(57)【要約】  本発明は、所望の植物におけるヌクレオチド配列の制御のための組成物及び方法が提供される。組成物としては、ウキクサのユビキチンや、ｒ−ヒストンや、キチナーゼの遺伝子から単離された発現制御因子の新規ヌクレオチド配列、及びそのバリアントやフラグメントを挙げることができる。本明細書で開示する発現制御因子を用いた植物における、所望のヌクレオチド配列の発現方法がさらに提供される。所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明の発現制御因子を含む発現構築物を植物、植物細胞、又は根粒に導入することを含む。特に、かかる組成物や方法は、ウキクサにおいて、所望のヌクレオチド配列の発現を増強することに使用される。さらに、新規なウキクサシグナルペプチドコード配列やコードされているシグナルペプチドもまた提供される。本発明の発言構築物が所望のポリペプチドを発現するために設計される場合、かかる新規シグナルペプチドコード配列は、所望のコードされたポリペプチドの細胞外分泌のために提供される本発明の発現構築物に包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、１３、又は１４に示される配列を含むヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、１３、又は１４に示される配列の少なくとも連続した５０ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であって、植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と、
（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６、１３、又は１４に示される配列の機能的なフラグメントを含むヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と、
（ｄ）配列番号１、２、３、４、５、６、１３、又は１４に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列であって、植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と、
（ｅ）（ａ）のヌクレオチド配列相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含む発現構築物。
【請求項３】
作動可能に連結した所望の非相同ヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の発現構築物。
【請求項４】
所望の非相同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの培地への分泌を誘導するシグナルペプチドの、作動可能に連結したコード配列をさらに含むことを特徴とする請求項３記載の発現構築物。
【請求項５】
シグナルペプチドが、
（ａ）配列番号１６に示される配列と、
（ｂ）配列番号１６に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であって、ポリペプチドの培地への分泌を誘導する配列と、
（ｃ）配列番号１６に示される配列の機能的なフラグメントであって、前記配列がポリペプチドの培地への分泌を誘導するフラグメントと
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４記載の発現構築物。
【請求項６】
シグナルペプチドのコード配列が、
（ａ）配列番号１５に示される配列と、
（ｂ）配列番号１５に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、
（ｃ）配列番号１５に示される配列のフラグメントと
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５記載の発現構築物。
【請求項７】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、ほ乳類のポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載の発現構築物。
【請求項８】
ほ乳類のポリペプチドが、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、プラスミノーゲン、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、サイトカイン、レセプター、ヒトワクチン、動物ワクチン、ペプチド、血清アルブミン、及びそれらの組合せ、からなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の発現構築物。
【請求項９】
請求項２記載の発現構築物を含む、形質転換された植物、植物細胞、又は根粒。
【請求項１０】
形質転換された植物、植物細胞、又は根粒が、単子葉植物であることを特徴とする請求項９記載の形質転換された植物、植物細胞、又は根粒。
【請求項１１】
単子葉植物が、ウキクサ属、ミジンコウキクサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びアオウキクサ属からなる群から選択される属由来であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換された植物、植物細胞、又は根粒。
【請求項１２】
コウキクサ、レムナサエ・ミニスクラ、ナンゴクウアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーであることを特徴とする請求項１０記載の形質転換された植物、植物細胞、又は根粒。
【請求項１３】
形質転換された植物、又は植物細胞若しくは根粒が、双子葉植物であることを特徴とする請求項９記載の形質転換された植物、植物細胞、又は根粒。
【請求項１４】
（ａ）配列番号７、８、又は９に示される配列を含むヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号７、８、又は９に示される配列の機能的なフラグメントを含むヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが植物細胞において転写を増強するヌクレオチド配列
とからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４記載の核酸分子を含む発現構築物。
【請求項１６】
作動可能に連結した所望のプロモーターをさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の発現構築物。
【請求項１７】
所望のプロモーターが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３、及び配列番号１４に示される配列を含むヌクレオチド配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６記載の発現構築物。
【請求項１８】
（ａ）配列番号１５に示される配列を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１５に示される配列の少なくとも連続した２５ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であって、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１５に示される配列の機能的なフラグメントを含むヌクレオチド配列であって、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び
（ｄ）配列番号１５に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列であって、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１９】
所望の非相同ヌクレオチド配列に作動可能に連結した請求項１８記載の核酸分子を含むことを特徴とする発現構築物。
【請求項２０】
作動可能に連結した所望のプロモーターをさらに含むことを特徴とする請求項１９記載の発現構築物。
【請求項２１】
所望のプロモーターが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３、及び配列番号１４に示される配列を含むヌクレオチド配列からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２０記載の発現構築物。
【請求項２２】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、ほ乳類のポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか記載の発現構築物。
【請求項２３】
ほ乳類のポリペプチドが、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、プラスミノーゲン、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、サイトカイン、レセプター、ヒトワクチン、動物ワクチン、ペプチド、血清アルブミン、及びそれらの組合せ、からなる群から選択されることを特徴とする請求項２２記載の発現構築物。
【請求項２４】
植物、植物細胞、又は根粒におけるヌクレオチド配列の発現方法であって、植物、植物細胞、又は根粒に発現構築物を導入することを含み、該発現構築物が所望の非相同ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御因子を含み、該発現制御因子が、
（ａ）配列番号１、２、３、１３、又は１４に示される配列を含むヌクレオチド配列と
（ｂ）配列番号１、２、３、１３、又は１４に示される配列の少なくとも連続した５０ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であって、植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と
（ｃ）配列番号１、２、３、１３、又は１４に示される配列の機能的なフラグメントを含むヌクレオチド配列であって、前記フラグメントが植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と
（ｄ）配列番号１、２、３、１３、又は１４に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列であって、植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と
（ｅ）（ａ）のヌクレオチド配列相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、植物細胞において転写を開始するヌクレオチド配列と
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２５】
植物、植物細胞、又は根粒が、単子葉植物であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
単子葉植物が、ウキクサ属、ミジンコウキクサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びアオウキクサ属からなる群から選択される属由来であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
単子葉植物が、コウキクサ、レムナ・ミニスクラ、ナンゴクウアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーであることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
植物、植物細胞、又は根粒が、双子葉植物であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
発現構築物が、所望の非相同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの培地への分泌を誘導する、作動可能に連結したシグナルペプチドをコードする配列を、さらに含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
シグナルペプチドが、
（ａ）配列番号１６に示される配列と、
（ｂ）配列番号１６に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であって、ポリペプチドの培地への分泌を誘導する配列と、
（ｃ）配列番号１６に示される配列の機能的なフラグメントであって、前記配列がポリペプチドの培地への分泌を誘導するフラグメントと
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
シグナルペプチドをコードする配列が、
（ａ）配列番号１５に示される配列と、
（ｂ）配列番号１５に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、
（ｃ）配列番号１５に示される配列のフラグメントと
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、ほ乳類のポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項２４〜３１のいずれか記載の方法。
【請求項３３】
ほ乳類のポリペプチドが、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、プラスミノーゲン、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、サイトカイン、レセプター、ヒトワクチン、動物ワクチン、ペプチド、血清アルブミン、及びそれらの組合せ、からなる群から選択されることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、所望の非相同ヌクレオチド配列をコードする配列において、ウキクサに好ましいコドンを含むことを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、ウキクサに好ましいコドンを７０〜１００％含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
植物、植物細胞、又は根粒におけるヌクレオチド配列の発現方法であって、植物、植物細胞、又は根粒に発現構築物を導入することを含み、該発現構築物が、所望の非相同ヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御因子を含み、該発現制御因子は、
