(57)【要約】本発明は、膵臓系統に沿った非胚性多能性幹細胞を分化させる方法を提供する。本発明は更に、膵臓細胞を対象に提供するための非胚性多能性幹細胞及びそれらに由来する子孫細胞も提供する。本発明の１つの実施形態により、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質、及びｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生することを含む、方法が、提供される。2009511061.tif 000024
2009511061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質、及びｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生することを含む、方法。
【請求項２】
前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞をＢＭＰ４と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｐｄｘ−１の発現が亢進した前記細胞をＥＧＦ又はＨＧＦと接触させて、Ｎｇｎ３の発現が亢進した細胞を産生することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｎｇｎ３の発現が亢進した前記細胞で、ＮｅｕｒｏＤの発現も亢進している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｎｇｎ３の発現が亢進した前記細胞をニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する細胞を産生することを更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
インスリンの前記発現が、Ｎｇｎ３を発現する前記細胞によって発現される量よりも亢進される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎｇｎ３の発現が亢進した前記細胞をＧＤＦ１１又はベータセルリンの一方又は両方と接触させることを更に含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を分化させる方法であって、
ａ）該非胚性幹、非生殖かつ非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と接触させ；
ｂ）手順ａ）で得られた該細胞を、アクチビンＡと、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性を阻害する第二の物質と接触させ；
ｃ）手順ｂ）で得られた該細胞をＥＧＦ又はＨＧＦと接触させ；
ｄ）手順ｃ）で得られた該細胞をニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて、
インスリンを発現する細胞を産生する、方法。
【請求項９】
手順ａ）、手順ｂ）又はそれらの両方が、前記細胞をＢＭＰ４と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
手順ｄ）が、前記細胞をＧＤＦ１１又はベータセルリンの一方又は両方と接触させることを更に含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二の物質がシクロパミン又は抗ＳＨＨ抗体である、請求項１又は８に記載の方法。
【請求項１２】
インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した前記細胞が、インスリン、ｃ−ペプチド又はそれらの組み合わせを分泌する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１３】
前記インスリンがインスリン−１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞に膵臓転写因子を形質導入する、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記膵臓転写因子がＮｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、Ｐｔｆｌａ／ｐ４８、Ｐａｘ６、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２又はそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記膵臓転写因子がＰｄｘ−１、Ｎｇｎ３又はそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
アクチビン−Ａである第一の物質、及びｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇを阻害する第二の物質、並びに外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を含む、組成物。
【請求項２１】
更にＢＭＰ４を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ＥＧＦ又はＨＧＦ、及び請求項１に記載の方法により調製されるＰｄｘ−１の発現が亢進した前記細胞を含む、組成物。
【請求項２３】
ニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方、及び請求項３に記載の方法により調製されるＮｇｎ３の発現が亢進した前記細胞を含む、組成物。
【請求項２４】
更にＧＦＤ１１又はベータセルリンの一方又は両方を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
更に細胞培地又は薬学的に許容される担体を含む、請求項２０〜２４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第二の物質がシクロパミン又は抗ＳＨＨ抗体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１又は３に記載の方法により調製される細胞及び細胞培地又は薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２８】
請求項５又は６に記載の方法により調製されるインスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した前記細胞、及び細胞培地又は薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２９】
組成物を調製する方法であって、アクチビン−Ａである第一の物質、及びｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇを阻害する第二の物質を、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞と結合させることを含む、方法。
【請求項３０】
ＢＭＰ４を結合させることを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
組成物を調製する方法であって、ＥＧＦ又はＨＧＦを、請求項１に記載の方法により調製されるＰｄｘ−１の発現が亢進した前記細胞と結合させることを含む、方法。
【請求項３２】
組成物を調製する方法であって、ニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方を、請求項３に記載の方法により調製されるＮｇｎ３の発現が亢進した前記細胞と結合させることを含む、方法。
【請求項３３】
ＧＦＤ１１又はベータセルリンの一方又は両方を結合させることを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞培地又は薬学的に許容される担体を結合させることを更に含む、請求項２９〜３３の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
組成物を調製する方法であって、請求項５、６又は８に記載の方法により調製されるインスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した前記細胞を、細胞培地又は薬学的に許容される担体と結合させることを含む、方法。
【請求項３６】
前記第二の物質がシクロパミン又は抗ＳＨＨ抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
処置を必要とする対象に膵臓細胞を提供する方法であって、
ａ）外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生し；
ｂ）Ｐｄｘ−１の発現が亢進した該細胞を投与して、膵臓細胞を該対象に提供する、
ことを含む、方法。
【請求項３８】
前記非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞をＢＭＰ４と接触させることを更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象に投与する前に、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した前記細胞を、ＥＧＦ又はＨＧＦと接触させて、Ｎｇｎ３の発現が亢進した細胞を産生することを含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象に投与する前に、Ｎｇｎ３の発現が亢進した前記細胞を、ニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した細胞を産生することを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｎｇｎ３の発現が亢進した前記細胞をＧＦＤ１１又はベータセルリンの一方又は両方と接触させることを更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
インスリンを発現する細胞を処置を必要とする対象に提供する方法であって、
ａ）外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と接触させ；
ｂ）手順ａ）で得られた細胞を、アクチビンＡと、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性を阻害する第二の物質と接触させ；
ｃ）手順ｂ）で得られた細胞をＥＧＦ又はＨＧＦと接触させ；
ｄ）手順ｃ）で得られた細胞をニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した細胞を産生し；
ｅ）インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した該細胞を該対象に投与する、
ことを含む、方法。
【請求項４３】
手順ａ）、手順ｂ）又はそれらの両方が更にＢＭＰ４を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
手順ｄ）がＧＤＦ１１又はベータセルリンの一方又は両方を更に含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象が哺乳動物である、請求項３７〜４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が膵臓障害又は膵臓損傷を有する、請求項３７〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記障害が、糖尿病、肥満、膵管閉鎖、膵炎、α１アンチトリプシン欠失症、遺伝性膵炎、膵臓癌、膵酵素欠失症又は高インスリン症を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記糖尿病がＩ型又はＩＩ型糖尿病である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記損傷が肉体的外傷、化学薬品、放射線、加齢、疾患又はそれらの組み合わせにより生じる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記膵臓障害又は膵臓損傷を処置する医薬品を調製するための、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法により調製される細胞の使用。
【請求項５２】
膵臓障害が、糖尿病、肥満、膵管閉鎖、膵炎、α１アンチトリプシン欠失症、遺伝性膵炎、膵臓癌、膵酵素欠失症又は高インスリン症を含む、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記糖尿病がＩ型又はＩＩ型糖尿病である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記損傷が肉体的外傷、化学薬品、放射線、加齢、疾患又はそれらの組み合わせにより生じる、請求項５１に記載の使用。
【請求項５５】
前記医薬品が更に生理学的に許容される担体を含む、請求項５１〜５４の何れか１項
に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／７２６，７５０号（２００５年１０月１４日出願）に対する優先権を主張する。この米国出願は、米国出願第１１／０８４，２５６号（２００５年３月２１日出願）の一部継続出願であり、この出願は、米国出願第１０／０４８，７５７号（現在発行されている米国特許第７，０１５，０３７号、２００２年２月１日出願）の継続出願であり、この出願は、ＰＣＴ／ＵＳ００／２１３８７（２０００年８月４日出願、２００１年２月１５日にＷＯ  ０１／１１０１１として英語で公開）の米国国内段階の出願であり、この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で米国仮特許出願第６０／１４７，３２４号（１９９９年８月５日出願）および同第６０／１６４，６５０号（１９９９年１１月１０日出願）からの優先権を主張し、そしてこの出願は、米国特許出願第１０／４６７，９６３号（２００３年８月１１日出願）の一部継続出願であり、この出願は、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２（２００２年２月１４日出願、２００２年８月２２日にＷＯ  ０２／０６４７４８として英語で公開）の米国国内段階の出願であり、この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で米国仮特許出願第６０／２６８，７８６号（２００１年２月１４日出願）；同第６０／２６９，０６２号（２００１年２月１５日出願）；同第６０／３１０，６２５号（２００１年８月７日出願）および同第６０／３４３，８３６号（２００１年１０月２５日出願）からの優先権を主張し、これらの出願、特許および公報の内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利の宣言）
本発明は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの米国助成金番号Ｕ１９  ＤＫ６１２４４の下で政府支援の補助によって行われた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は非胚性多能性幹細胞の分野に関し、具体的には膵臓細胞を提供するための非胚性多能性幹細胞の使用、及びそれらを産生及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
膵臓
膵臓は腹腔の左上の後ろにある横長で先細りの器管である。これは解剖学的には、膵頭部（十二指腸の近くの広い側）、膵体部、及び膵尾部（脾臓の近く先細りの側）の３つの主要部分から構成されているものとして説明されてきた。この器管には２つの主要な組織が存在する。１つが、腺房細胞と腺管細胞の両方からなる外分泌組織であり、もう１つが、血流に送達されるホルモン（即ち、インスリン）を産生する細胞を含有する内分泌組織である。膵臓の質量の約９５％を占める外分泌膵臓は、消化酵素（即ち、アミラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、エラスターゼ及びその他の種々のタンパク質）を産生する錐体状の分泌細胞の群を含有する腺房（ａｃｉｎｉ（腺房）と呼ばれる）である。これらの酵素は、同様に消化のための重炭酸塩も産生する立方腺管細胞から構築される管によって消化器系に送達される。分泌腺房と腺管の間には、腺房中心細胞と呼ばれる連結細胞成分がある。
【０００５】
膵臓の質量のわずか約１〜２％を占める内分泌膵臓は、ランゲルハンス島と呼ばれるホルモン産生細胞のクラスターを含有する（島細胞はインスリンを分泌することによって血糖値を維持する役割を果たす）。これらのクラスターは、インスリン産生β細胞、グルカゴン産生α細胞、ソマトスタチン産生δ細胞、及び膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞を含むがこれらに限定されない、少なくとも７種類の細胞からなる（Ｅｄｌｕｎｄ，Ｈ，２００２）。更に、ε細胞と呼ばれる下位の内分泌細胞集団が、最近になって報告されている（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これらの細胞は、消化管の腸内分泌細胞が分泌することが知られている食欲刺激ペプチドであるグレリンの産生を基に発見された。
【０００６】
内分泌膵臓及びβ細胞の分化の原因となる転写カスケード
内胚葉の指定、前腸及び中腸内胚葉の指定、並びにその後の膵臓の指定は、転写因子の補体によって調節される（図１）。具体的には、マウスにおける最初の内胚葉の指定は、Ｓｏｘ１７（Ｋａｎａｉ−Ａｚｕｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）並びにＧａｔａ−５及びＧａｔａ−６（Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｂｏｓｓａｒｄ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｚａｒｅｔ，Ｋ．Ｓ．１９９８）及びＭｉｘｅｒ／Ｍｉｘ．３（Ｈｅｎｒｙ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．１９９８）の発現を伴う。その後、幹細胞核因子であるＨｎｆ３β／Ｆｏｘａ２が、予定前腸及び後腸内胚葉の発達に必要とされる（Ａｎｇ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。その他の転写因子は、前腸及び後腸内胚葉が肝臓、甲状腺、肺、胃、十二指腸及び膵臓の内胚葉に分化するのに関与する。
【０００７】
マウスの膵臓は、腹側及び背側前腸内胚葉に一部由来し、その後融合して成熟臓器を形成する。膵臓への拘束（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）は、転写因子Ｈｌｘｂ９及びＰｄｘ−１の発現を伴う。Ｈｌｘｂ９（Ｈｅｎｔｓｃｈ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）又はＰｄｘ−１（Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）の欠失は、Ｐｄｘ−１欠失胚で背側膵芽が検出できていても、それぞれ背側又は完全な膵臓無発生を引き起こす。Ｈｌｘｂ９欠失胚において、腹側膵臓の形成は比較的正常であるのに対し、背側膵臓の指定は欠失する。
【０００８】
これらの表現型は、初期の指定が背側及び腹側膵臓の間で異なることを示唆している。膵芽が形成されていれば、何れかの転写因子が除去されていても、Ｈｌｘｂ９又はＰｄｘ−１が発現して膵臓への拘束がなされる前に、その他のシグナルが存在する場合がある。更に外分泌又は内分泌膵臓への拘束は、それぞれＰｔｆｌａ／ｐ４８（Ａｈｌｇｒｅｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）及びＮｇｎ３（Ｇｒａｄｗｏｈｌ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）の発現を伴う。注目すべきは、Ｐｔｆｌａ／ｐ４８が早期に、即ち腹側膵芽の指定時に必要とされているように思われる点である（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。膵臓内胚葉の指定に必要とされるＰｄｘ−１のように、Ｎｇｎ３は膵臓内胚葉から外分泌系統への指定に必要とされ、内分泌細胞はＮｇｎ３発現細胞に由来すると考えられている。Ｎｇｎ３は又、中枢神経系（ＣＮＳ）でも発現し、この転写因子が欠失すると、内分泌膵臓の発達だけでなく、神経系の発達にも影響が及ぶ。更に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのβ細胞への拘束は、Ｐａｘ４（Ｓｏｓａ−Ｐｉｎｅｄａ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、Ｐａｘ６（Ｓａｎｄｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、Ｎｋｘ２．２（Ｓｕｓｓｅｌ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；ヒトｍＲＮＡ配列の受入番号ＮＭ＿００２５０９）及びＮｋｘ６．１（Ｓａｎｄｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）の発現を伴う。
【０００９】
内分泌膵臓及びβ細胞の分化の原因となる細胞外シグナル
発達中に、内胚葉は、ＴＧＦβ及びＷｎｔファミリーのメンバーを含む因子の組み合わせにより指定を受ける。Ｗｎｔ３は原始線条及び発達中の中胚葉に発現し、Ｗｎｔ３欠失マウスは中胚葉も内胚葉も形成しない（Ｌｉｕ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。結節が外胚葉、及び原始線条の前領域に発現し（Ｚｈｏｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、Ｗｎｔ３欠失胚のように、結節が欠失している胚も、中胚葉及び内胚葉が発達しない。ツメガエルの外植体検定では、ＴＧＦファミリーの別のメンバーであるアクチビン−Ａが、用量依存的に中胚葉及び内胚葉の両方の指定を誘導し、アクチビン−Ａが高濃度であれば背側中胚葉及び内胚葉が、低濃度であれば腹側中胚葉が誘導されることが明らかにされている（ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１０】
その後の膵臓への拘束及び内分泌膵臓への拘束も、ＴＧＦβ及びＷｎｔファミリーのメンバー並びにＦＧＦ及びｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーのメンバーによって調節される。初期の内胚葉の指定はとりわけシグナルＷｎｔ３を必要とするが、Ｗｎｔは膵臓内胚葉の指定を阻害する場合がある。事実、Ｐｄｘ−１プロモーターの制御下でＷｎｔ１又はＷｎｔ５ａが発現すると、前腸領域が変化し、近位の十二指腸を正常に含むのではなく胃が後部に伸びるようになり、膵臓の減少又は完全な無発生を伴う。この所見と一致して、幾つかのＷｎｔシグナル伝達阻害剤が、ｓＦＲＰ−１、−２、−３及び−４並びにＤｋｋｓを含めたマウスの胎児膵臓で検出することができる（非特許文献１）。腹側並びに背側前腸内胚葉からの膵臓への拘束は、ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）（Ｈｅｂｒｏｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）によって阻害される。ＳＨＨの受容体であるパッチド（Ｐｔｃ）が除去されると、膵臓上皮への更に広範な分化を生じる。脊索からのアクチビン−Ａ（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）及び／又はＦＧＦ２（Ｈａｒｄｉｋａｒ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３）シグナルは、前膵臓内胚葉におけるＳＨＨの発現を抑制する働きを持つ。
【００１１】
腹側原腸内胚葉における膵臓及び肝臓への指定は、隣接する心臓内胚葉により産生されるＦＧＦ２によって少なくとも部分的に決定され（Ｊｕｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、それにより膵臓への指定が抑制されるが、低用量のＦＧＦ２は、背側前腸内胚葉からの膵臓への分化に重要となる場合がある（非特許文献２）。更に、膵臓への指定及び分化は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達により調節される（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｄｌｌ−１又はＨｅｓ−１といったＮｏｔｃｈ経路成分が除去されると、膵臓上皮への分化が促進される。
【００１２】
内分泌及び外分泌膵臓への分化は、内胚葉と中胚葉の相互作用によって調節され（Ｇｉｔｔｅｓ，Ｇ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、部分的には細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の相互作用によって、並びにアクチビン及びＴＧＦβを含めた成長因子のＢＭＰファミリーのメンバーによって媒介される。内胚葉と間葉の相互作用は、内分泌膵臓への分化において二重の役割を果たす。これらの相互作用は、膵臓への拘束を誘導するＥ９．５及び１０．５の間の鍵となるが、膵臓に拘束された内胚葉と、間葉により産生されるラミニンの間の相互作用はその後、外分泌系の表現型への分化を支配する（Ｓａｎｖｉｔｏ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。更に、間葉により産生されるＢＭＰ２等のＴＧＦβのメンバーは、内分泌系への指定を妨げる場合があると同時に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける外分泌膵臓への分化を容易にする。間葉細胞により産生されるＦＧＦ１０等のＦＧＦ類も役割を果たす。ＦＧＦ１０は、Ｐｄｘ−１＋膵臓前駆細胞の増殖において役割を果たすと思われる（Ｂｈｕｓｈａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００１３】
