(57)【要約】  本発明は、デンプン分解活性物を含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物、および本発明の酵素調製物を得るための精製方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
混入デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物の製造方法であって、液体クロマトグラフィを用いて粗プロリン特異性プロテアーゼ調製物を精製する工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により得られる、混入デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物。
【請求項３】
混入デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物の、飲料調製のための使用。
【請求項４】
混入デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物の、タンパク質加水分解物調製のための使用。
【請求項５】
混入デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物の、有毒な小麦グルテンエピトープに対する耐性を増大させるための使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、混入デンプン分解副活性物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃ  ｓｉｄｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物の製造方法、それにより得られるプロリン特異性プロテアーゼ調製物、およびその使用に関する。
【０００２】
プロリン特異性プロテアーゼは、タンパク質の加水分解物の生成や各種液体食品におけるヘイズ形成の予防という有利な特性によって、産業用酵素の新たなクラスを形成している。例えば、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットには、プロリン特異性プロテアーゼによりプロリンリッチなタンパク質基質から製造された加水分解物の苦味の実質的な除去について記載されている。タンパク質の加水分解物は特殊調製粉乳や臨床栄養にしばしば使用されている。これらの生成物の目的は、タンパク質アレルギーの誘発の展開を阻止するとともに、供給されたタンパク質の効率的代謝を確実にすることにある。医療以外の目的で必要とする消費者、例えば運動選手または痩せるためのダイエットを行っている人々向けの製品中に含まれるタンパク質加水分解物は、良好な風味を与えるための調節を行わなければならない。そのようなタンパク質加水分解物の殆どは、牛乳タンパク質、ほぼ例外なく牛乳のホエータンパク質部分から得られる。この目的でホエータンパク質がよく使用されるのは、多くの国でホエータンパク質がカゼインより安いという事実に基づくのみならず、カゼインは、よく知られているように酵素加水分解により、ホエータンパク質とは対照的に苦くなるからでもある。牛乳中のタンパク質の８０％はカゼインであるため、これらのカゼインはミルクのホエー部分では担えない栄養上の役割を果たすと考えて差し支えないであろう。したがって、カゼイン加水分解物を食用として利用できるようにすることは、栄養ひいては経済に相当の関連を有する。
【０００３】
国際公開第０２／０４６３８１号パンフレットには、プロリン特異性プロテアーゼの別の有用な用途が記載されている。この出願には、ビール、ワインおよびフルーツジュースにおけるヘイズ生成を防止する酵素による方法が記載されている。これらの飲料において生成されるヘイズは、通常、プロリンリッチの（「ヘイズ活性を有する」）タンパク質と植物性ポリフェノールとの会合体のコロイド状沈殿物である。ビール、ワインおよびフルーツジュースの製造過程で、タンパク質とポリフェノールが、製造の初期段階で粉砕された植物および／または果実の組織から抽出される。
【０００４】
