(57)【要約】  本発明は、クローニング技術によって増幅させた単一分子のアレイに由来する短いＤＮＡ配列などの核酸の配列決定を行うシステムおよび装置を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つまたは複数のポリヌクレオチドが結合される固体基材と、
（ｂ）上記ポリヌクレオチドに接触するように、１つまたは複数の蛍光標識された試薬を制御可能に移動させる流体誘導システムと、
（ｃ）上記基材および／または上記試薬の温度を調節する温度制御システムと、
（ｄ）内部全反射（ＴＩＲ）を介して上記蛍光部を励起させる照射システムと、
（ｅ）上記基材に近接して配置され、上記ＴＩＲシステムによって上記蛍光部の励起から生じる蛍光を検出する検出器部品と、
（ｆ）上記検出器に作動可能に接続され、上記検出器から蛍光画像を得るための指示セットを含むコンピュータと、
を備える、１つまたは複数のポリヌクレオチドをシーケンシングするシステム。
【請求項２】
上記温度制御システムが上記基材の温度を調節するために、上記検出器の遠位に上記基材を動かすことができることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
上記固体基材が、上記ポリヌクレオチドが結合される１つまたは複数の流体チャネルを有するフローセルを含むことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
上記基材が、ガラス、ケイ素またはプラスチックからなることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
上記固体基材が、ビードのアレイであることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
上記試薬が、上記１つまたは複数のポリヌクレオチドに相補的な第２のシーケンスを伸長させる成分を含むことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
上記試薬が蛍光標識されたヌクレオチド三リン酸であることを特徴とする請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
上記試薬が蛍光標識されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
上記照射システムが、光ファイバデバイスを介して結合された少なくとも１つの励起レーザを備えることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
一様な照射フットプリントを得るように、上記ファイバが物理的に変形されることを特徴とする請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
上記物理的な変形が絞りによることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
上記物理的な変形が振動によることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
上記検出器がＣＣＤカメラを含むことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
上記検出器が２台のＣＣＤカメラを含むことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
上記検出器が４台のＣＣＤカメラを含むことを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
上記検出器が、上記蛍光標識された試薬からの蛍光発光と、上記レーザからの１つまたは複数の光の波長と、に適当な１つまたは複数の光学フィルタをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
上記検出器部品が、自動焦点メカニズムを備えることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
２つのフローセルに同時に作用する２つの流体ステーションを備えることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
上記照射システムが光ファイバデバイスを介して結合された２つの励起レーザを備え、そのようなレーザが少なくとも部分的に同じ領域を照射することを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
上記検出器が、上記蛍光標識された４つの試薬からの蛍光発光と、上記レーザからの光の波長と、に適当な４つの光学フィルタをさらに備えることを特徴とする請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
上記レーザが、５３２ｎｍおよび６６０ｎｍの波長で放射することを特徴とする請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸シーケンシングの分野に関し、詳しくは、クローニング技術で増幅させた単一分子アレイから得られる短いＤＮＡシークエンスなどの核酸配列を解析するシステムおよび装置を提示する。
【０００２】
なお、本発明は、２００６年３月３１日に出願されたＵＳＳＮ６０／７８８，２４８号明細書および２００６年４月２６日に出願されたＵＳＳＮ６０／７９５，３６８号明細書の優先権を主張し、これらの全体を本願の参照とする。
【背景技術】
【０００３】
生物学の研究における近年の発達の多くは、核酸解析やシーケンシングの改良された手法から恩恵を受けている。例えば、ヒトゲノム計画は、病気の治療から基礎科学の発展までを含むさらなる発見につながることを期待して、ヒトゲノムの全塩基配列を決定した。「ヒトゲノム」の塩基配列が決定されても、依然として分析すべき遺伝物質（例えば、異なる人どうしの遺伝子の違い、組織、種など）が数多く存在する。
【０００４】
長さの異なる断片を分離することに基づいたＤＮＡシーケンシング用の装置は、１９８０年代に最初に発達し、それ以来ずっと市販されている。しかし、この技術は、ポリアクリルアミドゲルを充填したキャピラリーカラムに個別のサンプルを通過させることを含むので、各サンプルが通過する所要時間によって配列決定能力（スループット）が制限されてしまう。近年、増幅されない単一分子について大量の並行解析に基づいたＤＮＡシーケンシング技術が数多く報告され（国際公開００００６７７０号パンフレット；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ，１００，３９６０〜３９６４（２００３）、或いは、増幅された単一分子について、平面アレイの形態（国際公開９８４４１５１号パンフレット）またはビード上（国際公開０４０６９８４９号パンフレット；Ｎａｔｕｒｅ，４３７，３７６〜３８０（２００５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，５７４１，１７２８〜１７３２（２００５）；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６３０〜６３４４（２０００））での大量の並行解析に基づいたＤＮＡシーケンシング技術が数多く報告されている。
【０００５】
これらの新しいシーケンシング技術において核酸の配列解析に使用される方法は、蛍光標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出に基づいていることが多い。このようなアレイ上の蛍光信号を読み取るために使用される検出器具類は、例えば、国際公開９６４１０１１号パンフレット、国際公開００００６７７０号パンフレットまたは国際公開０２０７２８９２号パンフレットに記載されているように、落射蛍光顕微鏡または内部全反射顕微鏡のいずれかに基づくものであることが多い。
【０００６】
内部全反射顕微鏡を使用して表面上の一本鎖ＤＮＡ分子および増幅されたＤＮＡ分子の両方を撮像するときの、ロバスト性および信頼性のある４色ＤＮＡシーケンシングのプラットホーム（例えば、加熱システム、流体の制御、一様な照射、光学ビーム成形の制御、自動焦点システム、および、すべての構成要素についての完全ソフトウェア制御）について、本明細書で初めて記述する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
迅速かつ信頼性のある核酸シーケンシングを行うために、さらに優良でロバスト性があり、低コストの装置およびシステムが必要とされている。本発明は、本明細書の詳細な説明、請求項および図面から明らかとなる様々な利点を提示する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、さまざまな態様で、１つまたは複数のポリヌクレオチドの配列決定を行うためのシステムまたは装置を含む。これらのシステムは、（増幅されていない一本鎖分子、増幅された一本鎖分子、１つまたは複数の配列されたビードの集合体またはこれらの組合せなどを含み得る）平面基材を撮像するために使用することができる。これらのシステムは、シーケンシングに使用される場合、１つまたは複数のポリヌクレオチドが表面に結合される（例えば、基材に直接的に結合されるか又は基材に選択的に配列されたビードに結合される）平面固体基材と、様々な試薬（例えば、緩衝液、酵素、蛍光標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドなど）を上記ポリヌクレオチドに接触するように制御可能に導く流体誘導システムと、上記基材および／または上記試薬の温度を調節する温度制御システムと、内部全反射（ＴＩＲ）を介して蛍光部を励起させる照射システムと、上記基材に近接して上記ＴＩＲシステムによって上記部分の励起から生じる蛍光を検出する検出器部品と、上記検出器に作動可能に接続され、上記検出器から蛍光画像を得るための指示セットを含むコンピュータと、を選択的に備え得る。
【０００９】
いくつかの実施例においては、温度制御システムと相互作用させるために基材を検出器から外して、（例えば、ポリメラーゼ反応を促進させるように）基材の温度を調節することができる。これらの実施例においては、システムは、選択的にコンピュータ制御されるスキャニングステージまたは可動プラットホームを備え得る。加熱装置は、スキャニングステージに対して動くコンピュータ制御のペルティエ装置または他の加熱／冷却部品とすることができ、或いはステージを選択的に動かすことによってペルティエ装置が基材に接触することを確保できる。
【００１０】
ここでの様々な実施例においては、基材はフローセルを含み得る。フローセルは、ポリヌクレオチドが陳列される１つまたは複数の流体チャネルを含むことができ（例えば、ポリヌクレオチドは、フローセルに直接的に結合されているか、あるいはポリヌクレオチドがフローセル上に整列された１つまたは複数のビードに結合されている）、ガラス、ケイ素、プラスチックまたはこれらの様々な組合せから形成することができる。
【００１１】
典型的な実施例においては、試薬は、１つまたは複数のポリヌクレオチドと相補的な第２のシーケンスを合成する成分を含む。この合成は、標識されたヌクレオチド（これは、個別に添加しても良いし、またはヌクレオチドの混合物としてもよいし、あるいは標識されたオリゴヌクレオチドとしてもよい）を使って実行することができる。標識されたオリゴヌクレオチドの場合には、該標識されたオリゴヌクレオチドと相補的な１つまたは複数の塩基を特定することができる。標識されたヌクレオチドは、蛍光標識された三リン酸の形態を取ることができる。この形態は、添加を制御する保護基を含むことができ、各ポリヌクレオチドに単一のヌクレオチドが添加されることを保証することができる。蛍光体は、糖の３’位に配置できる保護基に結合させることができ、または保護基を除去するときと同じ条件で選択的に開裂させることができるリンカーを介してヌクレオチド塩基内に結合させることができる。同じ試薬を使ってリンカーと保護基とを開裂させてもよい。
【００１２】
ここでの様々な実施例において、内部全反射（ＴＩＲＦ）システムは、例えば、ランプまたはレーザを備える。このシステムは、光ファイバデバイスを介して結合された１つより多くの励起レーザを備え得る。そのようなレーザは、同じ領域の少なくとも一部を照射することができる（すなわち、オーバーラップ）。ここでのＴＩＲＦレーザは、レーザの照射フットプリント全体にほぼ一様な光学強度をつくるために、振盪、振動および波長板変調された、或いは圧電アクチュエータで絞られたファイバモードスクランブラを選択的に含む。照射強度および一様性を制御する多くのメカニズムが本明細書中に説明されている。ファイバの形状は、照射フットプリントの形状を制御するように使うことができる。
【００１３】
基材が焦点の位置に留められること、（１つまたは複数の）光ファイバが蛍光体の発光波長を伝えるとともに励起源からの光を遮断するのに適していること、および蛍光体からの蛍光発光を記録するシステムと、を確保するように、ここでの様々な実施例における検出器部品は、１つまたは複数の対物レンズ、追加的なチューブレンズ、ステージの位置および／または（１つまたは複数の）対物レンズの位置を調節する自動焦点システムを備え得る。
【００１４】
本発明の上記および他の特徴は、以下の詳細な説明を添付の図および請求項に関連させて読むことにより、さらに明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、例えば、クローニングによって増幅された単一分子のＤＮＡからなる数多くの様々な長さの核酸配列（シークエンス）を、フローセル内で、あるいはフローセルに固定されたビードの列に含まれる形態で、解析を行うシステムおよび装置を備える。本発明のシステムは、例えば、比較ゲノム科学（例えば、遺伝子型決定、ＳＮＰ検出、ＢＡＣ末端シーケンシング、染色体ブレイクポイント遺伝地図作製、および全体的なゲノムシーケンスアセンブリ）用のシーケンシング、遺伝子発現、マイクロＲＮＡシーケンス分析、発生遺伝学（例えば、メチル化マッピングＤＮａｓｅ−超感受性部位マッピングまたはクロマチン免疫沈降を使用する）、およびアプタマーおよびファージディスプレイライブラリの特徴付けなどに選択的に使用することができる。当業者であれば、本発明は、多様な他のシーケンシングの用途にも利用可能であることを容易に理解されるであろう。本発明のシステムは、以下にさらに詳細に説明する、光学的、機械的、流体的、電気的およびコンピュータ的なデバイス／態様からの様々な組合せからなる。さらに、本発明は、いくつかの実施例において特定の構成および／またはそれらの様態の組合せに関して記載されているが、当業者であれば、すべての実施例が、（特にそうするように言及されない限り）態様または特定の構成のすべてを含む必要はないことを理解されるであろう。
【００１６】
要約すると、本発明の概要は、バックライト設計のＴＩＲＦ撮像装置の一実施例を示す図１に概略的に示している。図１に見られるように、流体運搬モジュールすなわち装置１００は、試薬（例えば、蛍光ヌクレオチド、緩衝液、酵素、開裂試薬など）の流れをフローセル１１０や廃液弁１２０に（通流させるように）導く。特定の実施例においては、フローセルは、該フローセルの基材に選択的に結合されて配列決定される核酸シーケンスのクラスタ（例えば、約２００〜１０００塩基）を含むとともに、選択的に他の構成要素を含む。また、フローセルは、各々のビードが一本鎖シーケンスからの複数のコピーを選択的に含むようなビードのアレイを含むことができる。このようなビードは、例えば、米国特許６１７２２１８号明細書または国際公開０４０６９８４９号パンフレットに記載されている様々な技法（ビードエマルジョン核酸増幅）に従って準備することができる。
【００１７】
本発明のシステムは、フローセル内の流体の温度条件を選択的に調節することができる温度ステーションアクチュエータ１３０および加熱器／冷却器１３５をさらに備える。以下に説明するように、様々な実施例において、様々な加熱／冷却部品の構成とすることができる。フローセルは、フィルタスイッチングアセンブリ１４５、対物レンズ１４２、および集光レーザ／集光レーザセンブリ１５０内の様々なフィルタと相互作用することができるカメラシステム１４０（例えば、ＣＣＤカメラ）によって監視され、シーケンシングが追跡される。レーザ装置１６０（例えば、複数のレーザを選択的に含むアセンブリ内の励起レーザ）は、光ファイバ１６１（これは、１つまたは複数の再結像レンズ、光ファイバマウントなどを選択的に含み得る）を介してのレーザ照射によって、フローセル内で蛍光シーケンシング反応を発生させる働きをする。図示した実施例においては、低ワットランプ１６５、ミラー１８０および反転ダイクロイックミラー１８５がさらに示されている（以下を参照）。加えて、取付け台１７０は、本発明の様々な部品に対して、フローセル、温度アクチュエータおよびカメラなどの適当な位置決めや動きを可能にする。集光（ｚ軸）部品１７５は、様々な部品（例えば、対物レンズ）の操作や位置決めを助ける働きもする。このような部品は、選択的に、フレームワークに体系化されているか、および／またはハウジング構造体内に閉じられている。ここに示した図は、実施例を示すためのものであり、必ずしも限定するためのものではないことを理解されたい。従って、例えば、様々な実施例において、互いに様々な位置に部品が配置され得る（例えば、実施例Ａでは、図１に示す位置に加熱器／冷却器を含み、実施例Ｂでは、フローセルの下に加熱器／冷却器を含む）。
【００１８】
[定義]
本発明を詳細に説明する前に、本明細書中における本発明は、特定の核酸ないし生物学的システムについての使用に限定されるものではなく、様々に変化し得るものであることを理解されたい。また、本明細書中で使用される方法は、特定の実施例を説明するためのものであり、これに限定しないことを理解されたい。本明細書および添付の請求項で使用される単数名詞は、文脈で明確に示さない限り、複数名詞を含み得る。従って、例えば、「フローセル」と言及している箇所は、２つ以上のフローセルの組合せなどを選択的に含む。
【００１９】
本明細書中に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を示しているが、当業者であれば、本明細書中のシステムおよび装置は、リボ核酸（ＲＮＡ）についても使用可能であることを理解されるであろう。これらの用語は、塩基同等物から精製されたＤＮＡまたはＲＮＡ同等物や類似物を含むことを理解されたい。本明細書中で使用されるこの用語は、さらに、ｃＤＮＡすなわち相補的ＤＮＡや、例えば逆転写酵素の働きによるＲＮＡテンプレートから生成された複製ＤＮＡも含む。
【００２０】
本明細書中のシステムおよび装置によってシーケンシングされる一本鎖ポリヌクレオチドの分子は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの形態を起源とするものでもよいし、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態（例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ＰＣＲおよび増幅生成物およびこれらの類似物）を起源とするものでもよい。従って、一本鎖のポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドのうちのセンス鎖であってもよいし、アンチセンス鎖であってもよい。標準的な技術を用いる本発明の方法で使用するのに適当な一本鎖ポリヌクレオチド分子を準備する方法は、当技術分野において周知の方法である。一次的なポリヌクレオチド分子の精密な塩基配列は、概して、本発明の対象とする物質ではなく、知ることができるかもしれないし、できないかもしれない。一本鎖ポリヌクレオチド分子は、イントロン配列およびエキソン配列（配列をコードする）の両方を含む遺伝子ＤＮＡ分子（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）を表すことができるとともに、プロモータ配列やエンハンサ配列などの、配列をコードしない調節塩基配列を表すことができる。
【００２１】
いくつかの実施例においては、本発明を使用して配列決定される核酸は、基材（例えば、フローセル内の基材、またはフローセルなどの基材上の１つまたは複数のビード内の基材など）に固定されている。本明細書中で使う「固定されている」という用語は、特に明記し又は文脈で示さない限り、直接的または間接的な共有結合または非共有結合を含むことを意図する。本発明のいくつかの実施例においては、共有結合が好ましいが、概して要求されることは、分子（例えば、核酸）が固定されたままであるか、または支持体を使用することが意図された条件において（例えば、核酸配列決定を要求する適用例において）、支持体に結合されていることのみである。
【００２２】
本明細書中で使用される「固体支持体」（または、いくつかの使用例における「基材」）という用語は、ガラス表面、プラスチック表面、ラテックス、デキストラン、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面およびシリコンウェハーなどの、核酸が結合することができる不活性な基材ないし母材に言及している。多くの実施例において、固体支持体は、ガラス表面である（例えば、フローセルチャネルのプラナー表面）。いくつかの実施例において、固体支持体は、例えば、ポリヌクレオチドなどの分子に共有結合させる反応基を含む中間物質の層またはコーティングを適用することによって「機能化された」不活性な基材ないし母材を含み得る。非制限的な実施例において、これらの支持体は、ガラスなどの不活性な基材に支持されたポリアクリルアミドハイドロゲルを含み得る。このような実施例において、分子（ポリヌクレオチド）は、中間材（例えば、ハイドロゲル）に直接的に共有結合することができるが、この中間材自体は、基材ないし母材（例えば、ガラス基材）に、共有結合以外で結合させることができる。固体支持体への共有結合は、包括的なこの種の構成に応じて解釈される。
【００２３】
[システムの概観]
上記に示したように、本発明は、核酸のシーケンシングを行う新規のシステムおよび装置を備える。当業者には明らかであるように、本明細書中において、特定の核酸シーケンスについての言及は、文脈に応じて、該核酸シーケンスを含む核酸分子にも言及している。標的断片のシーケンシングは、時系列に塩基を読み取ることが確立されていることを意味する。読み取られる塩基は、隣接している必要はなく（隣接していることが好ましいが）、断片全体のすべての塩基がシーケンシングで配列決定される必要もない。種々の適当なシーケンシング技術を使って配列決定を行うことができ、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが３’ヒドロキシル基に首尾よく加えられ、５’末端から３’末端の方向にポリヌクレオチドの鎖が合成される。添加されたヌクレオチドの本質は、各々のヌクレオチドの添加後に確定されることが好ましい。また、（連続するすべての塩基の配列が決定されるのではない）連結反応によるシーケンシンングを用いるシーケンシング技術や、（塩基が表面上の鎖に添加される代わりに鎖から除去される）超並列シグネチャ系列（ＭＰＳＳ）などの技術も本発明のシステムおよび装置に使用することに適している。
【００２４】
