであろうチャンバーよりなる。サブアセンブリは、結合イベントの間、および、飽和後の反応をモニターするために、器具内に搭載されることができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、システムは、以下のものよりなる：マイクロアレイを結合させる手段、および、マイクロアレイの表面上でアッセイを行う手段を有するアッセイアセンブリ；および、マイクロアレイ上の複数のスポットのおのおのからの多数時点で測定された信号を、アッセイを行っている間に検出する手段よりなる検出器アセンブリ。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、アッセイを行う手段は、マクロアレイの表面が、該コンパートメントの床よりなるコンパートメントと、試薬および検体を該コンパートメント内に供給する手段よりなる。任意の方法は、マイクロアレイを、コンパートメントに、接着剤、および流体をシールするためのガスケットを用いて、シールするために用いることができる。任意の方法は、試薬および検体を、シリンジ、ピペット、チューブ、および、キャピラリーを用いて供給するために、用いることができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、システムは、温度を制御する手段を備える。温度の制御は、結合反応レートの制御を、たとえば厳密性を制御することにより、許すために、重要であり得る。温度は、システム内の任意の場所での温度を、流体の温度を、または、固体基板の温度を制御することにより、制御されることができる。任意の手段は、抵抗性ヒーター、ペルチェデバイス、赤外ヒーター、流体または気体の流れ、を含み、温度を制御するのに用いることができる。温度は、同じである、あるいは、液、または、基板、または、おのおのの異なる部分について、異なる、ことができる。理想的には、温度は、約、０．０１、０．０５、０．１、０．５、または１°C内に制御される。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、システムは、温度を結合反応の間に変化させることができる。いくつかの実施形態において、温度は、結合反応の間に急激に変化されることができる。いくつかの実施形態においては、システムは、温度を、約０．０１ｍｓｅｃ、０．１ｍｓｅｃ、０．５ｍｓｅｃ、１ｍｓｅｃ、５ｍｓｅｃ、１０ｍｓｅｃ、５０ｍｓｅｃ、１００ｍｓｅｃ、０．５ｓｅｃ、１ｓｅｃ、１０ｓｅｃ、または、６０ｓｅｃより少ない間に、１℃の変化に相当する温度変化レートで、変化させることができる。
【０１９９】
他の実施形態において、温度は、結合反応の過程にわたって、温度を徐々になまらせるよう、ゆっくりと変化される。
【０２００】
結合反応の間に、温度を変化させる好ましい実施形態は、結合する厳密性、および確率を、変化させるための温度の変化を含む。アフィニティベースバイオセンサにおけるほとんどの結合は、温度の強い関数であり、これにより、温度を変化させることにより、われわれは、厳密性を変更しかつ、新しい獲得プロセスを、新しいセットの獲得確率で獲得することを、観察することができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、システムは、液内の、または基板上の複数の位置で、温度を測定することができる。温度は、サーモメータ、サーモカップル、または、サーモ色シフトによる、を含み、任意の手段により測定することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、システムは、温度制御のためのフィードバックループ、そこでは、測定された温度は、温度制御をより正確に行うために、システムへの入力として用いられる。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、システムは、流体体積から、液体を、付加、または、除去することができる。いくつかの実施形態において、システムは、流体体積から、材料を、濃度、ｐH、厳密性、イオン強度、を変更するために、または、競争的結合剤を付加、または、除去するために、付加、または、除去することができる。