糖尿病
糖尿病は、変動するものの持続する高い血糖値（高血糖症）を特徴とする疾患である。糖尿病は先進国及び発展途上国の両方で流行伝染病のような罹患率に達する重篤で破壊的な疾病である。１９８５年には、世界中で約３０００万人が糖尿病に罹患しており、１９９５年にはその数が１億３５００万人にまで増加し、２０５０年には更に５０％近くの増加が予想されている。糖尿病は米国において５番目に多い死因となっている。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによれば、２００２年の米国における糖尿病による経済的費用は１兆３２００億ドルにのぼり、その内９２０億ドルが直接費となっている。この数字は、２０２０年までに１億９０００億ドルを超えると予想されている。
【００１４】
一般的に、糖尿病は、１型糖尿病と２型糖尿病の２種類に分類される。１型糖尿病は、血中にインスリンが殆ど又は全くないことが特徴であり、小児及び早期の青年期に好発する。原因は膵島のインスリン産生β細胞が破壊されることにある。１型糖尿病患者は、生存のために毎日数回インスリンを注射し、１日に何回も血糖値を計らなければならない。しかし、インスリンを毎日複数回注射しても、身体が毎分行っているインスリンの産生や糖代謝の正確な調節を適切に模倣できるものではない。通常の場合、血糖値は正常よりも高く、失明、腎不全、進行性の末梢血管潰瘍、心臓疾患又は卒中の早期発現、壊疽及び四肢の切断、神経損傷、インポテンツを含めた合併症を引き起こし、患者の寿命を１０〜２０年縮める。
【００１５】
２型糖尿病は、通常中年期以降に発症し、特に肥満の患者を冒す。２型糖尿病では、通常インスリンを必要とする身体の細胞がその感受性を失い、インスリンに正常に反応できなくなる。このインスリン抵抗性は、膵臓β細胞による過剰なインスリン産生量によって長年にわたり抑えていられることがある。しかし、最終的には、常に血糖値が高いためにβ細胞が過剰なインスリンを大量に産生しなければならないため、徐々に疲弊する。ついには、酷使されたβ細胞が死滅して、インスリンが分泌されなくなり、外部からのインスリン注射によってしかコントロールできなくなるまで血糖値が上昇する。２型糖尿病には通常、高血圧及びコレステロールの異常値が伴う。これらの病態に高血糖が加わると、心臓発作、卒中、及び下肢の循環障害による切断のリスクが上昇する。
【００１６】
この他、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）等、遺伝的欠失が原因の３型糖尿病がある。ＭＯＤＹは、インスリン産生細胞の遺伝的欠陥が原因であり、特殊な糖受容体を介して流入する糖を処理する能力が制限される。ＭＯＤＹ患者のβ細胞は、糖に反応して適切にインスリンを産生することができず、その結果、高血糖症が生じ、最終的にはこれもインスリン注射による処置が必要となる。
【００１７】
インスリン依存性糖尿病に対する現在可能な医学的処置は、インスリン投与、膵臓移植（全膵臓移植又は部分膵臓移植）及び膵島移植に限られている。インスリン療法は、膵臓移植及び膵島移植よりも遥かに多く行われている。しかし、血糖のコントロールすることは簡単なことではない。健康的な食事、運動の維持に厳しい注意を払い、常に適切な量のインスリンを注射していても、ストレス、ホルモン量の変化、成長期、疾病又は感染症、及び疲労を含めたその他多くの因子が患者の血糖コントロールに悪影響を及ぼすことがある。糖尿病患者は常に、生命を脅かす低血糖症及び高血糖症に備えていなければならない。
【００１８】
インスリン投与とは異なり、全膵臓移植又は部分膵臓移植は、糖尿病を治癒させることが知られている。しかし、生涯にわたって免疫抑制療法を行わなければならないため、この移植は腎臓移植が必要な場合にのみ実施されることが普通で、膵臓のみの移植は比較的稀である。膵臓移植は、もはやインスリンの注射が必要なくなり、長期の合併症が抑えられるところまで、インスリン依存性糖尿病患者の血糖を改善するという意味において極めて有効であるが、全膵臓移植には幾つかの欠点がある。最も重要なの点として、膵臓移植は大手術であり、外来の移植片である膵臓を身体の免疫系が破壊するのを予防するために、生涯にわたって免疫抑制薬を使用しなければならないことがあげられる。これらの薬物を投与しなければ、膵臓はおよそ数日で破壊されてしまう。これらの免疫抑制薬を服用すると、何れも生命を脅かす感染症及び腫瘍の罹患率が上昇するというリスクも生じる。
【００１９】
膵島移植は全膵臓移植よりも遥かに簡単且つ安全な手技であり、β細胞を置換することによって同じ効果が得られる。但し、移植可能な島細胞が不足していることが、依然として島細胞移植における未解決の問題となっている。膵島は膵臓全体の約２％を占めるにすぎないため、インスリンを産生しない残りの膵臓からこれらを分離するには約６時間がかかる。以前には１回の移植に５〜６個の膵臓が必要とされたが、現在は自動化された分離方法により、１個の膵臓から患者１人の移植に十分な膵島を分離できるようになっているとはいえ、依然として膵島の需要量が、遺体から回収される現在使用可能な臓器の供給量を遥かに上回っている。更に、糖尿病の症状を長期にわたって消失させるには至らないこともしばしばある。
【００２０】
このため、インスリン注射、膵臓移植、及び膵島移植の代替となる方法があれば、公衆衛生における大きな需要を満たすことになる。
【００２１】
幹細胞
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、無制限に自己再生し、全ての組織に分化することができる。ＥＳ細胞は、着床後胚の胎盤胞又は原始生殖細胞の内部細胞塊に由来する（胚性生殖細胞又はＥＧ細胞）。ＥＳ（及びＥＧ）細胞は、ＳＳＥＡ１（マウス）及びＳＳＥＡ４（ヒト）に対する抗体による陽性染色により同定することができる。分子レベルでは、ＥＳ及びＥＧ細胞は、これらの未分化細胞に特異的な多数の転写因子を発現する。これには、Ｏｃｔ−４及びｒｅｘ−１が含まれる。Ｒｅｘの発現はＯｃｔ−４に依存する。又、ＬＩＦ−Ｒ（マウス）及び転写因子ｓｏｘ−２及びｒｏｘ−１も認められる。Ｒｏｘ−１及びｓｏｘ−２も非ＥＳ細胞で発現する。ＥＳ細胞の別の特徴は、これらの細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで無制限に自己再生する能力を提供するテロメラーゼの存在である。
【００２２】
長期にわたって増殖可能な幹細胞集団から機能的島細胞を産生する能力は、糖尿病患者における移植用β細胞の供給源となると考えられる。検討対象となっているこのような集団の一つが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。胚性幹細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚様体を産生することができる場合、内胚葉細胞からβ細胞の特徴を有する細胞が認められることは稀である。近年の試験により、マウス及びヒトのＥＳ細胞から肝臓又は膵臓内胚葉への比較的特異的な分化は可能であることが明らかになった。高濃度のアクチビンを使用した処理により、ＥＳ細胞が内胚葉に指定された（Ｋｕｂｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。又、多数の試験が、多数の異なる戦略を使用してＥＳ細胞からインスリン陽性細胞を得ることができることを示唆している（Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈｏｒｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｏｒｉａ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｋａｈａｎ，Ｂ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかし、これらの試験の中には、検出されたインスリンがインスリン−１であるのか、神経細胞及び胚外内胚葉にも認められるインスリン−２（Ｓｉｐｉｏｎｅ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４）であるのか言及されていないものがある。更に事を複雑にしているのは、殆どの試験でＥＳ細胞はインスリンを含有する培地で培養されており、幾つかの研究チームは今ではインスリンは培地から細胞が吸収したものであることを明らかにしていることである（Ｖａｃａ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｒａｊａｇｏｐａｌ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈａｎｓｓｏｎ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。この他に乗り越えなければならない問題は、臨床で使用するＥＳ細胞由来のβ様細胞が、少数であっても未分化ＥＳ細胞の奇形腫形成を引き起こす能力を有することである（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００２３】
糖尿病は世界中で伝染病のような勢いに達しているため、新規の根治的療法が求められていることは確実である。１型糖尿病に対する有望な処置として膵島移植が登場したものの、ドナー膵臓の不足が制限要因となっている。このため、インスリン注射、膵臓移植及び膵島移植の代わりとして使用できる豊富で、臨床的価値のある細胞の供給源が求められている。
【００２４】
「多能性成体前駆細胞」（ＭＡＰＣ）は、非胚性（非ＥＳ）、非生殖及び非胚性生殖（非ＥＧ）細胞であり、１つ以上の外胚葉、内胚葉及び中胚葉細胞型に分化することができる。ＭＡＰＣはテロメラーゼ、Ｏｃｔ−３Ａ（Ｏｃｔ−３／４）又はそれらの組み合わせに対して陽性である。テロメラーゼ又はＯｃｔ−３／４は、未分化状態における一次産物である遺伝子と認識されてきた。テロメラーゼは複製老化を伴わない自己再生を行う上で必要となる。ヒト、マウス、ラット又はその他の哺乳動物由来のＭＡＰＣは、今日までに後期継代細胞でもテロメラーゼ活性を発現することが知られている唯一の正常で非癌性の体細胞（即ち非生殖細胞）である。テロメラーゼはＭＡＰＣでは長さが順々に減少しない。ＭＡＰＣは核型正常である。又、ＭＡＰＣはＳＳＥＡ−４及びｎａｎｏｇも発現する。
【００２５】
Ｏｃｔ−４遺伝子（ヒトではＯｃｔ−３）は、ヒトで少なくとも２種類のスプライスバリアント、Ｏｃｔ−３ＡとＯｃｔ−３Ｂに転写される。Ｏｃｔ−３Ｂスプライスバリアント（以前にはＯｃｔ３／４とも呼ばれた）は、未分化の胚性幹細胞に特異的であることが報告されている（Ｓｈｉｍｏｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｏｃｔ−４（ヒトではＯｃｔ−３）は、原腸形成前の胚、初期開裂段階の胚、胎盤胞の内部細胞塊の細胞及び胚性癌細胞（ＥＣ細胞）で発現する転写因子であり（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、細胞が分化へ誘導されると下方調節される。Ｏｃｔ−４の発現は、胚形成及び分化の早期手順を決定するのに重要な役割を果たす。Ｏｃｔ−４はＲｏｘ−１と組み合わさって、これもＥＳを未分化状態の維持に必要とされる亜鉛フィンガータンパク質Ｒｅｘ−１の転写を活性化する（Ｒｏｓｆｊｏｒｄ  ａｎｄ  Ｒｉｚｚｉｎｏ  Ａ．１９９７；Ｂｅｎ−Ｓｈｕｓｈａｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。又、ＥＳ／ＥＣでも他の分化細胞でも発現するｓｏｘ−２は、Ｏｃｔ−４と共にＥＳ／ＥＣの未分化状態を維持するのに必要とされる（Ｕｗａｎｏｇｈｏ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。マウスＥＳ細胞及び原始生殖細胞の維持にはＬＩＦが必要である。
【００２６】
ＭＡＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも、全ての原始胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の複製能を有する。この文脈において、ＭＡＰＣは胚性幹細胞と等価であり、骨髄から単離される間葉系幹細胞とは一線を画する。ＭＡＰＣの生物学的能力は、マウス、ラット及びラットにおけるヒト幹細胞の異種移植片又はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス等種々の動物モデルで明らかにされている（非特許文献３；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。この細胞集団のクローン化能も明らかにされている。単一の遺伝マーカーで標識されたＭＡＰＣをマウス胎盤胞に注入し、胎盤胞に着床させ、胚は満期まで発育した（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。キメラ動物の出生後解析により、肝臓を含む全ての組織及び器管が再構築されていることが明らかになった。二重染色試験では、遺伝標識されたＭＡＰＣが、これらの動物のみかけの機能的心筋細胞に、著明な割合で貢献していることが示された。これらの動物は胚状態でも成体状態でも心臓の異常又は不整を示さなかった。これらの動物に異常又は臓器機能不全は全く認められなかった。
【００２７】
ＭＡＰＣは分化能が低下しても広範に培養でき、奇形腫の形成なしにＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて効率的且つ長期に生着し、複数の系統に分化する（非特許文献３）。これには内皮系統への分化が含まれる（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，２００２；Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【非特許文献１】Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２００２，２２５：２６０−２７０
【非特許文献２】Ｈａｒｄｉｋａｒ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３；１００：７１１７−７１２２
【非特許文献３】Ｒｅｙｅｓ，Ｍ．およびＣ．Ｍ．Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００１；９３８：２３１−２３５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（発明の要旨）
一実施形態は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞由来のインスリン発現細胞及びその前駆細胞を提供するための組成物及び方法を提供する。例えば、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビン−Ａ及びＳＨＨ阻害剤に曝露すると、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞が産生される。Ｐｄｘ−１の発現が亢進したこれらの細胞を、ＥＧＦ又はＨＧＦ（又は両方）に曝露すると、Ｎｇｎ３の発現が亢進した細胞が産生される。Ｎｇｎ３の発現が亢進したこれらの細胞を、ニコチンアミド又はエキセンディン（エキセンディン）又は両方に曝露すると、インスリンの発現が亢進した細胞が産生される。従って、本発明は以下の組成物及び方法を対象とする。
【００２９】
一実施形態は、アクチビン−Ａである第一の物質、及びｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇを阻害する第二の物質、並びに外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を含む組成物を提供する。本組成物は又ＢＭＰ４を含む場合もある。
【００３０】
別の実施形態は、ＥＧＦ又はＨＧＦ、及びＰｄｘ−１の発現が亢進した細胞を含む組成物であって、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した該細胞が、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と、及びｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と、並びに場合によりＢＭＰ４と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生するにより調製される、組成物を提供する。
【００３１】
別の実施形態は、ニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方、及びＮｇｎ３の発現が亢進した細胞を含む組成物であって、Ｎｇｎ３の発現が亢進した該細胞が、ａ）外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と、並びに場合によりＢＭＰ４と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生し；ｂ）Ｐｄｘ−１の発現が亢進した該細胞をＥＧＦ又はＨＧＦと接触させて、Ｎｇｎ３の発現が亢進した細胞を産生するることによって調製される、組成物を提供する。一実施形態において、本組成物は更にＧＤＦ１１又はベータセルリンの一方又は両方を含む。
【００３２】
別の実施形態は、細胞培地又は薬学的に許容される担体、及びインスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した該細胞を含む組成物であって、ａ）外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と、並びに場合によりＢＭＰ４と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生し；ｂ）Ｐｄｘ−１の発現が亢進した該細胞をＥＧＦ又はＨＧＦと接触させて、Ｎｇｎ３の発現が亢進した細胞を産生し；ｃ）Ｎｇｎ３の発現が亢進した該細胞を、ニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて、インスリンの発現が亢進した細胞を産生することにより調製される、組成物を提供する。一実施形態において、Ｎｇｎ３の発現が亢進した細胞は、１つ以上のＧＤＦ１１又はベータセルリンと接触させる。
【００３３】
一実施形態において、本組成物は、細胞培地又は薬学的に許容される担体（例えば、薬学的に許容される培地）を含む。例えば、一実施形態は、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した又はＮｇｎ３の発現が亢進した細胞、並びに細胞培地又は薬学的に許容される担体（例えば、薬学的に許容される培地）を含む組成物を提供する。一実施形態において、該第二の物質は、シクロパミン又は抗ＳＨＨ抗体である。
【００３４】
一実施形態は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生することを含む方法を提供する。一実施形態において、非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞はＢＭＰ４とも接触される。
【００３５】
一実施形態において、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した該細胞は、ＥＧＦ又はＨＧＦと接触されて、Ｎｇｎ３の発現が亢進した細胞を産生する。別の実施形態において、Ｎｇｎの発現が亢進した該細胞では、ＮｅｕｒｏＤの発現も亢進する。
【００３６】
一実施形態において、Ｎｇｎ３の発現が亢進した該細胞は、ニコチンアミド又はエキセンディンの一方又は両方と接触されて、インスリンを発現する細胞を産生する。一実施形態において、インスリンの発現は、Ｎｇｎ３を発現する該細胞による発現量よりも亢進する。一実施形態において、Ｎｇｎ３の発現が亢進した該細胞が、ＧＤＦ１１又はベータセルリンの一方又は両方と接触される。
【００３７】
一実施形態は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を分化させる方法であって、ａ）該非胚性幹、非生殖かつ非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と接触させ（約３日又は約６日を含めた約１〜約９日以上）；ｂ）手順ａ）で得られた該細胞を、アクチビンＡと、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性を阻害する第二の物質と接触させ（約３日又は約６日を含めた約１〜約９日以上）；ｃ）手順ｂ）で得られた該細胞をＥＧＦ又はＨＧＦと接触させ（約６日を含めた約１〜約９日以上）；ｄ）手順ｃ）で得られた該細胞をニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて（約６日を含めた約１〜約９日以上）、インスリンを発現する細胞を産生する手順を含む、方法を提供する。一実施形態において、手順ａ）、手順ｂ）又はそれらの両方は、細胞をＢＭＰ４と接触させることを含む。別の実施形態において、手順ｄ）は更に該細胞をＧＤＦ１１又はベータセルリンの一方又は両方と接触させることを含む。一実施形態において、該第二の物質はシクロパミン又は抗ＳＨＨ抗体である。
【００３８】
一実施形態において、該接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、培養中）で行われる。一実施形態において、該接触は連続して行われる。一実施形態において、該接触は同時に行われる。一実施形態において、インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した該細胞は、インスリン（例えば、インスリン−１）、ｃ−ペプチド、又はそれらの組み合わせを分泌する。
【００３９】
一実施形態において、該非胚性幹、非生殖かつ非胚性生殖細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。別の実施形態においては、該非胚性幹、非生殖かつ非胚性生殖細胞（又はそれらの分化した子孫細胞）に膵臓転写因子を形質導入する。一実施形態において、該膵臓転写因子は、Ｎｇ３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、Ｐｔｆｌａ／ｐ４８、Ｐａｘ６、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２又はそれらの組み合わせを含む。別の実施形態において、該膵臓転写因子は、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３又はそれらの組み合わせを含む。
【００４０】
一実施形態は、処置を必要とする対象に膵臓細胞を提供する方法であって、ａ）外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）の活性を阻害する第二の物質と接触させて、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した細胞を産生し；ｂ）Ｐｄｘ−１の発現が亢進した該細胞を投与して、膵臓細胞を該対象に提供することを含む、方法を提供する。一実施形態において、該非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞は、ＢＭＰ４とも接触される。
【００４１】
別の実施形態において、Ｐｄｘ−１の発現が亢進した該細胞は、該対象に投与する前に、ＥＧＦ又はＨＧＦと接触させて、Ｎｇｎ３の発現が促進した細胞を産生する。
【００４２】
別の実施形態において、Ｎｇｎ３の発現が亢進した該細胞は、該対象に投与する前に、ニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した細胞を産生する。一実施形態において、Ｎｇｎ３の発現が亢進した該細胞は、ＧＦＤ１１又はベータセルリンの一方又は両方と接触される。
【００４３】
別の実施形態は、インスリンを発現する細胞を処置を必要とする対象に提供する方法であって、ａ）外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞型の少なくとも２つに分化することができる非胚性幹、非生殖、非胚性生殖細胞を、アクチビンＡである第一の物質と接触させ；ｂ）手順ａ）で得られた細胞を、アクチビンＡと、並びにｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性を阻害する第二の物質と接触させ；ｃ）手順ｂ）で得られた細胞をＥＧＦ又はＨＧＦと接触させ；ｄ）手順ｃ）で得られた細胞をニコチンアミド又はエキセンディン４の一方又は両方と接触させて、インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した細胞を産生し；ｅ）インスリンを発現する又はインスリンの発現が亢進した該細胞を該対象に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態において、手順ａ）、手順ｂ）又はそれらの両方は、更にＢＭＰ４を含む。別の実施形態において、手順ｄ）は更にＧＤＦ１１又はベータセルリンの一方又は両方を含む。
【００４４】
一実施形態において、該対象は哺乳動物（例えば、ヒト）である。別の実施形態において、該対象は膵障害又は膵臓の損傷を有する。一実施形態において、該障害は、糖尿病、肥満、膵管閉鎖、膵炎、α１アンチトリプシン欠失症、遺伝性膵炎、膵臓癌、膵酵素欠失症又は高インスリン血症を含む。一実施形態において、該糖尿病は１型又は２型糖尿病である。別の実施形態において、該損傷は肉体的外傷、化学薬品、放射線、加齢、疾患又はそれらの組み合わせにより生じる。
