(57)【要約】本発明は、感染した部位に存在する細菌の特定及びバクテリオファージを用いた感染部の治療に関する。ある実施例では、本発明が、細菌種と細菌特有アプタマーとの相互作用に基づいて感染部の少なくとも１の細菌種を特定し、特定した細菌種に感染する１又はそれ以上のバクテリオファージを選択し、感染を治療するための被検体に有効量のバクテリオファージを投与することによって、細菌感染を治療するための方法及び構成を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染部の細菌を検出するための方法であって、
（ａ）被検体の感染部位から検体を採取するステップと、
（ｂ）１又はそれ以上の細菌特有アプタマーに前記検体を接触させるステップと、
（ｃ）前記細菌特有アプタマーと前記検体に存在する細菌との間の相互作用を検出して前記感染部の細菌が検出されるステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、前記細菌特有アプタマーと前記細菌との相互作用に基づいて前記検体の中の少なくとも１の細菌種を特定するステップを具えている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、前記特定した細菌種に感染する１又はそれ以上のバクテリオファージを選択するステップと、
前記被検体に有効量の前記バクテリオファージを投与するステップと、
を具えていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記感染が、皮膚感染症、筋肉感染症、骨感染症、上部尿路感染症、下部尿路感染症、肺感染症、心臓血管感染症、中枢神経系感染症、眼の感染症、尿道感染症、生殖管感染症、又は血液感染症であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検体が、吸引、生検、スワブ、又は静脈穿刺で採取されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検体が、１種類から１０種類の間の異なる細菌特有アプタマーと接触することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検体が、１０種類から１００種類の間の異なる細菌特有アプタマーと接触することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌特有アプタマーを標識化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標識が、蛍光色素、量子ドット、又はカーボンナノチューブであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌特有アプタマーが、固相担体に固定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記固相担体が微小球であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌特有アプタマーと前記検体に存在する細菌との間の相互作用を検出するステップが、フローサイトメトリを具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌特有アプタマーと前記検体に存在する細菌との間の相互作用を検出するステップが、蛍光顕微鏡検査法を具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検体の中の１種類から３種類の間の異なる細菌種を特定することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記検体の中の３種類から１０種類の間の異なる細菌種を特定することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記検体の中で特定される前記１又はそれ以上の細菌種が、バシラス属、クロストリジウム属、シュードモナス属、キサントモナス属、ビブリオ属、バクテロイデス属、エシェリキア属、クレブシエラ属、サルモネラ属、シゲラ属、エルウィニア属、リケッチア属、クラミジア属、マイコプラズマ属、アクチノミセス属、ストレプトミセス属、マイコバクテリウム属、ミクロコッカス属、ブドウ球菌属、乳酸菌属、双球菌属、連鎖球菌属、及びボレリア属から成る群から選択される属であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
１種類から５種類の間の異なるバクテリオファージを選択することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
１又はそれ以上の前記バクテリオファージが、バシラス属、クロストリジウム属、シュードモナス属、キサントモナス属、ビブリオ属、バクテロイデス属、エシェリキア属、クレブシエラ属、サルモネラ属、シゲラ属、エルウィニア属、リケッチア属、クラミジア属、マイコプラズマ属、アクチノミセス属、ストレプトミセス属、マイコバクテリウム属、ミクロコッカス属、ブドウ球菌属、乳酸菌属、双球菌属、連鎖球菌属、又はボレリア属のうちの１又はそれ以上に対して特異的であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記バクテリオファージが前記感染部位に局所的に投与されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記バクテリオファージが注射によって投与されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記注射が感染部位の中への直接注射であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記注射が胸膜内注射又は静脈内注射であるであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、前記検体に存在する細菌の量を定量化するステップを具えていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
傷を治療するための方法であって、
（ａ）前記傷から組織又は流体検体を採取するステップと、
（ｂ）１又はそれ以上の細菌特有アプタマーに前記検体を接触させるステップと、
（ｃ）前記細菌特有アプタマーと前記検体に存在する細菌との間の相互作用を検出するステップと、