ビールの製造では、ヘイズ活性タンパク質および大部分のポリフェノールは、大麦麦芽から抽出される。ビールの発酵および熟成期間に生成されるタンパク質−ポリフェノール沈澱物は、最終的に、瓶詰ビール中の所謂「チルヘイズ」となり得る。このビール中のチルヘイズの生成の防止は、従来、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）またはシリカヒドロゲル処理が使用されている技術的に困難でかつ高コストの方法である。従来法とは対照的に、国際公開第０２／０４６３８１号パンフレットの酵素を使用するチルヘイズ防止アプローチは、比較的低コストで簡単である。ビールの製造において、プロリン特異性プロテアーゼは発酵工程で添加される。これによってビールの酸化リスクが最小限に抑えられる。インキュベーション時間を長くする（全発酵工程中）と、最小濃度のプロリン特異性プロテアーゼでヘイズ活性タンパク質をすべて十分に分解できることが保証される。これらの利点とビール生産量の巨大さを考慮すれば、酵素法によって削減されるコストは相当なものになる。
【０００５】
今、本願出願人は、プロリン特異性プロテアーゼを前記用途のいずれかで使用するとき、プロリン特異性プロテアーゼが好ましくはデンプン分解副活性物を含んでいないことが極めて重要であることを見出した。プロリン特異性プロテアーゼ調製物中のこれらのデンプン分解副活性物の濃度が高過ぎると、関連する最終製品中に含まれるポリサッカライドが分解される結果、有害な副次的影響が生じ得る。このようなポリサッカライド部分の分解によって、例えば、固体最終製品の軟化、さらには液化さえも引き起こされたり、あるいは、ビールなどの飲料の口当たり（ｍｏｕｔｈｆｅｅｌ）が損なわれたりするおそれがある。したがって、本発明の目的は、混入デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼ調製物を提供することにある。
【０００６】
用語「プロリン特異性プロテアーゼ」は、プロリン残基を含むペプチド結合を開裂させることができるエンドプロテアーゼまたはエキソペプチダーゼを意味する。すなわち、「プロリン特異性プロテアーゼ」は、ペプチドまたはタンパク質がプロリン残基を含む位置でペプチドまたはタンパク質を開裂させるものである。そのようなペプチド結合を開裂させることができるエンドプロテアーゼの例としては、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．２６；フュロップ（Ｆｕｅｌｏｐ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）１９９８年、９４、１６１−１７０頁）、およびセリンプロテアーゼのＳＣクランのＳ２８ファミリーに属するエンドプロテアーゼ（イーデンス（Ｅｄｅｎｓ）ら、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ）５３：７９５０−７９５７頁、２００５年；ハンドブック・オブ・プロテオリティック・エンザイムズ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）；バレット・Ａ．Ｊ．（Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．）；ローリングス・Ｎ．Ｄ．（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．）；ヴェスナー・Ｊ．Ｆ．（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  Ｊ．Ｆ．）編；アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）、英国（ＵＫ）、１９９８年、３６９−４１５頁）が挙げられる。プロリン残基を含むペプチド結合を開裂させることができるエキソプロテアーゼの中で、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＥＣ  ３．４．１４．４）およびジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＥＣ  ３．４．１４．２）の酵素は記載する価値がある。
【０００７】
用語「デンプン分解副活性物」は、スターチ、デキストリン、グリコーゲンなどのポリサッカライド中の１，４−アルファ−Ｄ−グルコシド結合を加水分解することができる酵素活性物を意味する。したがって、用語「デンプン分解副活性物」は、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２）、グルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）、グルカン１，４−アルファ−マルトヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）、およびこれら活性物の混合物などの酵素を含む。
