(57)【要約】流動制御および生物的粒子の処理のためのこの発明の特徴装置(例えば、細胞の強化および血の見本抽出)。装置はmicrofluidic弁の使用による液体の流れを制御する機能に基づいている。発明の弁は移動式ダイヤフラムで気分にさせられる微細構造によって、例えば、特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャネルおよび弁から成り立つmicrofluidic装置は言われたチャネルの最初の部屋の形成に終って言われた弁が開いた状態を備えているか言われたチャネルを通る流量を許可する、第1国家を閉め、第2言われたチャネルの上院の形成に終って国家を閉めた。
【請求項２】
言われた最初部屋または言われた上院かの形成に終って言われた微細構造の少なくとも部分、相関的な言われた微細構造の相関的な言われた基礎メンバーまたは言われた移動式ダイヤフラムの少なくとも部分の動きの言われた移動式ダイヤフラムの結果の作動言われた弁が移動式ダイヤフラム、微細構造および基礎メンバーから成り立つか、要求1のmicrofluidic装置。
【請求項３】
言われた微細構造の少なくとも部分が言われた移動式ダイヤフラムで気分にさせられる、および言われた微細構造の相関的な言われた基礎メンバーかの少なくとも部分の動きの言われた移動式ダイヤフラムの結果の言われた作動要求2のmicrofluidic装置。
【請求項４】
言われた微細構造の少なくとも部分が言われた基礎メンバーで気分にさせられる、および相関的な言われた移動式ダイヤフラムの動きの言われた移動式ダイヤフラムの結果の言われた作動言われた微細構造かの少なくとも部分要求2のmicrofluidic装置。
【請求項５】
言われた微細構造が高さ言われたチャネルの高さよりより少しであるか、要求2のmicrofluidic装置。
【請求項６】
要求2のmicrofluidic装置、言われた微細構造の少なくとも部分の間で形作られるシールの言われた移動式ダイヤフラムの結果の言われた作動および言われた移動式ダイヤフラムか言われた基礎メンバー、言われた作動形成言われた最初部屋または言われた上院の生じる。
【請求項７】
言われた作動が言われた最初部屋または言われた上院の言われた形成で起因するか言われた移動式ダイヤフラムの言われた作動が言われた微細構造の少なくとも部分の間で形作られるシールでおよび言われた移動式ダイヤフラムか言われた基礎メンバー起因しないか、要求2のmicrofluidic装置。
【請求項８】
要求1の装置を使用する方法。
【請求項９】
構成する液体を液体をチャネルおよび弁から成り立つmicrofluidic装置に導入して引っ掛ける方法は言われたチャネルの最初の部屋の形成に終って言われた弁が開いた状態を備えているか言われたチャネルを貫流するように言われた液体がする第1国家を閉め、第2言われたチャネルの上院の形成に終って国家を閉めた。
【請求項１０】
要求9の方法は、言われた最初部屋か言われた上院、第2液体から言われた液体を分ける。
【請求項１１】
構成する言われたチャネルの最初の部屋の形成に終って生物的粒子を引っ掛ける方法は言われた細胞を含んでいる液体をチャネルおよび弁から成り立つmicrofluidic装置に導入して言われた弁が開いた状態を備えているか言われたチャネルを通る流量を許可する、第1国家を閉め、第2言われたチャネルの上院の形成に終って国家を閉めた。
【請求項１２】
最初に言われたか、または二番目に閉められていた状態が言われた生物的粒子を引っ掛けるが、言われたチャネルを貫流するようにするか要求11の方法は、液体が。
【請求項１３】
言われた生物的粒子がmammalian細胞であるか、要求11の方法。
【請求項１４】
言われた弁が移動式ダイヤフラム、微細構造および基礎メンバーから成り立つか要求11の方法、言われた最初部屋または言われた上院の形成に終って言われた微細構造の少なくとも部分、言われた作動相関的な言われた微細構造の相関的な言われた基礎メンバーまたは言われた移動式ダイヤフラムの少なくとも部分の動きの言われた移動式ダイヤフラムの結果の作動。
【請求項１５】
言われた微細構造の少なくとも部分が言われた移動式ダイヤフラムで気分にさせられる、および言われた微細構造の相関的な言われた基礎メンバーかの少なくとも部分の動きの言われた移動式ダイヤフラムの結果の言われた作動要求14のmicrofluidic装置。
【請求項１６】
言われた微細構造の少なくとも部分が言われた基礎メンバーで気分にさせられる、および相関的な言われた移動式ダイヤフラムの動きの言われた移動式ダイヤフラムの結果の言われた作動言われた微細構造かの少なくとも部分要求14のmicrofluidic装置。
【請求項１７】
言われた微細構造が高さ言われたチャネルの高さよりより少しであるか、要求14のmicrofluidic装置。
【請求項１８】
要求14のmicrofluidic装置、言われた微細構造の少なくとも部分の間で形作られるシールの言われた移動式ダイヤフラムの結果の言われた作動および言われた移動式ダイヤフラムか言われた基礎メンバー、言われた作動形成言われた最初部屋または言われた上院の生じる。
【請求項１９】
言われた作動が言われた最初部屋または言われた上院の言われた形成で起因するか言われた移動式ダイヤフラムの言われた作動が言われた微細構造の少なくとも部分の間で形作られるシールでおよび言われた移動式ダイヤフラムか言われた基礎メンバー起因しないか、要求14のmicrofluidic装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明は細胞の強化、血の見本抽出およびmicrofluidic装置の分野に関連している。
【背景技術】
【０００２】
