(57)【要約】  本発明は、軸流クロマトグラフィーカラム、及びかかるカラムを用いて液体中の１種以上の被分析物を分離する方法に関する。このカラムは、移動相のための第１のポートと、充填されたベッドの全体にわたって均一に流体を分配するための横方向流体分配チャンネルとを含んでいる。第１のポートは、間に通路を有する入口及び出口を含み、この出口は流体分配チャンネルに対して非対称の配置を有する。【選択図】    図２
2009544025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
側壁を含むハウジング、
前記側壁で隔てられ、軸方向に間隔をおいて対向する第１及び第２のエンドユニットと、
第１のエンドユニットの一部であるか又はそれに隣接する横方向流体分配チャンネルと、
前記横方向流体分配チャンネルに隣接する第１のフィルター及び第２のエンドユニットに隣接する第２のフィルターであって、上記側壁と共に粒状媒体のベッドを収容するための囲繞ベッドスペースを画成する第１及び第２のフィルターと
を備える軸流クロマトグラフィーカラムであって、
第１のエンドユニットが、上記囲繞ベッドスペースと流体連通した中央ボアを有するバルブ手段を含んでおり、該バルブ手段が、第１のフィルター及び上記流体分配チャンネルを通して延在していて内部に通路を有する長手方向部材を含んでおり、該バルブが上記通路を介して粒状媒体でベッドスペースを充填することができるように作動可能に開閉可能であり、第１のエンドユニットが、上記ベッドスペースへの液体の添加又は上記ベッドスペースからの液体の除去のための第１のポートを含んでおり、
第２のエンドユニットが、上記囲繞ベッドスペースと流体連通していてベッドスペースを空にしたり又はそこに液体を充填したりすることができる第２のポートを含んでおり、
第１のポートが入口及び該入口との間に通路を有する単一の出口を含んでおり、該単一の出口が上記流体分配チャンネルと直接流体接続していて、該出口が上記流体分配チャンネルに対して非対称の配置を有することを特徴とする、軸流クロマトグラフィーカラム。
【請求項２】
前記流体分配チャンネルが円周方向溝を含んでいる、請求項１記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３】
流体分配チャンネルがさらに平面状ディスクを含んでいる、請求項１又は請求項２記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４】
流体分配チャンネルがさらにネットを含んでいる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項５】
前記流体分配チャンネルがリブ付きプレートを含んでいる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項６】
流体分配チャンネルが穴あきプレートを含んでおり、ここで前記プレートの１つの表面が窪んでいる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項７】
第２のユニットが横方向流体分配チャンネルを含んでいる、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項８】
第２のエンドユニットの前記横方向流体分配チャンネルが請求項２乃至請求項７のいずれか１項記載の流体分配チャンネルである、請求項７記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項９】
前記バルブ手段の前記長手方向部材がノズルを含んでいる、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１０】
前記ノズルがベッドスペースの外の所定の位置まで引っ込められる、請求項９記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１１】
前記中央出口が、ベッドスペースから粒状媒体を除去して空にすることを可能にしない、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１２】
前記カラムが粒状媒体で予め充填されている、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１３】
前記カラムが使い捨て式カラムである、請求項１１又は１２記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１４】
さらに、第２のポートと流体連通した中空部材を含んでおり、前記部材が液体の収集又は添加のための第３のポートを有している、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１５】
