(57)【要約】本開示は、高い親和力でO8Eに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。本開示の抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、および本開示の抗体を発現させるための方法もまた、提供される。本開示の抗体を含む、免疫複合体、二重特異性分子、および薬学的組成物もまた、提供される。本開示はまた、癌を治療するための方法も提供する。2009518049.tif 000019
2009518049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体が、
(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合し、かつ、
(b)乳房細胞癌腫瘍細胞株に結合する、
単離されたヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２】
IgG1アイソタイプまたはIgG4アイソタイプの完全長抗体である、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
抗体断片または単鎖抗体である、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
5.5×10-9Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項５】
3×10-9Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項６】
2×10-9Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項７】
内部移行される、請求項1記載の抗体。
【請求項８】
乳房細胞癌腫瘍細胞株が、SKBR3細胞株からなる群より選択される、請求項1記載の抗体。
【請求項９】
フコース残基を欠く、請求項1記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、O8Eへの結合について参照抗体と交差競合し、
該参照抗体が、
(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合し、かつ、
(b)乳房細胞癌腫瘍細胞株に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
参照抗体が以下を含む、請求項10記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１２】
参照抗体が以下を含む、請求項10記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１３】
参照抗体が以下を含む、請求項10記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１４】
参照抗体が以下を含む、請求項10記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１５】
参照抗体が以下を含む、請求項10記載の抗体：
(a)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項１６】
抗体がO8Eに特異的に結合し、
ヒトVH4-34遺伝子、ヒトVH3-53遺伝子、もしくはVH3-9遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
抗体がO8Eに特異的に結合し、
ヒトVKA17遺伝子もしくはヒトVKL6遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する軽鎖可変領域を含む、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項１９】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２０】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２１】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２２】
以下を含む、請求項1記載の抗体：
a)SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1;
b)SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2;
c)SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3;
d)SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2;および
f)SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3。
【請求項２３】
抗体がO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２４】
抗体がO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２５】
抗体がO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２６】
抗体がO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２７】
抗体がO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
a)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【請求項２８】
請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２９】
治療物質に連結された請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分を含む、免疫複合体。
【請求項３０】
請求項29記載の免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３１】
治療物質がサイトトキシンである、請求項30記載の免疫複合体。
【請求項３２】
請求項31記載の免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３３】
治療物質が放射性同位体である、請求項29記載の免疫複合体。
【請求項３４】
請求項33記載の免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３６】
請求項35記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３７】
請求項36記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
抗O8E抗体を調製するための方法であって、
請求項39記載の宿主細胞中で該抗体を発現させる段階、および該宿主細胞から該抗体を単離する段階を含む方法。
【請求項３９】
O8Eを発現する腫瘍細胞の増殖を特徴とする疾患を治療または予防する方法であって、
該疾患を治療または予防するのに有効な量の、請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法。
【請求項４０】
疾患が癌である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
癌が乳房細胞癌である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
癌が卵巣癌である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
癌が腎臓癌である、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
癌が頭頸部癌である、請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、いずれも参照により本明細書に組み入れられる2005年12月8日に出願された米国特許仮出願第60/748,914号および2006年9月5日に出願された米国特許仮出願第60/824,593号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、全体として、免疫学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、ヒト抗O8Eモノクローナル抗体、ヒト抗O8Eモノクローナル抗体をコードする核酸、ヒト抗O8Eモノクローナル抗体を調製するための方法、および、O8Eを発現する細胞の増殖を特徴とする癌のような疾患を治療するための方法が、本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
乳癌および卵巣癌は、それぞれ、米国における女性の癌死亡の第2位および第4位の主要原因である(American Cancer Society(2005) Cancer facts and figures（非特許文献1)。American Cancer Societyは、米国では2005年に約40,000人の女性が乳癌で死亡し、約16,000人が卵巣癌で死亡すると推定した。表面上皮性腫瘍は、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、類内膜腫瘍、および明細胞癌が含まれる卵巣悪性腫瘍全体の80％超を占める(Seidman et al.「Blaustein' s Pathology of the Female Genital Tract」791-4(Kurman編、第5版、New York, Springer- Verlag, 2002)（非特許文献2)。卵巣癌は、しばしば、転移性疾患が局所部位および遠位部位に広がった進行期に発現する(Pettersson, (1994) Int. Fed. Of Gyn. and Obstetrics、第22巻（非特許文献3);およびHeintz et al. (2001) J. Epidermiol. Biostat. 6： 107-38（非特許文献4))。したがって、乳癌の生涯発癌確率は、卵巣癌より有意に高いが、乳癌患者の5年生存率は、卵巣癌患者の場合より有意に良好である。
【０００４】
B7様分子は、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する。B7様分子の細胞外部分は、1つのIgVドメインおよび1つのIgCドメインを含み、約20％〜40％のアミノ酸同一性を有している。B7様分子は、抗原特異的な免疫応答の制御および微調整において重要な役割を果たしている。B7H4、B7x、およびB7S1としても公知のO8Eは、B7ファミリーのメンバーであり、T細胞応答の刺激性調節および阻害的調節の両方において役割を果たしていると考えられている(Carreno et al., (2002) Ann. Rev. Immunol. 20：29-53（非特許文献5)およびKhoury et al., (2004) Immunity 20：529-538（非特許文献6))。ヒトO8Eは、第1染色体上にマッピングされており、6つのエキソンおよび66kbに及ぶ5つのイントロンから構成され、そのうちエキソン6は、選択的スプライシングに使用されて2種の異なる転写物を生成する(Choi et al. (2003) J. Immunol. 171：4650-4654（非特許文献7))。
【０００５】
O8Eは、T細胞上の受容体に結合することによって生理的機能を発揮し、次に、細胞周期停止を誘導し、かつ、サイトカインの分泌、細胞障害作用の発生、ならびにCD4+T細胞およびCD8+T細胞のサイトカイン産生を阻害する(Prasad et al. (2003) Immunity 18：863-873（非特許文献8);Sica et al. (2003) Immunity 18：849-861（非特許文献9);Wang et al. (2004) Microbes Infect. 6：759-66（非特許文献10);およびZang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100：10388-10392（非特許文献11))。O8Eは、炎症応答のアテニュエータであり得、かつ、抗原特異的免疫応答および抗腫瘍応答の下方調節において役割を果たし得ることが示唆されている(Zang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100：10388-10392（非特許文献11);Prasad et al. (2003) Immunity 18：863-873（非特許文献8);Sica et al. (2003) Immunity 18：849-861（非特許文献9);Choi et al. (2003) J. Immunol. 171：4650-4654（非特許文献7);およびCarreno et al. (2003) Trends Immunol. 24：524-7（非特許文献12))。
【０００６】
O8E mRNAは、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、および小腸を含む広範囲の正常体細胞組織において検出されているが、タンパク質発現は検出されていない(Sica et al. (2003) Immunity 18：849-61（非特許文献9)およびChoi et al. (2003) J. Immunol. 171：4650-4（非特許文献7))。O8Eは、T細胞、B細胞、単球、および樹状細胞を刺激した際に誘導される。しかしながら、免疫組織化学解析では、一部の卵巣癌および肺癌(同書)における陽性染色を例外として、いくつかの末梢組織において発現はほとんど示されなかった。さらに、O8Eは、腫瘍のグレードまたは病期とは無関係に、原発性乳癌および転移性乳癌において一貫して過剰発現されることから、乳癌の生物学におけるこのタンパク質の重要な役割が示唆されている(Tringler et al. (2005) Clinical Cancer Res. 11：1842-48（非特許文献13))。それぞれ全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,962,980号（特許文献1)、同第6,699,664号（特許文献2)、同第6,468,546号（特許文献3)、同第6,488,931号（特許文献4)、同第6,670,463号（特許文献5)、および同第6,528,253号（特許文献6)も参照されたい。
【０００７】
放射線療法、細胞障害性抗腫瘍剤を用いる従来の化学療法、ホルモン療法(アロマターゼ阻害剤、黄体化ホルモン放出ホルモン類似体)、ビスホスホナート、およびシグナル伝達阻害物質を含む、多種多様の治療様式が、進行した乳癌および卵巣癌の治療のために利用可能である(Smith(2002) Lancet, 360：790-2（非特許文献14))。しかしながら、あいにく、多くの患者は、これらの治療様式のいずれに対しても不十分に応答するか、または全く応答しないかのいずれかである。したがって、乳癌および卵巣癌に対する新規の分子マーカーおよび治療物質を同定する必要がある。したがって、O8Eは、卵巣癌および乳癌を含む癌、ならびにO8E発現を特徴とする他の様々な疾患を治療するための有益な標的になる。
【０００８】
【非特許文献１】American Cancer Society(2005) Cancer facts and figures
【非特許文献２】Seidman et al.「Blaustein' s Pathology of the Female Genital Tract」791-4(Kurman編、第5版、New York, Springer- Verlag, 2002)
【非特許文献３】Pettersson, (1994) Int. Fed. Of Gyn. and Obstetrics、第22巻
【非特許文献４】Heintz et al. (2001) J. Epidermiol. Biostat. 6： 107-38
【非特許文献５】Carreno et al., (2002) Ann. Rev. Immunol. 20：29-53
【非特許文献６】Khoury et al., (2004) Immunity 20：529-538
【非特許文献７】Choi et al. (2003) J. Immunol. 171：4650-4654
【非特許文献８】Prasad et al. (2003) Immunity 18：863-873
【非特許文献９】Sica et al. (2003) Immunity 18：849-861
【非特許文献１０】Wang et al. (2004) Microbes Infect. 6：759-66
【非特許文献１１】Zang et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100：10388-10392
【非特許文献１２】Carreno et al. (2003) Trends Immunol. 24：524-7
【非特許文献１３】Tringler et al. (2005) Clinical Cancer Res. 11：1842-48
【非特許文献１４】Smith(2002) Lancet, 360：790-2
【特許文献１】米国特許第6,962,980号
【特許文献２】米国特許第6,699,664号
【特許文献３】米国特許第6,468,546号
【特許文献４】米国特許第6,488,931号
【特許文献５】米国特許第6,670,463号
【特許文献６】米国特許第6,528,253号
【発明の開示】
【０００９】
概要
本開示は、O8E(別名B7H4、B7S1、およびB7x)に結合し、かつ多数の望ましい特性を示す、単離されたモノクローナル抗体、特にヒト配列モノクローナル抗体を提供する。これらの特性には、ヒトO8Eに結合する高親和性が含まれる。また、本開示の抗体および組成物を用いて、O8E媒介による様々な疾患を治療するための方法も提供される。
【００１０】
1つの局面において、本開示は、
抗体が、
(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合し、かつ、
(b)O8EをトランスフェクトされたヒトCHO細胞に結合する、
単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。
【００１１】
一定の態様において、抗体は、細胞株SKBR3(ATCCアクセッション番号HTB-30)のような乳房細胞癌腫瘍細胞株に結合する。
【００１２】
典型的には、抗体はヒト抗体であるが、代替の態様において、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体でよい。
【００１３】
1つの態様において、抗体は、5×10-8Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、2×10-8Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、1×10-8Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、5×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、4×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、3×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、または2×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合する。
【００１４】
別の態様において、抗体は、SKBR3乳房細胞癌腫瘍細胞上で発現されているO8Eに結合した後、それらの細胞によって内部移行される。
【００１５】
別の態様において、本開示は、O8Eへの結合について参照抗体と交差競合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この参照抗体は、
(a)1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合し、かつ、
(b)O8EをトランスフェクトされたヒトCHO細胞に結合する。
【００１６】
様々な態様において、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または、参照抗体は、
(a)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
1つの局面において、本開示は、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVH4-34遺伝子の産物であるか(タンパク質産物は、本明細書においてSEQ ID NO：51として提示される)、またはヒトVH4-34遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。本開示はまた、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVH3-53遺伝子の産物であるか(タンパク質産物は、本明細書においてSEQ ID NO：52として提示される)、またはヒトVH3-53遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供する。本開示はまた、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVH3-9/D3-10/JH6b遺伝子の組合せの産物であるか(タンパク質産物は、本明細書においてSEQ ID NO：53として提示される)、またはヒトVH3-9/D3-10/JH6b遺伝子の組合せに由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供する。
【００１８】
本開示はさらにまた、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVK A27遺伝子の産物であるか(タンパク質産物は、本明細書においてSEQ ID NO：54として提示される)、またはヒトVKA27遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供する。本開示はさらにまた、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVKL6/JK1遺伝子の組合せの産物であるか(タンパク質産物は、本明細書においてSEQ ID NO：55として提示される)、またはヒトVKL6/JK1遺伝子の組合せに由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供する。
【００１９】
他の局面において、本開示は、抗体がO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
(a)ヒトVH4-34、VH3-53、またはVH3-9遺伝子の重鎖可変領域;および
(b)ヒトVKA27またはVKL6の軽鎖可変領域。
【００２０】
関連した態様において、抗体は、ヒトVH4-34遺伝子の重鎖可変領域およびヒトVKA27遺伝子の軽鎖可変領域を含む。別の関連した態様において、抗体は、ヒトVH3-53遺伝子の重鎖可変領域およびヒトVKA27遺伝子の軽鎖可変領域を含む。さらに別の関連した態様において、抗体は、ヒトVH3-9遺伝子の重鎖可変領域およびヒトVKL6遺伝子の軽鎖可変領域を含む。
【００２１】
さらに別の局面において、本開示は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、
(a)重鎖可変領域のCDR3配列が、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み;
(b)軽鎖可変領域のCDR3配列が、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み;
(c)抗体が、1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合し;
(d)O8EをトランスフェクトされたヒトCHO細胞に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００２２】
典型的には、重鎖可変領域のCDR2配列は、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR2配列は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。典型的には、重鎖可変領域のCDR1配列は、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1配列は、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００２４】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００２５】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００２６】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００２７】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００２８】
本開示の他の特定の抗体またはそれらの抗原結合部分は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２９】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００３０】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００３１】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００３２】
別の特定の組合せは、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および
(b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００３３】
本開示の別の局面において、O8Eへの結合について前述の抗体のいずれかと競合する抗体またはそれらの抗原結合部分が提供される。
【００３４】
本開示の抗体は、例えばアイソタイプIgG1、IgG2、またはIgG4の、例えば、完全長抗体でよい。あるいは、これらの抗体は、Fab断片、Fab'断片、もしくはFab'2断片などの抗体断片、または単鎖抗体(例えばscFv)でよい。
【００３５】
本開示はまた、サイトトキシンまたは放射性同位体などの治療物質に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。本開示はまた、本開示の抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第2の機能的部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
【００３６】
本開示の抗体もしくはその抗原結合部分、または免疫複合体もしくは二重特異性分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた、提供される。
【００３７】
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにそのような核酸を含む発現ベクター、そのような発現ベクターを含む宿主細胞、および、そのような宿主細胞を用いて抗O8E抗体を作製するための方法もまた、本開示に包含される。さらに、本開示は、本開示の抗体を発現する、ヒト免疫グロブリンの重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス、ならびに、本開示の抗体を産生する、そのようなマウスから調製されるハイブリドーマも提供する。
【００３８】
さらに別の局面において、本開示は、O8Eを発現する腫瘍細胞の増殖を特徴とする疾患を治療または予防する方法であり、その疾患を治療または予防するのに有効な量の本開示の抗O8Eヒト抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。疾患は、癌、例えば乳房細胞癌腫癌でよい。
【００３９】
さらに別の局面において、本開示は、自己免疫障害を治療する方法であり、自己免疫障害を治療するのに有効な量の本開示の抗O8Eヒト抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【００４０】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかになると考えられるが、これらは限定的なものとして解釈されるべきではない。本出願を通して引用されるすべての参考文献、Genbank登録番号、特許、および特許出願公開の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【００４１】
詳細な説明
本開示は、高い親和力でO8E(別名B7H4、B7S1、およびB7x)に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、特にヒト配列モノクローナル抗体に関する。一定の態様において、本開示の抗体は、特定の重鎖生殖系列配列および軽鎖生殖系列配列に由来し、かつ/または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域のような特定の構造的特徴を含む。本開示は、単離された抗体、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子、ならびに本開示の抗体、免疫複合体、または二重特異性分子を含む薬学的組成物を提供する。本開示はまた、例えばO8Eを検出するために、ならびに癌のようなO8Eの発現に関連した疾患を治療するために抗体を使用する方法にも関する。したがって、本開示はまた、例えば、乳房細胞癌、転移性乳癌、卵巣細胞癌、転移性卵巣癌、および腎細胞癌の治療において、様々な癌を治療するために本開示の抗O8E抗体を使用する方法も提供する。
【００４２】
本開示をより容易に理解できるようにするために、いくつかの用語を最初に定義する。その他の定義は、詳細な説明を通して説明する。
【００４３】
「O8E」、「B7H4」、「B7x」および「B7S1」という用語は、本明細書において同義的に使用され、ヒトO8Eの変種、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、およびパラログを含む。例えば、O8Eに特異的な抗体は、いくつかの場合において、ヒト以外の種に由来するO8Eと交差反応し得る。他の態様において、ヒトO8Eに特異的な抗体は、ヒトO8Eに完全に特異的であり得、種交差反応性も他のタイプの交差反応性も示し得ない。「ヒトO8E」という用語は、Genbankアクセッション番号NP_078902(SEQ ID NO：56)を有するヒトO8Eの完全なアミノ酸酸配列のようなヒト配列O8Eを意味する。O8Eはまた、例えば、BL-CAM、B3、Leu-14、およびLyb-8として当技術分野において公知である。ヒトO8E配列は、例えば、保存された変異、または非保存領域に変異を有することにより、SEQ ID NO：56のヒトO8Eと異なってよく、かつ、CD22は、SEQ ID NO：56のヒトO8Eと同じ生物学的機能を実質的に有する。例えば、ヒトO8Eの生物学的機能は、本開示の抗体が特異的に結合するO8Eの細胞外ドメイン中のエピトープを有することであるか、または、ヒトO8Eの生物学的機能は、例えば、T細胞増殖の阻害、サイトカイン産生の阻害、細胞周期発生の阻害、もしくはT細胞受容体への結合を含む。
【００４４】
個々のヒトO8E配列は、全体として、SEQ ID NO：56のヒトO8Eとアミノ酸配列が少なくとも90％同一であり、かつ、他の種(例えばマウス)のO8Eアミノ酸配列と比較した場合にそのアミノ酸配列をヒト由来と特定するアミノ酸残基を含む。一定の場合において、ヒトO8Eは、SEQ ID NO：56のO8Eとアミノ酸配列が少なくとも95％、またはさらに、少なくとも 96％、97％、98％、もしくは99％同一であってよい。一定の態様において、ヒトO8E配列は、SEQ ID NO：56のO8Eと10個以下のアミノ酸相違を示す。一定の態様において、ヒトO8Eは、SEQ ID NO：56のO8Eと5個以下、またはさらに、4個、3個、2個、もしくは1個以下のアミノ酸相違を示し得る。一致率は、本明細書において説明されるように決定することができる。
【００４５】
「免疫応答」という用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織を、選択的に、損傷するか、破壊するか、またはヒト身体から除去する、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および前述の細胞または肝臓によって産生される可溶性の高分子(抗体、サイトカイン、および補体を含む)の作用を意味する。
【００４６】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を意味する。本明細書において使用される場合、「細胞表面受容体」という語句は、例えば、シグナルを受け取ること、およびそのようなシグナルを細胞の形質膜を通過して伝達することができる分子および分子の複合体を含む。本開示の「細胞表面受容体」の例は、O8E受容体である。
【００４７】
本明細書において言及される「抗体」という用語は、全長抗体および任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)またはそれらの単鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に連結されている少なくとも2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3種のドメイン、すなわちCH1、CH2、およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、すなわちCLから構成される。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域と共に散在している、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的な補体系の第1成分(C1q)を含む、宿主細胞または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００４８】
抗体の「抗原結合部分」(または「抗体部分」)という用語は、本明細書において使用される場合、ある抗原(例えばO8E)に特異的に結合する能力を保持している、抗体の1つまたは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、(i)Fab断片、すなわちVLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価の断片;(ii)F(ab')2断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片;(iii)本質的には、ヒンジ領域の部分を有するFabであるFab'断片(Fundamental Immunology (Paul編、第3版、1993)を参照されたい);(iv)VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片;(v)抗体の単一のVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片;(vi)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989)Nature 341：544-546);ならびに(vii)単離された相補性決定領域(CDR);ならびに(viii)ナノボディ、すなわち単一の可変ドメインおよび2つの定常ドメインを含む重鎖可変領域が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメインであるVLおよびVHは別々の遺伝子によってコードされているが、VL領域およびVH領域が対になって一価の分子(単鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Bird et al. (1988)Science 242：423-426およびHuston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883を参照されたい)を形成している単一のタンパク質鎖としてそれらを作製するのを可能にする合成リンカーにより、組換え法を用いて、これらを連結することができる。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知である従来の技術を用いて得られ、かつこれらの断片は、完全な抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
【００４９】
「単離された抗体」とは、本明細書において使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味すると意図される(例えば、O8Eに特異的に結合する単離された抗体は、O8E以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、O8Eに特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来するO8E分子のような他の抗原に対する交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および/または化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００５０】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書において使用される場合、単一の分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５１】
「ヒト抗体」または「ヒト配列抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むと意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合は、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、天然の修飾または合成の修飾を含む修飾を後で含んでよい。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異)を含んでよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に接ぎ合わされている抗体を含むとは意図されない。
【００５２】
「ヒトモノクローナル抗体」(「ヒト」の後に「配列」という用語を含んでもよい)という用語は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を意味する。1つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるB細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００５３】
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるか、もしくは染色体導入された動物(例えばマウス)、またはそれから調製されるハイブリドーマ(下記に詳述する)から単離された抗体、(b)ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ(transfectoma)から単離された抗体、(c)組換えヒト抗体コンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、および(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列への接合を含む他の任意の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたすべてのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、一定の態様において、このような組換えヒト抗体は、インビトロの変異誘発(または、ヒトIg配列に関してトランスジェニックな動物が使用される場合は、インビボの体細胞変異誘発)に供されてよく、したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来し、かつ関係しているが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子にコードされる抗体クラス(例えば、IgMまたはIgG1)を意味する。
【００５５】
「ある抗原を認識する抗体」および「ある抗原に特異的な抗体」という語句は、「ある抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に本明細書において使用される。