セルベースの、基本的な科学的でか臨床応用は一次サンプルのコレクションのからの小さく約束する、安価で、多目的な装置のための実験室破片の技術のデータ解析のにすべてのプロシージャの統合すると(AnderssonおよびヴァンDen Berg、センサーおよびアクチュエーター B化学薬品、2003年、92、315-325; SiaおよびWhitesides、電気泳動、2003年、24、3563-3576; トナーおよびIrimia、生体医用工学の年次レビュー、2005年、7、77-103)。この複雑なプロセスの1つのステップはそれに続く処理および分析のために使用できるようにされる前に一次サンプルからの細胞が特定の刺激のステップの有無にかかわらず新しい緩衝解決で普通、分かれて、洗浄され、そして再停止されるとき、サンプル準備である。公有地が破片のサンプル準備にのために、容易に道具のアプローチ今日ないので、但し、ほとんどの場合このステップはピペットで移すことのようなプロシージャによって破片でベンチでない、達成されが、遠心分離。
【０００３】
microfluidic装置のmammalian細胞の処理はある大切な挑戦を提起する。Eukaryotic細胞一般におよびヒト細胞は特に他の細胞よりdeformable機械的に壊れやすく、である。それらはまた生物学的により敏感、環境の変更に答えてより速い。懸濁液の細胞を扱うための様々な方法が提案される間、各技術に潜在性を限る欠点がある。新しい試薬--に装飾そしてmammalian細胞をさらすための電界を使用して方法(RosenthalおよびVoldman、生物物理学ジャーナル、2005年、88、2193-2205; GascoyneおよびVykoukal、Ieeeの進行、2004年、92、22-42; 等Segerは、破片の実験室、2004年、4、148-151)細胞の懸濁液のための解決と細胞のタイプに依存している。比較的大きいmammalian細胞(等新井、電気泳動、2001年、22、283-288)の光学処理は困難、高く、容易にが機械構造(等Panaro、Biomolecular工学、2005年、21、157-162の使用量ることができない; 等荷車引き、分析化学、2003年、75、3581-3586; 細胞が機械的に引っ掛けられて容易に解放することができなければなら生体医用工学のグラスゴーの等荷車引き、Ieeeトランザクションは、2001年、通常48、570-578)不可逆、その後である。
【０００４】
全血のサンプルの精密なメーターで計ることは多くの臨床診断適用のために必要、例えば、血(等Tudos、破片の実験室、2001年、1、83-95)の生化学的な分析および血球カウントおよび分析である(トナーおよびIrimia、生体医用工学の年次レビュー、2005年、7、77-103)。少数のマイクロリットルがスポイトおよびmicropipettesを使用して正確に見本抽出することができると小さい血の容積。但し、使用されたそれらのようなより小さい容積は、装置を要求する血のような複雑で細胞豊富な液体に常に適しなかった異なったアプローチをmicrofabricated。疎水性障壁(等Pugia、臨床化学、2005年、51、1923-1932年が付いている出された毛管; 等Ahn、Ieeeの進行、2004年、92、154-173; コロンブスおよびPalmerは、臨床化学、1991年、37、1548-1556年)混合される必要がある流動区分間の空気泡を引っ掛けることができる。electrowettingプラットホーム(等Srinivasan、破片の実験室、2004年、4、310-315)のMicrodropletsは装置の外でピペットで移すことによって形作られなければならない; 最低のサイズはマイクロリットルの範囲に限られ、疎水性表面の血の蛋白質そして細胞の粘着性は問題となるかもしれない。最終的に、弁は弁の幾何学が細胞のために友好的でないが液体の補助的マイクロリットルの容積を見本抽出し、生化学的な試金(等Hansen、米国の国家科学院の進行、2002年、99、16531-16536)を行うように設計されていた。精密なメーターで計る容積は縦の壁(等李、電気泳動、2005年、26、3758-3764)が付いているチャネルの弁を使用して可能である。
【０００５】
従って、microfluidic装置のサンプルを処理する新しい装置そして方法のための必要性がある。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
発明はチャネルおよび弁を含むmicrofluidic装置を特色にする。弁はチャネルで開いた状態備えていて最初の部屋の形成に終るチャネルを通る流量を、最初の閉められていた状態、およびチャネルの上院の形成に終る第2閉められていた状態を許可する。発明はまた上記の装置を使用する方法を含んでいる。
【０００７】
発明はまた液体か生物的粒子(例えば、mammalian細胞)を引っ掛ける方法を特色にし、生物的粒子を含んでいる液体か液体をチャネルおよび弁を含むmicrofluidic装置に導入する。この具体化では弁は開いた状態を備えていてチャネルで最初の部屋の形成に終ってチャネル、最初の閉められていた状態、および上院の形成に終ってチャネルで第2閉められていた状態を貫流するように液体がする。
【０００８】
発明の装置の何れかでは、弁は移動式ダイヤフラム、微細構造および基礎メンバーを含むことができる。これらの装置では、可動装置のダイヤフラムの作動は最初の部屋または上院の形成に終って微細構造の少なくとも部分、相関的な基礎メンバーか移動式ダイヤフラムに関連して微細構造の少なくとも部分の動きで起因する。作動のこれらの方法の組合せはまた可能である。
【０００９】
微細構造の少なくとも部分は発明の装置の何れかの移動式ダイヤフラムで気分にさせることができる。これらの装置では、可動装置のダイヤフラムの作動は基礎メンバーに関連して微細構造の少なくとも部分の動きで起因する。また、微細構造の少なくとも部分は基礎メンバーで気分にさせることができる。これらの装置では、可動装置のダイヤフラムの作動は相関的な移動式ダイヤフラムの動きで微細構造の少なくとも部分起因する。微細構造は高さ上記の装置の何れかのチャネルの高さよりより少しである場合もある。