【０００８】
用語「デンプン分解副活性物を実質的に含まない」は、それぞれの製造プロセスでプロリン特異性プロテアーゼを有効量添加したとき、上述したような負の影響を伴うポリ−およびオリゴサッカライドの観測可能な分解が起きないほどデンプン分解副活性物が低濃度であることを意味する。このことは、プロリン特異性プロテアーゼ中に混入したデンプン分解副活性物の許容濃度が、特定のプロセス条件や含有するポリサッカライドの濃度およびタイプに依存して、製造プロセスにより変化し得ることを意味している。
【０００９】
用語「デンプン分解副活性物を実質的に含まない」は、また、所与のデンプン分解副活性物の活性（ある単位で）を所与のプロリン特異性プロテアーゼ活性物の活性（ある単位で）で除した比としても表され得る。この比は製造プロセスにより変化し得るものであり、製造プロセスで使用される特定のプロリン特異性プロテアーゼにも、使用される特定のプロリン特異性プロテアーゼ中に含まれる特定のデンプン分解副活性物にも依存するであろう。
【００１０】
本発明の分離方法の有利な点は、本発明の方法によればプロリン特異性プロテアーゼの収率が少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％であり、一方、残留するデンプン分解活性、例えばアルファデンプン分解活性が、一般に、１ＰＰＵ当たり５．０ＦＡＵ以下、例えば１ＰＰＵ当たり０．５ＦＡＵ以下、例えば１ＰＰＵ当たり０．０５ＦＡＵ以下、例えば１ＰＰＵ当たり０．００５ＦＡＵ以下、好ましくは０．０００５ＦＡＵ／ＰＰＵ以下であることである。アミログルコシダーゼ活性は、一般に、１ＰＰＵ当たり１ＡＧＩ以下、例えば１ＰＰＵ当たり０．５ＡＧＩ以下、例えば１ＰＰＵ当たり０．１ＡＧＩまたは１ＰＰＵ当たり０．０１ＡＧＩ以下であろう。ＦＡＵおよびＰＰＵの定義は、本願の材料および方法の項で規定される。また、グルコアミラーゼ活性（「ＡＧＩ」）の定義も同じ項で提供される。
【００１１】
プロリン特異性プロテアーゼの最適ｐＨが５．５より大きい場合には、ＰＰＵ測定は、通常、ｐＨ４．６および３７℃ではなく、例えば３７℃で、ｐＨ６．５で行われる。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼの製造方法であって、１つもしくはそれ以上の液体クロマトグラフィによる分離工程、好ましくは１つのクロマトグラフィによる分離工程を含む方法を提供する。当該技術分野ではクロマトグラフィによる多くの異なる分離法が知られており、本発明のプロリン特異性プロテアーゼを提供するために、これらをスクリーニングすることができる。適切なクロマトグラフ分離法としては、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィその他の方法が挙げられる。本発明では、イオン交換クロマトグラフィおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィを使用することが好ましい。
【００１３】
対象とするプロリン特異性プロテアーゼは、発酵ブロス中で対象とするプロリン特異性プロテアーゼを産生し、かつ好ましくは分泌するカビ、酵母および細菌などの微生物を用いる発酵法によって製造し得る。当該技術分野においては、そのような発酵法は知られており、例えば国際公開第０２／４５５２４号パンフレットを参照されたい。従来の方法では、プロリン特異性プロテアーゼは、これも当該技術分野では知られた技術により、発酵ブロスから回収され得る。第１工程として、生産微生物の細胞を遠心分離またはろ過によりブロスから分離し得る。
【００１４】
プロリン特異性プロテアーゼがブロス中で微生物により分泌される場合は、細胞を含まないブロスを、例えば限外ろ過によって濃縮し、こうして得られたプロリン特異性プロテアーゼ調製物を、グリセロールまたは他の多価アルコールなどの公知の安定剤により安定化させることができる。
【００１５】
プロリン特異性プロテアーゼが微生物によって分泌されず、細胞内に残っている場合には、産生微生物を溶解して、プロリン特異性プロテアーゼ活性物を放出させなければならない。細胞の残屑を除去するために、ろ過または遠心分離工程をもう一度行った後、分泌されたプロリン特異性プロテアーゼに関して上で記載したように、液体部分を濃縮し、安定化させることができる。公知の沈殿および／または蒸発および／または（スプレー）ドライ法により、場合により濃縮したプロリン特異性プロテアーゼ溶液から固体調製物を得てもよい。
【００１６】