【００５６】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の改変型、例えば、その抗体と別の作用物質または抗体との結合体を意味する。
【００５７】
「ヒト化抗体」という用語は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に接ぎ合わされている抗体を意味すると意図される。さらなるフレームワーク領域の改変を、ヒトフレームワーク配列内に起こしてもよい。
【００５８】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、かつ定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体のような、可変領域配列がある種に由来し、かつ定常領域配列が別の種に由来する抗体を意味すると意図される。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「ヒトO8Eに特異的に結合する」抗体は、1×10-7Mもしくはそれ以下、より典型的には5×10-8Mもしくはそれ以下、より典型的には3×10-8Mもしくはそれ以下、より典型的には1×10-9Mもしくはそれ以下、さらにより典型的には5×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合する抗体を意味すると意図される。
【００６０】
あるタンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、本明細書において使用される場合、そのタンパク質または細胞に結合しないこと、または高い親和力で結合しないこと、すなわち、1×10-6Mもしくはそれ以上、より好ましくは1×10-5Mもしくはそれ以上、より好ましくは1×10-4Mもしくはそれ以上、より好ましくは1×10-3Mもしくはそれ以上、さらにより好ましくは1×10-2Mもしくはそれ以上のKDでそのタンパク質または細胞に結合することを意味する。
【００６１】
「Kassoc」または「Ka」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度を意味すると意図されるのに対し、「Kdis」または「Kd」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を意味すると意図される。「KD」という用語は、本明細書において使用される場合、Kaに対するKdの比率(すなわちKd/Ka)から得られ、モル濃度(M)として表される、解離定数を意味すると意図される。抗体のKD値は、当技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いること、典型的にはBiacore(登録商標)システムのようなバイオセンサーシステムを用いることによる。
【００６２】
本明細書において使用される場合、IgG抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対するKDが1×10-7Mもしくはそれ以下、より典型的には5×10-8Mもしくはそれ以下、より典型的には1×10-9Mもしくはそれ以下、およびさらにより典型的には5×10-9Mもしくはそれ以下である抗体を意味する。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対しては異なり得る。例えば、IgMアイソタイプに対する「高親和性」結合とは、抗体が10-6Mもしくはそれ以下、より典型的には10-7Mもしくはそれ以下、さらにより典型的には10-8Mもしくはそれ以下であるKDを有することを意味する。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、魚類、爬虫類などの、哺乳動物および非哺乳動物を含む。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「O8E」という用語は、「B7H4」、「B7S1」、および「B7x」という用語と同義的に使用され、これらの用語は、化学文献において様々に現れる。O8E(B7H4)のアミノ酸配列は、Gen Bankアクセッション番号AAZ17406、AAS13400、AAP37283、CAI12739、およびCAI12737を参照することにより、および、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるPrasad et al. (2003)Immunity 18：863-873;Sica et al. (2003)Immunity 18：849-861および米国特許第6,891,030号を参照することにより、公的に入手可能である。
【００６５】
本開示の様々な局面を、以下の小節においてより詳細に説明する。
【００６６】
抗O8E抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性を特徴とする。例えば、これらの抗体は、ヒトO8Eに特異的に結合する。典型的には、本開示の抗体は、高親和性で、例えば、1×10-7Mもしくはそれ以下のKDでO8Eに結合する。本開示の抗O8E抗体は、典型的には、以下の特徴のうち1種または複数種を示す：
(a)1×10-7Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合すること;
(b)O8EをトランスフェクトされたヒトCHO細胞に結合すること。
【００６７】
典型的には、抗体は、5×10-8Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、2×10-8Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、5×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、4×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、3×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、2×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合するか、または、1×10-9Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合する。
【００６８】
例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、およびフローサイトメトリー解析を含む、O8Eに対する抗体の結合能力を評価するための標準的アッセイ法は、当技術分野において公知である。適切なアッセイ法は、実施例において詳細に説明される。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)もまた、ELISA、スキャッチャード解析、およびBiacore(登録商標)システム解析によってなど、当技術分野において公知の標準的アッセイ法によって評価することができる。別の例として、本開示の抗体は、乳癌腫瘍細胞株、例えば、SKBR3細胞株に結合し得る。
【００６９】
モノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12
本開示の例示的な抗体には、実施例1および実施例2で説明されるように単離され、かつ構造的に特徴付けられる、ヒトモノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12が含まれる。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVHアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5において示される。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVLアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、およびSEQ ID NO：10において示される。
【００７０】
これらの各抗体はO8Eに結合できるため、VH配列およびVL配列を「混合および適合させて（matched）」、本開示の他の抗O8E結合分子を作製することができる。このような「混合および適合させた」抗体のO8E結合は、前述および実施例で説明する結合アッセイ法(例えば、FACSまたはELISA)を用いて試験することができる。典型的には、VH鎖およびVL鎖が混合および適合される場合、個々のVH/VLペアに由来するVH配列は、構造的に類似したVH配列で置換される。同様に、典型的には、個々のVH/VLペアに由来するVL配列は、構造的に類似したVL配列で置換される。
【００７１】
したがって、1つの局面において、本開示は、抗体がO8E、典型的にはヒトO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;ならびに、
(b)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、およびSEQ ID NO：10からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００７２】
好ましい重鎖および軽鎖の組合せには、以下のものが含まれる：
(a)SEQ ID NO：1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
(b)SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
(c)SEQ ID NO：3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(d)SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;または
(e)SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００７３】
別の局面において、本開示は、1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12の重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3、またはそれらの組合せを含む抗体を提供する。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVH CDR1のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15において示される。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVH CDR2のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20において示される。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVH CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25において示される。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVk CDR1のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30において示される。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVk CDR2のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35において示される。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVk CDR3のアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40において示される。CDR領域には、Kabatシステム(Kabat, E. A., et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を用いて、線を引いている。
【００７４】
本明細書において1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12と呼ぶヒト抗体の上記に参照した各アミノ酸配列および各ヌクレオチド配列を以下の表1および配列リストに提示する。
【００７５】
（表１）ヒト抗体1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12の重鎖および軽鎖の可変領域および定常領域ならびに対応するCDRの配列
2009518049.tif 000003
2009518049.tif 000004
2009518049.tif 000005
2009518049.tif 000006
2009518049.tif 000007
2009518049.tif 000008
2009518049.tif 000009
2009518049.tif 000010
【００７６】
1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12と呼ぶ各ヒト抗体はO8Eに結合でき、かつ、抗原結合特異性は、CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域によって主として提供される場合には、VHのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列、ならびにVkのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を「混合および適合させて」(すなわち、異なる抗体に由来するCDRを混合および適合させることができる。ただし、各抗体は、VHのCDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにVkのCDR1、CDR2、およびCDR3を含んでいなければならない)、本開示の他の抗O8E結合分子を作製することができる。このような「混合および適合させた」抗体のO8E結合は、前述および実施例で説明する結合アッセイ法(例えば、FACS、ELISA、Biacore(登録商標)システム解析)を用いて試験することができる。典型的には、VHCDR配列が混合および適合される場合、個々のVH配列に由来するCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列は、構造的に類似したCDR配列で置換される。同様に、VkCDR配列が混合および適合される場合、個々のVk配列に由来するCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列は、典型的には、構造的に類似したCDR配列で置換される。1つまたは複数のVHCDR領域配列および/またはVLCDR領域配列を、モノクローナル抗体の抗体1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12に関して本明細書において開示するCDR配列に由来する構造的に類似した配列で置換することにより、新規なVH配列およびVL配列を作製できることは、当業者には容易に明らかになると考えられる。
【００７７】
したがって、別の局面において、本開示は、抗体がO8E、典型的にはヒトO8Eに特異的に結合し、以下を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
(a)SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のCDR1;
(b)SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のCDR2;
(c)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のCDR3;
(d)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のCDR1;
(e)SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のCDR2;ならびに、
(f)SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のCDR3。
【００７８】
好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：11を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：16を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：21を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：26を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：31を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：36を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００７９】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：17を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：22を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：27を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：32を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：37を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００８０】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：13を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：18を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：23を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：28を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：33を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：38を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００８１】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：14を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：19を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：24を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：29を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：34を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：39を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００８２】
別の好ましい態様において、抗体は、以下を含む：
(a)SEQ ID NO：15を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)SEQ ID NO：20を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)SEQ ID NO：25を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)SEQ ID NO：30を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)SEQ ID NO：35を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)SEQ ID NO：40を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００８３】
CDR3ドメインは、CDR1ドメインおよび/またはCDR2ドメインから独立して、同系の抗原に対する抗体の結合特異性を単独で決定できること、ならびに共通のCDR3配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体を予想されるように作製できることは、当技術分野において周知である。例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2)：252-260(2000)(マウスの抗CD30抗体Ki-4の重鎖可変ドメインCDR3のみを用いた、ヒト化抗CD30抗体の作製を記載している);Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296：833-849(2000)(マウスMOC-31抗EGP-2親抗体の重鎖CDR3配列のみを用いた、上皮糖タンパク質-2(EGP-2)組換え抗体を記載している);Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95：8910-8915(1998)(マウスの抗インテグリンαvβ3抗体LM609の重鎖および軽鎖の可変CDR3ドメインを用いたヒト化抗インテグリンαvβ3抗体のパネルであり、各抗体メンバーが、CDR3ドメインの外側であり、かつマウス親抗体と同じくらい高いか、またはそれより高い親和性で、マウス親抗体と同じエピトープに結合することができる、独特な配列を含む、パネルを記載している);Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116：2161-2162(1994)(CDR3ドメインが、最も顕著に抗原結合に寄与することを開示している);Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92：2529-2533(1995)(ヒト胎盤DNAに対する3種のFab(SI-1、SI-40、およびSI-32)の重鎖CDR3配列を、抗破傷風トキソイドFabの重鎖に接ぎ合わせ、それにより、既存の重鎖CDR3を置換することを記載し、かつ、CDR3ドメインが単独で結合特異性を与えたことを実証している);ならびにDitzel et al., J. Immunol. 157：739-749(1996)(グラフティング（grafting）研究(多特異性の親Fab LNA3の重鎖CDR3のみを、単特異性のIgG破傷風トキソイド結合Fab p313抗体の重鎖に導入することは、親Fabの結合特異性を保持するのに十分であった)を記載している)。これらの各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８４】
したがって、一定の局面において、本開示は、マウス抗体またはラット抗体などの非ヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含み、O8Eに特異的に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、非ヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含む、このような本発明の抗体は、対応する非ヒト親抗体と、(a)結合について競合することができるか、(b)機能的特徴を保持しているか、(c)同じエピトープに結合するか、かつ/または、(d)同様の結合親和性を有する。
【００８５】
他の局面において、本開示は、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体のような第1のヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体であり、第1のヒト抗体が、O8Eに特異的に結合することができ、かつ第1のヒト抗体に由来するCDR3ドメインが、O8Eに対する結合特異性を欠いているヒト抗体中のCDR3ドメインを置換して、O8Eに特異的に結合することができる第2のヒト抗体を生成する、モノクローナル抗体を提供する。いくつかの態様において、第1のヒト抗体に由来する1つまたは複数の重鎖CDR3ドメインおよび/または軽鎖CDR3ドメインを含む、このような本発明の抗体は、対応する第1のヒト親抗体と、(a)結合について競合することができるか、(b)機能的特徴を保持しているか、(c)同じエピトープに結合するか、かつ/または、(d)同様の結合親和性を有する。
【００８６】
特定の生殖系列配列を有する抗体
一定の態様において、本開示の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む。
【００８７】
例えば、好ましい態様において、本開示は、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVH4-34遺伝子の産物であるか、またはヒトVH4-34遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVH3-53遺伝子の産物であるか、またはヒトVH3-53遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、抗体がO8Eに特異的に結合し、組合せヒトVH3-9/D3-10/JH6b遺伝子の産物であるかまたは組合せヒトVH3-9/D3-10/JH6b遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００８８】
別の好ましい態様において、本開示は、抗体がO8Eに特異的に結合し、ヒトVKLA27遺伝子の産物であるか、またはヒトVKA27遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本開示は、抗体がO8Eに特異的に結合し、組合せヒトVK L6/JK1遺伝子の産物であるか、または組合せヒトVK L6/JK1遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００８９】
さらに別の好ましい態様において、本開示は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、この抗体は、
(a)(SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、およびSEQ ID NO：53において示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする)ヒトVH4-34遺伝子、ヒトVH3-53遺伝子、または組合せヒトVH3-9/D3-10/JH6b遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する重鎖可変領域を含み、
(b)(SEQ ID NO：54およびSEQ ID NO：55において示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする)ヒトVKA27遺伝子または組合せヒトVK L6/JK1遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する軽鎖可変領域を含み、かつ、
(c)O8E、典型的にはヒトO8Eに特異的に結合する。
【００９０】
VH4-34およびVKA27のVHおよびVKをそれぞれ有する抗体の例は、1G11および13D12である。VH3-53およびVKA27のVHおよびVKをそれぞれ有する抗体の例は、2A7および2F9である。VH3-9/D3-10/JH6bおよびVKL6/JK1のVHおよびVKをそれぞれ有する抗体の例は、12E1である。
【００９１】
本明細書において使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から抗体の可変領域が得られる場合、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列の「産物」であるか、またはそれに「由来する」、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを関心対象の抗原で免疫化する段階、またはファージ上にティスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを、関心対象の抗原を用いてスクリーニングする段階を含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか、またはそれに「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、かつヒト抗体の配列に最も配列が近い(すなわち、一致率(％)が最大である)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、それとして同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか、またはそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば、天然の体細胞変異または部位特異的変異の意図的な導入が原因で、生殖系列配列と比べてアミノ酸に相違を含む場合がある。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも90％同一であり、かつ、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えばマウスの生殖系列配列)と比べた場合に、ヒト抗体をヒト由来と特定するアミノ酸残基を含む。一定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも95％、またはさらに少なくとも96％、97％、98％、もしくは99％同一である場合がある。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比べて10個以下のアミノ酸相違を示すと考えられる。一定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比べて、5個以下、またはさらに4個、3個、2個、もしくは1個以下のアミノ酸相違を示す場合がある。
【００９２】
相同な抗体
さらに別の態様において、本開示の抗体は、本明細書において説明する好ましい抗体のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、かつ、これらの抗体は、本開示の抗O8E抗体の望ましい機能特性を保持している。
【００９３】
例えば、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、
(a)重鎖可変領域は、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含み;
(b)軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、およびSEQ ID NO：10からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含み;
(c)抗体は、1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合し;かつ、
(d)抗体は、O8EをトランスフェクトされたヒトCHO細胞に結合する。
【００９４】
様々な態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体でよい。
【００９５】
他の態様において、VHアミノ酸配列および/またはVLアミノ酸配列は、前述の配列に85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％相同である場合がある。前述の配列のVH領域およびVL領域に高い(すなわち80％またはそれ以上の)相同性を有するVH領域およびVL領域を有する抗体は、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、およびSEQ ID NO：50をコードする核酸分子の変異を誘発し(例えば、部位特異的変異誘発またはPCR法による変異誘発)、続いて、本明細書において説明する機能アッセイ法を用いて、保持されている機能(すなわち、上記の(c)および(d)において説明した機能)に関して、コードされる改変抗体を試験することによって、得ることができる。
【００９６】
本明細書において使用される場合、2つのアミノ酸配列間の相同率(％)は、2つの配列間の一致率(％)に等しい。2配列間の一致率(％)は、2つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列に共通である同一な位置の数の関数である(すなわち、相同率(％)=同一な位置の数/位置の総数×100)。配列の比較および2配列間の一致率(％)の決定は、下記の非限定的な実施例において説明するように、数学アルゴリズムを用いて遂行することができる。
【００９７】
2つのアミノ酸配列間の一致率(％)は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れられたE. MeyersおよびW.Miller(Comput. Appl. Biosci., 4：11-17(1988))のアルゴリズムを用い、PAM120残基ウェイトテーブル、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用して、決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間の一致率(％)は、GCGソフトウェアパッケージ(http：//www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み入れられたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. 48：444-453(1970))のアルゴリズムを用い、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップウェイト、および1、2、3、4、5、または6の長さウェイト(length weigh)を使用して、決定することもできる。
【００９８】
さらにまたはその代わりに、本開示のタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」としてさらに使用することもできる。このような検索は、Altschul, et al. (1990)J. Mol. Biol. 215：403-10のXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実施することができる。XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いてBLASTタンパク質検索を実施して、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップありアライメントを得るには、Altschul et al., (1997)Nucleic Acids Res. 25(17)：3389-3402に記載されているようにGapped BLASTを使用することができる。BLASTプログラムおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定パラメーターを使用することができる。http：//www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００９９】
保存的に改変された抗体
一定の態様において、本開示の抗体は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、これらのCDR配列のうち1つまたは複数は、本明細書において説明する好ましい抗体(例えば、1G11、2A7、2F9、12E1、もしくは13D12)をベースとする指定されたアミノ酸配列またはそれらの保存的改変体を含み、かつこれらの抗体は、本開示の抗O8E抗体の望ましい機能特性を保持する。したがって、本開示は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、
(a)重鎖可変領域のCDR3配列が、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み;
(b)軽鎖可変領域のCDR3配列が、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み;
(c)抗体が、1×10-7Mまたはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合し;かつ、
(d)抗体が、O8EをトランスフェクトされたヒトCHO細胞に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１００】
好ましい態様において、重鎖可変領域のCDR2配列は、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR2配列は、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、重鎖可変領域のCDR1配列は、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1配列は、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
様々な態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体でよい。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意に影響を及ぼすことも、結合特徴を有意に変更することもない、アミノ酸改変を意味すると意図される。このような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発およびPCR法による変異誘発など当技術分野において公知の標準的技術によって、本開示の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β-分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、本開示の抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置換することができ、かつ、改変された抗体を、保持されている機能に関して試験することができる。
【０１０３】
本開示の抗O8E抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の態様において、本開示は、本開示のO8Eモノクローナル抗体のいずれかと同じヒトO8E上のエピトープに結合する抗体(すなわち、O8Eへの結合について、本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体)を提供する。好ましい態様において、交差競合研究のための参照抗体は、モノクローナル抗体1G11(SEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：6においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体2A7(SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：7においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体2F9(SEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：8においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体12E1(SEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：9においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体13D12(SEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：10においてそれぞれ示すVH配列およびVL配列を有する)でよい。このような交差競合する抗体は、標準的なO8E結合アッセイ法において、1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12と交差競合する能力に基づいて同定することができる。例えば、BIAcore(登録商標)システム解析、ELISAアッセイ法、またはフローサイトメトリーを使用して、本開示の抗体との交差競合を実証することができる。ある試験抗体が、例えば、1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12のヒトO8Eへの結合を阻害できる場合、その試験抗体は、ヒトO8Eへの結合に際して1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12と競合することができ、したがって、1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12と同じヒトO8E上のエピトープに結合することが実証される。好ましい態様において、1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12と同じヒトO8E上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例において説明されるように調製および単離することができる。