（ｄ）前記細菌特有アプタマーと前記細菌との相互作用に基づいて前記検体の中の少なくとも１の細菌種を特定するステップと、
（ｅ）前記特定した細菌種に感染する１又はそれ以上のバクテリオファージを選択するステップと、
（ｆ）前記傷に有効量の前記バクテリオファージを局所的に投与して前記傷を治療するステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記傷が外科創傷であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記傷が急性創傷であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記傷がやけどであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記傷が糖尿病性潰瘍又は床擦れであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織検体が創面切除によって採取されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記流体検体が前記傷の吸引、洗浄、又はスワブによって採取されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記バクテリオファージの前記局所的な投与が、前記傷に局所的な乳剤又は包帯剤を塗布するステップを具えていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記バクテリオファージの前記局所的な投与が、前記傷にエアロゾル又はスプレーを塗布するステップを具えていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記バクテリオファージの前記局所的な投与が、真空の点滴注入法を用いて前記傷に注入するステップを具えていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年６月１９に出願され、全体的な内容が参照として本書に盛り込まれている米国仮特許出願第６０／８１４，７２５号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、概して細菌感染の治療に関する。特に本出願は、感染部位に存在する細菌の特定及びバクテリオファージを用いた感染の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
細菌感染は、１又はそれ以上の細菌種による宿主生物の有害なコロニー形成である。このような感染は、一般に抗生物質及び／又は消毒薬で治療され、多くの場合どのような細菌が存在しているかを特定せず、あるケースでは細菌が全く存在していないことを確認しない。細菌の特定を試みる場合、微生物培養が一般に用いられる方法である。このような方法では、検体が病変の可能性のある組織又は流体から採取され、成長培地又は成長培地のパネルと接触させる。成長培地の上に形成される細菌群の大きさ、色、形状及び形式は、特異菌種に特有である。さらに、特定のタイプの成長培地の上において、成長、成長しない、又は特定の色を生成する細菌の能力を使用して、検体に存在する細菌を特定する。微生物の培養物を要する診断方法の問題点は、細菌を成長させるのに要する時間、及びマイコバクテリウム属といった特異菌を培養するのが難しいという事実を含んでいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
独立して又は細菌の培養と組み合わせて使用される他の機器は顕微鏡である。顕微鏡を使用して細菌種の形態に基づいて細菌種を特定する。さらに、生化学的染色法と組み合わせて顕微鏡を使用して、細菌を特定する。これらの染色技術は、ギムザ染色、グラム染色、及び抗酸菌染色法といった染料を用いる。また、生化学的染色法は、特異菌種に特有の抗体を用いる。
【０００５】
細菌感染の治療は、一般に、抗体の使用を含んでいる。特異菌種を処置する際に、特定の抗体がより効果的である。あるケースでは、感染部から培養された細菌が抗体のパネルに晒されて、その細菌が敏感な又は抵抗力のある抗生物質を決定する。しかしながら、これは数日を要する。細菌の特定に関する遅れを避けるために、細菌の具体的な特定をせずに、又は感染が細菌によるものであることさえも確認せずに、抗生物質による治療が多くの場合処方される。これは、感染を引き起こす細菌について不要な又は不適切な治療をもたらす可能性がある。また、抗生物質の不要な又は不適切な使用は、薬物抵抗性の細菌株の選択を促す。抗生物質による治療に関する他の障害は、いくつかの抗生物質が特定の患者に引き起こす拒絶反応を含んでおり、抗生物質耐性菌株が発生する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は感染部の細菌を検出するための方法を提供しており、（ａ）被検体の感染部位から検体を採取するステップと、（ｂ）１又はそれ以上の細菌特有アプタマーに検体を接触させるステップと、（ｃ）細菌特有アプタマーと検体に存在する細菌との間の相互作用を検出して感染部の細菌が検出されるステップと、を具える。本発明の特定の態様では、本方法がさらに、細菌特有アプタマーと細菌との相互作用に基づいて検体の中の少なくとも１の細菌種を特定するステップを具えている。本発明のある態様では、本方法がさらに、特定した細菌種に感染する１又はそれ以上のバクテリオファージを選択するステップと、被検体に有効量のバクテリオファージを投与するステップと、を具えている。
【０００７】
別の実施例では、本発明が、感染を治療するための方法を提供しており、（ａ）被検体の感染部位から検体を採取するステップと、（ｂ）１又はそれ以上の細菌特有アプタマーに検体を接触させるステップと、（ｃ）細菌特有アプタマーと検体に存在する細菌との間の相互作用を検出するステップと、（ｄ）細菌特有アプタマーと細菌との相互作用に基づいて検体の中の少なくとも１の細菌種を特定するステップと、（ｅ）特定した細菌種に感染する１又はそれ以上のバクテリオファージを選択するステップと、（ｆ）検体に有効量のバクテリオファージを局所的に投与して傷を治療するステップと、を具える。ある実施例では、本方法がさらに、検体に存在する細菌の量を定量化するステップを具えている。
【０００８】
