(57)【要約】ＷＳＸ−１およびｐ２８（ＩＬ−３０）に関連する組成物および方法が提供される。特に、種々のＷＳＸ−１、ｐ２８、ＥＢＩ３、およびｇｐ１３０ポリペプチドおよび複合体またはそのような複合体に結合し、またはその活性を調節する部分を用いて哺乳動物患者において免疫疾患を治療する方法が記載される。可溶性ＷＳＸ−１またはｇｐ１３０ポリペプチドを含む単離または組換え複合体、単離または組換えＷＳＸ−１融合タンパク質、および単離または組換えｐ２８融合タンパク質も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体、またはその変異体を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物が抗炎症性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、ＩＬ−６および形質転換増殖因子βによって誘導されるナイーブＴ細胞からのＩＬ−１７細胞の発生を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、さらに一つまたは複数のＴ細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＣＤ２５の改変された発現、改変された増殖、または改変された生存を示す、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、さらに一つまたは複数のＢ細胞、肥満細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞、ｇｐ１３０を発現する細胞、またはＷＳＸ−１を発現する細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が形質転換増殖因子βを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
組換えまたは単離されたＷＳＸ−１融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が細胞特異的マーカーを認識する一つまたは複数のドメインを含み、または前記融合タンパク質がｐ２８またはＥＢＩ３に由来する一つまたは複数のポリペプチドドメインを含む、組換えまたは単離されたＷＳＸ−１融合タンパク質。
【請求項１０】
細胞特異的マーカーを認識する前記一つまたは複数のドメインが、細胞特異的マーカーを認識する一つまたは複数の抗体ドメインを含む、請求項９に記載の組換えまたは単離された融合タンパク質。
【請求項１１】
前記細胞特異的マーカーがＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、およびＮＫ１．１から選択される、請求項１０に記載の組換えまたは単離された融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項９の前記組換えまたは単離された融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１３】
前記核酸が、抗体ドメイン、Ｆｃ領域、ｐ２８ドメイン、またはＥＢＩ３ドメインから選択される一つまたは複数のポリペプチドドメインをコードする、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
組換えまたは単離されたｐ２８融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が一つまたは複数の抗体ドメインを含む、請求項１４に記載の組換えまたは単離された融合タンパク質。
【請求項１６】
前記抗体ドメインの少なくとも１つが細胞特異的マーカーを認識する、請求項１５に記載の組換えまたは単離された融合タンパク質。
【請求項１７】
前記細胞特異的マーカーがＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、およびＮＫ１．１から選択される、請求項１６に記載の組換えまたは単離された融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１４の前記組換えまたは単離された融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１９】
可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、または可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体に特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
前記抗体が前記ポリペプチドまたはポリペプド複合体の活性を増強させる、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
哺乳動物患者において炎症性疾患を治療する方法であって、前記患者に、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ｐ２８ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体、可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、ｐ２８ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ＥＢＩ３ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ＩＬ−２７および可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびｐ２８ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびＩＬ−２７、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびＥＢＩ３ポリペプチド、およびその変異体からなる群より選択される、単離されたまたは組換え部分を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記患者がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記炎症性疾患が、免疫異常、感染、癌、アレルギー、関節炎、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、ブドウ膜炎、乾癬、狼瘡、多発性硬化症、慢性感染性疾患、結核、強直性脊椎炎、移植片拒絶、サルコイドーシスおよび肝炎から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が前記投与に先立って炎症性疾患の前記患者を診断することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離されたまたは組換え部分が形質転換増殖因子βと組み合わせて前記患者に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物患者において炎症性疾患を治療する方法であって、前記患者にｇｐ１３０／ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体に特異的に結合し、または前記複合体の活性を調節する、または細胞中の前記複合体の形成を調節する部分を投与し、それにより前記疾患について前記患者を治療することを含む方法。
【請求項２７】
前記部分が、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、および活性調節因子から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症性疾患が、免疫異常、感染、癌、アレルギー、関節炎、喘息、炎症性腸疾患、クローン病、ブドウ膜炎、乾癬、狼瘡、多発性硬化症、慢性感染性疾患、結核、強直性脊椎炎、移植片拒絶、サルコイドーシスおよび肝炎から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、または可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体に結合し、またはその活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ．）前記ポリペプチドまたは複合体を含む生物学的または生化学試料を試験化合物と接触させることと、
（ｂ．）前記試験化合物の前記ポリペプチドまたは複合体への結合、または前記ポリペプチドまたは複合体の前記試験化合物による前記活性の調節を検出し、それにより前記ポリペプチドまたは複合体に結合し、またはその活性を調節する前記化合物を同定することと、
を含む方法。
【請求項３０】
前記化合物が前記ポリペプチドまたは複合体によるＴ細胞応答の阻害を増強し、ＩＬ−２またはＩＬ−１７に対するアンタゴニスト活性を増強し、またはＴ細胞の増殖、生存、もしくはＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＣＤ２５の発現を改変する、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、各々を全ての目的のために参照によりその全体を本明細書に組み込む、先の仮特許出願である２００６年７月１９日に出願されたＵＳＳＮ  ６０／８３２，２１３（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．Ｈｕｎｔｅｒ「ＷＳＸ−１／Ｐ２８  ＡＳ  Ａ  ＴＡＲＧＥＴ  ＦＯＲ  ＡＮＴＩ−ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＯＲＹ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ」）、および２００６年８月１１日に出願されたＵＳＳＮ  ６０／８３７，４５０（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．Ｈｕｎｔｅｒ「ＷＳＸ−１／Ｐ２８  ＡＳ  Ａ  ＴＡＲＧＥＴ  ＦＯＲ  ＡＮＴＩ−ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＯＲＹ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ」）の優先権および恩典を主張する非仮特許出願である。
【０００２】
連邦に補助された研究および開発下でなされた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの補助金番号ＡＩ４２３３４、ＡＩ４１１５８、および１−Ｔ３２−ＡＩ−０５５４２８下で政府の援助でなされた。政府は本発明に対してある種の権利を有することができる。
【０００３】
本発明は、前記種々のＷＳＸ−１、ｐ２８、ＥＢＩ３、およびｇｐ１３０ポリペプチドおよび複合体、もしくはそのような複合体と結合し、または活性を調節する部分を用いて、哺乳動物患者における炎症性疾患を治療する方法に関する。本発明はまた、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１またはｇｐ１３０  ポリペプチド、単離または組換えＷＳＸ−１融合タンパク質、および単離または組換えｐ２８融合タンパク質を含む、単離または組換え複合体に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの組換えサイトカインが種々の臨床的状況で用いられる。これらはインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を含む。これらのタンパク質は主として、免疫細胞の刺激体として用いられて、成長因子として作用させるため、または抗癌またはウイルスの応答を増強させる。免疫系を阻害するために少数のサイトカインはほとんど用いられておらず、例えば、Ｔ細胞機能に必要なアクセサリー細胞機能に間接的に働き、および特にクローン病および炎症性腸疾患を標的として開発されたＩＬ−１０、およびＴＧＦで阻害が試みられてきた。これらの成功は限定されたものであった。
【０００５】
ＩＬ−１２  ｐ４０のアンタゴニストが、クローン病の患者に臨床試験でテストされ、いくらかの成功を収めた。
【０００６】
ＩＬ−１５のアンタゴニストは、このサイトカインがこの病気の発生に関与したという観察結果に基づいて、関節炎について臨床試験中である。
【０００７】
前記ＩＬ−１受容体アンタゴニストは関節リウマチの患者を治療するために用いられる、市販されている製品である。これは、炎症促進性サイトカインＩＬ−１とその受容体との相互作用をブロックする製品である。
【０００８】
いくつかの会社が、関節リウマチの患者の治療で現在用いられるサイトカインＴＮＦ−αに特異的な抗体／アンタゴニストを開発した。この手法は炎症を妨げる内因性サイトカインの中和に依存する。同様な手法がＩＬ−１およびＩＬ−６に特異的な抗体で追求されてきた。１つの安全性の問題は、これらの治療がＴＢおよびトキソプラズマ症を含む日和見感染の発生に関連していることである。
【発明の概要】
【０００９】
ＷＳＸ−１は、ヘテロ二量体サイトカインＩＬ−２７に結合する、近年公表されたサイトカイン受容体である。本発明者らの研究は、このサイトカイン／受容体の組み合わせがＴ細胞介在炎症応答の負の調節に関与することを示唆した。Ｔ細胞活動亢進の抑制におけるＷＳＸ−１についての役割の同定は、Ｔ細胞介在炎症障害についての臨床的意味合いを有し、および免疫ベースの療法に対する新規標的を表す。本研究所の仕事は継続して、異なるＴ細胞応答におけるＩＬ−２７の阻害効果に焦点を当てており、本発明者らは、このサイトカイン受容体系の生物学における新しい識見を提供し、および抗炎症療法を開発するためにこの情報を用いる新しい方法を示唆したという、いくつかの観察結果をなした。
【００１０】
本発明者らの研究から、ＷＳＸ−１はＴ細胞応答に対して負の効果を有することは明らかである。ＩＬ−２７はＴｈ１およびＴｈ２応答、およびＴ細胞成長因子ＩＬ−２を産生するこれらの細胞の能力を阻害することができる。加えて、ＩＬ−２７は、主要な病理学的Ｔ細胞サブセットであると考えられる、新しいＴ細胞サブセット−Ｔ１７（ＩＬ−１７を産生するＴ細胞）を阻害する。融合タンパク質ＷＳＸ−１Ｆｃは、ＩＬ−２およびＩＦＮγのＴ細胞産生を阻害するＩＬ−２７の能力を増強させることができる。これは、この受容体の放出された異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）が、ＩＬ−２７またはその個々の成分がＴ細胞にシグナルを与えるのを容易とすることができることを意味する。これは、部分的には、ＩＬ−６活性に密接に関連するサイトカイン／受容体成分の生物学に基づく。この考えは、（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって供給され、ＩＬ−３０としても知られる）組換えｐ２８が、ＩＬ−２７程は効果的ではないが、ＩＬ−２およびＩＬ−１７の産生を拮抗することができるという観察結果によって裏付けられる。これらのデータは、単独の、修飾された、もしくはＷＳＸ−１を誘導するもう１つの分子または複合体の一部としてのｐ２８が、免疫系の細胞を変調する有用な治療手段を表すことを本発明者らに示唆する。同様に、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチドおよび複合体もまた有用な治療手段を表す。ＩＬ−２７はＷＳＸ−１およびｇｐ１３０双方を含む受容体複合体を介してシグナル伝達を行うことができるので、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよび複合体がさらなる有用な治療手段を表す。
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、実施形態の１つの一般的なクラスは、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体、またはその変異体を含む組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様において、組成物は抗炎症性である。組成物は任意で、例えば、組成物を患者に投与すべき実施形態において、薬学的に許容される賦形剤を含む。１つの実施形態において、組成物はＩＬ−６および形質転換増殖因子βによって誘導された、ナイーブＴ細胞からのＩＬ−１７細胞の発生を抑制する。
【００１３】
組成物は、一つまたは複数の細胞、例えば、一つまたは複数のＴ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞、もしくはｇｐ１３０またはＷＳＸ−１を発現する他の細胞を含むことができる。複合体は前記細胞の機能または活性に影響し得る。１つの実施形態において、組成物はＴ細胞を含み、および組成物はＴ細胞の機能または活性を改変する。例えば、Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＣＤ２５の発現の改変、増殖の改変、または生存の改変を呈することができる。組成物は任意で、形質転換増殖因子βを含む。
【００１４】
実施形態のもう１つの一般的なクラスは、組換えまたは単離されたＷＳＸ−１融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、例えば、前記融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、または前記融合タンパク質の内部に存在することができるＷＳＸ−１ポリペプチドを含む。ＷＳＸ−１ポリペプチドは、天然に存在するＷＳＸ−１（例えば、ヒトＷＳＸ−１）またはその変異体の細胞内ドメイン、またはそのサブ配列を含むことができる。
【００１５】
実施形態の１つのクラスにおいて、融合タンパク質は、細胞特異的マーカーを認識する一つまたは複数のドメイン、例えば、前記マーカーを認識する一つまたは複数の抗体ドメインを含む。例示的なマーカーは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、およびＮＫ１．１を含む。実施形態の１つのクラスにおいて、融合タンパク質はｐ２８またはＥＢＩ３に由来する一つまたは複数のポリペプチドドメインを含む。
【００１６】
実施形態のさらなる一般的なクラスは、組換えまたは単離されたｐ２８融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、例えば、前記融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、または前記融合タンパク質の内部に存在することができるｐ２８ポリペプチドを含む。前記ｐ２８ポリペプチドは天然に存在するｐ２８（例えば、ヒトｐ２８）またはその変異体に由来することができる。
【００１７】
前記融合タンパク質は、任意で、一つまたは複数の抗体ドメインを含む。例えば、前記融合タンパク質は細胞特異的マーカー、例えばＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、またはＮＫ１．１を認識する一つまたは複数の抗体ドメインを含むことができる。
【００１８】
ＷＳＸ−１およびｐ２８融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のもう１つの特徴である。例えば、実施形態の１つのクラスは、組換えまたは単離されたＷＳＸ−１融合タンパク質をコードする核酸を提供し、前記この融合タンパク質は、細胞特異的マーカーを認識する一つまたは複数のドメイン、またはｐ２８またはＥＢＩ３に由来する一つまたは複数のポリペプチドドメインを含む。前記核酸は任意で、抗体ドメイン、Ｆｃ領域、ｐ２８ドメイン、またはＥＢＩ３ドメインから選択される一つまたは複数のポリペプチドドメインをコードし、およびＷＳＸ−１ポリペプチドをコードする。実施形態のもう１つのクラスは、組換えまたは単離されたｐ２８融合タンパク質を含む核酸を提供する。
【００１９】
本発明のポリペプチドおよび複合体に結合する抗体もまた本発明の特徴である。従って、実施形態の１つのクラスは、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、または可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、任意で、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の活性を増強する。
【００２０】
本発明の１つの態様は、哺乳動物患者、例えば、ヒト患者の炎症性疾患を治療する方法を提供する。治療すべき例示的な炎症性疾患は、免疫異常（例えば、自己免疫病）；感染；多発性骨髄腫および骨髄性および他の白血病、ならびに腫瘍転移などの癌；アレルギー；関節炎；喘息；潰瘍性大腸炎またはクローン病などの炎症性腸疾患；ブドウ膜炎；乾癬；狼瘡；多発性硬化症；慢性感染症；結核；強直性脊椎炎；移植片拒絶；サルコイドーシス；肝炎；中枢神経系の炎症；後天性免疫不全症候群；急性膵炎；アジソン病；アルコール性肝硬変を含むアルコール誘導肝傷害；アルツハイマー病；無脊椎アテローム性動脈硬化症；喘息および他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫血管炎；自己免疫肝炎誘導肝傷害；胆汁性肝硬変；ＡＩＤＳ誘導悪液質を含む悪液質／食欲不振；慢性疲労症候群；クロストリジウム関連下痢を含むクロストリジウム関連病；鬱血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全、および冠動脈バイパスグラフトを含む冠動脈疾患および適応症；若年性発症１型、真性糖尿病、およびインスリン耐性を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎、および関連疾患；精巣上体炎；エリスロポエチン耐性；発熱；線維筋痛または無痛；糸球体腎炎；移植片対宿主病／移植片拒絶；グレーブス病；ギラン・バレー症候群；橋本病；溶血性貧血；出血性ショック；痛覚過敏；変形性関節炎、関節リウマチ、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群および反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎（例えば、川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘導関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎およびリウマチ性多発筋痛症および巨細胞性動脈炎を含む関節の炎症性疾患およびリウマチ病；例えば角膜移植に関連する炎症性眼病；例えば角膜移植に関連する炎症性眼病；炎症性腸疾患；脳虚血を含む虚血；川崎病；学習機能障害；肺疾患；ループス腎炎；多発性硬化症；重症筋無力症；筋疾患；神経炎症病；神経毒性；眼変性およびブドウ膜炎を含む眼疾患および症状；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；天疱瘡；歯周疾患；毛孔性紅色粃糠疹；早期陣痛；前立腺炎および関連疾患；乾癬および関連疾患；乾癬性関節炎；肺線維症；再灌流傷害；リウマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；強皮症；敗血症性ショック；放射線療法の副作用；シェーグレン症候群；睡眠障害；脊椎関節症；全身性エリテマトーデス；一過性顎関節病；甲状腺炎；組織移植または筋挫傷、捻挫、軟骨傷害、外傷および整形外科手術に起因する炎症性疾患；血管炎；ならびに筋挫傷、捻挫、軟骨傷害、外傷、整形外科手術、感染または他の疾患経過に起因する炎症性疾患を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
実施形態の１つのクラスにおいて、前記方法は、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ｐ２８ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体、可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、ｐ２８ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ＥＢＩ３ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ＩＬ−２７および可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびｐ２８ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびＩＬ−２７、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびＥＢＩ３ポリペプチド、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される、単離または組換え部分を患者に投与することを含む。組換えまたは単離ポリペプチドの組み合わせが投与される実施形態において（例えば、ｐ２８ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド）、ポリペプチドは複合体を形成することができるが複合体を形成する必要はなく、およびポリペプチドは同時投与または別々に投与することができる。前記方法は、任意で、前記投与に先立って炎症性疾患の患者を診断することを含む。単離または組換え部分は、任意で、第二の化合物、例えば、形質転換増殖因子βと組み合わせて患者に投与される。
【００２２】
実施形態のもう１つのクラスにおいて、前記本方法は、ｇｐ１３０／ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体に特異的に結合し、またはその活性を調節する、または細胞における複合体の形成を調節する部分を患者に投与し、それにより疾患について患者を治療することを含む。前記部分は、例えば、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、および活性調節因子であり得る。
【００２３】
もう１つの態様において、本発明は、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、または可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体に結合し、またはその活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。前記本方法において、ポリペプチドまたは複合体を含む生物学的または生化学試料を、試験化合物と接触させる。試験化合物のポリペプチドまたは複合体への結合または試験化合物によるポリペプチドまたは複合体の活性の調節が検出され、それによりポリペプチドまたは複合体に結合し、またはその活性を調節する化合物を同定する。化合物は、任意で、ポリペプチドまたは複合体によるＴ細胞応答の阻害を増強し、ＩＬ−２またはＩＬ−１７に対するアンタゴニスト活性を増強し、もしくはＴ細胞増殖、生存、またはＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＣＤ２５の発現を改変する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１のパネルＡおよびＢは、ＴＥの間の脳におけるＩＬ−２７の発現を示す。パネルＡは、ｅｂｉ３およびＩｌ２７（ｐ２８）ｍＲＮＡを検出するための、感染していないおよび慢性的に感染した（感染から３０日後）野生型（ＷＴ）  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳から単離された全細胞ＲＮＡについての定量的リアルタイムＰＣＲの結果の棒グラフを表す。パネルＢは、初期の野生型  Ｃ５７ＢＬ／６星状膠細胞培養から単離されたｅｂｉ３およびＩｌ２７ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲの結果の棒グラフを表す。１×１０６星状膠細胞をウェルあたりに平板培養し、１８時間刺激後、ＲＮＡを単離した。リアルタイムＰＣＲの結果は、Ａｃｔｂ（β−アクチン）のｍＲＮＡに対して規準化した。データは、２つの独立した実験の代表例である。ＮＤは「検出されず」を意味する。
【図２】図２のパネルＡ〜Ｈは、ＩＬ−２７が慢性ＴＥに対する耐性に必要であることを示す。パネルＡは、トキソプラズマ原虫（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）のＭｅ４９株由来の２０嚢胞で腹腔内感染させた後ＣＴＬＡ４−Ｉｇで処理したＩｌ２７ｒａ−／−（ｎ＝８）および野生型  Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝１０）マウスの生存を示す線グラフを示す。矢印は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ処理の日数を示す。パネルＢは、感染（矢印）から５日後に始めたスルファジアジン処理したＩｌ２７ｒａ−／−（ｎ＝１０）または野生型（ｎ＝１０）マウスの生存を示す線グラフを示す。処理は、２週間後に停止した。パネルＣは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇで処理したＩｌ２７ｒａ−／−マウスの、感染から１４日および３０日後の肝臓および肺の組織病理学的分析の写真を示す。パネルＤは、星状膠細胞特異的マーカーＧＦＡＰによる、感染から３０日後における慢性的に感染した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウスの脳における病理学分析についての写真を示す。パネルＥは、リアルタイム定量的ＰＣＲによって測定された、慢性的に感染した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウスの脳から単離された寄生虫ＤＮＡの棒グラフを示す。結果は、群当たり４〜５匹のマウスでの２回の実験の代表例である。パネルＦ〜Ｈは、ＳＴＡｇの存在下でインビトロにて再刺激した野生型またはＩｌ２７ｒａ−／−マウスから単離されたＢＭＮＣからのＮＯ（パネルＦ）、ＩＦＮ−γ（パネルＧ）、およびＩＬ−１２（パネルＨ）産生を示す棒グラフを表し、４８時間後に上清を収集し分析した。結果は、同様な結果およびＳＥＭを示すエラーバーを含む４つの独立した実験の代表例である。
【図３】図３のパネルＡ〜Ｅは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇がＩｌ２７ｒａ−／−マウスを救済し、脳における炎症を低下させることを示す。パネルＡは、４〜５匹の慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−および野生型マウスの群から収穫された全ＢＭＮＣの棒グラフを表す。結果は、３つの独立した実験の代表例である。パネルＢは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよび小膠細胞の棒グラフを表す。フローサイトメトリーによって測定した各ＢＭＮＣ調製物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよび小膠細胞の割合を用いて、各集団における細胞の合計数を計算した。棒はパネルＡのように着色する。結果は、４〜５匹のマウスの群での２つの独立した実験の代表例である。パネルＢは、２０個のＭｅ４９嚢胞で感染させ、感染から５日後からスルファジアジンで２週間処理し、４週間後からＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇を開始した、寄生虫複製の対照のＩｌ２７ｒａ−／−マウスの生存を示す線グラフを表す。データは、群当たり３匹のマウスでの、２つの独立した実験を表す。パネルＤは、脳におけるＣＤ４枯渇の成功を定量するため、単離ならびにＣＤ４およびＣＤ８について染色された、ＢＭＮＣまたは脾細胞のフローサイトメトリーを示す。パネルＥは、組織学のために感染から３５日後に採取された脳切片の写真を示す。＊は、Ｐ値≦０．０５を示す。
【図４】図４のパネルＡ〜Ｄは、ＩＬ−２７が、トキソプラズマ原虫で慢性的に感染したマウスの脳においてＩＬ−１７の産生を阻害することを示す。パネルＡは、慢性的に感染した、Ｉｌ２７ｒａ−／−および野生型マウスの脳におけるＩＬ−１７、ＩＬ−６およびＴＮＦのｍＲＮＡの、定量的リアルタイムＰＣＲの棒グラフを表す（感染から３０日後）。データは、２つの独立した実験の代表例である。パネルＢは、ＳＴＡｇの存在下でインビトロにて４８時間再刺激後、ＩＬ−１７、ＩＬ−６およびＴＮＦについて評価された野生型またはＩｌ２７ｒａ−／−マウスから単離されたＢＭＮＣの上清のＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフを表す。結果は、同様な結果およびＳＥＭを示すエラーバーを含む４つの独立した実験の代表例である。パネルＣは、野生型マウスから単離された後、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７またはＩＬ−２３およびＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＳＴＡｇで４８時間再刺激された、ＢＭＮＣの上清のＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフを表す。結果は、同様な結果を含む２つの独立した実験の代表例であり、エラーバーはＳＥＭを示す。パネルＤは、エクスビボにてＢＦＡの存在下、ＰＭＡおよびイオノマイシンで２時間刺激した後、ＩＬ−１７について細胞内染色した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウスのＢＭＮＣのフローサイトメトリーを示す。結果は、同様な結果を伴う２つの独立した実験の代表例である。ＮＤは「検出されず」を意味する。
【図５】図５のパネルＡ〜Ｃは、ＩＬ−２７がインビトロで生じたＴＨ−１７細胞によるＩＬ−１７の産生を阻害することを示す。パネルＡ〜Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離後、ＩＬ−２７（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）またはｐ２８（パネルＣ）の存在下または非存在下、ＴＨ−１７誘導条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化されたＣＤ４＋（パネルＡおよびＣ）およびＣＤ８＋（パネルＢおよびＣ）Ｔ細胞についてのフローサイトメトリーを示す。各々４日および３日間培養されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞内ＩＬ−１７（パネルＡ、Ｂ、およびＣ）、ＴＮＦ（パネルＡおよびＢ）またはＩＦＮ−γ（パネルＣ）について染色する前に４時間、ＢＦＡの存在下でＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激した。プロットは、特定された場合、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞について開放（ｇａｔｅ）され、象限における数は各々における細胞の頻度を表す。データは３つの独立した実験の代表例である。
【図６】図６のパネルＡ〜Ｆは、ＩＬ−２７が介在したＴ細胞によるＩＬ−１７産生阻害がＳＯＣＳ３から独立していることを示す。パネルＡおよびＢは、ＩＬ−１７産生のための抗ＩＬ−６抗体の存在または非存在下、ＩＬ−２７濃度を増大させて、ＴＨ−１７誘導条件下で成長したＣ５７ＢＬ／６マウスから単離された、ＣＤ４＋Ｔ細胞の上清の、ＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフを示す。パネルＣは、ＩＬ−６での刺激（５分、６０分または２４時間）後に細胞内Ｐ−ＳＴＡＴ３について染色されたｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆマウスまたは野生型同腹子対照から精製された、ＣＤ４＋Ｔ細胞についてのフローサイトメトリーを示す。パネルＤは、ｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆマウスまたは野生型同腹子対照から単離された後、細胞内ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γについての染色に４日先立って、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ−１７誘導条件下で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。パネルＥは、ＩＬ−１７産生を増大させるＩＬ−２７量の増加の条件下、ＴＨ−１７誘導条件下で成長させたｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆまたは野生型同腹子対照からの、ＣＤ４＋Ｔ細胞上清のＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフを表す。パネルＦは、細胞内ＩＬ−１７についての染色前に、ＩＬ−２７の存在下または非存在下でＩＬ−１７の産生を誘導するように活性化されたＣｒｅＭＭＴＶＳｏｃｓ３ｆｌ／ｆｌマウスから単離されたＳｏｃ３−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。プロットはＣＤ４＋Ｔ細胞について開放され、象限における数は各々における頻度を表す。データは３つの独立した実験の代表例である。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図７】図７のパネルＡ〜Ｂは、Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生のＩＬ−２７介在阻害がＳＴＡＴ１に依存するが、Ｔ−ｂｅｔには依存しないことを示す。パネルＡは、ＣＤ５７ＢＬ／６、ＳｔａｔＩ−／−、またはＴｂｘ２ｌ−／−マウスから単離後、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ−１７誘導条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化され、次いで細胞内ＩＬ−１７およびＴＮＦについて染色されたＣＤ４＋Ｔ細胞についてのフローサイトメトリーを示す。データは３つの独立した実験を示す。パネルＢは、トキソプラズマ原虫Ｍｅ４９株由来の２０個の嚢胞による腹腔内感染から７日後にＣ５７ＢＬ／６（ｎ＝３）またはＳｔａｔ１−／−（ｎ＝３）マウスから単離後、ＩＬ−１７産生についてＳＴＡｇの存在下または非存在下で４８時間再刺激された脾細胞の上清についてのＥＬＩＳＡアッセイの棒グラフを表す。プロットはＣＤ４＋Ｔ細胞について開放され、象限における数字は各々における頻度を表す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図８】慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−および野生型マウスの脳から単離されたＴ細胞が活性化された表現型を呈することを示すフローサイトメトリーデータを表す。ＢＭＮＣは慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−および野生型マウスから単離された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化マーカーＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌについて染色された。プロットは、示された場合、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞について開放される。データは、３つの独立した実験の代表例である。