【０１０４】
操作および改変された抗体
本開示の抗体はさらに、本明細書において開示される1つまたは複数のVH配列および/またはVL配列を有する抗体を、改変抗体を操作するための出発材料として用いて調製することもでき、この改変抗体は、出発抗体から変化した特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内および/または1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数の残基を改変することによって操作することができる。さらにまたはその代わりに、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を改変することによって操作することもできる。
【０１０５】
実施することができる1つのタイプの可変領域操作は、CDRグラフティングである。抗体は、重鎖および軽鎖の6つの相補性決定領域(CDR)中に位置しているアミノ酸残基を主に介して、標的抗原と相互作用する。このため、CDR内のアミノ酸配列の方が、CDRの外側の配列よりも、個々の抗体間で多様である。CDR配列は、大半の抗体-抗原相互作用を担っているため、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上に接ぎ合わされた、特異的な天然抗体に由来するCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的な天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998)Nature 332：323-327;Jones, P. et al. (1986)Nature 321：522-525;Queen, C. et al. (1989)Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86：10029-10033;Winterの米国特許第5,225,539号ならびにQueenらの米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照されたい)。
【０１０６】
したがって、本開示の別の態様は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、それぞれ、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15;SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20;ならびにSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30;SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35;ならびに、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12のVHCDR配列およびVLCDR配列を含むが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含み得る。
【０１０７】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースまたは出版されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベース(インターネットでwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseから入手可能)において、ならびに、Kabat, E. A., et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;Tomlinson, I. M., et al. (1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」 J. Mol. Biol. 227：776-798;およびCox, J. P. L. et al. (1994)「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」 Eur. J. Immunol. 24：827-836(各文献の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる)において、確認することができる。別の例として、ヒトの重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、Genbankデータベースにおいて確認することができる。例えば、HCo7 HuMAbマウス中に存在する以下の重鎖生殖系列配列が、添付のGenbankアクセッション番号：1-69(NG_0010109、NT_024637、およびBC070333)、3-33(NG_0010109およびNT_024637)、ならびに3-7(NG_0010109およびNT_024637)において入手可能である。別の例として、HCo12 HuMAbマウス中に存在する以下の重鎖生殖系列配列が、添付のGenbankアクセッション番号：1-69(NG_0010109、NT_024637、およびBC070333)、5-51(NG_0010109およびNT_024637)、4-34(NG_0010109およびNT_024637)、3-30.3(CAJ556644)、ならびに3-23(AJ406678)において入手可能である。
【０１０８】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知である、Gapped BLAST(Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Research 25：3389-3402)と呼ばれる配列類似性検索法の1つを用いて、まとめられたタンパク質配列データベースに対して比較される。BLASTは、抗体配列とデータベース配列間の統計学的に有意なアライメントが、アラインされたワードの高スコアセグメントペア(HSP)を含む可能性が高いという点で、発見的アルゴリズムである。伸長またはトリミングによってスコアを改善させることができないセグメントペアはヒットと呼ばれる。手短に言えば、VBASE(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)由来のヌクレオチド配列が翻訳され、かつFR1からFR3フレームワーク領域の間、およびそれらを含む領域が保持される。データベース配列の平均長は98残基である。タンパク質の全長に渡って完全に適合している全く同じ配列は、除外される。オフにされた低複雑度領域フィルター以外は初期設定の標準パラメーターおよびBLOSUM62の置換行列を用いたblastpプログラムを使用するタンパク質のBLAST検索により、配列一致を示している上位5ヒットを選択する。ヌクレオチド配列は6つの全フレームにおいて翻訳され、かつデータベース配列の適合したセグメント中にストップコドンを持たないフレームは潜在的なヒットとみなされる。これは、さらに、BLASTプログラムtblastxを用いて確認される。この場合、6つの全フレーム中の抗体配列を翻訳し、かつ、6つの全フレーム中の動力学的に翻訳されたVBASEヌクレオチド配列に、それらの翻訳物を比較する。
【０１０９】
一致とは、配列の全長に渡る、抗体配列とタンパク質データベースとのアミノ酸の完全な適合である。陽性(一致+置換適合)は、同一ではないが、BLOSUM62置換行列によってアミノ酸置換が導かれている。抗体配列がデータベース配列のうちの2つに同じ一致性で適合する場合、陽性の最も多いヒットが、適合している配列ヒットであると決定される。
【０１１０】
本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の選択された抗体によって使用されるフレームワーク配列に構造的に類似しているもの、例えば、本開示の好ましいモノクローナル抗体によって使用される、VH4-34 フレームワーク配列(SEQ ID NO：51)および/もしくはVH3-53フレームワーク配列(SEQ ID NO：52)および/もしくは組合せVH3-9/D3-10/JH6bフレームワーク配列(SEQ ID NO：53)、ならびに/またはVKA27フレームワーク配列(SEQ ID NO：54)および/もしくは組合せVKL6/JK1フレームワーク配列(SEQ ID NO：55)に類似しているものである。VHのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列、ならびにVKのCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中に存在する配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に接ぎ合わすことができるか、または、CDR配列を、生殖系列配列と比べて1つもしくは複数の変異を含むフレームワーク領域上に接ぎ合わすことができる。例えば、いくつかの場合において、抗体の抗原結合能力を維持または増強するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている(例えば、Queenらによる米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照されたい)。
【０１１１】
別のタイプの可変領域改変は、VHおよび/またはVKのCDR1領域、CDR2領域、および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させて、それによって関心対象の抗体の1種または複数種の結合特性(例えば親和性)を改善させるものである。部位特異的変異誘発またはPCR法による変異誘発を実施して、変異を導入することができ、かつ、抗体結合または関心対象の他の機能特性に対する影響を、本明細書において説明し、かつ実施例において提供するインビトロまたはインビボのアッセイ法において評価することができる。典型的には、(前述のような)保存的改変が導入される。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失でよいが、典型的には置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の1個、2個、3個、4個、または5個以下の残基が変更される。
【０１１２】
したがって、別の態様において、本開示は、以下を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗O8Eモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
(a)SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VHCDR1領域;(b)SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VHCDR2領域;(c)SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VHCDR3領域;(d)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VKCDR1領域;(e)SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、VKCDR2領域;ならびに(f)SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40と比べて1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのアミノ酸置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含む、VKCDR3領域。
【０１１３】
本開示の操作された抗体には、例えば、抗体の特性を改善するために、VHおよび/またはVK内のフレームワーク残基が改変されたものが含まれる。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を低減させるために実施される。例えば、1つのアプローチは、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異させる」ものである。より具体的には、体細胞変異を経験した抗体は、その抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含む場合がある。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、その抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって、同定することができる。
【０１１４】
例えば、1G11の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸71番残基はアラニンであるのに対し、対応するVH4-34 生殖系列配列中のこの残基はバリンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、部位特異的変異誘発またはPCR法による変異誘発によって、体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異」させることができる(例えば、1G11のVHのFR3の71番残基をアラニンからバリンに「復帰変異」させることができる)。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１１５】
別の例として、1G11の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸81番残基はアルギニンであるのに対し、対応するVH4-34生殖系列配列中のこの残基はリシンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、1G11のVHのFR3の81番残基をアルギニンからリシンに「復帰変異」させることができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１１６】
別の例として、13D12の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸83番残基はアスパラギンであるのに対し、対応するVH4-34生殖系列配列中のこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、13D12のVHのFR3の83番残基をアスパラギンからセリンに「復帰変異」させることができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１１７】
別の例として、2A7の場合、VHの(FR3内の)アミノ酸67番残基はバリンであるのに対し、対応するVH3-53生殖系列配列中のこの残基はフェニルアラニンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、2A7のVHのFR3の67番残基をバリンからフェニルアラニンに「復帰変異」させることができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１１８】
別の例として、2F9の場合、VHの(FR1内の)アミノ酸28番残基はイソロイシンであるのに対し、対応するVH3-53生殖系列配列中のこの残基はトレオニンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、2F9のVHのFR1の28番残基をイソロイシンからトレオニンに「復帰変異」させることができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１１９】
別の例として、12E1の場合、VHの(FR1内の)アミノ酸23番残基はバリンであるのに対し、対応するVH3-9生殖系列配列中のこの残基はアラニンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、12E1のVHのFR1の23番残基をバリンからアラニンに「復帰変異」させることができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１２０】
別の例として、1G11の場合、Vkの(FR1内の)アミノ酸7番残基はフェニルアラニンであるのに対し、対応するVk A27 生殖系列配列中のこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、1G11のVkのFR1の7番残基をフェニルアラニンからセリンに「復帰変異」させることができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１２１】
別の例として、1G11の場合、Vkの(FR2内の)アミノ酸47番残基はバリンであるのに対し、対応するVkA27生殖系列配列中のこの残基はロイシンである。フレームワーク領域配列を生殖系列での配置に戻すために、例えば、1G11のVkのFR2の47番残基をバリンからロイシンに「復帰変異」させることができる。このような「復帰変異させた」抗体もまた、本開示に包含されると意図される。
【０１２２】
別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、またはさらに1つもしくは複数のCDR領域内の1つまたは複数の残基を変異させて、T細胞エピトープを除去し、それにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減させることを含む。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、かつ、Carrらによる米国特許出願公開第20030153043号においてさらに詳細に記載されている。
【０１２３】
本開示の操作された抗体には、抗体上のT細胞エピトープの相互作用を変更するアミノ酸改変を介して、免疫原性応答を増大または低減させるために、アミノ酸残基が改変されたものも含まれる(例えば、米国特許第6,835,550号、同第6,897,049号、および同第6,936249号を参照されたい)。
【０１２４】
フレームワーク領域またはCDR領域内に起こされる改変に加えて、またはその代わりに、典型的には、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または抗原依存性の細胞障害性など抗体の1種または複数種の機能特性を変更するために、本開示の抗体を、Fc領域内に改変を含むように操作することができる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾してもよく(例えば、1つもしくは複数の化学的部分を抗体に結合することができる)、または、やはり抗体の1種もしくは複数種の機能特性を変更するために、そのグリコシル化を変更するように修飾してもよい。これらの各態様は、下記にさらに詳細に説明する。Fc領域中の残基の番号付けは、KabatのEU指数のものである。
【０１２５】
1つの態様において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加または減少されるように、改変される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号においてさらに記載されている。CH1のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするためか、または抗体の安定性を上昇もしくは低下させるために、変更される。
【０１２６】
別の態様において、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を短縮させるために変異させられる。より具体的には、1つまたは複数のアミノ酸変異が、Fcヒンジ断片のCH2-CH3ドメイン境界領域中に導入され、その結果、その抗体は、天然のFcヒンジドメインのブドウ球菌(Staphylococcyl)プロテインA(SpA)結合に比べて、SpA結合が障害される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号においてさらに詳細に記載されている。
【０１２７】
別の態様において、抗体は、生物学的半減期を延長するために改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardによる米国特許第6,277,375号に記載されているように、1つまたは複数の以下の変異を導入することができる：T252L、T254S、T256F。あるいは、生物学的半減期を延長するために、Prestaらによる米国特許第5,869,046号および同第6,121,022号において記載されているように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ(salvage)受容体結合エピトープを含むように、抗体のCH1領域またはCL領域内を改変することができる。
【０１２８】
さらに別の態様において、Fc領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって、改変される。例えば、アミノ酸残基234番、235番、236番、237番、297番、318番、320番、および322番から選択される1つまたは複数のアミノ酸は、その抗体が、エフェクターリガンドに対する親和性は変更されているが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が変更される対象のエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体、または補体のC1成分でよい。このアプローチは、いずれもWinterらによる米国特許第5,624,821号および同第5,648,260号においてさらに詳細に記載されている。
【０１２９】
別の実施例において、アミノ酸残基329番、331番、および322番より選択される1つまたは複数のアミノ酸は、抗体のC1q結合が変化し、かつ/または補体依存性細胞障害(CDC)が低減もしくは消滅するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号においてさらに詳細に記載されている。
【０１３０】
別の実施例において、アミノ酸231位から239位までの範囲内の1つまたは複数のアミノ酸残基が変更されて、それにより、抗体が補体に結合する能力が変更される。このアプローチは、BodmerらによるPCT公報WO 94/29351においてさらに記載されている。
【０１３１】
さらに別の実施例において、Fc領域は、以下の位置の1つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、抗体が抗体依存性細胞障害(ADCC)を媒介する能力を増大させるように、かつ/またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるように、改変される：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438、または439。このアプローチは、PrestaによるPCT公報WO 00/42072においてさらに記載されている。さらに、FcγR1、FcγRII、FcγRIII、およびFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位は、マッピングされており、かつ結合の改善された変種が説明されている(Shields, R.L.et al. (2001)J. Biol. Chem. 276：6591-6604を参照されたい)。256位、290位、298位、333位、334位、および339位の特異的変異は、FcγRIIIへの結合を改善することが示された。さらに、以下の組合せ変異体は、FcγRIII結合を改善することが示された：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、およびS298A/E333A/K334A。
【０１３２】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、アグリコシル化(aglycosylated)抗体を作製することができる(すなわち、この抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化を変更して、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。このような炭水化物変更は、例えば、抗体配列内の1つまたは複数の部位のグリコシル化を変更することによって、達成することができる。例えば、1つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を消失させ、それによってその部位のグリコシル化を無くす、1つまたは複数のアミノ酸置換を実施することができる。このようなアグリコシル化(aglycosylation)は、抗原に対する抗体の親和性を増大させ得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第5,714,350号および同第6,350,861号においてさらに詳細に記載されている。
【０１３３】
さらにまたはその代わりに、フコシル残基の量が減少した低フコシル化(hypofucosylated)抗体または分岐GlcNac構造の増加した抗体など、変更されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を増大させることが実証された。このような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が変更された宿主細胞において抗体を発現させることによって、達成することができる。グリコシル化機構が変更された細胞は、当技術分野において説明されており、かつ、本開示の組換え抗体を発現させて、それにより、グリコシル化が変更された抗体を産生させる場となる宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705、およびMs709は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のFUT8(α(1,6)フコシルトランスフェラーゼ)を欠き、その結果、Ms704、Ms705、およびMs709細胞株において発現される抗体は、炭水化物上のフコースを欠いている。Ms704、Ms705、およびMs709 FUT8-/-細胞株は、2つの置換ベクターを用いて、CHO/DG44細胞中のFUT8遺伝子を標的として破壊することによって、作製された(Yamaneらによる米国特許出願公開第20040110704号およびYamane-Ohnuki et al. (2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22を参照されたい)。別の例として、HanaiらによるEP1,176,195では、α1,6結合に関連した酵素を減少させるか、または排除することにより、そのような細胞株において発現される抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子を機能的に破壊した細胞株を記載している。Hanaiらはまた、抗体のFc領域に結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いか、またはその酵素活性を有さない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)も説明している。PrestaによるPCT公報WO 03/035835では、Asn(297)結合型炭水化物にフコースを結合させる能力が低減され、また、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらす、変種CHO細胞株のLec13細胞を記載している(Shields, R.L. et al. (2002)J. Biol. Chem. 277：26733-26740も参照されたい)。UmanaらによるPCT公報WO 99/54342では、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体のADCC活性の増大をもたらす分岐GlcNac構造の増加を示すように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現させるように操作された細胞株を記載している(Umana et al. (1999)Nat. Biotech. 17：176-180も参照されたい)。あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断して除いてもよい。例えば、フコシダーゼのα-L-フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する(Tarentino, A.L. et al. (1975)Biochem. 14：5516-23)。
【０１３４】
本開示によって企図される、本明細書における抗体の別の修飾は、ペグ化である。例えば、抗体の生物学的(例えば血清)半減期を延長するために、抗体をペグ化することができる。抗体をペグ化するには、抗体またはその断片を、典型的には、抗体または抗体断片に1つまたは複数のPEG基が結合される条件下で、ポリエチレングリコール(PEG)の反応性のエステル誘導体またはアルデヒド誘導体などのPEGと反応させる。典型的には、ペグ化は、反応性PEG分子(または類似した反応性の水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本明細書において使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1-C10)アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用された任意の形態のPEGを包含すると意図される。一定の態様において、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野において公知であり、かつ本開示の抗体に適用することができる。例えば、NishimuraらによるEP 0154316およびIshikawaらによるEP 0401384を参照されたい。
【０１３５】
抗体を操作する方法
前述したように、本明細書において開示するVH配列およびVK配列を有する抗O8E抗体を使用して、VH配列および/もしくはVK配列、またはそれに付属する定常領域を改変することにより、新しい抗O8E抗体を作製することができる。したがって、本開示の別の局面において、本開示の抗O8E抗体、例えば、1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12の構造的特徴を使用して、ヒトO8Eへの結合のような本開示の抗体の少なくとも1種の機能特性を保持している、構造的に関連した抗O8E抗体を作製する。例えば、1G11、2A7、2F9、12E1、もしくは13D12、またはそれらの変異体の1つまたは複数のCDR領域を、前述したように、公知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組換えによって組み合わせて、組換えによって操作されたさらなる本開示の抗O8E抗体を作製することができる。他のタイプの改変には、以前のセクションにおいて説明したものが含まれる。操作方法のための出発材料は、本明細書において提供される1つもしくは複数のVH配列および/もしくはVK配列、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域である。操作された抗体を作製するためには、本明細書において提供される1つもしくは複数のVH配列および/もしくはVK配列、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(すなわち、タンパク質として発現させる)ことは必要ではない。より正確に言えば、配列中に含まれる情報は、元の配列に由来する「第2世代」配列を作製するための出発材料として使用され、次いで、その「第2世代」配列が、タンパク質として調製および発現される。
【０１３６】
したがって、別の態様において、本開示は、以下の段階を含む、抗O8E抗体を調製するための方法を提供する：
(a)(i)SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、およびSEQ ID NO：15からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：20からなる群より選択されるCDR2配列、ならびに/もしくはSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、およびSEQ ID NO：25からなる群より選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列;ならびに/または(ii)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35からなる群より選択されるCDR2配列、ならびに/もしくはSEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40からなる群より選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する段階;
(b)重鎖可変領域抗体配列および/または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも1つの改変抗体配列を作製する段階;ならびに
(c)改変抗体配列をタンパク質として発現させる段階。
【０１３７】
標準的な分子生物学技術を使用して、改変抗体配列を調製し、かつ発現させることができる。
【０１３８】
典型的には、改変抗体配列にコードされる抗体は、本明細書において説明する抗O8E抗体の機能特性の1種、いくつか、またはすべてを保持しているものであり、これらの機能特性には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：
(i)1×10-7Mもしくはそれ以下のKDでヒトO8Eに結合すること;
(ii)O8EをトランスフェクトされたヒトCHO細胞に結合すること。
【０１３９】
改変抗体の機能特性は、実施例において説明するもののような(例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ法)、当技術分野において利用可能であり、かつ/または本明細書において説明する、標準的なアッセイ法を用いて評価することができる。
【０１４０】
本開示の抗体を操作する方法の一定の態様において、抗O8E抗体コード配列の全体または一部分に沿ってランダムにまたは選択的に変異を導入することができ、かつ、結果として生じる改変抗O8E抗体を、結合活性および/または本明細書において説明する他の機能特性に関してスクリーニングすることができる。変異の方法は、当技術分野において説明されている。例えば、ShortによるPCT公報WO 02/092780では、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはそれらの組合せを用いて、抗体変異体を作製およびスクリーニングするための方法を記載している。あるいは、LazarらによるPCT公報WO 03/074679では、抗体の生理化学特性を最適化するためにコンピュータスクリーニング方法を使用する方法を記載している。
【０１４１】
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の局面は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞中で、細胞溶解物中で、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在してよい。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞構成要素または他の混在物、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から離れるように精製された場合、「単離」されているか、または「実質的に純粋にされて」いる。F. Ausubel, et al.編、(1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本開示の核酸は、例えば、DNAまたはRNAでよく、かつイントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい態様において、核酸はcDNA分子である。
【０１４２】
本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、さらに後述するようなヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ)によって発現される抗体の場合、ハイブリドーマによって産生される抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅技術またはcDNAクローニング技術によって得ることができる。(例えばファージディスプレイ技術を使用する)免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる抗体の場合、抗体をコードする核酸は、そのライブラリーから回収することができる。
【０１４３】
本開示の好ましい核酸分子は、モノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1、または13D12のVH配列およびVL配列をコードするものである。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVH配列をコードするDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、およびSEQ ID NO：45において示される。1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12のVL配列をコードするDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、およびSEQ ID NO：50において示される。
【０１４４】
VHセグメントおよびVLセグメントをコードするDNA断片を得た後、これらのDNA断片を、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子に、またはscFv遺伝子に変換するために、標準的な組換えDNA技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、VLまたはVHをコードするDNA断片は、抗体定常領域または柔軟なリンカーなど別のタンパク質をコードする別のDNA断片に機能的に連結される。この文脈において使用される「機能的に連結される」という用語は、2つのDNA断片が、それら2つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように結合されることを意味すると意図される。
【０１４５】
VHをコードするDNAを、重鎖定常領域(CH1、CH2、およびCH3)をコードする別のDNA分子に機能的に連結することによって、VH領域をコードする単離されたDNAを完全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)、かつ、これらの領域を含むDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgDの定常領域でよいが、最も典型的には、IgG1またはIgG4の定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子の場合、VHをコードするDNAを、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に機能的に連結することができる。
【０１４６】
VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に機能的に連結することによって、VL領域をコードする単離されたDNAを完全長の軽鎖遺伝子(ならびにFab軽鎖遺伝子)に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)、かつ、これらの領域を含むDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκ定常領域またはλ定常領域でよいが、最も典型的にはκ定常領域である。
