(57)【要約】蛍光色素へのホスホン酸基の導入のための試薬が提供される。色素複合体を調製するための方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式およびその塩を有するシアニン色素試薬であって、1〜3個のLf基および1〜4個のPz基を有するシアニン色素試薬：
2009527629.tif 000111
式中、
Q1およびQ2が、O、S、N、およびCRaRb、または-C(=CH2)-より独立に選択され、RaおよびRbが、H、メチル、エチル、およびLfからなる群より独立に選択され；
環AxおよびAyが、縮合置換または非置換のアリール環またはヘテロアリール環を各々独立に示し、該環の各々が、ハロゲン、CN、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルキルアミノ、ジ(C1-C8)アルキルアミノ、Lf、Pz、およびLfまたはPzで置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールからなる群より独立に選択される1〜3つのメンバーで置換されていてもよく；
Qが、以下からなる群より選択される共役連結系を示し；
2009527629.tif 000112
式中、
Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh、Ri、Rj、およびRkが、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、C1-C6アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より各々独立に選択され；
RnおよびRpが、OおよびO-からなる群より各々独立に選択され；
下付き文字oの各々が、独立に0または1であり、
波線が、接合される構成要素への付着のポイントを示し；
RGおよびRG'が、H、C1-C8アルキル、ヘテロアルキル、アルキレンスルホン酸、アルキレンリン酸、アルキレンホスホン酸、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンカルボン酸、およびLfからなる群より独立に選択され、RGまたはRG'における該アリール基が、約1〜2個のPz基および約0〜約2個のLf基で置換されていてもよく；
Lfが、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；かつ
Pzが、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基であるか、または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000113
式中、
波線が、シアニン色素試薬の残基のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lが、連結基であり；Naが、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々が、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；RCが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護末端ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基からなる群より選択される。
【請求項２】
Qが
2009527629.tif 000114
である、請求項1記載のシアニン色素試薬。
【請求項３】
RnがO-であり、RpがOであり、かつRc、Rd、Re、Ri、Rj、およびRkの各々が、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、およびC1-C6アルキルからなる群より独立に選択される、請求項2記載のシアニン色素試薬。
【請求項４】
Qが
2009527629.tif 000115
である、請求項3記載のシアニン色素試薬。
【請求項５】
RGがC1-C8アルキレンスルホン酸であり；かつRG'がLfである、請求項1記載のシアニン色素試薬。
【請求項６】
Q1およびQ2の各々がCRaRbである、請求項1記載のシアニン色素試薬。
【請求項７】
AXおよびAYの各々が、ハロゲン、CN、CF3、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、(C1-C4)アルキルアミノ、ジ(C1-C4)アルキルアミノ、Lf、Pz、およびLfまたはPzで置換されていてもよいフェニル環からなる群より独立に選択される1〜2つのメンバーで置換されていてもよい縮合ベンゼン環を示す、請求項1記載のシアニン色素試薬。
【請求項８】
Q1およびQ2の各々がCRaRbであり；AXおよびAYの各々が、ハロゲン、CN、CF3、(C1-C4)アルキル、(C1-C4)アルコキシ、(C1-C4)アルキルアミノ、ジ(C1-C4)アルキルアミノ、Lf、Pz、およびLfまたはPzで置換されていてもよいフェニル環からなる群より独立に選択される1〜2つのメンバーで置換されていてもよい縮合ベンゼン環を示し；RGがC1-C8アルキレンスルホン酸であり；かつRG'がLfである、請求項1記載のシアニン色素試薬。
【請求項９】
下記式およびその塩を有する、請求項1記載のシアニン色素試薬：
2009527629.tif 000116
式中、RがCF3C(O)NH(CH2)4-である。
【請求項１０】
下記式およびその塩を有する、請求項1記載のシアニン色素試薬：
2009527629.tif 000117
式中、RがCF3C(O)NH(CH2)4-である。
【請求項１１】
下記式およびその塩からなる群より選択されるローダミン色素試薬であって、1〜3個のLf基および1〜4個のPz基を有するローダミン色素試薬：
2009527629.tif 000118
式Ic1〜Ic6中、
各出現におけるRa'が、水素、C1-C6アルキル、およびアリールより独立に選択され、アリール基が、PzまたはLfで置換されていてもよく；
各出現におけるRb'、Rb''、Rc'、Rd'、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、Rk'が、水素および(C1-C6)アルキルからなる群より独立に選択されるか、または隣接環原子に付着しているRb'、Rb''、Rc'、Rd'、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、もしくはRk'のいずれか2個の置換基が、PzもしくはLfで置換されてもよい融合6員アリール環を形成するために組み合わせられてもよく；
式Ic1〜Ic6の各々において橋頭窒素原子を有する環が5、6、または7員環であるように、下付き文字kおよびk'が各々独立に0〜2の整数であり；かつ
置換基X1〜X4が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつ、X1〜X4のいずれか2個の隣接置換基が、芳香環または芳香族複素環を形成するために組み合わせられてもよく；X1〜X4のアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；
Lfが、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；かつ
Pzが、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基であるか、または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000119
式中、
波線が、ローダミン色素試薬の残基のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lが、連結基であり；Naが、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々が、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；RCが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護末端ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基からなる群より選択される。
【請求項１２】
式Ic1を有する、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項１３】
式Ic2を有する、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項１４】
式Ic3を有する、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項１５】
式Ic4を有する、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項１６】
式Ic5を有する、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項１７】
式Ic6を有する、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項１８】
1個のLf基および1〜2個のPz基を有する、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項１９】
対称性色素試薬である、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項２０】
非対称性色素試薬である、請求項11記載のローダミン色素試薬。
【請求項２１】
下記式およびその塩を有するローダミン色素試薬であって、1〜3個のLf基および0〜2個のPz基を有するローダミン色素試薬：
2009527629.tif 000120
式中、
各出現におけるRb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、およびRk'が、水素、(C1-C6)アルキル、およびアリールからなる群より独立に選択されるか、または隣接環原子に付着しているRb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、もしくはRk'のいずれか2個の置換基が、PzもしくはLfで置換されてもよい融合6員アリール環を形成するために組み合わせられてもよく；
式Ic5において橋頭窒素原子を有する環が5、6、または7員環であるように、各下付き文字kが独立に0〜2の整数であり；かつ
置換基X1〜X4が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、PO(OH)(OLf)、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつX1〜X4のいずれか2個の隣接置換基が、芳香環または芳香族複素環を形成するために組み合わせられてもよく；X1〜X4のアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；
Lfが、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；かつ
Pzが、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基であるか、または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000121
式中、
波線が、ローダミン色素試薬の残基のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lが、連結基であり；Naが、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々が、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；RCが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護末端ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基からなる群より選択される。
【請求項２２】
Rb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、またはRk'の一つがフェニルである、請求項21記載のローダミン色素試薬。
【請求項２３】
Rb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、またはRk'の二つの隣接メンバーが、融合ベンゼン環を形成するために組み合わせられる、請求項21記載のローダミン色素試薬。
【請求項２４】
X1、X2、X3、またはX4の一つがPO(OH)(OLf)またはその塩である、請求項21記載のローダミン色素試薬。
【請求項２５】
2009527629.tif 000122
より選択される、請求項21記載のローダミン色素試薬。
【請求項２６】
2009527629.tif 000123
より選択される、請求項21記載のローダミン色素試薬。
【請求項２７】
下記式およびその塩を有するローダミン色素試薬であって、1〜3個のLf基および0〜2個のPz基を有するローダミン色素試薬：
2009527629.tif 000124
式中、
各出現におけるRa'が、水素、C1-C6アルキル、およびアリールより独立に選択され、アリール基が、PzまたはLfで置換されていてもよく；
各出現におけるRb'、Rc'、およびRd'が、水素、(C1-C6)アルキル、およびアリールからなる群より独立に選択されるか、または隣接環原子に付着しているRb'、Rc'、もしくはRd'のいずれか2個の置換基が、PzもしくはLfで置換されてもよい融合6員アリール環を形成するために組み合わせられてもよく；
式Ic5において橋頭窒素原子を有する環が5、6、または7員環であるように、各下付き文字kが独立に0〜2の整数であり；かつ
置換基X1〜X4が、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、PO(OH)(OLf)、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつX1〜X4のいずれか2個の隣接置換基が、芳香環または芳香族複素環を形成するために組み合わせられてもよく；X1〜X4のアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；
Lfが、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；かつ
Pzが、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基であるか、または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000125
式中、
波線が、ローダミン色素試薬の残基のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lが、連結基であり；Naが、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々が、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；RCが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護末端ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基からなる群より選択される。
【請求項２８】
各Rb'がメチルであり、Rc'およびRd'の各々が水素である、請求項27記載のローダミン色素試薬。
【請求項２９】
X1、X2、X3、またはX4の一つがPO(OH)(OLf)またはその塩である、請求項27記載のローダミン色素試薬。
【請求項３０】
下記式を有する、請求項27記載のローダミン色素試薬：
2009527629.tif 000126
。
【請求項３１】
請求項1〜8のいずれか一項記載の付着したシアニン色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３２】
付着した消光剤と請求項1〜8のいずれか一項記載の付着したシアニン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３３】
付着した消光剤と、マイナーグルーブ結合剤と、請求項1〜8のいずれか一項記載の付着したシアニン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３４】
請求項11〜20のいずれか一項記載の付着したローダミン色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３５】
付着した消光剤と請求項11〜20のいずれか一項記載の付着したシアニン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３６】
付着した消光剤と、マイナーグルーブ結合剤と、請求項11〜20のいずれか一項記載の付着したシアニン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３７】
請求項21〜26のいずれか一項記載の付着したローダミン色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３８】
付着した消光剤と請求項21〜26のいずれか一項記載の付着したローダミン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３９】
付着した消光剤と、マイナーグルーブ結合剤と、請求項21〜26のいずれか一項記載の付着したローダミン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４０】
請求項27〜30のいずれか一項記載の付着したローダミン色素試薬を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４１】
付着した消光剤と請求項27〜30のいずれか一項記載の付着したローダミン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４２】
付着した消光剤と、マイナーグルーブ結合剤と、請求項27〜30のいずれか一項記載の付着したローダミン色素試薬とを有するオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチドへの色素試薬の付着が、Lf上に存在する官能基を介する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2004年8月13日に出願された米国特許仮出願第60/601,599号の恩典を主張する米国特許出願第11/202,635号の一部継続出願である米国特許出願第11/360,040号の一部継続出願であり、すべての内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府委託研究または開発下でなされた発明に対する権利に関する記述
該当なし。
【０００３】
コンパクトディスクで提出された「配列表」、表、または付録を載せるコンピュータープログラムへの参照
該当なし。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
本発明は、1〜4つのホスホン酸基で置換されるローダミン、ロードール、およびフルオレセインを含むキサンテン色素などの多くの修飾色素を提供する。化学反応性色素および色素複合体を含む本発明の色素は、特に生物学的試料において、蛍光プローブとして有用である。
【０００５】
蛍光色素は、高感度検出試薬が必要とされる生物学的応用において特に有用であることが公知である。蛍光色素は、その他の物質に可視色および蛍光の両方を標識するために使用される。本発明の色素は、典型的にはフルオレセイン、ローダミン、またはロードール誘導体である、キサンテンに基づく色素のホスホン酸誘導体である。
2009527629.tif 000002
【０００６】
「フルオレセイン」色素は、典型的には9-位において2-カルボキシフェニル基によって置換される3H-キサンテン-6-オール-3-オンの誘導体を含む。「ローダミン」色素は、典型的には9-位において2-カルボキシフェニル基によって置換される6-アミノ-3H-キサンテン-3-イミンの誘導体を含む。「ロードール」色素は、典型的には9-位において2-カルボキシフェニル基によって置換される6-アミノ-3H-キサンテン-3-オンの誘導体を含む。フルオレセイン、ローダミン、およびロードールは、典型的には5または6員ラクトンまたはラクタム環を形成することが可能な誘導体によって置換される。例えば、フルオレセインの場合、色素のスピロラクトン型は、以下の構造を有する。
2009527629.tif 000003
【０００７】
多くの市販の蛍光色素は、多環式芳香族の性質を有し、疎水性である。それらの分子は、隣接する疎水性表面および残基との相互作用を介して任意の親水性環境への曝露を最小にする傾向もある。これらの相互作用は、色素-色素相互作用および色素-生体分子（例えば、タンパク質、脂質、オリゴヌクレオチド）相互作用を含む。疎水性相互作用は、蛍光色素に対する実質的な消光効果を引き起こし得る（例えば、Randolph, J.B.; Waggoner, A.S. Nucleic Acids Res. 1997, 25 (14), 2923-2929（非特許文献１）および本明細書において引用される参照を参照されたい）。この問題を克服するための一つの方法は、例えば色素分子にスルホン酸置換基を導入することによって、色素の親水性特徴を改善することである（スルホン酸化カルボシアニン色素は、米国特許第5,268,486号（特許文献１）において開示され、スルホン酸化キサンテン色素は、米国特許第6,130,101号（特許文献２）において開示される）。
【０００８】
本発明は、少なくとも一つのホスホン酸部分によって置換されるフルオレセイン、ロードール、およびローダミン色素を含む色素を記載する。本発明のホスホン酸置換色素は、それらの非置換疎水性類似体よりもかなりの利点を保有する。イオン化されると、ホスホン酸基は、色素分子に付加的な親水性をもたらし、水性溶液におけるそれらの可溶性を増加させる。重要なこととして、新しい色素の量子収量は、ホスホン酸部分の導入によって減少しない。スルホン酸化色素とは対照的に、本発明の色素は、市販のオリゴヌクレオチド合成器において使用される合成条件に適合する。
【０００９】
【非特許文献１】Randolph, J.B.; Waggoner, A.S. Nucleic Acids Res. 1997, 25 (14), 2923-2929
【特許文献１】米国特許第5,268,486号
【特許文献２】米国特許第6,130,101号
【発明の開示】
【００１０】
発明の簡単な概要
一つの局面において、本発明は、下記式およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する：
2009527629.tif 000004
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；Lfは、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；下付き文字mは、0〜2の整数であり；Pzは、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000005
式中、波線は、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lは、連結基であり；Naは、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、ならびにC(O)CF3、FMOC、tブチル、tBOC、フタルイミド、およびモノメトキシトリチルなどの不安定保護基からなる群より独立に選択され；下付き文字nは、1〜4の整数であり、好ましくは1〜2であり；RCは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基であるか、または末端ヒドロキシもしくは保護ヒドロキシ基、アミノ、保護アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、チオ、もしくは保護カルボキシを有するアルキレン連結基である。いくつかの態様においては、RCが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基であるか、またはアミノ、保護アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、チオ、もしくは保護カルボキシ基を有するアルキレン連結基であり；およびその塩である。一つの態様において、下付き文字nは、3〜4の整数である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、下記式およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する：
Fl-(P1)n
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；下付き文字nは、1〜4の整数であり；かつPlは、下記式を有する官能性をもたせたホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000006
式中、波線は、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；L1は、連結基であり；Rは、H、C1-C8アルキル、アリール、アリールC1-C4アルキル、-La-Na、および-La-NRARBからなる群より選択されるメンバーであり；Laは、アルキレン連結基であり、Naは、アンモニウムイオン基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつPaは、ホスホラミダイト部分、少なくとも一つの末端官能基または保護官能基を有する一、二、または三官能性連結基、固体支持体、および反応基からなる群より選択される官能基構成要素である。いくつかの態様において、下付き文字nは、3〜4の整数である。別の態様において、下付き文字nは、2〜4の整数である。
【００１２】
本発明のこの局面において、多くのシアニン色素試薬およびローダミン色素試薬が、本明細書において記載される。
【００１３】
その他の局面において、本発明は、ホスホン酸蛍光色素試薬およびプローブを調製する方法ならびに本明細書において提供されるような付着したホスホン酸蛍光色素を有するプローブ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を使用する方法を提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
略語および定義
他に特に記述されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される以下の語は、以下に与えられる意味を有する。
【００１５】
「アルキル」という語は、接頭語において示される炭素原子の数を有する、直鎖、分岐、もしくは環式飽和一価炭化水素ラジカル、または環式および直鎖もしくは分岐飽和一価炭化水素ラジカルの組み合わせを指す。例えば、(C1-C8)アルキルは、メチル、エチル、n-プロピル、2-プロピル、tert-ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチルなどを含むことを意図される。本明細書における定義の各々（例えば、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アリールアルコキシ）に対して、接頭語がアルキル部分における主鎖炭素原子の数を示すために含まれない場合、ラジカルまたはその部分は、8個またはそれ以下の主鎖炭素原子を有すると考えられる。
【００１６】
「アルキレン」という語は、接頭語において示される炭素原子の数を有する、直鎖飽和二価炭化水素ラジカルまたは分岐飽和二価炭化水素ラジカルを意味する。例えば、(C1-C6)アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、2-メチルプロピレン、ペンチレンなどを含むことを意図される。
【００１７】
「アルケニル」という語は、接頭語において示される炭素原子の数を有し、かつ少なくとも一つの二重結合を含む、直鎖一価炭化水素ラジカルまたは分岐一価炭化水素ラジカルを指す。例えば、(C2-C6)アルケニルは、エテニル、プロペニルなどを含むことを意図される。
【００１８】
「アルキニル」という語は、少なくとも一つの三重結合を含み、かつ接頭語において示される炭素原子の数を有する、直鎖一価炭化水素ラジカルまたは分岐一価炭化水素ラジカルを指す。例えば、(C2-C6)アルキニルは、エチニル、プロピニルなどを含むことを意図される。