第１のポート及び第３のポートが、当該クロマトグラフィーカラムにおいてベッドスペースのレベルの上方で本質的に同じレベル又は高さにある、請求項１４記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１６】
液体中の１種以上の被分析物を互いに分離するためのための方法であって、上記１種以上の被分析物を含有する液体を、粒状媒体のベッドを収容した請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のアキシャルクロマトグラフィーカラムに流し、上記１種以上の被分析物を移動相で溶出させ、カラムから溶離する前記移動相の画分を回収することを含んでなる方法。
【請求項１７】
液体中の被分析物間又は液体中の１種以上の被分析物と粒状媒体に結合している物質との間の化学的又は生化学的反応を実行するための方法であって、上記１種以上の被分析物を含有する液体を、上記粒状媒体のベッドを収容した請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のアキシャルクロマトグラフィーカラムに流すことを含んでなる方法。
【請求項１８】
液体中の１種以上の被分析物を互いに分離するためのシステムであって、
上記液体と流体連通した入口又は入口マニフォルド、
ポンプ、
請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム、及び
出口又は出口マニフォルド
を備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アキシャルクロマトグラフィーカラム、及びかかるクロマトグラフィーカラムを用いて液体中に存在する１種以上の被分析物を互いに分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、化学的及び生物学的物質を分離するための確立された価値ある技術であって、研究及び産業界において広く使用されており、化合物の調製、精製及び分析において多くの用途をもっている。多くの異なる形態のクロマトグラフィーがあるが、液体クロマトグラフィーはタンパク質、ペプチド及び核酸の調製、精製及び分析のための製薬及び生物産業で特に重要である。
【０００３】
典型的な液体クロマトグラフィー装置は直立したハウジングを有しており、そこでは通常本質的に粒状であり多孔性媒体からなる充填材料のベッドが透過性保持層により支持されている。液体移動相は、入口を通って、例えばカラムの頂部で、通常多孔性の穴あきフィルター、メッシュ又はフリットを通って入り、充填材料のベッドを通り、出口を介して、通例第２のフィルター、メッシュ又はフリットを通って除去される。
【０００４】
液体クロマトグラフィーに用いられるカラムは通例多孔性クロマトグラフィー媒体を内包する管状体を含んでおり、これを通って担体の液体又は移動相が流れ、多孔性媒体の移動相と固相との間で物質又は被分析物の分離が行われる。通例、多孔性媒体は充填ベッドとしてカラムに内包されており、一般にこの充填ベッドは、通常カラムの一端に位置する中央ボア又はノズルからカラム中へポンプで送り込まれ、注入され又は吸引されるスラリーといわれる離散的な粒子の懸濁物を押し固めることによって形成される。安定で一様なベッドの生成は最終分離過程にとって極めて重大であり、最適な結果はカラム端部を貫通して中央に配置されたボアを用いて得られる。
【０００５】
物質の分離におけるもう一つ別の重大な特徴は流体分配システムであり、特にクロマトグラフィーカラムの断面が増大したときの流体分配システムである。クロマトグラフ分離の効率は充填ベッドの流体の入口及び出口における液体の分配及び収集システムに依存している。
【０００６】
理想的には、担体液体は、充填材の頂部でその表面全体にわたって均一に導入され、充填材の横断面全体にわたって同じ速さで充填材を通って流れ、充填ベッドの底により画成される平面で均一に除去される。
【０００７】
液体クロマトグラフィーで使用する従来の分配システムは、カラムの分離効率に有害な影響を有する幾つかの固有の問題に対処しなければならない。これらの問題の中には、充填ベッドの頂部における不均一な初期流体分配がある。この不均一な初期流体分配の問題とは、一般に、充填ベッドの断面積全体にわたり同時に試料体積を適用する問題をいう。この問題は、システム全体にわたって流体と共に輸送されるトレーサー物質の伝達滞留時間の分布を拡大することによりクロマトグラフィーシステム内における分散を増大することになる。ベッドの頂部により画成される平面に流体を同時に導入しないと、いわゆる栓流挙動、すなわち充填ベッド及びカラムを通る試料の均一で明確に画成された移動を達成し、結果として均一な滞留時間分布を得ることは事実上不可能である。
【０００８】
この液体分配システムにより生じる分散は、拡散及び混合効果によってクロマトグラフィー充填ベッド自身により導入される分散の量に関連して制御しなければならない。