別の実施例では、本発明が傷を治療し又は傷の回復を促進させるための方法を提供しており、（ａ）傷から組織又は流体検体を採取するステップと、（ｂ）１又はそれ以上の細菌特有アプタマーに検体を接触させるステップと、（ｃ）細菌特有アプタマーと検体に存在する細菌との間の相互作用を検出するステップと、（ｄ）細菌特有アプタマーと細菌との相互作用に基づいて検体の中の少なくとも１の細菌種を特定するステップと、（ｅ）特定した細菌種に感染する１又はそれ以上のバクテリオファージを選択するステップと、（ｆ）傷に有効量のバクテリオファージを局所的に投与して傷を治療し及び／又は傷の回復を促進するステップと、を具える。傷は、例えば、外科創傷、急性損傷によって引き起こされる傷といった急性創傷、やけど、糖尿病性潰瘍又は床擦れといった潰瘍である。
【０００９】
本方法及び本発明の構成を、例えば、皮膚感染症、軟部組織感染症、筋肉感染症、骨感染症、上部尿路感染症、下部尿路感染症、肺感染症、心臓血管感染症、中枢神経系感染症、眼の感染症、尿道感染症、生殖管感染症、洞感染症、又は血液感染症（すなわち、敗血症）を含む細菌感染の特定及び治療に使用してもよい。本発明によって治療すべき被検体は、ヒト、家畜（例えば、ウシ、ウマ、羊、及びブタ）、及び家庭用のペット（例えば、ネコ及びイヌ）といった哺乳動物を含む細菌感染を起こし易い生物であるがこれらに限定されない。
【００１０】
感染は、体外又は体内のいずれかで細菌が存在しているか否かの検査が行われる。本発明のある態様では、検体が感染部位又はその周囲から採取される。検体を採取するための方法は、感染の場所及び／又は感染した組織に応じて変わる。医師は、所定の被検体の状態に対してどのような方法が適しているかを判定し得る。例えば、検体を吸引、生検、スワブ（ｓｗａｂｂｉｎｇ）、静脈穿刺、脊椎穿刺、又は尿サンプルによって採取してよい。
【００１１】
多くの細菌種が、宿主生物の中で感染を引き起こし得る。宿主との相利又は片利共生関係で存在しているものと概略考えられている各細菌は、例えば、宿主の免疫系が損なわれた場合又は細菌が通常は無菌の宿主の臓器に接近する場合、感染を引き起こす可能性がある。負傷、潰瘍（例えば、糖尿病性潰瘍又は床擦れ）、又は外科手術を原因とする傷は、傷によって細菌が宿主に侵入し得る皮膚又は粘膜に欠陥が形成されるため、細菌感染の機会を与える。傷又は他の感染部から一般に回収される細菌種は、大腸菌、プロテウス属、クレブシエラ属、緑膿菌及び他の緑膿菌属、エンテロバクター属、化膿連鎖球菌及び他の化膿連鎖球菌属、バクテロイデス属、プレボテラ属、クロストリジウム属、黄色ブドウ球菌及び他のブドウ球菌属を含む。特に嫌気性細菌は、特に組織に血液があまり供給されない場合に腐敗組織及び深い傷で増殖する傾向にある。疾病を引き起こす嫌気性細菌は、クロストリジウム属、ペプトコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、バクテロイデス属、アクチノミセス属、プレボテラ属を含んでいる。宿主の臓器に感染する他の細菌の例は、バシラス属、キサントモナス属、ビブリオ属、サルモネラ属、赤痢菌、エルビニア菌属、リケッチア属、クラミジア属、マイコプラズマ属、アクチノミセス属、ストレプトミセス属、マイコバクテリウム属、ミクロコッカス属、乳酸菌、双球菌属、及びボレリア属を含んでいる。感染は１又は複数種の細菌を含んでいる。本発明のある態様では、感染の中の１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０種、又はその中で誘導できる範囲の異なる細菌種を特定する。
【００１２】
上記のように、細菌特有アプタマーを用いて検体の中に存在する細菌を検出して特定する。細菌特有アプタマーは、細菌の表面の接近可能なマーカーに特異的に結合するアプタマーであり、ある細菌株、細菌種、又は細菌群と別の細菌株、細菌種、又は細菌群とを区別する。細菌特有アプタマーが結合するマーカーは、例えば、特定の細菌株、細菌種、又は細菌群に特有のタンパク質又はモチーフである。ある実施例では、細菌特有アプタマーが、プロテアーゼ、毒素、又はペニシリナーゼといった薬物耐性タンパク質に結合する。一実施形態では、細菌特有アプタマーが、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌と特異的に結合する。例えば、接着剤としての役割を果たすテイコ酸（ｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）は、グラム陽性細菌内のみに存在する。従って、テイコ酸に特別に結合するアプタマーを使用してグラム陽性細菌を検出及び特定してもよい。さらなる実施例では、リポタンパク質がグラム陰性細菌内のみに存在する。このため、細菌性リポタンパク質に特別に結合するアプタマーを使用して、グラム陰性細菌を検出及び特定してもよい。本発明のある態様では、細菌特有アプタマーが、大腸菌、化膿連鎖球菌、ウェルシュ菌、又は黄色ブドウ球菌に特異的に結合する。本発明の特定の態様では、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３又はその中で誘導できる範囲の異なる細菌特有アプタマーを使用して、細菌を検出及び／又は特定する。様々な細菌特有アプタマーのパネルを使用することによって、複数の異なる細菌を同時に特定してもよい。
【００１３】
細菌の検出及び／又は特定を促進するために、細菌特有アプタマーを標識化してもよい。アプタマーを標識化するための様々な方法が知られている。例えば、アプタマーを、蛍光、発色団、ｒａｄｉｏｐｈｏｒｅ、酵素タグ、抗体、化学発光、電界発光、親和性標識、バイオセンサ、分子指標、量子ドット、又はカーボンナノチューブで標識化してもよい。蛍光の例は、以下のものを含むがこれらに限られない：すなわち、ｔｈｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、ＡＭＣＡ，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｃｙ２TM、Ｃｙ３TM、及びＣｙ５TM、を含むがこれらに限定されないＣｙＤｙｅｓTM、ＤＮＡ挿入染料、６−ＦＡＭTM、フルオレセイン、ＨＥＸTM、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｌｕｅTM、ＲＥＧ、フィコエリトリン及びアロフィコシアニンを含むがこれらに限定されないｐｈｙｃｏｂｉｌｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎTM、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄTM、ＲＯＸTM、ＴＡＭＲＡTM、ＴＥＴTM、テトラメチルローダミン、及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）である。
