(57)【要約】  本発明の方法は、下記ａ）〜ｃ）を含み、ヒトの歯小嚢に属し、ＦＥＮＣと呼ばれる幹細胞を単離、拡大、及び保存する方法である。  ａ）無菌状態での小嚢の収集、消化、並びに初代培養及び拡大  ｂ）選択的な増幅  ｃ）ＦＡＣ分類【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ａ）〜ｃ）を含み、ヒトの歯小嚢に属し、ＦＥＮＣ（Follicle-derived Embryonic Neural crest stem cell）と呼ばれる幹細胞を単離、拡大、及び保存する方法。
ａ）無菌状態での小嚢の収集、消化、並びに初代培養及び拡大
ｂ）選択的な増幅
ｃ）ＦＡＣ分類
【請求項２】
タンパク質分解酵素及び抗体を用いて、上記消化を行う
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記酵素消化を、３ｍｇ／ｍＬ  Ｉ型コラゲナーゼ、４ｍｇ／ｍＬ  ディスパーゼ、１００U／ｍＬ  ペニシリン、１００ μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、及び５００μｇ／ｍＬ  クラリトロマイシンを添加したＰＢＳを含む水溶液を用いて行う、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記酵素消化を、３７℃で１時間、振盪下で行う
請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
初代培養及び拡大を、幹細胞に特異的な培地を用いて行う
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
培地は、１０％  ｐ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したＭｅｇａ  Ｃｅｌｌからなる培地である
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
３７℃、５％ＣＯ２下で１５‐２０日、３日毎に培地を換えつつ培養を行う
請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ＦＡＣ分類を、幹細胞マーカーとして、ＳＳＥＡ‐４，ＴＲＡ  １−６０，ＴＲＡ  １‐８１，ＣＤ１３３，ＣＤ９０，ｆｌｋ‐１を用いて行う
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
造骨細胞の前駆細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、含脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞を取得するための、請求項１から８のいずれか１項の方法によって得られたＦＥＮＣの使用。
【請求項１０】
骨格組織病理学、筋組織変性、ＣＮＳ病理学、ミエリン変性、腫瘍疾患の治療のための細胞治療プロトコルで使用するための、及び形成外科手術において使用するための自家移植物の調製への、造骨細胞の前駆細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、含脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
今日、ヒト組織から幹細胞を単離する機会は、議論を呼んでおり、よく話題になっている。幹細胞それ自体の定義、すなわち自己再生能及び由来する器官とは異なるあらゆる細胞型への分化能を有する、という定義は、成体幹細胞の抗原性特性及び機能的特性には合致しない。成体幹細胞は、誕生後のヒトからの収集が可能である。「自己再生」の側面からは、実際、これまでに単離された成体幹細胞は無限殖能を示さず、他の側面において、分化能が、複数分化能（multipotency：同一の基底層から生じる全ての細胞型に分化する能力）、又は多分化能（pluripotency：異なる基底層から生じる細胞型にも分化する能力）を超えつつ、分化全能性（totipotency：全ての細胞型に分化する能力）に達しないことは困難であった。後者は、受精卵及び胚盤胞が有する能力であり、ヒトの発生の最初の段階を引き起こす。他方、ヒトの胚から収集された細胞を治療的及び研究的な応用に用いるという試みは、技術的、倫理的及び法律的な困難としばしば衝突する。これらの理由により、成人から未分化の細胞型を単離することは、細胞の文化や組織関連癌についての単なる興味深い実験モデルであるだけでなく、組織退化に基づき量的及び質的な異常によって引き起こされる疾病の治療の重要な治療手段である。
幹細胞は、
１）無限自己再生能；
２）多数の細胞型への分化能
という特徴を有する。
【０００２】
ＷＯ  ０３／０６６８４０に開示され、小胞蝋膜（follicular cerotype）を含む先行技術に関して、本発明は、以下のような相違を示す：