【０００９】
標準的な流体分配システムは、移動相のための１つの中央の入口と、これと組み合わせた、充填ベッドの入口と出口の上面と底面を画成するフィルター（メッシュ、製織網又は焼結物）の後ろの細い分配チャンネル（ギャップ）とからなる。理論上、そして経験上、かかるシステムはカラムの直径が増大するとその性能が低下することは公知である。これは、入口から外側のカラム壁まで移動する流体成分とフィルター又はネット及び入口ポートの下の充填ベッド領域に直接入ることができる流体成分との間の滞留時間の差に起因する。この滞留時間の差はカラムの直径と共に大きくなり、クロマトグラフィーバンドの拡大に至るが、これは小さい粒子で最も深刻になる。この問題は不均一な初期流体分配に対応する。
【００１０】
複数の入口を有するカラムが提唱されている。複数の入口は滞留時間の差違が低減するが製造に費用がかかる。
【００１１】
さらにもう一つ別の技術が米国特許第４５３７２１７号に開示されている。これは層状の分配構造体からなり、第１の層がカバーとして機能し、そこには流体入口が形成されており、第２の層には、幾つかのチャンネルが形成されており、その各々が第２の層を通って延びる出口で終結している。この技術をさらに発展させたものとして、米国特許第５３５４４６０号には、上記層状分配構造体と同様な多数のファン形「ステップダウンノズル」を使用するものが開示されており、これらのノズルは同心のリング上に配列され、マニフォルドシステムにより相互に接続されている。そのモジュール状の構成に起因して、このシステムは大量生産技術を用いて製造することができるが、高度の複雑さのため依然として生産コストが高い。層状分配構造体と同様に、このタイプの複雑なシステムは清浄化するのが困難であり、従って衛生上の問題のリスクが増大する。
【００１２】
上記のシステムはいずれも、スラリー用の中央の入口の回りに配置された移動相用の中央入口システムを使用している。この中央の配置は媒体の均一なベッドを得るようにカラムを充填するのには重要であるが、かかる配置はクロマトグラフィーカラムの設計に対して、特にその構造とコストの点で制約がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４５３７２１７号明細書
【特許文献２】米国特許第５３５４４６０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
長年にわたりクロマトグラフィーの分野で頻繁に使用されており、しかも推測及び実験的に評価されたアキシャルクロマトグラフィーカラムに対して多くの分配システムが提案されているにも関わらず、１００ミリリットルを超える体積を使用することができる効率的な、かつ簡単で費用効率の高いカラムに対するニーズが相変わらず存在する。今までのところ、このニーズを満たすアキシャルクロマトグラフィーカラムは利用可能になっていない。
【００１５】
定義
「被分析物」とは、天然又は合成起源の物質、化合物又は化学品、又はそれらの反応生成物又は誘導体根市区は代謝物として定義される。疑念を回避するために、この用語はタンパク質、ペプチド、アミノ酸及び核酸のような生物学的分子、並びに薬剤及び／又はプロドラッグのような合成分子を包含するものとする。
【００１６】
「非対称」とは、相対的な用語であり、非中心を意味する。
【００１７】
「分配チャンネル」とは、断面ゾーンからクロマトグラフィー媒体の充填ベッドのためのエンクロージャー又はベッドスペースに流体を導入する際に通過する構造体をいう。
【００１８】
使い捨て式カラムは、非使い捨て式カラムの場合には必要となる設置及び特性確認作業を低減するためのクロマトグラフィー媒体のの前処理により特徴付けられる。最低限、この前処理には、多孔性媒体のベッドの形成が含まれる。その他の前処理としては微生物的負荷の低減、滅菌、発熱物質除去などであり得る。
【００１９】
使い捨て式カラムは単一回使用のカラムとして使用され得る。すなわち、ユーザーが繰返し使用の前に充填ベッドの特性確認（例えば試験、確認検査、など）を必要とする清浄化操作を実施しない。
【００２０】
１つの実施形態の使い捨て式カラムはクロマトグラフィー媒体が予め充填されて供給される完成したカラムである。
【００２１】
もう一つ別の実施形態の使い捨て式カラムは、作動中充填ベッドの１以上の側面にかかる圧力及び負荷に耐えて充填ベッドに寸法安定性を付与するように設計されたフレーム又は容器に相当する第１のデバイスと、作動のために第１のデバイスに結合している多孔性媒体又はベッドを収容する容器、シェル、カートリッジ、袋などに相当する第２のデバイスとからなる。この後者の実施形態の場合、多孔性媒体は二次容器内に収容されていて取り替えることができ、一方フレームは再使用可能である。この場合、作動に必要とされる多孔性媒体の圧縮の程度は収容された媒体をフレーム中に挿入した後に調節し得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１６６８１６号及び国際公開第２００５／００９５８５号参照）。
