(57)【要約】本発明は、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する抗体及びその使用、特に癌の診断及び治療に関する。ＩＧＦ−１Ｒ介在生存促進及び腫瘍増殖経路を阻害する特異的ヒト及びマウスモノクロナール抗体、並びにその変異体、フラグメント及び誘導体が提供される。リガンド、インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−Ｒ１）及びインスリン様成長因子受容体−２（ＩＧＦ−Ｒ２）がＩＧＦ−１Ｒ、並びにこのような抗体のフラグメント、変異体及び誘導体に結合する能力を阻害する特異的ヒト及びマウスモノクロナール抗体も提供される。本発明はまた、前記抗体、あるいはそのフラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含有するベクター及び宿主細胞を包含する。本発明は、さらに本発明の抗体を使用して癌を診断及び治療する方法を包含する。
2009532027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じインシュリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ−Ｒ１）エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体のＩＧＦ−Ｒ１への結合を競合的に阻害する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体の抗原結合ドメインと同一の抗原結合ドメインを含む単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項４】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項５】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項７】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項８】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項９】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１０】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１１】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨ及びＶＬが、それぞれ、２０個以下の保存アミノ酸置換それぞれを除いて、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１２】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１３】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される基準重鎖相補性決定領域−１アミノ酸配列（ＶＨ−ＣＤＲ１）と同一のＫａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１４】
前記ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１５】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される基準重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１６】
前記ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される、請求項１５に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１７】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される基準重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１８】
前記ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される、請求項１７に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１９】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される基準軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項２０】
前記ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される、請求項１９に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２１】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される基準軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項２２】
前記ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される、請求項２１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２３】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される基準軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項２４】
前記ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される、請求項２３に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項２５】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；並びに配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する（但し、前記ＶＨ−ＣＤＲ類の少なくとも１つにおける１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を除く）、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項２６】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；並びに配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項２７】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する（但し、前記ＶＬ−ＣＤＲ類の少なくとも１つにおける１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を除く）、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項２８】
ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項２９】
ＶＨフレームワーク領域がヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項３０】
ＶＬフレームワーク領域がヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項３１】
非線状立体配置エピトープに結合する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項３２】
アミノ酸残基バリン−４６２を含有するＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３３】
アミノ酸残基ヒスチジン−４６４を含有するＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３４】
アミノ酸残基バリン−４６２及びヒスチジン−４６４を含有するＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３５】
残基バリン−４６２から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触表面半径を有するＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３６】
残基ヒスチジン−４６４から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触表面半径を有するＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３７】
残基バリン−４６２及びヒスチジン−４６４から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触表面半径を有するＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３８】
ヒトＩＧＦ−１Ｒの残基バリン−４６２及びヒスチジン−４６４の中心から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触表面半径を有するＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３９】
線状エピトープに結合する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４０】
多価であり且つ少なくとも２個の重鎖と少なくとも２個の軽鎖を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４１】
多特異性である請求項１〜４０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４２】
二重特異性である請求項４１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４３】
二重特異性である請求項１〜４２のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４４】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が完全にヒト由来のものである、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４５】
前記の重鎖変領域及び軽鎖可変領域が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメントに由来する、請求項４４に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４６】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がマウス由来のものである、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４７】
前記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体に由来する、請求項４６に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４８】
ヒト化される請求項１〜４３及び４６〜４７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項４９】
キメラである請求項１〜４３及び４６〜４７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５０】
霊長類化される請求項１〜４３及び４６〜４７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５１】
完全にヒト由来のものである請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５２】
Ｆａｂフラグメントである、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５３】
Ｆａｂ’フラグメントである、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５４】
Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５５】
Ｆｖフラグメントである、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５６】
一本鎖抗体である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５７】
ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域よりなる群から選択される軽鎖定常領域を含有する、請求項１〜５４及び５６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５８】
重鎖定常領域又はそのフラグメントを含有する、請求項１〜５４及び５６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５９】
前記重鎖定常領域又はそのフラグメントがヒトＩｇＧ４である、請求項５８に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６０】
前記ＩｇＧ４がグリコシル化部位を除去するために変異を誘発する、請求項５９に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６１】
前記変異がＫａｂａｔナンバリング方式を使用するＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含有する、請求項６０に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６２】
ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−Ｒ１変異ポリペプチドに、前記基準モノクロナール抗体の解離定数（ＫＤ）よりも小さい解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６３】
ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−Ｒ１変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６４】
前記親和性が、約１×１０−１０〜約５×１０−９Ｍの範囲内の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６５】
前記親和性が、
（ａ）約１．１×１０−１０Ｍ；
（ｂ）約１．３×１０−１０Ｍ；
（ｃ）約３．６×１０−１０Ｍ；
（ｄ）約１．３×１０−９Ｍ；
（ｅ）約４．０×１０−９Ｍ；及び
（ｆ）約４．９×１０−９Ｍ；
よりなる群から選択される解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６６】
前記親和性が、
（ａ）１．１×１０−１０Ｍ；
（ｂ）１．３×１０−１０Ｍ；
（ｃ）３．６×１０−１０Ｍ；
（ｄ）１．３×１０−９Ｍ；
（ｅ）４．０×１０−９Ｍ；及び
（ｆ）４．９×１０−９Ｍ；
よりなる群から選択される解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６７】
マウスＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントあるいは非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントと比べて、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６８】
ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合し、且つ非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントにも結合する、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６９】
細胞の表面で発現されるＩＧＦ−Ｒ１に結合する、請求項１〜６８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７０】
前記細胞が、悪性細胞、新生物細胞、腫瘍細胞、又は転移性細胞である、請求項６９に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７１】
インスリン成長因子をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７２】
前記インスリン成長因子がインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）である、請求項７１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７３】
前記インスリン成長因子がインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である、請求項７１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７４】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする、請求項７１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７５】
ＩＧＦ−Ｒ１−介在性細胞増殖を阻害する、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７６】
ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２−介在性ＩＧＦ−Ｒ１リン酸化を阻害する、請求項１〜７５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７７】
腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７８】
ＩＧＦ−Ｒ１内部化を阻害する、請求項１〜７７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７９】
さらにそれに融合した異種ポリペプチドを含有する、請求項１〜７８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項８０】
前記抗体が、細胞障害性薬物、治療剤、細胞増殖抑制薬物、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はそのフラグメント、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び前記薬剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される薬剤に結合体化される、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項８１】
前記細胞障害性薬物が、放射線核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生物学的反応調節剤、あるいは前記細胞障害性薬物の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項８０に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項８２】
前記検出可能標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、あるいは前記検出可能な標識の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項８０に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項８３】
請求項１〜８２のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントと、担体とを含む組成物。
【請求項８４】
抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり；且つ前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される、請求項８４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく発現を高めるために最適化される、請求項８４又は８５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記最適化が、スプライス供与部位及びスプライス受容部位の識別及び除去を含む、請求項８６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記最適化が前記ポリヌクレオチドを発現する細胞のためのコドン使用頻度の最適化を含む、請求項８６又は８７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
前記核酸が、配列番号：３、配列番号：８、配列番号：１３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：４２、配列番号：４７、配列番号：５２、配列番号：５７、及び配列番号：６２よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有する、請求項８４〜８８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり；且つ前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項９１】
前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記ＶＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく発現を高めるために最適化される、請求項９０又は９１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記最適化が、スプライス供与部位及びスプライス受容部位の識別及び除去を含む、請求項９２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記最適化が、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞のためのコドン使用頻度の最適化を含む、請求項９２又は９３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
前記核酸が、配列番号：６７、配列番号：７２、配列番号：７７、配列番号：８２、配列番号：８７、配列番号：９２、配列番号：９７、配列番号：１０２、配列番号：１０７、配列番号：１１２、及び配列番号：１１７よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有する、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一であり；且つ前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項９７】
抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一であり；且つ前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項９８】
単離ポリヌクレオチドであって、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される基準ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ１を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項９９】
前記ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される、請求項９８に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１００】
単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される基準ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ２を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される、請求項１００に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１０２】
単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される基準ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される、請求項１０２に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１０４】
単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される基準ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＬ−ＣＤＲＬ１を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
前記ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される、請求項１０４に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１０６】
単離ポリヌクレオチドであって、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される基準ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＬ−ＣＤＲＬ２を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
前記ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される、請求項１０６に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１０８】
単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される基準ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される、請求項１０８に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１１０】
抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドが、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；並びに配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有し；且つ前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドが、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
さらに、前記抗体ＶＨポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を含有する、請求項８４〜１１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
さらに、前記抗体ＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を含有する、請求項８４〜１１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸を含有する、請求項８４〜１１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸を含有する、請求項８４〜１１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸を含有する、請求項８４〜１１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸を含有する、請求項８４〜１１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４である、請求項１１４〜１１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
前記ＩｇＧ４がグリコシル化部位を除去するために変異を誘発する、請求項１１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
前記変異がＫａｂａｔナンバリング方式を使用するＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含有する、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
さらに、前記ＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸を含有する、請求項８４〜１２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
前記軽鎖定常領域がヒトκ軽鎖定常領域である、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープを特異的に結合する、請求項８４〜１２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体を競合的に阻害する、請求項８４〜１２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
前記ＶＨポリペプチドのフレームワーク領域がヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）、請求項８４〜１２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
前記ＶＬポリペプチドのフレームワーク領域がヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）、請求項８４〜１２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが線状エピトープに結合する、請求項８４〜１２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが非線状立体配置エピトープに結合する、請求項８４〜１２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、多価であり且つ少なくとも２個の重鎖と少なくとも２個の軽鎖を含有する、請求項８４〜１２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが多特異性である、請求項８４〜１２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが二重特異性である、請求項８４〜１３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、完全にヒトに由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する、請求項８４〜１３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である、請求項１３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３４】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、マウスに由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する、請求項８４〜１３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３５】
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である、請求項１３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３６】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがヒト化される、請求項８４〜１３１及び１３４〜１３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３７】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがキメラである、請求項８４〜１３１及び１３４〜１３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３８】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが霊長類化される、請求項８４〜１３１及び１３４〜１３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３９】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが完全にヒト由来のものである、請求項８４〜１３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４０】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＦａｂフラグメントである、請求項８４〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４１】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＦａｂ’フラグメントである、請求項８４〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４２】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＦ（ａｂ）２フラグメントである、請求項８４〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４３】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＦｖフラグメントである、請求項８４〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４４】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖抗体である、請求項８４〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４５】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−Ｒ１変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する、請求項８４〜１４４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４６】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、マウスＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントあるいは非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントと比べて、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する、請求項８４〜１４５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４７】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合し、且つ非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントにも結合する、請求項８４〜１４５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４８】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、細胞の表面で発現されるＩＧＦ−Ｒ１に結合する、請求項８４〜１４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４９】
前記細胞が、悪性細胞、新生物細胞、腫瘍細胞、又は転移性細胞である、請求項１４８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５０】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、インスリン成長因子をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする、請求項８４〜１４９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５１】
前記インスリン成長因子がインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）である、請求項１５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５２】
前記インスリン成長因子がインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である、請求項１５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５３】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする、請求項１５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５４】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、ＩＧＦ−Ｒ１介在性細胞増殖を阻害する、請求項８４〜１５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５５】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２介在性ＩＧＦ−Ｒ１リン酸化を阻害する、請求項８４〜１５４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５６】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項８４〜１５５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５７】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、ＩＧＦ−Ｒ１内部化を阻害する、請求項８４〜１５６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５８】
さらに、異種ポリペプチドをコードする核酸を含有する、請求項８４〜１５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５９】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントが、細胞障害性薬物、治療剤、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はそのフラグメント、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び前記薬剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される薬剤に結合体化される、請求項８４〜１５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６０】
前記細胞障害性薬物が、放射線核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生物学的反応調節剤、あるいは前記細胞障害性薬物の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項１５９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６１】
前記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、あるいは前記検出可能な標識の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項１５９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６２】
請求項８４〜１６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと担体とを含む組成物。
【請求項１６３】
請求項８４〜１６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１６４】
前記ポリヌクレオチドがプロモーターと操作可能に結合される、請求項１６３に記載のベクター。
【請求項１６５】
請求項１６３又は請求項１６４に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１６６】
ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを製造する方法であって、請求項１６５に記載の宿主細胞を培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを製造する方法。
【請求項１６７】
請求項１６６に記載の方法によって製造される単離ポリペプチド。
【請求項１６８】
請求項８４〜１６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチド。
【請求項１６９】
前記ポリペプチドを含有する抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、請求項１６８に記載のポリペプチド。
【請求項１７０】
請求項１６８又は１６９に記載のポリペプチドを含有する単離抗体又はそのフラグメント。
【請求項１７１】
単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−Ｒ１を特異的に結合する、単離ＶＨコード化ポリヌクレオチドと、単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドとを含む組成物。
【請求項１７２】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含有する、請求項１７１に記載の組成物。
【請求項１７３】
単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、それぞれ、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−Ｒ１を特異的に結合する、単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１７４】
単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；並びに配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有するＶＨポリペプチドをコードし；前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有するＶＬポリペプチドをコードし；且つ前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−Ｒ１を特異的に結合する、単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１７５】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが、さらに、前記抗体ＶＨポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を含有する、請求項１７１〜１７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、さらに、前記抗体ＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を含有する、請求項１７１〜１７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが、さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸を含有する、請求項１７１〜１７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが、さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸を含有する、請求項１７１〜１７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが、さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸を含有する、請求項１７１〜１７８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが、さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸を含有する、請求項１７１〜１７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４である、請求項１７７〜１８０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記ＩｇＧ４がグリコシル化部位を除去するために変異を誘発する、請求項１８１に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記変異がＫａｂａｔナンバリング方式を使用するＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含有する、請求項１８２に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、さらに、前記ＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸を含有する、請求項１７１〜１８３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記軽鎖定常領域がヒトκ軽鎖定常領域である、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープを特異的に結合する、請求項１７１〜１８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないように競合的に阻害する、請求項１７１〜１８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記のＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドのフレームワーク領域がヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）、請求項１７１〜１８７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが線状エピトープに結合する、請求項１７１〜１８８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが非線状立体配置エピトープに結合する、請求項１７１〜１８８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９１】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、多価であり且つ少なくとも２個の重鎖と少なくとも２個の軽鎖を含有する、請求項１７１〜１８８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが多特異性である、請求項１７１〜１９１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９３】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが二重特異性である、請求項１７１〜１９２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９４】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、完全にヒト由来のものである重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する、請求項１７１〜１９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９５】
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である、請求項１９４に記載の組成物。
【請求項１９６】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、マウス由来のものである重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する、請求項１７１〜１９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９７】
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である、請求項１９６に記載の組成物。
【請求項１９８】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがヒト化される、請求項１７１〜１９３及び１９６〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９９】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがキメラである、請求項１７１〜１９３及び１９６〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２００】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが霊長類化される、請求項１７１〜１９３及び１９６〜１９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが完全にヒト由来のものである、請求項１７１〜１９５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０２】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＦａｂフラグメントである、請求項１７１〜２０１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＦａｂ’フラグメントである、請求項１７１〜２０１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０４】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＦ（ａｂ）２フラグメントである、請求項１７１〜２０１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０５】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＦｖフラグメントである、請求項１７１〜２０１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが一本鎖抗体である、請求項１７１〜２０１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０７】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−Ｒ１変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する、請求項１７１〜２０６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０８】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、マウスＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントあるいは非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントと比べて、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する、請求項１７１〜２０７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０９】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合し、且つ非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントにも結合する、請求項１７１〜２０７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１０】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、細胞の表面で発現されるＩＧＦ−Ｒ１に結合する、請求項１７１〜２０９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１１】
前記細胞が、悪性細胞、新生物細胞、腫瘍細胞、又は転移性細胞である、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２１２】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、インスリン成長因子をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする、請求項１７１〜２１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１３】
前記インスリン成長因子がインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）である、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１４】
前記インスリン成長因子がインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１５】
ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２の両方をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１６】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、ＩＧＦ−Ｒ１−介在性細胞増殖を阻害する、請求項１７１〜２１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１７】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２−介在性ＩＧＦ−Ｒ１リン酸化を阻害する、請求項１７１〜２１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１８】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項１７１〜２１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１９】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、ＩＧＦ−Ｒ１内部化を阻害する、請求項１７１〜２１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２０】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド、前記ＶＬコード化ポリヌクレオチド、又は前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドポリヌクレオチドの両方が、さらに、異種ポリペプチドをコードする核酸を含有する、請求項１７１〜２１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２１】
前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントが、細胞障害性薬物、治療剤、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はそのフラグメント、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び前記薬剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される薬剤に結合体化される、請求項１７１〜２２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２２】
前記細胞障害性薬物が、放射線核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生物学的反応調節剤、あるいは前記細胞障害性薬物の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２３】
前記検出可能標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、あるいは前記検出可能な標識の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２４】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが第１のベクター上に含有され且つ前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが第２のベクター上に含有される、請求項１７１〜２２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２５】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドが第１のプロモーターに操作可能に結合され且つ前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが第２のプロモーターに操作可能に結合される、請求項２２４に記載の組成物。
【請求項２２６】
前記第１及び第２のプロモーターが同じプロモーターのコピーである、請求項２２５に記載の組成物。
【請求項２２７】
前記第１及び第２のプロモーターが異なるものである、請求項２２５に記載の組成物。
【請求項２２８】
前記第１のベクター及び前記第２のベクターが単一の宿主細胞に含まれる、請求項２２４〜２２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２９】
前記第１のベクター及び前記第２のベクターが別々の宿主細胞に含まれる、請求項２２４〜２２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３０】
ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、請求項２２８に記載の宿主細胞を培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法。
【請求項２３１】
ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、請求項２２９に記載の別々の宿主細胞を同時に培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法。
【請求項２３２】
ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、請求項２２９に記載の別々の宿主細胞を別々に培養し、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドを一緒にし、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法。
【請求項２３３】
請求項２３０〜２３２のいずれか１項に記載の方法で製造されるＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメント。
【請求項２３４】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが同じベクター上に存在する、請求項１７１〜２２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３５】
請求項２３４に記載のベクター。
【請求項２３６】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、それぞれ、プロモーターに操作可能に結合される、請求項２３５に記載のベクター。
【請求項２３７】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、フレーム内に融合され、それと操作可能に結合された単一のプロモーターから同時転写され、一本鎖抗体又はその抗原結合性フラグメントに同時翻訳される、請求項２３５に記載のベクター。
【請求項２３８】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが、これらと操作可能に結合された単一のプロモーターから同時転写されるが、別々に翻訳される、請求項２３５に記載のベクター。
【請求項２３９】
前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドの間に配置されたＩＲＥＳ配列をさらに含有する、請求項２３８に記載のベクター。
【請求項２４０】
前記のＶＨをコードするポリヌクレオチド及び前記のＶＬをコードするポリヌクレオチドが別々に転写され、それぞれが別々のプロモーターに操作可能に結合される、請求項２３５に記載のベクター。
【請求項２４１】
前記別々のプロモーターが同じプロモーターのコピーである、請求項２４０に記載のベクター。
【請求項２４２】
前記別々のプロモーターが異なるものである、請求項２４０に記載のベクター。
【請求項２４３】
請求項２３５〜２４２のいずれか１項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２４４】
ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、請求項２４３に記載の宿主細胞を培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法。
【請求項２４５】
請求項２４４の方法によって製造される、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメント。
【請求項２４６】
動物の過剰増殖性疾患を治療する方法であって、治療を必要とする動物に、
ａ）請求項１〜８２、１７０、２３３及び２４５のいずれか１項に記載の単離抗体又はそのフラグメント；及び
ｂ）製薬学的に許容し得る担体
を含む組成物を投与することを含む、動物の過剰増殖性疾患を治療する方法。
【請求項２４７】
前記過剰増殖性疾患又は障害が、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、又はこれらの転移よりなる群から選択される、請求項２４６に記載の方法。
【請求項２４８】
前記抗体又はそのフラグメントが、悪性細胞の表面で発現されるＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
前記悪性細胞に対する前記抗体又はそのフラグメントの結合が前記悪性細胞の成長阻害をもたらす、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
前記抗体又はそのフラグメントが、ＩＧＦを前記悪性細胞に結合させないように阻害する、請求項２４６〜２４９に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５１】
前記ＩＧＦがＩＧＦ−１である、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５２】
前記ＩＧＦがＩＧＦ−２である、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５３】
前記ＩＧＦがＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２である、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５４】
前記抗体又はそのフラグメントが、ＩＧＦ−１を前記悪性細胞に結合させないように阻害するが、ＩＧＦ−２を阻害しない、請求項２５３に記載の方法。
【請求項２５５】
前記抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−２を前記悪性細胞に結合させないように阻害するが、ＩＧＦ−１を阻害しない、請求項２５３に記載の方法。
【請求項２５６】
前記抗体又はそのフラグメントが前記悪性細胞内へのＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進する、請求項２４６〜２４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５７】
前記抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する、請求項２４６〜２４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５８】
前記抗体又はそのフラグメントが腫瘍細胞の増殖を阻害する、請求項２４６〜２４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５９】
腫瘍細胞の増殖が転移成長の阻止又は遅延によって阻害される、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記抗体又はそのフラグメントが腫瘍細胞の遊走を阻害する、請求項２４６〜２４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６１】
腫瘍細胞の増殖が、隣接組織に広がる腫瘍の阻止又は遅延によって阻害される、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６２】
前記過剰増殖性疾患又は障害が、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎腺、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、又は生殖器系にある新生物である、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６３】
前記過剰増殖性疾患が、扁平上皮細胞癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳腫瘍、肺癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、並びに頭頸部癌よりなる群から選択される癌である、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６４】
前記癌が、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、大腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌、及び前立腺癌よりなる群から選択される、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記動物が哺乳動物である、請求項２４６〜２６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６６】
前記動物がヒトである、請求項２６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多数の疫学的研究により、正常血中濃度よりも高い濃度のＩＧＦ−１が、幾つかの一般的な癌、例えば乳癌（Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９８．３５１：１３９３−６）、前立腺癌（Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８．２７９：５６３−６）、肺癌（Ｙｕら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９．９１：１５１−６）及び結腸直腸癌（Ｍａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９．９１：６２０−５）における危険性の増大と関連があることが明らかにされている。ＩＧＦ−２の血中濃度の上昇も、子宮体癌の危険性の増大と関連があることが明らかにされている（Ｊｏｎａｔｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．２００４．１３：７４８−５２）。それどころか、ＩＧＦ結合性タンパク質の一つであるＩＧＦ−ＢＰ３の濃度上昇と、癌危険性に関して、逆相関が観察された。さらにまた、ＩＧＦ類の濃度上昇も癌患者で認められている（Ｐｅｙｒａｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９３．３５１：１３９３−６；Ｊｏｎａｔｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．２００４．１３：７４８−５２）。
【０００２】
ＩＧＦ系は、細胞の増殖、分化、アポトーシス及び形質転換の調節において重要な役割を果たす（Ｊｏｎｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖ．１９９５．１６：３−３４）。ＩＧＦ系は、２種類の関連のない受容体について、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ；ＣＤ２２１）及びインスリン様成長因子受容体２（ＩＧＦ−２Ｒ；ＣＤ２２２）；２つのリガンド、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）；数個のＩＧＦ結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）を含有する。また、ＩＧＦＢＰプロテアーゼ（例えば：カスパーゼ類、メタロプロテイナーゼ類、前立腺特異抗原）の大きな群は、ＩＧＦ結合ＩＧＦＢＰを加水分解して遊離のＩＧＦ類を放出し、次いで遊離のＩＧＦ類がＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦ−２Ｒと相互作用する。ＩＧＦ系はまた、インスリン及びインスリン受容体（ＩｎｓＲ）と密接に関連する（Ｍｏｓｃｈｏｓら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００２．６３：３１７−３２；Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７；Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４．４：５０５−５１６）。
【０００３】
癌細胞において、受容体チロシンキナーゼ（ＴＫ）は、細胞外腫瘍微小環境を、多様な細胞機能、例えば、細胞分裂周期、生存、アポトーシス、遺伝子発現、細胞骨格構造、細胞接着、及び細胞移動を制御する細胞内シグナル伝達経路に結び付けることにおいて重要な役割を果たす。細胞シグナル伝達を制御するメカニズムはよく理解されているので、これらの細胞機能の１つ以上の崩壊の治療方法が、リガンド結合、受容体の発現／リサイクリング、受容体活性化のレベル及びシグナル伝達事象に関与するタンパク質を標的とすることによって開発できるであろう（Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ  ２０００．１００：５７−７０）。
【０００４】
Ｉ型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーに属する（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９９０．，６１：２０３−１２）。ＩＧＦ−１Ｒは広く発現され、そのリガンド、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２は、生前及び生後発育、成長ホルモン応答、細胞形質転換、生存に重要な役割を果たし、浸潤性及び転移性腫瘍表現型の獲得に関与している（Ｂａｓｅｒｇａ、Ｃｅｌｌ．１９９４．７９：９２７−３０；Ｂａｓｅｒｇａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９．２５３：１−６、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７）。免疫組織化学研究により、多数のヒト腫瘍が、より高い濃度のＩＧＦ−１Ｒを発現することが明らかにされている。
【０００５】
ＩＧＦ−１Ｒの分子構造は、２つの細胞外αサブユニット（１３０−１３５ＫＤ）と、細胞質触媒キナーゼドメインを含有する２つの膜貫通βサブユニット（９５ＫＤ）とを含む。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）のように、共有結合二量体（α２β２）構造を有することによって他のＲＴＫファミリーメンバーと異なる。構造的に、ＩＧＦ−１Ｒは、ＩｎｓＲと極めて関連がある（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ及びＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２００２，１：７６９−８３）。ＩＧＦ−１Ｒは、キナーゼドメインにおいてＩｎｓＲに対して８４％の配列同一性を有し、これに対して膜近傍領域及びＣ末端領域は、それぞれ６１％及び４４％の配列同一性を共有する（Ｕｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８６，５：２５０３−１２；Ｂｌａｋｅｓｌｅｙら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，１９９６．７：１５３−５６）。
【０００６】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１Ｒの２つの活性化リガンドである。α鎖に対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の結合は、特定のチロシン残基でそれぞれのβ鎖の自己リン酸化をもたらし、受容体を非リン酸化状態から活性状態へ変える立体構造の変化を誘発する。キナーゼドメインの活性化ループ中の３個のチロシン残基（１１３１、１１３５及び１１３６のＴｙｒ残基）の活性化は、ＩＲＳ−１及びＳｈｃアダプタータンパク質などの基質のドッキングとリン酸化を引き起こす触媒活性の増大を招く。これらの基質の活性化は、生存（ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＴＯＲ、Ｓ６）及び／又は増殖（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ｐ４２／ｐ４４）のシグナル伝達カスケードに関与する別のタンパク質のリン酸化を招く（Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４．４：５０５−５１６；Ｂａｓｅｒｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ．１９９７．１３３２：Ｆ１０５−Ｆ１２６；Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７）。
【０００７】
ＩＧＦ−１ＲとＩｎｓＲとの間の高度な相同性にもかかわらず、証拠は、上記２つの受容体が異なる生物学的役割を有すること；すなわちＩｎｓＲが、グルコース輸送並びにグリコーゲン及び脂肪の生合成などの生理学的機能の重要な調節剤であり、これに対してＩＧＦ−１Ｒが、細胞の増殖及び分化の強力な調節剤であることを示唆している。ＩｎｓＲと異なり、ＩＧＦ−１Ｒは、組織増殖において役割を果たす組織において、ＩＧＦ−１を調節する成長ホルモン（ＧＨ）の制御下で普遍的に発現される。ＩＧＦ−１Ｒ活性化は、正常な細胞増殖を促進することが明らかにされているが、実験的証拠はＩＧＦ−１Ｒが絶対要件ではないことを示唆している（Ｂａｓｅｒｇａら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９．２５３：１−６；Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７）。
【０００８】
ＩＧＦ類は、細胞の増殖、分化及びアポトーシスの調節に重要な役割を果たす。ＩＧＦ−１Ｒ介在シグナル伝達の阻害が、腫瘍の増殖速度を低下させ、アポトーシスを高め、化学療法及びその他の分子標的療法による腫瘍の殺滅を高めることが明らかにされている（Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４．４：５０５−５１６；Ｚｈａｎｇら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００．２：１７０−７５；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２．６２：２００−０７に概説されている）。
【０００９】
腫瘍においてＩＧＦ−１Ｒ機能を阻害するために着手された実験的アプローチは、有望であるが制限のある成果を提供しており、その癌治療における有効性は、さらに臨床で調べられるべきである。実験的アプローチは、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（Ｋｕｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２５８：６５６１−６６；Ｋａｌｅｂｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４．５４：５５３１−４）、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２に対する中和抗体（Ｆａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６．５：１１４−２０；Ｍｉｙａｍｏｔｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，１１：３４９４−５０２）、小分子チロシンキナーゼ阻害剤（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｓｃｈｅｖｅｒｒｉａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００４．５：２３１−９；Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５．６５：３８６８−７６）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４．９４：１２３５−４２；Ｗｒａｉｇｈｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０００．１８：５２１−２６；Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００２．９：２９６−０７）、ＩＧＦ−１Ｒのドミナントネガティブ変異体（Ｐｒａｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９４，９１：２１８１−８５；Ｋａｌｅｂｉｃら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９８．７６：２２３−７；Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００２：１０１：１１−６）、ＩＧＦリガンドの類縁体（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２．１２：３８８３−８９）、組換えＩＧＦ結合タンパク質（Ｙｅｅら、Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１９９４．５：７３−７７；Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９７，３３：１１０８−１１１３；Ｊｅｒｏｍｅら、ＡＡＣＲ  ２００４，Ａｂｓｔｒａｃｔ＃５３３４）、ＧＨ−放出ホルモンであるＧＨＲＨのアンタゴニスト（Ｓｚｅｒｅｄａｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３：７９１３−１９；Ｌｅｔｓｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３．１００：１２５０−５５）及びＧＨ（Ｋｏｐｃｈｉｃｋら、２００２．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２３，６２３−４６）を包含する。
【００１０】
抗体がＩＧＦ−１Ｒ機能を阻害する能力は、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットの未知エピトープを標的とするマウスモノクロナール抗体（α−ＩＲ３）を用いて初めて実証された（Ｋｕｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２５８：６５６１−６６）。その後に、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットに対して発生させた別の抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ機能を種々の実験癌モデルで様々な程度まで阻害することが明らかにされている（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３：５０７３−８３；Ｂｕｒｔｒｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３：８９１２−２１；Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３．６３，６２７−３５；Ｃｏｈｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５．１１：３０６５−７４；Ｇｏｅｔｓｃｈら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００５．１１３：３１６−２８．Ｌｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４．２８０：１９６６５−７２）。
【００１１】
癌細胞において、生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）及び増殖シグナル伝達の他に、ＩＧＦ−１Ｒの活性化が運動性及び浸潤に関与することも明らかにされている（Ｒｅｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１．２０：４９０−００，Ｎｏｌａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９７．７２：８２８−３４，Ｓｔｒａｃｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９．２６４：２１５４４−４９；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１．２０：７３１８−２５）。
【００１２】
腫瘍細胞が、ＩＧＦ系の成分（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２Ｒ及びＩＧＦ−ＢＰ）の１つ以上を産生することが明らかにされている。インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）研究により腫瘍がＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２を産生できることが示されているが、翻訳研究（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ）は、ＩＧＦ−２が腫瘍においてより関連があり、且つ一般的に発現されるＩＧＦであることを示す。これは、ＩＧＦ−２遺伝子の両アレル発現を招くエピジェネティックな変化による腫瘍中の沈黙ＩＧＦ−２対立遺伝子の刷り込みの消失（ＬＯＩ）によるものである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これは、順番に、癌細胞に及び腫瘍増殖を支持する微小環境に対する高められたＩＧＦ−２供給をもたらす。
【００１３】
ＩＧＦ−１Ｒ感受性腫瘍は、血液循環（肝臓で生成）からＩＧＦ−１の受容体活性化シグナル及び腫瘍からＩＧＦ−２の受容体活性化シグナルを受け取り、このようにしてＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が介在する生物活性を崩壊させることをを目的としたアプローチが、よりよい抗腫瘍反応を提供するであろう。従って、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が介在する生物学的機能を効果的に妨害する抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体法が、腫瘍微小環境においてＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が介在するＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の生物学的機能を効果的に妨害しない他のアプローチよりも向上した効果を提供し得る。
【００１４】
安全性に関して、ＩＧＦ−１Ｒは普遍的に発現され、従ってＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体は、正常組織においてＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性に起因する毒性を避けるためにエフェクター機能を最小限有するか又は全く有さないであろう。このような抗体を発現させる（ｄｅｖｅｌｏｐｐｉｎｇ）１つの可能性は、ＡＤＣＣ機能又はＣＤＣ機能に介在しないヒトγ４Ｆｃ領域の非グリコシル化体を有することにある。
【００１５】
ＩＧＦ−１Ｒは、癌遺伝子介在性細胞形質転換に関与する。
【００１６】
ＩＧＦ／ＩＧＦ−１Ｒ活性化は、癌細胞において分裂誘発及び生存促進シグナル伝達に介在する。
【００１７】
ＩＧＦ−１Ｒ活性化はまた、細胞運動性及び転移を促進する。
【００１８】
ＩＧＦ−１Ｒは、多数の癌において過剰発現される。
【００１９】
正常な血中ＩＧＦ濃度よりも高い血中ＩＧＦ濃度を有する個人は、癌を患う危険性が高い。
【００２０】
ＩＧＦ１及び２の血漿濃度の上昇が、多数の癌患者で認められた。
【００２１】
ヒト腫瘍は、自己分泌成長因子としてＩＧＦ−２を産生する。
【００２２】
腫瘍増殖の阻止は、単一薬剤として及び化学療法剤と生物剤の組み合わせとして実証されている。
【００２３】
種々の新生物疾患、例えば癌及びその転移の治療のための種々の又は改良された結合特性、有効特性及び安全特性を有するＩＧＦ−１Ｒ抗体に対して当技術分野において要求が相変わらず存在する。
【非特許文献１】Ｆｉｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００４．４：１４３−５３
【非特許文献２】Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２００３．３５：６９４−０４
【非特許文献３】Ｄｅ  Ｓｏｕｚａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．ら、１９９７．１１：６０−７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
発明の簡単な要約
本発明は、細胞の増殖、分化、アポトーシス及び形質転換の調節におけるＩＧＦ系の重要な役割に基づく。特に、Ｉ型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）及びそのリガンド、すなわちＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２は、生前及び生後発育、成長ホルモン応答性、細胞形質転換、生存に重要な役割を果たし、浸潤性及び転移性腫瘍表現型の獲得に関与している。本発明は、一般的に、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、その抗原結合性フラグメント又は誘導体に関する。ある種のＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒ機能を阻害するか又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２介在性ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の生物学的機能を妨害する。さらに、本発明は、一般に、種々の新生物疾患、例えば癌及び転移、並びにＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に関連する種々の過剰増殖性疾患、障害又は損傷を治療する方法に関する。
【００２５】
幾つかの実施形態において、本発明は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００２６】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体のＩＧＦ−Ｒ１への結合を競合的に阻害する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００２７】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体の抗原結合性ドメインと同じ抗原結合性ドメインを含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００２９】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３０】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３１】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３２】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３３】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３４】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨ及びＶＬが、それぞれ、２０個以下の保存アミノ酸置換それぞれを除いて、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００３７】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される基準重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。別の実施形態において、前記ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される。