【００１９】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という語は、それらの従来的な意味において使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に付着しているアルキル基を指す。同様に、ジアルキルアミノという語は、同じであるまたは異なることができる2つの付着したアルキル基を有するアミノ基を指す。
【００２０】
「アリール」という語は、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、COR（Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキルカット（cut）、フェニルまたはフェニルアルキル、アリールまたはアリールアルキル）、-(CR'R'')n-COOR（nは、0〜5の整数であり、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキルカット、フェニルまたはフェニルアルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、または-(CR'R'')n-CONRaRb（nは、0〜5の整数であり、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRaおよびRbは、互いに独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキル、アリールまたはアリールアルキルである）より選択される1〜4個の置換基、好ましくは1個、2個、または3個の置換基で独立に非置換または置換される5〜10環原子の一価単環式、二環式、または多環式芳香族炭化水素ラジカルを意味する。より具体的には、アリールという語は、フェニル、ビフェニル、1-ナフチル、および2-ナフチル、ならびにその置換型を含むが、それらに限定されない。同様に、「ヘテロアリール」という語は、一つまたは複数のヘテロ原子またはヘテロ原子官能基が、環炭素を置換したが、例えばピリジル、キノリニル、キナゾリニル、チエニルなどの芳香族特性を保持するアリール基を指す。簡潔のために、アリールという語は、その他のラジカル（例えば、アリールオキシ、アリールアルキル）との組み合わせにおいて使用される場合、上に記載されるようなアリール基およびヘテロアリール基の両方を含むことを意図される。
【００２１】
「アリールアルキル」という語は、ラジカル-RaRbを指し、Raは、アルキレン基（炭素原子の示された数を有する、または規定されない場合は6個またはそれ以下の主鎖炭素原子を有する）であり、Rbは、本明細書において定義されるようなアリール基である。アリールアルキル基の例は、ベンジル、フェニルエチル、3-(3-クロロフェニル)-2-メチルフェニルなどを含む。
【００２２】
同様に、「アリールアルケニル」という語は、ラジカル-RaRbを意味し、Raは、アルキレン基であり、Rbは、例えば3-フェニル-2-プロペニルなどの、本明細書において定義されるようなアリール基である。
【００２３】
「アリールヘテロアルキル」は、ラジカル-RaRbを意味し、Raは、ヘテロアルキレン基（炭素原子の示された数を有する）であり、Rbは、例えば2-ヒドロキシ-2-フェニル-エチル、2-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-2-フェニル-エチルなどの、本明細書において定義されるようなアリール基である。
【００２４】
「アリールオキシ」という語は、ラジカル-ORを指し、Rは、例えばフェノキシ、ナフチルオキシなどのアリール基である。
【００２５】
「ハロ」という接頭語および「ハロゲン」という語は、置換基を記載するために使用される場合、-F、-Cl、-Br、および-Iを指す。
【００２６】
「ヘテロアルキル」という語は、ヘテロアルキルラジカルの付着のポイントが、ヘテロアルキルラジカルの炭素原子を介するという理解をともなって、シアノ、-ORa、-NRbRc、および-S(O)nRd（nは、0〜2の整数である）より独立に選択される1個、2個、または3個の置換基をともなう本明細書において定義されるようなアルキルラジカルを指す。Raは、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、またはモノ-もしくはジ-アルキルカルバモイルである。Rbは、水素、アルキル、アリール、またはアリールアルキルである。Rcは、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、モノ-もしくはジ-アルキルカルバモイル、またはアルキルスルホニルである。Rdは、水素（nが0の場合）、アルキル、アリール、アリールアルキル、アミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、またはヒドロキシアルキルである。代表的な例は、例えば、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-メトキシエチル、ベンジルオキシメチル、2-シアノエチル、および2-メチルスルホニル-エチルを含む。上記の各々に対して、Ra、Rb、Rc、およびRdは、NH2、フルオリン、アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、OH、またはアルコキシによってさらに置換され得る。付加的に、炭素原子の数を示す接頭語（例えば、C1-C10）は、シアノ、-ORa、-NRbRc、または-S(O)nRd部分を除くヘテロアルキル基の部分における炭素原子の総数を指す。
【００２７】
「複素環式」という語は、3〜8環原子の飽和または不飽和非芳香族環式ラジカルを指し、一つまたは二つの環原子は、O、NR（Rは、独立に水素またはアルキルである）、またはS(O)n（nは、0〜2の整数である）より選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子はCであり、一つまたは二つのC原子は、カルボニル基によって置換されていてもよい。複素環式環は、アルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、モノ-アルキルアミノ、ジ-アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、-COR（Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、フェニル、またはフェニルアルキルである）、-(CR'R'')n-COOR（nは、0〜5の整数であり、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキル-アルキル、フェニル、またはフェニルアルキルである）、または-(CR'R'')n-CONRaRb（nは、0〜5の整数、R'およびR''は、独立に水素またはアルキルであり、かつRaおよびRbは、互いに独立に、水素、アルキル、フェニル、またはフェニルアルキルである）より選択される1個、2個、または3個の置換基で独立に置換されていてもよい。より具体的には、複素環式という語は、テトラヒドロピラニル、ピペリジノ、N-メチルピペリジン-3-イル、ピペラジノ、N-メチルピロリジン-3-イル、3-ピロリジノ、2-ピロリドン-1-イル、モルホリノ、チオモルホリノ、チオモルホリノ-1-オキシド、チオモルホリノ-1,1-ジオキシド、ピロリジニル、およびその誘導体を含むが、それらに限定されない。炭素原子の数を示す接頭語（例えば、C3-C10）は、ヘテロ原子の数を除く複素環式基の部分における炭素原子の総数を指す。
【００２８】
「ヘテロアルキレン」という語は、-ORa、-NRbRc、および-S(O)nRd（nは、0〜2の整数である）より独立に選択される1個、2個、または3個の置換基をともなう1〜6個の炭素の直鎖飽和二価炭化水素ラジカルまたは3〜6個の炭素原子の分岐飽和炭化水素ラジカルを意味し、Ra、Rb、Rc、およびRdは、ヘテロアルキルラジカルに対して本明細書において定義されるようなものである。例は、2-ヒドロキシエタン-1,2-ジイル、2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイルなどを含む。
【００２９】
上記の語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、および「アリール」）は、示されるラジカルの置換および非置換型の両方を含むことを意図される。ラジカルの各々のタイプに対する好ましい置換基は、以下に提供される。
【００３０】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば呼ばれる基を含む）に対する置換基は、以下より選択される様々な基であり得る。0〜4の範囲の数、好ましくは0個、1個、2個、または3個の置換基における、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-CN、および-NO2。R'、R''、およびR'''は、各々独立に水素、非置換(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリール、1〜3個のハロゲンで置換されたアリール、非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリール-(C1-C4)アルキル基を指す。R'およびR''が、同じ窒素原子に付着している場合、それらは、5、6、または7員環を形成するために窒素原子と組み合わせられ得る。例えば、-NR'R''は、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルを含むことを意図される。置換基に関する上記の議論から、当業者は、「アリール」という語が、その最も広範の意味において、ハロアルキル（例えば、-CF3および-CH2CF3）およびアシル（例えば、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3など）などの基を含むことを意図されることを理解すると考えられる。他に特に規定されない限り、好ましくは、アルキル基は、0〜3個の置換基、より好ましくは0個、1個、または2個の置換基を有すると考えられる。
【００３１】
同様に、アリール基に対する置換基は変化し、以下より選択される。0〜芳香環系上の開原子価の総数の範囲の数における、-ハロゲン、-OR'、-OC(O)R'、-NR'R''、-SR'、-R'、-CN、-NO2、-CO2R'、-CONR'R''、-C(O)R'、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR''C(O)2R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-N3、-CH(Ph)2、ペルフルオロ(C1-C4)アルコキシ、およびペルフルオロ(C1-C4)アルキル；かつR'、R''、およびR'''は、水素、(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、(非置換アリール)-(C1-C4)アルキル、ならびに(非置換アリール)オキシ-(C1-C4)アルキルより独立に選択される。
【００３２】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の二つは、式-T-C(O)-(CH2)q-U-の置換基で置換されていてもよく、式中、TおよびUは、独立に-NH-、-O-、-CH2-、または一重結合であり、qは、0〜2の整数である。または、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の二つは、式-A-(CH2)r-B-の置換基で置換されていてもよく、式中、AおよびBは、独立に-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-、または一重結合であり、rは、1〜3の整数である。そのように形成された新しい環の一重結合の一つは、二重結合で置換されていてもよい。または、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の二つは、式-(CH2)s-X-(CH2)t-の置換基で置換されていてもよく、式中、sおよびtは、独立に0〜3の整数であり、かつXは、-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、または-S(O)2NR'-である。-NR'-および-S(O)2NR'-における置換基R'は、水素または非置換(C1-C6)アルキルより選択される。
【００３３】
本発明の特定の化合物またはオリゴヌクレオチドは、塩型で存在し得る。そのような塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムなどの塩基添加塩、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様の塩を含む。本発明の化合物または修飾オリゴヌクレオチドが、相対的に塩基性の官能性を含む場合、酸添加塩は、原液（neat）でまたは適した不活性溶剤において、そのような化合物の中性型を十分な量の望ましい酸と接触させることによって獲得され得る。許容される酸添加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などの無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、乳酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの有機酸に由来する塩を含む。アルギネートなどのアミノ酸の塩、ならびにグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge, S.M., et al,「Pharmaceutical Salts」, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照されたい）。本発明のある特定の化合物は、化合物が塩基または酸添加塩のいずれかに変換されることを可能にする塩基性および酸性官能性の両方を含む。
【００３４】
化合物の中性型は、塩を塩基または酸に接触させ、従来的な様式において親化合物を単離することによって再生され得る。化合物の親型は、極性溶剤における可溶性などの特定の物理的特性において様々な塩型とは異なるが、それ以外は、塩は、本発明の目的に対する化合物の親型と等価である。
【００３５】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和型ならびに水和型を含む溶媒和型で存在し得る。概して、溶媒和型は、非溶媒和型と等価であり、本発明の範囲内に包含されることを意図される。本発明の特定の化合物は、多結晶または非晶質型で存在し得る。概して、すべての物理型は、本発明によって検討される使用に対して等価であり、本発明の範囲内であることを意図される。
【００３６】
本発明の特定の化合物は、非対称性炭素原子（光学中心）または二重結合を保有する。ラセミ化合物、ジアステレオマー、幾何異性体、および個々の異性体は、すべて本発明の範囲内に包含されることを意図される。立体化学の決定および異性体の分離に対する方法は、当技術分野において周知である（ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 4th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992の4章における議論を参照されたい）。
【００３７】
本発明の化合物は、そのような化合物を構成する原子の一つまたは複数において原子同位体の非天然割合を含んでもよい。例えば、化合物は、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素-125（125I）、または炭素-14（14C）などの放射性同位体で放射性標識され得る。本発明の化合物のすべての同位体バリエーションは、放射性であるかないか（例えば、2H）にかかわらず、本発明の範囲内に包含されることを意図される。
【００３８】
「保護基」または「その保護型」は、分子マスクにおける反応基に付着している場合に、その反応性を軽減または妨害する原子の団を指す。保護基の例は、T.W. Greene and P.G. Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY, (Wiley, 2nd ed. 1991), Beaucage and lyer, Tetrahedron 48:2223-2311 (1992), およびHarrison and Harrison et al., COMPENDIUM OF SYNTHETIC ORGANIC METHODS Vols. 1-8 (John Wiley and Sons. 1971-1996)において見出され得る。代表的なアミノ保護基は、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（CBZ）、tert-ブトキシカルボニル（Boc）、トリメチルシリル（TMS）、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル（SES）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）、ニトロ-ベラトリルオキシカルボニル（NVOC）などを含む（Boyle, A. L. (Editor), CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000も参照されたい）。代表的なヒドロキシ保護基は、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化される場合、ベンジルおよびトリチルエーテルならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル、およびアリルエーテルなどのものを含む。付加的に、ヒドロキシ基は、α-メチル-6-ニトロピペロニルオキシカルボニルなどの光除去可能（photoremovable）基によって保護され得る（McGall, G.H. and Fidanza, J.A., Photolithographic synthesis of high-density oligonucleotide arrays, DNA ARRAYS METHODS AND PROTOCOLS, Rampal J. B.編, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 170:71-101 (2001), Humana Press, Inc., NY; Boyle, Ann L. (Editor), Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000.）。
【００３９】
「不安定保護基」という語は、分子の残部に有意に影響しない軽度の条件下で除去可能である保護基を指す。
【００４０】
本明細書において使用されるように、「反応基」という語は、別の構成要素との共有結合を形成するために使用され得る求電子基または求核基を指す。求核基の例は、-NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-OH、-COOH、または-SHを含む。求電子基は、活性化エステル、アクリルアミド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、アルデヒドまたはケトン、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジリジン、ボラネート（boranate）、カルボン酸、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホラミダイト、ハロゲン化シリル、スルホン酸エステル、およびハロゲン化スルホニルであり得る。付加的に、スペーサーは、直鎖もしくは非環式部分、環式部分、芳香環、またはその組み合わせにおけるヘテロ原子を含み得る。上記の内で、「活性化エステル基」は、カルボニル部分が例えばアミド形成などへの求電子中心である反応において、アルキルエステル（例えば、メチルエステル）よりも反応性があるカルボン酸エステルを指す。活性化エステルの例は、ペンタフルオロフェニル（PFP）エステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどを含む。
【００４１】
「多官能性連結部分」は、同じまたは異なり得る二つまたはそれ以上の構成要素を付着または結合するために使用され得る二つまたはそれ以上の官能基を有する連結基である。多官能性連結部分は、例えば、三価連結基および四価連結基を含む（例えば、米国特許第5,512,677号；同第5,419,966号；同第5,585,481号；同第5,942,610号、および同第5,736,626号を参照されたい）。
【００４２】
「ホスホラミダイト」は、典型的にはオリゴヌクレオチド合成において使用される三価リン基を指すために使用される専門用語である。ホスホラミダイト法によってオリゴヌクレオチドを形成するために使用される化学の詳細な説明は、Caruthers et al., 米国特許第4,458,066号および第4,415,732号；Caruthers et al., Genetic Engineering, 4:1-17 (1982)；Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, page 6-1 through 6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237 (1991)において提供され、それらの各々は、全体として参照により組み入れられる。標識オリゴヌクレオチドは、例えば、例えばStryer, Biochemistry, Chapter 24, W. H. Freeman and Company (1981)などのDNAポリメラーゼもしくはリガーゼを使用して酵素的に、または例えば、例えばGait, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, IRL Press (1990)などのホスホラミダイト法、亜リン酸-トリエステル法などによる化学合成によって合成され得る。標識は、標識ヌクレオシド三リン酸モノマーを使用して酵素合成の間に導入され得る、または標識非ヌクレオチドもしくはヌクレオチドホスホラミダイトを使用して化学合成の間に導入され得る、または合成の後に続いて導入され得る。オリゴヌクレオチド合成において使用される典型的なホスホラミダイト試薬は、以下の構造によって示される：
2009527629.tif 000007
式中、波線は、試薬の残部への付着を示し、置換基「a」および「b」は、各々独立にイソプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、2-シアノエチルオキシ、メトキシ、またはモルホリノであり；かつ「a」および「b」は、同じではない。
【００４３】
上記の定義における「任意の（optional）」または「任意で/されていてもよい（optionally）」は、その後に記載される事象または状況が、生じ得るが生じる必要がないこと、かつ説明が、事象または状況が生じる例およびそれが生じない例を含むことを意味する。例えば、「アルキル基で一または二置換されていてもよい複素環式基（heterocyclo group optionally mono- or di- substituted with an alkyl group ）」は、アルキルが存在し得るが存在する必要がないこと、かつ説明が、複素環式基がアルキル基で一または二置換される状態および複素環式基がアルキル基で置換されない状態を含むことを意味する。
【００４４】
「生物学的薬剤」という語は、本質的にいかなるヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、アミノ炭水化物、またはリガンド、ならびにその類似体（例えば、修飾または非天然塩基を有するオリゴヌクレオチド）をも指す。
【００４５】
「複合体」という語は、オリゴヌクレオチド、フルオロフォア、消光剤、マイナーグルーブ結合剤などの二つまたはそれ以上の構成要素の共有結合によって形成される分子を指す。
【００４６】
「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ほとんど同じ意味で使用され、修飾塩基、糖類似体などを有するヌクレオチドを含むがそれらに限定されない天然または合成のいずれかのヌクレオチドのポリマーを指す。上に指摘されるように、オリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも一つの共有結合フルオロフォア、消光剤、マイナーグルーブ結合剤（MGBまたはMB）、またはその他の有用なフラグメント、ならびに列挙される構成要素の組み合わせを有する、定義されるようなオリゴヌクレオチドを指すと考えられる。
【００４７】
「固体支持体」という語は、自動化オリゴヌクレオチド技術に対して有用かつ適合する本質的にいかなる固体または半固体マトリクスをも指し、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック、組み合わせなどを含む。有用な固体支持体の例は、例えば米国特許第5,262,530号、同第5,419,966号、同第5,512,667号、および同第5,589,586号において記載されている。
【００４８】
本明細書において使用されるように、「ホスホニル化色素（phosphonylated dye）」および「ホスホン酸色素（phosphonate dye）」という語は、両方とも、そこに付着している官能性をもたせたホスホン酸基を有する色素を指す。
【００４９】
本発明の実践は、他に特に示されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および修飾、生体複合体化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換えDNA、ならびに当技術の技能内であるような関連分野における従来的な技術を採用すると考えられる。これらの技術は、文献において完全に説明される。例えば、Maniatis, Fritsch and Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982); Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Gait (ed.), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL PRESS (1984); Eckstein (ed.), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)を参照されたい。
【００５０】
概要
本発明は、多種多様な蛍光色素（またはフルオロフォア）が、両性イオンホスホン酸基（またはその保護型）を有し調製され得るという発見に存在し、保存安定（shelf-stable）であり、本質的にいかなる生物学的薬剤（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、プローブなど）をも標識するために使用され得る試薬を提供する。従って、本発明は、新しい「ホスホニル化色素」ならびにこれらの「ホスホニル化色素」を使用して生物学的薬剤を標識する方法を提供する。本発明は、本明細書において記載されるホスホン酸置換色素から調製され得るホスホラミダイト誘導体化色素などの試薬をさらに提供する。付加的に、ホスホン酸色素から同様に調製される支持体結合色素も記載される。付加的に、生物学的薬剤を標識するための反応性ホスホニル化色素もまた開示される。
【００５１】
「ホスホン酸色素またはホスホニル化色素」（例えば、両性イオンホスホン酸基またはその保護型を有する色素）、ならびにそれらの色素を組み入れる試薬（例えば、支持体結合色素およびホスホラミダイト）は、例えばクマリン色素、ベンゾクマリン色素、フルオレセイン色素、ロードール色素、フェノキサジン色素、ベンゾフェノキサジン色素、キサンテン色素、ベンゾキサンテン色素、およびシアニン色素に適合することが見出されている。
【００５２】
