(57)【要約】本発明は、ヒトＦｃＲｎに結合してＦｃＲｎへのＩｇＧのＦｃ部分の結合を阻害し、それにより、血清ＩｇＧレベルを調整するペプチドに関する。開示の組成物および方法を、例えば、自己免疫疾患および炎症性障害の治療で使用することができる。本発明はまた、本発明のペプチドの使用方法および作製方法に関する。本発明は、ＦｃＲｎに特異的に結合してＦｃＲｎへのＩｇＧ  Ｆｃの結合を阻害し、それにより、リソソームによる分解からＩｇＧを防御する役割でＦｃＲｎが機能するのを妨害することによってＩｇＧが再利用されるのを防止するペプチドを提供する。例示的実施形態では、ペプチドは、ＦｃＲｎに結合してＦｃのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのＦｃＲｎへの結合を阻害する。
2009527499.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃ部分の結合を阻害することができるペプチドであって、以下の配列：
−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−
（式中、
−Ｘ６は、正電荷アミノ酸、芳香族アミノ酸、正電荷芳香族アミノ酸、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ７は、フェニルアラニンおよびフェニルアラニンアナログから選択され、
−Ｘ８およびＸ９は、グリシン、サルコシン、アスパラギン酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノイソ酪酸、およびそのアナログからそれぞれ独立して選択されるか、Ｘ８は、Ｘ９と組み合わせた場合、ジペプチド模倣物を形成し、
−Ｘ１０は、アミノ酸およびそのアナログから選択されるか、Ｘ１０は、Ｘ９と組み合わせた場合、ジペプチド模倣物を形成し、
−Ｘ１１は、チロシンおよびチロシンアナログから選択される）
を含み、
ここで、該ペプチドは７〜５０アミノ酸長の範囲であり、該ペプチドはヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害する、ペプチド。
【請求項２】
配列：
Ｒ１−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｒ２
（式中、
−Ｒ１は、式：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−
を有し、
ここで、
−Ｘ１は、水素、アシル、およびアミノ酸保護基から選択され、
−Ｘ２は、存在しないか、アミノ酸、２〜１５アミノ酸長のペプチド、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ３は、存在しないか、Ｘ１０、Ｘ１２、またはＸ１３と架橋を形成することができるアミノ酸またはそのアナログから選択され、ここで、該架橋は、アミノ末端−カルボキシ末端架橋、側鎖−骨格架橋、および側鎖−側鎖架橋から選択され、
−Ｘ４は、存在しないか、アミノ酸、２〜１５アミノ酸長のペプチド、およびそのアナログから選択され、
−Ｒ２は、式：−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５
を有し、
ここで、
−Ｘ１２は、存在しないか、アミノ酸またはそのアナログであり、
−Ｘ１３は、存在しないか、アミノ酸またはそのアナログであり、
−Ｘ１４は、存在しないか、アミノ酸、２〜１５アミノ酸長のペプチド、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ１５は、アミノ基またはカルボキシ保護基である）
を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列：
Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｐｈｅ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｔｙｒ
を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが直鎖である、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ１０、Ｘ１２、またはＸ１３の少なくとも１つが、Ｘ３と架橋を形成することができるアミノ酸またはそのアナログであり、該架橋が、アミノ末端−カルボキシ末端架橋、側鎖−骨格架橋、および側鎖−側鎖架橋から選択される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ３が、Ｘ１０、Ｘ１２、またはＸ１３と架橋を形成する、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ３がＸ１０と架橋を形成する、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘ３がＸ１２と架橋を形成する、請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｘ３がＸ１３と架橋を形成する、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸の間に９個のアミノ酸が存在し、該アミノ酸が架橋を形成する、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記架橋がアミノ末端−カルボキシ末端架橋である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記架橋が側鎖−骨格架橋である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記架橋が側鎖−側鎖架橋である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記側鎖−側鎖架橋が、ジスルフィド架橋、エーテル架橋，チオエーテル架橋、アルケン架橋、またはアミド架橋である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記側鎖−側鎖架橋が、
−システインとシステインとの間、
−システインとホモシステインとの間、
−システインとペニシラミンとの間、
−ホモシステインとホモシステインとの間、
−ホモシステインとペニシラミンとの間、および
−ペニシラミンとペニシラミンとの間
のジスルフィド架橋である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記側鎖−側鎖架橋が、
−アスパラギン酸とリジンとの間、
−アスパラギン酸とオルニチンとの間、
−アスパラギン酸と２，４−ジアミノ酪酸との間、；
−アスパラギン酸と２，３−ジアミノプロピオン酸との間、
−グルタミン酸とリジンとの間、
−グルタミン酸とオルニチンとの間、
−グルタミン酸と２，４−ジアミノ酪酸との間、
−グルタミン酸と２，３−ジアミノプロピオン酸との間
のアミド架橋である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１７】
少なくとも１つのシステインを含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのシステインが、
−ホモシステイン、
−Ｄ−システイン、および
−ペニシラミン
から選択されるシステインアナログである、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
Ｘ８およびＸ９の少なくとも１つが、
−グリシン、
−Ｄ−アミノ酸、
−α−アミノイソ酪酸、および
−サルコシン
から選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２０】
Ｘ８は、Ｘ９と組み合わせて、
−β−アラニン、
−４−アミノブタン酸、
−５−アミノペンタン酸、
−３−（アミノメチル）安息香酸、
−４−（アミノメチル）安息香酸、
−３−（アミノフェニル）酢酸、
−４−（アミノフェニル）酢酸、および
【化１】
2009527499.tif 000046
−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸、
−（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸、
−（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン酢酸、
−（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸、
−（３Ｒ）−３−アミノ−１−カルボキシメチル−バレロラクタム、および
−３−アミノ−Ｎ−１−カルボキシメチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−［１］−ベンゾアゼピン−２−オンから選択されるジペプチド模倣物を形成する、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２１】
少なくとも１つのフェニルアラニンがフェニルアラニンアナログであり、それぞれの該少なくとも１つのフェニルアラニンアナログが、
−トリプトファン、
−チロシン、
−２−アミノフェニルアラニン、
−３−アミノフェニルアラニン、
−４−アミノフェニルアラニン、
−ペンタフルオロフェニルアラニン、
−２−ピリジルアラニン、
−３−ピリジルアラニン、
−４−ニトロフェニルアラニン、
−１−ナフチルアラニン、
−ホモフェニルアラニン、
−フェニルグリシン、
−２−メチルフェニルアラニン、
−３−メチルフェニルアラニン、
−４−メチルフェニルアラニン、
−２−クロロフェニルアラニン、
−３−クロロフェニルアラニン、
−４−クロロフェニルアラニン、
−３，３−ジフェニルアラニン、
−４，４’−ビフェニルアラニン、
−４−ｔ−ブチルフェニルアラニン、
−シクロヘキシルアラニン、
−（４−アミノアセチル）フェニルアラニン、
−Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、
−Ｄ−β−メチルフェニルアラニン、および
−Ｌ−β−メチルフェニルアラニン
から独立して選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２２】
少なくとも１つのチロシンがチロシンアナログであり、それぞれの該少なくとも１つのチロシンアナログが、
−フェニルアラニン、
−４−アミノフェニルアラニン、
−４−メトキシフェニルアラニン、
−ペンタフルオロフェニルアラニン、
−２−ピリジルアラニン、
−３−ピリジルアラニン、
−４−ピリジルアラニン、
−４−ニトロフェニルアラニン、
−２−ニトロチロシン、および
−４−フルオロフェニルアラニン
から独立して選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２３】
Ｘ９およびＸ１０が、組み合わされて、
−Ｄ，Ｌ−フリーディンガーラクタム
【化２】
2009527499.tif 000047
および
−Ｌ，Ｌ−フリーディンガーラクタム
【化３】
2009527499.tif 000048
から選択されるジペプチド模倣物を形成する、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２４】
少なくとも１つのヒスチジンがヒスチジンアナログであり、それぞれの該少なくとも１つのヒスチジンアナログが、
−２，４−ジアミノ酪酸、
−チアゾリルアラニン、
−２，３−ジアミノプロピオン酸、
−グアニルアラニン、
−２−ピリジルアラニン、
−３−ピリジルアラニン、
−４−ピリジルアラニン、
−チエニルアラニン、
−オルニチン、
−リジン、
−アルギニン、
−４−グアニルフェニルアラニン、
−１−メチルヒスチジン、
−３−メチルヒスチジン、
−１，３−ジメチルヒスチジン、
−４−アミノフェニルアラニン、
−２−ピロリジニルアラニン、
−３−ピペルジルアラニン、および
−４−ピペリジルアラニン
から独立して選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２５】
Ｘ２が、アミノ酸、２または３アミノ酸長のペプチド、およびそのアナログから選択される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項２６】
Ｘ６が、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、グアニルアラニン、およびそのアナログから選択される正電荷アミノ酸またはそのアナログである、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２７】
Ｘ６が、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびそのアナログから選択される芳香族アミノ酸またはそのアナログである、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２８】
Ｘ６が、ヒスチジン、１−メチルヒスチジン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、４−グアニルフェニルアラニン、チアゾリルアラニン、およびそのアナログから選択される正電荷芳香族アミノ酸である、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項２９】
Ｘ６が４−グアニルフェニルアラニンおよびそのアナログである、請求項２８に記載のペプチド。
【請求項３０】
Ｘ６が、ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−グアニルフェニルアラニン、およびそのアナログから選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項３１】
Ｘ６が、ヒスチジンおよびそのアナログから選択される、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
Ｘ１０が、中性および疎水性アミノ酸およびそのアナログから選択される、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項３３】
前記ペプチドが多量体である、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項３４】
前記ペプチドが、二量体、三量体、または四量体である、請求項３３に記載のペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドが二量体である、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３６】
ヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃ部分の結合を阻害することができるペプチドであって、
ａ）ＱＲＦＣＴＧＨＦＧＧＬＹＰＣＮＧＰ（配列番号１）、ＧＧＧＣＶＴＧＨＦＧＧＩＹＣＮＹＱ（配列番号２）、ＫＩＩＣＳＰＧＨＦＧＧＭＹＣＱＧＫ（配列番号３）、ＰＳＹＣＩＥＧＨＩＤＧＩＹＣＦＮＡ（配列番号４）、およびＮＳＦＣＲＧＲＰＧＨＦＧＧＣＹＬＦ（配列番号５）から選択されるアミノ酸配列、
ｂ）ａ）と実質的に同一であるアミノ酸配列、
ｃ）ａ）と８０％同一であるアミノ酸配列、
ｄ）ａ）と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの欠失変異、置換変異、または付加変異を有するアミノ酸配列、
ｅ）少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾されたａ）のアミノ酸配列であって、該少なくとも１つのアミノ酸が、天然に存在するアミノ酸に置換される、アミノ酸配列、
ｆ）少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾されたａ）のアミノ酸配列であって、該少なくとも１つのアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸およびそのアナログに置換される、アミノ酸配列、
ｇ）少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾されたａ）のアミノ酸配列であって、該少なくとも１つのアミノ酸が、Ｎ−メチル化アミノ酸に置換される、アミノ酸配列、
ｈ）少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾されたａ）のアミノ酸配列であって、該少なくとも１つのアミノ酸が、天然に存在しないアミノ酸に置換される、アミノ酸配列、および
ｉ）少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾されたａ）のアミノ酸配列であって、該少なくとも１つのアミノ酸が、アミノ酸模倣物に置換される、アミノ酸配列
を含み、
ここで、該ペプチドがヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害する、ペプチド。
【請求項３７】
前記ｃ）のアミノ酸配列が、ａ）と少なくとも９０％同一である、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
請求項３６に記載のペプチドを含む二量体。
【請求項３９】
前記二量体が、還元的アルキル化の生成物である、請求項３５または請求項３８に記載の二量体。
【請求項４０】
前記二量体が、各ペプチド単量体と多価リンカーとの間の反応生成物である、請求項３５または請求項３８に記載の二量体。
【請求項４１】
前記多価リンカーが、チオール酸リンカー、アルコールリンカー、およびアミンリンカーから選択される、請求項４０に記載の二量体。
【請求項４２】
前記ペプチドが三量体である、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４３】
前記ペプチドがヒトＦｃＲｎに特異的に結合する、請求項１、請求項２、または請求項３６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４４】
前記ヒトＦｃＲｎに対するペプチドの親和性が５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲である、請求項４３に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記ヒトＦｃＲｎに対するペプチドの親和性が５００ｆＭ〜１００μＭの範囲である、請求項４３に記載のペプチド。
【請求項４６】
前記ヒトＦｃＲｎに対するペプチドの親和性が５ｐＭ〜１μＭの範囲である、請求項４３に記載のペプチド。
【請求項４７】
前記ペプチドがヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害し、ＩＣ５０が５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲である、請求項１、請求項２、または請求項３６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４８】
以下の構造（配列番号３１９）：
【化４】
2009527499.tif 000049
を含むペプチド。
【請求項４９】
別の分子と共に請求項１、請求項２、または請求項３６のいずれか１項に記載のペプチドを含む融合物。
【請求項５０】
前記分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、トランスフェリン、および免疫グロブリンのＦｃ部分から選択される、請求項４９に記載の融合物。
【請求項５１】
前記分子が免疫グロブリンのＦｃ部分である、請求項５０に記載の融合物。
【請求項５２】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される、請求項５１に記載の融合物。
【請求項５３】
治療有効量の請求項１、請求項２、または請求項３６のいずれか１項に記載のペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項５４】
前記治療有効量のペプチドが、ペプチドでの処置前のヒトＩｇＧの血清濃度と比較して、ヒトＩｇＧの血清濃度を減少させることができる、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ヒトＩｇＧの血清濃度の減少が少なくとも５％である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ヒトＩｇＧの血清濃度の減少が少なくとも１５％である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ヒトＩｇＧの血清濃度の減少が少なくとも２５％である、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
細胞を治療有効量の請求項１、請求項２、または請求項３６のいずれか１項に記載のペプチドと接触させる工程を含む、病状の調節方法。
【請求項５９】
前記細胞がＦｃＲｎを発現する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＩｇＧの血清濃度の調整によって前記病状を調節する工程をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＩｇＧが治療タンパク質に特異的である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記治療タンパク質がエリスロポエチンである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＩｇＧが遺伝子治療ベクターに特異的である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記病状が、炎症性疾患、自己免疫疾患、および癌から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記自己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑（ａｔｐ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病−疱疹性皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ｃｆｌｄｓ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、瘢痕性類天疱瘡、ｃＲＥｓｔ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、デゴス病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状狼瘡、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（Ｉｔｐ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存型糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症（ｍＧ）、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、移植片拒絶、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記自己免疫疾患が、水疱性類天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、天疱瘡、および移植片拒絶から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記天疱瘡が尋常性天疱瘡である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記病状が炎症性疾患から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記炎症性疾患が、喘息、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患症候群、アレルギー（アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、皮膚アレルギー（蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）／蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ）、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎）、食物アレルギー、薬物アレルギー、昆虫アレルギーが含まれる）、肥満細胞症、関節炎（骨関節炎、関節リウマチ、および脊椎関節症が含まれる）から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記治療タンパク質が凝固因子である、請求項６１に記載の方法。
【請求項７１】
前記凝固因子が、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはフォンウィルブランド因子から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記凝固因子が第ＶＩＩＩ因子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
ＦｃＲｎの検出方法であって、請求項１、請求項２、または請求項３６のいずれか１項に記載のペプチドを放射性同位体、検出可能な生成物を有する酵素、フルオロフォア、化学発光化合物、磁性粒子、ミクロスフィア、ナノスフィア、ビオチン、ストレプトアビジン、およびジゴキシンから選択される検出可能な標識で標識する工程を含む、方法。
【請求項７４】
前記検出方法が診断キットを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ペプチド二量体の合成方法であって、固相ペプチド合成を行う第１の工程、該固相樹脂を２つの隣接ペプチドと反応して結合することができる分子で処理を行う第２の工程、および結合した該ペプチドを該樹脂から放出させる第３の工程を含む、方法。
【請求項７６】
ＦｃＲｎを精製する方法であって、
（ａ）請求項１、請求項２、または請求項３６のいずれか１項に記載のペプチドを固体支持体に固定する工程、
（ｂ）ＦｃＲｎを含む溶液を固体支持体上の固定ペプチドと接触させる工程、および
（ｃ）該固体支持体からの溶液の分離によってＦｃＲｎを精製する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権出願
本願は、２００６年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７７４，８５３号、および２００６年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／８０５，６３４号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、免疫調節薬分野に関する。より具体的には、本発明は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合して免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合を阻害し、それにより、血清ＩｇＧレベルを調整するペプチドに関する。本発明は、さらに、ＦｃＲｎが血清中のＩｇＧレベルの維持に関連する細胞機構で機能するのを防止することができるＦｃＲｎ活性のペプチドモジュレーター、かかるペプチドを含む薬物、およびかかる薬物の投与による血清中のＩｇＧレベルの低下によって緩和することができる疾患および障害を罹患した被験体の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血清中の最も豊富な抗体アイソタイプはＩｇＧであり、これは、病原体に対する防御の媒介ならびに組織、粘膜、および皮膚表面への免疫系成分の動員を促進するアレルギー反応および炎症反応の媒介で極めて重要な役割を果たす。Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６（１）：２９（１９９７）。さらに、ＩｇＧは、多様な自己免疫疾患の重要な成分でもある。
【０００４】
正常な条件下で、ＩｇＧの血清半減期は、他の血漿タンパク質の血清半減期に関連して延長される。例えば、ＩｇＧの血清半減期は、マウスで５〜７日であり、ヒトで２２〜２３日である。Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：３５２８（２００３）；Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５５１２（１９９６）。部分的には、ＩｇＧのこの長い半減期は、Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎへのその結合に起因する。ＦｃＲｎは、Ｆｃとして公知のＩｇＧの定常領域に結合する。ＦｃＲｎは、母親のＩｇＧの新生児輸送受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として最初に特徴づけられたが、成人でもＩｇＧを分解から防御するように機能する。ＦｃＲｎは、飲作用したＩｇＧに結合してＩｇＧを分解性リソソームから防御し、これを再利用して細胞外区画に戻す。Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５５１２（１９９６），Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：３５２８（２００３）。ＩｇＧの濃縮によって利用可能なＦｃＲｎを超えるレベルに達した場合、非結合ＩｇＧは分解機構から防御されず、最終的に血清半減期がより短くなる。Ｂｒａｍｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０３：１３５２（１９６４）。さらに、ＦｃＲｎが細胞表面上に発現するにもかかわらず、多くのＦｃＲｎは細胞内に存在し、小胞体膜に会合し、ＩｇＧが細胞に飲作用された後にＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用が細胞内で起こると考えられる。
【０００５】
構造的に、ＦｃＲｎは、ベータ（β）と呼ばれる１つの軽鎖およびアルファ（α）鎖と呼ばれる１つの非共有結合重鎖から構成されるヘテロ二量体として存在する。ＦｃＲｎの軽鎖（β２−ミクログロブリン（β２ｍ）としてより公知である）はまた、主要組織適合性遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）の成分である。ＦｃＲｎのα鎖は、３つのサブドメインα１、α２、およびα３に分類される細胞外ドメイン、膜貫通領域、および比較的短い細胞質テールから構成される４６ｋＤのタンパク質である。Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３６（１９９４）。
【０００６】
ＦｃＲｎは、新生児ラットの消化管中で最初に同定され、母乳からのＩｇＧ抗体の吸収を媒介し、循環系へのその輸送を促進するように機能する。Ｌｅａｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７：３３１７（１９９６）。ＦｃＲｎはヒト胎盤からも単離されており、胎児循環系への母親のＩｇＧの吸収および輸送を媒介する。成体では、ＦｃＲｎは、上皮組織中に発現される（米国特許第６，０３０，６１３号および同第６，０８６，８７５号）（肺（Ｉｓｒａｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９２：６９（１９９７））、腸および腎近位尿細管の上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）；Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８（２００２））、ならびに鼻、膣、および胆道系の表面などであるが、これらに限定されない）。さらに、内皮細胞上のＦｃＲｎの遍在性発現は、ＩｇＧホメオスタシスのその重要性を連想させる。Ｗａｒｄら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５（２）：１８７（２００２）；Ｇｈｅｔｉｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６：６９０（１９９６）。
【０００７】
一般に、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ部分への結合によるＩｇＧの異化の拮抗によって、ＩｇＧホメオスタシスで機能する。一旦飲作用されると、ＩｇＧは、細胞内液胞中に捕捉され、酸性初期エンドソームと融合し始める。結晶学的研究により、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体の化学量論は、２分子のＦｃＲｎに対して１分子のＩｇＧから構成され（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３６（１９９４））、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接触面付近のＩｇＧのＦｃ部分で２分子の結合が起こると考えられる（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９（１９９４））。エンドソーム融合事象は、リソソーム分解経路の１段階に相当し、これにより、エンドソーム内に含まれる複合生体分子が構成成分に分解または異化される。初期エンドソームの低ｐＨ環境により、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合およびＩｇＧに結合した任意の抗原の放出が促進される。その結果、抗原が分解され、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体の分解が回避され、最終的に、細胞表面に再循環し、細胞外環境の生理学的ｐＨにより、ＦｃＲｎからのＩｇＧの放出が促進される。
【０００８】
ＩｇＧホメオスタシスへのＦｃＲｎの寄与を研究するために、β２ｍおよびＦｃＲｎ重鎖をコードする遺伝子の少なくとも一部が「ノックアウト」され、その結果これらのタンパク質が発現されないようにマウスを操作した。ＷＯ０２／４３６５８；Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５５１２（１９９６）。これらの両ノックアウトマウス系統では、血清中のＩｇＧの半減期および濃度は劇的に減少し、ＦｃＲｎ依存機構がＩｇＧホメオスタシスに関連することが示唆される。
【０００９】
ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の阻害は、ＩｇＧ再利用の防止によってＩｇＧ血清半減期が減少する。したがって、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を遮断または拮抗する薬剤を、免疫反応に関与する障害（例えば、自己免疫疾患および炎症性疾患など）および不適切に発現したＩｇＧ抗体の存在によって特徴づけられる障害を調節、治療、または防止する方法で使用することができる。ＦｃＲｎへのＩｇＧのＦｃを遮断する方法の一例は、ＦｃＲｎに対する遮断抗体の生成を含む。実際、ＦｃＲｎのＩｇＧとの結合を遮断することができる抗体は、ＦｃＲｎ重鎖ノックアウトマウス系統を使用して生成されている（特許文献１）。最近、ＦｃＲｎ複合体に結合するペプチドが同定された。非特許文献１；特許文献２。しかし、現時点では、免疫反応によって特徴づけられる容態、疾患、および障害を調節、治療、または防止するために、さらなる薬剤が必要である。
【特許文献１】国際公開第０２／４３６５８号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，２１２，０２２号明細書
【非特許文献１】Ｋｏｌｏｎｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（２０）：１３０５５−６０（２００２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
したがって、本発明は、ＦｃＲｎに特異的に結合してＦｃＲｎへのＩｇＧ  Ｆｃの結合を阻害し、それにより、リソソームによる分解からＩｇＧを防御する役割でＦｃＲｎが機能するのを妨害することによってＩｇＧが再利用されるのを防止するペプチドを提供する。例示的実施形態では、ペプチドは、ＦｃＲｎに結合してＦｃのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのＦｃＲｎへの結合を阻害する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、以下の配列：
−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−
（式中、
−Ｘ６は、正電荷アミノ酸、芳香族アミノ酸、正電荷芳香族アミノ酸、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ７は、フェニルアラニンおよびフェニルアラニンアナログから選択され、
−Ｘ８およびＸ９は、グリシン、サルコシン、アスパラギン酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノイソ酪酸、およびそのアナログからそれぞれ独立して選択されるか、Ｘ８は、Ｘ９と組み合わせた場合、ジペプチド模倣物を形成し、
−Ｘ１０は、アミノ酸およびそのアナログから選択されるか、Ｘ１０は、Ｘ９と組み合わせた場合、ジペプチド模倣物を形成し、
−Ｘ１１は、チロシンおよびチロシンアナログから選択される）を含む。
【００１２】
あるいは、本発明のペプチドは、以下の配列：
Ｒ１−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｒ２
（式中、
−Ｒ１は、式：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−
を有し、
ここで、
−Ｘ１は、水素、アシル、およびアミノ酸保護基から選択され、
−Ｘ２は、存在しないか、アミノ酸、２〜１５アミノ酸長のペプチド、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ３は、存在しないか、Ｘ１０、Ｘ１２、またはＸ１３と架橋を形成することができるアミノ酸またはそのアナログから選択され、ここで、架橋は、アミノ末端−カルボキシ末端架橋、側鎖−骨格架橋、および側鎖−側鎖架橋から選択され、
−Ｘ４は、存在しないか、アミノ酸、２〜１５アミノ酸長のペプチド、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ６、−Ｘ７、−Ｘ８、−Ｘ９、−Ｘ１０および−Ｘ１１は上記定義の通りであり、
−Ｒ２は、式：−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５
を有し、
ここで、
−Ｘ１２は、存在しないか、アミノ酸またはそのアナログであり、
−Ｘ１３は、存在しないか、アミノ酸またはそのアナログであり、
−Ｘ１４は、存在しないか、アミノ酸、２〜１５アミノ酸長のペプチド、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ１５は、アミノ基またはカルボキシ保護基である）を含み得る。
【００１３】
本発明のペプチドは、典型的には、少なくとも７アミノ酸長且つ５０アミノ酸長までである。本発明のペプチドは、多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体など）として存在することができる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、飲作用により感受性が高く、より迅速にペプチドに結合することができ、その結果、腎臓による排出が少ない。本発明は、さらに、１つまたは複数の本発明のペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【００１４】
本発明のペプチドは、
ａ）ＱＲＦＣＴＧＨＦＧＧＬＹＰＣＮＧＰ（配列番号１）、ＧＧＧＣＶＴＧＨＦＧＧＩＹＣＮＹＱ（配列番号２）、ＫＩＩＣＳＰＧＨＦＧＧＭＹＣＱＧＫ（配列番号３）、ＰＳＹＣＩＥＧＨＩＤＧＩＹＣＦＮＡ（配列番号４）、およびＮＳＦＣＲＧＲＰＧＨＦＧＧＣＹＬＦ（配列番号５）から選択されるアミノ酸配列、
ｂ）１つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５と実質的に同一であるアミノ酸配列、
ｃ）１つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５と８０％同一であるアミノ酸配列、
ｄ）１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの欠失変異、置換変異、または付加変異を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５、
ｅ）少なくとも１つのアミノ酸が、天然に存在するアミノ酸に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５、
ｆ）少なくとも１つのアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸およびそのアナログに置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５、
ｇ）少なくとも１つのアミノ酸が、Ｎ−メチル化アミノ酸に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５、
ｈ）少なくとも１つのアミノ酸が、天然に存在しないアミノ酸に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５、および
ｉ）少なくとも１つのアミノ酸が、アミノ酸模倣物に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を含み得る。
【００１５】
本発明は、さらに、ＦｃＲｎに結合してＩｇＧ分子のＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合を防止することができる１つまたは複数の本発明のペプチドを含む治療有効量の組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体の血清中のＩｇＧレベルを調節する方法に関する。一定の実施形態では、本発明の方法を使用して、被験体の血清中の可溶性ＩｇＧの半減期を減少させる。本発明の組成物の投与により、被験体の血清中の可溶性ＩｇＧの半減期が、ペプチド投与前の被験体の血清中のＩｇＧの半減期と比較して減少する。
【００１６】
本発明は、さらに、治療前のＩｇＧの血清濃度と比較して、ＦｃＲｎに対するＩｇＧのＦｃ部分の血清濃度を減少させるＦｃＲｎへのヒトＩｇＧのＦｃ部分の結合を阻害する方法に関する。ＩｇＧの血清濃度を減少させる方法は、ＦｃＲｎに結合してＩｇＧ分子のＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合を防止することができる１つまたは複数の本発明のペプチドを含む治療有効量の組成物を被験体に投与する工程を含む。１つの実施形態では、ヒトＩｇＧの血清濃度の減少は、少なくとも５％（少なくとも１５％の減少または少なくとも２５％のヒトＩｇＧの血清濃度の減少など）である。
【００１７】
本発明の１つの実施形態は、ＦｃＲｎに結合してＩｇＧ分子のＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合を防止することができる１つまたは複数の本発明のペプチドを含む治療有効量の組成物を被験体に投与する工程を含む、少なくとも１つの自己免疫疾患を有する被験体を治療する方法を提供する。本発明の別の実施形態は、ＦｃＲｎに結合してＩｇＧ分子のＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合を防止することができる１つまたは複数の本発明のペプチドを含む治療有効量の組成物を被験体に投与することによって少なくとも１つの炎症性障害を有する被験体の治療する方法を提供する。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、治療タンパク質または遺伝子治療ベクターに対する免疫応答を防止、治療、または調節することができる。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態、目的、および利点を、以下の説明に記載し、説明からその一部が明らかとなるか、本発明の実施によって確認することができる。添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせを用いて、本発明のこれらの実施形態、目的、および利点を実現および達成することができる。
【００１９】
前述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が例示および説明のみを目的とし、特許請求の範囲に記載の発明を制限しないと理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
実施形態の説明
１．定義
「親和性」は、結合相互作用の強度を示す２つの生物活性分子間の結合相互作用の特徴をいう。親和性の測定値を、解離定数（ＫＤ）として報告する。ＫＤは、特定の条件下で生物学的に活性な分子がその結合パートナーともはや結合しなくなり始める（解離し始める）生物学的に活性な分子を含む溶液の濃度（通常、ｎＭ、ｐＭ、またはｆＭで報告する）である。親和性強度は、ＫＤ値と反比例する。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、カルボン酸基およびアミノ基を含む化合物をいう。例えば、アミノ酸は、構造式：Ｈ２Ｎ−［Ｃ（Ｒ）（Ｒ’）］ｎ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（式中、ｎは１以上の整数であり、ＲおよびＲ’は、水素およびアミノ酸側鎖から独立して選択され、ＲおよびＲ’は共に炭素環または複素環を形成することできる）を有し得る。例えば、ｎが１以上である場合、式Ｈ２Ｎ−［Ｃ（Ｒ）（Ｒ’）］−Ｃ（Ｏ）ＯＨのアミノ酸はαアミノ酸であり、ｎが２である場合、式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ１’）−Ｃ（Ｒ２）（Ｒ２’）−Ｃ（Ｏ）ＯＨのアミノ酸はβアミノ酸であり、ここで、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、およびＲ２’は、アミノ酸側鎖からそれぞれ独立して選択され、ＲおよびＲ’またはＲ２およびＲ２’は共に炭素環または複素環を形成することができる。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸残基」は、ペプチドまたはタンパク質の一部であり、式−Ｎ（Ｈ）−［Ｃ（Ｒ）（Ｒ’）］ｎ−Ｃ（Ｏ）−を有するアミノ酸をいう。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸側鎖」は、天然に存在するアミノ酸または合成アミノ酸由来の任意の側鎖をいう。例えば、メチルはアラニン側鎖をいうことができ、２−アミノ−１−エチルは、２，４−ジアミノブタン酸の側鎖をいうことができる。
【００２２】
アミノ酸は、任意のキラル原子にＲまたはＳキラリティーを有し得る。フィッシャー変換を使用して、αアミノ酸がキラルである場合、αアミノ酸のα炭素原子のキラリティーをＬまたはＤとして指定する。「Ｄ−アミノ酸」は、α炭素にＤ配置を有するアミノ酸である。特定の配置を示さない場合、当業者は、アミノ酸がＬ−アミノ酸であると理解するであろう。本明細書中に記載のアミノ酸はまた、ラセミ混合物、非ラセミ混合物、およびジアステレオマー混合物の形態であり得る。
【００２３】
例示的アミノ酸を、２０のコードアミノ酸およびそのアナログならびに、例えば、他のα−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸、およびω−アミノ酸から選択することができる。非コードアミノ酸は、ペプチド分野で周知である（Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１ｓｔ  ａｎｄ  ２ｎｄ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９８４）ａｎｄ（１９９３）およびＳｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．，（１９８４）に記載されている非コードアミノ酸など）。コードおよび非コードアミノ酸およびアミノ酸アナログを、例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈから購入するか、当該分野で公知の方法を使用して合成することができる。
【００２４】
アミノ酸を、例えば、アラニン、β−アラニン、α−アミノアジピン酸、２−アミノブタン酸、４−アミノブタン酸、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノヘプタン二酸、７−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、アミノメチルピロールカルボン酸、８−アミノ−３，６−ジオキサ−オクタン酸、アミノピペリジンカルボン酸、３−アミノプロピオン酸、アミノセリン、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アゼチジンカルボン酸、ベンゾチアゾリルアラニン、ブチルグリシン、カルニチン、４−クロロフェニルアラニン、シトルリン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルスタチン、システイン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジメチルチアゾリジンカルボン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ホモセリン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、イソニペコチン酸、ロイシン、リジン、メタノプロリン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｐ−アミノ安息香酸、ペニシラミン、フェニルアラニン、フェニルグリシン、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、プロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン、セレノシステイン、セリン、スタチン、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アロ−イソロイシン、アロ−トレオニン、２，６−ジアミノ−４−ヘキサン酸、２，６−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ジカルボキシジン（ｄｉｃａｒｂｏｘｉｄｉｎｅ）、ホモアルギニン、ホモシトルリン、ホモシステイン、ホモシスチン、ホモフェニルアラニン，ホモプロリン、および４−ヒドラジノ安息香酸から選択することができる。
【００２５】
アミノ酸は、通常、側鎖の性質によって以下の４つの群に分類される：酸性、塩基性、親水性（極性）、および疎水性（非極性）。本明細書中に記載のアミノ酸を、そのフルネームまたは対応する標準的な一文字表記もしくは三文字表記によって識別することができる。小文字の一文字表記を使用して、Ｄキラリティーを示す。
【００２６】
「アミノ酸アナログ」は、所与のアミノ酸と共通の化学的性質、電荷、立体的特性、または他の特性を共有するアミノ酸またはアミノ酸の小分子模倣物である。例えば、アラニンアナログには、例えば、β−アラニン、エチルグリシン、α−アミノイソ酪酸（ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｒｙｉｃ  ａｃｉｄ）、およびＤ−アラニンが含まれ、システインアナログには、例えば、ホモシステイン、Ｄ−システイン、およびペニシラミンが含まれ、フェニルアラニンアナログには、例えば、３−フルオロフェニルアラニン、４−メチルフェニルアラニン、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、および３，３−ジフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、２−ピロリジニルアラニン、３−ピペリジルアラニン、４−ピペリジルアラニンが含まれ、ヒスチジンアナログには、例えば、１−メチルヒスチジン、２，４−ジアミノ酪酸、チアゾリルアラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グアニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、チエニルアラニン、オルニチン、４−グアニルフェニルアラニン、および４−アミノフェニルアラニンが含まれる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ保護基」は、分子上のアミノ基の化学反応を防止する一方で、分子中の他の場所で化学的変化を起こすために使用することができる任意の置換基をいう。アミノ保護基を、適切な化学的条件下で除去することができる。多数のアミノ保護基が当業者に公知であり、アミノ保護基、その付加方法、およびその除去方法の例を、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１ｓｔ  ａｎｄ  ２ｎｄ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）ａｎｄ（１９９３）およびＳｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９８４）（その開示が、本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。用語「保護（一置換）アミノ」は、（一置換）アミノ窒素原子上にアミノ保護基が存在することを意味する。さらに、用語「保護カルボキシアミド」は、カルボキシアミド窒素上にアミノ保護基が存在することを意味する。かかるアミノ保護基の例には、ホルミル（「Ｆｏｒ」）基、トリチル基、フタルイミド基、トリクロロアセチル基、クロロアセチル、ブロモアセチル、およびヨードアセチル基、ウレタン型封鎖基（ｔ−ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、２−（４−ビフェニルイル）プロピル−２−オキシカルボニル（「Ｂｐｏｃ」）、２−フェニルプロピル−２−オキシカルボニル（「Ｐｏｃ」）、２−（４−キセニル）イソプロポキシカルボニル、１，１−ジフェニルエチル−１−オキシカルボニル、１，１−ジフェニルプロピル−１−オキシカルボニル、２−（３，５−ジメトキシフェニル）プロピル−２−オキシカルボニル（「Ｄｄｚ」）、２−（ｐ−トルイル）プロピル−２−オキシカルボニル、シクロペンタニルオキシカルボニル、１−メチルシクロペンタニルオキシカルボニル、シクロヘキサニルオキシカルボニル、１−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−（４−トルイルスルホニル）−エトキシカルボニル、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル、２−（トリフェニルホスフィノ）−エトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（「Ｆｍｏｃ」）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、１−（トリメチルシリルメチル）プロプ−１−エニルオキシカルボニル、５−ベンズイソキサリルメトキシカルボニル、４−アセトオキシベンジルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−エチニル−２−プロポキシカルボニル、シクロプロピルメトキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、１−ピペリジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（「Ｃｂｚ」）、４−フェニルベンジルオキシカルボニル、２−メチルベンジルオキシカルボニル、α−２��４，５，−テトラメチルベンジルオキシカルボニル（「Ｔｍｚ」）、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、４−フルオロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンジルオキシカルボニル、３−クロロベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、４−ブロモベンジルオキシカルボニル、３−ブロモベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル、４−シアノベンジルオキシカルボニル、４−（デシルオキシ）ベンジルオキシカルボニルなど；ベンゾイルメチルスルホニル基、ジチアスクシノイル（ｄｉｔｈｉａｓｕｃｃｉｎｏｙｌ）（「Ｄｔｓ」）、２−（ニトロ）フェニルスルフェニル基（「Ｎｐｓ」）、ジフェニル−ホスフィンオキシド基などのアミノ保護基が含まれる。例えば、アミノ保護基を、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、およびＦｍｏｃから選択することができる。誘導体化アミノ基がその後の反応条件に対して安定であり、且つ適切な時点で化合物の残存物を妨害することなく除去することができる限り、種々のアミノ保護基のうちの１つを超えるアミノ保護基を使用することができる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「芳香族」は、一、二、または他の多炭素環式芳香族環系をいう。芳香族基を、任意選択的に、芳香族化合物、シクロアルキル、およびヘテロシクリルから選択される１つまたは複数の環に融合することができる。芳香族化合物は、５〜１４個の環員（例えば、５〜１０個の環員など）を有することができる。１つまたは複数の水素原子を、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アルケニル、アルコキシ、アルキル、アルキニル、アミノ、芳香族、アリールオキシ、アジド、カルバモイル、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、カルボキシアミノ、シアノ、シクロアルキル、二置換アミノ、ホルミル、グアニジノ、ハロ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシ、イミノアミノ、一置換アミノ、ニトロ、オキソ、ホスホンアミノ、スルフィニル、スルホンアミノ、スルホニル、チオ、チオアシルアミノ、チオウレイド、およびウレイドから選択される置換基に置換することもできる。芳香族基の制限されない例には、フェニル、ナフチル、インドリル、ビフェニル、およびアントラセニルが含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「芳香族アミノ酸」は、芳香環構造を含む側鎖を有するアミノ酸である。芳香族アミノ酸には、例えば、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、および４−ピリジルアラニンが含まれる。
【００３０】
「カルボキシ保護基」は、カルボン酸基を封鎖または保護しながら化合物上の他の官能基に対して反応させるために一般的に使用されるカルボン酸基のエステル誘導体の１つをいう。かかるカルボン酸保護基の例には、ｔ−ブチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２，４，６−トリメトキシベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、ペンタメチルベンジル、３，４−メチレンジオキシベンジル、ベンズヒドリル、４，４’−ジメトキシトリチル、４，４’，４’’−トリメトキシトリチル、２−フェニルプロピル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェナシル、２，２，２−トリクロロエチル、β−（トリメチルシリル）エチル、β−（ジ（ｎ−ブチル）メチルシリル）エチル、ｐ−トルエンスルホニルエチル、４−ニトロベンジルスルホニルエチル、アリル、シンナミル、１−（トリメチルシリルメチル）−プロペニルなどの部分が含まれる。誘導体化カルボン酸がその後の反応条件に対して安定であり、且つ適切な時点で化合物の残存物を妨害することなく除去することができる限り、使用されるカルボキシ保護基種は重要ではない。これらの基のさらなる例は、Ｅ．Ｈａｓｌａｍ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３），Ｃｈａｐｔｅｒ  ５およびＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ−Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１），Ｃｈａｐｔｅｒ  ５に見出される。関連用語「保護カルボキシ」は、上記カルボキシ保護基の１つに置換されたカルボキシ基をいう。
【００３１】
「結合する」、「結合」、および「結合した」は、２つの分子の立体的および化学的相補性に依存するポリペプチドと別の生物学的に活性な分子との間の非共有結合性相互作用をいう。ポリペプチドの立体的および化学的相補性は、特定のアミノ酸配列によって決定される。
【００３２】
「生物学的に活性な分子」は、生物学的状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）（例えば、生物、細胞、またはそのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル）における機能もしくは作用、または機能、作用、もしくは反応に対する刺激もしくは応答によって疾患または病体を治療することができるペプチド、核酸、および／または小分子（有機小分子または無機小分子など）ならびにそのフラグメントをいう。
【００３３】
「架橋」は、ペプチド中の２つの非隣接アミノ酸、アミノ酸アナログ、または他の化学的部分の間の共有結合をいう。架橋は、例えば、骨格−骨格架橋、側鎖−骨格架橋、または側鎖−側鎖架橋であり得る。架橋を、新規のアミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アルケン結合、またはジスルフィド結合が形成される環状化反応によって調製することができる。骨格−骨格架橋は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端でのラクタムの形成に起因する。
【００３４】
「環状ペプチド」は、２つの非隣接アミノ酸を架橋する細胞内結合を有するペプチドをいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語ペプチド「二量体」は、同一または異なり得る第１および第２のペプチド鎖を含む分子である。二量体は、さらに、２つのペプチドが共有結合する少なくとも１つの任意選択的なリンカーを含み得る。
【００３６】
「ジペプチド模倣物」は、例えば、グリシルグリシンなどのジペプチドと構造的に類似している（例えば、実質的に等比体積であるか、実質的に類似の位置または方向を有する）。ジペプチド模倣物は、上記の構造上の制限が認識される限り、結合分子の任意の組み合わせを含むことができる。ジペプチド模倣物は、例えば、当該分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）−ＣＯＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される架橋に任意選択的に置換される１つまたは複数のペプチド架橋を有することができる。当業者は、ジペプチド模倣物には、例えば、β−ターン模倣物も含まれると認識するであろう。例えば、Ｒ．Ｍ．Ｆｒｉｅｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５５５３−５５６６（２００３）およびＳ．Ｈａｎｅｓｓｉａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３：１２７８９−１２８５４（１９９７）を参照のこと。
ジペプチド模倣物の制限されない例には、
【００３７】
【化５】
2009527499.tif 000003
【００３８】
【化６】
2009527499.tif 000004
−（３Ｓ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸および（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸、
−（３Ｓ）−３−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン酢酸および（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン酢酸、
−（３Ｓ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸および（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸、
−（３Ｒ）−３−アミノ−１−カルボキシメチル−バレロラクタム、ならびに
−３−アミノ−Ｎ−１−カルボキシメチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−［１］−ベンゾアゼピン−２−オンが含まれる。
【００３９】
用語「ジスルフィド架橋」は、酸化の際に２つのアミノ酸（例えば、システイン、ペニシラミン、およびホモシステインなど）のスルフヒドリル（すなわち、チオールまたはメルカプタン）基の間に形成された共有結合をいう。ジスルフィド架橋は、同一の線状ペプチド中に含まれる２つのアミノ酸を架橋し、それにより、線状ペプチドを環状化することができる。ジスルフィド架橋を、２ペプチド間に形成し、ペプチド二量体を生成することもできる。
【００４０】
「ドメイン」は、いくつかの個別の物理的特徴または役割を有するペプチド領域であり、例えば、ペプチド鎖の１つの区分から構成される独立して折り畳まれた構造が含まれる。ドメインは、同一または異なる別のドメインに結合することができる。ドメインは、ペプチドの個別の物理的特徴を有する配列を含むことができるか、その結合特性（すなわち、第２のドメインに結合することができる）を保持する物理的特徴を有するフラグメントを含むことができる。
【００４１】
「有効用量」、「有効量」、および「治療有効量」などは、所望の生理学的変化、薬理学的変化、および／または認知変化を得るのに十分な薬剤の量をいい、この量は、患者、疾患、および治療に応じて変化し得る。この量は、特定の障害を有すると考えられる被験体の治療のための用量（この場合、障害または容態の症状を十分に緩和または改善すべきである）または予防用量（この場合、被験体の症状の出現を部分的または完全に防止するのに十分であるべきである）のいずれかであり得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「融合」は、本発明のペプチドと別の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子、ポリマー（ポリエチレングリコールまたはポリサッカリド）、または核酸であり得る）との間の共有結合性の抱合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をいう。ペプチド−小分子融合物またはペプチド−ポリマー融合物を合成によって調製することができるのに対して、ペプチド−タンパク質融合物またはペプチド−ペプチド融合物を、化学的抱合（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）または適切な宿主細胞中での発現によって調製することができる。
【００４３】
用語「調整する」、「調整（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、および「調整（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、活性ペプチドレベルの増加または減少をいう。直接または間接的に調整することができる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「多量体」は、同一または異なり得る複数のペプチド鎖を含む分子をいう。多量体は、さらに、少なくとも２つのペプチドが共有結合する少なくとも１つの任意選択的なリンかーをさらに含むことができる。多量体は、例えば、二量体、三量体、または四量体であり得る。リンカーは、例えば、ビス−チオールリンカー、トリス−チオールリンカー、テトラチオールリンカー、ジカルボン酸リンカー、トリカルボン酸リンカー、テトラカルボン酸リンカー、アミンリンカー、トリアミンリンカー、またはテトラアミンリンカーであり得る。
【００４５】
