(57)【要約】本発明は、突然変異体アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼまたは改変アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを利用して非−天然アミノ酸を対応するｔＲＮＡにチャージすることにより、非−天然アミノ酸をポリペプチドまたはタンパク質に組み込むための方法および組成物に関する一定の実施形態を提供する。一定の実施形態において、前記ｔＲＮＡは、その複合体が、非改変ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対と通常はウォブル塩基対を形成するコドンと厳密なワトソン・クリック塩基対を形成するようにも改変される。
2009528824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変アミノ−アシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）をコードするポリヌクレオチドを含有する第一ベクターを含む組成物であって、該改変シンテターゼをコードするポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡ分子と対形成するべきアミノ酸との相互作用に必要なアミノ酸結合領域をコードする１つ以上のコドンにて突然変異され、そして該改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子に非−天然アミノ酸をチャージすることができる、組成物。
【請求項２】
前記結合領域が、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下または５個以下の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記改変ＡＡＲＳが、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰｈｅＲＳが、アミノ酸配列位置番号４１２、４１５、４１８および４３７からなる群より選択されるアミノ酸配列位置にて突然変異される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＴｒｐＲＳが、アミノ酸配列位置番号４、５、７、１３２、１３３、１４１および１４３からなる群より選択されるアミノ酸位置にて突然変異される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＭｅｔＲＳが、アミノ酸配列位置番号１３にて突然変異される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
ｔＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有する第二ベクターをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記第一ベクターおよび前記第二ベクターが、同じベクターである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第一ベクターおよび前記第二ベクターが、異なるベクターである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｔＲＮＡが、改変される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｔＲＮＡが、天然ｔＲＮＡの親和性より大きい親和性で、対応するウォブル縮重コドンと塩基対形成する突然変異アンチコドンを含有するように改変される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＡＡＲＳおよび前記ｔＲＮＡが、同じかまたは異なる生物からのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記非−天然アミノ酸が、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、およびｐ−クロロフェニルアラニンからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
改変アミノ−アシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）を含むポリペプチドであって、この場合、該シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子と対形成するべきアミノ酸との相互作用に必要なアミノ酸結合領域内の１つ以上のコドンにて突然変異され、そして該シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子に非−天然アミノ酸をチャージすることができる、ポリペプチド。
【請求項１５】
前記結合領域が、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下または５個以下の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記改変ＡＡＲＳが、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＰｈｅＲＳが、アミノ酸配列位置番号４１２、４１５、４１８および４３７からなる群より選択されるアミノ酸配列位置にて突然変異される、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＴｒｐＲＳが、アミノ酸配列位置番号４、５、７、１３２、１３３、１４１および１４３からなる群より選択されるアミノ酸位置にて突然変異される、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＭｅｔＲＳが、アミノ酸配列位置番号１３にて突然変異される、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む翻訳系。
【請求項２１】
前記翻訳系が、宿主細胞を含む、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２２】
前記改変アミノ−アシルｔＲＮＡシンテターゼが、前記宿主細胞とは異なる生物に由来する、請求項２１に記載の翻訳系。
【請求項２３】
改変ｔＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２４】
前記改変ｔＲＮＡ分子が、前記宿主細胞とは異なる生物に由来する、請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２５】
前記改変ｔＲＮＡ分子が、真核細胞に由来し、前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項２３に記載の翻訳系。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、栄養素要求株である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
１種以上の非−天然アミノ酸を含有する培養基をさらに含む、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２８】
前記１種以上の非−天然アミノ酸が、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、およびｐ−クロロフェニルアラニンからなる群より選択される、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２９】
前記改変ＡＡＲＳが、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項３０】
標的ポリペプチドの１つ以上の指定位置に非−天然アミノ酸を組み込む方法であって、該方法が、
（１）該ポリペプチドの１つの指定位置での非−天然アミノ酸の組み込みのための該ポリペプチドの構造変化を決定する工程；
（２）翻訳系を提供する工程；
（３）請求項１に記載の第一ポリヌクレオチド、またはそれによってコードされている改変ＡＡＲＳを該翻訳系に提供する工程；
（４）該非−天然アミノ酸を該翻訳系に提供する工程；
（５）目的とするポリペプチドをコードするテンプレートポリヌクレオチドを該翻訳系に提供する工程；および
（６）該テンプレートポリヌクレオチドの翻訳を可能にし、それによって該目的のポリペプチドの指定位置に該非−天然アミノ酸を組み込む工程；
を含み、
工程（１）〜（４）が、任意の順序で実施される、
方法。
【請求項３１】
前記翻訳系が、細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（４）が、前記非−天然アミノ酸を含有する溶液と前記翻訳系を接触させることによって実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変ＡＡＲＳによる前記非−天然アミノ酸の活性化についての特異性定数（Ｋｃａｔ／ＫＭ）が、前記天然アミノ酸についてのものより少なくとも５倍大きい、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記改変ＡＡＲＳが、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％または８％以下の率でｔＲＮＡにミスチャージする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｔＲＮＡが、改変ｔＲＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第一ポリヌクレオチドまたは第二ポリヌクレオチドが、前記ｔＲＮＡまたはＡＡＲＳの発現を制御する、恒常的活性型プロモーター配列または誘導性プロモーター配列のいずれかをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
改変ＡＡＲＳを含有する細胞についてスクリーニングする工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記非−天然アミノ酸の組み込みを検証する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記改変ＡＡＲＳが、ＰｈｅＲＳ、ＴｙｒＲＳ、ＴｒｐＲＳおよびＭｅｔＲＳからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３０に記載の方法によって作製される、ポリペプチド。
【請求項４１】
標的ポリペプチドの１つ以上の指定位置に少なくとも１つの非−天然アミノ酸を組み込むための方法であって、該方法が、少なくとも１つの非−天然アミノ酸を含有する翻訳系を提供する工程；改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｙｒＲＳ、改変ＴｒｐＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される１つ以上の改変ＡＡＲＳを該翻訳系に提供する工程；目的とする標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該翻訳系に提供する工程；および目的とする翻訳を可能にし、それによって該標的ポリペプチドに少なくとも１つの非−天然アミノ酸を組み込む工程を含む、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法によって作製される、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／７７９，３７５号（２００６年３月３日出願）、および米国仮特許出願第６０／７７９，３７６号（２００６年３月３日出願）（これらの内容全体は、本明細書に参考として援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
（政府の権利に関する記載）
本発明は、ＮＩＨから授与された交付番号ＧＭ６２５２３での連邦政府支援を受けて行った。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
タンパク質工学は、天然タンパク質の構造的触媒および結合特性を改変するための、ならびに人工タンパク質の新規設計のための強力なツールである。タンパク質工学は、所望のタンパク質配列に突然変異体アミノ酸を組み込む有効な認識メカニズムに依存する。このプロセスは、組成および構築の正確な制御を伴う新規高分子の設計に非常に有用とされてきたが、突然変異誘発が２０の天然アミノ酸に限定されるという大きな限界がある。しかし、非天然アミノ酸の組込みによってタンパク質工学法の範囲および影響力を拡大できることが次第に明らかになってきている。
【０００４】
多種多様な新規官能基を有する非−天然アミノ酸が、世界的に、残基特異的置換または組換えタンパク質への組み込みに代わってきた。タンパク質への非カノニカルアミノ酸の生合成同化は、主として、自然発生アミノ酸の類似体を利用する野生型合成器官の能力を活用することによって達成されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。しかし、非−天然アミノ酸による単一部位置換または組み込みが求められる状況がある。こうした方法論は、目的とする特定の構造または機能特性を実現するタンパク質（アミノ酸のサイズ、酸性度、求核性、水素結合または疎水性など）のテーラリングを可能にするであろう。タンパク質にそうしたアミノ酸を部位特異的に組み込む能力は、タンパク質機能の探査と新たな特性を有するタンパク質の生成の両方のためにタンパク質の構造を合理的に且つ系統的に操作する能力を大きく拡大するであろう。例えば、重原子を含有する大量のタンパク質を合成する能力は、タンパク質構造決定を助長するであろうし、生細胞におけるタンパク質に蛍光体または光開裂性の基を部位特異的に置換する能力は、タンパク質機能をインビボで研究するための強力なツールとなるであろう。
【０００５】
近年、幾つかの研究所が、アンバーまたは４塩基コドンに応じて、それぞれ、ナンセンスサプレッサーまたはフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡのいずれかを使用してタンパク質に非カノニカルアミノ酸を組み込むことにより、多数の遺伝子コード化アミノ酸に関する増幅を遂行した（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。こうした方法は、野生型ペプチド合成を正常に終了させるであろうコドン位置に非カノニカルアミノ酸を挿入する（例えば、停止コドンまたはフレームシフト突然変異）。これらの方法は、新規アミノ酸の単一部位挿入には十分に役立っている。しかし、（残基特異的に対して）多部位位置特異的置換または組み込みの際のそれらの有用性は、あまりよくない（２０〜６０％）抑制効率により制限される（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。これは、実際一部は、高すぎる停止コドン抑制効率が、生物の一部の非標的タンパク質の正常な翻訳停止に干渉するであろうからである。一方、低い抑制効率は、標的タンパク質における１つより多くのナンセンスまたはフレームシフト突然変異部位を抑制するためには不十分である可能性が高いので、完全長タンパク質の合成、組み込む非カノニカルアミノ酸が多いほど困難にまたは非現実的になるであろう。
【０００６】
効率的な多部位組み込みは、例えば、基質特異性が緩和されたまたは編集活性が改変されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを使用することによる栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株における天然アミノ酸の置換によって遂行された（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献５；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。この方法は、多部位での類似体の効率的な組み込みをもたらすが、新規アミノ酸が天然アミノ酸の１つとコドンを「共有」しなければならないという制限を受ける。従って、天然アミノ酸と新規アミノ酸の両方を挿入することができるいずれの所与のコドン位置についても、組み込みの確率以外、どのアミノ酸が最終的に組み込まれることとなるのかは比較的少ししか制御できない。これは、望ましくないことであり得る。設計作製される酵素またはタンパク質について、意図していない部位での非カノニカルアミノ酸の組み込みは、そのタンパク質の機能を予想外に損なわせることがあり、そしてまた、計画された部位での非カノニカルアミノ酸の組み込みに失敗すると、計画された目標に到達することができないであろうからである。
【０００７】
一般に、多部位置換法は、実施が比較的簡単であるが、そのタンパク質全体にわたって特定の天然アミノ酸に対応するすべての部位が置換される。天然および非−天然アミノ酸の組み込み度も様々であり得る。さらに、類似体の多部位組み込みは、細胞を利用する場合、毒性を生じることが多く、このことが生細胞における突然変異体タンパク質の研究を難しくしている。本発明は、タンパク質におけるアミノ酸の部位特異的突然変異を可能にすることにより、これらの困難を克服する。
【０００８】
本明細書に開示する一定の実施形態は、遺伝子コードの縮重の破壊に基づくタンパク質への代替アミノ酸（自然発生アミノ酸、または非標準的もしくは非カノニカルアミノ酸を含む）の新規組み込み技術を提供する。具体的には、本明細書における一定の実施形態は、タンパク質への非−天然アミノ酸の高忠実度位置特異的置換または組み込みを可能にする。
【非特許文献１】Ｂｕｄｉｓａ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９５年，第２３０巻，ｐ．７８８−７９６
【非特許文献２】Ｄｅｍｉｎｇ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７年，Ａ３４，ｐ．２１４３−２１５０
【非特許文献３】Ｄｕｅｗｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，第３６巻，ｐ．３４０４−３４１６
【非特許文献４】ｖａｎ  ＨｅｓｔおよびＴｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９９８年，第４２８巻（１−２），ｐ．６８−７０
【非特許文献５】Ｓｈａｒｍａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２０００年，第４６７巻（１），ｐ．３７−４０
【非特許文献６】Ｂａｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８９年，第１１１巻，ｐ．８０１３
【非特許文献７】Ｎｏｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９年，第２４４巻，ｐ．１８２
【非特許文献８】Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１９９８年，第７巻，ｐ．４１９
【非特許文献９】Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００３年，第１００巻，ｐ．５６
【非特許文献１０】Ｈｏｈｓａｋａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９４年，第３４４巻，ｐ．１７１
【非特許文献１１】ＫｏｗａｌおよびＯｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７年，第２５巻，ｐ．４６８５
【非特許文献１２】Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２年，第１２４巻，ｐ．９６７４
【非特許文献１３】Ｂａｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年，第３５６巻，ｐ．５３７
【非特許文献１４】Ｈｏｈｓａｋａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００１年，第２９巻，ｐ．３６４６
【非特許文献１５】ＷｉｌｓｏｎおよびＨａｔｆｉｅｌｄ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８４年，第７８１巻，ｐ．２０５
【非特許文献１６】ＫａｓｔおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１年，第２２２巻，ｐ．９９
【非特許文献１７】Ｉｂｂａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４年，第３３巻，ｐ．７１０７
【非特許文献１８】ＴａｎｇおよびＴｉｒｒｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年，第４１巻，ｐ．１０６３５
【非特許文献１９】Ｄａｔｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２年，第１２４巻，ｐ．５６５２
【非特許文献２０】Ｄｏｒｉｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９２巻，ｐ．５０１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な概要）
本明細書に開示する一定の実施形態は、外的突然変異体アミノアシルｔＲＮＡ分子、外的突然変異体アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）分子、またはこれらのペア、ならびに該ペアの個々の成分を含む、タンパク質生合成機構において使用される成分の組成物に備えるものである。中でも本明細書において開示するように、外的突然変異体分子は、
非−天然アミノ酸をはじめとするアミノ酸をポリペプチドまたはタンパク質に組み込むことができる、外的突然変異体ｔＲＮＡ、外的突然変異体アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、およびそれらのペアを生成および選択するための方法も提供する。特定の実施形態の一定の組成物は、新規外的突然変異体ｔＲＮＡまたは外的突然変異体アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ対を含む。新規外的突然変異体ｔＲＮＡ分子、ＡＡＲＳ分子、またはＡＡＲＳ−ｔＲＮＡペアを使用して、ポリペプチドに非天然アミノ酸をインビトロおよびインビボで組み込むことができる。本発明の他の実施形態は、外的突然変異体ペアの選択を含む。
【００１０】
本発明の一部の組成物は、外的突然変異体アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを含み、この場合、該外的突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼは、非天然アミノ酸で外的突然変異体ｔＲＮＡを、場合によってはインビボで、優先的にアミノアシル化する。１つの実施形態において、外的突然変異体シンテターゼをコードする核酸もしくはポリヌクレオチド、またはそれらの相補核酸配列を提供する。
【００１１】
従って、一定の実施形態は、改変アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）をコードするポリヌクレオチドを含有する第一ベクターを含む組成物を含み、この場合、該ポリヌクレオチド改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子と対形成するべきアミノ酸との相互作用に必要なアミノ酸結合領域をコードする１つ以上のコドンにて突然変異され、そして該改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子に非−天然アミノ酸をチャージすることができる。一部の実施形態において、前記結合領域は、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下または５個以下の連続したアミノ酸残基を含む。少なくとも１つの実施形態において、前記改変ＡＡＲＳは、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される。前記ＡＡＲＳが改変ＰｈｅＲＳである一部の実施形態において、該ＰｈｅＲＳは、アミノ酸配列位置番号４１２、４１５、４１８および４３７からなる群より選択されるアミノ酸配列位置にて突然変異される。前記改変ＡＡＲＳが改変ＴｒｐＲＳである少なくとも１つの実施形態において、該ＴｒｐＲＳは、アミノ酸配列位置番号４、５、７、１３２、１３３、１４１および１４３からなる群より選択されるアミノ酸位置にて突然変異される。前記改変ＡＡＲＳが改変ＭｅｔＲＳである一部の実施形態において、該ＭｅｔＲＳは、アミノ酸配列位置番号１３にて突然変異される。
【００１２】
少なくとも１つの実施形態は、ｔＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含有する第二ベクターをさらに含む。少なくとも１つの実施形態において、前記第一ベクターおよび前記第二ベクターは、同じベクターである。他の実施形態において、前記第一ベクターおよび前記第二ベクターは、異なるベクターである。
【００１３】
少なくとも１つの実施形態において、前記ｔＲＮＡは、内在性であり、および少なくとも１つの実施形態において、前記ｔＲＮＡは、改変される。少なくとも１つの実施形態において、前記ｔＲＮＡは、天然ｔＲＮＡの親和性より大きい親和性で対応するウォブル縮重コドンと塩基対形成する突然変異アンチコドンを含有するように改変される。一部の実施形態において、前記ＡＡＲＳおよびｔＲＮＡは、同じかまたは異なる生物からのものである。少なくとも１つの実施形態において、前記非−天然アミノ酸は、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、およびｐ−クロロフェニルアラニンからなる群より選択される。
【００１４】
本明細書に開示する他の実施形態は、改変アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）を含むポリペプチドを含み、この場合、該改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子と対形成するべきアミノ酸との相互作用に必要なアミノ酸結合領域内の１つ以上のコドンにて突然変異され、そして該改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子に非−天然アミノ酸をチャージすることができる。少なくとも１つの実施形態において、前記結合領域は、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下または５個以下の連続したアミノ酸残基を含む。
【００１５】
少なくとも１つの実施形態において、前記改変ＡＡＲＳは、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される。前記改変ＡＡＲＳが改変ＰｈｅＲＳである一部の実施形態において、該ＰｈｅＲＳは、アミノ酸配列位置番号４１２、４１５、４１８および４３７からなる群より選択されるアミノ酸配列位置にて突然変異される。前記改変ＡＡＲＳが改変ＴｒｐＲＳである少なくとも１つの実施形態において、該ＴｒｐＲＳは、アミノ酸配列位置番号４、５、７、１３２、１３３、１４１および１４３からなる群より選択されるアミノ酸位置にて突然変異される。前記改変ＡＡＲＳが改変ＭｅｔＲＳである一部の実施形態において、該ＭｅｔＲＳは、アミノ酸配列位置番号１３にて突然変異される。
【００１６】
一定の実施形態は、改変アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）をコードするポリヌクレオチドを含む翻訳系を含み、この場合、該ポリヌクレオチド改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子と対形成するべきアミノ酸との相互作用に必要なアミノ酸結合領域をコードする１つ以上のコドンにて突然変異され、そして該改変シンテターゼは、ｔＲＮＡ分子に非−天然アミノ酸をチャージすることができる。少なくとも１つの実施形態において、前記系は、宿主細胞を含む。少なくとも１つの実施形態において、前記改変アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、宿主細胞とは異なる生物に由来する。もう１つの実施形態において、前記翻訳系は、改変ｔＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００１７】
一定の実施形態において、前記改変ｔＲＮＡ分子は、宿主細胞とは異なる生物に由来する。一定の実施形態において、前記改変ｔＲＮＡ分子は、真核細胞に由来し、前記宿主細胞は、原核細胞である。さらに他の実施形態において、前記細胞は、栄養素要求株である。
【００１８】
一部の実施形態において、前記翻訳系は、１種以上の非−天然アミノ酸を含有する培養基をさらに含む。さらに他の実施形態において、前記１種以上の非−天然アミノ酸は、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、およびｐ−クロロフェニルアラニンからなる群より選択される。さらに他の実施形態において、前記改変ＡＡＲＳは、改変ＰｈｅＲＳ、改変ＴｒｐＲＳ、改変ＴｙｒＲＳおよび改変ＭｅｔＲＳからなる群より選択される。
【００１９】
他の実施形態は、標的ポリペプチドの１つ以上の指定位置に非−天然アミノ酸を組み込むための方法に関し、この方法は、
（１）ポリペプチドの１の指定位置での非−天然アミノ酸の組み込みのための該ポリペプチドの構造変化を決定する工程；
（２）翻訳系を提供する工程；
（３）請求項１に記載の第一ポリヌクレオチド、またはそれによってコードされている改変ＡＡＲＳ、を前記翻訳系に提供する工程；
（４）非−天然アミノ酸を前記翻訳系に提供する工程；
（５）目的とするポリペプチドをコードするテンプレートポリヌクレオチドを前記翻訳系に提供する工程；および
（６）前記テンプレートポリヌクレオチドの翻訳を可能にし、それによって目的とするポリペプチドの指定位置に非−天然アミノ酸を組み込む工程
を含み、
この場合、工程（１）〜（４）は、任意の順序で実施される。
【００２０】
一定の実施形態において、前記翻訳系は、細胞を含む。一部の実施形態において、工程（４）は、非−天然アミノ酸を含有する溶液と前記翻訳系を接触させることによって実施される。少なくとも１つの実施形態において、前記改変ＡＡＲＳによる前記非−天然アミノ酸の活性化についての特異性定数（Ｋｃａｔ／ＫＭ）は、前記天然アミノ酸についてのものより少なくとも５倍大きい。一定の実施形態において、前記改変ＡＡＲＳは、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下または８％以下の率でｔＲＮＡにミスチャージする。さらに他の実施形態において、前記ｔＲＮＡは、改変ｔＲＮＡである。一定の実施形態において、前記第一ポリヌクレオチドまたは前記第二ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡまたはＡＡＲＳの発現を制御する恒常的活性型プロモーター配列または誘導性プロモーター配列のいずれかをさらに含む。少なくとも１つの実施形態において、前記方法は、改変ＡＡＲＳを含有する細胞についてスクリーニングする工程をさらに含む。もう１つの実施形態において、前記方法は、非−天然アミノ酸の組み込みを検証する工程をさらに含む。もう１つの実施形態において、前記改変ＡＡＲＳは、ＰｈｅＲＳ、ＴｙｒＲＳ、ＴｒｐＲＳおよびＭｅｔＲＳからなる群より選択される。さらに他の実施形態は、この開示する方法によって作製されるポリペプチドを含む。
【００２１】
本明細書に開示する一定の実施形態は、少なくとも１つの非−天然アミノ酸を標的ポリペプチドの１つ以上の指定場所に組み込むための方法を含み、この方法は、少なくとも１つの非−天然アミノ酸を含有する翻訳系を提供する工程；改変ＰｈｅＲＳ、ＴｙｒＲＳ、ＴｒｐＲＳおよびＭｅｔＲＳからなる群より選択される１つ以上の改変ＡＡＲＳを該翻訳系に提供する工程；目的とする標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該翻訳系に提供する工程；および目的とする翻訳を可能にし、それによって少なくとも１つの非−天然アミノ酸を該標的ポリペプチドに組み込む工程を含む。一定の実施形態は、この方法によって作製されるポリペプチドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
タンパク質は、光合成および視力からシグナル伝達および免疫応答まで、実質的にすべての生物学的プロセスの岐路にある。非−天然アミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチドの改変が、人間の治療、農業、バイオ燃料および他の分野において使用される可能性は大きい。
【００２３】
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、対応するトランスファーＲＮＡ分子によるタンパク質へのアミノ酸の組み込みのためのアミノアシル化反応を触媒する。シンテターゼ活性の正確な操作により、非カノニカルアミノ酸を所期のｔＲＮＡに安定して取り付けられるようにアミノアシル化特異性を改変することができる。その後、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とｔＲＮＡの間のコドン−アンチコドン相互作用により、アミノ酸類似体を成長ポリペプチド鎖に送達することができる。従って、タンパク質への非−天然アミノ酸の組み込みは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）のアミノ酸特異性の操作に依存する。
【００２４】
アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、二段階アミノアシル化反応により遺伝子コード配列を生体機能性タンパク質に変換するように機能する。最初の段階として、同種アミノ酸をＡＴＰの存在下でＡＡＲＳによって活性化して、アミノ酸アデニレートを形成し；その後、ＡＡＲＳが、そのエステル化反応を触媒して、そのアミノ酸を、その同種ｔＲＮＡの末端リボヌクレオチドの２’−または３’−ＯＨに連結させる。アミノアシル化反応が発生すると、そのアミノ酸は、チャージされたｔＲＮＡによって成長ポリペプチド鎖に向けられる。
【００２５】
本明細書に開示する一定の実施形態は、突然変異体または改変アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳまたはＲＳ）分子（これらは、該シンテターゼと対応する天然アミノ酸の間の分裂に起因してその酵素がｔＲＮＡ分子に代替アミノ酸、好ましくは非−天然アミノ酸をチャージすることができるように、突然変異または改変されている）に関する。
【００２６】
例えば、前記分裂は、ワトソン・クリック塩基対への干渉、ウォブル塩基対への干渉、または新規ウォブルもしくは他の塩基対の生成に起因し得る。
【００２７】
一部の実施形態は、天然アミノ酸についてのｔＲＮＡの突然変異体または改変ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに関し、この場合、該天然アミノ酸は、１つ以上のウォブル縮重コドンによってコードされ、該改変ｔＲＮＡは、該ウォブル縮重コドンのうちの１つとワトソン・クリック塩基対を形成する改変アンチコドン配列を含む。好ましくは、前記改変ｔＲＮＡは、天然アミノ酸についての内在性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）によってチャージされない、または不十分にしかチャージされない。１つの実施形態において、多数の改変ＡＡＲＳ分子を１つ以上のｔＲＮＡ分子と併用することがある。１つの実施形態では、１つ以上の改変または突然変異ＡＡＲＳ分子を１つ以上の天然ｔＲＮＡと併用することがあり、その一方で、もう１つの実施形態では、１つの改変または突然変異ＡＡＲＳを１つの改変または突然変異ｔＲＮＡ分子と併用することがある。一定の実施形態では、改変ＡＡＲＳ／ｔＲＮＡ分子の１つ以上のペアを利用することがある。一定の実施形態では、異種のペアを使用することがある。一定の実施形態において、１つ以上の改変または突然変異ＡＡＲＳおよび／またはｔＲＮＡが、同じ生物に由来することもあり、または異なる生物に由来することもある。
【００２８】
一部の例示的実施形態において、特定のＡＡＲＳは、代替アミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）をポリペプチドまたはタンパク質に組み込むために幾つかの方法を利用することがある。例えば、単一ＡＡＲＳは、ポリペプチドの特定の位置に代替アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を組み込むために、ナンセンスコドン（例えば、アンバー停止コドン）を利用することがある。加えて、またはこの代わりに、ウォブルコドン（例えば、ＵＵＵ）を、そのウォブルコドン部位にその代替アミノ酸を組み込むため使用することができよう（この例では、改変ＰｈｅＲＳを使用する）。
【００２９】
他の例示的実施形態では、多数の代替アミノ酸（例えば、２つの異なる非−天然アミノ酸）を、様々な方法の使用により、ポリペプチドまたはタンパク質に組み込むことができる。例えば、１つの非−天然アミノ酸をウォブル部位に組み込むことができ、その一方で、異なる非−天然アミノ酸をアンバー停止コドンに組み込むことができる。一部の例示的実施形態において、多数の代替アミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）の組み込みは、任意のアミノ酸の多数の異なるアミノ酸類似体のために、または特定の自然発生アミノ酸の多数の異なるアミノ酸類似体すべてのために、１つのＡＡＲＳを利用することを含む。従って、例えば、改変ＰｈｅＲＳを使用して、同じポリペプチドまたはタンパク質に多数の異なるフェニルアラニン類似体、例えばブロモフェニルアラニンおよび／またはｐ−ヨードフェニルアラニン、を組み込むことができる。
【００３０】
類似のアプローチは、異種シンターゼ、およびｔＲＮＡ分子と同じ生物または関連生物の突然変異体開始ｔＲＮＡの使用を含む（例えば、Ｋｏｗａｌら，ＰＮＡＳ，９８，２２６８（２００１）参照）。
【００３１】
一定の実施形態において、改変または突然変異ＲＳは、野生型ＲＳ酵素または野生型の対応するアミノ酸と比較したとき、そのアミノ酸代替物への酵素の改変された結合特異性および／または改変された触媒事象で、（天然アミノ酸であろうと、非天然アミノ酸であろうと）所望のアミノ酸代替物と相互作用する。
【００３２】
酵素反応速度、ｋｃａｔは、全触媒経路において最も遅い段階に相当する一次速度定数である。このｋｃａｔは、（酵素が、基質で「飽和」されている場合に発生する）単位時間当たりの酵素分子当たりの積に変換できる、基質の最大分子数を表し、従って、多くの場合、ターンオーバー数と呼ばれる。Ｋｍは、見掛けの解離定数であり、基質に対するその酵素の親和性に関する。これは、その経路における第一の非可逆的段階の前のすべての解離および平衡定数の積である。多くの場合、これは、酵素−基質解離定数の近似尺度である。ｋｃａｔ／Ｋｍは、遊離酵素を指す（酵素−基質複合体でない）、および酵素触媒の全効率の尺度でもある、および特異性定数とも呼ばれる、二次速度定数である。
【００３３】
一定の実施形態において、外的突然変異体シンテターゼは、自然発生アミノ酸、例えば２０の公知アミノ酸の１つ、と比較して非天然アミノ酸に対して改善または強化された酵素特性を有する（例えば、Ｋｍが、より高いまたはより低い、ｋｃａｔが、より高いまたはより低い、ｋｃａｔ／Ｋｍの値が、より高いまたはより高い、など）。非−天然アミノ酸についての突然変異体または改変ＡＡＲＳのＫｍは、好ましくは、対応する野生型天然アミノ酸についてのものと等しいか、それより低い。
【００３４】
一定の実施形態において、ＲＳ変異体のｋｃａｔ／Ｋｍ値は、自然発生アミノ酸についてのものより、３倍から、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、３８５倍、４００倍高い範囲にわたる。
【００３５】
一定の実施形態において、改変ｔＲＮＡとウォブル縮重コドンとは、好適にはその非改変バージョンとそのウォブル縮重コドンの間の相互作用より少なくとも１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、またはそれ以上の３７℃での親和性で、相互作用する。
【００３６】
例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、２つのコドン、ＵＵＣおよびＵＵＵ、によってコードされる。両方のコドンは、アンチコドン配列ＧＡＡを備えている単一ｔＲＮＡによって読み取られる。従って、ＵＵＣコドンは、コドンとアンチコドンの間の標準的ワトソン・クリック塩基対によって認識され；ＵＵＵは、そのアンチコドンの第一位置でのＧ−Ｕウォブル塩基対によって読み取られる（Ｃｒｉｃｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：５４８，１９９６；Ｓｏｌｌ  ａｎｄ  ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１１３，１９６７）。ＲＮＡ二本鎖の末端変性は、３７℃で、それぞれ４．１、６．５、６．３および２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌというＧ−Ｕ、Ｇ−Ｃ、Ａ−ＵおよびＡ−Ｃの融解のギブス自由エネルギーの推定値を生じた。従って、ウォブル塩基対、Ｇ−Ｕは、ワトソン・クリック塩基対、Ａ−Ｕより安定性が低い。ＡＡＡアンチコドンを装備した改変ｔＲＮＡＰｈｅ（ｔＲＮＡＰｈｅＡＡＡ）がＵＵＵコドンを読み取るように設計作製され、そうしたコドンを野生型ｔＲＮＡＰｈｅＧＡＡより早く読み取ると予測された。
【００３７】
一部の実施形態において、ＲＳの結合ポケットは、改変されたＲＳが対応する自然発生アミノ酸より非−天然アミノ酸に対して優先性を示すように改変される。好ましい実施形態において、ＲＳは、ＲＳとｔＲＮＡにチャージされるアミノ酸との構造的接触に必要な１つ以上のコドンにおいて改変される。一定の実施形態において、突然変異または改変のために選択される１つ以上のコドンは、コンピュータモデリングによって選択される。本開示に従って任意のＲＳを改変できるが、一定の実施形態は、フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）、またはトリプトファンｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）に関する。一部の実施形態において、改変ＲＳは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または別の真核細胞からのものである。他の実施形態において、改変ＲＳは、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の原核細胞からのものである。ＲＳがＰｈｅＲＳである一定の実施形態において、酵素は、その酵素のアルファサブユニット内での点突然変異（Ｎ４１２Ｇ）、（Ｔ４１５Ｇ）、（Ｔ４１５Ａ）、（Ｓ４１８Ｃ）もしくは（Ｓ４３７Ｆ）、または別の種もしくは生物の相同タンパク質における同等の場所もしくは位置での突然変異を有する。前記点突然変異（例えば、位置４１５でのＴからＧもしくはＡへの突然変異、または位置４１８でのＳからＣへの突然変異、または位置４１２でのＮからＧへの突然変異、または位置４３７でのＳからＦへの突然変異）は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）の結合ポケット領域内に位置する。
【００３８】
一部の例示的実施形態において、種々の類似体とＡＡＲＳについての代表的なＫｍ値は、約１５マイクロＭ、２０マイクロＭ、３０マイクロＭ、５０マイクロＭ、７５マイクロＭ、１００マイクロＭ、１５０マイクロＭ、２００マイクロＭ、３００マイクロＭ、４００マイクロＭ、４４０マイクロＭ、５００マイクロＭ、１０００マイクロＭ、１５００マイクロＭ、２０００マイクロＭ、３０００マイクロＭ、４０００マイクロＭ、５０００マイクロＭ、６０００マイクロＭから、もしくはそれ以上の範囲、またはこの間の任意の値であり得る。
【００３９】
同様に、そのアミノ酸類似体についての突然変異体ＡＡＲＳのｋｃａｔ値は、好ましくは、天然アミノ酸についてのものと等しいか、それより高い。例えば、種々の類似体と対応するＡＡＲＳについてのｋｃａｔ値は、約０．００２秒−１、０．００１８秒−１、０．０１５秒−１、０．０１４秒−１、０．１秒−１、０．３秒−１、１秒−１、３秒−１、５秒−１、８秒−１、１０秒−１、１３．３秒−１、１５秒−１から、またはそれより高い範囲であり得る。
【００４０】
従って、アミノ酸類似体についての突然変異体ＡＡＲＳのｋｃａｔ／Ｋｍは、最適には、天然野生型アミノ酸についてのものと等しいか、それより高い。代表的なｋｃａｔ／Ｋｍ値は、約．０００１Ｍ−１秒−１、．０００３Ｍ−１秒−１、．００５Ｍ−１秒−１、．０５Ｍ−１秒−１、．５Ｍ−１秒−１、．５４７Ｍ−１秒−１、１Ｍ−１秒−１、５Ｍ−１秒−１、１０Ｍ−１秒−１、２０Ｍ−１秒−１、３０Ｍ−１秒−１、３２Ｍ−１秒−１、５００Ｍ−１秒−１、６００Ｍ−１秒−１、１０００Ｍ−１秒−１、５０００Ｍ−１秒−１、１１０００Ｍ−１秒−１からの範囲であり得る。
【００４１】
突然変異ＡＡＲＳの点突然変異は、一般に、結合ポケットに関連付けられるが、突然変異のために選択されるＡＡＲＳのアミノ酸は、対応するｔＲＮＡをアミノアシル化することができる（従って、標的ポリペプチドまたはタンパク質に非−天然アミノ酸を組み込むことができる）任意のアミノ酸に改変することができる。
【００４２】
一定の実施形態では、ＡＡＲＳ点突然変異を、試験タンパク質／ポリペプチドへの組み込みに望ましい非−天然アミノ酸の特性に依存して、任意のアミノ酸に改変することができる。一定の実施形態では、ＡＡＲＳの結合ポケット内のアミノ酸を、小さな側鎖を有するアミノ酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸、環状アミノ酸、ヒドロキシルまたは硫黄含有側鎖を有するアミノ酸、芳香族アミノ酸、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸（またはアミド）のためのコドンに突然変異させることができる。特定のポイントでＡＡＲＳを突然変異させるためのアミノ酸の選択は常例的であり、所望される結果、および標的または試験ポリペプチド／タンパク質への組み込みに所望される非−天然アミノ酸に依存する。例えば、ＡＡＲＳ分子の結合ポケットを大きくすることが目標である場合には、ＡＡＲＳを突然変異させるために、脂肪族側鎖または小さな側鎖を有するアミノ酸を選択することができる。他の場合、荷電ポケットを収容する結合ポケットが所望される場合には、ＡＡＲＳの点突然変異のために塩基性または酸性アミノ酸を選択することができる。
【００４３】
本明細書に開示する一定の実施形態は、少なくとも１つの点突然変異によって結合ポケット領域を突然変異させた任意の改変ＲＳ分子を含む。一定の実施形態において、前記点突然変異は、ＲＳが（そのＲＳが、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化する、またはｔＲＮＡ分子にチャージする）アミノ酸と接触する１つ以上の位置にある。一定の実施形態において、多数の点突然変異は、ＲＳがアミノ酸と接触する多数の位置を含む。すなわち、一定実施形態では、ＲＳの全結合ポケット領域の多数のもしくはすべてのコドンを突然変異もしくは改変することができ、またはＲＳの結合ポケット領域の１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれ以上のコドンを突然変異もしくは改変することができる。一定の他の実施形態では、特定のＲＳとアミノ酸の間の構造的結合点に相当するそれぞれのコドンを突然変異または改変することができる。本明細書に開示するように、多数の異なるＲＳ分子をその結合点において様々な種から改変または突然変異されせた。当業者が同じように他のＲＳ相同分子を予想どおりに突然変異させるまたは改変することができる方法のガイダンスを提供する。本明細書に提供する一定の実施形態は、同様の方法で相同ＲＳ分子の結合点の改変および／または突然変異を可能にするだろう。従って、他のＲＳ分子のそうした突然変異または改変は、本明細書に提供するガイダンスにかんがみて常例的実験であろう。