【０１４７】
scFv遺伝子を作製するためには、VH配列およびVL配列が、柔軟なリンカーによって結合されたVL領域およびVH領域を有する連続的な単鎖のタンパク質として発現され得るように、VHおよびVLをコードするDNA断片を、柔軟なリンカーをコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードする断片に機能的に連結させる(例えば、Bird et al. (1988)Science 242：423-426;Huston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883;McCafferty et al., (1990)Nature 348：552-554を参照されたい)。
【０１４８】
本開示のモノクローナル抗体の作製
本開示のモノクローナル抗体(mAb)は、従来のモノクローナル抗体方法、例えばKohlerおよびMilstein(1975)Nature 256：495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則としては、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えばBリンパ球のウイルス形質転換または癌性形質転換を使用することができる。
【０１４９】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物の系はマウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は、十分に確立された手順である。融合用の免疫脾細胞を単離するための免疫化のプロトコールおよび技術は、当技術分野において公知である。融合相手(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順もまた、公知である。
【０１５０】
本開示のキメラ抗体またはヒト化抗体は、前述のように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、標準的な分子生物学技術を用いて、関心対象の非ヒトハイブリドーマから得、かつ、ヒト免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野において公知の方法を用いて、マウスの可変領域をヒト定常領域に連結することができる(例えば、Cabillyらによる米国特許第4,816,567号を参照されたい)。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野において公知の方法を用いて、マウスのCDR領域をヒトフレームワーク中に挿入することができる(Winterによる米国特許第5,225,539号、ならびにQueenらによる米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号を参照されたい)。
【０１５１】
好ましい態様において、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。O8Eに対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系の代わりに、ヒト免疫系の一部分を有するトランスジェニックマウスまたは、染色体導入されたマウスを用いて生成させることができる。これらのトランスジェニックマウスおよび染色体導入されたマウスには、それぞれHuMAbマウス(登録商標)およびKMマウス(登録商標)と本明細書において呼ばれるマウスが含まれ、本明細書において、まとめて「ヒトIgマウス」と呼ばれる。
【０１５２】
HuMAbマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、内因性のμ鎖およびκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的化された変異と共に、再配列されてないヒト重鎖(μおよびγ)ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al. (1994)Nature 368(6474)： 856-859を参照されたい)。したがって、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の低減を示し、かつ免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞変異を経験して、高親和性のヒトIgGκモノクローナルを生成する(Lonberg, N. et al. (1994)、前記;Lonberg, N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101に総説がある;Lonberg, N.およびHuszar, D.(1995)Intern. Rev. Immunol. 13：65-93、ならびにHarding, F.およびLonberg, N.(1995)Ann. N.Y. Acad. Sci. 764：536-546)。HuMabマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスが有するゲノム改変は、Taylor, L. et al. (1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295;Chen, J. et al. (1993)International Immunology 5：647-656;Tuaillon et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：3720-3724;Choi et al. (1993)Nature Genetics 4：117-123;Chen, J. et al. (1993)EMBO J. 12：821-830;Tuaillon et al. (1994)J. Immunol. 152：2912-2920;Taylor, L. et al. (1994)International Immunology 6：579-591;およびFishwild, D. et al. (1996)Nature Biotechnology 14：845-851においてさらに説明されており、これらの全文献の内容は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。さらに、米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,789,650号、同第5,877,397号、同第5,661,016号、同第5,814,318号、同第5,874,299号、および同第5,770,429号(すべてLonbergおよびKayによる);米国特許第5,545,807号(Suraniらによる);PCT公報WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884、およびWO 99/45962(すべてLonbergおよびKayによる);ならびにPCT公報WO 01/14424(Kormanらによる)を参照されたい。
【０１５３】
別の態様において、本開示のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスのような、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを用いて、産生させることができる。本明細書において「KMマウス(登録商標)」と呼ばれるこのようなマウスは、IshidaらによるPCT公報WO 02/43478に詳細に記載されている。
【０１５４】
さらになお、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系も当技術分野において利用可能であり、本開示の抗O8E抗体を産生させるために使用することができる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と呼ばれる代替のトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号、同第6,075,181号、同第6,114,598号、同第6150,584号、および同第6,162,963号に記載されている。
【０１５５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の染色体導入された動物系も当技術分野において利用可能であり、本開示の抗O8E抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「TCマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を有するマウスを使用することができる。このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000)Proc. Natl. Acad Sci. USA 97：722-727に記載されている。別の例として、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体を有する雌ウシが当技術分野において説明されており(Kuroiwa et al. (2002)Nature Biotechnology, 20：889-894)、本開示の抗O8E抗体を産生させるために使用することができる。
【０１５６】
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野において確立されている。例えば、Ladnerらによる米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号、および同第5,571,698号;Dowerらによる米国特許第5,427,908号および同第5,580,717号;McCaffertyらによる米国特許第5,969,108号および同第6,172,197号;ならびにGriffithsらによる米国特許第5,885,793号、同第6,521,404号、同第6,544,731号、同第6,555,313号、同第6,582,915号、および同第6,593,081号を参照されたい。
【０１５７】
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化した際にヒト抗体応答を生じさせることができるようにヒト免疫細胞を再構成されたSCIDマウスを用いて調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilsonらによる米国特許第5,476,996号および同第5,698,767号に記載されている。
【０１５８】
ヒトIgマウスの免疫化
本開示のヒト抗体を産生させるためにヒトIgマウスが使用される場合、このようなマウスは、Lonberg, N. et al. (1994)Nature 368(6474)：856-859、Fishwild, D. et al. (1996)Nature Biotechnology 14：845-851、ならびにPCT公報WO 98/24884およびWO 01/14424に記載されているように、O8Eを発現する細胞株、O8E抗原および/もしくは組換えO8Eの精製調製物もしくは濃縮調製物、またはO8E融合タンパク質で免疫化することができる。典型的には、マウスは、最初の免疫化の際に6〜16週齢である。例えば、O8E抗原の精製調製物または組換え調製物(5μg〜50μg)を使用して、腹腔内でヒトIgマウスを免疫化することができる。
【０１５９】
O8Eに対する完全なヒトモノクローナル抗体を生成させるための詳細な手順は以下の実施例1において説明する。様々な抗原を用いた累積的な経験により、完全フロイントアジュバント中の抗原で最初に腹腔内(IP)で免疫化し、続いて、不完全フロイントアジュバント中の抗原で1週間おきに腹腔内で免疫化(最長で合計6回)した場合、トランスジェニックマウスが応答することが示された。しかしながら、フロイントアジュバント以外のアジュバントも、効果的であることが判明している。さらに、アジュバント非存在下の全細胞も、免疫原性が高いことが判明している。免疫応答は、例えば眼窩後からの採血によって得られる血漿試料を用いて、免疫化プロトコールの過程を通して、モニターすることができる。血漿は、(実施例1で説明するように)ELISAによってスクリーニングすることができ、かつ十分な力価の抗O8Eヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合用に使用することができる。屠殺および膵臓切除の3日前に、静脈内でマウスに抗原を追加免疫してよい。各免疫化に対して2回〜3回の融合を実施する必要があり得ると予想される。典型的には、各抗原に対して6匹〜24匹の間のマウスが免疫化される。通常、HCo7系統およびHCo12系統の両方が使用される。HCo7マウス系統およびHCo12マウス系統の作製は、それぞれ、米国特許第5,770,429号およびPCT公報WO 01/09187の実施例2に説明されている。さらに、HCo7導入遺伝子およびHCo12導入遺伝子の両方を一緒に導入して、2種の異なるヒト重鎖導入遺伝子(HCo7/HCo 12)を有する1匹のマウスを育てることもできる。あるいは、またはさらに、PCT公報WO 02/43478で説明するように、KMマウス(登録商標)系統を使用することもできる。
【０１６０】
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化マウス由来の脾細胞および/またはリンパ節細胞を、単離し、かつ、マウス骨髄腫細胞株のような適切な不死化細胞株に融合させることができる。結果として生じるハイブリドーマを、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、50％PEGを用いて、3分の1の数のSp2/0非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1581)に融合させてよい。あるいは、免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Cyto Pulse大チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を用い、電場に基づく電気融合法によって、同数のSp2/0マウス骨髄腫細胞に融合させることもできる。細胞を約1×105個/ウェルで平底マイクロタイタープレート中に播種し、続いて、10％ウシ胎児血清(Hyclone、Logan、UT)、10％ P388D1(ATCC、CRL TIB-63)馴化培地、DMEM(Mediatech、CRL 10013、高グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含む)および5mM HEPES中3％〜5％オリゲン(origen)(IGEN)、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50mg/mlゲンタマイシン、および1×HAT(Sigma、CRL P-7185)を含む選択培地中で2週間インキュベーションする。約1〜2週間後、細胞は、HATをHTで置き換えた培地中で培養してよい。次いで、個々のウェルを、ELISAまたはFACSにより、ヒトモノクローナルIgM抗体およびIgG抗体についてスクリーニングすることができる。次いで、陽性クローンを、O8E組換えタンパク質においてはELISAによって、またはO8Eを発現する細胞、例えばO8EをトランスフェクトされたCHO細胞においてはFACSによって、O8E陽性抗体についてスクリーニングすることができる。大規模なハイブリドーマ増殖が起こった後で、通常10日〜14日後に培地を観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種し、再びスクリーニングしてよく、かつ、ヒトIgGについて依然として陽性である場合は、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングすることができる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴付けのために組織培養用培地中で少量の抗体を生成させることができる。
【０１６１】
ヒトモノクローナル抗体を精製するには、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の2リットルスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を、濾過および濃縮した後、プロテインAセファロース(Pharmacia、Piscataway、N.J.)を用いたアフィニティクロマトグラフィーにかけることができる。溶出されたIgGは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックして純度を保証することができる。緩衝液はPBSに交換することができ、かつ濃度は、吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は、等分し、かつ-80℃で保存することができる。
【０１６２】
本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本開示の抗体はまた、例えば、当技術分野において周知の組換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せ(例えば、Morrison, S.(1985)Science 229：1202)を用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させることもできる。
【０１６３】
例えば、抗体またはそれらの抗体断片を発現させるために、軽鎖および重鎖の一部分または完全長をコードするDNAを、標準的な分子生物学技術(例えば、関心対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いたPCR増幅またはcDNAクローニング)によって得ることができ、かつそれらのDNAを、それらの遺伝子が転写制御配列および翻訳制御配列に機能的に連結されるように発現ベクター中に挿入することができる。この文脈において、「機能的に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、その抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ベクターに連結されることを意味すると意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合性があるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入されてよく、またはより典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的な制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション)によって、発現ベクター中に挿入される。本明細書において説明する抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、VHセグメントがベクター内のCHセグメントに機能的に連結され、かつVKセグメントがベクター内のCLセグメントに機能的に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター中にそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製するのに使用することができる。さらにまたはその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)でよい。
【０１６４】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント(例えばポリアデニル化シグナル)を含むと意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990))に記載されている。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者には理解されると考えられる。哺乳動物宿主細胞発現のために好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス(CMV)、サルウイルス(Simian Virus)40(SV40)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーなど、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ-グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列も使用され得る。さらになお、調節エレメントは、SV40初期プロモーターおよびヒトT細胞白血病ウイルス1型の末端反復配列に由来する配列を含むSRαプロモーター系のように、異なる供給源に由来する配列から構成された(Takebe, Y. et al. (1988)Mol. Cell. Biol. 8：466-472)。
【０１６５】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)および選択マーカー遺伝子など付加的な配列を有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、いずれもAxelらによる米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号、および同第5,179,017号を参照されたい)。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、(メトトレキサート選択/増幅と共にdhfr-宿主細胞において使用するための)ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子および(G418選択のための)neo遺伝子が含まれる。
【０１６６】
軽鎖および重鎖を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技術によって宿主細胞中にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核宿主細胞または真核宿主細胞中に外因性DNAを導入するために一般に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、およびDEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含すると意図される。原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現させることが理論的に可能であるが、真核細胞、および最も典型的には哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。これは、そのような真核細胞、および特に哺乳動物細胞の方が、原核細胞よりも、正しくフォールディングされ、かつ免疫学的に活性な抗体を構築し、かつ分泌しやすいからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収量の活性抗体を産生させるのに効果的ではないことが報告されている(Boss, M. A.およびWood, C. R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
【０１６７】
本開示の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えば、R. J. KaufmanおよびP. A. Sharp(1982)Mol. Biol. 159：601-621で記載されているように、DHFR選択マーカーと共に使用される、UrlaubおよびChasin, (1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216-4220に記載されているdhfr-CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞、およびSP2細胞が含まれる。特に、NSO骨髄腫細胞と共に使用する場合、別の好ましい発現系は、WO 87/04462、WO 89/01036、およびEP 338,841において開示されているGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における抗体の発現、またはより典型的には、宿主細胞を増殖させる培地中への抗体の分泌を可能にさせるのに十分な期間、それらの宿主細胞を培養することによって、抗体を産生させる。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。
【０１６８】
抗原に対する抗体結合の特徴付け
本開示の抗体は、例えば、フローサイトメトリーによって、O8Eに対する結合について試験することができる。手短に言えば、O8Eを発現する細胞を組織培養フラスコから新しく採取し、かつ、単細胞懸濁液を調製する。O8Eを発現する細胞懸濁液を、直接、またはPBS中1％パラホルムアルデヒドで固定した後に、1次抗体で染色する。約100万個の細胞を、0.5％ BSAおよび50μg/ml〜200μg/mlの1次抗体を含むPBS中に再懸濁し、かつ、氷上で30分間インキュベートする。これらの細胞を、0.1％BSA、0.01％NaN3を含むPBSで2回洗浄し、1：100で希釈したFITC結合ヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)100μl中に再懸濁し、かつ、氷上でさらに30分間インキュベートする。これらの細胞をさらに2回洗浄し、洗浄緩衝液0.5ml中に再懸濁し、かつ、FACSCaliburサイトメーター(Becton-Dickinson, San Jose, CA)において蛍光染色を解析する。
【０１６９】
あるいは、本開示の抗体は、標準的なELISAによって、O8Eへの結合について試験することもできる。手短に言えば、マイクロタイタープレートを0.25μg/mlのPBS中精製O8Eでコーティングし、次いでPBS中5％ウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈物(例えば、O8Eで免疫化したマウスに由来する血漿の希釈物)を各ウェルに添加し、かつ37℃で1時間〜2時間インキュベートする。これらのプレートをPBS/Tweenで洗浄し、次いで、アルカリ性ホスファターゼに結合させた二次反応物(例えば、ヒト抗体に対しては、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル反応物)と共に、37℃で1時間インキュベートする。洗浄後、これらのプレートをpNPP基質(1mg/ml)を用いて発色させ、かつ405〜650のODで解析する。典型的には、最も高い力価を示すマウスが、融合に使用される。
【０１７０】
前述のELISAアッセイ法またはFACSアッセイ法はまた、O8E免疫原に対して陽性の反応性を示すハイブリドーマをスクリーニングするために使用することもできる。高い結合力でO8Eに結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴付ける。-140℃で保存される5〜10バイアルの細胞バンクを作製し、かつ抗体を精製するために、親細胞の反応性を保持している(EILSAまたはFACSによる)、各ハイブリドーマに由来する1つのクローンを選択することができる。
【０１７１】
抗O8E抗体を精製するには、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の2リットルスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過および濃縮した後、プロテインAセファロース(Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いたアフィニティクロマトグラフィーにかけることができる。溶出されたIgGは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックして純度を保証することができる。緩衝液はPBSに交換することができ、かつ濃度は、吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体は、等分し、かつ-80℃で保存することができる。
【０１７２】
選択された抗O8Eモノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するか判定するために、市販されている試薬(Pierce, Rockford, IL)を用いて、各抗体をビオチン標識することができる。非標識のモノクローナル抗体およびビオチン標識モノクローナル抗体を用いた競合研究は、前述したようにO8EでコーティングしたELISAプレートを用いて実施することができる。ビオチン標識mAbの結合は、ストレプトアビジン(strep-avidin)-アルカリ性ホスファターゼプローブを用いて検出することができる。あるいは、下記の実施例においてさらに説明するように、放射性標識抗体を用いて競合調査を実施することができ、かつ、標識されていない競合抗体をスキャッチャード解析において検出することもできる。
【０１７３】
精製した抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いて、アイソタイプELISAを実施することができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを、1μg/mlの抗ヒト免疫グロブリンで、4℃で一晩コーティングすることができる。1％BSAでブロッキングした後、これらのプレートを、周囲温度で1時間〜2時間、1μg/mlまたはそれより低濃度の試験モノクローナル抗体または精製したアイソタイプ対照と反応させる。次いで、これらのウェルを、ヒトIgG1またはヒトIgMに特異的なアルカリ性ホスファターゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。前述したように、プレートを発色させ、かつ解析する。
【０１７４】
抗O8EヒトIgGは、ウェスタンブロット法によって、O8E抗原との反応性に関してさらに試験することができる。手短に言えば、O8Eを調製し、かつドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、10％ウシ胎児血清でブロッキングし、かつ試験すべきモノクローナル抗体でプローブする。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリ性ホスファターゼを用いて検出し、かつBCIP/NBT基質タブレット(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)を用いて発色させることができる。
【０１７５】
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗O8E抗体の様々な物理的特性によってさらに特徴付けすることができる。様々なアッセイ法が、これらの物理的特性に基づいて様々なクラスの抗体を検出および/または区別するのに使用され得る。
【０１７６】
いくつかの態様において、本開示の抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のいずれかに、1つまたは複数のグリコシル化部位を含み得る。可変領域中に1つまたは複数のグリコシル化部位が存在することにより、抗原結合が変わるため、抗体の免疫原性の上昇または抗体のpKの変化が起こり得る(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702;Gala FAおよびMorrison SL(2004)J Immunol 172：5489-94;Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109;Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R;Parekh et al(1985)Nature 316：452-7;Mimura et al. (2000)Mol Immunol 37：697-706)。グリコシル化は、N-X-S/T配列を含むモチーフに存在することが公知である。可変領域のグリコシル化は、グリコブロット（Glycoblot）アッセイ法を用いて試験することができる。このアッセイ法では、抗体を切断してFabを生成させ、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基形成を測定するアッセイ法を用いてグリコシル化に関して試験する。あるいは、可変領域のグリコシル化は、Fab由来の糖類を単糖に切断し、かつ個々の糖類含有量を解析するDionex光クロマトグラフィー(Dionex-LC)を用いて試験することもできる。場合により、可変領域グリコシル化を含まない抗O8E抗体を有することが好ましい。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによって、または当技術分野において周知の標準的技術を用いてグリコシル化モチーフ内の残基を変異させることによって、実現することができる。
【０１７７】
好ましい態様において、本開示の抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸作用(effect)は、それぞれN-G配列またはD-G配列上で起こり得る。脱アミドまたはイソアスパラギン酸作用は、イソアスパラギン酸の生成をもたらし、これは、主鎖ではなく側鎖カルボキシ末端から離れたねじれた構造を作り出すことによって、抗体の安定性を低下させる。イソアスパラギン酸の生成は、逆相HPLCを使用してイソアスパラギン酸について試験する、等量(iso-quant)アッセイ法を用いて測定することができる。
【０１７８】
各抗体は、特有の等電点(pI)を有すると考えられるが、全体として、抗体は、6〜9.5の間のpH範囲に入ると考えられる。IgG1抗体のpIは、典型的には7〜9.5のpH範囲内に入り、IgG4抗体のpIは、典型的には6〜8のpH範囲内に入る。抗体は、この範囲から外れるpIを有することがある。これらの作用は一般に知られていないが、正常範囲から外れたpIを有する抗体が、インビボ条件下でアンフォールディングおよび不安定さをいくらか示す場合があるという推測がある。等電点は、pH勾配を作り出し、かつ精度を高めるためにレーザー集光を利用し得る、キャピラリー等電点電気泳動アッセイ法を用いて試験することができる(Janini et al(2002)Electrophoresis 23：1605-11;Ma et al. (2001)Chromatographia 53：S75-89;Hunt et al(1998)J Chromatogr A 800：355-67)。場合により、正常範囲に入るpI値を有する抗O8E抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のpIを有する抗体を選択することによって、または、当技術分野において周知の標準的技術を用いて表面の荷電残基を変異させることによって、実現することができる。
【０１７９】
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有する(Krishnamurthy RおよびManning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。熱安定性が高いほど、インビボでの総合的な抗体安定性がより高いことが示される。抗体の融点は、示差走査熱量測定のような技術を用いて測定することができる(Chen et al(2003)Pharm Res 20：1952-60;Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68：47-52)。TM1は、抗体が最初にアンフォールディングする温度を示す。TM2は、抗体が完全にアンフォールディングする温度を示す。全体として、本開示の抗体のTM1は、60℃より高く、好ましくは65℃より高く、さらにより好ましくは70℃より高いことが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は、円二色性を用いて測定することもできる(Murray et al. (2002)J. Chromatogr Sci 40：343-9)。
【０１８０】
好ましい態様において、急速に分解しない抗体が選択される。抗O8E抗体の断片化は、当技術分野において十分に理解されているように、キャピラリー電気泳動(CE)およびMALDI-MSを用いて測定することができる(Alexander AJおよびHughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。
【０１８１】
別の好ましい態様において、凝集作用が最小限である抗体が選択される。凝集は、望まれない免疫応答の誘発および/または薬物動態学的特性の変化もしくは好ましくない薬物動態学的特性をもたらし得る。全体として、凝集が25％またはそれ以下、好ましくは20％またはそれ以下、さらにより好ましくは15％またはそれ以下、さらにより好ましくは10％またはそれ以下、およびさらにより好ましくは5％またはそれ以下の抗体が許容される。凝集は、単量体、2量体、3量体、または多量体を同定するためのサイズ排除カラム(SEC)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、および光散乱を含む、当技術分野において周知のいくつかの技術によって測定することができる。
【０１８２】
免疫複合体
別の局面において、本開示は、サイトトキシン、薬物(例えば免疫抑制薬)、または放射性毒素などの治療的部分に結合された、抗O8E抗体またはその断片を特徴とする。このような複合体は、本明細書において「免疫複合体」と呼ばれる。1種または複数種のサイトトキシンを含む免疫複合体は、「免疫毒素」と呼ばれる。サイトトキシンまたは細胞障害性物質には、細胞に有害である(例えば死滅させる)任意の作用物質が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体またはホモログが含まれる。治療物質には、例えば、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis-ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えばダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに抗有糸分裂物質(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)も含まれる。
【０１８３】
本開示の抗体に結合され得る治療的サイトトキシンの他の好ましい例には、デュオカルマイシン、カリケアミシン、メイタンシン、およびアウリスタチン、ならびにそれらの誘導体が含まれる。カリケアミシン抗体複合体の例は、市販されている(Mylotarg(商標)、Wyeth-Ayerst)。
【０１８４】
サイトトキシンは、当技術分野において利用可能なリンカー技術を用いて、本開示の抗体に結合させることができる。サイトトキシンを抗体に結合させるのに使用されたリンカータイプの例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチドを含むリンカーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、リソソーム区画内の低pHによる切断の影響を受けやすいか、またはカテプシン(例えば、カテプシンB、C、D)のような腫瘍組織中で優先的に発現されるプロテアーゼのようなプロテアーゼによる切断の影響を受けやすいリンカーを選択することができる。
【０１８５】
サイトトキシンのタイプ、リンカー、および治療物質を抗体に結合させるための方法のさらなる考察については、Saito, G. et al. (2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55：199-215;Trail, P.A. et al. (2003)Cancer Immunol. Immunother. 52：328-337;Payne, G.(2003)Cancer Cell 3：207-212;Allen, T.M.(2002)Nat. Rev. Cancer 2：750-763;Pastan, I. およびKreitman, R. J.(2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3：1089-1091;Senter, P.D.およびSpringer, C.J.(2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53：247-264も参照されたい。
【０１８６】
