(57)【要約】  エステラーゼ活性を有する新規酵素およびブチノールエステルの速度論的分割のための方法におけるその使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を有する単離されたポリペプチドであって、ただし、配列番号1とは76位、99位および175位のアミノ酸のうちの少なくとも1つが異なっている、上記ポリペプチド。
【請求項２】
76位のアミノ酸がValである、請求項１記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項３】
99位のアミノ酸がGluである、請求項１記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項４】
175位のアミノ酸がAlaである、請求項１記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項５】
76位のアミノ酸がValであり、かつ175位のアミノ酸がAlaである、請求項１記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項６】
76位のアミノ酸がValであり、かつ99位のアミノ酸がGluであり、かつ175位のアミノ酸がAlaである、請求項１記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項７】
ラセミ体ブチノールエステルの速度論的分割のための、請求項１〜６のいずれか１項記載の酵素の使用。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか1項記載のポリペプチドの存在下にて、ラセミ体3-ブチン-2-オール-エステルを加水分解し、その後 (R)-3-ブチン-2-オール-エステルより(S)-3-ブチン-2-オールを分離することによる、光学活性 3-ブチン-2-オールの製造方法。
【化１】
2009511007.tif 000008
（式中、RはHまたはC1 -C6-アルキルである）
【請求項９】
分離した(R)-3-ブチン-2-オール-エステルを塩基で加水分解する、請求項８記載の(R)-3-ブチン-2-オールの製造方法。
【請求項１０】
pHが5〜9にある緩衝液中で加水分解を行う、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、エステラーゼ活性を有する酵素とブチノールエステルの速度論的分割法のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
定方向進化法は、生体触媒を改善するための最も有効な方法としてこの10年間に出現した（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）[1]。例えば、D-ヒダントイナーゼのエナンチオ選択性が逆転し、光学的に純粋なL-アミノ酸合成についての実質的に改善された方法を生じ得る（非特許文献５）[2]。
【０００３】
ReetzおよびJaegerは、Pseudomonas aeruginosa由来のリパーゼのキラルカルボン酸(2-メチルデカノエート)に対するエナンチオ選択性を、E=1.1 (野生型)からE=11に向上させることができた（非特許文献６、非特許文献７）[3]。様々な分子生物学的手法の組合せを使用して、彼らは最終的に、実際に有用な選択性(E=51)を有する変異体を同定することができた（非特許文献８、非特許文献９）[4] 。同様に、本発明者らは、エラープローンPCRと飽和突然変異誘発とを組み合わせることによって、3-フェニルブタン酸に対する、Ps. fluorescens由来のエステラーゼ(PFE)のエナンチオ選択性をE = 3.5 からE = 12に向上することができた（非特許文献１０）[5] 。
【０００４】
良好な定方向進化実験はいくつかの局面に強く依存する：向上したエナンチオ選択性を示す所望される変異体の同定は、用いられるハイスループットスクリーニング法に強く依存する。例えば、代用基質(すなわち、p-ニトロフェニルエステル) を用いて決定した選択性は、真の基質(すなわち、メチルエステル)とは顕著に異なり得、これは偽陽性変異体を生じ得る。さらに、変異をランダムに導入しても、微生物宿主における生体触媒の他の特性および生体触媒の産生に大きな影響はないと推察される。別の態様は、生産的な変異の位置である。定方向進化実験は変異体を生じることが多く、この際に有効な変異は活性部位領域から離れているが、基質特異性またはエナンチオ選択性に影響した。非特許文献１１[6]には、活性部位領域に近い変異が有効であるのか既に取り上げられている。