【図９】ＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激なしで、ＩＬ−２７がＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生を阻害することを示すフローサイトメトリーデータを表す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、非分極条件（抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−４）下において、α−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８で活性化した。単独またはＩＬ−６またはＩＬ−６、ＩＬ−１−β、ＴＮＦと組み合わせたＴＧＦ−βを用いて、ＩＬ−２７の存在下または非存在下でＴＨ−１７細胞を生じさせた。４日目に、細胞をＰＭＡおよびイオノマイシン刺激なしで、細胞内ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γについて染色した。プロットはＣＤ４＋Ｔ細胞について開放され、象限中の数は各々における細胞の頻度を表す。データは２つの独立した実験の代表例である。
【図１０】Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生のＩＬ−２７阻害がＳＯＣＳ３から独立していることを示すフローサイトメトリーデータを表す。ｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆマウスまたは野生型同腹子対照からのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ−１７誘導条件下で成長させた。しかしながら、本実験においては、細胞内ＩＬ−１７およびＴＮＦについての染色から４日目に先立ち、Ｔ細胞をＰＭＡおよびイオノマイシン＋ＢＦＡで４時間刺激した。プロットはＣＤ４＋Ｔ細胞について開放され、象限中の数は各々における細胞の頻度を表す。データは３つの独立した実験の代表例である。
【図１１】ＩＬ−１７のＩＬ−２７阻害がＩＬ−２産生を阻害する能力から独立して起こることを示す、ＩＬ−１７レベルの棒グラフを表す。トランスジェニックＤＯ１１．１０マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ−１７誘導条件下で、オボアルブミンペプチドで活性化した。ＥＬＩＳＡで細胞上清のＩＬ−１７について分析する前に、ヒトＩＬ−２の存在下または非存在下にて細胞を４日間培養した。データは２つの独立した実験の代表例である。
【図１２】ＩＬ−２７によるＩＬ−２およびＩＦＮγ産生の阻害が、ＷＳＸ−１ノックアウトマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞における可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチドによって増強されることを示す、ＩＬ−２およびＩＦＮγレベルの線グラフを表す。
【図１３】図１３のパネルＡ〜Ｃは、ＩＬ−２７受容体またはその成分ＷＳＸ−１およびｇｐ１３０を通じてのシグナル伝達を調節することによって炎症反応を調節するための戦略を模式的に示す。パネルＡは、ＩＬ−２７によるＩＬ−２７受容体を通じてのシグナル伝達を模式的に示す（ＥＢＩ３およびｐ２８のヘテロ二量体）。パネルＢは、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８複合体または可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体によるｇｐ１３０を通じてのシグナル伝達を模式的に示す。パネルＣは、可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８複合体または可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体によるＷＳＸ−１を通じてのシグナル伝達を模式的に示す。
【図１４】図１４のパネルＡ〜Ｃは、ＩＬ−２７がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０産生を促進することを示す。パネルＡは、非分極条件下で培養された細胞とＩＬ−２７で刺激された細胞間のパーセント変化として表される、ＲｏｄｅｎｔＭＡＰ（商標）バイオアッセイの結果を示す棒グラフを表す。パネルＢおよびＣは、７２時間の培養上清のフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによって測定されたＣＤ４＋Ｔ細胞（パネルＢ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（パネルＣ）の産生を示す（エラーバー、標準偏差）。Ｔ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓およびリンパ節から単離し、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、非分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化した。各々４日間および３日間培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞内ＩＬ−１０についての染色前に、ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシンで４時間刺激した。ボックス中の数字はＩＬ−１０＋細胞の割合を示す。太文字の数字は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。パネルＢおよびＣにおける結果は、同様な結果を伴う３つの独立した実験の代表例である。
【図１５】図１５のパネルＡ〜Ｃは、ＩＬ−１０の産生がＩＬ−２７Ｒシグナル伝達の非存在下で低下することを示す。パネルＡは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６（野生型）またはＩｌ−２７ｒａ−／−マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞の上清中のＩＬ−１０のＥＬＩＳＡの棒グラフを表し、細胞は、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、非分極条件下で成長させた。結果は同様な結果を伴う３つの独立した実験の代表例である（エラーバー、標準偏差）。パネルＢは、トキソプラズマ原虫で慢性的に感染させた野生型およびＩｌ−２７ｒａ−／−マウス由来のＢＭＮＣおよび脾臓のフローサイトメトリーを示し、細胞はブレフェルジンＡの存在下でＰＭＡおよびイオノマイシンでエクスビボにて５時間刺激し、ＩＬ−１０について細胞内染色した。ボックス中の数字はＩＬ−１０＋細胞の割合を示す。結果は同様な結果を伴う３つの独立した実験の代表例である。パネルＣは、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、可溶性トキソプラズマ抗原（ＳＴＡｇ）でインビトロにて４８時間再刺激した野生型  ＢＭＮＣ（ｎ＝４）由来の上清中のＩＬ−１０のＥＬＩＳＡの線グラフを表す。エラーバー、標準偏差＊、Ｐ＝０．０２７５。
【図１６】図１６のパネルＡ〜Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＨ１およびＴＨ２下でＩＬ−２７に応答してＩＬ−１０を産生するが、ＴＨ１７条件下ではそうではないことを示す。パネルＡは、細胞内ＩＬ−１０についての染色前に、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、非分極条件下にて抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化されたＣ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈分析を示す（時間、前記プロット）。プロットは、ＣＤ４＋Ｔ細胞について開放される。パネルＢは、ＩＬ−１０の細胞内染色前に、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ１、ＴＨ２またはＴＨ１７分極条件下で、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化されたＣ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。太文字の数字はＭＦＩを表す。パネルＡおよびＢでは、ボックス中の数はＩＬ−１０＋細胞の割合を示す。データは、同様な結果を伴う３つの独立した実験の代表例である。
【図１７】図１７のパネルＡ〜Ｂは、ＩＬ−２７がＴＨ１条件下でＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を誘導することを示す。パネルＡは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離後、細胞内ＩＬ−１０およびシグネチャーＴＨ関連サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７についての染色前に、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ１、ＴＨ２またはＴＨ１７分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。パネルＢは、細胞内ＩＬ−１０およびＩＬ−１７についての染色前に、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ１７誘導条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化されたＩＬ−１０−／−マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。プロットはＣＤ４＋Ｔ細胞につき開放され、象限中における数は各々における細胞の頻度を表す。データは３つ（パネルＡ）または２つ（パネルＢ）の独立した実験の代表例である。
【図１８】図１８のパネルＡ〜Ｃは、ＴＧＦ−βがＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２７駆動ＩＬ−１０産生を増大させることを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０の産生は、７２時間培養の上清のフローサイトメトリー（パネルＡ）およびＥＬＩＳＡ（パネルＢ）によって測定された。Ｃ７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−βまたは双方のサイトカインの組み合わせの存在下または非存在下、非分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＤＣ２８で活性化した。４日間培養したＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞内ＩＬ−１０についての染色前に、ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシンで４時間刺激した。ボックス中の数字はＩＬ−１０＋細胞の割合を示し、太文字の数字はＭＦＩを表す。データは１０匹のマウスの平均±標準偏差である。パネルＣは、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−βまたは双方のサイトカインの組み合わせの存在下または非存在下、非分極条件下で、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化されたＦｏｘｐ３ＧＦＰレポーターマウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。３日間培養したＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞内ＩＬ−１０およびＧＦＰについての染色前にブレフェルジンＡの存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシンで４時間刺激した。プロットは、ＣＤ４＋Ｔ細胞について開放され、象限中の数字は各々における細胞の頻度を表す。データは３つ（ａ、ｂ）または２つ（ｃ）の独立した実験の代表例である。
【図１９】図１９のパネルＡ〜Ｄは、ＩＬ−６がＴＧＦ−βと協同して、ＩＬ−１０の産生を促進することを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０の産生は、７２時間の培養の上清のフローサイトメトリー（パネルＡ）およびＥＬＩＳＡ（パネルＢ）によって測定された。Ｃ７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、または双方のサイトカインの組み合わせの存在下または非存在下、非分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化した。４日間培養したＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞内ＩＬ−１０についての染色前にブレフェルジンＡの存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシンで４時間刺激した。ボックス中の数字はＩＬ−１０＋細胞の割合を示し、太文字の数字はＭＦＩを表す。データは三連の平均±標準偏差である。パネルＣおよびＤは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。細胞を刺激しないまま放置し、またはＩＬ−６またはＩＬ−２７（時間、前記プロット）で刺激し、次いで、細胞内リン酸化（パネルＣ）ＳＴＡＴ１（Ｐ−ＳＴＡＴ１）または（パネルＤ）ＳＴＡＴ３（Ｐ−ＳＴＡＴ３）について染色した。ボックス中の数字は（パネルＣ）Ｐ−ＳＴＡＴ１＋または（パネルＤ）Ｐ−ＳＴＡＴ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を表す。データは３つ（パネルＡおよびＢ）または２つ（パネルＣおよびＤ）独立した実験の代表例である。
【図２０】図２０のパネルＡ〜Ｆは、ＩＬ−１０のＳＴＡＴ依存性誘導を示す。Ｃ７ＢＬ／６、Ｓｔａｔｌ−／−（パネルＡ）、Ｔｂｘ２ｌ−／−（パネルＢ）、Ｓｔａｔ３ＣＤ４−／−（パネルＣ）またはＳｔａｔ４−／−（パネルＤ）マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーは、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、非分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化し、次いで細胞内ＩＬ−１０を染色した。Ｃ７ＢＬ／６、Ｓｔａｔｌ−／−（パネルＥ）またはＳｔａｔ３ＣＤ４−／−（パネルＦ）から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーは、ＴＧＦ−βの存在下または非存在下、ＩＬ−６での非分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化し、次いで細胞内ＩＬ−１０について染色した。ボックス中の数字はＩＬ−１０＋細胞の割合を表す。データは３つの独立した実験の代表例である。
【図２１】ＩＬ−６がＴＨ２条件下でＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成を誘導することを示すフローサイトメトリーデータを表す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーは、細胞内ＩＬ−１０についての染色前に、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ１またはＴＨ２分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化された。ボックス中の数字はＩＬ−１０＋細胞の割合を表し、太文字数字はＭＦＩを表す。データは３つの独立した実験の代表例である。
【図２２】ＴＨ１条件下でのＩＬ−１０産生がＳＴＡＴ４に依存することを示すフローサイトメトリーデータを表す。Ｃ７ＢＬ／６およびＳｔａｔ４−／−マウスから単離され、ＣＤ４＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーは、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ１分極条件下で抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で活性化され、次いで細胞内ＩＬ−１０について染色された。ボックス中の数字はＩＬ−１０＋細胞の割合を表す。データは、３つの独立した実験の代表例である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
他の定義がなされているのでなければ、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。以下の定義は当分野におけるものを補い、本出願に向けられ、およびいずれかの関連するまたは関連しない場合、例えば、いずれかの共通に所有された特許または出願に転嫁されるべきではない。本明細書において記載されたのと同様なまたは同等ないずれの方法および物質も本発明のテストについての実施で用いることができるが、好ましい物質および方法は本明細書において記載される。従って、本明細書において用いる専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、限定的であることを意図しない。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いるように、単数形態「ある（ａ）、（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明らかに指令するのでなければ、複数言及を含む。従って、例えば、「あるタンパク質」への言及は複数のタンパク質を含み、「ある細胞」への言及は細胞の混合物を含む、等である。
【００２７】
用語「単離された」とは、通常は、その天然に存在する環境に付随、またはそれと相互作用する成分を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドなどの生物学的物質を指す。単離された物質は、任意で、例えば細胞などの天然の環境における物質と共に見いだされない物質を含む。例えば、物質が細胞などの自然環境にあるのであれば、前記物質はその環境で見出される物質に対して天然ではない細胞中の位置（例えば、ゲノムまたは遺伝因子）に位置されている。例えば、天然に存在する核酸（例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサー等）は、それがその核酸に対して天然でないゲノムの遺伝子座へ非天然手段（例えば、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクター、または単位複製配列）によって導入されたならば、単離になる。そのような核酸もまた「異種」核酸を指す。単離されたポリペプチドは、例えば、野生型ポリペプチドの自然環境以外の環境（例えば、細胞培養系、または細胞培養から精製された系）にある。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その治療、診断、予防、研究または他の使用に干渉しない自然環境で見出されるタンパク質、ポリペプチドまたは他の汚染を実質的に含まない。
【００２８】
用語「組換え」は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）が、人為的介入によって人工的または合成的（非天然的に）に改変されていることを示す。前記改変は、その自然環境または状態内、またはそこから取り出された物質について行うことができる。例えば「組換え核酸」は、例えばクローニング、ＤＮＡシャッフリングまたは他の手法の間に核酸を組み換えることによって作製されたものであり、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は、例えば、組換え核酸の発現によって産生されるポリペプチドまたはタンパク質である。
【００２９】
用語「核酸」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、一般的なＤＮＡまたはＲＮＡポリマー）、ＰＮＡ、修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドなどの生物学的ＲＮＡまたはＤＮＡに対して一般的でないヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）等を含むヌクレオチドの紐（ｓｔｒｉｎｇ）に対応し得る単量体単位の任意の物理的紐を包含する。核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖であり得る。特に示されていない限り、本発明の特定の核酸配列は、明示的に示された配列に加えて、相補的配列を包含する。
【００３０】
「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」は、文脈に応じて、ヌクレオチド（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、核酸等）のポリマー、またはヌクレオチドポリマーを表す文字列である。いずれかの特定のポリヌクレオチド配列から、既知の核酸または相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、相補的核酸）のいずれかを決定することができる。
【００３１】
「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は、（任意で、ＲＮＡの修飾、例えば、スプライシングを含む）ＤＮＡのＲＮＡへの転写、（場合により、ポリペプチドの引き続いての修飾、例えば、翻訳後修飾を含む）ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、または転写および翻訳の双方を、文脈によって示されたように意味する。
【００３２】
用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連したいずれの核酸も指すのに広く用いられる。遺伝子は、一般的にコード配列および／またはコード配列の発現に必要な調節配列を含む。用語「遺伝子」は特定のゲノム配列に、ならびにそのゲノム配列によってコードされたｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに適用される。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する、発現されない核酸セグメントも含む。発現されない調節配列は、転写因子などの調節タンパク質が結合し、その結果隣接するまたは近くの配列の転写がもたらされる「プロモーター」および「エンハンサー」を含む。「組織特異的」プロモーターまたはエンハンサーは、特異的組織型または細胞型において転写を調節するものである。
【００３３】
「発現ベクター」は、その中に取込まれた核酸の発現ならびに複製を促進することができるプラスミドなどのベクターである。一般的には、発現されるべき核酸はプロモーターおよび／またはエンハンサーに「操作可能に連結され」、プロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御に供する。
【００３４】
本明細書において、用語「コードする」とは、それによりポリマー巨大分子または配列中の情報を用いて、第一の分子または配列とは異なる第二の分子または配列の産生を指令する、いずれの工程を指す。本明細書において、この用語は広く用いられ、種々の適用を有することができる。１つの態様において、前記用語「コードする」は半保存的ＤＮＡ複製の工程を記載し、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる新しく合成された相補的姉妹染色分体をコードするための鋳型として用いられる。もう１つの態様において、用語「コードする」は、それにより１つの分子中の情報を用いて、第一の分子とは異なる化学的性質を有する第二の分子の産生を指令する、いずれの工程を指す。例えば、ＤＮＡ分子は、（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を取込む転写工程によって）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳工程に供されるポリペプチドをコードすることができる。１つの態様において、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、その場合に用いられる「コードする」は転写および翻訳の両方の工程を共に取込むと理解される。
【００３５】
「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸残基（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を含むポリマーである。前記このポリマーは、加えて、標識、消光剤、保護基等のような非アミノ酸要素を含むことができ、任意で、グリコシル化等のような修飾を含むことができる。ポリペプチドのアミノ酸残基は天然または非天然であり得、置換されていない、修飾されていない、置換されたまたは修飾されたものであり得る。
【００３６】
「アミノ酸配列」は、文脈に応じて、アミノ酸残基（タンパク質、ポリペプチド等）のポリマー、またはアミノ酸ポリマーを表す文字列である。
【００３７】
「インターロイキン−２７」または「ＩＬ−２７」は、「ＥＢＩ３」および「ｐ２８」を含むヘテロ二量体サイトカインである。文献中のｐ２８についての他の名称は、インターロイキン３０またはＩＬ３０を含む。ｐ２８は、例えば、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／Ｏｍｉｍのワールドワイドウェブにて、Ｍａｎデータベース中のＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅでのエントリー６０８２７３に記載されている。また、例えば、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚのワールドワードウェブにおけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  Ｅｎｔｒｅｚ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｂｒｏｗｓｅｒｓを通じて入手できるタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿６６３６３４およびＮＰ＿６６３６１１．１、ヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿１４５６５９およびＮＭ＿１４５６３６．１、およびＧｅｎｅ  ＩＤ２４６７７８および２４６７７９も参照されたい。ＥＢＩ３（「エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３」）は、例えば、ＭａｎデータベースにおけるＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ中のエントリー６０５８１６に記載されている。また、タンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿００５７４６およびＮＰ＿０５６５８１．１、ヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿００５７５５およびＮＭ＿０１５７６６、およびＧｅｎｅ  ＩＤ１０１４８および５０４９８も参照されたい。
【００３８】
ＩＬ−２７は、クラスＩサイトカイン受容体「ＷＳＸ−１」および「ｇｐ１３０」を含む受容体複合体を通じてシグナル伝達を行う。文献中のＷＳＸ−１についての他の名称はＴ細胞サイトカイン受容体（ＴＣＣＲ）、インターロイキン２７受容体α（ＩＬ２７ＲＡ）、およびインターロイキン２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）を含む。ＷＳＸ−１は、例えば、ＭａｎデータベースにおけるＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ中のエントリー６０５３５０に記載されている。また、タンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿００４８３４およびＮＰ＿０５７８８０．１、ヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿００４８４３およびＮＭ＿０１６６７１、およびＧｅｎｅ  ＩＤ９４６６および５０９３１も参照されたい。文献中におけるｇｐ１３０についての他の名称は、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）を含む。ｇｐ１３０は、例えば、ＭａｎデータベースにおけるＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ中のエントリー６００６９４に記載されている。また、タンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿００２１７５およびＮＰ＿０３４６９０、ヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿００２１８４およびＮＭ＿０１０５６０、およびＧｅｎｅ  ＩＤ３５７２および１６１９５も参照されたい。
【００３９】
「ＷＳＸ−１ポリペプチド」（または、類似して、「ｇｐ１３０ポリペプチド」、「ｐ２８ポリペプチド」または「ＥＢＩ３ポリペプチド」）とは、天然に存在するＷＳＸ−１（またはｇｐ１３０、ｐ２８、またはＥＢＩ３）の全長アミノ酸配列、またはそのサブ配列または断片、またはその変異体（すなわち、全長配列またはサブ配列の変異体）を含むポリペプチドを指す。例示的なＷＳＸ−１、ｇｐ１３０、ｐ２８、およびＥＢＩ３ポリペプチドは先に示した。ＷＳＸ−１、ｇｐ１３０、ｐ２８、およびＥＢＩ３ポリペプチドはそれぞれに対して相同なまたは実質的に同一のポリペプチド、およびそのサブ配列または変異体も含む。
【００４０】
「サブ配列」または「断片」は、完全配列以下の、およびそれを含む全配列のいずれかの部分である。一般的には、サブ配列または断片は全長配列未満を含む。任意で、完全な配列の長さに応じて、サブ配列は、例えば、完全な配列の少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、または少なくとも約５００連続アミノ酸を含むことができる。
【００４１】
ポリペプチドに関して用語「変異体」（または「誘導体」）は、前記その変異体が、参照配列（例えば、天然に存在する配列）に関する一つまたは複数のアミノ酸によって改変されるアミノ酸配列を有することを示す。前記変異体は「保存的」変化を有することができ、置換されたアミノ酸、例えば、ロイシンのイソロイシン置換は同様な構造的または化学的特性を有する。あるいは、変異体は「非保存的」変化、例えば、グリシンのトリプトファン置換を有することができる。類似の非主要変異もまたアミノ酸の欠失または挿入、または双方を含むこともできる。いずれのアミノ酸残基を生物学的または免疫学的活性を排除することなく置換し、挿入し、または欠失できるかの決定におけるガイダンスは、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアを用いて見出すことができる。保存的置換の例もまた以下に記載する。変異体は融合タンパク質、およびそうでなければポリペプチドに由来するポリペプチドも含む。任意で、変異体は参照配列（例えば、天然に存在する配列、例えば、ヒトまたはマウスＷＳＸ−１、ｇｐ１３０、ｐ２８、またはＥＢＩ３ポリペプチド配列）またはそのサブ配列に対して少なくとも約６０％同一である。しばしば、そのような配列は、例えば参照配列の少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、または少なくとも約５００の連続アミノ酸を含む参照配列のサブ配列にわたって、参照配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％である。
【００４２】
用語「に由来する」とは、特定の分子または前記特定の分子からの情報を用いて単離または作製された化合物を指す。例えば、第二のポリペプチドに由来するポリペプチドは、第二のポリペプチドのアミノ酸配列またはサブ配列と同一または実質的に同一である、アミノ酸配列またはサブ配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導された種は、例えば、自然発生的突然変異誘発、人工的な定方向突然変異誘発、人工的なランダム変異誘発、または組換えポリペプチドを産生するための他の技術によって得ることができる。ポリペプチドの突然変異誘発は、一般的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を必要とする。
【００４３】
用語「融合タンパク質」は、前記タンパク質が１より多い親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むことを示す。一般的には、融合タンパク質は、１つのタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームにて付着する、および任意でそれからリンカーによって分離される融合遺伝子から発現される。次いで、融合遺伝子を細胞によって（またはインビトロ発現系において）単一の組換え融合タンパク質として発現することができる。もう１つの例として、融合タンパク質は、各成分が別々に産生された後に、ポリペプチド成分を共有結合により（例えば、インビトロにて）連結することによって産生することができる。
【００４４】
「可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド」または「可溶性ＷＳＸ−１」は、ＷＳＸ−１ポリペプチド（例えば、天然に存在するＷＳＸ−１またはその変異体）の細胞外ドメインの全てまたは部分を含むが、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインは含まない。ポリペプチド（または前記ポリペプチドを含む複合体）は、任意で、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水溶液に可溶性である。
【００４５】
「可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド」または「可溶性ｇｐ１３０」は、ｇｐ１３０ポリペプチド（例えば、天然に存在するｇｐ１３０またはその変異体）の細胞外ドメインの全てまたは一部を含むが、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインは含まない。ポリペプチド（または前記ポリペプチドを含む複合体）は、任意で、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水溶液に可溶性である。
【００４６】
タンパク質の「ドメイン」は、完全なタンパク質以下およびそれを含む、全タンパク質のいずれかの部分であって、一般的には、完全なタンパク質未満を含む。ドメインは、その必要はないが、タンパク質鎖の残りから独立して折畳むことができ、および／または特定の生物学的機能または位置（例えば、リガンド結合ドメイン、もしくは細胞質、膜貫通または細胞外ドメイン）に相関することができる。
【００４７】
用語「炎症性疾患」とは、炎症が存在する任意の病気、障害、または他の疾患を指す。炎症は、例えば、急性、慢性、局所化、および／または全身であり得、生来のおよび／または適応的免疫反応の細胞によって介在される。
【００４８】
「抗炎症」組成物は、炎症を緩和するものである。例えば、組成物は炎症性疾患の消散（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を引き起こし、または炎症性疾患さらなる悪化を妨げることができる。
【００４９】
本明細書において「患者」は、一般的にはヒトであるが、非ヒト哺乳動物であり得る。例示的な非ヒト哺乳動物は、例えば、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、およびウシなどの、実験室動物、愛玩動物、ペット動物、スポーツ動物および家畜動物を含む。１つの態様において、そのような患者は炎症性疾患の治療に適格である。本明細書における目的では、そのような適格な患者は、炎症性疾患の一つまたは複数の症状、兆候または他の指標（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を経験している、または経験したことがあるものである。疾患の診断（および治療のための適格性の決定）は当分野で確立されているように行うことができる。
【００５０】
本明細書において患者の「処置」とは、治療的処置および予防的または予防措置の両方をいう。処置を必要とする患者は、炎症性疾患を既に有するおよび炎症が予防されるべき患者を含む。したがって、患者は炎症性疾患を有すると判断することができ、もしくは炎症性疾患に対して素因または感受性であり得る。
【００５１】
用語「緩和する」または「緩和」とは、本明細書において、異常または兆候を含む疾患、病気、障害または表現型の減少、低下または排除を指す。
【００５２】
疾患、病気または障害の「兆候」は、患者が経験した、病的兆候、または構造、機能または感覚における正常からの逸脱、および前記疾患、病気または障害の指標である。
【００５３】
表現「治療上有効量」とは、疾患、病気または障害を予防、緩和、または治療するのに効果的な量を指す。例えば、ポリペプチドまたは複合体の「治療上有効量」とは、特定の炎症性疾患を予防、緩和、または治療するのに効果的なポリペプチドまたは複合体の量を指す。同様に、ポリペプチドまたは複合体および第二の化合物（例えば、抗体、もう１つのポリペプチドまたは複合体、または薬物）の組み合わせの「治療上有効量」とは、組み合わせて、特定の疾患を予防、緩和、または治療するのに効果的なポリペプチドまたは複合体の量、および第二の化合物の量を指す。
