(57)【要約】  本発明は、異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防および/または緩和するための薬剤および方法に関し、化合物は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能なものである。詳細には本発明は、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症、アルドステロンに対する高い感受性、および/または本態性高血圧症を含む群から選択された個体の状態を予防および/または緩和するための薬剤および方法に関する。
2009511457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防および/または緩和するための、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の使用。
【請求項２】
個体における前記状態が、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症、アルドステロンに対する高い感受性、および/または本態性高血圧症を含む群から選択される、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
1個または複数の細胞内へのナトリウム移入を阻害および/または低減するための、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の使用。
【請求項４】
前記化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を阻害および/または低減することが可能である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を活性化および/または増大させることが可能である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分がプリン作動性受容体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記プリン作動性受容体がモノマープリン作動性受容体である、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
前記プリン作動性受容体が、P1プリン作動性受容体およびP2プリン作動性受容体を含む群から選択される、請求項6または7に記載の使用。
【請求項９】
前記プリン作動性受容体が、P2X4プリン作動性受容体である、請求項6から8のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記プリン作動性受容体が、マルチマープリン作動性受容体である、請求項6に記載の使用。
【請求項１１】
前記プリン作動性受容体が、ダイマープリン作動性受容体またはトリマープリン作動性受容体である、請求項6または10に記載の使用。
【請求項１２】
前記プリン作動性受容体が、P1プリン作動性受容体および/またはP2プリン作動性受容体を含む、請求項6、10、または11のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記P2プリン作動性受容体が、P2X4プリン作動性受容体である、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
前記プリン作動性受容体が、
iv) P2X4プリン作動性受容体およびP2X5プリン作動性受容体を含むダイマー、
v) P2X4プリン作動性受容体およびP2X5プリン作動性受容体およびP2X6受容体を含むトリマー、
vi) P2X4受容体およびP1プリン作動性受容体を含むマルチマー
を含む群から選択される、請求項12または13に記載の使用。
【請求項１５】
前記プリン作動性受容体の活性を低減および/または阻害することが可能な化合物が、プリン作動性受容体の拮抗薬である、請求項6から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記拮抗薬が、P1プリン作動性受容体の拮抗薬である、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記化合物が、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピル-キサンチンである、請求項16に記載の使用。
【請求項１８】
前記拮抗薬が、P2プリン作動性受容体の拮抗薬である、請求項15に記載の使用。
【請求項１９】
前記拮抗薬が、ピリドキサールホスフェート-6-アゾ(ベンゼン-2,4-ジスルホン酸)およびスラミンを含む群から選択される、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
前記拮抗薬が、P2X4プリン作動性受容体の拮抗薬である、請求項15に記載の使用。
【請求項２１】
前記拮抗薬が、シバクロンブルー、ブロモフェノールブルー、ブリリアントブルーGを含む群から選択される、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼの活性を低減および/または阻害することが可能な化合物が、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼの拮抗薬である、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
前記化合物が、2-(4-モルホリニル)-8-フェニル-1(4H)-ベンゾピラン-4-オン塩酸塩である、請求項22または23に記載の使用。
【請求項２５】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、カルシウムチャネルである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記カルシウムチャネルの活性を低減および/または阻害することが可能な化合物が、カルシウムチャネル遮断薬である、請求項25に記載の使用。
【請求項２７】
前記化合物が、ニフェジピン、ニカルジピン、およびアムロジピンからなる群から選択される、請求項25または26に記載の使用。
【請求項２８】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、上皮ナトリウムチャネル(ENaC)を含む群から選択されたナトリウムチャネルである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記ナトリウムチャネルの活性を低減および/または阻害することが可能な化合物が、ナトリウムチャネル拮抗薬である、請求項28に記載の使用。
【請求項３０】
前記化合物が、アミロライドからなる群から選択される、請求項28または29に記載の使用。
【請求項３１】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、頂端膜P2Y受容体である、請求項1から3または5のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記頂端膜P2Y受容体の活性を活性化および/または増大させることが可能な化合物が、頂端膜P2Y受容体の拮抗薬である、請求項31に記載の使用。
【請求項３３】
前記化合物が、スラミンおよび/またはピリドキサールホスフェート-6-アゾ(ベンゼン-2,4-ジスルホン酸)からなる群から選択される、請求項32に記載の使用。
【請求項３４】
前記細胞が、腎細胞、またはミネラルコルチコイド受容体が存在する細胞である、請求項3または4から33のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記腎細胞が、側底上皮細胞である、請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防および/または緩和するための、薬剤の製造における、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の使用。
【請求項３７】
プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物で、1個または複数の細胞を処理するステップを含む、インビトロでの1個または複数の細胞内へのナトリウム移入を阻害および/または低減する方法。
【請求項３８】
異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防および/または緩和する方法であって、その必要のある個体に、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３９】
前記状態が、原発性アルドステロン、続発性アルドステロン、アルドステロンに対する高い感受性、および/または本態性高血圧症を含む群から選択される、請求項36に記載の使用または請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
(i) 試験対象の化合物を提供するステップ、
(ii) プリン作動性シグナル伝達経路の成分を提供するステップ、
(iii) 前記化合物でプリン作動性シグナル伝達経路の成分を処理し、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を測定および/または決定するステップ、
(iv) 成分の活性が変化する場合には、成分の活性を調節することが可能であるとして、化合物を特定するステップ
を含む、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物を特定する方法。
【請求項４１】
前記化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を阻害および/または低減することが可能である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、請求項6から14のいずれか一項で定義されたプリン作動性受容体である、請求項40または41に記載の方法。
【請求項４３】
前記プリン作動性受容体が、P2X4プリン作動性受容体を含む、またはそれからなる、請求項40から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、請求項22に記載のホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ、または請求項25に記載のカルシウムチャネル、または請求項28で定義された上皮ナトリウムチャネル(ENaC)である、請求項40または41に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を活性化および/または増大させることが可能である、請求項40に記載の方法。
【請求項４６】
前記プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、頂端膜P2Y受容体である、請求項40または45に記載の方法。
【請求項４７】
(v) 請求項40から46のいずれか一項の方法によって特定可能な化合物を作製するステップ
をさらに含む、請求項40から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
(vi) 医薬品組成物を形成するために、前記化合物を、医薬品として許容される担体と配合するステップ
をさらに含む、請求項40から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物、および医薬品として許容される担体を含む、医薬品組成物。
【請求項５０】
本明細書で実質的に定義された、使用、方法、または医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防および/または緩和するための薬剤および方法であって、化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能である薬剤および方法に関する。詳細には本発明は、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症、アルドステロンに対する高い感受性、および/または本態性高血圧症を含む群から選択された個体の状態を予防および/または緩和するための薬剤および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類において、血漿中のナトリウム濃度は腎臓によって制御される。典型的には、人間の正常な血漿ナトリウム濃度は140mMであり、1日当たりナトリウム約25000mmolが、腎臓によって濾過されることを意味する。全体的なナトリウムバランスを維持するには、排泄量が、通常は100〜200mmol/日である食事による塩の摂取量と等しくなければならず、したがって腎臓は、濾過されたナトリウムのほとんど全てを再吸収しなければならない。これは、イオンチャネル、交換体、および輸送体の統合システム(Schrier、2003)によって実現される。つまり、濾過されたナトリウムの60%は、大部分がNa+/H+交換によって、ネフロンの近位尿細管に再吸収され、30%は、Na+-K+-2Cl-共輸送によって、ヘンレ係蹄の太い上行脚に再吸収され、7%は、遠位尿細管でのNa+-Cl-共輸送によって再生され、最後に2%は、皮質集合ダクト(CCD)とも呼ばれる皮質集合管(CCT)で、上皮性Na+チャネル(ENaC)を介して再吸収される(Garty & Palmer、1997; Liftonら、2001)。この最後のステップは、塩の再吸収のごく一部しか占めないが、主要な位置にあり、そこでは、ENaCの活性がレニン-アンギオテンシン-アルドステロン系(RAAS)によって高度に調節されるので、正味の塩バランスが通常通り決定される(Fraserら、1981; Gross、1958; Liftonら、2001)。RAASにおける最終の内分泌シグナル、即ちアルドステロンの過剰な分泌は、ヒト高血圧症をもたらす可能性がある(Brownら、1972; Connellら、2001; Fraserら、1981)。
【０００３】
ナトリウムホメオスタシス調節ホルモンアルドステロンは、1953年に初めて確認され(Simpsonら、1953)、現在では、ナトリウムの維持、マグネシウムおよびカリウムの損失、交感神経活性化、副交感神経阻害、心筋および血管線維症、圧受容器機能不全、血管損傷、および動脈コンプライアンスの障害を促進させることが知られている。作用の生化学的メカニズムに関する初期の研究は、EdemanおよびFimognari(1968)によって検討された。この研究は、ナトリウム輸送を測定するための短絡電流の、UssingおよびZerahn(1951)による序論によって、大きな助けを得た。Jean Crabbeは、ヒキガエルの膀胱および皮膚を横断するナトリウム輸送に対しての、アルドステロンの影響を最初に実証し、アルドステロンの作用における60〜90分の潜伏期間に注目した(Crabbe、1961; 1963)。彼は、アルドステロンによる中間体の合成または活性化を仮定した。Edelmanのグループによる研究は、DNA依存性RNA合成とタンパク質合成との阻害が、アルドステロンの影響を遮断することを示した(Edelmanら、1963)。Edelmanは、ナトリウム輸送のアルデストロン活性化がATP産生に極めて依存することを、実証し続けた(Edelmanら、1963)。基質が消費されたヒキガエルの膀胱では、アルドステロンはごく僅かしかまたは全く影響を及ぼさず、その応答は、媒質にグルコースまたはピルビン酸塩を添加することによって回復した。Edelmanは、基質に対するこの絶対的な依存性に関して可能性のある説明とは、エネルギーが消費された系において、ナトリウム輸送の活性化の速度がATPの局所濃度によって制限されることを示唆した。しかし彼は、基質が消費されたヒキガエルの膀胱が、ナトリウム輸送が通常通り増大する状態でバソプレッシンおよびアンホテリシンBに応答すると考えるなら、上述の内容は疑わしいと感じた。この研究は、とりわけ、ナトリウムポンプに利用可能なエネルギーの量を増大させるATPとの、アルドステロン作用のATP生成仮説として知られるようになった。