用語「ペプチド」は、アミド結合によって直線的にカップリングしたアミノ酸（例えば、ＬおよびＤアミノ酸が含まれる）を含む分子をいう。ペプチドは、さらに、アミノ酸誘導体または非アミノ酸部分（例えば、ジペプチド模倣物など）を含むことができる。本発明のペプチドは、例えば、２〜１００、５〜３０、７〜５０、１０〜３０、または１０〜５０アミノ酸長（これを含む）（例えば、１１〜３５アミノ酸長など）の範囲であり得る。ペプチドは、さらに、修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化，リン酸化，ＰＥＧ化，脂質化，または有機分子もしくは無機分子との抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）など）を含むことができる。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「正電荷」は、ｐＨ６を超える（例えば、ｐＨ６〜８、６〜９、７〜８、または７〜９など）正電荷のアミノ酸、アミノ酸模倣物、または化学的部分をいう。例えば、正電荷アミノ酸には、リジン、アルギニン、および２，４−ジアミノ酪酸が含まれる。
【００４７】
用語「正電荷芳香族アミノ酸」は、ｐＨ６を超える（例えば、ｐＨ６〜８、６〜９、７〜８、または７〜９など）正電荷のアミノ酸をいう。例えば、正電荷芳香族アミノ酸には、ヒスチジン、４−アミノフェニルアラニン、および４−グアニルフェニルアラニンが含まれる。
【００４８】
所与の配列と「実質的に同一の」アミノ酸配列は、例えば、所与の配列と、少なくとも６０％、６４％、７０％、７５％、７６％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９４％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。このアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の短縮、欠失、置換、または付加によって所与の配列から誘導することができ、そして／または、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸が、付加、欠失、または置換によって所与の配列と異なり得る。
【００４９】
「治療する」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患または容態の重症度または持続時間の減少、疾患または容態に関連する１つまたは複数の症状の改善、疾患または容態を罹患した被験体への有益な効果の提供をいい、必ずしも疾患または容態を治癒したり、疾患または容態を防止したりするわけではない。
【００５０】
ペプチド「三量体」は、同一または異なり得る第１、第２、および第３のペプチド鎖を含む分子である。ペプチド三量体は、さらに、少なくとも２つのペプチドが共有結合する少なくとも１つの任意選択的なリンカーをさらに含み得る。
【００５１】
ＩＩ．本発明のペプチド
本発明のペプチドを、ＦｃＲｎに対する相対的親和性およびＩｇＧのＦｃ部分がＦｃＲｎに結合するのを遮断する能力に基づいて評価した。ＦｃＲｎに結合し、そして／またはＩｇＧのＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合を遮断する能力を示すペプチドは、一定の配列の共通点または特徴を共有する。したがって、本発明の１つの実施形態は、ヒト新生児型Ｆｃ受容体へのヒトＩｇＧのＦｃ部分の結合を阻害することができるペプチドであって、以下の配列：
−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−
（式中、
−Ｘ６は、正電荷アミノ酸、芳香族アミノ酸、正電荷芳香族アミノ酸、およびそのアナログから選択され、
−Ｘ７は、フェニルアラニンおよびフェニルアラニンアナログから選択され、
−Ｘ８およびＸ９は、グリシン、サルコシン、アスパラギン酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノイソ酪酸、およびそのアナログからそれぞれ独立して選択されるか、Ｘ８は、Ｘ９と組み合わせた場合、ジペプチド模倣物を形成し、
−Ｘ１０は、アミノ酸およびそのアナログから選択されるか、Ｘ１０は、Ｘ９と組み合わせた場合、ジペプチド模倣物を形成し、
−Ｘ１１は、チロシンおよびチロシンアナログから選択される）を含む、ペプチドを提供する。
【００５２】
一定の実施形態では、ペプチドは７〜５０アミノ酸長の範囲であり、ヒトＦｃＲｎに結合してＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害する。
【００５３】
１つの例示的実施形態では、本発明のペプチドは、配列：
Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｐｈｅ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｔｙｒ
を含む。
【００５４】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、式：
Ｒ１−Ｇｌｙ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｒ２
（式中、
−Ｒ１は、式：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−
を有し、
ここで、
−Ｘ１は、水素、アシル、およびアミノ酸保護基から選択され、
−Ｘ２は、存在しないか、アミノ酸および２〜１５アミノ酸長のペプチドから選択され、
−Ｘ３は、存在しないか、Ｘ１０、Ｘ１２、またはＸ１３と架橋を形成することができるアミノ酸から選択され、ここで、架橋は、アミノ末端−カルボキシ末端架橋、側鎖−骨格架橋、および側鎖−側鎖架橋から選択され、
−Ｘ４は、存在しないか、アミノ酸および２〜１５アミノ酸長のペプチドから選択され、
−Ｘ６、−Ｘ７、−Ｘ８、−Ｘ９、−Ｘ１０、および−Ｘ１１は、上記定義の通りであり、
−Ｒ２は、式：−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５
を有し、
ここで、
−Ｘ１２は、存在しないかアミノ酸であり、
−Ｘ１３は、存在しないかアミノ酸であり、
−Ｘ１４は、存在しないか、アミノ酸および２〜１５アミノ酸長のペプチドから選択され、
−Ｘ１５は、アミノ基またはカルボキシ保護基である）によって示すことができる。
【００５５】
本発明のペプチドを定義するために使用される場合、用語「アミノ酸」には、アミノ酸アナログが含まれる。
【００５６】
１つの実施形態では、Ｘ６は、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、グアニルアラニン、およびそのアナログから選択される正電荷アミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ６は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびそのアナログから選択される芳香族アミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ６は、ヒスチジン、１−メチルヒスチジン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、４−グアニルフェニルアラニン、チアゾリルアラニン、およびそのアナログから選択される正電荷芳香族アミノ酸である。別の実施形態では、Ｘ６は４−グアニルフェニルアラニンである。別の実施形態では、Ｘ６は、ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−グアニルフェニルアラニン、およびそのアナログから選択される。
【００５７】
例示的ヒスチジンアナログは、ジアミノ酪酸、チアゾリルアラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グアニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、チエニルアラニン、オルニチン、４−グアニルフェニルアラニン、１−メチルヒスチジン、４−アミノフェニルアラニン、２−ピロリジニルアラニン、３−ピペルジルアラニン、および４−ピペリジルアラニンから選択されるが、これらに限定されない。
【００５８】
例示的フェニルアラニン誘導体は、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、２−メチルフェニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、４−メチルフェニルアラニン、２−クロロフェニルアラニン、３−クロロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、３，３−ジ−フェニルアラニン、４，４−ビフェニルアラニン、４−ｔ−ブチルフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、（４−アミノアセチル）−フェニルアラニン、Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、Ｄ−βメチルフェニルアラニン、およびＬ−βメチルフェニルアラニンから選択することができるが、これらに制限されない。
【００５９】
１つの実施形態では、Ｘ１０は、中性アミノ酸、疎水性アミノ酸、ならびにそのアナログから選択される。
【００６０】
１つの実施形態では、Ｘ２は、２または３アミノ酸長のアミノ酸およびペプチドから選択される。１つの実施形態では、Ｘ２は、少なくとも１つの疎水性アミノ酸を含む。別の実施形態では、Ｘ２は、カルボキシ末端のアミノ酸が疎水性アミノ酸である２〜１５アミノ酸長のアミノ酸またはペプチドである。
【００６１】
１つの実施形態では、Ｘ４は、カルボキシ末端アミノ酸がＮ−メチル化されている２〜１５アミノ酸長のアミノ酸またはペプチドである。
【００６２】
１つの実施形態では、ペプチドはリンカーである。別の実施形態では、Ｘ１０、Ｘ１２、またはＸ１３の少なくとも１つが、Ｘ３と架橋を形成することができるアミノ酸であり、架橋が、アミノ末端−カルボキシ末端架橋、側鎖−骨格架橋、および側鎖−側鎖架橋から選択される。１つの実施形態では、架橋は、側鎖−側鎖架橋であり、ジスルフィド架橋、エーテル架橋、チオエーテル架橋、アルケン架橋、またはアミド架橋であり得る。
【００６３】
１つの実施形態では、側鎖−側鎖架橋は、システインとシステインとの間、システインとホモシステインとの間、システインとペニシラミンとの間、ホモシステインとホモシステインとの間、ホモシステインとペニシラミンとの間、またはペニシラミンとペニシラミンとの間のジスルフィド架橋である。別の実施形態では、側鎖−側鎖架橋は、アスパラギン酸とリジンとの間、アスパラギン酸とオルニチンとの間、アスパラギン酸と２，４−ジアミノ酪酸との間、アスパラギン酸と２，３−ジアミノプロピオン酸との間、グルタミン酸とリジンとの間、グルタミン酸とオルニチンとの間、グルタミン酸と２，４−ジアミノ酪酸との間、またはグルタミン酸と２，３−ジアミノプロピオン酸との間のアミド架橋である。
【００６４】
１つの実施形態では、ペプチドは、ホモシステイン、Ｄ−システイン、およびペニシラミンから選択される少なくとも１つのシステイン（例えば、Ｘ３）またはシステインアナログを含む。
【００６５】
１つの実施形態では、Ｘ８およびＸ９の少なくとも１つはＤ−アミノ酸であるか、グリシン、α−アミノイソ酪酸、およびサルコシンから選択される。
【００６６】
１つの実施形態では、Ｘ８は、Ｘ９と組み合わせて、
−β−アラニン、
−４−アミノブタン酸、
−５−アミノペンタン酸、
−３−（アミノメチル）安息香酸、
−４−（アミノメチル）安息香酸、
−３−（アミノフェニル）酢酸、
−４−（アミノフェニル）酢酸、
【００６７】
【化７】
2009527499.tif 000005
−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸、
−（３Ｓ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸および（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸、
−（３Ｓ）−３−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン酢酸および（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン酢酸、
−（３Ｓ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸および（３Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸、
−（３Ｒ）−３−アミノ−１−カルボキシメチル−バレロラクタム、および
−３−アミノ−Ｎ−１−カルボキシメチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−［１］−ベンゾアゼピン−２−オンから選択されるジペプチド模倣物を形成する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、トリプトファン、チロシン、２−アミノフェニルアラニン、３−アミノフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、２−メチルフェニルアラニン、３−メチルフェニルアラニン、４−メチルフェニルアラニン、２−クロロフェニルアラニン、３−クロロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、３，３−ジフェニルアラニン、４，４’−ビフェニルアラニン、４−ｔ−ブチルフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、（４−アミノアセチル）フェニルアラニン、Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−Ｓ−カルボン酸、Ｄ−β−メチルフェニルアラニン、およびＬ−β−メチルフェニルアラニンから選択される少なくとも１つのフェニルアラニンアナログを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、フェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、４−メトキシフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、２−ニトロチロシン、および４−フルオロフェニルアラニンから選択される少なくとも１つのチロシンアナログを含む。
【００７０】
１つの実施形態では、Ｘ９およびＸ１０が、組み合わされて、
−Ｄ，Ｌ−フリーディンガーラクタム（Ｆｒｉｅｄｉｎｇｅｒ’ｓ  ｌａｃｔａｍ）
【００７１】
【化８】
2009527499.tif 000006
および
−Ｌ，Ｌ−フリーディンガーラクタム
【００７２】
【化９】
2009527499.tif 000007
から選択されるジペプチド模倣物を形成する。
【００７３】
一定の実施形態では、本発明のペプチドは、２，４−ジアミノ酪酸、チアゾリルアラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、グアニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、チエニルアラニン、オルニチン、リジン、アルギニン、４−グアニルフェニルアラニン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、１，３−ジメチルヒスチジン、４−アミノフェニルアラニン、２−ピロリジニルアラニン、３−ピペルジルアラニン、および４−ピペリジルアラニンから選択される少なくとも１つのヒスチジンアナログを含む。
【００７４】
一定の実施形態では、架橋を形成するアミノ酸の間のアミノ酸数は、６〜１２の範囲である。他の実施形態では、架橋を形成するアミノ酸の間に８個または９個のアミノ酸が存在する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも７アミノ酸長および５０アミノ酸長ほどである。他の実施形態では、ペプチドは、１１〜３５アミノ酸長である。
【００７６】
一定の実施形態では、本発明のペプチドは、多量体（二量体、三量体、または四量体など）として存在する。多量体のペプチドは、同一または異なり得る。
【００７７】
１つの実施形態では、ペプチドは、二量体（還元的アルキル化の生成物である二量体など）である。別の実施形態では、二量体は、個別のペプチド単量体と多価リンカーとの間の反応生成物である。１つの実施形態では、多価リンカーは、チオールリンかー、酸リンカー、アルコールリンカー、およびアミンリンカーから選択される。別の実施形態では、二量体は、アルキル化反応（例えば、チオールおよびアルキルハライドのアルキル化反応など）の生成物である。
【００７８】
１つの実施形態では、実施例１５に記載のように、ペプチドを樹脂上で合成し、次いで、多価リンカー（例えば、酸またはアミン多価リンカーなど）との反応によって多量体化（例えば、二量体化）する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも２つの上記修飾を含む。
【００８０】
一定の実施形態では、本発明のペプチドは、
ａ）ＱＲＦＣＴＧＨＦＧＧＬＹＰＣＮＧＰ（配列番号１）、ＧＧＧＣＶＴＧＨＦＧＧＩＹＣＮＹＱ（配列番号２）、ＫＩＩＣＳＰＧＨＦＧＧＭＹＣＱＧＫ（配列番号：３）、ＰＳＹＣＩＥＧＨＩＤＧＩＹＣＦＮＡ（配列番号４）、およびＮＳＦＣＲＧＲＰＧＨＦＧＧＣＹＬＦ（配列番号５）から選択されるアミノ酸配列、および
ｂ）１つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５と少なくとも６４％、少なくとも７０％、少なくとも７６％、少なくとも８２％、少なくとも８８％、少なくとも９４％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも１つまたは５つもの欠失、置換、または付加変異を有する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を含むことができる。本発明の全てのペプチドは、ＩｇＧへのヒトＦｃＲｎの結合を阻害する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を含むことができる。一定の実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸が天然に存在するアミノ酸に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸がＤ−アミノ酸に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を有することができる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸がＮ−メチル化アミノ酸に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸が天然に存在しないアミノ酸に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を有し得る。一定の実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸がアミノ酸模倣物に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換によって修飾された配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を有し得る。
【００８３】
あるいは、本発明のペプチドは、ＦｃＲｎに結合し、それにより、ＩｇＧ分子のＦｃ部分へのＦｃＲｎの結合を阻害することができる表１から選択されたアミノ酸配列を含むことができる。本発明は、さらに、表１に列挙した配列の変異型（ｖａｒｉａｎｔ）を含むペプチドを含む。この変異型には、短縮（少なくとも１つの表１のペプチドと少なくとも６８％、７２％、７６％、８０％、８４％、８８％、９２％、または９６％同一のペプチド）が含まれるが、これらに限定されない。変異型には、アミノ酸が、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはアミノ酸模倣物に置換された、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む表１に列挙した配列を含むペプチドが含まれる。
【００８４】
表１
【００８５】
【表１】
2009527499.tif 000008
１つの実施形態では、本発明のペプチドは、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える保存的アミノ酸置換を有する、表１に列挙したアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える天然に存在するアミノ酸に置換された、表１に列挙したアミノ酸配列を含むことができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える天然に存在しないアミノ酸に置換された、表１に列挙したアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、１、２、３、４、５、６，またはそれを超えるＮ−メチル化アミノ酸に置換された、表１に列挙したアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、１、２、３、４、５、６、またはそれを超えるＤ配置のアミノ酸に置換された、表１に列挙したアミノ酸配列を含むことができる。さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、１、２、３、４、５、６、またはそれを超えるアミノ酸模倣物に置換された、表１に列挙したアミノ酸配列を含むことができる。
【００８７】
本発明の例示的実施形態を以下に提供する。これらの実施形態の多くは、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように修飾された表１に列挙したアミノ酸配列を含む。これらの実施形態は適切な置換の例を提供する一方で、ペプチドの生物活性を破壊しない他の置換が本発明に含まれることを理解すべきである。
【００８８】
１つの例示的実施形態では、本発明のペプチドは、６位でのシステインからペニシラミンへの置換および１２位でのグリシンからサルコシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含む（アミノ酸の位置は、配列番号６のアミノ酸ナンバリングに基づく）。別の実施形態では、ペプチドは、６位でのシステインからペニシラミンへの置換および１３位でのロイシンからＮ−メチルロイシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、６位でのシステインからペニシラミンへの置換、１１位および１２位の両グリシンのそれぞれ１つの（３Ｒ）−アミノ−１−カルボキシメチル−２−バレロラクタムへの置換、および１３位でのロイシンからＮ−メチルロイシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含むことができる。
【００９０】
１つの実施形態では、本発明のペプチドは、６位でのシステインからペニシラミンへの置換、１２位でのグリシンからサルコシンへの置換、および１３位でのロイシンからＮ−メチルロイシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、６位でのシステインからペニシラミンへの置換、１１位および１２位の両グリシンのそれぞれ１つの（３Ｒ）−アミノ−１−カルボキシメチルカプロラクタムへの置換、および１３位でのロイシンからＮ−メチルロイシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含むことができる。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明のペプチドは、６位でのシステインからペニシラミンへの置換、９位でのヒスチジンから３−ピリジルアラニンへの置換、１２位でのグリシンからサルコシンへの置換、および１３位でのロイシンからＮ−メチルロイシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、６位でのシステインからペニシラミンへの置換、９位でのヒスチジンから４−グアニルフェニルアラニンへの置換、１２位でのグリシンからサルコシンへの置換、および１３位でのロイシンからＮ−メチルロイシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含むことができる。さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、６位でのシステインからペニシラミン（ｐｅｎａｃｉｌｌａｍｉｎｅ）への置換、９位でのヒスチジンから４−ピリジルアラニンへの置換、１２位でのグリシンからサルコシンへの置換、および１３位でのロイシンからＮ−メチルロイシンへの置換によって修飾された配列番号６のアミノ酸配列を含むことができる。
【００９２】
一定の実施形態では、本発明のペプチドは、多量体（二量体、三量体、または四量体など）として存在し得る。多量体のペプチドは、同一または異なり得る。ペプチドを、上記および下記の実施例に記載のように多量体化することができる。
【００９３】
１つの実施形態では、ＦｃＲｎに対する本発明のペプチドの親和性は、５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲の値のＫＤによって示されるであろう。別の実施形態では、本発明のペプチドの親和性は、５０ｆＭ〜１００μＭの範囲の値、５０ｆＭ〜１ｎＭの範囲の値、または１ｐＭ〜１ｎＭの範囲の値で示されるであろう。別の実施形態では、少なくとも１つの本発明のペプチドを含む組成物は、ＩｇＧの血清濃度を調整するであろう。１つの実施形態では、本発明のペプチドは、ＩｇＧ定常領域とも特異的に相互作用するＦｃＲｎの少なくとも１つのアミノ酸への結合によって、ＩｇＧ定常領域のＦｃＲｎへの結合を遮断することができる。
【００９４】
ＩＩＩ．本発明のペプチドの作製方法
１．一般的な本発明のペプチドの合成方法
本発明のペプチドを、当該分野で周知の技術を使用して合成することができる。例えば、完全に天然に存在するアミノ酸から構成される本発明のペプチドを、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、細胞中で組換えによって合成することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと。あるいは、本発明のペプチドを、固相合成などの公知の合成方法を使用して合成することができる。合成技術は、当該分野で周知である。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．ｐｐ．３３５−６１（１９７３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｄａｖｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４（１９８５）；Ｆｉｎｎら，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｄ  ｅｄ．）２：１０５（１９７６）；Ｅｒｉｋｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｄ  ｅｄ．）２：２５７（１９７６）を参照のこと。Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｄｓ．Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）および米国特許第３，９４１，７６３号に記載のように、標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕプロトコールを使用することができる。あるいは、本発明のキメラタンパク質を、組換え方法と合成方法との組み合わせを使用して合成することができる。一定の適用では、組換え方法、合成方法、または組換え方法と合成方法との組み合わせのいずれを使用することが有利であり得る。
【００９５】
２．本発明のペプチドのペプチドアナログの合成方法。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、２０種の従来のアミノ酸およびその略称は、慣習適用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ（１９９１）を参照のこと。従来の２０種のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸（α−、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、乳酸、および他の非慣習的アミノ酸も、本発明のポリペプチドに適切な成分であり得る。非慣習的アミノ酸には、以下が含まれる：アミノイソ酪酸、３−アミノ−１−カルボキシメチルバレロラクタム、４−グアニル−フェニルアラニン、５−アミノペンタン酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ペニシラミン、サルコシン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で使用される、ポリペプチド表記法では、標準的な使用法および慣習にしたがって、左側がアミノ末端であり、右側がカルボキシ末端である。
【００９７】
保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができ、この残基は、典型的には、生物系における合成よりもむしろ化学的ペプチド合成によって組み込まれる。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転形態または逆位形態が含まれる。
【００９８】
天然に存在する残基を、一般的な側鎖の性質に基づいて以下のクラスに分類することができる。
【００９９】
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１００】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの別のクラスとの交換を含み得る。
【０１０１】
かかる変化では、一定の実施形態にしたがって、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性および電荷の特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。指標を以下に示す：イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）。
【０１０２】
タンパク質への生物学的相互作用機能の付与におけるアミノ酸疎水性親水性指標の重要性は、当該分野で理解されている。Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１（１９８２）。一定のアミノ酸を類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換することができ、且つ依然として類似の生物活性を保持することが公知である。疎水性親水性指標に基づいた変化では、一定の実施形態では、その疎水性親水性指標が±２内であるアミノ酸置換を含める。一定の実施形態では、±１以内のアミノ酸を含め、一定の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸を含める。
【０１０３】
特に、作製された生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドを特定のタンパク質標的への結合で使用することを意図する場合、同類のアミノ酸の置換を、親水性に基づいて有効に行うことができることも当該分野で理解される。
【０１０４】
以下の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいた変化では、一定の実施形態では、その親水性値が±２以内のアミノ酸であるアミノ酸の置換を含め、一定の実施形態では、±１以内のアミノ酸を含め、一定の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸を含める。
【０１０５】
当業者は、周知の技術を使用して、本明細書中に記載のポリペプチドの適切な変異型を決定することができるであろう。一定の実施形態では、当業者は、活性に重要であると考えない領域のターゲティングによって活性を破壊することなく補充することができる分子の適切な領域を同定することができる。一定の実施形態では、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定することができる。一定の実施形態では、生物活性または構造に重要であり得る領域でさえ、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換に供することができる。
【０１０６】
さらに、当業者は、活性または構造に重要な類似のペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を再検討することができる。かかる比較を考慮して、類似のペプチド中の活性または構造に重要なアミノ酸に相当するペプチド中のアミノ酸の重要性を予想することができる。当業者は、かかる予想される重要なアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸の置換を選択することができる。
【０１０７】
当業者はまた、類似のペプチド中の構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析することができる。当業者は、所望の各アミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含む試験変異型を生成することができる。次いで、変異型を、当業者に公知の活性アッセイを使用してスクリーニングすることができる。かかる変異型を使用して、適切な変異形に関する情報を収集することができる。例えば、特定のアミノ酸残基の変化によって活性が破壊されるか、望ましくなく減少するか、不適切になることを発見した場合、かかる変化を有する変異型を回避することができる。言い換えれば、かかる日常的試験から収集した情報に基づいて、当業者は、単独または他の変異と組み合わせたさらなる置換を回避すべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１０８】
