(57)【要約】  ＫＬＤＲ結合アフィニティを有するペプチドベクターと、このようなベクターの製造方法を提供する。該ペプチドベクターはリン脂質にコンジュゲート化することができ、超音波造影剤組成物に含めることができる。このような超音波造影剤は特に、例えばＫＤＲ含有組織のイメージング及び、新生物状態に関連した血管新生過程の評価と処置におけるような、治療的及び診断的方法に有用である。本発明はまた、高度に純粋なダイマー及びモノマーのペプチド・リン脂質コンジュゲート並びに該コンジュゲートの形成に用いられる前駆体物質の大規模生産方法を提供する。本発明はさらに、非常に低レベルのＴＦＡを含有する、高度に純粋なペプチド・リン脂質コンジュゲートの大規模生産方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2009518448.tif 000026
【化２】
2009518448.tif 000027
から成る群から選択されるペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項２】
請求項１記載のコンジュゲートを含む超音波造影剤組成物。
【請求項３】
造影剤がガス充填微小嚢を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
ガス充填微小嚢がリン脂質を含む、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ガス充填微小嚢が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、パルミチン酸及びステアリン酸から成る群から選択される、２つ以上の成分をさらに含む、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣとＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
該コンジュゲートが配列番号：４を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣとＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
該コンジュゲートが配列番号：４を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＰＰＥ及びＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項９】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＰＰＥ及びＤＰＰＧを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１０】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＡを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１１】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＡを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１２】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣ及びＤＳＰＡを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１３】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１４】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１５】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１６】
該コンジュゲートがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ−ＧＧＧＫ［−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）］−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド｝−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１７】
該コンジュゲートが配列番号：１を含み、該造影剤がさらにＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣ及びステアレートを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１８】
糖、多糖類及びポリオール類から成る群から選択される成分をさらに含む、請求項５記載の組成物。
【請求項１９】
前記成分が、マンニトール、デキストラン及びポリエチレングリコールから成る群から選択される、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記ガスがフッ素化ガスを含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
該ガスが、任意に、空気、窒素、酸素又は二酸化炭素との混合物として、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０又はＳＦ６を含む、請求項３又は請求項７〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
哺乳動物におけるＫＤＲ含有組織のイメージング方法であって、請求項３記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与して、該哺乳動物をイメージングすることを含む方法。
【請求項２３】
哺乳動物における血管新生プロセスの検出又はイメージング方法であって、請求項３記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与して、該哺乳動物をイメージングすることを含む方法。
【請求項２４】
哺乳動物におけるＫＤＲ含有腫瘍組織の検出又はイメージング方法であって、請求項３記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与して、該哺乳動物をイメージングすることを含む方法。
【請求項２５】
【化３】
2009518448.tif 000028
を含むペプチド・モノマー。
【請求項２６】
【化４】
2009518448.tif 000029
から成る群から選択される１つ以上のモノマーを含む超音波造影剤組成物。
【請求項２７】
該造影剤が、ガス充填微小嚢を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
前記ガスがフッ素化ガスを含む、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
リン脂質をさらに含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、パルミチン酸及びステアリン酸から成る群から選択される、２つ以上の成分をさらに含む、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
該ガスが、任意に、空気、窒素、酸素又は二酸化炭素との混合物として、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０又はＳＦ６を含む、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
請求項２５記載のペプチド・モノマーの１つ以上を含むペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項３３】
該リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン及び修飾ホスファチジルエタノールアミンから成る群から選択される、請求項３２記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項３４】
該リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００である、請求項３３記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート。
【請求項３５】
哺乳動物におけるＫＤＲ含有組織のイメージング方法であって、請求項２６記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与して、該哺乳動物をイメージングする方法。
【請求項３６】
哺乳動物における血管新生プロセスの検出又はイメージング方法であって、請求項２６記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与して、該哺乳動物をイメージングする方法。
【請求項３７】
哺乳動物におけるＫＤＲ含有腫瘍組織の検出又はイメージング方法であって、請求項２６記載の組成物の有効量を該哺乳動物に投与して、該哺乳動物をイメージングする方法。
【請求項３８】
リン脂質を含むガス充填微小嚢の製造方法であって、
ａ．（ｉ）水を包含する水性媒質、（ｉｉ）水と実質的に混和しない有機溶媒、（ｉｉｉ）リン脂質、（ｉｖ）請求項１記載のペプチド−リン脂質コンジュゲート、及び（ｖ）分散保護剤を含む水性−有機エマルジョンを製造する工程；
ｂ．前記エマルジョンを凍結乾燥して、前記リン脂質を含む凍結乾燥マトリックスを得る工程；
ｃ．前記凍結乾燥マトリックスを生体適合性ガスと接触させる工程；
ｄ．前記凍結乾燥マトリックスを生理的に許容される水性キャリヤー液体中に溶解して、前記ガス充填微小嚢の懸濁液を得ることによって、前記凍結乾燥マトリックスを再構成する工程
を含む方法。
【請求項３９】
工程ａが、
ａ．ＰＥＧ化リン脂質と請求項１記載のコンジュゲートを含む水性懸濁液を製造する工程；
ｂ．水性媒質、有機溶媒、リン脂質及び分散保護剤を含む水性−有機エマルジョンを製造する工程；及び
ｃ．工程ａ１の前記水性懸濁液に工程ａ２の該エマルジョンを混合する工程
を含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
【化５】
2009518448.tif 000030
から成る群から選択されるペプチドをリン脂質と結合させることを含む、ペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造方法。
【請求項４１】
リン脂質がＰＥＧ化されている、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ＰＥＧ化リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
コンジュゲート化が該ペプチドのモノＮＨＳエステルを該リン脂質塩の遊離アミノ基と反応させることを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
低レベルのＴＦＡを有するペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造方法であって、
ペプチド・ダイマーＴＦＡ塩をアニオン交換によって酢酸塩に転化させる工程；及び
該ペプチド・ダイマーをリン脂質に結合させる工程を含む方法。
【請求項４５】
該ペプチドがペプチド・ダイマーを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
該ペプチド・ダイマーが、Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ［Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ）−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド］−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該アニオン交換クロマトグラフィーが酢酸アンモニウムのステップ勾配を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
該リン脂質がＰＥＧ化されている、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
該ＰＥＧ化リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
低レベルのＴＦＡを有するペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造方法であって、サイズ排除カラムにおいてペプチド・リン脂質コンジュゲート及びＴＦＡイオンを溶出することを含む方法。
【請求項５１】
前記溶出が炭酸水素アンモニウムの存在下で行われる、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
該ペプチド・リン脂質コンジュゲートがＰＥＧ化リン脂質を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
該ＰＥＧ化リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該ペプチド・リン脂質コンジュゲートがペプチド・ダイマーを含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
該ペプチド・ダイマーがＡｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ［Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（−Ａｄｏａ−Ａｄｏａ−Ｇｌｕｔ−Ｋ）−ＮＨ２環状（２−１２）ジスルフィド］−ＮＨ２環状（６−１３）ジスルフィドを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
該ペプチド・リン脂質コンジュゲートがペプチド・モノマーを含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５７】
該モノマーが、
【化６】
2009518448.tif 000031
から成る群から選択される、請求項５６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願No.60/833,342（July 25, 2006出願）及び米国仮出願No.60/749,240（December 9, 2005出願）に対する優先権とこれらの利益を主張するものであり、これによって、これらの仮出願の各々の内容は本明細書に援用される。
発明の分野
本発明は、治療用及び診断用組成物に有用である、ターゲットベクター・リン脂質コンジュゲート、特にターゲットペプチド・リン脂質コンジュゲートと、これらの製造方法に関する。本発明は、標的超音波造影剤と、特に、該ターゲットベクター・リン脂質コンジュゲートを含む標的マイクロバブルを包含する。
発明の背景
血管新生、新しい血管の形成は、胚発育及び正常な組織の成長と修復中にのみ生じるのではなく、女性の生殖周期、妊娠の確立と維持、及び創傷と骨折の修復にも関与する。正常な個体において生じる血管新生の他に、血管新生イベントは、多くの病的プロセス、特に、腫瘍の増殖と転移、並びに例えば、糖尿病性網膜症、乾癬及び関節症のような、血管増殖が増加するような、他の状態にも関与する。さらに、血管新生は、過形成性増殖から新生物性増殖までの腫瘍の転移に重要である。その結果、血管新生の阻害は、活発な癌治療研究分野になっている。
【０００２】
腫瘍誘導血管新生は、既存血管を静止状態かつ安定に保持する傾向にある他の力に打ち勝つ血管新生誘発性増殖因子の、腫瘍細胞によるの産生に依存すると考えられる。これらの血管新生誘発性作用因子若しくは増殖因子の最もよく特徴付けられたものは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である(Cohen et al., FASEB J., 13: 9-22(1999))。ＶＥＧＦは、多様な細胞種類によって、低酸素症及び幾つかの他の刺激に反応して、自然に産生される。多くの腫瘍も、多量のＶＥＧＦを産生する、及び／又はすぐ近くの間質細胞を誘発して、ＶＥＧＦを作らせる(Fukumura et al., Cell, 94: 715-725(1998))。ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａとも呼ばれる）は、１２１、１４５、１６５、１８９及び２０６アミノ酸の５種類の異なるスプライス・アイソフォームとして合成される。ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５は、特に腫瘍中で産生される主要なスプライス・アイソフォームである(Cohen et al., 1999,上記文献参照)。ＶＥＧＦ１２１は、ＶＥＧＦ１６５とは異なって、ＶＥＧＦ遺伝子のエキソン６と７によってコードされる基本ドメインを有さず、ヘパリン若しくは細胞外マトリックスに結合しない。このパラグラフに引用した参考文献の各々は、その全体で、本明細書に援用される。
【０００３】
ＶＥＧＦファミリーのメンバーは、主として、受容体型チロシンキナーゼに結合することによって作用する。一般に、受容体型チロシンキナーゼは、１つ以上の特定増殖因子と結合可能な細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（通常、αヘリックス）、膜近位ドメイン（ここで該受容体は例えばリン酸化によってレギュレートされうる）、チロシンキナーゼドメイン（該受容体の触媒成分）、及びカルボキシ末端テール（これは、多くの受容体において、チロシンキナーゼに対する基質の認識と結合に関与する）を有する糖たんぱく質である。ＶＥＧＦに結合することが知られている、３種類の内皮細胞−特異的受容体型チロシンキナーゼ：ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ若しくはＦｌｋ−１）及びＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）が存在する。Ｆｌｔ−１と、ＫＤＲ（これは、ＶＥＧＦＲ−２若しくはＦｌｋ−１としても知られており、これらの用語は本明細書では互変的に用いられる）は、主要な高アフィニティＶＥＧＦ受容体として同定されている。Ｆｌｔ−１の方がＶＥＧＦに対して高いアフィニティを有するが、ＫＤＲはより豊富な内皮細胞発現を示す(Bikfalvi et al., J. Cell. Physiol., 149: 50-59(1991))。さらに、ＫＤＲは、血管新生反応を支配すると考えられ、それ故、治療的及び診断的重要性がより大きい(Cohen et al., 1999, 上記文献参照)。ＫＤＲ発現は、特に、強い血管新生反応を誘発する腫瘍における新生血管では、高度にアップレギュレートされる(Veikkola et al., Cancer Res., 60: 203-212(2000))。血管新生におけるＫＤＲの重要な役割は、同型接合ＫＤＲノックアウトマウス胚における血管発生の完全な欠如によって強調される(Folkman et al., Cancer Medicine, 5th Edition(B.C. Decker Inc.; Ontario, Canada, 2000) pp.132-152)。
【０００４】
ＫＤＲ（キナーゼ・ドメイン領域）は、その成熟形において、１３３６アミノ酸から構成される。ＫＤＲのグリコシル化形は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約２０５ｋＤａの見かけの分子量で泳動する。ＫＤＲは、その細胞外ドメイン中に７個の免疫グロブリン様ドメインを有し、そのうちの最初の３個がＶＥＧＦ結合において最も重要である(Cohen et al., 1999, 上記文献)。ＶＥＧＦそれ自体は、２つのＫＤＲ分子に同時に結合することができるホモダイマーである。その結果、２つのＫＤＲ分子は結合時にダイマーになり、自己リン酸化して、非常に高活性になる。増強したキナーゼ活性は、次に、ＶＥＧＦのＫＤＲ特異性生物学的効果を仲介するシグナリング経路を開始する。
【０００５】
したがって、ＫＤＲのＶＥＧＦ結合活性のみがin vivoで血管新生に重要であるのではなく、内皮細胞上でのＫＤＲアップレギュレーションを検出する能力又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合複合体を検出する能力が、血管新生の検出又はモニターリングに極めて有利であると考えられる。
【０００６】
ガス充填超音波造影剤が、超音波検査（echography）のための特に効果的な超音波リフレクターであることは周知である。このような超音波造影剤は、例えば、ガス充填マイクロバブル及びガス充填マイクロバルーンのようなガス充填微小嚢を包含する。ガス充填マイクロバブルは、特に好ましい超音波造影剤である。（この開示では、“マイクロバブル”なる用語は、具体的には、リン脂質によって囲繞された若しくは安定化された気泡を表示する）。例えば、生体の血流中へキャリヤー液体中の空気充填若しくはガス充填マイクロバブル懸濁液を注入すると、超音波検査イメージング(ultrasonic echography imaging)が強化され、したがって、内部解剖学的構造の可視化が助成されることになる。血管及び内部器官のイメージングは、例えば、新生物性、心臓血管系及びその他の疾患の検出のための医学的診断に強力に役立つことができる。
【０００７】
所望のターゲット（例えば、ＫＤＲ又はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体）に対する高い結合アフィニティを示すターゲットベクター組成物を、ガス充填超音波造影剤に組み込むことは、診断的及び治療的目的の両方のために、特に有利であると考えられる。例えば、ターゲットベクター−リン脂質コンジュゲートと、特にターゲットペプチド−リン脂質コンジュゲートは、標的ガス充填超音波造影剤の製造に用いることができる。さらに、このようなターゲットベクター−リン脂質コンジュゲートの高度に精製された形の大規模生産方法を有することは、特に有利であると考えられる。このような組成物と方法は、例えば、レポーター部分、殺腫瘍剤又は血管新生阻害剤の標的部位への正確なターゲッティングのような、診断的用途又は治療的用途のための組成物の生産を可能にすると考えられる。
発明の概要
本発明は、ガス充填超音波造影剤の製造に有用であるターゲットベクター−リン脂質コンジュゲート、特にターゲットペプチド−リン脂質コンジュゲートを提供する。好ましい実施態様では、ターゲットペプチド−リン脂質コンジュゲートは、高いＫＤＲ結合アフィニティを示し、したがって、血管新生プロセスのイメージングのための造影剤の有用な成分であるターゲットペプチドを包含する。
【０００８】
本発明はさらに、ガス充填超音波造影剤の製造に、特に、ＫＤＲを標的とする超音波造影剤の製造に有用であり、血管新生プロセスのイメージングに有用でありうる、モノマー及びダイマーペプチド−リン脂質コンジュゲート（本明細書では、リポペプチドとも呼ぶ）を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、高度に純粋なモノマー及びダイマーペプチド−リン脂質コンジュゲート、特に、高いＫＤＲ結合アフィニティを有するモノマー及びダイマーペプチド−リン脂質コンジュゲートの大規模生産のための方法及びプロセスを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、最低レベルのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有する、高度に純粋なダイマーペプチド−リン脂質コンジュゲートの大規模生産のための方法及びプロセスを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、高度に純粋なモノマーペプチドの合成と、多重のペプチド・サブユニットからのペプチド−リン脂質コンジュゲートの構築のための方法を提供する。