本開示の抗体はまた、放射性同位体に結合させて、放射性免疫複合体とも呼ばれる細胞障害性放射性医薬品を作製することもできる。診断的または治療的に使用するために抗体に結合させることができる放射性同位体の例には、ヨウ素131、ヨウ素125、インジウム111、イットリウム90、およびルテチウム177が含まれるが、これらに限定されるわけではない。放射性免疫複合体を調製するための方法は、当技術分野において確立されている。Zevalin(商標)(IDEC Pharmaceuticals)およびBexxar(商標)(Corixa Pharmaceuticals)を含む、放射性免疫複合体の例は市販されており、かつ、同様の方法が、本開示の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製するのに使用され得る。
【０１８７】
本開示の抗体複合体は、所与の生物学的応答を変更するために使用され得、かつ薬物部分は、従来の化学治療物質に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドでよい。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナスエキソトキシン、もしくはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素またはそれらの活性断片;腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン-γなどのタンパク質;または、例えば、リンフォカイン、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)などの生体応答調節物質、または他の増殖因子が含まれ得る。
【０１８８】
このような治療的部分を抗体に結合させるための技術は周知であり、例えば、Arnon et al., 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (編)、243〜56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985);Hellstrom et al.、「Antibodies For Drug Delivery」、 Controlled Drug Delivery(第2版), Robinson et al. (編)、623〜53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987);Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」、Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (編)、475〜506頁(1985);「Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin et al. (編)、303〜16頁(Academic Press 1985)、およびThorpe et al.、「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」、Immunol. Rev., 62：119-58(1982)を参照されたい。
【０１８９】
二重特異性分子
別の局面において、本開示は、本開示の抗O8E抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分を誘導体化するか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質(例えば別の抗体もしくは受容体に対するリガンド)に連結させて、少なくとも2種の異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を作製することができる。本開示の抗体を実際に誘導体化するか、または他の複数の機能的分子に連結させて、2種より多い異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異性分子を作製することができる。このような多重特異性分子もまた、本明細書において使用される「二重特異性分子」という用語に包含されると意図される。本開示の二重特異性分子を作製するために、本開示の抗体を、二重特異性分子が結果として生じるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合ミメティックなど1種または複数種の他の結合分子に(例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合、または別の方法によって)機能的に連結させることができる。
【０１９０】
したがって、本開示は、O8Eに対する少なくとも1種の第1の結合特異性および第2の標的エピトープに対する第2の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の態様において、第2の標的エピトープはFc受容体、例えばヒトFcγRI(CD64)またはヒトFcα受容体(CD89)である。したがって、本開示は、FcγRまたはFcαRを発現するエフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージ、または多形核細胞(PMN))、およびO8Eを発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、O8Eを発現する細胞をエフェクター細胞に導き、かつ、O8Eを発現する細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成などFc受容体を介したエフェクター細胞活性を誘発する。
【０１９１】
二重特異性分子が多重特異性である本開示の態様において、この分子は、抗Fc結合特異性および抗O8E結合特異性に加えて、第3の結合特異性をさらに含み得る。1つの態様において、第3の結合特異性部分は、抗増強因子(EF)部分、例えば、細胞障害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば抗原もしくは受容体に結合し、それによって、Fc受容体または標的細胞抗原に対する結合決定基の作用の増強をもたらす、抗体、機能的な抗体断片、またはリガンドでよい。「抗増強因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第1の結合特異性部分および第2の結合特異性部分が結合する単位とは異なる単位に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、(例えば、CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、または標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらす他の免疫細胞を介して)細胞障害性T細胞に結合することができる。
【０１９２】
1つの態様において、本開示の二重特異性分子は、結合特異性部分として、少なくとも1つの抗体、または、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb、もしくは単鎖Fvを含む、その抗体断片を含む。抗体はまた、その内容が参照により明確に組み入れられるLadnerらによる米国特許第4,946,778号に記載されているように、軽鎖2量体もしくは重鎖2量体、またはFvもしくは単鎖構築物などそれらの任意の微小な断片でもよい。
【０１９３】
1つの態様において、Fcγ受容体に対する結合特異性は、モノクローナル抗体によって提供され、その結合は、ヒト免疫グロブリンG(IgG)によって妨害されない。本明細書において使用される場合、「IgG受容体」という用語は、第1染色体上に位置する8つのγ鎖遺伝子のいずれかを意味する。これらの遺伝子は、3つのFcγ受容体クラス、すなわちFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)に分類される合計12種の膜貫通型受容体アイソフォームまたは可溶性受容体アイソフォームをコードする。1つの好ましい態様において、Fcγ受容体は、ヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは、72kDaの分子であり、単量体IgGに対して高親和性を示す(108M-1〜109M-1)。
【０１９４】
いくつかの好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の作製および特徴付けが、PCT公報WO 88/00052および米国特許第4,954,617号においてFangerらによって説明されており、これらの教示は、参照により本明細書に完全に組み入れられる。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは異なる部位で、FcγRI、FcγRII、またはFcγRIIIのエピトープに結合し、したがって、それらの結合は、生理学的レベルのIgGによって実質的に妨害されない。本開示において有用な特異的抗FcγRI抗体は、mAb22、mAb32、mAb44、mAb62、およびmAb197である。mAb32を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection(アメリカ培養細胞系統保存機関)ATCCアクセッション番号HB9469から入手可能である。他の態様において、抗Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22のヒト化型(H22)である。H22抗体の作製および特徴付けは、Graziano, R.F. et al. (1995)J. Immunol 155(10)：4996-5002およびPCT公報WO 94/10332に記載されている。H22抗体を産生する細胞株は、HA022CL1という呼称でAmerican Type Culture Collectionに寄託されており、アクセッション番号はCRL 11177である。
【０１９５】
さらに別の好ましい態様において、Fc受容体に対する結合特異性は、ヒトIgA受容体、例えばFcα受容体(FcαRI(CD89))に結合する抗体によって提供され、その結合は、典型的には、ヒト免疫グロブリンA(IgA)によって妨害されない。「IgA受容体」という用語は、第19染色体上に位置する1つのα遺伝子(FcαRI)の遺伝子産物を含むと意図される。この遺伝子は、選択的スプライシングされたいくつかの55kDa〜110kDaの膜貫通型アイソフォームをコードすることが公知である。FcαRI(CD89)は、単球/マクロファージ、好酸性顆粒球および好中性顆粒球上で構成的に発現されるが、エフェクター細胞ではない細胞集団上では発現されない。FcαRIはIgA1およびIgA2の両方に対して中程度の親和性(約5×107M-1)を有し、これは、G-CSFまたはGM-CSFなどのサイトカインに曝露されると増加する(Morton, H.C. et al. (1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。IgAリガンド結合ドメインの外側でFcαRIに結合する、A3、A59、A62、およびA77として同定される4種のFcαRI特異的モノクローナル抗体が説明されている(Monteiro, R.C. et al. (1992)J. Immunol. 148：1764)。
【０１９６】
FcαRIおよびFcγRIは、(1)免疫エフェクター細胞、例えば、単球、PMN、マクロファージ、および樹状細胞上で主として発現され、(2)高レベルで発現され(例えば細胞当たり5,000個〜100,000個)、(3)細胞障害活性(例えば、ADCC、食作用)の媒介物であり、(4)それらを標的とする、自己抗原を含む抗原の抗原提示の亢進を媒介するため、本開示の二重特異性分子中で使用するのに好ましい誘発(trigger)受容体である。
【０１９７】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本開示の二重特異性分子中で使用され得る他の抗体には、例えば、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【０１９８】
本開示の二重特異性分子は、当技術分野において公知の方法を用いて、構成要素の結合特異性部分、例えば、抗FcR結合特異性部分および抗O8E結合特異性部分を結合させることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性部分を別々に作製し、次いで互いに結合させることができる。結合特異性部分がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合させるために、様々なカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセタート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン(cyclohaxane)-1-カルボキシラート(スルホ-SMCC)が含まれる(例えば、Karpovsky et al. (1984)J. Exp. Med. 160：1686;Liu, MA et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：8648を参照されたい)。他の方法には、Paulus(1985)Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al. (1985)Science 229：81-83およびGlennie et al. (1987)J. Immunol. 139：2367-2375に記載されているものが含まれる。好ましい結合剤は、SATAおよびスルホ-SMCCであり、いずれも、Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。
【０１９９】
結合特異性部分が抗体である場合、2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してそれらを結合させることができる。特に好ましい態様において、ヒンジ領域は、結合の前に、奇数、典型的には1個のスルフヒドリル残基を含むように改変される。
【０２００】
あるいは、両方の結合特異性部分を同じベクター中でコードし、かつ、同じ宿主細胞中で発現させ、構築することもできる。この方法は、二重特異性分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2、またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合、特に有用である。本開示の二重特異性分子は、1つの単鎖抗体および1つの結合決定基を含む単鎖分子、または2つの結合決定基を含む単鎖の二重特異性分子でよい。二重特異性分子は、少なくとも2つの単鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,455,030号、米国特許第4,881,175号、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,476,786号、米国特許第5,013,653号、米国特許第5,258,498号、および米国特許第5,482,858号に記載されている。
【０２０１】
特異的標的に対する二重特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ法(RIA)、FACS解析、バイオアッセイ法(例えば増殖阻害)、またはウェスタンブロットアッセイ法によって確認することができる。これらの各アッセイ法は、一般に、関心対象の複合体に対して特異的な標識された反応物(例えば抗体)を使用することによって、特定の関心対象のタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。例えば、FcR-抗体複合体は、例えば、抗体-FcR複合体を認識し、かつ特異的に結合する、酵素を結合させた抗体または抗体断片を用いて検出することができる。あるいは、これらの複合体は、様々な他のイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出することもできる。例えば、抗体は、放射標識し、かつラジオイムノアッセイ法(RIA)において使用することができる(例えば、参照により本明細書に組み入れられるWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい)。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０２０２】
薬学的組成物
別の局面において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に調剤された、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の1つまたは組合せを含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。このような組成物には、1つまたは組合せの(例えば2つもしくはそれ以上の異なる)本開示の抗体、または免疫複合体もしくは二重特異性分子が含まれ得る。例えば、本開示の薬学的組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体(または免疫複合体もしくは二重特異性物質)の組合せを含み得る。
【０２０３】
本開示の薬学的組成物はまた、併用療法において、すなわち他の作用物質と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも1種の他の抗炎症性物質または免疫抑制物質と組み合わせられた、本開示の抗O8E抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療物質の例は、下記の本開示の抗体の用途に関するセクションにおいてより詳細に説明する。
【０２０４】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。典型的には、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与(例えば、注射もしくは輸注による)に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体、または二重特異性分子は、化合物を不活性化する場合がある酸作用および他の天然の条件から化合物を保護するための材料でコーティングしてよい。
【０２０５】
本開示の薬学的化合物には、1種または複数種の薬学的に許容される塩が含まれ得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を保持しており、かついかなる望まれない毒物学的作用も与えない塩を意味する(例えば、Berge, S.M., et al. (1977)J. Pharm. Sci. 66：1-19を参照されたい)。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、および亜リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、ならびに、脂肪族のモノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、ならびに脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、ならびに、N、N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが含まれる。
【０２０６】
本開示の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤も含んでよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例には以下のものが含まれる：(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤;(2)パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、およびα-トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤;ならびに(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などの金属キレート剤。
【０２０７】
本開示の薬学的組成物中で使用され得る適切な水性担体および非水性担体の例には、水、エタノール、(グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなどの)ポリオール、ならびにそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射剤用の有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用によって、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０２０８】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤も含んでよい。微生物の存在の防止は、前記の滅菌手順、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸などを含めることの両方によって徹底することができる。糖および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含めることもまた、望ましい場合がある。さらに、注射用の薬剤形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延させる作用物質を含めることによって、実現することができる。
【０２０９】
薬学的に許容される担体には、無菌の注射用溶液または注射用分散液を用時調製するための、無菌の水溶液または水性分散液および無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合である場合を除いて、本開示の薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に混合することができる。
【０２１０】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則構造体として調製され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど)、ならびにそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒でよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用によって、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって実現することができる。
【０２１１】
無菌注射用溶液は、必要に応じて、前述の成分の1種または組合せと共に、適切な溶媒中で必要な量の活性化合物を混合し、続いて滅菌精密ろ過することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本となる分散媒および前述したもののうち必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製する。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から、活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ法(凍結乾燥)である。
【０２１２】
単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、治療される対象および個々の投与様式に応じて変わると考えられる。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、一般に、治療的効果をもたらす組成物の量であると考えられる。一般に、100パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、約0.01パーセント〜約99パーセントの活性成分、典型的には約0.1パーセント〜約70パーセント、最も典型的には約1パーセント〜約30パーセントの活性成分の範囲であると考えられる。
【０２１３】
投与計画は、最適な所望の応答(例えば治療応答)を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してよく、いくつかに分割した用量を、時間をかけて投与してよく、または、治療状況の緊急性によって必要とされるように、用量を比例的に減少もしくは増加させてよい。投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、単位剤形の非経口組成物を調剤することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療すべき対象に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を意味する。各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して所望の治療的効果をもたらすように計算された、所定の量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形の仕様は、(a)活性化合物の独特の特徴および実現すべき個々の治療的効果、ならびに(b)個体の感受性を治療するためにこのような活性化合物を調剤する技術に特有の制約によって決定され、かつこれらに直接依存する。
【０２１４】
抗体の投与の場合、投薬量は、約0.0001mg/kg〜100mg/kg受容者体重、およびより普通には、0.01mg/kg〜25mg/kg受容者体重の範囲にわたる。例えば、投薬量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、もしくは10mg/kg体重、または1mg/kg〜10mg/kgの範囲内でよい。より多い投薬量、例えば、15mg/kg体重、20mg/kg体重、または25mg/kg体重を必要に応じて使用することができる。例示的な治療計画は、1週間に1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回、1ヶ月に1回、3ヶ月毎に1回、または3〜6ヶ月毎に1回の投与を伴う。本開示の抗O8E抗体の特定の投与計画は、静脈内投与を介した、1mg/kg体重または3mg/kg体重を含み、抗体は以下の投薬スケジュールのうち1つを用いて与えられる：(i)4週間毎に6回投薬、次いで3ヶ月毎;(ii)3週間毎;(iii)3mg/kg体重を1回、次いで3週間毎に1mg/kg体重。
【０２１５】
いくつかの方法において、結合特異性が異なる2種またはそれ以上の本開示の抗O8Eモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は、指示された範囲内に収まる。抗体は、通常、複数の機会に投与される。1回の投薬の間の間隔は、例えば、毎週、毎月、3ヶ月毎、または毎年でよい。間隔は、患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則でもよい。いくつかの方法において、投薬量は、約1μg/ml〜1000μg/mlの血漿抗体濃度を実現するように調整され、かつ、いくつかの方法においては、約25μg/ml〜300μg/mlの血漿抗体濃度を実現するように調整される。
【０２１６】
他の方法において、本開示の1種または複数種の抗O8Eモノクローナル抗体は、例えば、抗CTLA-4および/または抗PD-1など異なる結合特異性を有する抗体と同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は、指示された範囲内に収まる。
【０２１７】
あるいは、抗体は、徐放製剤として投与することができ、この場合、必要とされる投与頻度は少なくなる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、続いて、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投薬量および投与頻度は、治療が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変動し得る。予防的適用では、比較的少ない投薬量が、長期間に渡って比較的頻度の低い間隔で投与される。一部の患者は、その後一生、治療を受け続ける。治療的適用では、比較的短い間隔で比較的多い投薬量が、疾患の進行が緩和または終結されるまで、および典型的には患者が疾患の症状の部分的または全面的な改善を示すまで、必要とされることがある。その後、予防的治療計画を患者に施すことができる。
【０２１８】
本開示の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、個々の患者、組成物、および投与様式に対して、患者に有毒とならずに、所望の治療応答を実現するのに効果的である活性成分の量を得るために、変更してよい。選択される投薬量レベルは、使用される本開示の個々の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排泄速度、治療期間、使用される個々の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および/または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、および以前の病歴、ならびに医薬分野において周知である同様の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存すると考えられる。
【０２１９】
本開示の抗O8E抗体の「治療的に有効な投薬量」は、典型的には、疾患症状の重症度の低減、疾患症状の無い期間の頻度および持続期間の増大、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは能力障害の予防をもたらす。例えば、O8E+腫瘍の治療の場合、「治療的に有効な投薬量」は、典型的には、未治療の対象と比べて、少なくとも約20％、より典型的には少なくとも約40％、さらにより典型的には少なくとも約60％、および、さらにより典型的には少なくとも約80％、細胞増殖または腫瘍増殖を阻害する。ある化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性の予測に役立つ動物モデル系において評価することができる。あるいは、ある組成物のこの特性は、その化合物の阻害能力、インビトロでのそのような阻害を、当業者に公知のアッセイ法によって検査することによって評価することができる。治療的有効量の治療的化合物は、腫瘍サイズを縮小し得るか、またはそうでなければ対象の症状を改善し得る。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択される個々の組成物または投与経路のような因子に基づいてそのような量を決定できると思われる。
【０２２０】
本開示の組成物は、当技術分野において公知である1種または複数種の様々な方法を用いて、1種または複数種の投与経路を介して投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望の結果に応じて異なると考えられる。本開示の抗体の好ましい投与経路には、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、脊髄投与、または例えば注射もしくは輸注による他の非経口投与経路が含まれる。本明細書において使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および輸注が含まれる。
【０２２１】
あるいは、本開示の抗体は、局所、表皮、または粘膜の投与経路など非経口ではない経路を介して、例えば、鼻腔内に、経口的に、腟に、直腸に、舌下に、または局所的に投与することができる。
【０２２２】
活性化合物は、埋め込み剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、急速な放出から化合物を保護すると考えられる担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許権を与えられているか、または、一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０２２３】
治療的組成物は、当技術分野において公知の医療器具を用いて投与することができる。例えば、好ましい態様において、本開示の治療的組成物は、米国特許第5,399,163号、同第5,383,851号、同第5,312,335号、同第5,064,413号、同第4,941,880号、同第4,790,824号、または同第4,596,556号に開示されている器具のような、針無しの皮下注入器具を用いて投与することができる。本開示において有用な周知の埋め込み物およびモジュール(module)の例には、以下が含まれる：制御された速度で医用薬剤を投与するための埋め込み可能なマイクロインフュージョンポンプを開示している米国特許第4,487,603号;皮膚を介して医薬品を投与するための治療用器具を開示している米国特許第4,486,194号;正確な輸注速度で医用薬剤を送達するための医用薬剤注入ポンプを開示している米国特許第4,447,233号;持続的な薬物送達用の流量可変な埋め込み可能輸注装置を開示している米国特許第4,447,224号;複数のチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第4,439,196号;および浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第4,475,196号。これらの特許は、参照により本明細書に組み入れられる。多数の他のこのような埋め込み物、送達系、およびモジュールが、当業者に公知である。
【０２２４】
一定の態様において、本開示のヒトモノクローナル抗体を、インビボでの適切な分布を確実にするように調剤することができる。例えば、血液脳関門(BBB)は、多くの親水性の高い化合物を排除する。(所望の場合は)本開示の治療的化合物がBBBを通過するよう徹底するために、例えばリポソーム中にそれらを調剤することができる。リポソームを製造する方法に関しては、例えば、米国特許第4,522,811号、同第5,374,548号、および同第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特異的な細胞または器官中に選択的に輸送され、それによって標的化された薬物送達を向上させる1種または複数種の部分を含んでよい(例えば、V.V. Ranade(1989)J. Clin. Pharmacol. 29：685を参照されたい)。例示的なターゲティング部分には、葉酸またはビオチン(例えば、Lowらによる米国特許第5,416,016号を参照されたい)、マンノシド(Umezawa et al., (1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153：1038)、抗体(P.G. Bloeman et al. (1995)FEBS Lett. 357：140;M. Owais et al. (1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39：180)、サーファクタントタンパク質A受容体(Briscoe et al. (1995)Am. J. Physiol. 1233：134)、p120(Schreier et al. (1994)J. Biol. Chem. 269：9090)が含まれる。K. Keinanen;M.L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346：123;J.J. Killion;I. J. Fidler(1994)Immunomethods 4：273も参照されたい。
【０２２５】
本開示の用途および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物、および方法は、例えば、O8Eの検出、癌の治療、またはO8Eの遮断による免疫応答の亢進を含む、インビトロおよびインビボでの多数の診断的有用性および治療的有用性を有する。好ましい態様において、本開示の抗体は、ヒト抗体である。例えば、これらの分子を、培養状態の細胞に、インビトロもしくはエクスビボで投与することができ、または、ヒト対象に、例えばインビボで投与して、様々な障害を治療、予防、および診断するか、または様々な状況において免疫を増強することができる。
【０２２６】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むと意図される。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの、哺乳動物および非哺乳動物を含む。好ましい対象には、O8E発現に関連した障害を有するか、または免疫応答の亢進を必要とするヒト患者が含まれる。これらの方法は、異常なO8E発現に関連した障害を有するヒト患者を治療するのに特に適している。これらの方法はまた、T細胞媒介性免疫応答を増強することによって治療できる障害を有するヒト患者を治療するのにも特に適している。免疫の抗原特異的な増強を実現するために、抗O8E抗体は、関心対象の抗原と共に投与され得る。O8Eに対する抗体が別の作用物質と共に投与される場合、これら2つは、順番に、または同時に投与され得る。
【０２２７】
O8Eに対する本開示の抗体の特異的結合を与えられる、本開示の抗体は、細胞表面上でのO8E発現を特異的に検出するのに使用することができ、かつさらに、イムノアフィニティー精製によってO8Eを精製するのに使用することもできる。
【０２２８】
癌
O8Eは、乳房細胞癌、転移性乳癌、卵巣細胞癌、転移性卵巣癌、および腎細胞癌を含む様々なヒト癌において発現される(Tringler et al. (2005)Clinical Cancer Res.11： 1842-48;Salceda et al. (2005)Exp Cell Res. 306：128-41;Tringler et al. (2006)Gynecol Oncol. 100：44-52;Krambeck et al. (2006)Proc Natl Acad Sci USA 103：10391-6;Chen et al. (2006)Kidney Int. Epub;Sun et al. (2006)Lung Cancer 53：143-51;Bignotti et al. (2006)Gynecol Oncol. 103：405-16;Kryczek et al. (2006)J Exp Med 203：871-81;Simon et al. (2006)Cancer Res. 66：1570-5)。抗O8E抗体は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために、単独で使用され得る。あるいは、抗O8E抗体は、後述するように、他の免疫原性物質、標準的な癌治療薬、または他の抗体と組み合わせて使用され得る。
【０２２９】
Bリンパ球およびTリンパ球アテニュエータ(BTLA)は、O8Eの受容体であることが発見され、かつ、細胞障害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)およびプログラム死- 1(PD-1)と同様に、免疫応答に対する阻害効果を有する(CarrenoおよびCollins(2003)Trends Immunol 24：524-7)。O8Eは、T細胞増殖、サイトカイン産生、および細胞周期発生の阻害によってT細胞免疫を負に調節することによって機能する(Choi et al. (2003)J Immunol. 171 ：4650-4)。O8E-Ig融合タンパク質はT細胞活性化を阻害するが、抗体によってO8Eを遮断すると、患者の免疫応答が増強され得る(Sica et al. (2003)Immunity 18：849-61)。
【０２３０】
1つの局面において、本開示は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるように抗O8E抗体をインビボで使用する、対象の治療に関する。抗O8E抗体は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために、単独で使用され得る。あるいは、抗O8E抗体は、後述するように、他の免疫原性物質、標準的な癌治療薬、または他の抗体と組み合わせて使用され得る。
【０２３１】
したがって、1つの態様において、本開示は、対象において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であり、治療的有効量の抗O8E抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、抗体は、(本明細書において説明するヒト抗ヒトO8E抗体のいずれかのような)ヒト抗O8E抗体である。さらにまたはその代わりに、抗体は、キメラ抗O8E抗体またはヒト化抗O8E抗体でよい。
【０２３２】
