(57)【要約】  本発明は破骨細胞による骨再吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防するための薬品の製造におけるＴＳＧ−６ポリペプチド、又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態の治療又は予防のための薬品の製造における、ＴＳＧ−６ポリペプチド又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２又は５のアミノ酸配列；
（ｂ）前記配列番号２又は５のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＮＦκＢ受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）との結合活性を有する（ａ）の変異体；又は、
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）又は（ｂ）の断片を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号２又は５に示す前記配列からなる、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１、４、８若しくは１２のコーディング配列；
（ｂ）（ａ）に示された配列に対し遺伝コードの結果により縮重している配列；
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）に示された配列と少なくとも６０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする配列；又は、
（ｄ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）に示すいずれか１の配列の断片を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１、４、８又は１２に示す核酸配列からなる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記薬品が、薬学的若しくは予防医学的に有効な量のオステオプロテゲリン（０ｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（ＯＰＧ）ポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体と併用して投与される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ＯＰＧポリペプチドが、
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）の変異体；又は、
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片を含む、請求項６に記載の使用。
より好ましくは、前記ＯＰＧポリペプチドは配列番号１５の前記配列を含み、又は配列番号１５の前記配列からなる。
【請求項８】
前記ＯＰＧポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１４のコーディング配列、
（ｂ）（ａ）に示された配列に対し遺伝コードの結果により縮重している配列；
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）に示された配列と少なくとも６０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする配列；又は、
（ｄ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）に示すいずれか１の配列の断片を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記疾病又は状態が骨関節炎、骨粗鬆症、骨癌、転移癌に伴う骨欠失、パゲット（Ｐａｇｅｔ）病、ゴーラムスタウト（Ｇｏｒｈｕｍ  Ｓｔｏｕｔ）病、原発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、骨折及び／又は人為的付替え関節（ｊｏｉｎｔ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）の無菌的弛緩、である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
薬学的若しくは予防医学的に有効な量のＴＳＧ−６ポリペプチド、又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象の骨疾病又は破骨細胞による骨吸収に伴う状態を必要に応じて治療又は予防する方法。
【請求項１１】
破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防する薬品の前記製造における、
（ａ）ＴＳＧ−６ポリペプチド、又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）ＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体
の使用。
【請求項１２】
破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態の治療又は予防における、同時、個別又は逐次的使用のための、
（ａ）ＴＳＧ−６ポリペプチド、又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）ＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体；を含有する製剤。
【請求項１３】
破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を、
（ａ）ＴＳＧ−６ポリペプチド、若しくはＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｂ）ＯＰＧポリペプチド、若しくはＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはＯＰＧ模倣体；
を同時、個別又は逐次的に投与し、併用して治療又は予防するための薬品の製造における、（ａ）又は（ｂ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）は関節炎の保護機能を有する炎症に誘導されるタンパクである。ＴＮＦ刺激遺伝子６の、〜３５キロダルトンの分泌産物である前記ＴＳＧ−６は、炎症誘起物及び成長因子に呼応して発現されるが、健康な組織においては前記タンパクは殆んど全く発現しないことが知られている(Milner & Day (2003) J. Cell Sci. 116, 1863-1873)。
【０００３】
ＴＳＧ−６は炎症に対応して誘導されるが、抗炎症性及び関節保護特性を有し、関節損壊に対する内在的抑制材とされている。この点に関してＴＳＧ−６は、好中球移動の抑制、プラスミン活性の下方制御、及びヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）（ＨＡ）鎖のクロスリンク等、すべてその関節保護特性に寄与するであろう広範な生物学的活性を有することが知られてきた(Wisniewski et al., (1996) J Immunol. 156, 1609-1615; 及びMilner et al, (2006) Biochem. Soc. Trans. 34, 446-450)。
【０００４】
ＴＳＧ−６は、隣接するＬｉｎｋ及びＣＵＢ＿Ｃ領域の殆んどすべてを含み、種々のタンパク及びグリコサミノグリカン  リガンド（ＨＡ、コンドロイチン−４−硫酸、アグレカン、インタ−α−インヒビター（ＩαＩ）、ペントラキシン−３、トロンボスポンジン−１、フィブロネクチン、及びヘパリン／硫酸ヘパランを含む）に結合するが、これらの相互作用の大半は、そのＬｉｎｋモジュール領域を通じて仲介される。突然変異研究によれば、Ｌｉｎｋモジュールには少なくとも３の非重複リガンド結合表面が存在することが分かった(Mahoney et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 27044-27055; 及びKuznetsova et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 30899-30908)。現在、ＣＵＢ＿Ｃ領域で同定されている唯一のリガンドはフィブロネクチンである(DJ Mahoney & AJ Day, 未発表データ)。更に、この領域は２価のカチオン結合サイトを含んでいる(Rugg et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 25674-25686)。
【０００５】
ＴＳＧ−６は、リューマチ性関節炎（ＲＡ）等の炎症性疾病の研究において検出され、関節滑液、軟骨及び滑液に存在する。その発現が培養ヒト軟骨細胞中でＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β及びＰＤＧＦにより誘導され得ること、及びＲＡ患者の滑液細胞により構成的に発現され、その生産がＩＬ−１、ＴＮＦ及びＩＬ−１７処理により更に増強されることから、ＴＳＧ−６は関節組織で局所的に生産されると見られる(Milner et al, (2006) Biochem. Soc. Trans. 34, 446-450)。
【０００６】
重要なことには、多くの最近の研究において、ＴＳＧ−６が関節炎の実験モデルで保護的な役割を果たしていることが明らかにされた。例えば、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ；ヒトＲＡと同様な皮膚病理を伴う自己免疫性多発関節炎）のモデルにおいては、ＴＳＧ−６組換えマウス又は組換えヒトＴＳＧ−６により全身的に処理された野生型マウスで発症が遅延し、病状と関節の炎症／損壊の双方の軽減がみられた(Mindrescu et al. (2000) Arthritis Rheum. 43, 2668-2677; 及びMindrescu et al. (2002) Arthritis Rheum. 46, 2453-2464)。ＴＳＧ−６組換え動物では、抗ＴＮＦ抗体処理に比較して改善効果がみられた。更に、軟骨特化ＴＳＧ−６組換えマウスでは、抗体誘導関節炎（ＡＩＡ；単一関節関節炎のモデル）の刺激が、ＭＭＰ及びアグレカナーゼ（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）によるアグレカン分解の軽減によって、コントロールと比較すると軟骨の損傷を遅延させ、これらの動物では発症後４−５週で軟骨再生の証拠がみられた(Giant et al. (2002) Arthritis Rheum. 46, 2207-2218)。同様な軟骨保護効果が、組換えネズミＴＳＧ−６をＡＩＡ罹患関節に直接注射、又はプロテオグリカン誘導関節炎に静脈注射した野生型マウスにおいてみられた（ＰＧＩＡ、ヒトＲＡのモデル) (Bardos et al. (2001) Am. J. Pathol. 159, 1711-1721)。
