(57)【要約】本発明は、癌およびその他の治療の処置における使用のために適切な５，１０メチレンテトラヒドロ葉酸の安定な凍結乾燥組成物を提供する。この組成物は、クエン酸およびアスコルビン酸と組み合わせて５，１０−ＭＴＨＦを、クエン酸とアスコルビン酸との重量比が約０．７５：１〜約２．２５：１、そしてクエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比が約１．４：１〜３．４：１で含む。凍結乾燥の前に、溶液は、本質的に中性のｐＨに調節される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸およびアスコルビン酸またはそれらの薬学的塩を含む５，１０−ＭＴＨＦの安定な凍結乾燥された組成物であって、クエン酸とアルコルビン酸との重量比が約０．７５：１〜約２．２５：１の範囲であり、そしてクエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比が約１．４：１〜３．４：１の範囲である、組成物。
【請求項２】
前記クエン酸とアルコルビン酸との重量比が、約１．５：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記クエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比が、約２：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
溶液中の請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物であって、該溶液が約５〜約７のｐＨを有する、組成物。
【請求項５】
前記溶液が、本質的に中性のｐＨを有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
５，１０−ＭＴＨＦの安定な凍結乾燥された組成物を処方する方法であって、（ａ）クエン酸およびアスコルビン酸またはそれらの薬学的塩の溶液を調製する工程であって、ここで、クエン酸とアルコルビン酸との重量比が約０．７５：１〜約２．２５：１の範囲である工程；（ｂ）該溶液中に５，１０−ＭＴＨＦを溶解する工程であって、ここで、クエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比が約１．４：１〜３．４：１の範囲である工程；および（ｃ）該溶液を凍結乾燥する工程、を包含する、方法。
【請求項７】
前記クエン酸とアルコルビン酸との重量比が、約１．５：１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記クエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比が、約２：１である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記溶液を、凍結乾燥の前に本質的に中性のｐＨに調節する工程をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
癌は主要な公衆健康関心事である。結腸直腸癌単独で、米国で１年あたり約５０，０００人の死亡を引き起こしている。毎年診断される約１３０，０００の結腸直腸癌の事例のほぼ半分は、化学的療法が唯一の処置である転移疾患とともに存在するか、または発現する。処置のための新たな有効薬物を基礎にした療法が、結腸直腸癌のためのみならず、例えば乳癌、膵臓癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、頸部癌、頭部および首の癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌のようなその他の癌に対して緊急に求められている。
【０００２】
抗癌薬物５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、核酸生合成のために必要な酵素であるチミジレートシンターゼ（ＴＳ）の阻害剤である。５−ＦＵは、結腸直腸および乳癌、ならびに頭部および首部癌、膵臓癌、胃癌、および非小細胞肺癌のような癌を処置するために一般に用いられている。５−ＦＵは、一般に、細胞内でＴＳのコファクターである還元葉酸に変換されるフォリン酸（ＦＡ、ロイコボリン）と組み合わせて用いられる。５−ＦＵとロイコボリンとの組み合わせは、５−ＦＵ単独の使用と比較したとき、増加した抗腫瘍効果を有することが見出されている。
【０００３】