本発明はさらに、ＫＤＲ若しくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に高いアフィニティで結合するモノマーペプチド、並びにこのようなモノマーペプチドの合成及び使用方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、このようなターゲットベクター−リン脂質コンジュゲートから製造される標的超音波造影剤をも提供する。このような標的超音波造影剤は、ターゲット含有組織のイメージングに有用である。好ましい実施態様では、標的超音波造影剤は標的マイクロバブルであり、ターゲットベクター−リン脂質コンジュゲートは、高いＫＤＲ結合アフィニティを有し、したがって、ＫＤＲ含有組織のイメージングのため、特に腫瘍及び血管新生プロセスのイメージングのための造影剤の有用な成分であるターゲットペプチドを包含する。このような標的超音波造影剤の製造及び使用方法も提供する。
詳細な説明
出願人は、標的超音波造影剤の製造に有用であり、予想外のＫＤＲ結合効率を有するペプチド−リン脂質コンジュゲートを意外にも発見した。これらの化合物のうちの２つは、高いアフィニティでＫＤＲに結合する線状ペプチドモノマーを含むモノマーペプチド−リン脂質コンジュゲートであり、他のものは、それぞれＫＤＲに結合する２つの識別可能なモノマー・サブユニットを含むダイマーペプチド−リン脂質コンジュゲートである。さらに、これらのコンジュゲート及び前駆物質の精製形の大規模生産のための高効率方法が発見されている。このような方法は、最低レベルのＴＦＡを有するダイマーペプチド−リン脂質コンジュゲートの製造を包含する。
【００１３】
リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン及び修飾ホスファチジルエタノールアミンから成る群から選択することができる。特に好ましいリン脂質は、それに親水性ポリマーを連結することによって修飾されたホスファチジルエタノールアミンを包含する。修飾ホスファチジルエタノールアミンの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって修飾されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、要約すれば“ＰＥ−ＰＥＧｓ”、即ち、親水性エタノールアミン部分が可変な分子量（例えば、３００〜５０００ダルトン）を有するＰＥＧ分子に連結しているホスファチジルエタノールアミン、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ又はＤＡＰＥ−ＰＥＧである。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３４００、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ３４００が好ましく、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が特に好ましい。例えば、トリメチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、ナトリウム塩等のような、該リン脂質の塩形も使用可能であることに注目のこと。
【００１４】
これらの化合物を例えばガス充填マイクロバブルのようなガス充填超音波造影剤中に組み込んで、ターゲット含有組織の優れたイメージングを与えるような造影剤を形成することができる。好ましい実施態様では、高いアフィニティでＫＤＲに結合するターゲットペプチドを包含するターゲットベクター−リン脂質コンジュゲートを、標的マイクロバブルに組み込む。本明細書に示すように、このような標的マイクロバブルはＫＤＲ含有組織に選択的に局在して、このような組織のイメージング、特に、腫瘍及び、腫瘍発生に関連したようなプロセスを含めた血管新生プロセスのイメージングを可能にする。
モノマーコンジュゲート
一般的
表１は、図１、２、９及び１０に示した同定ラベルを説明する。
【００１５】
【化１】
2009518448.tif 000002
【００１６】
図１と２に示すように、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）Ｎ−アセチル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリニル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニル−Ｌ１−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリニル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−｛Ｎ６−［１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミノカルボニルオキシ−（ＰＥＧ２０００）−アミノグルタリル］｝−Ｌ−リシンアミドは、リン脂質コンジュゲートである。このコンジュゲートは、Ａｃ−ＲＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ２（配列番号：１）及びＡｃ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ２とも呼ばれる。これは、２９アミノ酸線状ペプチドモノマー（２）Ｎ−アセチル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリニル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ１−アルギニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリニル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−リシンアミド（Ａｃ−ＲＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ−ＮＨ２（配列番号：２）とも呼ばれる）及びＡｃ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２を含む。この新規なペプチドモノマーは、高いアフィニティで、ＫＤＲに結合する。該モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）及び該線状ペプチドモノマー（２）の類似体及び誘導体が本発明の範囲内に包含されるように意図されることを理解すべきである。
【００１７】
図１０は、別のモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（３１）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−｛Ｎ６−［１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミノカルボニルオキシ−（ＰＥＧ２０００）−アミノグルタリル］｝−Ｌ−リシンアミド、リン脂質コンジュゲートの構造を提供する。このコンジュゲートは、Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ２（配列番号：４）及びＡｃ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ２とも呼ばれる。図９に示すように、該コンジュゲートは、２８アミノ酸線状ペプチドモノマー（３２）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシンアミドを含む、これはＡｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ−ＮＨ２（配列番号：５）及びＡｃ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２とも呼ばれる。同時係属出願、米国特許出願No.10/661,156（September 11,2003出願）に示されるように、このペプチドモノマーは、高いアフィニティで、ＫＤＲに結合する。該モノマーペプチド−リン脂質コンジュゲート及び線状ペプチドモノマーの類似体と誘導体が本発明の範囲内に包含されるように意図されることを理解すべきである。
【００１８】
実施例に示すように、例えば、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）及び（３１）によって処方されたガス充填マイクロバブル超音波造影剤は、高いＫＤＲ結合を示し、このことはウサギにおけるＶＸ２腫瘍の超音波検査を用いて確認された。
【００１９】
理想的には、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）若しくは（３１）の製造を促進するためには、該線状ペプチドモノマー（２）又は（３２）を大量に製造すべきである。次に、精製線状ペプチドモノマー（２）又は（３２）の、例えば、塩形でのＰＥＧ化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４））のようなリン脂質への、リンカー、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を介してのコンジュゲート化を用いて、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）又は（３２）を生成することができる。
モノマーペプチド−リン脂質コンジュゲートの製造方法
モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）及び（３１）の製造では、本発明による方法は、少なくとも下記利点：ペプチド合成の収率上昇；ラセミ化の程度の低下；合成中の以前に観察されたピペリジンアミド形成の回避；ペプチドモノマー（２）と（３２）の効果的な精製；ペプチドモノマー（２）と（３２）の大規模でのコンジュゲート化方法の開発；及び出発ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４）からのモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）と（３１）の容易な分離を可能にすると考えられる精製プロトコールの開発；を提供する。
【００２０】
モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートは以下のように製造することができる。モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの合成についてのこの典型的な説明中に挙げられる数値は代表的なものであることを理解すべきである。
【００２１】
線状ペプチドモノマーは、ＳＰＰＳによって製造することができる。該線状ペプチドモノマーの配列は、Ｐａｌ−Ｐｅｇ−ＰＳ−樹脂上にＣ−末端カルボキサミドとして構築することができる（置換レベル：０．２ｍｍｏｌ／ｇ）。ペプチド合成は、SONATA（登録商標）/ Pilot Peptide Synthesizer上でＦｍｏｃ化学を用いて達成することができる。この方法に関して今までに観察された問題は、ラセミ化、不完全なカップリング及びピペリジンアミド形成であり、これらの問題の各々が最適とは言えない収率及び純度に寄与している。Ｆｍｏｃ除去のための試薬としてＨＯＢｔ（０．１Ｍ）含有ＤＭＦ中２５％ピペリジンを用いることによって、ピペリジンアミドの形成を劇的に減らすことができる。ラセミ化は、大抵のカップリングに対する活性剤としてＤＩＣ／ＨＯＢｔを用い；無水ＤＭＦ（６ｘ）による洗浄を介在させて４倍過剰な予備活性化Ｆｍｏｃアミノ酸を用いる３時間のカップリング時間を用いることによって、かなり減らすことができる。Ｎα−Ｆｍｏｃアミノ酸を、それらのカップリングを行う直前に(just before their coupling turn)溶解し、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔによって４分間予備活性化して、反応器に移すことができる。これは、Ｓｏｎａｔａ機器上で、この機器のアミノ酸容器中に固体のＦｍｏｃアミノ酸を装入し、ＤＭＦ、ＨＯＢｔ／ＤＭＦ及びＤＩＣ／ＤＭＦを、溶液をバブリングさせながら、順次加えるように該機器をプログラミングすることによって、達成することができる。
【００２２】
収率を最適にするためには、最適のカップリング試薬を用いる場合にさえも破壊的でありうる、長いペプチドの合成中の樹脂凝集問題に対処することができる。ペプチド・アセンブリ中の凝集を減ずるために、ＸとＴｈｒ又はＸとＳｅｒの順次カップリングの代わりに、ジペプチドとしてのＸ−Ｔｈｒ又はＸ−Ｓｅｒを組み込むためにシュードプロリン・ジペプチドを用いるという手段を利用することができる。線状ペプチドモノマーのために、Ｌｅｕ１１−Ｓｅｒ１２及びＬｅｕ２２−Ｓｅｒ２３の順次カップリングの代わりに、シュードプロリン・ジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨの単回カップリングを用いることができる。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの順次カップリングの代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いることによってカップリング回数を減ずることにより、さらなる最適化を達成することができる。−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨのセグメント活性化は、末端アミド官能基(distal amide function)による活性化酸官能基(activated acid function)の環化をもたらして、不活性なジケトピペラジンを生成することができる；このことは、時間に依存して、カップリング収率を減ずる可能性がある。この問題は、反応器にＦｍｏｃ−Ｇｌｙｎ−ＯＨ（ｎ＝２、３）を添加して、続いて、ＨＯＢｔとＤＩＣを添加することによって回避することができ；ジケトピペラジンへの適当な環化が行われる前に、活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙｎ−ＯＨを樹脂結合アミノ基によって遮断することができる。これらの改良によって、線状ペプチドモノマーの合成はSonata Peptide Synthesizer上で１０ｍｍｏｌ合成規模で完成することができる。
【００２３】
鎖延長後に、Ｎ末端からＦｍｏｃを除去することができる。該ペプチドと該遊離アミノ基をアセチル化することができる。次に、“試薬Ｂ”（ＴＦＡ：水：フェノール：トリイソプロピルシラン、８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｗ／ｖ）を４時間用いて、該ペプチド配列を樹脂から切断して、脱保護することができる。切断反応後に、揮発物の蒸発、ジエチルエーテルを加えての残渣の摩砕、このようにして得られた固体の同溶媒の使用による洗浄によって、粗ペプチドを固体として単離することができる。他のバリエーションでは、反応混合物へジエチルエーテルを添加することによって、該反応混合物から該ペプチドを沈殿させて、このようにして形成された固体を回収し、同溶媒によって洗浄することができる。
【００２４】
線状ペプチドモノマーは、以下に述べるように精製することができる。この場合にも、数値記載(numerical references)は代表的なものである。粗線状ペプチドモノマー（０．５ｇ）をＣＨ３ＣＮ（４０ｍｌ／ｇ）中に溶解して、この溶液を水で１００ｍｌの最終量に希釈することができる。次に、該溶液を濾過することができる。濾過済み溶液を、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮと平衡した分取ＨＰＬＣカラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50 x 250mm)上に装填することができる。装填後に、溶離剤の組成を１分間にわたって２０％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）に傾斜させることができ、水（０．１％ＴＦＡ）中にＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．６％／分の速度で線形勾配を開始して、５０分間にわたってランすることができる。溶離された画分を分析用逆相Ｃ１８カラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS-C18, 10μ, 120Å, 4.6 x 50mm)上で純度に関して検査することができ、＞９５％純度で生成物を含有する画分を一緒にして、凍結乾燥することができる。粗ペプチド０．５ｇの各精製に関して、線状ペプチドモノマー０．１２ｇ（２４％）を常に単離して、ペプチドを同じ収率及び純度で得ることになる。
【００２５】
モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの合成は、以下に述べるように行うことができる。この場合も、数値記載は代表的なものである。合成における最後の工程は、例えばＰＥＧ化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩）のようなリン脂質の、線状ペプチドモノマーへのコンジュゲート化であることができる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４）のＰＥＧ２０００部分は、公称的に、４５エチレングリコール単位から成る。しかし、この物質がＰＥＧ含有種の分布であり、その質量中心(centroid)が４５エチレンオキシ単位を含有する公称的化合物であることを理解すべきである。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩による線状ペプチドモノマーのコンジュゲート化は、線状ペプチドモノマーのグルタール酸モノアミド・モノＮＨＳエステルの製造と、これと、該リン脂質アンモニウム塩の遊離アミノ基との反応によって達成することができる。したがって、線状ペプチドモノマーをＤＭＦ中のＤＳＧ（４当量）と、ＤＩＥＡ（５当量）の存在下で３０分間反応させることができる。この反応混合物を酢酸エチルで希釈することができ、その結果として、該ペプチドグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステルの沈殿が生じうる。未反応ＤＳＧを含有する上清をデカントして、中間体のペプチドモノＮＨＳエステルを酢酸エチルで数回洗浄して、痕跡量のＤＳＧを除去することができる。質量スペクトルデータは、クリーンな生成物としての該ペプチドモノＮＨＳエステルの形成を確証する。固体のモノＮＨＳエステルをＤＭＦ中に溶解して、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（０．９当量）とＤＩＥＡ（４当量）の存在下で２４時間反応させることができる。遊離のリン脂質アンモニウム塩は、高度に純粋な形でのモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの単離を困難にする可能性があるので、線状ペプチドモノマー・グルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステルを過剰に用いて、該リン脂質アンモニウム塩の消費を最大化することができる。
【００２６】
該反応混合物を水（０．１％ＴＦＡ）とＣＨ３ＣＮ−ＣＨ３ＯＨ（１：１、ｖ／ｖ）（０．１％ＴＦＡ）との１：１混合物（約１００ｍｌ）で希釈して、逆相Ｃ２カラム(Kromasil（登録商標）Prep C2, 10μ, 300Å、50x250mm, 流速１００ｍｌ／分)に供給して、該カラムを水（０．１％ＴＦＡ）とＣＨ３ＣＮ−ＣＨ３ＯＨ（１：１、ｖ／ｖ）（０．１％ＴＦＡ）との３：１混合物で溶出して、親水性不純物を除去することができる。次に、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＣＮ−ＣＨ３ＯＨ（１：１）（０．１％ＴＦＡ）の勾配を用いて、生成物を溶離することができる（詳細に関しては、実験セクションを参照）。回収した画分を、所望の生成物と、しばしば分離され難いＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質（これは、殆どＵＶ吸光度を有さない）との検出を可能にするＥＬＳデテクターを用いて、逆相ＨＰＬＣによって分析することができる。これは、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートとＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質との明確な分離を示唆する。純粋な生成物を含有する画分を回収して、回転蒸発器で濃縮し（メタノール含量を減ずるため）、凍結乾燥して、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを無色固体として得ることができる。必要量のモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを製造するために、線状ペプチドモノマー０．５〜１．０ｇを用いて、数回のランを行うことができる。あらゆる場合に、目的のモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを高い収率及び純度で単離することができる（例えば、５７〜６０％収率及び＞９９％純度）。
ダイマーコンジュゲート
一般的
表２は、図３、４及び５に示す同定ラベルを説明する。
【００２７】
【化２】
2009518448.tif 000003
【００２８】
これらの図に示すように、ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）アセチル−Ｌ−アラニル−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシル−Ｌ−スレオニル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシル［アセチル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−セリル−Ｌ−トリプトフィル−グリシル−グリシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシル（ジステアリルホスホエタノールアミノカルボノオキシ−ＰＥＧ２０００−アミノ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−グルタリル−Ｌ−リシル）アミド環状（２−１２）ジスルフィド］−アミド環状（６−１３）ジスルフィドは、ＫＤＲと結合する２つのモノマーペプチド鎖：２１アミノ酸環状ジスルフィド・ペプチドモノマー（１３）アセチル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−セリル−Ｌ−トリプトフィル−グリシル−グリシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシル（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル）アミド環状（２−１２）ジスルフィドと、これとグルタリル・リンカーによって結合した、２２アミノ酸環状ジスルフィド・ペプチドモノマー（１２）アセチル−Ｌ−アラニル−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシル−Ｌ−スレオニル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシンアミド環状（６−１３）ジスルフィドとから成る。該ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）及び該環状ジスルフィドペプチドモノマー（１２）と（１３）の類似体及び誘導体が本発明の範囲内に包含されるように意図されることを理解すべきである。
【００２９】
ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）によって処方された超音波造影剤（例えば、ガス充填マイクロバブル）は、高いＫＤＲ結合を示し、このことはウサギにおけるＶＸ２腫瘍の超音波検査を用いて確認された。
ダイマー−リン脂質コンジュゲートの製造方法
ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）の合成を達成するには、このために用いるモノマーを好ましくは大量に製造すべきである。次に、これらのモノマーを、リンカーとしてジスクシンイミジルグルタレートを用いて、相互に結合させて、前駆体ダイマーペプチド（１６）、アセチル−Ｌ−アラニル−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシル−Ｌ−スレオニル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシル［アセチル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−セリル−Ｌ−トリプトフィル−グリシル−グリシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシル（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−グルタリル−Ｌ−リシル）アミド環状（２−１２）ジスルフィド］−アミド環状（６−１３）ジスルフィドを形成することができる。次に、目的のダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）を得るために、この場合もジスクシンイミジルグルタレートによる、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（１８）への精製前駆体ダイマーペプチドのコンジュゲート化を用いることができる。
【００３０】
ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）の製造において、本発明による方法は、少なくとも下記利点：ペプチド配列の自動化鎖延長の収率上昇；合成中に遭遇するラセミ化の程度の低下；ペプチドモノマー（１３）の合成中の以前に観察されたピペリジンアミド形成の回避；なおも効果的かつ実際的なサンプル取り扱いを可能にするマルチグラム規模で実施し可能な手段を用いる、（１２）と（１３）の線状ジシステイン含有ペプチド前駆体の環化；モノマーペプチド（１２）と（１３）の効果的な精製；前駆体ダイマーペプチド（１６）の最大化された収率と純度；前駆体ダイマーペプチド（１６）の大規模でのコンジュゲート化方法の開発；及びリン脂質アンモニウム塩（１８）からの目的のダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）の容易な分離を可能にすると考えられる精製プロトコールの開発；を提供する。
【００３１】
ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）は、ペプチドモノマー（１２）
【００３２】
【化３】
2009518448.tif 000004
【００３３】
と、ペプチドモノマー（１３）
【００３４】
【化４】
2009518448.tif 000005
【００３５】
の自動化合成、ｉｖｅＤｄｅ保護ダイマーを得るためのジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を用いたそれらの効果的なカップリング、その脱保護及び続いての、この場合もグルタリル結合を介してのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２へのカップリングによって製造することができる。本発明による方法を用いて、モノマーペプチドを１０ｍｍｏｌ規模で困難なく合成することができ、ＨＰＬＣ精製後に、モノマーペプチドを約２０％収率及び＞９５％純度で得ることができる。このような方法は、ダイマー形成反応を可能にし、続いての、リン脂質成分へのコンジュゲート化が、グラム規模で実施されるダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）の形成を生じる。前駆体ダイマーペプチド（１６）はモノマーペプチドからルーチンに約３２％収率及び＞９５％純度で得ることができる。ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）は該前駆体ダイマーペプチド（１６）から５７〜６０％収率及び＞９９％純度で製造することができる。
【００３６】
ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートは、以下に説明するように製造することができる。ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの合成についてのこの典型的な説明中に挙げられる数値は代表的なものであることを理解すべきである。
【００３７】
ペプチドモノマー（１２）
【００３８】
【化５】
2009518448.tif 000006
【００３９】
と、ペプチドモノマー（１３）
【００４０】
【化６】
2009518448.tif 000007
【００４１】
の固相合成とジスルフィド環化の典型的な方法を以下に説明する。
該ペプチドは、Ｐａｌ−Ｐｅｇ−ＰＳ−樹脂上にそれらのＣ末端カルボキサミドとして構築することができる（置換レベル：０．２ｍｍｏｌ／ｇ）。鎖延長は、SONATA（登録商標）/ Pilot Peptide Synthesizer上でＦｍｏｃ化学を用いて、最適化脱保護とカップリングプロトコールを使って１０ｍｍｏｌ合成規模で達成することができる。自動化ＳＰＳＳによる該ペプチドの最適化合成は、ペプチド不純物と、得られるペプチドの総収率と純度に対する該プロトコールの特定要素を変えることの効果とを研究することによって、開発することができる。
【００４２】
モノマーペプチドの最適化されない合成から得られる不純物の分析は、主要な問題がラセミ化、不完全なカップリング及びピペリジンアミドの形成（恐らくは、アスパルトイミド中間体又はグルタルイミド中間体による）であり、これらの各々が最適とは言えない収率及び純度に寄与することを示唆する。ｆｍｏｃ除去のための試薬としてＨＯＢｔ（０．１Ｍ）含有ＤＭＦ中２５％ピペリジンを用いることによって、ピペリジンアミドの形成を劇的に減らすことができる。ラセミ化は、大抵のカップリングに対する活性剤としてＤＩＣ／ＨＯＢｔを用い；無水ＤＭＦ（６ｘ）による洗浄を介在させて４倍過剰な予備活性化Ｆｍｏｃアミノ酸を用いる３時間のカップリング時間を用いることによって、かなり減らすことができる。Ｎα−Ｆｍｏｃアミノ酸を、それらのカップリングを行う直前に溶解し、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔによって４分間予備活性化して、反応器に移すことができる。これは、Ｓｏｎａｔａ機器上で、この機器のアミノ酸容器中に固体のＦｍｏｃアミノ酸を装入し、ＤＭＦ、ＨＯＢｔ／ＤＭＦ及びＤＩＣ／ＤＭＦを順次加え、各添加後に溶液をバブリングさせるように該機器をプログラミングすることによって、達成することができる。
【００４３】
収率を最適にするためには、最適のカップリング試薬を用いる場合にさえも破壊的でありうる、長いペプチドの合成中の樹脂凝集問題に対処することができる。ペプチド・アセンブリ中の凝集を減ずるために、ＸとＴｈｒ又はＸとＳｅｒの順次カップリングの代わりに、ジペプチドとしてのＸ−Ｔｈｒ又はＸ−Ｓｅｒ（Ｘは、配列のｎ−１アミノ酸を意味する）を組み込むためにシュードプロリン・ジペプチドを用いるという手段を利用することができる。したがって、モノマー（１２）、
【００４４】
【化７】
2009518448.tif 000008
【００４５】
のために、適当に保護されたＴｈｒとＧｌｙ（上記に太字で示す）の順次カップリングの代わりに、シュードプロリン・ジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨの単回カップリングを用いることができる。同様に、モノマー（１３）、
【００４６】
【化８】
2009518448.tif 000009
【００４７】
の合成では、適当に保護されたＳｅｒとＡｓｐ（上記に太字で示す）の順次カップリングの代わりに、シュードプロリン・ジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨを用いることができる。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの順次カップリングの代わりに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨを用いてカップリング回数を減ずることにより、さらなる最適化を達成することができる。−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨセグメントの活性化は、末端アミド官能基による活性化酸官能基の環化をもたらして、不活性なジケトピペラジンを生成することができる；このことは、時間に依存して、カップリング収率を減ずる可能性がある。この問題は、反応器にＦｍｏｃ−Ｇｌｙｎ−ＯＨ（ｎ＝２、３）を添加して、続いて、ＨＯＢｔとＤＩＣを添加することによって回避することができ；ジケトピペラジンへの適当な環化が行われる前に、活性化Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙｎ−ＯＨを樹脂結合アミノ基によって遮断することができる。鎖延長が完了した後に、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ保護基を各ペプチドから除去することができ、遊離アミノ基をアセチル化することができる。
【００４８】
擬似直角的に保護された(pseudo-orthogonally protected)誘導体、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨを用いて、該モノマー及びダイマーペプチドのＣ−末端リシンのε−アミンの選択的露出(selective unmasking)と、それらのその後の官能化を可能にすることができ、これらも最適化することができる。該ペプチドモノマーの各々のＣ−末端リシンのε−アミン上のｉｖＤｄｅ基は、ＤＭＦ中の１０％ヒドラジンを用いて除去することができる。モノマー（１３）のＦｍｏｃ−Ａｄｏａ又はモノマー（１２）のＬｙｓ（ｉｖＤｄｅ）は、ＤＭＦ中の４当量のＦｍｏｃアミノ酸及びＤＭＦ中の各４当量のＤＩＣとＨＯＢｔを１０時間用いて、該露出リシンε−アミノ基に付加させることができる。この合成が完了した後に、“試薬Ｂ”（ＴＦＡ：水：フェノール：トリイソプロピルシラン、８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｗ／ｖ）を４時間用いて、該ペプチド配列を樹脂から切断して、脱保護することができる。切断反応が完了した後に、該ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させることができる。
【００４９】
その後の線状ジシステイン含有ペプチドの環化手段を用いて、モノマーペプチドの最適スケールアップを果たすことができる。一般に、線状ジシステイン含有ペプチドの空気中酸化は約０．５〜５ｍｇ／ｍｌ（開示ペプチドモノマー、ペプチドにおいて〜０．１８〜１．８ｍＭ、システインチオールにおいて〜０．３６〜３．６ｍＭ）で行うことができる。これより著しく高い濃度で操作するためには、ジシステインペプチドのＤＭＳＯ補助環化が、〜５０ｍｌ程度の少量の溶液中での該線状ペプチド〜１０ｇの良好な収率での環化を可能にする。それ故、粗線状ジシステインペプチドを、周囲温度においてｐＨ８．５の９５％ＤＭＳＯ−Ｈ２Ｏ（５ｍｌ／ｇ）中で環化することができる。該環化の進行は、質量分光分析とＨＰＬＣによってルーチンに追跡することができる。環化は本来は〜３６時間で完成することができるが、該反応混合物を一般に４８時間まで撹拌することができる。ＣＨ３ＣＮによる希釈によって環状ジスルフィドペプチドを反応混合物から沈殿させ、得られたオフホワイトの粗固体ペプチドを濾過によって回収することができる。これが、粗環状ペプチドからＤＭＳＯを除去するための都合のよい方法である。
【００５０】
モノマーペプチド（１２）、Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ［Ｋ（ｉｖＤｄｅ）］−ＮＨ２の精製と単離は、以下に述べるように達成することができる。本明細書で用いる限り、“Ｃ＊”なる表示がジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を意味することに注目のこと。水（０．１％ＴＦＡ）中３０％ＣＨ３ＣＮ  ３００ｍｌまでに該粗ペプチド０．５ｇを溶解する試みは、今までに成功していない。それ故、代替手段として、該粗ペプチド（０．５ｇ）をＤＭＳＯ（５ｍｌ／ｇ）中に溶解して、この溶液を２０％ＣＨ３ＣＮ−水で１００ｍｌの最終量になるまで希釈することができる。この溶液を濾過することができる。濾過済み溶液を、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）と平衡した分取ＨＰＬＣカラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50 x 250mm)上に装填することができ、該カラムからＤＭＳＯを洗浄するために、該カラムを水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）によって溶出することができる。次に、該溶離剤の組成を、３５％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）に１分間にわたって傾斜させ、水（０．１％ＴＦＡ）中にＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．５％／分の速度で線形勾配を開始して、５０分間にわたってランすることができる。溶離された画分を分析用逆相Ｃ１８カラム(Waters,XTerra MS-C18, 10μ, 120Å, 4.6 x 50mm)上で純度に関して検査することができ、＞９５％純度で生成物を含有する画分を一緒にして、凍結乾燥することができる。粗ペプチド０．５ｇの各精製に関して、ペプチドモノマー（１２）、Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ［Ｋ（ｉｖＤｄｅ）］−ＮＨ２  ０．１ｇ（２０％）を単離することができる。精製を繰り返すと、常に同じ収率及び純度で該ペプチドが得られることが判明している。
【００５１】
ペプチドモノマー（１３）、Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）−ＮＨ２は、ＤＭＳＯ含有希釈剤の代わりに、０．１％ＴＦＡ水溶液中２０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）中に対象のペプチドを溶解しうる（ペプチド０．５ｇ／１００ｍｌ）ことを除いて、ペプチドモノマー（１２）に関して述べたとおりに、精製して、単離することができる。得られた粗ペプチド溶液を、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮと平衡した分取ＨＰＬＣカラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50 x 250mm,流速100ml/分)上に装填することができる。該カラムを水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）によって１００ｍｌ／分で５分間溶出することができる。次に、溶離剤の組成を、３０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）／水（０．１％ＴＦＡ）に１分間にわたって傾斜させ、水（０．１％ＴＦＡ）中にＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．５％／分の線形勾配速度を開始して、所望のペプチドが該カラムから完全に溶出されるまで、維持することができる。生成物含有画分をWaters XTerra分析用逆相Ｃ１８カラム(10μ, 120Å)上で分析することができ、＞９５％純度で生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、環状ジスルフィド・ペプチドモノマー（１３）（０．１２ｇ、２４％収率）を＞９５％純度で得ることができる。粗ペプチドモノマー１０ｇをこのようにして連続的に精製することができる。
【００５２】
前駆体ダイマーペプチド（１６）、
【００５３】
【化９】
2009518448.tif 000010
【００５４】
を製造するための典型的な方法を以下に述べる。前駆体ダイマーペプチドの製造は、モノマーペプチドを２工程手段で結合させることによって達成することができる。最初に、Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ−［Ｋ（ｉｖＤｄｅ）］−ＮＨ２（１２）をＤＩＥＡ（５当量）の存在下のＤＭＦ中でジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ，５当量）と３０分間反応させることができる。反応混合物を酢酸エチルで希釈することができ、この結果、該ペプチドのグルタール酸モノアミド・モノＮＨＳエステルの沈殿が生じる。未反応ＤＳＧを含有する上清をデカントすることができ、該モノＮＨＳエステルを酢酸エチルで数回洗浄して、痕跡量のＤＳＧを除去することができる。質量スペクトルデータは、クリーンな生成物としての該モノＮＨＳエステルの形成を確証する。これをＤＭＦ中に再溶解して、モノマーペプチドＡｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）−ＮＨ２（１３）と、ＤＩＥＡ（５当量）の存在下で反応させることができる。ＨＰＬＣとＭＳの結果は、単一主要生成物としてのｉｖＤｄｅ含有ダイマーの形成を示唆する。該ダイマーのＬｙｓのε−アミン上ｉｖＤｄｅ保護基は、該反応混合物をＤＭＦ中ヒドラジン（１０％）と共に２０分間撹拌することによって除去することができる。次に、該溶液をＴＦＡによって酸性化し、１０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）−水（０．１％ＴＦＡ）で希釈し、分取逆相Ｃ１８ＨＰＬＣカラムに供給して、アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）から０．１％ＴＦＡ水溶液への勾配溶離によって精製することができる。必要量の前駆体ダイマーペプチドを得るために、モノマーペプチドの各々０．５ｇから１ｇ程度までを用いて、反応を行うことができる。あらゆる場合に、必要な前駆体ダイマーペプチドを〜３２％収率及び＞９５％純度で単離することができ、このことは、該手段の再現性と拡張性を確証する。
【００５５】
該合成における最終工程は、該前駆体ダイマーペプチドへのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（１８）のコンジュゲート化であることができる。既述したように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２のＰＥＧ２０００部分は、公称的に、４５エチレングリコール単位から構成される。しかし、この物質がＰＥＧ含有種の分布であり、その質量中心が４５エチレンオキシ単位を含有する公称的化合物であることを理解すべきである。
【００５６】
前駆体ダイマーペプチドへのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２のコンジュゲート化は、該前駆体ダイマーのグルタール酸モノアミド・モノＮＨＳエステルの製造と、これと、該リン脂質アンモニウム塩の遊離アミノ基との反応によって達成することができる。したがって、ｉｖＤｄｅ含有前駆体ダイマーペプチド（１６）を、ＤＭＦ中のＤＳＧ（４当量）と、ＤＩＥＡ（５当量）の存在下で３０分間反応させることができる。前駆体ダイマーペプチドの製造におけると同様に、この溶液を酢酸エチルで希釈して、該ダイマーのグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステル（１７）を固体として沈殿させることができる。未反応ＤＳＧを除去するために、上清をデカントすることができる。ダイマーペプチドの固体グルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステル（１７）を次に、酢酸エチルで数回洗浄して、痕跡量のＤＳＧを除去することができる。質量スペクトルの結果は、クリーンな生成物としての該ペプチドダイマーのグルタール酸モノアミド・モノＮＨＳエステルの形成を確証する。
【００５７】
該ダイマーグルタール酸モノアミド・モノＮＨＳエステル（１７）をＤＭＦ−ＣＨ２Ｃｌ２（８：２）中に溶解して、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（０．９当量）と、ＤＩＥＡ（４当量）の存在下で２４時間反応させることができる。遊離のリン脂質は、最終生成物の精製と単離を困難にする可能性があるので、該ＮＨＳエステル（１７）を過剰に用いて、該リン脂質アンモニウム塩の消費を最大化することができる。該反応混合物を水（０．１％ＴＦＡ）−ＣＨ３ＣＮ−ＣＨ３ＯＨ（１：１）（０．１％ＴＦＡ）（〜１００ｍｌ）で希釈して、逆相Ｃ４カラム(Kromasil（登録商標）Prep C4, 10μ, 300Å、50x250mm, 流速１００ｍｌ／分)に供給して、該カラムを水（０．１％ＴＦＡ）−ＣＨ３ＣＮ−ＣＨ３ＯＨ（１：１）（０．１％ＴＦＡ）溶媒混合物で溶出して、親水性不純物を除去することができる。次に、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＣＮ−ＣＨ３ＯＨ（１：１）（０．１％ＴＦＡ）の勾配を用いて、生成物を溶離することができる。回収した画分を、所望の生成物と、しばしば分離され難いＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（これは、強いＵＶ発色団を有さない）との検出を可能にするＥＬＳデテクターを用いて、逆相ＨＰＬＣによって分析することができる。これは、ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートとＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩との明確な分離を示唆する。純粋な生成物を含有する画分を回収して、回転蒸発器で濃縮し（メタノール含量を減ずるため）、凍結乾燥して、ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを無色固体として得ることができる。
【００５８】
必要量のダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを製造するために、前駆体ダイマーペプチド０．５〜１．０ｇを用いて、数回のランを行うことができる。あらゆる場合に、目的のダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを５７〜６０％収率及び＞９９％純度で単離することができる。上記の連続ランから得られるダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの総量（bulk quantity）は、個々のランからの生成物をｔ−ブタノール−アセトニトリル−水（１：１：３）に溶解し、続いて凍結乾燥することによって得ることができる。遊離チオールの定量算出(quantative estimation)のためのEllman方法を該ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの総合サンプル(bulk sample)に適用することができる；遊離チオールは、存在するとしても、検出限界未満であろう。アミノ酸組成分析は、許容可能な限界内の結果を生じて、該ペプチド誘導体の指定された構造を支持する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析も、該ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの推定された構造を支持する。
低い若しくは無視できるほどのＴＦＡレベルを有するダイマー・リン脂質コンジュゲートの製造方法
本発明はさらに、非常に低レベルのＴＦＡを有するダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造方法も提供する。ある一定の方法がこのようなコンジュゲートの、グラム規模での合成と精製を可能にするが、該コンジュゲートのリゾ型(lyso-version)の形成が５℃での凍結乾燥物質の貯蔵時に又は該コンジュゲートの水溶液の貯蔵時に観察されている。ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート中のリン脂質脂肪酸エステルの１つのＴＦＡ促進酸加水分解によってリゾ化合物(lyso-compounds)が形成されると考えられる。