本開示の抗体を用いて増殖を阻害することができる好ましい癌には、典型的に免疫療法に応答性の癌が含まれる。治療するのに好ましい癌の非限定的な例には、乳癌(例えば乳房細胞癌)、卵巣癌(例えば卵巣細胞癌)、および腎細胞癌(RCC)が含まれる。本開示の方法を用いて治療することができる他の癌の例には、黒色腫(例えば、転移性の悪性黒色腫)、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性の白血病、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性CNSリンパ腫、T細胞リンパ腫)、上咽頭癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副乳腺の癌(cancer of the adbreast gland)、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、幼児期の固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、乳房の盤状構造(breast pelvis)の癌、中枢神経系(CNS)の新生物、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものを含む環境的に誘発される癌、例えば中皮腫、ならびに前記癌の組合せが含まれる。
【０２３３】
任意で、O8Eに対する抗体を、癌細胞、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む)、細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞などの免疫原性物質と組み合わせてよい(He et al, J. Immunol. 173：4919-28(2004))。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例には、gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1、および/もしくはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチド、またはサイトカインGM-CSFを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が含まれる。
【０２３４】
ヒトにおいて、黒色腫のような一部の腫瘍が免疫原性であることが示された。O8E遮断によってT細胞活性化の閾値を上げることにより、宿主における応答において腫瘍が活性化され得ることが予想される。
【０２３５】
O8E遮断は、ワクチン接種プロトコールと組み合わされた場合に最も効果的である可能性が高い。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg、「Development of Cancer Vaccines」 ASCO Educational Book Spring：60-62(2000);Logothetis, ASCO Educational Book Spring：300-302(2000);Khayat, ASCO Educational Book Spring：414-428(2000);Foon, ASCO Educational Book Spring：730-738(2000)を参照されたい。同様に、RestifoおよびSznol, Cancer Vaccines、 61章、3023〜3043頁、DeVita, V. et al. (編)、  Cancer：Principles and Practice of Oncology. 第5版(1997)も参照されたい)。これらの戦略のうち1つにおいて、ワクチンは、自己由来または同種異系の腫瘍細胞を用いて調製される。典型的には、これらの細胞ワクチンは、GM-CSFを発現するように腫瘍細胞に形質導入する場合、最も効果的である。GM-CSFは、腫瘍ワクチンに対する抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている(Dranoff et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90：3539-43(1993))。
【０２３６】
様々な腫瘍における遺伝子発現および大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原が定義された(Rosenberg, Immunity 10：281-7(1999))。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、および腫瘍が発生した細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原gp100、MAGE抗原、およびTrp-2である。より重要なことには、これらの抗原の多くは、宿主中に存在する腫瘍特異的T細胞の標的であることを示すことができる。O8E遮断を、腫瘍において発現される組換えタンパク質および/またはペプチドの集団と組み合わせて使用して、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせることができる。これらのタンパク質は、通常は、免疫系によって自己抗原としてとらえられ、したがって、それらに対して寛容性である。腫瘍抗原はまた、染色体のテロメアの合成に必要とされ、かつ、85％超のヒト癌、およびごく限られた数の体細胞組織において発現されるタンパク質テロメラーゼも含み得る(Kim et al., Science 266：2011-2013(1994))。(これらの体細胞組織は、様々な手段によって免疫攻撃から保護され得る)。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を改変するか、もしくは2つの無関係な配列(すなわち、フィラデルフィア染色体中のbcr-abl)間の融合タンパク質を作り出す体細胞変異が理由となって癌細胞において発現される「新生抗原」またはB細胞腫瘍由来のイディオタイプでもよい。
【０２３７】
他の腫瘍ワクチンには、ヒトパピローマウイルス(HPV)、肝炎ウイルス(HBVおよびHCV)、ならびにカポジヘルペス肉腫ウイルス(KHSV)などヒト癌に関係があるウイルスに由来するタンパク質が含まれ得る。O8E遮断と組み合わせて使用され得る別の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織それ自体から単離された、精製された熱ショックタンパク質(HSP)である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含み、かつこれらのHSPは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達が著しく効率的である(SuotおよびSrivastava Science 269：1585-1588(1995));Tamura et al. Science 278：117- 120(1997))。
【０２３８】
樹状細胞(DC)は、抗原特異的応答を刺激する(prime)のに使用され得る強力な抗原提示細胞である。DCは、エクスビボで作製し、かつ様々なタンパク質抗原およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を添加することができる(Nestle, F. et al. (1998)Nature Medicine 4：328-332)。また、遺伝的手段によってDCに形質導入して、これらの腫瘍抗原を同様に発現させることもできる。DCはまた、免疫化するために、腫瘍細胞に直接融合された(Kugler, A. et al. (2000)Nature Medicine 6：332-336)。ワクチン接種の方法として、DC免疫化をPD-1遮断と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
【０２３９】
O8E遮断はまた、標準的な癌治療と組み合わせることもできる。O8E遮断は、化学療法計画と効果的に組み合わせることができる。これらの場合、投与される化学療法薬の用量を減少させることができる可能性がある(Mokyr, M. et al. (1998)Cancer Research 58：5301-5304)。このような組合せの例は、様々な癌の治療用にデカルバジン(decarbazine)と組み合わせた抗O8E抗体である。このような組合せの別の例は、様々な癌の治療用にインターロイキン-2(IL-2)と組み合わせた抗O8E抗体である。O8E遮断および化学療法の併用を支持する科学的な理論的根拠は、大半の化学療法用化合物の細胞障害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路中の腫瘍抗原のレベルの上昇をもたらすことが当然であるというものである。細胞死を介したO8E遮断との相乗作用をもたらし得る他の併用療法は、放射線療法、外科手術、およびホルモン抑制である。これらの各プロトコールは、宿主における腫瘍抗原の供給源を作り出す。また、血管新生阻害物質をO8E遮断と組み合わせてもよい。血管新生の阻害は腫瘍細胞の死滅を招き、これにより、宿主の抗原提示経路中に腫瘍抗原が供給され得る。
【０２４０】
O8E阻止抗体もまた、FcαまたはFcγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に導く二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる(例えば、米国特許第5,922,845号および同第5,837,243号を参照されたい)。二重特異性抗体は、2種の別々の抗原を標的とするために使用することができる。例えば、抗Fc受容体/抗腫瘍抗原(例えばHer-2/neu)二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に導くために使用されている。このターゲティングにより、腫瘍特異的応答がより効果的に活性化され得る。T細胞部のこれらの応答は、O8E遮断の使用によって増強されると思われる。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体を使用することによって、DCに直接送達することもできる。
【０２４１】
腫瘍は、多種多様なメカニズムによって、宿主の免疫監視から逃れる。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現され、かつ免疫抑制性であるタンパク質を不活性化することによって克服することができる。これらには、とりわけ、TGF-β(Kehrl, J. et al. (1986)J. Exp. Med. 163：1037-1050)、IL-10(Howard, M. およびO'Garra, A.(1992)Immunology Today 13：198-200)、およびFasリガンド(Hahne, M. et al. (1996)Science 274：1363-1365)が含まれる。これらの各存在物に対する抗体を抗PD-L1と組み合わせて使用して、免疫抑制物質の作用を打ち消し、かつ宿主による腫瘍免疫応答を促進することができる。
【０２４２】
宿主の免疫応答性を活性化するのに使用され得る他の抗体を、抗O8Eと組み合わせて使用することができる。これらには、DCの機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞表面の分子が含まれる。抗CD40抗体は、効果的にT細胞のヘルパー活性の代わりをすることができ(Ridge, J. et al. (1998)Nature 393：474-478)、O8E抗体と組み合わせて使用され得る。CTLA-4(例えば米国特許第 5,811,097号)、OX-40(Weinberg, A. et al. (2000)Immunol 164：2160-2169)、4-1BB(Melero, I. et al. (1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)、PD-1(del Rio et al. (2005)Eur J Immunol. 35：3545-60)、およびICOS(Hutloff, A. et al. (1999)Nature 397：262-266)などのT細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することによっても、T細胞活性化のレベルを上昇させることができる。
【０２４３】
骨髄移植は、現在、造血系由来の様々な腫瘍を治療するために使用されている。移植片対宿主疾患がこの治療の結果であるが、治療的利益は、移植片対腫瘍応答から得ることができる。O8E遮断を用いて、ドナーの移植される腫瘍特異的T細胞の有効性を高めることができる。
【０２４４】
腫瘍に対する抗原特異的T細胞のために、エクスビボでの抗原特異的T細胞の活性化および増殖ならびにレシピエントへのこれらの細胞の養子移入を伴う、いくつかの実験的な治療プロトコールもある(Greenberg, R.およびRiddell, S.(1999)Science 285：546-51)。これらの方法はまた、CMVのような感染性病原因子に対するT細胞応答を活性化するのにも使用することができる。抗O8E抗体の存在下でのエクスビボ活性化により、養子移入されるT細胞の出現率および活性が高まると予想することができる。
【０２４５】
様々な腫瘍細胞におけるO8Eの発現を考慮すれば、本開示のヒト抗体、抗体組成物、および方法は、腫瘍形成性障害、例えば、O8Eを発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする障害(例えば、乳癌(例えば乳房細胞癌)、卵巣癌(例えば卵巣細胞癌)、および腎臓癌を含む)を有する対象を治療するのに使用することができる。本開示の方法を用いて治療され得る他の癌の例には、黒色腫(例えば、転移性の悪性黒色腫)、前立腺癌、結腸癌および肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、多発性骨髄腫、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小型切れ込み核細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心芽細胞性(entroblastic)/中心細胞性(cb/cc)濾胞性リンパ腫癌、B細胞性びまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症(AILD)様T細胞リンパ腫、HIV関連体腔リンパ腫、胎児性癌、上咽頭の未分化癌(例えばシュミンケ腫瘍)、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および他のB細胞リンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性の白血病、幼児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎う癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、神経膠芽腫、脳腫瘍、上咽頭癌、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境的に誘発される癌、ならびに前記癌の組合せが含まれる。本開示はまた、転移性癌の治療にも有用である。
【０２４６】
したがって、1つの態様において、本開示は、対象において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であり、治療的有効量の抗O8E抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法を提供する。典型的には、抗体は、(本明細書において説明するヒト抗ヒトO8E抗体のいずれかのような)ヒト抗O8E抗体である。さらにまたはその代わりに、抗体は、キメラ抗O8E抗体またはヒト化抗O8E抗体でよい。
【０２４７】
感染症
本開示の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝露された患者を治療するのに使用される。したがって、本開示の別の局面は、対象において感染症を治療する方法であり、対象の感染症が治療されるように、抗O8E抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、抗体は、(本明細書において説明するヒト抗O8E抗体のいずれかのような)ヒト抗ヒトO8E抗体である。さらにまたはその代わりに、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体でよい。
【０２４８】
上記の腫瘍への適用と同様に、抗体を介したO8E遮断を、単独で、またはワクチンと組み合わせてアジュバントとして使用して、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療的アプローチが特に有用であり得る病原体の例には、現在のところ効果的なワクチンが無い病原体、または従来のワクチンが十分に効果的とは言えない病原体が含まれる。これらには、HIV、肝炎(Hepatitis)(A、B、およびC)、インフルエンザ(Influenza)、ヘルペス(Herpes)、ジアルジア(Giardia)、マラリア(Malaria)、リーシュマニア(Leishmania)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas Aeruginosa)が含まれるがそれらに限定されるわけではない。PD-1遮断は、感染症の経過中に抗原の変化を示すHIVのような病原因子によって確立された感染症に対して特に有用である。これらの新規なエピトープは、抗ヒトO8Eの投与時に異物として認識され、したがって、O8Eを介した負のシグナルによって抑制されない強いT細胞応答が喚起される。
【０２４９】
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例には、HIV、肝炎(A、B、またはC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、およびCMV、エプスタイン・バー(Epstein-Barr)ウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス(cornovirus)、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルスが含まれる。
【０２５０】
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例には、クラミジア(chlamydia)、リケッチア細菌、ミコバクテリア(mycobacteria)、ブドウ球菌(staphylococci)、連鎖球菌(streptococci)、肺炎連鎖球菌(pneumonococci)、髄膜炎菌(meningococci)およびコノコッカス(conococci)、クレブシエラ(klebsiella)、プロテウス(proteus)、セラチア(serratia)、シュードモナス(pseudomonas)、レジオネラ(legionella)、ジフテリア(diphtheria)、サルモネラ(salmonella)、桿菌(bacilli)、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、およびライム病菌が含まれる。
【０２５１】
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例には、カンジダ属(Candida)(アルビカンス(albicans)、クルセイ(krusei)、グラブラタ(glabrata)、トロピカリス(tropicalis)など)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス(Aspergillus)属(フミガーツス(fumigatus)、ニガー(niger)など)、ケカビ目(Mucorales)の属(ケカビ属(mucor)、アブシディア属(absidia)、クモノスカビ属(rhizophus))、スポロスリックス・シェンキー(Sporothrix schenkii)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、ブラジル・パラコクシジオイデス(Paracoccidioides brasiliensis)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)およびヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)が含まれる。
【０２５２】
本開示の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性寄生虫のいくつかの例には、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、ネグレリア・フォーレリ(Naegleria fowleri)、アカントアメーバ(Acanthamoeba)種、ランブル鞭毛虫(Giardia lambia)、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)種、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ネズミバベシア(Babesia microti)、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)、クルーズ・トリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ドノバン・リーシュマニア(Leishmania donovani)、トキソプラズマ・ゴンジ(Toxoplasma gondi)、ブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)が含まれる。
【０２５３】
上記の方法すべてにおいて、O8E遮断は、サイトカイン治療(例えば、インターフェロン、GM-CSF、G-CSF、IL-2)のような他の形態の免疫療法、または腫瘍抗原の提示を向上させる二重特異性抗体療法と組み合わせることができる(例えば、Holliger(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448;Poljak(1994)Structure 2：1121-1123を参照されたい)。
【０２５４】
自己免疫反応
抗O8E抗体は、自己免疫応答を喚起および増幅し得る。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを用いた抗腫瘍応答の誘導により、多くの抗腫瘍応答が、抗自己反応性(前記のvan Elsasらの抗CTLA-4+GM-CSF改変B16黒色腫で観察された色素脱失;Trp-2をワクチン接種されたマウスにおける色素脱失(Overwijk, W. et al. (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96：2982-2987);TRAMP腫瘍細胞ワクチン(Hurwitz, A.(2000)前記)、黒色腫ペプチド抗原ワクチン接種によって誘発される自己免疫性前立腺炎、およびヒト臨床試験において観察された白斑(Rosenberg, SAおよびWhite, DE(1996)J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1)：81-4))を伴うことが明らかになっている。
【０２５５】
したがって、抗O8E遮断を様々な自己タンパク質と共に使用することを検討して、疾患治療のためにこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生じさせるワクチン接種プロトコールを考案することが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳中のアミロイド沈着物中にAβペプチドの不適切な蓄積を伴う;アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着物を除くことができる(Schenk et al., (1999)Nature 400：173-177)。
【０２５６】
アレルギーおよび喘息の治療用のIgE、ならびに関節リウマチ用のTNFαなど他の自己タンパク質もまた、標的として使用することができる。最後に、様々なホルモンに対する抗体反応を、抗O8E抗体の使用によって誘導することができる。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は、避妊のために使用することができる。特定の腫瘍の成長に必要とされるホルモンおよび他の可溶性因子に対する中和抗体応答は、考え得るワクチン接種標的とみなすこともできる。
【０２５７】
抗O8E抗体を使用するための前述の類似した方法は、アルツハイマー病のAβを含むアミロイド沈着物、TNFαのようなサイトカイン、およびIgEなど他の自己抗原の不適切な蓄積を有する患者を治療するために治療的自己免疫応答を誘導するのに使用することができる。
【０２５８】
ワクチン
抗O8E抗体は、抗O8E抗体と関心対象の抗原(例えばワクチン)の同時投与によって抗原特異的免疫応答を刺激するのに使用され得る。したがって、別の局面において、本開示は、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であり、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、(i)抗原、および(ii)抗O8E抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、抗体は、(本明細書において説明するヒト抗O8E抗体のいずれかのような)ヒト抗ヒトO8E抗体である。さらにまたはその代わりに、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体でよい。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または病原体由来の抗原でよい。このような抗原の非限定的な例には、上記の腫瘍抗原(もしくは腫瘍ワクチン)、または前述のウイルス、細菌、もしくは他の病原体に由来する抗原など上記のセクションで考察したものが含まれる。
【０２５９】
本開示の抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに免疫複合体)をインビボおよびインビトロで投与するのに適した経路は当技術分野において周知であり、かつ当業者によって選択され得る。例えば、抗体組成物は、注射(例えば、静脈内または皮下)によって投与することができる。使用する分子の適切な投薬量は、対象の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および/または配合に依存する。
【０２６０】
前述したように、本開示のヒト抗O8E抗体は、1種または複数種の他の治療物質、例えば、細胞障害性物質、放射毒性物質、または免疫抑制物質と同時投与してよい。抗体は、(イムノコンプレックスとして)作用物質に連結させてよく、または作用物質とは別に投与してよい。後者の場合(個別投与)、抗体は、作用物質の前、後、もしくは同時に投与してよく、または、他の公知の療法、例えば、抗癌療法、例えば、放射線療法と同時に投与してよい。このような治療物質には、とりわけ、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラスチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、デカルバジン(decarbazine)、およびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗腫瘍剤が含まれ、これらは、それら自体では、患者に毒性または準毒性のレベルでのみ有効である。シスプラスチンは、4週毎に1回、100mg/用量として静脈内投与され、アドリアマイシンは、21日毎に1回、60mg/ml〜75mg/mlの用量として静脈内投与される。本開示のヒト抗O8E抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法物質との同時投与により、ヒト腫瘍細胞に細胞障害作用をもたらす異なるメカニズムを介して機能する2種の抗癌物質が提供される。このような同時投与により、薬物耐性の発生、または抗体との反応性を低下させると考えられる腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
【０２６１】
本開示の抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性分子もしくは多重特異性分子、または免疫複合体)および使用するための取扱い説明書を含むキットもまた、本開示の範囲内である。キットは、少なくとも1種の付加的な試薬、または1種もしくは複数種の付加的な本開示のヒト抗体(例えば、第1のヒト抗体とは異なるO8E抗原中のエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体)をさらに含んでよい。キットは、典型的には、キットの内容物の所期の用途を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットの表面に、もしくはキットと共に供給されるか、または別の方法でキットに添えられる、任意の書面または記録材料を含む。
【０２６２】
併用療法
1つの態様において、本開示は、過剰増殖性疾患を治療するための方法であり、O8E抗体ならびにCTLA-4抗体および/またはPD-1抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。別の態様において、抗O8E抗体が治療量以下の用量で投与されるか、抗CTLA-4抗体および/もしくは抗PD-1抗体が治療量以下の用量で投与されるか、または、両方が治療量以下の用量で投与される。別の態様において、本開示は、免疫賦活性物質を用いた過剰増殖性疾患の治療に伴う有害事象を変更するための方法であり、抗O8E抗体ならびに治療量以下の用量の抗CTLA-4抗体および/または抗PD-1抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。一定の態様において、対象はヒトである。一定の態様において、抗CTLA-4抗体はヒト配列モノクローナル抗体10D1であり、かつ、抗PD-1抗体は、17D8、2D3、4H1、5C4、および4A11などのヒト配列モノクローナル抗体である。ヒト配列モノクローナル抗体10D1は、米国特許第6,984,720号において説明されているように、単離され、かつ構造的に特徴付けられている。ヒト配列モノクローナル抗体17D8、2D3、4H1、5C4、および4A11は、米国特許仮出願第60/679,466号において説明されているように、単離され、かつ構造的に特徴付けられている。
【０２６３】
本開示の抗O8E抗体、抗CTLA-4抗体、および抗PD-1モノクローナル抗体(mAb)ならびにヒト配列抗体は、従来のモノクローナル抗体方法、例えばKohlerおよびMilstein(1975)Nature 256：495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための任意の技術、例えばBリンパ球のウイルス形質転換または癌性形質転換を使用することができる。ハイブリドーマを調製するための1つの動物の系はマウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は、十分に確立された手順である。免疫化のプロトコールおよび融合用の免疫脾細胞を単離するための技術は、当技術分野において公知である。融合相手(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順もまた、公知である(例えば、HarlowおよびLane(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New Yorkを参照されたい)。
【０２６４】
抗体の組合せは、O8EならびにPD-1および/またはCTLA-4の遮断による過剰増殖性疾患に対する免疫応答の亢進に有用である。好ましい態様において、本開示の抗体は、ヒト抗体である。例えば、これらの分子は、培養状態の細胞にインビトロもしくはエクスビボで、またはヒト対象に、例えばインビボで投与して、様々な状況における免疫を増強することができる。したがって、1つの局面において、本開示は、対象における免疫応答を変更する方法であり、対象における免疫応答が変更されるように、本開示の抗体組合せまたはその抗原結合部分の組合せを対象に投与する段階を含む方法を提供する。好ましくは、応答は、増強されるか、刺激されるか、または上方調節される。別の態様において、本開示は、免疫賦活性治療物質を用いた過剰増殖性疾患の治療に伴う有害事象を変更する方法であり、抗O8E抗体および治療量以下の用量の抗CTLA-4抗体または抗PD-1抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【０２６５】
抗体によってO8E、PD-1、およびCTLA-4を遮断することにより、癌細胞に対する患者の免疫応答を亢進することができる。本開示の抗体を用いて増殖を阻害することができる癌には、典型的に免疫療法に応答性の癌が含まれる。本開示の併用療法を用いて治療するための癌の代表的な例には、黒色腫(例えば、転移性の悪性黒色腫)、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、および肺癌が含まれる。本開示の方法を用いて治療することができる他の癌の例には、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性の白血病、幼児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎う癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境的に誘発される癌、ならびに前記癌の組合せが含まれる。本開示はまた、転移性癌の治療にも有用である。
【０２６６】
一定の態様において、本明細書において考察する治療的抗体の組合せは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物として同時に投与してもよく、または、薬学的に許容される担体中に各抗体を含む別々の組成物として同時に投与してもよい。別の態様において、治療的抗体の組合せは、逐次的に投与することができる。例えば、抗O8E抗体および抗PD-1抗体を逐次的に投与することができ、例えば、抗O8E抗体を最初に投与し、抗PD-1抗体を2番目に投与するか、または抗PD-1抗体を最初に投与し、抗O8E抗体を2番目に投与することができる。さらに、併用療法の複数の用量が逐次的に投与される場合には、逐次投与の順序は、投与の各時点で反対にしてもよく、または同じ順序で維持してよい。逐次投与は、同時投与またはその任意の組合せと組み合わせてよい。例えば、抗O8E抗体および抗PD-1抗体の組合せの第1の投与は同時でよく、第2の投与は逐次的で、最初に抗O8E抗体、2番目に抗PD-1抗体でよく、かつ、第3の投与は、逐次的で、最初に抗PD-1抗体、2番目に抗O8E抗体などでよい。別の代表的な投薬計画は、最初に抗PD-1抗体、2番目に抗O8E抗体を逐次的に投与する第1の投与を含んでよく、かつ、後続の投与は同時でよい。
【０２６７】
任意で、抗O8E抗体ならびに抗CTLA-4抗体および/または抗PD-1抗体の組合せを、癌細胞、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む)、細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞などの免疫原性物質とさらに組み合わせてよい(He et al. (2004)J. Immunol. 173：4919-28)。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例には、gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1、および/もしくはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチド、またはサイトカインGM-CSFを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞(下記にさらに考察する)が含まれる。
【０２６８】
組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断は、ワクチン接種プロトコールとさらに組み合わせることができる。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S.(2000)Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring：60-62;Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring：300-302;Khayat, D.(2000)ASCO Educational Book Spring：414-428;Foon, K.(2000)ASCO Educational Book Spring：730-738を参照されたい。同様に、RestifoおよびSznol, Cancer Vaccines、61章、3023〜3043頁、DeVita et al. (編)、1997, Cancer：Principles and Practice of Oncology. 第5版も参照されたい)。これらの戦略のうち1つにおいて、ワクチンは、自己由来または同種異系の腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンは、GM-CSFを発現するように腫瘍細胞に形質導入する場合、最も効果的であることが示された。GM-CSFは、腫瘍ワクチンに対する抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている(Dranoff et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90：3539-43)。
【０２６９】
様々な腫瘍における遺伝子発現および大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原が定義された(Rosenberg(1999)Immunity 10：281-7)。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、および腫瘍が発生した細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原gp100、MAGE抗原、およびTrp-2である。より重要なことには、これらの抗原の多くは、宿主中に存在する腫瘍特異的T細胞の標的であることを示すことができる。一定の態様において、本明細書において説明する抗体組成物を使用する、組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断を、腫瘍において発現される組換えタンパク質および/またはペプチドの集団と組み合わせて使用して、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせることができる。これらのタンパク質は、通常は、免疫系によって自己抗原としてとらえられ、したがって、それらに対して寛容性である。腫瘍抗原はまた、染色体のテロメアの合成に必要とされ、かつ、85％超のヒト癌、およびごく限られた数の体細胞組織において発現されるタンパク質テロメラーゼも含み得る(Kim et al. (1994)Science 266：2011-2013)。(これらの体細胞組織は、様々な手段によって免疫攻撃から保護され得る)。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を改変するか、もしくは2つの無関係な配列(すなわち、フィラデルフィア染色体中のbcr-abl)間の融合タンパク質を作り出す体細胞変異が理由となって癌細胞において発現される「新生抗原」またはB細胞腫瘍由来のイディオタイプでもよい。
【０２７０】
他の腫瘍ワクチンには、ヒトパピローマウイルス(HPV)、肝炎ウイルス(HBVおよびHCV)、ならびにカポジヘルペス肉腫ウイルス(KHSV)などヒト癌に関係があるウイルスに由来するタンパク質が含まれ得る。O8E遮断と組み合わせて使用され得る別の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織それ自体から単離された、精製された熱ショックタンパク質(HSP)である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含み、かつこれらのHSPは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達が著しく効率的である(SuotおよびSrivastava(1995)Science 269：1585-1588;Tamura et al. (1997)Science 278：117-120)。
【０２７１】
樹状細胞(DC)は、抗原特異的応答を刺激する(prime)のに使用され得る強力な抗原提示細胞である。DCは、エクスビボで作製し、かつ様々なタンパク質抗原およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を添加することができる(Nestle et al. (1998)Nature Medicine 4：328-332)。また、遺伝的手段によってDCに形質導入して、これらの腫瘍抗原を同様に発現させることもできる。DCはまた、免疫化するために、腫瘍細胞に直接融合された(Kugler et al.(2000)Nature Medicine 6：332-336)。ワクチン接種の方法として、DC免疫化を、組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断と効果的にさらに組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。