【００５４】
専門用語「２つの化合物の組み合わせ」は、化合物が相互に混合されて投与されなければならないことを意味しないのは理解されるべきである。従って、そのような組み合わせでの治療または前記使用は、化合物の混合物、または化合物の別々の投与を包含し、同日または異なる日での投与を含む。従って、専門用語「組み合わせ」は、２以上の化合物が治療のために、個々に、または相互に混合して用いられることを意味する。例えば、ポリペプチドまたは複合体および第二の化合物が組み合わせて患者に投与される場合、ポリペプチドまたは複合体が、ポリペプチドまたは複合体および第二の化合物が個々に、または混合されて患者に投与されるか否かを問わず、第二の化合物が患者に存在する時点で患者に存在する。
【００５５】
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で用いられ、具体的には、所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全（ｉｎｔａｃｔ）抗体から形成された多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体の断片を網羅する。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的に、または部分的にコードされる一つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識された免疫グロブリン遺伝子はκ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。
【００５６】
「抗体断片」は、好ましくは、その抗原結合領域を含む完全抗体の部分を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、二重特異性抗体、直鎖状抗体、単一鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。
【００５７】
「完全抗体」は、重鎖および軽鎖可変ドメインならびにＦｃ領域を含むもものである。
【００５８】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成された約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルヒド結合によって重鎖に連結しており、他方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖内で変化する。各重鎖および軽鎖は規則的に間隔が設けられた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、１つの端部において、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、１つの端部における可変ドメイン（ＶＬ）およびその他の端部における定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列し、および軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間で界面を形成するとみられている。
【００５９】
用語「可変」とは、可変ドメインのある部分は抗体の間で配列が大々的に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合およびその特異性において用いられる事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しない。可変性は、軽鎖および重鎖可変ドメイン双方において超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然型重鎖および軽鎖の可変ドメインは、いくつかの場合において部分的にβ−シート構造形成する、ループ結合を形成する３つの超可変領域によって連結された、β−シート立体配置を主として採用する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域はＦＲによって近接近して結合され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常領域は抗体を抗原に結合させることにおいて直接的に関与しないが、抗体依存性細胞介在細胞傷害性における抗体の参加などの種々のエフェクター機能を呈する。
【００６０】
抗体のパパイン消化が、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片、およびその名称が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生じる。用語「Ｆｃ領域」とは、単量体または多量体形態であるかを問わず、全抗体の消化から得られたそのような非抗原結合断片を指す。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として、抗原を架橋結合させることができるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００６１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原−認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接な非共有結合性会合した１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つの超可変領域は抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメインでさえ（または抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００６２】
Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加がある点で、Ｆａｂ断片とは異なる。「Ｆａｂ’−ＳＨ」は、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基であるＦａｂ’の意味である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生じた。抗体断片の他の化学的カップリングもまた公知である。他の抗体断片のより詳細な記載については、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照されたい。
【００６３】
種々の抗体断片は完全抗体の消化に関して規定されるが、当業者であれば、そのような断片は化学的にまたは組換えＤＮＡ方法を利用することによって新規合成することができる。従って、用語「抗体」は、本明細書において、全抗体の修飾によって生じた、または組換えＤＮＡ方法を用いて新規合成された抗体またはその断片を含む。
【００６４】
いずれかの脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明瞭に別々のタイプの１つに帰属させることができる。
【００６５】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体は異なるクラスに帰属させることができる。完全抗体は５つの主なクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分割することができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々、α（アルファ）、δ（デルタ）、ε（イプシロン）、γ（ガンマ）、およびμ（ミュー）と呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００６６】
「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合についての所望の構造を形成するのを可能とするＶＨとＶＬドメイン間にさらにポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００６７】
用語「二重特異性抗体」とは、２つの抗原結合部位を備える小さな抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。余りにも短くて、同一鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とできないリンカーを用いることによって、ドメインは強制的にもう１つの鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作り出す。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  １９９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）で、十分に記載されている。
【００６８】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書において、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、前記集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生の間に生起し得る可能な変異体を除き、同一でありおよび／または同一のエピトープに結合し、そのような変異体は、一般には、少量で存在する。一般的には、異なる決定基（エピトープ）に対して配向する、異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して配向する。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるものとしての抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクーナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製することができるか、または組換えＤＮＡ方法によって作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【００６９】
モノクローナル抗体は、本明細書において、具体的には、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来する、もしくは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残りは、別の種に由来もしくは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。目的のキメラ抗体は、本明細書において、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、またはカニクイザルなどの旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列、およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００７０】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基に置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基に置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高めるようになされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てが、前記したＦＲ置換を除いて、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、一般的には、ヒト免疫グロブリン定常領域やはり含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００７１】
用語「超可変領域」とは、本明細書において、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）、および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されたように、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７２】
用語「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するのに用いられる。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１に概説されている。将来に同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書において、用語「ＦｃＲ」に包含される。前記用語「ＦｃＲ」は、母性ＩｇＧの胎児への移動を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９）。
【００７３】
「活性修飾因子」は、ポリペプチドまたは複合体（例えば、受容体または受容体リガンド）の活性を部分的にまたは完全に調節（増強または阻害）する。調節因子は、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸などであり得る。
【００７４】
「アゴニスト」は、受容体に結合し、および受容体を活性化することができ、それによりその受容体に特徴的な応答（例えば、生理学的または薬理学的応答）を開始することができる化合物（例えば、内因性物質または薬物）である。アゴニストは、例えば、完全アゴニストまたは部分アゴニストであり得る。
【００７５】
「アンタゴニスト」は、受容体に結合でき、およびアンタゴニストがその受容体に結合し、および活性化するのを妨げることができる化合物（例えば、薬物）である。一般的には、アンタゴニストの受容体への結合は、あたかも受容体が占有されていないかのごとく、いずれの応答も生起させない複合体を形成する。あるいは、アンタゴニストは部分アゴニストであり得る。
【００７６】
ある種の化合物がアゴニストおよびアンタゴニストの双方として分類することができるのは言及する価値がある。例えば、「混合アゴニスト−アンタゴニスト」（「部分アゴニスト」とも呼ばれる）は、受容体に対する親和性を保有するが、完全アゴニストとは異なり、例え受容体のほとんどが前記この化合物によって占有されたとしても、その受容体に特徴的な応答をわずかしか誘発しない化合物である。部分アゴニストによる受容体のこのような占有は、完全アゴニスト（例えば、内因性アゴニスト）の受容体への結合を妨げ得る。
【００７７】
種々のさらなる用語が定義され、またはそうでなければ本明細書において特徴付けられる。
【００７８】
詳細な説明
Ｔ細胞が病気の臨界的メディエーターである多数の炎症性疾患があり、多くの努力がＴ細胞応答を特異的に阻害する戦略の開発に焦点を当ててきた。例えば、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症、ブドウ膜炎、乾癬、関節炎、喘息、狼瘡および移植片拒絶は、全てＴ細胞が関与する疾患である。免疫応答は、強直性脊椎炎（ａｎｋａｌｙｚｉｎｇ ｓｐｏｎａｄａｌｉｔｉｓ）およびサルコイドーシスなどの種々の他の特発性疾患にも関連付けられてきた。これらの疾患の全てについて、新しい治療手段を開発する差し迫った要求がある。ＷＳＸ−１がＴ細胞応答の阻害に重要であるという認識は、この受容体がこれらのタイプの免疫応答を妨げるための実行可能な標的を表すことを意味する。あるいは、この受容体の遮断は、例えば、ワクチン接種または癌のための免疫介在療法の間に、Ｔ細胞応答を増大させるのに用いることができる。加えて、ＷＳＸ−１を発現するある種のタイプの腫瘍も、この受容体を介しての阻害性シグナル伝達に感受性であり得る。
【００７９】
ＷＳＸ−１またはそのパートナーｇｐ  １３０を発現する他の細胞（双方を発現する細胞を含む）は同様に標的化することができる。ＷＳＸ−１発現細胞によって、またはｇｐ１３０発現細胞によって介在される応答は、例えば、各々可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドまたは複合体、もしくは可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチドまたは複合体、もしくはｐ２８によって調節することができる。従って、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞などに介在される応答は、関連受容体の活性化または遮断によって調節することができる。
【００８０】
潜在的な商業的使用および適用
ｐ２８は、単独またはＷＳＸ−１の可溶性形態と組み合わせてアレルギー、関節炎、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、ある種の癌、乾癬、狼瘡、多発性硬化症、および結核および肝炎などの慢性感染性疾患を含む多くの炎症性疾患を抑制するのに用いることができるが、これらの疾患に限定されない。同様の手法は、これらの観察結果からの有用な治療手段であると意味する。従って、内因性ＩＬ−２７と相互作用し、およびｇｐ１３０とのその相互作用を促進し、標的に対する負の効果を促進する、（例えば、免疫グロブリンとの）ＷＳＸ−１融合タンパク質が有用である。治療分子は、二重の機能を有するように構築することもでき、例えば、そのような分子は、１つの鎖がＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ等の、これら限定されない細胞特異的マーカーを認識することができ、他の鎖がＷＳＸ−１またはｐ２８融合を含む抗体構造に基づくことができる。これは、非常に特異的な細胞型の標的化を可能とする。加えて、受容体生物学がトランスシグナリングのエレメントを包含するという認識は、ＩＬ−２７またはｐ２８（またはＥＢＩ３さえ）との複合体におけるｇｐ１３０の可溶性形態は、ＷＳＸ−１を通じての特異的シグナル伝達を促進するように作用することもできるという考えを導く。いずれかの特定のメカニズムに制限されることなく、本発明者らの現在のモデルにおいては、ＩＬ−２７受容体の異なる受容体鎖は固有のシグナル伝達機能を有し、および別々のＴ細胞機能に影響し得る。この概念は、特定のサイトカインのＴ細胞産生に非常に特異的に影響する分子の設計を導く。本発明者らの仕事およびデータに専ら基づくと、本発明者らは、この手法を用いて、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２５、ならびにＩＬ−１０、ＩＬ−５、および／またはＣＤ２５を標的化することができることを示唆する。これらの全てはバイオテクノロジーにおける有効な薬物標的を表し、多くのＴ細胞介在炎症性疾患において重要である。図１３のパネルＡ〜Ｃはいくつかの候補戦略を概説する。本明細書におけるより詳細な検討およびさらなる実施例には、本発明者らが別々の免疫機能を合理的に標的化するのを可能とするこの情報に基づいて考案することができる多くのさらなる手法がある。
【００８１】
抗炎症性組成物
本発明の１つの態様は、抗炎症活性を有する組成物を含む、新規ポリペプチドおよび複合体を含む組成物を提供する。
【００８２】
実施形態の１つの一般的なクラスは、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体、またはその変異体を含む組成物を提供する。一例として、「可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体」はｐ２８ポリペプチドとの複合体中の可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチドを含み、および前記複合体の変異体は変異体可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチドおよび／または変異体ｐ２８ポリペプチドを含む。
【００８３】
１つの態様において、前記組成物は抗炎症性である。前記組成物は、任意で、このような投与に先立って炎症を呈する、例えばヒトまたは動物などの患者に投与する場合、炎症を減少させる。同様に、前記組成物は、任意で、前記組成物が適用される細胞において、例えば特定のサイトカインの発現などの炎症応答に特徴的な一つまたは複数の細胞活性を、前記組成物に曝露されていない細胞に対して改変する（例えば、減少させる）。前記組成物は、任意で、例えば、前記組成物を患者に投与すべき実施形態において、薬学的に許容される賦形剤を含む。１つの実施形態において、前記組成物は、ＩＬ−６および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）によって誘導されたナイーブＴ細胞由来の（Ｔ１７細胞とも呼ばれる）ＩＬ−１７産生細胞の発生を抑制する。例えば、前記組成物は、ＩＬ−６および形質転換増殖因子βによって誘導されるナイーブＴ細胞由来のＩＬ１７産生ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞（ＴＨ−１７）の発生を抑制することができる。同様に、前記組成物は、任意で、Ｔ１７細胞の一つまたは複数の機能を抑制する。１つの実施形態において、前記組成物はＴＧＦ−βを含む。
【００８４】
前記組成物は、例えば、一つまたは複数のＴ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞、もしくはｇｐ１３０またはＷＳＸ−１を発現する他の細胞（例えば、内皮細胞）を発現する他の細胞などである、一つまたは複数の細胞を含むことができる。前記複合体は細胞の機能または活性に影響し得る。１つの実施形態において、前記組成物はＴ細胞を含み、前記組成物は、前記組成物で処理されていない対応するＴ細胞に対して、Ｔ細胞の機能または活性を改変する。例えば、Ｔ細胞はＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＣＤ２５の改変された発現、改変された増殖、または改変された生存を呈することができる。種々のサイトカインの発現は、例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを検出するための当分野で周知の種々の技術のいずれかによって検出することができる。サイトカイン（例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）の発現は、一般的には、複合体によって下方制御されるが、阻害性サイトカインＩＬ−１０の産生は一般的には増大される。一般的には、ＷＳＸ−１複合体は、ｇｐ１３０（および、任意でＷＳＸ−１も）を発現する細胞の活性を調節するのに用いられ、他方ｇｐ１３０複合体はＷＳＸ−１（および、任意で、ｇｐ１３０も）を発現する細胞の活性を調節するのに用いられる。
【００８５】
適当な可溶性ＷＳＸ−１およびｇｐ１３０ポリペプチドは、例えば、ＷＳＸ−１またはｇｐ１３０の細胞外ドメインまたはその一部（サブ配列）を含む。細胞外ドメインは、任意で、融合タンパク質の一部、例えば、本明細書において記載されたもの、またはＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインとの融合である。例えば、例示的な可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチドの記載については、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」と題されたＨｕｎｔｅｒおよびＶｉｌｌａｒｉｎｏによる米国特許出願公開２００４０１８５０４９、およびＷｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｓｅｐｔｉｃ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ  ｂｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２７」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０．１０８４／ｊｅｍ．２００６０４７１を参照されたい。さらなる可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチドは容易に構築され、およびいくつかは市販されている。例えば、ヒトおよびマウスＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１／Ｆｃキメラは（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ（ｄｏｔ）ｃｏｍのウェブにて）Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、例えば、Ｊｏｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）「Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｐ１３０  ｉｓ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：１６０−１６７およびＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）「Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｐ１３０  ａｓ  ａｎ  ＥＬＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｉｎｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−ｃｙｃｌｉｎｇ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．Ｍａｙ  ２３  ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２００６０５４４を参照して、同様に産生することができる。同様に、適当なｐ２８およびＥＢＩ３ポリペプチドは、例えば、ｐ２８またはＥＢＩ３もしくはそれらのサブ配列を含む。複合体の成分は、任意で、複合体中で非共有結合により会合しているか、または複合体中で化学架橋剤などによって任意で共有結合により連結されている。
【００８６】
融合タンパク質は本発明のもう１つの特徴である。従って、実施形態の１つの一般的なクラスは組換えまたは単離されたＷＳＸ−１融合タンパク質を提供する。融合タンパク質は、例えば、前記融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、または前記融合タンパク質に対して内部に存在し得るＷＳＸ−１ポリペプチドを含む。前記ＷＳＸ−１ポリペプチドは、天然に存在するＷＳＸ−１（例えば、ヒトＷＳＸ−１）またはその変異体の細胞外ドメイン、またはそのサブ配列を含むことができる。
【００８７】
実施形態の１つのクラスにおいて、融合タンパク質は、細胞特異的マーカーを認識する一つまたは複数のドメイン、例えば、前記マーカーを認識する一つまたは複数の抗体ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）を含む。細胞特異的マーカーは本質的にいずれの細胞特異的マーカーとすることもでき、例えば、リンパ球集団、Ｔ細胞、好中球などの生来の免疫応答の細胞、樹状細胞、または肥満細胞、または癌細胞に対するマーカーとすることができる。種々の細胞型に対する種々のこのようなマーカーは当分野で公知であり、当業者に周知の技術によってより多くを決定することができる。実施形態の１つのクラスにおいて、細胞特異的マーカーはＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、およびＮＫ１．１から選択される。
【００８８】
実施形態の１つのクラスにおいて、融合タンパク質はｐ２８またはＥＢＩ３に由来する一つまたは複数のポリペプチドドメインを含む。融合タンパク質は、任意で、ｐ２８およびＥＢＩ３双方に由来するドメインを含む。ＷＳＸ−１ポリペプチドはリンカーを介してｐ２８またはＥＢＩ３ポリペプチドに連結することができる。多くの適当なリンカーが当分野で公知であり（例えば、４〜６のＧｌｙおよび／またはＡｌａ残基を含むリンカー）、およびさらなるリンカーは容易に設計される（例えば、Ｃｒａｓｔｏ  ａｎｄ  Ｆｅｎｇ（２０００）「ＬＩＮＫＥＲ：Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌｉｎｋｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３：３０９−３１２を参照されたい）。
【００８９】
融合タンパク質は単量体、二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）または多量体であり得る。融合タンパク質は好ましくは可溶性である。任意で融合タンパク質は、ｐ２８、ＥＢＩ３、またはＩＬ−２７と複合体を形成する。
【００９０】
本質的に、前記実施形態で述べた特徴の全ては、関連するものとして、同様にこれらの実施形態に適用される。例えば、融合タンパク質を含む組成物は、任意で、薬学的に許容される賦形剤、細胞（例えば、Ｔ細胞）、および／またはＴＧＦ−βを含む。
【００９１】
実施形態のもう１つの一般的なクラスは、組換えまたは単離されたｐ２８融合タンパク質を提供する。融合タンパク質は、例えば、前記融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、または前記融合タンパク質に対して内部に存在し得るｐ２８ポリペプチドを含む。ｐ２８ポリペプチドは天然に存在するｐ２８（例えば、ヒトｐ２８）またはその変異体に由来することができる。
【００９２】
融合タンパク質は、任意で、一つまたは複数の抗体ドメインを含む。例えば、融合タンパク質は、細胞特異的マーカーを認識する一つまたは複数の抗体ドメインを含むことができる。
【００９３】
前記した実施形態について述べた特徴の本質的に全ては、例えば、細胞特異的マーカー、溶解性、単量体、二量体または多量体の状態、複合体形成、（例えば、薬学的に許容される賦形剤、細胞、および／またはＴＧＦ−βと共に）組成物への包含などに関して、関連するものとして、同様にこれらの実施形態に適用される。
【００９４】
ｇｐ１３０およびＥＢＩ３融合タンパク質は同様に構築され、本発明のもう１つの特徴を形成することは明らかである。
【００９５】
調節因子のスクリーニング
ＷＳＸ−１、ｐ２８、ＥＢＩ３、および／またはｇｐ１３０の活性を調節する化合物は、例えば、炎症を治療し、またはそうでなければ炎症反応を調節するのに有用であり得る。従って、実施形態の１つの一般的なクラスは、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、または可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体に結合もしくはその活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。前記方法において、前記ポリペプチドまたは複合体を含む、生物学的または生化学試料を試験化合物と接触させる。前記ポリペプチドまたは複合体への試験化合物の結合、もしくは試験化合物による前記ポリペプチドまたは複合体の活性の調節は検出され、これにより前記ポリペプチドまたは複合体に結合もしくはその活性を調節する化合物を同定する。
【００９６】
実施形態の１つのクラスにおいて、前記化合物は、前記ポリペプチドまたは複合体によるＴ細胞応答の阻害を増強させ、ＩＬ−２またはＩＬ−１７に対するアンタゴニスト活性を増強させ、もしくはＴ細胞の増殖、生存、またはＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＣＤ２５の発現を、前記化合物で処理されていない対応するＴ細胞に対して改変する。前記化合物は、任意で、ＩＬ−２７受容体への結合、ＷＳＸ−１とｇｐ１３０間の相互作用のブロック、ＷＳＸ−１とｇｐ１３０間の相互作用の増強、ｐ２８のＷＳＸ−１またはＩＬ−２７受容体との相互作用の増強、等を行う。例示的な化合物は、抗体（例えば、ＷＳＸ−１、ｐ２８、ＥＢＩ３、および／またはｇｐ１３０ポリペプチドに対する抗体）、アゴニスト、アンタゴニスト、および例えば、小分子などの活性調節因子を含む。
【００９７】
生物学的または生化学試料は、単離または組換えたポリペプチドまたは複合体、細胞（例えば、Ｔ細胞）、組織試料等を含むことができる。増殖、生存、およびマーカー発現などのＴ細胞応答は当分野で公知の技術によってアッセイすることができる。
【００９８】
抗体
可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ｐ２８ポリペプチド、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、単離または組換え可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、またはその変異体に特異的に結合する抗体は、本発明の特徴である。このような抗体は、任意で、前記ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の活性を、例えば、増強などの調節をする。１つの実施形態において、抗体はｇｐ１３０／ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体に結合またはその活性を調節し、または細胞中で前記複合体の形成を調節する。例えば、抗体は前記複合体の半減期を増大させることができる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単一鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生された断片を含むことができるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば、炎症性疾患の治療において用途を見出す。このような抗体を生じさせる方法は本明細書において記載される。
【００９９】
抗体の産生または抗体についてスクリーニングするのに用いるべき抗原は、例えば、ＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０またはＥＢＩ３の可溶性形態、または所望のエピトープを含む一部または複合体であってよい。あるいは、または加えて、細胞表面においてＷＳＸ−１またはｇｐ１３０を発現する細胞を用いて、抗体の産生またはスクリーニングすることができる。抗体を作り出すのに有用なＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０またはＥＢＩ３ポリペプチドの他の形態は、当業者に明らかである。ＩＬ２およびＩＬ６の作用を容易とする抗体は当分野で公知であり、ＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０、および／またはＥＢＩ３の作用を容易とする抗体のスクリーニングは、同様な方法を通じて得ることができる。例えば、Ｂｏｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１９２４−１９２７、およびＳｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｓ  ｉｎ  ｂｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｏｘｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ」Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６２：２７７３−２７７８を参照されたい。例えば、（複合体を含む）ＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０、および／またはＥＢＩ３ポリペプチドに対して産生された抗体は、ポリペプチドまたはその複合体への結合についてのアッセイ、またはして、それらが当分野で公知の技術を用いてポリペプチドまたは複合体の活性を調節するか否かを決定するアッセイをすることができる。複合体に結合する抗体は、任意で、ポリペプチドが複合体の一部であるか否かに関わらず複合体のポリペプチド成分に結合する抗体であり、または任意で、複合体に特異的に結合し、および複合体のいずれかのポリペプチド成分には結合しない抗体である（例えば、前記抗体はそれが複合体の成分に結合するよりも少なくとも１０００倍大きな親和性で複合体に結合することができる）。
【０１００】
抗体を産生するための多数の方法が当業者に公知であり、本発明のポリペプチドまたは複合体に特異的な抗体を産生するために適合させることができる。以下の項、ならびに例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、およびそこで引用された文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅ．ｇ．，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（ｏｒ  ｌａｔｅｒ），Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ（ｅｄ．），Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；およびＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照されたい。抗体調製のための他の適当な技術は、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択を含む。Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、およびＷａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照されたい。抗体産生およびエンジニアリング技術についてのさらなる詳細は、ＵＳＰＮ  ５，４８２，８５６，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ），Ｐａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（Ｐａｕｌ），Ｏｓｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７，Ｏｓｔｂｅｒｇ，ＵＳＰＮ  ４，６３４，６６４およびＥｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＵＳＰＮ  ４，６３４，６６６に見出すことができる。特異的な抗体（例えば、特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体）および抗血清は、通常、少なくとも約０．１μＭ、好ましくは少なくとも約０．０１μＭまたはそれ以下、最も一般的および好ましくは０．００１μＭまたはそれ以下のＫＤで結合する。十分に理解されるように、このような抗体の結合特性は、一般的には、環境特性、例えば、ｐＨ、塩濃度などを含む抗体が晒される具体的適用に依存する。ある好ましい態様において、環境条件は、一般的には、例えば、約２〜約９の間（例えば、約７）のｐＨ、および例えば、約０ｍＭ〜１００ｍＭの間の生化学的���関連するイオン強度における塩レベルなどの生化学的系を含む。
