(57)【要約】  本発明は、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体の、添加物組成物または燃料中での脱泡剤としての利用、燃料の脱泡方法、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体と少なくとも一種の他の燃料添加物を含む添加物及び燃料組成物、及び少なくとも一種の燃料組成物の製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体の、添加物組成物または燃料中での脱泡剤としての利用。
【請求項２】
上記燃料がディーゼル燃料である請求項１に記載の利用。
【請求項３】
上記少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体が、燃料に対して０．１〜１００ｐｐｍの量で使用される請求項１又は２に記載の利用。
【請求項４】
少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を燃料に添加することを含む燃料の脱泡方法。
【請求項５】
上記燃料がディーゼル燃料である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体が、燃料に対して０．１〜１００ｐｐｍの量で使用される請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体及び少なくとも一種の他の燃料添加物を含むことを特徴とする添加物組成物。
【請求項８】
少なくとも一種の燃料を主成分として含み、さらに少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体及び少なくとも一種の他の燃料添加物を含むことを特徴とする燃料組成物。
【請求項９】
上記組成物が少なくとも一種の界面活性剤を含む請求項７又は８に記載の添加物組成物または燃料組成物。
【請求項１０】
上記組成物が少なくとも一種の乳化破壊剤を含む請求項７又は８に記載の添加物組成物または燃料組成物。
【請求項１１】
燃料または燃料組成物に、
（ａ）少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体及び少なくとも一種の他の燃料添加物を混合するか、
（ｂ）請求項７、９及び１０のいずいずれか一項に記載の添加物組成物を混合することを特徴とする、少なくとも一種の燃料組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体の、添加物組成物または燃料中での脱泡剤としての利用、燃料の脱泡方法、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体と少なくとも一種の他の燃料添加物を含む添加物及び燃料組成物、さらに少なくとも一種の燃料組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
燃料に使用される炭化水素混合物、例えば芳香族化合物や軽油、灯油などは、貯蔵槽や自動車の燃料タンクなどの貯蔵容器に入れると、空気と一緒となって発泡するといった不快な性質を有している。この結果、容器への移送が遅れるとともに、充填量も不満足なものとなる。このためディーゼル燃料には通常、脱泡剤が添加されている。これらの脱泡剤は最小濃度でも活性を示す必要があり、またエンジン内でのディーゼル燃料の燃焼で、有害物を形成したり、燃料の燃焼に悪影響を与えてはならない。このような活性脱泡剤が特許文献中に開示されている。
【０００３】
例えば、ケイ素系の消泡剤や脱泡剤が知られている。ＤＥ１０３１３８５３Ａには、例えば、有機機能的に変性されたポリシロキサンとその液体燃料、特にディーゼル燃料の脱泡への利用が開示されている。
【０００４】
ＧＢ−Ｂ２１７３５１０は、ディーゼル燃料またはジェット燃料の脱泡方法に関するもので、ケイ素ポリエーテルコポリマー系の消泡剤が燃料に添加されている。
【０００５】
既知の消泡剤の欠点は、湿ったディーゼル燃料に対する脱泡性能が弱いことである。湿ったディーゼル燃料とは、約２５０ｐｐｍの水分を含む燃料をいう。この水は、貯蔵槽中で燃料中に混入する結露水であったり、水槽からの水除去が不完全なために起こる油タンカーで輸送中に燃料に混入する水であったりする。
【０００６】
ＵＳ５５４２９６０によれば、フェノール誘導体（より好ましくはオイゲノール）が、湿ったディーゼル燃料に比較的良好な脱泡性能を示すことが知られている。
【０００７】
上記のディーゼル燃料用泡剤や他の既存の消泡剤は、色々な短所を有している。例えば、代表的なポリシロキサン−ポリオキシアルキレンコポリマーのケイ素含量は、１０〜１５重量％、場合によれば２０〜２５重量％に達する。このようにケイ素含量の高い化合物は、燃焼によりエンジン中に好ましくない二酸化ケイ素の析出をもたらす場合があるため、ケイ素比率の低いディーゼル燃料用脱泡剤、または少なくともこれらの添加物の使用濃度を低下できるほど消泡作用及び脱泡作用が改善されたディーゼル燃料用脱泡剤が求められている。
【０００８】
既存の消泡剤のもう一つの欠点は、原料ディーゼル油の性質の向上のために添加される添加物パッケージとのなじみ（混和性）が、多くの場合悪いことである。添加物パッケージとは、いろいろな添加物、例えば燃焼性能改善剤、煤煙生成減少剤、有毒排ガス生成減少剤、エンジンおよびその部材の腐食防止剤、界面活性物質、潤滑剤などの混合物をいう。このような添加物パッケージは、例えば、ＪＰ−０５１３２６８２、ＧＢ−２２４８０６８や、Journal Mineraloltechnik, 37(4), 20に記載されている。添加物パッケージ中の添加物は、有機溶媒に溶解されて濃縮物として貯蔵され、これが原料のディーゼル燃料に添加される。極性基を持つ消泡剤は、多くの場合、これらの添加物パッケージに均一に溶解せず、保存中に分離する。
【０００９】
これに対する対策の一つは、望ましい性質を有する天然型の添加物を使用することである。例えばタンパク質の中には、いろいろな望ましい物質が存在する。
【００１０】
タンパク質は、アミノ酸からなる高分子である。これらのポリペプチド鎖の長さは、５０未満、例えば１０アミノ酸から、１０００アミノ酸以上の範囲に及ぶ。
【００１１】
タンパク質の作用モードに関しては、その三次元構造が特に重要である。このタンパク質の構造は、一次構造や二次構造、三次構造、四次構造で示される。一次構造とは、ポリペプチド鎖内の個々のアミノ酸配列のことである。タンパク質中のアミノ酸の三次元配列は、二次構造と呼ばれる。三次構造は、二次構造を有するポリペプチド鎖の三次元配列である。これは、アミノ酸残基（即ち、側鎖）間に作用する力と結合により決められる。三次元配置をもつ複数の分子がある機能単位を持つとき、これを四次構造と呼ぶ。  
タンパク質は、主として二つのグループに分けられる。一つは球状タンパク質で、その三次または四次構造は、概ね球状のまたは梨状の外観をもち、水や塩溶液に通常、容易に溶解する。もう一つは繊維状タンパク質で、糸状または繊維状構造を有し、通常不溶性で、支持体や骨格物質に分類される。
【００１２】
ハイドロフォビン類は、約１００〜１５０個のアミノ酸からなる小型のタンパク質であり、糸状菌、例えば分裂酵母に特徴的なものである。これらは、一般に８個のシステイン単位を有している。
【００１３】
ハイドロフォビン類は、極めて界面に親和性を示し、このため両親媒性の膜を形成して界面の性質を変化させるための表面コーティングに適している。例えば、テフロン（登録商標）をハイドロフォビンでコーティングすると、親水性表面が得られる。
ハイドロフォビン類は、天然源から単離可能である。また、ハイドロフォビンやその誘導体の製造方法も知られている。
【００１４】
例えばＤＥ１０２００５００７４８０．４には、ハイドロフォビンとその誘導体の製造方法が開示されている。表面コーティングに適したハイドロフォビンの特異な性質のため、これらのタンパク質はいろいろな工業用途における利用可能性が極めて高い。従来技術では、ハイドロフォビンを種々の用途に使用している。ＷＯ９６／４１８８２には、疎水性表面の親水化や、親水性の基材の耐水性の改良、水中油型乳化液または油中水型乳化液の製造等のために、ハイドロフォビンを乳化剤、増粘剤、表面活性物質としての利用することが提案されている。軟膏やクリームの製造などの製薬分野での利用や、皮膚の保護やヘアシャンプーまたはヘアリンスの製造など化粧品分野での利用も提案されている。ＷＯ９６／４１８８２ではまた、ハイドロフォビンを含む組成物、特に製薬用途の組成物の特許が請求されている。
【００１５】
ＥＰ−Ａ１２５２５１６には、窓やコンタクトレンズ、バイオセンサ、医療器具、実験容器または保存容器、船殻、固体粒子、または自動車のフレームやシャーシへの、３０〜８０℃の温度でのハイドロフォビン含有溶液の塗布が開示されている。
【００１６】
ＷＯ０３／５３３８３には、化粧品用途においてケラチン材料の処理にハイドロフォビンを用いることが開示されている。
【００１７】
ＷＯ０３／１０３３１には、ハイドロフォビンが表面活性を持つことが開示されている。例えば、ハイドロフォビンを塗布したセンサーが、例えば試験電極として開示されており、この電極には、他の物質、例えば電気活性物質、抗体または酵素が非共有的に結合している。
【００１８】
ＷＯ２００４／０００８８０にはまた、ハイドロフォビンまたはハイドロフォビン様物質を用いる表面コーティングが開示されている。また、水中油型または油中水型の乳化液がハイドロフォビンの添加により安定化されることが開示されている。
【００１９】
ＷＯ０１／７４８６４は、ハイドロフォビン様タンパク質に関するものであり、ここには、これらが分散液や乳化液の安定化に使用できることが示されている。
【００２０】
ＥＰ０５００７２０８．１では、タンパク質、特にハイドロフォビンまたはその誘導体を、乳化破壊剤として利用することを提案している。
【００２１】
このような先行技術のもとで、本発明の目的は、良好な脱泡作用を有するとともにＳｉ含量が低い脱泡剤を提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、良好な脱泡性能に加えて、安価である脱泡剤を提供することにある。
【００２３】
本発明の更に他の目的は、良好な脱泡性能に加えて、安価で環境に適合する脱泡剤を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明によれば、本目的は、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を添加物組成物または燃料の脱泡剤として使用することで達成できる。ハイドロフォビン又はその誘導体の利用は、これらも生分解可能な天然物質であり環境汚染を引き起こさないという利点を持っている。また、分解しても、エンジンの領域に付着するような物質を形成することがない。
