(57)【要約】  本発明は、グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、乾燥および／または低温保存耐性に優れた醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のグリコーゲン分岐酵素であるGlc3pをコードする遺伝子GLC3、特にビール酵母に特徴的なnonScGLC3遺伝子の発現量を高めることによって、乾燥および／または低温保存耐性を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。【選択図】なし
2009528020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i)からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項９】
乾燥耐性が増大した請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
低温保存耐性が増大した請求項８に記載の酵母。
【請求項１１】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、乾燥耐性が増強された請求項９に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、低温保存耐性が増強された請求項１０に記載の酵母。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１４】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１３に記載の酒類の製造方法。
【請求項１５】
醸造する酒類がワインである請求項１３に記載の酒類の製造方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１７】
配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性について評価する方法。
【請求項１８】
被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性を評価する方法。
【請求項１９】
被検酵母を培養して請求項6に記載のタンパク質を定量、または配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする乾燥耐性および／または低温保存耐性に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２０】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、請求項１９に記載の酵母の選択方法。
【請求項２１】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項１９に記載の酵母の選択方法。
【請求項２２】
請求項８〜１２に記載の酵母および請求項１９〜２１に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いることを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子及びその用途に関し、特に、乾燥耐性および／または低温保存耐性に優れた実用酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質であるGlc3pをコードする遺伝子GLC3、特にビール酵母に特徴的なnonScGLC3遺伝子の発現量を高めることによって、乾燥耐性および／または低温保存耐性を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。なお、本発明の酵母は、パン酵母、産業用酵母としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
ビール醸造には、発酵終了後の酵母を回収して次回の発酵に用いる（これを連醸とよぶ）という工程上の特徴がある。酵母はエタノール存在下、0〜3℃程度に保たれたタンク内で保存されるが、この間酵母が死滅すると次回の発酵に支障をきたすのみならず、溶菌によって流出した細胞構成物が製品に好ましくない呈味を与える可能性もある。このことから、低温保存耐性に優れた酵母を用いることは、工程設計に自由度を与え、高品質な製品を安定に生産する上で非常に重要である。
【０００３】
また、連醸回数は発酵条件や用いる酵母の特性によって異なるが、ある程度の回数を経たところで終了させる。新しく使用する酵母を立ち上げる工程はプロパゲーションとよばれ、小スケールから数段階のスケールアップを経て拡大培養するが、一般的に数日〜数週間を要するため、この工程期間を短縮する、あるいは予め大量に培養した菌体を低温または乾燥状態で長期間安定に保存することができれば、生産効率面で大きなメリットが得られる。
【０００４】
高い生菌率を維持するような乾燥酵母の製造方法については、乾燥装置の工夫や温度・乳化剤添加などといった製造条件の工夫がなされている。例えばL-乾燥法は極めて高い生菌率を維持することができる一方で、時間やコストがかかることから実生産スケールで用いることは現実的ではない。
【０００５】
酵母の低温耐性に関しては、パン酵母を中心に、冷凍耐性向上を目的としたいくつかの試みが報告されている。これは、低温で発酵できるビールや清酒などの醸造酵母に比較すると、パン酵母であるサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は低温保存性に劣るためである。例えば、特開平11-155559号公報や特開2003-304864号公報では冷凍耐性および乾燥耐性を有するパン酵母が主にスクリーニング法によって見出されている。また、遺伝子工学的な手法を用いた例としては、特開平10-117771号公報でNTH1（トレハラーゼ遺伝子）破壊によるトレハロース高蓄積株が、特開2001-238665号公報でCAR1（アルギニン分解酵素遺伝子）破壊によってアルギニンなどの特定アミノ酸を高蓄積させた株が報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記状況において、醸造酵母の乾燥および／または低温保存耐性に関与するタンパク質をコードする遺伝子ならびに該タンパク質を利用して、酒類あるいは有用物質の高効率生産を可能にすることが求められていた。  本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母からグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、乾燥耐性および／または低温保存耐性が増大することを確認して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、ビール酵母に存在するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることにより酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性を強化する方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００８】
（１）以下の(a)〜(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００９】
（２）以下の(g)〜(i)からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１０】
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１１】
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７ａ）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；
(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（７ｂ）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；
(y)該プロモーターにセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
【００１２】
（８）上記（７）〜（７ｂ）のいずれかに記載のベクターが導入された酵母。
（９）乾燥耐性が増大した上記（８）に記載の酵母（実用酵母)。ここで、「実用酵母」とは、醸造用酵母、パン酵母、産業用酵母など、実用的価値を有する酵母をいう。
（１０）低温保存耐性が増大した上記（８）に記載の酵母。
（１１）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、乾燥耐性が増強された上記（９）に記載の酵母。
（１２）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、低温保存耐性が増強された上記（１０）に記載の酵母。
（１２ａ）醸造酵母である、上記（９）〜（１２）のいずれかに記載の酵母。
【００１３】
