(57)【要約】本発明は、ポリマー内にアミノ酸を含有する、ポリエステルアミド（ＰＥＡ）、ポリエステルウレタン（ＰＥＵＲ）およびポリエステル尿素（ＰＥＵ）ポリマーなどのポリマーに基づいた、例えば結晶形態である高分子生物製剤の送達のための、生分解性のポリマー粒子送達組成物を提供する。該ポリマー粒子送達組成物は、粒子内に分散した、例えばインシュリンなどの高分子生物製剤を含む、結合した水分子を含むポリマー粒子の液体分散または凍結乾燥粉末のいずれかとして処方することが可能である。薬物、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの生物活性剤も、局所、経口、粘膜または循環送達用の大きさの粒子を使用して送達することが可能である。また、実質的に本来の活性を有する高分子生物製剤を、例えば経口で対象に送達する方法も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子生物製剤の少なくとも１つの部位を介して生分解性ポリマーに結合する少なくとも１つの高分子生物製剤を含み、それによって前記高分子生物製剤の本来の活性を維持する、ポリマー粒子送達組成物であって、前記ポリマーが以下の少なくとも１つまたは混合物を含む、ポリマー粒子送達組成物：
構造式（Ｉ）によって表される化学式を有するポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）であって、
2009518289.tif 000038
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ１がα，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレンおよび(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレンの残基から独立して選択され、個々のｎモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、かつＲ４が(Ｃ２−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオール残基、または構造式（ＩＩ）
2009518289.tif 000039
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントおよびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択される、ポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）；
または、構造式（ＩＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＡポリマーであって、
2009518289.tif 000040
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０.１から０．９の範囲であり、ｐが約０．９から０．１の範囲であり、Ｒ１がα，ω−ビス(ｏ、ｍ、またはｐ−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンの残基から独立して選択され、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が(Ｃ２−Ｃ２０)アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオール残基、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択され、Ｒ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＡポリマー；
または、構造式（ＩＶ）によって表される化学式を有する（エステルウレタン）（ＰＥＵＲ）であって、
2009518289.tif 000041
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ３が水素、(Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療ジオール残基および構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントから成る群から選択され、Ｒ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、飽和または不飽和治療ジオールの残基、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、（エステルウレタン）（ＰＥＵＲ）；
または、一般構造式（Ｖ）によって表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマーであって、
2009518289.tif 000042
式中、ｎが、約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０．１から約０．９の範囲であり、ｐが約０．９から約０．１の範囲であり、Ｒ２が水素、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは保護基から独立して選択され、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および-(ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療ジオールの残基および構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントから成る群から選択され、Ｒ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、飽和または不飽和治療ジオールの残基の有効量、およびこれらの組み合わせから独立して選択され、かつＲ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵＲポリマー；
または、一般構造式（ＶＩ）で表される化学式を有するポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）であって、
2009518289.tif 000043
式中、ｎが約１０から約１５０であり、個々のｎモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオールの残基の有効量、または構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）；
または、構造式（ＶＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＵであって、
2009518289.tif 000044
式中、ｍが約０．１から約１．０であり、ｐが約０．９から約０．１であり、ｎが約１０から約１５０であり、Ｒ２が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルもしくは（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、または保護基であり、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオールの残基、または構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択され、かつＲ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵ。
【請求項２】
高分子生物製剤がタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
高分子生物製剤のうちの少なくとも１つが、その２つ以上の部位を介してポリマーに架橋するようにポリマーに結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
高分子生物製剤がオリゴマーの形態である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
オリゴマーがインシュリンオリゴマーである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
インシュリンオリゴマーがインシュリンプロトマーの六重項である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
高分子生物製剤がタンパク質の結晶または凝集体の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
タンパク質の結晶または凝集体が、カルシウムまたは遷移金属の少なくとも１つの原子をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
タンパク質の凝集体がインシュリンオリゴマーの結晶である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記インシュリンオリゴマーの結晶が、少なくとも１つの亜鉛原子をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
経口送達のために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が送達される予定の対象の種にとって自然であるポリマー内にマトリックス化された少なくとも１つの胆汁酸塩をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記対象の種がヒトであり、胆汁酸塩がコール酸を基本とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記オリゴマーが治療用タンパク質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１５】
前記結晶または凝集体が治療用タンパク質である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリマーが構造式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるＰＥＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つのＲ１がα,ω-ビス(ｏ,ｍ, または ｐ-カルボキシフェノキシ）（Ｃ１-Ｃ８）アルカン、３,３’-（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、もしくは４, ４’（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基であり、または少なくとも１つのＲ４が構造式（ＩＩ）の１, ４:３, ６-ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つのＲ１が、α，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、もしくは４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基、またはこれらの混合物であり、かつ少なくとも１つのＲ４が構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントであり、かつＲ７が−（ＣＨ２）４−である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリマーが構造式（Ｖ）または（ＶＩ）で表されるＰＥＵＲである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つのＲ１がα,ω-ビス(４-カルボキシフェノキシ）（Ｃ１-Ｃ８）アルカン、３,３’-（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、もしくは４, ４’-（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基であり、または少なくとも１つのＲ４が構造式（ＩＩ）の１, ４: ３, ６-ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つのＲ１がα，ω−ビス（４−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、もしくは４，４’（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基、またはこれらの混合物であり、かつ少なくとも１つのＲ４が、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントであり、かつＲ７が、−（ＣＨ２）４−である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリマーが構造式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）により表されるＰＥＵである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つのＲ１が構造式（ＩＩ）の１, ４: ３, ６-ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントであり、かつＲ７が-(ＣＨ２)４-である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ポリマー粒子の液体分散形態での投与のために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ポリマーが少なくとも１つの親水性側鎖官能基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記側鎖官能基が−ＣＯＯＨである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトール（ＩＩ）がＤ−グルシトール、Ｄ−マンニトールまたはＬ−イジトールに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
インビボで投与された場合に持続放出型のポリマーデポを形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
約２４時間から約９０日の期間にわたって生分解する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
平均直径が約１０ナノメートルから約１０００ミクロンの範囲である粒子の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ポリマー内に分散した少なくとも１つの生物活性剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの生物活性剤が、前記粒子の外側で前記ポリマーに結合される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記生物活性剤が、ターゲティングリガンド、薬物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗原、抗体、脂質、および単糖または多糖から成る群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記粒子の外側で前記ポリマーに結合した被膜水溶性分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記被膜水溶性分子が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ホスホリルコリン（ＰＣ）、グリコサミノグリカン、多糖、ポリ（イオン化可能なまたは極性のアミノ酸）、キトサンおよびアルギナートから成る群から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記粒子内の前記ポリマー分子の平均分子量が約５，０００から約３００，０００の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
少なくとも１つの生物活性剤が、前記粒子内の前記ポリマー分子に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
インビボで投与された場合に持続放出型のポリマーデポを形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記粒子の平均直径が約１０ナノメートルから約１０００ミクロンの範囲であり、かつ前記少なくとも１つの生物活性剤が前記粒子内に分散される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記粒子が、前記ポリマーの被膜をさらに含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４２】
ミスト中の粒子を含有する分散液滴の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ミストが噴霧器によって作られる、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
賦形剤中の前記粒子の分散液滴を含むミストを作るように作動可能な噴霧器内に入れられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４５】
注射によって前記組成物を投与するように作動可能な注射機器内に入れられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記粒子が、前記少なくとも１つの高分子生物製剤が分散されている前記ポリマーの少なくとも１つのより小さい粒子を含有する水様液をカプセル化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４７】
前記粒子が、前記少なくとも１つの高分子生物製剤を含有する水様液をカプセル化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４８】
肺内または胃腸送達のために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４９】
高分子生物製剤の少なくとも１つの付着部位を介して生分解性ポリマーに結合した少なくとも１つの高分子生物製剤を含むミセル形成ポリマー粒子送達組成物であって、
ａ）構造式（Ｉ）および（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）により表される化学構造を有する生分解性ポリマーまたはこれらの混合物を含む疎水性部分、ならびに
ｂ）水溶性部分であって、
１）少なくとも１つのブロックのイオン化可能なポリ（アミノ酸）、またはポリエチレングリコール、ポリグリコサミノグリカンもしくは多糖の繰り返し交互単位と、
２）少なくとも１つのイオン化可能なまたは極性のアミノ酸と
を含む水性部分
を含むミセル形成ポリマー粒子送達組成物であり、
前記繰り返し交互単位が実質的に類似した分子量を有し、かつ前記ポリマーの分子量が約１０ｋＤから３００ｋＤの範囲にある、ミセル形成ポリマー粒子送達組成物。
【請求項５０】
前記ポリマーの前記分子量が１０ｋＤを超え、かつ少なくとも１つのアミノ酸単位が、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、およびアルギニンから成る群から選択されるイオン化可能なまたは極性のアミノ酸である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記繰り返し交互単位が、約３００Ｄから約７００Ｄの範囲の実質的に類似した分子量を有する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
水溶性鎖内の少なくとも一部のイオン化可能なアミノ酸がイオン化するｐＨ値を持つ薬剤的に許容される水媒体をさらに含み、かつミセルを形成する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ミセルの平均の大きさが、約２０ｎｍから約２００ｎｍの範囲である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ポリマーの水溶性部分の分子量が約５ｋＤから約１００ｋＤの範囲である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ポリマーの完全な水溶性部分が、イオン化可能なまたは極性の水溶性ポリ（アミノ酸）を含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ポリマーの疎水性部分が、構造式Ｉ、ＩＩＩまたはＶＩによって表される化学構造を有する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ポリマーが、カルボン酸フェノキシプロパン（ＣＰＰ）、ロイシン−１，４：３，６−ジアンヒドロ−Ｄ−ソルビトール（ＤＡＳ）、およびこれらの組み合わせから選択される構成成分を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記高分子生物製剤が、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、高分子脂質、多糖、リポペプチド、リポタンパク、糖ペプチドまたは糖タンパク質の形態である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５９】
前記高分子生物製剤がオリゴマーの形態である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記オリゴマーが、インシュリンプロトマーの六重項である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６１】
前記高分子生物製剤がタンパク質の結晶または凝集体の形態である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項６２】
前記タンパク質の結晶または凝集体が、カルシウムまたは遷移金属の少なくとも１つの原子をさらに含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記タンパク質の凝集体がインシュリンオリゴマーの結晶である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記インシュリンオリゴマーの結晶が、少なくとも１つの亜鉛原子をさらに含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
経口送達のために処方されている、請求項４９に記載の組成物。
【請求項６６】
実質的に本来の活性のある高分子生物製剤を経時的に放出するように、酵素活性によって生分解するポリマー粒子の液体分散の形態で請求項１に記載のポリマー粒子送達組成物をインビボで前記対象に投与する段階を含む、高分子生物物質を対象に送達するための方法。
【請求項６７】
実質的に本来の活性を伴って、高分子生物製剤をインビボで制御した速度で送達する方法であって、
１）請求項１に記載のポリマー粒子を前記対象の体内のインビボ部位に投与する段階、および
２）実質的に本来の活性を伴って、前記高分子生物製剤を前記体内部位に制御した速度で送達する段階
を含む、方法。
【請求項６８】
前記粒子の平均直径が、約１μｍから約２００μｍの範囲である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記粒子が、前記体内部位に注入されて、大きさが増大した、粒子のポリマーデポを形成するように凝集する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物が、経口的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、中枢神経系（ＣＮＳ）に、腹膜内に、または臓器内に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
高分子生物製剤がヒトインシュリンであり、前記投与が経口投与である、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、薬物送達システムに関し、特に、様々な異なる高分子を徐放性の様式で送達することが可能なポリマー粒子送達組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
生物学的高分子は、多くの重要な種類の治療化合物を構成する。このような高分子は、１つ以上のポリマー鎖から成り、天然または合成されたタンパクやポリ核酸に見られるような、疎水性およびイオン性の両方の非共有結合力によって結合した３次元構造を形成する。これらの高分子の大部分は、これらの生物活性が依存する３次元構造の破壊を回避するために、注射またはカテーテルによって投与されなければならない。インビボでは、このような生物学的高分子が注射またはカテーテル以外の投与経路を経て標的組織へ送達されることを妨げる、多数の障壁が存在する。経口経路、直腸経路、膣経路および鼻内経路には、ｐＨの変化および加水分解酵素の作用を含む、安全な送達に対する多数の課題がある。加水分解酵素による生物学的高分子の急速な破壊に加えて、組織表面の生体付着や生体吸収を欠いていることが、標的組織においてこのような高分子の薬理学的効能が減少する一因となり得る。
【０００３】
多数のタンパク質およびポリペプチドは、生物学的環境に投与された場合の半減期が一般的に非常に短い、治療に役立つ高分子である可能性がある。これらの欠点を克服するための試みには、糖質ヒドロゲルのような天然ポリマー、またはポリエステル（例えばＰＬＧＡ）などの合成ポリマーなどから作られたゲルまたは粒子のいずれかの生分解性製剤内にこれらの生物製剤をカプセル化することが含まれてきた。これらの種類の製剤からの非結合高分子の放出は、ポリマー自体の性質により、拡散および生侵食のメカニズムを組み合わせることによって、制御される。
【０００４】