一定の実施形態によれば、アミノ酸置換は、以下：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少し、（２）酸化に対する感受性を減少し、（３）生物機能に関連する結合親和性を変化させ、そして／または（４）かかるポリペプチドに対して他の物理化学的性質または機能的性質を付与または修飾するアミノ酸置換であり得る。一定の実施形態によれば、単一または複数のアミノ酸置換（一定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列に行うことができる（一定の実施形態では、ドメインの外側のポリペプチドの一部に行い、分子内接触を形成することができる）。一定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造特性を実質的に変化させないかもしれない（例えば、置換アミノ酸は、親配列で起こるヘリックスの損傷または親配列を特徴づける他の二次構造型を破壊する傾向があるべきではない）。当該分野で認識されているペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【０１０９】
一定の実施形態では、アミノ酸誘導体は、共有結合性の修飾（ポリマー、脂質、または他の有機部分もしくは無機部分との化学結合が含まれるが、これらに限定されない）を含む。一定の実施形態では、化学修飾された特異的結合剤は、化学修飾されていない特異的結合剤より長い循環半減期を有し得る。一定の実施形態では、化学修飾された特異的結合剤は、所望の細胞、組織、および／または器官に対して改善されたターゲティング能力を有し得る。一定の実施形態では、誘導体特異的結合剤は、１つまたは複数の水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールが含まれるが、これらに限定されない）を結合するように共有結合性に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、および同第４，１７９，３３７号を参照のこと。一定の実施形態では、特異的結合剤の誘導体は、１つまたは複数のポリマー（モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールが含まれるが、これらに限定されない）およびかかるポリマーの混合物を含む。
【０１１０】
３．本発明のペプチドアナログの合成方法
ペプチドアナログは、テンプレートペプチドに類似の性質を有する非ペプチド薬として製薬産業で一般に使用されている。これらの非ペプチド化合物型は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｙ）」と命名されている。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）（本明細書中で参考として援用される）。かかる化合物は、しばしば、コンピュータ化した分子モデリングを使用して構築される。治療的に有用なペプチドに構造が類似のペプチド模倣物を使用して、類似の治療効果または予防効果を得ることができる。一般に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的性質または薬理学的活性を有するが（ヒト抗体など）、当該分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合に任意選択的に置換される１つまたは複数のペプチド結合を有するポリペプチド）に構造が類似している。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の同型のＤ−アミノ酸への体系的置換（例えば、Ｄ−リジンへのＬ−リジンの置換）を使用して、一定の実施形態では、より安定なペプチドを生成することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異型を含む制約されたペプチドを、当業者に公知の方法（例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基の付加など）によって生成することができる（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）（本明細書中で参考として援用される）。
【０１１１】
ペプチドの二量体化またはオリゴマー化により、所与の受容体に対するペプチド配列のアビディティを増大することができる。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１２：９３９（１９９７）を参照のこと。本発明のペプチドの二量体およびより高次の多量体を、当該分野で周知の種々の方法を使用して合成することができることが想定される。二量体または多量体を、連続ペプチド配列として、自動化ペプチド合成機によって直接合成することができる。あるいは、ペプチド多量体を、多価リンカー部分との各ペプチド単量体との反応によって合成することができる。例えば、Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３０（１９９４）を参照のこと。別の例として、「多抗原ペプチド」（ＭＡＰ）の合成などのペプチド配列の合成前の分岐リンカー基の組み込みによってペプチド多量体を合成することができる。Ｄ．Ｐｏｓｎｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７１９（１９８８）。本発明は、これらのペプチド二量体の新規の形成方法を提供し、この方法は、固相樹脂ビーズ上の隣接するペプチドが相互に反応して、ペプチドＮ末端に連結された二量体を形成するように、ペプチドのＮ末端を樹脂上でリンカー分子（例えば、コハク酸など）と反応させる工程を含む。その後の樹脂からの切断により、Ｎ末端結合ペプチド二量体が得られる。
【０１１２】
４．本発明のペプチドの発現のための発現ベクターの構築
本発明のペプチドをコードする核酸を、当該分野で公知の標準的方法（例えば、自動化ＤＮＡ合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販の合成機など））によって合成することができる。さらなる核酸合成方法が当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，０１５，８８１号、同第６，２８１，３３１号、同第６，４６９，１３６号を参照のこと。本発明のペプチドの組換え産生のために、ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメント、ＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入する。本発明のペプチドをコードする核酸を、ベクターの適切な読み枠中に挿入する。
【０１１３】
形質転換で使用されるベクターは、通常、形質転換体を同定するために使用される選択マーカーを含むであろう。細菌系では、これには、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれ得る。培養哺乳動物細胞中で用いる選択マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含む。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。１つの増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子またはＤＨＦＲ  ｃＤＮＡである。Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２４９５（１９８３）。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ（１９８６））によって概説されており、選択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。選択マーカーを、目的の遺伝子として細胞中の個別のプラスミドに同時に導入することもできるか、同一プラスミドに導入することができる。同一プラスミドで選択マーカーおよび目的の遺伝子が、異なるプロモーターまたは同一のプロモーターの調節下にあり得る場合、後者の配置により、バイシストロン性メッセージが得られる。この構築物型は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第４，７１３，３３９号）。
【０１１４】
発現系中の発現エレメントは、その強度および特異性で変化する。使用する宿主／ベクターに応じて、多数の適切な転写および翻訳エレメント（構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターが含まれる）のいずれかを、発現ベクターで使用することができる。例えば、細菌系でクローニングする場合、λバクテリオファージのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、およびｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用することができる。昆虫細胞系でクローニングする場合、バキュロウイルス多面体プロモーターなどのプロモーターを使用することができる。植物細胞系でクローニングする場合、植物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を使用することができる。哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用することができる。発現構築物の複数のコピーを含む細胞株を生成する場合、ＳＶ４０、ＢＰＶ、およびＥＢＶベースのベクターを、適切な選択マーカーと共に使用することができる。
【０１１５】
植物発現ベクターを使用する場合、線状または非環状化形態の目的のキメラタンパク質をコードする配列の発現を、多数のプロモーターによって駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４（１９８４））またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１（１９８７））を使用することができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０（１９８４）；Ｂｒｏｇｌｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３（１９８４））または熱ショックプロモーター（例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５（１９８６））を使用することができる。これらの構築物を、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入、エレクトロポレーションなどを使用して、植物細胞に導入することができる。Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）およびＧｒｉｅｒｓｏｎ＆Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９（１９８８）。
【０１１６】
目的のキメラタンパク質を産生するために使用することができる１つの昆虫発現系では、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多汗症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。このウイルスは、ヨトウガ細胞中で成長する。コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えば、多面体遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多面体プロモーター）の調節下におくことができる。コード配列の首尾のよい挿入により、多面体遺伝子が不活化され、非閉塞性（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイルス（すなわち、多面体遺伝子によってコードされるタンパク質コートを欠くウイルス）が産生される。次いで、これらの組換えウイルスを使用して、ヨトウガ細胞に感染させ、挿入遺伝子を発現させる（例えば、Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４（１９８３）；米国特許第４，２１５，０５１号を参照のこと）。この発現系のさらなる例を、Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆Ｗｉｌｅｙ  ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）に見出すことができる。
【０１１７】
本発明のペプチドを発現するために使用することができる別の系は、「ＧＳ発現系」とも呼ばれるグルタミン合成酵素遺伝子発現系である（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  ＰＬＣ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ  ＵＫ）。この発現系は、米国特許第５，９８１，２１６号に詳述されている。
【０１１８】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を使用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体（例えば、後期プロモーターおよび三者間（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）への挿入により、感染宿主中で生存可能であり、且つペプチドを発現することができる組換えウイルスが得られる。例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５５（１９８４）を参照のこと。ワクシニア７．５Ｋプロモーターも使用することができる。例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：７４１５（１９８２）；Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７（１９８４）；Ｐａｎｉｃａｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７（１９８２）を参照のこと。
【０１１９】
５．適切な標的細胞中での本発明のペプチドの発現
発現ビヒクルを、適切な標的細胞にトランスフェクションまたは同時トランスフェクションして、本発明のポリペプチドを発現することができる。当該分野で公知のトランスフェクション技術には、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １４：７２５（１９７８））、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯ，Ｊ．１：８４１（１９８２））、およびリポソームベースの試薬が含まれるが、これらに限定されない。種々の宿主発現系を使用して、本明細書中に記載のキメラタンパク質を発現することができる（原核細胞および真核細胞の両方が含まれる）。これらには、適切なコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌）などの微生物、適切なコード配列を含む組換え酵母または真菌発現ベクターで形質転換された酵母または糸状菌、適切なコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染された昆虫細胞系、適切なコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）に感染されたか、組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、動物細胞系（哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ細胞）が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
６．本発明のペプチドを含む融合分子の合成方法
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、本発明のペプチドおよび融合パートナーを含む融合タンパク質として存在する。１つの実施形態では、融合パートナーは、１つまたは複数の半減期の延長、安定性、本発明のペプチドの輸送の増強などの性質を付与し、そして／またはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効率を強化することができる。
【０１２１】
さらに、本発明の非相同ポリペプチドを、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせて、キメラポリペプチドを得ることができる。これらの特定の融合分子は、精製を容易にし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の増加が認められる。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質で認められる。欧州特許第０  ３９４  ８２７号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）。ＩｇＧ部分に起因するジスルフィド結合した二量体構造を有する融合分子は、いくつかの場合、例えば、単量体ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントのみよりも他の分子の結合および中和で有効であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。
【０１２２】
本発明は、上記の任意のペプチドの融合分子をコードするポリヌクレオチドも提供する。このポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの転写のための調節配列も含むベクターの一部であり得る。本発明は、さらに、上記の任意の融合分子、任意のこれらのペプチドの融合分子をコードするポリヌクレオチド、または任意のこれらのペプチドの融合分子をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの転写のための調節配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、なおさらに、任意の融合分子または上記ヌクレオチド、および／または上記の任意のベクターまたは宿主細胞、ならびに緩衝液または薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【０１２３】
ａ．抗体Ｆｃドメインを含む融合物
１つの実施形態では、本発明のペプチドを、ＩｇＧのＦｃドメインと抱合して、その循環半減期を増加させることができる。一定の実施形態では、ペプチドを、Ｆｃドメインに共有結合する。Ｆｃ免疫グロブリンドメインを含むキメラタンパク質を組換えおよび半合成的に作製する方法は、当業者に周知である。例えば、アルデヒドをペプチド誘導体に組み込み、ＦｃのＮ末端に選択性のある還元的アルキル化反応を使用して、Ｆｃタンパク質と反応させることができる。Ｋｉｎｓｔｌｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５４：４７７（２００２）。あるいは、ペプチドチオエーテルを、Ｎ末端システイン残基を保有するＦｃと反応させることができる。Ｄａｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：９２３（２０００）。
【０１２４】
かかるペプチド−Ｆｃ融合誘導体は、Ｆｃドメインを介したＦｃＲｎのさらなる２つの結合部位の付加によってＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断する能力が増加し得る。かかるペプチド−Ｆｃ融合物はまた、ペプチド分解を防御し、それにより、ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ効率を増強することができる。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５）に記載のように、ＩｇＧ部分に起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、本発明のペプチドよりも他の分子に対する結合および中和に高い効率を示し得る。
【０１２５】
本発明のペプチドがＩｇＧ  Ｆｃドメインとの融合タンパク質の一部である実施形態では、ヒトＩｇＦｃは、ヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４など）のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むことができる。米国特許第６，９００，２９２号に記載のように、本発明はまた、本発明のペプチドおよび変異Ｆｃポリペプチドまたは変異Ｆｃポリペプチドのフラグメントを含む融合分子であって、変異ＦｃがＰｒｏ３３１Ｓｅｒ変異したヒトＩｇＧ２のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む、融合分子を提供する。
【０１２６】
本発明のペプチドとの抱合に適切なＦｃドメインには、そのエフェクター効果（抗体依存性細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性が含まれる）を弱めるためにＦｃ領域の選択された位置に変異アミノ酸を有するＦｃドメインが含まれる。例えば、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ変異を有するＦｃγ２変異型は、天然のＦｃγ２よりも補体活性が低く、ＦｃγＲに結合しない。ＩｇＧ４  Ｆｃは、補体カスケードの活性化を欠き、ＦｃγＲに対する結合親和性は、もっとも活性なアイソタイプＩｇＧ１の結合親和性よりも約一桁低い。１つの実施形態では、本発明のペプチドを、天然のＦｃγ４と比較して最小のエフェクター機能を示すＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を有するＦｃγ４変異型に抱合する。別の実施形態では、本発明のペプチドを、天然のＦｃγ１よりも低いエフェクター機能も示すＬｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ、およびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ変異を有するＦｃγ１変異型に抱合する。
【０１２７】
ｂ．アルブミンを含む融合物
一定の実施形態では、本発明のペプチドを、アルブミン結合部分に抱合することができる。かかるアルブミン結合部分−ペプチド抱合物は、より長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有することができ、したがって、所望の治療効果を達成するためにより低いペプチド用量しか必要としない。Ｃｈｕａｎｇら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９：５６９（２００２）；米国特許第６，６８５，１７９号。したがって、本発明の１つの実施形態は、アルブミン、アルブミンの１つまたは複数のフラグメント、アルブミンに結合するペプチド、および／またはアルブミンに結合した脂質または他の分子と抱合する分子を含むアルブミン融合パートナーと共に本発明のペプチドを含む融合分子を提供する。
【０１２８】
アルブミンを含む融合タンパク質の作製方法は、当該分野で公知である。例えば、疎水性芳香族キャッピング試薬によって修飾されたペプチドは、アルブミンと非共有結合し、ウサギ中のペプチドの半減期を延長することが示されている。Ｚｏｂｅｌら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１３：１５１３（２００３）。別の例として、チオール反応基で修飾したペプチドは、血清アルブミン上の単一の遊離システイン残基に共有結合することが示されている。Ｋｉｍら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：７５１（２００３）。
【０１２９】
ｃ．ペグ化部分を有する融合物
１つの実施形態では、本発明のペプチドを、モノまたはポリ（例えば、２〜４）ＰＥＧ部分を含むようにペグ化することができる。当該分野で公知の任意のペグ化反応によってペグ化を行うことができる。ペグ化タンパク質生成物の調製方法は、一般に、（ａ）本発明のペプチドが１つまたは複数のＰＥＧ基に結合するようになる条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程を含む。一般に、至適な反応条件を、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて、個別に決定する。
【０１３０】
当業者が利用可能なＰＥＧ結合方法は多数存在し、例えば、欧州特許第０  ４０１  ３８４号；Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：１０２８−１０３５（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０（１９９２）；欧州特許第０  １５４  ３１６号；欧州特許第０  ４０１  ３８４号；ＷＯ９２／１６２２１号；およびＷＯ９５／３４３２６号に記載されている。例えば、本発明のペプチドのペグ化工程を、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。
【０１３１】
したがって、本発明のペプチドには、１つまたは複数のＰＥＧ基がアシル基またはアルキル基を介して結合したペグ化ペプチドが含まれる。かかるペプチドを、モノペグ化またはポリペグ化することができる（例えば、２〜６個または２〜５個のＰＥＧ基を含むペプチド）。ＰＥＧ基を、一般に、アミノ酸のα−またはε−アミノ基でペプチドに結合するが、ＰＥＧ基を、適切な反応条件下でＰＥＧ基に結合するようになるのに十分に反応性を示すペプチドの任意のアミノ基に結合することができることも意図される。
【０１３２】
アシル化によるペグ化は、一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性エステル誘導体と本発明のペプチドとの反応を含む。アシル化反応のために、選択されるポリマーは、典型的には、単一の反応性エステル基を有する。任意の公知またはその後に発見された反応性ＰＥＧ分子を使用して、ペグ化反応を行うことができる。適切な活性化ＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧである。本明細書中で使用される場合、アシル化には、本発明のペプチドとＰＥＧなどのポリマーとの間の以下の結合型が含まれることが意図されるが、これらに限定されない：アミド、カルバマート、およびウレタンなど。例えば、Ｃｈａｍｏｗ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：１３３−１４０（１９９４）を参照のこと。反応条件を、ペグ化分野で公知の任意の条件またはその後に開発された条件から選択することができるが、本発明のペプチドを不活化する温度、溶媒、およびｐＨなどの条件を回避すべきである。
【０１３３】
アシル化によるペグ化により、一般に、本発明のポリペグ化ペプチドが得られる。結合基はアミドであり得る。得られた生成物を、実質的に（例えば、９５％超）、モノ、ジ、またはトリペグ化のみ行うことができる。しかし、使用した特定の反応条件に応じて、より高いペグ化度を有するいくつかの種を形成することができる。必要に応じて、より精製されたペグ化種を、標準的な精製技術（特に、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、および電気泳動が含まれる）によって混合物（特に、未反応種）から分離することができる。
【０１３４】
アルキル化によるペグ化は、還元剤の存在下でＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を本発明のペプチドと反応させる工程を含む。還元的アルキル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水安定性を示すポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドまたはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である。例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと。
【０１３５】
７．生物学的に発現した本発明のペプチドの精製
使用した発現系に応じて、発現した本発明のペプチドを、当該分野で十分に確立された手順（例えば、アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ）によって単離する。
【０１３６】
発現ベクターは、組換えによって産生されたキメラタンパク質を容易に精製可能なタグをコードすることができる。例には、ハイブリッドタンパク質が産生されるように本発明のペプチドをコードするＤＮＡをｌａｃ  ｚコード領域とインフレームでベクターにライゲーションするベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））が含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグとの本発明のキメラタンパク質を発現することができる。これらのタンパク質は、通常可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着およびその後の遊離グルタチオンの存在下での溶離によって細胞から容易に精製することができる。ベクターは、精製後にタグを容易に除去するための切断部位（トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼまたはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎ．Ｊ．））を含む。
【０１３７】
生成効率を増加させるために、酵素切断部位によって分離された複数の本発明のペプチド単位をコードするようにポリヌクレオチドをデザインすることができる。得られたポリペプチドを切断して（例えば、適切な酵素での処理による）、ペプチド単位を回収することができる。これにより、単一のプロモーターによって駆動されるペプチドの収率を増加させることができる。適切なウイルス発現系で使用する場合、ｍＲＮＡによってコードされる本発明の各ペプチドの翻訳を、例えば、配列内リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって転写物内で内部的に指示する。したがって、多シストロン性構築物は、単一の巨大な多シストロン性ｍＲＮＡの転写を指示し、それにより、複数の各ポリペプチドの翻訳を指示する。このアプローチは、ポリタンパク質の産生および酵素的プロセシングを排除し、単一プロモーターによって駆動される本発明のペプチドの収率を有意に増加させることができる。
【０１３８】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を、適切な成長培地（すなわち、細胞成長に必要な栄養素を含む培地）中で成長させることができる。細胞成長に必要な栄養素には、炭素源、窒素源、必須アミン酸、ビタミン、ミネラル、および成長因子が含まれ得る。任意選択的に、培地は、仔ウシ血清またはウシ胎児血清を含むことができる。１つの実施形態では、培地は、実質的にＩｇＧを含まない。成長培地は、一般に、例えば、ＤＮＡ構築物上の選択マーカーによって補完されるかＤＮＡ構築物と同時トランスフェクションされる薬物選択性または必須栄養素の欠乏によってＤＮＡ構築物を含む細胞を選択する。培養した哺乳動物細胞を、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ）中で成長させる。使用した特定の細胞株に適切な培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。
【０１３９】
本発明のペプチドを、トランスジェニック動物（外来遺伝子をそのゲノムに組み込んだげっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、または他の非ヒト動物など）中で産生することができる。この遺伝子が生殖系列組織中に存在するので、この遺伝子は親から子孫へ受け継がれる。外因性遺伝子を、単細胞胚に導入する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８，１９８５）。トランスジェニック動物の産生方法は、当該分野で公知であり、免疫グロブリン分子を産生するトランスジェニック動物が含まれる。Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３７６（１９８１）；ＭｃＫｎｉｇｈｔら，Ｃｅｌｌ  ３４：３３５（１９８３）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：３３２（１９８３）；Ｒｉｔｃｈｉｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１７（１９８４）；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：８３１（２００３）；Ｒｏｂｌら，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：１０７（２００３）；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅら，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０（３）：２６７（２００３）。
【０１４０】
８．ＦｃＲｎに結合してＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用を遮断するペプチドをスクリーニングおよび発見する方法
ＦｃＲｎへのペプチド結合を、ファージディスプレイライブラリーを使用して同定することができる。ファージディスプレイライブラリーを、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．８７：３９１（１９９７）に記載のように容易に生成することができる。あるいは、ファージディスプレイライブラリーを、供給元（例えば、Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）など））から得ることができる。スクリーニング条件に応じて、種々の異なる性質を有するファージを同定することができる。ＦｃＲｎに結合する（したがって、ＩｇＧとＦｃＲｎ結合を競合する）ペプチドを同定するために、ＦｃＲｎへの結合およびＩｇＧとの競合についてファージライブラリーをスクリーニングすることができる。任意選択的に、ファージライブラリーの１つまたは複数の別の受容体とのインキュベーションによって別の受容体に結合するペプチドをライブラリーから排除することができる。したがって、別の受容体に結合したファージは、所望のファージプールから枯渇するであろう。ＦｃＲｎに結合することができるファージクローンのＤＮＡの配列決定により、ＦｃＲｎに結合してＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合を阻害することができるペプチドを同定することができる。