【０２７２】
組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断はまた、標準的な癌治療とさらに組み合わせることもできる。例えば、組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断は、化学療法計画と効果的に組み合わせることができる。これらの場合、抗O8E抗体ならびに抗CTLA-4抗体および/または抗PD-1抗体の組合せで観察されるように、本開示の組合せと共に投与される他の化学療法薬の用量を減少させることができる可能性がある(Mokyr et al. (1998)Cancer Research 58：5301-5304)。O8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断と化学療法の併用を支持する科学的な理論的根拠は、大半の化学療法用化合物の細胞障害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路中の腫瘍抗原のレベルの上昇をもたらすはずであるというものである。細胞死を介して、組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断との相乗作用をもたらし得る他の併用療法には、放射線療法、外科手術、またはホルモン抑制が含まれる。これらの各プロトコールは、宿主における腫瘍抗原の供給源を作り出す。また、血管新生阻害物質を、組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断と組み合わせてもよい。血管新生の阻害は腫瘍細胞の死滅を招き、これは、宿主の抗原提示経路中に供給される腫瘍抗原の供給源にもなり得る。
【０２７３】
O8EならびにPD-1および/またはCTLA-4阻止抗体の組合せもまた、FcαまたはFcγ受容体を発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に導く二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる(例えば、米国特許第5,922,845号および同第5,837,243号を参照されたい)。二重特異性抗体は、2種の別々の抗原を標的とするために使用することができる。例えば、抗Fc受容体/抗腫瘍抗原(例えばHer-2/neu)二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に導くために使用されている。このターゲティングにより、腫瘍特異的応答がより効果的に活性化され得る。T細胞部のこれらの応答は、組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断の使用によって増強されると思われる。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体を使用することによって、DCに直接送達することもできる。
【０２７４】
別の実施例において、抗PD-1抗体および抗CTLA-4抗体の組合せは、Rituxan(登録商標)(リツキシマブ)、Herceptin(登録商標)(トラスツズマブ)、Bexxar(登録商標)(トシツモマブ)、Zevalin(登録商標)(イブリツモマブ)、Campath(登録商標)(アレムツズマブ)、Lymphocide(登録商標)(エプラツズマブ)、Avastin(登録商標)(ベバシズマブ)およびTarceva(登録商標)(エルロチニブ)などの抗腫瘍抗体と組み合わせて使用することができる。例として、理論に拘束されることを望むものではないが、抗癌抗体または毒素に結合させた抗癌抗体を用いた治療は、癌細胞の死滅(例えば腫瘍細胞)をもたらすことができ、O8E、CTLA-4、またはPD-1によって媒介される免疫応答を増強すると思われる。例示的な態様において、過剰増殖性疾患(例えば癌腫瘍)の治療は、同時にもしくは逐次的に、またはその任意の組合せで、抗O8E抗体ならびに抗PD-1抗体および/または抗CTLA-4抗体と組み合わせた抗癌抗体を含んでよく、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
【０２７５】
腫瘍は、多種多様なメカニズムによって、宿主の免疫監視から逃れる。これらのメカニズムの多くは、腫瘍によって発現され、かつ免疫抑制性であるタンパク質を不活性化することによって克服することができる。これらには、とりわけ、TGF-β(Kehrl, J. et al. (1986)J. Exp. Med. 163：1037-1050)、IL-10(Howard, M. およびO'Garra, A.(1992)Immunology Today 13：198-200)、およびFasリガンド(Hahne, M. et al. (1996)Science 274：1363-1365)が含まれる。別の実施例において、これらの各存在物に対する抗体を、抗O8Eならびに抗PD-1および/または抗CTLA-4の組合せとさらに組み合わせて、免疫抑制物質の作用を打ち消し、かつ宿主による抗腫瘍免疫応答を促進することができる。
【０２７６】
宿主の免疫応答性を活性化するのに使用され得る他の抗体を、抗O8Eならびに抗PD-1および/または抗CTLA-4の組合せと組み合わせてさらに使用することができる。これらには、DCの機能および抗原提示を活性化する、樹状細胞表面の分子が含まれる。抗CD40抗体は、効果的にT細胞のヘルパー活性の代わりをすることができ(Ridge, J. et al. (1998)Nature 393：474-478)、抗CTLA-4と組み合わせると有効であることが示されている(Ito, N. et al. (2000)Immunobiology 201(5)527-40)。OX-40(Weinberg, A. et al. (2000)Immunol 164：2160-2169)、4-1BB(Melero, I. et al. (1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)、PD-1(del Rio et al. (2005)Eur J Immunol. 35：3545-60)、およびICOS(Hutloff, A. et al. (1999)Nature 397：262-266)などのT細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することによっても、T細胞活性化のレベルを上昇させることができる。
【０２７７】
骨髄移植は、現在、造血系由来の様々な腫瘍を治療するために使用されている。移植片対宿主疾患がこの治療の結果であるが、治療的利益は、移植片対腫瘍応答から得ることができる。組み合わせたO8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断を用いて、ドナーの移植される腫瘍特異的T細胞の有効性を高めることができる。
【０２７８】
腫瘍に対する抗原特異的T細胞のために、エクスビボでの抗原特異的T細胞の活性化および増殖ならびにレシピエントへのこれらの細胞の養子移入を伴う、いくつかの実験的な治療プロトコールもある(Greenberg, R.およびRiddell, S.(1999)Science 285：546-51)。これらの方法はまた、CMVのような感染性病原因子に対するT細胞応答を活性化するのにも使用することができる。抗O8E抗体ならびに抗PD-1抗体および/または抗CTLA-4抗体の存在下でのエクスビボ活性化により、養子移入されるT細胞の出現率および活性が高まると予想することができる。
【０２７９】
本明細書において説明するように、器官は、抗CTLA-4抗体による治療後のGI管(下痢および結腸炎)ならびに皮膚(発疹および掻痒症)など、免疫賦活性治療用抗体による治療後に免疫に関係した有害事象を示し得る。例えば、結腸以外の胃腸管での免疫に関係した有害事象もまた、抗CTLA-4抗体治療後に、食道(食道炎)、十二指腸(十二指腸炎)、および回腸(回腸炎)において観察されている。
【０２８０】
一定の態様において、本開示は、免疫賦活性物質を用いた過剰増殖性疾患の治療に伴う有害事象を変更するための方法であり、抗O8E抗体および治療量以下の用量の抗CTLA-4抗体を対象に投与する段階を含む方法を提供する。例えば、本開示の方法は、非吸収性ステロイドを患者に投与することによって、免疫賦活性治療用抗体によって誘発される結腸炎または下痢の発生率を減少させる方法を提供する。免疫賦活性治療用抗体を与えられる任意の患者は、そのような抗体によって誘発される結腸炎または下痢を発症するリスクがあるため、この患者集団全体が、本開示の方法による治療法に適している。ステロイドは、炎症性腸疾患(IBD)を治療し、かつIBDの増悪を防ぐために投与されるが、IBDと診断されていない患者のIBDを予防する(発病率を減少させる)ためには使用されていない。ステロイド、たとえ非吸収性ステロイドでも、付随する著しい副作用のため、予防的使用は思いとどまらされる。
【０２８１】
別の態様において、O8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断の組合せ(すなわち、免疫賦活性治療的抗体の抗O8E抗体ならびに抗PD-1抗体および/または抗CTLA-4抗体)は、任意の非吸収性ステロイドの使用とさらに組み合わせることができる。本明細書において使用される場合、「非吸収性ステロイド」は、広範囲の初回通過代謝を示し、その結果、肝臓での代謝の後に、ステロイドの生物学的利用能が低い、すなわち約20％未満になる、糖質コルチコイドである。本開示の1つの態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、局所的に作用するグルココルチコステロイドであり、経口投与後に、主として肝臓によって著しく代謝される。ENTOCORT EC(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸への、および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発された、ブデソニドのpHおよび時間に依存的な経口製剤である。ENTOCORT EC(登録商標)は、回腸および/または上行結腸に関係する軽度〜中程度のクローン病の治療用に米国で認可されている。クローン病治療用のENTOCORT EC(登録商標)の通常の経口投薬量は、6mg/日〜9mg/日である。ENTOCORT EC(登録商標)は、腸中に放出された後、腸粘膜中に吸収され、かつ保持される。ENTOCORT EC(登録商標)は、腸粘膜標的組織を通過した後、肝臓中のシトクロムP450系によって著しく代謝されて、糖質コルチコイド活性がごくわずかな代謝産物になる。したがって、生物学的利用能は低い(約10％)。ブデソニドは生物学的利用能が低いため、著しい初回通過代謝のより少ない他の糖質コルチコイドと比べて、より良い治癒比が得られる。程度のより低い視床下部下垂体抑制を含む、ブデソニドがもたらす有害作用の数は、全身的に作用するコルチコステロイドよりも少ない。しかしながら、ENTOCORT EC(登録商標)を長期的に投与すると、副腎皮質機能亢進症および副腎抑制など全身的な糖質コルチコイド作用を得ることができる。PDR 第58版2004;608-610を参照されたい。
【０２８２】
さらに別の態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせた、O8EならびにPD-1および/またはCTLA-4遮断の組合せ(すなわち、免疫賦活性治療的抗体の抗O8E抗体ならびに抗PD-1抗体および/または抗CTLA-4抗体)は、サリチラートとさらに組み合わせることができる。サリチラートには、例えば、スルファサラジン(AZULFIDINE(登録商標)、Pharmacia&UpJohn);オルサラジン(DIPENTUM(登録商標)、Pharmacia&UpJohn);バルサラジド(COLAZAL(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.);およびメサラミン(ASACOL(登録商標)、Procter&Gamble Pharmaceuticals;PENTASA(登録商標)、Shire US;CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm、Inc.;ROWASA(登録商標)、Solvay)などの5-ASA薬剤が含まれる。
【０２８３】
本開示の方法によれば、抗O8E抗体ならびに抗PD-1抗体および/または抗CTLA-4抗体、ならびに非吸収性ステロイドと組み合わせて投与されるサリチラートには、免疫賦活性抗体によって誘発される結腸炎の発病率を減少させるための、サリチラートおよび非吸収性ステロイドの任意の重複投与または逐次投与が含まれ得る。したがって、例えば、本開示による免疫賦活性抗体によって誘発される結腸炎の発病率を減少させるための方法は、サリチラートおよび非吸収性ステロイドを同時に、もしくは逐次的に(例えば、サリチラートを非吸収性ステロイドの6時間後に投与する)、またはその任意の組合せで投与する段階を含む。さらに、本開示によれば、サリチラートおよび非吸収性ステロイドは、同じ経路によって(例えば、両方が経口投与される)、または異なる経路によって(例えば、サリチラートが経口投与され、非吸収性ステロイドが直腸に投与される)投与してよく、これらの経路は、抗O8E抗体、抗PD-1抗体、および抗CTLA-4抗体と投与するのに使用される経路と異なってよい。
【０２８４】
補体に結合するIgG1、IgG-2、もしくはIgG-3、またはIgM由来の部分のような、補体結合部位を有する本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに免疫複合体)もまた、補体の存在下で使用することができる。1つの態様において、本開示の結合物質を有する標的細胞および適切なエフェクター細胞を含む細胞集団のエクスビボでの処置は、補体または補体を含む血清の添加によって補完することができる。本開示の結合物質でコーティングされた標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善することができる。別の態様において、本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子)でコーティングされた標的細胞を、補体によって溶解させることもできる。さらに別の態様において、本開示の組成物は、補体を活性化しない。
【０２８５】
本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子および二重特異性分子、ならびに免疫複合体)はまた、補体と共に投与することもできる。したがって、ヒト抗体、多重特異性分子もしくは二重特異性分子、および血清、または補体を含む組成物は、本開示の範囲内である。これらの組成物は、補体が、ヒト抗体、多重特異性分子、または二重特異性分子の極めて近くに位置しているという点で、有利である。あるいは、本開示のヒト抗体、多重特異性分子、または二重特異性分子、および補体または血清は、別々に投与することもできる。
【０２８６】
したがって、本開示の抗体組成物で治療する患者に、ヒト抗体の治療的効果を向上させるか、または増強する細胞障害性物質または放射毒性物質など別の治療物質を、(本開示のヒト抗体の投与の前、同時、または後に)さらに投与することができる。
【０２８７】
他の態様において、例えば、対象をサイトカインで処置することによって、FcγまたはFcγ受容体の発現または活性を調節する、例えば、増強または阻害する作用物質で、対象をさらに処置することができる。多重特異性分子を用いた治療期間中に投与するための好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、および腫瘍壊死因子(TNF)が含まれる。
【０２８８】
本開示の組成物(例えば、ヒト抗体、多重特異性分子、および二重特異性分子)は、FcγRまたはO8Eを発現する細胞を標的とするために、例えば、そのような細胞を標識するために使用することもできる。このような用途のために、結合物質を、検出できる分子に連結することができる。したがって、本開示は、FcγRのようなFc受容体またはO8Eを発現する細胞をエクスビボまたはインビトロで位置決定するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助因子でよい。
【０２８９】
特定の態様において、本開示は、試料中のO8E抗原の存在を検出するか、またはO8E抗原の量を測定するための方法であり、抗体またはその一部分とO8Eとの複合体の形成を可能にさせる条件下で、試料および対照試料を、O8Eに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる段階を含む方法を提供する。次いで、複合体の形成を検出し、その際、試料との複合体形成が対照試料と比べて異なる場合、試料中にO8E抗原が存在することが暗示される。
【０２９０】
他の態様において、本開示は、対象におけるO8Eの媒介による障害を治療するための方法を提供する。
【０２９１】
さらに別の態様において、本開示の免疫複合体は、標的化合物(例えば、治療物質、標識、サイトトキシン、放射性毒素、免疫抑制薬など)を、それらの化合物を抗体に連結することによって、O8Eの細胞表面受容体を有する細胞に導くために使用することができる。例えば、抗O8E抗体は、米国特許出願公開第10/160,972号、同第10/161,233号、同第10/161,234号、同第11/134,826号、同第11/134,685号、および米国特許仮出願第60/720,499号において説明されているUPT、ならびに/または、米国特許第6,281,354号および同第6,548,530号、米国特許出願公開第20030050331号、同第20030064984号、同第20030073852号、および同第20040087497号において説明されているか、もしくは、WO 03/022806において公開されている、毒素化合物のいずれかに結合させることができる(これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。したがって、本開示は、(例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補助因子など検出可能な標識を用いて)、O8Eを発現する細胞をエクスビボまたはインビボで位置決定するための方法も提供する。あるいは、免疫複合体は、サイトトキシンまたは放射性毒素をO8Eに導くことによって、O8Eの細胞表面受容体を有する細胞を死滅させるのに使用することもできる。
【０２９２】
本開示は、さらに限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本出願の全体にわたって引用されるすべての図面、ならびにすべての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【０２９３】
実施例
実施例1
O8Eに対するヒトモノクローナル抗体の作製
本実施例では、ヒトO8E(別名B7H4、B7S1、およびB7x)に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の作製を開示する。
【０２９４】
抗原
CHO細胞およびHEK-293細胞を、標準的な組換えトランスフェクション法を用いて、O8Eによりトランスフェクトし、かつ、免疫化のための抗原として使用した。さらに、組換えO8Eのみも、免疫化のための抗原として使用した。
【０２９５】
トランスジェニックなHuMAb Mouse(登録商標)およびKM Mouse(登録商標)
O8Eに対する完全なヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体遺伝子をそれぞれ発現する、トランスジェニックHuMAb Mouse(登録商標)のHCo7系統およびHCo12系統、ならびに染色体導入されたトランスジェニックマウスのKM系統を用いて調製した。これらの各マウス系統において、内因性のマウスκ軽鎖遺伝子は、Chen et al. (1993)EMBO J. 12：811-820で説明されているように、ホモ接合性に破壊されており、かつ内因性のマウス重鎖遺伝子は、PCT公報WO 01/09187の実施例1で説明されているように、ホモ接合性に破壊されている。これらの各マウス系統は、Fishwild et al. (1996)Nature Biotechnology 14：845-851において説明されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子のKCo5を有する。HCo7系統は、米国特許第5,545,806号、同第5,625,825号、および同第5,545,807号に記載されているHCo7ヒト重鎖導入遺伝子を有する。HCo12系統は、PCT公報WO 01/09187の実施例2に記載されているヒト重鎖導入遺伝子のHCo12を有する。KM Mouse(登録商標)系統は、PCT公報WO 02/43478に記載されているSC20導入染色体を含む。
【０２９６】
HuMAbおよびKM免疫化
O8Eに対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するために、HuMAb Mouse(登録商標)およびKM Mouse(登録商標)のマウスを、O8EをトランスフェクトしたCHO細胞、O8EをトランスフェクトしたHEK293細胞、および/または精製した組換えO8Eタンパク質で免疫化した。HuMAb Mouse(登録商標)に対する一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N. et al(1994)Nature 368(6474)：856-859;Fishwild, D. et al. (1996)Nature Biotechnology 14：845-851、およびPCT公報WO 98/24884に記載されている。マウスは、抗原の初回注入時に6〜16週齢であった。O8E タンパク質の精製した組換え調製物(5μg〜50μg)を用いて、HuMAbマウス(商標)およびKMマウス(商標)を免疫化した。
【０２９７】
トランスジェニックマウスを、完全フロイントアジュバントアジュバント中の抗原で、腹腔内(IP)または皮下(Sc)のいずれかで2回免疫化し、続いて、不完全フロイントアジュバント中の抗原で、IPまたはSCで3日〜21日(最多で合計11回の免疫化)免疫化した。免疫応答は、眼窩後からの採血によってモニターした。(後述のように)ELISAによって血漿をスクリーニングし、かつ、十分な力価の抗O8Eヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用した。屠殺および膵臓切除の3日前および2日前に、静脈内にマウスに抗原を追加免疫した。典型的には、各抗原に対して10回〜35回の融合を実施した。数十匹のマウスを各抗原に対して免疫化した。
【０２９８】
抗O8E抗体を産生するHuMbマウス(商標)またはKMマウス(商標)の選択
O8Eに結合した抗体を産生するHuMabマウス(商標)またはKMマウス(商標)を選択するために、免疫化したマウスに由来する血清を、Fishwild, D. et al. (1996)(前記)によって説明されているように、ELISAによって試験した。手短に言えば、マイクロタイタープレートを、PBS中に1μg/ml〜2μg/mlで溶かした精製組換えO8E(50μl/ウェル)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートし、次いで、200μl/ウェルのPBS/Tween(0.05％)中5％ニワトリ血清でブロッキングした。O8E免疫化マウス由来の血漿の希釈物を各ウェルに添加し、かつ周囲温度で1時間〜2時間インキュベートした。これらのプレートをPBS/Tweenで洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合させたヤギ抗ヒトIgG Fcポリクローナル抗体と共に、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、これらのプレートをABTS基質(Sigma、A-1888、0.22mg/ml)を用いて発色させ、かつ分光光度計により、OD415〜495で解析した。最も高力価の抗O8E抗体を示したマウスを融合に使用した。後述するように融合を実施し、かつ、ハイブリドーマ上清の抗O8E活性をELISAおよびFACSによって試験した。
【０２９９】
O8Eに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
HuMabマウス(商標)およびKMマウス(商標)から単離したマウス脾細胞を、標準的なプロトコールに基づいてPEGを用いて、PEGによってマウス骨髄腫細胞株に融合させた。次いで、結果として生じるハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、50％PEG(Sigma)を用いて、4分の1の数のSP2/0非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1581)に融合させた。細胞を約1×105細胞/ウェルで平底マイクロタイタープレート中に播種し、続いて、10％ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、10％ P388DI(ATCC、CRL TIB-63)馴化培地、DMEM(Mediatech、CRL 10013、高グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含む)および5mM HEPES中3％〜5％オリゲン(origen)(IGEN)、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50mg/mlゲンタマイシン、および1×HAT(Sigma、CRL P-7185)を含む選択培地中で約2週間インキュベーションした。1〜2週間後、細胞を、HATをHTに交換した培地中で培養した。次いで、個々のウェルを、(前述の)ELISAおよびFACSにより、ヒト抗O8EモノクローナルIgG抗体についてスクリーニングした。次いで、陽性クローンを、O8E組換えタンパク質においてはELISAによって、またはO8Eを発現する細胞、例えばO8EをトランスフェクトされたCHO細胞においてはFACSによって、O8E陽性抗体についてスクリーニングした。手短に言えば、O8Eを発現する細胞を組織培養フラスコから新しく採取し、かつ、単細胞懸濁液を調製した。O8Eを発現する細胞懸濁液を、直接、またはPBS中1％パラホルムアルデヒドで固定した後に、1次抗体で染色した。約100万個の細胞を、0.5％ BSAおよび50μg/ml〜200μg/mlの1次抗体を含むPBS中に再懸濁し、かつ、氷上で30分間インキュベートした。これらの細胞を、0.1％BSA、0.01％NaN3を含むPBSで2回洗浄し、1：100で希釈したFITC結合ヤギ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)100μl中に再懸濁し、かつ、氷上でさらに30分間インキュベートした。これらの細胞を再び2回洗浄し、洗浄緩衝液0.5ml中に再懸濁し、かつ、FACSCaliburサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)において蛍光染色を解析した。
【０３００】
大規模なハイブリドーマ増殖が一度起こったら、通常10日〜14日後に培地を観察した。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種し、再びスクリーニングし、かつ、ヒトIgGについて依然として陽性である場合は、抗O8Eモノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングした。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、さらに特徴付けするために組織培養用培地中で少量の抗体を生成させた。
【０３０１】
ハイブリドーマクローン1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12を、さらに解析するために選択した。
【０３０２】
実施例2
ヒトモノクローナル抗体1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12の構造的特徴付け
本実施例では、O8Eに特異的に結合する5種の(5)ヒトモノクローナル抗体の配列解析を開示する。
【０３０３】
1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードしているcDNA配列を、標準的なPCR技術を用いて、それぞれ、1G11、2A7、2F9、12E1、および13D12ハイブリドーマから獲得し、かつ、標準的なDNA配列決定技術を用いて配列決定した。
【０３０４】
1G11の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図1A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：41およびSEQ ID NO：1に示す。
【０３０５】
1G11の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図1B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：46およびSEQ ID NO：6に示す。
【０３０６】
1G11重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、1G11重鎖が、ヒト生殖系列VH4-34由来のVHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH4-34配列に対する1G11 VH 配列のアライメントを図6に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて1G11 VH配列をさらに解析して、図1Aおよび図6、ならびに、それぞれSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、およびSEQ ID NO：21に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３０７】
1G11軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、1G11軽鎖が、ヒト生殖系列VK A27由来のVLセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK A27配列に対する1G11 VL配列のアライメントを図9に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて1G11 VL配列をさらに解析して、図1Bおよび図9、ならびに、それぞれSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：31、およびSEQ ID NO：36に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３０８】
2A7の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図2A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：2に示す。
【０３０９】
2A7の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図2B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：47およびSEQ ID NO：7に示す。
【０３１０】
2A7重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、2A7重鎖が、ヒト生殖系列VH3-53由来のVHセグメントおよびヒト生殖系列JH6b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH3-53配列に対する2A7 VH配列のアライメントを図7に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて2A7 VH配列をさらに解析して、図2Aおよび図7、ならびに、それぞれSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、およびSEQ ID NO：22に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３１１】
2A7軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、2A7軽鎖が、ヒト生殖系列VK A27由来のVLセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK A27配列に対する2A7 VL配列のアライメントを図9に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて2A7 VL配列をさらに解析して、図2Bおよび図9、ならびに、それぞれSEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32、およびSEQ ID NO：37に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３１２】
2F9の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図3A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：43およびSEQ ID NO：3に示す。
【０３１３】
2F9の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図3B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：48およびSEQ ID NO：8に示す。
【０３１４】
2F9重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、2F9重鎖が、ヒト生殖系列VH3-53由来のVHセグメントおよびヒト生殖系列JH6b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH3-53配列に対する2F9 VH 配列のアライメントを図7に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて2F9 VH配列をさらに解析して、図3Aおよび図7、ならびに、それぞれSEQ ID NO：13、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：23に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３１５】
2F9軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、2F9軽鎖が、ヒト生殖系列VK A27由来のVLセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK A27配列に対する2F9 VL配列のアライメントを図9に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて2F9 VL配列をさらに解析して、図3Bおよび図9、ならびに、それぞれSEQ ID NO：28、SEQ ID NO：33、およびSEQ ID NO：38に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３１６】
12E1の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図4A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：44およびSEQ ID NO：4に示す。
【０３１７】
12E1の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図4B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：49およびSEQ ID NO：9に示す。
【０３１８】
12E1重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、12E1重鎖が、ヒト生殖系列VH 3-9由来のVHセグメント、ヒト生殖系列3-10由来のDセグメント、およびヒト生殖系列JH 6b由来のJHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH3-9配列に対する12E1 VH 配列のアライメントを図8に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて12E1 VH配列をさらに解析して、図3Aおよび図8、ならびに、それぞれSEQ ID NO：14、SEQ ID NO：19、およびSEQ ID NO：24に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３１９】
12E1軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、12E1軽鎖が、ヒト生殖系列VK L6由来のVLセグメントおよびヒト生殖系列JK1由来のJKセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK L6配列に対する12E1 VL配列のアライメントを図10に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて12E1 VL配列をさらに解析して、図3Bおよび図10、ならびに、それぞれSEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：39に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３２０】
13D12の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図5A、ならびにそれぞれSEQ ID NO：45およびSEQ ID NO：5に示す。
【０３２１】
13D12の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図5B、ならびにそれぞれSEQ ID NO：50およびSEQ ID NO：10に示す。
【０３２２】
13D12重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することにより、13D12重鎖が、ヒト生殖系列VH4-34由来のVHセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VH4-34配列に対する13D12 VH配列のアライメントを図6に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて13D12 VH配列をさらに解析して、図5Aおよび図6、ならびに、それぞれSEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、およびSEQ ID NO：25に示すように、重鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３２３】
13D12軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することにより、13D12軽鎖が、ヒト生殖系列VK A27由来のVLセグメントを使用していることが実証された。生殖系列VK A27配列に対する13D12 VL配列のアライメントを図9に示す。CDR領域を決定するKabatシステムを用いて13D12 VL配列をさらに解析して、図5Bおよび図9、ならびに、それぞれSEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、およびSEQ ID NO：40に示すように、軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、およびCD3領域に線を引いた。
【０３２４】
実施例3
抗O8Eヒトモノクローナル抗体の結合特異性の特徴付け
本実施例では、O8Eに対する結合の特異性を検査するために標準的なELISAによって実施した、免疫精製したO8Eに結合する際の抗O8E抗体の比較を開示する。
【０３２５】
Hisタグ付き組換えO8Eおよびmycタグ付き組換えO8Eでプレートを一晩コーティングし、次いで、抗O8Eヒトモノクローナル抗体2A7、12E1、および13D12に対する結合に関して試験した。標準的なELISA手順を実施した。抗O8Eヒトモノクローナル抗体を1μg/mlの濃度で添加し、かつ、1：2の段階希釈で力価を下げた(titrate down)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合させたヤギ抗ヒトIgG(Fcまたはκ鎖に特異的な)ポリクローナル抗体を二次抗体として使用した。