【００２２】
「レベル」とは、水平面又は特定の高さと定義される。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の目的は、従来技術のシステムの欠点を克服するクロマトグラフィーカラムを提供することである。
【００２４】
かかるクロマトグラフィーカラムの１つの利点は優れた分配特性を提供することである。
【００２５】
もう一つ別の利点は、本発明によると、現存するカラムと比較して製造が容易かつ安価であることである。
【００２６】
本クロマトグラフィーカラムのさらなる利点は、従来のカラムより容易に使用できることである。
【００２７】
相互接続される要素が少ないという設計の簡略さは、必要なシールの数が低減し、従って衛生問題に関連する漏れ又は汚染の可能性が低減するという点で有利である。これらの特徴は、カラムの調製（製造）中の微生物的負荷の低減、並びにカラムの保管及び輸送中のこれらの条件の維持を必要とする使い捨て式カラムの場合殊に重要である。
【００２８】
充填バルブを使用する設計のさらに別の利点は、カラムの充填が閉鎖系として実施できることであり、これは予め殺菌したカラム及び予め殺菌したクロマトグラフィー媒体から出発して無菌条件下でカラムを充填することさえできるということを意味している。
【００２９】
さらに別の利点はクロマトグラフィーカラムがスケール変更可能であることである（すなわち、カラムの大きさを増大又は縮小しても性能が予測可能である）。
【００３０】
本発明の第１の態様によると、
側壁を含むハウジング、
側壁で隔てられた軸方向に間隔をあけて対向する第１及び第２のエンドユニット、
第１のエンドユニットの一部であるか又は隣接する横方向流体分配チャンネル、
横方向流体分配チャンネルに隣接する第１のフィルター及び第２のエンドユニットに隣接する第２のフィルター（これらのフィルターは側壁と一緒になって、粒状媒体のベッドを収容するための囲繞ベッドスペースを画成する）、並びに
ベッドスペースに液体を添加するか又はそこから液体を除去するための第１のポート
を含んでなる軸流クロマトグラフィーカラムであって、
第１のエンドユニットは囲繞ベッドスペースと流体連通した中央ボアを有するバルブ手段を含んでおり、このバルブ手段は第１のフィルター及び流体分配チャンネルを貫通して延びていて内部に通路を有する長手方向部材を含んでおり、このバルブは通路を介して粒状媒体でベッドスペースを充填することができるように作動可能に開閉可能であり、
第２のエンドユニットは囲繞ベッドスペースと流体連通していてベッドスペースを空にするか又はそこに液体を充填することを可能にする第２のポートを含んでおり、
第１のポートが入口及びこの入口との間の通路を有する単一の出口を含んでおり、この単一の出口が流体分配チャンネルと直接流体接続しており、前記出口が流体分配チャンネルに対して非対称の配置を有している
ことを特徴とする前記軸流クロマトグラフィーカラムが提供される。
【００３１】
本発明の第２の態様において、１種以上の被分析物を含有する液体を、粒状媒体のベッドを収容している上記アキシャルクロマトグラフィーカラムに付し（適用し）、１種以上の被分析物を移動相で溶出させ、カラムから溶出する移動相の画分を回収することを含んでなる、液体中の１種以上の被分析物を互いに分離する方法が提供される。
【００３２】
本発明の第３の態様によると、液体中の被分析物間又は液体中の１種以上の被分析物と粒状媒体に結合している物質との間の化学的又は生化学的反応を実行するための方法であって、１種以上の被分析物を含有する液体を、前記粒状媒体のベッドを収容している上記アキシャルクロマトグラフィーカラムに（適用する）ことを含んでなる前記方法が提供される。すなわち、例えば、粒状媒体に結合している物質は液体中の被分析物間の反応を触媒して新たな被分析物を生成する触媒として作用することができる。或いは、前記物質は直接液体中の被分析物と反応して新たな被分析物を生成してもよい。得られた反応生成物（又は新たな被分析物）は次いでカラム上の反応体（すなわち元の被分析物）から分離することができる。
【００３３】
本発明の第４の態様においては、
液体と流体連通する入口又は入口マニフォルド、
ポンプ、
上記クロマトグラフィーカラム、及び
出口又は出口マニフォルド
を含んでなる、液体中の１種以上の被分析物を互いに分離するためのシステムが提供される。
【００３４】
本発明の実施形態は特許請求の範囲の従属請求項に定義されている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、従来技術のクロマトグラフィーカラムの基本的な特徴を示す概略横断面図である。
【図２】図２は、本発明によるクロマトグラフィーカラムの横断面を示す三次元概略図である。
