(57)【要約】  本発明は、ポリペプチドリンカーを介してトランスフェリン（Ｔｆ）と融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質、ならびに対応する核酸分子、ベクター、宿主細胞、および医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＩＩ型糖尿病、肥満症を治療するため、および体重を減少させるための、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドリンカーを介してトランスフェリン（Ｔｆ）と融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質。
【請求項２】
リンカーが非ヘリックスポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
リンカーが、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号６）、（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）、ＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたＰＥＡＰＴＤ（配列番号６）、およびＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせた（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記エキセンディン−４が配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記Ｔｆが天然のトランスフェリン分子と比較して低下したグリコシル化を示すように改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記Ｔｆが配列番号１７に示すアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
エキセンディン−４分子が、融合タンパク質のＮ末端、融合タンパク質のＣ末端、または融合タンパク質のＮ末端とＣ末端の両方で融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
融合タンパク質のＮ末端が分泌シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
シグナル配列が血清トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノトランスフェリン、またはその変異体由来のシグナル配列である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
シグナル配列がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列、改変ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列、またはＴｆシグナル配列である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
シグナル配列が配列番号１８に示すヒトＴｆシグナル配列である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
配列番号２３に示すアミノ酸配列を含む、改変トランスフェリン（ｍＴｆ）と融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号２５に示すアミノ酸配列を含む、ｍＴｆと融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号２３または２５に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１８】
配列番号２４または２６に示す配列を含む、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１５に記載の融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
０．５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲の用量で投与するように適応している、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
１ｍｇ〜１００ｍｇの用量で投与するように適応している、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
吸入による投与に適応している、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ポリペプチドリンカーを介してＴｆと融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質を患者に治療有効量投与することを含む、その必要があるヒト患者においてＩＩ型糖尿病を治療するまたは血糖を低下させる方法。
【請求項２７】
融合タンパク質が配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号２３に示すアミノ酸配列を含む前記融合タンパク質を、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇの用量で、約１週間に１回、２週間に１回、または１カ月に１回の頻度で投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドリンカーを介してＴｆと融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質を治療有効量投与することを含む、その必要があるヒト患者において肥満症を治療するまたは体重を減少させる方法。
【請求項３０】
融合タンパク質が配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号２３に示すアミノ酸配列を含む前記融合タンパク質を、約１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で、約１週間に１回、２週間に１回、または１カ月に１回の頻度で投与する、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキセンディン−４およびトランスフェリンを含む融合タンパク質、ならびにＩＩ型糖尿病などのグルコース血清レベルの上昇に関連する疾患を治療するため、および体重を減少させるためのその使用に関する。本発明の融合タンパク質を使用して、Ｉ型糖尿病、鬱血性心不全、心筋梗塞、過敏性腸症候群、アルツハイマー病およびハンチントン病などの神経系疾患や、非アルコール性非脂肪性肝疾患などの、エキセンディン−４および他のＧＬＰ−１受容体作用剤を用いた治療から利益を受けることが知られている他の疾患を治療することもできる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病とは、複数の原因因子に由来する疾患プロセスを言い、経口グルコース負荷試験中の絶食状態またはグルコースの投与後における、血漿グルコースレベルの上昇または高血糖症を特徴とする。２つの一般に認識されている糖尿病の型が存在する。Ｉ型糖尿病、すなわちインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）では、患者は、グルコースの利用を調節するホルモンであるインスリンを、わずかしか産生せず、またはまったく産生しない。ＩＩ型糖尿病、すなわちインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）では、患者は、しばしば、糖尿病でない対象と比較して同じまたはさらには上昇した血漿インスリンレベルを有する。しかし、これらの患者は、主なインスリン感受性組織である筋肉、肝臓および脂肪組織におけるグルコースおよび脂質代謝に対するインスリン刺激効果に耐性を生じている。血漿インスリンレベルは、上昇しているが、強いインスリン耐性に打ち勝つには不十分であり、その結果、高血糖症が生じる。
【０００３】
持続性または非制御の高血糖症は、罹患率および死亡率の増加および早発に関連している。しばしば、異常なグルコース恒常性は、脂質、リポタンパク質およびアポリポタンパク質の代謝の変化ならびに他の代謝および血行動態疾患に、直接および間接的に関連している。たとえば、ＩＩ型真性糖尿病に罹患している患者は、冠状動脈性心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、高血圧、腎症、および神経障害を含めた大血管および微小血管の合併症の危険性が特に増加している。
【０００４】
肥満症および過体重であることは、一般に、全体脂肪と相関しており、特定の疾患の危険性の測度として役割を果たす体重指数（ＢＭＩ）によって定義される。ＢＭＩは、体重のキログラムを身長のメートルの二乗で除算することによって計算する（ｋｇ／ｍ２）。過体重は典型的には２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩとして定義され、肥満症は典型的には３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩとして定義される。たとえば、国立心肺血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、成人の過体重および肥満症の同定、評価、および治療の臨床指針、エビデンス報告（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ，Ｔｈｅ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔ）、ワシントンＤＣ：米国保険社会福祉省、ＮＩＨ  出版物第９８−４０８３号（１９９８）を参照されたい。
【０００５】
過体重または肥満の個体は、高血圧、異常脂質血症、ＩＩ型（インスリン非依存性）糖尿病、インスリン耐性、グルコース不耐性、高インスリン血症、冠状動脈性心疾患、狭心症、鬱血性心不全、脳卒中、胆石症（ｇａｌｌｓｔｏｎｅｓ）、胆嚢症、胆石症（ｃｈｏｌｅｌｉｔｈｉａｓｉｓ）、痛風、骨関節炎、閉塞型睡眠時無呼吸および呼吸困難、胆嚢疾患、特定の型の癌（たとえば、子宮内膜、乳房、前立腺、および結腸）ならびに心理的障害（鬱病、摂食障害、歪んだ身体像および低い自尊心等）などの病気の危険性が高い。肥満症は、その健康のマイナス影響により米国における予防可能な死の第２位の原因であり、社会に顕著な経済的および心理社会的な影響を与えている。ＭｃＧｉｎｎｉｓ  Ｍ、Ｆｏｅｇｅ  ＷＨ．、「米国における実際の死因（Ａｃｔｕａｌ  Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）」、ＪＡＭＡ、２７０：２２０７〜１２、１９９３を参照されたい。
【０００６】
肥満症は現在、その関連する健康上の危険性を下げるために治療を必要とする慢性疾患として認識されている。減量が重要な治療結果であるが、肥満症の管理の主要な目的の１つは、肥満症に関連する罹患率および死亡率を下げるために心血管および代謝値を改善することである。５〜１０％の体重減少が、血糖、血圧、および脂質濃度などの代謝値を実質的に改善できることが示されている。したがって、５〜１０％の体重減少により罹患率および死亡率が低下し得ると考えられている。肥満症を管理するために現在利用可能な処方薬は、一般に、オーリスタットのように食事性脂肪の吸収を減少させることによって、またはシブトラミンで見られるように食物摂取を低下させるおよび／もしくはエネルギー消費を増加させることによってエネルギー欠損を生じさせることによって、体重を減少させる。
【０００７】
ＩＩ型糖尿病の現在の治療には、外因性インスリンの投与、薬物の経口投与ならびに食事療法および運動療法が含まれる。２００５年に、エクセナチド（エキセンディン−４；Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））が、メトホルミンおよび／またはスルホニル尿素を服用しているが十分な血糖制御に達成しなかったＩＩ型糖尿病患者の補助的療法としてＦＤＡによって認可された。エクセナチドとは、アメリカドクトカゲの唾液腺の内因性産物である強力なＧＬＰ−１受容体作用剤である、エキセンディン−４である。ＧＬＰ−１と同様、エキセンディン−４はインクレチンである。これは、インスリン分泌性であり、食物摂取および胃排出を阻害し、げっ歯類においてβ細胞向性である（Ｐａｒｋｓ他、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．、５０：５８３〜５８９、２００１；ＡｚｉｚおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１３２：９９０〜９９５、２００２；ならびにＥｇａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８７：１２８２〜１２９０、２００２）。さらに、ＧＬＰ−１と同様、これは、そのＮ末端の２位にグリシンが存在することが原因でＤＰＰＩＶの基質ではない。エクセナチドを使用することのマイナス面は、そのｔ１／２が２〜４時間でしかないために１日２回注射しなければならないことである（Ｋｏｌｔｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８８：３０８２〜３０８９、２００３およびＦｉｎｅｍａｎ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．、２６：２３７０〜２３７７、２００３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、血糖制御をもたらして体重を減少させる治療として使用できる、持続性がより長く、分解に対する耐性がより高いＧＬＰ−１受容体作用分子の必要性が、依然として存在する。長時間作用性のインクレチン模倣体の開発により、投薬の頻度がより低い利便性を伴った、グルコース依存性インスリン分泌の連続的な亢進により血糖制御を亢進する能力が提供される。本発明は、エキセンディン−４の生物活性を維持しながらｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を延長させる改変トランスフェリンと融合したエキセンディン−４分子を提供することによって、この必要性を満たす。さらに、本発明の融合タンパク質の使用により、インクレチンの使用と現在関連している嘔気および嘔吐の高い発生率が低下し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ペプチドリンカー、好ましくは非ヘリックスポリペプチドリンカーを介してトランスフェリン（Ｔｆ）分子と融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質を提供する。
【００１０】
好ましくは、リンカーは、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号６）、（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）、ＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたＰＥＡＰＴＤ（配列番号６）、およびＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせた（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）からなる群から選択される。より好ましくは、リンカーは（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）である。
【００１１】
本発明の融合タンパク質のＴｆ部分は、任意の哺乳動物Ｔｆ、好ましくはヒトＴｆに由来し得る。より好ましくは、Ｔｆは、天然のトランスフェリン分子と比較して低下したグリコシル化を示すように改変されており（ｍＴｆ）、さらにより好ましくは、Ｔｆは配列番号１７に示すアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、Ｔｆは、鉄結合および／またはＴｆ受容体との結合が低下するように改変されている。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質のＮ末端は、分泌シグナル配列、好ましくは、血清トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノトランスフェリン、またはその変異体由来のシグナル配列、より好ましくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列、改変ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列、またはＴｆシグナル配列をさらに含み、さらにより好ましくは、シグナル配列は配列番号１８に示すヒトＴｆシグナル配列（ｎＬ）である。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２３または配列番号２５に示すアミノ酸配列を含み、後者はＮ末端にｎＬリーダー配列をさらに含む、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。他の好ましい実施形態では、エキセンディン−４はエキセンディン−４（１〜３９）であり、配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、かつ／または、エキセンディン−４分子は、融合タンパク質のＮ末端、融合タンパク質のＣ末端、もしくは融合タンパク質のＮ末端とＣ末端の両方で融合している。
【００１４】
本発明はまた、上述の融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含む対応するベクター、ならびに核酸分子およびベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００１５】
本発明はまた、上述の融合タンパク質のいずれかおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物も特徴とする。
【００１６】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、配列番号２３のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を含み、一部の実施形態では、配列番号２３のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を含む組成物は、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇまたは約１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲の用量で投与するように適応している。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、組成物は、吸入による投与に適応している。
【００１８】
本発明はまた、ポリペプチドリンカー、好ましくは非ヘリックスリンカーを介してＴｆと融合したエキセンディン−４を含む融合タンパク質を患者に治療有効量投与することを含む、その必要があるヒト患者においてＩＩ型糖尿病を治療するまたは血糖を低下させる方法を特徴とする。
【００１９】
好ましくは、これらの方法は、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を投与することを含み、特定の実施形態では、配列番号２３に示す融合タンパク質は、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇの用量で、約１週間に１回、２週間に１回、または１カ月に１回の頻度で投与する。別の実施形態では、ポリペプチドリンカー、好ましくは非ヘリックスリンカーを介してＴｆと融合したエキセンディン−４、より好ましくは配列番号２３に示す融合タンパク質は、等価な治療的用量で治療有効性を達成するために、エクセナチドよりも低い頻度で投与する。
【００２０】
本発明はまた、ポリペプチドリンカー、好ましくは非ヘリックスリンカーを介してＴｆと融合したエキセンディン−４を含む、融合タンパク質を治療有効量投与することを含む、その必要があるヒト患者において肥満症を治療するまたは体重を減少させる方法を特徴とする。好ましくは、融合タンパク質は、配列番号２３に示すアミノ酸配列を含むエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を含み、特定の実施形態では、配列番号２３に示す融合タンパク質は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で、約１週間に１回、２週間に１回、または１カ月に１回の頻度で投与する。別の実施形態では、ポリペプチドリンカーを介してＴｆと融合したエキセンディン−４、好ましくは配列番号２３に示す融合タンパク質は、治療有効性を達成するために、エクセナチドよりも低い頻度で投与する。
【００２１】
