(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−６アンタゴニストと組み合わせてプロテアソームインヒビターを共投与することを含む、そのような処置の必要な哺乳動物における、がん性障害または症状、またはＩＬ−６関連障害または症状を処置する方法に対向される。
2009518447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６アンタゴニストと組み合わせてプロテアソームインヒビターを共投与することを含む、処置の必要な哺乳動物における、がん性障害または症状の処置方法。
【請求項２】
ＩＬ−６アンタゴニストが抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗体またはそのフラグメントがＩＬ６に結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗体またはそのフラグメントがＩＬ−６レセプターに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはその誘導体である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体が、ヒトＩＬ６に結合するためにモノクローナル抗体ｃＣＬＢ８と競合する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
モノクローナル抗体が静脈内に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１２．０ｍｇ／ｋｇ体重の量において投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体がボーラス用量において投与され、続いて該抗体の注入によって投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
プロテアソームインヒビターが、ボロン酸ジペプチドプロテアソームインヒビター  ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、ＰＳ−５１９（１Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］］−１−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．１］ヘプタン−３，７−ジオン）；クラスト（ｃｌａｓｔｏ）−ラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）β−ラクトン；ラクタシスチン、エポキソミシン（ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎ）、ＣＶＴ６３４（−５−メトキシ−１−インダノン−３−アセチル−ロイシル−Ｄ−ロイシル−１−インダニルアミド）、ＴＭＣ９６（（３−メチルブタノイル−Ｌ−トレオニンＮ−（１−（２−（ヒドロキシメチル）−オキシラン−２−イルカルボニル）−３−メチルブト−３エニル）アミド）、ＭＧ−１１５、ＣＥＰ１６１２およびＭＧ１３２からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
プロテアソームインヒビターが、ボロン酸ジペプチドプロテアソームインヒビター  ボルテゾミブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
がん性障害または症状が、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛状細胞性白血病、脊髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸がん腫、膵臓がん腫、腎細胞がん腫、前立腺細胞がん腫、鼻咽喉がん、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴性症候群／悪性の高カルシウム血症、固形腫瘍、腺がん、肉腫および悪性黒色腫から選ばれる、少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＩＬ６アンタゴニストが、プロテアソームインヒビターと、連続的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）、順次（ｓｅｒｉａｌｌｙ）または同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍の増殖を抑制するために有効な量において、膜結合レセプターを介するシグナリングのＩＬ６活性化を妨げるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを、プロテアソームインヒビターと一緒に哺乳動物に投与することを含む、それの必要な哺乳動物における該腫瘍の増殖を抑制する方法。
【請求項１７】
哺乳動物における転移を予防するために有効な量において、膜結合レセプターを介するシグナリングのＩＬ６活性化を妨げるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを、プロテアソームインヒビターと一緒に哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における転移を予防する方法。
【請求項１８】
抗体がｃＣＬＢ８またはそのフラグメントである、請求項３、１６または１７のいずれかの方法。
【請求項１９】
ＩＬ−６アンタゴニストと組み合わせてプロテアソームインヒビターを共投与することを含む、処置の必要な哺乳動物における、ＩＬ−６関連障害または症状の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんのような疾病について処置されている被験者の処置の応答を増進するために、インターロイキン−６アンタゴニストとの組み合わせにおけるプロテアソームインヒビターの使用に関する。また本発明は、プロテアソームインヒビターの有効量およびインターロイキン−６アンタゴニストの有効量を被験者に投与することによる、被験者におけるがんを処置する方法に関する。本発明は、特に、インターロイキン−６（インターフェロンβ２としても既知のＩＬ−６）タンパク質に対して特異的な、特定の部分またはバリアントを含む抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインＩＬ−６
ＩＬ−６（インターロイキン６）は、単球由来のヒトＢ細胞増殖因子、Ｂ細胞刺激因子２、ＢＳＦ−２、インターフェロンβ−２およびハイブリドーマ増殖因子として以前から既知の２２〜２７ｋＤａの分泌糖タンパク質であり、これは、増殖刺激と前炎症活性を有する（非特許文献１）。
【０００３】
ＩＬ−６は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）Ｍ（ＯＳＭ）、毛様体神経向性因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロピン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｎ）−１（ＣＴ−１）、ＩＬ−１およびＩＬ−１１を含む、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および骨髄単球増殖因子（ＭＧＦ）ファミリーに属する。ＩＬ−６は、一連の細胞型、もっとも顕著には、抗原提示細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞によって産生される。ＩＬ−６型サイトカインはすべて、共通のシグナル伝達タンパク質、ｇｐ１３０（以前にはＩＬ−６Ｒβ）を含有するレセプター複合体を介して作用する。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＣＴ−１およびＣＮＴＦは、特異的レセプタータンパク質に最初に結合し、これらが続いてｇｐ１３０に会合するのに対して、ＬＩＦおよびＯＳＭはＬＩＦ−Ｒおよびｇｐ１３０の複合体に直接結合する。特異的ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６α、ｇｐ８０、またはＣＤ１２６）は、膜結合性または可溶性（ｓＩＬ−６Ｒ、５５ｋＤ形態物）いずれかの形態物において存在し、これらは共にｇｐ１３０を活性化することができる。
【０００４】
数種の作用物質が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦａ、ＩＬ−４、ＩＦＮａ、オンコンスタチンおよびＬＰＳのようにＩＬ−６の発現を誘導することが知られている。ＩＬ−６は、ＢおよびＴ細胞活性化、造血、破骨活性、角質細胞増殖、急性期タンパク質合成、ニューロン成長および肝細胞活性化のような多様な活性に関与している（非特許文献２）。
【０００５】
ＩＬ−６は多くの経路に関与するが、ＩＬ−６ノックアウトマウスは正常な表現型を有し、それらは生存可能であり、生殖力があり、そして組織損傷に対してＴ細胞数の若干の減少と急性期タンパク質応答の低下を示す（非特許文献３）。反対に、大脳ＩＬ−６を過発現するトランスジェニックマウスは、神経学的疾病、例えば神経変性、星状細胞増加、大脳血管新生を発達させ、そしてこれらのマウスは血液脳関門を発生させない（非特許文献４）。
【０００６】
がんにおけるＩＬ−６の役割
ＩＬ−６は、種々のメカニズムによって数種の悪性疾患の病理生理学に関与している。ＩＬ−６は、無力症／悪液質および骨吸収のようながん関連罹患における原因因子であるとする仮説が立てられている。腫瘍由来の悪液質（非特許文献５）、骨吸収および関連する高カルシウム血症は、ＩＬ−６ノックアウトマウスにおいて減少されることが見出だされた（非特許文献６）。がん関係うつ病、および脳腫瘍に対して二次的な大脳浮腫もまた高レベルのＩＬ−６に関係していた（非特許文献７）。
【０００７】
種々のヒトがんの多数のインビトロおよびインビボモデルからの実験結果は、ＩＬ−６が抑制のための治療標的であることを例証した。ＩＬ−６は、腫瘍細胞の増殖、分化および生残を誘導し、アポトーシスを促進し（非特許文献８）、そして化学療法に対する抵抗性を誘導する（非特許文献９）ことができる。