【０１４１】
ＦｃＲｎ結合ペプチドを同定するための他の方法の例には、以下が含まれる：ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７（１９９７）、細胞ベースのディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３（１９９７）、および合成ペプチドライブラリー（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４（１９９１））。
【０１４２】
９．ＦｃＲｎに結合してＩｇＧ：ＦｃＲｎ相互作用を遮断するペプチドのアッセイ方法
多数の方法を使用して、ペプチドまたはペプチド模倣物がＦｃＲｎに結合してＦｃＲｎ：ＩｇＧ相互作用を遮断する能力を評価することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、結合事象を評価するための当該分野で周知の方法である（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。この方法を使用して、一方の結合パートナー（ＦｃＲｎまたはＩｇＧ）を、ＳＰＲセンサチップ上に固定し、他方の結合パートナーがチップ上を通過し、得られたシグナルをモニタリングする。同一実験では、ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用の競合物質として評価すべきペプチドが、チップ上を通過する。シグナルの任意の減少を、ペプチドがＦｃＲｎとＩｇＧとの間の相互作用を遮断する能力の指標と解釈することができる。
【０１４３】
ＩｇＧ：ＦｃＲｎ相互作用の可能性のあるペプチドインヒビターの他のアッセイ方法も、当該分野で周知である。かかる方法の１つは、９６ウェルプレート形式でのＩｇＧ競合アッセイである。この例示的アッセイでは、９６ウェルプレート上の可溶性ヒトＦｃＲｎを、ＩｇＧおよび試験ペプチドに曝露する。抗ＩｇＧ抗体および標準的ＥＬＩＳＡ視覚化試薬によって検出された残存する結合ＩｇＧにより、ペプチドがＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用を遮断する能力の指標が得られる。
【０１４４】
ヒトＦｃＲｎをコードするＤＮＡでトランスフェクションした細胞においてもペプチドがＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合を遮断する能力を果たし、その細胞表面上でヒトＦｃＲｎを発現することができる細胞株を開発することができる。ＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合のペプチドインヒビターが蛍光標識されたＩｇＧ分子と競合する結合競合アッセイを適用することができる。細胞に結合した残存ＩｇＧレベルを、例えば、標準的な蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して測定することができる。
【０１４５】
ｄ．本発明のペプチドの使用
本発明のペプチドは、ＦｃＲｎに結合してＩｇＧ定常領域のＦｃ部分のＦｃＲｎへの結合を阻害し、それにより、本発明のペプチドの非存在下でのＩｇＧの異化と比較してＩｇＧの異化が増加する。例示的実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスに由来する。特定の実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４サブクラスに由来する。したがって、本発明のペプチドは、ＩｇＧの異化の増加が望ましい任意の疾患または容態の治療に有用である。例えば、本発明のペプチドを使用して、自己免疫疾患、炎症性障害、炎症が病因の心血管疾患（例えば、動脈硬化）、移植片拒絶、および／または移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を治療することができる。本発明のペプチドを使用して、患者または生体サンプル（例えば、体液、組織または細胞サンプル、細胞培養物上清）中のＦｃＲｎを検出することもできる。本発明のペプチドを使用して、生体サンプル（例えば、体液、組織または細胞サンプル、細胞培養物上清）からＦｃＲｎを精製することもできる。
【０１４６】
したがって、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドを投与する工程を含む、不適切に発現したＩｇＧ抗体または望ましくない量またはレベルのＩｇＧによって特徴づけられる病状を調節する方法を提供する。１つの実施形態では、病態は、炎症性疾患、自己免疫疾患、および癌から選択される。他の実施形態では、本発明は、ＩｇＧの血清濃度の調整による病態の調節方法を提供する。一定の実施形態では、本発明の方法を使用して、治療タンパク質（例えば、エリスロポエチン、リソソーム蓄積酵素、または凝固因子（例えば、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはフォンウィルブランド因子など）など）に対する免疫反応を、治療、防止、または調節することができる。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、遺伝子治療ベクターに対する免疫反応を治療、防止、または調節することができる。
【０１４７】
１．自己免疫疾患
本発明のペプチドを使用して、自己免疫疾患（円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病−疱疹性皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、デゴス病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状狼瘡、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存型、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症（ＭＧ）、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、移植片拒絶、潰瘍性大腸炎ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない）を治療することができる。
【０１４８】
１つの実施形態では、自己免疫疾患は、水疱性類天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、および移植片拒絶から選択される。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明のペプチドを、免疫抑制のためのステロイドと組み合わせて使用することができる。
【０１５０】
２．炎症性障害
本発明のペプチドを使用して、炎症性障害（喘息、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患症候群、アレルギー（アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、皮膚アレルギー（蕁麻疹／蕁麻疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎）、食物アレルギー、薬物アレルギー、昆虫アレルギーが含まれる）、肥満細胞症、関節炎（骨関節炎、関節リウマチ、および脊椎関節症が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない）を治療することができる。
【０１５１】
３．治療タンパク質の投与が必要な疾患または容態
頻繁に、治療タンパク質の投与を必要とする疾患または容態では、被験体は、治療タンパク質に対して抗体を構築し、それにより、治療タンパク質のその意図する治療目的での利用を妨害する。したがって、本発明のペプチドを治療タンパク質と組み合わせて使用して、ＩｇＧレベル（ＩｇＧ抗体は、治療タンパク質の生物学的利用能の減少を担う）の減少によって治療タンパク質の利点を強化することができる。
【０１５２】
したがって、１つの実施形態は、細胞を治療有効量の本明細書中に開示の任意のペプチドを接触させる工程であって、凝固因子が、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、またはフォンウィルブランド因子から選択される、接触させる工程を含む、凝固因子に対する免疫応答に起因する容態、疾患、または障害を調節、治療、または防止する方法を提供する。この方法を使用して、例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂを罹患した患者における凝固因子に対する免疫応答を調節、治療、または防止することができる。１つの実施形態では、本発明のペプチドは、第ＶＩＩＩ因子インヒビターを遮断する。別の実施形態では、本方法を使用して、例えば、真性赤血球系無形成（ＰＲＣＡ）を罹患した患者における治療エリスロポエチンに対する免疫応答を調節、治療、または防止することができる。
【０１５３】
４．遺伝子療法を必要とする疾患または容態
疾患または容態の治療のための遺伝子療法の首尾のよい実施の障害となるものには、導入遺伝子によってコードされる治療タンパク質に特異的な抗体の構築および導入遺伝子の送達に使用されるベクターも含まれる。したがって、本発明のペプチドを遺伝子療法と組み合わせて投与して、ＩｇＧレベルの減少によってコードされる治療タンパク質の利点を強化することができる。これらの方法は、特に、ＩｇＧ抗体が遺伝子療法ベクターまたはコードされる治療タンパク質の生物学的利用能の減少を担う状況で有用である。遺伝子療法ベクターは、例えば、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターであり得る。遺伝子療法を使用して治療することができる疾患には、嚢胞性線維症、血友病、ＰＲＣＡ、筋ジストロフィ、またはリソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病およびファブリー病など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
５．ＦｃＲｎのｉｎ  Ｖｉｖｏ画像化および検出
本発明のペプチドを、ＦｃＲｎを検出するためのアッセイで使用することもできる。いくつかの実施形態では、アッセイは、本発明のペプチドのＦｃＲｎとの結合を検出する結合アッセイである。これらのアッセイでは、ＦｃＲｎまたは本発明のペプチドのいずれかを固定することができ、その一方で、他方（ＦｃＲｎまたは本発明のペプチドのいずれか）が固定化した結合パートナー上を通過する。ＦｃＲｎまたは本発明のペプチドのいずれかを、検出可能に標識することができる。適切な標識には、放射性同位体（６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍ、２４４Ｃｍ、および９９ｍＴｃ−ＭＤＰが含まれるが、これらに限定されない）；検出可能な生成物を有する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびβ−ガラクトシダーゼなど）；蛍光剤および蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミン）；蛍光発光金属（例えば、ＥＤＴＡなどの金属キレート基によって本発明のペプチドに結合した１５２Ｅｕまたは他のランタニド系）；化学発光化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、アクリジニウム塩、イミダゾール、およびシュウ酸エステル）；および生体発光化合物（例えば、ルシフェリンまたはエクオリン（緑色蛍光タンパク質）、および特定の結合分子（例えば、磁性粒子、ミクロスフィア、ナノスフィア、発光量子ドットナノ結晶などが含まれる。
【０１５５】
あるいは、例えば、検出可能に標識して、シグナルを増幅することができる第２段階の抗体または試薬を含む特異的結合対を使用することができる。例えば、本発明のペプチドを、ビオチンに抱合することができ、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジンを、第２段階の試薬として添加することができる。ジゴキシンおよび抗ジゴキシンにより、別の適切な結合部位が得られる。他の実施形態では、第２段階の抗体を、ペルオキシダーゼの存在下で変色する基質と組み合わせたペルオキシダーゼなどの酵素に抱合することができる。本発明のペプチドとＦｃＲｎとの間の結合の有無を、種々の方法（解離した細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡法、Ｘ線撮影法、蛍光光度法、発色検出、蛍光体画像化、フィルム上の化学発光の検出、およびシンチレーションカウンティングが含まれる）によって決定することができる。かかる試薬およびその使用方法は、当該分野で周知である。
【０１５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ診断への適用のために、ＦｃＲｎの発現によって少なくとも一部を特徴づけることができる特定の組織またはさらに特定の細胞傷害を、十分な量の標識した本発明のペプチドの投与によって画像化することができる。
【０１５７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ組織画像化に適切な広範な種々の金属イオンは、試験され、臨床的に利用されている。放射性同位体を使用した画像化のために、以下の特徴が一般に望ましい：（ａ）被験体に対して低線量、（ｂ）核医学的手順を短期間に行うことが可能な高光子収量、（ｃ）十分な量の産生能力、（ｄ）許容可能な費用、（ｅ）投与準備が簡潔なこと、および（ｆ）その後に患者を隔離する必要がないこと。これらの特長により、一般に、以下が得られる：（ａ）最も重篤な器官への被爆が５ｒａｄ未満であること、（ｂ）注入から数時間以内に単一画像を得ることができること、（ｃ）粒子の放出によって放射性同位体が崩壊しないこと、（ｄ）同位体を容易に検出できること、および（ｅ）半減期が４日未満であること（Ｌａｍｂ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，”Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，Ｉｎ  Ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．１  ，Ｒａｙｕｄｕ（Ｅｄ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．１７−６２）。１つの実施形態では、金属は、テクネチウム−９９ｍである。
【０１５８】
したがって、本発明は、放射性を示す金属を含む本発明の少なくとも１つのペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与する工程および放射性金属の崩壊から得たシンチグラフィ画像を記録する工程を含む、被験体の内部領域の画像を得る方法を提供する。同様に、本発明は、常磁性を示す金属を含む本発明の少なくとも１つのペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与する工程および被験体の内部領域のＭＲ画像を記録する工程を含む、被験体の内部領域の磁気共鳴（ＭＲ）画像の画質を高める方法を提供する。
【０１５９】
本発明によって提供される他の方法は、金属を含む本発明の少なくとも１つのペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与する工程および被験体の内部領域の超音波画像を記録する工程を含む、被験体の内部領域の超音波画像の画質を高める方法を含む。本願では、金属は、任意の非毒性重金属イオンであり得る。金属を含むペプチド組成物を被験体に投与する工程および被験体の内部領域のＸ線画像を記録する工程を含む、被験体の内部領域のＸ線画像の画質を高める方法も提供する。放射性非毒性重金属イオンを使用することができる。
【０１６０】
本発明のペプチドを、米国特許第５，３２６，８５６号に記載のキレート剤などのキレート剤に結合することができる。次いで、ペプチド−キレート剤複合体を放射性標識して、ＩｇＧレベルの調節を含む疾患または容態の診断または治療のための造影剤を提供することができる。本発明のペプチドを、画像化または放射線療法で使用する放射性標識ペプチドの作製のために、米国特許第５，４４９，７６１号に開示の方法で使用することもできる。
【０１６１】
６．投与および治療様式
本発明のペプチドを、静脈内、皮下、筋肉内、経口、舌下、口腔内、舌下、鼻腔内、直腸、膣内、または肺経路を介して投与することができる。本発明のペプチドを生体高分子内に埋め込むか結合して、所望の部位にキメラタンパク質を徐放することができる。
【０１６２】
本発明のペプチドの用量は、治療される疾患または容態、疾患または容態の重症度、被験体（その性別、年齢、体重、および所望の結果が含まれる）、および特に使用した投与経路に応じて変化するであろう。投薬量は、０．１から１００，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。１つの実施形態では、用量範囲は１〜１０，０００μｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量範囲は、１０〜１，０００μｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量範囲は、１００〜５００μｇ／ｋｇである。本発明のペプチドを、連続的または特定の間隔で投与することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、至適な用量範囲および／または投与スケジュールを決定することができる。当業者は、用量応答曲線を確立する日常的試験によって他の有効投薬量を容易に決定することができる。例えば、ＩｇＧレベルの増加または減少に必要な本発明のペプチドの量を、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験から計算することができる。当業者は、用量レベルは、特定の化合物の機能、症状の重症度、および副作用に対する被験体の感受性に応じて変化することができると容易に認識し、当業者は、種々の手段によって所与の化合物の好ましい投薬量を容易に決定する。例えば、本発明のペプチドの用量を計算するために、当業者は、特定の使用薬剤に応じて、所望の効果を得るのに必要な量に関する容易に利用可能な情報を使用することができる。
【０１６３】
７．薬学的組成物
本発明はまた、少なくとも１つの本発明のペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物に関する。適切な薬学的キャリアの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。賦形剤の例には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、石灰、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが含まれ得る。組成物はまた、ｐＨ緩衝試薬および湿潤剤または乳化剤を含むことができる。
【０１６４】
経口投与のために、薬学的組成物は、従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。組成物を、液体、例えば、シロップまたは懸濁液として調製することもできる。液体は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）を含むことができる。調製物はまた、香味物質、着色料、および甘味剤を含むことができる。あるいは、組成物を、水または別の適切なビヒクルでの構成のための乾燥生成物として存在することができる。
【０１６５】
口腔内および舌下投与のために、組成物は、従来のプロトコールにしたがった錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。
【０１６６】
吸入投与のために、本発明で使用される化合物を、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適切な気体）を含む加圧パックまたは噴霧器（例えば、ＰＢＳを含む）由来のエアゾールスプレーの形態で都合よく送達する。加圧エアゾールの場合、投薬単位を、バルブによって一定量を送達させることによって決定することができる。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含む、吸入器または空気吸入器で用いる例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０１６７】
ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内または筋肉内）のための薬学的組成物を処方することができる。注射用処方物は、単位投薬形態（例えば、防腐剤を添加したアンプルまたは複数回投与用容器）で提供することができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性ビヒクルの乳濁液などの形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含む。あるいは、有効成分は、適切なビヒクル（例えば、無発熱物質水）での構成のための粉末形態であり得る。
【０１６８】
例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の座剤用基剤を含む座剤または貯留浣腸剤としての直腸投与用の薬学的組成物を処方することもできる。
【０１６９】
本発明のペプチドを、米国特許第５，３２６，８５６号に記載のキレート剤などのキレート剤に結合することができる。次いで、ペプチド−キレート剤複合体を放射性標識して、ＩｇＧレベルの調節を含む疾患または容態の診断または治療のための造影剤を提供することができる。本発明のペプチドを、放射線療法で使用する放射性標識ペプチドの作製のために、米国特許第５，４４９，７６１号に開示の方法で使用することもできる。
【０１７０】
８．ＦｃＲｎの精製
本発明のペプチドを使用して、ＦｃＲｎを精製することもできる。いくつかの実施形態では、ペプチドを、適切なクロマトグラフィマトリックスに共有結合させて、有効なＦｃＲｎ分離担体を形成する。次いで、ＦｃＲｎを含む溶液を、クロマトグラフィ担体を通過させて、固定化結合パートナーにＦｃＲｎを非共有結合させる。ＦｃＲｎを含む溶液は、体液、組織または細胞サンプル、細胞培養物上清などの生体サンプルに由来し得る。適切な溶液で固定化ペプチド：ＦｃＲｎ複合体を洗浄して夾雑物を除去し、次いで、適切な溶離液を使用してクロマトグラフィマトリックスからＦｃＲｎを放出させることによってＦｃＲｎを精製する。
【０１７１】
本発明のペプチドを、当業者に周知の多数の化学的アプローチを使用して、適切なクロマトグラフィマトリックスに結合することができる。例えば、本発明のペプチドを、適切な反応基（チオール、アミン、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、アルキルハライド、Ｎ−アルキル−マレイミド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジルエステル、エポキシド、ヒドロキシルアミン、ヒドラジドなど）を含むマトリックスに結合することができる。
【０１７２】
他の実施形態では、本発明のペプチドを、適切なクロマトグラフィマトリックスに共有結合する化学的部分またはペプチド配列を含むように修飾することができる。例えば、ペプチドを、ビオチン部分で修飾し、アビジンタンパク質を含むクロマトグラフィマトリックスに非共有結合させることができる。あるいは、修飾ペプチドを、ＦｃＲｎ溶液とインキュベーションし、得られた混合物を、適切なクロマトグラフィマトリックスを通過させて、ＦｃＲｎ：ペプチド複合体を単離することができる。
【０１７３】
アフィニティ精製のためのペプチドの類似の使用例を、Ｋｅｌｌｅｙら，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｆｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｔｅｐ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｃＧＭＰ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ”，Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８７，Ｎｏ．３，Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃ，２００４，ｐｐ．４００−４１２および米国特許第６，１９７，５２６号に見出すことができる。
【実施例】
【０１７４】
実施例は、純粋に本発明の例示を意図し、したがって、本発明を決して制限しないと見なすべきであり、上記考察の本発明の詳細な態様および実施形態も記載する。実施例は、下記の実験が実施した全てまたは唯一の実験であることを示すこと意図しない。使用した数字（例えば、量、温度など）に関して確実に正確であるように努力したが、いくつかの実験誤差および偏差を考慮すべきである。他で示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１７５】
実施例１：可溶性ヒトＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ）の発現
文献に記載のように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でグルタミン合成酵素発現系を使用して、可溶性ヒトＦｃＲｎ  ｃＤＮＡをクローニングし、発現し、精製した。米国特許第５，６２３，０５３を参照のこと。ヒトＦｃＲｎのタンパク質配列中のアミノ酸２７４位の後に終止コドンを配置して、膜貫通領域を除去した。
【０１７６】
実施例２：ヒトＦｃＲｎでのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、製造者の推奨するプロトコールに従って、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してトランスフェクションした。図１に示す全長ＦｃＲｎ  ｃＤＮＡ構築物（Ｃ．Ｍ．Ｓｔｏｒｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７−２３８１（１９９４），Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１５２７−１５３１（１９９６））を、プラスミドベクターとしてのｐｃＤＮＡ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に最初にクローニングして、ＦｃＲｎ発現ベクターＦｃＲｎ：ｐＣＤＮＡ６を生成した。図１にも示したヒトβ２ｍ  ｃＤＮＡ構築物を、プラスミドベクターとしてのｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に最初にクローニングし、ヒトβ２ｍ発現ベクターβ２ｍ：ｐｃＤＮＡ３を生成した（Ｄ．Ｇｕｓｓｏｗら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３１３２−３１３８（１９８７））。
【０１７７】
トランスフェクション前日に、ＨＥＫ２９３細胞を、０．５−２．５×１０６細胞／１００ｍｍ皿で播種し、ｃＤＭＥＭ中にて３７℃および５％ＣＯ２で１６時間インキュベーションした。ｃＤＭＥＭの組成は以下を含む：１Ｌ  ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１１９９５−０６５）、１０ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５５）、１０ｍＬ  ＭＥＭアミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１１１３０−０５１）、１０ｍＬ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１１１４０−０５０）、１０ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１１３６０−０７０）、１０ｍＬのペニシリンストレプトマイシン液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１５１４０−１４８）、１０ｍＬ  Ｌ−グルタミン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号２５０３０−０８１）、１ｍＬの２−メルカプトエタノール溶液を含む５５ｍＭダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号２１９８５−０２３）、１００ｍＬ熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。トランスフェクション当日、５μｇのＦｃＲｎ：ｐＣＤＮＡ６構築物および５μｇのβ２ｍ：ｐＣＤＮＡ３  ＤＮＡを、２９０μＬのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加した。溶液を数秒間混合し、遠心分離した。次いで、６０μＬのＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）をＤＮＡ溶液に添加し、１０秒間ボルテックスした。ＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液を、室温で５〜１０分間インキュベーションし、その間に、細胞含有皿由来の培地を吸引し、細胞を４ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した。ＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔの５〜１０分間のインキュベーション後、３ｍＬの完全成長培地（ｃＤＭＥＭ）をＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液に添加し、溶液を混合し、その直後に１００ｍｍ皿中の細胞に添加した。
【０１７８】
細胞を、ＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液と３７℃および５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベーションした。ＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液を含む培地を細胞から除去し、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、新鮮なｃＤＭＥＭを細胞に添加した。４８時間のインキュベーション後、培地を、免疫ブロット分析によって評価して、ＦｃＲｎ／β２ｍ複合体の一過性発現が起こっているかどうかを決定した。さらに、細胞を、１：４の比率で、抗生物質としての２５０μｇ／Ｌゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびブラスチシジン耐性の安定なトランスフェクタントについて選択するための５μｇ／Ｌブラスチシジンを含むｃＤＭＥＭに継代した。抗生物質の選択の４週間後、生存細胞を、１細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養プレートに播種した。最後に、１２クローンを選択し、それぞれ拡大し、ＦｃＲｎおよびβ２ｍについての免疫ブロット分析によって発現についてチェックした。この分析により、ＦｃＲｎおよびβ２ｍ発現２９３クローン１１が最も高い発現レベルを示すことが同定され、これを、次のアッセイで使用した。
【０１７９】
実施例３：ＦｃＲｎ−ＩｇＧインヒビターについてのファージライブラリーのスクリーニング
ＦｃＲｎへのＩｇＧ  Ｆｃ部分の結合を阻害することができるペプチドを、Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から販売されている繊維状ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって同定した。より具体的には、以下の３つのライブラリーを組み合わせて使用した：ＴＮ−９−ＩＶ、ＴＮ１０−Ｘ、ＴＮ−１１−Ｉ、およびＴＮ−１２−Ｉをスクリーニングで使用した。各ライブラリー中に含まれる各生存ファージの総数を、Ｄｙａｘプロトコールに記載のように、ライブラリーを大腸菌中で発現させ、クローン希釈でプレートした場合の各ライブラリーについて確立した形質転換体数によって反映させた。ＴＮ−９−ＩＶ、ＴＮ１０−Ｘ、ＴＮ−１１−Ｉ、およびＴＮ−１２−Ｉの形質転換体数は、それぞれ、３．２×１０９、２×１０９、２．７×１０９、および１．４×１０９であった。所与の体積中の生存ファージの絶対数を言及するための別の方法は、単位体積あたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）の染色による方法である。
【０１８０】
Ａ．ファージスクリーニングで使用した緩衝液
ＦｃＲｎ結合ペプチドのスクリーニングのために以下の緩衝液を使用した。  
【０１８１】
１．ＮＺＣＹＭブロス：１０ｇ  ＮＺアミン−Ａ；５ｇ塩化ナトリウム、５ｇ  Ｂａｃｔｏ酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１ｇ  Ｃａｓアミノ酸、１ｇ硫酸マグネシウム無水物粉末：成分を、８００ｍＬの水に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に調整し、水で総体積を１Ｌにし、２０分間オートクレーブする。
【０１８２】
２．結合緩衝液（ＢＢ）：ＰＢＳ（ｐＨ６）＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ．Ｃ．ＮＺＣＹＭ−Ｔ：ＮＺＣＹＭブロス＋１２．５μｇ／ｍＬテトラサイクリン。
【０１８３】
３．ＨＢＳＳ−Ｅ：ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１８４】
４．ＭｉｎＡ塩：１０．５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４（二塩基性リン酸カリウム）、４．５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４（一塩基性リン酸カリウム）；１．０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４（硫酸アンモニウム）、および０．５ｇクエン酸ナトリウムを１Ｌ水に溶解する。