本発明はまた、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質、またはエキセンディン／Ｔｆ融合タンパク質を含む医薬組成物、好ましくはエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）Ｔｆ融合タンパク質の使用を提供し、より好ましくは、融合タンパク質は配列番号２３に示すものであり、これは、その必要がある患者においてＩＩ型糖尿病を治療するもしくは血糖を低下させる医薬品を製造するためのものであり、好ましくは、医薬品は、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇの用量で投与するように適応しているか、または、その必要があるヒト患者において肥満症を治療するもしくは体重を減少させる医薬品を製造するためのものであり、好ましくは、医薬品は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与するように適応している。
【００２２】
「エキセンディン−４」とは、配列番号４に示すエキセンディン−４（１〜３９）、および８または９個までのアミノ酸残基が配列番号４に示す配列のＣ末端から除去されて、たとえばエキセンディン−４（１〜３１）またはエキセンディン−４（１〜３０）を生じたエキセンディン−４断片、およびエキセンディン−４（１〜３９）、または他の上述のエキセンディン−４断片の１つに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するペプチドを意味する。
【００２３】
本明細書中で使用する２つ以上のＤＮＡコード配列は、ＤＮＡコード配列間のインフレーム融合の結果としてＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドへと翻訳される場合に、「結合した」または「融合した」と言う。また、語句「結合した」または「融合した」は、代替方法、たとえば化学的方法によって融合したペプチドを指すために使用することもできる。トランスフェリン（Ｔｆ）融合に関する用語「融合」には、それだけには限定されないが、少なくとも１つの治療タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのＴｆのＮ末端への付着、ＴｆのＣ末端への付着、および／またはＴｆ内の任意の２つのアミノ酸間への挿入が含まれる。
【００２４】
「薬学的に許容できる」とは、配合物を構成する他の成分および／またはそれを用いて治療する哺乳動物と化学的および／または毒物学的に適合性を有する必要がある、物質または組成物を意味する。
【００２５】
「治療有効量」とは、治療前に決定したまたはビヒクルで治療した群の適切な対照値に対して、血糖、カロリー摂取を低下させる、体重を低下させる、および／または体脂肪を低下させる、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の量を意味する。
【００２６】
用語「治療すること」、「治療する」、または「治療」とは、防止的、すなわち予防的な治療と対症的な治療をどちらも包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（ＧＬＰ−１／Ｔｆ）（図１Ａ）とエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（エキセンディン−４／Ｔｆ）（図１Ｂ）との間のコラゲナーゼ耐性（ＭＭＰ−１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ比較を示すグラフである。
【図２】糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスにおける血糖に対するエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（エキセンディン−４／Ｔｆ）の用量効果を示すグラフであり、エキセンディン−４制御の比較効果を示す。それぞれの点は平均グルコース測定値（ｎ＝３）を表す。
【図３】体重に対するエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（エキセンディン−４／Ｔｆ）の毎日の注射の用量効果を示すグラフであり、エキセンディン−４およびｍＴｆの制御の比較効果を示す。
【図４】エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（エキセンディン−４／Ｔｆ）およびエキセンディン−４の相対効力を比較するグラフである。これは、細胞に基づいたｃＡＭＰアッセイによって決定した。エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質のＥＣ５０は３１．３ｐＭであり、エキセンディン−４のＥＣ５０は６．６ｐＭである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質
本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、ポリペプチドリンカーを介してＴｆペプチドと融合したエキセンディン−４を含む。好ましくは、完全長エキセンディン−４（１〜３９）（配列番号４）、または８もしくは９個までのアミノ酸残基が配列番号４に示す配列のＣ末端から除去されて、たとえばエキセンディン−４（１〜３１）もしくはエキセンディン−４（１〜３０）を生じたエキセンディン−４断片を用いる。
【００２９】
好ましくは、非ヘリックスポリペプチドリンカー部分を用いてエキセンディン−４をＴｆと連結させる。
【００３０】
好ましいリンカーはＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号５）である。他のリンカーは、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号６）、ＩｇＧヒンジリンカー（配列番号７〜１６）と組み合わせたＰＥＡＰＴＤ（配列番号６）、およびＩｇＧヒンジリンカー（配列番号７〜１６）と組み合わせたＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号５）からなる群から選択することができる。実質的に非ヘリックスのリンカー部分を含有する本発明の融合タンパク質は、実質的に非ヘリックスのリンカーを有さない類似の融合タンパク質と比較して、発現性産生の増加を示し得る。さらに、実質的に非ヘリックスのリンカーを含有するエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、ヘリックスポリペプチドリンカーを有する類似の融合タンパク質と比較して発現の生産性の増加を示し得る。
【００３１】
好ましいエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、配列番号１７に提供するｍＴｆとリンカー（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）を介して連結したエキセンディン−４（１〜３９）（配列番号４）を含む。産生された際、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質がヒトトランスフェリン分泌シグナルまたはリーダー配列（ｎＬ）（配列番号１８）も含むことが好ましい。好ましいエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の構成成分のそれぞれをコードする核酸配列は、ｎＬリーダー配列（配列番号１９）、エキセンディン−４（１〜３９）（配列番号２０）、（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号２１）、およびｍＴｆ（配列番号２２）である。ｎＬリーダーを有さないエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の全体のアミノ酸配列は配列番号２３であり、その対応する核酸配列は配列番号２４である。Ｎ末端にｎＬリーダー配列を有するエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の全体のアミノ酸配列は配列番号２５であり、その対応する核酸配列は配列番号２６）である。
【００３２】
好ましいｍＴｆは上述のものであるが、任意のトランスフェリンを用いて本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を作製することができる。例として、野生型ヒトＴｆは約７５ｋＤａの６７９個のアミノ酸のタンパク質（グリコシル化を計上しない）であり、これは、遺伝子重複から生じると考えられる２つの主要なドメインまたはローブ、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を有する。その全体が本明細書中に参考として組み込まれているＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０６３、ＸＭ＿００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ＿０３９８４５、ＸＭ＿０３９８４７およびＳ９５９３６、ならびに配列番号２および３（配列番号２はｎＬヒトトランスフェリンリーダー配列の追加の１９個のアミノ酸配列を含む）を参照されたい。２つのドメインは長い間に分岐しているが、高い度合の同一性／類似性を保持している。
【００３３】
ＮおよびＣローブのそれぞれは、２つのサブドメイン、すなわちＮ１およびＮ２、Ｃ１およびＣ２にさらに分類される。Ｔｆの機能は、鉄を身体の細胞へと輸送することである。このプロセスは、すべての細胞、特に活動的に成長中の細胞上で発現されるＴｆ受容体（ＴｆＲ）によって媒介される。ＴｆＲは鉄と結合した形態のＴｆ（１つの受容体に２つのＴｆ分子が結合する）を認識してエンドサイトーシスを引き起こし、これによってＴｆＲ／Ｔｆ複合体がエンドソームへと輸送される。エンドソーム内のｐＨの局所的な低下は、結合した鉄の放出、ＴｆＲ／Ｔｆ複合体の細胞表面への再循環、およびＴｆの放出（その鉄と結合していない形態ではａｐｏＴｆとして知られる）をもたらす。受容体の結合は、ＴｆのＣドメインを介して起こる。グリコシル化されていない鉄と結合したＴｆは受容体と結合しないので、Ｃドメイン中の２つのグリコシル化部位は受容体の結合に関与していないと考えられる。
【００３４】
それぞれのＴｆ分子は、２つの鉄イオン（Ｆｅ３＋）を保有することができる。これらは、Ｎ１とＮ２、Ｃ１とＣ２のサブドメインの間の空間中で複合体形成されており、分子のコンホメーション変化をもたらす。
【００３５】
配列番号３のヒトトランスフェリンでは、鉄結合部位は、アミノ酸Ａｓｐ６３（天然のＴｆシグナル配列が含まれる配列番号２のＡｓｐ８２）、Ａｓｐ３９２（配列番号２のＡｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２のＴｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２のＴｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２のＴｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４または５１７（配列番号２のＴｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２のＨｉｓ２６８）、およびＨｉｓ５８５（配列番号２のＨｉｓ６０４）を少なくとも含む。ヒンジ領域は、配列番号３のＮドメインのアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８を少なくとも含む。配列番号３のヒトＴｆの炭酸結合部位は、アミノ酸Ｔｈｒ１２０（配列番号２のＴｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２のＴｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２のＡｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２のＡｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２のＡｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２のＡｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２のＧｌｙ１４６）、およびＧｌｙ４５９（配列番号２のＧｌｙ４７８）を少なくとも含む。
【００３６】
好ましくは、改変エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質はヒト由来であるが、ヒトＴｆ変異体、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サル、ならびに他のウシ科、イヌ科およびトリ科の種を含めた任意の動物のＴｆ分子を用いて本発明の融合タンパク質を産生し得る。これらのＴｆ配列はすべて、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の公開データベースから容易に入手可能である。ヒトＴｆ核酸配列が利用可能であり（配列番号１および上述の受託番号を参照）、ＴｆまたはＴｆのドメインと選択した治療分子との間の遺伝子融合を作製するために使用することができる。また、融合体は、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３４３）またはネズミメラノトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３９００）などの関連分子からも作製し得る。
【００３７】
メラノトランスフェリンとは、悪性黒色腫細胞中に高レベルで見つかるグリコシル化されたタンパク質であり、最初にヒト黒色腫抗原ｐ９７と命名された（Ｂｒｏｗｎ他、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３）。これは、ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリン、およびニワトリトランスフェリンと高い配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３、１９８２；Ｒｏｓｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：１２６１〜１２６５、１９８６）。しかし、これらの受容体とは異なり、メラノトランスフェリンの細胞受容体は同定されていない。メラノトランスフェリンは鉄と可逆的結合し、２つの形態で存在し、そのうちの一方はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞膜と結合し、他方の形態は可溶性かつ活動的に分泌される（Ｂａｋｅｒ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２９８、１９９２：２１５〜２１８；Ａｌｅｍａｎｙ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１０４：１１５５〜１１６２、１９９３；Ｆｏｏｄ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：７０１１〜７０１７、１９９４）。
【００３８】
天然の防御鉄結合タンパク質であるラクトフェリン（Ｌｆ）は、抗細菌、抗糸状菌、抗ウイルス、抗新生物および抗炎症の活性を有することが見出されている。このタンパク質は、正常な叢、すなわち、乳、涙、鼻浸出液、唾液、気管支粘液、胃腸管液、頚膣粘液および精液に一般的にさらされる外分泌液中に存在する。さらに、Ｌｆは、循環中の多形核好中球（ＰＭＮ）の二次的な特異的顆粒の主要な構成要素である。アポタンパク質は、敗血領域中のＰＭＮの脱顆粒の際に放出される。Ｌｆの主要な機能は、フリーラジカルに媒介される損傷を抑制し、侵入する微生物および新生細胞への金属の利用能を低下させるために、液体および炎症領域中の遊離鉄を捕捉することである。成体における１２５Ｉ  Ｌｆの代謝回転率を調査した研究では、Ｌｆは肝臓および脾臓によって素早く取り上げられ、放射活性が肝臓および脾臓内で数週間持続したことが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔ他、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）、５７：４５３〜４６０、１９７９）。
【００３９】
本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分にはトランスフェリンスプライシング変異体が含まれる。一例では、トランスフェリンスプライシング変異体はヒトトランスフェリンのスプライシング変異体でよい。具体的には、ヒトトランスフェリンスプライシング変異体はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ６１１４０のものでよい。
【００４０】
本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分にはラクトフェリンスプライシング変異体が含まれる。一例では、ヒト血清ラクトフェリンスプライシング変異体は、好中球ラクトフェリンの新規スプライシング変異体でよい。具体的には、好中球ラクトフェリンスプライシング変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ５９４７９に示される配列のものでよい。また、好中球ラクトフェリンスプライシング変異体は、アミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号２７）を含むことができ、これにはスプライシング変異体の新規領域が含まれる。
【００４１】
また、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、メラノトランスフェリン変異体が含まれる。
【００４２】
改変Ｔｆ融合は、任意のＴｆタンパク質、断片、ドメイン、または操作したドメインを用いて作製することができる。たとえば、融合タンパク質は、天然のＴｆシグナル配列を有するまたは有さない完全長Ｔｆ配列を用いて作製することができる。また、Ｔｆ融合タンパク質は、個々のＮもしくはＣドメインなどの単一のＴｆドメイン、または２つのＮもしくは２つのＣドメインを含むＴｆの改変型を用いて作製することができる（米国特許出願公開番号ＵＳ２００６／０１３０１５８号参照）。Ｃドメインがグリコシル化を低下、阻害または防止するように変化した、治療タンパク質と単一のＣドメインとの融合体を生成することができる。また、Ｔｆグリコシル化部位はＣドメインおよびＮドメイン中に存在するので、単一のＮドメインの使用が有利である。好ましくは、Ｔｆ融合タンパク質は、高レベルで発現される単一のＮドメインを有する。
【００４３】
本明細書中で使用する、Ｎ様ドメインとして機能するように改変されたＣ末端ドメインまたはローブは、天然のまたは野生型のＮドメインまたはローブのものと実質的に同様のグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すように改変されている。好ましくは、Ｃドメインまたはローブは、グリコシル化されておらず、関連するＣドメイン領域またはアミノ酸を天然のまたは野生型のＮドメインの対応する領域または部位中に存在するもので置換することによって鉄と結合しないように改変されている。
【００４４】
本明細書中で使用する、「２つのＮドメインまたはローブ」を含むＴｆ部分には、天然のＣドメインもしくはローブを天然のもしくは野生型のＮドメインもしくはローブまたは改変Ｎドメインもしくはローブで置き換えるように改変されているＴｆ分子、または野生型もしくは改変Ｎドメインと実質的に同様に機能するように改変されたＣドメインを含有するＴｆ分子が含まれる。
【００４５】
２つのドメインを重ねることによる（Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ  ３．７ｂ２、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｆｉｔ）、および直接アミノ酸アラインメントによる（ＣｌｕｓｔａｌＷ複数アラインメント）２つのドメインの分析から、２つのドメインが長い間に分岐したことを明らかとなる。アミノ酸アラインメントにより、２つのドメイン間で４２％の同一性および５９％の類似性が示された。しかし、構造同値に関してＮドメインの約８０％がＣドメインと一致する。また、Ｃドメインは、Ｎドメインと比較していくつかの余分なジスルフィド結合を有する。
【００４６】
一実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、トランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブが含まれる。さらなる実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブが含まれる。
【００４７】
