(57)【要約】【課題】本発明は、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに向けられた阻害抗体の中性化を可能にする血友病Ａを治療するための新しい手段を開発することを目的としている。【解決手段】このため、ファクターＶＩＩＩヒト阻害抗体に対するモノクローナル抗イデオタイプ抗体において、阻害抗体がファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対するものであり、抗体の各軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域（相補性決定領域）が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を含んでおり、そして、抗体の各重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有している。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファクターＶＩＩＩヒト阻害抗体に対するモノクローナル抗イデオタイプ抗体において、上記阻害抗体がファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対するものであり、上記抗体の各軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域（相補性決定領域）が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を含んでおり、そして、上記抗体の各重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有していることを特徴とするファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２】
前記抗体において、上記抗体の各軽鎖の各ＣＤＲ領域が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４に対してそれぞれ少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を含んでおり、上記抗体の各重鎖が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１に対してそれぞれ少なくとも７０％の同一性を有していることを特徴とする請求項１記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項３】
前記抗体において、上記抗体の各軽鎖の可変領域が、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコード表現され、上記抗体の各重鎖の可変領域が、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコード表現される
ことを特徴とする請求項１又は２のいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項４】
前記抗体において、上記抗体の各軽鎖の可変領域が核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６でコード表現され、そして上記抗体の各重鎖の可変領域が核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５でコード表現されることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項５】
前記抗体において、その各軽鎖の可変領域のペプチド配列が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８と少なくとも７０％の同一性を示す配列であり、その各重鎖の可変領域のペプチド配列が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７に対して少なくとも７０％の同一性を示す配列であることを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項６】
前記抗体において、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６から推定されるペプチド配列が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６であり、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５から推定されるペプチド配列が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７であることを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項７】
前記抗体において、阻害抗体が抗体ＲＨＤ５（ＬＭＢＰ  ６１６５ＣＢの番号でコレクションＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託）であることを特徴とする請求項１から６までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項８】
前記抗体において、上記抗イデオタイプ抗体がマウス抗体であることを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項９】
前記抗体において、上記抗イデオタイプ抗体がＩｇＧ１ｋａｐｐａであることを特徴とする請求項８記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１０】
前記抗体において、上記抗体がキメラ性抗体であることを特徴とする請求項１から９までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１１】
前記抗体において、上記抗体がヒト・ハイブリッド抗体であることを特徴とする請求項１０記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１２】
前記抗体において、上記請求項がヒト化された抗体であることを特徴とする請求項１から９までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１３】
前記抗体において、その抗体がＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ＣＵＲ領域、及びこれらフラグメントあるいは領域のいずれかの修飾されたもので構成される群から選択されることを特徴とする請求項１から１２までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１４】
前記抗体において、その抗体が国立微生物培養体コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  ：ＣＮＣＭ）にＣＮＣＭ  Ｉ−３５５９の番号で寄託されているハイブリドーマ１８Ｂ６によって生産可能であることを特徴とする請求項１から９までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１５】
請求項１から１３までのいずれかによる抗体をつくりだす安定した細胞株を特徴とするファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１６】
前記細胞株において、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト骨髄腫ナマルワ、ＰＥＲＣ６などのヒト由来のその他の細胞、細胞株ＣＨＯ、つまり、ＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８−６５３で構成される群から選択されるを特徴とする請求項１５項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１７】
国立微生物培養体コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）にＣＮＣＭ  Ｉ−３５５９の番号で寄託されているハイブリドーマ１８Ｂ６を特徴とするファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１８】
ファクターＶＩＩＩヒト阻害抗体に対するモノクローナ抗イデオタイプ抗体において、上記阻害抗体が国立微生物培養体コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  （ＣＮＣＭ）にＣＮＣＭ  Ｉ−３５５９の番号で寄託されているハイブリドーマ１８Ｂ６によって作り出されるファクターＶＩＩＩのＣ１領域に向けられたものであることを特徴とするファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項１９】
前記抗体の重鎖の可変領域をコード表現する配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５を示すＤＮＡフラグメント
としたことを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２０】
前記抗体の軽鎖の可変領域をコード表現する配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６を示すＤＮＡフラグメント
としたことを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２１】
前記抗体と少なくとも１つの賦形剤及び／又は少なくとも１つの薬学的に許容される基材を含む医薬品組成物としたことを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２２】