【図３】図３は、流体分配チャンネルに対するポートの非対称配置の詳細を示す本発明によるクロマトグラフィーカラムのエンドプレートの拡大概略横断面図である。
【図４】図４は、本発明によるクロマトグラフィーカラムの三次元概略図である。
【図５】図５は、図４のカラムの横断面である。
【図６】図６は、上昇流（点線）及び下降流（実線）モードにおける本発明によるクロマトグラフィーカラムでのアセトンのクロマトグラフ分離を示すクロマトグラムである。
【図７】図７は、低減したプレート高さ及び非対称因子を溶出ピークから計算する方法を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
図１に、従来技術（例えば、米国特許第６５２４４８４号参照）から公知のクロマトグラフィーカラム１の一般的な構成部品を概略的に示す。このカラムは、例えば半透明であってもよいステンレス鋼又は高強度／強化ポリマー性材料製の円筒状の流体不透過性側壁１１を有する。この側壁１１の開放頂部及び底部端部は頂部及び底部エンドアセンブリ又はユニット１２、１３により閉鎖されている。各エンドユニットは、密封嵌合して円筒状の壁１１の開口を塞いでいる、好ましくはステンレス鋼又は高強度エンジニアリングプラスチック材料、例えばポリプロピレン製の流体不透過性のエンドプレート３を有する。これらのエンドプレートは、その外面に抗してこれを担持すると共に側壁を越えて保持フランジ２２（これを通ってテンションロッド１４が固定されている）として半径方向に突出する金属製保持プレート２により裏打ちされている。これらは頂部と底部のエンドアセンブリ１２、１３を連結し、この構造体が高い流体圧力に耐えるのを補助している。
【００３７】
各エンドプレート３は、カラムの外部と、側壁１１及びエンドアセンブリ１２、１３により画成された充填ベッドスペース９との連通のために中央の貫通開口３１を有する。開口３１を貫通する通路は接続マニフォルド８を介して外部と接続された別々の導管に分割されている。
【００３８】
通例ろ過処理した(filtered)又は製織プラスチック又は鋼製のフィルター層４が、エンドプレート３の内面でベッドスペース９の面積全体にわたって延びている。エンドプレート３の内面３５はフィルター層４の後ろ側に、例えば図示したように円錐状に、好ましくはフィルター層４を後ろから支持する支持リブ（図には示してない）を用いることで、凹んでいてそれらの間に分配チャンネル３４を画成している。これらの連通導管の１つである移動相導管３３は、内側がこの分配チャンネル３４中に、また外側がマニフォルド８の移動相コネクター８１に開放している。
【００３９】
マニフォルド８から、アクセスバルブデバイス５がエンドプレート開口３１を通り、またフィルター層４の中央オリフィス４１を密封して通って内側に突出している。このアクセスバルブ５は、マニフォルド８からの１以上の導管とベッドスペース９との直接の連通を支配しており、すなわちフィルター層４を迂回する。図には、バルブ５により支配され、マニフォルド８のコネクター８２を介して外部と接続される第１及び第２のバルブ付き導管５１、６１が示されている。
【００４０】
このカラムの典型的な作動において、粒状固定相材料の充填ベッドが頂部と底部のフィルター層４の間のベッドスペース９を満たす。バルブデバイス５を閉じ、移動相コネクター８１（矢印「Ａ」）を通して移動相を供給し、導管３３を通して分配チャンネル３４中に入れ、フィルター層４を通して、充填ベッドを貫通して下方に溶出させて、その成分又は被分析物の分離を行う。液体溶出液は底部エンドアセンブリ１３のフィルター層４を通過し、その移動相コネクター８１を通って出（矢印「Ｂ」）、適宜収集される。これはカラムを通る移動相の下方移動によりクロマトグラフ分離が行われる「下降流」クロマトグラフィーの一例であるが、当業者には理解されるように分離は代わりに、単に移動相をカラムに通してポンプで上方に送ることで、すなわち流れの方向を逆転させることによって「上昇流」クロマトグラフィーにより達成してもよい。このモードの場合、移動相はコネクター８１でカラムに入り（矢印「Ｂ」）、固定相又は粒状媒体を通って上方に移動し、カラムの頂部でコネクター８１（矢印「Ａ」）から収集されることになろう。
【００４１】
図１に示したような中央アクセスバルブを使用する従来技術で公知のカラムは、通例、移動相接続（８１）と液体分配チャンネル（３４）との間の通路として導管（３３）を有するように設計されており、ここで前記導管（３３）は予め液体を分配チャンネル（３４）に対して対称的に分配するという目的をもっている。従って、液体が対称的に分配チャンネル（３４）中に供給されるように設計されており、これは導管（３３）を中央オリフィス（４１）の回りに環として、又は複数のボア若しくはチャンネルの配列として設計することによって達成され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１２５１８１号参照）。