【０００５】
1aのアセテートの加水分解酵素に触媒される分割は非常に難しい。それはこの第2級アルコールがその置換基の大きさにわずかな違いしかないことによる。「Kazlauskasの法則」（非特許文献１２）[7] によると、低度〜中程度のE値を有するリパーゼまたはエステラーゼによってのみ変換される。
【０００６】
(R)-アルコールは、(-)-アコラクトンA（akolactone A）、シクトトキシック（cyctotoxic）ブタノリド（非特許文献１３）[8]、パンクラスタチン（pancrastatin）、抗腫瘍アルカロイド（非特許文献１４）[9]およびキラルシクロプロパンベースのリガンド（非特許文献１５）[10] の合成、ならびに (R)-ベンジル4-ヒドロキシル-2-ペンチノアート（非特許文献１６）[11] の大規模生産のために用いることができる。1aの両方の純粋なエナンチオマーは、Johnson転位によるエナンチオ-およびジアステレオマー的に純粋なアリルボロニックエステルの製造に用いられ、エナンチオピュアなホモアリルアルコール（非特許文献１７）[12]を生じた。他の例としては、α-アミノアレン由来の3-ブロモ-ピロリン（非特許文献１８）[13]、HIVプロテアーゼインヒビターの合成に用いられる光学活性二環式リガンド（非特許文献１９）[14]またはαＶβ３アンタゴニスト(骨粗しょう症)の重要中間体（非特許文献２０）[15]の合成が挙げられる。(S)-アルコールの用途の一例は、キラル環状カーボナートの製造である（非特許文献２１）[16]
これまでに本発明者らは、1bの速度論的分割に関して100を超える加水分解酵素を調べた（非特許文献２２）[17] 。そして最良の酵素は、E. coliにて組換え的に発現されるPseudomonas fluorescens由来のエステラーゼ(PFE) (配列番号1)であった（非特許文献２３）[18]。しかし、反応の詳細な経時的解析によって、エナンチオ選択性がアセテートの加水分解の過程で大幅に低下すること(表1)および完全な変換によりラセミ体アルコール 1aが生じることが明らかとなった。同様の作用が、Pseudomonas glumae由来のエステラーゼに関する特許文献に記載されていた（特許文献１）[19]。対応するブチラートの加水分解において、最初の値はE〜30であったが、多量の分割を生じる高変換時に非常に低下し実用的でない。Nakamuraおよび共同研究者らのみが、許容範囲にあるエナンチオ選択性を報告しているが、大量のリパーゼ Amano AHを使用し、非常に長い反応時間 (2日間)を用いても非常に小規模の分割を生じただけであった（非特許文献２４）[20]。代替的な酵素によるケトンの非対称な還元は、60 %eeで(R)-アルコールを生じるLactobacillus brevis由来のNADPH依存性アルコール デヒドロゲナーゼまたは49 %eeで(S)-アルコールを生じるNADH依存性 Candida parapsilosisカルボニル還元酵素について示されるように、非常に低いエナンチオマー過剰率によって妨げられる（非特許文献２５）[21]。さらに、3-ブチン-2-オンは不安定であり熱分解される危険性が高く、例え高い選択性を有する還元酵素を利用できたとしても、大規模な還元を妨げる。
2009511007.tif 000002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、光学的に純粋な形態の3-ブチン-2-オールを製造するのに非常に有効であって、先行技術の酵素が有する欠点を有さない加水分解酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
スキーム1：エステラーゼに触媒される速度論的分割の原理
【化１】
2009511007.tif 000003
【０００９】