いくつかの実施形態において、システムは、流体体積の体積を、反応の間に変更することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、結合反応の間に、流体体積に、材料を、付加、または、除去する１つの好ましい実施形態は、インキュベーションバッファーの付加よりなる。インキュベーションバッファーは、検体がその中に存在するバッファーである。インキュベーションバッファーを付加することにより、システム内の検体の濃度は、減少し、それゆえ、結合確率、および結合動力学は、両者とも減少するであろう。さらに、もし、反応がすでに平衡に達したら、バッファーの付加は、システムをして、時間内にもう１つの平衡状態に移動せしめるであろう。
【０２０５】
結合反応の間に、流体体積に材料を付加するもう１つの好ましい実施形態は、競争的結合スピーシーズを付加することである。競争するスピーシーズは、検体の性質と同じ性質のものでもよいが、一般に、それらは、獲得するプローブに対する親和性を持つ分子である。ＤＮＡマイクロアレイについては、たとえば、競争するスピーシーズは獲得するプローブに、部分的に、または完全に相補的なシーケンスを持つ合成されたオリゴヌクレオチドであることができる。免疫アッセイにおいては、競争するスピーシーズは、アンチゲンである。
【０２０６】
いくつかの実施形態においては、システムは、流体体積に対して電気的ポテンシャルを与えて、媒体の厳密性を電気的に変化させる要素よりなる。いくつかの実施形態において、システムは、獲得領域に、該獲得領域の近傍に配置された電極構造を用いて、電気的刺激を与えるであろう。もし、検体が、電気活性スピーシーズ、かつ／または、イオンであれば、電気的刺激は、検体の静電的力を与えることができる。ある実施形態において、この電気的な力は、検体と獲得するプローブとの間の結合に力を印加するよう、調整される。もし、力が分子を離すよう印加されれば、検体−プローブ相互作用の親和性は低減され、かつこれにより、結合の厳密性が、評価される。電気的刺激は、一般に、DC、および／または、時間変化する電気的ポテンシャルである。それらの振幅は、１ｍVから１０Vの間であることができ、しかし、代表的に、１０ｍVから１００ｍVである。時間変化する信号の周波数は、１Hzから１０００MHｚの間であることができ、いくらかの実施形態においては、時間変化する信号の周波数は、１００Hzから１００ｋHｚの間である。厳密性を制御するための電気的ポテンシャルの使用は、米国特許第６，０４８，６９０号明細書に記述されている。
【０２０７】
いくらかの実施形態において、システムは、検出された信号を、分析するための計算システムを、備える。いくらかの実施形態において、システムは、時点データセットを、計算システムに転送することができ、各時点データセットは、ある時点での検出された信号に対応し、計算システムは、時点データセットを、検体およびプローブに関係する特性を決定するために解析することができる。本発明の方法は、いくらかの場合には、より多くのデータ、ときどきは、従来のマイクロアレイより、実質的により多くのデータを、生成することができる。これにより、データ（たとえば、時点でとられた映像）をストアし、処理することのできるコンピュータシステム、および、ソフトウェアは、システムの本質的な要素である。データは、反応がアンホールドする（重ならない）とき、実時間で解析され、のちのアクセスのためにストアされる。
【０２０８】
各時点での検出信号に対応する情報は、信号振幅のような特異値であることができ、あるいは、より複雑な情報であることができる、たとえば、ここで、各セットの信号情報は、アドレス可能な位置内にある多数位置での、領域を含む信号強度値のイメージに、対応する。
【０２０９】
検体、および／または、プローブに関係する特性は、たとえば、検体濃度、結合強度、または、競争する結合、または、クロス−混成であることができる。
【０２１０】
いくらかの実施形態において、計算システムは、濃度、および／または、クロス−混成、を決定するための、上記で記述されたアルゴリズムを、用いる。
【０２１１】
