(57)【要約】  本発明は、被験者の血液（血清／血漿）試料中ＥＧＦＲ変異の検出に関する。該方法は：（ｉ）該試料からＤＮＡを得て、（ii）タンパク質‐核酸プローブを用いるＰＣＲにより、ＥＧＦＲ遺伝子の特定領域に対応する核酸配列を増幅させ、そして（iii）該変異を検出することを含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液試料中ＥＧＦＲ遺伝子における変異の検出のための方法であって、
（ｉ）該試料からＤＮＡを得て、
（ii）タンパク質‐核酸プローブを用いるＰＣＲにより、ＥＧＦＲ遺伝子の特定領域に対応する核酸配列を増幅させ、そして
（iii）該変異を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
検出されるＥＧＦＲ遺伝子の変異が、エキソン１９のＥＬＲＥＡ欠損、エキソン２１のＬ８５８Ｒ変異、およびエキソン２１のＴ７９０Ｍ変異からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血液試料が血清または血漿試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出工程が核酸シーケンシングにより行われるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
検出工程がGeneScan技術により行われるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記GeneScan技術が、５′末端において蛍光色素により蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを含んでなるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光色素が６‐ＦＡＭ、ＨＥＸ、またはＮＥＤ色素からなる群より選択されるものである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、被験者の血液（血清／血漿）試料中ＥＧＦＲ変異の検出に関する。
【０００２】
背景技術
肺癌は、男性および女性の双方で癌関連死の主原因である。肺癌の罹患率は、男性において前立腺癌および女性において乳癌に次ぐものである。肺癌は、喫煙関連死の主原因として、心臓疾患を最近上回った。加えて、肺癌を生じるほとんどの患者は喫煙しており、心臓および肺臓に喫煙関連障害を有し、そのことが積極的な外科的または集学的(multimodality)治療法を実行し難い選択肢としてしまっている。ほとんどの肺癌腫は進行期で診断され、予後が悪い。
【０００３】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は全肺癌の約７５％を占める。ＮＳＣＬＣは組織型の異種集合体である。最も多い組織型は類表皮または扁平癌腫、腺癌、および大細胞癌腫である。
【０００４】
ＮＳＣＬＣ患者のサブグループを識別する上で、臨床医および研究者を助ける、臨床的、実験的な分子マーカーを特定するため、いくつかの研究が試みられてきた。これらの方針のもと、様々な研究により、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）が非小細胞肺癌および多くの他の上皮癌の４０〜８０％において過剰発現されていることが示された。
【０００５】
抗癌剤に対する感受性を制限する上で異常な上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）シグナリングは重要であり、またＥＧＦＲのリガンド非依存性チロシンキナーゼ活性化が、細胞外ドメインにおけるＥＧＦＲ変異により、しばしば引き起こされており、それは様々な腫瘍型、例えば多形性膠芽腫において観察されてきた。ＥＧＦＲシグナリングは、成長因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合により誘発される。チロシンキナーゼドメインを介するレセプターの自己リン酸化およびトランスリン酸化は、下流エフェクターのリクルートと増殖および細胞生存シグナルの活性化とに至る。
【０００６】
二種の変異が、肺腺癌でこれまでに報告されたＥＧＦＲ変異の約９０％を占めている。コーカサス人において、最も多い変異型は、エキソン１９における９、１２、１５、１８、または２４ヌクレオチドの短いフレーム内欠損であり、これはＥＧＦＲ変異をもつ症例の約６５％でみられるものである。次に多い変異は、ＥＧＦＲ変異をもつ症例の約３５％でみられるが、エキソン２１におけるヌクレオチド２５７３の点変異（ＣＴＧ→ＣＧＧ）であり、これはキナーゼの活性化ループのカルボキシ末端ローブにおいてＤＦＧモチーフに隣接するコドン８５８でアルギニンによるロイシンの置換（Ｌ８５８Ｒ）をもたらす。
【０００７】