半減期、生体付着、または組織の標的化を増加させるために、生物製剤は、ポリマー担体分子への共有結合性付着によって、誘導体化されてきた。たとえば、生物製剤への糖質またはペプチド鎖の共有結合性付着が、このような目的で使用されてきた。同様に、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）やメタクリル樹脂などの合成ポリマーも、半減期を延長し生体付着を高めるために、生物製剤に付加されてきた。しかしながら、このような合成ポリマーは、天然の生体分解を制限するという不利益を持つ可能性があり、より小さい構成部分に完全に生体内分解されず、身体からの除去は、組織からの溶出に依存するという結果になる。
【０００５】
短ペプチドなどの有機的薬剤様分子や小型の生物製剤とは異なり、生物学的高分子、特にタンパク質のインビボでの活性は、３次元構造の定常性に依存する。高分子鎖の空間的な高次構造上の折りたたみは、それぞれ、高分子鎖自体の共有結合よりはるかに弱い力の協調的作用によって共に保持されている。これらの非共有結合力はすべて、基本的には、性質において電子的であり、つまり、静電気的イオン力（水素結合を含む）または電気力学的分散力（近距離の疎水性）である。
【０００６】
ヒドロゲルのようなオープン製剤は、生物製剤分子を天然の含水環境に浸すことによって、治療機能を保存するように機能する。ゲルポリマーと生物製剤との間の、広範囲の直接的かつ水架橋性の水素結合は、場合によっては局部疎水性相互作用と一緒になって、ゲルからの分散による生物製剤の放出を制限する。しかし多くの場合、そのようなオープン製剤は、ゲルの、酵素と同じ大きさの穴から侵入する可能性がある分解酵素の侵入を許し、本来の活性を備えた生物学的高分子送達に特有の問題となる。
【０００７】
高分子生物製剤は、疎水性ポリマーによってさらに保護されているので、高分子生物製剤のマトリックス化またはカプセル化のための、より密度の高い構造が提示される。しかしながら、疎水性ポリマーは水をはじくため、このような合成ポリマー製剤は、自然の折り畳まれた状態を保つように、したがって生物製剤の本来の活性を保つように働く分子相互作用の能力が制限されている。例えば、疎水性ポリエステル（例えばＰＬＧＡ）は、限定されたイオン性結合能力だけを有する。特に、ポリエステルは、水素結合供与体を欠いている。同様に、メタクリル樹脂は疎水性であり、その他の非共有結合性能力を導入するように、広範囲に誘導体化することが必要である。さらに、ほとんどの合成疎水性ポリマーの生体侵食特性、あるいは、水／酸加水分解による分解は十分でないため、保護が求められている高分子生物製剤を改変する可能性がある分解物となる。
【０００８】
経口インシュリン送達は、送達技術の第一の目標であった。例えば、リポソームは、腸粘膜からインシュリンを送達するために使用されているが、腸内ではいくらか不安定であることが示されている。ポリマー製剤は、インシュリンを腸壁全体に送達するために開発されたが、食前のインシュリンの送達ではインシュリンの放出が遅いと考えられている。本問題を克服するために、人為的な浸透エンハンサーである、腸壁からの分子の吸収を向上させる外因性の分子もまたインシュリンの吸収を向上させるために使用されてきたが、腸内で好ましくない副作用が認められている。例えば、吸収を増加させるある種の界面活性剤は、腸に穴をあけるので、対象は、病気や腸過敏症に罹患しやすくなる。
【０００９】
化学者、生化学者および化学技術者は、皆、他の革新的な薬剤運搬システムを発見するために、従来の高分子網目を超えたものを目視している。このように、当技術分野には、様々な異なった種類の高分子生物製剤を制御して送達するための、新しい、より優れたポリマー粒子送達組成物の必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、アミノ酸を主材料とするＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵが生分解性の合成ポリマーであり、アミノ酸残基がジオールまたは二酸から派生した短い炭化水素の鎖によって互いに結合しており、天然または人工の構造的に無傷の高分子生物製剤の送達のためのポリマー粒子送達組成物を形成するために使用され得るという前提に基づいている。ポリマーを含むＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵの疎水性セグメントは、おそらくバルク水をはじくことよって、タンパク質の生分解速度と比較して、ポリマーの生分解速度を遅くすると考えられる。従って、ポリマーに分散した高分子生物製剤は、ポリマーの生分解により、一定かつ信頼性の高い手法で送達される。
【００１１】
このようなポリマー状態の短い炭化水素鎖は、特に、水素結合供与体を提供することによってイオン結合能力を高めるためにアミノ酸残基によって提供されるイオン領域と協調して働く、局所化したの疎水性セグメントを提供する。ＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーにおいて様々な長さの炭化水素鎖および様々なアミノ酸を使用することによって、ポリマーとその中に分散される高分子生物製剤との間の相互作用を最適化するために用いることが可能な変化が生まれ、高分子生物製剤の安定化を強化する。このように、これらの生分解性ポリマーは、タンパク質を含む天然の高分子生物製剤の結合能力に類似した非共有結合性結合能力を持つように合成することが可能である。
【００１２】
一態様において、本発明は、少なくとも１種の高分子生物製剤が生分解性ポリマーに分散するポリマー粒子送達組成物であって、前記ポリマーが、以下の少なくとも１つまたは混合物を含む、ポリマー粒子送達組成物を提供する：
構造式（Ｉ）によって表される化学式を有するポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）であって、
2009518289.tif 000002
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ1がα，ω−ビス（ｏｈｍ、またはｐ４−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンの残基から独立して選択され、個々のｎモノマーのＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオール残基、または構造式（ＩＩ）
2009518289.tif 000003
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントおよびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択される、ポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）；
または、構造式（ＩＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＡであって、
2009518289.tif 000004
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０．１から０．９の範囲であり、ｐが約０．９から約０．１の範囲であり、Ｒ１がα，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ４−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンの残基から独立して選択され、Ｒ２が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは保護基であり、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオール残基、または構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択され、Ｒ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＡ；
または構造式（ＩＶ）によって表される化学式を有するポリ（エステル・ウレタン）（ＰＥＵＲ）であって、
2009518289.tif 000005
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、またはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療ジオール残基、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから成る群から選択され、Ｒ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、ポリ（エステル・ウレタン）（ＰＥＵＲ）；
または、一般構造式（Ｖ）によって表される化学構造を有するＰＥＵＲであって、
2009518289.tif 000006
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０．１から約０．９の範囲であり、ｐが約０．９から約０．１の範囲であり、Ｒ２が水素、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは保護基から独立して選択され、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療ジオールの残基、および構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから成る群から選択され、Ｒ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、飽和または不飽和治療ジオールの残基、およびこれらの組み合わせから独立して選択され、かつＲ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵＲ；
または、一般構造式（ＶI）によって表される化学式を有するポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ポリマーであって、
2009518289.tif 000007
式中、ｎが約１０から約１５０であり、個々のｎモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオールの残基、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）ポリマー；
または、構造式（ＶＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＵであって、
2009518289.tif 000008
式中、ｍが約０．１から約１．０であり、ｐが約０．９から約０．１であり、ｎが約１０から約１５０であり、Ｒ２が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールであり、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオールの残基、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択され、Ｒ７が独立的して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵ。
【００１３】
別の態様において、本発明は、生分解性ポリマーの粒子内に分散した高分子生物製剤の送達のための、ミセル形成ポリマー粒子送達組成物を提供する。本態様では、ポリマーは、水溶性部分に結合した構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）によって表される化学構造を有する生分解性ポリマーを含む疎水性部分から作られる。水溶性部分は、少なくとも１つのブロックのイオン化可能なポリ（アミノ酸）、または（ｉ）ポリエチレングリコール、ポリグリコサミノグリカンもしくは多糖の繰り返し交互単位；および（ｉｉ）少なくとも１つのイオン化可能なまたは極性のアミノ酸から作られる。繰り返し交互単位は、実質的に同様な分子量を有し、ポリマーの分子量は約１０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲にある。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも１種の高分子生物製剤が中に分散したポリマー粒子の液体分散を含む発明のポリマー粒子送達組成物を対象にインビボで投与することによって、実質的に構造的に無傷の高分子生物製剤を対象に送達するための方法を提供し、前記粒子は、酵素作用によって生分解して、経時的に、実質的に本来の活性を有する高分子生物製剤をインビボで放出する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、実質的に本来の活性を有する高分子生物製剤を含むポリマー粒子を対象体内の局所部位に送達するための方法を提供する。この態様において、本発明の方法は、本明細書の構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）によって表されるポリマーの少なくとも１つまたはこれらの混合物を含むポリマーの粒子であって中に分散された高分子生物製剤を有する粒子の分散を対象の体内のインビボ部位に送達することを含み、注入した粒子は集合して、高分子生物製剤の制御された放出のための、サイズが大きくなった、粒子のポリマーデポを形成する。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、高分子生物製剤用の、生体適合性である、生分解性ポリマー送達組成物を提供する。使用されるポリマーは、全体的に見て親水性ではなく（すなわち、水溶性ではない）、従って、ヒドロゲルよりもさらに保護するように生物製剤を取り巻く。しかし、真に疎水性であるポリマーとは異なり、これらのポリマーは、天然の高分子生物製剤内に見られる同じ非共有結合力から、カーゴ生物学的高分子の３次元構造を安定化して、これらを、生物学的高分子の本来の活性を実質的に維持するように凝集させる。これらの安定化力は、近距離の分散力を生じさせる、ポリマー鎖に沿った個々の疎水性セグメント、および、水素結合を含む局所的なイオン相互作用を生じさせる、帯電したまたは部分的に帯電したポリマーの領域から発生する。特に、本発明の高分子生物製剤用ポリマー送達組成物では、水素結合は、ポリマーと高分子生物製剤との間で直接発生し得る。または、天然の生物学的高分子の表面に見られ、例えば結晶など、凝集物中の高分子間に架橋を形成する、ゆっくりと交換可能な結合した水分子に相当する手法で、個々の水分子を介して架橋してもよい。
【００１７】
本明細書で使用される「高分子生物製剤」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、核酸ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、高分子脂質、ならびに多糖を含み、これらの生活性は、分子の固有の３次元（例えば折りたたみ）構造に依存する。この３次元の分子構造は、原子間の水素結合および疎水性結合による相互作用（疎水性）などのような、特定の非共有結合性結合相互作用によって、実質的に維持される。「高分子生物製剤」は天然のものであるか、あるいは、当技術分野において公知である任意の方法によって人工的に作製することが可能である。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「生物活性剤」は、人工的または生物学的に作製されて、同時投与した場合に治療的または苦痛緩和の成果を伴って生物学的プロセスに影響を与える、「高分子生物製剤」以外の、任意の分子を意味する。短鎖ペプチド、因子、小分子薬剤、糖、脂質および全細胞が含まれるがこれらに限定されない。高分子生物製剤、および任意で生物活性剤は、様々な治療上の目標および投与経路に合わせた様々な大きさおよび構造を有するポリマー粒子に含有されて、投与される。「生物活性剤」は、ポリマーの骨格には組み込まれない。
【００１９】
本明細書において使用される「アミノ酸」および「α−アミノ酸」という用語は、アミノ基、カルボキシル基、および本明細書において定義されているＲ３基などのペンダントＲ基を含む化学化合物を意味する。本明細書において使用される「生物学的α−アミノ酸」という用語は、合成に用いられるアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、プロリンまたはこれらの混合物から選択されることを意味する。Ｒ７が水素の場合、ポリマー骨格中に異方向（ａｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）で、つまり、ペプチド結合に通常見られる方向以外の方向で組み込まれるが、リシンおよびオルニチンも含まれる。
【００２０】
本明細書において使用される「治療ジオール」とは、哺乳動物に投与された場合に治療的手法または苦痛緩和的手法において、ヒトなどの哺乳動物個体の生物学的プロセスに影響を与える、人工的に生産されたまたは天然（例えば、内因性）の任意のジオール分子を意味する。
【００２１】
本明細書において使用される「治療ジオールの残基」という用語は、本明細書において説明されているように、ジオールの２つのヒドロキシル基を除く治療ジオールの部分を意味する。その「残基」を含む対応する治療ジオールは、ポリマー化合物の合成において使用される。治療ジオールの残基は、組成物を加工するために選択されたＰＥＡ、ＰＥＵＲ、またはＰＥＵポリマーの特性に応じた制御様式での生分解により、ポリマーの骨格から放出されると、インビボ（または、同様のｐＨ、水性媒質などの条件下）において、対応するジオールに再構成される。前記特性は当技術分野で公知であり、本明細書において説明されている。
【００２２】
本発明のポリマー粒子送達組成物に用いられるポリマーを説明するために本明細書において使用される「生分解性」という用語は、ポリマーが、体内の通常機能の間に、アミノ酸などの無害の生成物に代謝可能であることを意味する。一態様において、ポリマー粒子送達組成物の全体が生分解性である。好ましい生分解性ポリマーは、生分解性を提供する加水分解可能なおよび／または酵素的に開裂可能なエステル結合および酵素的に開裂可能なアミド結合を有し、典型的には、大部分がアミノ基で終了する鎖である。任意で、これらのアミノ末端はアセチル化してもよく、またはそうでなければ、有機酸、アジュバント分子などの生物不活性生物製剤または生物活性化合物を制限なく含むように、他の任意の酸を含む生体適合性分子に結合させることによって、キャップしてもよい。
【００２３】
ポリマー粒子送達組成物は、さまざまな特性を提供するように処方することができる。一態様において、ポリマー粒子は、凝集するように加工され、インビボ、例えば、皮下、筋肉内、または臓器のような体内の部位に注射した場合に分散高分子生物製剤を周辺の組織／細胞に局部送達するための、持続放出型ポリマーデポを形成する。例えば、約１９から約２７ゲージの大きさの範囲の薬剤注射針から通過が可能な大きさの本発明のポリマー粒子は、例えば、約１μｍから約２００μｍの範囲の平均直径を有し、体内の部位に注射することが可能であり、かつ凝集すると考えられ、高分子生物製剤を局部に投与するためのデポを形成する増大サイズの粒子を形成する。その他の態様では、生分解性ポリマー粒子は、全身的な標的放出および持続放出のために循環内に入る、高分子生物製剤の担体として機能する。約１０ｎｍから約５００ｎｍの範囲の大きさの本発明のポリマー粒子は、このような目的のために循環内に直接入ると考えられる。
【００２４】
本発明のポリマー粒子送達組成物に用いられる生分解性ポリマーは、選択した時間の間に高分子生物製剤が連続して送達されるように、ポリマーの生分解の速度を調整するよう設計することができる。例えば、典型的には、本明細書で説明されるように、ポリマーデポは、約２４時間、約７日、約３０日、または約９０日、またはこれより長い期間にわたって生分解すると考えられる。より長い期間は、適切な治療反応または苦痛緩和反応を得るための組成物の反復注射の必要性を排除した、送達組成物の提供に特に適している。
【００２５】
本発明は、多種多様の疾病および症状の治療において、多種多様の高分子生物製剤を送達するために、および任意で生物活性剤を送達するために、生分解性ポリマー粒子媒介送達技法を利用する。本明細書に説明されるポリマー粒子送達組成物および方法の一定の個々の構成要素は知られていたが、このような組合せが、それらの要素を別々に使用した場合に実現されるレベルを超えて高分子生物製剤の持続放出送達の効率を向上させることは、予想外であり、驚くべきことであった。
【００２６】
本発明の生体適合性ポリマー粒子送達組成物を形成する場合に有用な生分解性ポリマーは、繰り返し単位あたり少なくとも１つの非アミノ酸部分に結合した少なくとも１つのアミノ酸を含むポリマーを含む。本発明を実施する場合に有用なＰＥＡ、ＰＥＵＲ、およびＰＥＵポリマーにおいて、複数の異なるαアミノ酸を単一のポリマー分子に用いることができる。本明細書において使用される「非アミノ酸部分」という用語は、さまざまな化学部分を含むが、特に、本明細書において説明されるように、アミノ酸誘導体およびペプチド模倣物を除外する。さらに、少なくとも１つのアミノ酸を含むポリマーは、特にそのように説明されない限り、天然のポリペプチドを含むポリ（アミノ酸）セグメントを含むとは意図されない。一態様において、非アミノ酸は、繰り返し単位の２つの隣接するアミノ酸の間に配置される。ポリマーは、例えば、ｎモノマーあたりなどの繰り返し単位あたり少なくとも２つの異なるアミノ酸を含むことができ、単一のポリマー分子は、分子の大きさに応じて、ポリマー分子中に複数の異なるαアミノ酸を含むことができる。別の態様では、非アミノ酸部分は疎水性である。また、ポリマーは、ブロックコポリマーであってもよい。別の態様では、ポリマーは、以下に説明するように、ミセルを作るために使用されるジ−またはトリ−ブロックコポリマー中の１つのブロックとして使用される。
【００２７】
本発明の実施において使用されるＰＥＡ、ＰＥＵＲ、およびＰＥＵは、側鎖上に一体型（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）の官能基を有していてもよく、かつ、ＰＥＡ、ＰＥＵＲ、またはＰＥＵの官能性をさらに発展させるために、これらの一体型の官能基を他の化学物質と反応させて、追加の官能基の組み込みを導いてもよい。従って、本発明の方法において使用されるこのようなポリマーは、粒子の水溶性を高めるために、親水性構造を有する他の化学物質と反応可能な状態であり、かつ任意には、事前の修飾を必要とせずに、生物活性剤および被膜分子と反応可能な状態である。
【００２８】
さらに、本発明のポリマー粒子送達組成物に用いられるポリマーは、生理食塩水（ＰＢＳ）媒質でテストすると、最小の加水分解を示すが、キモトリプシンまたはＣＴなどの酵素溶液では、均一の侵食挙動が観察された。
【００２９】
一態様において、本発明は、少なくとも１つの高分子生物製剤が生分解性ポリマーに分散しているポリマー粒子送達組成物を提供し、前記ポリマーは、以下のうちの少なくとも１つまたはそれらの混合物を含む：
構造式（Ｉ）によって表される化学構造を有するＰＥＡであって、
2009518289.tif 000009
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ１がα，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ-カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、および（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンの残基から独立して選択され、個々のｎモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオールの残基、構造式（ＩＩ）
2009518289.tif 000010
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択される、ＰＥＡ；
または、構造式（ＩＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＡポリマーであって、
2009518289.tif 000011
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０．１から０．９の範囲であり、ｐが約０．９から０．１の範囲であり、Ｒ１がα，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ-カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、または（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンの残基から独立して選択され、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオールの残基、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択され、かつＲ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＡポリマー。
【００３０】
例えば、本発明の粒子送達組成物に用いられるＰＥＡポリマーの１つの代替例では、少なくとも１つのＲ１は、α，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基であり、Ｒ４は、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントである。別の代替例では、ＰＥＡポリマーのＲ１は、α，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸のいずれかの残基である。さらに別の代替例では、ＰＥＡポリマー中、Ｒ１は、α，ω−ビス（ｏ、ｍ、またはｐ−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、例えば１，３−ビス（４−カルボキシフェノキシ）プロパン（ＣＰＰ）、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アジポイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基であり、Ｒ４は、ＤＡＳなどの、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントである。ＰＥＡのさらに別の代替例では、Ｒ７は、独立して（Ｃ３−Ｃ６）アルキル、例えば−（ＣＨ２）４−である。