【００１０】
上記の装置の移動式ダイヤフラムの作動はかもしれなくし、またはかもしれなくないし、微細構造の少なくとも部分の間で形作られるシールでそして移動式ダイヤフラムか基礎メンバー起因し。装置の最初の部屋か上院は第2液体から1つの液体を分けることができる。
【００１１】
最初または二番目に閉鎖した州は粒子を引っ掛けることができるが、液体がチャネルを貫流するようにする。
【００１２】
「生物的粒子によって」サンプル獲得、準備、貯蔵および分析の時間目盛の水様媒体で不溶解性である生物的起源のあらゆる種意味される。例は細胞(例えば、動物の細胞、植物の細胞、細菌およびイースト)、蛋白質、脂質、核酸および炭水化物を含む微粒子の細胞の部品、ウイルスおよび複合体が含まれている。
【００１３】
「部屋によって2つの容積間の材料の道が強いられるように」容積microfluidic装置の別の容積から分かれているmicrofluidic装置の意味される。言葉の部屋は部分的な分離を含むために意味される(例えば細胞か他の粒子が2つの容積の間で渡ることができない液体は2つの容積の間で)渡ることができるかところで。
【００１４】
「チャネルによって」液体が貫流するかもしれないギャップ意味される。チャネルは水様の液体が制限されるか別の方法で疎水性表面の親水性パターンの毛管、水路、またはストリップであるかもしれない。
【００１５】
「microfluidicによって」意味され1ミリメートル以下の少なくとも1つの次元を持っている。 
【００１６】
「微細構造によって」 1つの表面からチャネルで、例えば、突起流れる障害意味される。
【００１７】
「生物的粒子」を引っ掛けることによって望ましい部屋への生物的粒子を制限すること意味される。
【００１８】
「弁によって」液体の流れを制御する構造意味される。言葉弁は他の要素が流れるために割り当てられるが液体のある特定の要素が流れることから防がれるという、液体の部分的な制御を含んでいる、(例えばサイズに基づいて)。
【００１９】
他の特徴および利点は次の記述および要求から明白である。
【００２０】
発明の詳細な説明
一般に、発明はチャネルおよび弁を含んでいるmicrofluidic装置を特色にする。発明の弁は移動式ダイヤフラムおよび基礎メンバーを含んでいる。可動装置のダイヤフラムの作動は部屋の作成か破壊をもたらすチャネルの微細構造の相対的な動きで起因する。1つの例では、微細構造は移動式ダイヤフラムでダイヤフラムの作動が平面の基礎メンバーに対して部屋を形作る微細構造で起因することそのような物気分にさせられる。代わりに、微細構造は平面の移動式ダイヤフラムの作動が移動式ダイヤフラムに対して部屋を形作る微細構造で起因する基礎メンバーで気分にさせることができる。また、微細構造はまた移動式ダイヤフラムおよび基礎メンバー両方で気分にさせられるかもしれない。
【００２１】
移動式ダイヤフラムおよび基礎メンバーの特定の幾何学的な整理は、但し例外としてはダイヤフラムの原因の作動作成か部屋の破壊要求されない。普通、ダイヤフラムおよび基盤のメンバーはの反対におよび互いへの平行気分にさせられる。但し、他の整理は可能である、例えば、移動式ダイヤフラムと基盤のメンバー間の角度は0 (含んだ)そして180の程度の間にである場合もある(含んだ)。1具体化では、発明はまたnonplanar、例えば、曲げられた、移動式ダイヤフラムか基盤のメンバー含んでいる。
【００２２】
部屋を形作るとき流動サンプルの少なくとも部分の道が強いられる容積を作成するために、微細構造は全体として基礎メンバーおよびチャネルによって機能する。部屋を作成するのに使用される微細構造の高さはより、と等しい、か以上(イチジク1)それらが接続されるチャネルの高さより少しである場合もある。発明の重要な特徴は弁が閉鎖しているとき、微細構造はかもしれない、または、基礎メンバーが付いているシールを形作るためにことかもしれなくない。例えば、部屋の内部と外側間の液体の道を除く、または液体が形作られる渡るようにする望ましいサイズの上の粒状物質を、例えば、かもしれない部屋は防ぐ部屋は形作られるかもしれない(例えば、0.1μmからまで1mm (10-7年に10-3m))、部屋を書き入れるか、または出ることから。2つの部屋の間で流れるように液体がしている間発明のこの具体化が、例えば細胞を引っ掛けるのに使用する、ことができる。
【００２３】
発明の微細構造はあらゆる形(例えば、円柱、円環形状、球形、長方形、台形かまたはpyramidal)の部屋を形作ることができる。部屋の壁の厚さは微細構造の厚さによって一部には断固とした、少なくとも、である。発明の弁の作動によって形作られる部屋は同心または互いに連続的である場合もある。
【００２４】
移動式ダイヤフラムの作動は望ましく気学的に達成される。普通、制御通信路は移動式ダイヤフラムに隣接して取付けられる。部屋が形作るチャネルのそれに関連する制御通信路の圧力を、高めるによりまたは減らすことは、ダイヤフラムは動く。多数の部屋の形成が異なった部屋の形成の制御部屋の結果の異なった圧力差動、すなわち1歩ずつ達成する、ことができる、または同時にかもしれないようにダイヤフラムおよび微細構造は設計されている。発明の移動式ダイヤフラムの作動がチャネルで部屋の1つ、2つ、3つ、4つ、10のまたはいくつもを作成するのに使用することができる。ダイヤフラムを作動させるための他の方法は芸術で知られている。例えば、ダイヤフラムはダイヤフラムを引き起こすことができる手動かコンピューター制御ピストンに基礎メンバーに関連して動くためにつながれるかもしれない。他の具体化では、ダイヤフラムは電場、magnetic field、熱、ライト、またはph.によって作動するかもしれない。