不幸なことに、ロイコボリンと組み合わせた５−ＦＵの増加した抗腫瘍効果はまた、増加した、口内炎、粘膜炎、胃腸症状のような毒性、および血液学的毒性、特に好中球減少症、血小板減少症、および白血球減少症を含む。このような毒性は、一般に、この抗癌剤の投薬量を制限することにより、患者に利用可能な処置を制限する。従って、患者の生存を延長することで有効である、低減された毒性および／または改良された抗腫瘍活性を有する改良された抗癌薬物養生法を開発する必要性がある。
【０００４】
ロイコボリンが５−ＦＵ全身毒性の重篤度を増加するロイコボリンの可能性に加え、ロイコボリンは、細胞内で、その活性な代謝物５，１０メチレンテトラヒドロ葉酸（以下の名前のいずれかによって種々に知られる：（６Ｒ，Ｓ）−５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸；Ｎ−［４−（３−アミノ−１，２，５，６，６ａ，７−ヘキサヒドロ−１−オキソイミダゾ［１，５−ｆ］−プテリジン−８（９Ｈ）−イル）ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸；Ｎ−［ｐ−（３−アミノ−５，６，６ａ，７−テトラヒドロ−１−ヒドロキシイミダゾ［１，５−ｆ］−プテリジン−８（９Ｈ）−イル）ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸；（６Ｒ，Ｓ）−５，１０−メチレン−５，６，７，８−テトラヒドロプロロイルＬ−グルタミン酸；Ｎ５，Ｎ１０−メチレンテトラヒドロ葉酸；Ｄ／Ｌ−５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸；（６Ｒ，Ｓ）−５，１０−ＣＨ２−Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ−Ｃａ（以後：「５，１０−ＭＴＨＦ」）に複数ステップで変換されなければならない。しかし、複数の研究は、５，１０−ＭＴＨＦを（代表的にはカルシウム塩として）直接用いることが可能であり、しかも、この活性な薬学的成分が、５−ＦＵと組み合わせたロイコボリンと比較したとき、５−ＦＵと組み合わせて用いられるとき見かけ上より安全な毒性プロフィールで抗腫瘍活性を有することを示した。
【０００５】
５，１０−ＭＴＨＦの薬学的使用は、空気による酸化、中性および／または酸性環境、化学的分解、および加水分解を含む種々の要素に対するその不安定性によって制限されている（非特許文献１）。癌の処置のために５，１０−ＭＴＨＦの活性形態の臨床的に有効な用量を送達する所望性のために、患者に投与される５，１０−ＭＴＨＦの組成物が安定であり、そして所望および／または要求される強度を提供することが重要である。
【０００６】
５，１０−ＭＴＨＦは、厳格な空気閉鎖または塩基性ｐＨ環境における溶解で安定化され得ることが教示されている（非特許文献１、前述）。特許文献１は、５，１０−ＭＴＨＦの安定な薬学的組成物は、ｐＨを７．５と１０．５との間、好ましくは８．５と９．５との間に調節しながらこの活性成分を処方することにより得られ得ることを教示している。
【特許文献１】国際公開第２００４／１１２７６１号パンフレット
【非特許文献１】Ｍ．Ｊ．Ｏｓｂｏｒｎら、「Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ”Ａｃｔｉｖｅ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ”」Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．７８２：４９２１−４９２７（１９６０）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の発明者らは、先行技術に教示されるような実質的に塩基性のｐＨ環境で５，１０−ＭＴＨＦを処方、そして／または維持する必要性なくして、その安定かつ薬学的に活性な組成物を得ることが可能であることを今や発見した。本明細書で示されるように、５，１０−ＭＴＨＦの安定な組成物が処方され得、ここで、溶液中のこの組成物のｐＨは、約５と約７との間であり；凍結乾燥前および臨床目的のためには、本発明に従う５，１０−ＭＴＨＦの安定な組成物は、本質的に中性のｐＨに調節され得る。従って、本発明に従って、クエン酸およびアスコルビン酸と組み合わせて５，１０−ＭＴＨＦを含む５，１０−ＭＴＨＦの安定な凍結乾燥された組成物が提供され、ここで、クエン酸とアルコルビン酸との相対量は、この組成物の安定性に実質的に影響することなく、約０．７５：１〜約２．２５：１の重量比で変動し得、そしてクエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比は約１．４：１〜３．４：１で変動する。本発明の好ましい実施形態によれば、クエン酸とアルコルビン酸との重量比は約１．５：１であり、そしてクエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比は約２：１である。