これらのＥＧＦＲ変異は、ＮＳＣＬＣにおける真正の体細胞変異であり、他の一次腫瘍型では特定されていなかった。更に、ＥＧＦＲ変異は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）でゲフィニチブに対する腫瘍応答の強い決定因子である。他のずっと少ない変異はエキソン１８、２０、および２１についてであった。
【０００８】
これまでのところ、これらの変異に関するスクリーニングは直接シーケンシングまたは一本鎖高次構造多型解析に基づいていた。核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）は、正常なもののバックグラウンドの中で、少数の変異分子の検出をなしうる。少数の腫瘍細胞を検出する別な手段（例えば、フローサイトメトリー）は血液悪性疾患に通常限定されていたが、核酸増幅アッセイは、悪性細胞を特定して化学療法後の予後を予測する際に、高感度かつ特異的であることが見出された。
【０００９】
固形腫瘍組織で少数の変異分子を検出するための様々な核酸増幅戦略が開発されてきた。例えば、一つの高感度で特異的な方法は、重要な１２番目コドンで制限部位を開裂させる際の失敗に基づき、変異ｒａｓ癌遺伝子ＤＮＡを特定している（Kahn et al.Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via ‘enriched’ PCR amplification.Oncogene.1991 Jun,6(6):1079-83）。新生物においてＤＮＡの何らかの変異領域を検出して、他の癌遺伝子ＤＮＡまたは腫瘍関連ＤＮＡの検出を行うために、同様のプロトコールが適用しうる。変異ＤＮＡは、一次癌のみならず、前駆病変および転移部位においても検出されるため、核酸増幅アッセイは疾患に際する初期および終期の双方で癌を検出および測定する手段を提供する。
【００１０】
他の研究においては、癌患者の末梢血を解析して、患者の循環癌細胞から抽出された細胞内ＤＮＡを検出するために、核酸増幅アッセイを用いてきた。しかしながら、これらの研究においては、核酸ベース増幅アッセイを用いて、循環癌細胞内で抽出された細胞内ＤＮＡを検出しようと試みていることが、強調されねばならない。該アッセイは全血内の細胞ペレットまたは細胞を用いて癌患者からの血液の細胞フラクションで行われ、血清または血漿フラクションは一般に無視されるかまたは解析前に廃棄されている。このようなアプローチは（非血液系腫瘍の場合に）転移循環癌細胞の存在を必要とするため、それは初期癌の患者においての臨床使用に制限があり、それは非血液系非侵襲新生物または前悪性状態の検出には有用でない。
【００１１】
少ないが有意な量の正常ＤＮＡが健常人の血液中において循環していることが従来知られており、この量は癌状態で増加することが見出された。先行技術には、変異癌遺伝子ＤＮＡが癌患者の末梢血漿または血清で検出しえたという開示を含む。しかしながら、これらの報告も、進行癌または既知新生物もしくは増殖性疾患の患者に通常限定されていた。一部の著者（Kimura et al.,2006.EGFR Mutation of Tumor and Serum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-small Cell Lung Cancer）は、ＥＧＦＲ遺伝子の変異がＮＳＣＬＣに罹患した患者の血清試料で検出されうることを記載していた。該文献は、該変異に隣接するプライマーを用いたＰＣＲおよびシーケンシングによる、このような変異の検出を記載している。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は被験者の血液試料中ＥＧＦＲ遺伝子における変異の検出のための方法に関し、該方法は：
（ｉ）該試料からＤＮＡを得て、
（ii）タンパク質‐核酸プローブを用いるＰＣＲにより、ＥＧＦＲ遺伝子の特定領域に対応する核酸配列を増幅させ、そして
（iii）該変異を検出すること
を含んでなる。
【００１３】
さて、本発明者らは、血漿／血清試料中で最も多いＥＧＦＲ変異の検出のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースアッセイを開発および検証してきた。このアッセイは、標準法と比較して、タンパク質‐核酸（ＰＮＡ）プローブを用いることで解析される試料中変異対立遺伝子の増幅を高めることにより高い解析感度を呈し、それに際しては該変異に隣接するプライマーがＰＣＲ増幅、更にはシーケンシング解析に用いられる。このように、特異的ＥＧＦＲインヒビターに応答する可能性があるほとんどの肺癌患者の迅速な特定に向けた、堅調でアクセス可能なアプローチがここでは提供される。
【００１４】