【０３２６】
プロテインAを使用するクロマトグラフィーによって、B7H4-Ig構築物をトランスフェクトした293T細胞の上清から組換えB7H4-Igを精製した。ELISAプレートをヒト抗体でコーティングし、続いて、精製タンパク質を添加し、次いで、ウサギ抗B7H4抗血清を用いて検出した。図11Aを参照されたい。2A7アフィニティーカラムを使用するクロマトグラフィーによって、Penta-B7H4-C9構築物をトランスフェクトした293T細胞の上清から、C-9タグを有する組換えPenta-B7H4タンパク質を精製した。ELISAプレートを抗マウスFc、続いてモノクローナル抗C9(0.6ug/ml)でコーティングし、次に、図のようにPenta-B7H4、次いで1ug/mlのヒト抗体で滴定した。抗マウスFc、続いてM-抗-C9(0.6ug/ml)でコーティングし、次に、図のようにPenta-O8E、次いで1ug/mlのヒト抗体で滴定した。図11Bを参照されたい。
【０３２７】
抗O8Eヒトモノクローナル抗体2A7、12E1、および13D12は、高い特異性でO8Eに結合した。
【０３２８】
実施例4
乳癌癌細胞株の表面で発現されるO8Eに結合する抗O8E抗体の特徴付け
本実施例では、フローサイトメトリーによる、CHO-O8E(別名B7H4、B7S1、およびB7x)トランスフェクタントおよび細胞表面でO8Eを発現する乳房細胞癌細胞への抗O8E抗体の結合に関する試験を開示する。
【０３２９】
O8EをトランスフェクトされたCHO細胞株ならびに乳房細胞癌細胞株SKBR3(ATCCアクセッション番号HTB-30)を抗体結合に関して試験した。1×105個の細胞を濃度1μg/mlの2A7と共にインキュベートすることによって、HuMAb 2A7抗O8Eヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。これらの細胞を洗浄し、かつ、FITC標識抗ヒトIgG Abを用いて結合を検出した。FACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。これらの結果を図12および図13に示す。
【０３３０】
これらのデータにより、抗O8E HuMAbが、O8Eを発現するCHO細胞、および例示的な乳房細胞癌細胞株に結合することが実証される。
【０３３１】
実施例5
抗O8Eモノクローナル抗体の結合親和性のスキャッチャード解析
本実施例では、スキャッチャード解析を用いた、O8EをトランスフェクトしたHEK細胞株に対するヒトモノクローナル抗体1G11、2F9、2A7、12E1、および13D12モノクローナル抗体の結合親和性の試験を開示する。
【０３３２】
標準的な技術を用いて、HEK細胞に完全長O8Eをトランスフェクトし、かつ、10％ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI培地中でそれらの細胞を増殖させた。(図12は、2A7ヒト抗O8Eモノクローナル抗体を用いたこれらのHEK-O8E細胞のFACS解析を示す)。細胞をトリプシン処理し、Trisベースの結合緩衝液(24mM Tris pH7.2、137mM NaCl、2.7mM KCl、2mMグルコース、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1％BSA)中で1回洗浄し、かつ、これらの細胞を結合緩衝液中で2×106細胞/mlに調整した。Milliporeプレート(MAFB NOB)を、水に溶かした1％脱脂乾燥乳でコーティングし、かつ、4℃で一晩保存した。プレートを、結合緩衝液0.2mlで3回洗浄した。50マイクロリットルの緩衝液のみを、最大結合ウェルに添加した(全結合量)。25マイクロリットルの緩衝液のみを、対照ウェルに添加した(非特異的結合)。様々な濃度の125I抗O8E抗体を、体積25μlで、すべてのウェルに添加した。(一部の場合において、非標識材料が入手可能ではなかったため、FITC標識抗体を滴定用に使用した。これらの場合、結合は弱められる場合がある。)。100倍過剰な様々な濃度の非標識抗体を、体積25μlで、対照ウェルに添加し、かつ、結合緩衝液中のO8EをトランスフェクトさせたCHO細胞25μl(2×106細胞/ml)をすべてのウェルに添加した。これらのプレートを、200RPM、4℃で2時間、振とう機上でインキュベートした。インキュベーションの完了時に、Milliporeプレートを、冷洗浄緩衝液(24mM Tris pH 7.2、500mM NaCl、2.7mM KCl、2mMグルコース、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1％ BSA)0.2 mlで3回洗浄した。フィルターを取り出し、ガンマカウンター中で計数した。Prismソフトウェア(San Diego、CA)により、単一部位結合パラメーターを用いて、平衡結合の評価を実施した。
【０３３３】
S字形用量反応を用いた非線形回帰(PRIZM(商標))によってデータを解析し、EC50を算出し、これを用いて、表2に示すように抗体をランク付けした。これらの実験において算出したEC50値は、抗体親和性の定性的指標であり、O8Eに対する絶対的親和性を表さない。
【０３３４】
（表２）
2009518049.tif 000011
*最低値および最高値は、不完全な曲線を補うための定数として調整した。
【０３３５】
実施例6
抗O8Eモノクローナル抗体の内部移行
本実施例では、Hum-Zap内部移行アッセイ法を用いた、O8Eを発現するCHO細胞および乳癌細胞中に抗O8E HuMAbが内部移行する能力に関する試験を実証する。Hum-Zapアッセイ法では、毒素サポリンに結合されたヒトIgGに対する親和性を有する二次抗体の結合を介して、ヒト一次抗体の内部移行に関して試験する。
【０３３６】
O8Eを発現する乳癌癌細胞株SKBR3を、100μlウェル中に1.25×104細胞/ウェルで一晩播種した。抗O8E HuMAb抗体1G11、2F9、2A7、12E1、または13D12を、濃度10pMでウェルに添加した。O8Eに対して非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。Hum-Zap(Advanced Targeting Systems、San Diego、CA、IT-22-25)を濃度11nMで添加し、かつ、プレートを72時間インキュベートさせた。次いで、これらのプレートを1.0μCiの3H-チミジンで24時間パルス標識し、回収し、かつ、Top Count Scintillation Counter(Packard Instruments、Meriden、CT)で読み取った。これらの結果を下記の表3および図14〜図15に示す。抗O8E抗体1G11、2F9、2A7、12E1、および13D12は、O8Eを発現するSKBR3乳癌癌細胞において、3H-チミジン取込みの抗体濃度に依存的な減少を示した。
【０３３７】
これらのデータにより、抗O8E抗体1G11、2F9、2A7、12E1、および13D12が、乳癌癌細胞株に内部移行することが実証される。
【０３３８】
（表３）
2009518049.tif 000012
【０３３９】
内部移行効率のランク付けは、SKBR3における実験3回およびCHO-O8Eにおける実験2回の結果を平均した。CHO- O8Eに対する結合のEC50と共に、内部移行のランク付けを表4および表5に示す。結果により、内部移行効率が結合親和性と直接的には相関していないことが示され、これにより、内部移行がエピトープ依存性であることが示唆される。
【０３４０】
（表４）SBKR3乳癌細胞株における内部移行を基準に並び替えた内部移行効率
2009518049.tif 000013
【０３４１】
（表５）CHO-O8E細胞株における内部移行を基準に並び替えた内部移行効率
2009518049.tif 000014
【０３４２】
CHO-O8Eにおけるサポリン結合体の内部移行活性を、ヒトモノクローナル抗体2A7、2F9、および1G11を用いて、約500pM〜1pMの範囲に渡る用量反応を用いて測定した。図14に示すように、内部移行は、非常に効率的で、EC50はpMの低い範囲にあった。CHO親細胞株およびHu IgG-SAPを陰性対照として使用し、有意なバックグラウンド毒性も非特異的な内部移行も示さなかった。SAPに対する直接的な抗O8E結合体をSKBR3細胞と共に使用した。Ig-SAP用量の関数としての内部移行率(％)(対照に対する)を図15に示す。
【０３４３】
実施例7
乳房細胞癌細胞株に対する、毒素を結合させた抗O8E抗体の細胞死滅化の評価
本実施例では、毒素に結合させた抗O8Eモノクローナル抗体がO8E+乳房細胞癌細胞株を死滅させる能力に関する、細胞増殖アッセイ法における試験を開示する。
【０３４４】
抗O8E HuMAb抗体1G11、2F9、2A7、12E1、または13D12を、ペプチジルリンカー、ヒドラゾンリンカー、またはジスルフィドリンカーなどのリンカーを介して、毒素に結合させてよい。SKBR3のようなO8Eを発現する乳癌癌細胞株を、約1×104細胞/ウェル〜3×104細胞/ウェルの間で、100μlウェル中に3時間、播種する。抗O8E抗体-毒素結合体を、開始濃度30nMでウェルに添加し、かつ、1：3の段階希釈で力価を下げる。O8Eに対して非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用する。プレートを69時間インキュベートさせる。次いで、これらのプレートを1.0μCiの3H-チミジンで24時間パルス標識し、回収し、かつ、Top Count Scintillation Counter(Packard Instruments、Meriden、CT)で読み取る。抗O8E抗体は、O8Eを発現する乳癌癌細胞において、3H-チミジン取込みの抗体-毒素濃度に依存的な減少を示すことが予想される。このデータにより、抗O8E抗体1G11、2F9、2A7、12E1、および13D12が、毒素に結合された場合に、乳癌癌細胞に対して潜在的に細胞障害性であることが実証される。
【０３４５】
実施例8
抗O8E抗体のADCC活性の評価
本実施例では、抗O8Eモノクローナル抗体がエフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞障害(ADCC)によってO8E+細胞株を死滅させる能力に関する、蛍光細胞障害性アッセイ法における試験を開示する。
【０３４６】
ヒトエフェクター細胞は、以下のようにして、全血から調製した。標準的なフィコールパック(Ficoll-paque)分離法によって、ヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞を精製した。これらの細胞を、10％FBSおよび200U/mlヒトIL-2を含有するRPMI1640培地中に再懸濁し、かつ、37℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの細胞を採取し、培地中で4回洗浄し、かつ、2×107細胞/mlで再懸濁した。標的のO8E+細胞を、1×106標的細胞/mL当たりBATDA 2.5μlのBATDA試薬(Perkin Elmer、Wellesley、MA)と共に、37℃で20分間インキュベートした。標的細胞を4回洗浄し、遠心沈殿させ、かつ、最終体積を1×105細胞/mlに調整した。
【０３４７】
以下のようにDelfia蛍光発光解析を用いて、O8E+細胞株SKBR3ならびにO8EをトランスフェクトされたSKOV3 細胞株を、ヒト抗O8Eモノクローナル抗体に対する抗体特異的なADCCに関して試験した。各標的細胞株(標識した標的細胞100μl)を、エフェクター細胞50μlおよび抗体50μlと共にインキュベートした。標的とエフェクターの比1：50を、実験の全体を通して使用した。すべての研究において、ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。2000rpmでのパルススピンおよび37℃で1時間のインキュベーションの後、上清を採取し、再び高速で遠心し、かつ、上清20μlを平底プレートに移し、そこへEu溶液180μl(Perkin Elmer、Wellesley、MA)を添加し、RubyStarリーダー(BMG Labtech)中で読み取った。溶解率(％)を以下のようにして算出した：(試料からの放出量−自発的放出量*100)/(最大放出量−自発的放出量)。式中、自発的放出量は、標的細胞のみを含むウェルからの蛍光であり、最大放出量は、標的細胞を含み、2％ Triton-Xで処理されたウェルからの蛍光である。抗O8E抗体1G11、2F9、および2A7による SKBR3細胞に対する細胞障害性の溶解率(％)を、図17に示す。抗O8E抗体1G11、2F9、および2A7によるO8EをトランスフェクトされたSKOV3細胞株に対する細胞障害性の溶解率(％)を、図18に示す。抗O8E抗体2F9および2A7によるSKBR3細胞に対する濃度依存的な細胞障害性溶解率(％)を図19に示す。O8E+を発現する細胞株SKBR3およびSKOV3-O8Eの両方とも、HuMAb抗O8E抗体1G11、2F9、および2A7による、抗体を介した細胞障害性を示した。これらのデータにより、HuMAb抗O8E抗体が、O8E+を発現する細胞に対して特異的な細胞障害性を示すことが実証される。
【０３４８】
実施例9
裸の抗O8E抗体およびサイトトキシン結合抗O8E抗体を用いた、インビボの腫瘍異種移植モデルの治療
本実施例では、腫瘍増殖に対する抗体のインビボでの効果を検査するための、毒素を結合させた抗O8E抗体を用いた、乳房細胞癌腫瘍を移植されたマウスのインビボでの治療を開示する。
【０３４９】
標準的な実験室手順を用いて、SKBR3細胞または他の適切な乳房細胞癌細胞をインビトロで増殖させる。6週齢〜8週齢の間の雄のNcr無胸腺ヌードマウス(Taconic、Hudson、NY)の右側腹部に、マウス1匹当たりPBS/Matrigel(1：1)0.2mlに溶かした7.5×106個のACHN細胞またはA-498細胞を皮下移植する。移植後、毎週2回、マウスを計量し、かつ、電気式カリパスを用いて、腫瘍の3寸法を測定する。高さ×幅×長さとして、腫瘍体積を算出する。平均270mm3のACHN腫瘍または平均110mm3のA498腫瘍を有するマウスを無作為に処置群に分ける。これらのマウスに、PBSビヒクル、毒素を結合させたアイソタイプ対照抗体、または毒素を結合させた抗O8E HuMAbを0日目に腹腔内投与する。本開示の抗体に結合させることができる毒素化合物の例は、MEDX-0034US4に指定された係属中の米国特許出願において説明している。抗O8E HuMAbを与えられたマウスを、3種の異なる毒素化合物を用いて試験する。投与後60日間、マウスの腫瘍増殖をモニターする。腫瘍が腫瘍の終点(2000mm3)に達したら、マウスを安楽死させる。毒素に結合された適切な抗O8E抗体は、腫瘍の終点体積(2000mm3)に達するまでの平均時間を延長させ、かつ、腫瘍増殖の進行を遅らせる。したがって、このような抗O8E抗体-毒素結合体を用いた処置は、腫瘍増殖に対してインビボでの直接的な阻害効果を有する。
【０３５０】
実施例10
抗O8E HuMAb 2A7を用いた免疫組織化学
本実施例では、正常なマウス組織アレイ(IMGENEX Histo-Array;Imgenex Corp., San Diego, CA)を用いた免疫組織化学によって抗O8E HuMAb 2A7がO8Eを認識することを開示する。
【０３５１】
免疫組織化学のために、2,000μmの組織コアを使用した。30分間乾燥させた後、切片をアセトンで(室温で10分間)固定し、かつ、5分間風乾させた。スライドをPBS中でゆすぎ、次いで、PBS中10％正常ヤギ血清と共に20分間プレインキュベートし、続いて、10％正常ヤギ血清を含むPBS中の10μg/mlのFITC化(fitcylated)2A7と共に室温で30分間インキュベートした。次に、スライドをPBSで3回洗浄し、かつ、マウス抗FITC(10μg/ml DAKO)と共に室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSで再び洗浄し、かつ、ヤギ抗マウスHRP結合体(DAKO)と共に室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSでさらに3回洗浄した。茶色の染色をもたらすジアミノベンジジン(Sigma)を基質として使用した。蒸留水で洗浄した後、スライドをヘマトキシリンで1分間対比染色した。続いて、スライドを蒸留水の流水中で10秒間洗浄し、かつ、グリセルゲル(glycergel)(DAKO)中に封入した。これらの研究の結果を表6に示す。
【０３５２】
（表６）正常マウス組織アレイにおけるO8Eの免疫反応性
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【０３５３】
これらのデータならびに抗O8E抗体1G11および2F9に関して集められた対応するデータにより、強い〜激しいO8E免疫反応性(3+、4+)は、結腸および小腸の腸内分泌様細胞において、ならびに精嚢(seminary vesicle)の管腔液において存在し;弱い〜中程度のO8E免疫反応性(1+、2+)は、大脳の神経細胞において、大脳および脳橋の神経網および線維において、小脳の白質において、小腸の陰窩上皮細胞において、ならびに脾臓中の少数の大型リンパ系細胞において明らかになり;弱いO8E免疫反応性(1+)は、結腸表面上皮、小脳のプルキンエ細胞、ならびに唾液腺および膵臓の腺房上皮において実証され;あいまい〜弱いO8E免疫反応性は、膀胱の移行上皮、精巣の一次精母細胞、および胃の神経叢において示された。皮膚、肝臓、心臓、肺、胸腺、腎臓、子宮、卵巣、精巣上体、舌、および骨格筋を含む、他のすべての器官は、陰性〜あいまいな染色を示す。
【０３５４】
実施例11
脱フコシル化HuMAbの作製
本実施例では、フコシル残基を欠いている抗O8E HuMAbの作製を実証する。
【０３５５】
フコシル残基の量を減らした抗体は、抗体のADCC能力が増大していることが実証されている。フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8を欠くCHO細胞株Ms704-PF(Biowa, Inc.、Princeton、NJ)を、抗O8E HuMAbの重鎖および軽鎖を発現するベクターと共にエレクトロポレーションする。6mM L-グルタミンおよび500μg/ml G418(Invitrogen、Carlsbad、CA)を含むEx-Cell 325-PF CHO培地(JRH Biosciences、Lenexa、KS)中で増殖させることによって、薬物耐性クローンを選択する。標準的なELISAアッセイ法によって、クローンをIgG発現に関してスクリーニングする。2種の別々のクローン、すなわちB8A6およびB8C11を作製する。作製速度は、1日当たり細胞当たり1.0ピコグラム〜3.8ピコグラムの範囲である。
【０３５６】
実施例12
脱フコシル化抗O8E抗体のADCC活性の評価
本実施例では、脱フコシル化抗O8Eモノクローナル抗体および非脱フコシル化抗O8Eモノクローナル抗体がエフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞障害(ADCC)によってO8E+細胞株を死滅させる能力に関する、蛍光細胞障害性アッセイ法における試験を開示する。
【０３５７】
ヒト抗O8Eモノクローナル抗体を前述したように脱フコシル化する。ヒトエフェクター細胞は、以下のようにして、全血から調製する。標準的なフィコールパック分離法によって、ヘパリン処置した全血からヒト末梢血単核細胞を精製する。これらの細胞を、10％ FBS(培地)および200U/mlのヒトIL-2を含むRPMI1640培地中に再懸濁し、かつ、37℃で一晩インキュベートする。翌日、これらの細胞を採取し、培地中で1回洗浄し、かつ、2×107細胞/mlで再懸濁する。標的のO8E+細胞を、2.5mMプロベネシドを添加した培地(アッセイ用培地)中で1×106標的細胞/mL当たりBATDA 2.5μlのBATDA試薬(Perkin Elmer、Wellesley、MA)と共に、37℃で20分間インキュベートする。標的細胞を、20mM HEPESおよび2.5mMプロベネシドを含むPBS中で4回洗浄し、遠心沈殿させ、かつ、最終体積をアッセイ培地中1×105細胞/mlに調整する。
【０３５８】
以下のようにDelfia蛍光発光解析を用いて、O8E+細胞株ARH-77(ヒトBリンパ芽球性白血病;ATCCアクセッション番号CRL-1621)を、脱フコシル化ヒト抗O8Eモノクローナル抗体および非脱フコシル化ヒト抗O8Eモノクローナル抗体に対する抗体特異的なADCCに関して試験する。標的細胞株ARH77(標識した標的細胞100μl)を、エフェクター細胞50μlおよび1G11抗体または脱フコシル化1G11抗体のいずれか50μlと共にインキュベートする。標的とエフェクターの比1：100を、実験の全体を通して使用する。ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用する。2100rpmでのパルススピンおよび37℃で1時間のインキュベーションの後、上清を採取し、再び高速で遠心し、かつ、上清20μlを平底プレートに移し、そこへEu溶液180μl(Perkin Elmer、Wellesley、MA)を添加し、Fusion Alpha TRFプレートリーダー(Perkin Elmer)中で読み取る。溶解率(％)を以下のようにして算出する：(試料からの放出量−自発的放出量*100)/(最大放出量−自発的放出量)。式中、自発的放出量は、標的細胞のみを含むウェルからの蛍光であり、最大放出量は、標的細胞を含み、3％ Lysolで処理されたウェルからの蛍光である。O8E+を発現する細胞株ARH-77は、HuMAb抗O8E抗体1G11による抗体を介した細胞障害性を示し、かつ、抗O8E抗体1G11の脱フコシル型に関連した特異的溶解率の増大を示すと考えられる。したがって、脱フコシル化HuMAb抗O8E抗体は、O8E+発現細胞に対する特異的な細胞障害性を増大させる。
【０３５９】
実施例13
蛍光免疫染色解析によるHuMab抗O8E抗体の内部移行
標的細胞株であるO8E+ SKBR3(ヒト乳癌、ATCC番号HTB-30)およびZR-75(ヒト乳癌、ATCC番号CRL-1500)を用いて、細胞に結合する際のHuMab抗O8E抗体2A7C11、1G11H1、および2F9E6の内部移行を蛍光免疫染色によって試験した。
【０３６０】
0.25％トリプシン/EDTAを用いた処理によって組織培養フラスコから回収したSKBR3細胞およびZR-75細胞(96ウェルプレート中ウェル当たり100μl当たり104細胞)を、FACS緩衝液(PBS+5％FBS、培地)中の5μg/mlの各HuMab抗O8E抗体と共に氷上で30分間インキュベートした。ヒトIgG1アイソタイプ対照を陰性対照として使用した。培地で2回洗浄した後、細胞を培地(ウェル当たり100μl)中に再懸濁し、次いで、1：100で希釈した、PEと結合させたヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson ImmunoResearch Lab)と共に氷上で30分間インキュベートした。培地で洗浄した後、これらの細胞を、0分に蛍光顕微鏡(Nikon)下で直ちに画像化するか、または、様々な期間、37℃でインキュベートした。染色された細胞の細胞形態および免疫蛍光強度の画像を、下記の図に示すように様々な時点で撮影した。蛍光は、HuMab抗O8E抗体で染色した細胞においてのみ観察された。IgG1対照抗体では蛍光は検出されなかった。これらのアッセイ法において、FITCを直接結合させたHuMab 抗O8E抗体を用いた場合も同様の結果が得られた。
【０３６１】
画像データにより、3種すべてのHuMab抗O8E抗体の場合で、0分に細胞表面膜に蛍光が出現することが示された。30分間のインキュベーションで、膜の蛍光強度は有意に減少したのに対し、細胞内部の染色は増加した。120分の時点で、膜上の蛍光は、消失し、代わりに、細胞内区画中に存在すると思われた。このデータにより、HuMab抗O8E抗体が、O8Eを発現する内因性腫瘍細胞に結合する際に特異的に内部移行され得ることが実証される。
【０３６２】
実施例14
SCIDマウスのHEK-B7H4腫瘍に対する抗O8E抗体の有効性
本実施例において、HEK-B7H4腫瘍を移植されたSCIDマウスを、裸の抗O8E抗体を用いてインビボで治療して、腫瘍増殖に対する抗体のインビボでの効果を検査する。
【０３６３】
機能的なBリンパ球およびTリンパ球を欠いている重症複合免疫不全(SCID)マウスを、腫瘍増殖を研究するために使用した。B7H4をトランスフェクトされたHEK腫瘍細胞株に由来する細胞を、細胞500万個/マウス(マトリゲル中(50％(体積/体積)))で皮下移植した。各マウスに、0日目に0.2mlの細胞を接種した。マウスの腫瘍増殖のチェックを10日目に開始し、かつ、毎週2回、約6週間、腫瘍増殖をモニターした。腫瘍が約130mm3に達したら、腫瘍体積に基づいてマウスを3群に無作為に分けた。これらのマウスを、10mg/kgの裸の抗O8E抗体2A7、アイソタイプ対照抗体、または陰性対照としての調合緩衝液のいずれかで処理した。これらの動物に、5日毎に5回の注射を腹腔内注入によって実施した。電気式カリパスを用いて、腫瘍の3寸法を測定し(高さ×幅×長さ)、腫瘍体積を算出した。腫瘍が体積1500mm3に到達するか、または15％を超える体重減少を示した場合、マウスを安楽死させた。結果を図20に示す。腫瘍増殖は、抗O8E抗体2A7を用いた処置によって阻害された。2A7で処置した群の腫瘍増殖阻害の中央値は、34日目に63％であった。投与を中止した後、腫瘍は増殖を再開した。これらの結果により、抗O8E抗体が、O8Eを発現する腫瘍をインビボで治療する際に有効であることが示される。
【０３６４】
実施例15
抗O8E抗体を用いた免疫組織化学
抗B7H4 HuMAb 2A7が免疫組織化学によってB7H4を認識する能力を、卵巣癌、肺癌、乳癌、および頭頸部癌に由来する臨床的生検材料を用いて検査した。
【０３６５】
免疫組織化学のために、5μmの凍結切片を使用した(Ardais Inc、USA)。30分間乾燥させた後、切片をアセトンで(室温で10分間)固定し、かつ、5分間風乾させた。スライドをPBS中でゆすぎ、次いで、PBS中10％正常ヤギ血清と共に20分間プレインキュベートし、続いて、10％正常ヤギ血清を含むPBS中の10μg/mlのFITC化抗体と共に室温で30分間インキュベートした。次に、スライドをPBSで3回洗浄し、かつ、マウス抗FITC(10μg/ml DAKO)と共に室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSで再び洗浄し、かつ、ヤギ抗マウスHRP結合体(DAKO)と共に室温で30分間インキュベートした。スライドをPBSでさらに3回洗浄した。茶色の染色をもたらすジアミノベンジジン(Sigma)を基質として使用した。蒸留水で洗浄した後、スライドをヘマトキシリンで1分間対比染色した。続いて、スライドを蒸留水の流水中で10秒間洗浄し、かつ、グリセルゲル(DAKO)中に封入した。臨床的な生検免疫組織化学染色では、肺癌、乳癌、卵巣癌、および頭頸部癌の試料において陽性染色が示された。
【０３６６】
実施例16
正常組織および癌組織における定量的RT-PCR
様々な正常組織試料および癌組織試料を、定量的逆転写酵素PCR(RT-PCR)によって、O8E mRNA発現に関してスクリーニングした。mRNAの発現は、O8Eタンパク質発現を示している。
【０３６７】
定量的RT-PCRのために、以下のO8Eプライマーを使用した：Operon(Huntsville, AL)によって提供されるB7-H4.3： AGGATGGAATCCTGAGCTGCACTT;B7-H4.4： TCCGACAGCTCATCTTTGCCTTCT。標準的な反応条件を使用した(1ng/μlのcDNA鋳型5μl、40μMの上流プライマー0.1μl、40μMの下流プライマー0.1μl、2×SYBR Green PCRミックス(Applied Biosystems 4367659番)6μl、および水0.8μl)。ABI Prism 7900HT(Applied Biosystems, Foster City, CA)において標準的なPCR条件を用いて、40サイクルまでcDNAを増幅させた。定量的RT-PCRの結果を下記の表7に示す。カウント値未確定の試料は、蛍光閾値を下回る値に相当する。乳房腫瘍、卵巣腫瘍、および頭頸部腫瘍はO8Eを発現することが示され、一部の卵巣癌試料および頭頸部癌試料において最も高いレベルの発現が認められた。これにより、乳房腫瘍試料、卵巣腫瘍試料、および頭頸部腫瘍試料では、正常組織と比べてO8Eの発現が増大していることが実証される。
【０３６８】
（表７）正常組織および癌組織における定量的RT-PCR発現
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【０３６９】
本開示は、本明細書において説明する具体的な実施形態によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書において説明したものに加えて本開示の様々な改良法が、前述の説明および添付図面から当業者に明らかになると考えられる。このような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲に収まるものとする。
【０３７０】
特許、特許出願、刊行物、製品説明書、およびプロトコールが、本出願の全体を通して引用され、これらの開示内容は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０３７１】
図面および配列識別子の簡単な説明
【図１Ａ】1G11ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：41)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：1)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：11)、CDR2領域(SEQ ID NO：16)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：21)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図１Ｂ】1G11ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：46)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：6)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：26)、CDR2領域(SEQ ID NO：31)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：36)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図２Ａ】2A7ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：42)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：2)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：12)、CDR2領域(SEQ ID NO：17)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：22)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図２Ｂ】2A7ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：47)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：7)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：27)、CDR2領域(SEQ ID NO：32)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：37)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図３Ａ】2F9ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：43)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：3)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：13)、CDR2領域(SEQ ID NO：18)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：23)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図３Ｂ】2F9ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：48)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：8)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：28)、CDR2領域(SEQ ID NO：33)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：38)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図４Ａ】12E1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：44)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：4)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：14)、CDR2領域(SEQ ID NO：19)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：24)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図４Ｂ】12E1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：49)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：9)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：29)、CDR2領域(SEQ ID NO：34)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：39)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図５Ａ】13D12ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：45)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：5)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：15)、CDR2領域(SEQ ID NO：20)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：25)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のV、D、およびJが示されている。
【図５Ｂ】13D12ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO：50)およびアミノ酸配列(SEQ ID NO：10)を示す。CDR1領域(SEQ ID NO：30)、CDR2領域(SEQ ID NO：35)、およびCDR3領域(SEQ ID NO：40)には線が引かれ、かつ生殖系列由来のVおよびJが示されている。
【図６】1G11および13D12の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH4-34アミノ酸配列(SEQ ID NO：51)とのアライメントを示す。
【図７】2A7および2F9の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VH3-53アミノ酸配列(SEQ ID NO：52)とのアライメントを示す。
【図８】12E1の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、組合せヒト生殖系列VH3-9/D3-10/JH6bアミノ酸配列(SEQ ID NO：53 )とのアライメントを示す。
【図９】1G11、2A7、2F9、および13D12の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖系列VkA27アミノ酸配列(SEQ ID NO：54)とのアライメントを示す。
【図１０】12E1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、組合せヒト生殖系列VkL6/JK1アミノ酸配列(SEQ ID NO：55)とのアライメントを示す。
【図１１】図11Aおよび図11Bは、ヒトO8Eに対するヒトモノクローナル抗体がO8Eに特異的に結合することを実証するELISA実験の結果を示す。図11Aは、ELISAプレートをヒト抗O8E抗体でコーティングし、続いて、精製O8Eタンパク質を添加し、かつウサギ抗O8E抗血清を用いて検出した結果を示す。図11Bは、抗マウスFc、続いてモノクローナル抗C9(0.6μg/ml)でELISAプレートをコーティングし、次いで、図のように、ペンタ-O8Eタンパク質、次いで1μg/mlのヒト抗O8E抗体を用いて滴定した結果を示す。
【図１２】抗O8Eヒトモノクローナル抗体2A7が、O8EをトランスフェクトされたCHO細胞に結合することを実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１３】SKBR3乳癌細胞ならびにO8EをトランスフェクトされたSKOV3細胞およびHEK細胞におけるO8Eの発現を実証する、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１４】ヒトO8Eに対するヒトモノクローナル抗体が、O8E+CHO細胞中に内部移行できることを実証するHum-Zap 内部移行実験の結果を示す。
【図１５】ヒトO8Eに対するヒトモノクローナル抗体が、O8E+SKBR3細胞中に内部移行できることを実証するHum-Zap内部移行実験の結果を示す。
【図１６】1G11、2A7、2F9、および13D12を含む様々なヒト抗O8Eモノクローナル抗体を用いたエピトープマッピング研究の結果を示す。
【図１７】ヒトモノクローナル抗O8E抗体が、ADCCに依存的な様式で、ヒト乳癌細胞株SKBR3を死滅させることを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。
【図１８】ヒトモノクローナル抗O8E抗体が、ADCCに依存的な様式で、O8EをトランスフェクトされたSKOV3細胞を死滅させることを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。
【図１９】ヒトモノクローナル抗O8E抗体が、濃度およびADCCに依存的な様式で、ヒト乳癌細胞株SKBR3を死滅させることを実証する、抗体依存性細胞障害(ADCC)アッセイ法の結果を示す。
【図２０】抗O8E抗体によるHEK-B7H4腫瘍の腫瘍増殖阻害を示す、SCIDマウスを用いたインビボ研究の結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月29日(2008.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009518049000001.app
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６７】
定量的RT-PCRのために、以下のO8Eプライマーを使用した：Operon(Huntsville, AL)によって提供されるB7-H4.3： AGGATGGAATCCTGAGCTGCACTT（SEQ ID NO:57）;B7-H4.4： TCCGACAGCTCATCTTTGCCTTCT（SEQ ID NO:58）。標準的な反応条件を使用した(1ng/μlのcDNA鋳型5μl、40μMの上流プライマー0.1μl、40μMの下流プライマー0.1μl、2×SYBR Green PCRミックス(Applied Biosystems 4367659番)6μl、および水0.8μl)。ABI Prism 7900HT(Applied Biosystems, Foster City, CA)において標準的なPCR条件を用いて、40サイクルまでcDNAを増幅させた。定量的RT-PCRの結果を下記の表7に示す。カウント値未確定の試料は、蛍光閾値を下回る値に相当する。乳房腫瘍、卵巣腫瘍、および頭頸部腫瘍はO8Eを発現することが示され、一部の卵巣癌試料および頭頸部癌試料において最も高いレベルの発現が認められた。これにより、乳房腫瘍試料、卵巣腫瘍試料、および頭頸部腫瘍試料では、正常組織と比べてO8Eの発現が増大していることが実証される。
【国際調査報告】
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