【００４４】
一部の実施形態では、栄養要求宿主細胞または原栄養宿主細胞を含む翻訳系において、停止コドン（例えば、アンバー、オーカーもしくはオパールナンセンスコドン、特定の生物には存在しない停止コドン、任意のナンセンスコドン、４もしくは５塩基対コドン、またはタンパク質中に有意なレベルで存在しない別のアミノ酸、例えばメチオニン）の割当てを可能にするためにサプレッサーｔＲＮＡとともに改変ＲＳを使用して、別のアミノ酸（アミノ酸類似体を含む）を組み込むことができる。従って、ＲＳ酵素は、不規則な基質特異性について、部位特異的様式でのポリペプチドへの非−天然アミノ酸の組み込みを助長するように「再プログラム」することができる。特定の実施形態では、任意の芳香族非−天然アミノ酸を、改変ＰｈｅＲＳまたはＴｒｐＲＳと併用することができる。この再プログラミングにより、栄養要求宿主細胞を使用してまたはせずに、アミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）をポリペプチドまたはタンパク質に高い忠実度で組み込むことができる。
【００４５】
ＡＡＲＳ酵素の再プログラミングは、コンピュータモデリングまたは配列アラインメントをはじめとする構造または生化学分析を必要とすることがある。多くのＡＡＲＳ分子についての配列情報を、例えばＧｅｎＢａｎｋで、入手できるので、目的とする特定の配列領域が決定されたら、配列アラインメントの比較は常例的手順である。
【００４６】
栄養要求宿主細胞の使用は、非−天然アミノ酸の組み込みレベルを増加させることができ、または所望の非−天然アミノ酸以外の別のアミノ酸の組み込みレベルを減少させることができる。例えば、前記宿主における野生型ＡＡＲＳの発現により細胞アミノアシル化反応性を向上させた後、本発明者らは、驚くべきことに、栄養要求宿主細胞が不在の状態ででさえ、不活発なアミノ酸類似体の一部もタンパク質に導入され得ることを発見した。
【００４７】
一定の実施形態において、１つ以上の改変または突然変異体ＡＡＲＳ分子、１つ以上の改変または突然変異体ｔＲＮＡ分子、または両方の発現は、構成もしくは誘導性プロモーターまたは他の誘導性発現系によって調節することができる。
【００４８】
本明細書に開示する一定に実施形態は、任意のタンパク質の任意の所望の位置での１つ以上の非天然アミノ酸の部位選択的挿入を可能にすることに関し、（ｉｉ）は、原核細胞と真核細胞の両方に適用可能であり、ならびに大量の精製突然変異体タンパク質の産生に加えてインビボでの突然変異体タンパク質の研究を可能にする。加えて、一定の実施形態は、多種多様な非天然アミノ酸のいずれかをインビボでタンパク質に組み込むことへの適応に関する。従って、特定のポリペプチド配列では、非天然アミノ酸の多数の異なる部位選択的挿入が可能である。こうした挿入は、場合によってはすべて同じタイプであり（例えば、１つのポリペプチドの多数のポイントに挿入される、１つ非天然アミノ酸タイプの多数の例）、または場合によっては異なるタイプである（例えば、異なる非天然アミノ酸タイプが、１つのポリペプチドの多数のポイントに挿入される）。
【００４９】
本明細書に開示する１つの驚くべき結果は、ＡＡＲＳ酵素の合成部位の再設計によって、ポリペプチドまたはタンパク質に代替アミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）を導入する能力を拡大することができることを示している。一部の実施形態において、ＡＡＲＳを改変または突然変異させる組成物および方法は、その改変または突然変異体ＡＡＲＳの編集機能の改変を場合によっては含むことがある。一部の実施形態において、前記改変または突然変異体ＡＡＲＳの編集または校正能力は、野生型（未改変）ＡＡＲＳのものとほぼ等しい。他の実施形態において、前記改変または突然変異体ＡＡＲＳの編集または校正能力は、低減される。さらに他の実施形態において、前記改変または突然変異体ＡＡＲＳの編集または校正能力は、消去される。一部の一定の実施形態において、ＡＡＲＳの編集または校正機能の改変は、代替アミノ酸を収容するためのＡＡＲＳの改変（例えば、ＡＡＲＳの結合ポケットへの改変）に固有である。他の実施形態では、代替アミノ酸を収容するためのＡＡＲＳの改変に加えて、編集または校正機能に対する改変を行うことができる。さらに他の実施形態において、ＡＡＲＳの編集または較正機能は、改変されない。従って、ＡＡＲＳの結合ポケットの改変または改変に加えて、改変ＡＡＲＳの較正または編集ドメインも改変して、（内在性ｔＲＮＡであろうと、外的突然変異体ｔＲＮＡであろうと）ｔＲＮＡへの代替アミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）のアミノアシル化の特異性を増大させ、その上、形成し得る野生型アミノ酸−アデニレートを場合によっては加水分解し、結果として代替アミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）のポリペプチドまたはタンパク質への組み込みのより大きな忠実性または特異性を生じさせることができる。
【００５０】
一部の実施形態において、非−天然アミノ酸の組み込み率は、改変ＲＳを利用すると、約６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であった。
【００５１】
特に、本明細書に開示するように、改変される正確なＲＳの結晶構造、または相同ＲＳの結晶構造を酵素−アミノ酸相互作用の分子モデリングのために用いて、ＲＳと対応する自然発生アミノ酸との接触点、および／またはＲＳとポリペプチドに組み込むことが望まれる選択された非−天然アミノ酸との接触点を決定することができる。例えば、本明細書における一定の実施形態では、フェニルアラニンと複合したＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＰｈｅＲＳの結晶構造をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰｈｅＲＳの分子モデリング設計のために用いた。これらのシンテターゼの活性部位領域における約４０％の配列同一性のためである。位置４１５のトレオニンからグリジンまたはアラニンの突然変異（それぞれ、Ｔ４１５ＧまたはＴ４１５Ａ）は、その活性化部位を拡大し、より大きなフェニルアラニン類似体の収容を可能にした。特定のＲＳに指定される自然発生アミノ酸とのワトソン・クリック塩基対を破断するこのような突然変異は、非−天然アミノ酸の組み込みの特異性を増大させ、別のアミノ酸の誤った組み込みを減少させることができる。実施例および図に示すように、（Ｔ４１５）酵母フェニルアラニンアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）は、自然発生フェニルアラニン対してよりブロモフェニルアラニンに対して、５倍の優先性を示した。従って、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子（ＲＳ）を、所望のアミノ酸が、その特定のＲＳおよび所望のアミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）の特性に依存して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上、優先的に組み込まれるように、改変することができる。
【００５２】
もう１つの特定の実施形態において、ＴｒｐＲＳ（トリプトファンアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ）活性部位は、一般に、嵩高い非−天然アミノ酸を収容することができ、他の特定の点突然変異は、アミノ酸組み込みに関するさらなる特異性を可能にすることができる。例えば、ＴｒｐＲＳの位置１３２におけるＤの点突然変異によって疎水性アミノ酸に改変することができ、これが、嵩高い非−天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン誘導アミノ酸）の組み込みを可能にする。さらに、認識が非−天然アミノ酸の特定に官能基に対して発生する場所の結合部位における他の特定の位置での突然変異は、所望のアミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）の組み込みの特異性増大および／またはより高い忠実度を可能にし得る。
【００５３】
１つの特定の実施形態において、結合したＰｈｅのアリール環のパラ位周辺の空間は、Ｔｒｐなどの他の芳香族アミノ酸を中に入れないが、ｐＢｒＦなどの非−天然アミノ酸を尚、収容するように、わずかに減少させることができることが判明した。従って、１つの実施形態は、エチレンまたはアセチレン反応パートナーとのパラジウム触媒交叉カップリングにより化学選択的ライゲーションをもたらすことによる、ポリペプチドへのプログラムされた位置での臭化アリール官能基の組み込みを開示する。こうした再プログラムまたは改変されたＲＳは、任意の数の宿主（栄養要求宿主細胞を含む）において用いることができるが、一定の実施形態の改変ＲＳの所望のアミノ酸の高い組み込み効率レベル、ならびに高いタンパク質生産収率は、栄養要求宿主の使用を不要にする。
【００５４】
ほぼすべてのアミノ酸シンテターゼについての活性部位領域は判っているか、容易に導出されるので、自然発生アミノ酸から非−天然アミノ酸までアミノ酸の特異性を再プログラムしようとする際、成功を期待して、および過度の実験を伴わずに、そうした例示的技法を他のＡＡＲＳに適用することができる。
【００５５】
実例となる例として、酵母ＰｈｅＲＳにおける位置４１５のトレオニンは、Ｅ．ｃｏｌｉＰｈｅＲＳにおけるトレオニン２５１に相当する。従って、酵母ＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）の突然変異は、様々なＰｈｅ類似体の活性化を可能にする（本明細書における実施例参照）。さらに、点突然変異および／または栄養要求宿主細胞の使用により、Ｔ４１５Ｇ酵母ＰｈｅＲＳ変異体における誤った組み込みを減少させることができた。
【００５６】
本明細書に開示するもう１つの特定の実施形態において、アミノ酸位置３０とアミノ酸位置４０の間のワトソン・クリック塩基対を破断する突然変異体酵母トランスファーＲＮＡ（ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ）に、共発現酵母フェニルアラニンによって、ｐ−ブロモ−フェニルアラニン（ｐＢｒＦ）をチャージした。一定の実施形態において、ＡＡＲＳのアミノ酸結合ポケットは、約２００、約１００、約７５、約５０、約２５、約１０、約５またはそれ以上もしくは以下のアミノ酸を構成する。一部の実施形態において、活性または結合部位において突然変異されるアミノ酸は、連続したアミノ酸ストレッチである。他の実施形態において、突然変異されるアミノ酸は、互いにきわめて接近して位置するが、連続していない。
【００５７】
一定の実施形態において、天然アミノ酸は、２つ以上の遺伝子コードによってコードされる（従って、縮重遺伝子コードによってコードされる）。すべての場合ではないかもしれないが、ほとんどの場合、これは、２０個の天然アミノ酸のうち、ＭｅｔおよびＴｒｐを除く、１８個を含む。これらの状況下、天然アミノ酸についてのすべての縮重遺伝子コードを認識するために、野生型ｔＲＮＡのアンチコドンループは、ウォブル塩基対と純粋なワトソン・クリック塩基対の両方に頼る。本改変ｔＲＮＡは、改変されたアンチコドンループが、前はウォブル塩基対だけでそのｔＲＮＡが結合していた縮重遺伝子コードの１つへのワトソン・クリック塩基対を今や形成するような少なくとも１つの改変を、そのアンチコドンループに有する。
【００５８】
ワトソン・クリック塩基対は、ウォブル塩基対より常に強く、安定であるので、本改変ｔＲＮＡは、前のウォブル塩基対遺伝子コード（今やワトソン・クリック塩基対による）に、前のワトソン・クリック塩基対（今やウォブル塩基対による）より優先的に結合するであろう。従って、類似体は、本コドンに、天然アミノ酸（これは、この問題のコドンによってコードされる天然アミノ酸と同じであってもよいし、なくてもよい）の類似体が改変ｔＲＮＡにチャージされている場合、組み込むことができる。
【００５９】
従って、一定の実施形態において、一定のアミノ酸類似体をＭｅｔまたはＴｒｐについてのコドンに組み込むことが望ましい場合、天然アミノ酸についてのｔＲＮＡ（例えば、Ｍｅｔ  ｔＲＮＡ、Ｔｒｐ  ｔＲＮＡ、またはさらにＰｈｅ  ｔＲＮＡなど）を、ＭｅｔまたはＴｒｐコドンを認識するように改変することができる。このタイプのユニークな状況下、改変ｔＲＮＡと天然ｔＲＮＡの両方が、ワトソン・クリック塩基対によって同じ（単一の）遺伝子コードに結合しようと競合する。すべてではないが一部のコドンは、それらの天然アミノ酸を受け入れるであろうが、他のものは、改変ｔＲＮＡによって担持されたアミノ酸類似体を受け入れることがある。他の要因、例えば、天然アミノ酸の存在度  対  類似体の存在度が、最終結果に影響を及ぼすこともある（本明細書に開示する実施例参照）。
【００６０】
一定の好ましい実施形態において、改変ｔＲＮＡは、任意の天然アミノ酸についての内在性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）によってチャージされない、または不十分にしかチャージされないので、その改変ｔＲＮＡは、天然アミノ酸ではなく、（排他的ではないにせよ）主としてアミノ酸類似体を担持する。本改変ｔＲＮＡは、内在性ＡＡＲＳによって天然アミノ酸をチャージすることできる場合でも有用であり得る。
【００６１】
一定の実施形態において、アミノ酸類似体がチャージされた改変ｔＲＮＡは、その類似体−ｔＲＮＡがリボソーム的に許容される複合体である、すなわち、そのｔＲＮＡ−類似体複合体がインビボまたはインビトロ翻訳系における原核生物または真核生物リボソームによって許容され得る、ような総合的形状およびサイズを有する。
【００６２】
好ましくは、改変ＡＡＲＳは、改変ｔＲＮＡに類似体をいずれの天然アミノ酸より特異的にまたは優先的にチャージする。好ましい実施形態において、改変ＡＡＲＳによる類似体の活性化についての特異性定数（Ｋｃａｔ／ＫＭと定義する）は、天然アミノ酸ものと同じであるか、それより少なくとも約２倍大きい、好ましくは、天然アミノ酸のものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上大きい。
【００６３】
一定の実施形態において、改変ｔＲＮＡは、翻訳効率増大のために第四の拡張アンチコドン部位での突然変異をさらに含む。
【００６４】
拡張コドンの使用は、翻訳のフレームシフト抑制に基づく。４塩基コドンは、同じタンパク質に多数の非−天然アミノ酸を挿入する可能性を有する。例えば、４重項ＵＡＧＡは、１３から１６％の効率で、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕにより、解読され得る（例えば、Ｍｏｏｒｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５（２０００）参照）。単独の拡張コドンの使用は、拡張コドン内の３重項が全フレームシフト抑制と競合するので、最初の３塩基のフレーム内での読み過ごしなどの潜在的な問題を有する。場合により、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡張コドンは、他の望ましくない部位でのミスセンス読み過ごしおよびフレームシフト抑制を減少させることができる。しかし、これらの問題は、本明細書に開示する一部の実施形態に示すような拡張コドン／アンチコドンならびに改変ＡＡＲＳおよび／またはｔＲＮＡの使用で、克服することができる。
【００６５】
従って、要約すると、代替アミノ酸（自然発生アミノ酸または非−天然アミノ酸を含む）の組み込みのための突然変異体もしくは改変ＡＡＲＳおよび／または改変もしくは突然変異体ｔＲＮＡによる本明細書に開示する方法での使用のために特定のコドンが確保される。こうした方法としては、停止（ＴＡＧ）コドンを読み取るアンバー（ａｍｂｅｒ）（オーカー、オパール（ｕｍｂｅｒ）、または他のサプレッサーｔＲＮＡ）解読；コドンバイアスの原因である未使用ｔＲＮＡを活用するバイアス解読；ウォブルコドン、および４塩基もしくは５塩基（またはそれ以上の）アンチコドンを使用する突然変異体「サプレッサー」ｔＲＮＡを使用する拡張（４〜５塩基またはそれ以上の）コドンを読み取る新たなｔＲＮＡを作るウォブル解読の使用が挙げられる。
【００６６】
少なくとも１つの他の実施形態は、標的タンパク質の１つ以上の指定位置にアミノ酸類似体を組み込むための方法を提供し、この方法は、（１）ある環境に改変ｔＲＮＡ、すなわち本改変ｔＲＮＡ、のための第一の本ポリヌクレオチドを供給すること；（２）その環境に改変ＡＡＲＳをコードする第二の本ポリヌクレオチドを供給すること（この場合、該改変ＡＡＲＳは、該改変ｔＲＮＡに類似体をチャージすることができる）；（３）その環境にその類似体を供給すること；（４）標的タンパク質をコードするテンプレートポリヌクレオチドを供給すること（この場合、指定位置のための該テンプレートポリヌクレオチド上のコドンは、該改変ｔＲＮＡとしかワトソン・クリック塩基対を形成しない）；および（５）該テンプレートポリヌクレオチドの翻訳を進行させ、それによって該標的タンパク質の指定位置に該類似体を組み込むことを含み、前記工程（１）〜（４）は、任意の順序で実施される。
【００６７】
一定の実施形態において、前記方法は、例えば、質量分析法；タンパク質配列決定；蛍光、放射活性などによるアミノ酸標識付け；ＥＬＩＳＡ、または他の抗体スクリーニング、機能的アッセイもしくはスクリーニング；あるいは他の方法によって、前記類似体の組み込みを検証することをさらに含む。
【００６８】
一定の実施形態において、前記方法は、前記類似体を前記位置に少なくとも約５０％、または６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくはほぼ１００％の効率で組み込む。
【００６９】
（定義）
一定の実施形態を詳細に説明する前に、本発明が特定の組成物または生体系に限定されず、それらは、勿論、様々であることを理解しなければならない。本明細書で用いる専門用語が、特定の例証的実施形態の説明のみを目的とするものであり、限定するためのものではないことも理解しなければならない。本明細書および添付のクレームにおいて用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明瞭に別様に指示していない限り、多数の指示対象を含む。従って、例えば、「分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｒｅ）」への言及は、２つ以上のそうした分子の組み合わせなどを場合によっては含む。
【００７０】
下で特に定義されていなければ、本明細書において、本発明の全体的文脈の中で、およびそれぞれの用語が用いられている特定の文脈の中で用いる用語は、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を一般に有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのようにして作り、使用するかを説明する上で当業者に追加のガイダンスを提供するために、一定の用語を下または本明細書の別の箇所において論じる。ある用語のいずれの使用についての範囲および意味も、その用語が用いられている特定の文脈から明らかになろう。
【００７１】
「約」および「ほぼ」は、測定の性質または精度を想定して、測定された量についての許容される程度の誤差を一般に意味するであろう。一般に、誤差の例示的な程度は、所与の値または値範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、およびさらに好ましくは５％以内である。あるいは、および特に生体系では、用語「約」および「ほぼ」は、所与の値の一桁以内、好ましくは５倍以内、およびさらに好ましくは２倍以内である。本明細書に与える数的量は、別様の述べられていない限り近似値であり、これは、はっきりと述べられていない場合には用語「約」または「ほぼ」が推量され得ることを意味する。
【００７２】
「アミノ酸類似体」、「非カノニカルアミノ酸」または「非標準的アミノ酸」、「非−天然アミノ酸」、「非天然アミノ酸」などは、すべて、交換可能に用いることができ、これは、自然発生タンパク質中で一般に見出される２０のＬ−アミノ酸（ＷＩＰＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２，Ｔａｂｌｅ  ３において定義され、列挙されているとおりの、ＡｌａまたはＡ、ＣｙｓまたはＣ、ＡｓｐまたはＤ、ＧｌｕまたはＥ、ＰｈｅまたはＦ、ＧｌｙまたはＧ、ＨｉｓまたはＨ、ＩｌｅまたはＩ、ＬｙｓまたはＫ、ＬｅｕまたはＬ、ＭｅｔまたはＭ、ＡｓｎまたはＮ、ＰｒｏまたはＰ、ＧｌｎまたはＱ、ＡｒｇまたはＲ、ＳｅｒまたはＳ、ＴｈｒまたはＴ、ＶａｌまたはＶ、ＴｒｐまたはＷ、ＴｙｒまたはＹ）のうちの１つ以上に構造および／または総合的形状の点で類似しているすべてのアミノ酸様化合物を包含する意味をもつ。アミノ酸類似体は、改変された側鎖または骨格を有する天然アミノ酸である場合もある。アミノ酸は、Ｌ形ではなくＤ形の天然アミノ酸である場合もある。好ましくは、ＡＡＲＳの通常は高い特異性のため、これらの類似体は、通常、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）にとっての「基質」ではない。場合によってではあるが、天然アミノ酸のものに十分に近い構造または形状を有する一定の類似体は、ＡＡＲＳ、特に、基質特異性が緩和された改変ＡＡＲＳにより、タンパク質に誤って組み込まれることがある。好ましい実施形態において、類似体は、１つ以上の天然アミノ酸の骨格構造を、および／または大部分の側鎖構造をも共有し、唯一の違いは、分子内に１つ以上の改変された基を含有することである。こうした改変としては、原子（例えば、Ｎ）での関連原子（例えば、Ｓ）の置換、基（例えば、メチルもしくはヒドロキシル基など）または原子（例えば、ＣｌもしくはＢｒなど）の付加、基（上記）の欠失、共有結合の置換（単結合での二重結合の置換など）、あるいはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。アミノ酸類似体としては、α−ヒドロキシ酸、およびβ−アミノ酸を挙げることができ、ならびにアミノ酸類似体を「改変アミノ酸」または「非天然ＡＡＲＳ基質」と呼ぶこともある。
【００７３】
アミノ酸類似体は、天然のものである場合もあり、非天然のもの（例えば、合成されたもの）である場合もある。当業者には理解されるであろうが、１セットのロータマーが知られている、またはそれを生じさせることができる、いずれの構造も、アミノ酸類似体として使用することができる。側鎖は、（Ｒ）配置もしく（Ｓ）配置（または、ＤもしくはＬ配置）のいずれであってもよい。好ましい実施形態において、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ配置である。
【００７４】
好ましくは、アミノ酸類似体の総合的形状およびサイズは、（天然のまたは改変もしくは再設計された）ＡＡＲＳによって（天然のまたは改変もしくは再設計された）ｔＲＮＡにチャージされたとき、その類似体−ｔＲＮＡが、リボソーム的に許容される複合体である、すなわち、ｔＲＮＡ−類似体複合体が、インビトロまたはインビボ翻訳系において原核生物または真核生物のリボソームによって許容され得る、ような形状およびサイズである。
【００７５】
「アンカー残基」は、ＡＡＲＳと天然アミノ酸骨格の間の重要な相互作用を維持するＡＡＲＳ内の残基位置である。
【００７６】
「骨格」または「テンプレート」は、タンパク質（例えば、ＡＡＲＳ）の骨格原子および任意の固定側鎖（たとえば、アンカー残基側鎖）を含む。計算のために、類似体の骨格をＡＡＲＳ骨格の一部として処理する。
【００７７】
本明細書における「タンパク質骨格構造」または文法的相当語句は、特定のタンパク質の三次元構造を規定する三次元座標を意味する。（自然発生タンパク質の）タンパク質骨格構造を構成する構造は、窒素、カルボニル炭素、α−炭素およびカルボニル酸素とともに、α−炭素からβ−炭素へのベクターの方向である。
【００７８】
コンピュータによる分子構造または相互作用予測のためにコンピュータにインプットされるタンパク質骨格構造は、骨格とアミノ酸側鎖の両方についての座標である場合もあり、または骨格だけについての（すなわち、アミノ酸側鎖についての座標を除去した）座標である場合もある。前者を行えば、そのタンパク質構造のそれぞれのアミノ酸の側鎖原子を、当該技術分野において知られているようにタンパク質の構造から「ストリップ」または「除去」し、それによって「骨格」原子（窒素、カルボニル炭素および酸素、およびα−炭素、ならびに窒素およびα−炭素についている水素原子）についての座標のみを残すことができる。
【００７９】
場合により、下で概説する分析の前にタンパク質骨格構造を変更してもよい。この実施形態では、出発タンパク質骨格構造の表示がその二次構造要素の立体配置の説明記述に縮小される。二次構造要素の相対位置は、超二次構造パラメーターと呼ばれる１セットのパラメーターによって規定される。これらのパラメーターは、明確な骨格の可撓性を誘導するように二次構造要素の配置を変更するために系統的にまたはランダムに変えることができる割当て値である。次に、それらの変更された超二次構造パラメーターを反映するようにその骨格の原子座標を変化させ、これらの新たな座標を、その後のタンパク質設計自動化で用いるために、システムにインプットする。詳細については、米国特許第６，２６９，３１２号参照（この全内容が、本明細書に参照により取り入れられている）。
【００８０】
「配座エネルギー」は、高分子の特定の「配座」、すなわち三次元構造、に関連したエネルギー、例えば、特定のタンパク質の配座に関連したエネルギーを一般には指す。タンパク質を安定させる傾向がある相互作用は、負のエネルギー値として表されるエネルギーを有し、これに対して、タンパク質を不安定にする相互作用は、正のエネルギー値を有する。従って、いずれの安定なタンパク質についての配座エネルギーも、負の配座エネルギー値によって定量的に表される。一般に、特定のタンパク質についての配座エネルギーは、タンパク質の安定性に関係付けられるであろう。特に、より低い（すなわち、より負の）配座エネルギーを有する分子は、一般に、例えば、より高温で、より安定である（すなわち、それらは、より大きな「熱安定性」を有する）。従って、タンパク質の配座エネルギーを「安定化エネルギー」と呼ぶこともできる。
【００８１】
一般に、配座エネルギーは、分子の配座に依存する様々な相互作用からのエネルギー寄与率を計算するエネルギー「力場」を用いて計算される。力場は、アルファ炭素骨格、側鎖−骨格相互作用、および側鎖−側鎖相互作用の配座エネルギーを含む項から成る。一般に、骨格または側鎖との相互作用は、結合回転、結合ねじれ、および結合長についての項を含む。骨格−側鎖および側鎖−側鎖相互作用は、ファンデルワールス相互作用、水素結合、静電および溶媒和の項を含む。静電相互作用は、クーロン相互作用、双極子相互作用および４極子相互作用を包含し得る。他の類似の項も含むことがある。ポリマーについての配座エネルギーを決定するために用いることができる力場は、当該技術分野において周知であり、幾つか挙げてみると、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９８３，４：１８７−２１７；ＭａｃＫｅｒｅｌｌら，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１：２７１−２７７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，１９９８参照）、ＡＭＢＥＲ（Ｃｏｒｎｅｌｌら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７：５１７９；Ｗｏｏｄｓら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９５  ９９：３８３２−３８４６；Ｗｅｉｎｅｒら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９８６，７：２３０；およびＷｅｉｎｅｒら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８４，１０６：７６５参照）およびＤＲＥＩＤＩＮＧ（Ｍａｙｏら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９０，９４−：８８９７参照）力場などが挙げられる。
【００８２】
好ましいインプレメンテーションでの水素結合および静電の項は、Ｄａｈｉｙａｔ  ＆  Ｍａｙｏ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７  ２７８：８２）に記載されているとおである。力場は、他の参考文献におけるように、原子配座の項（結合角、結合長、ねじれ）を含めて記述することもできる。例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１２：６５７６６２（１９９９）；Ｓｔｉｋｏｆｆら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，６７：２２５１−２２６０（１９９４）；Ｈｅｎｄｓｃｈら，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，３：２１１−２２６（１９９４）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：５７４２−５７４３（１９９７）；Ｓｉｄｅｌａｒら，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，７：１８９８−１９１４（１９９８）参照。溶媒和の項も含まれることがある。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１１２５９−１１２６９（１９９３）；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：１９９−２０３（１９８６）；Ｓｔｒｅｅｔ  Ａ  Ｇ  ａｎｄ  Ｍａｙｏ  Ｓ  Ｌ，Ｆｏｌｄｉｎｇ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２５３−２５８（１９９８）；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｗｅｓｓｏｎ，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，１：２２７−２３５（１９９２）；Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｍａｙｏ，上記、参照。
【００８３】
「カップルド残基」は、任意のメカニズムにより相互作用する、分子中の残基である。従って、２残基間の相互作用は、「カップリング相互作用」と呼ばれる。カップルド残基は、一般に、カップリング相互作用によってポリマーの適合性に一般に寄与する。一般に、カップリング相互作用は、物理的または化学的相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、またはこれらの組み合わせである。カップリング相互作用の結果としてのいずれかの残基のアイデンティティーの変更は、特に、その変更がそれら２残基間のカップリング相互作用を崩壊させる場合、その分子の「適合性」に影響を及ぼすであろう。カップリング相互作用は、分子内の残基間の距離パラメーターによって記述されることもある。残基が一定のカットオフ距離内にある場合、それらは、相互作用しているとみなされる。
【００８４】
「適合性」は、分子、例えばタンパク質、の特定の特性または特性の組み合わせが最適化されるレベルまたは程度を示すために用いている。本発明の一定の実施形態において、タンパク質の適合性は、好ましくは、使用者が改善を望む特性によって決定される。従って、例えば、タンパク質の適合性は、そのタンパク質の熱安定性、触媒活性、結合親和性、溶解度（例えば、水性または有機溶媒への溶解度）などを指すことがある。適合特性の他の例としては、エナンチオ選択性、非天然基質に対する活性、および代替触媒メカニズムが挙げられる。カップリング相互作用は、適合性（安定性）を評価または予測する方法としてモデリングすることができる。適合性は、実験的にまたは理論的に、例えばコンピュータを使用して、決定または評価することができる。
【００８５】
好ましくは、適合性は、それぞれの分子、例えばそれぞれのアミノ酸が、個々の「適合性値」を有するように、定量される。例えば、タンパク質の適合性は、そのタンパク質が特定の化学反応を触媒する速度、またはリガンドに対するそのタンパク質の結合親和性であり得る。特に好ましい実施形態において、タンパク質の適合性は、ポリマーの配座エネルギーを指し、例えば、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて計算することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７−２１７（１９８３）；Ｍａｙｏら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，９４：８８９７−８９０９（１９９０）；Ｐａｂｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：５９８７−５９９１（１９８６），Ｌａｚａｒら，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，６：１１６７−１１７８（１９９７）；Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：４４８−４５１（１９９１）；Ｃｏｌｏｍｂｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：６８９５−６９０３（１９９９）；Ｗｅｉｎｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４（１９８４）参照。一般に、タンパク質の適合性は、その特性または特性の組み合わせが最適化されるにつれてその適合性値が増加するように、定量される。例えば、タンパク質の熱安定性を最適化することとなる（好ましくは、配座エネルギーを減少させる）実施形態において、適合性値は、負の配座エネルギーである、すなわち、Ｆ＝−Ｅ。
【００８６】
タンパク質残基の「適合性寄与率」は、アイデンティティーａを有する残基ｉａが、そのタンパク質の全適合性に寄与するレベルまたは程度ｆ（ｉａ）を指す。従って、例えば、特定のアミノ酸残基の変更または突然変異が、一般に、そのタンパク質の適合性を低下させる場合、その残基は、そのポリマーに対する高い適合性寄与率を有すると言われる。対照的に、タンパク質中の一部の残基ｉａは、一般に、そのタンパク質の適合性に影響を及ぼさない様々な可能なアイデンティティーを有することがある。従って、こうした残基は、そのタンパク質適合性に対して低い寄与率を有する。
【００８７】
「デッドエンド排除（Ｄｅａｄ−ｅｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）」（ＤＥＥ）は、不良ロータマーおよびロータマーの組み合わせを、単一解が残るまで、系統的に削除しようと努める決定的検索アルゴリズムである。例えば、アミノ酸残基を、固定骨格と相互作用するロータマーとしてモデリングすることができる。ＤＥＥの理論的基礎は、ＤＥＥ検索が収束した場合、その解は、不確実性を伴わない大域的最小エネルギー配座（ｇｌｏｂａｌ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＧＭＥＣ）であると規定している（Ｄｅｓｍｅｔら，１９９２）。
【００８８】
デッドエンド排除は、次の概念に基づく。残基ｉでの２つのロータマー、ｉｒおよびｉｔ、ならびに（ロータマーｊｓがメンバーである）ｉを除くすべての残基でのすべての他のロータマー配座｛Ｓ｝を考える。ｉｒとｊｓの間に寄与するペアでのエネルギーが、すべての｛Ｓ｝について、ｉｔとｊｓの間に寄与するペアでのエネルギーより高い場合には、ロータマーｉｒは、その大域的最小エネルギー配座で存在することができず、排除することができる。この概念は、次の不等式によって数学的に表される。
【００８９】
【数１】
2009528824.tif 000003
この式が真である場合、単一のロータマーｉｒを排除することができる（Ｄｅｓｍｅｔら，１９９２）。
【００９０】
この形での方程式Ａは、コンピュータで扱いにくい。排除を行うために、全配列（ロータマー）空間を数え上げる必要があるからである。この問題を簡単にするために、方程式Ａに含まれる範囲を利用することができる：
【００９１】
【数２】
2009528824.tif 000004
類似の独立変数を用いて、方程式Ｂを、ＧＭＥＣと一致しないロータマーペアの排除に広げることができる。これは、残基ｊでのロータマーｉｒと残基ｊでのロータマーｊｓとのペアが、すべての可能なロータマーの組み合わせ｛Ｌ｝でのロータマーｉｕおよびｊｖより高いエネルギーを常に与えることを決定することによって行われる。方程式Ｂと同様に、この言明の厳格な範囲は、
【００９２】
【数３】
2009528824.tif 000005
（この式中、εは、ロータマーペアについての併せたエネルギーである）
【００９３】
【数４】
2009528824.tif 000006
および
【００９４】
【数５】
2009528824.tif 000007
によって与えられる。
【００９５】
これは、ロータマーｉｒおよびｊｓのペアの二重排除につながるが、個々のロータマーを完全に排除することはできない。いずれも、独立して、ＧＭＥＣで存在することがあるからである。二重排除段階は、方程式６の右側で評価する必要がある可能なペアの数を減少させ（Ｓを減少させ）、それによってより多くのロータマーを個々に排除するとができる。
【００９６】
Ｄｅｓｍｅｔらによって提示された単一および二重の基準では、よりデッドエンドしているロータマーの決定につながる特別な条件を発見することができない。例えば、ロータマーｉｔのエネルギー寄与がｉｒより常に低く、ｉｒの最低値より低いｉｔの最高値はないという可能性がある。この問題に取り組むために、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  １９９４は、２つのロータマーのエネルギープロフィールが交差するかどうかを決定する基準の修正を提示した。それらがしない場合、エネルギーが高いほうのロータマーをデッドエンドしていると決定することができる。この二重計算は、単一計算より有意に長いコンピュータ計算時間を使用する。この処理を加速するために、最も成果が上がるであろう二重計算を予測する他のコンピュータ計算法が開発された（Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｍａｙｏ，１９９８）。総称してｆａｓｔ  ｄｏｕｂｌｅと呼ばれるこれらの種類の改良は、ＤＥＥの速度および有効性を向上させた。
【００９７】
幾つかの他の改良もＤＥＥを向上させる。多数の残基からのロータマーを併せていわゆるスーパー・ロータマーにして、さらなる排除を促すことができる（Ｄｅｓｍｅｔら，１９９４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９４）。これは、たった一段階で多数のロータマーを排除する長所を有する。加えて、ロータマー間の配座空間の「分割」がＤＥＥの効率を向上させることが証明された（Ｐｉｅｒｃｅら，２０００）。分割は、以下の特別なケースに対処する。ロータマーｉｒを考える。ロータマーｉｔ１が、その配座空間の一部分についてｉｒより低いエネルギーの一因となり、ロータマーｉｔ２が、その残りのフラクションについてｉｒより低いエネルギーを有する場合には、ｉｒを排除することができる。このケースは、あまり感度が高くないＤｅｓｍｅｔまたはＧｏｌｄｓｔｅｉｎ基準では検出することができない。本明細書に記載するような好ましいインプレメンテーションでは、記載するすべてのＤＥＥ向上法を用いた。
【００９８】
これらの方法のさらなる考察のために、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６６，１３３５−１３４０（１９９４）；Ｄｅｓｍｅｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，５３９−５４２（１９９２）；Ｄｅｓｍｅｔら，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｐｒｏｂｌｅｍ  ａｎｄ  Ｔｅｒｔｉａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｊｒ．，Ｋ．Ｍ．＆  Ｇｒａｎｄ，Ｓ．Ｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ．３０７−３３７（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４）；Ｄｅ  Ｍａｅｙｅｒら，Ｆｏｌｄｉｎｇ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ  ２，５３−６６（１９９７），Ｇｏｒｄｏｎ，ａｎｄ  Ｍａｙｏ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９，１５０５−１５１４（１９９８）；Ｐｉｅｒｃｅら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．２１，９９９−１００９（２０００）を参照のこと。
【００９９】
ＳＣＲＥＭ（側鎖ロータマーエネルギー分析法（Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｒｏｔａｍｅｒ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄ））と呼ばれるもう１つの計算を用いてもよい。ＳＣＲＥＡＭは、特定のＡＡＲＳへの２０の天然アミノ酸の相対結合エネルギーを計算することにより、同種でないアミノ酸を識別するメカニズムを調査することができる。（例えば、ＭｃＣｌｅｎｄｏｎら，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔ．１９：１９５−２０３（２００６）参照）。
【０１００】
第一段階として、他の可動側鎖を有さない空の骨格内の単一のアミノ酸について、ロータマーエネルギースペクトルを計算する。次に、その空の骨格からの最低ロータマーで出発して、側鎖を埋め、不一致を排除する。例えば、空の骨格のスペクトルから低励起状態のエネルギーを予測しながら１部位ごとに側鎖を配置し、不一致を有する配座を排除しながらペアでの相互作用を計算する。例えば、Ｅｔｏｔ（Ａ，Ｂ）＝Ｅｓｅｌｆ（Ａ）＋Ｅｓｅｌｆ（Ｂ）＋Ｅｉｎｔ．（Ａ，Ｂ）＝Ｅｓｅｌｆ（Ａ，Ｂ）およびＥｔｏｔ（Ａ，Ｂ，Ｃ）＝Ｅｓｅｌｆ（Ａ）＋Ｅｓｅｌｆ（Ｂ）＋Ｅｓｅｌｆ（Ｃ）＋Ｅｉｎｔ（Ａ，Ｂ）＋Ｅｉｎｔ（Ａ，Ｃ）＋Ｅｉｎｔ（Ｂ，Ｃ）＝Ｅｓｅｌｆ（Ａ，Ｂ）＋Ｅｓｅｌｆ（Ｃ）＋Ｅｉｎｔ（Ａ，Ｃ）＋Ｅｉｎｔ（Ｂ，Ｃ）＝Ｅｓｅｌｆ（Ａ，Ｂ）＋Ｅｓｅｌｆ（Ｃ）＋Ｅｉｎｔ（ＡＢ，Ｃ）により、再帰的関係が確立される。次に、空の骨格内のロータマーのエネルギー分布の増加が終わるまで、すべての側鎖低励起状態を分析しなければならない。簡単に言うと、すべての残基の基底状態エネルギーを評価し、その後、最低線形和エネルギーを有する１セットのロータマー、最後に、最低から２番目に低い線形和エネルギー、等々と評価する。さらに、チャージがその環境を分極させてそれらのチャージを遮蔽し、所望のアミノ酸相互作用を減少させる場合には、静電相互作用に取り組まなければならない。分子動力学モデリング法は、通常、分極を考慮しないので、バイアスは、塩架橋を優先する。この問題を克服するために、残基を中和し、ＤＲＥＩＤＩＮＧパラメーター表示法に従って再びパラメーターを評価する。
【０１０１】
ＤＲＥＤＩＮＧパラメーター表示法の場合、チャージを失ったものとチャージを有するものの相互作用およびチャージを有するものと双極子との相互作用を水素結合の項の導入によって補正する。これは、本明細書において説明するようなＣＨＡＲＭＭをはじめとする他のプログラムを併用して行うことができる。従って、特定のＡＡＲＳ、または別の生物からの相同ＡＡＲＳ、からの結晶構造を用い、ＳＣＲＥＡＭおよびＨｉｅｒＤｏｃｋまたは他のものなどのプログラムを使用して、どのアミノ酸が特定のＡＡＲＳへの結合について競合するかによって計算を命令することにより、最高結合モードおよび活性化モードで、結合部位における２０の天然アミノ酸のそれぞれについての結合配座および結合エネルギーを予測することができる。
【０１０２】
詳細には、アミノ酸およびＡＴＰ分子を供給して、ＡＡＲＳの活性部位に結合させる、選択的結合を先ず実行する。これは、配座変化をもたらすことがある。次に、そのアミノ酸とＡＴＰとの共有結合の形成を触媒するＡＡＲＳを選択的に活性化することにより、そのＡＡＲＳと複合したアミノアシルアデニレートを形成し、無機ピロリン酸塩を除去する。第三に、同種でないアミノ酸の誤った活性化が発生した場合、ＡＡＲＳは、（転移前較正として）そのアミノアデニル複合体を加水分解により開裂させる。最後に、同種でないアミノアシルアデニレートが生き残った場合、ＡＡＲＳは、アミノアシル−ｔＲＮＡ複合体を加水分解により開裂させることができる（転移後較正）。
【０１０３】
従って、こうしたコンピュータ計算プログラムは、野生型または突然変異体ＡＡＲＳ酵素による結合およびアミノアシル化に競合する天然アミノ酸の尤度の信頼できる予測を可能にする。多数のプログラム（例えば、一緒にＳＣＲＥＡＭおよびＨｉｅｒＤｏｃｋ）を用いることにより、誤った組み込みの率が減少し、ならびにそのアミノ酸に特異的に結合するアミノ酸の場所をより高い予測精度で選択することができる。
【０１０４】
さらに他のコンピュータモデリングプログラムとしては、ＳＣＡＰ（側鎖アミノ酸予測プログラムＳｉｄｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（Ｘｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｏｎｉｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１１，４２１−４３０（２００１））、および骨格依存型ロータマーライブラリーに基づくタンパク質骨格への側鎖の付加に有用なＳＣＷＲＬ（ロータマーライブラリーでの側鎖置換（Ｓｉｄｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｒｏｔａｍｅｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ））が挙げられる。ＳＣＷＲＬライブラリーは、カイ１−カイ２−カイ３−カイ４値のリスト、および所与のカイ−プサイ値の残基についてのそれらの相対確立を提供し、ならびにこれらの配座を探索して、側鎖−骨格不一致および側鎖−側鎖不一致を最小にする（例えば、Ｂｏｗｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６７，１２６８−１２８２（１９９７）参照）。
【０１０５】
コンピュータによる予測は、大部分、ＡＡＲＳ酵素の公知核酸および／またはアミノ酸配列の利用による。例えば、その触媒ドメインは、ＡＡＲＳ酵素の特定のクラスのすべてのメンバーにわたって保存される。（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ  ａｎｄ  Ｌｕｔｈｅｙ−Ｓｃｈｕｌｔｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．：５５０−５７３（２００３）；Ｄｉａｚ−Ｌａｚｃｏｚら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５（１１）：１５４８−１５６１（１９９８）；Ｗａｎｇら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１−１１（２００２））。
【０１０６】