【００５９】
製薬的に受容される対イオンを有する安定な物質としてリン脂質ペプチドを得るために、ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを得るための非常に効果的な方法が発見された、この方法は該ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートのＴＦＡ塩又は任意の適当な前駆体（単数又は複数）を類似の製薬的酢酸塩に転化させる。これらの方法の典型的な実施態様を以下に提供する。
【００６０】
表３は、図６、７及び８で示した同定ラベルを説明する。
【００６１】
【化１０】
2009518448.tif 000011
【００６２】
次に図６と７を参照すると、ある一定の実施態様において、ヘテロダイマーペプチド（２７）のモノマーペプチド成分、即ち、ＴＦＡ塩化合物（２２）と（２５）は、それらをそれらの酢酸塩に転化させるために、酢酸アンモニウムのステップ勾配を用いるマクロ細孔質スルホン酸カチオン交換樹脂ＡＧ  ＭＰ−５０上でのイオン交換クロマトグラフィーを受ける。次に、２つのペプチドモノマー酢酸塩（２３）と（２６）をグルタリル・リンカーによって結合させて、酢酸塩としてのダイマー（２７）を形成することができる。それぞれ１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃを含有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを用いる線形勾配方法を用いたＣ−１８分取ＨＰＬＣによる、（２７）の粗ダイマー酢酸塩の精製によって、純粋なダイマー酢酸塩（２７）が得られる。このダイマーからＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２（２９）へのコンジュゲート化と、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＡｃを用いるＣ−３分取ＨＰＬＣによる粗混合物の最終精製によって、化合物（２１）が酢酸塩として得られる。
【００６３】
さらに詳しくは、化合物（２２）、（２５）及び（２７）は全て、側鎖カルボン酸とアミノ基を有する。該ペプチドによる樹脂の完全な浸透を可能にし、樹脂の塩基基（アミノ基とグアニジン基）による該ペプチドの固定化を利用するために、ＡＧ  ＭＰ−５０、マクロ細孔質カチオン交換樹脂を用いることができる。該ペプチドのＴＦＡ塩を、ＡＧ  ＭＰ−５０カラム（スルホン酸形）に吸着させて、該カラムを水で洗浄して、次に、該ペプチドの溶解度に依存して０〜３０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中へのＮＨ４ＯＡｃのステップ勾配で溶出することができる。該ペプチドは約６００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃによって溶離することができ、次に、該ペプチドの酢酸塩形を純粋な形で得ることができる。ＩＣフッ素分析とＣＥ  ＴＦＡ対イオン分析の両方が一致して、該ペプチドの非常に低いＴＦＡ含量を示す。
【００６４】
好ましい方法はさらに、残留ＮＨ４ＯＡｃを除去するための最終ペプチドの数回の再溶解／再凍結乾燥を包含する。さもなければ、ペプチド中に存在する残留痕跡量のＮＨ４ＯＡｃが、ＤＩＥＡの存在下で遊離アンモニアを生じる可能性がある。これは、その後の、モノマー（２３）と（２６）からの（２７）の製造中に又は（２７）の酢酸塩からの最終リン脂質・ペプチドコンジュゲート（２１）中に主要生成物としての好ましくないペプチド−Ｇｌｕｔ−アミドの形成を生じる可能性がある。
【００６５】
次に図７を参照すると、別の実施態様が、マクロ細孔質スルホン酸カチオン交換樹脂ＡＧ  ＭＰ−５０上でのイオン交換クロマトグラフィーによって、ダイマー（２７）のＴＦＡ塩からその類似の酢酸塩への転化を生じる。次に、このダイマー酢酸塩をＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２とコンジュゲートさせ、続いて、粗物質をＣ−３分取カラムによってＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＡｃを用いて、精製して、最終化合物（２１）を酢酸塩として得ることができる。
【００６６】
上記及び図６と７に述べた方法は優れた結果を与えるが、第２アプローチは、必要な工程がさらに少ないという利点を有する。さらなる詳細は以下の実施例セクションに記載する。
【００６７】
図８を参照すると、別の実施態様が、リン脂質−ペプチドコンジュゲート（２１）とＴＦＡイオンとのサイズ差を利用して、最低量のＴＦＡを有するダイマーコンジュゲートを得る方法を提供する。この実施態様では、２１・ｎＴＦＡアダクツが、炭酸水素アンモニウム・バッファーの存在下でサイズ排除カラムから溶離することができる。水へのアセトニトリルの線形勾配を用いるZorbax Ｃ−３カラム上での分取ＨＰＬＣによって、粗２１・ｎＴＦＡから最初にリゾ化合物を除去することができる。両相を１０ｍＭ酢酸アンモニウムで緩衝化することができる。これは、分析用ＨＰＬＣによって実証されるように、リゾ化合物の分離を生じる。
【００６８】
ＴＦＡ量をさらに減ずるために、該物質をSephadex G-25カラムに供給して、炭酸水素アンモニウム水溶液によって溶出することができる。溶出液をＨＰＬＣによってモニターすることができる。生成物含有画分をプールし、凍結乾燥して、本質的にＴＦＡを含まない所望の物質（２１）を高い回収率で得ることができる。さらなる詳細は以下の実施例セクションに記載する。
【００６９】
本明細書に記載するモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートとダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの両方を、例えば、ガス充填微小嚢のような超音波造影剤に組み込むことができる。このようなガス充填微小嚢は、例えば、ガス充填マイクロバブル、ガス充填マイクロバルーン、ガス充填マイクロカプセル等を包含する。好ましい実施態様では、ガス充填マイクロバブルを含む超音波造影剤中に、ペプチド・リン脂質コンジュゲートを組み込むことができる。リン脂質とリン脂質コンジュゲートからのガス充填マイクロバブルの製造方法は、当業者に知られている。例えば、本発明によるマイクロバブルは、下記特許：
【００７０】
【化１１】
2009518448.tif 000012
【００７１】
のいずれかに記載された方法によって製造することができ、これらの特許はそれらの全体で本明細書に援用される。WO 04/069284に開示されている方法は、特に好ましい。
適当なリン脂質には、脂肪酸の１若しくは２分子（同じ若しくは異なる）及びリン酸によるグリセロールのエステルが包含され、この場合に該リン酸残基が次に、例えばコリン、セリン、イノシトール、グリセロール、エタノールアミン等の基のような親水性基に結合する。リン脂質中に存在する脂肪酸は、一般に、典型的に１２〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜２２個の炭素原子を有し、飽和であることも、又は１つ以上の不飽和結合を含有することもありうる長鎖脂肪酸である。適当な脂肪酸の例は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸である。リン脂質のモノエステルは、リン脂質の“リゾ(lyso)”形として当該技術分野に知られている。
【００７２】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸、即ち、脂肪酸によるグリセロール−リン酸のジエステル、スフィンゴミエリン、即ち、脂肪酸によるグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖によって置換されているホスファチジルコリン類似体、カルジオリピン、即ち、脂肪酸による１，３−ジホスファチジルグリセロールのエステル、ガングリオシド、セレブロシド等を包含する。
【００７３】
本明細書で用いる限り、リン脂質なる用語は、単独でも又は混合物としても用いることができる、自然発生した又は半合成的若しくは合成的に製造された生成物を包含する。
自然発生するリン脂質の例は、典型的には、大豆又は卵黄レシチンのような天然レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）である。半合成リン脂質の例は、自然発生レシチンの部分的若しくは完全に水素化した誘導体である。
【００７４】
合成リン脂質の例は、例えば、ジラウリロイル−ホスファチジルコリン（“ＤＬＰＣ”）、ジミリストイルホスファチジルコリン（“ＤＭＰＣ”）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（“ＤＰＰＣ”）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（“ＤＡＰＣ”）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（“ＤＳＰＣ”）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（“ＭＰＰＣ”）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（“ＰＭＰＣ”）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（“ＰＳＰＣ”）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（“ＳＰＰＣ”）、ジオレオイルホスファチジルコリン（“ＤＯＰＣ”）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジラウリロイル−ホスファチジルグリセロール（“ＤＬＰＧ”）とそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール（“ＤＡＰＧ”）とそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（“ＤＭＰＧ”）とそのアルカリ金属塩、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（“ＤＰＰＧ”）とそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（“ＤＳＰＧ”）とそのアルカリ金属塩、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（“ＤＯＰＧ”）とそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（“ＤＭＰＡ”）とそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（“ＤＰＰＡ”）とそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸（“ＤＳＰＡ”）、ジアラキドイルホスファチジン酸（“ＤＡＰＡ”）とそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン−ｅ（“ＤＭＰＥ”）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（“ＤＰＰＥ”）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（“ＤＳＰＥ”）、ジミリストイルホスファチジルセリン（“ＤＭＰＳ”）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（“ＤＡＰＳ”）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（“ＤＰＰＳ”）、ジステアロイルホスファチジルセリン（“ＤＳＰＳ”）、ジオレオイルホスファチジルセリン（“ＤＯＰＳ”）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（“ＤＰＳＰ”）、及びジステアロイルスフィンゴミエリン（“ＤＳＳＰ”）を包含する。
【００７５】
適当なリン脂質はさらに、それへの親水性ポリマーの結合によって修飾されたリン脂質を包含する。修飾されたリン脂質の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって修飾されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、簡単には、“ＰＥ−ＰＥＧｓ”、即ち、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ又はＤＡＰＥ−ＰＥＧ（この場合、ＤＡＰＥは１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである）のような、親水性エタノールアミン部分が可変分子量（例えば、３００〜５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に結合しているホスファチジルエタノールアミンである。該組成物はさらに、例えば、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸若しくはオレイン酸）；ステロール（例えば、コレステロール、又は脂肪酸若しくは糖酸によるステロールのエステル）；グリセロール又はグリセロールエステル（グリセロール・トリパルミテート、グリセロール・ジステアレート、グリセロール・トリステアレート、グリセロール・ジミリステート、グリセロール・トリミリステート、グリセロール・ジラウレート、グリセロール・トリラウレート、グリセロール・ジパルミテートを包含する）；第３級若しくは第４級アルキルアンモニウム塩（例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ））を含めた、他の両親媒性化合物及びこれらの混合物又は組み合わせを含有することもできる。
【００７６】
好ましくは、該組成物(formulation)は、例えば、ホスファチジン酸、ＰＥ−ＰＥＧ、パルミチン酸、ステアリン酸、エチル−ＤＳＰＣ又はＤＳＴＡＰのような、総合正味電荷(overall net charge)を有する、少なくとも１つの成分を、好ましくは約５０％未満のモル量で含む。特に好ましい組成物は、下記成分：ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、パルミチン酸及びステアリン酸の２つ以上の混合物を含む。幾つかの好ましいリン脂質と組成物を、実施例に記載する。本明細書に開示した又は当業者に知られたガスのいずれも使用可能である；しかし、例えば、ＳＦ６又はペルフルオロカーボン（例えば、ＣＦ４、Ｃ３Ｆ８及びＣ４Ｆ１０）のような不活性ガスが、場合によっては、例えば空気、窒素、酸素又は二酸化炭素のような他のガスとの混合物として、好ましい。
【００７７】
本発明の好ましいマイクロバブル懸濁液はリン脂質から、例えば、適当な溶媒中の粗リン脂質の溶液の凍結乾燥若しくは噴霧乾燥のような既知方法を用いて、又は下記特許：
【００７８】
【化１２】
2009518448.tif 000013
【００７９】
（これらは、それらの全体で本明細書に援用される）
に記載された方法を用いて製造することができる。好ましくは、国際特許出願WO 04/069284に開示されているように、水のエマルジョン又は水非混和性有機溶媒のエマルジョン中に分散した、分散保護剤(lyoprotecting agent)（例えば、炭水化物、糖アルコール、ポリグリコール及びこれらの混合物、以下に詳述）と、任意に他の両親媒性物質（例えば、ステアリン酸）との混合物としてリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ及び／又はＤＳＰＡ）を含有するマイクロエマルジョンを製造することができる。好ましい有機溶媒は、１．０ｇ／Ｌ以下、好ましくは、さらに低い約０．０１ｇ／Ｌの水中溶解度を有するものであり、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、１−ペンテン、２−ペンテン、１−オクテン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン、１−メチル−シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、１，２−ジメチルベンゼン、１，３−ジメチルベンゼン、ジブチルエーテルとジイソプロピルケトン、クロロホルム、四塩化炭素、２−クロロ−１−（ジフルオロメトキシ）−１，１，２−トリフルオロエタン（エンフルラン）、２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，１，１−トリフルオロエタン（イソフルラン）、テトラクロロ−１，１−ジフルオロエタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロベンゼン、ペルフルオロデカリン、メチルペルフルオロブチルエーテル、メチルペルフルオロイソブチルエーテル、エチルペルフルオロブチルエーテル、エチルペルフルオロイソブチルエーテル、及びこれらの混合物を包含する。本発明のペプチド−リン脂質コンジュゲートは、マイクロエマルジョン中で、微小嚢のエンベロープを形成するリン脂質と一緒に混合することができる。好ましくは、最初に、ペプチド−リン脂質コンジュゲートとＰＥ−ＰＥＧ（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の水性懸濁液を調製し、これを次に、該リン脂質と分散保護剤を含む水性―有機エマルジョンと一緒に混合する。好ましくは、前記混合を例えば約４０℃〜８０℃に加熱しながら行う。
【００８０】
水性キャリヤー中に分散させることによってマイクロバブルの懸濁液を形成する前に、凍結乾燥した又は噴霧乾燥したリン脂質粉末を空気若しくは他のガスと接触させる。水性キャリヤーと接触させると、その構造が破壊されている粉状リン脂質は、ラメラ状若しくは層状セグメントを形成し、該セグメントは、その内部にガスが分散しているマイクロバブルを安定化させる。この方法は、長期間貯蔵した場合にも安定であり、（好ましいガス雰囲気下で貯蔵されていた）乾燥した層状リン脂質の単なる溶解によって得られるマイクロバブルの懸濁液の製造を、振とう若しくは何らかの激しい撹拌なしに可能にする。
【００８１】
或いは、例えばWO 97/29783に開示されているように、ガスを高い撹拌速度で水溶液中に懸濁させることによって、マイクロバブルを製造することができる。マイクロバブルの他の製造方法は、本明細書に援用されるWO 2004/069284に開示されており、この方法は、リン脂質の存在下で水性媒質中に有機溶媒のエマルジョンを製造し、続いて、任意の洗浄及び／又は濾過工程後に前記エマルジョンを凍結乾燥することを含む。幾つかの好ましい製造方法を実施例に開示する。
【００８２】
ガス充填マイクロバブルを製造するための組成物は、有利には、例えば凍結防止及び／又は分散保護効果(cryoprotective and / or lyoprotective effect)を有する作用剤及び／又は充填剤(bulking agent)のような、凍結乾燥添加剤(lyophilization additive)、例えば、アミノ酸、例えば、グリシン；炭水化物、例えば、糖（例えばスクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、ラクトース若しくはシクロデキストリン）又は多糖（例えば、デキストラン）；又はポリグリコール、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）をさらに含む。
【００８３】
これらの超音波組成物のいずれも、さらに、できる限り、血液と等張性であるべきである。このため、上記超音波造影剤懸濁液のいずれにも、注入前に、少量の等張剤(isotonic agent)を添加することができる。該等張剤は、医薬に一般に用いられる生理学的溶液であり、該溶液は、生理的食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）、２．６％グリセロール溶液、５％デキストロース溶液等を含む。さらに、該超音波組成物は、例えば、乳化剤、粘度調節剤、凍結防止剤、分散保護剤(lyoprotectants)、充填剤等を含めた、標準的な製薬的に受容される添加剤を含むことができる。
【００８４】
本発明の超音波造影剤には、任意の生体適合性ガスを用いることができる。本明細書で用いる限り、“ガス”なる用語は、正常なヒト体温において実質的にガス形態である任意の物質（混合物を包含する）を包含する。したがって、該ガスは、例えば、空気、窒素、酸素、ＣＯ２、アルゴン、キセノン若しくはクリプトン、フッ素化ガス（例えば、ペルフルオロカーボン、ＳＦ６、ＳｅＦ６）、低分子量炭化水素（例えば、炭素原子１〜７個含有）、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン若しくはペンタンのようなアルカン、例えば、シクロプロパン、シクロブタン若しくはシクロペンテンのようなシクロアルカン、例えば、エチレン、プロペン、プロパジエン若しくはブテンのようなアルケン、又は例えば、アセチレン若しくはプロピンのようなアルキン、及び／又はこれらの混合物を包含しうる。しかし、フッ素化ガスが好ましい。フッ素化ガスは、少なくとも１個のフッ素原子を含有する物質、例えば、ＳＦ６、フレオン（炭素原子１個以上とフッ素を含有する有機化合物、即ち、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、ＣＢｒＦ３、ＣＣｌ２Ｆ２、Ｃ２ＣｌＦ５、及びＣＢｒＣｌＦ２）及びペルフルオロカーボンを包含する。ペルフルオロカーボンなる用語は、炭素原子とフッ素原子のみを含有する化合物を意味し、特に、飽和、不飽和及び環状ペルフルオロカーボンを包含する。通常好ましい飽和ペルフルオロカーボンは、式  ＣｎＦｎ＋２[式中、ｎは１〜１２、好ましくは２〜１０、最も好ましくは３〜８、さらにより好ましくは３〜６である]で示される。適当なペルフルオロカーボンは、例えば、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２、Ｃ６Ｆ２、Ｃ７Ｆ１４、Ｃ８Ｆ１８及びＣ９Ｆ２０を包含する。最も好ましくは、該ガス若しくはガス混合物は、ＳＦ６又は、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ２、Ｃ６Ｆ１２、Ｃ７Ｆ１４、Ｃ８Ｆ１８から成る群から選択されるペルフルオロカーボンを含み、Ｃ４Ｆ１０が特に好ましい。さらに、WO 97/29783、WO 98/53857、WO 98/18498、WO 98/18495、WO 98/18496、WO 98/18497、WO 98/18501、WO 98/05364、WO 98/17324も参照のこと。好ましい実施態様では、該ガスは、Ｃ４Ｆ１０又はＳＦ６を、任意に空気、窒素又は二酸化炭素との混合物として含む。
【００８５】
ある一定の状況では、ガス状物質の前駆体（例えば、“ガス前駆体”としばしば呼ばれる、in vivoでガスに転化することができる物質）を含むことが、好ましいと考えられる。ガス前駆体と、それが発生するガスは、生理的に許容されるものであることが好ましい。ガス前駆体は、ｐＨ活性化、光活性化、温度活性化等されうる。例えば、ある一定のペルフルオロカーボンは温度活性化ガス前駆体として用いることができる。例えばペルフルオロペンタンのような、これらのペルフルオロカーボンは、室温（又は該作用剤が製造される及び／又は貯蔵される温度）を超えるが、体温未満である液相／気相転移温度を有する；したがって、該ペルフルオロカーボンは、相シフトを受けて、人体内でガスに転化する。
【００８６】
上述したように、該ガスはガス混合物を含むことができる。下記組み合わせ：ガス（Ａ）と（Ｂ）の混合物[この場合、ガスの少なくとも１つ（Ｂ）が、０．５〜４１容量％の量で存在し、８０ダルトンより大きい分子量を有し、フッ素化ガスであり、（Ａ）は空気、酸素、窒素、二酸化炭素及びこれらの混合物から選択され、該ガス混合物のバランスがガス（Ａ）である]が、特に好ましいガス混合物である。
【００８７】