また、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、およびＨｉｓ２４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基で突然変異を有する、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブ；配列番号３のＬｙｓ２０６もしくはＨｉｓ２０７で突然変異を有する、組換えヒト血清トランスフェリンのＮ末端ローブ突然変異体；またはトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブも含まれることができる。さらなる実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれる。
【００４８】
さらなる実施形態では、Ｃ末端ローブ突然変異体には、グリコシル化を許容しない、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうちの少なくとも１つの突然変異がさらに含まれる。
【００４９】
別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基で突然変異を有する、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれ、突然変異体は、金属と結合する能力を保持している。代替の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基で突然変異を有する、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれ、突然変異体は、金属と結合する能力が低下している。別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基で突然変異を有する、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブが含まれ、突然変異体は、金属と結合する能力を保持しておらず、Ｎドメインと実質的に同様に機能する。
【００５０】
ＴｆのＣドメインが融合タンパク質の一部である場合、２つのＮ連結のグリコシル化部位、配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に対応するアミノ酸残基は、グリコシル化または過マンノシル化を防止し、融合タンパク質および／または治療タンパク質の血清半減期を延長するために、酵母系中で発現させるために突然変異させ得る（アシアロ−、または一部の例ではモノシアロ−Ｔｆもしくはジシアロ−Ｔｆを生成するため）。Ｎ４１３およびＮ６１１に対応するＴｆアミノ酸に加えて、突然変異を、グリコシル化を防止または実質的に低下させるために、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基に行ってもよい。米国特許第５，９８６，０６７号を参照されたい。また、ピキアパストリス中で発現されるＴｆのＮドメインは、Ｓ３２において単一の六単糖でＯ連結のグリコシル化され、これも、そのようなグリコシル化を防止するために突然変異または改変されていてよいことが報告されている。
【００５１】
したがって、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質には、トランスフェリンが、それだけには限定されないが、Ｔｆのアシアロ−、モノシアロ−およびジアシロ−型を含めた低下したグリコシル化を示す、改変トランスフェリン分子も含まれることができる。別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、グリコシル化を防止するために突然変異させた組換えトランスフェリン突然変異体が含まれる。また。エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、完全にグリコシル化された組換えトランスフェリン突然変異体も含まれることができる。さらなる実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、Ｎ連結のグリコシル化を防止するために突然変異させた組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうち少なくとも１つが、グリコシル化を許容しないアミノ酸へと突然変異している。別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、グリコシル化を防止または実質的に低下させるように突然変異させた組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、たとえば、突然変異は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接残基、たとえばＳ／Ｔ残基の突然変異に行う。さらに、グリコシル化は、セリンまたはスレオニン残基を突然変異させることによって低下または防止し得る。さらに、Ｘをプロリンに変更することでグリコシル化が阻害されることが知られている。
【００５２】
また、以下にさらに詳述するように、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質は、鉄と結合せず、かつ／またはＴｆ受容体と結合するように操作してもよい。本発明の他の実施形態では、鉄結合が保持され、Ｔｆの鉄結合能力を用いて、治療タンパク質またはペプチドを細胞の内部へ、上皮または内皮細胞膜を横切って送達し得る。鉄および／またはＴｆ受容体と結合するこれらの実施形態は、治療タンパク質の血清半減期を延長するために、グリコシル化を低下または防止するように操作されている。鉄を載せた場合、Ｎドメインは単独ではＴｆＲと結合せず、鉄と結合したＣドメインは、ＴｆＲと結合するが完全分子と同じ親和性ではない。
【００５３】
また、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、金属イオンと結合する能力を保持していない、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ得る。代替の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、金属イオンに対する結合親和性が野生型血清トランスフェリンよりも弱い、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれる。代替の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、金属イオンに対する結合親和性が野生型血清トランスフェリンよりも強力である、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれる。
【００５４】
別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、トランスフェリン受容体と結合する能力を保持していない、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれる。たとえば、本発明のエキセンディン−４およびＴｆの融合タンパク質は、細胞表面ＧＬＰ−１受容体と結合するがＴｆ受容体と結合しない場合がある。そのような融合タンパク質は、細胞表面で、すなわち細胞内に入らずに、治療上の活性を有することができる。
【００５５】
また、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、トランスフェリン受容体に対する結合親和性が野生型血清トランスフェリンよりも弱い、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体；トランスフェリン受容体に対する結合親和性が野生型血清トランスフェリンよりも強力である、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体；炭酸イオンと結合する能力を保持していない、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体；炭酸イオンに対する結合親和性が野生型血清トランスフェリンよりも弱い、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体；または炭酸イオンに対する結合親和性が野生型血清トランスフェリンよりも強力である、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体が含まれ得る。
【００５６】
別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基で突然変異を有する、組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれ、突然変異体は、金属イオンと結合する能力を保持している。代替の実施形態では、組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基で突然変異を有し、突然変異体は、金属イオンと結合する能力が低下している。別の実施形態では、組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基で突然変異を有し、突然変異体は、金属イオンと結合する能力を保持していない。
【００５７】
別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、金属イオンに対する結合親和性が野生型ヒト血清トランスフェリンよりも強力である、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７で突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれる（米国特許第５，９８６，０６７号参照）。代替の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、金属イオンに対する結合親和性が野生型ヒト血清トランスフェリンよりも弱い、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７で突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれる。さらなる実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のトランスフェリン部分には、金属イオンと結合しない、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７で突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が含まれる。
【００５８】
それだけには限定されないが、一般的に利用可能な分子技術、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載のものを含めた任意の利用可能な技術を用いて、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を生成し得る。部位特異的突然変異誘発を達成する当分野で周知の技術を用いてヌクレオチド置換を実施する場合、コードされたアミノ酸の変化は好ましくは軽微な性質のもの、すなわち保存的アミノ酸置換であるが、他の非保存的置換も、特にＴｆ融合タンパク質の改変トランスフェリン部分、たとえば、低下したグリコシル化や低下した鉄結合などを示す改変Ｔｆタンパク質を生成する場合に企図される。具体的には、アミノ酸の置換、小さな欠失もしくは挿入、典型的には１〜約３０個のアミノ酸；トランスフェリンドメイン間への挿入；アミノ末端のメチオニン残基などの小さなアミノもしくはカルボキシル末端の伸長、またはトランスフェリンドメイン間もしくはトランスフェリンタンパク質とエキセンディン−４とを連結する５０、４０、３０、２０もしくは１０個未満の残基の小さなリンカーペプチド、またはポリヒスチジン領域、抗原性エピトープもしくは結合ドメインなどの精製を容易にする小さな伸長が企図される。
【００５９】
保存的アミノ酸置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、ヒスチジン等）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸等）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン等）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン等）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン等）ならびに小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン等）の群内など、同じ群内で行う置換である。
【００６０】
非保存的置換は、１つの群のアミノ酸で別の群のアミノ酸を置換することを包含する。たとえば、非保存的置換には、極性アミノ酸で疎水性アミノ酸を置換することが含まれる。ヌクレオチド置換の一般的な説明には、たとえば、Ｆｏｒｄ他、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．、２：９５〜１０７、１９９１を参照されたい。非保存的な置換、欠失および挿入は、鉄結合を示さないもしくはそれが低下している、融合タンパク質とＴｆ受容体との結合を示さないもしくはそれが低下している、および／またはグリコシル化を示さないもしくはそれが低下している、本発明のＴｆ融合タンパク質を生成するために特に有用である。
【００６１】
鉄結合および／または受容体の結合は、配列番号３のＴｆのＮドメイン残基Ａｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９ならびに／またはＣドメイン残基Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４および／もしくはＨｉｓ５８５のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基内への欠失、置換または挿入を含めた突然変異によって低下または破壊し得る。また、鉄結合は、配列番号３のアミノ酸Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７またはＡｒｇ６３２への突然変異によっても影響を受け得る。炭酸結合は、配列番号３のＴｆのＮドメイン残基Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７ならびに／またはＣドメイン残基Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８および／もしくはＧｌｙ４５９のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基内への欠失、置換または挿入を含めた突然変異によって低下または破壊し得る。炭酸結合の低下または破壊は、鉄および／または受容体の結合に悪影響を与え得る。
【００６２】
Ｔｆ受容体との結合は、鉄結合について上述したＴｆのＮドメイン残基のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基内への欠失、置換または挿入を含めた突然変異によって低下または破壊し得る。
【００６３】
上述のように、グリコシル化は、Ｃドメイン残基Ｎ４１３および／またはＮ６１１に対応するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位の周りのＴｆのＣドメイン残基のうちの１つまたは複数に対応するアミノ酸残基内への欠失、置換または挿入を含めた突然変異によって低下または防止し得る（米国特許第５，９８６，０６７号参照）。たとえば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１をＧｌｕ残基へと突然変異させ得る。
【００６４】
本発明のＴｆ融合タンパク質がグリコシル化、鉄結合、炭酸結合および／または受容体の結合を防止するように改変されていない場合は、グリコシル化、鉄および／または炭酸イオンを融合タンパク質から剥ぎ取るまたは切断して取り除き得る。たとえば、利用可能な脱グリコシル化酵素を用いてグリコシル化残基、具体的にはＴｆ部分に付着した糖残基を融合タンパク質から切断してよく、グリコシル化を防止するためにグリコシル化酵素を欠く酵母を用いてもよく、および／または組換え細胞を、グリコシル化を防止する薬剤、たとえばツニカマイシンの存在下で増殖させてもよい。
【００６５】
また、融合タンパク質上の炭水化物は、融合タンパク質を脱グリコシル化酵素で処理することによっても、酵素的に低下させるまたは完全に除去し得る。脱グリコシル化酵素は当分野で周知である。脱グリコシル化酵素の例には、それだけには限定されないが、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、およびＥｎｄｏ  Ｈ脱グリコシル化酵素が含まれる。
【００６６】
とはいえ、特定の状況下では、経口送達には融合タンパク質のＴｆ部分が完全にグリコシル化されていることが好ましい場合がある。
【００６７】
鉄結合およびＴｆ受容体認識に必要なコンホメーション変化を防止するためのヒンジ領域への改変など、Ｔｆの三次元構造を変化させるためにＴｆに追加の突然変異を行い得る。たとえば、突然変異は、Ｎドメインのアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／もしくは３１６〜３１８ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／もしくは６５２〜６５８の中またはその周りで行い得る。さらに、Ｔｆの構造および機能を変化させるために、突然変異をこれらの部位のフランキング領域の中またはその周りで行い得る。
【００６８】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、治療タンパク質の半減期または生体利用度を延長し、一部の例では、治療タンパク質を細胞内および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って送達する、担体タンパク質として機能することができる。代替の実施形態では、融合タンパク質には、トランスフェリンがＢＢＢを横切る能力を保持していない改変トランスフェリン分子が含まれる。
【００６９】
別の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質には、トランスフェリン受容体と結合し、治療ペプチドを細胞内へと輸送する能力を保持している、改変トランスフェリン分子が含まれる。代替の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質には、トランスフェリン受容体と結合し、治療ペプチドを細胞内へと輸送する能力を保持していない、改変トランスフェリン分子が含まれる。
【００７０】
さらなる実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質には、トランスフェリン受容体と結合し、治療ペプチドを細胞内へと輸送する能力を保持しており、ＢＢＢを横切る能力を保持している、改変トランスフェリン分子が含まれる。代替の実施形態では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質には、ＢＢＢを横切る能力を保持しているが、トランスフェリン受容体と結合し、治療ペプチドを細胞内へと輸送する能力を保持していない、改変トランスフェリン分子が含まれる。
【００７１】
本発明の改変融合タンパク質は、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸から構成されることができ、遺伝子にコードされている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセス、または当分野で周知の化学修飾技術のどちらかによって改変し得る。そのような改変は、基本的な教科書およびより詳細な専攻論文、ならびに膨大な研究文献に十分に記載されている。
【００７２】
改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含めた、ポリペプチド内の任意の箇所で起こることができる。同じ種類の改変が同じまたは異なる度合で、所定のポリペプチド内のいくつかの部位で存在し得ることを理解されたい。また、所定のポリペプチドが多種類の改変を含有し得る。ポリペプチドは、たとえばユビキチン化の結果として分枝鎖状であってもよく、また、分枝鎖を有するまたは有さない環状であってもよい。環状、分枝鎖状、および分枝鎖環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じるか、または合成方法によって作製し得る。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ｐｅｇ化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、アルギニン化などの転移−ＲＮＡ媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が含まれる。（たとえば、タンパク質−構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９９３；タンパク質の翻訳後共有結合修飾（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１〜１２ページ、１９８３；ならびにＳｅｉｆｔｅｒ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２：６２６〜６４６、１９９０を参照）。