本発明の方法においては、デンプン分解副活性物を実質的に含まない本発明のプロリン特異性プロテアーゼ調製物を提供するために、細胞を含まないブロスまたは細胞残屑を含まない液体部分に対し、１つまたはそれ以上のクロマトグラフィによる分離工程を行うことができる。そのようなクロマトグラフィによる分離工程は、グリセロールまたは多価アルコールの添加による安定化前の調製物に対して行うことが好ましい。最適なクロマトグラフ分離法の選択は、例えば、プロリン特異性プロテアーゼや混入しているデンプン分解活性物の分子特性に大きく依存する。関連する特性としては、等電点、疎水性、分子の表面電荷分布、分子量、およびタンパク質の他のいくつかの化学的特性が挙げられる。プロテイン・ピュアリフィケーション・ハンドブック（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、現在はＧＥ・ヘルスケア・バイオサイエンシズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ディエゲム（Ｄｉｅｇｅｍ）、ベルギー（Ｂｅｌｇｉｕｍ）より発行）には、酵素の精製でこれらの特性を使用することについての実際的な背景が記載されている。
【００１７】
しかしながら、プロリン特異性プロテアーゼが微生物によって分泌されない場合、あるいは、デンプン分解副活性物が、プロリン特異性プロテアーゼの分子特性と非常に類似した分子特性を示す場合には、クロマトグラフィによる分離工程はかなり複雑なものになる。例えば、等電点の類似は、例えばイオン交換クロマトグラフィにおいて典型的な混乱をもたらし、それによって産生微生物は多くの種類の酵素（その１つがプロリン特異性プロテアーゼである）を分泌することになる。この場合、混入している酵素から所望のプロリン特異性プロテアーゼを精製することは容易ではなく、コスト効率良く、かつ大規模な工業的規模でこの精製を行わなければならない場合には非常に困難である。非常に多くの種類のクロマトグラフィ樹脂および溶出手順を調べた結果、極めて類似した等電点を有するタンパク質分解活性物と複数のデンプン分解活性物との完全な分離を実現する、工業的に適用可能なワンカラムの分離手順を本願出願人は考案することができた。本発明のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異性エンドプロテアーゼの好ましい精製方法では、イオン交換クロマトグラフィまたは疎水性相互作用クロマトグラフィを使用する。これらの精製法は本願の実施例２に例示されている。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、デンプン分解副活性物を実質的に含まないプロリン特異性プロテアーゼを提供する。そのようなプロリン特異性プロテアーゼは、ポリサッカライドの分解が望ましくないか要求されないような用途で有利に使用される。デンプン分解活性物には熱に対して比較的安定なものがあり、それらは通常使用される酵素不活性化手順または製品殺菌手順に耐え得る可能性が高い。その結果、プロリン特異性プロテアーゼを使用して製造されたタンパク質の加水分解物には、ポリ−またはオリゴサッカライドと組み合わせて調合された場合に重大な問題を引き起こす残留デンプン分解活性物が微量含まれ得る。したがって、本発明の方法により得られるプロリン特異性プロテアーゼは、得られたタンパク質加水分解物がスターチまたはマルトデキストリン含有化合物と組み合わされるあらゆる製品に好適に使用される。好ましくは、この製品は、固体、例えばエネルギーバーまたはプロテインバーであるか、粉末、例えば特殊調製粉乳に混合される粉末、またはシェイクの形態の栄養混合物を調製するための粉末であり、あるいは、製品は液体特殊調製粉乳またはパワードリンクなどの液体とすることも可能である。
【００１９】
さらに、本発明の方法で得られるプロリン特異性プロテアーゼは、活性酵素を大量に含有する最終製品において有利に使用される。そのような最終製品は、特に国際公開第２００５／０２７９５３号パンフレットおよび本願出願人の係属中の出願であるＰＣＴ／ＥＰ２００７／０００８９６号明細書に記載されている。これらの最終製品は、有毒なグルテンエピトープの影響を最小限とする意図をもって、小麦グルテンを含有する製品と共に消費され、セリアック病患者などのグルテンにアレルギーを有する人々には特に関係が深いものである。
【００２０】
最後に、本発明の方法により得られるプロリン特異性プロテアーゼは、植物由来の液体製品全てのヘイズ防止に使用することができる。好ましくは、この植物由来液体製品はビールである。本発明の方法により得られるプロリン特異性プロテアーゼの後者の用途における使用は、ポリ−およびオリゴサッカライドの過分解を防止し、それにより最終的なビールの口当たりを改善する。
