(57)【要約】非複合好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）は、将来の乳癌発症の主要な危険性因子である異形乳管過形成（ＡＤＨ）３を有する個体、卵巣癌を有する個体、ならびに侵襲的および非侵襲的な乳癌を有する個体において、増大したレベルで存在する。したがって、本発明は、例えば乳癌および卵巣癌を含む上皮由来の癌などの癌発症の危険性があるか、または癌が発症しているかを決定する一次検査として尿中の非複合ＮＧＡＬレベルを測定することに関する。
2009527735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が、癌を発症する危険性を有するか否か、または癌を発症したか否かを決定する方法であって、
ａ）個体から得た検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを決定するステップ、
ｂ）検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルとコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルとを比較するステップ
を含み、検査サンプル中の遊離ＮＧＡＬのレベルが、コントロールの遊離ＮＧＡＬレベルよりも高いことが、個体が癌を発症する増大した危険性を有するか、または癌を有していることを示す、前記方法。
【請求項２】
癌が上皮由来の癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上皮由来の癌が、乳癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、腎臓癌、前立腺癌および腎細胞癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌が、乳癌および／または卵巣癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
決定された遊離ＮＧＡＬレベルが、単量体ＮＧＡＬを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遊離ＮＧＡＬレベルが
ａ）検査サンプルまたはその調製物を、遊離ＮＧＡＬと特異的に結合する抗体ベースの結合部分と接触させ、抗体−ＮＧＡＬ複合体を形成するステップ、および
ｂ）抗体−ＮＧＡＬ複合体の存在を検出することで、遊離ＮＧＡＬの存在のレベルを測定すること
を含む方法によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体ベースの結合部分が、検出可能な標識によって標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標識が、放射性標識、ハプテン標識、蛍光標識および酵素標識からなる群より選択される標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗体ベースの結合部分が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
結果を点検し、尿がコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルより高レベルの遊離ＮＧＡＬを有していた場合、さらなる癌検査へと個体を導くステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
遊離ＮＧＡＬレベルが質量分光法によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
個体が癌治療後の患者であり、検査サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルがコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルよりも高かった場合、癌治療後の患者が癌の再発治療に差し向けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
癌の病期診断の方法であって、
ａ）個体から得た検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを決定するステップ、
ｂ）検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルとコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルとを比較するステップ
を含み、検査サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルがコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルよりも高いことが、個体が悪性または転移性癌発症の増大した危険性を有すること、または悪性または転移性癌を有することを示す、前記方法。
【請求項１５】
遊離ＮＧＡＬが単量体ＮＧＡＬを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
コントロールレベルが、健康な個体に関連づけられる遊離ＮＧＡＬレベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
尿サンプルを保持する容器および遊離ＮＧＡＬと特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ならびに使用説明書を含む、尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬを検査するキット。
【請求項１８】
ＮＧＡＬに特異的に結合する少なくとも２つの抗体を含み、抗体の一つは固相に固定され、もう一つの抗体は検出可能に標識されている、請求項１に記載のキット。
【請求項１９】
個体における癌、または癌発症の危険性をモニタリングする方法であって、
ａ）最初の遊離ＮＧＡＬレベルを得るための、個体から得た最初の検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを測定するステップ、
ｂ）二番目の遊離ＮＧＡＬレベルを得るための、個体から得た二番目の検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを測定するステップ、および
ｃ）最初および二番目の遊離ＮＧＡＬレベルを比較するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２０】
二番目のレベルが最初のレベルよりも高かった場合、個体が癌を有するまたは癌が発症する大きな危険性があり、あるいは転移癌を有するまたは転移癌を発症する大きな危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
個体が癌治療後の患者であり、二番目のレベルが最初のレベルよりも高かった場合、癌治療後の患者が癌の再発治療に差し向けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
癌治療後の患者において癌の再発をモニタリングする方法であって、
ａ）最初の遊離ＮＧＡＬレベルを得るための、癌治療後の患者から得た最初の検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを測定するステップ、
ｂ）二番目の遊離ＮＧＡＬレベルを得るための、癌治療後の患者から得た二番目の検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを測定するステップ、および
ｃ）最初および二番目の遊離ＮＧＡＬレベルを比較するステップ
を含み、二番目のレベルが最初のレベルよりも高かった場合、癌治療後の患者は癌の再発治療に差し向けられる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ１１９（ｅ）の下に、同時継続出願のアメリカ仮出願番号６０／７７４８２３、出願日２００６年２月１７日に対して優先権の利益を主張し、その全ての内容はあらゆる形で本願に参考文献の形で組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、患者から得た尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを測定することで、癌、例えば乳および卵巣癌を含む上皮由来の癌、の診断および予後診断の非侵襲的な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌の生存における最も重要な要因の一つは早期段階での検出である。発生初期の癌を検出する臨床的検定は、癌の発育に介入し、阻止する機会を提案する。遺伝子プロファイリングおよびプロテオミクスの発達と共に、特定の癌の診断および予後診断に用いることができる分子マーカーまたは「バイオマーカー」の同定において顕著な発達が起こってきた。例えば、前立腺癌の場合においては、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）が血液中で検出することができ、それが前立腺癌の存在の指標となる。したがって、前立腺癌の危険性のある人間の血液を、素早く、簡便に、および安全にＰＳＡレベルの上昇によって検査することができる。
【０００４】