【００２５】
本発明によれば、ハイドロフォビン又はその誘導体は、脱泡剤として使用され、燃料または燃料組成物の発泡が抑えられる。
【００２６】
本発明によれば、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を単独で、燃料に脱泡剤として添加することができる。しかしながら、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体と、少なくとも一種の脱泡剤として作用する他の化合物とを併用することも可能である。また、異なるハイドロフォビン又はその誘導体を併用してもよい。
【００２７】
本発明においてハイドロフォビンまたはその誘導体とは、ハイドロフォビンまたは修飾されたハイドロフォビンを意味するものとする。この修飾ハイドロフォビンは、例えばハイドロフォビンの融合したタンパク質であてもよく、あるいはハイドロフォビンのポリペプチド配列に少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、特に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を示すポリペプチド配列を持つタンパク質で、さらにハイドロフォビンの生物的性質のうち５０％、例えば６０％、特に７０％、より好ましくは８０％を満足させ、特に、これらのタンパク質を塗布することで表面特性が変化する、具体的にはガラス表面の水滴の接触角がこのタンパク質の塗布の前後で、少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、特に好ましくは少なくとも３０°増加するようなタンパク質であってもよい。
【００２８】
驚くべきことに、ハイドロフォビン又はその誘導体を脱泡剤として使用すると優れた結果が得られることが明らかとなった。
【００２９】
ハイドロフォビンの定義に当たり、最も重要なのは、ハイドロフォビンの構造特異性であり、配列特異性ではない。成熟ハイドロフォビン類のアミノ酸配列は多岐にわたるが、いずれも、８個の保存システイン残基からなる非常に特徴的なパターンを有している。これらの残基は、四個の分子内ジスルフィド架橋を形成する。  
Ｎ末端とＣ末端は、かなり大幅に変動する。当業界の熟練者には公知である分子生物学的な手段を用いて、アミノ酸数が１０〜５００の融合パートナータンパク質を連結することもできる。
【００３０】
また本発明においては、ハイドロフォビンやその誘導体は、類似構造をもつタンパク質や機能的に同一のタンパク質も意味するものとする。
【００３１】
本発明において、「ハイドロフォビン類」とは、以下の一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドを意味するものとする：
Ｘn−Ｃ1−Ｘ1-50−Ｃ2−Ｘ0-5−Ｃ3−Ｘ1-100−Ｃ4−Ｘ1-100−Ｃ5−Ｘ1-50−Ｃ6−Ｘ0-5−Ｃ7−Ｘ1-50−Ｃ8−Ｘm    （Ｉ）    
式中、Ｘは２０種の天然アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、ｌｉｅ  Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）のいずれであってもよい。式中、Ｘは、相互に同一であっても、異なっていてもよい。Ｘの添字はそれぞれ、アミノ酸の数を表し、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンを表し、
少なくとも四個のＣで示される残基はシステインであり、添字ｎとｍは、各々独立して、０〜５００の自然数、好ましくは１５〜３００の自然数である。
【００３２】
式（Ｉ）のポリペプチドの他の特徴は、ガラス表面に塗布すると、未塗布のガラス表面上の同じ大きさの水滴の接触角と較べて少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、より好ましくは３０°の水滴の接触角の上昇をもたらすことである。
【００３３】
Ｃ1〜Ｃ8で示されるアミノ酸は、好ましくはシステインである。しかしながら、これらは、似た立体構造の他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、メチオニンまたはグリシンであってもよい。しかしながら、Ｃ1〜Ｃ8の基の少なくとも四個、好ましくは少なくとも五個、より好ましくは少なくとも六個、特に好ましくは少なくとも七個が、システインからなる必要がある。本発明のタンパク質において、システインは、還元型で存在しても、あるいは相互にジスルフィド架橋していてもよい。特に好ましくは、分子内Ｃ−Ｃ架橋の形成したものであり、特に好ましくは、少なくとも一個の分子内ジスルフィド架橋、好ましくは二個の、より好ましくは三個の、最も好ましくは四個の分子内ジスルフィド架橋の形成したものである。  上記のようにシステインが似た立体構造を持つアミノ酸で置換される場合、これらのＣ位置が、相互に分子内ジスルフィド架橋を形成可能なアミノ酸のペアで置換されることが好ましい。
【００３４】
Ｘで示される位置にもシステイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンが使用される場合には、一般式中の個々のＣの位置の番号に変化が起こることとなる。
【００３５】
好ましくは、本発明の実施に当たり、一般式（ＩＩ）のハイドロフォビン：
Ｘn−Ｃ1−Ｘ3-25−Ｃ2−Ｘ0-2−Ｃ3−Ｘ5-50−Ｃ4−Ｘ2-35−Ｃ5−Ｘ2-15−Ｃ6−Ｘ0-2−Ｃ7−Ｘ3-35−Ｃ8−Ｘm      （ＩＩ）  
（ただし、Ｘ、Ｃ、およびＸとＣの添字は上述の通りであり、添字のｎとｍは各々、０〜３００であり、これらのタンパク質はまた上述の接触角変化をもたらし、Ｃで示される残基のうち少なくとも６個はシステインである）を使用することが好ましい。より好ましくは、すべての残基がシステインである。
【００３６】
特に好ましくは、一般式（ＩＩＩ）で表されるハイドロフォビン：
Ｘn−Ｃ1−Ｘ5-9−Ｃ2−Ｃ3−Ｘ11-39−Ｃ4−Ｘ2-23−Ｃ5−Ｘ8-9−Ｃ6−Ｃ7−Ｘ6-18−Ｃ8−Ｘm      （ＩＩＩ）  
（ただし、Ｘ、Ｃ、およびＸとＣの添字は上述の通りであり、添字のｎとｍは各々、０〜２００であり、これらのタンパク質はまた上記の接触角変化をもたらす）を使用することが好ましい。
【００３７】
ＸnとＸmの残基は、ハイドロフォビンに自然に結合しているペプチド配列であってもよい。しかしながら、これらの残基の一方または両方が、ハイドロフォビンに自然に結合しないペプチド配列であってもよい。このことはまた、これらのＸn及び／又はＸmの残基が、ハイドロフォビン中で自然に起こるペプチド配列に、ハイドロフォビン中では自然に起こらないペプチド配列が結合して延長したものであっても良いことを意味する。
【００３８】
Ｘn及び／又はＸmの残基がハイドロフォビン中に自然に結合しないペプチド配列である場合、このような配列の長さは、一般的には少なくとも２０アミノ酸、好ましくは少なくとも３５アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸、最も好ましくは少なくとも１００アミノ酸である。以下、自然にハイドロフォビンに結合しない残基を、融合パートナーと呼ぶこととする。つまり、このタンパク質は、少なくとも一種のハイドロフォビン基と、自然にはこのような形態で起こることのない融合パートナー基からなっていることを意味する。
【００３９】
この融合パートナー基は、いろいろなタンパク質の中から選択される。例えばハイドロフォビン基のアミノ末端（Ｘn）及びカルボキシル末端（Ｘm）において、複数の融合パートナーが一個のハイドロフォビン基に結合してもよい。しかしながら、例えば二個の融合パートナーが、本発明のタンパク質の一つの位置（ＸnまたはＸm）で結合してもよい。
【００４０】
特に好適な融合パートナーは、微生物中で自然に産生されるタンパク質、特に大腸菌または枯草菌で自然に産生されるものである。このような融合パートナーとしては、例えば、配列ｙａａｄ（配列識別番号：１５と１６）、配列ｙａａｅ（配列識別番号：１７と１８）、チオレドキシンがあげられる。これらの配列のフラグメントや誘導体で、上記の配列の一部、好ましくは７０〜９９％、より好ましくは８０〜９８％を持つもの、あるいは上記の配列と比べ、個々のアミノ酸またはヌクレオチドが異なっている（その比率はアミノ酸数により変動する）フラグメントや誘導体も、非常に好ましい。
【００４１】
ハイドロフォビン又はその誘導体として用いられる本発明のタンパク質は、そのポリペプチド配列において、グリコシル化、アセチル化、または例えばグルタールアルデヒドを用いる化学架橋により修飾されていてもよい。
【００４２】
本発明により使用されるハイドロフォビン又はその誘導体の特徴の一つは、表面を上記タンパク質で被覆した場合におこる表面特性の変化である。実験的には、この表面特性の変化は、例えば、表面をタンパク質で被覆し、その前後の水滴の接触角を測定し、これら二回の測定値の差を求めることで決定することができる。
【００４３】
接触角測定の実施方法は、一般に当業界の熟練者には公知である。測定は、５μｌの水滴を用いて室温で行われる。詳細な実験条件、例えば接触角の測定方法は、実験欄に示した。本発明により使用されるタンパク質は、非被服ガラス表面上の同じ大きさの水滴の接触角と較べて、上記の条件下で少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、より好ましくは少なくとも３０°の接触角が増加する性質を有している。
【００４４】
既知のハイドロフォビン又はその誘導体中のハイドロフォビン基では、極性アミノ酸と非極性アミノ酸の位置が保存されており、このことは、独特の疎水性プロットに現れている。生物物理的な性能と疎水性の差異により、既知のハイドロフォビンは二種類、第Ｉ類と第ＩＩ類に分けられる（Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437）。
【００４５】
第Ｉ類のハイドロフォビンによりできる膜は、極く難溶性（高温の１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）にも不溶）であり、濃トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはギ酸によってのみ解離することができる。これ対して、第ＩＩ類のハイドロフォビンよりできるものはより不安定である。これらは、６０％エタノールまたは１％ＳＤＳ（室温）ででも、溶解可能である。