前記組成物において、上記組成物が、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインとは異なったドメインに向けられた抗ＦＶＩＩＩ抗体に対する少なくとも１つの抗イデオタイプ抗体を含んでいることを特徴とする請求項２１記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２３】
前記組成物において、上記組成物がファクターＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する抗イデオタイプ抗体及び／又はファクターＶＩＩＩのＡ２ドメインに対する抗体に向けられた抗イデオタイプ抗体であることを特徴とする請求項２１または２２記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２４】
前記抗体を、医薬品を製造するために利用することを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２５】
前記抗体を、タイプＡ血友病の治療を目的とする医薬品を製造するために利用することを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２６】
前記タイプＡ血友病が阻害因子を伴う血友病であることを特徴とする請求項２５記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２７】
ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで中性化するために利用することを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２８】
ファクターＶＩＩＩ阻害抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出及び／又は精製のために利用することを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【請求項２９】
前記野抗体を含む医薬品としたことを特徴とする請求項１から１４までのいずれか１項記載のファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はファクターＶＩＩＩのＣＩドメインに結合するファクターＶＩＩＩ阻害因子モノクローナル抗イデオタイプ抗体、このモノクローナル抗イデオタイプ抗体を産出する細胞株、そして、このモノクローナル抗イデオタイプ抗体の医薬品としての利用に関するものであり、さらに具体的には、血友病Ａの治療のための医薬品製造のためのそのモノクローナル抗イデオタイプ抗体の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは、その病気に罹病している人における凝血を阻害する染色体Ｘの異常に関連した遺伝的な疾病である。
この病気は凝血に関与する蛋白質、つまりファクターＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩとも表記）蛋白質の遺伝子における突然変異の結果であり、血液中にファクターＶＩＩＩがまったく存在しないか、あるいはその部分的な欠損によって起きる病気である。
【０００３】
血友病Ａは凝血に影響を及ぼす最も一般的な不全であり、フランスにおいては、５０００人に１名の男性においてこの病気の発症が見られ、それは血友病患者全体の８０％を占めている。
他のタイプの血友病である血友病Ｂが血友病Ｂの２０％を占めており、ファクターＩＸとして知られる他の凝固因子における欠損によって引き起こされる。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０１４９５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在行われている血友病（タイプＡ及びタイプＢ）に対する治療は、欠損している、あるいは存在しない因子を静脈注射する方法で行われている。
フランスにおいては、血友病治療のためのファクターＶＩＩＩはＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ｄｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＬＦＢ）あるいは国際的な薬学研究機関によって提供される血液製剤の形態か、あるいは、遺伝子操作方法によって調製される遺伝子組み換え医薬品の形態で提供されている。
好適に、ファクターＶＩＩＩをコード表現するＤＮＡが哺乳動物の細胞において単離、発現され（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３３０−３３７）、そのアミノ酸配列がｃＤＮＡから推測された。
【０００６】
分泌されたファクターＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は分子量が３００Ｋｄａ（２３３２個のアミノ酸で構成されている）糖蛋白で、内在性の凝血経路の活性化において中心的な役割を果たしている。
不活性のファクターＶＩＩＩは６つの領域、つまり、Ｎ末端からＣ末端の方向に向けて、Ａ１（残基１−３７２）、Ａ２（残基３７３−７４０）、Ｂ（残基７４１−１６４８）、Ａ３（残基１６９０−２０１９）、Ｃ１（残基２０２０−２１７３）、及びＣ２（残基２１７３−２３３２）で構成されている。
分泌後、ファクターＶＩＩＩはフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）と反応し、これがファクターＶＩＩＩを血漿蛋白質分解酵素から護ってくれる。
トロンビンで切断するとファクターＶＩＩＩはｖＷＦから分離する。この切断によって、Ｂドメインがなくなり、異種二量体が形成される。ファクターＶＩＩＩはこの形で血漿内を循環する。
この二量体は重鎖（Ａ１、Ａ２）と軽鎖（Ａ３、Ｃ１、Ｃ２）で構成されている。
【０００７】
ファクターＶＩＩＩが血友病患者に注入されると、それは患者の血液循環の過程でフォン・ヴィレブランド因子と結合する。活性化されたファクターＶＩＩＩは活性化されたファクターＩＸの共同因子として作用し、ファクターＸの活性化ファクターＸへの転換を加速する。
活性化されたファクターＸはプロトロンビンをトロンビンに変わる。
すると、トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変え、それによって血液の凝固が起きる。
【０００８】
ファクターＶＩＩＩの投与に伴う最大の問題は、患者の体内でのファクターＶＩＩＩに対する抗体の出現で、この因子は『阻害因子』と呼ばれる。
これらの因子はファクターＶＩＩＩの凝血促進作用を中性化してしまい、ファクターＶＩＩＩは注入されるとすぐ中性化されてしまう。
従って、投与された凝固因子は出血が止まる前に破壊されてしまい、これが事態を複雑にして、治療を無効にしてしまう。
さらに、一部の遺伝的に血友病ではない患者においてもファクターＶＩＩＩに対する阻害因子が形成されてしまい、これは後天性血友病と呼ばれる。
【０００９】
この抗ファクターＶＩＩＩ免疫反応はほとんどの場合がＩｇＧ４及びＩｇＧ１亜綱、そして稀にはＩｇＧ２に属するポリクローナルＩｇＧタイプであることが、研究によって示されている。
ＩｇＧ３亜綱は決して示されない。
この軽鎖はしばしばカッパー・タイプと呼ばれる。
ＩｇＧ４が過剰に示されるのは、長期間にわたって確立された阻害因子を有する血友病患者に多く診られる。
ファクターＶＩＩＩ分子のＣ２及びＡ２ドメインはこの免疫反応の好ましい標的であるが、いくつかの場合、Ａ３ドメインに対する抗体も検出される。
血友病患者の血漿を固定化されたファクターＶＩＩＩによる免疫吸着カラムを通過させると、すべての抗ファクターＶＩＩＩ抗体を精製することができる。
回収量は総ＩｇＧの１０ｍｇあたり１００μｇ以上であることが多い（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．（１９３３）Ｂｌｏｏｄ；８２：２４５２−２４６１）。
ファクターＶＩＩＩの阻害因子の形成を調べるための動物モデルが開発されており、ヒト組み換えファクターＶＩＩＩで免疫化されたラットは、ポリクローナル・タイプの急速な免疫反応を示す（Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｏｅｍｏｓｔ．１９９６  Ｆｅｄ；７５（２）：３１８−２５）。
抗ファクターＶＩＩＩ抗体がファクターＶＩＩＩの機能に干渉するメカニズムは多数あり、ファクターＶＩＩＩの蛋白質分解切断への干渉、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、リン脂質（ＰＬ）、ファクターＩＸ、活性化ファクターＸ（ＦＸａ）、あるいはＡＰＣ（活性化蛋白質Ｃ）などの異なったパートナーとのファクターＶＩＩＩの相互作用への干渉などである。
【００１０】
この免疫反応の結果を緩和することができるいくつかの措置があり、例えば、ファクターＶＩＩＩの産出を促進する人工的なホルモンであるデスモプレシンを用いた治療、プロトロンビン複合体の濃縮物や活性化されたプロトロンビン複合体の濃縮部などの凝血促進剤、組み換えファクターＶＩＩａ、血漿交換、あるいは大量あるいは中程度の量のファクターＶＩＩＩを用いた治療などである。
しかしながら、これらの治療は経費が高く、しかも有効性は低い。
【００１１】
この免疫反応のｉｎ  ｖｉｖｏ分析の複雑さの故に、ファクターＶＩＩＩの一定のドメインに対するモノクローナル抗体がいくつかの研究チームによって単離されている。
こうした事情で、ＩｇＧ４カッパー・タイプというヒト・モノクローナル抗体が単離された。
この抗体はファクターＶＩＩＩのＣ１領域に対するもので、ファクターＶＩＩＩの活性と、そのフォン・ヴィレブランド因子への結合を阻害する（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：１５６−１６３）。
