(57)【要約】ここでは左心室拡張（ＬＶＤ）発現の高い可能性の存在に結びつく、被験体の体液からのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）のプロフィールを同定することを含む、被験体において拡張期心不全を検出または予測する方法がここで開示される。例えば、心筋梗塞後の被験体における左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常値より高い量のＭＭＰ−９を検出することを含む、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞後の被験体における左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常値より高い量のＭＭＰ−９を検出することを含む、方法。
【請求項２】
ＭＭＰ−９の量が正常値より少なくとも約１００％高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
心筋梗塞後の被験体における左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常値より高い量のＴＩＭＰ−１を検出することを含む、方法。
【請求項４】
ＴＩＭＰ−１の量が正常値より少なくとも約５０％高い、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
心筋梗塞後の被験体における左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常比率と比較しての、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−４の比率の上昇を検出することを含む方法。
【請求項６】
前記比率が、正常比率と比較して少なくとも約１００％上昇している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
心筋梗塞後の被験体において左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常比率と比較しての、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−１の比率の上昇を検出することを含む、方法。
【請求項８】
前記比率が、正常比率と比較して少なくとも約１００％上昇している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
心筋梗塞後の被験体において左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常比率と比較しての、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−２の比率の上昇を検出することを含む、方法。
【請求項１０】
前記比率が、正常比率と比較して少なくとも約１００％上昇している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
心筋梗塞後の被験体において左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常値より高い量のＭＭＰ−８を検出することを含む、方法。
【請求項１２】
前記ＭＭＰ−８の量が正常値より少なくとも約５０％高い、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
心筋梗塞後の被験体において左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、正常比率と比較しての、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−４の比率の上昇およびＭＭＰ−８対ＴＩＭＰ−４の比率の上昇を検出することを含む、方法。
【請求項１４】
前記ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−４の比率が、正常比率と比較して少なくとも約１００％上昇している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
心筋梗塞後の被験体において左心室拡張を検出または予測する方法であって、該被験体からの体液中での、ＭＭＰ−９の上昇、ＭＭＰ−８の上昇、ＴＩＭＰ−１の上昇、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−４の比率の上昇、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−１の比率の上昇、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−２の比率の上昇を検出することを含む、方法。
【請求項１６】
前記ＭＭＰ−９の量が正常値より少なくとも約１００％高く、前記ＭＭＰ−８の量が正常値より約５０％高く、前記ＴＩＭＰ−１の量が正常値より約５０％高く、前記ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−４の比率が正常比率と比較して少なくとも約１００％上昇しており、前記ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−１の比率が正常比率と比較して少なくとも約１００％上昇しており、そして前記ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−２の比率が正常比率と比較して少なくとも約１００％上昇している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記体液が血液である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記体液が、血漿、尿、滑液、唾液または心膜液である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国仮出願第６０／８１９，９８８号（２００６年７月１１日出願）および米国仮出願第６０／８９３，８０７号（２００７年３月７日出願）に対する優先権を主張する。これらの出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって与えられた契約番号ＰＯ１−ＨＬ−４８７８８、ＲＯ１−ＨＬ−５９１６５、ＭＯ１−ＲＲ−０１０７０−２５１、およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓによって与えられた契約番号ＶＡ  Ｇｒａｎｔ  Ｓｐｉｎａｌｅ  ００１の下での政府援助を得てなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
心筋梗塞（ＭＩ）後の重要な構造的事象は、一般に、その後ＬＶ容積の変化へと至る、心筋形状の変化を導く心筋へ基の細胞および細胞外成分内の変化と定義され得る、ＬＶリモデリングである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。このＭＩ後のリモデリング過程の速度と程度は、罹患率および死亡率の独立した予測因子であることが確立されている（非特許文献４；非特許文献５）。それ故、ＭＩ後リモデリングを発現する危険度が最も高い患者の同定ならびにＭＩ後リモデリングに寄与する基本的機序を同定することは、大きな診断的／治療的意義を有する。しかし、ＭＩ後リモデリングを発症する危険度が最も高い患者を同定するための実施可能な方法は、これまでのところ使用可能ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｒｌｅｂａｃｈｅｒ  ＪＡ，  Ｗｅｉｓｓ  ＪＬ，  Ｗｅｉｓｆｅｌｄｔ  ＪＬ，  Ｂｕｌｋｌｅｙ  ＢＨ．  Ｅａｒｌｙ  ｄｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ４（２）２０１−２０８，  １９８４
【非特許文献２】Ｐｆｅｆｆｅｒ  ＭＡ，  Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ．  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８１；１１６１−１１７２，  １９９０
【非特許文献３】Ｓｔ．  Ｊｏｈｎ  Ｓｕｔｔｏｎ  Ｍ，  Ｐｆｅｆｆｅｒ  ＭＡ，  Ｐｌａｐｐｅｒｔ  Ｔ，  Ｒｏｕｌｅａｕ  ＪＬ，  Ｍｏｙｅ  ＬＡ，  Ｄａｇｅｎａｉｓ  ＧＲ，  Ｌａｍａｓ  ＧＡ，  Ｋｌｅｉｎ  Ｍ，  Ｓｕｓｓｅｘ  Ｂ，  Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｓ，  Ｍｅｎａｐａｃｅ  ＦＪ，  Ｐａｒｋｅｒ  ＪＯ，  Ｌｅｗｉｓ  Ｓ，  Ｓｅｓｔｉｅｒ  Ｆ，  Ｇｏｒｄｏｎ  ＤＦ，  ＭｃＥｗａｎ  Ｐ，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｖ，  Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ，  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＳＡＶＥ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｐｔｏｐｒｉｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８９；６８−７５，  １９９４
【非特許文献４】Ｗｈｉｔｅ  ＨＤ，  Ｎｏｒｒｉｓ  ＲＭ，  Ｂｒｏｗｎ  ＭＡ，  Ｂｒａｎｄｔ  ＰＷ，  Ｗｈｉｔｌｏｃｋ  ＲＭＬ，  Ｗｉｌｄ  ＣＪ．  Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７６；（１）；４４−５１，  １９８７
【非特許文献５】Ｃｈａｒｅｏｎｔｈａｉｔａｗｅｅ，  Ｐ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  ＴＦ，  Ｈｉｒｏｓｅ  Ｋ，  Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＲＪ，  Ｒｕｍｂｅｒｇｅｒ  ＪＡ．  Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２５：５６７−５７３，  １９９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（簡単な概要）
本明細書において具体化され、広く記述される本発明の目的に従って、本発明は、被験体において拡張期心不全を検出または予測する方法であって、ここでは左心室拡張（ＬＶＤ）発現の高い可能性の存在に結びつく、被験体の体液からのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）のプロフィールを同定することを含む方法に関する。
【０００６】
開示される方法および組成物のさらなる利点は、一部には以下の説明において述べられ、また一部には説明から理解されるか、または開示される方法および組成物の実施によって学習され得る。開示される方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって実現され、達成される。前記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が単なる例示および説明であり、特許請求される本発明を限定しないことは了解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、開示される方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、その説明と共に、開示される方法および組成物の原理を明らかにする役割を果たす。
【図１】図１は、ＭＩ後患者において測定したＬＶ拡張末期容量（上のパネル）および駆出率（下のパネル）を示す（ｎ＝３２）。ＬＶ拡張末期容量はＭＩ後１日目に標準対照被験体の値から上昇し、１８０日の試験期間全体にわたって高いままであった。ＬＶ拡張末期容量はＭＩ後１日目の値からＭＩ後２８日目まで高かった（ｐ＝０．０２７）。ＭＩ後にＬＶ拡張が起こったが、ＬＶ駆出率は、ＭＩ後の早期にはわずかであるが有意に上昇し、その後ＭＩ後の試験期間中標準対照値内に低下した。灰色の影は標準対照範囲を指示する（平均±ＳＥＭ）。＊標準対照値に対してｐ＜０．０５。
【図２】図２は、ＭＩ後患者において連続的に測定した代表的ＭＭＰの血漿値を示す。前駆形態のＭＭＰ−２は、標準健常被験体と比較してＭＩ後患者の血漿中では低下していた。血漿中のＭＭＰ−７は、フォローアップ期間を通じて正常範囲内のままであった。ＭＭＰ−８レベルは最初の測定時点で上昇しており、ＭＩ後３日目に再び急上昇すると思われた。ＭＭＰ−９レベルはＭＩ後２８日目まで高かった。（正常標準範囲に対してｐ＜０．０５）。
【図３】図３は、ゼラチンザイモグラフィーを血漿試料に関して実施し、ＭＩ後２８日目まで、ＭＭＰ−９を指示する９２ｋＤａバンドの相対的上昇を明らかにしたことを示す（上のパネル）。７２ｋＤａのより低分子量のバンドすべての血漿試料において検出され、ＭＭＰ−２を指示した。ＭＩ後２８日目に相対的レベルの小さいが有意の上昇が認められた（下のパネル）。（＊１００％に設定した正常値に対してｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、標準正常値と比較したときすべてのＭＩ後時点で血漿ＴＩＭＰ−１レベルが高かったことを示す。ＴＩＭＰ−２レベルはＭＩ後２８日目に上昇し、残りのフォローアップ期間中高いままであった。ＴＩＭＰ−４レベルはＭＩ後５日目に有意に低下し、標準正常値内には戻らなかった。ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比は、ＭＩ後２８日目までの上昇を明らかにした。（正常標準範囲に対してｐ＜０．０５）。
【図５】図５は、ＭＩ後１日目から５日目までの血漿ＭＭＰ−９レベルの変化に関する個人別応答のプロットを示す。個人のＭＭＰ−９レベルの混合応答がこの時間枠内で起こり、それ故個々の応答をＭＩ後１日目の数値からのパーセント変化として計算した。これらの値を、次に、ＭＩ後２８日目のＬＶ拡張末期容量の変化に対して関係づけた（下のパネル）。持続的に高いまたはＭＩ後５日目に高いＭＭＰ−９を有していた患者においては、２８日目にＬＶ拡張末期容量のはるかに大きな上昇が起こった。（＊ＭＭＰ−９レベルの変化なしに対してｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、ＭＩ後１日目から５日目までのＭＭＰ−９レベルの３５％上昇に基づいて層化した血漿ＭＭＰ−９レベルの早期変化の相対的大きさを示す。血漿ＭＭＰ−９レベルがＭＩ後１日目の値からさらに上昇して患者では、ＭＩ後９０日目にＬＶ拡張末期容量のより大きなパーセント変化が起こった。（＊ＭＭＰ−９レベルの＜３５％変化に対してｐ＜０．０５）。
【図７】図７（上）は、ＨＯＣＭ患者における心室中隔貫通動脈へのアルコール注入後の血漿中の総クレアチンキナーゼ（ＣＫ）濃度のパーセント変化を示す。ピーク血漿ＣＫレベルは注入後１０−２０時間目に起こった。図７（下）は、アルコール注入後のＣＫ−ＭＢ１アイソフォームの血漿濃度のパーセント変化を示す。ＣＫ−ＭＢ１血漿レベルの有意の上昇がアルコール注入後４時間目に検出され、２４時間目まで上昇した。（＊０時点のベースライン値に対してｐ＜０．０５）。
【図８】図８（上）は、ＭＭＰ−２血漿レベルのベースラインからの小さいが有意の変化がアルコール注入後４時間目に認められたことを示す。図８（下）は、血漿ＭＭＰ−９レベルの有意の上昇がアルコール注入後に起こり、注入後５０時間までの間横ばい状態であると思われたことを示す。（＊０時点のベースライン値に対してｐ＜０．０５）。
【図９】図９（上）は、血漿ＭＭＰ−８レベルが、ＨＯＣＭ患者における心室中隔貫通動脈へのアルコール注入後２４時間目まで時間依存的に上昇し、アルコール注入後より長期間にわたって横ばい状態であったことを示す。（下）血漿ＭＭＰ−１３レベルの低下が、アルコール注入後早期に検出され、２４時間目に有意であった。（＊０時点のベースライン値に対してｐ＜０．０５）。
【図１０】図１０（上）は、血漿ＴＩＭＰ−１レベルが、アルコール注入直後には変化せず、より遅い時点で上昇する傾向があるが、統計的有意性には達しなかったことを示す（ｐ＝０．１５）。図１０（下）は、血漿ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１レベルの比を各々の患者についてコンピュータで計算し、ベースライン値からの変化としてプロットしたものを示す。この比率の有意の上昇がアルコール注入後６時間目までに起こった。（＊０時点のベースライン値に対してｐ＜０．０５）。
【図１１】図１１は、血漿クレアチンキナーゼＭＢ１分画およびＭＭＰ−９レベルに関して各々の患者（ｎ＝５１）について算定した血漿濃度−時間曲線（ＡＵＣ）下面積を示す。これら２つのパラメータの間に有意の直線関係が認められた。
【図１２】図１２Ａは、ベースライン時（０）、アルコール注入後１０、２０、３０および６０時間後の、３名の正常患者（Ｎ１、Ｎ２およびＮ３）および２名のＨＯＣＭ（ＨＯＣＭ１およびＨＯＣＭ２）患者からの血漿試料におけるＴＩＭＰ−４の相対レベルを示す代表的免疫ブロットを示す。ヒトＴＩＭＰ−４組換え標準品（Ｓ）を抗体特異性についての陽性対照として使用した。免疫ブロットを、グリコシル化（２９ｋＤａ）および非グリコシル化（２３ｋＤａ）形態のＴＩＭＰ−４のＬｏｏｐ２のペプチド配列に対応する抗血清５μｇ／ｍＬと共にインキュベートした。図１２Ｂは、免疫ブロットの写しを、一次抗体を置換してインキュベートし、ＴＩＭＰ−４に対応するバンドの完全な消失が生じたことを示す。図１２Ｃは、血漿試料に関して調製し、グリコシル化タンパク質に関して染色した電気泳動ゲルを示す。グリコシル化バンドは２９ｋＤａで同定された。
【図１３】図１３は、ＨＯＣＭ患者における標準正常値からのＴＩＭＰ−４レベルのパーセント変化を示す。挿入図は、非グリコシル化（２３ｋＤａ）およびグリコシル化（２９ｋＤａ）形態のＴＩＭＰ−４についての代表的免疫ブロットである。非グリコシル化およびグリコシル化の両形態のＴＩＭＰ−４に関して、ＴＩＭＰ−４レベルの上昇が標準正常値と比較してＨＯＣＭ患者において認められた（正常：ｎ＝１８；ＨＯＣＭ：ｎ＝１６）。データは平均±ＳＥＭとして提示されている。（＊正常レベルと比較してｐ＜０．０５）。
【図１４】図１４は、アルコール注入前および注入後に採取したＨＯＣＭ患者からの血漿試料のＴＩＭＰ−４レベルのデンシトメトリー分析を示す。数値はベースラインからのパーセント変化として報告されている。挿入図は、非グリコシル化（２３ｋＤａ）およびグリコシル化（２９ｋＤａ）形態のＴＩＭＰ−４についての代表的免疫ブロットである（ｎ＝１６）。図１４Ａは、ベースラインおよび１０時間目の時点と比較したとき、アルコール注入後３０時間目に非グリコシル化ＴＩＭＰ−４レベルの低下が起こったことを示す。図１４Ｂは、グリコシル化ＴＩＭＰ−４レベルが３０および６０時間目にベースラインより低下したことを示す。図１４Ｃは、グリコシル化と非グリコシル化の両形態のＴＩＭＰ−４を合わせることにより、総ＴＩＭＰ−４のヒストグラムがアルコール注入後３０時間目にＴＩＭＰ−４レベルの同様の低下を示すことを明らかにする。データは平均±ＳＥＭとして提示されている（＊ベースラインと比較してｐ＜０．０５、＃１０時間目と比較してｐ＜０．０５）。
【図１５】図１５は、性別に基づいて群を比較した正規化ＴＩＭＰ−４  ＩＯＤ値についての平均値として表わした免疫ブロットの結果を示す。ヒストグラムは、非グリコシル化およびグリコシル化の両形態のＴＩＭＰ−４における性差を表わす。図１５（左）は、性別にかかわりなく、非グリコシル化ＴＩＭＰ−４  ＩＯＤ値がＨＯＣＭ群においてより高かったことを示す。また、ＨＯＣＭ女性とＨＯＣＭ男性の間でＴＩＭＰ−４レベルに有意差があった。図１５（右）は、性別にかかわりなく、正常群と比較したときＨＯＣＭ群においてグリコシル化ＴＩＭＰ−４レベルがより高かったことを示す。グリコシル化ＴＩＭＰ−４の上昇は、正常男性と正常女性の間でも認められた。データは平均±ＳＥＭとして提示されている（＊正常女性群と比較してｐ＜０．０５、＃正常男性群と比較してｐ＜０．０５、＋ＨＯＣＭ女性群と比較してｐ＜０．０５）。
【図１６】図１６は、心筋梗塞：予後および管理についてのＭＭＰおよびＴＩＭＰアルゴリズムを示す。
【図１７】図１７は、多重解析によって決定したＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６についての検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（詳細な説明）
開示される方法および組成物は、以下の特定実施形態の詳細な説明およびその中に含まれる実施例、および図面とそれらの上記および下記の説明を参照することによってより容易に理解され得る。
【０００９】
開示される方法および組成物のために使用できる、それと合わせて使用できる、その製造において使用できる、またはその産物である物質、組成物および成分が開示される。これらや他の物質がここで開示され、これらの物質の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示されるとき、これらの化合物の各々様々な個別および集合的組合せおよび順列は明白に開示されないことがあるが、各々は明確に考慮され、ここで記述されることが了解される。例えばあるペプチドが開示され、論じられて、そのペプチドを含む多くの分子に多くの修飾を行い得ることが論じられる場合、特に異なる指示がない限り、ペプチドのありとあらゆる組合せと順列および可能な修飾が明確に考慮される。そこで、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスおよび分子の組合せ例が開示される場合、ならびに、分子Ａ−Ｄの組合せが開示される場合、各々が個別に列挙されない場合でも、各々は個別におよび集合的に考慮される。それ故、この例では、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆの組合せの各々が明確に考慮され、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；組合せ例Ａ−Ｄの開示から開示されるとみなされるべきである。同様に、これらのいかなるサブセットまたは組合せも明確に考慮され、開示される。そこで、例えばＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅの小群が明確に考慮され、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；組合せ例Ａ−Ｄの開示から開示されるとみなされるべきである。この概念は、開示される組成物を作製し、使用する方法における工程を含むが、これらに限定されない、本出願のすべての態様に適用される。それ故、実施できる様々な追加工程が存在する場合、これらの追加工程の各々が、開示される方法のいかなる特定実施形態または実施形態の組合せに関しても実施でき、各々のそのような組み合わせが明確に考慮され、開示されるとみなされるべきであることは了解される。
【００１０】
当業者は、単に常套的な実験だけを使用して、ここで述べる方法および組成物の特定実施形態の多くの等価物を認識するまたは確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【００１１】
開示される方法および組成物は、これらは変化し得るので、記述される特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されないことが了解される。また、ここで使用する用語は、特定実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが了解される。
【００１２】
明白に異なる記載がない限り、いかなる意味においても、ここで述べるいかなる方法もその工程が特定の順序で実施される必要があると解釈されることを意図しない。従って、方法の特許請求項がその工程に続くべき順序を実際に列挙しない場合、またはさもなければ、工程が特定順序に限定されるべきであることを特許請求項または説明において明確に記述しない場合、いかなる点においても順序が推測されることを意図しない。これは、以下を含む、解釈のためのいかなる可能な非明示ベースについても有効である：工程の手筈または操作の流れに関する論理事項；文法構成または句読点から導かれる単純な意味；および本明細書において記述される実施形態の数または種類。より詳細には、それらの量が測定されるＭＭＰおよびＴＩＭＰは、いかなる順序で行われた測定も有し得る。
【００１３】
Ａ．定義
異なる定義がない限り、ここで使用されるすべての技術および学術用語は、開示される方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。ここで述べるものと類似または等価のいかなる方法および材料も、本発明の方法および組成物の実施または試験において使用できるが、特に有用な方法、装置および材料は記述されるとおりである。ここで引用される公表文献およびそれらが引用される資料は、参照により明確にここに組み込まれる。ここに含まれるいかなる事柄も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。いかなる参考も先行技術を構成するとは認められない。参考文献の記述はそれらの著者が主張する事柄を述べるものであり、出願人は引用書類の正確さと適切性に異議を申し立てる権利を留保する。
【００１４】
ここでおよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なる指示を与えない限り複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。それ故例えば、「１個のペプチド」の言及は複数のそのようなペプチドを包含し、「そのペプチド」の言及は、１またはそれ以上のペプチドおよび当業者に公知のその等価物への言及である、等々である。
【００１５】
「選択的」または「場合により」は、その後に記述される事象、状況または物質が生じてもよくまたは生じなくてもよい、または存在してもよくまたは存在しなくてもよいこと、およびその記述が、事象、状況または物質が存在する場合および事象、状況または物質が生じないまたは存在しない場合を包含することを意味する。
【００１６】
範囲は、ここでは「約」ある特定値から、および／または「約」もう１つの特定値までとして表わされ得る。そのような範囲が表わされるとき、もう１つの実施形態は、ある特定値から、および／または他方の特定値までを包含する。同様に、値が、先行詞「約」の使用により、近似値として表わされるとき、その特定値はもう１つの実施形態を形成することが了解される。範囲の各々の終点は、どちらも他方の終点に対しておよび他方の終点とは独立して、有意であることがさらに了解される。また、多くの数値がここで開示されることおよび各々の数値はまた、その数値自体に加えて「約」その特定値としてもここで開示されることが了解される。例えば数値「１０」が開示される場合、「約１０」も同時に開示される。また、ある数値が開示されるとき、当業者に適切に理解されるように、その数値「以下」、「その数値以上」および数値の間の可能な範囲も同時に開示される。例えば数値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。また、本明細書全体を通じて、データは多くの異なる形態で提供されること、およびこのデータは、終点と出発点、およびデータの点のあらゆる組合せについての範囲であることが了解される。例えば特定データ点「１０」と特定データ点１５が開示される場合、１０および１５より大きい、１０および１５以上、１０および１５未満、および１０および１５以下、および１０および１５、ならびに１０から１５の間も開示されるとみなされることが了解される。また、２つの特定値の間の各々の単位も開示されることが了解される。例えば１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、１４も開示される。
【００１７】
この明細書の説明および以下の特許請求の範囲全体を通じて、「含む」という語および「含むこと」のようなこの後の変形は、「含むがこれらに限定されないこと」を意味し、例えばタンパク質の添加物、成分、整数または工程を排除することは意図されない。
【００１８】
「被験体」は、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生生物および核酸を有する何らかの他の生物または実体を含むが、これらに限定されない。被験体は、脊椎動物、より詳細には哺乳動物（例えばヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長動物、ウシ、ネコ、モルモットまたはげっ歯動物）、魚、鳥類または爬虫類または両生類であり得る。被験体は、無脊椎動物、より詳細には節足動物（例えば昆虫および甲殻類）であり得る。この用語は特定の年齢または性別を意味しない。それ故、雄性または雌性にかかわりなく、成体および新生児被験体ならびに胎児が包含されることが意図されている。患者は、疾患または障害に罹患している被験体を指す。「患者」という用語は、ヒト被験体および動物被験体を含む。