いくつかの実施例において、本発明は、合成によるシーケンス（ＳＢＳ）を利用する。ＳＢＳにおいては、蛍光標識された４つの修飾ヌクレオチドは、基材（例えばフローセル）の表面に存在する増幅ＤＮＡ（おそらく数百万クラスタ）の高密度クラスタをシーケンスするために使用される。発明者らは、ＳＢＳの手順および方法に関する様々な追加的な態様を記述しており、これらの手順および方法は、ここでのシステムおよび装置に利用することができる。例えば、国際公開０４０１８４９７号パンフレット、国際公開０４０１８４９３号パンフレットおよび米国特許７０５７０２６号明細書（ヌクレオチド）、国際公開０５０２４０１０号パンフレットおよび国際公開０６１２０４３３号パンフレット（ポリメラーゼ）、国際公開０５０６５８１４号パンフレット（表面結合技術）、ならびに国際公開９８４４１５１号パンフレット、国際公開０６０６４１９９号パンフレットおよび国際公開０７０１０２５１号パンフレット（これらの各々の内容の全体が本明細書中の参照となる）を参照されたい。
【００２５】
ここでのシステム／装置の特定の使用において、シーケンシング用の核酸サンプルを含むフローセルは、本発明の適当なフローセルホルダ内に配置されている（様々な実施例を本明細書中に記述する）。シーケンシング用のサンプルは、単一分子、クラスタの形態の増幅された単一分子、または核酸分子を含むビードの形態とすることができる。核酸は、未知の標的シーケンスに隣接するオリゴヌクレオチドプライマを含むように準備される。第１のＳＢＳシーケンスサイクルを開始するために、１つまたは複数の様々な標識されたヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼなどが、流体流サブシステム（これの様々な実施例を本明細書中に記述する）によってフローセル内に流入／通流される。一度に単一のヌクレオチドを添加することができ、或いはシーケンシングの手順で使用されるヌクレオチドを逆転写終止特性を有するように特別に設計することができ、これにより、標識された４種類のヌクレオチド（Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ）が存在する場合に、シーケンシング反応の各サイクルが同時に起こることを可能にする。４種類のヌクレオチドを一緒に混合するとき、ポリメラーゼは、取り込むべき正しい塩基を選択することができ、各シーケンスは、単一の塩基によって伸長される。本発明のシステムを使用するこれらの方法においては、４種類の代替物の自然の競合は、反応混合物中に１種類だけのヌクレオチドしか存在しない場合（従って、塩基配列のほとんどが正しいヌクレオチドに晒されない）と比較して、高い確度を導く。特定の塩基が次々に繰り返されるシーケンス（例えば、ホモポリマー）が種々の他のシーケンスと同様に対処され、しかも高い確度で対処される。
【００２６】
また、流体流サブシステムは、取り込まれた塩基の各々から、３’末端保護基（適当であれば）と蛍光体を除去するように、適当な試薬を流す。基材は、４つの保護されたヌクレオチドの第２周期目に晒すことができ、あるいは異なる個別のヌクレオチドを使って第２周期目に選択的に晒すことができる。続いて、このようなサイクルが繰り返され、各クラスタのシーケンスは、複数回の化学サイクルに亘って読み取られる。さらに長いポリマの配列を決定するために、本発明のコンピュータの態様は、各々の一本鎖分子、クラスタまたはビードから集められた配列データを選択的に整列させることができる。あるいは、画像処理および位置決めを独立したコンピュータで実行することができる。
【００２７】
本発明のシステムの加熱／冷却部品が、フローセルチャネルおよび試薬貯蔵領域／コンテナ（および、選択的に、カメラ部品、光学部品および／または他の部品）内の反応条件を調整する一方で、流体流部品は、取り込みに適した試薬に基材表面が晒されることを可能にし、取り込まれなかった試薬が洗い流される。フローセルを載せるための選択的に可動なステージが配置され、基材のレーザ（または他の光線）励起の正しい方向にフローセルが向くことを可能にするとともに、基材の異なる領域を読み取ることができるように、対物レンズに対して選択的に動かされる。加えて、本発明のシステムの他の部品（例えば、カメラ、対物レンズ、加熱器／冷却器など）もまた、選択的に、移動／調整することができる。レーザ励起の間に、基材上の核酸から発光された蛍光の結像／位置の特定は、カメラ部品によって捕捉され、これによって、各々の単一分子、クラスタまたはビードの第１の塩基についての識別性をコンピュータに保存する。
【００２８】
図２は、本発明のシステムの構成の一例を示す。図に見られるように、このシステムは、いくつかの基本グループ、例えば、流体素子および試薬貯蔵器を含む領域２００（流体の流れの発生および調整用のポンプやモータなどや適当な試薬温度にする加熱器／冷却器などを含む）と、フローセルおよび検出器（１つまたは複数のカメラまたは類似した装置、１つまたは複数のレーザまたは他の光源、１つまたは複数の適当な光学フィルタおよび光学レンズ、温度制御アクチュエータを含む領域２１０と、（例えば、フローセルの温度条件の制御用のペルティエ加熱器／冷却器と、システム内の様々な装置／部を正確に位置づけるように制御する可動ステージプラットホームおよびモータを有する）を含む）コンピュータモジュールを含む領域２２０（メモリや、表示パネルおよびキーボードなどのユーザインタフェースを含む）と、に分けることができる。
【００２９】
図３は、例示的なシステム内に配置されたフローセル（フローセル３００）を示す。光ファイバ３２０を介して結合されたレーザが（シーケンシングされる核酸サンプルを含む）フローセルを照射するように配置され、対物レンズ部品（部品３１０）が、レーザまたは他の光線によって蛍光体が照射されたときに様々な蛍光発光を捕捉および監視する。さらに図３に見られるように、試薬は、適当な試薬貯蔵器などと接続する１つまたは複数のチューブ（チューブ３３０）を介してフローセル内に通流される。図３におけるフローセルは、フローセルホルダ３４０内に配置されている（このフローセルダ３４０は、可動ステージ領域３５０上に配置される）。フローセルホルダ３４０は、シーケンシングが行われているときに、レーザ、プリズム（これは、結像面にレーザ照射を導く）およびカメラシステムに対して適当な位置にフローセルを保つ。他のフローセルおよびフローセルの構成については、以下に述べる。
【００３０】
本発明の様々な実施例は、いくつかの新規の特徴を提示する（特に示さない限り、すべての特徴がすべての実施例に必ずしも存在するのではないことに注意されたい）。例えば、ここでのシステムは、光ファイバデバイスを介して結合された２つの励起レーザを使用して、これらの２つの励起レーザが同じ領域を照射することを確保することができる（すなわち、レーザが重なり合った照射領域すなわちフットプリント）。加えて、照射フットプリントの全体に亘ってマルチモードビームからの光強度が一様につくられるように、本発明は、振盪され、絞られ、または波長板修飾されたファイバ（モードスクランブラ）を含み得る。ファイバの形状は、照射の形状がデータ収集装置（例えば、正方形のピクセルを有するＣＣＤ）の形状と合致させることができるように、例えば、正方形または長方形に調節することができる。さらに、いくつかの実施例においては、シングルレーザが、波長付近の狭帯域通過発光フィルタを使うことによって、またこれよりも長波長側でさらに広帯域通過発光フィルタを使うことによって、２種類の蛍光体を励起させる。このような構成により、２種類の色素の相対強度を正規化する（同じ帯域幅のフィルタを用いた場合、レーザ波長から遠い波長の色素は、大きく弱まる）。ここでの実施例は、（加熱および冷却を必要とする）化学反応が、同じ機器上で、しかし光学系の外側で起きることができるように、可動ステージをさらに含み得る。ここでのシステムは、数多くのタイルの自動撮像を可能にし、オンラインでの流体変化を実行する流体システムを含む。システム／装置の個々の部品（例えば、光源、カメラなど）は、選択的に、各々の電源すなわち電力供給源を有していてもよいし、あるいは１つの電力供給源からすべてに電力を供給してもよい。本明細書中における部品は、単独で、あるいは１つまたは２つの他の部品との関係で記述しているが、実施例における様々な部品は、典型的には、操作可能および／または機能可能に接続され、本明細書中のシステム／装置内で一緒に作動する。
【００３１】
[フローセル]
様々な実施例において、本明細書中のシステムは、１つまたは複数の基材を備え、この基材上に、シーケンシングされる核酸が、結合され、付着され、または関連付けられる。国際公開９８４４１５１号パンフレットまたは国際公開０２４６４５６号パンフレットを参照されたい。いくつかの実施例においては、基材は、「フローセル」の一部としてのチャネル内または他の領域内にある。本発明の様々な実施例で使用されるフローセルは、数百万の個別の核酸クラスタ（例えば、１チャネル当たり約２００万〜８００万クラスタ）を含むことができる。これらのクラスタの各々は、ＤＮＡシーケンシング用の少なくとも２５塩基の読み取り長さと、遺伝子発現分析用の２０塩基と、を与えることができる。ここでのシステムは、１回の運転で、ギガ塩基（１０億塩基）からなるシーケンスを生成することができる（例えば、１チャネル当たり５００万核酸クラスタ、１フローセル当たり８チャネル、１ポリヌクレオチド当たり２５塩基）。
【００３２】
図４Ａおよび図４Ｂは、フローセルの一実施例を示す。図から分かるように、特定のフローセル（フローセル４００）の実施例は、（例えば、深さ１０００μｍのホウケイ酸ガラスからなる）塩基層４１０、この塩基層上に重ねられた（例えば、エッチングされた深さ１００μｍのケイ素からなる）チャネル層４２０、および（例えば、深さ３００μｍの）保護層すなわち最上層４３０を備える。これらの層が一体に組み上げられるとき、保護層を介して、いずれかの端部に入口／出口を有するように閉塞チャネルが形成される。以下の追加的な記述から明らかとなるように、いくつかのフローセルは、底部にチャネル用の開口を備え得る。
【００３３】
当業者には周知であるように、チャネル層は、標準的なフォトリソグラフィー法を使って選択的に構築することができる。本発明に使用されるこのような方法の１つとしては、１００μｍのケイ素の層を露光させ、深部反応イオンエッチングまたは湿潤性エッチングを用いて、露光されたチャネルをエッチング除去する。
【００３４】
特定のフローセルの構成が本明細書中に示されているが、これらの構成は必ずしも限定するためのものではないことを理解されたい。従って、例えば、ここでの様々なフローセルは、様々な数のチャネルとすることができる（例えば、１チャネル、２チャネル以上、４チャネル以上、あるいは６，８，１０，１６チャネル以上など）。さらに、様々なチャネルは、様々な深さおよび／または幅のチャネルとすることができる（異なるフローセル内のチャネル間で異なる場合もあれば、同じフローセル内のチャネル間で異なる場合もある）。例えば、図４Ｂのセル内に形成されたチャネルが１００μｍの深さである一方、他の実施例においては、選択的に、さらに深いチャネル（例えば、５００μｍ）またはさらに浅いチャネル（例えば、５０μｍ）とすることができる。フローセルの設計のさらなる例を、図４Ｃおよび図４Ｄに示す（例えば、図４Ｃに示すように、流れの一様性を保つための８つの入口出口ポート（ポート４４５（８つの入口および８つの出口））を有する２チャネルからなる「広い」チャネルと、追加的に構造を補強する壁４５のような中央壁と、を備えるフローチャネルとしてもよいし、あるいは、１６オフセットチャネル（チャネル４８０）のようなオフセットチャネルを有するフローセルなどとすることができる。このようなフローセルは、照射された面からの蛍光を最大限に集めるとともに、回折限界の結像ができるように設計することができる。例えば、図４Ｃに示す設計の特定の実施例においては、１０００μｍの厚さの底層４６０（これは、本明細書中に示されるように、ホウケイ酸ガラス、溶解したケイ素または他の物質からつくることができる）を通過してチャネルに侵入する光や放出される光は、チャネル内で深さ１００μｍの水溶液と、深さ３００μｍの「最上」層材料４７０と、を通過するように進む。しかし、いくつかの実施例においては、球面収差を避けるとともに回折限界のスポットを結像させるように、「最上」層の厚さを３００μｍ未満とすることができる。例えば、標準的な回折限界の光学系で使用するために、最上層の厚さを約１７０μｍとすることができる。球面収差に煩わされることなく更に厚い最上層を使用するために、対物レンズは、例えばここに記述されるように、選択的にカスタム設計することができる。
【００３５】
ここでの様々な実施例においては、フローセルは、いくつかの可能な物質から／を使って、つくることができる。例えば、いくつかの実施例においては、フローセルは、必要に応じて形成することができ、巧みに処理することができるＦｏｔｕｒａｎ（登録商標）（独国マインツ所在のＭｉｋｒｏｇａｓｌａｓ社）またはＦｏｔｏｆｏｒｍ（登録商標）（東京所在のＨｏｙａ社）などの感光ガラスとすることができる。他の可能な物質としては、優れた光学的特性を有するとともに必要であれば高温に対して耐性を有する（例えば、１００℃まで）サイクリックオレフィンコポリマ（例えば、Ｔｏｐａｓ（登録商標）（ケンタッキー州フローレンス所在のＴｉｃｏｎａ社）またはＺｅｏｎｏｒ（登録商標）（ケンタッキー州ルイジビル所在のＺｅｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）とすることができる。図４から明らかなように、フローセルは、同じセル内にいくつかの異なる材料を含むことができる。従って、いくつかの実施例においては、ベース層、チャネルの壁および最上／保護層は、異なる材料から選択的につくることができる。
【００３６】
図４Ｂの実施例は３層からなるフローセルを示すが、他の実施例においては、２層からなるフローセル（例えば、エッチングされ／研磨され／あるいは内部に複数のチャネルが形成されたベース層および最上部の保護層）としてもよい。さらには、他の実施例においては、エッチングされ／研磨され／あるいは内部にフローチャネルが形成された１層だけからなるフローセルとすることができる。
【００３７】
いくつかの実施例においては、フローセルは、Ｆｏｔｕｒａｎ（登録商標）とすることができる。Ｆｏｔｕｒａｎは、様々な目的に合わせて構成することができる。Ｆｏｔｕｒａｎは、様々な所望のガラス特性（例えば、透過性、固さ、熱化学的抵抗など）と、厳しい許容誤差および高アスペクト比（孔の深さ／孔の幅）を有する高精度の構造を達成する能力と、を併せ持つ。Ｆｏｔｕｒａｎ（登録商標）を使う場合、もっとも小さい可能な構造としては、通常は、例えば、２５μｍとし、このときの粗さを１μｍとする。
【００３８】
図５Ａは、フローセル（例えば、Ｆｏｔｕｒａｎ（登録商標）からなるもの）をパターン化するのに可能な１つの方法を概略的に示す図である。最初に、基材５１０の表面上をマスク５００で所望のパターンにマスキングし、その後、紫外光に露光される。この露光ステップにおいては、ガラスは、２９０ｎｍ〜３３０ｎｍの波長の紫外光に露光される。２ｍｍまでの厚さの材料を照射することが可能である。典型的には、１ｍｍの厚さのＦｏｔｕｒａｎプレートを構築するのには、約２０Ｊ／ｃｍ2のエネルギ密度で十分である。紫外光露光ステップの際には、照射される領域（領域５２０）内に、銀または他の不純物原子が癒着する。次に、５００℃〜６００℃の熱処理の際に、領域５２０内において銀原子の周囲でガラスが結晶化する。最終的に、室温で１０％のフッ化水素酸でエッチング（異方性エッチング）するときに、結晶化領域は、ガラス質の領域と比較して２０倍のエッチング速度にすることができ、こうして、チャネル５３０を生じさせることができる。湿潤性化学エッチングを超音波エッチングまたはスプレーエッチングによって補助できる場合、生じる構造は、大きなアスペクト比を示す。図５Ｂは、Ｆｏｔｕｒａｎガラス（ｄ＝１ｍｍ）のサンプルからの透過スペクトラムを示す。
【００３９】
図６Ａ〜図６Ｅは、本明細書中で使用されるフローセルのサンプルを構築するためのエッチングプロセスの一例を示す。図６Ａにおいては、チャネル６００（後方図に見られる）および貫通する孔６０５（後方図に見られる）は、層６３０内に露光／エッチングされる。図６Ｅに見られるように、層６３０は、２層のフローセルのうちの「最上」層とすることができる（底層６２０と係合している）。貫通する孔（ここから試薬／流体がフローセルチャネル内に侵入する）およびチャネルは、Ｉｎｖｅｎｉｏｓ社（カリフォルニア州サンタバーバラ所在）から入手可能な３−Ｄプロセスなどを使って層６３０内にエッチングすることができる。保護層６３０は、上記に示した紫外光エッチング可能なＦｏｔｕｒａｎとすることができる。Ｆｏｔｕｒａｎは、紫外光に晒されたとき、色が変化し、光学的に不透明（すなわち偽の不透明）になる。こうして図６Ｂにおいて、保護層６３０は、この層に暗領域６１０を生成するように、マスキングされて光に晒される（図５Ａにおけるマスキングと似ているが、さらなるエッチングを伴わない）。このような光学的に不透明な領域は、ここでの塩基配列の読み取りの質に否定的な影響を与え得る、間違った方向への光、光の散乱または他の望ましくない反射を防ぐことを助ける。他の実施例においては、クロムまたはニッケルなどの金属の薄い（例えば、１００〜５００ｎｍ）層は、フローセルの層の間（例えば、図６Ｅにおいて、最上層と底層との間）に選択的に堆積されて、望ましくない光の散乱を封鎖することを助ける。図６Ｃおよび図６Ｄは、チャネル層６３０を有する底層６２０の係合を示し、図６Ｅは、これらの層の切り欠き図を示す。
【００４０】
さまざまな実施例において、フローセルの層は、いくつかの種々の方法で互いに接合させることができる。例えば、粘着剤、（例えば、熱的、化学的な）結合、および／または機械的方法を介して層を接合することができる。当業者であれば、様々なガラス／プラスチック／シリコンの層を互いに接着するための数多くの方法および技術について熟知しているであろう。
【００４１】
本明細書中において、特定のフローセルの設計および構造について説明しているが、これらの記述は、必ずしも限定的なものではないことを理解されたい。本発明の他のフローセルは、本明細書中のもの以外の様々な材料および設計とすることができ、および／または、本明細書中に提示した設計および／または様々なエッチング／研磨技術または本明細書中に開示した以外の製造方法を使ってつくり出すことができる。従って、特定のフローセル構成要素または構造は、すべての実施例において必ずしも限定するためのものではない。
【００４２】
[流体の流れ]
ここでの様々な実施例において、核酸シーケンシングに用いられる試薬や緩衝液などは、流体流のサブシステムまたは態様を介して調整かつ投与される。図７Ａ〜図７Ｃは、本発明の流体流装置の一例を概略的に示し、それぞれ、１通路圧送、８通路吸引および１通路吸引の構成に設定されている。概して、流体流サブシステムは、適当な流量かつ選択的に適当な温度で、試薬貯蔵領域（例えば、ボトルまたは他の貯蔵容器）からフローセルに適当な試薬（例えば、酵素、緩衝液、色素、ヌクレオチドなど）を通流させ、選択的に廃液溜め領域まで運ぶ。
【００４３】
流体流の態様は、選択的にコンピュータ制御され、様々な試薬成分の温度を選択的に制御することができる。例えば、いくつかの成分は、選択的に、（例えば、酵素を含む溶液に対して）４℃＋／−１℃程度の低温に保たれる一方で、他の試薬は、選択的に高温に保たれる（例えば、この高温で特定の酵素反応が起きているときに、緩衝液がフローセル内に流されるようにする）。
【００４４】
いくつかの実施例においては、フローセル内に流される前に、様々な溶液が選択的に混合される（例えば、希釈された適当なヌクレオチドなどと混合された濃縮緩衝液）。このような混合および調整も、本発明の流体流の態様によって選択的に制御される。多くの実施例において、混合流体とフローセルとの距離を最小限にできれば有利となる。そのために、このポンプを使って試薬をフローセル内に圧送する（図７Ａ）のとは反対に、フローセルの下にポンプを配置してフローセル内に試薬が吸引されるようにすることができる（図７Ｂおよび図７Ｃ）。この吸引構成は、ポンプ内の死容量に捕捉された種々の物質がフローセルを汚染しないことを意味する。フローセルの各チャネル内に均等な流れを確保するように、ポンプをシリンジ型ポンプとし、１つの流れチャネルにつき１つのシリンジを有するように構成することができる。８通路フローセルを使用することが望ましい場合、ポンプは、例えば、Ｋｌｏｅｈｎ８通路シリンジポンプ（ネバダ州ラスベガス所在のＫｌｏｅｈｎ社）などの８通路ポンプとすることができる。図７Ｂは、８通路吸引構成を流体工学的に図解する。図７Ａにおいて、流体の試薬は、試薬容器７００（例えば、室温における緩衝液、５倍ＳＳＣ緩衝液、酵素緩衝液、水、開裂緩衝液など）および試薬容器７１０（例えば、酵素用の低温容器、酵素混合物、水、ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｘなど）内に貯蔵されている。ポンプ７３０は、試薬容器から、試薬弁７４０、プライミング／廃液弁７７０を介して、フローセル７６０に圧送／吸引されるように流体を流す。
【００４５】
図７Ｂにおいては、流体の試薬は、試薬弁７０１を介して繋がれた試薬容器７０２（例えば、上記に挙げた緩衝液と同じ室温における緩衝液）および試薬容器７０３（例えば、上記に挙げた容器と同様の酵素用の低温容器など）内に貯蔵されている。当業者であれば、複数のライン／容器からのアクセス／へのアクセスを制御する複数通路の弁（反応弁など）について熟知しているであろう。試薬弁は、選択的なプライミング弁（または廃棄弁）７０４を介してフローセル７０５内に繋がれ、選択的にプライミングポンプ７０６に接続されている。プライミングポンプは、容器から選択的に試薬を吸引してチュービング内に待機させ、試薬がフローセル内に入る「準備ができている」ようにすることができる。こうして、不適切な温度環境で空気や試薬が死んでいる（これは、例えば、チュービング内に留まっていることによる）ことを避けることができる。プライミングポンプで吸引するとき、流出流は、廃液領域内へ逸らされる。プライミングポンプを使用しない間に、試薬は、廃液溜め７０８に接続された８チャネルポンプ７０７を使ってフローセル内に吸引することができる。
【００４６】
（圧送および吸引の）いずれの実施例においても、流体流装置は、容器から試薬を抽出するために、様々な試薬容器内に延びる「すすりチューブ」またはこれの類似物を備え得る。図７Ｃは、８チャネルポンプではなく、シングルチャネポンプを示す。シングルチャネルポンプ７２６は、選択的にプライミングポンプとして機能することもでき、従って、選択的なプライミングポンプまたは廃液弁７２３がバイパス７２５を介して直接的にポンプ７２６に接続されている。この実施例における構成要素の配置は、図７Ｂの配置に類似している。従って、この構成は、試薬容器７２１，７２２、複数通路選択弁７２０およびフローセル７２４などを含む。
【００４７】
流体流そのものは、Ｅｎｃｙｎｏｖａ（登録商標）２−１ポンプ（コロラド州Ｇｒｅｅｌｅｙ所在のＥｎｃｙｎｏｖａ社）またはＫｌｏｅｈｎ（登録商標）Ｖ３シリンジポンプ（ネバダ州ラスベガス所在のＫｌｏｅｈｎ社）などの種々のいくつかのポンプによって選択的に駆動される。ここでの特定のポンプなどの具体的な説明も、必ずしも限定するためのものではなく、ここに挙げた以外の様々なポンプおよび／またはポンプの種類を含み得ることを理解されたい。いくつかの実施例において、流体運搬速度は、８チャネルについて、約５０μＬ／分から約５００μＬ／分（例えば、＋／−２μＬに制御される）である。８通路吸引構成においては、プロセスに依存して、１チャネル当たりの流れ速度を１０〜１００μｌ／分とすることができる。いくつかの実施例においては、２５塩基のポリヌクレオチドのシーケンシングに要求されるヌクレオチド試薬の最大量は約１２ｍＬである。
【００４８】