「発現系」は、適する条件、例えば、そのベクターによって担持された異種ＤＮＡによりコードされ、その宿主細胞に導入されたタンパク質の発現に適する条件下の、宿主細胞、または細胞成分および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞、例えばＳｆ９、Ｈｉ５またはＳ２細胞、およびバキュロウイルスベクター、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞）および発現系、ならびに哺乳動物細胞およびベクターが挙げられる。
【０１０７】
「宿主細胞」は、その細胞による物質の生産のために選択される、改変される、形質転換される、増殖されるまたは何らかの方法で操作される、任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、その維持または増殖に必要な少なくとも１つの特定の有機化合物を合成することができず、別の源、例えばその環境または培養基、からその化合物を得なければならない、栄養素要求株であってもよい。加えて、栄養要求性宿主細胞は、その増殖または維持に必要な１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の有機化合物を合成することができないような、それぞれ、１、２倍、３倍、４倍またはそれ以上の栄養要求レベルを有する場合がある。例えば、宿主細胞は、特定の遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素を発現するように操作されているものであってもよい。宿主細胞は、インビトロで、または非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物または一過的にトランスフェクトされた動物）の１つ以上の細胞において培養することができる。
【０１０８】
本明細書に開示する一定の実施形態は、無細胞発現または翻訳系のみを特に利用し、宿主細胞を利用しない。一定の他の実施形態は、栄養要求性宿主細胞のみを特に利用する。さらに一定の他の実施形態は、非栄養要求性宿主細胞、すなわち原栄養性宿主細胞のみを特に利用する。
【０１０９】
配列類似性は、野生型配列と１つ以上の突然変異体との比較を含めて、配列を互いに比較する工程を含むことがあるような一定の実施形態に関連したものである。こうした比較は、例えば、当該技術分野において周知の配列アラインメントプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、幾つか挙げるとすれば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を用いる、ポリマー配列のアラインメントを一般に含む。こうしたアラインメントにおいて、突然変異が残基挿入または欠失を含む場合、その配列アラインメントが、残基挿入または欠失を有さないポリマー配列に「ギャップ」（一般に、ダッシュ、「−」または「Δ」によって表される）を導入することとなることは、当業者には容易に理解できる。
【０１１０】
そのすべての文法形およびスペル変化で、「相同（の）」は、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質、ならびに異なる生物種からの相同タンパク質をはじめとする、「共通の進化起源」を有する２つの分子（例えば、タンパク質、ｔＲＮＡ、核酸）の間の関係を指す。こうしたタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、同一率によってにせよ、または特定の残基もしくはモチーフの存在または保存位置によってにせよ、それらの配列類似性によって表されるような、配列および／または構造相同性を有する。相同分子は、類似の機能をまたは同一の機能さえも共有することが多い。
【０１１１】
一部の態様において、相同は、少なくとも５０％相同であるが、三次元で相同構造を呈する（すなわち、実質的に同様の表面電荷または疎水性基提示を含む）配列を含む場合がある。水素結合、ファンデルワールス力および疎水性相互作用は、ＡＡＲＳの結合ポケットにアミノ酸を結合させるように作用し得るので、ＡＡＲＳの構造の操作によってこれらの力のうちの１つ以上を変化させることができる。
【０１１２】
従って、本明細書で用いる場合、タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらが共通祖先のタンパク質またはタンパク質配列から自然にまたは人工的に得られるとき、「相同」である。同様に、核酸および／または核酸配列は、それらが共通祖先の核酸または核酸配列から自然にまたは人工的に得られるとき、相同である。例えば、任意の自然発生核酸を、任意の利用可能な突然変異誘発法により、１つ以上の選択コドンを含むように改変することができる。発現されたとき、この突然変異誘発された核酸は、１つ以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。勿論、突然変異プロセスは、１つ以上の標準コドンをさらに改変することがあり、それにより、結果として生ずるタンパク質中の１つ以上の標準アミノ酸も変化させることがある。相同性は、一般に、２つ以上の核酸もしくはタンパク質（またはそれらの配列）の間の配列類似性から推論される。相同性の確立に有用な配列間の正確な類似性百分率は、問題になっている核酸およびタンパク質によって様々であるが、わずか２５％ほどの配列類似性が、相同性の確立に日常的に用いられている。より高い配列類似性レベル、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％またはそれ以上が相同性の確立に用いられる場合もある。配列同一性百分率を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）は、本明細書中で説明しており、一般に利用できる。
【０１１３】
そのすべての文法形で、用語「配列類似性」は、共通の進化起源を共有しているまたはしていなことがある核酸またはアミノ酸配列の間の同一度または対応度を指す（Ｒｅｅｃｋら，上記を参照）。しかし、一般的な慣例および本出願において、用語「相同性」は、「高度に」などの副詞で改変されている場合、配列類似性を指すことがあり、ならびに共通の進化起源を指すことまたは指さないことがある。
【０１１４】
核酸分子は、その核酸分子の単一標準形を、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、他の核酸分子にアニールすることができる場合、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに「ハイブリダイズすることができる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。前記温度およびイオン強度条件は、そのハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決める。相同核酸の予備スクリーニングには、５５℃のＴｍ（融解温度）に対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％  ミルク、および無ホルムアミド；または３０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ）を用いることができる。中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、４０％  ホルムアミドと５×または６×ＳＳＣは、より高いＴｍに対応する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣは、最も高いＴｍに対応する。ＳＳＣはｍ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が遺伝子またはアミノ酸配列の相補ストレッチを含むことを必要とするが、そのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して塩基間にミスマッチが起こり得る。
【０１１５】
核酸をハイブリダイズするために適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補度、当該技術分野において周知の変数、に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似度または相同度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は高い。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対安定性は、次の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドより大きいハイブリッドについてのＴｍを計算するための方程式が導出された（Ｓａｍｂｒｏｃｋら，上記，９．５０−９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチド、とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置が、より重要となり、オリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決める（Ｓａｍｂｒｏｃｋら，上記，１１．７−１１．８参照）。ハイブリダイズ可能な核酸の最低長は、少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、およびさらに好ましくは、その長さは、少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【０１１６】
特に指定されていない限り、用語「標準ハイブリダイゼーション条件」は、約５５℃のＴｍを指し、上で述べたような条件を用いる。好ましい実施形態において、Ｔｍは、６０℃であり、さらに好ましい実施形態において、Ｔｍは、６５℃である。特定の実施形態において、「高ストリンジェンシー」は、０．２×ＳＳＣ中、６８℃での、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中、４２℃での、またはこれら２つうちのいずれかの条件下で観察されるものと等価のハイブリダイゼーションレベルをもたらす条件下での、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を指す。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドに（例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーに）適するハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドのほうが融解温度が低いため、完全長核酸（例えば、完全長ｃＤＮＡ）のものとは一般に多少異なる。オリゴヌクレオチドの融解温度は、関与するオリゴヌクレオチド配列の長さに依存することとなるため、適するハイブリダイゼーション温度は、使用されるオリゴヌクレオチド分子に依存して変わるであろう。例示的温度は、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドの場合）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドの場合）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドの場合）および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドの場合）であり得る。例示的なオリゴヌクレオチドに適するハイブリダイゼーション条件としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄、または同等のハイブリダイゼーションレベルをもたらす他の条件が挙げられる。
【０１１８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は、「ペプチド結合」と呼ばれる化学結合によって互いに連結されているアミノ酸の鎖を記述するために交換可能に用いている。タンパク質またはポリペプチド（酵素を含む）は、「天然」または「野生型」（これは、それが自然に発生することを意味する）である場合もあり、あるいは「突然変異体」、「変異体」、または「改変型」（これは、それが、天然タンパク質または別の突然変異体から作られた、改変された、得られた、または何らかの点でそれらとは異なるもしくはそれらから変化していることを意味する）である場合もある。
【０１１９】
「ロータマー」は、それぞれのアミノ酸または類似体側鎖についての１セットの可能な配座と定義する。Ｐｏｎｄｅｒら，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｄｏｎ）Ｌｔｄ．ｐｐ．７７５−７９１（１９８７）；Ｄｕｎｂｒａｃｋら，Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１（５）：３３４−３４０（１９９４）；Ｄｅｓｍｅｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：５３９−５４２（１９９２）参照。「ロータマーライブラリー」は、アミノ酸または類似体の所与のセットについての１セットの可能な／許容されるロータマー配座のコレクションでる。２つの一般的なタイプのロータマーライブラリーがある：「骨格依存型」および「骨格非依存型」。骨格依存型ロータマーライブラリーは、骨格内の残基の位置に依存して異なるロータマーを割り当てる。従って、例えば、一定のロイシンロータマーは、その位置がαヘリックス内である場合に割り当てられ、その位置がαヘリックス内でない場合には異なるロイシンロータマーが割り当てられる。骨格非依存型ロータマーライブラリーは、アミノ酸のすべてのロータマーをあらゆる位置で利用する。一般に、コアの可撓性は重要であるので、コア残基を考慮すると非骨格依存型ライブラリーが好ましい。しかし、骨格非依存型ライブラリーは、コンピュータ計算による費用がよりかかり、従って、表面および境界位置については骨格依存型ライブラリーが好ましい。しかし、いずれのタイプのライブラリーも、任意の位置で使用することができる。
【０１２０】
本明細書において、「可変残基位置」は、設計法の中で特定の残基またはロータマー、一般には野生型残基またはロータマー、に固定されていない、設計されるタンパク質のアミノ酸位置を意味する。ある位置が可変位置として選択される場合であっても、本明細書に開示する一定の方法は、その可変位置で野生型残基を選択するような方法で配列を最適化することが可能であることに留意しなければならない。これは、一般に、コア残基についてのほうが多く行われ、表面残基については然程定期的には行われない。加えて、残基を非野生型アミノ酸に固定することも可能である。
【０１２１】
「固定残基位置」は、１セットの配座であると三次元構造で同定された残基を意味する。一部の実施形態において、固定位置は、その元々の配座のままである（これは、使用されるロータマーライブラリーの特定のパラメーターに相関する場合もあり、しない場合もある）。あるいは、設計の必要に依存して、残基を非野生型残基に固定することができる。例えば、公知の部位特異的突然変異誘発法により、ある特定の残基が（例えば、タンパク質部分解部位を排除するために、またはＡＡＲＳの基質特異性を改変するために）望ましいことが証明された場合、その残基を、特定のアミノ酸に固定することができる。固定することができる残基としては、構造または生体機能性残基、例えば、アンカー残基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
一定の実施形態において、固定位置は、「浮動的」である場合があり、アミノ酸または類似体がその位置に固定されも、そのアミノ酸または類似体の異なるロータマーを試験する。この実施形態において、可変残基は、少なくとも１つ、または概して残基の総数の０．１％から９９．９％であり得る。従って、例えば、ほんの少数（または１つ）の残基を変えることができる場合があり、または大部分の残基を変えることができる場合があり、間のすべての可能性がある。
【０１２３】
本明細書で用いる場合、用語「外的突然変異体」は、対応する野生型アミノ酸でのアミノアシル化について（野生型または内在性のものと比較して）減少した効率を示す改変分子（例えば、外的突然変異体ｔＲＮＡおよび／または外的突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ）を指す。「外的突然変異体」は、目的とする翻訳系において対応する天然アミノ酸で機能するｔＲＮＡおよび／またはＲＳの不能または減少した効率、例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率もしくは例えば１％未満の効率を指す。例えば、目的とする翻訳系における外的突然変異体ＲＳは、野生型アミノ酸で目的とする翻訳系の任意の内在性ｔＲＮＡを、その内在性ＲＳによる内在性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して低減されたまたはさらにはゼロ効率でアミノアシル化する。
【０１２４】
しかし、外的突然変異体ＲＳは、（自然発生のものであろうと、非−天然のものであろと）代替アミノ酸で内在性ｔＲＮＡを、内在性ＲＳが代替アミノ酸で内在性ｔＲＮＡをアミノアシル化する能力と比較して増大された効率で、アミノアシル化することに留意しなければならない。同様に、外的突然変異体ｔＲＮＡは、（非−天然アミノ酸であろうと、他の自然発生アミノ酸であろうと）代替アミノ酸に対して、対応する野生型アミノ酸に対するより高い効率で機能する。
【０１２５】
「ウォブル縮重コドン」は、天然アミノ酸をコードしているコドン（このコドンは、ｍＲＮＡ中に存在するとき、少なくとも１つの非ワトソン・クリックまたはウォブル塩基対（例えば、Ａ−ＣまたはＧ−Ｕ塩基対）によって天然ｔＲＮＡアンチコドンを認識する）を指す。ワトソン・クリック塩基対は、Ｇ−ＣもしくはＡ−Ｕ（ＲＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）またはＡ−Ｔ（ＤＮＡ）塩基対のいずれかを指す。ｍＲＮＡコドン−ｔＲＮＡアンチコドン塩基対に関連して用いられている場合、ワトソン・クリック塩基対は、すべてのコドン−アンチコドン塩基対がＧ−Ｃ対またはＡ−Ｕ対のいずれかによって媒介されることを意味する。
【０１２６】
用語「優先的にアミノアシル化する」は、例えば、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％またはそれ以上効率的な効率を指す。この効率は、特定のｔＲＮＡ、ＡＡＲＳまたは両方に割り当てられる対応する天然アミノ酸と比較したとき、どの改変または外的突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが、（非天然アミノ酸であろうと、別の自然発生アミノ酸であろうと）代替アミノ酸でｔＲＮＡをアミノシル化するかによって測定することができる。用語「優先的にアミノアシル化する」は、特定のｔＲＮＡ、ＡＡＲＳまたは両方に割り当てられる対応する天然アミノ酸以外の任意のアミノ酸でｔＲＮＡをアミノアシル化する、または該アミノ酸をｔＲＮＡにチャージする、改変または外的突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの効率をさらに指す場合がある。用語「優先的にアミノアシル化する」は、非改変または自然発生アミノ酸ＡＡＲＳと比較して非−天然アミノ酸でｔＲＮＡをアミノアシル化する改変または外的突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの効率をさらに指す場合がある。
【０１２７】
ＡＡＲＳによるｔＲＮＡのアミノアシル化の効率を、標的ポリペプチドまたはタンパク質への非−天然アミノ酸の組み込みの特異性または忠実性の有効度と相関させることができることに留意しなければならない。これは、（野生型アミノ酸であろうと、非−天然アミノ酸であろうと）アミノ酸でｔＲＮＡがアミノアシル化されると、そのチャージされたｔＲＮＡがＡＡＲＳ酵素から放出され、そのアミノ酸が標的ポリペプチドに組み込まれるというタンパク質合成機構の機能による。ＡＡＲＳの較正能力が改変されると、この酵素は、代替アミノ酸をｔＲＮＡにチャージすることができ、標的タンパク質に組み込むために放出することができるであろう。従って、ＡＡＲＳによるアミノアシル化の効率は、標的ポリペプチドへの非−天然アミノ酸の組み込みの忠実性および特異性と直接相関する。
【０１２８】
その後、代替の（非−天然のものであろうと、自然発生のおのであろうと）アミノ酸は、高忠実度で、例えば、特定のコドンについて約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％より高い、または約９９％より高い効率で、成長ポリペプチド鎖に組み込まれる。
【０１２９】
用語「相補的」は、外的突然変異体ペアの成分、一緒に機能することができる外的突然変異体ｔＲＮＡと外的突然変異体シンテターゼ、を指し、例えば、外的突然変異体シンテターゼは、外的突然変異体ｔＲＮＡをアミノアシル化する。
【０１３０】
用語「に由来する」は、生物から単離される、または単離され、改変される、または生物からのその成分の情報を用いて生成される、例えば化学合成される成分を指す。
【０１３１】
用語「翻訳系」は、自然発生または非天然アミノ酸を成長ポリペプチド鎖（タンパク質）に組み込むために必要な成分を指す。例えば、成分としては、リボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡなどを挙げることができる。本明細書に開示する成分は、インビボでまたはインビトロで翻訳系に追加することができる。インビボ翻訳系は、細胞（真核細胞または原核細胞）であってもよい。インビトロ翻訳系は、無細胞系、例えば、（精製されたまたは組み替え生産された）異なる生物からの成分で再構成されたものであってもよい。一定の実施形態において、翻訳系は、細胞を含まない。一定の実施形態において、翻訳系は、栄養要求性細胞を含まない。翻訳系が栄養要求性細胞を含まない場合、それは、別の細胞または細胞成分を含むことがある。
【０１３２】
用語「不活性ＲＳ」は、自然発生のものであろうと、非−天然のものであろうと、任意のアミノ酸でその同種ｔＲＮＡをアミノアシル化することがもはやできないように突然変異されたシンテターゼを指す。用語「改変ＲＳ」は、対応する自然発生アミノ酸でその同種ｔＲＮＡをアミノアシル化することはもはやできないが、別のアミノ酸、好ましくは非−天然アミノ酸でその同種ｔＲＮＡをアミノアシル化できる場合があるシンテターゼを指す。
【０１３３】
用語「選択作用因子」は、存在するとき、集団から一定の成分を選択することができる作用因子、例えば、抗生物質、光の波長、抗体または栄養素などを指す。例えば濃度、強度などの選択作用因子は、変えることができる。
【０１３４】
用語「陽性選択マーカー」は、存在する（例えば、発現された、活性化されたなどの）とき、その陽性選択マーカーを有する生物とその陽性選択マーカーのないもとを識別する結果となるマーカーを指す。
【０１３５】
用語「陰性選択マーカー」は、存在する（例えば、発現された、活性化されたなどの）とき、所望の特性を有さない生物を（例えば、所望の特性を有する生物と比較して）識別することができるマーカーを指す。
【０１３６】
用語「レポーター」は、本開示に記載する成分を選択するために使用することができる成分を指す。例えば、レポーターとしては、緑色蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼタンパク質、または遺伝子、例えば、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、またはＡｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）などを挙げることができる。
【０１３７】
用語「効率的に認識されない」は、ある生物からのＲＳが外的突然変異体ｔＲＮＡをアミノアシル化する、例えば、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満の効率を指す。一定の実施形態において、前記ＲＳは、前記外的突然変異体ｔＲＮＡと同じ生物からのものであってもよいし、または異なる生物からのものであってもよい。一部の実施形態において、前記ＲＳは、特定のアミノ酸、好ましくは非−天然アミノ酸でｔＲＮＡをアミノアシル化するように改変されている。
【０１３８】
用語「真核生物」は、生物発生的ドメインＥｕｃａｒｙａに属する生物、例えば、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類）、繊毛虫、植物、真菌（例えば、酵母など）、鞭毛虫、微胞子虫類、原生生物などを指す。加えて、用語「原核生物」は、真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなど）および古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えば、Ｈａｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉおよびハロバクテリウム種ＮＲＣ−１、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐ．ｆｉｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａ．ｐｅｒｎｉｘなど）生物発生的ドメインに属する非真核生物を指す。
【０１３９】
（遺伝子コード、宿主細胞、および縮重コドン）
使用した大部分細胞の標準遺伝子コードを下に列挙する。
【０１４０】
【化１−１】
2009528824.tif 000008
【０１４１】
【化１−２】
2009528824.tif 000009
遺伝子コードは、縮重しており、この場合、タンパク質生合成機構が、６１のｍＲＮＡセンスコドンを用いて、２０の天然アミノ酸モノマーのテンプレート重合を命じる（Ｃｒｉｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ  １９２：１２２７，１９６１）。２つアミノ酸（すなわち、メチオニンおよびトリプトファン）だけが、一意的ｍＲＮＡトリプレットによってコードされる。
【０１４２】
標準遺伝子コードは、すべてではないが殆どのケースにあてはまる。多くの生物のミトコンドリアＤＮＡ、および少数の下等生物の核ＤＮＡにおいて、例外が見つかった。幾つかの例を次の表に与える。
【０１４３】
（非標準遺伝子コードの例）
【０１４４】
【化２】
2009528824.tif 000010
＊植物細胞は、ミトコンドリアにおいても、核においても、標準遺伝子コードを用いる。
【０１４５】
ＮＣＢＩ（米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））は、標準遺伝子コード、ならびに脊椎動物ミトコンドリアコード；酵母ミトコンドリアコード；糸状菌、原生動物および腔腸動物ミトコンドリアコードおよびマイコプラズマ／スピロプラズマコード；無脊椎動物ミトコンドリアコード；繊毛虫、カサノリおよびヒゲハラムシ核コード；棘皮動物および扁形動物ミトコンドリアコード；正倍数性核コード；細菌および植物プラスチドコード；代替酵母核コード；ホヤ類ミトコンドリアコード；代替扁形動物ミトコンドリアコード；ブレファリズマ（Ｂｌｅｐｈａｒｉｓｍａ）核コード；緑藻類ミトコンドリアコード；吸虫ミトコンドリアコード；セネデスムス・オブリカス（ｓｃｅｎｅｄｅｓｕｍｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）ミトコンドリアコード；トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ミトコンドリアコードをはじめとする様々な生物において用いられる遺伝子コードの詳細なリスト（すべて、本明細書に参照により取り入れられている）を保持している。これらは、主として、Ｏｓａｗａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：２２９−２６４，１９９２，ａｎｄ  Ｊｕｋｅｓ  ａｎｄ  Ｏｓａｗａ，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６Ｂ：４８９−４９４，１９９３による総覧に基づく。
【０１４６】
（宿主細胞）
本明細書に開示する一部の方法は、実際にはタンパク質の生産レベルを生じさせることができる細胞内で実施することができる。好ましい実施形態において、使用される細胞は、培養可能な細胞（すなわち、実験室条件下で増殖させることができる細胞）である。適する細胞としては、哺乳動物細胞（ヒトまたは非ヒト哺乳動物）、細菌細胞および昆虫細胞などが挙げられる。
【０１４７】
一例としては、ＰＦＥＮＥＸ（商標）技術が挙げられ、これは、Ｅ．ｃｏｌｉと比較して一定の糖の代謝に関して異なる経路を用いることに起因して一定の溶解度および活性特性を維持しながら細胞発現を増加させるシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）系細胞系統を使用する細胞系統である。
【０１４８】
加えて、他の栄養要求性宿主細胞系統としては、Ｋ１０系Ｐｈｅ栄養要求株（ＡＦ）、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ二重栄養要求株（ＡＦＷ）、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ／Ｌｙｓ三重栄養要求株（ＡＦＷＫ）、Ｍｅｔ栄養素要求株（Ｍ１５バックグラウンドでのＭ１５ＭＡ）、ならびにＤＨ１０Ｂ系ＡＦ株が挙げられる。
【０１４９】
本明細書に開示する一定の実施形態を実施するために使用することができる細胞としては、（原核性であろうと、真核性であろうと）栄養要求性宿主細胞が挙げられる。栄養要求性細胞は、１倍、２倍、３倍、４倍またはそれ以上のレベルの栄養要求性を示すことがある（それぞれの栄養要求性レベルは、その生物が合成できず、細胞に供給しなければならない特定の有機化合物を示す）。本明細書に開示する一定の実施形態は、栄養要求性宿主細胞を特に利用しない。栄養要求性宿主細胞を使用しないかぎり、本明細書に開示する一定の実施形態を実施するために別の細胞または細胞成分を、尚、使用することができる。他の実施形態は、同じかまたは異なる株または生物からのものであり得る１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の異なる栄養要求性宿主細胞を使用することがある。
【０１５０】
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本開示のベクターを用いて、遺伝子工学処理（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクト）される。前記ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または複合ポリヌクレオチドの形態であり得る。前記ベクターは、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、小型ビーズもしくは粒子のマトリックスの中にまたはその表面に核酸を有する小型粒子による高速衝撃貫入（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））をはじめとする標準的な方法によって、細胞および／または微生物に導入される。Ｂｅｒｇｅｒ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌは、様々な適する形質転換法を提供している。
【０１５１】
その工学処理された宿主細胞を、例えばスクリーニング工程、プロモーターの活性化または形質転換体の選択などの活動のために、適宜、改変した従来の栄養培地で培養した。場合によっては、これらの細胞を培養してトランスジェニック生物にすることができる。
【０１５２】
本明細書に開示する一定の実施形態は、改変ＡＡＲＳおよび／または改変ｔＲＮＡをスクリーニングする方法をさらに含む。例えば、１つの実施形態において、酵母ＰｈｅＲＳライブラリーをダブル・シーブ・スクリーニングに付して、非−天然アミノ酸の高レベルの組み込み、またはＧＦＰの高度のミスフォールディングもしくはアンフォールディングをもたらすであろうＰｈｅ以外の天然アミノ酸の誤った組み込みを検出する。酵母ＰｈｅＲＳライブラリー細胞を、例えば、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）に基づくハイ・スループット・スクリーニングに付す。先ず、酵母ＰｈｅＲＳライブラリー細胞を２Ｎａｌの存在下で発現させ、２Ｎａｌまたは他の天然アミノ酸のより高い組み込みを示す低蛍光細胞をＦＡＣＳによって回収する。次に、酵母ＰｈｅＲＳライブラリー細胞を２Ｎａｌなしで発現させる。明細胞を回収して、他の天然アミノ酸を誤って組み込みこむことがある酵母ＰｈｅＲＳ変異体を排除する。１つの例示的実施形態において、２サイクルのスクリーニングにより、２Ｎａｌの存在下で低い蛍光を有し、２Ｎａｌ不在下では高い蛍光を有した、Ｎ４１２Ｇ、Ｓ４１８Ｃ、Ｔ４１５ＧおよびＳ４３７Ｆに突然変異を有する突然変異体酵母ＰｈｅＲＳが得られた。この技術により、ＵＵＵコドンに２Ｎａｌを組み込み、約９０％まで増加させることができる。
【０１５３】
例えば細胞単離および培養についての（例えば、後続の核酸単離についての）、他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中で引用されている参考文献；Ｐａｙｎｅら，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ．）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ならびにＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ．）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａが挙げられる。
【０１５４】
細菌細胞に標的核酸を導入する幾つかの周知の方法を利用することができ、これらは、いずれも、本明細書に開示する一定の実施形態において使用することができる。これらとしては、レシピエント細胞とＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの融合、エレクトロポレーション、発射衝撃法、およびウイルスベクターでの感染などが挙げられる。細菌細胞を使用して、本明細書に開示する一定の実施形態のＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの数を増幅することができる。その細菌を対数期まで増殖させ、当該技術分野において公知の様々な方法によってその細菌中のプラスミドを単離することができる（例えば、Ｓｍｂｒｏｏｋ参照）。加えて、過多なキットが、細菌からプラスミドを精製するために市販されている（例えば、ＥＡＳＹＰＲＥＰ（商標）、ＦＬＥＸＩＰＲＥＰ（商標）（両方とも、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから）；ＳＴＲＡＴＡＣＬＥＡＮ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから）；およびＱＩＡＰＲＥＰ（商標）（Ｑｉａｇｅｎから）参照）。その後、それらの単離および精製されたプラスミドは、さらに、他のプラスミドを生産するために操作される、または細胞をトランスフェクトするために使用される、または生物を感染させるために関連ベクターに組み込まれる。
【０１５５】
代表的なベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。これらのベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物または両方におけるカセットを複製することができる配列（例えば、シャトルベクター）、および原核生物系と原核性物系の両方のための選択マーカーを場合によっては含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または好ましくは両方における複製および組み込みに適する。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（すべて上記）参照。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣによって提供されている、例えばＡＴＣＣによって出版されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら，（ｅｄｓ．）。配列決定、クローニングおよび分子生物学の他の態様についてのさらなる基礎手順ならびに基礎をなす理論的考察も、Ｗａｔｓｏｎら，（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹにおいて見つけられる。
【０１５６】
（縮重コドン選択）
上で説明したように、メチオニンおよびトリプトファンを除くすべてのアミノ酸は、１つより多くのコドンによってコードされる。本明細書に開示する一部の方法によると、天然アミノ酸をコードするために通常用いられるゲノム内のコドンは、代わりにアミノ酸類似体をコードするように、転写または翻訳機構によって、一部、再プログラムされる。アミノ酸類似体は、自然発生またはカノニカルアミノ酸類似体であってもよい。好ましい実施形態において、アミノ酸類似体は、カノニカルにコードされたアミノ酸ではない。
【０１５７】
コドン−アンチコドンペアの熱力学的安定性は、実験に基づいて予測または決定することができる。一部の実施形態によると、外的突然変異体ｔＲＮＡは、同じ配列を認識するであろう細胞における天然ｔＲＮＡより少なくとも約１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ強い、さらにいっそう好ましくは１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ強い、およびさらにいっそう好ましくは２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えて強い親和性（３７℃）で縮重コドンと相互作用ことが好ましい。これらの値は、当業者には公知であり、ならびに熱変性実験によって決定することができる（例えば、Ｍｅｒｏｕｅｈ  ａｎｄ  Ｃｈｏｗ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：１１１８，１９９９参照）。
【０１５８】
次の表は、Ｅ．ｃｏｌｉについての公知アンチコドン配列の一部のリストである。一般に、いずれの生物についても、当該技術分野において認知されている技法を用いて、ｔＲＮＡアンチコドン配列を常例的に決定することができる。例えば、いずれのｔＲＮＡ遺伝子も、例えばＰＣＲによって、増幅することができる。配列決定を行って、アンチコドンループの正確な配列を決定することができる。あるいは、生化学的結合アッセイを用いて、２〜６の可能なコドンのうちの１つに対する精製されたｔＲＮＡの結合親和性を決定することができる。最も高い特異性／親和性でｔＲＮＡに結合するコドンは、おそらく、３つすべてのコドン位置に純粋なワトソン・クリックマッチを有し、それ故、アンチコドンループの配列を決定することができる。
【０１５９】
一般に、アンチコドンループ内のウォブル塩基は、（ＡまたはＣではなく）ＧまたはＵである傾向がある。
【０１６０】
（Ｅ．ｃｏｌｉについての縮重コドン）
【０１６１】
【化３−１】
2009528824.tif 000011
【０１６２】
【化３−２】
2009528824.tif 000012
１ワトソン・クリック塩基対
２ウォブル塩基対
単一のｔＲＮＡが、そのｔＲＮＡのアンチコドンと１つのコドンの間の完全相補的相互作用によりコドンを認識するとき、それはワトソン・クリック塩基対と呼ばれる。単一のｔＲＮＡが、第二の縮重コドンを認識するとき、それは、ウォブルまたは他の非標準的塩基対と呼ばれる。本明細書に開示する一定の実施形態において、縮重コドンまたは非−天然アミノ酸のためのコドンに好ましくは相補的であるアンチコドン配列を有する、従って、ワトソン・クリック塩基対を利用する、新規ｔＲＮＡを構築することができる。同様に、代替アミノ酸（野生型以外  −  別の自然発生アミノ酸であってもよいし、または非−天然アミノ酸であってもよい）を利用して対応するｔＲＮＡをアミノアシル化する、新規ＡＡＲＳを構築ことができる。これは、代替アミノ酸の組み込みのためのｔＲＮＡ分子の改変に加えてであってもよいし、またはその代わりにであってもよい。
【０１６３】
改変ＡＡＲＳは、非−天然アミノ酸または別の選択された自然発生アミノ酸への結合効率が、対応する天然アミノ酸へのその改変ＡＡＲＳの結合効率より大きくなるように、改変することができる。このようにして、改変ＡＡＲＳは、非改変状態のＡＡＲＳに対応する自然発生アミノ酸の存在下ででさえ、非−天然アミノ酸に優先的に結合してｔＲＮＡにチャージすることができる。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのこの［再プログラミング」は、所望の部位への他のアミノ酸の誤った組み込みは低レベルで、非−天然アミノ酸をポリペプチドに組み込むことができる。
【０１６４】
この「再プログラミング」により、標準宿主細胞への高い組み込みレベルを有する、および栄養要求性宿主細胞を必要としない、および対応する天然アミノ酸の培地を枯渇させるまたはさせない、改変または外的突然変異体シンテターゼの使用を可能にすることができる。従って、本明細書に開示する一定の実施形態は、栄養要求性宿主細胞を使用することにより実施することができ、一定の他の実施形態は、栄養要求性宿主細胞を使用せずに実施することができる。一定の実施形態を実施するために栄養要求性宿主細胞を使用しない事象では、別の宿主細胞を使用してもよいし、細胞成分を使用してもよいし、またはまったく細胞の無い系を使用してもよい。
【０１６５】
細胞が、特定のアミノ酸についての多数のｔＲＮＡ分子を有するとき、および１つのｔＲＮＡが、選択された縮重コドンに完全に相補的なアンチコドンを有するとき、ｔＲＮＡをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的突然変異誘発、または遺伝子もしくは遺伝子のプロモーター配列の欠失をはじめとする、当業者が利用できる任意の手段によって、不能にすることができる。遺伝子の発現も、任意のアンチセンスまたはＲＮＡ干渉技術によって、不能にすることができる。
【０１６６】
（非天然または非−天然アミノ酸）
タンパク質工学プロセスにおける第一工程は、通常、所望の化学特性を有する１セットの非天然アミノ酸または非−天然アミノ酸の選択である。非−天然アミノ酸の選択は、有することを望む所定の化学特性、および標的タンパク質において行うことを望む改変に依存する。非天然アミノ酸を選択したら、それを供給業者から購入してもよいし、または化学合成してもよい。
【０１６７】
多種多様な非天然アミノ酸または非−天然アミノ酸を、本明細書に開示する方法において使用することができる。非天然アミノ酸は、その非天然アミノ酸の所望される特性、例えば、その非天然アミノ酸の機能（例えば、タンパク質の生物学的特性、例えば毒性、生体内分布、免疫原性もしくは半減期；構造特性；分光学的特性；化学および／または光化学的特性；触媒特性；他の分子と（共有結合的に、または非共有結合的に）反応する能力などの改変）に基づいて選択することができる。
【０１６８】
本明細書で用いる場合、「非天然アミノ酸」は、セレノシステインおよび次の２０の遺伝子コード化アルファ−アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、以外の任意のアミノ酸、改変アミノ酸またはアミノ酸類似体を指す。アルファ−アミノ酸の一般構造は、式Ｉによって図示される：
【０１６９】
【化４】
2009528824.tif 000013
非天然アミノ酸は、一般に、式中のＲ基が前記２０の天然アミノ酸に用いられているもの以外の任意の置換基である式Ｉを有する任意の構造である。例えば、前記２０の天然アミノ酸の構造については任意の生化学テキスト、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｙ  Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，３ｒｄ  ｅｄ．１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。本明細書に開示する非天然アミノ酸が、上の２０のアルファ−アミノ酸以外の自然発生化合物である場合もあることに留意すること。本明細書に開示する非天然アミノ酸は、一般に、側鎖に関してしか天然アミノ酸とは異ならないので、非天然アミノ酸は、他のアミノ酸（例えば、天然または非天然アミノ酸）とのアミド結合を、それらが自然発生タンパク質の中で形成されているのと同じように形成する。しかし、非天然アミノ酸は、それらを天然アミノ酸と区別する側鎖を有する。例えば、式Ｉ中のＲは、アルキル−、アリール−、アリールハライド、ビニルハライド、アルキルハライド、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ハライド、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシ−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジン、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環−、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、拘束された環、例えばシクロオクチン、チオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、アルファ−ケトカルボン酸、アルファもしくはベータ不飽和酸およびアミド、グリオキシルアミドまたはオルガノシラン基など、あるいはこれらの任意の組み合わせを場合によっては含む。
【０１７０】
アリール置換は、様々な位置、例えばオルト、メタ、パラ、において、そのアリール環上に位置する１つ以上の官能基で行うことができる。目的とする他の非天然アミノ酸としては、光活性化可能な架橋剤、スピン標識アミノ酸、色素標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、改変された親水性、疎水性、極性または水素結合能力を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージングされたおよび／または光異性体化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、例えば糖置換セリン、他の炭水化物改変アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールもしくはポリエーテル、ポリアルコールまたは多糖類を含むアミノ酸、複分解され得るアミノ酸、付加環化され得るアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的解裂可能なおよび／または光解裂可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長された（例えば、炭素が約５個多いまたは約１０個多い）側鎖（例えば、ポリエーテルまたは長鎖炭水化物）を有するアミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、薬物部分を含有するアミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸は、例えば式ＩＩおよびＩＩＩの構造によって図示されるような、改変骨格構造も場合によっては含む：
【０１７２】
【化５】
2009528824.tif 000014