【０００４】
いくつかの状態は、アルドステロンの異常なレベルまたは感受性、特に原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症、アルドステロンに対する高い感受性、および本態性高血圧症に関連付けられている。
【０００５】
原発性アルドステロン症は、1955年にConnによって最初に記述され(Conn、1955)、良性副腎腫瘍の除去によって、高血圧症および低カリウム血症の回復をもたらした。Connは、本態性高血圧症患者の20%が、この状態を有する可能性があることを最初に教示したが(Connら、1964)、これは過大評価であると認識された。アルドステロン-レニン比の測定を使用した、より最近の研究では、プライマリーケアに見られる高血圧症患者の約10%が、この状態を有する可能性があることを示唆している(Limら、1999)。
【０００６】
原発性アルドステロン症には、いくつかの全く異なる原因がある(Edwards、2001)。その中で、分子メカニズムは、グルココルチコイド抑制可能高アルドステロン症においてのみ、定義されている(Edwards、2001)。その他の原因には、球状層の腫瘍に起因した原発性アルドステロン症、特発性球状層過形成(IHA)、原発性副腎過形成症、Gordonおよびその同僚により記述された家族性の状態が含まれる(Edwards、2001)。Padfieldは、IHAが、低レニン本態性高血圧症の場合、連続体の一部であることを示唆した(Padfieldら、1981)。IHAおよびLREHに関する1つの可能性ある説明は、球状層が、アンギオテンシンIIに対して感受性があり過ぎるということである(Witzgallら、1985)。
【０００７】
原発性アルドステロン症は、副腎腫瘍の除去によって外科的に、またはアルドステロンの作用と拮抗し(例えばスピロノラクトン)もしくは腎尿細管イオン輸送を遮断する(例えばアミロライド)薬物によって内科的に治療されてきた(Edwards、2001)。スピロノラクトンによる副作用は、一般的であり、女性化乳房および月経機能不全が含まれる。副腎腫瘍患者における適切な用量では、スピロノラクトンは、血漿カリウムを正常化し、血圧を下げるのに有効である。腎尿細管イオン輸送の阻害剤は、通常、血圧を制御するのにそれほど有効ではない。
【０００８】
IHA患者は、個々に治療されるべきであり、通常は、スピロノラクトンまたはアミロライドがまず最初に与えられる。血圧応答は、しばしば最善とは言えず、カルシウムチャネル遮断薬やACE阻害剤などのその他の薬物が、頻繁に添加される。
【０００９】
続発性アルドステロン症は、レニン-アンギオテンシン-アルドステロン軸の活性化を伴う患者に見られる、一般的な状態である。これに関連した疾患には、うっ血性心不全、移行期または悪性期高血圧症、肝硬変、およびネフローゼ症候群が含まれる。まれな原因には、レニン分泌腫瘍が含まれる。現行の治療では、アルドステロン拮抗薬または腎尿細管イオン輸送の阻害剤が含まれる。最適な薬物療法を受けている重症のうっ血性心不全の患者に、スピロノラクトンまたはプラゼボが与えられる、RALES研究からは、アルドステロンの役割に対して特別な関心が集まっている(Pittら、1999)。スピノロラクトン群は、25%の死亡率低下を示した。
【００１０】
明らかな原発性アルドステロン症があるほとんどの状態、および低レニン本態性高血圧症の原因は、依然として明らかにされていない。かなりの数の証拠が、本態性高血圧症において血圧が「腎臓に追随する」という考えを裏付けている(例えば、正常血圧ドナーから高血圧患者への腎臓の移植は、正常な血圧をもたらす可能性がある- Curtisら、1983; Menetonら、2005)。実際に、高血圧症のメカニズムが今のところまだ定まっていない多くの患者は、血圧が高いという家族歴をしばしば有する。本態性高血圧症の治療は、その重症度に応じて異なるが、利尿薬、β遮断薬、ACE阻害剤、およびカルシウムチャネル遮断薬が含まれる。
【００１１】
この全ては、異常性が、アルドステロンに対する腎尿細管の過剰な感受性(即ち、アルドステロンに対する高い感受性)に関係しており、その結果、過剰なナトリウム貯留が行われ、結果としてレニン分泌が阻害されるという状態が、存在し得る可能性を高めている。最終的な結果は、原発性アルドステロンと診断することが可能なアルドステロン-レニン比の変化と考えられる。
【００１２】
治療サイドでは、アルドステロン過剰に関する現行の療法は、その副作用または効力の不足が理由で、満足のいくものではない。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、ナトリウム移入を刺激するプリン作動性シグナル伝達経路が活性化するように、オートクリン/パラクリン系で作用する腎臓上皮細胞の側底からのATPの放出を刺激することによって、アルドステロンがその効果をナトリウム移入に対して発揮することをついに発見した。プリン作動性経路は、アルドステロンの作用において重要な役割を演ずるので、この経路の阻害によって、アルドステロンが過剰でありまたはアルドステロンに対する腎尿細管感受性が高い状態を治療する新規な方法が提供される。このように、プリン作動性シグナル伝達経路は、異常ナトリウムホメオスタシスおよびアルドステロンの生物学的効果も存在する状態を調節するための治療標的を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、第1の態様では、本発明は、異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防および/または緩和するための、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の使用を提供する。
【００１５】
「異常ナトリウムホメオスタシス」は、異常なナトリウム貯留が存在し(例えば、原発性アルドステロンまたはその他のミネラルコルチコイド過剰症候群のように)、またはレニン-アンギオテンシン-アルドステロン軸の活性化が存在する(例えば、利尿療法、うっ血性心不全のように)状態を意味する。
【００１６】
異常ナトリウムホメオスタシスに関連する多くの状態は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することにより、予防および/または緩和できることが理解されよう。例えば、プリン作動性シグナル伝達経路の調節は、とりわけ、その全てが関連する医療分野の当業者に周知である、アルドステロン症、高血圧症、心関連障害、うっ血性心不全、移行期または悪性期高血圧症、肝硬変、およびネフローゼ症候群の形を治療するのに使用することができる。
【００１７】
本発明は、個体の状態が、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症、アルドステロンまたはその他のミネラルコルチコイドに対する高い感受性、および/または本態性高血圧症を含む群から選択され、化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能である使用を提供することが好ましい。
【００１８】
「原発性アルドステロン症」とは、個体の身体の要求よりも過剰であり、正常な慢性調節因子、抑制されるレニン-アンギオテンシン系が比較的自律的である、アルドステロン産生によって引き起こされた状態が含まれる。原発性アルドステロン症の初期の場合、低カリウム血症が大多数の患者に存在すると考えられたが、より最近の研究では、患者の大多数が正常カリウム血性である。非常にまれに、患者は正常血圧であり、場合によっては血漿および尿中アルドステロンの正常なレベルが見出された。このように、「原発性アルドステロン症」は、低カリウム血症および/または正常血圧の患者を含んでも含まなくてもよい。
【００１９】
「続発性アルドステロン」とは、レニン-アンギオテンシン-アルドステロン軸の活性化から生ずる状態を含む。
【００２０】
「アルドステロンに対する高い感受性」とは、腎尿細管が、アルドステロンまたはその他のミネラルコルチコイドのナトリウム貯留作用に対して、異常にまたは過剰に応答する状態を含む。
【００２１】
「本態性高血圧症」とは、今のところまだ定められていない高血圧症のメカニズムを有するが、血圧が高いという家族歴をしばしば有する患者の状態を含む。
【００２２】
個体は、好ましくはヒトであるが、家畜などの任意の哺乳類でよく、好ましくはウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、およびネコを含めた農業上重要な哺乳類である。
【００２３】
「化合物」とは、ポリヌクレオチド、および/またはポリペプチド、および/または小化学分子を含めた、任意の精製されまたは単離された天然のまたは化学的に合成された分子を含む。
【００２４】
「プリン作動性シグナル伝達経路」とは、ATPまたはその代謝産物の産生、および/または細胞挙動の変化をもたらすのに関与する細胞および核機構への、プリン作動性受容体作動薬およびプリン作動性受容体からの細胞シグナルの生成、増幅、伝達、およびその後の阻害に関わる、細胞内および細胞外機構、成分、および事象を含む。「プリン作動性シグナル伝達経路」は、アルドステロンとアルドステロン受容体との結合、およびその後の活性化であって、上皮腎細胞の側底からのATPの放出をもたらす活性化に関与する細胞ステップを含んでも含まなくてもよい。特に、腎臓細胞、またはミネラルコルチコイド受容体が存在する細胞でのプリン作動性シグナル伝達経路が含まれる。
【００２５】
したがって、「プリン作動性シグナル伝達経路」とは、プリン作動性シグナル伝達経路を介したシグナルの生成、増幅、伝達、およびその後の阻害に関わる細胞シグナル伝達分子を含む。そのような成分は、1種または複数のプリン作動性受容体作動薬、プリン作動性受容体(例えば、P1および/またはP2受容体)、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3キナーゼまたはPI3Kとしても知られる)、カルシウムチャネル、および/または転写因子を含んでもよいことが理解されよう。「プリン作動性シグナル伝達経路の成分」という文言は、上皮性ナトリウムチャネル、ENaCなどの1種または複数のナトリウムチャネルを含んでも含まなくてもよい。
【００２６】
プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性は、その成分の細胞機能または発現レベルを誘導および/または増大させることによって、あるいは阻害および/または阻止することによって、調節できることが理解されよう。
【００２７】
異常ナトリウムホメオスタシスは、その全てが、医学または生化学の関連分野の当業者にとって通常の技法である、血漿カリウム濃度、血圧、およびアルドステロン-レニン比の測定によって決定することができることが、関係ある医療分野の当業者に理解されよう。血漿中のナトリウム濃度は、一般に細胞メカニズムが血漿ナトリウム濃度のいかなる不均衡も補償するので、ナトリウムホメオスタシスの指標としては一般に不十分である。
【００２８】
第2の態様では、本発明は、1個または複数の細胞内へのナトリウム移入を阻害および/または低減するための、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の使用を提供する。この化合物は、上皮性ナトリウムチャネル、ENaCなどの、ナトリウムチャネルの活性を直接調節してもしなくてもよい。
【００２９】
「ナトリウム移入」とは、細胞膜を横断して細胞に入る、ナトリウムイオン(例えば、Na+)および/またはナトリウム含有化合物の輸送の課程を含む。移入は、通常、細胞膜内に位置付けられたイオンチャネルなどのチャネルによって、媒介されることが理解されよう。
【００３０】
頂端膜上のP2受容体を通した細胞外ATPによるNa+吸収の下方制御は、腎上皮における一般原則のように見える(Kunzelmannら、2001; McCoyら、1999)。しかし、上皮を横断するNa+輸送のATP誘導性の増加を実証する、多くの報告も存在する。Leipzigerおよびその同僚(Leipzigerら、1997)は、側底ATPによって媒介された、ラットの遠位結腸粘膜におけるNa+輸送の刺激を観察した。BrodinおよびNielsen(Brodin & Nielsen、2000)は、側底ATPが、カエルの皮膚上皮のサイトゾルCa2+濃度の増加を介して、P2YおよびP2Xプリン作動性受容体によって、Na+吸収を上方制御したことを報告した。最近になって、Froniusおよびその共働者(Froniusら、2004)は、細胞外ATPが、アフリカツメガエル(Xenopus)の肺上皮でアミロライド感受性Na+輸送を刺激することも示した。
【００３１】
本発明のこの態様は、インビボ(例えば、個体)および/またはエキソビボ(例えば、個体の身体の外側)および/またはインビトロ(例えば、細胞培養中)での、1個または複数の細胞内へのナトリウム移入を阻害および/または低減するための、化合物の使用を含むことが、関連分野の当業者に理解されよう。
【００３２】
好ましくは本発明は、化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を阻害および/または低減することが可能である使用を提供する。
【００３３】
好ましくは本発明は、化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を活性化および/または増大させることが可能である使用を提供する。
【００３４】
プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性の活性化および/または増大は、ナトリウム移入を調節するのに使用できることが理解されよう。
【００３５】
例えば、腎上皮細胞の頂端膜側でのP2Yプリン作動性受容体の活性化は、ナトリウム輸送を阻害することが知られている。このように、P2Y拮抗薬(スラミンおよび/またはピリドキサールホスフェート-6-アゾ(ベンゼン-2,4-ジスルホン酸))など)は、例えば頂端ATP過剰によって引き起こされたナトリウム貯留が存在する状態を治療するのに使用することができる。
【００３６】
あるいは、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性の増大は、ナトリウム移入を刺激および/または増大させるのに使用することができ、それによって、異常ナトリウムホメオスタシスをもたらす低ナトリウム移入が存在する状態を治療するための手法が提供される。
【００３７】
好ましくは本発明は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分がプリン作動性受容体である、使用を提供する。
【００３８】
プリン作動性受容体(「プリノセプター」としても知られる)は、細胞外アデノシン3リン酸(ATP)に結合することが可能でありかつこの細胞外ATPにより活性化することが可能であり、さらに、上皮細胞、血小板、好中球、線維芽細胞、平滑筋細胞、および膵臓の細胞を含めた数多くの細胞型に位置付けられている、細胞表面受容体である。ATPに対する特異性および親和性が異なった、P1およびP2と称する2つの受容体の型が記述されている。P2受容体の方が、ATPに対する親和性が高いと考えられている。
【００３９】
いくつかの種類のプリン作動性受容体が、明らかにされかつ記述されている。例えばP2プリン作動性受容体の種類には、P2Y、P2X、P2X4、およびP2X6が含まれる。
【００４０】
P2X受容体は、リガンド開口型陽イオンチャネルの制御因子である(Jansら、2002)。P2Y受容体は、Gタンパク質結合受容体である(GPCR)。Wolffら(2005)によって行われた位置特定研究では、P2Y(1)、P2Y(11)、P2Y(12)、P2Y(14)が側底膜に存在し、P2Y(1)、P2Y(4)、P2Y(6)が頂端膜に存在することが示された。P2Y(13)の位置は、まだわかっていない(Wolffら、2005)。
【００４１】