【０００７】
これらの研究で観察されたＴＳＧ−６の抗炎症及び軟骨保護効果は、１又は２以上のメカニズムによると思われる。最も重要なことは、ＴＳＧ−６が好中球の生体内噴出に対する強力な抑制剤であって、プラスミンが例えばそのＭＭＰ活性化を通じて、炎症中のタンパク分解のキー制御因子となっている場面で、ＩαＩの抗プラスミン効果を強化することによるプロテアーゼネットワークの抑制に関与していることである(Wisniewski et al. (1996) J. Immunol. 156, 1609-1615; 及びGetting et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 51068-51076)。この点では、ＴＳＧ−６を欠くマウスは、急速かつ広範な軟骨損傷と骨崩壊によりコントロールより加速的ではるかに激しい形のＰＧＩＡを展開する(Szanto et al. (2004) Arthritis Rheum. 50, 3012-3022)。好中球の浸透及びプラスミン効果の増加がＴＳＧ−６-/-マウスにおけるこれらの効果を説明していると示唆される。
【０００８】
発明の開示
本発明によりＴＳＧ−６が破骨細胞による骨吸収を抑制することが示された。破骨細胞は単核白血球マクロファージ系列に由来する大型の多核細胞であり、骨吸収の過程で骨の基質及び鉱物質を分解する。本発明者らは更に、ＴＳＧ−６ノックアウトマウスにおけるＴＳＧ−６の不在が破骨細胞による骨吸収の増加をもたらすことを示した。本発明者らは、ＴＳＧ−６が破骨細胞による骨吸収に伴う骨疾患又は状態の治療又は予防に有用であることを示した。本発明者らは更に、ＴＳＧ−６を併用するオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の投与が相乗的な結果を生ずることを示した。ＴＳＧ−６及びＯＰＧの併用は、破骨細胞による骨吸収を各要素単独の場合の和より大きく抑制した。
【０００９】
本発明に従って、破骨細胞による骨吸収に伴う骨疾病又は状態を治療又は予防するための薬品の製造における、ＴＳＧ−６ポリペプチド、又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。更に好ましい態様では、前記薬品は、治療上又は予防上有効な量のＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体と併用して投与される。
【００１０】
本発明は更に、対象（者）の破骨細胞による骨吸収に伴う骨疾病又は状態を、必要な場合に治療又は予防する方法を提供するが、その方法は、治療上又は予防上に有効な量のＴＳＧ−６ポリペプチド、若しくはＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。更に好ましい態様においては、その方法は、更に治療上又は予防上有効な量のＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体を前記対象に投与することを含む。
【００１１】
本発明は更に；
破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防する薬品の製造における、
（ａ）ＴＳＧ−６ポリペプチド、若しくはＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）ＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくはＯＰＧ模倣体の使用、
破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態の治療又は予防における、同時、個別又は逐次的な使用のための、
（ａ）ＴＳＧ−６ポリペプチド、又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｂ）ＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体；を含有する製剤、並びに
破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を、
（ａ）ＴＳＧ−６ポリペプチド、又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｂ）ＯＰＧポリペプチド、又はＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体；を同時、個別又は逐次的に投与し、併用して治療するための薬品の製造における、
（ａ）又は（ｂ）の使用；
を提供する。
【００１２】
本発明の一つの利点は、ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、破骨細胞による骨吸収抑制に加えて、抗炎症性及び／又は軟骨保護効果を持ち得ることである。これらの抗炎症性及び／又は軟骨保護効果は、好中球移動、プラスミン活性の下方制御及び／又はＨＡ鎖のＴＳＧ−６仲介によるクロスリンクの結果から生じ得る。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、破骨細胞による骨吸収に伴う骨疾病又は状態を治療又は予防する方法を提供するが、その方法は、治療上又は予防上に有効な量のＴＳＧ−６ポリペプチド又はＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。更に好ましい態様においては、その方法は、更に治療上又は予防上有効な量のＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体を前記対象（者）に投与することを含む。
【００１４】
ＴＳＧ−６ポリペプチド
ＴＳＧ−６ポリペプチドは、好ましくはヒトＴＳＧ−６、若しくはＲＡＮＫＬ結合活性を保つヒトＴＳＧ−６の変異体又は断片である。前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは破骨細胞による骨吸収を抑制する能力がある。前記変異体は霊長類、マウス又はラット等他の生物由来のＴＳＧ−６ポリペプチドであってもよい。
【００１５】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは、好ましくは、
（ａ）配列番号２若しくは５のアミノ酸配列；
（ｂ）前記配列番号２若しくは５のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＮＦκＢ受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）との結合活性を有する（ａ）の変異体；又は、
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片を含む。
【００１６】
更に好ましくは、前記ポリペプチドは配列番号２若しくは５の配列を含むか、又はそれらからなる。
【００１７】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは、更にシグナル配列を欠いていてもよい。従って、ＴＳＧ−６ポリペプチドは、好ましくは：
（ａ）配列番号３若しくは６のアミノ酸配列；
（ｂ）前記配列番号３若しくは６のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬ結合活性を有する変異体；又は、
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片を含む。
【００１８】
更に好ましくは、前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは配列番号３又は６の配列からなる。
【００１９】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは更に、ＣＵＢ＿Ｃ領域を欠いていてもよい。前記ＣＵＢ＿Ｃ領域は配列番号２又は５の１２９−２７７残基に相当する。前記ＴＳＧ−６ポリペプチドはヒトＴＳＧ−６のＬｉｎｋモジュールのみを含むことができる。前記Ｌｉｎｋモジュールは配列番号２及び５の３７−１２８残基に相当し、配列番号７に示される。前記ＬｉｎｋモジュールはＴＳＧ−６とヒアルロナン（ＨＡ）との結合活性、コンドロイチン−４−硫酸との結合活性、アグレカンとの結合活性、インター−α−インヒビター（ＩαＩ）との結合活性、ビクニンとの結合活性、ベルシカンとの結合活性、硫酸デルマタンとの結合活性、ペントラキシン３との結合活性、トロンボスポンジン−１との結合活性、ヘパリン／硫酸ヘパランとの結合活性及びＲＡＮＫＬとの結合活性の要因である。従って、前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは好ましくは：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を保ち、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する配列番号７のアミノ酸配列の変異体；又は
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片を含む。
【００２０】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは好ましくは配列番号７に示される配列からなる。
【００２１】
配列番号９は、ＴＳＧ−６のＬｉｎｋモジュール（Ｌｉｎｋ＿ＴＳＧ−６）を含む組換えポリペプチドを示す。従って、本発明で使用されるＴＳＧ−６ポリペプチドは好ましくは：
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を保ち、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する配列番号９のアミノ酸配列の変異体；又は
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片
を含む。
【００２２】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは好ましくは配列番号９に示される配列からなる。
【００２３】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは更に、Ｌｉｎｋモジュールを欠いていてもよい。前記Ｌｉｎｋモジュールは配列番号２及び５の３７−１２８残基に相当する。前記ＴＳＧ−６ポリペプチドはヒトＴＳＧ−６のＣＵＢ＿Ｃ領域のみを含み得る。前記ＣＵＢ＿Ｃ領域は配列番号２及び５の１２９−２７７残基に相当し、配列番号１０及び１１に示される。前記ＣＵＢモジュールは更に、ＴＳＧ−６のフィブロネクチン結合活性及びＴＳＧ−６のＲＡＮＫＬとの結合活性の要因となる。従って前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは：
（ａ）配列番号１０若しくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１０若しくは１１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を保ち、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）の変異体；又は