【００７３】
エキセンディン−４／Ｔｆをコードする核酸分子
本発明はまた、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。好ましい核酸分子は、（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）によってｍＴｆと連結したエキセンディン−４（１〜３９）のアミノ酸配列である、配列番号２３をコードする。例示的な核酸配列を配列番号２４として示す。最も好ましくは、本発明の核酸配列は、エキセンディン−４（１〜３９）のアミノ酸配列（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質＋ヒトトランスフェリン分泌シグナルまたはリーダー配列を表す追加のＮ末端の１９個のアミノ酸である、配列番号２５をコードする。配列番号２５をコードする例示的な核酸配列を配列番号２６として示す。
【００７４】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードする配列には、Ｃ末端にストップコドン（たとえば、ｔｇａ、ｔａａ、ｔａｇ）も含まれることができ、それだけには限定されないが、化学合成、野生型エキセンディン−４およびｃＤＮＡから得たトランスフェリンポリヌクレオチド配列の遺伝子突然変異、またはｃＤＮＡのゲノムライブラリスクリーニング、発現ライブラリスクリーニング、および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含めた様々な方法によって、容易に得ることができる。エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードする核酸分子は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ増幅、またはプライマーが所望の点突然変異を有する他の適切な方法を用いて作製し得る。本明細書中に記載の組換えＤＮＡ方法および突然変異誘発方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９、ならびに分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９４に記載のものである。
【００７５】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸ポリヌクレオチドは、発現されたタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を用いる発現クローニングによって同定し得る。典型的には、核酸ライブラリは、抗体または他の結合パートナー（たとえば受容体もしくはリガンド）と宿主細胞の表面上で発現および提示されるクローニングしたタンパク質との結合によってスクリーニングする。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために検出可能な標識で修飾されている。
【００７６】
以下に記述する説明に従って実施した組換え発現技術に従って、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを産生させ、コードされたポリペプチドを発現させ得る。たとえば、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクター内に挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に産生することができる。その後、配列を用いて検出プローブまたは増幅プライマーを作製することができる。別法として、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター内に挿入することができる。発現ベクターを適切な宿主内に導入することによって、コードされたエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を大量に産生させ得る。
【００７７】
適切な核酸配列を得る別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法では、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製する。その後、２つのプライマー、典型的にはエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの個別の領域に相補的なものを、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼと共にｃＤＮＡに加え、ポリメラーゼが２つのプライマーの間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【００７８】
ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有することができる。このメチオニンは、宿主細胞内で産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるように設計されているかどうかに応じて、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の成熟型上に存在するまたは存在しない場合がある。イソロイシンをコードするコドンも開始部位として用いることができる。当業者に知られている他の方法も使用し得る。特定の実施形態では、核酸変異体は、所定の宿主細胞におけるエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の最適な発現のために変化したコドンを含有する。具体的なコドンの変化は、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質および発現用に選択された宿主細胞に依存する。そのようなコドン最適化は、たとえば所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子での使用に好ましいコドンを選択することによるなど、様々な方法によって実施することができる。高度に発現される細菌遺伝子のコドン優先度の「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」などのコドン頻度表を組み込むコンピュータアルゴリズムを用いてよく、ウィスコンシン大学パッケージバージョン９．０（遺伝子コンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）によって提供されている。他の有用なコドン頻度表には、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が含まれる。
【００７９】
ベクター
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準のライゲーション技術を用いて適切な発現ベクター内に挿入する。ベクターは、典型的には用いる特定の宿主細胞内で機能的であるように選択する（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こることができるように、宿主細胞の機構と適合性を有する）。エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞内で増幅／発現させ得る。発現ベクターの総説には、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、第１８５巻、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０を参照されたい。
【００８０】
典型的には、任意の宿主細胞で使用する発現ベクターは、プラスミドを維持するためならびに外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび発現するための配列を含有する。特定の実施形態では、「フランキング配列」と総称するそのような配列には、典型的には、以下のヌクレオチド配列、すなわち、プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカー要素のうちの１つまたは複数が含まれる。これらの配列のそれぞれについて以下に記載する。
【００８１】
ベクターは、「タグ」付けしたコード配列、すなわち、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のコード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよい。このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、または市販されている抗体が存在するＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドが発現された際にポリペプチドと融合しており、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を宿主細胞から親和性精製する手段として役割を果たすことができる。親和性精製は、たとえば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして用いるカラムクロマトグラフィーによって達成することができる。続いて、タグを、特定の切断用のペプチダーゼを用いることなどの様々な手段、たとえば、アミノ酸配列のうちの１つの上流のＦＬＡＧタグ配列の３’のエンテロキナーゼ消化によって、精製したエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質から除去してもよい。
【００８２】
フランキング配列は、相同的（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来する）、非相同的（すなわち、宿主細胞の種または株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、複数の供給源に由来するフランキング配列の組合せ）、もしくは合成のものであるか、または、フランキング配列は、通常はエキセンディン−４の発現を調節するために機能する天然の配列であり得る。フランキング配列の供給源は、フランキング配列が宿主細胞の機構内で機能的であり、かつそれによって活性化されることができる限りは、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物生物、または、任意の植物であり得る。
【００８３】
有用なフランキング配列は、当分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。典型的には、本発明で有用なフランキング配列は、マッピングによっておよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって事前に同定されており、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。一部の事例では、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が知られている場合がある。ここでは、フランキング配列は、核酸の合成またはクローニングについて本明細書中に記載した方法によって合成し得る。
【００８４】
フランキング配列の全体または一部分のみが知られている場合は、これは、ＰＣＲを用いて、および／または同じもしくは別の種に由来する適切なオリゴヌクレオチドおよび／もしくはフランキング配列断片を用いてゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、得られ得る。フランキング配列が知られていない場合は、フランキング配列を含有するＤＮＡ断片は、より大きな、たとえば、コード配列またはさらには別の遺伝子もしくは複数の遺伝子を含有し得るＤＮＡ片から単離し得る。単離は、適切なＤＮＡ断片を生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、次いで、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ）、または当業者に知られている他の方法による単離によって達成し得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者には容易に明らかであろう。
【００８５】
複製起点は、典型的には購入した原核発現ベクターの一部であり、起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を支援する。ベクターを特定のコピー数まで増幅させることは、一部の事例では、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の最適発現に重要である可能性がある。選択したベクターが複製起点の部位を含有しない場合は、複製起点を既知の配列に基づいて化学合成し、ベクター内にライゲーションし得る。たとえば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）由来の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に適しており、様々な起点（たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が、ベクターを哺乳動物細胞内にクローニングするために有用である。一般に、複製起点の構成成分は哺乳動物の発現ベクターには必要ない（たとえば、ＳＶ４０起点は、多くの場合、初期プロモーターを含有するという理由だけで使用される）。
【００８６】
転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結させる役割を有する。通常、原核細胞内の転写終結配列は、Ｇ−Ｃに富んだ断片、続いてポリＴ配列である。この配列は、ライブラリから容易にクローニングされるか、さらにはベクターの一部として購入されるが、本明細書中に記載のものなどの核酸合成方法を用いて、容易に合成することもできる。
【００８７】
選択マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖させる宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、たとえば、原核宿主細胞ではアンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を与える；（ｂ）細胞の栄養要求欠損を補完する；または（ｃ）複合培地から利用できない重要栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も、原核および真核の宿主細胞の選択に使用し得る。
【００８８】
他の選択遺伝子を、発現される遺伝子を増幅するために用い得る。増幅とは、増殖に重要なタンパク質の産生の要求がより高い遺伝子を、組換え細胞の継続的な世代の染色体内で直列に反復させるプロセスである。哺乳動物細胞の適切な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが含まれる。哺乳動物細胞の形質転換体を、形質転換体のみが、ベクター内に存在する選択遺伝子のおかげで生存するように独自に適応している、選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度を次々に変化させ、それにより選択遺伝子およびエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡのどちらの増幅ももたらされる条件下で、形質転換細胞を培養することによって課す。その結果、増加した量のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質が、増幅したＤＮＡから合成される。
【００８９】
リボソーム結合部位が通常はｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン−ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴づけられる。この要素は、典型的には、プロモーターの３’側かつ発現させるエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質のコード配列の５’側に位置する。シャイン−ダルガノ配列は変動するが、典型的にはポリプリン（すなわち高いＡ−Ｇ含有率を有する）である。多くのシャイン−ダルガノ配列が同定されており、そのそれぞれを本明細書中に記載した方法を用いて容易に合成して原核ベクター内で使用することができる。
【００９０】
用語「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」または「分泌リーダー配列」は、互換性があるように使用され、たとえば、米国特許第６，２９１，２１２号および第５，５４７，８７１号に記載されている。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は分泌ペプチドをコードする。分泌ペプチドとは、細胞からの成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を指示するように作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは一般に疎水性アミノ酸の核を特徴とし、典型的には新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に見つかる（必ずしもそうではない）。頻繁に、分泌ペプチドは分泌中に成熟タンパク質から切断される。分泌ペプチドは、それが分泌経路を通る際に成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能にする、プロセシング部位を含有し得る。プロセシング部位は、シグナルペプチド内にコードされ、またはたとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によってシグナルペプチドに付加され得る。
【００９１】
分泌ペプチドを用いて本発明の融合タンパク質の分泌を指示し得る。他の分泌ペプチドと組み合わせて使用し得るそのような分泌ペプチドの１つは、α接合因子リーダー配列である。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳後プロセシングのステップに必要である。インタクトなシグナル配列が存在する場合、発現させるタンパク質は粗面小胞体の管腔内に入り、その後、ゴルジ体を介して分泌小胞へと輸送され、最終的に細胞から外に輸送される。一般に、シグナル配列は開始コドンの直後にあり、分泌させるタンパク質のアミノ末端のシグナルペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼによって切断されて取り除かれる。好ましいシグナル配列は、ウイルス、哺乳動物または酵母発現ベクターを用いた組換えタンパク質発現のプロセシングおよび輸出効率を改善する。
【００９２】
一実施形態では、天然のＴｆシグナル配列を用いて本発明の融合タンパク質を発現および分泌させ得る。トランスフェリン分子は、血液、涙、および乳などの様々な種類の分泌物中に存在するので、多くの異なるトランスフェリンシグナルペプチドが存在する。たとえば、トランスフェリンシグナルペプチドは、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリン、またはメラノトランスフェリンに由来することができる。また、天然のトランスフェリンシグナルペプチドは、昆虫、哺乳動物、魚、カエル、アヒル、ニワトリ、または他の種などの様々な種に由来することもできる。好ましくは、シグナルペプチドは哺乳動物のトランスフェリン分子に由来する。より好ましくは、シグナルペプチドはヒト血清トランスフェリンに由来する。様々な哺乳動物トランスフェリン分子に由来するシグナルペプチド配列は、米国特許出願公開番号第２００６／０２０５０３７号に記載されている。
【００９３】
好ましくは、トランスフェリンに由来するシグナル配列を用いて異種タンパク質を分泌させてよく、たとえば、Ｔｆシグナルを用いて、Ｔｆシグナル配列に非相同的な任意の目的タンパク質を発現および分泌させ得る。具体的には、Ｔｆシグナル配列を用いて組換え酵母からタンパク質を分泌させ得る。好ましくは、シグナルペプチドはヒト血清トランスフェリンに由来する（配列番号１８；配列番号１９によってコードされている）。他の好ましいシグナルペプチドには、ＨＳＡ／ＭＦα−１（配列番号４０；配列番号４１によってコードされている）、および改変ＨＳＡ／ＭＦα−１（配列番号４２；配列番号４３によってコードされている）が含まれる。
【００９４】