【００２１】
［材料および方法］
［プロリン特異性エンドタンパク質分解活性］
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異性エンドタンパク質分解活性を、ＣＢＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（バヘム（Ｂａｃｈｅｍ）、ブーベンドルフ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ）、スイス（Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ））を基質とし、ｐＨ４．６のクエン酸塩／リン酸二ナトリウム緩衝液中、３７℃で試験した。反応生成物を分光光度法により４０５ｎＭでモニターした。４０５ｎｍにおける吸収の時間的増加は、酵素活性の尺度である。プロリンプロテアーゼ単位（ＰＰＵ）は、特定の条件下、０．３７ｍＭのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ基質濃度で、１分当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリドを放出する酵素の量として定義される。
【００２２】
［アルファ−アミラーゼ活性］
使用したアルファ−アミラーゼ測定法は、Ｍｅｇａｚｙｍｅより供給されたＣｅｒａｌｐｈａ試験キット（Ｒ−ＣＡＡＲ−４；Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．、ブレイ（Ｂｒａｙ）、アイルランド（Ｉｒｅｌａｎｄ））に基づくものである。この方法では、試料を、「非還元性末端ブロックｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド」（ＢＮＰＧ７）と、過剰のアミログルコシダーゼおよびアルファ−グルコシダーゼと共にインキュベートする。このオリゴサッカリドがエンド型アルファ−アミラーゼにより加水分解されると、この混合物中に存在する過剰のアミログルコシダーゼおよびアルファ−グルコシダーゼが、ｐ−ニトロフェノール結合基質を即座にかつ定量的に加水分解する。インキュベーションでは、９０マイクロＬの基質溶液が、１ｍｌ当たり０．００１〜０．０１ＦＡＵを含有する１０マイクロＬのサンプル溶液と反応する。４２５秒のインキュベーション（ｐＨ５．２および３７℃で）後、インキュベーション反応を停止させ、７５マイクロＬのアルカリ性（２０．５ｇ／ｌ）ＴＲＩＳ溶液を添加して発色させる。４０５ｎｍの色の増加は、サンプル中のデンプン分解酵素活性に比例する。この方法では、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のアルファアミラーゼ含有標準調製物を系の校正に使用した。この標準の活性はＦＡＵ（Ｆｕｎｇａｌ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ｕｎｉｔｓ（カビアミラーゼ単位））で表わされる。１ＦＡＵは、ｐＨ５．０、３０℃、および反応時間１５〜２５分でヨウ素と反応させた後、６２０ｎｍにおいて標準色と等しい吸収を有する生成物中で、可溶性スターチを１時間に１グラムの割合で転換する酵素の量として定義される。標準色は、０．０１Ｎの塩酸１００ｍｌ中に２５．０ｇのＣｏＣｌ２・Ｈ２Ｏおよび３．８４の重クロム酸カリウムを溶解させたものからなるＣｏＣｌ２色標準の吸収として定義される。したがって、４０５ｎｍにおける０．５４の吸収増加は１ｍｌ当たり０．００５ＦＡＵのアミラーゼ活性に対応する。この方法の測定範囲は１ｍｌ当たり０．００１〜０．０１ＦＡＵであり、これは０．１１〜１．１の吸収の増加に対応する。
【００２３】
［アミログルコシダーゼ活性］
サンプル中のデンプン分解エキソ活性を定量化するために、アミログルコシダーゼ活性を測定した。Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．より供給されたアミノグルコシダーゼ検定用試薬（Ｒ−ＡＭＧＲ３）を使用した。アミログルコシダーゼ活性を、基質としてｐ−ニトロフェニル−β−マルトシドを用い、３７℃、ｐＨ４．５０で測定する。１アミログルコシダーゼ単位（ＡＧｌ）は、ｐＨ４．３、６０℃で、可溶性スターチから１分当たり１μｍｏｌのグルコースを生産する酵素の量として定義される。ｐ−ニトロフェニル−β−マルトシドの酵素加水分解により、ｐ−ニトロフェノールおよびセロビオースが放出される。