本発明の１つの側面は、検体とプローブとの間の結合を特徴づけるにおいて用いられるソフトウェアである。１つの実施形態において、ソフトウェアは、以下のステップを行う：i) 異なる時点で取られたストアされたイメージをアクセスする、ii) スポットの位置を決定し、データを、各スポットについて、信号強度の時間的動きを表す時間シリーズ（各スポットに１つ）の集まりに変換するよう、イメージ処理を行う、かつ、iii) アレイ上のスポットについて、反応が起こったかを決定する、（これは、しばしば、アレイ上の制御スポットと比較することによりなされる）。任意に、該ソフトウェアは、以下のステップを行うことができる：iv) 各スポットでの反応が、単一の検体、または、多数の検体の結合を含むかを、（たとえば、クロス混成が起こっているかを、）決定すること；v) 統計的システム同定方法を用いて、反応レートを予測すること。統計的システム同定方法の例は、プロニー法、等の方法を、含む。ステップiv)を用いる場合（スポットあたり多数結合）、各結合の反応レートは決定され、および、vi) たとえば、最適な、ベイエジアン方法を用いて、反応レートを用いて、未知の問題の量（検体濃度、結合強度等）を予測すること。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、システムは、器具とインタフェースし、ユーザをして、情報を実時間で表示することを許し、かつ、ユーザをして、反応と相互作用する（すなわち、試薬を付加し、温度を変化させ、ｐH 、希釈化等を変化させる）ことを許す、ソフトウェアを持つであろう。
使用
【０２１３】
プローブ、および検体が、核酸であるところでは、本発明は、発現モニタリング、および属差スクリーニングの方法を与える。用語 発現モニタリングは、特定の、代表的にあらかじめ選択された遺伝子の発現のレベルの決定を、言及するのに用いられる。本発明は、多くの遺伝子、たとえば、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、または、それ以上の遺伝子が、一度に解析されることを許す。核酸サンプルは、アレイに混成され、の結果として生じる時間関数としての混成信号は、問題の各遺伝子の発現のレベルの示しを、与える。いくつかの実施形態において、該アレイは、高度のプローブ冗長性（遺伝子ごとに、多数のプルーブ）を持ち、発現モニタリング方法は、正確な測定を与え、かつ、参照核酸に対する比較を、要求しない。
【０２１４】
もう１つの実施形態において、この発明は、２つ、またはそれ以上の核酸サンプルにおける特定の核酸の豊富さ（濃度）の差を特定する、属差スクリーニング方法を与える。属差スクリーニング方法は、２つ、またはそれ以上の核酸サンプルを、同じオリゴヌクレオチドアレイに、あるいは、同じヌクレオチドプローブ化合物を、かつ、任意に同じヌクレオチドプローブプローブ構成を持つ異なるオリゴヌクレオチドアレイに混成することを、含む。結果として生じる混成は、そののち比較され、どの核酸が２つの、またはそれ以上のサンプル間で豊富さ（濃度）が異なるかを決定することを、許している。
【０２１５】
サンプルよりなる核酸の濃度が、核酸がそれから引き出されるサンプルにおける遺伝子の転写レベルを反映しているところでは、属差スクリーニング方法は、２つ、またはそれ以上のサンプルよりなる核酸の転写（および、発現における含蓄による）の差の同定を、許す。このように同定された、異なって（たとえば、過大に、または、過小に）発現された核酸は、その発現レベルが、２つ、または、それ以上のサンプルの間で異なる遺伝子を、決定、および／または、孤立させるよう（たとえば、プルーブとして）、用いることができる。
【０２１６】
本発明の発現モニタリング、および差スクリーニング方法は、病気の検出、２つのサンプル間の差動的遺伝子発現の同定（たとえば、健康なサンプルに比較して、病理学的な）、特定の遺伝子の発現を、上方に調節する、または、下方に調節する化合物のためのスクリーニング、等の種々の状況において、使用することができる。
例
例１
【０２１７】