【００３１】
別の態様では、ポリマーは以下を含む：
構造式（ＩＶ）によって表される化学式を有するＰＥＵＲであって、
2009518289.tif 000012
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療ジオールの残基、および構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントから成る群から選択され、かつＲ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、飽和または不飽和治療ジオールの残基の有効量、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、ＰＥＵＲ；
または、一般構造式（Ｖ）によって表される化学構造を有するＰＥＵＲであって、
2009518289.tif 000013
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０．１から約０．９の範囲であり、ｐが約０．９から約０．１の範囲であり、Ｒ２が水素、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、または保護基から独立して選択され、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、および構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントから成る群から選択され、Ｒ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択され、かつＲ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵＲ。
【００３２】
ＰＥＵＲポリマーのある代替例では、少なくとも１つのＲ４は、１，４：３，６−ジアンヒドロソルビトール（ＤＡＳ）などの１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント（式（ＩＩ））であり、または、Ｒ６は、１，４：３，６−ジアンヒドロソルビトール（ＤＡＳ）などの１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントである。ＰＥＵＲポリマーのさらなる代替例では、Ｒ４および／またはＲ６は、１，４：３，６−ジアンヒドロソルビトール（ＤＡＳ）などの１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントである。ＰＥＵＲのさらに別の代替例では、Ｒ７は、独立して（Ｃ３−Ｃ６）アルキル、例えば−（ＣＨ２）４−である。
【００３３】
さらに別の態様では、本発明の粒子送達組成物のポリマーは以下を含む：
一般構造式（ＶＩ）によって表される化学式を有するＰＥＵであって、
2009518289.tif 000014
式中、ｎが約１０から約１５０であり、個々のｎモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオールの残基、または構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、ＰＥＵ；
または、構造式（ＶＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＵであって、
2009518289.tif 000015
式中、ｍが約０．１から約１．０であり、ｐが約０．９から約０．１であり、ｎが約１０から約１５０であり、Ｒ２が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは他の保護基であり、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、−（ＣＨ２）３−および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオールの残基の有効量、または構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントから独立して選択され、Ｒ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵ。ＰＥＡのさらに別の代替例では、Ｒ７は、独立して（Ｃ３−Ｃ６）アルキル、例えば−（ＣＨ２）４−である。
【００３４】
本発明の実施における使用に適切な保護基は、当技術分野で知られているようにｔ−ブチルなどを含む。１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの適切な二環式フラグメントは、Ｄ−グルシトール、Ｄ−マンニトール、およびＬ−イジトールなどの糖アルコールから誘導することができる。例えば、１，４：３，６−ジアンヒドロソルビトール（イソソルビド、ＤＡＳ）は、１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントとしての使用に特に適している。
【００３５】
これらのＰＥＵポリマーは、ヒトおよびその他の哺乳動物にさまざまな薬学的および生物学的活性剤を送達するための本発明のポリマー粒子送達組成物の作成に有用な高分子量ポリマーとして加工することができる。本発明のＰＥＵは、加水分解的に開裂可能なエステル基、およびポリマー鎖にαアミノ酸を含む非毒性で天然のモノマーを組み入れる。ＰＥＵの最終の生分解生成物は、αアミノ酸（生物学的であるか否かに関わらない）、ジオール、およびＣＯ２であると考えられる。ＰＥＡおよびＰＥＵＲとは対照的に、本発明のＰＥＵは、結晶または半結晶であり、有利な機械的特性、化学的特性、および生分解特性を有し、これらの特性によって、完全に合成の、それ故生産が容易な、例えば、ナノ粒子などの、結晶および半結晶のポリマー粒子の処方が可能になる。
【００３６】
例えば、本発明のポリマー粒子送達組成物に用いられるＰＥＵポリマーは、高度な機械的強度を有しており、ＰＥＵポリマーの表面侵食は、加水分解酵素などの生理学的条件に存在する酵素によって触媒されうる。
【００３７】
ＰＥＵポリマーのある代替例では、少なくとも１つのＲ１は、１，４：３，６−ジアンヒドロソルビトール（ＤＡＳ）などの１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントである。
【００３８】
本発明の実施における使用に適切な保護基は、当技術分野で知られているようにｔ−ブチルなどを含む。１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの適切な二環式フラグメントは、Ｄ−グルシトール、Ｄ−マンニトール、およびＬ−イジトールなどの糖アルコールから誘導することができる。例えば、ジアンヒドロソルビトールは、１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントとしての使用に特に適している。
【００３９】
ある代替例では、少なくとも１つのｎモノマーのＲ３は、ＣＨ２Ｐｈで、合成で使用されるαアミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニンである。モノマー内のＲ３が−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２である代替例では、ポリマーは、αアミノ酸、ロイシンを含む。Ｒ３を変更することにより、例えば、グリシン（Ｒ３が−Ｈの場合）、プロリン（Ｒ３がエチレンアミドの場合）、アラニン（Ｒ３が−ＣＨ３の場合）、バリン（Ｒ３が−ＣＨ（ＣＨ３）２の場合）、イソロイシン（Ｒ３が−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３の場合）、フェニルアラニン（Ｒ３が−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５の場合）、リシン（Ｒ３が−（ＣＨ２）４−ＮＨ２の場合）またはメチオニン（Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３の場合）など、その他のαアミノ酸も使用できる。
【００４０】
ポリマーが式ＩまたはＩＩＩ〜ＶＩＩのＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵである場合の別のさらなる態様では、少なくとも１つのＲ３は、さらに−（ＣＨ２）３−であることができ、Ｒ３は、構造式ＸＶによって表される化学構造を形成するように環化する。
2009518289.tif 000016
Ｒ３が−（ＣＨ２）３の場合、ピロリジン−２−カルボン酸（プロリン）に類似するαイミノ酸が使用される。
【００４１】
ＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵは、時間の経過とともに分散した高分子生物製剤を放出するように、酵素活性によって実質的に生分解される生分解性ポリマーである。使用されるポリマーの構造特性のため、本発明のポリマー粒子送達組成物は、３次元構造、したがって、生物活性を維持しながら、高分子生物製剤の安定充填を提供する。
【００４２】
本発明の実施において使用に適したポリマーは、ポリマーへの生物活性剤または被膜分子の任意の共有結合性付着を可能にする機能を持っている。例えば、カルボキシル基を持つポリマーは、ペプチドのアミノ部分と容易に反応することが可能であり、これにより、生じたアミド基を介してポリマーにペプチドを共有結合させる。本明細書に記載されるように、生分解性ポリマー、および、任意で、いずれの生物活性剤も、前記任意の生物活性剤を生分解性ポリマーに共有結合により結合させるために使用することが可能な多数の補助的官能基を含むことができる。
【００４３】
本発明のポリマー粒子送達組成物のポリマーは、ポリマーの生分解の間、このような高分子生物製剤および任意の薬剤を含む粒子またはポリマー分子をゆっくりと放出しながら、個体の内因性過程が高分子生物製剤および任意の生物活性剤と相互作用できるように十分な期間にわたって注射部位において高分子生物製剤および任意の生物活性剤を保持することによって、局部注射部位で治療過程における有効な役割を果たす。脆弱な高分子生物製剤は、高分子生物製剤の半減期および安定性を高めるように、ゆっくりと生分解するポリマーによって保護される。
【００４４】
さらに、本明細書中に開示されるポリマー（例えば、構造式（ＩおよびＩＩＩ〜ＶＩＩ）を有するポリマー）は、酵素による生分解時に生物学的または非生物学的アミノ酸を提供し、同時に、その他の分解生成物が脂肪酸および糖の場合と同様の生化学的経路で代謝され得る。高分子生物製剤を伴うポリマー粒子のインビボでの取り込みは安全である。研究では、対象は、ポリマー分解生成物を代謝／排出できることが示されている。これらのポリマーおよび本発明のポリマー粒子送達組成物は、従って、注射自体によって生じた外傷を除けば、注射部位と全身との両方において、対象にとって実質的に非炎症性であり、特に、経口または鼻内送達に適している。
【００４５】
凝集、オリゴマー化または結晶化による生物製剤注入および安定性の向上
中に含まれている炭水化物セグメントにより、本明細書中に記載された合成のＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵは、水に対して可溶性ではない。しかしながら、おそらく、個々の水分子は、アミノ酸残基に水素結合でき、それによってさらに多くの水分子へ架橋した水素結合を形成するので、部分的には可溶性になることが可能である。これらの結合した水分子は、個々の結合した水分子が高分子生物製剤の構造ならびにオリゴマーおよび結晶などの高次構造の安定化に重要であることが示されているのと同様に、ポリマーと高分子生物製剤との間の相互作用の安定性にとって重要であると考えられる。
【００４６】
結晶が穏和な条件下で形成される生物学的分子の結晶配列は、高分子構造を安定化させる一方で、最適の充填密度を実現できる、天然または半天然の構成を表す。確かに、例えば、プロインシュリンなど一部のタンパク質は、ミクロ結晶凝集体として貯蔵顆粒内で天然に保存される。
【００４７】
自然界では、多数の高分子生物製剤が、活性のある生物構成を表すことが多い、四次構造として存在する。四次構造として存在する高分子生物製剤の例には、一部の核酸（反平行、二重らせん二量体）、多数の遺伝子調節タンパク質（２つのプロトマーのＤＮＡ結合二量体）、運搬タンパク質ヘモグロビンおよびトランスサイレチン（それぞれ、プロトマーの四量体）、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ酵素（６つの調節プロトマーおよび触媒プロトマー）、正２０面体ウィルス被膜（６０個のプロトマーが複数）、らせんウィルス被膜（タバコモザイクウィルスは２１３０個のプロトマーを有する）、および、アクチンおよびチュブリンケーブルなどの細胞構造集合体（何千ものプロトマーから構成される）を含む。
【００４８】
２つ以上のこのような同じタンパク質分子またはプロトマーが、非共有的に、しかし具体的には、タンパク質オリゴマーを形成するように、結合する。プロトマーの空間的配列は、オリゴマーの四次構造と呼ばれる。ほとんどの生物的オリゴマーでは、プロトマーは、単純な回転対称によって空間的に関係する。しかしながら、多数のオリゴマータンパク質は、結晶学的に非対称の単位において２つ以上のプロトマーと結晶化するので、これらの対称性は必ずしも厳密ではない。オリゴマータンパク質の結晶構造において一般的に見られるプロトマーの四次構成の例は、追加の回転対称によって関係付けられる二量体の構成である。生じたオリゴマーは、生物的に活性な構成を示しても示さなくてもよいが、より安定であり、プロトマーの単純な翻訳後結晶凝集体に比べて、より低い自由エネルギー最小値を持つ。例えば、ヒトのインシュリンは容易に二量体になり、亜鉛原子が存在する場合、分子の安定な六量体を形成するように、３つの二量体が３回対称軸（three-fold axis of symmetry）の周囲に集合する。最適の条件下では、これらの可溶性六量体は凝集して、六量体と六量体との相互作用が亜鉛原子によってさらに安定化されるような結晶を形成する可能性がある。インシュリン以外の高分子生物製剤では、その他の遷移金属またはカルシウムの原子が、結晶を形成するようにオリゴマーの凝集を促進することができる。
【００４９】
タンパク質など、高分子生物製剤の結晶化の重要な一般的特徴を示すため、本明細書中でインシュリンの結晶化の例が記載される。結晶を結合する非共有性の電気力は、オリゴマーの四次構造を安定化させる力の種類および強さにおいて類似しており、実際に、タンパク質分子（つまり、プロトマー）自体の３次元フォールディングを維持する。
【００５０】
このように、高分子生物製剤の３次元フォールディング構造は、以下に対する高分子生物製剤の疎水性およびイオン性の結合の組合せによって、本発明のＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマー粒子送達組成物において保存することが可能である：（１）ポリマー、（２）高分子生物製剤自体の空間的に隣接するコピー（つまり、オリゴマー化を伴う、または伴わないミクロ結晶化）、および任意で、（３）高分子生物製剤自体の空間的に隣接するコピー（つまり、オリゴマー化を伴う、または伴わない結晶化）、ここで、少数のプロトマーがポリマーに結合している。分子量が約１００から約１，０００，０００Ｄａの範囲にある多価の生物学的活性分子（つまり、本明細書中の実施例１０のように、２つ以上の結合部位を有する高分子生物製剤）は、ポリマーを部分的に架橋して、システムに追加的な安定性を提供することが可能である。図１１に例証され、かつ本明細書中の実施例に例示されているように、これらのポリマー結合プロトマーは、種分子として機能して、緩和な条件下でオリゴマー化を伴い、または伴わず、周囲の遊離プロトマーの結晶化を促進し、これによりプロトマーの３次元構造を安定化させ、高分子生物製剤の本来の生物活性を保存すると考えられる。
【００５１】
すべての高分子生物製剤が、このように結晶またはオリゴマーを形成するわけではないが、多数は、分子の本来の活性を維持する凝集体を形成する。例えば、オリゴヌクレオチドは、センスとアンチセンス鎖との通常の塩基対合を通して、２分子凝集体を形成する。
【００５２】
従って、１つの態様では、本発明は、活性基を介して、少なくとも１つの高分子生物製剤が、構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）のいずれかによって表される化学式を有するＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵなどの生分解性ポリマーに結合している、ポリマー粒子送達組成物を提供する。高分子生物製剤のポリマーへの結合は、ＤＭＳＯタンパク質／ポリマー溶媒活性化エステル方法のような結合化学反応などを使用する、ＰＥＡに対するインシュリンまたはオボアルブミンの結合によって、本明細書中の実施例に例証されている。あるいは、溶媒ＨＦＩＰ活性化エステル方法を用いて、タンパク質オボアルブミンを使用することによってポリマーと生物製剤との結合体を作製することが可能である。そして、高分子生物製剤を含む結合体は、凝集体またはオリゴマー（例えば、亜鉛を伴うインシュリン六量体）に組み入れられ、本明細書中の実施例に記載され、当技術分野で公知の透析方法を使用して結晶化され得る。
【００５３】
結合体における高分子生物製剤の３次元構造を保護するために、結合体は、構造ＩまたはＩＩＩのＰＥＡ、または、構造ＩＶまたはＶのＰＥＵＲ、または、構造ＶＩまたはＶＩＩのＰＥＵなど、被膜ポリマーでコーティングし、または被膜ポリマー内にマトリックス化することが可能である。実施例１０および１１で例証されているように、ジオキサン、ジオキサン／ＨＦＩＰまたはＨＦＩＰのような溶媒を使用して、結合体をコーティングまたはマトリックス化するために、溶液凍結乾燥が使用される。
【００５４】
さらに、結合体における活性な高分子生物製剤の３次元構造は、有機溶媒（ｗ／ｏ乳剤）方法において水を使用して、ＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマー粒子内に結合体をカプセル化することによって、保護することが可能である。あるいは、有機オイルおよび極性有機溶媒（ｏ／ｏ乳剤）方法を採用する非混合性溶媒技法を使用して、プロトマー、オリゴマー、またはオリゴマーの結晶（図１１に例証）として、高分子生物製剤をカプセル化するナノ粒子などの粒子を形成することが可能である。以下に記載する、単独、二重および三重の乳剤技法はすべて、本目的に適用可能である。
【００５５】
別の態様では、インシュリンの経口送達を目的とする本発明のポリマー粒子送達組成物は、内因性の浸透エンハンサーである少なくとも１つの胆汁酸塩を、本明細書中に記載されるミクロ粒子のアミノ酸を主材料とするＰＥＡまたはＰＥＵＲポリマー中に分散した形態で、任意でさらに含むことができる。この態様では、ＰＥＡおよびＰＥＵＲのミクロ粒子は、タンパク質分解から保護することにより吸収のためのインシュリンの濃縮量を腸の微繊毛に送達することが期待されるので、インシュリンを経口送達するために使用することが可能である。本発明の組成物のインシュリンの濃縮量は、本明細書中に記載されるように、ポリマーに結合したインシュリン上に結合したインシュリン六量体の結晶形成によりもたらされる。腸内の正常な生理学的条件下では、円柱上皮によるインシュリンの吸収は非常に低い。本発明のこの代替的な態様では、インシュリン六量体を隔離するポリマーにマトリックス化された胆汁酸塩は、腸壁全体のインシュリンの浸透性を向上させるが、これは、ミクロ粒子の表面におけるステロール様の分子の存在によるものと思われる。このように、本発明のポリマー送達組成物におけるポリマーは、腸の内腔を通して移動する際、ポリマー-胆汁酸塩-インシュリンマイクロスフェア内のインシュリンの安定性に寄与し、保護する一方、腸の刷子縁の生理学的状態にさらされる際、胆汁酸塩がミクロ粒子からのインシュリンの急速な放出を促進する。
【００５６】
事実、放出されたインシュリンは、インシュリン周囲のミセルの自発的な形成によって保護されることが予想され、このことは、ミセルを形成する腸内の胆汁酸塩の生理学に基づく正しいメカニズムであると仮定され、これは繊毛の粘膜細胞を通したインシュリンの送達を促進する。正確なメカニズムがどのようなものであれ、インシュリンの濃縮ボーラスは、マイクロスフェアによって、単純な円形上皮をコーティングしている粘膜と糖衣層に急速に放出され得る。そこから、胆汁酸塩でコーティングされたインシュリンは、上皮細胞および固有層を通してカイロミクロン様の粒子として効果的に拡散して、食後の血糖レベルを減少するように、肝門静脈から血流によって肝臓の肝細胞に急速に運搬される。
【００５７】
１つまたは複数の胆汁酸塩がインシュリンを隔離するＰＥＡまたはＰＥＵＲのミクロ粒子にマトリックス化される本発明の態様では、小腸および大腸から肝臓へのインシュリン取り込みのために、主要な循環経路である腸肝循環経路を利用する。本経路は、食物の消化および吸収を助けるために、腸から肝汁塩をリサイクルするのに重要である。腸管腔から血液循環への、無傷の生物学的活性高分子の運搬は、食物の消化および吸収の通常の過程とは異なる、独特の現象である。生物活性ペプチドおよびさまざまなタンパク質の腸内吸収が報告されている（Ｚｉｖ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９８７）３６（７）：１０３５−１０３９）。タンパク質分解に対する保護は、「厳しい」腸管腔内でポリペプチドおよびタンパク質を無傷に保つことに関与する最初の段階である（Ｚｉｖ、前記を参照）。第二の段階は、高分子量の分子の吸収を可能にするための、小分子の選択的吸収に関与するメカニズムの改変に関わる。これらの天然の特殊化した「両親媒性」浸透エンハンサーは内因性であるため、個体において、他の種類の両親媒性分子に比べて重篤な副作用を起こす可能性が少ない。
【００５８】
胆汁は、以下の２つの主な機能を持つと考えられる肝臓の分泌物である：第一に、腸からの脂肪の消化および吸収を促進し、第二に、腎臓から排出されない、血液および肝臓由来の多数の内因性および外因性物質の排除を向上させる１。胆汁酸塩は、胆汁の主な成分であり、胆汁中の濃度は２から４５ｍＭであって、哺乳類では、Ｃ２４化合物であるコール酸を主材料とする酸性ステロールである。本発明で有用な胆汁酸塩は、以下のコール酸を主材料とする、一般的に見られる胆汁酸塩を含む：コール酸の環状構造上のヒドロキシル基の数が異なる、コール酸塩、ケノデオキシコール酸塩およびリトコール酸塩。本発明の組成物において任意で使用される天然の胆汁酸塩は、肝臓により、それ自体の胆汁の製造のために再使用される。このような塩の再吸収は、主に、十二指腸および回腸末端で発生し、小腸壁の細胞を通過後、胆汁酸塩は門脈循環によって肝臓に戻る。ヒトでは、胆汁酸塩のプールの９９％が腸肝循環内で維持され、各２４時間当たり、およそ４０ｇ（１００ｍｍｏｌ）の胆汁酸塩が肝臓によって門脈血から取り除かれる。過剰な胆汁酸塩は腸から排除される。（Ｓｔｒａｎｇｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９８４）６４（４）：１０５５−１１０２）。
【００５９】
胆汁酸塩は、主に門静脈から肝臓に到達するので、本発明の組成物への胆汁酸塩の追加は、その中に含まれるインシュリンの肝細胞への送達に顕著に寄与することが期待できる。肝細胞は、細胞１つ分の厚さのシート状に配置されて、輸入性および輸出性の血液供給の間に位置している。前記組成物は、まず、肝細胞の洞様表面に接触し、ここはインシュリン、グルカゴンおよび胆汁酸塩など、複数のホルモンのための受容体系の部位である。事実、インシュリンの場合には、肝細胞の洞様表面は、体内の主要な標的である。洞様表面の微繊毛は、血液と肝細胞との間の分子の交換に利用可能な表面積を大幅に増加させる。
【００６０】
従って、本発明の組成物におけるインシュリンが、肝細胞の洞様側に送達され、血液中のグルコース取り込みに影響を及ぼす一方で、胆汁酸塩は、肝細胞を通して胆汁にリサイクルされ、かつ、ポリマーは、腸内、およびおそらく循環系で、酵素によって生分解され、このため、本発明の組成物の胆汁酸塩を含む態様は、インシュリンの経口送達は安全である。
【００６１】
また別の態様では、本発明は、生分解性ポリマーの粒子内に分散した高分子生物製剤の送達のために、ミセル形成ポリマー粒子送達組成物を提供する。本態様では、ポリマーは、水溶性部分に結合した、構造式（Ｉ）によって表される化学構造を有する生分解性ポリマーを含む疎水性部分から構成される。水溶性部分は、少なくとも１つのブロックのイオン化可能なポリ（アミノ酸）、または（ｉ）ポリエチレングリコール、ポリグリコサミノグリカンもしくは多糖の繰り返し交互単位；ならびに（ｉｉ）少なくとも１つのイオン化可能なまたは極性のアミノ酸から構成される。繰り返し交互単位は、実質的に同様な分子量を有し、ポリマーの分子量は約１０ｋＤから３００ｋＤの範囲にある。
【００６２】
また別の態様では、本発明は、構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）のポリマーを含み、中に少なくとも１つの高分子生物製剤の有効量が分散している、ポリマー粒子の液体分散形態にある本発明のポリマー粒子送達組成物をインビボで対象に投与することによって、構造的に無傷の高分子生物製剤を対象に送達するための方法を提供する。この粒子は、インビボで時間経過とともに酵素作用によって生分解し、構造的に無傷の高分子生物製剤を放出する。
【００６３】
さらに別の態様では、本発明は、構造的に無傷な高分子生物製剤を含むポリマー粒子を対象の体内の局部に送達するための方法を提供する。本態様では、本発明の方法は、本明細書中で構造式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）または（Ｖ）によって表されるものから選択されたポリマーの粒子の分散物の、対象の体内のインビボ部位への送達に関与し、ここで、粒子はその中に分散した高分子生物製剤を有し、注入された粒子は凝集して、高分子生物製剤の制御放出のための、サイズの大きい、粒子のポリマーデポを形成する。