これらおよびその他の適した色素クラスの例は、Haugland, et al., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, SIXTH ED., Molecular Probes, Eugene, Ore. 1996;米国特許第3,194,805号；同第3,128,179号；同第5,187,288号；同第5,188,934号；同第5,227,487号；同第5,248,782号；同第5,304,645号；同第5,433,896号；同第5,442,045号；同第5,556,959号；同第5,583,236号；同第5,808,044号；同第5,852,191号；同第5,986,086号；同第6,020,481号；同第6,162,931号；同第6,180,295号；および同第6,221,604号；欧州特許第1408366号；Smith, et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1993, 1195-1204; Whitaker, et al., Anal. Biochem. 207:267-279 (1992); Krasoviskii and Bolotin, ORGANIC LUMINESCENT MATERIALS, VCH Publishers, NY., 1988; Zolliger, COLOR CHEMISTRY, 2nd Edition, VCH Publishers, NY., 1991; Hirschberg, et al., Biochemistry 37:10381-10385 (1998); Fieser and Fieser, REAGENTS FOR ORGANIC SYNTHESIS, Volumes 1 to 17, Wiley, US, 1995; Geiger, et al., Nature 359:859-861 (1992)において見出され得る。さらにその他の色素が、http://www.zeiss.com.などのオンラインサイトを介して提供される。
【００５３】
本発明の態様
一つの局面において、本発明は一般式（A）およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する：
2009527629.tif 000008
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；Lfは、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；下付き文字mは、0〜1の整数であり；Pzは、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000009
式中、波線は、該蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lは、連結基であり；Naは、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、ならびにC(O)CF3、FMOC、tブチル、tBOC、フタルイミド、およびモノメトキシトリチルなどの不安定保護基からなる群より独立に選択され；下付き文字nは、1〜4の整数であり、好ましくは1〜2であり；RCは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基であるか、または末端ヒドロキシもしくは保護ヒドロキシ基、アミノ、保護アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、チオ、もしくは保護カルボキシを有するアルキレン連結基である。いくつかの態様においては、RCが、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基であるか、またはアミノ、保護アミノ、カルボキシ、保護カルボキシ、チオ、もしくは保護カルボキシ基を有するアルキレン連結基であり；およびその塩である。
【００５４】
本発明との関連で、本質的にいかなる蛍光色素も、LfおよびPzのいずれかを含むように修飾され得る。典型的には、Pzは、以下に記載されるような合成方法を使用して、蛍光色素の芳香環上のsp2混成炭素原子に付着する。同様に、Lfは、色素上に存在する官能基に付着し得る、または例えば、ラクトン色素の痕跡であり得る（同時係属中の特許出願番号10/026,374を参照されたい）。
【００５５】
適した色素は、例えば、クマリン、ベンゾクマリン、キサンテン、ベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、ベンゾ[c]キサンテン、シアニン、アクリジン、ジピロメテンボロンジフルオリド、フェノキサジン、ベンゾ[a]フェノキサジン、ベンゾ[b]フェノキサジン、およびベンゾ[c]フェノキサジンより選択され得る。有用な色素のさらにその他のタイプは、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー転移色素、チアゾールオレンジ色素、N-アリール-1,8-ナフタルイミド色素、ポリメチン、および本出願において示されるその他の色素である。
【００５６】
態様の一つの群において、蛍光色素試薬は、下付き文字mが1であり、かつ下付き文字nが1であるものである。態様のこの群内で、Pzは、式（a）または（b）を有し得る。好ましくは、付加的な操作または合成方法を受けると考えられる試薬として、ホスホン酸エステル基は、保護される（例えば、式（b）におけるように）。試薬が、プローブ（以下で議論される態様を参照されたい）に組み入れられ、かつアッセイ法において使用される場合、ホスホネートは、両性イオン型である（例えば、式（a）におけるように）。
【００５７】
態様の別の群において、蛍光色素試薬は、下付き文字mが0であり、かつ下付き文字nが1であるものである。態様のこの群内で、Pzは、式（a）、（b）、または（c）を有し得る。好ましくは、付加的な操作または合成方法を受けると考えられる試薬として、ホスホン酸エステル基は、式（b）および（c）におけるように保護される。
【００５８】
態様のさらに別の群において、蛍光色素試薬は、下付き文字mが0であり、かつ下付き文字nが2であるものである。態様のこの群内で、Pz基の各々は、同じであってもまたは異なっていてもよく、式（a）、（b）、または（c）を有し得る。上記のように、試薬が付加的な操作または合成方法を受ける場合、ホスホン酸エステル基は、好ましくは保護される（例えば、式（b）および（c）におけるように）。
【００５９】
多くの態様において、Lは、C2-C8アルキレンである。上記の一般式のその他の態様において、Naは、式-N+(RD)3を有するアンモニウムイオン基であり、式中、各々のRDは、H、C1-C8アルキル、アリール、およびアリールC1-C4アルキルより独立に選択される。さらにより好ましくは、各々のRDは、HまたはC1-C8アルキルより独立に選択される。
【００６０】
上記の一般式に戻って、Lfは、当業者にとって公知の様々な連結基であり得る。多くの連結基は、市販供給源から使用でき、リンカーの一端を蛍光色素に、かつリンカーの他端を保護基にカップリングさせることによって、上記の試薬において使用され得る。態様の一つの群において、Lfは、(C2-C20)アルキレン基であり、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、アミノ、保護アミノ、カルボキシ、カルボン酸エステル、カルボキサミド、尿素などの官能基において終結する。その他の態様において、Lfは、付着したホスホラミダイト部分、好ましくは2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトを有するアルキレン基である。同様に、連結基Lは、2〜50個の主鎖原子を有する様々な連結基より選択され得る。連結基の例は、アルキレン連結基、ヘテロアルキレン連結基、ポリエーテル連結基、非環式基と環式基の組み合わせ（例えば、アルキレン基と複素環式基、またはヘテロアルキレン基とアリーレン基）を含む連結基などを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、連結基は、2〜50個の主鎖原子を有し、非環式基と環式基の組み合わせである。
【００６１】
以下のセクションにおいて、多くの色素および色素群が、具体的に議論され、特に関心対象の態様を示す。しかしながら、当業者は、本発明がそれらの態様に限定されないことを高く評価すると考えられる。
【００６２】
キサンテン色素
態様の一つの群において、Flは、ベンゾキサンテンを含むキサンテン色素のファミリー、より具体的には、フルオレセイン色素、ローダミン色素、およびロードール色素より選択される。
【００６３】
態様の特定の群において、蛍光色素試薬は、式（I）を有する。
2009527629.tif 000010
【００６４】
この態様の特定の局面において、式Iにおけるシンボル
2009527629.tif 000011
によって示されるAr環は、
2009527629.tif 000012
からなる群より選択される。Ar1において、A1は、O、N-Z、またはN+(Z)2を示す。式Iにおける結合
2009527629.tif 000013
は、一重または二重結合を示す。Ar2において、A1は、ORまたはN(Z)2を示す。各出現におけるZは独立に、水素、(C1-C8)アルキル、アリール-(C1-C8)-アルキル、アリール、または保護基であり；Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、C1-C4アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各出現におけるZ基は、融合5〜7員環を形成するためにR2またはR4と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる融合5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、Lf、またはPzで置換されてもよい。いくつかの態様において、Z基は、7員環を形成するためにR2またはR4と組み合わせられ、7員環は、置換されてもよいアリール環と融合されてもよい。別の態様において、Zは独立に、アリール-(C1-C8)-アルキル、アリール、または保護基であり；Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、C1-C4アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各出現におけるZ基は、融合5〜7員環を形成するためにR2またはR4と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる融合5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、Lf、またはPzで置換されてもよい。Ar2における置換基Rは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、保護基、およびLfより選択される。一つの態様において、Ar2における置換基Rは保護基である。
【００６５】
この態様の特定の局面において、A2はORまたはN(Z)2を示し、各Zは独立に、水素、(C1-C8)アルキル、アリール(C1-C8)アルキル、アリール、または保護基であり；Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各出現におけるZ基は、融合5〜7員環を形成するためにR1またはR1''と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる融合5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されてもよい。一つの態様において、Z基は、7員環を形成するためにR1またはR1''と組み合わせられてもよい。別の態様において、Zは独立に、アリール-(C1-C8)-アルキル、アリール、または保護基であり；Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各出現におけるZ基は、融合5〜7員環を形成するためにR2またはR4と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる融合5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、Lf、またはPzで置換されてもよい。Ar2における置換基Rは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、保護基、およびLfより選択される。一つの態様において、Ar2における基Rは保護基である。
【００６６】
この態様の特定の局面において、R1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4は、H、ハロゲン、シアノ、スルホ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、該アリールまたはヘテロアリール基は、Pzで置換されていてもよく；または芳香族、非芳香族、もしくは複素環式芳香族でありかつPzで置換されてもよい5もしくは6員融合環を形成するために、隣接環原子に付着しているR1'、R1''、R2、およびR3置換基のいずれか2個が組み合わせられてもよい。R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-またはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつR1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
【００６７】
R0は、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、下記式を有する置換または非置換へテロアリールまたはアリールである：
2009527629.tif 000014
式中、X1、X2、X3、X4、およびX5は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かついずれか2つの隣接X1〜X5は、芳香環または芳香族複素環を形成するために組み合わせられてもよい。上記のように、R0のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてよい。式Iにおける置換基R0'は、存在しないか、または(C1-C6)アルコキシ、ヒドロキシ、(C1-C6)アルキルアミノ、もしくはジ(C1-C6)アルキルアミノである。R0およびR0'基は、5〜6員複素環式環を形成するために組み合わせられてもよい。上記式内に、0〜1個のLf基および1〜4個のPz基、好ましくは1〜2個のPz基があると考えられる。
【００６８】
関連態様において、蛍光色素試薬は、保護蛍光色素である蛍光色素を使用する。そのような保護蛍光色素の例は、当業者にとって周知であり、以下の特定の態様の説明から明白であると考えられる。
【００６９】
いくつかの態様において、蛍光色素は、式（Ia）または（Ib）を有する保護キサンテン色素である：
2009527629.tif 000015
式中、A1およびA2は、各々独立にORまたはN(Z)2である。一つの態様において、A1およびA2は、各々独立にORまたはN(Z)2であり、Rは、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、Lfより選択され；かつZは、(C1-C8)アルキル、アリール(C1-C8)アルキル、およびアリールより独立に選択され、Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、またはLfもしくはPzで置換されていてもよい。R1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4は、H、ハロゲン、シアノ、アリール、ヘテロアリール、スルホ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、Lf、およびPzより各々独立に選択される、またはR1'、R1''、R2、およびR3の2つの隣接メンバーは、芳香族、非芳香族、もしくは複素環式芳香族でありかつPzで置換されていてもよい5もしくは6員融合環を形成するために組み合わせられてもよく、R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有する。この態様内において、シンボルX1、X2、X3、およびX4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かついずれか2つの隣接X1〜X4は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、および(C1-C6)アルコキシより選択される1〜4個の置換基でさらに置換されていてもよい芳香環または芳香族複素環を形成するために組み合わせられてもよい。上記式（IaおよびIb）内に、0〜1個のLf基および1〜2個のPz基があると考えられる。A1およびA2に対する好ましい基は、-O-C(O)-tブチルおよび-O-C(O)-イソプロピル、ジ(C1-C8)アルキルアミノ、N-(C1-C8)アルキル-N-C(O)(C1-C8)アルキル-アミノである。
【００７０】
本発明の一つの態様において、蛍光色素構成要素（Fl）は、式Icを有するローダミン色素である。
2009527629.tif 000016
【００７１】
式Icにおいて、各出現における基Z'またはZ''は、独立に、水素、(C1-C8)アルキル、アリール-(C1-C8)アルキル、またはアリールであり、Z'またはZ''基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、Lf、またはPzで置換されてもよく；かつ、各出現におけるZ'基は、融合5〜7員環を形成するためにR2またはR4と独立に組み合わせられてもよく、かつ各出現におけるZ''基は、融合5〜7員環を形成するためにR1またはR1''と独立に組み合わせられてもよい。存在する場合、該融合5〜7員環は、アリール環と融合され、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、Lf、またはPzで置換されてもよい。一つの態様において、各出現における基Z'またはZ''は、独立にアリール-(C1-C8)アルキルまたはアリールであり、Z'またはZ''基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、Lf、またはPzで置換されてもよく；かつ、各出現におけるZ'基は、融合5〜7員環を形成するためにR2またはR4と独立に組み合わせられてもよく、かつ各出現におけるZ''基は、融合5〜7員環を形成するためにR1またはR1''と独立に組み合わせられてもよい。式IcにおけるR1'、R1''、R1、R2、R3、R4、およびR0基は、式Iに対して上で記載されるのと同じである。
【００７２】
この態様の特定の局面において、ローダミン色素構成要素（Fl）は、以下に示されるような、式Ic1、Ic2、Ic3、Ic4、Ic5、またはIc6を有する。
2009527629.tif 000017
【００７３】
式Ic1〜Ic6中、各出現におけるRa'は、水素、(C1-C6)アルキル、およびアリールからなる群より独立に選択され、アリール基は、PzまたはLfで置換されていてもよい。各出現における置換基Rb'、Rb''、Rc'、Rd'、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、Rk'は、水素、(C1-C6)アルキル、およびアリール、好ましくは水素および(C1-C6)アルキルからなる群より独立に選択される。隣接環原子上に位置するいずれか2個の置換基、すなわちRb'、Rb''、Rc'、Rd'、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、またはRk'のいずれか2個は、PzまたはLfで置換されてもよい融合6員アリール環を形成するために組み合わせられてもよい。一つの態様において、Ra'は、PzまたはLfで置換されていてもよいアリールである。式Ic1〜Ic6中、下付き文字kおよびk'は、各々独立に0〜2の整数であり；かつ置換基X1〜X4は、式Iに対して上で規定されるのと同じである。
【００７４】
態様の一つの特に好ましい群において、ローダミン色素試薬は、式Ic5を有し、置換基は、上で提供される意味を有する。態様の一つの選択される群において、下付き文字kの各々は1であり；Rb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、およびRk'の各々は水素である。
【００７５】
態様の関連する群において、本発明は、下記式を有するローダミン色素試薬を提供する：
2009527629.tif 000018
式中、各出現におけるRb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、およびRk'は、水素、(C1-C6)アルキル、およびアリールからなる群より独立に選択されるか、または隣接環原子に付着しているRb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、もしくはRk'のいずれか2個の置換基は、PzもしくはLfで置換されてもよい融合6員アリール環を形成するために組み合わせられてもよく；式において橋頭窒素原子を有する環が5、6、または7員環であるように、各下付き文字kは独立に0〜2の整数であり；置換基X1〜X4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、PO(OH)(OLf)、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かつX1〜X4のいずれか2個の隣接置換基は、芳香環または芳香族複素環を形成するために組み合わせられてもよく；X1〜X4のアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
【００７６】
態様のこの群においては、Lfが、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体からなる群より選択される付着メンバーを有する連結基であり；かつPzが、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基であるか、または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり
2009527629.tif 000019
（式中、波線は、ローダミン色素試薬の残基のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lは、連結基であり；Naは、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々は、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；RCは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護末端ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基からなる群より選択される）；ならびにその塩であり；かつ上記ローダミン色素試薬は、1〜3個のLf基および0〜2個のPz基を有する。
【００７７】
特に好ましいのは、Rb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、またはRk'の一つが、フェニルである態様である。その他の好ましい態様は、Rb''、Rg'、Rh'、Ri'、Rj'、またはRk'の二つの隣接メンバーが、融合ベンゼン環を形成するために組み合わせられるものである。さらにその他の好ましい態様は、X1、X2、X3、またはX4の一つが、PO(OH)(OLf)またはその塩であるものである。
【００７８】
特に好ましいローダミン色素試薬の一つの群は、
2009527629.tif 000020
より選択される。
【００７９】
好ましいローダミン色素試薬の別の群は、
2009527629.tif 000021
より選択される。
【００８０】
態様の関連する群において、本発明は、下記式を有するローダミン色素試薬を提供する：
2009527629.tif 000022
式中、各出現におけるRa'は、水素、C1-C6アルキル、およびアリールより独立に選択され、アリール基は、PzまたはLfで置換されていてもよく；各出現におけるRb'、Rc'、Rd'は、水素、（C1-C6)アルキル、およびアリールからなる群より独立に選択されるか、または隣接環原子に付着しているRb'、Rc'、もしくはRd'のいずれか2個の置換基は、PzもしくはLfで置換されてもよい融合6員アリール環を形成するために組み合わせられてもよく；式において橋頭窒素原子を有する環が5、6、または7員環であるように、各下付き文字kは独立に0〜2の整数であり；かつ置換基X1〜X4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、PO(OH)(OLf)、CO2H、Lf、およびPzより各々独立に選択され、かつX1〜X4のいずれか2個の隣接置換基は、芳香環または芳香族複素環を形成するために組み合わせられてもよく；X1〜X4のアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
【００８１】
上記のように、態様のこの群においては、Lfが、保護または非保護官能基、反応基、多官能性連結部分、ホスホラミダイト部分、および固体支持体より選択される付着メンバーを有する連結基であり；かつPzが、式（a）を有する両性イオンホスホン酸基であるか、または式（b）もしくは（c）を有する保護ホスホン酸基であり
2009527629.tif 000023
（式中、波線は、ローダミン色素試薬の残基のsp2炭素への直接的な付着を示し；Lは、連結基であり；Naは、アンモニウムイオン基であり；RAおよびRBの各々は、Hおよび不安定保護基からなる群より独立に選択され；RCは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、不安定保護基、または末端ヒドロキシもしくは保護末端ヒドロキシ基を有するアルキレン連結基からなる群より選択される）；ならびにその塩であり；かつ上記ローダミン色素試薬は、1〜3個のLf基および0〜2個のPz基を有する。
【００８２】
好ましい態様の一つの群において、各Rb'は、メチルであり、RC'およびRd'の各々は、水素である。好ましい態様の別の群において、X1、X2、X3、またはX4の一つは、PO(OH)(OLf)またはその塩である。もっとさらに好ましいのは、下記式を有するローダミン色素試薬である。
2009527629.tif 000024
【００８３】
「対称性」および「非対称性」ローダミン色素の両方は、本発明の化合物において有用である。ここで概して記載される対称性ローダミンは、（Color Index, 3rd Edition, Vol. 4: 420 (1971)）において記載されるような合成手順に従って、無水フタル酸および3-アミノフェニル誘導体から開始するスキームA（下記）において以下に示される合成経路に従って容易に合成される。非対称性ローダミンは、反応スキーム4における2-(2,4-ジヒドロキシ-3-クロロフェニル)プロピオン酸メチルエステルを「3-アミノフェノール」の例である3-ジエチルアミノ-フェノールで置換することによって、反応スキーム4において記載されるものと類似の合成経路に従って合成され得る。
【００８４】
スキームA
2009527629.tif 000025
【００８５】
3-アミノフェノール類似体は、当技術分野において周知である。多くが、市販されているか、または文献において報告されている合成方法に従うことによって、もしくは当業者に概して公知の方法によって容易に利用できる。一つの態様において、本発明のローダミン色素構成要素の合成において有用である3-アミノフェノールは、表IAに記載されるものを含むが、それらに限定されない。
【００８６】
（表ＩＡ）
1. 3-[メチル(フェニル)アミノ]フェノール, 5-メチル-5,6-ジヒドロフェナントリジン-3-オール
2. 5-メチル-5,6-ジヒドロフェナントリジン-1-オール
3. 1-フェニルインドリン-4-オール, 1-フェニルインドリン-6-オール
4. 1-フェニル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-7-オール
5. 1-フェニル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-5-オール
6. 5-フェニル-5,6-ジヒドロフェナントリジン-3-オール
7. 5-フェニル-5,6-ジヒドロフェナントリジン-1-オール
8. 2,3,6,7-テトラヒドロ-1H,5H-ピリド[3,2,1-ij]キノリン-8-オール
9. 8H,13H-12b-アザ-ジベンゾ[a,de]アントラセン-7-オール
10. 8H,9H-8a-アザ-ベンゾ[fg]ナフタセン-1-オール
11. 10-メチル-9,10-ジヒドロアクリジン-3-オール
12. 10-メチル-9,10-ジヒドロアクリジン-1-オール, 2,3-ジヒドロ-1H
13. 7H-ピリド[3,2,10-de]アクリジン-4-オール
14. 2,3-ジヒドロ-1H,7H-ピリド[3,2,1-de]アクリジン-6-オール
15. 9-メチル-9H-カルバゾール-2-オールおよび9-メチル-9H-カルバゾール-4-オール
【００８７】