いずれのポンプ／ポンプの種類がここで使用される場合にも、これらの試薬は、貯蔵領域からチュービングを介してフローセルに選択的に運ばれる。ＰＴＦＥなどのチュービングは、例えば、試薬との相互作用を最小にするように選択することができる。チュービングの直径は、実施例ごとに（および／または試薬の貯蔵領域に応じて選択的に）変えることができるが、例えば、「死容量」すなわちライン中に残された流体の量を減らすための要求に応じて選択することができる。さらに、チュービングの寸法は、流れ通路の１つの領域から他の領域に向かって選択的に変えることができる。例えば、試薬貯蔵領域からのチューブの寸法は、ポンプからフローセルまでのチューブの寸法とは異なる直径にすることができる。
【００４９】
本発明の流体流サブシステムは、含まれる試薬の流量を制御することができる。流量は、各流路について選択的に調整することができる（例えば、いくつかの流路は他の流路よりも高い流速で流すことができ、流速を選択的に逆向きにすることができ、あるいは互いに異なるチャネル間で異なる試薬流を受けたり、異なるタイミングで試薬流を受けることなどができる）。流速は、例えば、フローセル内に所与の時間に適当な量の試薬を有するように、各流路についてチューブの直径に関連させて設定することができる。例えば、いくつかの実施例においては、試薬が通流するチュービングの内径（ＩＤ）は、０．３ｍｍ，０．５ｍｍまたは１．０ｍｍであって、このときの流速は、４８０μＬ／分または１２０μＬ／分である。いくつかの実施例においては、流れの速度は、試薬の利益を最適化するように、選択的にバランスがとられる。高い流速は、ラインの効率的なクリアランスを生じさせることができ、所与のフローセル容積内で試薬を交換する時間を最小にすることができるが、基材表面に高レベルのせん断力を生じさせ、漏れや泡に関わる大きな問題を生じさせてしまうことがある。試薬の導入についての典型的な流速は、いくつかの実施例においては、１チャネル当たり１５μｌ／分とすることができる。
【００５０】
本発明のシステムは、さらに、システムにおける漏出、封鎖および流量などの流体性能の特徴を自動的に検出および報告する圧力センサを備える。このような圧力センサすなわち流れセンサは、機器のメンテナンスやトラブル解消に有用となり得る。流体流装置は、例えば、以下に記すような１つまたは複数のコンピュータで制御することができる。本発明の様々な実施例における流体制御系は、例えば、試薬容器の数、チュービングの長さ／直径／組成、切換弁およびポンプなどの種類に関して、違うものにすることができる。
【００５１】
[加熱／冷却]
いくつかの実施例において、ここでのシステムは、例えば、ペルティエ装置などを使うことによる加熱／冷却能力を有する加熱／冷却制御部品を備える。ここでの様々な構成要素（例えば、フローセルおよびこれの内容物）は、環境温度を越えた反応条件をつくり出すように、選択的に、耐熱性要素によって加熱することができ、あるいは対流によって冷却することができる。このような（１つまたは複数の）加熱／冷却部品は、合成によるシーケンシングに要求される様々な反応の間に、フローセル（およびその内部の流体）の温度を制御することができる。例示的なフローセルの温度制御システムを（システムの他の部品から分離した姿で）図８に示す。図８において、ペルティエファン８００は、ヒートシンク８１０およびペルティエヒータ８２０との関係で示されている。フローセル加熱／冷却部品は、システムの他の部品（例えば、フローセルおよびフローセルホルダなど）に対して、選択的に位置づけ及び／または移動させることができる。こうして、加熱／冷却部品は、必要なときに所定の場所に移動させ（例えば、酵素の活性化などを可能にするように、フローセル内の試薬の温度を上昇させる）、必要でないときに離れるように移動させることができる。これに加えて及び／又は代替的に、加熱／冷却部品に対して、フローセルおよびフローセルホルダを選択的に動かすことができる。以下の図１０Ａおよび１０Ｂを参照されたい。様々な実施例において、温度制御要素は、システム／装置内で行われる反応による要求に応じて、例えば、約２０℃〜約６０℃または他の温度／温度範囲にフローセルの温度を制御する。加熱要素の温度は、フローセルおよびフローセル内の試薬の温度を制御するように調節することができる。フローセルが低温の試薬の流れに晒されるとき、加熱要素の温度は、フローセルの表面で要求される温度より高くしてもよい。例えば、フローセル温度を４５℃にするために、加熱要素を５５℃に設定することができる。
【００５２】
当業者であれば、温度制御に使用されるペルティエ装置（これは、ここでのシステム内で選択的に使用できる）に精通しているであろう。いくつかの加熱／冷却装置の使用についてここで説明示したが、必ずしもこのような使用に限定されないことを理解されたい。従って、いくつかの実施例においては、本発明の範囲を逸脱することなく、ペルティエ装置以外の加熱／冷却装置を選択的に備え得る。典型的な実施例においては、装置の種類によらず、加熱／冷却部品は、コンピュータによって（例えば、温度、特定の温度における時間、部品の動き、および／またはフローセルホルダなどの他の部品の加熱／冷却部品への動きに関して）選択的に制御される（以下を参照）。
【００５３】
いくつかの実施例においては、追加的な加熱／冷却要素は、フローセルに加えて又はフローセルの代わりに他の部品の温度を選択的に調整する。例えば、加熱／冷却部品は、カメラおよび試薬溜めの温度を選択的に調整して、例えば、４℃に冷却して、長いシーケンシング運転中における試薬の貯蔵寿命を延ばすことができる。また、機器内などの雰囲気温度を選択的に調整することができる。
【００５４】
[複数のフローセルおよび代替的なＴＩＲＦおよび加熱／冷却アプローチ]
ここでのいくつかの実施例においては、システム／装置は、フローセルの構成、ＴＩＲ照射、（１つまたは複数の）フローセルの加熱／冷却部品、およびフローセルを装置内に保持／安定化させる方法に、追加的なアプローチを含むことができる。そのようなアプローチは、いくつかの実施例において選択的に一緒に使用することができ、例えば、ここに示される種々の他のアプローチと互いに組み合わせて使用することができることが理解されよう。
【００５５】
ここでのフローセルは、いくつかの実施例においては、「底面流れ」フローセルである。こうして、例えば、図４，６，９に示すフローセルとは反対に、フローセルはクランプ留めされ、フローセルの天井側から流体の流れが侵入し、いくつかのフローセルにおいては、フローセルの底面から流体の流れが侵入する構成とすることもできる。このような底面フローセルは、「天井流れ」フローセルの構造および構成要素に類似させることができる。いくつかの実施例においては、底面流れフローセルは、含まれる流体の死容量をさらに小さくすることができ（例えば、フローセルの末端がクランプ／マニホールドなどによって覆われないので、天井流れフローセルと比べてチャネルの長さ全体を多く使用することができる）。例えば、図４４〜図４９を参照されたい。
【００５６】
底面流れフローセルは、クランプの代わりに真空チャッキングを介してフローセルホルダに選択的に保持され得る。そこで、真空は、適当な照射および撮像が行われるように、フローセルを装置内の正しい位置に保持することができる。図４４〜図４９と図９とを比較されたい。こうして、ここでのいくつかの実施例においては、フローセルおよび／またはプリズムをフローセルホルダ、ＸＹステージなどに保持するための真空（または部分的な真空など）をつくり出す１つまたは複数の真空創出装置がさらに含まれる。
【００５７】
図４６に、底面流れフローセルとともに使用することができるフローセルホルダマニホールドの様々な実施例を示す。図に見られるように、フローセルに流入／通流／流出する流体は、マニホールド内の様々な枝分かれチューブを介してフローセル内の特定のチャネルへ／から導かれる。これらの実施例は、チャネルの長さ全体に亘る照射／撮像を妨げる恐れのあるフローセルの天井面のいずれも（または実質的にいずれもではない）を選択的に妨害することができない。図４７は、流体弁の一例を示す。このような弁は、可動部および振動部がなく、死容量が小さい。この構成において、各々の試薬のボトル／容器は、開／閉弁を有することができる。流体を吸引した後、液溜め弁を閉じる前に空気を吹き込むことができ、それによって、試薬間の空気ギャップ弁を圧縮する。低温の試薬は、液溜めに戻すことができ、システムが停止した場合には、すべての試薬を戻すことができる。さらに、圧送／吸引ポンプ（例えば、ｋｌｏｅｈｎ  ｐｕｍｐ）に空気噴射ポンプを組み合わせることができる。
【００５８】
照射についての他のアプローチは、「トップダウン」照射を含むことができる。そのようなトップダウンアプローチは、真空チャッキング（および後述する底面温度制御）と一緒に使用されるとき、有用となり得る。これらの実施例は、フローセルの下の空間を利用することが多いので、真空チャッキングおよび底面側温度制御を用いる構成においは、（例えば、図１などに示すような）底面からの照射が問題となる場合がある。図４４に見られるように、トップダウン照射すなわち側面照射は、上方からプリズム４４０１内に侵入し、このプリズム上にはフローセル４４０２が支えられている（そして真空によって選択的に保持される）。このような構成は、フローセルの撓みを防ぐことを助け、そうすることで、自動焦点合わせや平面領域での結像を支援することができ、さらに、同時読み取りなどを行う複数のフローセルを含む構成において支援することができる。さらに、図４４は、ミラー４４０５およびマニホールド／流体コネクタ４４０４とともに、レーザ照射４４００がプリズム中に進入する様子を示す。
【００５９】
図４５は、フローセル（およびフローセル中の試薬および反応）の熱力学的制御についての他のアプローチである。この態様は、このような実施例においては、読み取りサイクル中の寸法の安定性と、スキャニング緩衝液の温度制御を確保することを助ける水冷却ベンチを備え得る。熱プレートは、プリズムおよびフローセルを過ぎてマニホールドの下に延在し、一様な温度制御を選択的に助けることができる。流体は、入口マニホールドを通過する際に、選択的に予熱することができる。さらに、プリズムの天井にＲＴＤ温度フィードバックを埋め込むことにより、フローセルを所望の設定温度に保つとともに、プリズムの耐熱性効果を最小限にすることができる。
【００６０】
図４８は、フローセルホルダ内に複数のフローセルを有する構成を示す。図に見られるように、図４８Ａに示すホルダ内に４つまでのフローセルを装着することができる（または２倍の広域フローセル、例えば、各々が１８〜２０チャネルを有する）。ペルティエ装置または他の類似の装置は、フローセルの下に配置することができ、フローセルは、（選択的に室温に保つことができる）ホルダベンチの態様を介して、選択的に水冷却することができる。
【００６１】
[ステージおよびフローセルホルダ]
例えば、フローセルおよびフローセルホルダ（または他の基材）の位置づけが行われる可動ステージによって、フローセル（及び従ってシーケンシングされる核酸）の位置づけ及び移動が制御され保証される。このような可動ステージは、レーザ照射およびチャネル内のシーケンス反応を読み取るために、対物レンズに対してフローセルを選択的に移動させることを可能にする。必要であれば、撮像サイクル中の基材の温度を制御するように、スキャニングサイクル中にスキャニングステージまたは他の部品を活発的に冷却することができる。
【００６２】
図９のパネルＡ〜Ｄは、本発明のフローセルホルダの一例を概略的に示す。図９Ａは、フローセルを設置する前のフローセルホルダ９００を示す。図に見られるように、ホルダは、該ホルダにフローセルをしっかりと固定する調節可能な（選択的にバネで装着される）クランプ９１０と、流体システムの残りにフローセルチャネルを流体的に接続する（例えば、選択的にクランプ内に含まれる）１つまたは複数のマニホールドと、を備える。マニホールドは、チャネルの各々を個別に並列に接続することができる。代替的に、マニホールドは、それぞれのチャネルが単一の入口ラインを介して接続されるようにチャネルを接続することができ、この入口ラインは、各々のチャネルに並行に流れるように枝別れする、あるいは単一の流体流を形成する「蛇行」構成にすることができる。このようなマニホールドは、単一の１−８からなる枝分かれを含む構成とすることができ、または、８チャネルの各々に沿ってさらに一様な流れを与えるように（１−２−４−８からなる枝分かれを得るように）、各々の流体チャネルが２つだけに枝分かれする二元チャネルとすることができる。８通路吸引構成においては、フローセルからの「出口」マニホールドは、８個の個別のポートを備えることができ、それぞれが８通路シリンジポンプのバレルに接続されている一方で、「入口」マニホールドは、フローセルを満たすのに必要とされるチュービングの長さを短くする単一の入口チューブを含むことができる。入口マニホールドは、１−８スプリッタを含むことができ、あるいは、８チャンネルの各々に流れを一様に枝分かれさせる二元１−２−４−８スプリッタを含むことができる。図９Ｂは、さらに、フローセルの下側に接触するように選択的に上下に動かすことができる調節可能なプリズム９２０を示す。このプリズムは、ＴＩＲＦが働いているときに、レーザと共に使用される。特定の実施例においては、プリズムと、一様で連続的な層に含まれるフローセルと、の間にオイル（例えば、Ｃａｒｇｉｌｌｅカタログ＃１９５７９などから調達可能な浸漬オイル）を配給し、プリズムとフローセルガラスの間の空気層を介して内部全反射をつくり出す。図９Ｃは、フローセル９３０のホルダへの取付けを示し、図９Ｄは、クランプおよびフローセルを固定するように低くされたハンドル／クランプ９４０とともに、フローセルホルダにクランプ留めされたフローセルを示す。
【００６３】
フローセルおよびフローセルホルダは、可動ステージないし可動プラットホーム上に位置づけることができる。このようなステージは、Ｘ軸、Ｙ軸およびＺ軸方向に選択的に調節可能である。このことは、レーザ、カメラ、光学レンズなどに対してフローセルの高さや位置の微調整を可能にし、フローセルの表面を撮像装置の焦点に保つことを可能にする。さらに、可動ステージは、加熱／冷却部品と光学／レーザ部品との間でフローセルを前後に動かすことを選択的に可能にする（すなわち、加熱したときの酵素反応を可能にし、カメラ／レーザ部品でこのような反応の結果を定量化できるようにする）。図１０は、加熱／冷却要素（左の絵）とカメラ／レーザ要素（右の絵）との間におけるフローセル１０２０およびフローセルホルダ１０１０の動きを示す。よって、ｘ成分およびｙ成分は、フローセルの（例えば、数１０センチメートルだけ）横方向への動きを可能にする一方で、垂直方向に高さを（例えば、数１０ナノメートルだけ）調節することによって画像の焦点合わせを可能にする。代替的に、ステージは、垂直方向設定のない単純なＸＹステージとし、焦点が維持されるように、対物レンズをＺ平面について調節できるようにしてもよい。加熱／冷却要素は、例えば、フローセルなどに近づけるように選択的に可動にできることを理解されたい。図１０Ａの左側の絵（加熱／冷却装置が上げられた）と図１０Ａの右側の絵（加熱／冷却装置が下げられた）とを比較されたい。
【００６４】
図１０Ａは、加熱ステップの前および加熱ステップ中であることを示す。（ファン１００１、ヒートシンク１００２およびヒータユニット１００３を備える）ペルティエ装置１０００は、ＸＹステージ１０５０上に設置されたフローセル１０２０およびフローセルホルダ１０１０と接触するように垂直方向に動く。チューブ１０４０を介してフローセル内に試薬が導入される。フローセルは、撮像のためにカメラ１０３０の下の位置に移動させることができる。図１０Ｂは、撮像位置にある装置を概略的に示し、ペルティエ装置１０７０（ファン１０７１、ヒートシンク１０７２およびヒータ１０７３を有する）は、高い位置にあり、フローセル１０８５およびステージ１０８６は、光ファイバマウント１０９０の隣かつ対物レンズ１０８０の下に位置づけられている。この光ファイバマウントは、Ｚステージ１０７５に接続され、対物レンズ１０８０の高さを制御する。フローセルは、マニホールドレバー／ハンドル１０９５によって、フローセルホルダ上の所定の位置にクランプ留めされる。
【００６５】
追加的に、ここでの様々な構成要素（例えば、レーザ部品、加熱／冷却部品など）が、足場材、シャーシないしフレームワークに典型的に配置され、機器を全体的または部分的に閉じ込めるように、ハウジング内に選択的に閉じ込められている。このようなフレームワークおよび／またはハウジングの特定の構成は、様々な実施例において、例えば、特定の部品やその寸法などに基づいて選択的に異なる。しかし、典型的な実施例においては、フレームワークは、様々な部品を固定して特定の位置および方向に保持するとともに、必要な部品の動きを選択的に支援することができる。フレームワークは、機器および様々な部品の内部振動を防ぐように十分に強固にするべきである。例えば、モードスクランブラは、撮像中のフローセルの振盪を防ぐように、動きが制振されるとともにステージから振動的に隔離され得る。図１１Ａは、カメラ（１１００）、加熱／冷却部品１１１０、フローセルおよびフローセルホルダ（図８と比較）、および可動ステージ１１２０を保持するフレームワークの一例を概略的に示す。様々な部品を一体に結びつけることを助けるフレームワークや据付けの追加的な態様と、様々な整列および据付けピン／位置を含む装置／システムの態様とは、レーザ部鉛直調節部品１１６５およびフローセル水平調節部品１１７５に用いる軸受の摺動を示す図１１Ｂに見ることができる。図１２に、ハウジング用の外部カバー（スキン）を含む他のフレームワークやハウジングを、コンピュータモニタ１２０１とともに示す。
【００６６】
[励起および観測]
ここでのいくつかの実施例においては、固有の蛍光体を有する固有の核酸塩基の取り込みは、レーザ励起およびカメラ観測によって追跡される。様々な実施例において、レーザ部品における内部全反射（ＴＩＲ）を用いて照射が行われる。ここでの「ＴＩＲＦレーザ」、「ＴＩＲＦレーザシステム」、「ＴＩＲレーザ」および他の類似の用語は、例えば、ＬＥＤ、ハロゲンおよびキセノンアークランプのような光源（これらのすべては、ここにおけるＴＩＲＦ、ＴＩＲＦレーザおよびＴＩＲＦレーザシステムなどの本記述にも含まれる）からのレーザ励起または他の種類の非レーザ励起を使用する検出機器／システムに基づくＴＩＲＦ（内部全反射蛍光体）にも言及している。従って、例えば、「ＴＩＲＦレーザ」は、ＴＩＲＦシステムで使用されるレーザであり、「ＴＩＲＦレーザシステム」は、レーザを使用するＴＩＲＦシステムである。しかし、ここでのＴＩＲＦシステムは（レーザの使用を含むことに関して記述される場合などにおいても）、励起源に基づく非レーザを備えるＴＩＲＦシステム／機器を含むことをさらに理解されたい。当業者であれば、ＴＩＲＦシステムの異なる態様や一般の使用について十分に認識されるであろう。様々な実施例において、カメラ部品は、ＣＣＤカメラからなる。いくつかの実施例において、レーザは、個別に５０ｍＷから５００ｍＷに変調された二元の固体レーザおよび／または半導体レーザからなり、これらのレーザは、ＴＩＲＦプリズムに結合され、選択的に５３２ｎｍおよび６６０ｎｍの励起波長を有する。２つのレーザのフットプリントが基質の同じ領域に焦点合わせされること（すなわちオーバーラップ）を保証するように、光ファイバを介して機器内にレーザを結合させることができる。
【００６７】
[モードスクランブル]
ここでの様々な実施例においては、（１つまたは複数の）レーザないし他の（１つまたは複数の）励起源がサンプルを照射する領域（この照射領域は、「フットプリント」と呼ばれる）は、一般に、平面かつ一様であることが望ましい。ここでの装置／システムは、多くの実施例において、照射される基材表面（例えば、フローセルの表面）などにレーザから平坦プロファイルつまり平頂プロファイルの照射フットプリントを生み出すように、マルチモードファイバの特質を利用して、すべての光モードがほぼ等しい振幅でコア内を伝播されるようにする。しかし、このようなファイバ内に存在する有限数のモードは、互いに強め合ったり弱め合うように干渉することがあり、レーザ（または他の光線）の強度プロファイルに極小値および極大値をつくり出す。例えば、図３３Ａおよび図３４Ａを参照されたい。これらの図は、マルチモードファイバからの不正確な出力から生じる極小値／極大値を示す。この問題を改善するために、ここでのいくつかの実施例では、例えば、波長板を使ってのビーム変調によって、あるいは、照射ビームを運ぶファイバの１つまたは複数の領域を振盪する、絞る、または圧縮することによる動的モードスクランブルを使用することによって、照射ビーム内の反射率を一定の割合で変化させ、ほぼ一様なフットプリントをつくり出す。こうして、本発明のいくつかの実施例においては、１つまたは複数の領域で照射ビームのモードを動的にスクランブルすることによって、例えば、ビームを運ぶファイバをその長さに沿った１つまたは複数の領域で、絞る／圧縮することによって、ほぼ一様な平頂出力（すなわち、レーザまたは光源からのほぼ一様な照射／励起フットプリント）をつくり出す。図３３および図３４は、ここで説明するモードスクランブルの様々な実施例を集約する。以下を参照されたい。
【００６８】
[動的モードスクランブルおよび低損失ビームの成形]
ここでの装置は、いくつかの実施例においては、「平頂」照射（例えば、図３５に示す特定の照射フットプリント全体に亘る一様な照射又はほぼ一様な照射）を生成する（１つまたは複数の）部品を備える。これらの実施例は、１つまたは複数のモードの照射を伝達する媒体（例えば、ファイバ）内で反射率を動的に変化させる１つまたは複数の態様を含む。例えば、反射率の連続的な変化を引き出すように、その長さに沿って様々な位置でファイバを絞ることができる。Ｓｔｅｐ  Ｉｎｄｅｘ  Ｆｉｂｅｒなどのファイバをそのように絞ることによって、ファイバ内のモードを空間的／一時的にスクランブルさせ、その結果、出力照射の所望の積分時間に亘って十分なオーバーラップを生じさせることができる。ここでも説明するように（以下を参照）、ファイバを振盪させる、回転させる、または他の方法で物理的に変形させることによって、ファイバを通過する光学経路を変えることができる。
【００６９】
概して、ファイバ内のモードの動的スクランブルにより、ユーザが確定した最小の積分時間に亘って空間的に一様な照射が行われることを可能にする。そして、この一様な照射は、生じるビーム中に明暗のパターンを生み出してしまう単色光伝播モードの干渉がマルチモードファイバ内で発生しないようにする。そのようなモードを上記最小の積分時間に亘って消失させることで選択的に十分となる。従って、いくつかの実施例においては、例えば機械的手段で、時間変化する曲率および屈折率をファイバに導入することによって、照射ビーム内のこれらのモードの相対経路長は、急速に変化する。動的モードスクランブルのいくつかのパラメータは、選択的に変えることができ、または異なる構成の範囲を含むことができる。いずれにせよ、一般に、動的モードスクランブルは、最終的な照射フットプリントを平均化する１つまたは複数の態様／部品を使用して、照射ビームの反射率を動的に変えることができる。現在の屈折光学素子の多くは、入力ガウスビームを要求し、現在の回折光学素子の多くは、波長に依存するが、提示する実施例においては、ガウスビーム入力を要求することなく、しかも波長に依存しない。
【００７０】
様々な実施例において、ここでの装置／システムは、シーケンシング反応などの励起／測定のために一様な照射フィールドを要求する。従って、マルチモードファイバ内の単色光伝播モードの干渉から生じる不均等な明／暗パターンは、一般には、望ましくない。（撮像中のカメラによる捕捉時間のような観測期間に亘って）光の統合を可能にするように、照射フットプリントの全体に亘って光出力を平均化することは、明／暗パターンが「消失する」つまり平均化されることを意味し、これによって、基材上の各々の蛍光体で見られる励起強度が一様になる。