【００６４】
「アリール」という用語は、本明細書中の構造式と関連して、約９から１０の環原子を有し、少なくとも１つの環は芳香族である、フェニルラジカルまたはオルト融合二環式炭素環ラジカルを示すために使用される。一定の態様では、１つまたは複数の環原子は、ニトロ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチル、または、トリフルオロメトキシのうち１つまたは複数で置換することが可能である。アリールの例は、フェニル、ナフチルおよびニトロフェニルを含むが、これらに限定されない。
【００６５】
「アルケニレン」という用語は、本明細書中の構造式と関連して、主鎖または側鎖に少なくとも１つの不飽和結合を含む、二価の分岐または非分岐炭水化物鎖を意味するために使用される。
【００６６】
本明細書中のＰＥＡおよびＰＥＵＲポリマーの分子量および多分散性は、ポリスチレン基準を使用するゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定される。より詳細には、分子量の数および量の平均（ＭｎおよびＭｗ）は、例えば、高圧液体クロマトグラフィーポンプを装備したモデル５１０のゲル透過クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）、Ｗａｔｅｒｓ  ４８６  ＵＶ検出器およびＷａｔｅｒｓ  ２４１０示差屈折率検出器を使用して決定される。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、溶離剤（１．０ｍＬ／分）として使用される。ポリスチレン基準は、分子量分布が狭い。
【００６７】
一般式のαアミノ酸を含む構造式のポリマーを作成する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｒ４がαアミノ酸に組み込まれている構造式（Ｉ）のポリマーの態様では、ポリマー合成について、ペンダントＲ３を有するαアミノ酸は、例えば、ジオールＨＯ−Ｒ４−ＯＨを有するペンダントＲ３を含むαアミノ酸を濃縮することによって、エステル化によりビス−α，ω−ジアミンに変換することが可能である。結果として、反応性α，ω−アミノ基のあるジエステルモノマーが形成される。続いて、ビス−α，ω−ジアミンは、セバシン酸、またはそのビス活性エステル、または、ビス−塩化アシルなどの二酸との重縮合反応を始め、エステル結合とアミド結合の両方（ＰＥＡ）を有する最終ポリマーが得られる。あるいは、例えば、構造（Ｉ）のポリマーについて、二酸の代わりに、活性化した二酸誘導体、例えば、ビス−パラ−ニトロフェニルジエステルを、活性化した二酸として使用することが可能である。さらに、ビス（ｐ−ニトロフェニル）ジカルボナートなどの、ビス−ジカルボナートを活性種として使用して、二酸の残基を含むポリマーを得ることが可能である。ＰＥＵＲポリマーの場合、エステル結合とウレタン結合の両方を有する最終ポリマーが得られる。
【００６８】
さらに詳細には、上記で開示された構造式（Ｉ）の生分解性ポリマーとして有用な不飽和ポリ（エステルアミド）（ＵＰＥＡ）の合成を、以降に説明する。
式中、
2009518289.tif 000017
および／または（ｂ）Ｒ４は−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−である。（ａ）が存在して（ｂ）が存在しない場合、（Ｉ）のＲ４は−Ｃ４Ｈ８−または−Ｃ６Ｈ１２−である。（ａ）が存在せず（ｂ）が存在する場合、（Ｉ）のＲ１は−Ｃ４Ｈ８−または−Ｃ８Ｈ１６−である。
【００６９】
ＵＰＥＡは、（１）不飽和ジオールのビス（α−アミノ酸）ジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩と飽和ジカルボン酸のジ−ｐ−ニトロフェニルエステル、または（２）飽和ジオールのビス（α−アミノ酸）ジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩と不飽和ジカルボン酸のジニトロフェニルエステル、または（３）不飽和ジオールのビス（α−アミノ酸）ジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩と不飽和ジカルボン酸のジニトロフェニルエステルのいずれかの溶液重縮合によって調製することが可能である。
【００７０】
ｐ−トルエンスルホン酸の塩は、アミノ酸残基を含むポリマーの合成における使用が公知である。ビス（α−アミノ酸）ジエステルのアリールスルホン酸塩は、再結晶化によって容易に精製されて、反応の間中アミノ基を非反応性アンモニウムトシラートの状態にするため、アリールスルホン酸塩は、遊離塩基の代わりに使用される。重縮合反応では、求核性アミノ基は、トリエチルアミンなどの有機塩基の追加によって容易に明らかになるので、ポリマー生成物は高収率で得られる。
【００７１】
構造式（Ｉ）のポリマーの場合、例えば、トリエチルアミンとｐ−ニトロフェノールをアセトンに溶解して、不飽和塩化ジカルボン酸の液滴を加えて−７８℃で攪拌し、水に注いで生成物を沈殿させることによって、不飽和ジカルボン酸のジ−ｐ−ニトロフェニルエステルは、例えば、ｐ−ニトロフェニルと不飽和塩化ジカルボン酸から合成することが可能である。適切な酸塩化物は、フマル酸、マレイン酸、メサコン酸、シトラコン酸、グルタコン酸、イタコン酸、エテニル−ブタン二酸および２−プロペニル−ブタン二酸の塩化物を含む。構造式（ＩＶ）および（Ｖ）のポリマーでは、飽和または不飽和ジオールのビス−ｐ−ニトロフェニル二炭酸が活性モノマーとして使用される。一般構造（ＸＩＩ）の二炭酸モノマーは、構造式（ＩＶ）のポリマーに用いられ、
2009518289.tif 000018
式中、Ｒ５は独立して、任意に１つまたは複数のニトロ、シアノ、ハロ、トリフルオロメチル、またはトリフルオロメトキシで置換された（Ｃ６−Ｃ１０）アリールであり、Ｒ６は、独立して（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルキルオキシまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンである。
【００７２】
α−アミノ酸および不飽和ジオールのジエステルのジアリールスルホン酸塩は、α−アミノ酸、例えば、トルエンの中のｐ−アリールスルホン酸一水和物および飽和または不飽和ジオールを混合して、水発生が最低になるまで還流温度へ加熱し、続いて冷却することによって、調製することが可能である。不飽和ジオールは、例えば、２−ブテン−１，３−ジオールおよび１，１８−オクタデカ−９−エン−ジオールを含む。
【００７３】
ジカルボン酸の飽和ジ−ｐ−ニトロフェニルエステルおよびビス−αアミノ酸エステルの飽和ジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩は、米国特許第６，５０３，５３８号Ｂ１に説明されているように調製することが可能である。
【００７４】
上記で開示された構造式（Ｉ）の生分解性ポリマーとして有用な不飽和ポリ（エステルアミド）（ＵＰＥＡ）の合成をここで説明する。構造式（Ｉ）を有するＵＰＥＡは、米国特許第６，５０３，５３８号の（ＩＩＩ）のＲ４および／または第６，５０３，５３８号の（Ｖ）のＲ１は、上記の（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンであることを除き、第６，５０３，５３８号Ｂ１の化合物（ＶＩＩ）に類似した手法で作製することが可能である。該反応は、例えば、室温で、乾燥トリエチルアミンを、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの中の第６，５０３，５３８号の前記の（ＩＩＩ）と（ＩＶ）の混合物および第６，５０３，５３８号の前記（Ｖ）に加えてから、温度を８０℃に上げて、１６時間攪拌し、反応溶液を室温まで冷却し、エタノールで希釈し、水に注いで、ポリマーを分離し、分離したポリマーを水で洗浄し、減圧下で約３０℃まで乾燥し、次いでｐ−ニトロフェノールとｐ−トルエンスルホナートについて陰性試験まで精製することによって実行する。第６，５０３，５３８号の好ましい反応物質（ＩＶ）は、リシンベンジルエステルのｐ−トルエンスルホン酸塩であり、ベンジルエステル保護基は、生分解性を与えるために（ＩＩ）から除去することが好ましいが、水素化分解は、望ましい二重結合を飽和するので、米国特許第６，５０３，５３８号の実施例２２のように、水素化分解によって除去してはならない。ベンジルエステル基は、不飽和を保つ方法によって、酸基に変換しなければならない。あるいは、第６，５０３，５３８号のリシン反応物（ＩＶ）は、不飽和を保ちながら、最終生成物で容易に除去可能なベンジルとは異なる保護基によって保護することが可能である。例えば、リシン反応物は、ｔ−ブチル（すなわち、反応物はリシンのｔ−ブチルエステルでありうる）で保護することが可能で、ｔ−ブチルは、生成物（ＩＩ）を酸で処理することによって、不飽和を保ちながら、Ｈに変換することが可能である。
【００７５】
構造式（Ｉ）を有する化合物の実施例は、第６，５０３，５３８号の実施例１の（ＩＩＩ）についてビス（Ｌ−フェニルアラニン）２−ブテン−１，４−ジエステルのｐ−トルエンスルホン酸塩で置換することによって、あるいは、第６，５０３，５３８号の実施例１の（Ｖ）についてジ−ｐ−ニトロフェニールフマラートで置換することによって、または、第６，５０３，５３８号の実施例１のＩＩＩについてビス（Ｌ−フェニルアラニン）２−ブテン−１，４−ジエステルのｐ−トルエンスルホン酸塩で置換することによって、さらに、第６，５０３，５３８号の実施例１の（Ｖ）についてビス−ｐ−ニトロフェニールフマラートで置換することによって、提供される。
【００７６】
構造式（Ｉ）または（ＩＶ）のいずれかを有する不飽和化合物では、以下が適用できる。例えば、４−アミノＴＥＭＰＯなどのアミノ置換アミノキシル（Ｎ−酸化物）ラジカルを持つ基は、凝縮剤として、カルボニルジイミダゾールまたは適当なカルボジイミドを使用して付着することが可能である。本明細書中で説明されているように、生物活性剤は、二重結合機能によって付着することが可能である。親水性は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートに結合することによって、与えられることが可能である。
【００７７】
またさらに別の態様では、本発明のポリマー粒子送達システムの形成での使用が考慮されるＰＥＡおよびＰＥＵＲポリマーは、米国特許第５，５１６，８８１号、第６，４７６，２０４号、第６，５０３，５３８号、および米国出願第１０／０９６，４３５号、第１０／１０１，４０８号、第１０／１４３，５７２号、および第１０／１９４，９６５号に記載のものを含み、それぞれの内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００７８】
生分解性のＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーは、ポリマー分子あたりに１つから複数のさまざまなαアミノ酸を含むことが可能で、平均分子量１０，０００から１２５，０００の範囲の分子量を有することが好ましい。これらのポリマーおよびコポリマーは、典型的に、標準の粘度測定方法によって決定される、２５℃で、０．３から４．０、例えば、０．５から３．５の範囲の固有の粘性を有する。
【００７９】
本発明の実施において使用が考慮されるＰＥＡおよびＰＥＵＲポリマーは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって合成することが可能である。例えば、トリブチルスズ（ＩＶ）触媒は、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド）などのポリエステルを形成するために通常使用される。しかしながら、本発明の実施における使用に適したポリマーを形成するには、広範囲のさまざまな触媒を使用することが可能なことが認識される。
【００８０】
使用が考慮されるこのようなポリ（カプラクトン）は、以下のような、例示的な構造式（Ｘ）を有する。
2009518289.tif 000019
【００８１】
使用が考慮されるポリ（グリコリド）は、以下のような、例示的な構造式（ＸＩ）を有する。
2009518289.tif 000020
【００８２】
使用が考慮されるポリ（ラクチド）は、以下のような、例示的な構造式（ＸＩＩ）を有する。
2009518289.tif 000021
【００８３】
アミノキシル部分を含む適切なポリ（ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）の例示的な合成を以下に説明する。第一の段階は、構造式（ＸＩＩＩ）のポリマーを形成するために、オクチル酸スズを触媒として使用して、ベンジルアルコールの存在下で、ラクチドとε−カプロラクトンとを共重合化することを含む。
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【００８４】
その後、ヒドロキシ末端ポリマー鎖が、構造式（ＸＩＶ）を有するポリマー鎖を形成するように、無水マレイン酸でキャップすることが可能である。
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【００８５】
この時点で、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシは、４−アミノ基とカルボン酸終端基との間の反応から生じるアミド結合によって、コポリマーに、アミノキシル部分を共有結合により結合するように、カルボン酸末端基と反応することが可能である。あるいは、マレイン酸をキャップしたコポリマーは、さらなるアミノキシル基のその後の付着のために追加のカルボン酸部分を提供するように、ポリアクリル酸と接合することが可能である。
【００８６】
ＰＥＵの構造式（ＶＩＩ）を有する不飽和化合物では、次が適用できる。例えば、４−アミノＴＥＭＰＯなどのアミノ置換アミノキシル（Ｎ−酸化物）ラジカルを持つ基は、凝縮剤として、カルボニルジイミダゾールまたは適当なカルボジイミドを使用して付着することが可能である。本明細書において説明されているように、生物活性剤などは、任意に、二重結合機能によって付着することが可能である。
【００８７】
例えば、構造式（Ｉ）を有する本発明の高分子量の半結晶ＰＥＵは、以下の反応図式１に示されているように、クロロフォルム／水系のビス−求電子性モノマーとして、ホスゲンを使用することによって、界面的に調製することが可能である。
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【００８８】
Ｌ−リシンエステルを含み、構造式（ＶＩＩ）を有するコポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）の合成は、同様な図式２によって実行することが可能である。
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【００８９】
例えば、トルエン中のホスゲン（ＣｌＣＯＣｌ）（毒性が高い）の２０％溶液（市販されている（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ，ＧＭＢＨ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、ジホスゲン（クロロギ酸トリクロロメチル）またはトリホスゲン（ビス（トリクロロメチル）カルボナート）のいずれかで置換することが可能である。毒性のより低いカルボニルジイミダゾールも、ホスゲン、ジホスゲンまたはトリホスゲンの代わりに、ビス−求電子性モノマーとして使用することが可能である。
【００９０】
ＰＥＵの合成のための一般手順
高分子量のＰＥＵを得るには、モノマーの冷却溶液を使用することが必要である。例えば、１５０ｍｌの水の中のビス（α−アミノ酸）−α，ω−アルキレンジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩の懸濁液に、無水炭酸ナトリウムを加え、室温で約３０分攪拌してから、約２〜０℃に冷却して、第一の溶液を形成する。並行して、クロロフォルム中のホスゲンの第二の溶液を約１５〜１０℃まで冷却する。第一の溶液を界面重縮合のために反応器に入れ、第二の溶液を一度に素早く加えて、約１５分間勢いよく攪拌する。続いて、クロロフォルム層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、ろ過することができる。得られた溶液は後で使用するために保管が可能である。
【００９１】
作製されたすべての例示的なＰＥＵポリマーは、クロロフォルムの溶液として得られ、これらの溶液は保管中安定している。しかしながら、例えば、１−Ｐｈｅ−４などの一部のポリマーは、分離後、クロロフォルムに溶解しなくなる。この問題を克服するため、ポリマーは、滑らかな疎水性表面上に流し込み、乾燥するまでクロロフォルムを蒸発させることによって、クロロフォルム溶液から分離することが可能である。得られたＰＥＵをさらに精製する必要はない。この手順によって得られる例示的なＰＥＵの収率と特徴は、本明細書中の表１にまとめられている。
【００９２】
浸透性ＰＥＵの調製のための一般手順
一般式のα−アミノ酸を含むＰＥＵポリマーを作製する方法をここで説明する。例えば、式（Ｉ）または（ＩＩ）のポリマーの態様では、α−アミノ酸は、例えば、ジオールＨＯ−Ｒ１−ＯＨを用いてα−アミノ酸を凝縮することによって、ビス（α−アミノ酸）−α，ω−ジオール−ジエステルモノマーに変換することが可能である。この結果、エステル結合が形成される。続いて、カルボン酸の塩化酸（ホスゲン、ジホスゲン、トリホスゲン）が、エステル結合と尿素結合の両方を有する最終ポリマーを得るために、ビス（α―アミノ酸）−アルキレンジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩と重縮合反応を始める。
【００９３】
不飽和ＰＥＵは、Ｒ１に少なくとも１つの二重結合を含む、ビス（α−アミノ酸）−アルキレンジエステルのジ−ｐ−トルエンスルホン酸塩の界面溶液凝縮によって、調製することが可能である。この目的で有用な不飽和ジオールは、例えば、２−ブテン−１，４−ジオールおよび１，１８−オクタデカ−９−エン−ジオールを含む。不飽和モノマーは、例えば、水酸化ナトリウム溶液のようなアルカリ水溶液で反応する前に溶解することが可能である。続いて、該水溶液は、例えば、クロロフォルムのような、単量体、二量体または三量体のホスゲンの等モル量を含む、有機溶媒層とともに、外から冷却しながら、激しく攪拌することが可能である。発熱反応は急速に進み、（ほとんどの場合）遷移金属、さらに、カルシウム、マグネシウム、有機溶媒に溶けたままであるポリマーが得られる。有機層は水で数回洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、蒸発させることが可能である。収率が約７５％〜８５％の不飽和ＰＥＵは、例えば、約４５℃で真空乾燥することが可能である。
【００９４】
浸透性の強力な物質を得るために、１−Ｌ−Ｌｅｕ−４および１−Ｌ−Ｌｅｕ−６などのＬ−Ｌｅｕを主材料とするＰＥＵは、以下に説明する一般的な手順を使用して作製することが可能である。このような手順は、Ｌ−Ｐｈｅを主材料とするＰＥＵに適用した場合の、浸透性の骨様物質の形成では、成功率が劣る。
【００９５】
界面重縮合の直後に得られた、クロロフォルムの中のＰＥＵの反応液または乳液（約１００ｍＬ）をガラスのビーカー内の約８０℃〜８５℃の１，０００ｍＬの水に攪拌しながら滴下して加える。ビーカーは、ビーカーの壁へのＰＥＵの付着を減らすように、ジメチルジクロロシランで疎水性にされていることが好ましい。ポリマーの溶液は、水の中で小さい液滴に分かれ、クロロフォルムはかなり激しく蒸発する。クロロフォルムが蒸発するにつれて徐々に、小さい滴が集まって小さなタール様の塊となり、粘着性のあるゴム状生成物に変化する。このゴム状生成物をビーカーから取り出して、疎水性の円筒状のガラス試験管に入れ、約２４時間約８０℃に温度調節装置で制御する。続いて、温度調節装置から試験管を取り出し、室温まで冷却してから、破壊してポリマーを得る。得られた浸透性の棒を真空乾燥機に入れて、約２４時間約８０℃にて減圧下で乾燥する。さらに、浸透性ポリマー物質を得るために当技術分野において公知の任意の手順も使用できる。
【００９６】
上記の手順により作製された高分子量の浸透性ＰＥＵの特性は、表１にまとめられているような結果をもたらす。
（表１）式（ＶＩ）のＰＥＵポリマーの特性
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＊一般的なＰＥＵの式（ＶＩ） １−Ｌ−Ｌｅｕ−４＝Ｒ１＝（ＣＨ２）４、Ｒ３＝ｉ−Ｃ４Ｈ９
１−Ｌ−Ｌｅｕ−６＝Ｒ１＝（ＣＨ２）６、Ｒ３＝ｉ−Ｃ４Ｈ９
１−Ｌ−Ｐｈｅ−６：＝Ｒ１＝（ＣＨ２）６、Ｒ３＝−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５．
１−Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＡＳ＝Ｒ１＝１，４：３，６−ジアンヒドロソルビトール、Ｒ３＝ｉ−Ｃ４Ｈ
ａ）減少した粘性は、２５℃のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、０．５ｇ／ｄＬの濃度で測定された。
ｂ）ＧＰＣ測定はＤＭＦ（ＰＭＭＡ）で実行された。
ｃ）ＴｇはＤＳＣ測定（加熱速度１０℃／分）から第二の加熱曲線から得られた。
ｄ）ＧＰＣ測定はＤＭＡｃ（ＰＳ）で実行された。
【００９７】
例示的な合成されたＰＥＵの引張強度が測定され、結果は表２にまとめられている。引張強度の測定結果は、平均の厚さが０．１２５ｍｍでクロロフォルム溶液からの成形されたダンベル形のＰＥＵフィルム（４×１．６ｃｍ）を使用し、６０ｍｍ／分のクロスヘッド速度で、Ｎｅｘｙｇｅｎ  ＦＭソフトウェア（Ａｍｔｅｋ，Ｌａｒｇｏ，ＦＬ）を使用するＰＣと統合された引張強度機（Ｃｈａｔｉｌｌｏｎ  ＴＤＣ２００）上で引張試験することにより得られた。ここで図説された例は、以下の機械的強度を有することが期待される。
１．例えば、約３５℃から約６５℃の範囲など、約３０℃から約９０℃の範囲のガラス転移温度、
２．平均の厚さが約１．６ｃｍのポリマーフィルムで、例えば、約２５Ｍｐａから約６０Ｍｐａまでなど、約２０Ｍｐａから約１５０Ｍｐａの収率で引張強度を有し、
３．平均の厚さが約１．６ｃｍのポリマーフィルムで、例えば、約５０％から約１５０％など、約１０％から約２００％のパーセントの伸びを有し、
４．平均の厚さが約１．６ｃｍのポリマーフィルムで、約５００Ｍｐａから約２０００Ｍｐａの範囲でヤング率を有する。下記表２には、この種の典型的なＰＥＵの特性がまとめられている。
（表２）
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ａ）ＴｇはＤＳＣ測定（加熱速度１０℃／分）の第二加熱曲線から得た。
【００９８】
ＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーなど、本発明のポリマー粒子送達組成物で有用なポリマーは、表面の酵素作用によって、生分解される。従って、例えば、ポリマーの粒子などのポリマーは、長期間にわたって、特定、かつ一定である制御された放出速度で、対象に対して高分子生物製剤および任意の生物活性剤を投与する。さらに、ＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーは、有害な副生成物を生じることなく、生体内で、加水分解酵素によって分解されるので、本発明のポリマー粒子送達組成物は、実質的に、非炎症性である。
【００９９】
本明細書において使用されている「分散」とは、開示されている少なくとも１つの生物活性剤が、例えば、粒子の表面に付着している、ポリマー粒子内で分散、混合、溶解、均質化、および／または共有結合（以下「分散」）することを意味する。本明細書においては、高分子分子に言及して使用されているように、「分散した」は、特に、ポリマーへの１つ以上の高分子生物製剤またはプロトマー、あるいはオリゴマーの結合を含むがこれに限定されない。
【０１００】
任意の生物活性剤は、ポリマーの運搬装置への化学的結合なく、ポリマーマトリックス内で分散することが可能であるが、生物活性または被膜分子は、使用される場合、広範囲のさまざまな適切な機能基を介して、生分解性ポリマーに共有結合することが可能であることが予想される。例えば、生分解性高分子ポリマーがポリエステルの場合、カルボキシル基鎖の終端は、ヒドロキシ、アミノ、チオなど、生物活性剤または被膜分子上の補助部分と反応させるために使用することが可能である。広範囲のさまざまな適切な試薬や反応条件が開示されており、例えば、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）およびＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌａｒｏｃｋ（１９９９）などがある。
【０１０１】
その他の態様では、生物活性剤を、アミド、エステル、エーテル、アミノ、ケトン、チオエーテル、スルフィニル、スルホニル、ジスルフィド連結を通して、本明細書中に記載されるＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵポリマーに連結させることが可能である。このような連結は、当該技術分野で知られている合成手順を使用して、適切に機能する開始物質から形成することが可能である。
【０１０２】
例えば、ある一態様では、ポリマーは、ポリマーのカルボキシル基（例えば、ＣＯＯＨ）を介して、生物活性剤に連結することが可能である。例えば、構造（Ｉ）および（ＩＶ）の化合物は、生物活性剤のアミノ機能基またはヒドロキシル機能基と反応することができ、それぞれ、アミド連結またはカルボキシエステル連結を介して付着された生物活性剤を有する生分解性ポリマーを提供する。別の態様では、ポリマーのカルボキシル基は、ハロゲン化アシル、無水アシル／無水「混合物」または活性エステル変換されるか、またはベンジル化することが可能である。その他の態様では、生物活性剤が、ポリマーのカルボキシル基だけを介して付着して、ポリマーの遊離終端を介して付着しないように、ポリマー分子の遊離ＮＨ２の終端をアシル化することが可能である。