（ａ）配列番号１０、１１、又は１２に示される配列を含むヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号１０、１１、又は１２に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列であって、植物細胞において遺伝子発現を増強するヌクレオチド配列と、
（ｃ）（ａ）のヌクレオチド配列相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、植物細胞において遺伝子発現を増強するヌクレオチド配列と
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項３７】
植物、植物細胞、又は根粒が、単子葉植物であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
単子葉植物が、ウキクサ属、ミジンコウキクサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びアオウキクサ属からなる群から選択される属由来であることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
単子葉植物が、コウキクサ、レムナ・ミニスクラ、ナンゴクウアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
植物、植物細胞、又は根粒が、双子葉植物であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
発現構築物が、所望の非相同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの培地への分泌を誘導する、作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
シグナルペプチドが、
（ａ）配列番号１６に示される配列と、
（ｂ）配列番号１６に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であって、ポリペプチドの培地への分泌を誘導する配列と、
（ｃ）配列番号１６に示される配列の機能的なフラグメントであって、前記配列がポリペプチドの培地への分泌を誘導するフラグメントと
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
シグナルペプチドをコードする配列が、
（ａ）配列番号１５に示される配列と、
（ｂ）配列番号１５に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、
（ｃ）配列番号１５に示される配列のフラグメントと
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、ほ乳類のポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項３６〜４３のいずれか記載の方法。
【請求項４５】
ほ乳類のポリペプチドが、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、プラスミノーゲン、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、サイトカイン、レセプター、ヒトワクチン、動物ワクチン、ペプチド、血清アルブミン、及びそれらの組合せ、からなる群から選択されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、所望の非相同ヌクレオチド配列をコードする配列において、ウキクサに好ましいコドンを含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、ウキクサに好ましいコドンを７０〜１００％含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
植物、植物細胞、又は根粒における非相同ポリペプチド配列を発現及び分泌する方法であって、植物、植物細胞、又は根粒に発現構築物を導入することを含み、該発現構築物が、前記非相同ポリペプチドのコードする配列を含むヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御因子と、前記非相同ポリペプチドの細胞外分泌を誘導するシグナルペプチドの作動可能に連結したコード配列とを含み、該シグナルポリペプチドが、
（ａ）配列番号１６に示される配列と、
（ｂ）配列番号１６に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であって、前記ポリペプチドの細胞外分泌を誘導する配列と、
（ｃ）配列番号１６に示される配列の機能的なフラグメントであって、前記配列が前記ポリペプチドの細胞外分泌を誘導するフラグメントと
からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
シグナルペプチドをコードする配列が、
（ａ）配列番号１５に示される配列と、
（ｂ）配列番号１５に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、
（ｃ）配列番号１５に示される配列のフラグメントと
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
所望の非相同ヌクレオチド配列が、ほ乳類のポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項４８又は４９記載の発現構築物。
【請求項５１】
ほ乳類のポリペプチドが、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、プラスミノーゲン、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、サイトカイン、レセプター、ヒトワクチン、動物ワクチン、ペプチド、血清アルブミン、及びそれらの組合せ、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
発現制御因子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１３、及び配列番号１４に示される配列を含むヌクレオチド配列からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４８〜５１のいずれか記載の方法。
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の遺伝子発現を増強する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウキクサは、単子葉植物ウキクサ科（Lemnaceae）の唯一のメンバーである。５属及び３８種は、いずれも小さな、浮動性の淡水植物であり、その地理的分布範囲は地球全体に広がっている(Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich)参照)。公知の植物のうち最も形態的に縮小された植物ではあるけれども、大部分のウキクサ種はいずれも、根、茎、花、種子、及び葉状体（fronds）を含む、より大きな植物の組織及び器官を全て保持する。ウキクサ種は広く研究されてきており、それらの生態、系統分類、ライフサイクル、代謝、疾患及び害毒感受性（pest susceptibility）、それらの生殖生物学、遺伝的構造、及び細胞生物学を詳述した相当数の文献が存在する(Hillman (1961) Bot. Review 27:221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich参照))。
【０００３】
ウキクサの成長習性は、微生物の培養方法としては理想的である。イースト菌における無性生殖と類似する、肉眼観察により識別できるような新規の葉状体の無性出芽（vegetative buds）によって、植物は急速に増殖する。この増殖は、分裂組織細胞からの無性出芽によって起こる。分裂組織領域は小さく、葉状体の腹部表面上に見い出だされる。分裂組織細胞は２つのポケットに存在し、葉状体の中静脈のそれぞれの側に１つずつ存在する。小さな中静脈領域は、そこから根が生成し、各葉状体とその母葉状体とを結合する茎が生じる部位である。分裂組織のポケットは組織フラップによって保護されている。葉状体は、これらのポケットから交互に出芽する。倍化時間は種によって変わるが、２０〜２４時間程度である（Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko and Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62: 316)。
【０００４】
ウキクサを集約的に培養することによって、単位時間あたりで最高のバイオマス蓄積率がもたらされ(Landolt and Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae-A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography (Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich))、乾燥質量蓄積は新鮮質量の６〜１５％の範囲である(Tillberg et al. (1979) Physiol. Plant. 46:5; Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Stomp, 未発表データ)。多様な条件下で成長する、多種のウキクサのタンパク質含有量は、乾燥質量の１５〜４５％の範囲であることが報告されている(Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Chang and Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et al. (1979) Aquatic Botany 7:272; Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251)。これらの値を用いた場合、ウキクサの培地１リットルあたりのタンパク質産生レベルは、イースト菌遺伝子発現系と同程度の規模である。
【０００５】
ウキクサ植物又はウキクサ根粒培養物（duckweed nodule cultures）は、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入（agrobacterium-mediated gene transfer）、衝撃照射(ballistic bombardment)、又はエレクトロポレーションを含む多数の方法のうちのいずれか１つにより、所望のヌクレオチド配列を含む発現カセットを用いて効率的に形質転換することができる。安定したウキクサ形質転換体は、所望のヌクレオチド配列と選択薬剤への耐性を付与する遺伝子との両方で、ウキクサ細胞を形質転換し、選択薬剤を含む培地で形質転換された細胞を培養することにより単離することができる。Stomp et al.への米国特許第６，０４０，４９８号明細書を参照のこと。
【０００６】
ウキクサの遺伝子発現系は、多数の研究及び商業用途に有用であると思われる重要な技術を提供する。概して、植物の分子生物学の研究においては、研究室の便利なイースト菌を用いて操作することができる分化した植物系が、単離された遺伝子の発生学的及び生理学的役割を分析するための非常に迅速な系を提供する。価値あるポリペプチドの商業的な生産のために、ウキクサベースの系は、既存の微生物又は細胞培養系に勝る多数の利点を有する。植物は、ほ乳類細胞と類似する翻訳後プロセシングを示すので、微生物細胞が、生物活性を有するほ乳類のポリペプチドを産生することに関連する１つの重大な問題を克服し、他方で、植物系においては、微生物系ではしばしば欠けている能力である、マルチサブユニットタンパク質を構築する能力を有することが示されてきた(Hiatt(1990) Nature 334:469)。ウキクサバイオマスを、組換えタンパク質の商業的生産に必要なレベルまでのスケールアップすることは、ほ乳類細胞を同様にスケールアップするより迅速で、コスト効率がよく、他に提示されている植物産生系、例えばダイズやタバコと異なり、ウキクサは、完全に密封され（fully-contained）、制御されたバイオマス産生容器中で成長させることができるので、かかる系は、既存のタンパク質産生の産業インフラへはるかに容易に統合される。
【０００７】
したがって、ウキクサにおけるタンパク質発現のための組成物及び方法を最適化する必要性が依然として存在する。
【特許文献１】米国特許第６，０４０，４９８号明細書
【非特許文献１】Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich
【非特許文献２】Hillman (1961) Bot. Review 27:221
【非特許文献３】Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271
【非特許文献４】Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19
【非特許文献５】Datko and Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16
【非特許文献６】Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62: 316
【非特許文献７】Hiatt(1990) Nature334:469
【非特許文献８】Landolt and Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae-A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography (Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich)
【非特許文献９】Tillberg et al. (1979) Physiol. Plant. 46:5
【非特許文献１０】Chang and Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91
【非特許文献１１】Porath et al. (1979) Aquatic Botany 7:272
【非特許文献１２】Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251
【発明の開示】
【０００８】