【００７１】
基調をなす動的モードスクランブルは、ある時間に亘って（例えば、ある時間に亘ってファイバを物理的に絞ることによって）光ビームの点つまり節点における屈折率を一定の割合で変化させることであり、これによって光がスクランブルされて異なる経路を通り、照射フットプリントにおける光出力が平均化される。従って、入力ビームの屈折率の変化に伴って、干渉が極小となる位置および極大となる位置が変化する。画像捕捉時間よりも速い周波数で屈折率が変化する場合、観測の時間スケール内に空間的に一様な像をつくり出すことができる。
【００７２】
本実施例は、入力モードすなわち出力に対するモードのランダム化と言われることが多い「モードスクランブル」の一般的な利用と混乱されるべきではないことを理解されたい。
【００７３】
本実施例の動的モードスクランブルは、特定の形状のコアを含むファイバと共に使用することにより、ビーム成形をして一様に照射することができる。例えば、四角いコアを使ってファイバを絞ることにより、四角いビームが一様に照射される。このビームは、特定の軸に沿って成形することにより長方形や楕円形の形状にすることができ、ビームは、結像面に当たるときに正方形や円の形状で撮像される。図１７〜図１８を参照されたい。例えば、図３４に示すように、光ファイバから長方形ビームを発生させることができる。
【００７４】
図３５は、様々なレーザ、ファイバおよびモードスクランブルの態様などからの光出力を示す。装置の作動中に、ファイバの端部は、ビームプロファイラ上に再結像された。図３５は、例えば、圧電アクチュエータを使って、１つまたは複数の節点でファイバを操ることによる動的モードスクランブルの効果を示す。この図は、各レーザの形式などについて、モードスクランブルが「オフ」であるときの光出力に対して動的モードスクランブルが「オン」であるときの光出力を示すことによって、様々なビーム成形器（長方形および円形の２つのバージョン）との関連で異なる波長のレーザ（例えば、５３２ｎｍや５５０ｎｍ）や異なるレーザ時間（固体およびダイオード）からの画像を比較し、これによって、例えば、圧電アクチュエータを使って、１つまたは複数の節点でファイバを操ることによる動的モードスクランブルの効果を示す。
【００７５】
従って、装置の一実施例においては、静的モードスクランブラの反対のものとして動的モードスクランブラを備え得ることを理解されるであろう。動的モードスクランブルは、所望の積分時間に亘ってモードをオーバーラップさせるような屈折率の動的変化である。屈折率は、１つまたは複数の位置（節点）において一定の割合で変化する。例えば、照射を伝達するファイバは、ある点において一定の割合で絞られるとともに、強度が変化する（例えば、零の絞りから最大の絞りまで、そしてその逆もある）。ファイバは、このような絞りによって一時的に変形させることができ、ファイバの形状は、円から楕円そしてまた円などと変化し、これが、屈折率を変化させ続ける。絞りを止めると直ぐにモードスクランブルが停止する。
【００７６】
フットプリントの照射出力を平均化する効率は、画像を捕捉する距離、屈折率の変化の程度、光源の種類／強度などに依存する。従って、これは、ユーザ制御可能な変数であり、必ずしも制限的なものではない。ユーザは、スクランブルの程度を選択的に制御し、フットプリントにおける光出力の平均化を微調整することができる。
【００７７】
従って、光出力の平均化に要する時間は変数として測定され、この時間は、例えば、光出力によって照射される領域（例えば、ここでのいくつかのシーケンシングの実施例におけるフローセル上のタイル（特有の画像捕捉領域））に画像が捕捉される時間とすることができる。いくつかの実施例においては、スクランブル効率についての時間は、カメラ（例えば、ここでの特定のシーケンシングにおけるＣＣＤカメラ）によって捕捉される各画像の露光時間に等しいか或いはほぼ等しい。このような露光時間は実施例ごとに異なり、実施例の特定の要求に依存して、例えば、１ミリ秒未満〜１時間以上となり得ることを理解されたい（例えば、少なくとも１，５，１０，２５，５０，１００，２５０，５００マイクロ秒またはそれ以上、少なくとも１，５，１０，２５，５０，１００，２５０，５００ミリ秒またはそれ以上、少なくとも１，５，１０，２５，５０，１００，２５０，５００秒またはそれ以上など）。ここで説明したシーケンシング反応については、撮像時間は、１回の露光当たり５０〜５００ミリ秒のオーダとすることができる。
【００７８】
様々な実施例において、本発明の動的モードスクランブラは、これが使用される全体的なシステムに拘わらず、様々な光源／光の種類、様々なビーム媒体、屈折率を変化させる様々な方法を用い、屈折率を変化させる節点を様々な数として使用することができる。
【００７９】
動的モードスクランブルは、使用される特定の光／照射によって制限されない。従って、例えば、ここでの多くの実施例においては、特定の波長（例えば、５３２ｎｍおよび／または６６０ｎｍ）のレーザを選択的に使用することができ、他の実施例においては、全体的に異なる波長の照射を使用することができる。動的モードスクランブルと共に使用するレーザは、例えば、可視光レーザ、赤外線レーザ、狭帯域化レーザ、広域線幅レーザなどとすることができる。ここでも特定のレーザの波長が述べられているが、これらの列挙は、必ずしも限定的なものではない。使用される様々なレーザの型式／強度の各々に応じて他のパラメータを選択的に調節することにより、ほぼ一様な照射が実現されることが理解されよう。例えば、屈折率が変化する節点の数、および／またはこれらの節点における屈折率の変化は、異なる光源についてフットプリントに同程度の一様性を実現するために選択的に異なる。
【００８０】
さらに、ここでの例は、概して、光ファイバライン内のモードスクランブルに対処しているが、ガラス、プラスチック、光ファイバ以外のライン、空気、真空などを通過して伝達される光に対して動的モードスクランブルを選択的に使用してもよい。従って、動的モードスクランブルは、光を伝達する媒体によって限定されない。ここでも、伝達媒体の違いは、ほぼ一様な出力を実現するのに必要とされるモードスクランブラの他の態様における違いと選択的に一致し得る。例えば、空気／真空（すなわち、ファイバなどの内部に含まれるものがない）を介して伝達される光については、屈折率は、輸送媒体中の種々の力学的変化よりも温度変化によって選択的に変化する／異なる率となる。
【００８１】
屈折率は、いくつかの手段を介して選択的に変化し得る。例えば、上記のように、ケーブル／ファイバを介さずに空気／真空中を横切るように光が伝達されるとき、光ビームの屈折率は、温度変化によって変わり得る。従って、１つまたは複数の加熱器／冷却器を使用して、光ビームの１つまたは複数の節点の温度を変えて屈折率を変化させることができる。ファイバ／ケーブル内を進行するビームについては、屈折率を異なる率にするためにファイバの物理特性を変化させることができる。例えば、それらの点における屈折率を異なる率にするように、１つまたは複数の節点において、ファイバが物理的に曲げられ、振盪され、捻られ、絞られ、圧縮され、引っ張られ、または加熱／冷却される。ファイバとの物理的相互作用は、（例えば、ローラ、ピンチャなどを介して、および／または（例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社（カルフォルニア州チノー所在）から調達可能なファイバと同様な）ファイバを絞る圧電アクチュエータを介して）実際の機械的操作によって行うことができる。一般に、屈折率を変化させるために種々の方法が使用される。
【００８２】
屈折率を変化させる様々な方法に加え、屈折率の変化の割合や節点の数なども、選択的に異なる。こうして、いくつかの実施例において、動的モードスクランブルは、照射ビーム上に１つまたは複数の節点（すなわち、屈折率が変化する領域）を含むことができ、この節点は、光ビームに沿って、固定／静止させることができ、或いは動かすことができる。一般に、節点の数が増えるほど、数多くのスクランブルが発生するが、これに制限されない。同様に、複数の節点について、屈折率の変化は、互いに同期していないことが望ましい（すなわち、屈折率の変化は、ランダムであることが望ましい）。
【００８３】
図３３〜図３５は、様々なファイバの形状と様々な光源を使ってモードスクランブルさせる例を示す。画像に見られるように、振動ファイバまたは絞りファイバを使って動的モードスクランブルが実行されるとき、ほぼ一様な「平頂」照射が実現される。これらの図は、コアが成形されたファイバを使用することにより像を成形できることをさらに示す。図３３は、スクランブルのなかったビーム出力（Ａ）を、ビーム出力との比較で示し、このファイバは、例えば、Ｐｏｉｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ社（英国ハンブル所在）からのＭＫＩＩＩ  ＭＳを使用して振盪されたもの（Ｂ）、例えば、Ｐｏｉｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ社のＭＫＩＶ  ＭＳを使って振動されたもの（Ｃ）、例えば、１つまたは複数の圧電スクイーザ／コンプレッサを使用して絞られたもの（例えば、１つの節点当たり約５００〜６００Ｈｔｚで６回に亘って絞られたもの）（Ｄ）を示す。図３３に示す結果は、すべて同じファイバおよびレーザの型式（例えば、１５ミクロンのステップ率のファイバおよび５３２ｎｍの固体レーザ）を使って実行されたものである。長方形コアのファイバについて、同様の結果を図３４Ａ〜図３４Ｄに示す（スクランブルされなかったもの（Ａ）、振盪されたもの（Ｂ）、振動されたもの（Ｃ）または絞られたもの（Ｄ））。図３４における例は、すべて同じファイバ／レーザの型式を使って行われたものである。図３５は、様々なレーザ源およびスクランブル手順についての類似した結果を示す。よって、図３５において、それぞれのパネルは、長方形のコアファイバ内の６６０μｍの波長のダイオードレーザを使ってモードスクランブルのない場合（Ａ）、同じファイバを使って動的モードスクランブルがある場合（Ｂ）、５３２μｍの波長の固体レーザを使ってモードスクランブルがない場合（Ｃ）、同じファイバを使って動的モードスクランブルがある場合（Ｄ）、６６０μｍの波長のダイオードレーザ（第２の長方形）を使ってモードスクランブルがない場合（Ｅ）および同じファイバを使って動的モードスクランブルがある場合（Ｆ）、５３２μｍの固体の第２の長方形ファイバを使ってスクランブルがない場合（Ｇ）および動的モードスクランブルがある場合（Ｈ）、６６０μｍのダイオードレーザ（円形）を使ってモードスクランブルがない場合（Ｉ）と動的モードスクランブルがある場合（Ｊ）、５３２μｍの固体レーザを使ってモードスクランブルがない場合（Ｋ）と動的モードスクランブルがある場合（Ｌ）、にそれぞれ対応する。
【００８４】
[低損失のビーム成形器]
ここでのいくつかの実施例において、正方形レーザビームまたは長方形レーザビームなどの特定のビーム形状が選択的に使用される。このように成形された照射によって、効率的な露光および（核酸のサンプルなどを含む）表面を覆うタイリングを行うことができ、これによって、ここでの様々な装置における配列決定能力をさらに向上させることができる。このことは、正方形ピクセルでＣＣＤデバイスを使って撮像する場合に有利となり得る。その理由は、画像捕捉領域の外側の領域への照射を避けるとともに、光脱色を避けるように、照射フットプリントないし結像領域をタイリングすることができるからである。
【００８５】
ここでのいくつかの実施例においては、ビームを成形するマスクを使用する代わりに、サンプル表面にマスクを再結像させ（これは、マスクの外側のエネルギを選択的に浪費させることができる）、正方形または長方形（または他の形状の）コアファイバ内にレーザが結合されるようにする。従って、すべての利用可能なレーザ出力が、効率よく照射に使用される。このように成形されたファイバの十分な長さを進行する伝播は、効率よくコアを満たして、所望のように照射を成形する。そして、このファイバの末端は、サンプル（例えば、フローセル基材）上に再結像させることができる。特定の実施例においては、ファイバからの照射のこのような再結像は、一般に、スクランブルおよび／またはビーム成形から実現される平頂プロファイルおよび／またはビーム成形を実質的に阻害しないことが望ましい（ビームが成形されていない場合やスクランブルされていない場合にもビームを歪ませてしまうことがある）。従って、再結像の態様（例えば、（１つまたは複数の）レンズなど）は、実現されたプロファイルを歪ませないように、さらにフローセルへの光出力を正確に拡大することなどを選択的に行うように、適切に選択される。特定の実施例においては、再結像は、非染色性を選択することもできる（すなわち、どの波長の光を使っても機能する）。いくつかの実施例においては、再結像部品は、フローセルの特定の領域に照射ランドを正しく有するように、該再結像部品をわずかに動かすことによって「ピストン運動される」ようにすることができる。
【００８６】
このような実施例における照射の一様性は、成形されたファイバ内に発射され、ファイバの長さに沿って結合されたビームの条件によって選択的に制御することができる。照射の一様性は、成形されたファイバ内のモードを動的にスクランブルすることによって、選択的に向上させることができる。例えば、成形されたコアファイバを様々な位置で連続的に絞る装置を使用する（上記を参照）。サンプル表面に送られるビームの範囲は、結像レンズによって選択的に操作することができる。
【００８７】
図３４および図３５は、長方形コア光ファイバを使用したときの結果を示す。このファイバの末端はビームプロファイラ上に再結像された。ビームプロファイルからの画像は、鉛直方向および水平方向に一様に照射される所望の長方形ビームを示す。
【００８８】
動的モードスクランブルおよび／またはビーム成形システムは、ＳＢＳ読み取り装置内のフローセルチャネル（または他の基材）の低位置の表面に向けて、ほぼ一様な、波長切換え可能なエバネセントビームを発生させて送る部品を備える。これらの部品は、ＳＢＳシステム（例えば、上記に示した様々な光学部品など）全体における様々な他のモジュール／部品と相互作用し、１つまたは複数のコンピュータ部品を介して制御／指向され得る。
【００８９】
本発明の動的モードスクランブルおよびビーム成形の実施例が、核酸シーケンシングシステム（例えば、ここで説明した合成装置による様々なシーケンシング）を含み、これらのシステムとの相互作用に関して全体的に記述されている場合にも、当業者であれば、そのような実施例が他の使用／システムに広範囲に適用できることを理解されるであろう。従って、動的モードスクランブルは、マルチモード光ファイバの光モードを混合するように照射ビームの屈折率を動的に変える１つまたは複数の態様を含む多様なシステムに含まれて、（例えば、カメラの画像捕捉時間などの）所望の時間フレーム内にほぼ一様な画像または出力を生成することができる。
【００９０】
動的モードスクランブルは、プレートまたはマイクロアレイまたはこれの類似物上の蛍光を追跡するようなシステムと共に選択的に利用することができる（すなわち、シーケンシング反応の追跡を含まない使用）。
【００９１】
[波長板を使用するモードスクランブル]
ここでのいくつかの態様においては、本発明は、波長板を使用することによってマルチモード光ファイバ内の光モードを混合するシステムを備える。このようなシステムは、光源（例えば、レーザ）を備え、この光源から送り出された光が、マルチモード光ファイバ内を通過し、さらに選択的に少なくとも１つの波長板を通過し、さらに選択的に（１つまたは複数の）再結像レンズおよびプリズムを通過して、基材（フローセル）に到達する。このようなシステムの波長板は、「回転している」波長板とすることができる。いくつかの実施例においては、波長板が実際に様々な回転速度で物理的に回転するが、液晶の波長板などを使用する他の実施例においては、プレートが「回転し」、液晶にかかる電圧を変えることによってプレートを通過する光を偏光させる。いくつかの実施例においては、波長板は、異なる方向に偏光を回転させるように指向されたリターダ区間を２つ以上含む。典型的な実施例においては、ファイバからの光出力は、所定の時間に亘って、表面上にほぼ一様な光出力を備える。ここでの様々な実施例において、表面への光出力は、１つまたは複数の回転波長板を備えていないマルチモード光ファイバからの出力と比較して、極小強度および極大強度がともに小さい。
【００９２】
他の態様においては、本発明は、マルチモード光ファイバを介しておよび１つまたは複数の回転波長板を介して光源（例えば、レーザ）から光を送ることによって、所定の時間内に、マルチモード光ファイバからの光出力を均等化して表面全体に照射する方法を含む。いくつかの実施例においては、表面への出力は、１つまたは複数の回転波長板を備えていないマルチモード光ファイバからの出力と比較して、極小強度および極大強度がともに小さい。いくつかの実施例においては、波長板は、実際に様々な回転速度で物理的に回転するが、液晶の波長板を使うような他の実施例においては、プレートが「回転し」、液晶にかかる電圧を変えることによってプレートを通過する光の偏光を変化させる。いくつかの実施例においては、波長板は、様々な方向に偏光を回転させるように指向されたリターダを２セクション以上含む。
【００９３】
ここでのいくつかの実施例に使用される「波長板」（つまり遅延板ないし位相差板またはこれらの類似物）は、光が通過するときの光線の速度を変化させる光学デバイスを指す。波長板は、典型的には、複屈折性結晶からなる。いくつかの実施例においては、液晶の波長板とすることができる。
【００９４】
上記に示したように、特定の実施例においては、レーザまたは他の励起源を含み、サンプルの照射（このときの照射領域は、「フットプリント」と呼ばれる）は、空間的に平坦で一様である。ここでの光学機器は、マルチモードファイバの特性を引き出し、フットプリントに平坦プロファイルつまり平頂プロファイルをつくるほぼ等しい振幅で、すべての光モードがファイバのコア内を伝播できるようにする。このようなファイバ内に存在する有限数のモードは、互いに強め合ったり弱め合うように干渉することがあるので、レーザ（または他の光）の強度プロファイルに極小値および極大値をつくり出す。いくつかの実施例においては、一様なフットプリントをつくり出すために、カメラが画像を捕捉するときの露光時間よりも短い時間スケールでファイバを物理的に振盪させる（この振盪が、極大強度および極小強度を平均化して一様な平頂フットプリントをつくり出す）。この振盪は、ファイバを回転および振盪させるためにオフバランス直流モータを必要とすることがあり、その場合に、望ましくない騒音および振動を発生させてしまうことがある（その場合に、撮像の問題が生じないように制振する必要がある）。オフバランス直流モータは、バランスモータと比べて、失敗間の平均時間が短いので、ここでの振盪は、信頼性を低下させる恐れがあり、さらには、ファイバに物理的な磨耗を増やしてしまう恐れがある。これらの要因から、機械的振動を使わず（パーツを動かさない場合を含む）に波長板を使うことによるマルチモード光ファイバ内におけるモード混合の方が有利となる場合がある。
【００９５】
本発明の一実施例においては、回転しているλ／２波長板（遅延板）を使ってマルチモード光ファイバのモードを混合することによってほぼ一様な平頂ビーム（すなわち、フットプリントの照射／励起領域）を生み出す。空間的なモードの実態は、入力光の偏光の状態に依存する。偏光が変化するにつれて、空間的な実態も変化する。従って、入力ビームの偏光が変化するにつれて、干渉が極大となる位置および極小となる位置が変化する。画像捕捉時間よりも速い角周波数で波長板が回転する場合、観測の時間スケール内に、空間的に一様な画像をつくり出すことができる。こうして、特定の実施例において、特定の時間をかけて、波長板は１つまたは複数の回転を完成する。この時間は、例えば、光出力によって照射される領域（例えば、ここでのシーケンシングのいくつかの実施例においては、フローセルの基材の領域）の画像が捕捉される時間に等しい。従って、いくつかの実施例においては、この時間は、カメラ（例えば、ここでの特定の実施例におけるＣＣＤカメラ）で各画像を捕捉するときの露光時間に等しいか又はほぼ等しい。このような露光時間は、実施例ごとに、例えば、１ミリ秒未満〜１時間以上（例えば、少なくとも１，５，１０，２５，５０，１００，２５０，５００またはこれより長いμ秒数、少なくとも１，５，１０，２５，５０，１００，２５０，５００またはこれより長い秒数など）に、実施例の特定の要求に応じて変えることができる。ここで使用されるカメラについては、露光時間を５０〜５００ミリ秒とすることができる。いくつかの実施例においては、波長板は、上記の全回転の所要時間よりも短時間または長時間の所要時間で回転させることができ、その場合に、いくつかの実施例においては、エイリアシングが発生する恐れがある。
【００９６】
多くの方法で偏光を回転させることができるが、典型的な実施例においては、波長板を回転させる。ここでの特定の実施例においては、適当なハウジング内のλ／２波長板（図３８の波長板３８００を参照）が、適当な直流モータなどによって回転され、適当な画像捕捉時間に空間的にほぼ一様な画像をつくり出せるほど速い速度で動作する。他の実施例においては、指向された波長板のいくつかの扇部ないし小さなピースからなる（１つまたは複数の）修正された波長板を備え、これらの速軸は様々な指向されている（図３９の波長板３９００を参照）。これらの扇部が様々な様式／量で偏光を回転させるので、さらに急速なモードの混合が発生することがあり、直流モータは、選択的に、いくつかの扇部を有する実施例ほど速くは回転しない。しかし他の実施例においては、液晶などの他のデバイス（コロラド州フレデリック所在のＭｅａｄｏｗｌａｒｋ  Ｏｐｔｉｃｓ社製のデバイスなどがあるが、これに限定しない）を使用して、レーザの偏光を回転させることができる。このような液晶を使用してデバイスにかかる電圧を変化させることによって、偏光を回転させることができる。
【００９７】
図４０は、本発明の装置の一実施例を概略的に示す。図４０においては、ダイオード圧送の固体レーザ（４２００）から線形に偏光された光４１００（２００ｍＷ，５３２ｎｍ）は、いくつかの光学（ＯＤ）フィルタを使って減衰される。ビームの強度は、λ／２波長板４９００（例えば、Ｃａｓｉｘ、Ｆｕｚｈｏｕ、Ｆｕｊｉａｎ、中国）および偏光ビームスプリッタキューブ４３００（例えば、ニュージャージー州ニュートン所在のＴｈｏｒｌａｂｓ社製）によってさらに制御される。様々な実施例において、全体的なレーザ強度は必要ではなく、従って、説明した例においては、わずか約０．１μＷだけが使用される。波長板４９００の回転によって、偏光を一定に保ちつつ、入力レーザのエネルギを精密に制御することができる。このビームは、次に第２のλ／２遅延波長板４４００を通過し、２つの鏡４５００，４６００によって案内されて、顕微鏡の対物レンズ４７００（例えばニコン、２０倍レンズ  開口数０．３）内に侵入する。この顕微鏡の対物レンズは、マルチモード光ファイバ４８００、２００μｍコア、０．２２ＮＡ（例えば、カナダ国オタワ所在のＯＺ  ｏｐｔｉｃｓ社）によって許容される要求寸法にビームを低減する。示した実施例におけるファイバの端部出力は、ＣＣＤカメラ４９０５（例えば、アリゾナ州トゥーソン所在のＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ社製Ｃａｓｃａｄｅ５１２）のチップ上に直接的に結像される。示した実施例においては、カメラはフレーム転送モードで作動され、ここで説明したようなビームプロファイルを捕捉するためには１００ミリ秒の露光が適当であった。
【００９８】