【０１０３】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ホスホリルコリン（ＰＣ）、ヘパリンを含むグリコサミノグリカン、ポリシアル酸を含む多糖、ポリセリン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリジンやポリアルギニンを含むポリ（イオン化可能なまたは極性のアミノ酸）、キトサンやアルギナートなどなど本明細書において記載される水溶性被膜分子や、抗体、抗原やリガンドなどの標的分子も、当該技術分野で既知のとおり、生物活性剤によって占められていない活性部位をブロックするか、または、特定の身体の部位への粒子の送達を目標とするため、粒子が生産された後、粒子の外側にあるポリマーに結合することが可能である。一個の粒子のＰＥＧ分子の分子量は、実質的に、粒子に付着したさまざまなＰＥＧ分子の分子量をさまざまに変化させるために、約２００から約２００，０００の範囲の任意の分子量にすることが可能である。
【０１０４】
あるいは、生物活性剤または被膜分子は、例えば、構造式（ＶＩＩ−ＸＩ）において記載されるように、リンカー分子によって、ポリマーに付着することが可能である。すなわち、生分解性ポリマーの表面の疎水性を向上させるため、酵素活性に向けて生分解性ポリマーのアクセス性を向上させるため、および、生分解性ポリマーの放出プロファイルを向上させるために、リンカーは、生物活性剤を生分解性ポリマーに間接的に付着させるために利用することができる。ある態様では、リンカー化合物は、約４４から約１０，０００の）、好ましくは、４４から２０００の分子量（ＭＷ）を有するポリ（エチレングリコール）、セリンなどのアミノ酸、反復数１から１００のポリペプチドと、および、その他任意の適切な低分子量のポリマーを含む。リンカーは、典型的に、約５オングストロームから約２００オングストロームまで、生物活性剤を、ポリマーから分離する。
【０１０５】
さらに別の態様では、リンカーは、Ｗ−Ａ−Ｑの式の２価の基であるが、ここで、Ａは（Ｃ１−Ｃ２４）アルキル、（Ｃ２−Ｃ２４）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ２４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールで、ＷとＱはそれぞれ独立して、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
【０１０６】
上記のリンカーを説明するために使用されるように、「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−へキシルなどの直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指す。
【０１０７】
上記のリンカーを説明するために使用されるように、「アルケニル」という用語は、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖のヒドロカルビル基を指す。
【０１０８】
上記のリンカーを説明するために使用されるように、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖のヒドロカルビル基を指す。
【０１０９】
上記のリンカーを説明するために使用されるように、「アリール」という用語は６から１４までの範囲の炭素原子を有する芳香族基を指す。
【０１１０】
ある態様では、リンカーは約２から約２５のアミノ酸を有するポリペプチドとすることができる。使用が考慮される適切なペプチドには、ポリ−Ｌ−グリシン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−セリン、ポリ−Ｌ−トレオニン、ポリ−Ｌ−チロシン、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｌ−リシン−Ｌ−フェニルアラニン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リシン−Ｌ−チロシンなどが含まれる。
【０１１１】
一態様では、生物活性剤は、ポリマーに共有結合的に架橋することが可能であり、つまり、生物活性剤は、２つ以上のポリマー分子に結合している。本共有結合性架橋は、さらなるポリマー-生物活性剤のリンカーを伴っても伴わなくても実行可能である。
【０１１２】
また、生物活性剤の分子も、２つのポリマー分子間の共有結合によって、分子内架橋に組み入れることが可能である。
【０１１３】
直線ポリマーのポリペプチドへの結合は、ポリペプチド骨格上の潜在的な求核基を保護して、ポリマーまたはポリマーのリンカー構成物に結合する反応基を１つだけ残すことによって、生成される。脱保護は、当該技術分野でよく知られているペプチドの脱保護法（例えば、ＢｏｃとＦｍｏｃの化学反応）に従って実施される。
【０１１４】
本発明の一態様では、ポリペプチドの生物活性剤は、レトロ-インベルソまたは部分的にレトロ-インベルソなペプチドとして提示される。
【０１１５】
他の態様では、生物活性剤は、マトリックスにおいて光架橋性の型のポリマーと混合され、架橋後、物質は、平均直径約０．１から約１０μｍの範囲内に分散される（粉砕される）。
【０１１６】
リンカーは、まず、ポリマーまたは生物活性剤または被膜分子に付着することが可能である。合成中、リンカーを、当業者に公知であるさまざまな保護基を使用して、保護されていない形または保護された形のいずれかにすることが可能である。保護リンカーの場合、リンカーの保護されていない終端を、まず、ポリマーまたは生物活性剤または被膜分子に付着させることが可能である。その後、保護基を、Ｐｄ／Ｈ２水素化分解、弱酸性または塩基の加水分解、または当該技術分野で知られているその他任意の一般的な脱保護方法を使用して、脱保護することができる。脱保護されたリンカーは、その後、生物活性剤または被膜分子、あるいは、ポリマーに付着させることが可能である。
【０１１７】
本発明に従う生分解性ポリマーの例示的な合成（付着される分子はアミノキシルである）を以下に説明する。
【０１１８】
ポリエステルを、例えば、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシなどのアミノ置換アミノキシル（Ｎ‐酸化物）ラジカルを持つ基とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールの存在下で反応させることにより、ポリエステル鎖の端末のカルボキシル基のヒドロキシ部分をアミノ置換アミノオキシル−（Ｎ酸化物）ラジカルを持つ基と置換することができる。これにより、アミノ部分がカルボキシル基のカルボニル残基の炭素へ共有結合により結合し、アミド結合が形成される。Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールまたは適当なカルボジイミドは、ポリエステルの鎖端末のカルボキシル基のヒドロキシ部分を、例えば、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシなど、アミノキシルと反応する中間生成部分に変換する。アミノキシル反応物は、典型的に、反応物のポリエステルに対するモル比が１：１から１００：１の範囲で使用される。Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールに対するアミノキシルのモル比は、約１：１が好ましい。
【０１１９】
典型的な反応は次のとおりである。ポリエステルは、反応溶媒に溶解して、反応は、溶解に利用された温度で容易に実行される。反応溶媒は、ポリエステルが溶解する任意の溶媒とすることができる。ポリエステルが、ポリグリコール酸またはポリ（グリコリド−Ｌ−ラクチド）（グリコール酸のＬ−乳酸に対するモノマーのモル比が５０：５０より大きい）の場合、１１５℃から１３０℃で非常に純化された（９９．９＋ ％純度）ジメチルスルホキシドまたは、室温のＤＭＳＯがポリエステルの溶解に最適である。ポリエステルが、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−ＤＬ−乳酸またはポリ（グリコリド−Ｌ−ラクチド）（グリコール酸のＬ−乳酸に対するモノマーモル比が５０：５０以下）の場合、室温から４０〜５０℃の、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびクロロフォルムがポリエステルの溶解に最適である。
【０１２０】
ポリマー−生物活性剤または高分子生物製剤の連結
一態様では、本明細書中において記載される本発明のポリマー粒子送達組成物を合成するために使用されるポリマーは、ポリマーに直接連結した１つ以上の高分子生物製剤または生物活性剤を有する。ポリマーの残基は、１つ以上の高分子生物製剤または生物活性剤の残基に連結することが可能である。例えば、ポリマーの１つの残基は、高分子生物製剤または生物活性剤の１つの残基に直接連結することが可能である。２つ以上の原子価のある高分子生物製剤の場合、高分子生物製剤は、ポリマーの２つ以上の残基に直接連結することが可能である。あるいは、２つ以上、複数、または、様々な治療もしくは苦痛緩和作用を有する高分子生物製剤と生物活性剤の混合物を、ポリマーに直接連結することが可能である。しかしながら、それぞれの高分子生物製剤または生物活性剤の残基は、少なくとも１つの結合点を介して、ポリマーの対応する残基に連結することが可能なので、１つ以上の高分子生物製剤または生物活性剤の残基の数は、ポリマーの残基上の使用されていない原子価の数に対応させることが可能である。
【０１２１】
本発明の組成物や方法は、高分子生物製剤として、すべての種類のＲＮＡとＤＮＡの使用を包含する。ある態様では、高分子生物製剤は、核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。さらに特定すると、核酸は任意のＤＮＡまたはＲＮＡである。ＲＮＡは、メッセンジャー（ｍＲＮＡ）、トランスファー（ｔＲＮＡ）、リボソーム（ｒＲＮＡ）および干渉（ｉＲＮＡ）を含む。干渉ＲＮＡは、転写後の遺伝子サイレンシングに関与する任意のＲＮＡで、センス鎖とアンチセンス鎖から構成される、二重らせんＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない。ＲＮＡの干渉のメカニズムにおいて、ｄｓＲＮＡは細胞に入り、酵素ＤＩＣＥＲによって２１−２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡに消化される。連続的な分裂事象によって、ＲＮＡは１９−２１のヌクレオチドに分解される。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ヌクレアーゼ複合体に結合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、ＲＩＳＣを形成する。活性化したＲＩＳＣは、塩基対合の相互作用によって、同種の転写物を標的とし、ｍＲＮＡを分裂して、標的の遺伝子の表現を抑制する。最近の研究では、本機構は、大部分が、ｍｉＲＮＡと同じである（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．（２００４）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１０２：３）ことが示唆されている。このように、ポリマーと関連付けられたｉＲＮＡは、ファーゴサイトーシスまたはピノサイトーシスによって、細胞に送達され、正常な生体内作用の経路に入るように放出される。
【０１２２】
遺伝子表現のための新たな配列特異的阻害剤である、小型の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）には高い治療潜在性があるが、このような分子の治療剤としての開発は、生体内のｓｉＲＮＡの急速な生分解により妨げられる。従って、ｓｉＲＮＡを治療用に使用するための主な成功要件は、遺伝子サイレンシング核酸の保護である。本発明では、ｓｉＲＮＡに対するこのような保護は、それぞれ、構造式ＩＩＩ、ＶおよびＶＩＩで表されるＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵ分子など、本明細書において記載された構造式ＶＩまたはＶＩＩの生分解性ポリマーのＶまたはＰＥＵにｓｉＲＮＡが結合することによって提供され、当該技術分野ではよく知られた手順を使用したＲＮＡ（またはＤＮＡ）の結合の機会が提供される。
【０１２３】
例えば、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖の送達のための本発明の粒子の加工においては、ｉＲＮＡのセンス鎖は、３’または５’の端末のいずれかで、ポリマーの活性基に結合される。アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの正常な塩基対合のみをもって、ポリマーに関連付けられており、（つまり、凝集形）、このアンチセンス鎖が反応溶液中に提供される。あるいは、センス鎖は、１つのポリマー鎖に結合され、アンチセンス鎖は別のポリマー鎖に結合されることができる。鎖の塩基対合は、粒子を安定化させる。どちらの場合も、さらなる非結合ＲＮＡを粒子に加えることが可能である。粒子の生分解の間に粒子から分裂した二重らせんＲＮＡまたは、センス鎖から遊離したアンチセンス鎖は、ｉＲＮＡの正常な生物学的経路に入る。
【０１２４】
このような手順の例は以下に模式的に図説される。
2009518289.tif 000028
ＤＮＡまたはＲＮＡのＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵへの結合は、以下に示された３’−または５’−アミノ修飾剤の使用によって、しかしこれに限定されず、実現することが可能である。
2009518289.tif 000029
【０１２５】
このようなアミノ修飾剤を使用して、当業者は、そのアミド結合によって、ポリマーにオリゴヌクレオチドを共有結合的に結合させることが可能である。あるいは、本明細書において記載したような適切な二重機能リンカーをポリマーと核酸の間に組み込むことが可能である。同様に、脂肪ならびに単糖および多糖などのその他の生物活性分子をＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーに結合させることが可能である。
【０１２６】
本明細書で使用されているように、「ポリマーの残基」とは、１つ以上のオープンな原子価を有するポリマーのラジカルを指す。ラジカルが生物活性剤の残基に付着される際、生物活性が実質的に保持されるという条件の下で、本発明のポリマーの合成的に実現可能な任意の1つもしくは複数の原子または官能基(例えば、ポリマーの骨格上またはペンダント基上)を除去して、オープンな原子価を提供することが可能である。さらに、ラジカルが生物活性剤の残基に付着される際、生物活性が実質的に保持されるという条件の下で、合成的に実現可能な任意の官能基(例えば、カルボキシル)をポリマー上で作成して(例えば、ポリマー骨格またはペンダント基上で)、オープンな原子価を提供することが可能である。望ましい連結に基づいて、当業者は、当技術分野で公知の手順を使用して、本発明のポリマーから派生しうる官能基化された開始物質を適切に選択することができる。
【０１２７】
本明細書で使用されているように、「構造式（＊）の化合物の残基」とは、１つ以上のオープンな原子価を有する、本明細書で記載されるポリマー式（Ｉ）および（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）の化合物の残基を指す。ラジカルが生物活性剤の残基に付着される際、生物活性が実質的に保持されるという条件の下、前記化合物の合成的に実現可能な任意の1つもしくは複数の原子または官能基(例えば、ポリマーの骨格上またはペンダント基上)を除去して、オープンな原子価を提供することが可能である。さらに、ラジカルが生物活性剤の残基に付着される際、生物活性が実質的に保持されるという条件の下、合成的に実現可能な任意の官能基(例えば、カルボキシル)を、式（Ｉ）および（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）の化合物上で作成して（例えば、ポリマー骨格またはペンダント基上で）、オープンな原子価を提供することが可能である。望ましい連結に基づいて、当業者は、当技術分野で公知の手順を使用して、式（Ｉ）および（ＩＩＩ〜ＶＩＩ）の化合物から派生しうる官能基化された開始物質を適切に選択することができる。
【０１２８】
例えば、生物活性剤の残基は、アミド(例えば−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）−）、エステル（例えば−ＯＣ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、エーテル（例えば−Ｏ−）、アミノ（例えば−Ｎ（Ｒ）−）、ケトン（例えば−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオエーテル（例えば−Ｓ−）、スルフィニル（例えば−Ｓ（Ｏ）−）、スルホニル（例えば−Ｓ（Ｏ）２−）、ジスルフィド（例えば、−Ｓ−Ｓ−）または直接（例えばＣ−Ｃ結合）連結（ここでＲは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）を通して、構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物の残基に連結することが可能である。このような連結は、当技術分野で公知の合成手順を使用して、適切に官能基化された開始物質から形成することが可能である。望ましい連結に基づいて、当業者は、構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物の残基から、および当技術分野で公知の手順を使用して生物活性剤の所与の残基またはアジュバントから、派生しうる適切に官能基化された開始物質を選択することができる。生物活性剤またはアジュバントの残基は、構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物の残基の合成的に実現可能な任意の位置に連結することが可能である。さらに、本発明は、構造式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物に直接連結された生物活性剤またはアジュバント生物活性剤の複数の残基を有する化合物も提供する。
【０１２９】
ポリマー分子に連結可能な高分子生物製剤および生物活性剤の数は、典型的には、ポリマーの分子量および組み入れられた官能基の相当量に依って決定しうる。例えば、構造式（Ｉ）の化合物の場合、ｎは約５から約１５０であり、好ましくは約５から約７０であり、最大約１５０までの高分子生物製剤または生物活性剤の分子（すなわち、その残基）が、ポリマーの側基と生物活性剤が反応することによって、ポリマー（すなわち、その残基）に直接連結することが可能である。不飽和ポリマーでは、生物活性剤は、ポリマーの二重（または三重）結合に反応することも可能である。
【０１３０】
ポリマー分子に連結可能な高分子生物製剤および生物活性剤の数は、典型的には、ポリマーの分子量に応じて決定しうる。例えば、構造式（Ｉ）の飽和化合物の場合、ｎは約５から約１５０であり、好ましくは約５から約７０であり、最大約１５０までの生物活性剤（すなわち、その残基）が、ポリマーの側基と生物活性剤が反応することによって、ポリマー（すなわち、その残基）に直接連結することが可能である。不飽和ポリマーでは、生物活性剤は、ポリマーの二重（または三重）結合に反応することも可能である。
【０１３１】
本明細書に記載のＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーは、水をわずかしか吸収しないので、小さい親水性分子が、親水性表面のチャネルから拡散することが可能である。この特徴によって、これらのポリマーは、このような分子の制御された放出を調節するように、粒子上の被膜としての使用に適している。水の吸収もまた、ポリマーの生体適合性およびこのようなポリマーに基づくポリマー粒子送達組成物の生体適合性を向上させる。さらに、ＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵポリマーの部分的な親水性によって、インビボで体温にて粒子として送達されると、粘着性となり凝集する傾向がある。このように、ポリマー粒子は、皮下注射針または針のない注射によって局所送達のために皮下または筋内注射されると、自然にポリマーデポーを形成する。直径平均が体内を効率的に循環しない大きさである約１ミクロンから約５００ミクロンの範囲の粒子は、このようなポリマーデポーをインビボで形成するのに適している。あるいは、経口投与の場合、消化管は、たとえば、約２０ナノメートルのナノ粒子から、最大約１０００ミクロンの平均直径のミクロ粒子まで、はるかに広範囲の粒子サイズに対して許容可能である。
【０１３２】
粒子内で高分子生物製剤をカプセル化するための方法
水溶性ではないが、本明細書に記載のＰＥＡ、ＰＥＵＲ、およびＰＥＵの種類は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの強い有機溶媒、ならびにヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）およびテトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）などの高極性のフッ素化溶媒に溶かすことができる。これらの２つの溶媒種類によって、２つの全く異なるカプセル化技術となるが、どちらも、非混和性溶媒の乳化に基づく。例えばエタノールとは異なり、どちらの種類の溶媒も、非脱水状態であり、結合水を脱安定化する必要がないことを留意することが重要である。さらに、金属イオンおよび界面活性剤のような、生物学的安定性および組み立ての他のイオン性のエンハンサーとともに、水分子を追加するとこれらの強力な有機溶媒の有意なドーピングが可能であり、本発明の組成物および方法で使用されるポリマー粒子内での高分子生物製剤のカプセル化が増強される。
【０１３３】
カプセル化の方法１：有機溶媒中の水（ｗ／ｏ乳化）
驚くべきことに、ほとんどの高分子生物製剤の折りたたみ構造は、ＤＣＭなどの強い有機溶媒では安定でないが、Ｚｎ−インシュリンなどの極めてわずかな高分子生物製剤の小型の結晶は強い有機溶媒において安定である。以下の段階は、Ｚｎ−インシュリンなど、強い有機溶媒で安定である高分子生物製剤の小型の結晶をカプセル化するために使用することができる。
【０１３４】
Ｚｎ−インシュリンのナノ／ミクロの結晶は、溶解相と非溶解相との間に、結合水の結晶体を保存するような様式で、Ｚｎ−インシュリンのミクロ滴定によって調製される。
【０１３５】
界面活性剤−Ａの存在下で、ＤＣＭ中のＰＥＡのような、ポリマーと結晶が混合されて、液体と固体のスラリーを形成する。僅かに水分を含む液体と固体のスラリーは、界面活性剤−Ｂを含むバルク水に乳化される。乳化のエネルギーは、ボルテックスの後に、超音波処理、その後に再びボルテックスという手順によって提供される。相の分離は、ポリマーがＺｎ−インシュリンの結晶体を粒子に包みこむように、水／有機の界面で生じる。
【０１３６】
揮発性の有機相が、回転蒸発によって除去される。重要なことは、本手順は、非揮発性の残留水が粒子のＺｎ−インシュリンとともに残ることができるように、完全には乾燥させないことである。こうして形成される粒子の凝集物は、界面活性剤−Ｃを含む水に再分散することが可能である。
【０１３７】
粒子のこのような分散は、運搬およびや保管が簡単なように、ミクロ結晶体のＺｎ−インシュリンおよび結合水を含むポリマー粒子の粉末へと任意で凍結乾燥できる。凍結乾燥粒子は、本明細書に記載のように、また当技術分野で知られているように、投与に適した媒体に再構成することが可能である。
【０１３８】
カプセル化の方法２：非極性有機物中の有機油（ｏ／ｏ）
本方法はインシュリンで説明されるが、一般的な高分子生物製剤に適用可能である。インシュリンモノマーは、小型で、共有結合性のジスルフィド結合によって強力に安定化される。対照的に、ほとんどのタンパク質はインシュリンより大きく、本質的に安定ではない。
【０１３９】
Ｚｎ−インシュリンは、温かいＨＦＩＰ／ＴＦＥ中にＰＥＡまたはＰＥＵＲと共に溶解する。（一般的に、塩、イオンおよび／または生物学的に適合可能な界面活性剤などの他の分子を、当業者に知られているように、以下のステージ（ｉｉｉ）の間のミクロ結晶化により、生物製剤の安定化を促すように、追加することが可能である）。
【０１４０】
ポリマー−生物製剤の混合物は、界面活性剤−Ｄを含むバルクの綿実油に乳化される。乳化のエネルギーは、高いｒｐｍで混合することによって提供され、相分離はｏ／ｏ界面で生じるので、ポリマーが、Ｚｎ−インシュリンを含む内側の極性有機相を粒子の中に包み込む。
【０１４１】
油の有機相は、その後、真空フィルターを通してヘキサンの中で洗浄することによって除去されて、揮発性溶剤（ヘキサン、ＨＦＩＰ、ＴＦＥ）は、凍結乾燥によって除去される。重要なことは、本手順によって、非揮発性結合水は、Ｚｎ−インシュリンとともに残留することができるので、粒子の収縮する極性内面で、インシュリンオリゴマーの結晶化を促進することである。
【０１４２】
その結果得られた粒子の凝集物は、界面活性剤Ｅを含む水中に再分散される。界面活性剤Ａ〜Ｅを当業者は、手近な粒子分子を溶解する能力によって選択することができるが、界面活性剤Ａ〜Ｅが、例えば、界面活性剤Ａ〜Ｅに十分である１、２または３つの生物学的に適合可能な界面活性剤など、少数の生物学的に適合可能な界面活性剤から選択される場合もある。この分散物は、任意で、再凍結乾燥させ、結晶体Ｚｎ−インシュリン及び結合水を含むポリマー粒子の粉末にすることができる。
【０１４３】
これらの方法の目的は、生体自体と取り巻くポリマー両方との相互作用を促進することによって、生物製剤を安定化させることである。ほとんどの生物製剤でこれを達成するために、疎水性とイオン性両方の相互作用の混合が重要で、イオン性結合の適切な強度が特に重要である。
【０１４４】
本明細書に含まれる実施例は、段階（ｉｉ）で遊離−ＣＯＯＨ  ＣＯ−ポリマーバージョンを含むことによって、未変化のポリマーと比較して、Ｚｎ−インシュリンの充填と安定性の両方が増強されることを示す。これは、−ＣＯＯＨと生物製剤の主要アミンまたは亜鉛との間の局部電界相互作用のためであると考えられる。さらに、本明細書に含まれる実施例は、充填と安定性が、段階（ｉ）でＺｎ−インシュリンを、次のように予め調製されたＺｎ−インシュリン−ＰＥＡの製剤と置換することによって、さらに増強されうることを示す。