植物における遺伝子発現の制御のための組成物及び方法が提供される。組成物としては、ウキクサのユビキチンや代替（replacement）（ｒ）−ヒストンやキチナーゼの遺伝子から単離された発現制御因子（例えば、プロモーターやイントロン）の新規ヌクレオチド配列を挙げることができる。本発明の発現制御因子は、植物において、作動可能に連結した非相同ヌクレオチド配列の転写を開始する。とりわけ、本発明の組成物は、配列番号１〜３、１３及び１４に示される発現制御因子、及びそのバリアント若しくはフラグメントを含む。組成物は、これらのウキクサ発現制御因子内の新規イントロン配列、配列番号７〜９に示されるイントロン配列、及びそのバリアント若しくはフラグメントをも含む。これらのイントロン配列は、植物において、作動可能に連結した非相同ヌクレオチド配列の発現を増強させるために所望のプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０００９】
配列番号１５に示される配列によってコードされ、配列番号１６に示される新規ウキクサキチナーゼシグナルペプチド、及びそれらのバリアント若しくはフラグメントが提供される。シグナルペプチドのコード配列は、コードされているポリペプチドの細胞外分泌を誘導する（direct）ための所望のポリペプチドのコード配列に作動可能に連結することができる。
【００１０】
発現制御因子、イントロン、所望の非相同ヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明のシグナルペプチドのコード配列のいずれか一つ以上を含む発現構築物（例えば、カセットやベクター）が提供される。本発明の発現構築物を有する安定して形質転換された植物、植物細胞、及び根粒がさらに提供される。
【００１１】
本発明の組成物は、植物、植物細胞及び根粒における所望のヌクレオチド配列を発現するように誘導する方法における使用を見い出すものである。本発明の方法としては、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結したウキクサのユビキチンやｒ−ヒストンやキチナーゼの発現制御因子（例えば、配列番号１〜３、１３及び１４に示される）、又はそれらのバリアント若しくはフラグメントを保持する発現構築物を、植物、植物細胞及び根粒に導入することを含む。本発明の方法は、イボウキクサ（Lemna gibba）リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子(例えば、配列番号１０〜１２に示されるＲｂｃＳ)から単離された発現制御因子を含む発現構築物を植物、植物細胞、又は根粒に導入することをさらに含む。別の実施態様では、本発明の方法は、所望のポリペプチドのコード配列に作動可能に連結したウキクサキチナーゼシグナルペプチドコード配列（例えば、配列番号１５に示される）、又はそのバリアント若しくはフラグメントを有する発現構築物を、植物、植物細胞、又は根粒に導入することを含む。
【００１２】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、植物発現系（例えば、ウキクサ発現系）における所望のヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドの産生に関するものである。本発明の植物発現系は、所望のポリペプチド配列を高レベルで産生するように最適化されている。それゆえ、本発明は、所望のヌクレオチド配列の発現のための発現構築物で形質転換された植物における、所望のヌクレオチド配列の発現方法を包含し、これらのヌクレオチド配列は、植物においてそれらの発現を増強するように修飾されている。
【００１３】
本発明のこれらの及び他の態様は、以下の発明の詳細な説明において説明される。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、植物において、非相同ヌクレオチド配列の転写を調節する植物発現制御因子の新規核酸を誘導する組成物及び方法を提供する。特に、本発明の組成物は、本明細書で以下に定義される配列番号１〜３、１３及び１４に示される発現制御因子、及びそのバリアント若しくはフラグメントを含むウキクサユビキチンや（ｒ）−ヒストンやキチナーゼの遺伝子から単離された発現制御因子を含む。かかる発現制御因子内の個々のプロモーター（配列番号４〜６、１３及び１４）及びイントロン（配列番号７〜９）の配列も、植物における転写調節に用いることができる。本発明は、新規のウキクサキチナーゼシグナルペプチド（配列番号１６）、それと対応するコード配列（配列番号１５）、及びそれらのバリアント若しくはフラグメントを提供する。
【００１５】
本明細書に用いられる「核酸」なる用語は、一重鎖又は二重鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸又はリボ核酸ポリマーを意味し、特段の限定がない場合には、天然に存在するヌクレオチドに類似する方法で、一重鎖核酸にハイブリダイズする天然の核酸の本質的な性質を有する公知のアナログを包含する（例えばペプチド核酸）。
【００１６】
本発明は、単離された、又は実質的に精製された核酸組成物を包含する。「単離された」又は「精製された」核酸分子においては、天然に存在する環境において見い出される核酸分子又はタンパク質と通常付随する又は相互作用する組成物が、実質的に又は本質的に存在しない。それゆえ、単離された又は精製された核酸分子においては、組換え技術により作製された場合は、他の細胞物質、又は培地が実質的に存在せず、化学合成された場合は、前駆的化学物質、又は他の化学物質が実質的に存在しない。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が由来する生命体のゲノムＤＮＡにおける核酸（すなわち核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）に自然に隣接する配列（好ましくはタンパク質コード配列）が存在しない。例えば、様々な実施態様で、単離された核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸分子に自然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂより小さいヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１７】
本発明の組成物としては、本明細書で以下に定義される配列番号１〜３、１３及び１４に示される発現制御因子のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、及びそれらのバリアント若しくはフラグメントを含む。「発現制御因子」は、ＤＮＡの調節領域は、ＲＮＡポリメラーゼIIが、特定のコード配列の適当な転写開始部位において、ＲＮＡ合成を開始するよう誘導することができるＴＡＴＡボックスを通常含むように意図されている。発現制御因子は、転写開始速度に影響を与える（例えば、増強し）、ＴＡＴＡボックスの上流又は５’末端に一般的に位置する別の認識配列を付加的に含んでもよい。さらに、発現制御因子は、転写開始速度に影響を与える（例えば、増強し）、ＴＡＴＡボックスの下流又は３’末端に一般的に位置する配列を付加的に含んでもよい。
【００１８】
本明細書に開示する発現制御因子領域のヌクレオチド配列は同定されており、本明細書で同定されている特定の発現制御因子領域から上流の５’末端非翻訳領域（ＵＴＲ）の調節因子をさらに単離し、同定することは最先端技術の範囲内であることが認識されている。それゆえ、例えば、本明細書に開示する発現制御因子領域は、組織、及び、コード配列やエンハンサーその他の一時的な発現に責任を有する因子など、付加的な調節因子をさらに含んでもよい。特に、豪州特許７７７５１／９４号明細書及び米国特許５，４６６，７８５号明細書及び５，６３５，６１８号明細書（双方とも参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【００１９】
本発明の発現制御因子は、ウキクサ科のいくつかのメンバーのユビキチンやｒ−ヒストンやキチナーゼの遺伝子から単離され、それゆえ「ウキクサ発現制御因子」と呼ばれている。配列番号１は、完全長のコウキクサ（Lemna minor）ユビキチン発現制御因子を示し、プロモーターと５’末端ＵＴＲ（１〜１６２５ヌクレオチド）、及びイントロン（１６２６〜２１６０ヌクレオチド）の両方を含む。配列番号２は、完全長のスピロデラ・ポリリザ（Spirodella polyrrhiza）ユビキチン発現制御因子を示し、プロモーターと５’末端ＵＴＲ（１〜１０４１ヌクレオチド）、及びイントロン（１０４２〜２０２１ヌクレオチド）の両方を含む。配列番号３は、完全長のナンゴクアオウキクサ(Lemna aequinoctialis)ユビキチン発現制御因子を示し、プロモーターと５’末端ＵＴＲ（１〜９６４ヌクレオチド）、及びイントロン（９６５〜２０６８ヌクレオチド）の両方を含む。配列番号４は、コウキクサユビキチン発現制御因子のプロモーターと５’末端ＵＴＲ部分を示す。配列番号５は、Ｓ．ポリリザ（S．polyrrhiza）ユビキチン発現制御因子のプロモーターと５’末端ＵＴＲ部分を示す。配列番号６は、ナンゴクアオウキクサ（L.aequinoctialis）ユビキチン発現制御因子のプロモーターと５’末端ＵＴＲ部分を示す。配列番号７は、コウキクサユビキチン発現制御因子のイントロン部分を示す。配列番号８は、Ｓ．ポリリザユビキチン発現制御因子のイントロン部分を示す。配列番号９は、コウキクサユビキチン発現制御因子のイントロン部分を示す。
【００２０】
配列番号１３は、完全長コウキクサｒ−ヒストン発現制御因子を示し、プロモーターと５’末端ＵＴＲを含む。配列番号１４は、完全長コウキクサキチナーゼ発現制御因子を示し、プロモーターと５’末端ＵＴＲを含む。配列番号１５は、コウキクサキチナーゼシグナルペプチドコード配列を示す。配列番号１６は、コウキクサキチナーゼシグナルペプチドコード配列を示す。
【００２１】
配列番号４〜６、１３及び１４に示される個々のプロモーターと５’末端ＵＴＲ配列、並びに、それらの生物活性バリアント及びフラグメントは、植物において作動可能に連結した所望のヌクレオチド配列の転写を調節するために用いることができる。同様に、配列番号７〜９に示される１又は複数のイントロン配列、及びそれらの生物活性フラグメント若しくはバリアントは、所望のプロモーターに作動可能に連結することができ、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を増強するために、配列番号４、５、６、１３、又は１４に示されるプロモーターを含む所望のプロモーターを含む。
【００２２】
開示している発現制御因子や、シグナルペプチドのコード配列や、コードされているシグナルペプチドのフラグメント及びバリアントも、本発明に包含される。発現制御因子との関連において「フラグメント」とは、例えば、配列番号１〜３、１３及び１４に示される発現制御因子のいずれか一部分のような、完全長発現制御因子の一部分を意図するものである。発現制御因子のフラグメントは、生物活性を維持し、ゆえに、作動可能に連結したヌクレオチド配列の発現を開始し又は増強することができるフラグメントを包含する。それゆえ、例えば、本明細書に開示される完全長に満たない発現制御因子が、非相同タンパク質をコードするヌクレオチド配列のように、作動可能に連結した所望のヌクレオチド配列の発現を推進するために利用されてもよい。特異的な、発現制御因子のフラグメントとしては、(ｉ)配列番号４〜９のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列(本明細書中上述の通り)；(ii)５’末端が切断されたコウキクサユビキチン発現制御因子(配列番号１)、例えば、配列番号１の１２８８〜２１６０ヌクレオチド(本明細書後述の、Ｅｇｓ２２構築物に見い出される、ＬｍＵｂｑの切断されたプロモーターＮｏ．１)や、配列番号１の１１３２〜２１６０ヌクレオチド(本明細書後述の、Ｅｇｓ２３構築物に見い出される、ＬｍＵｂｑの切断されたプロモーターＮｏ．２)；(iii)５’末端が切断されたコウキクサｒ−ヒストン発現制御因子(配列番号１３)、配列番号１３の４６１〜１８０８ヌクレオチド(本明細書後述の、Ｅｇｓ１９構築物に見い出されるＬｍＨＩＳ(４６１〜１８０８))、及び配列番号１３の８０５〜１８０８ヌクレオチド(本明細書後述の、Ｅｇｓ２０構築物に見い出されるＬｍＨＩＳ (８０５〜１８０８)、);(iv)５’末端が切断されたコウキクサキチナーゼ発現制御因子 (配列番号１４)、例えば、配列番号１４のヌクレオチド５１〜１３３８(本明細書後述のＥｇｓ２４とＥｇｓ２５構築物に見い出されるＬｍＣＨＴ(５１〜１３３８))を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２３】
本明細書で用いられる、特定されたヌクレオチド配列と関連する「完全長配列」とは、天然配列の完全長の核酸配列を有することを意味する。「天然配列」とは、内在性配列、すなわち生命体のゲノムに見い出される改変されていない配列を意図するものである。
【００２４】
それゆえ、ウキクサ発現制御因子フラグメントは、発現制御因子の生物活性部分として機能することができる。発現制御因子の生物活性部分は、本発明の発現制御因子のうちの一つの部分を単離し、発現制御因子の部分の活性（例えば、転写の開始能又は増強能）を評価することにより調製できる。発現制御因子の断片である核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１２００、１５００、１８００、若しくは２０００の連続したヌクレオチド、又は本明細書に開示する完全長の発現制御因子に存在する数以下のヌクレオチドである(すなわち、配列番号１の２１６０ヌクレオチド、配列番号２の２０２１ヌクレオチド、配列番号３の２０６８ヌクレオチド、配列番号１３の１８０８ヌクレオチド、及び配列番号１４の１３３８ヌクレオチド)。
【００２５】
かかるフラグメントのヌクレオチドは、特定の発現制御因子のＴＡＴＡ認識配列を通常含むものである。かかるフラグメントは、本明細書に開示する天然に存在する発現制御因子を切断する制限酵素を用いることにより得ることができ、すなわち、発現制御因子ＤＮＡ配列の天然に存在する配列由来のヌクレオチド配列を合成することにより；又は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いることにより得ることができる。特に、Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, and Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New   York)を参照のこと。部位特異的突然変異誘発法によってもたらされるなどの、これらの発現制御因子フラグメントのバリアントもまた、本発明の組成物に包含される。
【００２６】