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片
を含む。
【００２４】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは好ましくは配列番号１０又は１１に示される配列からなる。
【００２５】
配列番号１３はＴＳＧ−６（ＣＵＢ＿Ｃ＿ＴＳＧ−６）のＣＵＢ＿Ｃ領域を含む組換えポリペプチドを示す。従って、本発明において使用される前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは：
（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を保ち、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）の変異体；又は
（ｃ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片
を含む。
【００２６】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは好ましくは配列番号１３に示される配列からなる。  
【００２７】
変異ポリペプチドはそのアミノ酸配列が配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１３の配列から異なるが、ＴＳＧ−６の機能を保っている配列である。それ故、前記変異プリペプチドは、破骨細胞による骨吸収を抑制する。前記変異ポリペプチドはＲＡＮＫＬと結合する。
【００２８】
前記変異ポリペプチドはまた、典型的にＨＡ、コンドロイチン−４−硫酸、アグレカン、インター−α−インヒビター（ＩαＩ）、ビクニン、ベルシカン、硫酸デルマタン、ペントラキシン３、トロンボスポンジン−１、ヘパリン／硫酸ヘパラン及び／又はフィブロネクチンと結合する。前記変異ポリペプチドはまた、抗炎症及び／又は軟骨保護効果を示すことができる。
【００２９】
前記変異ポリペプチドの結合能力は、本発明に従って処置された対象に異なる効果を現すよう変更することができる。例えば、インター−α−インヒビター（ＩαＩ）に結合することができない変異ポリペプチドは対象に抗炎症効果を与えることができないであろう。あるいはまた、ＨＡに結合できない変異ポリペプチドは対象に軟骨保護効果を出す事ができないかも知れない。
【００３０】
典型的には、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１３のアミノ酸配列と、約５０％、５５％又は６５％を超える同一性を、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の、また特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドはＴＳＧ−６タンパクの変異体と考えられる。このような変異体は、前記ペプチドがＴＳＧ−６の基本的な機能を保持する限り、アレル変異体及びタンパク配列の中で単一のアミノ酸又はアミノ酸グループの欠失、変更若しくは挿入を含む。配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１３の変異体の同一性は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１３に示される配列の、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００若しくは少なくとも２５０又はこれを超える範囲にわたる隣接アミノ酸によって、また更に好ましくは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１３の全長にわたって測定される。
【００３１】
Mahoney et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 22764-22771 及び Blundell et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 49261- 49270 によれば、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列の変異体は、好ましくはヒアルロナン結合に必須とされる残基を含む。配列番号２又は５のアミノ酸配列の変異体は、好ましくは、配列番号２又は５の残基Ｌｙｓ−４６及び／又はＴｙｒ−４７及び／又はＴｙｒ−９４及び／又はＰｈｅ−１０５及び／又はＴｙｒ−１１３の残基を含む。最も好ましくは、配列番号２又は５の変異体は配列番号２又は５のＬｙｓ−４６、Ｔｙｒ−４７、Ｔｙｒ−９４、Ｐｈｅ−１０５及びＴｙｒ−１１３の各残基を含む。
【００３２】
配列番号３又は６のアミノ酸配列の変異体は、好ましくは、配列番号３又は６の残基Ｌｙｓ−２９及び／又はＴｙｒ−３０及び及び／又はＴｙｒ−７７及び及び／又はＰｈｅ−８８及び／又はＴｙｒ−９６の残基を含む。最も好ましくは、配列番号３又は６の変異体は並列番号３又は６のＬｙｓ−２９、Ｔｙｒ−３０、Ｔｙｒ−７７、Ｐｈｅ−８８及びＴｙｒ−９６の各残基を含む。
【００３３】
配列番号７のアミノ酸配列の変異体は、好ましくは、配列番号７の残基Ｌｙｓ−１０及び／又はＴｙｒ−１１及び／又はＴｙｒ−５８及び／又はＰｈｅ−６９及び／又はＴｙｒ−７７の残基を含む。最も好ましくは、配列番号７の変異体は配列番号７のＬｙｓ−１０、Ｔｙｒ−１１、Ｔｙｒ−５８、Ｐｈｅ−６９及びＴｙｒ−７７の核残基を含む。
【００３４】
配列番号９のアミノ酸配列の変異体は、好ましくは配列番号９の残基Ｌｙｓ−１２及び／又はＴｙｒ−１３及び／又はＴｙｒ−６０及び／又はＰｈｅ−７１及び／又はＴｙｒ−７９の残基を含む。最も好ましくは、配列番号９の変異体は、配列番号９のＬｙｓ−１２、Ｔｙｒ−１３、Ｔｙｒ−６０、Ｐｈｅ−７１及びＴｙｒ−７９の各残基を含む。
【００３５】
アミノ酸の同一性はいずれかの適当なアルゴリズムによっても計算することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージには、相同性を計算することができる（例えばそのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムが提供されている(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395)。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムは、（典型的にはこれらのデフォルト設定で）同一性を計算するため、又は配列を並べるために使用することができる（例えばAltschul (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300; Altschul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215, 403-10に記載されている）。
【００３６】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）により公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列の中にある同じ長さのワードにアラインメントさせたときに、ある正の値の閾値スコアＴに一致する又はこれを満たす、クエリー配列の中の長さＷの短いワードを同定することにより、スコアの高い配列ペア（High scoring sequence pair, HSPs）を同定する工程を含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）と呼ばれる（Altschul et al, 1990）。これらの最初の近傍ワードのヒットは、これらを含むＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして機能する。前記ワードヒットを各配列に沿って両方向に、累積アラインメントスコアができる限り高くなるまで長く伸長させる。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の時に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値よりも量Ｘだけ低下したとき；１つ以上の負のスコアの残基アラインメント（negative-scoring residue alignment）の累積により累積スコアがゼロ以下になるとき；又はいずれかの配列の端部に到達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、ワード長(Ｗ)＝１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff及びHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919参照）アラインメント(Ｂ)＝５０、期待値(Ｅ)＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００３７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間で類似性の統計的分析を行う。例えばKarlin及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの基準は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間で一致が偶然起こる確率を示す最小合計確率（the smallest sum probability）Ｐ(Ｎ)である。例えば、第１の配列を第２の配列と比較したときの最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、該配列は他方の配列に類似しているとみなされる。
【００３８】
前記変異体は典型的に、少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０又はそれを超える突然変異（アミノ酸の置換、欠失又は挿入が起こり得る）により異なる。例えば、１から５０、２から３０、３から２０、又は５から１０アミノ酸の置換、欠失又は挿入が起こり得る。変更されたポリペプチドは通常、ＲＡＮＫＬ結合性を保持している。前記置換は好ましくは、例えば次の表のような保守的な置換である。第２カラムの同一ブロックの、より好ましくは第３カラムの同一行のアミノ酸が互いに置換される。
2009532334.tif 000002
【００３９】
本発明において使用される前記ＴＳＧ−６ポリペプチドの前記断片はＴＳＧ−６の機能を保持している。それ故、前記ポリペプチド断片は破骨細胞による骨吸収を抑制する。前記ポリペプチド断片はＲＡＮＫＬに結合する。
【００４０】
前記ポリペプチド断片はまた、典型的にＨＡ、コンドロイチン−４−硫酸、アグレカン、インター−α−インヒビター（ＩαＩ）、ビクニン、ベルシカン、硫酸デルマタン、ペントラキシン３、トロンボスポンジン−１、ヘパリン／硫酸ヘパラン及び／又はフィブロネクチンと結合する。前記ポリペプチド断片は更に抗炎症及び／又は軟骨保護効果を示すことができる。
【００４１】