シグナル配列の効率的な除去を確実にするために、一部の事例では、シグナル配列と成熟タンパク質との間に短いプロペプチド配列を含めることが好ましい場合があり、プロペプチドのＣ末端部分は、酵母ｋｅｘ２ｐプロテアーゼなどのプロテアーゼの認識部位を含む。好ましくは、プロペプチド配列の長さは約２〜１２個のアミノ酸であり、より好ましくは約４〜８個のアミノ酸の長さである。そのようなプロペプチドの例は、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１３）、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１１４）、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１５）、およびＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１１６）である。
【００９５】
発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードする分子に作動可能に連結されているプロモーターを含有する。プロモーターとは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’）に位置する（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）転写されない配列である。プロモーターは、慣習的に、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの２つのクラスの一方に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素が存在するもしくはしないことまたは温度変化などの培養条件の何らかの変化に応答して、その制御下のＤＮＡの増加した転写レベルを開始する。他方で、構成的プロモーターは、連続的な遺伝子産物産生を開始する、すなわち、遺伝子発現に対する制御がわずかしか存在しないまたは存在しない。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、プロモーターをＤＮＡ源から制限酵素消化によって除去し、所望のプロモーター配列をベクター内に挿入することによって、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質にコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。天然のエキセンディン−４またはトランスフェリンプロモーター配列を用いて、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の核酸分子の増幅および／または発現を指示し得る。しかし、天然のプロモーターと比較して発現されたタンパク質がより多い転写および高い収率を可能にし、使用することを選択した宿主細胞系と適合性を有する場合は、非相同的プロモーターが好ましい。
【００９６】
酵母宿主で用いる適切なプロモーターも当分野で周知であり、以下に詳述する。酵母エンハンサーが酵母プロモーターで有利に使用される。哺乳動物宿主細胞で用いる適切なプロモーターは周知であり、それだけには限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどのウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得たものが含まれる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、非相同的哺乳動物プロモーター、たとえば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
【００９７】
原核宿主での使用に適したプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；大腸菌Ｔ７誘導性ＲＮＡポリメラーゼ；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。他の知られている細菌プロモーターも適している。それらの配列は公開されているので、当業者は、任意の有用な制限部位を供給する必要に応じてリンカーまたはアダプターを用いて、これらを所望のＤＮＡ配列内にライゲーションすることが可能である。
【００９８】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の発現の制御において興味深い可能性のあるさらなるプロモーターには、それだけには限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｍｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０：３０４〜１０、１９８１）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列内に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｃｅｌｌ、２２：７８７〜９７、１９８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４４〜４５、１９８１）；メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２、１９８２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７〜３１、１９７８）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１〜２５、１９８３）が含まれる。
【００９９】
高等真核生物におけるエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡの転写を増加させるために、エンハンサー配列をベクター内に挿入し得る。エンハンサーとは、通常は約１０〜３００ｂｐの長さの、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、ＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサーは、比較的、配向および位置に非依存性である。これらは、転写単位の５’および３’側に見つかっている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（たとえば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーを使用する。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが真核プロモーターを活性化させる例示的なエンハンサー要素である。エンハンサーは、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードする核酸分子の５’または３’側の位置でベクター内にスプライシングし得るが、典型的にはプロモーターの５’側の部位に位置する。
【０１００】
発現ベクターは、市販のベクターなどの開始ベクターから構築し得る。そのようなベクターは、所望のフランキング配列のすべてを含有していてもしていなくてもよい。本明細書中に記載のフランキング配列の１つまたは複数が既にベクター内に存在しない場合は、これらを個々に入手し、ベクター内にライゲーションし得る。フランキング配列のそれぞれを得るために用いる方法は当業者に周知である。
【０１０１】
本発明で使用するための適切な酵母ベクターは、たとえば、米国特許第６，２９１，２１２号に記載されており、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１０３５〜１０３９、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ他、Ｇｅｎｅ、８：１２１〜１３３、１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：１０４〜１０８、１９７８）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４ならびにその誘導体が含まれる。また、有用な酵母プラスミドベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）から入手可能なｐＲＳ４０３〜４０６、ｐＲＳ４１３〜４１６およびピキアベクターも含まれる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３も取り込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１．６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。
【０１０２】
そのようなベクターには、一般に、形質転換体の選択を可能にする表現型アッセイが存在する優性表現型を示す、多数の遺伝子のうちの１つであり得る選択マーカーが含まれる。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完する、抗生物質耐性を提供する、または細胞が特定の炭素源を利用することを可能にするものであり、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈ他、上記）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ他、Ｇｅｎｅ、８：１７、１９７９）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌ他、上記）またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ、欧州特許ＥＰ１７１，１４２号）が含まれる。他の適切な選択マーカーには、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子が含まれる。酵母で使用するための好ましいプロモーターには、酵母の解糖遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２５：１２０７３〜１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１：４１９〜４３４、１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）またはアルコール脱水素酵素遺伝子（Ｙｏｕｎｇ他、化学薬品のための微生物の遺伝子操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ他、３５５ページ、ニューヨーク州Ｐｌｅｎｕｍ、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０１：１９２〜２０１、１９８３）に由来するプロモーターが含まれる。この観点から、特に好ましいプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）およびＡＤＨ２−４Ｃ（米国特許第６，２９１，２１２号参照プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ、３０４：６５２〜６５４、１９８３）である。また、発現単位には転写ターミネーターも含まれ得る。好ましい転写ターミネーターはＴＰＩ１ターミネーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、上記）である。酵母発現系の他の好ましいベクターならびにプロモーターおよびターミネーターなどの好ましい構成成分は、欧州特許ＥＰ０２５８０６７号、ＥＰ０２８６４２４号、ＥＰ０３１７２５４号、ＥＰ０３８７３１９号、ＥＰ０３８６２２２号、ＥＰ０４２４１１７号、ＥＰ０４３１８８０号、ＥＰ１００２０９５ＥＰ号、ＥＰ０８２８７５９号、ＥＰ０７６４２０９号、ＥＰ０７４９４７８号、およびＥＰ０８８９９４９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４７７２号およびＷＯ９４／０４６８７号；ならびに米国特許第５，７３９，００７号、第５，６３７，５０４号、第５，３０２，６９７号、第５，２６０，２０２号、第５，６６７，９８６号、第５，７２８，５５３号、第５，７８３，４２３号、第５，９６５，３８６号、第６１５０，１３３号、第６，３７９，９２４号、および第５，７１４，３７７号に開示されている。
【０１０３】
酵母に加えて、本発明の融合タンパク質は、糸状菌、たとえば真菌アスペルギルスの株中で発現させることができる。有用なプロモーターの例には、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４：２０９３〜２０９９、１９８５）およびｔｐｉＡプロモーターなどの、偽巣性コウジ菌の解糖遺伝子に由来するものが含まれる。適切なターミネーターの例はａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、上記）である。そのような構成成分を利用する発現単位は、たとえば、アスペルギルスの染色体ＤＮＡ内へと挿入可能なベクター内にクローニングし得る。
【０１０４】
他のベクターは、細菌、昆虫、および哺乳動物の宿主細胞と適合性を有するものである。そのようなベクターには、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／１４３６３号）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）が含まれる。
【０１０５】
さらなる適切なベクターには、それだけには限定されないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが含まれるが、ベクター系は選択した宿主細胞と適合性を有する必要があることを理解されたい。そのようなベクターには、それだけには限定されないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数のＣｏｌＥ１系ファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのプラスミド、Ｔａｑで増幅したＰＣＲ産物のクローニング用に設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（たとえば、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの哺乳動物、酵母またはウイルスベクターが含まれる。
【０１０６】
また、発現ベクター内には、目的のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルも含有される。ポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、上記）、アデノウイルスの５Ｅ１Ｂ領域由来のポリアデニル化シグナルおよびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、９：３７１９〜３７３０、１９８１）が含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルはＶＨ遺伝子のターミネーターである（米国特許第６，２９１，２１２号参照）。発現ベクターには、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する、アデノウイルス２三者間リーダーなどの非コードウイルスリーダー配列が含まれ得る。また、好ましいベクターには、ＳＶ４０エンハンサーおよびマウス：（米国特許第６，２９１，２１２号参照）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅｌｌ、３３：７１７〜７２８、１９８３）などのエンハンサー配列も含まれ得る。また、発現ベクターには、アデノウイルスのＶＡ  ＲＮＡをコードする配列も含まれ得る。
【０１０７】
ベクターを構築し、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をコードする核酸分子をベクターの適切な部位内に挿入した後、完成したベクターを適切な宿主細胞内に挿入して増幅および／またはポリペプチド発現させ得る。エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の発現ベクターを選択した宿主細胞内に形質転換させることは、形質移入、感染症、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン方法、または他の知られている技術などの方法を含めた、周知の方法によって達成し得る。選択した方法は、部分的に、使用する宿主細胞の種類に応じる。これらの方法および他の適切な方法は当業者に周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載されている。本発明の融合タンパク質を含むクローニングしたＤＮＡ配列は、たとえばリン酸カルシウム媒介の形質移入によって、培養哺乳動物細胞内に導入し得る（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ、１４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、１９７３）。電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１：８４１〜８４５、１９８２）、またはリポフェクションなどの、クローニングしたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞内に導入するための他の技術も使用し得る。クローニングしたＤＮＡを組み込んだ細胞を同定するためには、一般に、選択マーカーを目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞内に導入する。培養哺乳動物細胞で使用するための好ましい選択マーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える遺伝子が含まれる。選択マーカーは増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーはＤＨＦＲ遺伝子である。特に好ましい増幅可能なマーカーはＤＨＦＲｒ（米国特許第６，２９１，２１２号参照）ｃＤＮＡ（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２４９５〜２４９９、１９８３）である。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（哺乳動物細胞技術（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、マサチューセッツ州Ｓｔｏｎｅｈａｍ）によって総説されており、選択マーカーの選択は、十分に当業者の通常技術範囲内にある。
【０１０８】
宿主細胞
本発明にはまた、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を発現するように形質転換させた細胞、好ましくは酵母細胞が含まれる。形質転換させた宿主細胞自体に加えて、本発明にはまた、栄養素培地中のこれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に相同な）培養物、またはモノクローナル培養物に由来する培養物が含まれる。ポリペプチドが分泌される場合は、培地は、細胞と共に、または濾過もしくは遠心分離して除去した場合は細胞を含まずに、ポリペプチドを含有する。
【０１０９】
本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を産生する特に有用な宿主細胞は、メチロトローフ酵母ピキアパストリスである（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．、６：６１９〜６２４、１９９５）。Ｐ．パストリスは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離およびクローニングされて以来、外来タンパク質を産生させる優れた宿主であるように開発されており、その形質転換は、１９８５年に最初に報告されている。Ｐ．パストリスは、グルコースが存在しない場合にメタノールを炭素源として利用することができる。Ｐ．パストリス発現系は、メタノール代謝の最初のステップを触媒する酵素であるアルコールオキシダーゼの発現をコードする遺伝子を制御する、メタノール誘導アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを使用することができる。このプロモーターは、特徴づけられ、一連のＰ．パストリス発現ベクター内に取り込まれている。Ｐ．パストリス内で産生されたタンパク質は、典型的には正しく折り畳まれて培地中に分泌されるので、遺伝子操作したＰ．パストリスの発酵は、大腸菌発現系に代わる優れた代替方法を提供する。破傷風毒素断片、ボルダテラ・ペルチュシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ペルタクチン、ヒト血清アルブミンおよびリゾチームを含めたいくつかのタンパク質が、この系を用いて産生される。
【０１１０】