遠位尿細管のP2プリン作動性受容体に関するほとんどの研究は、哺乳類の遠位尿細管に類似した輸送特性を示す、A6細胞系などの細胞系上で行われてきた(Turnerら、2003)。
【００４２】
Banderaliら(1999)は、A6細胞におけるヌクレオチドの頂端適用によって、P2Y2様受容体を介して媒介された塩化物分泌が一時的に増加することを示した。ラットでは、Turnerら(2003)は、ラットの遠位尿細管の側底セグメントでP2X4およびP2X6受容体しか検出することができず、皮質性集合ダクトでは低レベルのP2X5しか検出できなかった。
【００４３】
常染色体優性多発性嚢胞腎のラットモデルでは、嚢胞を裏打ちする細胞が、過剰なP2Y2およびP2Y6受容体とP2X7受容体とを示す。これは、局所放出ATPが、嚢胞裏打ち細胞内でP2受容体を活性化し、それによって増大する流体分泌から嚢胞拡張を引き起こすことを示唆している(Turnerら、2004)。
【００４４】
最近の研究では、ヒトおよびラットから得られたP2受容体は、これらの拮抗薬に対する感受性が異なる可能性があることが、実証されている。例えばP2X4受容体は、スラミンおよびピリドキサール5-ホスフェート-6-アゾ-2',4'-ジスルホン酸(PPADS)による拮抗作用に対して、感受性が非常に低い(NorthおよびSurprenant、2000)。さらに、ヒトP2X4受容体は、ラットP2X4の場合に非常に類似した作動薬効力プロファイルを示すが、拮抗薬スラミンおよびピリドキサール5-ホスフェート-6-アゾ-2',4'-ジスルホン酸に対して著しく高い感受性を有することが示されている。この異なる感受性に関与する領域が、マップされている(Garcia-Guzmanら、1997)。
【００４５】
プリン作動性受容体は、モノマーとして(即ち、単一のP2受容体など、単一のプリン作動性受容体サブユニットからなる)、またはマルチマーとして(即ち、P1および/またはP2プリン作動性受容体のダイマーまたはトリマーなど、いくつかのプリン作動性受容体サブユニットからなる)存在することが知られている。
【００４６】
好ましくは、本発明は、プリン作動性受容体がモノマープリン作動性受容体であり、好都合にはP1プリン作動性受容体またはP2プリン作動性受容体を含む、またはそれからなるモノマープリン作動性受容体である、使用を提供する。好ましい実施形態では、モノマープリン作動性受容体は、P2X4プリン作動性受容体を含む、またはそれからなる。
【００４７】
あるいは、プリン作動性受容体は、マルチマープリン作動性受容体であり(即ち、複数のプリン作動性受容体サブユニット、即ち複数のプリン作動性受容体サブユニットを含む)、好ましくはダイマープリン作動性受容体(即ち、2個のプリン作動性受容体サブユニットで形成される)またはトリマープリン作動性受容体(即ち、3個のプリン作動性受容体サブユニットで形成される)である。好ましくは、プリン作動性受容体は、P1プリン作動性受容体および/またはP2プリン作動性受容体を含み、より好ましくはP2X4プリン作動性受容体を含む。
【００４８】
一実施形態では、マルチマープリン作動性受容体が、
i) P2X4プリン作動性受容体およびP2X5プリン作動性受容体を含む、またはそれからなるダイマーと、
ii) P2X4プリン作動性受容体およびP2X5プリン作動性受容体およびP2X6受容体を含む、またはそれからなるトリマーと、
iii) P2X4受容体およびP1プリン作動性受容体を含む、またはそれからなるトリマーと
を含む、またはそれからなる群から選択される。
【００４９】
好ましくは、本発明は、プリン作動性受容体の活性を低減および/または阻害することが可能な化合物が、プリン作動性受容体の拮抗薬である、使用を提供する。好都合には、拮抗薬は、Sigma(Dorset、UK)から購入することができる、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピル-キサンチン(DPCPX)などのP1プリン作動性受容体の拮抗薬である。その他の拮抗薬は、関連分野の当業者に理解されよう。
【００５０】
あるいは拮抗薬は、ピリドキサールホスフェート-6-アゾ(ベンゼン-2,4-ジスルホン酸)およびスラミンを含む、またはそれからなる群から選択された拮抗薬など、P2プリン作動性受容体の拮抗薬である。その他の拮抗薬は、関連分野の当業者に理解されよう。
【００５１】
好ましくは拮抗薬は、P2X4プリン作動性受容体の拮抗薬であり、より好ましくは、その全てをSigma(Dorset、UK)から購入することができる、シバクロンブルー、ブロモフェノールブルー、およびブリリアントブルーGを含む、またはそれからなる群から選択された拮抗薬である。シバクロンブルーは、IC50が40〜140μMの場合にP2X4受容体の活性を低下させかつ/または阻害することで知られており、ブロモフェノールブルーはIC50が50μMの場合にそのようになることで知られている。ブリリアントブルーGは、Sigmaから購入することができる(Dorset、UK;カタログ番号B5133)。
【００５２】
好ましくは本発明は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分がホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(ホスホイノシチド-3キナーゼ、PI3キナーゼまたはPI3K)である、使用を提供する。
【００５３】
ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3K)は、多くのシグナル伝達経路を調節することが知られておりかつp85調節サブユニットおよびp110サブユニットを含み、下流のシグナル伝達機構の活性を変更するイノシトール脂質をリン酸化することが可能な、ヘテロダイマー酵素である。
【００５４】
より好ましくは、本発明は、PI3Kの活性を低減および/または阻害することが可能な化合物がPI3Kの拮抗薬である、使用を提供する。さらにより好ましくは、化合物は、Sigma(Dorset、UK)から購入することができる、2-(4-モルホリニル)-8-フェニル-1(4H)-ベンゾピラン-4-オン塩酸塩(LY-294002)である。その他の拮抗薬は、関連分野の当業者に理解されよう。
【００５５】
好ましくは本発明は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分がカルシウムチャネルである、使用を提供する。
【００５６】
イオンチャネルは、典型的には細胞膜に位置付けられており、脂質膜を横断するナトリウム(Na+)やカリウム(K+)、カルシウム(Ca2+)、塩化物(Cl-)などのイオンの輸送を促進させる。「カルシウムチャネル」とは、細胞膜を横断してカルシウムおよび/またはカルシウムイオンを輸送することが可能なイオンチャネルを含む。
【００５７】
より好ましくは、本発明は、カルシウムチャネルの活性を低減および/または阻害することが可能な化合物がカルシウムチャネル遮断薬である、使用を提供する。
【００５８】
カルシウムチャネル遮断薬は、特に心臓および細動脈の平滑筋における、細胞膜を通した細胞外カルシウムの進入によって誘導された内向き電流を阻害する。これは、心筋酸素要求量を低下させ、動脈圧を低下させ、収縮性を低下させることによって作用する。いくつかの薬剤は、反射性頻拍を誘発し(例えばニフェジピン、ニカルジピン、アムロジピン)、βアドレノセプターとの組合せにより最も良く投与される。これとは対照的に、ジルチアゼムおよびベラパミルは、房室(AV)結節を通した伝導を阻害しかつ徐脈を引き起こす傾向があるので、β遮断薬に耐えることができない患者に適している。全てのカルシウム拮抗薬は、心筋収縮を低減し、心不全を悪化させる可能性がある。ジヒドロピリジンカルシウム進入遮断薬は、反射性頻拍を避けるために、急性冠不全症候群ではβ遮断薬と共に用いられるべきである。β遮断薬に耐えることができない患者では、心拍数遅延カルシウム拮抗薬が適切と考えられる。短時間作用型のジヒドロピリジンは、急性冠不全症候群では単独で使用すべきではない。
【００５９】
好ましくは、カルシウムチャネル遮断薬は、ニフェジピン、ニカルジピン、およびアムロジピンからなる群から選択される。その他の拮抗薬は、関連分野の当業者に理解されよう。
【００６０】
好ましくは、プリン作動性シグナル伝達経路の成分が、上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)を含む群から選択されるナトリウムチャネルである本発明が、提供される。
【００６１】
イオンチャネルは、典型的には細胞膜に位置付けられ、脂質膜を横断するナトリウム(Na+)やカリウム(K+)、カルシウム(Ca2+)、塩素(Cl-)などのイオンの輸送を促進させる。「ナトリウムチャネル」とは、細胞膜を横断してナトリウムおよび/またはナトリウムイオンを輸送することが可能なイオンチャネルを含む。
【００６２】
ENaCに関する単一チャネル単位電導率は、Na+が外部溶液中の主要な伝導イオンである場合、室温で4〜5pSである(Garty & Palmer、1997; Palmer & Frindt、1986b)。興奮性組織で観察されたNa+チャネルとは異なり、ENaCの電流-電圧関係は、強力な電圧依存性ゲーティングを示さず、これは、膜過分極に対する応答の開確率の、わずかな上昇を明らかにしている(Canessaら、1994b; Garty & Palmer、1997)。ENaCチャネルは、K+に比べて約20倍高い感受性をNa+に対して有することを、特徴としている(Benosら、1980; Palmer、1982; Taylorら、1999)。このチャネルの、別の際立った特徴は、室温での開閉が長時間にわたるゲーティングの遅い動態である(Palmer & Frindt、1986a; Taylorら、1999)。
【００６３】
より好ましくは、本発明は、ナトリウムチャネルの活性を低減および/または阻害することが可能な化合物がナトリウムチャネル拮抗薬であり、さらにより好ましくはアミロイドである、使用を提供する。
【００６４】
プリン作動性シグナル伝達経路を負に調節する細胞成分の活性を増大させることによって、シグナル伝達を低減および/または阻止することになり、それによって、ナトリウム移入が減少および/または阻止されることが理解されよう。例えば、P1および/またはP2プリン作動性受容体の活性の内部移行および/または下方制御に関与する細胞成分の活性を増大させ、かつ/またはPTENなどのPI3Kの下方制御に関与する成分の活性を増大させることによって、経路を通したシグナル伝達を効果的に低減および/または阻止することになり、またナトリウム移入を低減および/または阻止することになる。
【００６５】
例えば、腎上皮細胞の頂端膜側のP2Yプリン作動性受容体の活性化は、ナトリウム輸送を阻止することがわかっている。このように、P2Y拮抗薬は、例えば頂端ATP過剰によって引き起こされるナトリウム貯留がある状態を治療するのに使用することができる。
【００６６】
好ましくは本発明は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分が頂端膜P2Yであり、より好ましくは頂端膜P2Y受容体の拮抗薬である使用を提供する。より好ましくは、拮抗薬は、スラミンおよび/またはピリドキサールホスフェート-6-アゾ(ベンゼン-2,4-ジスルホン酸)(PPADS)である。その他の拮抗薬は、関連分野の当業者に理解されよう。
【００６７】
好ましくは本発明は、細胞が腎細胞であり、またはミネラルコルチコイド受容体を含有する細胞である使用を提供する。その他の適切な細胞は、関連分野の当業者に明らかにされよう。
【００６８】
「腎細胞」とは、皮質および/または延髄集合管の細胞、特に主細胞を含めた、腎臓から得られる任意の細胞型を含む。より好ましくは、本発明は、腎細胞が側底上皮細胞である使用を提供する。
【００６９】
第3の態様では、本発明は、異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防および/または緩和するための薬剤の製造における、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の使用を提供する。
【００７０】
第4の態様では、本発明は、インビトロでの1個または複数の細胞内へのナトリウム移入を阻害および/または低減する方法であって、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物で1個または複数の細胞を処理するステップを含む方法を提供する。
【００７１】
第5の実施形態では、本発明は、異常ナトリウムホメオスタシスに関連した個体の状態を予防しかつ/緩和する方法であって、その必要がある個体に、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００７２】
好ましくは本発明は、状態が、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症、アルドステロンに対する高い感受性、および/または本態性高血圧症を含む群から選択される、使用および/または方法を提供する。
【００７３】
有効量の本発明の化合物は、経口、鼻、非経口、または静脈内投与を含めた任意の適切な送達方法または経路によって投与できることが、関連分野の当業者に理解されよう。そのような当業者は、投与経路に適切な処方を認識されよう。好ましくは、本発明の化合物は、スピノロラクトンなど、アルドステロンの治療で使用されるその他の薬物で知られるように、経口的に送達することができる。
【００７４】
「有効量」とは、1個または複数の細胞でのナトリウム移入を阻害および/または低減するのに十分な量であり、それによって、原発性アルドステロン症、続発性アルドステロン症、アルドステロンに対する高い感受性、および/または本態性高血圧症含む群から選択された個体の状態を予防および/または緩和させる量を含む。本発明の化合物の有効量は、医薬または生化学の関連分野の当業者にとってその全てが通常の技法である、血漿カリウム濃度、血圧、およびアルドステロン-レニン比に対する化合物の効果の測定によって、決定できることが理解されよう。高アルドステロン濃度または活性は、血圧の上昇、カリウム血漿濃度の不均衡、およびアルドステロン過剰の原因に応じたアルドステロン-レニン比の変化をもたらす。
【００７５】
第6の態様では、本発明は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物を特定する方法であって、
(i) 試験対象の化合物を提供するステップと、
(ii) プリン作動性シグナル伝達経路の成分を提供するステップと、
(iii) 前記化合物でプリン作動性シグナル伝達経路の成分を処理し、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を測定および/または決定するステップと、
(iv) 成分の活性が変化する場合には、成分の活性を調節することが可能であるとして化合物を特定するステップと
を含む方法を提供する。
【００７６】
好ましくは本発明は、化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を阻害および/または低減することが可能な方法を提供する。より好ましくは、プリン作動性シグナル伝達経路の成分は、本明細書に定義されるプリン作動性受容体である。好都合には、成分は、P2X4プリン作動性受容体を含む、またはそれからなる。
【００７７】
あるいは、プリン作動性シグナル伝達経路の化合物は、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼまたはカルシウムチャネルまたは本明細書で定義される上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)である。
【００７８】
好ましくは本発明は、化合物が、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を活性化および/または増大させることが可能な方法を提供する。好都合には、プリン作動性シグナル伝達経路の成分は、頂端膜P2Y受容体である。
【００７９】