癌の検出分野における発展にもかかわらず、当業界では臨床的用途、特に非侵襲的な方法による癌の検査、に簡便に用いられる、多様な癌に対する新たなバイオマーカーの同定に対する必要性が依然としてある。尿検査は恐らく最も患者に優しい選択肢（例えば瀉血を必要としない）を与え、ヘルスケア提供者に広く利用されているが、今までこのやり方で癌を診断することができる選択肢はほとんどなかったように見える。
【０００５】
多型上皮性ムチン（ＭＵＣ１）は卵巣癌において過剰発現している膜貫通型タンパク質で、ＭＵＣ１タンパク質を発現している腫瘍はしばしば血液循環に割って入り、腫瘍マーカーＣＡ１５−３として検出可能である。例えば、Bon et al. Clin. Chem 43:585(1997)参照。しかしながら、多くの患者はＭＵＣ１を発現していない腫瘍を有している。血清ＣＡ１２５レベルもまた卵巣癌と関連があると報告されている（Skakes, Cancer 76:2004(1995)）が、それらのレベルの査定は疾患の絶対的な指標ではない。臨床的に明らかに卵巣癌である女性のおおよそ８５％がＣＡ１２５レベルを増大させているが、ＣＡ１２５はまた妊娠の第一期を通して、月経を通して、非癌疾患、および他の部位における癌の存在によっても増大する。
【０００６】
好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ、リポカリン‐２）遺伝子の発現が、卵巣、結腸、肺、および子宮癌腫瘍組織において上方調節されていることが、遺伝子発現分析を用いて同定された（例えばWO02/102235、WO02/071928およびUS2004/0005563参照）
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
バイオマーカーの同定は特に癌、例えば乳および卵巣癌を含む上皮由来の癌、の診断、予後診断、および治療の改善に関係し、それゆえ当業界において素早く、簡便に、安全に検出可能なバイオマーカーに対する必要性がある。本明細書に記載された発明はバイオマーカー、尿中の遊離好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）を、癌のある対象の診断、病期分類、進行モニタリングまたは治療、特に疾患の侵襲性、潜在的転移性段階に利用可能にする。本分野における従前の仕事はこのことを信頼性のある、非侵襲的な癌、例えば乳癌または卵巣癌を含む上皮由来の癌、の検出方法として示しまたは提案していなかった。
【０００８】
本明細書に記載されているように、複合していないまたは「遊離（free）」のＮＧＡＬが異形乳管過形成（ＡＤＨ）、将来的な乳癌への発症に対する主要なリスク要因、を有する個体、卵巣癌を有する個体、および侵襲性および非侵襲性双方の乳癌を有する個体の尿中において増大したレベルで存在することが見出された。従って、本発明は個体が癌を発症する危険性があるか、または発症した癌、例えば卵巣、前立腺、または乳癌などの上皮由来の癌、および基底細胞癌、腎細胞癌、腺癌、胃腸癌、口唇、口腔、食道、小腸、胃、結腸、肝臓、膀胱、膵臓、子宮頸部、肺、皮膚、および腎臓癌、を有しているかを決定するために非複合尿中ＮＧＡＬを一次検査として測定することを包含する。治療上の有効性のためのマーカーとしての尿中ＮＧＡＬレベルのモニタリング方法もまた開示している。
【０００９】
実施例において、本発明は個体が癌を発症する危険性があるか、または発症した癌を有しているかを決定する方法を含む。個体から得た検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルが測定され、このレベルがコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルと比較される。コントロールの遊離ＮＧＡＬレベルよりも高い検査サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルは個体が癌を発症する増大した危険性があるか、または癌を有しているかを示す。別の実施例においては、個体は癌治療後の患者であり、テストサンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルがコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルよりも高かった場合、癌治療後の患者は癌の再発治療に差し向けられる。他の実施例において、がんは、例えば乳癌、基底細胞癌、腺癌、胃腸癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、腎臓癌、前立腺癌、または腎細胞癌などの上皮由来のがんである。他の実施例において、検出された遊離ＮＧＡＬは単量体ＮＧＡＬである。他の実施例において、選択的に遊離ＮＧＡＬと結合して抗体−ＮＧＡＬ複合体を形成する抗体ベースの結合部分（例えばモノクローナル抗体）が用いられ、遊離ＮＧＡＬの存在レベルを測定するために抗体−ＮＧＡＬ複合体の存在が検出される。抗体ベースの結合部分は放射性標識、ハプテン標識、蛍光標識または酵素標識などの検出可能な標識で標識されてよい。
【００１０】
他の実施例において、本発明は癌の病期分類法を含む。個体から得た検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルが測定され、このレベルはコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルと比較される。検査サンプル中の遊離ＮＧＡＬ、例えば単量体ＮＧＡＬ、のレベルがコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルより高いことは、個体が悪性または転移性の癌発症の増大した危険性がある、もしくはそれを有しているかのどちらかであることを示している。コントロールの遊離ＮＧＡＬレベルは健康な個体と関連づけられてよい。
【００１１】
対象の治療の方向付け方法もまた含まれる。実施例において、対象は対象から得た尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルを検査され、臨床医が結果を点検し、尿がコントロールの遊離ＮＧＡＬレベルよりも高レベルの遊離ＮＧＡＬを有していた場合は、臨床医は対象を癌のさらなる検査へと導く。検査は対象が居住する国と同一の国、または別の国で行われてもよく、結果は例えばウェブサイトを通して利用可能化され、または臨床医に送られてもよい。
【００１２】
癌または癌の危険性をモニタリングする方法もまた開示されている。初期の遊離ＮＧＡＬレベルを得るために、個体から得た最初の尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルが測定され、その検査尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬのレベルは２番目の遊離ＮＧＡＬレベルを得るために個体から得られた２番目の尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルと比較される。その後選択された間隔で尿収集および比較、つまりデータ点のセットの収集、がなされ、そのデータ点は測定された検査サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルが測定されたコントロールサンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルに対して上昇傾向にあるか否かを決定するために点検され、上昇傾向は癌が個体中でさらに発症または転移していることを示している。つまり、２番目のレベルが最初のレベルより大きければ、個体は癌を有しているまたは発症する大きな危険性がある、もしくは転移している癌を有しているまたは発症する大きな危険性があると考えられてよい。他の実施例において、個体は癌治療後の患者であり、２番目のレベルが最初のレベルよりも大きかった場合、癌治療後の患者は癌の再発治療に差し向けられる。
【００１３】
尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬを検出するキットもまた開示されている。このキットは尿サンプルを保持する容器、および遊離ＮＧＡＬと選択的に結合する少なくとも１つの抗体、および使用説明書を含む。キットは代替的に遊離ＮＧＡＬと選択的に結合する少なくとも二つの抗体、一つの抗体は固相に固定されもう一つの抗体は検出可能に標識されている、を含んでよい。
【００１４】
ＮＧＡＬは尿中で遊離ＮＧＡＬ、つまりマトリクスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）と結合していない、としておよび複合体ＮＧＡＬ、つまりＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体、として見出される。本明細書に記載された方法においては、遊離ＮＧＡＬが測定される。
【００１５】
一つの実施例において、個体が癌を発症する、または発症した癌、例えば乳および卵巣癌を含む上皮由来のもの、の危険性があるか否かを決定する方法を提供する。方法には検査サンプルの尿中に存在する遊離および複合ＮＧＡＬのレベルの測定、および検査サンプルから得られたレベルとコントロールサンプルとの比較を含み、検査サンプルの尿中のＮＧＡＬレベルが高いことは個体が癌を発症する、または既に癌を発症したという増大した危険性があることを示唆している。陽性の結果（高いレベル）はしたがって個体はさらなる癌の検査およびそれに応じたモニタリングを受けるべきであることを示す。好ましくは、遊離ＮＧＡＬのレベルが１．５倍、さらに好ましくは２倍またはそれ以上、コントロールのそれよりも高い。この増大レベルもコントロールレベルに対して検出される。