【０１０１】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの多数回の皮下または腹腔内注射によって動物で産生させる。例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じての接合）、（リジン残基を介する）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、ＲおよびＲ’が異なるアルキル基であるＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲなどの二機能性または誘導体化剤を用いて、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤などの関連抗原を免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質へ接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）接合させるのは有用であり得る。
【０１０２】
例えば、（各々、ウサギまたはマウスについて）１００μｇまたは５μｇのタンパク質または接合体を３容量のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、溶液を複数の部位に皮内注射することによって、動物を抗原、免疫原性接合、または誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、動物に、フロイントの完全アジュバント中の元の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは接合体で、複数部位に皮下注射によってブーストする。７〜１４日後に、動物から採血し、抗体力価について血清をアッセイする。力価がプラトーとなるまで動物に追加免疫する。好ましくは、動物は、異なるタンパク質に接合し、および／または異なる架橋剤を通じて接合した以外は同一抗原の接合体でブーストされる。接合体は、融合タンパク質として組換え細胞培養において作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に用いて、免疫応答を増強させる。
【０１０３】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、すなわち、前記集団を含む個々の抗体がモノクローナル抗体の産生の間に生起する可能な変異体を除いて同一であり、および／または同一エピトープに結合する、実質的に均質な抗体集団から得られ、そのような変異体は、一般的に少量存在する。従って、修飾語「モノクローナル」は、別々のまたはポリクローナル抗体の混合物ではない、抗体の特性を示す。
【０１０４】
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作成することができるか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作成することができる。
【０１０５】
ハイブリドーマ法において、ハムスターなどのマウスまたは他の適当な宿主動物を前記したように免疫化して、免疫化で用いるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生し、または産生することができるリンパ球を誘発させる。または、リンパ球はインビトロにて免疫化することができる。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１０６】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を含むことが好ましい適当な培養基に撒き、そこで成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマのための培地は、一般的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、その物質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を妨げる。
【０１０７】
好ましい骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベル産生を支持し、およびＨＡＴ培地などの培地に対して感受性であるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手できるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するもののような、マウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１０８】
ハイブリドーマ細胞がそこで成長している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱によってまたはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定することができる。
【０１０９】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈方法によってクローンをサブクローンし、標準的な方法によって成長させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｅｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的における適当な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞を動物中の腹水腫瘍としてインビボで成長させてもよい。
【０１１０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）架橋アガロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気詠動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手法によって培地、腹水または血清から適切に分離される。
【０１１１】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用い（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい原料としての役目を果たす。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、これを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの宿主細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞に形質転換して、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現についての総説文献は、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）を含む。
【０１１２】
さらなる実施形態において、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載された技術を用いて生じさせた抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、各々、ファージライブラリーを用いてネズミおよびヒト抗体の単離を記載する。続く刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８９（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアルの感染およびインビボの組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を記載する。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する、実行可能な代替法である。
【０１１３】
ＤＮＡは、例えば、相同なネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、もしくは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部を、免疫グロブリン−コード配列に共有結合させることにより連結することによって、修飾することもできる。
【０１１４】
任意で、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインの代わりに置換され、またはそれらは抗体の１つの抗原組み合わせ部位の可変ドメインの代わりに置換して、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原結合部位を含む、キメラ二価抗体を生じさせる。
【０１１５】
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当分野で記載されてきた。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである原料からそれに導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基を指し、これらは、一般的には、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列にを超可変領域配列で置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って本質的に行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここに、実質的に完全ヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種由来の対応する配列に置換されている。実施においては、ヒト化抗体は、一般的にいくつかの超可変領域残基および、場合により、いくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似の部位の残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１１６】
ヒト化抗体を作成するのに用いる軽鎖および重鎖双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「ベスト−フィット」方法に従い、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受容する（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブ群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同一フレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体で用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１１７】
抗体は、抗原に対する高い親和性、および他の好ましい生物学的特性を保持しつつヒト化されるのがさらに重要である。この目標を達成するには、好ましい方法に従い、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析工程によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは通常入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配座構造を説明および表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示の調査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における可能性が高い残基の役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ残基は、標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエントおよび移入配列から選択および組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。
【０１１８】
ヒト抗体
ヒト化に対する代替法として、ヒト抗体を生じさせることができる。例えば、今や、免疫化に際して、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の十分なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生するのが可能である。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされると記載されている。そのような生殖系突然変異体マウスへの、ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子配列（ａｒｒａｙ）の移入の結果、抗原誘発に際してヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号および第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０１１９】
または、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロにてヒト抗体および抗体断片を産生することができる。この技術に従い、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主たるまたは従たるコート−タンパク質遺伝子のいずれかにインフレームにてクローン化し、ファージ粒子の表面の機能的抗体断片として表示する。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択がもたらされる。従って、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは種々の型式で行うことができ、それらの総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの原料をファージディスプレイに用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムなコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様な配列を単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己抗原を含む）抗原の多様な配列に対する抗体を、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号を参照されたい。
【０１２０】
ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によって生じさせてもよい（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照）。
【０１２１】
抗体断片
抗体断片の産生のために、種々の技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は完全抗体のタンパク質消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、今や、組換え宿主細胞によって直接的に産生することができる。例えば、抗体断片は、先に議論した抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接的に回収することができ、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。もう１つの手法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は当業者に明らかである。他の実施形態において、選択した抗体は単一鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  １９９３／１６１８５および米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載された「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性であってよい。
【０１２２】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープについて結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体はＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０、またはＥＢＩ３抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体はＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０、またはＥＢＩ３の１つに結合することができ、さらに、ＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０、またはＥＢＩ３のもう１つ、もしくはＴ細胞表面マーカーに結合することができる。二重特異性抗体を用いて、薬物または細胞傷害薬物を、抗原を含む細胞に局所化してもよい。これらの抗体はＷＳＸ−１、ｐ２８、ｇｐ１３０、またはＥＢＩ３結合アーム、および薬物または細胞傷害薬物に結合するアームを保有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１２３】
二重特異性抗体を作成する方法は当分野で公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、そこでは、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、その内１つのみが正しい二重特異性構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じる。通常は、アフィニティークロマトグラフィー工程によってなされる正しい分子の精製はむしろ面倒であり、産物の収率は低い。同様な手法がＷＯ  １９９３／０８８２９において、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１２４】
異なる手法によれば、所望の結合特異性を備える抗体可変ドメイン（抗体−抗原組み合わせ部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。好ましい融合は、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合および、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これは、構築で用いる３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率を提供する場合の実施形態における、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整することにおいて大きな柔軟性を提供する。しかしながら、同等な比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現の結果、高い収率が得られる場合、または比率が特に重要でない場合、１つの発現ベクターに２つまたは全ての３つのポリペプチド鎖についてのコード配列を挿入するのが可能である。
【０１２５】
手法の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は１つのアームにおいて第一の結合特異性を備えるハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおいて（第二の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。この非対称構造は、二重特異性分子の半分における免疫グロブリン軽鎖の存在は、分離の容易な方法を供するため、望まない免疫グロブリン鎖組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易とすることが判明した。この手法は、ＷＯ  １９９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を生じさせるさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１２６】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されたもう１つの手法によると、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように設計することができる。好ましい界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面からの一つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。大きな側鎖に対する同一または同様なサイズの代償「キャビティ」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって第二の抗体分子の界面に生じさせる。これは、ホモ二量体などの他の望まない最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増大させるためのメカニズムを提供する。
【０１２７】
二重特異性抗体は、架橋されたまたは「ヘテロ接合」抗体を含む。例えば、へテロ接合体における抗体の１つをアビジンに、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞の望まない細胞への標的化（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療（ＷＯ  １９９１／００３６０、ＷＯ  １９９２／２００３７３、およびＥＰ  ０３０８９）のために提案されている。ヘテロ接合抗体は、いずれかの便利な架橋方法を用いて作成してもよい。適当な架橋剤は当分野で周知であり、例えば、多数の架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１２８】
抗体断片から二重特異性抗体を生じさせるための技術もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、完全抗体がタンパク質分解により切断されてＦ（ａｂ’）２断片を生じさせる手法を記載する。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生じたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエタノールアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再度変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生じた二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として用いることができる。
【０１２９】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し、単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモ二量体はヒンジ領域において還元されて単量体を形成し、次いで、再度酸化されて、抗体へテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生で利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載された「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体断片を作成するため代替メカニズムを提供した。前記断片は、余りにも短くて同一鎖上の２つのドメインの間の対合を可能としないリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、強制的にもう１つの断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合され、それにより２つの抗原結合部位を形成する。単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作成するためのもう１つの戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１３０】
２つより多い価数を備える抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１））。
【０１３１】
ある種の融合タンパク質、例えば、ある種のＷＳＸ−１またはｐ２８融合タンパク質は、二重特異性抗体の産生技術に類似の技術を用いて調製することができることが明らかである。二重特異性抗体に基づくＷＳＸ−１またはｐ２８融合タンパク質は、細胞特異的マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、およびＮＫ１．１）に結合する１つのアーム、および抗原結合ドメインがＷＳＸ−１またはｐ２８ポリペプチドでそこで置換された１つのアームを保有することができる。
【０１３２】
抗体の接合および他の修飾
本明細書において、前記方法で用いられ、または製品に含まれる抗体は、任意でＷＯ  ２００４／０３２８２８および米国特許出願公開２００６／００２４２９５に記載されているように、薬物に接合される。本発明の抗体は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ  １９８１／０１１４５を参照）を活性な抗癌剤または他の薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素と接合させてもよい。例えば、ＷＯ  １９８８／０７３７８、米国特許第４，９７５，２７８号、および米国特許出願公開２００６／００２４２９５を参照されたい。
【０１３３】
抗体の他の修飾が本明細書において考えられる。例えば、抗体は種々の非タンパク質性ポリマーのうちの１つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーに連結させることができる。
【０１３４】
本明細書で開示された抗体はリポソームとして処方してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、米国特許第４，４８５，０４５号、第４，５４４，５４５号、およびＷＯ１９９７／３８７３１  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｏｃｔ．２３，１９９７に記載されたような、当分野で公知の方法によって調製される。増強された循環時間を備えるリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１３５】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発方法によって産生することができる。リポソームを規定された孔径のフィルターを通して押出して、所望の直径を備えるリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド相互交換反応を介し、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されているようにリポソームに接合させることができる。化学療法剤は、任意で、リポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０１３６】
本明細書において記載されたタンパク質またはペプチド抗体のアミノ酸配列修飾が考えられる。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改良するのが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または残基への挿入、および／または残基の置換を含む。欠失、挿入、および置換のいずれの組み合わせも行って、最終構築体に到達し、最終構築体は所望の特性を保有する。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置の変化などのように、抗体の翻訳後プロセスを改変することもできる。
【０１３７】
突然変異誘発のための好ましい位置である抗体のある種の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって記載されたように、「アラニン−スキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここに、残基または標的残基の群が同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）に置換されて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響する。次いで、置換の部位において、または前記部位のために、さらなるまたは他の変異体を導入することによって、置換に対する機能的感度を示すアミノ酸の位置を改良する。従って、アミノ酸配列変動を導入するための部位は特定されているが、突然変異の性質は、それ自体、特定されている必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するためには、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で行い、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０１３８】
アミノ酸配列挿入は、１から１００の残基長以上を含むポリペプチドのアミノ−および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を備える抗体、または細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素、または抗体の血清中半減期を増大させるポリペプチドの、抗体のＮ−またはＣ末端への融合を含む。
【０１３９】
もう１つのタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。抗体の置換突然変異誘発のための最大の目標となる部位は超可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた考えられる。このような置換は保存的または非保存的であり得る。
【０１４０】
抗体の適切な立体配座の維持に関与しないいずれのシステイン残基も、一般にセリンで置換して、分子の酸化的安定性を改良し、異常な架橋を妨げることもできる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に）その安定性を改良することができる。
【０１４１】
１つのタイプの置換変異体は、親抗体の一つまたは複数の超可変領域残基での置換を含む。一般に、さらなる開発のために選択された取得変異体は、元の親抗体に対して改良された生物学的特性を有する。そのような置換変異体を生じさせるための便利な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟である。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生じた抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、線維状ファージ粒子から一価様式で表示される。次いで、ファージ表示変異体を、本明細書において開示されたように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するためには、アラニン−スキャニング突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。別法として、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体および抗原の間の接触点を同定するのは有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書において説明した技術による置換の候補である。一旦そのような変異体が産生されたならば、変異体のパネルを本明細書において記載されたようなスクリーニングに供し、一つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を備える抗体をさらなる開発のために選択することができる。
【０１４２】
抗体のアミノ酸変異体のもう１つのタイプは、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。このような改変は、抗体に見出される一つまたは複数の炭水化物部分の欠失、および／または抗体に存在しない一つまたは複数のグリコシル化部位の付加を含む。
【０１４３】
ポリペプチドのグルコシル化は、一般的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合とは、炭水化物部分のアスパラギン残基側鎖への付加を指す。Ｘがプロリンを除くいずれかのアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素付加のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じさせる。Ｏ結合グリコシル化とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロース糖のうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンへの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンを用いてもよい。
【０１４４】
グリコシル化部位の抗体への付加は、前記したトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位のための）の一つまたは複数を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって、都合よく達成される。前記改変は、一つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の（Ｏ結合グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への付加、または前記残基による置換によってなすこともできる。
【０１４５】
抗体がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を改変しまたは除去することができる。例えば、本明細書の１つのグリコシル化変異体において、一つまたは複数のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入して、一つまたは複数のグリコシル化部位を排除する。このような無グリコシル化抗体は、補体活性化および／または抗体依存性細胞介在細胞傷害性を誘導する能力が減少し、および無グリコシル化抗体がＦｃ受容体に対して低下した結合性（または無結合性）を有することができるように、例えば、ヒトＩｇＧ１と比較して低下したエフェクター機能を有することができる。
【０１４６】
ある種の抗体については、例えば、抗体の枯渇、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増強させるための抗体の修飾が望ましい。例えば、抗体のＦｃ領域に付着したフコースを欠如する成熟炭水化物構造を備える抗体はＵ．Ｓ．２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。また、Ｕ．Ｓ．２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を参照されたい。抗体のＦｃ領域に付着した炭水化物中のバイセクトＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を備える抗体は、ＷＯ２００３／０１１８７８，Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．および米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．に参照される。抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を備える抗体はＷＯ  １９９７／３００８７，Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．に報告されている。また、そのＦｃ領域に付着した改変された炭水化物を備える抗体に関するＷＯ  １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ  １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。
【０１４７】
従って、グリコシル化変異体は、任意で、Ｆｃ領域に付着した炭水化物構造がフコースを欠如するＦｃ領域を含む。そのような変異体は改良されたＡＤＣＣ機能を有する。任意で、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改良するその中の一つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４（残基のＥｕナンバリング）における置換をさらに含む。「脱フコシル化」または「フコース欠乏」抗体に関連する刊行物の例は、Ｕ．Ｓ．２００３／０１５７１０８、ＷＯ  ２０００／６１７３９、ＷＯ  ２００１／２９２４６、Ｕ．Ｓ．２００３／０１１５６１４、Ｕ．Ｓ．２００２／０１６４３２８、Ｕ．Ｓ．２００４／００９３６２１、Ｕ．Ｓ．２００４／０１３２１４０、Ｕ．Ｓ．２００４／０１１０７０４、Ｕ．Ｓ．２００４／０１１０２８２、Ｕ．Ｓ．２００４／０１０９８６５、ＷＯ  ２００３／０８５１１９、ＷＯ  ２００３／０８４５７０、ＷＯ  ２００５／０３５５８６、ＷＯ  ２００５／０３５７７８、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）を含む。脱フコシル化抗体を産生する細胞系の例は、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、Ｕ．Ｓ．２００３／０１５７１０８，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、およびＷＯ  ２００４／０５６３１２，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，特に実施例１１）、およびα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子および／またはＦＵＴ８−ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞系（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））を含む。