【００１４】
本発明のある実施例では、細菌特有アプタマーが、例えば、微小球、スライド、チップ（ｃｈｉｐ）、コラム（ｃｏｌｕｍｎ）、又はニトロセルロースといった固相担体に固定される。本発明のある態様では、微小球を標識化する。ある実施例では、第１の細菌特有アプタマーが固相に固定され、レポーター分子で標識化された結合されていない第２の細菌特有アプタマーの使用により細菌とアプタマーとの間の相互作用の視覚化を実現する。第１及び第２の細菌特有アプタマーは、同じ結合特性を有しても有していなくてもよい。
【００１５】
細菌に結合される細菌特有アプタマーの視覚化を、様々な方法によって行ってもよい。用いられる特別な方法は、使用される標識に部分的に依存する。本発明の特定の態様では、フローサイトメトリを使用して細菌特有アプタマーと細菌との間の相互作用を検出する。本発明の他の態様では、蛍光顕微鏡検査法を使用して細菌特有アプタマーと細菌との間の相互作用を検出する。
【００１６】
バクテリオファージによる治療を、感染部に存在する特定の細菌に特異的に調整してもよい。例えば、連鎖球菌、ブドウ球菌、及び大腸菌が存在する場合、大腸菌ファージ、連鎖球菌ファージ及びブドウ球菌ファージの混合物を感染部に適用してもよい。本発明のある態様では、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００種、又はその中で誘導できる範囲の異なるファージを被検体に投与してよい。異なるファージを同時又は連続的に投与してもよい。薬剤師又は臨床医は、ファージを部位の分離菌と結合させてもよく、個別治療が可能となる。バクテリオファージ又はバクテリオファージ混合物をいくつかの方法のうちの１によって局所的に適用してもよい。これらの方法は、局所的な乳剤又は包帯剤、液状製剤、胸膜内注射、点滴の適用、感染部位の中への直接的な注射、錠剤、座薬、洗浄、エアロゾル、及びスプレーを含んでいる。本発明のある態様では、バクテリオファージを傷といった感染領域の中に真空の点滴注入法を利用して注入してもよい。ある実施例では、抗生物質及び／又は消毒剤をバクテリオファージによる治療と組み合わせて使用してもよい。このような組み合わせた治療では、バクテリオファージ、抗生物質、及び／又は消毒剤を一緒に投与するか、又はそれらを異なる経路を介して及び／又は異なる時間で投与してもよい。
【００１７】
さらなる実施例では、本発明は、細菌感染の特定及び／又は治療に関して開示した方法とともに使用するためのキットに関わる。１又はそれ以上の細菌特有アプタマーを具える組成をキットに与えてもよい。このようなキットを使用して、いつでも使用できるよう保存容器に入った１又はそれ以上の細菌特有アプタマーを与えてもよい。本発明のある態様では、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００種、又はその中で誘導できる範囲の、異なる細菌特有アプタマーをキットに設ける。キットの容器は、少なくとも１の小瓶、試験管、フラスコ、ビン、注射器及び／又は他の容器を概略含んでおり、それらの中に少なくとも１の細菌特有アプタマーを入れ、及び／又は好適には適切に等分される。また、１又はそれ以上のバクテリオファージを具える調合物をキットに設けてもよい。このようなキットを使用して、いつでも使用可能な容器に保存された１又はそれ以上のこのようなバクテリオファージを提供する。本発明のある態様では、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００種又はその中で誘導できる範囲の、異なるファージをキットに設ける。キットの容器は、少なくとも１の小瓶、試験管、フラスコ、ビン、注射器及び／又は他の容器を概略含んでおり、それらの中に少なくとも１の細菌特有アプタマーを入れ、及び／又は好適には適切に等分される。本発明のキットは、細菌特有アプタマー、バクテリオファージ、又は委託販売のために厳重に管理された他の試薬容器を収容するための手段を有してもよい。このような容器は、中に所望の小瓶を入れるための射出成形及び／又は吹き込み成形されたプラスチック容器を有している。細菌特有アプタマー及びバクテリオファージを同じキットに一緒に詰めるか、又はそれらを別のキットに入れてもよい。また、このキットは標識化した分子及び固相担体といった追加の試薬を収容してもよい。
【００１８】
本書に記載の方法及び構成を本書に記載の他の方法又は構成に対して実施し得ると考えられる。
【００１９】
特許請求の範囲中で「又は」という用語を使用する場合、本開示は選択肢としての意味のみ及び「及び／又は」の意味のみに言及する定義をサポートするものであるが、選択肢としての意味のみに言及することが明示的に示されていない限り、又は選択肢としての意味が相互排他的でない限り、「及び／又は」を意味する。
【００２０】
本出願を通して「約」という用語を使用する場合、値がその値を判定するために使用される装置及び方法に関する誤差の標準偏差を含んでいることを示す。
【００２１】
長年にわたる特許法に従って、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という用語は、特許請求の範囲又は本明細書で「具える」という用語とともに使用する場合、特に指摘しない限り１又はそれ以上ということを意味する。
【００２２】
以下の詳細な説明から、本発明の他の目的、態様及び利点が明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明に関する当業者にとって本発明の精神及び範囲内で様々な変更及び修正が明らかであるため、詳細な説明及び特定の実施例は具体例としてのみ与えられることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
以下の図面は、本明細書の部分を形成しており、本発明の特定の態様のさらなる表示のために含まれる。本発明は、本書で与えられた特定の実施例の詳細な説明とともに、１又はそれ以上の図面を参照することによってさらに理解される。
【００２４】
【図１】図１は、微小球１０に固定された細菌特有アプタマー１１であって、細菌１２に結合する前（左上）及び細菌１２及び標識化した細菌特有アプタマー１３に結合した後（左下）の細菌特有アプタマー１１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ａ．細菌の検出