【００３８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される基準重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。別の実施形態において、前記ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される。
【００３９】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される基準重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。別の実施形態において、前記ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される。
【００４０】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される基準軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。別の実施形態において、前記ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される。
【００４１】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される基準軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。別の実施形態において、前記ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される。
【００４２】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される基準軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＫａｂａｔ  ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。別の実施形態において、前記ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；並びに配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する（但し、前記ＶＨ−ＣＤＲ類の少なくとも１つにおける１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を除く）、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００４４】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＨが、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；及び配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００４５】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する（但し、前記ＶＨ−ＣＤＲ類の少なくとも１つにおける１個、２個、３個又は４個のアミノ酸置換を除く）、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００４６】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントのＶＬが、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する、ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００４７】
前記抗体又はそのフラグメントの種々の実施形態において、ＶＨフレームワーク領域及び／又はＶＬフレームワーク領域は、ヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）。
【００４８】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、線状エピトープ又は非線状立体配置エピトープに結合する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、多価であり且つ少なくとも２個の重鎖と少なくとも２個の軽鎖を含む。
【００５０】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは多特異性である。別の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、二重特異性である。
【００５１】
前記抗体又はそのフラグメントの種々の実施形態において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が完全にヒト由来のものである。別の実施形態において、前記の重鎖変領域及び軽鎖可変領域は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメントに由来する。
【００５２】
前記抗体又はそのフラグメントの種々の実施形態において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、マウス由来のものである。別の実施形態において、前記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体に由来する。
【００５３】
種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ヒト化される。
【００５４】
種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、キメラである。
【００５５】
種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、霊長類化される。
【００５６】
種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、完全にヒト由来のものである。
【００５７】
ある実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、又はＦｖフラグメントである。
【００５８】
ある実施形態において、前記抗体は一本鎖抗体である。
【００５９】
ある実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域よりなる群から選択される軽鎖定常領域を含有する。
【００６０】
ある実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、重鎖定常領域又はそのフラグメントを含有する。別の実施形態において、重鎖定常領域又はそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ４である。ある別の実施形態において、前記ＩｇＧ４は、グリコシル化部位を除去するために変異を誘発する。別の実施形態において、ＩｇＧ４変異は、Ｋａｂａｔナンバリング方式を使用する、Ｓ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含有する。
【００６１】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−Ｒ１変異ポリペプチドに、前記基準モノクロナール抗体の解離定数（ＫＤ）よりも小さい解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する。別の実施形態において、解離定数（ＫＤ）は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下である。
【００６２】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、マウスＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントあるいは非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントと比べて、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する。
【００６３】
ある他の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合し、且つ非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントにも結合する。
【００６４】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、細胞の表面で発現されるＩＧＦ−Ｒ１に結合する。別の実施形態において、細胞は、悪性細胞、新生物細胞、腫瘍細胞、又は転移性細胞である。
【００６５】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、インスリン成長因子をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする。別の実施形態において、インスリン成長因子は、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）又はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。ある実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする。
【００６６】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−Ｒ１−介在性細胞増殖、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２−介在性ＩＧＦ−Ｒ１リン酸化、腫瘍細胞の増殖、又はＩＧＦ−Ｒ１内部化を阻害する。
【００６７】
さらなる実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、さらに、それに融合した異種ポリペプチドを含有する。
【００６８】
幾つかの実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、細胞障害性薬物、治療剤、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はそのフラグメント、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び前記薬剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される薬剤に結合体化される。別の実施形態において、前記細胞障害性薬物は、放射線核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生物学的反応調節剤、あるいは前記細胞障害性薬物の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される。別の実施形態において、前記検出可能標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、あるいは前記検出可能な標識の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、前記の抗体又はそのフラグメントと、担体とを含む組成物を包含する。
【００７０】
本発明のある実施形態は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり；且つ前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドを包含する。別の実施形態において、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される。
【００７１】
ある実施形態において、前記ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく発現を高めるために最適化される。別の実施形態において、前記最適化は、スプライス供与部位及びスプライス受容部位の識別及び／又は前記ポリヌクレオチドを発現する細胞のためのコドン使用頻度の最適化を含む。別の実施形態において、前記核酸は、配列番号：３、配列番号：８、配列番号：１３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：４２、配列番号：４７、配列番号：５２、配列番号：５７、及び配列番号：６２よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有する。
【００７２】
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり；且つ前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される。
【００７３】
ある実施形態において、前記ＶＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく発現を高めるために最適化される。別の実施形態において、前記最適化は、スプライス供与部位及びスプライス受容部位の識別及び除去及び／又は前記ポリヌクレオチドを発現する細胞のためのコドン使用頻度の最適化を含む。別の実施形態において、前記核酸は、配列番号：６７、配列番号：７２、配列番号：７７、配列番号：８２、配列番号：８７、配列番号：９２、配列番号：９７、配列番号：１０２、配列番号：１０７、配列番号：１１２、及び配列番号：１１７よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有する。
【００７４】
ある他の実施形態において、本発明は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：４、配列番号：９、配列番号：１４、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：４３、配列番号：４８、配列番号：５３、配列番号：５８、及び配列番号：６３よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一であり；且つ前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００７５】
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：６８、配列番号：７３、配列番号：７８、配列番号：８３、配列番号：８８、配列番号：９３、配列番号：９８、配列番号：１０３、配列番号：１０８、配列番号：１１３、及び配列番号：１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一であり；且つ前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００７６】
幾つかの実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される基準ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ１を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号：５、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：２１、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３９、配列番号：４４、配列番号：４９、配列番号：５４、配列番号：５９、及び配列番号：６４よりなる群から選択される。
【００７７】
幾つかの実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される基準ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ２を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号：６、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：２２、配列番号：２８、配列番号：３４、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：５０、配列番号：５５、配列番号：６０、及び配列番号：６５よりなる群から選択される。
【００７８】
幾つかの実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される基準ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号：７、配列番号：１２、配列番号：１７、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３５、配列番号：４１、配列番号：４６、配列番号：５１、配列番号：５６、配列番号：６１、及び配列番号：６６よりなる群から選択される。
【００７９】
幾つかの実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される基準ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲＬ１を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号：６９、配列番号：７４、配列番号：７９、配列番号：８４、配列番号：８９、配列番号：９４、配列番号：９９、配列番号：１０４、配列番号：１０９、配列番号：１１４、及び配列番号：１１９よりなる群から選択される。
【００８０】
幾つかの実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される基準ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲＬ２を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１００、配列番号：１０５、配列番号：１１０、配列番号：１１５、及び配列番号：１２０よりなる群から選択される。
【００８１】
幾つかの実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される基準ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号：７１、配列番号：７６、配列番号：８１、配列番号：８６、配列番号：９１、配列番号：９６、配列番号：１０１、配列番号：１０６、配列番号：１１１、配列番号：１１６、及び配列番号：１２１よりなる群から選択される。
【００８２】
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドが、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；並びに配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００８３】
幾つかの実施形態において、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドが、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有し；且つ前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００８４】
幾つかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、さらに、前記抗体ＶＨポリペプチド又は前記抗体ＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を含有する。
【００８５】
ある別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、さらに、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸を含有するか、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸を含有するか、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸を含有するか、又は前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸を含有する。別の実施形態において、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４である。ある他の実施形態において、前記ＩｇＧ４は、グリコシル化部位を除去するために変異を誘発する。別の実施形態において、ＩｇＧ４変異は、Ｋａｂａｔナンバリング方式を使用するＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含有する。
【００８６】
幾つかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸を含有する。別の実施形態において、前記軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域である。
【００８７】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープを特異的に結合する。
【００８８】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体を競合的に阻害する。
【００８９】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記ＶＨポリペプチド又は前記ＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、ヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）。
【００９０】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、本発明は、線状エピトープ又は非線状立体配置エピトープに結合する、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００９１】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、多価であり、且つ少なくとも２個の重鎖と少なくとも２個の軽鎖を含有する。
【００９２】
前記ポリヌクレオチドのある実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは多特異性である。前記ポリヌクレオチドの別の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、二重特異性である。
【００９３】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、完全にヒトに由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する。別の実施形態において、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である。
【００９４】
前記ポリヌクレオチドのある他の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウスに由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する。別の実施形態において、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である。
【００９５】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。
【００９６】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、霊長類化される。
【００９７】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、キメラである。
【００９８】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、完全にヒト由来のものである。
【００９９】
前記ポリヌクレオチドの種々の実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、又はＦｖフラグメントである。前記ポリヌクレオチドのある実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、一本鎖抗体である。
【０１００】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−Ｒ１変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する。
【０１０１】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウスＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントあるいは非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントと比べて、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する。
【０１０２】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合し、且つ非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントにも結合する。
【０１０３】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、細胞の表面で発現されるＩＧＦ−Ｒ１に結合する。別の実施形態において、細胞は、悪性細胞、新生物細胞、腫瘍細胞、又は転移性細胞である。
【０１０４】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、インスリン成長因子をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする。別の実施形態において、前記インスリン成長因子は、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）又はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。前記ポリヌクレオチドのある別の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２の両方をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする。
【０１０５】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−Ｒ１−介在性細胞増殖を阻害するか、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２−介在性ＩＧＦ−Ｒ１リン酸化を阻害するか、腫瘍細胞の増殖を阻害するか、又はＩＧＦ−Ｒ１内部化を阻害する。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、さらに、異種ポリペプチドをコードする核酸を含有する。
【０１０７】
前記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、細胞障害性薬物、治療剤、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はそのフラグメント、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び前記薬剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される薬剤に結合体化される。別の実施形態において、前記細胞障害性薬物は、放射線核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生物学的反応調節剤、あるいは前記細胞障害性薬物の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される。ある別の実施形態において、前記検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、あるいは前記検出可能な標識の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１０９】
ある他の実施形態において、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターと操作可能に結合される。さらに別の実施形態において、本発明は、このようなベクターを含有する宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、前記ポリヌクレオチドがプロモーターと操作可能に結合されているベクターを提供する。
【０１１０】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを製造する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有する宿主細胞を培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを製造する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、前記方法によって製造される単離ポリペプチドを提供する。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、本発明は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる単離ポリペプチドを提供する。
【０１１２】
前記ポリペプチドの別の実施形態において、前記ポリペプチドを含有する抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。他の実施形態は、前記ポリペプチドを含有する単離抗体又はそのフラグメントを包含する。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、本発明は、単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドのそれぞれが、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−Ｒ１を特異的に結合する、単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。別の実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含有する。
【０１１４】
ある他の実施形態において、本発明は、単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、それぞれ、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号：４及び配列番号：６８；配列番号：８及び配列番号：７３；配列番号：１４及び配列番号：７８；配列番号：２０及び配列番号：８３；配列番号：２６及び配列番号：８８；配列番号：３２及び配列番号：９３；配列番号：３８及び配列番号：９８；配列番号：４３及び配列番号：１０３；配列番号：４８及び配列番号：１０８；配列番号：５３及び配列番号：１０３；配列番号：５８及び配列番号：１１３；並びに配列番号：６３及び１１８よりなる群から選択される基準アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含有し；且つ前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントがＩＧＦ−Ｒ１を特異的に結合する、単離ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び単離ＶＬコード化ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。別の実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドは、配列番号：５、６、及び７；配列番号：１０、１１、及び１２；配列番号：１５、１６、及び１７；配列番号：２１、２２、及び２３；配列番号：２７、２８、及び２９；配列番号：３３、３４、及び３５；配列番号：３９、４０、及び４１；配列番号：４４、４５、及び４６；配列番号：４９、５０、及び５１；配列番号：５４、５５、及び５６；配列番号：５９、６０、及び６１；並びに配列番号：６４、６５、及び６６よりなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有するＶＨポリペプチドをコードし；前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、配列番号：６９、７０、及び７１；配列番号：７４、７５、及び７６；配列番号：７９、８０、及び８１；配列番号：８４、８５、及び８６；配列番号：８９、９０、及び９１；配列番号：９４、９５、及び９６；配列番号：９９、１００、及び１０１；配列番号：１０４、１０５、及び１０６；配列番号：１０９、１１０、及び１１１；配列番号：１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号：１１９、１２０、及び１２１よりなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含有するＶＬポリペプチドをコードし；且つ前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントはＩＧＦ−Ｒ１を特異的に結合する。
【０１１５】
前記組成物の種々に実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドは、さらに、前記抗体ＶＨポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を含有する。
【０１１６】
前記組成物の種々に実施形態において、前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、さらに、前記抗体ＶＬポリペプチドに融合したシグナルペプチドをコードする核酸を含有する。
【０１１７】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドは、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含有するか、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含有するか、前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含有するか、又は前記ＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含有する。別の実施形態において、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４である。ある他の実施形態において、前記ＩｇＧ４は、グリコシル化部位を除去するために変異を誘発する。別の実施形態において、前記ＩｇＧ４変異は、Ｋａｂａｔナンバリング方式を使用するＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含有する。
【０１１８】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、さらに、前記ＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸を含有する。別の実施形態において、前記軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域である。
【０１１９】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープを特異的に結合する。
【０１２０】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないように競合的に阻害する。
【０１２１】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、ヒト由来のものである（但し、５個以下のアミノ酸置換を除く）。
【０１２２】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、線状エピトープ又は非線状立体配置エピトープに結合する。
【０１２３】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、多価であり、且つ少なくとも２個の重鎖と少なくとも２個の軽鎖を含有する。
【０１２４】
前記組成物の幾つかの別の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、多特異性である。別の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、二重特異性である。
【０１２５】
前記組成物の幾つかの別の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、完全にヒトに由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する。別の実施形態において、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である。
【０１２６】
前記組成物の幾つかの別の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、マウスに由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有する。別の実施形態において、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一である。
【０１２７】
前記組成物の種々の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、ヒト化される。
【０１２８】
前記組成物の種々の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、霊長類化される。
【０１２９】
前記組成物の種々の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、キメラである。
【０１３０】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、完全にヒト由来のものである。
【０１３１】
前記組成物の種々の実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、又はＦｖフラグメントである。前記組成物のある実施形態において、前記のＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はそのフラグメントは、一本鎖抗体である。
【０１３２】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリヌクレオチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−Ｒ１変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する。
【０１３３】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリヌクレオチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウスＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントあるいは非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントと比べて、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する。
【０１３４】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリヌクレオチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒトＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合し、且つ非ヒト霊長類ＩＧＦ−Ｒ１ポリペプチド又はそのフラグメントにも結合する。
【０１３５】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリヌクレオチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、細胞の表面で発現されるＩＧＦ−Ｒ１に結合する。別の実施形態において、前記細胞は、悪性細胞、新生物細胞、腫瘍細胞、又は転移性細胞である。
【０１３６】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリヌクレオチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、インスリン成長因子をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする。別の実施形態において、前記インスリン成長因子は、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）又はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。前記組成物のある他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２の両方をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないようにブロックする。
【０１３７】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリヌクレオチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−Ｒ１−介在性細胞増殖を阻害するか、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２−介在性ＩＧＦ−Ｒ１リン酸化を阻害するか、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又はＩＧＦ−Ｒ１内部化を阻害する。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、前記組成物、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド、前記ＶＬコード化ポリヌクレオチド、又は前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドポリヌクレオチドの両方は、さらに、異種ポリペプチドをコードする核酸を含有する。
【０１３９】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記核酸によってコードされるポリヌクレオチドを含有する抗体又はその抗原結合性フラグメントは、細胞障害性薬物、治療剤、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はそのフラグメント、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び前記薬剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される薬剤に結合体化される。別の実施形態において、前記細胞障害性薬物は、放射線核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生物学的反応調節剤、あるいは前記細胞障害性薬物の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される。ある他の実施形態において、前記検出可能標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、あるいは前記検出可能な標識の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される。
【０１４０】
前記組成物の幾つかの実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドは、第１のベクター上に含有され且つ前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、第２のベクター上に含有される。別の実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチドは、第１のプロモーターに操作可能に結合され且つ前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、第２のプロモーターに操作可能に結合される。ある他の実施形態において、前記第１及び第２のプロモーターは、同じプロモーターのコピーである。別の実施形態において、前記第１及び第２のプロモーターが異なるものである。
【０１４１】
前記組成物の種々の実施形態において、前記第１のベクター及び前記第２のベクターは単一の宿主細胞に含まれる。
【０１４２】
前記組成物のある他の実施形態において、前記第１のベクター及び前記第２のベクターは、別々の宿主細胞に含まれる。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、前記宿主細胞を培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法を提供する。
【０１４４】
他の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、別々の宿主細胞を同時に培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法を提供する。前記方法の別の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及びＶＬコード化ポリヌクレオチドを一緒にし、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法を提供する。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、本発明は、前記の方法で製造されるＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを提供する。
【０１４６】
幾つかの実施形態において、本発明は、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドが同じベクター上に存在する組成物及びその中のベクターを提供する。
【０１４７】
前記ベクターの種々の実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、それぞれプロモーターに操作可能に結合される。
【０１４８】
前記ベクターの種々の実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、フレーム内に融合され、それと操作可能に結合された単一のプロモーターから同時転写され、一本鎖抗体又はその抗原結合性フラグメントに同時翻訳される。
【０１４９】
前記ベクターの種々の実施形態において、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドは、それと操作可能に結合された単一のプロモーターから同時転写されるが、別々に翻訳される。別の実施形態において、前記ベクターは、前記ＶＨコード化ポリヌクレオチド及び前記ＶＬコード化ポリヌクレオチドの間に配置されたＩＲＥＳ配列をさらに含有する。ある他の実施形態において、前記のＶＨをコードするポリヌクレオチド及び前記のＶＬをコードするポリヌクレオチドは、別々に転写され、それぞれが別々のプロモーターに操作可能に結合される。別の実施形態において、前記別々のプロモーターは、同じプロモーターのコピーであるか、又は前記別々のプロモーターは異なるものである。
【０１５０】
幾つかの実施形態において、本発明は、前記ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【０１５１】
他の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法であって、前記宿主細胞を培養し、前記抗体又はそのフラグメントを回収することを含む、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの製造方法を提供する。
【０１５２】
幾つかの実施形態において、本発明は、前記の方法によって製造される、ＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを提供する。
【０１５３】
幾つかの実施形態において、本発明は、動物の過剰増殖性疾患を治療する方法であって、治療を必要とする動物に、ａ）前記の単離抗体又はそのフラグメント；及びｂ）製薬学的に許容し得る担体を含む組成物を投与することを含む、動物の過剰増殖性疾患を治療する方法を提供する。別の実施形態において、前記過剰増殖性疾患又は障害は、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、又はこれらの転移よりなる群から選択される。
【０１５４】
前記方法の種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、悪性細胞の表面で発現されるＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。別の実施形態において、悪性細胞に対する前記抗体又はそのフラグメントの結合は、悪性細胞の成長阻害をもたらす。
【０１５５】
前記方法の種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦを前記悪性細胞に結合させないように阻害する。別の実施形態において、前記ＩＧＦは、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２である。
【０１５６】
前記方法の種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−１を悪性細胞に結合させないように阻害するが、ＩＧＦ−２を阻害しない。ある他の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−２を悪性細胞に結合させないように阻害するが、ＩＧＦ−１を阻害しない。
【０１５７】
前記方法の種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、悪性細胞内へのＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進する。
【０１５８】
前記方法の種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害するか、又は腫瘍細胞の増殖を阻害する。別の実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、転移成長の阻止又は遅延によって阻害される。
【０１５９】
前記方法の種々の実施形態において、前記抗体又はそのフラグメントは、腫瘍細胞遊走を阻害する。別の実施形態において、腫瘍細胞の増殖は、隣接組織に広がる腫瘍の阻止又は遅延によって阻害される。
【０１６０】
前記方法の種々の実施形態において、前記過剰増殖性疾患又は障害は、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎腺、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、又は生殖器系にある新生物である。
【０１６１】
前記方法の種々の実施形態において、前記過剰増殖性疾患は、扁平上皮細胞癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳腫瘍、肺癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、並びに頭頸部癌よりなる群から選択される癌である。別の実施形態において、癌は、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、大腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌、及び前立腺癌よりなる群から選択される。
【０１６２】
前記方法の種々の実施形態において、動物は哺乳動物である。別の実施形態において、動物はヒトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６３】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
“ある１つ（ａ又はａｎ）”の実体（ｅｎｔｉｔｙ）という用語は、１つ以上のその実体を指すことが認められるべきでである；例えば、“ある１つのＩＧＦ−１Ｒ抗体”は、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ抗体を表すと解釈される。このように、“ある１つ（ａ又はａｎ）”、“１つ以上”及び“少なくとも１つ”という用語は、本明細書において同じ意味で使用できる。
【０１６４】
本明細書で使用されるように、“ポリペプチド”という用語は、単数形“ポリペプチド”及び複数形“ポリペプチド”を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）で線状に連結されたモノマー（アミノ酸類）を含む分子を指す。“ポリペプチド”という用語は２個以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、生成物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、“タンパク質”、“アミノ酸鎖”、あるいは２個以上のアミノ酸の１つ以上の鎖を指すのに使用されるその他の用語は、“ポリペプチド”の定義の範囲に含まれ、また“ポリペプチド”という用語は、これらの用語のいずれの代わりに使用し得るし又はこれらの用語と同じ意味で使用し得る。“ポリペプチド”という用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば限定なしにグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク分解切断、又は非天然アミノ酸による修飾の生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然生物学的起源から誘導し得るか又は組換え技術で製造し得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、任意の方法で、例えば化学合成で生成し得る。
【０１６５】
本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、あるいは２，０００個以上のアミノ酸の大きさからなり得る。ポリペプチドは、定義された３次元構造を有し得るが、必ずしもこのような構造を有するとは限らない。定義された３次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると呼ばれ、また定義された３次元構造をもたないが、むしろ多数の種々の立体配座を取ることができるポリペプチドは、折りたたまれていないと呼ばれる。本明細書で使用されるように、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えばセリン残基又はアスパラギン残基の酸素含有側鎖又は窒素含有側鎖によってタンパク質に結合される少なくとも１個の糖質部分に連結されたタンパク質を指す。
【０１６６】
“単離”ポリペプチドあるいはそのフラグメント、変異体、又は誘導体とは、その自然環境にあるポリペプチドではないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その固有の環境又は自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現される組換え技術によって産生されたポリペプチド及びタンパク質は、適当な方法で分離され、分別され、あるいは部分的に又は実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドであるように、本発明の目的に単離されているとみなされる。
【０１６７】
また、本発明のポリペプチドとして、前記ポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、又は変異体、及びこれらの組み合わせも包含される。“フラグメント”、“変異体”、“誘導体”及び“類似体”は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗体ポリペプチドを指す場合には、対応する天然抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも幾つかを保持する任意のポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドのフラグメントとしては、本明細書の他の個所で論じる特異抗体フラグメントの他に、タンパク分解フラグメント、及び欠失フラグメントが挙げられる。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗体ポリペプチドの変異体としては、前記のフラグメント、及びアミノ酸の置換、欠失又は挿入による改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。変異体は、天然に生じ得るか又は非天然産であり得る。非天然変異体は、当技術分野で公知の変異誘発技術を使用して産生させ得る。変異ポリペプチドは、保存又は非保存アミノ酸置換、欠失又は付加を含有し得る。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドについて認められない別の特徴を示すように変性されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異ポリペプチドはまた、本明細書において“ポリペプチド類似体”とも呼び得る。本明細書で使用されるように、ＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗体ポリペプチドの“誘導体”とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１個以上の残基を有する主題のポリペプチドを指す。“誘導体”としては、２０個の標準アミノ酸の１個以上の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも包含される。例えば、４−ヒドロキシプロリンが、プロリンの代わりに使用し得；５−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用し得；３−メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに使用し得；ホモセリンがセリンの代わりに使用し得；及びオルニチンがリシンの代わりに使用し得る。
【０１６８】
“ポリヌクレオチド”という用語は、単一の核酸及び複数の核酸を包含することを意図し、単離核酸分子又は組立て体、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣用のホスホジエステル結合又は非慣用結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるようなアミド結合）を含有し得る。“核酸“という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１個以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを指す。“単離”核酸又はポリヌクレオチドとは、その固有の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されるとみなされる。単離ポリヌクレオチドの別の例としては、異種宿主細胞中に保持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明の単離ポリヌクレオチド又は核酸としては、さらに合成的に製造されたこのような分子が挙げられる。また、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節因子、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターであってもよいし又はこれらを含有していてもよい。
【０１６９】
本明細書で使用されるように、“コード領域”とは、アミノ酸に翻訳されるコドンを含む核酸の一部分である。“停止コドン”（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の部分であるとみなしてよい。しかし、任意のフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の部分ではない。本発明の２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド組立て体中に、例えば１個のベクター上に、又は別個のポリヌクレオチド組立て体中に、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在することができる。また、任意のベクターは、１つのコード領域を含有していてもよいし、あるいは２つ以上のコード領域を含有していてもよく、例えば、１個のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードしていてもよい。また、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、核酸は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体あるいはそのフラグメント、変異体、又は誘導体をコードする核酸に融合されているか又は融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域としては、限定されることなく、特殊な要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインが挙げられる。
【０１７０】
ある実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合は、ポリペプチドをコードする核酸を含有するポリヌクレオチドは、標準的に、プロモーター及び／又は１つ以上のコード領域と操作可能に結合されたその他の転写又は翻訳調節因子を含有し得る。操作可能な結合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、１つ以上の調節配列と、該調節配列（１つ以上）の影響又は制御下で遺伝子産物の発現を行うような方法で結合される場合である。、２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれと結合されたプロモーター）は、プロモーター機能の導入が、所定の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合に及び前記２つのＤＮＡフラグメントの間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨害しないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨害しない場合に、“操作可能に結合される”。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写に影響を及ぼすことができる場合には、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に結合されるであろう。プロモーターは、所定の細胞内のＤＮＡのみの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。その他の転写調節因子、プロモーターの他に、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するためにポリヌクレオチドと操作可能に結合することができる。適当なプロモーター及び他の転写調節領域が、本明細書に開示される。
【０１７１】
様々な転写調節領域が、当業者に知られている。これらの転写調節領域としては、限定されることなく、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス（即時型プロモーター、イントロン−Ａと併用して）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウスラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが挙げられる。他の転写調節領域としては、脊椎動物遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンから誘導される転写調節領域、並びに真核細胞において遺伝子発現を調節できる他の配列が挙げられる。別の適当な転写調節領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン類又はインターロイキン類によって誘導できるプロモーター）が挙げられる。
【０１７２】
同様に、様々な翻訳調節因子が当業者に知られている。これらの翻訳調節因子としては、以下に限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、並びにピコルナウイルスから誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる））が挙げられる。
【０１７３】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーンＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形である。
【０１７４】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードし、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示するする別のコード領域と結合させ得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、いったん粗面小胞体を横切る成長タンパク質鎖の輸出が開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般に、分泌型又は“成熟”型のポリペプチドを産生するために完全又は“全長”ポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを知っている。ある実施形態において、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、あるいはそれに操作可能に結合されるポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。あるいはまた、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用し得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されていてもよい。
【０１７５】
本発明は、ある種のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体に関する。具体的に自然発生抗体などのフルサイズの抗体に言及しない限りは、“ＩＧＦ−１Ｒ抗体”という用語は、フルサイズの抗体及びこのような抗体の抗原結合性フラグメント、変異体、類似体、又は誘導体、例えば自然発生抗体又は免疫グロブリン分子、あるいは抗体分子に似た方法で抗原を結合する操作された抗体分子又はフラグメントを包含する。
【０１７６】
“抗体”及び“免疫グロブリン”という用語は、本明細書において同じ意味で使用される。抗体又は免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変領域を含有し、及び普通は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域を含有する。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的によく理解される。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照。
【０１７７】
以下でさらに詳しく論じるように、“免疫グロブリン”という用語は、生化学的に区別することができる種々の広範な種類のポリペプチドを含有する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン（γ、μ、α、δ、又はε）として分類され、これらの間に幾つかのサブクラスを有する（例えば、γ１〜γ４）ことが分かるであろう。抗体の“クラス”をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥそれぞれとして決定することがこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などが十分に特定されており、機能特化を与えることが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの修飾バージョンは、当業者にはこの開示を考慮して容易に認識でき、従って、本発明の範囲内にある。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本発明の範囲内にあり、以下の論議は、一般的に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するであろう。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同じ軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同じ重鎖ポリペプチドを含む。この４つの鎖は、典型的には、軽鎖が“Ｙ”の口元で始まり且つ可変領域を通って続く重鎖を支えている“Ｙ”立体配置でジスルフィド結合によって接続される。
【０１７８】
軽鎖は、カッパ又はラムダ（κ、λ）として分類される、各重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖と結合され得る。一般に、軽鎖と重鎖は、相互に共有結合され、２つの重鎖の“尾部”部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作宿主細胞によって生じる場合には、ジスルフィド結合又は非共有結合によって相互に結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ立体配置のフォーク状末端でのＮ−末端から、それぞれの鎖の下部のＣ−末端まで続く。
【０１７９】
軽鎖及び重鎖の両方は、構造的及び機能的相同性の領域に分けられる。定常”及び“可変”という用語は、機能的に使用される。これに関して、Ｌ（ＶＬ）鎖部分及びＨ（ＶＨ）鎖部分の可変領域は、抗原認識及び特異性を決定することが理解されるであろう。反対に、軽鎖の定常領域（ＣＬ）及び重鎖の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は、重要な生物学的性質、例えば分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを与える。転化によって、定常領域ドメインのナンバリングは、抗原結合部位又は抗体のアミノ末端からより末端になるにつれて増大する。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ−末端部分では定常領域である；ＣＨ３及びＣＬドメインは、実際に重鎖及び軽鎖それぞれのカルボキシ末端を含有する。
【０１８０】
上記に示したように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、結合して３次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四級抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに詳しくは、抗原結合部位は、Ｖ重鎖及びＶ軽鎖のそれぞれの３つのＣＤＲによって規定される。ある場合には、例えば、ラクダ科動物種から誘導されるか又はラクダ科動物免疫グロブリンに基づいて操作されたある種の免疫グロブリン分子、完全免疫グロブリン分子は、重鎖のみからなり、軽鎖を有していない。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）参照。
【０１８１】
自然発生抗体において、各抗原結合性ドメインに存在する６個の“相補性決定領域”すなわち“ＣＤＲ”は、抗体が水性環境においてその３次元立体配置をとると考えられることから、抗原結合性ドメインを形成するために特異的に配置される短い隣接しないアミノ酸である。抗原結合性ドメインのアミノ酸の残部（“フレームワーク”領域と呼ばれる）は、少ない分子内変動性を示す。フレームワーク領域は、主としてβ−シート立体配置をとり、ＣＤＲは、β−シート構造を連結し且つある場合にはβ−シート構造の一部を形成するループを形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖内非共有相互作用によって正しい配向でＣＤＲの配置を提供する足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を形成するために働く。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合性ドメインは、免疫活性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、その同種エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を含有するアミノ酸は、それぞれ、これらが正確に定義されていることから、当業者によって所定の重鎖又は軽鎖可変領域について容易に確認されることができる（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）参照、これらはその全てが参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１８２】
当技術分野内で使用される及び／又は許容される用語について２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書で使用されるようにその用語の定義は、それとは反対に明記しない限りは全てのこのような意味を含むことを意図する。具体例は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの可変領域の中に認められる隣接しない抗原結合部位を説明するための用語“相補性決定領域”（ＣＤＲ）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されており（これらは参照として本明細書に組み込まれる）、この場合に、定義は、相互に比較される場合にはアミノ酸残基の重複又はサブセットを包含する。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書において定義され且つ使用される用語の範囲内にあることを意図する。上記で引用された参考文献のいずれかによって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、以下に比較として表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者は、どの残基が抗体の可変領域アミノ酸配列を与える特定のＣＤＲを含有するかを日常的に決定できる。
【０１８３】
【表１】
2009532027.tif 000003
１表１のＣＤＲの定義全てのナンバリングは、Ｋａｂａｔらによって示されたナンバリング規則に従う（以下、参照）
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用できる可変領域配列についてのナンバリング方式も定義した。当業者は、配列それ自体を超える実験データに依存することなく、任意の可変領域配列に対して“Ｋａｂａｔナンバリング”のこの体系を明確に割り当てることができる。本明細書で使用されるように、“Ｋａｂａｔ  ナンバリング”とは、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に示されたナンバリング方式を指す。特に明記しない限りは、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体の特定のアミノ酸残基部分のナンバリングに対する言及は、Ｋａｂａｔナンバリング方式に従う。
【０１８４】
ラクダ科動物種において、重鎖可変領域（ＶＨＨという）は、完全抗原結合性ドメインを形成する。ラクダ科動物ＶＨＨ可変領域及び従来抗体から誘導される可変領域（ＶＨ）の間の主な相違としては、（ａ）ＶＨＨの対応領域と比べてＶＨの軽鎖接触表面のより疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨのより長いＣＤＲ３、及び（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１とＣＤＲ３の間のジスルフィド結合の出現頻度が挙げられる。
【０１８５】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体、又は誘導体としては、以下に限定されないが、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含有するフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリン分子任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。
【０１８６】
抗体フラグメント（一本鎖抗体を含む）は、可変領域（１つ以上）を、単独で又は下記：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの全体又は一部と組み合わせて含有し得る。また、本発明には、可変領域（１つ以上）とヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせを含有する抗原結合フラグメントも含まれる。本発明の抗体又はその免疫特異的フラグメントは、任意の動物起源、例えば鳥類及び哺乳動物に由来するものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体、又はニワトリ抗体である。別の実施形態において、可変領域は、起源においてコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えば、サメ由来のもの）であり得る。本明細書で使用されるように、“ヒト”抗体としては、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ且つヒト免疫グロブリンライブラリーから単離される抗体、あるいは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離される抗体並びに以下に記載の及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載の内因性免疫グロブリンを発現しない抗体が挙げられる。
【０１８７】
本明細書で使用されるように、“重鎖部分”という用語は、免疫グロブリン重鎖から誘導されるアミノ酸配列を包含する。重鎖部分を含有するポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間部、及び／又は下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、あるいはこれらの変異体又はフラグメントの少なくとも１つを含有する。例えば、本発明で使用する結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及びＣＨ２ドメインを含有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖、あるいはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖を含有し得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖を含有する。また、本発明で使用する結合性ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全部又は一部）を欠いていてもよい。上記のように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）が自然発生免疫グロブリン分子由来のアミノ酸配列において異なるように修飾し得ることは、当業者には理解されるであろう。
【０１８８】
本明細書に記載のある種のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体において、多量体の１個のポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖の重鎖部分と同じである。あるいは、本発明の重鎖部分含有単量体同士は同じではない。例えば、各単量体は、例えば二重特異性抗体を形成する異なる標的結合部位を含有し得る。
【０１８９】
本明細書に開示された診断及び治療方法で使用する結合性ポリペプチドの重鎖部分は、種々の免疫グロブリン分子から誘導し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子から誘導されるＣＨ１ドメイン及びＩｇＧ３分子から誘導されるヒンジ領域を含有し得る。別の例において、重鎖部分は、一部分はＩｇＧ１分子から及び一部分はＩｇＧ３分子から誘導されるヒンジ領域を含有することができる。別の例において、重鎖部分は、一部分はＩｇＧ１分子から及び一部分はＩｇＧ４分子から誘導されるキメラヒンジを含有することができる。
【０１９０】
本明細書で使用されるように、“軽鎖部分”という用語は、免疫グロブリン軽鎖から誘導されるアミノ酸配列を包含する。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬ又はＣＬドメインの少なくとも１つを含有する。
【０１９１】
本明細書に開示されたＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいは抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、抗原のエピトープ（１つ以上）又は部分（１つ以上）、例えば、認識するか又は特異的に結合する標的ポリペプチド（ＩＧＦ−１Ｒ）に関して記載又は特定され得る。抗体の抗原結合性ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は、“エピトープ”又は“抗原決定基”である。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含有し得るが、典型的には少なくとも２個のエピトープを含有し、抗原の大きさ、立体配置及び種類に応じて多数のエピトープを含有することができる。また、標的ポリペプチド上の“エピトープ”が非ポリペプチド要素であってもよいし又は非ポリペプチド要素を含有していてもよいこと、例えば“エピトープ”が炭水化物側鎖を含有していてもよいことが認められるべきである。
【０１９２】
抗体のペプチド又はポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４個〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチド又はポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲが抗原性ペプチド又はポリペプチドをその三元体（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｆｏｒｍ）で認識できることから、エピトープを含有するアミノ酸は、隣接している必要がないし、及びある場合には、同じペプチド鎖上に存在していなくてもよい。本発明において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体によって認識されるペプチド又はポリペプチドエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は約１５個〜約２０個の連続又は不連続アミノ酸を含有する。
【０１９３】
“特異的に結合する”とは、一般に、抗体がその抗原結合性ドメインを介してエピトープに結合すること、及び結合が抗原結合性ドメインとエピトープの間である相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体がそのエピトープに、その抗原結合性ドメインを介して、任意の非関連エピトープに結合するよりも容易に結合する場合には、抗体はエピトープに“特異的に結合する”と言う。“特異性”という用語は、本明細書において、ある抗体があるエピトープに結合する相対親和性をいうのに使用される。例えば、抗体“Ａ”は、所定のエピトープについて抗体“Ｂ”よりも高い特異性を有するとみなしてよいし又は抗体“Ａ”は、関連エピトープ“Ｄ”について有するよりも高い特異性でエピトープ“Ｃ”に結合すると言い得る。
【０１９４】
“優先的に結合する”とは、抗体が関連エピトープ、同様のエピトープ、同種エピトープ、又は類似エピトープに結合するよりもより容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。従って、所定のエピトープに“優先的に結合する”抗体は、例えこのような抗体が関連エピトープと交差反応し得るとしても、関連エピトープに結合するよりもそのエピトープに結合するであろう。
【０１９５】
非限定的な例として、抗体は、第２のエピトープに対する抗体の解離定数（ＫＤ）よりも小さいＫＤで第１のエピトープを結合する場合には、第１のエピトープを優先的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例において、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも一桁小さい親和性で第１のエピトープを結合する場合には、第１のエピトープを優先的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例において、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも二桁小さい親和性で第１のエピトープを結合する場合には、第１のエピトープを優先的に結合するとみなしてよい。
【０１９６】
別の非限定的な例において、抗体は、第２のエピトープに対する抗体の解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｆｆ））よりも小さいｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープを結合する場合には、第１のエピトープを優先的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例において、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも一桁小さい親和性で第１のエピトープを結合する場合には、第１のエピトープを優先的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例において、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも二桁小さい親和性で第１のエピトープを結合する場合には、第１のエピトープを優先的に結合するとみなしてよい。
【０１９７】
本明細書に開示の抗体あるいは抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、本明細書に開示の標的ポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１、又は１０−３ｓｅｃ−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言い得る。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、又は１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１、又は１０−７ｓｅｃ−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言い得る。
【０１９８】
本明細書に開示の抗体あるいは抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、本明細書に開示の標的ポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言い得る。さらに好ましくは、本発明の抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、又は１０７ｓｅｃ−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言い得る。
【０１９９】
抗体は、エピトープに対する基準抗体の結合をある程度までブロックするという程度までそのエピトープに優先的に結合する場合には、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を競合的に阻害すると言い得る。競合阻害は、当技術分野において公知の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイで調べ得る。抗体は、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％まで競合的に阻害すると言い得る。
【０２００】
本明細書で使用されるように、“親和性”という用語は、個々のエピトープの免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、第２７−２８頁参照。本明細書で使用されるように、“結合活性”という用語は、１群の免疫グロブリンと抗原の間の結合体の全般的安定性、すなわち免疫グロブリン混合物と抗原の機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの第２９−３４頁参照。結合活性は、集団内の個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性、及び免疫グロブリン及び抗原の結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクロナール抗体と、重合体のような高反復エピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高結合活性の１つであろう。