【００２５】
移動式ダイヤフラムのリバーシブルの作動が望まれるとき、エラストマーか別の方法で可鍛性材料は用いられる。例はシリコーンおよび他の重合体のエラストマーが含まれている。ある特定の具体化では、可鍛性金属か形状記憶合金はまた用いられるかもしれない。不可逆作動が望まれるとき、し、前の形に容易に戻らない材料は用いられるかもしれない。一般にmicrofluidics分野で知られているように微細構造および基礎メンバーはあらゆる適した材料で製造されるかもしれない。例はケイ素、ガラス、金属および他のポリマーが含まれている。エラストマーコーティングと材料の組合せは堅い材料また流動堅いシールを保障するために、例えば用いられる、かもしれない。用いられる材料はかもしれなくし、または、多孔性であるためにまたは選択式に透過性かもしれなくない。例えば、装置の微細構造か他の部品は液体、例えば、ガスか液体交換、または化学兵器交換をイオン、薬剤、等、例えば可能にする、かもしれない。試薬か他の材料はまた装置の微細構造、基礎メンバー、diaphgram、または他の部品と分解するか、中断されるか、塗られるか、または別の方法で関連付けられるかもしれない。そのような試薬は試金の間に部屋に、例えば、分泌するかもしれないまたは、緩衝pHに、部屋の液体の部品と、例えば吸収するか不用な副産物を、または付属品に提供するアンカー場所を反応させなさい。微細構造はまた例えば、部屋の内容を解放するために、後望ましい時間そのうちに崩壊したか、またはユーザーの介在の後やっと、例えば崩壊する材料から製造されるかもしれ、ガラス転移または分解の温度の上の温度を上げ、溶媒、または電気故障または電気化学の低下で分解する。
【００２６】
microfluidic装置を製造するための方法は芸術で知られている。用いられた厳密な方法は装置を製造するのに使用された材料に一部には左右される。典型的な技術は写真平版、ぬれたまたは乾燥した化学薬品のエッチング、電気鋳造法および鋳造物を含んでいる。模範的な製造技術はここに記述されている。 
【００２７】
1つの例として、発明は普通閉鎖した空気弁(Figs. 2Aおよび2C)を特色にする。この弁は薄膜の金属の層を使用してPDMSおよびガラスのシーリングの制御によって組み立てられる。最下の層への膜のシーリングを避けるための他のメカニズムは使用することができる。これらは底からの間隔に吸引を制御部屋に適用し、接着の後で取除くことができる溶ける材料のパターン接触に互いに入って来る、または反対のメンバー (例えば光硬化性樹脂、写真エポキシおよびゲル)への微細構造の接着を防ぐ他のどの取外し不可能な材料含んでいる表面の非活動化を使用して膜を変形させることによって微細構造を保持することを。対応する接触の地域(Figs. 2Bおよび2C)の膜の構造の底は(例えば、クロムか金)金属の薄い(50A)層ガラスから分かれているかもしれない。残りのPDMSはガラスおよび形態の慣習的なチャネルおよび部屋に結合する。発明の付加的な具体化では、移動式ダイヤフラムで気分にさせられる微細構造は基礎メンバー (Figs.第2および2E)に気分にさせられる微細構造を伴って使用することができる。
【００２８】
発明の装置は細胞、液体および他のanalytesの処理そして分析に使用するかもしれない。発明の弁は実験室破片の塗布のための懸濁液の細胞リバーシブルに液体の流れおよび粒子の変位を、例えば減結合する、かもしれない。移動式ダイヤフラムの微細構造の使用によって、発明は興味の粒子の位置の精密な制御、および液体および細胞の懸濁液の流れを制御するための新しい機能を特色にする。発明の模範的な装置は血の見本抽出、細胞の強化および順次細胞の刺激の適用のための装置を含んでいる。さらに、発明の装置は2つ以上の液体の管理された連絡が望まれる時はいつでも用いられるかもしれない。 
【００２９】
発明は設計の細目、非制限例、製造および使用について今記述される。
【００３０】
例1。基本的な装置
発明の1 embodiementはガラスの2層PDMS装置を、それ組み込むサンプル準備のタイプ適用(イチジク3A)のための中断された細胞の小さい人口を扱うためのmicrofluidicネットワークそして制御層を、例えば、特色にする。PDMSの2つの層は別のエラストマーを投げることによってphotopatternedエポキシ型を製造された。上は、制御層空気弁のためのいくつかのチャネルそして作動の部屋を含んでいた。最下のネットワーク層は細胞および液体の処理のための異なった幅そして高さのチャネルの回路部品を含んでいた。 制御およびネットワーク層は一緒に結ばれ、膜は上の制御層および最下のネットワーク層(イチジク3B)の作動の部屋の間で形作られた。2層の構造物はスライドガラスの上でそれから選択式に結ばれた。ダイヤフラムの微細構造はガラス基質(イチジク3C)への微細構造の付着を防ぐ薄膜の金属パターンに一直線に並んだ。同時に、装置の残りは無防備ガラスと不可逆的に結ばれた。最も簡単な構成では、ネットワーク層のチャネルのシステムの流量は膜の横の微細構造によって制御された。不活性位置では、横の構造は金属パターンで休み、出口チャネル(イチジク3D)から単一か多数の入口チャネルを分けた。作動に、横の構造は制御通信路に膜の上向きの変形によって持ち上がり、入口チャネルの同時開始を出口チャネル(イチジク3E)に許可する。膜の脱線は十分に大きくサイズの50μmまであらゆる目的の道を、粒子か細胞可能にするには、より大きい変位は制御通信路の厚さを高めることによって可能である。
【００３１】
光硬化性樹脂は形成する  