前記ポリペプチド断片の結合活性は、本発明に従って処置された対象に異なる効果を現すよう変更することができる。例えば、インター−α−インヒビター（ＩαＩ）に結合することができないポリペプチド断片は対象に抗炎症効果を与えることができないであろう。あるいはまた、ＨＡに結合できないポリペプチド断片は対象に軟骨保護効果を出す事ができないかも知れない。
【００４２】
本発明で使用される前記ＴＳＧ−６ポリペプチドの前記断片は、ＴＳＧ−６のＲＡＮＫＬ結合活性を保持する限り、典型的に少なくとも１０、例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又はそれを超える長さのアミノ酸、更に１００、１５０、２００、２５０に至る長さのアミノ酸である。より好ましくは、前記ＴＳＧ−６ポリペプチドの前記断片は配列番号７に示される配列を含む。Mahoney et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 22764-22771及びBlundell et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 49261-49270 によれば、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列の断片は、好ましくはヒアルロナン結合に必須であるとされる残基を含む。配列番号２又は配列番号５のアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号２又は配列番号５の残基Ｌｙｓ−４６及び／又はＴｙｒ−４７及び／又はＴｙｒ−９４及び／又はＰｈｅ−１０５及び／又はＴｙｒ−１１３の残基を含む。最も好ましくは、配列番号２又は配列番号５のアミノ酸配列の断片は、配列番号２又は５のＬｙｓ−４６、Ｔｙｒ− ４７、Ｔｙｒ−９４、Ｐｈｅ−１０５及びＴｙｒ−１１３の各残基を含む。
【００４３】
配列番号７のアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号７の残基Ｌｙｓ−１０及び／又は Ｔｙｒ−１１及び／又はＴｙｒ−５８及び／又はＰｈｅ−６９及び／又はＴｙｒ−７７の残基を含む。最も好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列の断片は、配列番号７のＬｙｓ−１０、Ｔｙｒ−１１、Ｔｙｒ−５８、Ｐｈｅ−６９及びＴｙｒ−７７の各残基を含む。
【００４４】
配列番号９のアミノ酸配列の断片は、好ましくは配列番号９の残基Ｌｙｓ−１２及び／又は Ｔｙｒ−１３及び／又はＴｙｒ−６０及び／又はＰｈｅ−７１及び／又はＴｙｒ−７９の残基を含む。最も好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列の断片は、配列番号９のＬｙｓ−１２、Ｔｙｒ−１３、Ｔｙｒ−６０、Ｐｈｅ−７１及びＴｙｒ−７９の各残基を含む。
【００４５】
本発明において使用する好ましい断片は、配列番号１の３６−１３３残基である。
【００４６】
本発明において使用する前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは、化学的修飾、例えば翻訳後修飾を受けていても良い。例えば、それらはグリコシル化、燐酸化されていてもよく、修飾アミノ酸残基を含んでいてもよい。その精製を助けるためのヒスチジン残基付加、又は細胞膜への挿入を促進するためのシグナル配列の付加等の修飾を受けても良い。この様な修飾ポリペプチドも本発明で用いる用語“ポリペプチド”の範囲に含まれる。
【００４７】
前記ＲＡＮＫＬ結合活性は適切なアッセイ手段により測定される。例えば、ＴＳＧ−６ポリペプチドの前記ＲＡＮＫＬ結合活性は、本実施例に記載される方法を用いて測定される。ＴＳＧ−６ポリペプチドがＨＡ、コンドロイチン−４−硫酸、アグレカン、インター−α−インヒビター（ＩαＩ）、ビクニン、ベルシカン、硫酸デルマタン、ペントラキシン３、トロンボスポンジン−１、ヘパリン／硫酸ヘパラン及びフィブロネクチンと結合する能力を測定する適切なアッセイは周知の技術である(Getting et al.(2002) J. Biol. Chem. 277, 51068-51076; Mahoney et al. (2005) J. Biol. Chem. 280,27044-27055; Salustri et al. (2004) Development 131, 1577-1586; Parkar et al.(1997) FEBS Lett. 410, 413-417; Parkar et al. (1998) FEBS Lett. 428, 171-176; Mahoney et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 22764-22771 ; Nentwich et al. (2002) J.Biol Chem. 277, 15354-15362; 及びKuznetsova et al. (2005) J. Biol. Chem. 280,30899-30908)。
【００４８】
本発明に従って前記ＴＳＧ−６ポリペプチドを使用することにより、その破骨細胞による骨吸収を抑制する能力が示される。破骨細胞の抑制活性は適切なアッセイにより測定することができる。例えば、ＴＳＧ−６ポリペプチドの破骨細胞抑制活性は下記実施例に記載されるいかなる方法によっても決定することができる。
【００４９】
本発明に従うＴＳＧ−６ポリペプチドの使用は、実質的に単離された方法であるかも知れない。前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの意図された目的とは干渉しない基剤又は希釈剤と混合されるかも知れないが、それでもやはり実質的に単離されているとみなされる。本発明において使用されるポリペプチドは、更に実質的に精製された形であり、本発明のポリペプチドは、一般に製剤中５０％重量、例えば８０％、９０％、９５％又は９９％重量を超えるポリペプチドを含有している。
【００５０】
本発明において使用されるＴＳＧ−６ポリペプチドは、天然のポリペプチドであろう。ポリペプチドはＴＳＧ−６ポリペプチドを発現する、適切な生物なら如何なるものから分離されても良い。前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは、ヒト又は霊長類、ラット又はマウス等、他の適切な動物から分離されてよい。本発明において使用されるポリペプチドは、更にこれらの分離されたポリペプチドの断片として調製されても良い。
【００５１】
更に前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは、合成されたり組換え手法によって作製されても良い。例えば、組換えＴＳＧ−６ポリペプチドは、適切な制御配列と実施可能にリンクされたポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターによって培養細胞をトランスフェクトし、その細胞を培養し、細胞が生産した前記ＴＳＧ−６ポリペプチドを抽出し、精製することにより生産されても良い。ポリペプチドの組換え生産方法は周知の技術である(例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Harbour Laboratory Pressを参照)。
【００５２】
本発明において使用されるＴＳＧ−６ポリペプチドのアミノ酸配列は、自然には存在しないアミノ酸を含んだり、化合物の安定性を増加させたりするため修飾されても良い。前記ポリペプチドが合成手段により生産される場合には、そのようなアミノ酸は生産過程で導入されるかもしれない。前記ポリペプチドは更に、合成又は組換えの後に修飾されても良い。
【００５３】
本発明において使用されるＴＳＧ−６ポリペプチドはまた、Ｄ−アミノ酸を用いて製造されても良い。そのような場合には、ＣからＮへの方向を逆転してリンクされるであろう。これはそのようなポリペプチドを製造する上で慣用的な技術である。
【００５４】
多くの側鎖修飾法は公知の技術で、前記ポリペプチドが破骨細胞抑制能力を保持する限り、前記ＴＳＧ−６ポリペプチドの側鎖にも応用されるであろう。
【００５５】
ＴＳＧ−６ポリヌクレオチド
本発明に従って、ＴＳＧ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、変異体又は断片が破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療し又は予防するために使用される。特に、前記ポリヌクレオチドは好ましくは、（ａ）配列番号１、４、８若しくは１２のコーディング配列；（ｂ）（ａ）に示された配列に対し遺伝コードの結果により縮重している配列；（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）に示された配列と少なくとも６０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする配列；又は、（ｄ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）に示されるいずれか１の配列の断片；を含むか又はそれからなる。前記ポリヌクレオチドは好ましくは、（ａ）配列番号１、４、８若しくは１２のコーディング配列；（ｂ）（ａ）に示された配列に対し遺伝コードの結果により縮重している配列；（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）に示された配列と少なくとも６０％の同一性を有し、破骨細胞による骨吸収を抑制する能力を有するポリペプチドをコードする配列；又は、（ｄ）破骨細胞による骨吸収を抑制する能力を有するポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）に示されるいずれか１の配列の断片；を含むか又はそれからなる。
【００５６】
典型的には、前記ＴＳＧ−６ポリヌクレオチドはＤＮＡである。しかしながら前記ポリヌクレオチドはＲＮＡポリヌクレオチドであっても良い。前記ポリヌクレオチドは単鎖又は２重鎖でもよく、合成又は修飾ヌクレオチドをその中に含んでも良い。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的に、配列番号１、４、８又は１２のコーディング配列又はその相補的配列とバックグラウンドを有意に超えるレベルでハイブリダイズする。バックグラウンドハイブリダイゼイションは、例えば、ＤＮＡライブラリーに存在する他のＤＮＡによって起こり得る。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１、４、８又は１２のコーディング配列又はその相補的配列との間で形成される交互作用のシグナルレベルは、典型的には少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、他のポリヌクレオチドと配列番号１、４、８又は１２のコーディング配列との間の交互作用よりも強烈である。交互作用の強度は、例えば、プローブを３２Ｐで放射線標識することにより測定され得る。選択的ハイブリダイゼイションは典型的に、培地条件のストリンジェンシーを高めることにより達成される。しかしながら、このようなハイブリダイゼイションは公知技術のすべての適当な条件によって実現することができる(Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Harbour Laboratory Press参照)。例えば、高ストリンジェンシーが要求される時には、６０℃−６５℃で０．１−０．２×ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）が適切な条件に含まれる。もし低ストリンジェンシーが要求される時には６０℃で２×ＳＳＣが適切な条件に含まれる。