プリン作動性シグナル伝達経路での成分の活性を調節することが可能な化合物のスクリーニングは、インビトロ、インビボ、または生体外での生化学および/または生理学的アッセイを使用して行うことができることが理解されよう。
【００８０】
例えば、プリン作動性シグナル伝達経路を通したシグナル伝達は、限定するものではないが下記の実施例に記載されるモデルおよび実験を使用して、モニタおよび/または測定することができる。A6細胞系でのプリン作動性シグナル伝達経路の活性をスクリーニングする代替例として、哺乳類腎細胞から得られる細胞系など、その他の初代または形質転換細胞系を使用することができる。
【００８１】
例えば、スラミン、PPADS、およびATPの作用を試験するのに使用された、実施例に記載されたモデルおよび実験は、細胞単層の側底からのプリン作動性シグナル伝達経路の活性を調節することが可能な化合物を、スクリーニングするのに使用することができる。そのような手法は、例えば、経上皮電気抵抗(TEER)を測定することによって評価することができるP2X4プリン作動性受容体およびナトリウム輸送の活性を調節することが可能な化合物を、スクリーニングするのに使用してもよい。
【００８２】
好ましくは本発明は、(v)本発明の方法のいずれかによって特定可能な化合物を作製するステップをさらに含む方法を提供する。好ましくは本発明は、(vi)この化合物を、医薬品として許容される担体と配合して医薬品組成物を形成するステップをさらに含む方法を提供する。当業者なら、本発明の方法のステップ(v)および(vi)を行うのに適した方法および手法が理解されよう。
【００８３】
第7の態様では、本発明は、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の活性を調節することが可能な化合物、および医薬品として許容される担体を含む、医薬品組成物を提供する。
【００８４】
本発明の医薬品組成物は、プリン作動性シグナル伝達経路の活性および/またはアルドステロンの活性を調節することが可能なその他の化合物の有効量をさらに含んでもよいことが理解されよう。例えば、本発明の医薬品組成物は、本発明の2種以上の化合物の有効量を含んでもよい。その代わりにまたはそれに加えて、本発明の医薬品組成物は、アルドステロンの阻害剤および/またはアルドステロン受容体の拮抗薬をさらに含んでもよい。高カリウム血症をもたらす可能性があるので、アルドステロンの作用を完全に遮断することは望ましくないことが理解されよう。
【００８５】
次に、本発明のある態様を具体化する好ましい非限定的な実施例について、下記の図を参照しながら記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
(実施例)
(実施例1)
実験データ
1.1. プリン作動性経路の特定
材料および方法
細胞培養
実験は、単一A6細胞系(Dr P.DeSmet、Karnolieke Universiteit、ベルギーの好意により提供された)を使用し、127〜134継代の間で実施した。細胞は、前述のように膜フィルタ上で培養した(Gorelikら、2004; Kemendyら、1992)。
【００８７】
A6細胞系は、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)の腎臓から得られ、最初にRaffertyによって確立され(Rafferty & Sherwin、1969)、インビトロでアルドステロンの作用を研究するのに有用なモデルであることが示された(Watlingtonら、1982)。本発明者らのA6細胞系(Dr P.DeSmet、Katholieke Universiteit、Leuven、ベルギーの好意により提供された)を、127〜134継代の間で実施される全ての実験で使用した。
【００８８】
走査型イオン顕微鏡(SICM)のセットアップ
この方法については、既に記述されている(Korchevら、1997b; Hansmaら、1989)。簡単に言うと、高感度SICMプローブは、電解質が充填されたガラスナノピペットからなる(図1A)。そこに差し込まれたAg/AgCl電極は、ピペットの先端を通過するイオン電流を測定する電流増幅器に接続されている。3軸ピエゾ並進ステージ上に取り付けられたプローブを、サンプル表面に近付いたときに200Hzで垂直に100nm調節する。変調電流を増幅し、ロックイン増幅期に供給して、変調周波数に変化させる。出力をDSPカードに接続し、フィードバックシグナルを生成し、サンプルが垂直方向に取り付けられている並進ステージを移動させることによってプローブ-サンプルの分離距離を維持する。対照/データ収集のエレクトロニクスにより、側方および垂直位置の両方を記録し、組織分布画像を生成する。
【００８９】
スマートパッチ技法
SICMセットアップを、パッチクランピングにも適用した(Guら、2002)。組織分布画像を得た後、このシステムは、パッチ記録を行うために、ナノピペット(ここではパッチピペットして使用される)を問題の領域またはポイントの上方に正確に位置決めする。フィードバック制御のスイッチを切り、ピペットを下げ、吸引を行って、GΩシールを形成する。次いでイオンチャネルの記録を、細胞接着構造で従来のパッチクランプ法によって行う。
【００９０】
L-15培地を浴として使用し、ピペットに、SICMおよびパッチクランプ記録のために溶液を吸い込ませた。マイクロピペット、L15培地を吸い込んだときに、150MΩの平均先端抵抗を有していた。パッチクランプ記録では、電流を10kHzでサンプリングし、パルスプロトコルの生成にも使用されるAxopatch 200B増幅器およびpClamp 8.2(Axon Instruments,Inc.、Union City、CA、USA)を使用して、2kHzでフィルタにかけ(-3dB、4-pole Bessel)、単一チャネル活性を分析した。合計で60パッチが行われ、アルドステロンによる急性刺激後の、3つの異なるタイプの細胞収縮(合計で15パッチ)および非収縮(合計で45パッチ)を均等にプローブした。
【００９１】
アルドステロン刺激
修正Kemendyプロトコル(Kemendyら、1992)で、アルドステロンの作用について試験をした。簡単に言うと、成熟A6細胞単層を、上述の10%ウシ胎児血清と一緒に成長培地中に維持したが、1.5μMアルドステロン(Sigma、Dorset、UK)を補った。24時間後、単層をさらに24時間、アルドステロンの存在下で無血清培地中でインキュベートした。次いで細胞を、血清およびアルデステロンを含まない培地で成長させ、さらに48時間、空気中に1%CO2を含む加湿インキュベータ内でインキュベートした。
【００９２】
アルドステロン作用を評価する実験中、1.5μMアルドステロンを、単層の両側に再び添加した(Kemendyら、1992)。アルデステロンについて観察された全ての作用が、Na+チャネルを介した直接または間接的作用に関わっているか否かを決定するために、本発明者らは、細胞単層の頂端側で10μMアミロイド(Sigma)を使用した。
【００９３】
経上皮電導率(Gt)の測定
経上皮伝導率(Gt)を、直径23.1mmおよび膜の有効成長面積4.19cm2であるフィルタ上で培養された無傷の上皮を使用して、EVOMオーム計(World Precision Instriments、Hertfordshire、UK)で測定した。Na+透過率の変化を、Gt=1/TEERとしての、経上皮電気抵抗(TEER)の逐次測定から得た、Endohm 24チャンバ(World Precision Instriments)内に取り付けられたフィルタの端から端までのGt変化として決定した。単層全体のGtを、膜の有効成長面積で割って、細胞cm2当たりとして表した。
【００９４】
ATP放出
膜フィルタ上の単層を、L-15培地で灌流し、Endohm 24チャンバ内で60分間平衡にし、頂端および側底溶液体積を2mlに維持した。本発明者らは、先に報告された修正方法(Jansら、2002)に従い、ATP生物発光アッセイキット(Sigma)を使用してATP放出を定量した。簡単に言うと、500μlのサンプルを側底区画から採取し、ペトリ皿で、100μlのルシフェリン/ルシフェラーゼアッセイ試薬と500μlのL-15培地との混合物中に添加した。このペトリ皿を、光が漏れない区画に挿入し、一体型光電子増倍管(814光電子増倍管検出システム、Photon Technology International,Inc.、West Sussex、UK)によってATP発光強度を検出した。ATPアッセイの感度に影響を及ぼすサンプル培地中の構成成分を説明するために、漸増濃度のATP標準物質を、この研究の各シリーズにおける各測定ポイントごとに同じサンプルに添加することによって、検量線を作成した。
【００９５】
ATP放出は、製造業者の取扱い説明書に従って商用のATP生物発光アッセイキット(FL-AA、Sigma、Dorset、UK)を使用して、かつ先に報告された(Jansら、2002)修正済みの方法に従って、定量した。
【００９６】
ATPγSおよびヘキソキナーゼ
50μMのATPγS(非加水分解性ATP類似体)(Sigma、Dorset、UK)を、細胞単層の側底に添加して、ナトリウム再吸収および細胞形態変化に対するATPの役割を評価した。側底から遊離ATPを捕捉するために、6単位/mlヘキソキナーゼ(Sigma、Dorset、UK)および5mMグルコース(Sigma)を側底区画に添加した。
【００９７】
結果および考察
本発明者らは、アルドステロンの作用メカニズムを研究するために、SICMを使用して、生理学的条件でフィルタ支持体上で成長する生きているA6細胞の画像形成を行った(Gorelikら、2004)。図1Bは、膜フィルタインサート上で培養された単層内の、A6細胞の頂端膜の典型的なSICM組織分布画像を示す。ちなみに、同じ調製物の走査電子顕微鏡(SEM)画像は、類似した構造を明らかにしている(図1C)。微絨毛突起および細胞境界は、どちらの画像でも明確に視認され、同等である。
【００９８】
局在化した側底低浸透ストレスおよびアルドステロンが、ナトリウム輸送に及ぼす影響について、調査した。図2AおよびCは、どちらの刺激も、低浸透ストレス状態でアミロライド感受性ナトリウム輸送の増大に刺激を与え、アルドステロンよりも著しい活性化をもたらしたことを示す。次いで本発明者らは、これら2つの刺激が細胞形態に及ぼす影響について、調査した。SICM画像は、低浸透刺激により、調節容量減少(RVD)の後であっても維持される、長期にわたる細胞形態変化をもたらすことを実証した(図2B)。頂端膜拡張に伴う細胞のごくわずかな割合を有するこれらの組織分布変化は、細胞収縮の結果である可能性が最も高い。先に、本発明者らは、一部のA6上皮細胞が、基本条件下で遅い横収縮を示すことを実証した(Gorelikら、2004)。図2Dは、アルドステロンによる刺激の前後の、A6細胞の組織分布画像を示す。驚くべきことに、アルドステロンは、低浸透ストレスと同様の形態変化をもたらすが、これは各細胞で生ずるのではなく、細胞の個別のクラスターで生ずる。
【００９９】
次に本発明者らは、細胞収縮とナトリウム輸送との間の関係について検討した(図3)。アルドステロンの刺激中、同じ細胞の連続15分間のスキャンでは、個々の細胞の収縮が示された(図3A、1、2、3が付された細胞を参照)。アルドステロンまたは低浸透ストレスに応答する収縮細胞の進行漸増は(図3B)、Gtの増加の場合(図2A、C)と同様の時間的経過を有していた。しかし、電導率とは対照的に、アルドステロン誘導収縮は、アミロライドによって遮断されなかったが、LY-294002(PI-3-K阻害剤)によって遮断された(図3B)。
【０１００】
細胞収縮が、ナトリウム輸送に直接関連しているか否かを試験するために、本発明者らは、アルドステロン刺激中の非収縮細胞(図3C、上部パネル)および収縮細胞(図3C、下部パネル)について個々に調査した。本発明者らの走査パッチクランプ技法(Guら、2002)を使用した、細胞接着パッチクランプ単一チャネル記録と一緒の非収縮および収縮細胞のSICM画像を、図3CおよびDに示す。チャネル活性は、収縮細胞においてのみ見出された(図3D、下部パネル)。さらに高い解像度のSICMスキャンでは、収縮によって、微絨毛の表面突起の損失との細胞膜/細胞骨格の結合が、変わることが示された(図2E、下部パネル)。ENaCの機械感覚性(AwaydaおよびSubramanyan、1998)およびENaC活性Fアクチン細胞骨格依存性(Cantielloら、1991)を考えると、これらの変化は、ナトリウムチャネルの開放をもたらす可能性がある(図3F)。
【０１０１】
しかし、低浸透またはアルドステロン刺激中に、何が細胞収縮を引き起こすのか、明らかではない。上皮細胞収縮の既知のモジュレーターは、細胞内Ca2+の上昇を介して作用するプリン作動性刺激である(Nakanoら、1997)。既に論じたように、低浸透誘導ナトリウム輸送は、上皮細胞から側底区画へのATP放出と相関していること、およびこれによって細胞内Ca2+の上昇が刺激されることが、他者によって実証されている(Jansら、2002)。ATPが、ADPおよびAMPを介してアデノシンに素早く加水分解することは、周知である。これは、腎上皮プリン作動性受容体の広範な分布と一緒になって(ScwiebertおよびKishore、2001)、細胞収縮によるENaC活性化での、可能性ある一般的なプリン作動性メカニズムを示唆している。
【０１０２】
アルドステロンが、低浸透圧性と同様に、A6細胞の側底からATPを放出するか否かを決定するために、本発明者らは、経上皮電導率(Gt)の変化(図4A)と、アミロライド感受性GtENaCに対するATP放出速度(RATP)の関係(図4B)を測定した。アルドステロンは、予想通りにアミロライド感受性GtENaCを増大させ、これは、ATP放出の著しい増大に関連していた。
【０１０３】
ATP刺激そのものが、上皮細胞を収縮させるのか否かを試験するために、本発明者らは、側底由来のATPγSに対するA6細胞単層の応答を、画像化した。図4Cは、ATPが、単層細胞の約75%で収縮を引き起こしたことを示す。
【０１０４】
非加水分解性ATPγSの側底添加は、アミロライド感受性経上皮収縮の増大をもたらし(図4D)、これは、ATP放出およびGtENaCが結び付けられる可能性が高いことを示唆していた。本発明者らは、ATP消費系、ヘキソキナーゼ/グルコースを、側底区画に添加した。アルドステロンは、利用可能な細胞外ATPが存在しない状態では、収縮に影響を及ぼさなかった(図4B)。しかし、側底区画を洗浄することによってヘキソキナーゼおよびグルコースを除去した場合、Gtには素早い増大が見られた(図4B)。別の補完的実験では、ヘキソキナーゼおよびグルコースをアルドステロン前刺激A6単層に添加した場合、アミロライド感受性Gtは、徐々に低下した(図4F、上部パネル)。
【０１０５】
ATPは、ADPおよびAMPを介してアデノシンに急速に加水分解することが知られているので、本発明者らは、ADPおよびアデノシンのナトリウム輸送効果についてもチェックした。ADPは、アデノシンの場合に予測される増大とは対照的に(Jansら、2002)、電導率に影響を与えなかった(データは図示せず)。P1受容体拮抗薬8-シクロペンチル-1,3-ジプロピル-キサンチン(DPCPX)は、アルドステロン刺激ナトリウム輸送を低下させ(図4F、底部グラフ)、スラミンおよび/またはピリドキサールホスフェート-6-アゾ(ベンゼン-2,4-ジスルホン酸)(PPADS)(P2受容体遮断薬)は、電導率を低下させなかっただけではなく、スラミンの場合には電導率を著しく増大させた。LY-294002(2-(4-モルホリニル)-8-フェニル-1(4H)-ベンゾピラン-4-オン塩酸塩)によるPI-3-Kの阻害は、ATPまたはアデノシンによるナトリウム伝導を無くした(データは図示せず)。
【０１０６】
したがって本発明者らの実験は、スラミンもPPADSも、アルドステロン作用を阻害しないことを示す。1つの可能な説明は、アルドステロンの作用が、ラットにおけるこれら2つの拮抗薬に対して非感受性のP2X4プリン作動性受容体を、介することである(NorthおよびSurprenant、2000)。調査は、ラット遠位尿細管(即ち、アルドステロンの作用部位)が、P2X4受容体を含有することを示していた。ヒトP2X4受容体は、ラットP2X4の場合と非常に類似した作動薬効力プロファイルを示すが、拮抗薬スラミンおよびピリドキサール5-ホスフェート-6-アゾ-2',4'-ジスルホン酸に対して著しく高い感受性を有する。この異なる感受性に関与する領域を、マップした(Garcia-Gnzmanら、1997)。このように、P2受容体、特にP2X4受容体は、プリン作動性シグナル伝達経路に関わっている可能性が高く、ヒトにおいて治療上重要なものである可能性が高い。