【００４５】
一実施形態は、膵臓障害又は損傷を処置する医薬品を調製するための、本明細書に記載の方法により調製される細胞の使用を提供する。一実施形態において、該薬物は更に生理学的に許容される担体又は細胞培地を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書で使用される以下の用語は、以下の意味によって定義される。
【００４７】
「ＭＡＰＣ」は「多能性成体前駆細胞」の頭文字である。本明細書では、１つ以上の胚系統の細胞になる（分化する）ことができる非胚性幹細胞（ｎｏｎ−ＥＳ）、非生殖細胞、非胚性生殖細胞（ｎｏｎ−ＥＧ）を指す。ＭＡＰＣは分化して、少なくとも２つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）で細胞系統を形成することができる。ＭＡＰＣに関する「成体」という用語は非制限的である。これは非胚性体細胞を指す。
【００４８】
「多能性」は、１つ以上の胚系統の細胞になる能力を指す。ＭＡＰＣに関する場合の「多能性」は非制限的である。ＭＡＰＣは３つの原始胚葉（即ち、内胚葉、中胚葉及び外胚葉）全ての細胞系統を形成することができる。「ＭＡＰＣ」という頭文字で使用される「前駆細胞」という用語は、これらの細胞を特定の系統に制限するものではない。
【００４９】
「拡大」は、分化を伴わない細胞の伝播を指す。
【００５０】
「前駆細胞」は、その最終分化した子孫細胞の特徴の全てではないが幾つかを有する幹細胞の分化中に産生される細胞である。「膵臓前駆細胞」等のように規定された前駆細胞は、ある系統に拘束されるが、特異的細胞型又は最終分化細胞型には拘束されない。
【００５１】
「自己再生」は、そこから発生した細胞と同一の分化能を有する細胞の、複製娘細胞を産生する能力である。この文脈で使用される同様の用語は「増殖」である。
【００５２】
マーカー（例えば、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ又はインスリン１）の「発現亢進」は、細胞毎の平均に基づき、親細胞（前述の処理（アクチビン−Ａとの接触及び／又は複数の処理）を受ける前の細胞）に比した場合の（ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の）増加を指す（例えば、親細胞がマーカーを発現せず、子孫細胞が発現する場合、発現の亢進がみられる；又は子孫細胞が親細胞に比べて多量のマーカーを発現する場合も発現の亢進がみられる）。例えば、マーカー（例えば、Ｐｄｘ−１）の発現亢進は、（細胞毎の平均に基づき）親細胞に比べて約１．０１倍、約１．０１５倍、約１．０２倍、約１．０２５倍、約１．０３倍、約１．０３５倍、約１．０４倍、約１．０４５倍、約１．０５倍、約１．０５５倍、約１．０６倍、約１．０６５倍、約１．０７倍、約１．０７５倍、約１．０８倍、約１．８５倍、約１．９倍、約１．９５倍、約２倍（例えば、２×）、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１，０００倍、約２，０００倍、約３，０００倍、約４，０００倍、約５，０００倍、約６，０００倍、約７，０００倍、約８，０００倍、約９，０００倍、約１０，０００倍、約１５，０００倍、約２０，０００倍、約２５，０００倍、約３０，０００倍、約３５，０００倍、約４０，０００倍、約５０，０００倍、約６０，０００倍、約６５，０００倍、約７０，０００倍、約７５，０００倍、約８０，０００倍、約８５，０００倍、約９０，０００倍、約１００，０００倍以上までの発現量の増加であってよい。
【００５３】
物質（例えば、アクチビン−Ａ及びＳＨＨ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＧＤＦ１１又はベータセルリンを阻害する物質）の有効量とは、単独又は１個以上の他の物質と組み合わせた場合に、言及した細胞を分化させるのに有効な量である。
【００５４】
「生着する」又は「生着」は、所定の既存の組織又は部位への細胞の接触及び取り込みのプロセスを指す。一実施形態においては、投与したＭＡＰＣ又はそれ由来の子孫細胞の約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上又は約１００％が膵臓又はその他の組織に生着する。
【００５５】
持続性は、細胞が拒絶反応に抵抗し、時間の経過（例えば、数日間、数週間、数ヶ月間、数年間）と共にｉｎ  ｖｉｖｏでその数を留めるか増加させる能力を指す。このため、持続することによってＭＡＰＣ又は子孫細胞は膵臓又はその他の組織を占めるか、バリア装置又はその他のカプセル化された形態でｉｎ  ｖｉｖｏで留まることができる。
【００５６】
「免疫耐性」とは、レシピエントとなる対象における外来の（同種又は異種）組織、器管又は細胞の生存（量及び／又は時間の長さ）を指す。この生存は、外来細胞の導入に反応して本来ならば発現する免疫反応を備えるレシピエントの能力が阻害されることによりもたらされることが多い。免疫耐性は、数日、数週間、数ヶ月又は数年持続する免疫抑制を包含する。この免疫耐性の定義にはＮＫ介在性免疫耐性も含まれる。この用語は又、生着が宿主に耐容される例も包含する。
【００５７】
「単離」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏではその細胞に伴う１個以上の細胞又は１個以上の細胞構成要素を伴わない細胞を指す。「豊富な細胞集団」とは、ＭＡＰＣ等の所定の細胞の数が、非ＭＡＰＣ細胞型等の１個以上の他の細胞と比較してｉｎ  ｖｉｖｏ又は一次培養で増加することを指す。
【００５８】
「サイトカイン」は、ＭＡＰＣ又はその他の幹細胞、前駆細胞又は分化細胞のホーミング等の細胞の移動を誘導し促進する細胞因子を指す。又、サイトカインはこのような細胞が分裂又は分化するように刺激する。
【００５９】
「対象」又は細胞の供給源は、ヒト等の哺乳動物を含めた脊椎動物であってよい。哺乳動物は、ヒト、家畜、競技用動物及び愛玩動物を含むが、これらに限定されない。「動物」という用語には、イヌ、ネコ、サカナ、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル（例えば、サル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン）、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ及びトリが含まれる。
【００６０】
本明細書で使用される「処置」は、損傷又は疾患に起因する病態又は損傷又は疾患に起因する病態の症状を処置、回復、予防、改善又は抑制することを含む。
【００６１】
「有効量」は一般的に、所望の効果を提供する量を意味する。例えば、有効量は、臨床的転帰を含めた有益又は所望の結果を引き起こすのに十分な量である。用量は１回以上の投与によって投与することができ、予め選択したあらゆる細胞量を含むことができる。有効と思われる量の正確な決定は、体格、年齢、処置対象の損傷又は疾患及び損傷の発現又は疾患の発症から経過した時間を含めた各対象に固有の因子に基づくことができる。当業者、特に医師は、有効量を構築することのできる細胞の数を決定することができるはずである。用量は投与様式（例えば、局所又は全身投与；遊離又はカプセル化）によって左右されることができる。効果は生着又は、糖尿病の回復又は処置といった他の臨床的エンドポイントとすることができる。その他の効果には、β細胞の提供、内在細胞の動員、血管新生及び／又は膵臓前駆細胞の提供が含まれる。
【００６２】
「併用投与」は、２種類以上の物質の連続的、同時及び／又は別々の投与を含むことができる。
【００６３】
対象に膵臓細胞を提供するには幾つかの経路が可能である。一実施形態においては、ＭＡＰＣを投与して、膵臓細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで提供することができる。これは、本明細書に記載の通り、ＭＡＰＣそれ自体の分化又は内在細胞の動員といった他の手段によって実現することができる。或いは、ｅｘ  ｖｉｖｏでＭＡＰＣから分化させた細胞より成熟した細胞を投与することもできる。このような細胞は、成熟した膵臓細胞型になることのできる膵臓前駆細胞、あらゆる種類の細胞になることはできない拘束された前駆細胞及びβ細胞を含む更に分化した細胞を含めた、分化のあらゆる手順の子孫細胞を含む。
【００６４】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｉｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法でそれらに帰せられた意味を有することができ、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含めた（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができる。本明細書で使用される「含めた」又は「含まれる」等は制限なく含むことを意味する。
【００６５】
ＭＡＰＣ
ＭＡＰＣは、外胚葉、内胚葉及び中胚葉細胞型に分化することができる、非胚性幹細胞（非ＥＳ）、非生殖細胞及び非胚性生殖細胞（非ＥＧ）である。ＭＡＰＣはテロメラーゼ陽性であってよい。又、Ｏｃｔ−３Ａ（Ｏｃｔ−３／４）に対しても陽性であってよい。ＭＡＰＣはｉｎ  ｖｉｖｏで分化して、β細胞等の膵臓細胞を形成することができる。或いは、ＭＡＰＣはｅｘ  ｖｉｖｏで膵臓表現型の子孫細胞に分化することができる。ＭＡＰＣ又はその分化した子孫細胞は対象に投与することができる。
【００６６】
ヒト骨髄由来のＭＡＰＣについては、米国特許第７，０１５，０３７号（第ＰＣＴ／ＵＳ００／２１３８７号（第ＷＯ０１／１１０１１号として公表））及び米国特許出願第１０／４６７，９６３号（第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２号（第ＷＯ０２／０６４７４８号として公表））に記載があり、そのＭＡＰＣに関する記述の内容を本明細書で援用する。ＭＡＰＣは他の哺乳動物で同定されてきた。例えば、マウスＭＡＰＣについては米国特許第７，０１５，０３７号及び米国特許出願第１０／４６７，９６３号に記載があり、そのマウスＭＡＰＣに関する記述の内容を本明細書で援用する。ラットＭＡＰＣも１０／４６７，９６３に記載があり、そのラットＭＡＰＣに関する記述の内容を本明細書で援用する。ブタＭＡＰＣについては、米国特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３８９７９号に記載があり、そのブタＭＡＰＣに関する記述の内容を本明細書で援用する。カニクイザルＭＡＰＣについては、Ｃｌａｖｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）が記述しており、そのカニクイザルＭＡＰＣに関する説明の内容が、参考として本明細書で援用されている。
【００６７】
単離及び増殖
ヒト及びマウスのＭＡＰＣの単離方法は米国特許第７，０１５，０３７号（第ＰＣＴ／ＵＳ００／２１３８７号（第ＷＯ  ０１／１１０１１号として公表））に、ラットについては米国特許出願第１０／４６７，９６３号（第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２（第ＷＯ  ０２／０６４７４８号として公表））に記載があり、これらの方法並びにその中で開示されるＭＡＰＣの同定法は、本明細書で援用されている。
【００６８】
ＭＡＰＣはまず骨髄から単離されたが、後に脳及び筋肉を含めたその他の組織から樹立された（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。このように、ＭＡＰＣは、骨髄、胎盤、臍帯及び臍帯血、筋肉、脳、肝臓、背髄、血液又は皮膚を含むがこれらに限定されない複数の供給源から単離することができる。例えば、ＭＡＰＣは、当業者が使用可能な標準的な手段で得られた骨髄穿刺液に由来することができる（例えば、Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｂａｔｉｎｉｃ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０を参照）。このため、現在、当業者は骨髄穿刺液、脳又は肝臓生検標本及びその他の臓器を得て、これらの細胞に発現する（又は発現しない）遺伝子に基づく当業者には使用可能な陽性又は陰性選択技術を使用して、細胞を単離することができる（例えば、このような検定の教示内容を本明細書で援用している上述の出願に開示されているような、機能的又は形態学的検定等を使用する）。
【００６９】
米国特許第７，０１５０３７号に記載のヒト骨髄由来ＭＡＰＣ
骨髄単核球を、当業者が使用可能な標準的な手段で得られた骨髄穿刺液から単離した（例えば、Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｂａｔｉｎｉｃ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０を参照）。多能性成体幹細胞は骨髄（又は肝臓や脳等の他の臓器）内に存在するが、共通の白血球抗原ＣＤ４５又は赤芽球特異的グリコフォリン−Ａ（Ｇｌｙ−Ａ）を発現しない。この細胞の混合集団にＦｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ分離法を適用する。その後、細胞を抗ＣＤ４５及び抗Ｇｌｙ−Ａ抗体を使用した陰性選択にかけ、ＣＤ４５陽性及びＧｌｙ−Ａ陽性細胞集団を除去し、残りの約０．１％の骨髄単核球を回収した。細胞はフィブロネクチンでコーティングしたウェルに平板培養して、下記の要領で２〜４週間培養して、ＣＤ４５陽性及びＧｌｙ−Ａ陽性細胞集団を除去することもできる。
【００７０】
或いは、細胞特異的マーカーを組み合わせて陽性選択を使用して細胞を単離することもできる。陽性選択及び陰性選択技術は何れも当業者が使用可能であり、陰性選択を実施する上で好適な多数のモノクローナル及びポリクローナル抗体も当該技術分野で使用可能であり（例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ，Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．（１９９５）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、多数の供給元から購入できる。
【００７１】
混合細胞集団から哺乳動物細胞を分離する技術も、例えばＳｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，による米国特許第５，７５９，７９３号（磁気分離）、Ｂａｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３（免疫親和性クロマトグラフィー）及びＷｙｓｏｃｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ  １９７８（蛍光活性化細胞分離法：ＦＡＣＳ）に記載されている。
【００７２】
回収したＣＤ４５−／ＧｌｙＡ−細胞を、約５〜１１５ｎｇ／ｍＬ（約７〜１０ｎｇ／ｍＬを使用することができる）の血清フィブロネクチン又はその他の適切なマトリックスコーティング剤でコーティングした培養皿に平板培養した。約１〜５０ｎｇ／ｍＬ（約５〜１５ｎｇ／ｍＬを使用することができる）の血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、約１〜５０ｎｇ／ｍＬ（約５〜１５ｎｇ／ｍＬを使用することができる）の上皮成長因子（ＥＧＦ）、約１〜５０ｎｇ／ｍＬ（約５〜１５ｎｇ／ｍＬを使用することができる）のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）又は約１００〜１０，０００ＩＵ（約１，０００ＩＵを使用することができる）のＬＩＦと共に、約１０−１０〜約１０−８Ｍのデキサメタゾン又はその他の適切なステロイド、約２〜１０μｇ／ｍＬのリノール酸及び約０．０５〜０．１５μＭのアスコルビン酸を追加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）又はその他の適切な細胞培地で、細胞を維持した。その他の適当な培地には、例えばＭＣＤＢ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ及びＲＰＭＩが含まれる。細胞は無血清下、約１〜２％ウシ胎児血清の存在下又は例えば約１〜２％ヒトＡＢ血清又は自家血清の存在下の何れかで維持することができる。
【００７３】
約３日毎に約２×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で再播種すると、通常４０回を上回る分裂が認められ、分裂回数が７０回を上回る細胞集団もみられた。細胞の倍加時間は最初の２０〜３０回の分裂では約３６〜４８時間であった。この後、細胞の倍加時間は約６０〜７２時間にまで延びた。
【００７４】
５例のドナー（約２歳〜約５５歳）由来のＭＡＰＣを約２×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で約２３〜２６回の分裂を行うまで培養したところ、テロメア長は約１１〜１３ＫＢであった。これは、同じドナーから得られた血中リンパ球のテロメア長よりも３〜５ＫＢ長かった。２例のドナーから得た細胞のテロメア長を約２３及び約２５回の細胞分裂後にそれぞれ測定し、更に約３５回目の細胞分裂後に再測定したところ変化は認められなかった。これらのＭＡＰＣの核型は正常であった。
【００７５】
米国特許第７，０１５，０３７号に記載の条件下でのヒトＭＡＰＣの表現型
ＦＡＣＳにより約２２〜２５回の細胞分裂後に得られたヒトＭＡＰＣの免疫表現型の解析を実施したところ、細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ及びＰ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ−１、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋを発現せず、ＣＤ４４、ＨＬＡ−１型及びβ２マイクログロブリンを低レベルで発現し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１を発現する（Ｎ＞１０）ことが示された。
【００７６】
２×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で再播種した培養物中で細胞分裂の回数が４０回を上回ると表現型はより均一となり、ＨＬＡ１型又はＣＤ４４を発現する細胞はみられなくなった（Ｎ＝６）。集密状態に達するまで増殖すると、Ｍｕｃ１８、ＣＤ４４、ＨＬＡ１型及びβ２−マイクログロブリンを高レベルで発現するようになり、これはＭＳＣについて報告されている表現型と同様のものであった（Ｎ＝８）（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，１９９９）。
【００７７】
免疫組織化学的分析により、約２×１０３個／ｃｍ２の播種密度にて増殖したヒトＭＡＰＣは、ＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１及び２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１Ａ及びＢを発現し、ＭＡＰＣの細胞集団の一部（約１〜約１０％）は抗ＳＳＥＡ４抗体で染色されることが明らかになった（Ｋａｎｎａｇｉ，Ｒ  １９８３）。
【００７８】
２×１０３個／ｃｍ２の播種密度にて約２２〜約２６回の細胞分裂を経て培養したヒトＭＡＰＣの発現遺伝子プロファイルをＣｌｏｎｔｅｃｈ社のｃＤＮＡアレイを使用して評価し、以下の所見を得た。
Ａ．ＭＡＰＣは、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４４−Ｈ、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ；ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、Ｇ  ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、Ｆｌｔ３−Ｌ又はＣＮＴＦの受容体のｍＲＮＡを発現せず、ＨＬＡ１型、ＣＤ４４−Ｅ及びＭｕｃ−１８のｍＲＮＡを低レベルで発現した。
Ｂ．ＭＡＰＣは、サイトカインであるＢＭＰ１、ＢＭＰ５、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＭＣＰ１；サイトカイン受容体であるＦｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ１α、ｇｐ１３０、ＬＩＦ−Ｒ、アクチビン−Ｒ１及びＲ２、ＴＧＦＲ−２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ；接着受容体であるＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９及びＣＤ１０のｍＲＮＡを発現した。
Ｃ．ＭＡＰＣは、ｈＴＲＴ及びＴＲＦ１；ＰＯＵドメイン転写因子Ｏｃｔ−４、ｓｏｘ−２（ＥＳ／ＥＣの未分化状態を維持する上でＯｃｔ−４と共に必要とされる；Ｕｗａｎｏｇｈｏ  Ｄ．１９９５）、ｓｏｘ−１１（神経発生）、ｓｏｘ−９（軟骨形成）（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｖ．１９９８）；ホメオドメイン転写因子であるＨｏｘａ４及びａ５（頚部及び胸部骨格の指定；気道の臓器形成）（Ｐａｃｋｅｒ，Ａ．Ｉ．２０００）、Ｈｏｘ−ａ９（骨髄造血）（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｈ．１９９７）、Ｄｌｘ４（前脳及び頭部周辺構造の指定）（Ａｋｉｍｅｎｋｏ，Ｍ．Ａ．１９９４）、ＭＳＸ１（胚中胚葉、成体心及び筋肉、軟骨−骨の形成）（Ｆｏｅｒｓｔ−Ｐｏｔｔｓ，Ｌ．１９９７）、ＰＤＸ１（膵臓）（Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．１９９６）のｍＲＮＡを発現した。
Ｄ．Ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ及びｈＴＲＴのｍＲＮＡの存在が、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。
Ｅ．更に、ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｒｅｘ−１のｍＲＮＡ及びＲｏｘ−１のｍＲＮＡがＭＡＰＣで発現することが明らかになった。
【００７９】
ＭＡＰＣは又、ＣＤ１０５及びＣＤ１０６陰性であることが明らかになった。
【００８０】
ヒト及びマウス骨髄及びマウス肝臓及び脳由来のＭＡＰＣで、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１及びＲｏｘ−１が発現した。ヒトＭＡＰＣはＬＩＦ−Ｒを発現し、ＳＳＥＡ−４で陽性染色された。最後に、３０回を上回る分裂を経て培養されたヒトＭＡＰＣでは、Ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、Ｒｅｘ−１及びＲｏｘ−１のｍＲＮＡレベルが上昇し、結果として表現型がより均一な細胞が得られた。これとは反対に、高密度で培養したＭＡＰＣはこれらのマーカーを発現しなかった。これは約４０回の分裂に至る前の老化及び軟骨芽細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞以外の細胞への非分化を伴った。
【００８１】
米国特許第７，０１５，０３７号に記載のＭＡＰＣの培養
本明細書に記載の通り単離したＭＡＰＣは、本明細書で援用する米国特許第７，０１５，０３７号に記載の方法を使用して培養することができる。
【００８２】
要約すれば、ＭＡＰＣの培養には、細胞を未分化状態に維持するために低血清又は無血清培地が望ましかった。細胞を培養するのに使用する本明細書に記載の培地に、表１に記載の物質を追加した。ヒトＭＡＰＣはＬＩＦを必要としない。
【００８３】
（表１）
【００８４】
【表１】
2009511061.tif 000003
ヒトＭＡＰＣに約１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦを添加しても、短期の細胞増殖に影響は認められなかった（２５回目の分裂までの倍加時間、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４）発現レベルは同じ）。しかし、ヒト細胞で認められたのとは異なり、０日目にＣＤ４５陽性を除去した新鮮なマウス骨髄単核球をＭＡＰＣ培養培地で平板培養した場合、細胞の増殖は認められなかった。マウス骨髄単核球を平板培養し、１４日後に培養細胞からＣＤ４５陽性を除去した場合、ヒトＭＡＰＣに形態及び表現型が類似した細胞が出現した。これは、造血細胞が分泌する因子が、マウスＭＡＰＣの初期の増殖に必要とされることを示唆するものであった。ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＦＧをのみを追加して培養すると、細胞の分裂は遅く（６日超）、約１０回の分裂を超える培養を維持することはできなかった。約１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦの添加により細胞の増殖は大幅に向上した。
【００８５】
培養中で樹立された細胞は、約４０％ＦＣＳ及び約１０％ＤＭＳＯを加えたＤＭＥＭを使用して、凍結して凍結ストックとして保存することができる。培養細胞の凍結ストックを調製するための他の方法も当業者には既知である。
【００８６】
このように、ＭＡＰＣは当該技術分野で使用可能な培地で維持し拡大させることができる。このような培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地（登録商標）、イーグル最小必須培地（登録商標）、Ｆ−１２Ｋ培地（登録商標）、イスコーブ改変ダルベッコ培地（登録商標）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。低グルコース配合物でピルビン酸ナトリウムを含有するか含有しない多くの培地も入手可能である。