付加的な3-アミノフェノール誘導体は、上に記載される3-アミノフェノール化合物から調製することができ、それも、本発明のローダミン色素構成要素（Fl）の合成に対して有用であると考えられることが、当業者によって高く評価されると考えられる。例えば、その他の誘導体（例えば、ハロゲン化誘導体、およびその他の置換基を有する誘導体、適当な反応基を有するリンカーまたは連結基）は、当技術分野において公知の方法によって表IAに記載される3-アミノフェノール化合物から調製することができ、ローダミン色素構成要素（Fl）を調製するための有用な合成前駆体でもあると考えられる。一つの実例的な例において、表IAにおける化合物のハロゲン化誘導体は、例えばニトロ化などの公知の手順を使用して調製することができ、ニトロ化合物のアミンへの還元が続き、ザントマイヤー反応を使用してハロゲン化類似体に変換することができる（化合物28に対する類似のハロゲン化反応順序を記載する反応スキーム5を参照されたい）。ローダミン色素（Fl）の合成に対して有用であるハロゲン化3-アミノフェノール誘導体の具体的な群は、表1Bに記載される。
【００８８】
（表ＩＢ）
2009527629.tif 000026
X＝ハロゲン
【００８９】
表IBにおいて示されるハロゲン化3-アミノフェノール化合物は、ハロゲン化ローダミン色素構成要素を形成するために、例えば無水フタル酸とさらに反応することができ、式Icを有するローダミン色素構成要素（Fl）を形成するために、本明細書において記載されるパラジウム媒介合成方法を使用して、化合物（例えば、反応スキーム1において示される化合物3など）とさらに反応することができることが、当業者によって高く評価されると考えられる。付加的に、異なるハロゲン置換パターンを有する付加的なハロゲン化3-アミノフェノールならびに付加的な非ハロゲン化誘導体が、類似の方法によって調製され得ることが、高く評価されると考えられる。
【００９０】
ローダミン色素構成要素（Fl）を有する化合物の合成に関する付加的な詳細は、本出願の実施例セクションにおいて提供される。
【００９１】
一つの態様において、蛍光色素（Fl）構成要素は、対称性ローダミン色素であり、別の態様において、蛍光色素（Fl）構成要素は、非対称性ローダミン色素である。一つの態様において、対称性または非対称性ローダミン色素構成要素は、表IBに記載される3-アミノフェノール化合物を使用して調製される。
【００９２】
さらにその他の態様において、本発明は、Flが、例えばベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、またはベンゾ[c]キサンテンなどのベンゾキサンテン色素である化合物を提供する（置換基が上に提供される意味を有し、加えて、式の各々における下付き文字nが、0〜3の整数であり、各々のX0が、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より選択され、かつX0のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分が、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい、図1における式II、IIa、III、IIIa、IV、およびIVaを参照されたい）。
【００９３】
クマリン色素
態様のさらに別の群において、蛍光色素試薬は、下記式を有する：
2009527629.tif 000027
式中、R1、R1'、R1''、R2、およびR3は、H、ハロゲン、シアノ、スルホ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され；R1'、R1''、およびR1〜R3のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつR1'、R1''、およびR1〜R3のいずれかのアリールおよびヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；かつA1は、ORまたはN(Z)2を示し、各Zは、独立に、水素、(C1-C8)アルキル、アリール-(C1-C8)アルキル、アリール、または保護基であり、Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく、該融合5〜7員環は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、Lf、またはPzで置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール環と融合されてもよい。一つの態様において、Z基は、アリール-(C1-C8)アルキル、アリール、または保護基であり、Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよい。式VにおけるA1置換基のR基は、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、保護基、またはLfである。一つの態様において、式VにおけるA1置換基のR基は、保護基である。
【００９４】
色素のベンゾクマリンシリーズ（VI）は、R2およびR3が、融合ベンゼン環を形成するために組み合わせられ、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、および(C1-C6)アルコキシより選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい、式Vのものである。
【００９５】
シアニン色素
さらにその他の態様において、本発明は、上記の一般式を有するシアニン色素試薬を提供し、Flは、シアニン色素構成要素である。
【００９６】
様々なシアニン色素が、本発明において有用であり、概して、以下に提供されるような式を有する。
2009527629.tif 000028
【００９７】
式VIIにおいて、Q1およびQ2の各々は、O、S、N、およびCRaRb、または-C(=CH2)-より独立に選択され、RaおよびRbは、独立にH、メチル、エチル、または連結基（例えば、Lf）である。環AxおよびAyは、縮合置換または非置換のアリール環またはヘテロアリール環を各々独立に示し（以下の表1Cにおいて示される例を参照されたい）、アリールまたはヘテロアリール環は、ハロゲン、CN、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルキルアミノ、ジ(C1-C8)アルキルアミノ、またはLfもしくはPzで置換されていてもよいアリールもしくはヘテロアリール基で置換されていてもよい。一つの態様において、アリールまたはヘテロアリール環は、(C1-C8)アルキルアミノ、ジ(C1-C8)アルキルアミノ、またはLfもしくはPzで置換されていてもよいアリールもしくはヘテロアリール基で置換されていてもよい。文字Qは、共役連結系を示す。適した共役連結系は、以下のもの（Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh、Ri、Rj、およびRkが、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、(C1-C6)アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールより各々独立に選択され、該アリールおよびヘテロアリール基（置換または非置換）は、LfまたはPzで置換されてもよく；かつRnおよびRpが、各々独立に、水素、酸素、ハロゲン、-CN、-CF3、(C1-C6)アルキル、-NRm、-ORm、-SRm、または-NRmRmであり、各出現におけるRmが、独立に、水素、(C1-C6)アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、またはLfであり、該アリールまたはヘテロアリール基（置換または非置換）は、LfまたはPzで置換されてもよく；かつ下付き文字oが、整数0または1である）ならびにシアニン色素の表において提供される共役系である。一つの態様において、下付き文字oは、整数0であり；RnおよびRpは、各々独立に、酸素、ハロゲン、-CN、-CF3、-NRm、-ORm、-SRm、-NRmRmであり；かつRe、Rf、Rg、Rh、Ri、およびRkは、存在する場合、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、(C1-C6)アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールより各々独立に選択され、該アリールおよびヘテロアリール基（置換または非置換）は、LfまたはPzで置換されてもよい。別の態様において、下付き文字oは、整数1であり；RnおよびRpは、各々独立に、水素、酸素、ハロゲン、-CN、-CF3、(C1-C6)アルキル、-NRm、-ORm、-SRm、または-NRmRmであり；かつRc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh、Ri、Rj、およびRkは、水素、ハロゲン、-CN、-CF3、(C1-C6)アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールより各々独立に選択され、該アリールおよびヘテロアリール基（置換または非置換）は、LfまたはPzで置換されてもよい。
2009527629.tif 000029
【００９８】
上記のシアニン色素の式に戻って、シンボルRGおよびRG'は、H、(C1-C8)アルキル、ヘテロアルキル、アルキレンスルホン酸、アルキレンリン酸、アルキレンホスホン酸、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンカルボン酸、連結基（例えば、Lf）より独立に選択され、RGまたはRG'における該アリール基は、Pzで置換されていてもよく、式VIIの化合物は、少なくとも約1〜約2個のPz基および約0〜約2個のリンカー、Lf基を含み、Ra、Rb、R、AX、またはAYにおけるリンカーは、存在する場合、N、O、もしくはS求核剤などの官能基を含むか、またはN、O、もしくはS求核剤と反応することが可能な官能性を含む。一つの態様において、RGおよびRG'は、アルキレンリン酸、アルキレン、ホスホン酸、アルキレンアリール、および置換アルキレンアリールからなる群より選択され、RGまたはRG'における該アリール基は、Pzで置換されていてもよい。
【００９９】
上記式は、本明細書において記載される方法に従って修飾され得るシアニン色素の範囲を伝えることを意図されるが、「シアニン色素」または「シアニン」という語は、当技術分野において周知であるシアニン色素のいずれかを指す。合成アプローチは、欧州特許第1,065,250号；国際公開公報第05/014723号；国際公開公報第99/31181号；米国特許第5,268,486号；第5,658,751号；第5,808,044号；第5,981,747号；第5,658,751号；第4,937,198号；第4,937,198号；第6,080,868号；第6,110,630号；第6,225,050号；第6,238,838号；第6,716,994号、および第6,207,464号、ならびに米国公報番号2003/0113755において開示されている。公知のシアニン色素の代表的な例は、表1Cにおいて示される。表1Cの色素の合成が、本明細書において記載される一般方法を使用して両性イオンホスホン酸色素へと変換され得るハロゲン化色素を産出するために修飾され得ることが、当業者によって高く評価されると考えられる。加えて、適当な反応性官能基をともなう置換基、リンカー、または連結基は、当技術分野において公知のその他の標準的な方法によって、これらの色素または色素類似体に組み入れられ得る。
【０１００】
（表１Ｃ）公知のシアニン色素
2009527629.tif 000030
2009527629.tif 000031
2009527629.tif 000032
【０１０１】
ジピロメテンボロンジフルオリド色素（Bodipy色素）
ホスホン酸ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、下記式において示されるように提供される：
2009527629.tif 000033
式中、X1、X2、X3、およびX4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され、かついずれか2つの隣接X1〜X4は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、および(C1-C6)アルコキシより選択される1〜4個の置換基でさらに置換されていてもよい非芳香族、芳香族、または複素環式芳香族5または6員環を形成するために組み合わせられてもよい。上記式（VIII）内に、0〜1個のLf基および1〜2個のPz基がある。
【０１０２】
フェノキサジン色素
態様のさらに別の群において、蛍光色素試薬は、下記式を有する：
2009527629.tif 000034
式中、A1は、O、N+(Z)2、またはN-Zを示し、Zは、H、(C1-C8)アルキル、アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基、またはアリールであり、Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各Z基は、融合5〜7員環を形成するためにR2またはR4と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzでさらに置換されてもよく；A2は、ORまたはN(Z)2を示し、各Zは、独立に、H、(C1-C8)アルキル、アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基、またはアリールであり、Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各Z基は、5〜7員環を形成するためにR1またはR1''と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzでさらに置換されてもよく；Rは、H、保護基、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、およびLfであるか、または融合5〜7員環を形成するためにR1もしくはR1''と組み合わせられてもよい。一つの態様において、A1は、O、N+(Z)2、またはN-Zを示し、Zは、アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基、またはアリールであり、Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各Z基は、融合5〜7員環を形成するためにR2またはR4と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzでさらに置換されてもよく；A2は、ORまたはN(Z)2を示し、各Zは、独立に、アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基、またはアリールであり、Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各Z基は、5〜7員環を形成するためにR1またはR1''と独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる5〜7員環は、アリール環と融合されてもよく、かつハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzでさらに置換されてもよい。
【０１０３】
式IXにおいて、シンボルR1'、R1''、R1、R2、R3、およびR4は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、スルホ、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつ上記式内に0〜1個のLf基および1〜4個のPz基、好ましくは1〜2個のPz基があるように、R1'、R1''、およびR1〜R4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
【０１０４】
本発明のさらにその他の態様において、Flは、例えば、ベンゾ[a]フェノキサジン色素、ベンゾ[b]フェノキサジン色素、またはベンゾ[c]フェノキサジン色素などのフェノキサジン色素である（置換基が上に提供される意味を有し、加えて、式の各々における下付き文字nが、0〜3の整数であり、かつ各々のX0が、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルキルチオ、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、ヘテロアリール、SO3H、PO3H2、CO2H、Lf、およびPzからなる群より選択され、かつX0のいずれかのアリールまたはヘテロアリールが、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい、図2における式X、XI、およびXIIを参照されたい）。
【０１０５】
遷移金属錯体
2,2'-ジピリジルに基づくルテニウム（II）錯体色素などのホスホン酸金属錯体は、下記式において示されるように提供される：
2009527629.tif 000035
式中、X1、X2、X3、およびX4の各々は、H、OH、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより独立に選択され；X1、X2、X3、およびX4のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、カルボキシエステル、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつX1、X2、X3、およびX4のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよく；または2つのX1-4のいずれかの隣接組み合わせは、NまたはSより選択される0個、1個、またはそれ以上の複素環式環原子を含む飽和または不飽和置換または非置換5または6員環を形成してもよい。Mは、ランタニド金属および遷移金属より選択される金属イオンである。上記の式（XIII）内に、0〜1個のLf基および1〜2個のPz基があると考えられる。
【０１０６】
別の関連態様において、X1-4の一つは、LfまたはPzであり、かつX1-4の残部は、水素である。
【０１０７】
さらに別の関連態様において、Mは、ルテニウム、レニウム、またはオスミウムより選択される。
【０１０８】
別の例示的な態様において、金属イオン錯体は、核酸合成条件、ならびに核酸脱保護および開裂試薬に対して安定である。
【０１０９】
その他のホスホン酸置換色素
様々なその他の色素は、本明細書において記載される方法を用いて、本発明の色素試薬へと修飾され得る。転換（transformation）において有用なさらにその他の合成方法は、当業者にとって公知である。特に、色素は、a）ホスホン酸基の導入を可能にするためのハロゲン化、およびb）生物学的薬剤または物質タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、基質などの様々な官能基に対して反応性があるようにされることによって調製され得る（表2を参照されたい）。公知の蛍光色素構造は、表2の左カラムにおいて示される。左カラムにおける色素構造に基づくハロゲン化色素前駆体の例は、表2の右カラムにおいて示される。当業者は、ホスホン酸基が、ハロゲン化環のいずれかまたはハロゲン化が可能な場所に導入され得ることを高く評価すると考えられる。加えて、ホスホン酸色素を生物学的物質に付着させる基は、表2の色素における様々な位置に導入され得る。表2の提唱される色素が、一つまたは複数のホスホン酸基、生物学的またはその他の基質への色素の付着のための基を含むだけではなく、蛍光発光特性を調節するために環のいずれか上に一つまたは複数の置換基を任意で含み得ることがさらに高く評価されると考えられる。
【０１１０】
（表２）公知の色素およびハロゲン化色素の構造および物理的特性
2009527629.tif 000036
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【０１１１】
他に特に示されない限り、励起および発光波長は、Jonathan LindseyによるPhotochemCADパッケージからの化学スペクトルから取られた（http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/）。発光波長は、発光スペクトルから推定された。
【０１１２】
表2において示されるハロゲン化色素中間体は、本発明の方法によってホスホン酸色素に変換され得る。当技術分野において報告される蛍光色素が、様々な方法によって対応するハロゲン化色素に変換され得ることは、当業者にとって明白であると考えられる。一つのそのような方法は、ハロゲン化色素中間体で開始することである、またはいくつかの例において、ハロゲン置換基をその芳香環の1つへと導入することが可能であると考えられる。リンカー部分が、当技術分野において公知の方法または本発明によって開示されるものによって、色素分子へと導入され得ることがさらに明白であると考えられる。塩素および臭素での芳香環のハロゲン化は、当技術分野において周知であり、概論として、Breandlin and McBee, Olah, 「FRIEDEL-CRAFTS AND RELATED REACTIONS」Vol 3, pp 1517-1593, Interscience Publishers, Inc. NY, 1964およびBerliner, J. Chem. Educ. 43:124-132 (1966)を参照されたい。または、ハロゲン化物基は、Sandmeyer反応を使用するアミノ基のジアゾ化を介して芳香環へと導入され得る（Hodgson, Chem. Rev., 40:251-277(1947)）。表2の色素に存在するアリールおよびヘテロアリール部分が置換され得ることは、当業者にとってさらに明白であると考えられる。置換基は、当技術分野において公知の方法によって、色素に導入され得る。結果として、表2の色素の構造類似体（例えば、LfおよびPzを任意で組み入れるもの）も、本発明の特定の態様として検討される。
【０１１３】
エネルギー転移色素
ホスホン酸置換エネルギー転移色素は、本発明の色素試薬の別の例である。そのようなエネルギー転移色素の一つの例は、以下に示される電子供与および電子求引キサンテン色素カップルである。当業者は、その他の色素組み合わせも、本発明の一部であることを高く評価すると考えられる。
2009527629.tif 000041
【０１１４】
より詳しくは、キサンテン部分を採用する電子転移色素は、本質的にキサンテン色素（例えば、式I、Ia、およびIbにおいて上で提供されるもの）またはベンゾキサンテン色素のいずれかを含み得る。リンカー部分は、概して、環式、非環式、芳香族、またはその組み合わせのいずれかであるC、N、O、P、およびSより選択される約3〜50個の主原子を有し、かつ利用できる原子価を満たすための付加的な水素原子を有する様々なリンカーであり得る。エネルギー転移色素の例は、米国特許第5,800,996号；同第5,863,727号、および同第5,565,554号；ならびに欧州特許第0 747 700号において開示されている。表4は、ホスホン酸部分（および任意で上記の一般式において提供されるようなさらなる連結基）を付着させるための本明細書において記載される方法に従って修飾され得るエネルギー転移色素のいくつかの例を例証する。
【０１１５】
（表４）二量体蛍光エネルギー転移色素の例
2009527629.tif 000042
2009527629.tif 000043
【０１１６】
表4において示される二量体エネルギー転移色素に対する合成手順は、例えば、米国特許第5,800,996号、同第5,863,727号、および同第5,565,554号において、ならびに欧州特許第0 747 700号において記載されている。2つより多いの蛍光部分を含む蛍光エネルギー転移タグは、米国特許第6,627,748号において記載される。表4における色素は、少なくとも一つのキサンテン部分または少なくとも一つのシアニン部分を含み、キサンテン-またはシアニン-色素へのホスホン酸基の導入は、本明細書において記載される方法によって容易に達成され得る。
【０１１７】
チアゾールオレンジ類似体
さらにその他の態様において、ホスホン酸置換チアゾールオレンジ類似体が、下記式において示されるように提供される：
2009527629.tif 000044
式中、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、およびX11は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；またはX2〜X11の2つの隣接メンバーは、芳香族、非芳香族、または複素環式芳香族であり、かつPzで置換されていてもよい5または6員融合環を形成するために組み合わせられてもよく；かつX1およびX12は、各々独立にH、(C1-C6)アルキル、アリール、および置換アリールであり；X1〜X12のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつX1〜X12のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
【０１１８】
N-アリール-1,8-ナフタルイミド
ホスホン酸-アリール-1,8-ナフタルイミド類似体は、式XVにおいて示されるように提供される：
2009527629.tif 000045
式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6は、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzより各々独立に選択され；またはX1〜X6の2つの隣接メンバーは、芳香族、非芳香族、または複素環式芳香族であり、かつPzで置換されていてもよい5または6員融合環を形成するために組み合わせられてもよく；かつX7は、アリールまたはヘテロアリールであり；X1〜X6のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジアルキルアミノ、アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよく、かつ置換基のアルキル部分は、1〜6個の炭素原子を有し；かつX1〜X7のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。
【０１１９】
ポリメチン-ホスホン酸色素
さらにその他の態様において、式（XVIa〜XVIc）のポリメチンに基づくホスホン酸色素が提供される。ポリメチンに基づくホスホン酸色素およびそれらの合成は、すべての目的に対してその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2004/0260093号において記載される。
2009527629.tif 000046
【０１２０】
式XVIa〜XVIcにおいて、Aは、ORまたはN(Z)2を示し、各Zは、独立に、水素、(C1-C8)アルキル、アリール-C1-C8アルキル、保護基、またはアリールであり；Z基の脂肪族またはアリール部分は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく；あるいは各出現におけるZ基は、融合5、6、または7員環を形成するためにRccまたはRddと独立に組み合わせられてもよく、結果として生じる融合5〜7員環は、ハロゲン、(C1-C4)アルキル、アリール、Lf、またはPzで置換されていてもよく、かつアリール環と融合されてもよく；R基は、水素、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、保護基、またはLfである。各出現における置換基Ra'は、水素、(C1-C6)アルキル、およびアリールからなる群より独立に選択され、アリール基は、PzまたはLfで置換されていてもよい。置換基Raa、Rbb、Rcc、Rdd、Ree、Rff、Rgg、Rhh、およびRiiは、H、ハロゲン、シアノ、CF3、(C1-C8)アルキル、(C1-C8)アルキルチオ、(C1-C8)アルコキシ、(C1-C8)アルカン酸、(C1-C8)アルキルスルホン酸、アリール、ヘテロアリール、Lf、およびPzからなる群より各々独立に選択され；Raa、Rbb、Rcc、Rdd、Ree、Rff、Rgg、Rhh、Rii、およびRa'置換基のいずれか2個は、芳香族、非芳香族、または複素環式芳香族でありかつPzで置換されてもよい5または6員融合環を形成するために組み合わせられてもよい。Raa、Rbb、Rcc、Rdd、Ree、Rff、Rgg、Rhh、およびRa'のいずれかのアルキル部分は、ハロゲン、カルボキシ、スルホ、アミノ、モノ-もしくはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルコキシ、シアノ、ハロアセチル、またはヒドロキシで置換されていてもよい。Raa、Rbb、Rcc、Rdd、Ree、Rff、Rgg、Rhh、Rii、およびRa'のいずれかのアリールまたはヘテロアリール部分は、Pz、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-またはジ(C1-C6)アルキルアミノ、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルキルチオ、(C1-C6)アルコキシ、Lf、およびPzからなる群より選択される1〜4個の置換基で置換されていてもよい。基-D-E-は、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NRa''、または-NRa''-C(O)-からなる群より選択され、Ra''は、水素、(C1-C6)アルキル、またはアリールであり、アリール基は、PzまたはLfで置換されていてもよい。置換基RnおよびRn'は、水素、(C1-C6)アルキル、およびアリールからなる群より独立に選択され、アリール基は、PzまたはLfで置換されていてもよい。下付き文字nnは、1〜3の整数であり、式XVIa〜XVIcにおける下付き文字kは、1〜2の整数である。式XVIa〜XVIcを有するいかなる化合物も、少なくとも一つのPzを含むという条件がある。