【０１０７】
これらの結果を使用して、本発明者らは、アルドステロン誘導上皮ナトリウム輸送の新しいモデルを提示する(図5)。アルドステロンは細胞に進入し、まだ決定されていないメカニズムによって、ATP放出を刺激する。次いでATPが細胞から排出され、多くの細胞型で実証されているように、P2プリン作動性受容体を介してオートクリン/パラクリン系を介してシグナルを伝達する(BurnstockおよびWilliams、2000)。排出されたATPは、ADP、AMP、およびアデノシンに、急速に加水分解する。プリン作動性刺激因子でもあるアデノシンは、それ自体のP1受容体を介して作用する。本発明者らの実験は、ATPおよびアデノシンの両方で誘導されたNa+輸送は、LY-294002によって遮断することができ、これはENaC活性化においてPI-3-K経路が重要であることを実証する。多くの調査は、ATPおよびアデノシンの両方が、細胞内カルシウムを増大させることを確認している(Jansら、2002)。MacalaおよびHayslettは、腎ナトリウム輸送が、オータコイドとして作用する局所的に生成されたアデノシンによって制御することができ、したがって局所的な生理学的効果を誘発させることを示唆した(MacalaおよびHayslett、2000)。本発明者らは、これによって、観察された細胞収縮をもたらすと仮定する。類似したメカニズムが、筋上皮細胞に関して報告されている(Nakanoら、1997)。収縮は、正常な微絨毛構造が損失した状態で、頂端膜組織分布を大きく変化させる。ENaCの機械感覚性(AwaydaおよびSubramanyam、1998)およびENaC活性Fアクチン細胞骨格依存性(Cantielloら、1991)を考えると、これらの変化は、ナトリウムチャネルの開放も促進させることができる(図5)。
【０１０８】
側底区画と比較して頂端に放出された場合には、非常に異なるATPの作用を認識することが重要である。このように、モルモットに対する実験では、低浸透刺激によって管腔側に放出された遠位結腸ATPは、P2Y2受容体を介すると考えられるナトリウム吸収に対して、阻害効果を発揮した(YamamotoおよびSuzuki、2002)。
【０１０９】
伝統的に、アルドステロンの効果は、ナトリウム再吸収が2から3倍増大する初期応答(0.5〜3時間)と、その増大が20倍までである後期応答(3〜24時間)とに分けられる(Alvarezら、2000)。後期については十分研究されているが、ENaCサブユニットmRNAまたはタンパク質が少しでも増大する前の、上皮ナトリウムチャネル(ENaC)活性を調節する有力な初期効果は、十分に理解されていない(Chenら、1999)。ナトリウム輸送を増大させるには、2つの潜在的な方法があり、即ち、細胞膜チャネルの数を増加させること、または既存のENaCの開確率を高めることである。いくつかの研究は、アルドステロンが、初期段階ではナトリウムチャネルプールを調節しないことを示唆している(Kleymanら、1992)。この作用は、もっぱらチャネル密度の増加に起因するものであり(Helmanら、1998)、アルドステロン、バソプレッシン、およびインスリンは、頂端膜へのチャネルの組込みを促進させることによって、ナトリウム輸送に作用することが(AlvarezおよびCanessa、2003)、他者によって結論付けられている。逆に、いくつかの群では、おそらくは翻訳後修飾によって(Kleymanら、1992; Eatonら、2001)、アルドステロンがEnaC開確率を上昇させることが示唆されている(Kamendyら、1992)。ナトリウムチャネルの輸送および/または機能の調節は、アルドステロン誘導モジュレータータンパク質およびキナーゼによって制御されることが示唆されている(Snyderら、2002)。1つの調節カスケードは、小さいGタンパク質K-Ras2Aのアルドステロン誘導発現を介した作用を提示したが、その後にホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI-3-K)の活性化を伴い、それによってホスホイノシトール-3,4,5-3リン酸(PIP3)が生成され、これはENaC開確率の直接的な調節因子である作用を提示した(Eatonら、2001)。この調節は、対照的にチャネルの劣化を刺激するENaCの分解およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)を阻止する、血清およびグルココルチコイドキナーゼ(SGK1)も含む(Pearceら、2000: Tongら、2004)。A6細胞では、低浸透性並びにアルドステロンが、SGK1発現を誘導する(Rozanskyら、2002)。しかし、SGK1ノックアウトマウスの調査では、動物が標準的な摂取を行っているが食事による塩の制限が損なわれている場合、腎臓の塩の取扱いが通常通りであることが実証され、これは、SGK1が、ナトリウム再吸収のミネラルコルチコイドの調節に寄与しているが、その完全な説明にはなっていないことを示唆している(Wulffら、2002)。
【０１１０】
本発明者らは、アルドステロン作用の初期に関する文献で、その問題について十分説明している。ATPは、個々の細胞の素早い収縮をもたらし、これらは、チャネル活性を実証している。このように、ATPを介して作用するアルドステロンは、ENaCの開確率を上昇させるように見える。しかし時間と共に、電導率のゆっくりとした増大と並行して、個々の細胞の進行漸増が生ずる。この輸送細胞の数の漸増的変化は、見掛けの頂端膜チャネル密度の進行的増大と解釈される。
【０１１１】
この系の進化した態様は、重要である可能性が高い。塩から新鮮な水への原脊椎動物の転移は、非常に変化する外部環境にもかかわらず、内部環境が維持されるようにイオン輸送を調節することができる、系の開発を必要とした。この文脈では、P2X受容体が明らかに脊椎動物に限定されることが、興味あることである(North、2002)。進化中、アルドステロンは、浸透圧モル濃度の変化に応答して細胞体積を調節するために細胞が使用する作用の同じメカニズムを、適用したように見える。低浸透圧性は、腎上皮の端から端までのATP放出に強力な刺激である(Jansら、2002)。本発明者らは、A6単層の側底への低浸透圧性刺激の適用によって、アルドステロンまたはATPによってもたらされた場合と非常に類似した細胞収縮パターンが得られることを実証した。多くの研究では、ATP放出が、細胞体積の制御に関係することが確認されている(Wangら、1996)。
【０１１２】
細胞外流体体積およびナトリウムのバランスの調節は、血圧の重要な決定因子である。いわゆる本態性高血圧症の患者の約3分の1では、通常のアルドステロンレベルに付随して、血漿レニン活性が低い。この理由はわかっていない。1つの可能性は、一部の個体において腎上皮細胞がアルドステロンに大きく応答し、その結果、ナトリウム再吸収が増大するということである。その一部がこの条件及びその他の条件下にあると考えられる、このプリン作動性制御系において、十分に重要な変形例になり得るということを、本発明者らの結果に関連して推測することは、興味深い。ナトリウム輸送のいくらかの刺激は、この非常に基本的な細胞制御およびエネルギー系を取り入れてもよいと思われる。
【０１１３】
1.2.プリン作動性経路における側底受容体の特定
材料および方法
細胞培養
単一のアフリカツメガエル(Xenopus laevis)腎上皮A6細胞系(腎臓は、Dr P.DeSmet、Kamolieke Universiteit、ベルギーによって提供された)を、127〜134継代の間で実施される全ての実験で使用した。細胞を、前述のように空気中1%のCO2を有する加湿インキュベータ内で、25cm2のプラスチック細胞培養フラスコ(Corning)で、28℃で通常通り維持した(Sariban-Sohrbayら、1984)。培地は、pH7.4の、両生類に合わせて修正を加えた、L-グルタミン(Gibco、Parsley、UK)を含む1部のHam's F-12培地とL-グルタミン(Gibco)を含む1部のL-15培地との混合物であった。これらの成分の他に、培地には、10%ウシ胎児血清(Gibco)、200mg/nlのストレプトマイシン、および200U/mlのペニシリン(Gibco)も補った。最終的な成長培地の浸透圧モル濃度は、自動マイクロ浸透圧計(タイプ13/13DR-Autocal、CAMLAB、Cambridge、UK)を使用して測定し、260ミリオスモル/kg H2Oであることがわかった。細胞が90〜95%の集密度になったとき、成長培地を除去し、0.05%のトリプシンおよび0.6mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(Gibco)を含有する2価フリー(Ca2+およびMg2+)培地に曝すことによって、これを継代した。10分後、酵素の作用を、10%ウシ胎児血清を含有する成長培地で阻害した。次いで細胞を再懸濁し、特定の実験の要件に応じて、5×105細胞/cm2の密度で培養フラスコに、または異なる培養基質上に再び播いた。細胞内Ca2+の評価に利用される細胞を、ガラスカバースリップ(厚さ  No.0 直径13mm1、VWR、UK)上で、1×105細胞/cm2の密度で成長させた。ナトリウム輸送でのP2X4受容体の関与、および組織分布的観察に関する調査で使用される細胞は、全て、膜フィルタインサート(直径23mm、細孔0.4mm、1.6×106細孔/cm2、Falcon、Becton Dickinson Labware、Oxford、UK)上で、2×105細胞/cm2の密度で、10〜12日間、安定な経上皮電気抵抗を示すタイト上皮が形成されるまで成長させた。A6細胞を、1992年にKemendyらによって報告された修正プロトコルを使用して、アルドステロンで通常通り前処理した。簡単に言うと、このプロトコルでは、タイトA6細胞単層を、上述の10%ウシ胎児血清と一緒に、しかし細胞単層の側底区画に添加された1.5mMのアルドステロン(Sigma、Dorset、UK)が補われた成長培地中で、24時間維持した。24時間後、細胞単層を無血清培地中で、しかし依然として1.5μMのアルドステロンの存在下で24時間インキュベートして、最大ホルモン応答を促進させた。次いで細胞を、血清およびアルドステロンの両方を含まない培地中で成長させ、空気中に1% CO2を含む加湿インキュベータ内で、28℃で48時間インキュベートした。
【０１１４】
実験で使用する前に、自動マイクロ浸透圧計(タイプ13/13DR-Autocal、CAMLAB、UK)で確認された、最終的な浸透圧モル濃度が約260ミリオスモル/kgH2Oである修飾等浸透圧性L-15培地(Gibco)で、A6細胞を洗った。
【０１１５】
走査型イオン顕微鏡(SICM)
本発明者らは、前述の(Korchevら、1997a、1997b)SICM(Ionoscope Limited、London、UK)を使用して、A6細胞の組織分布画像を得た。簡単に言うと、SICMは、3軸ピエゾ並進ステージ上に取り付けられ、かつ細胞単層に対して垂直に配置されたナノピペットを、走査プローブとして使用する。SICMフィードバック制御システムは、ピペット内のイオン電流を一定にして、A6細胞表面からナノピペット先端のほぼ内部半径の範囲内で、一定の分離距離を維持しながら細胞に近付きかつ細胞をスキャンする。次いでSICMは、A6細胞膜表面の3D組織分布画像を生成する。
【０１１６】
SICMナノピペットを、レーザベースの電極プラー(P-2000、Sutter Instrument、Novato、California、USA)を使用して、ホウケイ酸ガラス毛細管(Intrafil、1.0mm OD×0.58mm UD; Intracel Ltd、Hertz、UK)から引き出した。走査を行うために、本発明者らは、先端内部半径が約50nmのピペットと、L15培地に浸漬したときに約100MΩの電気抵抗を使用した。
【０１１７】
経上皮電気抵抗(Rt)の測定および経上皮電導率(Gt)の計算
十分に発達したA6上皮細胞単層は、膜フィルタ上で培養した場合、安定で高い経上皮電気抵抗(Rt)を有することが実証されている(Handlerら、1981)。本発明者らの研究では、Rtは、前述のように(Gorelikら、2005; Zhangら、2005)EVOM電圧抵抗計(World Precision Instrument、Hertfordshire、UK)に接続された、商用の装置ENDOHM 24チャンバを使用して測定した。簡単に言うと、培養されたA6細胞を有する膜フィルタインサートを、ENDOHM 24チャンバに移し、測定を行った。Rt測定は、EVOM電圧抵抗計の読取りが安定した後に(約30〜60分)、室温で、L15培地で行った。EVOMからの、測定された抵抗出力を、Digidata 1322A 16ビットデータ収集システムおよびpClamp 8.2ソフトウェア(Axon Instruments,Inc.、Union City、CA、USA)を用いて1Hzでサンプリングした。Rtは、Ωm2で表し、測定された抵抗値に、細胞培養膜フィルタ支持体が4.19cm2であることが計算されたA6細胞単層の有効膜面積を掛けることによって、決定した。細胞単層は、全ての経上皮Na+輸送およびP2X4評価実験中、比較的不透過性であることが必須であった。
【０１１８】
これらの実験に向けて、8000Ωcm2よりも大きい安定な初期Rtを有する細胞のみ選択した。次いで経上皮電導率(Gt)を、Gt=1/Rtを使用して計算し、平方センチメートル当たりのジーメンス(S/cm2)で表した。
【０１１９】
細胞内カルシウム濃度の測定
ガラスカバースリップ上で1日間、低密度で成長させたA6細胞を、L15培地で洗い、灌流チャンバ(RC-25チャンバ、Warner Instruments Inc.、U.S.A.)に適応させた。これらを、フルオ-4アセトキシメチルエステル(フルオ-4 AM; Molecular Probes、Eugene、Oregon、U.S.A.)4μMと共に、1時間室温(24±2℃)で、0.08% Pluronic F-127(Sigma)の存在下でインキュベートした。残りのフルオ-4を、L15培地で洗浄し、その後、15分間エステル分解した。フルオ-4を450〜480nmで励起し、Nikon TE-2000倒立顕微鏡に連結されかつImage-Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics、Wokingham、UK)によって制御された増感CCD(CoolView IDIカメラシステム、Photonic Science、Sussex、UK)を使用して、放出された蛍光を>520nmで検出することにより、個々の細胞における細胞内遊離カルシウム濃度([Ca2+]i)を画像形成した。画像は、個々のフレーム露光時間を100msとし、秒当たり2フレームで通常通り獲得し、一方、[Ca2+]iの変動を長期観察するために、画像を、秒当たり約0.16フレームで、かつ同様に全てのフレームに関して100msの露光時間とし、光退色が最小限に抑えられるようにして取得した。対応する時間トレースは、正規化された蛍光強度を、問題となっている個々の細胞における蛍光と初期蛍光との比(F/F0)として示している。
【０１２０】
関係あるプリン作動性受容体の間接的な薬理学的スクリーニング: P2X4受容体作動薬および拮抗薬