【００８７】
又、哺乳動物の血清を含む細胞培地への追加も検討される。血清は、生存及び拡大に必要な細胞因子及び構成要素を含有することが多い。血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＢＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、仔ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ新生児血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、血清代替物及びウシ胚液が含まれる。補体カスケードの構成要素の不活化が必要である場合は、血清は約５５〜６５℃で熱不活化されることが知られている。
【００８８】
このほか追加物質を有益に供給して、細胞に微量元素を添加し、至適に増殖及び拡大させることができる。このような追加物質には、インスリン、トランスフェリン、セレンナトリウム及びそれらの組み合わせが含まれる。これらの構成要素には、ハンクス平衡塩類溶液（登録商標）（ＨＢＳＳ）、イーグル塩溶液（登録商標）、抗酸化物質ＭＣＤＢ−２０１（登録商標）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、アスコルビン酸及びアスコルビン酸−２−リン酸塩並びに追加のアミノ酸が含まれるがこれらに限定されない。多くの細胞培地はすでにアミノ酸を含有しているが、細胞を培養する前に追加を必要とする培地もある。このようなアミノ酸には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンが含まれるが、これらに限定されない。これらの追加物質の適切な濃度を決定することも当該技術分野で周知である。
【００８９】
抗生物質も、細菌、マイコプラズマ及び真菌による汚染を緩和するために一般的には細胞培養に使用される。一般的に使用される抗生物質又は抗真菌化合物はペニシリン／ストレプトマイシンの混合物であるが、以下に限定されないものの、アンフォテリシン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標））、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、チロシン及びゼオシンも含むことができる。抗細菌性及び抗真菌性の添加物は、実施する作業によっては若干の問題となることがある。抗生物質を含有する培地で起こる可能性がある状況として、細菌が依然として培養物の中に存在するが、抗生物質の作用が殺菌機序ではなく静菌機序として働くケースが含まれる。又、抗生物質は幾つかの種類の細胞の代謝に干渉することがある。
【００９０】
ホルモン類も細胞培養に有益に使用することができ、例としてはＤ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、βエストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン及びＬ−チロニンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
脂質及び脂質担体も細胞の種類及び分化細胞の運命に応じて、細胞培地に追加するために使用することができる。このような脂質及び担体には、シクロデキストリン（α、β、γ）、コレステロール、アルブミンに抱合したリノール酸、アルブミンに抱合したリノール酸及びオレイン酸、非抱合リノール酸、アルブミンに抱合したリノール−オレイン−アラキドン酸、アルブミンに抱合又は非抱合したオレイン酸等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
又、フィーダー細胞層の使用も検討される。フィーダー細胞は、幹細胞を含めた選好性の培養細胞の増殖を助けるのに使用される。フィーダー細胞は、γ線照射により不活化した正常な細胞である。培養においては、フィーダー層はその他の細胞の基底層として役立ち、それ自身ではそれ以上増殖も分裂もしない細胞因子を供給する（Ｌｉｍ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｂｏｄｎａｒ，Ａ．，２００２）。フィーダー細胞層の例は、ヒト二倍体肺細胞、マウス胚性線維芽細胞、スイスマウス胚性線維芽細胞であるが、幹細胞の至適な増殖、生存及び拡大を可能にするのに有益な細胞成分及び因子を提供できるあらゆる分裂終了細胞であってよい。多くの場合、白血病阻害因子（ＬＩＦ）が抗分化特性を有するため、未分化の増殖状態にあるＥＳ細胞を維持するために、フィーダー細胞は必要ではない。このため、ＬＩＦの追加は、幾つかの動物種のＭＡＰＣを未分化状態に維持するのに使用することができる。
【００９３】
培養中の細胞は、懸濁液として、又は細胞外マトリックス成分及び合成又はバイオポリマーといった固体の支持体に接着させて維持することができる。幹細胞は、固体支持体への接着を促進する、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＶ型コラーゲン、コンカナバリンＡ、硫酸コンドロイチン、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」及びフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ラミニン、ポリ−Ｄ及びポリ−Ｌリジン、トロンボスポンジン及びビトロネクチンといった追加の因子を必要とすることが多い。
【００９４】
幹細胞の維持条件には、ＭＡＰＣ等の幹細胞を未分化状態で維持させる細胞因子も含まれる。細胞が自己再生の未分化状態でとどまらなければならない条件下では、培地が上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ；選択された種において）及びそれらの組み合わせを含有するのが有益である。細胞を自己再生させることはできるが分化はさせない追加物は、分化前に培地から除去する必要があることは当業者には明白である。
【００９５】
幹細胞系及びその他の細胞は、別の種類の細胞と共に培養することで利益を得られる。このような共培養法は、特定の細胞がまだ同定されていないが幹細胞を特異的な系統又は細胞型に分化させることのできる細胞因子を供給することができるという所見に基づいて行われる。これらの細胞因子は細胞表面受容体の発現を誘導することもでき、それらはモノクローナル抗体によって容易に同定することができる。一般的に共培養のための細胞は、当業者が誘導したい系統の種類に基づいて選択し、共培養のために適切な細胞を選択することは当業者には可能である。
【００９６】
ＭＡＰＣの膵臓細胞への分化
ＭＡＰＣ及びＭＡＰＣから分化した膵臓前駆細胞は、膵臓細胞の供給源として有用である。アクチビン−Ａ（又はＴＧＦβファミリーの他のメンバー）、ＢＭＰ４（又はＢＭＰファミリーの他のメンバー）、ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性を阻害する物質（シクロパミン及び抗ＳＨＨ抗体を含むがこれらに限定されない）、ＥＧＦ又はＨＧＦ（又はその他の細胞分裂誘起タンパク質）、ニコチンアミド（及び場合によりニコチン酸）、エキセンディン（エキセンディン４及びｅｘｅｎａｔｉｄｅ（エキセンディン−４に極めて似た３９個のアミノ酸ペプチド）を含めたがこれらに限定されない）、ＧＤＦ１１（又は骨形態形成タンパク質／トランスフォーミング成長因子β（ＢＭＰ／ＴＧＦβ）スーパーファミリーの他のメンバー）、ベータセルリンを含むがこれらに限定されない適切な因子又は幹細胞の再生、拘束及び分化において役割を果たす因子を分泌する間質細胞又はその他の細胞と共にＭＡＰＣを培養することによって、ＭＡＰＣの成熟、増殖及び分化を行うことができる。
【００９７】
ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）活性（例えば、シグナル伝達）を阻害する物質は、ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇの機能又は発現を阻害する（例えば腹側神経管、四肢前後軸及び腹側体節のパターニング等の、初期胚のパターニングにおけるシグナルの提供を含むがこれに限定されない）あらゆる物質（例えば、ペプチド、抗体を含めたタンパク質、低分子、薬物、化学物質又はＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸）を含む。このような物質には、抗ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ抗体、シクロパミン（ＣＰＡ）、シクロパミン−４−エン−３−オン等の類似体又はその他のステロイド系アルカロイドが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される「阻害する」は、ＳＨＨ活性を阻害する物質の不在下におけるＳＨＨ活性と比べた場合のｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性の抑制（例えば約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％の抑制）を指す。
【００９８】
本明細書の実施例２に記載のように、ＭＡＰＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵臓前駆細胞及びβ細胞に分化させた。要約すれば、アクチビン−Ａ（例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬを含めた約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−４（例えば、約２０ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ又は約５０ｎｇ／ｍＬを含めた約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地でＭＡＰＣを約３日間培養し、その後アクチビンＡ、ＢＭＰ−４及びシクロパミン培養物（例えば、約１０μＭを含めた約５〜約５０μＭ）中で約６日間培養するか、抗ＳＨＨ抗体（約１０μｇ／ｍＬ）中で約６日間培養した。そこで得られた細胞を、次にＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍＬを含めた約５〜約１００ｎｇ／ｍＬ）又はＨＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍＬを含めた約５〜約１００ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地で約６日間培養した。そこで得られた細胞を、ニコチンアミド（例えば、約１０μＭを含めた約５μＭ〜約５０μＭ）又はエキセンディン４（例えば、約１０ｎＭを含めた約５ｎＭ〜約５０ｎＭ）、ＧＤＦ１１（例えば、約５０ｎｇ／ｍＬを含めた約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬＡ）及びベータセルリン（例えば、約５０ｎｇ／ｍＬを含めた約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地で約６日間培養した。
【００９９】
ＭＡＰＣの膵臓内胚葉への初期拘束（９日目にＰｄｘ−１陽性細胞）を促進する追加の因子は、Ｗｎｔファミリー、ＴＧＦ−βファミリー及びＦＧＦファミリーのメンバー等の内胚葉の拘束において役割を果たす既知の因子を含む。Ｗｎｔ−３は内胚葉の指定における役割を果たし（Ｈｅｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）、Ｗｎｔ３−／−マウスは内胚葉又は中胚葉を形成しない（Ｈｅｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。肝臓内胚葉は異なるが、膵臓内胚葉の指定はＷｎｔファミリーのメンバーによって調節される。初期の内胚葉指定はＷｎｔ−３に依存すると思われるのに対し、Ｗｎｔは膵臓内胚葉の指定を阻害すると考えられる。分泌タンパク質であるＤｋｋタンパク質ファミリーのメンバーであるＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質（Ｄｋｋ−１）は、Ｗｎｔの共受容体ＬＲＰ５／６に高親和性で直接結合し、ＬＲＰ５／６とＷｎｔ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ複合体との相互作用を阻害することにより、基本的なＷｎｔ経路に拮抗する（Ｎｕｓｓｅ  ２００１）。このため、Ｄｋｋ−１又はβカテニンの阻害剤（例えばＧＳＫＳｐ阻害剤ＩＸ等のＧＳＫ３阻害剤）の添加により（Ｗｉｌｌｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ＭＡＰＣから産生されるＰｄｘ−１陽性前駆細胞の数は増加する。
【０１００】
Ｎｏｄａｌ−／−マウスは内胚葉又は中胚葉を形成しないため、Ｎｏｄａｌも内胚葉指定において役割を果たしている。ＢＭＰ−４及びＴＧＦファミリーの他のメンバーは、内胚葉指定ではなく中胚葉を誘導し、ＢＭＰ−４−／−胚は構成された中胚葉を全く形成することなく妊娠初期に死亡する（Ｗｉｎｎｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＥＳ細胞の内胚葉への分化を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、高濃度のアクチビンＡが中胚葉ではなく内胚葉の細胞を指定することが明らかになった。膵臓内胚葉の指定に必要なその後の手順において（Ｋｕｂｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｄ’Ａｍｏｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）、アクチビンＡ（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）の単独使用又はｂＦＧＦ（Ｈａｒｄｉｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）との併用によりＳＨＨ発現が阻害され、膵臓内胚葉の指定が行われなくなった。
【０１０１】
ＦＧＦ−８は初期の内胚葉指定で役割を果たすと考えられる。同様にＦＧＦ−４は、少なくともニワトリでは内胚葉指定において役割を果たすことが確認された（Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。肝臓又は膵臓の指定におけるＦＧＦ−２の役割はより複雑である。上記のようにＦＧＦ−２は、膵臓の指定につながるＳＨＨの産生を阻害する（Ｈａｒｄｉｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｊｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。このため、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２又はそれらの組み合わせは（本明細書で言及する他の因子との併用によっても）、ＭＡＰＣの分化方法で使用することができる。
【０１０２】
前腸腹側並びに前腸背側内胚葉からの膵臓への拘束は、ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）によって阻害される（Ｈｅｂｒｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。脊索由来のアクチビンＡ（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）及び／又はＦＧＦ−２（Ｈａｒｄｉｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）のシグナルは、前膵臓内胚葉（ｐｒｅ−ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）におけるＳＨＨの発現を抑制する働きを持つ。或いは、又は加えて、ＳＨＨはシクロパミン又は特異的抗ＳＨＨ抗体によって遮断することができる。
【０１０３】
膵臓の指定及び分化は、複数の手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達系により調節される（Ｈａｒｄｉｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。具体的には、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系は膵臓、内分泌膵臓への拘束並びに内分泌Ｎｇｎ３の膵臓前駆細胞の成熟を妨げる。このため、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の阻害剤をＭＡＰＣの分化方法に使用することができる。
【０１０４】
幾つかの実験により、Ｐｄｘ−１の発現を誘導するには、アクチビンＡとＢＭＰ４との組み合わせがアクチビンＡ単独よりも優れていることが示されたが、培養中にも存在していたＢＭＰ４が中胚様細胞に対する役割を果たしていたと考えられる。このため、ＢＭＰ４は必要ではなく、ＢＭＰ２又はＢＭＰ７で置換できるか、低濃度で使用できるか、或いはアクチビンＡ単独で培養した後に数日間だけＢＭＰ４を使用することもできると考えられる。又、分化の最初の３日間にアクチビンＡとＷｎｔ−３を併用した場合、内胚葉の分化が更に促進されると考えられる。Ｗｎｔは膵臓内胚葉の分化を阻害するため、Ｄｋｋ−１の後にＷｎｔ−３を追加すると９日目には多数のＰｄｘ−１溶性細胞が誘導されると考えられる。これは、基本的なＷｎｔ経路を遮断するＧＳＫ３阻害剤の添加により裏付けることができる。Ｄｋｋ−１又はＧＳＫ３阻害剤の有効性は、リン酸化したβカテニンのレベルを測定することによって明らかにすることができる。その後、種々のＦＧＦ（ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−２）の役割を、手順的な用量のＦＧＦ−８及び／又はＦＧＦ−２及び手順的な用量のＦＧＦ−４及び／又はＦＧＦ２の阻害剤（例えば、ＳＵ５４０２）の添加によって明らかにすることができる。又、例えばγ−セクレターゼ阻害剤（化合物Ｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してＮｏｔｃｈシグナル伝達系を阻害することにより、膵臓内胚葉（Ｐｄｘ−１陽性細胞）の誘導に影響を与えることができる。γ−セクレターゼの有効性はＨｅｓ１及びＨｅｒｐの発現を評価することによって測定することができる。
【０１０５】
一実施形態において、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、Ｐｔｆｌａ／ｐ４８、Ｐａｘ６、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない膵臓転写因子を、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はウイルスによるトランスフェクション又はタンパク質の形質導入等によって細胞に形質導入することができる。これらの転写因子の発現は、ＭＡＰＣの膵臓への分化を誘導することができる。又、業界で既知の方法（例えば、相同組換え（米国特許第５，６４１，６７０号）、非相同組換え（米国特許第６，６０２，６８６号；ＲＡＧＥ（遺伝子発現の無作為的活性化）技術；Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．（米国オハイオ州クリーブランド））又は当業者が使用可能な他の内在因子発現技術によって、内在因子を活性化するか細胞内で増加させることができる（内在遺伝子活性化方法の教示に関して上記の特許を本明細書に引用し援用する）。又、本発明の方法においては本明細書に記載の因子／遺伝子に加えて、同じ生物学的機能／活性を有する当該因子／遺伝子の改変体、ホモログ又はオーソログを使用するか測定することができる。例えば、本発明で使用する改変体、ホモログ又はオーソログは、本明細書に記載の因子／遺伝子を含めた膵臓形成に関与する因子／遺伝子と相同であるか、配列同一性（ヌクレオチド又はアミノ酸配列）を有する。因子／遺伝子が相同であるかどうかを判定する検定及びプログラムは業界内で既知である。
【０１０６】
分化細胞を未分化細胞から同定して分離する方法は、業界で既知の方法及び本明細書に記載の方法で実施することができる。分化するべく誘導された細胞は、分化細胞の数が未分化細胞の数を上回る条件下で細胞を選択的に培養することにより同定することができる。同様に、分化細胞は、細胞のサイズ、細胞プロセスの数、細胞小器官の分布の複雑性及びインスリン又はＣペプチドの産生量及びグルコースに反応したインスリン又はＣペプチドの分布量等の、未分化状態では存在しない形態の変化及び特徴によって同定することができる。
【０１０７】
又、細胞受容体及び膜貫通タンパク質等の特異的な細胞表面マーカーの発現によって分化細胞を同定する方法も検討される。これらの細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を使用して分化細胞を同定できる。これらの細胞の検出は、蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって達成することができる。特異的遺伝子の転写の上方調節の見地からは、インスリン−１、インスリン−２、グルカゴン、ソマトスタチン、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２等の分化細胞は未分化細胞とは異なる（ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の増加又は減少）遺伝子発現レベルを示すことが多い。逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、このような分化中の遺伝子発現の変化をモニターすることができる。又、マイクロアレイ技術を使用した全ゲノム解析を使用して分化細胞を同定することができる。
【０１０８】
従って、分化細胞を同定できれば、必要に応じて未分化細胞から分離することができる。ＦＡＣＳ、選択的細胞培養、ＥＬＩＳＡ、磁性ビーズ及びそれらの組み合わせ等、上に詳述した同定の方法は、分離方法も提供する。本発明の好ましい実施形態は、細胞表面抗原の発現に基づき細胞を同定し分離するＦＡＣＳを想定するものである。
【０１０９】
追加の培養方法
ＭＡＰＣの培養密度は、約１００個／ｃｍ２又は約１５０個／ｃｍ２〜約１０，０００個／ｃｍ２、例えば約２００個／ｃｍ２〜約１５００個／ｃｍ２又は約２，０００個／ｃｍ２であってよい。この密度は種によって異なる。又、至適な密度は、培養条件及び細胞の供給源によって極めて異なる。任意の培養条件及び細胞での至適密度を決定することは当業者の技術の範囲内である。
【０１１０】
又、特定の実施形態において、細胞の単離、培養、拡大及び／又は分化のための大気中酸素濃度は約０．１％〜約１０％とする。その他の実施形態において、大気中酸素濃度は約１％〜約９％である。その他の実施形態において、大気中酸素濃度は約１．５％〜約８％である。追加の実施形態において、大気中酸素濃度は約２％〜約７％である。
【０１１１】
上述の範囲は、Ｏｃｔ３／４陽性であり、外胚葉、内胚葉及び中胚葉細胞型に分化することができる非ＥＳ、非ＥＧ、非生殖細胞の培養に使用する場合の大気中酸素濃度の例示的範囲であり、当業者はこれらの範囲の何れかに当てはまる酸素濃度を使用することができることが理解されるべきである。このため、当業者は培養酸素濃度を約０．１％、０．５％、．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、又はこれらの比率の何れかの間の他の酸素濃度に設定することができる。一実施形態において、酸素濃度は約２％〜約７％、例えば約５％であり、これは生体内の酸素濃度により近似している（Ｇｕｙｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，ｉｎ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．５１３−５２３  （１９９６））。酸素濃度は培養期間中に所定の範囲内で変化させることができる。その他の雰囲気ガスは、例えば窒素、アルゴン並びに二酸化炭素等の従来の不活ガスである。又、本発明の細胞は約５％〜約６％のＣＯ２下で培養される。
【０１１２】
５％ＣＯ２下でＭＡＰＣを単離し培養すると、細胞遺伝学的異常の発現が少なくなることが明らかになった。又、ＭＡＰＣの表現型にも僅かな変化が起こった。げっ歯類ＭＡＰＣを５％ＣＯ２下で単離し維持する場合、Ｏｃｔ−４の転写レベルは胚性幹細胞（ＥＳ）のそれ（５０〜８０％）と近似し、免疫組織化学的検査により９０％を上回る細胞がＯｃｔ−４タンパク質を核内で発現することが確認される。５％酸素下で処理したげっ歯類ＭＡＰＣも、ＥＳ細胞のそれに近似するレベルのＲｅｘ−１を発現する。マウスＭＡＰＣはＯｃｔ−４  ｍＲＮＡをＥＳ細胞と同様のレベルで発現したが、胚様体又は奇形腫は形成しなかった（５×１０６個のＭＡＰＣをヌードマウス５例の皮下に移植）。
【０１１３】
又、ＭＡＰＣは、ＧＳＫ３阻害剤（例えば、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯとも呼ばれる）を含むがこれに限定されない６−ブロモインジルビン化合物；ＧＳＫ３阻害剤の存在下における培養細胞に関して、米国仮特許出願第６０／７０３，８２３号（２００５年７月２９日出願）及び６０／７０４，１６９（２００５年７月２９日出願）及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９７３６号（２００６年７月３１日出願）及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２９５４７号（２００６年７月３１日出願）で参考として援用される）の存在下でも培養することができる。