【００１９】
ここで定義されるように、「試料」は、生物から得られた何らかの試料を指す。生物学的試料の例は、体液および組織標本を含む。試料の入手源は、血液、血清、血漿、母乳、膿、組織擦過物、洗浄液、尿、リンパ節などの組織等のような生理的媒質であり得る。
【００２０】
この明細書全体を通じて、様々な公表文献が参照される。これらの公表文献の開示全体が、本明細書が関連する技術水準をより完全に説明するために参照により本明細書に組み込まれる。開示される参考文献はまた、その参考文献を根拠とする文の中で論じられる、参考文献中に含まれる資料に関して、個別におよび明確に参照によりここに組み込まれる。
【００２１】
Ｂ．方法
１．拡張期心不全
ここでは左心室拡張（ＬＶＤ）発現の高い可能性の存在に結びつく、被験体の体液からのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）のプロフィールを同定することを含む、被験体において拡張期心不全を検出または予測する方法が提供される。
【００２２】
心筋梗塞（ＭＩ；心臓発作）後の基本的な事象は、ＬＶリモデリングと称される左心室（ＬＶ）の構造組成の変化である。これは、細胞過程と細胞外過程の両方を含み、その後多くの画像法によって測定できるＬＶの幾何学的変化によって要約される複雑な過程である。ＭＩ後期間内の時点で測定した特定のタンパク質分解酵素の血漿プロフィールは、この基礎をなすリモデリング過程に関する診断および予後情報を提供しる。ＬＶリモデリングを測定するためのより一般的な画像化様式の１つは、心エコー検査を通してである。従って、本出願において述べる血漿プロフィールの有効性確認のために、ＭＩ後の患者において心エコー検査を連続的に実施し、ＬＶリモデリングの程度を一般的な臨床測定：ＬＶ容積を通して評価した。有意の基礎となるＬＶリモデリングがＭＩ後患者において起こる場合、ＬＶ容積は上昇し、これは一般にＬＶ拡張と称される。そこで、本出願のために、これらの血漿アッセイがＭＩ後患者において基礎となるＬＶリモデリングを予測するという原理の証明は、心エコー検査によるＬＶ拡張である。しかし、ＬＶリモデリングについての結果判定法はまた、例えば放射性核種イメージング、心室造影法、磁気共鳴、陽電子放射断層撮影法、コンピュータ断層撮影法のような他の画像化様式を含み得る。
【００２３】
２．ＭＭＰ
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は亜鉛依存性エンドペプチダーゼである；他のファミリーメンバーは、アダマリシン、セラリシンおよびアスタシンである。ＭＭＰは、メチンシンスーパーファミリーとして知られるプロテアーゼのより大きなファミリーに属する。
【００２４】
ＭＭＰは共通ドメイン構造を有する。３つの共通ドメインは、プロペプチド、触媒ドメインおよび柔軟なヒンジ領域によって触媒ドメインに連結されているヘモペキシン様のＣ末端ドメインである。
【００２５】
ＭＭＰは、最初は、酵素が活性になる前に除去されねばならないプロペプチドドメインを有する不活性チモーゲンとして合成される。プロペプチドドメインは、活性部位で亜鉛と相互作用し、基質の結合と切断を妨げて酵素を不活性形態に保持する、保存されたシステイン残基を含む「システインスイッチ」の一部である。ＭＭＰの大部分では、システイン残基は保存された配列ＰＲＣＧｘＰＤ内にある。一部のＭＭＰは、切断されたとき酵素を活性化する、プロホルモンコンバターゼ切断部位（フリン様）をこのドメインの一部として有する。ＭＭＰ−２３ＡおよびＭＭＰ−２３Ｂはこのドメイン内に膜貫通セグメントを含む（ＰＭＩＤ  １０９４５９９９）。
【００２６】
いくつかのＭＭＰ触媒ドメインのＸ線結晶構造は、このドメインが３５×３０×３０Å（３．５×３×３ｎｍ）と測定される偏球であることを示した。活性部位は、触媒ドメインを横切って走る２０Åの溝である。活性部位を形成する触媒ドメインの部分には、触媒的に重要なＺｎ２＋イオンが存在し、これは保存された配列ＨＥｘｘＨｘｘＧｘｘＨ内に認められる３つのヒスチジン残基によって結合されている。それ故、この配列は亜鉛結合モチーフである。
【００２７】
ＭＭＰ−２などのゼラチナーゼは、触媒ドメイン内の亜鉛結合モチーフの直前に挿入されるフィブロネクチンＩＩ型モジュールを組み込む（ＰＭＤＤ  １２４８６１３７）。
【００２８】
触媒ドメインは、柔軟なヒンジまたはリンカー領域によってＣ末端ドメインに結合されている。これは７５アミノ酸までの長さであり、確定できる構造を有さない。
【００２９】
Ｃ末端ドメインは、血清タンパク質、ヘモペキシンに構造類似性を有する。このドメインは４枚羽根を持つβプロペラ−構造を有する。βプロペラ−構造は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると思われる大きくて平坦な表面を与える。これが基質特異性を決定し、ＴＩＭＰとの相互作用のための部位である。ヘモペキシン様ドメインは、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−２６および植物および線虫には存在しない。ＭＴ−ＭＭＰはこのドメインを通して形質膜に固定されており、これらの一部は細胞質ドメインを有する。
【００３０】
ＭＭＰは種々の方法で細分するっことができる。ＭＭＰの一次構造を比較するためのバイオインフォマティクス法の使用は、ＭＭＰの以下の進化的分類を示唆する：ＭＭＰ−１９；ＭＭＰ１１、１４、１５、１６および１７；ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９；その他のすべてのＭＭＰ。
【００３１】
孤立した触媒ドメインの分析は、酵素の基質特異性によっても指示されるように、いったん主要群が分化したあと触媒ドメインがさらに進化したことを示唆する。最も一般的に使用される分類（ＭＭＰ生物学における研究者達による）は、一部にはＭＭＰの基質特異性の歴史的評価に基づき、一部にはＭＭＰの細胞局在に基づく。これらの群は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンおよび膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）である。伝統的な群のいずれにも適合しない多くのＭＭＰが存在するので、これらの区分が幾分不自然であることが次第に明らかになりつつある。
【００３２】
コラゲナーゼは、三重らせん線維性コラーゲンを特徴的な３／４および１／４フラグメントに分解することができる。これらのコラーゲンは骨および軟骨の主要成分であり、ＭＭＰはそれらを分解することができる唯一の公知の哺乳動物酵素である。伝統的に、コラゲナーゼは以下のとおりである：ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ−１８（コラゲナーゼ４、ｘｃｏｌ４、ツメガエルコラゲナーゼ、公知のヒトオーソログは存在しない）。ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）も線維性コラーゲンを切断することが示されており、より議論されている点として、ＭＭＰ−２がコラーゲン分解することができる証拠が存在する。
【００３３】
ストロメライシンは、細胞外マトリックスタンパク質を切断する幅広い能力を示すが、三重らせん線維性コラーゲンは切断することができない。この群の３つの標準メンバーは、ＭＭＰ−３（ストロメライシン１）、ＭＭＰ−１０（ストロメライシン２）およびＭＭＰ−１１（ストロメライシン）である。ＭＭＰ−１１は、ＭＴ−ＭＭＰにより類似性を示し、コンバターゼ活性化可能であって、それ故通常はコンバターゼ活性化可能なＭＭＰに結合して分泌される。
【００３４】
マトリライシンは、ＭＭＰ−７（マトリライシン、ＰＵＭＰ）およびＭＭＰ−２６（マトリライシン２、エンドメターゼ）を含む。
【００３５】
ゼラチナーゼの主要基質はＩＶ型コラーゲンとゼラチンであり、これらの酵素は触媒ドメインに挿入された付加的なドメインの存在によって区別される。このゼラチン結合領域は亜鉛結合モチーフの直前に位置し、触媒ドメインの構造を分断しない別個の折りたたみ単位を形成する。この小群の２つのメンバーは、ＭＭＰ−２（７２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ−９（９２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼＢ）である。
【００３６】
分泌型ＭＭＰは、ＭＭＰ−１１（ストロメライシン３）、ＭＭＰ−２１（Ｘ−ＭＭＰ）およびＭＭＰ−２８（エピライシン）を含む。
【００３７】
膜結合型ＭＭＰは以下を含む：ＩＩ型膜貫通システインアレイＭＭＰ−２３、グリコシルホスファチジルイノシトール結合ＭＭＰ−１７および２５（それぞれＭＴ４−ＭＭＰおよびＭＴ６−ＭＭＰ）、およびＩ型膜貫通ＭＭＰ−１４、１５、１６、２４（それぞれＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰおよびＭＴ５−ＭＭＰ）。
【００３８】
６つのＭＴ−ＭＭＰすべてが、ＭＭＰ−１１にも共有される特徴である、プロペプチド内にフリン切断部位を有する。
【００３９】
他のＭＭＰは、ＭＭＰ−１２（マクロファージメタロエラスターゼ）、ＭＭＰ−１９（ＲＡＳＩ−１、場合によりストロメライシン４とも称される）、エナメライシン（ＭＭＰ−２０）、およびＭＭＰ−２７（ＭＭＰ−２２、Ｃ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２３Ａ  （ＣＡ−ＭＭＰ）、およびＭＭＰ−２３Ｂを含む。
【００４０】
３．ＴＩＭＰ
ＭＭＰはメタロプロテイナーゼの特異的内因性組織阻害因子（ＴＩＭＰ）によって阻害され、前記ＴＩＭＰは、４つのプロテアーゼ阻害因子のファミリー：ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４を含む。全体として、ひとたびＴＩＭＰが活性化されるとすべてのＭＭＰがＴＩＭＰによって阻害されるが、この酵素が潜在型であるとき、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）はＴＩＭＰと複合体を形成し得る。ＴＩＭＰ−２と潜在型ＭＭＰ−２（プロＭＭＰ−２）の複合体は、膜固定型ＭＭＰであるＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）による細胞表面でのプロＭＭＰ−２の活性化を促進する役割を果たす。
【００４１】
４．ＭＭＰ／ＴＩＭＰ比
心筋梗塞および高血圧性心臓病におけるＭＭＰ−ＴＩＭＰプロファイリングの独特の特徴の１つは、心臓特異的ＴＩＭＰ、ＴＩＭＰ−４を利用し、これを、心筋梗塞および高血圧患者においてより大きな度合で変化するＭＭＰの背景化に置くことである。また、ＭＭＰ−９またはＭＭＰ−１３などのＭＭＰ対ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−４などのＴＩＭＰの比率も開示される。特に、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比は、心筋梗塞患者では１００％以上上昇し、高血圧患者では５０％以上低下する。また、実施例１に示すように、ＭＭＰ−８レベルはＭＩ後の早期に上昇する。ＴＩＭＰ−４レベルは実際にこのＭＩ後早期に低下する。それ故、ＭＭＰ−８／ＴＩＭＰ−４比は上昇し、これらの患者において起こりつつある有害な心筋リモデリングの相対的程度に関するさらなる定量的情報を提供する。これらの比率およびＴＩＭＰ−４は、本発明において初めて、診断鑑別手段としておよび明らかに異なる疾患状態を有する患者を同定するために使用される。
【００４２】
５．血漿スクリーニング
本発明の教示の鍵となる利点は、この血漿スクリーニングが、ＭＩ後に有害なＬＶリモデリングを発現する危険度の高い患者を同定するためならびにこの過程が加速度的に起こりつつある患者を同定するためのより迅速で簡単な方法を提供することである。そこで、ここで開示される方法は、血液、尿、血漿、血清、涙、リンパ、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣分泌物、汗、精液、漏出液、滲出液、および滑液などの、被験体の体液中のＭＭＰおよびＴＩＭＰの検出を含み得る。
【００４３】
血漿は、その中に血球が懸濁している血液の液体成分である。血漿は血液の最大の単一成分であり、全血液量の約５５％を占める。血清は、凝固因子（フィブリンなど）が除去された血漿を指す。血漿は、フィブリノーゲン、グロブリンおよびヒト血清アルブミンを含む多くの生体タンパク質を含有する。時として血漿は、ウイルスプロセシングを通して抽出されねばならないウイルス不純物を含み得る。
【００４４】
血漿のような体液中の特異的ＭＭＰおよびＴＩＭＰのレベルを評価するために少なくとも２つのアプローチがある。例えばＭＩ後患者から得たＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルを標準正常値と比較することができる。正常値からのパーセント変化を、次に、図５および６に示すような予測アルゴリズムに供することができる。例えばＭＩ後のＭＭＰ−９の早期上昇は、患者がより重篤な形態の心室リモデリングおよび心不全へと進行することになるかどうかを予測するために使用できる。
【００４５】
実施例１に示す、選択的な、必ずしも相互排他的ではないアプローチは、ＭＩ後に特定の時間間隔でＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルを測定することである。これは、ＭＩ後の早期時点（７２時間以内）およびその後常套的な臨床フォローアップにおける（５−７日間）測定を必要とする。採血は、常用臨床化学パネルの一部としてＭＩ後患者においてこれらの時点で常套的に実施されるので、これらは容易に入手される。その後、ＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルの変化の相対的な大きさを予測アルゴリズムにおいて使用することができる。
【００４６】
特定時点で測定を入手して、標準対照を使用するため、または個々の患者における連続測定を評価するためのアプローチは、同定されたすべてのＭＭＰ／ＴＩＭＰ分析物に適用される。
【００４７】
ＭＩ後の期間のＭＭＰプロファイリングのためのこの手順の臨床適用に関して、３つの主要なカテゴリーの有用性が存在する：診断、予後および治療的介入処置の誘導。
【００４８】
６．免疫測定法
開示される方法において使用できる、当技術分野において公知のまたは新たに発見された分析物、例えばＭＭＰおよびＴＩＭＰのようなタンパク質を検出するための数多くの方法が存在する。例えばＭＭＰおよびＴＩＭＰは標準免疫検出法を用いて検出することができる。種々の有用な免疫検出法の工程は、例えば、各々が、全体としておよび特に免疫検出法についてのその教示に関して参照によりここに組み込まれる、Ｍａｇｇｉｏら、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，（１９８７）およびＮａｋａｍｕｒａら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７．１−２７．２０（１９８６）のような学術文献に記述されている。免疫測定法は、それらの最も単純で直接的な意味において、抗体と抗原の間の結合を含む結合アッセイである。免疫測定法の多くの種類と様式が公知であり、すべてが、開示されるバイオマーカーの検出に適する。免疫測定法の例は、酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、放射免疫沈降測定法（ＲＩＰＡ）、免疫ビーズ捕捉アッセイ、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、マルチプレックスビーズアレイ、磁気捕獲、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、および光退色後蛍光回復測定／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
【００４９】
一般に、免疫測定法は、免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件下で、場合によって、対象分子（開示されるバイオマーカーなど）を含むことが疑われる試料を対象分子に対する抗体と接触させることまたは対象分子に対する抗体（開示されるバイオマーカーに対する抗体など）を抗体によって結合され得る分子と接触させることを含む。免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするために有効な条件下でおよびそのために十分な期間にわたって、試料を対象分子に対する抗体または対象分子に対する抗体によって結合され得る分子と接触させることは、一般に分子または抗体と試料を単純に接触させること、および抗体が、抗体が結合し得る何らかの存在する分子（例えば抗原）と免疫複合体を形成する、すなわち結合するために十分な時間、混合物をインキュベートすることである。免疫測定法の多くの形態では、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウエスタンブロットなどの試料−抗体組成物を、次に、何らかの非特異的に結合した抗体種を除去して、一次免疫複合体内の特異的に結合している抗体だけを検出することを可能にするように洗浄し得る。
【００５０】
免疫測定法は、試料中の対象分子（開示されるバイオマーカーまたはそれらの抗体など）を検出するまたは対象分子の量を測定するための方法を含み得、それらの方法は一般に、結合過程の間に形成される何らかの免疫複合体の検出または定量を含む。一般に当技術分野で知られている免疫複合体の形成の検出は、多数のアプローチを適用することにより実行される。これらの方法は一般に、放射性、蛍光、生物学的または酵素タグまたは何らかの他の公知の標識のような標識またはマーカーの検出に基づく。例えば、各々が、全体としておよび特に免疫検出法および標識についての教示に関して参照によりここに組み込まれる、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号参照。
【００５１】
ここで使用するとき、標識は、蛍光染料、ビオチン／ストレプトアビジンのような結合対のメンバー、金属（例えば金）、または、着色基質または蛍光を生じることなどによって検出し得る分子と特異的に相互作用し得るエピトープタグを含み得る。タンパク質を検出可能に標識するための適切な物質は、蛍光染料（ここでは蛍光色素および蛍光体としても知られる）および比色基質（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）と反応する酵素を含む。蛍光染料の使用は、それらが非常に低い量で検出し得るので、本発明の実施において一般に好ましい。さらに、多数の抗原を単一アレイと反応させる場合は、同時検出のために各々の抗原を異なる蛍光化合物で標識することができる。蛍光光度計を用いてアレイ上の標識スポットを検出し、シグナルの存在は特異抗体に結合した抗原を指示する。
【００５２】
蛍光団は、発光する化合物または分子である。典型的には蛍光団は１つの波長で電磁エネルギーを吸収し、２番目の波長で電磁エネルギーを放射する。代表的な蛍光団は、１，５  ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシナフトフルオレセイン；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ  ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−Ｉメチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）；ＡＢＱ；酸性フクシン；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；  アクリフラビン；アクリフラビンフュールゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光タンパク質）；ＡＦＰ−自己蛍光タンパク質−（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ参照；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（商標）；アリザリンコンプレクソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アニリンブルー；ステアリン酸アントロシル（Ａｎｔｈｒｏｃｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ；アストラゾンオレンジＲ；アストラゾンレッド６Ｂ；アストラゾンイエロー７  ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＦＱ；オーラミン；オーロホスフィンＧ；オーロホスフィン；ＢＡＯ  ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン；βラクタマーゼ；ＢＦＰブルーシフト化ＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；青色蛍光タンパク質；ＢＦＰ／ＧＦＰ  ＦＲＥＴ；ビマン；ビスベンズアミド；
ビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）；ビス−ＢＴＣ；ブランコフォアＦＦＧ；ブランコフォアＳＶ；ＢＯＢＯ（商標）−１；ＢＯＢＯ（商標）−３；ボディピー４９２／５１５；４９３／５０３；ボディピー５００／５１０；ボディピー；５０５／５１５；ボディピー５３０／５５０；ボディピー５４２／５６３；ボディピー５５８／５６８；ボディピー５６４／５７０；ボディピー５７６／５８９；ボディピー５８１／５９１；ボディピー６３０／６５０−Ｘ；ボディピー６５０／６６５−Ｘ；ボディピー６６５／６７６；ボディピーＦｌ；ボディピーＦＬ  ＡＴＰ；ボディピーＦｌ−セラミド；ボディピーＲ６Ｇ  ＳＥ；ボディピーＴＭＲ；ボディピーＴＭＲ−Ｘコンジュゲート；ボディピーＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ；ボディピーＴＲ；ボディピーＴＲ  ＡＴＰ；ボディピーＴＲ−Ｘ  ＳＥ；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−１；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−３；ブリリアントスルホフラビンＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ−５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムゾン−；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋染料；カルシウムグリーン−２  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ１８  Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフルオルホワイト；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）；カスケードイエロー；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）；ＣＦＰ／ＹＦＰ  ＦＲＥＴ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ−ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；コエレンテラジン；コエレンテラジンｃｐ；コエレンテラジンｆ；コエレンテラジンｆｃｐ；コエレンテラジンｈ；コエレンテラジンｈｃｐ；コエレンテラジンｉｐ；コエレンテラジンｎ；コエレンテラジンＯ；クマリンファロイジン；Ｃ−フィコシアニン；ＣＰＭ  Ｉメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２（商標）；Ｃｙ３．１  ８；Ｃｙ３．５（商標）；Ｃｙ３（商標）；Ｃｙ５．１  ８；Ｃｙ５．５（商標）；Ｃｙ５（商標）；Ｃｙ７（商標）；シアンＧＦＰ；サイクリックＡＭＰ蛍光センサー（ＦｉＣＲｈＲ）；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；ダンシルクロライド；ダンシルＤＨＰＥ；ダンシルフルオリド；ＤＡＰＩ；ダポキシル；ダポキシル２；ダポキシル３’ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインニ酢酸）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ；Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ（ｎｏｎ−ｒａｔｉｏ）；ＤｉＡ（４−Ｄｉ  １６−ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセインニ酢酸（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ−親油性トレーサー；ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））；Ｉジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））；ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；Ｄｓレッド；ＤＴＡＦ；ＤＹ−６３０−ＮＨＳ；ＤＹ−６３５−ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ  ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；エチジウムブロマイド；エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）；