凍結乾燥生成物は、特別な貯蔵条件を必要とすることが知られている過分極化ガスを含有しない限り、その環境の温度制御を必要とせずに、貯蔵し、輸送することができ、特に、該凍結乾燥生成物は、病院及び医師に、このような使用者が特別な貯蔵設備を有する必要なく、すぐに使える投与可能な懸濁液に現場で処方するために供給することができる。好ましくは、このような場合に、該凍結乾燥生成物は、２つの分離容器又は二重チャンバ容器を含むことができる２成分キットの形態で供給することができる。前者の場合には、該容器は好ましくは、慣用的な中隔密閉式バイアルであり、この場合に、工程（ｂ）の凍結乾燥残渣を含有するバイアルが中隔で密閉され、該中隔を通してキャリヤー液体を任意に予め充填された注射器を用いて注入することができる。このような場合に、第２成分の容器として用いられる注射器は、次に、造影剤を注入するためにも用いられる。後者の場合には、二重チャンバ容器は好ましくは、二重チャンバ注射器であり、凍結乾燥物が再構成され、次に適当に混合され、穏やかに振とうされたならば、該造影剤を直接注入するために、該容器を用いることができる。両方の場合に、該容器の内容物への充分な気泡形成エネルギーの供給を行う又は可能にする手段が備えられる。しかし、上述したように、本発明による安定化造影剤では、ガスマイクロバブルのサイズは、再構成された乾燥生成物に与えられる撹拌エネルギー量に実質的に依存しない。したがって、一貫したマイクロバブル・サイズを有する再現可能な生成物を得るために、一般に、穏やかな手動振とうのみが必要であるに過ぎない。
【００８８】
乾燥粉末と水溶液とを無菌形式で一緒にすることができる、他の２チャンバ再構成系も本発明の範囲内であることは、当業者によって理解されることができる。このような系では、生成物の貯蔵寿命を高めるために、水不溶性ガスと環境との間に水相を介在させることができるならば、特に有利である。造影剤の形成のために必要な物質（例えば、再構成中にリン脂質に結合させるべきターゲット・リガンド）が容器内に前から存在しない場合には、これを、キットの他の成分との容易な組み合わせを促進するのに適した形で又は容器内で、キットの他の成分でパッケージすることができる。
【００８９】
特別な容器、バイアル又は結合系は必要ではない；本発明は、慣用的な容器、バイアル及びアダプターを用いることができる。唯一の必要条件は、ストッパーと容器との間の良好なシールである。それ故、該シールの性質は第一の重要な問題である；シール一体性の何らかの破壊は好ましくない物質のバイアルへの侵入を許す可能性がある。無菌性を保障することの他に、安全性と適当な再構成を保障するために、周囲圧又は減圧においてストッパーを施された(stoppered)生成物に対して真空保持することが重要である。該ストッパーは、例えばポリ（イソブチレン）又はブチルゴムのような、エラストマーに基づく化合物又は多成分組成物でありうる。
【００９０】
超音波適用の場合に、リン脂質安定化マイクロバブルによって形成された造影剤は、例えば、リン脂質の注入量が０．１〜２００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜３０μｇ／ｋｇの範囲内であるような投与量で投与することができる。
【００９１】
本発明によって用いることができる超音波イメージング法は、例えば、カラーDoppler、パワーDoppler、Doppler振幅、刺激音響イメージング(stimulated acoustic imaging)、及び二次元若しくは三次元イメージング技法のような、既知方法を包含する。イメージングは調波（共鳴周波数）モード又は基本モードで行うことができ、二次調波モードが好ましい。
【００９２】
本発明の超音波造影剤はさらに、多様な治療的イメージング方法に用いることができる。治療的イメージングなる用語は、その意味の範囲内に、造影剤の使用を含み（例えば、選択された受容体若しくは組織への治療剤のデリバリーのため）、in vitro及び／又はin vivoで生物学的効果を発揮する又は発揮させることができる、患者における疾患の任意の治療方法を包含する。治療的イメージングは、有利には、例えば、高い音圧（典型的に、非破壊的診断イメージング法に一般に用いられる圧力よりも高い）における超音波バーストを用いた、ガス充填微小嚢の制御された限局的破壊と関連付けることができる。この制御された破壊は、例えば、任意に、適当な治療剤の限局的放出と組み合わせて、血栓の治療に用いることができる（ソノトロンボリシスとしても知られた技法）。或いは、前記治療的イメージングは、微小嚢の限局的破裂によって誘発される、細胞レベルでの一過性膜透過性化の結果として、細胞中への治療剤のデリバリーを包含することができる。この手法は、例えば、細胞中への遺伝物質の効果的デリバリーのために用いることができる；場合によっては、薬物を遺伝物質と組み合わせて限局的にデリバリーすることができ、このようにして、患者の複合薬剤学的／遺伝的治療法を可能にする（例えば、腫瘍治療の場合）。
【００９３】
“治療剤”なる用語は、その意味の範囲内に、例えば、患者における疾患の治療方法におけるような、何らかの治療用途に使用可能である、任意の物質、組成物又は粒子、並びにin vitro及び／又はin vivoで生物学的効果を発揮する又は発揮させることができる任意の物質を包含する。したがって、治療剤は、患者における何らかの病的状態（病気、苦痛、病変(disease lesion)又は損傷を包含する）の治療（診断、予防、緩和、鎮痛又は治癒を包含する）に用いることができる任意の化合物又は物質を包含する。治療剤の例は、薬物、医薬品、生理活性剤(bioactive agents)、細胞傷害剤(cytotoxic agents)、化学療法剤、放射線療法剤、タンパク質、天然若しくは合成ペプチド（オリゴペプチド及びポリペプチドを包含する）、ビタミン、ステロイド並びに遺伝物質（ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及びプラスミドを包含する）である。
物質と分析方法
反応、クロマトグラフィー精製及びＨＰＬＣ分析のための溶媒は、VWR Corporation ( West Chester, PA)からのE. Merck Omniグレード溶媒であった。Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はPharmco Products Inc.( Brookfield, CT)から入手し、ペプチド合成グレード又はlow water/amine-free Biotechグレード品質であった。ピペリジン（sequencingグレード、再蒸留９９＋％）とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（spectrophotometricグレード又はsequencingグレード）はSigma-Aldrich Corporation (Milwaukee, WI)から又はFluka Chemical Division of Sigma-Aldrich Corporationから入手した。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、フェノール（９９％）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）は、Sigma-Aldrich Corporationから購入した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、シュードプロリン・ジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨ及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）は、Novabiochem (San Diego, CA)から入手した。Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ａｄｏａ）は、NeoMPS Corp. (San Diego, CA)又はSuven Life Sciences (Hyderabad, India)から入手した。ジスクシンイミジル・グルタレート（ＤＳＧ）と１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−エタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］アンモニウム塩[ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２]は、それぞれ、Pierce Chemical Co. (Rockford, IL.)とAvanti（登録商標）Polar Lipids (Alabaster, AL)から入手した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨとＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨは、対応するトリグリシン又はジグリシンからＦｍｏｃ−ＯＳｕとの反応によって、当社内で(in-house)製造した。ＡＧ  ＭＰ−５０イオン交換樹脂は、Bio-Rad (Hercules, CA)から入手した。
【００９４】
分析用ＨＰＬＣデータは、一般に、Waters XTerra MS-C18 4.6 x 50 mmカラム（粒度：５μ；１２０Å孔度）と勾配若しくは均一濃度(isocratic)溶離系（溶離剤Ａとして水（０．１％ＴＦＡ）及び溶離剤ＢとしてＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）若しくはＣＨ３ＣＮ−ＣＨ３ＯＨ（１：１，ｖ／ｖ）を用いる）を用いるShimadzu LC-10AT VP複式ポンプ・グラジエント系を用いて得た。化合物の検出は２２０及び２５４ｎｍにおいてＵＶを用いて達成した。リン脂質−ＰＥＧ−ペプチド誘導体の純度は、YMC C-4 (5μＭ，300Å, 4.6 x 250mm )カラム上又はZorbax 300 SB-C3 (3.5μＭ，300Å, 3 x 150mm )カラム上で、SEDEX 55 Light Scattering Detector( LSD)とＵＶデテクターを用いて測定した。
【００９５】
分取ＨＰＬＣは、分取フローセル付きSPD-10A V UVデテクターを装備したShimadzu LC-8A複式ポンプ・グラジエント系で行った。一般に、分取用Shimadzu LC-8A複式ポンプ・グラジエント系に取り付けた第３ポンプを用いて、粗ペプチドを含有する溶液を、該化合物の特性に依存して、逆相Ｃ１８、Ｃ４又はＣ３カラム上に装填した。粗生成物混合物の溶液を分取用ＨＰＬＣカラムに供給した後に、反応溶媒と、例えばＤＭＦ若しくはＤＭＳＯのような、希釈剤として用いた溶媒が、低有機相組成で(at low organic phase composition)カラムから溶出した。次に、溶離剤Ｂから溶離剤Ａへの勾配溶離を用いて、所望の生成物を溶出させた。生成物含有画分を、分析用ＨＰＬＣと質量スペクトル分析によって測定した、それらの純度に基づいて、一緒にした。一緒にした画分を凍結乾燥させて、所望の生成物を得た。
【００９６】
アミノ酸組成分析はYale University (New Haven, CT)におけるKeck Biotechnology Resource Laboratoryにおいて行った。質量スペクトルデータは、MScan Inc.( 606 Brandywine Parkway, West Chester PA 19380)から得たか、又は当社内でAgilent LC-MSD 1100 Mass Spectrometer上で得た。画分選択と生成物の特徴付けのために、質量スペクトル値は通常、API-ESを陰イオンモードで用いて得た。一般に、ターゲットペプチドの分子量は〜３０００であった；質量スペクトルは通常、[Ｍ−Ｈ]−ではなく、二重若しくは三重に負に荷電したイオン質量値を示した。これらを、回収と組み合わせのための画分選択に用いて、ＨＰＬＣ精製中に純粋なペプチドを得た。幾つかの場合に、画分は、質量スペクトル中に［Ｍ−２Ｈ］／２＋５７又は［Ｍ−２Ｈ］／２＋１１４に帰属する主要なピークを示した。これらのピークは、ペプチド１分子につきトリフルオロ酢酸１若しくは２分子のアダクツの形成によるものである。ＭＳ結果とＨＰＬＣ純度及び凍結乾燥過程を比較することによって画分を細心に回収した後に、少量の単離された綿毛状固体を水中に溶解し（０．５ｍｇ／ｍｌ）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン水溶液（〜０．５Ｍ）の１滴によって処理した。精製ペプチドの最終純度結果のために、この溶液をＨＰＬＣとＭＳによって分析した。Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンの存在下のペプチド溶液は、質量スペクトルに［Ｍ−２Ｈ］／２＋５７又は［Ｍ−２Ｈ］／２＋１１４質量値ピークを示さず、その代わりに予想された[Ｍ−２Ｈ]／２又は[Ｍ−３Ｈ]／３ピークが観察された。
【００９７】
下記非限定的実施例は、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート及びダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの多量の高度に純粋な形態を得るために用いた、効果的な方法についてのさらなる詳細を提供する。これらの非限定的実施例はさらに、該モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート及びダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを含む典型的な標的マイクロバブルの製造をも説明する。これらの実施例はさらに、ＫＤＲトランスフェクション細胞(KDR-transfected cell)での静的結合試験及びＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｆｃキメラタンパク質での動的結合試験におけるこのような標的マイクロバブルの使用をも説明する。実施例はさらに、ウサギＶＸ２腫瘍モデルにおけるＫＤＲ結合リポペプチドを含有する超音波造影剤の評価を記載する。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例１〜２は、図２に示したモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートに関する。この化合物の合成方法は、図１に示す。これらの実施例は、図２に示した化合物の合成方法を特に詳しく述べるが、同様な方法を用いて、図１０に示したモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートと図９に示した線状ペプチドモノマー（３２）並びに他のモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを製造することができる。さらに、同時係属米国出願No.10 / 661,156 (September 11,2003出願)は、該ペプチドモノマーの製造方法を述べており、該出願はその全体で本明細書に援用される。
【００９９】
実施例１
線状ペプチドモノマー（２）：
【化１３】
2009518448.tif 000014
Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシンアミドの固相合成（ＳＰＰＳ）と精製
【０１００】
線状ペプチドモノマー（２）を、SONATA（登録商標）／Pilot Peptide Synthesizerでの確立された自動化プロトコルによって、ＤＭＦ中でＦｍｏｃ−Ｐａｌ−Ｐｅｇ−ＰＳ樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸及びＤＩＣ仲介ＨＯＢｔエステル活性化を用いて合成した。該ペプチド配列を、Ｆｍｏｃ−Ｐａｌ−Ｐｅｇ−ＰＳ樹脂上でのＳＰＰＳ方法によって、典型的には１０ｍｍｏｌ規模で、段階的やり方で(in stepwise fashion)合成した。ＤＭＦ中で４倍過剰な、アミノ酸とＤＩＣ−ＨＯＢｔ試薬対の各々によってアミノ酸カップリングを行った。
【０１０１】
アミノ酸の典型的なカップリングでは、樹脂１ｇにつき乾燥ＤＭＦ５ｍｌを用いた。使用した樹脂に基づいて、算出したＤＭＦの総量を、溶液調製のためにアミノ酸とＨＯＢｔとＤＩＣに割り当てた。例えば、樹脂５０ｇ（１０ｍｍｏｌ規模）を必要とする合成のためには、ＤＭＦの算出量（２５０ｍｌ）をアミノ酸（１５０ｍｌ）とＨＯＢｔ（５０ｍｌ）とＤＩＣ（５０ｍｌ）に分配した。Sonata Pilot Peptide Synthesizer上のアミノ酸容器に固体乾燥アミノ酸（該樹脂に関して４倍過剰量）を装填した。カップリング工程の開始時に、該機器のソフトウェアを用いて、ＤＭＦの選択量（アミノ酸の希釈用）とＤＭＦ中のＨＯＢｔ（４当量）とＤＭＦ中のＤＩＣ（４当量）を連続的に供給し、窒素バブリングによる混合を開始して、４分間行った。これは、該アミノ酸を予備活性化し、該混合物の全ての成分の完全な溶解を保証するのに役立った。活性化後に、活性化Ｆｍｏｃアミノ酸溶液の、該樹脂含有反応器への移送を該ソフトウェアが仲介した(mediated)。移送が完了した後に、該容器を３時間、窒素バブリングの反復によって撹拌した。３時間のカップリング時間後に、該樹脂をＤＭＦ（５ｍｌ／ｇ，６ｘ）によって完全に洗浄し、ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）含有ＤＭＦ中２５％ピペリジン（５ｍｌ／ｇ）によって、Ｆｍｏｃ基の切断を行った(２ｘ１０分間)。その後のアミノ酸カップリングに備えて、該樹脂からのピペリジンの完全な除去を保証するために、該樹脂をＤＭＦ（５ｍｌ／ｇ，６ｘ）で完全に洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨの場合には、本文中に(in the text)記載したように活性化時間中のジケトピペラジン形成を最少にするために、該アミノ酸ボトル中での予備活性化を行わなかった。それ故、これらの２つの場合には、アミノ酸、ＨＯＢｔ及びＤＩＣの溶液を反応器に連続的に加えて、カップリング・プロセスを“現場(in situ)”活性化によって行った。
【０１０２】
鎖延長が完了した後に、Ｎ−末端アミノ酸のＦｍｏｃ基を標準方法で除去し、続いて、ＤＭＦによって標準的に洗浄した（上記参照）。次に、新たに調製したアセチル化混合物（ＤＭＦ／６ｍｌ／ｇ樹脂中の０．５Ｍ無水酢酸、０．１２５Ｍ  ＤＩＥＡ及び０．０１５Ｍ  ＨＯＢｔ）によってＮ−末端アミノ酸にキャップを施した(２ｘ２０分間)。ペプチド合成が完了した後に、該樹脂を切断用カクテル(cleavage cocktail)、“試薬Ｂ”(ＴＦＡ：水：フェノール：トリイソプロピルシラン，８８：５：５：２，ｖ／ｖ／ｗ／ｖ)（１０ｍｌ／ｇ樹脂）によって４時間処理した。揮発物を除去し、このようにして得られたペーストをエーテルと共に摩砕して、固体を得て、遠心分離を介在させながら（上清のデカンテーションを可能にするように懸濁固体を圧縮するため）、該固体をエーテル（３ｘ）によって洗浄し、次に真空下で乾燥させて、所望のペプチドをオフホワイト色固体として得た。線状ペプチドモノマー（２）の１０ｍｍｏｌ規模合成によって、粗ペプチド３３．８２ｇ（理論量の１０３％）を得た。理論量より大きい収率は、恐らく水分(moisture)と残留溶媒によると思われた。
【０１０３】
線状ペプチドモノマー（２）：
【化１４】
2009518448.tif 000015
Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシンアミドの精製
【０１０４】
粗線状ペプチドモノマー（２）の〜０．５ｇ部分を最少量のＣＨ３ＣＮ（〜２０ｍｌ）中に溶解した。水によって、該溶液量を〜１００ｍｌに調節して、該溶液を、第３ポンプを用いて、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮと予め平衡させてある逆相Ｃ１８分取カラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50 x 250mm,流速100ml/分)上に装填した。該カラムは、サンプル溶液の供給中に、平衡化溶離剤(equlibrating eluent)によって溶出しなかった。該サンプル溶液を該カラムに供給した後に、溶離剤の組成を２０％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）に１分間にわたって傾斜させ、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．６％／分の速度で線形勾配を開始して、５０分間維持した。生成物溶離のインジケーターとして２２０ｎｍにおけるＵＶを用いて、画分（１５ｍｌ）を手動で回収した。回収した画分をWatersXTerra分析用逆相Ｃ−１８カラム（５μ粒子，１２０Å孔）上で分析して、＞９５％純度の生成物含有画分をプールし、凍結乾燥させて、対応する純粋な線状ペプチドモノマー（２）を得た。典型的には、粗生成物（２）０．５ｇの精製によって、所望の生成物（＞９５％純度）０．１２ｇ（２４％収率）が得られた。
【０１０５】
実施例２
モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）：
【化１５】
2009518448.tif 000016
Ｎ−アセチル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ロイシル−１−セリニル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−セリニル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシンアミドの製造
【０１０６】
モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）、Ａｃ−ＲＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ２（配列番号：１）は、（３）、ペプチドモノマー（２）のグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステルの、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４）によるコンジュゲート化によって製造した。
【０１０７】
電磁気撹拌バーと中隔キャップを備えた丸底フラスコに、無水ジメチルホルムアミド（７．５ｍｌ）と、ジスクシンイミジル・グルタレート(ＤＳＧ，０．２５ｇ，０．７５ｍｍｏｌ)と、ジイソプロピルエチルアミン(０．１０ｇ，０．７８ｍｍｏｌ)を撹拌しながら、連続的に装入した。固体線状ペプチドモノマー（２）（０．５ｇ，０．１５２ｍｍｏｌ）を上記溶液に２分間の時間にわたって少量ずつ加えた；次に、該溶液を周囲温度において３０分間撹拌した。反応混合物を無水酢酸エチルによって〜５０ｍｌにまで希釈した；この結果、中間体モノＮＨＳエステル（３）、ペプチドモノマー（２）のグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステルの沈殿が生じた。この溶液を遠心分離して、モノＮＨＳエステル（３）を無色固体として沈降させた。過剰なＤＳＧを含有する上清を、圧縮された固体モノＮＨＳエステル（３）からデカントし、該圧縮固体を、さらに２回、再び酢酸エチル中に分散させて、遠心分離し、洗浄して、残留する痕跡量のＤＳＧを除去した。このようにして得られた固体中間体モノＮＨＳエステル（３）を無水ＤＭＦ（１０．０ｍｌ）中に溶解し；ジイソプロピルエチルアミン(０．１０ｇ，０．７８ｍｍｏｌ)を加えた；そして該混合物を撹拌した。
【０１０８】
一方では、別のフラスコにおいて、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４）(０．３８ｇ，０．１４ｍｍｏｌ，０．９当量)を乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）中に懸濁させ、トリフルオロ酢酸（２滴）を加えて、該ホスホジエステル酸素をプロトン化して、ジクロロメタン中のリン脂質アンモニウム塩の可溶化を促進させた。次に、該透明な溶液を回転蒸発器上で蒸発させて、揮発物を除去して、さらに真空下で乾燥させた。
【０１０９】