同様に、阻害因子を伴い血友病の患者のメモリーＢ細胞のライブラリーからつくられたＢ０２Ｃ１１  （ＩｇＧ４カッパー）と呼ばれるファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対するヒトのモノクローナル抗体も単離されている（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｌｏｏｄ  １９９８Ｊｕｌ  １５；９２（２）：４９６−５０２）。
Ｂ０２Ｃ１１はファクターＶＩＩＩのＣ２ドメインを識別し、そのフォン・ヴィレブランド因子及びリン脂質への結合を阻害する。
それは、天然及び活性化されたファクターＶＩＩＩの凝血促進活性を完全に阻害する。
モノクローナル抗体のさらに別の例はファクターＶＩＩＩのＡ２ドメインに対するＢ０ＩＩＢ２抗体である。
このＢ０ＩＩＢ２抗体抗体はファクターＶＩＩＩの活性を９８％阻害する。
Ａ２ドメインに結合することで、この抗体はＦＩＸａの結合に干渉してそれを阻害する。
そして、ＦＩＸａはファクターＶＩＩＩのこの領域の低親和性結合サイトを含んでいるので、従って、ＦＩＸａの酵素活性が阻害される。
二番目に考えられる作用経路は、ファクターＶＩＩＩの二量体形態（Ａ２：Ａ１及びＡ３：Ｃ１：Ｃ２）とファクターＶＩＩＩの二量体形態（Ａ２及びＡ１とＡ３：Ｃ１：Ｃ２）との間の均衡を、これらの複合体のＡ２ドメインの解離を加速させることで干渉して、それらの機能を失わせることである（Ａｎａｎｙｅｖａ  ＮＭ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．Ｍａｒ．１５（２）：１０９−２４、Ｒｅｖｉｅｗ）。
【００１２】
これらの新しい手段の助けを借りて、さらに、ファクターＶＩＩＩ阻害因子抗体に対するより最近の戦略的な取り組みでは、上記阻害因子抗体を中性化する抗イデオタイプ抗体（他の抗体の可変領域と相互作用する能力を有する抗体）の投与が検討されている（Ｓａｉｔ−Ｒｅｍｙ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ；７７（ｓｕｐｐｌ  １）：  ２１−２４）。
資料ＷＯ２００４／０１４９５５で化維持されている１４Ｃ１２という名称で知られているマウスの抗イデオタイプ抗体は、ファクターＶＩＩＩ標的抗体（モノクローナル抗体ＢＯ２Ｃ１１）の阻害性能を、投与量に依存した形態でｉｎ  ｖｉｖｏで中性化する。
ファクターＶＩＩＩのＡ２ドメインに向けられたポリクローナル・マウス抗イデオタイプ抗体を用いた抗ファクターＶＩＩＩ免疫反応も開発されている（これも特許出願ＦＲ  ０５  ０８３２０に述べられている）。Ａ２ドメインは４３ｋＤのドメインで、その機能は未だ十分には解明されていないが、ファクターＶＩＩＩのＡ２ドメインに向けられた阻害性抗体が、遷移状態での複合体ＦＸａｓｅ／ＦＸの転換を阻害することでファクターＶＩＩＩの機能を阻害することが示されている（Ｌｏｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４  Ｊｕｎ：９３（６）：２４９７−５０４、Ｆａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１（１１）：６０２７−６０３２）。
【００１３】
しかしながら、ファクターＶＩＩＩに対する免疫反応はポリクローナル性のものであるから、従って、阻害性抗体はＡ２及びＤ２ドメインとは異なったドメインに対するものであることが示唆される。
実際、抗ファクターＶＩＩＩ抗体のエピトープ特性の研究がこれらの阻害因子の大部分がその重鎖のＡ２ドメイン及び／又は軽鎖のＣ２ドメイン上に位置するファクターＶＩＩＩ分子の限定された範囲を認識することを示しているとしても、他のエピトープもしばしば認識されている。
実際、患者からの血漿の一部はファクターＶＩＩＩの軽鎖のＣ１ドメインに結合することができる抗体を含んでいる（Ｍｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａ．，２０００；９５（１１）：３４３５−４４１；Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；９５（１）：１５６−１６２）。
【００１４】
従って、血友病患者の抗ファクターＶＩＩＩポリクローナル反応をより完全に中性化させるために、ファクターＶＩＩＩの他の阻害抗体の中性化を可能にするさらに別の手段に対する必要性が常に存在している。
【００１５】
従って、本出願者はファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに向けられた阻害抗体の中性化を可能にする血友病Ａを治療するための新しい手段を開発する努力を重ねてきた。
【００１６】
本発明の第１の目的は、ファクターＶＩＩＩヒト阻害抗体に対するモノクローナル抗イデオタイプ抗体において、上記阻害抗体がファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対するものであり、上記抗体の各軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域（相補性決定領域）が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を含んでおり、そして、上記抗体の各重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有していることを特徴とするモノクローナル抗イデオタイプ抗体に関するものである。
【００１７】
関連するＣＤＲ領域はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３である。
【００１８】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４がＫｏｂａｔによって定義されている［Ｋｏｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｒｅｓｔ”、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１−３２４２（１９９１）］。
【００１９】
特に好適な１つの実施の形態で、上に述べた各配列の一致度は少なくとも８０％、好ましくは９５％、９５％、９９％、そしてより好ましくは１００％である。
一致度の％は比較される２つの配列を並べて、そして同一のアミノ酸を有する位置の数を数え、この数をその配列のアミノ酸の総数で割ることによって計算される。
いずれにしても、これらの配列の違いはそのモノクローナル抗体の標的に対する親和性、あるいはその機能性にはまったく影響を及ぼさない。
【００２０】
ファクターＶＩＩＩの『阻害抗体』あるいは『阻害因子』とは、ファクターＶＩＩＩの凝血活性のすべて、あすいはその一部をそれと結合することによって阻害する因子、特にそのエピトープがファクターＶＩＩＩ上に存在している抗ファクターＶＩＩＩ抗体を意味している。
好適に、本発明による抗体は本発明の抗イデオタイプ抗体の標的であるファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害因子の凝血阻害活性の少なくとも２０％、好適には少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％、好適には少なくとも５０％、好適には少なくとも６０％、そしてさらに好適には、少なくとも７０％、８０％、９０％、９９％、あるいは１００％を中性化する能力を有している。
【００２１】
阻害抗体の凝血阻害活性を中性化する能力は、『ファクターＶＩＩＩクロモゲン・テスト』などのアッセイで、阻害抗体及び抗イデオタイプ抗体の存在下でのファクターＶＩＩＩの活性を測定することによって判定される（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２．４９４−５０６）。
【００２２】
『抗イデオタイプ抗体』という表現は、標的阻害抗体の可変領域に対する抗体を意味している。
本発明の１つの特殊な実施態様においては、本発明による抗イデオタイプ抗体は阻害抗体に対するものであり、上記抗体の重鎖の可変ドメインは生殖細胞系ＤＰ−１０に関係している。
こうした阻害抗体はヒト（例えば、阻害抗体を有する患者の血清）から、あるいはマウス、ウマ、ヤギ、ヒト以外の霊長類などから、ファクターＶＩＩＩあるいはファクターＶＩＩＩから得られるフラグメント、そしてより具体的にはＣ１ドメインの全体あるいは一部を含むフラグメントによって免疫化することで得ることが出来る。
【００２３】
好適に、本発明による抗イデオタイプ抗体の標的阻害抗体はその天然のままの構成におけるＣ１ドメインを認識する。
好適に、本発明による抗イデオタイプ抗体の標的阻害抗体は  突然変異種であるＲ２１５０Ｈの同じドメインは認識しない。
【００２４】
本発明によるモノクローナル抗イデオタイプ抗体はヒトからのものでも、動物からのものであってもよい。
さらに、それはさまざまな方法を用いて得ることができる。
例えば、抗イデオタイプ抗体を産出する細胞を抗ファクターＶＩＩＩ阻害抗体を有する患者の抹消血液リンパ球からでも健康な人からでも得ることが出来る。
これらの細胞は当業者に周知の技術を用いて不死化させ、産出された抗イデオタイプ抗体のファクターＶＩＩＩに対する阻害抗体を中性化する能力によって選択することができる。
本発明によるさらに別の、モノクローナル抗イデオタイプ抗体をつくる方法は動物、好適にはマウスから、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対するファクターＶＩＩＩ阻害抗体を注入し、そして、脾臓リンパ球を骨髄腫細胞株、好適にはマウス骨髄腫の細胞株と共に溶融して、ファクターＶＩＩＩ阻害抗体に対する抗イデオタイプ抗体を産出する細胞培養体を確認、クローニングする方法である。
【００２５】
本発明の好ましい１つの実施の形態で、本発明の抗イデオタイプ抗体の軽鎖の各ＣＤＲ領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４で表される配列と少なくとも７０％の一致度をそれぞれ有しており、そして、上記抗体の各重鎖の各ＣＤＲ領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１と少なくとも７０％の一致度を有するペプチド配列を有している。