【０１４８】
例えば、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増強させるために、エフェクター機能に関する抗体の修飾は、一つまたは複数のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することによって達成することができる。別法として、または加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入することにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とすることができる。このようにして産生したホモ二量体抗体は、改良された内在化能力および／または増大した補体介在細胞致死およびＡＤＣＣを有することができる。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を備えるホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されたようにヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製することもできる。または、二重Ｆｃ領域を有する抗体を作成することができ、およびそれにより増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。ＷＯ  ２０００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）は、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ機能が改良された抗体を記載し、前記抗体はそのＦｃ領域においてアミノ酸置換を含む。好ましくは、改良されたＡＤＣＣを備える抗体は、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４における置換を含む。好ましくは、改変されたＦｃ領域は、これらの位置のうち１、２または３における置換を含む、または置換からなるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。
【０１４９】
改変されたＣ１ｑ結合および／またはＣＤＣを備える抗体は、ＷＯ  １９９９／５１６４２および米国特許第６，１９４，５５１号、第６，２４２，１９５号、第６，５２８，６２４号、および第６，５３８，１２４号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。抗体は、そのＦｃ領域の一つまたは複数のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３、および／または３３４におけるアミノ酸置換を含む。
【０１５０】
抗体の血清中半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されたように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に取込むことができる。本明細書において、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させることを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。そのＦｃ領域における置換、および増大した血清中半減期を備える抗体はＷＯ  ２０００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。
【０１５１】
本発明の非枯渇（または他の）抗体のいずれも、ＦｃＲｎ結合または血清中半減期を改良する、Ｆｃ領域における少なくとも１つの置換を含むことができる。例えば、本発明は、改変された新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合親和性を備える、変異体Ｆｃ領域を含む抗体をさらに提供する。ＦｃＲｎは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と構造的に同様であり、β２−ミクログロブリンに非共有結合したα鎖からなる。新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎの複数の機能はＧｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３９−７６６に概説されている。ＦｃＲｎは、母親からの免疫グロブリンＩｇＧの子供への受動的送達、および血清中ＩｇＧレベルの調節において役割を果たす。ＦｃＲｎは、細胞内および細胞を横切って完全形態の飲作用を受けたＩｇＧに結合しおよびそれを輸送し、それらを初期分解経路から救済するサルベージ受容体として作用する。ＩｇＧをサルベージすることを担うメカニズムは依然として明らかでないが、未結合ＩｇＧはリソソーム中でのタンパク質分解に向けられ、他方、結合したＩｇＧは細胞の表面に再利用され、放出されると考えられる。この制御は、成人の組織全体に位置した内皮細胞内で起こる。ＦｃＲｎは少なくとも肝臓、乳腺、および成人の腸において発現される。ＦｃＲｎはＩｇＧに結合し、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用は広く研究されており、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３ドメイン界面における残基に関連するようである。これらの残基は、ＦｃＲｎのα２ドメインに初期に位置する残基と相互作用する。
【０１５２】
本発明のある実施形態において、非枯渇変異体抗体はＦｃＲｎに対する増大した結合を表示でき、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のいずれかの一つまたは複数におけるアミノ酸修飾を含むことができ、Ｆｃ領域における残基のナンバリングはＫａｂａｔにおけるＥＵ指標のそれである。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、および、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。本発明の１つの実施形態において、抗体は、少なくともＡｓｎ  ４３４のＨｉｓ（Ｎ４３４Ｈ）へのアミノ酸置換を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。本発明の１つの実施形態において、抗体は、少なくともＡｓｎ  ４３４のＡｌａ（Ｎ４３４Ａ）への、アミノ酸置換を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。一般的には、これらの変異体は、天然配列／野生型配列Ｆｃ領域を有するポリペプチドよりもＦｃＲＮに対するより高い結合親和性を含む。これらのＦｃ変異体ポリペプチドおよび抗体は、分解されるよりはむしろサルベージおよび再利用される利点を有する。これらの非枯渇抗体は本明細書において提供された方法で用いることができる。
【０１５３】
３以上の（好ましくは、４の）機能的抗原結合部位を備える作成された抗体も考えられる（ＵＳ  ２００２／０００４５８７Ａ１，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０１５４】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法は、（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合における）天然源からの単離、または抗体のより初期に調製された変異体または非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド介在（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット変異導入による調製を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５５】
炎症の治療
本発明の１つの態様は、哺乳動物患者、例えば、ヒト患者において炎症性疾患を治療する方法を提供する。治療すべき炎症性疾患は本質的にいずれの炎症性疾患でもあり得る。前記疾患は、任意で、Ｔ細胞介在のものであり、例えば、前記疾患はＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、Ｔ１７細胞、ＴＨ−１７細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γ／δＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、および／または調節性Ｔ細胞によって介在され得る。治療すべき例示的な炎症性疾患は、免疫異常（例えば、自己免疫病）；感染；多発性骨髄腫、骨髄性および他の白血病、ならびに腫瘍転移などの癌；アレルギー；関節炎；喘息；潰瘍性大腸炎またはクローン病などの炎症性腸疾患；ブドウ膜炎；乾癬；狼瘡；多発性硬化症；慢性感染性病；結核；強直性脊椎炎；移植片拒絶；サルコイドーシス；肝炎；中枢神経系の炎症；後天性免疫不全症候群；急性膵炎；アジソン病；アルコール性肝硬変を含むアルコール誘導肝傷害；アルツハイマー病；無脊椎アテローム性動脈硬化症；喘息および他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫血管炎；自己免疫肝炎誘導肝傷害；胆汁性肝硬変；ＡＩＤＳ誘導悪液質を含む悪液質／食欲不振；慢性疲労症候群；クロストリジウム関連下痢を含むクロストリジウム関連病；鬱血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全、および冠動脈バイパスグラフトを含む冠動脈疾患および適応症；若年性発症１型、真性糖尿病、およびインスリン耐性を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎、および関連疾患；精巣上体炎；エリスロポエチン耐性；発熱；線維筋痛または無痛；糸球体腎炎；移植片対宿主病／移植片拒絶；グレーブス病；ギラン・バレー症候群；橋本病；溶血性貧血；出血性ショック；痛覚過敏；変形性関節炎、関節リウマチ、若年性（リウマチ性）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群および反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎（例えば、川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘導関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎およびリウマチ性多発筋痛症および巨細胞性動脈炎を含む、関節の炎症性疾患およびリウマチ病；例えば角膜移植に関連する炎症性眼病；例えば角膜移植に関連する炎症性眼病；炎症性腸疾患；脳虚血を含む虚血；川崎病；学習機能障害；肺疾患；ループス腎炎；多発性硬化症；重症筋無力症；筋疾患；神経炎症病；神経毒性；眼変性およびブドウ膜炎を含む眼疾患および症状；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；天疱瘡；歯周疾患；毛孔性紅色粃糠疹；早期陣痛；前立腺炎および関連疾患；乾癬および関連疾患；乾癬性関節炎；肺線維症；再灌流傷害；リウマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；強皮症；敗血症性ショック；放射線療法の副作用；シェーグレン症候群；睡眠障害；脊椎関節症；全身性エリテマトーデス；一過性顎関節病；甲状腺炎；組織移植または筋挫傷、捻挫、軟骨傷害、外傷および整形外科手術に起因する炎症性疾患；血管炎；または筋挫傷、捻挫、軟骨傷害、外傷、整形外科手術、感染または他の疾患経過に起因する炎症性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
実施形態の１つのクラスにおいて、前記方法は、患者に、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ｐ２８ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、ＥＢＩ３ポリペプチド、可溶性ＷＳＸ−１／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、可溶性ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＩＬ−２７複合体、可溶性ｇｐ１３０／ｐ２８ポリペプチド複合体、可溶性ｇｐ１３０／ＥＢＩ３ポリペプチド複合体、ｐ２８ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ＥＢＩ３ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、ＩＬ−２７および可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびｐ２８ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびＩＬ−２７、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよびＥＢＩ３ポリペプチド、およびその変異体からなる群より選択される、単離または組換え部分を投与することを含む。組換えまたは単離されたポリペプチドの組み合わせが投与される実施形態においては（例えば、ｐ２８ポリペプチドおよび可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド）、ポリペプチドが複合体を形成できるが、その必要はなく、ポリペプチドは同時投与でき、または別々に投与できる。
【０１５７】
実施形態のもう１つのクラスにおいて、前記方法は、患者にｇｐ１３０／ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体に特異的に結合またはその活性を調節する、もしくは（例えば、原形質膜において）細胞中の複合体の形成を調節する部分を投与することにより疾患について患者を治療することを含む。前記部分は、例えば、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、および活性調節因子であり得る。任意で、前記部分はｇｐ１３０／ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７複合体の形成または活性を増強させる。
【０１５８】
実施形態のいずれかのクラスにおいて、前記方法は任意で、前記投与に先立って炎症性疾患の患者を診断することを含む。治療上有効量の成分が、一般的に患者に投与される。任意で、患者は治療に対する応答についてモニターされる。実施形態の１つのクラスにおいて、治療の開始後、患者は、炎症の減少、例えば、炎症細胞数の低下、循環中または炎症の部位におけるＩＬ１７＋Ｔ細胞数の低下、および／またはＩＬ１７の発現の減少を示す。
【０１５９】
関連複合体は、任意で、インビボで形成され得るのは明らかである。例えば、ポリペプチドが投与される実施形態において、ポリペプチドは内因性タンパク質とで活性複合体を形成できる。１つの例として、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド（例えば、ＷＳＸ−１Ｆｃ融合タンパク質）が患者に投与される場合、ＷＳＸ−１は内因性ｐ２８および／またはＩＬ−２７とで複合体を形成でき、治療的結果に導く。投与されるべきポリペプチドは、任意で、例えば、野生型タンパク質よりも受容体成分に対してより高い親和性を有する変異体である（例えば、変異体が由来する、対応する天然型ｐ２８よりも、ＷＳＸ−１またはＷＳＸ−１／ｇｐ１３０受容体複合体に対してより高い親和性を有する変異体ｐ２８、またはｇｐ１３０に対して増大した親和性を有する変異体可溶性ＷＳＸ−１）。
【０１６０】
１つの態様において、前記方法は、治療上の有効量を、前記部分および少なくとも第二の化合物との組み合わせを患者に投与することを含む。前記第二の化合物は、一般的には、例えば、標準的治療または実験的治療などの炎症性疾患を治療するのに用いるものである。例示的な第二の化合物は、ＩＬ−２３、ＩＬ−１２、ＩＬ−６またはＴＧＦに影響する免疫調節因子（例えば、ＩＬ−１２  ｐ４０、ｐ３５またはＩＬ−２３  ｐ１９に特異的な抗体）；ＩＬ−１（例えば、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、可溶性ＩＬ−１受容体）およびＴＮＦ（例えば、抗ＴＮＦ抗体、エタネルセプト、インフリキシマブ、およびレフルノミド）の機能と拮抗する抗体または薬剤；細胞傷害薬物；免疫抑制剤（例えば、シクロホスファミド）；Ｂ細胞表面マーカーアンタゴニスト；Ｂ細胞表面マーカーに対する抗体；例えば、リツキシマブ（ＵＳ２００６００５１３４５を参照）などのＣＤ２０抗体；ＣＤ５、ＣＤ２８、またはＣＤ４０抗体または遮断薬；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））などのα４−インテグリン抗体またはアンタゴニスト、ミコフェノール酸モフェチル、スタチン、ＬＦＡ−１またはＣＤ−１１ａ抗体もしくは遮断薬（「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」と題されたＪａｒｄｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開２００５０２８１８１７を参照）、インターロイキン−１２抗体、βインターフェロン（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標）などのインターフェロンβ−１ａ、またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）などのインターフェロンβ−１ｂ）、グラチラマー酢酸（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））、アレムツヅマン（ＣａｍＰａｔｈ（登録商標））などのＣＤ５２抗体、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）、インターロイキン−２受容体αサブユニットに対する抗体）などのインターロイキン受容体抗体等を含むが、これらに限定されない。実施形態の１つのクラスにおいて、第二の化合物は増形質転換殖因子β（ＴＧＦ−β）である。
【０１６１】
１つの実施形態において、患者は炎症性疾患を治療するために薬物で従前には決して治療されておらず、および／または本発明の成分で従前には決して治療されていない。もう１つの実施形態において、患者は炎症性疾患を治療するために従前に薬物で治療されており、および／またはそのような成分で従前に治療されている。
【０１６２】
一般的には、患者はすなわち、適格患者などの、炎症性疾患の治療に適格がある。本明細書における目的において、このような適格患者は、炎症性疾患の一つまたは複数の症状、兆候または他の指標を経験しつつあり、経験したことがある、または経験した可能性が高い；例えば、新たに診断された、新しい再発または悪化と従前に診断され、および寛解されている等に拘わらず、炎症性疾患と診断されたことがある；および／または炎症性疾患を発症する危険性がある患者である。
【０１６３】
投与
当業者に理解されるように、本発明の成分の適当な用量（例えば、ポリペプチド、複合体、抗体等）は、一般には、同様な成分が単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与される臨床的療法で既に使用されたものの程度である。用量の変動は、治療すべき疾患に依存して起こる可能性が高い。治療を投与する医師は、個々の患者についての適当な用量を決定することができる。前記成分と組み合わせて投与される市販されている第二の化合物についての調製および投与スケジュールは、製造業者の指示に従って用いることができるか、または技量がある実施者によって経験的に決定できる。
【０１６４】
病気の予防または治療のための、前記成分、および前記成分と組み合わせて投与されるいずれかの第二の化合物の適当な用量は、前記定義の治療すべき病気のタイプ、病気の重症度および経過、前記成分または組み合わせが予防的または治療的目的で投与されるか、従前の療法、抗体または組み合わせに対する患者の臨床的履歴および応答、ならびに主治医の裁量に依存する。前記成分または組み合わせは、一般的に一連の治療にわたって、１回以上患者に適切に投与される。
【０１６５】
病気のタイプおよび重症度に依存して、例えば、一つまたは複数の別々の投与によるか、または持続注入によるかを問わず、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の前記成分が患者への投与のための最初の候補用量である。一般的な日用量は、前記した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上におよぶ。数日以上にわたる反復投与では、疾患に依存して、病兆の所望の抑制が起こるまで治療を維持する。しかしながら、他の投与計画は有用であり得る。一般的には、臨床家は、必要とされる生物学的効果を提供する用量に到達するまで、本発明の成分を（単独でまたは第二の化合物と組み合わせて）投与する。本発明の療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１６６】
前記成分は、非経口、局所、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、および／または病巣内投与を含むいずれかの適当な手段によって投与することができる。非経口注入は筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。鞘内投与もまた考えられる（例えば、Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚによる米国特許出願公開２００２／０００９４４４を参照）。加えて、前記成分は、適切には、例えば、前記成分の用量を減少させつつパルス注入によって投与することができる。任意で、投与は静脈内または皮下に、任意で静脈内注入によって行われる。同一または異なる投与手段を用いて各曝露を提供することができる。１つの実施形態において、各曝露は静脈内投与による。
【０１６７】
上で述べたように、前記成分は単独でまたは少なくとも第二の化合物との組み合わせて投与することができる。これらの第二の化合物は、一般には同一用量で、および以前に用いられていた投与経路で、または以前に使用された用量の約１〜９９％で用いられる。このような第二の化合物を用いる場合、任意で、前記成分が存在しないよりも低い量で第二の化合物を用いることにより引き起こされる副作用を排除し、または低下させる。
【０１６８】
本発明の成分、およびいずれかの第二の化合物の投与は同時に、例えば、単一組成物としてまたは同一または異なる投与経路を用いて２以上の別々の組成物として行うことができる。別法として、または加えて、前記投与はいずれかの順序で順次に行うことができる。ある実施形態において、数分〜数日、ないし数週間〜数ヶ月におよぶ間隔を、２以上の組成物の投与の間に存在させることができる。例えば、前記成分を最初に投与し、続いて本発明の第二の化合物を投与することができる。しかしながら、同時投与または本発明の第二の化合物の最初の投与も考えられる。
【０１６９】
第三、第四等の化合物を、任意で、前記成分および前記第二の化合物と組み合わせて投与する。同様に、に対して二次的なまたは炎症性疾患（例えば、痙性、失禁、疼痛、疲労等）に関連する兆候の治療を、例えば前記成分または組み合わせでの治療の間に患者に投与することができる。
【０１７０】
医薬処方
本発明に従って用いる本発明の成分（例えば、ポリペプチド、複合体、抗体等）の治療処方は、所望の程度の純度を有する成分を、凍結乾燥処方または水溶液の形態で、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、およびリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなどの）保存剤；（約１０残基未満の）低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１７１】
皮下投与に適合させた凍結乾燥処方は、例えば、米国特許第６，２６７，９５８号（Ａｎｄｙａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。このような凍結乾燥処方は適当な希釈剤で高タンパク質濃度まで元に戻すことができ、および元に戻された処方は本明細書中で治療すべき哺乳動物に皮下投与できる。前記成分の結晶化形態もまた考えられる。例えば、Ｕ．Ｓ．２００２／０１３６７１９Ａ１（Ｓｈｅｎｏｙ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。
【０１７２】
前記処方は、本明細書において、少なくとも治療すべき特定の適応症に必要な第二の化合物、好ましくは、相互に悪影響しない相補的活性を備えるものを含むこともできる。例えば、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、細胞傷害薬物（例えば、メトトレキセート、シクロホスファミド、またはアザチオプリン）、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニストまたは抗体、成長因子、ホルモン、インテグリン、インテグリンアンタゴニストまたは抗体（例えば、ＬＦＡ−１抗体、またはナタリズマブなどのα４インテグリン抗体）、ＩＦＮ−β−１ａまたはＩＦＮ−β−１ｂなどのインターフェロンのクラスの薬物、酢酸グラチラマーなどのオリゴペプチド、静脈内免疫グロブリン（γグロブリン）、リンパ球枯渇薬物（例えば、ミトキサントロン、シクロホスファミド、ＣａｍＰａｔｈ（登録商標）抗体、またはクラドリビン）、非リンパ球枯渇免疫抑制薬物（例えば、ＭＭＦまたはサイクロスポリン）、「スタチン」クラスのコレステロール降下薬、エストラジオール、狼瘡またはＭＳ（例えば、痙性、失禁、疼痛、疲労）の二次的または関連する兆候を治療する薬物、ＴＮＦ阻害剤、疾患修飾性抗リウマチ薬物、非ステロイド抗炎症薬物、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、またはグルココルチコイド）、レボチロキシン、サイクロスポリンＡ、ソマトスタチンアナログ、抗代謝産物、Ｔ−またはＢ細胞表面アンタゴニスト／抗体等、もしくは処方において前記した他のものをさらに提供するのが望ましい。このような他の薬剤のタイプおよび有効量は、例えば、処方に存在する成分量、治療すべき炎症性疾患のタイプ、および患者の臨床的パラメーターに依存する。
【０１７３】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）における、またはマクロエマルジョンにおける、各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入することもできる。このような技術は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１７４】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適当な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透膜マトリックスを含み、このマトリックスは、例えばフイルム、またはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。徐放マトリックスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸塩から構成される注射可能マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０１７５】
インビボ投与で用いるべき処方は滅菌されていなければならない。これは、除菌膜を通じての濾過によって容易に達成される。
【０１７６】
関連技術の議論
現在開発中であるか、または市販されているいくつかのサイトカインまたはサイトカイン特定アンタゴニストがある。
【０１７７】
多数の組換えサイトカインが種々の臨床背景において用いられる。これらはＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩ型ＩＦＮを含む。これらのタンパク質は、主として免疫細胞の刺激体として、および成長因子として作用させるため、もしくは抗癌またはウイルス応答を増強させるために用いられている。免疫系を阻害するサイトカインは、例えば、Ｔ細胞機能に必要なアクセサリー細胞の機能に間接的に働き、標的としてのクローン病および炎症性腸疾患に対して特異的に開発されたＩＬ−１０、およびＴＧＦなど、少数しか用いられていない。。これらでの成功は制限されている。
【０１７８】
ＩＬ−１２  ｐ４０のアンタゴニストは、いくらかの成功によってクローン病の患者について、臨床試験でテストされてきた。
【０１７９】
ＩＬ−１５のアンタゴニストは、このサイトカインがこの病気の発生に関与したという観察結果に基づいて、関節炎について臨床試験中である。
【０１８０】
ＩＬ−１受容体アンタゴニストは、関節リウマチの患者を治療するのに用いられる市販品である。これは、炎症促進性サイトカインＩＬ−１とその受容体との相互作用を遮断する製品である。
【０１８１】
（とりわけ）Ａｍｇｅｎ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒｏｃｏｒは、関節リウマチの患者の治療で現在使用されているサイトカインＴＮＦ−αに特異的な抗体／アンタゴニストを開発した。これは、炎症を妨げるための内因性サイトカインの中和に依拠する手法である。同様な手法が、ＩＬ−１およびＩＬ−６に特異的な抗体で調べられている。１つの安全性の問題は、これらの治療が、ＴＢおよびトキソプラズマ症を含む日和見感染の発生に関連付けられていることである。
【０１８２】
他の製品に対する差／利点
これらの製品（特に、ＩＬ−１０）の多くは、炎症時にＴ細胞応答を直接的に標的とできない。ＷＳＸ−１はＴ細胞によって発現されるので、この受容体を標的とする戦略は、現在用いられているまたは開発されつつある他の手法のいくつかよりもかなり特異的な効果を有すると予測される。加えて、現在の標的の多くはＴ細胞活性の下流の単一分子であり、他方、ｐ２８／ＷＳＸ−１（および他の融合タンパク質および本明細書において記載された複合体）はこれらの因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、ＩＬ−６）の多くを直接的に標的とし、加えてＩＬ−１０の発現を増大させることができることにより治療効果を増幅させる。加えて、副作用が多くのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ）で認められているが、本発明者らは、組換えＩＬ−２７で処理されたマウスにおいて、いかなる臨床疾患の明らかな兆候も観察されなかった。
【０１８３】
核酸およびポリペプチド配列および変異体
種々の天然型ＷＳＸ−１、ｇｐ１３０、ｐ２８、およびＥＢＩ３タンパク質および核酸についての配列は公的に入手できる。例えば、ヒトｐ２８についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿６６３６３４およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿１４５６５９、ヒトＥＢＩ３についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿００５７４６およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿００５７５５、ヒトＷＳＸ−１についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿００４８３４およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿００４８４３、ヒトｇｐ１３０についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿００２１７５およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿００２１８４、ネズミｐ２８についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿６６３６１１．１およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿１４５６３６．１、マウスＥＢＩ３についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿０５６５８１．１およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿０１５７６６、マウスＷＳＸ−１についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿０５７８８０．１およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿０１６６７１、およびマウスｇｐ１３０についてのタンパク質配列ｉｄ  ＮＰ＿０３４６９０およびヌクレオチド配列アクセッション番号ＮＭ＿０１０５６０を参照されたい。これらのヌクレオチドまたはアミノ酸配列に相同なまたは実質的に同一な配列もまた、本発明の目的である。本明細書において述べたように、このようなタンパク質の種々の可溶性および／または融合変異体は記載されており（例えば、米国特許出願公開２００４０１８５０４９およびＷｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，前記を参照）、およびｐ２８およびＥＢＩ３の組換え変異体は市販されている。
【０１８４】
新規ＷＳＸ−１およびｐ２８融合タンパク質を含む、多数のさらなる新規なポリペプチドが本明細書において記載されている。このような融合タンパク質は抗体ドメインを含むことができ、前記で詳細に記載したように、任意で、二重特異性抗体に基づく。
【０１８５】
１つの態様において、本発明は、本発明の新規なポリペプチドをコードする種々のポリヌクレオチドを提供する。例えば、１つの実施形態は、組換えまたは単離されたＷＳＸ−１融合タンパク質をコードする核酸を提供し、前記融合タンパク質は、細胞特異的マーカー、またはｐ２８またはＥＢＩ３由来の一つまたは複数のポリペプチドドメインを認識する、一つまたは複数のドメインを含む。核酸は、任意で、抗体ドメイン、Ｆｃ領域、ｐ２８ドメイン、またはＥＢＩ３ドメインから選択される一つまたは複数のポリペプチドドメイン、ならびにＷＳＸ−１ポリペプチドをコードする。もう１つの例示的な実施形態は、組換えまたは単離されたｐ２８融合タンパク質を含む核酸を提供する。これまでの実施形態に関して、核酸は、任意で、一つまたは複数の抗体ドメイン、Ｆｃ領域、およびＥＢＩ３ドメイン、ならびにｐ２８ポリペプチドをコードする。
【０１８６】
当業者であれば、本明細書において記載された機能を備える多くの関連配列、例えば、ＷＳＸ−１融合タンパク質、ｐ２８融合タンパク質、ｇｐ１３０融合タンパク質、ＥＢＩ３融合タンパク質、可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド等をコードするポリヌクレオチドを提供することを認識する。
【０１８７】
遺伝暗号の縮重のため、多くのポリヌクレオチドは、同等に所定のポリペプチド配列をコードする。前記した配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチド配列が、本発明のポリヌクレオチド内に含まれる。同様に、核酸の実質的全長にわたって、高ストリンジェント条件下で前述のポリヌクレオチドにハイブリダイズする（および天然に存在するポリヌクレオチド以外である）人工的なまたは組換え核酸は、本発明のポリヌクレオチドである。
【０１８８】
ある実施形態において、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）は本発明のポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ベクターは発現ベクターである。もう１つの実施形態において、発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドの一つまたは複数に操作可能に連結されたプロモーターを含む。もう１つの実施形態において、細胞は本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【０１８９】
当業者であれば、開示された配列の多くの変異体が本発明に含まれるも認識する。例えば、機能的に同様な配列を生じる開示された配列の保存的変異は本発明に含まれる。変異体が少なくとも１つの開示された配列にハイブリダイズする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体は、本発明に含まれると考えられる。例えば、標準的な配列比較技術によって決定するように、本明細書において開示された配列がユニークなサブ配列もまた、本発明に含まれる。
【０１９０】
保存的変異
遺伝暗号の縮重のため、「サイレント置換」（すなわち、コードされたポリペプチドの改変をもたらさない核酸配列における置換）は、アミノ酸配列をコードするあらゆる核酸配列の言外の特徴である。同様に、アミノ酸配列中の１または限定数のアミノ酸が、高度に同様な特性を備えた、異なるアミノ酸で置換される「保存的アミノ酸置換」もまた、開示された構築体と高度に同様であるとして容易に同定される。各開示された配列のこのような保存的変異は、本発明の特徴である。
【０１９１】
特定の核酸配列の「保存的変異」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指し、もしくは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。当業者であれば、コードされた配列中の単一アミノ酸またはほんの数パーセントのアミノ酸（一般的には、５％未満、より一般的には４％、２％または１％未満）を改変し、付加しまたは欠失する個々の置換、欠失または付加は「保存的に修飾された変異」であり、前記改変が、関連機能を保有しつつ、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に同様なアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすことを認識する。従って、本発明の列挙されたポリペプチド配列の「保存的変異」は、ポリペプチド配列のアミノ酸のほんの数パーセント、一般的には５％未満、より一般的には２％または１％未満の、同一保存的置換基のアミノ酸での置換を含む。最後に、非機能的またはタグ配列（核酸におけるイントロン、コードされるポリペプチド中のポリＨｉｓまたは同様な配列等）の付加などの核酸分子にコードされた活性を改変しない配列の付加は、基本核酸またはポリペプチドの保存的変異である。