加えて、新生物組織の直接解析は多くの場合（例えば、不顕性、未認識疾患の場合）に困難または不可能であるが、上記の方法は該変異の検出のために血液、例えば末梢血を用いる利点を有する。末梢血は核酸ベースアッセイへ容易にアクセス可能でなじみやすい。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本記載の理解を容易にするために、本発明に関して一部用語および表現の意味を以下において説明する。
【００１６】
“被験者”という用語は、あらゆる年齢または人種の男性または女性に関する。好ましくは、それは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するまたは有する疑いのあるヒトを含む。ＮＳＣＬＣの診断法およびＮＳＣＬＣ診断の臨床描写は医療業者に周知である。例として、ＮＳＣＬＣを有する疑いのある被験者を特定するための方法には、身体検査、被験者の家族病歴、被験者の病歴、肺生検、またはいくつかのイメージング技術、例えば超音波検査がある。
【００１７】
“核酸”という用語は、ポリヌクレオチドを形成するためにホスホジエステル結合で結合された、含窒素ヘテロ環式塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含んでなる多量体(multimeric)化合物に関する。
【００１８】
“ＤＮＡ”という用語はデオキシリボ核酸に関する。ＤＮＡ配列はデオキシリボ核酸配列である。ＤＮＡはヌクレオチドの長いポリマーであり、遺伝コードを用いてタンパク質におけるアミノ酸残基の配列をコードする。
【００１９】
“タンパク質‐核酸プローブ”という用語は、プリンおよびピリミジン塩基がメチルカルボニルリンカーで結合されたＮ‐（２‐アミノエチル）グリシンの反復単位によりホスホジエステル主鎖が置き換えられた、合成ＤＮＡアナログに関する。
【００２０】
一つの態様において、本発明は、被験者の血液試料中ＥＧＦＲ遺伝子における変異の検出のための、ここでは“本発明の方法”と称されている方法に関し、該方法は：
（ｉ）該試料からＤＮＡを得て、
（ii）タンパク質‐核酸プローブを用いるＰＣＲにより、ＥＧＦＲ遺伝子の特定領域に対応する核酸配列を増幅させ、そして
（iii）該変異を検出すること
を含んでなる。
【００２１】
本発明の方法は、ＥＧＦＲ遺伝子における何らかの変異を検出するために用いられる。本発明の具体的態様において、検出されるＧＦＲ遺伝子の変異は、エキソン１９のＥＬＲＥＡ欠損、エキソン２１のＬ８５８Ｒ変異、およびエキソン２１のＴ７９０Ｍ変異からなる群より選択される。
【００２２】
試料
本発明の方法を用いて核酸が抽出および解析されうる試料の限定されない実例としては、正常および癌性双方の血液（血清または血漿）、および検出されうる核酸を含有した他の体液があるが、それらに限定されない。
【００２３】
本発明の方法を実施するために、試料が研究対象の被験者から得られる。具体的な態様において、試料は血液試料である。試料は、ＮＳＣＬＣと既に診断されたまたは診断されていない被験者から、あるいは抗ＮＳＣＬＣ治療を受けているまたは以前に治療を受けていた被験者から得られる。ある態様において、試料は正常な肺機能組織を有する被験者、即ちＮＳＣＬＣの証拠がない被験者からの試料である。
【００２４】
本発明の実施に際して、血清の調製には抗凝血剤なしの、あるいは血漿の調製にはＥＤＴＡ、ヘパリン、または類似抗凝血剤、最も好ましくはＥＤＴＡ入りの、好ましくはシリコーン処理ガラスを含めた、コレクションチューブ中へ、標準法により血液が採取される。血漿は、場合によりその後で、凝固が生じるまで、３７℃において短時間、最も好ましくは１〜３分間にわたる等量の塩化カルシウムとの抗凝血剤処理血漿のインキュベーションにより、血清へ変換してもよい。血餅は次いで短い遠心によりペレット化され、脱タンパク質化血漿が他のチューブへ移される。一方、遠心は省略してもよい。血餅アクチベーターチューブを用いても血清が得られる。
【００２５】
ＤＮＡ増幅
本発明の具体的態様においては、血清または血漿が変異ＤＮＡの特定のために直接利用されうる。他の具体的態様においては、核酸が本発明の初期工程として血漿または血清から抽出される。このような場合、該試料から抽出された全ＤＮＡが次の増幅に適した作業物質となる。
【００２６】
試料が得られたなら、核酸の増幅が行われる。具体的態様において、ＤＮＡの増幅はＰＣＲにより行われる。ＰＣＲを用いるような、核酸の増幅および検出のための一般原理および条件は、当業者に周知である。特に、本発明の方法により行われるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＥＧＦＲ標的配列を特異的に増幅させるために、適切で特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたは増幅オリゴヌクレオチドを用いる。このような増幅オリゴヌクレオチドの限定されない実例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列がある。