【０００８】
本発明に従ってまた提供されるのは、５，１０−ＭＴＨＦの安定な凍結乾燥され、そして薬学的に受容可能な組成物を処方する方法であって、この方法は、（ａ）クエン酸およびアスコルビン酸を含む溶液中に５，１０−ＭＴＨＦを溶解する工程であって、ここで、クエン酸とアルコルビン酸との重量比が約０．７５：１〜約２．２５：１であり、そしてクエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比が約１．４：１〜３．４：１の範囲である工程；および（ｂ）この溶液を凍結乾燥する工程を包含する。この溶液のｐＨは、約５〜約７の間であり得る。好ましい実施形態によれば、凍結乾燥の前に、溶液中のこの組成物のｐＨは、本質的に中性のｐＨに緩衝化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、水性溶液中および凍結乾燥されるときの両方で安定である５，１０−ＭＴＨＦの新規処方物を提供する。本発明の５，１０−ＭＴＨＦの処方物は、種々の癌の処置、特に、５−ＦＵおよび／またはさらなる化学療法剤と組み合わせるプロトコール内で医薬として用いられ得る。
【００１０】
本発明による５，１０−ＭＴＨＦの新規処方物は、クエン酸およびアスコルビン酸と組み合わせて５，１０−ＭＴＨＦを含む。クエン酸とアスコルビン酸との比は、この組成物の安定性に実質的に影響することなく、約０．７５：１〜約２．２５：１の重量比で変動し得、そしてクエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比は約１．４：１〜３．４：１で変動し得る。本発明の好ましい実施形態によれば、クエン酸とアルコルビン酸との重量比は約１．５：１であり、そしてクエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比は約２：１である。この溶液のｐＨは、約５〜約７で変動し得、この溶液は、凍結乾燥の前に本質的に中性のｐＨに緩衝化される。本発明に従うこの処方物は、好ましくは、約２５０〜約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの等浸透圧範囲にある容量オスモル濃度を有する。
【００１１】
本発明はまた、癌およびその他の疾患の処置における医薬としての使用のために５，１０−ＭＴＨＦを処方する方法を提供する。本発明に従うこの方法は、（ａ）クエン酸およびアスコルビン酸の溶液を調製する工程であって、ここで、クエン酸とアルコルビン酸との重量比が約０．７５：１〜約２．２５：１である工程；（ｂ）この溶液中に５，１０−ＭＴＨＦを溶解する工程であって、ここで、クエン酸およびアスコルビン酸の合計と５，１０−ＭＴＨＦとの重量比が約１．４：１〜３．４：１の範囲である工程；および（ｃ）この溶液を本質的に中性のｐＨに調節および／または緩衝化する工程を包含する。好ましくは、クエン酸およびアスコルビン酸のこの溶液は１０℃まで冷却され、そしてすべての５，１０−ＭＴＨＦが溶液中に行くまで、この温度で冷却されたままである。工程（ｃ）では、本質的に中性のｐＨの溶液が、ＮａＯＨまたはＨＣｌでのように、当該技術分野で公知の任意の様式で溶液のｐＨを調節および／または緩衝化することにより得られ、次いで、処方された５，１０−ＭＴＨＦが、バイアル中に充填され、そして凍結乾燥され得る。
【実施例】
【００１２】
（実施例１  ５，１０−ＭＴＨＦの種々の処方物の相対的安定性）
この実施例は、塩基性ｐＨに調節することなく（すなわち、約５の酸性ｐＨで維持される）、クエン酸およびアスコルビン酸とともに処方された５，１０−ＭＴＨＦが、クエン酸単独とともに処方され、そして７．５またはより高い塩基性ｐＨに調節された５，１０−ＭＴＨＦより安定であることを示す。
【００１３】
【化１】
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凍結乾燥で得られる対照処方物の各バイアルは、１００ｍｇの５，１０−ＭＴＨＦ、２６９ｍｇのクエン酸ナトリウム二水和物（クエン酸三ナトリウム）を含み、そして凍結乾燥前に水酸化ナトリウムで７．５と１０．５との間にｐＨ調節された。
【００１４】
凍結乾燥で得られる試験処方物＃１および＃２の各バイアルは、１００ｍｇの５，１０−ＭＴＨＦ、２５０ｍｇのクエン酸三ナトリウム、および１７６ｍｇのアスコルビン酸を含む。ｐＨは約５であった。
【００１５】
（水中の溶解）