【０１４５】
ポリマー−生物製剤結合体による、生物製剤のオリゴマー化および結晶化のシーディング方法
ここで、遊離インシュリンとして説明される高分子生物製剤のモノマーは、本明細書に記載れ、当技術分野で知られている方法によって、ＰＥＡ−Ｈ（式ＩＩＩ；Ｒ２＝Ｈ）に結合される。インシュリンの場合、ＡとＢの鎖が１つのプロトマーを形成して、２つの鎖は、２つのジスルフィド結合によって共有連結される。アミド結合形成によるポリマーへの結合は、インシュリンプロトマーの鎖のいずれかまたは両方である可能性がある。
【０１４６】
続いて、遊離インシュリンが、Ｚｎの存在中で、オリゴマー化と結晶化を促進する条件で、追加される。オリゴマー化により、５つの追加のモノマーの存在下で、インシュリン結合体の再フォールドが安定化すると考えられる。一部の場合には、あるパーセンテージのポリマー鎖がこの六量体化によって架橋されると予測できる（ここで六量体は、複数の結合体を含むが、一般的には、Ｚｎ−六量体１つにつき、１つの結合インシュリンモノマーが存在する）。架橋のパーセンテージも、インシュリンの充填の密度、ポリマー鎖あたりの結合体の量などの要因、および遊離インシュリンに対する結合体の相対量に依存する。これらの固定Ｚｎ−六量体は、その周囲の近接する過剰な遊離Ｚｎ−六量体の結晶化の種となる。
【０１４７】
結合体および遊離インシュリンの混合物全体は、凍結乾燥によって濃縮され、９５％までの遊離インシュリンを含む粉末になるが、それでも、ポリマーの存在により、その後の処理段階の間、有意に保護され、強化される。
【０１４８】
これらの方法の一般的適用
インシュリンが高分子生物製剤の例として、本発明を説明するために使用されてきたが、原則として、本明細書に記載される組成物および方法はいかなる高分子の保存および送達にも適用することが出来る。重要な特性は、アミノ酸を主材料とするポリマーの特性を使用して高分子のマイクロ凝縮の安定性を増強することである。これらのマイクロ凝縮は真性結晶性、または部分的に結晶性のアレイを、オリゴマーまたはモノマーのいずれかで含むことが出来る。
【０１４９】
原則として、いかなる高分子も本方法により、保護し送達することが出来る。
【０１５０】
また合成ワクチン調合物は、抗原の構造が保存される、この種類の製剤によって改良され、抗体認識を可能にし、Ｂ−細胞応答ならびにＴ−細胞応答の増強につながる。
【０１５１】
本発明のポリマー粒子送達組成物の使用に適した粒子は、非混和溶剤技術を用いて、作成することが出来る。一般的に、これらの方法は、２つの非混和液のエマルジョンの調製を伴う。単一エマルジョン法は、少なくとも１つの疎水性生物活性剤を組み込むポリマー粒子を作成するために使用することが出来る。単一エマルジョン法において、粒子に組み込まれる生物活性剤は最初に溶剤中でポリマーと混合され、それから界面活性剤のような表面安定剤を伴う水溶液で乳化される。本方法において、疎水性生物活性剤結合体を伴うポリマー粒子が形成され、粒子における疎水性結合体は水溶液への顕著な溶出なしに安定である水溶液に懸濁されるが、そのような分子は筋肉組織のような生体組織に溶出する。
【０１５２】
ポリペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、細胞などを含む大抵の生物製剤は親水性である。二重エマルジョン法を使用して、内部水相と、そこに分散される任意の親水性生物活性剤を含むポリマー粒子を生成することが出来る。二重エマルジョン法において、水相または水に溶解される親水性生物活性剤を最初にポリマー脂溶性液で乳化して第一エマルジョンを形成し、それから最初のエマルジョンを水に入れ再び乳化して第二エマルジョンを形成し、ここで連続的な高分子相と分散相中に水性高分子生物製剤とを有する粒子が形成される。
【０１５３】
界面活性剤および添加剤は両方の乳化で使用され粒子の凝集を妨げることが出来る。水に混和されないクロロフォルムまたはＤＣＭは、ＰＥＡおよびＰＥＵＲポリマーのための溶剤として使用されるが、その後、調製において、その溶剤は当技術分野において公知の方法を用いて除去される。
【０１５４】
しかしながら、水難溶性の特定の生物活性剤に対して、これらの２つのエマルジョン方法には限界がある。本文脈において、「水難溶性」とは、タキソールのような、真の脂溶性薬よりも疎水性が低いが、多くの生物製剤のように真の水溶性薬よりも親水性が低い、生物活性剤を意味する。これらの種類の中間化合物は、単一エマルジョン粒子への高充填および安定したマトリックス化には親水性過ぎるが、二重エマルジョン内での高充填および安定性を得るには疎水性過ぎる。そのような場合、ポリマー層は、図７で図式的に描写されるように、三重エマルジョンプロセスを用いて、ポリマーおよび薬物から作られた粒子上に水難溶性でコーティングされる。本方法は、比較的低い薬物充填（約１０％ｗ／ｗ）を提供するが、構造的安定性および制御された薬物放出率を示す。
【０１５５】
三重エマルジョンプロセスにおいて、第一エマルジョンは生物活性剤をポリマー液に混合し、混合物を水溶液内で、界面活性剤またはジ−（ヘキサデカノイル）ホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ；天然脂質の短鎖誘導体）のような脂質で乳化することにより作成される。このようにして、活性剤を含む粒子が形成され、水中に懸濁して第一エマルジョンが形成される。第二エマルジョンは第一エマルジョンをポリマー液へ入れ混合液を乳化することにより形成され、その結果、中にポリマー／薬物粒子を含む水滴がポリマー液内に形成される。水および界面活性剤または脂質は粒子を分離し、粒子をポリマー液に溶解する。第三エマルジョンは、第二エマルジョンを界面活性剤または脂質の水溶液へ入れ、混合液を乳化し、最終粒子を水中において形成することによって形成される。結果として得られる粒子構造は、図７に説明されるように、中心にポリマー及び生物活性剤によって作製される１つ以上の粒子を有し、その周りを界面活性剤または脂質のような表面安定剤が囲み、純粋なポリマー殻で覆われる。表面安定剤および水は、ポリマー被膜の溶剤が被膜内の粒子に接触することおよびそれらを溶解することを防ぐ。
【０１５６】
三重エマルジョン方法による生物活性剤の充填を増加するために、水難溶性を有する活性剤を、ポリマー被膜なしに、また生物活性剤を水に溶解することなく、第一エマルジョンにおいて表面安定剤でコーティングすることが出来る。この第一エマルジョンにおいて、水、表面安定剤および活性剤は同様の体積または、それぞれ、（１から３）：（０．２から約２）：１の範囲の体積比を有する。この場合、水は、活性剤を溶解するためではなく、生物活性剤を表面安定剤の力で保護するために使用される。続いて、二重および三重エマルジョンが前述のように調製される。本方法は、最大５０％までの薬物を充填することが出来る。
【０１５７】
代わりとしてまたは追加として、前述の単一、二重または三重エマルジョン方法において、粒子を作成するポリマーを使用する前に、生物活性剤または高分子生物製剤を、本明細書に記載されるポリマー分子に結合することができる。さらなる代わりの方法として、生物活性剤または高分子生物製剤を、粒子の生成の後、本明細書に記載される粒子の外側上でポリマーに結合することが出来る。
【０１５８】
多くの乳化技術は上述のエマルジョンを作成する際に使用できる。しかし、エマルジョンを作成する現在の好ましい方法は、水に混合されない溶剤を使用することによるものである。例えば、単一エマルジョン方法において、乳化手順はポリマーを溶剤で溶解する段階、高分子生物製剤および／または生物活性剤の分子で混合する段階、水へ入れる段階、ならびにその後ミキサーおよび／または超音波破砕機で撹拌する段階からなる。粒子の大きさは、撹拌速度ならびに／またはポリマー、生物活性剤、および表面安定剤の濃度を制御することで、制御されることができる。被膜が使用される場合、被膜の厚さは、第二エマルジョンと第三エマルジョンの比率を調節することにより制御することができる。
【０１５９】
適したエマルジョン安定剤としては、マンナイドモノオレ−ト（mannide monooleate）、デキストラン７０，０００、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコールエーテルなどの非イオン界面活性剤が挙げられることができ、そのすべては、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから市販され容易に手に入る。界面活性剤は、約０．３％から約１０％の濃度で存在し、好ましくは、約０．５％から約８％、さらに好ましくは、約１％から約５％で存在する。
【０１６０】
本発明の粒子送達組成物からの少なくとも１つの高分子生物製剤の放出速度は、被膜の厚さ、粒子の大きさ、構造、および被膜の密度を調節することによって、制御することができる。被膜の密度は、被膜に結合された生物活性剤の充填を調節することによって、調節することができる。例えば、被膜が生物活性剤を含まない場合、ポリマー被膜は最も密度が高く、粒子の内側からの高分子生物製剤または生物活性剤は被膜を最もゆっくりと溶出する。それに反して、生物活性剤が、被膜のポリマーに充填される場合（すなわち、混合または「マトリックス化」される場合）、または代わりとして、被膜のポリマーに結合される場合、いったん生物活性剤が被膜の外部表面から始まって、ポリマーから遊離し、溶出すると、被膜は多孔性になる。それによって、粒子の中心の高分子生物製剤または任意の生物活性剤は、増加した速度で溶出することができる。被膜における充填が高ければ高いほど、被膜層の密度は低くなり、溶出速度は高くなる。被膜における生物活性剤の充填は外側被膜の下の粒子内部で高分子生物製剤よりも低くも高くも成り得る。粒子からの高分子生物製剤および／または生物活性剤の放出速度もまた、粒子を上述のように調合された異なる放出速度で混合することにより、制御することができる。
【０１６１】
二重および三重エマルジョンポリマーの作成方法の詳細説明は、Ｐｉｅｒｒｅ  Ａｕｔａｎｔら，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ／ｏｒ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，米国特許第６，０２２，５６２号；Ｉｏｓｉｆ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒｏｓｃａら，Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ９９（２００４）２７１−２８０；Ｌ．  Ｍｕ，Ｓ．Ｓ．Ｆｅｎｇ，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）：ＰＬＧＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ＴＰＧＳ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ８６（２００３）３３−４８；Ｓｏｍａｔｏｓｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｗ／Ｏ／Ｗ−ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ，１２６（１９９５）１２９−１３８、およびＦ．Ｇａｂｏｒ，Ｂ．Ｅｒｔｌ，Ｍ．Ｗｉｒｔｈ，Ｒ．Ｍａｌｌｉｎｇｅｒ，Ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎｐｏｌｙ（ｄ，ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ，１６（１）（１９９９）１−１２に見られることができ、それぞれは、全体で本明細書に組み入れられる。
【０１６２】
高分子生物製剤および任意水溶性生物活性剤の送達のためのなおさらなる態様において、粒子は循環への送達のために約２０ｎｍから約２００ｎｍの平均直径を有するナノ粒子へ作り変えることができる。ナノ粒子は、単一エマルジョン方法によって、その中で分散された、すなわち、本明細書に記載の、エマルジョンへ混合された、またはポリマーへ結合された高分子生物製剤で作成することができる。ナノ粒子は、生物活性剤に結合した、本明細書に記載のＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵのポリマーを含むミセル組成物としても提供することができる。ミセルは水溶液において形成されるため、任意に水溶性生物活性剤は、ミセルに同時に溶剤なしで充填することができる。
【０１６３】
さらに具体的には、図１０に描写される、該生分解性ミセルは、水溶性ポリマー鎖に結合される疎水性ポリマー鎖から形成される。ミセルの外側部分は主に、ポリマーの水溶性のイオン性部分または極性部分からなる一方、ポリマーの疎水性部分は主にミセルの内部に分割し、ポリマー高分子を一緒に保持する。
【０１６４】
該ポリマーの生分解性疎水性部分は、本明細書に記載のようにＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵのポリマーから作成される。強い疎水性のＰＥＡ、ＰＥＵＲまたはＰＥＵの区分のため、カルボン酸フェノキシプロペン（ＣＰＰ）および／またはロイシン−１，４：３，６−ジアンヒドロ−Ｄ−ソルビトール（ＤＡＳ）のような構成要素は高分子繰り返し単位において含めることができる。一方で、ポリマーの水溶性部分はポリエチレングリコール、ポリグリコサミノグリカンまたは多糖類の繰り返し交互単位および最低１つのイオン化可能なまたは極性のアミノ酸を含み、繰り返し交互単位は実質的に同様な分子重量を有し、ポリマーの分子重量は約１０ｋＤから約３００ｋＤの範囲である。繰り返し交互単位は約３００Ｄから約７００Ｄの範囲の実質的に同様な分子重量を有することができる。ポリマーの高分子重量が１０ｋＤを越える、１つの態様において、アミノ酸単位の少なくとも１つはイオン性であるか、またはセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リシンおよびアルギニンから選択された極性アミノ酸である。１つの態様において、１ブロックのグルタメートまたはアスパルテートのようなイオン化可能なポリ（アミノ酸）含むイオン化可能なアミノ酸の単位をポリマーに含めことができる。本発明のミセル組成物はさらに、ポリマーの水溶性部分におけるイオン化可能なアミノ酸の少なくとも一部がイオン化されるｐＨ値で薬学的に許容される水媒体を含んでもよい。
【０１６５】
ポリマーの水溶性部分の分子量が高ければ高いほど、ミセルの多孔率は大きくなり、かつ高分子生物製剤および水溶性生物活性剤のミセルへの充填は高くなる。１つの態様においては、それゆえ、ポリマーの完全な水溶性部分の分子量は約５ｋＤから約１００ｋＤの範囲である。
【０１６６】
一度形成されると、ミセルは保管と輸送のために凍結乾燥され、上述の水媒体に再構成されることができる。しかし、凍結乾燥プロセスによって変性する特定のタンパク質のような高分子生物製剤または生物活性剤を含むミセルを凍結乾燥することは推奨されない。
【０１６７】
ミセル内の荷電された部分は、水溶液内で部分的にお互いに分離し、水溶性高分子生物製剤および任意の水溶性生物活性剤の吸収のためのスペースを作る。同様のタイプの荷電を持つイオン化鎖はお互いに反発し、より多くのスペースを作る。イオン化ポリマーはまた、高分子生物製剤を引き付け、マトリックスへ安定性を提供する。さらに、ミセルの水溶性外部は、イオン化部位が高分子生物製剤および任意の生物活性剤によって取られた後、体液において、ミセルがタンパク質へ接着するのを防ぐ。このタイプのミセルは、ミセル体積の９５％までという非常に高い多孔率を有し、水溶性高分子生物製剤およびポリペプチド、ＤＮＡ、およびその他の生物活性剤のような追加水溶性生物活性剤の高充填を可能にする。ミセルの粒子の大きさの範囲は、約２０ｎｍから約２００ｎｍであり、約２０ｎｍから約１００ｎｍが血液内での循環には、好ましい。
【０１６８】
粒の大きさは、例えば、例としてヘリウムネオンレーザを組み込むスペクトロメータを用いたレーザー光散乱によって測定されることができる。一般的に、粒子の大きさは、室温で測定され、当該サンプルの複数回の分析を必要とし（例えば、５〜１０回）、粒子直径の平均値を得る。粒子の大きさは、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用しても、容易に計測することができる。そのようにするためには、乾燥粒子が約１００オングストロームの厚さまで金／パラジウム混合物でスパッタコートされ、それから走査型電子顕微鏡を用いて測定される。または、粒子形態のもしくはそうでないポリマーは、当技術分野において周知であり、後述の通りの任意の複数の方法を用いて、高分子生物製剤へ、またはその少なくとも１つのプロトマーへ、直接的に共有結合することができる。高分子生物製剤内容量は、概して、ポリマーに対して約０．１％から約４０％（ｗ／ｗ）の生物活性剤を示す量であり、さらに好ましくは、約１％から約２５％（ｗ／ｗ）の生物活性剤であり、なおさらに好ましくは、約２％から約２０％（ｗ／ｗ）の生物活性剤である。高分子生物製剤の割合は、より詳細に下記に説明されるように、望まれる投与量および治療される状態によって変わる。
【０１６９】
本発明の生分解性ポリマー粒子送達組成物への分散およびそれからの放出のための生物活性剤はまた、抗増殖剤、ラパマイシンおよびその類似体または誘導体のいずれか、パクリタキセルまたはそのタキサン類似体もしくは誘導体のいずれか、エベロリムス、シロリムス、タクロリムスまたはそのすべての〜リムスと命名された薬のファミリー、およびシンバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチンのようなスタチン類、１７ＡＡＧ（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）のようなゲルダナマイシン；エポチロンＤおよびその他エポチロン類、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシ−ゲルダナマイシンおよびその他の熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）のポリケチド阻害剤、シロスタゾールなども含む。
【０１７０】
さらに、本発明のポリマー粒子送達組成物において使用されるポリマー内での分散を考慮した生物活性剤は、それらの分解の間にポリマー粒子から遊離するかまたは溶出される場合に、内皮細胞によって内因的に生産される、一酸化窒素のような治療用自然創傷治癒薬剤の内因性生産を促進する薬剤を含む。または、分解の間にポリマーから放出された生物活性剤は、内皮細胞による自然創傷治癒プロセスを促進する際に直接的に活性にする場合がある。これらの生物活性剤は、一酸化窒素を供与、転移、もしくは放出するか、一酸化窒素の内因性レベルを高めるか、一酸化窒素の内因性合成を刺激するか、あるいは、一酸化窒素シンターゼの基質として機能する任意の薬剤、または平滑筋細胞の増殖を阻害する任意の薬剤であることができる。そのような薬剤の例として、アミノキシル、フロキサン、ニトロソチオール、ニトレートおよびアントシアニン、アデノシンのようなヌクレオシド、およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のようなヌクレオチド、アセチルコリンおよび５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン／５−ＨＴ）のような神経伝達物質／神経修飾物質、アドレナリンおよびノルアドレナリンのようなヒスタミンならびにカテコールアミン、スフィンゴシン−１−リン酸およびリゾホスファチジン酸のような脂質分子、アルギニンおよびリシンのようなアミノ酸、ブラジキニン、Ｐ物質ならびにカルシウム遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）のようなペプチド、およびインシュリン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のようなタンパク質、またトロンビンが挙げられる。
【０１７１】
図２に示されるように、分子および生物活性剤のリガンドをコーティングするさまざまな生物活性剤は、例えばポリマー粒子の表面へ共有結合することができる。追加の高分子生物製剤および標的ポリペプチド（例えば、抗原）および薬のような生物活性剤などは、ポリマー粒子の界面へ共有結合することができる。さらに、抗体もしくはポリペプチドの接着のためのリガンドとしてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または粒子が患者の非標的生体分子および表面にくっつくことを阻止するための、粒子の表面上で接着部位を阻害する手段としてのホスファチジルコリン（ＰＣ）のような被膜分子もまた表面結合であることができる（図３）。
【０１７２】
例えば、細菌のタンパク質ＡのＢ領域およびタンパク質Ｇの機能的に同等の領域のような小タンパク質モチーフは、Ｆｃ領域によって、抗体分子に結合し、その結果抗体分子を捕獲することが知られている。そのようなタンパク質モチーフは、ポリマーに付着することができ、特にポリマー粒子の表面に付着することができる。そのような分子は、例えば、ターゲティングリガンドとして使用するための抗体に付着するための、または前駆体細胞もしくは患者の血流からの捕捉細胞を保持する抗体を捕獲するためのリガンドとして作用すると考えられる。それゆえ、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇの機能的領域を用いて、ポリマー被膜へ付着することのできる抗体種類は、Ｆｃ領域を含むものである。捕捉抗体は、次いで、ポリマー表面の近くで、前駆細胞のような前駆体細胞に結合またはそれを保持し、その一方、好ましくはポリマー内の培殖培地に入れられる前駆体細胞は、さまざまな因子を分泌し、対象のその他の細胞と相互作用する。任意で、ブラジキニンのようなポリマー粒子において分散される１つまたは複数の生物活性剤は、前駆体細胞を活性させる場合がある。
【０１７３】
前駆体細胞の接着または対象の血液からの前駆内皮細胞（ＰＥＣｓ）の捕獲のために考慮される追加の高分子生物製剤は、公知の前駆体細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を含む。例えば、内皮細胞の表面を装飾すると報告されている相補的決定因子（ＣＤ）は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１０２、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤｗｌ３０、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗｌ４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、およびＣＤ１６６を含む。これらの細胞表面マーカーは、さまざまな特異性を持つことができ、特定の細胞／発達のタイプ／段階に対する特異性の程度は、多くの場合、完全に特徴化されていない。さらに、抗体が生成されたこれらの細胞マーカー分子は（抗体認識に関して）、特に同じ系統の細胞上のＣＤと重複する（内皮細胞の場合の単球）。循環内皮前駆細胞は（骨髄）単球から成熟内皮細胞への発生経路にいくらか沿う。ＣＤ１０６、１４２および１４４は一部の特異性を有する成熟内皮細胞をマークすることが報告されてきた。ＣＤ３４は、現在、前駆内皮細胞に特異的であると知られ、それゆえ、一般的にポリマー粒子が活性剤の局所送達のために移植される部位の血液からの前駆内皮細胞の捕獲に好ましい。そのような抗体の例としては、一本鎖抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびヒト化抗体が挙げられる。
【０１７４】
本発明の組成物において用いられるＰＥＡ、ＰＥＵＲおよびＰＥＵのポリマーの汎用性により、ポリマー骨格に組み込まれた治療的ジオールの量は、ポリマーの構成要素の比率を変化させることにより、制御することができる。例えば、ＰＥＡの組成によって、１７β−エストラジオールの充填は４０％ｗ／ｗまで達成されることができる。さまざまな充填比の１７β−エストラジオールを伴う２つの異なる規則的な、線形ＰＥＡは下記図式３に示される。
2009518289.tif 000030
【０１７５】
同様に、ＰＥＵＲおよびＰＥＵのポリマーへの治療用ジオールの充填は、ポリマーの２つまたはそれ以上の構成要素の量を変化させることにより、変えることができる。１７−β−エストラジオールを含むＰＥＵＲの合成は、下記の例９に示される。
【０１７６】