【０１１４】
ＭＡＰＣ及びその子孫細胞の使用
本発明の膵臓前駆細胞又はβ細胞及び／又はＭＡＰＣを使用して、損傷部位への直接的な導入又は全身投与の何れかにより、細胞を損傷部位にホーミングさせて膵臓を再構築（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）することができる。従って、本発明は、対象に本発明の膵臓前駆細胞又はＭＡＰＣの有効量を投与することを含む、膵臓細胞を必要とする対象の処置方法を提供する。
【０１１５】
本明細書に記載の目的のため、遺伝学的に変化させたか変化させていない、未分化状態、最終分化状態又は部分的な分化状態の何れかにある自家、同種又は異種細胞の何れかを、所定の部位（例えば許容可能なマトリックスの表面上又は周囲）への直接的な導入又は薬学的に許容される担体との全身投与により患者に投与し、既存及び／又は新規の膵臓細胞の増殖を修復、置換又は促進させることができる。
【０１１６】
一般的に、本発明は膵臓障害の処置方法を提供する。「膵臓障害」又は「膵臓障害」という用語は、膵臓機能が損なわれた状態を指す。本発明の組成物及び方法で処置することのできる「膵臓障害」又は「膵臓疾患」の例には、糖尿病（１型、２型、ＭＯＤＹ及びその他の遺伝的原因による糖尿病を含む）、肥満、膵管閉鎖、膵炎、α１アンチトリプシン欠失症、急性、慢性又は遺伝性膵炎、膵臓癌（膵の内分泌腫瘍を含む）、嚢胞性線維症又はＳｈｗａｃｈｍａｎ  Ｄｉａｍｏｎｄ症候群に起因する膵臓機能不全、膵臓不全又は膵酵素欠失症、膵嚢胞症、高インスリン症、膵液消化疾患、外分泌膵臓の遺伝的障害及び、肉体的外傷（手術を含むがこれに限定されない）、化学薬品、放射線、加齢及び／又は疾患による損傷を含むがこれらに限定されない膵臓損傷が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞の投与
ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞は、局所注射、カテーテル投与、全身投与、腹腔内注射、非経口投与、動脈内注射、静脈内注射、経血管投与、筋肉内注射、手術による所定の組織への外科的注射（例えば、膵臓への注射）又は組織表面への直接的な塗布（例えば、手術中又は創傷上）を含めたがこれらに限定されない当業界で使用可能な種々の方法で対象に投与することができる。
【０１１８】
ＭＡＰＣは循環系を介して末梢又は局所の何れかで投与することができる。幹細胞の「ホーミング」により、増殖及び機能しやすい環境に移植細胞が集中する。ホーミングを促進するためのサイトカインによる患者の前処置は、本発明の方法において検討される更に別の代替法である。特定のサイトカイン（例えば、ＭＡＰＣ又はその他の幹細胞、前駆細胞又は分化細胞のホーミング等の細胞の移動を誘導又は促進する細胞因子）は、ＭＡＰＣ又はその子孫細胞の移動を促進することができる。サイトカインには、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、アンギオポイエチン１、胎盤由来成長因子（ＰＩＧＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。又、サイトカインには、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ及びホーミングプロセスを促進するその他の因子等、内皮接着分子の発現を促進するあらゆる物質が含まれる。
【０１１９】
新たに形成された組織の生存率は血管新生によって強化される。血管新生を促進する因子には、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、アンジオゲニン、アンジオテンシン−１及び２、ベータセルリン、ｂＦＧＦ、Ｘ因子、Ｘａ因子、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、アンジオモジュリン、アンジオトロピン、アンジオポエチン−１、プロスタグランジンＥ１及びＥ２、ステロイド、ヘパリン、１−ブチリル−グリセロール及びニコチンアミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
アポトーシスを抑制する因子も、膵臓組織等の新しい組織の形成を促進することができる。アポトーシスを抑制する因子には、β遮断剤、アンジオテンシン転換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、ＡＫＴ、ＨＩＦ、カルベジロール、アンジオテンシンＩＩ１型受容体拮抗剤、カスパーゼ阻害剤、カリポリド及びエニポリドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
外因性因子（例えば、サイトカイン、分化因子（例えば、系統拘束を誘導する成長因子又は血管新生因子等の細胞因子）、血管新生因子及び抗アポトーシス因子）は、ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞の前、後又は同時に投与することができる。例えば、同時投与形態は、投与前にＭＡＰＣ懸濁液培地に対象となる因子を結合させることを含む。投与方法は様々であり、第一回の投与後にその後の投与を行うことも包含する。
【０１２２】
細胞の生存率を高める可能性のある方法は、ＭＡＰＣ又は子孫細胞をバイオポリマー又は合成ポリマーに組み込む方法である。患者の病態によっては、注射部位が瘢痕又はその他の障害により、細胞播種及び増殖に適さないことがある。バイオポリマーの例には、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲン及びプロテオグリカンが含まれるが、これらに限定されない。これは、サイトカイン、分化因子、血管新生因子又は抗アポトーシス因子と共に、又はこれらを使用せずに構築することができる。又、これらは懸濁液にすることができる。別の代替例は、細胞バイオポリマー混合剤の間隙に包埋された細胞を有する三次元ゲルである。ここでも、サイトカイン、分化因子、血管新生因子、抗アポトーシス因子又はそれらの組み合わせをゲル内に含めることができる。これらは本明細書に記載の種々の経路を介して注射によって展開（ｄｅｐｌｏｙ）することができる。
【０１２３】
又、細胞は、養分及び酸素を透過しつつ、適切な細胞産物（例えば島細胞の場合はインスリン）を血流又は隣接組織に放出することのできるカプセルに入れることができる。一実施形態において、カプセル材料は、インプラントを拒絶し破壊することがある免疫細胞及び抗体を除外するのに十分に制限されたものとする。このようなカプセル化は、例えばポリマーを使用して達成することができる（Ｃｈａｎｇ，２０００）。このようなポリマーカプセル系には、アルギネート（例えば、アルギネートビーズ）、多糖類ヒドロゲル、キトサン、アルギニン酸カルシウム又はバリウム、アルギネート及びポリリジンの層化マトリックス、光重合ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマー（Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．）、Ｂｉｏｄｒｉｔｉｎという名称のポリアニオン性材料（米国特許第６，２８１，３４１号）、ポリアクリレート、光重合ポリ（エチレングリコール）ポリマー及びヒドロキシエチルメタクリレートメチルメタクリレート等のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
細胞をカプセル化する別の方法は、生存細胞を幅わずか数ナノメートルの孔を有するシリコンカプセルに封入する半導体産業から応用したフォトリソグラフィーの技術の使用を含む（Ｄｅｓａｉ  ２００２）。
【０１２５】
又、ポリ−ｌ−リジン（ＰＬＬ）ポリカチオン又はポリ−ｌ−オルニチン又は塩酸ポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）を含むがこれらに限定されない好適な免疫適合性ポリカチオンを使用して細胞をカプセル化することもできる。
【０１２６】
又、場合によってはキャピラリーデバイス内で、封入した細胞を取り巻く生体適合性の半透過性膜を使用して細胞をカプセル化し、機能的膵臓又は肝臓細胞を含むようなミニチュアの人工器官（例えば、肝臓又は膵臓人工デバイス）を創製することができる。これはマクロカプセル化と呼ばれることが多い。この膜は糖、酸素及びインスリンを血流との間で出し入れし、好ましくは当該細胞（例えば、膵島）を破壊することがある免疫系の抗体及びＴ細胞を立ち入らせない。このような膜は、潅流デバイス、身体の循環血と直接接触できる血管へ移植したカプセルで使用することができる。このデバイスは血液から養分を取り込み、インスリンを放出して身体中に循環させることができる。別の方法は、小群の島細胞（マクロカプセル化）又は個々の島細胞（マイクロカプセル化）をコーティングし、それらを腹腔内部に植え込むものである。これらのデバイスでは養分及びインスリンは、それが植え込まれた組織を透過する体液を介して交換される。
【０１２７】
投与する細胞の量は、処置の対象によって異なる。好ましい実施形態においては、約１０４〜約１０８個、より好ましくは約１０５〜約１０７個、最も好ましくは約３×１０７個の幹細胞及び場合により約５０〜約５００μｇ／ｋｇ／日のサイトカインをヒト対象に投与することができる。但し、どの程度を有効量とみなすかに関しては、体格、年齢、疾患又は損傷、損傷の程度、損傷が発現してから経過した時間、送達様式に伴う因子（例えば、直接注入では低用量、静脈内注入では高用量）といった各患者に固有の因子に基づき、正確な決定を行う。この開示内容及び当該技術分野の所見により、当業者は投与量を容易に確定することができる。
【０１２８】
幹細胞又はその子孫細胞の使用に関する課題は、増殖又は単離した細胞集団の純度である。例えば、骨髄細胞は種々の細胞が混じった集団であり、所望の効果を得るのに十分な程度まで精製することができる。当業者であれば、蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）等の種々の既知の方法を使用して、集団内のＭＡＰＣ又は子孫細胞の百分率を容易に測定することができる。ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞を包含する集団における純度の好ましい範囲は、約５０〜５５％、約５５〜６０％及び約６５〜７０％である。より好ましくは、純度は約７０〜７５％、約７５〜８０％及び約８０〜８５％であり、最も好ましくは、純度は約８５〜９０％、約９０〜９５％及び約９５〜１００％である。但し、約２５〜３０％、約３０〜３５％、約３５〜４０％、約４０〜約４５％及び約４５〜５０％といった低純度の細胞集団も有用である。ＭＡＰＣ又はその子孫細胞の純度は、集団内での遺伝子発現プロファイルによって測定することができる。投与量は当業者によって容易に調節することができる（例えば、純度が低い場合は用量を増量する必要がある）。
【０１２９】
当業者は、本発明の方法で投与する組成物中の細胞の量及び至適な添加剤、ビヒクル又は担体を容易に決定することができる。一般的には、添加剤（活性幹細胞又はサイトカインに加えて）はリン酸緩衝生食水の約０．００１〜約５０ｗｔ％の量で存在し、活性成分はマイクログラムからミリグラムの単位で、例えば約０．０００１〜約５ｗｔ％、好ましくは約０．０００１〜約１ｗｔ％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５ｗｔ％又は約０．００１〜約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％及び最も好ましくは約０．０５〜約５ｗｔ％で存在するのがよい。無論、動物又はヒトに投与されるあらゆる組成物について、あらゆる特定の投与法について、以下を決定するのが好ましい。好適な反応を引き出すための、マウス等のげっ歯類等の好適な動物モデルにおいて致死量（ＬＤ）及びＬＤ５０を測定すること等による毒性、組成物の投与量、組成物中の構成要素の濃度、組成物の投与時期等である。このような決定は、当業者の所見、本開示内容及び本明細書で言及した資料をもってすれば、過度の実験を必要としない。又、連続投与の時間は過度の実験を行わずに確定することができる。
【０１３０】
本発明の治療的組成物を投与する場合、一般的には単位用量の注射剤として配合することができる（溶液、懸濁液、エマルジョン）。注射に好適な医薬配合物には、滅菌水溶液及び分散液が含まれる。担体は、例えば水、生食水、リン酸緩衝生食水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びその好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってよい。
【０１３１】
又、組成物の安定性、滅菌性及び等張性を促進する、抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート化剤及び緩衝剤を含めた種々の添加剤を添加することができる。微生物の活動は、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の種々の抗菌及び抗真菌剤によって予防することができる。多くの場合、例えば糖、塩化ナトリウム等の等張化剤を含むのが好ましい。注射製剤を長期にわたって吸収させるには、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収遅延剤を使用することができる。但し、本発明によると、使用するあらゆるビヒクル、希釈剤又は添加剤は細胞と適合する必要がある。
【０１３２】
滅菌注射液は、本発明の実施に使用する細胞を必要量の適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて種々の量の他の成分を添加することによって調製することができる。
【０１３３】
一実施形態において、ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞を最初に投与し、その後ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞を更に投与することによって維持することができる。例えば、ＭＡＰＣは一つの注射法によって投与し、その後、異なるか同じ方法によって更に投与することができる。
【０１３４】
ヒト対象は一般的にイヌやその他の実験動物よりも長期にわたって処置され、処置期間の長さは疾患プロセスの長さ及び有効性に比例する。用量は単回投与又は数日間にわたって反復投与される。このため、当業者は例えばラット、マウス、イヌ等の動物実験から、本明細書の開示内容及び引用された資料又は業界内の所見に基づく技術により、過度の実験を行うことなくヒトへスケールアップすることができる。処置は一般的に、疾患プロセスの長さ及び処置の有効性及び処置対象に比例して長くなる。
【０１３５】
ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞を含む組成物の例には、懸濁液を含む投与用液体製剤及び、滅菌懸濁液又はエマルジョン等の直接投与又は静脈内投与用の製剤（例えば、注射投与）が含まれる。このような組成物は、滅菌水、生食水、グルコース、ブドウ糖等の好適な担体、希釈剤又は調剤と混合することができる。組成物は凍結乾燥することもできる。組成物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化剤又は増粘剤、保存剤、風味剤、着色剤等の副次的な物質を、所望の投与経路及び製剤に応じて含有することができる。本明細書で援用する“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ，”  １７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５等の標準的なテキストを参照して、好適な製剤を過度の実験をせずに調製することができる。
【０１３６】
組成物は、選択したｐＨに緩衝した例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン又は粘性組成物等の液体製剤として簡便に提供される。液体製剤は通常はゲル、他の粘性組成物及び固体組成物よりも容易に調製することができる。又、液体組成物は、特に注射によって投与が若干簡便である。これに対し、粘性組成物は特定の組織とより長時間接触させるため、適切な粘性範囲内に収まるよう配合する必要がある。
【０１３７】
好適な担体及びその他の添加物の選択は、実際の投与経路及び液体剤型等の特定の剤型の性状（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲル又は徐放剤型又は液体充填剤型等の別の液体剤型の何れに配合されようとも）に左右される。
【０１３８】
溶液、懸濁液及びゲルは通常、細胞に加えて大量の水（好ましくは精製滅菌水）を含有する。ｐＨ調節剤（例えば、ＮａＯＨ等の塩基）、乳化剤又は分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤及びジェル剤（例えば、メチルセルロース）等の少量の他の成分も存在することができ、組成物は等張性であってよい。即ち血液及び涙液と同じ浸透圧を有することができる。
【０１３９】
本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム又は、ブドウ糖、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール又はその他の無機又は有機溶質等の薬学的に許容される他の物質を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝剤として特に好ましい。
【０１４０】
必要であれば組成物の粘性を、薬学的に許容される増粘剤で選択したレベルに維持することができる。メチルセルロースは、容易且つ安価に入手可能で扱いやすいため、好ましい。その他の好適な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が含まれる。好ましい増粘剤の濃度は、選択した増粘剤及び所望の粘度によって異なる。粘性組成物は通常、このような増粘剤を添加することによって溶液から調製される。
【０１４１】
薬学的に許容される保存剤又は細胞安定化剤を、組成物の有効期限を延ばすために使用することができる。好ましくは、保存剤が必要な場合は、本発明に記載のＭＡＰＣ又は子孫細胞の生存能力及び有効性を損なわない組成物を選択する当業者の範囲内に収まるのがよい。
【０１４２】
当業者は、本組成物の構成要素が化学的に不活であるべく選択する必要があることを認識するであろう。これは化学及び薬学の原則に通じた当業者には何の問題もなく、問題があっても本開示内容及び本明細書で引用された資料の標準的なテキスト又は簡単な実験（過度の実験は含まず）を参照することにより容易に避けることができる。
【０１４３】
組成物は医学及び獣医学における当業者が使用可能な投与量及び技術により、年齢、性別、体重及び特定の患者の病態及び投与に使用する組成物の剤型（例えば、固体又は液体）を考慮に入れて投与することができる。ヒト又はその他の動物への投与量は、本開示内容及び本明細書で引用された資料及び当該技術分野の所見に照らし合わせて、当業者により過度の実験を行うことなく決定することができる。
【０１４４】
初回投与及び用量又はその後の投与のための好適な投与計画も様々であり、初回投与の後にその後の投与を行うことも含まれるが、それでもなお、当業者は本開示内容及び本明細書で引用された資料及び当該技術分野の所見に照らし合わせて、確定することができる。
【０１４５】
免疫拒絶反応を予防するための移植方法
幾つかの実施形態において、移植細胞に対する宿主の免疫反応を刺激するリスクを抑制するため、移植／投与前にＭＰＡＣ（又は分化した子孫細胞）を処理するか、別の方法で変化させることが望ましい。宿主の免疫反応を刺激するリスクを抑制する当該技術分野で既知のあらゆる方法を使用することができる。以下に幾つかの例を示す。
【０１４６】
１．万能ドナー細胞：
ＭＡＰＣを遺伝子操作して万能ドナー細胞とすることができる。未分化状態のＭＡＰＣはＭＨＣ−Ｉ又はＩＩ抗原を発現しないが、幾つかの分化した子孫細胞はこれらの抗原の一方又は両方を発現することがある。ＭＡＰＣを改変して、ＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ抗原を除去し、場合によっては予定レシピエントからＭＨＣ−抗原を導入して、細胞がＮＫが媒介するＫｉｌｌｉｎｇ活性の容易な標的にならないようにするか、無制限のウイルス複製又は悪性転化を起こしやすくならないようにすることにより、万能ドナー細胞とすることができる。ＭＨＣ−抗原の除去は、例えば相同組換え又はプロモーター領域での点変異の導入又は抗原の最初のエクソンに点変異を導入することによるキメラプラスト等の終止コドンの導入によって達成することができる。宿主ＭＨＣ−抗原の移入は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス又はその他のウイルスによる形質導入又は標的細胞をＭＨＣ−抗原ｃＤＮＡでトランスフェクションすることにより達成可能である。
【０１４７】
２．免疫認識を回避するための子宮内移植：
ＭＡＰＣを使用して遺伝的異常を修正するか、免疫系の発達前の宿主によって忍容される細胞を導入する子宮内移植を行うことができる。これにより大量のヒト細胞を動物中で作製するか、正しいタンパク質又は酵素を作製する細胞を移植することによってヒト胚の遺伝的異常を修正することができる。
【０１４８】
３．造血のキメラ現象及び免疫耐性誘導
移植片対宿主反応のリスクをもたらさない免疫系を再構築できる幹細胞を使用することにより、利益が得られる。移植片対宿主反応は、骨髄移植片に内在する汚染Ｔ細胞に起因する。骨髄由来の造血幹細胞の精製は日常的に行われているが、患者におけるその生着にはアクセサリーＴ細胞の付随が必要である。このため、Ｔ細胞の生着による利益と、移植片対宿主反応による悪影響の間で決定的な均衡を保つ必要がある。
【０１４９】
ＭＡＰＣ及びＥＳ細胞は、それらがＴ細胞を含めた造血細胞を広範にわたってもたないことから、移植片対宿主反応のリスクなしに送達することができる。これは臨床的リスクを大幅に低減するものである。ＮＫ細胞活性を細胞送達の早期手順で一時的に除去することにより、長期にわたる免疫抑制のリスクなしに、臨床的に有用な程度まで原始幹細胞の生着及び造血細胞の再構築が行われることが多くなる。
【０１５０】
ＭＡＰＣ又はＥＳ細胞は生着して造血に寄与するため、新たに形成されたＴ細胞は、上述のように宿主Ｔ細胞と同じく、胸腺及び末梢で自己教育又は非自己教育（ｓｅｌｆ  ｖｅｒｓｕｓ  ｎｏｎ−ｓｅｌｆ  ｅｄｕｃａｔｉｏｎ）を受けることになる。新たに創製されたドナーの未感作Ｔ細胞を宿主細胞と共に曝露することにより、反応性細胞を互いに除去することができ、ＭＡＰＣ又はＥＳドナー由来の同種抗原を発現するＴ細胞に対する耐性が達成される。このため、患者はＭＡＰＣ又はＥＳドナーの免疫系の細胞及び分子的構成要素に対する耐性を有し、拒絶反応なしに細胞組織又は器管移植片を受け入れる。
【０１５１】
４．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能：
ＮＫ細胞を細胞集団から除去する等といったＮＫ細胞の機能を阻害する物質等のあらゆる手段も、免疫拒絶反応を予防し、生着を促進し、免疫耐性を促進するために投与することができる。このような物質には、抗ＮＫ細胞抗体、照射又はＮＫ細胞機能を阻害するあらゆる他の方法が含まれる。ＮＫ機能の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける幹細胞の持続性を介助するためのＮＫ細胞の阻害方法の教示に関して、本明細書で援用するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５７４０号（出願日２００５年５月５日）に更に記載がある。
【０１５２】
本発明の一実施形態において、ＮＫ細胞が媒介する細胞毒性の阻害を含めたＮＫ細胞機能の阻害のために少なくとも１つの手段を実施する。ＮＫ細胞機能は、遺伝的手段（ＮＫ細胞欠失のレシピエント）又は後成的手段（ｉｎ  ｖｉｖｏでの例えば抗ＮＫ抗体の除去／不活化）によって無効にすることができる。ＮＫ細胞機能を阻害することのできるあらゆる材料を（例えばＰ−セレクチン糖タンパク質１（ＰＳＧＬ−１）とＴ細胞又はＮＫ細胞上で結合する多量体化合物（米国特許公開第２００４／０１１６３３３号）又はＳＨ２を含有するイノシトールホスファターゼ（ＳＨＩＰ）の発現又は機能の改変（米国特許公開第２００２／０１６５１９２号））使用することができる。化学的手段（例えば、医薬化合物、薬物、低分子を含むがこれらに限定されない化学的化合物）、タンパク質（例えば、抗ＮＫ細胞抗体）、ペプチド、微生物、生物学的手段、核酸（遺伝子組換えタンパク質又は抗体をコードする遺伝子を含む）又は遺伝的構築物（例えば、ＮＫ細胞活性に対する拮抗物質を発現させる発現ベクターを含むがこれに限定されない発現ベクター等のベクター）を含むがこれらに限定されないあらゆる手段／物質を使用してＮＫ細胞の機能を阻害することができる。
【０１５３】
当該技術分野では、抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ；米国特許第６，２９６，８４６号）、ＴＭ−β１（抗ＩＬ−２受容体β鎖抗体）、抗ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１抗体（免疫原は糖脂質ＧＡ１）、抗ＮＫ１．１抗体又はモノクローナル抗ＮＫ細胞抗体（５Ｅ６；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含むがこれらに限定されない、ＮＫ細胞の機能を阻害する幾つかの抗体が使用可能である。又、例えばＮＫｐ４６を含めた天然細胞毒性受容体（ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＣＲ）に対する抗体又は、例えばＬＡＩＲ−１を含む白血球関連Ｉｇ様受容体に対する抗体又は、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＲＩ２ＤＬ２又はＫＲ２ＤＬ３のキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーのメンバーに対する抗体が当業者には使用可能であり、又は当業者が使用可能な方法で作製することができ、本発明に有用である。