【００４２】
図１及び上記説明は構成部品の一般的な関係及び典型的な作動モードを例証するためのものである。当業者には了解されるように、また以下の記載からも明らかになるように、異なる種類のプロセスでは他の特定の構成及び作動モードが適当であり得る。
【００４３】
本発明に従うカラムの概略断面図を図２に示す。このカラム１０１は、テンションロッド１１４によって第１のエンドユニット１１２と第２のエンドユニット１１３に固定されてベッドスペース１０９を画成している管状ハウジング１１１を含んでいる。ハウジング１１１及びエンドユニット１１２、１１３は通例ステンレス鋼又はポリプロピレンのような高強度プラスチック材料からなっている。カラムが生物学的に活性な物質の分離のために使用されることになる好ましい実施形態において、前記材料は米国薬局方（ＵＳＰ）＜８８＞Ｃｌａｓｓ  VIに基づきヒトにおいて免疫応答を引き起こさないように生物学的に不活性である。ヘッド１１６を有するテンションロッド１１４は、エンドユニット１１２、１１３を側壁１１１に固定して、高い作動圧力に耐えることができる流体漏れのないベッドスペース１０９を形成している。
【００４４】
このカラムには、バルブ手段１２０を介してスラリーの形態の粒状媒体を充填することができる。このバルブ手段１２０は中央ボア（１２１）及び通路（図には示してない）を有する長手方向部材１２２、並びにノズル１２４を含んでいる。図２で、ノズル１２４は後退した位置に示されているが、カラムの充填を容易にするためにベッドスペース１０９内の所定の位置に移動することができることが了解されよう（図３参照）。ベッドスペース内のスラリーの分配及び一様な充填を容易にする広範囲のノズルを使用することができる。充填バルブ及びノズルにおける開放／閉鎖機能を達成するための１つの代案は、ベッドスペース内に固定され（従って引っ込められない）、その位置に応じてノズルを開放及び／又は閉鎖するノズルの内側又は外側の可動エレメント又はスリーブに隣接して位置するノズルを使用することである。各フィルター１０４は、エンドユニット１１２、１１３の内面上に配置され、側壁１１１と共にベッドスペース１０９を画成し、またベッドスペース１０９から粒状媒体が漏れるのを防止するように働く。分配チャンネル１０６は第１のエンドユニット１１２の面を横方向に跨って位置しており、フィルター１０４と流体連通している。この流体分配チャンネルは液体の半径方向の分配を容易にするように機能する。
【００４５】
単純な形態において、分配チャンネル１０６は第１のエンドユニットの面内に円周方向の溝１０６ａを含んでいる。この溝は、第１のポート１３３の出口１３７から出る液体の円周方向の分布をノズル１２４の回りで均一にするように配置される。
【００４６】
もう一つ別の実施形態において、分配チャンネルは、流体連通している第１のネット１０６ｂと第２のネット１０６ｄとの間に挟まれた平坦な不透過性ディスク１０６ｃも含んでいる。これらのネットは厚さがおよそ０．１〜１０ｍｍの範囲であり、第１のネット１０６ｂが第２のネット１０６ｄより厚いのが好ましい。ネットはスペーサーとして作用し、分配チャンネルの高さを定める。適切なネットとしては、例えば、ＳＥＦＡＲ（登録商標）Ｐｒｏｐｙｌｔｅｘ  ０５−１０００／４５及び０５−２４００／５０（ＳＥＦＡＲ  ＡＧ、Ｒｕｓｈｌｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）がある。
【００４７】
異なる実施形態において、分配チャンネルは細かいネットに隣接し、これと流体連通したリブ付きプレートを含んでいる。このプレート上のリブは分配チャンネルの高さを定める上で既に記載したネットと同じ機能を果たす。
【００４８】
さらに別の実施形態において、分配チャンネルはプレートの１つの表面が窪んでいる穴あきプレートを含んでいる。ここでもまた、この窪みが分配チャンネルの高さを定める上でスペーサーとして機能する。
【００４９】
このように、分配チャンネルのいろいろな実施形態は全て同様の三次元幾何学を生み出すことにより同じ技術的効果を達成するように働く。
【００５０】
カラム上で分離される１種以上の被分析物又は物質を含有する移動相又は液体は、入口１３５、出口１３７及びその間の通路１３４を有する第１のポート１３３を介して加えられる。エンドユニット１１２内の第１のポート１３３の配置は、第１のポートが流体分配チャンネル１０６に対して非対称に配置されるようなものである。図では、移動相又は液体をカラム中に導入する入口１３５と、移動相又は液体が分配チャンネル１０６上に出ていく出口１３７との両方が、かかる非対称配置を有するものとして示されている。しかし、当業者には理解されるように、本発明の本質的な特徴は出口１３７が流体分配チャンネルに対して非対称な配置を有することである。
【００５１】