さらに、４−アンドロステン−３,１７ジオール（４−アンドロステンジオール）、５−アンドロステン−３,１７ジオール（５−アンドロステンジオール）、１９−ノル５−アンドロステン−３,１７ジオール（１９−ノルアンドロステンジオール）のようなテストステロンまたはコレステロールに基づく合成ステロイドを主材料とするジオールは、本発明によるＰＥＡおよびＰＥＵＲのポリマーの骨格への組み込みに適している。さらに、本発明のポリマー粒子送達組成物の調合の使用に適した治療用ジオール化合物としては、例えば、アミカシン、アムホテリシンＢ、アピサイクリン、アプラマイシン、アルベカシン、アジダムフェニコール、バンベルマイシン、ブチロシン、カルボマイシン、セフピラミド、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、クリンダマイシン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、ジアチモスルホン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、フォルチマイシン、ゲンタマイシン、グルコスルホンソラスルホン、グアメサイクリン、イセパマイシン、ジョサマイシン、カナマイシン、ロイコマイシン、リンコマイシン、ルセンソマイシン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミクロノマイシン、ミデカマイシン、ミノサイクリン、ムピロシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、パロマイシン、ピパサイクルン、ポドフィリン酸２−エチルヒドラジン、プリマイシン、リボスタマイシン、リファミド、リファンピン、ラファマイシンＳＶ、リファペンチン、リファキシミン、リストセチン、ロキタマイシン、ロリテトラサイクリン、ラサラマイシン、ロキシスロマイシン、サンサイクリン、シソマイシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、テイコプラニン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チオストレプトン、トブラマイシン、トロスペクトマイシン、ツベラクチノマイシン、バンコマイシン、カンジシジン、クロルフェネシン、デルモスタチン、フィリピン、ファンギクロミン、カナマイシン、ロイコマイシン、リンコマイシン、ルセンソマイシン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミクロノマイシン、ミデカマイシン、ミノサイクリン、ムピロシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、パラモマイシン、ピパサイクリン、ポドフィリン酸２−エチルヒドラジン、プライシン、リボスタミジン、リファミド、リファンピン、リファマイシンＳＶ、リファペンチン、リファキシミン、リストセチン、ロキタマイシン、ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、サンサイクリン、シソマイシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトン、オトブラマイシン、トロスペクトマイシン、ツベラクチノマイシン、バンコマイシン、カンジシジン、クロルフェネシン、デルモスタチン、フィリピン、ファンギクロミン、メパルチシン、ミスタチン、オリゴマイシン、エリマイシンＡ、ツベルシジン、６−アザウリジン、アクラシノマイシン、アンシタビン、アンスラマイシン、アザシタジン、ブレオマイシンカルビシン、カルジノフィリンＡ、クロロゾトシン、クロモマイシン、ドキシフルリジン、エノシタビン、エピルビシン、ゲムシタビン、マンノムスチン、メノガリル、アトルバシプラバスタチン、クラリスロマイシン、ルプロリン、パクリタキセル、ミトブロニトール、ミトラクトール、モピダモール、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プレドニムスチン、ピューロマイシン、ラニムスチン、ツベルシジン、ビンジン、ゾルビシン、クメタロール、ジクマロール、ビスクマ酢酸エチル、エチリジンジクマロール、イロプロスト、タプロステン、チオクロマロール、アミプリローズ、ロムルチド、シロリムス（ラパマイシン）、タクロリムス、サリチルアルコール、ブロモサリゲニン、ジタゾール、フェプラジノール、ゲンチシン酸、グルカメタシン、オルサラジン、Ｓ−アデノシルメチオニン、アジスロマイシン、サルメテロール、ブデソニド、アルブチアル、インジナビル、フルバスタチン、ストレプトゾシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、プリカマイシン、イダルビシン、ペントスタチン、メトキサントロン、シタラビン、リン酸フルダラビン、フロクスウリジン、クラドリン、カペシタビン、ドセタキセル、エトポシド、トポテカン、ビンブラスチン、テニポシドなどが挙げられる。治療用ジオールは飽和または不飽和ジオールのいずれかになるように選択することができる。
【０１７７】
高分子生物製剤の局所送達のための持続放出型の生分解性ポリマーデポを形成する大きさであろうと、本明細書に説明されるように、全身循環へ入る大きさであるであろうと、以下の生物活性剤および小分子薬は、任意に、本発明のポリマー粒子組成物内で効果的に分散されることができる。本発明の送達組成物および治療方法で使用されるポリマー粒子において分散される任意の生物活性剤は、対象の疾患、またはその症候の治療において適したそれらの治療効果または緩和効果について選択される。
【０１７８】
1つの態様において、適した生物活性剤は、持続放出方式において存在する場合、創傷治癒を促進するか、またはそれに貢献するさまざまなクラスの化合物を含むが、それらに限定されない。そのような生物活性剤は、本発明の組成物の生分解性ポリマー粒子によって保護および送達されることのできる、特定の前駆体細胞を含む創傷治癒細胞を含む。そのような創傷治癒細胞としては、例えば、炎症性治癒細胞のみならず周皮細胞および内皮細胞が挙げられる。そのような細胞を生体内でポリマーデポの部位へ補充するため、本発明の送達組成物および治療方法に使用されるポリマー粒子は、抗体およびより小さい分子リガンドのようなこのような細胞のためのリガンドを含み、それは特異的に「細胞接着分子」（ＣＡＭｓ）に結合することができる。創傷治癒細胞のための例示的リガンドは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４抗原）、ＩＣＡＭ−２（ＣＤｌ０２抗原）、ＩＣＡＭ−３（ＣＤ５０抗原）、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２抗原）、およびＩＣＡＭ−５のような細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６抗原）のような血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、ＮＣＡＭ−１（ＣＤ５６抗原）のような神経細胞接着分子分子（ＮＣＡＭ）、またはＮＣＡＭ−２、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１抗原）のような血小板内皮細胞接着分子ＰＥＣＡＭ、ＬＥＣＡＭ−１のような白血球内皮細胞接着分子（ＥＬＡＭ）、またはＬＥＣＡＭ−２（ＣＤ６２Ｅ抗原）、および同類のものに特異的に結合するリガンドを含む。
【０１７９】
別の態様において、適した生物活性剤は、細胞外マトリックスタンパク質、本発明の送達組成物に使用されるポリマー粒子へ分散されることのできる高分子を含み、例えば、共有的に、または非共有的に結合される。細胞外マトリックスタンパク質の例としては、例えば、通常、タンパク質（プロテオグリカン）へ連結されるグリコサミノグリカン、および線維性タンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラミニン）が挙げられる。細胞外タンパク質の生物模倣体も使用されることができる。これらは通常、非ヒトであるが、生体適合性である、アルギナートおよびキチン誘導体のようなグリコタンパク質である。そのような細胞外マトリックスタンパク質の特異的フラグメントである創傷治癒ペプチドおよび／またはそれらの生物模倣体は、生物活性剤として使用されることができる。
【０１８０】
タンパク質成長因子は、本発明の送達組成物、および本明細書に記載される高分子生物製剤の送達のための方法に使用されるポリマー粒子内で任意で分散することができる生物活性剤の別のカテゴリーである。そのような生物活性剤は、創傷治癒の促進および当技術分野において公知のその他の病態において有効である。例えば、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、サイモシンＢ４、および、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のようなさまざまな血管新生因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、およびインシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）などである。これらのタンパク質成長因子の多くは、市販され入手可能であるか、または当技術分野において周知の技術を用いることにより、組み換え生成可能である。
【０１８１】
または、さまざまな生体分子をコードする遺伝子を組み込む、ベクター、特にアデノウイルスベクターを含む発現系は、持続放出型送達のためにポリマー粒子において分散される。そのような発現系およびベクターを調製する方法は当技術分野において周知である。例えば、タンパク質性成長因子は、ポリマーデポを形成する粒子の大きさを選択することによる局所送達のために望ましい身体部位へ成長因子を投与すること、または、循環に入る大きさの粒子を選択することによる全身的に成長因子を投与することのいずれかのために本発明のポリマー粒子へ分散することができる。ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＮＧＦのような成長因子、および進化的にならびに機能的に関連する生物製剤、およびトロンビンのような血管新生酵素は、本発明において生物活性剤としても使用することができる。
【０１８２】
小分子薬は、本発明の送達組成物および本明細書に記載される高分子生物製剤の送達の方法に使用されるポリマー粒子において任意で分散されることのできる生物活性剤のさらに別のカテゴリーである。そのような薬としては、例えば、特定の治療プロモーターのみならず、例えば、ビタミンＡおよび脂質化酸化の合成成阻害剤のような抗菌剤および抗炎症薬剤が挙げられる。
【０１８３】
さまざまな抗生物質は、本発明の送達組成物で使用されるポリマー粒子で任意で分散されることができ、感染を防ぐかまたは抑制することにより、間接的に自然治癒プロセスを促進することができる。適した抗生物質は、アミノグリコシド抗生物質またはキノロン類、またはセファロスポリン、例えば、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシン、バンコマイシン、オキサシリン、クロキサシリン、メチシリン、リンコマイシン、アンピシリンおよびコリスチンのようなβ−ラクタムのような多くのクラスを含む。適した抗生物質は、文献に記載されている。
【０１８４】
適した抗菌剤としては、例えば、ＡｄｒｉａｍｙｃｉｎＰＦＳ／ＲＤＦ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  Ｕｐｊｏｈｎ）、Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標）（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標）（ＮｅＸｓｔａｒ）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（Ｓｅｑｕｕｓ）、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（登録商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）ＰＦＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  Ｕｐｊｏｈｎ）、Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ）、Ｍｉｔａｍｙｃｉｎ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｎｉｐｅｎ（登録商標）（ＳｕｐｅｒＧｅｎ）、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｅｘ）およびＲｕｂｅｘ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）が挙げられる。1つの態様において、ペプチドはグリコペプチドであることができる。「グリコペプチド」は、オリゴペプチド（例えば、へプタペプチド）抗生物質を示し、バンコマイシンなどのサッカリド基で置換されてもよい多重環ペプチドコアを特徴とする。
【０１８５】
抗菌剤のこのカテゴリーに含まれるグリコペプチドの例は、Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．ＲａｏおよびＬｏｕｉｓｅ  Ｗ．Ｃｒａｎｄａｌｌによる「Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ａｎｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙ」、（「Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｖｏｌｕｍｅ６３、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｎａｇａｒａｊａｎ編、Ｍａｒｃａｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．より出版）で見られる。グリコペプチドの追加的な例は、米国特許番号第４，６３９，４３３号、第４，６４３，９８７号、第４，４９７，８０２号、第４，６９８，３２７号、第５，５９１，７１４号、第５，８４０，６８４号、および第５，８４３，８８９号、ＥＰ  ０  ８０２  １９９、ＥＰ  ０  ８０１  ０７５、ＥＰ  ０  ６６７  ３５３、ＷＯ９７／２８８１２、ＷＯ９７／３８７０２、ＷＯ９８／５２５８９、ＷＯ９８／５２５９２、およびＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，１３１０７−１３１０８、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９７，１１９，１２０４１−１２０４７、およびＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９４、１１６、４５７３−４５９０に開示される。代表的なグリコペプチドとしては、Ａ４７７、Ａ３５５１２、Ａ４０９２６、Ａ４１０３０、Ａ４２８６７、Ａ４７９３４、Ａ８０４０７、Ａ８２８４６、Ａ８３８５０、Ａ８４５７５、ＡＢ−６５、アクタプラニン、アクチノイジン、アルダシン、アボパルシン、アズレオマイシン、バリマイシン(Balhimyein)、クロロオリエンチン(Chloroorientiein)、クロロポリスポリン、デカプラニン、−デメチルバンコマイシン、エレモマイシン、ガラカルディン、ヘルベカルディン、イズペプチン、キブデリン、ＬＬ−ＡＭ３７４、マンノペプチン(Mannopeptin)、ＭＭ４５２８９、ＭＭ４７７５６、ＭＭ４７７６１、ＭＭ４９７２１、ＭＭ４７７６６、ＭＭ５５２６０、ＭＭ５５２６６、ＭＭ５５２７０、ＭＭ５６５９７、ＭＭ５６５９８、ＯＡ−７６５３、オリエンチシン(Orenticin)、パルボジシン、リストセチン、リストマイシン、シンモニシン、テイコプラニン、ＵＫ−６８５９７、ＵＤ−６９５４２、ＵＫ−７２０５１、バンコマイシンなどとして識別されるグリコペプチドが挙げられる。本明細書に使用される「グリコペプチド」または「グリコペプチド抗生物質」という用語は、糖部分の存在しない、すなわち一連のグリコペプチドのアグリコンの場合に上述のグリコペプチドの一般分類を含むことも意図する。例えば、穏やかな加水分解によるバンコマイシン上のフェノールへ付加された二糖の部分の除去により、バンコマイシンアグリコンが得られる。また、「グリコペプチド抗生物質」という用語の範囲内に含まれるものとして、アルキル化およびアシル化誘導体を含む、上述のグリコペプチドの一般分類の合成の誘導体が挙げられる。さらに、バンコサミンと同様の方法で、さらに多糖残基、特にアミノグリコシドを付加されたグリコペプチドもこの用語の範囲内である。
【０１８６】
「脂質化グリコペプチド」という用語は、具体的に、脂質置換基を含むように合成的に修飾されたグリコペプチド抗生物質を指す。本明細書に使用されるように、「脂質置換基」という用語は、５個以上の炭素原子、好ましくは、１０個から４０個の炭素原子を含む任意の置換基を指す。脂質置換基は任意で、ハロ、酸素、窒素、硫黄、およびリン酸から選択される１個から６個のヘテロ原子を含んでもよい。脂質化グリコペプチド抗生物質は、当技術分野において周知である。その開示が参照によって全体として本明細書に組み込まれる。例えば、米国特許番号第５，８４０，６８４号、第５，８４３，８８９号、第５，９１６，８７３号、第５，９１９，７５６号、第５，９５２，３１０号、第５，９７７，０６２号、第５，９７７，０６３号、ＥＰ６６７、３５３、ＷＯ９８／５２５８９、ＷＯ９９／５６７６０、ＷＯ００／０４０４４、ＷＯ００／３９１５６を参照されたい。
【０１８７】
抗炎症性生物活性剤もまた、任意で、本発明の組成物および方法に使用されるポリマー粒子において分散させることが出来る。身体部位および治療される疾患に応じて、そのような抗炎症性生物活性剤としては、例えば、鎮痛薬（例えば、ＮＳＡＩＤＳおよびサリチル酸）、ステロイド、抗リウマチ薬、胃腸薬、痛風剤、ホルモン（グルココルチコイド）、点鼻剤、点眼薬、耳の薬（例えば、抗生物質とステロイドとの組合せ）、呼吸器薬、および皮膚と粘膜の薬剤が挙げられる。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、２００５年版を参照されたい。具体的には、抗炎症性薬剤は、（１１ｇ、１６Ｉ）−９−フルロ−１１，１７，２１−トリヒドロキシ−１６−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオンとして化学的に命名される、デキサメタゾンを含むことが出来る。あるいは、抗炎症性生物活性剤は、ストレプトミセス ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)から単離されたトリエンマクロライド抗生物質である、シロリムス（ラパマイシン）でありうるか、またはそれを含みうる。
【０１８８】
本発明の組成物および方法に任意で含まれるポリペプチド生物活性剤は、「ペプチド模倣薬」も含みうる。「ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」として本明細書に示される、そのようなペプチド類似体は、ペプチド類似体の鋳型ペプチドに類似した特性のため、一般的に製薬産業において使用され（Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．（１９８６）Ａｄｖ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  Ｒｅｓ．，１５：２９；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ、３９２ページ；およびＥｖａｎｓら、（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９）、また、通常、コンピュータ化された分子モデリングの援助によって開発される。概して、ペプチド模倣薬は構造的にパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド）と同様であるが、１つ以上のペプチド結合が、−−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から成る群から選択される結合によって、当技術分野に公知である方法によって任意で置換される。また該方法は、以下の参考文献でさらに説明されている。Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７ページ（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（１９８３年３月）、Ｖｏｌ．１、議題３、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」（一般評論）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ、Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、（１９８０）４６３ページ４６８ページ（一般評論）；Ｈｕｄｓｏｎ、Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，（１９７９）１４：１７７−１８５（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．ら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，（１９８６）３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ−）；Ｈａｒｍ、Ｍ．Ｍ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  Ｉ（１９８２）３０７−３１４（−ＣＨ＝ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ、Ｒ．Ｇ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（１９８０）２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｅ、Ｃ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，（１９８２）２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅ、Ｍ．ら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ．，ＥＰ４５６６５（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ、Ｍ．Ｗ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，（１９８３）２４：４４０１−４４０４（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ、ＶＪ．、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、（１９８２）３１：１８９−１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）。そのようなペプチド模倣薬は、例えば、より経済的な生産、より大きい化学的安定性、強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性、など）��変化した特異性（例えば、生物学的活性の広域スペクトラム）、減少抗原性、およびその他を含む、自然のポリペプチド形態に対する有意な優越性を有する可能性がある。
【０１８９】
さらに、ペプチド内での１つ以上のアミノ酸の置換（例えば、Ｌ−リシンの位置にＤ−リシンを伴う）を、より安定したペプチドおよび内因性ペプチダーゼに対して抵抗性のあるペプチドを生成するために使用してもよい。あるいは、生分解性ポリマーに共有結合される合成ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸からも調製されうり、インベルソペプチドと呼ばれる。ペプチドが天然ペプチド配列の反対方向に組み立てられた場合、それはレトロペプチドと呼ばれる。一般的に、Ｄ−アミノ酸から調製されたポリペプチドは、酵素的な加水分解に対して非常に安定である。レトロ−インベルソポリペプチドまたは部分的レトロ−インベルソポリペプチドについての保存された生物学的活性について多くの事例が報告されている（米国特許、第６，２６１，５６９Ｂ１号およびその参考文献、Ｂ．Ｆｒｏｍｍｅら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００３）１４４：３２６２−３２６９）。
【０１９０】
対象発明が、多岐にわたる疾患またはその症候を予防または治療するために使用されうることは、容易に明らかである。
【０１９１】
少なくとも１つの高分子生物製剤および任意の生物活性剤の任意の適した有効な量も、ポリマー粒子（生体内で形成されたポリマーデポのポリマー粒子を含む）から徐放することができ、それが存在する場合は、一般的に、例えば、特異的なポリマー、すなわち粒子またはポリマー／高分子生物製剤結合の種類に依存する。一般的に、ポリマー粒子は循環を避ける大きさの粒子によって生体内で形成されたポリマーデポから、約１００％まで放出することが出来る。具体的には、それらは約９０％まで、７５％まで、５０％まで、または２５％ポリマーデポから放出することが出来る。一般的にポリマーからの放出率に影響する要因は、ポリマー、高分子生物製剤、および任意の生物活性剤の性質および量、ポリマー／高分子生物製剤または生物活性剤結合の種類、ならびに製剤に存在する追加の物質の性質および量である。
【０１９２】
いったん本発明のポリマー粒子送達組成物が、上記のように作成されると、次に本発明のポリマー組成物は肺内、胃腸内(gastroenteral)、経皮下、筋肉内から選択される経路による被検体への導入、または中枢神経系、腹膜内への導入、または臓器内送達のために処方される。該組成物は、一般的に、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどの経口送達、粘膜送達または皮下送達に適した「薬学的に許容される添加剤または賦形剤」の１つまたは複数を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、香味剤などの補助物質が、そのような賦形剤中に存在してもよい。
【０１９３】
例えば、鼻腔内および肺の処方は、通常、鼻粘膜への刺激を引き起こさず、および繊毛機能を著しく阻害しない賦形剤を含む。水、生理食塩水またはその他の公知の物質のような希釈剤を、対象の本発明の化合物および処方と共に使用することが出来る。該肺内処方も、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤を含んでもよいが、それらに限定されない。界面活性剤は鼻粘膜による吸収を強化するために存在してもよい。
【０１９４】
直腸および尿道の坐剤のため、本発明の組成物および処方に使用される賦形剤は、ココアバター（カカオ脂）またはその他のトリグリセリド、エステル化、水素化および／または分別によって改変された植物油、グリセリンゼラチン、ポリアルカリグリコール、さまざまな分子量のポリエチレングリコールの混合物、ならびにポリエチレングリコールの脂肪酸エステルなどの、従来の結合剤およびキャリアを含むと考えられる。
【０１９５】
膣内送達のため、本発明の処方は、ポリエチレントリグリセリドの混合物を含むペッサリーベースに組み込むことが出来、コーン油またはゴマ油のような油類に懸濁することが出来、任意でコロイドシリカを含むことが出来る。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９５）１１５：９−１５を参照されたい。
【０１９６】