【０１５４】
又、ＮＫ細胞上でＬＡＩＲ−１分子と架橋結合できる物質等の手段を使用して、ＮＫ細胞の機能を阻害することができる。又、照射（致死、亜致死及び／又は局所照射）を使用してＮＫ細胞の機能を阻害することもできる。一実施形態において、ＮＫ細胞の機能を阻害する手段は、ナチュラルキラー細胞と反応する抗体である。又、ＮＫ細胞の機能を阻害する手段は、免疫抑制のために開発されたものを含めた免疫系を調節する物質を含むことができる。これらのあらゆる手段／物質は、単独又は組み合わせて使用することができることに留意する必要がある。
【０１５５】
このため、本明細書では、ＭＡＰＣの集団及びナチュラルキラー細胞の機能を阻害する物質の有効量を対象に投与して、ＭＡＰＣに対する免疫耐性が前記阻害剤を投与しない方法に比べて高くすることを含む、対象のＭＡＰＣに対する免疫耐性の誘導方法も提供される。
【０１５６】
５．遺伝子治療：
ＭＡＰＣは身体から抽出及び単離して、未分化状態で培養物で増殖するか、培養物で分化を誘導し、一般的には種々の技術、特にウイルスの形質導入により遺伝学的に変化させることができる。遺伝材料の取り込み及び発現は証明することができ、外来ＤＮＡの発現は発達期間を通じて安定である。外来ＤＮＡを幹細胞に挿入するためのレトロウイルス及びその他のベクターは、当業者は使用可能である（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｚｈａｎｇ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。レトロウイルスベクターを使用して形質導入を行うと、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現は最終分化した筋細胞、内皮細胞及び単離ＭＡＰＣに由来するｃ−Ｋｉｔ陽性細胞でも持続し、ＭＡＰＣに導入されたレトロウイルスベクターの発現が分化期間にわたって持続することを示した。前もってレトロウイルスベクターを形質導入し、初期のＭＡＰＣ培養期間の数週間で選別した約１０個のｅＧＦＰ陽性細胞から開始した培養物から最終分化を誘導した。
【０１５７】
ＭＡＰＣ又はその子孫細胞の投与後の対象のモニタリング
移植後、投与したＭＡＰＣ又は子孫細胞の増殖又は分化又はＭＡＰＣ又は子孫細胞の治療効果をモニターすることができる。例えば、血液、糖、血糖及び／又は血中インスリンをモニターすることができる。
【０１５８】
投与後、対象のＭＡＰＣ又は子孫細胞に対する免疫耐性を、当該技術分野で既知の種々の方法で試験し、対象のＭＡＰＣに対する免疫耐性を評価することができる。対象のＭＡＰＣに対する耐性が最適状態に及ばない場合（例えば、対象の免疫系が外来ＭＡＰＣを拒絶する場合）、当該技術分野で既知の免疫抑制のための治療的補助剤を対象に投与することができる。
【０１５９】
遺伝子改変ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞
ＭＡＰＣ又はそこから分化した子孫細胞はｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝的に変化させ、遺伝子治療で最も重大な障壁の一つを除去することができる。例えば、対象の骨髄穿刺液を入手し、その穿刺液からＭＡＰＣを単離する。その後、ＭＡＰＣを遺伝的に変化させ、１つ以上の所望の遺伝子産物を発現させる（例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン又は膵臓が産生する消化酵素をコードする種々の遺伝子の何れかを含むがこれらに限定されない膵臓遺伝子）。その後、ＭＡＰＣをｅｘ  ｖｉｖｏでスクリーニング又は選択して、変化が成功した細胞を同定し、局所投与又は全身投与の何れかで、これらの細胞を対象に導入するか、分化させてから対象に導入することができる。或いは、ＭＡＰＣを分化させてから、その分化細胞を遺伝的に変化させて投与することができる。何れの場合も、細胞は、所望の遺伝子産物を発現することのできる安定にトランスフェクトされた細胞の供給源を提供する。特に、患者自身の組織、例えば骨髄はＭＡＰＣの供給源であり、この方法は移植用の細胞を産生する免疫学的に安定した方法を提供する。
【０１６０】
ＭＡＰＣ又は分化した子孫細胞の遺伝学的変更方法
本明細書に記載の方法によって単離された細胞又はその分化した子孫細胞は、当業者が使用可能な種々の方法を使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に導入することにより遺伝的に改変することができる。これらの方法は一般的に４つに大別される。（１）例えばレンチウイルス（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓａｌｍｏｎｓ，Ｂ．ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｕｒｇ，Ｗ．Ｈ．，１９９３；Ｓｕｔｔｏｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋａｆｒｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｄｕｌｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗｏｌｄ，Ｗ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９９８），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ．；Ｍｏｌｉｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照）、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスを含めた、アルファウイルス（米国特許第５，８４３，７２３号；Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｆｒｏｌｏｖ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ヘルペスウイルス（Ｌａｑｕｅｒｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）及びウシパピローマウイルスを含めたレトロウイルス等のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター；（２）リン酸カルシウムトランスフェクション及びＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法を含めた化学的移入；（３）リポソーム（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，Ｊ．，１９９３）、赤血球ゴースト及び原形質等のＤＮＡ負荷膜小胞体を使用した膜融合による移入；及び（４）マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル  Ｊ．Ｗｏｌｆｆ  ｉｎ  “Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”  （１９９４）  ａｔ  ｐａｇｅ  １９５（Ｊ．Ｗｏｌｆｆ  ｉｎ  “Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”  （１９９４）  ａｔ  ｐａｇｅ  １９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０を参照）、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション又は直接の「裸」ＤＮＡの移入等の物理的移入技術である。
【０１６１】
細胞は予め選択した単離ＤＮＡの挿入、細胞ゲノムのセグメントの予め選択した単離ＤＮＡによる置換、又は細胞の細胞ゲノムの少なくとも一部分の欠失又は不活化により、遺伝的に変化させることができる。細胞ゲノムの少なくとも一部分の欠失又は不活化は、例えば、遺伝子組換え、アンチセンス技術（ペプチド核酸又はＰＮＡの使用を含む）又はリボザイム技術等によって達成することができるが、これらに限定されない。１つ以上の予め選択したＤＮＡ配列の挿入は、相同組換え又は宿主細胞ゲノムへのウイルスの組み込みによって達成することができる。非相同組換えの方法も、例えば、非相同組換えの方法に関する全開示内容が本明細書で援用される、米国特許第６，６２３，９５８号、第６，６０２，６８６号、第６，５４１，２２１号、第６，５２４，８２４号、第６，５２４，８１８号、第６，４１０，２６６号、第６，３６１，９７２号に記載の通り既知である。
【０１６２】
所望の遺伝子配列は、プラスミド発現ベクター及び核局在配列の使用により、細胞内特に核内に組み込むことができる。ポリヌクレオチドを核に移入する方法は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）が報告しているように、シグナルペプチドをプラスミドＤＮＡに結合させ、ＤＮＡを核に移入してより効率的に発現させることができる。
【０１６３】
遺伝材料は、特定の化学物質／薬物を使用して所定の遺伝子を正又は負に誘導するか、任意の薬物／化学物質の投与後に除去することのできるプロモーターを使用することによって導入できるか、標識されて化学物質（タモキシフェン反応性変異エストロゲン受容体を含むがこれに限定されない）によって特定の細胞コンパートメント（細胞膜を含むがこれに限定されない）を誘導することができる。
【０１６４】
あらゆるトランスフェクション又は形質導入技術を応用して、転写調節配列をＭＡＰＣ又は子孫細胞に導入し、所望の内在遺伝子を活性化させることができる。これは、相同組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号）又は非相同組換え（例えば、米国特許第６，６０２，６８６号）の両方によって実現することができる。これらの特許は、内在遺伝子活性化の方法の教示に関して、参考として援用する。
【０１６５】
標的細胞のトランスフェクション又は形質導入が成功したかどうかは、当該技術分野で既知の技術における遺伝子マーカーを使用して確認することができる。例えば、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は、遺伝子改変した造血細胞の同定及び追跡に有効なマーカーであることが明らかにされている（Ｐｅｒｓｏｎｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。別に選択可能なマーカーには、β−Ｇａｌ遺伝子、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）神経成長因子受容体、薬物選択マーカー（ＮＥＯ、ＭＴＸ、ハイグロマイシンを含むがこれらに限定されない）が含まれる。
【０１６６】
タンパク質の形質導入
細胞膜を自由且つ迅速に通過することのできる小さなカチオン性ペプチドドメインであるタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に結合している場合、そのタンパク質は細胞へ直接移入することができる。ポリ−アルギニン（ポリ−アルギニン介在性タンパク質形質導入）及びＨＩＶ由来Ｔａｔ等の幾つかのＰＴＤが同定されてきており、融合タンパク質が効率よく細胞膜を通過できるようになった。タンパク質の形質導入の明白な利点とは、形質導入されたタンパク質が細胞内に一過性にしか存在しないという、発現したタンパク質の内因性代謝回転に左右されるという特性を有することである。又、形質導入されたタンパク質の細胞内濃度は、添加するタンパク質の量を変化させることによって制御することができる。
【０１６７】
ＭＡＰＣにおける膵臓前駆細胞の同定
ＭＡＰＣ並びにインスリン１陽性細胞から中間前駆細胞を同定するには、トランスジェニックマウス由来のＭＡＰＣ細胞系を、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３、Ｐａｘ４等の膵臓プロモーター及びインスリンプロモーターの制御下で、蛍光色素等のマーカーを発現するように操作することができ、種々の交雑を産生することができる（例えばＰＤＸ１−ＧＦＰ、Ｎｇｎ３−ＹＦＰ、Ｐａｘ４−ＲＦＰ及びＭＩＰ−ＧＦＰを有するマウス並びにＮｋｘ６．１−ＧＦＰ及びＰＤＸ−１×Ｎｇｎ３マウスの骨髄（ＢＭ）からＭＡＰＣを単離することができる）。クローン集団を単離し、その多能性、表現型、細胞遺伝及びβ細胞様細胞への分化（経時的によるＰｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｐａｘ４、Ｎｋｘ６．１及びインスリンの発現を評価）に関して試験することができる。これらの細胞株により、分化プロセスを追跡し、分化培養物から中間前駆細胞を選択することができる。
【実施例】
【０１６８】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態及び側面を明らかにし更に説明するために提供するもので、その適用範囲を制限するものとしてみなされるべきではない。
【０１６９】
（実施例１）
ＭＡＰＣからβ細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏでの分化
Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）が記載している通り、マウスＭＡＰＣ細胞系を、ｅＧＦＰトランスジェニックＣ５７Ｂ１／６  Ｔｈｙ１．１マウス骨髄から樹立した。ヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）１０ｎｇ／ｃｍ２をコーティングした皿（Ｎｕｎｃ）に、約５％二酸化酸素及び約５％酸素下で、６０％  ＤＭＥＭ−ＬＧ  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ），４０％  ＭＣＤＢ−２０１  （Ｓｉｇｍａ）に１ｘ  ＳＩＴＥ  （Ｓｉｇｍａ）、１ｘレノレイン酸ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ  アスコルビン酸２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  （Ｇｉｂｃｏ）、０．０５μＭ  デキサメタゾン、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ  ペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１０００Ｕ  ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１０００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ  （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ｍＥＧＦ  （Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ｈＰＤＧＦ−ＢＢ  （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、２％ウシ胎児血清  （ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を入れ、そこでＭＡＰＣを培養した。平板培養した細胞密度は約１００個／ｃｍ２で、細胞は２日毎に分割した。
【０１７０】
約０．０３−１×１０６個の５％酸素下で培養したｅＧＦＰ  Ｃ５７／Ｂ１／６低酸素ＭＡＰＣを、２７５ｃＧｙの照射の後、６〜８週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ｎ＝２８）に尾静脈注射により移植した。抗ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１抗体（Ｗａｋｏ）（ストック溶液２０μＬをＰＢＳ１ｘ３８０μＬで希釈）の腹腔内注射を、前日、１０日目及び２０日目に実施して、ＮＫ活性を抑えた。
【０１７１】
注入後（５〜２０週間後）、定期的に末梢血（ＰＢ）内の造血細胞の再構築を評価した後、動物を屠殺した。屠殺した全ての動物で、血液、ＢＭ及び脾臓にｅＧＦＰ造血細胞が存在するかどうかを評価し、小腸、膵臓、肝臓、肺、皮膚、骨格筋肉及び脳を回収して、脾臓造血系系統へのＭＡＰＣ由来細胞の寄与を確認した。
【０１７２】
図１０に記載の通り、動物２８例中２１例で、ＭＡＰＣに由来する造血作用の徴候が認められた。生着を示さなかった残る７例は、Ｏｃｔ−４が低レベル（＜１％  ｍＥＳＣ）のＭＡＰＣを移植されていたのに対し、その他の動物は全てＯｃｔ４  ｍＲＮＡのレベルがｍＥＳＣ  ３０〜８０％であるＭＡＰＣを移植されていた。リンパ造血組織の解析により、多系統にわたる生着が明らかになった（図１０）。ＰＢ、ＢＭ、脾臓及び胸腺のＦＡＣＳ解析により、全ての骨髄細胞、Ｔ細胞、β細胞及びＮＫ細胞を含めた多系統にわたる生着が認められる。ｅＧＦＰで選別した脾臓ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞は、混合リンパ球反応培養物及び抗ＣＤ３＋  抗ＣＤ２８  ｍＡｂによる刺激に対して反応することができた（図示せず）。又、ＧＦＰ陽性細胞の〜１％がＳｃａ１＋ｃＫｉｔ又はＴｈｙ１＋ｃＫｉｔを発現し、ＭＡＰＣから造血幹細胞（ＨＳＣ）が産生されていることが示唆され、これはｅＧＦＰ＋  ＣＦＵ−Ｍｉｘ及びＢＦＵ−Ｅが培養されうるという事実及び、一次レシピエント由来のＢＭが致死線量の照射を受けた二次レシピエントの造血系を再構築する能力と矛盾するものではなかった。
【０１７３】
肺、膵臓、心臓、肝臓及び小腸といった他の臓器にも、ＭＡＰＣ由来の子孫細胞が存在するかどうかを解析した。高レベルの分化が消化管に認められ、消化管上皮の形態学的及び表現型的特徴を有する細胞へ分化していた。興味深いことに、陰窩の下部３〜４細胞を除く全てで生着が認められ、これは消化管幹細胞コンパートメントへの生着と一致していた。この所見は動物１２例中２例に認められ、何れも約５〜６週目で極めて重症となったが、抗生剤の投与で回復した。この２例の動物を１３週目で屠殺した。その他の１０例では、消化管上皮への生着は認められなかった。その他の臓器については、低レベルの生着が主として間葉コンパートメントに認められた。心臓では２００〜３００個のＧＦＰ＋心筋トロポニン陽性細胞が検出された。
【０１７４】
ＭＡＰＣの移植後に、膵臓におけるインスリン及びＧＦＰを免疫蛍光測定法で測定し、ＧＦＰを免疫組織化学的方法で測定した。まず、膵臓におけるＧＦＰに対する免疫組織化学的試験を下記のように実施した。膵臓をＰＢＳ中の１０％中性緩衝ホルマリンで、４℃で２４時間固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、試料をパラフィン包埋した。６ミクロンの切片を切り出し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライドに乗せた。標準的な脱ろう及び再水和の後、切片を蒸留水で５分間洗浄するのを３回繰り返した。家庭用炊飯器を使用して０．０１Ｍ  クエン酸緩衝液ｐＨ６．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２０分間蒸した後、２０分間の冷却期間を設けることによって抗原を回収した。蒸留水で迅速に洗い流した後、切片をＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間浸透させた。内在性ペルオキシダーゼは、蒸留水に１．８％  Ｈ２Ｏ２を添加して５分間培養した後に、水道水の流水で５分間洗浄して、蒸留水に２．５％過ヨウ素酸（Ｓｉｇｍａ）を添加して５分間と連続的に培養することによって遮断した。水道水の流水で５分間洗浄した後、スライドを蒸留水に０．０２％水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加して２分間培養した。５分間水道水の流水で洗浄した後、内在性ビオチンを、アビジン及びビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用した１回１５分間の連続的培養の間に、ＰＢＳ＋０．０５Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄する時間を設けて遮断した。ビオチンとの培養の後、切片をＰＢＳ＋０．０５Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄した。非特異的結合部位は、ＰＢＳ中の０．４％魚の皮ゼラチンと共に３０分間培養して遮断した。遮断緩衝液を除去し、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％ＢＳＡで希釈した一次抗体を切片に添加し、一晩４℃で培養した。Ａｂｃａｍ  （ａｂ６５５６）からウサギ抗ＧＦＰを購入し、０．６７μｇ／ｍＬで使用した。翌朝、スライドをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した。ビオチン化した抗ウサギＦ（ａｂ’）２抗体をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１５００倍に希釈し、切片に添加して、３０分間培養した。スライドをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した。製造者の指示に従って調製したＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を切片に添加し、３０分間培養した。スライドをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した。製造者の指示に従って、ＤＡＢ＋（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して着色を行った。標準的なヘマトキシリン対比染色、脱水及びマウントを行い、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２に装着したＮｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘ  ４５００デジタルカメラで写真を撮影した。
【０１７５】
ＧＦＰ＋の島細胞は、単回の染色実験において２例の動物に認められた。
【０１７６】
次に、ＭＡＰＣの移植後に、膵臓におけるインスリン及びＧＦＰを免疫蛍光測定法で下記の通り測定した。膵臓をＰＢＳ中の１０％中性緩衝ホルマリンで、４℃で２４時間固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、試料をパラフィン包埋した。６ミクロンの切片を切り出し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライドに乗せた。標準的な脱ろう及び再水和の後、切片を蒸留水で５分間洗浄するのを３回繰り返した。家庭用炊飯器を使用して０．０１Ｍ  クエン酸緩衝液ｐＨ６．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２０分間蒸した後、２０分間の冷却期間を設けることによって抗原を回収した。蒸留水で迅速に洗い流した後、切片をＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間浸透させた。非特異的結合部位は、ＰＢＳ中の０．４％魚の皮ゼラチンと共に３０分間培養して遮断した。遮断緩衝液を除去し、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％ＢＳＡで希釈した一次抗体を切片に添加し、一晩４℃で培養した。モルモット抗インスリンをＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ａ０５６４）から購入し、２１．２５μｇ／ｍＬで使用した。ウサギ抗ＧＦＰはＡｂｃａｍ  （ａｂ６５５６）から購入し、２μｇ／ｍＬで使用した。翌朝、スライドをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した。１：１０００でＴＯ−ＰＲＯ−３−ｉｏｄｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＰＢＳでそれぞれ１２５倍及び４５０倍に希釈したシアニン−２標識抗モルモット及びシアニン−３標識抗ウサギＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に切片を３０分間培養した。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した後、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してスライドをマウントした。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ２に装着したＢｉｏＲａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２１００で共焦点レーザー顕微鏡写真を撮影した。
【０１７７】
未分化状態のＧＦＰ＋ＭＡＰＣを移植した少なくとも２例のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて、ＧＦＰ＋／インスリン＋島細胞が膵臓内で検出された（図１１）。
【０１７８】
（実施例２）
げっ歯類ＭＡＰＣのβ細胞前駆体及びβ細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化
内分泌膵臓系統へのＭＡＰＣの拘束