（式中、Ｚは、一般に、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ２Ｏ−、ＮＨ−Ｒ’、Ｒ’ＮＨ−、Ｒ’Ｓ−、またはＳ−Ｒ’−を含み；ＸおよびＹは、同じかまたは異なることがあり、一般に、Ｓ、ＮまたはＯを含み；ならびにＲおよびＲ’は、場合により同じであるか異なり、一般に、式Ｉを有する非天然アミノ酸について上で説明したＲ基についてのものと同じ成分リストおよび水素または（ＣＨ２）ｘもしくは天然アミノ酸側鎖から選択される）。例えば、本明細書に開示する非天然アミノ酸は、式ＩＩおよびＩＩＩによって図示したようなアミノ酸またはカルボキシル基に関する置換を場合によっては含む。このタイプの非天然アミノ酸としては、例えば上記２０の天然アミノ酸にまたは非天然アミノ酸側鎖に対応する側鎖を有する、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸α−アミノチオカルボキシレート、またはα−α−二置換アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。それらには、β−アミノ酸またはγ−アミノ酸、例えば、置換β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸もが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、α−炭素における置換または改変は、ＬまたはＤ異性体、例えば、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、およびアミノ酪酸などを場合によっては含む。他の構造的選択肢としては、環状アミノ酸、例えば、プロリン類似体ならびに３、４、６、７、８および９員環プロリン類似体が挙げられる。一部の非−天然アミノ酸、例えば、アリールハライド（ｐ−ブロモ−フェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン）は、アリールハライドと多種多様なカップリングパートナーとの間で炭素−炭素、炭素−窒素および炭素−酸素結合を形成することができる、エチンまたはアセチレン反応との多様なパラジウム触媒クロスカップリング反応を生じさせる。
【０１７３】
例えば、多くの非天然アミノ酸アミノ酸は、天然アミノ酸、例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどに基づく。チロシン類似体としては、パラ置換チロシン、オルト置換チロシンおよびメタ置換チロシンが挙げられ、前記置換チロシンは、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６〜Ｃ２０直鎖または分枝炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基などを含む。加えて、多置換アリール環も考えられる。グルタミン類似体としては、α−ヒドロキシ誘導体、β−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的フェニルアラニン類似体としては、メタ置換フェニルアラニン（この場合の置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、またはアセチル基などを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
非天然アミノ酸の具体的な例としては、ホモアリルグリシン、シス−またはトランス−クロチルグリシン、６，６，６−トリフルオロ−２−アミノヘキサン酸、２−アミノヘプタン酸、ノルバリン、ノルロイシン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｏ−、ｍ−またはｐ−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−３−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｏ−、ｍ−またはｐ−ブロモフェニルアラニン、２−、３−または４−ピリジルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ジアミノ酪酸、アミノ酪酸、ベンゾフラニルアラニン、３−ブロモ−チロシン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロール−３−イル）プロパン酸、アジドノルロイシン、アジドホモアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ｐ−エチル−フェニルアラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、３−（１−ナフチル）アライン、３−ヨード−チロシン、Ｏ−プロパルギル−チロシン、ホモグルタミン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、セレノシステイン、アルキンフェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−（２−プロピニル）−Ｌ−チロシン、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ホモプロパルギルグリシン、アジドホモアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、ジヒドロキシ−フェニルアラニン、ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、およびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、トリフルオロロイシン、ノルロイシン、４−、５−または６−フルオロ−トリプトファン��４−アミノトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、ビオシチン、アミノオキシ酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニルアラニン、ｍ−アリルフェニルアラニン、ｍ−メトキシフェニルアラニン基、β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、α−ＧａｌＮＡｃ−トレオニン、ｐ−アセトアセチルフェニルアラニン、パラ−ハロ−フェニルアラニン、セレノ−フェニルアラニン、エチオニン、Ｓ−ニトロソ−ホモシステイン、チア−プロリン、３−チエニル−アラニン、ホモ−アリル−グリシン、トリフルオロイソロイシン、トランスおよびシス−２−アミノ−４−ヘキセン酸、２−ブチニル−グリシン、アリル−グリシン、パラ−アジド−フェニルアラニン、パラ−シアノ−フェニルアラニン、パラ−エチニル−フェニルアラニン、ヘキサフルオロロイシン、１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、２−フルオロ−ヒスチジン、Ｌ−メチルヒスチジン、３−メチル−Ｌ−ヒスチジン、β−２−チエニル−Ｌ−アラニン、β−（２−チアゾリル）−ＤＬ−アラニン、ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）ならびにアジドホモアラニン（ＡＨＡ）などをはじめとする、ｏ、ｍおよび／またはｐ形のアミノ酸またはアミノ酸類似体（非−天然アミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な非限定的な非天然アミノ酸の構造は、図、例えば、ＵＳ  ２００３／０１０８８８５Ａ１（この全内容が本明細書に参照により取り入れられている）の図２９、３０および３１、で提供されている。
【０１７５】
チロシン類似体としては、パラ置換チロシン、オルト置換チロシンおよびメタ置換チロシン（この場合の置換基は、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６〜Ｃ２０直鎖または分枝炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基などを含む）が挙げられる。加えて、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては、α−ヒドロキシ誘導体、β−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。フェニルアラニン類似体の例としては、メタ置換フェニルアラニン（この場合の置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、またはアセチル基などを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
加えて、他の例としては、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；トレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせ；光活性化可能な架橋剤有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有結合的にまたは非共結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射活性アミノ酸；フォトケージングされたアミノ酸；光異性体化可能なアミノ酸；ビオチンまたはビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化されたまたは炭水化物で改変されたアミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールを含むアミノ酸；ポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的解裂可能なまたは光解裂可能なアミノ酸；伸長された側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば糖置換セリンなど；炭素連結糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；ならびに環状アミノ酸が場合によっては挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
一般に、本明細書において一定の実施形態に利用する非天然アミノ酸は、上記２０の天然アミノ酸では入手できない追加の特性をもたらすように選択または設計することができる。例えば、非天然アミノ酸は、例えばそれらが組み込まれるタンパク質の生物学的特性を改変するように、場合によっては設計または選択される。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を含めることにより、次の特性が場合によっては改変される：毒性、生体内分布、溶解度、安定性（例えば、熱安定性、加水分解安定性、酸化安定性、耐酵素分解性など）、精製および加工の容易さ、構造特性、分光学的特性、化学および／または光化学的特性、触媒活性、レドックス電位、半減期、他の分子と（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）反応する能力など。
【０１７８】
アミノ酸類似体の他の例としては、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；トレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケトもしくはアミノ置換アミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせ；光活性化可能な架橋剤有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有結合的にまたは非共結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射活性アミノ酸；フォトケージングされたアミノ酸；光異性体化可能なアミノ酸；ビオチンまたはビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化されたまたは炭水化物で改変されたアミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールを含むアミノ酸；ポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的解裂可能なまたは光解裂可能なアミノ酸；伸長された側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば糖置換セリンなど；炭素連結糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；ならびにプロリン以外の環状アミノ酸が場合によっては挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
【０１７９】
（アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ）
本明細書に開示する一定の方法において使用されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（本明細書では、ＡＡＲＳ、ＲＳまたは「シンテターゼ」と交換可能に用いている）は、同じもの（同種）であろうと、異なるもの（異種）であろうと生物に由来する天然シンテターゼ、突然変異もしくは改変されたシンテターゼ、または設計されたシンテターゼであり得る。
【０１８０】
使用されるシンテターゼは、利用可能な関連アミノ酸に関して所望の（非天然）アミノ酸類似体を選択的に認識することができる。例えば、使用されることとなるアミノ酸類似体が、自然発生アミノ酸に構造的に関連している場合、シンテターゼは、その自然発生アミノ酸のものと少なくとも実質的に等価の効率、およびさらに好ましくはその天然アミノ酸のものより少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上の効率で、所望のアミノ酸類似体を外的突然変異体ｔＲＮＡ分子にチャージしなければならない。しかし、明確なタンパク質産物が必要でないケースでは、シンテターゼは、緩和されたアミノ酸チャージ特異性を有することがある。こうした実施形態では、様々なアミノ酸または類似体と外的突然変異体ｔＲＮＡの混合物が生産されるだろう。
【０１８１】
一定の実施形態において、シンテターゼは、アミノ酸類似体とｔＲＮＡ分子の対応するコドンによってコードされるアミノ酸の両方に対する活性を有する。
【０１８２】
シンテターゼは、例えば、コンピュータ計算法、選択法、および他の生物からのシンテターゼの組み込みなどの技法の組み合わせをはじめとする、当業者には公知の様々な技法によって得ることができる（下記参照）。
【０１８３】
一定の実施形態では、宿主細胞のシンテターゼによってチャージされないｔＲＮＡ分子を効率的にチャージするシンテターゼを使用または発生させることができる。例えば、一般に、宿主細胞とは異なる生物からのシンテターゼの改変によって適するペアを生成することができる。一定の実施形態において、前記シンテターゼは、選択手順によって発生させることができる。一定の実施形態において、前記シンテターゼは、Ｄａｔｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：５６５２−５６５３、２００２、および米国特許第７，１３９，６６５号（これらは、本明細書に参照により取り入れられている）に記載されているものなどのコンピュータ計算技術を用いて設計することができる。
【０１８４】
（ＡＡＲＳのコンピュータによる設計）
具体的に言うと、１つの実施形態において、本方法は、非カノニカルアミノ酸類似体を基質として取り込み、そうした非カノニカルアミノ酸を改変ｔＲＮＡにチャージする（そのアンチコドンにチャージする）ことができるような、緩和された基質特異性を有する改変形への、天然ＡＡＲＳの設計および工学処理に、一部、依存する。後続の段落は、そうした改変ＡＡＲＳの生成方法を簡単に説明するものであり、この方法は、米国特許第７，１３９，６６５号（この全内容が本明細書に参照により取り入れられている）に、より詳細に記載されている）。
【０１８５】
簡単に言うと、その中に記載されている一部の実施形態の方法は、その酵素が、タンパク質翻訳系において、インビトロで、全細胞において、または他の翻訳系において、アミノ酸類似体をより効率的に利用できるようにするように、突然変異によりアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）の基質特異性を改変するためのコンピュータ計算ツールに関する。一部の実施形態の特徴としては、ＡＡＲＳ酵素の基質結合部位を系統的に再設計して、その酵素が触媒するペプチドまたはタンパク質翻訳反応での非天然アミノ酸基質の使用を助長することが挙げられる。
【０１８６】
１つの方法によると、人工アミノ酸のロータマーライブラリーは、そのねじれ角を変えて、その天然基質のための結合ポケットに適合するロータマーを作ることによって、構築される。そのアミノ酸類似体の骨格の幾何学的配向は、その結晶構造におけるその天然基質の骨格の結晶配向によって規定される。構造類似性に依存して、生物特異的アミノ酸シンテターゼの結晶構造を用いてもよいし、または別の生物からの相同構造を用いてもよい。その後のタンパク質設計計算において、その類似体上の側鎖と相互作用するそのシンテターゼの結合ポケット内のアミノ酸を同一性およびロータマーの配座に関して変化させることができる。
【０１８７】
１つのそうしたプロトコルもコンピュータ計算法を利用して、基質位置とタンパク質位置の間の相互作用を強化する。これは、エネルギー計算においてそのタンパク質上の設計位置で許される基質とアミノ酸とのペアでのエネルギーを拡大することによって行う。タンパク質間相互作用と比較して、タンパク質−基質相互作用を拡大する最適化計算では、配列選択を、基質との好適な相互作用を有するものであるようなアミノ酸の選択にかたよらせる。
【０１８８】
記載されている方法は、関連Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＰｈｅＲＳ（ｔＰｈｅＲＳ）の公知構造に基づいて、新規組換え形のＥ．ｃｏｌｉフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼを構築するために役立った。この新規改変形のＥ．ｃｏｌｉフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｅＰｈｅＲＳ）は、組換えタンパク質への反応性アリールケトン官能基の効率的なインビボ組み込みを可能にする。加えて、改変トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼを同様に改変し、自然発生トリプトファンの代わりにポリペプチドに非−天然アミノ酸類似体を組み込むことができることを実証した。そこに記載されている結果は、非−天然アミノ酸の活性化およびチャージのためのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの開発におけるコンピュータでのタンパク質設計の総体的能力も明示している。
【０１８９】
（Ａ．ｔＲＮＡシンテターゼについての入手可能な配列および構造情報）
ｍＲＮＡテンプレートからのタンパク質翻訳は、リボソームによって行われる。翻訳プロセスの間、それぞれのｔＲＮＡを、それがリボソームに達するかなり前に、そのアミノ酸類似体とマッチングする。このマッチングは、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）として知られている酵素のコレクションによって行われる。これらの酵素は、それぞれのｔＲＮＡに正しいアミノ酸をチャージし、その結果、それぞれのｔＲＮＡは、ＤＮＡ（およびそのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ）の遺伝子コードからタンパク質のアミノ酸コードへの正しい翻訳を行うことができることとなる。
【０１９０】
大部分の細胞は、２０の異なるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを、アミノ酸のそれぞれのタイプついて１つ作る。これらの２０の酵素を、その固有の特定のアミノ酸、およびそのアミノ酸に適するｔＲＮＡ分子のセットで、機能について、それぞれ最適化する。アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、高精度でそれらのタスクを行わなければならない。これらの酵素の多くは、それらのｔＲＮＡ分子をアンチコドンを用いて認識する。これらの酵素は、１０，０００中１つの間違いを起こす。大部分のアミノ酸にとって、この精度レベルを達成することは然程難しくない。大部分のアミノ酸は、互いに全く異なるからである。
【０１９１】
本方法において、ｔＲＮＡについてのＡＡＲＳ結合ポケットの正確な説明記述は、コンピュータ設計アプローチにとって（それが、タンパク質骨格の説明記述のために結晶構造に依存するので）重要であるが、結晶学的結合ポケット構造の説明記述の代わりに相同タンパク質（例えば、関連種からの相同体）の結晶構造を用いること、または保存ドメインを用いることさえ、完全に許容されることが多い。結晶構造は、シンテターゼの結合ポケット内の天然基質アミノ酸の配向、ならびにシンテターゼ残基、特に、その結合ポケットの中および周囲の残基、に対するそのアミノ酸基質の相対位置も規定する。類似体のための結合ポケットを設計するには、これらの類似体がその天然基質アミノ酸と同じ配向でそのシンテターゼに結合することが好ましい。この配向は、アデニル化工程にとって重要であり得るからである。
【０１９２】
ＡＡＲＳは、原核生物および真核生物をはじめとする任意の生物からのものであってよく、細菌、真菌、苛酷な環境で生きられる生物（ｅｘｔｒｅｍｅｏｐｈｉｌｅｓ）、例えば古細菌、蠕虫、昆虫、魚、両生類、鳥類、動物（特に、哺乳動物および特にヒト）ならびに植物からの酵素がすべて可能である。
【０１９３】
上に記載したように、大部分の細胞は、２０の異なるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを、アミノ酸のそれぞれのタイプついて１つ作る。幾つかの適するシンテターゼが知られており、酵母フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｋｗｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：７５１２−７５１３，２００３）；メタノコッカス・ヤナイシ・チロシン−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｗａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，４９８−５００，２００１）、および酵母チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏｈｎｏら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０，４１７−４２３，２００１）を含む。実際、２０の異なるＡＡＲＳ酵素ほぼすべてについての結晶構造は、現在、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５３５−５４２，１９７７参照）から入手できる。２００１年４月現在、結晶構造が解明されているすべてのＡＡＲＳのリストをＰＤＢウェブサイトで入手することができる。例えば、フェニルアラニンと複合したサーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ａｑｕａｔｉｃｕｓ）フェニルアラニンｔＲＮＡシンテターゼの結晶構造は、２．７Åの分解能を有し、そのＰＤＢ  ＩＤは、１Ｂ７０である。
【０１９４】
前記構造データベースまたは分子モデリングデータベース（ＭＭＤＢ）は、結晶学的およびＮＭＲ構造決定からの実験データを含む。ＭＭＤＢについてのデータは、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ））から得られる。ＮＣＢＩ（米国国立生物工学情報センター）は、構造データを、文献情報に、配列データベースに、およびＮＣＢＩ分類にクロスリンクした。Ｅｎｔｒｅｚからの分子構造の簡単な対話式視覚化には、Ｃｎ３Ｄ（ＮＣＢＩ３Ｄ構造ビューア）を用いることができる。
【０１９５】
Ｅｎｔｒｚ  ３Ｄ  Ｄｏｍａｉｎｓデータベースは、ＮＣＢＩ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）からのタンパク質ドメインを含む。計算生物学者は、反復配列パターンまたはモチーフに基づいて保存ドメインを規定する。ＣＤＤは、現在、２つの評判の良いコレクション（ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍ）とＮＣＢＩでの同僚からの寄贈品（例えば、ＣＯＧ）に由来するドメインを含む。これらのソースデータベースも説明記述を提供し、引用箇所にリンクしている。保存ドメインは、コンパクトな構造単位に対応するので、ＣＤは、可能な限りＣｎ３Ｄによる３Ｄ構造へのリンクを含む。
【０１９６】
タンパク質配列内の保存ドメインを同定するために、ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈサービスは、逆方向位置特異的ＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用する。基礎となる保存ドメインのアラインメントから作製された位置特異的スコアマトリックスと問い合わせ配列を比較する。問い合わせ配列と代表ドメイン配列のペアでのアラインメントとして、または多重アラインメントとして、ヒットを表示することができる。さて、ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈをタンパク質ＰＬＡＳＴ検索と並行してデフォルトによって実行する。使用者が、要求をさらに処理するためにＢＬＡＳＴのキューを待っている間に、その問い合わせのドメイン構造を早くも検討することができる。加えて、ＣＤＡＲＴ（保存ドメイン構造検索ツール（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｒｃｈｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｏｏｌ））により、使用者は、類似したドメイン構造を有するタンパク質を検索することができる。ＣＤＡＲＴは、事前のコンピュータでのＣＤ検索結果を使用して、問い合わせのものに類似した１セットのドメインを有するタンパク質を迅速に同定する。さらなる詳細については、Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：３８３−３８７，２００３、およびＭａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：２８１−２８３，２００２参照。
【０１９７】
加えて、公知アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのデータベースは、Ｍａｃｉｅｊ  Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ、Ｍａｒｚａｎｎａ  Ａ．ＤｅｎｉｚｉａｋおよびＪａｎ  ＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉによってＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９：２８８−２９０，２００１（「Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＴＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ」と題する）に発表されている。対応するウェブサイト（ｒｏｓｅ．ｍａｎ．ｐｏｚｎａｎ．ｐｌ／ａａｒｓ／ｓｅｑ＿ｍａｉｎ．ｈｔｍｌ）は、様々な種からのほぼすべての公知ＡＡＲＳの詳細を提供している。例えば、このデータベースによると、放射線耐性菌デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）（アクセッション番号ＡＡＦ１０９０７）のイソロイシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、１０７８のアミノ酸を有し、Ｗｈｉｔｅらにより、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１５７１−１５７７（１９９９）に発表されており；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ハツカネズミ））のバリル−ｔＲＮＡシンテターゼは、１２６３のアミノ酸を有し（アクセッション番号ＡＡＤ２６５３１）、Ｓｎｏｅｋ  Ｍ．およびｖａｎ  Ｖｕｇｔ  Ｈ．により、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９：４６８−４７０（１９９９）に発表されており；ならびにヒト、ショウジョウバエ、Ｓ．ｐｏｍｂｅおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅ．ｃｏｌｉおよび非常の多数の他の細菌（サーマス・アクアティクス種サーモフィルスを含む）のフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ配列も入手できる。このデータベースは、最後に２００６年１１月にアップデートされた。他の新たに同定されたＡＡＲＳについての類似の情報は、例えば、利用可能な公共データベース（例えば、ＮＣＢＩにおける非齧歯動物データベース、すなわち、「ｎｒ」）または所有者のある私有データベースに対してＡＡＲＳデータベース内の任意の公知配列を問い合わせとして使用してＢＬＡＳＴ検索を行うことにより、得ることができる。
【０１９８】
あるいは、一定の実施形態において、特定のＡＡＲＳの正確な結晶構造は判らないが、そのタンパク質配列が、公知の結晶構造を有する公知のＡＡＲＳ配列に類似しているまたは相同である場合。そうした場合、問題のＡＡＲＳの配座は、その相同ＡＡＲＳの公知の結晶構造に類似していると予想される。従って、その既知構造を、目的とするＡＡＲＳについての構造として用いることができ、または、さらに好ましくは、目的とするＡＡＲＳの構造を予測する（すなわち、「相同性モデリング」または「分子モデリング」）ために用いることができる。特定の例として、上に記載した分子モデリングデータベース（ＭＭＤＢ）（Ｗａｎｇら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００，２８：２４３−２４５；Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９９，２７：２４０−２４３参照）は、三次元構造が判っている隣接配列を含む、タンパク質配列（ＭＭＤＢでは「隣接」配列と呼ばれている）に類似しているまたは相同であるタンパク質および／または核酸を同定するために用いることができる検索エンジンを提供している。このデータベースは、公知の構造と共にアラインメントおよび視覚化ツール、例えばＣｎ３Ｄ（ＮＣＢＩによって開発されたもの）、ＲａｓＭｏｌなどへのリンクをされに提供しており、それによって、相同および親配列を比較することができ、そうした配列アラインメントおよび公知の構造に基づいてその親配列についての構造を得ることができる。
【０１９９】
３Ｄ構造が判っている相同ＡＡＲＳ配列は、アミノ酸基質結合のための活性部位領域またはポケット領域において、目的とするＡＡＲＳと、好ましくは少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％同一である。こうした活性部位またはポケットは、遠いアミノ酸がその３Ｄ構造内で集まることができるので、ＡＡＲＳの一次アミノ酸配列の中で連続していなくてもよい。この場合、配列相同性または同一性は、例えば、互いにアラインされる（比較される２つの配列のいずれにも挿入および欠失がない）および基質アミノ酸結合に関与することが判っている残基を含む領域において、デフォルト条件を用いるＮＣＢＩ標準ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて、計算することができる。例えば、サーマス・アクアティクスフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ触媒（アルファ）サブユニットは、他の種からのその相同体と比較したとき、残基１５６から１６５の「挿入」領域を有するようである。この領域は、配列同一性の計算では無視することができる。あるいは、相同ＡＡＲＳは、好ましくは、全体的に見て、目的とするＡＡＲＳと約３５％、または４０％、または４５％、または５０％または５５％同一である。Ｅ．ｃｏｌｉフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼアルファサブユニットは、サーマス・アクアティクスフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼと、全体的にみて約４５％同一であり、および活性部位領域において約８０％同一である。ヒトフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼアルファサブユニットは、そのショウジョウバエ、蠕虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）対照物と、それぞれ、全体的に見て約６２％、６０％、５４％、５０％同一である。
【０２００】
特定のＡＡＲＳ配列が判らないまたは入手できないことがある少数のケースでは、常例的実験技術（例えば、Ｘ線結晶学および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学）を用い、過度な実験を伴わずに、その構造を決定することができる。例えば、ＮＭＲ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇ．Ｃ．Ｋ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｉｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：７４０−７４３，２０００；Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈ．Ｂｉｏｍ．２７：３５７−４０６，１９９８；Ｋａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７５：１−１５，１９９７；Ｄａｙｉｅら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．４７：２４３−２８２，１９９６；Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ａｃｔａ  Ｃｙｒｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  ５１：２４９−２７０，１９９５；Ｋａｈｎら，Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ．７：１３１−１３８，２０００；Ｏａｋｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｅ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐ．２７：１４５−１５１，２０００；Ｆｏｕｒｍｅら，Ｊ．Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔ．６：８３４−８４４，１９９９参照。
【０２０１】
あるいは、ＡＡＲＳの三次元構造は、それ自体の配列から計算することができ、および当該技術分野において既に知られている分子モデリング技術を最初から用いて計算することができる。例えば、Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．４：２１７−２２５，１９９７；Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２４：１６９−１７９，１９９６；Ｂｏｈｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．５９：１−３２，１９９６；Ｆｅｔｒｏｗ  ａｎｄ  Ｂｒｙａｎｔ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．１１：４７９−４８４，１９９３；Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：５１２−５１９，１９９１；Ｌｅｖｉｔｔら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：５４９−５７９，１９９７；Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．３０：１−９４，１９９５；Ｘｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３００：１７１−１８５，２０００；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：３７１−３７９，２０００参照。最初からのモデリングにより得られる三次元構造は、経験的技術（例えば、ＮＭＲ分光学もしくはＸ線結晶学）または半経験的技術（例えば、相同モデリング）を用いて得られる構造より、一般に信頼性が低い。しかし、こうした構造は、一般に、本明細書に開示する一部の方法での使用には、あまり好ましくはないが、十分な質のものであろう。
【０２０２】
（Ｂ．配列相同性に基づく３Ｄ構造の予測法）
結晶化されておらず、他の構造決定のまとになっていないＡＡＲＳタンパク質についても、やはり、当該技術分野において利用できる多数の技術を用いて、ＡＡＲＳおよびその結合部位のコンピュータ作成分子モデルを作成することができる。例えば、相同モデリング技術を用いて、標的ＡＡＲＳ配列のＣα−カーボン位置を、類似した配列を有するＡＡＲＳ酵素（「公知ＡＡＲＳ」）の特定の配位パターンにマッピングして構造を導出し、その標的タンパク質の構造およびそれぞれの原子の速度を、アミノ酸類似体とのドッキングシミュレーションを決定することとなるシミュレーション温度（Ｔｏ）で計算することができる。一般に、こうしたプロトコルは、公知ＡＡＲＳタンパク質によって提供されるものなどの三次構造から得られる主鎖トレースを想定して、モデリングした標的タンパク質における側鎖配座を予測することを、主として含む。エネルギー最小化ルーチンを実行するためのコンピュータプログラムを一般に用いて、分子モデルを生成する。例えば、ＣＨＡＲＭＭアルゴリズム（Ｂｒｏｏｋｓら，（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７）とＡＭＢＥＲアルゴリズム（Ｗｅｉｎｅｒら，（１９８１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）は両方とも、分子システムセットアップ、力場計算および分析のすべてを処理する（例えば、Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら，（１９９１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｃ３７６−３８６；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｅｌｇ  ４６：４９−５４；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６４０−６４４；Ｂｕｒｂａｍら，（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：９９−１１１；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５）Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  ６１：１８５−１９０；およびＫｉｎｉら，（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  ９：４７５−４８８も参照）。これらのプログラムの中心は、そのモデルのすべての原子の位置を想定して、その系の全ポテンシャルエネルギーおよびそれぞれの原子に対する力を計算する、１セットのサブルーチンである。これらのプログラムは、原子配座とポテンシャルエネルギー関数の様々な項と分子トポロジー（共有結合構造）の説明記述のスターティングセットを利用し得る。こうした分子モデリングの共通の特徴としては、水素結合および他の拘束力の処理への対策；周期的境界条件の使用；ならびに温度、圧力、容積、拘束力または他の外部制御条件を維持または変化させるための位置、速度または他のパラメーターの臨機調整への対策が挙げられる。
【０２０３】
大部分の従来的なエネルギー最小化法は、入力配座データと、ポテンシャルエネルギー関数がデカルト座標の明確な微分可能関数であるという事実とを用いて、原子位置の任意のセットについてのポテンシャルエネルギーおよびその傾き（これは、それぞれの原子に対する力を与える）を計算する。この情報を用いて、全ポテンシャルエネルギーを減少させようとする中で座標の新たなセットを生成し、ならびにこのプロセスを何度も何度も繰り返すことにより、所与の外部条件セットのもとでの分子構造を最適化することができる。これらのエネルギー最小化法は、本ＡＡＲＳタンパク質に類似した分子に常例的に適用される。
【０２０４】
一般に、エネルギー最小化法は、所与の温度（Ｔｉ）について行われ、前記Ｔｉは、ドッキングシミュレーション温度（Ｔｏ）とは異なる場合がある。Ｔｉでその分子のエネルギーを最小化したら、その系におけるすべての原子の座標および速度をコンピュータ計算する。加えて、その系の正常モードを計算する。それぞれの正常モードが、その系のすべての部分が互いに同期して動く集団、周期運動であること、およびその分子の運動が、すべての正常モードの重ね合わせであることは、当業者には理解されるであろう。所与の温度についての特定モードでの運動の平均二乗振幅は、そのモードについての有効力定数に逆比例する。これに関しては、低周波数振動が、多くの場合、分子の運動を支配する。
【０２０５】
分子モデルをＴｉでエネルギー最小化した後、所望の温度（Ｔｏ）に達するまで原子の速度を段階的に増減する平衡ランの実施により、その系をシミュレーション温度（Ｔｏ）に「加熱」または「冷却」する。その系の一定の特性、例えば平均運動エネルギーが一定した状態になるまで、所定の時間、その系をさらに平衡させる。その後、その平衡した系からそれぞれの原子の座標および速度を得る。
【０２０６】
さらなるエネルギー最小化ルーチンを行ってもよい。例えば、第二のクラスの方法は、タンパク質についての制約のあるＥＯＭに対する近似的解の計算を含む。これらの方法は、反復アプローチを用いてラグランジュ乗数について解き、一般に、必要とされる補正が少ない場合には少しの反復しか必要としない。このタイプの最も評判の良い方法、ＳＨＡＫＥ（Ｒｙｃｋａｅｒｔら，（１９９７）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｈｙｓ．２３：３２７；およびＶａｎ  Ｇｕｎｓｔｅｒｅｎら，（１９７７）Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓ．３４：１３１１）は、実行が容易であり、制約の数が増すについれてＯ（Ｎ）として増減する。従って、この方法は、ＡＡＲＳタンパク質などの高分子に適用することができる。代替法、ＲＡＴＴＬＥ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｈｙｓ．５２：２４）は、ベルレットアルゴリズムの速度バージョンに基づく。ＳＨＡＫＥと同様に、ＲＡＴＴＬＥは、反復アルゴリズムであり、本ＡＡＲＳタンパク質のモデルのエネルギー最小化に用いることができる。
【０２０７】
（Ｃ．代替法）
他の実施形態において、アミノ酸類似体のアイデンティティーを一定に保つことおよび（幾つかの異なる突然変異体構造をモデリングすることにより）ＡＡＲＳ構造を変化させることではなく、本方法は、（例えば、も１つの非アンカーアミノ酸残基が変更されている）単一の改変ＡＡＲＳについての分子モデルを使用し、様々な異なるアミノ酸類似体またはそれらの可能性のあるフラグメントをサンプリングして、その改変ＡＡＲＳ酵素と相互作用し、その基質となる可能性が高い類似体を同定することによって行われる。このアプローチは、アミノ酸類似体（ロータマー変異体を含む）の座標ライブラリーを利用する場合もあり、または連結してアミノ酸類似体の側鎖を形成することができる官能基およびスペーサーのライブラリーを利用する場合もある。
【０２０８】
上で説明したものなどのアプローチ、例えば、相同モデリングを用いて、改変ＡＡＲＳの結合部位の座標セットを得ることができる。
【０２０９】
改変ＡＡＲＳの基質結合部位と相互作用するために適切な立体的および電子特性を有するであろうアミノ酸類似体の構造の同定に容易に適応させることができる様々なコンピュータ計算法がある。例えば、Ｃｏｈｅｎら，（１９９０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．３３：８８３−８９４；Ｋｕｎｔｚら，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ（１９８８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．３１：７２２−７２９；Ｂａｒｔｌｅｔｔら，（１９８９）（Ｓｐｅｃ．Ｐｕｂｌ．，Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．）７８：１８２−１９６；Ｇｏｏｄｆｏｒｄら，（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．２８：８４９−８５７；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｍ．２９：２１４９−２１５３）参照。指示される方法は、一般に２つのカテゴリーに分類される：（１）（例えば、結晶学系データベースからの）既知の分子の３Ｄ構造をＡＡＲＳ結合部位構造とドッキングさせ、適合度について採点する、類推による設計；および（２）アミノ酸類似体モデルを、ＡＡＲＳ結合部位において区分的に構築する、新規設計。特に、後者のアプローチは、本改変ＡＡＲＳ結合部位に結合するように一意的に設計される新規分子の開発を助長することができる。
【０２１０】
例証となる実施形態において、特定の改変ＡＡＲＳとともに機能し得る可能性のあるアミノ酸類似体の設計は、酵素の基質結合部位に相補的な形状の全般的な見通しから始まり、その基質結合部位に幾何学的に合う候補について公知三次元構造の小分子のデータベースをスキャンすることができる検索アルゴリズムを利用する。そうしたライブラリーは、一般的な小分子ライブラリーであってもよいし、またはアミノ酸類似体もしくはアミノ酸類似体を作るために使用することができる小分子に関するライブラリーであってもよい。この形状検索において見つけられる分子は、それら自体、必ずしも糸口にならないと思われる。化学的相互作用の評価は、必ずしも初期検索中になされないからである。むしろ、こうした候補は、適切な原子置換を行うことができる分子骨格を生じさせる、さらなる設計のための枠組みとしての役割を果すと予想される。勿論、これらの分子の化学的相補性を評価してもよいが、原子タイプは、基質結合部位との静電的、水素結合性および疎水性相互作用を極大化させるために変更されることとなると予想される。このタイプの殆どのアルゴリズムは、ＡＡＲＳ基質結合部位の形状に相補的であり得る化学的構造の幅広い組み合わせを見つける方法となる。
【０２１１】
例えば、特定のデータベース、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＣＣＤＢ）（Ａｌｌｅｎら、（１９７３）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｄｏｃ．１３：１１９）、からのそれぞれの小分子セットを、ドッキングアルゴリズムを用いて多数の幾何学的に許容される配向で改変ＡＡＲＳの結合部位に個々にドッキングさせる。好ましい実施形態では、ＤＯＣＫと呼ばれる１セットのコンピュータアルゴリズムを、結合部位を構成する陥入および溝の形状の特性付けに用いることができる。例えば、Ｋｕｎｔｚら，（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８参照。このプログラムは、その形状が改変ＡＡＲＳの特定の結合部位に相補的であるテンプレートについて小分子のデータベースを検索することもできる。この目的に適応させることができる例示的アルゴリズムは、例えば、ＤｅｓＪａｒｌａｉｓら，（１９８８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：７２２−７２９に記載されている。