出口１３７から出てベッドスペース１０９中に入る移動相は分配チャンネル１０６全体に一様に分配され、フィルター１０４を通過した後粒状媒体のベッドを通って均一に溶出する。最後に移動相は第２のポート１４０を通ってカラムから出ていく。分配チャンネル１０６に対する出口１３７の非対称な配置はエンドユニット１１２を製造する際の設計要件を簡単にし、従って製造コストが低減する。
【００５２】
当業者には理解されるように、カラムは上記のように「下降流」モードで、又は移動相がカラムを上に向かって移動するように移動相流れの方向を逆転させた「上昇流」モードで作動させることができる。上昇流モードの場合、移動相は第２のポート１４０を介してカラムに入り、粒状媒体のベッドを通って上方に移動し、第１のポート１３３を介してカラムから出て収集される。
【００５３】
図で、第２のポート１４０は、エンドユニット１１３を貫通して垂直に延びてユニットの対向する外面に出る通路１４２を含んでいる。もう一つ別の実施形態（図示してない）において、第２のポート１４０はユニット１１３の側面を通って出る。この配置では、適当なコネクター又は中空部材（図示してない）によって、移動相／液体をカラムに適用する高さと同じ高さ（すなわち、エンドユニット１１２と同じ高さ。例えば図４又は５参照）での移動相／液体の収集が可能になる。単一のエンドユニット上の同じ高さでの移動相の適用と収集は、オペレーターのアクセスと取扱いの点で簡単になり、システムへの空気の導入のリスクが低減し、カラムを設置するのに必要な空間が少なくなる。
【００５４】
ハンドル１５０はカラムの持ち上げと操作を容易にする。
【００５５】
広範囲のカラム容量が可能であり、通例０．１〜２０００リットルの範囲であることが理解される。カラムを使い捨て式カラムとして使用するときの好ましい容量は０．５〜５０リットルの範囲である。
【００５６】
図３は、本発明による（図２に示したような）クロマトグラフィーカラムのエンドプレート２１２の拡大横断面図であり、入口２３５並びに流体分配チャンネル２０６に対するポート２３３の出口２３７の非対称配置の詳細を示している。流体分配チャンネル２０６に対するバルブ手段２３１の中央位置が図３に示されている。図から分かるように、スラリーの形態の粒状媒体でベッドスペース２０９を充填することができるように、ノズル２２４はベッドスペース２０９中に下げられている。ノズル２２４は、カラムが粒状媒体で充填されたらカラムでのクロマトグラフ分離の前に長手方向部材２２２の本体中に後退することが理解される。充填粒状媒体のベッドは、当技術分野で周知の慣用の手段により、例えば一方のエンドユニットを移動させてベッドを圧縮することにより得られる。
【００５７】
分離しようとする１種以上の被分析物を含有する液体は第１のポート２３３の入口２３５を介し、通路２３４及び出口２３７を介してカラムに導入される。図示した実施形態において、流体分配チャンネル２０６は円周方向の溝２０６ａ、及び流体連通している第１のネット２０６ｂと第２のネット２０６ｄとの間に挟まれた平坦な不透過性ディスク２０６ｃを含んでいる。これらの要素は、フィルター２０４に隣接する粒状媒体（図示してない）の表面全体にわたり液体を半径方向に分配させる。その後、液体はフィルター２０４を通って、粒状媒体（図示してない）が充填されたベッドスペース２０９に入る。
【００５８】
このようにして粒状媒体上に導入された被分析物のクロマトグラフ分離は移動相の導入及びそれによる溶出によって行われる。移動相は液体に関して上記したのと同様にしてカラムに加えられる（すなわち、ポート２３３の入口２３５を介し、従って出口２３７から分配チャンネル２０６及びフィルター２０４を通ってベッドスペース２０９中に導入される）。得られた移動相の画分は図２に関して上記したようにして収集される。
【００５９】
図２に関連して上記したように、図３に例示したカラムはまた上昇流モードで作動させることもでき、この場合移動相は第２のポート（図示してない）でカラムに入り、カラムを通って上方に移動し、第１のポート２３３から収集されることが理解される。
【００６０】
本発明に従うクロマトグラフィーカラム３０１のもう一つ別の実施形態の三次元概略図を図４に示す。この図からカラムの外部の特徴が明らかである。このカラムは第１のエンドユニット３１２、第２のエンドユニット３１３、並びにテンションロッド３１４及びヘッド３１６により互いに固定されて流体漏れのないシールを形成しているハウジング３１１を含んでいる。スラリーの形態の粒状媒体はバルブ手段３２０を介してベッドスペース（図示してない）中に導入することができる。第１のポート３３３は粒状媒体上で分離される被分析物を含有する移動相又は液体のための導管として機能する。ベッドスペースからの移動相のための第２のポート（図示してない）と流体連通した中空部材３６０は第３のポート３６５内で終わり、ここから、カラムから溶出した移動相の適当な画分が収集され得る。図から分かるように、第３のポート３６５は移動相が導入される際に通る第１のポート３３３と同じレベル又は高さにある。この配置により、ユーザーの操作及び試料の取扱いが容易になる。図４に示した実施形態において、カラムの容量はおよそ１０リットルである。広範囲のカラム容量、通例０．１〜２０００リットルの範囲のカラム容量が可能であることが理解される。このカラムを使い捨て式カラムとして使用するときの好ましい容量は０．５〜５０リットルの範囲である。