試薬により過剰のβ−グルコシダーゼが添加されると、セロビオースはグルコースに確実に加水分解し、セロビオースによるアミログリコシダーゼの競合的阻害が防止される。ｐ−ニトロフェノールの定量的放出は、酵素活性の尺度であり、アルカリ性条件下で測定される。インキュベーションでは、９０マイクロＬの基質溶液が、１ｍｌ当たり１〜６ＡＧｌを含有する１０マイクロＬのサンプル溶液と反応する。４２５秒のインキュベーション後、７５マイクロＬのアルカリ性（４１．０ｇ／ｌ）ＴＲＩＳ溶液を加えて酵素反応を停止させる。その後、４０５ｎｍの波長で吸収を測定する。この方法では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のアミログルコシダーゼ標準調製物を系の校正に使用した。したがって、４０５ｎｍにおける０．４の吸収増加は１ｍｌ当たり３ＡＧｌのアミログルコシダーゼ活性に対応する。この方法の測定範囲は１ｍｌ当たり１〜６ＡＧｌであり、これは０．１４〜０．８０の吸収の増加に対応する。
【００２４】
［糖プロファイル解析］
イオン交換クロマトグラフィにより精製したプロリン特異性プロテアーゼのサンプルを、脱ガスしたビール（ハイネケンピルスナー（Ｈｅｉｎｅｋｅｎ  Ｐｉｌｓｅｎｅｒ）、Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｑｕａｌｉｔｙ）で１０倍に希釈し、３７℃で終夜のインキュベーションを行った。インキュベートしたビールの糖プロファイルを、Ｂｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ４２Ａ、３００×７．８ｍｍカラムで、Ｂｉｏｒａｄカチオンおよびアニオン交換体を使用して過剰の塩を除去して、分析した。マルトース、マルトトリオースおよびアルファ−シクロデキストリンハイドレートを分子量の標準物質として使用した。グルコースを用いた校正により、定量的情報が得られた。カラム温度８５℃、ＭｉｌｌｉＱ水の流量０．５ｍｌ／分とした。
【００２５】
［実施例］
［実施例１］
［ビールのポリサッカライドおよび糖成分に及ぼすデンプン分解副活性物の影響］
混入したデンプン分解副活性物の負の影響を調べるために、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異性エンドプロテアーゼ粗調製物（国際公開第０２／０４６３８１号パンフレット参照）を、脱ガスしたラガービールに加え、３７℃で終夜インキュベートした。この事例を説明するために、この実験では過剰な量のタンパク質分解酵素（ヘイズ防止に十分な０．２５ＰＰＵ／ｌ−ビールより多い１．０ＰＰＵ／ｌ−ビール）を使用した。また、対照として、等体積の緩衝液（しかし酵素活性は有さない）をビールに添加し、これも終夜インキュベートした。翌朝、両ビールサンプルについて、材料および方法の項で詳述した手順に従って、糖分析を行った。得られた結果（表１参照）により、プロリン特異性エンドプロテアーゼ粗調製物と共に酵素をインキュベートした結果、ラガービール中に存在するポリサッカライドはほぼ完全に分解して、グルコースのみならず多くの異なるオリゴ糖が生成されることが明らかである。例えば、グルコースは、酵素処理ビール中に大量に存在し、対照のビールサンプルには存在しない。そのような転換がビール製造の醗酵段階で起これば、酵母は直ちに全てのグルコースおよびマルトースを消費し、それによりエタノールをさらに生成するであろう。そのような変化は、最終的なビールのエタノールパーセントを変化させるばかりでなく口当たりを変えるため、明確にわかる。この簡単な実験は、望ましくないデンプン分解活性物がプロリン特異性エンドプロテアーゼ粗調製物中に存在することを示している。
【００２６】
【表１】
2009534045.tif 000002
【００２７】
［実施例２］
［アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異性エンドプロテアーゼからのデンプン分解副活性物のクロマトグラフィによる除去］