【００４６】
アミノ酸配列を比較すると、第ＩＩ類のハイドロフォビン中のシステインＣ3とＣ4の間の領域の長さが、第Ｉ類のハイドロフォビンより明らかに短いことがわかる。また、第ＩＩ類のハイドロフォビンは、第Ｉ類より多くの荷電アミノ酸を有している。
【００４７】
本発明の実施に当たり特に好ましいハイドロフォビンは、ｄｅｗＡ、ｒｏｄＡ、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｓｃ３、ｂａｓｆ１、及びｂａｓｆ２型のハイドロフォビンであり、それぞれ下記の配列表に示す構造を有している。これらの一部または誘導体であってもよい。同一または異なる構造を有する複数のハイドロフォビン基、好ましくは２個または３個のハイドロフォビン基が相互に結合し、さらに自然にはハイドロフォビンに結合していない適当なポリペプチド配列に結合したものであってもよい。
【００４８】
本発明において特に好適なのは、配列識別番号２０、２２、及び２４で示されるポリペプチド配列との融合タンパク質であり、またそれらをコードする核酸配列、特に配列識別番号１９、２１、及び２３の配列である。特に好ましい実施形熊は、配列識別番号２０、２２または２４で示されるポリペプチド配列由来のタンパク質であって、全アミノ酸の少なくとも一部、多くても１０％、好ましくは５％、より好ましくは５％が置換、挿入または欠失したもので、元のタンパク質の生物学的性質の少なくとも５０％を保持するものである。なお、タンパク質の生物学的性質とは、上記の接触角の少なくとも２０°の変化をいう。
【００４９】
好適な融合パートナーは、表面に塗布可能であるとともに界面活性剤処理に耐性を示す融合タンパク質を与えるタンパク質である。融合パートナーの例としては、大腸菌のｙａａｄやｙａａｅ、チオレドキシンがあげられる。
【００５０】
このように得られた融合タンパク質はすでに機能的に活性があり、文献に記載のようにトリフルオロ酢酸またはギ酸処理により解離させ活性化させる必要がないことが明らかとなった。これらの融合タンパク質を含む溶液、または融合タンパク質を切断して除きハイドロフォビンのみを含む溶液は、そのまま表面の塗布に使用できる。
【００５１】
迅速で効率的な精製のために、  Ｃ末端またはＮ末端にアフィニティータグ（例えば、Ｈｉｓ6、ＨＡ、カルモジュリン−ＢＤ、ＧＳＴ、ＭＢＤ、キチン−ＢＤ、ストレプトアビジン−ＢＤ−Ａｖｉタグ、フラグタグ、Ｔ７等）を結合させることが好ましいことが明らかとなった。これらの標準的な方法は、アフィニティタグの供給会社より入手可能である。
【００５２】
ハイドロフォビンと融合パートナーの間、あるいは融合パートナー間の開裂部を利用して、誘導体化（例えば、メチオニンでのＢｒＣＮ開裂、Ｘａ因子開裂、エンテロキナーゼ開裂、トロンビン開裂、ＴＥＶ開裂、等）されていない純粋なハイドロフォビンを放出することができる。
【００５３】
一個の融合パートナー、例えばｙａａｄあるいはｙａａｅから、連結した融合タンパク質を得ても良いし、異なる配列を持つ複数のハイドロフォビンから連結融合タンパク質、例えばＤｅｗＡ−ＲｏｄＡ、またはＳｃ３−ＤｅｗＡ、Ｓｃ３−ＲｏｄＡを得てもよい。同様に、ハイドロフォビンのフラグメント（例えば、Ｎ末端またはＣ末端トランケーション）、または最大７０％の相同性を持つ変異タンパク質を用いてもよい。いずれの場合も、最適のコンストラクトが、特定の用途、即ち脱泡される燃料に応じて選択される。
【００５４】
本発明により使用されるポリペプチドまたは本発明の組成物中に存在するポリペプチドは、既知のペプチド合成法、例えばメリフィールド固相合成法により化学的に合成できる。
【００５５】
天然型のハイドロフォビンは、天然資源より適当な方法により分離できる。例えば、Woesten et al., Eur. J. Cell Bio. 63, 122-129 (1994)  又はＷＯ９６／４１８８２を参照されたい。
【００５６】
融合タンパク質は、好ましくは遺伝子工学的な方法で合成さる。具体的には、融合パートナーをコードする核酸配列とハイドロフォビン基をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列を、所望のタンパク質が宿主生物内で産生されるように結合させ、この連結した核酸配列の遺伝子発現により合成される。このような製造方法は、例えば、ＤＥ１０２００５００７４８０．４に開示されている。
【００５７】
製造に好適な宿主生物（産生生物）は、原核生物（古細菌を含む）または真核生物であり、特に、ハロバクテリアやメタノコックス属のバクテリア、糸状菌、昆虫細胞、植物細胞や哺乳類細胞が好ましく、大腸菌、枯草菌、巨大菌、こうじ菌、偽巣性コウジ菌、アスペルギルス・ニガー、ピキア・パストリス、シュードモナス属、乳酸杆菌、ハンセヌラ・ポリモルファ、トリコデルマ・リーゼイ、ＳＦ９  （または関連細胞）、等が特に好ましい。
【００５８】
本方法においては、調整核酸配列のコントロール下にある本発明で使用されるポリペプチドをコードする核酸配列と少なくとも一種のこれらの発現コンストラクトを含むベクターとを持つ発現コンストラクトが使用される。
【００５９】
好ましく使用されるコンストラクトは、特定のコード配列の５’側上流にあるプロモーターと３’側下流にあるターミネーターとを有し、必要なら、他の従来から使用されている調整因子を、各々のコード配列に作動可能な状態で連結して有していてもよい。
【００６０】
本発明において、「作動可能な状態で連結」しているとは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、さらに必要なら他の調整因子が、各々の調整因子がコード配列の発現において意図したように機能するように、順序良く配列されていることを意味する。
【００６１】
作動可能な状態で連結できる配列の例としては、標的配列及びエンハンサー、ポリアデニル化シグナル等があげられる。また、調整配列は、選択可能なマーカー、増幅信号、複製開始点等を含んでいる。好適な調節配列が、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００６２】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節が実際の構造遺伝子の上流に存在するかもしれないし、必要ならこれを、自然調節を抑えて遺伝子の発現を増加させるように遺伝的に変異させてもよい。
【００６３】
好ましい核酸コンストラクトは、さらに一個以上の機能的にプロモーターに連結したいわゆる「エンハンサー」配列を有しており、この配列により核酸配列の発現の増加が可能となる。このＤＮＡ配列の３’末端に、他の望ましい配列、たとえば他の調整因子やターミネーターなどの配列を挿入してもよい。
【００６４】
コンストラクト中には、これらの核酸のコピーが１個以上存在してもよい。また、必要ならコンストラクトの選定のために、他のマーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子や栄養要求性遺伝子が、コンストラクト中に存在してもよい。
【００６５】
これらの調剤に好ましい調節配列が、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、Ｉｐｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、Ｉａｃｌｑ−Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ−、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、などのプロモーターやｌａｍｂｄａ−ＰＲあるいはｉｍｌａｍｂｄａ−Ｐプロモーターの中に存在し、これらはグラム陰性バクテリア中で好ましく使用される。他の好ましい調節配列としては、例えばグラム陽性プロモーターのａｍｙやＳＰ０２、酵母や真菌プロモーターのＡＤＣ1  、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ1  、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨがあげられる。
【００６６】
合成プロモーターを調節に用いることもできる。
【００６７】
宿主生物で発現させるために、この核酸コンストラクトを、好ましくはプラスミド又はファージ等のベクターに挿入して、宿主中で遺伝子を好適に発現させる。ベクターとは、プラスミドやファージ以外にも、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスやアデノウイルスなどのウイルス、トランスポソン、ＩＳ因子、プラスミド、コスミド、直線状又は環状ＤＮＡ、及びアグロバクテリウムシステムなどの当業界の熟練者には公知のすべてのベクターを含む。
【００６８】
これらのベクターは、宿主生物中で自律的に複製されることもあり、また染色体を経由して複製されることもある。好適なプラスミドとしては、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４  、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８  、ｐＵＣ１９  、ｐＫＣ３０  、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ”３−Ｂ１、ｔｇｔ１１、又はｐＢｄＣｌ；ストレプトミセス属のｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、又はｐＩＪ３６１；バシルス属のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４  又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７；真菌類のｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２、又はｐＢＢ１１６；酵母の２ａｌｐｈａ、ＰＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３又はｐＥＭＢＬＹｅ２３；又は植物のｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４又はｐＤＨ５１があげられる。なお、これらの特定プラスミドは可能なプラスミドのほんの一部にすぎない。他のプラスミドは、当業界の熟練者に公知であり、例えば、Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018)に記載されている。