シグナルペプチドをコードする配列とコードされたシグナルペプチドとの関連において、「フラグメント」とは、コード配列の一部、又はコードされているシグナルペプチドの一部を意味することが意図されている。コード配列に関しては、ヌクレオチド配列のフラグメントは、天然ポリペプチド、この場合コウキクサの天然のキチナーゼシグナルペプチド、の生物活性を維持するポリペプチドフラグメントをコードすることができる。それゆえ、コウキクサ（L. minor）キチナーゼシグナルペプチドの機能的フラグメントは、植物細胞の分泌経路を通じて所望の成熟タンパク質の挙動を誘導する。コードヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、及び、コウキクサキチナーゼシグナルペプチドをコードする完全長ヌクレオチド配列以内(すなわち、配列番号１５の８４以下のヌクレオチド)に及ぶことができる。
【００２７】
「バリアント」とは、本明細書に開示する発現制御因子（例えば、配列番号１〜３、１３及び１４）若しくはそのフラグメント（例えば、配列番号４〜９に示される配列）、あるいはシグナルペプチドコード配列（例えば、配列番号１５）若しくはシグナルペプチド（例えば、配列番号１６）、又は、それらのフラグメントと実質的な類似性を有する配列を意図するものである。ヌクレオチド配列としては、これら天然に存在するバリアントは、例えば、以下に概説されているＰＣＲやハイブリダイゼーション技術などの周知の分子生物学の技術を用いて同定することができる。バリアントのヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的突然変異誘発法を用いることにより作製されるなどした、合成されたヌクレオチド配列をも含む。一般に、本発明の特定のヌクレオチド配列のバリアントは、配列番号１〜９及び１３〜１５のいずれかのバリアントを含んでおり、本明細書で後述されるデフォルトパラメーターを用いる配列アラインメントプログラムにより決定される特定のヌクレオチド配列と、少なくとも４０％、５０%、６０％、６５％、７０％，一般に少なくとも７５％、８０％、８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％まで、９６％、９７％、より好ましくは約９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する。生物活性バリアントも、本発明に包含される。生物活性バリアントは、例えば、１又は複数の置換、欠失又は挿入を有する本発明の、天然の発現制御因子、又は、天然のシグナルペプチドのコード配列を含む。
【００２８】
本明細書で用いられる、２つの核酸配列又は２つのポリペプチド配列と関連する「配列の同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウインドウで最大一致させてアラインしたときに同一の２つの配列における残基に言及する。「比較ウインドウ」とは、ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の連続した、特定の区域を意図し、２つの配列の最適化されたアラインメントの参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、付加又は欠失（例えばギャップ）を含んでもよい。一般に、比較ウインドウは、少なくとも連続した２０ヌクレオチド長／アミノ酸長、及び任意に３０、４０、５０、１００又はより長いヌクレオチド／アミノ酸であってよい。
【００２９】
配列比較のためのアラインメント方法は、当該技術分野で周知である。したがって、任意の二つの配列間の配列同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。かかる数学的アルゴリズムの例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17; the local alignment algorithm of Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; the global alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; the search-for-local alignment method of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; the algorithm of Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modified as in Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００３０】
これらの数学的アルゴリズムのコンビュータによる実践は、配列同一性を決定するための配列比較のために利用することができる。かかる実践としては、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ(Intelligenetics社製, Mountain View, Californiaより購入可能); ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）、並びに、ＧＣＧウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージ、バージョン１０におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ(Accelrys Inc.社製 9685 Scranton Road, San Diego, California, USAより購入可能)を挙げることができるがこれらに限定されない。これらのプログラムを用いるアラインメントは、デフォルトパラメーターを用いることで実行することができる。
【００３１】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65;及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331に詳細に説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムに基づくものである。ＰＡＭ１２０重み付き残基テーブル（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティが、アミノ酸配列を比較する場合にＡＬＩＧＮプログラムと共に用いることができる。Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムに基づくものである。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、スコア＝１００、語長＝１２にて、本発明のヌクレオチド配列と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラムと共に実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、スコア＝５０、語長＝３にて、本発明のタンパク質又はポリペプチドと相同のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラムと共に実行することができる。比較として、ギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０における）を、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に説明されているように用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０における）を、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行するために用いることができる。Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合は、それぞれのプログラムにおけるデフォルトパラメーター(例えば、ヌクレオチド配列のためにＢＬＡＳＴＮ、タンパク質のためにＢＬＡＳＴＸ)を用いることができる。
【００３２】
ＧＡＰは、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小にする２つの完全配列のアラインメントを見い出すために、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のアルゴリズムを用いる。ＧＡＰは、全ての可能性のあるアラインメントとギャップのポジションを考慮し、最大マッチ数の塩基と最小ギャップを有するアラインメントを作成する。マッチした塩基の単位におけるギャップ挿入ペナルティ（gap creation penalty）とギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）の提供を可能にする。ＧＡＰは、挿入した各ギャップのマッチ数のギャップ伸長ペナルティの利を得なければならない。ゼロより大きいギャップ伸長ペナルティが選択された場合、ＧＡＰは、さらに、挿入した各ギャップに、ギャップの長さとギャップ伸長ペナルティとの乗の利を得なければならない。タンパク質配列についてのＧＣＧウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージバージョン１０においては、デフォルトギャップ挿入ペナルティ値とギャップ伸長ペナルティ値は、それぞれ８と２である。ヌクレオチド配列については、デフォルトギャップ挿入ペナルティは５０であるのに対し、デフォルトギャップ伸長ペナルティは３である。ギャップ挿入とギャップ伸長ペナルティは、０〜２００からなる整数群から選択された整数として表現することができる。それゆえ、例えば、ギャップ挿入とギャップ伸長ペナルティは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又はより大きくてもよい。
【００３３】
ＧＡＰは、最善のアラインメントのファミリーの一つのメンバーを提示する。このファミリーには多数のメンバーがあるが、他のメンバーが、よりよい品質を有することはない。ＧＡＰは、アラインメントの４種類の利点、すなわち品質、比率、同一性、及び類似性を掲示する。品質は、配列をアラインするための最大の距離関数（metric）である。比率は、より短いセグメントの塩基の数により分割される数量（quality）である。同一の割合は、実際にマッチするシンボルの割合である。類似の割合は、類似のシンボルの割合である。ギャップを隔てたシンボルは無視される。対になっているシンボルのマトリックス値が、類似度の閾値である０．５０以上を記録すると、類似であると記録される。ＧＣＧウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージ、バージョン１０において用いられる記録用マトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である(Henikoff and Henikoff (1992) Proc． Natl． Acad． Sci． USA 89：10915参照)。アラインメントは、検査しながら手動で行うこともできる。
【００３４】
あるいは、２つの核酸分子が密接に関係することを示す別の目安としては、２つの分子がストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズするということがある。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境パラメータ下において相違するものである。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度とｐＨにおける特定の配列の融解温度（Ｔｍ）より５℃〜２０℃低く選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度とｐＨにおいて）標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度である。核酸のハイブリダイゼーションの条件とストリンジェンシーの計算については、例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)、及びTijssen (1993) Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY)を参照することができる。
【００３５】
本発明の目的のためには、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間にミスマッチが２５％未満である時だけ、ハイブリダイゼーションが起こるような条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、より正確な定義のための特定のレベルのストリンジェンーに分類される。それゆえ、本明細書における「中程度の（moderate）ストリンジェンシー」とは、２５％を超えてミスマッチを有する配列を有する分子がハイブリダイズしないような条件をいい；「中度の（medium）ストリンジェンシー」の条件とは、１５％を超えてミスマッチを有する配列がハイブリダイズしないような条件をいい、「高度のストリンジェンシー」の条件とは、１０％を超えてミスマッチを有する分子がハイブリダイズしないような条件をいう。「非常に高度のストリンジェンシー」の条件とは、６％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしないような条件をいう。
【００３６】
ウキクサ発現制御因子、又はそれらのフラグメント若しくはバリアントの任意の発現制御因子の活性は、当業者に周知の様々な技術を用いてアッセイをすることができ、例えば、ノーザンブロット解析、転写融合から得られたレポーター活性測定等を挙げることができる。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。あるいは、発現制御因子アッセイは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や、発現制御因子、又はそのフラグメント若しくはバリアントの制御の下に産生されたその他のレポーター遺伝子のレベルの測定に基くものであってもよい。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許６，０７２，０５０号明細書を参照のこと。コウキクサキチナーゼシグナルペプチド、又はそのフラグメント若しくはバリアントの活性は、所望のポリペプチドの細胞外分泌を誘導するキチナーゼシグナルペプチド、又はそのフラグメント若しくはバリアントの検出能などを含めて、当業者に周知の様々な技術を用いて同様にアッセイできる。
【００３７】