酵母、出芽酵母の株は別の好ましい宿主である。好ましい実施形態では、酵母細胞、より詳細には、糖タンパク質のアスパラギン連結のグリコシル化に必要な遺伝子の遺伝子欠損を含有する出芽酵母宿主細胞を使用する。そのような欠損を有する出芽酵母宿主細胞は突然変異および選択の標準技術を用いて調製し得るが、多くの利用可能な酵母株は、グリコシル化または過マンノシル化を防止または低下させるために改変されている。Ｂａｌｌｏｕ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：５９８６〜５９９１、１９８０）は、アスパラギン連結のグリコシル化に影響を与える遺伝子に欠損があるマンノタンパク質生合成突然変異体の単離を記載している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：４８１〜４８６、１９９７）は、酵母におけるタンパク質のＯ−グリコシル化の最初のステップを司る酵素をコードする少なくとも６個の遺伝子のファミリー（ＰＭＴ１〜６）を記載している。これらの遺伝子のうちの１つまたは複数が欠損している突然変異体は、低下したＯ連結のグリコシル化および／または変化したＯ−グリコシル化の特異性を示す。
【０１１１】
一実施形態では、宿主は、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ０５／０６１７１８号に記載の出芽酵母株である。たとえば、宿主は、ＰＤＩ１遺伝子または任意の他のシャペロン遺伝子のコピーを株中に保有し、宿主のそれぞれＰＤＩ１または他のシャペロンをノックアウトした、ｐＳＡＣ３５系プラスミドを含有することができる。そのような構築体は、増強した安定性を与える。
【０１１２】
また、異種タンパク質の産生を最適化するために、宿主株が、タンパク質分解活性の低下をもたらす出芽酵母ｐｅｐ４突然変異（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：２３〜３３、１９７７）などの突然変異を保有することも好ましい。他のプロテアーゼのコード領域中に突然変異を含有する宿主株が、大量の本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を産生するために特に有用である。
【０１１３】
宿主細胞は、適切な条件下で培養した場合、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を合成し、続いてこれを、培地から（宿主細胞がそれを倍地中に分泌する場合）またはそれを産生する宿主細胞から直接（それが分泌されない場合）、回収することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）および生物活性のある分子への折り畳みの容易さなどの、様々な要素に依存する。
【０１１４】
他の宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌など）または真核宿主細胞（昆虫もしくは脊椎動物細胞など）であり得る。いくつかの適切な宿主細胞が当分野で知られており、その多くはバージニア州Ｍａｎａｓｓａｓのアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手可能である。例には、それだけには限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９７：４２１６〜２０、１９８０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３もしくは２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物産生、および精製の方法は、当分野で知られている。他の適切な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞系、ならびにＣＶ−１細胞系である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、形質転換細胞系を含めた霊長類細胞系およびげっ歯類細胞系が含まれる。正常二倍体細胞、一次組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に由来する細胞株、および初代移植片も適している。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型で欠損しているか、または優性に作用する選択遺伝子を含有していてよい。他の適切な哺乳動物細胞系には、それだけには限定されないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３系、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系が含まれる。これらの細胞系のそれぞれは、タンパク質発現分野の技術者に知られており、利用可能である。
【０１１５】
細菌細胞が適切な宿主細胞として同様に有用である。たとえば、大腸菌の様々な株（たとえば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）は、生命工学分野において宿主細胞として周知である。枯草菌、シュードモナス種、他のバチルス種、およびストレプトマイセス種の様々な株も用い得る。
【０１１６】
さらに、所望する場合は、昆虫細胞系をエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の発現に利用し得る。そのような系は、たとえば、Ｋｉｔｔｓ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０〜１７、１９９３；Ｌｕｃｋｌｏｗ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：５６４〜７２、１９９３；およびＬｕｃｋｌｏｗ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６〜７９、１９９３に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１１７】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の産生
本発明のＤＮＡ構築体を含有する宿主細胞は、適切な増殖培地中で増殖させる。本明細書中で使用する用語「適切な増殖培地」とは、細胞の増殖に必要な栄養素を含有する培地を意味する。細胞増殖に必要な栄養素には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび成長因子が含まれ得る。増殖培地は、一般に、たとえば、薬物選択またはＤＮＡ構築体上の選択マーカーによって補完されるもしくはＤＮＡ構築体と共に同時形質移入した必須栄養素の欠損によって、ＤＮＡ構築体を含有する細胞について選択する。たとえば、酵母細胞は、好ましくは、炭素源、たとえばスクロース、非アミノ酸窒素源、無機塩、ビタミンおよび必須アミノ酸添加物を含む既知組成の培地中で増殖させる。培地のｐＨは、好ましくは２を超え８未満のｐＨ、好ましくはｐＨ５．５〜６．５に維持する。安定したｐＨを維持する方法には、緩衝することおよび常にｐＨ制御を行うことが含まれる。好ましい緩衝剤にはコハク酸およびビス−トリス（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）が含まれる。アスパラギン連結のグリコシル化に必要な遺伝子が欠損している酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定化剤を含有する培地中で増殖させる。好ましい浸透圧安定化剤は、０．１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍの濃度で培地に添加するソルビトールである。
【０１１８】
大腸菌細胞を培養するために適切な培地には、たとえば、ルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス（ＬＢ）および／またはテリフィック（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ）ブロス（ＴＢ）が含まれる。真核細胞を培養するために適切な培地には、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地１６４０（ＲＰＭＩ１６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）が含まれ、これらにはすべて、培養する特定の細胞系の必要に応じて血清および／または成長因子を添加し得る。昆虫の培養に適切な培地は、必要に応じてイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解物、および／またはウシ胎児血清を添加したグレース（Ｇｒａｃｅ）培地である。
【０１１９】
典型的には、形質移入または形質転換した細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物を、添加剤として培地に加える。使用する化合物は、宿主細胞を形質転換させたプラスミド上に存在する選択マーカー要素によって指示される。たとえば、選択マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に加える化合物はカナマイシンとなる。選択的増殖のための他の化合物には、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが含まれる。
【０１２０】
また、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いても、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を産生させ得る。ＢａｃＰＡＫ（商標）バキュロウイルス発現系（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））は、昆虫宿主細胞において組換えタンパク質を高レベルで発現する。標的遺伝子を輸送ベクター内に挿入し、これを昆虫宿主細胞内に直鎖状にしたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡと共に同時形質移入する。ＢａｃＰＡＫ６  ＤＮＡは、バキュロウイルスゲノムの必須部分を欠く。ＤＮＡがベクターと組み換える際、必須元素が修復され、標的遺伝子がバキュロウイルスゲノムへと移される。組換え後、いくつかのウイルス溶菌斑を選択して精製し、組換え表現型を確認する。その後、新しく単離した組換えウイルスを増幅し、昆虫細胞培養物に感染させて大量の所望のタンパク質を産生させるために使用することができる。
【０１２１】
また、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、トランスジェニック植物および動物を用いても産生させ得る。たとえば、ヒツジおよびヤギは、その乳中に治療タンパク質を産生することができる。または、タバコ植物はその葉中にタンパク質を含めることができる。トランスジェニック植物および動物によるタンパク質の産生はどちらも、融合タンパク質をコードする新しい遺伝子を生物のゲノム内に付加することを含む。トランスジェニック生物は新しいタンパク質を産生できるだけでなく、この能力をその子孫へと受け継ぐことができる。
【０１２２】
宿主細胞によって産生されたエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の量は、当分野で知られている標準方法を用いて評価することができる。そのような方法には、それだけには限定されないが、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイなどの活性アッセイが含まれる。
【０１２３】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質が宿主細胞系から分泌されるように設計されている場合は、ポリペプチドの大多数は細胞培地中に見つかり得る。しかし、ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合は、これは細胞質および／または核（真核宿主細胞）もしくはサイトゾル（グラム陰性細菌宿主細胞）中に存在する。
【０１２４】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核宿主細胞）もしくはサイトゾル（細菌宿主細胞）中に位置するエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質では、当業者に知られている任意の標準技術を用いて細胞内物質（グラム陰性細菌の封入体を含む）を宿主細胞から抽出することができる。たとえば、宿主細胞をフレンチプレス、ホモジナイズ、および／または超音波処理によって溶解させてペリプラズム／細胞質の内容物を放出させ、次いで遠心分離を行うことができる。
【０１２５】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質がサイトゾル内で封入体を形成している場合は、封入体はしばしば細胞内膜および／または細胞外膜と結合することができ、したがって、遠心分離後に主にペレット物質中に見つかる。その後、ペレット物質をｐＨ極値処理するか、または洗剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、もしくは尿素誘導体などのカオトロピック剤を用いて、アルカリ性ｐＨではジチオスレイトールもしくは酸性ｐＨではトリスカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤の存在下で処理して、封入体を放出、分解、または可溶化させることができる。その後、可溶化したエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を、ゲル電気泳動、免疫沈降などを用いて分析することができる。ポリペプチドを単離することが所望される場合は、本明細書およびＭａｒｓｔｏｎ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１８２：２６４〜７５、１９９０に記載のものなどの標準方法によって単離を行い得る。
【０１２６】
封入体がエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の発現の際に顕著な度合で形成されない場合は、ポリペプチドは、主に細胞ホモジネートの遠心分離後の上清中に見つかる。ポリペプチドは、本明細書中に記載のものなどの方法を用いて上清からさらに単離し得る。
【０１２７】
ポリペプチドを産生させるいくつかのさらなる方法が当分野で知られており、これらの方法を用いてエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を産生させることができる。たとえば、ｍＲＮＡとそのコードされたペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載しているＲｏｂｅｒｔｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２２９７〜３０３、１９９７を参照されたい。Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、３：２６８〜７３、１９９９も参照されたい。
【０１２８】
ペプチドまたはポリペプチドを産生するプロセスは、米国特許第５，７６３，１９２号、第５，８１４，４７６号、第５，７２３，３２３号、および第５，８１７，４８３号にも記載されている。このプロセスは、確率的遺伝子またはその断片を産生させ、その後、これらの遺伝子を、確率的遺伝子によってコードされている１つまたは複数のタンパク質を産生する宿主細胞内に導入することを含む。その後、宿主細胞のスクリーニングを行って、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生するクローンを同定する。組換えペプチド発現の他のプロセスは、米国特許第６，１０３，４９５号、第６，２１０，９２５号、第６，６２７，４３８号、および第６，７３７，２５０号に開示されている。このプロセスでは、大腸菌および大腸菌の一般分泌経路を利用する。ペプチドはシグナル配列と融合しており、したがってペプチドは分泌の標的となる。
【０１２９】
ペプチドまたはポリペプチドを産生させる別の方法がＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９９／１５６５０号に記載されている。遺伝子発見のための遺伝子発現のランダム活性化と呼ばれるこの公開されたプロセスは、ｉｎ  ｓｉｔｕ組換え方法による内在遺伝子発現の活性化または遺伝子の過剰発現を含む。たとえば、内在遺伝子の発現は、非相同的または非正統的な組換えによって遺伝子の発現を活性化することができる標的細胞内に調節配列を組み込むことによって、活性化または増加させる。最初に標的ＤＮＡを放射線照射に供し、遺伝子プロモーターを挿入する。プロモーターは、最終的に遺伝子の前の区切りを見つけ、遺伝子の転写を開始する。その結果、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現がもたらされる。
【０１３０】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の単離／精製
分泌された生物活性のあるエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、生物活性のある融合タンパク質の分泌を可能にする条件下で増殖させた宿主細胞の培地から単離し得る。細胞物質を培地から除去し、当分野で知られている単離技術を用いて生物活性のある融合タンパク質を単離する。適切な単離技術には、沈降ならびにゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含めた様々なクロマトグラフィー方法による分画が含まれる。
【０１３１】
特に好ましい精製方法は、鉄結合もしくは金属キレートカラム上のアフィニティークロマトグラフィーまたはポリペプチド融合体のトランスフェリンもしくは治療タンパク質に対する抗原を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーである。抗原は、好ましくは、固体担体または基質上に固定または付着している。一実施形態では、基質はＣＮＢｒ活性化セファロースである（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）。この方法によって、培地を、結合が起こることを可能にする条件下で、抗原／基質と混合する。複合体を洗浄して未結合の物質を除去してよく、複合体形成に望ましくない条件を用いることでエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質が放出または溶出される。特に有用な溶出方法にはｐＨの変化（固定した抗原が第１のｐＨでエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質に対して高い親和性を有し、第２の（より高いもしくは低い）ｐＨでより低い親和性を有する）；特定のカオトロピック剤の濃度の変化；または洗剤の使用が含まれる。
【０１３２】
溶液からのエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の精製は、様々な技術を用いて達成することができる。ポリペプチドが、そのカルボキシルまたはアミノ末端のどちらかにヘキサヒスチジン９などのタグまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、コネチカット州Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの他の小ペプチドを含有するように合成されている場合は、これは、溶液を、カラムマトリックスがタグに対して高い親和性を有する親和性カラムに通すことによって、１ステップのプロセスで精製し得る。
【０１３３】
たとえば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性でニッケルと結合する。したがって、ニッケルの親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）のニッケルカラムなど）を精製に使用することができる。分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、セクション１０．１１．８（上記）を参照されたい。
【０１３４】
さらに、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を特異的に認識して結合することができるモノクローナル抗体を使用することで精製し得る。
【０１３５】
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を、汚染物質を部分的または実質的に含まないように部分的または完全に精製することが好ましい場合は、当業者に知られている標準方法を使用し得る。そのような方法には、それだけには限定されないが、電気泳動による分離、次いで電気溶出、様々な種類のクロマトグラフィー（親和性、免疫親和性、モレキュラーシーブ、およびイオン交換）、ＨＰＬＣ、ならびに調製用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機械／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）が含まれる。一部の事例では、２つ以上の精製技術を組み合わせてより高い純度を達成し得る。
【０１３６】
医薬組成物