【００６９】
さらに存在する他の遺伝子を発現する核酸コンストラクトは、好ましくは、宿主生物に応じまた使用する一種以上の遺伝子に応じて好適に発現できるように選択された、発現増加用の３’末端及び／又は５’末端調節配列を含んでいる。
これらの調節配列は目的の遺伝子及びタンパク質を選択的に発現させるものである。つまりこのことは、宿主生物によっては、これら遺伝が誘導後に初めて発現又は過発現されたり、直ちに発現及び／又は過発現されることを意味している。
【００７０】
これらの調節配列や調整因子は、正の影響を有し、挿入遺伝子の発現を増加させることが好ましい。したがって、調節成分の増幅は、プロモーター及び／又は「エンハンサー」などの強い転写シグナルを用いて、転写レベルで起こることが好ましい。しかし、例えばｍＲＮＡの安定性を増加させることで、翻訳を増加させることもできる。
ベクターの他の実施様態においては、核酸コンストラクト又は核酸を含むベクターを、直線状ＤＮＡの形で微生物に挿入して、宿主生物のゲノム中に異形組換え又は相同組換えにより導入することができる。この直線状ＤＮＡは、プラスミドなどの直線状ベクターであっても核酸コンストラクト又は核酸のみの直線状ベクターであってもよい。
【００７１】
生物中で異形遺伝子を好適に発現させるためには、その生物で用いられている特定の「コドン使用頻度」に対応して核酸配列を変化させることが好ましい。この「コドン使用頻度」は、その生物の他の既知の遺伝子をコンピューターで解析することにより容易に決定することができる。
【００７２】
発現カセットは、適当なプロモーターと適当なコード核酸配列及びターミネーター又はポリアデニル化シグナルとを融合することにより得られる。この目的のためには、従来の組換え法やクローニング法が用いられる。例えば、以下を参照：T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); in T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984); 及びin Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)。
【００７３】
適当な宿主生物に発現させるには、組換え核酸コンストラクト又は遺伝子コンストラクトを、宿主において遺伝子を好適に発現させる宿主特異的なベクターに挿入させることが望ましい。ベクターは、当業界の熟練者には公知であり、例えば、“Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., Ed. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に記載されている。
【００７４】
ベクターを用いることで、例えば少なくとも一種のベクターで形質転換された、本発明で使用されるハイドロフォビン又はその誘導体の製造に使用可能な組換え微生物を作成することが可能となる。上記の組換えコンストラクトは、適当な宿主システムに挿入されて発現されることが好ましい。特定の核酸が特定の発現システムで発現されるようにするため、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等の当業界の熟練者には公知の汎用のクローニング法及びトランスフェクション法を用いることが好ましい。適当な系は、例えば以下に記載されている。Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed. Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989。
【００７５】
また、相同の組換え微生物を作ることも可能である。この目的のために、少なくとも本発明で使用される遺伝子の一部含むベクター、又は適当ならその配列を変化させ即ち機能的に混乱させるために、少なくとも一個のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を起こさせているコード配列（「ノックアウト」ベクター）含むベクターが作られる。挿入される配列は、例えば関連する微生物の同属体であってもよく、哺乳類、酵母又は昆虫由来のものであってもよい。相同組換えに用いられるベクターの場合、その中の内因性遺伝子が変異又は変化しても、機能性のタンパク質がコードされているようにする（例えば、内因性タンパク質の発現が変化するように、上流の調整領域を変更してもよい）。本発明の遺伝子の変化する領域が、相同組換えベクター中に含まれている。相同組換え用に適当なベクターを作成する方法が、例えば、Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503に記載されている。
【００７６】
原則としてあらゆる原核生物及び真核生物が、本発明で用いられる核酸又は核酸コンストラクト用の組換え宿主生物として好適である。使用する宿主生物は、好ましくはバクテリア、真菌類、酵母などの微生物である。グラム陽性又はグラム陰性バクテリアの使用が好ましく、好ましいバクテリアとしては、腸内細菌、シュードモナス科、リゾビウム科、ストレプトマイセス科又はノカルディア科の細菌があげられ、特に好ましくは、大腸菌、シュードモナス、ストレプトミセス、ノカルディア、ブルコルデリア、サルモネラ、アグロバクテリウム又はロドコッカスなどのバクテリアがあげられる。
【００７７】
上記の融合タンパク質の調整の用いられる生物は、当業界の熟練者には公知の方法により、宿主生物に応じて生育又は培養させられる。微生物は、一般に液体培地で培養され、培地は、主として糖類の炭素源、主として酵母抽出物などの有機窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩からなる窒素源、鉄塩、マンガン塩やマグネシウム塩などの微量成分、及び適当ならビタミン類を含み、その温度は０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃で、培養は酸素下で行われる。なお、培養中の栄養液のｐＨは一定であってもよい、つまり培養中、調整しても調整しなくてもよい。培養は、バッチ式、半バッチ式、連続式のいずれでもよい。栄養物質は、培養開始時に添加してもよいし、後から半連続的にあるいは連続的に供給してもよい。酵素は、これらの生物から実施例に記載の方法で単離してもよいし、粗抽出物として反応に用いてもよい。
【００７８】
本発明により使用されるタンパク質、またはその機能性で生物活性のフラグメントは、タンパク質産生微生物を培養する組換え法により生産することができる。必要なら、タンパク質の発現を誘導し、これらのタンパク質を培地から単離する。このようにして、必要ならこれらのタンパク質を工業規模で生産することも可能である。組換え微生物は、既知の方法により培養、発酵される。バクテリアは、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地中で、２０〜４０℃の温度で６〜９のｐＨで成長させる。適当な培養条件が、例えば、T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に記載されている。
【００７９】
これらのタンパク質が培養培地中に分泌されない場合は、細胞を破砕し、既知のタンパク質単離方法により溶解物から産生品を単離する。必要に応じて、細胞破砕には、高周波の超音波処理、高圧、例えばフレンチ高圧セル処理、浸透圧処理、界面活性剤、加水分解酵素又は有機溶剤などの薬剤処理、ホモジナイザー処理、あるいは、これらの方法の二種以上の組み合わせのいずれを用いてもよい。
【００８０】
これらのタンパク質の精製は、既知のクロマトグラフィー法、例えばモレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、Ｑ−セファローズクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性クロマトグラフィーを用いて行うことができ、また、限外濾過、晶出、塩析、透析、及びゲル電気泳動などの他の既知の方法と組合わせてもよい。好適な方法が例えば以下に記載されている。Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical working methods], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin。
【００８１】
組換えタンパク質を単離するのに、特定の核酸配列によりｃＤＮＡを延長させるベクターシステム又はオリゴヌクレオチド、また修飾ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするベクターシステム又はオリゴヌクレオチドを利用することが好ましい。こうすることで、精製が容易となる。好適な修飾とは、アンカーとして作用するいわゆる「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカーのような修飾や、抗体により抗原として認められるエピトープがあげられる  （例えば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press参照）。他の好適なタグとしては、例えば、ＨＡ、カルモジュリンＢＤ、ＧＳＴ、ＭＢＤ、キチンＢＤ、ストレプトアビジンＢＤ、Ａｖｉタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｔ７等があげられる。これらのアンカーにより、固定されたサポートに、例えばクロマトグラフィーカラムに充填されるポリマーマトリックスやマイクロタイター板などのキャリア上で使用されるポリマーマトリックスに、これらのタンパク質を付着させることができる。これらの精製方法は、市販アフィニティータグの供給会社から入手可能である。
【００８２】
このように製造されたタンパク質は、融合タンパク質として直接用いてもよいし、融合パートナーを切断分離後、「純粋な」ハイドロフォビンとして用いてもよい。
【００８３】
融合パートナーを除去したい場合は、融合タンパク質のハイドロフォビン単位と融合パートナー単位の間に切断可能部位（特定のプロテアーゼ認識部位）を導入することが好ましい。好適な切断部位、特にハイドロフォビン単位中あるいは融合パートナー単位中に通常存在しないペプチド配列は、バイオインフォマチックの手段により容易に発見することができる。特に好適なのは、メチオニン上でのＢｒＣＮ切断、又はＸａ因子やエンテロキナーゼ、トロンビン、ＴＥＶ切断（タバコエッチウイルスプロテアーゼ）などのプロテアーゼを用いた切断である。