“オリゴヌクレオチドプライマー”または“増幅オリゴヌクレオチド”という用語はここでは互換的に用いられ、約２〜５残基の下限と約５００〜９００残基の上限を有するサイズ範囲のものを含めて、通常１０００以下の残基を有するポリマー核酸に関する。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは約５〜約１５残基の下限と約１００〜２００残基の上限を有するサイズ範囲にある。更に好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは約１０〜約１５残基の下限と約１７〜１００残基の上限を有するサイズ範囲にある。オリゴヌクレオチドプライマーは天然核酸から精製しうるが、それらは様々な周知酵素または化学法のいずれかを用いて通常合成される。本発明の具体的態様において、このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、ＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９で特定ヌクレオチドの欠損に対応するＤＮＡフラグメントの特異的な増幅を可能にする。
【００２７】
このように、具体的態様において、本発明の方法はエキソン１９においてＥＬＲＥＡ欠損の検出のために用いられる。好ましい態様において、本発明はＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９において９、１２、１５、１８、または２４ヌクレオチド欠損の検出のための方法に関する。
【００２８】
他の具体的態様において、本発明の方法はＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１においてＬ８５８Ｒ変異の検出のために用いられる。他の態様において、本発明の方法はＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１においてＴ７９０Ｍ変異の検出のために用いられる。
【００２９】
“増幅オリゴヌクレオチド”という用語は、標的核酸またはその相補体とハイブリッド形成し、核酸増幅反応に関与する、オリゴヌクレオチドに関する。増幅オリゴヌクレオチドとしては、テンプレートとして他の核酸鎖を用いてオリゴヌクレオチドの３′末端が酵素的に伸長される、プライマーおよびプロモーター‐プライマーを含む。一部の態様において、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（またはその相補鎖）の領域と相補的な、少なくとも約１０連続塩基、更に好ましくは約１２連続塩基を含有する。標的結合塩基は、それが結合する配列と、好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは約９０％〜１００％相補的である。増幅オリゴヌクレオチドは好ましくは約１０〜約６０塩基長であり、修飾ヌクレオチドまたは塩基アナログを含有してもよい。
【００３０】
“増幅する”または“増幅”という用語は、標的核酸配列またはその相補体もしくはそのフラグメントのマルチコピーを作製するための操作に関する（即ち、完全な標的配列に満たない増幅産物に含める）。例えば、標的核酸の内部箇所とハイブリッド形成してそこから重合を開始させる増幅オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸の一部を増幅させることにより、フラグメントが作製されうる。既知増幅法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、レプリカーゼ媒介増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写関連または転写媒介増幅（ＴＭＡ）を含む。ＰＣＲ増幅では、ＤＮＡまたはｃＤＮＡのマルチコピーを合成するために、ＤＮＡポリメラーゼ、反対鎖のためのプライマーおよびサーマルサイクリングを用いる。レプリカーゼ媒介増幅では、ＲＮＡ配列を増幅させるために、ＱＢレプリカーゼを用いる。ＬＣＲ増幅は、ハイブリッド形成、連結、および変性のサイクルを用いることで標的の相補鎖を増幅させるために、少なくとも四種の異なるオリゴヌクレオチドを用いる。ＳＤＡにおいては、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含むプライマーと、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼとを用い、次いで一連のプライマー伸長および鎖置換工程を行う。エンドヌクレアーゼニッキングに依存しない等温鎖置換増幅法も知られている。転写関連または転写媒介増幅は、標的配列からマルチ転写物を作製し、こうして標的配列を増幅させるために、プロモーター配列を含むプライマーと、該プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼとを用いる。