本発明は、細菌感染を検出及び治療するための方法及び構成を提供する。感染に関する細菌の初期の特定によって、感染を治療するための処置を特別に調整してもよい。全ての細菌が硬いペプチドグリカン細胞壁によって囲まれており、細胞壁の構成は様々な細菌の間で大きく変化する。このような差異は、本発明に従って様々な細菌種及び菌株を特定するための基準を与える。ペプチドグリカン層は、アミノ糖、すなわちβ−（１，４）−グリコシド結合によって結合されたＮ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルムラミン酸の鎖で形成されている。配列及び構造が細菌種の間で変化するアミノ酸鎖がアミノ糖に付着している。特定の実施例では、検出が細胞壁の表面に露出した成分を特別に認識するアプタマーを用いた細菌種の特定を含んでいる。
【００２６】
細菌特有アプタマーが標的となるマーカーの例は、プロテアーゼ、毒素、薬剤耐性タンパク質、テイコ酸、及びリポタンパク質を含んでいる。また、当業者はウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔｏｏｌｓ／で入手できる、ＢＬＡＳＴを用いた細菌の検出及び特定に適した様々なマーカーを選択できるであろう。
【００２７】
感染型細菌を特定するために、その細菌に特有の１又はそれ以上のタンパク質又はモチーフを特定する。ある実施例では、タンパク質又は細胞表面モチーフに特有のアプタマーを選択して細菌の特定のために使用できる。また、本発明の特定の態様では、検出が存在する各細菌種の定量化を含んでいる。上記の実施例に加えて、診断目的で視覚化する他の方法を使用してもよい。例えば、アプタマーに付けられた量子ドットの使用を通して体外での分析を行ってもよい。様々な大きさの量子ドットを特定のアプタマーの種類に結合させることができる。各大きさの量子ドットは、光エネルギによって励起されると、わずかに異なる波長の光として見える。このため、量子ドットの使用はまた多重診断分析を可能とする。診断を目的とする他の視覚化の方法は、抗体−フルオレセイン結合、及び他の抗体−染料又は蛍光性成分を有しているが、これらに限定されない。
【００２８】
Ｂ．アプタマー
上記のように、タンパク質又は細胞表面モチーフに特有のアプタマーを選択して細菌の特定に使用できる。アプタマーは、体内での選択の繰り返しラウンドを介して処理される核酸分子であり、例えば、タンパク質、核酸、細胞、組織、及び臓器を含む様々なターゲットに結合する。アプタマーの選択性及び結合能のため、アプタマーは診断薬として大きな可能性を有している。いくつかのケースでは、アプタマーが抗体といった他の分子よりも良好な診断薬であることが分かっている。アプタマーを用いるさらなる利点は、大量生産により動物細胞又は培養細胞のいずれも要しないことである。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）又はオリゴヌクレオチド合成によってアプタマーの合成を行ってもよく、得られたアプタマーは室温で安定しており、長い保存期限を有する。
【００２９】
アプタマーの開発は、一般に、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）又はＳＥＬＥＸプロセスの変形によって行われる。ＳＥＬＥＸプロセスは、Ｔｕｒｅｋ及びＧｏｌｄによって１９９０年の米国特許番号第５，２７０，１６３号及び第５，４７５，０９６号に記載されており、参照することにより本書に盛り込まれている。また、ｐｈｏｔｏ−ＳＥＬＥＸ，ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ，ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ，ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＳＥＬＥＸ，ｂｌｅｎｄｅｄ−ＳＥＬＥＸ，及びａｕｔｏｍａｔｅｄ−ＳＥＬＥＸといった、ＳＥＬＥＸプロセスの変形が報告されている。ＳＥＬＥＸによって、オリゴヌクレオチドの大きな個体群が関心のあるターゲット（例えば、細菌細胞又は細菌細胞の表面から孤立したタンパク質）と相互作用し得る。ターゲットに結合した分子（サクセスフルと呼ばれる）は、いくつかの方法のうちの１つによって、結合しない分子と分けられる。例えば、ターゲットに結合したアプタマーを、ニトロセルロースへの結合、親和性クロマトグラフィー等によって個体群から離してもよい。そして、結合したアプタマーをＰＣＲで増幅させてもよい。
【００３０】
治療の目的でアプタマーの使用を促進するために、視覚化のためアプタマーをある形式のラベルに結合する。このような目的のために、蛍光試薬、発色団、ｒａｄｉｏｐｈｏｒｅ、酵素タグ、抗体、化学発光、電界発光、親和性標識、バイオセンサ、又は分子指標といった、多くの様々なラベルを使用する。視覚化の方法は、細菌の検出が体内又は体外で行われるか否かに応じて異なっている。ある実施例では、アプタマーを、赤色光で励起した場合に近赤外域で蛍光を発し得るカーボンナノチューブに結合させる。単層カーボンナノチューブの外面を機能的にすることで、特定の生体分子が吸収される場合に放射を調節することができる。ある実施例では、染料又は蛍光試薬をアプタマーに組み込むか、又はアプタマーが二重層の外側に結合された状態で脂質二重層に封入する。また、ある態様では、消光分子をアプタマーに組み込むか、アプタマーが二重層の外側に結合された状態で脂質二重層に封入する。特異菌への標識化したアプタマーの結合が、視覚化を可能とし得る。
【００３１】
ある方法が微小球の多重化を含んでいる。Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ又はＢｉｏ−Ｒａｄといったものから入手できる微小球を特定のアプタマーに結合してもよい。各タイプの細菌特有アプタマーは、わずかに異なる蛍光特性を有するビーズに結合される。そして、ビーズ／アプタマーの混合体を感染が疑わしい検体とともに培養する。細菌はそれらの特定のアプタマーに結合する。例えば、ビオチニル化アプタマーを具えた別の培養がストレプトアビジン培養に続く視覚化を可能とする。ビーズはデュアル・レーザ、血球計算器（すなわち、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で「読まれる」。分類レーザがビーズ−アプタマーのタイプ（例えば、ブドウ球菌アプタマー）の分類を可能とする。ストレプトアビジン・シグナルの強度を読み込むことで、レポーターレーザが存在する細菌の分類を可能にする。このような方法により、１００個又はそれ以上の細菌を１回の分析で特定及び定量化する。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術は、例えば、米国特許第５，７３６，３３０号，第５，９８１，１８０号，及び第６，０５７，１０７号に記載されており、それらの全てが参照することにより具体的に盛り込まれている。