【０２０１】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体はまた、その交差反応性に関して記載又は特定され得る。本明細書で使用されるように、“交差反応性”という用語は、ある抗原に特異的な抗体の第２の抗原に反応する能力；２つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度を指す。従って、抗体は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合には交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導性エピトープと同じ相補的構造特性の多くを有し、ある場合には実際には現物よりも適合し得る。
【０２０２】
例えば、ある抗体は、関連するが同じでないエピトープ、例えば基準エピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、及び少なくとも５０％同一性（当技術分野で公知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して算出される）を有するエピトープを結合するという点である程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、及び５０％未満の同一性（当技術分野で公知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して算出される）を有するエピトープを結合しない場合には、交差反応性は、ほとんどない又は全く有していないと言い得る。抗体は、あるエピトープについて、そのエピトープの他のアナローグ、オルソログ、又はホモローグを結合しない場合には“高特異性”であるとみなしてよい。
【０２０３】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体あるいは抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性に関して記載又は特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２０４】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体あるいは抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体は、“多特異性”、例えば、二重特異性、三重特異性又はそれよりも大きい多特異性であり、１つ以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）上に存在する２つ以上の異なるエピトープを認識し、同時に結合することを意味する。従って、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が“単一特異性”であるか又は“多特異性”、例えば“二重特異性”であるかは、結合性ポリペプチドが反応する多数の異なるエピトープを指す。多特異性抗体は、本明細書に記載の標的ポリペプチド種々のエピトープに特異的であり得るか、又は標的ポリペプチド及び異種エピトープ、例えば異種ポリペプチド又は固体支持材料に特異的であり得る。
【０２０５】
本明細書で使用されるように、“結合価”という用語は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、結合性ポリペプチド又は抗体中に存在する可能な結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を指す。それぞれの結合ドメインは、１つのエピトープを特異的に結合する。ＩＧＦ−１Ｒ抗体、結合性ポリペプチド又は抗体が２つ以上の結合ドメインを含有する場合には、それぞれの結合ドメインは、２つの結合ドメインを有する抗体について同じエピトープを特異的に結合し得る（“二価単一特異的”と呼ばれる）か又は２つの結合ドメインを有する抗体について異なるエピトープに特異的に結合し得る（“二価二重特異的”と呼ばれる）。抗体はまた、二重特異性であり且つそれぞれの特異性について二価であり得る（“二重特異性四価抗体”と呼ばれる）。別の実施形態において、四価ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）又はドメイン欠失抗体が調製され得る。
【０２０６】
二重特異性二価抗体及びその調製方法は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；第５，８０７，７０６号；第５，８２１，３３３号；及び米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号及び第２００２／０１５５５３７号に記載されており、これら全ての開示は、本明細書に参照として組み込まれる。二重特異性四価抗体及びその調製方法は、例えば、国際出願公開ＷＯ０２／０９６９４８号及びＷＯ００／４４７８８号に記載されている。この両方の開示は、本明細書に参照として組み込まれる。一般的には、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５号；ＷＯ９２／０８８０２号；ＷＯ９１／００３６０号；ＷＯ９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号；第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）参照。
【０２０７】
前記に示したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び３次元立体配置は周知である。本明細書で使用されるように、“ＶＨドメイン”という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変領域を包含し、また“ＣＨ１ドメイン”という用語は、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端）定常領域ドメインを包含する。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣り合っており且つ免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。
【０２０８】
本明細書で使用されるように、“ＣＨ２ドメイン”という用語は、慣用のナンバリングスキームを使用して例えば、抗体の約残基２４４個から残基３６０個まで伸びる重鎖分子の部分を包含する（残基２４４−３６０、Ｋａｂａｔナンバリング方式；及び残基２３１−３４０、ＥＵナンバリング方式；Ｋａｂａｔ  ＥＡら、ｏｐ．ｃｉｔ．参照）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対をなさないという点で独特である。むしろ、２つのＮ−結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。ＣＨ３ドメインがＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで伸び且つ約１０８個の残基を含有することも十分に文書で証明されている。
【０２０９】
本明細書で使用されるように、“ヒンジ領域”という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を包含する。このヒンジ領域は、約２５個の残基を含有する及び柔軟性があり、従って２個のＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン：上部ヒンジドメイン、中間ヒンジドメイン、及び下部ヒンジドメインに細分化し得る（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
【０２１０】
本明細書で使用されるように、“ジスルフィド結合”という用語は、２個の硫黄原子の間で形成される共有結合を包含する。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか又は第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含有する。大部分の天然ＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域とＣＬ領域は、スルフィド結合によって連結され、また２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリング方式を使用する２３９及び２４２に対応する位置（位置２２６又は２２９、ＥＵナンバリング方式）での２つのジスルフィド結合によって連結される。
【０２１１】
本明細書で使用されるように、“キメラ抗体”という用語は、免疫活性領域又は部位が第１の種から得られるか又は誘導され且つ定常領域（これは、無傷であってもよいし、部分であってもよいし又は本発明に従って修飾されていてもよい）が第２の種から得られる抗体を意味することを含むであろう。好ましい実施形態において、標的結合領域又は部位は、非ヒト起源（例えば、マウス又は霊長類）に由来するであろうし、定常領域はヒト由来のものである。
【０２１２】
本明細書で使用されるように、“操作された抗体”という用語は、抗体であって、重鎖及び軽鎖又はその両方のいずれかの可変領域が公知の特異性をもつ抗体由来の１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって及び必要ならば、部分的フレームワーク領域の置換及び配列変化によって変えられる抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が誘導される抗体と同じクラス又は場合によっては同じサブクラスの抗体から誘導し得るが、ＣＤＲが異なるクラスの抗体から、好ましくは異なる種由来の抗体から誘導されることが予想される。公知の特異性をもつ非ヒト抗体由来の１つ以上の“ドナー”ＣＤＲがヒト重鎖又は軽鎖フレームワーク領域にグラフトされている操作された抗体は、本明細書において“ヒト化抗体”という。ＣＤＲの全てをドナー可変領域由来の完全ＣＤＲで置換して一方の可変領域の抗原結合能を他方の可変領域の抗原結合能に移動させることは必ずしも必要でないかもしれない。むしろ、標的結合部位の活性を維持することが必要である残基を移動させることが必要であるだけであり得る。例えば米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号に記載の説明を考慮に入れると、日常実験を行うことによって又は試行錯誤試験によって機能的な操作された又はヒト化された抗体を得ることは、当業者の能力の範囲内に十分にあるであろう。
【０２１３】
本明細書で使用されるように、“適切に折り畳まれたポリペプチド”という用語は、ポリペプチドを含有する機能ドメインの全部が明らかに活性であるポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体）を包含する。本明細書で使用されるように、“不適切に折り畳まれたポリペプチド”という用語は、ポリペプチドの機能ドメインの少なくとも１つが活性ではないポリペプチドを包含する。一つの実施形態において、適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合によって連結されたポリペプチド鎖を含有し、また反対に、不適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合によって連結されていないポリペプチド鎖を含有する。
【０２１４】
本明細書で使用されるように、“操作された”という用語は、合成手段による（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成によるか、ペプチドの酵素的又は化学的結合によるか、あるいはこれらの方法の幾つかの組み合わせによる）核酸又はポリペプチド分子の操作を包含する。
【０２１５】
本明細書で使用されるように、“連結された”、“融合された”又は“融合”という用語は、同じ意味で使用される。これらの用語は、化学的結合又は組換え手段を含めたいずれかの手段による２つよりも多い要素又は成分の一緒の結合を包含する。“枠内融合”とは、元のＯＲＦの正確な翻訳読み取り枠を維持する方法で、連続するより長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチド読み取り枠（ＯＲＦ）の結合を指す。従って、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦ（このセグメントは、通常は全くそのように結合されていない）によってコードされたポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である。従って、読み取り枠は融合セグメント全体を通じて連続するが、セグメントは、例えば枠内リンカー配列によって物理的に又は空間的に分離されていてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、枠内で融合されていてもよいが、“融合”ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限りは、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又は別のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離されていてもよい。
【０２１６】
ポリペプチドとの関連で、“線状配列”又は“配列”とは、配列内の互いに隣り合っている残基がポリペプチドの一次構造において連続しているアミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチド内のアミノ酸の整列である。
【０２１７】
本明細書で使用されるように“発現”という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスとしては、細胞内の遺伝子の機能的な存在の発現、例えば、限定されることなく、遺伝子ノックダウン並びに一時的な発現及び安定な発現が挙げられる。このプロセスとしては、限定されることなく、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は他のＲＮＡ産物への転写、及びこのようなｍＲＮＡのポリペプチド（１つ以上）の翻訳が挙げられる。最終的な所望の産物が生化学物質である場合には、発現は、その生化学物質及び任意の前駆物質の作成を含む。遺伝子の発現は、“遺伝子産物”を産生する。本明細書で使用されるように、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、又は転写物から翻訳されるポリペプチドであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物としては、さらに転写後修飾、例えばポリアデニル化を有する核酸、又は翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク分解切断などを有するポリペプチが挙げられる。
【０２１８】
本明細書で使用されるように、“治療する”又は“治療”という用語は、目的は、好ましくない生理学的変化又は疾患、例えば癌の進行又は拡大を防止又は遅らせる（小さくする）べきである治療処置及び予防的又は予防措置の両方を指す。有益な又は望ましい臨床結果としては、以下に限定されないが、検出できるものであれ、検出できないものであれ症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、病気の進行の遅延又は減速、疾患の改善又は軽減、及び寛解（部分的又は全体的）が挙げられる。“治療”とは、治療を受けない場合に予期される生存と比べて延長する生存を意味することもできる。治療を必要としている人としては、病気又は疾患を既に有している人及び病気又は疾患を患う傾向がある人、あるいは病気又は疾患が予防されるべき人が挙げられる。
【０２１９】
“対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）”又は“個体”又は“動物”又は“患者”又は“哺乳動物”とは、診断、予後、又は治療を望む任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、家畜（ａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、及び動物園、運動又は愛玩動物、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、ウシ、乳牛などが挙げられる。
【０２２０】
本明細書で使用されるように、“結合性分子の投与により恩恵を受ける対象”及び“治療を必要とする動物”などの語句は、対象、例えば結合性分子によって認識される抗原の検出のため（例えば、診断方法のため）に使用される結合性分子の投与により及び／又は所定の標的タンパク質を特異的に結合する結合性分子を用いた癌などの病気の治療、すなわち、軽減又は予防により恩恵を受ける哺乳動物対象を包含する。本明細書においてさらに詳しく説明するように、結合性分子は、結合体化されていない形で使用できるし又は薬物、プロドラッグ、又は同位体に結合体化させることができる。
【０２２１】
“過剰増殖性疾患又は障害”とは、全ての新生細胞の成長及び増殖、悪性であろうと良性であろうと、例えば全ての形質転換細胞及び組織並びに全ての癌性細胞及び組織を意味する。過剰増殖性疾患又は障害としては、以下に限定されないが、前癌病変、異常細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍、及び“癌”が挙げられる。本発明のある実施形態において、過剰増殖性疾患又は障害、例えば、前癌病変、異常細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍、又は“癌”は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞を含有する。
【０２２２】
過剰増殖性疾患、障害及び／又は状態の別の例としては、以下に限定されないが、悪性であろうと良性であろうと、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎腺、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び生殖器系にある新生物が挙げられる。このような新生物は、ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する。
【０２２３】
別の過剰増殖性疾患としては、以下に限定されないが、高γグロブリン血症、リンパ球増殖性疾患、異常タンパク血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、及びその他の過剰増殖性疾患、さらには前記の器官系にある新形成が挙げられる。本発明のある実施形態において、前記疾患は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞を含む。
【０２２４】
本明細書で使用されるように、“腫瘍”又は“腫瘍組織”という用語は、過剰細胞分裂に起因する組織、ある場合にはＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞を含有する組織の異常塊を指す。腫瘍又は腫瘍組織は、異常成長特性を有し且つ有用な身体機能を有していない新生細胞である“腫瘍細胞”を含有する。腫瘍、腫瘍組織及び腫瘍細胞は、良性であってもよいし又は悪性であってもよい。腫瘍又は腫瘍組織はまた、“腫瘍関連非腫瘍細胞”、例えば腫瘍又は腫瘍組織を提供するために血管を形成する血管細胞も含有し得る。非腫瘍細胞は、腫瘍細胞によって、例えば腫瘍又は腫瘍組織における血管新生の誘導によって複製及び成長するために誘導され得る。
【０２２５】
本明細書で使用されるように、“悪性腫瘍”という用語は、非良性腫瘍又は癌を指す。本明細書で使用されるように、“癌”という用語は、無秩序の細胞増殖又は制御されない細胞増殖に特徴がある悪性腫瘍を含むある種の過剰増殖性疾患を意味する。癌の例としては、以下に限定されないが、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。このような癌のさらに具体的な例は、以下に記載され且つその例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮性扁平上皮細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、例えば消化管癌、膵癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌が挙げられる。“癌”という用語は、原発性悪性細胞又は腫瘍（例えば、元の悪性腫瘍又は腫瘍の部位以外患者の体の部位に移動していない悪性細胞又は腫瘍）及び続発性悪性細胞又は腫瘍（例えば、転移、すなわち元の腫瘍の部位と異なる二次的部位への悪性細胞又は腫瘍細胞の移動により生じる悪性細胞又は腫瘍）を包含する。本発明の治療方法に役立つ癌は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞を含む。
【０２２６】
癌又は悪性腫瘍の別の例としては、以下に限定されないが、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂癌及び尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部及び視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体及びテント上原始外胚葉腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚路及び視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮体癌、上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、毛髪細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高γグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性原発不明頸部扁平上皮癌、転移性原発性頸部扁平上皮癌、転移性頸部扁平上皮癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、妊娠中非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、原発不明転移性頸部扁平上皮癌、口腔咽頭癌、骨／悪性繊維性肉腫、骨肉腫／悪性繊維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性繊維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、異常タンパク血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、頸部扁平上皮癌、胃癌、テント上原始外胚葉及び松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、移行腎盂及び尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、ウィルム腫瘍、及びその他の過剰増殖性疾患、さらには上記の器官系にある新生物が挙げられる。
【０２２７】
本発明の方法は、前記の疾患に限定されないが前記疾患を含め、前癌状態を治療し且つ新生物又は悪性状態への進行を防止するに使用し得る。このような使用は、特に、過形成、化成、又は特に異形成症を含む非新生細胞増殖が生じた場合に、異常増殖又は癌への先立つ進行について知られるか又は疑われる状態において必要とされる（このような異常増殖状態の概説につていは、Ｒｏｂｂｉｎｓ及びＡｎｇｅｌｌ、Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ．６８−７９（１９７６）参照）。細胞がＩＧＦ−１Ｒを発現し始めるか、過剰発現し始めるか、又は異常発現し始めるこのような状態は、本発明の方法で特に治療できる。
【０２２８】
過形成は、構造又は機能の有意な変化なしに組織又は器官の細胞の数の増大を伴う制御された細胞増殖の１つの形である。本発明の方法で治療することができる過形成疾患としては、以下に限定されないが、脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖症、好酸球性増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖症、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺過形成、嚢胞性過形成、乳房の嚢胞性過形成、義歯性繊維症、導管過形成、子宮内膜増殖症、繊維筋性過形成、局所性上皮肥厚、歯肉増殖症、炎症性繊維性過形成症、炎症性乳頭状過形成症、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生性過形成、偽上皮腫性増殖、老人性脂腺増生症、及び疣贅性肥厚が挙げられる。
【０２２９】
化成は、ある種の成熟又は完全分化細胞が別種の成熟細胞に置き換わる制御された細胞増殖の１つの形である。本発明の方法で治療できる化生性疾患としては、以下に限定されないが、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、異型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、骨髄様化生、原発性骨髄様化生、続発性骨髄様化生、扁平上皮化生、羊膜扁平上皮化生、及び症候性骨髄化生が挙げられる。
【０２３０】
異形成症は、癌の前触れである場合が多く、主として上皮に認められる；異形成症は、非新生細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性及び細胞の構造配向の喪失を含む。異形成細胞は、異常に大きく、濃く染色される核を有する場合が多く、多形性を示す。異形成症は、慢性的な刺激又は炎症が存在する場合に特徴的に生じる。本発明の方法で治療できる異形成疾患としては、以下に限定されないが、無汗性外胚葉性異形成症、前後形成異常症、窒息性胸部形成異常、心房指状異形成症、気管支肺異形成症、脳異形成症、頸部異形成症、軟骨外胚葉性異形成症、鎖骨頭蓋異形成症、先天性外胚葉性異形成症、頭蓋骨幹異形成症、頭蓋手根骨足根骨異形成症、頭蓋骨幹端異形成症、象牙質異形成症、骨幹異形成症、外胚葉異形成、エナメル質異形成症、脳眼異形成症、片肢性骨端異形成症、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、顎の家族性繊維性異形成症、家族性白色屈曲異形成症、繊維筋性異形成症、繊維性骨異形成症、開花性骨異形成症、遺伝性腎網膜形成異常、発汗性外胚葉形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少胸腺形成異常、乳腺異形成症、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ型内耳形成異常、単発性繊維性骨異形成、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖セメント質異形成症、多発性繊維性骨異形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔視覚異形成症、脊柱骨端異形成症及び心室橈骨形成異常が挙げられる。
【０２３１】
本発明の方法で治療できる別の新生物発生前疾患としては、以下に限定されないが、良性の異常増殖性疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性疾患、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、及び食道異形成症）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、及び日光性角化症が挙げられる。
【０２３２】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、癌、特に上記に挙げた癌の増殖、進行及び／又は転移を阻止するのに使用できる。
【０２３３】
別の過剰増殖性疾患、障害、及び／又は状態としては、以下に限定されないが、悪性腫瘍及び関連疾患、例えば白血病（例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病））、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非−ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、重鎖病、及び固体腫瘍、例えば、以下に限定されないが、肉腫及び癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨液肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルム腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴覚経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜細胞腫の進行及び／又は転移が挙げられる
ＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒ
自然発生インスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）ＩＧＦ−１Ｒは、ジスルフィド結合によって連結された２つのα−サブユニット（それぞれ１３０  ＫＤａ）と２つのβ−サブユニット（それぞれ９０  ＫＤａ）を含むヘテロ四量体形質膜糖タンパク質である。Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．及びＣｚｅｃｈ、Ｍ．Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５０３８−５０４５（１９９２）。ＩＧＦ−１Ｒはまた、当技術分野においてＣＤ２２１及びＪＴＫ１３という名前でも知られている。ヒトＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００８７５として入手でき、本明細書に配列番号：１として示す。
【０２３４】
【数１】
2009532027.tif 000004
【０２３５】
【数２】
2009532027.tif 000005
前駆物質ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿０００８６６として入手でき、本明細書に配列番号：２として示す。
【０２３６】
【数３】
2009532027.tif 000006
配列番号：２のアミノ酸１−３０は、ＩＧＦ−１Ｒシグナルペプチドをコードすることが報告されており、配列番号：２のアミノ酸３１−７４０は、ＩＧＦ−１Ｒ  α−サブユニットをコードすることが報告されており、及び配列番号：２のアミノ酸７４１−１３６７は、ＩＧＦ−１Ｒ  β−サブユニットをコードすることが報告されている。ＮＰ＿０００８６６  ＧｅｎＢａｎｋ  ｅｎｔｒｙに報告されているヒトＩＧＦ−１Ｒのこれらの特徴及びその他の特徴を表２に示す。
【０２３７】
【表２】
2009532027.tif 000007
本発明はまた、非ヒトＩＧＦ−１Ｒタンパク質、例えば、げっ歯類又は非ヒト霊長類由来のＩＧＦ−１Ｒに特異的に、優先的に又は競合的に結合するＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体に関する。
【０２３８】
ＩＧＦ−１Ｒは、多数の腫瘍細胞、例えば、以下のあるものに限定されないが、膀胱腫瘍（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３（２００３））；脳腫瘍（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１８２２（２００２））；乳房腫瘍（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０：３０７（１９９４）及びＨｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．３６：４４８−４４９（２００５））；結腸腫瘍、例えば、腺癌、転移、及び腺腫（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．３０：１１２８（１９９９）、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ．Ａｒｃ．４４３：１３９（２００３）、及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：８４３（２００４））；胃腫瘍（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２１：７５５（２００４））；腎臓腫瘍、例えば、明細胞、嫌色素性及び乳頭状ＲＣＣ（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２２：９３１−９３７（２００４））；肺腫瘍（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３−８０８（２００３）及びＪ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌ．１１９：６６５−６６８（１９９３））；卵巣腫瘍（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３−８０８（２００３））；膵臓腫瘍、例えば、導管腺癌（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｃｉ．４８：１９７２−１９７８（２００３）及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：３２３３−３２４２（２００５））；及び前立腺腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２９４２−２９５０（２００２））において発現される。
ＩＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体
１つの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体に関する。例えば、本発明は、表３及び４に示すある種のモノクロナール抗体、並びにそのフラグメント、変異体、及び誘導体の少なくとも抗原結合性ドメインを包含する。表３は、実施例にさらに詳しく記載した、ファージディスプレイライブラリー及び抗体の種々の結合特性から確認されるヒト抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ領域を記載する。表４は、実施例にさらに詳しく記載した、ハイブリドーマ技術、及び抗体の種々の結合特性によって確認されたマウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒモノクロナール抗体を記載する。
【０２３９】
【表３】
2009532027.tif 000008
【０２４０】
【表４−１】
2009532027.tif 000009
Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の完全長抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（“ＡＴＣＣ”）に２００６年３月２８日付で寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４及びＰＴＡ−７４４５それぞれを得た。Ｆａｂ抗体フラグメントＭ１４−Ｇ１１を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（“ＡＴＣＣ”）に２００６年８月２９日付で寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５を得た。
【０２４１】
完全長ヒト抗体Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、及びＰ１Ａ２．２Ｂ１１を発現するハイブリドーマ細胞系は、ＡＴＣＣにそれぞれ２００６年３月２８日、２００６年６月１３日及び２００６年３月２８日付けで寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５８、ＰＴＡ−７７３２、及びＰＴＡ−７４５７、それぞれを得た。完全長ヒト抗体２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８を発現するハイブリドーマ細胞系は、それぞれ２００６年３月２８日、２００６年７月１１日及び２００６年７月１１日付けで寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５６、ＰＴＡ−７７３０、及びＰＴＡ−７７３１それぞれを得た。抗体及び寄託細胞系の相互関係についてはＡＴＣＣ寄託表（以下）を参照。
【０２４２】
ＡＴＣＣは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに置かれている。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項に従ってなされた。
【０２４３】
本発明のある実施形態は、以下の表（“ＡＴＣＣ寄託表”）に示すアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託した。
【０２４４】
【表４−２】
2009532027.tif 000010
本明細書で使用されるように、“抗原結合性ドメイン”という用語は、抗原（例えばＩＧＦ−１Ｒのエピトープ）上のエピトープを特異的に結合する部位を包含する。抗体の抗原結合性ドメインは、典型的には免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部を含有する。これらの可変領域によって形成される結合部位は、抗体の特異性を決定する。
【０２４５】
本発明は、さらに詳しくは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体であって、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−ＢＯ１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する、ＩＧＦ−１Ｒ抗体あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。
【０２４６】
本発明は、さらに、ＩＧＦ−Ｒ１抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体であって、ＩＧＦ−Ｒ１抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないように競合的に阻害する、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。
【０２４７】
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体であって、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択されるモノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体の抗原結合性ドメインと同じ抗原結合性ドメインを含有する、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体又は誘導体に関する。
【０２４８】
抗体の調製方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される。一度、種々のフラグメントに対する抗体、又はシグナル配列を有していない完全長ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体が産生されると、抗体又は抗原結合性フラグメントがＩＧＦ−１Ｒのどのアミノ酸又はエピトープに結合するかを調べることは、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコル及び当技術分野で公知の方法で調べることができる（例えば、“Ｃｈａｐｔｅｒ  １１−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅら，ｖ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載のような二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）。別のエピトープマッピングプロトコルは、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に見出し得る。上記の両方は、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。エピトープマッピングはまた、市販の手段で行うこともできる（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ、Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））。
【０２４９】
さらに、ＩＧＦ−１Ｒの任意の部分に結合する産生された抗体は、次いで、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに対するインスリン成長因子、例えばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方の結合を阻害するために、ＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進するために、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害するために、下流のリン酸化、例えば、Ａｋｔ又はｐ４２／４４ＭＡＰＫの下流のリン酸化を阻害するために、あるいは腫瘍細胞の増殖、運動性又は転移を阻害するために、ＩＧＦ−１Ｒのアンタゴニストとして作用するその能力について選別することができる。抗体は、これらの特性及びその他の特性について実施例に詳しく記載した方法に従って選別することができる。本発明の抗体の他の機能は、本明細書に記載の他のアッセイを使用して試験することができる。
【０２５０】
他の実施形態において、本発明は、エピトープが配列番号：２の少なくとも約４個〜５個のアミノ酸、配列番号：２の少なくとも７個、少なくとも９個、又は少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含むなるか、該アミノ酸のみから本質的になるか又は該アミノ酸のみからなる、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体を包含する。前記の配列番号：２の所定のエピトープのアミノ酸は、連続しているか又は線状であってもよいが、連続しているか又は線状である必要はない。ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面で発現されるか又は例えばＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合された可溶性フラグメントとして発現されるようなＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインによって形成される非線状ドメインを含むか、該非線状ドメインのみから本質的になるか又は該非線状ドメインのみからなる。従って、ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、配列番号：２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５個〜約３０個、あるいは少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、又は１００個の連続又は不連続アミノ酸を含むか、該アミノ酸のみから本質的になるか、又は該アミノ酸のみからなり、この場合の不連続アミノ酸は、タンパク質折り畳みによってエピトープを形成する。
【０２５１】
他の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、誘導体であって、エピトープが、前記の配列番号：２の１個、２個、３個、４個、５個、６個以上の連続又は不連続アミノ酸の他に、タンパク質を修飾する別の部分、例えば炭水化物部分は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、修飾された標的タンパク質を、該タンパク質の未修飾バージョンに結合するよりも高い親和性で結合するように含まれていてもよい糖質部分を含むか、該糖質部分のみから本質的になるか、又は糖質部分のみからかる、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体を包含する。あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、標的タンパク質の未修飾バージョンを全く結合しない。
【０２５２】
ある態様において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに、所定の基準モノクロナール抗体についての解離定数（ＫＤ）よりも小さいＫＤによって特徴付けられる親和性で、特異的に結合する抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体に関する。
【０２５３】
ある実施形態において、本発明の抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、誘導体は、前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわちこのようなエピトープに非関連又はランダムエピトープに結合するよりも容易に結合するか；前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、このようなエピトープに、関連の、同様の、同種の、類似のエピトープに結合するよりも容易に結合するか；それ自体が前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体のあるエピトープに特異的に又は優先的に結合する基準抗体の結合を競合的に阻害するか；あるいは前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体の少なくとも１つのエピトープに、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、又は約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤによって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する。具体的な態様において、前記抗体又はそのフラグメントは、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメントに比べて、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメントに優先的に結合する。別の具体的態様において、前記抗体又はそのフラグメントは、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、例えば、１つ以上の哺乳動物ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドに優先的に結合するが、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）ポリペプチドには結合しない。理論に束縛されるものではないが、インスリン受容体ポリペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドと幾つかの配列類似性を有することが知られており、ＩｎｓＲと交差反応する抗体は、インビボで望まれていない副作用、例えばグルコース代謝の妨害を生じ得る。
【０２５４】
抗体結合解離定数との関連で使用されるように、“約”という用語は、抗体親和性を測定するのに利用される方法に固有の変化の程度を考慮に入れる。例えば、使用する装置の精度の程度、測定される試料の数に基づく標準誤差、及び丸め誤差に応じて、“約１０−２Ｍ”という用語は、例えば０．０５Ｍから０．００５Ｍまでを含み得る。
【０２５５】
特定の実施形態において、本発明の抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１、又は１０−３ｓｅｃ−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。あるいは、本発明の抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、又は１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１、又は１０−７ｓｅｃ−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。
【０２５６】
他の実施形態において、本発明の抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。あるいは、本発明の抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１あるいは１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。
【０２５７】
種々の実施形態において、本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ＩＧＦ−１Ｒ活性をもつアンタゴニストである。ある実施形態において、例えば、腫瘍細胞上で発現されるＩＧＦ−１Ｒに対するアンタゴニストＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合は、ＩＧＦ−１Ｒに対するインスリン成長因子、例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方の結合を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進し、それによってそのシグナル伝達能を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害するか、シグナル伝達経路の下流の分子、例えば、Ａｋｔ又はｐ４２／４４  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害するか、あるいは腫瘍細胞の増殖、運動性又は転移を阻害する。
【０２５８】
明記しない限りは、本明細書で使用されるように、抗体に関連して“そのフラグメント“とは、抗原結合性フラグメント、すなわち、抗原に特異的に結合する抗体の部分を指す。１つの実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、本発明の抗体は、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、二重特異性抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、又は２つ以上のエピトープ、例えば、２つ以上の抗原又は同一抗原上の２つ以上のエピトープについて結合特異性を有する融合タンパク質である。１つの実施形態において、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。別の実施形態において、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、標的ポリペプチド上のエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメイン及び薬物又は毒素に特異的な少なくとも１つの標的結合ドメインを有する。さらに別の実施形態において、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチド上のエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメイン及びプロドラッグに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な２つの標的結合ドメイン及び第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有する４価抗体であり得る。従って、４価二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、それぞれの特異性について２価であり得る。
【０２５９】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、当業者に公知であるように、１つ以上のエフェクター機能を媒介する定常領域を含有することができる。例えば、抗体定常領域に対する補体のＣ１要素の結合は、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用及び溶解に重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏にも関与し得る。また、抗体は、Ｆｃ領域を介して種々の細胞上の受容体に結合し、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体結合部位は細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。種々のクラスの抗体、例えばＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）に特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、多数の重要且つ多様な生物学的反応、例えば抗体被覆粒子の取込及び破壊、免疫結合体体の浄化、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞障害、すなわちＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエータの放出、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を誘発する。
【０２６０】
従って、本発明のある実施形態は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体であって、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも１つの画分が、欠失しているか、又は所望の生化学的性質、例えばほぼ同じ免疫原性をもつ完全な変化のない抗体と比べた場合に、エフェクター機能の低下、非共有的に二量化する能力、腫瘍の部位で局限する能力の上昇、血清半減期の低下、又は血清半減期の増大を提供するように変化されている、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体を包含する。例えば、本明細書に記載の診断及び治療方法で使用されるある抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似したポリペプチド鎖を含有するが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠いているドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体においては、修飾された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失しているであろう、例えば、ＣＨ２ドメインの全部又は一部が欠失しているであろう。他の実施形態において、本明細書に記載の診断及び治療方法で使用されるある抗体は、本明細書の他の個所で“ａｇｌｙ”抗体と呼ばれる、グリコシル化を除外するために変化させた定常領域、例えばＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。理論に束縛されるものではないが、“ａｇｌｙ”抗体は向上したインビボ安全性及び安定性プロフィルを有し得ると考えられる。
【０２６１】
本明細書に記載の、あるＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体において、そのＦｃ部分は、当技術分野において公知の方法を使用してエフェクター機能を低下させるために変異させ得る。例えば、定常領域ドメインの欠失又は不活性化（点変異又は他の手段による）は、血中修飾抗体のＦｃ受容体結合を抑制し、それによって腫瘍局在を増加させ得る。別の場合に、それは、本発明と一致する定常領域の修飾は、補体結合を緩和し、従って血清半減期及び結合体化細胞毒の非特異的結合を軽減することであり得る。定常領域のさらに別の修飾は、増大した抗原特異性又は抗体柔軟性により高められた局在を可能にさせるジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を修飾するのに使用し得る。得られる生理学的プロフィル、生体利用性及び修飾の他の生化学的効果、例えば腫瘍局在、体内分布及び血清半減期は、過度の実験を行うことなく周知の免疫学的方法を使用して容易に測定及び定量し得る。
【０２６２】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体の修飾体は、全前駆物質又は親抗体から、当技術分野で公知の方法を使用して調製できる。典型的な方法は、本明細書でさらに詳しく論じる。
【０２６３】
ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体の可変領域及び定常領域の両方は、完全にヒト由来のものである。完全ヒト抗体は、当技術分野において公知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して調製できる。例えば、特異抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与に反応してこのような抗体を産生するために修飾されているが、その内在性遺伝子座（ｌｏｃｉ）が機能不能にされているトランスジェニック動物に、前記抗原を投与することによって調製できる。このような抗体を調製するのに使用できる典型的な方法は、米国特許：第６，１５０，５８４号；第６，４５８，５９２号；第６，４２０，１４０号に記載されている。他の方法は、当技術分野において知られている。完全ヒト抗体は、同様に、本明細書の他の個所でさらに詳しく説明するように、種々のディスプレイ技術、例えば、ファージディスプレイ又は他のウイルスディスプレイ系で産生させることができる。
【０２６４】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、当技術分野において公知の方法を使用して調製又は製造できる。ある実施形態において、抗体分子又はそのフラグメントは、“組み換えにより産生される”、すなわち組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。抗体分子又はそのフラグメントを調製するための典型的な方法は、本明細書の他の個所でさらに詳しく論じる。
【０２６５】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体はまた、例えば、共有結合が、抗体がその同種エピトープに特異的に結合するのを妨害しないように、抗体に対する任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を包含する。例えば、限定の目的ではないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質に対する連結などによって修飾されている抗体が挙げられる。多数の化学修飾のいずれかを、公知の方法、例えば、以下に限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などによって行い得る。さらに、誘導体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０２６６】
ある実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、治療すべき動物において、例えばヒトにおいて、有害な免疫応答を誘発しないであろう。１つの実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、当技術分野で認められている方法を使用してその免疫原性を低下させるために修飾される。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫することができるし、又はキメラ抗体が調製できる。これらの種類の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するか又は実質的に保持するが、ヒトにおいて低免疫原性である非ヒト抗体、典型的にはマウス又は霊長類抗体から誘導される。これは、種々の方法で、例えば（ａ）非ヒト可変領域全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を生成させることによって；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部をヒトフレームワーク及び定常領域に、フレームワーク残基を保持しながら又は保持することなくグラフトすることによって；又は（ｃ）非ヒト可変領域全体を移植するが、これらを表面残基の置換によるヒト様セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）で“覆う”ことによって達成し得る。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、並びに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１９０，３７０号に開示されている。これらは全部、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。
【０２６７】
脱免疫はまた、抗体の免疫原性を低下させるのに使用できる。本明細書で使用されるように、“脱免疫”という用語は、はＴ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を包含する（例えば、国際出願公開ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、ＷＯ００３４３１７Ａ２号参照）。例えば、出発抗体由来のＶＨ及びＶＬ配列が分析され、それぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ“マップ”は、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びその他のキー残基に関連してエピトープの配置を示す。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープが、最終抗体の活性を変化させる低い危険性で、別のアミノ酸置換を確認するために分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含有する一連の代替ＶＨ及びＶＬ配列が設計され、これらの配列は、その後に一連の結合性ポリペプチド、例えば本明細書に開示の診断及び治療方法で使用されるＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントに組み込まれ、次いで機能について試験される。典型的には、１２〜２４個の変異体抗体が作成され、試験される。修飾されたＶ領域及びヒトＣ領域を含有する完全な重鎖及び軽鎖遺伝子は、次いで発現ベクターにクローン化され、その結果生じたプラスミドが全抗体の産生のために細胞系に導入される。次いで、抗体は、適切な生化学的及び生物学的アッセイにおいて比較され、最適変異体が確認される。
【０２６８】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、当技術分野において公知の適当な方法で生じさせ得る。興味ある抗原に対するポリクロナール抗体は、当技術分野において周知の種々の方法で産生させ得る。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、抗原に特異的なポリクロナール抗体を含有する血清の産生を誘導するために、種々の宿主動物、例えば、以下に限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヒツジ、ロバなどに投与することができる。種々のアジュバントが、宿主の種に応じて免疫反応を高めるために使用し、該アジュバントとしては、以下に限定されないが、フロイント（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール・リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルヴァム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。このようなアジュバントもまた当技術分野において周知である。
【０２６９】
モノクロナール抗体は、当技術分野において公知の様々な方法を使用して、例えばハイブリドーマ、組換え体の使用、及びファージディスプレイ法、あるいはこれらの組み合わせを使用して調製できる。例えば、モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ法、例えば当技術分野において公知であり且つ例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）に教示されているハイブリドーマ法を使用して産生できる（前記の参考文献は、その全てが参照として組み込まれる）。本明細書で使用されるように“モノクロナール抗体”という用語は、ハイブリドーマ法によって産生される抗体に限定されない。“モノクロナール抗体”という用語は、単一クローン、例えば真核生物クローン、原核生物クローン、又はファージクローンから誘導され且つそれが産生される方法ではないクローンを指す。従って、“モノクロナール抗体”という用語は、ハイブリドーマ法によって産生される抗体に限定されない。モノクロナール抗体は、エピトープ認識の領域を増加させるためにＩＧＦ−１Ｒノックアウトマウスを使用して調製できる。モノクロナール抗体は、当技術分野において公知の様々な方法、例えば本明細書の他の個所に記載のようなハイブリドーマ及び組換え体の使用並びにファージディスプレイ法を使用して調製できる。
【０２７０】
当技術分野で認められているプロトコルを使用して、１つの例において、抗体は、哺乳動物中で関連抗原（例えば、精製ＩＧＦ−１ＲあるいはＩＧＦ−１Ｒを含有する細胞又は細胞抽出物）及びアジュバントの頻回皮下又は腹腔内注射によって上昇される。この免疫化は、典型的には、活性化脾臓細胞又はリンパ球から抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。生じた抗体はポリクロナール調剤を提供するために動物の血清から採取し得るが、多くの場合にモノクロナール抗体（ＭＡｂ）の均質調剤を提供するために脾臓、リンパ節又は末梢血から個々のリンパ球を単離することが望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から得られる。
【０２７１】
この周知の方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注射されている哺乳動物に由来する比較的短命であるか又は死ぬべき運命のリンパ球が不死腫瘍細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）と融合され、このようにして不死であり且つＢ細胞の遺伝子コード化抗体を産生できるハイブリッド細胞すなわち“ハイブリドーマ”を産生する。得られるハイブリッドは、選別、希釈、及び再増殖によって単一の遺伝子株に分離され、それぞれ個々の株は単一抗体の形成に特異的な遺伝子を含有する。これらは、産所望の抗原に対して同質である抗体を産生し、その純粋な遺伝起源に関連して、“モノクロナール”と呼ばれる。
【０２７２】
このようにして調製されるハイブリドーマ細胞は、未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有することが好ましい適当な培地に接種され、増殖される。当業者には、ハイブリドーマの形成、選別及び増殖用の試薬、細胞系及び培地は多数の供給源から商業的に入手でき且つ標準化されたプロトコルが十分に確立されていることが認められるであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が増殖する培地が、所望の抗原に対するモノクロナール抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、インビトロアッセイ、例えば免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で決定される。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性及び／又は活性をもつ抗体を産生することが確認された後に、クローンは限界希釈法によってサブクローン化し、標準法で増殖させ得る（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎｌａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９−１０３（１９８６））。また、サブクローンによって分泌されるモノクロナール抗体は、培地、腹水又は血清から、慣用の精製法で、例えばプロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーで分離し得ることが認められるであろう。
【０２７３】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の方法で生じさせ得る。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え技術によって産生させ得るか、あるいは酵素、例えばパパイン（Ｆａｂフラグメントを産生させるため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生させるために）を使用して免疫グロブリン分子のタンパク分解切断によって産生させ得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０２７４】
また、当業者には、抗体又は抗体フラグメント（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡもまた、抗体ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーから誘導し得ることが認められるであろう。特に、このようなファージは、レパートリー又は組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現される抗原結合性ドメインを表示するのに利用できる。興味のある抗原を結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原を使用するか、あるいは固体表面に又はビーズに固定又は捕捉された抗原を使用して、選択又は確認することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖又は重鎖由来の個々のＦｖ領域）を有するファージから発現されたｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含有するか、あるいはファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換えによって融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを含有する線状ファージである。典型的な方法は、例えば、欧州特許公告第ＥＰ３６８  ６８４Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．及びＣｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に示されている。これらはそれぞれ、参照として本明細書に組み込まれる。幾つかかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））は、鎖シャフリング、並びに大きなファージライブラリーを構築するための方法として組み合わせ感染及びインビボ組換えによる高親和性ヒト抗体の産生を記載している。別の実施形態において、リボソームディスプレイ法が、ディスプレイプラットホームとしてバクテリオファージを置換するのに使用できる（例えば、Ｈａｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；又はＩｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）参照）。さらに別の実施形態において、細胞表面ライブラリーが、抗体について選別できる（Ｂｏｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。このような方法は、モノクロナール抗体の単離及びその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ法の代替を提供する。
【０２７５】
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、これらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子に表面に表示される。例えば、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ組織のヒト又はマウスｃＤＮライブラリー）又は合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅されるか、あるいは単離される。ある実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲでｓｃＦＶＬリンカーにより一緒に結合され、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６又はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）にクローン化される。ベクターは、大腸菌に電気穿孔され、この大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的にはｆｄ及びＭ１３を含有する線状ファージであり、ＶＨ又はＶＬ領域は、通常はファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩいずれかに組換えにより融合される。興味のある抗原（すなわち、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント）に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば固体表面又はビーズに固定又は捕捉された標識抗原又は抗原を使用して選択又は同定できる。
【０２７６】
抗体を調製するのに使用できるファージディスプレイ法の別の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号；ＷＯ９１／１０７３７号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９３／１１２３６号；ＷＯ９５／１５９８２号；ＷＯ９５／２０４０１号；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号及び５，９６９，１０８号に記載の方法が挙げられる；これらのそれぞれは、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。
【０２７７】
前記参考文献に記載のように、ファージ選別後に、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、完全抗体、例えばヒト抗体、又は任意の他の所望の抗原結合性フラグメントを生成させるのに使用し、任意の所望の宿主、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌において発現させる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え産生させる方法もまた、当技術分野において公知の方法、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；並びにＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記の参考文献は、その全てが参照として本明細書に組み込まれる）に記載の方法を使用して用いることもできる。
【０２７８】
一本鎖Ｆｖｓ及び抗体を産生させるのに使用できる方法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載の方法が挙げられる。ヒトでの抗体のインビボ使用及びインビトロ検出アッセイを含め幾つかの用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を使用することが好ましいものであり得る。キメラ抗体は、抗体の種々の部分が種々の動物種から誘導される分子、例えばマウスモノクロナール抗体及びヒト免疫グロブリン定常領域から誘導される可変領域を有する抗体である。キメラ抗体を産生させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；及び第４，８１６，３９７号参照。これらは、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する所望の抗原を結合する非ヒト種抗体である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変させるために、好ましくは向上させるためにＣＤＲ供与抗体由来の対応残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を確認するためにＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル化及び特定の位置での異常なフレームワーク残基を確認するための配列比較によって確認される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）参照、これはその全てが参照として本明細書に組み込まれる）。抗体は、当技術分野において公知の様々な方法、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許ＥＰ２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号参照）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６号；ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９１３（１９９４））、及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用してヒト化することができる。
【０２７９】
完全ヒト抗体が、ヒト患者の治療に特に望ましい。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な方法、例えばヒト免疫グロブリン配列から誘導される抗体ライブラリーを使用する前記のファージディスプレイ法で調製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；並びにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号、及びＷＯ９１／１０７４１号も参照；これらのそれぞれは、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。
【０２８０】
また、ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して産生させることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子結合体体は、無作為に又は相同的組換えによってマウス胚幹細胞に導入し得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子の他に、マウス胚幹細胞に導入し得る。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個に又は同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生を阻止する。修飾された胚幹細胞は、拡大され、未分化胚細胞に微量注入されて、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスは、飼育されてヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば所望の標的ポリペプチドの全体又は部分を用いて通常の方法で免疫される。抗原に対するモノクロナール抗体は、慣用のハイブリドーマ法を使用して免疫化トランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって含有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配置され、その後にクラススイッチンング及び体細胞変異を行う。従って、このような方法を使用して、治療に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を産生させることができる。ヒト抗体を産生させるためのこの方法の概説に関しては、Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）が参照される。ヒト抗体及びヒトモノクロナール抗体を産生させるためのこの方法及びこのような抗体を産生させるためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；及び第５，９３９，５９８号が参照される。これらは、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。また、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）及びＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）などの会社が、前記の方法と同様の方法を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供するのに関与し得る。
【０２８１】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、“ガイディッド・セレクション（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）”と呼ばれる技術を使用して生成させることができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導くのに使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９−９０３（１９８８）。米国特許第５，５６５，３３２号も参照）。
【０２８２】
また、本発明の標的ポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の方法を使用して標的ポリペプチドを“模倣する（ｍｉｍｉｃ）”抗イディオタイプ抗体を作り出すのに次々に利用できる。（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）及びＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）参照）。例えば、本発明のポリペプチドに結合し、ポリペプチド多量体化及び／又はリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体は、ポリペプチド多量体化及び／又は結合ドメインを“模倣する（ｍｉｍｉｃ）”抗イディオタイプを作り出すのに使用でき、結果としてポリペプチド及び／又はそのリガンドに結合し、これらを中和することができる。このような中和抗イディオタイプ又はこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、治療計画においてポリペプチドリガンドを中和するのに使用できる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体は、所望の標的ポリペプチドを結合し及び／又はそのリガンド／受容体を結合し、それによってその生物活性を妨害するのに使用できる。
【０２８３】
別の実施形態において、所望のモノクロナール抗体をコードするＤＮＡは、慣用の方法を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定し得る。単離され、サブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一度単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され、次いで原核生物又は真核宿主細胞、例えば以下に限定されないが、別の方法で免疫グロブリンを産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞に移入され得る。さらに詳しくは、単離ＤＮＡ（これは本明細書に記載のようにして合成し得る）は、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（これは、本明細書に参照として組み込まれる）に記載のような抗体を製造するためのクローン定常領域及び可変領域配列に使用し得る。本質的に、これは、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの転化、及びＩｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴う。この目的に適したプライマーもまた米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下でさらに詳しく論じるように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリの臨床及び商用供給量を提供するために比較的多量に増殖させ得る。
【０２８４】
１つの実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも２つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも３つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも４つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも５つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲを含有する。対象ＩＧＦ−１Ｒ抗体に含有され得る少なくとも１つのＣＤＲを含有する典型的な抗体分子は、本明細書に記載される。
【０２８５】
具体的な実施形態において、重鎖及び／又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を確認するために、当技術分野において周知の方法で、例えば配列超可変性の領域を調べるために他の重鎖及び軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列と比較することによって詳しく調べ得る。常用の組換えＤＮＡ法を使用して、１つ以上のＣＤＲを、非ヒト抗体をヒト化するためにフレームワーク領域内に、例えばヒトフレームワーク領域内に挿入し得る。フレームワーク領域は、天然又は共通フレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）参照）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組み合わせによって生じるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましく、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で行い、好ましくは、アミノ酸置換は、抗体のその抗原に対する結合を向上させる。さらに、このような方法は、１個以上の鎖中ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成するために鎖中ジスルフィド結合に関与する１個以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を行うのに使用し得る。ポリヌクレオチドの別の改変は、本発明によって包含され且つ当技術分野範囲に包含される。
【０２８６】
また、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性をもつヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングによって“キメラ抗体”を産生させるために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用できる。本明細書で使用されるように、キメラ抗体は、種々の部分が種々の動物種から誘導される分子、例えばマウスモノクロナール抗体から誘導される可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子、例えばヒト化抗体である。
【０２８７】
あるいは、一本鎖抗体の産生のための記載されている方法（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；及びＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：５４４−５５４（１９８９））が、一本鎖抗体を作成するのに適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖及び軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋によって連結し、一本鎖抗体を得ることによって形成される。大腸菌中で機能的Ｆｖフラグメントを組立てる方法もまた、使用し得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２８８】
本発明のさらに別の実施形態は、内因性免疫グロブリンを産生できないトランスジェニック動物（例えば、マウス）（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号及び第５，５８９，３６９号参照、これらのそれぞれは、参照として本明細書に組み込まれる）においてヒト抗体又は実質的にヒト抗体を作成することを含む。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖結合性領域のホモ接合性欠失が内因性抗体産生の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスに対するヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、抗原投与と同時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を作り出す別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号（これは、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質もまた本明細書に記載のようにして単離し、操作し得ることが認められるであろう。
【０２８９】