１０ｍｌの滅菌水を、凍結乾燥で得られる５，１０−ＭＴＨＦの対照処方物に、および凍結乾燥で得られる試験処方物に添加し、１０ｍｇ／ｍｌ（この溶解容量および濃度は、癌療法のための５，１０−ＭＴＨＦの最近推奨された臨床使用ガイドラインに対応する）の最終濃度を得た。非処方５，１０−ＭＴＨＦは、６ｍｇ／ｍｌの濃度に水中で溶解された。非処方５，１０−ＭＴＨＦのより低い濃度は、非処方５，１０−ＭＴＨＦは、水中で約６ｍｇ／ｍｌの最大溶解度を有するという事実に起因した（クエン酸三ナトリウム中に溶解されるとき、５，１０−ＭＴＨＦは、かなりより高い（＞１０ｍｇ／ｍｌ）溶解度を揺する）。サンプルは、予期される現実の世界の使用に可能な限り近く模倣するように周囲空気条件下、室温で貯蔵された。
【００１６】
（ＨＰＬＣによる安定性分析）
水中に溶解された５，１０−ＭＴＨＦの安定性をＨＰＬＣによって測定した。データは、以下の式：％標準化純度＝（％  ５，１０−ＭＴＨＦ  時間Ｘ）÷（％  ５，１０−ＭＴＨＦ  時間０）×（１００）に従って、出発純度を基に５，１０−ＭＴＨＦの標準化された純度として報告される。
【００１７】
（ｐＨ分析）
水中に溶解された５，１０−ＭＴＨＦのｐＨは、デジタルｐＨメーターを用い、複数の時点で測定された。
【００１８】
（データ分析）
５，１０−ＭＴＨＦ安定性動力学は、線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア）によって推定された。
【００１９】
（結果）
【００２０】
【表１】
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表１から観察されるように、水中に溶解後の異なる５，１０−ＭＴＨＦ処方物のｐＨ分析は、出発ｐＨ読み取り値および定常状態ｐＨ読み取り値における変動を示した。非処方５，１０−ＭＴＨＦは、６．９のほぼ中性のｐＨを有していたが、クエン酸三ナトリウムのみを含む凍結乾燥で得られた対照処方物は、約７．９の塩基性ｐＨを有していた。対照的に、アスコルビン酸およびクエン酸三ナトリウムとともに処方された５，１０−ＭＴＨＦは、約５．０〜５．１の酸性ｐＨを有していた。これらのｐＨ値は、２４時間の期間安定であった。
【００２１】
【表２】
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表２から観察され得るように、ＨＰＬＣ分析は、各処方物は、異なる安定性プロフィールを有していたことを示した。先の報告と同様に、中性ｐＨにおける非処方５，１０−ＭＴＨＦは、経時的に急速に分解した。水中の溶解の２４時間後、非処方５，１０−ＭＴＨＦの純度は、出発純度のわずか４４．９％であった。クエン酸三ナトリウムのみとともに処方され（ｐＨ調節＞７．５）凍結乾燥で得た対照処方物は、水中に溶解後より遅い分解を示した。しかし、２４時間後の純度は、出発純度と比較して、なおほんの６５％であり、クエン酸三ナトリウムの添加およびｐＨの調節によっては分解が効率的に阻害されなかったことを示す。
【００２２】
驚くべきことに、アスコルビン酸およびクエン酸三ナトリウムの両方とともに処方された５，１０−ＭＴＨＦは、先に５，１０−ＭＴＨＦ安定性を劇的に低減することが示されている酸性ｐＨでさえ、最も安定な処方物であった。この結果は、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）は酸性環境（ｐＨ＜７）における分解から５，１０−ＭＴＨＦを保護できないことが先に報告されているのでなおより驚くべきである。
【００２３】
【表３】
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安定性プロフィールの直線回帰分析は、５，１０−ＭＴＨＦ分解は、経時的に直線状であったことを示した（図１を参照のこと）。各処方物の分解速度（最良適合直線の傾き）は、最も速いから最も遅い分解に以下の順序を示した：非処方＞クエン酸三ナトリウムのみで処方＞アスコルビン酸およびクエン酸三ナトリウム両方で処方（表３）。さらに、クエン酸三ナトリウムのみを含む対照処方物のアスコルビン酸とクエン酸三ナトリウム両方を含む試験処方物との最良適合傾きの統計学的比較は、試験処方物の統計学的により遅い分解速度（ｐ＜０．０５）を示した。
【００２４】
（実施例２  安定５，１０−ＭＴＨＦの処方物）
この実施例は、クエン酸およびアスコルビン酸を含み、本質的に中性のｐＨで、５，１０−ＭＴＨＦの安定な凍結乾燥された組成物を処方する代表的な方法を示す。
【００２５】
【化２】
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（手順）
１．フィルターを通した窒素ガス、ＮＦを、ＷＦＩに３０分間まき散らす。
２．１００ｍＬプラスチックボトルの風袋ｗｔを記録する。
３．クエン酸、アスコルビン酸および約９０ｇのＮ２をまき散らした水の重量を計る。混合して溶解する。