【０２１２】
配向を適合度について評価し、最良のものは、分子力学プログラム、例えばＡＭＢＥＲまたはＣＨＡＲＭＭ、を用いるさらなる試験のために保持する。こうしたアルゴリズムは、受容体または酵素の所与の結合部位に形状が相補的である様々な分子でうまくいくことが以前に証明されており、幾つかの魅力的な特徴を有することが明らかになった。第一に、こうしたアルゴリズムは、非常に様々な分子構造を検索することができる。第二に、最良の構造は、他のタンパク質への以前の適用において、広い表面積全体にわたって堂々たる形状相補性を明示した。第三に、全アプローチが、候補原子の位置決めの小さな不確実性に関して相当強いようである。
【０２１３】
一定の実施形態において、本方法は、Ｇｏｏｄｆｏｒｄ（１９８５，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７）およびＢｏｏｂｂｙｅｒら（１９８９，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２：１０８３−１０９４）によって記載されたアルゴリズムを利用することができる。これらの論文には、結合部位の分子表面の異なる化学基（プローブと呼ばれる）に対して親和性の高い領域を決定しようと努めるコンピュータプログラム（ＧＲＩＤ）が記載されている。従って、ＧＲＩＤは、結合を強化し得る公知リガンドの改変を提案するためのツールとなる。ＧＲＩＤによって高親和性領域と識別される一部の部位は、一連の公知リガンドから推論により決定される「ファーマコフォアパタン」に対応すると予想できる。本明細書で用いる場合、ファーマコフォアパタンは、結合に重要と考えられる、予想されるアミノ酸類似体の特徴の幾何学的配置である。ＧｏｏｄｓｅｌｌおよびＯｌｓｏｎ（１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１９５−２０２）は、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ（模擬アニーリング）アルゴリズムを用いて、単一の既知リガンドを標的タンパク質にドッキングした。彼等のアプローチは、ＡＡＲＳ結合部位とのドッキングに適するアミノ酸類似体の同定に適応させることができる。このアルゴリズムは、アミノ酸側鎖にねじり可撓性を許容することができ、ならびに近似的相互作用エネルギーをコンピュータ計算するために高速参照テーブルとしてＧＲＩＤ相互作用エネルギーマップを使用することができる。
【０２１４】
さらに、さらなる実施形態は、立体的に許容もされ、候補分子と周囲アミノ酸残基との好適な化学的相互作用を達成する高い尤度も有するようにＡＡＲＳの基質結合部位において配向させることができる小分子についてＣＣＤＢなどのデータベースを検索するＣＬＩＸなどのコンピュータアルゴリズムを利用する。この方法は、異なる化学基についての一団の好適結合位置による基質結合位置の特性付け、個々の候補化学基とその一団のメンバーとの最大の空間的一致を生じさせる候補分子の配向についてのその後の検索に基づく。現在、コンピュータ能力を利用するには、新規リガンドについてのコンピュータベースの検索が幅優先戦略に従うことが条件となる。幅優先戦略は、１つの候補の最大詳細分析を次に進む前に行う深さ優先戦略とは対照的に、次第にストリンジェンシーが増す基準の適用によって可能性のある候補検索空間のサイズを漸進的に減少させることを目的とする。ＣＬＩＸは、結合についてのその分析が基本である（好適な結合相互作用が実際に発生する十分な条件を課さずとも、空間的適合の必要条件および結合のために「正しい」場所に個々の基を有するという必要条件を満たそうと努める）点で、この戦略に準拠する。好適な配向に関する分子の格付け「選抜候補リスト」を作り、その後、コンピュータグラフィックおよびさらに洗練された分子モデリング技術を用いてそれを分子単位で調査することができる。ＣＬＩＸは、結合を強化し得る候補分子の置換化学基への変更を提案することもできる。重ねて、出発ライブラリーは、アミノ酸類似体のものである場合もあり、またはアミノ酸類似体の側鎖を生じさせるために用いることができる分子のものである場合もある。
【０２１５】
ＣＬＩＸのアルゴリズムの詳細は、Ｌａｗｅｒｅｎｃｅら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １２：３１−４１に記載されており、このＣＬＩＸアルゴリズムは、次のように要約することができる。ＧＲＩＤプログラムを用いて、多種多様な代表的化学基についてのＡＡＲＳタンパク質の結合部位における別個の好適な相互作用位置（標的部位と呼ばれる）を決定する。ＣＣＤＢにおけるそれぞれの候補リガンドについて、そのタンパク質の結合位置における空間的な意味で、候補の置換化学基のペアとＧＲＩＤによって提案される対応する好適な相互作用部位のペアとを一致させる網羅的試みを行う。リガンド基のペアとＧＲＩＤ部位のペアのすべての可能な組み合わせがこの手順の間に考慮される。こうした一致を位置決めすると、このプログラムは、基の２つのペアについて候補リガンドを交代させ、立体障害および他の候補原子団と適する標的部位との一致について確認する。その結合部位において良好な幾何学的適合度であり、原子団とＧＲＩＤ部位の十分な一致を示す特定の候補／配向の組み合わせを保持する。
【０２１６】
幅優先戦略と一致して、このアプローチは、仮定の単純化を含む。固定されたタンパク質および小分子の幾何形状が全体をとおして維持される。第一の近似として、固定された幾何形状は、たとえ局部的なものであってもその分子について最小のエネルギーを示す、改変ＡＡＲＳの結合部位のエネルギー最小化座標として、許容される。
【０２１７】
ＣＬＩＸに潜在的に含まれるさらなる仮定は、可能性のあるリガンドが、改変ＡＡＲＳの基質結合部位に導入されたとき、そのタンパク質の立体化学の変化および偏ったチャージ分布を誘導せず、そのため、ＧＲＩＤ相互作用エネルギーマップをコンピュータ計算した基礎を変えないという仮定である。ＧＲＩＤによって予測される相互作用部位が、位置およびタイプの意味でしか用いられないこと、すなわち、候補原子団がＧＲＩＤによって好適と予測された部位に位置するとき、結合幾何形状、プロトン化の状態および偏ったチャージ分布が、タンパク質と原子団との強い相互作用にとって有利であることを保障するための確認が一切行われないことも強調しなければならない。こうした詳細分析は、ＣＬＩＸ選抜候補リストにおいて同定された候補についてのより進んだモデリングの一部を成すであろう。
【０２１８】
所定の改変ＡＡＲＳにより利用され得るアミノ酸類似体を同定するためのコンピュータ支援分子設計法のさらにもう１つの実施形態は、その酵素の基質結合部位との望ましい構造的および静電的相補性を示すであろう小分子フラグメントのアルゴリズムの連結による可能性のある阻害剤の新規合成を含む。この方法論は、ＡＡＲＳ基質結合部位のモデルにおいて小分子の大きなテンプレートセットを繰り返しつなぎ合わせてながら用いる。ファンデルワールスおよびクーロン相互作用、伸長リガンドの内部ひずみエネルギー、およびリガンドと酵素の両方の脱溶媒を考慮する分子力学に基づくエネルギー関数に従って、それぞれのリガンド成長段階を評価する。検索空間は、結合基準による剪定によって制御し続けるデータツリーの使用によって管理することができる。
【０２１９】
さらにもう１つの実施形態では、改変ＡＡＲＳ酵素の基質結合部位における官能基のエネルギー的に好適な位置を決定するためにエネルギー最小化クエンチ分子動力学的アルゴリズムに基づく方法を用いて、可能性のあるアミノ酸類似体を決定することができる。この方法は、既知アミノ酸およびアミノ酸類似体の改変によって、または新規合成によって、そうした官能基を組み込む分子の設計を助長することができる。
【０２２０】
例えば、Ｍｉｒａｎｋｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １１：２９−３４によって記載された多コピー同時検索法（ＭＣＳＳ）は、本方法での使用に適応させることができる。タンパク質の力場における官能基の局所最小値を決定および特性付けするために、選択された官能基の多数のコピーを、先ず、ＡＡＲＳタンパク質上の目的とする結合部位に分布させる。分子力学またはクエンチ動力学によるこれらのコピーのエネルギー最小化は、明確な局所的最小値を生じさせる。その後、これらの最小値の付近をグリッドサーチまたは拘束のある最小化によって探査することができる。１つの実施形態において、ＭＣＳＳ法は、古典的時間依存型ハートリー（ＴＤＨ）近似を用いて、そのタンパク質の力場内の多数の同一の基を同時に最小化またはクエンチする。
【０２２１】
ＭＣＳＳアルゴリズムの実行には、官能基の選択およびそれらそれぞれについての分子力学モデルが必要である。基は、容易に特性付けおよび操作できるほど単純（３〜６個の原子、二平面の自由度は殆どまたは全くない）でなければならないが、その官能基がＡＡＲＳタンパク質の部位に結合する基質に関して有するであろう立体および静電相互作用を概算できるほど複雑でなければならない。好ましいセットは、例えば、大部分の有機分子をそうした基のコレクションとして説明することができるものである（Ｐａｔａｉ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ，ｅｄ．Ｓ．Ｐａｔａｉ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ，ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，（１９８９））。これは、アセトニトリル、メタノール、アセテート、メチルアンモニウム、ジメチルエーテル、メタンおよびアセトアルデヒドなどのフラグメントを含む。
【０２２２】
結合部位における局所エネルギー最小値の決定は、多数の開始位置のサンプリングを必要とする。これは、例えば１，０００〜５，０００個の基を結合部位を中心にした球の内部にランダムに分布させることによって達成することができ、タンパク質によって占有されない空間だけを考慮する必要がある。一定の位置の特定の基とタンパク質の相互作用エネルギーが、所与のカットオフ（例えば、５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりプラスである場合、その基は、その部位から切り捨てられる。開始位置のセットを考え合わせると、ＴＤＨ近似の使用によりすべてのフラグメントが同時に最少化される（Ｅｌｂｅｒら（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：９１６１−９１７５）。この方法では、それぞれのフラグメントに対する力は、その内力およびタンパク質に起因する力から成る。この方法の本質的原理は、フラグメント間の相互作用を削除し、タンパク質に対する力を単一フラグメントに起因する力に正規化することである。このようにして、単一タンパク質の場における任意の数の官能基の同時最少化または動力学的処理を実施することができる。
【０２２３】
例えば１００個のランダムに配置された基のサブセットに関する最少化を逐次的に実施する。１，０００間隔など、一定の段階数の間隔をおいて、結果を検査して、同じ最小値に収束する基を削除することができる。このプロセスを、最少化が完了する（例えば、０．０１ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ÅのＲＭＳの傾き）まで繰り返す。こうして得られるエネルギー最小化分子セットは、アミノ酸類似体についての可能な側鎖に相当する三次元での不連続フラグメントのセットに事実上等しいものを含む。
【０２２４】
その後、次の工程は、小さな化学単位（原子、鎖または環部分）から組み立てられたスペーサーとそれらの断片を接続して、アミノ酸類似体を形成する工程であり、例えば、例えばＮＥＷＬＥＡＤ（Ｔｓｃｈｉｎｋｅら（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８６３−３８７０）などのコンピュータプログラムを用いて、前記不連続フラグメントのそれぞれを空間で連結させて、単一分子を生じさせることができる。ＮＥＷＬＥＡＤが採る手順は、次の一連のコマンドを実行する：（１）２つの孤立した部分を接続する、（２）さらなる処理のための途中解を保持する、（３）不連続単位が見つからなくなるまで途中解のそれぞれについて上記工程を繰り返す、および（４）それぞれが単一の分子である最終解を出力する。こうしたプログラムは、例えば、３つのタイプのスペーサー（ライブラリースペーサー、単一原子スペーサーおよび融合環スペーサー）を用いることがある。ライブラリースペーサーは、小分子、例えば、エチレン、ベンゼンおよびメチルアミドの最適化構造である。ＮＥＷＬＥＡＤなどのプログラムによって生成される出力は、今はスペーサーによって接続されている元々のフラグメントを含有する１セットの分子から成る。入力フラグメントに属する原子は、それらの元々の空間配向を維持する。これらの分子は、スペーサーおよび官能基の単純な組成のため化学的に妥当と思われ、ならびにファンデルワールス半径に違反する解の拒絶のためエネルギー論的に許容される。
【０２２５】
加えて、この方法の工程を行う順序は、本質的に単なる実例に過ぎない。実際、これらの工程は、本開示により別の指示がない限り、いずれの順序で行ってもよく、または並行して行ってもよい。
【０２２６】
さらに、本明細書に開示する方法は、ハードウェア、ソフトウェア、またはこれらの任意の組み合わせで行うことができる（これらの用語は、当該技術分野において現在知られているとおり）。詳細には、本方法は、任意のタイプのコンピュータでのソフトウェア、ファームウェア、またはマイクロコード操作によって行うことができる。加えて、ソフトウェアは、任意のコンピュータ可読媒体（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、磁気媒体、穿孔テープまたはカード、任意の形態のコンパクトディスク（ＣＤ）、ＤＶＤなど）に記憶された任意の形態（例えば、原始コード、目的コード、解釈コードなど）のコンピュータ命令を含む。さらに、こうしたソフトウェアは、インターネットに接続された装置間で転送される周知ウェブページの中で見つけられるような、搬送波に組み入れられたコンピュータデータシグナルの形態である場合もある。従って、一定の実施形態は、本開示において特に別様に述べられていない限り、いずれの特定のプラットフォームにも限定されない。
【０２２７】
一定の実施形態の実施に適する例示的コンピュータハードウェア手段は、１０Ｒ１００００プロセッサが並行して動作するＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅサーバーであり得る。適するソフトウェア展開環境としては、Ｂｉｏｓｙｍ／Ｍｏｌｅｃｕｒａ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州、サンディエゴ）によるＣＥＴＩＵＳ２、または他の等価物が挙げられる。
【０２２８】
上で説明したコンピュータ計算法を、非天然アミノ酸の組み込みを可能にするためのタンパク質合成機構の酵素（例えば、ＡＡＲＳ）の改変に有効に用いた。コンピュータ計算ツールのこの同じスイートにてこ入れして、非天然アミノ酸が組み込まれる最終製品（例えば、モノクローナル抗体または他の治療薬）を、それらの構造的または機能特性を強化または改変するように、設計することもできる。
【０２２９】
本明細書に開示する特定の実施形態を証明し、説明したが、より広い態様から逸脱することなく変更および改変を行うことができることおよび、従って、添付のクレームが、本発明の真の精神に入るそうした変更および改変すべてをそれらの範囲に包含するものであることは、当業者には理解されるであろう。
【０２３０】
（異なる生物からのＡＡＲＳの採用）
外的突然変異体ｔＲＮＡ、改変もしくは外的突然変異体ＲＳ、または改変ｔＲＮＡ／ＲＳペアを生じさせる第二の戦略は、別の生物から目的とする翻訳系、例えばＥ．ｃｏｌｉへのｔＲＮＡおよび／またはシンテターゼの移入を含む。この特定の例において異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉｔＲＮＡにあまり十分にチャージされない（好ましくは、まったくチャージされない）ことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉシンテターゼによって妥当にアシル化されない（好ましくは、まったくされない）ことが挙げられる。
【０２３１】
Ｓｃｈｉｍｍｅｌらは、Ｅ．ｃｏｌｉＧｌｎＲＳ（ＥｃＧｌｎＲＳ）が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｔＲＮＡＧｌｎをアシル化しないと報告した（ＥｃＧｌｎＲＳは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧｌｎＲＳ（ＳｃＧｌｎＲＳ）によりプロセッシングされるＮ末端ＲＮＡ結合ドメインを欠く）。Ｅ．Ｆ．Ｗｈｅｌｉｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：２９６８（１９９７）参照。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ・アンバーサプレッサｔＲＮＡＧｌｎ（ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡ）を分析して、それもＥｃＧｌｎＲＳの基質でないかどうかを決定した。インビトロアミノアシル化アッセイにより、これがそのケースであることが証明され、インビトロ抑制研究は、ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡが翻訳能力を有することを示している。例えば、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，ＰＮＡＳ．Ｕ  Ｓ  Ａ，９６：４７８０（１９９９）参照。ＳｃＧｌｎＲＳは、いずれのＥ．ｃｏｌｉｔＲＮＡもアシル化せず、インビトロでＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡのみをアシル化することが、さらに証明された。ＳｃＧｌｎＲＳがＥ．ｃｏｌｉにおけるＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡをアシル化できる程度も、インビボ相補性アッセイを用いて評価された。アンバーナンセンス突然変異が、β−ラクタマーゼ遺伝子における許容される部位に導入された。アンバーサプレッサーｔＲＮＡによる突然変異の抑制は、完全長β−ラクタマーゼを生じさせ、細胞にアンピシリン耐性を付与するであろう。ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡのみが発現される場合、細胞は、２０μｇ／ｍＬ  アンピシリンのＩＣ５０を示し、これは、内在性Ｅ．ｃｏｌｉシンテターゼによるアシル化が実質的にないことを示し；ＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡがＳｃＧｌｎＲＳと共発現される場合、細胞は、約５００μｇ／ｍＬ  アンピリジンのＩＣ５０を獲得し、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＳｃＧｌｎＲＳがＳｃｔＲＮＡＧｌｎＣＵＡを効率的にアシル化することを明示している。Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｚ，ＰＮＡＳ，Ｕ  Ｓ  Ａ，９６：４７８０（１９９９）参照。
【０２３２】
もう１つの例として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｔＲＮＡＡｓｐは、Ｅ．ｃｏｌｉシンテターゼに対する外的突然変異体であることが知られている。例えば、Ｄｏｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｍｕｄｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３８：３６７７（１９６３）；およびＫｗｏｋ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：２１３（１９８０）参照。それに由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＳｃｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡ）もＥ．ｃｏｌｉにおける外的突然変異体であることが、上で説明したインビボβ−ラクタマーゼアッセイを用いて実証された。しかし、ｔＲＮＡＡｓｐのアンチコドンは、ＡｓｐＲＳの重要な認識要素であり（Ｇｉｅｇｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７８：６９５（１９９６）参照）、ＣＵＡへのアンチコドンの突然変異は、結果として、ＡｓｐＲＳに対するそのサプレッサーの親和性を喪失させる。Ｅ．ｃｏｌｉＡｓｐＲＳ  Ｅ９３Ｋ突然変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉアンバーサプレッサーｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡをｗｔ  ＡｓｐＲＳよりほぼ一桁良好に認識することが証明された。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，‘Ｔｈｅｓｉｓ’，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌｏｕｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ，１９９５参照。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡｓｐＲＳ（Ｅ１８８Ｋ）への関連突然変異の導入は、ＳｃｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡに対するその親和性を回復させ得ると推測された。インビトロアミノアシル化実験により、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡｓｐＲＳ（Ｅ１８８Ｋ）突然変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉｔＲＮＡをアシル化しないが、中等度の効率でＳｃｔＲＮＡＡｓｐＣＵＡにチャージされると決定された。例えば、Ｐａｓｔｒｎａｋら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，８３：２２７７（２０００）参照。
【０２３３】
類似のアプローチは、異種シンテターゼを外的突然変異体シンテターゼとして、および同じ生物または関連生物の突然変異体開始ｔＲＮＡを改変ｔＲＮＡとして使用することを含む。ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙおよび共同研究者は、ヒトイニシエーターｔＲＮＡｆＭｅｔのアンバー突然変異体が、酵母細胞において、ＥｃＧｌｎＲＳが共発現された場合にのみ、Ｅ．ｃｏｌｉＧｌｎＲＳによってアシル化され、アンバーサプレッサーとして作用することを発見した。Ｋｏｗａｌら，ＰＮＡＳ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９８：２２６８（２００１）参照。従って、このペアは、酵母において使用するための外的突然変異体ペアの代表である。また、Ｅ．ｃｏｌｉイニシエーターｔＲＮＡｆＭｅｔアンバー突然変異体は、いずれのＥ．ｃｏｌｉシンテターゼに対しても不活性であることが判明した。この突然変異体ｔＲＮＡにチャージされ、結果として、Ｅ．ｃｏｌｉに外的突然変異体ペアをもたらす突然変異体酵母ＴｙｒＲＳが、選択された。
【０２３４】
本明細書に開示する方法を用いて、上の望ましいペアおよびペアの成分を発展させて、例えば非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化することができる、望ましい特性を有する外的突然変異体ｔＲＮＡおよび／またはＲＳを生じさせる。
【０２３５】
一定の実施形態において、改変ｔＲＮＡおよび改変ＲＳは、様々な生物からの自然発生ｔＲＮＡおよびＲＳの突然変異によって得ることができる。１つの実施形態において、改変ｔＲＮＡおよび／または改変ＲＳは、少なくとも１つの生物に由来す、この場合の生物は、原核生物、例えば、メタノコッカス・ヤナシイ、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａ．フルギダス、Ｐ．フィリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、またはＴ．サーモフィルスなどである。場合によっては、前記生物は、真核生物、例えば、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物などの高等植物）、藻類、真菌（例えば、酵母など）、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物など）、昆虫、または原生生物などである。場合によっては、改変ｔＲＮＡは、第一の生物からの自然発生ｔＲＮＡの突然変異によって得られ、改変ＲＳは、第二の生物の自然発生ＲＳの突然変異によって得られる。１つの実施形態において、改変ｔＲＮＡおよび改変ＲＳは、突然変異ｔＲＮＡおよび突然変異ＲＳから得ることができる。一定の実施形態において、第一の生物からの改変ＲＳおよび／または改変ｔＲＮＡは、その改変ｔＲＮＡまたは改変ＲＳによって認識されるコドンに対して非機能性の内在性ＲＳおよび／またはｔＲＮＡを場合によっては有する第二の生物の翻訳系に提供される。
【０２３６】
外的突然変異体ｔＲＮＡおよび／または外的突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼも、場合によっては、様々な生物から単離される。１つの実施形態において、外的突然変異体ｔＲＮＡおよび／または外的突然変異体シンテターゼは、少なくとも１つの生物に由来す、この場合の生物は、原核生物、例えば、メタノコッカス・ヤナシイ、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａ．フルギダス、Ｐ．フィリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、またはＴ．サーモフィルスなどである。場合によっては、前記生物は、真核生物、例えば、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物などの高等植物）、藻類、真菌（例えば、酵母など）、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物など）、昆虫、または原生生物などである。場合によっては、外的突然変異体ｔＲＮＡは、第一の生物からの自然発生ｔＲＮＡから単離され、外的突然変異体シンテターゼは、第二の生物の自然発生ＲＳから単離される。１つの実施形態において、外的突然変異体ｔＲＮＡおよび／または外的突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼは、１つ以上のライブラリー（これは、（原核生物および／または真核生物を含むものをはじめとする）１つ以上の生物からの１つ以上のｔＲＮＡおよび／またはＲＳを場合によっては含む）から単離することができる。
【０２３７】
任意の翻訳系において使用するための外的突然変異体ｔＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡシンテターゼ対の選択方法も本明細書に開示する。この方法は、第一生物から単離されたまたは得られたマーカー遺伝子、ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を、第二の生物からの細胞の第一のセットに導入すること；そのマーカー遺伝子およびｔＲＮＡまたはＲＳを、第二の生物からのもう１つの全く同じ細胞セットに導入すること；およびそのもう１つの全く同じ細胞セットにおいて生存できない、第一のセットにおける生存細胞について選択することを含み、この場合、第一のセットおよびもう１つの全く同じ細胞セットは、選択剤の存在下で増殖させたものであり、ならびに生存細胞は、翻訳系において使用するための外的突然変異体ｔＲＮＡおよび／またはＲＳを含む。１つの実施形態において、比較および選択は、インビボ相補性アッセイを含む。もう１つの実施形態において、選択剤の濃度を変化させる。同アッセイを第二の生物に基づくインビトロまたはインビボ系において行うこともできる。
【０２３８】
（突然変異誘発および選択／スクリーニングによるＡＡＲＳの生成）
標的ポリペプチドまたはタンパク質への非−天然アミノ酸の組み込みのために用いることができるＡＡＲＳの突然変異または改変は、所望の接触アミノ酸残基が同定され次第、定方向突然変異誘発を用いることにより、行うことができる。前記接触アミノ酸の同定は、結晶学的分析、コンピュータモデリング、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学、ライブラリースクリーニング、またはこれらのもしくは他の方法のいずれかの組み合わせをはじめとする、ＡＡＲＳの構造を分析することができる任意の方法を用いて行うことができる。
【０２３９】
多数のＡＡＲＳ分子が配列決定されており、それらは、どのアミノ酸が、対応するｔＲＮＡにチャージするアミノ酸を結合するために重要であるかについてのガイダンスとなる。例えば、配列番号４８〜１０３参照。
【０２４０】
一定の実施形態において、特定の外的突然変異体ｔＲＮＡに特定のアミノ酸をチャージすることができるＡＡＲＳは、候補のライブラリーを生成するためのそのＡＡＲＳの突然変異誘発、その後、所望される機能が可能な候補ＡＡＲＳのスクリーニングおよび／または選択によって、得ることができる。こうした外的突然変異体ＡＡＲＳおよび外的突然変異体ｔＲＮＡは、改変された非天然アミノ酸を有する所望のタンパク質のインビトロ／インビボ生産に使用することができる。
【０２４１】
非天然アミノ酸を組み込むために使用することができるタンパク質生合成機構の構成要素、例えば、外的突然変異体ＲＳ、外的突然変異体ｔＲＮＡ、および／または外的突然変異体ｔＲＮＡ／ＲＳペアを生じさせるための方法を、本明細書に開示する一定の実施形態において提供する。
【０２４２】
１つの実施形態において、少なくとも１つの組換え外的突然変異体アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの生産方法は、（ａ）第一の生物、例えば、真核生物（例えば、酵素）また原核生物、例えば、メタノコッカス・ヤナシイ、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａ．フルギダス、Ｐ．フィリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、またはＴ．サーモフィルスなど、からの少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から得た（場合によっては突然変異体）ＲＳのライブラリーを生成すること；（ｂ）非天然アミノ酸および天然アミノ酸の存在下で外的突然変異体ｔＲＮＡをアミノアシル化するメンバーについてそのＲＳ（場合によっては突然変異体ＲＳ）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）し、それによって活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを生じさせること；および／または（ｃ）非天然アミノ酸不在の状態でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（例えば、突然変異体ＲＳ）についてそのプールを（場合によっては陰性選択によって）選択し、それによって少なくとも１つの組換え外的突然変異体シンテターゼを生じさせること（この場合の少なくとも１つの組換え外的突然変異体シンテターゼは、非天然アミノ酸でその外的突然変異体ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する）を含む。前記方法によって生産された組換え外的突然変異体シンテターゼも、本明細書に開示する一定の実施形態に含まれる。
【０２４３】
１つの実施形態において、前記ＲＳは、不活性ＲＳであり、これは、活性ＲＳを突然変異させることから生成されたものであり得る。例えば、この不活性ＲＳは、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、もしくは少なくとも約１０、またはそれ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸、例えばアラニンに突然変異させることによって生成することができる。
【０２４４】
突然変異体ＲＳのライブラリーは、当該技術分野において公知の様々な突然変異誘発技術を用いて生成することができる。例えば、突然変異体ＲＳは、部位特異的突然変異、ランダム突然変異、多様性を生じさせる組換え突然変異、キメラ構築物によって、および本明細書に記載するまたは当該技術分野において公知である他の方法によって、生成することができる。
【０２４５】
１つの実施形態において、活性である、例えば、非天然アミノ酸および天然アミノ酸の存在下で外的突然変異体ｔＲＮＡをアミノアシル化する、メンバーについてのＲＳ（場合によっては突然変異体ＲＳ）のライブラリーの選択（および／またはスクリーニング）は、陽性選択またはスクリーニングマーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子など、および（場合によっては突然変異体）ＲＳのライブラリーを、多数の細胞に導入すること（この場合の陽性選択および／またはスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのコドンを含み、その翻訳は、（天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸を）外的突然変異体ｔＲＮＡにチャージする候補ＲＳの能力に依存する）；選択剤の存在下でその多数の細胞を増殖させること；陽性選択またはスクリーニングマーカーにおけるコドンをうまく翻訳することによりその選択剤および／またはスクリーニング剤の存在下で生存する（または特定の応答を示す）細胞を同定し、それによって、活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを含有する陽性選択細胞のサブセットを生じさせることを含む。場合によっては、前記選択および／またはスクリーニング剤濃度を変えることがある。一定の実施形態において、前記細胞は、そのコドンの翻訳を助長することができる機能性内在性ｔＲＮＡ、ＲＳまたはｔＲＮＡ−ＲＳペアを含有しない。内在性ｔＲＮＡ／ＲＳペアは、遺伝子欠失および／またはＲＳ阻害剤によって不能にすることができる。
【０２４６】
細胞の多くの必須遺伝子も、機能性内在性ＲＳ／ｔＲＮＡペア不在の状態で改変ｔＲＮＡにチャージする外的突然変異体シンテターゼの能力に依存するようなコドンを含有する可能性が高いので、１つの実施形態では、陽性選択プロセスに余分な陽性選択マーカーを必要としない  −  陽性選択プロセスの読み出しとして細胞の生存を用いることができる。
【０２４７】
１つの態様において、前記陽性選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子である。場合によっては、前記陽性選択マーカーは、β−ラクタマーゼ遺伝子である。もう１つの態様において、前記陽性選択マーカーは、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（例えば、細胞表面マーカー）を含む。
【０２４８】
類似の実施形態では、無細胞インビトロ系を用いて、陽性スクリーニングにおいて改変ｔＲＮＡにチャージする外的突然変異体シンテターゼお能力を試験することができる。例えば、陽性スクリーニング遺伝子、例えば蛍光マーカー遺伝子、を翻訳するそのインビトロ系の能力は、そのマーカー遺伝子のコドンによって読み取るために改変ｔＲＮＡにチャージする外的突然変異体シンテターゼの能力に依存し得る。
【０２４９】
１つの実施形態において、非天然アミノ酸不在の状態で突然変異体ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性ＲＳ（場合によっては突然変異体）についてのそのプールを陰性選択またはスクリーニングは、陰性選択またはスクリーニングマーカーと、陽性選択またはスクリーニングからの活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールとを多数の翻訳系に導入すること（この場合の陰性選択またはスクリーニングマーカーは、少なくとも１つのコドン（例えば、毒性マーカー遺伝子、例えばリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子）を含み、その翻訳は、（天然アミノ酸を）外的突然変異体ｔＲＮＡにチャージする候補ＲＳの能力に依存する）；ならびに非天然アミノ酸とスクリーニングまたは選択剤を補足した第一の培地において特定のスクリーニング応答を示すが、天然アミノとそのスクリーニングまたは選択剤を補足した第二の培地ではその特定の応答を示すことができない翻訳系を同定し、それによって、少なくとも１つの組換えＲＳを有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞をもたらすことを含む。
【０２５０】
１つの態様では、選択（および／またはスクリーニング）剤の濃度を変化させる。一部の実施形態において、前記第一の生物と第二の生物は異なる。例えば、前記第一および／または第二の生物は、原核生物、真核生物、哺乳動物、Ｅ．ｃｏｌｉ、真菌、酵母、古細菌、真正菌類、植物、昆虫、原生生物などを場合によっては含む。他の実施形態において、前記スクリーニングマーカーは、蛍光または発光スクリーニングマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【０２５１】
また、一部の態様は、陰性選択マーカーが、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子（これは、少なくとも１つの前記コドンを含む）を含む態様を含む。他の態様は、スクリーニングマーカーが、蛍光または発光スクリーニングマーカーまたは親和性に基づくスクリーニングマーカーを場合によっては含む態様を含む。本明細書における実施形態において、前記スクリーニングおよび／または選択は、そのスクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシーの変化を場合によっては含む。
【０２５２】
１つの態様において、少なくとも１つの組換えＲＳに由来する突然変異ＲＳの第二のセットは、突然変異誘発、例えば、ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え、またはこれらの組み合わせによって生じさせることができる。
【０２５３】
本明細書に具体的に表す方法は、非天然アミノ酸が、例えば、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−Ｌ−チロシン４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡβｃ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、およびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される方法を場合によっては含む。本明細書における方法によって生産される組換えＲＳも、本明細書に開示する実施形態に包含される。
【０２５４】
関連態様において、組換え外的突然変異体ｔＲＮＡの生産方法は、（ａ）第一の生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡから得た突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを生成すること；（ｂ）第一の生物からのＲＳが不在の状態で第二の生物からのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化される（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡについてそのライブラリーを選択（例えば、陰性選択）またはスクリーニングし、それによってｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールを生じさせること；および（ｃ）導入された外的突然変異体ＲＳによってアミノアシル化されるメンバーについてｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングし、それによって少なくとも１つの組換えｔＲＮＡを生じさせること（この場合、前記少なくとも１つの組換えｔＲＮＡは、非−天然アミノ酸コドンを認識し、および第二の生物からのＲＳによって十分に認識されず、および外的突然変異体ＲＳによって優先的にアシルアミノ化される）を含む。
【０２５５】
本明細書に開示する様々な方法は、選択またはスクリーニングが、１つ以上の陽性または陰性選択またはスクリーニング、例えば、アミノ酸透過性の変更、翻訳効率の変更、および翻訳忠実度の変更を含む方法を場合によっては含む。加えて、前記１つ以上の変更は、外的突然変異体ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用してそうしたタンパク質を生産する生物における１つ以上の遺伝子の突然変異に場合によっては基づく。ここでの選択および／またはスクリーニングは、１つ以上の選択遺伝子中のまたは１つ以上のスクリーニング遺伝子中の少なくとも２つのコドンを使用する選択および／またはスクリーニングを場合によっては含む。場合により、そうした多数のコドンは、同じ遺伝子中にあり、または異なるスクリーニング／選択遺伝子中にある。加えて、場合により、任意の多数のコドンが、異なるコドンであり、または同じタイプのコドンを含む。
【０２５６】
キットは、本明細書に開示する一定の実施形態の追加の特徴である。例えば、本キットは、上で述べたような１つ以上の翻訳系（例えば、細胞）、１つ以上のｔＲＮＡ（改変または突然変異ｔＲＮＡを含む）、１つ以上のＡＡＲＳ（改変または突然変異ＡＡＲＳを含む）、１つ以上の非天然アミノ酸を、例えば、適切な包装材料、そのキットの構成要素を保持するための容器、および／または本明細書における方法を実施するためのインストラクション材料などと共に含むことができる。１つ以上のＡＡＲＳおよび／または１つ以上のｔＲＮＡが１つのキットで提供される場合、それらは、核酸またはタンパク質として提供されることがあり、ならびに単一のベクターの一部であることがあり、または別のベクターに含まれていることがある。同様に、翻訳系（例えば、非天然アミノ酸を含むＥＰＯ類似体などのタンパク質）の製品は、キットの形態で、例えば、そのキットの構成要素を保持するための容器、および／または本明細書における方法を実施するためのインストラクション材料などとともに提供することができる。
【０２５７】
（例示的使用）
伝えられるところでは、１００を十分に超えるコーディングされていないアミノ酸（すべてリボソーム的に許容されるもの）が、他の方法を用いてタンパク質に導入されており（例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：１５６３−１５６７，１９８１；Ｈｉｎｓｂｅｒｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４：７６６−７７３，１９８２；Ｐｏｌｌａｃｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１０３８−１０４０，１９８８；Ｎｏｗａｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９−４４２，１９９５参照）、これらすべての類似体は、これらの類似体のタンパク質産物への効率的な組み込みのために、本方法で用いることができる。
【０２５８】
もう１つの好ましい実施形態では、２つ以上の類似体を、同じインビトロまたはインビボ翻訳系（それぞれ、その外的突然変異体ｔＲＮＡまたは外的突然変異体シンテターゼ対を有する）において用いることができる。これは、天然アミノ酸が４つ以上（例えば、ＬｅｕおよびＡｒｇについては６つ）のコドンによってコードされるとき、より容易に遂行される。しかし、２つのコドンによってしかコードされないアミノ酸の場合、一方は、天然アミノ酸のために保存され得るが、他方は、１つ以上のアミノ酸類似体によって「共有される」ことがある。これらの類似体は、１つだけの天然アミノ酸（例えば、別のＰｈｅ類似体）に似ていることがあり、または異なるアミノ酸（例えば、ＰｈｅおよびＴｙｒの類似体）に似ていることがある。
【０２５９】
一定の実施形態において、第一の核酸は、細胞／インビトロ翻訳系（ＩＶＴ）において内在アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによって十分にチャージされない外的突然変異体／改変ｔＲＮＡ分子、または該外的突然変異体／改変ｔＲＮＡそれ自体をコードする。一部の実施形態によると、外的突然変異体／改変アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＡＲＳ）をコードする第二の核酸も細胞／ＩＶＴに導入される。外的突然変異体／改変ＡＡＲＳは、選択されたアミノ酸類似体を外的突然変異体／改変ｔＲＮＡにチャージすることができる。その後、そのアミノ酸類似体を細胞に供給して、それをその細胞またはＩＶＴの中の１つ以上のタンパク質に組み込むことができる。
【０２６０】
他の実施形態において、その環境は細胞である。例えば、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞）をはじめとする様々な細胞（またはＩＶＴに適するそれらの溶解産物）を一定の方法で使用することができる。１つの実施形態において、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞であり、もう１つの実施形態において、細胞は、シュードモナス属細胞である。
【０２６１】
一定の実施形態において、アミノ酸類似体は、細胞またはＩＶＴとその類似体を直接接触させることによって、例えば、培養中の細胞にその類似体の溶液を適用することによって、またはＩＶＴにその類似体を直接添加することによって、供給することができる。前記類似体は、１つ以上の追加の核酸構築物を細胞／ＩＶＴに導入することによって供給することもでき、この場合、該追加の核酸構築物は、所望の類似体の合成に必要な１つ以上のアミノ酸類似体合成タンパク質をコードする。
【０２６２】
一定の実施形態は、テンプレート核酸構築物を細胞／ＩＶＴに導入することを含み、該テンプレートは、タンパク質をコードしており、該核酸構築物は、少なくとも１つの縮重コドン配列を含有する。細胞／ＩＶＴに導入される核酸は、１つの構築物としてまたは多数の構築物として導入することができる。一定の実施形態では、様々な核酸が、同じ構築物に含まれている。例えば、細胞／ＩＶＴにおいてコードされたｔＲＮＡおよび／またはタンパク質を発現することができる任意の適するベクターに核酸を導入することができる。１つの実施形態において、前記第一および第二核酸配列は、１つ以上のプラスミドに供給される。もう１つの実施形態において、使用されるベクターは、例えばアデノウイルスおよびレンチウイルスベクターをはじめとする、ウイルスベクターである。前記配列は、細胞／ＩＶＴに適するプロモーター配列、または前記配列の発現の制御を誘導することができる多数の配列と共に導入することができる。
【０２６３】