１）抗原パターン及び細胞の選択方法。ＷＯ  ０３／０６６８４０は、選択方法については何ら開示していないが、本発明の方法は、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ１‐６０、ＴＲＡ１‐８１、ＣＤ１３３、ＣＤ９０、ｆｌｋ‐１等の抗原検出による、サイトフルオロメトリーによる胚性幹細胞の選択を用いる。こうして、本発明では均一な胚性細胞集団を得ることが可能となる。
２）培養方法、細胞増殖、及び分化。実際、ＷＯ  ０３／０６６８４０は、成体幹要素のわずかな部分にしか含まれない細胞集団を収集する技術について述べているが、本発明の選択情報によると、均一な胚性様幹細胞集団を調製することができる。
【発明の開示】
【０００３】
〔要旨〕
本発明は、ヒトの歯小嚢から得られ、胚性様の抗原性状を有する新たな幹細胞の亜集団を単離する新たな方法に関し、また、その培養の拡大方法に関する。単離された細胞は、実験的及び治療的使用のために、集合体として特徴付けられると共に、保存可能である。
【０００４】
特に、本発明は、１）ドナーから得られた歯嚢組織から得られた幹細胞の単離；それらの in vitro での増殖、特に、胚性態様を有する状態での単離を可能とする培養条件；生存能力を保持するためのそれらの塊；異なる細胞型への分化；種々の原因による損傷の再生に用いられる、細胞治療のための単離幹細胞型の使用及び／又はドナー自身若しくはＨＬＡ適合型ホストにおける組織工学、について述べる。
【０００５】
本発明は、特異的抗体を用いた適切な染色の後のFAC分類選択による、小胞（follicular sack）からの新たな非造血細胞及び間葉幹細胞亜集団の単離方法について述べる。これらの細胞を、以降、ＦＥＮＣ（Follicle-derived Embryonic Neural crest stem cells：小胞由来胚性神経堤幹細胞）と称する。
【０００６】
本発明は同様に、ＦＥＮＣの培養及び増殖方法も提供する。本発明の方法で取得された細胞は、３つの基底層由来の組織の全てに分化可能であり、ＦＥＮＣを複数分化／多分化能を有する細胞集団とする。FENCは、その生存能力を保持したまま保存できるので、成人患者から集めた胚性幹細胞を保存するための細胞塊を樹立することが可能である。本発明は、同様に、ＦＥＮＣを用いた細胞及び／又は遺伝子治療のための方法、及び、FENCの分化によって得られる細胞及び組織の臨床的治療への適用を提供する。
【０００７】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、成人から収集される胚性幹細胞の新たな細胞型の単離方法に関し、特に、小胞からのこれらの選択を含むこれらの細胞の単離方法に関する。
歯小嚢は、萌出の前の歯の形成の間に歯を包む組織複合体であり、下記の２つの理由のために、未分化細胞の有用な採取源の代表的なものである。
【０００８】
１）歯はそれぞれ、永久歯及び乳歯の双方とも、誕生時には不完全な器官である。それゆえ、その成長部位において、未分化の細胞は、増殖の後に歯性細胞になる。これらの細胞の未熟さは、神経堤由来であるという胚起源により説明することができる。歯牙形成の終期においても、これらの未分化細胞は、萌出まで、あるべき場所、つまり小胞内にとどまる。なぜなら、これらの細胞は将来、萌出の後で成長する歯周組織及び根端の細胞になるからである。今や、歯根膜（Gronthos, Lancet 2004)及び歯髄（Gronthos, PNAS 2000; Miura, PNAS 2003; Laino, JBMR 2005）中の成体幹細胞の存在は、疑う余地がない。
【０００９】
２）歯小嚢は、外科的に容易に接触可能な生物学的なニッチェであり、未分化幹細胞と組織の収量との間の比率が高い。親不知は非常に頻繁に見られるものであって、小胞の集積を必要とするので、幹細胞を集めるために犠牲となる組織量は最小量に抑えられる。幹細胞は、これらの生物学的試料から得られる胚性特性を有し、研究及び自己移植治療への応用のために保存可能である。
これらの細胞は、神経外胚葉に由来し、この層を起源とする細胞型における分化能を発現する。
【００１０】
本発明は、成人由来の胚性特性を有する均一な細胞集団を単離する初めての方法を提供する。
この方法は、以下のような利点を有する：１）局部麻酔を用いた低侵襲手術、２）その部位の低罹患率、３）造血画分の欠如に起因した間葉細胞培養の高クローン形成、４）成人からの胚性細胞の単離。
【００１１】
＜ＦＥＮＣの取得＞
幹細胞は、器官形成中の神経堤を起源とする間葉細胞に直接由来する小胞から取得される。この起源は、これらの細胞の可塑性を説明する。幹細胞を小胞から単離するために、後者は、口腔との接触によって損なわれていないことが必要とされる。
【００１２】