【０１８５】
５．ＬＢブロス：１０ｇ  Ｂａｃｔｏトリプトン、５ｇ  Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、１０ｇ塩化ナトリウムを、１Ｌ水に溶解し、２０分間オートクレーブする。
【０１８６】
６．ＣＢＳ（ｐＨ２）：５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム：緩衝液をＨＣｌでｐＨ２にし、濾過滅菌する。
【０１８７】
７．ＬＢ寒天：３０ｇ  Ｂａｃｔｏトリプトン、１５  ｇＢａｃｔｏ酵母抽出物、３０ｇ塩化ナトリウムを３Ｌの水に溶解し、２０分間オートクレーブする。
【０１８８】
８．ＬＢ軟寒天：２０ｇ  Ｂａｃｔｏトリプトファン、１０  ｇＢａｃｔｏ酵母抽出物、２０ｇ塩化ナトリウム、１４ｇ  Ｂａｃｔｏ寒天をボイルせずに穏やかに加熱しながら２Ｌの水に溶解した。
【０１８９】
９．ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）
Ｂ．スクリーニングプロトコール：ラウンド１
各ライブラリーの約１００のランダムライブラリー等価物をその力価に応じてプールした。これは、以下を意味していた：２４μＬのＴＮ９−ＩＶ（１．３×１０１０ｐｆｕ／μＬ）、１２．５μＬのＴＮ１０−Ｘ（１．６×１０１０ｐｆｕ／μＬ）、２２５μＬのＴＮ１１−Ｉ（１．２×１０９ｐｆｕ／μＬ）、および４８．７μＬのＴＮ１２−Ｉ（２．９×１０９ｐｆｕ／μＬ）を、１８９μＬ  ＰＢＳ、７５μＬの氷冷１７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（平均分子量：８０００Ｄａ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および７５μＬの３Ｍ塩化ナトリウムと混合し、氷上で３０分間インキュベーションした。２９３クローン１１細胞（実施例２）の１つのＴ７５フラスコを、ＨＢＳＳ−Ｅと１：３の比率で分割した。細胞を、１ｍＬ微量遠心管に移し、冷結合緩衝液で１回洗浄し、上清を除去した。細胞を、ファージと回転版上にて４℃で１．５時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を、１ｍＬの氷冷ＢＢで５回洗浄し、各回に１４００ｒｐｍで２分間遠心分離した。強力に結合したファージを、６６μＭヒトＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の添加によって溶離し、ＢＢに透析した。ファージ−ＩｇＧミックスを、細胞と４℃で１時間インキュベーションした。遠心分離工程後（１４００ｒｐｍで２分間のスピン）、細胞ペレットを、最初に２００μＬの６６μＭ  ＩｇＧで洗浄し、遠心分離し（１４００ｒｐｍで２分間のスピン）、最終回は１００μＬ  ＩｇＧで洗浄した。ＩｇＧ洗浄物をＩｇＧ溶離物と合わせ、最終体積５００μＬとなった。下記のように、溶離物中のファージの力価を測定し（ｔｉｔｅｒｅｄ）、増幅した。
【０１９０】
Ｃ．ファージ力価
ファージ溶液を、１００倍に希釈した。典型的には、２μＬのファージ溶液を、１９８μＬのＮＺＣＹＭブロスに連続様式で添加して、１０−１０まで希釈した。希釈したファージを、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞の培養物に添加し、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞を対数期まで成長させ、Ａ６００での光学密度（６００ｎｍでのＵＶ吸光度）を０．５に到達させた。培養物を、室温で１０分間インキュベーションした。その後、０．５ｍＬの感染細胞を、約５５℃の３．５ｍＬのｍｏｌｔｅｎ  ｔｏｐ寒天（ＬＢブロスとＬＢ寒天との５０／５０混合物）に添加し、標準的な寒天プレートに広げ、３７℃で一晩インキュベーションした。３０〜３００個のプラークを含むプレートから力価を計算した。１０−８ファージ希釈物からプレートした５０プラークを含むプレートについて、計算を以下のように行うであろう：５０プラーク／５００μＬ感染細胞×感染中の１０倍希釈物×１０８倍ファージ希釈物＝１０８ファージ形成単位／μＬ。
【０１９１】
その後のファージＥＬＩＳＡおよび配列決定分析のために必要な場合、ファージプラークを含む各寒天プラグを、オートクレーブしたパスツールピペットで選別した。プラグを、９６ウェル滅菌丸底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に分注し、これに、１００μＬ／ウェルのＴＥを添加した。ファージを、３７℃で２時間または４℃で一晩プラークから溶離した。
【０１９２】
Ｄ．ファージ増幅
ＸＬ１  ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞の培養物を、ＮＺＣＹＭブロス−Ｔ中で、飽和一晩培養物の１００倍希釈物から培養物のＡ６００での光学密度が０．５に到達するまで成長させた。細胞を、３５００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって濃縮し、その後に、ＭｉｎＡ塩に最初の体積の１／２０に再懸濁した。選択ラウンド後に細胞から溶離したファージを、ＭｉｎＡ塩で最終体積１ｍＬに希釈し、１ｍＬの濃縮細菌培養物に添加した。３７℃の水浴中での１５分間のインキュベーション後、ファージ−細胞ミックスを、２ｍＬ  ２×ＮＺＣＹＭブロスに添加し、ＮＺＣＹＭ＋５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む巨大なＮＵＮＣプレート上に乾燥するまで広げた。プレートを、３７℃で１４〜１８時間インキュベーションした。一晩で形成されたコロニーを、２０ｍＬのＰＢＳの存在下で、拡大棒（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｂａｒ）を使用して穏やかに掻き取った。ＰＢＳ含有細菌およびファージを、遠心管に回収した。プレート上に残存した細菌を、１０ｍＬＰＢＳの存在下で再度掻き取った。最後の１０ｍＬのＰＢＳリンスをプレートに適用し、掻き取った全ての物質と共にプールした。細菌細胞を、遠心分離（３５００ｒｐｍで１５分間）によってペレット化し、透明な上清を別の遠心管にデキャントし、再度明澄化し、最後に再度デキャントした。次いで、体積０．１５ｍＬの１７％ＰＥＧ＋３Ｍ  ＮａＣｌを上清に添加し、混合し、４℃で一晩保存した。遠心分離（８５００×ｇで３０分間）によって沈殿ファージを回収した後、上清をデキャントした。ファージペレットを、小体積のＰＢＳに再懸濁し、短時間のスピンによって明澄化し、体積０．１５の１７％  ＰＥＧ＋３Ｍ  ＮａＣｌで再度沈殿させた。最終ファージペレットをＰＢＳに再懸濁し、次の選択ラウンドのために調製物中で力価を測定した。
【０１９３】
Ｅ．ラウンド２
１ｍＬの結合緩衝液にたった１０個のランダムライブラリー等価物が希釈されるように、増幅したファージライブラリーを希釈した。非トランスフェクション２９３細胞のＴ７５フラスコの１／３を、冷結合緩衝液で１回洗浄した。ＦｃＲｎを発現しなかった細胞に結合することができるペプチドを発現したライブラリーからのファージの除去を含むサブトラクション工程を、１５分間の非トランスフェクション細胞とのファージのインキュベーションによって２回行った。上清を回収した。次いで、２９３クローン１１細胞のＴ７５フラスコの１／３を、冷結合緩衝液で１回洗浄し、ファージと回転子中にて４℃で１．５時間インキュベーションした。１ｍＬ冷結合緩衝液を使用して、細胞を５回洗浄および遠心分離し（１４００ｒｐｍで２分間のスピン）、強く結合したファージを、ファージ−細胞−ＩｇＧ混合物の４℃で１時間のインキュベーションによって２００μＬの６６μＭヒトＩｇＧ（結合緩衝液中で透析）で溶離した。遠心分離後（１４００ｒｐｍで２分間のスピン）、上清を回収し、ペレットを２００μＬの６６μＭＩｇＧで洗浄し、その後に、１００μＬの６６μＭ  ＩｇＧで洗浄した。以下の標識ファージ力価およびファージ増幅の項に記載のように、溶離液中のファージの力価を測定し、増幅した。
【０１９４】
Ｆ．ラウンド３
本ラウンドを、上のラウンド２に記載のように行った。ラウンド３の完了後、溶離液中のファージの力価を測定し、ファージＥＬＩＳＡを使用して、ＩｇＧ−ＦｃＲｎインヒビターについてアッセイした。
【０１９５】
Ｇ．ファージＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって以下の工程を行い、ＦｃＲｎに結合することができるペプチドをコードするファージを同定した。第１に、以下の溶液を調製した。
緩衝液Ａ：ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ＋０．５％ＢＳＡ。
緩衝液Ｂ：１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ。
緩衝液Ｃ：５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ。
ＦｃＲｎに結合する能力を証明するファージの増殖のためのＸＬ１  ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌培養物を、一晩培養物の１００倍希釈物からＡ６００での光学密度が０．５になるまで成長させた。次いで、上記のように調製した１０μＬの各ファージ溶離物を、９６ウェルプレートのウェル中の３０μＬのＸＬ１  ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞に添加し、室温で１５分間インキュベーションした。次いで、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１３０μＬのＮＺＣＹＭブロスを各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１９６】
ストレプトアビジンコーティングされたＢＳＡブロッキングしたマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２００μＬ／ウェルの緩衝液Ａでのリンスおよび１ｍｇ／ｍＬのビオチン化可溶性ヒトＦｃＲｎ（実施例４、第Ａ項）を含む緩衝液Ａと４℃で一晩コーティングすることによって調製した。ＦｃＲｎ含有緩衝液を破棄し、プレートを緩衝Ｃで２回リンスした。次いで、７０μＬの緩衝液Ｂをプレートの各ウェルに添加し、その後に３０μＬのファージ含有細菌培養物を添加した。室温で１時間後、プレートを、２００μＬの緩衝液Ｃで５回洗浄した。次いで、ＨＲＰ抱合抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１００００倍希釈物を含む１００μＬの緩衝液Ｃを、各ウェルに添加した。プレートを、室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートを緩衝液Ｃで９回洗浄し、１ステップＴＭＢ（ＫＰＬ）で発色させ、５〜１５分後に２Ｍ硫酸で発色を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４５０ｎｍで読み取った。
【０１９７】
Ｈ．ファージＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＴＥ中のプラークから溶離したファージを、製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがってＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩキットの使用によって配列決定のために増幅させた。次いで、５ｍＬの溶離ファージを、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５００ｎＭのプライマー３ＰＣＲＵＰ（５’−ＣＧＧＣＧＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’）（配列番号１１）、５００ｎＭのプライマー３ＰＣＲＤＮ（５’−ＣＡＴＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣ−３’）（配列番号１２）、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（１０×：５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５℃の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１．２５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む反応混合物に添加した。反応物を、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＣＴ−２００サーマルサイクラーの以下のプログラムに供した：９４℃で５分；９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間からなる３０サイクル、その後の７２℃で７分間。得られた産物を、製造者の説明書にしたがってＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、Ａ２６０での吸光度によって定量し、プライマー３ＳＥＱ−８０（５’−ＧＡＴＡＡＡＣＣＧＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＣＣ−３’）（配列番号１３）を使用して配列決定した。
【０１９８】
３ラウンドのスクリーニング後に増幅したファージの配列決定により、図１に示したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が明らかとなった。これらの「ファージヒット」を集合的に使用して、コンセンサスペプチド配列を同定し、以下のアミノ酸配列によって定義した：Ｇ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ（配列番号１４）。
【０１９９】
実施例４：ペプチド−ＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡ
繊維状ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング由来の本発明のペプチドもＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を妨害することができるかどうかを決定するために、以下のＥＬＩＳＡアッセイを考案し、実施した。
【０２００】
Ａ．ｓｈＦｃＲｎのビオチン化
可溶性ヒトＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ）を含むＴｒｉｓ緩衝液を、２回（それぞれ、２ＬのＰＢＳ（ｐＨ８．０）で３時間）透析した。ｓｈＦｃＲｎの回収量を、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって決定した。ｓｈＦｃＲｎ濃度を、吸光度の読み取り値×ｓｈＦｃＲｎの減衰係数（ε＝８５８８０Ｍ−１ｃｍ−１）によって得た。透析したｓｈＦｃＲｎの２倍モル過剰のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）での４℃で２時間の処理によって、ＳｈＦｃＲｎのビオチン化を行った。その後、ｓｈＦｃＲｎ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン反応混合物を、２Ｌの冷ＰＢＳで２回透析し、その後に別の吸光度の読み取りを行って残存タンパク質の濃度を決定した。ビオチン化ｓｈＦｃＲｎを、必要になるまで０．１％アジ化ナトリウムを使用して４℃で保存した。
【０２０１】
Ｂ．ペプチド−ＩｇＧ競合ＥＬｌＳＡアッセイ
ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でブロッキングした９６ウェルＲｅａｃｔｉＢｉｎｄニュートラビジンコーティングプレートを、２００μＬ／ウェルの緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Ｇｉｂｃｏ，１４０４０）、０．５％ＢＳＡ（無ＩｇＧ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄した。ウェルを、１００μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬビオチン化−ｓｈＦｃＲｎを含む緩衝液Ａでコーティングした。プレートをシールし、３７℃で２時間インキュベーションした。その後、プレートを、２００μＬ／ウェルの緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ（無）ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。次いで、５０μＬ／ウェルの６ｎＭヒトＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む緩衝液Ｂおよび５０μＬ／ウェルの種々のペプチド競合物（種々の濃度）を添加し、その結果、ウェル中のＩｇＧの最終濃度は３ｎＭであった。混合するために、プレートを２分間震盪し、シールし、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、液体をプレートから吸引し、１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）フラグメント特異的Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を含む緩衝液Ｂを添加した。プレートに蓋をし、室温で３０分間インキュベーションし、２００μＬ／ウェルの氷冷緩衝液Ｂで４回洗浄した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質溶液（１００μＬ／ウェル、ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加し、プレートを発色するまでプレートを室温でインキュベーションし、これに５〜１０分かかった。一旦発色すると、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ停止溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。データを、吸光度対５０％阻害濃度を誘導するためのペプチド濃度（ＩＣ５０値）としてプロットした。
【０２０２】
実施例５：ペプチド−ＩｇＧ競合ＦＡＣＳアッセイ
繊維状ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング由来の本発明のペプチドも細胞上のＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を妨害するかどうかを決定するための実施例４に記載のＥＬＩＳＡアプローチの使用に加えて、以下の蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイを考案し、実施した。
【０２０３】
Ａ．Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８を使用したＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の標識
製造者の推奨するプロトコールにしたがってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ヒト化ＩｇＧ１（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標），ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を標識した。簡潔に述べれば、５０μＬの１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）を、５００μＬの２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧのＰＢＳ溶液に添加した。このタンパク質溶液を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８スクシニミジルエステル（乾燥粉末）に添加し、室温で１時間インキュベーションした。キットの構成要素であるカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−３０  Ｆｉｎｅサイズ排除精製樹脂）を使用したサイズ排除クロマトグラフィによってタンパク質を精製した。サンプルをカラムにロードし、ＰＢＳで溶離した。第１の有色バンドは、標識タンパク質を含んでいた。溶離したＩｇＧの２８０ｎｍおよび４９４ｎｍの吸光度の測定によって標識度を決定した。タンパク質のモル濃度を、以下の式を使用して決定した：タンパク質濃度（Ｍ）＝「Ａ２８０−（Ａ４９４×０．１１）×希釈係数］／２０３，０００。さらに、タンパク質１モルあたりの色素のモル数を導くために使用した式を以下であった：＝Ａ４９４×希釈係数／７１，０００×タンパク質濃度（Ｍ）。典型的には、ＩｇＧ１モルあたり４〜７モルのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８が組み込まれた。
【０２０４】
Ｂ．２９３クローン１１細胞を使用したＩｇＧ−ペプチド競合ＦＡＣＳアッセイ
アッセイの準備において、５μｇ／ｍＬブラスチシジンおよび２５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む完全ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中のＨＥＫ２９３クローン１１細胞（実施例２）をスピンダウンし、緩衝液Ｃ（緩衝液Ｃ：１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中に３×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。細胞（０．１ｍＬ）を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルにピペッティングし、プレートを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ７ベンチトップ遠心分離機を使用して、２６００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を穏やかにデキャントし、プレートをペーパータオル上で拭き取った。種々の濃度で緩衝液Ｃ中に溶解したペプチド競合物（９０μＬ）をプレートに添加し、マルチチャネルピペットを使用して混合した。１０μＬのＡｌｅｘａ  ４８８標識Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）をプレート上の各ウェルに添加し、その結果、Ａｌｅｘａ４８８標識Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）の最終濃度は１００ｎＭであった。プレートをフォイルで包み、氷上に１時間置き、その後にＳｏｒｖａＩＩ  ＲＴ７ベンチトップ遠心分離機中にて２６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１００μＬの緩衝液Ｃで１回洗浄し、第２の遠心分離ステップを行った。細胞を、２００μＬの緩衝液Ｃに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーターで分析した。
【０２０５】
実施例６：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したペプチドの平衡結合定数（ＫＤ）の決定方法
Ｂｉａｃｏｒｅ（ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ４．２，Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって推奨されるように、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含むカップリング反応によって、ＣＭ５センサチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のデキストラン表面に可溶性ヒトまたはカニクイザルＦｃＲｎを架橋するために以下のステップを行った。ＦｃＲｎタンパク質を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中で１０〜３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これを使用して、センサチップ上の一方のフローセルをコーティングした。ＦｃＲｎフローセル上の残存部位を、１Ｍエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でブロッキングした。コントロールフローセルを、基準サブトラクションのためにエタノールアミンでブロッキングした。単量体ペプチドの分析のために、ＦｃＲｎを、際集密度４０００〜５０００反応単位（ＲＵ）にコーティングした。ペプチド二量体の分析のために、ＦｃＲｎを、２０００〜２５００ＲＵの密度にコーティングした。ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、全てのＳＰＲを測定した。ｐＨ６またはｐＨ７．４のいずれかで行う測定のために、５０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中で実験を行った。
【０２０６】
Ａ．単量体ペプチドの結合定数の代表的な決定手順
１０個のペプチドの２倍希釈物を、２０μＬ／分の速度で２分間、ＦｃＲｎ−ＣＭ５チップに注入した。緩衝液を使用して、ペプチドをチップから２．５分間解離させた。ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の３０μＬ／分の速度での３０秒間の注入を使用して、任意の残存ペプチドをチップから除去した。センサーグラムを作成し、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアバージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析した。各注入で認められた平衡ＲＵを、濃度に対してプロットした。ＢｉａＥｖａｌソフトウェア中に含まれる定常状態アフィニティモデルを使用したプロットの分析によって、平衡ＫＤ値を導いた。
【０２０７】
Ｂ．二量体ペプチドの結合定数の代表的な決定手順
１０個のペプチドの２倍希釈物を、３０μＬ／分の速度で１０分間、ＦｃＲｎ−ＣＭ５チップに注入した。緩衝液を使用して、ペプチドをチップから１０分間解離させた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％界面活性剤Ｐ２０（ｐＨ９．０）を含む溶液の１００μＬ／分での２回６０分の注入を使用して、任意の残存ペプチドをチップから除去した。
【０２０８】
センサーグラムを作成し、ＢｉａＥｖａｌソフトウェアバージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析した。各注入で認められた平衡ＲＵを、濃度に対してプロットした。ＢｉａＥｖａｌソフトウェア中に含まれる定常状態アフィニティモデルを使用したプロットの分析によって、平衡ＫＤ値を導いた。
【０２０９】
実施例７：ジスルフィド結合を含む単量体ペプチドの合成
フリットガラス丸底フラスコを使用した手作業またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  ３９６−ｏｍｅｇａ合成機（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）の使用のいずれかによる固相ペプチド合成を使用して、単量体を合成した。切断の際にＣ末端アミドを得るためのＲｉｎｋアミド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と組み合わせて、標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕプロコールを使用した（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｄｓ．，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００））。カップリング試薬は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。塩基は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は溶媒であった（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）。典型的な合成サイクルは、２０％ピペリジンを含むＤＭＦを使用した２×１０分間の脱保護工程、ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵを使用した２×３０分間のアミノ酸カップリング、および無水酢酸／ＨＯＢｔを使用した１０分間のキャッピング工程を含んでいた。９５％トリフルオロ酢酸、２．５％エタンジオール、１．５％トリイソプロピルシラン、および１％水での２時間の処理によってペプチドを樹脂から切断し、氷冷エーテルで沈殿させ、遠心分離し、エーテルで３回トリチュレートした（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）。
【０２１０】
酢酸：水の４：１混合物（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）中の１ｍｇ／ｍＬの濃度へのペプチドの溶解によって、粗システイン含有ペプチドをその対応するジスルフィドに酸化した。１０モル当量のヨウ素（１Ｍ水溶液、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を溶液に添加し、反応混合物を室温で１時間混合した。透明な溶液が得られるまで１Ｍチオ硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を連続的に添加することによって反応を停止させた。反応混合物を真空下で濃縮し、その後、２５０ｍｍ×２１．２ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ  ＣＡ）Ｃ１８カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ６００逆相ＨＰＬＣシステム（Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して精製した。ＨＰＬＣ精製工程のために選択した溶離液は、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡを含む水におけるアセトニトリルの勾配であった。適切な画分を回収し、プールし、凍結乾燥した。ペプチドの同一性および純度を、２５０ｍｍ×２ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）と組み合わせ、エレクトロスプレー質量分析器（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を接続した逆相分析ＨＰＬＣによって確認した。
【０２１１】
表２は、ヒトＦｃＲｎに対する高い親和性およびＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断する能力を有するペプチドを同定するために使用したペプチド発現ライブラリーのスクリーニング由来の元のファージペプチド配列を列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
【０２１２】
表２：元のファージペプチド配列
【０２１３】
【表２】
2009527499.tif 000009
表３は、配列番号６のペプチドの短縮を列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす短縮の影響を示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
【０２１４】
表３．配列番号６の短縮
【０２１５】
【表３】
2009527499.tif 000010
表４は、単一のアミノ酸がアラニンに置換された（アラニンスキャン）配列番号１由来のペプチドおよびペプチドアナログを列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす置換の影響を示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表４．配列番号１のアラニンスキャン
【０２１６】
【表４−１】
2009527499.tif 000011
【０２１７】
【表４−２】
2009527499.tif 000012
表５は、配列番号１由来のペプチドおよびシステインのシステイン誘導体への置換を行ったペプチドアナログを列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす置換の影響を示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表５．配列番号１のシステイン誘導体
【０２１８】
【表５】
2009527499.tif 000013
＊”Ｐｅｎ”＝Ｌ−ペニシラミン；”ｈＣ”＝Ｌ−ホモシステイン；
表６は、配列番号１および単一のアミノ酸がＮ−メチルアミノ酸に置換されたペプチド番号３２由来のペプチドを列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす置換の影響を示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表６．配列番号１およびペプチド番号３２のＮ−メチルスキャン
【０２１９】
【表６】
2009527499.tif 000014
＊Ｓａｒ＝サルコシン、ＮＭｅＡｌａ＝Ｎ−メチルアラニン、「ＮＭｅ」接頭辞は、Ｎ−メチルアミノ酸を示す。
【０２２０】
表７は、ペプチド番号３２由来ペプチド誘導体の短縮を列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす短縮の影響を示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表７．ペプチド番号３２の短縮
【０２２１】
【表７】
2009527499.tif 000015
＊「Ｐｅｎ」＝Ｌ−ペニシラミン。
【０２２２】