【００１６】
本発明は発展的に危険性査定または癌、例えば乳および卵巣癌を含む上皮由来の癌、の早期検出に利用される。例えば、対象は年１回の身体検査を通して医師に検査される。遊離ＮＧＡＬのレベルがコントロールのそれよりも高いという陽性の検査結果はその個体が癌前駆病巣または癌を有しているか否かを決定するさらなる診断的評価を正当化する。
【００１７】
上述したように、本発明はまた同一患者から得た複数の検査サンプル中に存在する尿中遊離ＮＧＡＬのレベルを査定することにも使用され、長期にわたる遊離ＮＧＡＬ量の進歩的な増加は癌の増加する攻撃性（例えば転移潜在能力）を示唆している。このように、ＮＧＡＬレベルは病気の状態および病期の予測材料としての役目を果たす。
【００１８】
実施例において、ＮＧＡＬレベルは、例えば乳および卵巣癌を含む上皮由来の癌などの癌患者を治療するためにデザインされた治療体制の治療上の有効性をモニタリングするために、１または２以上のインターバルで査定される。
【００１９】
本発明の一側面において、検査尿サンプル中に存在するＮＧＡＬレベルは、特に（遊離）ＮＧＡＬタンパク質またはそれらの一部分と選択的に結合する抗体ベースの結合部分のある検査サンプル、またはそれらを調整したもの、と接触することで測定される。「選択的に」とは、抗体が（例えばＭＭＰ−９と）複合しているかもしれないＮＧＡＬよりも遊離ＮＧＡＬと結合することを意味する。実施例において、遊離ＮＧＡＬは単量体ＮＧＡＬである。抗体ベースの結合部分は検出可能なＮＧＡＬと複合体を形成し、それによってＮＧＡＬのレベルが測定される。遊離ＮＧＡＬと複合したＮＧＡＬを区別するために、遊離ＮＧＡＬと選択的に反応する抗体ベースの結合部分が、例えばＥＬＩＳＡなどで利用可能である。そのような抗体結合部分はＭＭＰ−９／ＮＧＡＬ結合領域の中のエピトープに対して産生されてよい。
【００２０】
抗体ベースの免疫測定法はＮＧＡＬタンパク質レベルの測定方法としては好ましい手法である。しかしながら当業者に知られたあらゆる手法がＮＧＡＬレベルの査定に利用可能である。例えばいくつかの実施例において、ＮＧＡＬの発現レベルがＳＥＬＤＩ質量分析法を含む質量分析法で検定される。
【００２１】
発明の詳細な説明
定義
「遊離ＮＧＡＬ」は「非複合ＮＧＡＬ」という用語と互換的に使用され、例えばＭＭＰ−９などのマトリクスメタロプロテイナーゼと複合していないＮＧＡＬのことを言う。
【００２２】
「上皮由来の癌」は、これに限定するものではないが、乳癌、基底細胞癌、腺がん、胃腸癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌および胃癌、結腸癌、肝臓癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、扁平上皮細胞および基底細胞癌などの乳癌および皮膚癌、前立腺癌、腎細胞癌、ならびに上皮細胞に作用する体中の他の知られた癌を含む上皮細胞から発生した癌を含む。上皮由来の癌は、例えば腎臓、乳、子宮内膜、卵巣または前立腺癌などのホルモン依存の癌であってよい。
【００２３】
「コントロールサンプル」は、「正常」または「健康な」癌を有していないと信じられる個体から得た尿サンプルを含む。コントロールは当業者によく知られた方法を用いて選択されてよい。一旦レベルがコントロール集団としてよく確立されれば、検査尿サンプルからの多数の結果は周知のレベルと直接比較可能である。好ましくは、コントロールサンプルは年齢および性別が一致するコントロール尿サンプルである。
【００２４】
「コントロールレベル」は検体の検査レベルの比較対象となる検体のレベルである。コントロールレベルは、経験的に決定された興味のある疾患（例えば癌など）を有さないまたは特定の病期の興味のある疾患（良性または早期癌対悪性または後期癌）を有すると信じられる個体集団からの検体レベルの平均値または中間値でありえ、活性サンプル（例えば陽性コントロール）中の周知な検体レベルでありえ、または特定の個体（例えば２または３以上の時点で個体をモニタリングしている場合）の以前検出した検体レベルでありえる。検体は、例えば、遊離ＮＧＡＬである。
【００２５】
「検査サンプル」は検査される対象から得た尿サンプルを含む。
【００２６】
「攻撃的」または「侵襲的」は境界を越えて付近の組織内に拡大しようとする腫瘍の傾向を含む（Darnell, J. (1990), Molecular Cell Biology第３版, W.H. Freeman, NY）。侵襲的な癌は、腫瘍が特定の器官に限定される器官限定的な癌と対照をなす。腫瘍の侵襲的な特性はしばしばコラーゲナーゼなどのタンパク質分解酵素の合成と同時に発生し、カプセルの境界を超え、および腫瘍が存在する特定組織の境界を越えて腫瘍が拡大できるように基質物質および基底膜物質を減少させる。
【００２７】
「転移」は起源器官から患者の付加的な末梢部分へと癌が拡がっていく状態を含む。腫瘍転移の過程は細胞間基質の局地的な侵襲および破壊、血管、リンパ管または他の輸送経路への侵入、循環の中での生存、管から二番目の場所への遊出、新たな場所での成長を伴う多段階現象である（例えば、Fidler, et al., Adv. Cancer Res. 28, 149〜250 (1978)、 Liotta, et al., Cancer Treatment Res. 40, 223〜238 (1988)、 Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175〜224 (1988)、およびZetter, N. Eng. J. Med. 322, 605〜612 (1990)参照）。悪性細胞の運動性の増加は、動物と同様ヒトの腫瘍における強化された転移潜在性と関係がある（Hosaka, et al., Gann 69, 273〜276 (1978)およびHaemmerlin, et al., Int. J. Cancer 27, 603〜610 (1981)）。
【００２８】
「主腫瘍」は対象内の最初の場所に現れた腫瘍を含み、対象の体内の主腫瘍から離れた部分に現れた「転移腫瘍」と区別できる。
【００２９】
「ＮＧＡＬ」はGenebank accession, Genpept, CAA58127(Homo sapiens)のＮＧＡＬタンパク質を含む（配列番号１）（図６）。ＮＧＡＬはまた好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンおよびリポカリン−２のことを言う。「ＮＧＡＬ」はまた、種変異体、ホモログ、対立形質、突然変異体、およびそれらと同等のものを包含する。
【００３０】
「高レベル」という用語は、コントロールサンプルと検査サンプルの比較または本明細書で開示されている方法におけるコントロールレベルおよびテストサンプルレベルについての文脈で使用されているときは、コントロールサンプル中に見出されたレベルよりも統計的に顕著なまたは顕著に上のレベル、例えば１．３倍高いまたは１．５倍高いなど、を含む。好ましくは、「高レベル」は少なくとも２倍またはそれ以上高い。
【００３１】
「統計的に顕著な」または「顕著に」は統計的有意性を含み、一般的にはマーカー濃度が通常より２標準偏差（２ＳＤ）またはそれ以上高いことを意味する。
【００３２】
「ＬＣＩＳ」は非浸潤性小葉癌である。ＬＣＩＳはまた小葉腫瘍とも呼ばれ、時に非侵襲的な乳癌のタイプに分類される。これは小葉の壁を通り抜けない。これは通常これ自身が侵襲的な癌になることはないが、この状況にある女性は侵襲的な乳癌を同じまたは反対の胸に発症する高い危険性を有する。
【００３３】
「ＤＣＩＳ」は非浸潤性乳管癌である。非浸潤性乳管癌は最もありふれた非侵襲的乳癌のタイプである。ＤＣＩＳにおいて、悪性の細胞は乳管の壁を通って胸の脂肪組織へと転移しない。面皰癌は他のタイプのＤＣＩＳよりも乳腺腫瘍摘出術のあとに同じ場所により戻って来やすいタイプのＤＣＩＳであり、他の形態のＤＣＩＳよりも侵襲的乳管癌の結果的な発症により密接に関連している。
【００３４】
癌の「増大した危険性」は一般集団のそれよりも増大した癌の危険性を含む。癌の増大した危険性を有するといわれたヒトは癌の発症および継続的な癌危険性マーカーの存在をモニタリングする必要がある。
【００３５】
本開示においてさらなる詳細を記述していくと、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などの高転移性乳癌派生のセルラインは、Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７などの良性、器官が明確な乳癌派生のセルラインよりも多量のＮＧＡＬを発現および分泌している。さらに、ＮＧＡＬ（−）乳癌セルライン（ＭＣＦ−７）におけるＮＧＡＬの過剰発現は間葉様の表現型を誘発し、細胞移動および侵襲を増大させ、上皮間葉移行（ＥＭＴ）マーカーの転写および発現を制御し、転移性疾患におけるＮＧＡＬの役割を示唆している。
【００３６】
本発明者らは尿中遊離ＮＧＡＬが癌、例えば乳および卵巣癌を含む上皮由来の癌、の存在および／または進行を検出するバイオマーカーとして利用可能であること、ならびに非侵襲的検定および検査が癌の診断および治療の本質的部分として利用可能であることを発見した。癌診断に関係する患者にとって、検査の非侵襲的な本質は過程と同時に発生する何かの不安を改善する。医師および介護人にとって、本明細書に記載のやり方で尿検査をすることは迅速で信頼性があり、本発明の方法は、例えば癌の診断または治療の行程（癌の診断後または治療後の患者に採用される治療上の指標）の一部として癌がより攻撃的または転移的になるかを決定することなどを得るためにＥＬＩＳＡなどの標準的な方法論を活用する。他の癌は腹膜腫瘍、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮癌、甲状腺癌、肺癌、腎臓癌および膵臓癌を含む。例えば癌の再発、拡散、または患者の生存の見込みの決定は、より保守的またはより急進的な治療法をとるべきか、または治療モダリティが組み合わされるべきか否かを決定することを支援することができる。例えば癌の再発が起こりそうな場合、外科的治療に先んじてまたは続いて化学療法、放射線療法、免疫療法、生物学的修飾療法、遺伝療法、ワクチンなどをすること、または患者が治療を受ける期間を調整することは有利となりうる。本発明が可能にするそのような見識による簡便性とスピードは明らかに有利な点である。