被験者は、手術前の一週間、口腔衛生学上の適切なプロトコル（例えば、口腔を１日に少なくとも２回、ＣＨＸ０．１２又は同類の薬剤にてすすぐこと）に従わなければならない。小胞を収集するために、麻酔の後、小胞に包まれて歯茎に埋伏した歯に至るように、蓋となる組織片を切除し、骨の扉を開く。無菌状態で試料を一旦集め、試料を３７℃で１時間、消化溶液中に浸す。最初の１時間の終了時、集合体及びECM粒子を除くために消化溶液をろ過する。この後、消化工程を停止させ、細胞を培養する（Ｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ培地（ＳＩＧＭＡ‐Ｍｉｌａｎ、イタリア)を使用）。また、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞葉の培地を代わりに用いてもよい。培養の初日から始める顕微鏡観察によると、得られた細胞数は良好であると考えられ、細胞はクローンの起源となるものであり、フラスコ底に付着する。７５ｍｌフラスコで培養して５日後、６０クローンを数えることができる。
【００１３】
９〜１０日目、上清を除いた後、細胞は、幹マーカーが陽性である細胞クローンを収集するＦＡＣ分類にかけられる。
単離されたＦＥＮＣは、刺激を与えられ又は刺激無しに、異なる細胞型に分化する。培地にβＦＧＦを添加することで、分化を起こさずに増殖させることが可能である。
細胞が適切な数になった後は、凍結し、−８０℃の液体窒素中で保存可能である。
手順は、以下のようにまとめることができる：
１）無菌状態での小胞の収集、消化、及び培養；
２）必要に応じた初代培養の増幅；
３）ＦＡＣ分類；
４）増幅、凍結、及び／又は細胞分化；
５）ＦＡＣ解析；
６）未分化状態の維持；
７）分化した細胞を用いた組織工学。
【００１４】
ＦＥＮＣ分化から獲られる全ての型の細胞は、細胞治療だけでなく、異なる組織の構築にも用いることができる。
例えば、ＦＥＮＣは、造骨細胞の前駆細胞を得るのに使用可能である。前駆細胞はＲＵＮＸ‐２を発現し、ＨＬＡ‐１、ＣＤ４４、ＲＵＮＸ‐２、ＣＤ５４、及びオステオカルシンを発現する.骨芽細胞は、この前駆細胞に由来する。
【００１５】
ＬＡＢ（Living Autologous Bone：生体自己骨）と呼ばれる骨基質は、骨芽細胞から取得、拡大、及び凍結が可能である。ＬＡＢは、骨組織試料から作られ、１ｃｍ以上の厚さ及び１ｃｍ３以上の体積を有する。ＬＡＢ形成は、骨を活発に生産する骨芽細胞を含み、１）中心領域の無機結晶内で、コラーゲン線維及び糖タンパク質を分泌するクラスターの形成、及び２）石灰化した骨基質を構築するこの構造の三次元組織、によって特徴付けられる。
【００１６】
上述のＬＡＢは、５％ＣＯ２雰囲気下かつ３７℃において、２０％  ｐ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ培地を用いて細胞を育てることで、形成される。ＬＡＢ形成は、栄養の欠如によってのみ阻害される。
【００１７】
公知の細胞低温保存の技術を用いて、骨芽細胞を４℃又は０℃未満の温度に維持することで、上記ＬＡＢを継続的に生成し、骨組織を貯蔵することができる。
ＬＡＢを含む三次元マトリックスは、細胞が定着した三次元の生体適合基質の存在下で骨芽細胞を培養することによっても、同様に得ることができる。上記生体適合基質は、再吸収性を有するか、又はｉｎ  ｖｉｖｏでないものである。好適な基質としては、ラクチド  コ−グリコール酸、合成コラーゲン、ＨＡ，バイオサンゴ、硫酸カルシウム等が挙げられ、また、ポリメタクリレート、ＰＴＦｅ、チタン、小型ＨＡ、二相性ＨＡ（５０％ＨＡ及び５０％β‐ＴＣＰ）、セラミックによって再吸収性を持たないものが挙げられる。
【００１８】
本発明の更なる実施形態によると、平滑筋を得るために、２％  ｐ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含み、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβが添加されたＭｅｇａ  Ｃｅｌｌ培地を用いて、ＦＥＮＣを筋芽細胞に分化させることができる。
【００１９】
同様に、横紋筋を得るために、ネズミの筋管であるＣ２Ｃ１２と共培養することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＥＮＣを筋芽細胞に分化させることができる。
共培養は、１：１０の比率で、７日間行われる。用いる培地は、４ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１．５ｇ／Ｌ  重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ  グルコース、及び１．０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ＦＢＳ添加のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００２０】