様々な実施例において、本発明は、使用される全体のシステムに依らず、様々な波長板（例えば、種類、配置、構成、構造などに関して異なる）、様々なミラーおよび様々なビームスプリッタ（例えば、種類、位置、角度などに関して異なる）を備え得る。このように、様々な実施例において、例えば、λ／２波長板、λ／４波長板（例えば、入力偏光が円形のとき）、および他の特定のλ／ｎ遅延波長板などを備えることができ、さらに様々な構成において、少なくとも１つの波長板、少なくとも２つの波長板、少なくとも３つの波長板、または少なくとも５つまたはそれ以上の波長板を備えることができる。本発明の波長板は、その構造が必ずしも限定されない。従って、ここでは、固体結晶（例えば、結晶石英または種々の他の適当な基材）および液晶の波長板を含む。
【００９９】
本実施例は、核酸シーケンシングシステム（例えば、ここに記述したような合成装置による様々なシーケンシング）を含み、このシステムに関わる相互作用について一通り説明しているが、当業者であれば、本発明は広範囲に亘る他の使用／システムにも適用可能であることを理解されるであろう。ゆえに、この実施例は、所望の時間フレーム（例えば、カメラなどによる画像捕捉時間）内に、空間的にほぼ一様な画像つまり出力をつくり出すようにマルチモード光ファイバの光モードを混合する１つまたは複数の波長板（典型的には、回転している）を備えるシステムを含み得る。本発明の波長板の態様は、プレートまたはマイクロアレイなどの上で蛍光を追跡する（これは、シーケンシング反応ではない）ようなシステムにも選択的に使用される。使用されるシステムに応じて、波長板の態様は、ファイバの光モードを１つまたは複数の（典型的に回転している、さらには画像捕捉時間または所望の時間フレームよりも速い速度で典型的に回転している）波長板に通過させることによって、所望の時間フレーム内にマルチモード光ファイバからほぼ一様な画像つまり出力を生み出す方法をさらに含み得る。
【０１００】
このような実施例におけるカメラの露光から得られた様々な画像を図４１に示す。図４１Ａは、一回の露光後に明暗のピクセルが明確な領域を示す。マルチモード光ファイバ内に存在する様々なモードの強め合いや弱め合いの干渉から、明／暗の画像が生じる。波長板を回転することによって、図４１Ｂの一連の画像に示すような明暗領域の空間的再配分が生じる。これらの図において、各々の画像は、互いに異なる波長板の設定で撮られたものである。上述したように、画像捕捉時間よりも波長板が速く回転する場合、空間的プロファイルが平均化され、画像が一様に補整される。そのような一様な補整は、多くの画像を撮ってそれらの画像を平均化したものと比較することができる。図４１Ｃおよび図４１Ｄは、それぞれ、単一の画像をスペクトラム線輪郭で示し（４１Ｃ）、５４枚の画像の平均に関連するスペクトラム線輪郭で示す（４１Ｄ）。図４２は、（１つまたは複数の）波長板を使用することによってつくり出されたほぼ一様なフットプリントを示す。
【０１０１】
撮像フットプリント上で光ビームが一様であることを保証する他の方法としては、ソレノイドを使用すること、ファラデーセルまたはポッケルスセルを使用して電界中ないし磁界中で光ビームを回転させること、ディフューザを通過した後の光を再結像させること、などがある。ディフューザは、ホログラフィックディフューザとすることができ、このホログラフィディフューザは、光波を重ねて所望のビーム形状を生み出すように、ファイバの端部で（ファイバが接続されている場合）、あるいはレーザの位置で（ファイバがない場合）、発生する光波を重ね合わせる。一例としては、ガウスビームを平頂ビームに変換するｓｉｎｃ（ｘ）＾２（ｓｉｎｃは、ｓｉｎ（ｘ）／ｘ）の強度プロファイルを有するディフューザがある。
【０１０２】
ここでの様々なモードスクランブルの態様は、１つまたは複数のコンピュータを介して選択的に制御／操作することができ、典型的には、（さらに典型的には、ここでのコンピュータの態様によって）光照射部品および光検出部品と協調／同期化される。
【０１０３】
[蛍光を検出する装置]
蛍光を検出するためのデバイスは多くあり、例としては、フォトダイオードおよびカメラなどがあり、これらは、本発明の（１つまたは複数の）検出部／検出部品となり得る。ここでのいくつかの実施例においては、検出部品は、８μｍピクセル１０２４×１０２４後方間引きＣＣＤカメラのような１メガピクセルＣＣＤに基づいた光学撮像系とすることができ、この光学撮像系は、０．５ｍｍ×０．５ｍｍのレーザスポットサイズ（例えば、正方形スポットまたは直径０．５ｍｍの円スポットまたは楕円スポットなど）を使用して、０．３３ｍｍ×０．３３ｍｍ／１タイルの領域を４０倍の拡大率で選択的に撮像することができる。このカメラは、選択的に１００万ピクセル以上または以下のピクセル数のカメラとすることができ、例えば、４メガピクセルのカメラを使用することができる。多くの実施例において、カメラの読み出し速度をできるだけ速くすることが望ましく、例えば、転送速度を１０ＭＨｚまたはこれよりも速くし、さらには２０ＭＨｚまたは３０ＭＨｚとすることができる。ピクセル数を大きくすることは、一般に、撮像面の領域が大きくなることを意味し、これによって、一回の露光で同時に、さらに多くのシーケンス反応を撮像できることを意味する。また、ステージの移動およびフィルタホイールの要求変化が小さくなるという利点があり、撮像速度を速めることに寄与する。特定の実施例においては、ここでのＣＣＤカメラ／ＴＩＲＦレーザは、１６００タイル／１サイクルを識別するために、約６４００枚の画像を集めることができる（所定の位置に選択的に異なるフィルタを使って、４色の異なる色で選択的に撮像されるので）。１メガピクセルＣＣＤについては、いくつかの画像が、約５，０００〜５０，０００のランダムに配置された独特の核酸クラスタを選択的に含み得る（すなわち、フローセル表面上の画像）。図２９に示すように、単位領域（または１画像）当たりの解像可能なクラスタの理論密度はクラスタの寸法に依存し、図２９は、１メガピクセルの画像において、全クラスタ数および最小クラスタ領域の関数として検出されるクラスタの数を示す。４色について１タイル当たり２秒間の撮像速度で、２５，０００クラスタ／１タイルの密度である場合に、ここでのシステムは、１時間当たり約４，５００万の特徴部を選択的に定量化することができる。さらに速い撮像速度でさらに高密度のクラスタにおいては、撮像速度を著しく向上させることができる。例えば、２０ＭＨｚのカメラの最大読み出し速度で、２０ピクセルごとに１クラスタが解像される場合に、読み出し速度を１００万／秒とすることができる。１つのカメラより多くのカメラを有するように機器を構成することができる。その場合には、光を分割して２つのカメラに同時に２色を結像させることができ、さらには４つのカメラに４色を結像させることができる。４つのカメラを並列に使用することによって、１００万塩基／秒（８６４億塩基／日）のシーケンスを行うことができる。
【０１０４】
２つのカメラシステムに対して光信号を分裂させるために２つの方法がある。２つのレーザを使う場合、赤色励起および緑色励起が生じ、半分に分割された発光が各カメラに向かう。代替的に、両方のレーザを両方の照射サイクルに使用することができ、光は、適当なダイクロイックミラーを通過して、一方に赤い光を送り、他方に緑色の光を送ることができる（図３６）。このようなシステムは、ビームの分割に関連する信号の損失を回避するが、強度が記録される前に、これら２種類の色素がレーザに晒されることを意味する。いくつかの実施例においては、例えば図３６に示すような励起ブロッカは、二元ノッチフィルタ（例えば、５３２ｎｍおよび６６０ｎｍ）からなり得る。２つの検出カメラ３７００および２つの流体システム３７０１（および２つのフローセル３７０２）を有する機器を図３７に示す。
【０１０５】
ここでの「タイル」は、基材表面上にマッピングされた画像の寸法に関数的に等しい。タイルの寸法は、カメラのピクセルの数および寸法と、所望のレベルの拡大率と、に大きく依存するが、例えば、０．３３ｍｍ2，０．５ｍｍ2，１ｍｍ2，２ｍｍ2などとすることができる。また、タイルは、レーザ（または他の光源）からの照射フットプリントと等しい寸法または形状であれば、光退色を最小にすることが望ましい場合には有利となり得るが、必ずしも等しくする必要はないことを理解されたい。
【０１０６】
上記のように、ここでの様々な実施例において、カメラ／レーザシステムは、４種類の異なる蛍光体色素（すなわち、フローセルに加えられる各ヌクレオチドの塩基の種類に対応する色素）から蛍光を集める。ＳＢＳシーケンシングの他の態様に関する追加的な材料およびこれに関する他の概念は、出願者が同時係属中の出願（例えば、国際公開０４０１８４９７号パンフレット、国際公開０４０１８４８９３号パンフレットおよび米国特許７０５７０２６号明細書（ヌクレオチド）、国際公開０５０２４０１０号パンフレットおよび国際公開０６１２０４３３号パンフレット（ポリメラーゼ）、国際公開０５０６５８１４号パンフレット（表面への結合技術）、並びに、国際公開９８４４１５１号パンフレット、国際公開０６０６４１９９号パンフレットおよび国際公開０７０１０２５１号パンフレット（クラスタの準備およびシーケンシング））中に見られることに再度留意されたい。
【０１０７】
図１および図１３〜図１６は、本発明のカメラおよびレーザの様々な可能な構成を示し、例えば、バックライト設計、ＴＩＲＦ撮像装置、レーザ集光装置、白色光観測装置および代替的なレーザ集光設計などがある。白色光励起源は、励起レーザと一緒にまたは励起レーザの代わりとして選択的に使用することができる。図１は、ＴＩＲＦ撮像装置において画像を記録するバックライト設計システムを示す。ＴＩＲＦ撮像を行う図１の装置は、選択的に、図１３に示されるように設定されたバックライト設計の装置にすることができる。図１においては、（レーザアセンブリ１６０における）２つのレーザのうちの１つのレーザが、（フローセル１１０内の）サンプルを照射することに使用され、単一の発光波長を記録するとともに、散乱したレーザ光をカットするために、（フィルタ切替アセンブリ１４５における）４つの発光フィルタから単一のフィルタが選択される。撮像中に、集光レーザ（１５０）および選択的な白色光ランプ（１６５）はともに、シャッタで遮断されているか或いはスイッチが切られているときのいずれの場合にも、サンプルを照射しない。レーザ照射１０１と、フローセルから上に向かって対物レンズを通過する照射と、カメラ１０２と、が示されている。図１３は、バックライト設計におけるシステムのすべての部品を示す（具体的なＴＩＲＦ撮像装置を除く）。図１と図１３を比較されたい。図１３は、流体運搬モジュール１３００、フローセル１３１０、廃液弁１３２０、温度アクチュエータ１３３０、加熱／冷却部品（例えば、ペルティエ装置）１３３５、カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）１３４０、対物レンズ１３４２、フィルタ切替アセンブリ１３４５、集光レーザセンブリ１３５０、励起レーザセンブリ１３６０、低ワットランプ１３６５、精密ＸＹステージ１３７０、集光（ｚ軸）装置１３７５、ミラー１３８０、「反転」ダイクロイックミラー１３８５、およびレーザ光ファイバ１３９０を示す。
【０１０８】
図１４は、図１のシステムと類似のシステムを示すが、（レーザアセンブリ１４６０において）励起レーザおよび選択的な白色光１４６５のスイッチが切られているレーザ集光装置として示す。このシステムに集光レーザ１４５０を設置してシステム内に照射し、ビームスプリッタ１４８５（例えば、ピックオフミラー１％ビームスプリッタ）に当てる。このビームスプリッタ１４８５は、対物レンズより下に細いビーム１４０２を導いて、（フローセル１４１０内の）サンプル上の小さなスポットに当てる。サンプルからの散乱光は、対物レンズ（１４４２）より上に戻り、フィルタホイールスイッチングアセンブリ１４４５内の空のスロットを介してＣＣＤカメラ１４４０で撮像される。カメラ上のスポットの位置は、サンプルが対物レンズから正しい距離にあって、焦点に像が結ばれることを保証するために使用される。図１４における要素の符号の付け方は、図１３における要素の符号の付け方と類似しているが、「１３」の代わりに「１４」として符号付けされている（例えば、１４６０は、１３６０の類似の要素として対応する）。自動焦点システムについて、以下にさらに詳細に記述する。
【０１０９】
図１５は、集光レーザ１５５０および照射レーザ１５６０が切られているときの選択的な白色光観測装置を示す。このような装置においては、低ワットランプ１５６５からの白色光は、システム内にビーム１５０３として入射し、カメラに直接的に撮像される。ここでも、要素の符号の付け方は、ビーム１５０３などを除いて、図１３および図１４の符号の付け方に従う。図１６は、代替的な集光装置を示し、ここでのシステムは、（象限検出器となり得る）第２の集光カメラ１６４１、ＰＳＤ、または表面から反射した散乱ビームの位置を測定するための同様な検出器を含む。この装置は、データを収集しつつ焦点制御を行うことを可能にする。集光レーザの波長は、最も赤い色素発光フィルタの波長よりも選択的に長くすることができる。
【０１１０】
図１７〜図１９は、本発明のここでのシステムを使用してつくられたビームの形状とＴＩＲＦプリズムを通過した寸法とについての様々な概略図である。図２０は、ここでのシステムで使用されるＴＩＲＦプリズムの選択的な実施例を表す。こうして、レーザビームおよび／またはレーザビームによって照射される結像領域の形状（例えば、丸い、正方形など）は、実施例に応じて選択的に変えることができる。図１７は、ファイバから出現するときのビームの寸法および形状を示す。基材表面に直角の角度でビームが当たるので、基材上に円を照射するためには、楕円のファイバからビームを投射しなければならない。円の縁の外観１７００は、楕円１７３０によって投射される（例えば、ファイバの出口でファイバ内央線を２２°で見下ろしているように要求される楕円形のビーム形状）。プリズム表面の一部の輪郭１７１０は拡大されずに、楕円１７３０の縁の外観１７２０が短軸上に示されている。同様に、基材上に正方形を照射するためには、基材に向けて長方形の形状でビームを照射しなければならない（図１８）。図１８に、長方形１８３０を示す。ファイバ出口において、（２２°でファイバ内央線を見下ろしているように）長方楕円形のビーム形状が要求される。また、長方形１８３０によって投射された正方形の縁の外観１８００は、プリズム表面の一部の輪郭１８３０（拡大されず）や、長方楕円１８３０の縁の外観１８２０と（短軸）して示されている。
【０１１１】
図１９に示すように、内部全反射を実現するとともに基材表面で蛍光体を励起させるエバネセントビームを発生させるために、プリズムは、結像ビームが（直角に対して）約６８°で基材表面に当たることができるように設計されている。プリズムを通過するビームの経路を制御し、それによって、フローセルが動いても照射フットプリントが静止した対物レンズを直接的に覆ったままであるように、プリズムの形状は、表面に対してプリズムの角度を同じく６８°になるようにすることができ、これによって、光が常に９０°の角度でプリズムに当たることを保証する。プリズムの所望の形状は、国際公開０３０６２８９７号パンフレットにさらに詳述されており、図２０に例示的な寸法および形状などを示す。
【０１１２】
ここでのレーザのビーム形状は、例えば、正方形ビームをつくり出すために、マルチモードファイバの出力端部を磨くことによって選択的に制御される。例えば、図２１を参照されたい。図２１は、そのように磨かれた後の結像ビームを示す。他の実施例においては、ビームは選択的に丸い形状である。いくつかの例においては、ビームの特性は、以下の特性を有するガウスプロファイルとする。すなわち、半径０．１７ｍｍの公称スポットサイズ、半径０．２５ｍｍの最大スポットサイズ、およびレーザ強度の効果がなくなり始める点として０．３２ｍｍのスポットサイズとする。いくつかの実施例においては、ビーム強度は、公称スポットサイズの範囲にあるすべての位置で極大強度の９０％より大きく、最大スポットサイズの範囲にあるすべての位置で極大強度の８０％より大きく、半径０．３２ｍｍを越えたスポットサイズにおいては極大強度の１％より小さい。（動的モードスクランブラが存在しない）様々な実施例において、いずれの点における強度も、１秒〜１時間の時間スケール内で５％ＲＭＳより大きく変化することはなく、全体的な（総合的な）レーザ出力は、２４時間の測定で３％ＲＭＳよりも大きくは変化しない。
【０１１３】
[照射システム]
本発明による装置において、様々な照射システムを使用することができる。照射システムは、ランプおよび／またはレーザを備え得る。照射システムは、１つまたは複数の異なる波長の照射レーザを含み得る。ここでの照射システムは、例えば、５３２ｎｍおよび６６０ｎｍの２つのレーザを含むが、他の波長のレーザを使用してもよい。また、ここでのシステムにおけるレーザは、様々な実施例において、０．１℃のレベルまで活発的に温度制御され、６６０ｎｍのレーザダイオードに対して１００ミリ秒よりも短い濯ぎ時間でＴＴＬ変調を有し、５３２ｎｍのレーザの高速変調用に一体化された手動のシャッタを有し、ＳＮ比を最大化するために機器のインタフェースに最適なビームアスペクト比が維持されることを保証するように統合されたビーム成形光学素子を有し、マルチモードファイバの出力におけるリップルを減らすように統合されたモードスクランブラを有し、さらに発生する熱を抑える。遮断およびＴＴＬ変調は、カメラが画像を記録しているときにサンプル表面だけに照射が行われることを確保するために使用される。蛍光体への照射は光退色を生じさせることがあるので、必要でないときには（特に画像が記録される前には）、通常は、基材がレーザに晒されることを抑える。
【０１１４】
図２２Ａおよび図２２Ｂは、様々な光学装置とともに使用される様々なフィルタホイール装置のいくつかの実施例を示す。図２２Ｂに示すように、４種類の蛍光体を検出するために２つのレーザ励起システムを使用することは、蛍光体のうちの２つが最大吸収波長で励起されることを意味する。４つのチャネルすべてで使用される発光フィルタが同じ帯域幅であるとすれば、５３２ｎｍのレーザおよび６６０ｎｍのレーザ波長付近の２つの蛍光体は、このレーザによってさらに励起される２つの蛍光体よりも著しく明るいであろう。しかし、このファクタは、フィルタの帯域幅を変えることによって消すことができる。例えば、図２２Ｂに示すように、５３２ｎｍのレーザを使用する場合、例えば５３０ｎｍおよび５６０ｎｍの吸収波長の色素は共に、５３２ｎｍのレーザで励起させることができる。レーザの波長に近い狭帯域通過フィルタ（例えば、５６０／２０）を使用すると、５５０ｎｍ〜５７０ｎｍの光が入射したときに、５３２ｎｍの色素からの光だけが通過する。レーザの波長から遠い広帯域通過フィルタ（例えば、６１０／７５）を使用すると、５７２ｎｍ〜６４７ｎｍの光が入射したときに、両方の蛍光体からの光が通過する。
【０１１５】
５６０／２０フィルタを通過する５３２蛍光体の強度は、６１０／７５フィルタを通過する５６０蛍光体の強度と同程度である。従って、これら２種類の蛍光体は、単一のレーザと２種類の発光フィルタを使うことによって明確に識別することができる。
【０１１６】
この効果は、波長に固有のものではなく、種々の励起波長を使って実行することができる。従って、赤色レーザを使っても同じ効果を達成することができる。６５０ｎｍおよび６８０ｎｍの吸収波長を有する２つの蛍光体は、レーザの波長に近い狭帯域通過フィルタ（例えば、６８２／２２）を使って識別することができ、レーザの波長から遠い広帯域通過フィルタ（例えば７００ロングパス）を使って識別することもできる。それぞれのフィルタを通過する２つの色素の強度は同程度であるが、６８２／２２フィルタを通過する６８０色素からの信号は、大きく低減している。７００ロングパスでは両方の色素が発光するが、これらの信号は、狭帯域通過フィルタでの異なるレベルの発光によって明確に識別することができる。種々の波長の長さを使って４種類の蛍光体セットを得るように、レーザ波長、蛍光体の選択、およびフィルタの帯域幅を構成することができ、さらにフィルタの帯域幅を使って各チャネルを通過する発光の強度を標準化し、どれだけの光が送られるかを管理することができる。
【０１１７】
図２３は、公称設計３０倍システムにおける光線の軌跡を示し、図２４は、その３０倍の撮像性能を示す。このシステムにおける撮像性能は、このシステム内の対物レンズおよび他のレンズの拡大率に依存する。拡大率が小さいほど撮像される基材の領域が大きいが、密接に詰められたクラスタの解像度と各クラスタの明るさを犠牲にしてしまう。拡大率は、選択的に１０倍〜４０倍であることが好ましく、例えば、２０倍または３０倍とすることができる。対物レンズは、非標準的な幾何学形状（例えば、さらに厚いガラス基材）を介して蛍光体を観測するときに、回折限界の結像が保たれるようにカスタム設計することができ、球面収差が現れないようにすることができる。対物レンズは、さらなるチューブレンズを介して検出器に接続されるようにしてもよい。
【０１１８】
[自動焦点システム]
ここでのシステムは、特定の実施例において、クラスタの撮像に適当な集光がなされるように寄与する部品を備える。概して、自動焦点設定されたここでの特定の実施例において、自動集光レーザビームが対物レンズを介してサンプルを照らし、フローセルの表面から反射してレンズに戻り、次いでカメラに戻り、画像上にスポットをつくり出す。固定されたサンプルに対して対物レンズを上／下に動かすとき、スポットの重心は、画像に関する直線の付近に並ぶ（較正曲線）。この較正ラインに沿っての移動距離「ｄｒ」は、対物レンズと焦点面との間の距離の変化「ｄ（ｚ−ｚf）」に比例する。多くの実施例において、作動の前に、ソフトウェアが、較正ラインの向き（直線の傾き）及び「感度」：ｄｚ／ｄｒ（ｎｍ／ピクセル）を確定する。これは、視覚的に確定された集光位置の付近でｚ軸方向に１０００ｎｍのステップで２１枚の画像を撮ることによってなされる。このソフトウェアは、サンプルが焦点（ｘf，ｙf）にあるときに、スポットのピクセル座標（ｘ，ｙ）をさらに要求することができる。この座標は、２１枚の較正画像のセットからの第１の（中央の）焦点画像から確定される。例えば、ここでの装置は、ｚ軸方向に５０ｍｍまで動くように設置されて１００ｎｍの解像度を実現する自動焦点機能対物レンズを選択的に備える。基材に対して垂直方向に対物レンズを選択的に動かすことができ、照射入力も基材に対して動くように、照射レーザをｚ方向の動きに結びつけることができる。自動焦点能力を有する実施例においては、顕微鏡の対物レンズの縁（最大感度に対応するために選択的にできるだけ軸から離間している）に沿って、自動焦点ビームが選択的に送られる。自動焦点ビームは、照射レーザからのものとすることができ、或いは照射レーザとは選択的に異なる波長（例えば、４８８ｎｍ，６３０ｎｍまたは７００ｎｍの赤外レーザまたは更に波長の長い光）を有する独立したソースからのものとすることができる。次に、反射ビームは、象限セルによって或いはダイクロイックビームスプリッタを介しての蛍光体撮像カメラへの漏出によって、選択的に監視される。このような実施例においては、レンズおよびカメラは、選択的に、機器内で使用されるものと同じもの（例えば、２０倍レンズ）にすることができる。本発明のシステムおよび装置に選択的に含まれる類似の自動焦点システムについては、例えば、国際出願０３０６０５８９号パンフレットに既に記述されている。
【０１１９】
ここでの特定の自動焦点の態様を使って、対物レンズに対して結像面が動くとき、反射した監視ビームも横方向に動く（すなわち、図２５において、実線は、検出されたビームが焦点面に集光されずに横方向シフトが生じる表し、点線は、焦点面に集光されることを表す）。この実施例において選択されるダイクロイックミラーは、普通は、自動焦点ビームを反射させるミラーである。実際に透過する漏出が小さい場合にも（ｃ．ａ．＜５％）、発光通路に発光フィルタなしで、ＣＣＤカメラで観測するのには十分である。図２６は、撮像カメラ上に見られる、スポットが焦点にない画像およびスポットが焦点にある画像のサンプル写真を示す。下段の画像は、撮像カメラ上に検出された自動焦点スポットを示す。スポットは、システムから分離した検出器でも見ることができる（図２７）。