【００２６】
従って、本発明の抗体の各軽鎖のＣＤＲ１領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２と少なくとも７０％の一致度を有するペプチド配列を有しており、本発明の抗体の各軽鎖のＣＤＲ２領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３と少なくとも７０％の一致度を有するペプチド配列を有しており、本発明の抗体の各軽鎖のＣＤＲ３領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも７０％の一致度を有するペプチド配列を有しており、そして、本発明の抗体の各重鎖のＣＤＲ１領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９と少なくとも７０％の一致度を有するペプチド配列を有しており、本発明の抗体の各重鎖のＣＤＲ２領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０と少なくとも７０％の一致度を有するペプチド配列を有しており、そして本発明の抗体の各重鎖のＣＤＲ３領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１と少なくとも７０％の一致度を有するペプチド配列を有している。
１つの好適な方法では、上に述べた各配列の一致度は少なくとも８０％、好ましく名９０％、９５％、９９％、そしてより好ましくは１００％である。
【００２７】
好適に、本発明によるモノクローナル抗イデオタイプ抗体の各軽鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６と少なくとも７０％の一致度を有する核酸配列によってコード表現され、そして、上記モノクローナル抗イデオタイプ抗体の各重鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５と少なくとも７０％の一致度を有する核酸配列によってコード表現される。
【００２８】
本発明の目的を達成するために、例えば、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２をそれぞれつくりだすために、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６に信号ペプチドを加えることができ、この場合、そうした信号ペプチドによって本発明の抗体の活性や選択性に悪影響が生じることはない。
【００２９】
特に好適な１つの形態においては、配列の一致度は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９５％から９９％の範囲である。
一致度の割合（％）は、比較される２つの配列を並べて、同じヌクレオチドを含む位置の数を数え、この数をその配列のヌクレオチドの総数で割って求める。
遺伝子コードの変質は、異なったヌクレオチドのいくつかの三つ組みで同じアミノ酸をコード表現できるという事実に導く。いずれにせよ、モノクローナル抗イデオタイプ抗体の標的に対する親和性や、標的阻害抗体の阻害活性を中性化させる能力はこれらの配列の差によってもまったく影響を受けない。
【００３０】
本発明の１つの好ましい形態においては、上記モノクローナル抗イデオタイプ抗体の各軽鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６によってコード表現され、そして、そのモノクローナル抗イデオタイプ抗体の各重鎖の可変領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５によってコード表現される。
【００３１】
１つの好適な実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の各可変領域のペプチド配列は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８に対して少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％か９０％、そしてより好適には少なくとも９９％の一致度を有する配列である。
【００３２】
本発明の目的を達成するために、例えば、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３と配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４  をつくりだすために、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７と配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８に信号ペプチドを加えることができ、この場合、本発明の抗体の活性も特異性もそうした信号ペプチドによって損なわれることはない。
【００３３】
好適に、本発明の抗体の重鎖の各可変領域のペプチド配列は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に対して少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％か９０％、そしてさらに好適には少なくとも９９％の一致度を有する配列である。
【００３４】
本発明の抗体の各軽鎖のペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に対して少なくとも７０％、そして好適には少なくとも８０％か９０％、そしてさらに好適には少なくとも９９％の一致度を有する配列であり、本発明の抗体の各重鎖のペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に対して少なくとも７０％、そして好適には少なくとも８０％か９０％、そしてさらに好適には少なくとも９９％の一致度を有する配列である。
【００３５】
好ましくは、本発明の抗体の各軽鎖のペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４である。
【００３６】
好ましくは、本発明の抗体の各軽鎖のペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３である。
【００３７】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６から推定されるペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８であり、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５から推定されるペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７である。
好ましくは、本発明のモノクローナル抗イデオタイプ抗体の各掲載の可変領域はペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を有しており、本発明のモノクローナル抗イデオタイプ抗体の各重鎖の可変領域はペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７を有している。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明の抗イデオタイプ抗体の標的阻害抗体は２００４年８月に、ベルギーのヘント大学（住所：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  ２９７、Ｂ−９０５２  Ｚｗｉｊｎａａｒｅｄｅ、Ｂｅｌｇｕｉｕｍ）の分子生物学研究所、ベルギー共同微生物／プラスミド・コレクション（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ）にコーレン研究財団（Ｃｏｌｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒａｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）が登録番号ＬＭＢＰ  ６１６５ＣＢの名称で寄託した抗体ＲＨＤ５である。
抗体ＲＨＤ５は、最初に血友病Ａ、つまり、高レベルの阻害因子を有する後天性の重篤な血友病の患者から得たリンパ球から産出されたファクターＶＩＩＩのＣＩドメインに対するヒト・モノクローナルＩｇＧ１抗体である。
この抗体は亜綱ＩｇＧ１に属しており、生殖細胞株ＤＰ−１０から生じるものである。
ファクターＶＩＩＩ上で該抗体によって認識されるエピトープはその天然の構成のＣ１ドメインであるが、Ｒ２１５０Ｈ突然変異を有する同じドメインではない。抗体ＲＨＤ５はファクターＶＩＩＩ活性を最大９８％阻害することができる。
【００３９】
本発明の抗体は１つ、あるいは複数のアミノ酸が置換あるいは欠失させられている本発明の特徴を有するすべての修飾抗体を含む。
そうした置換あるいは欠失はその分子上のどの位置であってもよい。
いくつかのアミノ酸が置換あるいは欠失されている場合、置換あるいは欠失のどのような組み合わせも想定できる。
本発明の抗体の可変領域のこうした配列修飾は、本発明の抗イデオタイプ抗体あるいは標的阻害抗体と接触する可能性のある残基の数を増大させるために行うことができる。
【００４０】
本発明の１つの実施の形態で、抗イデオタイプ抗体はマウス抗体である。
【００４１】
好適に、このモノクローナル抗イデオタイプ抗体はＩｇＧ１カッパーである。
【００４２】
好ましくは、本発明のこのモノクローナル抗体はキメラ性抗体である。
『キメラ性抗体』という表現は、軽鎖及び重鎖の可変領域がそれら軽鎖及び重鎖の定常領域とは別の種に属していることを意味する。
従って、本発明の抗体は非マウス種に属する軽鎖及び重鎖の定常領域も含んでいる。