ＦＥＮＣは、Ｂ２７タンパク質 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ミラノ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ミラノ，イタリア）中での１５‐３０日の培養により、同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでニューロン及びグリア細胞に分化可能である。
【００２１】
ＦＥＮＣ分化によって得られたニューロンのグリア細胞は、グリア細胞に対する抗‐ＧＦＡＰ抗体を用いたＦＡＣ分類によって選択される。
ＦＥＮＣは、同様に、２０％  ｐ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、１０‐８Ｍ  デキサメタゾンを添加したα‐ＭＥＭにおける３０日間の培養によって、含脂肪細胞に分化可能である。
【００２２】
軟骨を得るために、ＦＥＮＣを軟骨細胞に分化させるには、２０％  ｐ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したα‐ＭＥＭで、還元雰囲気ｐＯ２＜４０ｍｍＨｇ下で、ＦＥＮＣを３０日間培養すればよい。
【００２３】
本発明は、細胞治療プロトコルにおけるＦＥＮＣの自家移植への使用を可能にする。
特に、ＦＥＮＣの自家移植使用及びこれに由来する細胞は、以下の用途に応用可能である。
・ＦＥＮＣ由来の筋芽細胞を用いた骨格組織病理学、平滑及び横紋組織の双方
・ＦＥＮＣ由来のニューロンを用いたＣＮＳ病理学
・ＦＥＮＣ由来のグリア細胞を用いたミエリン分化
・形成外科手術において、脂肪組織の形成が望まれるときの手段としてのＦＥＮＣ由来の含脂肪細胞
・腫瘍及び形成外科手術の分野における、ＦＥＮＣ由来の軟骨細胞の使用。
【００２４】
＜発がん試験＞
発がん性を排除するために、ヌードマウスにレンチウイルスIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｍｉｌａｎｏ，  Ｉｔａｌｉａ）を感染させた後、ＧＦＰ（green fluorescence protein）ｃＤＮＡを含むベクターを用いて、ＦＥＮＣｓ及び分化細胞をヌードマウスに注入した。移植の後、３０日間経過後にこの動物を処理した。移植箇所及び主要器官の双方について、組織学的観察を行ったところ、がんの発生は見られなかった。
【００２５】
細胞について、主要ながんマーカーによる試験及び細胞周期分析を行ったところ、全ての細胞について発がん性を示す兆候は見られなかった。
ＦＥＮＣｓのいくつかの例については、以下に述べる。
【００２６】
実施例１．細胞単離及び培養
健康な被験者に、手術の１週間前から、１日２回、ＣＨＸ  ０．１２  ｗ／ｖ により口をゆすぐ処置を行ってもらった。小胞を収集するために、局所麻酔後、蓋となる組織を切り、骨の扉を開けて、小胞に包まれた状態で歯茎内に埋伏している歯に到達した。グレーシーキュレット又は歯槽匙によって、無菌状態で収集すると、試料を消化溶液に３７℃で１時間浸した。消化溶液は、３ｍｇ／ｍＬ  Ｉ型コラゲナーゼ、４ｍｇ／ｍＬ  ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）、１００U／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、及び５００μｇ／ｍＬ  クラリトロマイシンを添加したＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４、１Ｍ）であった。溶液の体積は、収集した小胞の体積によって決められ、８〜１５ｍＬの範囲で変更された。試料を溶液中に３７℃で１時間保持した。１時間経過時に、溶液をＦａｌｃｏｎ（登録商標）ろ過器７０μｍによりろ過し、ＥＣＭ、細胞、又は大きな凝集体を除去した。組織片が残存しているようであれば、試料にさらに３０分の消化処理を行った。消化物の体積の１０倍の体積を消化溶液に加え、１４０ｇで１０分間遠心分離を行って、消化を停止させた。培地としては、１０％ｗ／ｖ  牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００μＭ ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＭｅｇａ  Ｃｅｌｌ（ＳＩＧＭＡ，ミラノ，イタリア）を用いた。遠心分離の終了時に、チューブの底から、２５ｍｌの懸濁液を回収し、５０ｍｌのフラスコで、３７℃、５％ＣＯ２下で、１週間に２回培地を交換しながら培養した。培養の初日から開始した顕微鏡観察によると、接着細胞が細胞クローンの起源となっていた。
【００２７】