固体リン脂質アンモニウム塩（４）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解して、モノＮＨＳエステル（３）の撹拌溶液に移し入れ、得られた混合物を周囲温度において２４時間撹拌した。該反応混合物をＣＨ３ＯＨとＣＨ３ＣＮ−水（１：１，ｖ／ｖ）との１：１混合物によって１００ｍｌになるまで希釈して、不溶物を濾過した。濾過済み溶液の半分を、水（０．１％ＴＦＡ）とＣＨ３ＯＨ−ＣＨ３ＣＮ（１：１，ｖ／ｖ，０．１％ＴＦＡ）との３：１（ｖ／ｖ）混合物と予め平衡させてある逆相Ｃ２分取カラム（Kromasil（登録商標）Prep C2, 10μ, 300Å, 50 x 250mm）上に１００ｍｌ／分の流速で装填した。サンプルの装填中に該カラムが平衡化溶離剤によって溶出しなかったことに注目のこと。サンプル溶液をカラムに装填した後に、ＤＭＦのプラグが溶出されるまで、該カラムを平衡化溶離剤で洗浄した。溶離剤の組成を９分間にわたって７０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ３ＣＮ（１：１，０．１％ＴＦＡ）に傾斜させ、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＯＨ−ＣＨ３ＣＮ（１：１，０．１％ＴＦＡ）の０．７５％／分の線形勾配を開始して、４０分間にわたってランした。生成物溶離のインジケーターとしてＵＶ（２２０ｎｍ）を用いて、画分（１５ｍｌ）を回収した。画分を分析用ＨＰＬＣ系（カラム：YMC C-4, 5μ,300Å, 4.6 x2 50mm）上で、２２０ｎｍにおけるＵＶとエバポレイティブ光散乱デテクター（ＥＬＳＤ）を用いて純度に関して検査した。後者のデテクター（ＥＬＳＤ）を用いて、２２０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を殆ど有さないＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４）を検出した。＞９８％純度であって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（４）を有さない生成物含有画分を一緒にして、回転蒸発器上で濃縮して、ＣＨ３ＯＨ含量を減少させた。濃縮した溶液を次に、微かな綿毛状沈殿が形成されるまで、水中１０％ＣＨ３ＣＮで希釈した。得られた溶液を凍結乾燥して、モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）を無色固体として得た。粗モノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）の第２部分を上述したように精製した。ターゲットのモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）の複合収量は０．４０ｇ（４７％収率）であった。
【０１１０】
以下の実施例３〜５は、図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートに関する。該ダイマーコンジュゲートの典型的な合成方法を、図３、４、６、７及び８に示す。
実施例３
モノマーペプチド（１２）：Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ[Ｋ（ｉｖＤｄｅ）]−ＮＨ２と（１３）：Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）−ＮＨ２の固相合成（ＳＰＰＳ）、環化及び精製
該線状ペプチドを、SONATA（登録商標）／Pilot Peptide Synthesizerでの確立された自動化プロトコルによって、ＤＭＦ中でＦｍｏｃ−Ｐａｌ−Ｐｅｇ−ＰＳ樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸及びＤＩＣ仲介ＨＯＢｔエステル活性化を用いて合成した。Ｆｍｏｃ−Ｐａｌ−Ｐｅｇ−ＰＳ樹脂上の該ペプチド配列を、ＳＰＰＳ方法によって、典型的には１０ｍｍｏｌ規模で、段階的やり方で合成した。ＤＭＦ中でアミノ酸とＤＩＣ−ＨＯＢｔ試薬の各々を４倍過剰に用いて、アミノ酸カップリングを行った。
【０１１１】
該配列中のアミノ酸の典型的なカップリングでは、樹脂１ｇにつき乾燥ＤＭＦ５ｍｌを用いた。使用した樹脂に基づいて、算出したＤＭＦの総量を、溶液調製のためにアミノ酸とＨＯＢｔとＤＩＣに割り当てた。例えば、樹脂５０ｇを必要とする合成のためには、ＤＭＦの算出量（２５０ｍｌ）をアミノ酸（１５０ｍｌ）とＨＯＢｔ（５０ｍｌ）とＤＩＣ（５０ｍｌ）に分配した。Sonata（登録商標）Pilot Peptide Synthesizer上のアミノ酸容器に固体乾燥アミノ酸（該樹脂に関して４倍過剰量）を装填した。カップリング工程の開始時に、ＤＭＦの選択量とＤＭＦ中のＨＯＢｔ（４当量）とＤＭＦ中のＤＩＣ（４当量）を連続的にデリバリーして、各デリバリー後に、窒素バブリングによる混合を行った。最後の試薬をデリバリーした後に、窒素バブリングによる混合を開始して、４分間行った。これは、該アミノ酸を予備活性化し、該混合物の全ての成分の完全な溶解を保証するのに役立った。
【０１１２】
活性化後に、活性化Ｆｍｏｃアミノ酸溶液を該樹脂含有反応器へ移した。移送が完了した後に、該容器を３時間、窒素バブリングの反復によって撹拌した。３時間のカップリング時間後に、該樹脂をＤＭＦ（５ｍｌ／ｇ，６ｘ）によって完全に洗浄し、ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）含有ＤＭＦ中２５％ピペリジン（５ｍｌ／ｇ）によって、Ｆｍｏｃ基の切断を行った(２ｘ１０分間)。その後のアミノ酸カップリングに備えて、該樹脂からのピペリジンの完全な除去を保証するために、該樹脂をＤＭＦ（５ｍｌ／ｇ，６ｘ）で完全に洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨの場合には、本文中に記載したように活性化中のジケトピペラジン形成を最少にするために、該アミノ酸ボトル中での予備活性化を行わなかった。それ故、これらの２つの場合には、アミノ酸、ＨＯＢｔ及びＤＩＣの溶液を反応器に連続的に加えて、カップリング・プロセスを“現場”活性化によって行った。鎖延長が完了した後に、Ｎ−末端アミノ酸のＦｍｏｃ基を標準方法で除去し、続いて、ＤＭＦによって標準的に洗浄した（上記参照）。次に、新たに調製したアセチル化混合物（ＤＭＦ−６ｍｌ／ｇ樹脂中の０．５Ｍ無水酢酸、０．１２５Ｍ  ＤＩＥＡ及び０．０１５Ｍ  ＨＯＢｔ）によってＮ−末端アミノ酸にキャップを施した(２ｘ２０分間)。
【０１１３】
該モノマーペプチドのＣ−末端リシン部分のε−アミノ基の官能化（必要に応じて、Fmoc-Adoa又はFmoc-Lys(ivDde)による）を、最初に、新たに調製したＤＭＦ中１０％ヒドラジン（５ｍｌ／ｇ樹脂−２ｘ１０分間）によって該ε−アミノ基のivDde基を除去することによって達成した。Fmoc-Adoa又はFmoc-Lys(ivDde)を付加させるために、カップリング時間を１０時間に高めた。ペプチド合成が完了した後に、該樹脂を切断用カクテル、“試薬Ｂ”(ＴＦＡ：水：フェノール：トリイソプロピルシラン，８８：５：５：２，ｖ／ｖ／ｗ／ｖ)（１０ｍｌ／ｇ樹脂）によって４時間処理した。真空下で揮発物を蒸発させた後に、ペーストをエーテルと共に摩砕して、固体を得て、該固体を濾過によって回収し、ジエチルエーテルによって洗浄し、乾燥させた。（１２），Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ[Ｋ（ｉｖＤｄｅ）]−ＮＨ２の１０ｍｍｏｌ規模合成によって、粗ペプチド３０ｇ（理論量の１０３％）を得た。（１３），Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）−ＮＨ２の場合には、１０ｍｍｏｌ規模合成によって、粗ペプチド２８ｇ（理論量の１０７％）が得られた。理論量より大きい収率は、恐らく水分(moisture)と残留溶媒によると思われる。
線状ジシステインペプチドから環状ジスルフィドペプチドへの環化
環状ジスルフィドペプチドを、対応する線状ジシステインペプチドからＤＭＳＯ補助酸化によって、ＤＭＳＯ／水（９５／５，ｖ／ｖ）を用いて製造した。該粗線状ペプチドを広口ビーカーにおいて溶媒混合物（５ｍｌ／ｇ）中に溶解し、該溶液のｐＨを固体Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンの少量ずつの添加によって８．５に調節した。得られた混合物を周囲温度において３６時間撹拌した。次に、該溶液をアセトニトリル（５０ｍｌ／ｇ）で希釈し、混合物を２分間撹拌した。固体の環状ジスルフィドペプチドを濾過によって回収して、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させた。
【０１１４】
モノマーペプチドの精製
ペプチドモノマー（１２）：
【化１６】
2009518448.tif 000017
【０１１５】
粗環状ジスルフィドペプチドモノマー（１２）の〜０．５ｇ部分を最少量のＤＭＳＯ（〜３ｍｌ）中に溶解した。２０％ＣＨ３ＣＮ−水によって、該溶液量を〜１００ｍｌに調節して、該溶液を、第３ポンプを用いて、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮと予め平衡させてある逆相Ｃ１８分取カラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50 x 250mm,流速100ml/分)上に装填した。該カラムへのサンプル溶液の供給中に、分取ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れは停止した。該サンプル溶液を該カラムに供給した後に、勾配ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れを再度開始させ、該カラムを１０％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）によって、ＤＭＳＯが溶出するまで、溶出させた。次に、溶離剤の組成を３５％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）に１分間にわたって傾斜させ、その後に、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．５％／分の速度で線形勾配を開始して、５０分間維持した。生成物溶離のインジケーターとして２２０ｎｍにおけるＵＶを用いて、画分（１５ｍｌ）を手動で回収した。回収した画分をWatersXTerra分析用逆相Ｃ−１８カラム（５μ粒子，１２０Å孔）上で分析して、＞９５％純度の生成物含有画分をプールし、凍結乾燥させて、対応する環状ジスルフィドペプチドモノマー（１２）を得た。典型的には、粗生成物モノマー（１２）０．５ｇの精製によって、所望の生成物（＞９５％純度）０．１ｇ（２０％収率）が得られた。
【０１１６】
ペプチドモノマー（１３）：
【化１７】
2009518448.tif 000018
【０１１７】
ペプチドモノマー（２）のＨＰＬＣ精製に用いた方法に従って、２０％ＣＨ３ＣＮ−水混合物（１００ｍｌ）中に溶解した粗環状ジスルフィドペプチドモノマー（１３），Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）−ＮＨ２（０．５ｇ）を、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）と予め平衡させてある逆相Ｃ１８分取カラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ粒子, 300Å孔, 50 x 250mm,流速100ml/分)上に装填した。該カラムへのサンプル溶液の供給中に、分取ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れは停止した。該サンプル溶液を該カラムに供給した後に、勾配ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れを再度開始させ、該カラムを１０％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）によって５分間溶出させた。次に、溶離剤の組成を３０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）−水（０．１％ＴＦＡ）に１分間にわたって傾斜させ、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．５％／分の速度で線形勾配の溶離を開始して、５０分間維持した。生成物溶離のインジケーターとして２２０ｎｍにおけるＵＶを用いて、画分（１５ｍｌ）を手動で回収した。該画分をWatersXTerra分析用逆相Ｃ−１８カラム（4.6mm i.d. x 50mm, ５μ粒子，１２０Å孔）上で分析して、＞９５％純度の生成物含有画分をプールし、凍結乾燥させて、対応する環状ジスルフィドペプチドモノマー（１３）を得た。典型的には、粗ペプチドモノマー（３）０．５ｇの精製によって、所望の生成物（＞９５％純度）０．１２ｇ（２４％収率）が得られた。
【０１１８】
実施例４
前駆体ダイマーペプチド（１６）：
【化１８】
2009518448.tif 000019
の製造と精製
【０１１９】
図３に示したように、ジスクシンイミジル・グルタレート（ＤＳＧ，０．２８ｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を撹拌無水ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ）中に溶解して、ジイソプロピルエチルアミン(０．１１ｇ，０．８５ｍｍｏｌ)を一度に加えた。次に、固体ペプチドモノマー（１２）Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ[Ｋ（ｉｖＤｄｅ）]−ＮＨ２（０．５０ｇ，０．１７ｍｍｏｌ）をＤＳＧの該撹拌溶液に少量ずつ２分間の時間にわたって加えた。室温において３０分間撹拌した後に、該溶液を無水酢酸エチルによって〜５０ｍｌになるまで希釈した（これは、中間体モノＮＨＳエステル（１４）を沈殿させるのに役立った）。混合物全体を遠心分離し、上清をデカントして、中間体モノＮＨＳエステル（１４）を無色固体として残した。該固体を酢酸エチルによって再懸濁させ；懸濁固体モノＮＨＳエステル（１４）を含有する溶液を遠心分離し、該固体を分離して、上清を再びデカントした。この洗浄プロセスを２回繰り返して、過剰なＤＳＧを完全に除去した。
【０１２０】
固体モノＮＨＳエステル（１４）を撹拌無水ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ）中に溶解して、ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を加えた。次に、固体ペプチドモノマー（１３），Ａｃ−ＶＣ＊ＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣ＊ＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（Ａｄｏａ−Ａｄｏａ）−ＮＨ２（０．５０ｇ，０．１９ｍｍｏｌ，１．１２当量）を少量ずつ該撹拌溶液に３分間にわたって加え、得られた混合物を１８時間撹拌した。該反応を質量分光分析法によってモニターした；ペプチドモノマー・グルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステル（１４）が完全に消費されたことが確認された後に、ニートなヒドラジン（０．１ｍｌ）を加えて、ｉｖＤｄｅ含有ダイマー（１５）のｉｖＤｄｅ保護基を除去し、混合物を室温において２０分間撹拌した。
【０１２１】
次に、該溶液をＴＦＡの滴加によって酸性化して、混合物を水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）によって１００ｍｌになるまで希釈した。該溶液を濾過して、粒子を除去し、清澄化した溶液の半分を、水（０．１％ＴＦＡ）中１０％ＣＨ３ＣＮと予め平衡させてある逆相Ｃ１８分取カラム(Waters,XTerra（登録商標）Prep MS C18, 10μ, 50 x 250mm,流速100ml / 分)上に装填した。該カラムへのサンプル溶液の供給中に、分取ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れは停止した。該サンプル溶液を該カラムに供給した後に、勾配ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れを再度開始させ、該カラムからＤＭＦをフラッシュするために、該カラムを１０％ＣＨ３ＣＮ−水（０．１％ＴＦＡ）によって溶出させた。次に、ＤＭＦプラグの溶離が完了した後に、溶離剤の組成を２０％ＣＨ３ＣＮに１分間にわたって高めて、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）０．６％／分の線形勾配速度によって溶離を続けた。生成物溶離のインジケーターとしてＵＶ（２２０ｎｍ）を用いて、画分（１５ｍｌ）を回収した。該画分を逆相Ｃ−１８カラム（Waters MS C18, 4.6mm i.d. x 50mm, ５μ粒子，１２０Å孔）上で分析して、＞９５％純度の生成物含有画分をプールし、凍結乾燥させて、前駆体ダイマーペプチド（１６）を無色綿毛状固体として得た。残りの粗前駆体ダイマーペプチド（１６）を同じやり方で精製した。モノマーペプチド（１２）と（１３）の各々０．５ｇから、所望のダイマー（１６）３２０ｍｇ（総収率３３％）が得られた（＞９５％純度）。
【０１２２】
実施例５
ＫＤＲ結合ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）アセチル−Ｌ−アラニル−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−トレオニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−チロシル−Ｌ−チロシル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−１−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシル−Ｌ−トレオニル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシル[アセチル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−セリル−Ｌ−トリプトフィル−グリシル−グリシル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−シスチニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル−グリシル−グリシル−グリシル−Ｌ−リシル（ジステアリルホスホエタノールアミノカルボノキシ−ＰＥＧ２０００−アミノ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル−グルタリル−Ｌ−リシル）アミド環状（２−１２）ジスルフィド]−アミド環状（６−１３）ジスルフィド：
【化１９】
2009518448.tif 000020
の製造
【０１２３】
該ＫＤＲ結合ダイマー（１１）は、前駆体ダイマーペプチド（１６）：
【０１２４】
【化２０】
2009518448.tif 000021
【０１２５】
の、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（１８）によるコンジュゲート化によって、図４に示すように、製造することができる。
固体前駆体ダイマーペプチド（１６）（０．５ｇ，０．０９２ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（３．０ｍｌ）中のジスクシンイミジル・グルタレート（ＤＳＧ，０．１５ｇ，０．４６ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン(０．０６ｇ，０．４７ｍｍｏｌ)との溶液に撹拌しながら３分間の時間にわたって少量ずつ加えた。次に、該溶液を周囲温度において３０分間撹拌した。反応混合物を無水酢酸エチルによって〜５０ｍｌになるまで希釈した；これによって、ダイマーグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステル（１７）、前駆体ダイマーペプチド（１６）のグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステルの沈殿が生じた。該溶液を遠心分離して、ペレット６（m/z, neg. ion, 1887.3(M-3H)/3, 1415.1(M-4H)/4, 1131.9(M-5H)/5）を無色固体として得た。圧縮された固体ダイマーグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステル（１７）から上清の過剰なＤＳＧを含有する酢酸エチル層をデカントして、該固体ダイマーグルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステル（１７）を、さらに２回、再び酢酸エチル中に再懸濁させ、遠心分離し、洗浄して、残留するＤＳＧ痕跡量を除去した。このようにして得られた固体中間体グルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステルダイマー誘導体（１７）を無水ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（８：２，ｖ／ｖ）（３．０ｍｌ）中に溶解して、ジイソプロピルエチルアミン（０．０６ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を加えて、この溶液を撹拌した。
【０１２６】
一方では、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（１８）（０．２３５ｇ，０．０８４ｍｍｏｌ，０．９当量）を分離フラスコにおいて乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）中に懸濁させて、ＴＦＡ（２滴）を加えて、該ホスホジエステル酸素をプロトン化して、ジクロロメタン中のリン脂質アンモニウム塩（１８）の可溶化を促進させた。該透明な溶液を濃縮して、揮発物を除去して、さらに真空下で乾燥させた。
【０１２７】
固体リン脂質アンモニウム塩（１８）をＤＭＦ（２ｍｌ）中に溶解して、グルタール酸モノアミドモノＮＨＳエステルダイマー誘導体（１７）の撹拌溶液に移し入れ、得られた混合物を周囲温度において２４時間撹拌した。該反応混合物を５０％ＣＨ３ＯＨと２５％ＣＨ３ＣＮと２５％水（１：１，ｖ／ｖ）との溶液によって〜１００ｍｌになるまで希釈して、不溶物を濾過した。濾過済み溶液の半分を、ＣＨ３ＯＨとＣＨ３ＣＮ（１：１，０．１％ＴＦＡ）と水（０．１％ＴＦＡ）との１：１混合物と予め平衡させてある逆相Ｃ４分取カラム（Kromasil（登録商標）Prep C4, 10μ, 300Å, 50 x 250mm）上に１００ｍｌ／分の流速で装填した。カラムへのサンプル溶液の供給中に、分取ＨＰＬＣ系からの平衡化溶離剤の流れは停止した。サンプル溶液を装填した後に、平衡化溶離剤の流れを再度開始して、ＤＭＦのプラグが溶出されるまで、該カラムを洗浄した。
【０１２８】