組換え抗体を生じさせるためのさらに別の高効率手段は、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。具体的には、この方法は、サル可変領域及びヒト定常領域配列を含有する霊長類化抗体の作成をもたらす。この参考文献は、その全体を本明細書に参照として組み込まれる。さらに、この方法は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号及び第５，７５６，０９６号（これらのそれぞれは、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２９０】
別の実施形態において、リンパ球は顕微操作によって選択し、可変領域遺伝子群を単離し得る。例えば、末梢血単核細胞は、免疫哺乳動物から単離し、インビトロで約７日間培養し得る。培養物は、選別基準を満たす特定のＩｇＧについて選別できる。陽性ウエルから細胞を単離できる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳで単離できるし又はこれらを補体介在溶血プラークアッセイで確認することによって単離できる。Ｉｇ産生Ｂ細胞は、管内に顕微操作することができ、ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクター中にクローン化し、発現用の細胞（例えば、真核又は原核生物細胞）に移入することができる。
【０２９１】
あるいは、抗体産生細胞系を、選択し、当業者に周知の方法を使用して培養し得る。このような方法は、様々な実験室マニュアル及び一次刊行物に記載されている。この点で、以下に記載のように本発明において使用するのに適当な方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている（これは、補足を含めその全てが参照として本明細書に組み込まれる）。
【０２９２】
本発明の抗体は、抗体の合成について当技術分野において公知の任意の方法で、特に化学合成によって又は好ましくは本明細書に記載のような組換え発現法で産生させることができる。
【０２９３】
１つの実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、１つ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している（“ドメイン欠失抗体”である）合成定常領域を含有する。ある実施形態において、適合した修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠失組立て体又は変異体（ΔＣＨ２組立て体）を含有するであろう。別の実施形態について、短い連結ペプチドが、可変領域について柔軟性及び移動の自由を提供するために欠失ドメインの代わりに使用され得る。当業者には、このような組立て体が、抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性により特に好ましいことが認められるであろう。ドメイン欠失組立て体は、ＩｇＧ１ヒト定常領域をコードするベクターを使用して誘導することができる（例えば、国際出願公開ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号及びＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号参照）。このベクターは、操作されてＣＨ２ドメインを欠失し、ドメイン欠失ＩｇＧ１ヒト定常領域を発現する合成ベクターを提供する。
【０２９４】
ある実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ミニボディーである。ミニボディーは、当技術分野に記載の方法を使用して調製できる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号又は国際公開ＷＯ９４／０９８１７Ａ１号参照）。
【０２９５】
１つの実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、単量体サブユニット同士の間で結合を可能にする限りは、数個又は場合によっては１個のアミノ酸の欠失又は置換を有する免疫グロブリン重鎖を含有する。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域の１個のアミノ酸の変異は、実質的にＦｃが結合するのを抑制するのに十分であり、それによって腫瘍の局在を高め得る。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインのその部分を簡単に欠失することが望ましいものであり得る。定常領域のこのような部分欠失は、対象の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を無傷の状態にしながら、抗体（血清半減期）の選択された特性を向上させ得る。また、上記で言及したように、開示の抗体の定常領域は、得られる組立て体のプロフィルを高める１個以上のアミノ酸の変異又は置換による合成物質であり得る。この点で、修飾抗体の立体配置及び免疫原性プロフィルを実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を妨害することが可能であり得る。さらに別の実施形態は、エフェクター機能などの望ましい特性を高めるか又はより多くの細胞毒又は糖質の結合を提供するために１個以上のアミノ酸の付加を含有する。このような実施形態において、選択された定常領域ドメインから誘導される特定の配列を挿入又は複製することが望ましいものであり得る。
【０２９６】
本発明はまた、本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、該変異体から本質的になるか、又は該変異体のみからなる抗体を提供し、抗体又はそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体に免疫特異的に結合する。当業者に公知の標準方法が、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするヌクレオチド配列の変異、例えば、以下に限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発及びＰＣＲ介在変異誘発を誘導するのに使用できる。好ましくは、前記変異体（誘導体を含む）は、基準ＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲｌ、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲｌ、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３に対して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、又は２個未満のアミノ酸置換をコードする。“保存アミノ酸置換”は、アミノ酸残基が同様の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。同様の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基の群は、当技術分野で定義されている。これらの群としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいは、変異は、コード化配列の全体又は部分に沿って、例えば飽和変異誘発によって、無作為に誘導することができ、得られる変異体は、活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドを結合能）を保持する変異体を確認するために生物活性について選別することができる。
【０２９７】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域にのみ又はＣＤＲ領域にのみ変異を導入することができる。導入された変異は、サイレント変異又は中立ミスセンス変異であり得る、すなわち、抗体の抗原結合能に全く又はほとんど影響を及ぼさない、実際に、幾つかのこのような変異はアミノ酸配列を何であれ変化させない。これらの型の変異は、コドン使用頻度を最適化するか、又はハイブリドーマの抗体産生を向上させるのに有用であり得る。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするコドン最適化コード領域は、本明細書の他のどこかに開示される。あるいは、非中立ミスセンス変異は、抗体の抗原結合能を変化させ得る。大部分のサイレント変異及び中立ミスセンス然変異の位置は、おそらくはフレームワーク領域内に存在するように思われ、これに対して大部分の非中立ミスセンス変異の位置はおそらくはＣＤＲ内にあるように思われる。しかし、これは絶対条件ではない。当業者は、所望の性質、例えば抗原結合活性の未変化又は結合活性の変化（例えば、抗原結合活性の向上又は抗体特異性の変化）を有する変異体分子を設計し、試験することができるであろう。変異誘発後に、コード化タンパク質は、日常的に発現させ、コード化タンパク質の機能活性及び／又は生物活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを免疫特異的に結合する能力）を、本明細書に記載の方法を使用して又は当技術分野において公知の修飾方法で調べることができる。
【０２９８】
ＩＶ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体をコードする核酸分子を提供する。
【０２９９】
１つの実施形態において、本発明は、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ又は重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の基準重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。あるいは、前記ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、表５に示すポリペプチド配列に関連したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０３００】
【表５−１】
2009532027.tif 000011
【０３０１】
【表５−２】
2009532027.tif 000012
【０３０２】
【表５−３】
2009532027.tif 000013
【０３０３】
【表５−４】
2009532027.tif 000014
【０３０４】
【表５−５】
2009532027.tif 000015
【０３０５】
【表５−６】
2009532027.tif 000016
＊Ｋａｂａｔ体系（上記参照）によって調べた
Ｎ＝ヌクレオチド配列、Ｐ＝ポリペプチド配列。
【０３０６】
当技術分野で公知のように、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド同士の間の“配列同一性”は、１つのポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸又は核酸配列を、第２のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で論じる場合に、特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるか否かは、当技術分野で公知の方法及びコンピュータープログラム／ソフトウエア、例えば、以下に限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム  （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局部相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列の相同性の最もよいセグメントを見つけ出す。ＢＥＳＴＦＩＴ又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明の基準配列と９５％同一であるか否かを決定する場合には、そのパラメーターは、もちろん、参照ポリペプチド配列の完全長にわたって算出されるように及び参照配列中のアミノ酸の総数の最大５％までの相同性のギャップが許されるように設定される。
【０３０７】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。ある実施形態において、ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それによってコードされるアミノ酸配列を変化させることなく改変される。例えば、配列は、スプライス部位を除去するか、又は制限酵素部位を除去するために、所定の種における改良されたコドン使用頻度について改変され得る。これらのような配列最適化は、実施例に記載され、当業者によって日常的に行われる。
【０３０８】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表５に示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３０９】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的になるか、又は該ＶＨのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクロナール抗体又はフラグメントをＩＧＦ−１Ｒに結合させないように競合的に阻害するであろう。
【０３１０】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的になるか、又は該ＶＨのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３１１】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドであって、軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ又は軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の基準軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の基準軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、表６に示すポリペプチド配列に関連したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０３１２】
【表６−１】
2009532027.tif 000017
【０３１３】
【表６−２】
2009532027.tif 000018
【０３１４】
【表６−３】
2009532027.tif 000019
【０３１５】
【表６−４】
2009532027.tif 000020
＊Ｋａｂａｔ体系（上記参照）によって調べた
ＰＮ＝ヌクレオチド配列、ＰＰ＝ポリペプチド配列。
【０３１６】
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３１７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同じポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３１８】
別の態様において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群をコードするヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列によってコードされる、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３１９】
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的になるか、又は該ＶＬのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクロナール抗体又はフラグメントをＩＧＦ−１Ｒに結合させないように競合的に阻害するであろう。
【０３２０】
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的になるか、又は該ＶＬのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３２１】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３よりなる群から選択される基準ＶＨポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＨをコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２２】
別の態様において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３よりなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２３】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７、及び６２よりなる群から選択される基準核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＨコード核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２４】
別の態様において、本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨのアミノ酸配列が配列番号：４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３よりなる群から選択される、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸の配列が配列番号：３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７、及び６２よりなる群から選択される、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２５】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的になるか、又は該ＶＨのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクロナール抗体又はフラグメントをＩＧＦ−１Ｒに結合させないように競合的に阻害するか、あるいは、このようなモノクロナール抗体をＩＧＦ−１Ｒに結合させないように競合的に阻害するであろう。
【０３２６】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的になるか、又は該ＶＨのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３２７】
別の実施形態において、本発明は、離ポリヌクレオチドであって、配列番号：６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８よりなる群から選択されるアミノ酸を有する基準ＶＬポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＬをコードする核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２、及び１１７よりなる群から選択される参照核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＬコード化核酸を含むか、該核酸から本質的になるか、又は該核酸のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２８】
別の態様において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８よりなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、本発明のＶＬをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸の配列が配列番号：６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２、及び１１７よりなる群から選択される、本発明のＶＬをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、又は該核酸配列のみからなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２９】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的になるか、又は該ＶＬのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクロナール抗体又はフラグメントをＧＦ−１Ｒに結合させないないように競合的に阻害するであろう。
【０３３０】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的になるか、又は該ＶＬのみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３３１】
前記のポリヌクレオチドのいずれかは、さらに、別の核酸であって、例えば、コード化ポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載のような抗体定常領域、又は本明細書に記載のような他の異種ポリペプチドをコードする別の核酸を包含する。
【０３３２】
また、本明細書に他の個所でさらに詳しく記載するように、本発明は、前記のポリヌクレオチドの１つ以上を含有するポリヌクレオチドを含む組成物を包含する。１つの実施形態において、本発明は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む組成物であって、前記第１のポリヌクレオチドが本明細書に記載のＶＨポリペプチドをコードし及び前記第２のポリヌクレオチドが本明細書に記載のＶＬポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を包含する。具体的には、組成物は、ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドを含むか、ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドから本質的になるか、又はＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドのみからなり、この場合に前記ＶＨポリヌクレオチド及び前記ＶＬポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号：４及び６８、８及び７３、１４及び７８、２０及び８３、２６及び８８、３２及び９３、３８及び９８、４３及び１０３、４８及び１０８、５３及び１０３、５８及び１１３、及び６３及び１１８よりなる群から選択される基準ＶＬ及びＶＬポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一のポリペプチドをコードする。あるいは、組成物は、配列番号：３及び６７、８及び７２、１３及び７７、１８及び７７、１９及び８２、２４及び８２、２５及び８７、３０及び８７、３１及び９２、３６及び９２、３７及び９７、４２及び１０２、４７及び１０７、５８及び１０２、５７及び１１２、及び６２及び１１７よりなる群から選択される基準ＶＬ及びＶＬ核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一のＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドを含むか、該ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチから本質的になるか、又は該ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドのみからなる。ある実施形態において、このような組成物中のポリヌクレオチドによってコードされるＶＨ及びＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３３３】
本発明はまた、本明細書の他の個所に記載のようなポリヌクレオチドのフラグメントを包含する。本明細書に記載のように、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント、及び他の誘導体をコードする別のポリヌクレオチドも本発明によって意図される。
【０３３４】
前記ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の方法で産生又は製造し得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合には、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されている）から組立て、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含有するオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、これらオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、次いで連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０３３５】
あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適当な供給源由来の核酸から作り出し得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、抗体分子の配列が公知である場合には、該抗体をコードする核酸は、化学的に合成し得るし、あるいは適当な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又は抗体又は他のＩＧＦ−１Ｒ抗体を発現する任意の組織又は細胞、例えば抗体を発現させるために選択されるハイブリドーマ細胞から単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ、から作り出されるｃＤＮＡライブラリー）から、３’末端及び５’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを使用してＰＣＲによって得てもよいし、あるいは例えば、抗体又は他のＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンを同定する特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得てもよい。ＰＣＲによって生成された増幅核酸は、次いで当技術分野で周知の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローン化させ得る。
【０３３６】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体のヌクレオチド配列及び対応アミノ酸配列が一度決定されると、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ法、部位特異的変異誘発法、ＰＣＲ法など（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載の方法を参照、これらは両方共に本明細書においてその全てが参照として組み込まれる）を使用して操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作り出し得る、例えば、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を作り出し得る。
【０３３７】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドからなり、これは未修飾ＲＮＡ又はＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡからなることができるし、一本鎖及び二本鎖領域の混和物であるＤＮＡからなることができるし、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡからなることができるし、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混和物であるＲＮＡを含むことできるし、一本鎖であり得るか又はさらに典型的には二本鎖であり得るか、あるいは一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含有するハイブリッド分子を含むことができる。また、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡを含有するか、あるいはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含有する三重鎖領域を含むことができる。ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾された塩基又は安定性の理由から又は他の理由から修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ主鎖を含有していてもよい。“修飾された”塩基としては、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの独特な塩基が挙げられる。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行い得る；従って“ポリヌクレオチド”は、化学修飾体、酵素修飾体、又は代謝修飾体を包含する。
【０３３８】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖部分又は軽鎖部分）から誘導されるポリペプチドの非天然変異体をコードする単離ポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失がコード化タンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失を、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作成することができる。変異は、標準方法で、例えば部位特異的変異誘発及びＰＣＲ介在変異誘発によって導入し得る。好ましくは、保存アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
【０３３９】
Ｖ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチド
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を構成する単離ポリペプチド、及びこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン分子から誘導されるＩＧＦ−１Ｒ−特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含有する。指定されたタンパク質“から誘導される”ポリペプチド又はアミノ酸配列とは、あるアミノ酸配列を有するポリペプチドの起源を指す。ある場合には、特定の出発ポリペプチド又はアミノ酸配列から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列のアミノ酸配列、又はその部分と本質的に同じアミノ酸配列を有し、この場合の前記部分は、少なくとも１０−２０個のアミノ酸からなるか、少なくとも２０−３０個のアミノ酸からなるか、少なくとも３０−５０個のアミノ酸からなるか、又は別の方法で当業者に出発配列中にその起源を有すると識別可能である。
【０３４０】
１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリペプチドであって、前記重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つ又は前記重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する基準重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリペプチドを提供する。あるいは、前記ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する基準重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、上記の表５に示す群に関連したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表５は、Ｋａｂａｔ体系によって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ体系によって定義されるＶＨ−ＣＤＲも本発明に包含される。ある実施形態において、前記ＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４１】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表５に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリペプチドを提供する。ある実施形態において、前記ＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４２】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表５に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する（但し、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲ中の１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸置換を除く）、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリペプチドを提供する。大きいＣＤＲ、例えば、ＶＨ−ＣＤＲ−３において、ＶＨ−ＣＤＲを含有するＶＨがＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する限りは、ＣＤＲにおいてさらなる置換を行い得る。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。ある実施形態において、前記ＶＨを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４３】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号：配列番号：４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３よりなる群から選択される基準ＶＨポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一のＶＨポリペプチドを含むか、該ＶＨポリペプチドから本質的になるか、又は該ＶＨポリペプチドのみからなる単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４４】
別の態様において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号：配列番号：４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３よりなる群から選択されるＶＨポリペプチドを含むか、該ＶＨポリペプチドから本質的になるか、又は該ＶＨポリペプチドのみからなる単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４５】
ある実施形態において、前記のＶＨポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＨポリペプチドの１つ以上から本質的になるか、又は該ＶＨポリペプチドの１つ以上のみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクロナール抗体又はフラグメントをＩＧＦ−１Ｒに結合させないように競合的に阻害するであろう。
【０３４６】
ある実施形態において、前記ＶＨポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＨポリペプチドの１つ以上から本質的になるか、又は該ＶＨポリペプチドの１つ以上のみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３４７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリペプチドであって、前記軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ又は前記重鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する基準重鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリペプチドを提供する。あるいは、前記ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクロナールＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する基準重鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、上記の表６に示すポリペチド群に関連したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表６は、Ｋａｂａｔ体系によって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ体系によって定義されるＶＬ−ＣＤＲも本発明に包含される。ある実施形態において、前記ＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４８】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、前記ＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４９】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する（但し、任意の１個のＶＬ−ＣＤＲの１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸置換を除く）、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的になるか、又はそれのみからなる単離ポリペプチドを提供する。大きいＣＤＲにおいて、ＶＬ−ＣＤＲを含有するＶＬがＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する限りは、ＶＬ−ＣＤＲにおいてさらなる置換が行われ得る。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。ある実施形態において、前記ＶＬを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５０】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号：６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８よりなる群から選択される基準ＶＬポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％と同一のＶＬポリペプチドを含むか、該ＶＬポリペプチドから本質的になるか、又は該ＶＬポリペプチドのみからなる単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５１】
別の態様において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号：６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８よりなる群から選択されるＶＬポリペプチドを含むか、該ＶＬポリペプチドから本質的になるか、又は該ＶＬポリペプチドのみからなる単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５２】
ある実施形態において、前記のＶＬポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＬポリペプチドの１つ以上から本質的になるか、又は該ＶＬポリペプチドの１つ以上のみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクロナール抗体又はフラグメントをＩＧＦ−１Ｒに結合させないように競合的に阻害するであろう。
【０３５３】
ある実施形態において、前記のＶＬポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＬポリペプチドの１つ以上から本質的になるか、又は該ＶＬポリペプチドの１つ以上のみからなる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はそのフラグメント、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３５４】
他の実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含むか、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドのみから本質的になるか、又はＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドのみからなり、この場合に、前記ＶＨポリペプチド及び前記ＶＬポリペプチドは、それぞれ、配列番号：４及び６８、８及び７３、１４及び７８、２０及び８３、２６及び８８、３２及び９３、３８及び９８、４３及び１０３、４８及び１０８、５３及び１０３、５８及び１１３、及び６３及び１１８よりなる群から選択される基準ＶＬ及びＶＬポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。ある実施形態において、これらのＶＨ及びＶＬポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５５】
前記のポリペプチドのいずれかは、さらに別のポリペプチド、例えばコードされたポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載のような抗体定常領域、又は本明細書に記載のような他の異種ポリペプチドを包含する。また、本発明のポリペプチドは、他の個所に記載のようなポリペプチドフラグメントを包含する。さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のような、融合ポリペプチド、Ｆａｂフラグメント、及び他の誘導体を包含する。
【０３５６】
また、本明細書の他の個所にさらに詳しく記載するように、本発明は、前記のポリペプチドを含む組成物を包含する。
【０３５７】
また、当業者には、本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、これらが誘導される天然の結合性ポリペプチドに由来するアミノ酸配列において変化するように修飾されていてもよいことが理解されるであろう。例えば、指定されたタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と類似していてもよく、例えば該出発配列とある一定の％の同一性を有していてもよく、例えば出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であってもよい。
【０３５８】
さらにまた、“非必須”アミノ酸領域において同類置換又は変化を招くヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は挿入が行われていてもよい。例えば、指定されたタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、１個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を除いて、出発配列と同一であってもよい。指定されたタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、１個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を除いて、出発配列と同一であってもよい。他の実施形態において、指定されたタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を除いて、出発配列と同一であってもよい。ある実施形態において、指定されたタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と比べて１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、又は１〜２０個の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する。
【０３５９】
本発明のあるＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列からなるか、該アミノ酸配列から本質的になるか、該アミノ酸配列のみからなる。しかし、あるＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、別の哺乳動物種から誘導される１個以上の連続するアミノ酸を含有する。例えば、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、霊長類重鎖部分、ヒンジ部分、又は抗原結合部分を含有し得る。別の例において、１個以上のマウス由来のアミノ酸は、非マウス抗体ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位に存在し得る。別の例において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位は、完全にマウス由来のものである。ある治療用途において、ＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は類似物質は、抗体が投与される動物において免疫原性であるように設計される。
【０３６０】
ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、抗体と正常に結合しないアミノ酸配列あるいは１つ以上の部分を含有する。典型的な修飾を、以下でさらに詳しく説明する。例えば、本発明の一本鎖ｆｖ抗体フラグメントは、フレキシブルリンカー配列を含有してもよいし、又は機能性部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、又は標識）を付加するために修飾されていていもよい。
【０３６１】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、融合タンパク質からなるか、該融合タンパク質から本質的になるか、又は該融合タンパク質のみからなる。融合タンパク質は、キメラ分子であって、例えば、少なくとも１つの標的結合部位と、少なくとも１つの異種部分、すなわち性質においてそれと自然に連結されない部分を有する免疫グロブリン抗原結合性ドメインを含有するキメラ分子である。アミノ酸配列は、通常は、融合ポリペプチド中に一緒にもたらされる別個のタンパク質中に存在していてもよいし又は該アミノ酸配列は、通常は、同じタンパク質中に存在していてもよいが、融合ポリペプチド中に新たな配置で配置される。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって作り出し得るか、又はペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを作成し、翻訳することによって作り出し得る。
【０３６２】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用される“異種”という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが比較される要素の残部の要素と異なる要素から誘導されることを意味する。例えば、本明細書で使用されるように、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は類似物質に融合されるべき“異種ポリペプチド”は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、あるいは異なる種の免疫グロブリン又は非免疫グロブリンポリペプチドから誘導される。
【０３６３】
“保存アミノ酸置換”とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基の群、例えば、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）は、当技術分野において定義されている。従って、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖の群に由来する別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。別の実施形態において、一連のアミノ酸は、側鎖群の構成メンバーの順序及び／又は組成において異なる構造上類似の一連のアミノ酸で置換することができる。
【０３６４】
あるいは、別の実施形態において、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発によって、免疫グロブリンコード化配列の全体又は部分に沿ってランダムに導入されていてもよく、得られる突然変異体は、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用されるＩＧＦ−１Ｒ抗体に組み込まれ、その所望の抗原、例えばＩＧＦ−１Ｒに対する結合能について選別できる。
【０３６５】
ＶＩ．融合タンパク質及び抗体結合体
本明細書の他の個所でさらに詳しく論じるように、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、さらに異種ポリペプチドにＮ−又はＣ−末端で組換えにより融合させ得るか、あるいはポリペプチド又は他の組成物に化学的に結合体化（例えば、共有結合又は非共有結合による結合体化）させ得る。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ−特異的ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子に及びエフェクター分子、例えば異種ポリペプチド、薬物、腫放射性核種、又は毒素に組換えにより融合又は結合体化させ得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５号；ＷＯ９１／１４４３８号；ＷＯ８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；及び欧州特許第３９６，３８７号参照。
【０３６６】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体としては、すなわち、共有結合が、抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合することを妨害しないように、抗体に対する任意の種類の分子の共有結合によって修飾されている誘導体が挙げられる。例えば、限定の目的ではないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィレーション（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質に対する連結などによって修飾されている抗体が挙げられる。多数の化学修飾が、公知の方法によって、例えば、以下に限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などによって実施し得る。さらに、前記誘導体は、１個又それ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０３６７】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわちアイソスターによって相互に結合されたアミノ酸から構成され、また２０個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体は、ナチュラルプロセス、例えば翻訳後プロセシングによって、又は当技術分野において周知の化学修飾法によって修飾し得る。このような修飾は、基本的な教科書、より詳細なモノグラフ、並びに多数の研究文献に記載されている。修飾は、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体のどこかで、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端で、あるいは糖質などの部分で生じ得る。同じ種類の修飾が所定のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体の幾つかの部位に同程度で又は種々の程度で存在し得ることが認められるであろう。また、所定のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体は、多数の種類の修飾を含有し得る。ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体は、ユビキチン化の結果として分岐していてもよいし、分岐を有するか又は有せずに環状であってもよい。環状、分岐、及び分岐環状ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体は、翻訳後ナチュラスプロセスの結果として生じ得るか又は合成法によって作り得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン化、硫酸化、タンパク質に対するアミノ酸の転写ＲＮＡ介在付加、例えばアルギニン化、及びユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【０３６８】
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体と、異種ポリペプチドとを含有する融合タンパク質を提供する。抗体が融合する異種ポリペプチドは、機能的に有用であり得るし又はＩＧＦ−１Ｒポリペプチドを発現する細胞を標的とするのに有用である。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の１つ以上のＶＨ領域のアミノ酸配列又は本発明の抗体あるいはそのフラグメント又は変異体の１つ以上のＶＬ領域のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む、該ポリペプチドから本質的になるか、又は該ポリペプチドのみからなる。別の実施形態において、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体、あるいはそのフラグメント、変異体、又は誘導体の１個、２個又は３個のＶＨ−ＣＤＲのアミノ酸配列、あるいはＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体、あるいはそのフラグメント、変異体、又は誘導体の１個、２個又は３個のＶＨ−ＣＤＲのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、該ポリペプチドから本質的になるか、又は該ポリペプチドのみからなる。１つの実施形態において、融合タンパク質は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体、又は変異体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含有してなり、該融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体の少なく１つのＶＨ領域のアミノ酸配列と、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体あるいはそのフラグメント、誘導体又は変異体の少なく１つのＶＬ領域のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。融合タンパク質のＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する単一起源の抗体（あるいはｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）に相当することが好ましい。さらに別の実施形態において、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体の任意の１個、２個又は３個のＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列と、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体、あるいはそのフラグメント又は変異体の任意の１個、２個又は３個のＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。２個、３個、４個、５個、６個、又はそれ以上のＶＨ−ＣＤＲ又はＶＬ−ＣＤＲは、本発明の単一起源の抗体（あるいはｓｃＦｖ又はＦａｂフラグメント）に相当することが好ましい。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明に包含される。
【０３６９】
文献に報告された典型的な融合タンパク質としては、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７−３５３（１９９０）；及びＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；及びＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８及びＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；及びＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；及びＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ及びＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８（１９９１））の融合体が挙げられる。
【０３７０】
本明細書の他の個所で論じるように、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ポリペプチドのインビボ半減期を増大させために又は免疫測定法で使用するために、当技術分野において公知の方法を使用して異種ポリペプチドに融合し得る。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体にそのインビボ半減期を増大させるために結合体化させ得る。Ｌｅｏｎｇ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；又はＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）。
【０３７１】
また、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、これらの精製又は検出を促進するためにペプチドなどの標識配列に融合させることができる。好ましい実施形態において、標識アミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター中に提供される標識（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ，９１３１１）、であり、特に、その多くは商業的に入手できる。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）で論じられているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用な他のペプチド標識としては、以下に限定されないが、“ＨＡ”標識（これは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープに対応する）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））及び“ｆｌａｇ”標識が挙げられる。
【０３７２】
融合タンパク質は、当技術分野において周知の方法を使用して調製できる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び第５，２２５，５３８号参照）。融合が行われる正確な部位は、融合タンパク質の分泌及び結合特性を最適化するために実験的に選択し得る。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、発現用の宿主細胞に移入しる。
【０３７３】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、結合体化されていない形で使用し得るし、又は様々な分子の少なくとも１つに、例えば、該分子の得る治療特性を向上させるために、標的検出を促進するために、あるいは患者の画像化又は治療のために結合体化し得る。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、精製を行う場合には、精製の前に又は後に、標識するか又は結合体化し得る。
【０３７４】
特に、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、又はＰＥＧに結合体化させ得る。
【０３７５】
当業者には、結合体はまた、結合体化させるべき選択された薬剤に応じて様々な方法を使用して組み立て得る。例えば、ビオチンとの結合体は、例えば結合性ポリペプチドを、ビオチンの活性化エステル、例えばビオチンＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルと反応させることによって調製される。同様に、蛍光標識との結合体は、カップリング剤、例えば本明細書に記載のカップリング剤の存在下で又はイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応で調製し得る。本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体の結合体は、同様の方法で調製される。
【０３７６】
本発明はまた、診断又は治療剤に結合体化させた本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体を包含する。ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、例えば、所定の治療及び／又は予防計画の有効性を調べるための臨床試験手順の一部として、例えば神経疾患の発生又は進行を監視するのに診断使用できる。検出は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体を検出可能な物質に連結することによって促進できる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影法を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断法として使用される抗体に結合体化させることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号参照。適当な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適当な補欠族結合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。
【０３７７】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体はまた、それを化学発光化合物に連結することによって検出可能に標識できる。この場合に、化学発光標識されたＩＧＦ−１Ｒ抗体の存在は、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって調べられる。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０３７８】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体を検出可能に標識できる方法の一つは、これらを酵素に連結し、得られた連結生成物を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら、（ｅｄｓ．），酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、化学書院、東京（１９８１）。ＩＧＦ−１Ｒ抗体に結合される酵素は、適当な基質、好ましくは色素形成基質と、例えば分光光度手段、蛍光光度手段又は視覚手段で検出できる化学部分を生成するような方法で反応するであろう。抗体を検出可能に標識するのに使用できる酵素としては、以下に限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。また、検出は、酵素用の色素形成基質を用いる比色法で達成できる。検出はまた、同様に調製された標準と比較して基質の酵素反応の程度を目視比較することによっても達成し得る。
【０３７９】
検出はまた、他の様々な免疫検定法を使用して達成し得る。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体を放射活性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用により抗体を検出することができる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６）参照。これらは参照として本明細書に組み込まれる）。放射性同位元素は、手段、例えば、以下に限定されないが、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、又はオートラジオグラフィーで検出できる。
【０３８０】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体はまた、蛍光放射金属、例えば１５２Ｅｕ、又はランタニド系列の金属を使用して検出可能に標識できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して、抗体に結合することができる。
【０３８１】
Ｔ種々の部分を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体に結合体化させるための方法は、周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｄｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、及びＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）参照。
【０３８２】
特に、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、細胞毒（例えば、放射性同位元素、細胞障害性薬剤、又は毒素）、治療剤、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、免疫活性リガンド（例えば、調節性分子が新生細胞及びエフェクター細胞、例えばＴ細胞の両方に結合するリンホカイン又は他の抗体）、又はＰＥＧに結合体化させ得る。別の実施形態において、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用する結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、腫瘍の血管新生を減少させる分子に結合体化させることができる。他の実施形態において、開示の組成物は、薬物又はプロドラッグに連結させた結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを含有し得る。本発明のさらに別の実施形態は、特定の生体毒素又はその細胞障害性フラグメント、例えばリシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素に結合体化された結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントの使用を含む。使用すべき結合体化又は非結合体化結合性分子の選択は、癌の種類及び病期、補助的治療（例えば、化学療法又は外部放射）の使用並びに患者の状態に依存するであろう。当業者がこのような選択を本明細書の教示を考慮して容易になし得ることが認められるであろう。
【０３８３】
過去の研究において、同位体で標識された抗腫瘍抗体が、動物モデルにおいて、及びある場合にはヒトにおいて固形腫瘍及びリンパ腫／白血病の細胞を破壊するのに首尾よく使用されてきたことが認められるであろう。典型的な放射性同位元素としては、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅが挙げられる。放射性核種は、核ＤＮＡにおいて多数の鎖切断を引きこし、細胞死を招く電離放射線を生じることによって作用する。治療用結合体を製造するのに使用される同位体は、典型的には、短いパス長を有する高エネルギーα又はβ粒子を生成する。このような放射性核種は、これらが極めて接近している細胞、例えば、前記結合体が結合しているか又は入っている新生細胞を殺す。これら放射性核種は、非局在細胞に対してはほとんど又は全く影響を及ぼさない。放射性核種は、本質的に非免疫原性である。
【０３８４】
本発明に関連して放射性標識結合体の使用に関して、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、直接に標識し得てもよいし（例えば、ヨウ素化によって）又はキレート化剤の使用によって間接的に標識してもよい。本明細書で使用されるように、“直接標識”及び“間接標識アプローチ”という語句は、両方共に、キレート化剤が結合性分子に共有結合される及び少なくとも１つの放射線核種がキレート化剤と結合されることを意味する。このようなキレート化剤は、典型的には、ポリペプチド及び放射性同位元素の両方を結合することから、二価キレート化剤と呼ばれる。特に好ましいキレート化剤は、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン四酢酸（“ＭＸ−ＤＴＰＡ”）及びシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（“ＣＨＸ−ＤＴＰＡ”）誘導体である。他のキレート化剤は、Ｐ−ＤＯＴＡ及びＥＤＴＡ誘導体を含む。間接標識に特に好ましい放射性核種としては、１１１Ｉｎ及び９０Ｙが挙げられる。
【０３８５】
本明細書で使用されるように、“直接標識”及び“間接標識アプローチ”という語句は共に、放射線核種がポリペプチドに（典型的にはアミノ酸残基）によって共有結合されることを意味する。さらに詳しくは、これらの連結法としては、ランダム標識化及び部位特異的標識化が挙げられる。後者の場合には、標識化は、ポリペプチド上の特定部位、例えば結合体のＦｃ部分上にのみ存在するＮ−結合糖残基に対して行われる。また、種々の直接標識法及びプロトコルが本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９標識ポリペプチドは、リガンド交換法によって調製し得るし、スズイオン溶液を用いて過テクネチウム酸（ＴｃＯ４−）を還元し、還元されたテクネチウムをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム上でキレート化し、このカラムに結合性ポリペプチドを適用することによって調製し得るし、又はバッチ標識法によって、例えば過テクネチウム酸、ＳｎＣｌ２のような還元剤、フタル酸ナトリウム・カリウム溶液のような緩衝液、及び抗体をインキュベートすることによって調製し得る。いずれにしても、抗体を直接標識するのに好ましい放射性核種は、当技術分野において周知であり、直接標識するのに好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有結合された１３１Ｉである。本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、例えば、放射性ヨウ化ナトリウム又はカリウム及び化学酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど、又は酵素酸化剤、例えばラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、及びグルコースを用いて誘導し得る。
【０３８６】
キレート剤及びキレート剤結合体に関する特許は、当技術分野において公知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミン五酢酸キレート及びそれを含有するタンパク質結合体、並びにこれらの製造方法に関する。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、第５，２４６，６９２号、第５，２８６，８５０号、第５，４３４，２８７号及び第５，１２４，４７１号もまた、多置換ＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許明細書は、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。適合する金属キレート剤の別の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８、１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡ又はＣＨＸ−ＤＴＰＡが、特に好ましく、以下に広範囲にわたって例示する。さらに別の適合するキレート剤、例えばこれから発見されるべきキレート剤は、当業者には容易に識別し、明らかに本発明の範囲内にある。
【０３８７】
適合するキレート剤、例えば米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号及び第５，８４３，４３９号（これらの全体は、参照として本明細書に組み込まれる）のキレート化を促進するのに使用される特定の二価キレート剤は、三価金属に対する高親和性を提供するために、高められた腫瘍−対−非腫瘍の比及び減少した骨吸収並びに標的部位、すなわちＢ−細胞リンパ腫腫瘍部位での放射線核種のより大きいインビボ保持を示すために選択されることが好ましい。しかし、これらの特性の全部を有していてもよいし又は有していなくてもよい他の二価キレート剤は、当技術分野において公知であり、及び腫瘍治療にも役立ち得る。
【０３８８】
本明細書の教示に従って、結合性分子が診断及び治療目的に種々の放射性標識に結合体化させ得ることも認められるであろう。このために、前記の米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号及び第５，８４３，４３９号は、治療用抗体の投与前の腫瘍の診断“画像化”用の放射性標識治療用結合体を開示している。“Ｉｎ２Ｂ８”結合体は、二価キレート剤、すなわちＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）（これは、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡと１−メチル−３−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡとの１：１混合物を含む）によって１１１Ｉｎに結合される、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクロナール抗体、２Ｂ８を含む。１１１Ｉｎは、その約１〜約１０ｍＣｉが検出可能な毒性なしに安全に投与できることから、診断放射線核種として特に好ましい；及び画像化データは、一般にその後の９０Ｙ−標識抗体分布を予測する。大部分の画像化研究は、５ｍＣｉの１１１Ｉｎ標識抗体を利用している。その理由は、この用量は安全であり且つ及びより低い用量と比べて画像化効率を高めており、最適画像化が抗体投与後３〜６日目に生じるからである。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）及びＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）参照。
【０３８９】
上記で示したように、様々な放射性核種が本発明に適用でき、当業者は、どの放射線核種が種々の環境下で最も適しているかを容易に決定できる。例えば、１３１Ｉは、標的免疫療法に使用される周知の放射線核種である。しかし、１３１Ｉの臨床有用性は、幾つかの因子、例えば８日の物理的半減期；血中及び腫瘍部位の両方でのヨウ素化抗体の脱ハロゲン化；及び腫瘍の局在用量析出に最適以下であり得る放出放射特性（例えば、大きなγ成分）によって制限され得る。優れたキレート化剤の出現により、キレート基をタンパク質に結合するための機会が、他の放射性核種、例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙを利用する機会を高めた。９０Ｙは、放射免疫治療用途での利用について幾つかの利点を提供する：９０Ｙの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体蓄積を可能にするのに十分に長く、例えば１３１Ｉと異なり、９０Ｙはその崩壊においてγ線を伴わず、１００〜１，０００細胞直径の組織内範囲を有する高エネルギーの純粋なβ放射体である。また、透過性放射線の最小量が、９０Ｙ標識抗体の外来患者投与を可能にする。さらに、標識抗体の内部化は、細胞の殺滅に必要とされず、及び電離放射線の局部放射は標的分子を欠く隣接腫瘍細胞に死をもたらすであろう。
【０３９０】
結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントに対する結合体化用の別の好ましい薬剤は、細胞障害性薬剤、特に癌療法に使用される細胞障害性薬剤である。本明細書で使用されるように、“細胞毒又は細胞障害性薬剤”は、細胞の成長及び増殖に有害であり、細胞又は悪性腫瘍を抑制、阻害又は破壊するために作用し得る薬剤を意味する。典型的な細胞毒としては、以下に限定されないが、放射性核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド及び生物学的反応調節剤、例えばサイトカインが挙げられる。免疫活性細胞又は悪性細胞の成長を遅らせるか遅くするために作用する細胞毒は、本発明の範囲内にある。
【０３９１】
典型的な細胞毒としては、一般的に、細胞増殖抑制剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモン類及びホルモン拮抗物質、などが挙げられる。本発明に適合する典型的な細胞増殖抑制剤としては、アルキル化物質、例えばメクロレタミン、トリエチレンホスホロアミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン又はトリアジクォン、あるいはニトロソ尿素化合物、例えばカルムスチン、ロムスチン、又はセムスチンが挙げられる。別の好ましいクラスの細胞障害性薬剤としては、例えば、メイタンシノイドファミリーの薬剤が挙げられる。別の好ましいクラスの細胞障害性薬剤としては、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬剤、ビンカファミリーの薬剤、マイトマイシン類、ブレオマイシン類、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬剤、ジイネン類、及びポドフィロトキシンが挙げられる。これらのクラスの特に有用なメンバーとしては、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニギリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポルフィロマシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、又はポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシド又はリン酸エトポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）などが挙げられる。本明細書の教示に適合するさらに別の細胞毒としては、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにこれらの類似化合物又は同族化合物が挙げられる。ホルモン類及びホルモン拮抗物質、例えばコルチコステロイド類、例えばプレドニゾン、プロゲスチン類、例えばヒドロキシプロゲステロン又はメドロプロゲステロン、エストロゲン類、例えばジエチルスチルベストロール、抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、アンドロゲン類、例えばテストステロン、及びアロマターゼ阻害剤が挙げられ、例えばアミノグルテチミドもまた本明細書の教示と適合する。当業者は、所望の化合物に化学修飾を行い、本発明の結合体を調製するために該化合物の反応をより都合よくし得る。
【０３９２】
特に好ましい細胞毒の１つの例は、エンジインファミリーの抗腫瘍抗生物質のメンバー又は誘導体、例えばカリケアマイシン、エスペラマイシン類又はダイネミシン類を含む。これらの毒素は、極めて強力であり、核ＤＮＡを切断し、細胞死を招くことによって作用する。インビボで切断されて多数の不活性であるが免疫原性のポリペプチドフラグメントを与えることができるタンパク質毒素と異なり、毒素、例えばカリケアマイシン、エスペラマイシンル及び他のエンジイン類は、本質的に非免疫原性である小分子である。これらの非ペプチド毒素は、２量体又は４量体に、モノクロナール抗体及びその他の分子を標識するのに従来使用されている方法で化学的に連結される。これらの連結方法としては、前記組立て体のＦｃ部分にのみ存在するＮ−連結糖残基による部位特異的結合が挙げられる。このような部位特異的連結方法は、組立て体の結合特性に対して結合の可能な影響を減少させる利点を有する。
【０３９３】
先に言及したように、結合体の調製に適合する細胞毒は、プロドラッグからなり得る。本明細書で使用されるように、“プロドラッグ”という用語は、腫瘍細胞に対して親薬物に比べて細胞障害性が低く且つより活性な親型に酵素活性化又は転換することができる医薬活性物質の前駆物質又は誘導体を指す。本発明に適合するプロドラッグとしては、以下に限定されないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されていてもよフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は場合により置換されていてもよいフェニルアセタミド含有プロドラッグ、より活性な細胞障害性遊離薬物に転化させることができる５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。本発明で使用するプロドラッグ体に誘導し得る細胞障害性遊離薬物の別の例は、前記の化学療法剤を含む。
【０３９４】
他の細胞毒の中で、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えば本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントもまた、生体毒素、例えばリシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス、シアンジノシン類、サキシトキシン、シガトキシン、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルコロゲン又は毒性酵素に結合又は結合体化させることができる。好ましくは、このような組立て体は、抗体−毒素組立て体の特異的発現を可能にする遺伝子工学技術を使用して調製されるであろう。結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えば本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントに結合され得る別の生物学的反応調節剤は、サイトカイン類、例えばリンホカイン類及びインターフェロン類を含む。この開示を考慮して、当業者は慣用の方法を使用してこのような組立て体を容易に形成できると言える。
【０３９５】
開示された結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントと共に使用し得るか又はこれらに結合体化させ得る適合細胞毒の別のクラスは、腫瘍又は免疫活性細胞に効果的に指向され得る放射線増感薬である。このような薬剤は、電離放射線に対する感受性を高め、それによって放射線治療の効果を増大する。腫瘍細胞によって取り込まれる抗体結合体は、放射線増感剤を放射線増感が最大であろう核のより近くに送達するであろう。本発明の結合性分子を連結した非結合放射線増感剤は、血中から急速に除去され、標的腫瘍中に残る放射線増感剤を局部に留め且つ正常組織において最小限の吸収を提供する。血中から迅速除去後に、補助放射線治療が、３通りの方法：１．）腫瘍に特異的に向けられる外部照射、２．）腫瘍中に直接に埋め込まれた放射能又は３．）同じ標的化抗体を用いた全身放射免疫治療の１つで施されるであろう。このアプローチの潜在的に魅力ある変型は、放射線増感免疫結合体に対する治療用放射性同位元素の結合であり、それによって患者に単一の薬物を投与する便宜を提供するであろう。
【０３９６】
ある実施形態において、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントの安定性又は効果を高める部分が結合体化され得る。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧは、本発明の結合性分子にそのインビボ半減期を増大させるために結合体化させることができる。Ｌｅｏｎｇ、Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；又はＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）。
【０３９７】
本発明は、さらに、診断又は治療剤に結合体化させた結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又は免疫特異的フラグメントの使用を包含する。結合性分子は、例えば、所定の及び／又は予防計画の有効性を調べるために臨床試験手順の部分として、例えば腫瘍の発生又は進行を監視するために診断的に使用できる。検出は、結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを検出可能な物質に結合することによって促進することができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影法を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断法として使用される抗体に結合体化させることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号参照。適当な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適当な補欠族結合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。
【０３９８】
結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントはまた、それを化学発光化合物に連結することによって検出可能に標識できる。この場合に、化学発光標識された結合性分子の存在は、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって調べられる。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０３９９】
結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを検出可能に標識できる方法の一つは、これらを酵素に連結し、得られた連結生成物を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら、（ｅｄｓ．），酵素免疫測定法、化学書院、東京（１９８１）。結合性分子に結合される酵素は、適当な基質、好ましくは色素形成基質と、例えば分光光度手段、蛍光光度手段又は視覚手段で検出できる化学部分を生成するような方法で反応するであろう。抗体を検出可能に標識するのに使用できる酵素としては、以下に限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。また、検出は、酵素用の色素形成基質を用いる比色法で達成できる。検出はまた、同様に調製された標準と比較して基質の酵素反応の程度を目視比較することによっても達成し得る。
【０４００】
検出はまた、他の様々な免疫検定法を使用して達成し得る。例えば、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、あるいはその免疫特異的フラグメントを放射活性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用により癌抗原を検出することができる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６）参照、これらは本明細書に参照として組み込まれる）。放射性同位元素は、手段、例えば、以下に限定されないが、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、又はオートラジオグラフィーで検出できる。
【０４０１】
結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、あるいはその免疫特異的フラグメントはまた、蛍光放射金属、例えば１５２Ｅｕ、又はランタニド系列の金属を使用して検出可能に標識できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して、抗体に結合することができる。
【０４０２】
種々の部分を、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、あるいはその免疫特異的フラグメントに結合体化させるための方法は、周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｄｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、及びＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）参照。
【０４０３】
ＶＩＩ．抗体ポリペプチドの発現
周知のように、ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞から又は他の形質転換細胞から、標準方法、例えばグアニジウムイソチオシアネート抽出及び沈降、次いで遠心分離又はクロマトグラフィーで単離し得る。望ましい場合には、ｍＲＮＡは、全ＲＮＡから、標準方法、例えばオリゴｄＴセルロースを用いたクロマトグラフィーで単離し得る。適当な方法は、当技術分野において周知である。
【０４０４】
１つの実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従って、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを使用して同時に又は別々に調製し得る。ＰＣＲは、共通定常領域プライマーで又は公表された重鎖及び軽鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づいてより特異的なプライマーで開始し得る。上記で論じたように、ＰＣＲはまた、抗体軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するのに使用し得る。この場合に、ライブラリーは、共通プライマー又は大きな異種プローブ、例えばマウス定常領域プローブで選別し得る。