【０１９２】
機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換の表は当分野で周知であり、１つのアミノ酸残基が同様な化学的特性（例えば、芳香族側鎖または正に荷電した側鎖）を有する他のアミノ酸残基に代えて置換された結果、ポリペプチド分子の機能的特性は実質的に変化しない。表１は、同様な化学的特性の天然アミノ酸を含有する例示的な群を記載し、群内の置換は「保存的置換」である。
【表１】
2009543579.tif 000002
【０１９３】
核酸ハイブリダイゼーション
比較ハイブリダイゼーションを用いて、本発明の核酸の保存的変異を含む本発明の核酸を同定することができる。加えて、高、超高および超−超高ストリンジェント条件下で本発明の核酸にハイブリダイズする標的核酸は、前記核酸が天然型核酸以外である場合、本発明の特徴である。このような核酸の例は、本発明の所定の核酸配列と比較して、１または少数のサイレントまたは保存的核酸置換を備えるものを含む。
【０１９４】
「テスト核酸」は、それ自体が完全に一致した相補的標的に少なくとも５０％程度でプローブにハイブリダイズする場合、すなわち、完全に一致したプローブが完全に一致した相補的標的に結合する場合が、いずれかの一致していない標的核酸へのハイブリダイゼーションにおいて観察されたＳＮ比より少なくとも約５倍〜１０倍高い条件下で、標的に対するプローブのハイブリダイゼーションの少なくとも半分以上のＳＮ比である場合、プローブ核酸に特異的にハイブリダイズするという。
【０１９５】
核酸は、一般的に溶液中で会合する場合、「ハイブリダイズ」する。核酸は、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等のような、種々のよく特徴付けられた物理化学力によりハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドが、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  パートＩ第二章，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の間のジョイントベンチャー、（２００７を通じて補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）において見出される；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）およびＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）は、オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識、検出および定量についての詳細を提供する。
【０１９６】
サザンまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に１００より多い相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃において１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルマリンで一晩行われるハイブリダイゼーションである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃における１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）を参照）。しばしば、高ストリンジェント洗浄の前に低ストリンジェント洗浄を行い、バックグラウンドプローブシグナルを除去する。例示的な低ストリンジェント洗浄は４０℃における１５分間の２×ＳＳＣ洗浄である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブの観察結果よりも５倍の（またはそれより高い）ＳＮ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。
【０１９７】
サザンまたはノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引はＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前記において、およびＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，１および２に見出される。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、いずれのテスト核酸についても経験的に容易に決定することができる。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の決定において、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、（例えば、温度の上昇せ、塩濃度の減少、界面活性剤濃度の増大せ、および／またはハイブリダイゼーションまたは洗浄におけるホルマリンなどの有機溶媒濃度の増加によって）、基準の選択された組が満足されるまで、徐々に増大される。例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件においては、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブの一致していない標的へのハイブリダイゼーションで観察結果より少なくとも５倍高いＳＮ比で、プローブが完全に一致した相補的標的に結合するまで、徐々に増大させる。
【０１９８】
「非常にストリンジェントな」条件は、特定のプローブの熱融点（Ｔｍ）と同等となるように選択される。Ｔｍは、テスト配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。本発明の目的において、一般に、「高度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定配列についてのＴｍよりも約５℃低いように選択される。
【０１９９】
「超高ストリンジェントな」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、完全に一致した相補的標的核酸に対するプローブの結合についてのＳＮ比が、一致していない標的核酸のいずれかに対するハイブリダイゼーションについて観察されたＳＮ比より少なくとも１０倍高くなるまで増加させるものである。完全に一致した相補的標的核酸のＳＮ比の少なくとも１／２のＳＮ比でハイブリダイズする条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超高ストリンジェント条件下でプローブに結合するという。
【０２００】
同様に、より高いレベルのストリンジェンシーでさえ、関連ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を徐々に増加させることによって決定することができる。例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーを、完全に一致した相補的標的核酸に対するプローブの結合についてのＳＮ比が、一致していない標的核酸のいずれかへのハイブリダイゼーションで観察されたＳＮ比の少なくとも１０×、２０×、５０×、１００×、または５００×以上高くなるまで増大させることが挙げられる。完全に一致した相補的標的核酸のＳＮ比の少なくとも１／２のＳＮ比で、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超−超高ストリンジェント条件下でプローブに結合するといわれている。
【０２０１】
ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号によって可能にされる最大コドン縮重を用いて作り出される場合に起こる。
【０２０２】
配列の比較、同一性、および相同性
２以上の核酸またはポリペプチド配列との関係で用語「同一」または「同一性割合」とは、以下に記載する配列比較アルゴリズムの１つ（または当業者に入手できる他のアルゴリズム）を用いて、または目視検査によって測定して最大対応性について比較および整列させた場合に、同一であるかまたは同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合を有する２以上の配列またはサブ配列を指す。
【０２０３】
２つの核酸またはポリペプチド（例えば、ＷＳＸ−１、ｐ２８、ＥＢＩ３、またはｇｐ１３０ポリペプチドをコードするＤＮＡ、またはＷＳＸ−１、ｐ２８、ＥＢＩ３、またはｇｐ１３０ポリペプチドのアミノ酸配列）との関係で語句「実質的に同一」とは、配列比較アルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定して最大対応性について比較および整列させた場合に、少なくとも約６０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する、２以上の配列またはサブ配列を指す。そのような「実質的に同一な」配列は、一般的には、現実の起源に言及することなく「相同」であると考えられる。好ましくは、「実質的な同一性」は、長さが少なくとも約５０残基である配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は少なくとも約１５０残基にわたって、または比較すべき２つの配列の全長にわたって実質的に同一である。
【０２０４】
タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらが通常の起源タンパク質またはタンパク質配列に、天然でまたは人工的に由来する場合、「相同」である。同様に、核酸および／または核酸配列は、それらが、共通の起源核酸または核酸配列に、天然でまたは人工的に由来する場合、相同である。相同性は、一般には、２以上の核酸またはタンパク質（またはその配列）間の配列類似性から推測される。相同性を確立するのに有用な配列間の類似性の正確な割合は、課題の核酸およびタンパク質で変化するが、５０、１００、１５０以上の残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）における２５％以下の配列相同性をルーチン的に用いて、相同性を確率する。例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上などのより高いレベルの配列類似性を用いて、相同性を確立することもできる。配列類似性割合を決定するための方法（例えば、初期パラメーターを用いるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）は本明細書において記載されており、一般に利用できる。「相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」は、種分化によって共通の起源遺伝子から進化した、異なる種における遺伝子である。通常、相同分子種は、進化の過程において同一または同様な機能を保有する。本明細書において用いるように、「相同分子種」は用語「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」に含まれる。
【０２０５】
配列の比較および相同性の決定のためには、一般的には１つの配列は、比較されるテスト配列対して参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テストおよび参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対するテスト配列の配列同一性割合を計算する。
【０２０６】
比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての調査、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の間のジョイントベンチャー，２００７まで補遺を参照）によって行うことができる。
【０２０７】
配列同一性割合および配列類似性を決定するのに適するアルゴリズムの１つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手できる。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同一長さのワードと整列させた場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致またはそれを満足する、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高いスコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前記）。これらの初期隣接ワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための調査を開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードのヒットは、累積整列スコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチング残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積整列スコアが達成されたその最大値から量Ｘだけ外れ；一つまたは複数の負のスコアリング残基整列の累積により、累積スコアがゼロ以下となり；またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向へのワードヒットの延長が停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは整列の感度およびスピードを決定する。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期設定として、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワード長さ（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）。
【０２０８】
配列同一性割合の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対するテスト核酸の比較における最も小さな合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は参照配列に対して類似であると考えられる。
【０２０９】
組換えポリペプチドの作成および単離
一般に、本発明の、または本発明の方法または組成物で用いるポリペプチドをコードする核酸は、クローニング、組換え、インビトロ合成、インビトロ増幅および／または他の入手可能な方法によって作成することができる。本質的にいずれの核酸も、特注品、またはＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）などの、種々の商業的供給源のいずれかから注文された標準品であり得る。加えて、種々の組換え方法を、本発明のポリペプチドをコードする発現ベクターを発現するのに用いることができる。核酸を作成するための組換え方法、発現された産物の発現および単離は周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ａｎｄ  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【０２１０】
細胞からのプラスミドまたは他の関連核酸の精製用に、大量のキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈのＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）およびＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）；およびＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ（商標）を参照）。いずれの単離されたおよび／または精製された核酸も、他の核酸を産生、細胞への形質移入、発現用の生物に感染させるため関連ベクターへの取込み等のために、さらに操作することができる。一般的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、および特定の標的核酸の発現調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、任意で、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物、原核生物、または双方におけるカセットの複製を可能とする配列（例えば、シャトルベクター）、および原核生物および真核生物系双方の選択マーカーを含む遺伝子発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または双方における複製および取込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｓｕｐｒａ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｓｕｐｒａ，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい。クローニングで有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣによって堤供される。例えば、Ｔｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅは、ＡＴＣＣによって毎年発行される。配列決定、クローニング、ならびに分子生物学および基礎をなす理論考察の他の態様についてのさらなる基本的な手法は、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹにおいても見出される。
【０２１１】
例えば、（例えば、次の核酸またはポリペプチド単離のための）細胞の単離および培養のための他の有用な文献は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第三版Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中に引用された文献；Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ａｎｄ  Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬを含む。
【０２１２】
種々のタンパク質の単離および検出方法は公知であり、例えば、本発明の組換え融合または可溶性タンパク質を発現する細胞の組換え培養からポリペプチドを単離するのに用いることができる。種々のタンパク質単離および検出方法は当分野で周知であり、例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；およびその中に引用された文献に記載されているものを含む。タンパク質精製および検出方法に関するさらなる詳細は、Ｓａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ  ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）に見出すことができる。
【０２１３】
従って、可溶性ＷＳＸ−１およびｇｐ１３０ポリペプチド、ｐ２８ポリペプチド、およびＥＢＩ３ポリペプチドを当業者が発現させ、精製することができる。または、多数のこのようなポリペプチドは市販されている。例えば、組換えｐ２８およびＥＢＩ３は、Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｂｎｏｖａ（ｄｏｔ）ｃｏｍ（ｄｏｔ）ｔｗ）から入手できる。ポリペプチド複合体が望まれる場合、複合体の２つ（またはそれ以上）のポリペプチド成分が、任意で、複合体と一緒に同時発現され、精製されるか、または成分は別々に精製後、組み合わせて複合体を形成することができる。成分は、任意で、複合体中で非共有結合により会合し、または任意で複合体中の化学的架橋剤等によって共有結合により連結される。
【実施例】
【０２１４】
本明細書において記載された実施例および実施形態は例示目的だけのためであり、その観点から種々の修飾または変化が当業者に示唆されており、本出願の精神および目的、および添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであると理解される。従って、以下の実施例は主張される発明を説明するために掲げるが、それを限定するものではない。
【実施例１】
【０２１５】
インターロイキン２７は、慢性ＣＮＳ炎症時におけるインターロイキン１７−産生Ｔヘルパー１７細胞の発生を負に調節する。
最近の研究は、実験的自己免疫脳炎などの自己免疫性に関連するＴＨ−１７細胞の発生に影響する事象に焦点を当ててきたが、ＴＨ−１７エフェクター応答に拮抗するサイトカインについては比較的ほとんど知られていない。本明細書における実験は、トキソプラズマ原虫に慢性的に感染したインターロイキン（ＩＬ）−２７Ｒ−欠損マウスが、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存性および顕著なＩＬ−１７応答に関連する、重度の神経炎症を発生したことを示す。インビトロでは、ナイーブ一次Ｔ細胞のＩＬ−２７処理は、ＳＴＡＴ１に依存するが、ＩＬ−６シグナル伝達のＳＯＣＳ３介在阻害から独立した、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βによって誘導されたＴＨ−１７細胞の発生を抑制した。従って、ＴＨ−１７細胞発生の強力な阻害剤であるＩＬ−２７は、これらの細胞によって介在される炎症病を治療するための有用な標的である。同様に、前記の融合タンパク質および複合体は、これらの細胞によって介在される炎症病を治療するための有用な手法を提供する。
【０２１６】
Ｔヘルパータイプ１（ＴＨ−１）−ＴＨ２パラダイムは約２０年間Ｔヘルパー細胞の機能の研究を支配してきたが１、最近の研究は、ＩＬ−２３に対する応答においてＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＴＮＦおよびＩＬ−６を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の新規なサブセットを同定した２、３。これらの「ＴＨ−１７」リンパ球は、実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）およびコラーゲン誘導関節炎を含むいくつかの自己免疫疾患に関連する炎症のメディエーターとして関係しているとみなされてきた３−７。結果として、これらの病理学的ＣＤ４＋Ｔ細胞の個体発生およびこれらの活性を調節する因子の定義において、関心対象であった８−１０。初期の研究は、ＴＨ−１７細胞産生を促進におけるＩＬ−２３の役割を確立する一方で、最近の研究は、ＩＬ−２３がＴＨ−１７細胞の新規産生における強い誘導因子ではないことを示した。ＩＬ−２３で刺激した場合に３、ＩＬ−２３欠損マウスからのＴ細胞がＩＬ−１７を分泌できるという観察結果は、他の因子がＩＬ−１７産生細胞の発生を促進することを示した８。いくつかの最近の報告は、事実、ネズミＴＨ−１７細胞の新規発生におけるＴＧＦ−βおよびＩＬ−６の臨床的な役割を同定した１１−１３。これらの発生におけるＩＬ−６およびＴＧＦ−βの重要性を示す際の成功は（少なくともマウスにおいては）比較的迅速であったが、ＴＨ−１７細胞の生理学的アンタゴニストについてはほとんど知られていない。
【０２１７】
エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）およびｐ２８から構成されるヘテロ二量体サイトカインであるＩＬ−２７は、ＩＬ−２７Ｒ（ＷＳＸ−１／ＴＣＣＲ）およびｇｐ１３０から構成される受容体複合体を介してシグナル伝達を行う１４、１５。ＩＬ−２７Ｒの発現は免疫細胞に制限されるが１５−１８、ＩＬ−６を含むいくつかのサイトカインの共有の受容体成分である相手方のｇｐ１３０は、免疫および非免疫細胞上で恒常的に発現される１９、２０。ＩＬ−２７の産生に導く事象に直接的に取り組んでいる研究はほとんどないが、現在のモデルは、ＩＬ−２７ヘテロ二量体が活性化ＡＰＣによって産生されると判断している２１。初期の報告は、Ｔ細胞増殖およびＴＨ１応答の発生を促進するＩＬ−２７の能力に焦点を当てており１８、２２；続く研究は、それが、種々の寄生虫感染に対する耐性に関与するＴＨ１およびＴＨ２応答も制限できることを示した。従って、ＩＬ−２７Ｒ−欠損（Ｉｌ２７ｒａ−／−）マウスは、トキソプラズマ症、シャーガス病、リーシュマニア症の急性段階の間に、過剰なＴヘルパー細胞応答および続く蠕虫攻撃を発生する２３−２６。最近、同様な表現型がＩＬ−２産生のＩＬ−２７阻害に関連付けられているが２７、ＩＬ−２７が他のＴ細胞サブセットまたは機能に対するさらなる抑制効果を有するか否かは明らかでなかった。
【０２１８】
炎症の急性モデルにおけるＩＬ−２７の役割の評価があるが８、慢性病におけるＩＬ−２７の役割、およびＩＬ−２７の組織特異的効果、理解については限られていた。証拠は、ＩＬ−２７がＣＮＳにおける炎症時に産生されるが２８、慢性トキソプラズマ症時におけるＩＬ−２７の可能な機能には取り組まれていないことを示唆し；ＩＬ−２７が「免疫特権」ＣＮＳにおいて炎症促進性または抗炎症効果を有するか否かは明瞭でなかった。
【０２１９】
本明細書において記載された結果は、トキソプラズマ原虫で慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−マウスが、脳における寄生虫の複製を制御するが、過剰なＴＨ−１７応答に関連する致死的なＣＤ４＋Ｔ細胞介在症状を生じることを明示する。さらなるエクスビボ研究は、ＩＬ−２７、またはそのｐ２８成分単独でさえ、度合は低いが、ＴＨ−１７細胞の発生に拮抗することができたことを示した。ＩＬ−２７の抑制活性は、ｇｐ１３０シグナル伝達のＳＯＣＳ３依存性阻害から独立していたが、ＳＴＡＴ１には依存していた。同時に、これらの知見は、ＩＬ−２７がＴＨ−１７細胞発生のアンタゴニストであることを同定し、従って、ＴＨ−１７細胞に関連する炎症病を治療するための可能な治療的標的を示す。
【０２２０】
結果
トキソプラズマ症脳炎時のＩＬ−２７の産生
リアルタイムＰＣＲを用いて、ＴＥ時のＩＬ−２７についての転写産物の相対的レベルを定量した。少量〜最小量のｅｂｉ３（ＥＢＩ３に対する遺伝子）およびＩｌ２７（ｐ２８に対する遺伝子）のｍＲＮＡが未感染脳において検出された。しかしながら、慢性的に感染したマウスからの組織においては、脳におけるｅｂｉ３  ｍＲＮＡの量の３倍より大きい増加、およびＩｌ２７についてのｍＲＮＡ量の５００倍より大きい増加があった（図１のパネルＡ）。樹状細胞およびマクロファージが末梢組織におけるＩＬ−２７の産生源であると考えられると仮定すれば１４、ＴＥ時に検出された上昇したｅｂｉ３およびＩｌ２７転写体は、これらの細胞のＣＮＳへの移動による可能性がある。または、ＩＬ−２７を産生することもできる常在脳細胞は、小膠細胞および脳常在単球を含む２9。ＴＥの間における、ＣＮＳ中での常在細胞のサブセットである星状膠細胞の活性化、および感染応答においてサイトカインを産生する星状膠細胞の能力３０は、星状膠細胞がＩＬ−２７の産生源であることを意味することを示唆する。しかしながら、野生型マウスからの一次星状膠細胞は基底レベルのｅｂｉ３  ｍＲＮＡを発現したが、ＬＰＳ＋ＩＦＮ−γでの刺激応答において増加は観察されなかった（図１のパネルＢ）。対照的に、Ｉｌ２７  ｍＲＮＡの量はＬＰＳおよびＩＦＮ−γでの刺激後にほぼ２０００倍に増加した。これらの観察結果は、同時に、ＩＬ−２７の両成分がＴＥの間に局所的に産生され、および活性化された星状膠細胞がＥＢＩ３およびｐ２８の両方を発現できることを示唆する。
【０２２１】
トキソプラズマ原虫での慢性感染時におけるＩＬ−２７の役割
ＩＬ−２７に対する従前の焦点は、ナイーブＴ細胞のエフェクターＴＨ１細胞への分化におけるそれに対する役割に関連していた１４、３１−３４。しかしながら、Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスは、トキソプラズマ原虫で攻撃した場合には、頑強なＴＨ１応答を生じることが判明したが、マウスは、重度の肝臓病変および肺病理２６に伴うＩＦＮ−γおよびＩＬ−２２６、２７の過剰な産生によって特徴付けられる、急性致死ＣＤ４＋Ｔ細胞依存性炎症病で死亡した。
【０２２２】
急性トキソプラズマ症に対するＩｌ２７ｒａ−／−マウスの感受性を仮定することのより、慢性感染を発生させるいくつかの戦略が工夫された。これらのうち最初のものは、Ｔ細胞３５のＣＤ２８依存性同時刺激のアンタゴニストであるＣＴＬＡ４−Ｉｇで、感染から７日および１０日後に感染したマウスを処理することであった。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ処理後、感染したＩｌ２７ｒａ−／−マウスは感染後１４日にわたって生存し、慢性期に進行したがＣＴＬＡ４−Ｉｇを受けたＩｌ２７ｒａ−／−マウスは感染から５週間以内に死亡したため、前記処理は長期間の保護を提供しなかった。同一処理を受けた野生型マウスは生存していたので、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ処理の後に観察された死亡率は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ介在免疫抑制の二次的結果であるように見えなかった（図２のパネルＡ）。肝臓および肺の組織学的分析は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇで処理したＩｌ２７ｒａ−／−マウスが急性期で生存するが、感染後１４日において、依然としてそれらの器官における顕著な免疫細胞浸潤、壊死および炎症を発生したことを明らかにした（図２のパネルＣ）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇで処理したか否かに拘らず、病態は感染した野生型マウスにおいて明らかでなかった（データは示さず）。この時点において肝臓および肺で観察されたものとは対照的に、いずれかのＩｌ２７ｒａ−／−または野生型マウスの脳で観察された炎症の組織学的徴候はなかった（データは示さず）。
【０２２３】
しかしながら、感染の慢性期（３０日）まで進行したＩｌ２７ｒａ−／−マウスにおいては、急性感染時における肝臓および肺に存在する病態は解決した（図２のパネルＣ）。対照的に、脳およびＣＮＳにおいては、Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスは、強い炎症の領域、実質における多数の血管周囲への浸潤および重度の髄膜炎を示した（図２のパネルＤ）。他方、野生型マウスは最小〜中程度ＴＥを有した。さらに、星状膠細胞活性化は、グリア線維性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する染色によって評価して、感染は野生型動物におけるこの構造的タンパク質の発現を増大に導いたが、これはＩｌ２７ｒａ−／−マウスにおいて顕著に増加した（図２のパネルＤ）ことを明らかにした。Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスを慢性期まで進行させる補足的な手法において、寄生虫複製を阻害するが感染を根絶しない、感染後５日において開始する抗寄生虫薬物スルファジアジンでの処理もまた、Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスにおいて急性死亡率を下げた。薬物処理の停止後に、野生型マウスは慢性病を発現しなかったが、Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスは重度のＣＮＳ病態に関連する病気の徴候を発生し、２〜３週間内に死亡した（図２のパネルＢ）。従って、本実施例の残りに示したデータは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇまたはスルファジアジンでの処理を通じて慢性病を発生させられたマウスに由来するものであり、これらの異なる実験群の間で差は明らかでなかった。
【０２２４】
ＩＬ−２７が、ＣＮＳ３６におけるトキソプラズマ原虫の制御に対して決定的なサイトカインであるＩＦＮ−γの産生を増大させることができるという報告を前提として１８、２２、３１−３４、ＩＬ−２７シグナル伝達の非存在下における脳で見られた増強された炎症は、ＩＦＮ−γ産生の失敗、および寄生虫複製を制御する能力の欠如の結果であり得る。しかしながら、寄生虫負荷の測定可能な差は、慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−および野生型マウスの脳では見出せなかった（図２のパネルＥ）。さらに、野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウスの脳（ＢＭＮＣ）から単離された単核細胞は、ＩＦＮ−γ依存性抗寄生虫エフェクター分子一酸化窒素（ＮＯ）を産生する能力は欠損していなかった（図２のパネルＦ）。この観察結果に合致して、ＳＴＡｇ（可溶性トキソプラズマ症抗原）で刺激した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウス由来のＢＭＮＣは、同様なレベルのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを生じた（図２のパネルＧおよびＨ）。これらの知見は、Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスにおける重度の神経炎症が、ＩＦＮ−γ産生の欠損、または寄生虫負荷の増加の結果ではなかったことを示した。ＩＬ−２７はＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生を阻害するので２７，３７、ＩＬ−２７シグナル伝達の非存在下において、脳におけるこのＴ細胞成長因子の産生の増大は、観察結果の免疫病理に寄与し得る可能性があった。しかしながら、従前の報告と同様に、慢性的に感染した野生型マウスの脳において検出可能な量のＩｌ２（ＩＬ−２）ｍＲＮＡまたはタンパク質は見出されず、この結果はＩＬ−２７Ｒの非存在下で変化しなかった（データは示さず）。同様に、これらの実験群の脳において、Ｉｌ４（ＩＬ−４）またはＩｌ１３（ＩＬ−１３）、２つのＴＨ２関連サイトカインについての検出可能な転写産物はなかった。最後に、他のＴ細胞サブセットの検査は、脳におけるＦｏｘｐ３＋Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）細胞の小量の存在を明らかとしたが、慢性的に感染した野生型またはＩｌ２７ｒａ−／−マウス間で細胞数の差はなかった（データは示さず）。
【０２２５】
病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞の蓄積におけるＩＬ−２７Ｒ効果の欠如
ＩＬ−２７Ｒの非存在下における顕著な感染誘導ＣＮＳ炎症を仮定して、実験を行って浸潤性細胞の表現型を同定した。組織病理学に従い、慢性的に感染したマウスから単離したＢＭＮＣの分析は、Ｉｌ２７ｒａ−／−脳から回収された細胞の数の顕著な増加（Ｐ≦０．０５；図３のパネルＡ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数およびパーセンテージの有意な増加（Ｐ≦０．０５）、ならびに回収されたＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示した（図３のパネルＢ）。Ｔ細胞集団の組成の差に拘らず、野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウス由来の脳のＴ細胞分析は、ＣＤ４４ｈｉおよびＣＤ６２Ｌｌｏｗの活性化された表現型を示した（図８）。さらに、双方の組のマウス由来の単球は、それらの表面での主要組織適合性複合体クラスＩＩの発現の増大によって特徴付けられる、活性化された表現型を示した（データは示さず）。しかしながら、常在小膠細胞（ＣＤ１１ｂｉｎｔ、ＣＤ４５ｉｎｔ）の数の差はなかったが、ＩＬ−２７Ｒの非存在下において浸潤性マクロファージ（ＣＤ１１ｂｈｉ、ＣＤ４５ｈｉ）の数の有意な増加があった（Ｐ≦０．０５；図３のパネルＢ）。
【０２２６】
前記の実験において、慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−マウスで認められた著しい特徴の１つは、脳に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞数の有意な増加である。浸潤するリンパ球がＴＥの制御で必要であるが３８、この感染時におけるＣＮＳ病理学の発生にも寄与し得る３９。慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−マウスで見られた致死的病気にＣＤ４＋Ｔ細胞が関与するかどうかを決定するために、マウスを感染から４週間後にＣＤ４に特異的な枯渇ｍＡｂで処理し、生存についてモニターした。抗ＣＤ４  ｍＡｂでの処理後のマウスの分析は、脾臓における９５％より大きいＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇、および脳における５０％に減少したＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇を明らかにした（図３のパネルＣ）。抗ＣＤ４  ｍＡｂで処理したＩｌ２７ｒａ−／−マウスの生存は感染から６０日より長く、他方、未処理マウスの大部分は脳において重度の病理学を発生し、５０日までに病気で死亡した（図３のパネルＤ）。さらに、この処理から７日後の組織学的分析は、実質および髄膜炎における炎症の減少を明らかにした（図３のパネルＥ）。同時に、これらのデータは、浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＬ−２７の非存在下でＴＥの間に観察された脳における致死的病態に寄与することを確立した。
【０２２７】
ＩＬ−２７は、抗原を経験したＴ細胞によるＩＬ−１７の産生を阻害する
慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−マウスにおける神経病態は欠陥があるＴＨ１応答の結果ではないが、代わりに、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって介在されるという認識は、致死的病態におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の最近記載されたＴＨ−１７サブセットの可能性を調べる判断に導いた。ＴＨ−１７細胞は、ＣＮＳ炎症のモデルにおける病気の発生に関与しているＩＬ−１７、ＩＬ−６およびＴＮＦの産生によって特徴付けられるので３、これらのサイトカインについてのｍＲＮＡ転写体の量は、慢性的に感染した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウスの脳に由来するＲＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲによって評価された。野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−双方のマウスは同量程度ののＩｌ６（ＩＬ−６）およびＴｎｆ（ＴＮＦ）を発現したが、Ｉｌ１７（ＩＬ−１７）の転写産物はＩｌ２７ｒａ−／−マウス由来の試料のみで検出された（図４のパネルＡ）。
【０２２８】
ＴＥの間、脳においてはＩＬ−６およびＴＮＦに対する多数の細胞源（星状膠細胞、小膠細胞、マクロファージ、Ｔ細胞）があるが、ＩＬ−１７の産生はＴ細胞によって大いに制限される。従って、Ｉｌ２７ｒａ−／−マウス由来のＢＭＮＣは野生型マウスからの細胞よりも、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、およびＴＮＦをより有意に産生したＳＴＡｇの存在下で再刺激された（図４のパネルＢ）。ＩＬ−２３を添加することによって増加し、ＩＬ−２７の添加によってほとんど完全にブロックされた、ＳＴＡｇで刺激された野生型  ＢＭＮＣによって少量のＩＬ−１７もまた産生された（図４のパネルＣ）。さらに、慢性的に感染した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウスからのＢＭＮＣ調製物におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の細胞内染色は、Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスの脳における細胞による、ＩＬ−１７産生の増大を明らかにした（図４のパネルＤ）。同時にこれらの結果は、ＩＬ−２７が、ＴＨ−１７活性を制限することによって、慢性的ＴＥの間にＣＮＳにおいて炎症を調節することを示唆する。
【０２２９】
ＩＬ−２７は、ＩＬ−１７  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を阻害する。
インビトロでのＴＨ−１７細胞の分化に対する最近の報告は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からのこれらの細胞の発生についてＴＧＦ−βおよびＩＬ−６が必要であり、他方、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の遮断はＴＨ−１７発生について好都合な環境を支持すると結論した３、１１−１３、４０、４１。従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から単離されたナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をこれらの条件下で培養して、ＩＬ−１７のＴ細胞産生を阻害するＩＬ−２７の能力を直接的に評価した。ＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激に続き、ほとんどすべてのＴ細胞はＴＮＦを産生し、およびかなりの集団がＩＬ−１７およびＴＮＦを同時発現した。先に示した研究と同様に、ＩＬ−２７の添加はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生を効果的に阻害したが、これらの細胞によるＴＮＦの産生を変化させなかった（図５のパネルＡおよびＢ）。ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激の非存在下では、ＩＬ−１７産生細胞の割合および平均蛍光強度はより低かったが、ＩＬ−２７は、依然としてこの活性の強力なアンタゴニストであった（図９）。
【０２３０】
ｐ２８の元の記載は、このタンパク質がそれ自体によって分泌されるが、ＩＬ−２７とは異なり、Ｔ細胞増殖を促進せず、またはＩＦＮ−γ産生を促進しなかったことを示した１４。ＩＬ−２７がＩＬ−１７産生を阻害し、ｐ２８発現が活性化された星状膠細胞において劇的に増加するという知見の観点から、ＥＢＩ３発現は変化しなかったが（図１のパネルＢ）、実験を行って、ｐ２８それ自体がＴ細胞によるＩＬ−１７の産生を阻害し得るかを決定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｐ２８の存在下、ＩＬ−１７誘導条件下で刺激された。ＩＬ−２７ほどは効果的ではなかったが、単独のｐ２８処理では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７の産生を阻害できた（図５のパネルＣ）。
【０２３１】
ｇｐ１３０関連サイトカインは、ＴＨ−１７発生に対して別々の効果を有する。
多数のグループによる最近の研究は、ＴＨ−１７細胞の発生におけるＩＬ−６についての役割を明らかにした１１−１３。ＩＬ−６およびＩＬ−２７は共有される受容体成分ｇｐ１３０を通じてシグナル伝達を行うため、ＩＬ−１７の産生を阻害するＩＬ−２７の能力は、ｇｐ１３０結合および／またはシグナル伝達に対するＩＬ−６との競合の結果であった可能性があった。この論点に取り組むために、野生型  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から単離されたＣＤ４＋Ｔを用いて一連の実験を行った。これらの細胞を非分極条件下でＩＬ−２３またはＴＧＦ−βの存在下で抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体で活性化した場合（抗ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−４）、ＩＬ−１７の顕著な分泌が起こり、およびＩＬ−２７の添加は用量依存的にＩＬ−１７の産生を阻害できた（図６のパネルＡおよびＢ）。（抗ＩＬ−６抗体を用いる）培養条件におけるＩＬ−６の続く中和の結果、従前の報告と同様にＩＬ−１７産生の減少がもたらされた１１；しかしながら、これらの条件においてさえ、ＩＬ−２７の添加は、依然として、用量依存的にＩＬ−１７のレベルを低下させ（図６のパネルＡおよびＢ）、これは、密接に関連するサイトカインであるＩＬ−２７およびＩＬ−６がＴＨ−１７細胞に対して対照的な効果を有することを示す。
【０２３２】
多くのタイプＩサイトカインによるシグナル伝達の直接的な結果の１つは、ＳＯＣＳタンパク質の下流活性化であり、これは、負の調節フィードバックループを通じてのＴ細胞応答の抑制を導く４２。ＩＬ−６のように、ＩＬ−２７はＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＯＣＳ３発現を誘導すると従前に報告されており２７，３７、およびこの活性は、ＩＬ−２の産生を阻害するＩＬ−２７の能力を説明すると提唱されている３７。ＴＨ−１７活性を阻害するＩＬ−２７能力についてのこの経路の可能性を探るために、ｇｐ１３０における高次形態突然変異を発現するｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆマウスを用いた４３。これらのトランスジェニックマウスにおいて、野生型ｇｐ１３０は、Ｔｙｒ７５７残基がフェニルアラニンで置換されたバージョンに交換されている。従前の研究は、この残基を、ＳＯＣＳ３およびＳＨＰ２の結合と関連付けており、この観察結果と合致して、この置換の結果、ＳＴＡＴ３のＩＬ−６介在超活性化、およびＲａｓ−ＥＲＫ経路の損なわれた活性化をもたらす４４。
【０２３３】
ＩＬ−６で刺激したｇｐ１３０Ｙ７５７ＦマウスからのＴ細胞の結果、過剰なかつ持続したＳＴＡＴ３リン酸化がもたらされた（図６のパネルＣ、データは示さず）。ＳＴＡＴ３リン酸化のピークは１時間において起こり、２４時間後にｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆ  Ｔ細胞は上昇したままであった（図６のパネルＣ、およびデータは示さず）。続いてＣＤ４＋Ｔ細胞はｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆマウスおよび野生型同腹子対照から単離後、ＴＨ−１７誘導条件下で４日間成長させ、続いて、細胞内ＩＬ−１７を測定した。これらの実験において、ｇｐ１３０におけるこの突然変異は、ＰＭＡおよびイオノマイシンでの再刺激なしで、ＩＬ−１７＋細胞の頻度を３桁の増大に導いた（図６のパネルＤ）が、この効果は、ＰＭＡおよびイオノマイシン刺激を用いた場合にはあまり明らかでなかった（図１０）。培養上清の分析は、ｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆ  ＣＤ４＋Ｔ細胞が野生型  ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも５倍多くＩＬ−１７を分泌したことを明らかにした（図６のパネルＥ）。これらのデータは、ＳＯＣＳ３のＩＬ−６介在産生がＩＬ−１７を促進するＩＬ−６の能力を制限し、および最近報告されたＩＬ−２３誘導ＩＬ−１７産生における負のレギュレーターとしてのＳＯＣＳ３の役割と合致することを確立する４５。それにも拘らず、ＩＬ−２７の添加は、ＰＭＡおよびイオノマイシン再刺激の有無にかかわらず、ｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆ  ＴＨ−１７細胞によるＩＬ−１７の産生と拮抗し（図６のパネルＤおよび図１０）、およびＩＬ−２７は用量依存的に突然変異体および野生型  ＣＤ４＋Ｔ細胞による分泌ＩＬ−１７のレベルを低下させることができた（図６のパネルＥ）。最後に、ＩＬ−２７によるＩＬ−１７産生を制限する際のＳＯＣＳ３の役割を直接的に調べるために、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳｏｃｓ３の条件欠失を備えるＣｒｅＭＭＴＶＳｏｃｓｆｌ／ｆｌマウスを用いた。ＣｒｅＭＭＴＶＳｏｃｓｆｌ／ｆｌＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−２７の存在下、ＴＨ−１７誘導条件下で成長させた場合、ＩＬ−１７産生は依然として阻害された（図６のパネルＦ）。同時に、これらの結果は、ＩＬ−１７産生を阻害するＩＬ−２７の能力は、ｇｐ１３０−ＩＬ−６シグナル伝達のＳＯＣＳ３介在減衰に寄与できないことを示す。
【０２３４】
ＩＬ−２７はＳＴＡＴ１を通じてのＩＬ−１７産生を阻害する。
ＩＬ−６およびＩＬ−２７は密接に関連するサイトカインであり、およびｇｐ１３０介在シグナル伝達を共有するが、示されたデータは、これらがＩＬ−１７産生に対して反対の効果を有することを大いに示す。この結論は、ＩＬ−２７由来の阻害シグナルがＩＬ−２７Ｒ特異的成分を介して介在され、およびＩＬ−６がＳＴＡＴ３を主に活性化するが、いくつかの研究はユニークなＩＬ−２７Ｒ鎖をＳＴＡＴ１の活性化および転写因子Ｔ−ｂｅｔに続く誘導に繋げていることを意味する３２、３３。従って、ＩＬ−１７産生を阻害するＩＬ−２７の能力がこれらの転写因子に関係したかを決定するために、Ｓｔａｔ１−／−またはＴｂｘ２１−／−（Ｔ−ｂｅｔ−欠損）マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、ＴＨ−１７誘導条件下で刺激した。これまでのように、ＩＬ−２７添加の結果、野生型およびＴ−ｂｅｔ−欠乏ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生の顕著な阻害がもたらされたが、効果はＳＴＡＴ１の非存在下で折衷された（図７のパネルＡ）。これらのデータは、ＴＨ−１７機能に拮抗するＩＬ−２７の能力における、ＳＴＡＴ１についての主要な役割を同定する。
【０２３５】
インビボでのＳＴＡＴ１の役割を調べるために、Ｓｔａｔ１−／−マウスをトキソプラズマ原虫で急性的に感染させ、ＩＬ−１７の産生をモニターした。脾細胞の感染後７日におけるＳＴＡｇでの再刺激は、Ｓｔａｔ１−／−脾細胞がそれらの野生型の対応物よりも多くＩＬ−１７を分泌することを示した（図７のパネルＢ）。Ｓｔａｔ１−／−マウスは寄生虫複製を制御できないので４６、インビトロのデータと合致するが、インビボのデータは慎重に解釈されるべきである。なお、結果は、従前に、ＴＨ−１７活性のＳＴＡＴ１介在阻害についてのインビボ証拠を提供したＥＡＥ７での実験と同様である。
【０２３６】
考察
最近、ＩＬ−１７、ＴＮＦおよびＩＬ−６の産生に係るＴ細胞独自のサブセットが、多発性硬化症、炎症性腸疾患および関節リウマチのモデルにおいて観察された病態の発生に関連付けられている３−７。異常なＴＨ−１７応答が自己免疫性に関連付けられている一方で、これらは病原体クレブシエラおよびトキソプラズマの攻撃に対する急性耐性においても役割を有するが４７−４９、これらの状況においては、ＴＨ−１７応答は自己免疫性に導かない。これらの結果の意味は、ほとんどのＴ細胞応答について調べているのと同様に、ＴＨ−１７活性を適切に調節するためのメカニズムが存在することであり、今日、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４が、ＴＨ−１７細胞に拮抗する他のＴヘルパー細胞に必要であるという明らかな証拠がある３，１３，４０，４１。
【０２３７】
本明細書における結果は、トキソプラズマ原虫で慢性的に感染したＩｌ２７ｒａ−／−マウスは、ＩＬ−１７、ＩＬ−６およびＴＮＦの異常なＴ細胞産生に関連付けられる、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって介在される重度の神経障害を発症することを示し、これは、ＴＨ−１７活性調節におけるＩＬ−２７の役割を示す。ＴＨ−１７細胞に対するＩＬ−２７の抑制効果は、ＩＬ−２３で刺激された慢性的に感染したマウス、ならびにＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞および脾臓由来ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来のＢＭＮＣによるＩＬ−１７の産生をＩＬ−２７が阻害した実験によって示された。これらの結果は、ＩＬ−２７が炎症の他の面においてＴＨ−１７細胞を調節する可能性が高いことを示す。
【０２３８】
先に強調したように、ＩＬ−６およびＩＬ−２７は、共に、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を行う、密接に関連したサイトカインであり、およびこれらの細胞効果はＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を通じて介在されるが８，５２、これらがＴＨ−１７活性に対して非常に異なる効果を有する。最近の報告は、ＳＴＡＴ３のＩＬ−２３誘導活性化を、ＩＬ−１７のＣＤ４＋Ｔ細胞産生の促進に関連付けており５３、ＴＨ−１７活性を促進するＳＴＡＴ３の主なアクチベーターであるＩＬ−６の能力と合致する知見である。同様に、ｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆ  Ｔ細胞がＩＬ−１７産生量を上げるという観察結果は、ＳＯＣＳ３がＩＬ−６介在シグナル伝達を制限する古典的な負のフィードバックループの一部であることを示す現在のモデルと合致する。しかしながら、ＩＬ−２７はＳＯＣＳ３を活性化するが２７，３７、ＩＬ−６の非存在下、およびｇｐ１３０Ｙ７５７Ｆ−またはＳＯＣＳ３−欠乏ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＨ−１７活性を低下させるＩＬ−２７の能力は、それが、単に拮抗するＩＬ−６介在シグナル伝達とは別の阻害効果を有することを示す。
【０２３９】
初期の報告はＩＬ−２７の炎症促進性活性に焦点を当ててきたが、ＩＬ−２７が病理学的Ｔ細胞応答に拮抗するという認識が増えつつある。ＩＬ−２のＴヘルパー細胞産生をＩＬ−２７が阻害することを示す最近の研究は、その可能な抗炎症活性に対する識見を提供した２７。さらに、外因性ＩＬ−２の存在下においてＩＬ−１７産生を減少するＩＬ−２７の能力は、減少したＴＨ−１７活性が単純にＩＬ−２レベルが低下した結果ではないことを示す（図１１）。事実、いくつかのデータは、ＩＬ−２がＩＦＮ−γを優先的に促進し、ＩＬ−１７応答をしないことを示唆する１１。
【０２４０】
本明細書において示したデータは、ＩＬ−２７がＳＴＡＴ１を使用して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７産生を抑制することを示し、これは、Ｔ−ｂｅｔから独立した効果である。この観察結果は、ＩＬ−２産生によるＩＬ−２７阻害がＳＴＡＴ１から独立していたという従前の報告とは対照的である２７。ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２７によるＳＴＡＴ１の活性化はＴＨ１応答の発生に主に関連付けられてきたが、本データは、このシグナル伝達経路もやはり抗炎症活性を介在することを強調する。この結論は、Ｓｔａｔ１−／−マウスにおけるインビボでのＴＨ−１７細胞の発生が増強されたという観察結果７、５４によって、およびＩＦＮ−γの中和がＩＬ−１７産生を促進するという事実３、４０、４１によって裏付けられる。さらに、ＳＴＡＴ１のＩＬ−２７介在活性化は、ＣＮＳにおけるＩＬ−１７産生Ｔ細胞の内因性阻害経路を表すという仮定は、Ｓｔａｔ１−／−マウスがより多量のＥＡＥを産生するという知見を説明できる５５。後者の知見はＩＦＮ−γシグナル伝達の欠如に帰結されているが８、低下したＩＬ−２７活性の機能であり得る可能性が高いように思われる。現在、異なる実験系におけるＳＴＡＴ１の阻害効果についての分子的機序は知られていないが、免疫応答の抑制における種々のＳＴＡＴの役割を強調する文献が増え続けている５６、５７。
【０２４１】
ｐ２８単独によるＩＬ−１７産生の阻害は、どのようにしてこのタンパク質がその受容体に結合し、その阻害効果を変換するかという、生物学的機序についてのいくつかの疑問を生起させる。１つの可能性は、ｐ２８の分泌がＩＬ−２７の形成に導く構成的に利用可能なＥＢＩ３とで二量体化できるか、またはｐ２８がＩＬ−６と同様にして分子間シグナル伝達できるということである１９。ＩＬ−２７の免疫刺激活性のいずれも、従前にはｐ２８に帰されていないが１４、この分泌タンパク質の生物学的機序のさらなる理解は、これを治療的に用いることができる方法に対して識見を提供することができる。本明細書において提示された知見は、ｐ２８シグナル伝達それ自体の関連性、およびＴＨ−１７活性の生理学的アンタゴニストとしてのＩＬ−２７の重要性を示唆する。ＩＬ−１７活性の遮断が種々の自己免疫異常において病気を緩和するという強力な証拠が発見されているが３、５０、５１、５８、ＩＬ−１７の中和はＴＨ−１７活性の下流のサイトカインを特異的に標的にする。対照的に、ＩＬ−２７および／またはそのｐ２８サブユニットによる刺激は、抗原特異的ＴＨ−１７細胞に直接的に拮抗でき、ＩＬ−１７の細胞源を特異的に標的にする機会を提供し、これは、ある種の自己免疫疾患の治療に対するより効果的な手法を提供することができる。
【０２４２】
方法
マウスおよび寄生虫
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、ＷＳＸ−１−／−（Ｉｌ２７ｒａ−／−）マウスはＣｈｒｉｓｔｉａａｎ  Ｓａｒｉｓ博士（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）より提供された。Ｉ−Ａｄと関連するニワトリオボアルブミンペプチド（ＯＶＡ（３２３−３３９））に対してＴＣＲ特異的なトランスジェニックＤＯ１１．１０マウス、Ｓｔａｔ１−／−マウスおよびＴｂｘ２１−／−マウスはＰｈｉｌｌｉｐ  Ｓｃｏｔｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）より提供された。ｇｐ１３０Ｙ７５７ＦおよびＣｒｅＭＭＴＶＳｏｃｓ３ｆｌ／ｆｌマウスは従前に記載されている４３、４５。マウスを、制度的ガイドラインに従って、ペンシルバニア大学の病理生理学部門において特異的病原体が無い施設に収容し、育種した。
【０２４３】
トキソプラズマ原虫のＭｅ４９株は、慢性的に感染したＣＢＡ／ｃａマウスから調製し、２０個の嚢胞で実験動物を腹腔内感染させた。Ｉｌ２７ｒａ−／−マウスは、感染後７日および１０日において、２００μｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）を腹腔内投与するか、または感染後５日において飲料水に２００ｍｇ／Ｌのスルファジアジン（Ｓｉｇｍａ）を加えて２週間処理した。可溶性トキソプラズマ抗原（ＳＴＡｇ）は、先に記載したようにＲＨ株のタキゾイトから調製した５９。組織学的調査のために、肝臓、肺および脳を動物から収集し、１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、区分し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。星状膠細胞活性化を決定するために、脳セクションを従前に記載されているようにＧＦＡＰについて染色した３０。寄生虫負荷を測定するために、３５倍反復トキソプラズマ原虫  Ｂ１遺伝子を、従前に記載された条件を用いてＡＢ７５００速リアルタイムＰＣＲマシーン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中でＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるリアルタイムＰＣＲによって増幅した３０。実験試料から得られたＣｔ値を規準化するめに、マウスβ−アクチン遺伝子を同一条件下で増幅した３０。
【０２４４】
脳単核細胞（ＢＭＮＣ）の分析
慢性的に感染した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウスからのＢＭＮＣの単離を、従前に記載されたプロトコルに従って行った３０、６０。細胞を、従前に記載されているようにエクスビボ表面染色および細胞内染色のために処理した２７。細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体を用いて、表面に染色した。ＩＬ−１７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体を用いて、Ｔ細胞を細胞内染色した。試料をＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で獲得し、ＦｌｏＪｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて結果を分析した。ＢＭＮＣを、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で２００μｌの最終容量中のウェル当たり２×１０５細胞の最終密度で平板培養した。組換えｍＩＬ−２７（１００ｎｇ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、ＩＬ−２３（１０ｎｇ／ｍｌ；ＤＮＡＸ）または双方の存在下または非存在下で、細胞をＳＴＡｇ（５０μｇ／ｍｌ）の有無にかかわらず刺激した。上清を４８時間後に収集し、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦおよびＩＬ−６のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。酸化窒素（ＮＯ）レベルをグレイス（Ｇｒｅｉｓｓ）アッセイの使用によって測定した。
【０２４５】
リアルタイム定量的ＰＣＲ分析
全細胞ＲＮＡを、標準的な手法を用いて慢性的に感染した野生型およびＩｌ２７ｒａ−／−マウス、ならびに感染していない野生型マウスの、灌流後ホモジナイズした脳から単離した後、記載されているようにｃＤＮＡに変換した２６。加えて、全ＲＮＡを野生型  Ｃ５７ＢＬ／６一次星状膠細胞培養から単離し、これを用いてｃＤＮＡを作成した。一次星状膠細胞を、従前に記載されているように、１〜３日齢マウスの脳から収穫し３０、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色（抗マウスＧＦＡＰ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって判断した星状膠細胞培養の純度は一貫して９０％を超えていた。Ｑｉａｇｅｎから入手したプライマーを用いて、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−２７ｐ２８およびＥＢＩ３の発現を決定し、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎ（登録商標）試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢ７５００速リアルタイムＰＣＲマシーンで行った。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プライマー、プローブ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した試薬を用いて、ＩＬ−１７の発現を決定した。β−アクチンハウスキーピング遺伝子を双方の場合における規準化対照として用いた。
【０２４６】
ＴＨ−１７細胞の作製
ＩＬ−１７−産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、他の文献等に記載されている１１、４０、方法を改変して産生させた。簡単に述べると、前記したマウスから単離した脾細胞をＣＤ８＋およびＮＫ１．１＋細胞について枯渇させて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を豊富化させ、またはそれらをＣＤ４＋およびＮＫ１．１＋細胞について枯渇させて、磁性ビーズ分離（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＣＤ８＋Ｔ細胞を豊富化させた。細胞を５×１０６細胞／ｍｌの密度にて９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で平板培養した。Ｔｇ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を５μｇ／ｍｌのＯＶＡペプチドで刺激し、他方、他のＴ細胞を抗ＴＣＲ抗体（抗ＣＤ３；１μｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で刺激した。ＴＨ−１７細胞の産生のために、培養に、組換えマウスＩＬ−２３（１０ｎｇ／ｍｌ；ＤＮＡＸ）またはヒトＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）単独またはＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）との組み合わせを補充した。加えて、抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ；クローンＸＭＧ１．２）および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ；クローン１１Ｂ１１）を用いて、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を培養中で中和した。規定される場合には、組換えＩＬ−２７（１００ｎｇ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ）を加えた。組換えｐ２８はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供され、規定される場合、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を３日目に収穫し、他方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は３日目に新鮮な培地および試薬を補足し、４日目に収穫した。双方の細胞型を、続いてＰＭＡおよびイオノマイシン刺激＋ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下にて、細胞内ＩＬ−１７、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γにつき染色した。
【０２４７】
統計学
独立スチューデントｔ検定を用いて有意差を決定し、０．０５未満のＰ値は有意と考えられた。
【０２４８】
実施例１についての文献
2009543579.tif 000003
2009543579.tif 000004
2009543579.tif 000005
2009543579.tif 000006
【実施例２】
【０２４９】
可溶性ＷＳＸ−１はＩＬ−２７によるＩＬ−２産生阻害を増強する。
全脾細胞を２匹のＩｌ２７ｒａ−／−マウス（ＷＳＸ−１  ＫＯ１およびＷＳＸ−１  ＫＯ２）から単離した。脾細胞からＮＫ１．１＋およびＣＤ８＋細胞を枯渇させて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を豊富化した。次いで、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル）で標識し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した。ｓＩＬ−２７Ｒ  Ｆｃタンパク質（可溶性ＷＳＸ−１ポリペプチド、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．によって提供された、ＷＳＸ−１細胞外ドメイン配列を含むＦｃ融合タンパク質）の有無に関わらず、ＩＬ−２７を、細胞を含むウェルに加えた。ｓＩＬ−２７Ｒ  Ｆｃタンパク質を細胞ウェルへの添加に先立ってＩＬ−２７と共に３０分間インキュベートして、結合を促進した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。上清をＥＬＩＳＡアッセイで用いて、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生を測定した（図１２）。
【０２５０】
可溶性ＷＳＸ−１融合タンパク質ｓＩＬ−２７Ｒ  Ｆｃの添加は、ＩＬ−２７によるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生阻害を増強させた。結果は、可溶性受容体が内因性受容体の非存在下で機能できることを示し、受容体は分子間で働くことができることを示す。
【実施例３】
【０２５１】
ＩＬ−１０のＴ細胞産生におけるＳＴＡＴ３のインターロイキン２７およびＩＬ−６介在活性化についての中心的役割
ＩＬ−１０は、保護的Ｔ細胞応答と病理学的Ｔ細胞応答の間のバランスを調節する際に主な役割を有する。この活性と合致して、ミエロイド細胞ならびに種々のＴ細胞サブセットを含むこのサイトカインの多数の産生源がある。しかしながら、ＩＬ−１０の生来の産生を調節する多くの経路があるが、適応応答によるその産生を支配する因子はあまり理解されていない。本実施例において提示した実験は、ＩＬ−２７およびＩＬ−６が種々のＴ細胞集団を誘導してＩＬ−１０を産生させることができることを明らかにする。この効果は、ＩＬ−２７については転写因子ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３、ならびにＩＬ−６についてはＳＴＡＴ３に依存する。同時に、これらの実験は、免疫系が炎症応答を和らげるのを可能とする新規な経路を同定する。
【０２５２】
ＩＬ−１０は、ＴＨ１細胞によるＩＦＮ−γの産生を阻害したＴＨ２関連サイトカインとして最初は記載された１，２。後に、これは間接的な効果であって、およびＴＨ１細胞機能を緩和する能力は、アクセサリー細胞活性を拮抗させる能力によるものであったと認識された。従って、ＩＬ−１０は、ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−１２などの炎症促進性サイトカインを産生するマクロファージの能力を低下させ、およびＴ細胞応答に必要な同時刺激性およびＭＨＣ分子の発現を減少させた３−９。ＩＬ−１０は種々の生物学的特性を有するが、インビボでのその主な役割の１つは、抗原提示細胞に対するその阻害効果と合致する炎症応答に限定する。この機能は、ＩＬ−１０−／−マウスは自然発症的に炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を発症することを明らかとした最初の報告において、まず強調された。敗血症、感染疾患および自己免疫のマウスモデルを用いた続いての研究は、ＴＨ１、ＴＨ２およびＴＨ１７活性に関連する先天性および適応応答の調節におけるＩＬ−１０の役割について広範の理解を有する１１−１３。感染疾患との関係では、どのようにしてＩＬ−１０の非存在が病原体に対する耐性の増強を導くが、宿主を殺すことができる異常な炎症応答の発生をももたらす、いくつかの例がある１４−１６。同時に、これらの研究は、保護免疫性と病態発生間のバランスを維持する際の、ＩＬ−１０の中心的役割を示す。
【０２５３】
炎症を制限する際にＩＬ−１０の重要な役割を仮定すると、恐らくは、微生物産物で刺激されたマクロファージおよび樹状細胞を含む、この免疫調節因子の多数の産生源があることは驚くべきことではない。加えて、ＩＬ−１０はＴＨ２サイトカインとして最初は特徴付けられたが１，２、今では、Ｔｒ１細胞１７、ＣＤ２５＋１８，１９、ＣＤ２５調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）２０，２１、およびＴＨ１細胞２２，２３もまたＩＬ−１０を分泌することが認識されている。ＩＬ−１０の産生源としての３つの異なるサブセットと相対的重要性が長期にわたる疑問であったが２４，２５、近年、Ｔｒｅｇ細胞とＩＬ−１０間の関連性はこの領域の研究を優勢なものとした。それにもかかわらず、種々の病気状況においては、ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１０＋Ｔヘルパー細胞の存在について確立した文献があり２６，２７、いくつかの最近の研究は、トキソプラズマ原虫での感染時に、および森林型熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）の非治癒モデルにおいて、ＩＦＮ−γをやはり産生するＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞によるＩＬ−１０依存性免疫抑制の重要性を強調している２８，２９。それにもかかわらず、炎症を制限するＴ細胞由来ＩＬ−１０の重要性に対する多くの証拠によっても、Ｔ細胞によるこのサイトカインの産生を誘導する事象は不明瞭なままであった２４，２５。
【０２５４】
ＩＬ−１０は、炎症を制御するための免疫系によって用いられる唯一の抗炎症メディエーターではなく、このプロセスに関与する経路（ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＰＤ１）のリストは継続的に増大している。最近、エプスタイン・バー誘導タンパク質３（ＥＢＩ３）およびｐ２８から構成されるヘテロ二量体サイトカインであるサイトカインＩＬ−２７が３０、いくつかのＴ細胞機能のアンタゴニストとして記載されてきた。このサイトカインは、最初、ＴＨ１細胞の発生を促進する因子として同定されたが３１、３２、続いての報告は、ＩＬ−２７が感染および自己免疫の種々のモデルに関与するＴＨ１、ＴＨ２およびＴＨ１７応答をも制限することができることを強調した３２−４０。事実、これらの研究所における研究は、ＩＬ−１０−／−マウスのように、トキソプラズマ原虫に感染させたＩＬ−２７ｒａ−／−マウスが、炎症促進性サイトカインの過剰な産生、肝臓における壊死の大きな面積および多数の器官における激しい免疫細胞浸潤物の存在によって特徴付けられる、致死的ＣＤ４＋Ｔ細胞介在応答を発生したことを明らかとした１４，３３，３８，４１，４２。これらの表現型の類似性は、これらの抗炎症性サイトカインが継続する免疫応答を調節する際に果たす重要な役割を強調するのみならず、これら２つの免疫調節因子間の可能な関連性を示唆する。
【０２５５】
Ｔ細胞に対するＩＬ−２７の効果をより理解するために、ＩＬ−２７の存在下または非存在下における６７の可溶性免疫メディエーターの産生をアッセイした。この分析は、ＩＬ−２７がＴＨ１、ＴＨ２およびＴＨ１７細胞に関連する多数のサイトカインを阻害したが、驚くべきことに、ＩＬ−２７はＩＬ−１０の産生も促進したことを明らかとした。なぜなら、トキソプラズマ原虫で慢性的に感染したＩＬ−２７ｒａ−／−マウス由来のＴ細胞は、ＩＬ−１０を作製する能力の欠陥を有していたため、この観察結果は、インビボにおいても酷似していた。インビトロ実験は、ＩＬ−２７がＩＬ−１０のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を増強できるが、ＩＬ−２７によって誘導されたＩＬ−１０＋Ｔ細胞の大部分はＦｏｘｐ３を発現しないことを明らかとし、これはＩＬ−２７が多数のＴ細胞集団によるＩＬ−１０産生を刺激できることを示す。さらに、ＩＬ−２７＋ＴＧＦ−βによるＴ細胞の刺激の結果、ＴＧＦ−βもまたＩＬ−１０の強力なインデューサーでもあったことと組み合わせた場合、（ＩＬ−２７のように、ｇｐ１３０を介してシグナル伝達を行う）ＩＬ−１０、およびＩＬ−６に対する相加的効果をもたらした。ＩＬ−１０産生を刺激するＩＬ−２７の能力は、細胞内シグナル伝達分子ＳＴＡＴ４および転写因子Ｔ−ｂｅｔから独立していたが、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３活性化に依存しており、他方、ＩＬ−６はＳＴＡＴ３のみを必要とする。集合的に、これらのデータは、ＩＬ−１０のＴ細胞産生を促進するサイトカインの環境、およびこの調節経路を支持する分子事象に対する新規な識見を提供する。
【０２５６】
結果
ＩＬ−２７はＩＬ−１０のＴ細胞産生を誘導する。
最近の研究は多数の炎症促進性サイトカインのＴ細胞産生を阻害するＩＬ−２７の能力を強調してきたが３８、４３、ＩＬ−２７に対するさらなる標的を同定することができるスクリーニングが目的であった。従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、アクセサリー細胞が存在下するＩＬ−２７の存在下または非存在下、非分極条件下で（α−ＩＦＮ−γおよびα−ＩＬ−４）、抗ＴＣＲ（α−ＣＤ３）およびα−ＣＤ２８抗体で活性化した。細胞を３日間培養した後、げっ歯類Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ（ＲｏｄｅｎｔＭＡＰ（商標））を用いて、上清を６７の分泌免疫産物のパネルについてアッセイした。従前の報告と合致して、ＩＬ−２７のこれらの非分極培養物への付加は、ＴＨ１（ＩＦＮ−γ）、ＴＨ２（ＩＬ−５）およびＴＨ１７（ＩＬ−１７）応答に関連する多数のサイトカインの減少に導くだけでなく、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１αおよび−βおよびリンホタクチンも含んだ（図１４のパネルＡ）。加えて、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＩＬ−７を含むいくつかの他のサイトカインおよびＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−９を含むケモカインはこの処理によって変化しなかった（表２）。しかしながら、最も顕著な結果は、ＩＬ−２７が、これらの培養上清におけるＩＬ−１０のレベルの１０００倍増加に導いたという観察結果であった（図１４のパネルＡおよび表２）。