【０００８】
多発性骨髄腫は形質細胞を伴う悪性腫瘍である。ＩＬ−６は、悪性細胞のアポトーシスの抑制を伴う自律分泌またはパラ分泌メカニズムをとおして多発性骨髄腫（ＭＭ）における悪性形質細胞の増殖、分化および生残を増進することが知られている。したがって、ＩＬ−６の遮断は有効な療法であると主張された（非特許文献１０）。インビトロ実験（非特許文献１１）および臨床試行（非特許文献１２および１３）の両方が実施され、そして結果は、ＩＬ−６遮断ががん細胞増殖に対して論証できる影響を有することを示している。
【０００９】
治療標的としてのプロテアソーム経路
近年の実験的証拠は、プロテアソームインヒビターがある種の病気、例えばがん、喘息、脳梗塞および自己免疫性脳脊髄炎において実際に有益であるかもしれないということを強く示唆する。悪性腫瘍では、薬物は、種々の細胞周期インヒビターの分解の抑制を介して、あるいは抗アポトーシス性転写レギュレーターＮＦ−κＢの抑制を介して作用できるが、他方、神経保護においては、それらは、ＮＦ−κＢの活性化を抑制することによって作用でき、この場合には、これは炎症応答を惹起する。自己免疫疾患では、それらは、「自己」ペプチドの提示を抑制することによって作用するが、また細胞免役カスケードに沿ったシグナル伝達を妨げることによっても作用することができる。
【００１０】
ボロン酸ジペプチドプロテアソームインヒビター  ＰＳ−３４１、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）（ＶＥＬＣＡＤＥ（Ｒ））は、強力かつ特異的なプロテアソームインヒビターとして作用することが知られた最初の承認された治療剤である。ボルテゾミブは骨髄腫の処置における重要な進歩であるが、無反応性または再発疾患を有する患者の２７％が、そのＦＤＡ認可をもたらした初期の第２相臨床試験において部分的または比較的良好な応答を有しただけであった（非特許文献１４）。前臨床研究は、プロテアソームインヒビターへの曝露においてアップレギュレーションされ、それによってそれらの抗腫瘍効力を弱める、抗アポトーシス経路を含む誘導される化学療法抵抗性（ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の重要なメディエーターを同定した（非特許文献１５）。
【００１１】
プロテアソームインヒビターに対する化学療法抵抗性の１つのメカニズムは、ＨＳＰ−７０、アポトーシスの重要なインヒビターの発現の誘導である。プロテアソームの抑制は、転写因子、ＨＳＦ−１．５−８の活性化を介して、ミスホールドされた（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）タンパク質の蓄積および熱ショックタンパク質ファミリーのメンバー、もっとも顕著にはＨＳＰ−７０の劇的なアップレギュレーションをもたらす。他の研究では、ｓｉＲＮＡまたは抗センス技術をによるＨＳＰ−７０発現のダウンレギュレーションが、がんの他の前臨床モデルにおけるプロテアソームインヒビターのプロ・アポトーシス活性を強化した（非特許文献１６；１７）。
【００１２】
誘導性化学療法抵抗性の第２の例は、ＭＫＰ−１ホスファターゼであり、これはプロテアソームインヒビターによって転写を介してアップレギュレーションされる（非特許文献１８）。ＭＫＰ−１ホスファターゼは、また抗アポトーシス性であるストレス応答タンパク質であり、ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼの失活によって作用する。ＭＫＰ−１のダウンレギュレーションは、プロテアソームインヒビターの抗腫瘍効力を増進することが示された（非特許文献１９）。
【００１３】
ＩＬ−６は、骨髄腫の病原論において中心的役割を演じていて、このことは、骨髄の微小環境における骨髄腫細胞の増殖および生残因子として機能し、そして広範な化学療法に対する感受性を減少させる抗アポトーシス・プログラムを活性化するその能力によって例証される。ＩＬ−６は、いくつかのモデル系においてＨＳＰ−７０の発現をアップレギュレーションすることが示されている。第２に、ＳＴＡＴ−１、ＩＬ−６のシグナル伝達によって活性化される重要な下流転写因子は、ＨＳＦ−１と相互作用して熱ショック応答のメンバーの転写を促進する。
【００１４】
したがって、より効力のある、より毒性の低い、かつ一層持続性のある臨床応答に関する研究では、ある種のがんおよび関連もしくは非関連筋衰弱（ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｓｔｉｎｇ）、ならびにある種の炎症または神経もしくは非神経起源の自己免疫疾患の処置において価値のある作用物の組み合わせ物を例証することが重要であろう。ＩＬ−６インヒビターおよびプロテアソームインヒビターのサイトカインを組み合わせることの有利な効果は、従来、例証されていない。
【非特許文献１】Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：７３−７６，１９８６
【非特許文献２】Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ；１６（３−４）：２４９−８４，１９９８
【非特許文献３】Ｋｏｐｆ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ：３６８：３３９−４２，１９９４
【非特許文献４】Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ９０：１００６１−１００６５，１９９３
【非特許文献５】Ｃａｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；６０（１９）：５４８８−９
【非特許文献６】Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献７】Ｍｕｓｓｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．；１５８（８）：１２５２−７，２００１
【非特許文献８】Ｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：１９８−２０８，２００１
【非特許文献９】Ｃｏｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：８８５１−８８５８，２００１
【非特許文献１０】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：１４７−１６５，２０００
【非特許文献１１】Ｔａｓｓｏｎｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２１（４）：８６７−８７３，２００２
【非特許文献１２】Ｂａｔａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ；８６（２）：６８５−９１
【非特許文献１３】Ｖａｎ  Ｚａａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９８：１４４１−１４４８
【非特許文献１４】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＰＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００３，３４８：２６０９−１７
【非特許文献１５】総説、Ｓａｌｅｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００，２：４７６−８３
【非特許文献１６】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９９，３４４：４７７−８５
【非特許文献１７】Ｇａｂａｉ  ＶＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００５，２４：３３２８−３８
【非特許文献１８】Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  ＲＺ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，２７７：２７８６４−７１
【非特許文献１９】Ｓｍａｌｌ  ＧＷ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００４，６６：１４７８−９０
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、プロテアソームインヒビターの有効量およびインターロイキン−６アンタゴニストの有効量を被験者に投与することによる、被験者における疾病を処置する方法に関する。本発明の方法は、ボルテゾミブまたは関連プロテアソームインヒビターと、連続的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）、順次（ｓｅｒｉａｌｌｙ）または同時に、抗ＩＬ６アンタゴニストを投与することを含む。１つの実施態様では、ＩＬ６アンタゴニストは高親和性抗ＩＬ６抗体である。その他の実施態様では、ＩＬ６アンタゴニストは抗ＩＬ６Ｒ抗体である。
【００１６】
本発明の方法を受け入れる疾病は、がん、喘息、炎症性疾患および神経学的疾患を含む。１つの実施態様では、疾病は、がん性障害または症状である。
【００１７】
さらに、本発明は、少なくとも１種のＩＬ−６アンタゴニストおよび少なくとも１種のプロテアソームインヒビターの組み合わせ物の利用を予測する方法を提供する。
【００１８】
図１は、指定時間の間処置される多発性骨髄腫細胞に及ぼすＣＮＴＯ３２８濃度の増加の影響を示すグラフである。
図２Ａ−Ｄは、抗体、Ｆ１０５および無関係な対照ＭａｂもしくはＣＮＴＯ３２８ならびに指定濃度のボルテゾミブとともに培養された指定細胞の相対生存率パーセントを表す棒グラフである：Ａ）抗体と予めインキュベートされ、次いで指定濃度におけるボルテゾミブにより処置されたＡＮＢＬ−６多発性骨髄腫細胞、Ｂ）抗体と予め培養され、次いで指定濃度におけるボルテゾミブにより処置されたＫＡＳ−６多発性骨髄腫細胞、Ｃ）ＲＰＭＩ８２２６  ＩＬ６非依存性骨髄腫細胞、およびＤ）ＣＮＴＯ３２８およびボルテゾミブにより同時に処置されたＡＮＢＬ−６多発性骨髄腫細胞。