図１０は、６ｘ６ＤＮＡマイクロアレイのレイアウトを示す。３つの異なる濃度（２μＭ、１０μＭ、および２０μＭ）を持つ３つの異なるＤＮＡプローブ（１、２、および、制御）が、図示されるように、表面上にスポットされ、不動化されている。プローブは、単一Ｃｙ３蛍光発光分子を、５’端に含む。この実験におけるＤＮＡターゲットは、消失剤分子を含む。このシステムにおける検体結合は、あるスポットにおいて、蛍光発光モデュールの消失を生ずる。図１１は、そこでは、制御目標がシステムに付加される、マイクロアレイ実験の実時間測定のいくつかのサンプルを示す。図１１に示されるように、スポットは、検体結合により消失される。
【０２１８】
図１２から図１５は、おのおの、同じオリゴヌクレオチド獲得プローブを持つ４つの異なるスポットについてのデータを、示す。ターゲットＤＮＡ検体は、時間０でシステム内に導入され、消失（信号の削減）は、結合が起こるときのみに起こる。図１２について、変化の光強度係数は、約１５％であったが、しかし、実時間測定からの予測された時定数は、４．４％の変動のみを持った。図１３について、変化の光強度係数は、約１５％であったが、しかし、実時間測定からの予測された時定数は、２．１％の変動のみを持った。図１４について、変化の光強度係数は、約２２％であったが、しかし、実時間測定から予測された時定数は、６％の変動のみを持った。図１５について、変化の光強度係数は、約２２％であったが、しかし、実時間測定から予測された時定数は、４．８％の変動のみを持った。
【０２１９】
図１６において、ターゲット２が、最初２ｎｇに、次に０．２ｎｇに、マイクロアレイに適用された２つの実時間実験の間に測定された信号が、示される。対応するプローブスポットでの測定された光強度は、目標がプローブに結合するとき、時間とともに減衰し、消失剤は、プローブの端に取り付けられた蛍光発光ラベルに直近することとなる。カーブフィッティング技術により予測することができる、減衰のレートは、存在するターゲットの量に比例する。測定されたプロセスの時定数は、減衰のレートの逆数として定義される。２つのプロセスの時定数の比は、１０であり、これは、正確に、該２つの実験において適用された目標の量の比である。
例２
【０２２０】
この例は、実時間結合データより検体濃度を決定するための、アルゴリズムの導出、およびアルゴリズムの使用を、与える。該導出は、以下のように行われる：
【０２２１】
混成プロセスは、ｔ = 0 で開始するとし、かつ、時間長Δt の離散的時間間隔を考慮する。時間間隔（ i Δｔ, （i＋１）Δｔ）の間の結合目標分子の数の変化を考える。われわれは、
ｎb(ｉ＋１)−ｎb(ｉ)＝［ｎt−ｎb(ｉ)］ｐb(ｉ) Δｔ−ｎb(ｉ)ｐr(ｉ) Δｔ，
と書く。
ここで、ｎtは、目標分子の全数を示し、ｎb(ｉ)および、ｎb(ｉ＋１)は、t ＝ i Δｔ およびt＝（i＋１）Δｔ のそれぞれでの結合検体目標の数であり、ここで、ｐb(ｉ)およびｐr(ｉ)は、i番目の時間間隔の間の、獲得プルーブに、結合する、および、から離れる目標分子の確率を、それぞれ示す。これにより、
【数１】
2009540299.tif 000021
【０２２２】
目標の開放の確率は、時間間隔の間に変化しない、すなわち、すべてのi についてｐr(i) =ｐr であると仮定するのが効果的である。他方、目標−プローブペアを形成する確率は、アレイの表面上のプローブの利用可能性に依存する。もし、われわれが、あるスポットにおけるプローブの数を、ｎpとすれば、そのときわれわれは、この確率を、以下のようにモデル化する、
【数２】
2009540299.tif 000022
ここで、ｐb は、プローブの究極的な豊富さを仮定して、目標―プローブペアを形成する確率を示す。
【０２２３】
（1）と（2）を結合して、Δｔ → 0 とすると、われわれは、以下に到着する。
【数３】
2009540299.tif 000023
【０２２４】
(3) において、nb = nb(t) のみであるとし、一方、すべての他の量は、既知でなくても、定数パラメータであるとする。さらに処理をする前に、われわれは、以下のように書くことが有用であることがわかる。
【数４】
2009540299.tif 000024
【０２２５】
明らかに、(4) より、
2009540299.tif 000025
【０２２６】
(4) を用いて、われわれは、(3) を、
【数５】
2009540299.tif 000026