この研究では、本発明者らは、測定区画における細胞外ATPの影響のみを対象とした。細胞外ATPが上皮頂端膜に及ぼす影響は、先に実証されているので(Cuffeら、2000: Leipziger、2003; Shrileyら、2005; Wildmanら、2005)、側低から頂端側へのATP作動薬の拡散を完全に避けるために、これらの実験は、接続されたリザーバからの重力供給によって、L15培地を含む頂端浴溶液(2ml)の5ml/分の速度での、連続灌流下で行った。P2X4受容体のスクリーニングに使用される作動薬は、ATPγS、2-メチルチオ-ATP(2-MeSATP)、α,β-メチレン-ATP(αβmeATP)、およびCTPを含むATP類似体であった(Boら、1995; Garcia-Guzmanら、1997; Northら、2000: Sotoら、1996)。β,γ-メチレン-ATP(βγmeATP)は、P2Y受容体よりもP2X受容体でより強力なATPの、別の安定な類似体であるので(Ralevicら、1998)、βγmeATPも使用した。全ての作動薬は、Sigmaから購入し、最終濃度50mMで使用した。P2X4受容体の活性を増強することが証明された10mMイベルメクチン(Sigma)(Northら、2000; Prielら、2004; Ralevicら、1998)も、本発明者らの研究で使用した。
【０１２１】
プリン作動性受容体の活性化に関する情報を得るための、代替の方法は、そのようなP2受容体を遮断する拮抗薬の使用である。選択的P2X4受容体拮抗薬は、容易に入手できないので、本発明者らは、単独でまたは100〜300μMピリドキサールホスフェート-6-アゾ(ベンゼン-2,4-ジスルホン)酸(PPADS、非特異的P2受容体拮抗薬)(ShwiebertおよびZsembery、2003; Xiaら、2004)と一緒に使用される、一般的なP2受容体遮断薬スラミン(100〜300μM)(Jansら、2002)を使用し、A6細胞単層側底に添加した。P2X4受容体と拮抗するのに使用される、比較的選択的な化合物-10μMブリリアントブルーG(BBG)(Jiangら、2000)も、側底区画に添加した。PPADS、スラミン、およびBBGも、Sigmaから得られる。
【０１２２】
アミロライドの効果
ATP類似体で観察されたあらゆる効果が、アミロライド感受性上皮Na+チャネル(ENaC)を介した作用に関わっているのか否かを決定するために、10μMアミロライド(Sigma)をA6細胞単層の頂端区画に添加して、実験を繰り返した。実験中、アミロライドの洗い流しは、溶液を除去しかつ浴のレベルが安定に維持されるよう、吸引ポンプシステムに連結された、ENDOHM 24チャンバ(World Precision Instruments)に接続されたリザーバからの重力供給により、A6細胞単層の頂端側(2ml)を、6ml/分の速度でL15培地で連続的に灌流することによって実現させた。アミロライド遮断の完全な除去には、約3分を要した。
【０１２３】
データ分析
全てのデータは、n回の実験の平均値として表した(平均値±SEM)。統計的有意性を評価するための、データの比較では、ステューデントt検定を使用した。報告された、P値および実験の回数または平均値に寄与する測定値の数は、必要に応じて、図の凡例で与えられる。P<0.05のレベルでの平均値の差は有意であると見なし、P<0.01は、統計的に非常に有意であり、P<0.001は、非常に高度に有意であった。統計分析は、Microcal Originバージョン5.0(Microcal Software Inc.、MA、U.S.A.)を使用して行った。
【０１２４】
結果
本発明者らは、最近、ATPγP(50μM)の側底添加が、A6単層で頂端膜拡張を伴う進行的横細胞収縮を引き起こすことを見出した(Gorelikら、2005)。本発明者らが発見した内容に関わるP2X受容体をさらに調査するために、本発明者らは、組換えおよび天然P2X4受容体の最も強力な作動薬であることが実証されている、ATP、2MeSATPの別の非加水分解性形態に応答した、A6細胞の膜構造の変化を観察するために、SICMを使用した(Ralevicら、1998; Shenら、2006)。図6Aは、2時間にわたって取得された、A6細胞単層の同じ領域での、6つの選択された時間系列SICM画像を示す。最初の2つの対照フレーム(0:00から0:18)は、細胞間に十分に発達した密着結合を有しかつ細胞膜を覆う顕著な微絨毛を有する、平らで均一な細胞単層を示す。2MeSATP(50mM)の側底添加の後、細胞形態は、進行的横細胞収縮および頂端膜上昇と共に著しく変化した(フレーム0:36から1:12)。最後のフレーム(1:48)は、細胞の当初の形態の段階的な回復を示す。細胞頂端膜構造の、これらの典型的な変化を強調するために、図6A(フレーム0:00)でアスタリスクが付された、選択されたA6細胞の組織分布プロファイルの変化を示した(図6B)。スキャンされたプロファイルは、フレーム0:18および1:12上に記された同じ長さの波線によって示される、アスタリスクが付された細胞と2つのその他の隣接する細胞とが並置される点に、それぞれ位置する密着結合接合「a」および「b」の2点を横断する。対照フレーム(フレーム0:18;図6B上部トレース)のプロファイルと比較すると、2MeSATP刺激後にスキャンされたプロファイルのライン(フレーム1:12;図6B下部トレース)は、垂直方向の頂端膜上昇を伴う、明らかな横収縮(密着結合接合「b」の、矢印がふされた位置の変化に留意されたい)を示している。そのような2MeSATP誘導細胞形態変化は、本発明者らが前にアルドステロン、低浸透圧ストレス、またはATPγSに応答してA6細胞のENaC活性に結び付けたような膜構造変化に、非常に類似している(Gorelikら、2005)。
【０１２５】
本発明者らはさらに、A6細胞の側底に50mM 2MeSATPを添加すると、本発明者らが公表したATPγSに応答した実験結果と同様に(Gorelikら、2005)、上皮ナトリウムチャネル(ENaC)阻害剤アミロライドによって阻害された細胞単層経上皮電導率(Gt)の、素早い上昇をもたらすことを観察した(図7)。
【０１２６】
P2X受容体ファミリーは多様な薬理作用を有し、作動薬の効力順序は、P2Xサブタイプ同士で著しく変わる(North、2002)。クローニングされたP2X4受容体の作動薬効力プロファイルは、ATP≧2MeSATP>CTP>αβmeATPである(Garcia-Guzmanら、1997; Northら、2000; Sotoら、1996)。
【０１２７】
ATPγSも、概して効力がATPの場合よりも少ない、組換えP2X4受容体での作動薬である。
【０１２８】
P2X4受容体がナトリウム輸送に特に関与しているか否かを試験するために、本発明者らは、A6単層のアミロライド感受性ナトリウム伝導率変化(ΔGtENaC)を測定することによって、その作動薬感受性を試験した。2MeSATP、ATPγS、βγmeATP、αβmeATP、およびCTPを含めた、選択されたP2X作動薬(50mM)の側底添加は、全てが細胞単層のΔGtENaCを著しく増大させた(図8)。A6単層における2MeSATP、ATPγS、およびCTPに対する関係あるP2X受容体の感受性(2MeSATP≧ATPγS≧CTP)は、クローニングされたP2X4受容体の場合に類似した作動薬効力プロファイルを示す。
【０１２９】
しかし、クローニングされたP2X4受容体と比較すると、A6細胞単層は、作動薬βγmeATPおよびαβmeATPに関して著しく高い感受性を有していた(2MeSATP>βγmeATP≧αβmeATP>CTP)。
【０１３０】
P2X4受容体は、種々のイオンの作用に関して、それ自体の特性プロファイルも有している。Zn2+は、クローニングされたP2X2およびP2X4受容体でATPによって誘導される陽イオン伝導率を増強し、Cu2+は、P2X2受容体を通したATP活性化電流を増大するが、P2X4受容体では影響を及ぼさないことが報告されている(Garcia-Guzmanら、1997; Northら、2000; Sotoら、1996)。このイオン依存性により、P2X4をその他のP2X受容体と区別することが可能になる。本発明者らの研究では、亜鉛(図9)が、A6単層の2MeSATP誘導アミロライド感受性ナトリウム輸送を増強したが、Cu2+では増強されなかった(データは図示せず)。P2X4受容体は、既知のP2受容体拮抗薬スラミンおよびPPADSに非感受性であることが実証されている(Buellら、1996; Northら、2000)。図9は、A6単層の2MeSATP誘起Gt変化を、スラミンおよびPPADSで阻害できないことを示す(100〜300mM)。さらに、両方の拮抗薬が、A6単層の2MeSATP誘起ナトリウム輸送に及ぼす影響は、Townsent-Nicholsonら(1999)がマウスP2X4受容体で観察した場合、およびクローニングされたP2X4受容体でBoら(1995)によって見出された場合と類似しており、このスラミンおよびPPADSは、ATP媒介作用を低下させたのではなく、さらに増大させた。
【０１３１】
イベルメクチンは、抗寄生虫薬としてヒトおよび獣医学で広く使用されており、ホモマーおよびヘテロマー構造においてP2X4受容体の活性を増強することが証明されているが、その他のタイプのプリン作動性受容体を発現する細胞では、細胞外ATP誘導電流に影響を及ぼさない(North、2002; Northら、2000; Prielら、2004)。50mM 2MeSATP処理のみと比較すると、10mMイベルメクチンと共にA6単層の側底を5分間プレインキュベートすることによって、A6単層の2MeSATP誘導GtENaCに対して著しい増強作用が生じた(図10A)。比較的選択的なP2X4拮抗薬および特異的P2X7拮抗薬ブリリアントブルーG(BBG)(Jiangら、2000)を使用して、A6単層の2MeSATP誘導GtNaC変化に関与するP2Xサブタイプをさらに評価した(図10B)。ラットおよびヒトP2X4受容体を使用した、Jiangらによって公表された結果と同様に(Jiangら、2000)、A6単層を10mM BBGと共にプレインキュベートした場合、2MeSATP誘導アミロライド感受性Gt増大を完全には阻害せず、2MeSATPがΔGtENaCに及ぼす影響を著しく低下させた。
【０１３２】
図11は、2MeSATPに応答した個々のフルオ-4負荷A6細胞における、正規化された蛍光強度変化の2つのグラフを示す。P2Xファミリーは、その脱感作動態に相違があり、P2X4受容体は、ゆっくりと脱感作するものに分類されている(North、2002; Ralevicら、1998)。選択された8個のA6細胞での、2MeSATP誘導[Ca2+]iの上昇は、約1〜2分以内で基準レベルに戻る(図11A)。このゆっくりとした脱感作処理は、P2X4様受容体が関与している可能性があることも示している。他の実験では、100μMスラミンの添加は、予想した通り、10個の選択されたA6細胞において後続の50mM 2MeSATP誘起[Ca2+]i上昇を遮断しなかった(図11B)。それにも関わらず、スラミンの添加は一部のA6細胞で[Ca2+]i上昇を引き起こし(図11B)、結果は、培養されたラット腎尿細管細胞においてDockrellおよび共働者により見出された場合(Dockrellら、2001)と類似する。
【０１３３】
考察
P2X4受容体は、P2Xリガンドゲートイオンチャネルスーパーファミリーで最も広く行き渡ったメンバーである(Boら、2003、1995; North、2002)。P2X4受容体の活性化は、非選択的陽イオンチャネルの開放をもたらし、組換えP2X4受容体は、2MeSATPによって最も強力に活性化される(Boら、1995; Seguelaら、1996)。本発明者らの研究では、A6細胞単層の側底への2MeSATP添加によって、前進的細胞収縮および頂端膜突起がもたらされた。ATPγSおよびその他の生理学的刺激によって誘発された、類似する形態変化は、本発明者らの先の実験において、A6細胞のENaC活性に明らかに結び付けられていることが示された(Gorelikら、2005)。2MeSATP、ATPγS、およびCTPに対するA6単層のアミロライド感受性Gt変化によって決定される作動薬の効力順序は(2MeSATP≧ATPγ>CTP)、クローニングされたP2X4受容体の場合に類似した作動薬効力プロファイルを示すが、作動薬βγmeATPおよびαβmeATPに対しては、著しく高い感受性を有する。P2X4受容体で不活性でありまたは弱い作動薬であるべきβγmeATPおよびαβmeATPに対するA6細胞の著しい応答は(Boら、1995; North、2002; Ralevicら、1998)、その効果が現在知られているP2X受容体のいずれかを介したものであるか否かに関して、問題を提起している。P2X1またはP2X3受容体など、αβmeATPに対して感受性のあるサブタイプは、スラミンおよびPPADSに対して高い感受性を有しているので、関与する傾向にない。しかし、添加されたATP作動薬が細胞内シグナル伝達分子を模倣する能力は、ATP放出速度、エクト-ATPアーゼによる加水分解、およびエクトヌクレオチドジホスホキナーゼによるATP合成速度にも依存することが知られている(Josephら、2004)。βγmeATPやαβmeATPなどのメチレンATP類似体は、それらの名前が示唆するように、ATPのホスフェート部分同士のホスホジエステル結合において酸素の代わりに置換される、メチレン基を保有する。これにより、そのような類似体は、ヌクレオチドホスホヒドロラーゼによる加水分解侵襲に対して比較的耐性を有するようになるので、あるP2受容体の安定な作動薬として、およびエクト-ATPアーゼによって媒介されるATP分解のより有効な阻害剤として、使用されている(Josephら、2004)。50μM βγmeATPおよびαβmeATPをP2X作動薬として利用した場合、βγmeATPは、いくつかの細胞型において、αβmeATPよりも、エクト-ATPアーゼをより強力に阻害することができる(Josephら、2004)。さらに、両方のメチレンATP類似体は、細胞外ATP合成およびATP蓄積も2次的に引き起こし、P2X4受容体の最も強力な作動薬である(Josephら、2004)。βγmeATPは、アデノシン/P1受容体で、作動薬として直接働くことができることも明らかである(Ralevicら、1998)。これらの受容体は、A6細胞におけるNa+輸送のプリン作動性調節にも関わることが実証されている(Gorelikら、2005; Maら、1996)。
【０１３４】
A6細胞におけるATP誘起ナトリウム輸送の、いくつかの別の異なる特徴は、P2X4様受容体の活性化からもたらされると結論付けることが可能である。第1は、イベルメクチンによる増強と、スラミンまたはPPADSによる任意の遮断の欠如である(Buellら、1996; North、2002)。A6単層の側底を10mMイベルメクチンと共にプレインキュベートすると、A6細胞における2MeSATP媒介ナトリウム輸送に著しい増強作用が生じた。スラミン(100μM)もPPADS(100μM)もATPγS(Gorelikら、2005)または2MeSATP媒介ナトリウム輸送を阻害せず、マウスP2X4受容体でのTownsend-Nicholsonら(Townsent-Nicholsonら、1999)の観察内容と同様に、2MeSATP誘起ナトリウム輸送は、A6細胞においてPPADSおよびスラミンによって実際に増強される。P2X4は、受容体中にリジン残基が存在しないので、従来の拮抗薬スラミンおよびPPADSに対して比較的非感受性である(Buellら、1996)。さらに、スラミンに対するプリン作動性受容体の非感受性は、ATPを崩壊させるエクト-ATPアーゼの阻害に起因することが示唆されている(Crackら、1994)。ここで本発明者らは、P2受容体に対するATP効果を増強することができる特定の証拠として、スラミンが[Ca2+]iの上昇も誘導できることも実証した。
【０１３５】
本発明者らの研究では、Ca2+は何の影響も及ぼさず、Zn2+は、2MeSATP応答を再び増強させ、P2X4受容体が関与することを示していた。A6単層を、比較的選択的なP2X4拮抗薬および特異的P2X7拮抗薬、BBGと共にプレインキュベートした場合、2MeSATP誘導電導率の上昇を完全には阻害せず、ナトリウム電導率に対する2MeSATPの影響を著しく低下させたが、これは、P2X4様受容体の関与も示唆している。さらに、A6細胞における2MeSATP誘導[Ca2+]i上昇の脱感作動態も、P2X4受容体のゆっくりとした不活性化に従っている。異種発現したP2X受容体の機能特性の研究は、天然組織におけるその分布の試験と共に、P2X受容体がホモおよびヘテロマルチマーとしてインビボで生ずる傾向があることを示唆している(Mackenzieら、1999; North、2002)。P2X4は、P2X6受容体と天然組織中でしばしば一緒に見出され、かつ免疫共沈殿することができるので、P2X4はP2X6受容体とヘテロ重合し得るといういくつかの証拠がある(Northら、2000)。機能的に発現したホモマーP2X6受容体は、PPADSに対して感受性があり、スラミンに対しては比較的非感受性であり、αβmeATP感受性をヘテロマーP2X4/6受容体に関与させることができる(Jonesら、2004; Khakhら、1999)。