1bを分割するためのエナンチオ選択性変異体を作製するために、PFEのepPCRライブラリーを作製し、その後本発明者らの研究室にて以前に開発された「酢酸アッセイ」[22]を使用してハイスループットスクリーニング (HTS)を行った。エステラーゼによって触媒されるアセテート 1bの加水分解中に放出される酢酸を、酵素カスケード反応にてNADHへと化学量論的に変換し、分光光度法で340 nmにて定量する。エナンチオピュアな(R)-および(S)-アセテートをマイクロタイタープレートの別個のウェルに用いると、各エステラーゼ変異体の見かけ上のエナンチオ選択性 (Eapp)を、これらの初期の速度測定より決定できた。続いて、E値を、小規模な実験において陽性エステラーゼ変異体を振盪フラスコにて産生した後にGC解析による速度論的分割によって確認した(Etrue)。7,000未満の変異体をスクリーニングした後、PFE変異体を同定した。これは54 %の変換にてEtrue= 89を示した。残念ながら反応時間は、PFE 野生型を使用すると同様の変換値を得るのにわずか数分を必要とする(データ示さず)のと比べて、極めて長かった（24時間以上）。
【００１０】
この変異体の配列決定によって、3つの点突然変異を同定した (Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala)。驚くべきことに、細胞分画およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によるそのペレットの解析により、野生型とは異なりこの3つの変異が37℃にて封入体 (IB)として産生され、可溶性タンパク質のわずかな分画のみが形成されることが示された。これはアッセイ基質としてp-ニトロフェニルアセテート(pNPA)を使用した場合に、PFE 野生型では77 U mgprotein-1の比活性を有するのに対して、わずか0.0006 U mgprotein-1の比活性であった。封入体形成は、0.5026 U mgprotein-1の比活性を生じる25℃における培養によって減少した。1bの加水分解は、非常に高いエナンチオ選択性 (E >>100)を伴いながら、40分後に44 %の変換を生じた。
【表１】
2009511007.tif 000004
【００１１】
Gly98Ala変異を欠いている４つの変異体 (VEA2, V, VA2およびA2)は野生型と同様の比活性度を示し、IBを形成しなかった。注目すべきは、変異体 VEA2 (Ile76Val/Asp99Glu/Val175Ala)はIBを形成せず(V2Aと比較して)、WTと同様の比活性度を有していたことである。この点より本発明者らは、触媒トライアドに隣接するGly98Ala変異 (A1)がIB形成に機能すると結論付けた。
【００１２】
次に、全ての変異体のエナンチオ選択性を小規模の分割によって調べた。本発明者らは1bの分割にて高いエナンチオ選択性が維持されていたのに、２つの変異体が十分な活性を示したことを見出した：二つの変異体、すなわちE = 96 (53 %変換、20 分) を有するVA2 (Ile76Val/Val175Ala)およびE = 92 (53 %変換、7時間)を有するVEA2 (Ile76Val/Asp99Glu/Val175Ala)。両変異体は、PFE 野生型と同じ温度安定性と最適pH を有する(データ示さず)。
【００１３】
このように、本発明者らは、定方向進化およびその後の部位特異的突然変異誘発によって複数のエステラーゼ変異体を作製することができた。これらは(S)-エナンチオマーを生じる3-ブチン-2-オールのアセテートの分割において、優れたエナンチオ選択性および反応速度論を示した。その高い選択性および活性のために、この変異体を用いて(R)-エナンチオマーをまた、残りのアセテートから得ることができる。
【００１４】
本発明の第一の実施形態は、配列番号1の配列を有する単離したポリペプチドであるが、ただし76位、98位、99位、および175位のうちの少なくとも1つのアミノ酸が、配列番号1の各位置のものとは異なっている。
【００１５】
本発明で単離したポリペプチドは：
76位にPhe、Leu、Met、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Tyr、His、Gln、Asn、Lys、Asp、Glu、Cys、Trp、ArgおよびGlyからなる群より選択されるアミノ酸、ならびに／または
98位にPhe、Leu、Ile、Met、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Tyr、His、Gln、Asn、Lys、Asp、Glu、Cys、TrpおよびArgからなる群より選択されるアミノ酸、ならびに／または