【００３７】
ここに開示されている手法は個体が癌、例えば乳および卵巣癌を含む上皮由来の癌、を有しているか否か、または癌発症の増大した危険性があるかを決定するために利用されてもよい。本手法は個体から得た検査サンプル中の遊離ＮＧＡＬのレベルを測定すること、および遊離ＮＧＡＬの観察されたレベルとコントロールレベル、例えばコントロールサンプル中に見出されたもの、または上で定義されたコントロールレベル、を比較することを含む。ＮＧＡＬレベルがコントロールレベルよりも高いことは個体が癌発症の増大した危険性があるか、または癌を有していることを示す。ＮＧＡＬのレベルは、例えば密度計、照度計、またはＥＬＩＳＡプレートリーダーから得られた単位など、任意の単位で表すことができる。
【００３８】
比較の目的のために、検査サンプルおよびコントロールサンプルは同じタイプである、つまり尿から得られたものである。しかしながら、コントロールサンプルは健康な個体から得られた尿サンプル中に通常見出されるＮＧＡＬと同濃度で含む標準サンプルでありうる。
【００３９】
尿サンプルは、好ましくはＮＧＡＬタンパク質の分解を抑制するように処理されたものである。分解を阻害するまたは抑制する手法は、これに限定するものではないが、サンプルのプロテアーゼ阻害剤による処理、サンプルの凍結、またはサンプルの氷上への設置を含む。好ましくは、分析に先だって、サンプルは絶え間なくＮＧＡＬタンパク質の分解の抑制環境下におかれる。
【００４０】
本発明の一側面において、補助的な診断のステップが行える。例えばＮＧＡＬのレベルが癌の危険性または存在を示すように見出された場合、癌の危険性または癌の存在を検出する付加的な手法が、確認のために行える。例えば、癌の危険性を査定するために、個体は、胸の異形は生検、乳輪周囲の非選択的穿刺吸引法または乳管洗浄法で診断されうるなどの当業者に周知の方法で、異形乳管過形成（ＡＤＨ）または非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）のための検査をされうる。ＢＲＣＡ１、またはＢＲＣＡ２または他の知られた癌の遺伝子マーカーなどの、危険性の遺伝子マーカーもまた査定されうる。
【００４１】
超音波、マンモグラフィ、ＰＥＴスキャニング、ＭＲＩ、熱画像法、または他の画像技術、生検、乳管洗浄法、乳管造影（ductogram）、臨床検査、または当業者に知られた他のあらゆる方法などのどんな多様な付加的診断のステップも癌の存在を確認するために利用可能である。
【００４２】
癌の増大した危険性を有する患者は、好ましくはパップスメアおよび他の危険性マーカーによる査定を伴うマンモグラフィなどの癌検出体制に置かれている。患者はまた血管形成阻害剤または選択的ホルモン受容体調節物質の投与などの予防体制に置かれていてもよく、予防体制は当業者によく知られている。癌を有する患者は当業者によく知られた癌治療へと導かれる。
【００４３】
加えて、疾患の進行は個々の患者内の、遊離ＮＧＡＬレベルなどの後のＮＧＡＬレベルによって査定可能である。例えば、個体の状態の変化は時とともにＮＧＡＬ発現レベルの変化、例えば患者における関係する状態の長期的な調査を実行するための標準的な手法を通して比較することでモニタリング可能である。ＮＧＡＬレベルの進行的な増大は時間とともに観察している個体に対する理由次第で癌、腫瘍侵襲および転移および／または後期の癌、を有している増大した潜在性を示唆している。代替的に、治療計画の治療上の効果は固体中のＮＧＡＬレベルを時間とともにモニタリングすることによってモニタリング可能である。例えば時間とともにＮＧＡＬレベルが減少すれば治療計画の効果を示唆できる。長期にわたるモニタリングは２または３以上の時点で起こりうる。
【００４４】
前段落で概説した方法はまた有利に、例えば再発した癌などの癌治療を受けた長期にわたるモニタリングの患者に使われてもよい。尿中ＮＧＡＬ、例えば遊離ＮＧＡＬ、は本開示内において有効な癌バイオマーカーであることが見出され、治療後患者の尿中ＮＧＡＬの増大したレベルは、例えばさらなる診断、または適切な場合さらなる治療などそれに応じて決定されうる。治療後患者において尿中ＮＧＡＬのコントロールレベルが、例えば１もしくは数回測定した尿中ＮＧＡＬ値を利用して確立され、どちらも分析的に適切である。治療後患者の状態の変化を、必要ならば個体における発現レベルの変化を比較することでモニタリングすることができる。状態次第で患者にとって適切ならば、患者の母集団または特定の癌、尿中ＮＧＡＬレベルの漸進的または段階的増大か、あるいは急速な上昇か、は再発を示唆しうる。癌再発の決定はより保守的なまたはより急進的な治療法をとるべきか、あるいは治療モダリティを組み合わせるべきかを決定することを支援可能である。癌の再発が起こりそうな場合、外科的治療に先んじてまたは続いて化学療法、放射線療法、免疫療法、生物学的修飾療法、遺伝療法、ワクチンなどをすること、または患者が治療を受ける期間を調整することは有利となりうる。
【００４５】
代替的に、癌の再発を検査された個体の尿中遊離ＮＧＡＬレベルは経験的に決定されたコントロールレベルと比較することができる。個体からの検査レベルがコントロールレベルよりも大きいことは再発を示唆し、上述したように、さらなる治療またはモニタリングを続けることができる。
【００４６】
遊離尿中ＮＧＡＬレベルの測定
遊離尿中ＮＧＡＬレベルは好ましくは遊離ＮＧＡＬレベルを検出するための抗体、またはそれと同等のものの利用を通して測定されてよい。ＷＯ２００４／０８８２７６で開示されているものなどの他の方法もまた適していて、ＮＧＡＬレベルはまた質量分析によってモニタリングされてもよい。
【００４７】
一つの実施例において、ＮＧＡＬタンパク質のレベルは尿サンプルを遊離ＮＧＡＬ、または遊離ＮＧＡＬの断片と選択的に結合する抗体ベースの結合部分と接触させることによって測定される。抗体−ＮＧＡＬ複合体の形成がそこで遊離ＮＧＡＬレベルの指標として検出される。
【００４８】
「抗体ベースの結合部分」または「抗体」は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子、例えばＮＧＡＬまたは本発明の付加的なバイオマーカーと選択的に結合する（免疫反応する）抗原結合領域を含む分子、の免疫学的に活性な決定基を含む。「抗体ベースの結合部分」は例えばそのいかなるアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ，ＩｇＥ、など）、およびＮＧＡＬタンパク質とまた特に反応性の高いその断片などの抗体全体を含む。抗体は慣習的な技術を利用して断片化できる。したがって、その用語はタンパク質分解的に開裂されたセグメント、または組み換え技術によって調整された、特定タンパク質と選択的に反応できる抗体分子の一部を含む。そのようなタンパク質分解性のおよび／または遺伝子組み換え的な断片の非制限的な例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄＡｂｓおよびペプチドリンカーによって結合されるＶＬおよびＶＨドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは共有的にまたは非共有的に連結して２または３以上の結合領域を有する抗体を形成してもよい。したがって、「抗体ベースの結合部分」はポリクローナル、モノクローナル、または他の抗体および組み換え抗体の精製調整を含む。「抗体ベースの結合部分」という用語はさらにヒト化抗体、二重特異性抗体、および抗体分子から派生の抗原結合決定基を少なくとも１つ有しているキメラ分子を含むことを意図する。好ましい実施例において、抗体ベースの結合部分は検出可能に標識されている。
【００４９】
「標識された抗体」は検出可能な手段で標識された抗体および、酵素的に、放射能的に、蛍光的に、および化学発光的に標識された抗体を含む。抗体はまたｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、またはＨＩＳなどの検出可能なタグで標識されていてもよい。
【００５０】
ＮＧＡＬの検出のために抗体ベースの結合部分を利用した本発明の診断および予後診断方法において、尿サンプル中に存在するＮＧＡＬタンパク質のレベルは検出可能に標識された抗体から発せられるシグナル強度に相関する。
【００５１】
一つの好ましい実施例において、抗体ベースの結合部分は抗体が酵素に連結されることによって検出可能に標識されている。酵素は、言い換えれば、その基質に曝露した場合に、例えば分光学的、蛍光学的または視覚的手法によって検出可能な化学部位を産生するというやり方で基質と反応する。本発明の抗体を検出可能に標識するのに利用できる酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。化学発光法は抗体ベースの結合部分を検出するのに利用可能な別の方法である。
【００５２】