実施例２．増殖及び特性解析
７５個のフラスコ中の上記培地又は胚用培地（ＥＳ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ミラノ、イタリア）における培養から５日後、６０個のクローンが認められた。
【００２８】
９日〜１０日目、上清を除いて、無菌ＰＢＳで洗浄した後、細胞をフラスコの底から剥がした。４ｍＬの０．０２%ＥＤＴＡを加えたＰＢＳ（Ｍｇ／Ｃａフリー）を用いて、３７℃で１０分間、ＦＡＣ分類を行った。収集した細胞クローンは、幹細胞マーカーに対して陽性であった。細胞をペレット化し（１４０ｇで１０分）、０．０１%ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）を加えたＰＢＳで洗浄し、４℃で３０分、１０μＬの抗体原液で染色した。インキュベーションの後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を１回洗浄し、未反応や非特異的の抗体を除去して、以下の抗体、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１‐６０，ＴＲＡ１‐８１，ＣＤ１３３，ＣＤ９０，ｆｌｋ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対して陽性かどうかを解析した。７０％の細胞がＳＳＥＡ‐４に、８０％がＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１に陽性であった。特に、ＳＳＥＡ−４＋はＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１の双方に陽性であった。ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ１−６０及びＴＲＡ１−８１は、未分化の細胞又は胚性幹細胞（ＥＳ分化全能性）及び胚性生殖細胞（ＥＧ多分化性）にのみ存在する表面分子である。分類後、少量のサンプルについて、通常は胚性未分化細胞においてのみ検出される３つの転写因子Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ‐４、Ｒｅｘ−１について調べた。上述の抗体に対して陽性であるということは、細胞の胚様特性（ＥＳ）を裏付けるものである（Zhang Nature 2003）。ＯＣＴ‐４は保存された細胞の１００％で陽性であった。Ｎａｎｏｇ及びＲｅｘ１の解析については、好適な細胞数を得た後、ＲＮＡを分離し、ＲＴ−ＰＣＲで解析した。
【００２９】
実施例３．ａ型分化（骨、平滑筋、及び軟骨）
実施例１及び２で単離し、解析したＦＥＮＣｓは、刺激を受けて又は刺激無しに分化可能であるか、又は８ｎｇ／ｍＬのβＦＧＦを加えることによって、分化を抑制しつつ増殖可能である。
骨分化のために、細胞は、２０％  ｗ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭにより培養可能である。細胞は、約２５日で骨芽細胞に分化し、Ｉ型及びIII型コラーゲン、オステオカルシン、オステオネクチン、ＢＡＰに対する抗体に陽性である線維性骨を形成する。
【００３０】
平滑筋分化のためには、ＦＥＮＣを、２％  ｐ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含み、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβを添加したＭｅｇａ  Ｃｅｌｌ培地（ＳＩＧＭＡ）で培養すべきである。これらの条件下で、細胞は約４‐５日で分化し、平滑筋分化のマーカーであるＳＭＡ抗体染色で陽性となる。
【００３１】
軟骨細胞分化のために、ＦＥＮＣを、２０％  ｗ／ｖ  ＦＢＳ、１００  μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したα‐ＭＥＭで、還元雰囲気ｐＯ２＜４０ｍｍＨｇ、３７℃、５％ＣＯ２下で、培養した。軟骨構造は、高細胞密度（５００．０００／１５ｍＬ）により約３０日で発生し、II型コラゲナーゼの発現の解析により検証可能である。
【００３２】
実施例４．ｂ型分化（ニューロン及びグリア細胞）
濾胞細胞は、自然発生的に、又はＢ２７タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ミラノ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ミラノ，イタリア）を用いることで、分化可能である。培養は、５‐７日間行った。どちらの場合も分化したニューロン及びグリア細胞を多数取得できた。抗‐ＧＦＡＰ抗体を用いたサイトフルオロメトリーアッセイにより、２つの細胞型を選別し、単離することができる。実際、分化した細胞は、