図３Ａ−Ｂは、抗体およびボルテゾミブ組み合わせ物により処置されたＩＬ６依存性細胞系ＡＮＢＬ−６（Ａ）およびＫＡＳ−６（Ｂ）において測定されたアポトーシスにおける相対的倍増を表す棒グラフであり、ここでＦ１０５は対照Ｍａｂである。
図４は、ＨＳＣ−７０およびＭＫＰ−１に対してプローブされた、ＣＮＴＯ３２８または対照Ｍａｂおよび増加濃度のボルテゾミブにより処置された後のＡＮＢＬ−６細胞サンプルのタンパク質ゲルのウエスタンブロットである。
図５は、担体対照（ＤＭＳＯ）または２つの濃度のボルテゾミブおよび増加濃度の熱ショックタンパク質アテニュエーターＫＮＫ４３７とともに培養されたＡＮＢＬ−６細胞において測定されたアポトーシスにおける相対的倍増を表す棒グラフである。
図６は、担体対照（ＤＭＳＯ）または２つの濃度のボルテゾミブおよび増加濃度の熱ショックタンパク質アテニュエーターＫＮＫ４３７とともに培養された、ＨＳＦ欠乏（−／−）または正常（＋／＋）であるＭＥＦ細胞において測定されたアポトーシスにおける相対的倍増を示す棒グラフである。
【００１９】
略語
Ｉｇ  免疫グロブリン、ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ、ＩＬ  インターロイキン、ＩＬ６  インターロイキン−６、ＩＬ−６Ｒ  インターロイキン−６レセプター、ｓＩＬ−６Ｒ  可溶性インターロイキン−６レセプター、ＨＳＦ−１  熱ショック転写因子、ＨＳＰ  熱ショックタンパク質、ＭＡＰＫ  マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ＭＰＫ−１  ＭＡＰＫホスファターゼ、Ｍａｂ  モノクローナル抗体、ＳＴＡＴ  シグナル伝達活性化。
【００２０】
定義
本明細書における用語「抗体」は、広範な意味において使用され、そして具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を発揮するくらい長い抗体フラグメントをカバーする。「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部分、一般に、その抗原結合ドメインまたは可変ドメインを含む。抗原フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ｄｉａｂｏｄｙ；線状（ｌｉｎｅａｒ）抗体；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む。
【００２１】
「キメラ抗体」は、１つの種からの明確なドメイン、通常は可変ドメインおよびその他の種からの残りの部分を保持するそれらの抗体；例えば、マウス−ヒトキメラである。
【００２２】
本明細書で使用されるところの用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するか、またはそれと密接に一致する可変および定常部を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされてないアミノ酸残基（例えば、インビトロで無作為にまたは部位特異的突然変異誘発によるか、あるいはインビボで体細胞変異によって、例えばヒト重鎖のＶ、ＤおよびＪセグメントの組み換え中に、導入された変異物）を含んでもよい。かくして、本明細書で使用されるところの用語「ヒト抗体」は、タンパク質の実質的にあらゆる部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、ヒト生殖系列の抗体遺伝子によってコードされた部分と実質的に類似である抗体を指す。ヒト抗体は、それらのアミノ酸配列類似性に基づくグループ分けにより分類された、参照、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／。かくして、配列類似性検索を使用して、類似の線状配列をもつ抗体が、ヒトまたはヒト化抗体を選別または創成する鋳型として選ぶことができる。
【００２３】
本明細書で使用されるところの用語、抗体に対する「高親和力」は、１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、なおより好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。本明細書で使用されるところの用語「Ｋｄｉｓ」または「ＫＤ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度（ｒａｔｅ）を指すことを意図している。「ＫＤ」は、会合速度（ｋ１）または「オン−レート（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋｏｎ）」に対する、解離速度（ｋ２）、また「オフ−レート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（Ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる、の比である。かくして、ＫＤはｋ２／ｋ１またはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、そしてモル濃度（Ｍ）として表される。それは、Ｋｄが、より小さければ、結合が、より強いことを示す。したがって、１０−６Ｍ（または１ｍＭ）は、１０−９Ｍ（または１ｎＭ）に比較して弱い結合を示している。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「ユビキチン−プロテアソーム系」は、望ましくないタンパク質を同定し、分解する多成分系である。この系は、それらの損傷、ミスフォールディングまたは短命（ｓｈｏｒｔ  ｌｉｖｅｄ）細胞特性による望ましくないタンパク質を認識するのに要求される酵素を含み、これは、望ましくないタンパク質のユビキチン化に関係する酵素、ならびに核および細胞質ゾルの両方に見出だされる多サブユニット複合体であるプロテアソーム構造を含む分解酵素である。
【００２５】
本明細書で使用されるところの用語「プロテアソームインヒビター」は、プロテアソームのペプチダーゼの阻害剤を含むことが意図される。より具体的には、プロテアソームのペプチダーゼのこれらのインヒビターは、チオールおよびセリンプロテアーゼに加えて、キモトリプシン様およびトリプシン様プロテアーゼのインヒビターを含む。
【００２６】
本明細書で使用されるところのがん細胞に関する場合の治療剤に対する用語「抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」は、正常または非抵抗性細胞が、同じレベルまたは濃度の治療剤との接触においてもたらされる場合に較べて、そのレベルの治療剤との接触の結果として、増殖を損傷または抑制するか、または非常に低い程度まで抑制される薬剤の環境レベルまたは濃度に対する曝露によって通常惹起される薬剤の効果に対して、細胞が抵抗性を達成したことを意味する。治療剤に対して抵抗性になる性質は高度に可変的であり、種々のがん細胞は、種々の条件下で与えられた治療剤に対して種々のレベルの「抵抗性」を示す。
【００２７】
プロテアソームインヒビター・ボルテゾミブは、多発性骨髄腫の処置における有意な進歩を表すが、その効力は、多くの抵抗メカニズムによって制限される。もっとも重要なものの１つは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）およびストレス応答経路であり、これらは、ＨＳＰ−７０およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ホスファターゼ（ＭＫＰ）−１のようなメンバーを介して、ボルテゾミブのプロ・アポトーシス活性に抵抗する。インターロイキン（ＩＬ）−６シグナル伝達は、転写のシグナルトランスデューサー（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）およびアクチベーター（ＳＴＡＴ）−１および熱ショック転写因子（ＨＳＦ）−１を介して熱ショック応答を増大するので、特許出願者らは、ＩＬ−６シグナル伝達のダウンレギュレーションが、ボルテゾミブによるＨＳＰ誘導を弱め、それによってその抗骨髄腫活性を増進するという仮説を立てた。
【００２８】
ボルテゾミブおよびＣＮＴＯ３２８、キメラモノクローナルＩＬ−６中和抗体の組み合わせ物によるＩＬ−６依存性多発性骨髄腫細胞系ＫＡＳ−６およびＡＮＢＬ−６の処置は、時間−および濃度−依存様式においていずれかの薬物単独によるよりも大きい細胞生存率の低下をもたらした。このことは、同じ条件下で、２種の個々の薬剤単独の合計よりも大きいアポトーシスの増進された誘導と関連していて、相乗的相互作用を示唆している。類似の知見は、イソタイプの対照抗体を使用した場合、およびＩＬ−６非依存性ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫細胞系の研究では見られなかった。細胞がＣＮＴＯ３２８により前処置され、続いてボルテゾミブによって処置された場合、あるいはそれが両薬剤で同時に処置された場合には、ボルテゾミブと、それに続くＣＮＴＯ３２８による処置に較べて、活性の増大が見られた。ＣＮＴＯ３２８による処置は、ＳＴＡＴ−３およびｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化の顕著な遮断によって例証されたように、ＩＬ−６媒介の下流シグナル伝達経路を強力に抑制した。ＣＮＴＯ３２８は、ＨＳＰ７０およびＭＫＰ−１発現のボルテゾミブ媒介の誘導を、それぞれ４５％および９０％減少させた。注目すべきは、ＣＮＴＯ３２８は、転写活性のあるホスホ−ＳＴＡＴ−１のレベルを著しく低下し、そしてＨＳＦ−１の高リン酸化を減少させた。薬理学的インヒビターＫＮＫ４３７の使用を含む、熱ショック応答を抑制する他の戦略もまた、ボルテゾミブとの組み合わせにおける相乗的抗骨髄腫効果に関する証明を与える。ＫＮＫ４３７およびボルテゾミブの相乗活性は、正常なマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）では再現されなかったが、ＨＳＦ−１ノックアウトＭＥＦでは鈍化された。まとめると、出願者らは、ＩＬ−６シグナル伝達の抑制がボルテゾミブの抗骨髄腫活性を増進することを例証した。また、それらは、転写活性のあるＳＴＡＴ−１およびＨＳＦ−１のダウンレギュレーションを介して熱ショック応答のプロテアソームインヒビター媒介の誘導を弱めることによって、少なくとも一部は、このことが起きるという仮説を支持する。本発明のこの教示は、ボルテゾミブまたは関連プロテアソームインヒビターと、連続的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）、順次（ｓｅｒｉａｌｌｙ）または同時に、抗ＩＬ６抗体を用いて、それを必要とする被験者を処置する方法に関する原理を提供する。