【００５８】
配列番号１、４、８又は１２のコーディング配列は、ヌクレオチド置換例えば１、２又は３−１０、２５、５０、１００、１５０又は２００置換により変更され得る。配列番号１、４、８又は１２のコーディング配列は、２者択一に又は付加的に１又は２以上の挿入及び／又は欠失、及び／又はいずれか又は双方の末端の延長により変更され得る。シグナル配列等の付加的な配列もまた含まれる。前記変更ポリヌクレオチドはＲＡＮＫＬ結合活性を有するポリペプチドをコードする。前記変更ポリヌクレオチドは、以上で論議されたいかなる変異体や断片をもコードすることができる。縮重置換が可能であり及び／又は前表に示されたように、変更された配列が翻訳されるとき保守的なアミノ酸の置換になるような置換もまた可能である。
【００５９】
配列番号１、４、８又は１２のＤＮＡコーディング配列に相補的な配列と選択的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列は、一般的に  配列番号１、４、８又は１２のコーディング配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、少なくとも６０、更に好ましくは少なくとも１００の隣接ヌクレオチド範囲、又は最も好ましくは配列番号１、４、８又は１２の全長、又は配列番号２、５、９又は１３に示される配列を有するポリペプチドをコードする配列番号１、４、８又は１２の長さにわたる配列に対して有するであろう。配列同一性は例えば、上述した適切ないかなる手法によっても決定することができる。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドを定義するために、上述した配列同一性の程度及び最小のサイズのあらゆる組み合わせは、より好ましい更に厳しいストリンジェント条件（すなわち、より長い範囲にわたるより高い配列同一性）に対しても利用することができる。従って、例えば、２０、より好ましくは３０ヌクレオチドにわたる少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドも、４０ヌクレオチドを超える少なくとも９５％の配列同一性と同様に本発明の１態様を示す。
【００６１】
ポリヌクレオチドの断片は、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５又は少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０又は少なくとも４０ヌクレオチドの長さを有するであろう。それらは、典型的には４０、５０、６０、７０、１００又は１５０ヌクレオチドに至る長さであろう。断片は、１５０ヌクレオチドより長くはなく、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ヌクレオチドに至る長さ、あるいは配列番号１、４、８又は１２のコーディング配列に数ヌクレオチド、例えば５、１０又は１５ヌクレオチド及ばない長さも可能である。
【００６２】
本発明に使用するポリヌクレオチドは、組換えにより、合成により、又はこの技術分野で利用可能ないかなる手法で生産することもできる。それらはまた、標準的な技術でクローニングすることもできる。前記ポリヌクレオチドは、典型的には単離され及び／又は精製された形で提供される。
【００６３】
一般に、短いポリヌクレオチドは要求される核酸配列を、一度に１ヌクレオチドのステップワイズ生産法を含む合成手法で製造する。これを自動的に達成する技術は既に利用可能である。
【００６４】
より長いポリヌクレオチドは一般に、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）クローニング技術を利用する組換え手法により製造される。この手法は、クローニングしたいＴＳＧ−６遺伝子の範囲に一対のプライマー（約１５−３０ヌクレオチドの）を作製し、前記プライマーをバクテリア細胞から取得したＤＮＡに接触させ、必要とする範囲の増幅を促す条件下でポリメラーゼチェイン反応を行い、増幅された断片を分離（反応混合物をアガロースゲル上で精製）しそして増幅されたＤＮＡを回収する過程を含む。プライマーは増幅されたＤＮＡ適当なクローニングベクターにクローンできるよう、適切な制限酵素認識部位を含むように設計されよう。
【００６５】
このような手法は、これまでに記載されたＴＳＧ−６遺伝子配列のすべて又は一部を取得するために利用される。一般に、ここに記載された手法は公知の技術ではあるが、特に以下の文献を参照されたいSambrook et al., 2001 , Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Harbour Laboratory Press。
【００６６】
ここに記載されたＴＳＧ−６ポリヌクレオチドは、本発明における使用のために、試験管内、生体内又は生体外で前記ポリペプチドを製造するのに有益である。前記ポリペプチドは治療剤としてそれ自身で又は組換えタンパク合成に含まれて使用することができる。
【００６７】
本発明において使用するための前記ポリペプチドは典型的に組換え複製ベクターに合体する。前記ベクターは、適合したホスト細胞の中で核酸を複製させる。それ故、本発明において使用するためのポリペプチドは、複製ベクターの中にＴＳＧ−６ポリヌクレオチドを導入し、適合するホスト細胞の中に前記ベクターを導入しそして前記ベクターの複製を促す条件下でそのホスト細胞を成長させる。
【００６８】
好ましくは、前記ベクターはＴＳＧ−６ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。そのような発現ベクターは分子生物技術では日常的に構築され、例えばプラスミドＤＮＡ及び適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び他の、例えば、恐らく必要であり、そしてタンパク発現を可能にするために正しい方向に位置づけられているポリアデニレーションシグナル、のような要素の使用を含む。他の適切なベクターはこの分野に習熟した技術者には明らかであろう。この点において更に他の例については以下を引用するSambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Harbour Laboratory Press。
【００６９】
好ましくは、本発明において使用するためのベクター中におけるポリペプチドは、ホスト細胞によってコーディング配列の発現を提供できるコントロール配列と実施可能にリンクされたベクターである、すなわち前記ベクターは発現ベクターである。“実施可能にリンクした”の用語は並置を意味し、そこでは、記された構成部分（複数）が、それらの企図された態様で機能することが許される関係にある。コーディング配列と“実施可能にリンクした”プロモーターのような調節配列は、コーディング配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるように位置づけられている。
【００７０】
前記ベクターは例えば、任意に前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターであったり、任意に前記プロモーターのレギュレーターであったりしてもよいが、複製の起源から提供されたプラスミド、ウイルス又はファージであり得る。前記ベクターは典型的に生体内での使用に適合している。
【００７１】
プロモーター及び他の発現調節シグナルは、発現が設計されているホスト細胞と適合するよう選択できる。β―アクチンプロモーターのような哺乳類のプロモーターが使用されよう。組織特異的プロモーターが特に好ましい。モロニーネズミ白血病ウイルス長端末リピート（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ ＩＥプロモーター等のような）、又はＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）等のウイルス性プロモーターも更に利用され得る。ウイルス性プロモーターは技術分野ではただちに利用可能となっている。
【００７２】
前記ベクターは更に真核ゲノム配列、更に好ましくは哺乳類ゲノム配列と相同な配列を含むポリヌクレオチドを形成するポリヌクレオチドのフランキング配列を含むことができる。これにより、本発明のポリヌクレオチドを真核細胞のゲノムに相同組換えによって導入することが可能となる。特に、ウイルス配列がフランキングされた発現カセットを含むプラスミドベクターが、本発明のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に送達するのに適したウイルスベクターを調製するのに使用可能である。適切なウイルスベクターの他の例としては、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター及びレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス及びＨＰＶウイルス等を含むレトロウイルスがあげられる。これらのウイルスを利用した遺伝子移転手法はこの技術の習熟者には公知である。例えば、レトロウイルスベクターはホストゲノムに取り込むポリヌクレオチドに前記ポリヌクレオチドを安定して統合するために利用され得る。複製不全なアデノウイルスベクターはこれに反し、エピソームに止まり、それ故一過性な発現を可能にする。
【００７３】
ＯＰＧポリペプチド
本発明の１の好ましい態様では、ＯＰＧポリペプチドは破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防するためＴＳＧ−６と組み合わせて投与される。ＯＰＧポリペプチドは、好ましくはヒトＯＰＧ、又はＲＡＮＫＬ結合活性を有するヒトＯＰＧの変異体又は断片である。ＯＰＧポリペプチド破骨細胞による骨吸収を抑制する能力を有する。変異体は霊長類、マウス又はラット等の他の生物からのＯＰＧポリペプチドであり得る。
【００７４】
ＯＰＧポリペプチドは好ましくは：
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する（ａ）の変異体でＲＡＮＫＬ結合活性の受容体活性化因子を有する；又は
（ｄ）ＲＡＮＫＬ結合活性を有する（ａ）若しくは（ｂ）の断片
を含む。
【００７５】
好ましくは、ＯＰＧポリペプチドは配列番号１５の配列を含み、又はそれからなる。
【００７６】