（１３）上記（８）〜（１２ａ）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１４）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１３）に記載の酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類がワインである上記（１３）に記載の酒類の製造方法。
（１６）上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１４】
（１７）配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性について評価する方法。
（１７ａ）上記（１７）に記載の方法によって、乾燥耐性および／または低温保存耐性が増強された酵母を選別する方法。
（１７ｂ）上記（１７ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えばビール、工業用アルコールなど）を製造する方法。
（１７ｃ）上記（１７ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて有用物質（例えば、タンパク質）を製造する方法。
（１８）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性を評価する方法。
（１８ａ）上記（１８）に記載の方法で、被検酵母を評価し、グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、乾燥耐性および／または低温保存耐性の高い酵母を選別する方法。
（１８ｂ）上記（１８ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１８ｃ）上記（１８ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて有用物質（例えば、タンパク質）を製造する方法。
【００１５】
（１９）被検酵母を培養して上記（６）に記載のタンパク質を定量、または配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とする乾燥耐性および／または低温保存耐性に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２０）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、上記（１９）に記載の酵母の選択方法。
（２１）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（１９）に記載の酵母の選択方法。
【００１６】
（２２）上記（８）〜（１２ａ）に記載の酵母および上記（１９）〜（２１）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いることを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の形質転換酵母は、乾燥保存または低温保存において高い生菌数を維持することができるため、醸造などに使用された場合、酵母管理の煩雑さを解消することができ、品質の安定化にも貢献することが期待できる。さらに、乾燥酵母は長期保存に適しかつ重量も軽減されることから流通輸送に非常に有利であり、工業用アルコール生産や有用タンパク質生産などの産業用微生物としても有用である。なお、本発明の酵母は、パン酵母、産業用酵母としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者らは、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のグリコーゲン分岐酵素をコードするnonScGLC3遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１９】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド及び(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、グリコーゲン分岐酵素活性は、例えばMol Cell Biol. 1992 Jan;12(1):22-9.に記載の方法で評価することができる。
【００２０】
また、本発明は、(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２１】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２２】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、DNA）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２３】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
【００２４】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
【００２５】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質である。
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリコーゲン分岐酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２６】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；  C群：アスパラギン、グルタミン；  D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；  E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；  F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；  G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２７】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２８】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。なお、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入するのが好ましい。
【００２９】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
【００３０】
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、実用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
【００３１】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、実用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、任意の酵母（実用酵母）、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母やパン酵母、工業用アルコール生産酵母や有用タンパク質生産酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等、パン酵母、例えばNBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３２】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約30℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。  その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３３】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを酵母に導入することによって、乾燥耐性および／または低温保存耐性に優れた酵母を得ることができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択することによっても乾燥耐性および/または低温保存耐性に優れた酵母を得ることができる。本発明で得られる酵母の使用対象としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ワイン、ウイスキー、清酒などの酒類の醸造、パンの製造、工業用アルコール生産や有用タンパク質生産等の有用物質の製造等が挙げられる。
これらの生産を行う場合は、親株の代わりに本発明において得られた実用酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と同様のものを用いることができ、コストを増加させることなく実施することができる。
【００３４】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01／040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子またはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００３５】