【００３１】
本発明の好ましい態様においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅で本増幅オリゴヌクレオチドを用いて、ＥＧＦＲ標的配列を増幅させる。ポリメラーゼ媒介プライマー伸長を用いる他の核酸増幅法でこれらの増幅オリゴヌクレオチドが直ちに用いられる、と当業者であれば理解するであろう。
【００３２】
本発明の方法の増幅工程においては、ＥＧＦＲ遺伝子の特定領域に対応する核酸配列がタンパク質‐核酸（ＰＮＡ）プローブを用いるＰＣＲにより増幅される。ＰＮＡプローブは、Ｎ‐（２‐アミノエチル）グリシン単位から通常形成される合成ペプチド主鎖で天然核酸の糖リン酸主鎖が置き換えられて、アキラルな無荷電ミミックをもたらす、核酸アナログである。この新しい分子は化学的に安定で、加水分解（酵素）開裂に抵抗性であり、そのため生細胞内で分解されないと予想される。天然核酸からのこれらすべての態様にもかかわらず、ＰＮＡはワトソン‐クリック水素結合規則に従いＤＮＡおよびＲＮＡとなお配列特異的に結合しうる。そのハイブリッド複合体は驚くべき熱安定性を呈し、独特なイオン強度性を示す。多くの適用例において、ＰＮＡプローブは核酸プローブより好ましく、何故ならば低塩の条件下において不安定化される核酸／核酸二重鎖とは異なり、ＰＮＡ／核酸二重鎖は極低塩の条件下において形成されて安定なままだからである。ハイブリッド形成のストリンジェンシーを負荷または制御するために常用される因子には、ホルムアミド濃度（または他の化学変性試薬）、塩濃度（即ち、イオン強度）、ハイブリッド形成温度、デタージェント濃度、ｐＨ、およびカオトロープの存在または非存在を含む、と核酸ハイブリッド形成の当業者であれば理解するであろう。プローブ／標的配列組合せに最良のストリンジェンシーは、上記ストリンジェンシーの因子のいくつかを定めてから単一ストリンジェンシーファクターを変えた効果を調べる周知技術により、多くの場合に見出される。同様のストリンジェンシーの因子は調節することにより核酸へのＰＮＡのハイブリッド形成のストリンジェンシーを制御してもよいが、但しＰＮＡのハイブリッド形成はイオン強度と全く無関係である。アッセイに最良のストリンジェンシーは、所望の識別度に達するまで各ストリンジェンシーの因子の試験により、実験的に決められる。
【００３３】
ＰＮＡオリゴマーは、ペプチドに関する標準固相合成プロトコール（Merrifield,B.1986.Solid-phase synthesis.Science 232,341-347）に従い、例えば固体支持体として（メチル‐ベンズヒドリル）アミンポリスチレン樹脂を用いて作製しうる。ＰＮＡには、ＰＮＡオリゴマーがＤＮＡオリゴマーへ融合されたＰＮＡ／ＤＮＡキメラのようなキメラ構築物を含んでもよい。
【００３４】
臨床試料は、変異対立遺伝子のＤＮＡ分子に加えて、野生型対立遺伝子のＤＮＡ分子を含有する。そのため、正常条件下においては、野生型ＥＧＦＲ遺伝子（野生型対立遺伝子）の大きなバックグラウンドの中でＥＧＦＲ変異（変異対立遺伝子）を検出することが困難である。具体的な場合において、本発明者らにより利用されるＰＮＡプローブは野生型ＥＧＦＲ配列を特異的に認識してそれとハイブリッド形成しうる。限定されない実例として、本発明の方法を実施するために用いられるＰＮＡプローブは、本発明の実施例においてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として記載されたＰＮＡプローブを含む。このようなプローブはＰＣＲ反応ミックスへ加えられ、こうして野生型対立遺伝子の増幅を阻止して、試料中に存在する変異対立遺伝子、即ちＥＧＦＲ変異体の増幅を有利にさせ、その事後検出を容易にさせる。適切なＰＮＡプローブはこれらプロービング核酸配列のままで機能させる必要はなく、具体的アッセイ条件に従い多くの場合で修飾される、と当業者であれば理解するであろう。例えば、ハイブリッドの安定性が調節されることでＴｍを低下させるおよび／またはストリンジェンシーに合わせて調整する必要があれば、核酸配列のトランケーションにより短いＰＮＡプローブも作製してよい。同様に、識別性核酸配列がＰＮＡプローブの配列内に残存する限り、核酸配列は一端でトランケートして他端で伸長させてもよい。ここで記載されたパラメーター内におけるプロービング核酸配列のこのような態様も、本発明の態様であるとみなされる。
【００３５】
本発明の実施例１において観察されるように、本発明の方法で適用されるこのようなＰＮＡプローブを用いたポリメラーゼ連鎖反応の条件としては、ＥＧＦＲ遺伝子におけるエキソン１９の対象の変異を含む１２０ｂｐゲノムフラグメントを含んでなる正確なＰＣＲ増幅産物の獲得のためにはわずか４０サイクルの増幅で十分である。
【００３６】