2つの別々の型は標準的な写真平版の技術を使用してシリコンの薄片で準備された。制御通信路のための型はマイラーのマスク(Finelineイメージ投射、コロラドスプリングス、CO)を通ってSU8エポキシの1つの50のμmの厚さの層を(Microlithography Corp.、ニュートン、MA)、photopatternedおよび製造業者の指定に従って処理されて使用した。流体のネットワーク層のための型は1つの層(30 μm)またはSU-8エポキシの2つの層を(3および30 μm)使用した。単一の層は制御層と同じ議定書を使用してシリコンの薄片でphotopatterned、あった。2つの層が用いられたときに、薄層は最初に処理され、次により厚い層は最初のものの上に同じような条件の下で一直線に並び、露出された。2つの層のためのマスク位置合わせの小さい間違いはマスクのそのような物設計によってより小さく、より大きい構造が延長容認されだった、部分的にできること重複。
【００３２】
スライドガラス(45 × 50の× 0.1ミリメートル;  、ピッツバーグはクロム(50 Aと科学、フィッシャー PA)放出させた; 槍のGoddardの仲間、養育関係都市、カリフォルニア)。 続いて、薄いメタル・フィルムは標準的なmicrofabricationの技術を使用して模造された。端に、スライドガラスはガラス罫書針を使用してより小さいスライドにさいの目に切られた。
【００３３】
装置アセンブリ  
多(ジメチルシロキサン) (PDMS、Sylgard 184; Dow Corning、Midland製造業者の指示に従って、MI)準備された。PDMSで補足のmicrochannelsを、4ミリメートルの厚い層作成するためにはおよび別に100のμmの層は制御およびネットワーク型に、それぞれ投げられた。ネットワーク層の厚さは40秒の500のrpmのネットワーク型の回転PDMSによって制御された。穴は削られた25測定針(NE251PL、小さい部品株式会社、miami湖、FL)を使用して制御層によって打たれた。 2つのPDMSの層は平行版血しょうアセル(3月株式会社、一致、カリフォルニア)の酸素血しょう-- (50 W、2% O2、25秒)にさらされ、接触および暖房(75の°C、5分)の後で結ばれた。穴を通って、ネットワーク層のための入口そして出口を定義して続いて同じ針のサイズを使用して打たれた。PDMSおよびスライドガラスの結合表面は酸素血しょうと扱われた。スライドのPDMSと薄膜の金属パターン間の精密な直線はstereomicroscope (Leica MZ8、Leica、Heerbrugg、スイス連邦共和国)の下で達成された。装置のアセンブリの後でガラスまたはポリマーの透明物を通して全チャネルの妨げる物がない概観を許可するために、金属パッチは金属のetchant解決を使用して任意に取除くことができる。スポイトからの蒸留水との広汎な洗浄はエッチングの解決の跡を取除き、細胞に対する毒作用を避けるために用いられた。
【００３４】
Tygonの管(TGY-010入口および出口の穴で、小さい部品)は挿入され、鈍いスポイトの針(NE301PL、小さい部品)を通して流動貯蔵所(ネットワークチャネル)または1 MLのスポイト(制御通信路)に接続された。制御通信路の圧力変更はスポイトのプランジャーの手動変位によって達成された。
【００３５】
細胞の準備
人間のmonocytic白血病の細胞(THP-1、アメリカのタイプ文化コレクション、Manassas、VA)は10%の胎児の牛のような血清(Invitrogen)、ピルボン酸塩1ミリメートルのとナトリウムの(シグマAldrich、St.Louis、MO)および50 nMのmercaptoethanol (シグマAldrich)補われたRPMI媒体(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア)で培養された。文化からの細胞は10´106細胞の集中への隣酸塩緩衝された解決(PBS、Invitrogen)で/ML遠心分離機にかけられ、再停止された。複数の希薄は元の懸濁液の因数へのPBSの付加によって範囲103から107の細胞/MLで準備された。毛管血は健康なボランティアの中指の皮を突き刺すこと、および装置の入口に置かれた10 μLまで容積の後で集められた。
【００３６】
例2。 細胞の懸濁液からの精密な容積の見本抽出
別の膜の4つの障壁は細胞の懸濁液(例えば全血)からの見本抽出の精密な容積のためのT-junctionのタイプ構造を実現するために結合された。2つの弁は、つながれる制御部屋縦の軸線(イチジク4A)に沿う細胞の懸濁液の流れを制御する。 第2組の弁は出口の見本抽出チャネル(イチジク4B)への横の軸線に沿う緩衝の流れによって正確にメーターで計られたサンプルの変位を可能にした。曲げられた障壁の形の弁の微細構造は、30nL容積が付いている円柱部屋の壁を定義した(イチジク4C)。全血の繰り返されたメーターで計ることは装置で互い違いに弁を作動させることによって達成された。メーターで計ることの精密は見本抽出の部屋のある細胞の不在によって後緩衝洗浄(イチジク4D)確認された。
【００３７】
使用はのクロマトグラフィーのT接続点のようにの設計の4つの弁の実施のためのダイヤフラムを、許可した血の30 nLの精密なメーターで計をmicrostructured。少数のnanolitersからの複数のマイクロリットルへの容積が付いている部屋は微細構造の位置を変えることまたは部屋の高さを変えることによって設計されていた。サンプルの後の部屋からのすべての血球の有効な取り外しのために、薬室容積の倍数と等しい血の容積はまた正確にメーターで計ることができる。これを、血および緩衝を制御する弁の反復的な達成するためには、代わりとなる開始そしてclosingは部屋に荷を積み、荷を下すのに使用することができる。
【００３８】