【０１２０】
自動焦点の態様を備える実施例においては、コンピュータ部品は、自動集光アルゴリズムを選択的に備える。このようなアルゴリズムは、（例えば、上記の測定およびこの測定に従う調節を監視することによって）正確な集光を確定することに寄与する。自動焦点スポットが一次元方向に（例えば、ｘ方向かつｙ方向ではなくｙ方向だけに）動くよう座標を決めることができ、これによって処理を簡単にできる。対物レンズの焦点位置は、ｚ方向に動くと仮定する。
【０１２１】
自動焦点分析の実施例の第１のステップは、対物レンズのいくつかの座標（ｚ1，ｚ2…ｚn）に対して撮像カメラ上の自動焦点スポットの座標（ｙ1，ｙ2…ｙn）が測定されることからなる「応答関数の設定」である。典型的には、５つの座標があれば十分である。図２７は、３つの座標による分析を示す。反射したスポットの動きは、蛍光カメラ上に撮像されている（下段のパネル）。各々のＺ平面に対して、カメラ上の反射スポット（重心）の対応するｙ座標が存在する。これらの５つのデータの位置（ｚ1，ｙ1），（ｚ2，ｙ2），（ｚ3，ｙ3），（ｚ4，ｙ4），（ｚ5，ｙ5）は、１本の線で説明できる。
【０１２２】
【数１】
2009532031.tif 000002
【０１２３】
ここで、ｍとｃの値は、各データの点から最小二乗法を使って次のように求められる。
【０１２４】
【数２】
2009532031.tif 000003
【０１２５】
【数３】
2009532031.tif 000004
【０１２６】
【数４】
2009532031.tif 000005
【０１２７】
こうして、５つのデータの点からｃ，ｍ，ｙ0の値が確定されて既知の応答関数を与える。
【０１２８】
このような自動焦点分析の実施例における次のステップは、各位置ｃが一定であるとき（すなわち焦点から外れる変化や焦点位置への変化をしないとき）に、「（焦点位置から外れる場合の）ｎｅｗＣを計算せよ。」を含む。しかし、各位置ｃは、様々な位置に変化する。よって、ステージが新しい位置に移動するとともに、変化したＺの値とｙの値からｎｅｗＣが計算される。
【０１２９】
【数５】
2009532031.tif 000006
【０１３０】
このプロセスにおける第３のステップは、ｎｅｗＣを使用して、焦点位置におけるｙ座標（ｙ0）を得るために要求されるＺ座標（ｎｅｗＺ）を計算することである。
【０１３１】
【数６】
2009532031.tif 000007
【０１３２】
【数７】
2009532031.tif 000008
【０１３３】
ｍおよびｙ0は、ステップ１で、（１チップにつき一回）測定される。ｎｅｗＣは、ステップ２から（すべての位置で）測定される。こうして、ｎｅｗＺを計算することができる。
【０１３４】
本発明の自動焦点部品における他の態様は、レーザの指向性の安定を要求する。拡大した図２８に示すように、適当な焦点距離で、簡易的な薄いレンズの対物レンズを通して観測することにより、自動集光レーザで許容される指向性誤差を評価することができる。
【０１３５】
簡易的な幾何学図形におけるｙ方向の変位は角度Φを生じさせ、この角度Φは、自動集光レーザビームが１ピクセルだけシフトされて現れるようにする角度であり、これは、約（Δ／Ｆ）の小さな角度として得ることができる。
【０１３６】
（いくつかの実施例においては、チューブレンズとリレーレンズとの組み合わせである）２０倍対物レンズについては、ピクセルの寸法は、およそ０．３μｍである。このときのレンズの焦点距離は、１０ｍｍである。従って、１ピクセルに対応する誤差角度は、３０μラジアンである。本発明のシステムのいくつかの実施例においては、自動焦点セットは、ｚ方向の１ミクロンの移動に対して自動集光レーザスポットが約４ピクセルだけシフトされるような感度を有する
０．５μｍの焦点誤差（レーザスポットの位置における２ピクセルのシフトに対応する）が許容されると仮定すると、自動集光レーザについて許容できる最大の指向角度の変化は６０μラジアンであると考えられる。
【０１３７】
通常の温度変化に亘って上記のような安定の要求を満たすために、ファイバに光学的に結合されたレーザを使用することが高く推奨される。固体レーザは、注意深く温度制御しなければ、通常の環境温度における特定の範囲（例えば、２０〜３０℃）で、この程度の指向性確度を維持することは困難であろう。
【０１３８】
焦点追跡アルゴリズムに関する追加的な情報や理論を提示するために、自動焦点システムについてのさらに詳しい実施例を以下に説明する。
【０１３９】
集光追跡手順のいくつかの実施例における第１のステップは、撮像装置（これは、撮像カメラとすることができる）上に、自動集光レーザスポットの画像を捕捉することである。この一次スポットからのデータは、２つのパス内に引き出される（スポットのおよその位置や寸法を確定する第１の粗いパスと、第１にパスに続いて、ＣＯＬ（光の中心）や他のスポットの特徴を確定する前に、スポットの境界を正しく画定する第２の微細なパス）。第１のパスにおける解析は、以下の５つのステップで行うことができる。（１）最大で２５５の画像セットおよび最小で０の画像セットを使って、並びにこれらの間のすべての他のグレースケールの値を線形的に使って、１６ビットの画像を８ビットの画像に変換する。（２）画像の質が計算される。画像の質は、その画像自体に左方向への単位ピクセルシフトおよび下方向への単位ピクセルシフトがなされた画像の正規化自己相関の平均として確定される。画像にノイズが多い場合、ノイズは画像自体とは関連しないので、測定は以下のようになる。（３）次に、この像は、１２８で閾値を与えられる。この値より大きな値であれば、フォアグラウンドと見なされ、この水準以下の値は、バックグラウンドと見なされる。グレースケール２５５（すなわち、ホットスポット）から始まって、８ビット接続されたすべてのフォアグラウンド成分を見つけるように領域が成長する。（４）これらの候補となるフォアグラウンド成分のすべての中から、最も高い平均の明るさを有する成分が、一次スポットの位置およびおよその寸法を特定する「その」成分として選ばれる。（５）この成分のバウンディングボックスが計算で求められる。
【０１４０】
第２の（微細な）パスにおける解析は、３つのステップで行われる。（１）バウンディングボックスの領域の２倍に対応するサブ画像が、８ビットのグレースケール画像から切り出される。これは、フォアグラウンドおよびバックグラウンドのピクセル数をほぼ等しくし、閾値を与える技術に基づく標準画像のヒストグラムが確実に機能することを容易にする。（２）サブ画像のヒストグラムが計算によって求められるとともに、バックグラウンドとフォアグラウンドとを分離する「最良の」グレースケール閾値が確定される。この閾値は、「オオツの閾値」と呼ばれる（ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎ，ａｎｄ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．９，ｐｐ．６２−６６，１９７９またはＣｏｍｐｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｏｔ  Ｖｉｓｉｏｎ，ｖｏｌｕｍｅ１．Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，１９９２．を参照）。および、（３）オオツの閾値で画像が閾値に達し、８ビット接続されたフォアグラウンド成分が決定される。これが一次スポットブロブとなり、続いての特徴のすべてがこのブロブから抽出される。
【０１４１】
二次スポットの位置を抽出するために追加的なパスを実行することができる。そのような追加的なパスは、以下の４つのステップで実行することができる。（１）８ビットの（第１のパスからの）画像が、１６の低い閾値に達せられる。（２）この低い閾値において、一次スポット成分のピクセル（領域）数が増やされる。この一次スポットの面積が記録され、この領域がどのくらい密であるか又は拡散しているかを測定するために使用される。（３）一次スポット成分に最も近い位置にある（十分なサイズの）成分が、二次スポットとして認識される。（４）二次スポットの幾何学的重心が記録される。
【０１４２】
[光の中心の決定]
自動焦点用に光の中心（ＣＯＬ）を決定するために、一次スポットの光の中心として、
【０１４３】
【数８】
2009532031.tif 000009
【０１４４】
と表示する。これは、一次スポットブロブについて次のように計算される。
【０１４５】
【数９】
2009532031.tif 000010
【０１４６】
ここでの総和は、座標系（ｘi，ｙi）およびグレースケールｇi（閾値より大きい）に基づいた画像を有するブロブ内のすべてのピクセルｉについて取り込まれる。
【０１４７】
[他のスポットの特徴]
写真の質および光の中心に加えて、一次スポットブロブ用に計算される特徴のリストは、一次ブロブがどの程度拡散している（密ではない）かを示す測定値であるＡｒｅａを含む。これは、低い閾値における一次ブロブの面積（ピクセル数）をオオツの閾値における面積で割った値に設定されている。計算される他の特徴は、Ｖｏｌｕｍｅ（閾値より大きいときの平均の明るさ×一次ブロブのＡｒｅａ）、平均の明るさ（ブロブ内におけるピクセルのグレー値の合計をその面積で割った値）、および最大の明るさ（最大グレー値）などである。
【０１４８】
抽出したデータは、Ｚ焦点を較正するために使用することができ、これにより、画像が集光されるために対物レンズをどのくらい動かしたらよいのかを決定する。較正手順の概要は、以下のようになる。（１）Ｚ焦点の較正は、すべての運転の始めに、（ユーザの助けを借りて）行われる。（２）較正の始めに、ユーザは、画像が焦点（すなわち、集光面）にあることを確認する。そこで、彼／彼女は、Ｚ焦点をｚFと設定する。（３）この自動焦点の実施例は、ユーザの入力および画像上の自動集光レーザスポットの座標に依存する。（４）較正プロセスでｚが変化するにつれて、スポットは、ラインに沿ったｚの変化に線形に比例して移動する。
【０１４９】
較正アルゴリズムの手順は、ｚの変化につれて得られる連続的な自動焦点スポットの画像から抽出された光の中心（ｘ，ｙ）の点列から始める。これらの点は、グラフ化されたときに、完全に直線上に収まることが理想的である。
【０１５０】
【表１】
2009532031.tif 000011
【０１５１】
実際には、これらの点は、物理的および計算上の様々なノイズ源によって、以下に示すように理想の直線からは外れている。
【０１５２】
【表２】
2009532031.tif 000012
【０１５３】
従って、回帰に基づくＸＹ主成分分析（例えば、Ｉ．Ｔ．Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００２）が、ＸとＹの間で行われ、以下に示すような新しい（Ｒ，Ｑ）座標系を導く。
【０１５４】
【表３】
2009532031.tif 000013
【０１５５】
以下のことに留意されたい。（１）（Ｒ，Ｑ）座標系の起源は、質点の中心（ｘ，ｙ）とする。（２）最良の当てはめ（主成分）線がＲ軸を確定し、（３）Ｒ軸と直交する線がＱ軸を確定する。このモデルは、ＸとＹの間に高い相関性を要求する。従って、Ｑ座標の値は、最良の当てはめ線からの誤差「剰余」と見ることができ、これらの剰余を取り除いて観測値を補正することが理想的である。
【０１５６】
最終的には、このモデルは、（図示するように）空間座標とｚ座標の間に線形の関係を求める。ｒとｚとの間で線形回帰を実行し、この直線の係数を決定する。
【０１５７】
【表４】
2009532031.tif 000014
【０１５８】
加えて、自動焦点追跡は、回帰エンジンの様々な学習を含み得る。
【０１５９】
[ＸＹ  ＰＣＡ  回帰エンジンの学習］
【０１６０】
【表５】
2009532031.tif 000015
【０１６１】
［ＲＺ線形回帰エンジンの学習］
【０１６２】
【表６】
2009532031.tif 000016
【０１６３】
［外れ値検出器の学習］
外れ値検出のスキームは、泡の存在を報知するために使用されるか、またはフィルタホイールの問題に警告を与える。
【０１６４】
【表７】
2009532031.tif 000017
【０１６５】
［自動焦点システムの運転］
自動集光レーザスポットの画像から運転を開始し、較正プロセスで学習した変換係数を使用して、焦点まで動かすのに要求されるｚ軸方向の移動距離を最良に評価する。
【０１６６】
【表８】
2009532031.tif 000018
【０１６７】
［コンピュータ］
上記に示したように、本発明のシステムの様々な構成要素は、適切にプログラムされたプロセッサないしコンピュータに接続され、これらのプロセッサないしコンピュータは、プログラムされた指示またはユーザが入力した指示と一致するようにシステムの内の機器の操作を指示し、システム内の機器からデータや情報を受け、その情報を解釈、処理し、ユーザに報告する。このように、コンピュータは、典型的には、これらの機器／部品（例えば、必要に応じて、アナログ−デジタル変換器またはデジタル−アナログ変換器を含む）に適切に接続されている。
【０１６８】
コンピュータは、設定パラメータフィールドにユーザが入力する形態（例えば、ＧＵＩ）で、あるいは、予めプログラムされた（例えば、自動焦点、ＳＢＳシーケンシングなどの様々な特定の操作のために予めプログラムされた）形態で、ユーザからの指示を受ける適切なソフトウェアを選択的に含む。このソフトウェアは、（例えば、流体の誘導および輸送、自動集光などについての）所望の作動が実行されるように、ユーザからの指示を適切な言語に変換して、正しい作動を指示する。
【０１６９】
例えば、コンピュータは、例えば様々なチュービングを通流する流体流を制御する流体流部品を導くために選択的に使用される。この流体流部品は、適切な緩衝液、ヌクレオチド、酵素などの流れの向きを、フローセルに流入および通流するように選択的に導く。
【０１７０】
コンピュータは、システム内に含まれる１つまたは複数のセンサ／検出器からのデータを選択的に受け、解釈し、ユーザに理解されるフォーマット内に提供するか、或いは、プログラミング（例えば、流量や温度などの監視および制御など）と一致するように、制御装置に次の命令を開始するためにデータを使用する。
【０１７１】
本発明においては、コンピュータは、フローセル中の物質の監視および制御を行うソフトウェアを典型的に含む。加えて、ソフトウェアは、標識された蛍光体の励起を制御し、さらには生じる発光を監視するために選択的に使用される。コンピュータは、例えば、加熱／冷却部品および自動焦点システムなどに典型的に指示を与える。
【０１７２】
種々の制御装置またはコンピュータは、モニタ（これは、ブラウン管（ＣＲＴ）ディスプレイであることが多い）、フラットパネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリクス駆動の液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ）などを選択的に含む。本発明のシステムから生み出されたデータ（例えば、核酸シーケンスの結果）は、モニタ上に電子形態で選択的に表示される。加えて、例えば、核酸アレイからの発光プロファイルのデータまたは本発明のシステムから集められた他のデータを印字形態で出力することができる。このデータは、印字形態であるか電子形態（例えば、モニタに表示される）であるかに拘わらず、様々なフォーマット即ち複数のフォーマット（例えば、曲線、ヒストグラム、連続的な数値、表、グラフなど）にすることができる。
【０１７３】
コンピュータ回路網は、例えば、マイクロプロセッサ、メモリ、インタフェース回路などの多くの一体化された回路チップを含むボックス内に設置されていることが多い。このボックスは、さらに選択的に、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、書換え可能ＣＤ−ＲＯＭなどの高容量リムーバブルドライブおよび他の共通の周辺要素を含む。キーボードまたはマウスなどの入力デバイスは、ユーザが入力することと、比較対象となるシーケンスをユーザが選択すること（さもなければ関連するコンピュータシステム内で処理される）と、を選択的に提供する。
【０１７４】
［使用例および構成要素の変化］
ここでのＳＢＳシステムは、多くの実施例において、（典型的には、フローセル内の）１サンプル当たり数百万の核酸を撮像することができる励起・撮像サブシステムに基づくＣＣＤ／ＴＩＲＦレーザを備え、このレーザは、４種類の蛍光体色素（４つの塩基の各々に対して１色素）の各々を検出することができる。例えば、ヌクレオチドなどのＳＢＳ化学成分（国際出願０４０１８４９７号パンフレット、国際出願０４０１８４９３号パンフレットおよび米国特許７０５７０２６号明細書）、ポリメラーゼ（国際出願０５０２４０１０号パンフレットおよび国際出願０６１２０４３３号パンフレット）、表面接合技術（国際出願０５０６５８１４号パンフレット）、クラスタの準備およびシーケンス（国際出願９８４４１５１号パンフレット、国際出願０６０６４１９９号パンフレットおよび国際出願０７０１０２５１号パンフレット）は、チャネルが形成されたフローセル部品などと共に使用することができる。本発明のシステムにおけるコンピュータまたはデータ分析システムの態様は、１時間当たり数千の画像をシーケンス情報として処理することが選択的に可能である。
【０１７５】
要約すると、ＳＢＳによるシーケンシングの特定の例においては、ゲノムＤＮＡがランダムに断片化され、周知のシーケンスで端部がキャップされ、例えば、共有結合性プライマへのハイブリダイゼーションによって、（フローセル内のチャネルなどの）基材に共有結合される。このように結合されたＤＮＡから、国際出願９８４４１４１号パンフレットおよび国際出願０７０１０２５１号パンフレットに記述されるように、核酸クラスタのアレイがつくり出される。（例えば、ここでのシステムおよび装置を使用する）ＳＢＳ分析は、連続的なクラスタの画像を生成することができる。これらの画像は、各クラスタ内の核酸シーケンスを読み取るように処理することができ、これらのクラスタを参照シーケンスに対して整列させることにより、シーケンスの違いや、さらに大きな全体的なシーケンスなどを決定することができる。核酸の短い読み取り配列についてのアルゴリズムは、国際公開０５０６８０８９号パンフレットに記述されている。
【０１７６】
上記のように、各シーケンシングサイクルは、核酸鎖の成長に１回の取り込みを含む。このようなサイクルは、４種類すべてのＮＴＰを追加することによって典型的に行われ、ｄＮＴＰの各々の各塩基は、特定の蛍光体によって識別できるように修飾されている。加えて、伸長を制御するとともに各サイクルにおいて各分子に２つ以上の塩基が加えられないように、三リン酸塩は、３’の位置で修飾される。図３０〜図３２に、ランダムなアレイ上に単一のテンプレート分子からクラスタを増殖させる一般的な方法、続いての上記アレイにおけるシーケンシングを示す。これらの図は、ここでのシステムで実行されるシーケンシング手順および方法の様々な態様を概略的に示す。例えば、核酸クラスタが形成され、クラスタアレイが生産される（このクラスタアレイが「典型的な」アレイに対して比較される）基本概要のステップと、シーケンシング方法のすべての概要を示している。図３０は、核酸クラスタの創出およびシーケンシングの基本概要を示し、図３１は、アレイ（左側）と、本発明のシステム／装置に使用することができるような核酸クラスタ基材上（右側）と、の間で核酸の密度を比較する。図３２は、例えば、本発明によって実施されるようなＳＢＳシーケンシングの手順の概要を示す。
【０１７７】
開裂可能リンカーを介してクラスタを構成する核酸に蛍光標識されたヌクレオチドが取り込まれるステップの後に、種々の取り込まれていないヌクレオチドおよび酵素を除去するために、流体流サブシステムによってフローセルのチャネルが洗浄される。
【０１７８】
次に、このシステムによって取り込みステップが行われ、取り込まれた（各クラスタ内のグループとして読み取られた）個別の標識の特性が光学顕微鏡を使って記録され、対応する取り込まれた塩基が記録される。このシーケンシングシステムは、スペクトラムの異なる部分について、波長が明確に異なる２つのレーザを使って、内部全反射顕微鏡（ＴＩＲＦ）および４種類の別個の発光フィルタを介して、４種類の蛍光体を読み取ることができる。これらの画像は、ＣＣＤカメラ上に記録されるとともに、付属のコンピュータモジュール内に報告される。
【０１７９】
具体的な取り込みが読み取られた後、脱保護ステップで標識部を除去し、表面の結合ＤＮＡからブロックする。脱保護ステップは、遺伝子コンテクスト内の（フローセル上に存在する）各核酸クラスタのシーケンスが独特に配置される程度の十分な情報サイクルが得られるまで、上記取り込みステップおよび読み取りステップの反復を可能にする。例えば、ヒトゲノムの場合、このサイクルは、１６サイクルよりも多く、例えば、約２５〜５０サイクルである。これらの画像は、オフラインに保存することができ、或いはシーケンシングプロセス中に個別の塩基が読み取られるように実時間内に処理することができる。これらの画像を処理することにより、サンプル（例えば、ゲノム）全体のランダムな位置から抽出される各々のクラスタについて、どのクラスタから始まるシーケンス読み取りについてもデータベースを提供する。こうして、手順の過程で、ゲノムのすべての部分をカバーする数百万のシーケンス読み取りのデータベースが典型的に構築される。このようなデータベースは、例えば、参照シーケンスなどに由来するすべてのシーケンスのデータベースと比較することができる。様々な実施例において、画像の分析、配列の決定、および／またはシーケンスの配置は、蛍光画像を捕捉した後に、選択的に「オフライン」で実行することができる。また、これらの手順は、本発明のシステム中に存在するコンピュータから分離されたコンピュータによって選択的に実することができる。
【０１８０】
上記にすべて示したように、本発明は、実施例（例えば、構成要素またはサブシステムの数や種類）に応じて異なる。例えば、本発明の一実施例（実施例「ｂ」）において、構成要素は、以下の要素を含み得る。すなわち、フローセル内のチャネル底部に直径０．５ｍｍの円を投射するように出力７５ｍＷ（または選択的にこれより大きい）で照射される５３２ｎｍおよび６６０ｎｍの照射レーザ（これは、シーケンシング反応で蛍光体を励起させるために使用される）、ガラス製ＴＩＲプリズム（６８°または７１°）、深さ１００μｍの８つのチャネルを有する１ｍｍ×６１ｍｍの領域（３９ｍｍ×１ｍｍが観測用に使用される即ちアクセス可能）を有するガラス製フローセル、（ガラスの厚さについて補正された）Ｎｉｋｏｎ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ２０ｘ，０．７５ＮＡからなるカメラ部品の対物レンズ、５５７±１１ｎｍ，６１５±４０ｎｍ，６８４±１１ｎｍおよび７４０±５０ｎｍの帯域通過フィルタを含む発光フィルタ（または、図２２に示すフィルタまたはこれに類似した選択的なフィルタ）、約２３倍の正味の拡大率に対するＮａｖｉｔａｒ１．３３倍アダプタを含む光学リレーまたは拡大率のないチューブレンズを含む光学リレー、および、ピクセルサイズが８μｍで読み出し速度が１０ＭＨｚのＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃａｓｃａｄｅ  １ＭＰｉｘないし１ＫカメラからなるデジタルＣＣＤカメラである。さらに、０．７５ＮＡ（開口数）で２０倍の拡大率の顕微鏡対物レンズを含み得る。カスケード実施例「ｂ」は、（回折限界よりわずかに大きな）約０．８μｍの光解像度を有する０．３５ｍｍ四方の領域の正味の性能を与えることができる。