本発明の方法のＰＣＲのための一般条件は、本発明の実施例１において実証されている通りである。この実施例において、ＰＣＲ増幅反応に用いられるＤＮＡは血漿／血清試料からのものである。
【００３７】
ＤＮＡ変異の検出
ＰＣＲ増幅産物を検出および解析するための多くの方法が以前に開示されてきた。特に、ＤＮＡ配列変異体の検出は当業者に知られたいくつかの方法のいずれで行ってもよい（Kilger et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:2032-4）。本発明の具体的態様において、本発明の方法の検出工程は核酸シーケンシングにより行われる。核酸シーケンシング法の限定されない実例はサイクルシーケンジング（Sarkar et al.,1995,Nucleic Acids Res.23:1269-70）または直接ジデオキシヌクレオチドシーケンシングであり、そこでは試料から回収された対象の一部または全ＤＮＡがシーケンシング反応用の鋳型として用いられる。対象の遺伝子またはＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたは一連のプライマーが、標準シーケンシング反応で用いられる。ＤＮＡシーケンシングの他の方法、例えばハイブリッド形成によるシーケンシング、ハイブリッド形成用に多くのオリゴヌクレオチドを含有した“チップ”（例えば、Affymetrix Corp.製のもの、Ramsay et al.,1998,Nature Biotechnology 16:40-44、Marshall et al.,1998,Nature Biotechnology 16:27-31）を用いるシーケンシング、ＨＰＬＣによるシーケンシング（DeDionisio et al.,1996,J.Chromatogr.A 735:191-208）およびＤＮＡシーケンシング戦略の修正法、例えば多重対立遺伝子特異的診断アッセイ（ＭＡＳＤＡ、Shuber et al.,1997,Hum.Molec.Genet.6:337-47）、ジデオキシフィンガープリンティング（Sarkar et al.,1992,Genomics 13:441-3、Martincic et al.,1996,Oncogene 13:2039-44）および蛍光プローブベースＰＣＲ法（例えば、Taqman、Perkin-Elmer Corp.、Heid et al.,1996,Genome Res.6:986-94）およびcleavaseベース法が用いられる。
【００３８】
一方、増幅は適切に標識されたプライマーを用いて実施でき、増幅されたプライマー伸長産物は標識の検出のための操作および装置を用いて検出しうる。好ましくは、本発明のプローブは少なくとも一つの検出可能部分において標識され、該検出可能部分は共役体、分岐検出システム、発色団、蛍光団、スピン標識、放射性同位元素、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、および発光化合物からなる群より選択される。限定されない実例として、本発明の方法においては、用いられるプライマーが蛍光団により標識される。更に詳しくは、本発明の方法の逆プライマーは、その５′末端において６‐ＦＡＭ蛍光団により標識される。この蛍光団は５２２ｎｍのピーク波長で蛍光を発する。ＰＣＲは、例えばＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、またはＮＥＤ色素により標識されたプライマーの一つを用いて行える。
【００３９】
本発明の好ましい態様において、本発明の方法により増幅されたＤＮＡの事後検出および解析は、本発明の実施例において実証されているように、GeneScan技術により行われる。そのため、本発明の方法の検出工程を実施するための限定されない実例として、ＰＣＲ反応のアリコート（典型的には１μＬ）が９μＬのホルムアミドＨＩ‐ＤＩおよび０．２５μＬのGeneScanマーカー‐５００ＬＩＺサイズ標準へ加えられる。変性後、試料がＡＢＩ３１３０ Genetic Analyzerへ入れられ、キャピラリー電気泳動が行われる。生データがGeneScanソフトウェアを用いて解析される。ＰＣＲ産物がインサンプルサイズ標準への外挿によりサイズ分けされることから、この解析は非常に重要である。この技術を用いて、本発明者らは非常に正確で精密な手法により対象の変異を検出することができる。
【実施例】
【００４０】
本発明は下記実施例において更に実証されるが、これは本発明のある態様を実証するために提示されており、本発明を限定すると解釈されるべきでない。
【００４１】
実施例１
GeneScanによるＥＧＦＲ遺伝子のエキソン１９におけるＥＬＲＥＡ欠損の判定
材料および方法：
１‐サンプルコレクション