【００２９】
本発明のＩＬ６アンタゴニスト
本発明において使用されるＩＬ−６アンタゴニストは、それがＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、そしてＩＬ−６の生物学的活性を抑制するならば、いかなる起源のものであってもよい。ＩＬ−６アンタゴニストの例は、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、ｇｐ１３０抗体、ＩＬ−６変異体、ＩＬ−６Ｒアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒの部分ペプチドを含む。本発明において使用されるＩＬ−６変異体の例は、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，８６−９３，１９９４またはＳａｖｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３，１３５７−１３６７，１９９４において開示されている。ＩＬ−６変異体ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ＩＬ−６のシグナル伝達効力を保持しないが、ＩＬ−６Ｒとの結合活性を保持しており、そしてＩＬ６のアミノ酸配列中に置換、欠失または挿入の形態で変異を導入することによって作成される。使用される動物種には制限はないが、ヒト起源のＩＬ６を使用することが好ましい。同様に、いかなるＩＬ−６部分ペプチドまたはＩＬ−６Ｒ部分ペプチドも、それらが、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒ（ｇｐ８０）またはｇｐ１３０がシグナル伝達に影響するのを妨ぎ、それによってＩＬ−６関連の生物学的活性を妨げるならば、本発明において使用されてもよい（ＩＬ−６部分ペプチドおよびＩＬ−６Ｒ部分ペプチドに関する詳細は、米国特許第５，２１０，０７５号；欧州特許第６１７１２６号）。なおその他の実施態様では、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒ  ＲＮＡサイレンシングまたはアンチセンスメカニズムの可能なオリゴヌクレオチドは、本発明の方法において使用することができる（ＩＬ−６Ｒアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する詳細は、日本特許第５−３００３３８号）。
【００３０】
本発明の抗体
本発明において有用な抗体は、単離されたキメラ、ヒト化および／またはＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体またはヒトの抗体を含み、これらはＩＬ６の生物学的機能を抑制することができる少なくとも１つの抗原結合域を有する。本発明の抗体の例は、ＩＬ−６結合抗体、ＩＬ−６Ｒ（ｇｐ８０）結合抗体、ｇｐ１３０結合抗体を含む。適当な抗原結合域をもつＩＬ−６Ｒ抗体の例は、ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３，２９００−２９０６，１９８９）、およびＡＵＫ１２−２０、ＡＵＫ６４−７またはＡＵＫ１４６−１５抗体（ＷＯ９２−１９７５９）を含む。その他の実施態様では、抗ＩＬ６Ｒ抗体は、米国特許第５８８８５１０号および同第６１２１４２３号において開示されたＭＲＡとして既知の再構築（ｒｅｓｈａｐｅｄ）抗体である。
【００３１】
１つの実施態様では、抗原結合域は、高親和性ＣＬＢ−８抗ＩＬ−６抗体由来である。ＣＬＢ−６由来の本発明の代表的抗体は、本出願者の同時係属出願米国特許第１０／２８０７１６号に記述されているようなＣＮＴＯ３２８であり、出願の内容は、引用によって本明細書に組み入れられている。その他の実施態様では、抗体は、本出願者の同時係属米国暫定特許出願第６０／６７７，３１９号に記述されているような高親和力によりＩＬ６を結合するヒト抗体である。本発明の抗体は、具体的には、高親和力によりヒトＩＬ−６を中和する。
【００３２】
本発明による方法において使用されてもよい抗ＩＬ−６抗体は、本発明の抗体中に組み入れられてもよい、重鎖もしくは軽鎖定常部、フレームワーク部またはそのいずれかの部分と組み合わせて、マウスＣＬＢ−８モノクローナル抗体由来の、重鎖または軽鎖の少なくとも１つの相補性決定部（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分を含むすべてのタンパク質またはペプチド分子を含む。１つの実施態様では、本発明は、２種の軽鎖および２種の重鎖を含んでなる抗ＩＬ−６キメラ抗体に対向され、これらの鎖の各々は、ヒト定常部の少なくとも一部およびヒトＩＬ−６に特異性を有するマウスｃ−ＣＬＢ８モノクローナル抗体由来の可変部（ｖ）の少なくとも一部を含んでなり、該抗体は、抗体ｃＣＬＢ−８のように、高親和力により結合して、ヒトＩＬ−６のエピトープを阻止および／または中和する。また本発明は、そのような抗体のフラグメントまたは誘導体、例えば、重鎖の定常、結合、多様または可変部、あるいは軽鎖の定常、結合または可変部のような抗体鎖の１個以上の部分を含む。
【００３３】
本発明の好適な抗体は、抗ＩＬ−６マウスＣＬＢ−８、キメラ抗ＩＬ−６ＣＬＢ−８、または実質的に同じ結合特性を有する抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび領域のヒトＩＬ−６に対するインビボ結合を競合的に阻止できる、それらのキメラの、ヒト化および／またはＣＤＲ移植された抗体か、またはヒト抗体を含む。
【００３４】
本発明の抗体は、好ましくは、少なくとも１０−９Ｍ、好ましくは少なくとも１０−１０Ｍの親和力（Ｋｄ）により抗ＩＬ６または抗ＩＬ６Ｒを結合し、そして／または実質的に、少なくとも１種のＩＬ−６タンパク質の少なくとも１つの活性を中和する。好適な実施態様では、抗体は、少なくとも１Ｘ１０−１１Ｍ、好ましくは５Ｘ１０−１１Ｍの親和力（Ｋｄ）によりＩＬ−６を結合し、ヒトＩＬ−６を中和する。好ましくは、抗体は、他のＩＬ−６スーパーファミリーメンバーを結合せず、そしてＧＰ１３０のトランス−シグナリングを遮断する。
【００３５】
プロテアソームインヒビター
プロテアソームは、高度に保存されている多触媒性プロテイナーゼである細胞内構造物である。プロテアソームは、重要な調節的な細胞プロセスに伴われる多数のタンパク質のＡＴＰ依存性タンパク質分解に関与している。かくして、プロテアソームは細胞の増殖および分化における調節要素である。平均的なヒト細胞は、約３０，０００のプロテアソームを含有し、これらの各々が数種のタンパク質消化プロテアーゼを含有する。これらの複合体は、転写、細胞周期制御、ストレス応答、リボソーム生物発生および異常タンパク質異化を含む無数の細胞機能においてなる。したがって、それらは、免疫および炎症応答（ＷＯ９５／２５５３３）、ウイルス感染、発がん、神経および筋変性（米国特許第５，３４０，７３６号）、ＤＮＡ修復および細胞分化のようなプロセスにおいて役割を演じる。プロテアソーム活性は、分解されるタンパク質の速度および特定の種類にわたって厳しい管理を維持するために精巧に制御される。
【００３６】
いくつかの段階が、プロテアソームまたは「ユビキチン−プロテアソーム」経路を介するタンパク質分解に必要である。最初に、タンパク質が、ユビキチンとして既知の低ポリペプチドの鎖により破壊のための目印が付けられる。ユビキチン化はプロテアソームの閉ざされたタンパク質分解チャンバー中にそのタンパク質を導く。３種の酵素活性、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３が、ユビキチン化のために必要とされる。ＡＴＰ依存性Ｅ１酵素はユビキチンを活性化し、そしてそれをユビキチン共役酵素、Ｅ２に結び付ける。Ｅ３酵素、ユビキチンリガーゼは、次に、ユビキチン分子をタンパク質に結合させる。このプロセスが反復されて、指定されたポリペプチドがユビキチン部分の長鎖を辿って行き、そして最後に、プロテアソームはタンパク質を小さいフラグメントに分解する。ユビキチン−プロテアソーム経路は、細胞中のすべての異常なミスフォールドされたタンパク質の９０％、および短命な調節タンパク質の全部の分解に関与する。これらの短命なタンパク質の半減期は３時間未満であるが、これらは全細胞タンパク質の１０％〜２０％を数える。また、この経路は、多量の長命な細胞タンパク質を分解する。かくして、ユビキチン−プロテアソーム経路は全細胞内タンパク質の８０％〜９０％の分解に関与している。
【００３７】
以前に報告されたプロテアソームインヒビターはペプチジルアルデヒドを含んだ。これらの予備的な最適化は、Ｐ１位におけるロイシンおよびＰ２またはＰ３位における大きい疎水性残基、例えばナフチルアラニンを優先することを示唆した。また、ペプチジルアルデヒドは、チオールプロテアーゼ（例えば、カルパイン、カテプシン）の強力な阻害を例証し、そしてα−位におけるプロトンの酸性により立体配置的に不安定であるので、アルデヒド基の置換が研究された。
【００３８】