インビトロ使用の場合、１つ以上の突然変異体シンテターゼを組換え生産し、任意の入手可能なインビトロ翻訳系（たとえば、対でのインビトロ転写／翻訳のための市販Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｌｙｓａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ−ＰＲＯ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）のＥ．ｃｏｌｉ系；またはＡｍｂｉｏｎ（登録商標）からのウサギ網状赤血球溶解産物に基づくＲｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ（商標）Ｋｉｔ）に供給することができる。場合により、インビトロ翻訳系から１つ以上の天然ＡＡＲＳ（例えば、天然ＡＡＲＳに対する固定化抗体を使用するイムノデプリーション（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により）および／または天然アミノ酸を選択的に枯渇させて、類似体の組み込み増進を達成することができる。あるいは、再設計された外的突然変異体シンテターゼをコードする核酸を組み換え生産されたＡＡＲＳの代わりに供給してもよい。インビトロ翻訳系には、成熟タンパク質産物に組み込まれる類似体も供給される。
【０２６４】
インビトロタンパク質合成は、通常、インビボ合成と同じ規模で行うことはできないが、インビトロ法は、アミノ酸類似体を含有する何百マイクログラムもの精製タンパク質を生じさせることができる。そうしたタンパク質は、円偏光二色性（ＣＤ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法およびＸ線結晶学を用いるそれらの特性付けに十分な量で生産された。この方法論は、タンパク質の安定性およびフォールディングを決定する際に疎水性、充填、側鎖エントロピーおよび水素結合の役割を調査するために用いることもできる。タンパク質における触媒メカニズム、シグナル伝達および電子移動を探査するために用いることもできる。加えて、この方法論を用いてタンパク質の特性を改変することができる。例えば、光分解によって活性化し得る、フォトケージされたタンパク質を生成することができ、ならびに光学および他の分光プローブの部位特異的組み込みのための新規化学的ハンドルがタンパク質に導入された。
【０２６５】
増殖培地から直接、インビボタンパク質にアミノ酸類似体を組み込むための一般アプローチの開発は、一般に、非天然アミノ酸突然変異誘発力を大きく向上させるであろう。例えば、重原子を含有する大量のタンパク質を合成する能力は、タンパク質構造決定を助長するであろうし、生細胞におけるタンパク質に蛍光体または光解裂性の基を部位特異的に置換する能力は、インビボでタンパク質機能を研究するための強力なツールとなるであう。あるいは、ケト含有アミノ酸などの新たな官能基を有する結合ブロックを供給することによってタンパク質の特性を向上させることができる場合もある。
【０２６６】
インビボで使用する場合、１つ以上のＡＡＲＳを、宿主細胞（原核細胞または真核細胞）に、遺伝物質として、例えば、場合により宿主ゲノムに組み込み、再設計されたＡＡＲＳを構成的にまたは誘導可能に発現することができるプラスミドまたはウイルスベクター上のコーディング配列として、供給することができる。目的とする異種または同種タンパク質を、そうした宿主細胞において、供給されたアミノ酸類似体の存在下で、発現させることができる。その後、任意の当該技術分野において認知されているタンパク質精製技術、または目的とするタンパク質のために特別に設計された技術を用いて、それらのタンパク質産物を精製することができる。
【０２６７】
これらは、ポリペプチドをコードする転写産物を生じさせるための数少ない可能な手段である。一般に、転写産物を生じさせるための当該技術分野において公知の任意の手段を利用して、アミノ酸類似体を有するタンパク質を合成することができる。例えば、任意のインビトロ転写系または対になった転写／翻訳系を、目的とする転写産物の産生に用いることができ、その後、それらは、タンパク質合成のテンプレートとして役立つ。あるいは、遺伝物質からタンパク質を発現させることができる任意の細胞、工学処理された細胞／細胞系統、または機能性成分（溶解産物、膜画分など）を使用して、転写産物を生じさせることができる。転写産物を生じさせるためのこれらの手段は、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、ＳＰ６など）および補因子など、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）、必要転写因子、および適切な緩衝条件、ならびに少なくとも１つの適するＤＮＡテンプレートなどの成分を一般に含むが、最適化反応条件のために他の成分を加えてもよい。当業者は、本明細書に記載するものに類似した他の実施形態を容易に想像することができるであろう。
【０２６８】
（化学的部分）
一定の実施形態において、非天然アミノ酸および／または治療用分子は、化学反応性部分を含む。前記部分は、強求電子性または求核性であり得、その結果、治療用分子または抗体もしくはそのフラグメントとの直接反応に利用することができる。あるいは、前記部分は、弱求電子性または求核性であり得、そのため、治療用分子または抗体もしくはそのフラグメントとのコンジュゲーションの前に活性化する必要がある。この代案は、作用因子をその分子に添加するまで化学反応性部分の活性化を遅らせて、その作用因子とその部分の反応を防止ることが必要な場合、望ましいであろう。どちらのシナリオにおいても、前記部分は、化学反応性であり、これらのシナリオは、（抗体と反応させるシナリオの場合）、作用因子の添加後なのか、その部分を抗体もしくはそのフラグメントと直接反応さるのか、または１つ以上の化学物質と先ず反応させて、その部分を抗体もしくはそのフラグメントと反応できるようにするのかが異なる。一定の実施形態において、化学反応性部分としては、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、カルボニル含有基、またはアルキル脱離基が挙げられる。
【０２６９】
一定の実施形態は、クリックケミストリーを利用することがあり、それらとしては、Ｈｕｉｓｇｅｎ  １，３−双極子付加環化、特に、Ｃｕ（Ｉ）触媒段階的変異、ディールス・アルダー反応、求核置換、特に、エポキシおよびアジリジン化合物のような小さな張力環への求核置換、ウレアおよびアミドのカルボニル化学様形成、エポキシ化およびジヒドロキシル化のような炭素−炭素二重結合への付加反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７０】
従って、本明細書に開示する実施形態のポリペプチドのグリコシル化に加えて、またはその代わりに、他の化学的部分（ポリ（エチレン）グリコール）を改変ポリペプチドに付加、連結、接続、または別様にコンジュゲートもしくは組み込むことができる。ＰＥＧ化は、オリゴ糖類および合成ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を治療用タンパク質分子に部位特異的に共有結合で付ける１つのプロセスである。ＰＥＧ化は、ポリペプチドをタンパク質分解酵素から保護し、そのタンパク質の見掛けのサイズを増大させることによってタンパク質の半減期を有意に増すことができ、従って、クリアランス率を減少させる。さらに、ＰＥＧコンジュゲートは、タンパク質の溶解度を増すことができ、生体内分布に対して有益な効果を生じることができる。ＰＥＧ化タンパク質の物理的および薬理学的特性は、そのポリペプチドに付いているＰＥＧ鎖の数およびサイズ、ＰＥＧ部位の場所、ならびにＰＥＧ化に用いられる化学による影響を受ける。
【０２７１】
タンパク質へのＰＥＧコンジュゲーションの例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体化ＰＥＧとリジンの反応、マレイミドおよびビニルスルホン誘導体化ＰＥＧとシステインの１，４−付加反応、ならびにヒドラジン含有ＰＥＧと糖タンパクの酸化によって生成されたアルデヒドとの縮合が挙げられる。１つより多くの反応部位（多数のアミノもしくはチオール基）がタンパク質に存在する、または反応性求電子体を用いると、１つまたは多数のＰＥＧ分子の非選択的付着が発生し、分離が難しい不均質混合物の生成につながる。ＰＥＧ鎖を付着させる際の選択性および位置制御の喪失は、生物活性の有意な喪失につながることがあり、ことによると、そのコンジュゲートしたタンパク質の免疫原性を強化することがある。実際、歴史的に、生物活性の喪失および生成物不均質性は、標準的ＰＥＧ化技術を用いる長時間作用性タンパク質製剤の開発の際に遭遇する２つの最も一般的な問題である。アミン反応性ＰＥＧでのタンパク質の改変は、生物活性に重要なタンパク質の領域に位置するリジン残基の改変に起因して、生物活性を激しく喪失させることとなる。一定の状況では、成長ホルモンの生物活性は、４００倍以上減少される。例えば、ＧＣＳＦの生物活性は、従来のアミン−ＰＥＧ化技術を用いてタンパク質を改変したとき、１，０００倍減少される（Ｃｌａｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９，１９９６；  Ｂｏｗｅｎら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７，４２５，１９９９）。従って、タンパク質のＰＥＧ鎖を完全に部位特異的および可逆的に付けることができる方法が必要である。
【０２７２】
先進タンパク質工学技術を用いて、例えば、工学処理された薬物タンパク質が、より長い半減期および／または持続されたもしくは強化さえされた生物活性を達成することができるように、非天然アミノ酸を薬物タンパク質に組み込むことによって、長時間作用性の「患者に優しい」ヒトタンパク質製剤を作ることは、有利なことであろう。この目的に向けて、本明細書に開示する一定の実施形態を用いて、標準的なアミン−ＰＥＧ化技術に固有の不均質性および活性喪失などの問題を克服することができる。非天然アミノ酸の組み込みは、ＰＥＧ分子を部位特異的にコンジュゲートさせることができる、標的タンパク質上の結合または触媒部位から離れた独特な所定の部位を生じさせるであろう。加えて、ＰＥＧ分子を、アミン−ＰＥＧ化以外の技術によって非天然アミノ酸に付けることができ、従って、リジンの第一アミン基が望ましくないＰＥＧ化を受けずにすむ。これらの技術を用いて、癌、内分泌学、感染症および炎症などの特定分野を含むすべての領域におけるバイオ製剤の半減期、効能および／または安全性を増すことができる。
【０２７３】
例証となる例として、クリックケミストリーまたは付加環化を用いて、トリアゾール結合を形成することができる。付加環化の１つの特定の例は、タンパク質において見出されるすべての官能基にとって外的突然変異体であり、安定なトリアゾール結合を形成するアジドおよびアルキンの銅媒介Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化（Ｔｏｒｎｏｅら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７，２００２；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：５９６，２００２；およびＷａｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：３１９２，２００３）であり、この反応は、タンパク質の選択的ＰＥＧ化に用いることができる。例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓら（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４（２３）：５７４３−５７４５，２００４）は、酵母におけるタンパク質へのパラ−アジドフェニルアラニンの部位特異的組み込みに基づく一般に適用可能なＰＥＧ化方法論を報告している。アジド基を、アルキン誘導体化ＰＥＧ試薬との穏やかな［３＋２］付加環化反応において用いて、選択的ＰＥＧ化タンパク質を生じさせた。この戦略は、治療用途の選択的ＰＥＧ化タンパク質の生成に有用であるだろう。
【０２７４】
一定の実施形態において、本ポリペプチドは、アルファ−１−アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗溶血因子、抗体（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ダイボディー、トリボディー、テトラボディー、二量体、三量体またはミニボディーから選択される抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体を含む）、血管新生分子、血管新生抑制分子、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒルジン、毛様体神経栄養因子、骨形態形成因子（いずれかおよびすべてのＢＭＰ）、心房性タンパク質、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えば、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば、単球化学誘導タンパク質−１、単球化学誘導タンパク質−２、単球化学誘導タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、カルシトニン、Ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、（例えば、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、デオキシリボ核酸、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン、表皮剥脱毒素ＡおよびＢ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、フォリトロピン、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、グルカゴン、ＧＬＰ−１、増殖因子、ヘッジホッグタンパク質（例えば、ソニック、インディアン、デザート）、ヒト成長ホルモン、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝炎ウイルス、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−ζ、ＩＦＮ−η、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−λ、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ξ、ＩＦＮ−ω）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５など）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、黄体形成ホルモン、Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、パラトルモン（ＰＴＨ）、プロラクチン、発熱性外毒素Ａ、ＢおよびＣ、リラキシン、レニン���リボ核酸、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、１ＩＬ−５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、すなわちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）、毒素ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦベータ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦアルファ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ；細胞の増殖、分化もしくは調節を変調する転写モジュレーター（この場合の転写モジュレーターは、真菌、植物、酵母、昆虫および動物（哺乳動物を含む）をはじめとする、原核生物、ウイルスもしくは真核生物からのものである）；サイトカイン、炎症性分子、増殖因子、それらの受容体、癌遺伝子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８など）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、およびヒアルリン／ＣＤ４４から選択される発現アクチベーター；シグナル伝達分子および対応する癌遺伝子産物、例えば、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、ＲａｆおよびＭｅｔ；転写アクチベーターおよびサプレッサー、例えば、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ；エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬもしくはコルチコステロンの受容体から選択されるステロイドホルモン受容体；またはアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えば、ｐ４５０ｓ）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、サブチリジン、トランスアミナーゼもしくはヌクレアーゼから選択される酵素、から選択される治療用、診断用または他のタンパク質である。
【０２７５】
改変する目的とするタンパク質または分子が、抗体または抗体フラグメントである場合、望まれる目標に依存して、抗体構造におけるいずれの場所または位置でも非−天然アミノ酸残基を置換することができる。例えば、Ｆａｂ可変領域、Ｆｃ領域、またはその抗体のＦｃ領域と相互作用する別の場所で非−天然アミノ酸残基を置換することができる。他の実施形態では、非−天然アミノ酸残基を、抗体の結合界面、またはＶＨ領域で置換することができる。一定の実施形態において、改変抗体は、１つ以上の標的を死滅させるその能力の増大または減少を示す。特に、１つ以上の標的を死滅させる能力が増加したまたは副作用が減少した抗体が、望ましいであろう。
【０２７６】
他の実施形態において、非−天然アミノ酸は、強化された結合親和性をＦｃ受容体に、および／または補体系のＣ１ｑに付与する。詳細には、改変抗体は、抗原またはタンパク質結合パートナー（例えば、補体のＣ１ｑ、および／またはマクロファージ上のＦｃ受容体など）に対する改変された（例えば、強化された）親和性および／または特異性を有することができる。例えば、分子の改変は、その抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）機能、または補体固定活性を増加させる場合もあり、減少させる場合もある。他の例において、特定の分子の改変が、天然対構造のもう一方の分子（例えば、抗体）に結合するその能力を増加させる場合もあり、減少させる場合もある。
【０２７７】
（非天然アミノ酸によるグリコシル化）
グリコシル化によるタンパク質の後翻訳修飾は、タンパク質のフォールディングおよび安定性に影響を及ぼすことができ、タンパク質の固有活性を改変することができ、ならびに他の生体分子とのそれらの相互作用を変調することができる。例えば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９７−１３０，１９９３参照。天然糖タンパク質は、多数の異なるグリコフォームの集団として存在することが多く、これが、グリカン構造の分析ならびにタンパク質構造および機能に対するグリコシル化の影響の研究を難しくする。従って、グリカンの機能を系統的に理解するために、および改善された糖タンパク質治療薬を開発するために、天然および非天然均一グリコシル化タンパク質の合成方法が必要である。
【０２７８】
所望のグリコシル化パターンを有するタンパク質を製造するための１つの以前から知られているアプローチは、グリコシダーゼを使用して、不均一天然糖タンパク質を単純な均一コアに転化させ、その後、それに糖類をグリコシルトランスフェラーゼで逐次的にグラフトさせることができる。例えば、Ｗｉｔｔｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８，１９９７参照。このアプローチの限界は、主要なグリコシル化部位が、タンパク質を発現する細胞系統によって予め決められていることである。あるいは、所望のグリカン構造を含有するグリコペプチドを固相ペプチド合成によって合成することができる。自然化学的ライゲーション（例えば、Ｓｈｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１１６８４−１１６８９，１９９９参照）、発現タンパク質ライゲーション（例えば、Ｔｏｌｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：５４２１−５４２８，２０００参照）により、または工学処理したプロテーゼを用いて（例えば、Ｗｉｔｔｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９７９−１９８９，１９９８参照）、このグリコペプチドを他のペプチドまたは組換えタンパク質フラグメントとカップリングさせて、大きな糖タンパク質を生じさせることができる。自然化学的ライゲーションと発現タンパク質ライゲーションは両方とも、小タンパク質で最も有効であり、ならびに糖タンパク質のＮ末端のシステイン残基を必要とする。
【０２７９】
プロテアーゼを用いてペプチドを互いにライゲートする場合、そのライゲーション部位は、良好なカップリング収率のために、そのグリコシル化部位とは遠く離れた位置になければならない。例えば、Ｗｉｔｔｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９７９−１９８９，１９９８参照。第三のアプローチは、化学的方法を用いて糖類でタンパク質を直接改変するアプローチである。良好な選択性は、システインのチオール基とカップリングしているハロアセトアミド糖類誘導体で達成することができる（例えば、Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２：６７９３−６７９６，１９９１；およびＭａｃｍｉｌｌａｎら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：１４６７−１４７０，２００２参照）。しかし、この方法は、１つより多くのシステイン残基を有するタンパク質を用いると、問題が多くなる場合がある。
【０２８０】
本明細書に提供する一定の実施形態は、糖タンパク質の合成方法を開示するものである。一部の実施形態において、これらの方法は、第一反応性基を含む非天然アミノ酸をタンパク質に導入すること；およびそのタンパク質を、第二の反応性基を含む糖類部分と接触させることを含み、この場合、第一の反応性基は、第二の反応性基と反応し、それによって、そのタンパク質の非天然アミノ酸に糖類部分を付ける共有結合を形成する。これらの方法によって生成される糖タンパク質も一定の実施形態に包含される。
【０２８１】
一部の実施形態において、第一の反応性基は、求電子基（例えば、ケト部分および／またはアルデヒド部分など）であり、第二の反応性基は、求核部分である。一部の実施形態において、第一の反応性基は、求核部分であり、第二の反応性基は、求電子部分（例えば、ケト部分および／またはアルデヒド部分など）である。例えば、求電子部分を糖類部分に付け、求核部分を非天然アミノ酸に付ける。糖類部分が、単一の炭水化物部分を含むこともあり、または糖類部分が、２つ以上の炭水化物部分を含むこともある。
【０２８２】
一部の実施形態において、前記方法は、糖類部分とグリコシルトランスフェラーゼ、糖供与部分、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体とを、その糖を糖供与部分から糖類部分に移すために十分な時間、適する条件下で接触させることを含む。所望される場合には、この反応の生成物を、適切な糖供与部分とともに少なくとも第二のグリコシルトランスフェラーゼに接触させることができる。
【０２８３】
一定の実施形態において、前記方法は、糖類部分を、β１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α１，４−フコシルトランスフェラーゼ、β１−４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、および／またはシアリルトランスフェラーゼなどのうちの１つ以上と接触させて、二分岐型または三分岐型オリゴ糖類構造を形成することをさらに含む。１つの実施形態において、糖類部分は、末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与部分は、ＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼは、β１−４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。
【０２８４】
１つの実施形態において、糖類部分は、末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与部分は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼは、β１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。
【０２８５】
場合により、一部の方法は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応の生成物をβ１−４マンノシルトランスフェラーゼおよびＧＤＰ−マンノースと接触させて、Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖類部分を形成することをさらに含む。場合により、前記方法は、そのＭａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−３マンノシルトランスフェラーゼおよびＧＤＰ−マンノースと接触させて、Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖類部分を形成することをさらに含む。場合により、前記方法は、そのＭａｎα１−３Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をα１−６マンノシルトランスフェラーゼおよびＧＤＰ−マンノースと接触させて、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖類部分を形成することをさらに含む。場合により、前記方法は、そのＭａｎα１−６（Ｍａｎ１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させて、Ｍａｎ１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖類部分を形成することをさらに含む。場合により、前記方法は、そのＭａｎ１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−部分をβ１−２Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと接触させて、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−を含む糖類部分を形成することをさらに含む。
【０２８６】
一部の実施形態において、第一の反応性基を含む非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む工程は、外的突然変異体ｔＲＮＡ、外的突然変異体ＲＳ、または外的突然変異体ｔＲＮＡ／ＲＳペアの使用を含む。そうした場合、外的突然変異体ｔＲＮＡは、野生型ｔＲＮＡについての縮重コドンを優先的に認識し、その縮重コドンに応じてその非天然アミノ酸をそのタンパク質に組み込み、そこで、外的突然変異体シンテターゼは、その非天然アミノ酸で外的突然変異体ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。一部の実施形態では、非天然アミノ酸をインビボでポリペプチドに組み込む。
【０２８７】
多種多様な適する反応性基が当業者には公知である。そうした適する反応性基としては、例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート、カルボニル、アルケニル、アルキニル、アルデヒド、エステル、エーテル（例えば、チオ−エーテル）、アミド、アミン、ニトリル、ビニル、スルフィド、スルホニル、ホスホリル、または同様に化学的に反応性の基を挙げることができる。追加の適する反応性基としては、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロトリ酢酸、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル（例えば、ブロモアセチル、ヨードアセチル）、活性化カルボキシル、ヒドラジン、エポキシ、アジリジン、スルホニルクロライド、トリフルオロメチルジアジリジン、ピリジルジスルフィド、Ｎ−アシル−イミダゾール、イミダゾールカルバメート、ビニルスルホン、スクシンイミジルカーボネート、アリールアジド、無水物、ジアゾアセテート、ベンゾフェノン、イソチオシアネート、イソシアネート、イミドエステル、フルオロベンゼン、ビオチンおよびアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８８】
一部の実施形態において、反応性基の１つは、求電子部分であり、第二の反応性基は、求核部分である。前記求核部分または求電子部分のいずれかを非天然アミノ酸の側鎖に付けることができ、その後、その対応する基を糖類部分に付ける。
【０２８９】
求核部分と反応して共有結合を形成する、適する求電子部分は、当業者には公知である。一定の実施形態において、そうした求電子部分としては、例えば、カルボニル基、スルホニル基、アルデヒド基、ケトン基、ヒンダードエステル基、チオエステル基、安定なイミン基、エポキシド基、アジリジン基などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
求電子部分と反応することができる、適する求核部分は、当業者には公知である。一定の実施形態において、そうした求核部分としては、例えば、脂肪族または芳香族アミン、例えば、エチレンジアミンが挙げられる。一定の実施形態において、求核部分としては、例えば、−ＮＲ１−ＮＨ２（ヒドラジン）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ２ＮＨ２（セミカルバジド）、−ＮＲ１（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ２ＮＨ２（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ１ＮＨ２（カルボニルヒドラジン）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ１ＮＨ２（チオカルボニルヒドラジン）、−（ＳＯ２）ＮＲ１ＮＨ２（スルホニルヒドラジン）、−ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ３ＮＨ２（カルバジド）、ＮＲ１ＮＲ２（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ３ＮＨ２（チオカルバジド）、および−Ｏ−ＮＨ２（ヒドロキシルアミン）などが挙げられるが、これらに限定されず、この場合、それぞれのＲ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈであるか、１〜６個の炭素を有するアルキルであり、好ましくはＨである。一定の実施形態において、反応性基は、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、カルボヒドラジド、またはスルホニルヒドラジンなどである。
【０２９１】
求核部分と求電子部分との反応の生成物は、一般に、求核部分に元々存在する原子を取り入れる。アルデヒドまたはケトンと求核部分の反応によって得られる代表的な連結は、用いられる求核部分、およびその求核部分と反応させる求電子部分（例えば、アルデヒドおよび／またはケトンなど）に依存して、オキシム、アミド、ヒドラゾン、還元ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンまたは類似の官能基などの反応生成物を含む。カルボン酸との連結は、一般に、カルボヒドラジンまたはヒドロキサム酸と呼ばれる。スルホン酸との連結は、一般に、スルホヒドラジドまたはＮ−スルホニルヒドロキシルアミンと呼ばれる。結果として生じた連結は、その後、化学的還元によって安定させることができる。
【０２９２】
これらの方法は、糖類部分と、グリコシルトランスフェラーゼ、糖供与部分、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の反応体とを、その糖を糖供与部分から糖類部分に移すために十分な時間、適する条件下で接触させることをさらに含む場合がある。一定の実施形態において、前記方法は、グリコシルトランスフェラーゼ反応の生成物と、少なくとも１つの第二のグリコシルトランスフェラーゼおよび第二の糖供与部分とを接触させることをさらに含む。言い換えれば、本明細書に開示する一定の実施形態は、アミノ酸連結糖類部分、または糖類部分を含む非天然アミノ酸を、さらにグリコシル化する方法を提供する。これらのグリコシル化工程は、好ましくは（必然的にではないが）、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、または当業者には公知の他の酵素を使用して、酵素的に行う。一部の実施形態において、２つ以上の異なるグリコシルトランスフェラーゼを含有する単一の反応混合物で多数の酵素的工程を行う。例えば、その反応混合物にシアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼの両方を含めることによって、ガラクトシル化工程とシアリル化工程を同時に行うことができる。
【０２９３】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を含む酵素的糖類合成の場合、組換え細胞が、グリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの異種遺伝子を場合によっては含有する。多くのグリコシルトランスフェラーゼが公知であり、それらのポリヌクレオチド配列も公知である。例えば、「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｆｅｒａｓｅｓ」（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで入手可能）参照。グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列、およびアミノ酸配列を導出することができるグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列も、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬおよび他のものを含む様々な公的に利用できるデータベースにおいて見つけることができる。
【０２９４】
一定の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フルコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。適するグリコシルトランスフェラーゼとしては、真核生物または原核生物に由来するものが挙げられる。
【０２９５】
グリコシルトランスフェラーゼの受容体は、本明細書に開示する方法によって改変された糖タンパク質上に存在するであろう。適する受容体としては、例えば、ガラクトシル受容体、例えばＧａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ−；Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−；ラクト−Ｎ−テトラオース−；Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−；Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−；Ｇａｌβ１，３Ａｒａ−；Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ−；およびＧａｌβ１，４Ｇｌｃ−（ラクトース）が挙げられる。他の受容体は、当業者には公知である（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４，１９７８参照）。一般に、これらの受容体は、糖タンパク質に付いている糖類部分の鎖の一部を構成する。
【０２９６】
１つの実施形態において、糖類部分は、末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与部分は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであり、グリコシルトランスフェラーゼは、β１−４Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。もう１つの実施形態において、糖類部分は、末端ＧｌｃＮＡｃを含み、糖供与部分は、ＵＤＰ−Ｇａｌであり、グリコシルトランスフェラーゼは、β１−４Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼである。追加の糖を付加させることもできる。
【０２９７】
グリコシル化反応は、適切なグリコシルトランスフェラーゼおよび受容体に加えて、グリコシルトランスフェラーゼのための糖供与体として作用する活性化ヌクレオチド糖を含む。前記反応は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を助長する他の成分も含むことがある。これらの成分としては、二価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）、ＡＴＰ再生に必要な物質、リン酸イオンおよび有機溶媒を挙げることができる。このプロセスにおいて使用される様々な反応体の濃度または量は、反応条件、例えば温度およびｐＨ値、ならびにグリコシル化される受容体糖類の選択および量をはじめとする非常に多数の因子に依存する。反応媒質は、必要な場合には、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）および有機溶媒、例えばメタノールまたはエタノールも含むことがある。
【０２９８】
宿主細胞を含むことがあり、含まないことがある翻訳系、外的突然変異体ｔＲＮＡ、外的突然変異体ＲＳ、またはこれらのいずれかもしくはすべてを含む組成物も、糖タンパク質を改変するために、一定の実施形態によって提供される。
【０２９９】
本明細書で用いる場合、用語「糖類部分」は、天然および非天然糖部分（すなわち、非自然発生糖部分、例えば、例えば１つ以上のヒドロキシルまたはアミノ位置が改変されている、例えば脱ヒドロキシル化されている、脱アミノ化されている、エステル化されているなどの糖部分；例えば、２−デオキシＧａｌは、非天然糖部分の一例である）を指す。
【０３００】
用語「炭水化物」は、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有するものであり、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類を含むが、これらに限定されない。オリゴ糖類は、代替的に糖として知られている糖類単位から成る鎖である。糖類単位は、いずれの順序で配列されていてもよく、２つの糖類単位間の連結は、約１０の異なる方法のうちのいずれで行われていてもよい。以下の略語を本明細書では用いる：Ａｒａ＝アラビノシル；Ｆｒｕ＝フルコシル；Ｆｕｃ＝フルコシル；Ｇａｌ＝ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ＝グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ＝マンノシル；およびＮｅｕＡｃ＝シアリル（一般には、Ｎ−アセチルノイラミニル）。
【０３０１】
オリゴ糖類は、その糖類の還元末端に実際に還元糖があるにせよ、ないにせよ、還元末端および非還元末端を有すると考えられる。公認命名法に従って、オリゴ糖類は、本明細書では、左側に非還元末端および右側に還元末端で描く。本明細書に記載するすべてのオリゴ糖類は、非還元単位についての名称または略語（例えば、Ｇａｌ）、続いて、グリコシド結合の配座（αまたはβ）、環結合、その結合に関与する還元糖類の環位、そしてその後、還元糖類の名称または略語（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）で記載する。２つの糖の間の連結は、例えば、２，３；２→３；２−３；または（２，３）と表示することがある。２つの糖の間の天然および非天然連結（例えば、１−２；１−３；１−４；１−６；２−３；２−４；２−６など）が、一定の実施形態に含まれる。それぞれの糖類は、ピラノースである。
【０３０２】
用語「シアル酸」（「Ｓｉａ」と略される）は、９炭素カルボキシル化糖ファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミノ−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸）（多くの場合、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡと略される）である。このファミリーの第二のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチルがヒドロキシル化されているＮ−グリコシル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第三のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７，１９８６；Ｋａｎａｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９，１９９０）。９−置換シアル酸、例えば、９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ（例えば、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ）、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、およびアジド−９−デオキシＮｅｕ５Ａｃも含まれる。シアル酸ファミリーの総覧については、例えば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０，１９９２；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照のこと。シアル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、例えば、国際出願ＷＯ  ９２／１６６４０（全内容が本明細書に参照により取り入れられている）に記載されている。
【０３０３】
グリコシルトランスフェラーゼの供与体基質は、活性化ヌクレオチド糖である。こうした活性化糖は、一般に、ウリジンおよびグアノシン二リン酸、ならびにシチジン一リン酸、糖の誘導体（ヌクレオシド二リン酸または一リン酸が、脱離基としての役割を果す）から一般に成る。細菌、植物および真菌系は、時には、他の活性化ヌクレオチド糖を用いることがある。
【０３０４】
非天然アミノ酸、例えば、糖類部分を付けることができる部分を含む非天然アミノ酸、または糖類部分を含む非天然アミノ酸によって、タンパク質および／または機能の変化、例えば、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位への接近容易性、タンパク質部分への標的接近などの変化、の調整を行うことができる。非天然アミノ酸、例えば、糖類部分を付けることができる部分を含む非天然アミノ酸、または糖類部分を含む非天然アミノ酸、を含むタンパク質は、強化された、または完全に新しいことさえある、触媒または物理的特性を有することがある。
【０３０５】
例えば、タンパク質に非天然アミノ酸、例えば、糖類部分を付けることができる部分を含む非天然アミノ酸、または糖類部分を含む非天然アミノ酸、を含めることによって、次の特性が場合によっては改変される：毒性、生体内分布、構造特性、分光学的特性、化学および／または光化学的特性、触媒能、半減期（例えば、血清半減期）、ならびに他の分子と、例えば共有結合的にまたは非共有結合的に、反応する能力、など。少なくとも１つの非天然アミノ酸、例えば、糖類部分を付けることができる部分を含む非天然アミノ酸、または糖類部分を含む非天然アミノ酸、を含むタンパク質を含む組成物は、例えば、新規治療薬、診断薬、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（例えば、抗体）、ならびに例えば、タンパク質の構造および機能の研究のために有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５−５６２（２０００）参照。
【０３０６】
１つの態様において、組成物は、少なくとも１つ、例えば、少なくとも約２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または少なくとも約１０以上の非天然アミノ酸、例えば、糖類部分を付けることができる部分を含む非天然アミノ酸、または糖類部分を含む非天然アミノ酸、を有する少なくとも１つのタンパク質を含む、および／または別の非天然アミノ酸を含む。前記非天然アミノ酸は、同じである場合もあり、または異なる場合もあり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質の中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上の異なる部位があり得る。もう１つの態様において、組成物は、非天然アミノ酸、例えば、糖類部分を付けることができる部分を含む非天然アミノ酸、または糖類部分を含む非天然アミノ酸、で置換されたタンパク質中の存在する少なくとも１つ、しかしすべてよりは少数、の特定のアミノ酸を有するタンパク質を含む。１つより多くの非天然アミノ酸を有する所与のタンパク質の場合、それらの非天然アミノ酸は、同一であることもあり、または異なることもある（例えば、そのタンパク質は、２以上の異なるタイプの非天然アミノ酸を含むことがあり、または２つの同じ非天然アミノ酸を含むこともある）。２つより多くの非天然アミノ酸を有する所与のタンパク質の場合、それらの非天然アミノ酸は、同一であることもあり、異なることもあり、または同じ種類の多数の非天然アミノ酸と少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸の組み合わせであることもある。
【０３０７】
非天然アミノ酸、例えば、糖類部分を付けることができる部分を含む非天然アミノ酸、例えばアルデヒド−もしくはケト−誘導体化アミノ酸、または糖類部分を含む非天然アミノ酸（および任意の対応するコーディング核酸、例えば、１つ以上のセレクターコドンを含むもの）を含む本質的にいずれのタンパク質（またはそれらの部分）も、本明細書における組成物および方法を用いて生産することができる。何十万もの公知タンパク質の同定を試みず、それらをいずれも、例えば、適切な翻訳系に１つ以上の適する縮重コドンを含めるように任意の利用可能な突然変異法を調整することにより、１つ以上の非天然アミノ酸を含むように改変することができる。公知タンパク質の一般的な配列保管場所としては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＮＣＢＩが挙げられる。他の保管場所は、インターネットを検索することにより、容易に特定することができる。
【０３０８】
一般に、タンパク質は、例えば、任意の利用可能なタンパク質（例えば、治療用タンパク質、診断用タンパク質、工業用酵素、またはそれらの一部分など）と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％以上同一であり、それらは、１つ以上の非天然アミノ酸を含む。
【０３０９】
タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の改変に加えて、タンパク質の炭水化物組成を改変する、すなわちグリコシル化により改変することができる。グリコシル化によるタンパク質の後翻訳修飾により、タンパク質のフォールディングおよび安定性に影響を及ぼすこと、タンパク質の固有活性を改変すること、ならびに他の生体分子とのそれらの相互作用を変調することができる。例えば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９７−１３０，１９９３参照（その全体が本明細書に参照により取り入れられている）。天然糖タンパク質は、多くの異なるグリコフォームの集団として存在することが多く、これが、グリカン構造の分析ならびにタンパク質構造および機能に対するグリコシル化の影響の研究を難しくする。従って、グリカンの機能を系統的に理解するために、および改善された糖タンパク質治療薬を開発するために、天然および非天然均一グリコシル化タンパク質の合成方法が必要とされている。
【０３１０】
本明細書に開示する一定の組成物および方法を用いて製造することができるタンパク質の１つのクラスは、転写モジュレーター、酵素、またはそれらの一部分を含む。転写モジュレーターの例としては、細胞の増殖、分化または調節などを変調する、遺伝子および転写モジュレーターが挙げられる。転写モジュレーターは、広範な治療標的をもたらす、真菌、植物、酵母、昆虫および動物（哺乳動物を含む）をはじめとする原核生物、ウイルスおよび真核生物において見出される。発現および転写アクチベーターが、多くのメカニズムによって、例えば、受容体への結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現の調節、プロモーターおよびエンハンサーへの結合、プロモーターおよびエンハンサーに結合するタンパク質への結合、ＤＮＡの巻き戻し、プレ−ｍＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡのポリアデニル化、ならびにＲＮＡの分解によって、転写を調節することは、理解されるであろう。酵素の一部の例としては、例えば、アミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えば、ｐ４５０ｓ）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、サブチリジン、トランスアミナーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１１】
本明細書に開示する一定の実施形態に従って改変することができるポリペプチドの一部は、市販されており（例えば、ｔｈｅ  Ｓｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  ｐｒｉｃｅ  ｌｉｓｔ参照）、対応するタンパク質配列および遺伝子、ならびに、一般に、それらの多数の変異体は、周知である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ参照）。
【０３１２】
本明細書に開示する実施形態のいずれかによって操作または改変（グリコシル化、および／またはＰＥＧ化、および／または非−天然アミノ酸の組み込みを含む）することができる治療関連特性の例としては、血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、非天然アミノ酸に関する検出能（例えば、レポーター基（例えば、標識または標識結合部位）を含めることによる）、特異性、ＬＤ５０または他の副作用の低減、または胃管を通して体内に入る能力（例えば、経口アベイラビリティー）などが挙げられる。関連診断特性の例としては、貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出能、または特異性などが挙げられる。関連酵素特性の例としては、貯蔵半減期、安定性、特異性、酵素活性、または生産能力が挙げられる。
【０３１３】
様々な他のタンパク質も、本明細書に開示する一定の実施形態に従って、１つ以上の非天然アミノ酸を含めるように改変することができる。例えば、感染性真菌、例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種；病原菌についてのモデルの役割を果す細菌、特にＥ．ｃｏｌｉ、ならびに医学的に重要な細菌、例えば、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉｉ）（例えば、黄色ブドウ球菌（ａｕｒｅｕｓ））、または連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉｉ）（例えば、肺炎連鎖球菌（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物、例えば、胞子虫類（例えば、マラリア病原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ））、根足虫類（例えば、体内寄生性アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ））および鞭毛虫（トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リューシマニア属’Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）など）；ウイルス、例えば、（＋）ＲＮＡウイルス［例としては、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、例えば、ワクシニアウイルス；ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、例えば、ポリオウイルス；トガウイルス群（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）、例えば、風疹ウイルス；フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＣＶ；およびコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）が挙げられる］、（−）ＲＮＡウイルス［例えば、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＶＳＶ；パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＲＳＶ；オルトミクロウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、インフルエンザウイルス；ブンヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓｅｓ）；およびアレイウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）］；ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ））、ＲＮＡ  ｔｏ  ＤＮＡウイルス、すなわち、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶ、ならびに一定のＤＮＡ  ｔｏ  ＲＮＡウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）、からのタンパク質。
【０３１４】
農業関連タンパク質、例えば、昆虫耐性タンパク質（例えば、Ｃｒｙタンパク質）、デンプンおよび脂質生産酵素、植物および昆虫毒素、毒素耐性タンパク質、マイコトキシン解毒タンパク質、植物成長酵素（例えば、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポオキシゲナーゼ（ＬＯＸ）、およびホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）カルボキシラーゼも、本明細書に開示する一定の実施形態による改変に適する標的である。
【０３１５】
一定の実施形態において、本明細書に開示する方法および／または組成物における目的とするタンパク質またはポリペプチド（またはそれらの一部分）は、核酸によってコードされる。一般に、前記核酸は、少なくとも１つの縮重コドン、少なくとも約２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または少なくとも約１０以上の縮重コドンを含む。
【０３１６】
従って、上で説明した人工（例えば、人造、および非自然発生）ポリペプチドおよびポリヌクレオチドも、本明細書に開示する一定の実施形態の特徴である。人工ポリヌクレオチドとしては、例えば、（ａ）人工ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチド配列に相補的である、または（ａ）ポリヌクレオチド配列をコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）その核酸の実質的に全長にわたって、ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９８％同一であるポリヌクレオチド；ならびに（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の保存的変形を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０３１７】
非天然アミノ酸は、上に一般に説明されている。式Ｉ中のＲが、糖類部分に付いている反応性基と反応して、非天然アミノ酸を含むタンパク質にその糖類部分を連結させることができる部分を含む、非天然アミノ酸は、本明細書に開示する糖タンパク質の製造に特に興味深い。適するＲ基としては、例えば、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン−、シアノ−、ハロ−、アミノオキシ−、アルケニル、アルキニル、カルボニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、チオエステル、ヒンダードエステル、ヒドロキシルアミン、およびアミンなど、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、前記非天然アミノ酸は、光活性化可能な架橋剤を有する。
【０３１８】
新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸は、例えば、式ＩＩおよびＩＩＩの構造によって図示されるような、改変骨格構造も場合によっては含む：
【０３１９】
【化６】
2009528824.tif 000015
（これらの式中、Ｚは、一般に、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’またはＳ−Ｒ’を含み；ＸおよびＹは、同じであることもあり、または異なることもあり、一般に、ＳまたはＯを含み；ならびにＲおよびＲ’は、場合により同じであるか異なり、一般に、式Ｉを有する非天然アミノ酸について上で説明したＲ基についての同じ成分リストならびに水素から選択される）。例えば、本明細書に開示する非天然アミノ酸は、式ＩＩおよびＩＩＩによって図示されているようなアミノまたはカルボキシ基における置換を場合によっては含む。このタイプの非天然アミノ酸としては、例えば一般的な２０の天然アミノ酸に対応する側鎖または非天然側鎖を有する、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、α−炭素での置換は、場合により、Ｌ、Ｄまたはα−α−二置換アミノ酸、例えば、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、およびアミノ酪酸などを含む。他の構造的選択肢としては、環状アミノ酸、例えば、プロリン類似体、ならびに３、４、６、７、８および９員環プロリン類似体、βおよびγアミノ酸、例えば、置換β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸が挙げられる。
【０３２０】
例えば、多数の非天然アミノ酸は、天然アミノ酸、例えば、チロシン、グルタミンおよびフェニルアラニンなどに基づく。チロシン類似体としては、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、およびメタ置換チロシンが挙げられ、この場合の置換チロシンは、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６〜Ｃ２０直鎖または分枝炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、またはニトロ基などを含む。加えて、多置換アリール環も考えられる。グルタミン類似体としては、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体、およびアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。フェニルアラニン類似体の例としては、メタ置換、オルト置換、および／またはパラ置換フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されず、この場合の置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド基またはケトン基などを含む。
【０３２１】
非天然アミノ酸の具体的な例としては、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−トレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−トレオニン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、および本発明において下にまたは他の箇所に列挙するものなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２２】
本明細書に開示する一部の方法における使用に適する非天然アミノ酸としては、アミノ酸側鎖に付いている糖類部分を有するものも挙げられる。１つの実施形態において、糖類部分を有する非天然アミノ酸としては、Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＦｕｃまたはＧａｌ部分を有する、セリンまたはトレオニンアミノ酸が挙げられる。糖類部分を含む非天然アミノ酸の例としては、例えば、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、β−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧａｌＮＡｃ−α−トレオニン、α−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−トレオニン、Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−セリン、テトラ−アセチル−Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−セリン、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−セリン、Ｇｌｃ−Ｌ−セリン、テトラアセチル−Ｇｌｃ−Ｌ−セリン、ｆｕｃ−Ｌ−セリン、トリ−アセチル−ｆｕｃ−Ｌ−セリン、Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−セリン、テトラ−アセチル−Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−セリン、ベータ−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−トレオニン、トリ−アセチル−ベータ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−トレオニン、Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−トレオニン、テトラ−アセチル−Ｏ−Ｍａｎ−Ｌ−トレオニン、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−トレオニン、トリ−アセチル−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ−Ｌ−トレオニン、Ｇｌｃ−Ｌ−トレオニン、テトラアセチル−Ｇｌｃ−Ｌ−トレオニン、ｆｕｃ−Ｌ−トレオニン、トリ−アセチル−ｆｕｃ−Ｌ−トレオニン、Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−トレオニン、およびテトラ−アセチル−Ｏ−Ｇａｌ−Ｌ−セリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態は、上記のものの非保護およびアセチル化形も含む。
【０３２３】
一部の実施形態において、非天然アミノ酸の設計は、シンテターゼ、例えば、外的突然変異体ｔＲＮＡをアミノアシル化するために使用される外的突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼ、の活性部位についての公知情報により偏る。例えば、アミドの窒素原子で置換されている誘導体（１）、γ位にメチル基（２）、およびＮ−Ｃγ−環状誘導体（３）を含む、グルタミン類似体の３つのクラスを提供する。重要な結合部位残基が酵母ＧｌｎＲＳに相同であるＥ．ｃｏｌｉＧｌｎＲＳのＸ線結晶構造に基づいて、グルタミンの側鎖の１０Å殻の中の残基のおびただしい数の側鎖突然変異を補足するように、類似体を設計した。例えば、小さな疎水性アミノ酸への活性部位Ｐｈｅ２３３の突然変異を、ＧｌｎのＣγ位での立体的な嵩の増加によって補足することができた。
【０３２４】
例えば、Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸１，５−無水物（ＷＯ  ０２／０８５９２３の図２３中の化合物番号４）を場合によっては用いて、アミドの窒素に置換基を有するグルタミン類似体を合成する。例えば、Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｄｄ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９，１９４９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２，１９５９；Ｃｒａｉｇら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０，１９８８；およびＡｚｏｕｌａｙら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５，１９９１参照。一般に、前記無水物は、先ず、アミンをフタルイミドとして保護し、続いて酢酸中で還流することによって、グルタミン酸から調製される。その後、そのアルデヒドを多数のアミンで開環させ、結果として、そのアミドに一定範囲の置換基をもたらす。ＷＯ  ２００２／０８５９２３の図２３に示されているように、ヒドラジンでのフタロイル基の脱保護によって遊離アミノ酸が得られる。
【０３２５】
γ位での置換は、一般に、グルタミン酸のアルキル化によって遂行される。例えば、Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６，１９８９参照。例えば、ＷＯ  ０２／０８５９２３の図２４中の化合物番号５によって示されるような、保護アミノ酸は、場合によっては、先ず、９−ブロモ−９−フェニルフルオレン（ＰｈｆｌＢｒ）でアミノ部分をアルキル化し（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９，１８５９−１８６６，１９８５参照）、その後、Ｏ−ｔ−ブチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルイソウレアを使用してその酸部分をエステル化することにより、調製される。ＫＮ（Ｓｉ（ＣＨ３）３）２の付加により、そのメチルエステルのα位で位置選択的に脱保護してエノラートを形成し、その後、それを、一定範囲のヨウ化アルキルで場合によってはアルキル化する。ｔ−ブチルエステルおよびＰｈｆｌ基の加水分解により、所望のγ−メチルグルタミン類似体（ＷＯ  ０２／０８５９２３の図２４中の化合物番号２）が得られる。
【０３２６】
一定の他の実施形態は、標的（例えば、標的細胞）に特異的な抗体（またはその機能性フラグメント）を含む免疫コンジュゲートを含み、前記抗体（またはそのフラグメントもしくは機能的等価物）は、特定の所定の位置で２つ以上の治療用分子とコンジュゲートしており、この場合、前記位置のそれぞれが、非天然アミノ酸を含む。一定の実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、またはＦｖフラグメントである。
【０３２７】
一定の実施形態において、前記２つ以上の治療用分子は、同じである。一定の実施形態において、前記２つ以上の治療用分子は、異なる。一定の実施形態において、前記治療用分子は、同じ非天然アミノ酸にコンジュゲートしている。一定の実施形態において、前記治療用分子は、異なる非天然アミノ酸にコンジュゲートしている。
【０３２８】
一定の実施形態において、前記非天然アミノ酸／治療用分子連結の性質または化学は、一定の条件、例えば、中または弱酸性条件（例えば、約ｐＨ４〜６、好ましくは約ｐＨ５）、還元環境（例えば、還元剤の存在）または二価カチオン、のもとでその連結の切断を可能にし、場合によっては、熱によって加速される。
【０３２９】
一定の実施形態において、前記治療用分子は、リンカー／スペーサー（例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、メチレンオキシ（−ＣＨ２−Ｏ−）、メチレンカルボニル（−ＣＨ２−ＣＯ−）、アミノ酸、またはこれらの組み合わせの１以上のリピート）により、抗体にコンジュゲートしている。
【０３３０】
（多タンパク質複合体）
非天然アミノ酸を使用して、固有の官能基を有する２つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットを連結させることもできる。例えば、２つの抗体（またはそれらの機能的部分またはそれらの誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖフラグメントなど）をそれらに組み込まれた非天然アミノ酸によって連結させることにより、二重特異性抗体を生成することができる。
【０３３１】
従って、本明細書における一定の実施形態は、多タンパク質コンジュゲートの合成方法を提供する。一部の実施形態において、これらの方法は、第一の反応性基を含む第一の非天然アミノ酸を第一のタンパク質（例えば、第一の抗体）に組み込むこと；および第二の反応性基を含む第二の非天然アミノ酸を含む第二のタンパク質（例えば、第二の抗体）と前記第一のタンパク質とを接触させ（この場合、前記第一の反応性基が、前記第二の反応性基と反応する）、それによって、第二のタンパク質を第一のタンパク質に付ける共有結合を形成することを含む。
【０３３２】
一部の実施形態において、前記第一の反応性基は、求電子部分（例えば、ケト部分、および／またはアルデヒド部分など）であり、前記第二の反応性基は、求核部分である。一部の実施形態において、前記第一の反応性基は、求核部分であり、前記第二の反応性基は、求電子部分（例えば、ケト部分、および／またはアルデヒド部分など）である。例えば、求電子部分は、第一Ａｂの非天然アミノ酸に付いており、求核部分は、第二Ａｂの非天然アミノ酸は付いている。
【０３３３】
異なるタンパク質の異なる機能性ドメインを同様の方法で互いに連結させて、新規官能基を有する新規タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインの固有の組み合わせを有する新規転写因子；新規調節ドメインを有する新規酵素など）を作ることができる。
【０３３４】
（ｐＨ感受性結合）
多くのタンパク質相互作用は、あるタンパク質のその通常の結合パートナーへの結合親和性が、環境ｐＨ変化につれて変化し得るという意味で、ｐＨ感受性である。例えば、多くのリガンド（例えば、インスリン、インターフェロン、成長ホルモンなど）は、それらそれぞれの細胞表面受容体に結合して、シグナル伝達を惹起する。その後、リガンド−受容体複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスによって内在化され、一連のますます酸性の強いエンドソームを通過することとなる。結局、リガンド−受容体相互作用は、一定の酸性ｐＨ（例えば、約ｐＨ５．０）で弱められ、リガンドが受容体から解離する。一部の受容体（およびことによると一部のリガンド）は、もとの細胞表面に再循環されることがある。そこで、それらは、それらのそれぞれの正常な結合パートナーに結合することができる。
【０３３５】
リガンド−受容体複合体を比較的高いｐＨで解離することができるように、ｐＨ感受性結合を変調できる場合には、一定のリガンドをそれらの受容体より早く解離させることができ、それらは、分解されるのではなく優先的に細胞表面に再循環されるようになる。これは、そうしたリガンドのインビボ半減期を増加させる結果となり、これは、糖尿病患者において同じ（またはより良好な）効能のために必要とし得るインシュリンがより少ないので好ましい。他の状況では、より低いｐＨでの好適な結合によりｐＨ感受性結合を変調することが望ましいこともある。
【０３３６】
例えば、モノクローナル抗体は、一般に、それらの標的に非常に特異的である。しかし、癌療法などの多くの用途において、それらは、例えば、非腫瘍組織への結合により、一定の副作用を惹起する傾向がある。１つの理由は、モノクローナル抗体を産生させる腫瘍標的が、腫瘍細胞上で特異的に発現されず、一部の健常細胞上でも（より少ない数であり得るが）発現されるからであり得る。こうした副作用は、一般に望ましくなく、改善された特異性を有する抗体が必要とされている。
【０３３７】
人血のｐＨは、高度に調節され、約７．６〜７．８の範囲で維持される。一方、腫瘍細胞は、劣った腫瘍血管新生のために十分に除去されない代謝酸の蓄積に起因して、６．３〜６．５の細胞外ｐＨを有する。腫瘍抗原とその治療用抗体との相互作用を、低ｐＨでの結合に有利であるように変調できれば、腫瘍−抗体は、同じ抗原が、時には正常な組織上で見出されたとしても、それらの腫瘍抗原に対する一層の特異性／親和性／選択性を有することができる。
【０３３８】
実際、そうした改変抗体は、癌療法に望ましいばかりでなく、正常より低いレベルのｐＨで発生し得るいずれの抗原−抗体結合にも望ましいであろう。
【０３３９】
（一般技術）
本明細書に開示する実施形態の実施は、別の指示がなければ、当業者の範囲内である分子生物学、細胞生物学、細胞培養、微生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を利用することとなる。そうした技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．Ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら；米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕら，ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）参照。
【０３４０】
さらに、一般的なクローニング、突然変異および細胞培養などを開示している一般的なテキストとしては、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２００２）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらのテキストには、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、なたびに例えば、外的突然変異体ｔＲＮＡ、外的突然変異体シンテターゼおよびそれらのペアに関連した多数のトピックが記載されている。
【０３４１】
一定の実施形態において、例えば、新規シンテターゼまたはｔＲＮＡを生産するために、様々なタイプの突然変異誘発を用いている。それらとしては、部位特異的突然変異誘発（例えば、アンバー（Ａｍｂｅｒ）、オーカー、オパール（Ｕｍｂｅｒ）、または他の停止コドンによる）、ウォブルコドンによる突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）、ウラシル含有テンプレートを用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート改変ＤＮＡ突然変異誘発、またはギャップド・デュプレックスＤＮＡ法を用いる突然変異誘発などが挙げられるが、これらに限定されない。追加の適する方法としては、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成および二本鎖破壊修復などによる突然変異誘発が挙げられる。例えばキメラ構築物を伴う突然変異誘発も一定の実施形態に含まれる。１つの実施形態において、突然変異誘発は、自然発生分子または改変もしくは突然変異させた自然発生分子の公知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、または結晶構造などによって導くことができる。
【０３４２】
これらの手順は、上記テキストおよびここで見出される例、ならびに以下の出版物およびその中に引用されている参考文献に記載されている：Ｓｉｅｂｅｒ，ら．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｌｉｎｇら，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｉ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：４５０−４５５（１９９３）；Ｂａｓｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｓａｋａｍａｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４（１９８８）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）Ｃａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒら，Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｎａｍｂｉａｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；およびＺｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）。上記方法の多くに関するさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４において見出すことができ、これにも、様々な突然変異誘発法に伴う問題のトラブルシューティングに有用な操作が記載されている。
【０３４３】
例えば、シンテターゼのライブラリーを突然変異させる、またはｔＲＮＡを改変する、例えば、一定の実施形態における突然変異誘発において使用するための、オリゴヌクレオチドは、一般に、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されているような自動合成装置を使用して、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２，（１９８１）によって記載されている固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、化学的に合成される。
【０３４４】
加えて、本質的にいずれの核酸も、様々な供給業者、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、  Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、アラミダ）および多数の他の供給御者、のいずれかから、個別または標準注文によって手に入れることができる。
【０３４５】
本明細書に記載するすべての実施形態は、本開示の異なるセクションで説明されているものであっても、１つ以上の他の実施形態と組み合わせることができると解釈する。
【０３４６】
本明細書において言及する、および／または出願データシートに列挙する、上記米国特許、米国特許公開出願、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物のすべては、それら全体が本明細書に参照により取り入れられている。
【実施例】
【０３４７】
これらの実施例は、タンパク質における一般にフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を特異的にコードするまたはトリプトファン（Ｔｒｐ）を特異的にコードするコドンによってコードされた位置へのアミノ酸類似体の組み込みを例証するものである。図１に略図を示す。同様のアプローチを任意の他の類似体に用いることができる。
【０３４８】
Ｐｈｅは、２つのコドン、ＵＵＣおよびＵＵＵ、によってコードされる。両方のコドンは、アンチコドン配列ＧＡＡを備えている単一のｔＲＮＡによって読み取られる。従って、ＵＵＣコドンは、コドンとアンチコドン間の標準的なワトソン・クリック塩基対によって認識され、ＵＵＵは、Ｇ−Ｕウォブル塩基対によってそのアンチコドンの第一の位置で読み取られる（Ｃｒｉｃｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：５４８，１９６６；Ｓｏｌｌ  ａｎｄ  ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１１３，１９６７）。ＲＮＡ二本鎖の熱変性により、３７℃で、それぞれ４．１、６．５、６．３および２．６ｋｃａ／ｍｏｌというＧ−Ｕ、Ｇ−Ｃ、Ａ−ＵおよびＡ−Ｃ塩基対のギブス自由エネルギーの推定量が得られた。従って、ウォブル塩基対、Ｇ−Ｕ、は、ワトソン・クリック塩基対、Ａ−Ｕ、より安定性が低い。ＡＡＡアンチコドンを装備している改変ｔＲＮＡＰｈｅ（ｔＲＮＡＰｈｅＡＡＡ）を、ＵＵＵコドンを読み取るように工学処理し、これは、野生型ｔＲＮＡＰｈｅＧＡＡより早くそうしたコドンを読み取ると予測された。
【０３４９】
９つのＰｈｅ残基を含有するマウスジヒドロフォレートレダクターゼ（ｍＤＨＦＲ）を試験タンパク質として選択した。発現プラスミドｐＱＥ１６は、バクテリオファージＴ５プロモーターの制御下でｍＤＨＦＲをコードする。このタンパク質にＣ末端ヘキサ−ヒスチジン（ＨＩＳ６）タグを装備させて、固定化金属親和性クロマトグラフィーによる精製を助長する。
【０３５０】
シンテターゼのα−サブユニットでのＴｈｒ４１５ＧｌｙまたはＴｈｒ４１５Ａｌａ突然変異の導入により、改変酵母ＰｈｅＲＳ（ｍｕ−ｙＰｈｅＲＳ）を作製した（Ｄａｔｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：５６５２，２００２）。ｍｕ−ｙＰｈｅＲＳによるＮａｌおよびＰｈｅの活性化の動態をアデノシン三リン酸−ピロリン酸交換アッセイによってインビトロで分析した。ｍｕ−ｙＰｈｅＲＳによるＮａｌの活性化についての特異性定数（Ｋｃａｔ／ＫＭ）は、１．５５×１０−３（秒−１Ｍ−１）であり、Ｐｈｅについてのものより８倍大きいことが判明した。従って、培養基中のＮａｌのＰｈｅに対する比率が高いとき、ｙｔＲＮＡＰｈｅＡＡＡには、主としてＮａｌがチャージされるであろう。加えて、Ｔ４１５Ｇ突然変異体を４プライマー突然変異誘発によって産生させた。
【０３５１】
Ｅ．ｃｏｌｉシンテターゼと酵母シンテターゼの両方が、α２β２ヘテロ四量体であり、それぞれのサブユニットについての分子量は、相当異なる；α（ｅＰｈｅＲＳ）＝３７ｋＤＡ；α（ｙＰｈｅＲＳ）＝５７ｋＤａ；β（ｅＰｈｅＲＳ）＝８７ｋＤａ；およびβ（ｙＰｈｅＲＳ）＝６７．５（すべて近似的に）。
【０３５２】
従って、以下の実施例は、例証の手段として提供するものであり、限定するために提供するものではない。
【０３５３】
（実施例１）
酵母アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの能力を改変するために、ＰｈｅＲＳ遺伝子のアルファおよびベータサブユニットをコードするテンプレートプラスミドｐＵＣ−ＡＳａｂ２からｙＰｈｅＲＳ遺伝子を増幅させた。この増幅は、ベータサブユニット遺伝子のＡＴＧ開始コードの上流に翻訳再開始部位を含有する１４塩基対遺伝子間配列を用いて行った。
【０３５４】
次のオリゴプライマーをＰＣＲのための使用した：５’−ＣＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  Ｇ−３’（ヘテロアリール：７）（制限部位ＢａｍＨＩを有するプライマー１）および５’−ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＴＡＣ−３’（配列番号：８）（制限部位ＫｐｎＩを有するプライマー２）。得られたＤＮＡ産物を、ｐＱＥ３２のＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位に導入して、ｐＱＥ３２−ｙＦＲＳを得た。標準的技術によるプライマー突然変異誘発を用いることにより、突然変異体ｙＰｈｅＲＳポリヌクレオチドを産生させた。
【０３５５】
簡単に言うと、２つの相補的オリゴヌクレオチド：５’−ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＡＣＧ  ＧＣＧ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣ−３’（配列番号：９）（プライマー３）および５’−ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＧＴＡ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＡＧ−３’（配列番号：１０）（プライマー４）を合成して、そのｙＰｈｅＲＳポリヌクレオチドのアルファサブユニットの位置４１５に特異的突然変異をもたらした。
【０３５６】
（実施例２）
プラスミドｐＱＥ３２−ｙＦＲＳ、およびｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ｇ、ｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ａを、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞株ＢＬＲ（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）からのもの）に形質転換させて、発現株ＢＬＲ（ｐＱＥ３２−ｙＦＲＳ＿およびＢＬＲ（ｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ｇ）を形成した。細胞をＬＢ培地においてＯＤ６００で０．６の濃度まで増殖させた。その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間、発現を誘発した。細胞を回収し、ニッケル−ニトリロ三酢酸親和性カラムにより、その製造業者（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））のプロトコルに従って本来の条件下で、ポリペプチドを精製した。溶出緩衝液中のイミダゾールを脱塩カラムによって除去し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液にポリペプチドを溶出させた。ポリペプチドのアリコートを５０％グリセロールと共に−８０℃で保存した。
【０３５７】
（実施例３）
アミノ酸依存性ＡＴＰ−ＰＰｉ交換反応を用いて、ｙＰｈｅＲＳによる非−天然アミノ酸の活性化を評価した。アッセイは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．６）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰ、および０．２〜０．５ＴＢｑ／ｍｏｌの比活性を有する２ｍＭ［３２Ｐ］−ＰＰｉを含有する２００マイクロリットルの反応緩衝液中で行った。様々な非−天然アミノ酸とシンテターゼの活性に依存して、アミノ酸濃度は、１０マイクロＭから５ｍＭまで様々であり、酵素濃度は、１０ｎＭから１００ｎＭまで様々であった。２０マイクロリットルのアリコートを様々な時点で反応溶液から取り出し、２００ｍＭ  ＮａＰＰｉ、７％  ｗ／ｖ  ＨＣｌＯ４および３％  ｗ／ｖ活性炭を含有する５００マイクロリットルの緩衝溶液に入れてクエンチした。その炭を回転沈降させ、５００マイクロリットルの１０ｍＭ  ＮａＰＰｉおよび０．５％  ＨＣｌＯ４溶液で２回洗浄した。その炭に吸着した放射標識ＡＴＰを液体シンチレーション法によって定量した。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｍｅｎｔｅｎモデルへのデータの非線形回帰あてはめによって、特異性定数を計算した。ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）、野生型ｙＰｈｅＲＳおよびｙＰｈｅＲＳ＿ｎａｐｈ変異体によるアミノ酸のＡＴＰ−ＰＰｉ交換についての動力学的パラメーターを下の表に示す。
【０３５８】
【化７】
2009528824.tif 000016
（実施例４）
発現プラスミド、ｐＱＥ１６（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ遺伝子を有するマーカーポリペプチドマウスジヒドロフォレートレダクターゼ（ｍＤＨＦＲ）とともに、バクテリオファージＴ５プロモーターおよびｔ０ターミネーターの制御下で用いた。
【０３５９】
ＱＵＩＣＫ−ＣＨＡＮＧＥ（登録商標）突然変異誘発キットを使用して、アンバーコドン（ＴＡＧ）をｍＤＨＦＲの第３８位に配置した。２つの相補的オリゴプライマー（５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＴＧ−３’（配列番号：１１）および５’−ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＧＧ−３’（配列番号：１２））を使用して、ｐＱＥ１６ａｍを生産した。突然変異体ｙＰｈｅＲＳ遺伝子Ｔ４１５ＧをｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ｇから増幅させ、ｌａｃリプレッサーが完全に破壊された結合部位を有する構成的ｔａｃプロモーターをその遺伝子の開始コドンの上流に付加させた。
【０３６０】
Ｔ４１５Ｇの全発現カセットをｐＱＥ１６のＰｖｕｌＩ部位に挿入して、ｐＱＥ１６ａｍ−Ｔ４１５Ｇを生じさせた。突然変異体酵母サプレッサーｔＲＮＡ（ｍｕｔＲＮＡＰｈｅ（ＣＵＡ））をＩｐｐプロモーターの制御下で構成的に発現させた。公知の方法を用いて、ｍｕｔＲＮＡＰｈｅ（ＣＵＡ）の発現カセットをレプレッサープラスミドｐＲＥＰ４に挿入して、ｐＲＥＰ４−ｔＲＮＡを形成した。
【０３６１】
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）栄養要求菌株、ＡＦ（Ｋ１０、Ｈｆｒ（Ｃａｖａｌｌｉ）ｐｈｅＳ１３ｒｅｌ−１  ｔｏｎＡ２２  ｔｈｉ  Ｔ２Ｒ  ｐｈｅＡ１８）を宿主株として使用した。Ｐｈｅ／Ｔｒｐ二重栄養要求二重株、ＡＦＷ（Ｋ１０、Ｈｆｒ（Ｃａｖａｌｌｉ）ｐｈｅＳ１３ｒｅｌ−１  ｔｏｎＡ２２  ｔｈｉ  Ｔ２Ｒ  ｐｈｅＡ１８、ｔｒｐＢ１１４）およびＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｌｙｓ三重栄養要求株ＡＦＷＫ（Ｋ１０、Ｈｆｒ（Ｃａｖａｌｌｉ）ｐｈｅＳ１３ｒｅｌ−１  ｔｏｎＡ２２  ｔｈｉ  Ｔ２Ｒ  ｐｈｅＡ１８、ｔｒｐＢ１１４、ｌｙｓＡ）を、ｔｒｐＢ：：Ｔｎ１０およびｌｙｓＡ：：Ｔｎ１０トランスポゾンでのＰ１ファージ媒介形質導入によって作製した。
【０３６２】
（実施例５）
栄養要求宿主細胞株ＡＦ、ＡＦＷおよびＡＦＷＫを、それぞれ、ｐＱＥ１６ａｍ−Ｔ４１５ＧおよびｐＲＥＰ４−ｔＲＮＡで形質転換させて、発現株ＡＦ［ｐＱＥ１６ａｍ−Ｔ４１５Ｇ／ｐＲＥＰ４−ｔＲＮＡ］およびＡＳＦ［ｐＱＥ１６ａｍ−Ｔ４１５Ｇ／ｐＲＥＰ４−ｔＲＮＡ］をそれぞれ生じさせた。グルコース、チアミン、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、２０のアミノ酸（２０ｍｇ／Ｌ）、抗生物質（カナマイシンおよびアンピシリン）を補足したＭ９最小培地においてそれらの細胞を増殖させた。細胞が、１．０のＯＤ６００読取値に達したら、それらを遠心法によって沈降させ、冷０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、そして１７のアミノ酸（２０ｍｇ／Ｌ）、３ｍＭの目的とする非−天然アミノ酸、ならびに指示濃度のＰｈｅ、ＴｒｐおよびＬｙｓを含有する補足されたＭ９培地に移した。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）の添加により、タンパク質発現を誘発した。４時間後、細胞をペレット化し、Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ、および製造業者（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））の説示に従ってニッケル−ＮＴＡスピンカラムにより、そのタンパク質を精製した。
【０３６３】
（実施例６）
突然変異体ｍＤＨＦＲを変性条件下で精製し、標準的緩衝液（８Ｍ  ウレア、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ４．５）で溶出させた。９０マイクロリットルの７５ｍＭ（ＮＨ４）２ＣＯ３で希釈した１０マイクロリットルのその溶液を用いてそれらのポリペプチドをトリプシン消化し、そのｐＨを８に調整した。２マイクロリットルの改変トリプシン（０．２マイクログラム／マイクロリットル）を添加し、そのサンプルを室温で一晩、インキュベートした。それらのポリペプチドを、Ｌｙｓ−Ｃ（９０マイクロリットルの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８および１ｍＭ  ＥＤＴＡで希釈した１０マイクロリットルの溶液）でエンドプロテイナーゼ消化した。次に、２マイクロリットルのＬｙｓ−Ｃ（０．２マイクログラム／マイクロリットル；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））を添加し、その反応を１０時間、３７℃でインキュベートした。２マイクロリットルのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加により、その消化反応を停止させた。その溶液をＺＩＰＴＩＰＣ１８（登録商標）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））によって精製し、消化されたペプチドを、３マイクロリットルの５０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡで溶出させた。１マイクロリットルを、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および２，５−ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとして用いるマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）の分析のために使用した。この分析は、線形および陽イオンモードでＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＰＲＯ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置を使用して行った。
【０３６４】
ＨＰＬＣポンプおよびＥＳＩプローブを用いるＦＩＮＮＩＧＡＮ（登録商標）ＬＣＱイオントラップ質量分析で、プロテアーゼ消化ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。突然変異体ｍＤＨＦＲの位置３８の残基を含むプロテアーゼ消化フラグメントに対応するｍ／ｚを有する前駆体イオンの分画により、タンデム質量シーケンシングを行った。
【０３６５】
（実施例７）