【０１８１】
このような１メガピクセルの実施例は、直径０．５ｍｍの円を照射し、この円の内側にある０．３５ｍｍ四方の正方形を検出することができる。これらの実施例におけるフローセルは、１チャネルまたはさらに多くのチャネル内に総計１５６個の互いに重ならないタイルを有し得る。クラスタは、１μｍのオーダとすることができる。顕微鏡の開口数は、７００ｎｍの波長において約０．６μｍのＰＳＦを選択的に与えることができる。こうして、「典型的な」クラスタは、約１．２μｍの見かけの直径を得ることができる。結像面において、１ピクセルが約０．３５μｍ四方を表示するので、典型的なクラスタは、直径に亘って約３．５ピクセルを有する。クラスタの領域内では、約９．２５ピクセルとなる。１メガピクセルＣＣＤ上の１０のエリアピクセル対象物のポアソン分布は、最大約３８，０００個の対象物が互いに重ならないことを示す（図２８）。図２９は、本発明のシステムの例示的な構成におけるスループットの一例を与える。検出されるクラスタの数は、全クラスタの数および最小クラスタ領域の関数である。
【０１８２】
「ｂ」実施例において、（レイリーの基準を使っての）解像度の限界は約０．６μｍであり、クラスタは、約１．２μｍの見かけの寸法に対して約１μｍの寸法である。結像面におけるピクセルマップが約０．３５μｍまでなので、１つのクラスタは、領域の直径に亘って約３．５ピクセルとなり、領域内において約１０ピクセルとなる。ランダムに分配されたクラスタについては、１メガピクセルのカメラにおいて混乱されていないクラスタの最大数は、０．３５ｍｍ四方の正方形のタイル内に約３８，０００とすることができる。「ｂ」フローセルは、１フローセル当たり総計１２００タイルについて、１チャネル当たり互いに重なっていない１５０の照射タイルに対処する。これは、４５．６メガ塩基／１サイクル、すなわち約１ギガ塩基／２５サイクルに相当する。互いに照射を重ね合わせ、タイルを密に敷き詰めることによって、１チャネル当たり２００タイルを撮像することができ、従って、１フローセル当たり１６００タイルを撮像することができる。
【０１８３】
「ｂ」照射サブシステムのスループットについて、レーザの波長は、緑色レーザの波長が５３２ｎｍ（緑色レーザは、選択的に７５ｍＷを出力する）、赤色レーザの波長が６６０ｎｍであり（赤色レーザは、選択的に７５ｍＷを出力する）、投射ＴＩＲＦビームの直径は０．５ｍｍであり、ビームの許容変動率は２０％である。
【０１８４】
他の実施例（実施例「ｇ」）においては、本発明のシステムは、以下の要素を含み得る。すなわち、各々が出力５００ｍＷの５３２ｎｍ，６６０ｎｍ照射レーザ（０．５ｍｍ四方の正方形として照射されることが理想的である）、ガラス製のＴＩＲプリズム（６８°）、深さ１００μｍの８つのチャネルを有する１ｍｍ×６１ｍｍ（このうち５０ｍｍが利用可能）の領域からなるガラスフローセル、Ｎｉｋｏｎ  Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ  ４０ｘ，０．６ＮＡ  ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ  ｃｏｌｌａｒまたはＳＢＳフローセルに対して補正されたｃｕｓｔｏｍ４０ｘ，０．７５ＮＡからなる対物レンズ、５５７±１１ｎｍ，６１５±４０ｎｍ，６８４±１１ｎｍ，７４０±５０ｎｍの帯域パスフィルタからなる発光フィルタ、およびＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  Ｋ４（２０４８×２０４８ピクセル、４メガピクセルのカメラ、７．４μｍのピクセル寸法、２０ＭＨｚの読み出し速度）からなるデジタルＣＣＤカメラである。このような実施例は、０．７μｍの回折限界よりも小さな回折で、０．５ｍｍの領域の正味の性能を与えることができる。これは、０．７５倍のリレーレンズを含むことができ、システム全体の拡大率が３０倍になる。
【０１８５】
いくつかのこのような「ｇ」実施例において、０．５ｍｍ四方の正方形が一様に照射され、同じ０．５ｍｍ四方の正方形が検出されることが望ましい（２０４８ｘ７．４／３００００）。ここでのフローセル上のクラスタは、０．５μｍまで小さくすることができる。７００ｎｍにおけるＰＳＦは、約０．７μｍである。よって、１ピクセルが０．２５μｍを表す場合に、各クラスタは０．８６μｍの大きさで表示される。従って、典型的なクラスタの直径に亘って３．５ピクセルとなり、クラスタの領域内には９．２５ピクセルとなる。４メガピクセルＣＣＤは、１タイル当たり、最大で約１３５，０００の互いに重なっていないクラスタを与える。
【０１８６】
照射フットプリントを４倍大きくすることは、同じ露光時間で同じレベルの信号を得るためにレーザ出力を４倍に増大させることが必要であることを意味する。レーザ出力を増大させることにより、露光時間を抑えることができる。よって、このようなシステムが１回の実験当たり２０億塩基のシーケンスを生成することができるのは、以下のパラメータが使用される場合である。すなわち、対物レンズについて開口数０．８および２０倍の拡大率、４メガピクセルのカメラ、７６０μｍ×７６０μｍの照射タイル、１フローチャネル当たり１撮像レーン／１フローチャネル、１レーン当たり４８タイル、１チップ当たり８チャネル、平均寸法０．７μｍのクラスタ、および４０塩基の読み取り長さ、である。従って、全体のスループットは、８チャネル×４８タイル×１３５，０００クラスタ／タイル×４０サイクル＝２０．７億塩基（Ｇ）となる。
【０１８７】
撮像されるタイル数、クラスタ密度または読み取り長さを増やすようにフローセルの寸法を大きくすることによって、１フローセル当たりに生成される塩基の数を増やすことができる。２つまたは４つのカメラを並列に設置して、スループットが２倍または４倍のシステムを得ることができる。図３６および図３７に、２つのカメラを使う構成を示す。スキャニング時間は、遅延時間積分（ＴＤＩ）などの技法を使って短くすることができ、これは、表面が別個のタイルに撮像されることよりも、継続的にスキャニングされることを意味する。単一の光学系に接続された複数の流体システムを使って複数の化学ステップを実行するように機器を構成することができる。この単一の化学系においては、光学系が撮像をしていないときに、化学ステップが行われている。サイクルにおいて化学パートの時間と撮像パートの時間がほぼ同じ長さである場合、サイクル時間の５０％に亘って、機器はデータを記録していない。このシステムにおけるスキャニングパートがさらに速くなれば、さらに高い割合の実験時間を化学パートに費やされる。この問題は、常に１つのセルが撮像されている間に複数のセルが同時に処理されているようにシステムを構成することにより緩和することができる。図４３は、二元フローセルホルダを概略的に示す。
【０１８８】
説明するシステムにおいては、下方から照射がなされ、対物レンズが上方に示されているが、このシステムは、上方から照射がなされ、検出システムを下方に有するシステムに転換することができる。上記を参照されたい。加熱および照射は、基材のいずれの面に向けても行うことができるので、底面を加熱して上面を照射するシステムであっても、本発明の範囲に含まれる。本発明の範囲に含まれるシステムの作動は、以下の一般的な方法において詳細に説明する。
【０１８９】
［本発明のシステムをシーケンシングに使用する例］
以下は、本発明のシステムで選択的に適用することができる一般的な技法や手法の例（例えば、核酸クラスタの形成）である。これらの説明および例は、必ずしも本発明のシステムを制限するものではなく、特に示さない場合にも利用され得ることを理解されたい。核酸クラスタの形成およびシーケンシングの方法は、国際特許出願０７０１０２５１号明細書にすべて記述され、この方法のプロトコールの全体が本願の参考となるが、これらのプロトコール要素のいくつかを以下にまとめる。
【０１９０】
［基材の準備および核酸クラスタの形成］
｛ガラスチップのアクリルアミドコーティング｝
シーケンシングを行うために核酸の結合に使用される固体の支持体は、選択的に、Ｓｉｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社（スウェーデン）から調達されるような８チャネルのガラスチップとすることができる。しかし、本発明の実験条件および手順は、他の個体の支持体にも容易に適用することができる。いくつかの実施例において、チップは、ｎｅａｔＤｅｃｏｎで３０分間、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ2Ｏで３０分間、ＮａＯＨで１５分間、０．１Ｎ  ＨＣｌで１５分間およびｍｉｌｌｉＱ  Ｈ2Ｏで３０分間、洗浄された。ポリマ溶液の準備が必要とされる。
１０ｍｌの２％ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｉｘに対して、
・ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ2Ｏ中における１０ｍｌの２％アクリルアミド溶液
・ＤＭＦ中における１６５μｌの１００ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）溶液（２３５μｌのＤＭＦ中に２３．５ｍｇ）
・１１．５μｌのＴＥＭＥＤ
・ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ2Ｏ中における１００μｌの５０ｍｇ／ｍｌ過硫酸カリウム（４００μｌのＨ2Ｏ中に２０ｍｇ）
これらの実施例において、アクリルアミドの溶液は、最初にアルゴンを使って１５分間脱気した。アクリルアミドの溶液に、ＢＲＡＰＡ、ＴＥＭＥＤおよび過硫酸カリウムの溶液を首尾よく加えた。続いて、室温で１時間３０分、重合を行った。その後、ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ2Ｏで３０分間チャネルを洗浄し、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液を満たして必要とされるまで貯蔵した。
【０１９１】
｛Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）の合成｝
【０１９２】
【化１】
2009532031.tif 000019
【０１９３】
Ｎ−Ｂｏｃ−１，５−ジアミノペンタントルエンスルホン酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社から調達した。塩化ブロモアセチルおよび塩化アクリロイルは、Ｆｌｕｋａ社から調達した。すべての他の試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ製品であった。
【０１９４】
【化２】
2009532031.tif 000020
【０１９５】
硫酸Ｎ−Ｂｏｃ−１，５−ジアミノペンタントルエン（５．２ｇ，１３．８８ｍｍｏｌ）と、０℃でＴＨＦ（１２０ｍｌ）中のトリエチルアミン（４．８３ｍｌ，２．５当量）と、を攪拌した懸濁液に、等圧滴下漏斗を介して、塩化アクリロイル（１．１３ｍｌ，１当量）を１時間に亘って添加した。次に、この反応混合物を室温で攪拌し、反応の進行はＴＬＣ（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）で監視した。２時間後、反応で生成された塩を濾過し、濾液をエバポレータで乾燥させた。この残渣をフラッシュ・クロマトグラフィ（酢酸エチルで６０％まで傾斜される純粋な石油エーテル）で精製し、ベージュ色の固体として２．５６ｇ（９．９８ｍｍｏｌ，７１％）の生成物２を生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）の結果は、１．２０−１．２２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．２９−１．４３（ｍ，１３Ｈ，ｔＢｕ，２ｘＣＨ２），２．８６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１２．９Ｈｚ，ＣＨ２），３．０７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１２．９Ｈｚ，ＣＨ２），５．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１０．１Ｈｚ，ＣＨ），６．０５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，ＣＨ），６．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，ＣＨ），６．７７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，ＮＨ），８．０４（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）であった。Ｃ１３Ｈ２４Ｎ２Ｏ３  ２５６に対して計算された質量（エレクトロスプレー＋）は、２７９（２５６＋Ｎａ＋）であった。
【０１９６】
【化３】
2009532031.tif 000021
【０１９７】
生成物２（２．５６ｇ，１０ｍｍｏｌ）は、トリフルオロ酢酸：ジクロロメタン（１：９，１００ｍｌ）中に溶解し、室温で攪拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール９：１）で監視した。完成後、反応混合物をエバポレータで乾燥させ、この残渣をトルエンと一緒に３回蒸発させ、次いでフラッシュ・クロマトグラフィ（酢酸エチルで６０％まで傾斜される純粋な石油エーテル）で精製した。白色粉末として２．４３ｇ（９ｍｍｏｌ，９０％）の生成物３が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）の結果は、１．２９−１．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．５２（ｑｕｉｎｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，ＣＨ２），１．６１（ｑｕｉｎｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ＣＨ２），２．９２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＣＨ２），３．２１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ２），５．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１０．１Ｈｚ，ＣＨ），６．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，ＣＨ），６．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，ＣＨ）であった。Ｃ８Ｈ１６Ｎ２Ｏ  １５６に対して計算された質量（エレクトロスプレー＋）は、１７９（１５６＋Ｎａ＋）であった。
【０１９８】
生成物３（６．１２ｇ，２２．６４ｍｍｏｌ）と、ＴＨＦ（１２０ｍｌ）中のトリエチルアミン（６．９４ｍｌ，２．２当量）との懸濁液に、−６０℃（デュワー瓶中でｃａｒｄｉｃｅおよびイソプロパノールの浴）で、等圧滴下漏斗を介して、塩化ブロモアセチル（２．０７ｍｌ，１．１当量）を１時間に亘って添加した。次いで、この反応混合物を室温で一晩攪拌し、反応の終了は、翌日ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール＝９：１）によってチェックした。この反応で生成された塩を濾過し、反応混合物をエバポレータで乾燥させた。この残渣をクロマトグラフィで精製した（メタノールで５％まで傾斜される純粋なジクロロメタン）。白色粉末として３．２ｇ（１１．５５ｍｍｏｌ，５１％）の生成物１（ＢＲＡＰＡ）が得られた。石油エーテル：酢酸エチル中で行ったさらなる再結晶化により、３ｇの生成物１が得られた。１Ｈ  ＮＭＲの結果（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）の結果は、１．２１−１．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．３４−１．４８（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ２），３．０２−３．１２（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ２），３．８１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），５．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８５Ｈｚ，ＣＨ），６．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．９Ｈｚ，ＣＨ），６．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１６．９Ｈｚ，ＣＨ），８．０７（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２７（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）であった。Ｃ１０Ｈ１７ＢｒＮ２Ｏ２  ２７６または２７８に対して計算された質量（エレクトロスプレー＋）は、２７９（２７８＋Ｈ＋），２９９（２７６＋Ｎａ＋）であった。
【０１９９】
｛クラスタ形成プロセス｝
流体工学
クラスタ形成プロセス中のすべての流体ステップにおいて、チュービングＩｓｍａｔｅｃ  Ｒｅｆ  ０７０５３４−０５１（橙／黄色，０．５１ｍｍの内径）を備えた蠕動ポンプＩｓｍａｔｅｃ  ＩＰＣを選択的に使用する。このポンプは、順方向に送るように働く（流体を吸引する）。蠕動ポンプチュービングの出口で使用済みの溶液を回収するために廃液皿を設ける。各チャネル内で溶液の回収ポンピングを監視するために、プロセスの各ステップの間に、１チップ入口チュービング当たり１チューブを使って、種々の使用済み溶液を８チューブマイクロチューブストリップス中に分注する。１チャネル当たりに要求される量は、各ステップ毎に特定される。
【０２００】
熱制御
クラスタ形成プロセス中に、様々な温度で定温放置することができるように、ＳｉｌｅｘチップをＭＪ−Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラの頂部に設置する。このサーモサイクラの平坦加熱ブロックに結合された特注の銅製ブロックの頂部にチップが位置する。このチップは、小さいＰｅｒｓｐｅｘブロックで覆われ、粘着テープによって所定の位置に保たれる。ポンプとサーモサイクラは共にコンピュータランスクリプトによって制御され、このコンピュータランスクリプトは、ユーザに各ステップ間で溶液を変えることを促す。
【０２０１】
ＳＦＡコーティングされたチップの表面へのプライマのグラフト重合
ＳＦＡコーテンングされたチップは、上記に示したように、変更したＭＪ−Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラ上に配置され、蠕動ポンプに取付けられる。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に０．５μＭの順方向プライマと、０．５μＭの逆方向プライマからなるグラフト混合物は、２０℃において、６０μｌ／分の流速で７５秒間、チップのチャネル内に圧送される。次いで、サーモサイクラを５１．６℃まで加熱し、この温度で１時間チップを定温貯蔵する。この時間中に、グラフト混合物は、１８サイクルの圧送を受ける。グラフト混合物は、１５μｌ／分で２０秒間圧送され、次いで、この溶液は、順方向および逆方向に（１５μｌ／分で５秒間順方向に、１５μｌ／分で５秒間逆方向に）１８０秒間圧送される。１８サイクルの圧送後に、チップは、１５μｌ／分で３００秒間、５１．６℃において、５ｘＳＳＣ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に圧送することによって洗浄される。次いで、サーモサイクラは、２０℃まで冷却される。
【０２０２】
鋳型ＤＮＡのハイブリダイゼーション
移植チップにハイブリッドされるＤＮＡの鋳型は、５ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中における要求濃度（最新は、０．５〜２ｐＭ）に希釈される。希釈したＤＮＡを、加熱ブロック上で１００℃において５分間加熱し、２本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションに適する１本鎖に変性させる。次に、このＤＮＡを、氷／水浴で３分間急冷する。このＤＮＡを含むチューブは、種々の凝縮物を回収するために、しばらく回転させて遠心力が働くようにし、次いで、冷却前の８チューブストリップに移して直ぐに使用する。
【０２０３】
上記移植されたチップは、５ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中で、２０℃において、６０μｌ／分で７５秒間圧送することによって準備される。次に、サーモサイクラは、９８．５℃まで加熱され、変性したＤＮＡは、１５μｌ／分で３００秒間圧送される。ハイブリダイゼーション混合物を加熱することによって形成される泡を介して洗い流されるように、１００μｌ／分で１０秒間、追加的な圧送が行われる。続いて、この温度は、９８．５℃に３０秒間保ち、その後、１９．５分かけて４０．２℃までゆっくりと冷却する。このスクリプトは、次のステップに繋がる。
【０２０４】
増幅
ハイブリッド鋳型分子は、移植プライマおよび熱的安定ポリメラーゼを使う架橋ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。１０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、１Ｍベタインおよび１．３％ＤＭＳＯからなる増幅緩衝液は、４０．２℃において、１５μｌ／分で２００秒間、チップ内に圧送される。その後、２００μＭ  ｄＮＴＰｓおよび２５Ｕ／ｍｌ  Ｔａｑポリメラーゼを追加した上記の緩衝液の増幅混合物は、４０．２℃において、６０μｌ／分で７５秒間、圧送される。次に、サーモサイクラは、７４℃まで加熱され、この温度に９０秒間保たれる。このステップは、ＤＮＡ鋳型鎖がハイブリダイズされる表面の結合されたプライマの伸長を可能にする。次に、サーモサイクラは、９８．５℃に４５秒間（架橋された鎖の変性）、５８℃に９０秒間（表面のプライマへの鎖のアニーリング）、および７４℃に９０秒間（プライマの伸長）、加熱することによって、５０サイクルの増幅を実行する。９８．５℃における定温放置の終わりに、未使用のＰＣＲ混合物が１５μｌ／分で１０秒間、チップのチャネル内に圧送される。このステップは、ＰＣＲの各サイクルに未使用の試薬を提供するとともに、表面から分離したＤＮＡ鎖およびプライマを除去してクラスタ間に汚染を導いてしまうことがある。熱サイクルの終わりに、チップは２０℃まで冷却される。次に、このチップは、１５μｌ／分で３００秒間、７４℃において、０．３ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中に圧送することによって洗浄される。次に、サーモサイクラは、２０℃まで冷却される。