【００３２】
Ｃ．タンパク質技術
ある実施例では、本発明が細菌からタンパク質を分離する方法を用いる。そして、特異菌種又は菌株に特有の分離したタンパク質をＳＥＬＥＸといった方法で使用して、タンパク質に特異的に結合したアプタマーを構成する。タンパク質を分離する方法は、当業者に良く知られており、様々な種類のクロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、連続抽出、及び高速液体クロマトグラフィー）を含むがこれらに限定されない。
【００３３】
ある実施例では、本発明が２次元のゲル電気泳動法を用いて、生体試料からタンパク質を分離してタンパク質のスポットの２次元配列に入れる。２次元の電気泳動法は、分子の複雑な混合体を分離するのに有用な方法であり、多くの場合１次元の分離で得られる場合よりも非常に高い分解能を与える。２次元のゲル電気泳動法を当技術分野で既知の方法を用いて実行できる（例えば、米国特許番号第５，５３４，１２１号及び第６，３９８，９３３号を参照）。一般に、検体の中のタンパク質は、まず等電点電気泳動法によって分離され、その際に検体の中のタンパク質がｐＨ勾配の中で分離されて、タンパク質がそお正味の電荷がゼロになる点（すなわち、等電点）に達する。このような初めの分離段階により、タンパク質の１次元配列をもたらす。タンパク質の１次元配列は、さらに、第１の分離段階で使用される方法と概略異なる方法を用いて分離される。例えば第２の局面で、タンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、さらに分離される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質の分子量に基づいたさらなる分離を可能とする。
【００３４】
２次元配列のタンパク質を当技術分野で既知の適切な方法を用いて検出できる。比色染料（例えば、クマシー）、銀染色法、又は蛍光染色法（ルビー色；ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ）でタンパク質の染色を実施できる。当業者に知られているように、生じたスポット又はタンパク質パターンはさらに分析される。例えば、タンパク質をゲルから取り除いて質量分析法で分析する。代替的に、電場をかけることによって不活性膜にタンパク質を移動させることができ、マーカーの分子量とほぼ一致する膜の上のスポットを質量分析法で分析できる。
【００３５】
ある実施例では、本発明は、質量分析法を採用する。質量分析法は、真空内で分子をイオン化してそれらを蒸発させて「飛ばす」ことによって、個別の分子の「重さのある」平均値を与える。電場及び磁場の双方の影響下では、イオンは個々の質量（ｍ）及び電荷（ｚ）に応じて軌跡を描く。電極によって検出されるまでのイオンの「飛行時間」は、イオンの質量−電荷（ｍ／ｚ）比の測定値である。質量分析法（ＭＳ）は、その顕著な選択性及び感受性のため、薬剤、代謝産物、ペプチド及びタンパク質を含む広範囲の生物分析の定量化のための強力な手段となり得る。
【００３６】
マトリクス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）は、質量分析法の一種であり、測定物質がレーザ脱離の前にマトリクスの中に配置される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、ペプチド、タンパク質及び大部分の他の生体分子（オリゴヌクレオチド、炭水化物、天然物、及び脂質）のための広く知られた分析機器となっている。２Dゲル電気泳動法と組み合わせると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、ペプチド質量のフィンガープリンティング又はマイクロシークエンシングによって、タンパク質のスポットの特定に特に適している。
【００３７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析では、分析はまずマトリクス化合物で共結晶化され、その後の測定物質−マトリクス混合体のパルスＵＶレーザ照射により、測定物質を担持するマトリクスが蒸発する。このように、レーザの光エネルギを強力に吸収して間接的に測定物質を蒸発させることによって、マトリクスが鍵穴の役割を果たす。また、マトリクスは、プロトン供与体又は受容体として機能して、陽イオン及び陰イオンの双方のイオン化モードで測定物質をイオン化するように働く。タンパク質は、多くの場合、その構成要素である（検体の化学的又は酵素処理によって生成される）ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって特定し得る。
【００３８】
別のタイプの質量分析法は、表面増強レーザ脱離イオン化質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの変形であるＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって、タンパク質全体を分析できる。ＳＥＬＤＩ−  ＴＯＦ  ＭＳでは、タンパク質の親和特性に基づく分別を使用して検体の複雑さを低減する。例えば、疎水性、親水性、陰イオン交換、陽イオン交換、及び固定化金属アフィニティー表面を使用して、検体を分別できる。そして、表面に選択的に結合されるタンパク質をレーザで照射する。レーザは付着したタンパク質を脱離し、それらをイオンとして放出させる。タンパク質の分析におけるＳＥＬＤＩ−  ＴＯＦ  ＭＳ法は、商業的に実施されている（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）。
【００３９】
タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、当技術分野で知られた別のタイプの質量分析法である。ＭＳ／ＭＳ分析では第１のステージ分析器でｍ／ｚ値に従って分離したイオンが、フラグメンテーションのために選択され、その後で断片が第２の分析器で分析される。当業者は、ＱＴＯＦ、イオントラップ、及びＦＴＭＳ／ＭＳを含むＭＳ／ＭＳを用いたタンパク質の分析に精通しているであろう。また、電気スプレー又はナノスプレーインターフェイス又はＭＡＬＤＩインターフェイスを介した液体クロマトグラフィーとともに、ＬＣＭＳ／ＭＳ、ＬＣＬＣＭＳ／ＭＳ、又はＣＥＭＳ／ＭＳといったＭＳ／ＭＳを使用することができる。
【００４０】
上記の方法に加え、当技術分野で知られた他のタンパク質の分離又は分析方法を本発明の実施に使用してもよい。タンパク質の分離及び分析の方法を単独又は組み合わせて使用してもよい。
【００４１】
ある実施例では本発明は２次元ゲル電気泳動法を用いてタンパク質をタンパク質のスポットの２次元配列に分離する。２次元電気泳動法は、分子の複雑な混合物の分離に関して有用な方法であり、多くの場合１次元の分離で得られる場合よりも非常に高い分解能を得る。２次元ゲル電気泳動法を当技術分野で知られた方法を用いて実施できる（例えば、米国特許番号第５，５３４，１２１号及び第６，３９８，９３３号参照）。一般に、検体の中のタンパク質は、まず等電点電気泳動法によって分離され、その際に検体の中のタンパク質がｐＨ勾配で分離されて正味の電荷がゼロであるスポット（すなわち、等電点）に達する。第１の分離段階により、１次元のタンパク質配列を得る。さらに、１次元配列におけるタンパク質が、第１の分離段階で使用されるのと概略異なる方法を用いて分離される。例えば、第２の段階では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってタンパク質がさらに分離される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質の分子量に基づいたさらなる分離を可能とする。
【００４２】
２次元配列のタンパク質を当技術分野で既知の適切な方法を用いて検出できる。比色染料（例えば、クマシー）、銀染色法、又は蛍光染色法（ルビー色；ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ）でタンパク質の染色を実施できる。当業者に知られているように、生じたスポット又はタンパク質パターンはさらに分析される。例えば、タンパク質をゲルから取り除いて質量分析法で分析する。代替的に、電場をかけることによって不活性膜にタンパク質を移動させることができ、マーカーの分子量とほぼ一致する膜の上のスポットを質量分析法で分析できる。
【００４３】
ある実施例では、本発明は、質量分析法を採用する。質量分析法は、真空内で分子をイオン化してそれらを蒸発させて「飛ばす」ことによって、個別の分子の「重さのある」平均値を与える。電場及び磁場の双方の影響下では、イオンは個々の質量（ｍ）及び電荷（ｚ）に応じて軌跡を描く。電極によって検出されるまでのイオンの「飛行時間」は、イオンの質量−電荷（ｍ／ｚ）比の測定値である。質量分析法（ＭＳ）は、その顕著な選択性及び感受性のため、薬剤、代謝産物、ペプチド及びタンパク質を含む広範囲の生物分析の定量化のための強力な手段となり得る。ＭＳの改良型が開発されており、タンパク質の分離及び特定で使用されている。例えば、これらは、マトリクス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、表面増強レーザ脱離イオン化質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）及びタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を含んでいる。
【００４４】
上記の方法に加え、当技術分野で知られた他のタンパク質の分離又は分析方法を本発明の実施に使用してもよい。タンパク質の分離及び分析の方法を単独又は組み合わせて使用してもよい。クロマトグラフィーを使用して有機化合物の電荷、大きさ、形状、及び溶解度に基づいて有機化合物を分離する。クロマトグラフィーは、移動相（分離すべき溶媒及び分子）及び移動相が通過する紙（ろ紙クロマトグラフィー）又はガラスビーズ、樹脂（カラムクロマトグラフィー）でできた固定相から成る。分子は、その親和力のため様々な速度で固定相を通過する。本発明で使用されるクロマトグラフィーのタイプは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）であるがこれらに限定されない。使用される他の種類のクロマトグラフィーは、吸収、分離、親和、ゲルろ過、及び分子篩を含んでおり、それらを使用するための多くの特別な方法がカラム、紙、薄膜、及びガスクロマトグラフィー含んでいる（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，１９８２）。
【００４５】
Ｄ．バクテリオファージによる治療
細菌が特定されると、バクテリオファージによる治療が開始する。存在する細菌の初めの特定により、感染部に対する治療が特別に調整される。例えば、連鎖球菌、ブドウ球菌、及び大腸菌が存在する場合、大腸菌ファージ、連鎖球菌ファージ、ブドウ球菌ファージの混合物が感染部に適用される。薬剤師又は臨床医は、部位のファージの分離株を組み合わせて個別治療を行うことができる。バクテリオファージ又はバクテリオファージの混合物をいくつかの方法のうちの１つによって局所的に適用してもよい。これらの方法は、局所的な乳剤又は手当用品、液剤、胸膜内注射、点滴の適用、錠剤及びエアロゾルを含んでいる。これらの方法の大部分は、既に試験されている。実質的には、重篤な合併症がバクテリオファージによる治療と関連すると報告されていない。バクテリオファージの送出に関する上記の方法に加え、バクテリオファージが真空の点滴注入法を介して創傷部といった感染領域の中に注入される。これはＶ．Ａ．Ｃ．（登録商標）Ｉｎｓｔｉｌｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍといった機器の使用を伴う。ある実施例では、抗生物質及び／又は消毒剤をバクテリオファージによる治療と組み合わせて使用する。このような組み合わせた治療では、バクテリオファージ、抗生物質、及び／又は消毒剤を一緒に投与するか又はそれらを異なる経路及び／又は異なる時間を介して投与してもよい。
【００４６】