突然変異誘発方法とヌクレオチド配列変更の方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol.154:367-382; U.S.Patent No. 4,873,192（参照により本明細書に組み入れられる）；Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, NY)及びその中で引用される文献を参照のこと。
【００３８】
本発明のウキクサ発現制御因子、及びそれらのバリアント若しくはフラグメントは、発現制御因子が作動可能に連結した所望のヌクレオチド配列となるように、ヌクレオチド構築物内で集合している場合、植物、植物細胞及び根粒（例えば、ウキクサ属（genus Spirodela）、ミジンコウキクサ属（genus Wolffia）、ウォルフィエラ属（genus Wolfiella）、ランドルティア属（genus Landoltia）、及びアオウキクサ属（genus Lemna）などのウキクサ植物、ウキクサ植物細胞又は根粒）において、作動可能に連結したヌクレオチド配列の発現を可能にする。「作動可能に連結した」なる用語は、所望のヌクレオチド配列の転写又は翻訳は、発現制御因子の影響下にあることを意図する。このように、本発明の発現制御因子のヌクレオチド配列は、植物並びに植物細胞及び根粒における発現のために、通常は非相同ヌクレオチド配列である所望のヌクレオチド配列と共に、発現カセット又はベクターにおいて提供される。「非相同ヌクレオチド配列」なる用語は、発現制御因子と、天然には、作動可能に連結しない配列を意図するものである。一方、ヌクレオチド配列は、発現制御因子に対して非相同であるから、植物宿主に対して、相同、天然、非相同、外来のいずれでもよい。
【００３９】
本発明の発現制御因子、又はそれらのバリアント若しくはフラグメントは、それぞれの天然のコード配列の発現を推進するために用いることができることが認められている。かかる構築物は、植物又は植物細胞における天然のポリペプチドの発現レベルを変更することができる。それゆえ、植物又は植物細胞の表現型を変えることもできる。
【００４０】
本明細書で用いられる「ベクター」なる用語は、例えば、発現カセット等のヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入するための、プラスミド、コスミド、又はバクテリオファージなどのＤＮＡ分子を意味するものである。クローニングベクターは、１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を通常含有し、かかる部位に、ベクターの必須の生物学的機能を失うことなく、確立した方法で外来ＤＮＡ配列を挿入することができ、また、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定と選択のために用いることが適切な、後述のマーカー遺伝子をも含有する。
【００４１】
本明細書で用いられる「植物」なる用語は、植物全体、植物器官（例えば、葉、幹、根、その他）、種子、植物細胞、及びこれらの子孫の意味を含む。トランスジェニック植物の各部は、本発明の範囲内と理解され、例えば、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、並びにトランスジェニック植物由来の花、胚珠、幹、果実、葉、根、根端、幹、又は本発明のＤＮＡ分子で以前に形質転換し、それゆえ、少なくとも一部がトランスジェニック細胞からなるそれらの子孫を含む。 本明細書において「植物細胞」なる用語は、種子、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、小胞子を挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の方法において用いることができる植物類（class of plants）は、単子葉植物及び双子葉植物を含む形質転換技術を適用できるより高等な植物類と同様に、通常幅広い。かかる植物としては、例えば、ウキクサを挙げることができる。
【００４２】
「ウキクサ」なる用語は、ウキクサ（Lemnaceae）科のメンバーを指す。この科は現在、以下の５属及び３８種のウキクサに分類されている：アオウキクサ（Lemna）属（Ｌ．ウキクサ、Ｌ．ディスペルマ（L.disperma）、Ｌ．エクアドリエンシス（L.ecuadoriensi）、イボウキクサ、Ｌ．ジャポニカ（L.japonica）、コウキクサ、Ｌ．ミニスクラ（L.miniscula）、Ｌ．オブスクラ（L.obscura）、Ｌ．ペルプシラ（L.perpusilla）、Ｌ．テネラ（L.tenera）、ヒンジモ（L.trisulca）、Ｌ．ツリオニフェラ（L.turionifera）、チリウキクサ（L.valdiviana））；スピロデラ（Spirodela）属（Ｓ．インテルメディア（S.intermedia）、Ｓ．ポリリザ、Ｓ．ポンクタタ（S.punctata）)；ミジンコウキクサ（Wolffia）属（Ｗａ．アングスタ（Wa.angusta）、Ｗａ．アリザ（Wa.arrhiza）、Ｗａ．オーストラリナ（Wa.australina）、Ｗａ．ボレアリス（Wa.borealis）、Ｗａ．ブラジリエンシス（Wa.brasiliensis）、Ｗａ．コロンビアナ（Wa.columbiana）、Ｗａ．エロンガタ（Wa.elongata）、Ｗａ．グロバサ（Wa.globosa）、Ｗａ．ミクロスコピア（Wa.microscopica）、Ｗａ．ネグレクタ（Wa.neglecta））；ウォルフィエラ（Wolfiella）属（Ｗｌ．カウダタ（Wl.caudata）、Ｗｌ．デンティクラタ（Wl.denticulata）、Ｗｌ．グラディアタ（Wl.gladiata）、Ｗｌ．ヒアリナ（Wl.hyalina）、Ｗｌ．リングラタ（Wl.lingulata）、Ｗｌ．レプンダ（Wl.repunda）、Ｗｌ．ロタンダ（Wl.rotunda）、及びＷｌ．ネオトロピカ（Wl.neotropica））及びランドルティア（Landoltia）属（Ｌ．ポンクタタ（L.punctata）。それらが存在する場合、ウキクサ科の任意の他の属又は種も本発明の態様である。Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds : The family of Lemnaceae-A Monograph Study （Geobatanischen Institut ETH,Stiftung Rubel,Zurich）によって記載された分類スキームを用いて、アオウキクサ種を分類してもよい。
【００４３】
本明細書で用いられる「ウキクサの根粒培養物」なる用語は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の細胞が分化細胞であるウキクサ組織細胞を含むウキクサ組織を指す。本明細書で用いられる「分化細胞」なる用語は、未分化細胞又は他の組織型中で見られる細胞と、分化細胞とを区別する、少なくとも１つの表現型特性（例えば、特徴的な細胞形態、あるいはマーカー核酸又はタンパク質の発現）を有する細胞である。本明細書に記載するウキクサの根粒培養物の分化細胞は、組織中に広がる葉状体の原基に構造化し始めた根粒と、それらの隣接細胞壁において融合した相互連結細胞の、タイル状の滑らかな表面を形成する。根粒培養物の組織の表面は、原形質連絡（plasmadesmata）を通じて互いに結合した表皮細胞を有する。
【００４４】
いくつかの実施態様では、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結したウキクサ発現制御因子、又はそれらのバリアント若しくはフラグメントを包含する発現カセット又はベクターは、植物、植物細胞、又は根粒における所望のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの発現のために提供される。作動可能に連結した所望のヌクレオチド配列は、植物、植物細胞、及び根粒において望ましい発現をするいずれの配列であってもよい。所望のヌクレオチド配列は、通常、本明細書で定義される非相同ヌクレオチド配列である。所望の非相同配列としては、例えば、インスリン、成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、β−グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ（β-glucoronidase）、網膜芽細胞腫（retinoblastoma）タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンギオスタチン、レプチン、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、プラスミノーゲン、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、サイトカイン、受容体、ヒトワクチン、動物ワクチン、ポリペプチド及び血清アルブミンなどのほ乳類のポリペプチドをコードする配列を挙げることができるがこれらに制限されない。
【００４５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」なる用語は、本明細書では、同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。かかる用語は、１又は複数のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸、及び、天然に存在するアミノ酸ポリマーに対応する人工の化学的アナログである、アミノ酸ポリマーを意味する。本明細書で用いられる、「コードする（encoding）」又は「コードされている（encoded）」なる用語は、特定の核酸の関連において用いられる場合、ヌクレオチド配列の特定のタンパク質への翻訳を誘導するための必要な情報を含む核酸を意味する。タンパク質をコードする情報は、コドンを使用することで特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を包含してもよく、かかる介在非翻訳配列を欠いていてもよい（例えば、ｃＤＮＡにおけるように）。
【００４６】
特に、形質転換されたウキクサは、例えば、ウキクサユビキチン発現制御因子(例えば配列番号１〜３に示される)やそのフラグメント（例えば配列番号４〜９に示される)、ウキクサｒ−ヒストン発現制御因子(例えば配列番号１３に示される)や、ウキクサキチナーゼ発現制御因子(例えば配列番号１４に示される)、又は作動可能に連結した非相同の所望のヌクレオチド配列のバリアントを含む発現カセットで形質転換することで得ることができるがこれらに限定されない。形質転換されたウキクサは、所望の非相同ヌクレオチド配列に作動可能に連結した、イボウキクサＲｂｃＳ発現制御因子（例えば、配列番号１０〜１２で示される;ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ４５１６５（ＳＳＵ１３; ６９４〜７５７ヌクレオチド)、Ｓ４５１６６（ＳＳＵ５Ａ; ６９８〜７５５ヌクレオチド)及びＳ４５１６７（ＳＳＵ５Ｂ；ヌクレオチド６９０〜７５１)を参照のこと)又はそれらのバリアント若しくはフラグメントを含む発現カセットで形質転換することで得ることができるがこれらに制限されない。配列番号１０〜１２に示される発現制御因子は、因子を保持しない発現と比較して、形質転換されたウキクサにおいて、作動可能に連結した所望の非相同ヌクレオチド配列の発現を有利に増強する。
【００４７】
本発明の発現カセットは、発現制御因子の転写調節下で、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入のための複数の制限部位を提供する。発現カセットは、所望の単一遺伝子をコードしてもよい。あるいは、発現カセットは、２又は３以上の所望の遺伝子をコードしてもよい。
【００４８】
本発明の発現カセットは、転写の５’−３’方向に、植物における機能的な転写、転写及び翻訳開始領域（例えば、本発明の発現制御因子又はそれらの生物活性バリアント若しくはフラグメント）、所望のヌクレオチド配列、並びに転写及び翻訳停止領域を含む。当該技術分野で知られているいずれかの適切な停止配列を、本発明に従い使用することができる。停止領域は転写開始領域と共に未変性（native）のものであってもよいし、所望のヌクレオチド配列と共に未変性のものであってもよいし、あるいは他の源に由来するものであってよい。オクトピンシンテターゼ及びノパリンシンテターゼ停止領域といった好都合な停止領域が、Ａ・トゥメファシエンス（A.tumefaciens）のＴｉ-プラスミドから入手可能である。Guerineau et al.(1991) Mol.Gen.Genet.262:141; Proudfoot (1991) Cell64:671; Sanfacon et al.(1991) Genes Dev.5:141; Mogen et al.(1990) Plant Cell2:1261; Munroe et al.(1990) Gene91:151; Ballas et al.(1989) Nucleic Acid Res.17:7891;及びJoshi et al.(1987) Nucleic Acid Res.15:9627も参照のこと。他の停止配列としては、例えば、ｐｅａ ＲｕｂＰカルボキシラーゼの小サブユニットの停止配列、及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの停止配列、及び多くの植物種由来のユビキチンターミネーターを挙げることができる。他の適切な停止配列は、当業者には明らかである。
【００４９】
一般に発現カセットは、形質転換細胞又は組織の選択に関して選択可能な遺伝子マーカーを含むものである。選択可能なマーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＥＯ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIII、及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）等をコードする遺伝子など抗生物質耐性をコードする遺伝子と、除草剤化合物に対する耐性を与える遺伝子とがある。除草剤耐性遺伝子は、一般に、除草剤に鈍感な改変標的タンパク質、あるいは除草剤が作用する可能性がある前に植物中の除草剤を分解又は解毒する酵素をコードする。DeBlock et al.(1987) EMBO J.6:2513; DeBlock et al.(1989) Plant Physiol.91:691; Fromm et al.(1990) BioTechnology8:833; Gordon-Kamm et al.(1990) Plant Cell2:603;及びFrisch et al.(1995) Plant Mol.Biol.27:405-9を参照のこと。例えば、グリホスフェート又はスルホニル尿素系除草剤に対する耐性は、突然変異標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）及びアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコードする遺伝子を使用して得られている。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する耐性は、それぞれの除草剤を解毒するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトラーゼ、又は２，４−ジクロロフェノキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードするバクテリア遺伝子を使用することによって得られている。