放線菌から初めて単離された抗生物質インヒビターに加えて、種々のペプチドアルデヒドが合成された、例えば、Ｓｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，（ＷＯ９１／１３９０４）により記述されたキモトリプシン様プロテアーゼのインヒビター。プロテアソーム複合体の種々のインヒビターが報告された、例えば、Ｄｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：２７２５（１９９１）；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：３７５（１９９２）；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：９（１９９２）；Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：１０２８９（１９８９）；Ｒｉｖｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．２１８：１（１９８９）；Ｒｉｖｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１２，２１５（１９８９）；Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．４：１（１９９２）。また、プロテアソームインヒビターは、米国特許第５，６９３，６１７号において議論されていて、これの開示は、引用によって本明細書に組み入れられている。
【００３９】
好適なプロテアソームインヒビターは、「ＰＳ−３４１」であり、これは、ボロン酸ジペプチドプロテアソームインヒビター  ボルテゾミブを指し、商品名ＶＥＬＣＡＤＥ（Ｒ）、（ＷＯ９６／０１３２６６）の下で販売されている（ＭＬＮ−３４１，ＬＤＰ−３４１およびＰＳ−３４１；Ｎ−（モルホリノ）カルボニル）−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸）。ＰＳ−３４１は転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制する。またＰＳ−３４１は、数種のアポトーシスインヒビターの発現をダウンレギュレーションし、薬物抵抗性多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系および患者細胞のカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）依存性アポトーシスを誘導し、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）へのＭＭ細胞結合を抑制し、そして骨髄環境におけるＭＭ増殖および生残因子の生産を抑制する。
【００４０】
プロテアソームおよびシステインプロテアーゼの両活性を阻害するペプチドアルデヒドに対して、ボルテゾミブは、プロテアソームのはるかに強力かつ選択的なインヒビターである。それは、ヒト白血球エラスターゼ、カテプシンＧ、キモトリプシンおよびトロンビンを含む、他のセリンプロテアーゼ以上のプロテアソームに対する非常に高い（＞５００倍）選択性を有する。ボルテゾミブは、近年、再発性、無反応性の多発性骨髄腫を処置する用途のために認可された。種々の腫瘍細胞モデルにおけるボルテゾミブによる腫瘍細胞プロテアソーム活性の阻害はアポトーシスの誘導と関連される。
【００４１】
特異的プロテアソームインヒビターは、プロテアソーム中の活性部位トレオニンと相互作用するファルマコホア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）によって識別される５クラス：ペプチドアルデヒド、例えばＣＥＰ１６１２およびＭＧ１３２、ペプチドボロネート、例えばボルテゾミブ、ペプチドビニルスルホネート、ペプチドエポキシケトンおよびβ−ラクトンインヒビター、例えばラクトシスチン（ｌａｃｔｏｃｙｓｔｉｎ）：にはいる。また、次の化合物またはその類似体が、本発明におけるプロテアソームインヒビターとして使用されることが意図される：ＰＳ−５１９（１Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］］−１−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．１］ヘプタン−３，７−ジオン）；クラスト（ｃｌａｓｔｏ）−ラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）β−ラクトン；ラクタシスチン、エポキソミシン（ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎ）、ＣＶＴ６３４（−５−メトキシ−１−インダノン−３−アセチル−ロイシル−Ｄ−ロイシル−１−インダニルアミド）、ＴＭＣ９６（（３−メチルブタノイル−Ｌ−トレオニンＮ−（１−（２−（ヒドロキシメチル）−オキシラン−２−イルカルボニル）−３−メチルブト−３エニル）アミド）、ＭＧ−１１５、ＣＥＰ１６１２およびＭＧ１３２。
【００４２】
プロテアソームプロテアーゼインヒビターに加えて、ユビキチン−プロテアソーム経路は、促進酵素  ユビキチン−活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン共役酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３酵素）のインヒビターによって遮断されてもよい。Ｅ１インヒビターは、ｈｉｍｅｉｃ  ａｃｉｄＡとして同定された（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｂｉｏｏｒｇａｎ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １５（１）：１９１−１９４）。当該技術分野において既知の他の方法、例えばＲＮＡスプライシングもまた、特異的ユビキチン化関連酵素の活性を低下または除去するために使用されてもよい。
【００４３】
プロテアソームインヒビター活性のモニタリング
哺乳動物においてプロテアソームインヒビターの薬力学的薬物作用をモニターする方法は、米国特許第６６１３５４１号において教示されるが、発明者らは、驚くべきことに、生物学的サンプルにおいて、薬物濃度よりもむしろプロテアソーム活性のエクスビボアッセイが、プロテアソームインヒビターの薬力学的薬物作用をモニターする有用な方法を提供し、そしてこのデータが、将来において投与されるプロテアソームインヒビターのさらなる投与量および投与回数を選択するための指針を提供することを見出だした。
【００４４】
この方法は、哺乳動物にプロテアソームインヒビターを投与し；プロテアソームインヒビターの投与後、１回以上の特定時間において哺乳動物から１個以上の試験生物サンプルを得て；試験生物サンプルにおけるプロテアソーム活性を測定し；試験生物サンプルにおけるプロテアソーム活性の量を決定し；そして試験生物サンプルにおけるプロテアソーム活性の量を、プロテアソームインヒビターが投与されなかった哺乳動物から得られた参考生物サンプルにおける量と比較することを含む。
【００４５】
さらに、米国特許第６６１３５４１号は、プロテアソームインヒビターについての用量用法を決定する方法、ヒトを含む哺乳動物における基礎プロテアソーム活性を決定する方法を提供し、そして哺乳動物からの生物サンプルにおけるプロテアソーム活性を測定するためのキットを提供する。米国特許第６，６１３，５４１号の方法は、血液、尿および組織生検サンプルから選ばれる生物サンプルにおいて実施されてもよい。
【００４６】
ＩＬ６の測定
ＩＬ６は、ＩＬ６応答細胞系（参照：７ＴＤ１；Ｂ９；ＣＥＳＳ、ＫＰＭＭ２、ＫＴ−３；Ｍ１、ＭＨ６０−ＢＳＦ−２、ＭＯ７Ｅ；ＭｏｎｏＭａｃ６；ＮＦＳ−６０；ＰＩＬ−６；ＳＫＷ６−Ｃ１４；Ｔ１１６５；ＸＧ−１）を用いるバイオアッセイにおいて検出することができる。ＩＬ６は、ハイブリドーマ増殖因子（参照、ＨＧＦ）としてのその活性によってアッセイされてもよい。感受性イムノアッセイおよび比色法試験もまた利用できる。代替検出方法はサイトカインのＲＴ−ＰＣＲ定量法である。ＥＬＩＳＡアッセイは、レセプター関連ｇｐ１３０タンパク質を検出するために存在する（そのような試薬は、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得られる）。
【００４７】
ＣＮＴＯ３２８に結合されたＩＬ６の検出では、抗ＩＤ（出願者の同時係属出願米国特許第１０／２８０７１６号において開示された抗可変部抗体）が、ＥＬＩＳＡ型アッセイのようないずれかの標準イムノアッセイ形式における検出のために使用されてもよい。
【００４８】
本発明の方法による処置を受け入れる疾病
ＩＬ６の脱調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）発現は、多分、多数の疾病の病因に関連される主要因子の１つである。ＩＬ６（および他のＢ細胞分化因子）の極端な過生産は、種々の病理学的症状、例えばリウマチ様関節炎、多発性骨髄腫、Ｌｅｎｎｅｒｔ症候群（組織球リンパ腫）、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ’ｓ病（形質細胞の大量浸潤によるリンパ節症、高γ−グロブリン血症、貧血および急性期タンパク質の濃度増進）、心臓粘液腫および肝硬変において観察された。グリア芽腫によるＩＬ６の構成的合成および脳脊髄液中へのＩＬ６の分泌が観察された。
【００４９】
免疫媒介炎症性疾患（ＩＭＩＤ）に関して、過度の濃度のＩＬ６が滑液中に見出だされるので、ＩＬ６は慢性の多発関節炎の病因に係わっている。炎症性腸疾患では、ＩＬ６の血漿レベルの上昇が疾病状況の指標になることがある。メサンギウム増殖性糸球体腎炎をもつ患者では、ＩＬ６の尿レベルの上昇がまた疾病状況の指標である。ＩＬ６は、Ｉ型およびＩＩ型両真性糖尿病の免疫媒介の病因において役割を演じることがある。
【００５０】
したがって、本発明は、また、プロテアソームインヒビターの投与とともに、本発明の少なくとも１種のＩＬ−６抗体を使用して、例えば、ＩＬ−６抗体の治療学的有効量を、細胞、組織、器官、動物または患者に投与するか、またはそれと接触させて、当該技術分野において既知の、または本明細書に記述されるような、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種のＩＬ−６関連の疾病を調節または処置する方法を提供する。また本発明は、限定されるものではないが、肥満、免疫関連疾患、心臓血管病、感染性疾患、悪性疾患または神経学的疾患の少なくとも１つを含む、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種のＩＬ−６関連の疾病を調節または処置する方法を提供する。
【００５１】