オイクリシン；ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ；ユーロピウム（１１１）クロライド；ＥＹＦＰ；ファーストブルー；ＦＤＡ；フュールゲン（パラロサニリン）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）；ＦＩＴＣ；フラゾオレンジ；フルオ−３；フルオ−４；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセインニ酢酸；フルオロ−エメラルド；フルオロ−ゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；フルオル−ルビー；フルオルＸ；ＦＭ  １−４３（商標）；ＦＭ  ４−４６；Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（商標）（高ｐＨ）；Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（商標）／Ｆｌｕｏ−３；Ｆｕｒａ−２；Ｆｕｒａ−２／ＢＣＥＣＦ；ゲナクリルブリリアントレッドＢ；ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ；ゲナクリルピンク３Ｇ；ゲナクリルイエロー５ＧＦ；ジーン・ブレイザー；（ＣＣＦ２）；ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）；ＧＦＰレッドシフト（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；グロキサン酸；グラニュラーブルー；ヘマトポルフィリン；ヘキスト３３２５８；ヘキスト３３３４２；ヘキスト３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）；ヒドロキシトリプタミン；Ｉｎｄｏ−１、高カルシウム；Ｉｎｄｏ−１、低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；イントラホワイトＣｆ；ＪＣ−１；ＪＯ  ＪＯ−１；ＪＯ−ＰＲＯ−１；レーザープロ；ラウロダン（Ｌａｕｒｏｄａｎ）；ＬＤＳ  ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ  ７５１（ＲＮＡ）；ロイコフォアＰＡＦ；ロイコフォアＳＦ；ロイコフォアＷＳ；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモダイマー；ＬＯＬＯ−１；ＬＯ−ＰＲＯ−１；ルシファーイエロー；リソトラッカーブルー；リソトラッカーブルー−ホワイト；リソトラッカーグリーン；リソトラッカーレッド；リソトラッカーイエロー；リソセンサーブルー；リソセンサーグリーン；リソセンサーイエロー／ブルー；マググリーン；マグダーラレッド（フロキシンＢ）；マグ−フラレッド；マグ−フラ−２；マグ−フラ−５；マグ−インド−１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリーナブルー；Ｉマキシロンブリリアントフラビン１０  ＧＦＦ；マキシロンブリリアントフラビン８  ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；ミトトラッカーグリーンＦＭ；ミトトラッカーオレンジ；ミトトラッカーレッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾキサジドール；ノルアドレナリン；ニュークリアファストレッド；ニュークリアイエロー；ニロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５００；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５１４；パシフィックブルー；パラロサニリン（フュールゲン）；ＰＢＦＩ；ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−テキサスレッド（レッド６１３）；フロキシンＢ（マグダー���レッド）；ホルワイトＡＲ；ホルワイトＢＫＬ；ホルワイトＲｅｖ；ホルワイトＲＰＡ；ホスフィン３Ｒ；フォトレジスト；フィコエリスリンＢ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロムブルーブラック；ＰＯＰＯ−１；ＰＯＰＯ−３；ＰＯ−ＰＲＯ−１；ＰＯ−Ｉ  ＰＲＯ−３；プリムリン；プロシオンイエロー；ヨウ化プロピジウム（Ｐ１）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ  ４１４；Ｒｈｏｄ−２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５  ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ  ２００；ローダミンＢエクストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；  ローダミンファリシジン；ローダミン：ファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコシアニン；Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロンブリリアントレッド２Ｂ；セブロンブリリアントレッド４Ｇ；セブロンＩブリリアントレッドＢ；セブロンオレンジ；セブロンイエローＬ；ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）；ＳＩＴＳ（プリムリン；スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ−１；ＳＮＡＦＬ−２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；
ナトリウムグリーン；スペクトルアクア；スペクトルグリーン；スペクトルオレンジ；スペクトルレッド；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢおよびＣ；スルホローダミンエクストラ；ＳＹＴＯ  １１；ＳＹＴＯ  １２；ＳＹＴＯ  １３；ＳＹＴＯ  １４；ＳＹＴＯ  １５；ＳＹＴＯ  １６；ＳＹＴＯ  １７；ＳＹＴＯ  １８；ＳＹＴＯ  ２０；ＳＹＴＯ  ２１；ＳＹＴＯ  ２２；ＳＹＴＯ  ２３；ＳＹＴＯ  ２４；ＳＹＴＯ  ２５；ＳＹＴＯ  ４０；ＳＹＴＯ  ４１；ＳＹＴＯ  ４２；ＳＹＴＯ  ４３；ＳＹＴＯ  ４４；ＳＹＴＯ  ４５；ＳＹＴＯ  ５９；ＳＹＴＯ  ６０；ＳＹＴＯ  ６１；ＳＹＴＯ  ６２；ＳＹＴＯ  ６３；ＳＹＴＯ  ６４；ＳＹＴＯ  ８０；ＳＹＴＯ  ８１；ＳＹＴＯ  ８２；ＳＹＴＯ  ８３；ＳＹＴＯ  ８４；ＳＹＴＯ  ８５；ＳＹＴＯＸブルー；ＳＹＴＯＸグリーン；ＳＹＴＯＸオレンジ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＯＮ；チオライト；チアゾールオレンジ；チノポールＣＢＳ（カルコフルオルホワイト）；ＴＩＥＲ；ＴＯ−ＰＲＯ−１；ＴＯ−ＰＲＯ−３；ＴＯ−ＰＲＯ−５；ＴＯＴＯ−１；ＴＯＴＯ−３；トリカラー（ＰＥ−Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣテトラメチルローダミンイソチオシアネート；トゥルーブルー；トゥルーレッド；ウルトラライト；ウラニンＢ；ユービテックスＳＦＣ；ｗｔ  ＧＦＰ；ＷＷ  ７８１；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；黄色ＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ−ＰＲＯ−１；ＹＯ−ＰＲＯ  ３；ＹＯＹＯ−１；ＹＯＹＯ−３；Ｓｙｂｒグリーン；チアゾールオレンジ（インターキレート化染料）；量子ドットなどの半導体ナノ粒子；またはケージドフルオロフォア（光または他の電磁エネルギー減で活性化され得る）、またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
標識は直接であるかまたは間接的であり得る。直接標識では、検出抗体（対象分子についての抗体）または検出分子（対象分子に対する抗体によって結合され得る分子）が標識を含む。標識の検出は、検出抗体または検出分子の存在を指示し、それが次に、それぞれ対象分子または対象分子に対する抗体の存在を指示する。間接標識では、付加的な分子または部分を免疫複合体と接触させるかまたは免疫複合体の部位で生成する。例えば酵素のようなシグナル生成分子または部分を検出抗体または検出分子と結合し得るまたは会合させ得る。シグナル生成分子は次に、免疫複合体の部位で検出可能なシグナルを生じる。例えば酵素は、適切な基質が供給されるとき、免疫複合体の部位で可視または検出可能な生成物を生じ得る。ＥＬＩＳＡはこの種の間接標識を用いる。
【００５４】
間接標識のもう１つの例として、一次抗体に対する二次抗体のような、対象分子または対象分子に対する抗体（一次抗体）のいずれかに結合し得る付加的な分子（結合物質と称し得る）を免疫複合体に接触させ得る。付加的な分子は、標識またはシグナル生成分子または部分を有し得る。付加的な分子は抗体であり得、それ故それは二次抗体と称され得る。一次抗体への二次抗体の結合は、最初の（または一次）抗体および対象分子と共にいわゆるサンドイッチを形成し得る。免疫複合体を、二次免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件下でおよびそのために十分な期間、標識二次抗体と接触させ得る。二次免疫複合体は、次に、一般に何らかの非特異的に結合した標識二次抗体を除去するために洗浄することができ、その後二次免疫複合体内の残りの標識を検出することができる。付加的な分子はまた、ビオチン／アビジン対のような、相互に結合し得る分子または部分の対の一方であり得るかまたはそれを含み得る。この方法では、検出抗体または検出分子は対の他方のメンバーを含むべきである。
【００５５】
間接標識の他の方法は、２段階アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。例えば対象分子または対応する抗体に対して結合親和性を有する、抗体などの分子（第一結合物質と称され得る）を、上述したような二次免疫複合体を形成するために使用できる。洗浄後、二次免疫複合体を、やはり免疫複合体の形成を可能にするために有効な条件下でおよびそのために十分な期間、第一結合物質に対して結合親和性を有するもう１つ別の分子と接触させ得る（従って三次免疫複合体を形成する）。第二結合物質を検出可能標識またはシグナル生成分子または部分に連結し、そのようにして形成された三次免疫複合体の検出を可能にし得る。本システムは、シグナル増幅を提供する。
【００５６】
タンパク質または特定タンパク質に対する抗体などの基質の検出を含む免疫測定法は、ラベルフリーアッセイ、タンパク質分離法（すなわち電気泳動）、固相捕捉アッセイ、またはインビボ検出を含む。ラベルフリーアッセイは、一般に試料中の特定タンパク質または特定タンパク質に対する抗体の存在または不在を判定する診断手段である。タンパク質分離法は、付加的に、大きさまたは正味電荷などの、タンパク質の物理的性質を評価するために有用である。捕捉アッセイは、一般に試料中の特定タンパク質または特定タンパク質に対する抗体の濃度を定量的に評価するためにより有用である。最後に、インビボ検出は、物質の空間発現パターン、すなわち物質が被験体、組織または細胞内のどこで検出され得るかを評価するために有用である。
【００５７】
濃度が十分であることを条件として、抗体−抗原相互作用によって生成される分子複合体（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）は裸眼で可視であるが、光束を散乱させるそれらの能力により、より小量も検出し、測定し得る。複合体の形成は両方の反応物が存在することを指示し、免疫沈降アッセイでは、特異抗原（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）を測定するために一定濃度の試薬抗体が使用され、特異抗体（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）を検出するために試薬抗原が使用される。試薬種があらかじめ細胞上に（赤血球凝集アッセイにおけるように）または非常に小さな粒子上に（ラテックス凝集アッセイにおけるように）被覆されている場合、被覆粒子の「凝集（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）」ははるかに低い濃度で可視である。これらの基本原理に基づく様々なアッセイが、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、および免疫比濁法（ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃ）および比濁法（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙｓ）を含めて、一般的に使用される。そのようなアッセイの主たる制限は、標識を用いるアッセイと比較して限られた感度（より低い検出限界）および、一部の場合、非常に高濃度の分析物が実際上複合体形成を阻害し得るという事実であり、手順をより複雑にする予防手段が必要である。これらの第１群アッセイの一部は抗体の発見まで遡り、それらのいずれもが実際の「標識」（例えば抗原−酵素）を有していない。ラベルフリーである他の種類の免疫測定法はイムノセンサーに依存し、抗体−抗原相互作用を直接検出できる様々な装置が現在市販されている。大部分は、固定化されたリガンドを有するセンサー表面でエバネッセント波を生成することに依存し、これはリガンドへの結合を持続的にモニタリングすることを可能にする。イムノセンサーは動力学的相互作用の容易な検討を可能にし、より低コストの特殊装置の出現により、将来は免疫分析において広く適用されるであろう。
【００５８】
特定タンパク質を検出するための免疫測定法の使用は、電気泳動によるタンパク質の分離を含み得る。電気泳動は、電場に応答した溶液中の荷電分子の移動である。それらの移動速度は、場の強さ；分子の正味電荷、大きさおよび形状；およびまた、分子がその中で移動する媒質のイオン強度、粘度および温度に依存する。分析ツールとして、電気泳動は簡単・迅速であり、高度感受性である。単一荷電種の性質を検討するためおよび分離手法として分析的に使用される。
【００５９】
一般に、試料は、紙、酢酸セルロース、デンプンゲル、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルなどの支持基質中を泳動する。基質は加熱によって引き起こされる対流混合を阻害し、電気泳動の記録を提供する；泳動終了時に、基質を染色し、走査、オートラジオグラフィーまたは保存のために使用できる。加えて、最も一般的に使用される支持基質−アガロースおよびポリアクリルアミド−は、それらが多孔性ゲルであることから、大きさによって分子を分離する手段を提供する。多孔性ゲルは、大きな高分子の運動を遅延させるかまたは一部の場合は完全に妨げ、一方より小さな分子は自由に移動させることにより、ふるいとして機能し得る。希薄アガロースは一般により剛性であり、同じ濃度のポリアクリルアミドよりも扱いやすいので、核酸、大型タンパク質およびタンパク質複合体などのより大きな高分子を分離するためにはアガロースが使用される。より高度濃度で取り扱いやすく、作製しやすいポリアクリルアミドは、遅延のために小さなゲル孔径を必要とする大部分のタンパク質および小さなオリゴヌクレオチドを分離するために使用される。
【００６０】
タンパク質は両性化合物である；それらの正味電荷は、それ故、それらが懸濁している媒質のｐＨによって決定される。その等電点より上のｐＨを有する溶液中では、タンパク質は正味負電荷を有し、電場の陰極に向かって移動する。その等電点以下では、タンパク質は正に荷電し、陽極の方に移動する。加えて、タンパク質が担持する正味電荷はその大きさとは無関係である、すなわち分子の単位質量（または長さ、所与のタンパク質および核酸は線状高分子である）当たりに担持される電荷はタンパク質によって異なる。所与のｐＨで、それ故、および非変性条件下で、タンパク質の電気泳動分離は分子の大きさと電荷の両方によって決定される。
【００６１】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、ポリペプチド骨格を「包み込む（ｗｒａｐｐｉｎｇ  ａｒｏｕｎｄ）」ことによってタンパク質を変性する陰イオン界面活性剤であり、ＳＤＳは１．４：１の質量比でかなり特異的にタンパク質に結合する。そのとき、ＳＤＳはポリペプチドにその長さに比例した負の電荷を付与する。さらに、通常、タンパク質が大きさによる分離のために必要なランダムコイル形状をとる前にタンパク質内のジスルフィド架橋を還元する（変性する）必要がある；これは２−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール（ＤＴＴ）で行われる。変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離では、それ故、移動はポリペプチドの内在性電荷によってではなく、分子量によって決定される。
【００６２】
分子量の決定は、特性決定しようとするタンパク質と共に公知の分子量のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行われる。ＳＤＳ変性ポリペプチドまたは未変性核酸の分子量の対数とそのＲｆの間には直線関係が存在する。Ｒｆは、マーカー染料フロントが移動した距離に対する分子が移動した距離の比率として計算される。電気泳動によって相対分子量（Ｍｒ）を決定する簡単な方法は、公知の試料について移動距離対ｌｏｇ１０分子量の標準曲線をプロットし、同じゲル上を移動した距離を測定した後、試料のｌｏｇＭｒを読み取ることである。
【００６３】
二次元電気泳動では、タンパク質を最初に１つの物理的性質に基づいて分画し、２番目の工程でもう１つ別の物理的性質に基づいて分画する。例えば等電点電気泳動は、チューブゲルにおいて好都合に実施される一次元目のために使用でき、スラブゲルでのＳＤＳ電気泳動は二次元目のために使用できる。手順の一例は、二次元電気泳動法に関するその教示について全体が参照によりここに組み込まれる、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１（１９７５）の手順である。他の例は、各々、二次元電気泳動法に関する教示についてその全体が参照によりここに組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＬとＡｎｄｅｒｓｏｎ，ＮＧ，Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４２１−５４２５（１９７７），Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．，Ｄｉｓｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｌ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１：３２１３４９（１９６４）に認められるものを含むが、これらに限定されない。
【００６４】
電気泳動法に関する教示についてその全体が参照によりここに組み込まれる、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０（１９７０）は、ＳＤＳで変性したタンパク質を分解するための不連続系を開示する。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝系におけるリーディングイオンは塩素であり、トレーリングイオンはグリシンである。従って、分解ゲルと濃縮ゲルはトリス−ＨＣｌ緩衝液（異なる濃度とｐＨの）中で作製され、タンク緩衝液はトリス−グリシンである。すべての緩衝液は０．１％ＳＤＳを含む。
【００６５】
本発明の方法において考慮される電気泳動を使用する免疫測定法の一例は、ウエスタンブロット分析である。ウエスタンブロット法または免疫ブロット法は、タンパク質の分子質量の決定および異なる試料中に存在するタンパク質の相対量の測定を可能にする。検出方法は、化学発光および発色検出を含む。ウエスタンブロット分析の標準方法は、各々、ウエスタンブロット法に関する教示についてそれらの全体が参照によりここに組み込まれる、Ｄ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（第２版、１９９６）およびＥ．Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、米国特許第４，４５２，９０１号に認められる。一般に、タンパク質はゲル電気泳動によって、通常ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離される。タンパク質は特殊なブロッティング用ろ紙、例えばニトロセルロースのシートに移されるが、他の種類の紙または膜も使用できる。タンパク質は、ゲル上で有していた分離の同じパターンを保持する。ブロットを一般的タンパク質（乳タンパク質など）と共にインキュベートし、ニトロセルロース上の残存する粘着部に結合させる。次に、その特異的タンパク質に結合することができる抗体を溶液に添加する。
【００６６】
特異的固定化抗原への特異的抗体の結合は、通常は発色基質（例えばアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）または発光基質を使用する、間接酵素免疫測定手法によって容易に視覚化できる。プロービングのための他の可能性は、蛍光または放射性同位体標識（例えばフルオレセイン、１２５Ｉ）の使用を含む。抗体結合の検出のためのプローブは、結合抗免疫グロブリン、結合ブドウ球菌プロテインＡ（ＩｇＧに結合）、またはビオチン化一次抗体に対するプローブ（例えば結合アビジン／ストレプトアビジン）であり得る。
【００６７】
この手法の検出力は、その抗原性および分子質量による特定タンパク質の同時検出にある。タンパク質を最初にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて質量によって分離し、次に免疫測定段階で特異的に検出する。それ故、不均一な試料中の対象タンパク質の分子質量に近付けるためにタンパク質標準品（ラダー）を同時に泳動させ得る。
【００６８】
ゲルシフトアッセイまたは電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、どちらも定性的および定量的に、ＤＮＡ結合タンパク質とそれらのコグネイトＤＮＡ認識配列の間の相互作用を検出するために使用できる。例示的な手法は、各々、ゲルシフトアッセイに関する教示についてその全体が参照によりここに組み込まれる、Ｏｒｎｓｔｅｉｎ  Ｌ．，Ｄｉｓｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ｉ：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１：３２１−３４９（１９６４）、およびＭａｔｓｕｄｉａｒａ，ＰＴとＤＲ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＳＤＳ  ｍｉｃｒｏｓｌａｂ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７：３８６−３９６（１９８７）に述べられている。
【００６９】
一般的なゲルシフトアッセイでは、精製タンパク質または粗細胞抽出物を標識（例えば３２Ｐ放射性標識）ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと共にインキュベートし、次いで非変性ポリアクリルアミドゲルを通して遊離プローブから複合体を分離することができる。複合体は、ゲルを通って非結合プローブよりも緩やかに移動する。結合タンパク質の活性に依存して、標識プローブは二本鎖または一本鎖のいずれかであり得る。転写因子のようなＤＮＡ結合タンパク質の検出のためには、精製または部分精製タンパク質もしくは細胞核抽出物が使用できる。ＲＮＡ結合タンパク質の検出のためには、精製または部分精製タンパク質、もしくは細胞核または細胞質抽出物が使用できる。推定上の結合部位に対するＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質の特異性は、対象タンパク質についての結合部位を含むＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドもしくは他の無関係な配列を使用する競合実験によって確認される。特異的および非特異的競合物質の存在下で形成される複合体の性質および強度の差は特異的相互作用の同定を可能にする。ゲルシフト法に関する教示についてその全体が参照によりここに組み込まれる、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｆａｑ／ｇｅｌｓｈｆａｑ．ｈｔｍｌ＞（最終アクセス２００５年３月２５日）にて入手可能な、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ  ＦＡＱ参照。
【００７０】
ゲルシフト法は、例えばポリアクリルアミド電気泳動ゲルのようなゲル中でタンパク質を検出するためにコロイド形態のクマシー（ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ）（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ）ブルー染色を使用することを含み得る。そのような方法は、例えば各々、ゲルシフト法に関する教示についてその全体が参照によりここに組み込まれる、Ｎｅｕｈｏｆｆら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ６：４２７−４４８（１９８５）、およびＮｅｕｈｏｆｆら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ９：２５５−２６２（１９８８）に述べられている。上記で言及した従来のタンパク質検定法に加えて、コンビネーションクリーニングおよびタンパク質染色組成物（ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）が、ゲルシフト法に関する教示についてその全体が参照によりここに組み込まれる、米国特許第５，４２４，０００号に述べられている。その溶液は、リン酸、硫酸および硝酸、およびアシッドバイオレット染料を含み得る。
【００７１】
放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）は、血清中の特異抗体を検出するために放射性標識抗原を使用する高感度アッセイである。抗原を血清と反応させ、次に、例えばプロテインＡセファロースビーズのような特殊試薬を用いて沈降させる。その後、結合した放射性標識綿基沈降物を、一般にはゲル電気泳動によって分析する。放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）はしばしばＨＩＶ抗体の存在を診断するための確認試験として使用される。ＲＩＰＡはまた、当技術分野ではファールアッセイ（Ｆａｒｒ  Ａｓｓａｙ）、プレシピチンアッセイ、放射免疫プレシピチンアッセイおよび放射免疫沈降分析法とも称される。
【００７２】
対象とする特定タンパク質を分離し、検出するために電気泳動を利用する上記免疫測定法は、タンパク質の大きさの評価を可能にするが、タンパク質濃度を評価するためにはあまり高感度でない。しかし、タンパク質またはタンパク質に特異的な抗体が、試料からそれぞれ抗体または対象タンパク質を捕獲するために固体支持体（例えばチューブ、ウェル、ビーズまたは細胞）に結合している免疫測定法を、支持体上でタンパク質またはタンパク質に特異的な抗体を検出する方法と組み合わせることも考慮される。そのような免疫測定法の例は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、マルチプレックスビーズアレイ、および磁気捕獲を含む。
【００７３】
放射免疫測定法（ＲＩＡ）は、直接または間接的に、特異的抗体または他の受容体系への非標識物質の結合を測定するために放射能標識した物質（放射性リガンド）を使用する、抗原−抗体反応の検出のための古典的な定量的アッセイである。放射免疫測定法は、例えばバイオアッセイを使用する必要なしに血液中のホルモンレベルを調べるために使用される。非免疫原性物質（例えばハプテン）も、抗体形成を誘導することができるより大きな担体タンパク質（例えばウシγ−グロブリンまたはヒト血清アルブミン）に結合する場合は測定され得る。ＲＩＡは、放射性抗原（ヨウ素原子をタンパク質内のチロシン残基に導入できる容易さの故に、放射性同位元素１２５Ｉまたは１３１Ｉがしばしば使用される）を、その抗原に対する抗体と混合することを含む。抗体は一般に、チューブまたはビーズのような固体支持体に結合される。非標識または「非放射性（ｃｏｌｄ）」抗原を、次に、既知量で添加し、置換された標識抗原の量を測定する。最初は、放射性抗原が抗体に結合される。非放射性抗原を添加したとき、２つは抗体結合部位に関して競合し、非放射性抗原の濃度が高いほど抗体により多く結合し、放射性変異型を置換する。結合抗原を溶液中の非結合抗原から分離し、各々の放射能を使用して結合曲線を作成する。この手法は極めて高感度および特異的である。
【００７４】
酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）またはより一般的に称されるＥＩＡ（酵素免疫測定法）は、タンパク質に特異的な抗体を検出することができる免疫測定法である。そのようなアッセイでは、抗体結合または抗原結合試薬のいずれかに結合する検出可能標識は酵素である。その基質に暴露されたとき、この酵素は、例えば分光測光法、蛍光光度法または視覚的手段によって検出できる化学成分を生成するように反応する。検出のために有用な試薬を検出可能に標識するために使用できる酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、アスパラギナーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない。ＥＬＩＳＡ手順の説明については、各々、ＥＬＩＳＡ法に関する教示についてその全体が参照によりここに組み込まれる、Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編集），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８０；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｏｌ．１（Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９２，ｐｐ．２０９−２５９；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｉｎ：ｖａｎ  Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ら（編集），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編集），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１）；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，“ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９５；米国特許第４，３７６，１１０号参照。
【００７５】