低酸素、高Ｏｃｔ−４（図２；一実施形態において、高Ｏｃｔ−４はラット胚性幹細胞又は万能ｍＲＮＡ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍＲＮＡ）で認められるそれの約５〜２５％であり、低Ｏｃｔ−４は一般的に約４桁少ない）を発現するマウスＭＡＰＣ及びラットＭＡＰＣ（本明細書に記載の通り単離し培養）を使用して、内胚葉→膵臓→内分泌膵臓→β細胞拘束及び分化において役割を果たすことが既知である転写因子は、インスリン１ｍＲＮＡを発現する最終分化細胞集団を回収できる正しい配列において活性化することができることが明らかになった。例えば、ＭＡＰＣを誘導してβ細胞の転写プログラムを発現させ、転写因子（ＴＦ）Ｈｎｆ３β、Ｈｎｆ６、Ｐｄｘ−１、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｐａｘ４、Ｎｋｘ６１並びにインスリン−１、インスリン−２、グルカゴン及びソマトスタチンｍＲＮＡ、アクチビン−Ａ及びＢＭＰ４  ｄ０−９と培養する場合は、抗ＳＨＨ  ｄ３−ｄ９、ＥＧＦ  ｄ９−１５；ニコチンアミド（又はエキセンディン  ４）、βセルリン及びＧＤＦ１１  ｄ１５−２１を連続的に発現した。
【０１７９】
げっ歯類ＭＡＰＣの拡大及び分化用培地（本明細書の下に記載する因子を追加）について表２に記載する。
【０１８０】
（表２）
【０１８１】
【表２】
2009511061.tif 000004
又、培養皿／フラスコは室温で１時間かけて１０ｎｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングした。
【０１８２】
サイトカインが介在する分化
サイトカインが介在する分化が、内胚葉、前腸、膵臓及び内分泌膵臓の指定及び分化において役割を果たすことが既知である種々のサイトカイン又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素の作用を多因子解析することによって達成された。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲを使用して、未分化のラットＭＡＰＣが著明なレベルのＰｄｘ−１、Ｎｇｎ３、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｋｘ６．１、Ｉｎｓ−１及びＩｎｓ−２（３５周期未満）の転写産物を発現せず、低レベルのＨｎｇ１、Ｈｎｆ３β（３０〜３５周期）の転写産物を発現し、検出可能なレベルのＮｋｘ２．２及びＧｌｕｔ２（３０周期未満）の転写産物を発現することを明らかにした。
【０１８３】
本明細書に記載のＱ−ＲＴ−ＰＣＲ反応での、一次配列を表３〜５に示し、以下のプロトコールを使用した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；米国カリフォルニア州ヴァレンシア）を使用してＲＮＡを細胞から抽出した後、ＤＮＡ−ＦｒｅｅＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ［米国テキサス州オースチン］）を使用してＤＮａｓｅ処理を行った。ＲＮＡをＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ［米国カリフォルニア州フォスターシティ］；手順１（培養）：２５℃、１０分間、手順２（ＲＴ）：４８℃、３０分間、手順３（ＲＴ不活化）：９５℃、１０分間）を使用して逆転写した。反応混合物を表６に示す。
【０１８４】
【表３−１】
2009511061.tif 000005
【０１８５】
【表３−２】
2009511061.tif 000006
【０１８６】
【表４】
2009511061.tif 000007
【０１８７】
【表５−１】
2009511061.tif 000008
【０１８８】
【表５−２】
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【０１８９】
【表５−３】
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【０１９０】
【表５−４】
2009511061.tif 000011
（表６）
【０１９１】
【表６】
2009511061.tif 000012
逆転写の後、定量的実時間ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を下記の通り実施した。手順１：５０℃で２分間（培養）；手順２：９５℃で１０分間（Ｔａｑ活性化）；手順３：９５℃で１５秒間（変性）、６０℃で１分間（伸長）、これを４０サイクル繰り返し；手順４：９５℃で１５秒間（解離）；手順５：６０℃で２０秒間（融解曲線）；手順６：９５℃で１５秒間。表７はＱ−ＲＴ−ＰＣＲ用の反応混合物を提供する。
【０１９２】
（表７）
【０１９３】
【表７】
2009511061.tif 000013
試験の前半で測定したのは、単独又は２又は３種類の組み合わせ及び種々の時系列での、細胞密度（約１０４〜１０５個／ｃｍ２）、ＥＣＭ構成要素（フィブロネクチン、コラーゲン、マトリゲル）及び種々の濃度（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）のｂＦＧＦ（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、アクチビンＡ（例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ）、レチノイン酸（約１０−６Ｍ）、ＥＧＦ（例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ１０（例えば約５０〜約１５０ｎｇ／ｍＬであって約１００ｎｇ／ｍＬを含む）、ＨＧＦ（例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＦ１１（例えば約５０〜約１５０ｎｇ／ｍＬ）、シクロパミン（例えば約１０μＭ）、抗ＳＨＨ抗体（例えば約１０μｇ／ｍＬ）、ニコチンアミド（例えば５μＭ〜約５０μＭであって約１０μＭを含む）、エキセンディン４（約５ｎＭ〜約５０ｎＭであって、約１０ｎＭを含む）、ベータセルリン（約５０〜約１５０ｎｇ／ｍＬ）の転写因子インスリン、グルカゴン及びソマトスタチン発現レベルの誘導への作用を、６、１２及び１８日後にＱ−ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した。
【０１９４】
アクチビンＡ、ＢＭＰ４及びシクロパミンの組み合わせ又は抗ＳＨＨ抗体は、Ｐｄｘ−１ｍＲＮＡの誘導を最も促進した（１００倍超）。ＰＤＸ−１ｍＲＮＡの増加が最大になったのは、細胞をマトリゲル上に約５０，０００個／ｃｍ２で平板培養した場合であった。但し、細胞を６日超維持すると、ＭＡＰＣ由来細胞は死滅するようであった。
【０１９５】
更なる増殖及び膵臓に拘束された細胞の成熟した内分泌膵臓への分化において役割を果たすと考えられている、ＥＧＦ（例えば約５０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（例えば約５０ｎｇ／ｍＬ）及びＦＧＦ１０（例えば約１００ｎｇ／ｍＬ）等の因子を単独又は組み合わせて更に添加して試験した。これらの試験により、細胞の生存率はアクチビンＡ、ＢＭＰ４及びシクロパミン又は抗ＳＨＨ抗体を６日目後に除去して、ＥＧＦ又はＨＧＦの存在下（ＦＧＦ１０は不可）で維持した場合に極めて良好となることが明らかになった。ＥＧＦ、ＨＧＦ及び／又はＦＧＦ１０の組み合わせによって相加効果は認められなかった。しかし、培養物をＥＧＦで維持した場合、細胞は１２日目を超えると死滅するようであった。１０μＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ［米国ミズーリ州セントルイス］）及び１０ｎＭのエキセンディン４（Ｓｉｇｍａ［米国ミズーリ州セントルイス］）を１２日目後に添加したところ細胞の生存率は良好となり、１８日目までにインスリン−１ｍＲＮＡが更に２〜４倍増加する程度まで内分泌膵臓への分化が更に進んだ。ＧＤＦ１１を添加した場合、Ｉｎｓ１及びＩｎｓ２ｍＲＮＡレベルの更なる上昇が認められた。更なる至適化は、βセルリン（５０ｎｇ／ｍＬ）の添加等、分化の経過における種々の手順の長さを調節することによって得られた。２０％酸素下でエキセンディン４（又はニコチンアミド）、ＧＤＦ１１及びベータセルリンと共に分化させると、膵臓の１〜３％のレベルでインスリン１ｍＲＮＡが回収された。ＭＡＰＣを膵臓細胞に分化させる図式を図３に示す。
【０１９６】
この分化図式によれば、分化は１５〜１８日目まで延長した。１８日目に、プレートの底に接着した細胞から細胞のクラスターが分離した（図４）。この培養物における転写因子及びホルモンｍＲＮＡの発現及び、１８日目からは「マトリックスフィーダー層」上のクラスターにおける転写因子及びホルモンｍＲＮＡの発現を図５に要約する。
【０１９７】
これらの試験は、３日目からＨｎｆ３α、Ｈｎｆ６、Ｈｎｆ１αｍＲＮＡの発現が早期から一貫して亢進することを示すものである。Ｐｄｘ−１  ｍＲＮＡは３日目から増加し始め、発現量は２１日目まで増加する。Ｎｇｎ転写産物は３日目に検出されたが、１２〜１８日目には更に１０，０００倍超増加した。その下流の標的であるＮｅｕｒｏ−Ｄは６日目から著明に増加した。Ｎｋｘ２．２、インスリン−１及び２  ｍＲＮＡの著明な増加が１５日目から認められた。培養物の上清から１８日目及び２１日目に回収したクラスターは、ラット膵臓の合計量の〜１％のインスリン−１ｍＲＮＡを、ラット膵臓の合計量の〜１％のインスリン−２ｍＲＮＡを、ラット膵臓の合計量の〜０．５％のグルカゴンｍＲＮＡ（図示せず）を発現した。高レベルのＮｇｎ３及びＮｅｕｒｏ−Ｄ  ｍＲＮＡは依然として検出され、クラスター内の細胞は種々の分化手順にあることを示唆した。予期しないことに、幾つかの転写因子（Ｎｇｎ３及びＮｅｕｒｏ−Ｄ及びそれほどでないにせよＨＮＦ３β及びＨＮＦ６）のレベルは１２日目及び／又は１８日目に急激に減少するようであり、その後レベルは再び増加した。これは、培養物にどのようにして養分を与えたかを反映するものであると思われる。即ち培地の半分の交換は３日目、６日目、１２日目、１８日目及び２１日目に行い、培地全ての交換を９日目及び１５日目に行い、その時にサイトカインの混合物も同時に交換している。このため、全培地の交換のため、培養系それ自体に分泌されていたサイトカイン又は急激に切り替わったサイトカインが原因であるとも考えられる。
【０１９８】
１８日目、２１日目及び２４日目に、接着した細胞の「マトリックス」層の内胚葉及び中胚葉の特徴を調べた。Ｈｎｆのレベルはフィーダー上のクラスターで検出されたものと著明な差はなく、検出された。但し、接着層におけるＰｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ、Ｉｎｓ１及びＩｎｓ２のｍＲＮＡのレベルは、非接着のクラスターで測定されたものの１／１０００〜１／１０，０００であった。又、マトリックス層には、多数の内皮遺伝子（Ｆｌｋ１、Ｆｌｔ１、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びｖＷＦ）及び平滑筋遺伝子（ＳＭ２２及びαＳＭＡ）の転写産物が容易に検出された。内皮が存在するということは、膵臓（及び肝臓）の発育は内皮の存在によって左右される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌａｍｍｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）という著明な数のエビデンスに照らし合わせると有益である。
【０１９９】
内分泌膵臓の転写産物とは別に、アミラーゼを含めた低レベルの外分泌膵臓転写産物も検出された。これらのレベルは、新鮮膵臓組織のそれの１／１０７〜１／１０８に過ぎなかった（データは示さず）。更に、他の内胚葉遺伝子、特にＡＦＰ及びアルブミンを含めた肝臓細胞関連遺伝子も膵臓分化を目的とした培養物に発現し、分化条件が膵臓に１００％特異的であるわけではないことを示した。
【０２００】
タンパク質レベルにおける内分泌膵臓マーカーの発現を評価した。培養ラットＭＡＰＣの膵臓分化条件下（アクチビン−Ａ及びＢＭＰ４  ０日目〜９日目、抗ＳＨＨ  ３日目〜９日目、ＥＧＦ  ９日目〜１５日目；ニコチンアミド、ベータセルリン、エキセンディン４及び／又はＧＤＦ１１  １５日目〜２５日目）における培養から２１日間の免疫組織学的検査を実施した。マトリックスフィーダー層から分離した細胞のクラスターに対して、グルカゴン、ｃ−ペプチド及びＰｄｘ−１の存在を調べるため染色を実施した。図６に示す通り、細胞の１０〜２０％がＰｄｘ−１に対して一般的な核パターンで陽性染色され、クラスター内の細胞の１〜２％がｃ−ペプチドに対して一般的な顆粒パターンで陽性染色され、その全てがＰｄｘ−１陽性でもあり、細胞の５〜１０％がグルカゴンに対して陽性染色され、これは細胞質にのみ認められた。対照としてのラットインスリノーマ（ＲＩＮ）細胞はインスリン及びグルカゴンに対して染色された。
【０２０１】
５％酸素又は２０％酸素下で実施した分化の作用も試験した。２０％酸素下での分化のほうが高レベルのインスリン−１を回収できることが明らかになった。
【０２０２】
転写因子の形質導入及び任意にサイトカインが介在する分化
近年の発表により、ＥＳ細胞（Ｍｉｙａｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）又は成体組織（腸類上皮細胞；Ｙｏｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）における外来の膵臓系統転写因子Ｐｄｘ−１の発現又は、ＥＳ細胞（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｂｅｎｄａｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）又は成体組織（膵管細胞；Ｈｅｒｅｍａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）における外来の二次転写因子ニューロゲニン−３の発現は、これらの細胞でインスリンを上方調節することができることが明らかにされている。
【０２０３】
膵臓内胚葉の分化経路へと誘導したラットＭＡＰＣを、マウスＰｄｘ−１及びマウスＮｇｎ３  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルスベクターに形質導入する試験を実施した。ベクターはヘマグルチニンで標識したマウスニューロゲニン３（Ａｄ−Ｎｇｎ３）又はマウス膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（Ａｄ−Ｐｄｘ１）又は励起した緑色蛍光タンパク質（Ａｄ−ＧＦＰ）をコードする配列を含有し、全てがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で構成的に発現した（Ｈｅｒｅｍａｎｓ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。又、Ｎｇｎ３をコードするアデノウイルスも、別個のＣＭＶプロモーターの下流にｅＧＦＰ  ｃＤＮＡを含有した（Ａｄ−Ｎｇｎ３−ＧＦＰ）。Ｈｅ  Ｔ−Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８が記載した標準的なプロトコールに従って、遺伝子組換え複製欠失アデノウイルスを増幅した。
【０２０４】
形質導入は、０日目、最初にアクチビン、ＢＭＰ４及び抗ＳＨＨ抗体で処理を行った後の６日目又は最初にアクチビン、ＢＭＰ４及び抗ＳＨＨ抗体で処理を行い、その後６日間ＥＧＦで処理した１２日目に実施した。培養細胞のアデノウイルス感染を、１２ウェルマルチウェルプレートで実施した。細胞をリン酸緩衝生食水（ＰＢＳ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で２回洗浄した。１ウェルの培養細胞をトリプシン処理し、細胞数を決定するのに使用した。単一感染実験、即ちＡｄ−ＧＦＰ、Ａｄ−Ｐｄｘ１又はＡｄ−Ｎｇｎ３−ＧＦＰでは、１ｇ／Ｌグルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含有する低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、感染効率（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）２５００までウイルスを希釈した（細胞あたり２５００個の感染ウイルス粒子）。二重感染実験、即ちＡｄＰｄｘ１＋ＡｄＮｇｎ３ＧＦＰでは、何れのウイルスもＭＯＩ１２５０まで希釈した。陰性対照はウイルスを含有しないＤＭＥＭとした。最終のＰＢＳによる洗浄後、ＰＢＳを細胞から除去し、ウイルス懸濁液０．３５ｍＬをウェル毎に添加して、細胞を加湿大気（２１％酸素）中で、３７℃、７．５％二酸化炭素で培養した。２時間後、ウイルス懸濁液を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、更に、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した６０％低グルコースＤＭＥＭ、４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ）において、加湿大気（２１％酸素）中で、３７℃、７．５％二酸化炭素で培養した。形質導入後、細胞をサイトカインの不在下又はエキセンディン、ニコチンアミド及び／又はＧＤＦ１１の存在下で３日間維持した。
【０２０５】
アデノウイルスベクターを形質導入した後、マウスＰｄｘ−１及びＮｇｎ３  ｍＲＮＡのレベルは、成熟マウス膵臓で検出されるレベルと同等（Ｐｄｘ−１）又は著明に高かった（Ｎｇｎ３）。両方のアデノウイルス（Ａｄ−Ｐｄｘ１及びＡｄ−Ｎｇｎ３、それぞれＭＯＩ１：１２５０）を形質導入した培養細胞を、Ｐｄｘ−１及びＮｅｕｒｏＤ１に対する抗体で染色すると、殆どの細胞が陽性染色された。
【０２０６】
０日目の形質導入では、Ｐｄｘ−１及びＮｇｎ３の下流にあると考えられていたＮｅｕｒｏＤ１等の転写産物に変化は全く認められなかった。低レベルの内在性Ｐｄｘ−１が存在していた６日目の形質導入では、ＮｅｕｒｏＤ１及びＩｎｓ１の発現の若干の亢進が認められた。１２日目にラットＭＡＰＣにＡｄ−Ｐｄｘ１を単独で形質導入すると、ＮｅｕｒｏＤ１の発現が＜１００倍亢進し、Ｉｎｓ１及びソマトスタチンｍＲＮＡレベルにも僅かな作用が認められた。１２日目にラットＭＡＰＣにＡｄ−Ｎｇｎ３を単独で形質導入すると、ＮｅｕｒｏＤ１  ｍＲＮＡの発現が１０，０００倍超亢進し、ソマトスタチンｍＲＮＡの１００，０００倍の増加及びインスリン−１及びグルカゴンｍＲＮＡの僅かな増加が認められた。
【０２０７】
１２日目にラットＭＡＰＣにＡｄ−Ｐｄｘ−１及びＡｄ−Ｎｇｎ３の組み合わせを形質導入すると、ラットＰｄｘ−１  ｍＲＮＡが１０倍、ＮｅｕｒｏＤ１  ｍＲＮＡが５０倍、Ｐａｘ−４  ｍＲＮＡが１００倍に増加すると共に、Ｉｎｓ１が１０，０００倍超、ソマトスタチンｍＲＮＡが３，０００倍増加し、アミラーゼｍＲＮＡは検出されなかった。Ｈｎｆ３β及びＨｎｆ６等の早期内胚葉の転写因子のレベルは、アデノウイルスの形質導入にって著明に影響を受けず、Ｐａｘ６及びＮｋｘ６．１等の他の内分泌膵臓転写因子はわずかに影響を受けたのみであった。
【０２０８】
これらの試験により、Ｎｇｎ３単独の過剰発現がＮｅｕｒｏＤ１及びソマトスタチンのレベルを上昇させても、インスリン−１ｍＲＮＡには僅かな影響しか認められないことが明らかになった。但し、Ｎｇｎ３とＰｄｘ−１の組み合わせは、ＮｅｕｒｏＤ１の発現を誘発するだけでなく、インスリン１の発現も誘発し、２個のインスリン１エンハンサー調節因子であるＮｅｕｒｏＤ１及びＰｄｘ１の両方が高レベルで存在する場合、インスリンのプロモーターは最大限活性化するという所見と一致した。
【０２０９】
培養細胞中のＰｄｘ−１、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ１及びインスリンに関する免疫組織化学的検査を下記の通り実施した。細胞をＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）で固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞に１５分間、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を浸透させた。内在性ペルオキシダーゼを、メタノール（Ｓｉｇｍａ）中の３％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）における３０分間の培養によって遮断した。蒸留水で２分間洗浄した後、内在性ビオチンを、アビジン及びビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用した１回１５分間の連続的培養の間に、ＰＢＳ＋０．０５Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄する時間を設けて遮断した。ビオチンとの培養の後、切片をＰＢＳ＋０．０５Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄した。非特異的結合部位は、ＰＢＳ中の０．４％魚の皮ゼラチンと共に３０分間培養して遮断した。遮断緩衝液を除去し、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で希釈した一次抗体を細胞に添加し、一晩４℃で培養した。Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮａｓｈｖｉｌｌｅのＣ．Ｗｒｉｇｈｔ氏から寄贈されたウサギ抗ＧＦＰを、１：２０００で使用した。Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  （ＡＢ５６８６）からウサギ抗ＮｅｕｒｏＤ１を購入し、０．６７μｇ／ｍＬで使用した。モルモット抗インスリン（Ａ０５６４）をＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎから購入し、２１．２５μｇ／ｍＬで使用した。ウサギ及びモルモットアイソタイプ対照をＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、それぞれの一次抗体と同じ最終濃度で使用した。翌朝、スライドをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した。ビオチン化した抗ウサギ又は抗モルモットＦ（ａｂ’）２抗体をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１５００倍に希釈し、細胞に添加して、３０分間培養した。細胞をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した。製造者の指示に従って調製したＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を細胞に添加し、３０分間培養した。細胞をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄するのを３回繰り返した。製造者の指示に従って、ＤＡＢ＋（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して着色を行った。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２に装着したＮｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘ  ４５００デジタルカメラで写真を撮影した。
【０２１０】
パラフィン包埋した懸濁細胞液中のＣ−ペプチドに関する免疫組織化学的検査を下記の通り実施した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の１０％中性緩衝ホルマリン１０分間で固定した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中のパラフィン包埋した２％Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  Ｌｏｗ  Ｇｅｌｌｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅアガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）で細胞を捕捉した。６ミクロンの切片を切り出し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔＰｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に乗せた。標準的な脱ろう及び再水和の後、培養細胞におけるＰｄｘ−１、Ｎｅｕｒｏ−Ｄ１及びインスリンの免疫組織化学的検査について上述した通りに染色及び写真撮影を行った。ウサギ抗Ｃ−ペプチド（ａｂ１０４３）はＢｅｔａ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから入手し、１：２０００で使用した。
【０２１１】
インスリン及びＣ−ペプチドを、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）及びＲａｔ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｗａｋｏ）を使用してＥＬＩＳＡで測定した。例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ４及び抗ＳＨＨ抗体と共に６日間分化させ、その後ＥＧＦと共に６日間分化させたラットＦｉｓｈｅｒ  ＭＡＰＣを、Ａｄ−Ｐｄｘ１及びＡｄ−Ｎｇｎ３（何れもＭＯＩ１２５０）に感染させた。感染から３日後、上清を回収してインスリン及びＣ−ペプチドの基底レベルを測定した。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭグルコース７５０μＬと共に培養した。１時間後、これらの細胞の上清中のインスリン及びＣ−ペプチドのレベルを測定した。これらの細胞からＲＮＡ試料も回収し、インスリン及びその他の膵臓マーカーの発現を評価した。表８はＣペプチド分泌に関する結果の要約である。連続的なサイトカイン添加及びＰｄｘ−１及びＮｇｎ−３のアデノウイルスベクターによる形質導入を行い産生された細胞は、２０ｍＭのグルコースに反応してＣペプチドを分泌する。