本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、一般に、医薬組成物の形態で投与する。医薬組成物は、たとえば、経口投与（たとえば、錠剤、カプセル、丸薬、散剤、液剤、懸濁液）、非経口注射（たとえば、滅菌溶液、懸濁液もしくは乳剤）、鼻腔内投与（たとえばエアロゾルドロップなど）、直腸投与（たとえば坐薬）または経皮（たとえばパッチ）に適した形態であり得る。医薬組成物は、正確な用量の単一投与に適した単位剤形であり得る。医薬組成物は本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を活性成分として含み、従来の医薬担体を含むことができる。さらに、これは他の医薬剤、アジュバントなどを含み得る。
【０１３７】
生物活性ペプチドの様々な医薬組成物を調製する方法は、薬学分野で知られている。たとえば、米国特許出願公開番号第２００５／０００９７４８号（経口投与）；ならびに米国特許出願公開番号第２００４／０１５７７７７、２００５／０００２９２７号および第２００５／０２１５４７５号（経粘膜投与、たとえば、鼻腔内または頬側投与）を参照されたい。また、レミントン：薬学の実施（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、第２０版、２０００も参照されたい。
【０１３８】
伝統的に、ペプチドおよびタンパク質薬物は、経口投与した場合の生体利用度が乏しいために注射によって投与してきた。これらの薬物は化学的およびコンホメーション的な不安定さを起こしやすく、しばしば胃内の酸性条件、ならびに胃および胃腸管内の酵素によって分解される。これらの送達の問題に応えて、薬物担体として疎水性主鎖および親水性分枝鎖を有するポリマーからなるナノ粒子中へのカプセル封入、微粒子中へのカプセル封入、乳剤中のリポソーム内への挿入、ならびに他の分子とのコンジュゲーションなど、経口送達の特定の技術が開発されている。これらはすべて、本発明の融合分子で用い得る。
【０１３９】
ナノ粒子の例には、キトサンおよびカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）でコーティングした粘膜接着ナノ粒子（Ｔａｋｅｕｃｈｉ他、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、４７：３９〜５４、２００１）ならびに帯電した組合せポリエステル、ポリ（２−スルホブチル−ビニルアルコール）およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）を含有するナノ粒子（Ｊｕｎｇ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、５０：１４７〜１６０、２０００）が含まれる。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド領域および陽イオン性ポリ−ビニルアミン基を有する表面ポリマーを含有するナノ粒子は、ラットに経口投与した場合にサケカルシトニンの吸収の改善が見られた。
【０１４０】
アルギン酸およびペクチンからなる、ポリリシンで強化した薬物送達粒子は、酸および塩基に比較的耐性があり、薬物の担体として用いることができる。これらの粒子は、生体接着の利点である吸収の増強および持続放出を併せ持つ（Ｌｉｕ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５１：１４１〜１４９、１９９９）。
【０１４１】
さらに、合成ソマトスタチンなどのペプチドのＮおよびＣ末端とコンジュゲートしたリポアミノ酸基およびリポ糖基により両親媒性の界面活性剤が作製され、これは、生物活性を保持する組成物を生じることが示された（Ｔｏｔｈ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４２（１９）：４０１０〜４０１３、１９９９）。
【０１４２】
他のペプチド送達技術の例には、目的ペプチドと、ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンおよびカルボルポールまたはタウロコール酸およびカルボポールのどちらかとを含有する、カルボポールでコーティングした粘膜接着乳剤が含まれる。これらは、血清カルシウム濃度を低下させるためにラットに経口投与した場合に有効であることが示された（Ｏｇｉｓｏ他、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２４：６５６〜６６１、２００１）。ホスファチジルコリンから誘導したホスファチジルエタノールを用いて、ホスファチジルエタノールをインスリンの担体として含有するリポソームを調製した。これらのリポソームは、ラットに経口投与した場合に活性があることが示された（Ｋｉｓｅｌ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、２１６：１０５〜１１４、２００１）。
【０１４３】
また、インスリンは、インスリンおよびアプロチニンまたはバシトラシンなどのプロテアーゼ阻害剤を含有するポリ（ビニルアルコール）−ゲル球中でも配合されている。これらのゲル球のグルコース低下特性がラットにおいて実証されており、インスリンは下部腸管内で大部分が放出される（Ｋｉｍｕｒａ他、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９：８９７〜９００、１９９６。
【０１４４】
また、インスリンの経口送達は、界面活性剤を用いて油性相中に分散させたポリ（アルキルシアノアクリレート）からなるナノ粒子を用いて（Ｄａｍｇｅ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８６：１４０３〜１４０９、１９９７）、およびキトサンでコーティングしたカルシウムアルギン酸ビーズを用いて（Ｏｎａｌ他、Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３０：２２９〜２３７、２００２）、研究されている。
【０１４５】
他の方法では、ペプチドのＮおよびＣ末端をポリエチレングリコールと連結させ、その後、アリル鎖と連結させて、酵素分解に対する耐性が改善され、かつ胃腸管壁を通る拡散が改善されたコンジュゲートを形成する（ｗｗｗ．ｎｏｂｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。
【０１４６】
ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（登録商標）とは、ペプチドと非共有的に相互作用して保護コーティングまたは層を作製する、カチオン性脂質混合物である。ペプチド−脂質複合体は細胞の形質膜と融合することができ、ペプチドが細胞内に内部移行する。
【０１４７】
リポソームを出発物質として用いるプロセスには、渦巻き型の粒子が医薬ビヒクルとして開発されている。ペプチドを、主に陰性に帯電した脂質を含有するリポソームの懸濁液に加える。カルシウムの添加により、リポソームが崩壊して脂質二重層からなる大きなシートへと融合することが引き起こされ、これはその後、自発的に渦巻き型へと巻き上がるまたは積み重なる（米国特許第５，８４０，７０７号）。
【０１４８】
さらに、本発明には、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質配合物の肺送達が含まれる。肺送達は、他の投与経路によって送達することが困難な巨大分子の送達に特に有望である。肺に送達した薬物は肺胞領域を通って血液循環内に容易に直接吸収されるので、そのような肺送達は、肺の疾患を治療するための全身送達および局所送達のどちらにも有効な場合がある。
【０１４９】
本発明は、様々な状態または疾患を治療するための、経口吸入（肺送達）用の薬物分散物を形成するために適した組成物を提供する。融合タンパク質配合物は、液体噴霧器、エアロゾル系の定量吸入器（ＭＤＩ）、および乾燥散剤分散装置などの様々な手法によって送達することができる。肺送達するための組成物を配合するにあたって、対象への組成物の均一な肺送達を増強するために、一般に、安定性、分散性、稠度、および／またはバルク特徴を提供するために表面活性剤または界面活性剤およびバルク担体を含めた薬学的に許容できる担体を加える。
【０１５０】
表面活性剤または界面活性剤は、粘膜の膜または裏側を通るポリペプチドの吸収を促進する。有用な表面活性剤または界面活性剤には、脂肪酸およびその塩、胆汁酸塩、リン脂質、またはアルキル糖が含まれる。脂肪酸およびその塩の例には、カプロン酸（Ｃ８）、カプリン酸（Ｃ１０）、ラウリン酸（Ｃ１２）およびミリスチン酸（Ｃ１４）のナトリウム、カリウムおよびリシン塩が含まれる。胆汁酸塩の例には、コール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、およびウルソデオキシコール酸が含まれる。
【０１５１】
リン脂質の例には、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトールおよびリゾホスファチジルセリンなどの単鎖リン脂質、またはジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルイノシトールおよびジアシルホスファチジルセリンなどの二重鎖リン脂質が含まれる。アルキル糖の例には、デシルグルコシドおよびドデシルマルトシドなどのアルキルグルコシドまたはアルキルマルトシドが含まれる。
【０１５２】
担体として有用な医薬賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調節剤または緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムなどの塩が含まれる。これらの担体は、結晶形もしくは非晶質形であってよく、または２つの混合物であってもよい。
【０１５３】
充填剤として使用する炭水化物の例には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、およびソルボースなどの単糖、ラクトースおよびトレハロースなどの二糖；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、ならびにラフィノース、マルトデキストリン、およびデキストランなどの多糖類、マンニトールおよびキシリトールなどのアルジトールが含まれる。充填剤として使用するポリペプチドの例にはアスパルテームが含まれる。アミノ酸にはアラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
【０１５４】
組成物の微量構成成分である添加剤は、噴霧乾燥中のコンホメーション安定性および散剤の分散性を改善させるために含め得る。これらの添加剤には、トリプトファン、チロシン、ロイシン、およびフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸が含まれる。
【０１５５】
適切なｐＨ調節剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸および塩基から調製した有機塩が含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０１５６】
肺送達のためのＧＬＰ−１受容体作用剤の融合組成物は、治療有効量の組成物がブリスターパックまたはゼラチンカプセルなどの単位用量容器内に存在する、単位用量として包装し得る。ブリスターパックまたはゼラチンカプセルの製造は、典型的には、包装の分野で一般的に周知の方法によって実施する。
【０１５７】
米国特許第６，５２４，５５７号は、（ａ）ＨＦＡ噴霧剤；（ｂ）噴霧剤中に分散可能な薬学的に活性のあるポリペプチド；および（ｃ）Ｃ８〜Ｃ１６脂肪酸もしくはその塩、胆汁酸塩、リン脂質、またはアルキル糖であり、下気道においてポリペプチドの全身吸収を増強する界面活性剤を含む、医薬エアロゾル配合物を開示している。本発明はまた、そのような配合物の製造方法および患者の治療におけるそのような配合物の使用も提供する。
【０１５８】
乾燥散剤薬物を肺送達する一手法では、加圧ガスの供給源を提供するための手押しポンプを備えた手持ち装置を利用する。加圧ガスはベンチュリノズルなどの散剤分散装置から急激に放出され、分散散剤が、患者が吸入するために利用可能となる。
【０１５９】
乾燥散剤分散装置はいくつかの特許に記載されている。米国特許第３，９２１，６３７号は、散剤医薬品の単一のカプセルを穿孔するための針を備えた手動ポンプを記載している。医薬品の複数の容器ディスクまたはストリップの使用は、欧州特許ＥＰ０４６７１７２号；ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９１／０２５５８号およびＷＯ９３／０９８３２号；ならびに米国特許第４，６２７，４３２号、第４，８１１，７３１号、第５，０３５，２３７号、第５，０４８，５１４号、第４，４４６，８６２号、第５，０４８，５１４号、および第４，４４６，８６２号に記載されている。
【０１６０】
タンパク質治療剤のエアロゾル化は、欧州特許ＥＰ０２８９３３６号に開示されている。治療エアロゾル配合物は、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９０／０９７８１号に開示されている。
【０１６１】
治療方法
本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、本明細書中に記載の病状または状態を治療するために、他の医薬剤と併せて使用し得る。したがって、本発明の化合物を他の医薬剤と組み合わせて投与することが含まれる治療方法も、本発明によって提供される。
【０１６２】
本発明の方法態様では、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を、単独で、または１つもしくは複数の他の医薬剤と組み合わせて、当分野で知られている末梢投与の従来の方法のいずれかで、個別にまたは一緒に対象に末梢投与する。したがって、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質または組合せは、非経口的に（たとえば、静脈内、腹腔内、筋肉内もしくは皮下）、鼻腔内、経口、舌下、頬側、吸入によって（たとえばエアロゾルによる）、直腸（たとえば坐薬による）または経皮で、対象に投与し得る。非経口であるが経口でない投与（たとえば注射）が好ましい投与方法であり、皮下投与が好ましい非経口投与方法である。吸入による肺送達も好ましい投与方法である。
【０１６３】
非経口注射に適した組成物には、一般に、薬学的に許容できる滅菌の水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液、または乳剤、および滅菌注射溶液または分散液へと再構成するための滅菌散剤が含まれる。適切な水性および非水性の担体または希釈剤（溶媒およびビヒクルを含む）の例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油を含めたトリグリセリド、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。
【０１６４】
非経口注射用のこれらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、可溶化剤、乳化剤、および分散剤などの賦形剤も含有し得る。組成物の微生物汚染の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸を用いて達成することができる。等張化剤、たとえば、糖および塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。注射用医薬組成物の持続吸収は、吸収を遅延させることができる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。
【０１６５】
本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質は、投与様式、対象の年齢および体重、治療する疾患、状態または障害の重篤度、ならびに投与するエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の薬理活性を含めたいくつかの要素に応じて変化する用量で対象に投与する。特定の患者の用量範囲および最適用量の決定は、当業者の技術範囲内に十分ある。
【０１６６】
血糖を低下させるための治療の非経口注射には、配列番号２３に示すエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を、約０．５〜５０ｍｇ／用量、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／用量の範囲の用量レベルで、約１週間に１回、２週間に１回、または１カ月に１回の投薬で、ヒト対象に投与し得る。
【０１６７】
体重を減少させるための治療の非経口注射には、用量範囲は、血糖を低下させるためのものよりも高くてもよい。したがって、体重を減少させるための治療の非経口投与には、配列番号２３に示すエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を、約１〜１００ｍｇ／用量の範囲の用量レベルで、約１週間に１回、２週間に１回、または１カ月に１回の投薬で、ヒト対象に投与し得る。
【０１６８】
本発明はまた、ヒト患者においてＩＩ型糖尿病を治療するまたは血糖を低下させるために使用する、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質を提供する。ヒト患者において肥満症を治療するまたは食物摂取を減少させるために使用する、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質をさらに提供する。本発明のさらなる態様は、ヒト患者においてＩＩ型糖尿病を治療するまたは血糖を低下させるための医薬品の製造における、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の使用を提供する。さらなる態様は、肥満症を治療するまたは食物摂取を減少させるための医薬品の製造における、本発明のエキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の使用を提供する。本発明の方法態様の特長は、これらの態様のそれぞれに適用し得る。
【０１６９】
本発明の実施形態を以下の実施例によって例示する。しかし、当業者には、他のその変形が知られているか、または本開示および添付の特許請求の範囲に鑑みて明らかとなるので、本発明の実施形態はこれらの実施例の具体的な詳細に限定されないことを理解されたい。本明細書中で言及するすべての参考文献は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
【実施例】
【０１７０】
（実施例１）
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の構築
エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質
部位重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲを用いて、エキセンディン−４（１〜３９）ＤＮＡ配列（配列番号２０）を、ｐＲＥＸ０５４９の分泌シグナル配列（ｎＬ）（配列番号１９）とｍＴｆ配列（配列番号２２）との間に挿入した。Ｐ０７０２（配列番号２８）およびＰ０７０３（配列番号２９）の２つのプライマーを設計して、ｐＲＥＸ０５４９を鋳型として用いて配列を挿入した。
【０１７１】
ＤＮＡ配列は、酵母発現に最適なコドン（配列番号３０）を用いて、エキセンディン−４アミノ酸配列の逆翻訳によって得た。最初に、ＡｆｌＩＩ部位の５’のプライマー、Ｐ０７０２を有するＰ０１７７（配列番号３１）、またはＢａｍＨＩ部位の３’のプライマー、Ｐ０７０３を有するＰ００１４（配列番号３２）を用いて、２つのＰＣＲ産物を作製した。これらの反応からの産物をゲル精製し、２回目のＰＣＲで外側プライマー、Ｐ０１７７およびＰ００１４のみを使用して結合させた。
【０１７２】
この２回目の反応からの産物をゲル精製し、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、プラスミドｐＲＥＸ０５４９も消化した。これらの反応からの適切な産物を一緒にライゲーションしてｐＲＥＸ０５６１が得られ、これを、ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩ部位の間でＤＮＡ配列決定を行って、エキセンディン−４配列の正しい挿入を確認した。ＮｏｔＩを用いた制限酵素消化によって発現カセットをｐＲＥＸ０５６１から回収し、ＮｏｔＩで消化した子ウシ腸管のアルカリホスファターゼで処理したｐＳＡＣ３５内にライゲーションして、ｐＲＥＸ０５８９が得られた。
【０１７３】
ｐＲＥＸ０５６１を鋳型として用いて、プライマーＰ１８１０（配列番号３３）およびＰ１８１１（配列番号３４）を用いてＳＯＥ  ＰＣＲを行って、リンカーペプチド配列（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号２１）を、コードされたエキセンディン−４配列のＣ末端とコードされたｍＴｆ配列のＮ末端との間に、上述の手順と同じ手順を使用して導入した。
【０１７４】