検出はまたあらゆる種類の他の免疫測定法を利用して達成されてもよい。例えば、抗体の放射能標識によって、抗体を放射線免疫測定法の利用を通して検出可能である。放射性同位体はガンマ線カウンターまたはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィなどの手法によって検出可能である。本発明の目的において特に有用な同位体は、３Ｈ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃおよび好ましくは１２５Ｉである。
【００５３】
抗体を蛍光物質で標識することもまた可能である。蛍光標識された抗体が特定波長の光に曝露された場合、その存在は蛍光のために検出できる。最も普通に利用されている蛍光標識物質はＣＹＥ染料、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒドおよびフルオレスカミンである。
【００５４】
抗体はまた１５２Ｅｕまたは他のランタノイド系などの蛍光放出金属を利用して標識することでも検出できる。これらの金属はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート群を利用して抗体に取り付け可能である。
【００５５】
抗体はまた化学発光物質と連結標識して検出可能である。化学発光抗体の存在は化学反応の進行で生じる蛍光の存在を検出することで決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【００５６】
上で論じたように、遊離ＮＧＡＬレベルは酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）、ウェスタンブロッティング法、または免疫組織化学などの免疫測定法によって検出可能であり、それぞれの方法はより詳細を以下に記載する。抗体アレイまたはタンパク質チップもまた使用可能であり、例えばアメリカ特許公報Ｎｏｓ．２００３００１３２０８Ａ１、２００２０１５５４９３Ａ１および２００３００１７５１５，およびアメリカ特許Ｎｏｓ．６，３２９，２０９および６，３６５，４１８を参照。
【００５７】
「放射線免疫測定法」は標識（例えば放射能標識）された形態の抗原を利用して抗原の濃度を検出および測定する技術である。抗原への放射能標識の例は３Ｈ、１４Ｃ、および１２５Ｉを含む。生体サンプル中の遊離ＮＧＡＬ抗原の濃度は、生体サンプル中の抗原を、標識（例えば放射能）された抗原と、抗原のための抗体との結合を競合させることで測定される。標識抗原と未標識抗原の競合的な結合を保障するため、標識抗原は抗体の結合領域を飽和させるのに十分な濃度中に存在している。サンプル中の抗原の濃度が高いほど、標識抗原が抗体に結合する濃度は低くなる。
【００５８】
放射線免疫測定法において、抗体に結合した標識抗原の濃度を決定するため、抗原抗体複合体は遊離抗原から分離されなければならない。抗原抗体複合体を遊離抗原から分離する一つの方法は、抗原抗体複合体を抗アイソタイプ抗血清で沈殿させることである。抗原抗体複合体を遊離抗原から分離する他の方法は、抗原抗体複合体をホルマリン殺菌した黄色ブドウ球菌（S.aureus）によって沈殿させることである。さらに他の抗原抗体複合体を遊離抗原から分離する方法は、抗体をセファロースビーズ、ポリスチレンウェル、ポリ塩化ビニルウェル、またはマイクロタイターウェルに結合（例えば共有的に）させた「固相放射線免疫測定法」を行うことである。抗体に結合した標識抗原の濃度と知られた抗原濃度を有するサンプルに基づいた標準曲線との比較によって、生体サンプル中の抗原濃度が決定可能である。
【００５９】
「免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）」は抗体リガンドが放射線標識されている免疫測定法である。ＩＲＭＡは例えばウサギ血清アルブミンなどのタンパク質との抱合などの技術によって、多価抗原抱合体の産生を必要とする。多価抗原抱合体は１分子あたり少なくとも２つの抗原残基を有しなければならず、抗原残基は少なくとも２つの抗体が抗原に結合できる程度に十分な距離が離れていなければならない。例えば、ＩＲＭＡにおいて多価抗原抱合体はプラスチック球などの固体表面に取り付け可能である。未標識の「サンプル」抗原および放射能標識された抗原用の抗体は多価抗原抱合体でコートされた球を含む検査管に加えられる。サンプル中の抗原は多価抗原抱合体と抗原抗体結合領域を巡って競合する。適切なインキュベーション期間の後、未結合の反応物を洗浄して取り除き、固相上の放射能量が測定される。放射能抗体の結合量はサンプル中の抗原濃度に反比例している。
【００６０】
最も普通の酵素免疫測定法は「酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）」である。ＥＬＩＳＡは標識（例えば酵素結合）した形態の抗体を利用して抗原の濃度を検出および測定する技術である。異なる形態のＥＬＩＳＡがあり、当業者にはよく知られている。当業者に知られたＥＬＩＳＡの標準的な技術は「Methods in Immunodiagnosis」第２版、Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980、Campbell et al., "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964、およびOellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904に記載されている。
【００６１】
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」において、抗体（例えば抗ＮＧＡＬまたは抗遊離ＮＧＡＬ）は固相（つまりマイクロタイタープレート）と連結していて、抗原（例えばＮＧＡＬなど）を含む生物学的サンプルに曝露される。固相はそこで未結合の抗原を取り除くために洗浄される。標識された抗体（例えば酵素連結）がそこで結合抗原（存在した場合）に結合して抗体−抗原−抗体サンドイッチを形成する、抗体に連結できる酵素の例は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、およびβ−ガラクトシダ−ゼである。酵素結合抗体は基質と反応し、測定可能な有色反応生成物を発生する。
【００６２】
「競合ＥＬＩＳＡ」において、抗体（例えば抗ＮＧＡＬまたは抗遊離ＮＧＡＬ）は抗原（つまりＮＧＡＬ）を含むサンプルとともにインキュベートされる。抗原−抗体混合物はそこで抗原（つまりＮＧＡＬ）でコートされた固相（例えばマイクロタイタープレート）と接触される。サンプル中に抗原が多く存在すればするほど、固相と結合できる遊離抗体が少なくなる。標識（例えば酵素連結）された二次抗体がそこで固相に結合した主抗体の量を決定するために固相に加えられる。
【００６３】
「免疫組織化学検定」において、組織切片は特定のタンパク質を、組織を検定されるタンパク質に特異的な抗体に曝露することによって検査される。抗体はそこであらゆる存在タンパク質の存在および量を決定するいくつもの方法によって視覚化される。抗体の視覚化に利用される方法の例は、例えば、抗体に連結した酵素（例えばルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）を通して、または化学的方法（例えばＤＡＢ／基質色素源）によってである。
【００６４】
他の技術もまた、実行者の選択によって本発明のバイオマーカーの検出に利用してよく、本開示に準拠してよい。一つのそのような技術はウェスタンブロッティング法（Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)）であり、適宜処理したサンプルを、ニトロセルロースフィルターなどの固体支持体に転写する前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに泳動する。ＮＧＡＬに選択的に結合する検出可能に標識された抗体（例えば抗ＮＧＡＬまたは抗遊離ＮＧＡＬ）はそこで存在ＮＧＡＬ量に相関する検出可能な標識からのシグナル強度によってＮＧＡＬレベルを査定するために利用可能である。レベルは、例えば濃度測定によって定量可能である。
【００６５】
質量分析法
加えて、ＮＧＡＬ（例えば遊離ＮＧＡＬ）はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析法、核磁気共鳴スペクトル法、またはタンデム質量分析法（例えばＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど）などの質量分析法を利用して検出してもよい。例えばアメリカ特許公表番号２００３０１９９０１、２００３０１３４３０４、および２００３００７７６１６参照。
【００６６】
質量分析法は当業者に周知であり、タンパク質の定量および／または同定に利用されている（例えばLi et al. (2000) Tibtech 18: 151-160、Rowly et al. (2000) Methods 20: 383-397、Kuster and Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400参照）さらに、質量分析技術は、単離タンパク質の少なくとも部分的な新規シークエンシングを可能にするまでに発展してきている。Chait et al., Science 262:89-92 (1993)、Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999)、Bergman, EXS 88:133-44 (2000)のレビュー。
【００６７】