【０４０５】
ＤＮＡは、典型的にはプラスミドＤＮＡは、細胞から当技術分野において公知の方法を使用して単離し、制限地図化し、例えば、組換えＤＮＡ技術に関して前記の参考文献に詳しく示される標準の周知の方法に従って配列決定し得る。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセス又はその後の分析中の任意の時点で本発明に従って合成し得る。
【０４０６】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体を提供するために単離された遺伝物質の操作の後に、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所定量のＩＧＦ−１Ｒ抗体を産生させるのに使用し得る宿主細胞に導入するための発現ベクターに挿入される。
【０４０７】
抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体又は類似物質、例えば、本明細書に記載の標的分子、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体の重鎖又は軽鎖の組換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの組み立てを必要とする。抗体分子あるいは本発明の抗体、又はその部分（好ましくは、重鎖又は軽鎖可変領域を含有する）の重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生用のベクターは、当技術分野において周知の方法を使用して組換えＤＮＡ技術で産生し得る。従って、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製する方法は、本明細書に記載されている。当業者に周知の方法が、抗体コード化配列及び適切な転写及び翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを組み立てるのに使用できる。これらの方法としては、例えば、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列、あるいはプロモーターに操作可能に連結された重鎖又は軽鎖可変領域を含有する複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含有し得（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７号；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６号；及び米国特許第５，１２２，４６４号参照）、抗体の可変領域は、完全な重鎖又は軽鎖の発現のためにこのようなベクターにクローン化し得る。
【０４０８】
宿主細胞に、本発明の２つの発現ベクター、すなわち重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターと、軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクターとを同時に移入し得る。上記２つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同じ選択可能なマーカーを含有し得る。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用し得る。このような状況において、軽鎖は、過剰の毒性のない重鎖を避けるために重鎖の前に配置されることが都合がよい（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖及び軽鎖のコード化配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含有し得る。
【０４０９】
“ベクター”又は“発現ベクター”という用語は、本明細書において、宿主細胞中の所望の遺伝子に導入し、発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するのに使用される。当業者には公知のように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスよりなる群から容易に選択し得る。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニング並びに真核又は原核生物細胞に入る及び／又は複製する能力を促進させるのに適切な制限部位を含有するであろう。
【０４１０】
本発明のために、多数の発現ベクター系が使用し得る。例えば、１つのクラスのベクターは、動物ウイルス、例えばウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスから誘導されるＤＮＡ要素を利用する。他のベクターは、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を伴う。また、染色体にＤＮＡを組み込んでいる細胞は、形質移入された宿主細胞の選択を可能にする１個以上のマーカーを導入することによって選択し得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、耐殺生物剤性（例えば、抗生物質）又は銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能な標識遺伝子は、発現させるべきＤＮＡ配列に直接に連結できるか、又は同じ細胞に同時形質転換によって導入できる。別の要素もまた、ｍＲＮＡの最適合成に必要とし得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含有し得る。
【０４１１】
特に好ましい実施形態において、クローン化可変領域遺伝子が、前記で論じたように合成の重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）に沿って発現ベクターに挿入される。１つの実施形態において、これは、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号に開示されている）と呼ばれるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の所有の発現ベクターを使用して行われる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１及びエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域及び定常領域遺伝子の組み込み、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、次いでＧ４１８含有培地における選別及びメトトレキセート増幅で抗体の極めて高レベルの発現をもたらすことが見出された。勿論、真核細胞において発現を誘発することができる任意の発現ベクターが本発明において使用し得る。適当なベクターの例としては、以下に限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手できる）、及びプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩから入手できる）が挙げられる。一般的に、高レベルの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を適切に発現する細胞について多数の形質転換細胞を選別することは、例えば、ロボットシステムで実施できる日常実験である。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号及び第５，６５８，５７０号に教示されている。これらのそれぞれは、本明細書においてその全てが参照として組み込まれる。この系は、高、例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。他の典型的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０４１２】
他の好ましい実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体は、ポリシストロニック組立て体、例えば２００２年１１月１８日付けで出願され且つその全てが本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１Ａ１号に開示されたポリシストロニック組立て体を使用して発現させ得る。これらの新規な発現系において、興味ある多数の遺伝子産物、例えば抗体の重鎖及び軽鎖は、単一のポリシストロニック組立て体から産生し得る。これらの系は、真核宿主細胞中で比較的高レベルのＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを提供するために内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を都合よく使用する。適合するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号（これもまた、本明細書において援用される）に開示されている。当業者には、このような発現系が本明細書に開示されるＩＧＦ−１Ｒ抗体の完全な範囲を効果的に産生するのに使用し得ることが認められるであろう。
【０４１３】
さらに一般的には、いったんＩＧＦ−１Ｒ抗体の単量体サブユニットをコードするベクター又はＤＮＡ配列が調製される、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入し得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の方法で達成できる。これらの方法としては、以下に限定されないが、トランスフェクション法（例えば、電気泳動法及び電気穿孔法）、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム沈降法、包膜ＤＮＡを用いた細胞融合法、顕微注射法、及び無傷ウイルスによる感染法が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｎｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）参照。典型的には、プラスミドの宿主への導入は、電気穿孔法による。発現組立て体を含む宿主細胞は、軽鎖及び重鎖の産生に適切な条件下で増殖され、重鎖及び／又は軽鎖タンパク質合成についてアッセイされる。典型的なアッセイ法としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は蛍光活性化細胞選別分析法（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
【０４１４】
発現ベクターは、宿主細胞に慣用の方法で移入され、次いで移入細胞は慣用の方法で培養されて、本明細書に記載の方法で使用される抗体を産生する。従って、本発明は、本発明の抗体、又はその重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有し、異種プロモーターに操作可能に連結された宿主細胞を包含する。好ましい実施形態において、二重鎖抗体の発現のために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターが、以下に詳述するように、全免疫グロブリン分子の発現用の宿主細胞に同時発現され得る。
【０４１５】
本明細書で使用されるように、“宿主細胞”とは、組換えＤＮＡ技術を使用して組立てられ且つ少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを含む細胞を指す。組換え体宿主から抗体を単離する方法の記載において、“細胞”及び“細胞培養”という用語は、特に明記しない限りは、抗体の起源を表すのに同じ意味で使用される。言い換えれば、“細胞”からのポリペプチドの回収とは、全細胞の遠心分離から又は培地と懸濁細胞の両方を含有する細胞培養からの回収を意味する。
【０４１６】
様々な宿主−発現ベクター系が、本明細書に記載の方法で使用される抗体分子を発現するのに利用し得る。このような宿主−発現系は、興味のあるコード配列を産生し、その後に精製されるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換又は移入される場合には、本発明の抗体分子をその場で発現し得る細胞も表す。これら発現系としては、以下に限定されないが、微生物、例えば抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母〔例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）菌〕；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、すなわちＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、すなわちＴＭＶ）を感染させた植物細胞系又は抗体コード配列を含有する組組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーター（例えば、アデノウイルスレートプロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現組立て体を含む哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。組換え抗体分子の発現のために、好ましくは、細菌細胞、例えば大腸菌が使用され、さらに好ましくは、特に全組換え抗体分子の発現のために真核細胞が使用される。例えば、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと共に、抗体の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０４１７】
タンパク質の発現に使用される宿主細胞系は、哺乳動物起源のものである場合が多い；当業者は、その中で発現させるべき所望の遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞系を優先的に調べることができると考えられる。典型的な宿主細胞系としては、以下に限定されないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌細胞）、ＣＶＩ（サル腎臓細胞系）、ＣＯＳ（ＣＶＩのＳＶ４０Ｔ抗原との誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＤ８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞系は、典型的には商業サービス、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から又は観光された文献から入手できる。
【０４１８】
また、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望される特定の方法で遺伝子産物を修飾し、処理する宿主細胞系を選択し得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。種々の宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に特徴的及び特定のメカニズムを有する。適切な細胞系又は宿主系が、発現される異種タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするために選択できる。この目的に、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用し得る。
【０４１９】
組換えタンパク質の長期の高収率産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞系が、操作され得る。ウイルス複製基点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、及び選択可能な標識によって調節されるＤＮＡを用いて形質転換することができる。異種ＤＮＡの導入後に、操作された細胞は、強化培地で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に代え得る。組換えプラスミドにおける選択可能な標識は、選択に対する耐性を与え、細胞がその染色体にプラスミドを安定的に組み込み、順番にクローン化され、細胞系に広がり得る病巣（ｆｏｃｉ）を形成するために増殖することを可能にする。この方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞系を操作するに都合よく使用し得る。
【０４２０】
多数の選択系、例えば、以下に限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）を使用し、遺伝子はｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞それぞれにおいて使用できる。また、代謝拮抗物質抵抗性は、  次の遺伝子：ｄｈｆｒ〔これは、メトトレキセートに対する抵抗性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））〕；ｇｐｔ〔これは、ミコフェノール酸に対する抵抗性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））〕；ｎｅｏ〔これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を与える；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３）〕；及びｈｙｇｒｏ〔これは、ハイグロマイシンに対する抵抗性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））〕についての選択の基準として使用できる。使用できる組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；及びＣｈａｐｔｅｒｓ  １２及び１３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、これらは明細書においてその全てが参照として組み込まれる。
【０４２１】
抗体分子の発現は、ベクターの増幅によって高めることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３（１９８７）参照）。抗体を発現するベクター系の標識が増幅可能である場合には、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤の濃度の上昇は、標識遺伝子のコピーの数を増大させるであろう。増幅領域が抗体遺伝子に結合されることから、抗体の産生も増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０４２２】
インビトロでの産生は、スケールアップが大量の所望のポリペプチドを得ることを可能にする。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養する方法は、当技術分野において公知であり、該方法としては、例えばエアリフト式反応器又は連続攪拌式反応器での均質懸濁培養、あるいは、例えば、中空繊維、マイクロカプセル中で、アガロースミクロビーズ又はセラミックカートリッジ上での固定化又は封入細胞培養が挙げられる。必要ならば及び／又は所望ならば、ポリペプチドの溶液は、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの選択的生合成後にあるいは本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィー工程の前に又は後に、慣用のクロマトグラフィー法で、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー又は（イムノ−）アフィニティークロマトグラフィーで精製できる。
【０４２３】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、あるいはその抗原結合性フラグメント、変異体、又は誘導体をコードする遺伝子もまた、非哺乳動物細胞、例えば細菌細胞又は昆虫細胞又は酵母細胞又は植物細胞中で発現させることができる。核酸を容易に受け入れる細菌としては、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー、例えば大腸菌又はサルモネラ菌；バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバー、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が挙げられる。細菌中で発現される場合には、異種ポリペプチドは、典型的に、融合体の一部になることがさらに認められるであろう。異種ポリペプチドは、単離され、精製され、次いで機能分子に組み立てられなければならない。抗体の四価体が望まれる場合には、サブユニットが四価抗体中に自己組み立てられるであろう（国際公開ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号）。
【０４２４】
細菌系において、多数の発現ベクターが、発現される抗体分子について意図される用途に応じて都合よく選択し得る。例えば、抗体分子の医薬組成物の製造のために多量のこのようなタンパク質が産生されるべきである場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいものであり得る。このようなベクターとしては、以下に限定されないが、抗体コード配列が、融合タンパク質が産生されるように、ｌａｃＺコード領域を有する枠内のベクターに個々に連結され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現させるのに使用し得る。一般的に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、溶解細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズに吸着及び結合させ、次いで遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されることができるように、又は因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０４２５】
原核生物の他に、真核生物細菌も使用し得る。多数の他の菌株、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が一般的に利用できるが、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち一般的なパン酵母が、真核微生物の中で最も一般的に使用される。
【０４２６】
サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌における発現のために、プラスミドＹＲｐ７、例えば、（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７））用の選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子をすでに含有している。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１病変の存在は、この場合にはトリプトファンの不存在下での増殖による形質転換を検出する亜目の効果的な環境を提供する。
【０４２７】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、典型的には、異種遺伝子を発現するベクターとして使用される。前記ウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。
【０４２８】
本発明の抗体分子は、いったん組換えにより発現されると、免疫グロブリン分子の精製の用の当技術分野において公知の方法で、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインタンパクＡの後の特異抗原に対する親和性による、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度で、あるいはタンパク質精製用の他の標準方法で精製し得る。あるいは、本発明の抗体の親和性を高める好ましい方法は、米国特許出願公開第２００２０１２３０５７Ａ１号に記載されている。
【０４２９】
ＶＩＩＩ．治療用ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを使用する治療方法
本発明の１つの実施形態は、過剰増殖性疾患又は障害、例えば、癌、悪性腫瘍、腫瘍、又はこれらの転移を、このような疾患を患うか又はこのような疾患にかかる傾向がある動物において治療する方法であって、前記動物に、ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＧＦ−１Ｒの変異体に結合する抗体又はその免疫特異的フラグメントの有効量を投与することを含むか、投与することから本質的になるか、又は投与することのみからなる、過剰増殖性疾患又は障害、例えば、癌、悪性腫瘍、腫瘍、又はこれらの転移を治療する方法を提供する。適当な抗体としては、本明細書に記載の抗体及びその抗原特異的フラグメントが挙げられる。例として、以下に限定されないが、単離抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメント；ＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないように競合的に阻害するものである単離抗体又はその抗原結合性フラグメント；あるいはＩＧＦ−Ｒ１に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はそのフラグメントが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４よりなる群から選択される基準モノクロナールＦａｂ抗体フラグメント、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８よりなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される基準モノクロナール抗体の抗原結合性ドメインと同一の抗原結合性ドメインを含有するものである単離抗体又はその抗原結合性フラグメントが挙げられる。
【０４３０】
ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、１つ以上のインスリン成長因子、例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する。他の実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、１つ以上のインスリン成長因子の結合に際してＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する。別の実施形態において、細胞、特に、腫瘍細胞上で発現されるＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞の増殖、運動性及び／又は転移に関与する下流のシグナル伝達分子のリン酸化を阻害する。このような分子としては、以下に限定されないが、Ａｋｔ及びｐ４２／４４ＭＡＰＫが挙げられる。別の実施形態において、細胞上で発現されるＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、表面で発現されるＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進し、ＩＧＦと相互作用するためにその利用可能性を制限する。さらに別の実施形態において、細胞、特に腫瘍細胞上で発現されるＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞の増殖、運動性及び／又は転移を阻害する。
【０４３１】
本明細書に開示の治療方法で使用されるべきＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞過剰増殖に関与する細胞活性、例えば、多くの場合に過剰増殖性疾患又は障害に関連する血管新生の変化した又は異常なパターンを引き起こす細胞活性を停止させるか、抑制するか、防止するか、又は阻害する治療剤を調製でき、治療剤として使用できる。
【０４３２】
本発明の抗体又はその免疫特異的フラグメントとしては、以下に限定されないが、ＩＧＦ−１Ｒなどの腫瘍関連タンパク質に特異的に結合する抗体のモノクロナール抗体、キメラ又はヒト化抗体、及びフラグメントが挙げられる。前記抗体は、一価、二価、多価、又は二官能の抗体であり、抗体フラグメントとしてはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖが挙げられる。
【０４３３】
本発明の治療用抗体は、未標識の形又は結合体化されていない形で使用できるし、あるいは治療効果を発揮する薬物を製造するために、細胞障害性部分、例えば放射性標識及び生化学的細胞毒に結合又は連結することができる。
【０４３４】
ある実施形態において、本発明の抗体、又はその免疫特異的フラグメントは、抗原結合性ドメインを含有する。抗原結合性ドメインは、一方の抗体から他方の抗体に変化する抗体可変領域によって形成される。天然抗体は、少なくとも２つの抗原結合性ドメインを含有し、すなわち、天然抗体は、少なくとも二価である。本明細書で使用されるように、“抗原結合性ドメイン”という用語は、抗原（例えば、細胞表面又は可溶性抗原）上のエピトープを特異的に結合する部位を包含する。抗体の抗原結合性ドメインは、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部分とを含有する。これらの可変領域によって形成される結合部位は、抗体の特異性を決定する。
【０４３５】
本発明は、哺乳動物において、例えば腫瘍増殖を阻止することによって種々の過剰増殖性疾患を治療する方法であって、前記哺乳動物に、ＩＧＦ−Ｒ１、例えばヒトＩＧＦ−Ｒ１に特異的に又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントの有効量を投与することを含むか、投与することから本質的になるか、又は投与することのみからなる、種々の過剰増殖性疾患を治療する方法を提供する。
【０４３６】
本発明は、さらに具体的には、過剰増殖疾患を治療する方法、例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒトにおいて、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍の侵入、及び／又は転移形成を阻止又は防止する方法であって、その治療を必要とする動物に、ＩＧＦ−１Ｒの１つ以上のエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体又はその免疫特異的フラグメントの有効量を投与することを含むか、投与することから本質的になるか、又は投与することのみからなる、過剰増殖疾患を治療する方法、例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒトにおいて、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍の侵入、及び／又は転移形成を阻止又は防止する方法を提供する。
【０４３７】
他の実施形態において、本発明は、過剰増殖性疾患を治療する方法、例えば、動物、例えばヒト患者において、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍の侵入、及び／又は転移形成を阻止する方法であって、このような治療を必要とする動物に、製薬学的に許容し得る担体の他に、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体、又はその免疫特異的フラグメントを含むか、これらから本質的になるか、又はこれらのみからなる組成物の有効量を投与することからなり、前記エピトープが、配列番号：２の少なくとも約４個〜５個のアミノ酸アミノ酸、配列番号：２の少なくとも７個、少なくとも９個、又は少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらのみからなるものである、過剰増殖性疾患を治療する方法、例えば、動物、例えばヒト患者において、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍の侵入、及び／又は転移形成を阻止する方法を包含する。記載のような配列番号：２の所定のエピトープのアミノ酸は、連続的であってもよいが、連続的である必要はない。ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面で発現されるようにＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインによって形成される非線状エピトープからなるか、該非線状エピトープから本質的になるか又は該非線状エピトープのみからなる。従って、ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、非連続アミノ酸がタンパク質折り畳みによってエピトープを形成する場合には、配列番号：２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、あるいは少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個の連続又は不連続アミノ酸を含むか、該アミノ酸から本質的になるか又は該アミノ酸のみからなる。
【０４３８】
他の実施形態において、本発明は、過剰増殖性疾患を治療する方法、例えば、動物、例えばヒト患者において、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍侵入、及び／又は転移形成を阻止する方法であって、このような治療を必要とする動物に、製薬学的に許容し得る担体の他に、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体、又はその免疫特異的フラグメントからなるか、これらから本質的になるか、又はこれらのみからなる組成物の有効量を投与することからなり、前記エピトープが、前記の配列番号：２の１個、２個、３個、４個、５個、６個以上の連続又は不連続アミノ酸と、タンパク質を修飾する別の部分を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらのみからなるものであり、例えば、炭水化物部分が、結合性分子が修飾される標的タンパク質に、タンパク質の未修飾バージョンに結合するよりも高親和性で結合するように含有され得るものである、過剰増殖性疾患を治療する方法、例えば、動物、例えばヒト患者において、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍の侵入、及び／又は転移形成を阻止する方法を包含する。あるいは、結合性分子は、タンパク質の未修飾バージョンには全く結合しない。
【０４３９】
さらに詳しくは、本発明は、ヒトにおいて癌を治療する方法であって、治療を必要とするヒトに、有効量のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体とを含む組成物を投与することからなる、ヒトにおいて癌を治療する方法を提供する。治療すべき癌の種類としては、以下に限定されないが、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌、及び前立腺癌が挙げられる。
【０４４０】
ある実施形態において、抗体又はそのフラグメントは、前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわち、このようなエピトープに、非関連又はランダムエピトープに結合するよりも容易に結合するか；前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、このようなエピトープに、非関連、同様、異種又は類似のエピトープに結合するよりも容易に結合するか；前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体のある種のエピトープにそれ自体特異的に又は優先的に結合する基準抗体の結合を競合的に阻害するか；あるいは、前記のＩＧＦ−１Ｒあるいはフラグメント又は変異体の少なくとも１つのエピトープに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤによって特徴づけられる親和性で結合する。抗体結合解離定数との関連で使用されるように、“約”という用語は、抗体親和性を測定するのに利用する方法に固有の変数の程度を考慮する。例えば、使用される計測の精度のレベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、及び丸め誤差に応じて、“約１０−２Ｍ”という用語は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含み得る。ある実施形態において、本発明の抗体及びそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質がもたらされる他の種のＩＧＦ−１Ｒタンパク質と交差反応する、例えば、ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するし、また霊長類ＩＧＦ−１Ｒ及び／又はマウスＩＧＦ−１Ｒにも特異的に結合する抗体又はそのフラグメントと交差反応する。本発明の他の適当な抗体又はそのフラグメントとしては、高度に種特異的であるものが挙げられる。
【０４４１】
特定の実施形態において、本明細書に開示の抗体又はその免疫特異的フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１、又は１０−３ｓｅｃ−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。本明細書に開示の別の抗体又はその免疫特異的フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、又は１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１、又は１０−７ｓｅｃ−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。
【０４４２】
本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される別の抗体又はその免疫特異的フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。本明細書に開示の診断及び治療方法に使用する別の抗体又はその免疫特異的フラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドあるいはそのフラグメント又は変異体を、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、又は５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、あるいは１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。
【０４４３】
種々の実施形態において、前記の１つ以上の結合性分子は、ＩＧＦ−１Ｒ活性のアンタゴニストであり、例えば腫瘍細胞上で発現されるようなＩＧＦ−１Ｒに対するアンタゴニストＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合は、ＩＧＦ−１Ｒに対するインスリン成長因子、例えばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方の結合を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進し、それによってそのシグナル伝達能を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害するか、シグナル伝達経路の下流の分子、例えば、Ａｋｔ又はｐ４２／４４ＭＡＰＫのリン酸化を阻害するか、あるいは腫瘍細胞の増殖、運動性又は転移を阻害する。
【０４４４】
ＩＸ．ＩＧＦ−１Ｒ−特異的結合性分子及び核酸増幅アッセイを使用する診断又は予後方法
ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体、又は類似体は、ＩＧＦ−１Ｒの異常な発現及び／又は活性に関連する疾患、障害及び／又は状態を発見、診断又は監視する診断目的に使用できる。ＩＧＦ−１Ｒの発現は、腫瘍組織及び他の新生物状態において高められる。
【０４４５】
ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はそのフラグメントは、哺乳動物、好ましくはヒトの過剰増殖性疾患の診断、治療、予防及び／又は予後に有用である。このような疾患としては、以下に限定されないが、癌、新生物、腫瘍及び／又は本明細書の他の個所に記載のような癌、新生物、腫瘍、特にＩＧＦ−１Ｒ−関連の癌、例えば胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌、及び前立腺癌が挙げられる。
【０４４６】
例えば、本明細書に開示のように、ＩＧＦ−１Ｒの発現は、少なくとも胃、腎臓、脳、膀胱、結腸、肺、乳房、膵臓、卵巣、及び前立腺の腫瘍組織に関連する。従って、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（及び抗体フラグメント）は、高められた量のＩＧＦ−１Ｒを発現する特定の組織を発見するのに使用し得る。これらの診断アッセイは、インビボ又はインビトロで、例えば例えば、血液試料、生検組織又は剖検組織で行い得る。
【０４４７】
従って、本発明は、癌及びその他の過剰増殖性疾患の診断中に有用な診断方法であって、個体に由来する組織又はその他の細胞あるいは体液中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質又は転写物の発現量を測定し、測定された発現量を正常な組織又は体液の標準ＩＧＦ−１Ｒ発現量と比較することを伴い、それによって標準と比べた発現量の増加が疾患を示す診断方法を提供する。
【０４４８】
１つの実施形態は、体液又は組織試料中の異常な過剰増殖細胞、例えば、前癌細胞又は癌細胞の存在を発見する方法であって、個体の組織又は体液試料中のＩＧＦ−１Ｒの発現をアッセイし、試料中のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又は量を、標準組織又は体液試料のパネル（ｐａｎｅｌ）のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又は量と比較することからなり、ＩＧＦ−１Ｒ発現の検出又は標準に対するＩＧＦ−１Ｒ発現の増大が異常な過剰増殖細胞の増殖を示す、体液又は組織試料中の異常な過剰増殖細胞、例えば、前癌細胞又は癌細胞の存在を発見する方法を提供する。
【０４４９】
さらに詳しくは、本発明は、体液又は組織試料中の異常な過剰増殖細胞の存在を発見する方法であって、（ａ）本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを使用して個体（ａｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）の組織又は体液試料中のＩＧＦ−１Ｒの発現をアッセイし、（ｂ）試料中のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又は量を、標準組織又は体液試料のパネル（ｐａｎｅｌ）のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又は量と比較し、それによってＩＧＦ−１Ｒ発現の検出又は標準に対するＩＧＦ−１Ｒ発現の増大が異常な過剰増殖細胞の増殖を示すことを含む、体液又は組織試料中の異常な過剰増殖細胞の存在を発見する方法を提供する。
【０４５０】
癌に関して、個体に由来する生検組織中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質の比較的多い量は、腫瘍又はその他の悪性増殖の存在を示し得るか、このような悪性腫瘍又は腫瘍の発生の素因を示し得るか、又は実際の臨床症状の出現の前に病気を発見する手段を提供し得る。この種のより信頼のおける診断は、医療専門家がより早く予防措置又は積極的な治療を採用することを可能し、それによって癌の発生又はさらなる進行を防止し得る。
【０４５１】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体は、当業者に公知の古典的免疫組織学的方法を使用して生物学的試料中のタンパク質の量をアッセイするのに使用できる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）参照）。タンパク質の発現を検出するのに有用な他の抗体による方法としては、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。適当な抗体アッセイ標識は、当技術分野において公知であり、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼ；放射性同位元素、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）；発光標識、例えばルミノール；及び蛍光標識、例えばフルオレセイン及びローダミン、並びにビオチンが挙げられる。適当なアッセイは、本明細書の他の個所で詳細に記載する。
【０４５２】
本発明の１つの態様は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトのＩＧＦ−１Ｒの異常な発現に関連する過剰増殖性疾患又は障害のインビボ発見又は診断方法である。１つの実施形態において、診断は、ａ）対象に、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する本発明の標識抗体又はそのフラグメントの有効量を投与し（例えば、非経口的に、皮下に、又は腹腔内に）；ｂ）投与後のある時間間隔で、標識された結合性分子をＩＧＦ−１Ｒが発現される対象の部位に優先的に集中させる（且つ未固定の標識分子がバックグラウンドレベルまで消失させる）のを待ち；ｃ）バックグラウンドレベルを測定し；且つｄ）バックラウンドレベルを超える前記標識分子の検出が、前記対象がＩＧＦ−１Ｒの異常発現に関連する特定の疾患又は障害を有することを示すように、前記対象の標識分子を検出することを含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系について予め測定された標準値と比較することを含む種々の方法で測定できる。
【０４５３】
当業者には、前記対象の大きさ及び使用した画像化装置が診断画像を作成するのに必要とされる画像部分の量を決定することが理解されるであろう。放射性同位元素部分の場合には、ヒト対象については、注入される放射能の量は、標準的には、例えば９９Ｔｃについては約５〜２０ミリキューリーの範囲にあるであろう。次いで、標識された結合性分子、例えば、抗体又は抗体フラグメントは、特異的タンパク質を含有する細胞の位置で優先的に蓄積するであろう。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｏｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載されている。
【０４５４】
幾つかの変数、例えば使用する標識の種類及び投与の方式に応じて、標識分子を前記対象の部位に優先的に集中させるため及び未固定の標識分子をバックグラウンドレベルまで消失させるための投与後の時間間隔は、６〜４８時間又は６〜２４時間あるいは６〜１２時間である。別の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日又は７〜１０日である。
【０４５５】
標識分子の存在は、インビボスキャン技術について公知の方法を使用して患者において検出できる。これらの方法は、使用した標識の種類に左右される。当業者は、特定の標識を検出する適当な方法を決定することができるであろう。本発明の診断方法で使用し得る方法及びデバイスはとして、以下に限定されないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、全身スキャン法、例えば陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）、及び超音波検査法が挙げられる。
【０４５６】
具体的な実施形態において、前記結合性分子は、放射性同位元素で標識され、患者において放射線反応外科機器を使用して検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、前記結合性分子は、蛍光化合物で標識され、患者において蛍光反応走査装置を使用して検出される。別の実施形態において、前記結合性分子は、陽電子放射金属で標識され、患者において陽電子放射断層撮影法を使用して検出される。さらに別の実施形態において、前記結合性分子は、常磁性標識で標識され、患者において磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）を使用して検出される。
【０４５７】
ＩＧＦ−１Ｒ発現のインビボ画像化用の抗体標識又はマーカーとしては、Ｘ線撮影法、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲ）、ＭＲＩ、ＣＡＴ−スキャン又はデンシスピン共鳴画像法（ＥＳＲ）で検出できる抗体標識又はマーカーが挙げられる。Ｘ線撮影法については、適当な標識としては、放射性同位元素、例えばバリウム又はセシウムが挙げられ、これらは検出可能な放射線を放出するが、対象に対して明らかに有害でない。ＮＭＲ及びＥＳＲに適したマーカーとしては、検出可能な特徴的スピンを有するマーカー、例えば重水素が挙げられ、これは、関連のあるハイブリドーマ用の栄養素の標識によって抗体中に取り込まれ得る。インビボ画像化を使用して、ヒトにおいて診断のためのＩＧＦ−１Ｒの高められたレベルの発現を検出する場合には、本明細書の他の個所に記載のようにヒト抗体又は”ヒト化”キメラモノクロナール抗体を使用することが好ましいものであり得る。
【０４５８】
前記に関連した実施形態において、すでに診断された疾患又は障害の監視は、例えば最初の診断後１ヶ月目、最初の診断後６ヶ月目、最初の診断後１年目などに、疾患又は障害を診断する方法にいずれか１つを繰り返すことによって行われる。
【０４５９】
疾患の診断、例えば腫瘍の診断が、これまでに慣用の方法に従って行われている場合には、本明細書に開示の発見方法は、予後指標として有用であり、それによって高められたＩＧＦ−１Ｒ発現を示し続ける患者は、が標準レベルにより近く低下する患者に比べて悪い臨床結果を経験するであろう。
【０４６０】
“腫瘍関連ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドをアッセイする”とは、第１の生物学的試料中のＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの量を、直接的に（例えば、絶対タンパク質量を測定又は推定することによって）又は相対的に（例えば、第２の生物学的試料中の癌関連ポリペプチド量と比較することによって）測定又は評価することを意図する。第１の生物学的試料中のＩＧＦ−１Ｒポリペプチド発現量は、測定又は評価され、標準ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド量と比較すされることが好ましい。前記標準は、疾患をもたない個体から得られる第２の生物学的試料から採取されるか又は疾患をもたない個体群からの平均量によって決定される。当技術分野において認められているように、“標準”ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド量が分かると、それは比較のため標準として繰り返し使用できる。
【０４６１】
“生物学的試料”とは、個体、細胞系、組織培養物、又はＩＧＦ−１Ｒを発現する可能性のある他の細胞供給源から得られる生物学的試料を意図する。示されるように、生物学的試料としては、体液（例えば、血漿、尿、滑液及び髄液）、及びＩＧＦ−１Ｒを発現する可能性のある細胞を含有するその他の組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生体検査及び体液を得る方法は、当技術分野において周知である。
【０４６２】
さらなる実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの立体配置エピトープに向けられる抗体、又は抗体の免疫特異的フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子産物又は保存変異体又はそのペプチドラグメントの存在を定性的に又は定量的に検出するのに使用され得る。これは、例えば、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、又は蛍光検出と一緒に、蛍光標識抗体を用いる免疫蛍光法によって達成できる。
【０４６３】
前記の方法を使用して診断、及び／又は予知し得る癌としては、以下に限定されないが、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌、及び前立腺癌が挙げられる。
【０４６４】
Ｘ．イムノアッセイ
本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、免疫特異的結合について当技術分野において公知の方法でアッセイし得る。使用できるイムノアッセイとしては、以下に限定されないが、数例を挙げると、ウェスタンブロットなどの方法を使用する競合的及び非競合的アッセイ系、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、“サンドイッチ”イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラヂジオメトリックアッセイ、蛍光免疫測定法、プロテインＡイッムノアッセイが挙げられる。このようなアッセイは、日常的であり、当技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）参照、これは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。典型的なイッムノアッセイは、以下に手短に説明する（しかし、限定を意図するものではない）。
【０４６５】
免疫沈降プロトコルは、一般に、溶解緩衝液、例えばタンパク質ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補足したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０又はトリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）中で細胞の集団を溶解し、得られる細胞溶菌液に興味のある抗体を加え、４℃である時間（例えば、１〜４時間）インキュベートし、前記細胞溶菌液にプロテインＡ及び／又はプロテインＧセファロースビーズを加え、４℃で１時間又はそれ以上インキュベートし、前記ビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、該ビーズをＳＤＳ／試料緩衝液に再懸濁することを含む。興味のある抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウェスタンブロット分析で評価することができる。当業者は、抗原に対する抗体の結合を増加させるために及びバックグラウンドを低下させるために修飾することができるパラメーターについて精通しているであろう（例えば、細胞溶菌液をセファロースビーズで予備洗浄）。免疫沈降プロトコルに関する別の考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）  ａｔ  １０．１６．１参照。
【０４６６】
ウェスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料を調製し、該タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動を行い、該タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース膜、ＰＶＤ膜Ｆ又はナイロン膜などの膜に移し、得られた膜をブロック溶液（例えば、３％ＢＳＡ又は脱脂乳を有するＰＢＳ）でブロックし、前記膜を洗浄用緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で洗浄し、この膜をブロック用緩衝液で希釈した一次抗体（興味のある抗体）を用いてブロックし、この膜を洗浄用緩衝液中で洗浄し、この膜を、ブロック用緩衝液中で希釈した酵素基質（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）又は放射性分子（例えば、３２Ｐ又は１２５Ｉ）に結合体化させた二次抗体（これは、一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する）で洗浄し、この膜を洗浄用緩衝液中で洗浄し、且つ抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増大させるために及びバックグラウンドノイズを低下させるために修飾することができるパラメーターについて精通しているであろう。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）ａｔ  １０．８．１参照。
【０４６７】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルに抗原を塗布し、検出可能な化合物、例えば酵素基質（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）に結合体化させた興味ある抗体を、前記ウエルに加え、ある時間インキュベートし、且つ抗元の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡにおいて、前記の興味ある抗体は、検出可能な化合物に結合体化させるべきではなく；その代わりに、検出可能な化合物に結合体化させた第２の抗体（これは、前記の興味ある抗体を認識する）を前記ウエルに添加し得る。また、抗原を塗布する代わりに、抗体をウエルに塗布し得る。この場合に、検出可能な化合物に結合体化させた第２の抗体は、塗布されたウエルに興味ある抗原を加えた後に、添加し得る。当業者は、検出されるシグナルを増大させるために修飾することができるパラメーター及び当技術分野において公知のＥＬＩＳＡのその他の変化について精通しているであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．１（１９９４）ａｔ  １１．２．１参照。
【０４６８】
抗体と抗原の結合親和性及び抗体−抗原相互作用の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、競合結合アッセイによって測定できる。競合結合アッセイの１つの例は、増加量の非標識抗原の存在下で標識抗原（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉ）と、興味ある抗体とをインキュベートし、標識抗原に結合された抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する興味ある抗体のの親和性及び結合解離速度は、スカッチャードプロット分析によってデータから測定できる。第２の抗体との競合もまた、ラジオイムノアッセイを使用して測定できる。この場合に、抗原は、標識化合物（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉ）に結合体化させた興味ある結合体と共に、増量の未標識の第２の抗体の存在下でインキュベートされる。
【０４６９】
ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体は、さらに、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法又は非免疫アッセイにおけるように、癌抗原遺伝子産物あるいはその保存変異体又はペプチドフラグメントのその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での検出のために、組織学的に使用し得る。その場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での検出は、患者から組織学的検体を取り出し、それに標識ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はそのフラグメントを適用することによって達成し、好ましくは該標識抗体（又はフラグメント）を生物学的試料上に置くことによって達成し得る。このような方法の使用によって、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質、又は保存変異体又はペプチドフラグメントの存在ばかりではなく、検査した組織中のその分布も調べることができる。本発明を使用して、当業者は、様々な組織学的方法（例えば染色法）のいずれかをこのようなその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での検出を達成するために部分的に変更できると容易に理解するであろう。
【０４７０】
ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子産物又は保存変異体又はそのペプチドフラグメントのイムノアッセイ及び非イムノアッセイは、典型的には、試料、例えば生体液、組織抽出物、新鮮な採取細胞、又は細胞培養中にインキュベートされている細胞の溶解液を、ＩＧＦ−１Ｒ又は保存変異体又はそのペプチドフラグメントに結合することができる検出可能に標識された抗体の存在下でインキュベートし、結合された抗体を、当技術分野おいにて周知の多数の方法のいずれかの方法で検出することを含む。
【０４７１】
生物学的試料は、固相支持体又は担体、例えばニトロセルロース、あるいは細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を固体化できる他の固体支持体と接触させ、その表面に固定化し得る。次いで、支持体を、適当な緩衝液で洗浄し、次いで検出可能に標識された抗体ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体を用いて処理し得る。次いで、固相支持体を適当な緩衝液で２回洗浄して非固定化抗体を除去し得る。場合により、抗体はその後に標識される。次いで、固体支持体上に固体された標識の量を慣用の手段で検出し得る。
【０４７２】
“固相支持体又は担体”とは、抗原又は抗体を結合することができる任意の支持体を意図する。周知の支持体又は担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるか又は不溶性であり得る。支持材料は、結合された分子が抗原又は抗体に結合できる限りは、任意の可能な構造形状を実質的に有し得る。従って、支持体形状は、ビーズのように球状であってもよいし、あるいは試験管内面又は棒の外面のように円筒状であってもよい。あるいは、支持体表面は、シート、試験紙などのように平面であってもよい。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者には、抗体又は抗原を結合するのに適した多数の他の担体がわかるであろうし、又は日常実験を使用することによってこれらを確認できるであろう。
【０４７３】
所定のロットのＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定し得る。当業者は、日常実験を使用することによってそれぞれの測定のための操作及び最適アッセイ条件を決定できるであろう。
【０４７４】
抗体−抗原相互作用の親和性を測定するのに利用できる種々の方法があるが、速度定数を測定するための方法は比較的少ない。大部分の方法は、必然的に日常測定を困難にし及び測定量の不確実性を導入する、抗体又は抗原を標識することに依存する。
【０４７５】
ＢＩＡｃｏｒｅを用いて行われるような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体−抗原相互作用の親和性を測定する慣用の方法よりも多数の利点：すなわち（ｉ）抗体又は抗原のいずれかを標識する必要がない；（ｉｉ）抗体を予め精製する必要がなく、細胞培養上清を直接に使用できる；（ｉｉｉ）種々のモノクロナール抗体相互作用の迅速半定量的比較を可能にするリアルタイム測定が可能であり、多数の評価目的に十分である；（ｉｖ）生体特異表面が、一連の種々のモノクロナール抗体が同一条件下で容易に比較できるように再生できる；（ｖ）分析操作が完全に自動化され、及び多数の測定をユーザーが操作しなくても行うことができる；という利点を提供する。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ  １９９８），ＢＩＡＣＯＲＥ  ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ  １９９８），ＢＩＡＣＯＲＥ  ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８４。
【０４７６】
ＳＰＲに基づいた結合の研究は、結合対の一方をセンサー表面に固定化することを必要とする。固体化される結合パートナーは、リガントと呼ばれる。溶液中の結合パートナーは、検体と呼ばれる。いくつかの場合において、リガンドは、表面に、他方の固定化分子（これは、捕捉分子と呼ばれる）に結合することによって間接的に結合される。ＳＰＲ応答は、検体が結合するか又は解離するのにつれて検出器表面での質量濃度の変化を表す。
【０４７７】
ＳＰＲに基づいて、リアルタイムＢＩＡｃｏｒｅ測定は、相互作用を、それが生じるにつれて直接的に監視する。この方法は、速度パラメーターの測定によく適している。比較親和性の順位付けは極めて簡単に行われ、速度定数及び親和性定数の両方は、センサーグラムデータから誘導することができる。
【０４７８】
検体がリガンド表面全体を横切って不連続パルスで注入されると、得られるセンサーグラムは、３つの本質的な相（ｐｈａｓｅ）：すなわち（ｉ）試料注入中の検体とリガンドの結合；（ｉｉ）検体結合の速度が結合体から解離することによってバランスのとれる、試料注入中の平衡状態又は定常状態；（ｉｉｉ）緩衝液が流れる間の前記表面から検体の解離；に分けることができる。
【０４７９】
結合相及び解離相は、検体−リガンド相互作用（ｋａ及びｋｄ、すなわち結合体の形成の速度及び解離速度、ｋａ／ｋｄ＝ＫＤ）の速度論に関する情報を提供する。平衡相は、検体−リガンド相互作用（ＫＤ）の親和性に関する情報を提供する。
【０４８０】
ＢＩＡ評価ソフトウエアは、数値積分法及びグローバルフィッティング（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ）アルゴリズムを使用して曲線適合のための総合的な機能を提供する。データの適当な分析に関して、相互作用について別の速度定数及び親和性定数を、簡単なＢＩＡｃｏｒｅ調査から得ることができる。この方法によって測定できる親和性の範囲は、ｍＭからｐＭまでの極めて広い範囲に及ぶ。
【０４８１】
エピトープ特異性は、モノクロナール抗体の重要な特徴である。ＢＩＡｃｏｒｅによるエピトープマッピングは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ又は他の表面吸着法を使用する慣用の方法と比べて、抗体の標識及び精製を必要とせず、しかも一連の数種のモノクロナール抗体を使用して多部位特異性試験を可能にする。さらに、多数の検体を自動的に処理できる。
【０４８２】
ペアワイズ（Ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）結合実験は、２つのＭＡｂが同じ抗原に同時に結合することができる能力を試験する。別個のエピトープに対する複数のＭＡｂは、独立して結合するであろう。これに対して同一エピトープ又は密接に関連したエピトープに対する複数のＭＡｂは、互いの結合を妨害するであろう。ＢＩＡｃｏｒｅを用いたこれらの結合実験は、実施することが簡単である。
【０４８３】
例えば、第１のＭａｂを結合するのに捕捉分子を使用し、次いで、抗原を加え、第２のＭＡｂを連続的に加えることができる。センサーグラムは、１．どの位の抗原が第１のＭａｂを結合するか、２．どの程度まで第２のＭＡｂが表面に結合された抗原に結合するか、３．第２のＭＡｂが結合しない場合には、ペアワイズ（Ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）試験の順序を逆転させると結果が変わるか否かを明らかにするであろう。
【０４８４】
ペプチド阻害は、エピトープマッピングに使用される別の方法である。この方法は、補体ペアワイズ抗体結合研究を補足することができ且つ抗原の一次配列が公知である場合には、機能性エピトープを構造的特徴に関連付けることができる。ペプチド又は抗原フラグメントは、固定化抗原に対する種々のＭＡｂの結合の阻害について試験される。所定のＭＡｂの結合を妨害するペプチドは、そのＭＡｂによって規定されるエピトープに構造的に関連すると考えられる。
【０４８５】
ＸＩ．医薬組成物及び投与方法
ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントの調製方法及びＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントをそれを必要とする対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する方法は、当業者には周知であるか又は容易に決定されるであろう。結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントの投与の経路は、例えば、経口、非経口、吸入又は局所によるものであり得る。本明細書で使用される非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣投与を包含する。これらの投与形態の全ては本発明の範囲内にあると明らかに考えられるが、投与のための形態は、注射用、特に静脈内又は動脈内注射又は点滴用の溶液である。通常は、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合によっては安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含有し得る。しかし、本明細書の記載に適合した他の方法においては、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、有害細胞文群の部位に直接に送達させ、それによって治療剤に対する罹患組織の暴露を高めることができる。
【０４８６】
非経口投与用製剤としては、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類である。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液、例えば食塩水及び緩衝媒体が挙げられる。主題発明において、製薬学的に許容し得る担体としては、以下に限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ及び好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液又は０．８％食塩水が挙げられる。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体及び栄養補充物、電解質補充物、例えばリンゲルデキストロースを基材とする補充物などが挙げられる。防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、及び不活性ガスもまた存在させ得る。
【０４８７】
さらに詳しくは、注射剤用途に適した医薬組成物としては、滅菌水（水溶性である場合）又は分散液、及び滅菌注射剤溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。このような場合に、前記組成物は、滅菌されなければならず、また易注射針通過性が存在する程度まで液体であるべきである。前記組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定であるべきであり、及び微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用から保護されることが好ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適当な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。本明細書に開示の治療方法で使用する適当な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０４８８】
微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどで達成できる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含有させることが好ましいであろう。注射剤組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによってもたらし得る。
【０４８９】
いずれの場合でも、滅菌注射剤溶液は、適切な溶媒に、所定量の活性化合物（例えば、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントをそれ自体で又はその他の活性剤と組み合わせて）を、本明細書に列挙した成分の一つ又は組み合わせと共に含有させ、必要ならば、次いで濾過滅菌によって調製することができる。一般に、分散物は、塩基性分散媒及び前記に列挙した成分から必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を含有させることによって調製される。滅菌注射剤溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これは、有効成分と、追加の所望の成分との粉末を、これらの予め滅菌濾過した溶液から生成する。注射剤用の調剤は、加工され、容器、例えばアンプル、バッグ、瓶、注射器又はバイアルに詰められ、当技術分野において公知の方法に従って無菌条件下で密封される。また、製剤は、包装され、同時出願中の米国特許出願第０９／２５９，３３７号（米国特許出願公開第２００２−０１０２２０８Ａ１号）明細書（これは、その全てが参照として本明細書に組み込まれる）に記載のキットのようなキットの形で販売し得る。このような製造物品は、関連組成物が自己免疫又は新生物疾患を患うか又は患いやすい対象を治療するのに有用であることを示す標識又は包装挿入物を有することが好ましいであろう。
【０４９０】
本明細書に記載の過剰増殖性疾患の治療のための本発明の組成物の有効量は、多数の種々の因子、例えば投与、標的部位、患者がヒトであるか又は動物であるかにかかわらず、患者の生理学的状態、投与される他の医薬品、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかに応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例えばトランスジェニック哺乳動物もまた治療できる。治療用量は、安全性及び効果を最適化するために当業者に公知の常用の方法を使用して測定し得る。
【０４９１】
抗体又はそのフラグメントを用いた過剰増殖性疾患の治療について、その用量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、など）宿主体重の範囲にあり得る。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の中間の用量もまた、本発明の範囲内にあることが意図される。対象には、このような用量を、毎日、隔日、毎週又は実験分析によって決定される他のスケジュールに従って投与し得る。典型的な治療は、長期間、例えば少なくとも６ヶ月の長期間にわたる多重投薬における投与を伴う。別の典型的な治療計画は、２週間毎に１回又は１ヶ月に１回あるいは３〜６ヶ月毎に１回の投与を伴う。典型的な投薬計画は、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、隔日３０ｍｇ／ｋｇ又は毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。幾つかの方法において、種々の結合特異性を有する２種又はそれ以上のモノクロナール抗体が、同時に投与され、この場合には投与されるそれぞれの抗体の用量は前記に示した範囲内にある。
【０４９２】
本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、多数の場合に投与できる。単回投与の間隔は、毎週、毎月、毎年であり得る。間隔はまた、患者の標的ポリペプチド又は標的分子の血中濃度を測定することによって示されるように不規則であり得る。幾つかの方法において、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、幾つかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿ポリペプチド濃度を達成するために調節される。あるいは、結合性分子は、徐放性製剤として投与でき、その場合には頻回投与をあまり必要としない。投薬量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。結合性分子の半減期はまた、安定なポリペプチド又は部分、例えばアルブミン又はＰＥＧに対する融合によって延ばすこともできる。一般に、ヒト化抗体は、最も長い半減期を示し、その後にキメラ抗体及び非ヒト抗体が続く。１つの実施形態において、本発明の結合性分子は、結合体化されていない形で投与できる。別の実施形態において、本明細書に開示の方法で使用する結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、結合体化させた形で多数回投与できる。さらに別の実施形態において、本発明の結合性分子は、結合体化されていない形で投与し、次いで結合体化させた形で投与することができ、あるいはその逆もできる。
【０４９３】
投薬量及び投与の頻度は、治療が予防的であるか又は治療的であるかに応じて変化させることができる。予防用途において、抗体又はその混合物を含有する組成物は、未だ疾患状態にないか又は疾患にかかる前の状態の患者に患者の抵抗性を高めるために投与できる。このような量は、“予防有効量”と定義される。この使用において、正確な量はまた、患者の健康状態及び全身免疫に応じるが、一般に投与当たり０．１〜２５ｍｇ、特に用量当たりに０．５〜２．５ｍｇの範囲にある。比較的少ない投薬量が、長期間にわたって比較的まれな間隔で投与される。ある患者は、その生存中、治療を受け続ける。
【０４９４】
治療用途においては、比較的多い用量（例えば、投与当たり約１〜４００ｍｇ／ｋｇ結合性分子、例えば抗体、５〜２５ｍｇの用量が放射免疫結合体についてより一般的に使用され、場合によっては細胞毒−薬物結合体分子についてより多い用量が、使用される）が比較的短い間隔で、疾患の進行が抑えられるか又は止まるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで必要とされる要とされる。その後に、患者には予防的計画を施し得る。
【０４９５】
１つの実施形態において、対象を、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントをコードする核酸分子（例えば、ベクター中の）を用いて治療できる。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、又は３０〜３００μｇＤＮＡの範囲にわたる。伝染性ウイルスベクターについての用量は、投与当たり１０〜１００又はそれ以上のビリオンで変化する。
【０４９６】
治療剤は、予防及び／又は治療処置のために非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内又は筋肉内手段で投与できる。幾つかの方法において、薬剤は、ＩＧＦ−１Ｒ−を発現する細胞が蓄積している特定の組織に直接に注射される、例えば頭蓋内注射される。筋肉内注射又は静脈内注射が、抗体の投与について好ましい。幾つかの方法において、特定の治療用抗体は、直接に頭蓋に注射される。幾つかの方法において、抗体は、徐放性組成物又はデバイス、例えばＭｅｄｉｐａｄＴＭデバイスとして投与される。
【０４９７】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体又はそのフラグメントは、場合により、処置（予防処置又は治療処置）を必要とする疾患又は状態を治療するのに有効なその他の薬剤と組み合わせて投与できる。
【０４９８】
９０Ｙ標識した結合性ポリペプチドの有効単一治療投薬量（すなわち、治療有効量）は、約５〜約７５ｍＣｉ、さらに好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの範囲内にある。１３１Ｉ標識抗体の有効単一治療投薬量は、約５〜約７０ｍＣｉ、さらに好ましくは約５〜約４０ｍＣｉの範囲内にある。１３１Ｉ標識抗体の有効単一治療切除投薬量（すなわち、自己骨髄移植を必要とし得る）は、約３０〜約６００ｍＣｉ、さらに好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉ未満の範囲内にある。キメラ抗体と併用して、マウス抗体に対する長い血中半減期に起因して、１３１Ｉ標識キメラ抗体の有効単一治療非骨髄切除投薬量は、約５〜約４０ｍＣｉ、さらに好ましくは約３０ｍＣｉ未満の範囲内にある。例えば１１１Ｉｎについての画像化基準は、典型的には約５ｍＣｉ未満である。
【０４９９】
多くの臨床経験が１３１Ｉ及び９０Ｙを用いて得られているが、その他の放射性標識は、当技術分野において公知であり、同様の目的に使用されている。さらに別の放射性同位元素が画像化用に使用される。例えば、本発明の範囲に適合する別の放射性同位元素としては、以下に限定されないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、及び２１３Ｂｉが挙げられる。この点においてα、γ及びβ放射体は全て、本発明において適合する。また、本明細書の開示を考慮して、当業者はどの放射性核種が過度の実験を行うことなく選択された治療経路に適合するかを容易に決定できると思われる。この目的に、臨床診断ですでに使用されている別の放射性核種としては、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、及び１１１Ｉｎが挙げられる。抗体はまた、目標とされた免疫療法において可能性のある使用のために種々の放射性核種で標識されている（Ｐｅｉｒｅｒｓｚら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７））。これらの放射性核種としては、それほどではないにせよ１８８Ｒｅ及び１８６Ｒｅ並びに１９９Ａｕ及び６７Ｃｕが挙げられる。米国特許第５，４６０，７８５号は、のような放射性同位元素に関する更なるデータを提供し且つ参照として本明細書に組み込まれる。
【０５００】
本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントが結合体化された形又は結合体化されていない形で使用されるか否かに関わらず、本発明の主な利点は、骨髄抑制患者、特に補助療法、例えば放射線療法又は化学療法を受けつつあるか又は受けた骨髄抑制患者においてこれらの分子を使用できることであることが認められるであろう。すなわち、これらの分子の有益な送達プロフィル（すなわち、比較的短い血清滞留時間、比較的結合性親和性及び高められた局在性）は、これらの分子を、低下した予備赤色骨髄を有し及び骨髄毒性に感受性である患者を治療するのに特に有用にする。これに関して、前記分子の独特な送達プロフィルは、これらの分子を骨髄抑制癌患者に対する放射性標識結合体の投与に極めて有効にする。それ自体、本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ−  特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、結合体化された形又は結合体化されていない形で、補助療法、例えば遠隔照射療法又は化学療法をすでに受けている患者において有用である。別の好ましい実施形態において、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメント（これらもまた結合体化された形又は結合体化されていない形で）は、化学療法剤を用いた併用治療計画において使用し得る。当業者には、このような治療計画は、前記開示の抗体又は他の結合性分子及び１つ以上の化学療法剤の連続投与、同時投与、併用投与又は同一投与からなり得ることが認められるであろう。本発明のこの態様の特に好ましい実施形態は、放射性標識結合性ポリペプチドの投与を含む。
【０５０１】
ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、すぐ上に記載のようにして投与し得るが、他の実施形態において、結合体化された形又は結合体化されていない結合性分子は、最初の治療剤として他に異常にない患者に投与し得ることが強調されねばならない。このような実施形態において、結合性分子は、標準又は平均患者及び／又は補助療法、例えば遠隔照射療法又は化学療法を受けていなかった及び受けていない患者に投与し得る。
【０５０２】
しかし、前記で論じたように、選択された実施形態において、本発明は、骨髄抑制患者に、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを投与するか、あるいは１つ以上の補助療法、例えば遠隔照射療法又は化学療法を（すなわち、併用治療計画）と組み合わせて又はと共に投与することを含む。本明細書で使用されるように、ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントを補助療法と共に又は組み合わせた投与は、連続投与、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）投与、併用投与、同一（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）投与、同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）投与又は同時（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）投与、あるいは治療及び開示の結合分子の施用を意味する。当業者には、併用治療計画の種々の成分の投与又は施用が、治療の全般的な有効性を高めるために時期を選び得ることが認められるであろう。例えば、化学療法剤は、標準的な、周知の一連の治療において投与でき、次いで数週間以内に本明細書に記載の放射性免疫結合体を投与できる。反対に、細胞毒結合体結合性分子は、静脈内に投与され、次いで限局性腫瘍遠隔照射療法が施され得る。さらに別の実施形態において、結合性分子は、１回の外来診療において１種以上の選択された化学療法剤と同時に投与され得る。当業者（例えば、経験のある癌専門医）は、選択された補助療法及び本明細書の教示に基づいて、過度の実験を行うことなく有効な併用治療計画を容易に見分けることができるであろう。
【０５０３】
この点で、結合性分子（細胞毒を有する又は有していない）と化学療法剤の組み合わせは、任意の順序で及び治療的恩恵を患者に提供する時間枠内で投与し得ることが認められるであろう。すなわち、化学療法剤とＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、任意の順序で投与し得るし又は同時に投与し得る。選択された実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、化学療法をすでに受けている患者に投与されるであろう。さらに別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、化学療法と実質的に同時に又は共に投与されるであろう。例えば、患者は、一連の化学療法を受けながら、結合性分子を投与されてもよい。好ましい実施形態において、前記結合性分子は、任意の化学療法剤又は治療の１年以内に投与されるであろう。別の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、任意の化学療法剤又は治療の１０ヶ月以内、８ヶ月以内、６ヶ月以内、４ヶ月以内、又は２ヶ月以内に投与されるであろう。さらに別の好ましい実施形態において、前記結合性分子は、任意の化学療法剤又は治療の４週以内、３週以内、２週以内又は１週以内に投与されるであろう。さらに別の実施形態において、前記結合性分子は、選択された化学療法剤又は治療の５日以内、４日以内、３日以内、２日以内又は１日以内に投与されるであろう。２つの薬剤又は治療が数時間又は数分以内に（すなわち、実質的に同時に）に患者に投与又は施用し得ることがさらに認められるであろう。
【０５０４】
また、本発明に従って、骨髄抑制患者は、血球数の低下を示す患者を意味することを含むであろう。当業者には、骨髄抑制の臨床指標として慣用されるいくつかの血球値パラメーターがあること及び骨髄抑制が患者で生じる程度を容易に測定できることが認められるであろう。当技術分野で受け入れられている骨髄抑制測定値の例は、絶対好中球数（ＡＮＣ）又は血小板数である。このような骨髄抑制又は部分的骨髄破壊は、種々の生化学的障害又は疾患の結果であるか、おそらくは前の化学療法又は放射線治療の結果としてあり得る。この点において、当業者には、伝統的な化学療法を受けた患者が典型的には低下した予備赤色骨髄を示すことが認められるであろう。前記のように、このような患者は、死亡率又は罹患率の上昇をもたらす容認できない副作用、例えば貧血又は免疫抑制のせいで、多くの場合、最適レベルの細胞毒（すなわち、放射性核種）を使用して治療することができない。
【０５０５】
さらに具体的には、本発明の結合体化されているか又は結合体化されていないＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、約２０００／ｍｍ３よりも低いＡＮＣ又は約１５０，０００／ｍ３よりも低い血小板数を有する患者を効果的に治療するのに使用し得る。さらに好ましくは、本発明ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、約１５００／ｍｍ３よりも低いＡＮＣ、約１０００／ｍｍ３よりも低いＡＮＣ、又はさらに好ましくは約５００／ｍ３よりも低い血小板数を有する患者を効果的に治療するのに使用し得る。同様に、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、約７５，０００／ｍ３よりも低い血小板数、約５０，０００／ｍ３よりも低い血小板数、又はさらに約１０，０００／ｍ３よりも低い血小板数を有する患者を効果的に治療するのに使用し得る。より一般的な意味で、当業者は、政府実施（ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）ガイドライン及び手順を使用して患者が骨髄抑制される場合に容易に決定できるであろう。
【０５０６】
上記に示したように、多くの骨髄抑制患者が、一連の治療、例えば化学療法、移植放射線治療又は遠隔照射療法を受けている。後者の場合には、遠隔照射源は悪性腫瘍の局所照射用である。放射線治療実施方法について、放射性試薬は、悪性腫瘍内に外科的に配置され、それによって選択的に疾患の部位を照射する。いずれにしても、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、原因に関わらず骨髄抑制を示す患者の疾患を治療するのに使用し得る。
【０５０７】
この点で、さらに本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントが、インビボで新生細胞の増殖をなくすか、抑制するか又は調節する化学療法剤又は薬剤（例えば、併用治療計画を提供するあめに）と共に又は組み合わせて使用し得ることが認識されるであろう。論じたように、このような薬剤は、多くの場合、予備赤色骨髄の低下をもたらす。この低下は、このような患者の腫瘍形成の積極的な治療を都合よく可能にする本発明の化合物の低下した骨髄毒性によって、全体的に又は部分的に、相殺し得る。別の実施形態において、本明細書に開示の放射性標識免疫結合体は、新生細胞の放射性核種に対する感受性を高める放射線増感剤と共に効果的に使用し得る。例えば、放射線増感化合物は、放射性標識結合性分子が血流から多量に除去されているが、さらに１つ以上の腫瘍の部位に治療有効量で残っている後に、投与し得る。