Microstructuredのふるいは支持の膜の作動によってすぐにでき、管理された細胞の装飾のために再生し、解放実行された。 新しい細胞の強化のプロシージャは3つの一桁の強化が容易に達成されたときに非常に低い元の細胞の集中のために非常に有効だった。さらに、装置は上澄みを取除いている間遠心分離が主要な細胞の損失のために効果がないときに状態効率的に非常に小さいサンプルを扱うことができる。そのような機能は試薬の付加によって細胞の懸濁液を薄くして非常に本当らしいとき最初の細胞の集中の再構成がより遅い分析のために重要なmicrofluidic装置に有用であり。例えば、buffyコートの等量の準備の間の血液サンプルの細胞の選択的な破壊は通常large-volumeで、低細胞の集中のサンプル(等Sethu、分析化学、2004年、76、6247-6253)起因する。それに続く細胞の分析の議定書はサンプル容積を減らし、細胞の集中を高めることから寄与する。さらに、破片の処理はより穏やか、遠心分離の間に機械圧力への露出によって興味の細胞に影響を与えてより少なく本当らしい(StibenzおよびBuhrer、Immunologyのスカンジナビアジャーナル、1994年、39、59-63; 等Alvarez、人間のReproduction、1993年、8、1087-1092年; KatkovおよびMazur、細胞生化学およびBiophysics、1999年、31、231-245)。新しい細胞の強化のプロシージャはまた血球の機械ろ過と対等なアプローチに分離されたティッシュからの細胞の分離および残骸(Singh、Cytometry、1998年、31、229-232)の取り外しのために、またはサイズに基づいて粒子の細胞を分けるために有用かもしれない(トナーおよびIrimia、生体医用工学の年次レビュー、2005年、7、77-103)。
【００３９】
例3。細胞の分離
複数の微細構造は細胞の動きそして流量の部分的な減結合のための同じ膜で結合された。同じ膜の異なった高さの2つの構造は細胞の懸濁液を集中するために明瞭な部屋(Figs. 5A、5Eおよび5F)に液体および細胞の分裂によって、使用された。機械的に細胞を妨げている間第1、漏れやすい障壁、3つの× 10のμmチャネルを通して休息位置で、液体の道だけ可能にした。第2下水管チャネルに、完全な障壁漏らされた液体を指示した。付加的のダイヤフラム弁を下水管チャネルの流れを独自に制御するのに使用されたmicrostructured (イチジク5B)。細胞の懸濁液は入口チャネルを通してもたらされ、細胞は漏れやすい障壁で引っ掛かった。最初の障壁の細胞の蓄積によって、流れは小さく漏れやすいチャネルの妨害のために、妨げられた。集められた細胞は出口チャネルに簡潔に持ち上がることによってそれから運ばれ、それからすぐに解放はダイヤフラムをmicrostructured。富ませた細胞の集りは出口チャネル(イチジク5C)におよびふるい再生し、より多くの細胞を捕獲するために用意する指示された。下水管チャネルに捕獲された細胞の無駄を避けるためには、排水栓はこのステップの間に閉鎖していた。このプロシージャによって、希薄な細胞の懸濁液の密度は複数の一桁によって出力チャネルで増加できる。1´103から1´107細胞まで/ML及ぶ集中の細胞の懸濁液は1´107細胞に/ML富んだ。集中の増加は希薄な細胞の懸濁液(イチジク5D)の場合にはより劇的、3つまでの一桁、だった。細胞の懸濁液の増加する集中によって、細胞の増加する数は第1間の30のμmスペースで引っ掛かり、第2障壁をmicrostructured、1´107細胞の上の細胞の懸濁液のための強化の収穫を/ML限る下水管チャネルに無駄になった。低い集中の懸濁液の、強化のための制限要因は懸濁液の液体を流出させ、最初の障壁で細胞の最大数を引っ掛けるために必要な時間だった。
【００４０】
例4。細胞の化学刺激
1個の細胞は化学薬品の速く一時的な順序--にさらされた。Aは2つの同心の構造が付いている膜を雇われた細胞(Figs. 6A-D)のまわりで解決の急速な交換を可能にした構成の細胞そして試薬を引っ掛けるためにmicrostructured。内部の微細構造が入口チャネルと同じ高さの間、外の1つは適度な圧力が制御通信路を通して応用だった、および下方に変形した膜にことができるときにだけより短く、最下ガラス触れる(イチジク6C)。2つの同心の構造は3つの明瞭なコンパートメントに膜の下で部屋を分けた。内部コンパートメント(S1)は細胞が元の懸濁液の液体の実験の初めに引っ掛かったコンパートメントだった。中間コンパートメント(S2)は内部コンパートメントのまわりでリングを形作り、順序の最初の解決で満ちていた。外コンパートメント(S3)は一時的な順序の第2解決で満ちていた。装置に荷を積むためには、膜は制御通信路の圧力の減少によって持ち上がり、細胞の懸濁液はもたらされた(イチジク6A)。1個の細胞は内部コンパートメント(S1)で制御部屋を出すことによって引っ掛かったそして穏か膜(イチジク6B)。続いて、中間および外コンパートメントを満たす最初の試薬は導入された。中間コンパートメントは膜を押下げることによってそして隔離され、2つの同心の構造(イチジク6C)の間で密封された。装置は第2試薬(イチジク6E)と外コンパートメントの詰物の後で完全に荷を積まれた。完全なシーリングは、順次混合する前に必要とされて限り便利に利用できたのためにだった膜(イチジク6D)を持ち上げることによって選択の時に堪能。図6F.の量を示された総蛍光性からのそのうちにコンパートメントの推定される解決の集中の変更は、示される。私達は内部コンパートメント(S1)の集中のために最初の減衰指数を、それ達した構成された膜の下でより大きい、限られたスペースの希薄に一貫した平衡のレベルに観察した。私達はまた最初の速い増加を、細胞のレベルで内部コンパートメントの最初の試薬(S2)のより遅い減少に先行しているおよそ30秒にわたって測定した。速い集中の増加は遅い腐食は拡散運転の混合のために代表的だったが、中間コンパートメントからの拡散そして対流の累積効果に一貫していた。私達は15秒外コンパートメント(S3)からの試薬の細胞のレベルで集中の増加で遅れる記録した。集中の増加はS2より遅く、しかしまだ速くだけ拡散によってより期待されて作動に続く少なくとも短い伝達性プロセスを提案する。システムのaxisymmetric構成は内部コンパートメントの真中の細胞が一時的な勾配--にだけさらされたこと、保証した細胞のまわりで空間的な勾配がない時。私達は見られ、持ち上がることが膜を均一条件からのより1%の偏差が露出の間に20のμmの直径の細胞の円周にフルオレスセインの解決との中間コンパートメントに荷を積んだ後microstructuredより少しに推定した。