ＥＬＩＳＡ手法の変法は当業者に公知である。１つの変法では、タンパク質に結合し得る抗体を、ポリスチレンマイクロタイタープレート内のウェルのようなタンパク質親和性を示す選択表面に固定化することができる。次に、マーカー抗原を含むことが疑われる被験組成物をウェルに添加し得る。結合後および非特異的結合免疫複合体を除去するための洗浄後に、結合抗原を検出し得る。検出は、検出可能標識に連結された、標的タンパク質に特異的な二次抗体の添加によって達成され得る。この種のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、二次抗体の添加、次いで、二次抗体に結合親和性を有する、検出可能標識に連結された三次抗体の添加によっても達成され得る。
【００７６】
もう１つの変法は競合ＥＬＩＳＡである。競合ＥＬＩＳＡでは、被験試料は、既知量の標識抗原または抗体との結合に関して競合する。試料中の反応種の量は、被覆したウェルとのインキュベーションの前またはインキュベーションの間に既知の標識種と試料を混合することによって測定され得る。試料中の反応種の存在は、ウェルへの結合のために使用可能な標識種の量を低減し、それ故最終的なシグナルを低減する役割を果たす。
【００７７】
使用する様式に関わらず、ＥＬＩＳＡは、被覆、インキュベーションまたは結合、非特異的結合種を除去するための洗浄、および結合免疫複合体の検出のような、共通する一定の特徴を有する。抗原または抗体は、プレート、ビーズ、ディップスティック、膜またはカラムマトリックスの形態のような、固体支持体に連結することができ、分析する試料を固定化された抗原または抗体に適用し得る。抗原または抗体でプレートを被覆する場合、一般にプレートのウェルを抗原または抗体の溶液と共に一晩または指定された時間インキュベートする。次に、不完全に吸着された物質を除去するためにプレートのウェルを洗浄し得る。ウェルの何らかの残存する使用可能な表面は、その後、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「被覆」され得る。これらは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインおよび粉乳の溶液を含む。被覆は、固定化表面上の非特異的吸着部位をブロックすることができ、それ故表面への抗血清の非特異的結合によって生じるバックグラウンドを低減することを可能にする。
【００７８】
ＥＬＩＳＡにおいては、直接手順ではなく二次または三次検出手段も使用できる。そこで、ウェルへのタンパク質または抗体の結合、バックグラウンドを低減するための非反応性物質による被覆、および非結合物質を除去するための洗浄後、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするために有効な条件下で、固定化表面を対照臨床試料または試験する生物学的試料と接触させる。免疫複合体の検出は、次に、標識二次結合物質または標識三次結合物質と組み合わせた二次結合物質を必要とする。
【００７９】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするために有効な条件下」とは、条件が、非特異的結合を低減するためおよび妥当なシグナル対ノイズ比を促進するためにＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような溶液で抗原および抗体を希釈することを含むことを意味する。
【００８０】
適切な条件はまた、インキュベーションが、有効な結合を可能にするために十分な温度および期間であることを意味する。インキュベーション工程は、典型的には約１分間から１２時間、約２０℃から３０℃の温度であり得るか、または約０℃から約１０℃で一晩インキュベートし得る。
【００８１】
ＥＬＩＳＡにおけるすべてのインキュベーション工程後、非結合物質を除去するために接触表面を洗浄し得る。洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸緩衝液のような溶液による洗浄を含み得る。被験試料ともとの結合物質の間での特異的免疫複合体の形成とそれに続く洗浄後、ごくわずかな量の免疫複合体の発生も測定することができる。
【００８２】
検出手段を提供するために、二次または三次抗体は、上述したように検出を可能にするための結合標識を有し得る。これは、適切な発色基質とのインキュベーション後に呈色を生じさせ得る酵素であり得る。そこで、例えば一次または二次免疫複合体を、さらなる免疫複合体形成の発現を促進する期間および条件下で（例えばＰＢＳ−ＴｗｅｅｎのようなＰＢＳ含有溶液中室温で２時間のインキュベーション）標識抗体に接触させ、共にインキュベートすることができる。
【００８３】
標識抗体とのインキュベーション、およびそれに続く非結合物質を除去するための洗浄後、標識の量は、例えばペルオキシダーゼを酵素標識として使用する場合、尿素とブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジド−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸［ＡＢＴＳ］とＨ２Ｏ２のような発色基質と共にインキュベートすることによって定量できる。数量化は、その後、例えば可視スペクトルの分光光度計を使用して、色生成の程度を測定することによって達成され得る。
【００８４】
タンパク質アレイは、ガラス、膜、マイクロタイターウェル、質量分析計プレート、およびビーズまたは他の粒子を含む表面上の固定化タンパク質を使用する固相リガンド結合アッセイ系である。このアッセイは高度に平行（多重化）であり、しばしば小型化されている（マイクロアレイ、タンパク質チップ）。その利点は、迅速で、自動化可能であり、高感度であり得ること、試薬に関して経済的であり、１回の実験で豊富なデータを提供することを含む。バイオインフォマティクスの支援が重要である；データの取扱いには洗練されたソフトウエアとデータ比較解析が求められる。しかし、ハードウエアおよび検出システムの多くと同様に、ソフトウエアはＤＮＡアレイのために使用されるものから適合させ得る。
【００８５】
主要な様式の１つは捕捉アレイであり、このアレイでは、通常は抗体であるが選択的タンパク質足場、ペプチドまたは核酸アプタマーでもよい、リガンド結合試薬を、血漿または組織抽出物のような混合物中の標的分子を検出するために使用する。診断においては、捕捉アレイは、例えば個々の血清中のいくつかの分析物を試験するためおよび多くの血清試料を同時に試験するための両方の目的で、複数の免疫測定法を並行して実施するために使用できる。プロテオミクスでは、捕捉アレイは、健常および疾患状態の種々の試料中のタンパク質のレベルを定量し、比較するため、すなわちタンパク質発現プロファイリングのために使用される。特異的リガンド結合物質以外のタンパク質が、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−薬剤、酵素−基質等のようなインビトロでの機能的相互作用スクリーニングのためのアレイ様式において使用される。捕捉試薬自体が多くのタンパク質に対して選択およびスクリーニングされ、これはまた、多数のタンパク質標的に対する多重アレイ様式においても実施できる。
【００８６】
アレイに構築に関して、タンパク質のソースは、組換えタンパク質のための細胞ベースの発現系、天然ソースからの精製、無細胞翻訳系によるインビトロでの生産、およびペプチドのための合成法を含む。これらの方法の多くはハイスループット生産のために自動化できる。捕捉アレイおよびタンパク質機能分析のためには、タンパク質が正しく折りたたまれており、機能性であることが重要である；これは、例えば組換えタンパク質が変性条件下で細菌から抽出される場合には、必ずしも当てはまらない。それにもかかわらず、変性タンパク質のアレイは、抗体を交差反応性に関してスクリーニングする、自己抗体を同定する、およびリガンド結合タンパク質を選択する上で有用である。
【００８７】
タンパク質アレイは、しばしば蛍光読み出しを利用する、ＥＬＩＳＡおよびドットブロット法のような慣用免疫測定法の小型化と称され、多くのアッセイを平行して実施することを可能にするロボット工学およびハイスループット検出システムによって促進されてきた。一般的に使用される物理的支持体は、スライドガラス、シリコン、マイクロウェル、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜、および磁気または他のマイクロビーズを含む。平らな表面に送達されるタンパク質の微小滴が最も慣例的な様式であるが、選択的構造は、マイクロ流体工学（Ｇｙｒｏｓ，Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）の発達と、プレート内に工作されたマイクロチャネル（例えばＴｈｅ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｈｉｐ（商標），Ｂｉｏｔｒｏｖｅ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）およびシリコン表面上の極めて小さな３Ｄポスト（Ｚｙｏｍｙｘ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）のような特殊なチップデザインに基づくＣＤ遠心分離装置を含む。懸濁液中の粒子も、それらが同定のためにコード化されることを条件として、アレイのベースとして使用できる；システムは、マイクロビーズのためのカラーコード（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と半導体ナノ結晶（例えばＱＤｏｔｓ（商標），Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）、およびビーズのためのバーコード（ＵｌｔｒａＰｌｅｘ（商標），ＳｍａｒｔＢｅａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｂａｂｒａｈａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と多金属マイクロロッド（ｍｕｌｔｉｍｅｔａｌ  ｍｉｃｒｏｒｏｄｓ）（例えばＮａｎｏｂａｒｃｏｄｅｓ（商標）粒子、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を含む。ビーズはまた、半導体チップ上の平面アレイに構築することもできる（ＬＥＡＰＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）。
【００８８】
タンパク質の固定化は、カップリング試薬および結合する表面の性質の両方を含む。良好なタンパク質アレイ支持体表面は、カップリング手順の前後で化学的に安定であり、良好なスポット形態を可能にし、最小限の非特異的結合を示し、検出システムにおけるバックグランドに寄与せず、種々の検出システムと適合性である。使用される固定化法は、再現性があり、種々の性質（大きさ、親水性、疎水性）のタンパク質に適用でき、ハイスループットおよび自動化に適合しやすく、完全な機能的タンパク質活性の保持と適合性である。表面結合タンパク質の配向は、活性部位でそれをリガンドまたは基質に提示する上での重要な因子として認識されている；捕捉アレイのためには、一般にタンパク質の部位特異的標識を必要とする、配向された捕捉試薬によって最も効率的な結合結果が得られる。
【００８９】
タンパク質の固定化の共有結合法および非共有結合法の両方が使用されており、様々な賛否両論がある。表面への受動吸着は方法的には簡単であるが、定量的または配向制御がほとんど許容されない；タンパク質の機能的性質を変化させる場合やさせない場合があり、再現性および効率も多様である。共有結合カップリング法は、安定な連結を提供し、様々なタンパク質に適用でき、良好な再現性を有する；しかし、配向は可変的であり得、化学的誘導体化はタンパク質の機能を変化させることがあり、安定な相互作用性表面を必要とする。タンパク質上のタグを利用する生物学的捕捉法は、安定な連結を提供し、特異的に且つ再現可能な配向でタンパク質に結合するが、生物学的試薬を最初に適切に固定化しなければならず、アレイは特殊な取扱いを必要とすることがあり、様々な安定性を有し得る。
【００９０】
いくつかの固定化化学およびタグが、タンパク質アレイの製造のために記述されている。共有結合のための基質は、アミノまたはアルデヒド含有シラン試薬で被覆したスライドガラスを含む。Ｖｅｒｓａｌｉｎｘ（商標）システム（Ｐｒｏｌｉｎｘ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）では、フェニルジボロン酸で誘導体化されたタンパク質と支持体表面に固定化されたサリチルヒドロキサム酸の間の相互作用によって可逆的共有結合カップリングが達成される。これはまた、低いバックグラウンド結合と低い内在性蛍光を有し、固定化タンパク質が機能を保持することを可能にする。非修飾タンパク質の非共有結合は、三次元ポリアクリルアミドゲルに基づく、ＨｙｄｒｏＧｅｌ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）のような多孔構造内で起こる；この基質は、高い能力およびタンパク質機能の保持と共に、ガラスマイクロアレイで特に低いバックグラウンドを与えることが報告されている。広く使用される生物学的カップリング法は、タンパク質を適切に修飾した、ビオチン／ストレプトアビジンまたはヘキサヒスチジン／Ｎｉ相互作用を通してである。ビオチンは、二酸化チタン（Ｚｙｏｍｙｘ）または五酸化タンタル（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ，Ｗｉｔｔｅｒｓｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のような表面に固定化されたポリリシン骨格に結合され得る。
【００９１】
アレイ製造方法は、ロボットによる密着焼きつけ、インクジェット法、圧電スポッティング法およびフォトリソグラフィーを含む。多くの市販のアレイヤー［例えばＰａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］ならびに手動装置が使用可能である［Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］。細菌コロニーを、インサイチューでのタンパク質発現の誘導のためにロボット操作によりＰＶＤＦ膜にグリッド化することができる。
【００９２】
スポットの大きさおよび密度の限界は、ナノメートルの空間スケール上にスポットを有し、１ｍｍ２未満の単一チップ上で数千の反応を実施することを可能にする、ナノアレイである。ＢｉｏＦｏｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、光学検出の限界で、１ｃｍ２当たり２５００万スポットに等しい、８５平方ミクロン内に１５２１のタンパク質スポットを有するナノアレイを開発した；それらの読み出し方法は、蛍光および原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）である。
【００９３】
蛍光標識および検出法は広く使用されている。ＤＮＡマイクロアレイを読み取るために使用されるのと同じ装置がタンパク質アレイに適用できる。ディファレンシャルディスプレイのために、捕捉（例えば抗体）アレイを２つの異なる細胞状態からの蛍光標識したタンパク質でプローブすることができ、この方法では、色が標的量の変化についての読み出しとしての役割を果たすように、細胞溶解産物を種々の蛍光体（例えばＣｙ−３、Ｃｙ−５）と直接結合し、混合する。蛍光読み出しの感度は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって１０−１００倍増幅することができる。平面導波路技術（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ）は、超高感度蛍光検出を可能にし、介在する洗浄手順がないという付加的な利点を備える。高感度はまた、フィコエリトリンを標識として使用する（Ｌｕｍｉｎｅｘ）または半導体ナノ結晶の性質を利用する（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ）、懸濁ビーズおよび粒子によっても達成され得る。多くの新規選択的読み出し法が、特に商業的生物工学分野において、開発されている。これらは、表面プラズモン共鳴（ＨＴＳ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ，Ｔｅｍｐｅ，ＡＺ）の適合、ローリングサークル型ＤＮＡ増幅（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ  ＣＴ）、質量分析法（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、共鳴光散散乱（Ｇｅｎｉｃｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および原子間力顕微鏡検査［ＢｉｏＦｏｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］を含む。
【００９４】
捕捉アレイは発現プロファイリングのための診断チップおよびアレイの基礎を形成する。それらは、ハイスループット方式で特異的標的リガンドに結合し、検出するために、従来の抗体、単一ドメイン、工作された足場、ペプチドまたは核酸アプタマーのような高親和性捕捉試薬を用いる。
【００９５】
抗体アレイは、特異性と許容されるバックグラウンドという求められる性質を有し、一部は市販されている（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；ＢｉｏＲａｄ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。捕捉アレイのための抗体は、従来の免疫（ポリクローナル血清およびハイブリドーマ）によって、もしくは、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリーからの選択後、通常は大腸菌において発現される組換えフラグメントとして（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；Ｂｉｏｌｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ；Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）作製される。従来の抗体に加えて、ＦａｂおよびｓｃＦｖフラグメント、ラクダからの単一Ｖドメインまたは工作されたヒト等価物（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）もアレイにおいて有用であり得る。
【００９６】
「足場」という用語は、特異性と親和性という抗体様特性を有する多様な標的分子に結合することができる多数の変異体へと工作される、タンパク質のリガンド結合ドメインを指す。変異体は、一般的なライブラリー方式で生産され、ファージ、細菌またはリボソームディスプレイによって個々の標的に対して選択され得る。そのようなリガンド結合足場またはフレームワークは、黄色ブドウ球菌プロテインＡに基づく「アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ａｆｆｉｂｏｄｙ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む。フィブロネクチンに基づく「トリネクチン（Ｔｒｉｎｅｃｔｉｎｓ）」（Ｐｈｙｌｏｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）およびリポカリン構造に基づく「アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）」（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ−Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。これらは、抗体と同様に捕捉アレイで使用でき、堅固さと生産の容易さという利点を有し得る。
【００９７】
非タンパク質捕捉分子、特に高い特異性と親和性でタンパク質リガンドに結合する一本鎖核酸アプタマーも、アレイにおいて使用される（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）。アプタマーは、Ｓｅｌｅｘ（商標）手順によってオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択され、それらのタンパク質との相互作用は、臭素化デオキシウリジンおよび紫外線活性化架橋（フォトアプタマー）の組込みを通して、共有結合によって増強され得る。リガンドへの光架橋は、特異的な立体要求の故に、アプタマーの交差反応性を低下させる。アプタマーは、自動化オリゴヌクレオチド合成による生産の容易さおよびＤＮＡの安定性と堅固さという利点を有する；フォトアプタマーアレイでは、結合を検出するために万能蛍光タンパク質染色が使用できる。
【００９８】
抗体アレイに結合するタンパク質分析物は、直接またはサンドイッチアッセイにおける二次抗体によって検出され得る。直接標識は、異なる色を有する異なる試料の比較のために使用される。同じタンパク質リガンドに対する抗体の対が使用可能である場合、サンドイッチ免疫測定法は高い特異性と感受性を提供し、それ故サイトカインのような量の少ないタンパク質について選択される方法である；それらはまた、タンパク質修飾の検出の可能性を与える。質量分析、表面プラズモン共鳴および原子間力顕微鏡検査を含む無標識検出法は、リガンドの変化を回避する。いかなる方法からも求められるのは、高いシグナル対ノイズ比を与える低いバックグラウンドと共に、最適の感受性と特異性である。分析物濃度は広範囲にわたるので、感受性を適切に調整しなければならない；試料の連続希釈または異なる親和性の抗体の使用がこの問題に対する解決策である。対象タンパク質はしばしば、サイトカインまたは細胞中の低発現産物のような、ピコグラム範囲またはそれ以下での検出を必要とする、体液および抽出物中に低濃度で存在するものである。
【００９９】
捕捉分子のアレイの代替物は、「分子インプリント」技術を通して作製されるものであり、この方法では、ペプチド（例えばタンパク質のＣ末端領域からの）が、重合可能なマトリックスにおいて構造的に相補的な配列特異的空洞（ｃａｖｉｔｙ）を生成するための鋳型として使用され、次にそれらの空洞が、適切な一次アミノ酸配列を有する（変性）タンパク質を特異的に捕捉し得る（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｉｎｔ（商標），Ａｓｐｉｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。
【０１００】
診断的におよび発現プロファイリングにおいて使用できるもう１つの方法はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）であり、この方法では、固相クロマトグラフィー表面が、血漿または腫瘍抽出物のような混合物からの類似の電荷または疎水性特徴を有するタンパク質を結合し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法が保持タンパク質の検出のために使用される。
【０１０１】
多数の精製タンパク質を固定化することによって大規模機能性チップが構築されており、他のタンパク質とのタンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用、酵素−基質等のような広い範囲の生化学的機能を検定するために使用されてきた。一般にそれらは、大腸菌、酵母等にクローニングされた発現ライブラリーを必要とし、その後、例えばＨｉｓタグによって、発現されたタンパク質がそれらから精製され、固定化される。無細胞タンパク質転写／翻訳は、細菌または他のインビボ系では良好に発現しないタンパク質の合成のための実行可能な代替法である。
【０１０２】
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、タンパク質アレイは、細胞ベースの酵母ツーハイブリッドシステムに対するインビトロでの代替法であり得、分泌タンパク質またはジスルフィド架橋を有するタンパク質を含む相互作用のように、前記システムが不十分である場合に有用であり得る。アレイ上の生化学的活性のハイスループット分析は、酵母プロテインキナーゼおよび酵母プロテオームの様々な機能（タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質−脂質相互作用）に関して記述されており、すべての酵母オープンリーディングフレームの大きな割合がマイクロアレイで発現され、固定化された。大規模な「プロテオームチップ」は、機能的相互作用の同定、薬剤スクリーニング等において非常に有用であることを期待させる（Ｐｒｏｔｅｏｍｅｔｒｉｘ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）。
【０１０３】
個々の要素の二次元表示として、タンパク質アレイは、抗体、合成足場、ペプチドおよびアプタマーを含む特異的結合パートナーを選択するために、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングするために使用できる。このようにして、「ライブラリー対ライブラリー」スクリーニングが実施できる。ゲノムプロジェクトから同定されたタンパク質標的のアレイに対する、コンビナトリアル化学物質ライブラリーにおける薬剤候補物質のスクリーニングは、このアプローチのもう１つの適用である。
【０１０４】
例えばＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙのような、マルチプレックスビーズアッセイは、可溶性分析物を捕捉し、定量するために使用できる一連のスペクトル的に別個の粒子である。分析物を、次に、蛍光に基づく発光の検出およびフローサイトメトリー分析によって測定する。マルチプレックスビーズアッセイはＥＬＩＳＡベースのアッセイに比肩し得るデータを生じるが、「多重化」または同時様式である。未知の物質の濃度は、サンドイッチ形式のアッセイと同様に、すなわち公知の標準品の使用および標準曲線に対して未知物質をプロットすることを通して、サイトメトリービーズアレイに関して算定される。さらに、マルチプレックスビーズアッセイは、試料容量の制限の故にこれまで一度も考慮されたことがない試料中の可溶性分析物の定量を可能にする。定量的データに加えて、一見しただけで使用者に付加的な情報を提供する独特のプロフィールまたは特徴を明らかにする強力な視覚画像が生成され得る。
【０１０５】
ここで開示するＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールは、個々のＭＭＰまたはＴＩＭＰの測定に基づく。これらの量は、これらのうちのいずれかが分析する試料中にどの程度存在するかの許容される指標を与えることが公知の何らかの手段によって測定できる。測定手段の一例を実施例に示す。分析物（例えばＭＭＰまたはＴＩＭＰ）の量を測定する工程は、分析物の皆無または検出不能量の測定を含む。
【０１０６】
本発明の基礎を形成するＭＭＰおよびＴＩＭＰを測定するための手法およびアプローチは高感度免疫測定法に基づいた。これらの免疫測定法のいくつかは本研究室によって開発された（すなわちＴＩＭＰ−４アッセイ測定）。表４に示す測定を提供するために標準化された免疫測定アプローチを酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）によって実施した。しかし、ＭＭＰおよびＴＩＭＰの血中レベルを測定するための他のより感受性のある迅速な方法が本研究室によって実施されており、これらはマルチプレックスアッセイシステムの使用を含む。この例では、血漿または他の生物学的試料のような容量の限られた試料中の多数の分析物を、ビーズベースのマルチプレックスサンドイッチ免疫測定法を用いて測定できる。多重分析のためのこの新たに出現した手法は、ＥＬＩＳＡの感受性をフローサイトメトリー検出と組み合わせる技術の上に確立されたものであり、５０μｌ未満の単一試料中の１００までの異なる分析物の特定的測定を可能にする。このアプローチは小さな血液試料中の多数のＭＭＰおよびＴＩＭＰの測定を可能にする。この種のアプローチは、ここで述べる診断、予後、予測および治療監視適用に極めて適する。特に、分析物濃度を同時に測定するために、マイクロビーズを試料（すなわち血液試料）と共にインキュベートし、特定対象分析物（すなわちＭＭＰ）と複合体を形成させる。次に、各々の分析物上の２番目のエピトープに特異的な検出抗体（ビオチン化）を混合物に添加し、分析物と複合したマイクロビーズに結合させる。その後混合物を蛍光レポーター分子（ストレプトアビジン−フィコエリトリン）と共にインキュベートし、試料全体を２角度レーザーフローサイトメトリー検出器に通す。１つのレーザーは、検査する特定分析物を定義するマイクロビーズの正確な蛍光を検出し、多胞のレーザーは、結合した分析物の量に直接比例するレポーター蛍光の量を検出する。この工程は、多くのＭＭＰおよびＣＨＦ過程への潜在的可能性を保持する他の分析物に適用されており、これらを図１７および表１に示す。これは、どのようにして単一または多数の分析物が非常に少量の血液試料で測定できるかの一例にすぎない。ＭＭＰ／ＴＩＭＰ分析物に関して実施された測定の他の例は、放射免疫測定法および免疫ブロット分析を含む。これらのアプローチも抗体ベースである。