ある実施例において、気相イオン分光光度計が用いられる。他の実施例において、レーザー脱離／イオン化質量分析法がサンプル分析に用いられる。最新のレーザー脱離／イオン化質量分析法（「ＬＤＩ−ＭＳ」）は２つの主なバリエーション、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法および表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）、で実践可能である。ＭＡＬＤＩにおいて、検体はマトリクスを含む溶液に混合され、液体のしずくが下地表面に置かれる。マトリクス溶液はそこで生体分子と共結晶化される。下地は質量分析器に入れられる。レーザーエネルギーが、生体分子を顕著に断片化せずに脱着およびイオン化する下地表面に導かれる。しかしながら、ＭＡＬＤＩは分析機器に制限がある。サンプルを断片化する手法を提供しないし、マトリクス材料が、特に低分子量検体において、検出を妨げる可能性がある。例えばアメリカ特許番号５，１１８，９３７および５，０４５，６９４参照。
【００６８】
ＳＥＬＤＩにおいて、下地表面は脱離過程に活性的に参与するように修飾されている。一つの変化型において、表面は興味のあるタンパク質に選択的に結合する吸収および／または捕獲リガンドに誘導体化されている。他の変化型において、表面はレーザーに打たれたときに脱離しないようなエネルギー吸収分子に誘導体化されている。他の変化型において、表面は興味のあるタンパク質に結合し、レーザーの使用によって壊れるような光分解性結合を含む分子に誘導体化されている。それぞれの方法において、一般的な誘導体化剤はサンプルが供される下地表面の特定の場所に局在化する。例えばアメリカ特許番号５，７１９，０６０およびＷＯ９８／５９３６１参照。２つの方法は、例えば検体を捕獲するＳＥＬＤＩ親和性表面の使用およびエネルギー吸収材料の提供としてマトリクス含有液体の捕獲された検体への付加などと組み合わせることができる。
【００６９】
質量分析器に関係する付加的な情報には、例えばPrinciples of Instrumental Analysis第３版, Skoog Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985、およびKirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology第４版Vol.15 (John Wiley & Sons, New York 1995), pp. 1071-1094参照。
【００７０】
マーカーまたは他の物質の存在の検出は典型的にシグナル強度の検出を伴う。これは、言い換えれば、物質と結合したポリペプチドの量および特徴を反映可能である。例えば、ある実施例において、第一サンプルおよび第二サンプル由来のスペクトルのピーク値のシグナルの強さは比較可能（例えば視覚的に、コンピューター分析によって、など）で、特定の生体分子の相対量を決定できる。Biomarker Wizardプログラム（Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.）などのソフトウェアプログラムを、質量スペクトル分析を補助するために利用可能である。質量分析器およびその技術は当業者に周知である。
【００７１】
どの当業者も、どの質量分析器の構成要素（たとえば、脱離源、質量分析部、検出部など）および多様なサンプル調整が本明細書に記載されたもしくは当業者に周知の他の適切な構成要素または調整と組み合わせ可能であることを理解する。例えば、いくつかの実施例において、コントロールサンプルは重原子（例えば１３Ｃ）を含んでよく、したがって検査サンプルに周知のコントロールサンプルを同一の質量分析器稼働時において混合することが許される。
【００７２】
一つの好ましい実施例において、レーザー脱離飛行時間（ＴＯＦ）質量分析器が利用される。レーザー脱離質量分析器において、結合マーカーと下地は吸気装置に導入される。マーカーはイオン化源からのレーザーによって気相へ脱離およびイオン化される。発生したイオンはイオン光学アセンブリ（ion optic assembly）によって集められ、そこで飛行時間質量分析部に入れられ、イオンは短い高電圧場を通して加速され、高真空容器内に流れ込む。高真空容器の遠い終端では、加速されたイオンが感受検出器表面に異なる時間で衝突する。飛行時間はイオン質量の関数であるので、イオン形成とイオン検出器衝突の間の経過時間が、特定質量と電荷比を持つ分子の存在または欠失の特定に利用可能である。
【００７３】
いくつかの実施例において、第一または第二サンプル中の１または２以上の生体分子の相対量が、プログラム可能なデジタルコンピューターでアルゴリズムを実行することで一部決定された。アルゴリズムは第一の質量スペクトルおよび第二の質量スペクトルの少なくとも１つのピーク値を同定する。アルゴリズムはそこで第一の質量スペクトルのピーク値のシグナルの強さと第二の質量スペクトルのピーク値のシグナルの強さを比較する。関係するシグナルの強さは、第一および第二サンプル中に存在する生体分子（例えばＮＧＡＬまたは遊離ＮＧＡＬ）の量の示唆である。既知の量の生体分子を含む標準は第二サンプルとして、第一サンプル中に存在する生体分子の量のよりよい定量のために分析可能である。ある実施例において、第一および第二サンプル中の生体分子の正体もまた決定可能である。一つの好ましい実施例において、バイオマーカーレベルはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される。
【００７４】
抗体
本発明で利用される遊離ＮＧＡＬ結合抗体は商業的供給源（例えば抗遊離ＮＧＡＬ抗体はR&D Systems, Minneapolis, MN USAのＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡキット＃ＤＬＣＮ２０で利用可能）から獲得可能である。代替的に、遊離ＮＧＡＬのみに対して反応しＭＭＰ−９／ＮＧＡＬに対しては反応しない抗体を発生させるために、抗体は遊離ＮＧＡＬまたはバイオマーカーポリペプチドの一部、例えば通常ＭＭＰ−９／ＮＧＡＬ複合体では隠れているアミノ酸部分、に対して抗体産生されてもよい。そのような抗体結合部位はＭＭＰ−９／ＮＧＡＬ結合領域内のエピトープに対して、当業者によって抗体産生されてもよく、ここでさらなる詳細について開示する必要はない。
【００７５】
本発明に利用される抗体は、例えばモノクローナル抗体産生（Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsecier Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands (1984)、St. Groth et al., J. Immunology, (1990) 35: 1-21、およびKozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72）などの抗体産生の標準的な方法で産生できる。抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーなどの抗体ライブラリーを、当業者に周知の方法によってタンパク質の抗原部分を利用したスクリーニングをすることによって手軽に獲得可能である。例えば、アメリカ特許番号５，７０２，８９２およびＷＯ０１／１８０５８はバクテリオファージディスプレイライブラリーおよび抗体結合領域断片産生による選択方法を開示する。
【００７６】
ＮＧＡＬ検出キット
卵巣癌の検出および予後的評価のため、ならびに乳癌の検出および予後的評価のための商業的キットは本開示に基づいて提供される。キットは当業者に周知のいかなる形態であってもよく、ＮＧＡＬの検出のために本明細書に記載された１または２以上の方法を行うのに有用である。キットは、尿サンプル中のＮＧＡＬ検出のための検定を実施するための本質的な試薬を、全てではないにしても、多量に供給することにおいて重宝である。加えて、検定は好ましくは、検査結果が定量または認証できるために、キットに含まれる既定量のＮＧＡＬタンパク質などの標準または多数の標準と同時に行われる。
【００７７】
キットはＮＧＡＬレベルを検出する手法、つまりＮＧＡＬタンパク質と選択的に結合するＮＧＡＬ結合抗体または抗体断片も含まれる。診断検定キットは優先的に標準２抗体結合形式に考案されており、一つのＮＧＡＬ特異的抗体が患者サンプル中のＮＧＡＬを捕らえ、別のＮＧＡＬ特異的抗体は捕らえられたＮＧＡＬを検出するのに使われる。例えば捕らえられた抗体は固相、例えば検定プレート、検定ウェル、ニトロセルロース膜、ビーズ、ディップスティック、または溶出カラムの構成材、上に固定される。二次抗体、つまり検出抗体、は典型的に比色分析剤または放射性同位体などの検出可能な標識によってタグを付けられる。
【００７８】
一つの好ましい実施例において、キットは尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルの検出手法を包含する。特定の実施例において、特異的にＮＧＡＬタンパク質と結合する抗ＮＧＡＬ抗体または断片がその上に固定された「ディップスティック」を含む。ＮＧＡＬタンパク質との特異的結合はそこで、例えば比色分析剤または放射性同位体で検出可能に標識された二次抗体を利用して検出でき、遊離ＮＧＡＬの量は当業者が理解するように定量的に決定されてもよい。
【００７９】
他の実施例において、検定キットは（これに限定するものではないが）以下の技術、競合的および非競合的検定、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、生物発光および化学発光検定、蛍光検定、サンドイッチ検定、免疫放射定量検定、ドットブロット法、ＥＬＩＳＡを含む酵素連結検定、マイクロタイタープレート、および免疫細胞化学、を採用してもよい。各キットの検定の範囲、感度、正確性、信頼性、特異性および再現性は当業者に周知の方法で確立される。