【００４１】
化学刺激への細胞応答の調査は多くの生物学の調査のための基本的な重要性をもつ。 ピペットおよびペトリ皿を使用してマクロスコピック技術が生物学実験室でまだ広く利用されている間、そこにより精密な方法利用できる直通のmicrofluidicsのために興味を高めている。最も頻繁に、懸濁液の細胞を調査するとき、細胞は流れおよび機械障害(等荷車引き、分析化学、2003年、75、3581-3586を使用して引っ掛かる; 李および李、分析化学、2005年、77、4315-4322; 等ヤン、分析化学、2002年、74、3991-4001)、遠心分離(等李、破片の実験室、2004年、4、174-180)、dielectrophoresis (等Seger、破片の実験室、2004年、4、148-151; 等Voldman、生物物理学ジャーナル、2001年、80、531-541)、またはレーザ光線(等新井、電気泳動、2001年、22、283-288)、および伝達性の流れによって細胞に持って来られる溶ける刺激。代わりに、中断された細胞は流れの環境(等Irimia、分析化学、2004年、76、6137-6143)で含まれ、解決は短い間隔からの拡散によって細胞に持って来た。の同軸コンパートメントの使用は無比他のどの現在の技術によっても2つの性能達成されたアプローチをmicrostructured。円周に沿う細胞の均一刺激ははじめて可能であって、空間的な勾配がない時一時的な刺激への細胞の応答を調査するための役に立つツールになるかもしれない。その上に、順次刺激の精密で一時的な制御は単一の作動によって可能だった。刺激の一時的なプロフィールそして順序はリングコンパートメントのサイズの変更によって調節することができ、一度物理的な装置に組み込んだ障壁のサイズは洗練された装置がない時実験の再現性を保証できる。
【００４２】
私達が新しい概念をの示した上記の例でeukaryotic細胞の制御およびmicrofluidicチャネルのネットワークの流動変位のための膜をmicrostructured。高いアスペクトレシオのチャネルの細胞の位置そして変位は細胞のリバーシブルの減結合によって正確に制御することができ、を使用して液体動きは膜をmicrostructured。処理プロセス中、細胞は同じ焦点平面で維持され、顕微鏡検査を使用して容易な観察を可能にする。さらに、の1つの独特な特徴は膜をだった同時のための可能性の同じ膜の多数の特徴の統合microstructuredまたは複雑な作動を可能にする順次変位は制御の限られた数と計画する。
【００４３】
膜を許可した横断面のチャネルの制御をmicrostructured。2:1 (幅への高さ)の高いアスペクトレシオまたはより大きいSU8 photopatterningプロセスかアプリケーション使用要件によってだけ容易に、限られて達成できる。比較のために、他のPDMS弁はチャネル(等Unger、科学、2000年、288、113-116の円形にされた横断面に依存している; グローバー等、センサーそしてアクチュエーター B化学薬品、2003年、89、315-323; 等Studer、応用物理のジャーナル、2004年、95、393-398; 等Weibelは、分析化学、1:1に2005年、77、4726-4733)、およびそれらガラス基質(グローバー等、センサーそしてアクチュエーター B化学薬品、2003年、89、315-323)でエッチングされたとき1:10からのアスペクトレシオの制御通信路、陽性を使用して製造されたとき抵抗する退潮(等Unger、科学、2000年、288、113-116)に、できる。の側面作動を用いる弁は長方形の断面チャネルチャネルの部分的な閉鎖だけ可能だったが、示された(等Sundararajan、破片の実験室、2005年、5、350-354)。制御通信路の幾何学的な特徴の直接結果はmammalian細胞の懸濁液の容易な制御だった。 円形にされた横断面は処理の液体および小型の(少数のミクロンの)粒子のために(細菌のように)よく働く間、そのような大きい細胞がチャネルの全体の横断面を使用しないまたはより悪い、円形にされたチャネルの端の鋭角で引っ掛けられる10そして20 μm.間の平均のサイズを持っているeukaryotic細胞を扱うために適切でない。 
【００４４】
膜を作動圧力がない時チャネルを、だけバルブシートに対して押す膜の伸縮性によって密封できる3層PDMS弁(グローバー等、センサーそしてアクチュエーター共有された特徴B化学薬品、2003年、89、315-323によってmicrostructured; 等李、電気泳動、2005年、26、3758-3764; HosokawaおよびMaeda、MicromechanicsのジャーナルおよびMicroengineering、2000年、10、415-420)。対照的に、他のエラストマー機械弁のほとんどは薄い膜を通って圧力の適用に密封し、制御通信路の細胞の懸濁液のホメオスタティスの維持の挑戦をもたらすかもしれない。ガスは作動圧力(等Leclerc、人間工学の進歩、2004年、20、750-755)の下で膜を通っておよび細胞の懸濁液で拡散するか、または細胞を損なうことができる気泡を形作るために容易に拡散できる。この問題のための共通の解決が液体の制御通信路の詰物の間、最近の結果はPDMSがある一般的な液体に透過性(RandallおよびDoyle、米国の国家科学院の進行、2005年、102、10813-10818)である報告し、細胞のまわりで圧力作動の間に媒体のホメオスタティスの維持の心配を上げる。そのような潜在的な欠点はの真空の作動によってmicrostructured膜を避ける。PDMSの伸縮性のために膜の出版物を微細構造バルブシートに対してmicrostructured、弁を普通閉まった作動がない時保つ。弁が制御部屋の補足圧力なしで抗できる圧力は、少数のパスカルの範囲で、多分比較的低かったしかし細胞の懸濁液のドライブ非常に遅い動きと圧力と対等。