典型的には、配列番号１５のアミノ酸配列と約５０％、５５％又は６５％を超える、好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％そして特に好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドはＯＰＧタンパクの変異体と考えられる。この様な変異体には、前記ペプチドがＯＰＧの基本的な機能性を有する限り、アレル変異体及びタンパク配列中の単一アミノ酸又はアミノ酸グループの欠失、変更又は挿入が含まれる。配列番号１５の変異体の同一性は、ＴＳＧ−６について既に論議した通り配列番号１５の種々の範囲に及んで測定され得る。変異体の配列は典型的には、ＴＳＧ−６について既に論議した通り配列番号１５から１又は２以上の突然変異により異なっている。
【００７７】
本発明で使用される前記ＯＰＧポリペプチドの断片はＯＰＧの機能を保持している。それ故、前記断片ポリペプチドは破骨細胞による骨吸収を抑制する。前記断片ポリペプチドはＲＡＮＫＬに結合する。
【００７８】
前記ＯＰＧポリペプチドの断片の結合活性は、ＴＳＧ−６について既に論議した通り変更され得る。
【００７９】
本発明において使用される前記ＯＰＧポリペプチドの断片は、ＴＳＧ−６について既に論議した通り、典型的に長さが少なくとも１０アミノ酸である。
【００８０】
本発明で使用される前記ＯＰＧポリペプチドは、ＴＳＧ−６について既に論議した通り、化学的に修飾されていても良い。
【００８１】
前記ＯＰＧポリペプチドのＲＡＮＫＬ結合活性及び破骨細胞抑制活性は、ＴＳＧ−６について既に論議した通り、決定することができる。
【００８２】
本発明で使用される前記ＯＰＧポリペプチドは、ＴＳＧ−６について既に論議した通り実質的に単離された形であろう。それらはＴＳＧ−６について既に論議した通り、天然のポリペプチド又は合成され又は組換え手法で作製されたものであっても良い。
【００８３】
本発明において使用されるＯＰＧポリペプチドの前記アミノ酸配列は、ＴＳＧ−６について既に論議したように、修飾されていても良い。
【００８４】
ＯＰＧポリヌクレオチド
本発明の好ましい１の態様では、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、変異体又は断片は、ＴＳＧ−６と併用して、破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防するために投与される。特に、前記ポリヌクレオチドは好ましくは：（ａ）配列番号１４のコーディング配列；（ｂ）（ａ）に示された配列に対し遺伝コードの結果により縮重している配列；（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）に示された配列と少なくとも６０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする配列；又は（ｄ）ＲＡＮＫＬとの結合活性を有するポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）に示されるいずれか１の配列の断片；を含むか又はそれからなる。  前記ポリヌクレオチドは好ましくは、（ａ）配列番号１４のコーディング配列；（ｂ）（ａ）に示された配列に対し遺伝コードの結果により縮重している配列；（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）に示された配列と少なくとも６０％の同一性を有し、破骨細胞による骨吸収を抑制する能力を有するポリペプチドをコードする配列；又は、（ｄ）破骨細胞による骨吸収を抑制する能力を有するポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）に示されるいずれか１の配列の断片；を含むか又はそれからなる。
【００８５】
典型的には、前記ＯＰＧポリヌクレオチドはＤＮＡである。しかしながら前記ポリヌクレオチドはＲＮＡポリヌクレオチドであっても良い。前記ポリヌクレオチドは単鎖又は２重鎖でもよく、合成又は修飾ヌクレオチドをその中に含んでも良い。
【００８６】
ＯＰＧポリヌクレオチドは、ＴＳＧ−６について既に論議した通り、配列番号１４のコーディング配列又はその相補体とハイブリダイズすることができる。ＴＳＧ−６について既に論議した通り、配列番号１４のコーディング配列は変更され得る。
【００８７】
配列番号１４のＤＮＡコーディング配列の前記相補配列と選択的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列は、ＴＳＧ−６について既に論議した通り、少なくとも２０隣接ヌクレオチド又は最も好ましくは配列番号１４の全長又は配列番号１５に示されるポリペプチドをコードする配列番号１４の長さにわたって、一般的に配列番号１４のコーディング配列と少なくとも６０％の同一性を有するであろう。
【００８８】
ポリヌクレオチド断片は好ましくは、ＴＳＧ−６について既に論議した通り、少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有するだろう。
【００８９】
本発明において使用するＯＰＧポリヌクレオチドは、ＴＳＧ−６について既に論議したあらゆる方法により作製できる。それらは、ＴＳＧ−６について既に論議した通り、ＯＰＧポリペプチドの作製のためにも利用できる。
【００９０】
ＯＰＧ模倣体
本発明の好ましい１の態様においては、ＯＰＧ模倣体はＴＳＧ−６と組み合わせて、破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防するために投与される。ＯＰＧ模倣体は、ＲＡＮＫＬと結合することにより破骨細胞による骨吸収を抑制する要素である。
【００９１】
ＯＰＧ模倣体は抗体のようなポリペプチドであり得る。前記ＯＰＧ模倣体は好ましくは、ＲＡＮＫＬと結合し抑制するＡｍｇｅｎのモノクローナル抗体、ＡＭＧ−１６２である。あるいはまた、前記ＯＰＧ模倣体は、ＲＡＮＫＬと結合し抑制することにより破骨細胞による骨吸収を抑制するポリペプチドであり得る。
【００９２】
疾病と状態
本発明に従って、ＴＳＧ−６ポリペプチド、又はポリヌクレオチドは破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防するために利用される。破骨細胞による骨吸収は破骨細胞による骨基質及び鉱物質の破壊である。破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態は破骨細胞による骨吸収率が異常となる疾病又は状態である。破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態は、破骨細胞が、前記疾病又は状態がみられない比較の対象者で観察される骨吸収（破壊）率よりも高い比率で再吸収（破壊）される疾病又は状態である。前記疾病又は状態は、破骨細胞による骨吸収率の増加を含む。
【００９３】
前記疾病又は状態は、同一対象における骨の生成率よりも高い骨の再吸収率を含み得る。前記疾病又は状態は、それ故、正味の骨量の損失を含み得る。あるいはまた、前記疾病又は状態は、同一対象における骨の生成率と同等又は低い骨の再吸収率をも含み得る。前記疾病又は状態は、正味骨量の損失がない場合も含み得る。前記疾病又は状態は、正味骨量の増加も含み得る。前記疾病又は状態は、前記疾病又は状態を伴わない比較の対象者で観察される正味骨量の増加率に比較して正味骨量増加の率が遅い場合をも含み得る。
【００９４】
前記疾病又は状態は、好ましくは骨関節炎、骨粗鬆症、骨癌、転移癌に伴う骨欠失、パゲット（Ｐａｇｅｔ）病、ゴーラムスタウト（Ｇｏｒｈｕｍ  Ｓｔａｕｔ）病、原発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、骨折及び／又は人為的付替え関節（ｊｏｉｎｔ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）の無菌的弛緩である。前記骨癌は、Ｅｗｉｎｇ肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫（巨骨細胞腫）及び／又は破骨細胞であり得る。骨欠失に至る転移癌は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌及び／又は成人Ｔ−細胞白血病であり得る。
【００９５】
前記対象は典型的には、マウス、ラット、霊長類（マモセット、又はサル等）のような哺乳動物対象（者）である。対象はヒト又はヒト以外の動物であり得る。対象がマウス、ラット又は霊長類のような動物の場合には、破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を誘導するための処置が可能である。次表は破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態のための動物モデルが存在するか、又は動物モデルでどのように破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態が誘導されるかを要約している。
【００９６】
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【００９７】
治療と予防
本発明は破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態を治療又は予防するためのＴＳＧ−６ポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用を提供する。処置は治療的又は予防的であることができる。
【００９８】
ＴＳＧ−６ポリペプチド及びポリヌクレオチドは疾病又は状態の１又は２以上の症候の開始を予防するために個体に投与され得る。この態様では、前記対象は無症候のことがある。前記対象は前記疾病に対する遺伝的傾向を有することもある。そのような個体に対しては、予防に有効なポリペプチド又はポリヌクレオチドの量が投与される。予防に有効な量とは、疾病又は状態の１又は２以上の症候の開始を予防する量である。
【００９９】
治療に有効な前記ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドの量とは、疾病又は
状態の１又は２以上の症候の改善に効果的な量である。好ましくは、治療される前記個体はヒトである。
【０１００】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドは前記対象に対しあらゆる適切な手段で投与され得る。ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、経口、口腔、肛門、肺、静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、関節内、等の腸管又は非経口的な経路、局所的又は他の適切な投与経路を通して投与され得る。
【０１０１】
前記ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドは前記対象に対して、治療を特定の場所に目標付けるよう投与されるであろう。例えば、前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは局所的に骨の表面に対して注射されるであろう。前記ＴＳＧ−６ポリペプチドは骨又は破骨細胞に結合する試薬と抱合されるであろう。前記ＴＳＧ−６ポリヌクレオチドに対しては、前記ＴＳＧ−６ポリペプチドをコードする発現ベクターが、例えば組織特異的プロモーター又はＲＮＡｉを用いることにより、ＴＳＧ−６の発現を特定の組織に指向するために使用される。
【０１０２】