次に、溶離剤の組成を７０％ＣＨ３ＯＨ−ＣＨ３ＣＮ（１：１，０．１％ＴＦＡ）−水（０．１％ＴＦＡ）に１分間にわたって傾斜させ、水（０．１％ＴＦＡ）中へのＣＨ３ＯＨ−ＣＨ３ＣＮ（１：１，０．１％ＴＦＡ）の０．７５％／分の線形勾配を開始した。カラムからの生成物の完全な溶出に達するために、１００％Ｂに達した後に溶離を続けた。生成物溶離のインジケーターとしてＵＶ（２２０ｎｍ）を用いて、画分（１５ｍｌ）を回収し、主要な生成物が溶出した後に、出発物質のリン脂質アンモニウム塩（１８）の痕跡量の溶出を保証するために、画分回収を数分間続けた。画分を分析用ＨＰＬＣ系（カラム：YMC C4, 5μM,300Å, 4.6 x2 50mm）上で、２２０ｎｍにおけるＵＶとエバポレイティブ光散乱デテクター（ＥＬＳＤ）を用いて純度に関して検査した。後者のデテクターを用いて、２２０ｎｍに弱い発色団を有するＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２を検出した。＞９８％純度であって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２リン脂質アンモニウム塩（８）を有さない生成物含有画分を一緒にして、濃縮して、ＣＨ３ＯＨ含量を減少させた。該溶液を次に、微かな綿毛状沈殿が形成されるまで、水中１０％ＣＨ３ＣＮで希釈した。得られた溶液を凍結乾燥して、ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）を無色固体として得た。粗ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）の第２部分を上述したように精製した。ターゲットのダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）の複合収量は０．３９ｇ（５７％収率）であった。種々なサンプル精製ランから製造されたダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）のサンプルを一緒にプールし、ｔｅｒｔ−ブタノール−アセトニトリル−水混合物中に溶解し、再度凍結乾燥して、ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）を無色の、綿毛状の固体として得て、これを真空下でさらに乾燥させた。
【０１２９】
以下の実施例６〜８は、図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造に関し、この場合に該ダイマーコンジュゲートは、ごく低レベルのＴＦＡを含有する。図６〜８は、以下の実施例に記載する方法を説明する。
実施例６
低いＴＦＡレベルを有するダイマーコンジュゲートの、グルタリル・リンカーの使用による製造
ＡＧ  ＭＰ−５０イオン交換樹脂による、（２２）、（２５）及びダイマーペプチド２７・ｎＴＦＡ塩から酢酸塩への転化による（２３）、（２６）及びダイマーペプチド（２７）酢酸塩(acetate salt)の製造
化合物（２３）に関しては、ＡＧ  ＭＰ−５０イオン交換樹脂（１．５ｍｅｑ／ｍｌ樹脂床）を２０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中に懸濁させた。該懸濁液を３ｘ３０ｃｍガラスカラムに充填した、最終量は１５０ｍｌであった。該カラムをポンプ及び導電率計に連結した。これを２０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏによって１７ｍｌ／分の流速で、導電率が１μｓ／ｃｍ未満になるまで洗浄した。化合物（２２）（２１０ｍｇ）を２０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（８０ｍｌ）中に溶解して、得られた溶液を該カラムに装填した。該カラムを再び同じ溶離剤によって、その導電率が１μｓ／ｃｍ未満になるまで洗浄した。２０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中のＮＨ４ＯＡｃの勾配を各２５０ｍｌにつき２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ及び８００ｍＭで適用した。化合物は６００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃで出現した。画分をＨＰＬＣによって分析し、化合物を含有する画分を一緒にして、物質の重量が一定になるまで、数回凍結乾燥させた。純粋な物質（２３）１７６ｍｇが白色綿毛状固体として得られた。収率は８３．８％であった。
【０１３０】
さらなるパラメーター及び結果は次のとおりであった：ＨＰＬＣ：保持時間：５．６分間；アッセイ＞９８％（面積％）；カラム：Waters XTerra MS-C18, 4.6 x 50mm, 5μ粒子, 120Å孔；溶離剤：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件：１５％Ｂ、８分間にわたって線形勾配１５〜５０％Ｂ；流速：３ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ；質量スペクトル：ＡＰＩ−ＥＳ；モード：陰イオン；１４４１．７[Ｍ−２Ｈ]／２，９６０．９［Ｍ−３Ｈ］／３．ＣＥ分析（対イオン  ％ｗｔ／ｗｔ）：ＴＦＡ０．３％であると推定；アセテート１．１％．
化合物（２６）に関しては、化合物（２３）に対すると同じ手段に従って、Ｈ２Ｏによって１μｓ／ｃｍの導電率になるまで洗浄した１５０ｍｌのＡＧ  ＭＰ−５０カラムに、水８０ｍｌ中のペプチドＴＦＡ塩（２５）３００ｍｇを１７ｍｌ／分で装填した。装填後に、該カラムを次にＨ２Ｏによって再び洗浄し、化合物（２３）のイオン交換に用いたものと同じ、Ｈ２Ｏ中へのＮＨ４ＯＡｃ水溶液の同じステップ勾配を適用した。一緒にした画分を一定重量になるまで凍結乾燥して、酢酸塩（２６）２００ｍｇを綿毛状白色固体として得た。収率は６６．７％であった。
【０１３１】
さらなるパラメーター及び結果は次のとおりであった：ＨＰＬＣ：保持時間：５．６分間；アッセイ９７．０％（面積％）；カラム：Waters XTerra MS-C18, 4.6 x 50mm, 5μ粒子, 120Å孔；溶離剤：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件：１５％Ｂ、８分間にわたって線形勾配１５〜５０％Ｂ；流速：３ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ；質量スペクトル：ＡＰＩ−ＥＳ；モード：陰イオン；１３３６．９[Ｍ−２Ｈ]／２，８９０．８［Ｍ−３Ｈ］／３．ＣＥ分析（対イオン  ％ｗｔ／ｗｔ）：ＴＦＡ  ０．４％であると推定；アセテート４．２％；ＩＣ分析（Ｆ％）：０．２６．
ダイマーペプチド（２７）酢酸塩に関しては、化合物（２３）に対する手段と同様に、ＡＧ  ＭＰ−５０カラム（湿潤体積(wet volume)１００ｍｌ）を３０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏによって、導電率が１μｓ／ｃｍ未満になるまで、洗浄した。ＴＦＡ塩としての化合物（２７）（３０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（８０ｍｌ）中１２０ｍｇ）を該カラムに装填して、該カラムを同じ溶離剤によって、導電率が１μｓ／ｃｍにおいて安定するまで、洗浄した。３０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中へのＮＨ４ＯＡｃ−３０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏのステップ勾配は、化合物（２３）に対すると同様にランした、そして該化合物は約６００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃにおいて溶離した。一緒にした画分を凍結乾燥し、その後、該物質が一定重量を示すまで、数回再度凍結乾燥して、純粋な物質（２７）１０４ｍｇを酢酸塩として得た。収率は８６．７％であった。
【０１３２】
さらなるパラメーター及び結果は次のとおりであった：ＨＰＬＣ：保持時間：５．２分間；アッセイ＞９９％（面積％）；カラム：Waters XTerra MS-C18, 4.6 x 50mm, 5μ粒子, 120Å孔；溶離剤：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件：２０％Ｂ、８分間にわたって線形勾配２０〜６０％Ｂ；流速：３ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ；質量スペクトル：ＡＰＩ−ＥＳ；モード：陰イオン；１８１６．３[Ｍ−３Ｈ]／３，１３６２．０［Ｍ−４Ｈ］／４，１０８９．２［Ｍ−５Ｈ］／５；ＣＥ分析（対イオン  ％ｗｔ／ｗｔ）：ＴＦＡ  ０．２％であると推定；アセテート０．１５％．
化合物（２３）と化合物（２６）からのダイマーペプチド（２７）酢酸塩の製造と精製
無水ＤＭＦ（０．１ｍｌ）中のジスクシンイミジル・グルタレート（１８ｍｇ，０．０５５ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＤＭＦ（０．２ｍｌ）中の化合物（２３）（６１ｍｇ，０．０２１ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した（ｐＨ８、ＤＩＥＡによって中和）。透明な溶液を室温において０．５時間撹拌した。ＨＰＬＣとＭＳは、反応の完成を示した。溶媒を真空下で除去して、ＥｔＯＡｃ（８ｍｌ）を加えて、中間体（２４）を沈殿させた。混合物を遠心分離し、デカントして、過剰なグルタレートを除去した。このＥｔＯＡｃ洗浄をさらに３回繰り返して、得られた固体を、乾燥窒素流を用いて乾燥させた。次に、これを無水ＤＭＦ（０．３ｍｌ）中に溶解した。化合物（２６）(５６ｍｇ，０．０２１ｍｍｏｌ)を加えて、該溶液のｐＨを、ＤＩＥＡの添加によって、８に調節した。この溶液を室温において１６時間撹拌した、その後、ＨＰＬＣとＭＳ分析によって、反応の完成が実証された。ＮＨ２ＮＨ２の３０μｌアリコートを加えて、混合物を５分間撹拌して、ｉｖＤｄｅ基を切断した。反応混合物をＨＰＬＣとＭＳによって分析した、これはｉｖＤｄｅ基の完全な除去を実証した。
【０１３３】
ダイマーペプチド（２７）酢酸塩の精製前に、ＴＦＡを含まない溶離剤、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃによって、カラムを含む分取ＨＰＬＣ系全体を細心に洗浄するように注意した。次に、粗反応混合物を、１５％Ｂ（Ａ：Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ；Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ，９／１、ｖ／ｖ中１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ）と予め平衡した逆相Ｃ−１８分取カラム（Atlantis C-18, 5μm粒子, 100Å孔, 30 x 150mm, 流速30ml /分）に供給した。該カラムを同じ溶離剤によって、ＤＭＦプラグが溶出するまで、洗浄した。該溶離剤組成を２分間にわたって２５％Ｂに高め、その後、４０分間にわたって６５％Ｂまで傾斜させた。画分を分析用逆相Ｃ−１８カラム(Waters MS C-18, 4.6 x 50mm, 5μm粒子, 100Å孔, 流速3ml /分)上で分析して、＞９５％純度の生成物含有画分をプールし、凍結乾燥して、ダイマーペプチド（２７）２５ｍｇを綿毛状白色固体としてのその酢酸塩として得た。収率は２１．８％であった。
【０１３４】
さらなるパラメーター及び結果は次のとおりであった：ＨＰＬＣ：保持時間：５．２分間；アッセイ＞９９％（面積％）；カラム：Waters XTerra MS-C18, 4.6 x 50mm, 5μ粒子, 120Å孔；溶離剤：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件：２０％Ｂ、８分間にわたって線形勾配２０〜６０％Ｂ；流速：３ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ；質量スペクトル：ＡＰＩ−ＥＳ；モード：陰イオン；[Ｍ−３Ｈ]／３，１３６２．０［Ｍ−４Ｈ］／４，１０８９．２［Ｍ−５Ｈ］／５；ＣＥ分析（対イオン  ％ｗｔ／ｗｔ）：ＴＦＡ  ０．２％未満であると推定；アセテート１．１％．
実施例７−図７
イオン交換樹脂による、低ＴＦＡレベルを有するダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの製造
ダイマーペプチド（２７）酢酸塩からのリン脂質ペプチドコンジュゲート（２１）のその酢酸塩としての製造と精製
無水ＤＭＦ（０．１ｍｌ）中のジスクシンイミジル・グルタレート−ＤＳＧ（３．７ｍｇ，１１．３μｍｏｌ）の溶液に、無水ＤＭＦ（０．２ｍｌ）中の中和されたダイマーペプチド（２７）酢酸塩（１５ｍｇ，２．７５μｍｏｌ）の溶液を滴加した。該反応溶液を室温において０．５時間撹拌した。Waters XTerra C-18カラムによるＨＰＬＣ分析とＭＳは、反応の完成を示した。溶媒を蒸発させて、ＥｔＯＡｃ（８ｍｌ）を加えて、中間体（２８）を沈殿させた。沈殿した中間体（２８）を含有する容器を遠心分離し、液層をデカントした。この手段を３回繰り返して、過剰なＤＳＧを除去した。固体を乾燥窒素流によって乾燥させ、次に、無水ＤＭＦ（０．３ｍｌ）中に溶解した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２アンモニウム塩（２９）(６．５ｍｇ，２．３３μｍｏｌ)を固体形で加えて、混合物のｐＨを（２８）に合わせて調節した。この反応混合物を室温において１６時間撹拌した。該混合物をＭＳと、Zorbax 300 SB-C3カラムによるＨＰＬＣによって分析した、これは、反応が完成したことを実証した。
【０１３５】
ＴＦＡによる生成物の可能な汚染を最少にするために、粗反応混合物を、ＴＦＡに暴露させたことが決してない、新しいZorbax 300 SB-C3カラム（21.2 x 150mm, 5μ粒子）を用いて装備した分取ＨＰＬＣによって精製した。該ＨＰＬＣ系をＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＡｃによって徹底的に予め洗浄して、痕跡量のＴＦＡを除去した。この反応混合物を、２０％Ｂ（Ａ：Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ；Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ，９／１，ｖ／ｖ中１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ）と予め平衡したカラム上に流速３０ｍｌ／分で装填した。該カラムを同じ溶離剤によって、ＤＭＦプラグが溶出するまで、３０ｍｌ／分で溶出させた。次に、溶離剤組成を３分間にわたって４０％Ｂに高めて、次に５０分間にわたって９０％Ｂにまで傾斜させた。回収した画分を分析用逆相Ｃ−３カラム(Zorbax 300SB-C3, 3 x 150mm, 3.5μm粒子, 300Å孔, 流速: 0.5ml /分)上で分析した、この場合、検出は２２０ｎｍにおけるＵＶとエバポレイティブ光散乱デテクター（ＥＬＳＤ）を用いて達成した。純粋な生成物含有画分をプールし、凍結乾燥した。最終生成物（２１）酢酸塩の６．５ｍｇ部分を得た。収率は３３．０％であった。
【０１３６】
さらなるパラメーター及び結果は次のとおりであった：ＨＰＬＣ：保持時間：１３．３分間；アッセイ＞９９％（面積％）；カラム：Zorbax 300SB-C3, 3 x150mm,3. 5μ, 300Å孔；溶離剤：Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ  １／１（０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件：６０％Ｂ、３分間にわたって線形勾配６０〜９０％Ｂ；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶとＥＬＳＤ；ＣＥ分析（対イオン  ％ｗｔ／ｗｔ）：％ｗｔ  ＴＦＡ：０．３％；％ｗｔ  アセテート０．４％．
実施例８−図８
Zorbax C-3 RP分取ＨＰＬＣとSephadex G-25ゲル透過クロマトグラフィーを用いた連続精製による、低ＴＦＡレベルを有するダイマーコンジュゲートの製造
用いた物質と、分析用ＨＰＬＣ系の条件は下記を包含する：カラム：Zorbax 300SB C-3；３ｍｍ内径ｘ１５０ｍｍ；３．５μｍ粒子；溶離剤Ａ：Ｈ２Ｏ（容量で０．１％ＴＦＡを有するＨＰＬＣ等級）；溶離剤Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（容量で０．１％ＴＦＡ）；溶離：初期条件：５０％Ｂ、次に３分間にわたって線形勾配５０〜９０％Ｂ、９０％Ｂに１１分間維持；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ．保持時間：（化合物（２１））：６．７７分間、Ｒｔ（リゾ）：４．０６分間．
化合物（２１）からリゾ化合物を除去するために分取Zorbax C-3カラムを用いた分取ＨＰＬＣ
粗化合物を３０％溶離剤Ｂの濃度で装填した。用いた物質と条件は下記を包含する：条件：カラム：Waters Zorbax 300SB C-3；21.2mm内径ｘ150mm；3.5μｍ粒子；溶離剤：溶離剤Ａ：Ｈ２Ｏ（１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃを有するＨＰＬＣ等級）；溶離剤Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ，９／１（最終ＮＨ４ＯＡｃ濃度：１０ｍＭ）．
次に、溶離剤の組成を４５％Ｂに２分間にわたって変化させ、その後、カラムを４５〜１００％Ｂの線形勾配で４０分間にわたって溶出した；流速：３０ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ．
粗化合物（１００ｍｇ）を３０％Ｂの溶液（２５ｍｌ）中に溶解した。分取ＨＰＬＣ系を３０％Ｂにおいて平衡させた。化合物をZorbax C-3カラム上に装填した。移動相の組成を２分間にわたって４５％Ｂに傾斜させた。４０分間にわたる４５〜１００％Ｂの線形勾配を化合物（２１）の溶離に用いた。生成物は２６．５〜３３分間に溶出した。
【０１３７】
化合物（２１）を含有する画分を一緒にして、凍結乾燥させて、白色綿毛状固体を得た。これを水−アセトニトリル中に溶解して、次に、再び凍結乾燥させた。これは、リゾ化合物を含まない生成物７０ｍｇを生成した。回収率は約７０％であった。クロマトグラフィーが完了した後に、該系を９５％Ｂによって流速３０ｍｌ／分において１５分間洗浄した。次に、該カラムをＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０／５０，ＴＦＡ又はバッファーのいずれも含まず）によって流速１５ｍｌ／分において３０分間洗浄した。その後、該カラムを今後の使用のために室温において保存した。分析用ＨＰＬＣが、単離物質中にリゾ化合物が存在しないことを確証した。さらなる分析が、室温における５日間後にリゾ化合物が形成されなかったことを確証した。該物質はまだ、有意な量（４．２重量％）のＴＦＡを含有した。
Sephadex G-25上でのゲル透過クロマトグラフィーによる化合物（２１）からのＴＦＡの除去。
【０１３８】
Sephadex G-25カラム（１００ｇ樹脂，ビーズサイズ：２０〜８０μｍ，総ゲル量：〜５００ｍｌ，カラム高さ：２７ｃｍ）を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（４Ｌ）と平衡させた。次に、化合物（２１）（７０ｍｇ）を１０％アセトニトリル水溶液中６０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（３０ｍｌ）（最終量）中に溶解した。この溶液を濾過して、次に、Sephadex G-25カラム上に装填した。該カラムを５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム・バッファーによって溶出し、１０ｍｌ画分を回収した。回収した画分を分析用ＨＰＬＣ（２２０ｎｍにおけるＵＶ検出）によってモニターした。結果は以下の表４に提供する。
【０１３９】
【化２１】
2009518448.tif 000022
【０１４０】
画分２０〜２８をプールして、凍結乾燥させた。得られた凍結乾燥物質を少量の水に再溶解して、この溶液を凍結し、凍結乾燥させて、炭酸水素アンモニウムの残留量を除去した。所望の物質の最終重量は５８ｍｇであった。回収率は８３％であった。
【０１４１】
ＴＦＡの有効な除去を確認するために、サンプルにＴＦＡ及びアセテートイオンに関するＣＥ分析を行った。ＴＦＡは以前の分析によると出発物質中に明らかに存在する（４．２％）が、ゲル透過手段後には殆ど検出されない（０．２％）。アセテートイオンは検出されなかった。
連続的なZorbax C-3分取ＨＰＬＣとSephadex G-25ゲル透過クロマトグラフィーによって得られた、化合物（２１）の分析データ
用いた物質と、分析データを回収するための条件は下記を包含する：フッ素分析（ＱＴＩによるＩＣ）：７５１ｐｐｍ（０．１５％ＴＦＡ  ｗｔ／ｗｔ）；質量スペクトル：方法：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；モード：陽イオン；検出された平均分子量は８４６１であり、典型的なＰＥＧ２０００質量分布曲線が観察された。ＨＰＬＣ：系Ａ：カラム：Zorbax 300SB C-3；３ｍｍ内径ｘ１５０ｍｍ；３．５μｍ粒子；溶離剤Ａ：水（容量によって０．１％ＴＦＡを有するＨＰＬＣ等級）；溶離剤Ｂ：アセトニトリル（容量によって０．１％ＴＦＡ）．初期条件：５０％Ｂ；溶離：３分間にわたって５０〜９０％Ｂの線形勾配、９０％Ｂに１１分間維持；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍにおけるＵＶ．保持時間：６．７７分間；面積％：９９．６％．系Ｂ：カラム：Zorbax 300SB C-3；３ｍｍ内径ｘ１５０ｍｍ；３．５μｍ粒子；溶離剤Ａ：水（容量によって０．１％ＴＦＡを有するＨＰＬＣ等級）；溶離剤Ｂ：アセトニトリル（容量によって０．１％ＴＦＡ）．初期条件：５０％Ｂ；溶離：３分間にわたって５０〜９０％Ｂの線形勾配、その後、１００％Ｂにまで１２分間にわたって傾斜；流速：０．５ｍｌ／分；検出：ＬＳＤ；保持時間：１３．９８分間；面積％：９９．３％．
以下の表５は、用いた略号の定義と、実施例９〜１２に記載した物質の供給源を示す。
【０１４２】
【化２２】
2009518448.tif 000023
【０１４３】
実施例９
ＤＳＰＣ／ＤＰＰＧエンベロープを有する標的マイクロバブルの製造
実施例９Ａ
ＤＳＰＣ／ＤＰＰＧ／及び図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）の混合物（モル比率４９．７５／４９．７５／０．５、それぞれ、３成分１８７．１ｍｇ、１７６．４ｍｇ及び１９．８ｍｇに対応）３８３ｍｇと、ＰＥＧ−４０００（２２．６ｇ）を、水浴において６０℃のｔ−ブチルアルコール（１２０ｇ）中で可溶化した。該溶液をバイアル中にそれぞれ溶液０．８ｍｌずつ充填した。サンプルを−４５℃において凍結し、凍結乾燥させた。ヘッドスペース中の空気をＣ４Ｆ１０／窒素（５０／５０）の混合物と交換して、バイアルにキャップを施して、クリンプした(crimped)。凍結乾燥サンプルをバイアルにつき５ｍｌのＨ２Ｏによって再構成した。
実施例９Ｂ
ＤＳＰＣ／ＤＰＰＧ／及び図１０に示したモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（３１）の混合物（モル比率４９．５／４９．５／１、それぞれ、３成分１８２．８ｍｇ、１７２．３ｍｇ及び２８．２ｍｇに対応）を用いて、実施例９Ａを繰り返した。
実施例１０
ＤＰＰＥ／ＤＰＰＧエンベロープを有する標的マイクロバブルの製造
実施例１０Ａ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００（０．４３ｍｇ−０．２４μｍｏｌｅ）と図１０に示したモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（３１）（３．０ｍｇ−０．５μｍｏｌｅ）との水性懸濁液を、６０℃の蒸留水（５００μｌ）中に調製して、ミセル懸濁液を得た。
【０１４４】
別に、ＤＰＰＥ（１５．８ｍｇ−２２．８μｍｏｌｅ）とＤＰＰＧ（４．２ｍｇ−５．７μｍｏｌｅ）を７０℃の蒸留水中マンニトール１０％の溶液（２０ｍｌ）中に２０分間分散させた。次に、該分散液を室温に冷却した。ペルフルオロヘプタン（１．６ｍｌ）を該水相中に、高速ホモジナイザー(Polytron PT3000, プローブ直径３ｃｍ)を１０５００ｒｐｍで１分間用いて、乳化して、エマルジョンを得た。
【０１４５】
該エマルジョンに該ミセル懸濁液を加えて、得られた混合物を６０℃において撹拌しながら１時間加熱した。室温に冷却した(１時間)後に、得られたエマルジョンを５０ｍｌ丸底フラスコ中の４ｍｌ画分に分割した。該エマルジョンを−４５℃において５分間凍結し、０．２ｍｂａｒにおいて２４時間凍結乾燥させた(Freeze-Drier Christ Beta 1-8K)。
【０１４６】
再分散させる前に、該凍結乾燥物をＣ４Ｆ１０／窒素（容量で５０／５０）を含有する雰囲気に暴露した。その後、凍結乾燥生成物を最初の量の２倍の水量中に穏やかなハンドシェイキングによって分散させた。