【０５０８】
本発明のこれらの態様に関して、本発明に適合する典型的な化学療法剤としては、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキセート及びプレドニゾンが挙げられる。４種類の薬物の組み合わせＭＯＰＰ（ｍｅｃｈｌｅｔｈａｍｉｎｅ（窒素マスタード）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、プロカルバジン及びプレドニゾン）は、種々のタイプのリンパ腫を治療するのに極めて有効であり、本発明の好ましい実施形態を包含する。ＭＯＰＰ耐性患者では、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン及びストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰとＡＢＶＤ、ＭＯＰＰとＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシン及びビンブラスチン）又はＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）の組み合わせを使用できる。Ａｒｎｏｌｄ  Ｓ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ及びＬｅｅ  Ｍ．Ｎａｄｌｅｒ、Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７７４−１７８８（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら、ｅｄｓ．，１３ｔｈ  ｅｄ．１９９４）及びＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら（１９９７）並びに標準投薬及びスケジューリングのためにその中に挙げられた参考文献。これらの療法は、個々の患者に必要なように変化させずに又は変化させて、本発明の１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントと組み合わせて使用できる。
【０５０９】
本発明との関連で有用な別の治療計画としては、単一のアルキル化剤、例えばシクロホスファミド又はクロラムブシルの使用、あるいは組み合わせ、例えばＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰ及びドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰと、プロカルバジン及びブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰと、メトトレキセート、ブレオマイシン及びロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド及びロイコボリンと、標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキセート及びロイコボリン）及びＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量プレドニゾン、ブレオマイシン及びロイコボリン）の使用が挙げられる。当業者は、これらの治療計画のそれぞれについて標準用量及びスケジュールを容易に決定できるであろう。ＣＨＯＰはまた、ブレオマイシン、メトトレキセート、プロカルバジン、窒素マスタード、シトシンアラビノシド及びエトポシドとも併用されている。その他の適合性化学療法剤としては、以下に限定されないが、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコホルマイシン及びフルダラビンが挙げられる。
【０５１０】
中悪性度及び高悪性度の悪性腫瘍をもつ、寛解又は再発を達成できない患者については、サルベージ療法が使用される。サルベージ療法は、シトシンアラビノシド、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド及びイホスファミドなどの薬剤を単独で使用するか又は組み合わせて使用する。再発した形又は進行する形のある種の新生物疾患において、以下のプロトコルが多くの場合に使用される：ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキセート及びエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキセート及びエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビン及びシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン及びブレオマイシン）及びＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン及びプレドニゾン）（それぞれ周知の用量及びスケジュールを有する）。
【０５１１】
本発明ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントと併用される化学療法剤の量は、患者によって変化し又は当技術分野において公知の量に従って投与し得る。例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２３３−１２８７（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら、ｅｄｓ．，９ｔｈ  ｅｄ．（１９９６））参照。
【０５１２】
別の実施形態において、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、生物学的製剤と共に投与される。癌の治療に有用な生物学的製剤は、当技術分野において公知であり、本発明の結合性分子は、例えばこのような公知の生物学的製剤と共に投与し得る。
【０５１３】
例えば、ＦＤＡ（食品医薬品局）は、乳癌の治療に以下の生物学的製剤を承認している：ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；ＨＥＲ２−陽性乳癌において抗腫瘍活性を有するヒト化モノクロナール抗体）；ファスロデックス（登録商標）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ；乳癌を治療するのに使用されるエストロゲン−受容体拮抗薬）；アリミデックス（登録商標）（アナストゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＬＰ；アロマターゼ、すなわちエストロゲンを調製するのに必要とされる酵素をブロックする非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）；アロマシン（登録商標）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；乳癌の治療に使用される不可逆性、ステロイド性アロマターゼ不活性化剤）；フェマーラ（登録商標）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ；乳癌を治療するのにＦＤＡによって承認された非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）；及びノルバデックス（登録商標）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；乳癌を治療するのにＦＤＡによって承認された非ステロイド性抗エストロゲン）。本発明の結合性分子と併用し得るその他の生物学的製剤としては、：アバスチンＴＭ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；血管新生を阻害するために設計された最初のＦＤＡ承認治療剤）；及びＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｂ細胞リンパ腫の治療用に現在承認されている放射性標識モノクロナール抗体）が挙げられる。
【０５１４】
また、ＦＤＡは、結腸直腸癌の治療用の以下の生物学的製剤：アバスチンＴＭ；エルビタックスＴＭ（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，及びＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するモノクロナール抗体である）；  グリベック（登録商標）（イマチニブメシレート；プロテインキナーゼ阻害剤）；及びエルガミゾール（登録商標）（塩酸レバミゾール、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ；ジュークスのステージＣの結腸癌を有する患者において外科切除後の５−フルオロウラシルとの併用した補助治療剤として１９９０年にＦＤＡによって承認された免疫調節剤）を承認している。
【０５１５】
非ホジキンリンパ腫の治療における使用について、現在承認されている治療剤としては、ベクザー（登録商標）（トシツモマブ及びヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ；放射性分子（ヨウ素Ｉ−１３１）に連結されたマウスモノクロナール抗体（トシツモマブ）を含む多段治療剤）；イントロン（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ；アントラサイクリン含有併用化学療剤（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン［ＣＨＯＰ］）と共に濾胞性非ホジキンリンパ腫の治療用に承認されたインターフェロンの一つのタイプ）；リツキサン（登録商標）（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，及びＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；非ホジキンリンパ腫の治療用に承認されたモノクロナール抗体；オンタック（登録商標）（デニロイキンジフチトクス、Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；インターロイキン−２に遺伝子組み換え融合させたジフテリア毒素のフラグメント融合を含むタンパク質）；及びゼバリン（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ；Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療用にＦＤＡによって承認された放射性標識  モノクロナール抗体）が挙げられる。
【０５１６】
白血病の治療については、本発明の結合性分子と併用し得る典型的な生物学的製剤としては、グリベック（登録商標）；キャンパス（登録商標）−１Ｈ（アレムツズマブ、Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ；慢性リンパ球性白血病の治療に使用されるモノクロナール抗体の１つのタイプ）が挙げられる。また、ジェナセンス（オブリメルセン、Ｇｅｎｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ；白血病を治療するために開発中のＢＣＬ−２アンチセンス療法を使用し得る（例えば、単独であるいは化学療法剤、例えばフルダラビン及びシクロホスファミドと組み合わせて））は、本願の結合性分子と共に投与し得る。
【０５１７】
肺癌の治療については、典型的な生物学的製剤としては、タルセバＴＭ（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ；ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）経路を標的とするために設計された小分子）が挙げられる。
【０５１８】
多発性骨髄腫の治療については、典型的な生物学的製剤としては、ベルケイド（登録商標）ベルケイド（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ；プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。別の生物学的製剤としては、タリドミド（登録商標）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ；免疫調節及び多数の作用、例えば骨髄腫細胞の増殖及び生存並びに抗血管新生を阻害する能力を有すると思われる）が挙げられる。
【０５１９】
その他の典型的な生物学的製剤としては、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．によって開発されたＭＯＡＢ  ＩＭＣ−Ｃ２２５が挙げられる。
【０５２０】
先に論じたように、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメント、あるいはこれらの変異体、哺乳動物の過剰増殖性疾患のインビボ治療のために医薬有効量で投与し得る。この点について、開示の抗体は活性剤の投与を容易にし且つ安定性を促進するように製剤化されることが認められるであろう。好ましくは、本発明の医薬組成物は、製薬学的に許容し得る無毒性の滅菌担体、例えば生理学的食塩水、無毒性緩衝液、防腐剤などを含む。本発明の目的に、治療剤に結合体化された形又は結合体化されていない本発明ＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメント、あるいはその組換え体の医薬有効量とは、標的に対する効果的な結合を達成するのに十分な量及び例えば、疾患又は障害の症状を改善するか又は物質又は細胞を検出する利点を達成するのに十分な量を意味するであろう。腫瘍細胞の場合には、前記結合性分子は、好ましくは、新生物又は免疫活性細胞、あるいは非新生細胞、例えば、新生細胞に関連する血管細胞上の選択された免疫活性抗原と相互作用することができるであろうし、またこれらの細胞の死亡率の増加を提供するであろう。勿論、本発明の医薬組成物は、医薬有効量の結合性分子を提供するために１回以上投与し得る。
【０５２１】
この開示の範囲と一致して、本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、ヒト又はその他の動物に、前記の治療方法に従って、治療又は予防効果を生じるのに十分な量で投与し得る。本発明のＩＧＦ−１Ｒ−特異抗体又はその免疫特異的フラグメントは、このようなヒト又はその他の動物に、公知の方法に従って、本発明の抗体を慣用の製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製した慣用の剤形で投与し得る。当業者には、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤の形状及び特性は、併用されるべき有効成分の量、投与の経路及びその他の周知の変数によって規定されることが認められるであろう。また、当業者には、本発明の１種以上の結合性分子を含有する混合物が特に効果的であり得ることが認められるであろう。
【０５２２】
本発明の実施は、特に示されない限りは、当業者の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の慣用の方法を用いるであろう。このような方法は、文献に詳しく十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ及びＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４及び１５５（Ｗｕら，ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；並びにＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）参照。
【０５２３】
抗体工学の一般原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に説明されている。タンパク質工学の一般原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ら、Ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に説明されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般原理は：Ｎｉｓｏｎｏｆｆ、Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；及びＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ及びＨａｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８４）に説明されている。また、当技術分野において公知であり且つ具体的に記載されていない免疫学の標準法は、一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら（ｅｄｓ）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）並びにＭｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に記載のように従う。
【０５２４】
免疫学の一般原理を説明する標準参考文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ら、ｅｄｓ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．ら、ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４），Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｋｉｎｄｔ及びＢａｒｂａｒａ  Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．（２０００）；Ｒｏｉｔｔ，Ｌ，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．及びＭａｌｅ  Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ  Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．及びＬｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ，Ａｎｔｏｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｏｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）が挙げられる。
【０５２５】
上記に挙げた参考文献及び本明細書で引用した参考文献はすべて、その全体を参照することにより、本明細書において援用される。
【実施例】
【０５２６】
実施例１
ファージライブラリーからのＩＧＦ−１Ｒ特異Ｆａｂの選別
組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ外部ドメインを使用して、３．５×１０１０個のユニーククローンを含有するヒト未変性ファージミドＦａｂライブラリーを選別した（Ｈｏｅｔ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３４４−８（２００５），（“Ｈｏｅｔら”）、これは、その全てが参照として本明細書に組み込まれる）。２つの異なるパニングアームを、ビオチン化ＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓ及びＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃタンパク質を使用して生じさせた。タンパク質は、ストレプトアビジンを塗布した電磁ビーズ上に捕捉し、その後にファージライブラリーと共にインキュベートした。ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃの場合には、ビオチン化抗Ｆｃ抗体は、磁ビーズ上に捕捉し、次いでＦｃ融合タンパク質を捕捉した。選別は、Ｈｏｅｔらの論文に記載のようにして行った。３回のパニング後に、４７９ｂｐの遺伝子ＩＩＩ基部（ｓｔｕｍｐ）を、ＭｌｕＩ消化によって除去し、ＴＧ１細胞中の可溶性Ｆａｂ発現のためにベクターを再連結した。ビオチン化ＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓアーム由来の９２０個のクローンのＥＬＩＳＡ分析により、３３個のユニーク配列を含有する５９３個の陽性クローンを得た。ＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓアーム由来の９２０個のクローンのＥＬＩＳＡ分析により、１２個のユニーク配列を含有する１６３個の陽性クローンを得た。全てのクローンの配列分析により、パニング法の両方のアームにおいて単離された１２個のクローンを決定した。ユニーククローンを精製し、結合を、ＥＬＩＳＡによる組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ外部ドメインに対し及び完全長ヒトＩＧＦ−１Ｒに安定的に移入された３Ｔ３細胞に対して再確認した（図ＩＡ及びＩＢ）。結合データに基づいて、両方のアームの単離された１２個のユニーククローンのうちの６個を、さらに分析するために選別した。
【０５２７】
実施例２
腫瘍細胞で発現されたＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂの結合活性
Ｆａｂの野生型ＩＧＦ−１Ｒに対する結合能を、ＭＣＦ−７腫瘍細胞系を使用してフローサイトメトリーで調べた。
【０５２８】
ＭＣＦ−７細胞（ＮＣＩから得たヒト乳腺癌細胞）を、アッセイのセットアップの前に２４時間分裂させ、７０％密集単層を得た。日常的に、ＭＣＦ−７細胞系は、２０継体以内に維持した。細胞を、細胞解離用緩衝液（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１３１５１−０１４）を用いて引き上げ、算定し、洗浄し、細胞１×１０６個／ｍｌに調整し、次いで１ｍｌの細胞を、それぞれの試験管（１２×７５ｍｍ管  Ｆａｌｃｏｎカタログ＃３５２０５４）に加えた。細胞をペレット化し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより上清を除去し、次いで得られた細胞ペレットに１００μｌの希釈抗体を加えた。精製Ｆａｂを、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：３希釈液を用いて２１０μｇ／ｍｌ又は６０μｇ／ｍの開始濃度から０．００１μｇ／ｍｌまで下げて試験した。アッセイ全体を通じて使用したＦＡＣＳ緩衝液は、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ａ−７９０６）及び０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｓ２００２）を含有するＰＢＳ（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含有していない）であった。陽性対照として、ＩＲ３マウス抗体（Ａｂ−１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃ＧＲ１１Ｌ）を使用した。試料を氷の上で１時間１５分インキュベートし、次いで２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃で、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、ＦＡＣＳ緩衝液を入れたそれぞれの対応試験管に１００μｌの第２の検出抗体を加えた。次いで、試料を氷の上で、暗中で３０分間インキュベートした。細胞を前記のように洗浄し、次いで、試験管／試料当たり２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【０５２９】
細胞結合Ｆａｂを、ＦＩＴＣ−結合体化親和性精製Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的ヤギ抗−ヒト−ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂカタログ＃１０９−０９６−００６；５μｇ／ｍｌで使用する）を使用して検出し、一方、陽性マウス対照抗体を、Ｆ（ａｂ’）２ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１１５−０９６−０６２；５μｇ／ｍｌで使用した）を使用して検出した。細胞を、生存細胞を調べるためにヨウ化プロピジウム染色溶液（死滅細胞除外用のＰＩ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  カタログ＃５１−６６２１  ＩＥ又は５５６４６３；ＦＡＣＳ緩衝液中で、最終１：５００で使用）を用いて染色した。試料を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に流し、試料当たり１０，０００の有効事象（ｌｉｖｅ  ｅｖｅｎｔ）を集めた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．０ソフトウエア（ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．，１１４５２  Ｅ１  Ｃａｍｉｎｏ  Ｒｅａｌ，＃２１５，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１３０  ＵＳＡ）を使用して、データ解析を行った。
【０５３０】
試料が流され、幾何平均が決定されると、抗体濃度（Ｘ軸）対幾何平均（Ｙ軸）を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ）グラフ作成プログラムを使用してｌｏｇ１０にグラフ化した。次いで、データセットを、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）に変換し（Ｘ値データセット＝抗体濃度）、非直線回帰曲線適合、シグモイド用量応答を使用してグラフ化した。Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈソフトウエアを使用してＥＣ５０値及びＲ２値を得た。
【０５３１】
６個のＦａｂ全部が、ＭＣＦ−７腫瘍細胞で発現される野生型ＩＧＦ−１Ｒに対して良好な活性を示した（図２）。結合のＥＣ５０は、９〜４２ｎＭの範囲にあった（表３）。
【０５３２】
実施例３
ＦａｂによるＩＧＦ−１Ｒに対するリガンドの結合の阻害
ＦａｂがＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドの結合をブロックする能力を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して調べた。
【０５３３】
リガンドブロッキングアッセイ（ＲＩＡ）。組換えヒトＩＧＦ−１（Ｃａｔ＃２９１−Ｇ１）、ＩＧＦ−２（Ｃａｔ＃２９２−Ｇ２）、インスリン（Ｃａｔ＃Ｃｕｓｔｏｍ０２）ヒトインスリン受容体（Ｃａｔ＃１５４４−１Ｒ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入した。インスリン（Ａｒｇ−インスリン、Ｃａｔ＃０１−２０７）は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ（現在は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ（ＵＳＡ）の一部門）から購入した。１２５Ｉ−ｒｈＩＧＦ−１（Ｃａｔ＃ＩＭ１７２）、１２５Ｉ−ｒｈＩＧＦ−２（Ｃａｔ＃ＩＭ２３８）及びｌ２５Ｉ−ｒｈＩｎｓｕｌｉｎ（Ｃａｔ＃ＩＭ１６６）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。ＡｆｆｉＰｕｒｅヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異抗体（Ｃａｔ＃１０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｒｎｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの捕捉に使用した。検出抗体として、ヤギ抗−マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｃａｔ＃１０３０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用した。
【０５３４】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２ブロッキング用の陽性対照として、ＩＲ３（Ａｂ−１、Ｃａｔ．＃ＧＲ１１ＬＳＰ５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及び１Ｈ７（ＩＧＦ−１Ｒα−鎖に特異的なマウスモノクロナール、ｓｃ−４６１、ＩｇＧ１  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、それぞれ使用した。ヒトインスリン受容体α−サブユニット特異抗体、クローン８３−１４（Ｃａｔ＃ＡＨＲ０２２１、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）及びクローン４７−９（Ｃａｔ＃Ｅ５５５０２Ｍ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓａｃｏ，ＭＥ）を、インスリン−インスリン受容体結合実験のブロッキングの陽性対照として使用した。組換えＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で製造された。
【０５３５】
アイソタイプ適合マウス陰性対照抗体として、２Ｂ８（マウスα−ＣＤ２０．ＩｇＧ１）及び２Ｂ８  ｍｋｍ．Ｇ２ａ（マウスα−ＣＤ２０  ＭＡｂ、ＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｌｏｔ＃ＮＢ３３０４−８７，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した。Ｆａｂについての陰性対照は、Ｃｈｒｉｓｔｉｌｙｎ  Ｇｒａｆｆ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によって提供されたＲ００１−１Ｂであった。緩衝液に使用したＰＢＳは、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｃａｔ．＃１７−５１３Ｆ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。
【０５３６】
組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ヒスチジン標識バージョン）又はＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．５）で２５０ｎｇ／ウエルの濃度に希釈したＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ（高結合性）Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ  ｓｔｒｉｐｓ（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ｃａｔ．＃６３０２）の表面に塗布した。４℃で一夜インキュベートした後に、ウエルを、洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）で３回洗浄し、次いでブロック用緩衝液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロックした。ブロック用緩衝液を除去し、ウエルを３回以上洗浄した。抗体、Ｆａｂ、又はリガンド調剤を、希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）で所定の濃度に希釈し、二重反復で、ウエル当たり５０μｌを入れた。室温で４５分後に、５０μｌの希釈用緩衝液中の［１２５Ｉ］ｒｈＩＧＦ−１又は［１２５Ｉ］ｒｈＩＧＦ−２いずれかの１００，０００ｃｐｍを、ウエル当たりに加えた。これを、室温で１時間以上インキュベートした。ウエルを再度３回以上洗浄し、最後の洗浄後に放置して液体をなくした。風乾したウエルを、Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンターを用いて算定した。
【０５３７】
あるいは、Ｆａｂはプレートに固定化した抗−ヒトＩｇＧを使用して捕捉する部分変更捕捉アッセイで評価した。固定化は、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異抗体（２００ｎｇ／ウエル）を炭酸塩コーティング緩衝液中で一夜インキュベートすることによって行った。ウエルを洗浄し、ブロックし、２５０ｎｇのＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃをウエル当たりにつき加えた。
【０５３８】
６種類のＦａｂのＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２、あるいは両方のリガンドの結合をブロックする能力を、表３に示す。異なるブロッキング活性を有する上位６個のＦａｂを、さらに分析するために選択した。
【０５３９】
実施例４
ＦａｂはＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２介在ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害した
細胞系：ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７（ＮＣＩ）を発現するＩＧＦ１Ｒを、１０％ＦＢＳ、１Ｘ非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１０００Ｕ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＭＥＭイーグル（ＡＴＣＣ）中に、３７℃及び５％ＣＯ２で保持した。細胞を、維持及びアッセイのために週に２回継体培養し、最大１２継体で使用した。
【０５４０】
ＭＣＦ−７細胞を、ポリ−Ｄ−リシン被覆１２ウエルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５−６４７０）の２ｍｌ増殖培地に細胞２×１０５〜４．０×１０５個／ウエルで塗布し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４８時間で、培地を除去し、細胞血清を３７℃、５％ＣＯ２で一夜餓死させた（ｓｔａｒｖｅｄ）。血清無含有培地を除去し、対照抗体又は試験抗体を、示した濃度で、３５０μｌの新しい血清無含有培地血清に加え、室温又は７℃で１時間インキュベートした。Ｆａｂを、２００ｎＭ、２０ｎＭ及び２ｎＭの濃度で試験し、ｍＡｂを６７ｎＭ、６．７ｎＭ及び０．６７ｎＭで試験した。使用した市販抗−ＩＧＦ−１Ｒ対照抗体は、αＩＲ３（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、＃Ｄ２７２４９）であった。１３ｎＭのヒト組換えＩＧＦ−１又は２７ｎＭのＩＧＦ−２（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２９１−Ｇ１、＃２９２−Ｇ２）を、３５μｌ血清無含有培地を入れたウエルに加え、３７℃で１５分間インキュベートした。リガンドを、３７℃抗体実験のために室温でインキュベートした。細胞を、１×細胞溶解用緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃９８０３）中で１ｍＭのＰＭＳＦを用いて室温で１時間溶解した。
【０５４１】
細胞溶解液を、ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（クローン１−２、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、＃ＡＨＲ０３６１）を予め塗布したＥＬＩＳＡプレートに加え、２時間インキュベートした。その後にプレートを洗浄し、プレートに結合されたリン酸化受容体を、ビオチン標識抗−ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（カタログ＃１６−１０３、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ（現在はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ（ＵＳＡ）の一部門）及びストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５４０６６）を用いて検出した。アッセイは、ＴＭＢ基質（ＫＩＥＲＫＥＧＡＡＲＤ  ＆  ＰＥＲＲＹ、＃５０−７６−００）を加えることによって展開し、４ＮのＨ２ＳＯ４（ＬａｂＣｈｅｍ，Ｃａｔ＃ＬＣ２５８３０−１）を加えることによって発色を停止させた。光学濃度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定し、及びリガンド対照に対する阻害％を、それぞれの抗体−リガンド試料について算出した。
【０５４２】
表３に、ＦａｂによるＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−１ＲのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２介在ＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害を要約する。合計１６個のＩＧＦ−１ＲＦａｂを、ＥＬＩＳＡで受容体リン酸化の阻害について選別した。９個の抗体が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２又はその両方に対して２００ｎＭの濃度で“＋”又はそれよりもよい陽性反応を示した。
【０５４３】
これらの抗体を、量のスケールアップのために選別し、再び用量依存阻害反応について試験した。リガンド結合及び受容体リン酸化を阻害する能力に基づいて、４つのＦａｂを、完全長抗体転換のリード候補として選択した（実施例６参照）。
【０５４４】
図３（Ａ及びＢ）は、上部の６個のＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂのスケールアップ物質のＩＧＦ−１Ｒリン酸化阻害を表す。
【０５４５】
実施例５
ＩＮＳＲと対比したＩＧＦ−１Ｒに対する抗体結合特異性及び親和性
パートＩ：酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用する可溶性ＩＮＳＲと対比した可溶性ＩＧＦ−１に結合する抗体の分析
ＥＬＩＳＡアッセイを行い、インスリン受容体と対比した可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂフラグメント抗体の特異結合を調べた。プレートを、１０μｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３０５−ＧＲ）又はｒｈ−ＩＮＳＲ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１５４４−ＩＲ）で一夜被覆し、５％ミルクを用いてブロックした。抗体を、Ｆａｂについては２μＭ〜０．２ｎＭの範囲で又はマウスＭＡｂについては６６７〜０．０６７ｎＭの範囲で、１：１０連続希釈で加え、室温で１時間インキュベートした。結合された抗体を、ＦａｂについてはＨＲＰＯ標識ヤギα−ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、＃２０６０−０５）を用いて検出し、マウスＭＡｂについてはヤギα−マウスＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、＃１１５−０３５−１６４）を用いて検出した。発色を４ＮのＨ２ＳＯ４を加えることによって停止させ、光学濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定し、結合曲線を作成した。
【０５４６】
ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂは、任意の濃度で可溶性インスリン受容体に特異的結合を示さなかった（表３）が、予測されたようにＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対して良好な結合を示した。
【０５４７】
図４（Ａ及びＢ）は、Ｆａｂ類、すなわちＭ１４−Ｂ０１、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１２−Ｇ０４を用いて得られた代表的な結合曲線を例証する。同様の結合パターンが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１及びＭ１２−Ｅ０１について観察された（データは示さなかった）。
【０５４８】
パートＩＩ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ｔｒ−ＦＲＥＴ）を使用する可溶性ＩＮＳＲと対比した可溶性ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体の分析
可溶性ヒトＩＧＦ−１Ｒ及びインスリン受容体外部ドメインに対するＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗体の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）及び時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ｔｒ−ＦＲＥＴ）を使用して比較し；またＭ１３−Ｃ０６抗体が、インスリン受容体、マウスＩＧＦ−１Ｒ、又はヒトＩＧＦ−１Ｒ先端切断バージョン（すなわち、第１及び第２のロイシンに富む反復ドメイン並びにシステインに富む反復ドメインのみを含有するが、ＩＧＦ−１Ｒの３つのフィブロネクチンＩＩＩ形ドメインを欠くｈＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基１−４６２）との優位な交差反応性を示さないことを実証した。
【０５４９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ＳＰＲ分析を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を使用して行った。この装置を２５℃に設定し、アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅから購入したランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（ｐＨ７．２）（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８８）を用いて行った。完全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅセンサーチップ表面に、Ｂｉａｃｏｒｅから提供されるプロトコルに従って標準ＮＨＳ／ＥＤＣ−アミン反応化学を使用して〜１０，０００ＲＵに固定化した。固定化のために、抗体を、１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．０緩衝液に４０μｇ／ｍＬに希釈した。前記ヒト抗体のそれぞれに対するヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））及びヒトＩＮＳＲ（２８−９５６）−Ｈｉｓ１０（ＩＮＳＲ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））の完全長の外部ドメインの結合及び解離の相対速度を調べるために、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０又はＩＮＳＲの濃度を上昇させながらセンサーチップ表面に注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０濃度系列は、１．０ｎＭから２５０ｎＭまでの範囲にわたり、これに対してＩＮＳＲ濃度は、１．０ｎＭから２５０μＭまでの範囲にわたった。全ての抗体表面を、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）で確実に再生させた。反復された再生は、抗体表面のいずれにも活性喪失を招かなかった。流量は、２０μｌ／分であった。（“Ｈｉｓ１０”は、組立て体のＣ末端の１０−残基ヒスチジン標識を表す。）
時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ｔｒ−ＦＲＥＴ）アッセイ
ＭＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０及びＭ１３−Ｃ０６を、色素製造業者のプロトコルに従って標準ＮＨＳ化学を使用して、Ｃｙ５及びユーロピウムキレートそれぞれに共有的に結合体化させた。数種の非標識可溶性外部ドメイン受容体競合剤、（１）ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０、（２）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−ＦｌａｇＨｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、（３）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、（４）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、（５）マウスＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）又は（６）ＩＮＳＲの６．２５μｇ（５０μｌの１２５μｇ／ｍｌ原液）で開始する連続希釈液を、９６−ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒからのｂｌａｃｋ）中で０．１μｇのｈＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５（２５μｌの４μｇ／ｍｌ原液）及び０．０７５μｇのＥｕ−Ｃ０６（３μｇ／ｍｌ原液の２５μｌ）と混合した。タンパク質濃度に関して各色素の吸光度で測定されるように、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５についての複合濃度は６．８：１（Ｃｙ５：ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０）であり、Ｅｕ−Ｃ０６については１０．３：１（Ｅｕ：Ｃ０６）であった。全容量は、各試料について１００μｌであった。プレートを、プレート攪拌機で、室温で１時間インキュベートした。蛍光測定は、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＬＡＮＣＥプロトコルを使用して、３４０ｎｍの励起波長及び６６５ｎｍの発光波長を用いて行った。全ての組立て体は、少なくとも二重反復で試料採取した。
【０５５０】
全てのＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃで誘導された可溶性ＩＧＦ−１Ｒ受容体外部ドメイン組立て体を、ＣＨＯ発現用のＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ＰＶ−９０ベクターに記載の方法（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙら、２００３）を使用してサブクローン化した。Ｃ末端ＩｇＧ−Ｆｃ標識を含有する各受容体は、前記のようにして単一のプロテインＡＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）工程を使用して親和性精製した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０は、前記（Ｄｅｍａｒｅｓｔら、２００６）のようにしてＮｉ２＋−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
結果：
完全ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲ外部ドメイン組立て体に対するこれらの競合結合活性について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０及びＩＮＳＲを、固定化抗体表面に同じプロトコルを使用して注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０は、最も低い濃度０．５ｎＭでも３つの抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体全部に結合することを実証した（データは示さない：濃度は１〜２５０ｎＭにわたり、及び受容体注入相（ｐｈａｓｅ）は、４００−２２００秒であり、次いで緩衝液解離相及びその後のグリシンｐＨ２．０による再生であった）。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０結合は、Ｍ１３−Ｃ０６表面に対して最も強かった。それに対し、ＩＮＳＲは、２μＭほどの高い濃度の受容体でさえもＭ１３−Ｃ０６表面に対してほとんど活性を実証しなかった（ＩＧＦ−１Ｒ結合について観察されたよりも＞１００００高い（データは示さない：濃度は１．０ｎＭ〜２μＭにわたり及び受容体注入相は、５００−１０００秒であり、次いで緩衝液解離相であった）。Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｇ１１表面もまた、ＩＮＳＲに対してほとんど結合活性を実証しなかった。
【０５５１】
次に、Ｍ１３−Ｃ０６に対する種々の組換えＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲ組立て体の親和性を、競合系ｔｒ−ＦＲＥＴアッセイを使用して調べた。全ての組換え受容体組立て体（以下に記載）について最も適合した結合曲線を調べた（データは示さない）。全てのデータが、対応ＩＣ５０値を測定した１つの部位結合モデルに適合した。３つの完全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ外部ドメイン組立て体（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０、及びｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０）全部が、２．９μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、５．２μｇ／ｍｌのＩＣ５０値それぞれと濃度に依存した方法で競合した。先端切断ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ組立て体、完全長マウスＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ組立て体、及び完全長ヒトＩＮＳＲ−Ｈｉｓ１０組立て体は、Ｃｙ５−標識ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を、組換え完全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ組立て体のＩＣ５０よりも１００倍高い濃度で阻害せず、これら前者の組立て体が、後者の完全長ヒトＩＧＦ−１Ｒと比べてＭ１３−Ｃ０６に対して顕著な結合反応性を示さないことを示唆した。
【０５５２】
パートＩＩＩ：可溶性ヒト対マウスＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６抗体の相対結合親和性
マウスＩＧＦ−１Ｒと対比したヒトＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の相対結合親和性を比較した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、マウスＩＧＦ−１ＲＦｃ及びヒトＩＧＦ−１ＲＦｃに対するＭ１３−Ｃ０６の親和性を調べた。実験は、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ  ３０００で、ＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８８）をランニング緩衝液として使用して行った。抗−ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓからの２Ｃ１１、Ｃａｔ．Ｎｏ．５２１８−９８５０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１０００−１４）表面にＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中５００ｎＭで注入することによって固定化させ飽和させた。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ又はｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、チップ表面に４０μＬの２０ｎＭ受容体を３μＬ／分で注入することによって捕捉させた。受容体の捕捉後に、４０μＬのＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂを３μＬ／分で注入した。Ｆａｂの解離を、〜２７分間測定した。Ｆａｂを２５ｎＭから０．４ｎＭまで連続希釈して、濃度依存速度結合曲線を得た。それぞれの注入系列の間の表面チップの再生を、１００ｍＭグリシンｐＨ２．０の６０μＬ／分で３×１０μＬの注入を使用して行った。それぞれの曲線を、（１）抗−ＩｇＧ抗体２Ｃ１１を欠いたＣＭ５チップ表面から得たデータ及び（２）受容体の１次注入、次いでＨＢＳ−ＥＰ緩衝液の２次注入から得たデータを使用して、二重に参照した。各受容体についてのＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂの濃度系列は、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア内に提供された１：１結合モデルに適合させた。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合するＭ１３−Ｃ０６のｋｄを得るために、実験を、Ｍ１３−Ｃ０６Ｆａｂを２５ｎＭで用い及びｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを２０ｎＭで用いて反復した。元のプロトコルの唯一の変化は、３時間までの解離時間の延長であった。
結果：
Ｍ１３−Ｃ０６Ｆａｂを、ＭＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ又はｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを含有するＢｉａｃｏｒｅ表面に加えて、前記２種類の受容体に対する抗体の相対親和性を調べた。Ｃ末端ＩｇＧ１−Ｆｃ標識の存在は、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ受容体組立て体のさらなる多量体化をもたらす（データは示さない）；従って、結合モデルの適合は、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対親和性又は見かけ親和性の尺度を提供する。ヒト及びマウスＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂの親和性が、０．９７８ｎＭ及び８９．１ｎＭそれぞれであることが認められた。マウスＩＧＦ−１Ｒに対する結合の１００倍の低下は、結合曲線及び解離曲線、速度定数、及び平衡解離定数を示す図２７ＡとＢを比較した場合に容易に明らかである。図２７Ａは、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂの濃度依存結合特性を表す（ｋａ（１／Ｍｓ）＝８．５２ｅ５Ｍ−１ｓ−１；ｋｄ（１／ｓ）＝８．３３ｅ−４ｓ−１；及び、ＫＤ＝９．７８ｅ−１０Ｍ）。図２７Ｂは、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂの遅い結合及び解離結合特性を表す（ｋａ（１／Ｍｓ）＝４７１Ｍ−１ｓ−１；ｋｄ（１／ｓ）＝４．２０ｅ−５ｓ−１；ＫＤ＝８．９１ｅ−８Ｍ）。ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃからＭ１３−Ｃ０６Ｆの極めて遅い解離により、動力学的解離速度定数、ｋｄ、は、最初のデータセットを使用して測定することができなかった。第２の実験は、３時間の解離時間を使用して行って解離速度定数、４．２０ｅ−５ｓ−１のｋｄを、これを使用して元のデータセットから平衡解離定数、ＫＤ、（上記）を得た。Ｃ末端ＩｇＧ１−Ｆｃ標識の存在は、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ受容体組立て体のさらなる多量体化をもたらす（データは示さない）；従って、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対親和性又は見かけ親和性の尺度を提供する。
【０５５３】
パートＩＶ：Ｍ１３−Ｃ０６完全長抗体は、哺乳動物細胞中で発現されるＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合するが、ＩＮＳＲを結合しない。
【０５５４】
組換えＩＧＦ−１Ｒ及びインスリン受容体（ＩＲ）を、独立して哺乳動物細胞（３Ｔ３又はＣＨＯ）中で発現させた。細胞を、１％トリトンＸ−１００を用いて溶解し、受容体を、陰性対照抗体（ＩＤＥＣ−１５１）、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（Ｃ０６）、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（Ｇ１１）、又はＩＮＳＲ抗体（α−ＩＲ）に結合させたプロテインＡ／Ｇビーズを用いて免疫沈降させた。抗体／抗原結合体を、酸処理によってビーズから放出させ、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加え、ニトロセルロース膜にブロットした。検出を、マウス抗−ヒト１Ｒ（図２６Ａ）又はマウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ（図２６Ｂ）及びヤギα−マウスＩｇＧを使用して行った。結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、哺乳動物細胞中で発現されるＩＧＦ−１Ｒを特異的に結合するが、ＩＮＳＲを結合しない。
【０５５５】
実施例６
完全長の抗−ＩＧＦ−１ＲＩｇＧの組み立て
４つのＦａｂを、ＩｇＧ４．Ｐ．ａｇｌｙバージョンに変え、ＣＨＯ細胞中で発現させた。４種類の抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂｓ−Ｍ１３−Ｃ０６（図５（Ａ）−（Ｄ））、Ｍ１４−Ｃ０３（図５（Ｅ）−（Ｈ））、Ｍ１４−Ｇ１１（図５（Ｉ）−（Ｌ））、及びＭ１４−Ｂ０１（図５（Ｍ）−（Ｐ））をコードするＤＮＡ配列を、ヒト抗体ファージライブラリー（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ）から、組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ外部ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質に対するバイオパニングによってから選択した。４種類の抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂのそれぞれは、ＶＨ３−２３ヒト重鎖生殖系列フレームワークを含有し、κ軽鎖であった。Ｆａｂ遺伝子配列を使用して、哺乳動物細胞中で抗体産生用のｐＶ９０ＡＳ発現ベクター系を使用して完全長の抗−ＩＧＦ−Ｒ１抗体をコードする発現プラスミドを組み立てた。ｐＶ９０ＡＳは、一次転写産物の交互スプライシングによって単一のプロモーターから２個の転写物を生成させるために設計された部分改変ｐＶ９０発現ベクターである（参照：ＵＳＰＴＯ出願ＷＯ２００５／０８９２８５号）。天然ＣＭＶスプライス供与体を、抗体軽鎖コード化転写物を生成させるために部分損傷スプライス受容体に、又は抗体重鎖コード化転写物を生成させるために天然ＣＭＶスプライス受容体にいずれかにプライスする。部分損傷スプライス受容体は、類似量の重鎖及び軽鎖転写物の両方をもたらすために操作されている。それぞれの抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６；Ｍ１４−Ｃ０３；Ｍ１４−Ｇ１１及びＭ１４−Ｂ０１）の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）（配列番号：１５３及び１５４、図５（Ｙ）−（Ｚ））を、ＰＣＲで増幅した（表７）。５’軽鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＦＫは、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：１３１−４１（２０００）（これは、その全てが参照として本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従って、ＶＬ領域のアミノ末端に対応する配列に対して枠内に、Ｓｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位、その後に免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチドをコードする配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号：１５７）を含有していた。４つの成熟ＩＧＦｌＲ軽鎖配列は全て同一のアミノ末端を有していた。３’軽鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＲＫは、ＣＬ領域のカルボキシル末端に対応する配列とＡｓｃ  Ｉ部位とを含有していた。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲルＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）を使用する電気泳動と抽出とによって精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ  Ｉ及びＡｓｃ  Ｉを用いて消化し、Ｓｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ消化ｐＨＬＰ０２５ベクター（Ｈｏｌｌｙ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ）と連結した。ｐＨＬＰ０２５ベクターは、天然ＣＭＶスプライス供与部位配列、部分損傷スプライス受容部位配列、及びポリＡシグナル配列の他に、Ｓｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ消化ＰＣＲフラグメントとして、抗体軽鎖（シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ）受け入れるためのＳｆｉ  Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する（参照：ＵＳＰＴＯ出願ＷＯ２００５／０８９２８５号）。
【０５５６】
それぞれの抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６；Ｍ１４−Ｃ０３；Ｍ１４−Ｇ１１及びＭ１４−Ｂ０１）の重鎖可変領域（ＶＹ）を、ＰＣＲで増幅した。５’重鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＦＨは、前記のようなＶＨ領域のアミノ末端に対応する配列に対して枠内に、Ｎｃｏ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位、その後に合成重鎖シグナルペプチドをコードする配列ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号：１２２））を含有していた。３’重鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＲＨは、ＶＨ領域のカルボキシル末端に対応する配列とＳｆｉ  Ｉ部位とを含有していた。ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）を使用するアガロースゲル電気泳動と抽出とによって精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ  Ｉ及びＳｆｉ  Ｉを用いて消化し、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ消化ｐＨＬＰ０２９ベクター（Ｈｏｌｌｙ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ）と連結した。ｐＨＬＰ０２５ベクターは、上流ポリＡシグナル配列、天然ＣＭＶスプライス受容部位配列、及び下流ポリＡシグナル配列の他に、Ｎｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ消化ＰＣＲフラグメントとして、抗体シグナルペプチド−ＶＨ配列受け入れるためのＮｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ部位を含有する（参照：ＵＳＰＴＯ出願ＷＯ２００５／０８９２８５号）。
【０５５７】
ｐＨＬＰ０２５中の（Ｓｆｉ  Ｉ部位−軽鎖シグナルペプチド−抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＬ及びＣＬ）をコードする配列及びｐＨＬＰ０２９中の（重鎖シグナルペプチド−抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨ−Ｓｆｉ  Ｉ部位）をコードする配列を、単一のＤＮＡフラグメント中に、ＰＣＲ増幅によって、前記の５’軽鎖ＩＧＦ１Ｒ−ＦＫ  ＰＣＲプライマー及び３’重鎖ＶＨ  ＩＧＦ１Ｒ−ＲＨ  ＰＣＲプライマーを使用して両方のベクター中に存在する共通重複配列を介して、組み立てた。得られたＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットプロトコル（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）を使用するアガロースゲル電気泳動と抽出とによって精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ  Ｉを用いて消化し、Ｄｒａ  ＩＩＩ消化ｐＸＷＵ００７ベクターと連結した。手短に言えば、ｐＸＷＵ００７は、最初にＩｇＧ４ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を含有し且つＣＨ２ドメインにＴ２９９Ａ突然変異を含有するＡｇｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩヒトＩｇＧ４定常領域フラグメント、ＥＵナンバリング方式（Ｋａｂａｔ，Ｅ，Ｗｕ，ＴＴ，Ｐｅｒｒｙ，ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＫＳ，Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ、１９９１）（配列番号：１５５及び１５６、図５（ＡＡ）−（ＢＢ））を、プラスミドｐＥＡＧ１８０８（Ｅｌｌｅｎ  Ｇａｒｂｅｒから提供された）からＡｇｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩ消化ｐＨＬＰ０２８ベクターにサブクローニングすることによって組み立てた。ｐＨＬＰ０２８は、前記の単一のＳｆｉ  Ｉ−消化ＰＣＲ生成物を受け入れるためのＤｒａ  ＩＩＩ部位を含有するために変性されたＶ９０  ＩｇＧ４ベクターである（参照：ＵＳＰＴＯ出願ＷＯ２００５／０８９２８５号）。
【０５５８】
得られたプラスミドは、交互スプライシングの際に翻訳的に活性な抗体重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡをほぼ化学量論的な量で生じる２シストロン転写物を産生する。完全長アグリコシル化ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ抗体を産生するための中間体及び発現ベクターを、表８に示す。正確な配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。哺乳動物細胞でのプラスミドｐＸＷＵ０２０、ｐＸＷＵ０２２、ｐＸＷＵ０２４、及びｐＸＷＵ０２５から完全長抗体の発現は、安定なアグリコシル化ヒトＩｇＧ４．Ｐ抗体の産生をもたらす。
表７．ヒト抗体ドメインのＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチド
フォワード５’軽鎖ＰＣＲプライマーは、Ｓｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線を付した）及び軽鎖シグナルペプチドをコードする配列を含む；
リバース３’軽鎖ＰＣＲプライマーは、Ａｓｃ  Ｉ部位（下線を付した）を含む。
【０５５９】
フォワード５’重鎖可変ＰＣＲプライマーは、Ｎｃｏ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（下線を付した）及び重鎖シグナルペプチドをコードする配列を含む。
【０５６０】
リバース３’重鎖可変ＰＣＲプライマーは、Ｓｆｉ  Ｉ部位（下線を付した）を含む。
【０５６１】
【表７】
2009532027.tif 000021
【０５６２】
【表８】
2009532027.tif 000022
実施例７
哺乳動物細胞において向上した発現のための完全長抗−ＩＧＦ−１Ｒの組立て
抗体発現収率及び生成物の品質を向上させるために、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ、すなわちＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、及びＭ１４−Ｂ０１から元のＶＨ遺伝子配列を修飾した。最初に、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨ配列を、公表配列認識プログラム（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＧｅｎｅＳｐｌｉｃｅｒ／ｇｅｎｅ＿ｓｐｌ．ｈｔｍｌ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｐｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９７１２  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５０）、ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ）（Ｍａｒｔｉｎ  Ｇ．Ｒｅｅｓｅ及びＦｒａｎｋ  Ｈ．Ｅｅｃｋｍａｎ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，１  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、９４７２０；また、Ｒｅｅｓｅ  ＭＧ，Ｅｅｃｋｍａｎ，ＦＨ，Ｋｕｌｐ，Ｄ，Ｈａｕｓｓｌｅｒ，Ｄ，１９９７．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｉｅ”．Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ  ４（３），３１１−２３．も参照）を用いて推定スプライス部位を含有する配列について分析した。次に、抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂの重鎖可変領域のコドンを、元の抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨポリペプチド配列の変化に何ら遭遇することなくＣＨＯ細胞で首尾よく発現されている抗体からの同じＫａｂａｔ位置に対応するコドンで置換した。この第２の工程は、主に推定スプライス部位を除去するが、別のスプライス部位分析、次いで同義語コドン交換が行われて推定スプライス部位が存在するという予測された可能性を減少させる。
【０５６３】
抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ  −  Ｍ１３−Ｃ０６（配列番号：１８、図５（Ｑ））、Ｍ１４−Ｃ０３（配列番号：３０、図５（Ｓ））、Ｍ１４−Ｇ１１（配列番号：３６、図５（Ｕ））、及びＭ１４−Ｂ０１（配列番号：２４、図５（Ｗ））の配列最適化ＶＨ配列を有する枠内の合成重鎖リーダーをコードするＤＮＡフラグメントを、商業プロバイダー（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡ）から化学合成二本鎖ＤＮＡ配列として得た。５’及び３’におけるＮｃｏ  Ｉ及びＳｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位は、前記合成フラグメント内に含有されていた。前記リーダー及び抗−ＩＧＦ１Ｒ配列最適化ＶＨ領域フラグメントを、実施例６に記載のようにしてＮｃｏ  Ｉ／Ｓｆｉ  Ｉ消化ｐＨＬＰ０２９ベクター内にクローン化した。ｐＨＬＰ０２５中の適切な対応軽鎖を用いた組み換え、その後の及び単一フラグメントのｐＸＷＵ００７へのクローニングは、上記の実施例６に記載の通りである。配列最適化完全長アグリコシル化ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ抗体を産生する発現組立て体を、表９に示す。正確な配列は、ＤＮＡ配列分析で確認した。哺乳動物細胞におけるプラスミド系列ｐＸＷＵ０２９−ｐＸＷＵ０３２由来の完全長抗体の発現は、安定なアグリコシル化ヒトＩｇＧ４．Ｐ抗体の産生をもたらす。
【０５６４】
【表９】
2009532027.tif 000023
実施例８
ＩＧＦ−１Ｒ抗体の一時的発現及び特性決定
プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の一時的な産生のためのＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を形質転換させた。２０μｇのプラスミドＤＮＡを、４×１０６個の細胞と、０．４ｍＬの容量の１×ＰＢＳ中で一緒にした。この混合物を、０．４ｃｍキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に加え、氷の上に１５分間置いた。細胞を、ジーン・パルサー・エレクトロポレーター（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（ＢｉｏＲａｄ）を用いて６００ｕＦ及び３５０ボルトで電気穿孔した。細胞を、ＣＨＯ−ＳＳＦＭ  ＩＩ培地と１００ｕＭヒポキサンチン及び１６ｕＭチミジンを入れたＴ−２５フラスコに入れ、３７℃で４日間インキュベートした。上清を、収集し、ウェスタンブロットで生化学的に特性を決定し、抗原結合についてＥＬＩＳＡで試験した。
【０５６５】
あるいは、選択したＦａｂを完全長ヒトＩｇＧ４．Ｐバージョンに変換し、異なるベクター系を使用して以下に記載の方法で発現させた。５種類の異なる抗−ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ抗体、すなわちＭ１２−Ｅ０１、Ｍ１２−Ｇ０４、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１をコードするＤＮＡ配列を、完全長ヒトＩｇＧ４．Ｐの発現のためのベクターに移した。５種類の抗体全てはＶＨ３−２３ヒト重鎖生殖系列フラグメントを使用する。可変性重鎖を、可溶性Ｆａｂ発現ベクターから制限酵素Ｍｆｅｌ及びＢｓｔＥＩＩで消化することによって取り出した。得られたフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）を使用するアガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｍｆｅｌ／ＢｓｔＥＩＩ消化ｐＲＲ２５３ベクター（Ｒａｃｈｅｌ  Ｒｅｎｎａｒｄ）に連結した。得られたプラスミドは、重鎖シグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶ  ＡＴ  ＡＴＧＡＨＳ、配列番号：１２７）、その後にヒト用の抗−ＩＧＦＩＲ  ＶＨ及びＩｇＧ４．Ｐ定常領域を含有する。
【０５６６】
５種類の抗体のうち４つの抗体Ｍ１２−Ｇ０４、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１は、κ軽鎖を含有する。可変性軽鎖を、プライマーを用いてＰＣＲで増幅して、可変領域のＥｃｏＲＶ部位５’及びＢｓｇｌ部位３’に導入した。得られたＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）を使用するアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＴＯＰＯ２．１  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に連結した。可変性κ軽鎖を、ＴＯＰＯベクターから制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＢｓｇｌで消化することによって取り出し、精製した。フラグメントを、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ、配列番号：１２８）及び定常領域κドメインを含有するＥｃｏＲＶ／ＢｓｇＩ消化ｐＲＲ２３７ベクターに連結した。得られたベクターを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、発現カセット全体（シグナル配列、可変領域及び定常領域κドメイン）、を精製し、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＲＲ２２３に連結した。
【０５６７】
Ｍ１２−Ｅ０１抗体は、λ軽鎖を含有する。可変性軽鎖を、ＰＣＲで増幅して、可変領域のＡｇｅｌ部位５’に導入した。得られたＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＣＡ）を使用するアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＴＯＰＯ２．１  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に連結した。可変性λ軽鎖を、ＴＯＰＯベクターから制限酵素ＡｇｅＩ及びＡｖｒＩＩで消化することによって取り出し、精製した。フラグメントを、免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ、配列番号：１２９）及び定常領域λドメインを含有するＡｇｅＩ／ＡｖｒＩＩ消化ｐＸＷ３４７ベクター（Ｘｉｎ  Ｗａｎｇ）に連結した。得られたベクターを、ＮｏｔＩで消化し、発現カセット全体（シグナル配列、可変領域及び定常領域λドメイン）、を精製し、ＮｏｔＩ消化ｐＲＲ２２３に連結した。
【０５６８】
プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の一時的発現のための２９３Ｅ細胞に移入した。１．２μｇのそれぞれ（重鎖及び軽鎖）プラスミドＤＮＡを、２×１０６個の細胞に、ＱｉａｇｅｎのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用いて移入した。細胞を３７℃で３日間インキュベートした。上清を収集し及び完全長抗体をウェスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ法で確認した。完全ＩｇＧ４．ＰのＩＧＦ−１Ｒを結合する能力を、ＥＬＩＳＡで確認した。
【０５６９】
実施例９
抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体産生ＣＨＯ細胞系の発生
本実施例は、完全長ヒンジｄ−修飾ａｇｌｙガンマ４、κ（本明細書において“ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ”又は”Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ”という）抗体としてＦａｂＭ１３−Ｃ０６の結合ドメインを含有する抗−ＩＧＦ−ｌＲ抗体の発現の詳細な説明を提供する。本明細書に記載の別のＦａｂ、すなわち表３に記載のＦａｂを同様の方法で発現させた。Ｍ１３−Ｃ０６の可変領域及び定常領域は、ヒトは配列起源のものである。軽鎖及び重鎖可変領域全体は、ＤＹＡＸファージディスプレイ法でヒトＩＧＦ−１Ｒに対して生じたＦａｂから誘導される。可変領域及び軽鎖定常領域を、交互（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）スプライス発現ベクターにサブクローンした。交互スプライス立体配置は、１つのスプライスを、それぞれのスプライス受容体が前記２つの鎖の１つをコードする転写物を生じる２つのスプライス受容体と共に使用することによって、軽鎖及び重鎖を連結する。免疫グロブリン遺伝子をコードする発現ベクターＤＮＡを、インスリン依存性チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４ｉ）に電気穿孔した。ＣＨＯトランスフェクトーマ（細胞系４０Ｂ５）を産生用に選択した。
【０５７０】
ｐＸＷＵ００７−“空（ｅｍｐｔｙ）”発現ベクターは、哺乳動物細胞において遺伝子発現のためのヒトγ４定常領域（重鎖）並びに別個のプロモーター−エンハンサー及びポリアデニル化領域を有するが、可変領域を含有していない。発現され、翻訳された場合には、重鎖ポリペプチドは、２個のアミノ酸置換、Ｓ２２８Ｐ及びＴ２９９Ａを含有し、それぞれ“半抗体”の形成を抑制し且つＮ−結合グリコシル化を除外する。
【０５７１】
Ｍ１３−Ｃ０６の軽鎖遺伝子の対応する可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）並びにＭ１３−Ｃ０６の重鎖遺伝子の可変領域（ＶＨ）由来の相補的ＤＮＡを、発現ベクターｐＸＷＵ００７中にクローン化した。前記ｐＸＷＵ００７ベクターは、ヒト重鎖定常領域のすぐ上流の全軽鎖及び可変性重鎖ｃＤＮＡを挿入するためのクローン部位を含有する。Ｉｇ遺伝子の他に、この発現ベクターは、哺乳動物細胞において選別のために使用できるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有する。
【０５７２】
次いで、得られた発現ベクターを、ＣＨＯ細胞に移入して抗−ＩＧＦ−１Ｒ分泌ＣＨＯ細胞系（４０Ｂ５）の生成を開始させた。
【０５７３】
ＰＸＷＵ０２２をＣＨＯ細胞中に電気穿孔した。免疫グロブリン軽鎖特異的ＰＣＲプライマーを使用して、Ｆａｂ軽鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。５’特異的オリゴ配列は、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ抗−ＣＤ２３分子の軽鎖由来の天然シグナルペプチドを含有していた。５’及び３’オリゴ配列は、中間体ベクター（ｐＨＬＰ０２５）中にサブクローンニングするために、Ｓｆｉ  Ｉ及びＡｓｃ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列それぞれを含有していた。ＶＨ  ｃＤＮＡを、合成重鎖シグナルペプチドを含有していた５’オリゴ配列を使用してＰＣＲ増幅した。５’及び３’オリゴ配列は、中間体ベクター（ｐＨＬＰ０２９）中にサブクローンニングするために、Ｎｃｏ  Ｉ及びＳｆｉ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列それぞれを含有する。
【０５７４】
軽鎖５’及びＶＨ３’オリゴ及びｐＨＬＰ０２５及びｐＨＬＰ０２９を鋳型として使用して重複ＰＣＲを、軽鎖及びＶＨ領域を一つのｃＤＮＡセグメントとして組み合わせるために用いた。得られた産物を、ｐＸＷＵ００７のＤｒａ  ＨＩ部位にサブクローン化し、このようにして最終的交互スプライス発現ベクターｐＸＷＵ０２２を作製した。交互スプライス立体配置は、一次転写産物の交互スプライシングによって単一のプロモーターから２つの転写物を生成する。天然ＣＭＶスプライス供与体は、軽鎖コード転写物を生成するために次善のスプライス受容体か、又は重鎖コード転写物を生成するために天然ＣＭＶスプライス受容体か、いずれかにスプライスされる。前記次善のスプライス受容体は、両方の転写物を同様の量で生成するために設計されている。
【０５７５】
ＤＮＡベクター（ｐＸＷＵ０２２）は、ＣＨＯ細胞への電気穿孔に先立ってＨＥＢＳ緩衝液中で〜７００ｎｇ／μＬの濃度で調製した。５回の電気穿孔を、種々の濃度のＤＮＡ（１５、２０、３０、４０、及び４５μｇ）を使用して行った。それぞれの電気穿孔は、０．７ｍｌ滅菌ＨＥＢＳ緩衝液中の４×１０６対数期ＣＨＯ細胞及び０．１ｍＬのＨＥＢＳ中のＤＮＡ（０．８ｍＬ全容量）を入れた廃棄可能な０．４ｃｍキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。細胞に、２９０ボルト、９５０マイクロファラデーに設定したＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸＣＥＬＬを使用してショックを与えた。次いで、ショックを受けた細胞を、室温で１０分間放置し、次いで１０ｍＬの室温のインスリン無含有ＣＨＯＭ１６倍地と混合し、遠心分離し（３’１０００ｒｐｍで）、アスピレーターで吸引した。次いで、細胞を、１２ｍＬ（室温）のインスリン無含有ＣＨＯＭ１６倍地に再懸濁し、Ｔ−７５組織培養フラスコに移した。
【０５７６】
細胞及び培地：電気穿孔に先立って、前記ＣＨＯ細胞を、１Ｘヌクレオシドを添加した血清無含有培地（ＣＨＯＭ２４）中で増殖させた。ＣＨＯＭ２４は、動物成分を何ら含有さない自家製合成培地製剤である。メトトレキセート選別を、ヌクレオシド無含有ＣＨＯＭ１６及びＣＨＯＭ２４合成培地中で行った。
【０５７７】
電気穿孔の後に、４×１０６個のＣＨＯ細胞を、Ｔ−７５フラスコにプールした。ＤＨＦＲ発現について選別を、ヌクレオシド無含有培地に接種するにつれて直ちに開始した。細胞を、最終的にＣＨＯＭ２４中で１２５ｍＬ振盪フラスコに増やした（〜３週間）。クローン細胞系を単離するために、前記の移入した安定なプールを希釈し、４つの９６ウエルプレートの２００μＬのＣＨＯＭ１６に１細胞／ウエルで接種した。プレートを、抗体力価について選別するまで、３６℃で維持した。
【０５７８】
ＣＨＯクローンを、免疫グロブリン産生について、細胞上清をヒトκ鎖に特異的なＥＬＩＳＡを使用してアッセイすることによって選別した（接種後２１〜２８日目）。ＥＬＩＳＡで使用した捕捉抗体は、ポリクロナールヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）であり、検出抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）に結合体化させたポリクロナールヤギ抗−ヒトκであった。最も多い量の免疫グロブリンを分泌するクローンを膨張させた。
【０５７９】
接種した１９２０ウエルの合計３８１個のほぼ密集したウエルを、アッセイした。３８１ウエルのうち、６０ウエルは、さらに調べるために膨張させ、これら６０ウエルのうち、４ウエルを増幅のために選択した（１５Ａ７、４０Ｂ３、４０Ｂ５、４０Ｆ６）。
【０５８０】
実施例１０
完全ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の精製及び特性決定：
ＣＨＯ細胞中で産生した抗体を、以下に記載の方法で精製し、特性決定した。
【０５８１】
プロテインＡ捕捉：プロテインＡカラムを１Ｘ  ＰＢＳ（平衡用緩衝液）を、３カラム容量について１００〜１５０ｃｍ／時間で用いて予め平衡化した。上清を、樹脂ミリリットル当たり最大１０ｍｇのαＩＧＦ−１Ｒを用いて１５０ｃｍ／時間で充填した。充填後に、カラムを、５カラム容量の平衡用緩衝液で洗浄した。次いで、１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を用いて上向き方向で段階的に溶出した。所望の画分を採取し、２Ｍトリス塩基で中性ｐＨに滴定した。採取した画分を１ＸＰＢＳに対して透析し、サイズ排除工程用に調製するために物質を濃縮した。
【０５８２】
ＳＵＰＥＲＤＥＸＴＭ２００（サイズ排除）凝集物除去工程は、ＳＵＰＥＲＤＥＸＴＭ２００の１．５カラム容量の１Ｘ  ＰＢＳを３６ｃｍ／時間の流量での平衡、次いでタンパク質の装填及び所望の画分の採取を含んでいた。
同一性試験は、以下の通りに行った：
１）分子量測定をエレクトロスプレー質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳＤ）で行う質量分析による完全（ｉｎｔａｃｔ）質量分析。分析に先立って、試料を還元してジスルフィド結合を除去した。デコンボリューション処理質量スペクトルは、重鎖及び軽鎖の質量を表す。
【０５８３】
２）Ｎ末端配列分析は、オンラインＰＴＨアナライザーを備えたＡＢＩタンパク質配列決定装置を使用してエドマン分解により行った。軽鎖及び重鎖の初期アミノ酸について配列を確認した。
【０５８４】
３）質量分光分析によるペプチドマッピング：トリプシン分解及び／又はＥｎｄｏＬｙｓＣペプチドマップ作成を行って、各ペプチドから得られたＬＣ／ＭＳデータの分析によって完全配列範囲を得た。さらに、酸化及び脱アミド化の部位及び量の決定を検出した。
【０５８５】
純度試験は、以下によって行った：１）ＳＤＳ−Ｐａｇｅ又はＣＥ−ＳＤＳ：還元及び非還元試料、この方法を使用して、抗体フラグメンテーション、凝集及び不純物を測定した、２）ＬＳ及びＲＩ法を用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、凝集及びフラグメンテーションを測定し、及び光散乱は試料成分の分子量を測定する。３）ＳＤＳゲル又はキャピラリーＥＥＦ方法を使用して、Ｃ−及びＮ−末端異質性及び／又は脱アミド化から得ることができる帯電イソ型の等電位点電気泳動パターン及びｐｉ分布を測定した。
【０５８６】
最後に、内毒素濃度を、カブトガニ変形細胞溶菌液（ＬＡＬ）動態比濁法で測定した。
【０５８７】
図６は、完全ヒトＭ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙバージョンの非還元及び還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を表す。抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、及びＭ１４−Ｇ１１のＧ４．Ｐ及びＧ４．Ｐ．ａｇｌｙバージョンの両方が、産生された。Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４がＧ４．Ｐバージョンとして産生された。
【０５８８】
実施例１１
完全ヒト抗−ＩＧＦ−ｌＲ抗体の結合活性
抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＧ４．Ｐバージョンの可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する結合活性を、ＥＬＩＳＡで試験した。０．０２５Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中の２．５μｇ／ｍｌの可溶性ＩＧＦ−１受容体融合タンパク質（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）を、９６ウエル（ＩＭＭＵＬ０Ｎ２  ＨＢ、Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．＃３４５５）プレートに５０μｌ／ウエルで塗布し、４℃で一夜インキュベートした。プレートを、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中０．０２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃９２４０）（ｐＨ７．４）で洗浄し、１％脱脂乳、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する緩衝液（ｐＨ７．４）でブロックし、次いで室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００中０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたＰＢＳで洗浄した。アッセイのために、可溶性ＩＧＦ−１受容体塗布プレートを、次いで、種々の濃度の対照及び試験抗体と共にインキュベートし、１％脱脂乳、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０に５０μｌ／ウエルで希釈した。室温で１時間インキュベーションの後に、プレートを、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００中０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたＰＢＳで洗浄した。ヤギ抗−ヒトκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃａｔ＃２０６０−０５）の、１％脱脂乳、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０の２００倍希釈液を、結合抗体を検出するために５０μｌ／ウエルを加えた。室温で１時間インキュベートしたプレートを、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ  ３００中０．０２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたＰＢＳで洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ  ＆  ＰＥＲＲＹ  ＬＡＢＳ，ＩＮＣ．ｃａｔ：５０−７６−００）を１００μｌ／ウエルの量で加え、２分後に５０ｕｌ／ウエルの４ＮのＨ２ＳＯ４（ＬａｂＣｈｅｍ，Ｃａｔ＃ＬＣ２５８３０−１）を用いて反応を停止させた。吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを使用してＴＭＢについて４５０ｎｍし、バックグラウンド５４０で測定した。データを、ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯソフトウエア・パッケージ・バージョン４．３ＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して解析した。
【０５８９】
図７（Ａ）は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４のＧ４バージョンの濃度依存性結合を表し、これに対して対照抗体ＩＤＥＣ−１５１（Ｇ４．Ｐ）は、ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対して何ら結合を示さなかった。
【０５９０】
図７（Ｂ）は、ＥＬＩＳＡによる可溶性ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｂ０１のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙバージョンの濃度依存性結合を表す。陰性対照として使用した無関連特異性をもつＧ４．Ｐ抗体（ＩＤＥＣ−１５１）は、ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対して何ら結合を示さなかった。
【０５９１】
腫瘍細胞で発現される野生型ＩＧＦ−１Ｒに対するヒト抗体の結合活性を、フローサイトメトリーで測定した。腫瘍細胞系ＭＣＦ−７及びＣａｌｕ−６を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃３０００Ａ）及び５０μ／ｍｌのゲンタマイシン（アミノグリコシド系抗生物質）（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１５７５０−０６０）を補足したイーグルの最少必須培地（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃３０−２００３）で培養した。Ｐａｎｃ−１、Ｃｏｌｏ−２０５、ＮＣＩ−Ｈ２３及びＺＲ−７５を、１０％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（アミノグリコシド系抗生物質）を捕捉したＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃３０−２００１）で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｔ４０４９）溶液を。培養容器から付着細胞を取り出すのに使用した。
【０５９２】
細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃９２４０）（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、トリプシン処理し、ＰＢＳ及び１０％ＦＢＳで１回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％アジ化ナトリウム、２％ＦＢＳ、１０％標準ヤギ血清及び１００μｇ／ｍｌ標準ヤギＩｇＧ）中に細胞１０７個／ｍｌに調整し、氷の上に少なくとも１５分間置いた。対照及び試験抗体を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７９０プレートに分別した。細胞を５０μｌ／ウエルで、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７９９プレートに加えた。Ｃｏｍｉｎｇ  ３７９０プレートから一次抗体を５０μｌ／ウエルで、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３７９９プレートのそれぞれのウエルに加えた。次に、細胞（細胞０．５×１０６個／試料）を氷の上で４５分インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、次いで上清をアスピレーターで吸引した。細胞を、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。プレートを、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、次いで上清をアスピレーターで吸引した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃａｔ＃２０４０−０９）のＦＡＣＳ緩衝液への７５０倍希釈液を、１００μ／ウエルで加えた。次に、細胞（細胞０．５×１０６個／二次抗体）を、氷の上で４５分インキュベートした。７ＡＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｏｒｂｅｓ、Ｃａｔ＃Ａ１３１０）のＦＡＣＳ緩衝液への５００倍希釈液を５０μ／ウエルで加え、氷の上で５分間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、次いで上清をアスピレーターで吸引した。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。プレートを、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、次いで上清をアスピレーターで吸引した。細胞を、１００μｌ／ウエルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を入れた１２×７５ｍｍのＦＡＣＳ管に移した。最後に、細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（両方共にＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を使用して蛍光強度について調べた。
【０５９３】
図８は、ＭＣＦ−７細胞で発現されたＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐの濃度依存性結合を表す（図８（Ａ））。抗体の細胞−表面結合特異性を、ＩＧＦ−１Ｒ／３Ｔ３形質転換体及び３Ｔ３親細胞に対する結合を試験することによって確認した。リード抗体の全部が、ＩＧＦ−１Ｒ発現３Ｔ３に特異反応性を示したが、３Ｔ３細胞には示さなかった。（図８（Ｂ））。
【０５９４】
実施例１２
完全ヒト抗体によるＩＧＦ−１Ｒに対するリガンド結合の阻害
ヒト抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＧ４．Ｐバージョンが可溶性ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の結合をブロックする能力を調べた。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４のＩｇＧ４バージョンは、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２の両方の結合をブロックしたが、これに対してＭ１４−Ｃ０３はＩＧＦ−２をブロックしただけであった（図９（Ａ）及び（Ｂ））。
【０５９５】
抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体のリガンドブロック能を、実施例３に記載のようにして固相ＲＩＡ捕捉法で調べた。手短に言えば、種々の濃度（１００ｎＭ〜０．０１ｎＭ）の抗体を、ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを予め固定化した（２００ｎｇ／ウエル）９６ウエルＩＭＭＵＬＯＮ２プレートのウエル中で１００，０００ｃｐｍの１２５Ｉ−標識ＩＧＦ−１又は１２５Ｉ−標識ＩＧＦ−２と同時にインキュベートした。室温で１時間のインキュベーション後に、ウエルを洗浄し、ガンマカウンターで結合放射能を計数した。アイソタイプ整合陰性抗体対照、ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を使用した。パーセント（％）阻害を、＝［１−（Ａｂの平均ＣＰＭ）／（緩衝液の平均ＣＰＭ）］×１００％として算出した。
【０５９６】
得られた結果は、完全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｂ０１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１２−Ｅ０１．Ｇ４．Ｐ、及びＭ１２−Ｇ０４．Ｇ４．Ｐが、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２の両方の結合をブロックするが、これに対して抗体Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ及びＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−２をブロックするだけであることを実証する（図９（Ａ）−（Ｂ））。
【０５９７】
実施例１３
完全ヒト抗体による腫瘍細胞増殖の阻止
抗体がＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２駆動腫瘍細胞増殖をブロックする能力を、細胞生存性アッセイを使用して試験した。
【０５９８】
ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｃａｌｕ−６、Ｃｏｌｏ−２０５、Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ）腫瘍細胞系は、ＡＴＣＣから購入した。細胞系は、ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する完全増殖培地で増殖させた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を、培養容器から付着細胞を除去するのに使用した。リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）は、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ  Ｉｎｃから購入した。発光アッセイ用の９６ウエル透明ボトムプレートは、Ｗａｌｌａｃ  Ｉｎｃから購入した。
【０５９９】
８０％単層まで増殖させた細胞を、トリプシン処理し、洗浄し、再懸濁し、２００μｌの２％増殖培地を入れた９６ウエルプレートに、ＮＣＩ−Ｈ２３及びＣｏｌｏ−２０５細胞については細胞８×１０３個／ウエルで；及びＣａｌｕ−６、Ｐａｎｃ−１及びＢｘＰＣ−３細胞については細胞５×１０３個／ウエルで接種した。２４時間後に、培地を１００μｌの血清無含有培地（ＳＦＭ）に置き換え、５０μｌの４×濃度の連続希釈抗体を加えた。３７℃でさらに１時間のインキュベーションドの後に、５０μｌの４×濃度のＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−２を加え、細胞増殖を測定するために４８時間まで３７℃でインキュベートした。処理は全て三重反復で行った。細胞の増殖を、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭ発光細胞生存性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定した。試薬とＳＦＭとの１：１混合物を、２００μｌ／ウエルで加えた。発光は、Ｗａｌｌａｃ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）プレートリーダーで検出した。
【０６００】
抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の種々のヒトＩｇＧ４バージョンは、Ｈ−２３（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）細胞、Ｃａｌｕ−６（ＩＧＦ−２）細胞におけるＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２駆動細胞増殖の阻害を示した（図１０（Ａ）−（Ｃ））。その他の細胞系は、同程度の傾向を示した（例えば、実施例２０参照）。
【０６０１】
実施例１４
完全ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部化
ＭＣＦ−７細胞を、染色操作の４８時間前に、８ウエルチャンベースライド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎｃ  Ｔｙｐｅ  １塗布培養スライド、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔＴＭ＃３５４６３０）に、ウエル当たり５０，０００細胞で接種した。細胞は、通常、２０継体以下に維持した。染色操作の日に、培地をそれぞれのウエルから廃棄し、５００μｌコールドインキュベーション緩衝液（ＭＥＭイーグル  ＡＴＣＣ＃３０−２００３＋１％ＢＳＡ）に置換した。細胞をこの緩衝液で、各洗浄を３分間、２回洗浄した。次いで、試験すべき各ｍＡｂ又はヒトＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体２５０μｌを、適切なウエルに１０μｇ／ｍｌの濃度で加え、インキュベーション培地に希釈し、氷の上で１時間インキュベートした。マウス抗−ヒト−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ／ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、クローン２４−３１  ｃａｔ＃ＭＳ−６４１）を、陽性対照抗体として使用して内部化の程度を比較した。氷上で１時間のインキュベーション後に、時間０（ｔ＝０）のスライドを、５００μｌの冷洗浄用緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋２％ヤギ血清）で、各洗浄を３分間、３回洗浄した（スライドは常に氷の上に保持した）。次いで、ｔ＝０のスライドを、５００μｌの４％パラホルムアルデヒド（１６％ストックからＰＢＳで希釈した；ＥＭＳ＃１５７１０）を用いて室温で１５分間固定した。次いで、ｔ＝０のスライドを、再度、冷洗浄用緩衝液で、各洗浄を３分間、３回洗浄し、次いで氷の上に放置した。しばらくして、残りのスライドを、その指定された時間点の間（１５及び６０分）３７℃のインキュベーターに入れた。そのインキュベーション時間の最後に、各スライドを、上記と同じ操作、すなわち洗浄及び固定化を行い、氷の上に置いた。次いで、スライド全てを、２００μｌの冷透過用緩衝液（洗浄用緩衝液＋０．５％トリトン−Ｘ）を用いて氷上で１０分間透過処理した。次いで、スライド全てを、５００μｌの冷洗浄用緩衝液で、各洗浄を３分間、３回洗浄した。二次抗体を、ストックバイアルの１０，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間の初期遠心分離後に、洗浄用緩衝液中に１：１０００希釈で調製した（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ−抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ｍＡｂ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）用のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ＃Ａ１１０２９、Ｇ４抗体用Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ＃Ａ１１０１３）。２５０μｌの希釈二次抗体を、各ウエルに加え、室温で４０分間、暗中で（覆いをして）インキュベートした。スライドを、再度、５００μｌの冷洗浄用緩衝液で３回洗浄した。最終洗浄時に、緩衝液を廃棄し、全部のウエルを空にした。次いで、チャンバーを、スライドから、提供された取り外しツールを使用して取り外し、ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖａｃｔｏｒ＃Ｈ−１５００、Ｈａｒｄ  ＳｅｔＴＭ）を用いてカバースリップをのせた。スライドを、４℃で、暗中で一夜保存して、封入剤を乾燥させた。
【０６０２】
スライドの像を、ＬａｓｅｒＳｈａｒｐ２０００プログラム（ＢｉｏＲａｄ  ｖ５．２）を試用して共焦点顕微鏡で撮り、Ｋａｌｍａｎ  １０  ａｖｅｒａｇｅから青及び緑成分の組み合わせ（ｍｅｒｇｅ）として表した。
【０６０３】
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、図１３Ａに示すように、６０分でＩＧＦ−１Ｒの急速な内部化を示した。Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４−Ｇ１１．４．Ｐの両方は全て、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体と同様の内部化特性を示した（データは示さない）。予測されるように、陽性対照、クローン２４−３１も、受容体を取り込み、これに対してアイソタイプ適合陰性対照は（マウス７Ｆ２及びヒトＧ４、ＩＤＥＣ−１５２．Ｇ．Ｐ（霊長類化抗体））結合も取り込みもしなかった（図１３（Ｂ）−（Ｃ））。
【０６０４】
また、受容体内部化の割合を、ＦＡＣＳに基づいた方法でマウスモノクロナール抗体のある種の抗体について調べた。７０％密集単層に増殖したＭＣＦ−７細胞を、細胞解離用緩衝液（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１３１５１−０１４）を用いてフラスコから引き上げた。培地に再懸濁された細胞及び５×１０６個の細胞を、１２×７５ｍｍの試験管（Ｆａｌｃｏｎカタログ＃３５２０５４）に加えた。この場合の各試験管は、試験すべき異なるｍＡｂを表す。１０μｇ／ｍｌのｍＡｂを、アジ化物を含有していない０．５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を入れたその対応試験管、及び実験内部化誤差を測定するための抗体を含有していない対照試験管に加えた。試験管を、氷の上で１時間１５分インキュベートし、次いで洗浄し、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に戻した。１００μｌの各試料を、内部化を防止するために氷の上に保持した９６ウエルｕ−ボトムプレート（ＮＵＮＣ＃１６３３２０）の１つのウエルに取り出し、時間０（ｔ＝０）と命名した。これを、１００％Ａｂ結合対照として使用した。次いで、試験管を３７℃の水浴に移し、１００μｌの試料を時間（ｔ）＝５分、１０分、２０分、４０分、及び６０分（後に５分、１０分、１５分、３０分、及び６０分に変えた）で取り出し、氷の上の９６ウエルｕ−ボトムプレートの別々のウエルに入れた。試料全部を採取したら、プレートを４℃の遠心分離機で、１２００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。受容体の内部化を検出するために加えた抗体は、細胞表面に残る受容体を検出するための抗−ＣＤ２２１−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ＃５５５９９９−抗−ＩＧＦ−１Ｒ；１０μ／１００μｌ試料）  であるか、又は細胞表面に残る受容体を検出するためのヤギ−抗−マウス−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ｃａｔ＃１１５−１１６−１４６；５μｇ／ｍｌ）であった。試料を、０．１％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液中で１時間インキュベートし、１回洗浄し、アジ化物を含有するＦＡＣＳ緩衝液に最終容量２００μｌにした。次いで、試料を試験し、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（ＢＤ）を使用して採取し、幾何平均を測定した。また、ＰＥ−標識Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ＃３４０４９５）も試験して、細胞表面に結合されたＰＥ分子の数を定量した。この場合に、前記Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズを、試料と同じＦＬ２設定で試験した。ビーズに結合されたＰＥ分子の数はそのパッキングで提供され、試料及びビーズの幾何平均を使用して細胞表面に結合されたＰＥ分子の数の定量を可能にする。ＦＡＣＳアッセイは、試験したマウスモノクロナール抗体がＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進することを示した（データは示さない）。
【０６０５】
実施例１５
完全ヒト抗体によるＩＧＦ−１Ｒ介在シグナル伝達の阻害
パートＩ：Ｉ：  ＭＣＦ−７細胞でのシグナル伝達の阻害
ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に対する影響を、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌細胞）を使用して評価した。抗体がＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２介在ＩＧＦ−１Ｒ受容体リン酸化をブロックする能力を、実施例４に記載のようにして調べた。完全ヒト抗体のＩｇＧ４バージョンの全部が、良好な阻害（ＥＣ５０＜１ｎＭ）を示し、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻止した（図１１（Ａ及びＢ）。
【０６０６】
下流のシグナル伝達に対する影響を検出するために、細胞溶解液を、実施例４に記載のようにして生じさせた。シグナル伝達実験について、対照及び試験抗体を、血清飢餓後に１００ｎＭ、１５ｎＭ、５ｎＭ及び１ｎＭで３５０μｌの新しい血清無含有培地中に加え、３７℃で１時間インキュベートした。１３ｎＭのヒト組換えＩＧＦ−１又は２７ｎＭのＩＧＦ−ＩＩ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２９１−Ｇ１及び＃２９２−Ｇ２）を、３５μｌ血清無含有培地を入れたウエルに加え、室温で１５分間インキュベートした。細胞を、溶解し、４〜１２％ビス−トリスゲルを使用して分離した試料を回収し、固定化ニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）に固定化した。ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路を、部位Ｔｈｒ３０８（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４０５６）でホスホ−Ａｋｔを用いて及びＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４部位（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃９１０１）でホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫを用いて並びに抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃７０７１）を用いて検出した。バンドを、ＥＣＬルミノール試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃ＲＰＮ２１０９）とオートラジオグラフィーを使用して可視化した。各ブロットを、抗体から取り（ｓｔｒｉｐ）、それぞれ総Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃９２７２）又は総ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃９１０２）及び抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰについて再探査した。バンドを、ＥＣＬルミノール試薬とびオートラジオグラフィーを使用して可視化した。
【０６０７】
下流のシグナル伝達イベント、例えばＡｋｔ及びＭＡＰＫリン酸化に対する抗体の影響を調べた。自己リン酸化からの細胞溶解液を、ポリクロナールＩＧＦ−１Ｒβ抗体−アガロース結合体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃ＳＣ−７１３）で免疫沈降させた。回収した受容体タンパク質を、４〜１２％トリス−グリシンゲルを使用して分離し、ニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）に固定化した。受容体を、抗−ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ部位Ｔｙｒ１１３１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃３０２１）又は抗−ＩＧＦ−１Ｒβ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃ＳＣ−９０３８）及び抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃７０７１）を用いて検出した。バンドを、ＥＣＬルミノール試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃ＲＰＮ２１０９）とオートラジオグラフィーを使用して可視化した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【０６０８】
図１２Ａ及びＢは、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙがＡｋｔ及びｐ４２／４４ＭＡＰＫのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２介在リン酸化を容量に依存した方法で阻止したことを示す。特に、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙＩＧＦ−１Ｒ抗体は、アミノ酸残基Ｓｅｒ４７３でＡｋｔのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２誘発リン酸化の阻害によって実証されるように、ＭＣＦ７細胞のリガンド誘発Ａｋｔシグナル伝達を試験した全ての濃度（すなわち、１〜１００ｎＭ）で阻害した（図１９）。対照抗体は１００ｎＭで試験し、これに対してＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．ｐ．ａｇｌｙは、１００ｎＭ、１５ｎＭ、５ｎＭ及び１ｎＭで試験した。抗体ＩＤＥＣ−１５２、すなわち無関連特異性の抗体のヒトＧ４バージョンを、陰性対照として使用した。抗体ＩＲ３、すなわちＩＧＦ−１Ｒに対するマウスモノクロナール抗体を、陽性対照として使用した。また、Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ完全長抗体もまた、Ａｋｔ及びｐ４２／４４ＭＡＰＫ活性化のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２駆動シグナル伝達を阻害した（データは示さない）。
【０６０９】
パートＩＩ：Ａ５４９、ＣａＩｕ−６、及びＨＩ２９９細胞でのシグナル伝達の阻害
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙがインスリン受容体基質（ＩＲＳ−Ｉ）とｐ８５すなわちホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の調節サブユニットとの会合を分離させる能力を、腫瘍細胞系で同時免疫沈降アッセイで調べた。特に、ＩＲＳ−１は、ＰＩ３Ｋサブユニットｐ８５に、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体に感受性のＮＳＣＬＣ細胞系でＩＧＦ−１Ｒ−に依存した方法で結合する。従って、２つの非小細胞肺癌細胞系（ＮＳＣＬＣ）Ａ５４９及びＨ１２９９（Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ）及び１つのＮＳＣＬＣ細胞系、Ｃａｌｕ−６（Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙにあまり応答しない）を、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又は対照抗体（ＩＤＥＣ−１５１）の存在下で２４時間増殖させた。細胞溶解液を、抗−ｐ８５抗体を用いて免疫沈降させ、抗−ＩＲＳ−１（上部ブロット）及び抗−ｐ８５（下部ブロット）抗体を用いてウェスタンブロット分析に供した（図２５）。
【０６１０】
このアッセイについて、ヒト肺腫瘍細胞系Ａ５４９、Ｃａｌｕ−６、及びＮＣＩ−１２９９細胞を、ＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地１６４０中で維持した。細胞を、１００ｍｍペトリ皿にぺちりペトリ皿当たり３×１０６細胞で接種し、２４時間培養し、次いで１００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＢＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４．Ｐアイソタイプ適合陰性対照抗体）で５％ＦＢＳの存在下で、２４時間処理した。細胞溶解液を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ  ＵＳＡ）製の１％トリトンＸ−１００溶解用緩衝液中で調製した。免疫沈降については、抗−ｐ８５抗体（Ｃａｔ＃０６−６４９、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（現在、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ（ＵＳＡ）の一部門）を、前記溶解液に加え（１〜２ｍｇの溶解液当たり４ｕｇの抗体）、４℃で一夜インキュベートした。次いで、免疫結合体を、プロテインＧアガロースビーズと、４℃で２時間混合することによって捕捉した。免疫沈降物を、氷冷溶解用緩衝液で洗浄し、２×ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）試料緩衝液中で沸騰させ、その後にＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％ビス−トリスゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ（ＵＳＡ））で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＩＲＳ−１（Ｃａｔ＃０６−２４８、Ｕｐｓｔａｔｅ）及びｐ８５（Ｃａｔ＃０６−６４９、Ｕｐｓｔａｔｅ）抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入し、免疫ブロッティングを、製造業者のプロトコルに従って行った。
結果：
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、Ａ５４９及びＨ１２９９細胞系において血清の存在下でＩＲＳ−ＩとＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットとの結合を阻害したが、Ｃａｌｕ−６細胞系においては阻害しなかった（図２５）。
【０６１１】
実施例１６
非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体交差反応性
抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体が非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒ由来のＩＧＦ−１Ｒを認識する能力を試験した。最初に、アカゲザル及びカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒを、クローン化し、ＣＨＯ細胞中で発現させた。全ての抗体の結合を、フローサイトメトリーで調べ、共焦点顕微鏡で確認した。Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐは全て、アカゲザル及びカニクイザルの両方のＩＧＦ−１Ｒに対して特異的な結合活性を示した（データは示さない）。別の種の交差反応性研究は、マウスＩＧＦ−１Ｒ発現ＣＨＯ細胞に対するＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ及びＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの結合を示さなかった（データは示さない）。
【０６１２】
ＣＨＯ細胞で発現されるカニクイザルＩＧＦ−１Ｒの他に、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体もまた、この種由来の顆粒球及び単球で発現されるカニクイザルＩＧＦ−１Ｒと交差反応する（結合の特異性は、可溶性組換えヒトＩＧＦ−１ＲがＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体結合をブロックする能力によって実証された（データは示さない））。同様に、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体もまた、確立されたカニクイザル線維芽細胞系に結合する（実施例２６、図２３参照）。これらの結果は、毒性試験が行われている理想的な非げっ歯類種でることを示している。
【０６１３】
霊長類でＩＧＦ−１Ｒ受容体を用いた結果と異なって、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＦＡＣＳ分析で評価されるように免疫細胞（顆粒球、単球、リンパ球）で発現されるラット又はマウスＩＧＦ−１Ｒに対して交差反応性を示さなかった。
【０６１４】
実施例１７
ＩＧＦ−１Ｒ特異的マウスＭａｂの生成
ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的なマウスモノクロナール抗体を、標準ハイブリドーマ法で生成させた。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞を、ＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞を用いて免疫し、及びＩＧＦ−１Ｒ．Ｉｇ融合タンパク質を、ＰＥＧ誘発体細胞融合に使用した。表４に、抗−ＩＧＦ−１Ｒマウスモノクロナール抗体の特性を要約する。
【０６１５】
数種のヒト腫瘍株（肺、Ｈ−２３、Ｃａｌｕ−６；膵臓、ＢｘＰｃ−３、Ｐａｎｃ−１、ＭｉａＰａＣａ及び結腸  Ｃｏｌｏ２０５）のＩＧＦ／ＩＧＦ−１Ｒ依存インビトロ増殖を阻止する能力を、実施例１３に記載のようにして増殖によって測定した。図１４（Ａ）−（Ｆ）は、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１存在下の腫瘍細胞増殖に対する８種のマウス抗体の抗体濃度依存性阻止効果を示す。
【０６１６】
抗体がＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２駆動腫瘍細胞増殖をブロックする能力を、ＮＣＩ−Ｈ２３肺腫瘍細胞系を使用して比較した。図１５は、３種類のマウスＭＡｂ（Ｐ２Ａ７−３Ｅ１１、２０Ｃ８−３Ｅ８、Ｐ１Ａ２−２Ｂ１１）及び完全ヒト抗体の１、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙを用いて認められた増殖阻止の例を示す。前記抗体の全部が、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２駆動腫瘍増殖の阻害を示した。陽性対照ＩＲ３として、商業的に入手できる抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体を使用した。マウスＩｇＧ（抗−ＥＤｅｃｔｉｎ、ＩｇＧｌ）及び関連のない特異性のＩＤＥＣ−１５２抗体のヒトγ４バージョンを、実験用のアイソタイプ適合対照として使用した。
【０６１７】
実施例１８
マウス抗−ヒトＩＧＦ−１ＲｍＡｂのクローニング
抗−ＩＧＦ−１ＲマウスハイブリドーマＰ２Ａ７．３Ｅ１１免疫グロブリン可変領域のクローニング
マウスハイブリドーマ細胞由来の全細胞ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを使用し、製造業者の推奨プロトコルに従って調製した。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、全細胞ＲＮＡからＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｆｉｒｓｔ  ＳＴＲＡＮＤ  ｃＤＮＡ合成キットを使用し、プライミング用にランダムヘキサマーを使用する製造業者の推奨プロトコルに従って、ＲＴ−ＰＣＲでクローン化した。
【０６１８】
Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１可変領域のクローニング及びキメラ化を、例として詳細に説明する（他のｍＡ可変領域は、同様の方法でクローン化し、キメラ化するが、簡潔さのために詳細に説明しない。その理由は、抗体組換え操作の当業者に周知の標準分子生物学法を使用からである）。完全シグナル配列を有するマウス免疫グロブリン可変領域のＰＣＲ増幅について、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）に記載のような多マウス免疫グロブリン遺伝子ファミリーシグナル配列にハイブリダイズするフォワードプライマーとマウス定常領域の５’末端に特異的な単一のリバースプライマーとを生成する混合物を使用した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑポリメラーゼを使用するＰＣＲ条件は：９４ｏで２分の初期変性、次いで９４ｏで１分の変性、４５ｏで１分のアニール及び７２ｏで１分の鎖伸張の３０サイクルであった。Ｐ２Ａ７重鎖可変領域は、次のプライマー：５’ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＲ  ＡＴＧ  ＳＡＧ  ＣＴＧ  ＫＧＴ  ＭＡＴ  ＳＣＴ  ＣＴＴ  ３’（Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、及びＳ＝Ｃ／Ｇ）（配列番号：１３０）及び５’ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＹＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＲＲＣ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＧＡＣ  ３’（Ｒ＝Ａ／Ｇ、及びＹ＝Ｃ／Ｔ）（配列番号：１３１）を用いて増幅した。そのシグナル配列を有するＰ２Ａ７軽鎖可変領域は、次のプライマー：５’ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ３’（配列番号：１３２）及び５’ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡ  ３’（配列番号：１３３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用し、製造業者の推奨プロトコルに従ってゲル精製した。精製したＰＣＲ産物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに、そのＴＯＰＯクローニングキットを使用して、製造業者の推奨プロトコルに従ってサブクローン化した。多独立サブクローン由来のインサートをＰＣＲエラーから保護するために配列決定した。
【０６１９】
前記可変領域配列のＢｌａｓｔ分析は、これらの免疫グロブリンの同一性を確認した。Ｐ２Ａ７重鎖可変領域は、マウス亜群ＩＩ（Ａ）のメンバーである。Ｐ２Ａ７成熟重鎖可変領域の配列（そのＣＤＳに下線を付した）（Ｋａｂａｔの指定に基づき、ＣＤＲ、すなわち相補性決定領域を有する）を以下に示す：
【０６２０】
【数４】
2009532027.tif 000024
Ｐ２Ａ７軽鎖可変領域は、マウスκ亜群ＩＶのメンバーである。Ｐ２Ａ７成熟軽鎖可変領域の配列（そのＣＤＲに下線を付した）を以下に示す：
【０６２１】
【数５】
2009532027.tif 000025
ｃｈＰ２Ａ７の組立て及び発現
重鎖及び軽鎖のマウスＰ２Ａ７可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、ｍｕＰ２Ａ７可変領域がヒトＩｇＧ４及びκ定常領域に連結されているマウスヒトキメラ（ｃｈＰ２Ａ７）の発現用ベクターを組み立てた。前記重鎖キメラの組み立てのために、Ｐ２Ａ７重鎖サブクローンｐＣＮ３６３由来の０．４７ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｍＢＩフラグメントと、ｐＥＡＧ１９９５（遺伝子組み換え的に取り出されたＩｇＧ４のＣ末端リシン残基を有する配列確認されたアグリコシル化Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ命名法）変異ｈｕＩｇＧ４重鎖定常領域ｃＤＮＡを含有するプラスミド）由来の１．０ｋｂのＢｓｍＢＩ−ＮｏｔＩフラグメントとを、ｐＶ９０（異種遺伝子発現をＣＭＶ−ＤＢプロモーターとヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより調節するＳＶ４０早期プロモーター駆動ｄｈｆｒ選択可能標識を含有する配列確認されたｐＵＣ−に基づくＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ専有発現ベクター）のホスファターゼ処理した６．１ｋｂのＮｏｔＩ−線状化ベクター主鎖にサブクローン化した。
【０６２２】
得られたプラスミドｐＥＡＧ２０４５の重鎖ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。キメラＰ２Ａ７重鎖ｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を、以下に配列番号：１３４として示す：
【０６２３】
【数６】
2009532027.tif 000026
【０６２４】
【数７】
2009532027.tif 000027
予測された成熟ｃｈＰ２Ａ７重鎖タンパク質配列を、以下に配列番号：１３５として示す：
【０６２５】
【数８】
2009532027.tif 000028
マウス可変領域は残基１−１２２であり、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２３−４５９である。Ｋａｂａｔ  ＥＵ−指定Ｓ２２８Ｐヒンジ置換（ＩｇＧ４の傾向を是正して半抗体を形成するために）は、上記残基２３１であり、これに対して、Ｎ−結合グリコシル化を組換えにより除去するためにＣＨ２におけるＴ２９９Ａ置換は、上記配列の残基３０２である。
【０６２６】
前記重鎖キメラの組み立てのために、ＰＣＲ増幅Ｐ２Ａ７  軽鎖を、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用して、製造業者の推奨プロトコルに従って、変異原性プライマー５’ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧ  ３’（配列番号：１３６）及びその逆相補鎖（これは、重鎖シグナル配列のユニークＮｏｔＩ部位５’を誘導した）と、５’ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＣＣ  ３’（配列番号：１３７）及びその逆相補鎖（これは、軽鎖可変領域／κ定常領域接合点のすぐ下流のユニークＢｓｉＷＩ部位を誘導した）を用いて、部位特異的突然変異誘発に供した。突然変異プラスミドは、導入したＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩ部位の変化について選別することにより同定した。軽鎖配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。前記のようにして産生された０．４２ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｉＷＩ軽鎖可変領域フラグメント、及び配列確認されたヒト化抗−ＬＴｂＲ  κ軽鎖定常領域ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＡＧ１５７２由来の０．３４ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、発現ベクターｐＥＡＧ１２５６（異種遺伝子発現をＣＭＶ−ＩＥプロモーター及びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって調節するホスホグリセロキナーゼプロモーター駆動ネオ選択可能標識を含有する配列確認されたｐＵＣ−に基づいた発現ベクター）のＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。得られたプラスミドの軽鎖ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。キメラＰ２Ａ７軽鎖ｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を以下に示す（配列番号：１３８）：
【０６２７】
【数９】
2009532027.tif 000029
【０６２８】
【数１０】
2009532027.tif 000030
予測された成熟ｃｈＰ２Ａ７軽鎖タンパク質配列を以下に示す（配列番号：１３９）：
【０６２９】
【数１１】
2009532027.tif 000031
マウス可変領域は、上記の残基１−１０８の領域であり、これに対してヒトκ定常領域は上記配列の残基１０９−２１５である。
【０６３０】
ｃｈＰ２Ａ７重鎖発現ベクター及びｃｈＰ２Ａ７軽鎖発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時に移入し、移入細胞を抗体分泌及び特異性について試験した。空ベクター−及びｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子クローン化ＣＤ４０Ｌ−特異的ｍＡｂ）−移入細胞を、対照として役立てた。状態調節培地のウェスタンブロット分析（抗−ヒト重鎖及び軽鎖抗体を用いて展開した）は、ｃｈＰ２Ａ７−移入細胞が重鎖及び軽鎖を合成し、効率的に分泌したことを示した。移入細胞由来の状態調節培地を用いて染色されたＩＧＦ−１Ｒ−発現ＭＣＦ７ヒト哺乳動物腺癌細胞のＦＡＣＳ分析は、ｃｈＰ２Ａ７抗体が結合し、ｍｕＰ２Ａ７の染色パターンと同様の染色パターンを生じ、これに対してｍｏｃｋ−及びｈｕ５ｃ８−移入細胞由来の状態調節培地は、ＭＣＦ７細胞を染色することができなかった（ＰＥ−結合体化抗−ヒト重鎖及び軽鎖抗体を用いて検出した）ことを示した。希釈滴定は、ｃｈＰ２Ａ７ｍＡｂを含有する状態調節培地を用いた特異染色が用量応答を実証することを示した。ＣＨＯ細胞を、ｃｈＰ２Ａ７重鎖発現ベクター及びｃｈＰ２Ａ７軽鎖発現ベクターに同時に移入して、キメラＰ２Ａ７−アグリコシル化ｈｕＩｇＧ４、κｍＡｂを発現する安定な株を産生させた。
抗−ＩＧＦ−１Ｒマウスハイブリドーマ２０Ｃ８．３Ｂ８免疫グロブリン可変領域のクローニング
その他のｍＡｂの抗−ＩＧＦ−１Ｒ可変領域を、クローン化し、Ｐ２Ａ７  ｍＡｂについて記載の標準組換えＤＮＡ法と同様の標準組換えＤＮＡ法でキメラ化した。
【０６３１】
マウス亜群Ｉ（Ａ）に属する２０Ｃ８．３Ｂ８  ｍＡｂ  重鎖可変領域の予測された成熟配列を、以下に示し、そのＣＤＲに下線を付した：
【０６３２】
【数１２】
2009532027.tif 000032
マウス亜群ＩＩＩに属する２０Ｃ８  軽鎖可変領域の予測された成熟配列を、以下に示す：
【０６３３】
【数１３】
2009532027.tif 000033
キメラ２０Ｃ８  重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡ用の発現ベクターを、上記のようにして組み立てた。プラスミドのインサートの免疫グロブリンｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。キメラ２０Ｃ８重鎖ｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を、以下に配列番号：１４０として示す：
【０６３４】
【数１４】
2009532027.tif 000034
【０６３５】
【数１５】
2009532027.tif 000035
予測された成熟ｃｈ２０Ｃ８重鎖タンパク質配列を、以下に配列番号：１４１として示す：
【０６３６】
【数１６】
2009532027.tif 000036
マウス可変領域は、残基１−１２２であり、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２３−４５９である。
【０６３７】
キメラ２０Ｃ８軽鎖ｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を、以下に配列番号：１４２として示す：
【０６３８】
【数１７】
2009532027.tif 000037
予測された成熟ｃｈ２０Ｃ８軽鎖タンパク質配列を、以下に配列番号：１４３として示す：
【０６３９】
【数１８】
2009532027.tif 000038
マウス可変領域は、残基１−１１１であり、ヒトκ定常領域は、上記の配列の残基１１２−２１８である。
【０６４０】
ｃｈ２０Ｃ８  重鎖発現ベクター及びｃｈ２０Ｃ８軽鎖発現ベクターを２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時移入し、移入細胞を抗体分泌及び特異性について試験した。空ベクター−及びｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子クローン化ＣＤ４０Ｌ特異的ｍＡｂ）−移入細胞は、対照として役立てた。状態調節培地のウェスタンブロット分析（抗−ヒト重鎖及び軽鎖抗体を用いて展開した）は、ｃｈ２０Ｃ８−移入細胞が重鎖及び軽鎖を合成し、効率的に分泌したことを示した。移入細胞由来の状態調節培地を用いて染色されたＩＧＦ−１Ｒ−発現ＭＣＦ７ヒト哺乳動物腺癌細胞のＦＡＣＳ分析は、ｃｈ２０Ｃ８抗体が力価測定可能な用量応答で結合し、これに対してｍｏｃｋ−及びｈｕ５ｃ８−移入細胞由来の状態調節培地は、ＭＣＦ７細胞を染色することができなかった（ＰＥ−結合体化抗−ヒト重鎖及び軽鎖抗体を用いて検出した）ことを示した。ＣＨＯ細胞を、ｃｈ２０Ｃ８  重鎖発現ベクター及びｃｈ２０Ｃ８  軽鎖発現ベクターに同時に移入して、キメラ２０Ｃ８−アグリコシル化ｈｕＩｇＧ４、κｍＡｂを発現する安定な株を産生させた。
抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  ２０Ｃ８．２４Ｂ１１免疫グロブリン可変領域のクローニング
前記ｍＡｂ  ２０Ｄ８．２４Ｂ１１は、２０Ｃ８．３Ｂ８（両方は融合７から誘導される）のシスタークローンであって、共通軽鎖を共有し且つＦＲ４の単一残基によって２０Ｃ８の重鎖と異なる重鎖を有する２０Ｃ８．３Ｂ８のシスタークローンであると思われる。マウス亜群Ｉ（Ａ）に属する２０Ｄ８．２４Ｂ１１  ｍＡｂ重鎖可変領域の予測された成熟配列を、以下に示し、そのＣＤＲに下線を付した：
【０６４１】
【数１９】
2009532027.tif 000039
ＦＲ４  Ｋａｂａｔ残基１０９に対応する単一の同類相違（以下の残基１１８）を強調する２０Ｄ８（上部）及び２０Ｃ８（下部）重鎖可変領域のアラインメントを以下に示す：
【０６４２】
【数２０】
2009532027.tif 000040
キメラ２０Ｄ８  重鎖ｃＤＮＡ用の発現ベクターを組み立て、プラスミドｐＣＮ３８０の重鎖ＣＤＮＡインサートを、ＤＮＡ配列決定により確認した。キメラ２０Ｄ８  重鎖ｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を、以下に配列番号：１４４として示す：
【０６４３】
【数２１】
2009532027.tif 000041
【０６４４】
【数２２】
2009532027.tif 000042
上記の配列によってコードされる予測された成熟ｃｈ２０Ｄ８  重鎖タンパク質配列を、以下に配列番号：１４５として示す：
【０６４５】
【数２３】
2009532027.tif 000043
マウス可変領域は、残基１−１２２であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４  重鎖定常領域は、残基１２３−４５８である。
【０６４６】
２０Ｄ８  軽鎖可変配列は、２０Ｃ８の軽鎖可変配列と同一である：２０Ｃ８に関して先に記載の情報を参照。
抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８免疫グロブリン可変領域のクローニング
成熟Ｐ１Ｇ１０  重鎖可変領域の予測された配列を、以下に配列番号：５８として示し、そのＣＤＲに下線を付した：
【０６４７】
【数２４】
2009532027.tif 000044
成熟Ｐ１Ｇ１０は、マウス重鎖可変領域亜群ＩＩ（Ａ）に属するが、重鎖ＩＩ（Ａ）共通配列とわずか５５％の同一性を有すると思われる。
【０６４８】
キメラＰ１Ｇ１０  重鎖ｃＤＮＡ用の発現ベクターを組立て、そのｃＤＮＡインサートを配列決定により確認した。キメラＰ１Ｇ１０  重鎖  ｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を、以下に配列番号：１４６として示す：
【０６４９】
【数２５】
2009532027.tif 000045
【０６５０】
【数２６】
2009532027.tif 000046
上記の配列をコードする予測された成熟ｃｈＰ１Ｇ１０  重鎖タンパク質配列を、以下に配列番号：１４７として示す：
【０６５１】
【数２７】
2009532027.tif 000047
マウス可変領域は、残基１−１２１であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４重鎖定常領域は、残基１２２−４５７である。
【０６５２】
マウスκ亜群Ｖに属する成熟ｃｈＰ１Ｇ１０  軽鎖可変領域の予測された配列を、以下に配列番号：１１３として示し、そのＣＤＲに下線を付す：
【０６５３】
【数２８】
2009532027.tif 000048
キメラＰ１Ｇ１０  軽鎖ｃＤＮＡ用の発現ベクターを組立て、そのｃＤＮＡインサートを配列決定により確認した。キメラＰ１Ｇ１０  軽鎖ｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を、以下に配列番号：１４８として示す：
【０６５４】
【数２９】
2009532027.tif 000049
【０６５５】
【数３０】
2009532027.tif 000050
上記の配列をコードする予測された成熟ｃｈＰ１Ｇ１０の軽鎖タンパク質の配列を、以下に配列番号：１４９として示す：
【０６５６】
【数３１】
2009532027.tif 000051
マウス可変領域は、上記の残基１−１０７であり、これに対してヒトκ定常領域は、上記の配列の残基１０８−２１４である。
【０６５７】
ｃｈＰ１Ｇ１０の重鎖発現ベクター及びｃｈＰ１Ｇ１０の軽鎖発現ベクターを２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時に移入し、移入細胞を抗体分泌及び特異性について試験した（空ベクター−及びｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子クローン化ＣＤ４０Ｌ特異的ｍＡｂ）−移入細胞は、対照として役立てた）。状態調節培地のウェスタンブロット分析（抗−ヒト重鎖及び軽鎖抗体を用いて展開した）は、ｃｈＰ１Ｇ１０−移入細胞が重鎖及び軽鎖を合成し、効率的に分泌したことを示した。移入細胞由来の状態調節培地を用いて染色されたＩＧＦ−１Ｒ−発現ＭＣＦ７ヒト哺乳動物腺癌細胞のＦＡＣＳ分析は、ｃｈＰ１Ｇ１０抗体が力価測定可能な用量応答で結合し、これに対してｍｏｃｋ−及びｈｕ５ｃ８−移入細胞由来の状態調節培地は、ＭＣＦ７細胞を染色することができなかった（ＰＥ−結合体化抗−ヒト重鎖及び軽鎖抗体を用いて検出した）ことを示した。ＣＨＯ細胞を、ｃｈＰ１Ｇ１０の重鎖発現ベクター及びｃｈＰ１Ｇ１０の軽鎖発現ベクターに同時に移入して、キメラｃｈＰ１Ｇ１０−アグリコシル化ｈｕＩｇＧ４、κｍＡｂを発現する安定な株を産生させた。
抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１免疫グロブリン可変領域のクローニング
マウス亜群ＩＩ（Ａ）に属する成熟Ｐ１Ａ２の重鎖可変領域の予測された配列を、以下に配列番号：４８として示す：
【０６５８】
【数３２】
2009532027.tif 000052
Ｐ１Ａ２の重鎖は、Ｐ１Ｇ１０の重鎖（両方共に融合５から誘導される）と９２．６％同一であり、１個のＦＲ１、１個のＦＲ２、２個のＣＤＲ２、２個のＦＲ３、２個のＣＤＲ３、及び１個のＦＲ４の相違を有する。Ｐ１Ａ２（上部の行）及びＰ１Ｇ１０（下部の行）重鎖の可変領域のアラインメントを以下に示す：
【０６５９】
【数３３】
2009532027.tif 000053
キメラＰ１Ａ２の重鎖用の発現ベクターを上記の方法で組み立てた。そのプラスミドによってコードされるｃｈＰ１Ａ２の重鎖の予測された配列（配列番号：１５０）は、次の通りである：
【０６６０】
【数３４】
2009532027.tif 000054
【０６６１】
【数３５】
2009532027.tif 000055
マウス可変領域は、上記の残基１−１２０であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９ＡのＩｇＧ４重鎖  定常領域は、残基１２１−４５６である。
【０６６２】
マウスκ亜群Ｖに属する成熟Ｐ１Ａ２の軽鎖可変領域の予測された配列を、以下に配列番号：１０８として示し、そのＣＤＲに下線を付す：
【０６６３】
【数３６】
2009532027.tif 000056
Ｐ１Ａ２の重鎖は、Ｐ１Ｇ１０の軽鎖（両方共に融合５から誘導される）と９７．２％同一であり、２個のＦＲ２及び１個のＦＲ３の相違を有するが、同一のＣＤＲを有する。Ｐ１Ａ２（上部の行）及びＰ１Ｇ１０（下部の行）の軽鎖の可変領域のアラインメントを以下に示す：
【０６６４】
【数３７】
2009532027.tif 000057
キメラＰ１Ａ２の軽鎖用の発現ベクターを上記の方法で組み立て、ｃＤＮＡインサートを配列決定により確認した。キメラＰ１Ａ２の軽鎖のｃＤＮＡインサート（イニシエーターＡＴＧからターミネーターＴＧＡまでのシグナル配列に由来）の配列を、以下に配列番号：１５１として示す：
【０６６５】
【数３８】
2009532027.tif 000058
ｐＣＮ３７９によってコードされるｃｈＰ１Ａ２の軽鎖の予測された配列を、以下に配列番号：１５２として示す：
【０６６６】
【数３９】
2009532027.tif 000059
マウス可変領域は、上記の残基１−１０７であり、これに対してヒトκ定常領域は、上記の配列の残基１０８−２１４である。
【０６６７】
マウスκ亜群Ｖに属する成熟Ｐ１Ａ２の軽鎖可変領域の予測された配列を、以下に配列番号：１０８として示し、そのＣＤＲに下線を付す：
抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２免疫グロブリン可変領域のクローニング
Ｐ１Ｅ２可変領域のクローニングを前記の方法で行った。
【０６６８】
実施例１９
ＩＧＦ−１ＲＦａｂ抗体は高親和性で可溶性ＩＧＦ−１Ｒに結合する
方法：  可溶性のＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂの結合活性を表面プラズモン共鳴を用いて測定した。ビオチニル化したＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）を、ストレプトアビジンで被覆したセンサーチップの上に固定化した。可溶性／二量体のＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ外部ドメイン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）が、ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体によって表面に捕捉された。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、又はＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂ（０．５ｎＭ〜１０００ｎＭ）の副次注射を実施した。表面はｐＨ４．０の３つの短い酢酸塩注射で再生された。
【０６６９】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６Ｆａｂは、ＫＤ＝１．３ｎＭのもと、最高の親和性で、組換え体ＩＧＦ−１Ｒに結合し、これに対しＭ１４−Ｇ１１  ＦａｂはＫＤ＝４．０ｎＭで結合し、Ｍ１４−Ｃ０３  ＦａｂはＫＤ＝４．９ｎＭで結合した（データは示さない）。
【０６７０】
実施例２０
完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体による、腫瘍細胞の増殖を刺激したＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２の抑制
方法：インビボでの腫瘍増殖に及ぼす抗体の影響を、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１  ＵＳＡ）を用いて測定した。ＲＰＭＩ培地を含む１０％ＦＢＳ内のＢｘＰＣ３細胞を、Ｗａｌｌａｃ  ９６−ウエル透明ボトムＴＣ処理プレート（８０００細胞／ウエル）で培養した。２４時間後、培養培地を血清無含有条件に変え、種々の濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、及び０．１ｎＭ）の抗体を添加した。３０分培養後に、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−２を添加した。細胞を、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭ試薬を用いてＡＴＰの存在量を算出するために溶解されるまでさらに４８時間培養した。抑制は、［１−（Ａｂ−ＳＦＭ）／（ＩＧＦ−ＳＦＭ）］×１００％として算出した。アイソタイプ適合抗体、ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）抗体を、陰性対照として用いた。
【０６７１】
結果：完全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ及びＭ１４−Ｃ０３、Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２によって駆動されたＢｘＰＣ３（ヒト膵臓腺癌）細胞の増殖を抑制した（図１６）。同様の増殖抑制結果が、ヒトの肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ２３（図１７；Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体）及びヒトの肺癌細胞系Ａ５４９（図１８；Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体）で組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２によって駆動された細胞増殖に抗したこれらの抗体で得られた。全てのの３つの細胞系において、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、Ｍ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐバージョンと同様な結果を示した（データは示さない）。
【０６７２】
実施例２１
完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体によるインビトロでの腫瘍細胞増殖の細胞周期の停止
方法：  完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体が細胞周期の進行を停止させる能力を、培養したＢｘＰＣ３細胞でのヨウ化プロピジウムの取り込みを監視するＦＡＣＳ分析で評価した。ＢｘＰＣ３細胞（４×１０５細胞／ウエル）を６ウエルプレートに移植した。２４時間後に、細胞を、血清無含有培地（ＳＦＭ）に変え、引き続き２４時間培養した。次に、最終的に濃度１３３．３ｎＭ（２０μｇ／ｍｌ）でＩＧＦ−１Ｒ抗体、そして２００ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＧＦ−１を培地に添加した。２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定した。ＤＮＡ含量は、ＦＡＣＳ分析に先立ちヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。抗体適合アイソタイプ、ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を陰性対照として使用した。
【０６７３】
結果：  完全ヒト抗体であるＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（表１１）、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、細胞周期のＧ０／Ｇ１相でＢｘＰＣ３腫瘍細胞を抑制した。
表１１：
【０６７４】
【表１１−１】
2009532027.tif 000060
実施例２２
膵癌モデルでの腫瘍増殖のインビボ抑制
方法：  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の単剤インビボ効力を、ＢｘＰＣ３（膵癌）細胞を用いて、異種移植膵癌モデル系で評価した。ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに、２×１０６細胞を接種し、腫瘍増殖について監視した。治療開始時の平均腫瘍量は、〜２００ｍｍ３であった。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、週１回、５週間にわたって、６０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。アイソタイプの適合抗体であるＥＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を陰性対照として週１回、５週間にわたって６０ｍｇ／ｋｇ投与した。腫瘍は、接種後、指示された間隔（図２０）で取り出し、全腫瘍量を測定した。
【０６７５】
結果：  完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、用量に依存した方法で腫瘍の増殖を抑制した（図２０）。抗体は、６０、３０及び１５ｍｇ／ｋｇを１週に１回、５週間にわたる投与で、統計学的に有意な単剤効果を実証した。なお、抗体は週１回、１５ｍｇ／ｋｇ投与と同じ位の低い薬量で有効であった（図２０）。
【０６７６】
実施例２３
肺癌モデルでの腫瘍増殖のインビボ抑制
方法：  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体のインビボ単剤効力を、Ａ５４９（肺癌）細胞を用いて、異種移植肺癌モデル系で評価した。ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに３〜５×１０６細胞を接種し、腫瘍増殖を監視した。治療開始時の平均腫瘍量は、〜１５０ｍｍ３であった。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、週２回、４週間にわたって、３０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。アイソタイプの適合抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を陰性対照として３０ｍｇ／ｋｇ投与した。腫瘍を接種後に指示された間隔で取り出し（図２１）全腫瘍量を測定した。
結果：  完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、用量に依存した方法で腫瘍の増殖を抑制した（図２１）。抗体は、４週間にわたって３０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの用量の投与で統計学的に有意な単剤効力を示した（図２１）。このモデルで行った付加実験では、Ｃ０６は週に７．５ｍｇ／ｋｇ程度の低い用量で有効であることを示した（データは示さない）。
【０６７７】
実施例２４
併用療法を用いた腫瘍増殖のインビボ抑制
方法：  ゲムシタビン（非小細胞肺癌、膵臓癌、膀胱癌及び乳癌を治療するのに一般的に用いられている薬剤）と組み合わせた腫瘍増殖の抑制におけるＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の効果を、ＢｘＰＣ３異種移植モデルで試験した。週２回、３０ｍｇ／ｋｇで７週間（データは示さない）あるいは週１回６０ｍｇ／ｋｇで５週間（図２２）腹腔内に投与したＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の効力を、現行の標準的な治療（すなわち、４週間にわたって、３日毎に８０ｍｇ／ｋｇ）に従って投与したゲムシタビンとの併用で評価した。ゲムシタビン単独、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体単独、及び送達用ビヒクル単独の偽注射を、陰性対照として投与した。治療開始時の腫瘍量は、おおよそ約２００ｍｍ３であった。
結果：  Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体と単剤としてのゲムシタビン（すなわち、単独投与）は、同様の効力を示した。ゲムシタビンと組み合わせた、１週間のスケジュールで２回３０ｍｇ／ｋｇ（データは示さない）あるいは毎週のスケジュールで６０ｍｇ／ｋｇ（図２２）のＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体投与は、単剤処置に比べ付加効力を示した。さらに、１５ｍｇ／ｋｇとの併用もまた、付加効力を示した（データは示さない）。
【０６７８】
実施例２５
完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体はカニクイザルの線維芽細胞系に結合する
方法：  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体はカニクイザル由来のユリアの確立された線維芽細胞系に結合する。線維芽細胞は、皮膚生検に由来するものであった。抗体結合を、維芽細胞を細胞解離緩衝液でリフトし、ビオチン化したＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙと共に４℃で４５分間インキュベートすることによって評価した。細胞を洗浄した後に、ストレプトアビジン−ＰＥを添加し、暗中で、４℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２００ｕｌ冷却ＰＢＳを加え、次いで１％ホルムアルデヒドを加え、穏やかにボルテックスした。抗体結合を、ＦＡＣＳ分析で評価した。
【０６７９】
結果：  Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、用量に依存した方法でカニクイザルの線維芽細胞系で発現されたＩＧＦ−１Ｒに結合する（図２３）。
【０６８０】
実施例２６
パートＩ：完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の生物学的特性の要約
完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体について評価した生物学的特性を表１１及び１２に示す。これら諸特性は、本明細書に記載の方法、実験、及び実施例によって確証されている及び／又は
当業者によって知られ、実施されている方法及び実験によって日常的に決定し得る。
【０６８１】
【表１１−２】
2009532027.tif 000061
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体血清の半減期
腫瘍をもたないマウスでの薬物動態（ＰＫ）研究を、ＳＣＩＤマウスにおいて３ｍｇ／ｋｇのＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（１回投与量、腹腔内注射）を使用して実施した。ＳＣＩＤマウス血清中のＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ＩｇＧに特異的なＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ウエル）をｉｍｍｕｌｏｎプレート上に固定した。血清は、１：２５から開始し、２倍連続希釈法で、３重反復で力価を測定した。結合は、ヤギ抗−ヒトκ−ＨＲＰを用いて調べた。この研究の結果は、このマウスのモデル実験系では、血清半減期が〜１１．５であることを示す（データは示さない）。
【０６８２】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの血清濃度を、動物に生産させるＭＣＦ−７腫瘍を有する動物（３０ｕｇ／ｋｇの抗体）及びＢｘＰＣ３腫瘍を有する動物（１５ｕｇ／ｋｇの抗体）に腹腔内注射をした後に測定した。９６ウエル（ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ、Ｄｙｎａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．＃３４５５）に固定したヤギ抗−ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ウエル）に対するＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の結合を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。３倍連続希釈で１０ｕｇ／ｍｌから始め、標準曲線による力価を測定した。血清は、２倍連続希釈で１：２５で開始して力価測定した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、ヤギ抗−ヒトκ−ＨＲＰを用いて検出した。ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯソフトウエアパッケージバージョン４．３  ＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して抗体濃度を調べた。
【０６８３】
平均血清濃度を以下に示すとおり観察した。
【０６８４】
【表１１−３】
2009532027.tif 000062
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の薬物動態もまた、薬量１０ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇの用量の注射後に、カニクイザルで研究されており、血清の半減期が〜１０−１２日（データはを示さない）であると認められている。
【０６８５】
表１２及び１３は、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体をＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２を補足した細胞培養液（表１２）あるいは１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）やウシ血清（ＦＢＳ）を補足した細胞培養液（表１３）に添加した場合に、種々の肺、膵臓及び結腸の腫瘍細胞系に対して認められるインビボ細胞増殖の用量依存性阻害（％阻害）を示す。
【０６８６】
【表１２】
2009532027.tif 000063
【０６８７】
【表１３−１】
2009532027.tif 000064
【０６８８】
【表１３−２】
2009532027.tif 000065
パートＩＩ：抗体親和性測定
目的：
目的は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合親和性を測定することにあった。
方法：
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂの調製
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂ抗体は、固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２０３４１）で消化することによって調製した。パパイン樹脂を、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム；１０ｍＭのＥＤＴＡ；２０ｍＭのシステインで洗浄した。抗体を、５００ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのｐＨ７．０のシステイン中でパパイン樹脂と混合し、３７℃の水浴中で３時間消化し、次いで反転振盪器で室温で一夜混合した。各消化の完了は、分析的サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で決定した。焼結ガラスロートフィルターで、消化したタンパク質から樹脂を除去し、ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸塩で洗浄した。濾液を集めて、ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸塩で１０倍希釈した。Ｆａｂフラグメントを、塩の直線勾配を用いたＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した。溶出画分について分析ＳＥＣを行い、所望の画分をプールし、ＰＢＳに透析した。続いて、Ｆａｂをアルキル化して、は（Ｆａｂ）２産生をもたらすヒンジ二硫化物の再生を阻止した。アルキル化は、１Ｍトリスを希釈することにより行った。即ち、ｐＨ８．５の２００ｍＭヨード酢酸塩をＦａｂ溶液に１０倍希釈することにより行った。混合物を、反転振盪器で、室温で２０分間インキュベートし、次いで１ｘＰＢＳに完全に透析した。各Ｆａｂの最終精製を、分取サイズ除外クロマトグラフィーを用いて行った。
【０６８９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）親和性測定
全ての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、操作用緩衝剤としてＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８８）を使用して２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ  ３０００で実施した。ビオチン標識抗−ＨｉｓＴａｇ抗体（ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３４４４０）を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で、５００ｎＭで注入することよってＢｉａｃｏｒｅ  ＳＡ片（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１０００−３２）表面に飽和する固定化した。組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ−１０Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０５−ＧＲ−０５０）を、２０μＬの４０ｎＭタンパク質を２μＬ／分で注入することによってビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面に捕捉した。ＩＧＦ−１Ｒ注入に続いて、流量を２０μＬ／分まで増やした。次に、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体又はＦａｂの１３０μＬの注入を受容体との相互作用を調べるために行った。それぞれの抗体及びＦａｂを、６４ｎＭから０．５ｎＭに連続的に希釈して、濃度依存速度論的結合曲線を得た。各注入系列は、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸塩を２０μＬ／分で３×１０μＬの注入を使用してすることで再生した。それぞれの曲線は、（１）ＩＧＦ−１Ｒを欠いたストレプトアビジン表面から得られたデータ及び（２）ＩＧＦ−１Ｒの一次注入、次いでＨＢＳ−ＥＰ緩衝液の二次注入で得られたデータを使用して、二重に参照した。それぞれの抗体及びＦａｂの濃度系列は、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア内に備えられた１：１結合モデルに適合していた。
【０６９０】
結果
組換え抗−ＩＧＦ−ｌＲ抗体、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、上記のようにして表面プラズモン共鳴を用いて試験した。３つの抗体全てが、受容体に対して強い結合を実証した。固定化組換えヒトＩＧＦ−１Ｒに対するそれぞれの抗体（６４ｎＭから０．５ｎＭ連続希釈された）の濃度に依存した結合が観察された（データは示さない）。抗体が種々の濃度で適用した場合にＩＧＦ−１Ｒ塗布表面に蓄積する割合及び純粋な緩衝液の適用中に解離する割合を、データを１：１結合モデルに適合させることにより調べた。おおよその反応速度定数及び平衡解離定数を算出した（表１４）。
【０６９１】
【表１４】
2009532027.tif 000066
【０６９２】
【表１５】
2009532027.tif 000067
別個の親和性を得るために、それぞれの抗体のＦａｂフラグメントを、上記のようにしてパパイン消化を使用して生成させた。単一の抗原結合部位の存在により、Ｆａｂは、完全長抗体に関して述べたのと同じ方法でＩＧＦ−１Ｒ受容体に適用すると、一様に単相結合並びに解離曲線を実証した（データは示さない）。ＩＧＦ−１に対するそれぞれのＦａｂの親和性を、表１５に示す。
【０６９３】
実施例２７
パートＩ：  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、他のＩＧＦ−１Ｒ抗体に比べ特異なエピトープ結合特性を有する。
【０６９４】
交差競合抗体結合の研究を行い、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙと他のＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＧＦ−ＩＲ抗体結合エピトープを比較した。図２４参照。非標識競合抗体を、これらが可溶性ＩＧＦ−１Ｒに結合するための５種類の標識抗体と交差競合する能力について分析した。用いた５つの標識抗体は、ビオチン標識Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（“ビオチン−Ｃ０６”）、ビオチン標識Ｍ１４−Ｇ１１（“ビオチン−Ｇ１１”）、ｚｅｎｏｎ標識Ｐ１Ｂ１０−１Ａ１０（“Ｚｅｎｏｎ−Ｏ”）、ｚｅｎｏｎ標識２０Ｃ８−３Ｂ４（“Ｚｅｎｏｎ−Ｍ”）又はｚｅｎｏｎ標識ＩＲ３抗体（“Ｚｅｎｏｎ−ＩＲ３”）である。図２４参照。
【０６９５】
抗体を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（＃２１３３５）製のビオチン化キットを用いてビオチン標識した。
【０６９６】
Ｚｅｎｏｎ標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｚ２５０００）製のＺｅｎｏｎマウスＩｇＧ標識キットを用いて行った。
【０６９７】
＋＋＋＋＋＝それ自体に対する抗体結合競合（９０〜１００％）
＋＋＋＋＝７０〜９０％競合
＋＋＋＝５０〜７０％競合
＋＋＝３０〜５０％競合
＋＝１０〜３０％競合
＋／−＝０〜１０％競合
Ｎ／Ａ＝結果が得られない。
【０６９８】
この分析の結果は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体がＩＧＦ−１Ｒの同じ領域か又は類似領域に結合することを示し、それは試験した他の全ての抗体と異なる。特に、ビオチン標識Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体のみが、非標識Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又は非標識Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙによるＩＧＦ−１Ｒ結合とは効果的に競合した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙがよく研究されたＩＲ３抗体と交差競合しないことも注目に値する。従って、これら２つの抗体は、特に、異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する。
パートＩＩ：  Ｍ１３−Ｃ０６は、ＦｎＩＩＩ−ＩドメインのＮ末端領域に結合する抗体によってＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合親和性をアロステリックに低下させる。
【０６９９】
目的：
目的は、ＩＧＦ−１Ｒ上でのＭ１３−Ｃ０６抗体の結合エピトープ及びＩＧＦ−１Ｒに結合するＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の阻止を支持する（ｂｅｈｉｎｄ）メカニズムを明らかにすることであった。
【０７００】
背景：
ＩＧＦ−１Ｒは６つのドメインを含む（図２９Ａ）。Ｌ１（ロイシンに富む反復ドメイン１）、ＣＲ（システイン富む反復ドメイン）及びＬ２と表されるＩＧＦ−１Ｒの最初３つのドメインの突然変異並びにドメイン５（ＦｎＩＩＩ−２、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン２）におけるペプチドループ領域の突然変異は、結合しているＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２結合に対して悪影響を及ぼすことが公表されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。ここで、本発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６抗体は、成育因子結合部位と競合的に相互作用することによってＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の結合を妨害するのではなく、代わりにＦｎＩＩＩ−Ｉに結合し且つＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２のシグナル伝達をアロステックに阻害することを実証する。ＦｎＩＩＩ−Ｉは、ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲ（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）の両方の受容体のホモ二量体化を促進し且つリガンドを結合する際に、第４の構造変化によりＣ末端チロシンキナーゼドメインに膜貫通領域を通して活性化信号を伝えると考えられる。この実施例からのデータは、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が下流受容体シグナル伝達を導くＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２によって誘発される立体構造変化を阻害することを示唆している。
【０７０１】
方法：
Ｍ１３−Ｃ０６抗体の存在下又は不存在下のＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ結合実験
幾つかの組立て体を使用して、ＩＧＦ−１Ｒ受容体又はインスリン受容体：すなわち、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と表す、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓより）、ヒトＩＮＳＲ（２８−９５６）−Ｈｉｓ１０（ＩＮＳＲと表す、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓより）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと表す、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｅによって製造）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃと表わす、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｅによって製造）及びマウスＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと表わす、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ製造）に結合する抗体／ＩＧＦ−１を調べた。“Ｈｉｓ１０”とは、組立て体のＣ−末端の１０−ヒスチジン残基標識を表す。“Ｆｃ”とは、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃを表す。
【０７０２】