【０１０７】
【表１】
2009544013.tif 000002
７．抗体
ＭＭＰおよびＴＩＭＰに特異的な抗体は公知であり、市販されている。抗体の例を表２に示す。
【０１０８】
【表２】
2009544013.tif 000003
「抗体」という用語は、ここでは広い意味で使用され、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。無傷免疫グロブリン分子に加えて、それらがＭＭＰまたはＴＩＭＰと相互作用する能力のために選択される限り、これらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたは重合体、およびヒト型またはヒト化免疫グロブリン分子またはそのフラグメントも、「抗体」の用語に包含される。抗体は、ここで述べるインビトロアッセイを使用してまたは類似の方法によって、それらの所望活性に関して試験することができ、その後、それらのインビボでの治療および／または予防活性が公知の臨床試験法に従って試験される。
【０１０９】
ここで使用する「モノクローナル抗体」という用語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、すなわち集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセット内に存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、ここでは特に、それらが所望拮抗活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来するもしくは特定抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分はもう１つ別の種に由来するもしくはもう１つ別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体内の対応配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１１０】
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を生産する何らかの手順を用いて作製され得る。例えば開示されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって述べられているようなハイブリドーマ法を用いて作製できる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物を、典型的には、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を惹起するために免疫化剤で免疫する。あるいは、リンパ球は、例えばここで述べるＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４共受容体複合体を使用して、インビトロで免疫され得る。
【０１１１】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）に述べられているような組換えＤＮＡ法によっても作製され得る。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離でき、それを、従来の手順を用いて（例えばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定し得る。抗体または活性な抗体フラグメントのライブラリーも作製でき、例えばＢｕｒｔｏｎらへの米国特許第５，８０４，４４０号およびＢａｒｂａｓらへの米国特許第６，０９６，４４１号に述べられているようなファージディスプレイ手法を用いてスクリーニングし得る。
【０１１２】
インビトロ法も一価抗体を作製するのに適する。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生成するための抗体の消化は、当技術分野において公知の常用手法を用いて達成され得る。例えば、消化はパパインを使って行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日公開の国際公開広報第ＷＯ９４／２９３４８号および米国特許第４，３４２，５６６号に述べられている。抗体のパパイン消化は、典型的には、各々が１つの抗原結合部位を有する、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りのＦｃフラグメントを生産する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、まだ抗原に架橋することができるフラグメントを生じる。
【０１１３】
フラグメントはまた、他の配列に結合しているか否かにかかわらず、抗体または抗体フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して有意に変化していないまたは損なわれていないことを条件として、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択修飾を含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合することができるアミノ酸を除去する／付加する、その生体寿命（ｂｉｏ−ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）を延長する、その分泌特性を変化させる等のような何らかの付加的性質を提供し得る。いかなる場合も、抗体または抗体フラグメントは、そのコグネイト抗原への特異的結合のような生物活性を有していなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能的または活性領域は、タンパク質の特定領域の突然変異誘発とそれに続く発現および発現されたポリペプチドの試験によって同定され得る。そのような方法は、当業者に容易に明白であり、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を含み得る（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【０１１４】
ここで使用するとき、「抗体」という用語はまた、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を表わし得る。多くの非ヒト抗体（例えばマウス、ラットまたはウサギに由来するもの）は生来ヒトにおいて抗原性であり、従ってヒトに投与したとき望ましくない免疫応答を生じさせ得る。それ故、上記方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が望ましくない免疫応答を惹起する可能性を低減させる役割を果たす。
【０１１５】
８．参照値
被験体におけるＬＶＤの存在を指示するまたはＬＶＤの発症を予測するＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰのプロフィールが提供される。被験体におけるＬＶＤの存在を指示するまたはＬＶＤの発症を予測するプロフィールは、正常値に対して相対的であり得る。所与の分析物（ＭＭＰまたはＴＩＭＰ）についての正常値は、有意の心臓血管疾患の証拠を有さない、年齢が適合する被験体についての参照値であり得る。そこで、正常値は、有意の数の健常個人から導かれる、集団に基づく値であり得る。これらの参照正常値は、集団に基づく試験から得られ得る。例えば参照群におけるＴＩＭＰ−１の相対的レベルを約８００ｎｇ／ｍＬと特定した、大きな集団に基づく試験が存在し（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００４；１０９：２８５０−２８５６）、前記の値は表４に示す参照対照値と一致する。
【０１１６】
あるいは、正常値は、所与の被験体について正常とみなされる値であり得る。例えば関連分析物のベースライン測定値を健常個人について作製し、現在の疾患またはＬＶＤへの進行を特定するためにその個人から後日獲得された測定値との比較のために使用することができる。
【０１１７】
ＭＭＰおよびＴＩＭＰの各々ならびにＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ比の参照正常値を表７に示す。
【０１１８】
付加的な参照正常値および心筋梗塞後の患者において生じる値を表４にまとめる。有意とみなされるこれらの分析物の各々の予測パーセント変化および疾患過程についての診断は、これらの絶対値より下に置かれる。２以上のＭＭＰまたはＴＩＭＰ測定は、高い特異性で診断するためまたは最適予後情報を提供するために特に有用であり得る。例えば、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−７の変化を伴わずに、１００％より大きいＭＭＰ／ＴＩＭＰ比と結びついた、ＭＭＰ−９の１００％以上の上昇は、最大の感受性と特異性を提供する。
【０１１９】
例えばＭＭＰ−１３についての別個の所見は、所与の分析物の血漿濃度のような連続的変数を二値変数に変換する場合である。この特定の場合、＋／−値がＭＭＰ−１３に割り当てられ、１０ｎｇ／ｍＬより大きい値は検出可能または陽性値とみなされ、１０ｎｇ／ｍＬ未満の値は陰性値とみなされる。
【０１２０】
例えば、被験体の組織または体液中のＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰレベルを測定し、前記レベルを参照値と比較することを含む、被験体における心筋梗塞の不在を診断する、または被験体が、心筋梗塞に特異的な有害心室リモデリングによる心不全を発症する危険度が高くないことを判定する方法が提供される。それ故、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−８、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４のうちの１、２、３、４、５、６、７または８についての正常値は、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１２１】
一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−２血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−９血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−８血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＴＩＭＰ−１血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＴＩＭＰ−２血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＴＩＭＰ−４血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１２２】
一部の態様では、約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００および１５００ｎｇ／ｍｌを含む、約１０００−１５００ｎｇ／ｍｌのＭＭＰ−２血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１２３】
一部の態様では、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎｇ／ｍｌ未満を含む、約２０ｎｇ／ｍｌ未満のＭＭＰ−９血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１２４】
一部の態様では、約３、２または１ｎｇ／ｍｌ未満を含む、約３ｎｇ／ｍｌ未満のＭＭＰ−８血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１２５】
一部の態様では、約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０または１０ｎｇ／ｍｌ以上を含む、約１０００ｎｇ／ｍｌ未満のＴＩＭＰ−１血漿レベルは、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１２６】
前記方法は、２またはそれ以上のＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰの血漿レベルを測定することをさらに含み得る。例えば前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−８、ＴＩＭＰ−Ｉ１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４のうちの２、３、４、５、６、７または８を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９、またはＭＭＰ−２とＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−７とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−７とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−１３とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３とＴＭＰ−１、ＭＭＰ−１３とＴＩＭＰ−１３、ＭＭＰ−１３とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−４、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−４、ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−１；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。これらの分析物の他の組合せが考慮され、ここで開示される。
【０１２７】
前記方法はさらに、他のＭＭＰまたはＴＩＭＰに対するＭＭＰまたはＴＩＭＰの１またはそれ以上の比率を計算することを含み得る。例えば前記方法は、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−４の比率を計算することを含み得る。
【０１２８】
例えば一部の態様では、約１５×１０３、１４×１０３、１３×１０３、１４×１０３、１１×１０３、１０×１０３、９×１０３、または８×１０３未満を含む、約１５×１０３未満のＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率は、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１２９】
一部の態様では、約５０×１０４、４０×１０４、３０×１０４、または２０×１０４未満を含む、約５０×１０４未満のＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率は、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１３０】
一部の態様では、約１０、９、８、７、６、５、４、３または２未満を含む、約１０未満のＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心筋梗塞の不在の指標である。
【０１３１】
９．診断
ＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰについての血漿プロフィールは、ＭＩ後の早期期間に得られ得る。これは、最も一般的なＭＩのための介入処置（血栓溶解、血管形成術、ステント等）の時間である、ＭＩから約７２時間以内と定義される。このプロフィールから、破壊されるＬＶ心筋マトリックスの程度が評価でき、心筋層がＭＩによってどの程度影響を受けているかの決定的で固有の測定を提供する。このセットのＭＭＰ／ＴＩＭＰ測定は、トロポニンまたはクレアチンキナーゼレベルのようなＭＩが起こっていることを同定するためのバイオマーカーの現在の使用と組み合わせて使用され得る。しかし、これらのバイオマーカーと異なり、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールは、心筋層がＭＩによってどの程度影響を受けているかを同定する（損傷心筋層および「境界（ｂｏｒｄｅｒ）」または無害な無関係の心筋層）。ここで述べる特異的ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールは、ＭＩ後に起こる心筋層の構造変化の程度に関する情報を提供し、これらの構造変化がどのような心室形状、すなわち容積の変化を生じさせるかの予測的および定量的評価を提供し得る。加えて、バイオマーカーの現在の慣用測定とＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルを組み合わせることにより、全体的心筋損傷および潜在的な罹患心筋層の範囲に関する診断を導く数学モデルを構築することができる。例えばＭＭＰ／ＴＩＭＰ測定値と組み合わせたトロポニン値の使用は、ＭＩ後の早期期間に急性血行力学的代償の危険度が高い患者を同定し、層化するために使用できる。説明のために、ＭＩ後２４時間目に正常値の３倍のＭＭＰ−９レベルおよび正常値より２倍低いＴＩＭＰ−４レベルと共に、正常値の２．５倍のトロポニン値を有する患者は、おそらくより慎重な監視と潜在的な致死的不整脈のための追加薬剤に値する。この説明の論理的根拠は、ＭＩ後の早期期間の罹病率および死亡率の重要な原因である致死的不整脈が、不可逆的に損傷された心筋層の程度それ自体のために起こるのではなく、むしろ、主としてＭＭＰ／ＴＩＭＰの変化によって決定される、生存可能な再灌流心筋層の急性リモデリングの程度によって起こるという事実である。
【０１３２】
例えば、被験体の組織または体液中のＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰレベルを測定し、前記レベルを参照値と比較することを含む、被験体において心筋梗塞を診断する方法が提供される。一部の態様では、組織または体液は、胸痛の発現から約７２時間以内に被験体から採取される。
【０１３３】
一部の態様では、約１０００、９９０、９８０、９７０、９６０、９５０、９４０、９３０、９２０、９２０、９００、８９０、８８０、８７０、８６０、８５０、８４０、８３０、８２０、８１０、８００、７９０、７８０、７７０、７６０、７５０、７４０、７３０、７２０、７１０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、２５０または１００ｎｇ／ｍｌ未満を含む、約１０００  ｎｇ／ｍｌ未満のＭＭＰ−２血漿レベルは、心筋梗塞の指標である。
【０１３４】
一部の態様では、正常値より高いＭＭＰ−９血漿レベルは心筋梗塞の指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９の量は、心筋梗塞の指標であり得る。一部の態様では、約２０、２１、２２、２３、２４、１５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍｌ以上を含む、約２０ｎｇ／ｍｌより高いＭＭＰ−９血漿レベルは、心筋梗塞の指標である。
【０１３５】
一部の態様では、正常値より高いＭＭＰ−８血漿レベルは心筋梗塞の指標である。例えば正常平均値を少なくとも約５０％上回るＭＭＰ−８の量は、心筋梗塞の指標であり得る。一部の態様では、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇ／ｍｌ以上を含む、約３ｎｇ／ｍｌより高いＭＭＰ−８血漿レベルは、心筋梗塞の指標である。
【０１３６】
一部の態様では、正常値より高いＴＩＭＰ−１血漿レベルは心筋梗塞の指標である。例えば正常平均値を少なくとも約５０％上回るＴＩＭＰ−１の量は、心筋梗塞の指標であり得る。一部の態様では、約１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００または１５００ｎｇ／ｍｌ以上を含む、約１０００ｎｇ／ｍｌより高いＴＩＭＰ−１血漿レベルは、心筋梗塞の指標である。
【０１３７】
一部の態様では、正常範囲内のＴＩＭＰ−２血漿レベルは心筋梗塞の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＴＩＭＰ−４血漿レベルは心筋梗塞の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−７血漿レベルは心筋梗塞の指標である。一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−１３血漿レベルは心筋梗塞の指標である。
【０１３８】
本発明の方法はさらに、２またはそれ以上のＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰの血漿レベルを測定することを含み得る。例えば前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−８、ＴＩＭＰ−１、ＴＭＰ−２およびＴＭＰ−４のうちの２、３、４、５、６、７または８を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９、またはＭＭＰ−２とＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−７とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−７とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−１３とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３とＴＭＰ−１、ＭＭＰ−１３とＴＩＭＰ−１３、ＭＭＰ−１３とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−４、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−４、ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−１；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。これらの分析物の他の組合せが考慮され、ここで開示される。
【０１３９】
前記方法はさらに、他のＭＭＰまたはＴＩＭＰに対するＭＭＰまたはＴＩＭＰの１またはそれ以上の比率を計算することを含み得る。例えば前記方法は、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−４の比率を計算することを含み得る。
【０１４０】
一部の態様では、正常値より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率は心筋梗塞の指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１の比率は、心筋梗塞の指標であり得る。例えば一部の態様では、約１５×１０３、１６×１０３、１７×１０３、１８×１０３、１９×１０３、２０×１０３、２１×１０３、２２×１０３、２３×１０３、２４×１０３、１５×１０３、２６×１０３、２７×１０３、２８×１０３、２９×１０３、３０×１０３、３１×１０３、３２×１０３、３３×１０３、３４×１０３、３５×１０３、３６×１０３、３７×１０３、３８×１０３、３９×１０３、４０×１０３、４１×１０３、４２×１０３、４３×１０３、４４×１０３、４５×１０３、４６×１０３、４７×１０３、４８×１０３、４９×１０３、５０×１０３、５５×１０３、６０×１０３、６５×１０３、７０×１０３、７５×１０３、８０×１０３、８５×１０３、９０×１０３、９５×１０３または１００×１０３以上を含む、約１５×１０３より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率は、心筋梗塞の指標である。
【０１４１】
一部の態様では、正常値より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率は心筋梗塞の指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２の比率は、心筋梗塞の指標であり得る。一部の態様では、約５０×１０４、５１×１０４、５２×１０４、５３×１０４、５４×１０４、５５×１０４、５６×１０４、５７×１０４、５８×１０４、５９×１０４、６０×１０４、６５×１０４、７０×１０４、７５×１０４、８０×１０４、８５×１０４、９０×１０４、９５×１０４、１００×１０４、１０５×１０４、１１０×１０４、１１５×１０４、１２０×１０４、１２５×１０４、１３０×１０４、１３５×１０４、１４０×１０４または１５０×１０４以上を含む、約５０×１０４より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率は、心筋梗塞の指標である。
【０１４２】
一部の態様では、正常値より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は心筋梗塞の指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４の比率は、心筋梗塞の指標であり得る。一部の態様では、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００以上を含む、約１０より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心筋梗塞の指標である。
【０１４３】
一部の態様では、約１５×１０３より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率、約５０×１０４より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率、および約１０より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心筋梗塞の指標である。
【０１４４】
一部の態様では、約１０００ｎｇ／ｍｌ未満のＭＭＰ−２血漿レベル、約３ｎｇ／ｍｌより高いＭＭＰ−８血漿レベル、約１５×１０３より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率、約５０×１０４より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率、および約１０より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心筋梗塞の指標である。
【０１４５】
１０．予後
ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールは、数日間にわたるＭＩ期間後早期に、例えば好ましくは１−７日目の間のいつかに測定することができる。これは非常に一般的なフォローアップ期間であり、それ故ＭＩ後５−７日間を以下で報告する実現可能性試験において使用した。しかし、本明細書中別の部分で述べるように、有用な予後および診断情報は、急性疾患の経過中を通じてまたは回復期の時点で得られ得る。特異的ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの変化を、次に、その後数カ月／数年以内に重篤な有害ＬＶリモデリングおよび拡張の危険度が高い患者を同定するために使用できる。実施例に示すように、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの予後的価値を裏付ける実質的なデータが生成された。例えばＭＩ後７日間のいずれかの時点で患者においてＭＭＰ−９、ＭＭＰ−８、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４を測定することは、特異的な時間的パターンを明らかにした。この時間的パターンは、ＭＩの約１カ月後に起こるＬＶ拡張の程度を予測するために使用できる。この予後情報は、次に、さらなる画像試験、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールおよびより積極的な投薬レジメンの追加を通して危険度の高い患者をより積極的に追跡するために使用できる。
【０１４６】
例えば被験体の組織または体液中のＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰレベルを測定し、前記レベルを参照値と比較することを含む、心筋梗塞に特異的な有害心室リモデリングによる心不全を発症する危険度が高い被験体を同定する方法が提供される。
【０１４７】