遺伝子又は特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流または下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性質についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００３６】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性を評価することもできる。なお、グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、該遺伝子の転写産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリコーゲン合成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である株を選択することによって、所望の酒類の醸造や有用物質生産に好適な酵母を選択することができる。
【００３７】
または、被検酵母を培養して、グリコーゲン分岐酵素活性の高い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造または有用物質生産に好適な被検酵母を選択することができる。＜「グリコーゲン合成開始活性」は「グリコーゲン分岐酵素活性」とすべきように思われましたので、変更いたしました。例えば、３行下には、「グリコーゲン分岐酵素活性」の評価方法が記載されています。＞
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。グリコーゲン分岐酵素活性は、例えばMol Cell Biol. 1992 Jan;12(1):22-9.に記載の方法で評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS（エチルメタンスルホネート）、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39  酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、任意の酵母（実用酵母）、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母やパン酵母、工業用アルコール生産酵母や有用タンパク質生産酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス  パストリアヌス、サッカロマイセス  セレビシエおよびサッカロマイセス  カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等、パン酵母、例えばNBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：グリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子（nonScGLC3）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母のグリコーゲン分岐酵素をコードする遺伝子、nonScGLC3を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScGLC3_for（配列番号：３）／nonScGLC3_rv（配列番号：４）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある。）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScGLC3の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
【００４０】
上記のようにして得られたnonScGLC3遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScGLC3遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４１】
実施例２：ビール試醸中のnonScGLC3遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度              12.69％
麦汁容量                    70L
麦汁溶存酸素濃度            8.6ppm
発酵温度                    15℃
酵母投入量                  12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScGLC3遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScGLC3遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４２】
実施例３：nonScGLC3高発現株の作製
実施例１に記載の方法によって得られるnonScGLC3/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotIで消化し、nonScGLC3遺伝子を含むDNA断片を調製した。これを制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScGLC3高発現ベクターnonScGLC3/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNot はYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
【００４３】
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でAJL4004株を形質転換してジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００４４】
実施例４：nonScGLC3高発現株の乾燥耐性評価
親株（AJL4004株）ならびに実施例３に記載の方法で得られたnonScGLC3高発現株の乾燥耐性を以下の方法で評価した。
1白金耳の酵母を10mL麦汁（100mg/Lのジェネチシンを含む）に植菌し、30℃で一晩振盪培養した。この前培養液をOD660=0.5となるように10mL麦汁（同上）に植菌して本培養を開始した。培養は2日間、酵母の増殖が定常期に達するまで行い、終了時の菌体濁度を測定してOD660=2となるように滅菌水に懸濁した。このように調整した懸濁液100(Lを1.5mLマイクロチューブにとり、減圧乾燥機（DNA110 SpeedVac（登録商標）、ThermoSavant社製）で1時間処理することにより菌体を乾固させた。
生菌率の測定は以下の方法で行った。上記で得られた乾燥菌体を50(Lの滅菌水に再懸濁し、50(Lの0.02%メチレンブルー溶液（pH4.5）を添加して、還元力を失い青く染色された菌体を死菌とした。次にこの懸濁液を顕微鏡下で観察し、細胞生死判別システム（DAセルカウンター、ヤマト科学株式会社製）を用いて生菌率を計測した。実験誤差を抑えるため、母数が2,000細胞以上となるようにカウントした。
図４に示すように、親株の生菌率が19.9%であったのに対し、高発現株の生菌率は30.2%となり、nonScGLC3高発現によって酵母の乾燥耐性が向上することが示された。
【００４５】
実施例５：nonScGLC3高発現株の低温耐性評価
親株（AJL4004株）ならびに実施例３に記載の方法で得られたnonScGLC3高発現株の低温耐性を以下の方法で評価する。実施例４に記載の方法で培養し、OD660=2に調製した酵母懸濁液を2本のマイクロチューブにそれぞれ900(Lずつ分注し、一方には100(Lの滅菌水を、もう一方には100(Lの99.5%エタノールを添加（最終濃度10%）する。これを5℃で4週間保存した後、実施例４と同様の方法で生菌率を計測する。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、酵母の乾燥耐性および／または低温保存耐性を向上させることができるので、酵母を長期間安定に保存することができ、酒類（例えば、ビール）の醸造、パンの製造、工業用アルコール生産や有用タンパク質生産等の有用物質の製造などの効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるnonScGLC3遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】図４は、親株ならびにnonScGLC3高発現株の乾燥耐性試験の結果を示す図である。
【図１】
2009528020.tif 000003
【図２】
2009528020.tif 000004
【図３】
2009528020.tif 000005
【図４】
2009528020.tif 000006
【配列表】
2009528020000001.app
【国際調査報告】
2009528020.tif 000007
2009528020.tif 000008
2009528020.tif 000009
2009528020.tif 000010