と書く。
ここで、λ1 および、λ2 は、便宜のために導入され、かつ、以下の根を、
β−αｎb＋γｎb2＝０
と示す。
【０２２７】
γ＝ β／（λ1/λ2）であることにお気づきください。(5) に対する解は、
【数６】
2009540299.tif 000027
であると見つけられる。
【０２２８】
われわれは、(3)は、マイクロアレイの単一のプローブスポットにおけるプローブにより獲得される目標分子の量、ｎb、ｎ0の変化を記述することを指摘すべきであろう。同様の方程式が、おそらくパラメータｎp,ｎt,ｐb, および、ｐrの異なる値について、他のスポット、および、他の目標いついて、成り立つであろう。
該モデルのパラメータを予測する
【０２２９】
以下は、パラメータの予測の手続のアウトラインである。究極的に混成プロセスを観察することにより、われわれは、ｎp,ｎt,ｐb, および、ｐrを得たいであろう。しかしながら、われわれは、(6)におけるｎb(t)にいつも直接アクセスするものではなく、しかしむしろ、ｙb(t) = ｋnb(t)にするものであり、ここで、ｋは、変換係数を、示す。特に、われわれは、
【数７】
2009540299.tif 000028
を観察する。
ここで、λ1* = k λ1、 λ2* = k λ2であり、β* = k β  である。
【０２３０】
便宜のために、われわれは、
【数８】
2009540299.tif 000029
を導入する。
【０２３１】
(5) より、以下のようになる。
【数９】
2009540299.tif 000030
【０２３２】
一般性を損失することなく、２つのうちで、λ1*はより小さく、λ2*はより大きく、すなわち、λ1* = min(λ1，λ2)、かつ、λ2* = ｍａｘ (λ1，λ2) であると仮定する。(7)より、われわれは、yb(t)の定常状態をみつける。
【数１０】
2009540299.tif 000031
【０２３３】
したがって、(9)および(10) より、われわれは、(7)における３つのパラメーターのうちの２つ、β*、およびλ1*、を決定することができる。残りの１つ、λ2*、を見つけるために、人は、カーブ(7) を、実験データに、フィットさせる必要がある。
【０２３４】
β*、λ1*、および、λ2*、を決定して、われわれは、(8) を用いて、α*、および、γ*を得る。そののち、われわれは、(4) を用いて、ｐb,ｐr,ｎp, および、ｎtおよび、α*、β*、および、γ*を得るべきである。しかしながら、(4) は、われわれに、決定されるべき４つの未知数があるが、３つの方程式のみを与える。それゆえ、われわれは、望まれるすべてのパラメータを、見つけるために、少なくとも２つの実験を必要とする。２つの実験におけるアレイ、および、条件は、適用される目標量を除いて、同じであると仮定する。ターゲット量を、nt1, nt2 とし；他方、ｐbおよび、ｐrは、２つの実験において同じとする。第１の実験は、α1*、β1*、および、γ1*を引き出し、第２の実験は、α2*、β2*、および、γ2*を引き出す（われわれは、γ1*＝γ2* であることに気づく。）。そののち、
【数１１】
2009540299.tif 000032
が示される。
かつ、
【数１２】
2009540299.tif 000033
【０２３５】
さらに、
【数１３】
2009540299.tif 000034
かつ、
【数１４】
2009540299.tif 000035
【０２３６】
われわれは、量 (13) および(14) は、変換係数ｋ内で知られており、ここで、ｋ =ｙb(0)／ｎp である。ｋ、および、これにより、量 ｎp,ｎt1、ｎt2、をあいまい性なく得るために、われわれは、較正実験（すなわち、目標ｎtを既知の量での実験）行う必要がある。
実験例
【０２３７】