【００８０】
本発明はさらに後述の例によって説明されている。これらの例は本発明の理解を補助するために提供されており、本発明を制限すると解釈するものではない。
【００８１】
実施例１
卵巣および乳癌の尿中バイオマーカーとしてのＮＧＡＬ
本実施例は遊離ＮＧＡＬが癌、例えば乳および／または卵巣癌などの上皮由来のもの、のバイオマーカーとしての役目を果たせることを示している。さらに、遊離ＮＧＡＬが癌の診断、予後診断および病期診断に有用であることを明示している。図１Ａおよび１Ｂは様々な卵巣癌セルラインにおけるＮＧＡＬ転写発現レベルを示したものである。図３Ａおよび３Ｂは様々な乳癌セルラインにおけるＮＧＡＬ転写発現レベルを示したものである。発現レベルはリアルタイムＰＣＲを利用して測定された。これらの結果は、ＮＧＡＬが非癌性（ＨＯＳＥ）セルラインと比較して癌セルラインにおいて過剰発現していることを裏付けるものである。
【００８２】
図２は卵巣癌セルラインから馴化培地に分泌されたＮＧＡＬタンパク質の量を、Borregaard博士に提供していただいた抗ＮＧＡＬ抗体を利用して、Kjeldsen L, Koch C, Arnljots K, Borregaard N., 「新規に記載されるヒト好中球中のリポカリン、ＮＧＡＬ用の２つのＥＬＩＳＡ法の特性」（Characterization of two ELISAs for NGAL, a newly described lopocalin in human neutrophils.） J Immunol Methods. 1996 Nov 13; 198(2):155-64に記載されているBorregaard ＥＬＩＳＡによって測定して描いたグラフを示している。ＳＫＯＶ−３はＯＶＣＡＲ−５よりも顕著に低い分泌量を有しているのだが、ＯＶＣＡＲ−５は最高レベルの分泌を示した。図４は乳癌セルラインから馴化培地に分泌されたＮＧＡＬタンパク質の量をBorregaard ＥＬＩＳＡを利用して描いたグラフを示している。器官限定的癌から派生したセルライン（ＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ）においては顕著に少ない分泌であったが、高転移性の癌から派生したセルライン、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はは最高レベルのＮＧＡＬ分泌量を示した。
【００８３】
しかしながら、本発明者らは後述のデータにおいて、遊離尿中ＮＧＡＬタンパク質は乳および／または卵巣癌のバイオマーカーとしての役目を果たすことを示す。特に、癌を有さない患者からのコントロール尿サンプルと比較して、悪性の癌を有する患者からの尿サンプル中の遊離ＮＧＡＬレベルの増大がある。
【００８４】
疾患のない、良性卵巣疾患、または悪性卵巣癌を有する患者からの尿サンプル中のＮＧＡＬタンパク質レベルがウェスタンブロット分析（図５Ａおよび５Ｂ）を利用して決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元性状態の下で行われ、遊離および複合体ＮＧＡＬが両方測定された。図５ＡはR&D Systems（Minneapolis, MN USA）からの抗ヒトＮＧＡＬを用いた尿サンプルのウェスタンブロット分析を示している。図５Ｂは疾患のない、良性卵巣疾患、または悪性卵巣癌を有する患者からの少なくとも５つの尿サンプルから得た結果の定量的分析を示している。悪性の卵巣癌を有する患者は疾患のない個体からのサンプルと比較して尿中に多量のＮＧＡＬを示した。これはBorregaard ＥＬＩＳＡ検定によって裏付けられた（図７）。乳癌患者からの尿サンプルの同様の分析もまた、悪性の癌を有する患者からの尿中に、疾患のない患者と比較して高レベルのＮＧＡＬを示した。（図８）
【００８５】
さらに、将来的な乳癌の発症に対する主な危険性因子である異形乳管過形成（ＡＤＨ）を有する個体が、健康な個体に見られるレベルよりも尿中に高レベルの遊離ＮＧＡＬを有することを発見した。遊離ＮＧＡＬのみを認識する抗ＮＧＡＬ抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN USAのNGAL ELISA kit #DLCN20からのもの）を利用したＥＬＩＳＡ検定が遊離ＮＧＡＬレベルを査定するのに利用され、結果は図９に示されている。Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡを利用して、健康な個体においてみられるレベルと比較して遊離ＮＧＡＬの増大したレベルがまた、非侵襲性乳癌の最も普遍的な型である非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）および侵襲性乳癌（ＩＢＣ）を有する個体においても検出された。（図１２）。
【００８６】
遊離ＮＧＡＬは尿中に少なくとも単量体、二量体および三量体の型で存在する。遊離単量体尿中ＮＧＡＬの検出は、本開示に従って可能である。この場合、調査はR&D Systems, Minneapolis, MN USAからのNGAL ELISA kit #DLCN20によって行われる。単量体ＮＧＡＬの存在は、図１３に示したように、とくに良性および悪性卵巣癌の指標であるように見える。図１３は良性および悪性腫瘍を有する患者からの卵巣癌尿サンプル中に存在する遊離ＮＧＡＬ単量体の量と通常サンプルとの比較を示したグラフである。悪性腫瘍サンプルは良性サンプル集団よりとても高い遊離ＮＧＡＬレベルを証明している。
【００８７】
したがって、尿中遊離ＮＧＡＬのレベルを測定することは、個体が、例えば乳および／または卵巣癌などの上皮由来の、癌を有するかまたは癌発症の増大した危険性があるか否かを決定するのに利用可能な、素早く、簡便な、および安全な検査を提供する。年齢および性別の一致したコントロールサンプルと比較して高レベルの尿中遊離ＮＧＡＬは、個体は癌を有するかまたは乳および／または卵巣癌発症の増大した危険性があることを示す。陽性検査は個体がさらなる癌のための検査およびモニタリングを適宜されるべきであることを示す。
【００８８】
例２
上皮間葉移行におけるＮＧＡＬの関与
上皮間葉移行（ＥＭＴ）は上皮細胞が間葉的な、繊維芽細胞様の特性を獲得し、細胞間接着性の減少および移動性の増大を示す重要な過程である。ＥＭＴ様の出来事は腫瘍進行および悪性形質転換を通して起こり、がん細胞に侵襲的および転移的特性を授けると信じられている（Laruel et al. Oncogene (2005) 24, 7443-7454）。
【００８９】
攻撃的な癌発症におけるＮＧＡＬの潜在的な役割を査定するため、我々はＮＧＡＬを過剰発現する安定なＭＣＦ−７セルライン、Ｎ１およびＮ２を調整した。ＭＣＦ−７はＮＧＡＬをほとんど発現しない乳癌セルラインである。我々はＮ１およびＮ２セルクローン（ＮＧＡＬを過剰発現するＭＣＦ−７細胞）が間葉様の表現型を見せ、これらの細胞は細胞接触を失い、細胞表面のいたる所により均一に分散することを発見した（データ提示なし）。
【００９０】
ＮＧＡＬ過剰発現細胞の細胞移動は、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎフルオロブロック２４マルチウェルインサートシステム（BD Falcon HTS FluoroBlok 24-Multiwell Insert System） (BD Bioscience, Bedford, MA)を製品のマニュアルに従って利用して評価した。ＭＣＦ−７コントロールおよびＮＧＡＬ過剰発現細胞（Ｎ１／Ｎ２）は７０％コンフルエンスまで生育し、そこでトリプシン処理および無血清培地内に再懸濁した。５×１０４個の細胞がトップチャンバーに播種された。完全培地（７５０μｌ）は化学誘引物質として利用され、下部チャンバーに加えられた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベート後、培地は上部チャンバーから取り除かれた。インサートプレートをそこで０．５ｍｌ／ウェルの１０μＭ CellTracker CMFDA (Molecular Probes)入りの新たな２４ウェルプレートに移動し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。BD FluoroBlok膜は膜を通って細胞移動した標識細胞だけを蛍光顕微鏡下で視覚化する。査定の結果ははっきりと、ＮＧＡＬの過剰発現が移動性を増大させたことを示している。ＮＧＡＬを過剰発現した細胞は母体であるＭＣＦ−７細胞よりも多く細胞移動している（図１０）。
【００９１】
加えて、細胞侵襲がＮＧＡＬ過剰発現によって活性化されている。ＮＧＡＬ過剰発現細胞の侵襲性は、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  ２４マルチウェルガン細胞浸潤アッセイシステム（24-well BD BioCoat Tumor Invasion System） (BD Bioscience, Bedford, MA)を製品のマニュアルに従って利用して評価した。このシステムにおいて、FluoroBlok膜はMatrigelＴＭ層で覆われている。ＭＣＦ−７コントロールおよびＮＧＡＬ過剰発現細胞（Ｎ１／Ｎ２）を７０％コンフルエンスまで育成し、そこでトリプシン処理および無血清培地内に再懸濁した。５×１０４個の細胞がトップチャンバーに播種された。完全培地（７５０μｌ）は化学誘引物質として利用され、下部チャンバーに加えられた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベート後、培地は上部チャンバーから取り除かれた。インサートプレートをそこで０．５ｍｌ／ウェルの１０μＭ CellTracker CMFDA (Molecular Probes)入りの新たな２４ウェルプレートに移動し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。BD FluoroBlok膜はBD MatrigelＴＭ膜を通して侵入した標識細胞のみを蛍光顕微鏡下で視覚化する。この検定の結果は、ＮＧＡＬの過剰発現が侵襲性を増大させることを示している（図１１）。