99位にPhe、Leu、Ile、Met、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Tyr、His、Gln、Asn、Lys、Glu、Cys、Trp、ArgおよびGlyからなる群より選択されるアミノ酸、ならびに／または
175位にPhe、Leu、Ile、Met、Ser、Pro、Thr、Ala、Tyr、His、Gln、Asn、Lys、Asp、Glu、Cys、Trp、ArgおよびGlyからなる群より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００１６】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1の76位にVal、Leu、もしくはAlaを、および／または99位にGlu、GlnもしくはAsnを、および／または175位にAla、LeuもしくはIleを有する。
【００１７】
より好ましい実施形態において、ポリペプチドは、上記位置のうち２または３箇所が配列番号1とは異なっている。
【００１８】
好ましくは、当該ポリペプチドは、配列番号1の配列を有し、ただし、76位のアミノ酸がValであり、175位がAlaであるポリペプチドおよび配列番号1の配列を有するが、76位のアミノ酸がValであり、99位がGluであり、かつ175位がAlaであるポリペプチドである。
【００１９】
98位のアミノ酸(Gly) の変異のいくつかは、封入体の形態でE.coliに発現されるポリペプチドを生じる。特にGly98がAla98に変異した場合である。
【００２０】
本発明の別の態様は、速度論的分割、特にラセミ体ブチノールエステルの速度論的分割のための上記酵素の使用である。
【００２１】
好ましい実施形態は、請求項1〜６のいずれか1項記載のポリペプチドの存在下にてラセミ体3-ブチン-2-オール-エステルを加水分解し、その後 (R)-3-ブチン-2-オール-エステルより(S)-3-ブチン-2-オールを分離することによる光学活性 3-ブチン-2-オールの製造方法である。
【化２】
2009511007.tif 000005
【００２２】
本発明方法では、最終生成物を分離することによって(S)-3-ブチン-2-オールを生じる。当該分離は、蒸留、抽出またはクロマトグラフ法などの当該分野にて既知の方法によって行うことができる。
【００２３】
(R)-3-ブチン-2-オールが所望される生成物である場合、上記方法の (R)-3-ブチン-2-オール-エステルは、KOHもしくはNaOHなどの塩基またはNaOEtなどのアルカリアルコレートで処理して加水分解できる。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記方法はpH 5〜9、好ましくはpH 6〜8の緩衝液中で実施する。緩衝液としては、 ホスフェートが好ましい。
【００２５】
効率的な速度論的分割に有用な生体触媒の製造以外に、本研究はまた、活性部位に近い変異がタンパク質の折り畳みにかなりの影響を与え得ることを示した。この特徴はこれまで文献に記載されたことはなく、タンパク質工学、特に定方向進化法を使用したタンパク質工学にて考慮されるべきである。さらに、活性部位付近の変異はエナンチオ選択性を変化させてはならず、この場合かなり離れた変異が最も効率的に高いエナンチオ選択性酵素を製造できることを示した。
【００２６】
さらに、本発明は、定方向進化法を使用して第2級アルコールに対するエナンチオ選択性が大幅に改善されたエステラーゼを良好に製造する最初の例である。
【実施例】
【００２７】
概要：
全ての試薬は特に明記しない限り、Fluka (Buchs, Switzerland)、Sigma (Steinheim, Germany)およびMerck (Darmstadt, Germany)より購入した。制限酵素（リガーゼ、DNAseIおよびポリメラーゼ）はPromega (Madison, WI, USA)およびNewEngland BioLabs GmbH (Beverly, MA, USA)より得た。MWG-Biotech (Ebersberg, Germany)はプライマー提供と配列決定を行った。
【００２８】
菌株、プラスミド、増殖条件およびタンパク質解析： 