【０２１２】
（表８）
内分泌膵臓に分化したＭＡＰＣによるＣペプチドの分泌
【０２１３】
【表８】
2009511061.tif 000014
（ＭＡＰＣを均質に平板培養し、アクチビン、ＢＭＰ４及び抗ＳＨＨ抗体で順番に処理し（１〜６日目）、ＥＧＦと処理した（６〜１２日目）。１２日目、細胞にＡｄ−Ｐｄｘ−１及びＡｄ−Ｎｇｎ３を形質導入し、基底培地（ＦＣＳ２％）で３日間維持するか、エキセンディン及びニコチンアミド及びＧＤＦ１１と共に、或いはＧＤＦ１１は除いて維持した。その後、細胞を０ｍＭ／ｍＬグルコース又は２０ｍＭ／ｍＬグルコースに１時間曝露し、培地を回収してＣペプチドを測定した。ラット特異的ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡを使用した結果をｎｇ／Ｌで示す。）
このデータは、連続的なサイトカイン添加及びＰｄｘ−１及びＮｇｎ−３のアデノウイルスベクターによる形質導入を行い産生された細胞が、２０ｍＭのグルコースに反応してＣペプチドを分泌することを示している。１ｆｍｏｌのＣ−ペプチドが０．００３３２５ｎｇのＣペプチドを含有すると仮定すれば、約１５０．９７ｆｍｏｌのＣペプチド／ウェル（０．６ｍＬの培地／ウェル）が検出された。このため、これらの試験は、Ｉｎｓ１  ｍＲＮＡ及びＰｄｘ１  ｍＲＮＡを発現させるように誘導したＭＡＰＣが、グルコースに反応してインスリンを分泌するという機能的β細胞の顕著な特性を有することを示している。
【０２１４】
非ウイルスベクターも使用した。例えば、ＰＤＸ１及びニューロゲニン３（ヒト又はラット）をコードするｃＤＮＡを、ＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の何れかから増幅した。該当遺伝子のオープンリーディングフレーム配列のみを増幅し、翻訳の亢進を開始するためのＫｏｚａｋ配列（ｃｃａｃｃＡＴＧ）を導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ（ａａｇｃｔｔ）及びＸｈｏＩ（ｃｔｃｇａｇ）用のフランキング領域の独自の制限酵素部位を組み込んで、ｃＤＮＡのクローニングを容易にするべくデザインされたプライマーを使用して、標準的な方法を使用してＰＣＲによる増幅を行った。表９は、これらのｃＤＮＡを産生するためのプライマーを示す。
【０２１５】
（表９）
【０２１６】
【表９】
2009511061.tif 000015
次に、増幅したｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで分解し、市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｖ８７０−２０）の相補部位へクローニングした。精製ベクターをＡｈｄＩ又はＢｇｌＩＩで線状化した後、細胞のトランスフェクションを行った。線状化したｃＤＮＡを化学的トランスフェクション法によりＭＡＰＣにトランスフェクトした。ハイグロマイシンを選択剤として含有する拡大用培地で細胞を増殖させた。
【０２１７】
非形質導入細胞におけるグルコースに反応したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣペプチドの分泌
高グルコースの影響下でのＭＡＰＣ子孫細胞によるインスリン産生量を測定した。インスリン１ｍＲＮＡを高レベルで発現した試料は、２０ｍＭグルコースの影響下で培地にてインスリンを分泌し、ＭＡＰＣが内分泌膵臓の特性を有する細胞に分化できることを更に示した。
【０２１８】
又、Ｃペプチドの分泌量を測定して、放出されたインスリンが、インスリンを含有する培地から吸収されたインスリンではないことを確認した（図７）。この評価では、４つの培養物を低グルコース（３ｎＭ）下で培養し、１６〜２４日目には１時間における一日パルス（ｄａｉｌｙ  ｐｕｌｓｅ  ｆｏｒ  １  ｈ）の１８ｎＭのグルコースを培養物に添加した後、上清を回収してｃ−ペプチドの産生量を測定した。これらの試験は、上述の条件下で培養したＭＡＰＣが、培養開始から１８日目から毎日ｃペプチドを分泌し、分泌量が最大となるのは２０日目〜２２日目であることを示した。
【０２１９】
インスリン及びＣペプチドをＥＬＩＳＡで測定した（Ｒａｊａｇｏｐａｌ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０２２０】
チャネル発現を評価するためのカルシウム画像化
膵臓β細胞は、糖レベルの上昇に反応してインスリンを分泌する。β細胞は、この機能に役立つ糖トランスポーター、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル及び電圧活性化（Ｌ型）カルシウムチャネルを備える。画像化及び全細胞パッチクランプ試験を使用して、幹細胞由来の膵臓β様細胞が、細胞外の糖の上昇（３〜３０ｍＭ）に反応するため同様のものを備えているかどうかを決定することができる。
【０２２１】
ＭＡＰＣ由来β細胞は、Ｋチャネル及びＬ型電圧活性化カルシウムチャネル（カルシウム画像化実験をカルシウムインジケーターＦｕｒａ−２  ｒｅｓｐｏｎｄを有する細胞で実施）を発現することが明らかになった。図８は、１個の細胞の反応を示す。同じ結果が同じクラスター内の別の１２個の細胞でも得られ、同じ方法で分化させた他の２個のクラスターでも得られた。このデータは、ＭＡＰＣ由来のβ細胞が制御条件下で開くＫチャネルを有することを示唆するものである。細胞外でＫ濃度が上昇すると脱分極が起こり、電圧活性化型カルシウムチャネルが開く。これらのチャネルは糖への反応において役割を果たし、β細胞によるインスリンの分泌にも役割を果たしていることが知られている。
【０２２２】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるβ細胞の機能的評価
ＭＡＰＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したβ細胞が成体マウスから単離したβ細胞と機能的に等価であるという証拠が、ＳＺＯで処理したヌードマウスの腎臓被膜下に移植した細胞から得られた。ストレプトゾトシン（２００〜２４０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈を介して単回静脈内注射することにより、マウスを糖尿病状態にした。糖尿病は２日間連続血糖値が＞４００ｍｇ／ｄＬであることにより確認した。レシピエントマウスに０．０１５ｍＬ／ｇのアベルチンを使用して麻酔をかけた。左腎又は右腎を側腹部切開から曝露し、腎臓の上極で腎臓切開を行い、腎臓実質から微細なガラスのプローブを使用して腎臓の下方の前外側へと腎臓被膜を分離することによってパウチを作製し、ＭＡＰＣ由来細胞を緩徐にこのパウチの中に入れた。細胞を全く入れなかったマウスを陰性対照とし、３００個の成体島細胞を移植したマウスを陽性対照とした（高血糖症が１日以内に回復）。
【０２２３】
糖尿病状態でマウスは長期間生存できないため、インスリンペレット（ＬｉｎＢｉｔ，ＬｉｎＳｈｉｎ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ  （Ｔｏｒｏｎｔｏ），Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を植え込んで、血糖値を約３００ｍｇ／ｄＬまで降下させた。３連続日で血糖値が＜２００ｍｇ／ｄＬとなったら、インスリンペレットを手順的に取り外す。或いは、ＭＡＰＣ由来β細胞を移植した反対側の腎臓の腎臓被膜下に島細胞を同系移植する。これにより、動物の血糖は正常になる。その後、ＭＡＰＣ由来のβ細胞／移植片の移植から約２、４又は６週間後に、島移植片を除去する。
【０２２４】
あるセットの移植において、２１日目のＭＡＰＣ由来子孫細胞を、ＳＺＯで処理した８例の動物の腎臓被膜下に移植した。動物は細胞移植の５日以上前からＳＺＯを投与されていた。全ての動物の血糖値は＞５００ｍｇ／ｄＬであった。−１日目、インスリンペレットを皮下に植え込んだ（インスリンペレットは動物の体重に応じて植え込んだ。最初は２０グラムに対し１ペレット、次に５グラム毎に１ペレットずつ追加）。０日目に、細胞を腎臓被膜下に移植した。４例の動物で、１００万個の懸濁クラスターを移植した（〜１０−２０，０００インスリン陽性細胞）。別の４例には、１００万個の懸濁クラスター（〜１０−２０，０００インスリン陽性細胞）及び１００万個の接着マトリックス細胞（内皮及び平滑筋マーカーを発現する細胞に富むが、内胚葉転写産物及びインスリン１転写産物は低レベル）の組み合わせを移植した。動物の血糖値を１〜２日毎に評価した。４週間後、インスリンペレットを除去し、動物を６〜７日間観察した。血糖値が２連続日＞６００ｍｇ／ｄＬであった動物を屠殺した。血糖値が４００ｍｇ／ｄＬ以下であった動物は６日間保持した後、移植を行った腎臓を摘出した。その後動物を更に３〜４日間維持して、血糖値を評価した。図式を図９に示す。
【０２２５】
図９に示す通り、上清の細胞のみを移植された動物１例は、インスリンペレットを除去した後もほぼ血糖値は正常であった（１００〜２００ｍｇ／ｄＬ）。腎臓を摘出すると、外科的な問題により横隔膜が損傷した。手術にて矯正したものの、動物は重症のままであり、餌を摂取しなかったため、腎臓摘出術後の血糖値は評価することができなかった。
【０２２６】
４例の動物中２例は、上清細胞と接着マトリックス細胞の組み合わせを移植され、血糖値はインスリンペレットの除去後は３５０〜４５０ｍｇ／ｄＬとなり、腎臓摘出術後に血糖値は＞６００ｍｇ／ｄＬまで上昇した。
【０２２７】
これらの試験は、動物８例中３例の腎臓に移植された細胞が、インスリンを分泌する細胞を含んでおり、それが血糖値を１５０〜４５０ｍｇ／ｄＬに維持したことを示唆している。
【０２２８】
（参考文献の目録）
【０２２９】
【数１】
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【０２３０】
【数２】
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【０２３１】
【数３】
2009511061.tif 000018
【０２３２】
【数４】
2009511061.tif 000019
【０２３３】
【数５】
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【０２３４】
【数６】
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【０２３５】
【数７】
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【０２３６】
【数８】
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全ての刊行物、特許及び特許出願を本明細書で援用する。上記の明細書で本発明を特定の好ましいその実施形態と関連付けて説明しており、多くの詳細を説明目的のために設定したが、当業者には本発明が追加の実施形態を可能にし、本明細書に記載の特定の詳細は本発明の基本的原則から離れることなく著明に変更することができることが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】図１は、特異的な転写因子の補体により調節される内胚葉の指定、前腸及び中腸内胚葉の指定及びその後の膵臓の指定を示す。
【図２Ａ】図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ａ）幾つかのクローンは、胚性幹細胞５〜４０％のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現する（酸素正常状態（２０％酸素）の条件下で単離したＭＡＰＣにおけるそれより１０００倍超高い）。図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ｂ）これをＯｃｔ−４タンパク質についてはＦＡＣＳで、Ｏｃｔ−４については細胞内染色＊で確認した。ＥＳ細胞に比べて、ＭＡＰＣはＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｆｂｘ１５、ＦｏｘＤ３、Ｅｇｓ１、Ｄｎｍｔ３１及びＥｃａｔ７をＥＳレベルで発現するが、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、Ｆｇｆ４、Ｕｔｆｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｃａｔ１及びＧＤＦ３は発現しない。低酸素由来マウスのＭＡＰＣは、Ｓｃａ１、Ｔｈｙ１、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＭＨＣ−クラスＩ及びＩＩ、ＣＤ４４陰性であるが、ｃＫｉｔ陽性である。マウスＭＡＰＣはＥＳＣと同等のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現するが、胚様体又は奇形腫を形成することはない（５×１０６個のＭＡＰＣをヌードマウス５匹の皮下に移植した）。酸素量が正常な条件下で単離したＭＡＰＣを引き続き５％酸素条件に切り替えた場合、転写又は細胞表面の表現型に変化は認められず、低酸素下での単離は、より原始的な細胞集団及び表現型がｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されない細胞集団を選択することができることが示唆される。
【図２Ｂ】図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ａ）幾つかのクローンは、胚性幹細胞５〜４０％のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現する（酸素正常状態（２０％酸素）の条件下で単離したＭＡＰＣにおけるそれより１０００倍超高い）。図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ｂ）これをＯｃｔ−４タンパク質についてはＦＡＣＳで、Ｏｃｔ−４については細胞内染色＊で確認した。ＥＳ細胞に比べて、ＭＡＰＣはＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｆｂｘ１５、ＦｏｘＤ３、Ｅｇｓ１、Ｄｎｍｔ３１及びＥｃａｔ７をＥＳレベルで発現するが、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、Ｆｇｆ４、Ｕｔｆｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｃａｔ１及びＧＤＦ３は発現しない。低酸素由来マウスのＭＡＰＣは、Ｓｃａ１、Ｔｈｙ１、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＭＨＣ−クラスＩ及びＩＩ、ＣＤ４４陰性であるが、ｃＫｉｔ陽性である。マウスＭＡＰＣはＥＳＣと同等のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現するが、胚様体又は奇形腫を形成することはない（５×１０６個のＭＡＰＣをヌードマウス５匹の皮下に移植した）。酸素量が正常な条件下で単離したＭＡＰＣを引き続き５％酸素条件に切り替えた場合、転写又は細胞表面の表現型に変化は認められず、低酸素下での単離は、より原始的な細胞集団及び表現型がｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されない細胞集団を選択することができることが示唆される。
【図２Ｃ】図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ａ）幾つかのクローンは、胚性幹細胞５〜４０％のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現する（酸素正常状態（２０％酸素）の条件下で単離したＭＡＰＣにおけるそれより１０００倍超高い）。図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ｂ）これをＯｃｔ−４タンパク質についてはＦＡＣＳで、Ｏｃｔ−４については細胞内染色＊で確認した。ＥＳ細胞に比べて、ＭＡＰＣはＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｆｂｘ１５、ＦｏｘＤ３、Ｅｇｓ１、Ｄｎｍｔ３１及びＥｃａｔ７をＥＳレベルで発現するが、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、Ｆｇｆ４、Ｕｔｆｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｃａｔ１及びＧＤＦ３は発現しない。低酸素由来マウスのＭＡＰＣは、Ｓｃａ１、Ｔｈｙ１、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＭＨＣ−クラスＩ及びＩＩ、ＣＤ４４陰性であるが、ｃＫｉｔ陽性である。マウスＭＡＰＣはＥＳＣと同等のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現するが、胚様体又は奇形腫を形成することはない（５×１０６個のＭＡＰＣをヌードマウス５匹の皮下に移植した）。酸素量が正常な条件下で単離したＭＡＰＣを引き続き５％酸素条件に切り替えた場合、転写又は細胞表面の表現型に変化は認められず、低酸素下での単離は、より原始的な細胞集団及び表現型がｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されない細胞集団を選択することができることが示唆される。
【図２Ｄ】図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ａ）幾つかのクローンは、胚性幹細胞５〜４０％のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現する（酸素正常状態（２０％酸素）の条件下で単離したＭＡＰＣにおけるそれより１０００倍超高い）。図２は、低酸素マウスＭＡＰＣの表現型を示す。ｍＭＡＰＣを５％酸素で得て維持する。（Ｂ）これをＯｃｔ−４タンパク質についてはＦＡＣＳで、Ｏｃｔ−４については細胞内染色＊で確認した。ＥＳ細胞に比べて、ＭＡＰＣはＯｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、Ｆｂｘ１５、ＦｏｘＤ３、Ｅｇｓ１、Ｄｎｍｔ３１及びＥｃａｔ７をＥＳレベルで発現するが、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、Ｆｇｆ４、Ｕｔｆｌ、Ｅｒａｓ、Ｅｃａｔ１及びＧＤＦ３は発現しない。低酸素由来マウスのＭＡＰＣは、Ｓｃａ１、Ｔｈｙ１、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＭＨＣ−クラスＩ及びＩＩ、ＣＤ４４陰性であるが、ｃＫｉｔ陽性である。マウスＭＡＰＣはＥＳＣと同等のレベルでＯｃｔ−４  ｍＲＮＡを発現するが、胚様体又は奇形腫を形成することはない（５×１０６個のＭＡＰＣをヌードマウス５匹の皮下に移植した）。酸素量が正常な条件下で単離したＭＡＰＣを引き続き５％酸素条件に切り替えた場合、転写又は細胞表面の表現型に変化は認められず、低酸素下での単離は、より原始的な細胞集団及び表現型がｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されない細胞集団を選択することができることが示唆される。
【図３Ａ】図３Ａは、膵臓分化プロトコールを示す。３Ｂ及び３Ｃは、ＭＡＰＣの膵臓への分化に使用される種々の因子及び分化プロセスで発現できる種々の転写因子を示す。
【図３Ｂ】図３Ａは、膵臓分化プロトコールを示す。３Ｂ及び３Ｃは、ＭＡＰＣの膵臓への分化に使用される種々の因子及び分化プロセスで発現できる種々の転写因子を示す。
【図３Ｃ】図３Ａは、膵臓分化プロトコールを示す。３Ｂ及び３Ｃは、ＭＡＰＣの膵臓への分化に使用される種々の因子及び分化プロセスで発現できる種々の転写因子を示す。
【図４】図４は、ＭＡＰＣβ細胞の分化培養の形態学的外観を示す。１５日後に、類上皮細胞の大きな斑点が、接着層に「ストローマ」様細胞に囲まれて認められる。１８日後にこれらの斑点は、培養物上清で最終的には分離される三次元の極めて緻密に描写したクラスターを形成しはじめる（２１日目）。
【図５Ａ】図５は、２１日かけて内分泌膵臓へと分化するラットＭＡＰＣのＱ−ＲＴ−ＰＣＲ評価の結果を示す。図３Ａに記載の連続プロトコールを使用して、ラットＭＡＰＣをマトリゲルに平板培養した。３日毎に培養物を回収し（１８日目、２１日目及び２４日目のデータは接着していないクラスターのみのデータである）、ＲＮＡを抽出し、転写因子及びホルモンのレベルを、ＧＡＰＤＨを対照としてＱ−ＲＴ−ＰＣＲで測定し、ラット胎仔ＲＮＡとレベルを比較したＮｇｎ−３、Ｎｋｘ２．２及びＮｅｕｒｏ−Ｄ１を除き、原始的なラット膵で検出されるレベルと比較した。ここに示す結果は３回の実験の平均値±ＳＥＭである。
【図５Ｂ】図５は、２１日かけて内分泌膵臓へと分化するラットＭＡＰＣのＱ−ＲＴ−ＰＣＲ評価の結果を示す。図３Ａに記載の連続プロトコールを使用して、ラットＭＡＰＣをマトリゲルに平板培養した。３日毎に培養物を回収し（１８日目、２１日目及び２４日目のデータは接着していないクラスターのみのデータである）、ＲＮＡを抽出し、転写因子及びホルモンのレベルを、ＧＡＰＤＨを対照としてＱ−ＲＴ−ＰＣＲで測定し、ラット胎仔ＲＮＡとレベルを比較したＮｇｎ−３、Ｎｋｘ２．２及びＮｅｕｒｏ−Ｄ１を除き、原始的なラット膵で検出されるレベルと比較した。ここに示す結果は３回の実験の平均値±ＳＥＭである。
【図５Ｃ】図５は、２１日かけて内分泌膵臓へと分化するラットＭＡＰＣのＱ−ＲＴ−ＰＣＲ評価の結果を示す。図３Ａに記載の連続プロトコールを使用して、ラットＭＡＰＣをマトリゲルに平板培養した。３日毎に培養物を回収し（１８日目、２１日目及び２４日目のデータは接着していないクラスターのみのデータである）、ＲＮＡを抽出し、転写因子及びホルモンのレベルを、ＧＡＰＤＨを対照としてＱ−ＲＴ−ＰＣＲで測定し、ラット胎仔ＲＮＡとレベルを比較したＮｇｎ−３、Ｎｋｘ２．２及びＮｅｕｒｏ−Ｄ１を除き、原始的なラット膵で検出されるレベルと比較した。ここに示す結果は３回の実験の平均値±ＳＥＭである。
【図６】図６は、クラスターの免疫組織学的所見を示す。上の図：クラスターを１５日目及び２１日目に回収し、トリプシンで解離し、抗Ｐｄｘ−１、ｃ−ペプチド及びグルカゴン抗体で染色した。下の図：クラスターを２１日目に回収し、ウェスタンブロットをＰｄｘ−１及びβアクチンに対する抗体で実施した。何れの図でもＲＩＮ細胞を対照とした。
【図７】図７は、１８ｍＭのグルコースに反応するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃ−ペプチドの分泌を示す。細胞を３ｎＭグルコースと培養し、１６〜２４日目に、グルコース１８ｎＭ１時間の日次パルスを培養物に添加した後、上清を回収してｃ−ペプチドの産生量をＥＬＩＳＡで測定した。
【図８】図８は、β様細胞のクラスター上の機能的Ｋ及びＣａチャネルを示す。左は、ｆｕｒａ−２  ＡＭを有し、倒立型蛍光顕微鏡に置いてビデオ撮影した細胞のクラスター像である。右のプロットは、画像内の円形で示した領域における、ｆｕｒａ−２比が反映する細胞内カルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の変化を示す。［Ｃａ２＋］ｉの上昇は、５０ｍＭまでの細胞外Ｋイオン濃度の上昇（３ｍＭから）により惹起され、この上昇はＬ型カルシウムチャネル阻害剤であるニフェジピン（５０μＭ）により阻害された。
【図９】図９は、ラットＭＡＰＣから分化した内分泌膵臓のＳＺＯで処理したヌードマウスへの移植を示す。Ｙ軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を、Ｘ軸は日単位の時間を示す。
【図１０】図１０は、ＭＡＰＣからの造血系の再構築を示す。６週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに２７５ｃＧｙの照射を行い、抗ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１を注射した後に、１００万個のＴｇ−ＧＦＰ  ＭＡＰＣ  ＩＶを静脈内投与した（−１日目、１１日目、２１日目）。１６週間後、マウスを屠殺した。ＰＢ、ＢＭ及び脾臓造血細胞についてドナー細胞の有無及びその系統分化をＦＡＣＳで分析した。生着したマウス２１例中の１例を代表として例示する。
【図１１】図１１は、ＧＦＰ  ＭＡＰＣを移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＧＦＰ陽性インスリン陽性のドナー膵島を示す。６週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに２７５ｃＧｙの照射を行い、抗ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１を注射した後に、１００万個のＴｇ−ＧＦＰ  ＭＡＰＣを投与した（−１日目、１１日目、２１日目）。１２週間後、マウスを屠殺した。ＰＢ、ＢＭ及び脾臓造血細胞の７０％がＧＦＰ陽性であった。又ＧＦＰ陰性のＴ細胞が７％存在した。マウスの膵臓を抗インスリン抗体に結合させた抗ＧＦＰ抗体で解析した。図示したのは同じ膵臓由来のＧＦＰ陽性の膵島及びＧＦＰ陰性の膵島である（２例の同一のマウスの１例）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月12日(2008.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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