【００９２】
我々はまた上皮間葉移行（ＥＭＴ）に関与することで知られている分子を制御するＮＧＡＬの能力を査定した。ＲＴ−ＰＣＲおよびＮＧＡＬを過剰発現するセルラインを利用して、我々はＮＧＡＬの過剰発現が間葉性マーカーであるビメンチンおよびフィブロネクチンの発現を増大させることを見出した（データ提示なし）。ＮＧＡＬの過剰発現はＥＭＴを制御する転写因子であるＳｌｕｇの発現を増大させる一方で、ＥＲαおよびＥ−カドヘリンの発現を減少させる。
【００９３】
したがって、ＮＧＡＬは攻撃的な癌において見出されるのと一致した細胞表現型の発展に関与している。
【００９４】
均等物
当業者は、ただのありふれた実験を利用して、本明細書に記載された特定の手段と均等な多くの物を認める、または解明するだろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、後述の特許請求の範囲によって保護されている。多様な代用品、改変、および改良は、特許請求の範囲によって定義された本発明の精神および範囲から逸脱しないように、本発明に対してなされてよい。他の態様、利点、および改良は本発明の範囲内である。本出願を通して引用されている全ての参照文献の内容、交付済み特許、および公開された特許出願は、参考文献によって本明細書に組み込まれる。これらの特許、出願および他の文書の適切な成分、過程、および方法は本発明およびその実施例のために選択されてよい。
【００９５】
参考文献
Santin et al., Int. J. Cancer 2004, 112: 14-25. 主要な卵巣漿液性乳頭状腫瘍および正常卵巣上皮の遺伝子発現プロファイル：卵巣ガン診断および治療のための分子マーカー候補の同定（Gene expression profiles in primary ovarian serous papillary tumors and normal ovarian epithelium: Identification of candidate molecular markers for ovarian cancer diagnosis and therapy.）
【００９６】
Mishara et al, J. Am. Soc. Nephrol. 14:2534-2543 虚血生腎障害の新規早期尿中バイオマーカーとしての好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンの同定（Identification of neutrophil gelatinase associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury.）
【００９７】
O'Brien et al, Experimental. Dermatology 2002, 11: 584-591 好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンはヒト皮膚における調和不全なケラチン生成細胞分化のマーカーである。（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin is a marker for dysregulated keratinocyte differentiation in human skin.）
【図面の簡単な説明】
【００９８】
本明細書に取り込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図は、本発明の実施例を描き、説明とともに、本発明の対象、利点、および原理を説明する役目を果たす。
【００９９】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、卵巣癌セルラインにおけるＮＧＡＬ転写物の発現レベルを示す。発現レベルはリアルタイムＰＣＲを用いて測定された。図１Ａはコントロール転写物ＧＡＰＤＨと比較したアガロース上で分離された転写物を示す。図１ＢはＮＧＡＬ／ＧＡＰＤＨ比率をＹ軸にとって描写したグラフである。ＨＯＳＥは正常卵巣セルラインであり、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５、およびＳＫＯＶ−３は卵巣癌セルラインである。
【０１００】
【図２】図２はBorregaard ＥＬＩＳＡによって測定された、卵巣癌セルライン、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５およびＳＫＯＶ−３から馴化培地に分泌されたＮＧＡＬタンパク質の量を描いたグラフである。
【０１０１】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、乳癌セルラインにおけるＮＧＡＬ転写物の発現レベルを示す。発現レベルはリアルタイムＰＣＲを利用して測定された。図３Ａはコントロール転写物ＧＡＰＤＨと比較したアガロース上で分離された転写物を示す。図３ＢはＮＧＡＬ／ＧＡＰＤＨ比率をＹ軸にとって描写したグラフである。Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７は「器官限定的」乳癌セルラインであり、他方ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は「高転移性セルライン」である。
【０１０２】
【図４】図４はBorregaard ＥＬＩＳＡによって測定された、乳癌セルライン、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１から馴化培地に分泌されたＮＧＡＬタンパク質の量を描いたグラフである。
【０１０３】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、疾患なし、良性卵巣疾患を有する、および悪性卵巣疾患を有する患者からの尿サンプル中のＮＧＡＬタンパク質レベルを示す。図５Ａは抗ＮＧＡＬ抗体を利用した尿サンプルのウェスタンブロット分析を示す。図５Ｂは図５Ａで記載したウェスタンブロットの定量的分析を示す。ブロットは濃度計を用いて定量化され、レベルは任意の濃度測定単位で表されている。
【０１０４】
【図６】図６はヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列（配列番号１）である。
【０１０５】
【図７】図７は、Borregaard ＥＬＩＳＡで測定された、健康なコントロールサンプルと比較した卵巣癌尿サンプル中のＮＧＡＬタンパク質発現のグラフである。
【０１０６】
【図８】図８はBorregaard ＥＬＩＳＡで測定された、健康なコントロールサンプルと比較した乳癌尿サンプル中のＮＧＡＬタンパク質発現のグラフである。
【０１０７】
【図９】図９は将来的な乳癌の発症に対する主要な危険性因子である異形乳管過形成（ＡＤＨ）または非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）を有する個体におけるＮＧＡＬタンパク質発現を健康な個体において見られるレベルと比較したグラフである。Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡが利用された。例１参照。
【０１０８】
【図１０】図１０は乳癌細胞、ＮＧＡＬをほとんど発現しないＭＣＦ−７細胞、およびＮＧＡＬを過剰発現させた２つのセルラインクローンＮ１およびＮ２、の細胞移動検定におけるフィールドごとの移動細胞の量（ｙ軸）を描いたグラフである。
【０１０９】
【図１１】図１１は乳癌細胞、ＮＧＡＬをほとんど発現しないＭＣＦ−７細胞、およびＮＧＡＬを過剰発現させた２つのセルラインクローンＮ１およびＮ２、の腫瘍侵襲検定における細胞侵襲の量を描いたグラフである。
【０１１０】
【図１２】図１２は将来的な乳癌の発症に対する主要な危険性因子である異形乳癌過形成（ＡＤＨ）、非浸潤性乳癌の最も普遍的な型である非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、および侵襲性乳癌（ＩＢＣ）を有する個体におけるＮＧＡＬタンパク質発現と健康な個体において見られるレベルとを比較したグラフである。Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡが利用された。
【０１１１】
【図１３】図１３は正常、良性および悪性腫瘍を有する患者からの卵巣癌尿サンプル中に存在する遊離ＮＧＡＬ単量体の量を示したグラフである。悪性腫瘍サンプルは良性サンプル集団よりも高い遊離ＮＧＡＬレベルを証明している。これらの研究はNGAL ELISA kit #DLCN20（R&D Systems, Minneapolis, MN USAから入手可能）で行われた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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