【００６１】
図５は図４のカラムの横断面図を示す。カラム４０１は、テンションロッド４１４によって互いに固定されて流体漏れのないシールを形成している管状ハウジング４１１、第１のエンドユニット４１２（部分的に示す）及び第２のエンドユニット４１３を含んでいる。バルブ手段４２０と第１のポート４３３が図に示されている。第２のポート４４０は、第２のエンドユニット４１３を通って（中空部材４６０を介して）第３のポート４６５まで延び、これと流体連通した通路４４２を含んでおり、この第３のポートから液体を加えたり又は収集したりすることができる。図から明らかなように、第３のポート４６５は第１のポート４３３と本質的に同じレベル又は高さにあり、そのためカラムに対する移動相の添加及びカラムからの移動相の収集が容易になる。この配置は、カラムの設置を補助し、吸い上げのリスクを低減し、またカラム中への空気の導入の可能性を低減するというさらなる利点を有する。
【００６２】
図６に、本発明に従う１０リットルのカラムを下降流（実線）及び上昇流（点線）モードの両方で作動させて行ったトレーサーパルス実験の例によってクロマトグラフ分離効率を示す。カラムには、８５μｍのアガロース粒子直径のＣａｐｔｏＴＭＱアニオン交換樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のベッドを充填した。カラムは体積が１０．８リットル、直径が２６３ｍｍ、ベッド高さが２００ｍｍであった。アセトン（充填ベッド体積の１％）をトレーサー物質として用い、移動相として水を用いてカラムから溶出し、吸光度を２８０ｎｍでモニターした。下記表１から分かるように、８５μｍのアガロース媒体を下降流（実線）又は上昇流（点線）モードで用いて優れたカラム効率が観察された。
【００６３】
【表１】
2009544025.tif 000003
表１のデータは図６のクロマトグラムから導出された。
【００６４】
カラム効率の目安として、低減したプレート高さは、図７に示すような溶出ピークの半値幅ｗｈを用いて決定される。この手法は、ガウス型分布の近似値である。実際には、溶出ピークはこの理想的なガウス分布形状から外れることが多く、ピークの非対称度はいわゆる非対称因子Ａｆにより定性的に記述され、ここでＲＴＤにおける「リーディング」はＡｆ＜１により示され、「テーリング」はＡｆ＞１により示される。非対称因子に対して一般に適用される許容度基準は適用のタイプに応じて０．８＜Ａｆ＜１．５−１．８である。
【００６５】
【数１】
2009544025.tif 000004
おおざっぱにいって、媒体の特性のばらつきは通例、バイオテクノロジー下流工程においてタンパク質クロマトグラフィーに使用する極めて多孔性の媒体を考慮した場合、最適化された表面速度でｈ＝１．５〜２．０の範囲の低減したプレート高さを与える。媒体の理想的な効率は、低減したプレート高さの増大が周辺機器、試料体積、ベッド不均一性及び分配システムによる他のばらつきの結果であるクロマトグラフィーシステムの実験的に決定された効率に匹敵しなければならない。実際上、タンパク質のイオン交換分離に使用するクロマトグラフィーユニットの典型的な標準設置特性は実験的に決定された低減したプレート高さｈユニット，見掛け＜３．０である。
Ａｆ  非対称因子
ｄｐ  粒子直径
ｈ  低減したプレート高さ
ＨＥＴＰ  理論プレートに相当する高さ
Ｌ  ベッド高さ、充填ベッド
ｕｓ  充填ベッドにおける表面速度
ＶＲ  保持体積
ｗｈ  最大ピーク高さの５０％におけるピーク幅
【符号の説明】
【００６６】
１０１  カラム
１０４  フィルター
１０６  流体分配チャンネル
１０６ａ  円周方向溝
１０６ｂ  ネット
１０６ｃ  ディスク
１０６ｄ  ネット
１０９  ベッドスペース
１１１  ハウジング、側壁
１１２  第１のエンドユニット
１１３  第２のエンドユニット
１２０  バルブ手段
１２１  中央ボア
１２２  長手方向部材
１２４  ノズル
１３３  第１のポート
１３４  通路
１３５  入口
１３７  出口
１４０  第２のポート
１４２  通路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2009544025.tif 000009
【図６】
2009544025.tif 000010
【図７】
2009544025.tif 000011
【国際調査報告】
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