【０１２１】
関連局面において、本発明は、一般式（B）およびその塩を有する蛍光色素試薬を提供する：
2009527629.tif 000047
式中、Flは、蛍光色素構成要素であり；下付き文字nは、1〜4の整数であり；かつP1は、下記式を有する官能性をもたせたホスホン酸基であり、
2009527629.tif 000048
式中、波線は、蛍光色素構成要素のsp2炭素への直接的な付着を示し；L1は、連結基であり；Rは、H、(C1-C8)アルキル、アリール、アリール(C1-C4)アルキル、-La-Na、および-La-NRARBより選択され；Laは、アルキレン連結基であり、Naは、アンモニウムイオン基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、ならびにC(O)CF3、FMOC、C(O)t-ブチル、フタルイミド、およびモノメトキシトリチルなどの不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつPaは、ホスホラミダイト部分、少なくとも一つの末端官能基または保護官能基を有する一、二、または三官能性連結基、固体支持体、および反応基（例えば、以下に記載されるような求電子または求核基）からなる群より選択される官能基構成要素である。Rがアルキルである態様に対して、好ましいアルキル基は、分子におけるその他の官能基の存在下で除去され得るものである（例えば、tert-ブチル、tert-アミル、メチル）。一つの態様において、式B中の下付き文字nは、2〜4の整数である。
【０１２２】
初めに記載された蛍光色素試薬のように、本発明のこの局面は、典型的にはクマリン、ベンゾクマリン、キサンテン、ベンゾ[a]キサンテン、ベンゾ[b]キサンテン、ベンゾ[c]キサンテン、シアニン、アクリジン、ジピロメテンボロンジフルオリド、フェノキサジン、ベンゾ[a]フェノキサジン、ベンゾ[b]フェノキサジン、およびベンゾ[c]フェノキサジンより選択される様々な蛍光色素構成要素（Fl）を含む。いくつかの態様において、蛍光色素構成要素は、クマリン色素、レゾルフィン色素、ジピロメテンボロンジフルオリド色素、ルテニウムビピリジル色素、エネルギー転移色素、チアゾールオレンジ色素、N-アリール-1,8-ナフタルイミド色素、ホスホン酸ポリメチン色素、メロシアニン、スチルベン、スチリルに基づく色素、およびジピリンより選択される。さらにその他の態様において、蛍光色素構成要素は、フルオレセイン色素、ローダミン色素、およびロードール色素より選択される。より詳しくは、蛍光色素は、式I、Ia、Ib、II、IIa、III、IIIa、IV、IVa、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVIにおいて提供される色素、または表1Cもしくは2の色素のいずれかであってよく、Plは、Pzに対して上に記載されるような位置におけるsp2混成炭素原子に付着する。
【０１２３】
ホスホン酸部分は、本明細書において記載される方法を使用して（例えば、ハロゲン色素構成要素中間体のホスホニル化（phosphonylation）を介して）色素構成要素に付着してもよく、ホスホネートが末端基（例えば、Pa）への連結をともなって提供される適した合成段階が後に続く。
【０１２４】
ホスホニル化色素の一般合成
さらに別の局面において、本発明は、ホスホニル化蛍光色素誘導体を調製する方法を提供し、その方法は、ホスホニル化蛍光色素誘導体を形成するために、ハロゲン原子を除去しかつホスホン酸基を芳香環炭素原子に共有結合させるのに十分な条件下で、芳香環炭素原子に付着した少なくとも一つのハロゲン原子を有するハロ蛍光色素基質を、亜リン酸試薬と接触させることを含む。
【０１２５】
多くの態様において、ハロ蛍光色素基質は、ハロクマリン、ハロベンゾクマリン、ハロキサンテン、ハロベンゾ[a]キサンテン、ハロベンゾ[b]キサンテン、ハロベンゾ[c]キサンテン、ハロシアニン、ハロアクリジン、ハロジピロメテンボロンジフルオリド、ハロフェノキサジン、ハロベンゾ[a]フェノキサジン、ハロベンゾ[b]フェノキサジン、およびハロベンゾ[c]フェノキサジンより選択される。
【０１２６】
本発明の亜リン酸試薬は、対称性または非対称性であり得る。対称性亜リン酸試薬は、式：HP(=O)(OR)2を有するものであり、亜リン酸エステルR基の各々は、-La-NRARBであり；Laは、アルキレン連結基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつRAおよびRBの少なくとも一つは、保護基である。そのような保護基の例は、C(O)CF3、フタルイミド、C(O)Ot-Bu、C(O)OBn、モノメトキシトリチル、FMOCなどである。
【０１２７】
非対称性亜リン酸試薬は、式：HP(=O)(OR)(OR')を有するものであり、亜リン酸エステルR'基は、Rの存在下で除去され得る保護基である、または-La-NRARBであり；かつR基は、-L1-PaまたはLa-NRARBであり；L1は、アルキレン連結基であり、かつPaは、保護または非保護官能基である。RおよびR'の各々に対して、Laはアルキレン連結基であり、かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基からなる群より独立に選択され；かつRAおよびRBの少なくとも一つは、保護基である。有用なR'エステル基の例は、t-ブチル、ベンジル、フェニルなどである。Rが-La-NRARBでもある態様に対して；RAおよびRBの各々は、独立にH、(C1-C8)アルキル、または不安定保護基であり；かつRAおよびRBの少なくとも一つは保護基であり、そのような保護基の例は、C(O)CF3、フタルイミド、C(O)Ot-Bu、C(O)OBn、モノメトキシトリチル、Fmocなどである。当業者は、RAまたはRBが保護基である態様に対して、R'基がエステル（または保護基）であり、かつRAまたはRB基が直交保護基（すなわち、その他の保護基の存在下で選択的に除去され得る保護基）であることを高く評価すると考えられる。
【０１２８】
上を考慮して、本発明は、下記式を有する化合物を提供する：
2009527629.tif 000049
式中、Lは、(C1-C8)アルキレンおよび(C1-C8)ヘテロアルキレン連結基からなる群より選択されるメンバーであり；Xは、官能基および保護官能基からなる群より選択されるメンバーであり、該官能基は、ヒドロキシル、カルボキシ、チオ、スルホン酸、または式NRARBを有するアミノであり；Rは、不安定保護基および-L-NRARBからなる群より選択されるメンバーであり；かつRAおよびRBの各々は、H、(C1-C8)アルキル、および不安定保護基より独立に選択され、かつRAおよびRBの少なくとも一つはH以外である。いくつかの態様において、Rは、第三ブチルである。その他の態様において、Rは-L-NRARBであり、かつXは-NRARBである。より好ましくは、各々のRAはHであり、かつ各々のRBは保護基であり、好ましくは-C(O)CF3、-C(O)OtBu、FMOC、フタルイミド、および-C(O)O-ベンジルより選択される。その他の態様において、Xは-O-ジメトキシトリチル（DMT）である。最も好ましい態様において、化合物は下記より選択される。
2009527629.tif 000050
上の構造は、単一の互変異性型において提供されるが、当業者は、列挙が、一般的に使用される三価亜リン酸型を含むすべての型を含むことをさらに意図されることを高く評価すると考えられる。
【０１２９】
選択された亜リン酸試薬の調製および本発明の蛍光色素試薬を調製することにおけるそれらの使用に対するより具体的なスキームが、以下のスキームにおいて提供される。
【０１３０】
ホスホニル化色素合成のための試薬およびホスホニル化色素の調製
反応スキーム1は、対称性亜リン酸試薬亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)の合成を図示する（3）。
【０１３１】
反応スキーム1
2009527629.tif 000051
【０１３２】
2,2,2-トリフルオロ-N-(4-ヒドロキシブチル)アセトアミド（1）は、ピリジンにおいて亜リン酸ジフェニル（2）と反応させ、ホスファイト3を産出した。この試薬は、本発明の芳香族ビス-トリフルオロアセトアミドホスホン酸色素を調製するために使用された。濃NH4OHにおけるジエステルの脱保護は、両性イオン4-アミノブチルホスホン酸基を生成する。
【０１３３】
反応スキーム2
2009527629.tif 000052
【０１３４】
反応スキーム2は、ホスホニル化ペンタクロロフルオレセインホスホラミダイト11の合成を図示する。メチルエステル4は、メチルスルホン酸の存在下で4-ブロモベンゼン-1,3-ジオールと反応させ、中間体5を産出し、トリフルオロ酢酸/無水トリフルオロ酢酸でラクトン6に変換した。次いで、ラクトン6は、6-アミノヘキサノールおよびジメトキシトリチルと反応させて、DMT-中間体7を形成し、次いで、亜リン酸試薬3と反応させ、ホスホン酸エステル8を産出した。エステル8は、ヒドロキシル基を保護するために無水トリメチル酢酸で処置し、SiO2精製の後に完全に保護された色素類似体9を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、アルコール10を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（Aldrich, St. Louis, MO）での処置により、望ましいホスホラミダイト11を得た。
【０１３５】
反応スキーム3
2009527629.tif 000053
【０１３６】
反応スキーム3は、完全に保護されたホスホニル化ベンゾフルオレセインホスホラミダイト19の合成を図示する。AlCl3の存在下で4-ブロモフタル酸無水物およびメチル-3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオネートを組み合わせ、ベンゾフェノン12を産出し、1,3-ジヒドロキシナフタレンと反応させ、フルオレセイン類似体13の二つの異性体を形成した。中間体13は、トリフルオロ酢酸/無水トリフルオロ酢酸で、ラクトン14に変換した。次いで、ラクトンは、O-ジメトキシトリチル-6-アミノヘキサノール（Tetrahedron Letters, 2004, 45(2):317-320）と反応させ、DMT-中間体異性体を形成し、シリカゲルで分離し、純粋な多い6-異性体15を産出した。次いで、6-異性体15は、無水トリメチル酢酸と反応させ、完全に保護された類似体16を産出し、亜リン酸試薬3と反応させ、ホスホン酸エステル17を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、ヒドロキシル誘導体18を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト19を得た。
【０１３７】
反応スキーム4は、完全に保護された6-ホスホニルロードール27の合成を図示する。
【０１３８】
反応スキーム4
2009527629.tif 000054
【０１３９】
4-ブロモフタル酸無水物と8-ヒドロキシジュロリジンとの反応は、ベンゾフェノン20を産出し、3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチルと反応させ、ロードール類似体21を形成し、トリフルオロ酢酸/無水トリフルオロ酢酸でラクトン22に変換した。次いで、ラクトンは、O-ジメトキシトリチル-6-アミノヘキサノールと反応させ、DMT-中間体23を形成し、次いで、無水トリメチル酢酸と反応させ、完全に保護された類似体24を産出した。異性体は、シリカゲルで分離し、6-異性体を継続した。この類似体は、亜リン酸試薬3と反応させ、ホスホン酸エステル25を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、アルコール26を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト27を得た。
【０１４０】
反応スキーム4bは、3-アミノフェノール化合物の合成を図示する。
【０１４１】
反応スキーム4b
2009527629.tif 000055
【０１４２】
1-(4-インドフェニル)インドリン-4-オール（92）の合成は、反応スキーム4bにおいて提供される。Cs2CO3の存在下での1-フルオロ-4-ニトロベンゼンと4-メトキシ-1H-インドールの反応により、4-メトキシ-1-(4-ニトロフェニル)-1H-インドール（88）を得、H2/Pdで還元し、4-(4-メトキシ-1H-インドール-1-イル)ベンゼンアミン（89）を産出した。89のアミノ基を、ザントマイヤー反応を介して1-(4-インドフェニル)-4-メトキシ-1H-インドール（90）に変換し、ボロシアノヒリド（borocyanohyride）ナトリウムでの還元で、1-(4-インドフェニル)-4-メトキシインドリン（91）を得た。インドリン91をBBr3で脱メチル化し、望ましい92を提供した。
【０１４３】
反応スキーム5は、4-(4-ヨードフェニル)レゾルシノール（31）の合成を図示する。
【０１４４】
反応スキーム5
2009527629.tif 000056
【０１４５】
テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムの存在下で2,4-ジメトキシフェニルボロン酸および1-ブロモ-4-ニトロベンゼンは、4-(4-ニトロフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（28）を産出した。パラジウム触媒の存在下での28の水素化は、粗アミン（29）を産出し、精製をともなわずにジアゾ化し、KI溶液で処置し、望ましい4-(4-ヨードフェニル)-2,4-ジメトキシベンゼン（30）を産出した。ジメトキシ類似体（30）は、三臭化ホウ素で処置し、望ましい4-(4-ヨードフェニル)レゾルシノール（31）を産出した。
【０１４６】
反応スキーム6
2009527629.tif 000057
【０１４７】
反応スキーム6は、ホスホラミダイト39の合成を図示する。AlCl3の存在下での3-クロロフタル酸無水物と3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチルとの反応は、ベンゾフェノン類似体を形成し、結晶化により純粋な6-クロロ異性体32を産出した。この異性体は、31と反応させ、7'-(4-ヨードフェニル)置換フルオレセイン類似体33を産出し、無水トリメチル酢酸およびN-メチルイミダゾールで処置し、ラクトン34を与えた。次いで、ラクトンは、O-ジメトキシトリチル-6-アミノヘキサノールと反応させ、DMT-中間体35を形成し、次いで、無水トリメチル酢酸と反応させ、完全に保護された色素36を産出した。この色素中間体36は、亜リン酸試薬3と反応させ、ホスホン酸エステル37を産出した。TFA処置でのDMT-保護基の除去は、アルコール38を産出し、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト39を得た。
【０１４８】
有用な非対称性亜リン酸試薬41の合成は、反応スキーム7において示される。試薬41は、ホスホン酸部分を介するホスホラミダイトなどの反応性連結基の導入を可能にする。
【０１４９】
反応スキーム7
2009527629.tif 000058
【０１５０】
例において、ホスファイト41は、反応スキーム8において示されるようなホスホン酸置換フルオレセインホスホラミダイト46の調製に対して使用した。
【０１５１】
反応スキーム8
2009527629.tif 000059
【０１５２】
反応スキーム8は、ホスホラミダイト46の合成を図示する。メタンスルホン酸の存在下での4-ブロモフタル酸無水物とレゾルシノールとの反応は、ブロモフルオレセイン42の5-および6-異性体の混合物を産出し、無水トリメチル酢酸およびN-メチルイミダゾールで処置し、シリカゲルクロマトグラフィーの後に、ブロックされたエステルの純粋な6-異性体43を与えた。中間体43は、中間体41と反応させ、ホスホネート44を産出し、次いで、トリフルオロ酢酸で処置し、アルコール45を産出した。アルコールは、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト46を得た。
【０１５３】
ホスホン酸置換シアニン色素試薬の合成
反応スキーム9は、ホスホン酸置換シアニンホスホラミダイト53の合成を図示する。
【０１５４】
反応スキーム9
2009527629.tif 000060
【０１５５】
2,3,3-トリメチルインドレニンと1,4-ブタンスルトン（5.4 g、40 mmol）との反応は、望ましいインドリナム塩47を産出し、N,N'-ジフェニルホルムアミジンと反応させ、ホルムアミジン48を与えた。1-(スルホブチル)-2,3,3-トリメチル-5-ブロモインドリナム分子内塩49（J.Heterocycle Chem., 39:263-269 (2002)を参照されたい）との48の反応は、シアニン中間体50を与えた。中間体50は、ホスファイト41と反応させ、ホスホネート51を産出し、次いで、トリフルオロ酢酸で処置し、アルコール52を産出した。アルコールは、2-シアノエチルN,N,ジイソプロピルクロロホスホラミダイトでの処置により、望ましいホスホラミダイト53を得た。
【０１５６】
反応スキーム10は、本発明の固体支持体結合色素試薬59の調製を示す。
【０１５７】
反応スキーム10
2009527629.tif 000061
【０１５８】
反応スキーム10は、シアニン固体支持体結合色素試薬59の合成を図示する。1,3-プロパンスルトンとの5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドールの反応は、望ましいインドリナム塩54を提供し、N,N'-ジフェニルホルムアミジンと反応し、シアニン中間体55を与えた。中間体55は、ホスファイト41と反応させ、ジメトキシトリチル-ホスホネート56を産出し、次いで、トリフルオロ酢酸で処置し、モノメトキシトリチルホスホン酸中間体57を産出した。中間体57は、最初に無水コハク酸、次いで、PFP-TFAと反応させ、PFP-活性エステル58を産出した。次いで、PFPエステルは、アミノアルキル制御孔ガラス（NH2-CPG）と反応させ、望ましい固体支持体59を与えた。
【０１５９】
反応スキーム11は、本発明の活性化エステル-ホスホン酸置換シアニン色素試薬の調製を示す。
【０１６０】
反応スキーム11
2009527629.tif 000062
【０１６１】
反応スキーム11において、5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニンは、tert-ブチル6-ヨードヘキサノエートまたはヨウ化エチルのいずれかと反応させ、それぞれインドリナム塩60および61を与えた。次いで、化合物61は、塩化アセチルおよび無水酢酸の存在下でマロンアルデヒドビス(フェニルイミノ)一塩酸塩との反応によって中間体62へと変換した。61および62の縮合は、色素63を引き起こし、次いで、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムおよびN-エチルモルホリンの存在下でホスファイト3との反応によってホスホニル化し、ホスホン酸色素64を与えた。保護tert-ブチル基を除去するために、化合物64は、トリフルオロ酢酸で処置した。次いで、結果として生じた酸65は、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートとの反応によりPFPエステル66へと変換した。
【０１６２】
反応スキーム11において記載される合成経路は、表3において以下に記載される化合物67〜70を調製するために使用し得る。
【０１６３】
（表３）好ましいホスホン酸置換シアニンホスホラミダイト
2009527629.tif 000063
【０１６４】
反応スキーム12aは、活性化エステルの形式におけるホスホニル化シアニン色素試薬（80）の調製を示す。
【０１６５】
反応スキーム12a
2009527629.tif 000064
【０１６６】
反応スキーム12aにおいて、インドリニウム塩54を、3,4-ジブトキシ-3-シクロブテン-1,2-ジオンと反応させ、結果として生じた粗生成物を加水分解し、一置換中間体77を産出し、順にインドリニウム塩60と反応させて、非対称性色素78を得た。ホスホニル化色素79を、ホスファイト3との反応によって獲得した。色素79のカルボン酸エステル基を、トリフルオロ酢酸での処置によって脱保護し、次いで、PFP（ペンタフルオロフェニル）エステルへと変換し、望ましい活性化色素誘導体80を産出した。
【０１６７】
反応スキーム12bは、中間体85および86の合成を図示する。
【０１６８】
反応スキーム12b
2009527629.tif 000065
【０１６９】
中間体85および86は、反応スキーム11bにおいて概説される合成経路に従い、かつ化合物54および60をそれぞれ化合物85および86で置換することによって、活性化シアニン色素エステル87の合成に対する開始物質として使用し得る。化合物81（国際公開公報第02/085854号を参照されたい）と1-ブロモ-4-ニトロベンゼンとのパラジウム触媒反応により、ニトロフェニルインドレニン82を得た。続く転換は、水素化およびジアゾ化-ヨウ素化反応を含み、共通の中間体84を提供し、1,4ブタンスルトンまたはtert-ブチル6-インドヘキサノエートによってさらにアルキル化し、それぞれ化合物85および86を得た。
【０１７０】
選択されたローダミン色素の調製における付加的な試薬およびそれらの使用は、反応スキーム13および13aにおいて提供される。
【０１７１】
反応スキーム13
2009527629.tif 000066
【０１７２】
ピリジンにおける亜リン酸ジフェニルを用いた、tert-ブチル6-ヒドロキシヘキサノエート（J. Org. Chem., 49: 2147 (1984)）およびtert-ブチル4-ヒドロキシブチルカルバメート（J. Med. Chem. 49:4183-4195 (2006)）の反応により、望ましいホスファイト88を得た。
【０１７３】
反応スキーム13a
2009527629.tif 000067
【０１７４】
トルエンにおける8-ヒドロキシジュラリジン（hydroxyjulalidine）、4-ブロモフタル酸無水物の混合物を加熱し、ベンゾフェノンを得、メタンスルホン酸/プロピオン酸の存在下での8-ヒドロキシジュラリジンとのさらなる反応で、ブロモローダミン89aおよび89bの望ましい異性体混合物を得た。カラムクロマトグラフィーの後に、純粋な5-ブロモローダミンを回収し、Pd(Ph3P)4の存在下でホスファイト88と反応させ、ホスホニル化ローダミン90を産出した。最初にTFAで、次いでトリエチルアミン/メタノールでの90の処置により、ヘキサン酸置換ホスホニル化ローダミン91を得、PFPエステル92に活性化した。
【０１７５】
以下のセクションにおいて、スキームは、様々な色素の例示的な合成に対して提供される。当業者は、本発明が、これらの方法に限定されないことを高く評価すると考えられる。加えて、当業者は、提唱される反応スキームが、反応スキーム14〜19における望ましい生成物を得るために改変されなければならない可能性があることを高く評価すると考えられる。
【０１７６】
反応スキーム14
2009527629.tif 000068
【０１７７】
6-置換ホスホン酸クマリン色素は、反応スキーム14において示されるように、保護6-ブロモ-7-ヒドロキシ-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルボン酸（1）から開始して合成され得る（合成に対して、Baker, et al., Chem. Soc. 170-173 (1970)を参照されたい）。化合物1は、5-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)ペンタン-1-アミンと反応させ、DMT-アミド類似体2を産出する。亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)（3）との2の反応は、保護ホスホン酸置換色素4を提供する。次の段階において、ジメトキシトリチル保護基を除去し、アルコール5を産出し、保護ホスホラミダイト6へと変換し得る。
【０１７８】
8-置換ハロゲンクマリン類似体の合成は、国際公開公報第03023357号において開示された。8-ブロモクマリンラクトン7は、反応スキーム14において記載されるのと同じ方法で変換でき、反応スキーム14aにおいて示される等価のホスホラミダイト8を産出する。
【０１７９】
反応スキーム14a
2009527629.tif 000069
【０１８０】
反応スキーム15
2009527629.tif 000070
【０１８１】
ハロゲン化レゾルフィンラクトン9の合成は、国際公開公報第03/023357号において開示された。ここで手短に述べると、酸性MnO2の存在下でのニトロソベンゼン-1,3-ジオールと3-(3-ブロモ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロパン酸メチルとの反応は、レゾルフィン-N-オキシド（9）を産出し、ブロモ-レゾルフィンプロピオン酸10へと還元され得る（反応スキーム15）。この化合物は、ラクトン化されて化合物11を提供し、反応スキーム15において記載されるのと同様にホスホン酸ラクトン類似体12へと変換し得る。ブロモ酸（bromoacid）（10）は、ホスホン酸レゾルフィンホスホラミダイト13へと変換してもよい。
【０１８２】
反応スキーム16
2009527629.tif 000071
【０１８３】
生物学的物質への付着のための反応基をともなうジピロメテンボロンジフルオリド親複素環式化合物は、米国特許第4,774,339号において最初に開示された。ジピロメテンボロンジフルオリド生成物は、スルホン化、ニトロ化、アルキル化、アシル化、およびハロゲン化を含むがそれらに限定されない当業者にとって公知の化学技術によってその後の反応において修飾可能であることが報告された。置換基が、いくつかの場合において、化学的反応性官能基を導入するために、さらに修飾され得ることがさらに報告された。手短に、これらの置換ジピロメテンボロンジフルオリドは、反応スキーム16において示されるように調製される。置換ピロール-5-カルボキサルデヒドは、臭化水素酸の存在下で置換ピロールと反応させ、置換ジピロメテン中間体14を産出し、置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素15へと変換した。シンボルX1、X2、X3、およびX4は、色素のこのクラスに対して以前に記載されるのと同じ定義を有する。
【０１８４】
反応スキーム17
2009527629.tif 000072
【０１８５】
対象となるジピロメテンボロンジフルオリドホスホン酸色素は、反応スキーム17において示されるように合成され得る。4-ブロモピロール-2-カルボキサルデヒドおよび3-(2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-イル)プロパン酸から開始する反応は、ブロモ-中間体14cを産出し、BF3塩基でブロモジピロメテンボロンジフルオリド15cを産出する。色素15cは、ホスホン酸中間体を介してホスホン酸ジピロメテンボロンジフルオリド中間体16へとさらに変換してよく、R*は、固体支持体またはホスホラミダイトであり得る。
【０１８６】
別の態様において、中間体15cにおけるカルボン酸基は、ペンタフルオロフェニル-またはスクシンイミジルエステルなどの反応性部分へと変換し得る。
【０１８７】