【００５０】
本発明の目的のために選択可能なマーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（Fraley et al.(1986) CRC Critical Reviews in Plant Science4:1）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIII（Frisch et al.(1995) Plant Mol.Biol.27:405-9）、シアナミドヒドラーゼ（Maier-Greiner et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4250）、アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（Perl et al.(1993) BioTechnology11:715）；ｂａｒ遺伝子（Toki et al.(1992) Plant Physiol.100:1503; Meagher et al.(1996) Crop Sci.36:1367）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijin et al.(1993) Plant Mol.Biol.22:907）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ;Southern et al.(1982) J.Mol.Appl.Gen.1:327）；ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ又はＨＹＧ; Shimizu et al.(1986) Mol.Cell.Biol.6:1074）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR; Kwok et al.(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4552）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlock et al.(1987) EMBO J.6:2513）；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Buchanan-Wollatron et al.(1989) J.Cell.Biochem.13D:330）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Anderson et alへの米国特許第４，７６１，３７３号; Haughn et al.(1988) Mol.Gen.Genet.221:266）；５−エノールピルビルシキミ酸−リン酸シンターゼ（aroA; Comai et al.(1985) Nature317:741）；ハロアリールニトリラーゼ（Stalker et alへのＷＯ８７／０４１８１）；アセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（Parker et al.(1990) Plant Physiol.92:1220）；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（sulI; Guerineau et al.(1990) Plant Mol.Biol.15:127）；及び３２ｋＤａの光化学系IIポリペプチド（psbA; Hirschberg et al.(1983)） Science222:1346(1983)をコードする遺伝子を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５１】
ゲンタマイシン（例えばaacC1、Wohlleben et al.(1989) Mol.Gen.Genet.217:202-208）；クロラムフェニコール（Herrera-Estrella et al.(1983) EMBO J.2:987）；メトトレキセート（Herrera-Estrella et al. (1983) Nature303:209; Meijer et al.(1991) Plant Mol.Biol.16:807）；ヒグロマイシン（Waldron et al.(1985) Plant Mol.Biol.5:103; Zhijian et al.(1995) Plant Science108:219; Meijer et al.(1991) Plant Mol.Bio.16:807）；ストレプトマイシン（Jones et al.(1987) Mol.Gen.Genet.210:86）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al.(1996) Transgenic Res.5:131）；ブレオマイシン（Hille et al.(1986) Plant Mol.Biol.7:171）；スルホンアミド（Guerineau et al.(1990) Plant Mol.Bio.15:127）；ブロモキシニル（Stalker et al.(1988) Science242:419）；２，４−Ｄ（Streber et al.(1989) BioTechnology7:811）；ホスフィノトリシン（DeBlock et al.(1987) EMBO J.6:2513）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard and Chupeau,Transgenic Research5:131）に対する耐性をコードする遺伝子も含まれる。
【００５２】
ｂａｒ遺伝子は、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）又はビアラホスなどの、グルホシネート型除草剤に対する除草剤耐性を付与する。前述のように、ベクター構築物において使用することができる他の選択可能なマーカーとしては、ビアラホス及びホスフィノトリシン耐性に対してＰＡＴ遺伝子、イミダゾリノン耐性に対してＡＬＳ遺伝子、ヒグロマイシン耐性に対してＨＰＨ又はＨＹＧ遺伝子、グリホサート耐性に対してＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、Ｈｃ−毒素に対する耐性に対してＨｍ１遺伝子、及び当業者に日常的に使用され知られている他の選択物質を挙げることができるがこれらに限定されない。Yarranton (1992) Curr.Opin.Biotech.3:506; Chistopherson et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314; Yao et al.(1992) Cell71:63; Reznikoff (1992) Mol.Microbiol.6:2419; Barkley et al.(1980) The Operon 177-220; Hu et al.(1987) Cell48:555; Brown et al.(1987) Cell49:603; Figge et al.(1988) Cell52:713; Deuschle et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5400; Fuerst et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549; Deuschle et al.(1990) Science248:480; Labow et al.(1990) Mol.Cell.Biol.10:3343; Zambretti et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952; Baim et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072; Wyborski et al.(1991) Nuc.Acids Res.19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol.And Struc.Biol.10:143; Degenkolb et al.(1991) Antimicrob.Agents Chemother.35:1591; Kleinschnidt et al.(1988) Biochemistry27:1094; Gatz et al.(1992) Plant J.2:397; Gossen et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547; Oliva et al.(1992) Antimicrob.Agents Chemother.36:913; Hlavka et al.(1985) Handbook of Experimental Pharmacology78;及びGill et al.(1988) Nature334:721を参照のこと。このような開示は参照により本明細書に組み入れられている。
【００５３】
上述のリストの選択マーカー遺伝子はそれらに限定されるものではない。致死又は非致死の選択マーカー遺伝子のいずれも本発明において用いることができる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、所望の植物において発現を増強するために所望のヌクレオチド配列の発現を修飾するために提供されている。植物に好ましいコドンと共にヌクレオチド配列を合成する方法は、当該技術分野において入手可能である。例えば、米国特許５，３８０，８３１号明細書及び５，４３６，３９１号明細書（両方とも参照により本明細書に組み入れられる）；Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15:3324; Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; and Murray et al. (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477を参照のこと。
【００５５】
例えば、所望の植物がウキクサである場合、１つのかかる修飾は、ウキクサの好ましいコドンを用いた所望のヌクレオチド配列の合成である。ウキクサにおいて発現するタンパク質における最高頻度のコドンにより、好ましいコドンを決定することができる。したがって、ウキクサ中の特定のコドンの使用頻度は、一群のウキクサのコード配列中のコドン使用を分析することにより決定することができる。多数のウキクサのコード配列は当業者に公知である。例えば、メリーランド州ベセスダに位置するNational Center for Biotechnology Information、National Library of Medicineの一部門のウェブサイトを介してアクセスすることができる、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース中に含まれる配列を参照のこと。最新のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）リリース中に含まれる配列に基づくコドン使用の頻度を示す表は、日本国千葉県のかずさＤＮＡ研究所のウェブサイト上で見ることができる。このデータベースは、Nakamura et al.(2000) Nucl.AcidsRes.28:292中に記載されている。
【００５６】
ウキクサ及び他の単子葉植物又は双子葉植物における発現を最適化する遺伝子は、本発明の方法において用いることができることが認められている。例えば、欧州特許０ ３５９ ４７２号明細書、欧州特許０ ３８５ ９６２号明細書、国際公開９１／１６４３２号パンフレット；Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324; Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; Murray et al.(1989) Nucleic Acids Res. 17:477;その他を参照のこと。遺伝子配列のすべて又はいずれの部分も最適化され、又は合成されてもよいことがさらに認められている。換言すれば、完全に最適化された又は部分的に最適化された配列をもまた用いてもよい。例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のコドンは、植物に好ましいコドン、例えば、ウキクサに好ましいコドンであってもよい。それゆえ、いくつかの実施態様では、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、５０〜１００％のウキクサに好ましいコドン、又は７０〜１００％ウキクサに好ましいコドンを含んでもよい。一実施態様では、９０〜９６％のコドンは、ウキクサに好ましいコドンである。所望のヌクレオチド配列のコード配列は、ウキクサに少なくとも１７％の頻度で用いられるコドンを含んでもよい。イボウキクサ（表１）とコウキクサ（表２）におけるコドンの使用を以下に示す。いくつかの実施例では、表１又は表２は、ウキクサに好ましいコドンを選択するために用いられる。
【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
植物においてその発現を最適化するために所望のヌクレオチド配列に別の修飾も行うことができる。かかる修飾としては、偽ポリアデニル化シグナル、エクソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピート、その他遺伝子発現に有害となりうる特徴的な配列をコードする配列を排除することを挙げることができるがこれらに限定されない。配列のＧＣ含量は、宿主細胞における公知の発現した遺伝子を基準にして計算された既知の細胞宿主の平均レベルに調整されてもよい。可能な場合は、配列は、予測されるヘアピン二次的ｍＲＮＡ構造を避けるために修飾されてもよい。