E.coli DH5αまたはJM109を、プラスミドDNAを形質転換するための宿主として使用した。この株を100μg ml-1アンピシリンを添加したLB液体培地またはLB寒天培地にて37℃で培養した[25]。ラムノース誘導性プロモーターを含むベクターpJOE2792.1をPFEの発現用に用いた。ラムノース (終濃度0.2 % v/v)を添加してエステラーゼ産生を誘導し、そして5時間継続して培養した。細胞を遠心分離(15分間、4℃、3939 g)によって回収し、リン酸ナトリウム緩衝液 (10 mM、pH 7.4、4℃)で２回洗浄した。細胞を氷上にて5分間、50%パルスにてソニケーションして破壊し、遠心分離して可溶性画分を不溶性画分より分離した。後者には封入体が含まれる。上清を凍結乾燥し、4℃にて保存した。タンパク質含有量を、Bradford試薬を使用して、標準としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。
【００２９】
エステラーゼ活性はリン酸ナトリウム緩衝液 (10 mM, pH 7.4)中にてp-ニトロフェノールアセテート (pNPA, DMSO中10 mM)を加水分解することによって、分光光度法で測定した。放出されたp-ニトロフェノールを410 nm (ε = 15*103 M-1 cm-1)にて定量した。１ユニット（Ｕ）の活性は、アッセイ条件下にて1分間あたりに1μmol p-ニトロフェノールを放出する酵素量として規定した [25]。可溶性画分および不溶性画分由来のタンパク質はまた、12%分離および 4%スタッキングドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルによって分析した [25]。電気泳動後、ゲルを最初にα-ナフチルアセテートおよびFast Redを用いて活性染色[18]を行い、続いてCoomassieブリリアントブルー染色を行った。
【００３０】
epPCRライブラリーの作製：
QIAprepキット(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して単離したプラスミドを、終濃度0.1 ng μl-1にてepPCR に用いた。反応混合物は100μlの終量で、10μl dNTP Mix (2 mM ATP, 2 mM GTP, 10 mM CTP, 10 mM TTP)、10μl変異緩衝液 (70 mM MgCl2; 500 mM KCl; 100 mM Tris pH 8; 0.1 % (w/v) ゼラチン)、100 pmolの各プライマー(順向プライマー：GACTGGTCGTAATGAACAATTC、逆向プライマー：AATGATGATGATGATGGCATC)、1μl Taq ポリメラーゼ、3μl 10 mM MnCl2 およびプラスミド DNAから構成された。反応条件は以下の通りであった： 1) 95℃ 60秒、2) 25サイクル：95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 45秒、3) 72℃ 150秒。PCR産物をQIAquickTM PCR Purification Kitを用いて精製し、BamHIおよびNdeIで消化して付着端を作製し、空ベクターpJOE2792.1にライゲーションして、塩化ルビジウム法を使用して作製されたコンピテントE. coli細胞に形質転換した。形質転換体をL-ラムノースを含有するLB/Ampアガープレートにレプリカ平板法によって移し、エステラーゼ産生を誘導してα-ナフチルアセテートに対する活性を解析した。Fast Redにより赤色を示す活性クローンを、各ウェルに200 μl LB/Ampを含む マイクロタイタープレート(MTP) (マスタープレート)に移した。このプレートを16時間、37℃、50 rpmにてインキュベートし、グリセロールまたはDMSO (終濃度10 %, v/v)を添加し、そしてMTPを−80℃にて保存した。
【００３１】
「定常状態増殖法」を用いたマイクロタイタープレートにおける酵素産生：:
上記マスタープレートを、96ピンを用いて、各ウェルにつき200μl LB/Ampを含有する新たなマイクロタイタープレート(産生プレート)にコロニーを移すことによって複製した。この新たなプレートを24時間、37℃、50 rpmにてインキュベートし、そしてこの培養物を増殖定常期とした。ピペットロボット(Miniprep 75, Tecan, Crailsheim, Germany)を用いて、100μlの培養物を各ウェルより100μlの新たなLB/Ampを含有する新たなMTPウェルに移し、さらに3時間インキュベートして指数増殖期とした。次に、L-ラムノースを添加して、さらに5時間エステラーゼ産生を誘導した。細胞を遠心分離(1750 g, 15分間, 4℃)によって回収し、上清を廃棄した。DNAseI (終濃度1 U ml-1)およびリゾチーム(終濃度0.1 % w/v)を含有する200μl 溶解緩衝液(300 mM NaCl, 50 mM Na2HPO4, pH 8)を添加し、そして細胞を1回の凍結融解によって破壊した。エステラーゼを含有する上清を、凍結乾燥するか、または直接−20℃にて保管した。