国際公開第０２／０４６３８１号パンフレットに詳述されているＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異性エンドプロテアーゼ調製物から、デンプン分解副活性物を除去するために、多くのクロマトグラフィ樹脂をスクリーニングした。この目的のために、カチオン交換体ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦおよび疎水性相互作用（ＨＩＣ）樹脂ブチルＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）を選択した。両樹脂を、ＵＮＩＣＯＲＮ  ３．２０でコントロールされるＡＥＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００およびＵＮＩＣＯＲＮ  ３．２１でコントロールされるＡＥＫＴＡ  ＰｕｒｉｆｉｅｒをＦＲＡＣ−９５０フラクションコレクターと組み合わせて使用し、Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／１００カラム（ＣＶ＝２，２ｍｌ）で試験した。溶出後、生成された全フラクションについて、材料および方法の項で明記した方法を用いて、プロリン特異性エンドプロテアーゼ活性およびデンプン分解活性を試験した。
【００２８】
出発材料として、酵素活性１０ＰＰＵ／ｍｌ、ｐＨ４および電気伝導度約４ｍＳ／ｃｍのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異性エンドプロテアーゼのろ液を使用して、下記の条件でＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−６ＦＦのクロマトグラフィを行った。
【００２９】
【表２】
2009534045.tif 000003
【００３０】
使用したクロマトグラフィの条件下、プロテアーゼは樹脂と結合したが、主な混入物質であるデンプン分解活性物は結合しなかった。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィは、タンパク質分解活性物とデンプン分解活性物の等電点の差が０，８ｐＨ単位未満であっても、タンパク質分解活性物とデンプン分解活性物の分離が可能であることを示した。
【００３１】
下記の条件でＨＩＣクロマトグラフィを実施した。出発材料として、ここでもまた、活性１０ＰＰＵ／ｍｌおよびｐＨ４のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異性プロテアーゼのろ液を使用した。このろ液を２ＭのＮａ２ＳＯ４を含有する２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝４．２、Ｇ＝１２１ｍＳ／ｃｍ））で２倍に希釈し、その後、カラムに注入する前に無菌ろ過（０．２μｍ）を行った。
【００３２】
【表３】
2009534045.tif 000004
【００３３】
酵素をカラムに注入後、かなりのテーリングが起こることから、ベースライン分離を実現するには長い洗浄手順を必要とした。最終的には、緩衝液Ｂによりプロリン特異性プロテアーゼをカラムから溶出させることができた。プロリン特異性タンパク質分解活性物を含むフラクションをプールし、残留するデンプン分解副活性物を測定して、表２にまとめたデータを得た。希釈されてはいるものの、元のタンパク質分解活性にまで戻って計算すれば（カッコ内の数値を参照）、精製物からはデンプン分解活性物が大きく減少していた。
【００３４】
【表４】
2009534045.tif 000005
【００３５】
［実施例３］
［精製したＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異性エンドプロテアーゼは、ビールのマルトデキストリン成分に影響を及ぼさない］
クロマトグラフィにより精製したプロリン特異性エンドプロテアーゼのビール中の働きを試験するために、実施例１に記載した実験を繰り返した。しかし、この場合、より実際的な酵素添加量を使用した。すなわち、粗酵素も精製酵素も、活性が０．２５ＰＰＵ／ｌ−ビールとなるように添加した。ここでも、酵素活性を有さない緩衝液をブランクとして使用した。３７℃で終夜のインキュベーションをもう１度行い、各種ビールサンプルにおける糖プロファイルを再び測定した。得られたデータ（表３）は、精製酵素と共にインキュベートしたビールの糖プロファイルが対照ビールの糖プロファイルと同じであることを示している。粗酵素（しかし、今回は実際的な濃度）と共にインキュベートしたビールの糖プロファイルは、ＤＰ２およびＤＰ３残留物の含有率がより高いことから、対照物とはほんの僅かではあるが重大な違いがある。実際的なビール適用条件下では、酵素は発酵および熟成プロセスの全期間に亘って存在するであろうから、僅かなデンプン分解性混入物でも顕在化するであろう。
【００３６】
【表５】
2009534045.tif 000006
【国際調査報告】
2009534045.tif 000007
2009534045.tif 000008
2009534045.tif 000009