これまでに記載された、いかなる前記ＴＳＧ−６ポリペプチド及びポリヌクレオチドの処方も、前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの特性及び治療すべき条件等の要因に依存するであろう。前記ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドは種々の調剤法により投与され得る。それは経口的に（例えばタブレット、トローチ、錠剤、水又は油への懸濁、分散性の粉状又は粒状）、非経口的、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、胸骨内、経皮的又は点滴等により投与されよう。前記ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドはまた座剤としても投与され得る。各特定の患者に対して内科医が必要な経路を決定できるだろう。
【０１０３】
典型的には、前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドは薬学的に許容される基剤又は希釈剤とともに調剤されるが、これは薬学的技術として通常の方法により実施される。薬学的基剤又は希釈剤は例えば、等張溶液であろう。例えば固形経口剤は、活性化合物とともに、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ又はポテトスターチ等の希釈剤；シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び／又はポリエチレングリコール等の潤滑剤；澱粉、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルローズ、カルボキシメチルセルローズ、又はポリビニルピロリドン等の結合剤；澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩又は澱粉グリコール酸ナトリウム等の分散剤；起沸性混合物；染料；甘味剤；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩等の加湿剤；更に薬剤の処方に用いられる一般的に毒性がなく薬学的に不活性な物質を含んでいても良い。これらの薬剤処方は、例えば混合、顆粒化、タブレット化、蔗糖コーティング、フィルムコーティング等の公知の方法で製造される。
【０１０４】
経口投与のための液状分散剤は、シロップ、乳化剤及び懸濁液であろう。シロップは基剤として例えばサッカロース又はサッカロースとグリセリン及び／又はマンニトール及び／又はソルビトールを含み得る。
【０１０５】
懸濁剤及び乳化剤は基剤としては例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルローズ、カルボキシメチルセルローズ、又はポリビニルアルコールが含まれる。筋肉注射のための懸濁液又は溶液は、活性化合物とともに薬学的に許容される基剤、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール等のグリコール及び、もし必要なら適量の塩酸リドカインが含まれても良い。
【０１０６】
静脈注射又は点滴用の溶液は、基剤として例えば、滅菌水が含まれ、好ましくはそれらは、滅菌され、水様で、等張食塩水溶液であろう。
【０１０７】
座剤としては、慣用の結合剤、及び基剤は例えば、ポリアルキレングリコール、又はトリグリセリドが含まれ、このような座剤は活性成分を０．５％−１０％、より好ましくは１％−２％の範囲で含有する混合物から作製されるであろう。
【０１０８】
経口製剤は例えば薬品級品質のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリド、セルローズ、炭酸マグネシウム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの混合物は溶液、懸濁液、タブレット、ピル、カプセル、遅効製剤又は粉剤とされ、活性成分を１０％−９５％、好ましくは２５％−７０％含有する。薬剤混合物が凍結乾燥される場合には、凍結乾燥された試料は投与に先立って、例えば懸濁液に再構成される。再構成は好ましくはバッファー中で行われる。
【０１０９】
患者に経口投与するカプセル、タブレット及びピルは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ“Ｓ”、Ｅｕｄｒａｇｉｔ“Ｌ”、セルロースアセテート、フタル酸酢酸セルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルローズ等を含む腸溶コーティングにより提供される。
【０１１０】
無針注射、例えば経皮的に、による送達に適した薬剤もまた使用され得る。
【０１１１】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドの治療に有効な量が投与される。薬量は特に、使用されるポリペプチド又はポリヌクレオチド；治療される患者の年齢、体重及び状態；投与経路；及び要求される養生法等種々のパラメタに従って決定されるだろう。再び、内科医が特定のいかなる患者に対しても、必要な投与経路及び薬量を決定できるだろう。典型的な１日当たりの薬量は、個々の抑制剤の活性、治療される対象の年齢、体重及び状態、疾病のタイプと劇症度及び投与の頻度と経路に従って、体重キログラム当たり約０．１−５０ｍｇ、好ましくは約０．１−１０ｍｇである。より好ましくは、日当たり薬量レベルは５ｍｇから２ｇである。
【０１１２】
上記のＴＳＧ−６ヌクレオチド配列及びそのような配列を含む発現ベクターは、更に上に要約したような薬剤処方として使用することができる。好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡ等の核酸、特にＤＮＡが治療される個体の細胞で発現可能な発現ベクターの形として提供される。ワクチンは裸のヌクレオチド配列を含み又はカチオン性リピド、ポリマー又はターゲットシステムとの組み合わせである。前記ワクチンはいかなる可能な手法によっても送達され得る。例えば、前記核酸は、好ましくは皮内注射、皮下注射又は筋肉注射等の注射によって導入され得る。あるいはまた、前記核酸は粒子媒介遺伝子送達のような核酸送達手段により直接経皮的に送達され得る。前記核酸は局所的に皮膚へ又は粘膜表面例えば鼻孔内、口内、膣内、直腸内へ投与され得る。
【０１１３】
核酸構造物の取り込みは、例えばトランスフェクション剤の使用を含むいくつかの公知のトランスフェクション技術によって促進され得る。これらの薬品の例には燐酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン等のカチオン剤、及びリポフェクタム及びトランスフェクタム等の脂質トランスフェクション剤が含まれる。投与される前記核酸の用量は変更され得る。典型的には、前記核酸は粒子媒介遺伝子送達では１ｐｇ−１ｍｇ、より好ましくは１ｐｇ−１０μｇの核酸、及び他の経路では１０μｇ−１ｍｇの範囲で投与される。
【０１１４】
本発明は更に血液のＴＳＧ−６ポリペプチドへの接触を含む、破骨細胞による骨吸収に伴う疾病又は状態に悩む患者から取り出された血液の治療法、体外の、を提供する。このようにＴＳＧ−６は血液の体外での治療のために使用され得る。前記ＴＳＧ−６は血漿又は血清のような１又は２以上の血液成分を処置するのに使用される。ここに記載される前記体外方法は患者の身体から既に取り出された血液に対し実施される。前記血液又は血液成分はＴＳＧ−６ポリペプチドと接触させられたのち、任意に前記患者に戻してもよい。
【０１１５】
併用療法
前記ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドは単独で又は薬学的に活性なエージェントと併用して投与され得る。１の態様においては、前記ＴＳＧ−６ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、長いペントラキシン３（ＰＴＸ３）と併用して投与されない。同一の態様では、本発明に従って製造された薬品は、ＰＴＸ３を含まない。
【０１１６】
より好ましい態様では、前記方法は対象に対して更に治療上又は予防上有効な量のＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体を投与することを含む。同一の態様では、前記薬品は、治療上又は予防上有効な量のＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体を併用して投与される。
【０１１７】
前記ＴＳＧ−６及びＯＰＧはシナジー的に作用する。換言すれば、ＴＳＧ−６及びＯＰＧ併用して投与すれば、破骨細胞による骨吸収を抑制する上で各単独効果の合計よりも大きな効果を有する。
【０１１８】
ＯＰＧポリペプチド、ポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体の治療上有効な量は、疾病又は状態の１又は２以上の症候を改善するのに有効な量である。予防上有効な量は、疾病又は状態の１又は２以上の症候開始を防ぐ量である。
【０１１９】
前記ＴＳＧ−６及びＯＰＧは同時に、分離して又は逐次的に投与され得る。もし同時に投与すれば、前記ＴＳＧ−６及びＯＰＧは、同一の薬品に又は別々の薬品に存在していても良い。もし分離して又は逐次的に投与されれば、前記ＴＳＧ−６及びＯＰＧはどういう順序で投与されても良い。
【０１２０】
典型的には、ＴＳＧ−６ポリペプチド及びＯＰＧポリペプチドが一緒に投与され、又はＴＳＧ−６ポリヌクレオチド及びＯＰＧポリヌクレオチドが一緒に投与される。しかしながら、ある態様では、ＴＳＧ−６がポリペプチド、一方ＯＰＧがポリヌクレオチドであり、またその逆であっても良い。
【０１２１】
前記ＯＰＧポリペプチド、ＯＰＧポリヌクレオチド又はＯＰＧ模倣体は、ＴＳＧ−６に関して既に論議した、いかなる手法で、いかなる処方でまたいかなる薬量でも投与することができる。
【０１２２】
以下の実施例は本発明を例示する。
【０１２３】
実施例：
以下の実験は、ＴＳＧ−６が骨再吸収の新規な抑制剤であることを示す。
【０１２４】
実施例１−ＴＳＧ−６による破骨細胞の抑制
全長ヒトＴＳＧ−６タンパクのＱ１４４アロタイプ（配列番号１に示す）をNentwich et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 15354-15362に記載のショウジョウバエＳ２細胞で発現させた。試験管内で破骨細胞の分化に及ぼすこの組換えタンパクの効果が測定された。ヒト単核白血球が破骨細胞に分化し、２１日間で骨―再吸収表現型を展開した。破骨細胞の活性は象牙質スライス上の孔隙再吸収の程度により測定した。ヒト単核白血球はｓＲＡＮＫＬ（ＮＦκＢリガンドの可溶性受容体活性化因子；３０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はＭ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養され、組換えＴＳＧ−６の存在又は不在下で骨再吸収活性が測定された。この培養システムへのＴＳＧ−６の付加は象牙質の劣化を実質的に低下させ（図１）、この効果は薬量に依存している（図２）。それ故、ＴＳＧ−６は破骨細胞による骨吸収を抑制する。
【０１２５】