また本発明は、限定されるものではないが、リウマチ様関節炎、若年性リウマチ様関節炎、全身的に到来するリウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、セロネガティブ関節症、変形性関節症、骨溶解、整形外科移植片の無菌弛緩、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性紅斑性狼瘡、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺繊維症、全身性脈管炎／Ｗｅｇｎｅｒ’ｓ肉芽腫症、類肉腫症、精巣炎／精管切除反転操作、アレルギー／アトピー性疾患、喘息、アレルギ性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植片、臓器移植拒絶、移植片対宿主病、全身性炎症応答症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少熱、尿性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、火傷、イオン化放射曝露、急性膵炎、成人呼吸ストレス症候群、リウマチ様関節炎、アルコール由来肝炎、慢性炎症病、類肉腫症、クローン病、鎌状赤血球貧血、糖尿病、腎症、アトピー性疾患、過敏反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、多年生鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、すべての臓器または組織の移植拒絶、腎移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、皮膚同種移植拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺移植拒絶、上皮小体移植拒絶、すべての臓器および組織の異種移植拒絶、同種移植拒絶、抗レセプター過敏反応、Ｇｒａｖｅｓ病、Ｒａｙｎｏｕｄ’ｓ病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、重症性筋無力症、抗体媒介細胞毒性、ＩＩＩ型過敏反応、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経病、臓器巨大、内分泌病、単クローン性高ガンマグロブリン血症、および皮膚変化症候群）、多発神経病、臓器巨大、内分泌病、単クローン性高ガンマグロブリン血症、皮膚変化症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合結合組織疾患、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、脈管炎、ｐｏｓｔ−ＭＩ心臓切開症候群、ＩＶ型過敏症、接触皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植拒絶、細胞内生物による肉芽腫、薬物感受性、代謝性／特発性、Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ病、血色症、α−１−アンチトリプシン欠乏、糖尿病性網膜症、ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性繊維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性食血細胞性リンパ組織球増多症、皮膚症状、乾癬症、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒素、子癇前症、ｏｋｔ３治療、抗ｃｄ３治療、サイトカイン治療、化学療法、放射線療法（例えば、限定されるものではないが無力症、貧血、悪液質などを含む）、慢性サリチル酸中毒など、の少なくとも１つを含む、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種のＩＬ−６関連の免疫関連疾患を調節または処置する方法を提供する。参照、例えば、ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ−１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａ���ｗａｙ，ＮＪ（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９），Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｌｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）、これらの各々は引用によって完全に組み入れられている。
【００５２】
また本発明は、限定されるものではないが、心臓性昏倒症候群、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血性卒中、出血、動脈硬化症、アテローム性硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化疾患、高血圧、動脈高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心臓血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性収縮、心房粗動、心房細動（持続性または痙攣性）、潅流後症候群、心肺バイパス炎症応答、多源性（ｃｈａｏｔｉｃ  ｏｒ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ）心房頻拍、規則的な狭いＱＲＳ頻拍、特定不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性障害、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁疾患、心内膜炎、心臓周囲疾患、心臓腫瘍、大動脈および抹消動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈およびその枝の閉鎖、抹消血管障害、閉鎖性動脈障害、抹消性アテローム硬化疾患、閉塞性血栓脈管炎、機能性抹消動脈障害、レイノー現象および障害、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤血管、動静脈瘤、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポンプ後症候群、虚血性再潅流傷害など、の少なくとも１つを含む、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種の心臓血管病を調節または処置する方法を提供する。そのような方法は、場合によっては、そのような調節、処置または治療の必要な細胞、組織、器官、動物または患者に対して少なくとも１種の抗ＩＬ−６抗体を含んでなる組成物または製薬学的組成物の有効量を投与することを含んでもよい。
【００５３】
また本発明は、限定されるものではないが、細菌、ウイルスおよび真菌の感染、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経病、髄膜炎、肝炎（例えば、Ａ，ＢまたはＣまたは類似のもの）、化膿性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌Ｏ１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群／血栓崩壊性血小板減少性紫斑病、マラリヤ、デング出血熱、ライシュマニア症、癩症、毒素ショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌群、ニューモシスチスカリニ肺炎、骨盤炎症疾患、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ｌｙｍｅ病、インフルエンザ、エプスタイン・バールウイルス、ウイルス関連食血細胞症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎などを含む、急性または慢性の細菌感染症、急性および慢性の寄生または感染経過：の少なくとも１つを含む、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種のＩＬ−６関連感染性疾患を調節または処置する方法を提供する。
【００５４】
また本発明は、限定されるものではないが、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性髄鞘発生性白血病、慢性骨髄球白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛状細胞性白血病、脊髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸がん腫、膵臓がん腫、鼻咽喉がん、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴性症候群／悪性の高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭部がん、頸部がん、遺伝性非ポリープがん、ホジキンリンパ腫、肝がん、肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん腫、睾丸がん、腺がん、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移疾患、がん関連骨吸収、がん関連骨痛など：の少なくとも１つを含む、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種のＩＬ−６関連悪性疾患を調節または処置する方法を提供する。
【００５５】