【００８４】
本発明において、燃料とは、内燃機関を作動させるのに使用される狭い意味での燃料と、一般的な燃料の双方を意味するものとする。
【００８５】
好適な燃料は、原油中間留分とガソリン燃料である。しかしながら、中間留分を使用することが好ましい。
【００８６】
好適な中間留分とは、１２０〜５００℃の範囲で沸騰するものであり、例えば、ディーゼル燃料や、灯油、加熱油があげられる。好ましい中間留分は、ディーゼル燃料である。
【００８７】
これらのディーゼル燃料としては、例えば、沸点範囲が１００〜４００℃である原油ラフィネートがあげられる。これらは、通常、９５％蒸留点が３６０℃以上である留分である。しかしながら、これらは、９５％点が例えば３４５℃未満であり硫黄含量が０．００５重量％未満である、または９５％点が例えば２８５℃で硫黄含量が０．００１重量％であることを特徴とする「超低硫黄ディーゼル」または「シティーディーゼル」であってもよい。精留により得られるディーゼル燃料に加えて、石炭のガス化またはガス液化（「ガス液体転換」（ＧＴＬ））により得られ燃料も好適である。上記のディーゼル燃料とバイオディーゼルやバイオエタノールなどの再生可能な燃料との混合物もまた好適である。
【００８８】
これらのディーゼル燃料としては、より好ましくは、低硫黄含量のもの、即ち硫黄含量が０．０５重量％未満、好ましくは０．０２重量％未満、特に好ましくは、０．００５重量％未満、さらに好ましくは０．００１重量％未満の硫黄を含むものである。加熱油は、より好ましくは低硫黄含量のものであり、例えば硫黄含量が多くても０．１重量％、好ましくは多くとも０．０５重量％、より好ましくは多くとも０．００５重量％、特に好ましくは多くとも０．００１重量％のものである。
【００８９】
本発明においては、ハイドロフォビンまたはその誘導体を、ディーゼル燃料の脱泡剤として使用することが好ましい。
【００９０】
したがって他の実施形熊においては、本発明は、上述のように少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を消泡剤として用いることに関し、その燃料がディーゼル燃料である。
【００９１】
本発明によれば、上記の少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体の使用量は、好ましくは燃料に対して０．０１〜１００ｐｐｍ、好ましくは０．１５〜５０ｐｐｍ、より好ましくは０．２〜３０ｐｐｍ、または０．３〜１０ｐｐｍである。
【００９２】
本出願において、単位ｐｐｍは、ｋｇ当たりのｍｇを意味する。
【００９３】
したがって上述のように、他の実施形熊においては、本発明は、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体の消泡剤としての利用に関し、その際、上記少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体が燃料に対して０．１〜１００ｐｐｍの量で使用される。
【００９４】
本発明によれば、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を添加することで、燃料、特にディーゼル燃料の発泡が抑えることができる。
【００９５】
したがって、本発明は、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を燃料に添加することを特徴とする燃料の脱泡方法に関する。
【００９６】
上述のように他の実施形熊においては、本発明は、燃料の脱泡方法に関し、その場合の燃料はディーゼル燃料である。
【００９７】
上述のようにさらに好ましい実施形熊においては、本発明は燃料の脱泡方法に関し、その際の少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体に使用量は、その燃料に対して０．１〜１００ｐｐｍである。
【００９８】
本発明において、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を、燃料に直接投与してもよく、燃料組成物に投与してもよく、または添加物組成物の形で投与してもよい。
本発明はさらに、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体に加え、更に少なくとも一種の他の燃料添加物を含む添加物組成物に関する。また、本発明は、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体と少なくとも一種の他の燃料添加物からなる燃料組成物に関する。
【００９９】
したがって他の実施形熊においては、本発明は少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体に加え、少なくとも一種の他の燃料添加物とを含む添加物に関する。
【０１００】
また他の実施形熊においては、本発明は、主成分としての少なくとも一種の燃料とともに、なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体と少なくとも一種の他の燃料添加物とを含む燃料組成物に関する。
【０１０１】
上記の添加物組成物または燃料は、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体以外に、少なくとも一種の他の燃料添加物、特に少なくとも一種の界面活性剤及び／又は乳化破壊剤を含んでいる。好適な界面活性剤添加物及び乳化破壊剤を以下に示す。これらに代えてまたはこれらに加えて、この添加物組成物および燃料には、種々の燃料添加剤が添加可能であり、例えばキャリアー油類、腐食防止剤、酸化防止剤、帯電防止剤、染料マーカーなどが挙げられる。しかしながら、これらの添加物組成物または燃料は、好ましくは少なくとも一種の界面活性剤及び／又は乳化破壊剤と、必要に応じて他の異なる燃料添加物を含んでいる。
【０１０２】
したがって、さらに好ましい実施形熊においては、本発明は、上述のように、少なくとも一種の界面活性剤を含んでいる添加物組成物または燃料組成物に関する。さらに好ましい実施形熊においては、本発明はまた、上述のように、少なくとも一種の乳化破壊剤を含んでいる添加物組成物または燃料組成物に関する。
【０１０３】
好適な界面活性剤添加物の例を、以下に示す。
【０１０４】
これらの界面活性剤添加物は、好ましくは数平均分子量（Ｍｎ）が８５〜２００００である少なくとも一種の疎水的な炭化水素基と以下の基から選択される少なくとも一種の高極性基を有する両親媒性物質である。
（ａ）最大６個の窒素原子を有するモノ−またはポリアミノ基で、うち少なくとも一個の窒素原子が塩基性を示すもの；    
（ｂ）ニトロ基、必要に応じて水酸基と組合わせて；  
（ｃ）水酸基とモノ−またはポリアミノ基（うち少なくとも一個の窒素原子が塩基性である）；    
（ｄ）カルボキシル基、またはそのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩；
（ｅ）スルホン酸基、またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩；
（ｆ）ポリオキシ−Ｃ2−〜−Ｃ4−アルキレン基で、末端に水酸基、モノ−またはポリアミノ基を有する基、（ただしポリアミノ基中の少なくとも一個の窒素原子は塩基性を示す）、またはカルバメート基で置換されている基；
（ｇ）カルボン酸エステル基；
（ｈ）無水コハク酸由来の基で、ヒドロキシル及び／又はアミノ及び／又はアミド及び／又はイミド基を有する基；及び／又は  
（ｉ）置換フェノールとアルデヒド及びモノ−またはポリアミンとのマンニッヒ反応により得られる基。
【０１０５】
上記界面活性剤添加物中の疎水性炭化水素基は、燃料中への適当な溶解度を保障するものであり、その数平均分子量（Ｍｎ）は８５〜２００００、特に１１３〜１００００、更に特に３００〜５０００である。これらの疎水性炭化水素基、特に高極性基（ａ）、（ｃ）、（ｈ）および（ｉ）と併用する場合の疎水性炭化水素基の典型例としては、ポリプロペニル基、ポリブテニル基、ポリイソブテニル基があげられ、それぞれのＭｎは３００〜５０００、特に好ましくは５００〜２５００、さらに特に好ましくは７００〜２３００である。
【０１０６】
界面活性剤添加物の上記の基の例としては次のものが挙げられる：
モノ−またはポリアミノ基を有する添加物（ａ）は、好ましくはポリプロピレン、または従来のポリブテンまたはポリイソブテン（即ち、内部二重結合を多数有するもの）でＭｎが３００〜５０００である樹脂系のポリアルケンモノアミンまたはポリアルケンポリアミンである。  内部二重結合を多数有するポリブテンまたはポリイソブテン（β及びγ位）を添加物製造の出発原料として使用する場合、可能な合成経路は、塩素化及び続くアミノ化、または空気またはオゾンにより二重結合を酸化させ、得られるカルボニルまたはカルボキシル化合物を、次いで還元性の（水素化）条件下でアミノ化するものである。アミノ化に用いられるアミン類としては、例えば、アンモニア、モノアミン類、またはジメチルアミノプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミンまたはテトラエチレンペンタミンなどのポリアミン類があげられる。ポリプロピレン系の添加物は、特にＷＯ９４／２４２３１に記載されている。
【０１０７】
さらに好ましいモノアミノ基を含む添加物（ａ）は、特に国際公開９７／０３９４６に記載のように、平均重合度Ｐが５〜１００であるポリイソブテンと酸化窒素、または酸化窒素と酸素の混合物との反応生成物を水素化して得られるものである
さらに好ましいモノアミノ基を含む添加物（ａ）は、特にＤＥ−Ａ１９６２０２６２に記載のように、ポリイソブテンエポキシドから、アミン類との反応、次いでそのアミノアルコールの脱水と還元により得られる化合物類である。
【０１０８】
必要なら水酸基とともにニトロ基を含む添加物（ｂ）は、特にＷＯ９６／０３３６７および９６／０３４７９に記載のように、好ましくは平均重合度Ｐが５〜１００または１０〜１００のポリイソブテンと、酸化窒素、または酸化窒素と酸素の混合物との反応で得られる反応生成物である。これらの反応生成物は、一般的には、純粋なニトロポリイソブテン（例えば、α，β−ジニトロポリイソブテン）と混合ヒドロキシニトロポリイソブテン（例えば、α−ニトロ−β−ヒドロキシポリイソブテン）の混合物である。  