【０１３６】
しかし、それらのヘテロマーP2X4/6受容体は、スラミンおよびPPADSよりも高い感受性を有することが実証されており(Leら、1998)、したがって、これらのホモマーP2X6およびヘテロマーP2X4/6受容体は、本発明者らの研究においてA6細胞がスラミンおよびPPASに対して非感受性であるので、関与している可能性が低い。しかしP2X4/5ヘテロマーも形成することができ(Torresら、1999)、3つのサブタイプP2X4/5/6の全ては、新規な表現型を形成するために結合し得ることが、さらに可能である。本発明者らは、広く行き渡ったP2X4サブユニットが基本的なサブユニットとして働いて、おそらくは遠位ネフロンにおいてその他のP2およびP1サブユニットとの新規なヘテロマーを形成する可能性を、排除することができない。
【０１３７】
UnwinおよびBurnstockのグループは、P2X4およびP2X6受容体のみが、ラット遠位尿細管上皮の側底膜上に存在することを見出した(Turnerら、2003)。カエル遠位尿細管から得られたA6上皮細胞系内にP2X4様受容体が存在していることを、本発明者らの結果が示しているという事実は、それらの知見に一致したものである。腎上皮細胞からのATP放出が、アルドステロンの作用メカニズムにおいて極めて重要な役割を演ずることを示している本発明者らの結果を考えると(Gorelikら、2005)、これらのプリン作動性受容体の正確な位置は、それらの塩および水のバランスの調節における可能性ある役割により、興味あるものである。本発明者らは、ナトリウム再吸収が、遠位ネフロンの尿細管側底に沿ったP2X4受容体の活性化によって刺激を受け、問題となっているこれら受容体の取扱いは、アルドステロンが過剰な状態でまたはミネラルコルチコイドに対する腎応答性が高められた状態で行われることを示唆している。より良好な作動薬および拮抗薬が、天然P2X4受容体の生理を調査するのに必要であり、これらの結果は、新しい治療手段を指し示すことができる。
【０１３８】
まとめると、本発明者らは、A6細胞側底膜でのP2X4様受容体の存在を示した。側底P2受容体はNa+輸送を促進させ、Na+輸送の頂端P2受容体媒介性阻害に関して十分裏付けられた証拠があることが実証されている(Cuffeら、2000; Leipziger、2003; Shirleyら、2005; Wildmanら、2005)。多数のATP放出メカニズムの複雑さ、およびネフロンに沿って所与の腎上皮細胞によって発現された多数のタイプのP2受容体についても、記述されている(Baileyら、2000; Bucheimerら、2004; Burnstock、2006; Inserら、2001; Schwiebertら、2003; Turnerら、2003)。これは、Na+輸送の制御のために側底および頂端部位の両方で作用する、洗練された相互プリン作動系を示唆している。そのような系は、腎尿細管機能のオートクリンおよび/またはパラクリン調節のために、ATPの側底または頂端放出をもたらす細胞内のメカニズムを必要とする可能性がある。
【０１３９】
(実施例2)
好ましい医薬品製剤と投与形態および用量
本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、注射可能な持続放出薬物送達システムを使用して送達することができる。これらは、注射回数がすくなくなるように特に設計される。そのようなシステムの例は、一旦注射したら長時間にわたってゆっくりとrhGHを放出する、生分解性微小球内に組換えヒト成長ホルモン(rhGH)がカプセル封入されているNutropin Depotである。
【０１４０】
本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、必要な部位に直接薬物を放出する、外科的に埋め込まれた用具によって、投与することができる。例えばVitrasertは、CMV網膜炎を治療するために、眼に直接ガンシクロビルを放出する。疾患部位へのこの毒物の直接施用は、薬物の著しい全身性副作用なしで、有効な両方を実現する。
【０１４１】
電気穿孔療法(EPT)システムも、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤を投与するのに用いることができる。パルス電場を細胞に送達する用具は、薬物に対する細胞膜の透過性を増大させ、その結果、細胞内薬物送達が著しく高められる。
【０１４２】
本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、エレクトロインコーポレーション(EI)によって送達することもできる。EIは、皮膚表面の直径30ミクロンまでの小さい粒子が、電気穿孔法で使用されたものと同一のまたは類似した電気パルスを受けたときに生ずる。EIでは、これらの粒子は、角質層を通ってより深い皮膚層へと追いやられる。粒子には、薬物または遺伝子を添加しまたはコーティングすることができ、あるいは粒子は単に、薬物が進入することができる皮膚に孔を発生させる「弾丸」として働くことができる。
【０１４３】
本発明の核酸、分子、および医薬品製剤を送達する代替方法は、熱感受性であるReGel注射システムである。体温よりも低い場合、ReGelは注射液であるのに対し、体温では、ReGelは、知られている安全な生分解性ポリマーを侵食し、その内部に溶解する、ゲルリザーバを即座に形成する。
【０１４４】
本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、経口的に送達することもできる。このプロセスは、タンパク質およびペプチドを同時送達するために、体内におけるビタミンB12の経口摂取の天然プロセスを用いる。ビタミンB12摂取システムによって、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、腸壁内を移動することができる。錯体が、ビタミンB12類似体と、この錯体のビタミンB12部分中の内性因子(IF)に対する著しい親和性およびこの錯体の活性物質の著しい生物活性の両方を保持する薬物との間で合成される。
【０１４５】
本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、「Trojanペプチド」によって細胞に導入することができる。これらは、転座特性を有しかつ原形質膜の端から端まで親水性化合物を運ぶことが可能な、ペネトラチンと呼ばれるポリペプチドの種類である。この系によって、オリゴペプチドを細胞質および核に直接仕向けることが可能になり、非細胞型特異的および非常に効率的にすることができる。Derossiら(1998)参照。
【０１４６】
好ましくは、本発明の医薬品製剤は、日用量または単位、日低用量またはその適切な割合の活性成分を含有する単位製剤である。
【０１４７】
本発明の核酸、分子、医薬品製剤は、通常、経口的にまたは任意の非経口経路によって、活性成分を含む医薬品製剤の形で、任意選択で無毒性の有機または無機の酸または塩基、付加塩の形で、医薬品として許容される剤形で投与されることになる。治療がなされる障害および患者、並びに投与経路に応じて、この組成物を様々な用量で投与することができる。
【０１４８】
ヒトの治療では、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤を単独で投与することができるが、一般には、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択された、適切な医薬品賦形剤、希釈剤、または担体との混合物として投与されることになる。
【０１４９】
例えば、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、即時、遅延、または制御放出施用を目的に、香料または着色料を含有してもよい錠剤、カプセル、腔座薬、エリキシル、溶液、または懸濁液の形で、経口、頬側、または舌下から投与することができる。本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、海綿体内注射を介して投与してもよい。
【０１５０】
そのような錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第2リン酸カルシウム、およびグリシンなどの賦形剤、デンプン(好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、およびある複合ケイ酸塩などの崩壊剤、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシ-プロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチン、およびアカシアなどの顆粒化結合剤を含有してもよい。あるいは、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、およびタルクなどの潤滑剤を含めてもよい。
【０１５１】
類似のタイプの固体組成物を、ゼラチンカプセルの充填剤として用いてもよい。これに関する好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および/またはエリキシルの場合、本発明の組成物を、様々な甘味料または香料、着色物質または染料、乳化剤および/または懸濁剤、水やエタノール、プロピレングリコール、グリコエリンなどの希釈剤、およびこれらの組合せと組み合わせてもよい。
【０１５２】
本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、非経口的に、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、または皮下から投与することもでき、あるいは、輸液技法によって投与してもよい。これらは、その他の物質、例えば血液と浸透圧が等しい溶液を作製するのに十分な塩またはグルコースを含有してもよい、滅菌水溶液の形で最も良く使用される。水溶液は、必要ならば、適切に緩衝させるべきである(pH3から9)。滅菌条件下で適切な非経口製剤は、当業者に周知の標準的な製薬技法によって、容易に実現される。
【０１５３】
非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤の浸透圧を意図されるレシピエントの血液と等しくする溶質を含有することができる水性および非水性滅菌注射液; 懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または多回用量容器内、例えば密封したアンプルおよびバイアル内に存在させてもよく、使用直前に、滅菌液体担体、例えば注射用の水の添加のみ必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存してもよい。即時注射液および懸濁液は、先に述べた種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
【０１５４】
ヒト患者への経口および非経口投与の場合、本発明の化合物の日用量レベルは、通常、単回または分割用量で投与されることになる。
【０１５５】
したがって、例えば本発明の化合物の錠剤またはカプセルは、必要に応じて一度に1個または2個以上投与するための活性化合物を含有してもよい。医師は、いずれにしても、任意の個々の患者に最も適切になる実際の投薬量を決定することになり、またその投薬量は、特定の患者の年齢、体重、および応答に応じて変わることになる。上記投薬量は平均的事例の例示である。当然ながら、より高くまたはより低い投薬量範囲がメリットをを与える個々の場合が存在し得るものであり、そのような場合も本発明の範囲内である。
【０１５６】
本発明の核酸および分子および医薬品製剤は、鼻内からまたは吸入によって投与することもでき、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134A3)や1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EA3)などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、またはその他の適切な気体を用いた、加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーからの、乾燥粉末吸入器またはエアロゾルスプレーを呈示する形で都合良く送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するための弁を設けることによって、決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーは、潤滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンを追加として含有することができる、例えば溶媒としてエタノールおよび噴射剤の混合物を使用して、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよい。吸入器または気体吸入器で使用されるカプセルおよびカートリッジ(例えばゼラチン製)は、本発明の化合物およびラクトースやデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を含有するように、配合することができる。
【０１５７】
エアロゾルまたは粉末製剤は、それぞれ計量された用量または「パフ」が、患者に送達するための本発明の化合物の有効量を含有するように、準備することが好ましい。エアロゾルに関する全日用量は、患者ごとに異なることになり、1日当たり単回用量でまたはより一般的には分割用量で投与できることが理解されよう。
【０１５８】
あるいは、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、坐薬またはペッサリーの形で投与することができ、またはローション、溶液、クリーム、軟膏、もしくは粉剤の形で局所的に施用してもよい。本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、例えば皮膚パッチの使用によって、経皮的に投与してもよい。これらは、特に眼の疾患を治療するために、眼内経路によって投与してもよい。
【０１５９】
眼科的用途では、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤を、等張性がありpH調節がなされた滅菌生理食塩液に懸濁させた微粒化懸濁液として、または好ましくは、等張性がありpH調節がなされた滅菌生理食塩液に溶かした溶液として、これらを任意選択で塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組み合わせた状態で、配合することができる。あるいは、ワセリンなどの軟膏に配合してもよい。
【０１６０】
皮膚への局所的な施用では、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、例えば下記の物質: 鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水の1種または複数との混合物中に、懸濁しまたは溶解した活性化合物を含有する、適切な軟膏として配合することができる。あるいは、例えば下記の物質: 鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水の1種または複数の混合物中に懸濁しまたは溶解した、適切なローションまたはクリームとして配合することができる。
【０１６１】