実施例２−ＴＳＧ−６ノックアウトマウスにおける破骨細胞の活性
実施例１と同様の実験がＴＳＧ−６-/-マウスの長骨からの破骨細胞前駆体を用いて実行された。ｓＲＡＮＫＬ又はＭ−ＣＳＦ及びｓＲＡＮＫＬの存在下で培養すると、野生型のコントロール動物からの細胞に比較して、前記破骨細胞は試験管内の孔隙再吸収の顕著な増加を示した（図３）。これらの結果は、ＰＧＩＡの導入に続くＴＳＧ−６―欠損動物にみられるより激しい症候（骨劣化等）においても普遍的である。これらの試験はＴＳＧ−６が破骨細胞生成及び／又は破骨細胞の活性化に対する重要で新規な抑制剤であることを示す。
【０１２６】
実施例３−ＲＡＮＫＬと結合するＴＳＧ−６
ＲＡＮＫＬとその受容体ＲＡＮＫは骨再構成の鍵となるレギュレータで、特にＲＡに起こる骨欠失と関連付けられていきた。ＲＡＮＫＬは膜に結合したＴＮＦ−スーパーファミリーリガンドで、破骨細胞及びストローマ組織細胞により産生されるが、ＲＡＮＫは膜間シグナル分子で、単核破骨細胞前駆体の表面で発現する。ＲＡＮＫＬは、ＰＧＥ２、ＩＬ−１及びＴＮＦ等のカルシウム調節因子に対応してＲＡＮＫと結合し、この交互作用は破骨細胞の分化を誘導するのみならず、成熟した破骨細胞の骨再吸収活性を促進する(Tanaka et al. (2005) Immunol. Rev. 208, 30-49に総説あり)。まさに、ＲＡＮＫＬ（Ｍ−ＣＳＦと組み合わせて）は破骨細胞の分化を制御する主要な因子である(Quinn et al. (1998) Endocrinology 139, 4424-4427)。
【０１２７】
現在、ＲＡＮＫＬの可溶性おとり型受容体であるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は破骨細胞の成熟と活性化を試験管内で効果的に抑制するＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ交互作用の唯一の抑制剤であり(Simonet et al. (1997) Cell 89, 309-319)、ＯＰＧ活性の模倣体（ＡＭＧ１６２）が現在骨粗鬆症の治療に関する臨床試験中である。
【０１２８】
ＲＡＮＫＬは更にＲＡ患者からの滑液エフェクターＴ細胞の表面で発現し、ＡＩＡ（ヒトＲＡと共通な多くの特徴を有する）ラットの研究によれば、ＲＡＮＫＬが破骨細胞蓄積による関節損傷及び骨劣化に至る鍵となることが示され、ＯＰＧによる治療がこれらの結果に対する保護を提供した(Kong et al. (1999) Nature 402, 304-309)。
【０１２９】
実施例１及び２に示された骨再吸収に対するＴＳＧ−６の効果に基づいて、ＴＳＧ−6が直接にＲＡＮＫＬに対して有する交互作用が研究された。実施例１に示されたように組換え全長ＴＳＧ−６を発現させた。前記単離されたＬｉｎｋモジュール領域（Ｌｉｎｋ＿ＴＳＧ−６；配列番号９）をDay et al. (1996) Protein Express. Purif. 8, 1-16に従って大腸菌で発現させた。前記ＣＵＢ_Ｃ領域（ＣＵＢ_Ｃ＿ＴＳＧ−６；配列番号１３）を大腸菌で発現させた(DJ Mahoney及びAJ Day, 未発表)。全長ＴＳＧ−６，Ｌｉｎｋ＿ＴＳＧ−６又はＣＵＢ＿Ｃ＿ＴＳＧ−６を濃度のある範囲でマイクロタイタープレート上にコートし、ｓＲＡＮＫＬ（５ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）との結合をＲＡＮＫＬ−特化抗体により測定した。
【０１３０】
プレート結合アッセイの結果、全長ＴＳＧ−６、その単離されたＬｉｎｋモジュール領域（Ｌｉｎｋ＿ＴＳＧ−６；配列番号９）、及び単離されたＣＵＢ＿Ｃ領域（ＣＵＢ＿Ｃ＿ＴＳＧ−６；配列番号１３）のすべてがｓＲＡＮＫＬと結合したが、全長ＴＳＧ−６が前記単離領域より高い結合親和性を示した（図４）。このデータは、ＴＳＧ−６がＲＡＮＫＬ―誘導の破骨細胞生成／破骨細胞活性化をＲＡＮＫＬに直接結合することにより、恐らくＯＰＧに対してと同様に、抑制するのではないかと示唆している。
【０１３１】
実施例４−ＴＳＧ−６とＯＰＧの協働
我々のデータ（未発表）によれば、ＯＰＧ（公知のＲＡＮＫＬ抑制剤）と組み合わせたＴＳＧ−６は培養により作製された酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ＋）多核破骨細胞の数で測定された破骨細胞形成に対する抑制に協働効果を有することが示されている（すなわち、個々のタンパクが存在する実験に比較して、ＴＳＧ−６とＯＰＧの双方が存在する場合の方が破骨細胞形成がより強く抑制される）。ＴＳＧ−６とＯＰＧの前記協働効果を説明できる１の可能なメカニズムは、これら双方のタンパク質が安定な三つの要素から成る複合体を作って同時にＲＡＮＫＬと結合できることである。
【０１３２】
実施例５−ＴＳＧ−６のＬｉｎｋ及びＣＵＢ＿Ｃ領域が破骨細胞形成を抑制する
更に、我々のデータ（未発表）は、単離されたＬｉｎｋ及びＣＵＢ＿Ｃ領域は全長タンパクよりも低い活性ではあるが、破骨細胞形成の抑制剤であることを示した。これは、これらのＴＳＧ−６の断片が骨再吸収の抑制剤を設計する基礎として利用できることを示す。
【０１３３】
実施例６−関節滑液内のＴＳＧ−６及びＯＰＧのレベル
我々は種々の骨の不調（例えば、骨関節炎（ＯＡ）、リューマチ性関節炎（ＲＡ）、痛風及びピロ燐酸関節炎（ＰＰＡ）；図５参照）を患う患者の関節滑液中に高いレベルのＴＳＧ−６（０−２００ｎｇ／ｍｌ）を測定した。ＯＡの関節滑液中のＴＳＧ−６及びＯＰＧレベルのＥＬＩＳＡ解析によれば、ＴＳＧ−６タンパクのレベルにはＯＰＧと比較して患者間に大きな変異が存在することが示された（図６参照）。これは、ＴＳＧ−６の不在／低レベルが骨疾病の範囲と劇症度に貢献していることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１はＴＳＧ−６が破骨細胞の生成に及ぼす効果を示す。ｓＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦに仲介されたヒト破骨細胞の形成が組換えヒトＴＳＧ−６(２５ｎｇ／ｍｌ （０．８ ｎＭ）) の不在（右側の薄色の棒グラフ）と存在（左側の黒色の棒グラフ）下で示される。データ（８例の象牙質スライス）は各４反復からなる２独立試験の平均値±標準誤差で表わされる。
【図２】図２はＴＳＧ−６がＴＳＧ−６濃度のある範囲内で孔隙の再吸収に及ぼす抑制効果を示す。データ（８例の象牙質スライス）は各４反復からなる２独立試験の平均値±標準誤差で表わされる。
【図３】図３は野生型（ＷＴ、左側の棒グラフ）及びＴＳＧ−６−／−マウス（ＫＯ、右側の棒グラフ）の骨髄から由来する破骨細胞による骨吸収活性の比較を示す。データ（４例の象牙質スライス）は４反復からなる２独立試験の平均値±標準誤差で表わされる。
【図４】図４はＴＳＧ−６とｓＲＡＮＫＬとの交互作用を示す。全長のＴＳＧ−６、Ｌｉｎｋ＿ＴＳＧ−６又はＣＵＢ＿Ｃ＿ＴＳＧ−６はある濃度範囲でマイクロタイター上にコートされ、ＲＡＮＫＬ特化抗体を利用してｓＲＡＮＫＬ （５ ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）との結合が測定される。すべてのデータは平均吸光度（４０５ｎｍ）値（８例）±標準誤差でプロットされる。
【図５】図５は種々の骨障害を患う患者の関節滑液中のＴＳＧ−６及びＯＰＧの定量結果を示す。種々の骨障害におけるタンパクレベルは“社内仕様”のＥＬＩＳＡ分析により測定された。ＴＳＧ−６のレベルは左側の薄色の棒グラフで示される。ＯＰＧのレベルは右側の黒色の棒グラフで示される。この図は骨関節炎（ＯＡ）、ピロ燐酸関節炎（ＰＰＡ）、リューマチ性関節炎（ＲＡ）及び痛風等の骨疾病の劇症度及び進行度に依存するＴＳＧ−６及びＯＰＧのレベルの変化を示す。各サンプルは３回反復され、各条件の関節滑液サンプル数は（例数Ｎの値）で与えられる。測定値は各グループの平均値±標準誤差で表わされる。
【図６】図６は骨関節炎（ＯＡ）患者（ｎ＝２０）の滑液内のＴＳＧ−６とＯＰＧのレベル間の比較を示す。このデータはＯＰＧのレベルと比較して、ＴＳＧ−６のレベルの変異性が疾病の範囲と劇症度に貢献し得ることを示す。
【０１３５】
配列の簡箪な説明
配列番号１はヒトＴＳＧ−６の全長Ｑ１４４アロタイプ変異体をコードする核酸配列を示す。
【０１３６】
配列番号２はヒトＴＳＧ−６の全長Ｑ１４４アロタイプ変異体をコードするアミノ酸配列を示す。このアロタイプ変異体は１４４位にグルタミン残基（Ｑ）を有する。それは最も普通のアロタイプ変異体でコーカシア人種の約８６％で見出される(Nentwich et al. (2002) 277, 15354-15362)。
【０１３７】
配列番号３（配列番号２の１８−２７７残基）はシグナル配列を除くヒトＴＳＧ−６のＱ１４４アロタイプ変異体のアミノ酸配列を示す。
【０１３８】
配列番号４はヒトＴＳＧ−６の全長Ｒ１４４アロタイプ変異体をコードする核酸配列を示す。
【０１３９】
配列番号５はヒトＴＳＧ−６の全長Ｒ１４４アロタイプ変異体をコードするアミノ酸配列を示す。このアロタイプ変異体は１４４位にアルギニン残基（Ｒ）を有する。それはより普通でないアロタイプ変異体でコーカシア人種の約１４％に見出される(Nentwich et al. (2002) 277, 15354-15362）。
【０１４０】
配列番号６（配列番号５の１８−２７７残基）はシグナル配列を除くヒトＴＳＧ−６のＲ１４４アロタイプ変異体のアミノ酸配列を示す。
【０１４１】
配列番号７（配列番号２及び５の３７−１２８残基）はヒトＴＳＧ−６のＬｉｎｋモジュールのアミノ酸配列を示す。
【０１４２】
配列番号８は実施例で用いられるＬｉｎｋ＿ＴＳＧ−６をコードする核酸配列を示す(Day et al. (1996) Protein Expr. Pruif. 8, 1-16)。
【０１４３】
配列番号９は実施例で用いられるＬｉｎｋ＿ＴＳＧ−６のアミノ酸配列を示す。配列番号９の３−９５残基は配列番号７に相当する（配列番号２及び５の３７―１２８残基）。開始コドンのメチオニン（Ｍｅｔ−１）はＬｉｎｋ＿ＴＳＧ−６の発現には除かれる(Day et al. (1996) Protein Expr. Pruif. 8, 1-16)。
【０１４４】
配列番号１０（配列番号２の１２９−２７７残基）はヒトＴＳＧ−６のＱ１４４アロタイプ変異体のＣＵＢ＿Ｃ領域のアミノ酸配列を示す。
【０１４５】
配列番号１１（配列番号５の１２９−２７７残基）はヒトＴＳＧ−６のＲ１４４アロタイプ変異体のＣＵＢ＿Ｃ領域のアミノ酸配列を示す。
【０１４６】
配列番号１２は実施例で用いられるＣＵＢ＿Ｃ＿ＴＳＧ−６をコードする核酸配列を示す。
【０１４７】
配列番号１３は実施例で用いられるＣＵＢ＿Ｃ＿ＴＳＧ−６のアミノ酸配列を示す。配列番号１３の２−１５０残基は配列番号１１に相当する（配列番号５の１２９−２７７残基）。開始コドンのメチオニン（Ｍｅｔ−１）はＣＵＢ＿Ｃ＿ＴＳＧ−６の発現には除かれない（Day, 未発表データ）。
【０１４８】
配列番号１４は全長ヒトＯＰＧをコードする核酸配列を示す。
【０１４９】
配列番号１５は全長ヒトＯＰＧのアミノ酸配列を示す。
【図１】
2009532334.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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