・ＧＦＡＰ抗体に陽性であればグリア細胞；
・抗ＴｕＪ１、抗‐神経フィラメント、抗Ｂｒｎ３Ａ（転写因子）抗体に陽性であればニューロン；
・抗‐ペリフェリン及び抗‐ｐ７５抗体に陽性であれば末梢ニューロン
である。
【００３３】
実施例５．ｃ型分化（横紋筋及び含脂肪細胞）
ネズミの筋管であるＣ２Ｃ１２と共培養することによって、ＦＥＮＣを横紋筋細胞へ分化させることができる。共培養は、１：１０の割合で、既知の手法（例えばLaino et al., 2006）を用いて、４ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１．５ｇ／Ｌ  重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ  グルコース、及び１．０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを添加した１０％ＦＢＳのDulbecco's modified Eagle's medium （ＤＭＥＭ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１週間行った。共培養の後、ネズミの筋管と融合したＦＥＮＣの割合を、抗‐ヒト核ラミニンを用いて算出した。通常、融合した細胞の割合は、１５‐２０％であった。融合した筋管は、移植に使用できる。
【００３４】
含脂肪細胞への分化を、２０％  ｐ／ｖ  ＦＢＳ、１００μＭ  ２Ｐ‐アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したα‐ＭＥＭに、１０‐８Ｍ  デキサメタゾンを添加して、３０日間培養することによって得た。最終的に、含脂肪細胞は、スーダンブラックによる染色で、又はオイルレッドＯにより、観察できた。
脂肪細胞は、形成手術に用いることができる。
【００３５】
実施例６．細胞工学及び臨床応用
ＦＥＮＣは、一旦分化すると、ローラ装置における回転培養によって組織の再構築に使用可能である。例えば、骨芽細胞へ分化した細胞は、足場（１５日以内に再吸収される）であるコグリコール酸ラクチド（８５：１５）上に蒔けばよい。回転培養（１／５秒）は、５％ＣＯ２下で３０日間行う。厚さが１ｃｍに達すると、組織学的、免疫組織学的、及びＳＥＭ技術を用いて、三次元組織構造を観察及び評価できる。
【００３６】
骨組織は、再生不良に用いることができる。これらの細胞は被験者から採取すればよく、足場をモデル化し、三次元構造を作ることができる。２０‐３０日後、足場‐細胞の複合体は、患者の患部に移植可能となる。
移植は、標準的な外科的手技を用いて行うことができる。移植を受ける箇所は、顕著な溢血及び皮質層の減少を伴う。従って、ホストと足場‐細胞との融合は、容易に形成可能であり、移植の実行が可能である。
完全な融合は、４０‐６０日で形成された。
組織の修復は、幹細胞を用いた自家移植技術によって、実現可能である。
【００３７】
［用語］
Ｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ＝細胞培養用培地（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ，ミラノ，イタリア）
ＥＳ＝培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ミラノ，イタリア）
βＦＧＦ＝ベータ線維芽細胞成長因子
α‐ＭＥＭ＝ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
抗‐ＧＦＡＰ＝グリア線維性酸性蛋白質を検出する抗体
ＧＦＡＰ＝グリア線維性酸性蛋白質
ＳＭＡ＝平滑筋アクチン
ＴＧＦβ＝Tumor Growth Factor β：腫瘍成長因子ベータ
ＢＡＰ＝Bone Alkaline Phosphatase：骨型アルカリフォスファターゼ
βＦＧＦ＝Fibroblast Growth Factor β：線維芽細胞成長因子ベータ
ＲＴ−ＰＣＲ＝Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
Ｎａｎｏｇ＝初期発生で見られる胚細胞の転写因子
Ｒｅｘ１＝初期発生で見られる胚細胞の転写因子
ＯＣＴ‐４＝Ｏｃｔａｍｅｒ  ４
ＳＳＥＡ‐４＝Stage-specific embryonic antigen：ステージ特異的胚性抗体
ＴＲＡ  １＝Tumor rejection antigen-1：腫瘍退縮抗原‐１
ＣＤ＝Cluster of differentiation：白血球分化抗原
ｆｌｋ‐１＝Foetal Liver Kinase -1：胎児肝キナーゼ‐１
ＨＡ＝ハイドロキシアパタイト
ＴＣＰ＝リン酸３カルシウム
【国際調査報告】
2009527223.tif 000002
2009527223.tif 000003
2009527223.tif 000004