バクテリオファージは、細菌に感染し得るウイルスである。ファージは、標的とする細菌の表面の特定の分子に概略結合する。ウイルスのＤＮＡが、複製が行われる宿主細菌の中に注入される。バクテリオファージは、溶菌又は溶原性として一般に分離される。一般に溶菌のバクテリオファージのみが、治療目的に有用である。溶菌ファージを使用ずる場合、細菌代謝の破壊を確実に行うことで細菌が溶解する。動物実験が、細菌感染を治療する際にファージによる治療が抗生物質による治療よりも優れていることを示している。例えば、抗生物質は多くの場合、有害な細菌及び有益な細菌の双方を殺すが、ファージは感染した細菌のみを殺すよう特定できる。バクテリオファージは細菌の中で自己複製して、感染部の中に深く浸透して細菌を破壊する。さらに、バクテリオファージは存在するために特異菌を要するため自己限定をも行い、細菌が存在しない場合には迅速に消滅する。また、バクテリオファージの製剤は非常に安定しており、培地の中に容易に分散する。またそれらは、低コストで生産され長期間保存される。
【００４７】
Ｅ．医薬品
１．製剤
被検体に投与するためのバクテリオファージの医薬品が本発明によって考えられる。当業者は、被検体にバクテリオファージを投与するための技術について良く理解しているであろう。さらに当業者は、被検体への投与の前にこれらのバクテリオファージの調整に必要な技術及び試薬について良く理解しているであろう。
【００４８】
本発明のある実施例では、医薬品はバクテリオファージを含む含水調合物である。本発明の含水調合物は、薬学的に許容できる担体又は水性溶媒の中の有効量のバクテリオファージの溶液を具えている。本書に使用する「医薬品」又は「医薬調合物」は、溶媒、分散媒、コーテイング、抗菌及び抗真菌薬、アイソトニック及び遅延吸収薬剤のいずれか又は全てを含んでいる。医薬品有効成分に関するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で良く知られている。バクテリオファージが従来の媒体又は薬剤と不適合である場合を除いて、治療用の調合物の使用が考えられる。また、補助的な有効成分をこの調合物に盛り込むことができる。人間への投与では、製剤は米国食品医薬品局によって要求される無菌状態、発熱性、一般的安全性及び純度の基準に合致しなければならない。
【００４９】
投与する場合に、投与処方に適合する方法で治療上有効な量の溶液が投与される。抗生物質による治療といった、被検体の治療規格の一部である他の薬剤とともにバクテリオファージを投与してもよい。
【００５０】
２．投与
本発明は、細菌感染の治療に関するバクテリオファージの投与を考慮する。当業者は、本開示を考慮して、投与すべきバクテリオファージの数及び投与の頻度を判断できるであろう。また、投与すべき量は、処置及び投与の数に比例しており、治療すべき被検体、被検体の状態、感染部の場所、感染部に存在する細菌の量、及び／又は感染部位に送られる血液の量に応じたものである。また、治療用の調合物の正確な量は施術者の判断によって決まり、個人に特有なものである。投与の頻度は、施術者の判断に応じて２乃至６時間から、６乃至１０時間、１乃至２日、１乃至４週間又はさらに長い期間に及ぶ。
【００５１】
ある実施例では、被検体に連続的にバクテリオファージの製剤を与えるのが望ましい。（傷といった）関心のある領域の連続的なかん流が好ましい。かん流の周期は、特定の患者及び状況に関して医師によって選択されるが、時間は約１乃至２時間から、２乃至６時間、約６乃至１０時間、約１０乃至２４時間、約１乃至２日、約１乃至２週間又はさらに長い期間に及ぶ。連続的なかん流を介したバクテリオファージの投与は、１回分が投与される周期によって調整され、１回又は複数回の投与によって与えられるものに相当する。
【００５２】
バクテリオファージによる治療と感染部の治療に使用される他の抗菌剤又は方法とを組み合わせるのが望ましい。このような抗菌剤は、抗生物質又は防腐剤である。また、感染部位の清拭をバクテリオファージによる治療と組み合わせて行ってもよい。組み合わせた治療は、バクテリオファージ及び追加の抗菌剤の双方を含む１つの調合物又は医薬品を被検体に投与するか、又は一方の調合物がバクテリオファージを含み他方の調合物が追加の抗菌剤を含んでいる、２つの異なる調合物又は製剤を被検体に投与することによって実現する。２又はそれ以上の異なる調合物又は製剤が被検体に投与される場合、バクテリオファージによる治療は数分から数週間に及ぶ間隔で他の治療の前又は後に来る。また、異なる調合物又は製剤が、同時に又は間隔を置いて異なる投与の経路を介して投与されることが考えられる。例えば、調合物を含む抗生物質を経口投与する一方で、調合物を含むバクテリオファージを局所的に投与してもよい。
【００５３】
本書で開示され請求の範囲に記載した調合物及び方法の全てを、本開示を考慮に入れて必要以上の実験なしに構成及び実行できる。本発明の調合物及び方法を好適な実施例に関して説明する一方、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなしに、本書に記載の調合物及び方法及び方法のステップ又はステップの手順の様々な変更を適用してもよいことは、当業者にとって明らかである。さらに、同一又は類似する結果を得ながら本書に記載の薬剤を化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤に換えてもよいことに留意されたい。このような当業者に明らかな似たような置換及び変更全ては、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると考えられる。
【００５４】
参考文献
以下の参考文献が、本書の説明を補助する典型的な手続に関する又は他の詳細を与える限りにおいて、参照することにより本書に明確に盛り込まれている。
米国特許番号第５，２７０，１６３号
米国特許番号第５，４７５，０９６号
米国特許番号第５，５３４，１２１号
米国特許番号第５，７３６，３３０号
米国特許番号第５，９８１，１８０号
米国特許番号第６，０５７，１０７号
米国特許番号第６，３９８，９３３号
Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｉｎ：「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第二版Ｗｍ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ，１９８２
Ｔｕｒｅｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５−５１０，１９９０
【図１】
2009541746.tif 000002
【国際調査報告】
2009541746.tif 000003
2009541746.tif 000004