表８は、ペプチド番号３２由来ペプチドおよび種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体と置換された（通常は、配列：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表８．ペプチド番号３２のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕのアナログ
【０２２３】
【表８−１】
2009527499.tif 000016
【０２２４】
【表８−２】
2009527499.tif 000017
＊「Ｓａｒ」＝サルコシン、「Ａｉｂ」＝アミノイソ酪酸。
【０２２５】
表９は、ペプチド番号３２由来ペプチドおよび種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体と置換された（通常は、配列：Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ペニシラミンが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表９．ペプチド番号３２のＡｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｅｎのアナログ
【０２２６】
【表９】
2009527499.tif 000018
表１０は、ペプチド番号３２由来ペプチドおよび種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体と置換された（通常は、配列：ペニシラミン−Ｔｈｒ−Ｇｌｙが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１０．ペプチド番号３２のＰｅｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙのアナログ
【０２２７】
【表１０】
2009527499.tif 000019
”ＮＭｅＡｌａ”＝Ｎ末端アラニン。
【０２２８】
表１１は、ペプチド番号１８７由来ペプチドおよび種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体と置換された（通常は、配列：Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−サルコシンが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１１．ペプチド番号１８７のＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓａｒのアナログ
【０２２９】
【表１１】
2009527499.tif 000020
＊「Ｓａｒ」＝サルコシン、「Ａｉｂ」＝アミノイソ酪酸。
【０２３０】
表１２は、ペプチド番号３２由来ペプチドおよび種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体と置換された（通常は、配列：Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、Ｐｈｅアナログ側鎖の化学構造を示す。列４は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第５列は、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１２．ペプチド番号３２のＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙのアナログ
【０２３１】
【表１２−１】
2009527499.tif 000021
【０２３２】
【表１２−２】
2009527499.tif 000022
＊「Ｓａｒ」＝サルコシン；「ＮＭｅＬｅｕ＝Ｎ末端ロイシン、
１ＳＹＮ９２７は、Ａｓｐ側鎖とＬｙｓ側鎖との間のアミド結合によって環状化されている。
【０２３３】
表１３は、単一のアミノ酸がチロシンに置換された種々のペプチドおよびペプチドアナログを列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす置換の影響も示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、Ｔｙｒアナログ側鎖の化学構造を示す。第４列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第５列および第６列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１３．チロシン置換
【０２３４】
【表１３】
2009527499.tif 000023
表１４は、ペプチド番号３２由来ペプチドおよび種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体と置換された（通常は、配列：Ｇｌｙ−Ｌｅｕが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１４．ペプチド番号３２のＧｌｙ−Ｌｅｕのアナログ
【０２３５】
【表１４】
2009527499.tif 000024
表１５は、ペプチド番号３２由来ペプチドおよびグリシンおよびロイシンが共にジペプチド模倣物と置換された（通常は、配列：Ｇｌｙ−Ｌｅｕが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、配列中のＸの同一性についての説明を示す。第４列は、Ｘと指定されたアナログの化学構造を示す。第５列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第６列は、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１５．ペプチド番号３２のＧｌｙ−Ｌｅｕでのペプチド模倣アナログ
【０２３６】
【表１５】
2009527499.tif 000025
実施例８：ヒスチジンアナログを含むペプチドの合成
以下の修飾ヒスチジンアナログを除く単量体ペプチドジスルフィドの合成について実施例７に記載のように、修飾ヒスチジンアナログ（表１６）を合成した。ペプチド番号９９に対する完全に保護されたペプチドアナログを含む樹脂を非希釈ヨウ化メチル中で１５時間懸濁することによってペプチド番号２５９を合成した。上記のように樹脂をジクロロメタンで洗浄し、ペプチドを樹脂から切断し、酸化し、ＨＰＬＣによって精製して、モノメチル化ヒスチジンペプチド（ペプチド番号２５９）を得た。
【０２３７】
ペプチド番号９９に対する完全に保護されたペプチドアナログを含む樹脂を非希釈ヨウ化メチル中で７２時間懸濁することによってペプチド番号２６０を合成した。上記のように樹脂をジクロロメタンで洗浄し、ペプチドを樹脂から切断し、酸化し、ＨＰＬＣによって精製して、ジメチル化ヒスチジンペプチド（ペプチド番号２６０）を得た。
【０２３８】
ペプチド番号２４８に対する完全に保護されたペプチドアナログを含む樹脂を窒素下でジクロロメタンに懸濁することによってペプチド番号２６９を合成した。１０モル当量の２，４，６−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルピリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を懸濁液に添加し、その後に、５モル当量のメチル−トリフルオロメタン−スルホナート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した。震盪しながら反応を４時間進行させ、最初にジクロロメタンでリンスし、その後にジメチルホルムアミドでリンスし、最後に、ジクロロメタンで再度リンスした。記載のようにペプチドを樹脂から切断し、酸化し、ＨＰＬＣによって精製して、Ｎ−メチル−チアゾリウムペプチド（ペプチド番号２６９）を得た。
【０２３９】
３３％エタノール、１０％アセトニトリル、１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中での３０当量の硫酸銅、３０当量のアスコルビン酸、および１０当量のアジ化ナトリウムでのペプチド番号２６１の処理によってペプチド番号２７１を合成した。反応を２時間進行させ、上記のように混合物をＨＰＬＣによって精製して、ペプチド（ペプチド番号２７１）を含む１，２，３−トリアゾール側鎖を得た。
【０２４０】
表１６は、単一のアミノ酸がヒスチジンに置換された種々のペプチドおよびペプチドアナログを列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす置換の影響も示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、Ｈｉｓアナログ側鎖の化学構造を示す。第４列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第５列および第６列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１６．ヒスチジン置換
【０２４１】
【表１６−１】
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【０２４２】
【表１６−２】
2009527499.tif 000027
実施例９：Ｇｌｙ−Ｇｌｙのペプチド模倣物を含むペプチドの合成
全てのＧｌｙ−Ｇｌｙアミノ酸模倣物（表１７）を、そのＦｍｏｃ−アミノ保護アミノ酸として組み込み、これは、他で示さない限り、市販のものである（Ｃｈｅｍ−ｌｍｐｅｘ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）。３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸を含むペプチドを、Ｒ．Ｍ．Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：１０４−１０９（１９８２）に記載のプロトコールにしたがったペプチド番号２２７への３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸のＮ−Ｆｍｏｃ誘導体の組み込みによって合成した。３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸を含むペプチドを、Ｒ．Ｍ．Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：１０４−１０９（１９８２）に記載のプロトコールにしたがったペプチド番号２１４への３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸のＮ−Ｆｍｏｃ誘導体の組み込みによって合成した。５，５−二環式ジペプチド模倣物を含むペプチドを、全てＤ−アミノ酸を使用したことを除いてＮ．Ｌ．Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２３５６−２３６１（１９９３）に記載のプロトコールにしたがったペプチド番号１９７またはペプチド番号１９８への５，５−二環式ジペプチド模倣物の組み込みによって合成した。６，５−二環式ジペプチド模倣物を含むペプチドを、全てＤ−アミノ酸を使用したことを除いてＦ．Ａ．Ｅｔｚｋｏｒｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１０４１２（１９９４）に記載のプロトコールにしたがったペプチド番号２０４への６，５−二環式ジペプチド模倣物の組み込みによって合成した。（Ｄ，Ｌ）−フリーディンガーラクタムを含むペプチドを、Ｄ−メチオニンの代わりにＬ−メチオニンを使用したことを除いてＲ．Ｍ．Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：１０４−１０９（１９８２）に記載のプロトコールにしたがったペプチド番号２１６への（Ｄ，Ｌ）−フリーディンガーラクタムの組み込みによって合成した。
【０２４３】
表１７は、配列番号１由来ペプチドおよび種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体と置換された（通常は、２つの隣接するグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）が存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１７．配列番号１のＧｌｙ−Ｇｌｙのアナログ
【０２４４】
【表１７】
2009527499.tif 000028
「ｂｅｔａ−Ａｌａ」＝β−アラニン；「Ａｐａ」＝５−アミノペンタン酸。
【０２４５】
表１８は、ペプチド番号９９由来ペプチドおよび２つのグリシンが共にペプチド模倣物と置換された（通常は、配列：Ｇｌｙ−Ｇｌｙが存在する）ペプチドアナログを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、配列中のＸと指定したペプチド模倣アナログの同一性についての説明を示す。第４列は、Ｘと指定されたアナログの化学構造を示す。第５列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第６列は、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１８．ペプチド番号９９のＧｌｙ−Ｇｌｙでのペプチド模倣アナログ
【０２４６】
【表１８−１】
2009527499.tif 000029
【０２４７】
【表１８−２】
2009527499.tif 000030
実施例１０：ラクタム架橋を介して環状化したペプチドの合成
ラクタム環状化ペプチド（表１９）を、以下のアミノ酸を種々のシステインとの置換基として使用したことを除いて上記の実施例７に概説の固相ペプチド合成によって合成した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）。樹脂上での完全に保護されたペプチドを生成するためのプロセスの完了後、樹脂を、ジクロロメタン中で膨潤させ、窒素でパージし、０．１モル当量のテトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３０モル当量のフェニルシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理し、反応を３時間進行させた。樹脂を最初にジクロロメタンで洗浄し、ＤＭＦで洗浄し、最後に１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミンおよび１％（ｗ／ｖ）ジエチルジチオカルバミン酸のＤＭＦ溶液でさらに５回洗浄した。ＤＭＦでのさらなる洗浄工程後、樹脂をベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスホナート（ＰｙＢＯＰ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）およびＤＩＥＡで１６時間処理した。実施例７に記載のように、ペプチドを樹脂から切断し、精製した。
【０２４８】
表１９は、ラクタム架橋を介して各ペプチドが環状化されると考えられるシステイン残基のアミノ酸およびアミノ酸アナログへのアミノ酸置換を有する本発明の種々のペプチドを列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターに及ぼす置換の影響も示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表１９．ラクタム環状化ペプチド
【０２４９】
【表１９−１】
2009527499.tif 000031
【０２５０】
【表１９−２】
2009527499.tif 000032
１下線のアミノ酸の側鎖間にアミド結合が存在する；Ｄａｂ＝１，３−ジアミノ酪酸、Ｄａｐ＝１，２−ジアミノプロピオン酸；Ｏｒｎ＝オルニチン。
【０２５１】
実施例１１：直鎖ペプチドアナログの合成
直鎖ペプチドアナログを、表２０および２１に記載のようにジスルフィド形成アミノ酸が置換されることを除いて実施例７に記載のように合成した。
【０２５２】
表２０は、本発明の配列番号１由来の直鎖ペプチドおよびペプチドアナログを列挙している。ヒトＦｃＲｎに対するこれらのペプチドの結合パラメーターも示す。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表２０．配列番号１の直鎖アナログ
【０２５３】
【表２０−１】
2009527499.tif 000033
【０２５４】
【表２０−２】
2009527499.tif 000034
１「Ｓａｒ」＝サルコシン、「ＮＭｅＬｅｕ」＝Ｎ−メチルロイシン。
【０２５５】
表２１は、種々のペプチド模倣アナログが置換された（通常は、グリシン−サルコシン配列（Ｇｌｙ−Ｓａｒ）が存在する）ペプチド番号２３６由来ペプチドを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、配列中のＸと指定したペプチド模倣アナログの同一性についての説明を示す。第４列は、Ｘと指定されたペプチド模倣アナログの化学構造を示す。第５列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第６列は、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６で決定した各ペプチドのＫＤを含む。
表２１．ペプチド番号２３６のＧｌｙ−Ｇｌｙでの線状ペプチド模倣アナログ
【０２５６】
【表２１−１】
2009527499.tif 000035
【０２５７】
【表２１−２】
2009527499.tif 000036
１「Ｓａｒ」＝サルコシン、「ＮＭｅＬｅｕ」＝Ｎ−メチルロイシン。
【０２５８】
実施例１２：還元的アルキル化によるペプチド二量体の合成
ペプチド二量体（表２２）を、ペプチドアルデヒドおよびペプチドアミン（Ｎ）またはカルボキシ（Ｃ）末端アミンの還元的アルキル化によって生成した。
【０２５９】
ペプチドＮ末端アミンを、単量体ペプチドジスルフィドの合成についての実施例７に記載のように合成した。
【０２６０】
ペプチドＣ末端アミンを、合成工程で１，２−ジアミノエタン樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用したことを除いて単量体ペプチドジスルフィドの合成についての実施例７に記載のように合成した。その結果として、樹脂からの切断によってＣ末端エチルアミンが得られた。
【０２６１】
ペプチドＮ末端アルデヒド（図２）を、ＤＩＥＡを含むＤＭＦの存在下における５当量の無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とのＮ末端アミノ酸の非保護アミンの２時間の反応によって合成した。ＰｙＢＯＰおよびＤＩＥＡの存在下での２，２−ジメチル−１，３−ジオキソランメタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とのその後の２時間の反応により、保護ジオール樹脂を得た。次いで、樹脂からのペプチドの切断、その後の単量体ペプチドジスルフィドの合成についての実施例７に記載のシステインの酸化および精製により、ペプチドジオールを得た。ジオールを３３％酢酸に溶解後、２当量の過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、反応を５分間進行させた。反応混合物を、２０当量（ジオールに関して）のエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で反応を停止させ、１０分後、粗反応混合物を水で３倍に希釈し、０．１％ＴＦＡを含む水中でのアセトニトリルの漸増勾配を使用してＣ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で精製した。ペプチドアルデヒドを凍結乾燥させ、実施例７に記載の液体クロマトグラフィ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）後に質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）による分析に供した。
【０２６２】
ペプチドＣ末端アルデヒドを、Ｆｍｏｃ−１−アミノ−２，３−プロパンジオール−２’−クロロトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をＲｉｎｋアミド樹脂の代わりに使用することを除いて、単量体ペプチドジスルフィドの合成について実施例７に記載のように合成した。したがって、得られたペプチド樹脂は、マスキング下Ｃ末端ジオールを含んでいた。樹脂からの切断後、上のＮ末端アルデヒドについて記載のように、ジオールをアルデヒドに酸化した。
【０２６３】
ペプチド番号２７５などのラクタム環状化ペプチドを合成するためのペプチド単量体を、ラクタム架橋によって環状化されたペプチドを合成するための上の実施例１０に記載の方法にしたがって合成した。それにより、樹脂上でＡｓｐ−Ｌｙｓ環状化を行い、その後に樹脂から切断した。
【０２６４】
２％酢酸を含むＤＭＦ中での濃度４０ｍｇ／ｍＬの１当量のアミン含有ペプチドとの１当量のペプチドアルデヒドの反応によってペプチド二量体を合成した（図３）。６０分後、２当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、反応物を１時間震盪した。反応混合物を、水で１０倍に希釈し、ＨＰＬＣによって精製し、実施例７に記載のように、液体クロマトグラフィ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）後の質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）によって分析した。
【０２６５】
表２２は、還元的アルキル化によって合成された本発明の二量体ペプチドを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。第６列は、実施例５に概説した競合的ＩｇＧ結合ＦＡＣＳ分析によって決定した各ペプチドのＩＣ５０を含む。
表２２．還元的アルキル化によって合成された二量体および三量体
【０２６６】
【表２２−１】
2009527499.tif 000037
【０２６７】
【表２２−２】
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【０２６８】
【表２２−３】
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Ｘ＝３（ｒ）−３−アミノ−１−カルボキシメチル−バレロラクタム。
【０２６９】
実施例１３：チオールリンカーおよびブロモアセチル化ペプチドによるペプチド二量体の合成
ペプチド二量体（表２３）も、チオールリンカーとのブロモアセチル化ペプチドの反応によって合成した。ブロモアセチル化ペプチドを、ＤＭＦ中での４当量のブロモアセチルブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および８当量のＤＩＥＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）との保護ペプチド樹脂の遊離α−アミノ基の反応によって合成した（図４）。１時間後、実施例７に記載のように樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後にＤＣＭによって洗浄し、樹脂から切断した。ビス−チオールリンカーを使用してラクタム環状化ペプチドを二量体化した場合、ブロモアセチル化工程前に樹脂上での環状化工程を行った。ビス−チオールリンカーを使用してジスルフィド含有ペプチドを二量体化した場合、実施例７に記載のように切断後にヨウ素酸化工程を行った。
【０２７０】
ビス−チオールリンカーを、ＤＭＦ中における２当量のＰｙＢＯＰ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＤＩＥＡの存在下での２当量のＮ，Ｎ−ビス（Ｎ’−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピル）グリシンヘミ硫酸カリウム（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）とのＮＨ２−Ｇｌｙ−２−クロロトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の１８時間の反応によって合成した（図４）。Ｆｍｏｃ保護基を、２０％ピペリジンを含むＤＭＦでの１０分間で２回の処理によって除去した。いくつかのリンカー化合物のために、β−アラニンもスペーサー単位として組み込んだ。Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を、上記のようにＰｙＢＯＰおよびＤＩＥＡを使用して樹脂にカップリングした。Ｆｍｏｃ保護基を、２０％ピペリジンを含むＤＭＦを使用して除去し、別のβ−アラニンスペーサー単位を挿入したか、２当量のＮ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオナート（ＳＡＴＰ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）および４当量のＤＩＥＡとの遊離Ｎ末端アミン樹脂の１８時間の反応によってビス−チオールリンカーを組み込んだ。
【０２７１】
その後、１ｍＬのＤＭＦおよび０．４ｍＬの緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：１Ｍ  ヒドロキシルアミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含む脱気溶液との０．０５ｍｍｏｌのペプチド樹脂の１８時間の反応によってＳ−アセチル保護基を除去した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後にＤＣＭで洗浄し、２％トリイソプロピルシランを含む５０％ＴＦＡのＤＣＭ溶液を１５分間使用して樹脂から切断した。実施例７に記載のように粗リンカーを処理し、精製した。
【０２７２】
１０％水および５０％  １００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含むＤＭＦ中における２当量のブロモアセチル化Ｎ末端ペプチドとの１当量の精製ビス−チオールリンカーの反応によって、ビス−チオールを使用してペプチド二量体を生成した（図４）。１８時間後、粗反応混合物を、実施例７に記載のように逆相ＨＰＬＣカラムによって精製した。
【０２７３】
ＳＡＴＰで誘導体化したペプチドとのブロモアセチル化ペプチドの反応によって、ペプチド番号１２２を合成した（図５）。簡潔に述べれば、遊離Ｎ末端アミンを有する粗ペプチド樹脂を、２当量のＳＡＴＰとＤＭＦ中で２時間反応させた。Ｓ−アセチル保護基を上記のように除去し、その後に樹脂から切断し、上記のように精製した。
【０２７４】
表２３は、チオールリンカーによって合成された本発明の二量体ペプチドを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。第４列および第５列は、それぞれ、実施例６に概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によってｐＨ６およびｐＨ７．４で決定した各ペプチドのＫＤを含む。第６列は、実施例５に概説した競合的ＩｇＧ結合ＦＡＣＳ分析によって決定した各ペプチドのＩＣ５０を含む。
表２３．チオールリンカーを使用して合成された二量体
【０２７５】
【表２３−１】
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【０２７６】
【表２３−２】
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１Ｐｅｎ＝ペニシラミン、Ｓｕｃ＝コハク酸、Ｓａｒ＝サルコシン、ｐ＝Ｄ−プロリン、Ｘ＝（３Ｒ）−３−アミノ−１−カルボキシメチル−バレロラクタム、ＮＭｅＬｅｕ＝Ｎ−メチルロイシン。
【０２７７】
実施例１４：還元的アルキル化によるペプチド三量体：ペプチド番号２４７
ペプチドアルデヒドおよびペプチドアミノ  Ｎ末端アミンの還元的アルキル化によってペプチド三量体（表２２）を生成した。
【０２７８】
Ｎ末端を二官能性アミンリンカー（ビス−アミノプロピルグリシン（ＢＡＰＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｌ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入したＢｉｓ−Ｆｍｏｃ−ＢＡＰＧとして使用）など）でキャッピングし、その後にサルコシンをカップリングすることを除いて単量体ペプチドジスルフィドの合成について実施例７に記載のように単量体ペプチドＮ末端アミンを合成した。ペプチドＮ末端アルデヒド（図２）を、実施例１２に記載のように合成した。２％酢酸を含むＤＭＦ中での濃度４０ｍｇ／ｍＬの１当量のアミン含有ペプチドとの２当量のペプチドアルデヒドの反応によってペプチド三量体を合成した（図３など）。６０分後、４当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、反応物を１時間震盪した。反応混合物を、水で１０倍に希釈し、ＨＰＬＣによって精製し、実施例７に記載のように、液体クロマトグラフィ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）後の質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）によって分析した。
【０２７９】
実施例１５：二価酸およびアミンリンカーを使用したペプチド二量体の合成
二官能性酸リンカーとの２つの樹脂上のペプチド単量体のＮ末端の反応または二官能性アミンリンカーを含む樹脂上でペプチドを合成し、それにより、２つの樹脂上のペプチド単量体のＣ末端を繋留することのいずれかによって、アミン結合ペプチド二量体（表２４）を生成した。
【０２８０】
Ｎ末端結合ペプチド二量体を、以下を除いて、単量体ペプチドジスルフィドの合成について実施例７に記載のように合成した：ペプチドを樹脂から切断する前に、２つのペプチド単量体のＮ末端を、二官能性酸リンカーに連結する。例えば、１当量のＰｙＢＯＰおよび２当量のＤＩＥＡの存在下における０．５当量のコハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とのペプチド番号２３５に類似のペプチド配列を含むペプチド樹脂の反応によってペプチド番号２８３を合成した。これにより、樹脂上にそのＮ末端を介したアミド結合によって共有結合した隣接ペプチドが得られる。
【０２８１】
ＨＰＬＣ精製前にペプチドジスルフィドを酸化しないことを除き、実施例７に記載のように、得られたペプチド二量体を樹脂から切断し、精製した。精製した還元ペプチドを、２０％ＤＭＳＯを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中にて約０．１ｍｇ／ｍＬに溶解し、室温で３日間混合した。この酸化工程により、二量体の２つの単量体間とは対照的に、二量体の１つのペプチド単量体内にジスルフィド結合が形成される。反応混合物をペプチド濃度０．０５ｍｇ／ｍＬに水で希釈して、０．１％ＴＦＡを含む水中の漸増勾配のアセトニトリルを使用したＣ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で精製した。ペプチド二量体を凍結乾燥させ、実施例７に記載のように、液体クロマトグラフィ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）後の質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）によって分析した（図６を参照のこと）。ペプチド番号２８３の場合、ジスルフィド結合パターンを、トリプシンでのペプチドの３０分間の消化、その後の得られたペプチドのＬＣＭＳによる分析によって確認した。トリプシンは、アルギニン残基およびリジンリジン残基の後を切断することが公知であり、ペプチド番号２８３をアルギニン−フェニルアラニン結合で切断する。ペプチド番号２８３のＬＣＭＳの主な生成物は、ＮＨ２−［Ｐｈｅ  Ｐｈｅ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＮＭｅＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＣＯＮＨ２（ジスルフィド）（ＬＣＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１３５５．６Ｄａ）であり、これは、ペプチド番号２８３のジスルフィド結合が各１３アミノ酸ペプチド単量体の間に形成されることを示す。
【０２８２】
ペプチド配列がペプチド番号３２に類似し、使用した二価酸リンカーがエチレングリコール−ビス（コハク酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であり、カップリング反応のためにＰｙＢＯＰを使用しなかったことを除いてペプチド番号２８３のようにペプチド番号２０１を合成した。
【０２８３】
使用した二価酸リンカーがビス−ｄＰＥＧ６−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎｓ  Ｌｔｄ．）であり、カップリング反応のためにＰｙＢＯＰを使用しなかったことを除いて、ペプチド番号２７９をペプチド番号２８３のように合成した。
【０２８４】
ペプチド−樹脂を大過剰の無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理し、それにより、樹脂上の全ペプチドのＮ末端がコハク酸塩キャッピングされることを除いて、ペプチド番号２８１をペプチド番号２８３のように合成した。この樹脂を、１当量のＰｙＢＯＰおよび２当量のＤＩＥＡの存在下にて０．５当量のＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理した。その後の切断、精製、および酸化工程を、ペプチド番号２８３と同様に行った。
【０２８５】
使用した二価酸リンカーがＮ−メチル−イミノジ酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であったことを除いて、ペプチド番号２８２をペプチド番号２８３のように合成した。
【０２８６】
使用した二価酸リンカーが３，３−ジメチルグルタル酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であったことを除いて、ペプチド番号２８４をペプチド番号２８３のように合成した。
【０２８７】
使用した二価酸リンカーがＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であったことを除いて、ペプチド番号２８５をペプチド番号２８３のように合成した。
【０２８８】
使用した二価酸リンカーがＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であったことを除いて、ペプチド番号２８６をペプチド番号２８３のように合成した。