各被験者からの静脈血（１０ｍＬ）を、リットル当たり５０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するチューブへ入れ、ゲノムＤＮＡを製造業者の指示に従いＱＩＡｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Qiagen,Germany）で単離した。
【００４２】
２‐GeneScan反応調製
１．１‐材料
‐Abi Prism３１３０ＤＮＡアナライザー（Perkin-Elmer,Applied Biosystems）
‐９６ウェル・オプティカル・リアクション・プレート（Applied Biosystems,Cat.No.4306737）
【００４３】
１．２‐ＰＮＡプローブとのＰＣＲ反応ミックス
ＰＣＲ反応ミックスを次のように作製した：
‐２．５μＬ緩衝液１０ｘ（Ecogen）
‐０．５μＬ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ecogen）
‐０．６２５μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰ（Promega）
‐１．２５μＬ １０μＭの各プライマー
‐０．１μＬ ＴＡＱポリメラーゼ（Ecogen）
‐１２．５μＬ ５ｍＭ ＰＮＡプローブ（Applied Biosystems）
‐５μＬ  血清または血漿からのＤＮＡ
‐２５μＬの最終容量まで無菌蒸留水を加える
【００４４】
１．３‐ＰＮＡプローブなしのＰＣＲ反応ミックス
ＰＣＲ反応ミックスを次のように作製した：
‐２．５μＬ緩衝液１０ｘ（Ecogen）
‐０．５μＬ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ecogen）
‐０．６２５μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰ（Promega）
‐１．２５μＬ １０μＭの各プライマー
‐０．１μＬ ＴＡＱポリメラーゼ（Ecogen）
‐５μＬ  血清または血漿からのＤＮＡ
‐２５μＬの最終容量まで無菌蒸留水を加える
【００４５】
逆プライマーを６‐ＦＡＭ蛍光団により標識した（６‐ＦＡＭは５２２ｎｍのピーク波長で蛍光を発する）。
プライマーフォワード：ＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
プライマーリバース：６‐ＦＡＭ‐ＣＣＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＰＮＡプローブ配列：Ａｃ‐ＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
【００４６】
１.３‐ＰＣＲプログラム
ＰＣＲを次のように行った：９５℃で５分間、次いで９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１分間の４０サイクル、および７２℃で５分間の最終伸長
【００４７】
３‐GeneScan調製
‐９μＬ ホルムアミドＨＩ‐ＤＩ（Applied Biosystems）
‐０．２５μＬ GeneScanマーカー‐５００ＬＩＺサイズ標準（Applied Biosystems）
‐１μＬ希釈最終ＰＣＲ産物
試料を９３℃において３分間変性させ、氷上で１０分間冷却した。それらを次いでキャピラリー電気泳動に付し、その後でＡＢＩ３１３０ＤＮＡアナライザーで５２２ｎｍの発光波長の検出のために４９４ｎｍの励起波長へ付した。
【００４８】
結果：
全部で４１の血清／血漿試料をエキソン１９で欠損の検出のためにGeneScanで解析した。解析された全試料が腫瘍組織で陽性変異の患者からのものであった。
GeneScan解析結果は、腫瘍組織で陽性変異の試料の５５％がGeneScan解析でも陽性であったことを示す（表１）。
【表１】
2009544283.tif 000002
【００４９】
実施例２
GeneScanによるＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１におけるＬ８５８Ｒ変異の判定
材料および方法：
１‐サンプルコレクション
各被験者からの静脈血（１０ｍＬ）を、リットル当たり５０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するチューブへ入れ、ゲノムＤＮＡを製造業者の指示に従いＱＩＡｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Qiagen,Germany）で単離した。
【００５０】
２‐Taqman反応（５′ヌクレアーゼ活性アッセイ）
１．１‐材料
‐ＡＢ７０００または７９００ＨＴ（Applied Biosystems）
１．２‐ＰＮＡプローブとのＰＣＲ反応（５′ヌクレアーゼ活性アッセイ）ミックス
ＰＣＲ反応ミックスを次のように作製した（表２）：
【表２】
2009544283.tif 000003