また本発明は、限定されるものではないが、神経変性疾患、多発性硬化症、偏頭痛、ＡＩＤＳ痴呆複合症、髄鞘脱落性疾患、例えば多発性硬化症および急性横断性脊髄炎；錐体外路および小脳障害、例えば皮質脊髄系の病変；脳幹神経節の障害；運動亢進性運動障害、例えばＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ舞踏病および老年舞踏病；薬物誘導性運動障害、例えばＣＮＳドーパミンレセプターを遮断する薬物によって誘導される運動障害；運動低下性運動障害、例えばパーキンソン病；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；旧小脳の変性、例えば脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調、小脳皮質変性、多発性系変性（Ｍｅｎｃｅｌ，Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｉ−ＤｒａｇｅｒおよびＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）；全身系障害（Ｒｅｆｓｕｍ’ｓ疾患、無β−リポタンパク血症、麻痺、毛細管拡張症およびミトコンドリア性多系障害）；髄鞘脱落性コア障害、例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；および神経に由来する筋萎縮のような運動ユニットの障害（前角細胞変性、例えば筋委縮性測索硬化症、小児性脊髄性筋委縮および若年性脊髄性筋委縮）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；広範性Ｌｅｗｙ体疾患；Ｌｅｗｙ体型の老年性痴呆；Ｗｅｒｎｉｃｋｅ−Ｋｏｒｓａｋｏｆｆ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルド・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、Ｈａｌｌｅｒｒｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ疾患；ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ痴呆；神経外傷性損傷（例えば、脊髄損傷、脳損傷、振盪症、反復振盪症）；疼痛；炎症性疼痛；自閉症；鬱病；卒中；認識障害；癲癇など：の少なくとも１つを含む、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１種のＩＬ−６関連神経学的疾患を調節または処置する方法を提供する。そのような方法は、場合によっては、そのような調節、処置または治療の必要な細胞、組織、器官、動物または患者に対して少なくとも１種のＴＮＦ抗体または特定の部分もしくは変異体を含んでなる組成物または製薬学的組成物の有効量を投与することを含んでもよい。参照、例えば、ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）。
【００５６】
投与の方法
本発明の方法は、プロテアソームインヒビターの投与を含む処置とともに、そのような調節、処置または治療の必要な細胞、組織、器官、動物または患者に対して少なくとも１種の抗ＩＬ−６抗体を含んでなる組成物または製薬学的組成物の有効量を投与することを含む。本発明の方法は、該少なくとも１種のＩＬ−６アンタゴニストの投与が指示されるそのような疾病または障害を処置することを含む。さらに本発明の方法は、少なくとも１種のプロテアソームインヒビターの前、同時および／または後に、ＩＬ６アンタゴニストを共投与することを含む。特定の実施態様では、ＩＬ６アンタゴニストは、ＩＬ６の生物学的機能を予防または抑制する抗体、例えば中和ＩＬ６抗体または抗ＩＬ６Ｒ抗体であり、そしてプロテアソームインヒビターは、ＰＳ−３１４（ボルテゾミブ）、ＰＳ−５１９；クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトン；ラクタシスチン、エポキソミシン、ＣＶＴ６３４、ＴＭＣ９６、ＭＧ−１１５、ＣＥＰ１６１２およびＭＧ１３２からなる群から選ばれる。
【００５７】
典型的には、病理学的症状の処置は、活性作用物の比活性に応じて、１用量について患者の１ｋｇ当たり少なくとも１種の抗ＩＬ−６抗体の総平均少なくとも約０．０１〜５００ｍｇの範囲、好ましくは、１回または多数回投与について患者の１ｋｇ当たり少なくとも約０．１〜１００ｍｇの抗体が、組成物中に含有される抗ＩＬ−６抗体組成物の有効量または用量（ｄｏｓａｇｅ）を投与することによって実施される。あるいはまた、有効血清濃度は、１回または多数回投与について０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含んでもよい。適当な用量は、医学的熟練者には周知であり、そして勿論、特定の疾病状態、投与される組成物の比活性、および処置されている特定の患者に応じて異なってもよい。若干の例では、所望の治療学的量を達成するためには、反復投与、すなわち特定のモニターまたは定量化される用量（ｄｏｓｅ）の反復個別投与を提供することが必要のこともあり、この場合、所望の１日用量または効果が達成されるまで、個々の投与が反復される。
【００５８】
非経口投与では、抗体またはプロテアソームインヒビターは、製薬学的に許容できる非経口媒質と一緒にまたは別々に提供される、液剤、懸濁剤、乳剤、粒剤（ｐａｒｔｉｃｌｅ）、散剤、または凍結乾燥散剤として調合されてもよい。そのような媒質の例は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および１〜１０％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび非水性媒質、例えば不揮発油もまた使用されてもよい。媒質または凍結乾燥散剤は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、バッファーおよび保存剤）を維持する添加物を含有してもよい。調合物は既知または適当な技術によって滅菌される。
【００５９】
適当な製薬学的担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版、この分野における標準参考文書、において記述されている。
【００６０】
投与
本発明にしたがうＩＬ６アンタゴニストおよびプロテアソームインヒビターの製薬学的に有効な量を投与するためには、多くの既知または開発された方式が、本発明にしたがって使用されてもよい。非経口投与が典型的投与であるが、他の投与方式が本発明にしたがって使用されて適当な結果を得ることができる。本発明の組成物は、本明細書に記述されているか、または当該技術分野において既知の、吸入または他の方式による投与のために適当な種々のデバイスおよび方法のすべてを使用して、溶液、乳液、コロイドまたは懸濁液として、または乾燥粉末として、担体中で送達されてもよい。
【００６１】
その他の投与経路は、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腹腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）、膣内、肛門内、口腔内、舌下、鼻内、または経皮手段を含む。
【実施例１】
【００６２】
プロテアソームインヒビターとの組み合わせ物における抗ＩＬ６抗体の活性
キメラモノクローナルＩＬ−６中和抗体、ＣＮＴＯ３２８によるＩＬ−６の抑制が、ＨＳＰ−７０のボルテゾミブ媒介アップレギュレーションを弱めることによって、プロテアソームインヒビター、ボルテゾミブの抗骨髄腫活性を強化するであろうという仮説に基づいて、次に示す研究が計画され、実施された。
【００６３】
Ａ．  モノクローナル抗体、ＣＮＴＯ３２８によるＩＬ−６シグナル伝達の抑制が、ＩＬ−６依存性多発性骨髄腫細胞系、ＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６の細胞生存率を減少させる。
【００６４】
ＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６細胞（Ｄｒ．Ｄｉａｎｅ  Ｊｅｌｉｎｅｋ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ）が、ＣＮＴＯ３２８またはイソタイプ対照抗体、Ｆ１０５の濃度を増加して２４および４８時間培養された。最後の４時間、細胞はＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の存在下で培養された。生存細胞による水溶性ホルマザンへのＷＳＴ−１の還元が、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎＭの吸光において測定された。生存率は、無処置細胞に比較しての生存率パーセントとして測定された。全細胞は１０％ＦＢＳおよびＩＬ−６の１ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において処置された。
【００６５】
結果は、図１においてグラフで示される（値は５並列培養の平均である；バー，ＳＥＭ）。ＣＮＴＯ３２８によるＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６細胞の処置は、細胞生存率において用量−および時間−依存性の低下をもたらす。ＫＡＳ−６細胞は、ＡＮＢＬ−６細胞よりもＩＬ−６抑制効果に対して有意に感受性であった。
【００６６】
Ｂ．  ＣＮＴＯ３２８はＩＬ−６依存性骨髄腫細胞においてボルテゾミブの抗骨髄腫活性を強化する。
【００６７】
ＡＮＢＬ−６、ＫＡＳ−６、またはＩＬ−６非依存性ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫細胞系が、対照抗体、Ｆ１０５、またはＣＮＴＯ３２８の０．１ｍｃｇ／ｍｌ（ＫＡＳ−６）または１０ｍｃｇ／ｍｌ（ＡＮＢＬ−６およびＲＰＭＩ８２２６）とともに２４時間予備培養され、続いて、Ｆ１０５またはＣＮＴＯ３２８の連続存在下で、ＤＭＳＯ対照または濃度の増加するボルテゾミブのいずれかとともに、さらに２４時間同時培養された。連続する実験では、ＡＮＢＬ−６細胞は、１）Ｆ１０５またはＣＮＴＯ３２８とともに２４時間、それに続いてＦ１０５またはＣＮＴＯ３２８およびボルテゾミブ５ｎＭとともに、さらに２４時間（抗体→ボルテゾミブ）；２）Ｆ１０５またはＣＮＴＯ３２８およびボルテゾミブ５ｎＭとともに同時に２４時間（抗体＋ボルテゾミブ）、あるいはボルテゾミブ５ｎＭにおいて１２時間、それに続いてＦ１０５またはＣＮＴＯ３２８とともに２４時間（ボルテゾミブ→抗体）：の処置を受けた。細胞生存率は上記のようにアッセイされ、そして無処置細胞に比較しての生存率パーセントとして測定された。全細胞は１０％ＦＢＳおよびＩＬ−６の１ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において処置された。カラム、５並列培養の平均；バー、ＳＥＭ。