【００４５】
実用的な重要性をmicrostructuredエポキシの光硬化性樹脂(例えばSU8)にだけ基づいて柔らかい石版印刷の技術を使用して製造されるべき弁を可能にする単一製作プロシージャはもつ。但し、普通閉鎖した弁の製作は1つの重要な挑戦を提起した、選択式に2つの明瞭なPDMSの構造を密封し同時に弁を持っていることを避ける方法を即ちネットワーク層の結合の間に密封されるようになる。前の技術的な解決は模造されたPDMSの結合のために機械的に2つのガラス(グローバー等、センサーおよびアクチュエーター B化学薬品、2003年、89、315-323)、機械接着を伴う部分的な結合(等李、電気泳動、2005年、26、3758-3764)、または水溶性の抑制剤(Baek Micromechanicsの等、ジャーナルおよびMicroengineering、2005年、15、1015-1020年)間のPDMSの膜を締め金で止めることを使用した。私達のアプローチでは、結合の模造された制御はバルブシートの場所の金属の層の模造によって達成された。ガラスの金属の薄層はバルブシートにそして一直線に並び、ガラスに酸素血しょうへの露出の後でPDMSの結合を防ぐ。金属の層は十分に透明な装置に終って製作プロセスの終わりに結局エッチングできる。
【００４６】
単一製作プロシージャはこれらの装置の製作と関連付けられるコストの削減においてまた重要である。ある特定の実験のために装置が様々な解決ときれいにすることができ、適用で再使用されて間、人の血液かヒト細胞を含んで、安全問題はこれらの装置が単一の使用であるように要求する。それにもかかわらず、設計を異なった材料に翻訳した場合、単一製作プロシージャの実施がより安く、使い捨て可能な装置に終ってより少ない、最終的にchallangeingになる。
【００４７】
他の具体化
上記の指定で述べられるすべての出版物、パテントおよび特許出願は参照によってこれによって組み込まれる。発明の記述されていた方法そしてシステムの様々な修正そして変化は発明の規模そして精神から出発しないで芸術で巧みなそれらに明白である。発明は特定の具体化に関連して記述されていたが、要求されるとして発明がそのような特定の具体化に過度に限られるべきでないこと理解されるべきである。全く、芸術で巧みなそれらに明らかである発明を遂行するための記述されていたモードの様々な修正は発明の範囲内にあるように意図されている。
【００４８】
他の具体化は要求にある。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】移動式ダイヤフラムに気分にさせられる微細構造の高さが以上チャネルの高さどこにであるか図1は一組の弁に示す設計図である。
【図２】図2Aおよび2Bはaを使用して作用の細胞の換散の部屋の設計図microstructuredダイヤフラムをである。図2Cは一組の作用の換散の部屋の顕微鏡写真である。第2一組の移動式ダイヤフラムおよび基礎メンバー両方の微細構造の作用装置の設計図であることを計算しなさい。図2Eは移動式ダイヤフラムおよび基盤のメンバー両方の微細構造の作用装置の顕微鏡写真である。
【図３】図3Aは装置の製作を示す設計図である。図3Bおよび3Cは組み立てられた装置の側面および平面図を示す設計図である。図3Dおよび3Eはaのスキャンの電子顕微鏡からの顕微鏡写真microstructured多数の入口および1つの出口が付いている弁として作用するダイヤフラムをである。図3Dは閉鎖した位置で弁を示す。図3Eは開位置で弁を示す。
【図４】図4Aは組の細胞を隔離するのに使用される障壁を示す設計図である。図4B-4Dは装置の顕微鏡写真である。図4Cおよび4Dは全血の30 nLの処理を示す。
【図５】図5Aは2つの微細構造を結合するダイヤフラムの設計図である: 小さい漏出チャネルおよび完全な障壁が付いている障壁。図5Bおよび5Cは細胞の装飾を示す顕微鏡写真である。図5Dは細胞の強化を示すグラフである。図5Eはの次元の設計図が実験室破片装置の細胞のpre-concentrationのためのダイヤフラムをmicrostructured 3である。図5Fは一組の作用の細胞のコンセントレイターを示す設計図である。
【図６】図6A-6Dは次々に中央コンパートメントの媒体S1および中間コンパートメントの解決S2の細胞を引っ掛けるのに使用される異なった高さの円の隆起部分を示す設計図である。図6Eはの顕微鏡写真microstructured円の隆起部分が付いているダイヤフラムをである。図6Fは時間の機能として中心コンパートメントで相対的な集中の変更を示すグラフである。
【図１】
2009511021.tif 000002
【図２−１】
2009511021.tif 000003
【図２−２】
2009511021.tif 000004
【図３】
2009511021.tif 000005
【図４】
2009511021.tif 000006
【図５−１】
2009511021.tif 000007
【図５−２】
2009511021.tif 000008
【図６】
2009511021.tif 000009
【国際調査報告】
2009511021.tif 000010