この点で、すべての非マウス哺乳動物族あるいは種を用いることができ、例えば、ヒト、サル、（マウス以外の）ネズミ類、イノシシ科、ヘビ科、ウマ科、ネコ科、イヌ科、それに鳥類などを用いることができる。
【００４３】
本発明のキメラ性抗体は当業者の周知の組み換えＤＮＡの標準技術を用いて、さらに具体的に言えば、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１．ｐｐ．６８５１−５５（１９８４）に記載されている『キメラ性』抗体を用いて構成することができ、この場合、ヒト以外の哺乳動物由来の交代の重鎖の定常領域及び／又は軽鎖の定常領域をヒトの免疫グロブリンの対応する領域と置換するために、組み換えＤＮＡ技術が用いられる。
【００４４】
本発明の１つの具体的な実施態様で、本発明の抗体はヒト・ハイブリッド抗体、つまり、その定常領域がヒトのものであるキメラ性抗体である。
この実施の形態はヒトにおける抗体の免疫原性の低下を可能にし、そのことによって、人間に対する治療のための投与でのその有効性を改善してくれる。
【００４５】
好適に、本発明による抗体はヒト化された抗体である。
そうした抗体はヒト以外の種のモノクローナル抗体の１つあるいは複数のＣＤＲ領域（相補性決定領域）をヒトのフレームワーク領域（フレームワークとして知られる、可変領域の中でも保存性の非常に高い部分）で、その製造プロセスは先行技術で知られている（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３２１：５２２；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３）。
ファクターＶＩＩＩのＣ１領域を認識する阻害抗体の可変領域に向けられたヒト化された抗体はヒトのフレームワーク領域と、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４のうちの１つあるいは複数のＣＤＲ領域を含むことができる。
本発明によるヒト化された抗体の１つはファクターＶＩＩＩのＣ１領域を認識する阻害抗体の可変領域に対するヒト化された抗体で、そのＣＤＲ領域は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４の領域である。
【００４６】
１つの好適な例で、本発明のモノクローナル抗イデオタイプ抗体はハイブリドーマ１８Ｂ６によってつくられた抗体１８Ｂ６で、これは国立微生物培養体コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ：ＣＮＣＭ：２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５）に登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５５９で寄託されている。
モノクローナル抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６の各軽鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６によってコード表現され、モノクローナル抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６の各重鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５によってコード表現される。
ハイブリドーマ１８Ｂ６を入手するための方法は、本明細書の実施例の箇所に記載してある。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗イデオタイプ抗体は抗体１８Ｂ６のフラグメントを含むすべての抗体を意味し、より具体的には、抗体１８Ｂ６の軽鎖の可変領域及び／又は抗体１８Ｂ６の重鎖の可変領域及を含むすべての抗体、さらには、抗体１８Ｂ６の軽鎖の可変領域及び／又は重鎖の可変領域のいずれかのフラグメントを含む抗体も意味する。
『フラグメント』という表現は、Ｆ（ａｂ’）１２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ＣＤＲ領域、あるいはこれらのフラグメントや領域の修飾されたものを意味する。
【００４８】
本発明の１つの具体的な実施の形態で、本発明のモノクローナル抗イデオタイプ抗体はＦ（ａｂ’）１２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ＣＤＲ領域、あるいはこれらのフラグメントや領域の修飾されたものである。
パパインで免疫グロブリンを酵素消化すると、『Ｆａｂフラグメント』（フラグメント抗原結合）と呼ばれるフラグメントとＦｃフラグメント（結晶可能な部分）の２つの同じフラグメントが得られる。
Ｆｃフラグメントは免疫グロブリンのエフェクター機能の基礎である。
【００４９】
ペプシン消化を用いて、両方のフラグメントがジスルフィド結合で結合されたままのＦ（ａｂ’）２フラグメントが発生させ、このＦｃフラグメントをいくつかのペプチドに分割する。
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは２つのＦａｂ’フラグメント（Ｆａｂとヒンジ領域で構成される１つのＦａｂ’フラグメント）で形成され、Ｆ）ａｂ’）２を形成するために懸垂線間ジスルフィド結合で結合される。
【００５０】
抗体の結合サイトを含むこうしたフラグメントはその発生源である元の完全な抗体の属性の一部、例えば、相補体を活性化したり、Ｆｃガンマ・レセプタを結合させたりする能力は失っているかもしれない。
しかし、これらのフラグメントは阻害抗体を中性化するという元の抗体の能力は失っていない。
従って、本発明は抗体１８Ｂ６のＦ（ａｂ’）１２、Ｆａｂ’、Ｆａｂフラグメント、あるいはＣＤＲ領域やこれらのフラグメントあるいは領域の修飾されたものなどもその範囲に含む。特に、これらのフラグメントはＲＨＤ５抗体を中性化する元の抗体の能力を保持している。
【００５１】
本発明のさらに別の目的は、上に述べたよう抗体を産出する安定した細胞株を提供することである。
本発明のこのような安定した細胞株はヒト由来、あるいは動物由来のいずれであってもよい。
本発明の安定した細胞株はヒトの不死化された細胞からつくりだすことができる。
本発明のさらに別の実施の形態では、この細胞株は、例えばマウスなどの動物由来の不死化させた細胞からつくりだされたものであってもよい。
本発明のこの実施の形態で得られる細胞株の１つの好ましい例は株１８Ｂ６で、これはＩ−３５５９の番号でＣＮＣＭに寄託されている。
さらに別の実施の形態で、本発明の安定した細胞株は遺伝子の望ましい箇所に本発明の抗体を発現させる遺伝子構成を組み込んだ株である。
そうした細胞を獲得するためのステップは安定したトランスフェクションである。
このステップはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物で保持できる限り、どんなタイプの細胞にも適用できる。
安定したトランスフェクションを行うためには、その遺伝子構成物の一体化が必要で、これは相同的組み換えで、あるいはランダムに行うことができる。
その細胞に対して抗生抵抗を与える問題の遺伝子を含む遺伝子構成物における正の選択カセットの存在は、例えば、その細胞ゲノムへのトランス遺伝子の挿入を示すものである。
サブ−クローニング・ステップの結果として、本発明の抗体、例えば１８Ｂ６から長期間用いることができる産出用細胞を得ることが出来、この細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で保存することができる。
【００５２】
本発明の抗体を発現するこの安定した細胞株は、ヒトの細胞株、齧歯類、例えばネズミなどの細胞株、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ナマルワなどのヒト骨髄腫、あるいはその他の例えばＰＥＲＣ６などのヒト由来の細胞株、それにＣＨＯ細胞株、つまりＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ  ＤＸ  Ｂ１１、ＣＨＯ  ＤＧ４４）、あるいはさらに、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＥ０、ＳＰ２／０−Ａｇ  １４、及びＰ３Ｘ６３ＡｂＢ８−６５３から選択される細胞株などから選択することができる。
【００５３】
本発明のさらに別の具体的なものは、国立微生物培養体コレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ：ＣＮＣＭ）に登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５５９で寄託されているハイブリドーマ１８Ｂ６である。
このハイブリドーマ１８Ｂ６によって産出されるモノクローナル抗イデオタイプ抗体の各軽鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６によってコード表現され、ハイブリドーマ１８Ｂ６によって産出されるモノクローナル抗イデオタイプ抗体の各重鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５によってコード表現される。
このハイブリドーマ１８Ｂ６によって産出される抗体は抗体１８Ｂ６で、ハイブリドーマ１８Ｂ６を獲得するための方法は本明細書の『実施例』の箇所に記載されている。
【００５４】
本発明のさらに別の主題は上に述べたような本発明の抗体の重鎖の可変領域をコード表現する配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５のＤＮＡフラグメントである。
このＤＮＡフラグメントは、好ましくは抗体のポリペプチドの発現を可能にするベクターに導入・保持することができる。