【００３２】
対応するラセミ体およびエナンチオピュアなアセテートの合成：
アセテートを、5 ml n-ヘキサン中1.5等量のビニルアセテート、モレキュラーシーブおよび5 mg Candida antarctica リパーゼ B (CAL-B, Novozym, Denmark)を用いて、37℃にて一晩撹拌することによって、1等量のrac-1aよりエステル交換反応において酵素的に合成した。酵素およびモレキュラーシーブを遠心分離によって除去し、溶媒および過剰量のビニルアセテートを蒸発した。CAL-Bは1aにたいしてエナンチオ選択性を示さなかったために、ラセミ体アセテートへの完全な変換が可能であった。
【００３３】
酢酸アッセイによるスクリーニング：
放出された酢酸を測定するための試験キット（R-Biopharm GmbH (Darmstadt, Germany)製）を、製造者のプロトコルに従って用いた。試験キットの構成要素からなる150μlの混合物に、上記産生プレートに由来する20μlの酵素溶液およびエナンチオピュアな(R)-または(S)-2-アセトキシ-3-ブチン (1b)の20μl基質溶液 (7.5 mg ml-1) を添加した。NADHの増加を、「Fluostar Galaxy」または「Fluostar Optima」(BMG, Offenburg, Germany)を用いて340 nmにて調べた。試験キットの構成要素と緩衝液またはエステラーゼ遺伝子を含まないベクターを含む誘導されたE. coliの細胞溶解物との混合物をコントロールとして用いた。各エナンチオマーについて測定された初速度の割合を、見かけ上のエナンチオ選択性 (Eapp)として規定した[17]。
【００３４】
エステラーゼに触媒される小規模な分割についての一般的な方法：
リン酸緩衝液(10 mM, pH 7.4)における基質1b(25 mM)の撹拌溶液に、エステラーゼ溶液を添加した。この反応混合液を、サーモシェーカー(Eppendorf, Hamburg, Germany) 中37℃にて撹拌した。別々の時点にて、100μlのサンプルを採取し、100μlのジクロロメタンを用いて2回抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、そして有機溶媒を窒素下で除去した。サンプルを、キラルカラム Hydrodex（登録商標）−β-3P (ヘプタキス-(2,6-ジ-O-メチル-3-O-ペンチル-β-シクロデキストリン) (25 m, 0.25 mm) を使用し、キャリアガスとして水素を用いたガスクロマトグラフィー (GC-14A Gaschromatograph, Shimadzu, Japan)によって分析した。エナンチオ選択性 (Etrue)および変換は、Chenら[26]に従って算出した。
【００３５】
QuikChangeTM：
QuikChangeTM 部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, USA)を、製造者の指示に従い、相補的プライマー：G229A置換：5'-CTTCGCCGACGACATCGCCCAGTTGATC-3'、C296G置換：5'-CATGGGCGGCGGCGATGTGGCCCG-3'およびC527T置換：5'-TCTCCCAAGGCGTGCAGACCCAGACC-3'；３つの変異をコードするプラスミドを用いて、以下の反応条件: 1) 95℃ 45秒、 2) 20サイクル：95℃ 45 秒、55℃ 60秒、 68℃ 10分で使用した。変異プラスミドをコンピテントE. coli細胞に形質転換した(50μl のコンピテント細胞中4μlの反応物)。
【００３６】
参考文献
2009511007.tif 000006
2009511007.tif 000007
【配列表】
2009511007000001.app
【国際調査報告】
2009511007.tif 000009
2009511007.tif 000010
2009511007.tif 000011
2009511007.tif 000012