口内の局所投与に適した製剤には、着香ベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むトローチ; ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性ベース中に活性成分を含む香錠; 適切な液体担体中に活性成分を含むマウスウォッシュが含まれる。
【０１６２】
一般に、ヒトにおける本発明の核酸、分子、および医薬品製剤の経口または非経口投与は、好ましい経路であり、最も好都合である。
【０１６３】
獣医学的用途では、本発明の核酸、分子、および医薬品製剤は、通常の獣医学的診療に従って、適切に許容される製剤として投与され、獣医は、特定の動物に最も適切になる投与計画および投与経路を決定することになる。
【０１６４】
製剤は、医薬品製剤であることが好都合である。
【０１６５】
製剤は、獣医用製剤であることが有利である。
【０１６６】
(実施例3)
例示的な医薬品製剤
本発明の化合物は、単独で投与することが可能であるが、1種または複数の許容される担体と共に医薬品製剤として存在させることが好ましい。担体は、本発明の化合物に対して適合性があり、そのレシピエントに有害ではないという意味で、「許容され」なければならない。典型的には、担体は、滅菌されかつ発熱物質を含まない、水または生理食塩液になる。
【０１６７】
下記の実施例は、活性成分が本発明の化合物である、本発明による医薬品製剤を例示する。
【０１６８】
(実施例A)
【表１】
2009511457.tif 000003
【０１６９】
錠剤は、湿式顆粒化とその後の圧縮によって、前述の成分から調製される。
【０１７０】
(実施例B)
【表２】
2009511457.tif 000004
【０１７１】
(実施例C)
錠剤の配合
下記の製剤AおよびBは、ポビドンの溶液との成分の湿式顆粒化と、その後のステアリン酸マグネシウムの添加および圧縮によって調製される。
【０１７２】
【表３】
2009511457.tif 000005
【０１７３】
【表４】
2009511457.tif 000006
【０１７４】
【表５】
2009511457.tif 000007
【０１７５】
下記の製剤DおよびEは、混合成分の直接圧縮によって調製される。製剤Eで使用されるラクトースは、直接圧縮タイプのものである。
【０１７６】
【表６】
2009511457.tif 000008
【０１７７】
【表７】
2009511457.tif 000009
【０１７８】
製剤F(制御放出製剤)
製剤は、ポビドンの溶液との成分(下記)の湿式顆粒化と、その後のステアリン酸マグネシウムの添加および圧縮によって調製される。
【０１７９】
【表８】
2009511457.tif 000010
【０１８０】
薬物放出は、約6〜8時間にわたって生じ、12時間後に終了した。
【０１８１】
(実施例D)
カプセル製剤
製剤A
カプセル製剤は、上記実施例Cの製剤Dの成分を混合し、2部型硬質ゼラチンカプセル内に充填することによって調製される。製剤B(下記)は、類似の手法で調製される。
【０１８２】
【表９】
2009511457.tif 000011
【０１８３】
【表１０】
2009511457.tif 000012
【０１８４】
カプセルは、Macrogol 4000 BPを融解し、その融解物に活性成分を分散し、その融解物を2部型硬質ゼラチンカプセルに充填することにより、調製される。
【０１８５】
【表１１】
2009511457.tif 000013
【０１８６】
カプセルは、活性成分をレシチンおよび落花生油中に分散し、その分散液を、軟質の弾性ゼラチンカプセルに充填することによって、調製される。
【０１８７】
製剤E(制御放出カプセル)
下記の制御放出カプセル製剤は、押出し機を使用して成分a、b、およびcを押し出し、その後、押出し物を球状化することによって調製される。次いで乾燥したペレットを、放出制御膜(d)でコーティングし、2部型硬質ゼラチンカプセル内に充填する。
【表１２】
2009511457.tif 000014
【０１８８】
(実施例E)
【表１３】
2009511457.tif 000015
【０１８９】
活性成分をリン酸緩衝液(35〜40℃)のほとんどに溶解し、次いで体積が得られるまで調節し、滅菌ミクロポアフィルタに通して、滅菌した10mlアンバーガラスバイアル(タイプ1)内に濾過し、滅菌したクロージャおよびオーバーシールで密封する。
【０１９０】
(実施例F)
【表１４】
2009511457.tif 000016
【０１９１】
活性成分を、グリコフロールに溶解する。次いでベンジルアルコールを添加し、溶解し、水を添加して3mlにする。次いで混合物を、滅菌ミクロポアフィルタに通して濾過し、滅菌した3mlガラスバイアル(タイプ1)中に密封する。
【０１９２】
(実施例G)
【表１５】
2009511457.tif 000017
【０１９３】
安息香酸ナトリウムを、精製水の一部に溶解し、ソルビトール溶液を添加する。活性成分を添加し、分散させる。グリセロール中には増粘剤を分散させる(分散性セルロース)。2種の分散液を混合し、精製水を用いて、必要とされる体積が得られるまで調節する。さらなる濃密化は、懸濁液にさらに剪断力をかけることによって、必要に応じて実現される。
【０１９４】
(実施例H)
【表１６】
2009511457.tif 000018
【０１９５】
Witepsol H15の5分の1を、最高45℃の水蒸気ジャケット付きパン内で融解する。活性成分を、200μmの篩に通して移動させ、滑らかな分散液が実現されるまで、カッティングヘッドを備えたsilversonを使用して、混合しながら融解ベースに添加する。この混合物を45℃で維持しながら、残りのWitepsol H15を懸濁液に添加し、均質な混合物が確実に得られるまで撹拌する。懸濁液全体を、250μmステンレス鋼スクリーンに通し、連続的に撹拌しながら40℃に冷却させる。38℃から40℃の温度で、混合物2.02gを適切なプラスチックモールド内に充填する。坐薬を室温に冷却させる。
【０１９６】
(実施例I)
【表１７】
2009511457.tif 000019
【０１９７】
上記成分を直接混合し、得られた混合物の直接圧縮によってペッサリーを調製する。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】（Ａ）SICMセットアップの概略図である。膜フィルタインサで成長させたA6単層が、フィードバック&スキャン制御システムによって制御される3Dピエゾスキャナ上に取り付けられている。調節されたガラスナノピペットが、単層の頂端側をスキャンし、細胞膜の組織分布画像を得る。（Ｂ）膜フィルタインサート上で培養された、生きているA6細胞のSICM画像である。（Ｃ）膜フィルタインサート上で培養された、固定されたA6細胞単層のSEM画像である。
【図２】（Ａ）浸透ストレスおよびアルドステロンが、A6細胞単層の経上皮電導率(Gt)および組織分布に及ぼす影響を示す図である。側底低浸透ストレスが、A6細胞単層のアミロライド感受性GtENaCに及ぼす、典型的な時間依存性効果を示す図である。（Ｂ）浸透ストレスおよびアルドステロンが、A6細胞単層の経上皮電導率(Gt)および組織分布に及ぼす影響を示す図である。側底低浸透ストレスの前(対照)および1時間後(+Hypo)にスキャンされた、膜フィルタ上で培養されたA6細胞単層の選択領域のSICM画像である。（Ｃ）浸透ストレスおよびアルドステロンが、A6細胞単層の経上皮電導率(Gt)および組織分布に及ぼす影響を示す図である。アルドステロンが、A6細胞単層のGtに及ぼす典型的な時間依存性効果を示す図である。（Ｄ）浸透ストレスおよびアルドステロンが、A6細胞単層の経上皮電導率(Gt)および組織分布に及ぼす影響を示す図である。アルドステロン刺激の前(対照)および2時間後(+アルドステロン)にスキャンされた、膜フィルタ上で培養されたA6細胞単層の選択領域のSICM画像である。
【図３】（Ａ）アルドステロン誘導細胞収縮およびナトリウム輸送を示す図である。アルドステロン刺激中に、15分間隔で別々に行われた連続画像形成の2回の逐次スキャンから得られた細胞収縮(細胞1、2、および3を観察する)を示す、A6細胞単層の組織分布画像である。（Ｂ）アルドステロン誘導細胞収縮およびナトリウム輸送を示す図である。アルドステロン(●)(n=8)、アルドステロンおよびアミロライド(W)(n=5)、アルドステロンおよびLY-294002(X)(n=7)、および低浸透ストレス(Y)(n=7)、またはいかなる刺激もない場合(○)(n=5)が、収縮したA6細胞のパーセンテージに及ぼす影響を示す図である。全てのデータは、平均値±S.E.として表した。（ＣおよびＤ）アルドステロン誘導細胞収縮およびナトリウム輸送を示す図である。アルドステロン刺激中の、収縮A6細胞(下部パネル)および非収縮A6細胞(上部パネル)からの、細胞接着構造におけるENaCのスマートパッチクランプ記録である。この記録の左側の画像は、パッチされた細胞の形態を示す。（Ｅ）アルドステロン誘導細胞収縮およびナトリウム輸送を示す図である。アルドステロン刺激中の、非収縮(上部)および収縮(下部)A6細胞の頂端膜の微細構造を示す、高解像SICM画像である。（Ｆ）アルドステロン誘導細胞収縮およびナトリウム輸送を示す図である。アルドステロン誘導細胞収縮およびENaC活性化の、概略的モデルである。収縮A6細胞(下部)の頂端膜を持ち上げ、おそらくはENaCが活性化される。非収縮細胞(上部)では、頂端膜の典型的な微絨毛構造が維持され、ENaC活性化は無い。
【図４】（Ａ）アルドステロンはATP放出を誘発し、A6細胞の形態を変化させる。アルドステロン(n=8)および側底低浸透ストレス(n=7)が、A6細胞単層のアミロライド感受性経上皮電導率(GtENaC)に及ぼす影響を示す図である。全てのデータは、実験の平均(平均±S.E.)として表した。アスタリスクは、対応ステューデントt検定に基づいた、対照とは統計的に異なる値を示す(*P<0.05; **P<0.005)。（Ｂ）アルドステロンはATP放出を誘発し、A6細胞の形態を変化させる。アルドステロン刺激(n=7)および側底低浸透ストレス(n=5)中の、A6細胞単層からのATP放出(RATP)の速度を示す図である。全てのデータは、実験の平均(平均±S.E.)として表した。アスタリスクは、対応ステューデントt検定に基づいた、対照とは統計的に異なる値を示す(*P<0.05; **P<0.005)。（Ｃ）アルドステロンはATP放出を誘発し、A6細胞の形態を変化させる。側底ATPγSが、A6細胞の組織分布に及ぼす影響を示す図である。ATPγSによる刺激の前(対照)および後(+ATP)の、生きているA6細胞単層の選択領域に関する2つのSICM組織分布画像である。（Ｄ）アルドステロンはATP放出を誘発し、A6細胞の形態を変化させる。ATPγSが、A6細胞単層の経上皮電導率(Gt)に及ぼす影響を示す図である。50μM ATPγSを側底に添加した。図の底部の太線は、A6細胞単層の頂端側へのアミロイドの適用を示す。（Ｅ）アルドステロンはATP放出を誘発し、A6細胞の形態を変化させる。ヘキソキナーゼが、A6細胞単層のアルドステロン誘導Gtに及ぼす影響を示す図である。アルドステロン、ヘキソキナーゼ、およびグルコースを一緒に、矢印が付された時間で側底区画に添加し、90分後にヘキソキナーゼを除去した。図の底部の太線は、A6細胞単層の頂端側へのアミロイドの適用を示す。（Ｆ）アルドステロンはATP放出を誘発し、A6細胞の形態を変化させる。ヘキソキナーゼおよびグルコースを、矢印(上部グラフ)が付された時間に、アルドステロン刺激A6細胞単層の側底区画に添加した。100nM DPCPX、P1受容体拮抗薬を、矢印(下部グラフ)が付された時間に、アルドステロン刺激A6細胞単層の側底区画に添加した。図の底部の太線は、A6細胞単層の頂端側へのアミロイドの適用を示す。
【図５】上皮細胞におけるナトリウム輸送および細胞収縮の、アルドステロン刺激のモデルを示す図である。
【図６】（Ａ）側底2MeSATP応答した、A6細胞形態の変化を示す図である。側底50mM 2MeSATPに曝されたA6細胞単層の、選択された40mm×40mm領域の時間差系列(スキャンとスキャンの間には、18分の時間の空白がある)SICMスキャンで選択された、6つの画像である。フレーム上にマークされた時間は、時間:分を表す。（Ｂ）側底2MeSATP応答した、A6細胞形態の変化を示す図である。(A)フレーム0:00でアスタリスクが付された、選択されたA6細胞の、典型的な形態的変化(フレーム0:18から1:12)を示す図である。(A)フレーム0:18(上部トレース)およびフレーム1:12(下部トレース)でアスタリスクが付された細胞の、密着結合接合「a」および「b」を横断する、波線に沿ったスキャンを表す組織分布プロファイルを示す図である。
【図７】側底2MeSATPが、A6細胞単層の経上皮電導率(Gt)に及ぼす影響を示す図である。50mM 2MeSATPの側底添加がA6単層のGt増加に及ぼす、典型的な時間依存性効果である。Gtの増加の大部分は、アミロライド感受性であった。2MeSATPを、トレース上方の実線によって示される期間中添加した。図の底部の太線は、A6細胞単層の頂端側へのアミロライドの適用を示す。
【図８】様々なP2X作動薬(50mM)が、A6単層のアミロライド感受性Gt変化に及ぼす影響を示すグラフである。対照と比較すると、2MeSATP、ATPγS、βγmeATP、αβmeATP、およびCTPを含めた選択されたP2X作動薬の側底添加は全て、細胞単層のアミロライド感受性GtENaC変化を著しく増大させた。2MeSATPは、これらの選択された作動薬の中で、最も強力な作動薬であった。A6単層のΔGtENaCの全てのP2X作動薬誘導変化を、対照実験で正規化した。カラムおよびバーは、平均±SEMを表す。*P<0.01 vs. 対照、#P<0.05 vs. 2MeSATP。
【図９】Zn2+、スラミン、およびPPADSは、A6単層の2MeSATP誘発Gt変化に増強を誘発させた。A6細胞単層の側底区画への50mM 2MeSATPの添加によって、細胞単層のアミロライド感受性Gtが増大した。10mM ZnCl2を側底に添加することにより、2MeSATP誘導Gtの増大が増強した。100mMスラミンおよびPPADSは、A6単層のGtを低下させなかっただけではなく、Gtをさらに増大させた。2MeSATP、Zn2+、スラミン、およびPPADSは、トレース上方に記された実線により示される期間、添加した。図の底部の太線は、A6細胞単層の頂端側へのアミロイド添加を示す。
【図１０】（Ａ）イベルメクチンは、A6単層のΔGtENaCにおける2MeSATP誘導変化を増強させ、BBGは低下させた。50mM 2MeSATPのみによる処理と比較すると、10mMイベルメクチンによるA6単層の側底のプレインキュベーションは、A6単層のΔGt ENaCの2MeSATP誘導変化に対して、著しい増強作用があった。A6単層のΔGt ENaCの全ての変化を、対照実験により正規化した。カラムおよびバーは、平均±SEMを表す。*P<0.05 vs. 2MeSATP対照。（Ｂ）イベルメクチンは、A6単層のΔGtENaCにおける2MeSATP誘導変化を増強させ、BBGは低下させた。10mM BBGとの側底A6細胞のプレインキュベーションは、A6単層のΔGt ENaCの2MeSATP誘導増大を完全には阻害せず、ΔGt ENaCに対する2MeSATPの作用を著しく低下させた。A6単層のΔGt ENaCの全ての変化を、対照実験により正規化した。カラムおよびバーは、平均±SEMを表す。*P<0.05 vs. BBG対照、#P<0.001 vs. 2MeSATP。
【図１１】個々のフルオ-4負荷A6細胞の2MeSATPおよびスラミン添加によって誘発された、[Ca2+]iの増加。100μMスラミンが無い状態(A、n=8)および存在する状態(B、n=10)での、50μM 2MeSATPに応答する個々のA6細胞の正規化蛍光強度(F/F0)変化を示す、代表的な蛍光強度グラフである。異なる色のトレースのそれぞれは、異なる細胞からのものである。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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