野生型ｙＰｈｅＲＳおよび本明細書において実施例１で説明したとおりのｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）についてのプラスミドを構築した。加えて、次のプライマーを用いて、テンプレートプラスミドｐＸＬＬｙｓＫＳ１からＰＣＲによってＥ．ｃｏｌｉｌｙｓＳ遺伝子を増幅した：５’−ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＣＡＧ−３’（配列番号：１３）（ＮｃｏＩ制限部位を有する）および５’−ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＴＣＧ  Ｃ−３’（配列番号：１４）（ＢａｍＨＩ制限部位を有する）。得られたＤＮＡをｐＱＥ６０のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位に導入して、ｐＱＥ６０−ｅＬｙｓＳを生じさせた。クローニングされた酵素は、タンパク質精製を助長するためにＮ末端またはＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含有する。
【０３６６】
最初の２つの反応において、（プライマー１およびプライマー４）ならびに（プライマー２およびプライマー３）を個々の試験管に添加し、これらの２つのＰＣＲ反応から２つのＤＮＡフラグメントを生成した。２つの反応生成物と追加の外部プライマーの混合物を用いて、３４００ｂｐ  ＤＮＡフラグメントを得た。そのフラグメントを標準的な方法によって精製し、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、ｐＱＥ３２に挿入して、ｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ｇを生成した。クローニングされたＰｈｅＲＳ酵素は、精製のためのＮ末端既知ヘキサ−ヒスチジン配列タグを含有した。検証のために、全ｙＰｈｅＲＳ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定した。
【０３６７】
（実施例８）
プラスミドＰＱＥ３２−Ｔ４１５Ａ、およびｐＱＥ６０−ｅＬｙｓＳを、個々に、リプレッサープラスミドｐＲＥＰ４とともにＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲに共形質転換させて、発現株ＢＬＲ（ｐＱＥ３２−ｙＦＲＳ）、ＢＬＲ（ｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ｇ）、ＢＬＲ（ｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ａ）、ＢＬＲ（ｐＱＥ６０−ｅＬｙｓＳ）を形成した。１００マイクログラム／ｍＬのアンピシリンおよび３５マイクログラム／ｍＬのカナマイシンを伴う２×ＹＴ培地で過発現行った。ＯＤ  ６００＝０．６で、ｙＰｈｅＲＳ変異体、およびｌｙｓＳ遺伝子によってコードされたＥ．ｃｏｌｉリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｅＬｙｓＳ）の発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発した。４時間の発現後、細胞を回収し、ニッケル−ニトリロ三酢酸親和性カラムをその製造業者（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））のプロトコルに従って本来の条件下で用いてタンパク質を精製した。溶出緩衝液中のイミダゾールを脱塩カラムによって除去し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液にポリペプチドを溶出させた。ポリペプチドのアリコートを５０％グリセロールとともに−８０℃で保存した。ｙＰｈｅＲＳ変異体およびｅＬｙｓＳの濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定した。
【０３６８】
（実施例９）
ポリペプチド３８（残基２６〜３９；ＮＧＤＬＰＷＰＰＬＲＮＥアンバーコドンＫ）（配列番号：１５）は、位置番号３８にアンバーコドンを含有する。ペプチド（Ｋ３８Ｓ、Ｋ３８Ｌ）、ペプチドＷ３８およびペプチドｐＢｒＦ（Ｚ）３８をＭＳによって分離し、検出した。ポリペプチドは、（ａ）ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡおよびｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）；（ｂ）ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧおよびｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）；（ｃ）ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡおよびｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ａ）；（ｄ）ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧおよびｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ａ）を有する三重栄養要求宿主細胞において、または（ｅ）ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧおよびｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ａ）を有する単一栄養要求株において合成した。発現最小培地には、６．０ｍＭ  ｐＢｒｆ、０．０１ｍＭ  Ｔｒｐ、１．０ｍＭ  Ｌｙｓ、０．０３ｍＭ  Ｐｈｅ（ａおよびｂ）または０．０１ｍＭ  Ｐｈｅ（ｃ、ｄおよびｅ）および２５ｍｇ／Ｌの１７のアミノ酸を補足した。結果を図９に示す。
【０３６９】
（実施例１０）
アミノ酸依存性ＡＴＰ−ＰＰｉ交換反応を用いて、上の実施例で説明したようなｙＰｈｅＲＳによるアミノ酸類似体の活性化を評価した。簡単に言うと、反応緩衝液の２００マイクロリットルアリコートは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、２０ｎＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰ、および１０〜５０Ｃｉ／ｍｏｌの比活性を有する２ｍＭ  ３２Ｐ−ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を含有する。そのシンテターゼによる類似体の活性化に依存して、アミノ酸濃度は、１０マイクロＭから２．５ｍＭまで様々であり、酵素濃度は、１０ｎＭから１００ｎＭまで様々であった。２０マイクロリットルのアリコートを反応溶液から様々な時点で取り出し、２００ｍＭ  ＮａＰＰｉ、７％  ｗ／ｖ  ＨＣｌＯ４および３％  ｗ／ｖ活性炭を含有する５００マイクロリットルの緩衝溶液に入れてクエンチした。その炭を回転沈降させ、５００マイクロリットルの１０ｍＭ  ＮａＰＰｉおよび０．５％  ＨＣｌＯ４溶液で２回洗浄した。その炭に吸着した放射標識ＡＴＰを液体シンチレーション法によって定量した。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｍｅｎｔｅｎモデルへのデータの非線形回帰あてはめによって、特異性定数を計算した。
【０３７０】
動力学的パラメーターの結果を表Ｉに示す。インドール環での（特に、第６位での）置換は、一部の類似体（８〜１０）にとって非常に有利であった。
【０３７１】
（表Ｉ：外的突然変異体酵母ＰｈｅＲＳによる例示的アミノ酸（１〜１１）のＡＴＰ−ＰＰｉ交換についての動力学的パラメーター）
【０３７２】
【化８】
2009528824.tif 000017
ここでのアミノ酸は、図２として示す。
【０３７３】
（実施例１１）
突然変異体酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ）をｌｐｐプロモーターの制御下で構成的に発現させた。本明細書における実施例の中で前に説明したように、ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡの発現カセットをリプレッサープラスミドｐＲＥＰ４に挿入して、ｐＲＥＰ４−ｙｔＲＮＡを形成した。突然変異体酵母サプレッサーｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿３０Ｕ４０Ｇ（ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧ）を、ＱＵＩＣＫ−ＣＨＡＮＧＥ（登録商標）突然変異誘発キットの使用により、ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡから構築した。フォアードプライマーのためにプライマーＵＧ−ｆ（５’−ＧＡＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ−３’）（配列番号：１６）およびリバースプライマーのためにプライマーＵＧ−ｒ（５’−ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＴＴＣ−３’）（配列番号：１７）と呼ばれる２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成して、突然変異体酵母サプレッサーｔＲＮＡの位置３０または位置４０のいずれかに特異的突然変異をもたらした。ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧをコードする遺伝子を有する、結果として生じたプラスミドを、ｐＲＥＰ−４ｙｔＲＮＡ＿ＵＧと呼ぶ。ｙｔＲＮＡＰｈｅのインビトロ転写のためのプラスミドを構築するために、ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡおよびｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧ遺伝子を、テンプレートプラスミドｐＲＥＰ４−ｙｔＲＮＡおよびｐＲＥＰ４−ｔＲＮＡ＿ＵＧからそれぞれ増幅させた。ｔＲＮＡ配列の末端に、ＢｓｔＮＩ部位を挿入して、ｙｔＲＮＡＰｈｅの正確な転写産物を生産した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｙｔＲＮＡＰｈｅのインビトロ転写のために、Ｔ７プロモーター配列を付加させた。次のプライマーをＰＣＲのために使用した：５’−ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＧＡ  ＡＣＴ  ＣＴＧ−３’（配列番号：１８）（制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＮＩを有する）および５’−ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＣＧ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  Ｃ−３’（配列番号：１９）（ＥｃｏＲＩ制限部位およびＴ７プロモーター配列を有する）。結果として生じたＤＮＡをｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に導入して、ｐＵＣ１８−ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡおよびｐＵＣ１８−ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧを生じさせた。
【０３７４】
ＤＮＡ操作を助長するために、ｐＵＣ１８−ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡのＴ７プロモーター配列に近いＢｓｔＮＩ解裂部位を除去して、ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントのサイズを１８０ｂｐからＢｓｔＮＩ消化後には５００ｂｐに減少させた。２つの相補的オリゴヌクレオチド、フォワードプライマーのための５’−ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  Ｇ−３’（配列番号：２０）およびリバースプライマーのための５’−ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  Ｇ−３’（配列番号：２１）を合成して、特異的突然変異をもたらした。
【０３７５】
（実施例１２）
以前に記載されているとおり、ｐＵＣ１８−ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡおよびｐＵＣ１８−ｙｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧのＢｓｔＮＩ消化により線形化ＤＮＡを作製した（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：１０３３−１０３７（１９８８）参照）。線形化ＤＮＡテンプレートのインビトロ転写および転写産物の精製は、以前に記載されているとおり行った（Ｎｏｗａｋら，Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｐｔ．Ｂ  ２９３：５０４−５２９（１９９８）参照）。７６量体ｔＲＮＡ転写産物を生産するための線形化ＤＮＡのインビトロ転写は、ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）Ｔ７−ＭＥＧＡＳＨＯＲＴＳＣＲＩＰＴ（登録商標）キットで行った。転写産物を２５：２４：１  フェノール：ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（ＰＣＩ）抽出で単離した。有機層を水で再抽出し、水性層に対して２４：１  ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（ＣＩ）を行った。その後、水層を同じ容量のイソプロパノールと混合し、一晩、−２０で沈殿させ、ペレット化し、乾燥させ、水に再び溶解した。そのｔＲＮＡ溶液中の未反応ヌクレオチドを、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−３０（登録商標）ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））を使用して除去した。それらの転写産物の濃度を、２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定した。
【０３７６】
ｙＰｈｅＲＳ変異体によるＰｈｅおよびＴｒｐでの野生型ｙｔＲＮＡＰｈｅＧＡＡのアミノアシル化を、以前に記載されているとおり行った（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：１０３３−１０３７（１９８８）参照）。アミノアシル化反応は、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４５）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＫＣｌおよび２ｍＭ  ＡＴＰを含有する緩衝液中、３０℃で、１００マイクロリットルの反応容量で行った。精製された酵母の全ｔＲＮＡは、アッセイにおいて４ｍｇ／ｍＬの最終濃度（ｙｔＲＮＡＰｈｅＧＡＡ濃度  約２．２４マイクロＭ）で使用した。Ｐｈｅのアミノアシル化には、１３．３マイクロＭ［３Ｈ］−Ｐｈｅ（５．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および８０ｎＭ  ｙＰｈｅＲＳ変異体を使用し、Ｔｒｐのアミノアシル化には、３．３マイクロＭ［３Ｈ］−Ｔｒｐ（３０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および１６０ｎＭ  ｙＰｈｅＲＳ変異体を使用した。ｙｔＲＮＡＰｈｅ転写産物のアミノアシル化は、ｅＬｙｓＳについては、３７℃で、１００ｍＭ  カリウム−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＡＴＰおよび４単位／ｍＬ酵母無機ピロホスファターゼを含有する緩衝液中の１００マイクロリットルの反応容量で行った。Ｌｙｓのアミノアシル化には、４マイクロＭのｙｔＲＮＡＰｈｅ転写産物、１．１マイクロＭ［３Ｈ］−Ｌｙｓ（９１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および８０ｎＭ  ｅＬｙｓＳを使用した。ｔＲＮＡは、使用前、アニーリング緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で４分間、８５℃に加熱し、その後、ゆっくりと室温に冷却することによってアニールした。酵素の添加によって反応を開始させ、５％ＴＣＡに浸漬したＷｈａｔｍａｎフィルターディスクへのスポッティングによって、１０マイクロリットルアリコートをクエンチした。フィルターを氷冷５％ＴＣＡ中で１０分間、３回洗浄し、氷冷９５％エタノール中で洗浄し、液体シンチレーション法によってカウントした。
【０３７７】
（実施例１３）
非−天然アミノ酸のインビボ組み込みのためのプラスミド構築を、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ二重栄養要求株、ＡＦＷ、およびＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｌｙｓ三重栄養要求株、ＡＦＷＫ、で行った。これらの栄養要求株は、Ｐ１ファージ媒介トランスポゾン形質導入により、Ｐｈｅ栄養要求株、ＡＦ（Ｋ１０、Ｈｆｒ（Ｃａｖａｌｌｉ）ｐｈｅＳ１３ｒｅｌ−１  ｔｏｎＡ２２  ｔｈｉ  Ｔ２Ｒ  ｐｈｅＡ１８、ｔｒｐＢ１１４）（Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ，７：４１９−４２６（１９９８）参照）から構築した。バクテリオファージＴ５プロモーターおよびｔ０ターミネーターの制御下でＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ遺伝子を有するマーカータンパク質マウスジヒドロフォレートレダクターゼ（ｍＤＨＦＲ）をコードするｐＱＥ１６ベクター（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を、発現プラスミドとして選択した。Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用して、２つの相補的オリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＴＧ−３’（配列番号：１１）；５’−ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＧＧ−３’（配列番号：１２））でｍＤＨＦＲの第３８位にアンバーコドン（ＴＡＧ）を配置して、ｐＱＥ１６ａｍを生じさせた。突然変異体ｈＰｈｅＲＳ遺伝子Ｔ４１５ＧおよびＴ４１５Ａを、ｐＱＥ３２−Ｔ４１５ＧおよびｐＱＥ３２−Ｔ４１５Ａから増幅させ、ｌａｃリプレッサーが完全に破壊された結合部位を有する構成的ｔａｃプロモーターをその遺伝子の開始コドンの上流に付加させた。Ｔ４１５ＧおよびＴ４１５Ａの全発現カセットをｐＱＥ１６ａｍ−Ｔ４１５ＧおよびｐＱＥ１６ａｍ−Ｔ４１５ＡのＰｖｕＩＩ部位に挿入した。
【０３７８】
（実施例１４）
栄養要求菌株ＡＦ、ＡＦＷおよびＡＦＷＫを、ｙＰｈｅＲＳ変異体を含有するプラスミドｐＱＥ１６ａｍおよびｙｔＲＮＡ変異体を含有するｐＲＥＰ４−ｙｔＲＮＡベクターで形質転換して、ｐＢｒＦ組み込みを調査した。グルコース、チアミン、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、２０のアミノ酸（２５ｍｇ／Ｌで）、抗生物質（３５ミリグラム／ｍＬのカナマイシンおよび１００マイクログラム／ｍＬのアンピシリン）を補足したＭ９最小培地において、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株を増殖させた。細胞が、０．８〜１．０のＯＤ６００に達したら、それらを遠心法によって沈降させ、冷０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、１７のアミノ酸（２０ｍｇ／Ｌで）、６ｍＭのｐＢｒＦ（ｐ−ブロモ−フェニルアラニン）またはｐＩｏｄｏＦ（ｐ−ヨード−フェニルアラニン）ならびに指示濃度のフェニルアラニン、トリプトファンおよびリジンを補足した発現培地に移した。１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって、タンパク質発現を誘発した。４時間の発現の後、細胞を遠心法によってペレット化し、そのタンパク質をＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグにより、製造業者（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））の説示に従ってニッケル−ＮＴＡスピンカラムによって精製した。精製後、ｍＤＨＦＲの発現レベルを２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定した。
【０３７９】
（実施例１５）
ＨＰＬＣポンプおよびＥＳＩプローブを有するＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析装置で、ｍＤＨＦＲのトリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。変性条件下で精製した突然変異体ｍＤＨＦＲは、溶出緩衝液（８Ｍ  ウレア、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｉｒｓ、ｐＨ４．５）中のものであった。トリプシン消化のために、１０マイクロＬの溶液を９０マイクロＬの７５ｍＭ（ＮＨ４）２ＣＯ３で希釈した。１マイクロリットルの改変トリプシン（０．２マイクログラム／マイクロリットル）を添加した。そのサンプルを３７℃で２から６時間、インキュベートした。１２マイクロＬの５％ＴＦＡ溶液の添加により、消化反応を停止させた。消化ペプチド溶液をＣ１８  Ｖｙｄａｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎカラム（ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  ｇｒｏｕｐ）での脱塩に付し、５０マイクロＬの８０％アセトニトリルおよび２０％の０．１％  ｗ／ｖギ酸で溶出させた。Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎカラムから溶出した消化ペプチドを乾燥させ、１０％アセトニトリルおよび９０％の０．１％ＴＦＡの溶液に再び溶解し、ＨＰＬＣポンプに注入した。Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８カラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ、３００Å、０．３×１５０ｍｍ）によってペプチドを分離し、３０分間、１０〜９５％の溶媒Ａ（９０％のアセトニトリルおよび１０％の０．１Ｍ  酢酸の溶液）および溶媒Ｂ（２％のアセトニトリルおよび９８％の０．１Ｍ  酢酸の溶液）の勾配を用いて、３０マイクロＬ／分の流量で溶出させた。カラム溶出液は、エレクトロスプレー源へと流れ、トリプシン消化物のそれぞれのシグナルが検出された。突然変異体ｍＤＨＦＲの位置３８の残基を含むプロテアーゼ消化フラグメントに対応するｍ／ｚを有する前駆体イオンの分画により、タンデム質量シーケンシングを同時に行った。従って、ＤＨＦＲポリペプチドは、（ａ）、（ｂ）酵母ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡおよび酵母ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）；（ｃ）酵母ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧおよび酵母ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）；（ｄ）酵母ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡおよび酵母ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ａ）；（ｅ）酵母ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧおよび酵母ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ａ）を有する三重栄養要求宿主細胞において、または（ｆ）酵母ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧおよび酵母ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ａ）を有する単一栄養要求株において合成した。これらの結果を表１２に示す。
【０３８０】
（実施例１６）
バチスル・ステロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）からのＴｒｐＲＳの結合ポケットを突然変異させて、非−天然アミノ酸をポリペプチドに組み込んだ。突然変異分析のための候補部位としては、疎水性アミノ酸結合ポケットとして認識される領域にあるアミノ酸配列位置番号４（Ｆ）、５（Ｆ）、７（Ｎ）、１３２（Ｄ）、１３３（Ｉ）、１４１（Ｖ）および１４３（Ｖ）が挙げられる。
【０３８１】
【化９】
2009528824.tif 000018
トリプトファンの融合環は、その認識部位を第二の芳香族環に合わせる。それは、配座での「パラ」より「メタ」ほうが大きいので、位置１３２の突然変異（ＤからＧ）を試験した。簡単に言うと、分子モデリングにより、６−エチニルインドールがＰｈ５骨格とぶつかり、これが運動を抑制することを明らかにした。骨格の運動がなければ、アミノ酸（類似体）は、結合ポケットに、はまらないであろう。位置１３２（Ｄ）のアミノ酸は高度に保存されるので、本発明者らは、その改変がＴｒｐＲＳ内の水素結合網を崩壊させると予測した。従って、位置１３２のアミノ酸とぶつからないので、結合部位における５−エチニルトリプトファンを、コンピュータでモデリングした。この類似体を収容できるように、アミノ酸配列位置１４３を（ＡおよびＧにそれぞれ）突然変異させた。結合の差異化は、５−エチニルトリプトファンの結合については５．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ（Ｖ１４３Ａ）および４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ（Ｖ１４３Ｇ）であることが判明し、これによって、トリプトファンと類似体が識別される。
【０３８２】
加えて、アミノ酸配列位置１３２から他のアミノ酸への突然変異を試験した。動力学的データを下の表に示す。
【０３８３】
【化１０−１】
2009528824.tif 000019
（実施例１７）
酵母ＰｈｅＲＳライブラリーを（緑色蛍光タンパク質すなわちＧＦＰを使用して）スクリーニングして、Ｎａｌの組み込みを可能にするＰｈｅＲＳ突然変異を同定した。突然変異された特異的アミノ酸配列位置としては、残基番号４１２、４１５、４１８および４３７（これらは、結合部位に位置し、そのアミノ酸と接触する）が挙げられる。図１３に示すように、改変酵母ＰｈｅＲＳを用いて、ｐ−エチニル−フェニルアラニンを試験タンパク質に組み込んだ。
【０３８４】
簡単に言うと、標準的な手順に従って、突然変異体Ｔ４１５Ｇまたは野生型酵母ＰｈｅＲＳ遺伝子を含有するベクターにＧＦＰをライゲートした。突然変異体酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｙｔＲＮＡＰｈｅＡＡＡ）をｌｐｐプロモーターの制御下で構成的に発現させ、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ二重Ｅ．ｃｏｌｉ栄養要求株ＡＦＷに形質転換させた。グルコース、チアミン、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、２０のアミノ酸（２５ｍｇ／Ｌ）、抗生物質（３０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を補足したＭ９最小培地においてそれらの細胞を増殖させた。細胞が、０．８〜１．０のＯＤ６００に達したら、細胞をペレット化し、氷冷０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、そして１８のアミノ酸（２０ｍｇ／Ｌで）ならびに様々な濃度のフェニルアラニン、トリプトファンおよび２Ｎａｌを補足した発現培地に移した。タンパク質発現をＩＰＴＧにより誘発した。
【０３８５】
（実施例１８）
選択した４つのアミノ酸残基（Ｎ４１２、Ｔ１４５、Ｓ４１８およびＳ４３７）の突然変異誘発を、二段階ＰＣＲ突然変異によって行った。簡単に言うと、４つの相補的プライマーペア
【０３８６】
【化１０−２】
2009528824.tif 000020
を使用して、ｐＱＥ９＿ＧＦＰＵＶプラスミド（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））におけるＧＦＰＵＶ遺伝子で一連のＰＣＲ突然変異誘発を行った。
【０３８７】
ＧＦＰ突然変異体は、本明細書において説明するとおり産生させた。簡単に言うと、ＧＦＰ３は、１２のＰｈｅ残基を有し、そのうち５つは、Ｐｈｅウォブルコドン（ＵＵＵ）によってコードされる。ＧＦＰ５およびＧＦＰ６変異体は、２段階ＰＣＲ反応、それに続くライゲーションを用いてＵＵＣコドンをＵＵＵで置換することによって作製した。ＧＦＰ５は、１２のプライマー
【０３８８】
【化１０−３】
2009528824.tif 000021
を使用して、Ｆ８、Ｌ６４、Ｆ８４、Ｆ９９およびＦ１６５残基における４つのＵＵＣコドンおよび１つのＬｅｕコドンをＵＵＵコドンで置換することによって作製した。５つのプライマーセット（１および３；２および５；４および７；６および９；８および１０）での５つのＰＣＲ反応により、ＧＦＰ発現カセットの５つの部分的オーバーラッピングフラグメントを得た。
【０３８９】
これらのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動法、それに続くゲル抽出によって精製した。６つのプライマーを使用して、ＧＦＰ５の２つのＰｈｅコドン（Ｆ７１および９９）をＵＵＵコドンで置換することにより、すべてのＰｈｅ残基がＵＵＵによってコードされるＧＦＰ６を作製した。
【０３９０】
【化１０−４】
2009528824.tif 000022
（実施例１９）
ライブラリー構築を２段階でも行った。簡単に言うと、４つの残基（Ｎ４１２、Ｔ４１５、Ｓ４１８およびＳ４３７）における飽和突然変異誘発を二段階ＰＣＲ突然変異誘発で遂行した。先ず、２つの相補的プライマー
【０３９１】
【化１０−５】
2009528824.tif 000023
でのＰＣＲ突然変異誘発により、縮重コドンをＳ４３７に導入した。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで１時間消化した後、ＰＣＲ産物をＸＬ−１  ｂｌｕｅクローニング宿主に形質転換させた。第４３７位のプラスミドを飽和させ、単離し、第二のＰＣＲ突然変異誘発のテンプレートとして使用して、残基Ｎ４１２、Ｔ４１５およびＳ４１８に突然変異を導入した。第二のＰＣＲ突然変異誘発は、別の相補的プライマーペア
【０３９２】
【化１０−６】
2009528824.tif 000024
で行った。ＰＣＲ後、その産物をＤｐｎＩで１時間消化し、スピンカラムによってそれを浄化し、濃縮した。溶出液を、ＥｌｅｃｔｒｏＴｅｎ−Ｂｌｕｅエレクトロコンピテントセル（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）に、製造業者のプロトコルに従って、エレクトロポレートした。８，０００，０００の形質転換体を得た。ライブラリープラスミドを培養で増幅させ、ＮｓｉＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。これらの挿入物を精製した後、それらを、ＮｓｉＩおよびＢｇｌＩＩでの消化によって得られたｐＱＥ９＿ＧＦＰ６＿ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）およびｐＱＥ９＿ＧＦＰ９＿ｙＰｈｅＲＳ（Ｔ４１５Ｇ）の大きなフラグメントとライゲートした。
【０３９３】
そのライブラリーをケミカル・コンピテントＡＦＷおよびＤＨＦＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換させた。その後、カナマイシンを有する２×ＹＴ培地にこれらの細胞を摂取し、一晩、増殖させた。細胞が、０．８のＯＤ６００に達したら、細胞をペレット化し、蒸留水に再び懸濁させた。当該技術分野において標準的であるように、そのライブラーのグリセロールストックを発現させた。
【０３９４】
３時間のＧＦＰの発現後、１ｍＬの細胞（１．０のＯＤ６００に基づく）をＰＢＳで洗浄し、蒸留水で希釈し、その後、４８８ｎｍの励起波長、５２５ｍｍの放射、および４９５ｎｍのカットオフフィルターを使用するフローサイトメトリー分析（ＭｏＦｌｏ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（登録商標）、コロラド州、フォートコリンズのＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）に付した。少なくとも２０，０００の事象をそれぞれの測定において収集した。Ｓｕｍｍｉｔソフトウェア（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）でデータを分析した。ライブラリースクリーニングは、陽性および陰性、両方で行った。すなわち、ＵＵＵコドンのＰｈｅを除く２Ｎａｌまたは任意の他の天然アミノ酸の高度な組み込みを可能にするｙＰｈＲＳ変異体は、ＧＦＰをアンフォールディングするであろうし、あまり明るくなく、そのため、低蛍光細胞を回収する。ＵＵＵコドンのＰｈｅを除く任意の他の天然アミノ酸を組み込むことができないｙＰｈｅＲＳ変異体は、ＧＦＰのフォールディングに影響をおよぼさないであろうし、明るい。従って、明細胞を回収する。図１４は、ＧＦＰ  ｙＰｈｅＲＳライブラリースクリーニングのヒストグラムを図示するものである。
【０３９５】
（実施例２０）
Ｅ．ｃｏｌｉからの改変ＭｅｔＲＳを、本明細書において他の実施例について説明している方法に従ってプラスミドｐＱＥ−８０における試験タンパク質（ＤＨＦＲ）にアジドノルロイシンを組み込むためにアミノ酸配列位置１３（Ｌ→Ｇ）で、および配列番号：１で、突然変異させた。この特定の実施形態において、ＤＨＦＲおよびＭｅｔＲＳ遺伝子は、同じプラスミドベクター内に位置する。
【０３９６】
（実施例２１）
インターフェロン−ベータ分子を試験分子として使用して、４つのメチオニン残基のうちの３つを他の代替アミノ酸（非−天然アミノ酸を含む）に突然変異させた。アミノ酸位置３６、６２および１１７のメチオニン残基を、側鎖ロータマー励起分析によって他のアミノ酸に突然変異させた。分子動力学ソフトウェアおよび突然変異構造のエネルギー計算（サルベーションを含む）を用いて、構造を最適化した。次に、野生型インターフェロンベータ分子と改変インターフェロンベータ分子エネルギー計算値の比較を行って、改変分子の総合的安定性を決定した。様々な点突然変異に伴うエネルギー計算の結果を下の表に示す：
【０３９７】
【化１１】
2009528824.tif 000025
本明細書において言及する、および／または出願データシートに列挙する、上記米国特許、米国特許公開出願、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物のすべては、それら全体が本明細書に参照により取り入れられている。
【０３９８】
上記のことから、例証を目的として本明細書において本発明の特定の実施形態を説明したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができることは、理解されるであろう。従って、本発明は、添付のクレームによる場合を除き、限定されない。
【０３９９】
（等価物）
当業者には、代替、変異体、付加、欠失、改変および置換をはじめとする本明細書に記載する特定の方法および試薬に対する非常に多数の等価物が分かるであろうし、または常例的実験以上のものを用いずともそれらを突き止めることができるであろう。そうした等価物は、本発明の範囲内であるとみなされ、後続のクレームに包含される。
【図面の簡単な説明】
【０４００】
【図１】図１は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの保存配列からのＰｈｅＲＳ変異体の配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、本明細書に開示する一部の実施形態のために用いる幾つかの例示的アミノ酸（天然または非天然）を示す。
【図３】図３は、本明細書に開示する一部の実施形態のために用いる例示的ポリペプチド、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、についてのアミノ酸配列を示す。下線を引いた４つのタンパク質分解ペプチドフラグメント（ペプチドＡ、ペプチドＢ、ペプチドＣおよびペプチドＤと表示）をＭＡＬＤＩおよび液体クロマトグラフィー−質量スペクトル／質量スペクトル（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析に用いた。
【図４Ａ】図４は、（ａ）アミノ酸１（３ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸７（３ｍＭ）および１（０．０３ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸２（３ｍＭ）および１（０．０３）；（ｄ）アミノ酸２（３ｍＭ）および１（０．０３ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。（ｃ）において培地に１ｍＭのトリプトファンを補足する以外、誘発中にトリプトファンを補足しない。１つのＰｈｅコドンを含有するペプチドＢは、対照である。ペプチドＡは、アンバーコドン（Ｚ）を含有し、これについてのアミノ酸は、異なる発現条件でペプチドＡについての質量単位を基に割り当てられる。ペプチドＡでのリジン組み込みに起因して（ｃ）、Ｃ末端リジンが切断されて、より短いペプチドＡ（ＮＧＤＬＰＷＰＰＬＲＮＥＫ）（配列番号：４）が生成された。
【図４Ｂ】図４は、（ａ）アミノ酸１（３ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸７（３ｍＭ）および１（０．０３ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸２（３ｍＭ）および１（０．０３）；（ｄ）アミノ酸２（３ｍＭ）および１（０．０３ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。（ｃ）において培地に１ｍＭのトリプトファンを補足する以外、誘発中にトリプトファンを補足しない。１つのＰｈｅコドンを含有するペプチドＢは、対照である。ペプチドＡは、アンバーコドン（Ｚ）を含有し、これについてのアミノ酸は、異なる発現条件でペプチドＡについての質量単位を基に割り当てられる。ペプチドＡでのリジン組み込みに起因して（ｃ）、Ｃ末端リジンが切断されて、より短いペプチドＡ（ＮＧＤＬＰＷＰＰＬＲＮＥＫ）（配列番号：４）が生成された。
【図５】図５は、アミノ酸７（３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）を補足した培地において発現されたＤＨＦＲから得たペプチドＡ（ＮＧＤＬＰＷＰＰＬＲＮＥＺＫ）（配列番号：５）のタンデム質量スペクトルである。ＰＷＰＰＬＲＮＥの部分配列（配列番号：６）およびペプチドＡの残基Ｚ（アミノ酸７に対応する）は、それぞれ、注釈ｙおよびｂイオン系列から割り当てることができる。
【図６Ａ】図６は、（ａ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸３（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．０１ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。１つのＰｈｅコドンを有するペプチドＣは、対照である。
【図６Ｂ】図６は、（ａ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸３（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．０１ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。１つのＰｈｅコドンを有するペプチドＣは、対照である。
【図６Ｃ】図６は、（ａ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸３（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．０１ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。１つのＰｈｅコドンを有するペプチドＣは、対照である。
【図６Ｄ】図６は、（ａ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸２（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．２ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸３（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１３（０．０１ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。１つのＰｈｅコドンを有するペプチドＣは、対照である。
【図７Ａ】図７は、（ａ）アミノ酸９（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０１ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸１０（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸１１（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳの結果を示す。ペプチドＤは、対照である。
【図７Ｂ】図７は、（ａ）アミノ酸９（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０１ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸１０（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸１１（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳの結果を示す。ペプチドＤは、対照である。
【図７Ｃ】図７は、（ａ）アミノ酸９（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０１ｍＭ）；（ｂ）アミノ酸１０（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０３ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）；（ｃ）アミノ酸１１（３ｍＭ）およびアミノ酸６（０．０１ｍＭ）およびアミノ酸１（０．０３ｍＭ）を補足した培地において発現されたｍＤＨＦＲから得たタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳの結果を示す。ペプチドＤは、対照である。
【図８】図８は、ｅＬｙｓＳによるリジンでの酵母ｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ（四角）およびｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ＿ＵＧ（丸）のアミノアシル化を示す。
【図９】図９は、ｍＤＨＦＲポリペプチドのトリプシン消化のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【図１０】図１０は、野生型酵母ＰｈｅＲＳおよび外的突然変異体酵母ＰｈｅＲＳ  Ｔ４１５Ｇまたは外的突然変異体酵母ＰｈｅＲＳ  Ｔ４１５Ａによるフェニルアラニン、トリプトファンおよびｐ−ブロモフェニルアラニンについてのＡＴＰ−ＰＰｉ交換率を示す。
【図１１Ａ】図１１は、野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼまたは外的突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｔ４１５ＧまたはＴ４１５Ａ）によるフェニルアラニンおよびトリプトファンのアミノアシル化を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼまたは外的突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｔ４１５ＧまたはＴ４１５Ａ）によるフェニルアラニンおよびトリプトファンのアミノアシル化を示す。
【図１２】図１２は、リジン（白四角）、トリプトファン（斜交平行線模様）またはｐ−ブロモフェニルアラニン（格子縞模様）の組み込みを示す。
【図１３】図１３は、宿主細胞において改変ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｔ４１５Ｇ）とアンバーサプレッサーを有するｔＲＮＡＰｈｅとを使用してポリペプチドに組み込んだｐ−エチニルフェニルアラニンの質量スペクトルを示す。
【図１４Ａ】図１４は、試験タンパク質におけるアンバー抑制コドンを使用するアミノ酸の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）組み込みのＦＡＣＳを示す。
【図１４Ｂ】図１４は、試験タンパク質におけるアンバー抑制コドンを使用するアミノ酸の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）組み込みのＦＡＣＳを示す。
【図１５】図１５は、突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｔ４１５Ｇ）の例示的プラスミドマッピングを図示する。
【図１６】図１６は、酵母フェニルアラニンｔＲＮＡシンテターゼにおいて行った例示的突然変異を図示する。
【図１Ａ】
2009528824.tif 000026
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2009528824.tif 000033
【図５】
2009528824.tif 000034
【図６Ａ】
2009528824.tif 000035
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
2009528824.tif 000039
【図７Ｂ】
2009528824.tif 000040
【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2009528824.tif 000044
【図１１Ａ】
2009528824.tif 000045
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月12日(2008.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2009528824.tif 000142
2009528824.tif 000143
2009528824.tif 000144
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