その抗体の重鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５によって発現され、それから誘導されるペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７である。このベクターはホスト細胞内でこの外来核酸フラグメントの発現を可能にするが、それはこのベクターがこの発現に必要な配列（プロモータ、ポリアデニルか配列、選択遺伝子）を含んでいるからである。
こうしたベクターは当業者には周知であり、アデノウィルス、レトロウィルス、プラスミド、ありはバクテリアファージなどであってもよい。
さらに、どの哺乳動物の細胞でもホスト細胞として、つまり、上記ポリペプチドや本発明による抗体を発現できる細胞として用いることができ、それらの細胞には、例えば、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、マワルワなどのヒト骨髄腫、ＰＥＲＣ６などのヒト由来のその他の細胞、細胞株ＣＨＯ、つまり、ＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ  １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８−６５３などである。
【００５５】
本発明のさらに別の目的は、上に述べたような本発明の抗体の軽鎖の可変領域をコード表現する配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６のＤＮＡフラグメントである。
このＤＮＡフラグメントは好ましくは抗体のペプチドの発現を可能にするベクターに挿入することができ、ホスト細胞内に導入、保持することが可能である。
上記抗体の軽鎖の可変領域は核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６によってコード表現することができ、その推定されるペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８である。
このベクターは、その発現に必要不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を含んでいるので、この外来核酸フラグメントを発現することができる。
こうしたベクターは当業者には周知であり、アデノウィルス、レトロウィルス、プラスミド、あるいはバクテリオファージなどであるが、これらだけに限定されるものではない。
さらに、どのような哺乳動物の細胞でもホスト細胞、つまり本発明のポリペプチドを発現する細胞として用いることができ、それらの細胞とは、例えば、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、マワルワなどのヒト骨髄腫、ＰＥＲＣ６などのヒト由来のその他の細胞、細胞株ＣＨＯ、つまり、ＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ  １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８−６５３などである。
【００５６】
本発明のさらに別の目的は本発明の抗体と少なくとも１つの賦形剤及び／又は１つの楽額的に許容される基剤を含んだ医薬品組成物を提供することである。
好ましくは、本発明の医薬品組成物に含まれるモノクローナル抗イデオタイプ抗体は抗体１８Ｂ６、１８Ｂ６のフラグメントあるいはその１つの領域であり、あるいは、１８Ｂ６の可変領域あるいはＣＤＲを含んでおり、本明細書ですでに述べてあるようなキメラ性あるいはヒト化された抗体もそれに該当する。
本発明の医薬品組成物は治療を受ける患者が受け入れることができるどのような賦形剤にでも入れて製剤化することができる。
そうした賦形剤としては、水、食塩水溶液、リンゲル液、デキストロース液、及びその他の適切な水性生理液などである。
これらの賦形剤はその組成物の等張性及び安定性を増大させるための添加剤を少量含んでいてもよい。
そうした賦形剤にはリン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、及びトリス緩衝液などがある。
こうした賦形剤は当業者には周知である。
標準的な製剤は注入量の液体かあるいは投与する前に適切な液体に再懸濁させることができる固体製剤である。
本発明の医薬品組成物を作成するために通常用いられる基材は動物や患者におけるその治療用組成物の半減期を増大させたり、活性成分の放出を制御したりする機能を有している。
こうした基材としては有機性のものでも無機性のものでもよく、一定の割合で医薬品成分を流布させたり、あるいは一定の環境の下でだけ医薬品成分を流布させたりすることができる化合物、あるいはリポゾームなどもその目的のために使用することができる。
【００５７】
好適に、本発明の医薬品組成物は、さらに、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインとは異なったドメインに結合する阻害抗体に対する少なくとも１つの抗イデオタイプ抗体を含んでいる。
この抗体は、ファクターＶＩＩＩのＡ１、Ａ３、あるいはＢ、Ａ２あるいはＣ２ドメインと結合する阻害抗体に対する抗イデオタイプ抗体であってもよい。
実際、血友病Ａに罹っていて阻害抗体を発生している患者は、ほとんどの場合、いくつかのタイプの阻害抗体を示す。
さらに、これら異なったタイプの阻害抗体の量と性質は一定ではなく、患者の一生を通じて変化を示す。
同じ患者にみられるこれらの異なった阻害抗体は、したがってファクターＶＩＩＩの異なったドメインに向けられ、したがって異なった阻害抗体に対して向けられる１つだけではなく複数のタイプの抗イデオタイプ抗体で患者を治療する上で極めて好適である。
【００５８】
好ましくは、この医薬品組成物はファクターＶＩＩＩのＣ２ドメインに結合する阻害抗体及び／又はファクターＶＩＩＩのＡ２ドメインに結合する阻害抗体に対して向けられたモノクローナル抗イデオタイプ抗体と、本発明によるモノクローナル抗体を含んでいる。
実際、Ａ２及びＣ２ドメインは抗ファクターＶＩＩＩ免疫反応の主要な標的である。
従って、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに結合する阻害抗体に向けられた抗イデオタイプ抗体とＣ２ドメインに結合する阻害抗体に対して向けられた抗イデオタイプ抗体の混合物を含んだ医薬品組成物は患者の体内に存在するすべての阻害抗体の少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％あるいは９０％を中性化する。
本発明の好ましい実施の形態では、本発明によるこの医薬品組成物は抗体１４Ｃ１３（ベルギー共同微生物コレクションにＬＭＢＰ５８７８ＣＢの登録番号で寄託）及び／又は抗体３０Ｄ１（Ｉ−３４５０の登録番号でＣＮＣＭに寄託）を含んでいる。
本発明のさらに別の実施の形態においては、この医薬品組成物はＣＮＣＭにＩ−３５１０の登録癌号で寄託されているキメラ性抗体１４Ｃ１２及び／又は抗体３０Ｄ１から得られたキメラ性あるいはヒト化された抗体、つまり抗体３０Ｄ１の可変領域を含んだ抗体を含んでいる。
【００５９】
本発明のさらに別の目的は、本発明を医薬品として用いることである。
【００６０】
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗体を医薬品製造のための用いることである。
好適に、そうした医薬品はファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体を原因とする血友病の患者の出血を減らしたり、阻止したり、あるいは治療したりするために用いられる。
【００６１】
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗体をタイプＡ血友病の治療に向けられた医薬品を製造するために用いることである。
【００６２】
好適に、このようにして治療される血友病Ａは阻害因子によって引き起こされる血友病である。
本発明の抗体によって治療されるこのタイプの血友病は先天的な場合と、後天的な場合とがある。
その阻害抗体を中性化することにより、本発明の抗体は患者に対するファクターＶＩＩＩの注入による治療を有効にする。
何故なら、ファクターＶＩＩＩの活性が阻害抗体によって阻害されないからである。
【００６３】
本発明のさらに別の目的は、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害活性を中性化するための、本発明による抗体の利用である。
このプロセスは患者の血液からのファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体を枯渇させ、その血液を患者に再注入することによって行うことができる。
【００６４】
本発明のさらに別の目的は、本発明による抗体、好ましくは抗体１８Ｂ６を服務医薬品に関連している。
【００６５】
本発明のさらに別の目的は、、例えばファクターＶＩＩＩ阻害抗体を生成するために、阻害抗体を吸収するために上記抗体を用いることである。
【００６６】
最後に、本発明のもうひとつの目的は本発明による抗体をファクターＶＩＩＩ阻害抗体を検出及び／又は生成するために用いることである。
そうした検出及び精製法を実行する一般的なプロセスは当業者には周知である。
例として言えば、例えば、その表面に本発明の抗体を移植したビーズを含む免疫精製カラムの利用である。
その抗体によって認識された分子だけがそのビーズに固着する。
他の分子はそのカラムを通過する。
その分子を回収するためには、その溶液のイオン強度を高めるだけで十分である。
【課題を解決するための手段】
【００６７】
そこで、この発明は、上述不都合を除去するために、ファクターＶＩＩＩヒト阻害抗体に対するモノクローナル抗イデオタイプ抗体において、上記阻害抗体がファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対するものであり、上記抗体の各軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域（相補性決定領域）が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を含んでおり、そして、上記抗体の各重鎖の少なくとも１つのＣＤＲ領域が配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０、及び配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１から選択される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有していることを特徴とする。