【表２】
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【０２５７】
細胞内染色を用いるさらなる分析は、同様な条件下で刺激し、続いてフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンで再刺激した場合、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のほんの数パーセントがあったが、ＩＬ−２７の付加はこのパーセンテージの顕著な増加を導いたことを明らかとした（図１４のパネルＢおよびＣ）。これらの結果は、同様な数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＬ−２７に応答してＩＬ−１０を産生したことを示したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞が豊富化された培養からの上清中のＩＬ−１０の量は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の差と合致して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する培養で観察されたものよりも高かった（図１４のパネルＢおよびＣ）。結果として、本実施例で示された研究の大部分は、ＩＬ−１０の産生源としてのＣＤ４＋Ｔ細胞に焦点を当てた。
【０２５８】
ＩＬ−２７Ｒは、インビトロおよびインビボでのＩＬ−１０の最適Ｔ細胞産生に必要である。
前記した実験は、ＩＬ−２７がＩＬ−１０のＴ細胞産生を増強できることを示した。これらの事象におけるＩＬ−２７Ｒの役割を評価するために、野生型またはＩｌ−２７ｒａ−／−マウス由来の脾細胞を、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、非分極条件下で活性化し、ＩＬ−１０をアッセイした。野生型マウス由来の細胞はＩＬ−２７に応答した増強されたレベルのＩＬ−１０を分泌したが、これはＩｌ−２７ｒａ−／−マウス由来の培養では観察されなかった（図１５のパネルＡ）。事実、これらの上清における均一基礎レベルのＩＬ−１０は野生型対照と比較して低下した。ＩＬ−２７／ＩＬ−２７Ｒがインビボにて炎症応答の調節に関与したか否かを評価するために、野生型およびＩｌ−２７ｒａ−／−マウスをトキソプラズマ原虫３８で慢性的に感染した実験系を用いた。これらの実験において、脳単核細胞（ＢＭＮＣ）調製物および慢性的に感染した野生型マウス由来の脾細胞の再刺激は、ＩＬ−１０を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を直接的にエクスビボにて明らかにした。対照的に、慢性的に感染したＩｌ−２７ｒａ−／−マウスの脳および脾臓由来の細胞を用いた場合、ＩＬ−１０において顕著な欠陥があった（図１５のパネルＢ）。逆に、ＩＬ−２７の存在下における野生型ＢＭＮＣのＳＴＡｇでの再刺激の結果、ＩＬ−１０の有意な増加があった（図１５のパネルＣ）。これらの結果は、集合的に、インビトロでのＩＬ−１０のＴ細胞産生の促進における、およびトキソプラズマ原虫に関連する慢性感染誘導炎症の状況における、ＩＬ−２７およびＩＬ−２７Ｒに対する顕著な役割を示唆する。
【０２５９】
ＩＬ−２７は、ＴＨ１およびＴＨ２条件下でＩＬ−１０の産生を誘導するが、ＴＨ１７条件下では誘導しない。
前記した実験は中性条件下で行ったが、トキソプラズマ原虫で感染させたマウスからのデータは、ＴＨ１支配的応答の間におけるＩＬ−１０プロデューサーの発生におけるＩＬ−２７についての役割を示す。従って、さらなるインビトロ実験を行って、Ｔ細胞活性化後のいずれの時点において、ＩＴ−１０が産生されたかを決定し、およびＴＨ１、ＴＨ２またはＴＨ１７細胞の発生に好都合な条件下で、ＩＬ−１０を促進するＩＬ−２７の能力を評価した。ＩＬ−２７に応答した４日間にわたるＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０産生の分析は、活性化から４８時間後に細胞がＩＬ−１０の産生を開始し、７２時間においてピークとなったＩＬ−１０＋細胞の数は９６時間に渡って維持されたことを明らかにした（図１６のパネルＡ）。加えて、細胞をＣＦＳＥ標識して、ＩＬ−２７によって生じたＩＬ−１０産生Ｔ細胞が活発に増殖しているか、またはＴ細胞の非複製集団の一部であるかを決定した。ＣＦＳＥ希釈によって示されるように、ＣＦＳＥ反応がはっきりしない細胞のみがＩＬ−２７に応答してＩＬ−１０を産生した。この知見は、Ｔ細胞がサイトカイン産生を獲得するのに増殖が必要である際のモデルと合致する４４。また、これらの実験におけるＩＬ−１０産生のパターンは、最近活性化されたＴ細胞についてのＩＬ−２７Ｒの発現プロフィールに相関する４５。
【０２６０】
従前の報告２３と合致し、ＴＨ１条件下で（ＩＬ−１２＋α−ＩＬ−４）、ＩＬ−１０を産生した少数のＣＤ４＋Ｔ細胞があったが、ＩＬ−２７添加の結果、ＩＬ−１０について陽性に染色された細胞の割合の増加をもたらした（図１６のパネルＢ）。ＴＨ２条件下（ＩＬ−４＋α−ＩＦＮ−γ）では、従前の報告と同様に、かなりの数のＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞があり、ＩＬ−２７の添加の結果、割合およびＩＬ−１０染色についてのＭＦＩの顕著な増加がもたらされた。驚くほど、ＴＨ１７条件下（ＴＧＦ−β＋ＩＬ−６）でのＣＤ４＋Ｔ細胞の分極の結果、全ての他の条件を比較した場合に、ＩＬ−１０を産生したＴ細胞の最大集団の存在をもたらした。しかしながら、ＩＬ−２７を加えた場合、ＩＬ−１０のさらなる増加はなかった（図１６のパネルＢ）。同時に、これらのデータは、ＩＬ−１０産生を促進するＩＬ−２７の能力はＴＨ１およびＴＨ２条件下では最も顕著であるが、ＴＨ１７条件下ではそうでないことを示す。
【０２６１】
デュアルサイトカイン産生株に対するＩＬ−２７の効果
ＩＬ−２７はＴＨ１およびＴＨ２条件下でＩＬ−１０の産生を促進でき、ＴＨ１７分極に続いてＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のかなりの割合があったが、これらのＩＬ−１０＋細胞もこれらのＴＨサブセットに関連するシグネチャーサイトカイン（ｓｉｇｕｎａｔｕｒｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を産生するか否かは明らかでなかった。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＨ１、ＴＨ２およびＴＨ１７条件下で刺激し、ＩＬ−１０についての細胞内染色を、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３またはＩＬ−１７各々と組み合わせた。ＴＨ１条件下で刺激した場合、ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の大部分もまた、ＩＦＮ−γについて陽性に染色されたが、二重プロデューサーのこの集団は、依然としてまさにＩＦＮ−γを産生する細胞と比較して少数であった（図１７のパネルＡ）。ＩＬ−２７の添加はＩＦＮ−γ＋細胞の数を低下させず、その代わりＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の増加をもたらした。ＴＨ２条件下では、ＩＬ−１０＋細胞のほぼ５０％がやはりＩＬ−１３を産生していた（図１７のパネルＡ）。ＩＬ−２７の添加はＩＬ−１０＋細胞の割合を増大させ、ＩＬ−１３＋ＩＬ−１０＋細胞およびＩＬ−１３単一産生株数の同時低下を引き起こした。
【０２６２】
予想外に、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の産生のためにＩＬ−６＋ＴＧＦ−β（ＴＨ１７）と共に培養したＴ細胞の分析結果は、Ｔ細胞の３つの別々の集団：ＩＬ−１７またはＩＬ−１０の単一の産生株、およびＩＬ−１７＋ＩＬ−１０＋細胞の集団の存在を明らかとした（図１７のパネルＡ）。従前の報告３８と同様に、ＩＬ−２７の添加はＩＬ−１７の発現を阻害したが、ＩＬ−１０を発現する細胞の割合を増加させなかった。むしろ、ＩＬ−１０＋ＩＬ−１７−Ｔ細胞増殖の増加があった。これらの培養におけるアクセサリー細胞の存在を仮定すると、ＩＬ−１７の産生を阻害するＩＬ−２７の能力は、ＩＬ−１０分泌を誘導する能力の結果である可能性があった。しかしながら、ＩＬ−１０−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた場合、ＩＬ−２７は依然として、ＩＬ−１７産生を阻害できた（図１７のパネルＢ）。
【０２６３】
ＴＧＦ−βは、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を駆動するＩＬ−２７の能力を増強する。
ＴＨ１７細胞は、これらの条件下でＩＬ−２７はＩＬ−１０を増強することができないことと組み合わせて、有意なレベルのＩＬ−１０を産生したという知見は、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−６もまたこれらの事象の調節に関与し得ることを示唆した。ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴＧＦ−βの効果の調査は、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β単独とは異なり、ＩＬ−１０の中程度の増加をもたらしたが、ＩＬ−２７と組み合わせた場合、ＩＬ−１０＋細胞の割合の増加ならびにＭＦＩの増加に導く相加的効果を有したことを明らかとした（図１８のパネルＡおよびＢ）。加えて、外因性ＴＧＦ−βはＩＬ−１０産生を増加させないが、内因性ＴＧＦ−βの中和は、ＩＬ−１０産生を促進するＩＬ−２７の能力を排除しなかったが、ＩＬ−１０＋細胞の割合を中程度の低下に導いた（データは示さず）。
【０２６４】
ＴＧＦ−βはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋誘導Ｔｒｅｇ細胞に変換できるので４６，４７、ＴＧＦ−βを含めるのはＴｒｅｇ増殖に好都合であり、ＩＬ−２７はＩＬ−１０のＴｒｅｇ分泌を促進する可能性があった。従って、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰでキメラマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞４８は、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２７または双方のサイトカインの組み合わせ存在下、非分極条件下でα−ＣＤ３およびα−ＣＤ２８で活性化された。非分極条件下での７２時間のインキュベーション後、ＴＧＦ−βを含まない培養においては少数のＦｏｘｐ３ＧＦＰ＋細胞しか存在せず、しかしながら、ＴＧＦ−βの添加の結果、１０％以下のＩＬ−１０を産生するＦｏｘｐ３ＧＦＰ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のより大きな集団の発生がもたらされた（図１８のパネルＣ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−２７の存在下で培養した場合、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ＋細胞の増殖はなかったが、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ＋細胞の５０％はＩＬ−１０を産生していた。しかしながら、ＩＬ−２７に応答して産生したＩＬ−１０産生Ｔ細胞の大部分はＦｏｘｐ３ＧＦＰ−（２０％対１．４％）であった。最後に、ＴＧＦ−βをＩＬ−２７とを組み合わせた場合、ＴＧＦ−β単独を含む培養と比較して、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ＋細胞数が約７０％減少した。ＩＬ−２７単独で見られたように、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ＋細胞の５０％近くがＩＬ−１０を作製したが、ＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分はＦｏｘｐ３ＧＦＰ−に存在し、ＩＬ−１０産生に対するＩＬ−２７の効果はＦｏｘｐ３＋Ｔ  ｒｅｇｓに対して特異的でないことを示す。同時に、これらのデータは、ＴＧＦ−βは、ＩＬ−２７と組み合わせた場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１０産生に対して相乗効果を有することを示し、この結果は、これらの培養におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞数の増大によるものではない。
【０２６５】
ＩＬ−１０産生の促進におけるＩＬ−６の役割
ＴＧＦ−βは、ＩＬ−１０産生単独を刺激するＩＬ−２７の能力を増強させることができるが、ＴＨ１７条件下で存在するＩＬ−１０＋Ｔ細胞の高い割合を説明できない。従って、ＩＬ−２７と構造的相同性および受容体サブユニットを共有するタイプＩのサイトカインであるＩＬ−６もまた、ＩＬ−１０の産生を促進できるかを決定するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を非分極条件下でＩＬ−６と共にインキュベートした。これらの実験においてＴＧＦ−βで見られたように、ＩＬ−６の添加の結果、ＩＬ−１０の中程度の増大のみがもたらされた（図１９のパネルＡおよびＢ）。なお、ＴＧＦ−βと組み合わせた場合、ＩＬ−６は相乗的に、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の大きな集団の出現を促進した。ＩＬ−１０を正に調節するＩＬ−２７の能力はＴＨ１分極条件下で最も明らかであったので、ＴＨ１およびＴＨ２条件下でのＩＬ−１０産生に対するＩＬ−６の効果を調べた。ＩＬ−２７とは異なり、ＩＬ−６は続いてのＴＨ１分極下でＩＬ−１０を増強させることができなかった（図２１）。対照的に、ＴＨ２分化条件下で、ＩＬ−６の添加は、ＩＬ−１０の産生レベルに対して相加的効果を有した（図２１）。
【０２６６】
ＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生におけるＳｔａｔ１およびＳｔａｔ３の役割
ＣＤ４＋Ｔ細胞における特異的ＳＴＡＴタンパク質の活性化は、Ｔ細胞の別々のＴＨ細胞系への分化に関連した寄与因子の１つであり、ＩＬ−２７は、ＳＴＡＴ１（および結果として、Ｔ−ｂｅｔ）、ＳＴＡＴ３および、より程度は低いが、ＳＴＡＴ４を含む多数のＳＴＡＴタンパク質を活性化することが示されており４９、５０、他方、ＩＬ−６は主としてＳＴＡＴ３および、程度はより低いが、ＳＴＡＴ１を活性化する５１、５２。ＩＬ−２７およびＩＬ−６がＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３を活性化する動態学を決定するために、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を３時間にわたって各サイトカインで刺激し、これらの転写因子のリン酸化をモニターした。これらの実験は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−６およびＩＬ−２７に応答してＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３をリン酸化できたが、ＩＬ−６はＩＬ−２７よりも早い速度でこれを行うことができたことをを明らかにした（図１９のパネルＣおよびＤ）。最高数のＰ−ＳＴＡＴ１＋細胞はＩＬ−２７での刺激後３０分まで見られなかったが、ＩＬ−６とＩＬ−２７応答のピーク間に、Ｐ−ＳＴＡＴ１＋細胞の割合の差はなかった。他方、ＩＬ−６はＳＴＡＴ３リン酸化のそのように強いインデューサーであったので、刺激の５分後には、Ｔ細胞のほぼ９０％はＰ−ＳＴＡＴ３＋であり、高レベルのＰ−ＳＴＡＴ３は３時間にわたって維持された。対照的に、わずかな割合のＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−２７に応答してＰ−ＳＴＡＴ３につき陽性に染色され、Ｐ−ＳＴＡＴ３＋細胞のこの集団は刺激から３時間後に維持されていなかった。
【０２６７】
ＩＬ−２７によるＩＬ−１０の誘導におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の役割をさらに調べるために、個々のＳＴＡＴタンパク質が欠損したマウスを用いた。ＩＬ−１７を阻害するＩＬ−２７の能力は、以前はＳＴＡＴ１を活性化するその能力に帰されており３８、他方、ＴＨ１分化の促進におけるＩＬ−２７Ｒシグナル伝達の役割は、ＳＴＡＴ１依存性ならびに非依存性メカニズムを介するＴ−ｂｅｔの活性化にほとんどが帰されてきた５３。従って、ＩＬ−１０を促進するＩＬ−２７の能力がこれらのタンパク質に関係するかを決定するために、Ｓｔａｔ１−／−およびＴｂｘ２１−／−（Ｔ−ｂｅｔ−欠損）マウスから得られたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２７の存在下または非存在下、非分極条件下で刺激した。ＳＴＡＴ１−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−２７に応答してＩＬ−１０を産生できない（図２０のパネルＡ）一方で、Ｔ−ｂｅｔの非存在は、ＩＬ−１０を促進するＩＬ−２７の能力に影響しなかった（図２０のパネルＢ）。
【０２６８】
ＳＴＡＴ３の役割を評価するために、ＣＤ４−Ｃｒｅ導入遺伝子（Ｓｔａｔ３ＣＤ４−／−）５４をも発現するｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）ＳＴＡＴ３対立遺伝子を有するマウスから誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２７の存在下または非存在下にて先のように刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＳＴＡＴ３対立遺伝子の除去は、Ｓｔａｔ３ｆｌ／ｆｌ  ＣＤ４−Ｃｒｅ−陰性野生型同腹子対照と比較して、ＩＬ−２７に応答してＩＬ−１０を産生するそれらの能力を低下させた（図２０のパネルＣ）。これらのデータは、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３がＩＬ−１０産生を促進するＩＬ−２７の能力に関与することを示す。
【０２６９】
加えて、ＩＬ−２７もまたＳＴＡＴ４に関連しているが、Ｓｔａｔ４−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２７の存在下、非分極条件下で培養した場合、ＳＴＡＴ４の非存在はＩＬ−１０を促進するＩＬ−２７の能力を妨げず（図２０のパネルＤ）、これはＳＴＡＴ４非依存性事象であることを示す。しかしながら、ＳＴＡＴ４−／−Ｔ細胞をＴＨ１条件下で培養した場合、ＩＬ−２７を加えた場合でさえ、ＩＬ−１２に応答した野生型細胞と比較しても、ＩＬ−１０産生が少なかったことに注意するのは重要である（図２２）。
【０２７０】
最後に、Ｓｔａｔ１−／−およびＳｔａｔ３  ＣＤ４−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、単独でまたはＴＧＦ−βと組み合わせてＩＬ−６で刺激した場合に、ＩＬ−１０を産生するそれらの能力について評価した。Ｓｔａｔ１−／−およびＳｔａｔ３ＣＤ４−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−６に応答してＩＬ−１０を産生する能力の低下を示した（図２０のパネルＥおよびＦ）。対照的に、Ｓｔａｔ１−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型対照と比較して、ＩＬ−６＋ＴＧＦ−βと共にインキュベートした場合に等量のＩＬ−１０を産生し、他方、Ｓｔａｔ３ＣＤ４−／−マウス由来のＴ細胞は、これらの同一条件下でＩＬ−１０を産生する能力を欠乏していた。これらの知見は、ＳＴＡＴ１シグナル伝達ではなく、ＳＴＡＴ３シグナル伝達が、ＴＨ１７条件下でＩＬ−１０産生を開始するためには、ＩＬ−６を要求することを示す。
【０２７１】
考察
ＴＨ２細胞に関連するサイトカインとしてのＩＬ−１０の元の記載以来、今日、免疫応答の多くのクラス（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７）の全体的阻害剤として作用するＩＬ−１０の多くの先天的および適合する産生源があることが認識されている。それにも拘わらず、Ｔ細胞はＩＬ−１０の主な産生源であるという初期の認識に拘わらず、これらのリンパ球におけるその発現を支配する因子について多くの疑問が依然として存在する。Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉおよび同僚による初期の研究は、ＩＬ−１２をＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０ダブルプロデューサー２３、２６の発生の駆動に関連付けており、これはＴＨ１条件下で、ＳＴＡＴ４がこれらの事象に関与することを示すデータによって本明細書に反復された観察結果である。さらに、ＩＬ−１０の存在下におけるヒトおよびマウスＴ細胞の慢性的刺激は、高レベルのＩＬ−１０を分泌し、結腸炎１７を軽減し得るＴヘルパー細胞（Ｔｒ１）の集団の出現を導いた。同様に、デキサメタゾン＋ビタミンＤ３での、インビトロでのナイーブヒトおよびネズミＣＤ４＋Ｔ細胞の反復刺激は、Ｔｒｅｇ細胞の集団によってＩＬ−１０産生を促進することが示されている５５。対照的に、本明細書において提示された研究は、短期間の刺激後においてさえ、ＩＬ−２７およびＩＬ−６が種々の分極条件下でＩＬ−１０のＴ細胞産生を誘導できたことを明らかとする。この観察結果は、ＩＬ−１０の産生を促進し、およびＩＬ−６／ＩＬ−１２ファミリーメンバーの炎症促進性および抗炎症性特性間の複雑な関係を補強する新しい経路を同定する。
【０２７２】
ＩＬ−２７は最初、ＴＨ１応答を促進する能力に基づいて記載されたが、今日、このタイプＩサイトカインはＴ細胞応答の強度および持続の負のレギュレーターとしての役割を有すると認識されている３２−３４。ＩＬ−２７の広い抗炎症効果は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１７の産生の阻害を通じてＴヘルパー細胞の機能に拮抗する能力に帰されている５０、５６。しかしながら、多数の実験的状況においては、Ｉｌ−２７ｒａ−／−マウスの表現型はＩＬ−１０−／−マウスのそれと顕著に同様であった３３、３８、３９。例えば、トキソプラズマ原虫に感染させたＩＬ−１０−／−およびＩｌ−２７ｒａ−／−両方のマウスは、調節不全ＴＨ１応答に関連する致死的ＣＤ４＋Ｔ細胞介在炎症を急性に発生したが１４、１５、３３、改変されたＴＨ１７は慢性疾患に応答する３８、４２。これらの後者の報告に関し、Ｓｈｅｒおよび同僚は、トキソプラズマ誘導病態を妨げるのに、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３−ＩＬ−１０＋Ｔ細胞が必要とされることを確立した２９。これらの知見と共に本明細書において提示されたデータは、ＩＬ−２７の機能の１つは、感染時にＴ細胞介在病態を制限するのを補助するＩＬ−１０のＴ細胞産生を促進するモデルを示唆する。推定上、この調節経路はトキソプラズマ症に制限されず、種々の感染および炎症状況５０、５６においてＩｌ−２７ｒａ−／−マウスで観察された炎症の増強が、少なくとも部分的には、ＩＬ−１０応答欠陥に帰すことができる。
【０２７３】
ＩＬ−１０の多数の細胞源があるが、ＩＬ−１０転写についての系特異的要件を規定した少数の研究がある。マクロファージにおいては、微生物の産物および免疫複合体はＩＬ−１０およびＭＡＰＫを誘導することができ、ＮＦ−ＫＢおよびＳｐ１はこの遺伝子の転写調節に関連付けられている５７−５９。Ｔ細胞においては、ＴＨ２細胞においては、ＪＵＮタンパク質がこれらの事象に関係付けられており、およびＧＡＴＡ３がこの遺伝子の転写に必要なＩＬ−１０遺伝子座の再構築および安定性に関連付けられているが、ＩＬ−１０合成を制御する分子事象についてはそれほど知られていない６０。ＩＬ−２７はＧＡＴＡ３発現を拮抗するので６１、この特定の転写因子は、ＴＨ１およびＴＨ１７分極条件下でＩＬ−１０転写を促進するＩＬ−２７およびＩＬ−６の能力を説明しないように見える。むしろ、本明細書において提示したデータは、主にＳＴＡＴ３、ならびにＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ４を、ＩＬ−１０のサイトカイン介在誘導に関連付ける。この観察結果は、ＩＬ−１０プロモーター中のＳＴＡＴ結合部位の存在、およびＩＦＮ−αはＩＬ−１０受容体を分子間活性化するＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の動員を誘導することができるという従前の報告と合致する６２。
【０２７４】
ＩＬ−６およびＩＬ−２７は共にｇｐ１３０を通じてシグナル伝達を行い、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３を活性化し、ＩＬ−１０を促進できるが、ＩＬ−２７のみがＩＬ−２およびＩＬ−１７をダウンレギュレートでき、一方で、ＩＬ−６がＴＨ１７活性を促進することは注目すべきである。これらの観察結果は、ＴＨ細胞の分化および機能におけるＳＴＡＴ分子の外見上の反対効果のいくつかを強調してきた文献の一部である。１９９０年代半ば以来、ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ６はＴＨ１およびＴＨ２の発生を促進する鍵となる転写因子であると認識されており６３、６４、他方、より最近の研究はＳＴＡＴ３をＴＨ１７細胞に関連させてきた６５−６７。今日、いずれのＳＴＡＴタンパク質がＴ細胞におけるＩＬ−２７の効果を介在するかは明らかになりつつある。従って、ＳＴＡＴ１を誘導するＩＬ−２７の能力はＴＨ１７発生に拮抗できる一方で、ＩＬ−２７がＩＬ−１０を誘導するのにＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３が必要とされる。対照的に、ＴＨ１７活性およびＩＬ−１０を促進するＩＬ−６の能力は、ＳＴＡＴ３依存性である。これらの別々の効果についての有望な説明は、ＩＬ−６およびＩＬ−２７双方に対する受容体はｇｐ１３０を含むが、ユニークなＩＬ−６ＲａおよびＩＬ−２７Ｒａ鎖が存在するということである。これは、ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ３ヘテロ−二量体がＩＬ−２７効果を介在することを示すかどうかとしても、（ＴＦＧと組み合わせた場合に）ＩＬ−６が、ＳＴＡＴ３ホモ−二量体を要求することはまた公式に試験されていない。あるいは、ＩＬ−６とＩＬ−２７間のＳＴＡＴ３リン酸化の程度の差は、ＩＬ−６によって能動的に誘導された高レベルのＳＴＡＴ３がＩＬ−１０を促進するのに十分である一方で、ＩＬ−２７がＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の組み合わせを必要とすることを示唆する。
【０２７５】
本実施例に記載されたこの研究の焦点は、ＩＬ−１０を促進するＩＬ−６およびＩＬ−２７の能力に当てられてきたが、恐らくは、同等に重要なのは、ＴＧＦ−βもまたこの経路に影響するという観察結果である。部分的には、ＴＧＦ−β−／−マウス６８におけるＴ細胞介在炎症の存在、ならびにＩＮＦ−γ１、６９、７０の先天性および適合産生を直接的に阻害するＴＧＦ−βの能力に基づいて、ＴＧＦ−βは抗炎症性サイトカインであると推定された。ＴＧＦ−βは、ＴｒｅｇおよびＴＨ１７細胞の発生、ならびに現在、非Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０の産生において顕著な役割を有するという認識の下で、それがＴ細胞の分化を指令するか、または細胞運命を決定する環境に存在するサイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−２７）によって調節されるＴ細胞活性の共有された中枢的レギュレーターであるかは明らかでないままである。
【０２７６】
本明細書において提示した研究は、ＩＬ−１０のＴ細胞産生を促進する因子としてのＩＬ−２７およびＩＬ−６を同定したが、より大きな問題の１つは、この観察結果が別々のＴ細胞サブセットの開発を示すか否かに関連する。ＭｏｓｓｍａｎおよびＣｏｆｆｍａｎが最初にＴＨ１およびＴＨ２細胞を記載した時点で、彼らは、Ｔ細胞表現型の全多様性、および他のＴ細胞型がインビボで存在するかどうかに疑問を持った７１。いずれの特定のメカニズムにも限定されるものではなく、本明細書において提示したデータの１つの可能な解釈は、Ｔヘルパーサブセットは、単独でまたはＩＬ−１０と組み合わせてＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１７を産生する能力によって規定することができることである。現在に至るまで、インビトロにてＩＬ−１０産生Ｔ細胞の安定な集団を生じさせるためにＩＬ−２７を用いる当初の試みは不成功に終わった。これらの予備的データを解釈するいくつかの方法があるが、１つの可能性は、ＩＬ−１０を分泌する能力は別々のＴ細胞サブセットの顕著な特徴ではなく、むしろ、ＩＬ−２７およびＩＬ−６などのサイトカインは、慢性炎症との関係でそれらにＩＬ−１０を産生させる主なＴ細胞サブセットに対する修飾剤を表すことである。再度、これは、異なるクラスの病原体を取り扱うのに要求される適当なＴヘルパーサブセットの確立を可能とする１つのメカニズムであるが、それら自身の炎症活性を規制するためのメカニズムを備える３つの別々のエフェクターサブセットの各々を提供するが、これらに限定されない。それにも拘わらず、強力な抗炎症サイトカインとしてのＩＬ−１０の同定により、ＩＬ−１０を用いて種々の自己免疫疾患を治療することができるという希望がある。しかしながら、明らかでないという理由で、ＩＬ−１０での臨床試験は期待外れであった。ＩＬ−１０の産生を促進するそれらの能力と組み合わせたＴ細胞エフェクター機能を阻害できるＩＬ−２７などのサイトカインの使用は、炎症性疾患の管理においてより有用であると予測される。
【０２７７】
本発明との関係では、本実施例に記載された実験は、前記した複合体および融合タンパク質が炎症応答を抑制できる（Ｔ細胞に対する直接的作用に加えて）もう１つの経路としてのＩＬ−１０発現の誘導を同定する。加えて、本実施例に記載した結果は、形質転換増殖因子βの同時投与は、複合体および融合タンパク質の効果を増強することができることを示す。
【０２７８】
方法
マウスおよび寄生虫
Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｓｔａｔ４−／−およびＴｂｘ２１−／−マウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ＷＳＸ−１−／−（Ｉｌ２７ｒａ−／−）マウスはＣｈｒｉｓｔｉａａｎ  Ｓａｒｉｓ博士（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）より提供された。Ｓｔａｔ１−／−マウスはＰｈｉｌｌｉｐ  Ｓｃｏｔｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）より提供された。Ｆｏｘｐ３についての翻訳の部位においてノックインされたＧＦＰレポーターを備えるマウスが従前に記載されており７２、Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｔｕｒｋａ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）より提供された。制度ガイダンスに従い、ペンシルベニア大学の病理生物学部門における特異的病原体が無い施設にマウスを収容し、育種した。
【０２７９】
トキソプラズマ原虫のＭＥ４９株は慢性的に感染させたＣＢＡ／ｃａマウスから調製し、２０個の嚢胞で実験動物を腹腔内感染させた。Ｉｌ２７ｒａ−／−および野生型Ｃ５７ＢＬ／６対照マウスを、感染から５日後において飲料水に２００ｍｇ／Ｌのスルファジアジン（Ｓｉｇｍａ）を加えて２週間処理して、Ｉｌ２７ｒａ−／−を感染の慢性期まで進行させた。可溶性トキソプラズマ抗原（ＳＴＡｇ）は、従前に記載されているように、ＲＨ株のタキゾイトから調製した７３。慢性的に感染させたマウスからのＢＭＮＣは、公表されたプロトコルに従って単離した７２、７４。
【０２８０】
ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の産生
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ分離（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、ＣＤ８＋およびＮＫ１．１＋細胞を枯渇させてＣＤ４＋Ｔ細胞を豊富化した、またはＣＤ４＋およびＮＫ１．１＋細胞を枯渇させて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を豊富化させた脾細胞およびリンパ節から単離した。細胞を、５×１０６細胞／ｍｌの密度で、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で平板培養した。細胞を抗ＴＣＲ抗体（α−ＣＤ３；１μｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で刺激した。ＩＬ−１０の産生のために、Ｔ細胞培養に、組換えマウスＩＬ−２７（１００ｎｇ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ）、もしくはヒトＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）単独またはＩＬ−２７との組み合わせを補充した。加えて、抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ；クローンＸＭＧ１．２）および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ；クローン１１Ｂ１１）を用いて、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を非分極培養中で中和した。いくつかの場合においては、Ｔ細胞を、ＴＨ１（１０ｎｇ／ｍｌ組換えＩＬ−１２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＩＬ−４）、ＴＨ２（８ｎｇ／ｍｌ組換えＩＬ−４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＩＦＮ−γ）またはＴＨ１７（１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β；Ｒ＆Ｄ，１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＋１０μｇ／ｍｌ  α−ＩＦＮ−γおよびα−ＩＬ−４）条件下で培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を３日目に収穫する一方で、３日目のＣＤ４＋Ｔ細胞に新鮮な培地および試薬を補充し、４日目に収穫した。次いで、Ｔ細胞をＰＭＡおよびイオノマイシン＋ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）で再刺激した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＢＤＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。全ての抗体は、ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＧＦＰの細胞内染色のために、細胞をまずマウス抗ＧＦＰ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、続いてウサギ抗マウス−ＦＩＴＣ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で第二の染色を行った。
【０２８１】
Ｐ−ＳＴＡＴ１およびＰ−ＳＴＡＴ３についての細胞内染色
ＣＤ４＋単離キット（Ｍｉｌｌｔｅｎｙｉ）を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから精製した。１×１０６の精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−６またはＩＬ−２７と共に５、３０、６０または１８０分間インキュベートした。次いで、細胞を、２％パラホルムアルデヒドで、３７℃で１０分間固定した。次いで、固定後、細胞に９０％メタノールを氷上で３０分間浸透させ、続いてＣＤ４、Ｐ−ＳＴＡＴ１およびＰ−ＳＴＡＴ３について染色した。ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のリン酸化されたチロシン残基に対する抗体は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。
【０２８２】
統計学
独立スチューデントのｔ検定を用いて有意差を決定し記載し、Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。
【０２８３】
実施例３についての文献
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【０２８４】
前述の本発明は明瞭性および理解の目的でいくらか詳細に記載してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態および詳細において種々の変形をなすことができるのは、本開示を読んだ当業者に明らかである。例えば、前記した全ての技術および装置を種々の組み合わせで用いることができる。本出願において引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の書類は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の書類が個々に示されて、全ての目的で参照により組み込まれるのと同程度に、全ての目的で参照によりその全体が組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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