４．１ＮのＮａＯＨまたはＨＣｌでｐＨを７．０±０．１に調節する。
５．この溶液を１０℃に冷却する。
６．５，１０−ＭＴＨＦを添加し、混合して溶解する。
７．ｐＨを記録する（７．０±０．２）。
８．さらに水を添加し１１０ｇ（または１００ｍＬ）の最終重量にする。ｗｔを記録する。
９．この溶液を可能な限り冷却して維持しながら、０．２ミクロンのフィルターを通す。
１０．この溶液を可能な限り冷却して維持しながら、バイアルに充填する（バイアルあたり２ｍＬまたは１００ｍｇの５，１０−ＭＴＨＦカルシウム塩）。
１１．凍結乾燥する。
１２．ヘッドスペースにある窒素とともにわずかに減圧下でバイアルをシールする。
１３．バイアルをクリンプ止めする。
【００２６】
（実施例３  処方された５，１０−ＭＴＨＦの短期間安定性）
この実施例は、本質的に中性のｐＨで、種々の比率にあるクエン酸およびアスコルビン酸とともに処方された５，１０−ＭＴＨＦの組成物が、短期間（３日まで）溶液中で安定であることを示す。
【００２７】
【化３】
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（手順）
１．凍結乾燥された５，１０−ＭＴＨＦの各バイアルに２．５ｍＬの脱イオン水を添加し、５ｍｇ／ｍＬ溶液を得る。
２．２〜８℃に溶液を冷却する。
３．０、１、２および３日に、０．５ｇの溶液を引き抜き、そして４．５ｇの冷却したＨＰＬＣ希釈液（２０％デキストロース）を添加する。
４．ＨＰＬＣ中に注入し、そして濃度を分析する。
【００２８】
（結果）
【００２９】
【表４】
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表４から観察され得るように、３つすべての処方物は、試験された時間の期間に亘って、処方物Ｆ２８が最大の安定性を示して、顕著な安定性を示した。
【００３０】
（実施例４  処方された５，１０−ＭＴＨＦの中程度期間安定性）
この実施例は、本発明に従って、種々の比率にあるクエン酸およびアスコルビン酸とともに処方された５，１０−ＭＴＨＦの組成物が、ストレス条件（４０℃の温度）下でさえ、中程度期間（７〜１４日）凍結乾燥された形態で安定であることを示す。
【００３１】
（材料−上記の実施例３と同じ）
（手順）
１．凍結乾燥物を４０℃に維持する。
２．各時点（１週および２週）で、（実施例２に記載のように処方された）凍結乾燥された５，１０−ＭＴＨＦの各バイアルに２．５ｍＬの脱イオン水を添加し、２分間良く混合し、透明な黄色の溶液を得る。
３．０．５ｇの溶液を引き抜き、そして４．５ｇの冷却したＨＰＬＣ希釈液（２０％デキストロース）を添加し、０．５ｍｇ／ｍＬの理論濃度を得る。
４．ＨＰＬＣ中に注入し、そして濃度を分析する。
【００３２】
（結果）
【００３３】
【表５】
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表５から観察され得るように、３つすべての凍結乾燥された処方物は、２週間後、処方物Ｆ２８が最大の安定性を示して、顕著な安定であった。
【００３４】
（実施例５  処方された５，１０−ＭＴＨＦの長期間安定性）
この実施例は、本発明に従って、本質的に中性のｐＨで、クエン酸およびアスコルビン酸とともに処方された５，１０−ＭＴＨＦの組成物が、２５℃の温度で維持されるときでさえ、長期間、凍結乾燥された形態で安定であることを示す。
【００３５】
（材料）
処方され、そして凍結乾燥された５，１０−ＭＴＨＦを上記に記載のように調製した。各バイアルは、１００ｍｇの５，１０−ＭＴＨＦ、１２７ｍｇのクエン酸および８５ｍｇのアスコルビン酸を含んでいた。
【００３６】
（手順）
凍結乾燥物を、５℃または２５℃いずれか、および６０％相対湿度に維持した。各時点（３週および６週）で、１０ｍＬの滅菌水を凍結乾燥された５，１０−ＭＴＨＦの各バイアルに添加し、そして透明な薄いアンバー色の溶液を得、そしてｐＨを測定した。２ｍＬの溶液を、２５ｍＬのＨＰＬＣ希釈液で希釈し、そしてＨＰＬＣによって濃度を分析する。
【００３７】
（結果）
【００３８】
【表６】
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表６から観察され得るように、６週間後、両方の貯蔵条件で安定であった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】記載なし。
【図１】
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【国際調査報告】
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2009518305.tif 000014