【発明の効果】
【００６８】
以上詳細に説明した如くこの本発明によれば、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体を開発でき、ファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに向けられた阻害抗体の中性化を可能として血友病Ａを治療するための新しい手段とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
以下図面に基づいてこの発明の実施例を詳細に説明する。
本発明のさらなる態様や利点は以下の実施例に述べるが、これらの実施例は本発明の説明を目的とするものであって、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００７０】
実施例１：  ファクターＶＩＩＩのＣ１領域に対するヒト・モノクローナル抗体〈抗Ｃ１抗体〉の作成
【００７１】
資料Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｂｌｏｏｄ  ９２、４９６−５０６及び特許ＷＯ２００５／０１６４５５で述べられている手順に従って、ファクターＶＩＩＩに対する免疫反応を示す血友病Ａに罹った患者のＢリンパ球を不死化することで、以下に述べるヒトのリンパ芽球様細胞を得た。
【００７２】
モノクローナル抗Ｃ１  ＲＨＤ５抗体を産出する細胞株は、２００４年８月に、ベルギーのヘント大学（住所：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  ２９７、Ｂ−９０５２  Ｚｗｉｊｎａａｒｅｄｅ、Ｂｅｌｇｕｉｕｍ）の分子生物学研究所、ベルギー共同微生物／プラスミド・コレクション（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ）にコーレン研究財団（Ｃｏｌｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒａｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）が登録番号ＬＭＢＰ  ６１６５ＣＢの名称で寄託された。
【００７３】
ＲＨＤ５抗体の重鎖の可変領域の核酸配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５で、ＲＨＤ５抗体の軽鎖の可変領域の核酸配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６である。
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に対応するペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７であり、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に対応するペプチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８である。
【００７４】
オプションとして、動物の細胞を不死化することによって、必要な属性を示す抗体をつくりだすことができる。
この場合、ヒト・ファクターＶＩＩＩが補助剤と共にマウスに注入される。
脾臓リンパ球をマウス骨髄種細胞株で溶融することにより、モノクローナル抗ヒト抗体が得られる。
この抗ファクターＶＩＩＩ抗体をつくりだす細胞上澄み液が特定され、限定希釈でクローンされる。
こうした方法についての一般的な記述は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９４に見られる。
望ましい属性を示す阻害因子のさらなう選択について以下に述べる。
【実施例２】
【００７５】
実施例２：抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６の作成
【００７６】
Ｉ．マウス細胞の不死化
【００７７】
生後６週間のＢａｌｂ／ｃの雌のマウス４匹をファクターＶＩＩＩ  ＲＨＤ５抗体のヒト抗Ｃ１ドメインをフロイント・アジュバント（ＡＣＦ）に懸濁させ（第１次免疫化）、次いで不完全フロイント・アジュバント（ＡＩＦ）に懸濁させたもの１０μｇを脚パッドに３回皮下注射した。
【００７８】
免疫化を行う前に第１回の瀉血（瀉血０）を行い（瀉血日０（Ｄ０））、その後、
注射と瀉血を以下のようにおこなった。
Ｄ１  ：  注射  Ｎｏ１  （完全フロイント・アジュバントの存在下でＲＤＨ５を１０μｇ）
Ｄ１５：  瀉血  Ｎｏ１
Ｄ１６：  注射  Ｎｏ２  （不完全フロイント・アジュバントの存在下でＲＤＨ５を１０μｇ）
Ｄ２８：  瀉血  Ｎｏ２
Ｄ２９：  注射  Ｎｏ３  （不完全フロイント・アジュバントの存在下でＲＤＨ５を１０μｇ）
Ｄ４４：  瀉血  Ｎｏ３
【００７９】
ＩＩ．マウスの免疫反応の評価
【００８０】
異なった瀉血での抗ＲＨＤ５抗体の存在を評価するために、直接結合によるＥＬＩＳＡアッセイを行った。
この目的のために、ＲＨＤ５抗体、あるいは比較対象としての１ｍｌにＩｇＧ１  ３μｇを溶かしたものを不溶かさせ、１ウェルあたり５０μｌの割合でグリシン緩衝液内で温度４ｏＣで一昼夜培養した（グリシン緩衝液＝０．１Ｍ  グリシン、０．１７Ｍ  Ｎａｃｌ、ｐＨ  ９．２）。
その後、瀉血された血液をマジック緩衝液内で１／１０、１／１００、１／１０００及び１／１００００に希釈して、室温で２時間培養した（１ウェルあたり５０μｌ）。
そして、３回の洗浄をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ液内で行った。
その後、その反応系をＨＲＰ（ホースラディッシュ・ペロキシダーゼ）でラベルしたヤギ・ポリクローナル・マウス抗ｉｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の１μｇ／ｍｌ溶液で室温で２時間（１ウェルあたり５０μｌ）（マジック緩衝液で希釈）培養した。
そして、その反応系をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ液で３回洗浄して、色原体（オルト−フェニル・ジアミン）で顕在化させ、得られた着色の度合いを波長４９０／６５０ｎｍに対応するフィルター付のリーダー（リーダー：Ｅｍａｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｔｈｅｓｅ、  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で読み取った。
【００８１】
比較対象ＩｇＧ１で得られた光学強度の結果
【表１】
2009528285.tif 000002
【００８２】
ＲＨＤ５で得られた光学強度の結果
【表２】
2009528285.tif 000003
【００８３】
得られた結果を図１に示す。
結論：  ＲＨＤ５  Ｆａｂフラグメントの注入に対して、各マウスは正しく応答し、同様の反応を示した。マウスＮｏ．４を選んで、溶融を行った。
【００８４】
ＩＩＩ．溶融及びスクリーニング
【００８５】
マウスＮｏ．４の脾臓リンパ球と骨髄腫ＳＰ２／０の細胞との溶融を行った。
溶融は当業者に周知の方法（Ｊ．Ｇ．Ｇｉｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３：２６１７−２３；Ｐ．Ｃｏｒｎｅｉｓ、＜＜Ｌｅｓ  ａｎｔｉｃｏｒｐｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｕｘ＞＞、  Ｒｅｖｕｅ  ＩＲＥ、ｖｏｌ．７、Ｎ”４．１９８３）で行われた。
【００８６】
これらの細胞をヒポキサンチンとチミジンを含むＤＭＥＭ培養液（ダルベッコの修正イーグル培養液）を限界希釈の原則に従って連続的に膨張させ、ＩＩで述べたような手順で直接結合ＥＬＩＳＡアッセイで、テストでポジティブとされたクローンを検出した。
【００８７】
結合の特異性は、不適切な特性を有する研究所で作成したヒトＩｇＧ１を不溶かすることによって確認した。
【００８８】
ハイブリドーマの安定性を判定するために、クローン拡張中に、２００μｌから５ｍｌの異なった体積の培養液中で、エピトープ・スクリーニング・テスト（テスト１−３）を実施した。
テスト１＝２００μｌのウェル内での測定
テスト２＝１ｍｌのウェル内での測定
テスト３＝５ｍｌのウェル内での測定
【００８９】
異なったエピトープ・スクリーニング中に得られた結果を以下の表に示す。
【表３】
2009528285.tif 000004
【００９０】
ＩＶ．培養上澄み液での阻害アッセイ
【００９１】
表３に示すように、培養上澄み液を用いて阻害のテストが行われた。
このアッセイは、クローンの中から、ＲＨＤ５  Ａｂのパラトープ・レベルに位置するエピトープ決定因子を正確に認識する抗イデオタイプ抗体を選別するために実施された。
【００９２】
これらの抗イデオタイプ抗体はＥＬＩＳＡアッセイで、不溶化されたファクターＶＩＩＩに対するＲＨＤ５の結合の阻害に関してテストされた。
【００９３】
組み換えファクターＶＩＩＩ（ｒｅｃＦＶＩＩＩ）（Ｂａｘｔｅｒ社）をグリシン緩衝液内に２μｇ／ｍｌで溶かしたものを１ウェルあたり５０μｌの量で入れて、不溶化し、室温で２時間放置した。
ＲＨＤ５抗体（あるいは無関係のＩｇＧ１）を最終濃度０．６μｇ／ｍｌに調整して、マジック緩衝液内で１／１、１／２、及び１／４に希釈した。
これらのウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で３回洗浄した後、マジック緩衝液を１ウェルあたり１００μｌの割合で入れて飽和させた（室温で３０分）。