一部の態様では、約１０００、９９０、９８０、９７０、９６０、９５０、９４０、９３０、９２０、９２０、９００、８９０、８８０、８７０、８６０、８５０、８４０、８３０、８２０、８１０、８００、７９０、７８０、７７０、７６０、７５０、７４０、７３０、７２０、７１０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、２５０または１００ｎｇ／ｍｌ未満を含む、約１０００  ｎｇ／ｍｌ未満のＭＭＰ−２血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１４８】
一部の態様では、正常値より高いＭＭＰ−９血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９の量は、心不全を発症する危険度が高いことの指標であり得る。一部の態様では、約２０、２１、２２、２３、２４、１５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍｌ以上を含む、約２０ｎｇ／ｍｌより高いＭＭＰ−９血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１４９】
一部の態様では、正常値より高いＴＩＭＰ−１血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。例えば正常平均値を少なくとも約５０％上回るＴＩＭＰ−１の量は、心不全を発症する危険度が高いことの指標であり得る。一部の態様では、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍｌ以上を含む、約５０ｎｇ／ｍｌより高いＴＩＭＰ−１血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１５０】
一部の態様では、正常範囲内のＴＩＭＰ−２血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。一部の態様では、正常範囲内のＴＩＭＰ−４血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。一部の態様では、約１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００または１５００ｎｇ／ｍｌ以上を含む、約１０００ｎｇ／ｍｌより高いＴＩＭＰ−２血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１５１】
一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−７血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−８血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。一部の態様では、正常範囲内のＭＭＰ−１３血漿レベルは、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。一部の態様では、ＴＩＭＰ−４血漿レベルは正常範囲内である。
【０１５２】
本発明の方法はさらに、２またはそれ以上のＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰの血漿レベルを測定することを含み得る。例えば前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−８、ＴＩＭＰ−１、ＴＭＰ−２およびＴＭＰ−４のうちの２、３、４、５、６、７または８を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９、またはＭＭＰ−２とＭＭＰ−７、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−７とＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−７とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−７とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−１３とＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３とＴＭＰ−１、ＭＭＰ−１３とＴＩＭＰ−１３、ＭＭＰ−１３とＴＩＭＰ−４、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−８とＴＩＭＰ−４、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−４、ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−１；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４；ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。それ故、前記方法は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−４を測定することを含み得る。これらの分析物の他の組合せが考慮され、ここで開示される。
【０１５３】
前記方法はさらに、他のＭＭＰまたはＴＩＭＰに対するＭＭＰまたはＴＩＭＰの１またはそれ以上の比率を計算することを含み得る。例えば前記方法は、ＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−４の比率を計算することを含み得る。
【０１５４】
一部の態様では、約１５×１０３、１６×１０３、１７×１０３、１８×１０３、１９×１０３、２０×１０３、２１×１０３、２２×１０３、２３×１０３、２４×１０３、１５×１０３、２６×１０３、２７×１０３、２８×１０３、２９×１０３、３０×１０３、３１×１０３、３２×１０３、３３×１０３、３４×１０３、３５×１０３、３６×１０３、３７×１０３、３８×１０３、３９×１０３、４０×１０３、４１×１０３、４２×１０３、４３×１０３、４４×１０３、４５×１０３、４６×１０３、４７×１０３、４８×１０３、４９×１０３、５０×１０３、５５×１０３、６０×１０３、６５×１０３、７０×１０３、７５×１０３、８０×１０３、８５×１０３、９０×１０３、９５×１０３または１００×１０３以上を含む、約１５より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１５５】
一部の態様では、正常値より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２の比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標であり得る。一部の態様では、約５０×１０４、５１×１０４、５２×１０４、５３×１０４、５４×１０４、５５×１０４、５６×１０４、５７×１０４、５８×１０４、５９×１０４、６０×１０４、６５×１０４、７０×１０４、７５×１０４、８０×１０４、８５×１０４、９０×１０４、９５×１０４、１００×１０４、１０５×１０４、１１０×１０４、１１５×１０４、１２０×１０４、１２５×１０４、１３０×１０４、１３５×１０４、１４０×１０４または１５０×１０４以上を含む、約５００より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１５６】
一部の態様では、正常値より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４の比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標であり得る。一部の態様では、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００以上を含む、約１０より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１５７】
一部の態様では、正常値より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。例えば正常平均値を少なくとも約１００％上回るＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１の比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標であり得る。一部の態様では、約１５×１０３より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率、約５０×１０４より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率、および約１０より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１５８】
一部の態様では、約１０００ｎｇ／ｍｌ未満のＭＭＰ−２血漿レベル、約３ｎｇ／ｍｌより高いＭＭＰ−８血漿レベル、約１５×１０３より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１血漿レベルの比率、約５０×１０４より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２血漿レベルの比率、および約１０より大きいＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４血漿レベルの比率は、心不全を発症する危険度が高いことの指標である。
【０１５９】
１１．治療的介入処置の誘導
急性ＭＩ期間後、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの監視がＬＶ心筋リモデリングについてのバイオマーカーとして使用される。これに関して、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールは、薬理的効果の読み出しとしてモニタリングすることができる。この適用に関連して構築され得る数多くの臨床例が存在するが、説明例をここで適用する。現在の米国心臓学会／米国心臓病学会のガイドラインは、ＭＩ後患者を現在の薬剤：スタチン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断薬および血小板アンタゴニストの投与下に置くべきであることを明確に述べている。これらの薬剤が推奨されているが、特定患者について最適効果を与える特定用量は不明である。さらに、これらの薬剤のいくつかは、用量を上昇させたとき、望ましくない副作用（低血圧、性的副作用等）を増加させ得る。そこで、ＭＩ後患者において起こりつつある心筋リモデリングの程度の指標を与える信頼し得るバイオマーカーのセットは、合理的な投与レジメンを開発するための方法を提供する。治療標的は、ＭＩ後患者においてＭＭＰおよびＴＩＭＰレベルを正常化し、これらのＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルを連続的にモニタリングして、正常ＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルを維持するために必要に応じて薬剤を調節することである。スタチンおよびアンギオテンシン変換酵素阻害剤などの薬剤が心臓血管系内のＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルに影響を及ぼし得ることを明らかにした堅固なセットの試験が存在する。それ故、現在の薬剤がＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルに影響を及ぼし得るという事実と合わせて実施例１、２、３および４に示すデータは、ＭＩ後期間に治療効果を誘導するための手段としてのＭＭＰ／ＴＩＭＰプロファイリングの使用に関する根拠を提供する。
【０１６０】
１２．併用
ここで開示される方法は、心不全の他のマーカーを検出することをさらに含み得る。例えばここで開示される方法は、被験体の組織または体液中のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルを測定し、前記レベルを参照値と比較することをさらに含み得る。ここで開示される方法は、被験体の組織または体液中のトロポニンＩレベルを測定し、前記レベルを参照値と比較することをさらに含み得る。
【０１６１】
１３．測定の時期
時期決定のためには２つの段階がある。第一は、基礎となる疾患過程の存在を考慮してまたは除外して、予後情報を提供することである。２番目は、スクリーニングのために血漿プロファイリングを利用し、心不全発症の危険性があり得る患者を同定することである。以下で説明し、診断、予後および治療モニタリングのために明らかにされるように、測定の時期は症例特異的である。診断のためには、初めの測定の時期はＭＩの発症から最初の７２時間以内である。これは、患者がＭＩの徴候および症状（胸痛等）を経験し、これらの症状が、ＭＩを指示するＥＣＧによって確認される時点と定義される。医師は次に、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの異常の程度およびＭＩの結果として起こりつつある心筋リモデリングの程度を判定するための血液検査を適用する。これは医師をさらなる診断検査および治療計画へと導く。採血の時期のもう１つの例は、患者が急性ＭＩについて成功裏に治療されたときであるが、医師は、その後の医学的／介入的管理を導くための予後情報を得たいと考える。この場合、ＭＩ後早期期間（７日目まで）にわたってＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールを連続的にモニタリングすることが、実施例１においてＬＶ拡張として定義される、ＬＶリモデリングの進行についての予測ツールとして使用できる。それ故、本出願において述べる試験のための血液採取の時期は症例依存的である。これらの試験は、所与の被験体において診断ツールとして１回だけ適用され得るか、または複数回にわたって連続的に適用され得る。
【０１６２】
心筋梗塞の状況では、血漿プロファインリングは心筋梗塞の確認から７２時間以内に開始され得る。血漿プロファインリングは、入院期間中（２−７日間）および定期的に予定されるフォローアップ訪問時に継続され得る。これは、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ比についての経時的地図を提供し、より高いＭＭＰおよびＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルを有する患者を同定する。これらの患者は、心不全が進行したとき有害な心室リモデリングの危険性が高いとみなされる。これらの測定は、確定された心筋梗塞後最初の２年間、３か月ごとに実施され得るが、２−９６ヶ月間毎日、週に１回または月に１回の測定が考慮される。心筋梗塞後の心不全（冠症候群）の危険度が高い患者を追跡し、同定するために使用される潜在的アルゴリズムの概略図を図１６に示す。
【０１６３】
ひとたび患者が閾値ＭＭＰ、ＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルを有すると同定されれば、より積極的な慣例的医学療法が開始され得る。これは、βアドレナリン作動薬の漸増、アンギオテンシン阻害（変換酵素および受容体阻害）、スタチン療法、追加的な血管再生介入処置（カテーテルおよび外科手術ベース）を含み得る。次に、ＭＭＰおよびＭＭＰ／ＴＩＭＰ比を月に１回の割合で測定し、医学／介入戦略の有効性を測定するために使用する。
【０１６４】
そこで、ＭＭＰ量およびＭＭＰ／ＴＩＭＰ比をモニタリングし、これらの測定および比率に基づき心不全の危険度の高い患者を同定して、患者に適切な薬剤またはより高レベルの適切な薬剤（βアドレナリン作動薬、アンギオテンシン阻害（変換酵素および受容体阻害）、スタチン）、または追加的な血管再生介入処置（カテーテルおよび外科手術ベース）を与えることを含む、改善された心臓患者ケアの方法が提供される。
【０１６５】
心筋梗塞、心臓血管性胸痛、または他の冠動脈事象の病歴を有する患者は、一次医療または医学的スクリーニング検査の間に血漿プロフィールを実施され得る。ＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルが表４で特定されるものに合致するまたはそれらを超える場合、これらの患者はより積極的に評価され、さらなるフォローアップが開始され得る。
【０１６６】
最初の試料は、ＥＲ／胸痛診療所への入院時に、ＥＣＧ判定基準によるＭＩの確認後に採取され得る。ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールをこの時点で測定し得る。２回目のＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールは、この最初の測定から７２時間以内に測定し得る。しかし、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの時間的忠実度を高めるために１回目と２回目の測定の間の断続的試料採取（８−１２時間の間隔）も実施し得る。患者に退院の準備させる時点で、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの変化の相対的大きさを、本出願の中で述べるアルゴリズムに供し得る。これは、有害なＬＶリモデリングおよび心不全を発症する危険度の高い患者の危険度層化を可能にする。その後、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールのより大きな変化を有する患者を、より積極的な投薬戦略およびより高い頻度の診療所来訪下に置くことができる。診療所来訪戦略を以下で述べる。
【０１６７】
患者がＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの有意のシフトを有すると診断される場合、月に１回の間隔で来訪を反復し、その際にＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールを測定して、これらのプロフィールを「正常化する」ために薬剤の調節を行うことができる。これらの値が正常化したときには、患者を３カ月に１回の間隔で測定し得る。
【０１６８】
ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールの小さなシフトの診断を有する患者は、半年ごとの割合で反復測定を受けることができる。これらのプロフィールの上方へのシフトが起こる場合は、薬剤増加および試料採取頻度上昇に関して上述した戦略を進めることができる。
【０１６９】
ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールが、指標事象（ＭＩの急性治療のための入院）の時点で最初に測定されなかった、ＭＩの病歴を有する患者も、この診断アプローチに含めることができる。この場合、ＭＩの病歴がある有害ＬＶリモデリングの高危険度を有する患者は、最初の診療所来訪時に試料採取し得る。ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールを正常参照範囲と比較して、有害なＬＶリモデリングの危険度を指示する高いＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールを有する患者を、前の章で述べたような積極的治療に関して考慮することができる。
【０１７０】
Ｃ．キット
ここで開示される方法を実施するときに使用できる試薬を与えるキットがここで開示される。キットは、ここで論じるもしくは開示される方法の実施において必要とされるまたは有益であることが了解される試薬または試薬の組合せを含み得る。前の章で述べたように、ＭＭＰ／ＴＩＭＰキットの成分は、対象とするＭＭＰおよび／またはＴＩＭＰを検出試薬に結合するために必要な試薬を含む。免疫測定法アプローチの例において、特異的ＭＭＰまたはＴＩＭＰに対する蛍光標識抗体を血液試料と共にインキュベートし、洗浄および非特異的結合の除去工程後、対象ＭＭＰまたはＴＩＭＰに結合した抗体の量を、蛍光の相対的程度を測定することによって算出する。これは、スクリーニングのため、または多数のＭＭＰ／ＴＩＭＰを単一試料から測定するより複雑なシステムのために使用できる、非常に簡単なキットであり得る。１つの対象ＭＭＰまたはＴＩＭＰの測定を多数のＭＭＰ／ＴＩＭＰを同時に測定することへと進めるアプローチについての論理的根拠は前の章に述べられている。スクリーニングアッセイ（例えばＭＭＰ−９）のために、小さな血液試料を血漿へと処理し（遠心分離）、血漿をＭＭＰ−９標的抗体と混合する。混合物を再び遠心分離し、ＭＭＰ−９に結合した特異的結合抗体を蛍光定量システムによって読み取る。この装置および測定システムは、容易に小さなスーツケースまたは卓上システムにすることができる。システムからの読み出しは、ＭＭＰ−９が特定閾値測定（ここで定義されるような）より下または上であるかどうかを指示する。
【実施例】
【０１７１】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、ここで特許請求される化合物、組成物、製品、装置および／または方法がどのようにして作製され、評価されるかの完全な開示と説明を当業者に提供するために提示されるものであり、純粋に本発明の例示であることが意図され、発明人が自らの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されない。数（例えば量、温度等）に関しては正確さを保証するために努力を払ったが、ある程度の誤差および逸脱が含まれるはずである。異なる指示がない限り、割合は重量比であり、温度はセ氏または周囲温度であり、圧は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１７２】
（１．実施例１：心筋梗塞後の患者におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの詳細な経時的プロフィール：左心室リモデリングとの関係）
結論：ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−８の早期で堅固な上昇、ＴＩＭＰ−２の遅れて起こる上昇、および心臓特異的ＴＩＭＰ−４の均一な低下を含む、ＭＭＰ／ＴＩＭＰの詳細な時間的パターンがＭＩ後患者において生じた。これらの独特の所見は、予後および診断の両方の重要性を保持する特異的なＭＭＰ／ＴＩＭＰ血漿プロフィールがＭＩ後に起こることを示す。
【０１７３】
方法
被験体：心筋梗塞（ＭＩ）が確認された３２名の患者および５３名の参照対照被験体を、インフォームドコンセントを得た後でこの試験に登録した。ＭＩの確認は、心電図検査および陽性心筋酵素パネルによって実施した。ＭＩ被験体としての登録のための判定基準は、救急治療室に搬入された時点から４８時間以内に記録されたトロポニンＩ値が検査室参照値より２．５倍高いことであった。以下のいずれかが存在する場合は患者を登録から除外した：１）ＭＩの既往歴、２）過去２４カ月以内の冠動脈血管再生手術、３）緊急冠動脈血管再生の必要が予想されること、４）虚血性心疾患以外の心臓病状態（アミロイドーシス、サルコイドーシス、ＨＩＶ、遺伝性肥大型閉塞性心筋症、心臓弁膜症など）、５）過去３年以内の活動性悪性疾患、６）重大な腎または肝機能不全、７）重大な抗炎症薬、ステロイドまたは免疫抑制薬を必要とする進行中または活動性のリウマチ疾患、８）物質乱用の重大な経歴。以下の項で述べる試験の時期は、救急治療室への最初の搬入時点と定義される、指標事象に基づいた。この試験に関して、これらの初めのセットの測定をＭＩ後１日目と同定した。この試験のために、登録期間は２００１年秋から２００２年春までであった。症状の発現に対する治療介入処置までの平均時間は３．５±０．９時間であり、最初の検査までの時間は７１±８時間で、平均時間は５０時間であった。このＭＩ後患者コホートにおいて、３３％が血栓溶解治療を受け、８９％が経皮的冠動脈形成術（ステントを伴うまたは伴わない血管形成術）を受けた。ＭＩの分布は、心電図検査によって測定したとき３６％が前壁、６１％が下壁、および３％が後壁であった。ＳＴ部分上昇がＭＩ患者の８４％で認められ、Ｑ波がＭＩ患者の４８％で認められた。ピークトロポニンレベルは１６６±３０ｎｇ／ｍＬであった。入院時の平均白血球数は１０．７±０．７２  １０３細胞／ｍｍ３で、わずかに上昇していた。
【０１７４】
参照対照群は、心臓血管疾患の証拠がない被験体で構成された。心臓血管疾患は、完全な病歴、包括的な理学的検査、心電図および心エコー図を実施することによって除外した。参照対照およびＭＩ被験体についての患者情報および投薬プロフィールを表３に示す。ＭＩ患者については、投薬プロフィールは、ＭＩ後１日目に実施され、試験期間を通じて継続されたものである。ＭＩ患者についての投薬プロフィールは主治医によって決定され、米国心臓学会／米国心臓病学会のガイドラインに従った。対照被験体については、βアンタゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、及びアンギオテンシン受容体アンタゴニストが収縮期血圧の軽度の上昇を治療するために使用されたが、心エコー検査に基づき肥大の証拠は存在しなかった。１名の患者において、心房性細動の１回のエピソードのずっと以前の病歴を治療するためにジギタリスが使用されていた。参照対照群において、アスピリンまたは抗炎症薬が関節炎の痛みに対する日常的薬剤管理の一部として使用されていた。
【０１７５】
【表３】
2009544013.tif 000004
プロトコール：ＭＩ患者については、試験登録の時点で（「ＭＩ後１日目」）検査を実施した。最初の試験は、完全な病歴、包括的な理学的検査、１２誘導心電図、心エコー図、およびＭＭＰとＴＩＭＰプロフィールの測定のための血漿の採集を含んだ。血液は末梢静脈から採取し、遠心分離によって血漿を収集した。血漿を、ＭＩ後２−５日目、およびＭＩ後２８、９０および１８０日目にＭＭＰおよびＴＩＭＰプロフィールの測定のために使用した。ＭＩ後５、２８、９０および１８０日目に心エコー図も入手した。各々の試験に先立ってすべての患者を一晩絶食させたが、処方されている午前中の薬剤は服用させた。対照被験体については、ＭＩ後１日目にＭＩ後患者に対するものと同じ完全な試験を実施した。
【０１７６】