ＰＣＲを次のように行った：６０℃において２分間、次いで９５℃で１０分間の５０サイクル、次いで９５℃で１５秒間および６０℃で１分３０秒間の５０サイクル
【００５１】
３‐プライマー、プローブ、およびＰＮＡ
野生型配列を検出するためのプローブを蛍光団ＶＩＣで標識し、一方変異対立遺伝子を検出するためのプローブを蛍光団ＦＡＭで標識した。
プライマーフォワード：ＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
プライマーリバース：ＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
蛍光団ＶＩＣにより標識された野生型対立遺伝子の検出のためのプローブ：
ＶＩＣ‐ＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣ‐ＴＡＭＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
蛍光団ＦＡＭにより標識された変異対立遺伝子の検出のためのプローブ：
６‐ＦＡＭ‐ＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣ‐ＴＡＭＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
ＰＮＡプローブ：ＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
【００５２】
結果：
全部で４１の血清／血漿試料をＬ８５８Ｒで変異の検出のためにGeneScanで解析した。解析された全試料が腫瘍組織で陽性変異の患者からのものであった。
５′ヌクレアーゼ活性アッセイ解析結果は、腫瘍組織で陽性変異の試料の５５％（Ｌ８５８Ｒ）がこの解析でも陽性であったことを示す（表３）。
【表３】
2009544283.tif 000004
【００５３】
実施例３
Taqman反応によるＥＧＦＲ遺伝子のエキソン２１におけるＴ７９０Ｍ変異の判定
材料および方法：
１‐サンプルコレクション
各被験者からの静脈血（１０ｍＬ）を、リットル当たり５０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するチューブへ入れ、ゲノムＤＮＡを製造業者の指示に従いＱＩＡｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Qiagen,Germany）で単離した。
【００５４】
２‐Taqman反応（５′ヌクレアーゼ活性アッセイ）
１．１‐材料
‐ＡＢ７０００または７９００ＨＴ（Applied Biosystems）
１．２‐ＰＮＡプローブとのＰＣＲ反応（５′ヌクレアーゼ活性アッセイ）ミックス
ＰＣＲ反応ミックスを実施例２のように作製した（表２参照）：
ＰＣＲを次のように行った：６０℃において２分間、次いで９５℃において１０分間の５０サイクル、次いで９５℃において１５秒間、および６０℃で１分３０秒間の５０サイクル
【００５５】
３‐プライマー、プローブ、およびＰＮＡ
野生型配列を検出するためのプローブを蛍光団ＶＩＣにより標識し、一方変異対立遺伝子を検出するためのプローブを蛍光団ＦＡＭにより標識した。
プライマーフォワード：ＡＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
プライマーリバース：ＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
蛍光団ＶＩＣにより標識された野生型対立遺伝子の検出のためのプローブ：
ＶＩＣ‐ＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡ‐ＭＧＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
蛍光団ＦＡＭにより標識された変異対立遺伝子の検出のためのプローブ：
６‐ＦＡＭ‐ＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＡ‐ＭＧＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
ＰＮＡプローブ：ＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
【００５６】
結果：
全部で四つの血清／血漿試料を解析した。解析された全試料が腫瘍組織で陽性変異の患者からのものであった。
５′ヌクレアーゼ活性アッセイ解析結果は、腫瘍組織で陽性変異の試料の７５％（Ｔ７９０Ｍ）がこの解析でも陽性であったことを示す（Ｔ７９０Ｍに関する表４）。
【表４】
2009544283.tif 000005
【配列表】
2009544283000001.xml
【国際調査報告】
2009544283.tif 000010
2009544283.tif 000011