ピロロメテン（pyrrolomethene）の合成に対して必要なピロール-2-カルボキサルデヒドは、市販されている、またはVilsmeyer Haakホルミル化によって対応するピロールから容易に調製される（R. M. Silverstein, E. E. Ryskiewicz and C. Willard. ORG. SYNTH. COLL VOL IV, page 831）。
【０１８８】
適当に置換されたピロール誘導体（反応スキーム17）は、市販されている、または例えば記載されるような当技術分野において公知の方法によって合成され得る（R. Elderfield, HETEROCYCLIC COMPOUNDS, vol. 1, ch. 6, THE CHEMISTRY OF PYRROLE AND ITS DERIVATIVES, Corwin (1950)；Silverstein, Ryskiewicz and Willard. ORG. SYNTH. COLL VOL IV, page 831およびKorostova et al., Russ. J. Org. Chem. 34, 1691 (1998)）。ピロール脂肪酸は、カルボキシまたは保護カルボキシ末端ホスホニウムまたはホスホン酸誘導体とのピロールアルデヒドのWitting反応（Witting and Schollkopf, Ber. 87: 1318 (1954)を参照されたい）によって最も都合良く調製される。
【０１８９】
ルテニウム（II）錯体ホスホン酸色素
混合リガンドルテニウム（II）錯体ホスホラミダイト色素の合成は、以前に報告されており、市販されているシス-ビス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム（II）脱水塩化物（Khan et al, Inorg. Chem. 38:3922-3925 (1999)）から開始する。シス-ビス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム（II）脱水塩化物（18a）および(2,2'-ビピリジン)-5-カルボン酸、5'-ブロモ-メチルエステル（17；Haino et al, Chem. Comm., 402-403 (2002)）で開始する。Khan et al手順は、反応スキーム18において示されるようにルテニウムビピリジルホスホラミダイト19の合成を可能にする。
【０１９０】
反応スキーム18
2009527629.tif 000073
【０１９１】
手短に、標準的な手段は、メチルエステル17をブロックされたホスホン酸ビピリジルアルコール18bへと変換し、Khan et alによって開示されるようなホスホラミダイトの導入が後に続く18aと反応させ、ホスホン酸ビピリジルルテニウムホスホラミダイト19を提供し得る。
【０１９２】
別の態様において、化合物19におけるカルボン酸基は、ホスホラミダイト基の代わりにペンタフルオロフェニル-またはスクシンイミジルエステルなどの反応性部分へと変換し得る。
【０１９３】
ポリメチンに基づくホスホン酸置換色素
ホスホン酸ポリメチンに基づく色素は、米国特許第2004/0260093号において開示される基本的な方法によって合成され得る。アプローチは、反応スキーム19において手短に概説される。
【０１９４】
反応スキーム19
2009527629.tif 000074
【０１９５】
Ac2Oの存在下での活性-CH化合物20bとの7-(ジエチルアミノ)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルバルデヒド（20a）の反応は、ブロモ-中間体21を提供し、リン酸試薬3との反応により、ブロックされたホスホン酸中間体22を提供する。この中間体は、通常の方法で、ホスホラミダイト試薬23へと変換し得る。
【０１９６】
関連態様において、中間体23におけるカルボン酸基は、ホスホラミダイト基の代わりにペンタフルオロフェニル-またはスクシンイミジルエステルなどの反応性部分へと変換し得る。
【０１９７】
さらに別の態様において、式XVIa〜XVIcを有する蛍光色素試薬において、化合物23上のホスホン酸基（Pz）は、選択的に化合物における2-オキソ-2H-クロメン基上に位置する。Pzのこの置換を有する化合物は、ハロゲン置換2-オキソ-2H-クロメン-3-カルバルデヒド試薬で開始することによって調製され得る。ハロゲン基は、sp2-混成炭素位のいずれか一つにおいてホスホン酸基で置換され得る。
【０１９８】
7-(アミノ)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルバルデヒドの付加的な類似体（20a）およびCH-活性ヘテロアリール類似体20bは、市販ベンダーから入手できるか、または当技術分野において公知の方法によって合成され得る。20aおよび20bの適当なハロゲン化類似体は、本明細書において記載される方法を使用して、ホスホン酸誘導体に変換し得る。CH-活性ピリジンおよび3H-インドール類似体は、市販されているか、または当技術分野において公知の方法によって合成され得る。式XVIa〜XVIcの化合物の合成に対して有用である特定の7-(アミノ)-2-オキソ-2H-クロメン-3-カルバルデヒドは、表5において示される。
【０１９９】
（表５）
2009527629.tif 000075
【０２００】
オリゴヌクレオチドプローブおよびその他の標識生物学的薬剤
別の局面において、本発明は、上記の蛍光色素の一つまたは複数が、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどに付着しているオリゴヌクレオチドプローブおよびその他の生物学的薬剤を提供する。上で指摘されるように、本発明は、核酸（ヌクレオチド、ヌクレオシド、DNA、RNA、PNA、固定核酸、オリゴヌクレオチドなど）、ペプチドまたはタンパク質、オリゴ糖、グリコシル化タンパク質、およびその他の生物学的薬剤の標識化において、広範な応用を見出す。付加的に、核酸は、修飾塩基（例えば、5-置換ピリミジン、3-置換プリン、置換デアザプリン、置換ピラゾール[3,4-d]ピリミジンなど）を含み得る。例えば、同時係属中の特許出願番号09/724,988および同09/447,936を参照されたい。本発明は、オリゴヌクレオチドならびにマイナーグルーブ結合剤、消光薬剤または消光剤、挿入剤、架橋基などの付着基を有する修飾オリゴヌクレオチドの標識化における有用性も見出す。
【０２０１】
本発明の一つの態様において、ホスホン酸色素は、少なくとも一つの基-L-RXを含み、RXは、共有結合Lによってフルオロフォアに付着する反応基である。特定の態様において、RXへホスホン酸色素を付着させる共有結合は、スペーサーとしての役目を果たす複数の介在原子を含む。反応性RX基をともなう色素は、適した反応性をともなう官能基を含むまたは含むように修飾される多種多様な有機または無機物質を蛍光標識し、-L-RYによって示される共役物質（RY）の化学的付着を引き起こす。反応基および官能基は、典型的には、共有結合を生成し得る求電子剤および求核剤である。典型的には、反応性色素と結合される物質との間の結合反応は、反応基RXの一つまたは複数の原子が、ホスホン酸色素を共役物質RYに付着させる新しい結合Lへと組み入れられることを引き起こす。
【０２０２】
求電子基と求核基との反応が共有結合を産出する結合を形成することに関与する官能基の選択された例は、以下に示される。
【０２０３】
求核基の例は、-NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC=(O)NHNH2、-OH、-COOH、または-SHを含む。求電子基は、活性化エステル、アクリルアミド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、アルデヒドまたはケトン、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジリジン、ボラネート（boranate）、カルボン酸、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホラミダイト、ハロゲン化シリル、スルホン酸エステル、およびハロゲン化スルホニルである。付加的に、スペーサーは、直鎖もしくは非環式部分、環式部分、芳香環、またはその組み合わせにおいて、ヘテロ原子を含み得る。
【０２０４】
共役物質は、核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド複合体、タンパク質、ペプチド、薬物、免疫グロブリン、受容体、毒素、有機小分子リガンド、酵素基質、ビタミン、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、固体基質、および本明細書において記載されかつ使用されるオリゴヌクレオチド合成のための固体支持体を含む。
【０２０５】
一つの態様において、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマーなどの生物学的ポリマーの複合体は、エネルギー転移ペアを形成するために、本発明の付加的な色素を含む二次蛍光または非蛍光色素でも標識される。
【０２０６】
さらに別の態様において、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマーなどの生物学的ポリマーの複合体は、本発明の色素に加えて二次蛍光または非蛍光色素でも標識され、後者の蛍光が消光されるエネルギー転移ペアを形成する。それらの天然の受容体または相補体へのこれらの複合体の結合は、蛍光における増加をともなう結合の立体構造変化または開裂を引き起こす。二重標識オリゴヌクレオチドプローブの好ましい選択された例は、5'-(MB)ny-FlA-オリゴヌクレオチド-FlB-3'、5'-FlA-オリゴヌクレオチド-FlB-MB-3'であり、FlAおよびFlBは、プローブがただ一つの消光剤および一つのフルオロフォアを含み得るという条件付で、フルオロフォアまたは消光剤のいずれかであり、MBは、マイナーグルーブ結合剤であり、かつnyは0または1である。一つの態様において、消光剤は非蛍光である。
【０２０７】
関連態様において、好ましい複合体プローブは、核酸標的を検出するための増幅方法、核酸多型および遺伝子発現分析において使用される。これらの方法は、米国特許第6,312,894号、国際公開公報第2004/018626号、Livak, KJ and Schmittgen, TD. Methods 25: 402-408 (2001)において開示される。
【０２０８】
マイナーグルーブ結合剤の例は、米国特許第5,801,155号において開示され、消光剤は米国特許6,699,975号および国際公開公報第02099141号において開示され、すべては全体として参照により含まれる。
【０２０９】
別の態様において、共役物質は、アルキニル結合（米国特許第5,047,519号；米国再発行特許第38,416号）、アミノアリル結合（米国特許第4,711,955号）、またはその他の結合などの、本発明の色素の付着のために付加的なリンカーまたはスペーサーを保有するように修飾されたものを含む、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸ポリマーである。
【０２１０】
一つの態様において、キサンテンホスホネート（XP）は、開裂可能リンカーを介して固体支持体に付着する。リンカー分子は、DMTr（または同様のもの）ブロッキング基で保護されたヒドロキシル基も含む。DMTr基の除去後、オリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル基へのヌクレオチドユニットの段階的な付着によって自動化オリゴヌクレオチド合成器で合成される。消光剤は、適当なホスホラミダイトをともなってまたは合成後に反応基を含む消光剤をともなって5'端に導入され、付着したキサンテンホスホネート部分（XP）および消光剤（Q）を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）を産出する。オリゴヌクレオチド合成と適合する固体支持体は、制御孔ガラス、ポリスチレン、プラスチック、ナイロン、金などを含む。
【０２１１】
一つの態様において、消光剤は、開裂可能リンカーを介して固体支持体に付着している。リンカー分子は、DMTr（4,4'-ジメトキシトリチル）（または同様のもの）ブロッキング基で保護されたヒドロキシル基も含む。DMTr基の除去後、オリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル基へのヌクレオチドユニットの段階的な付着によって自動化オリゴヌクレオチド合成器で合成される。XPフルオロフォアは、適当なホスホラミダイトをともなってまたは合成後に反応基を含むXPフルオロフォアをともなって3'端に導入され、付着した消光剤（Q）およびXP部分を有するODNを産出する。または、XPおよび消光剤（Q）に加えてMBを導入し、MB-Q-ODN-L-Fl複合体を産出する。これに関連して、MBの合成およびODNへのそれらの付着は周知であることが指摘される（例えば、米国特許第5,801,155号、米国特許出願第09/539,097号、および第9/141,764号を参照されたい。そのすべては、参照により本明細書に明確に組み入れられる）。
【０２１２】
反応スキーム20は、オリゴヌクレオチドに付着している保護ホスホニル化色素の脱保護を図示する。
【０２１３】
反応スキーム13
2009527629.tif 000076
【０２１４】
保護オリゴヌクレオチド-色素-ホスホン酸複合体（71および74）は、本発明のホスホラミダイトのいずれかで合成され得る。水酸化アンモニウム脱保護は、オリゴヌクレオチドホスホン酸-色素複合体（73および76）を産出する。
【０２１５】
新規の亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)（3）試薬は、本発明のその他の色素の合成において使用され得る。
【０２１６】
実施例
一般実験
すべての空気および水感受性反応は、アルゴンの微陽圧下で実行された。無水溶剤は、Aldrich（Milwaukee, WI）から獲得された。フラッシュクロマトグラフィーは、230〜400メッシュシリカゲルで行なわれた。融点は、開（open）CapillaRYにおけるMel-Temp融点装置で決定され、補正されなかった。要素解析は、Quantitative Technologies Inc. (Boundbrook, NJ)によって行なわれた。UV-可視吸収スペクトルは、UV-2100 (Shimadzu)またはLambda 2 (Perkin Elmer)スペクトロフォトメーターで200〜400-nm領域において記録された。1H NMRスペクトルは、Varian 300スペクトロフォトメーターで20℃で実行された。化学シフトは、Me4Siからのppmダウンフィールドにおいて報告される。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル60 F-254 (EM Reagents)アルミニウム支援プレートで実行された。
【０２１７】
以下の実施例において、化合物ナンバリングは、反応スキーム1〜13において提供されるナンバーを指す。
【０２１８】
実施例1
亜リン酸ビス(4-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ブチル)（3）
この実施例は、反応スキーム1において示されるような新しいホスホニル化試薬3の合成を実証する。
【０２１９】
250 mLフラスコは、磁気攪拌棒、化合物1（J. Org. Chem. 62(20): 6712-6713 (1997)を参照されたい）（9.455 g、51 mmol）、ピリジン（100 mL）、および亜リン酸ジフェニル（2）（7.035 g、25.5 mmol）を入れられた。混合物は、室温で1時間攪拌され、次いで、ロータリーエバポレーターで濃縮され、酢酸エチル（200 mL）で希釈され、10％クエン酸（2×150 mL）で洗浄された。水相は、酢酸エチル（100 mL）で再抽出され、有機相は、組み合わせられ、ブライン（100 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、真空で濃縮された。残留物は、シリカでクロマトグフィーにより分離され、第一にフェノールを分離するために酢酸エチルで、第二に望ましいホスファイト3を溶出するためにアセトンで溶出した。純粋な生成物画分の濃縮は、粘性液体として8.0 g（75％）のホスファイト3を与えた。
2009527629.tif 000077
【０２２０】
実施例2
この実施例は、反応スキーム2において示されるような保護4',4,5,6,7-ペンタクロロ-7'-ホスホノ-フルオレセイン類似体11の合成を例証する。
【０２２１】
化合物5
磁気攪拌棒を備えた0.5 L丸底フラスコは、4-ブロモレゾルシノール（3.62 g、19.2 mmol）、化合物4（8.264 g、16.0 mmol、国際公開公報第03/023357号において記載されるように調製される）、およびトリフルオロ酢酸（50 mL）を入れられた。メタンスルホン酸（50 mL）が添加され、結果として生じた混合物は、3時間＋80℃で攪拌された。結果として生じた赤色溶液は、冷却され、氷（〜400 g）に注がれた。獲得された固体は、焼結ガラス漏斗での濾過によって収集され、水（3×40 mL）で洗浄され、水（300 mL）およびトリエチルアミン（10 mL）の混合物に溶解された。溶液は、攪拌しながら沸点まで加熱され、次いで、冷却され、水性塩酸を添加することによってpH〜2まで酸性化された。結果として生じた上質の懸濁液は、酢酸エチルで抽出され、ブラインで2回洗浄され、MgSO4上で乾燥された。濃縮は、縮合反応の間に形成されたその脱臭素化類似体が混入された粗生成物5を与えた。混合物は、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離され、ジクロロメタンにおける3％トリエチルアミンにおけるメタノールの勾配（0〜15％）で溶出した。純粋な化合物5（トリエチルアンモニウム塩）を含む画分は、収集されかつ濃縮された。残留物は、1 N塩酸に懸濁され、酢酸エチルで抽出された。有機溶液は、分離され、ブラインで2回洗浄され、MgSO4上で乾燥され、濾過され、真空で濃縮かつ乾燥され、純粋な望ましい生成物5（5.37 g、51％）を与えた。
【０２２２】
化合物7
0.5 L丸底フラスコは、化合物5（2.1 g、2.29 mmol）、トリフルオロ酢酸（10 mL）、CH2Cl2（10 mL）、および無水トリフルオロ酢酸（10 mL）を入れられた。10分間室温で保たれた後、溶液は濃縮された。残留TFAは、ジクロロメタンとの共蒸発によって除去された。真空下での乾燥は、オフホワイト固体としてラクトン6を与えた。DMF（30 mL）における6-アミノヘキサノール（0.75 g、6.44 mmol）およびトリエチルアミン（2.1 mL、1.53 g、15.0 mmol）の溶液が、ラクトンに添加され、結果として生じた混合物は、20分間攪拌された。トリエチルアミン（4.2 mL、3.03 g、30.0 mmol）が添加され、その後塩化ジメトキシトリチル（13.47 g、9.625 mmol）が続いて添加された。反応混合物は、オーバーナイトで攪拌され、酢酸エチル（300 mL）で希釈され、10％クエン酸（100 mL）および水（4×30 mL）で洗浄された。有機相は、分離され、Na2SO4上で乾燥され、真空で濾過されかつ濃縮された。残留物は、シリカでクロマトグラフィーで分離され、酢酸エチルで溶出し、赤色固体として2.2 g（91％）の望ましい生成物7を与えた。
【０２２３】
化合物9
25 mLフラスコは、磁気攪拌棒、化合物7（2.10 g、1.99 mmol）、DMF（5.0 mL）、トリエチルアミン（0.50 mL、0.362 g、3.58 mmol）、およびホスファイト3（0.873 g、3.15 mmol）を入れられた。アルゴンは、2分間溶液を介してバブリングされ、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（0.30 g、0.26 mmol）が添加された。反応混合物は、3時間80℃で攪拌された。各々のトリエチルアミンの別の部分（0.25 mL、0.181 g、1.8 mmol）およびホスファイト3（0.426 g、1.57 mmol）、およびPd(PPh3)4（0.15 g、0.13 mmol）が、反応を完了するために添加され、8を産出した。さらに1時間80℃で攪拌された後、反応は、冷却され、トリエチルアミン（2.23 mL、1.618 g、16.0 mmol）、1-メチルイミダゾール（0.1 mL、0.104 g、1.26 mmol）、および無水トリメチル酢酸（1.622 mL、1.49 g、4.0 mmol）で処置された。反応は、オーバーナイトで室温で進行することを可能にされ、次いで、濃縮された。獲得された油は、酢酸エチル（200 mL）に溶解され、飽和重炭酸ナトリウム（50 mL）、ブライン（2×30 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、乾燥剤から濾過されかつ濃縮された。残留物は、シリカでクロマトフィーで分離され（溶出液、酢酸エチルにおける30％DCM）、非晶質固体として純粋な望ましい生成物9（1.27 g、0.81 mol、収率＝41％）を与えた。
【０２２４】
化合物10
メタノール（50 mL）における化合物9（1.20 g、0.83 mmol）の溶液は、トリフルオロ酢酸（0.5 mL、0.74 g、6.5 mmol）で処置された。室温で1時間保たれた後、溶液は、トリエチルアミン（1.0 mL、0.726、7.2mol）を添加することによって中和され、次いで、真空で濃縮され、酢酸エチル（100 mL）に再溶解された。溶液は、10％クエン酸（30 mL）、ブライン（2×30 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、乾燥剤から濾過されかつ濃縮された。酢酸エチルで溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィー、その後の純粋な生成物画分の濃縮は、非晶質固体として0.37 g（38％）の化合物10を与えた。
【０２２５】
化合物11
無水CH2Cl2（10 mL）における化合物10（0.35 g、0.28 mmol）、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（53 mg、0.31 mmol）の溶液に、2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.169 g、0.56 mmol）が添加された。反応は、2時間攪拌され、CH2Cl2（80 mL）で希釈された。溶液は、飽和水性重炭酸ナトリウム（30 mL）、ブライン（10 mL）で洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。抽出物は、濾過されかつ濃縮された。粗生成物は、ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（50〜100％）を使用して、CH2Cl2/Et3N、その後にCH2Cl2で前洗浄されたシリカゲルでクロマトフィーで分離され、白色非晶質固体として望ましいホスホラミダイト11（0.22 g、54％）を与えた。
【０２２６】
実施例3
保護4-クロロ-6-ホスホノ-ベンゾフルオレセイン類似体（19）
この実施例は、反応スキーム3において概説されるような保護4'クロロ-6-ホスホン酸ベンゾフルオレセイン類似体19の合成を例証する。
【０２２７】
化合物12
30 mLの無水1,2-ジクロロエタンにおける4-ブロモフタル酸無水物（2.27 g、10 mmol）の懸濁液に、3.3 g（25 mmol）のAlCl3、その後に3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチル（国際公開公報第03023357号）（2.3 g、10 mmol）が添加された。混合物は、数分間攪拌され、黄褐色溶液を与えた。反応は、30分間還流され、次いで、冷却されかつ濃縮された。結果として生じたゼラチン状物質は、冷1 N塩酸（70 mL）と酢酸エチル（100 mL）との間で分配された。有機相は、飽和NaClで洗浄され、Na2SO4上で乾燥されかつ濃縮された。結果として生じた油は、ジクロロメタンに懸濁されかつ冷却され、結晶化を起こした。結晶は、濾過によって収集され、冷ジクロロメタンで洗浄されかつ乾燥され、2.3 g（51％）のベンゾフェノン12の異性体混合物を与えた。
【０２２８】
化合物13
1,3-ジヒドロキシナフタレン（4.0 g、25 mmol）、ベンゾフェノン12（7.5 g、16.3  mmol）、およびトリフルオロ酢酸（20 mL）は、組み合わせられ、溶液が形成されるまで攪拌された。この溶液に、メタンスルホン酸（20 mL）が添加され、反応は、7時間80℃で加熱された。反応は、冷却され、氷および水の混合物に注がれた。沈殿固体は、濾過によって収集され、水で洗浄された。真空での乾燥は、9.0 g（97％）の色素13（二つの異性体の混合物）を与えた。
【０２２９】
化合物14
トリフルオロ酢酸（20 mL）の化合物13（2.75 g、4.84 mmol）の溶液に、20 mLの無水トリフルオロ酢酸が添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、蒸発させ、残留物は、酢酸エチルとの共蒸発によって乾燥された。固体残留物は、酢酸エチル（25 mL）に懸濁され、濾過された。少量の酢酸エチル/ヘキサン混合物（50％/50％）での洗浄および真空下での乾燥は、オフホワイト固体として2.35 g（75％）の望ましいラクトン14を与えた。
【０２３０】
化合物16
25 mLの無水DMFにおける6-(O-DMT)-ヘキシルアミン（3.07 g、7.25 mmol）（Tetrahedon Letters (2004), 45(2), 317-320）およびトリエチルアミン（1.5 mL, 10.8 mmol）の溶液に、2.3 g（3.6 mmol）の固体ラクトン14が添加された。1時間攪拌した後、N-メチルイミダゾール（4 mL、50 mmol）および無水トリメチル酢酸（4 mL、19.7 mmol）が添加された。反応は、オーバーナイトで進行することを可能にされた。DMFは、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、結果として生じた油は、水と酢酸エチルとの間で分配された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤蒸発の後に獲得された物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（30〜50％）で溶出し、過剰なDMT副生成物（最速で動く構成要素）を除去し、異性体を分離した。少ない5-異性体は、最初に溶出され、その後多い6-異性体が続いて溶出された。6-異性体を含む画分は、組み合わせられかつ濃縮された。真空下での乾燥は、淡黄色非晶質固体として1.77 g（43％）の化合物16を与えた。
【０２３１】
化合物17
化合物16（2.5 g、2.2 mmol）、ホスファイト3（1.63 g、3.9 mmol）、およびトリエチルアミン（0.82 mL、5.9 mmol）は、DMF（1.5 mL）およびトルエン（1.5 mL）の混合物に溶解された。この溶液に、0.163 g（0.14 mmol）のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)が添加された。混合物は、触媒を溶解するために〜50℃まで加温され、80℃の油バスへと置かれた。攪拌しながらの加熱は、50分間継続された。反応は、冷却され、酢酸エチル（30 mL）で希釈された。この混合物は、シリカゲルカラム上にロードされ、酢酸エチルで溶出された。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、淡黄色非晶質固体として2.2 g（68％）の望ましいホスホネート17を与えた。
【０２３２】
化合物18
MeOH（30 mL）およびCH2Cl2（60 mL）の混合物における化合物17（2.1 g、1.43 mmol）の溶液に、0.6 mLのトリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は、トリエチルアミン（0.9 mL）で中和されかつ濃縮された。結果として生じた油は、シリカでクロマトフィーで分離され、第一に酢酸エチルで、第二に酢酸エチルにおける5％MeOHで溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮されかつ乾燥され、淡黄色非晶質固体として1.5 g（90％）の化合物18を与えた。
【０２３３】
化合物19