ＭＭＰおよびＴＩＭＰプロフィール：この試験のために、種々のＭＭＰクラスからの代表的ＭＭＰを測定した。詳細には、間質コラゲナーゼＭＭＰ−８、ゼラチナーゼ；ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９、およびマトリライシンサブクラスからのＭＭＰ−７（Ｓｐｉｎａｌｅ  ＦＧ．２００２；Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  ＦＪ．１９９８；Ｇｕｎａｓｉｎｇｈｅ  ＳＫら、２００１）。これらのＭＭＰ型を選択するための理論的根拠は、それらがＭＩ後に変化することが動物試験において同定されており、急性損傷後のマトリックスリモデリングに結び付けられて来たことである（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＪＴら、２００１；Ｃｒｅｅｍｅｒｓ  ＥＥら、２００２；Ｄｕｃｈａｒｍｅ  Ａら、２０００；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  Ｒら、２００３；Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭら、２００３；Ｓｃｈｕｌｚｅ  ＣＪら、２００３）。ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２の組織阻害因子が患者の血漿中で成功裏に同定され、ＭＩの動物モデルにおいて変化することが示されたので（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  Ｒら、２００３；Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭら、２００３；Ｂｒａｄｈａｍ  ＷＳら、２００２；Ｊｏｆｆｓ  Ｃら、２００１；Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭら、２００２）、これらを本試験において測定した。すべての測定のためのアプローチは、先に述べられている方法を利用する（Ｂｒａｄｈａｍ  ＷＳら、２００２；Ｊｏｆｆｓ  Ｃら、２００１；Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭら、２００２）２部位酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用した。簡単に述べると、患者を２０分間仰臥位のままにした後、血液を採集した。試料を直ちに遠心分離し、血漿層を取り出した。分離した血漿を３つの等しいアリコートに分け、−８０℃で凍結した。試料を解凍せず、再凍結した。血漿およびそれぞれのＭＭＰ標準品を、対象ＭＭＰまたはＴＩＭＰに対する抗体を含む前被覆したウェルに添加し、洗浄した。生じた反応を４５０ｎｍの波長で読み取った（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣＣ／３４０，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）。ＭＭＰ−２アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＲＰＮ  ２６１７）は、ＭＭＰ−２のプロ形態およびＴＩＭＰ−２と複合したＭＭＰ−２を検出する。ＭＭＰ−９アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＲＰＮ  ２６１４）は、この酵素のプロ形態およびＴＩＭＰ−１と複合したＭＭＰ−９を検出する。ＭＭＰ−８アッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＲＰＮ２６１９）は、プロ形態および活性形態を検出する。ＭＭＰ−７アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＤＭＰ７００）は、プロ形態および活性形態を検出する。ＴＩＭＰ−１アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＲＰＮ  ２６１１）は、遊離ＴＩＭＰ−１およびＭＭＰと複合したＴＩＭＰ−１を検出する。ＴＩＭＰ−２アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＲＰＮ  ２６１８）は、遊離ＴＩＭＰ−２および活性ＭＭＰと複合したＴＩＭＰ−２の両方を検出する。これらは、０．０１６−１ｎｇ／ｍＬの検出範囲を有する高感度アッセイ系であった。すべての試料を２回分析し、平均化した。これらの測定についてのアッセイ内変動係数は６％未満であった。過去の試験は、ＴＩＭＰ−４が心臓��管系、特に心筋層内で固有におよび高度に発現されることを実証した（Ｌｉ  ＹＹら、１９９９；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｊら、１９９６）。さらに、過去の試験は、この特異的なＴＩＭＰがＭＩの動物モデルにおいて変化していることを実証した（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  Ｒら、２００３；Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭら、２００３；Ｙａｒｂｒｏｕｇｈ  ＷＭら、２００３）。この研究室は以前に、ＴＩＭＰ−４が免疫測定法アプローチを通して測定され得ることを報告した（Ｓｔｒｏｕｄ  ＲＥら、２００５）。従って、高い特異性（他のＴＩＭＰまたはプロテアーゼとの交差反応性なし）を有する高感度（０．００８ｎｇ／ｍＬ）ＥＬＩＳＡが使用された（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）。このアッセイは、広範囲のＴＩＭＰ−４標準品にわたって（０．００３−０．０１８ｎｇ／ｍＬ）高い直線性（ｒ２＝０．９５）で遊離および結合ＴＩＭＰ−４の両方を測定した。このＥＬＩＳＡはまた、以前にこの研究室によって記述された定量的免疫測定法を利用して交差較正され（ｃｒｏｓｓ−ｃａｌｉｂｒａｔｅ）、有効性確認された（Ｓｔｒｏｕｄ  ＲＥら、２００５）。定量的ＥＬＩＳＡを通してＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を測定することに加えて、半定量的測定がゼラチンザイモグラフィーを通して実施された（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＪＴら、２００１；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  Ｒら、２００３；Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭら、２００３；Ｓｐｉｎａｌｅ  ＦＧら、２０００）。
【０１７７】
心エコー検査法：経胸壁超音波心臓検査を、Ｓｏｎｏｓ  ５５００システムをＳ−４  ＭＨｚトランスデューサーと共に使用して実施した。測定は、米国心エコー図学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ）の判定基準を使用して行った（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＮＢら、１９８９）。ＬＶ容積および駆出率の測定を得るために標準的な短軸および左室長軸断面図を使用して二次元心エコー検査を実施した。「ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｄｉｓｃｓ」を用いてＬＶ拡張末期および収縮末期容量を計算した（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＮＢら、１９８９）。３拍動の平均をすべての測定に使用した。僧帽弁逆流の程度を検査し、定量するために僧帽弁のドップラーおよびカラー心エコー検査を実施した。画像をコード化して、盲検方式で読み取り、試験の完了までのこの解析をＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルには結びつけないままにした。
【０１７８】
データの解析：心エコー図およびＭＭＰとＴＩＭＰの血漿測定から導かれた測定値の分布を、歪度および尖度の試験に基づく正規性に関して検定した。この評価は、データが正規分布に合致すると推定され得ることを明らかにし、それ故パラメトリック統計学を用いた。それ故、本試験において提示されたすべてのＭＭＰ／ＴＩＭＰデータは、未変換方式で提示された。参照対照試料とＭＩ後患者の間のベースライン比較を、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。反復測定ＡＮＯＶＡを用いて経時的な変化を解析し、平均値分離ボンフェローニ補正法（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｂｏｕｎｄｓ）によって実施した。ＭＩ後期間のＬＶ容積に対するＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルの変化の関係を直線回帰法によって検討した。ピークトロポニンレベルは正規分布ではなく（シャピロ・ウィルクＷ検定、ｐ＝０．００１）、それ故ＭＭＰレベルの変化とＬＶ容積の間の関連付けを、スピアマン相関アプローチを用いて実施した。＜０．０５のｐ値を有意とみなした。すべての値は平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示している。すべての統計手順はＳｔａｔａ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳｔａｔａＣｏｒｐ，Ｒｅｌ  ８．０，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を用いて実施した。著者はデータへのフルアクセス権を有し、その完全性について責任を負う。すべての著者が原稿を読み、記載されている通りであることに同意している。
【０１７９】
結果
年齢が適合する対照とＭＩ後患者についての最初の試験で得た、ＬＶ形状および機能ならびに全身血圧と心拍数の測定を表４にまとめる。このＭＩ後早期の時点で、参照対照被験体と比較してＬＶ拡張末期容量は増大し、全身動脈血圧は低下した。図１に示すように、ＭＩ後群ではＬＶ拡張末期容量が時間依存的に増大した。ＬＶ拡張末期容量は、ＭＩ後２８日目にＭＩ後１日目の値から上昇していた。ＬＶ拡張がＭＩ後群において起こったが、ＬＶ駆出率はＭＩ後早期にわずかに上昇し、その後残りのＭＩ後試験期間中は参照対照範囲内に低下した。ドップラー試験は、ＭＩ後試験期間を通じて評価したとき、ＭＩ後患者の７２％で有意の僧帽弁逆流（ＭＲ）を示さず、ＭＩ後患者の１９％でごくわずかなＭＲ、９％で１＋ＭＲを明らかにした。
【０１８０】
【表４】
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最初の試験時点で得られたＭＭＰ−２、−７、−８、−９、ＴＩＭＰ−１、−２および−４の血漿レベルについての絶対値を、参照対照群およびＭＩ後群に関して表５にまとめる。これらの測定を参照対照値からのパーセント変化としても算定した。ＭＭＰ−２レベルは、ＭＩ後１日目には参照対照値よりも低かった。これに対し、ＭＭＰ−８および−９レベルは、参照対照値と比較してＭＩ後１日目には有意に高かった。例えば血漿ＭＭＰ−９レベルは、ＭＩ後１日目には参照対照値より２００％以上高かった。血漿ＴＩＭＰ−１レベルはＭＩ後１日目により高かったが、ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−４レベルは参照対照値から変化しなかった。相対的ＭＭＰ−９レベルの変化とＴＩＭＰレベルの変化の間の化学量論的関係を検討するため、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ比を算定した（表４）。参照対照値と比較したとき、ＭＩ後１日目にＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１比は１００％以上上昇し、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−２およびＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比は２００％以上上昇した。
【０１８１】
【表５】
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ＭＩ後患者において経時的に測定したＭＭＰプロフィールを図２に示す。ＭＭＰ−２のプロ形態についての血漿レベルは、比較対照値より低いままであった。総ＭＭＰ−７についての血漿レベルは、試験期間全体にわたって参照対照値と同等のままであった。ＭＭＰ−８レベルはＭＩ後１日目に有意に上昇し、ＭＩ後３日目に再び急上昇すると思われた。ＭＭＰ−９のプロ形態についての血漿レベルは、ＭＩ後９０日目まで有意に高いままであった。血漿試料をゼラチンザイモグラフィーに供し、おそらくＭＭＰ−９レベルを反映する、明瞭なタンパク質分解性バンドが９２ｋＤａで認められた（図３）。この９２ｋＤａ領域でのザイモグラフィー活性は、ＭＩ後早期の時点で参照正常対照に比べて高かった。ＭＭＰ−２を反映する、７２ｋＤａのタンパク質分解性バンドは、ＭＩ後２８日目に上昇すると思われたが、他のすべてのＭＩ後時点では正常参照値内のままであった。
【０１８２】
ＴＩＭＰプロフィールの連続的血漿測定を図４に示す。ＴＩＭＰ−１レベルはＭＩ後試験期間を通じて実質的に高いままであり、ＴＩＭＰ−２レベルはＭＩ後２８日目および９０日目に参照対照値より高かった。ＴＩＭＰ−４血漿レベルは、すべてのＭＩ後時点で参照対照値より低いままであった。ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−４の時間依存的変化の間の関係を図４に示す。ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比はＭＩ後早期の時点で有意に高く、ＭＩ後１８０日目に再び上昇した。
【０１８３】
ＭＩ後１日目から５日目までの血漿ＭＭＰ−９レベルの変化についての個別応答プロットを図５に示す。個別ＭＭＰ−９レベルの混合応答がこの時間枠内で起こり、それ故個別応答をＭＩ後１日目の値からのパーセント変化として算定した。これらの値を、次に、ＭＩ後２８日目のＬＶ拡張末期容量の変化に関係づけた（図５）。持続的に高いＭＭＰ−９レベルを有するまたはＭＩ後５日目にＭＭＰ−９レベルの上昇があった患者では、２８日目にＬＶ拡張末期容量のはるかに大きな上昇が起こった。血漿ＭＭＰ−９レベルの早期変化の相対的な大きさを、ＭＩ後１日目から５日目へのＭＭＰ−９レベルの３５％上昇に基づいて層化した。血漿ＭＭＰ−９レベルがＭＩ後１日目の値からさらに上昇した患者では、ＭＩ後９０日目にＬＶ拡張末期容量のより大きなパーセント変化が起こった（図６）。ＬＶ拡張の程度とＭＭＰ−２、−７、−８またはＴＩＭＰ−１、−２レベルの早期変化の間に有意の関係は存在しなかった（それぞれｒ＝０．２７、０．１０、０．０４、−０．２０、−０．２４、すべてｐ＞０．２０）。しかし、ＬＶ拡張の程度とＭＭＰ−９の早期変化の間には有意の関係があった。特に、ＭＩ後１日目から３日目までの間に検出されたＭＭＰ−９レベルのより堅固な変化は、ＭＩ後９０日目のより大きな程度のＬＶ拡張に結びついた（ｒ＝０．６３、ｐ＝０．０３）。ピークトロポニンレベルはＭＭＰ−９レベルの早期変化に結びつかず（ｒ＝０．０１、ｐ＝０．９４）、ＬＶ拡張末期容量の変化にも関連しなかった（ｒ＝−０．３２、ｐ＝０．１７）。他の共変数に関しては、ＭＩの位置またはＭＩ後の薬剤にわたって層化したとき、ＭＭＰ／ＴＩＭＰレベルに有意差はなかった（ｐ＞０．４０）。
【０１８４】
本試験は、ＭＩ後の患者における代表的ＭＭＰおよびＴＩＭＰ型についての血漿プロフィールならびにＬＶ形状を連続的に測定した。この試験からの独自で有意の所見は２相性であった。第一に、ＭＭＰとＴＩＭＰ放出の異なる時間的パターンがＭＩ後患者において生じた。詳細には、血漿ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−８の急激な上昇がＭＩ後に起こったが、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−２のような他のＭＭＰ型は、変化しないままであるかまたは参照対照より低かった。血漿ＴＩＭＰ−１レベルは上昇したが、心臓特異的ＴＩＭＰ−４はＭＩ後に低下した。第二に、特定のＭＭＰ型、すなわちＭＭＰ−９の早期上昇と、ＭＩ後後期に起こるＬＶ拡張の程度の間に関係が認められた。これらの結果は、ＭＩ後の患者においてＭＭＰおよびＴＩＭＰレベルに動的変化が起こること、およびこのタンパク質分解系のプロファイリングがＭＩ後の有害なＬＶリモデリングに関して臨床的有用性を有することを明らかにした。
【０１８５】
ＭＩ後期間に、ゼラチナーゼサブクラスに属するＭＭＰの血漿プロフィールには明確で区別的な変化があった。詳細には、ＭＭＰ−２レベルはＭＩ後早期の期間に低下し、より長いＭＩ後期間では正常範囲内に戻った。これに対し、血漿ＭＭＰ−９レベルはＭＩ後３０日目まで有意に高く、その後正常範囲内に戻った。ＭＩ後患者におけるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９プロフィールのこれらの相違の根拠は、おそらく転写調節の相違ならびにこれらのＭＭＰ型についての細胞ソースの相違によるものである。ＭＭＰ−９は、そのプロモーター領域内に、ＭＭＰ−２プロモーター領域内には存在しない、ＡＰ−１結合部位のような多くの転写因子結合ドメインを含む（Ｂｏｒｄｅｎ  Ｐら、２００４）。腫瘍壊死因子のようなサイトカインはＭＩ後早期の期間に産生され、インビトロでＭＭＰ−９転写を誘導することが明らかにされた（Ｅｓｔｅｖｅ  ＰＯら、２００２；Ｅｔｏｈ  Ｔら、２００１）。しかし、サイトカインを介したＭＭＰ−２転写の同様の堅固な上昇は報告されていない。それ故、ＭＩ後期間におけるサイトカインの活性化および他の生物活性分子の産生は、ＭＭＰ−９を特異的に誘導すると考えられる。筋細胞および線維芽細胞のようなすべての細胞型がＭＭＰ−９を発現し得るが、ＭＭＰ−９の重要なソースは好中球である（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  ＦＪ．１９９８；Ｇｕｎａｓｉｎｇｈｅ  ＳＫら、２００１）。それ故、ＭＩ後早期の期間に認められるＭＭＰ−９レベルの堅固な上昇は、おそらく好中球の局所動員および脱顆粒によるものであった。
【０１８６】
本試験は、血漿ＭＭＰ−９の早期変化とＭＩ後期間の後期に起こる有害なＬＶ拡張の間の結びつきを提供する。本臨床報告からの結果は、ＭＩ後早期に認められるＭＭＰ−９レベルの堅固な上昇が、おそらく後期ＭＩ後期間にＬＶ拡張として発現する有害な心筋構造リモデリング過程の開始を反映することを示唆する。本試験では、このＬＶリモデリングは、ＬＶ駆出率の変化がないことによって実証されたように、収縮機能の有意の低下には結びつかなかった。早期時点で認められたＬＶ駆出率の上昇は、おそらく神経ホルモン系の活性化上昇によるものであった。
【０１８７】
コラゲナーゼＭＭＰ−８の血漿レベルの早期上昇がＭＩ後患者において検出された。ＭＭＰ−８は、主として好中球およびマクロファージのような炎症細胞によって合成され、放出されるが、心線維芽細胞および筋細胞を含む他の細胞型においても発現されることが報告された（Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭら、２００３）。ＭＩ後１日目に同定されたＭＭＰ−８の高い血漿レベルは、おそらく急性炎症過程を反映する。２番目のピークは、極めて変動的であるが、ＭＩ後３日目に起こった。ＭＭＰ−８についてのこの２番目のピークは、おそらくＭＩ治癒過程のこの段階の間に起こるマクロファージの流入を反映する。
【０１８８】
ＴＩＭＰは、すべてのＭＭＰの活性触媒ドメインに結合し、それによってこの酵素のタンパク質分解作用を阻害する低分子量タンパク質のファミリーである。これが、当初はこれらの低分子量タンパク質の唯一の機能であるとみなされていたが、現在では、ＴＩＭＰは、細胞の増殖および生存能への作用ならびにＭＭＰ活性化カスケードへの関与を含む、広い範囲の付加的な生物学的性質を有することが認識されている（Ｂａｋｅｒ  ＡＨら、２００２）。本試験では、６か月のフォローアップ期間を通じてＭＩ後患者においてはＴＩＭＰ−１についての血漿レベルが有意に高かった。本試験は、ＭＩ後期間の早期にはＭＭＰ−９対ＴＩＭＰ−１またはＴＩＭＰ−２比は高いままであり、それが長期的なＭＭＰ活性化状態を促進するが、ＭＩ後期間の後期にはこれらの化学量論的関係は正常化するかまたは逆転することを明らかにした。これは、心筋層において高発現される特異的ＴＩＭＰ、ＴＩＭＰ−４（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｊら、１９９６；Ｓｔｒｏｕｄ  ＲＥら、２００５）をＭＩ後患者において測定した最初の試験である。年齢が適合する対照被験体と比較したとき、血漿ＴＩＭＰ−４レベルは低下し、相対的ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比は上昇していた。これらの所見は、ＭＩ後患者においては心筋ＭＭＰの阻害性制御の有意で長期的な変化が起こることを示す。
【０１８９】
この試験に包含されたＭＩ後患者の血漿中で認められたＭＭＰおよびＴＩＭＰレベルの経時的変化は、心筋層内で起こる動的変化を反映する。本試験は、ＭＭＰおよびＴＩＭＰの固有で時間的に多様な血漿プロフィールがＭＩ後患者において定量でき、予後および診断的有用性を有することを明らかにした。
【０１９０】
本出願全体を通じて、様々な公表文献が参照される。これらの公表文献の開示全体が、本発明が関連する技術分野の技術水準をより詳細に説明するために参照により本出願に組み込まれる。
【０１９１】
（２．実施例２：肥大型閉塞性心筋症におけるアルコール中隔焼灼術後のマトリックスメタロプロテイナーゼの放出）
この試験は、肥大型閉塞性心筋症（ＨＯＣＭ）を有する患者におけるアルコール誘導性ＭＩの前後の一部のＭＭＰおよびＴＩＭＰ種の血漿レベルを検討した。
【０１９２】
方法および結果：ＨＯＣＭを有する５１名の患者（年齢５５±２歳）において、ゼラチナーゼ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９について、およびコラゲナーゼ、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３についての血漿レベル、ならびにＴＩＭＰ−１プロフィール（ＥＬＩＳＡによる）を、ベースライン時およびＭＩを誘導するための心室中隔貫通動脈へのアルコール注入後６０時間目まで連続的に得た。心筋損傷を指示する、血漿クレアチンキナーゼ（ＭＢアイソフォーム）はＭＩ後１８時間目に２１５０％上昇していた（ｐ＜０．０５）。ＭＩ後１２時間目までに、血漿ＭＭＰ−９はベースライン値から４００％以上上昇し、ＭＭＰ−８は１００％以上上昇した（ベースライン値に対してｐ＜０．０５）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−１３に関しては同様の時間的プロフィールは認められなかった。加えて、ＭＩ後に血漿ＴＩＭＰ−１レベルの付随する上昇は起こらなかった。結果として、ＭＭＰ／ＴＩＭＰ化学量論（ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１比）はＭＩ後有意に上昇し、細胞外心筋リモデリングを潜在的に増強する、ＴＩＭＰ−１媒介性ＭＭＰ−９阻害の低下を示唆した。
【０１９３】
結論：これの独特の結果は、特にアルコール誘導性ＭＩを通しての、ヒトにおける制御された心筋損傷の誘導が、ＭＩ後早期の状況での心筋リモデリングを促進するＭＭＰ／ＴＩＭＰ化学量論の種および時間依存的変動を引き起こすことを明らかにした。
【０１９４】
肥大型閉塞性心筋症（ＨＯＣＭ）は、最も一般的にはＬＶ流出路の中隔大動脈下領域の過剰増殖性心筋成長によって特徴づけられる遺伝性疾患である（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２）。ＨＯＣＭは、それ故、血行力学的に重大なＬＶ流出路閉塞、最終的なＬＶポンプ機能不全、および結果として起こるＬＶ不全の症状をもたらし得る。ＨＯＣＭ患者におけるＬＶ流出路閉塞の軽減のための現在の１つのアプローチは、中隔大動脈下領域内で選択的にＭＩを誘導することによる（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ｂ；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＷＨら、２０００）。心室中隔貫通動脈へのエタノールの標的注入を通して、ＬＶ流出路閉塞に関与する心筋層の選択的破壊が多くの患者において成功裏に実施されている（Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ｂ；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＷＨら、２０００）。概念的には、この治療アプローチはアルコール誘導性ＭＩを生じさせ、それ故、患者におけるＭＭＰと心筋損傷の間の関係についてのいくつかの決定的に重要な問題に取り組むまたとない機会を提供する。第一に、アルコール誘導性ＭＩ後の患者の血漿中の特定ＭＭＰ種の経時的プロフィールはどのようなものであるか？第二に、アルコール誘導性ＭＩによって誘導される心筋損傷の程度と血漿ＭＭＰレベルの間に相関は存在するのか？本試験の目標は、アルコール誘導性ＭＩの前後にＨＯＣＭ患者においてＭＭＰおよびＴＩＭＰ血漿レベルを連続的に測定することにより、これらの特定の問題を取り上げることであった。
【０１９５】
方法
患者：ＨＯＣＭを有すると診断され、選択的アルコール中隔焼灼術が予定されている患者（ｎ＝５１）を、インフォームドコンセントを得た後、試験に登録した。このプロトコールは、Ｂａｙｌｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅの施設内治験審査委員会およびｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａによって検討され、承認された。患者の年齢は５５±２歳であり、男性３２名と女性１９名から成った。カテーテル検査時に、ベースラインＬＶ対動脈圧勾配は６２±６ｍｍＨｇであり、有意のＬＶ流出路閉塞を指示した。アルコール中隔焼灼術手順は、以前に述べられているように実施した（Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ｂ）。簡単に述べると、バルーンカテーテルを心室中隔貫通動脈に挿入し、エタノール２−５ｍＬを注入した。バルーンを注入後５分間膨張させたままにし、その後除去した。アルコール注入の６週間後、反復カテーテル検査は２５±４ｍｍＨｇの勾配を明らかにし（ｐ＜０．０５）、ＬＶ流出路閉塞の軽減を指示した。アルコール誘導性ＭＩ後のＨＯＣＭ患者におけるＬＶ機能と血行力学の変化は広く記述されている（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ｂ；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＷＨら、２０００）。
【０１９６】
血漿収集：血液試料（５ｃｃ）を、末梢静脈から、冷却しておいたＥＤＴＡチューブに収集した。試料を遠心分離し、傾瀉した血漿をアリコートに分けて、アッセイまで−７０℃で保存した。試料は、ベースライン時（カテーテル検査および中隔焼灼術の前）およびアルコール注入後６０時間目まで４−６時間の間隔で収集した。
【０１９７】
ＭＭＰおよびＴＩＭＰアッセイ：この試験は、２つの公知のクラスのＭＭＰ：ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３を含む間質コラゲナーゼ、およびＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を含むゼラチナーゼに焦点を合わせた（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＤＲら、１９９６；Ｃｒｅｅｍｅｒｓ  ＥＥＪＭら、２００１；Ｇｕｎａｓｉｎｇｈｅ  ＳＫら、１９９７）。もっともよく特徴づけられているＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−１である（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＤＲら、１９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  ＭＰ．２００１）。従って、ＴＩＭＰ−１の測定も本試験において実施した。ＭＭＰおよびＴＩＭＰ種の定量は、先に述べられているような（Ｓｐｉｎａｌｅ  ＦＧら、２０００；Ｊｏｆｆｓ  Ｃら、２００１）２部位結合法を用いた固相酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を利用して実施した。ＭＭＰ−２（ＲＰＮ  ２６１７）については、使用した抗血清はプロ形態のＭＭＰ−２（プロＭＭＰ−２）に対して反応し、活性形態に対しては反応しない。ＭＭＰ−９（ＲＰＮ  ２６１４）については、抗血清はプロ形態の酵素（プロＭＭＰ−９）を検出する。ＭＭＰ−８（ＲＰＮ  ２６１９）については、抗血清はプロ酵素と活性形態のＭＭＰ−８の両方を検出する。ＭＭＰ−１３（ＲＰＮ  ２６２１）については、抗血清はこの酵素のプロ形態を検出するために開発された。ＴＩＭＰ−１については、抗血清は機能性タンパク質（ＲＰＮ  ２６１１）を検出するために開発された。これらのアッセイ系についての変動係数は３−５％であり、他のプロテアーゼとは交差反応せず、感受性は少なくとも０．０２ｎｇ／ｍＬであった。
【０１９８】
血漿試料を、マイクロ粒子酵素免疫測定手法（ＡｘＳＹＭ，Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｌｌ）を用いて総血漿クレアチンキナーゼ濃度ならびにＭＢ１アイソフォームの濃度に関して平行測定した。
【０１９９】
データの解析：ＭＭＰ、ＴＩＭＰおよびクレアチンキナーゼ血漿レベルを、最初に、処理効果をアルコール注入後の時間とする分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて検討した。その後、値をベースラインからのパーセント変化として算定した。これらの結果をＡＮＯＶＡ、次いで各々の時点についてボンフェローニ補正ｔ検定を用いたポストホック平均値分離に供し、帰無仮説はベースラインからの変化がゼロに等しいことであった。クレアチンキナーゼとＭＭＰ値の間の関係を検討するため、各々の患者についての濃度−時間曲線下面積を、ｐｏｌｙｇｏｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎアルゴリズム（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ，Ｊａｎｄｅｌ，Ｓａｎ  Ｒａｆｅａｌ，ＣＡ）を用いて算定した。次にこれらの点を直線回帰に供した。値は平均±ＳＥＭで表わしている。すべての統計手順はＳＹＳＴＡＴ統計ソフトウエア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ）を用いて実施した。
【０２００】
結果