【０２０５】
線形近似
０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムおよび０．１Ｍエタノールアミンからなる線形混合物は、２０℃において、１５μｌ／分で１時間、チップ内に圧送される。次に、このチップは、２０℃において、１５μｌ／分の水を３００秒間圧送することによって洗浄される。
【０２０６】
ブロッキング（選択的）
このステップは、ジデオキシヌクレオチドを（グラフト重合されたプライマおよび増幅したクラスタ分子の両方の）ＤＮＡ鎖の３’ＯＨ末端に取り込むために、末端転写酵素を使用する。
【０２０７】
５０ｍＭ  酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ジチオトレイトール（ｐＨ７．９）および２５０μＭ  ＣｏＣｌ２からなるブロッキング緩衝液が、２０℃において、１５μｌ／分で２００秒間、チップ内に圧送される。その後、２．４μＭ  ｄｄＮＴＰｓおよび２５０Ｕ／ｍｌ  末端転写酵素を加えた上記の緩衝液のブロッキング混合物が、３７．７℃において、１５μｌ／分で３００秒間、圧送される。サーモサイクラは、３７．７℃に３０分間保たれ、この間に、ブロッキング混合物は、３分ごとに、１５μｌ／分で２０秒間チップ内に圧送される。このチップは、ブロッキング後、２０℃において、１５μｌ／分で３００秒間、０．３ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎを圧送ることによって洗浄される。
【０２０８】
クラスタの変性およびシーケンシングプライマのハイブリダイゼーション
このステップは、増幅され、線形化され、さらにブロックされたクラスタの鎖のうちの１つを変性させるとともに洗い流すためにＮａＯＨを使用する。ＮａＯＨを除去するように洗浄した後、シーケンシングプライマは、表面上に残された一本鎖上にハイブリダイズされる。
【０２０９】
クラスタ中の二本鎖ＤＮＡは、２０℃において、１５μｌ／分で３００秒間、０．１Ｎ  ＮａＯＨを圧送することによって変性される。シーケンシングプライマは、５ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中で０．５μＭに希釈され、２０℃において、１５μｌ／分で３００秒間、チャネル内に圧送される。次に、サーモサイクラは、６０℃まで加熱され、この温度に１５分間保たれる。次に、サーモサイクラが４０．２℃まで冷却され、チップは、０．３ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎを圧送することによって、１５μｌ／分で３００秒間洗浄される。
【０２１０】
クラスタは、（例えば、本発明のシステムおよび装置を使用する）第１のサイクルのシーケンシング酵素反応用に準備される。
【０２１１】
このプロセスで使用されるＤＮＡシーケンスは、端部が移植プライマと相補的な４００塩基の単一鋳型シーケンスである。二本鎖ＤＮＡは、上記のように変性された。
【０２１２】
プライマの移植
プライマは、典型的には、開裂に要求される種々の特定のシーケンスまたは変更を取り込む５’−ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。これらのシーケンスおよびサプライヤは、これらが使用される実験に応じて変化し、この場合には、鋳型二本鎖の５’末端と相補的であった。
【０２１３】
線形化されたクラスタのシーケンシング
増幅されたクラスタは、移植クラスタのうちの１つの内部にジオール連鎖を含んでいた。
ジオール連鎖は、固相増幅法に使用されるプライマのうちの１つの内部に適当な連鎖を含ませることによって、導くことができる。
【０２１４】
種々の所望の鋳型固有シーケンスを含む適当なプライマは、商業的な供給業者（例えば、Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，ＡＴＤ）から調達可能な部品を使用する標準的な自動ＤＮＡ合成技術によって製造され得る。
【０２１５】
開裂可能なジオール含有プライマは、以下の構造を典型的に有する。
【０２１６】
５’−ホスホロチオエート−アーム２６−ジオール２２Ａ−シーケンス−３’ＯＨ
ここでの「シーケンス」は、鋳型にハイブリダイゼーションされて増幅されることができるヌクレオチドのシーケンスを表す。
【０２１７】
アーム２６およびジオール２２Ａの成分（米国メリーランド州所在のＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，から調達可能）の構造は以下のようである。
【０２１８】
【化４】
2009532031.tif 000022
【０２１９】
このようなジオール連鎖を含む生成物は、上記に示したように過ヨウ素酸を使って開裂させることができ、この結果、上記のようにハイブリダイズされた一本鎖ポリヌクレオチドが生じる。
【０２２０】
［ＤＮＡシーケンシングサイクル］
シーケンシングは、国際特許出願２００４／０１８４９３号明細書に記載されるように準備された修飾ヌクレオチドを使用して行い、４つの異なる市販の蛍光体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）で標識された。
【０２２１】
変種の９°Ｎポリメラーゼ酵素（三本鎖変異  Ｌ４０８Ｙ／Ｙ４０９Ａ／Ｐ４１０ＶおよびＣ２２３Ｓを含むｅｘｏ−ｖａｒｉａｎｔ）を、ヌクレオチド取り込みステップに使用した。
【０２２２】
ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘ、ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０，５０ｍＭ  ＮａＣｌ）ｐｌｕｓ１１０ｎＭ  ＹＡＶ  ｅｘｏ−Ｃ２２３Ｓ、および１μＭ  標識された４つの修飾ヌクレオチドの各々を、クラスター化された鋳型に適用し、４５℃まで加熱した。
【０２２３】
鋳型を４５℃に３０分間維持し、２０℃まで冷却し、ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、続いて５ｘＳＳＣ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。その後、鋳型をイメージング緩衝液（溶解したばかりの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０，３０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム）に晒した。鋳型は、室温において４色でスキャニングした。
【０２２４】
その後、以下のように、開裂および取り込みのシーケンシングサイクルに鋳型を晒した。
【０２２５】
｛開裂｝
・開裂緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４，０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でプライミングする。６０℃に加熱する。
・開裂混合物（開裂緩衝液中に１００ｍＭ  ＴＣＥＰ）でクラスタを処理する。
・４分毎に未使用の緩衝液を圧送し、全体で１５分間待つ。
・２０℃に冷却する。
・酵素化学上の緩衝液で洗浄する。
・５ｘＳＳＣ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。
・イメージング緩衝液でプライミングする。
・室温において４色でスキャニング。
【０２２６】
｛取り込み｝
・ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒでプライミングし、６０℃に加熱する。
・ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘで処理する。４分毎に未使用の緩衝液を圧送して全体で１５分間待つ。
・２０℃に冷却する。
・ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄する。
・５ｘＳＳＣ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。
・イメージング緩衝液でプライミングする。
・室温において４色でスキャニング。
・要求されるのと同じ数のサイクルに亘って、取り込み及び開裂のプロセスを繰り返す。
・取り込まれたヌクレオチドは、上記の蛍光撮像装置を使って検出された。
【０２２７】
代替的に、フローセルは、完全に自動でシーケンシングすることができ、第１の取り込みは、以下に記述するように、この器具上に行われる。
【０２２８】
器具マニホールド上にフローセルを設定した後、以下に説明するシーケンシングサイクルに鋳型を晒すことができる。すなわち、第１の塩基の取り込み、結像次いで交互開裂、結像および取り込み、要求数と同じ数のシーケンシングサイクルに亘る結像ステップである。
【０２２９】
第１の塩基の取り込み
・室温で１０００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを圧送する。
・温度を５５℃に設定して保つ。
・２分間待つ。
・６００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘを圧送する。
・４分間待つ。
・２００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘを圧送する。
・４分間待つ。
・２００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘを圧送する。
・４分間待つ。
・温度を２２℃に設定する。
・２分間待つ。
・６００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを圧送する。
・６００μｌの高塩濃度緩衝液を圧送する。
・８００μｌのｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｘを圧送する。
・能動冷却を止める。
【０２３０】
結像ステップ
開裂
・１０００μｌの開裂緩衝液を室温で圧送する。
・温度を５５℃に設定して保つ。
・２分間待つ。
・６００μｌの開裂混合物を圧送する。
・４分間待つ。
・２００μｌの開裂混合物を圧送する。
・４分間待つ。
・２００μｌの開裂混合物を圧送する。
・４分間待つ。
・温度を２２℃に設定して保つ。
・２分間待つ。
・６００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを圧送する。
・６００μｌの高塩濃度緩衝液を圧送する。
・８００μｌのｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｘを圧送する。
・能動冷却を止める。
【０２３１】
イメージングステップ
取り込み
・１０００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを室温で圧送する。
・温度を５５℃に設定して保つ。
・２分間待つ。
・６００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘを圧送する。
・４分間待つ。
・２００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘを圧送する。
・４分間待つ。
・２００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘを圧送する。
・４分間待つ。
・温度を２２℃に設定して保つ。
・２分間待つ。
・６００μｌのｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを圧送する。
・６００μｌの高塩濃度緩衝液を圧送する。
・８００μｌのｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｘを圧送する。
・能動冷却を止める。
【０２３２】
上記の完全ではない自動化プロセスに用いる各チップの各タイルは、標識されたヌクレオチドに対応する４色の各々で記録された。これらの画像を分析して、各クラスタに対して最も明るい色を拾い出し、その画像強度の分析を使って、各サイクルで各クラスタについての塩基を呼び出した。各サイクルからの画像は、各クラスタに対応するシーケンスを得るように共局在化された。各クラスタのシーケンスは周知のもので、かつ上記の実験においてすべてのクラスタについて同じであれば、ヌクレオチド取り込みの各サイクルについて、誤差率（すなわち、正しい手順でクラスタが呼び出されない）を分析することができるであろう。本実験の最初の２０サイクルについて、誤差率は１％より低かった。このことは、単一鋳型の周知のシーケンスが正しく呼び出されたことを意味する。
【０２３３】
上述の発明は、明確性および理解されることを目的としていくつかの詳細を記述したが、当業者であれば、この開示を読めば、本発明の特許請求の範囲を逸脱することなく形態および詳細に様々な変更がなされ得ることが明らかであろう。例えば、上記に説明したすべての技術および装置は、様々に組み合わせて使用することができる。各個別の発行物、特許、特許明細書または他の文書が参照のみを目的として取り込まれることが個別に示される程度に、この明細書に引用されたすべての発行物、特許、特許明細書または他の文書は、全体が本願の参照とされる。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】本発明のシステムの一例における主な部品を概略的に示す図。
【図２】囲いのシャーシないし覆いを取り払った本発明のシステムの一例を示す図。
【図３】本発明のシステムに含まれる、フローセル、レンズ、対物レンズおよび光ファイバレーザ装置の一例を示す図。
【図４Ａ】フローセルの形状の一例
【図４Ｂ】フローセルの形状の一例
【図４Ｃ】フローセルの形状の一例
【図４Ｄ】フローセルの形状の一例
【図５Ａ】本発明のシステムのフローセルを形成する方法の１つを示す図。
【図５Ｂ】Ｆｏｔｕｒａｎガラスの遷移スペクトラムを示す図。
【図６Ａ】フローセルを構築するエッチング方法の一例を示す図。
【図６Ｂ】フローセルを構築するエッチング方法の一例を示す図。
【図６Ｃ】フローセルを構築するエッチング方法の一例を示す図。
【図６Ｄ】フローセルを構築するエッチング方法の一例を示す図。
【図６Ｅ】フローセルを構築するエッチング方法の一例を示す図。
【図７Ａ】本発明のシステムにおける流体を流す部品／装置の概略図（圧送構成）。
【図７Ｂ】本発明のシステムにおける流体を流す部品／装置の概略図（吸引構成）。
【図７Ｃ】本発明のシステムにおける流体を流す部品／装置の概略図（吸引構成）。
【図８】本発明の他の部品から切り離して本発明のシステムの加熱／冷却部品を示す図。
【図９Ａ】本発明のフローセルおよびフローセルホルダの構成を概略的に示す図。
【図９Ｂ】本発明のフローセルおよびフローセルホルダの構成を概略的に示す図。
【図９Ｃ】本発明のフローセルおよびフローセルホルダの構成を概略的に示す図。
【図９Ｄ】本発明のフローセルおよびフローセルホルダの構成を概略的に示す図。
【図１０Ａ】加熱／冷却部品およびフローセルホルダの移動を示す本発明の一実施例。
【図１０Ｂ】一例としてのシステムにおける他の部品と関連さえて加熱／冷却部品を概略的に示す図。
【図１１Ａ】光学レンズ、光ファイバレーザマウント、加熱器／冷却器およびフローセルホルダ部品を保持するフレームワークの一例を示す図。
【図１１Ｂ】水平位置を調節するフローセルの構成の一例を示す図。
【図１２】本発明のシステムのフレームワークおよびハウジングを示す本発明のシステムの一実施例を示す図。
【図１３】本発明のシステムのカメラ、光源および他の部品の選択的な構成を示す図。
【図１４】本発明のシステムのカメラ、光源および他の部品の選択的な構成を示す図。
【図１５】本発明のシステムのカメラ、光源および他の部品の選択的な構成を示す図。
【図１６】本発明のシステムのカメラ、光源および他の部品の選択的な構成を示す図。
【図１７】ここでのシステムの一実施例におけるＴＩＲＦレーザについてのビームの形状および寸法を示す図。
【図１８】ここでのシステムの一実施例におけるＴＩＲＦレーザについてのビームの形状および寸法を示す図。
【図１９】ここでのシステムの一実施例におけるＴＩＲＦレーザについてのビームの形状および寸法を示す図。
【図２０】ここでのシステムおよび装置と共に使用するＴＩＲＦプリズムの選択的な一実施例を示す図。
【図２１】マルチモードファイバ出力の端部を研磨することによって正方形のレーザビームをつくり出すことを示す図。
【図２２Ａ】ここでの様々な実施例に選択的に使われるフィルタおよびフィルタホイールの構成の一例を示す図。
【図２２Ｂ】レーザの波長の位置で励起される４つの例示的な蛍光体との関連で図２２Ａのフィルタのスペクトラムを示す図。
【図２３】本発明のシステムにおける光学部品の一例としての公称１Ｇ設計３０ｘＫ４  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒａｙ  ｔｒａｃｅを示す図。
【図２４】本発明のシステムの一例の３０ｘＫ４結像性能を示す図。
【図２５】ここでのシステムの一例における自動焦点特性を概略的に示す図。ここ
【図２６】ここでのシステム／装置における様々な実施例によってつくられた集光した測定および集光していない測定の写真図。
【図２７】ここでのシステム／装置における様々な実施例によってつくられた集光した測定および集光していない測定の写真図。
【図２８】自動集光レーザビームを図解して示す図。
【図２９】本発明の実施例によって検出された全クラスタ数および最小クラスタ領域の関数として検出された核酸クラスタの数のグラフ。
【図３０】核酸クラスタの概要および本発明のシステム／装置でのシーケンシングを示す図。
【図３１】核酸クラスタの概要および本発明のシステム／装置でのシーケンシングを示す図。
【図３２】核酸クラスタの概要および本発明のシステム／装置でのシーケンシングを示す図。
【図３３】円形の光ファイバに対して３つの異なる形態の物理変形がファイバから出現するビームに与える効果を示す図。
【図３４】長方形の光ファイバに対して３つの異なる形態の物理変形がファイバから出現するビームに与える効果を示す図。ファイバを振動させること又は絞ることにより結像の全時間に亘ってファイバから出現する光を一様にすることを示す図。
【図３５Ａ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｂ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｃ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｄ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｅ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｆ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｇ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｈ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｉ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｊ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｋ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３５Ｌ】様々なモードスクランブルが多数の異なる光ファイバから出現する光に与える効果を示す図。
【図３６】本発明の二元カメラシステムの可能な配置の一実施例を示す図。
【図３７】同じ画像に２色で同時に記録するための２つのカメラを含む本発明の一実施例を示す図。
【図３８】λ／２波長板を概略的に示す図。
【図３９】異なる方向に向けられた扇形を含むλ／２修飾波長板を概略的に示す図。
【図４０】本発明の一実施例におけるモード波長板修飾混合システムの概要を示す図。
【図４１】マルチモード光ファイバからの照射フットプリント領域と、波長板の使用を介しての光モードの混合からの結果と、の写真図。
【図４２】波長板の使用を介してのマルチモードの混合からほぼ一様なレーザフットプリント領域を示す図。
【図４３】機器のスキャニング時間を最大化するように化学作用を並列に行う本発明の二元フローセルホルダの実施例。
【図４４Ａ】底流フローセル、プリズム、および側／頂面ＴＩＰＦ照射の実施例を示す図。
【図４４Ｂ】底流フローセル、プリズム、および側／頂面ＴＩＰＦ照射の実施例を示す図。
【図４４Ｃ】底流フローセル、プリズム、および側／頂面ＴＩＰＦ照射の実施例を示す図。
【図４４Ｄ】底流フローセル、プリズム、および側／頂面ＴＩＰＦ照射の実施例を示す図。
【図４４Ｅ】底流フローセル、プリズム、および側／頂面ＴＩＰＦ照射の実施例を示す図。
【図４４Ｆ】底流フローセル、プリズム、および側／頂面ＴＩＰＦ照射の実施例を示す図。
【図４５】フローセルおよびプリズムの下にある温度調整部品の一例を示す図。
【図４６】底流フローセルなどと共に使用する流体弁およびマニホールドの一例を示す図。
【図４７】本発明の流体弁の一例を示す図。
【図４８】本発明の可能な二元フローセルの構造を示す図。
【図４９Ａ】本発明の底流フローセルと共に使用することができる底部温度調整構造の一例を示す図。
【図４９Ｂ】本発明の底流フローセルと共に使用することができる底部温度調整構造の一例を示す図。
【図４９Ｃ】本発明の底流フローセルと共に使用することができる底部温度調整構造の一例を示す図。
【図４９Ｄ】本発明の底流フローセルと共に使用することができる底部温度調整構造の一例を示す図。
【図４９Ｅ】本発明の底流フローセルと共に使用することができる底部温度調整構造の一例を示す図。
【図４９Ｆ】本発明の底流フローセルと共に使用することができる底部温度調整構造の一例を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３５Ｈ】
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【図３５Ｉ】
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【図３５Ｊ】
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【図３５Ｋ】
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【図３５Ｌ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４４Ｆ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図４９Ｅ】
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【図４９Ｆ】
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【国際調査報告】
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2009532031.tif 000110
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