2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.57 g、1.9 mmol）は、20 mLの無水CH2Cl2における化合物18（1.4 g、1.2 mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.27 g、1.56 mmol）の溶液に、滴下形式で添加された。オーバーナイトで室温で保たれた後、反応は、酢酸エチルで希釈され、飽和NaHCO3で洗浄された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、油へと濃縮された。この物質は、トリエチルアミンおよび酢酸エチルの混合物、その後に酢酸エチルで前洗浄され、酢酸エチルで溶出したシリカでクロマトフィーで分離された。生成物を含む画分の濃縮および真空下での乾燥は、淡黄色非晶質固体として1.2 g（73％）の望ましいホスホラミダイト19を与えた。
【０２３４】
実施例4
この実施例は、反応スキーム4において概説されるような保護6-ホスホン酸ロードール類似体27の合成を例証する。
【０２３５】
化合物23
4-ブロモフタル酸無水物（6.47 g、28 mmol）は、7 mLの無水DMFに溶解された。この溶液に、19 mLのトルエン、その後に3.58（18.9 mmol）の8-ヒドロキシジュロリジンが添加された。反応は、30分間110℃で攪拌しながら加熱され、次いで、室温まで冷却され、濃縮された。獲得された物質は、水とCH2Cl2（200 mL）との間で分配された。有機相は、Na2SO4上で乾燥され、濃縮され、暗黒色油性物質を与えた。それは、シリカでクロマトフィーで分離され、CH2Cl2、その後にCH2Cl2における5％MeOHで溶出した。生成物を含む画分は、組み合わせられかつ濃縮された。真空下での乾燥は、黄色非晶質固体として7.5 g（95％）の望ましいベンゾフェノン20（異性体の混合物）を与えた。
【０２３６】
化合物21
化合物20（4.16 g、10 mmol）および3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチル（2.31 g、10 mmol）は、21 mLのメタンスルホン酸に懸濁され、固体を溶解するためにわずかに加熱された。溶液が獲得された場合、それは、油バスへと置かれ、1時間80℃で加熱された。反応は、冷却され、氷（300 mL）と混合され、13.5 gのNaOHで処置された。結果として生じた混合物は、65℃まで加熱され、ゆっくりと室温まで冷却することを可能にされた。濃塩酸（2 mL）が、pH 2まで溶液を酸性化するために添加された。沈殿物質は、濾過によって収集され、水で洗浄された。P2O5上の50℃での真空下での乾燥は、暗赤色固体として5.3 g（89％）の望ましい色素21（異性体の混合物）を与えた。
【０２３７】
化合物24
30 mLのトリフルオロ酢酸における化合物21（3.0 g、5 mmol）の溶液に、30 mLの無水トリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は濃縮され、残留物はCH2Cl2（2×100 mL）との共蒸発によって乾燥され、粘性シロップとしてラクトン22を与えた。それは、40 mLのCH2Cl2に溶解され、10 mLのCH2Cl2におけるO-DMT-6-アミノヘキサノール（2.5 g、5.9 mmol）およびトリエチルアミン（10 mL）の溶液で処置された。2時間室温で攪拌された後、反応に、トリエチルアミン（3 mL）、1-メチルイミダゾール（3 mL）、および6 mLの無水トリメチル酢酸が添加された。反応を早めるために、混合物は、油型まで濃縮され、8時間45℃で加熱された。水および酢酸エチルが、反応の分配構成要素に添加された。有機相は、10％クエン酸、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤蒸発の後に獲得された物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける50％酢酸エチルで溶出し、過剰なDMT副生成物（最速で動く構成要素）を除去し、異性体を分離した。少ない5-異性体は、最初に溶出され、その後多い6-異性体が続いて溶出された。純粋な6-異性体を含む画分は、組み合わせられかつ濃縮された。真空下での乾燥は、淡桃色非晶質固体として1.1 g（20％）の化合物24を与えた。
【０２３８】
化合物25
化合物24（0.8 g、0.72 mmol）、7（0.6 g、1.7 mmol）、およびトリエチルアミン（0.3 mL、2.1 mmol）は、DMF（0.7 mL）およびトルエン（0.7 mL）の混合物に溶解された。この溶液に、70 mg（0.06 mmol）のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)が添加された。混合物は、触媒を溶解するためにわずかに加温され（〜50℃）、80℃の油バスへと置かれた。攪拌しながらの加熱は、30分間継続された。反応は、冷却され、酢酸エチル（10 mL）で希釈された。この混合物は、シリカゲルカラム上へロードされ、最初は副生成物を除去するために酢酸エチルで、その後、生成物を溶出するためにCH2Cl2における5％MeOHで溶出された。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、薄桃色粘性シロップとして0.9 g（88％）の望ましいホスホネート25を与えた。
【０２３９】
化合物26
MeOH（15 mL）およびCH2Cl2（30 mL）の混合物における化合物25（0.9 g、0.63 mmol）の溶液に、0.3 mLのトリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は、トリエチルアミン（0.45 mL）で中和され、濃縮された。獲得された赤色残留物は、シリカでロマトフィーで分離され、ジクロロメタンにおけるMeOHの勾配（5〜15％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮かつ乾燥され、淡黄色非晶質固体として0.5 g（71％）の化合物26を与えた。
【０２４０】
化合物27
2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.21 g、0.7 mmol）は、10 mLの無水CH2Cl2における化合物26（0.45 g、0.45 mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（90 mg、1.56 mmol）の溶液に、滴下形式で添加された。3時間室温で保たれた後、反応は、酢酸エチルで希釈され、飽和NaHCO3で洗浄された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、油へと濃縮された。この物質は、少量の酢酸エチルから無水ペンタンへと沈殿され、初めは油性沈殿物を与え、ペンタンの新鮮な部分での研和により最終的に固体化された。固体は、濾過によって収集され、真空で乾燥され、薄桃色非晶質固体として0.4 g（74％）のホスホラミダイト27を与えた。
【０２４１】
実施例5
この実施例は、反応スキーム5および6において提供されるようなレゾルシノール31および色素試薬39の調製を例証する。
【０２４２】
4-(4-ニトロフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（28）
600 mLの1,4-ジオキサンにおける4-ブロモニトロベンゼン（24.37 g、120.63 mmol）および2,4-ジメトキシフェニルボロン酸（20.95 g、115.07 mmol）の脱気溶液に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（8.0g、7 mmol）、その後に120 mLの水における炭酸カリウム（17.06 g、124.3 mmol）の溶液が添加された。反応は、24時間80℃で加熱しながら攪拌され、冷却され、濾過され、濃縮された。結果として生じた物質は、酢酸エチルと水との間で分配された。有機層は、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、MgSO4上で乾燥され、濃縮された。結果として生じた固体物質は、ヘキサン-酢酸エチルから再結晶化され、黄色結晶として23.56 gの望ましい生成物28を与えた。
2009527629.tif 000078
【０２４３】
4-(4-アミノフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（29）
300 mLのTHFにおける28（23.2 g、89.5 mmol）の溶液は、8時間2.0 gの10％ Pd/Cの存在下で50 psiで水素化された。触媒は、Celiteを介する濾過によって除去された。濾液は濃縮され、粗アミン29（20.8 g）を与え、付加的な精製をともなわずに次の反応において使用された。
2009527629.tif 000079
【０２４４】
4-(4-ヨードフェニル)-2,4-メトキシベンゼン（30）
80 mLの1,4-ジオキサンにおける粗アミン29（20.8 g）の溶液に、濃HCl（347 mL）および氷（172 g）の混合物が添加された。反応は、氷/水バスに置かれ、0〜3℃まで冷却することを可能にされた。420 mLの水におけるNaNO2の溶液は、20分にわたって攪拌しながら添加され、攪拌は、さらに1時間継続された。ヨウ化カリウム（150.5 g）の溶液は、10分にわたって攪拌しながら添加された。反応は、室温まで加温することを可能にされ（〜2時間）、酢酸エチル（1.2 L）で抽出された。有機層は、飽和NaHCO3、Na2SO3、およびブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。粗生成物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける20％酢酸エチルで溶出した。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、15.83 g（51.3％）の30を与えた。
2009527629.tif 000080
【０２４５】
4-(4-ヨードフェニル)レゾルシノール（31）
-70℃の150 mLの無水ジクロロメタンにおける30（15.83 g、46.54 mmol）の溶液に、13.63 mL（144.3 mmol）の三臭化ホウ素が滴下形式で添加された。40分後、溶液は、室温まで加温することを可能にされ、500 gの氷へ注ぐことによってゆっくりと急冷された。混合物は、1 N（〜390 mL）でpH 〜10まで希釈され、酢酸エチル（300 mL）で抽出された。有機層は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤の蒸発および真空下での乾燥は、淡桃色固体として純粋な31（14.4 g、99％）を与えた。
2009527629.tif 000081
【０２４６】
6-クロロ-2-({3-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-5-[2-(メトキシカルボニル)エチル]フェニル}カルボニル)安息香酸（32）
60 mLの無水1,2-ジクロロエタンにおける3-クロロフタル酸無水物（3.7 g、20 mmol）（J. Org. Chem., 1987, 52, 129-134）の溶液に、6.6 g（50 mmol）のAlCl3、その後に4.6 g（20 mmol）の3-(3-クロロ-2,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸メチル（国際公開公報第03/023357号）が添加された。反応は、30分間還流で加熱され、冷却されかつ濃縮された。結果として生じたゼラチン状物質は、冷2 N HCl（100 mL）と酢酸エチル（100 mL）との間で分配された。有機層は、1 N HCl、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、濃縮され、油性物質（6-および2-クロロ異性体の混合物）を与えた。油は、ジクロロメタン（〜40 mL）に溶解され、手短に超音波分解され（超音波バス）、結晶化を起こした。混合物は、冷却され（氷/水バス）、30分間結晶化することを可能にされた（延長された結晶化時間は、望ましくない2-クロロ異性体の共結晶化を引き起こすと考えられる）。結晶は、濾過によって収集され、冷ジクロロメタンで洗浄された。真空下での乾燥は、4.01 gの望ましい6-クロロ異性体32を与えた。
2009527629.tif 000082
【０２４７】
3-(7,13-ジクロロ-16-(4-ヨードフェニル)-12,15-ジヒドロキシ-1-オキソスピロ[3-ヒドロイソベンゾフラン-3,9'-キサンテン]-11-イル)プロピオン酸（33）
TFA（12 mL）およびメタンスルホン酸（12 mL）の混合物における32（2.45 g、7.8 mmol）および31（2.48 g、6.0 mmol）の懸濁液は、3時間攪拌しながら80℃で加熱された。反応は、冷却され、水（200 mL）で希釈された。結果として生じた固体は、濾過によって収集され、水で洗浄され、乾燥された。粗物質は、酢酸エチル/ヘキサンから結晶化され、橙色固体として3.2 g（78％）の望ましい色素33を与えた。
2009527629.tif 000083
【０２４８】
化合物34
30 mLの無水DMFにおける色素酸33（3.4 g、5 mmol）の溶液に、3 mLの無水トリメチル酢酸、その後に3 mLのN-メチルイミダゾールが添加された。1時間後、反応は、濃縮され、酢酸エチルに再溶解された。溶液は、10％クエン酸、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤の蒸発は、粗生成物を与え、ヘキサンにおける50％酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製された。純粋な生成物画分の濃縮は、オフホワイト固体として1.6 g（43％）の望ましいラクトン34を与えた。
2009527629.tif 000084
【０２４９】
化合物36
15 mLの無水DMFにおけるラクトン34（1.6 g、2.16 mmol）の溶液は、20 mLの無水DMFにおける6-(O-DMT)-ヘキシルアミン（1.1 g、2.6 mmol）（Tetrahedron Letters (2004), 45(2), 317-320）およびトリエチルアミン（0.3 mL）の冷（0℃、氷/水バス）溶液に添加された。2時間0℃で攪拌された後、反応は、室温まで加温され、1 mLの無水トリメチル酢酸および0.44 mL N-メチルイミダゾールで処置された。反応は、2時間進行することを可能にされ、次いで、濃縮された。残留物は、酢酸エチル（〜75 mL）に溶解され、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤は、蒸発させ、結果として生じた物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、2:1酢酸エチル:ヘキサンで溶出した。純粋な生成物画分の濃縮は、非晶質白色固体として2.3 g（85％）の36を与えた。
2009527629.tif 000085
【０２５０】
化合物37
4 mLのトルエンにおける36（2.3 g、1.85 mmol）、亜リン酸ビス-(4-トリフルオロアセトアミドブチル)（1.15 g、1.5 eq.）、トリエチルアミン（0.75 mL）の溶液に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（130 mg、0.11 mmol）が添加された。反応は、1時間80℃で攪拌され、室温まで冷却された。混合物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおけるアセトンの勾配（40〜60％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮され、真空下で乾燥され、白色非晶質固体として2.66 g（94％）の望ましいホスホネート37を与えた。
2009527629.tif 000086
【０２５１】
化合物38
ジクロロメタン（50 mL）およびメタノール（50 mL）の混合物における37（2.4 g、1.56 mmol）の溶液に、0.6 mLのTFAが添加された。溶液は、30分間室温で保たれ、0.9 mLのトリエチルアミンを添加することによって中和された。反応は濃縮され、シリカでクロマトフィーで分離され、酢酸エチルにおけるメタノールの勾配（0〜5％）で溶出した。純粋な生成物画分の濃縮は、白色非晶質固体として1.86 g（97％）の化合物38を与えた。
2009527629.tif 000087
【０２５２】
化合物39
ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.26 g、1.5 mmol）は、20 mLの無水ジクロロメタンにおける38（1.79 g、1.46 mmol）の溶液に添加された。反応は、テトラゾリドを溶解するために5分間攪拌された。結果として生じた溶液に、0.7 g（2.3 mmol）の2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトが添加された。5時間攪拌された後、反応は、酢酸エチル（100 mL）で希釈され、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。抽出物は、濃縮され、少量の酢酸エチル（〜2 mL）に再溶解された。エーテル（10 mL）が、生成物を沈殿させるために添加された。混合物は、無水ヘプタン（200 mL）でさらに希釈され、結果として生じた乳液は、静置することを可能にされた（〜10分）。液体相を静かに移した後で獲得された残留物は、真空下で乾燥され、オフホワイト非晶質固体として1.69 g（81％）のホスホラミダイト39を与えた。
2009527629.tif 000088
【０２５３】
実施例6
この実施例は、代替のホスホニル化試薬の例として非対称性モノ-DMT-モノ-トリフルオロアセトアミドブチル亜リン酸試薬41の調製を例証する。反応の略図は、反応スキーム7において提供される。
【０２５４】
化合物41
40 mLの無水ピリジンにおけるモノ-DMT-1,6-ヘキサンジオール（40）（Nucleic Acids Research (1993), 21(1), 145-150）（4.0 g、9.5 mmol）および化合物5（1.76 g、9.5 mmol）の溶液に、2.5 g（〜10 mmol、10〜15％フェノールを含む）の亜リン酸ジフェニルが添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、濃縮され、酢酸エチル（100 mL）に溶解された。溶液は、10％クエン酸、飽和NaClで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。濃縮後に獲得された物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（60〜100％）で溶出した。ビス-DMT副生成物は、最初に溶出され、望ましいモノ-DMT-モノ-トリフルオロアセトアミド誘導体41が続いて溶出された。適当な画分は、組み合わせられ、濃縮され、真空で乾燥され、無色粘性液体として2.0 g（32％）のホスファイト41を与えた。
2009527629.tif 000089
【０２５５】
実施例7
この実施例は、反応スキーム8において概説される方法に従って、ヒドロキシヘキシル-6-ホスホノフルオレセインおよびそのホスホラミダイト36の調製を例証する。
【０２５６】
化合物42
50 mLのメタンスルホン酸における4-ブロモフタル酸無水物（6.8 g、30 mmol）およびレゾルシノール（8.8 g、80 mmol）の懸濁液は、5時間80℃で攪拌しながら加熱された。反応は、冷却され、氷および水の混合物（300 mL）へと注がれた。固体沈殿物は、濾過によって収集され、水で洗浄された。真空下での乾燥は、橙色固体として12.1 g（98％）のブロモフルオレセイン42（5-および6-異性体の混合物）を与えた。
【０２５７】
化合物43
化合物42（4.1 g、10 mmol）、1-メチルイミダゾール（1 mL）、および無水トリメチル酢酸（8 mL、40 mmol）の溶液は、2時間50℃で加熱された。TLC分析（ヘキサンにおける20％EtOAc）は、二つの新しい生成物（5-および6-異性体）への開始物質の完全な変換を示した。MeOH（5 mL）は、過剰な無水物を急冷するために添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、濃縮され、酢酸エチルに再溶解された。溶液は、10％クエン酸、飽和NaHCO3、飽和NaClで洗浄され、Na2SO4上で乾燥された。溶剤蒸発の後、混合物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ヘキサンにおける20％酢酸エチルで溶出した。画分の三つの群が、収集された。第一の群は、より速く溶出する5-異性体を含んだ。第二の群は、5-および6-異性体の混合物であり、画分の第三の群は、純粋な6-異性体、より遅く溶出する生成物（化合物43）を含んだ。溶剤の蒸発および真空下での乾燥は、1.6 gの5-異性体、1.6 gの異性体混合物、および1.9 g（33％）の望ましい6-異性体（化合物43）を与えた。
2009527629.tif 000090
【０２５８】
化合物44
3 mLのトルエンにおける化合物43（1.16 g、2.0 mmol）、化合物41（1.9 g、2.9 mmol）、トリエチルアミン（0.8 mL、5.75 mmol）、およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（140 mg、0.12 mmol）の溶液は、1時間80℃で加熱された。反応は、冷却され、20 mLのヘキサンにおける66％酢酸エチルで希釈された。沈殿臭化トリエチルアンモニウムは、濾過された。濾液は、シリカゲルカラムにロードされた。ヘキサンにおける酢酸エチルの勾配（50〜80％）での溶出、その後の濃縮および真空での乾燥は、非晶質白色固体物質として1.95 g（85％）のホスホネート44を与えた。
2009527629.tif 000091
【０２５９】
化合物45
MeOH（30 mL）およびCH2Cl2（60 mL）の混合物における化合物44（1.85 g、1.6 mmol）の溶液に、0.6 mLのトリフルオロ酢酸が添加された。30分間室温で保たれた後、反応は、トリエチルアミン（1 mL）で中和され、濃縮された。獲得された赤色残留物は、シリカでクロマトフィーで分離され、酢酸エチルにおけるMeOHの勾配（0〜5％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮かつ乾燥され、非晶質白色固体として1.05 g（77％）の化合物45を与えた。
2009527629.tif 000092
【０２６０】
化合物46
2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.57 g、1.9 mmol）は、20 mLの無水CH2Cl2における化合物45（1.0 g、1.18 mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（0.2 g、1.17 mmol）の溶液に、滴下形式で添加された。オーバーナイトで室温で保たれた後、反応は、酢酸エチルで希釈され、飽和NaHCO3で洗浄された。有機相は、ブラインで洗浄され、Na2SO4上で乾燥され、濃縮された。残留物は、、トリエチルアミンおよび酢酸エチルの混合物、その後に酢酸エチルで前洗浄され、酢酸エチルで溶出した、シリカでクロマトフィーで分離された。生成物を含む画分の濃縮および真空下での乾燥は、白色非晶質固体として0.72 g（58％）の望ましいホスホラミダイト46を与えた。
【０２６１】
実施例8
この実施例は、反応スキーム9において概説される方法を使用するホスホン酸シアニンホスホラミダイト（53）の合成を例証する。
【０２６２】
1-(スルホブチル)-2,3,3-トリメチルインドリナム、分子内塩（47）
2,3,3-トリメチルインドレニン（6.3 g、40 mmol）および1,4-ブタンスルトン（5.4 g、40 mmol）の混合物は、5時間100℃で加熱された。結果として生じた暗黒色半固体は、生成物結晶化を起こすために（inforce）、ジクロロメタンに懸濁され、冷却された。結晶は、濾過によって収集され、冷ジクロロメタンおよびエーテルで洗浄された。真空下での乾燥は、淡桃色含水固体として9.9 g（83％）の望ましいインドリナム塩47を与えた。
【０２６３】
1-(スルホブチル)-2,3,3-トリメチル-5-ブロモインドリナム、分子内塩（49）は、5-ブロモ-2,3,3-トリメチルインドレニンから開始する非臭素化類似体に対して上に記載されるように調製された（J. Heterocycle Chem. 2002, 39(2), 263-269）。
【０２６４】
化合物48
25 mLの無水酢酸における47（6.0 g、20.3 mmol）およびN,N'-ジフェニルホルムアミジン（4.0 g、20.4 mmol）の懸濁液は、1.5時間攪拌しながら110℃で加熱された。結果として生じた溶液は、室温まで冷却され、生成物結晶化のためにオーバーナイトで放置された。結晶は、濾過によって収集され、少量のジクロロメタンおよび多量のエーテルで洗浄された。真空下での乾燥は、橙赤色固体として6.66 g（71％）の化合物48を与えた。
【０２６５】
化合物50
7 mLの無水酢酸における49（3.7 g、9.9 mmol）および48（4.0 g、10 mmol）の懸濁液は、1時間攪拌しながら110℃で加熱され、室温まで冷却された。不溶性物質は、濾過によって収集され、少量の無水酢酸および多量のエーテルで洗浄された。真空下での乾燥は、4.0 g（61％）の化合物50を与えた。粗物質は、付加的な精製をともなわずに、次の反応において使用された。
【０２６６】
化合物51
1.5 mLのDMFにおける50（0.68 g、1.0 mmol）、トリエチルアミン（0.5 mL、3.75 mmol）、ホスファイト41（0.96 g、1.46 mmol）の混合物は、真空下で脱気された。この懸濁液に、70 mg（0.06 mmol）のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)が添加された。反応は、1時間攪拌しながら80℃で加熱され、次いで、室温まで冷却された。混合物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタンにおける5％トリエチルアミンにおけるMeOHの勾配（0〜15％）で溶出した。生成物を含む画分の濃縮および真空下での乾燥は、非晶質赤色固体として1.2 g（89％）の望ましいホスホネート51を与えた。
【０２６７】
化合物52
ジクロロメタン（50 mL）およびMeOH（50 mL）の混合物における51（1.1 g、0.81 mmol）の溶液に、0.1 mLのTFAが添加された。1時間室温で保たれた後、反応は、0.2 mLのトリエチルアミンで中和され、濃縮された。次いで、残留物は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス10％トリエチルアミン）におけるMeOHの勾配（0〜15％）で溶出した。純粋な生成物画分は、濃縮かつ乾燥され、0.62 g（77％）の化合物52を与えた。
【０２６８】
化合物53
10 mLの無水ジクロロメタンにおける52（0.6 g、0.6 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（1 mL）の溶液に、0.2 mL（0.9 mmol）の2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトが、攪拌しながら滴下形式で添加された。室温で保たれた後、反応は、エーテル（100 mL）で希釈された。液体相は、静かに移され、残留物は、さらなるエーテルで洗浄された。残留シロップ状物質は、泡立てられ、紫色非晶質固体として0.7 gの不安定ホスホラミダイト53を与えた。不安定性により、ホスホラミダイトは、調製後1日以内にDNA合成に使用されなければならなかった。実用的な配慮から、ホスホラミダイト（53）は、その日のオリゴヌクレオチド合成必要条件に対して十分な量において、中間体52から日々合成された。
【０２６９】
実施例9
この実施例は、反応スキーム10において概説されるようなホスホン酸置換Cy5 CPG試薬59の調製を例証する。
【０２７０】
化合物54
5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン（Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 1974, 9(3), 274-280）（4.74 g、16.6 mmol）およびプロパンスルトン（2.0 g、16.4 mmol）の混合物は、30分間+100℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、エーテルで研和された。固体物質は、濾過され、エーテル、ジクロロメタンで洗浄され、真空で乾燥され、オフホワイト固体として望ましい生成物（5.5 g、82％）を与えた。