実施例１０Ｂ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００（０．５ｍｇ−０．２７μｍｏｌｅ）と図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）（５．３ｍｇ−０．６３μｍｏｌｅ）との水性懸濁液を、６０℃の蒸留水（５００μｌ）中に調製して、ミセル懸濁液を得た。
【０１４７】
別に、ＤＰＰＥ（１５．８ｍｇ−２２．８μｍｏｌｅ）とＤＰＰＧ（４．２ｍｇ−５．７μｍｏｌｅ）を７０℃の蒸留水（２０ｍｌ）中ＰＥＧ４０００  １０％の溶液中に２０分間分散させた。次に、該分散液を室温に冷却した。ペルフルオロヘプタン（１．６ｍｌ）を該水相中に、高速ホモジナイザー(Polytron PT3000, プローブ直径３ｃｍ)を１００００ｒｐｍで１分間用いて、乳化して、エマルジョンを得た。
【０１４８】
該エマルジョンに該ミセル懸濁液を加えて、得られた混合物を８０℃において撹拌しながら１時間加熱した。室温に冷却した(１時間)後に、得られたエマルジョンを遠心分離(２００ｇ／１０分−Sigma centrifuge 3K10)によって１回洗浄して、過剰なリン脂質を除去した。分離したペレット（乳化した溶媒ミクロ滴を含有）を回収し、１０％ＰＥＧ４０００水溶液の最初の量によって再懸濁させた。
【０１４９】
得られたエマルジョンをＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（１ｍｌ／バイアル）。次に、バイアルを−５０℃において冷却し(Christ Epsilon 2-12DS Freeze-Drier )、−２５℃及び０．２ｍＢａｒにおいて１２時間凍結乾燥させた、最終乾燥工程は３０℃及び０．１ｍＢａｒにおいて７時間であった。バイアルをＣ４Ｆ１０／窒素（容量で３５／６５）を含有する雰囲気に暴露して、密封した。凍結乾燥生成物を最初の量の２倍の水量中に穏やかなハンドシェイキングによって再分散させた。
実施例１１
ＤＳＰＣ／ＤＳＰＡエンベロープを有する標的マイクロバブルの製造
実施例１１Ａ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００（２．５ｍｇ−１．４μｍｏｌｅ）と図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）（７．０ｍｇ−０．８４μｍｏｌｅ）との水性懸濁液を、６０℃の蒸留水（１ｍｌ）中に調製して、ミセル懸濁液を得た。
【０１５０】
別に、ＤＳＰＣ（１６．３ｍｇ−２０．６μｍｏｌｅ）とＤＳＰＡ（３．７ｍｇ−５．１５μｍｏｌｅ）を８０℃のシクロオクタン（１．６ｍｌ）中に溶解した。次に、この有機相を、水中ＰＥＧ４０００の１０％溶液（２０ｍｌ）中に、高速ホモジナイザー(Polytron T3000, プローブ直径３ｃｍ)を８０００ｒｐｍで１分間用いて、加えて、エマルジョンを得た。
【０１５１】
該ミセル懸濁液に該エマルジョンを混合して、得られた混合物を８０℃において撹拌しながら１時間加熱した。室温に冷却した(１時間)後に、得られたエマルジョンを遠心分離(１５００ｇ／１０分間−Sigma centrifuge 3K10)によって１回洗浄して、過剰なリン脂質を除去した。分離した上清（乳化した溶媒ミクロ滴を含有）を回収して、１０％ＰＥＧ４０００水溶液の最初の量の２倍中に再懸濁させた。
【０１５２】
得られたエマルジョンをＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（１ｍｌ／バイアル）。次に、バイアルを−５０℃に冷却し(Christ Epsilon 2-12DS Freeze-Drier )、−２５℃及び０．２ｍＢａｒにおいて１２時間凍結乾燥させた、最終乾燥工程は３０℃及び０．１ｍＢａｒにおいて７時間であった。バイアルをＣ４Ｆ１０／窒素（容量で３５／６５）を含有する雰囲気に暴露して、密封した。
【０１５３】
次に、凍結乾燥生成物を最初の量の２倍の水量中に穏やかなハンドシェイキングによって再分散させた。
実施例１１Ｂ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（０．７ｍｇ−０．２６μｍｏｌｅ）と図２に示したモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）（１．６ｍｇ−０．２６μｍｏｌｅ）を用いた以外は、実施例１１Ａを繰り返して、ミセル懸濁液を製造した。
実施例１１Ｃ
ＤＳＰＣ（１６．３ｍｇ−２０．６μｍｏｌｅ）、ＤＳＰＡ（３．７ｍｇ−５．１５μｍｏｌｅ）及び図１に示したモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）（１．６ｍｇ−０．２６μｍｏｌｅ）を８０℃のシクロオクタン（１．６ｍｌ）中に溶解した。この有機相を、ＰＥＧ４０００の１０％水溶液（２０ｍｌ）中に、高速ホモジナイザー(Polytron PT3000, プローブ直径３ｃｍ)を８０００ｒｐｍで１分間用いて、乳化して、エマルジョンを得た。
【０１５４】
得られたエマルジョンを８０℃において撹拌しながら１時間加熱した。室温に冷却した(１時間)後に、得られたエマルジョンをＰＥＧ４０００の１０％水溶液（２０ｍｌ）によって希釈した。
【０１５５】
該エマルジョンをＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（１ｍｌ／バイアル）。次に、バイアルを−５０℃において冷却し(Christ Epsilon 2-12DS Freeze-Drier )、−２５℃及び０．２ｍＢａｒにおいて１２時間凍結乾燥させた、最終乾燥工程は３０℃及び０．１ｍＢａｒにおいて７時間であった。バイアルをＣ４Ｆ１０／窒素（容量で３５／６５）を含有する雰囲気に暴露して、密封した。凍結乾燥生成物を最初の量の２倍の水量中に穏やかなハンドシェイキングによって再分散させた。
実施例１２
ＤＳＰＣ／ステアレート・エンベロープを有する標的マイクロバブルの製造
実施例１２Ａ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（２．５ｍｇ−０．９μｍｏｌｅ）と、図５に示したダイマーリン脂質コンジュゲート（１１）（２．５ｍｇ−０．３μｍｏｌｅ）との水性懸濁液を６０℃の蒸留水（６６０μｌ）中に調製して、ミセル懸濁液を得た。
【０１５６】
別に、ＤＳＰＣ（１８．２ｍｇ−２３．１μｍｏｌｅ）とステアレート（１．８ｍｇ−５．８μｍｏｌｅ）を８０℃のシクロオクタン（１．６ｍｌ）中に溶解した。この有機相を、水中ＰＥＧ４０００の１０％溶液（２０ｍｌ）中に、高速ホモジナイザー(Polytron T3000, プローブ直径３ｃｍ)を９０００ｒｐｍで１分間用いて、加えて、エマルジョンを得た。
【０１５７】
該ミセル溶液に該エマルジョンを混合して、得られた混合物を８０℃において撹拌しながら１時間加熱した。室温に冷却した(１時間)後に、得られたエマルジョンを遠心分離(１５００ｇ／１０分間−Sigma centrifuge 3K10)によって１回洗浄して、過剰なリン脂質を除去した。分離した上清（乳化した溶媒ミクロ滴を含有）を回収して、１０％ＰＥＧ４０００水溶液の最初の量の２倍中に再懸濁させた。
【０１５８】
得られたエマルジョンをＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（１ｍｌ／バイアル）。次に、バイアルを−５０℃に冷却し(Christ Epsilon 2-12DS Freeze-Drier )、−２５℃及び０．２ｍｂａｒにおいて１２時間凍結乾燥させた、最終乾燥工程は３０℃及び０．１ｍｂａｒにおいて７時間であった。バイアルをＣ４Ｆ１０／窒素（容量で３５／６５）を含有する雰囲気に暴露して、密封した。
【０１５９】
凍結乾燥生成物を最初の量の２倍の水量中に穏やかなハンドシェイキングによって分散させた。
実施例１２Ｂ
図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）を、図２に示したモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）の同じ相対的モル量に換えて、実施例１２Ａを繰り返した。
実施例１２Ｃ
ＤＳＰＣ（１８．２ｍｇ−２３．１μｍｏｌｅ）と、ステアリン酸ナトリウム（１．８ｍｇ−５．８μｍｏｌｅ）と、図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）（２．２ｍｇ−０．２６μｍｏｌｅ）によって、実施例１１Ｃを繰り返した。乳化のための撹拌速度は９０００ｒｐｍに固定した。室温に冷却した(１時間)後に、得られたエマルジョンを遠心分離(１５００ｇ／１０分間−Sigma centrifuge 3K10)によって１回洗浄して、過剰なリン脂質を除去した。分離した上清（乳化した溶媒ミクロ滴を含有）を回収して、１０％ＰＥＧ４０００水溶液の最初の量の２倍中に再懸濁させた。
実施例１３
ＫＤＲトランスフェクション細胞での静的結合試験
プラスミド製造と精製
全長ＫＤＲをｐｃＤＮＡ６ベクター中にクローン化して、該プラスミドをコンピテントＤＨ５α大腸菌(E.coli)において増幅させた。プラスミド増幅と精製は、大腸菌ＪＭ１０９と、Quiagenからのキットを用いて行った。
Thermanox（登録商標）カバースリップ上での２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
２４ウェル・プレートにおいてポリ−Ｄ−リシン被覆Thermanox（登録商標）円形カバースリップ上で細胞を増殖させた。０．１ｍｌ中にＤＮＡ（ｐｃ−ＤＮＡ６−ｆＫＤＲ）１μｇ／カバースリップ（１．３ｃｍ２）を用いて、リポフェクタミン２０００プロトコル(Invitrogen, cat# 11668-019)での推奨のように、トランスフェクションを行った。トランスフェクションは、無血清培地において行い、２時間後に、トランスフェクション試薬ミックスを細胞から取り出し、通常の血清含有培地と交換した。細胞被覆カバースリップの一部を模擬トランスフェクションした(mock-transfected)（ＤＮＡなしに）。翌日、ＫＤＲ受容体の発現を、免疫細胞化学によって評価して、結合アッセイを行った。
バブル結合アッセイ
該トランスフェクション細胞を、ＰＢＳ中５０％ヒト血漿中に再懸濁させたＫＤＲ標的マイクロバブルと共にインキュベートした。トランスフェクション細胞と共にインキュベーションするために、小プラスチック・キャップに１．３ｘ１０８バブルを含有する懸濁液を充填して、該トランスフェクション細胞を標的マイクロバブルと接触させるように、該キャップを、逆さにしたThermanox(登録商標)カバースリップによって覆った。室温における３０分間のインキュベーション後に、該カバースリップをピンセットで持ち上げて、ＰＢＳ中で３回すすぎ洗いして、顕微鏡下で検査して、標的マイクロバブルの結合を評価した。
マイクロバブルで覆われた表面％の測定
デジタルカメラＤＣ３００Ｆ（Leica）によってイメージを得て、イメージした面積中の結合マイクロバブルによって覆われた表面の割合を、ソフトウェアＱＷｉｎバージョン３．１(Leica Microsystem AG, Basel, Switzerland)を用いて測定した。各Thermanox(
登録商標）カバースリップ毎の写真を撮影した。実施例９と１０の各製剤(preparation)に対して、結合アッセイを少なくとも２回繰り返して、このようにして、覆われた表面の平均値を得た。
【０１６０】
下記表６と７では、上記実施例９と１０に従って製造したマイクロバブルの結合活性を記録する。
表が示すように、同じペプチドが、マイクロバブルの安定化エンベロープを形成する異なるリン脂質製剤中に（リポペプチドとして）含まれる場合には、異なる結合活性を示すことがありうる。本発明のＫＤＲ結合リポペプチド含有マイクロバブルは、ＫＤＲ発現細胞に特異的に結合するが、これらは、模擬(mock)トランスフェクション細胞には感知できるほどには結合しなかった。
実施例１４
ｒｈＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｆｃキメラタンパク質での動的結合試験
Ｆｃ−ＶＥＧＦ−Ｒ２被覆カバースリップの製造
ガラスカバースリップ（直径４０ｍｍ，Bioptechs Inc., Butler, PA, USA）を組み換えヒトＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｆｃキメラタンパク質（R & D Systems）によって、下記方法論に従って被覆した。
【０１６１】
該ガラス・カバースリップ上に、大きさ１４ｘ２５ｍｍの表面を特定のマーカー（Dako Pen）を用いて画定して、ＰＢＳ中４μｇ／ｍｌでのＦｃ−ＶＥＧＦ−Ｒ２溶液(４００μｌ)をこの表面上に沈着させた。４℃において一晩インキュベーションした後に、溶液を吸引して、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．４）中のＢＳＡ１％（ｗ／ｖ）の溶液（０．５ｍｌ）と交換して、室温において３時間インキュベートした。次に、該カバースリップをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０（５ｍｌ）によって３回洗浄した。
結合アッセイ
標的バブルの結合試験を、平行平板型フローチャンバ(parallel-plate flow chamber)(FCS2, Bioptech Inc., Butler, PA, USA)を厚さ０．２５ｍｍのチャンバ・ガスケットと共に用いて、逆さまチャンバ反転のための特製アダプターによって行った。被覆されたカバースリップを該フローチャンバのプレートとして挿入した。マイクロバブル（ＰＢＳ中５０％ヒト血漿中５ｘ１０６バブル／ｍｌ）を、該フローチャンバを通して、調節可能な輸液ポンプ（Auto Syringe（登録商標）AS50輸液ポンプ，Baxter, Deerfield, IL, USA）を６０ｍｌ注射器(Terumo)と共に用いて汲み出した。ポンプ流速を１ｍｌ／分に調節して、所望の剪断速度約１１４ｓ−１を得た。１０分間後に、流れを停止させ、倒立Olympus IX 50顕微鏡に接続した４０ｘ対物レンズとＣＣＤモノクロムカメラ(F-View II, Soft Imaging Systems, Germany)を用いて、ランダムに、カバースリップ上(約０．０２５ｍｍ２の面積上)の種々な位置において写真を撮影した。
【０１６２】
各写真上のマイクロバブル数を測定し、写真の総数に関して平均化して、次に、得られた値を１０によって割った（“勾配(slope)”即ち、結合マイクロバブル／分の平均量を得るため）。
【０１６３】
実施例１１と１２の各製剤に関して、結合アッセイを４回繰り返して、このようにして、勾配の平均値を得た。
該勾配は、ターゲット基質上のバブル結合率を表す。例えば、８の勾配値は、平均８０マイクロバブルが１０分間に被覆カバースリップ上に結合したことを示す。これより高い勾配は、フロー条件下でのターゲットへのバブルのより良好な結合能力を示す。
【０１６４】
下記表８と９では、上記実施例１１と１２によって製造したマイクロバブルの結合活性を説明した。
表から推定されるように、同じペプチドが、マイクロバブルの安定化エンベロープを形成する異なるリン脂質製剤中に（ペプチド−リン脂質コンジュゲート又はリポペプチドとして）含まれる場合には、異なる結合活性を示すことがありうる。
【０１６５】
【化２３】
2009518448.tif 000024
【０１６６】
【化２４】
2009518448.tif 000025
【０１６７】
実施例１５
ＫＤＲを標的とする超音波造影剤のin vivo評価
本発明のＫＤＲ結合リポペプチドを含有する超音波造影剤がin vivoでＫＤＲ発現組織に結合する能力を、血管新生の既知モデル：ウサギＶＸ２腫瘍モデルを用いて評価した。
【０１６８】
血管新生組織の既知モデルを用いて、ＫＤＲ標的超音波マイクロバブルが血管新生組織に局在する能力を試験して、血管新生組織のイメージを得た。
ＶＸ２ウサギ癌を、体重２．５／３ｋｇを有するNew Zealandウサギ(Charles River Laboratories, France)の背部筋肉に連続的に移植した。
腫瘍ホモジェネートの調製
腫瘍を外科的に取り出して、１０％ウシ胎児血清、抗生物質、１．５ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉを含有するＭｃＣｏｙ培養培地中に入れ、小片にカットして、該小片をすすぎ洗いして、血液とデブリーを除去した。次に、腫瘍小片（３〜５ｃｍ３）を、完全培地５ｍｌを含有する５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ管中に入れた。腫瘍組織を、固体片がもはや見られなくなるまで、摩砕した（Polytron）。濁った流体を３００ｇにおいて５分間遠心分離して、上清をデカントした。ペレット５ｍｌにつき新たな培地７ｍｌを加えた。
腫瘍移植
ウサギに最初にVetranquil（０．３ｍｌ）(Acepromazine, Sanofi, 筋肉内に注射)を投与し、次にウサギをKetaminol（登録商標）５/ Xylazine( Veterinaria AG / Sigma)混合物(５０／１０ｍｇ／ｍｌ，０．７ｍｌ／ｋｇ)の筋肉内注射によって麻酔した。ＶＸ２腫瘍ホモジェネート（１００μｌ）を筋肉内に注射した。ＶＸ２腫瘍ホモジェネートの移植後１５日目に、動物を再び同じ混合物によって麻酔し、これに加えて、イメージング実験のために５０％Ｕｒｅｔｈａｎｅ（２ｍｌ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）（Sigma）を皮下注射した。
in vivo超音波イメージング
Ｌ７−４線形プローブを装備した超音波イメージング系ＡＴＬ  ＨＤＩ５０００装置を用いて、ＶＸ２腫瘍イメージングを行った。高音響パワー（ＭＩ＝０．９）におけるＢモードパルス反転を用いて、新血管の内皮上に発現されたＫＤＲ受容体上の標的マイクロバブルの蓄積を評価した。線形プローブを直接、移植された腫瘍上の皮膚に固定した。
【０１６９】
実施例１６又は実施例１７のいずれかの製剤を用いてバブル（ガス、０．１μｌ／ｋｇ）を注入した後に、インソネーション(insonation)を停止して、バブルを２５分間蓄積させた。次に、インソネーションを高音響パワー（ＭＩ０．９）で再活性化して、腫瘍内に存在する全てのバブルを破壊した。次に、インソネーションなしに２０秒間蓄積させた後に得られたシグナルを記録することによって、自由循環バブル量を評価した。ＶＸ２腫瘍イメージング実験からのビデオフレームをビデオキャプチャーによって記録して、Image-Pro Plus 2.0ソフトウェアによって分析した。自由循環バブルを示すイメージを、２５分間において得られたイメージから控除して、結合バブルを示すイメージを得た。
【０１７０】
図１１（実施例１６の製剤による結果を示す）と図１２（実施例１７の製剤による結果を示す）に関して、図１１Ａと図１２Ａは、バブル注入前のイメージ（基底）を示し；図１１Ｂと図１２Ｂは、注入後２５分間の腫瘍中のバブル造影(bubble contrast)の保持を示す；そして図１１Ｃと図１２Ｃは、基底と自由循環バブルを控除した後に得られた結果を示し、本発明によるＫＤＲリポペプチドを含有する結合マイクロバブルを表す。実施例１５〜１７及び実施例１１と１２は、このようなＫＤＲ結合部分を有する超音波造影剤が、動物モデルにおけるＫＤＲ発現（及びそれ故の血管新生）組織に局在することを確証する。
実施例１６
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００をＤＳＰＥ−ＰＥＧ１０００（２．７ｍｇ，１．５４μｍｏｌ）と交換し、図５に示したダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）（２．５ｍｇ，０．３１μｍｏｌ）を用いることによって、実施例１２Ａを繰り返した。
実施例１７
ダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートを、同じモル量の、図２に示したモノマー・リン脂質コンジュゲート（１）と交換することによって、実施例１６を繰り返した。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、線状ペプチドモノマー（２）からのモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）の製造方法を説明する。
【図２】図２は、ＫＤＲに対して高い結合アフィニティを有するペプチドを含むモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）を説明する。
【図３】図３は、ペプチドモノマーからの前駆体ダイマーペプチド（１６）の製造方法を説明する。
【図４】図４は、ＫＤＲに高いアフィニティで結合するペプチドを含有するダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）を形成するための、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨ２への図１に示した前駆体ダイマーペプチドのコンジュゲート化方法を説明する。
【図５】図５は、ＫＤＲに対して高い結合アフィニティを有するペプチドを含有するダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）を説明する。
【図６】図６は、最低レベルのＴＦＡを有するダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（例えば（２１））の製造方法を説明する。
【図７】図７は、最低レベルのＴＦＡを有するダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（例えば（２１））の別の製造方法を説明する。
【図８】図８は、最低レベルのＴＦＡを有するダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲートの別の製造方法を説明する。
【図９】図９は、ＫＤＲに対して高い結合アフィニティを有する、別の典型的なモノマーペプチド（３２）を説明する。
【図１０】図１０は、図９に示したモノマーペプチドを含む、別のモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（３１）を説明する。
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、造影剤中にダイマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１１）（図５２に示す）を用いることによって得られたイメージを示す：（１）基底（図１１Ａ）；（２）２５分間後(図１１Ｂ)；及び（３）基底と自由循環バブルの控除後（図１１Ｃ）。
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、造影剤中にモノマーペプチド・リン脂質コンジュゲート（１）（図２に示す）を用いることによって得られたイメージを示す：基底（図１２Ａ）；２５分間後(図１２Ｂ)；及び基底と自由循環バブルの控除後（図１２Ｃ）。
【図１】
2009518448.tif 000032
【図２】
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【図３】
2009518448.tif 000034
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009518448.tif 000038
【図８】
2009518448.tif 000039
【図９】
2009518448.tif 000040
【図１０】
2009518448.tif 000041
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2009518448.tif 000043
【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
2009518448.tif 000045
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【国際調査報告】
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2009518448.tif 000049
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