水酸基とモノ−またはポリアミノ基を含む添加物（ｃ）は、特にＥＰ−Ａ４７６４８５に記載のように、特に好ましくは主に末端二重結合を有し、Ｍｎが３００〜５０００であるポリイソブテンとアンモニアまたはモノ−またはポリアミン類とから得られるポリイソブテンエポキシドの反応生成物である。
【０１０９】
カルボキシル基、そのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を含む添加物（ｄ）は、好ましくはＣ2〜Ｃ40−オレフィン類と無水マレイン酸とのコポリマーであり、総モル質量が５００〜２００００で、そのカルボキシル基の一部または全部がアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩に変換され、残りのカルボキシル基がアルコール類またはアミン類と反応させられたものである。このような添加物は、特にＥＰ−Ａ３０７８１５に開示されている。これらの添加物は、主に弁座の摩耗防止のために使用されるものであり、ＷＯ８７／０１１２６に記載のように、既存の燃料用界面活性剤、例えばポリ（イソ）ブテンアミンまたはポリエーテルアミンとともに使用することが好ましい。
【０１１０】
特にＥＰ−Ａ６３９６３２に記載のように、スルホン酸基またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を含む添加物（ｅ）は、好ましくはアルキルスルホサクシネートのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩である。
【０１１１】
これらの添加物は、主に弁座の摩耗防止のために使用されるものであり、
既存の燃料用界面活性剤、例えばポリ（イソ）ブテンアミンまたはポリエーテルアミンとともに使用することが好ましい。
【０１１２】
ポリオキシ−Ｃ2−〜Ｃ4−アルキレン基を含む添加物（ｆ）は、好ましくはＣ2−〜Ｃ60−アルカノール、Ｃ6−〜Ｃ30−アルカンジオール、モノ又はジＣ2〜Ｃ30−アルキルアミン、Ｃ1〜Ｃ30−アルキルシクロヘキサノールまたはＣ1−Ｃ30−アルキルフェノールと、水酸基またはアミノ基に対して１〜３０ｍｏｌのエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシドとの反応により得られ、ポリエーテルアミンの場合、さらにアンモニア、モノアミン類またはポリアミン類を用いた還元性のアミノ化により得られるポリエーテルまたはポリエーテルアミンである。このような生成物は、特にＥＰ−Ａ３１０８７５、ＥＰ−Ａ３５６７２５、ＥＰ−Ａ７００９８５、およびＵＳ４８７７４１６に記載されている。ポリエーテルの場合、このような生成物はキャリアー油としての性能も有している。これらの具体例としては、トリデカノールブトキシレート、イソリデカノールブトキシレート、イソノニルフェノールブトキシレートや、ポリイソブテノールのブトキシレートやプロポキシレート、及びこれらのアンモニアとの反応生成物があげられる。
【０１１３】
特にＤＥ−Ａ３８３８９１８．に記載のようにカルボン酸エステル基を含む添加物（ｇ）は、好ましくは、モノ−、ジ−またはトリカルボン酸と長鎖アルカノールまたはポリオールとのエステル類、特に１００℃での最小粘度が２ｍｍ2／ｓであるものである。使用するモノ−、ジ−またはトリカルボン酸は、脂肪族酸であっても芳香族酸であってもよく、特に好適なエステルアルコール類またはエステルポリオール類は、例えば炭素原子数が６〜２４の長鎖化合物である。これらのエステル類の具体的な例としては、イソオクタノールやイソノナノール、イソデカノール、イソリデカノールのアジピン酸エステル、フタール酸エステル、イソフタール酸エステル、テレフタール酸エステル、トリメリット酸エステルがあげられる。このような生成物はキャリアー油としての性質も有している。
【０１１４】
無水コハク酸由来でヒドロキシル及び／又はアミノ及び／又はアミド及び／又はイミド基を有する基を含む添加物（ｈ）は、好ましくは既存のまたは高反応性のＭｎが３００〜５０００であるポリイソブテンと無水マレイン酸の熱反応、または塩素化ポリイソブテンを経由する反応により得られるポリイソブテニルコハク酸無水物の誘導体である。特に興味があるのは、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミンまたはテトラエチレンペンタミンなどの脂肪族ポリアミンとの誘導体である。ヒドロキシル及び／又はアミノ及び／又はアミド及び／又はイミド基を有する基とは、例えば、カルボン酸基、酸アミド類、ジ−またはポリアミン類のアミド類（アミド機能以外に遊離アミン基を有する）、コハク酸誘導体（酸及びアミド機能を有する）、モノアミンとのカルボキシイミド類、ジ−またはポリ−アミンとのカルボキシイミド類（イミド機能以外に遊離アミン基を有する）、およびジ−またはポリアミン類と二種のコハク酸誘導体との反応で得られるジイミド類があげられる。このような燃料添加物は、特にＵＳ４８４９５７２に記載されている。
【０１１５】
置換フェノールと、アルデヒド類とモノ−またはポリアミン類とのマンニッヒ反応で得られた基を含む添加物（ｉ）は、好ましくはポリイソブテン置換フェノールと、ホルムアルデヒドとモノ−またはポリアミン、例えばエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミンまたはジメチルアミノプロピルアミンとの反応生成物である。このポリイソブテニル置換フェノールは、既存のまたは高反応性のＭｎが３００〜５０００のポリイソブテンに由来するものであってもよい。このような「ポリイソブテン−マンニッヒ塩基」は、特にＥＰ−Ａ  ８３１１４１に記載されている。
【０１１６】
これらの燃料添加物個別の詳細な定義に関しては、上記の先行技術文書を参照されたい。
【０１１７】
特に好ましいのは、（ｈ）基を持つ界面活性剤添加物である。これらは、特にポリイソブテニルで置換されたスクシンイミドであり、特に脂肪族ポリアミンとのイミドである。
【０１１８】
本発明において好適な乳化破壊剤の例としては、次のものが挙げられる。
【０１１９】
なお、乳化破壊剤は、乳化液の分離を引き起こす物質である。これらは、相界面で効果を示すイオン形成性または非イオン形成性の物質である。したがって、あらゆる表面活性質が原理的には好適な乳化破壊剤となる。特に好適な乳化破壊剤は、アニオン活性化合物類（例えば、アルキル置換フェノールのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩や、及びナフタレンスルホン酸及びそれらのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩）、非帯電化合物類（例えば、アルコールエトキシレートなどのアルコールアルコキシレート類）、フェノールアルコキシレート類（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルフェノールエトキシレートまたはｔｅｒｔ−ペンチルフェノールエトキシレート）、脂肪酸類、アルキルフェノール類、エチレンオキシド（ＥＯ）及びプロピレンオキシド（ＰＯ）の縮合物（例えば、ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）、ポリエチレンイミン類、ポリシロキサン類から選択される。
【０１２０】
この添加物組成物と燃料とを、更に他の既存の成分や添加剤と混合してもよい。特記すべきは、例えば、界面活性剤としての作用のあまりないキャリアー油類が、ガソリン燃料を使用する場合に採用されていることである。しかしながら、これらは中間留分において使用されることもある。
【０１２１】
好適なキャリアー油類を、以下に例示する。
【０１２２】
好適な鉱物性キャリアー油類は、粘度が例えばＳＮ５００〜２０００クラスのブライトストックまたは基油などの原油精製で得られる留分や、芳香族炭化水素類、パラフィン炭化水素類、アルコキシアルカノール類である。鉱油精製で得られる留分で、「水添分解油」と呼ばれるもの（蒸留範囲が約３６０〜５００℃である真空蒸留留分で、高圧下触媒的に水添・異性化し、パラフィンをのぞいた天然鉱油から得られるもの）も同様に有用である。上記の鉱物キャリアー油の混合物もまた好適である。
【０１２３】
本発明のおいて有用な合成キャリアー油類は、ポリオレフィン類（ポリ−α−オレフィン類またはポリ（内部オレフィン）類）、（ポリ）エステル類、（ポリ）アルコキシレート類、ポリエーテル類、脂肪族ポリエーテルアミン類、アルキルフェノール開始ポリエーテル類、アルキルフェノール開始ポリエーテルアミン類、長鎖アルカノールのカルボン酸エステル類から選ばれる。
【０１２４】
好適なポリオレフィン類の例としては、Ｍｎが４００〜１８００のオレフィンポリマー、特にポリブテンまたはポリイソブテン系のポリマー（水素化または非水素化）があげられる。
【０１２５】
好適なポリエーテル類またはポリエーテルアミン類の例としては、好ましくはＣ2〜Ｃ60−アルカノール、Ｃ6〜Ｃ30−アルカンジオール、モノ又はジＣ2〜Ｃ30−アルキルアミン、Ｃ1〜Ｃ30−アルキルシクロヘキサノールまたはＣ1〜Ｃ30−アルキルフェノールと、水酸基またはアミノ基に対して１〜３０ｍｏｌのエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシドとを反応させ、ポリエーテルアミンの場合、更にアンモニア、モノアミン類またはポリアミン類を用いて還元的にアミノ化させて得られるポリオキシ−Ｃ2〜Ｃ4−アルキレン基を有する化合物類である。このような生成物は、特にＥＰ−Ａ３１０８７５、ＥＰ−Ａ３５６７２５、ＥＰ−Ａ７００９８５、及びＵＳ４，８７７，４１６に記載されている。例えば、上記のポリエーテルアミンは、ポリ−Ｃ2〜Ｃ6−アルキレンオキシドアミン類またはその機能性の誘導体であってもよい。この具体例としては、トリデカノールブトキシレート類またはイソトリデカノールブトキシレート類、イソノニルフェノールブトキシレート類、及びポリイソブテノールのブトキシレート類及びプロポキシレート類、さらにこれらのアンモニアとの反応生成物があげられる。
【０１２６】
長鎖アルカノールのカルボン酸エステル類の例としては、特にＤＥ−Ａ３８３８９１８に記載ように特に長鎖アルカノールまたはポリオールのモノ−、ジ−またはトリカルボン酸エステル類があげられる。使用するモノ−、ジ−またはトリカルボン酸は、脂肪族酸であっても芳香属酸であってもよく、好適なエステルアルコール類またはポリオール類としては、特に、例えば炭素原子数が６〜２４の長鎖化合物があげられる。これらのエステル類の典型的な例としては、イソオクタノール、イソノナノール、イソデカノール、イソトリデカノールのアジピン酸エステル、フタール酸エステル、イソフタール酸エステル、テレフタール酸エステル及びトリメリット酸エステルがあげられ、例えばジ−（ｎ−またはイソトリデシル）フタレートである。