このＰＣＲからの最終産物をゲル精製し、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、プラスミドｐＲＥＸ０５４９も消化した。これらの反応からの適切な産物を一緒にライゲーションしてｐＲＥＸ０９３５が得られ、これを、ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩ部位の間でＤＮＡ配列決定を行って、（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）をコードする配列の正しい挿入を確認した。ＮｏｔＩを用いた制限酵素消化によって発現カセットをｐＲＥＸ０９３５から回収し、ＮｏｔＩで消化したアルカリホスファターゼで処理したｐＳＡＣ３５内にライゲーションして、ｐＲＥＸ０９３６が得られた。ｎＬリーダー配列を有さないエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質のアミノ酸配列を、本明細書中に配列番号２３として提供する。配列番号２３をコードする核酸配列は、本明細書中に配列番号２４として提供する。ｎＬリーダー配列を有するエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中に配列番号２５として提供する。配列番号２５をコードする核酸配列は、本明細書中に配列番号２６として提供する。
【０１７５】
さらなるエキセンディン−４／Ｔｆ構築体
エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１と比較してＣ末端に追加の９個のアミノ酸を有する。遊離ペプチドの状況では、これらの追加の残基は、ＧＬＰ−１受容体に対するより高い親和性およびより高いプロテアーゼ耐性を与えると考えられている。しかし、これは、ペプチドの免疫原性もある程度司っている可能性がある。上述の手順と実質的に同じ手順を使用して２つのさらなる構築体を作製し、これは、構築体ＧＬＰ−１に相同的な配列のみを有する構築体、すなわち、エキセンディン−４（１〜３１）またはエキセンディン−４（１〜３０）を、それぞれ残基３２〜３９または３１〜３９をコードするＤＮＡ配列の欠失によって作製した。エキセンディン−４（１〜３１）には、プライマーＰ０９０４（配列番号３５）およびＰ０９４１（配列番号３６）を用い、適切な産物をライゲーションした（ｐＲＥＸ０６２９／ｐＲＥＸ０６５８）。エキセンディン−４（１〜３０）には、プライマーＰ０９４２（配列番号３７）およびＰ０９４３（配列番号３８）を用い、適切な産物をライゲーションした（ｐＲＥＸ０６３０／ｐＲＥＸ０６５９）。
【０１７６】
また、エキセンディン−４（１〜３９）配列および代替リンカー、たとえば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３９）、ＰＥＡＰＴＤ（ｐＲＥＸ１００５）（配列番号６）、またはＩｇＧヒンジ（ｐＲＥＸ０９３８）（配列番号７〜１６）を用いて構築体を作製した。
【０１７７】
他のシグナル配列を有するさらなるエキセンディン−４／Ｔｆ構築体−相対的生産性に対する影響
シグナル配列ＨＳＡ／ＭＦα−１（ｐＲＥＸ１３５４）（配列番号４０；配列番号４１によってコードされている）および改変ＨＳＡ／ＭＦα−１（ｐＲＥＸ１３４５）（配列番号４２；配列番号４３によってコードされている）と連結したエキセンディン−４／ｍＴｆ（配列番号２３；配列番号２４によってコードされている）を発現させるために、構築体を作製した。３つの異なるシグナル配列を有するエキセンディン−４／ｍＴｆを発現する酵母株の生産性の比較により、トランスフェリンシグナル配列（ｎＬ）／ＨＳＡ／ＭＦα−１／改変ＨＳＡ／ＭＦαの相対的生産性の比が１：１／１．７５／１．３２であることが明らかとなった。
【０１７８】
（実施例２）
エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質の効力の決定
効力は、試料と共にインキュベーションした後の、ラットＧＬＰ−１受容体（ＣＨＯ−ＧＬＰ−１Ｒ）で形質移入したＣＨＯ細胞におけるＧＬＰ−１受容体に媒介されるリガンド結合の結果として生じるｃＡＭＰの測定された応答から計算した。９６ウェル組織培養プレートにＣＨＯ−ＧＬＰ−１Ｒ細胞を播種し、終夜培養した。翌日、細胞をクレブス−リンガー緩衝液（ＫＲＢ）ですすぎ、ｃＡＭＰを処理する細胞内酵素を阻害するホスホジエステラーゼ阻害剤３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、２ｍＭ）を含有するＫＲＢ中でインキュベーションを行った。試験化合物および対照の段階希釈液をＫＲＢ／ＩＢＭＸ中で調製し、細胞の３つ組ウェルに試料および対照を接種した。インキュベーション後、競合に基づいた蛍光免疫アッセイ（ＣａｔｃｈＰｏｉｎｔ（登録商標）ｃＡＭＰ蛍光アッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いて、個々の試料溶解物のアッセイを行って細胞内ｃＡＭＰレベルの増加を測定した。ＧＬＰ−１受容体に媒介されるリガンド結合後の細胞中のｃＡＭＰの蓄積の量を用いて、生物活性および相対効力を決定する。
【０１７９】
表１のデータは、エキセンディン−４／Ｔｆ融合が、ＧＬＰ−１受容体を活性化させることにおいてＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質よりも強力であることを示している。それぞれの融合タンパク質中のｍＴｆ部分は、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有していた。
【０１８０】
【表１】
2009544301.tif 000002
【０１８１】
（実施例３）
エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質のＭＭＰ−耐性
エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（配列番号２３）を、マトリックスメタロプロテアーゼＩ（ＭＭＰ−１、コラゲナーゼ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの失活に対する耐性について試験した。エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質およびＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の試料を、組換えＭＭＰ−１と共に４８時間、３７℃でインキュベーションし、その後、活性について試験した。図１は、エキセンディン−４／Ｔｆ融合タンパク質がＭＭＰ−１による失活に対して耐性があることを示し（図１Ｂ）、ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質は対照的である（図１Ａ）。この分解の差は、分子の活性部分のアミノ酸配列が非常に類似しているにもかかわらず起こる。
【０１８２】
（実施例４）
糖尿病マウスの血糖に対するエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の効果
糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスに様々な用量のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（配列番号２３）、ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２ｍＴｆ融合タンパク質、またはエキセンディン−４ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、ペンシルバニア州Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ）を注射し、血糖計を用いて血液試料を分析することによって血糖濃度を監視した。図２に示すように、１．３ナノモル／ｋｇと低いエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の用量が、これらの動物の血糖を、皮下注射の３時間までに有意に低下した。グルコースレベルはすべての治療群においてほぼ正常になり、このレベルは２４時間持続した。グルコース濃度は、投与した用量に応じて治療後４８〜７２時間の間に治療前のレベルまで徐々に上昇した。エキセンディン−４ペプチドは、用量にかかわらずエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質ほどは血糖を低下させず、エキセンディン−４のグルコース低下効果は約１２時間までに完全に消えた。このことは、エキセンディン−４を用いて達成可能な血糖の最大低下が約３７％であるという文献の報告に矛盾しない。エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質で見られた低下は約７０％であった。また、血糖に対するエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の効果は、等しい用量のＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質よりも有意に高く、かつより長く持続した。
【０１８３】
（実施例５）
ラットの体重に対するエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の効果
スプラーグドーリーラットに様々な用量のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（配列番号２３）、およびエキセンディン−４ペプチドを皮下注射した。ｍＴｆまたは生理食塩水を対照として使用した。ラットの体重を毎日量った（投薬日は投薬前）。動物はいつでも食物および水を利用することができた。
【０１８４】
図３に示すように、１０および１００ナノモル／ｋｇの用量のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質で治療した動物は、最初の注射後に体重が減り、減量は全投与期間の間続いた。５日目には、１００ナノモル／ｋｇの用量で治療した動物は、対照と比較して体重が平均７５グラム（１７％）減り、減量は食物および水の摂取の低下に関連している。劇的かつ急性な減量が観察されたため、薬物の毎日の投与を５日目に停止した。５日間の投与期間の後は、すべての動物は同様の割合で体重が増えた。しかし、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質で治療した群、特に高用量の群は、それでも、最後の投与の２０日後に対照動物よりも体重が低かった。
【０１８５】
（実施例６）
ＩＩ型糖尿病患者における血糖制御および減量のためのエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の予測的用量
公開されたデータに基づいて、１０μｇのエクセナチド（ＢＹＥＴＴＡ（登録商標））の治療単一用量は、ヒトにおいて２００ｐｇ／ｍＬのＣｍａｘを生じた。エクセナチドとエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（配列番号２３）との分子の大きさの差（４．２ｋＤａ対８０．５ｋＤａ）は、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の血液レベルである約３．８ｎｇ／ｍＬが、血糖低下効果に関してエクセナチドの治療レベルと等価であることを示している。大きさに加えて、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質は、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現するＣＨＯ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に基づいて、エキセンディン−４よりも約５倍弱い（図４）。したがって、１０μｇのエクセナチドと同様の治療活性を達成するためには、約２０ｎｇ／ｍＬの循環濃度のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質が必要となるはずである。
【０１８６】
エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質およびＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質は、大きさおよび構造がどちらも類似している。エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の分子量は８０．５ｋＤａであり、ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の分子量は７９．６ｋＤａである。エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質よりも約４〜８倍強力である。カニクイザルに１ｍｇ／ｋｇを静脈内および皮下投与した後のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の平均薬物動態パラメータを、表２に示す。カニクイザルに０．６ｍｇ／ｋｇを皮下投与した後のＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の平均薬物動態パラメータを、表３に示す。
【０１８７】
【表２】
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【０１８８】
【表３】
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【０１８９】
別の実験で、ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の生体利用度はカニクイザルにおいて約５０％であることが示された。
【０１９０】
静脈内および皮下投与の両方のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の排出半減期（ｔ１／２）、Ｔｍａｘの範囲、ならびに生体利用度（Ｆ（％））は、ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質のサル薬物動態パラメータと類似していた。
【０１９１】
ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を用いた以前のヒトでの経験により、薬物動態は３０μｇ／ｋｇ〜９００μｇ／ｋｇの用量で直線的であり、平均Ｔｍａｘは４８時間であり、平均ｔ１／２は約５０時間であることが示されている。Ｃｍａｘは、３００μｇ／ｋｇ（または３０ｍｇ／患者１００ｋｇ）の用量で７５８±４３５ｎｇ／ｍＬであり、９００μｇ／ｋｇ（９０ｍｇ／患者１００ｋｇ）の用量で１，６０９±８０５ｎｇ／ｍＬであった。しかし、融合タンパク質は、これらの用量でも、１８００μｇ／ｋｇの用量でも、糖尿病対象において血糖レベルに対して強い効果を示さなかった。
【０１９２】
これら２つの化合物間の大きさおよび構造の類似性、ならびにサルにおける類似の前臨床薬物動態プロフィールにより、ヒトにおけるエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の薬物動態の特徴は、ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質と類似していることが予測される。
【０１９３】
ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆに対する類似性、ＧＬＰ−１（７〜３７、Ａ８Ｇ、Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆと比較して相対的に４〜８倍高いエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力、およびエクセナチドと比較して相対的に５倍低いエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力に基づいて、２ｍｇの用量のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質がグルコース低下効果を有することができることは、驚くべきである。さらに、週１回の投薬基準の１０ｍｇ／対象の用量が、２０ｎｇ／ｍＬの定常Ｃｍｉｎを達成するために必要となるはずである。したがって、治療的な血糖低下のためのエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（配列番号２３）の有効な用量の範囲は、週１回の用量基準で投与する０．５〜５０ｍｇ／用量である。そのような用量は、２週間に１回または１カ月に１回に投与することもできる。
【０１９４】
血糖に対する効果に加えて、１０ナノモル／ｋｇ以上のエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質は、マウスおよびラットにおける動物体重の減少に関連していた。単一用量の１０または１００ナノモル／ｋｇのエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質をマウスに投与してから２４時間後、対照または１ナノモル／ｋｇのエキセンディン−４で治療した動物における１％の平均減少と比較して、それぞれ６％および１４％の体重の平均低下をもたらした。エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の毎日の投与も、１００ナノモル／ｋｇの用量でラットにおいて１６％の減量をもたらした。減量は、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を投薬した動物で観察された、ＧＬＰ−１受容体活性化の知られている薬理学的効果である食物摂取の減少に起因していると考えることができる。利用可能なデータは、減量に必要な用量はグルコースの低下に必要な用量よりも約２〜３倍高いことを示している。したがって、減量のためのエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（配列番号２３）の有効な用量の範囲は、１週間に１回投与する１．０〜１００ｍｇ／用量である。そのような用量は、２週間に１回または１カ月に１回投与することもできる。
【０１９５】
（実施例７）
吸入によるエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の送達
エアロゾルをＡｅｒｏｔｅｃｈ  ＩＩ圧縮空気ジェット噴霧器（ＣＩＳ−ＵＳ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）を用いて発生させ、直径１．５８ｃｍのステンレス鋼エアロゾル送達ラインを通して２４口の流路げっ歯類曝露系（ＩＮ−ＴＯＸ、ＡＢＱ、ＮＭ）に送った。チャンバから出る排気流速は、約１１．５Ｌ／分であった。噴霧器圧は約３０ｐｓｉに維持した。
【０１９６】
融合タンパク質に対するエアロゾル化の効果を試験するために、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ中の、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質（配列番号２３）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を噴霧化し、続いて、エアロゾルからの５ｍＬの凝縮液体を８分間の間にバイオサンプラーで回収し、その完全性および活性について試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって判断して、エアロゾル化手順は、エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の構造に対して検出可能な有害作用を与えておらず、明らかな分解または凝集体の形成は存在しなかった。回収された物質は生物活性があることも示された。
【０１９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）を吸入チャンバ内に入れ、エアロゾル化したエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を様々な時間の長さで呼吸させた。吸入曝露期間の終了後、続く７２時間の間マウスの血糖を監視した。チャンバ内での吸入時間は、動物が皮下投与の０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量に等しい曝露を受けるように選択した。対照として、吸入投与経路に対するｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較するためにこれらの用量を皮下投与した（ＳＣ）。吸入によってエキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質を受ける動物における血糖レベルは、薬物への曝露後に有意な低下を示した。エキセンディン−４（１〜３９）（ＰＥＡＰＴＤ）２（配列番号５）ｍＴｆ融合タンパク質の循環レベルの評価により、この非最適化系および配合物について約１０％の生体利用度が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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