ここで、われわれは、提案されたモデルの有効性をテストし、パラメータ予測手続を、証明するよう設計された実験を、記述する。この目的のために、２つのＤＮＡマイクロアレイ実験が行われる。カスタム８ｘ９アレイは３つの異なるプローブ密度で印刷された２５mer プローブを含む。該目標は、異なる濃度でアレイに適用されたAmbion ｍＲＮＡ Spikes である。２つの実験で用いられた濃度は、８０ｎｇ／５０μｌおよび、１６ｎｇ/５０μｌである。第１の実験で測定された信号は、ここでは、８０ｎｇの目標がアレイに印加されるが、図１７に示されている。同じ図に示される円滑な線は、(7)に従って得られたフィットを示す。第２の実験においては、１６ｎｇの目標がアレイに印加される。測定された信号、および、(7)に従って得られたフィットは、ともに、図１８に示される。
【０２３８】
(11)から(14)を、適用して、われわれは
ｐb＝１．９ｘ１０-3，ｐr＝２．９９ｘ１０-5
を、得る。
【０２３９】
さらに、われわれは、
【数１５】
2009540299.tif 000036
を、見つける。
【０２４０】
上記比は、その真の値８０/１６＝５に等しいことを、見てください。最後に、実験の１つが校正のために用いられると仮定し、われわれは、変換係数の値が、ｋ＝４．１x１０-4 であり、かつ、観察されたプローブスポットにおけるプローブ分子の数が、ｎP＝１.６ｘ１０-11であることを、見つける。
例３
【０２４１】
この例は、本発明の方法、および、システムが、遺伝子発現の測定にどのように用いられることができるかを、示す。実時間マイクロアレイ技術は、たとえば、異なるセルタイプ、または組織のための発現レベル差、区別される展開ステージ、ガン 対 通常セル、または組織、処理された 対 処理されていないセル、または組織、変異株 対 野生株セル、組織、または、生体を測定することができる。
【０２４２】
シロイヌナズナフローラルホメオティック変異株の、非蛍光発光の遺伝子発現プロファイル、apetala1, apetala2, apetala3, pistillata, および、無配偶子は、ワイルドタイププラントのそれと、比較されることができる。ここの変異株／野生株比較からのデータセットを結合させることにより、多くの数の遺伝子、それは、花の中で、１つのタイプのフローラルオルガンにおいて、特定的に、または、少なくとも主要に表現されるよう、予告された多くの数の遺伝子を特定することができる。各サンプルについて、約５０プラントからの花房が集められ、ＲＮＡは、RNeasy ＲＮＡ アイソレーションキット（キアゲン社）で、１００ｍｇ の組織から分離される。それらのサンプルからのラベルされた目標材料を準備するために、インビトロ転写増幅方法、それには、アミノアリルＵＴＰ媒介されたラベリングがつづく、が用いられる。簡単に、第１、および第２ストランドｃＤＮＡは、T7プロモーターシーケンスで、ポリA プライマーを用い、全ＲＮＡの３μｇより合成される。そののち、インビトロ転写が、Megascript（登録商標）T7 キット（Ambion社） を用いて、アミノアリルＵＴＰ、および減少された量のＵＴＰの存在下で行なわれ、修整されたａａＵＴＰを、転写プロセスの間にaＲＮＡ内に組み込む。最後に、ダイ分子（Cy3 Mono-Reactive Dye、Cy5 Mono-Reactive Dye、アマシャム社）が、増幅されたＲＮＡに結合され、かつ、ダイラベルされたＲＮＡが、混成の前に分断化される。これらの、および同様のプロトコルは、マイクロアレイ分野でよく打ち立てられており、かつ、当業者に良く知られており、かつ、商業的キットは、Ambion社からの、アミノアリルMessage Amp（登録商標）II aＲＮＡ増幅キットによるような、ｃＤＮＡ合成インビトロ転写増幅、およびアミノアリルラベリングに有用である。アミノアリルＵＴＰは、Ｎ−ヒドロキシサクシミディルエステル誘導された反応性ダイ（ＮＨＳエステルダイ）に、簡単な有効な反応において化学的に結合された、ウラシルのＣ５ポジション上の反応性主要アミノグループを含む。
【０２４３】