【０２７１】
化合物55
20 mlのピリジンにおける54（2.3 g、5.6 mmol）およびマロンアルデヒドビス(フェニルイミノ)一塩酸塩（0.72 g、2.8 mmol）の溶液に、無水酢酸（3.4 g、33.6 mmol）が添加された。反応は、4時間室温で攪拌され、濃縮された。結果として生じた物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス5％ピリジン）におけるメタノールの勾配（0〜10％）で溶出した。望ましい色素55の収率は、56％であった（紫色固体）。
【０２７２】
化合物56
55（0.46 g、0.49 mmol）、ホスファイト41（1.0 g、1.53 mmol）、N-エチルモルホリン（0.3 ml）、およびDMF（1 ml）の混合物は、1分間真空下で脱気された。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（0.1 g、0.086 mmol）が添加され、混合物は、1時間80℃で攪拌された。反応混合物は、冷却され、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス5％ピリジン）におけるメタノールの勾配（0〜10％）で溶出した。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、0.8 g（82％）の望ましいホスホン酸色素56を与えた。
【０２７３】
化合物57
20 mlのジクロロメタンにおける56（0.7 g、0.35 mmol）の溶液に、メタノール（0.0115 g、0.35 mmol）、その後にTFA（0.05 ml）が添加された。反応は、10分間進行することを可能にされ、トリエチルアミン（0.1 ml）で中和された。溶剤は、蒸発させ、結果として生じた物質は、シリカでクロマトフィーで分離され、ジクロロメタン（プラス5％ピリジン）におけるメタノールの勾配（0〜20％）で溶出した。純粋な生成物画分の濃縮および真空下での乾燥は、0.12 g（20％）の望ましい生成物57を与えた。
【０２７４】
化合物58
1.5 mlの無水DMFにおける57（0.11 g、0.065 mmol）、N-メチルイミダゾール（5 mg、0.065 mmol）、トリエチルアミン（80 mg、0.78 mmol）、および無水コハク酸（40 mg、0.39 mmol）の溶液は、20時間室温で攪拌された。ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（0.22 g、0.78 mmol）が添加された。1時間室温で保たれた後、反応は濃縮され、エーテル、その後に酢酸エチルで研和された。真空下での乾燥は、粗（TFA塩が混入される）生成物58を与え、付加的な精製をともなわずに次の反応において使用された。
【０２７５】
制御孔サイズ支持体（CPG）59の調製
長鎖アミノアルキルCPG、500A（1.5 g、105μmol/g）は、8 mlの無水DMFにおける58（90 mg、〜45μmol）およびトリエチルアミン（50 mg、0.49 mmol）の溶液に添加された。懸濁液は、3時間オービターシェーカーを使用して攪拌され、次いで、未反応アミノ基をキャップするためにピリジン（1 ml）および無水酢酸（1 ml）で処置された。さらに1時間攪拌された後、CPGは、濾過によって収集され、DMF、酢酸エチルで洗浄され、真空で乾燥された。DMTローディング：18μmol/g。
【０２７６】
実施例10
この実施例は、反応スキーム11において概説されるようなホスホン酸置換Cy5 PFPエステル試薬66の調製を例証する。
【０２７７】
化合物60
5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン（Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 1974, 9(3), 274-280）（1.0 g、3.5 mmol）およびtert-ブチル6-ヨードヘキサノエート（1.382 g、4.6 mmol）の混合物は、9時間+90℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、エーテルで研和された。固体物質は、濾過され、エーテルで洗浄され、真空で乾燥され、淡桃色固体として望ましい生成物60（1.2 g、59％）を与えた。
2009527629.tif 000093
【０２７８】
化合物61
5-ヨード-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン（2.0 g、7.0 mmol）およびヨウ化エチル（1.76 ml、3.42 g、22 mmol）の混合物は、3時間+90℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、エーテルで研和された。固体物質は、濾過され、エーテルで洗浄され、真空で乾燥され、桃色固体として望ましい生成物61（2.45 g、79％）を与えた。
2009527629.tif 000094
【０２７９】
化合物62
61（1.5 g、3.4 mmol）、マロンアルデヒドビス(フェニルイミノ)一塩酸塩（1.76 g、6.8 mmol）、塩化アセチル（2.5 ml）、および無水酢酸（25 ml）の混合物は、1.5時間+120℃で加熱された。反応混合物は、冷却され、攪拌エーテルに滴下形式で添加された。固体物質は、濾過され、エーテル、EtOAcで洗浄され、真空で乾燥され、茶色固体として粗生成物（1.87 g、90％）を与え、精製をともなわずにさらに使用された。
【０２８０】
化合物63
62（1.25 g、2.04 mmol）、60（1.162 g、2.0 mmol）、無水酢酸（2 ml）、およびピリジン（20 ml）の混合物は、1.5時間室温で磁気的に攪拌された。反応混合物は真空で濃縮され、残留物は、DCM/MeOH（9:1）混合物に溶解され、溶液は、攪拌エーテルに滴下形式で添加された。沈殿物は、濾過され、エーテルで洗浄され、真空で乾燥され、粗生成物を与え、シリカカラム（10％MeOH/DCM）で精製され、紫色固体として望ましい生成物（0.94 g、50％）を与えた。
2009527629.tif 000095
【０２８１】
化合物64
25 mlフラスコは、化合物63（0.84 g、0.9 mmol）、ホスファイト3（2.24 g、5.4 mmol）、DMF（2 ml）、トルエン（2 ml）およびエチルモルホリン（0.859 ml、0.777 g、6.75 mmol）を入れられた。フラスコは、アルゴンを流され、アルゴンは、2分間溶液を介してバブリングされた。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（208 mg、0.18 mmol）が添加され、反応混合物は、2時間+80℃で磁気的に攪拌された。反応混合物は、室温まで冷却され、攪拌メチルt-ブチルエーテルに滴下形式で添加された。溶液は、静かに移され、残留油性物質は、エーテルでリンスされ、MeOH/DCM（9:1）混合物に溶解され、シリカカラム（DCMにおける10〜15％MeOH）で分離され、紫色固体として望ましい生成物（250 mg、19％）を与えた。
2009527629.tif 000096
【０２８２】
化合物65
64（0.25 g、0.16 mmol）、ジクロロメタン（5 ml）、およびトリフルオロ酢酸（5 ml）の混合物は、1時間室温で磁気的に攪拌された。反応混合物は、真空で濃縮し、DMFと共蒸発させた。残留物は、アセトンに溶解され、エーテルで希釈された。結果として生じた溶液は、静かに移され、残った油性残留物は、エーテルでリンスされ、高真空で乾燥され、紫色固体として望ましい生成物（0.20 g、88％）を与えた。
2009527629.tif 000097
【０２８３】
化合物66
ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（0.18 g、0.64 mmol）は、65（0.20 g、0.14 mmol）、DMF（3 ml）、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.082 g、0.64 mmol）の混合物に添加された。結果として生じた混合物は、10分間室温で磁気的に攪拌された。次いで、反応混合物は、減圧下で濃縮され、残留物は、アセトニトリルに溶解され、エーテルで希釈された。結果として生じた溶液は、油性残留物から静かに移された。操作は繰り返され、次いで、油性残留物は、エーテルでリンスされ、高真空下で乾燥され、紫色固体として望ましい生成物（0.15 g、56％）を与えた。
2009527629.tif 000098
【０２８４】
実施例11
ホスホン酸および非ホスホン酸色素-オクタチミジレート（octathymidylate）に対する逆相HPLC滞留時間の比較
この実施例は、a）保護キサンテンホスホネートホスホラミダイトでのオリゴヌクレオチド合成、b）オリゴヌクレオチド複合体の脱ブロッキング、およびc）キサンテンホスホネートオリゴヌクレオチド複合体の増加した極性を実証する。
【０２８５】
オリゴヌクレオチド合成は、AB 3900 DNA Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA)で行なわれた。保護オリゴヌクレオチド複合体は、標準的な条件（70℃で2時間、濃NH4OHにおける10％エタノール）下で処置され、純粋な非保護オリゴヌクレオチド複合体を産出した。
【０２８６】
表6における精製オリゴヌクレオチド複合体は、C18逆相クロマトグラフィーによって分析された。HPLC条件は以下であった：C18逆相、Luna、4.6×100 mmカラム、30分におけるアセトニトリルの勾配（0〜45％）、0.1 M酢酸トリエチルアンモニウム、pH 7.5、1 mL/minの流速。
【０２８７】
表6において示されるように、ホスホン酸キサンテンの滞留時間は、非ホスホン酸キサンテンよりもより速く、それらのより極性の性質を確認した。
【０２８８】
（表６）ホスホン酸および非ホスホン酸色素-オクタチミジレートに対する逆相HPLC滞留時間、吸収および蛍光特性の比較
2009527629.tif 000099
【０２８９】
実施例12
MB-Q-オリゴヌクレオチド-PY複合体のオリゴヌクレオチド合成
この実施例は、a）MB-Q-オリゴヌクレオチド-PY複合体の合成、b）保護基の除去、およびc）複合体の精製を実証する。
【０２９０】
図3は、3'端においてホスホラミダイト試薬18bを使用するホスホン酸キサンテン色素で標識された5'-マイナーグルーブ結合剤-消光剤DNAプローブのオリゴヌクレオチド合成の例を示す。この実施例は、成功しかつ再現可能なホスホラミダイトカップリング化学および脱保護の間の保護基の効率的な除去を実証する。オリゴヌクレオチドは、Kutyavin et al, Nucl. Acids Res., 28:655-661 (2000)において記載されるように合成された。複合体は、Wave System, Transgenomic, Inc., Omaha, Nebraskaで精製された。複合体の滞留時間は、同様の完全に脱保護された複合体に対して観測された位置に相当した。
【０２９１】
実施例13
この実施例は、多重化ハイブリダイゼーションに基づく検出アッセイ法におけるホスホン酸標識MGB Eclipseプローブの使用を実証し、HSV 1,2プローブが、FAMで標識され、内部対照は、ホスホン酸色素（14）で標識される。
【０２９２】
MGB Eclipse PY-標識プローブを使用したリアルタイムPCR
リアルタイムPCRは、ABI Prism（登録商標）7900 Sequence Detection System (SDS)（Applied Biosystems, Foster City, CA）、またはMJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycle (Waltham, MA)（Afonina et al., J. Clin. Ligand Assay, Vol. 25, Vol. 23, pp.268）のいずれかで実施された。両方の機器において、3段階PCR（5秒間95℃、20秒間58℃、および30秒間76℃）プロファイルの50サイクルが、95℃での初めの2分の後に、実行された。必要な場合、蛍光データは、ABI 7900 SDSで58℃において収集された。最終量0.37U/μlまでJumpStart Taq Polymerase（Sigma カタログ#90 4184）で補足された2mM最終Mg++濃度（Sigma #D 74403）をともなう市販されている2×Jump Start（商標）Taq Ready Mix（商標）for Quantitative PCRが使用された。両方のプローブの最終濃度は、0.2μMであった。制限プライマーの濃度は、0.1μMであり、過剰プライマーは2μMであった。各々の5μl反応は、反応セットアップに先行して高速真空で96または384ウェルプレートにおいて凍結乾燥された10 ngのゲノムDNAを含んだ。Biomek（登録商標）2000 Laboratory Automation Station（Beckman Coulter, USA）は、セットアップPCR反応に対して使用された。
【０２９３】
HSV 1,2検出
成功する多重化は、標的および内部対照の両方の増幅が、ほぼ100％効率的であることを必要とする（Livak, KJ and Schmittgen, TD. 2001. Methods 25: 402-408）。そのようなPCR効率的反応が、単一反応において多重化される場合、濃度に対するCtの滴定曲線からのリアルタイムデータは、0.99よりも大きなR2値をともなう-3.333の傾きを与えるべきである。HSV 1,2 FAM標識プローブおよびホスホン酸標識内部対照が多重化される場合、傾きは、0.996のR2値をともなう-3.14であり、未知の試料の検出をともなって進行するのに許容される値である。
【０２９４】
図4は、HSV 1,2 MGB Eclipseプローブアッセイ法の滴定を例証し、FAM標識プローブは、PYで標識された内部対照（IC）プローブで多重化される。多重化FAMおよびPYプローブに対する滴定リアルタイムデータは、a）において示される。滴定は、100〜106コピーの10倍濃度をともなうクローン化HSV 1,2プラスミド標的で行なわれる。ICの1000コピーは、すべてのHSV希釈において使用され、ICプライマー濃度は、すべてのHSV希釈において0.3μMであった。HSV 1,2アッセイ法に対する配列は、
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（プローブ）、
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（内部対照プローブ）、
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（制限プライマー）および
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（過剰プライマー）である。MGBリガンドは、DPI3であり；Qは、Eclipse Dark Quencherであり、Zは、ユニバーサル塩基である。
【０２９５】
実施例14
この実施例は、反応スキーム12aにおいて記載されるような本発明のシアニンホスホン酸置換試薬80の合成を実証する。
【０２９６】
化合物78
化合物54（1.0 g、2.46 mmol）、3,4-ジブトキシ-3-シクロブテン-1,2-ジオン（0.556 g、0.531 ml、2.46 mmol）、エタノール（25 ml）、およびトリエチルアミン（2.48 g、3.42 ml、24.6 mmol）の混合物を、5時間還流した。水性1 M NaOH（5.41 ml、5.41 mmol）を添加し、結果として生じた混合物を、30分間さらに還流した。反応混合物を室温まで冷却し、1 M HCl（5.66 ml、5.66 mmol）を添加した。溶剤の蒸発により、粗中間体77を得、次いで、トルエン/ブタノール混合物（1：1、50 ml）に溶解し、化合物60（1.363 g、2.34 mmol）を添加した。結果として生じた混合物を、3時間ディーンスタークトラップで還流し、冷却し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラム（DCMにおける20％MeOH）で分離し、藍色固体として望ましい生成物78（0.45 g、0.48 mmol、収率＝20％）を得た。
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【０２９７】
化合物79
化合物78（0.39 g、0.42 mmol）、ホスファイト3（1.40 g、3.36 mmol）、DMF（4 ml）、トルエン（4 ml）、およびエチルモルホリン（0.535 ml、0.484 g、4.2 mmol）の混合物を、Pd(PPh3)4（97 mg、0.084 mmol）の添加の前に脱気した。結果として生じた混合物を、2時間＋80℃で磁気的に攪拌し、室温まで冷却し、真空で濃縮し、シリカ（DCMにおける20％MeOH）でクロマトグラフィーで分離し、青色固体として望ましい生成物79（0.43 g、0.28 mmol、収率＝67％）を得た。
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【０２９８】
化合物80
トリフルオロ酢酸（5 ml）を、DCM（5 ml）における化合物79（0.36 g、0.24 m）の溶液に添加し、結果として生じた混合物を、1時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、DCMと共蒸発させ、真空で乾燥させた。残留物をアセトンに溶解し、攪拌エーテルにゆっくりと添加した。結果として生じた沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させ、脱保護中間体（0.31 g、0.21 mmol、収率＝88％）を得た。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（0.060 ml、0.098 g、0.35 m）を、DMF（3 ml）における獲得された中間体（0.22 g、0.15 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（0.061 ml、0.045 g、0.35 mmol）の溶液に添加した。反応混合物を、10分の期間の後に、真空で濃縮した。残留物をエーテルでリンスし、アセトニトリルに溶解し、攪拌エーテルへ注いだ。沈殿物を濾し取り、エーテルで洗浄し、真空で乾燥させ、暗青色固体として望ましいPFPエステル80（210 mg、0.13 mmol、2段階に対して収率＝77％）を得た。
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【０２９９】
実施例15
以下の実施例は、反応スキーム12bにおいて記載されるようなホスホン酸置換シアニン試薬87の合成において使用され得る様々な中間体の合成を実証する。
【０３００】
化合物82
化合物81（5.0 g、17.5 mmol）、1-ブロモ-4-ニトロベンゼン（5.30 g、26.25 mmol）、炭酸カリウム（水24.5 mlにおける6.772 g、49.0 mmol）、およびジメトキシエタン（75 ml）の混合物を、Pd(PPh3)4（2.022 mg、1.75 mmol）添加の前に脱気した。混合物を、3時間＋83℃で磁気的に攪拌し、次いで、冷却しEtOAcで希釈した。有機相を、ブラインおよび水で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、真空で濃縮した。残留物をシリカゲルカラム（DCMにおける10％アセトン）で分離し、黄色半固体として望ましい生成物82（4.04g、14.4 mmol、収率＝82％）を得た。
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【０３０１】
化合物83
チャコール上のパラジウム（10％、0.5 g）を、メタノール（200 ml）における化合物82（4.0 g、14.2 mmol）の溶液に添加し、結果として生じた混合物を、2時間30 psiでParr装置上で水素化した。反応混合物を、セライトを介して濾過し、濃縮し、真空で乾燥させ、望ましい生成物83（3.5 g、14.0 mmol、収率＝99％）を得た。
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【０３０２】
化合物84
冷塩酸（6.6 M、150 ml）を、ジオキサン（20 ml）における化合物83（3.5 g、14.0 mmol）の溶液に添加した。結果として生じた混合物を、氷水バスを使用して0℃まで冷却し、水（100 ml）における亜硝酸ナトリウム（1.213 g、17.57 mmol）の溶液を、10分以上かけて滴下形式で添加した。反応混合物を、＋0℃で1時間磁気的に攪拌し、水（120 ml）におけるヨウ化カリウム（23.241 g、140.0 mmol）の溶液を、激しく攪拌しながら15分以上かけて添加した。反応混合物を、室温で1時間攪拌し、次いで、EtOAc（300 ml）で希釈した。有機相を分離し、飽和水性チオ硫酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、真空で濃縮した。粗生成物を、DCMにおける20％EtOAcで溶出するシリカでクロマトグラフィーで分離し、黄色固体として望ましい生成物84（2.73 g、7.6 mmol、収率＝54％）を得た。
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【０３０３】
化合物85
化合物84（1.0 g、2.77 mmol）、1,4-ブタンスルトン（0.446 g、3.65 mmol）、およびジメチルアセトアミド（5 ml）の混合物を、16時間＋100℃で加熱した。結果として生じた混合物を冷却し、エーテルで希釈した。溶液をデカントし、残留物をメタノール/DCM（1：9）混合物に溶解した。溶液を、攪拌エーテルにゆっくりと添加した。固体物質を濾過し、エーテルで洗浄し、真空で乾燥させ、灰色固体として化合物85（1.13 g、2.34 mmol、収率＝84％）を得た。
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【０３０４】
実施例16
以下の実施例は、反応スキーム13および13aにおいて図示される様々な化合物の合成を提供する。
【０３０５】
化合物88
tert-ブチル6-ヒドロキシヘキサノエート（J. Org. Chem., 49: 2147 (1984)）（2.6 g）およびtert-ブチル4-ヒドロキシブチルカルバメート（J. Med. Chem. :4183-4195 (2006)）（2.6 g）を、20 mlの乾燥ピリジンに溶解し、共蒸発によって乾燥させた。残留物を、15 mlの乾燥ピリジンに再溶解し、3.1 mlの亜リン酸ジフェニル（純度85％）で処置した。オーバーナイトで室温で保った後、反応物を濃縮し、EtOAcに再溶解し、10％クエン酸、飽和NaClで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、再度濃縮した。粗物質を、最初に1：1ヘキサン/EtOAc→EtOAcで溶出するシリカゲルでクロマトグラフィーで分離した。TLC（1：1ヘキサン/EtOAc）に従う純粋な画分の濃縮により、無色粘液として2.05 gの望ましいホスファイト（88）を得た。構造は、NMRによって確認した。
【０３０６】
化合物89aおよび89b
8-ヒドロキシジュラリジン（5.0g）、4-ブロモフタル酸無水物（3.0 g）、およびZnCl2（10 g）の混合物を、スパチュラを使用して周期的に攪拌しながら、〜1時間150℃で加熱した。温度を、170℃まで上昇させ、加熱を5時間続けた。結果として生じる粘性塊を冷却し、約20 mlのメタノールに溶解し、180 mlのCH2Cl2で希釈した。溶液を、シリカゲルカラム（5×30 cm）にロードし、CH2Cl2における10％MeOHで溶出した。色素含有画分をプールし、濃縮し、5.4 gの粗色素を得た。この物質を、20 ml CH2Cl2に溶解し、CH2Cl2における5％MeOHで溶出するシリカ（5×30 cmカラム）でクロマトグラフィーで分離した。より速く溶出する異性体（89a）の比較的純粋な画分を、黒色非晶質固体（0.86 g）として獲得した。構造は、NMRによって確認した。
【０３０７】
化合物90
化合物89a（5 mmol）を、1 ml DMF、1 mlトルエン、および1.5 mlイソアミルアルコールに溶解した。この溶液に、0.5 ml Et3NおよびPd(Ph3P)4を添加し、次いで、1時間80℃で攪拌しかつ加熱した。HPLC分析により、反応が約50％完了していることが示された。さらに2時間後、分析により、さらなる生成物は形成されていないことが示された。反応物を濃縮し、エーテルで練和し、粗生成物を沈殿させた。物質を、10％→20％→50％MeOH/CH2Cl2で溶出するシリカゲルでクロマトグラフィーで分離し、約45％開始物質を含む0.2 gの90を産出した。
【０３０８】
化合物91
CH2Cl2（2 ml）およびTFA（2 ml）の混合物における90の溶液を、1時間室温で保った。HPLC分析により、10分のRfを有する生成物が示された。反応物を濃縮し、最初にCH2Cl2における10％MeOH、第二に10％MeOH/10％Et3N→10％CH2Cl2における50％MeOH/10％Et3Nで溶出するシリカゲルでクロマトグラフィーで分離した。生成物含有画分を濃縮し、MeOH（5 ml）およびEt3N（3ml）の混合物に溶解した。〜30時間室温で保った後、HPLCにより、反応が完了していることが示された。反応物を濃縮し、CH2Cl2およびDIPEAと共蒸発させ、真空で乾燥させ、〜0.1 gの91（暗紫色非晶質物質）を産出した。
【０３０９】
化合物92
化合物91（〜0.1 g）を、上記の化合物66に対して記載されるのと類似の方法で、化合物92に変換した。
【０３１０】
当業者は、提供される説明、図、および実施例から、改変および変化が、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の様々な態様になされ得ることを認識すると考えられる。付加的に、すべての参照、特許、特許刊行物などは、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０３１１】
【図１】本発明のベンゾキサンテン色素の選択されたクラスの構造を図示する。
【図２】本発明のベンゾフェノキサジン色素の選択されたクラスの構造を図示する。
【図３】MB-Q-オリゴヌクレオチド-PYのHPLCクロマトグラムを図示する（実施例12を参照されたい）。
【図４】HSV 1,2 MGB Eclipseプローブアッセイ法の滴定を図示し、FAM標識プローブは、PY標識プローブで多重化される（実施例13）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月3日(2009.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９４】
図4は、HSV 1,2 MGB Eclipseプローブアッセイ法の滴定を例証し、FAM標識プローブは、PYで標識された内部対照（IC）プローブで多重化される。多重化FAMおよびPYプローブに対する滴定リアルタイムデータは、a）において示される。滴定は、100〜106コピーの10倍濃度をともなうクローン化HSV 1,2プラスミド標的で行なわれる。ICの1000コピーは、すべてのHSV希釈において使用され、ICプライマー濃度は、すべてのHSV希釈において0.3μMであった。HSV 1,2アッセイ法に対する配列は、
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（配列番号：1）（プローブ）、
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（配列番号：2）（内部対照プローブ）、
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（配列番号：3）（制限プライマー）および
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（配列番号：4）（過剰プライマー）である。MGBリガンドは、DPI3であり；Qは、Eclipse Dark Quencherであり、Zは、ユニバーサル塩基である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009527629000001.app
【国際調査報告】
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2009527629.tif 000137
2009527629.tif 000138