【０１２７】
他の好適なキャリアー油系が、例えば、ＤＥ−Ａ３８２６６０８、ＤＥ−Ａ４１４２２４１、ＤＥ−Ａ４３０９０７４、ＥＰ−Ａ０４５２３２８、及びＥＰ−Ａ０５４８６１７に記載されている。なお、これらの文献は、参照として本願明細書に組み込むこととする。
【０１２８】
特に好適な合成キャリアー油類の例としては例えばプロピレンオキシド、ｎ−ブチレンオキシド、及びイソブチレンオキシド単位から選ばれるＣ3〜Ｃ6−アルキレンオキシド単位数が約５〜３５、例えば約５〜３０であるアルコール開始ポリエーテル類、またはそれらの混合物があげられる。好適な開始アルコール類の例としては、長鎖アルカノール類やフェノール置換された長鎖アルキル（ただし、長鎖アルキル基は特に直鎖または分岐状Ｃ6〜Ｃ18−アルキル基である）があげられるが、これらに限定されるわけではない。好ましい例としては、トリデカノールやノニルフェノールがあげられる。
【０１２９】
他の好適な合成キャリアー油は、ＤＥ−Ａ１０１０２９１３．６に記載のように、アルコキシレート化されたアルキルフェノール類である。
【０１３０】
本発明の組成物は、適当なら他の共添加剤を含んでいてもよい。
【０１３１】
他の既存の添加物は、燃料の冷時の性質を向上させる添加物であり、その例としては、核剤、流動化助剤、パラフィン分散剤、およびこれらの混合物、エチレン−ビニルアセテートなどのコポリマー；  例えばフィルム形成性のある有機カルボン酸アンモニウム塩系のまたは非鉄金属腐食の保護の場合、複素芳香族化合物系の腐食防止剤；曇り防止剤；  例えば特定のシロキサン化合物などの消泡剤；セタン価改善剤（点火改善剤）；  燃焼改善剤；  パラフェニレンジアミン、ジシクロヘキシルアミン、またはその誘導体などのアミン系酸化防止剤または安定剤、あるいは２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールまたは３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などのフェノール系酸化防止剤または安定剤；  帯電防止剤；  フェロセンなどのメタロセン類；  メチルシクロペンタジエニルマンガントリカルボニル；  特定の脂肪酸、アクレケニルコハク酸エステル類、ビス（ヒドロキシアルキル）油脂系アミン類、ヒドロキシアセトアミド、またはヒマシ油などの潤滑性改善剤；  及び染料（マーカー類）があげられる。適当なら燃料のｐＨを下げるためにアミン類が加えられる。
【０１３２】
界面活性剤添加物として、例えば高極性基（ａ）〜  （ｉ）を有するものが使用される場合、これらの添加物は、燃料に対して、重量比で１０〜５０００ｐｐｍ、特に５０〜１０００ｐｐｍ、より好ましくは２５〜５００ｐｐｍの量で添加される。
【０１３３】
乳化破壊剤を使用する場合、これらは、燃料に対して重量比で０．１〜１００ｐｐｍ、特に０．２〜１０ｐｐｍの量で添加される。
【０１３４】
上記の他の成分や添加物は、必要なら、その目的に通常使用される量で添加される。本発明の添加物組成物が界面活性剤添加物を含む場合、その量は、組成物の総重量当たり、好ましくは１〜６０重量％、好ましくは１〜５０重量％、より好ましくは１〜４０重量％、特に好ましくは１〜１５重量％である。
【０１３５】
本発明の添加物組成物が乳化破壊剤を含む場合、その量は、組成物の総重量当たり、好ましくは０．０１〜５重量％、より好ましくは０．０１〜２．５重量％、特に好ましくは０．０１〜１重量％である。
【０１３６】
本発明の組成物は、必要ならさらに溶剤または希釈剤を含んでいてもよい。
【０１３７】
好適な溶剤や希釈剤としては、例えば芳香族炭化水素や脂肪族炭化水素であり、具体的には、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなどのＣ5−Ｃ10−アルカン類、それらの異性体や混合物；石油エーテル、べンゼン、トルエン、キシレンやソルベントナフサなどの芳香族化合物；炭化水素系溶媒と併用して、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノールなどの炭素原子数が３〜８のアルカノール類；アルコキシアルカノール類等が挙げられる。適当な希釈剤としては、例えば、灯油、ナフサまたはブライトストックなどの原油精製の際に得られる留分があげられる。中間留分の場合に、特にディーゼル燃料や加熱油の場合に、好ましく使用される希釈剤としては、ナフサ、灯油、ディーゼル燃料、重質ソルベントナフサ、ソルベッソ（Ｒ）またはシェルゾール（Ｒ）などの芳香族炭化水素、及びこれらの溶剤や希釈剤の混合物があげられる。
【０１３８】
個々の成分は、燃料または従来の燃料組成物に、個別に添加しても良いし、前もって調整した濃縮混合物（添加物パッケージ、添加物組成物）として添加してもよい。
【０１３９】
本発明は、また、燃料または燃料組成物に加えて、以下のものが混合された少なくとも一種の燃料組成物の製造方法に関する。
（ａ）少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体および少なくとも一種の他の燃料添加物、または  
（ｂ）上述のような添加物組成物。
【０１４０】
ハイドロフォビン又はその誘導体は、燃料の脱泡に関して良好な性質を有している。
【０１４１】
本発明を以下、実施例を参照しながら説明する。
【０１４２】
実施例
実施例１    
ｖａａｄ−Ｈｉｓβ／ｖａａＥ−Ｈｉｓ6のクローニング用の製剤
オリゴヌクレオチドＨａｌ５７０とＨａｌ５７１（Ｈａｌ５７２／Ｈａｌ５７３）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。使用したテンプレートＤＮＡは、微生物枯草菌のゲノムＤＮＡであった。得られたＰＣＲフラグメントには、枯草菌ｙａａＤ／ｙａａＥ遺伝子のコード配列が含まれ、それぞれの末端にＮｃｏｌとＢｇｌＩＩ制限酵素切断部を有していた。このＰＣＲフラグメントを精製し、制限エンドヌクレアーゼのＮｃｏｌとＢｇｌＩＩで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして用い、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌとＢｇｌＩＩで前もって直線化させたキアゲン社のベクターｐＱＥ６０にクローニングした。このようにして得たベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２とｐＱＥ６０ＹａａＥ＃５は、ＹＡＡＤ：：Ｈｉｓ6またはＹＡＡＥ：：Ｈｉｓ6からなるタンパク質の発現に用いることができる。
Ｈａｌ５７０：ｇｃｇｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｔｃａａａｃａｇｇｔａｃｔｇａ
Ｈａｌ５７１：ｇｃａｇａｔｃｔｃｃａｇｃｃｇｃｇｔｔｃｔｔｇｃａｔａｃ
Ｈａｌ５７２：ｇｇｃｃａｔｇｇｇａｔｔａａｃａａｔａｇｇｔｇｔａｃｔａｇｇ
Ｈａｌ５７３：ｇｃａｇａｔｃｔｔａｃａａｇｔｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｔａｔａｔｔｃｃ
【０１４３】
実施例２    
ｖａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6のクローニング  
オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１６とＫａＭ４１７を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。使用したテンプレートＤＮＡは、かびの偽巣性コウジ菌のゲノムＤＮＡであった。得られたＰＣＲフラグメントは、ハイドロフォビン遺伝子ｄｅｗＡのコード配列とＮ末端のＸａ因子プロテイナーゼ開裂部を含んでいた。このＰＣＲフラグメントを精製し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断した。このＤＮＡフラグメントをインサートとして用い、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌとＢｇｌＩＩで前もって直線化させたベクターｐＱＥ６Ｏ  ＹＡＡＤ＃２にクローニングした。このようにして得たベクター＃５０８は、ＹＡＡＤ：：Ｘａ：：ｄｅｗＡ：：Ｈｉｓ6からなる融合タンパク質の発現に用いることができる。
ＫａＭ４１６：ＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＧＣ
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
【０１４４】
実施例３    
ｖａａｄハイドロフォビンＲｏｄＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５０８と同様にして、オリゴヌクレオチドのＫａＭ４３４とＫａＭ４３５を用いてプラスミド＃５１３をクローニングした。
ＫａＭ４３４：Ｇ  ＣＴＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣ
ＫａＭ４３５：ＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧ
【０１４５】
実施例４    
ｖａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ１−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５０８と同様にして、オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１７とＫａＭ４１８を用いてプラスミド＃５０７をクローニングした。
【０１４６】
使用したテンプレートＤＮＡは、合成ＤＮＡ配列（ハイドロフォビンＢＡＳＦ１）であった（付属データ、配列識別番号１１と１２を参照）。
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【０１４７】
実施例５    
ｖａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ２−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５０８と同様にして、オリゴヌクレオチドのＫａＭ４１７とＫａＭ４１８を用いてプラスミド＃５０６をクローニングした。
【０１４８】