アミン反応性消失剤は、たとえば、インビトロジェン社より、商業的に入手可能な、ＱＳＹ（登録商標）９カルボン酸、サクシミニディルエステルである。実時間マイクロアレイ技術は、簡単な準備、およびラベリング手続に対して、最小の修整を持って：つまり、Ｃｙ−ダイエステルに対して、ＱＳＹ−９エステルの簡単な置き換えで、使用される。純粋化された全ＲＮＡは、そののち、Ambionからの、アミノアリルMessage Amp（登録商標）II aＲＮＡ増幅キットを用いて増幅され、かつ、結果として生じるaＲＮＡは、ＱＳＹ９によりラベルされる。このラベルされたＲＮＡ人口は、そののち、シロイヌナズナ実時間マイクロアレイによる混成において、使用される。このようなアレイは、シロイヌナズナゲノムにおけるすべての（または、サブセットの）遺伝子に対応する配列されたプローブの集合よりなる。オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光発光部分（Ｃｙ３のような）によりラベルされ、かつ、CodeLink（登録商標）スライド（ＧＥヘルスケア）上のコンタクト体積により印刷され、これは、製造指示に従い、印刷ののち処理され、ブロックされる。
例４
【０２４４】
この例は、アルゴリズムを用いて、クロス−混成を測定することに関係する。信号を回復する種々の異なる技術は、トータルリーストスクウェア、ＥＳＰＲＩＴ、および プロニー法（Dowling et al. IEEE Trans. On Antennas and Propag., vol.42, no.5, 1994  および、van der Veen et al. Proc. Of the IEEE, 81(9):1277-1308, 1993  参照）、を含むが、これらに限定されない。
【０２４５】
この例において、われわれは、シミュレーションにおける１つのこのようなアルゴリズムの遂行を研究し、結果を、図１９に図示している。特に、われわれは、２つの目標検体が同じプローブスポットに、１つは混成より、他は、クロス−混成により結合する状況における、いわゆるトータルリーストスクウェア（ＴＬＳ）アルゴリズムを、考慮する。システムのパラメータ（混成、クロス−混成、開放、等の確率）は、現実的実験シナリオを擬態するよう、選択された。混成の確率は、クロス−混成の確率より５倍大きい（すなわち、ｐh／ｐc＝５）と予測される。混成目標の数は、＄ｎh= １０9＄であり、一方、クロス混成モデュールの数は、変化する。図１９において、われわれは、ｎh（雑音の大きな実現に対して平均化されている）を、ｎh／ｎcの関数として評価する相対平均―平方エラーをプロットする。 シミュレーション結果は、ｎh／ｎcの３次の大きさのオーダーに対して、クロス混成の可能性のある、成功的な抑圧を、含む。
【０２４６】
本発明の好ましい実施形態は、示され、ここで記述されたが、当業者にとって、このような実施形態は例のみとして与えられることは明らかであろう。多くの変形、変更、および、置き換えは、本発明から離れることなく、当業者に起こるであろう。ここで記述された本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明を実施するにおいては、用いられることが理解されるであろう。以下のクレームは、本発明の範囲を定義し、これらのクレーム、およびその等価物の範囲内の方法および構造が、それによりカバーされることが、意図されている。
【図１】
2009540299.tif 000037
【図２】
2009540299.tif 000038
【図３】
2009540299.tif 000039
【図４】
2009540299.tif 000040
【図５】
2009540299.tif 000041
【図６】
2009540299.tif 000042
【図７】
2009540299.tif 000043
【図８】
2009540299.tif 000044
【図９】
2009540299.tif 000045
【図１０】
2009540299.tif 000046
【図１１】
2009540299.tif 000047
【図１２】
2009540299.tif 000048
【図１３】
2009540299.tif 000049
【図１４】
2009540299.tif 000050
【図１５】
2009540299.tif 000051
【図１６】
2009540299.tif 000052
【図１７】
2009540299.tif 000053
【図１８】
2009540299.tif 000054
【図１９】
2009540299.tif 000055
【国際調査報告】
2009540299.tif 000056
2009540299.tif 000057