ヒトＩＧＦ−１は、ミリポア社から入手した。ＩＧＦ−１のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対する親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した。ビオチン標識抗−ＨｉｓＴａｇ抗体（ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３４４４０）を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液の５００ｎＭを注入することによってＢｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１０００−３２）表面に飽和するまで固定化した。各センサーグラムについて、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（実施例５（パートＩＩ）に記載）を、１μＬ／分で４０ｎＭタンパク質の２０μＬを注入することによってビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面に捕捉した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０の注入に続いて、流量を２０μＬ／分に増やした。次に、ＩＧＦ−１を含有する１３０μＬの注入を行って、成長ホルモンとその受容体との相互作用を調べた。ＩＧＦ−１を、６４ｎＭから０．１２５ｎＭまで連続的に希釈して濃度依存反応結合曲線を得た。各注入系列は、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸塩の２０μＬ／分で３×１０μＬの注入を使用して作成した。各曲線は、（１）ペンタ−Ｈｉｓ抗体を欠くストレプトアビジン表面から得たデータ及び（２）ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０の一次注入、次いでＨＢＳ−ＥＰ緩衝液の二次注入から得たデータを用いて二重に参照した。ＩＧＦ−１に対する濃度系列は、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア内に備えられた１：１結合モデルに適合していた。２組のデータが得られた、すなわち一方は操作緩衝液、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０注入緩衝液及びＩＧＦ−１注入緩衝液中の４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の存在下のデータと、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０注入緩衝液及びＩＧＦ−１注入緩衝液中の４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の不存在下のデータが得られた。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６抗体の３元結合体のプルダウン（Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）及びウェスタンブロット分析
再懸濁したプロテインＡ／Ｇビーズ（３００μｌ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２０４２２）を、１ｘＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌのエッペンドルフ管内の１．０ｍｇのＭ１３−Ｃ０６と、回転振盪器で、室温で２時間混合した。別の管では、１２μｇのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び４６０ｎｇのヒトＩＧＦ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＦ００６）を、室温で１時間（１：１のプロテイン：プロテイン比）混合した。結合したＭ１３−Ｃ０６を有するプロテインＡ／ＧをＰＢＳで洗浄し、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０／ＩＧＦ−１混合物と室温で３０分間インキュベートした。結合したタンパク質を有するロテインＡ／Ｇを、ＰＢＳで洗浄し、次いで結合タンパク質をｐＨ３．０の１００ｍＭグリシン３００μＬで溶出した。陰性対照として、１２μｇのヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０の添加を省いた。溶出したタンパク質は、一次抗体として抗−ヒトＩＧＦ−１抗体（ウサギ抗−ヒトＩＧＦ−１ビオチン、ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ７６６１−０１Ｂ）及び抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−ｌＲα  １Ｈ７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−４６１）を用い、次いで二次抗体としてＨＲＰ−標識ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７１００−０５）及びＨＲＰ−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．１１９０４−４０Ｊ）を用いてウェスタンブロット法で検出した。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６が３元複合体を形成する能力を実証するために、この実験で使用したＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１Ｒの濃度は、と同様に、これらタンパク質（特に血清中のＩＧＦ−１）の通常の生理学的濃度及びＩＧＦ−１Ｒ／ＩＧＦ−１について測定した平衡解離定数を十分に上回っていた（１５倍以上）。例えば、Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら、１９９７年参照。
【０７０３】
ＩＧＦ−１Ｒ（ｌ−４６２）−Ｆｃの組み立て及び完全長受容体外部ドメインと対比した競合抗体結合の研究
ヒトＩＧＦ−１のＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合ドメイン、すなわちＬ１−ＣＲ−Ｌ２（残基１−４６２）の組み立ては、既に公表されている（ＭｃＫｅｒｎ  １９９７）。この情報を利用して、本発明者らは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ残基１−４６２（Ｎ末端シグナル配列の沿った）を完全長ヒト外部ドメイン（残基１−９０３、ｈＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ）を産生させるのに使用されている自家製ＰＶ９０ベクターにサブクローン化した。ＣＨＯでの発現は、すでに報告されている方法（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ  ２００３）を用いて促進させた。タンパク質をＣＨＯ上清から、他のＦｃ−融合タンパク質についで既に報告されている（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ２００６）プロテインＡ親和性カラムに通すことによって精製した。タンパク質組み立て体は、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃと表す。
【０７０４】
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗体がｈＩＧＦ−１Ｒ（Ｉ−４６２）−Ｆｃ及び完全長外部ドメイン組立て体、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用してＳＰＲで調べた。前記装置を２５℃に設定した、また操作緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．２（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８８）であった。完全ヒト抗体、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、Ｂｉａｃｏｒｅによって提供されたプロトコルに従って標準ＮＨＳ／ＥＤＣ−アミン反応化学を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅ  ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１０００−１４）表面上に〜１０，０００ＲＵになるまで固定化した。固定化のために、抗体を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸塩緩衝液に４０μｇ／ｍＬに希釈した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃのヒト抗体との結合及び解離の相対速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を調べるために、それぞれの受容体組立て体の濃度を上昇させながら、センサーチップ表面全体に注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ濃度系列は、１．０ｎＭから１００ｎＭまでに及び、一方ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ濃度系列は、１．０ｎＭから２μＭまでに及んだ。全ての抗体表面は、確実にｐＨ２．０の１００ｍＭグリシンで再生した。反復再生は、抗体表面のいずれに対しても活性喪失をもたらさなかった。流量は２０μｌ／分であった。
【０７０５】
エピトープマッピング突然変異
ＩＧＦ−１Ｒ上のＭ１３−Ｃ０６抗体のエピトープを探査するための変異体の選択は、マウスＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の結合親和性が著しく低下しているか又はＢｉａｃｏｒｅ及びＦＲＥＴ結合実験（実施例５（パートＩＩＩ））で検出できないという観察に基づいていた。マウス及びヒトＩＧＦ−１Ｒは、９５％の一次アミノ酸配列同一性を共有する。ヒトＩＧＦ−１Ｒ及びヒトＩＮＳＲは、５７％の同一性（７３％の類似性）を共有する。本発明者らは、外部ドメインにおいてマウス及びヒトＩＧＦ−１Ｒの間で異なる３３個の残基を同定した（表１６）。ＩＮＳＲ外部ドメイン内の相同的位置は最近のＩＮＳＲ結晶構造（ｐｄｂ  ｃｏｄｅ  ２ＤＴＧ、ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）に基づいて溶媒に暴露されているから、これらの残基のうち２０個が突然変異の標的とされた。接近可能な表面積は、半径１．４Åのプローブ半径を有するＳｔｒｕｃＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｂｉｏ／ｂａｓｉｃ．ｈｔｍｌ）を使用して算出した。ＩＮＳＲの構造の中にはない４つの付加残基もまた、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合に重要であることが実証されているＦｎＩＩＩ−２ドメインの非構造ループ領域の中に存在していたことから、突然変異誘発のために選択された（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。エピトープマッピングの研究に選択された２４個の変異体のリストを、表１７に示す。
【０７０６】
表１６：ヒトＩＧＦ−１ＲとマウスＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸の相違
それぞれの残基の位置の溶媒接近性を、同種ＩＮＳＲ外部ドメインの公に入手可能な構造に基づいて決定した。ボールド体／イタリック体で示した残基は、溶媒に対してその表面積の３０％以上が暴露され、Ｍ１３−Ｃ０６のＩＧＦ−１Ｒエピトープを選別するために突然変異が誘発された。
【０７０７】
【表１６】
2009532027.tif 000068
２４変異体エピトープマッピングライブラリーを、製造業者のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ部位特異的突然変異誘発を使用して野生型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ＰＶ−９０プラスミドを突然変異させることによって構築した。各変異体（又はＳＤ００４、ＳＤ００１、ＳＤ０１４、ＳＤ０１６、及びＳＤ０１９ライブラリーメンバーの場合には二重変異体）のＰＶ−９０ベクターへの取り込みを、本発明物らの社内ＤＮＡ配列決定施設で確認した。プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ及びＱｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍａｚｉｋｉｔｓそれぞれを用いてミニプレップ及びマックスプレップした。各変異体プラスミド２００μｇを、培地中に可溶性タンパク質分泌のためのＰｏｌｙＦｅｃｔ  トランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１００ｍＬのＨＥＫ２９３  Ｔ細胞に２×１０６細胞／ｍＬで一時的に移入した。細胞を、ＤＭＥＭ（ＩｖｒｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ＦＢＳ（低ＩｇＧウシ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  −  ２０ｍＬプロテインＡカラムに通すことによってウシＩｇＧをさらに減らしたもの）中で、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で培養した。７日後、各ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体を含んだ上清を１２００ｒｐｍで遠心分離し、０．２μｍフィルターで濾過することによって回収した。各変異体を、上清をＩＸＰＢＳで予め平衡させた１．２ｍＬプロテインＡセファロースＦＦカラムに上清を通すことによってアフィイニティー精製した。変異体はｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンを用いてカラムから溶出し、ｐＨ８．５の１Ｍトリス、０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０で中和し、ＶｉｖａＳｐｉｎ  ６  ＭＷＣＯ  ３０，０００遠心分離濃縮装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＳ０６２１）を用いて〜３００μＬに濃縮した。
【０７０８】
ＩＧＦ−１変異体のウェスタンブロット分析
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの変異体試料を、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＩ０００１）を使用して標準製造業者のプロトコルに従って４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ６０２８）上に流し込んだ。試料は、標準製造業者のプロトコルに従い、ｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＢ１００１）及びＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＢ３０１０−０１又は３０１０−０２）を用いてニトロセルロースに移した。膜を２５ｍｌのＰＢＳＴ；５ｍｇ／ｍｌの脱脂乾燥乳中で４℃で一夜ブロックした。ブロック後に、膜を２５ｍｌのＰＢＳＴで１回、室温で５分間洗浄した。膜を１０ｍｌのＰＢＳＴに１：１００の状態にした一次抗−ＩＧＦ−ｌＲβ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−９０３８）と共に、室温で１時間インキュベートした。その後、膜を、５分間、２５ｍｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。検出のために、膜を、１０ｍｌのＰＢＳＴで１，０００倍希釈した二次ＨＲＰ−ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ１９０４−４０Ｊ）と共に室温で１時間インキュベートした。膜を、２０分間、２５ｍｌのＰＢＳＴで１回洗浄し、次いで５分間、２５ｍｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。タンパク質のバンドを、標準製造業者のプロトコルに従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｗｅａｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１０８）を用いて検出した。
【０７０９】
ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体ライブラリーのＢｉａｃｏｒｅ分析
２つの別個の同種二量体領域（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩｇＧ１−Ｆｃ）の取り込みによって誘導された高度多価性によって、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは共に、上記のＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１のセンサーチップ表面に高度に明らかな親和性で結合する。Ｍ１３−Ｃ０６に対する実際の高親和性ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃとＭ１３−Ｃ０６に対するｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの低親和結合の間を区別するために、受容体−Ｆｃ融合体を、Ｍ１３−Ｃ０６センサーチップ表面に捕捉、次いで可溶性Ｍ１３−Ｃ０６Ｆａｂ結合事象を捕捉した。受容体−Ｆｃ組立て体を、６０μＬのアフィニティー精製され、濃縮された物質を１μ／分の流量で注入することによってＭ１３−Ｃ０６チップ表面（上記のようにして調製した）に捕捉した。受容体−Ｆｃの装填工程の完了後に、流量を５μｌ／分に上げた。１０ｎＭ、３ｎＭ、及び１ｎＭのＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂ濃縮物を、それぞれの受容体−Ｆｃ組立て体の装填に引き続いて注入した（５０μＬ）。それぞれのサンサーグラムの終わりに、流量を３０μｌ／分に上げ、チップ表面をｐＨ２の０．１Ｍグリシン２×１０μＬの注入により再生させた。
【０７１０】
ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体スクリーンニングのための時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ｔｒ−ＦＲＥＴ）アッセイ
０．２５−０．５μｇ（２５μｌ）で開始する変異受容体の連続希釈液を、３８４ウエルマイクロタイタープレート（ｗｈｉｔｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｓｔａｒ）で０．０５μｇのＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５（１２．５μｌ）及び０．００３７５μｇのＥｕ：Ｃ０６（１２．５μｌ）と混合した。ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５についての結合レベルは、Ｃｙ５：ＩＧＦｌＲ−Ｈｉｓ１０が６．８：１であり、Ｅｕ−Ｃ０６についてはＥｕ：Ｃ０６が１０．３：１であった。総量は各試料当たり５０μｌであった。プレートを、プレート撹拌器上で、室温で１時間インキュベートした。蛍光測定を、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＬＡＮＣＥプロトコルを使用して３４０ｎｍの励起波長及び６６５ｎｍの放射波長を用いて実施した。あらゆるデータが、対応ＩＣ５０値を測定した１−部位結合モデルと一致していた。
【０７１１】
結果
Ｍ１３−Ｃ０６によるｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２の結合阻害は、実施例３に既に記載のようにして実証された。たとえ飽和状態であっても、ほとんどの抗体が、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−２の結合を十分に抑制するとは限らない。特に、Ｍ１３−Ｃ０６については、本発明者らはリガンド結合の阻害が非競合的であるか又はアロステリックであるかも知れないと仮説した。この仮説を試験するために、本発明者らは、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６抗体の存在下で又は不存在下でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の親和性を調べた（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対する抗体の親和性の〜４０００倍以上）。ＳＰＲを使用して、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を、抗−Ｈｉｓｔａｇ抗体を使用し、次いで濃度を上昇させながら（６４ｎＭにまで高めた）ＩＧＦ−１を注入してチップ表面い固定した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の結合は、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の不存在下及び存在下で明らかであった（データは示さない：表面プラズモン共鳴は、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の不存在下及び存在下でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の結合を実証する。ＳＰＲの会合相は、１４００−１８００秒の間にあるが、解離相は１８００−３０００秒の間にあった。Ｍ１３−Ｃ０６の不存在下では、ＩＧＦ−１はＫＤ＝１７ｎＭ（ｋａ＝２．４×１０−５／Ｍ＊ｓ）でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した。４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６存在下では、ＩＧＦ−１はＫＤ＝５９ｎＭ（ｋａ＝７．１×１０−４／Ｍ＊ｓ）でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した））。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合するＩＧＦ−１の反応結合定数はＭ１３−Ｃ０６の存在下では約３倍低下し、Ｍ１３−Ｃ０６が受容体に対するリガンドの親和性をアロステリックに低下させるということを示唆する。
【０７１２】
Ｍ１３−Ｃ０６がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対する結合についてＩＧＦ−１と直接競合しないことを裏付ける証拠が、Ｍ１３−Ｃ０６をｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０対するＩＧＦ−１及びＭ１３−Ｃ０６両方の見掛の（ａｐｐｒｅｎｔ）親和性を十分に越える濃度で使用して、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０とＩＧＦ−１の同時免疫沈降を行うことによって得られた。ウェスタンブロット分析は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と混合したＩＧＦ−１物質の〜７０−１００％がＭ１３−Ｃ０６と共にプルダウンし、それによって３元の複合体を形成するためにｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０とＭ１３−Ｃ０６及びＩＧＦ−１との同時関与が可能であることが実証することを実証した（データは示さない）。これらの結果は、普通のＩＧＦ−１血清濃度でＩＧＦ−１結合のＭ１３−Ｃ０６阻害のアロステリックな性質を実証し且つＭ１３−Ｃ０６の結合部位がＩＧＦ−１のリガンド結合ポケットと重複しないことを示唆している。
【０７１３】
次に、本発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６がＩＧＦ−１Ｒの推定上のリガンド結合ドメン（Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２）を結合するのか否かを調べた。本発明者らは、ＩｇＧ１−Ｆｃに融合したＮ末端の３つのドメイン（残基１−４６２）を含む受容体の先端切断バージョンを作成し、そのＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を結合する能力を、完全長受容体外部ドメイン組立て体の能力と、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて比較した。Ｍ１４−Ｇ１１は、受容体の先端切断バージョンに対して同等の結合を実証し、一方、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の結合は劇的に低下した。（データは示さない：表面固定化Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗体を、２μＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ及び１ｎＭにわたる濃度でｈＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）Ｆｃ及び先端切断バージョンｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）Ｆｃに対する結合について試験した。ＳＰＲ結合相は４８０−９６０秒の間にあり、一方、解離相は９６０−１１７０秒の間にあった。）残存する結合は、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の両者について明らかであった；しかし、データは、少なくともこれら抗体のエピトープの良好な部分がリガンド結合ドメイン外のＩＧＦ−１Ｒ領域に存在することを示唆している。
【０７１４】
本発明者らは、マウスＩＧＦ−１Ｒが、ＩＧＦ−１Ｒ上のＭ１３−Ｃ０６結合部位の位置を評価すべくｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ内のマウス変異体のライブラリーを設計するためには、Ｍ１３−Ｃ０６抗体には結合しないという事実を利用した。試験したｈＩＧＦ−１Ｒにおける種々の変異体を、表１７に示した。ウェスタンブロット分析を使用して、それぞれのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体の発現を確認し且つ精製ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを陽性対照として使用して、それぞれの変異タンパク質の相対的濃度に近似させるための標準曲線を作成した（データは示さない）。
【０７１５】
表１７：Ｍ１３−Ｃ０６に結合するＩＧＦ−１Ｒに及ぼす変異体の影響。ＳＤ０１５は、２つのアッセイフォーマットにおいてＭ１３−Ｃ０６に対する結合がほとんどない〜全くないことを実証する唯一の残基である場合にボールド体である。ＮＤ＝測定されなかった
【０７１６】
【表１７】
2009532027.tif 000069
ＳＰＲ及びｔｒ−ＦＲＥＴを使用して、Ｍ１３−Ｃ０６に対するＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの結合を阻害する変異体について選別した。ＳＤ０１５変異体を除いて、全ての変異ＩＧＦ−１Ｒ組立て体が、ＳＰＲ実験でＭ１３−Ｃ０６結合活性又はＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂ結合活性を実証した。図２８及び表１７参照。データは示さない（競合阻害分析を使用して、非標識ＭＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ＳＤＷＴ）、マウスＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ｍＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ）及び変異ｈＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ組立て体の濃度を上昇させることによってＣｙ５−標識ＩＧＦ１Ｒに結合されたＥｕ−Ｍ１３−Ｃ０６の置換についての結合曲線を確立した）
ｔｒ−ＦＲＥＴを使用して測定されたＩＣ５０値と、ＳＰＲを使用して測定された相対結合強度において、発現における自然バージョン及びウェスタンブロットによる定量に起因してある偏りがあった；しかし。ＳＤ０１５は両方のアッセイでＭ１３−Ｃ０６に対して実質的に結合活性がないことを実証し且つｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ対照について測定された結果に匹敵する唯一の変異体であった。Ｈｉｓ４６４は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ組立て体の先端切断バージョン（すなわち、ｈＩＧＦ−ｌＲ（１−４６２）−Ｆｃ）のＣ末端に向かって１次アミノ酸配列の２つのアミノ酸Ｃ末端に配置される。先端切断ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）に対するＭ１３−Ｃ０６の残存結合活性は、Ｍ１３−Ｃ０６の結合エピトープがＶａｌ４６２−Ｈｉｓ４６４残基を最少限度に包囲していることを示唆している。証拠がＭ１３−Ｃ０６のエピトープが立体配置に依存することを示しているように、別の残基が抗体とエピトープの結合の相互作用に関与していると思われる。しかし、明白に残基Ｖａｌ４６２及びＨｉｓ４６４はＦｎＩＩＩ−Ｉドメインの外面にあると予測される（図２９）。
【０７１７】
Ｍ１３−Ｃ０６エピトープ（すなわち、４６２−４６４に対するどんな周囲の残基が抗体結合及び活性に重要なのか）の範囲を特定する試みにおいて、本発明者らは、ある構造モデル化アプローチを取り入れた。ヒトＩＧＦ−１Ｒ及びヒトＩＮＳＲは、５７％の同一性（７３％類似性）及び同様の３次構造を共有している。先のＸ線結晶構造タンパク質抗原：抗体結合表面の解析は、結合エピトープの中心から半径約１４Åを有する７００Å（オングストローム平方）の平均結合表面を示唆した（Ｄａｖｉｅｓ  １９９６）。ＩＮＳＲの同種外部ドメインのＸ線結晶構造を用いて、本発明者らは、Ｈ４６４を通ってＩＮＳＲ残基Ｌ４７２及びＫ４７４までのＩＧＦ−１Ｒ残基Ｖ４６２をマッピングすることで４６２−４６４残基の半径１４Åの範囲内でＦｎＩＩＩ−Ｉドメインの残基を計算した。切り取られた距離は、半径１４Åの範囲内のど任意の原子―原子間距離にも適用され、一方、平均距離はＬ４７２及びＫ４７４のＣα間の距離から表面パッチ内のそれぞれの残基まで計算した。計算された平均距離は、Ｃα間の距離が１４Åより大きいが、その中の側鎖が１４Å以内で切り取られている残基に対しては１４Åと記載する。Ｍ１３−Ｃ０６結合及び活性について重要と思われる残基を表１８に記載する。
【０７１８】
表１８．Ｍ１３−Ｃ０６結合及び活性に重要と予測されるＩＧＦ−１Ｒ内の残基。残基４６２及び４６４を、これらがＩＧＦ−１Ｒの結合エピトープの予測された中心を表すので、イタリック体で表し、また実験データはＭ１３−Ｃ０３結合におけるこれら残基の重要性を実証する。
【０７１９】
【表１８】
2009532027.tif 000070
発表された研究は、残基４４０−５８６を認識する抗体がＩＧＦ−１結合に対しては抑制性及び作動性であり得ることを示している（Ｓｏｏｓ  １９９２；Ｋｅｙｎｈａｎｆａｒ  ２００７）。４４０−５８６は、Ｌ２の全てと抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体に接近しやすい多くの潜在的で重なり合うことのない表面を持つＦｎＩＩＩ−Ｉに相当する。本発明者らの研究は、ＩＧＦ−１Ｒの阻害性エピトープが特定の残基にどこでマッピングされているかを知った最初の研究である。ＩＮＳＲの最近の構造は、インスリンがその受容体に結合することを阻害すると知られている抗−ＩＮＳＲ抗体と共に同時結晶化されている（Ｓｏｏｓ  １９８６；  ＭｃＫｅｍ  ２００６）。ＩＧＦ−１ＲのＨｉｓ４６４に対する同種残基（ＩＮＳＲのＫ４７４）はＩＮＳＲを有するこの抗体の結合表面の部分である。Ｍ１３−Ｃ０６は、アンタゴニスト抗−ＩＮＳＲ抗体と類似したＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害するための阻害メカニズム共有している可能性がある。
【０７２０】
実施例２８
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、腫瘍細胞に対してインビボで効果的に局在し、Ｋｉ６７発現を阻害し、ＩＧＦ−１Ｒの発現をダウンレギュレートする。
【０７２１】
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、インビボで腫瘍細胞に局在する
方法：  ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスに、エストロゲン（０．３６ｍｇペレット、９０日放出（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ））の存在下でＭＣＦ−７細胞２×１０６個（マトリゲル中で）を注射した。腫瘍を３００〜５００ｍｍ３まで増殖させ、次いでマウスに３０ｍｇ／ｋｇのＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を腹腔内注射した。マウスを犠牲し、ＯＣＴ中で凍結した注射後２、６、１２、２４、及び４８時間で腫瘍を取り出し、免疫組織化学分析（ＩＨＣ）用に６μｍに切片化した。抗体注射を受けていない腫瘍を、対照として切除した。腫瘍をＯＣＴ中で凍結し、ＩＨＣ用に、６μｍに切片化した。基質は、ベクターＶＩＰ（紫色に染まる）である。結合抗体を、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｈｕｍａｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＩＤＥＣ１５１（陰性対照抗体）処理腫瘍について検出した。ＩＧＦ−１Ｒ発現を、α−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｍａｂ（クローン２４−３１、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ／Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）を使用して、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＩＤＥＣ１５１処理腫瘍について検出した。同様の研究をＢｘＰＣ３膵癌異種移植片モデルで行った。
【０７２２】
結果（データは示さない）：マウスＭＣＦ−７乳房腫瘍又はＢｘＰＣ３膵臓腫瘍異種移植片モデルを使用するインビボ効果実験は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの腹腔内注射が腫瘍細胞増殖の阻止において３０及び１５ｍｇ／ｋｇで有効でることを明らかにした。経時実験を行って、ＭＣＦ−７又はＢＸ−Ｐｃ３腫瘍を有するマウスそれぞれにおけるＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの３０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇの１回投与の薬物動態を研究した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、処理後６時間程度の速さで腫瘍に局在し、免疫組織化学分析（ＩＨＣ）に調べられるように、４８時間で局在が最大であった。ウエスタン及びＩＨＣ分析で調べたようにＩＧＦ−１Ｒの発現は、処理後６時間でＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ処理腫瘍においてＩＧＦ−１Ｒの顕著な喪失を示し、２４時間でＧＦ−１Ｒのほぼ完全な喪失を示した。アイソタイプ適合対照抗体を用いて処理した腫瘍では、変化が認められなかった。シグナル伝達経路についての腫瘍溶解液の分析は、２〜１２時間でリン酸化Ｅｒｋ及びＡｋｔの一時的な低下を明らかにした。
【０７２３】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体はＫｉ６７発現を阻害する
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ処理腫瘍のＫｉ６７染色もまた、対照抗体処理腫瘍に比べて多数の増殖細胞の減少を示した（データは示さない）。これらのデータは、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙがインビボ腫瘍に効果的に局在し、ＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーション及びＩＧＦ−１Ｒ介在シグナル伝達の阻害によって腫瘍の増殖を阻止することを示した。
【０７２４】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは腫瘍中のＩＧＦ−１Ｒをダウンレギュレートし、分解する
ＩＧＦ−１Ｒを、ヒト膵臓細胞（ＢｘＰＣ３；図３０（Ａ））及び乳癌細胞（ＭＣＦ−７；図３０（Ｂ））を用いて生じさせたＳＣＩＤマウス腫瘍の溶解液から免疫ブロットした。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＩＤＥＣ−１５１陰性対照抗体を用いた処理後の指定した時間点で、腫瘍を切片化した。腫瘍をスナップ（ｓｎａｐ）凍結し、粉末化し、溶解した。腫瘍細胞溶解液のタンパク質濃度を標準化し、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＳＤ、ＣＡ）で分離した。ゲルをニトロセルロース濾紙にブロットし、ポリクロナール抗−ＩＧＦ−１Ｒβを用いてプローブし、抗−ウサギ−セイヨウワサビペルオキシダーゼを用いた酵素反応により検出した。結果は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが陰性対照抗体と比べてＩＧＦ−１のダウンレギュレーション及び低下をもたらすことを示す。
【０７２５】
実施例２９
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、種々の腫瘍モデル系で体内抗腫瘍活性を実証する
先の実施例に記載のように肺及び膵臓のモデル系においてＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙについて実証した腫瘍増殖のインビボ阻止のほかに、以下の実験により、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが活性を示す多様な腫瘍細胞モデルをさらに実証する。
【０７２６】
ＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞を用いて生じさせた腫瘍におけるＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性
雌性ＳＣＩＤマウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＰＢＳ中の２×１０６個のＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞を右脇腹に接種した。腫瘍を１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）の大きさまで到達させ、マウスを区分けし、単一薬剤（抗体単独）及び併用処理（Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体及びゲムシタビン）を腹腔内投与した。ゲムシタビン単独（２０ｍｇ／ｋｇ、Ｑ４Ｄ×３）及びＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（３０ｍｇ／ｋｇ）との併用並びにＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ単独（共に１５ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ；１×週×６）は腫瘍増殖を阻止した。
【０７２７】
ゲムシタビンの他に、その他の多数の併用療法も試験でき、本発明の抗体と併用される。例えば、以下のカテゴリーの化合物に併用療法が、小さな典型的な見本を示すが、本発明の抗体と共に利用できる：
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、例えば：
タルセバ（エルロチニブ）
イレッサ（ゲフィニチブ）
ＥＧＦＲ抗体、例えば：
エルビタックス（セツキシマブ）
ベクチビックス（パニツムマブ）
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば：
テムシロリムス
ラパマイシン
及びその他の抗癌化合物、例えば：
グリベック（イマチニブ）
スーテント（スニチニブ）
ソラフェニブ（Ｂａｙ−４３９００６）
ＳＡＨＡ（ＨＤＡＣ阻害剤）
ＨＳＰ９０阻害剤
Ｍ２００（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）。
【０７２８】
原発性ヒト結腸腺癌から誘導される細胞を用いて生じさせた腫瘍でのＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性
雌性ＳＣＩＤマウスに、１ｍｍ３の結腸腫瘍断片を右脇腹に接種した。腫瘍断片は、結腸腺癌を有す患者から腫瘍を外科切除した後に得られた結腸腫瘍組織を連続的に通過させる（５回）ことによって誘導した。腫瘍を１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）の大きさまで到達させ、マウスを区分けし、示した処理（ｎ＝６）を用いて投与した（図３１）。１５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの抗体を週に１回腹腔投与した。
【０７２９】
結果：  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＳＣＩＤマウスにおいて原発性結腸腫瘍（ＣＴ３）の増殖を効果的に阻止した（図３１）。
【０７３０】
ＭＣＦ−７乳癌細胞を用いて生じさせた腫瘍でのＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性
雌性ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＰＢＳ中の２×１０６個のＭＣＦ−７細胞（エストロゲン依存性）を右脇腹に接種した。細胞接種の２４時間前に、エストラジオールペレットを、左脇腹に埋め込んだ（０．３６ｍｇペレットエストラジオール、９０日放出（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ））。腫瘍を１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）の大きさまで到達させ、マウスを区分けし、示した処理（ｎ＝１０）を用いて投与した（図３２）。抗体を１回／週、腹腔内投与し、一方、落花生油中のクエン酸タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）をそれぞれの治療計画について週に５回皮下投与した。統計分析を、対にしたスチューデントのｔ検定を使用して行った。
【０７３１】
結果：  Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＭＣＦ−７乳癌腫瘍の増殖を効果的に阻止した（図３２）。
【０７３２】
もちろん、本発明の抗体の腫瘍阻止効果もまた、その他の多数の癌細胞種（少ない典型的な見本を挙げると、例えば：肺癌細胞系Ｈ−１２９９、Ｈ−４６０、Ｈ−２３；結腸癌細胞系Ｃｏｌｏ２０５及びＨＴ−２９；膵癌細胞系、例えばＰａｎｃ−１；及び前立腺癌細胞系、例えばＰＣ−３）で容易に試験できる。
【０７３３】
実施例３０
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体はインビトロＡＤＣＣ活性を示さない。
【０７３４】
方法：
ヒト末梢血単核細胞を、ヘパリン化した全血から標準フィコールパーク分離法で精製した。細胞を、１０％ＦＢＳ及び２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＧＩＢＣＯＴＭ  ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、３７℃で一夜インキュベートした。翌日に、細胞を採取し、培養培地中で１回洗浄し、１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０７３５】
標的細胞（ＭＣＦ−７、乳癌細胞）を、１００μＣｉの５１Ｃｒと共に３７℃で１時間インキュベートした。標的細胞を１回洗浄して、取り込まれなかった５１Ｃｒを除去し、１×１０４細胞／ウエルの容量で移植した。標的細胞を、５０μｌのエフェクター細胞及び５０μｌの抗体と共にインキュベートした。１：５０の標的とエフェクターの比を実験全体を通じて意使用した。含有させた対照を、抗体と共に又は抗体を存在させずにインキュベートし、これらは、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、ハーセプチン（陽性対照）及びＩＤＥＣ−１５１（陰性対照−  ＣＤ４に特異的なアカゲザル／ヒトキメラＩｇＧ１モノクロナール抗体）。３７℃で４時間インキュベートした後に、上清を採取し、ガンマカウンター（Ｉｓｏｄａｔａ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して数えた。％溶解を、次式を用いて調べた：
％溶解＝［試料放出（ＣＰＭ）−自然放出（ＣＰＭ）］／［最大放出（ＣＰＭ）−自然放出（ＣＰＭ）］×１００％
結果：
ハーセプチン抗体陽性対照と比べて、Ｍ１３−Ｃ０６又はＩＤＥＣ−１５１抗体のいずれもＡＤＣＣ活性を示さず、それによってこれら後者の抗体についてエフェクター機能の欠如を示す（図３３）。
【０７３６】
実施例３１
抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体を使用するヒトの癌の治療
本実施例は、悪性細胞、例えばＩＧＦ−１Ｒの発現が検出された過剰増殖細胞を標的としてＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を使用して癌を治療する方法を説明する。
【０７３７】
ある実施形態において、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（又は本発明の他の抗体）は精製され、注射剤用の適当な製薬ビヒクルを用いて製剤される。過剰増殖性疾患を有するヒト患者に、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（又は本発明の他の抗体）を、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重で、例えば、２週毎に１回又は月に１回、少なくとも６ヶ月間、静脈内注入によって複数回投与する。間隔は、患者の指標を測定することによって示されるように不規則であり得る。
【０７３８】
抗体は、本明細書に記載のような標準的な放射線治療計画の前に、同時に又は後に投与することができる。患者は、例えば、腫瘍退縮、新たな腫瘍の発生の減少、より少ない腫瘍抗原発現、又は病気予後を評価す売るその他の手段に基づいて、治療が抗腫瘍反応をもたらしたか否かを調べるために監視される。
【数４０】
2009532027.tif 000071
【数４１】
2009532027.tif 000072
【０７３９】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法施行規則第３．２５（３）号規規則）。
（カナダ）
出願人は、本出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは本出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
（クロアチア）
出願人はここにおいて、本願において言及された寄託された生物学的材料のサンプルが、無関係の専門家に対して、本願の公開と特許査定との間に入手可能とされる旨を、請求する。サンプルは、本特許の権利存続中に、本特許の出願人または適用可能な場合にはその権利者がはっきりと以下のような保証を放棄しない限りは、サンプルの請求人が、このようなサンプルまたはこれらに由来するあらゆる材料を第三者に対して入手可能としないこと、ならびに、実験または研究の目的を除いて、このようなサンプルまたはこれらに由来するあらゆる材料を使用しないことに同意する場合にのみ、入手可能とされる。
（デンマーク）
出願人はここにおいて、本出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
（フィンランド）
出願人はここにおいて、本出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、特許および統制委員会により作成された公認専門家のリストに記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
（ドイツ）
出願人は、ここにおいて、生物学的試料は、特許の付与、またはこの出願が拒絶され、取り下げられる場合は、出願日から２０年間、出願人により指名された独立の専門家にのみ試料が分譲されることを請求する。
（アイスランド）
出願人はここにおいて、特許が付与されるか、または特許が付与されない、この出願に関するアイスランド特許庁による最終的な決定がなされるまでは、この出願で言及される寄託された生物学的材料の試料の供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリストに記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
（シンガポール）
出願人はここにおいて、微生物の試料の供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。
（スペイン）
出願人は、ここにおいて、生物学的材料は、スペイン特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられる場合は、出願日から２０年間、Ａｒｔｉｃｌｅ  ４５  ＳＰＬで示されるように独立の専門家にこの出願で言及される寄託された生物学的材料の試料を分譲することによってのみ入手可能となされることを請求する。
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、出願日から２０年以内に拒絶または取り下げられた出願に対しても適用される。
（スイス）
出願人はここにおいて、第三者に対するサンプルの供与は、その第三者が、寄託者への通知のために氏名および住所を寄託機関に知らせ、そして、（ａ）寄託された培養物またはこれに由来する培養物を第三者に対して入手可能としないこと；（ｂ）法律の権限外でこの培養物を使用しないこと；ならびに、（ｃ）係争中の場合には、項目（ａ）および（ｂ）の下の義務違反がない旨の証書を発行することに同意する、という条件でなされ得る旨を、請求する。
（マケドニア共和国（旧ユーゴスラビア連邦））
出願人はここにおいて、第三者に対するサンプルの供与は、その第三者が、（ａ）生存可能な生物学的材料または微生物材料のサンプルが入手可能とされることを要求する権利を有し；そして（ｂ）特許の効力の存続期間の満了前に、出願人は、その寄託された生存可能な生物学的材料または微生物材料のサンプルを任意の第三者に対して入手可能とする権限を与えられていないことに同意している、という条件でなされ得る旨を、請求する。
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。
（欧州特許庁）
出願人はここにおいて、欧州特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられる場合は、出願日から２０年間、生物学的材料は、ＥＰＣ施行規則の規則２８（３）に定められるように、サンプルの請求人により指名された専門家にサンプルを分譲することによってのみ入手可能となされる旨を、請求する（ＥＰＣ規則２８（４））。
【図面の簡単な説明】
【０７４０】
【図１】ＩＧＦ−１Ｒ特異的Ｆａｂ類の結合活性を表す。（ａ）は、ＥＬＩＳＡによる組換えＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓ及びＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃタンパク質に対する精製抗ＩＧＦ１ＲＦａｂ抗体の結合を表す。（ｂ）は、フローサイトメトリーによる３Ｔ３上で発現されたヒトＩＧＦ１Ｒに対する精製抗−ＩＧＦ１ＲＦａｂ抗体の結合を表す。
【図２】ＭＣＦ−７細胞上で発現されたＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ類の結合活性を表す。
【図３】抗−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ類が、ＭＣＦ７細胞において（ａ）ＩＧＦ−Ｉ及び（ｂ）ＩＧＦ−２誘発リン酸化を阻害したことを表す。
【図４】ＥＬＩＳＡによる可溶性ＩＧＦ−１Ｒ（ａ）及びＩＮＳＲ（ｂ）に対するＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂフラグメント抗体の結合を表す。
【図５−１】Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｂ０１のＶ重鎖及びＶ軽鎖のオリジナルバージョンと修飾バージョンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表す。（ａ）（配列番号：１３）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂ）（配列番号：７７）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｃ）（配列番号：１４）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｄ）（配列番号：７８）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｅ）（配列番号：２５）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｆ）（配列番号：８７）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｇ）（配列番号：２６）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｈ）（配列番号：８８）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｉ）（配列番号：３１）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｊ）（配列番号：９２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｋ）（配列番号：３２）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｌ）（配列番号：９３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１アミノ酸配列を表す。（ｍ）（配列番号：１９）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｎ）（配列番号：８２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｏ）（配列番号：２０）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｐ）（配列番号：８３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｑ）（配列番号：１８）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｒ）（配列番号：１４）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｓ）（配列番号：３０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｔ）（配列番号：２６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｕ）（配列番号：３６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｖ）（配列番号：３２）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｗ）（配列番号：２４）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｘ）（配列番号：２０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｙ）（配列番号：１５３）は、軽鎖定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｚ）（配列番号：１５４）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。（ａａ）（配列番号：１５５）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂｂ）（配列番号：１５６）は、重鎖ａｇｌｙＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を表す。
【図５−２】Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｂ０１のＶ重鎖及びＶ軽鎖のオリジナルバージョンと修飾バージョンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表す。（ａ）（配列番号：１３）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂ）（配列番号：７７）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｃ）（配列番号：１４）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｄ）（配列番号：７８）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｅ）（配列番号：２５）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｆ）（配列番号：８７）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｇ）（配列番号：２６）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｈ）（配列番号：８８）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｉ）（配列番号：３１）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｊ）（配列番号：９２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｋ）（配列番号：３２）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｌ）（配列番号：９３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１アミノ酸配列を表す。（ｍ）（配列番号：１９）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｎ）（配列番号：８２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｏ）（配列番号：２０）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｐ）（配列番号：８３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｑ）（配列番号：１８）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｒ）（配列番号：１４）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｓ）（配列番号：３０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｔ）（配列番号：２６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｕ）（配列番号：３６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｖ）（配列番号：３２）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｗ）（配列番号：２４）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｘ）（配列番号：２０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｙ）（配列番号：１５３）は、軽鎖定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｚ）（配列番号：１５４）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。（ａａ）（配列番号：１５５）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂｂ）（配列番号：１５６）は、重鎖ａｇｌｙＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を表す。
【図５−３】Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｂ０１のＶ重鎖及びＶ軽鎖のオリジナルバージョンと修飾バージョンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表す。（ａ）（配列番号：１３）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂ）（配列番号：７７）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｃ）（配列番号：１４）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｄ）（配列番号：７８）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｅ）（配列番号：２５）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｆ）（配列番号：８７）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｇ）（配列番号：２６）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｈ）（配列番号：８８）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｉ）（配列番号：３１）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｊ）（配列番号：９２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｋ）（配列番号：３２）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｌ）（配列番号：９３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１アミノ酸配列を表す。（ｍ）（配列番号：１９）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｎ）（配列番号：８２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｏ）（配列番号：２０）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｐ）（配列番号：８３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｑ）（配列番号：１８）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｒ）（配列番号：１４）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｓ）（配列番号：３０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｔ）（配列番号：２６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｕ）（配列番号：３６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｖ）（配列番号：３２）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｗ）（配列番号：２４）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｘ）（配列番号：２０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｙ）（配列番号：１５３）は、軽鎖定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｚ）（配列番号：１５４）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。（ａａ）（配列番号：１５５）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂｂ）（配列番号：１５６）は、重鎖ａｇｌｙＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を表す。
【図５−４】Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｂ０１のＶ重鎖及びＶ軽鎖のオリジナルバージョンと修飾バージョンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表す。（ａ）（配列番号：１３）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂ）（配列番号：７７）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｃ）（配列番号：１４）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｄ）（配列番号：７８）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｅ）（配列番号：２５）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｆ）（配列番号：８７）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｇ）（配列番号：２６）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｈ）（配列番号：８８）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｉ）（配列番号：３１）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｊ）（配列番号：９２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｋ）（配列番号：３２）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｌ）（配列番号：９３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１アミノ酸配列を表す。（ｍ）（配列番号：１９）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｎ）（配列番号：８２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｏ）（配列番号：２０）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｐ）（配列番号：８３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｑ）（配列番号：１８）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｒ）（配列番号：１４）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｓ）（配列番号：３０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｔ）（配列番号：２６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｕ）（配列番号：３６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｖ）（配列番号：３２）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｗ）（配列番号：２４）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｘ）（配列番号：２０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｙ）（配列番号：１５３）は、軽鎖定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｚ）（配列番号：１５４）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。（ａａ）（配列番号：１５５）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂｂ）（配列番号：１５６）は、重鎖ａｇｌｙＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を表す。
【図５−５】Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｂ０１のＶ重鎖及びＶ軽鎖のオリジナルバージョンと修飾バージョンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表す。（ａ）（配列番号：１３）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂ）（配列番号：７７）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｃ）（配列番号：１４）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｄ）（配列番号：７８）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｅ）（配列番号：２５）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｆ）（配列番号：８７）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｇ）（配列番号：２６）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｈ）（配列番号：８８）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｉ）（配列番号：３１）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｊ）（配列番号：９２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｋ）（配列番号：３２）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｌ）（配列番号：９３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１アミノ酸配列を表す。（ｍ）（配列番号：１９）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｎ）（配列番号：８２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｏ）（配列番号：２０）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｐ）（配列番号：８３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｑ）（配列番号：１８）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｒ）（配列番号：１４）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｓ）（配列番号：３０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｔ）（配列番号：２６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｕ）（配列番号：３６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｖ）（配列番号：３２）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｗ）（配列番号：２４）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｘ）（配列番号：２０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｙ）（配列番号：１５３）は、軽鎖定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｚ）（配列番号：１５４）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。（ａａ）（配列番号：１５５）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂｂ）（配列番号：１５６）は、重鎖ａｇｌｙＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を表す。
【図５−６】Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｂ０１のＶ重鎖及びＶ軽鎖のオリジナルバージョンと修飾バージョンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を表す。（ａ）（配列番号：１３）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂ）（配列番号：７７）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｃ）（配列番号：１４）は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｄ）（配列番号：７８）は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｅ）（配列番号：２５）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｆ）（配列番号：８７）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｇ）（配列番号：２６）は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｈ）（配列番号：８８）は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｉ）（配列番号：３１）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｊ）（配列番号：９２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｋ）（配列番号：３２）は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｌ）（配列番号：９３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１アミノ酸配列を表す。（ｍ）（配列番号：１９）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｎ）（配列番号：８２）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｏ）（配列番号：２０）は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｐ）（配列番号：８３）は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｑ）（配列番号：１８）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｒ）（配列番号：１４）は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を表す。（ｓ）（配列番号：３０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｔ）（配列番号：２６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を表す。（ｕ）（配列番号：３６）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｖ）（配列番号：３２）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を表す。（ｗ）（配列番号：２４）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｘ）（配列番号：２０）は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を表す。（ｙ）（配列番号：１５３）は、軽鎖定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｚ）（配列番号：１５４）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を表す。（ａａ）（配列番号：１５５）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域の一本鎖ＤＮＡ配列を表す。（ｂｂ）（配列番号：１５６）は、重鎖ａｇｌｙＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を表す。
【図６】完全ヒトＭ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙバージョンの非還元及び還元ＳＤＡ  ＰＡＧＥ分析を表す。
【図７】ＥＬＩＳＡで測定される完全ヒトＧ４．Ｐ（ａ）及びＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ（ｂ）バージョンの結合活性を表す。
【図８】ＭＣＦ−７（８．ａ）、ＩＧＦ−１Ｒ／３Ｔ３（８．ｂ）細胞上で発現されたＩＧＦ−１Ｒに対する完全ヒト抗体の結合を、フローサイトメトリーで調べらた。ＭＣＦ−７上の結合ＥＣ５０は、２．７−１２×１０−１０ｎＭの範囲にあった。
【図９】ＩＧＦ−１Ｒに結合するＩＧＦ−１（ａ）及びＩＧＦ−２（ｂ）をブロックする完全ヒト抗体のＧ４バージョンの能力を、ＲＩＡで調べた。
【図１０−１】（ａ）は、完全ヒト抗体のＧ４バージョンによるＩＧＦ−１に応答するＨ−２３腫瘍細胞の増殖の阻害を表し；（ｂ）は、完全ヒト抗体のＧ４バージョンによるＩＧＦ−２に応答するＨ−２３腫瘍細胞の増殖の阻害を表す。
【図１０−２】（ｃ）は、完全ヒト抗体のＧ４バージョンによるＩＧＦ−１に応答するＣａｌｕ−６腫瘍細胞の増殖を表す。
【図１１】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体、Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体及びＭ１４．Ｇ１１．Ｐ抗体によるＩＧＦ−１（ａ）及びＩＧＦ−２（ｂ）駆動受容体リン酸化の阻害を表す。
【図１２Ａ】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙによる下流シグナル伝達の阻害を表す。（ａ）は、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）及び全Ａｋｔを、上段及び下段それぞれに示す。（ｂ）は、上部ホスホｐ４４／４２ＭＡＰＫ及び全ｐ４４／４２ＭＡＰＫを、上段及び下段それぞれに示する。
【図１２Ｂ】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙによる下流シグナル伝達の阻害を表す。（ａ）は、Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）及び全Ａｋｔを、上段及び下段それぞれに示す。（ｂ）は、上部ホスホｐ４４／４２ＭＡＰＫ及び全ｐ４４／４２ＭＡＰＫを、上段及び下段それぞれに示する。
【図１３Ａ】ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部化を表す。Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部化（ａ）が、共焦点顕微鏡で時間０分、１５分及び６０分で観察された。抗−マウスＩＧＦ−１Ｒ抗体クローン２４−３１は、陽性対照（ｂ）であり、マウス７Ｆ２抗体及びヒトＧ４．Ｐ抗体ＩＤＥＣ−１５１．Ｇ４．Ｐは、実験のアイソタイプ適合陰性対照（ｃ）であった。
【図１３Ｂ】ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部化を表す。Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部化（ａ）が、共焦点顕微鏡で時間０分、１５分及び６０分で観察された。抗−マウスＩＧＦ−１Ｒ抗体クローン２４−３１は、陽性対照（ｂ）であり、マウス７Ｆ２抗体及びヒトＧ４．Ｐ抗体ＩＤＥＣ−１５１．Ｇ４．Ｐは、実験のアイソタイプ適合陰性対照（ｃ）であった。
【図１３Ｃ】ヒト抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部化を表す。Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部化（ａ）が、共焦点顕微鏡で時間０分、１５分及び６０分で観察された。抗−マウスＩＧＦ−１Ｒ抗体クローン２４−３１は、陽性対照（ｂ）であり、マウス７Ｆ２抗体及びヒトＧ４．Ｐ抗体ＩＤＥＣ−１５１．Ｇ４．Ｐは、実験のアイソタイプ適合陰性対照（ｃ）であった。
【図１４】選択されたＩＧＦ−１ＲｍＡｂ類によるＩＧＦ−１介在腫瘍細胞増殖の阻害を表す。（ａ）はＨ２３について表し；（ｂ）はＣａｌｕ−６について表し；（ｃ）はＰａｎｃ−１について表し；（ｄ）はＢｘＰＣ３について表し；（ｅ）はＭａＰａＣａについて表し；及び（ｆ）、Ｃｏｌｏ２０５について表す。バーは、平均及びＳＤを表す。
【図１５】抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＨ−２３細胞のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２駆動増殖の阻害を表す。
【図１６】Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体によるＢｘＰＣ３細胞増殖（組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２により駆動される）の阻害を表す。
【図１７】Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体によるＮＣＩ−Ｈ２３細胞増殖（組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２により駆動される）の阻害を表す。
【図１８】Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体によるＡ５４９細胞増殖（組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２により駆動される）の阻害を表す。
【図１９】完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体によるアミノ酸残基Ｓｅｒ４７３でのＡｋｔのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２誘発リン酸化の阻害を表す。
【図２０】完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、膵癌モデルにおいて腫瘍増殖のインビボ用量依存阻害を示すことを表す。
【図２１】完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、肺癌モデルにおいて腫瘍増殖のインビボ用量依存性阻害を示すことを表す。
【図２２】ゲムシタビンと組み合わせて投与された完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、腫瘍増殖の阻害において高められた効果を示すことを表す。
【図２３】完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、確立されたカニクイザル線維芽細胞系で発現されたＩＧＦ−１Ｒに結合することを表す。
【図２４】ＩＧＦ−１Ｒ抗体結合性エピトープの交差競合結合分析を表す。
【図２５】ＩＲＳ−１及びｐ８５（ＰＢＫの調節サブユニット）の同時免疫沈降が、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達のＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ介在阻害を実証することを表す。
【図２６】哺乳動物細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲの免疫沈降が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するがインスリン受容体に結合しないＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を実証することを表す。ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲタンパク質は、マウス抗−ヒトＩＲ（Ａ）又はマウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ（Ｂ）を用いた免疫ブロット（ウェスタンブロット）によって検出された。
【図２７】（Ａ）ｈＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ及び（Ｂ）ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂの相対結合親和性測定を表す。ｘ軸及びｙ軸の目盛りは、（Ａ）及び（Ｂ）について同じである。結合フィットに関する残余（Ｒｅｓｉｄｕａｌｓ）を、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対親和性の測定における１：１結合モデルの適用性を示すために各パネルの下部に示す。
【図２８】ＩＧＦ−１Ｒ変異タンパク質ＳＤ００６（結合陽性）及びＳＤ０１５（結合陰性）に結合する抗体と比較したＳＰＲアッセイにおけるｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ対照に結合するＭ１３．Ｃ０６抗体の例を表す。
【図２９】ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲの構造を表す。Ａ）は、ＩＧＦ−１Ｒの構造の概略図を表す。Ａ）ＦｎＩＩＩ−２は、図に示すようなインビボでタンパク質分解処理されるループ構造を含む。膜貫通領域は、リン脂質二重層の概略図を横断するヘリカルループとして示す。ＩＧＦ−１Ｒ内のＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合部位の位置は、星印で示す。１個のＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２分子のみが各ＩＧＦ−１Ｒヘテロ二量体分子に結合することが実証されている。Ｂ及びＣ）は、相同ＩＮＳＲの構造の表面に地図化されたＭ１３−Ｃ０６  ＩＧＦ−１Ｒ結合性エピトープを表す。Ｍ１３−Ｃ０６  ＩＧＦ−１Ｒ結合性エピトープは、高相同性ＩＮＳＲ結晶構造に基づいてモデル化された。Ｂ）ＩＧＦ−１ＲのＶ４６２−Ｈ４６４（すなわち、ＥｓｆＳＲのＬ４７２−Ｋ４７４）の相同的位置に対応するアミノ酸残基位置を有するＩＮＳＲの構造の表面に、黒く陰影を付す。ＩＧＦ−１Ｒ（すなわち、Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２）（例えば、本明細書に記載の切断ＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ組立て体に含まれる）に対応する最初の３つのドメインに、灰色に陰影を付ける。Ｃ）溶媒に表面積を暴露し且つＩＧＦ−１Ｒの４６２−４６４（すなわち、ＩＮＳＲの４７２−４７４）に対応する残基の１４Å（オングストローム）の半径（すなわち２８Åの直径）内にある残基を有するＩＮＳＲの表示を、黒く陰影を付す。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸４６２−４６４に対応する残基に、提案されたエピトープの実験的に確認された表面積を示すために灰色の陰影を付す。
【図３０】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を用いて処置されたマウス腫瘍におけるインビボＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫ブロット（ウェスタンブロット）分析を表す。
【図３１】原発性ヒト結腸腫瘍から生じた腫瘍におけるＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのインビボ抗腫瘍活性を表す。
【図３２】乳癌（ＭＣＦ−７）細胞から生じた腫瘍におけるＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのインビボ抗腫瘍活性を表す。
【図３３】Ｍ１３−Ｃ０６抗体が、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＡＤＣＣ活性を示さないことを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年1月13日(2009.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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