その後、この培養上澄み液を５０μｌのＲＨＤ５（あるいは無関係のＩｇＧ１）で培養して（マジック緩衝液を用いて室温で２時間）、３回洗浄した。
不溶化したｒｅｃＦＶＩＩＩに結合したＲＨＤ５抗体を、マウス・ポリクローナル・ヒト抗ＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でラベルした抗体溶液をマジック緩衝液内に１μｇ／ｍｌの割合で溶かしたものを１ウェルあたり５０μｌの分量で入れることによって検出した。
これらの連続的な洗浄はＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ液で行った。
そして、色原体（ＯＰＤオルト−フェニル・ジアミン）を用いて顕在化させ、波長４９０／６５０ｎｍに対応するフィルターを有するリーダー（リーダー：Ｅｍａｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｔｈｅｓｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて得られた色強度の読取を行った。
【００９４】
結論
表３に示すように、クローンはＲＨＤ５が不溶化されたｒｅｃＦＶＩＩＩに対して結合するのを特異的に阻害することができる。
（マイナスの数値はパラトープの外側領域に結合する可能性を示すか、あるいは、培養上澄み液内のＡｂ濃度の不十分さを示している。しかしながら、プラスの数値に関しては、以下のテストからネガティブなウェルは除外された。）
【００９５】
Ｖ．上澄み培養液を用いた機能テスト：ＲＨＤ５抗体の阻害活性（抗ファクターＶＩＩＩ）の中性化の測定
【００９６】
ＲＨＤ５抗体を阻害テスト中に選択された種々のクローンの上澄み液（３倍、６倍、１２倍及び２４倍に希釈されたもの）を用いて、マジック緩衝液中で、３７度Ｃの温度で、１μｇ／ｍｌの濃度で培養した。３０分後、ＦＶＩＩＩコグネート（Ｂａｙｅｒ社）を最終濃度０．５Ｕ／ｍｌで加えて、３０度Ｃの温度で３０分間、補足的培養を行った。
これらのサンプルをマジック緩衝液内で３０倍に希釈して、色原性ＤＡＤＥテスト（ファクターＶＩＩＩ色原性、Ｄａｄｅ  Ｂｅｒｒｉｎｇ  Ｇｍｂｈ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示に従って加えた。
【００９７】
表３に示す通り、１０のクローンはＲＨＤ５抗体の阻害活性を中性化することができた。
抗体１８Ｂ６は選んで、実験結果と中性化曲線を以下に示す。
【００９８】
ＶＩ．選択された１８Ｂ６抗ＲＨＤ５クローンの大量作成
【００９９】
抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６をＤＭＥＭ培養液内で作成した。
その後、プロテインＧ親和性カラム上で精製した（このカラムは抗体の精製、濃縮を可能にすると同時に、得られた抗イデオタイプ抗体の特異性の確認も可能にしてくれる）。
【０１００】
ＶＩＩ．特異性評価
【０１０１】
種々の製剤について、ＩＩ及びＩＶで述べたのと同じ手順に従って、ＥＬＩＳＡテストで評価を行った。
【０１０２】
１：ＥＬＩＳＡアッセイ：抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６の不溶化された抗体ＲＨＤ５に対する直接の結合
【０１０３】
抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６の不溶化された抗体ＲＨＤ５に対する直接の結合を図２に示す。
曲線は抗体１８Ｂ６のＲＨＤ６に対する結合が投与量に依存していることを示している。
【０１０４】
２：ＥＬＩＳＡアッセイ：不溶化された組み換えＦＶＩＩＩに対する抗体ＲＨＤ５結合の阻害
【０１０５】
ＲＨＤ５の不溶化された組み換えＦＶＩＩＩに対する結合の阻害をＩＶに述べた手順に従って測定した。
用いられたＲＨＤ５の濃度は２μｇ／ｍｌであった。
【０１０６】
【表４】
2009528285.tif 000005
【０１０７】
結果を図３に示す。
ＲＨＤ５：１８Ｂ６のモル比が２．５の場合に、ＦＶＩＩＩに対するＲＨＤ５の結合が５０％阻害された。
【０１０８】
３．機能テスト：ＲＨＤ５抗体阻害活性（抗ＦＶＩＩＩ）の中性化の測定
【０１０９】
手順はＶに述べた通りで、ＲＨＤ５の最終濃度は０．４μｇ／ｍｌで、最終濃度が４から０．００２μｇ／ｍｌの範囲での精製された抗イデオタイプ抗体について、曲線で示す。
【０１１０】
これらの結果は以下の表５に示す。
【表５】
2009528285.tif 000006
【０１１１】
結果を図４に示す。
ＲＨＤ５と１８Ｂ６のモル濃度が等しい場合に、ＲＨＤ５の阻害活性が５０％阻害された。
【０１１２】
４：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる『表面プラズモン共振バイオコア』法によって、抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６の阻害因子ＲＨＤ５への結合動力学ついて評価を行った。
ＲＨＤ５抗体をＣＭ５プローブの活性化された表面上に固定した。
抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６をそのプローブ上に固定された種々の濃路のＲＨＤ５に注入した。
結合及び解離定数を判定した。
Ｋａ  （Ｍ−１Ｓ−１）＝４，２６  ｘ  １０３  
Ｋｄ  （Ｓ−１）＝１．４５  ｘ  １０−５  
ＫＤ  ：Ｍ．３．４  ｘ  １０−９  
【０１１３】
５．抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６亜綱の特徴付け
【０１１４】
抗体１８Ｂ６の亜綱を判定するために、Ｒｏｃｈｅ社のＩｓｏＳｔｒｉｐシステムを用いた（比色分析用ストリップ）。
その結果、抗体１８Ｂ６はＩｇＧ１カッパーであることが確認された。
【０１１５】
ＶＩＩＩ．抗体１８Ｂ６の配列
【０１１６】
配列決定を行うために、抗イデオタイプ抗体１８Ｂ６をつくりだすハイブリドーマのｍＲＮＡをＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて単離した。
Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを合成した。
重鎖（Ｖｈ）及び軽鎖（ＶＬ）をコードするｃＤＮＡを、マウスに見出される可能性のある遺伝子の種々の族に対応するプライマーを用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）によって増幅した。
ＰＣＲによる生成物をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｏｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１．５％濃度のアガロース・ゲルから単離し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてクローニングした。
ポジティブ・コロニーのプラスミドＤＮＡをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って単離し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  （ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いて両方向の配列決定を行った。
【０１１７】
ＩＸ．１８Ｂ６抗体の特殊な属性
【０１１８】
抗体１８Ｂ６はＲＨＤ５抗体の、その抗原であるファクターＶＩＩＩへの結合を完全に阻害する。
ＲＨＤ５抗体は１８Ｂ６のそれと相補的なイデオタイプを有している。
【０１１９】
抗体のその抗原への結合には、水素結合、つまり疎水性あるいは極性誘引及びによって相互に結合するバンデルウォルス（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｓ）ブリッジによって相互に結合する多数のアミノ酸に対応する６−１２オングストロームの相互認識インターフェースが関与している。
【０１２０】
機能レベルでは、１つの抗体が抗体のその抗原への結合を完全に阻害する場合、それはその阻害抗体がその抗原の『内部イメージ』、つまり、その抗原の三次元構造を模倣する三次元構造を有していることを示唆している。
【０１２１】
１８Ｂ６抗体の一次構造（アミノ酸配列）はファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインに対しての一致度は低いが、１８Ｂ６抗体の二次構造とＲＨＤ５抗体の抗原性標的でありファクターＶＩＩＩのＣ１ドメインとの整合性、及び１８Ｂ６の三次元モデリングが、Ｃ１ドメインの三次元構造と重なり合うことで、１８Ｂ６の軽鎖（ＶＬ）の可変部分がＣ１ドメインの内部イメージを示していることを示唆している。
【０１２２】
こうした観察は、１８Ｂ６抗体が特異な、新しい、そしてこれまで予見されなかった属性を持っていることを示すものである。
言い換えるなら、ＲＨＤ５などの抗体による免疫かによって１８Ｂ６に類似した抗体をつくりだそうとする如何なる試みも、１８Ｂ６と同じ現実の抗体はつくりだし得ないのである。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】この発明の実施例を示す４匹のマウスにおける抗イデオタイプ抗体のＲＨＤ５に対する結合の増大（平均値）を示す図である。
【図２】上記抗イデオタイプ抗体が不溶化された交代ＲＨＤ５に直接結合した様子を示す図である。
【図３】抗体ＲＨＤ５の不溶化された組み換えファクターＶＩＩＩへの結合の阻害を示す図である。
【図４】１８Ｂ６によるＲＨＤ５の中性化を示す図である。
【図１】
2009528285.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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