【００６０】
翻訳開始の効率に影響を与えうる、動物及び植物における翻訳開始コドンのために最適化された翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列（optimal translation intiation context nucleotide sequence）と、かかる翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列（translation initiation context nucleotide sequence）の組成物との間には公知の相違がある。例えば、Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154:89-98; and Joshi et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:993-1001を参照のこと。本発明のいくつかの実施態様では、所望のヌクレオチド配列の翻訳開始コドンのための翻訳開始コンテキストヌクレオチド配列は、ウキクサにおいて発現を増強するために修飾してもよい。一実施態様では、ヌクレオチド配列は、所望のヌクレオチド配列の翻訳開始コドンの直接的に上流にある３つのヌクレオチドが「ＡＣＣ」となるように修飾される。第二の実施態様では、これらのヌクレオチドは、「ＡＣＡ」である。
【００６１】
植物における非相同ヌクレオチド配列の発現を開始し、又は増強するための本明細書に開示する発現制御因子に加えて、所望のヌクレオチド配列の発現は、様々な調節因子を最適に用いることにより増強されることもできる。本明細書で用いられる「調節因子」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡいずれかのヌクレオチド配列を意味し、通常は構造遺伝子のコード配列の上流（５’側の）に位置し、例えば、リーダー配列、プロモーター、翻訳及び転写エンハンサー又はリプレッサーなどの転写制御配列や、ｍＲＮＡ安定性及び不安定性決定因子等を含む。イントロン内で見い出される配列もまた、所望のコード領域の発現を制御してもよい。調節因子は、３’末端から転写開始部位にかけて、又は転写領域において見い出されることもある。様々な制御因子は、他の制御因子と作動可能に連結することができる。本明細書で用いられる「リーダー配列」なる用語は、ｍＲＮＡの５’末端に位置する核酸の一部分を意味し、５’末端ＣＡＰ部位からタンパク質翻訳開始コドンＡＵＧに及ぶものである。リーダー配列は、翻訳開始及び遺伝子発現調節において重要である。
【００６２】
例えば、１又は複数のリーダー配列は、標的ヌクレオチド配列の発現を増強するために組み合わせてさらに用いることができる。翻訳リーダーは当該技術分野で周知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー(脳心筋（Encephalomyocarditis）５’末端非コード領域Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6126);ポチウイルスリーダー、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス；Gallie et al. (1995) Gene 165:233）;ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP; Macajak and Sarnow (1991) Nature 353:90);アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ 4; Jobling and Gehrke (1987) Nature 325:622）；タバコモザイクウイルスリーダー(ＴＭＶ; Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56);ジャガイモエッチウイルスリーダー(Tomashevskaya et al. (1993) J. Gen. Virol. 74:2717-2724);Fed-1 ５’末端非翻訳領域(Dickey (1992) EMBO J. 11:2311-2317); RbcS ５’末端非翻訳領域(Silverthorne et al. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15:49-58);及びトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ; Lommel et al. (1991) Virology 81:382)を挙げることができるがこれらに限定されない。また、Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965をも参照のこと。トウモロコシデヒドロゲナーゼ１遺伝子、トウゴマカタラーゼ遺伝子、又はシロイヌナズナトリプトファン経路遺伝子ＰＡＴ１由来のイントロン配列を含めた、植物のイントロン配列を含むリーダー配列が、植物において翻訳効率を増加させることが示されてきた(Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920)。
【００６３】
本明細書に既に記載されているように、ウキクサユビキチンイントロンは（例えば、配列番号７〜９に示されているように）、作動可能に連結した所望のヌクレオチド配列の発現を増強させるそれぞれのユビキチンプロモーターとは別のプロモーターとともに用いてもよい。ユビキチンイントロンと共に用いられるプロモーターは、配列番号１３及び１４それぞれに開示されている新規のウキクサｒ−ヒストン及びキチナーゼプロモーターを含む所望の植物において適切に用いられる任意のプロモーターでよい。他の適切なプロモーターは、植物又は植物ＤＮＡウイルス等の様々な出所から得ることができる。有用なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ及び３５Ｓ（ＣａＭＶ１９Ｓ及びＣａＭＶ３５Ｓ）転写プロモーター等のカリモウイルス群から単離されたプロモーターを挙げることができる。他の有用なプロモーターとしては、Kat et al. (1987) Science 236:1299-1302に開示されている、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(eCaMV35S)、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ オキシゲナーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニットプロモーターを挙げることができる。他の適切なプロモーターとしては、ライスアクチンプロモーター；シクロフィリンプロモーター；ＡＤＨ１プロモーター(Callis et al. (1987) Gene Dev. 1:1183-1200);クラスIパタチンプロモーター(Bevan et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:4675-4638)；ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼプロモーター;β−コングリシニンプロモーター(Tiemey et al. (1987) Planta 172:356-363)；Ｅ８プロモーター(Deikman et al. (1988) Embo J. 7:3315-3320)；２ＡIIプロモーター(Pear et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:639-651)；及び酸性キチナーゼプロモーター(Samac et al. (1990) Plant Physiol. 93:907-914)を挙げることができる。
【００６４】
上述の発現を増強させるヌクレオチド配列修飾はいずれも、任意の単一の修飾であっても、任意の修飾の可能な組合せであっても、本発明に用いることができる。
【００６５】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物及び方法は、例えば、ウキクサ発現系などの植物発現系において利用され、所望の非相同ヌクレオチド配列は、分泌タンパク質である。分泌タンパク質は、小胞体（ＥＲ）の膜上の受容体タンパク質と相互作用し、膜を横断して成長するポリペプチド鎖細胞の転移（translocation）を誘導し、その後細胞からの分泌のために小胞体へと誘導する「シグナルペプチド」を含む前駆ポリペプチドから通常翻訳される。かかるシグナルペプチドは、シグナルペプチドが欠如した「成熟」ポリペプチドを産生するために、前駆ポリペプチドからしばしば切断される。このようにして、生物活性ポリペプチドは、例えば、本発明の発現制御因子を有する発現構築物、又はその生物活性バリアント又はフラグメントから、例えばウキクサなどの植物において発現し、培地へのポリペプチドの分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とさらに作動可能に連結した所望のヌクレオチド配列と作動可能に連結している。「生物活性のあるポリペプチド」とは、１又は複数の生物学的機能、又は生物学的なコンテクストにおいてポリペプチドに通常起因する活性のセットを実行することができるポリペプチドを意味する。小胞体への（細胞外への分泌のための）タンパク質の転移を標的とする植物シグナルペプチドは公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許６，０２０，１６９号明細書を参照のこと。
【００６６】
一実施態様では、シグナルペプチドは、配列番号１６に示される新規のコウキクサキチナーゼシグナルペプチド、又はそのバリアント若しくはフラグメントであり、発現構築物としては、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、かかるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、このシグナルペプチドコード配列は、配列番号１５に示される配列である。
【００６７】
本発明のコウキクサキチナーゼシグナルペプチド、又はそのバリアント若しくはフラグメントは、所望のコードされたポリペプチドの任意のものの細胞外分泌を指示するために用いることができることが認められている。このように、配列番号１５のシグナルペプチド、又はそのバリアント若しくはフラグメントをコードする配列は、所望のプロモーターと所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に正しい読み枠で作動可能に連結するように任意の発現構築物に組み入れることができる。かかる発現構築物は、所望のコードされたポリペプチドの発現と細胞外分泌を提供するために植物、植物細胞、又は根粒に導入することができる。
【００６８】
あるいは、ほ乳類のシグナルペプチドを、例えばウキクサ等の分泌用に遺伝子工学処理した植物において発現している組換えポリペプチドを標的とするために用いることができる。植物細胞は、小胞体を標的とするほ乳類のシグナルペプチドを認識し、これらのシグナルペプチドは原形質膜を通じてだけではなく植物細胞壁を通じても、ポリペプチドの分泌を誘導することができることが実証されてきている。両者とも参照により本明細書に組み入れられる、Hiatt et alへの米国特許第５，２０２，４２２号明細書及び第５，６３９，９４７号明細書を参照のこと。
【００６９】
分泌されたポリペプチドは、当該技術分野で慣用の手段により、培地から採取することができ、クロマトグラフィー、電気泳動、透析法、溶媒−溶媒抽出、その他の手段により精製することができる。
【００７０】
本発明の方法は、植物、植物細胞、又は根粒に発現構築物を導入することを伴う。「導入する」とは、構築物が、植物の細胞の内部にアクセスすることができるように発現構築物を植物に提示することを意味する。本発明の方法は、植物へ発現構築物を導入する特定の方法に依拠するのではなく、発現構築物が、少なくとも一つの植物の細胞の内部にアクセスすることができるというのみである。発現構築物を植物に導入する方法は公知であり、例えば、安定した形質転換法、一時的な形質転換法、及びウイルスが介在する方法を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００７１】
「安定した形質転換」とは、植物に導入されたヌクレオチド配列が、植物のゲノムに組み入れられ、その子孫により受け継がれることができることを意図する。「一時的な形質転換」とは、植物に導入されたヌクレオチド配列（例えば、発現構築物に含まれるヌクレオチド配列）が、植物のゲノムに組み入れられないことを意味する。
【００７２】
本発明のヌクレオチド配列は、ウイルス又はウイルス性核酸を植物、植物細胞、又は根粒に接触させることにより、植物、植物細胞、又は根粒に導入してもよい。一般に、かかる方法は、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に本発明のヌクレオチド配列を組み入れることに関する。植物、植物細胞、又は根粒にヌクレオチド配列を導入する方法、及びウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関してコードされているタンパク質を発現させる方法は、当該技術分野において公知である。参照により本発明に組み入れられる米国特許５，８８９，１９１号、５，８８９，１９０号、５，８６６，７８５号、５，５８９，３６７号、及び５，３１６，９３１号明細書を参照のこと。
【００７３】
形質転換のプロトコルや、ヌクレオチド配列を植物に導入するプロトコルは、形質転換の標的が、単子葉植物か双子葉植物かといった、植物、植物細胞、又は根粒のタイプに依拠して変化しうる。ヌクレオチド配列を植物、植物細胞、又は根粒に導入する適切な方法としては、マイクロインジェクション(Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334参照)、エレクトロポレーション(Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606参照)、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入（米国特許５，５６３，０５５号、及び５，９８１，８４０号明細書、両方とも参照により本発明に組み入れられる）、遺伝子直接導入（Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722参照)、衝撃粒子加速（ballistic particle acceleration）（米国特許４，９４５，０５０号、米国特許５，８７９，９１８号、米国特許５，８８６，２４４号、及び米国特許５，９３２，７８２号明細書、両方とも参照により本発明に組み入れられる）、及びTomes et al. (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926)を参照のこと。形質転換された細胞は、慣用の用法により植物として成長させてもよい。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照のこと。