使用したテンプレートＤＮＡは、合成ＤＮＡ配列（ハイドロフォビンＢＡＳＦ２）であった（付属データ、配列識別番号１３と１４を参照）。
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【０１４９】
実施例６    
ｖａａｄハイドロフォビンＳＣ３−Ｈｉｓ6のクローニング  
Ｔプラスミド＃５０８と同様にして、オリゴヌクレオチドのＫａＭ４６４とＫａＭ４６５を用いてプラスミド＃５２６をクローニングした。
【０１５０】
使用したテンプレートＤＮＡは、スエヒロタケのｃＤＮＡであった（付属データ、配列識別番号９と１０を参照）。
ＫａＭ４６４：ＣＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣ
ＫａＭ４６５：ＧＣＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴ
【０１５１】
実施例７    
ｖａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6産生遺伝子組み換え大腸菌種の培養
１５ｍｌ容量のグラナーチューブに入っている３  ｍｌのＬＢ液体培地に、ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6を発現する大腸菌株を接種する。振とう機を用いて２００ｒｐｍで３７℃で８時間培養する。いずれの場合も、１ｍｌの予備培養物を、２５０ｍｌのＬＢ培地（＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン）の入った二個の１ｌの邪魔板つき三角フラスコに接種し、３７℃で振とう機を用い１８０ｒｐｍで９時間培養する。
【０１５２】
０．５ｌの予備培養物（ＯＤ600nm、１：１０、Ｈ2Ｏに対し）を、２０ｌの培養機に入った１３．５ｌのＬＢ培地（＋  １００μｇ／ｍｌのアンピシリン）に接種する。ＯＤ600nmが約３．５となるとき、１４０ｍｌの１００ｍＭのＩＰＴＧを添加する。３時間後培養機を１０℃に冷却し、培養ブロスを遠心分離する。更に精製するには、細胞ペレットを使用する。
【０１５３】
実施例８    
遺伝子組み換えハイドロフォビン融合タンパク質の精製
（Ｃ末端にＨｉｓ6タグを有するハイドロフォビン融合タンパク質の精製）
１００ｇの細胞ペレット（１００〜５００ｍｇのハイドロフォビン）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、全量２００ｍｌとして、再懸濁させる。この懸濁液をＴ２５型ウルトラタラックス（ヤンケアンドクンケル；ＩＫＡラボテクニック）で１０分間処理し、次いで５００単位のベンゾナーゼ（メルク、独国、注文番号１．０１６９７．０００１）とともに、室温で１時間培養して、核酸を分解させる。細胞破砕に先だって、ガラスカートリッジ（Ｐ１）を用いて濾過を行なう。細胞破砕および残存しているゲノムＤＮＡの切断のために、１５００ｂａｒで、二回のホモジナイザーサイクルを実施する（マイクロフルイダイザーＭ−１１０ＥＨ；  マイクロフルイディックス社）。ホモジネートを遠心分離し（ソルバールＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡローター、２５０  ｍｌ遠心ビーカー、６０分間、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）、上清を氷冷し、ペレットを１００  ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁する。遠心分離と再懸濁を３回繰返する。ただし、三回目には、１％のＳＤＳを含むリン酸ナトリウム緩衝液を使用する。再懸濁後、混合物を１時間攪拌し、最後の遠心分離を行う（ソルバールＲＣ−５Ｂ、ＧＳＡローター、２５０ｍｌ遠心ビーカー、６０分間、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、最後の遠心分離後の上清中にハイドロフォビンが存在する（図１）。この実験により、該当する大腸菌細胞中に封入体の形で存在する用であることがわかる。５０ｍｌのハイドロフォビン含有上清を５０ｍＭリスＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーで前もって平衡化した５０ｍｌのニッケルセファロース高性能１７−５２６８−０２カラム（アマーシャム）にかける。このカラムを５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーで洗浄し、ハイドロフォビンを次いで、２００  ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭトリスＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーで溶離させる。イミダゾールを除くため、この溶液を５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーに対して透析する。
【０１５４】
図１に、得られたハイドロフォビンの精製を示す。
レーンＡ：ニッケルセファロースカラムにかけた混合物（１：１０希釈）  
レーンＢ：初期溶離液：洗浄工程溶出液  
レーンＣ〜Ｅ：溶離フラクションのＯＤ２８０最大値（ＷＰ１、ＷＰ２、ＷＰ３）  
レーンＦは、添付のマーカーを示す。  
図１のハイドロフォビンの分子量は約５３ｋＤである。小さなバンドのいくつかは、ハイドロフォビンの分解産物を示す。
【０１５５】
実施例９    
性能試験：ガラス上の水滴の接触角変化によるハイドロフォビンの評価
基質：  ガラス（窓ガラス、スードドイチェガラス、独国）
−ハイドロフォビン濃度：１００μｇ／ｍｌ    
−５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）＋０．１％ツイーン２０中で、ガラス板を一夜（温度８０℃）培養
−次いで、蒸留水中で水洗
−次いで、１０分間／８０℃／蒸留水中１％ＳＤＳ溶液で培養
−蒸留水中で洗浄  
ガラス板試料を風乾し、５μｌの水滴の接触角（°）を測定。
【０１５６】
接触角は、データフィジックス接触角システムＯＣＡ１５＋、ソフトウェアＳＣＡ２０．２．０．（２００２年１１月）を使用して測定した。測定は、製造業者の指示に従って実施した。
【０１５７】
未処理のガラスの接触角は３０±５°であり、実施例８の機能性ハイドロフォビン（ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ6）を塗布すると、接触角は７５±５°となった。
【０１５８】
実施例１０    
ハイドロフォビン濃縮物（Ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ6）の脱泡剤としての利用
脱泡性能は、以下の手を用いた泡立ち試験で評価した：  
−１００ｍｌの燃料または添加剤を含む燃料を、２５０ｍｌのネジ蓋つきガラス瓶に入れて密閉した；    
−試料を二分間振盪した
−試料を直ちに静置し、泡の容量と泡の分解時間（秒）を測定した。
【０１５９】
この試験には、ハイドロフォビン濃縮物（Ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ6、ＮａＨ2ＰＯ4バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）溶液）を使用した。出発試料のハイドロフォビン濃度は６．１ｍｇ／ｍｌであった。２ｍｌの出発試料を、１００ｍｌに希釈（ハイドロフォビン溶液１）し、その溶液３ｍｌを、９７ｍｌの燃料（ＥＮ５９０燃料）に添加した。試験結果を次表にまとめた。
【０１６０】
【表１】
2009511689.tif 000002
【０１６１】
ハイドロフォビン濃縮物を添加した場合には、ディーゼル燃料がいずれのハイドロフォビンも含まない場合より、泡の発生量が少なく、泡の分解時間が短かった。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１に、得られたハイドロフォビンの精製を示す。
【図１】
2009511689.tif 000003
【配列表】
2009511689000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月25日(2008.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を、脱泡剤として、添加剤組成物又は燃料に使用する方法。
【請求項２】
上記燃料がディーゼル燃料である請求項1に記載の使用方法。
【請求項３】
上記少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体が、燃料に対して0.1〜100ppmの量で使用される請求項1に記載の使用方法。
【請求項４】
少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体を燃料に添加する工程を含むことを特徴とする燃料の脱泡方法。
【請求項５】
上記燃料がディーゼル燃料である請求項4に記載の燃料の脱泡方法。
【請求項６】
上記少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体が、燃料に対して0.1〜100ppmの量で使用される請求項4に記載の燃料の脱泡方法。
【請求項７】
少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体と少なくとも一種の他の燃料添加剤とを含むことを特徴とする添加剤組成物。
【請求項８】
少なくとも一種の燃料を主成分として含み、さらに少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体及び少なくとも一種の他の燃料添加物を含むことを特徴とする燃料組成物。
【請求項９】
上記組成物が少なくとも一種の界面活性剤を含む請求項7に記載の添加物組成物。
【請求項１０】
上記組成物が少なくとも一種の乳化破壊剤を含む請求項7に記載の添加物組成物。
【請求項１１】
燃料または燃料組成物に、少なくとも一種のハイドロフォビンまたはその誘導体及び少なくとも一種の他の燃料添加物を混合することを特徴とする、少なくとも一種の燃料組成物の製造方法。
【国際調査報告】
2009511689.tif 000031
2009511689.tif 000032
2009511689.tif 000033
2009511689.tif 000034
2009511689.tif 000035
2009511689.tif 000036