【００６８】
ＣＮＴＯ３２８によるＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６の前培養は、対照抗体、Ｆ１０５とともに前培養された細胞に比較して細胞生存率における有意な低下によって例証されるように、ボルテゾミブの細胞傷害を強化した（図２ＡおよびＢ）。ＣＮＴＯ３２８は、ＩＬ−６非依存性骨髄腫細胞系、ＲＰＭＩ８２２６ではボルテゾミブの活性を増進しなかった（パネルＣ）。ＡＮＢＬ−６細胞がＣＮＴＯ３２８とともに前培養され、続いてボルテゾミブと培養されるか、あるいはＣＮＴＯ３２８およびボルテゾミブとともに同時に処置される場合には、ＣＮＴＯ３２８は、ボルテゾミブの細胞傷害性をもっとも増進した。反対に、ＣＮＴＯ３２８は、細胞がボルテゾミブとともに前処置された場合、ほとんど、さらなる効果をもたなかった（パネルＤ）。
【００６９】
Ｃ．  ＣＮＴＯ３２８によるＩＬ−６シグナル伝達の抑制は、ＩＬ−６依存性多発性骨髄腫細胞系、ＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６のボルテゾミブ媒介アポトーシスを増進する。
【００７０】
ＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６細胞が、ＣＮＴＯ３２８または対照抗体、Ｆ１０５の１０ｍｃｇ／ｍｌ（ＡＮＢＬ−６）または１ｍｃｇ／ｍｌ（ＫＡＳ−６）とともに８（ＡＮＢＬ−６）〜１２（ＫＡＳ−６）時間培養された。アポトーシスは、モノ−およびオリゴ−ヌクレオソーム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の存在を測定するＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して決定され、そしてＤＭＳＯおよびＦ１０５処置対照以上のアポトーシスにおける倍増として表された。細胞は１０％ＦＢＳおよびＩＬ−６の１ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において処置された（図３ＡおよびＢ，カラムの高さは３並列培養の平均を表す；バー、ＳＥＭ）。
【００７１】
ＣＮＴＯ３２８とボルテゾミブによるＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６細胞の処置は、いずれかの薬物単独で処置された細胞と比較して、アポトーシスの増進された誘導をもたらした。ＣＮＴＯ３２８はＩＬ−６非依存性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６ではアポトーシスを強化することができなかった（データ未掲載）。
【００７２】
Ｄ．  ＣＮＴＯ３２８はインターロイキン−６シグナル伝達をダウンレギュレーションし、そしてＡＮＢＬ−６細胞における抗アポトーシス性ＭＫＰ−１およびＨＳＰ−７０のボルテゾミブ媒介誘導を弱める。
【００７３】
ＡＮＢＬ−６細胞が、増加濃度のボルテゾミブの存在または不在下で、ＣＮＴＯ３２８または対照抗体、Ｆ１０５の１０ｍｃｇ／ｍｌとともに８時間培養された。細胞溶解物を調製し、イムノブロット分析にかけた。ブロットを除き、そしてＨＳＰ−７０をプローブして、１列当たりの等しいタンパク質負荷を確立した。デンシトメトリーをＨＳＰ−７０およびＭＫＰ−１イムノブロットにおいて実施した。
【００７４】
ＣＮＴＯ３２８によるＡＮＢＬ−６細胞の処置は、ホスホ−ｐ４２／４４ＭＡＰＫおよびホスホ−ＳＴＡＴ−３のレベルにおける低下によって例証されるように、ＩＬ−６シグナル伝達の下流メディエーターにおける劇的な減少をもたらした（図４）。注目すべきは、ボルテゾミブの用量増加もまた、ホスホ−ＳＴＡＴ−３およびホスホ−ｐ４２／４４ＭＡＰＫのレベルを減少させた。これらのデータは、ボルテゾミブがＩＬ−６シグナル伝達を妨げる（また、Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３，２２：８３８６−９３によって報告された）ことを示している。さらにまた、ＣＮＴＯ３２８は、ＨＳＰ−７０およびＭＫＰ−１のボルテゾミブ媒介誘導を、それぞれ４５および９０％妨害し、これは、転写活性のあるホスホ−ＳＴＡＴ−１および高リン酸化ＨＳＦ−１のレベル低下と相関した。
【００７５】
Ｅ．  ＫＮＫ４３７はＡＮＢＬ−６およびＨＳＦ−１＋／＋ＭＥＦ細胞のボルテゾミブ媒介アポトーシスを増進する。
【００７６】
ＡＮＢＬ−６またはＭＥＦ細胞（対照およびＨＳＦ−１−／−）が、ＤＭＳＯ対照または増加濃度のボルテゾミブおよびＫＮＫ４３７のいずれかとともに１２（ＡＮＢＬ−６）〜２４時間（ＭＥＦ）培養された。アポトーシスは前記のように決定され、そしてＤＭＳＯ処置対照以上のアポトーシスにおける倍増として表された。ＡＮＢＬ−６細胞は１０％ＦＢＳおよびＩＬ−６の１ｎｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において処置された（図５、カラム、３並列培養の平均；バー、ＳＥＭ）。
【００７７】
ＫＮＫ４３７によるＡＮＢＬ−６細胞の処置は、対照処置細胞と比較してボルテゾミブ媒介アポトーシスにおける有意な増大をもたらした。ボルテゾミブ媒介アポトーシスの増進は、対照ＭＥＦに較べてＨＳＦ−１−／−ＭＥＦにおいて鈍化された（図６）が、これは、組み合わせによる活性増大が熱ショックタンパク質応答のダウンレギュレーションによることを示唆している。
【００７８】
ＣＮＴＯ３２８とボルテゾミブとの組み合わせ物の結果の総括
ＩＬ−６中和抗体ＣＮＴＯ３２８は、多発性骨髄腫細胞系ＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６の生存率を用量−および時間−依存様式において減少させた。ＣＮＴＯ３２８によるＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６細胞の処置は、対照抗体およびボルテゾミブと比較して、組み合わせ物による細胞生存率における低下およびアポトーシスの増進によって例証されるように、ボルテゾミブの抗骨髄腫活性を強化した。ＣＮＴＯ３２８の抗骨髄腫効果は、細胞がボルテゾミブに続いてＣＮＴＯ３２８により連続して処置された場合には、逆の順序によるよりも減少されたが、これは多分、ＩＬ−６シグナリングの重要な下流メディエーターをダウンレギュレーションするボルテゾミブの能力によるか、あるいは熱ショックタンパク質応答のメンバーの早期のアップレギュレーションによるものであろう。
【００７９】
ＣＮＴＯ３２８によるＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６細胞の処置は、ホスホ−ＳＴＡＴ−３およびホスホ−ｐ４２／４４ＭＡＰＫレベルにおける顕著な減少によって示されるように、ＩＬ−６シグナリングのダウンレギュレーションをもたらした。ボルテゾミブもまた、ホスホ−ＳＴＡＴ−３およびホスホ−ｐ４２／４４ＭＡＰＫのレベルを濃度依存様式でダウンレギュレーションした。
【００８０】
ＣＮＴＯ３２８とボルテゾミブの組み合わせによる活性の増大は、抗アポトーシス性ＨＳＰ−７０およびＭＫＰ−１のボルテゾミブ媒介蓄積の減少に関連していた。減少されたＨＳＰ−７０誘導は、ホスホ−ＳＴＡＴ−１および高リン酸化ＨＳＦ−１のレベル低下と相関した。
【００８１】
ＫＮＫ４３７によるＡＮＢＬ−６およびＫＡＳ−６細胞の処置は、ボルテゾミブのアポトーシス活性を増進したが、これは、増進されたアポトーシス効果がＨＳＦ−１陰性のマウス胎児繊維芽細胞において顕著に鈍化された事実によって例証されるように、一部は、熱ショックタンパク質応答の誘導を妨げるボルテゾミブの能力によるものであった。
【００８２】
総括すると、上記データは、ボルテゾミブ／ＣＮＴＯ３２８組み合わせ物を臨床試験に移行し、そしてボルテゾミブに対する抵抗性をダウンレギュレーションすること（例えば、ＨＳＰ−７０、ＭＫＰ−１のインヒビター）に向けられる他の新規戦略を案出するための理論的根拠を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】指定時間の間処置される多発性骨髄腫細胞に及ぼすＣＮＴＯ３２８濃度の増加の影響を示すグラフである。
【図２Ａ−Ｄ】抗体、Ｆ１０５および無関係な対照ＭａｂもしくはＣＮＴＯ３２８ならびに指定濃度のボルテゾミブとともに培養された指定細胞の相対生存率パーセントを表す棒グラフである：Ａ）抗体と予めインキュベートされ、次いで指定濃度におけるボルテゾミブにより処置されたＡＮＢＬ−６多発性骨髄腫細胞、Ｂ）抗体と予め培養され、次いで指定濃度におけるボルテゾミブにより処置されたＫＡＳ−６多発性骨髄腫細胞、Ｃ）ＲＰＭＩ８２２６  ＩＬ６非依存性骨髄腫細胞、およびＤ）ＣＮＴＯ３２８およびボルテゾミブにより同時に処置されたＡＮＢＬ−６多発性骨髄腫細胞。
【図３Ａ−Ｂ】抗体およびボルテゾミブ組み合わせ物により処置されたＩＬ６依存性細胞系ＡＮＢＬ−６（Ａ）およびＫＡＳ−６（Ｂ）において測定されたアポトーシスにおける相対的倍増を表す棒グラフであり、ここでＦ１０５は対照Ｍａｂである。
【図４】ＨＳＣ−７０およびＭＫＰ−１に対してプローブされた、ＣＮＴＯ３２８または対照Ｍａｂおよび増加濃度のボルテゾミブにより処置された後のＡＮＢＬ−６細胞サンプルのタンパク質ゲルのウエスタンブロットである。
【図５】担体対照（ＤＭＳＯ）または２つの濃度のボルテゾミブおよび増加濃度の熱ショックタンパク質アテニュエーターＫＮＫ４３７とともに培養されたＡＮＢＬ−６細胞において測定されたアポトーシスにおける相対的倍増を表す棒グラフである。
【図６】担体対照（ＤＭＳＯ）または２つの濃度のボルテゾミブおよび増加濃度の熱ショックタンパク質アテニュエーターＫＮＫ４３７とともに培養された、ＨＳＦ欠乏（−／−）または正常（＋／＋）であるＭＥＦ細胞において測定されたアポトーシスにおける相対的倍増を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２Ａ−Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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