【００７４】
いくつかの実施例では、安定して形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物細胞又は根粒は、コスト上若しくは物流上の制限、又はその両方を理由として、既存の遺伝子発現システムにより商業的に産生することは効果的にできない生物活性ポリペプチドを発現する。例えば、タンパク質が、ほ乳類細胞において、細胞生存、細胞増殖、細胞分化又はタンパク質集合を干渉するので、いくつかのタンパク質は、ほ乳類系において発現することができない。かかるタンパク質としては、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３、アンジオスタチン、及びレプチンを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明は、ほ乳類の調節タンパク質を産生するために有利に利用することができる。すなわち、これらのタンパク質がウキクサにおける調節手順を干渉するほど、高等な植物とほ乳類の間に大きな進化距離があるということはない。トランスジェニックウキクサは、既存の発現系の産生能力に対抗するように、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）、ヘモグロビン、及びコラーゲンなどの多量体のタンパク質を産生するために用いることもできる。
【００７５】
加えて、より高等な植物系では、ほ乳類系よりもはるかに容易に、生物活性多量体タンパク質（例えば、モノクローナル抗体、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキシダーゼ、コラーゲン、及びその他）を産生するように設計することができる。ウキクサにおける生物活性多量体タンパク質アプローチを産生する一つの例は、ポリペプチドサブユニットの全てをコードする遺伝子を含む発現構築物を用いることである。例えば、During et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:281、及びvan Engelen et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1701を参照のこと。かかる構築物は、衝撃照射や、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入などの公知の形質転換方法を用いてウキクサ細胞に導入される。この方法は、多量体タンパク質を集合させるのに必要なポリペプチドの全てを発現するクローン細胞系をもたらす。かかるアプローチの変形としては、単一遺伝子構築物を作製し、これらの構築物を一緒にＤＮＡに混合し、かかる混合物を、衝撃照射（ballistic bombardment）か、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入を用いて、植物細胞内に導入することを挙げることができる。別の変形としては、構築物のいくつか又は全てが、多量体タンパク質（すなわち、多量体タンパク質におけるサブユニットの数よりも少ないウキクサクローンが交雑するように）の複数のサブユニットをコードすることを挙げることができる。あるいは、それぞれのウキクサクローンは、多量体タンパク質のサブユニットの少なくともひとつを発現し、それぞれのサブユニットを分泌しているウキクサクローンは、一緒に培養され、多量体タンパク質は、様々な分泌されたサブユニットから培地に集合している。いくつかの例では、工業若しくは化学的プロセス用に、或いは診断、治療又はワクチンを目的として、形質転換されたウキクサ植物又はウキクサ根粒培養物においては、多量体タンパク質の全てのサブユニットよりも少なく、場合によっては単一タンパク質サブユニットを産生することが望ましい場合もある。
【００７６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例］
【実施例１】
【００７７】
（発現ベクター）
以下の本実施例で用いられる発現ベクターとしては、Ｅｇｓ０５、Ｅｇｓ０７、Ｅｇｓ１１、Ｅｇｓ２２、Ｅｇｓ２３、Ｅｇｓ４６、Ｅｇｓ５０、Ｅｇｓ５１、Ｅｇｓ１９、Ｅｇｓ２０、Ｅｇｓ２４、Ｅｇｓ２５、ＩＦＮ５３、及びＩＦＮ５４を挙げることができる。Ｅｇｓ０５とＥｇｓ０７は、大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のコード配列に作動可能に連結した制御プロモーターを含む非改変発現ベクターであり、それぞれが異なる選択マーカー遺伝子を保持する。Ｅｇｓ１１は、ＧＵＳコード配列に作動可能に連結する、完全長コウキクサユビキチン発現制御因子(配列番号１)を含み、選択マーカー遺伝子を保持する。Ｅｇｓ２２とＥｇｓ２３は、類似の構築物であるが、コウキクサユビキチン発現制御因子の切断バージョンを用いるものである。Ｅｇｓ２２において、配列番号１の１２８８〜２１６０ヌクレオチドは、作動可能に連結したＧＵＳコード配列の発現を推進する。Ｅｇｓ２３において、配列番号１の１１３２〜２１６０ヌクレオチドは、かかるＧＵＳコード配列の発現を推進する。Ｅｇｓ４６は、Ｅｇｓ１１に類似するが、異なる選択マーカー遺伝子を含む。
【００７８】
Ｅｇｓ５０は、ＧＵＳコード配列に作動可能に連結した完全長Ｓ．ポリリザのユビキチン発現制御因子(配列番号２)を含み、選択マーカー遺伝子を保持する。同様に、Ｅｇｓ５１は、選択マーカー遺伝子を有する、ＧＵＳコード配列に作動可能に連結した完全長のナンゴクアオウキクサユビキチン発現制御因子(配列番号３)を含む。
【００７９】
Ｅｇｓ１９は、ＧＵＳコード配列に作動可能に連結したコウキクサｒ-ヒストン発現制御因子(配列番号１３)の４６１〜１８０８ヌクレオチドを含み、選択マーカー遺伝子を保持する。Ｅｇｓ２０においては、配列番号１３の８０５〜１８０８ヌクレオチドが、ＧＵＳコード配列の発現を推進する。
【００８０】
Ｅｇｓ２４は、ＧＵＳコード配列に作動可能に連結したコウキクサキチナーゼ発現制御因子(配列番号１４)の５１〜１３３８ヌクレオチドを含み、選択マーカー遺伝子を保持する。Ｅｇｓ２５は、選択マーカー遺伝子を有する、トウモロコシＡＤＨ１イントロンとＧＵＳコード配列に作動可能に連結したコウキクサキチナーゼ発現制御因子(配列番号１４)の５１〜１３３８ヌクレオチドを含む。
【００８１】
ＩＦＮ５３とＩＦＮ５４の発現ベクターは、それぞれＡｍａｓＰｍａｓスーパープロモーターであるイボウキクサＲｂｃＳ ＳＳＵ５Ｂ発現制御因子(配列番号１２)と、コドンが最適化されたインターフェロンアルファ２ｂ遺伝子に作動可能に連結したトウモロコシＡＤＨ１イントロンを含み、コドンが最適化されたアルファアミラーゼシグナル配列（ＩＦＮ５３）か、コウキクサキチナーゼシグナル配列（配列番号１５、ＩＦＮ５４）のいずれかを有する。
【実施例２】
【００８２】
（ウキクサの形質転換）
ウキクサ葉状体又はウキクサ根粒培養培地（実施例におけるコウキクサ株８６２７由来の)は、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入を用いて、上述の発現構築物で形質転換した。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８Ｚ７０７株、安全な（disarmed）、広範な宿主範囲のＣ５８株(Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969)が、これらの実施例において、形質転換のために用いることができる。上述の発現構築物は、エレクトロポレーションにより、又は可動性プラスミドｐＲＫ２０１３を保持する大腸菌ＭＭ２９４を用いて三親性交配手順（triparental mating procedure）によりＡ．トゥメファシエンスに移入された(Hoekema et al. (1983) Nature 303:179-180; Ditta et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7350)。上述の発現構築物を含むＣ５８Ｚ７０７株は、ストレプトマイシン５００ｍｇ／Ｌ、スペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌ及び硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＡＢ最小培地 (Chilton et al. (1974) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71:3672-3676参照)、又はＹＥＢ若しくはＬＢ(１ｇ／Ｌイーストエキストラクト、５ｇ／Ｌビーフエキストラクト、５ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌスクロース、０．５ｇ／ＬＭｇＳＯ４)培地にストリークされ、２８℃にて一晩成長させた。
【００８３】
形質転換のためのウキクサの根粒培養物は、以下のように作製した。ウキクサの葉状体を分離し、滅菌した外科用メスを用いて根を切断し、葉状体は腹面側を下にして、５μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．５μＭの１−フェニル−３（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）尿素チジアズロン(Sigma社製P6186)、３％スクロース、０．４Ｄｉｆｃｏ寒天（Bacto-agar）(Fisher Scientific社製)、及び０．１５％ゲルライト（Gelrite）(Sigma社製)で補完したムラシゲ−スクーグ培地（カタログ番号Ｍ−５５１９；Sigma Chemical Corporation社製、St.Louis,MO）ｐＨ５．６に置かれる。葉状体は５〜６週間成長した。この時点で、根粒（黄色がかった小さな細胞塊）が、通常腹面側の中心部から生じた。この根粒組織を母葉状体から脱着させ、３％スクロース、０．４％Ｄｉｆｃｏ寒天、０．１５％ゲルライト、１μＭの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、及び２μＭのベンジルアデニンで補完したムラシゲ−スクーグ培地で培養した。
【００８４】
ウキクサ根粒培養物は以下の様に形質転換される。適当なアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株は、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンと１００μＭアセトシリンゴン（acetosyringone）とを添加したポテトデキストロース寒天、又はＹＥＢ若しくはＬＢ寒天上で成長させ、０．６Ｍマニトール及び１００μＭアセトシリンゴンで補完したムラシゲ・スクーグ培地で再懸濁した。根粒培養組織は、再懸濁させたバクテリアの溶液中に１〜２分間浸すことにより植菌し、余分な水分を除去するためにブロットし、根粒の成長を促進するために最適化したオーキシンとサイトカイニン、及び、１００μＭアセトシリンゴンを補完したムラシゲ・スクーグ培地からなる共培養培地に播種された。Yamamoto et al. (2001) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37:349-353を参照のこと。
【００８５】
選択用に、根粒培養物組織は再生培地、すなわち１％スクロース、０．４％Ｄｉｆｃｏ寒天、０．１５％ゲルライト、５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び６ｍｇ／Ｌのゲネチシンを補完した０．５×シェンク及びヒルデブラント培地に移し、連続光（２０〜４０μＭ／ｍ２・ｓｅｃ）下において約６〜８週間培養した。根粒組織は、７日毎に新たな培養培地に移した。根粒組織が選択培地上で激しい増殖を示す場合に、選択は終了する。
【実施例３】
【００８６】
（ウキクサにおける大腸菌ＧＵＳの一時的発現）
ＧＵＳの一時的発現は、Ｅｇｓ０５、Ｅｇｓ０７、Ｅｇｓ１１、Ｅｇｓ２２、Ｅｇｓ２３、Ｅｇｓ４６、Ｅｇｓ５０、Ｅｇｓ５１、Ｅｇｓ１９、Ｅｇｓ２０、Ｅｇｓ２４、及びＥｇｓ２５構築物で形質転換されたウキクサ根粒培養物において評価された。すべての構築物は、２４時間染色によって測定された、ＧＵＳの強い発現を推進することができるものであった（表３参照）。
【００８７】
さらに、ＧＵＳ酵素アッセイは、Ｅｇｓ０７、Ｅｇｓ４６、Ｅｇｓ５０、及びＥｇｓ５１構築物で形質転換された、ウキクサ根粒培養物について行われた。３６個のＥｇｓ０７形質転換株は、１．３４５％ＧＵＳが平均値であり、２９個のＥｇｓ４６形質転換株は、２．３２０％ＧＵＳが平均値であり、４個のＥｇｓ５０形質転換株は、４．００８％ＧＵＳが平均値であり、８個のＥｇｓ５１形質転換株は、６．６８２％ＧＵＳが平均値である。
【００８８】
2009523431.tif 000008
【実施例４】
【００８９】
（ウキクサにおけるインターフェロンの発現）
数百のトランスジェニックウキクサ株が、ＩＦＮ５３とＩＦＮ５４構築物を用いて産生され、ひき続いてＥＬＩＳＡによる、インターフェロン発現についてのスクリーニングが行われた。同レベルのインターフェロンの発現が２つの構築物で観察された。ＩＦＮ５３が１７３５．６６ｎｇ／ｍｌで最高のエクスプレッサー（expresser）であり、３６２．０４ｎｇ／ｍｌが平均の発現であった。ＩＦＮ５４は１１７３．８１ｎｇ／ｍｌが最高のエクスプレッサーであり、３４７．４０ｎｇ／ｍｌが平均の発現であった。
【００９０】
本明細書中で述べた全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者の程度を示すものである。全ての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることを示すのと同程度で、参照により本明細書に組み込まれている。
【００９１】
理解を明確にする目的で例示及び例によって、前述の本発明をある程度詳細に記載してきたが、ある程度の変更及び変更形態を、添付の実施形態の範囲内で実施することができることは明らかである。
【配列表】
2009523431000001.app
【国際調査報告】
2009523431.tif 000010
2009523431.tif 000011
2009523431.tif 000012
2009523431.tif 000013
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