【０２８９】
ペプチド合成前に二官能性アミンリンカーを樹脂にカップリングすることを除いて、Ｃ末端結合ペプチド二量体を、単量体ペプチドジスルフィドの合成について実施例７に記載のように合成した。これにより、アミド結合によって共有結合したそのＣ末端とのペプチド二量体が得られる。例えば、ペプチド番号２８０を、最初の樹脂へのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のカップリングおよびその後のアミノ酸のカップリングによってペプチド番号２３５に類似の配列が得られることによって合成した。これにより、樹脂上で合成される場合、２つのペプチド鎖が共有結合する。Ｎ末端結合二量体について上記のように、得られたペプチド二量体を、樹脂から切断し、精製し、酸化する（図７を参照のこと）。
【０２９０】
グリシン残基（Ｇｌｙ）をペプチド番号２３５配列と分岐リジンリンカーとの間に挿入することを除いて、ペプチド番号２８７をペプチド番号２８０のように合成した。
【０２９１】
２つのリシン残基（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）をペプチド番号２３５配列と分岐リジンリンカーとの間に挿入することを除いて、ペプチド番号２８８をペプチド番号２８０のように合成した。
【０２９２】
表２４は、アミド結合を使用して合成した本発明の二量体ペプチドを列挙している。第１列は、ペプチド識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。
表２４．アミドリンカーを使用して合成した二量体
【０２９３】
【表２４−１】
2009527499.tif 000042
【０２９４】
【表２４−２】
2009527499.tif 000043
１Ｐｅｎ＝ペニシラミド、Ｓａｒ＝サルコシン、ＮＭｅＬｅｕ＝Ｎ−メチルロイシン。
【０２９５】
実施例１６：還元的アルキル化によるペプチド−Ｆｃ融合物の合成
ペプチドＮ末端アルデヒドであるペプチド番号２５２、ペプチド番号２２９、およびペプチド番号２３２（表２５）を、実施例１２に記載のように合成した。３つ全てのペプチド−Ｆｃ融合物を、以下の同一のプロトコールを使用して生成した（図８）。ＣｙｓＦｃ（Ｎ末端システインを有するＦｃドメイン）および４．５当量のペプチドアルデヒドを、氷上で８０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中で１時間インキュベーションした。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度２０ｍＭまで添加し、反応物を４℃で１６時間インキュベーションした。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、主に単一のペプチドがＦｃタンパク質に付加されていることを確認した。タンパク質混合物をＰＢＳで２回透析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏブロッキング活性についてアッセイした（表２５）。ペプチド番号２５２−Ｆｃの場合、タンパク質を、ＴＧ３２ＢマウスＩｇＧ異化モデルにおいても評価した（図１５）。米国特許出願公開番号ＵＳ２００５／００２７１０９号（ＣｙｓＦｃ生成の開示が本明細書中で参考として援用される）に記載のようにＣｙｓＦｃを生成することができる。
【０２９６】
表２５は、ＣｙｓＦｃおよびアルデヒド−ペプチドを使用して合成した本発明のペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を列挙している。第１列は、ペプチド−Ｆｃ融合物の識別番号を含む。第２列は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。第３列は、実施例４に概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡによって決定された各ペプチドのＩＣ５０を含む。
表２５．ペプチド−Ｆｃ融合物
【０２９７】
【表２５】
2009527499.tif 000044
１Ｐｅｎ＝ペニシラミド、Ｓａｒ＝サルコシン、ＮＭｅＬｅｕ＝Ｎ−メチルロイシン。
【０２９８】
実施例１７：トランスジェニックマウス
トランスジェニックマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ  Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ博士から入手した。内因性マウスＦｃＲｎおよびβ２ｍ遺伝子を、相同組換えによる外来ポリヌクレオチド配列の挿入によって不活化し、ヒトＦｃＲｎおよびヒトβ２ｍ遺伝子と一過性に置換した（ｍｕＦｃＲｎ（−／−）、ｍｕβ２ｍ（−／−）、＋ｈｕＦｃＲｎ、＋ｈｕβ２ｍ）。これらのマウスを、系統名ＴＧ３２Ｂという。
【０２９９】
実施例１８：５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで使用したＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に及ぼすペプチド番号２７０の影響
ｔ＝０時間（Ｔ０）で成体ＴＧ３２Ｂマウスに５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４，４８，７２，９６、および１２０時間後、マウスに５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇペプチド番号２７０のいずれかを静脈内注射した。１５ｍＭ酢酸ナトリウムを含むビヒクルＰＢＳ（ｐＨ５）を使用して、各時点でコントロール注射を行った。全時点の注射前および１６８時間後に血液サンプルを採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを行うまで−２０℃で保存した（図９）。
【０３００】
ＩｇＧ  Ｆｃドメイン特異的ＥＬＩＳＡを使用して、各時点での血清中のヒトＩｇＧレベルを検出した。簡潔に述べれば、３０μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の１０μｇ／ｍＬストック溶液を、６ｍＬの０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で希釈した。９６ウェルプレートを、５０μＬ／ウェルのこの溶液でコーティングし、３７℃で１時間インキュベーションした。コーティング溶液を除去し、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水）で１回洗浄した。次いで、２００μＬ／ウェルの２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ストック溶液を含むＰＢＳを添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。ウェルを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬのｈＩｇＧ１から出発する２．５倍希釈の実施によって、三連で検量線を作成した。次いで、１００μＬの標準溶液またはサンプル溶液のいずれかをウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴでさらに３回洗浄し、その後に１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ［Ｆｃ］−ＨＲＰ抱合物（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の１０，０００倍希釈物の２％ＢＳＡを含むＰＢＳを添加した。プレートを、３７℃で１時間インキュベーションし、その後ＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬのＴＭＢ一成分基質（ＢｉｏＦＸ，Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）を各ウェルに添加した。５分後に各ウェルへの１００μＬの０．２５Ｍ硫酸の添加によって発色を止めた。各ウェルの４５０ｎｍでのＵＶ吸収を測定し、検量線を使用して、血清ＩｇＧ濃度対実験期間のプロットを導いた。
【０３０１】
実施例１９：ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に及ぼすペプチド番号２３１、ペプチド番号２７４、およびペプチド番号２５２−Ｆｃの影響
ｔ＝０時間（Ｔ０）で成体ＴＧ３２Ｂマウスに５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４、４８、および７２時間後、マウスに１ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２３１、１ｍｇ／ｋｇペプチド番号２７４、または２０ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２５２−Ｆｃのいずれかを静脈内注射した。１５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を使用して、各時点でコントロール注射を行い、これを全注射のビヒクルとしての機能を果たした。全時点の注射前および３０、９６、１４４時間後に血液サンプルを採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを行うまで−２０℃で保存した。
【０３０２】
各時点での血清中のヒトＩｇＧ濃度を、実施例１８に記載のように決定した（図１５）。
【０３０３】
実施例２０：カニクイザルにおけるヒトＩｇＧ異化ならびに内因性ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびアルブミンに及ぼすペプチド番号２７０の影響
０時間で平均体重が４．８ｋｇの成体カニクイザルに、ＩＶ用量が５ｍｇ／ｋｇのビオチン化ヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４、４８、７２、および９６時間後、動物に、１ｍＬ／分の速度で１０ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０または同体積のビヒクル（３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５））のいずれかを静脈内注射した。１２０時間後、動物ＣＯ６２１５を、１０ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０で５回処置した。全注射前、１２０、１６８、１９２、２４４時間後、および３０日後に血液サンプルを採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを行うまで−２０℃で保存した（図１０〜１２）。
【０３０４】
ビオチン−ｈＩｇＧトレーサーを、ストレプトアビジン−Ｆｃ特異的ＥＬＩＳＡを使用して検出した。ストレプトアビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ｃａｔ＃１５１２１）を、ＰＢＳＴ（リン酸緩衝化生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。血清サンプルおよび標準物質を、ＰＢＳＢ（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ）で希釈した。１．５６ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲で検量線を作成した。希釈サンプル（１００μＬ）または標準物質を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションした。その後、ウェルを、ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）で３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，，Ｃａｔ＃３１４１６）をＰＢＳＢで２５，０００倍に希釈し、１００μＬ／ウェルを添加し、プレートを室温で３０分間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＢｉｏＦｘ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ，Ｏｗｉｎｇ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）を使用して、室温で約５分間発色させた。１００μＬ／ウェルの０．２５Ｍ硫酸の添加によって反応物の発色を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０３０５】
内因性カニクイザルＩｇＧを、異化のＥＬＩＳＡプロトコールを使用して検出した。第１に、ウサギ抗サルＩｇＧを、コーティング緩衝液（コーティング緩衝液＝１炭酸塩−重炭酸塩カプセル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ｃａｔ＃Ｃ−３０４１（１００ｍＬに溶解））で２μｇ／ｍＬに希釈した。次に、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１００μＬ／ウェルの２μｇ／ｍＬウサギ抗サルＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＢ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ；１０％ＢＳＡを含むＰＢＳストックから希釈；ＫＰＬ）で３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを、ＰＢＳＴで再度４回洗浄した。血清サンプルおよび標準物質を、ＰＢＳＢで希釈した。２０００ｎｇ／ｍＬ〜１．９ｎｇ／ｍＬのサルＩｇＧ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）の範囲で検量線を作成した。次いで、１００μＬ／ウェルの各サンプルを、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルのウサギ抗サルＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のＰＢＳＢでの３０，０００倍希釈物を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して室温で約５分間発色させた。１００μＬ／ウェルのＴＭＰ停止溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で発色反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０３０６】
内因性カニクイザル血清アルブミンを、以下のＥＬＩＳＡプロトコールを使用して検出した。第１に、ウサギ抗サル血清アルブミンを、コーティング緩衝液（コーティング緩衝液＝１炭酸塩−重炭酸塩カプセル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ｃａｔ＃Ｃ−３０４１（１００ｍＬに溶解））で５μｇ／ｍＬに希釈した。次に、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１００μＬ／ウェルの５μｇ／ｍＬウサギ抗サル血清アルブミン（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｃａｔ＃ＲＡＭｏｎ／Ａｌｂ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、３００μＬ／ウェルの５％魚類ゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ｃａｔ＃Ｇ−７７６５）ストック溶液を含むＰＢＳを使用して３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを、ＰＢＳＴで再度４回洗浄した。血清サンプルおよび標準物質を、ＰＢＳＢで希釈した。２００ｎｇ／ｍＬ〜０．３９ｎｇ／ｍＬのサル血清アルブミン（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｃａｔ＃ＭｏｎＡｌｂ  Ｂａｔｃｈ＃６０８２）の範囲で検量線を作成した。次いで、１００μＬ／ウェルの各サンプルを、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。１００μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトアルブミン−ＨＲＰ抱合物（Ａｃａｄｅｍｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ｃａｔ＃ＡＬ１０Ｈ−Ｇ１ａ）のＰＢＳＢでの３０，０００倍希釈物を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、室温で約５分間発色させた。１００μＬ／ウェルのＴＭＰ停止溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で発色反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定した（図１３）。
【０３０７】
内因性カニクイザルＩｇＭを、以下のＥＬＩＳＡプロトコールを使用して検出した。第１に、ヤギ抗サルＩｇＭ抗体を、コーティング緩衝液（コーティング緩衝液＝１炭酸塩−重炭酸塩カプセル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ｃａｔ＃Ｃ−３０４１（１００ｍＬに溶解））で５μｇ／ｍＬに希釈した。次に、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１００μＬ／ウェルの５μｇ／ｍＬヤギ抗サルＩｇＭ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ｃａｔ＃０７１−１１−０３１）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、２００μＬ／ウェルのＰＢＳＢ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ；１０％ＢＳＡを含むＰＢＳストックから希釈；ＫＰＬ）を使用して３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを、ＰＢＳＴで再度４回洗浄した。血清サンプルおよび標準物質を、ＰＢＳＢで希釈した。２０００ｎｇ／ｍＬ〜１５．６ｎｇ／ｍＬのサルＩｇＭ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ｃａｔ＃２００１３０１）の範囲で検量線を作成した。次いで、１００μＬ／ウェルの各サンプルを、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのヤギ抗サルＩｇＭ−ＨＲＰ抱合物（ＲＤＩ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ，ｃａｔ＃６１７１０３００７）のＰＢＳＢでの：１０，０００倍希釈物を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、室温で約５分間発色させた。１００μＬ／ウェルのＴＭＰ停止溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で発色反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定した（図１４）。
【０３０８】
実施例２１：種々の投与スケジュールを使用した、ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に及ぼすペプチド番号２７０の影響
ｔ＝０時間（Ｔ０）で、成体ＴＧ３２Ｂマウスに５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。４匹のマウスからなる第１の群に、ｔ＝２４時間で、５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０を静脈内注射し、４匹のマウスからなる第２の群に、ｔ＝２４および７２時間で、５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０を静脈内注射し、４匹のマウスからなる第３の群に、ｔ＝２４、４８、７２、９６時間で、２．５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０を静脈内注射した。さらなるマウス群を使用して、１５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を含むビヒクルＰＢＳを用いて各時点でコントロール注射を行った。全時点の注射前および１６８時間後に血液サンプルを採取した。血清を調製し、実施例１８のようにＥＬＩＳＡを行うまで−２０℃で保存した（図１６）。
【０３０９】
実施例２２：さらなるＴＧ３２Ｂマウス実験
ＴＧ３２Ｂマウスにおいてペプチド番号２７０を使用してさらなる実験を行った。実施例１８と同一の実験デザインを使用して、ペプチド番号２７０が皮下（ＳＣ）および腹腔内（ＩＰ）投与経路を使用したＩｇＧ異化速度の加速に有効であることが見出された。２４時間後から出発した５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０の５日間の毎日の投与により、ペプチド番号２７０の皮下（ＳＣ）および腹腔内（ＩＰ）注射後にＩｇＧの半減期が５６時間に減少することが見出された。これらの半減期は、８０〜１００時間のＩｇＧ半減期を示す典型的なコントロールよりも有意に短い。さらに、ｈＩｇＧ濃度は、コントロール群と比較して、ペプチド番号２７０を使用した１６８時間後に５６％（ＳＣ）および６６％（ＩＰ）減少した。
【０３１０】
実施例１８に記載の実験プロトコールを使用して、ＴＧ３２Ｂマウスにおけるペプチド番号２３０も試験した。ヒトＩｇＧの静脈内注射から２４時間後に、５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２３０の毎日の静脈内（ＩＶ）注射を全部で５回行った。ｈＩｇＧの半減期は、９２時間のコントロール群の半減期と比較して、３９時間に減少した。さらに、ｈＩｇＧ濃度は、コントロール群と比較して、１６８時間後に７６％減少した。
【０３１１】
３日間の毎日のペプチド投与と比較したペプチド単回投与の影響を評価するようにデザインした２つの実験において、ペプチド番号２３０も試験した。実施例１８に記載の実験プロトコールを使用して、ヒトＩｇＧのＩＶ注射の２４時間後、第１の動物群を、５ｍｇ／ｋｇペプチド番号２３０単回ＩＶ投与で処置し、第２の動物群を、５ｍｇ／ｋｇペプチド番号２３０の３日間の連続する毎日のＩＶ投与を行った。１２０時間後、ペプチド番号２３０の単回投与により、マウス中のｈＩｇＧ濃度は４１％減少した。ペプチド番号２３０の３日間の毎日の投与を行ったマウス群では、１２０時間後にｈＩｇＧ濃度は６１％減少した。
【０３１２】
実施例２３：ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に及ぼすペプチド番号２８３の影響
ｔ＝０時間（Ｔ０）で、成体ＴＧ３２Ｂマウスに５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４、４８、７２、および９６時間後、マウスに、０．５、１、２．５、５、または１０ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２８３のいずれかを静脈内注射した。１５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を使用して、各時点でコントロール注射を行い、これを全注射のビヒクルとしての機能を果たした。全時点の注射前および１２０時間後、１６８時間後、および３０日後に血液サンプルを採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを行うまで−２０℃で保存した。
【０３１３】
各時点での血清中のヒトＩｇＧ濃度を、実施例１８に記載のように決定した（図１７）。
【０３１４】
実施例２４．ペグ化ペプチド番号２８９の合成
ペプチド番号２８５を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、１当量のＰＥＧ３ＯｋＤａ−スクシニミジルエステル（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ，Ｊａｐａｎ，Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥＧＣ−３０ＴＳ）で１８時間処理した。粗反応混合物を、実施例７に記載のようにＣ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製し、凍結乾燥させ、および陽イオン交換クロマトグラフィ（Ｆｒａｃｔｏｐｒｅｐ  ＳＯ３−，Ｃａｔ  Ｎｏ．１．１７９７２，ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で再度精製し、それにより、ペプチドが１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中の樹脂に結合し、樹脂を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄し、ペプチドを、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で溶離した。ペプチド溶離物を、１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥させた。精製したペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して約５０ｋＤａのペプチド染色バンドが認められ、ＨＰＬＣにより、残存する遊離ペプチドが存在しないことが証明された（図１８）。
表２６．ペプチド番号２８５のペグ化アナログ
【０３１５】
【表２６】
2009527499.tif 000045
実施例２５．ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に及ぼすペプチド番号２８９の影響
ｔ＝０時間（Ｔ０）で、成体ＴＧ３２Ｂマウスに５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４時間後、マウスに、２５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２８９を静脈内注射した。２４、４８、７２、９６、１２０、および１６８時間後に血液サンプルを採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを行うまで−２０℃で保存した。各時点での血清中のヒトＩｇＧ濃度を、実施例１８に記載のように決定した（図１９）。
【０３１６】
実施例２６：カニクイザルにおけるｈＩｇＧ異化ならびに内因性ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびアルブミンに及ぼすペプチド番号２８３の影響
１８頭のカニクイザルを、それぞれ３頭の動物からなる６つの群に分け、ｔ＝−３日に、全動物に５ｍｇ／ｋｇビオチン化ヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で処置した。ｔ＝０から出発して、以下の投与計画にしたがって、動物をペプチド番号２８３で４週間処置した：１）１ｍｇ／ｋｇで３回／週の静脈内投与、２）１ｍｇ／ｋｇで１回／週の皮下投与、３）１ｍｇ／ｋｇで３回／週の皮下投与、４）５ｍｇ／ｋｇで３回／週の静脈内投与、５）５ｍｇ／ｋｇで１回／週の皮下投与、６）５ｍｇ／ｋｇで３回／週の皮下投与。群４の最後のペプチド投与が１６日目であったことに留意のこと。３日前、１５分前、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１４日目、１６日目、１８日目、２１日目、２３日目、２５日目、２８日目、３０日目、３２日目、３５日目、４２日目、４９日目、７７日目に血清サンプルを採取した。ビオチン化ヒトＩｇＧ、内因性ＩｇＧ、およびアルブミンの濃度を、実施例２０に記載のように決定し、図２０〜２４に示した。
【０３１７】
本明細書は、明細書内に引用した引例の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態を例示し、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。当業者は、多数の他の実施形態が本発明に含まれることを容易に認識する。本開示で引用した全ての刊行物および特許は、その全体が参考として援用される。参考として援用される資料が本明細書と矛盾するか一致しない範囲については、明細書は任意のかかる資料より優先される。本明細書中の任意の引例の引用は、かかる引例が本発明の先行技術であることを承認しているわけではない。
【０３１８】
他で示さない限り、本明細書中（特許請求の範囲が含まれる）で使用された成分および反応条件などの量を示す全ての数値は、全ての場合に、用語「約」で修飾されると理解すべきである。したがって、他で示さない限り、数値のパラメーターは近似値であり、本発明によって得られることが求められる所望の性質に応じて変化し得る。少なくとも特許請求の範囲の範囲への均等論の適用を制限することは意図しておらず、各数値のパラメーターを、有効数字および日常的な端数計算に照らして解釈すべきである。
【０３１９】
他で示さない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素中の各要素に対して言及していると理解される。当業者は、日常的実験しか用いずに、本明細書中に記載の発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するか確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３２０】
【図１】図１は、ヒト全長ＦｃＲｎおよびヒトβ−２ミクログロブリン（β２ｍ）読み取り枠（ＯＲＦ）のｃＤＮＡ配列を示す。
【図２】図２は、Ｎ末端アルデヒドペプチド単量体（配列番号３１９）の合成の概要を示す。
【図３】図３は、還元的アルキル化によるペプチド二量体の合成の概要を示す。例として、ペプチド番号２７０の合成を示す。
【図４】図４は、ペプチドおよびブロモアセチル化ペプチドを含むビス−チオールリンカーの使用によるペプチド二量体の合成の概要を示す。例としてペプチド番号１００の合成を示す。ペプチド配列上に配置した水平方向の括弧は、架橋の存在を示す（配列番号３２０）。
【図５】図５は、ペプチドおよびブロモアセチル化ペプチドを含むチオールリンカーを使用したペプチド二量体の合成を示す。例としてペプチド番号１２２の合成を示す。ペプチド配列上に配置した水平方向の括弧は、架橋の存在を示す（配列番号３２０）。
【図６】図６は、リンカーを含む二価酸を使用したペプチド二量体の合成を示す。例としてペプチド番号２８３の合成を示す。ペプチド配列下に配置した水平方向の括弧は、架橋の存在を示す（配列番号３２１）。
【図７】図７は、リンカーを含むアミンを使用したペプチド二量体の合成を示す。例としてペプチド番号２８０の合成を示す。ペプチド配列下に配置した水平方向の括弧は、架橋の存在を示す（配列番号３２１）。
【図８】図８は、ペプチドアルデヒドおよびタンパク質ＣｙｓＦｃを使用したペプチド−Ｆｃ融合物の合成を示す。例としてペプチド番号２５２−Ｆｃの合成を示す。ペプチド配列下に配置した水平方向の括弧は、架橋の存在を示す。
【図９】図９は、ＴＧ３２Ｂマウス（ヒトＦｃＲｎおよびヒトβ２ｍを発現するが、マウスＦｃＲｎまたはβ２ｍを発現しないように操作されたマウス）におけるヒトＩｇＧ異化の動態学を示す。
【図１０】図１０は、カニクイザルにおけるビオチン化ヒトＩｇＧの異化動態学がペプチド番号２７０の静脈内注射後に加速されることを示す。
【図１１】図１１は、ペプチド番号２７０の静脈内注射後のカニクイザルにおける内因性ＩｇＧの血清レベルを示す。
【図１２】図１２は、内因性カニクイザルＩｇＧレベルをＴ０レベルに対して規準化した図１１に示す結果を示す。
【図１３】図１３は、ペプチド番号２７０の静脈内注射後のカニクイザルにおける内因性血清アルブミンレベルを示す。
【図１４】図１４は、ペプチド番号２７０の静脈内注射後のカニクイザルにおける内因性ＩｇＭレベルを示す。
【図１５】図１５は、ペプチド番号２３１、ペプチド番号２７４、およびペプチド番号２５２−Ｆｃの静脈内注射後のＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化の動態学を示す。
【図１６】図１６は、ペプチド番号２７０の静脈内注射後のＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化の動態学を示す。
【図１７】図１７は、ペプチド番号２８３の静脈内注射後のＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化の動態学を示す。
【図１８】図１８は、４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙゲルでの精製ペプチド番号２８９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるペプチド番号２８９の分子量を示す。レーン１は、分子量マーカーを含む。レーンは、非抱合ＰＥＧ３０ｋＤａ出発物質を含む。レーン３は、粗反応混合物を含む。レーン４は、精製ペプチド番号２８９を含む。
【図１９】図１９は、ペプチド番号２８９の静脈内注射後のＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化の動態学を示す。
【図２０】図２０は、５ｍｇ／ｋｇペプチド番号２８３の静脈内注射後のカニクイザルにおけるビオチン化ヒトＩｇＧ異化の動態学を示す。
【図２１】図２１は、１ｍｇ／ｋｇペプチド番号２８３の静脈内注射後のカニクイザルにおけるビオチン化ヒトＩｇＧ異化の動態学を示す。
【図２２】図２２は、カニクイザルにおけるＩｇＧ濃度に及ぼすペプチド番号２８３（５ｍｇ／ｋｇ）の影響を示す。
【図２３】図２３は、カニクイザルにおけるＩｇＧ濃度に及ぼすペプチド番号２８３（１ｍｇ／ｋｇ）の影響を示す。
【図２４】図２４は、カニクイザルにおけるアルブミン濃度に及ぼすペプチド番号２８３（５ｍｇ／ｋｇ、３回／週、ｉｖ）の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月31日(2008.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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