心室中隔貫通動脈へのアルコール注入は、５１名のＨＯＣＭ患者全員において成功裏に実施され、連続的な血液試料が収集された。ベースラインクレアチンキナーゼおよびＭＢ１分画を表６に提示する。アルコール注入後の血漿クレアチンキナーゼおよびＭＢ１アイソフォームの変化を図７に示す。血漿中の総クレアチニンキナーゼおよびＭＢ１アイソフォームの有意の上昇が６時間目までに起こり、アルコール注入後約２４時間でピークに達した。ベースラインＭＭＰおよびＴＩＭＰ−１血漿レベルを表５にまとめており、以前に患者について報告された血漿レベルの範囲内である（Ｉｎｏｋｕｂｏ  Ｙら、２００１；Ｊｏｆｆｓ  Ｃら、２００１）。アルコール注入後の血漿ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の変化を図８に示す。血漿ＭＭＰ−２の小さいが統計的に有意の上昇が、アルコール注入後４時間目に起こった。これに対し、血漿ＭＭＰ−９の堅固な上昇がアルコール注入後６時間目に起こり、注入後５０時間まで高いままであった。血漿ＭＭＰ−８レベルも注入後６時間目までに上昇し、注入後６０時間まで高いままであった（図９）。血漿ＭＭＰ−１３レベルはアルコール注入後いずれの時点でも有意に上昇せず、実際には注入後２４時間目にわずかであるが有意の変化で低下した（図９）。血漿ＴＩＭＰ−１レベルは、アルコール注入後遅い時点で上昇する傾向にあったが、統計的有意性には達しなかった（図１０；ｐ＞０．１５）。しかし、血漿ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１比は注入後６時間目に上昇し、アルコール注入後６０時間まで高いままであった（図１０）。同様の変化がＭＭＰ−８／ＴＩＭＰ−１比についても起こり、この比はアルコール注入後有意に上昇した。血漿クレアチンキナーゼＭＢ１についての曲線下面積およびＭＭＰ−９についての時間曲線下面積を各々の患者に関してプロットし、図１１に示す。クレアチニンキナーゼＭＢ１放出と血漿ＭＭＰ−９レベルの間には有意の直線関係が認められた。
【０２０１】
【表６】
2009544013.tif 000007
考察
肥大型閉塞性心筋症（ＨＯＣＭ）によって引き起こされるＬＶ流出路閉塞は、標的心筋病変の作製を通して軽減され得る（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｃｈ  ＳＦら、１９９９ｂ；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＷＨら、２０００）。詳細には、ＬＶの肥大領域に供給する冠動脈へのエチルアルコールの注入は血管の硬化を生じさせ、その後標的心筋層の虚血／梗塞を引き起こす。しかし、ＨＯＣＭ患者においてアルコール誘導性心筋梗塞（ＭＩ）後のＬＶリモデリングに寄与する細胞および細胞外事象についてはほとんど知られていない。従って、本試験は、アルコール誘導性ＭＩ後のＨＯＣＭ患者において選択ＭＭＰおよびＴＩＭＰ種の血漿レベルの変化を連続的に測定した。本試験の新しい独自の所見は２相性であった。ＴＩＭＰ−１レベルの付随する上昇を伴わない、一部のＭＭＰ種（ＭＭＰ−８、−９）の堅固な放出が、ＨＯＣＭ患者におけるアルコールの冠動脈内注入後に起こった。これは、心筋マトリックス分解を促進するＭＭＰ−ＴＩＭＰ化学量論をもたらした。第二に、一部のＭＭＰの放出はアルコール誘導性ＭＩ後４８時間まで持続し、心筋損傷の程度に関連していた。これらの所見は、ヒトにおける孤立性心筋損傷後のＭＭＰおよびＴＩＭＰ放出の独特の経時的プロフィールを提供する。
【０２０２】
この試験は、患者においてアルコール誘導性ＭＩ後の血漿ＭＭＰおよびＴＩＭＰ種をプロファイリングする初めての試験である。本試験は、患者において誘導された孤立性心筋損傷が、時間および種依存的なＭＭＰの血漿放出を生じさせることを明らかにした。
【０２０３】
アルコール誘導性ＭＩ後早期に、ＭＭＰ−２血漿レベルの小さな上昇が起こったが、速やかにベースラインに戻った。この小さな上昇は、おそらく心筋損傷領域からのＭＭＰ−２の細胞内貯蔵からの放出によるものである。ＭＭＰ−２と異なり、ＭＭＰ−９血漿レベルの堅固で持続的な上昇がアルコール誘導性ＭＩ後に生じた。従って、アルコール誘導性ＭＩ後の血漿ＭＭＰ−９の急激な上昇の基礎は、おそらく浸潤性好中球からのＭＭＰ−９の放出と心筋損傷部位における血小板凝集であった。免疫測定法はプロ形態のＭＭＰ−９だけを検出したので、このＭＭＰ種の持続的に高い血漿レベルは、新たな合成が起きたことを示唆する。それ故、ＭＭＰ−９の高レベルは、細胞外マトリックスに対する筋細胞界面を変化させ、それによってＬＶリモデリングを促進すると考えられる。
【０２０４】
間質コラゲナーゼＭＭＰ−８の血漿レベルは、アルコール誘導性ＭＩ後著明に上昇した。ＭＭＰ−８は主として好中球内で同定されている（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＤＲら、１９９６；Ｃｒｅｅｍｅｒｓ  ＥＥＪＭら、２００１；Ｇｕｎａｓｉｎｇｈｅ  ＳＫら、１９９７；Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  ＪＦら、２０００；Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  ＭＰ．２００１）。しかし、最近のデータは、ＭＭＰ−８が多くの心筋細胞型において発現され得ることを示唆する（Ｈｅｒｍａｎ  ＭＰら、２００１）。そこで、ＭＩ誘導後の高い血漿ＭＭＰ−８レベルは、おそらく急性炎症応答ならびに心筋層からの放出に続発するものであった。ＭＭＰ−１３はヒトＬＶ心筋層において検出されており、末期ＣＨＦを有する患者で上昇する（Ｓｐｉｎａｌｅ  ＦＧら、２０００）。ＭＭＰ−１３血漿レベルはアルコール誘導性ＭＩ後わずかに低下し、その後ベースラインレベルに戻った。ＭＭＰ−１３に関する免疫測定法はＭＭＰ−１３のプロ形態を対象とした。それ故、循環ＭＭＰ−１３のわずかな低下は、おそらく活性化増強とその後のクリアランスによるものであった。筋原線維コラーゲンを含む多くの細胞外タンパク質が、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３の基質であることが明らかにされている。従って、アルコール誘導性ＭＩ後のこのクラスのＭＭＰの活性化は、心筋の細胞外構造と組成を有意に変化させる。
【０２０５】
本試験では、ＴＩＭＰ−１レベルは、ＨＯＣＭ患者におけるアルコール誘導性ＭＩ後有意に変化しなかった。ＭＭＰ対ＴＩＭＰの相対的化学量論を算定することは、正味のＭＭＰタンパク質分解能力を定義するために利用できる（Ｓｐｉｎａｌｅ  ＦＧら、２０００；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＧＩら、１９８９）。ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１の化学量論を、ＨＯＣＭ患者におけるＭＩ誘導後に算定した。ＭＩ後１２時間目までに、血漿ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１比はベースラインから５００％以上上昇した。ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１化学量論のこれらの変化は、心筋組織内での持続的なＭＭＰ−９活性を促進し得る。ＴＩＭＰ−１は最も広く特性決定されたＴＩＭＰであるが、４つのＴＩＭＰ種すべてがヒト心筋層内で同定された（Ｔｈｏｍａｓ  ＣＶら、１９９８；Ｓｐｉｎａｌｅ  ＦＧら、２０００；Ｌｉ  ＹＹら、１９９８）。一部のＴＩＭＰは特定プロ形態のＭＭＰに選択的に結合するが、すべてのＴＩＭＰが、活性化ＭＭＰに１：１の化学量論比で結合する。
【０２０６】
まとめ：本試験は、アルコール誘導性ＭＩ後の心筋クレアチンキナーゼとＭＭＰ放出の間の関連性を明らかにした。この試験は、アルコール誘導性ＭＩ後に血漿中への特定ＭＭＰ種の放出が起こることを明瞭に示した。これは、ヒトにおける孤立性の定義された心筋損傷後のＭＭＰおよびＴＩＭＰレベルの経時的変化を定量した初めての試験である。本試験は、患者におけるアルコール誘導性ＭＩ後に血漿中に放出されるＭＭＰの固有のプロフィールを明らかにし、これは心筋損傷の程度に直接関連した。本試験からの結果は、ＭＭＰおよびＴＩＭＰプロフィールをモニタリングすることは、ＭＩ後の創傷治癒および心筋リモデリング過程を監視するための新規アプローチを提供することを指示する。
【０２０７】
（３．実施例３：肥大型閉塞性心筋症におけるアルコール中隔焼灼術後のＭＭＰ−４の血漿モニタリング）
目的：本試験の全体的目標は、血漿中のＴＩＭＰ−４の相対量を測定するための半定量的アッセイ手順を開発し、次に急性心筋梗塞（ＭＩ）後の肥大型閉塞性心筋症（ＨＯＣＭ）患者においてＴＩＭＰ−４レベルの動的変化を測定するためにこのアプローチを利用することであった。
【０２０８】
方法／結果：血漿ＴＩＭＰ−４レベルを、アルコール誘導性ＭＩ後の正常患者（ｎ＝１８）およびＨＯＣＭ患者（ｎ＝１６）において検査した（半定量的免疫ブロット法によって）。血漿ＴＩＭＰ−４レベルの連続的測定を、ＨＯＣＭを有する患者においてアルコール誘導性ＭＩ後６０時間まで実施した。非グリコシル化血漿ＴＩＭＰ−４レベルは、正常対照と比較したときＨＯＣＭ患者では２５０％高かった。総血漿ＴＩＭＰ−４レベルは、アルコール誘導性ＭＩ後３０時間目に２０％低下していた。
【０２０９】
結論：独特の結果は、特にアルコール誘導を通しての、制御された心筋梗塞の誘導が、ＭＩ後早期の状況での心筋リモデリングを促進する、アルコール誘導性ＭＩ後のＨＯＣＭ患者における血漿ＴＩＭＰ−４レベルの低下を生じさせることを明らかにした。
【０２１０】
肥大型閉塞性心筋症（ＨＯＣＭ）は、最も一般的には左心室流出路の中隔大動脈下領域の過剰増殖性心筋成長によって特徴づけられる遺伝性疾患である（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２）。心室中隔貫通動脈へのエタノールの標的注入を通して、左心室（ＬＶ）流出路閉塞に関与する心筋層の選択的破壊が多くの患者において成功裏に実施されている（Ｎａｇｕｅｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｅｈ  ＳＦら、１９９９ｂ；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＷＨ．２０００）。それ故、本試験は、ＨＯＣＭを有する患者においてアルコール誘導性ＭＩ後に血漿ＴＩＭＰ−４レベルの経時的変化が起こるという仮説を試験した。
【０２１１】
方法
患者：正常患者（ｎ＝１８）およびＨＯＣＭを有すると診断され、選択的アルコール中隔焼灼術が予定されている患者（ｎ＝１６）を、インフォームドコンセントを得た後、試験に登録した。平均年齢４７±５歳の正常患者は、男性９名と女性９名から成り、心臓疾患または他の関連する健康上の問題がないことを確認するため十分に検査された。ＨＯＣＭ患者の年齢は５３±４歳であり、男性１１名と女性５名から成った。カテーテル検査時に、ベースラインＬＶ対動脈圧勾配は６２±６ｍｍＨｇであり、有意のＬＶ流出路閉塞を指示した。アルコール中隔焼灼術手順は、以前に述べられているように実施した（Ｎａｇｕｅｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｅｈ  ＳＦら、１９９９ｂ）。簡単に述べると、バルーンカテーテルを心室中隔貫通動脈に挿入し、エタノール２−５ｍＬを注入した。バルーンを注入後５分間膨張させたままにし、その後除去した。アルコール注入の６週間後、反復カテーテル検査は２５±４ｍｍＨｇの勾配を明らかにし（ｐ＜０．０５）、ＬＶ流出路閉塞の軽減を指示した。アルコール誘導性ＭＩ後のＨＯＣＭ患者におけるＬＶ機能と血行力学の変化は広く記述されている（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２；Ｎａｇｕｅｈ  ＳＦら、１９９９ａ；Ｎａｇｕｅｈ  ＳＦら、１９９９ｂ；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＷＨ．２０００）。
【０２１２】
血漿の収集と調製：血液試料（５ｃｃ）を、末梢静脈から、冷却しておいたエチレンジアミン四酢酸チューブに収集した。試料を４℃、３，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、傾瀉した血漿を細分して、アッセイまで−７０℃で保存した。ＨＯＣＭ患者についての試料は、ベースライン時（カテーテル検査および中隔焼灼術の前）およびアルコール注入後１０、２０、３０および６０時間目に収集した。血漿試料を最初に陽イオン交換カラム（Ｃ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ；Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  Ｍａｓｓ）で溶出し、次に真空遠心分離によって乾燥した。遠心分離後、５０ｍＭ還元剤、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Ｐｉｅｒｃｅ）および２Ｘドデシル硫酸リチウム泳動用試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液に再溶解した。最適の血漿対試料緩衝液容量比を決定するために一連の最初の希釈を実施した。全体として、血漿１００μＬの最初の容量および試料緩衝液３６μＬの再溶解容量がこのアッセイのために理想的であると決定した。
【０２１３】
半定量的免疫ブロット法：データ獲得に先立って、感受性と特異性を測定するために様々な市販のＴＩＭＰ−４抗体に関して多数の試験を実施した。以下の抗体をスクリーニングした：マウスモノクローナル抗ヒトＴＩＭＰ−４（ＭＡＢ９７４，Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＴＩＭＰ−４ループＮｏ．３に対するウサギ抗体（ＲＰ３Ｔ４，Ｔｒｉｐｌｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）、ヒトＴＩＭＰ−４ループＮｏ．１に対するウサギ抗体（ＲＰ１Ｔ４，Ｔｒｉｐｌｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＩＭＰ−４に対するヒツジポリクローナル抗体（ＰＣ４３４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ウサギ抗ＴＩＭＰ−４ポリクローナル抗体（ＡＢ８１６，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、およびウサギ抗ＴＩＭＰ−４、ループＮｏ．２ポリクローナル抗体（ＡＢ  １９０８７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。抗体を、２３ｋＤａおよび２９ｋＤａのバンド、またはそれぞれ非グリコシル化およびグリコシル化形態のＴＩＭＰ−４を同定するそれらの能力に関してスクリーニングした（Ｒａｄｏｍｓｋｉ  Ａら、２００２）。分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに精製組換えヒトＴＩＭＰ−４（Ｈ−ＴＩＭＰ−４，  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）を陽性対照としてすべての免疫ブロットに含めた。ループＮｏ．２ポリクローナル抗体（ＡＢ  １９０８７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）は、両方の形態のＴＩＭＰ−４に結合するその能力の故に本試験において使用するＴＩＭＰ−４抗血清として選択した。最適ＴＩＭＰ−４抗血清濃度を決定するため、多数の膜を、０．０５−０．６μｇ／ｍＬにわたる種々の濃度のループＮｏ．２ＴＩＭＰ−４抗体と共にインキュベートした。これらの結果は、この免疫ブロット手順のための抗体の最適濃度を提供し、ループＮｏ．２ＴＩＭＰ−４抗体０．５μｇ／ｍＬであった。ＴＩＭＰ−４タンパク質に対するＴＩＭＰ−４抗血清の応答が線形であるかどうかを調べるため、組換えＴＩＭＰ−４標準品の濃度を変化させた。１０−８０μｇ／ｍＬのＴＩＭＰ−４濃度の間の直線関係が確認された（ｒ２＝０．９９）。
【０２１４】
このプロジェクトのために、ＴＩＭＰ−４の相対レベルを、先に詳細に記述されている（Ｓｐｉｎａｌｅ  ＦＧら、２０００）半定量的免疫ブロット法によって検査した。血漿試料（１２μＬ）を４％−１２％ビストリスゲルに負荷し、電気泳動分離に供した。分離したタンパク質を、次に、ニトロセルロース膜に移した。ブロッキングと洗浄工程後、膜を、グリコシル化および非グリコシル化形態のＴＩＭＰ−４のループ２のペプチド配列に対応する抗血清（ＡＢ  １９０８７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）中でインキュベートした。二次抗体とのインキュベーション後、免疫反応性シグナルを化学発光（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって検出した。加えて、血漿中の他のタンパク質への非特異的結合の可能性を調べるため、各々の免疫ブロットについて陰性対照（二次抗体単独）を使用した。積分光学密度（ＩＯＤ）値を得るために免疫ブロットをデンシトメトリー法によって分析した。また、同じ試料の反復ＩＯＤ値を測定することにより、アッセイ内の変動係数を１０．５％と決定した。すべての測定を２回ずつ実施した。
【０２１５】
データの解析：ＨＯＣＭ被験体からの非グリコシル化およびグリコシル化形態の血漿ＴＩＭＰ−４に関して得たＩＯＤ値を、各免疫ブロットについて含めた参照対照試料からの平均ＩＯＤ値に正規化した。ベースライン血漿ＴＩＭＰ−４を、スチューデントｔ検定を使用して参照対照とＨＯＣＭ被験体の間で比較した。アルコール誘導性ＭＩの間およびＭＩ後の血漿ＴＩＭＰ−４の経時的変化を個々のベースライン値に比較して算定し、パーセンテージとして表わした。加えて、ＨＯＣＭ被験体に関しては、総血漿ＴＩＭＰ−４を決定するために非グリコシル化およびグリコシル化ＩＯＤ値の合計を計算した。種々の時点で記録された血漿ＴＩＭＰ−４レベルの変化を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。ポストホック平均値分離を、ボンフェローニ補正ペアワイズｔ検定を用いて実施した。最後に、参照対照とＨＯＣＭ被験体における血漿ＴＩＭＰ−４の性別特異的な差の存在を判定した。この比較のため、血漿ＴＩＭＰ−４  ＩＯＤ値を、ゲルごとの変動性を排除するために既知濃度の組換えＴＩＭＰ−４標準品の値に対して正規化した。詳細には、血漿ＴＩＭＰ−４  ＩＯＤ値を性別および臨床状態に基づいて分類した。ＡＮＯＶＡを用いて群間の差を比較した。この比較のために、ボンフェローニ補正ペアワイズｔ検定を用いてポストホック平均値分離を実施した。すべての統計手順はＳｙｓｔａｔ（ＳＰＳＳ）で実施した。結果は平均±ＳＥＭで示している。ｐ＜０．０５のボンフェローニ補正確率ペアワイズｔ検定の値を統計的に有意とみなした。
【０２１６】
結果
正常患者およびＨＯＣＭ患者からの血漿試料中のＴＩＭＰ−４の相対的レベルを明らかにする代表的免疫ブロットを図１２に示す。２３ｋＤａおよび２９ｋＤａに対応する免疫反応性バンドが認められた。一次抗体の置換は、ＴＩＭＰ−４に対応するバンドの完全な消失を生じさせた。さらなる電気泳動ゲルを血漿試料で調製し、グリコシル化タンパク質に関して染色した（Ｗｅｂｅｒ  ＫＴら、１９９１）。２９ｋＤａに対応するグリコシル化バンドがすべての血漿試料において認められ、おそらくグリコシル化ＴＩＭＰ−４を反映すると考えられる（Ｒａｄｏｍｓｋｉ  Ａら、２００２）。参照正常対照と比較したＨＯＣＭ患者における血漿ＴＩＭＰ−４レベルを図１３にまとめる。ＨＯＣＭ患者では非グリコシル化（２３ｋＤａ）およびグリコシル化（２９ｋＤａ）の両形態のＴＩＭＰ−４レベルが高かった。
【０２１７】
アルコール誘導性ＭＩ後のＨＯＣＭ患者における血漿ＴＩＭＰ−４レベルの時間依存的変化を図１４に示す。ベースラインと比較して、非グリコシル化血漿ＴＩＭＰ−４レベルは、アルコール誘導性ＭＩ後１０時間目には高かったが、その後アルコール誘導性ＭＩ後３０時間目には低下していた。グリコシル化ＴＩＭＰ−４に関しては、レベルは、アルコール誘導性ＭＩ後３０時間目および６０時間目にベースラインより低かった。総ＴＩＭＰ−４（非グリコシル化およびグリコシル化形態）も、アルコール誘導性ＭＩ後３０時間目および６０時間目には低下していた（図１４）。性別に関する相対的血漿ＴＩＭＰ−４レベルを図１５に示す。ＨＯＣＭ女性の値は、非グリコシル化ＴＩＭＰ−４に関してはＨＯＣＭ男性の値より高かった。非グリコシル化ＴＩＭＰ−４値は、性別にかかわりなくＨＯＣＭ群において有意に高かった。同様の傾向がグリコシル化血漿ＴＩＭＰ−４レベルでも認められた。しかし、正常男性についてのグリコシル化ＴＩＭＰ−４レベルは正常女性よりも高かった。
【０２１８】
この試験は、患者からの血漿においてＴＩＭＰ−４の相対的レベルを測定する免疫ブロット手順を開発するため最初の試験である。本試験では、血漿ＴＩＭＰ−４レベルは、正常対照と比較してＨＯＣＭ患者においてより高かった。ＨＯＣＭは、ＬＶ流出路の中隔大動脈下領域の過剰増殖性心筋成長（肥大）によって特徴づけられる（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２）。このＬＶ流出路の閉塞は、最終的には左心室全体の肥大を生じさせる（Ｍａｒｏｎ  ＢＪ．２００２）。慢性圧過負荷に応答して起こるＬＶ肥大は、細胞外マトリックス沈着（コラーゲン蓄積）の上昇を含む（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ＴＨら、２００１）。本試験では、血漿ＴＩＭＰ−４レベルはＨＣＯＭ患者においてより高く、これは、次には心筋層内でのＴＩＭＰ−４の平行上昇を反映する可能性が高い。それ故、ＨＯＣＭ患者におけるＴＩＭＰ−４のレベル上昇は、次には心筋ＭＭＰ活性を低下させ、それによってコラーゲン蓄積を促進する。実際に、心筋生検は、ＨＯＣＭを有する患者ではコラーゲン蓄積が上昇していることを明らかにした（Ｎｕｅｇｈ  ＳＦら、２００１）。
【０２１９】
本試験は、アルコール誘導性ＭＩ後の血漿ＴＩＭＰ−４レベルの経時的変化をプロファイリングする初めての試験である。アルコール誘導性ＭＩのような制御された心筋損傷におけるＭＭＰとＴＩＭＰの不均衡を測定することは、急性心筋損傷後に起こることをここで示すＴＩＭＰ放出の時間的関係についての改善された理解を提供する。実施例１に示すように、本試験の結果は、心筋損傷のより一般的な原因：梗塞を伴う冠動脈閉塞を有する患者に拡大適用することができる。
【０２２０】
興味深いことに、本試験は、性別に関する相対的血漿ＴＩＭＰ−４レベルの変化を明らかにした。しかし、ＴＩＭＰ−４のこれらの変化を調節する上流機構はほとんど理解されないままである（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｊら、１９９６）。ＴＩＭＰ−４タンパク質発現は、類似のサイトカインおよび他のＴＩＭＰの発現を調節する他の生物学的分子ステロイドによって影響され得る（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｊら、１９９６）。過去の試験は、月経周期の間にＴＩＭＰ種の発現が変化することを明らかにし、卵巣ステロイドの影響を示唆した（Ｇｏｆｆｍ  Ｆら、２００３）。本試験では、ＴＩＭＰ−４の血漿レベルは正常男性よりも正常女性においてより低かった。正常女性における低いＴＩＭＰ−４レベルというこの所見は、卵巣ステロイドレベルの差によって引き起こされると考えられる。しかし、ＨＯＣＭ群では、女性の血漿ＴＩＭＰ−４レベルはＨＯＣＭ男性よりも高かった。これは、この肥大過程を有する患者においてＴＩＭＰ−４の上方調節を促進する他の優先的な生物学的シグナルによるものであると考えられる。
【０２２１】
（４．実施例４：心筋梗塞後の患者において心室リモデリングおよび心不全を鑑別し、予測し、診断するための判定基準）
年齢範囲内の性別を超えたヒト被験体についての正常値の明瞭なセットを表７に提供する。この表ほど包括的なＭＭＰ／ＴＩＭＰに関する正常参照値の集積リストはこれまでになく、さらに、心臓血管疾患を有さない年齢適合被験体が含まれるので、正常参照範囲も提供される。さらに、以下の表で詳細に示すように重要な診断および予後情報を有することが明らかにされる、ＭＭＰ／ＴＩＭＰプロフィールについての新規化学量論比を提供する。これらのデータは、１００名以上の被験体から収集し、解析した。
【０２２２】
【表７】
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表８は、心筋梗塞（心臓発作）から７２時間以内の患者における、絶対的なＭＭＰおよびＴＩＭＰ値、絶対的なＭＭＰ／ＴＩＭＰ比、および絶対値に基づく正常参照値からのパーセント変化を示す。これらの値は、親出願の主文の中で述べたように収集された。動物試験またはこれまでに公表された限られた臨床試験における過去の報告からは予測されない、独特の血漿プロフィールが明らかにされる。この独特のプロフィールは、ＭＭＰ−２の低下、ＭＭＰ−９の上昇、およびより重要な点としてＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比の上昇を含む。ＴＩＭＰ−４は心臓血管ソースからしか放出されないので、高いＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比は心臓特異性を提供する。それ故、これは、心臓血管特異性および心筋梗塞の早期発達の間のＭＭＰおよびＴＩＭＰの独特のプロフィールを提供するための手段を与える初めてのデータである。さらに、先の出願において示したように、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比のこの早期変化は、ＭＩ後６か月目までの有害な心室リモデリングおよび心不全を発症する高い危険度を予測することができた。これらのデータは、心臓血管特異的プロフィール（ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比）の早期変化（７２時間以内）と後期有害事象および予後（心室拡張）の間の因果関係を実際に結びつける初めてのデータであった。これらの新しいデータが治療と臨床意思決定を導くためにどのように使用できるかは親出願に述べられている。
【０２２３】
【表８】
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表９は、最初の心臓発作（心筋梗塞）後に、詳細には１カ月後に、患者において起こるＭＭＰ／ＴＩＭＰの独特で区別的なプロフィールを提供する。この時点で、心筋梗塞に特異的な有害心室リモデリングによる心不全を発症する危険度が高い患者を同定するために使用できる、ＭＭＰおよびＴＩＭＰの独特で区別的な変化が起こる。この場合、ＭＭＰ−９は高いままであり、ＴＩＭＰ−１レベルは上昇する。ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−１およびＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−４比のこの変化は、有害な心室リモデリング、心室拡張、および最終的には駆出能の低下（収縮期心不全）の危険度が高い患者についての診断である。
【０２２４】
【表９】
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最後に、ここで開示する独特の血漿特徴（ｐｌａｓｍａ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）は、心不全を呈する患者に関して基礎をなす原因を鑑別する能力を初めて提供する。具体的には、表１０に示すように、心筋梗塞に続発する心不全または高血圧のような他の心臓血管疾患を発現するまたは呈する危険度が高い患者から、独特で非常に異なる血漿プロフィールが浮かび上がる。これらのデータは、この出願の基礎を形成する我々の完了した試験から収集された。それ故、これらのプロフィールに基づいて鑑別診断を行うことができ、またより重要な点として、より明確な臨床意思決定および治療戦略を考慮することができる。このプロフィールの臨床適用の例およびこれらが臨床意思決定においてどのように利用されるかは、親出願に述べられている。
【０２２５】
【表１０】
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Ｅ．参考文献
【０２２６】
【表１１−１】
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【０２２７】
【表１１−２】
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【０２２８】
【表１１−３】
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【０２２９】
【表１１−４】
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【０２３０】
【表１１−５】
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【０２３１】
【表１１−６】
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【０２３２】
【表１１−７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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