経口送達のため、固液表面張力および自由エネルギー変化を減少させ、腸壁への透過性を促進するための好ましい物理化学的性質を伴う分子および賦形剤は、陰性の生理的特性／毒性が最低限であるかまたは全くないものであるが、不活性な成分に関するＦＤＡガイドラインに記載される一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ））、または公的な薬事規制機関により定められる、必要な毒性および耐容性の研究が行われている化合物を含む。腸の透過性に対し影響のある分子および賦形剤のカテゴリーは、胆汁酸塩、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、脂肪酸、グリセリド、アシルカルニチン、コリン、サリチル酸塩、キレート剤、および膨潤性ポリマーである。このカテゴリーに当てはまるこれらの分子および賦形剤の例としては、天然の、半合成、あるいは合成のものである、リン脂質、ポリエチレントリグリセリド、ゼラチン、イオン性界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）ならびにＣｒｅｍａｐｈｏｒｅ（登録商標）、胆汁酸ならびに胆汁酸誘導体、食用油（例えば、綿実油、コーン油、大豆油、およびオリーブ油）、クエン酸、ＥＤＴＡ、ステアロイルマクロゴグリセリド、ラウロイルマクロゴグリセリド、プロピレングリコール誘導体、すなわち、プロピレングリコールカプリラートならびにプロピレングリコールモノカプリラート、プロピレングリコールラウラートならびにプロピレングリコールモノラウラート、オレオイルマクロゴールグリセリド、カプリロカプロイルマクロゴールグリセリド、グリセロールモノリノレアート、グリセリルモノオレアート、オレイン酸ポリグリセリル、脂肪酸のグリセロールエステル、中鎖トリグリセリド、カプリン酸ナトリウム、アシルカルニチンおよびコリン、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウムおよびメトキシサリチル酸ナトリウム）、キトサン、デンプン、ポリカルボフィル、Ｎ−アセチル化α−アミノ酸、Ｎ−アセチル化非−α−アミノ酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ならびにジエチレングリコールモノエチルエテールが挙げられるが、それらに限定されない。例えば膵臓阻害剤、大豆トリプシン阻害剤、ＦＫ−４４８、メシル酸カモスタット、アプロチニン、ｐ−クロロメリクリ安息香酸（ｐ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｉｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ）、およびバシトラシンのような化合物である、競合的基質ならびにプロテアーゼ阻害剤もまた本リストに含まれる。
【０１９７】
さらに、経口送達のために、ｐＨにより起こる分解から粒子を保護する手助けをする被膜には、セラック、セルロースアセテート、セルロースアセテートブチラート、フタル酸セルロースアセテート、メタクリル酸コポリマー（例えば、ポリメタクリル酸アミノエステルコポリマー）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸エチルセルロース、およびフタル酸ポリビニルアセテートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
送達の特定のモードの使用のために適した賦形剤についてのさらなる説明は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．，第１９版、１９９５を参照されたい。当業者は、特定の高分子生物製剤／ポリマー粒子の組合せに使用するための適切な賦形剤、粒子の大きさ、および投与の方法を容易に決定することが出来る。
【０１９９】
ヒトへの治療に加えて、本発明のポリマー粒子送達組成物は、ペット（例えば、猫、犬、ウサギ、フェレットなど）、農耕動物（例えば、ブタ、ウマ、ラバ、乳牛および肉用ウシ）および競走馬などのさまざまな哺乳類罹患動物に対しての、高分子生物製剤ならびに生物活性剤の送達においての使用も意図される。
【０２００】
本発明の方法で使用された組成物は、対象の高分子生物製剤の「有効量」を含む。例えば、高分子生物製剤は、症状を予防、軽減、取り除くための十分な治療的反応または緩和反応を対象に起こさせる量で、組成物に送達のために含まれる。正確な必要量は、他の要因の中では、治療される対象、年齢、高分子生物製剤が送達される対象の一般的な健康状態、対象の免疫システムの能力、望まれる効果の程度、治療される状態の重症度、選択される特定の高分子生物製剤および組成物の投与方法によって異なる。適した有効量は、当業者によって、容易に決定することができる。従って、「有効量」は、定められた試験を通じて決定されうる比較的広い範囲になると考えられる。例えば、本発明の目的のため、有効量は、一般的に、約１μｇから約１００ｍｇの範囲であり、例えば約５μｇから約１ｍｇ、または、約１０μｇから約５００μｇの範囲の、１投与当たりに送達される、高分子生物製剤、および、任意で、生物活性剤である。
【０２０１】
いったん処方されると、本発明のポリマー粒子送達組成物は、標準技術を用いて、経口的に、経粘膜で、または皮下注射もしくは筋肉注射などにより投与される。経鼻投与、肺投与、膣投与、および直腸投与技術を含む粘膜送達技術に関して、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．，第１９版，１９９５を、同様に経鼻投与の技術に関して、欧州公報第５１７，５６５号およびＩｌｌｕｍら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ，（１９９４）２９：１３３−１４１を参照されたい。
【０２０２】
投与治療は、本発明のポリマー粒子送達組成物の単一投与、または当技術分野において既知である複数投与計画であってもよい。投薬計画は、少なくとも一部において、その対象の必要性に応じて決定され、かつ開業医の判断にもよる。さらに、疾患の予防が望まれる場合、ポリマー粒子送達組成物は、一般的に、初期の疾患の発現、または対象の疾患の症状に先立って、高分子生物製剤の送達のため投与される。例えば、症状または再発の軽減などの、治療が望まれる場合、ポリマー粒子送達組成物は一般的に、初期の疾患の発現の後に、高分子生物製剤の送達のために投与される。
【０２０３】
製剤は、経口送達、経皮送達、経粘膜送達の研究のために開発された多くの動物モデルにおいて生体内で検査することが出来る。血液サンプルは、当技術分野において既知の標準技術を用いて高分子生物製剤のために分析される。
【０２０４】
以下の実施例は本発明の限定ではなく、説明を意味するものである。
【０２０５】
実施例１
単一エマルジョン法によるＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚナノ粒子および粒子の調製
アセチル化末端およびベンジル化ＣＯＯＨ基（ＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚ）（２５ｍｇ）を含む、構造式（ＩＩＩ）のＰＥＡポリマーを１ｍｌのＤＣＭ中で溶解させ、撹拌しながら５ｍｌの０．１％界面活性剤ジヘプタノイル−ホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）の水溶液へ加えた。回転蒸発後、２０ｎｍ〜１００μｍの範囲の粒子サイズを有するＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚエマルジョンが得られた。撹拌速度が大きくなるほど、粒子サイズは小さくなる。粒子サイズは、ポリマーの分子量、溶液濃度、ならびに、マイクロフルイダイザー、超音波噴霧器、超音波処理機、および機械的または磁気的な撹拌機などの装置によって制御される。
【０２０６】
実施例２
鎮痛薬を含むＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚ粒子の調製
ＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚ（２５ｍｇ）およびＢｕｐｉｖｉｃａｎｅ（５ｍｇ）を１ｍｌのＤＣＭ中で溶解させ、該溶液を均質化しながら５ｍｌの０．１％ＤＨＰＣ水溶液に加えた。回転蒸発器を使用して、０．５μｍ〜１０００μｍの範囲の、好ましくは、１μｍ〜約２０μｍの範囲の平均粒子サイズを有するＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚエマルジョンを作製した。
【０２０７】
実施例３
二重エマルジョン法を使用したポリマー粒子の調製
粒子を、二段階の二重エマルジョン技術を用いて調製した。第一段階では、ＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚ（２５ｍｇ）を１ｍｌのＤＣＭ中で溶解させ、次に５０μｌの１０％界面活性剤ジヘプタノイル−ホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）を加えた。混合物を室温でボルテックスし、水／油（Ｗ／Ｏ）の第一エマルジョンを形成させた。第二段階では、混合溶液を均質化しながら、第一エマルジョンをゆっくりと５ｍｌの０．５％ＤＨＰＣの溶液に加えた。１分間の均質化後、エマルジョンを回転蒸発させてＤＣＭを除去し、水／油／水の二重エマルジョンを得た。生成された二重エマルジョンは、０．５μｍ〜１０００μｍの範囲のサイズ、大部分が約１μｍ〜１０μｍのサイズを有する懸濁ポリマー粒子を有した。界面活性剤の量、撹拌速度、および水の体積などの要因を削減することは、粒子サイズの増大につながる。
【０２０８】
実施例４
二重エマルジョン法を用いて抗体をカプセル化するＰＥＡ粒子の調製
粒子を、二段階の二重エマルジョン技術を用いて調製した。第一段階では、ＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚ（２５ｍｇ）を１ｍｌのＤＣＭ中で溶解させ、次に６０μｇの抗Ｉｃａｍ−１抗体および４．０ｍｇのＤＨＰＣを含む５０μｌの水溶液を加えた。混合物は室温でボルテックスされ、水／油の第一エマルジョンを形成した。第二段階では、第一エマルジョンを、均質化しながらゆっくりと５ｍｌの０．５％ＤＨＰＣ溶液へ加えた。１分間の均質化後、エマルジョンを回転蒸発させてＤＣＭを除去し、水／油／水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）の二重エマルジョン構造を有する粒子を得た。約７５％〜９８％の抗体が、この二重エマルジョン技術の使用によってカプセル化された。
【０２０９】
実施例５
二重エマルジョン法を用いてＤＮＡをカプセル化するＰＥＡ粒子の調製
粒子を、二重エマルジョン技術を用いて調製した。第一段階では、ＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚ（２５ｍｇ）を１ｍｌのＤＣＭ中で溶解させ、２００μｌのＤＮＡ（１２．５ｍｇ／ｍｌのＤＨＰＣ水溶液中の０．２ｍｇ／ｍｌのｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を加え、次に５０μｌの１０％界面活性剤ジヘプタノイル−ホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）を加えた。混合物は１０秒間プローブ超音波処理され、水／油（Ｗ／Ｏ）の第一エマルジョンを形成した。第二段階では、第一エマルジョンをゆっくりと０．２％ＤＨＰＣの５ｍｌ溶液へ加えた。エマルジョンをボルテックスし、次に１０秒間プローブ超音波処理した。エマルジョンを回転蒸発させてＤＣＭを除去し、水／油／水の二重エマルジョンを得たが、これを次に水中で一晩透析した。生成された二重エマルジョンは、顕微鏡分析により評価すると平均直径０．５μｍ〜１０００μｍのサイズを有し、大部分が平均直径約１μｍ〜１０μｍである懸濁ポリマー粒子を有した。
【０２１０】
ＤＮＡ充填の成功を判定するため、７５０μｌの粒子懸濁液を１４，０００ｘｇＲＣＦで遠心分離した。懸濁液を採取し、そのペレットを７００μｌエタノールで溶解させてＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを５０μｌの水中に再懸濁した。各溶液２５μｌを、電気泳動のため０．７％アガロースゲルに入れた。ＤＮＡプラスミドの適切な分子量のバンドによって、ＤＮＡが懸濁液と粒子ペレットの両方に含まれたことが実証され、これは、不完全ながらカプセル化の成功を示した。
【０２１１】
実施例６
１つまたは複数の第一粒子が共にポリマー被膜内にカプセル化されて第二微粒子を形成する、三重エマルジョン構造を有する粒子の調製
三重エマルジョン構造を有する粒子は、以下の２つの異なる経路で調製された。
【０２１２】
多粒子カプセル化
最初の経路では、単一相用の標準手順を用いて第一粒子を調製し、ＰＥＡ−Ｈナノ粒子（Ｒ１＝（ＣＨ２）８；Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である、式（ＩＩＩ）のＰＥＡ−Ｈ）を調製して、約１．０ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（ポリマー／水性ユニット）の範囲のストックサンプルを提供した。加えて、界面活性剤重量が２０％であり、この２０％が（界面活性剤のミリグラム）／（ＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚのミリグラム＋界面活性剤のミリグラム）として計算される、ＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚストックサンプル溶液を調製した。さまざまな界面活性剤が調査されたが、１，２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＨＰＣ）が最も成功した。ＰＥＡ−Ｈナノ粒子のストックサンプルを、ＰＥＡ−ＡｃＢｚポリマーのＤＣＭ溶液中に注入した。典型的な例は以下のとおりである。
2009518289.tif 000031
【０２１３】
この最初の添加を「第一エマルジョン」と呼ぶ。サンプルを、シェイクプレートによって５〜２０分間撹拌した。十分な均質性が認められたら、第一エマルジョンを、水性媒体（５〜１０ｍｌ）に０．１％の表面安定剤を含む標準バイアルへ移した。これらの内容物を、「外部水相」と呼ぶ。低速で（５０００〜６０００ＲＰＭ）ホモゲナイザーを使用して、低速均質化を行いながら第一エマルジョンをゆっくりと外部水相へとピペッティングした。６０００ＲＰＭで３〜５分間実施した後、全サンプル（「第二エマルジョン」と呼ぶ）を真空下で濃縮してＤＣＭを除去し、同時に、連続したＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚマトリックス内にＰＥＡ−Ａｃ−Ｈナノ粒子をカプセル化した。
【０２１４】
第二ポリマー被膜へ充填される低分子の調製
三重エマルジョン構造を有する粒子の調製のための第二経路において、第一段階については、単一エマルジョン粒子を作製するための上述の手順に従った。最終段階では、単一エマルジョン粒子をカプセル化するポリマー被膜（すなわち、油中水型相）を、次に調製した。
【０２１５】
さらに具体的には、油中水型相（第一エマルジョン）を作製した。この場合において、まず薬物（５ｍｇ）および界面活性剤（ＤＨＰＣなど）の濃縮混合物を、最小体積の水を用いて調製した。次に、濃縮混合物をＰＥＡ．Ａｃ．ＢｚのＤＣＭ溶液に加え、超音波処理浴に５〜１０分間供した。十分な均質性が認められたら、内容物を均質化しながら水５ｍｌへ加えた。真空蒸発によるＤＣＭの除去の後、薬物の水性分散液を含むＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚの三重エマルジョンを得た。
【０２１６】
別の例において、薬物を含むＰＥＡ−Ｈナノ粒子のストックサンプルが調製された。ＰＥＡ−Ｈ（２５ｍｇ）および薬物（５ｍｇ）を２ｍｌのＤＣＭ中で溶解させ、５〜１０分間の超音波処理によって、５ｍｌの水と混合した。十分な均質性が認められたら、内容物を回転蒸発させてＤＣＭを除去した。本方法を用いて作製された調製物の典型例は以下の内容物を有した。
2009518289.tif 000032
【０２１７】
上述の調製物を次にテフロン皿内で一晩蒸発させ、水分をさらに減少させて、約２ｍｌの体積を得た。外側ポリマー被膜、すなわち最大５ｍｌのＤＣＭ中の２５ｍｇのＰＥＡ−Ａｃ−Ｂｚを第一エマルジョンと組み合わせ、１分以内のボルテックスを行うことによって第二エマルジョン全体を撹拌した。最終的に、第二エマルジョンを０．１％の表面安定剤を含む水性媒体（１０〜１５ｍｌ）へ移し、６０００ＲＰＭで５分間均質化させ、再度真空下で濃縮してＤＣＭの第二相を除去し、これにより、図６に示すような三重エマルジョン構造を有する粒子を得た。
【０２１８】
実施例７
三重エマルジョンによる薬物捕捉（５０％）
以下の例はポリマー被膜中の低分子薬物の充填を示す。高充填量のブピバカインＨＣｌを含むＰＥＡ粒子を、二重エマルジョンプロトコル（ほぼ半分の水が使用された）と比較して、第一エマルジョン中の最小量のＨ２Ｏを用いる３重エマルジョン技術によって製造した。水相における減少を可能にする構造を安定化させるため、水性液滴での薬物の可溶化を補助する表面安定剤は、薬物が内部水相に加えられる前に、内部水相においてそれ自体が溶解する。具体的には、ＤＨＰＣ（下記の量）を最初に１００μｌのＨ２Ｏ中で溶解させ、その後５０ｍｇの薬物をその相へ加えた。本技術は、同じ大きさの二重エマルジョン粒子を作製する際に使用された量よりも少ない量の水を用いた、より大きな投与量の薬物の、粒子中への充填を可能にした。合成中は、以下のパラメータに従った。
2009518289.tif 000033
【０２１９】
実施例８
治療用薬剤によりトリブロックコポリマーミセルを生成するためのプロセス
まず、中心において、疎水性ＰＥＡまたはＰＥＵＲポリマーの鎖を、その両末端にＰＥＧの交互ユニットおよびリシンまたはグルタミン酸塩のような少なくとも１つのイオン化可能なアミノ酸を含む水溶性ポリマー鎖と、結合させることによって、Ａ−Ｂ−Ａタイプのトリブロックコポリマー分子を形成する。該トリブロックコポリマーをその後、精製する。
【０２２０】
次いでミセルが、前記トリブロックコポリマーを使用して生成される。トリブロックコポリマーおよび少なくとも１つの高分子生物製剤は、水溶液中に、好ましくは、そのｐＨが水溶性鎖におけるイオン化可能なアミノ酸の少なくとも一部分が、水溶液においてトリブロックポリマーの分散をもたらすようなイオン化された形態である方法で選択された値に調製されている生理食塩水溶液中に溶解される。界面活性剤または脂質のような表面安定剤は分散液へ加えられ、形成される粒子を分離し安定させる。混合溶液は次いで、機械的もしくは磁気的撹拌機、または超音波処理器によって撹拌される。ミセルは本方法で形成され、図１０に示されるように、主に殻に水溶性部分を伴い、核に疎水性部分を伴い、それによってミセル粒子の完全性が維持される。ミセルは、高分子生物製剤の充填のための高空隙率を有する。タンパク質および他の生物製剤は、水溶性部分において帯電領域へ引き付けられる。形成されたミセル粒子は約２０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の大きさである。
【０２２１】
実施例９
薬物と混合される異なるポリマーから生成された粒子上のポリマー被膜
単一エマルジョンの使用は、粒子を非常に小さく（２０ｎｍから２００ｎｍ）作成することが出来るが、その薬物は粒子でマトリックス化され、早すぎる溶出の可能性があるという問題を残す。二重および三重エマルジョン粒子に関して、粒子は、水溶液の内部に起因して、単一エマルジョン技術によって調製される粒子よりも大きい。しかしながら、薬物をマトリックス化するために使用されるものと同じポリマーが、粒子の被膜に使用される場合、第三エマルジョン（ポリマー被膜）を作製する際に使用される溶剤は、マトリックス化された粒子を溶解し、被膜はマトリックスの一部となる（その中に薬物を伴う）。本問題を解決するために、薬物をマトリックス化するために使用されるものとは異なるポリマーを使用して、粒子の被膜を作製し、ポリマー被膜を作製する際に使用される溶剤は、マトリックスポリマーが溶解しないものが選択される。
【０２２２】
例えば、ＰＥＡはエタノールに溶解することが出来るが、ＰＬＡは出来ない。したがって、ＰＥＡは薬物をマトリックス化するために使用することが出来、ＰＬＡは被膜ポリマーとして使用することが出来るか、またはその逆も同様である。別の例において、エタノールはＰＥＡを溶解することが出来るが、ＰＥＵＲを溶解することはできず、アセトンはＰＥＵＲを溶解することが出来るが、ＰＥＡを溶解することは出来ない。したがって、ＰＥＵＲは薬物をマトリックス化するために使用することが出来、ＰＥＡは被膜ポリマーとして使用することが出来るか、またはその逆も同様である。
【０２２３】
したがって、使用される一般プロセスは以下のとおりである。ポリマーＡを使用し、ポリマー粒子において薬物またはその他の生物活性剤をマトリックス化するための単一エマルジョン手順を用いて、溶液（ポリマーＡがＰＥＡ、ＰＥＵＲ、またはＰＥＵの場合は水性）内で、粒子を調合する。凍結乾燥により溶剤を完全に乾かし、乾燥粒子を得る。ポリマーＡ粒子を溶解しない溶剤においてポリマーＢの溶液へ、乾燥粒子を分散させる。水溶液で混合物を乳化させる。得られる粒子は、マトリックス化された薬物を含むポリマーＡの粒子上のポリマーＢのコーティングを伴うナノ粒子である。
【０２２４】
実施例１０
活性エステル法を用いたインシュリンポリマー結合体の調製
材料：
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＨＮＳ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ  イソプロパノール（ＨＦＩＰ）、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）を、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから購入し、さらに精製せずに使用した。その他の溶剤、アセトン、へキサン、およびエタノール（フィッシュ
【０２２５】
本実施例は、その中のアミノ基を介したＰＥＡポリマーへのインシュリンの共有結合を示す。インシュリンは複数の付着部位を有するため（すなわち、１つの分子につき３つの一級アミノ基）、ポリマーへの結合は、単一部位で（インシュリン分子はＰＥＡポリマーの１つのカルボキシルにのみ付着する）または複数部位で（１つのポリマー鎖のまたは複数のポリマー鎖からの、１つ以上のカルボキシレートがインシュリンの１つの分子ごとに結合される）のいずれかであることが出来る。複数部位での付着の場合は、さまざまな技術によって検出することが出来る。例えば、平均分子重量および重量分布における変化はＧＰＣによりモニタリングされる。
【０２２６】
Ｒ１＝（ＣＨ２）８；Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である式（ＩＩＩ）のＰＥＡ−Ｈは、５９，０００ｇ／モルの分子重量および１．５５７の多分散性を有し、結合薬剤としてＤＣＣおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）を使用して、最初にＤＭＦ内で活性化された。アルゴン下、２．８ｍＬのＤＭＦ内に０．６０７ｇのＰＥＡ−Ｈ（３２８μｍｏｌ）を溶解すること、ならびにその後３７．３ｍｇのＤＣＣ（１８１μｍｏｌ、約０．５５等量）および２０．８ｍｇのＮＨＳ（１８１μｍｏｌ、０．５５等量）の存在下でその透明の反応混合物を、室温で約２４時間、撹拌することを伴った。本反応混合物を次いで、０．４５μｍの細孔の大きさのフリットを通してろ過し、その後１ｍＬのＤＭＦで洗い流した。結果として得られたＰＥＡ−ＯＳｕ溶液を、分離することなくさらに結合させた。
【０２２７】
ＰＥＡ−ＯＳｕＺ（ｚは０からｐの範囲であり、Ｒ２はサクシンイミド残基である）として指定されたＮ−ヒドロキシサクシンアミド活性ＰＥＡは、さらにインシュリンと反応した。活性ポリマーへのインシュリンの結合体は、予め決められた量のインシュリン溶液をＤＭＳＯに加えることによって達成された。さらに具体的には、ポリマーへのインシュリン結合体は以下のように実行された。０．９９０ｇのインシュリン（１６５μｍｏｌ、０．９等量）は６．７ｍＬのＤＭＳＯ内に個別に溶解された。インシュリン溶液および８６μＬのＤＩＰＥＡ（４９７μｍｏｌ、３．０等量）は活性ＰＥＡ−Ｏｓｕ溶液へ加えられ、４８時間撹拌された。反応混合物内のインシュリンの全体濃度は８６．８ｍｇ／ｍＬであった。反応溶液は、インシュリン六量体プロセスへ進めるか、１５ｍＬエーテル／アセトン（１：１）内で沈殿させ、４℃において３６００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって回収するか、のいずれかであった。残った遊離インシュリンを除去するために、ＰＥＡ−インシュリン結合体を、ｐＨ＝３．７緩衝液で数回洗浄した。残った遊離インシュリンのピークはＧＰＣでモニタリングされた。
【０２２８】
ＰＥＡインシュリン結合体はＧＰＣによって分析され、表３に要約されるように、２０４，０００ｇ／モルの分子重量および多分散性２．２８を有した。サンプルの分子量は単一部位の付着に関して予想される最大分子量を超え、架橋結合が生じたことを示した。
【０２２９】
架橋結合をよりよく制御するために、ＰＥＡ−インシュリン結合反応は、ＤＭＳＯ内でさまざまな希釈濃度（上記反応溶液８６．８ｍｇ／ｍＬに関して６ｘ、１０ｘ、１７ｘ）において実施された。表３に示されるように、分子量および希釈反応の多分散性は、以前の反応および単一部位の付着の予想範囲内よりも顕著に低かった。この結果は、分子間架橋はもう生じず、鎖内結合生成物が得られたことを示す。
【０２３０】
（表３）さまざまな濃度のインシュリン溶液を適用した後に得られたＰＥＡ−インシュリン結合体の分子量
2009518289.tif 000034
ａ）各実験に関して、０．６０７ｇのＰＥＡ−Ｈ（３２８μｍｏｌ）が結合された。
ｂ）ＧＰＣ測定が、ＤＭＡｃ、（ＰＳ）内で実行された。
【０２３１】
インシュリン六量体形成および結晶化
ポリマーインシュリン結合体、ＰＥＡ−インシュリンｚをＤＭＳＯに溶解し、ｐＨ６．５の硫酸亜鉛およびフェノールを含む緩衝液で１：４の体積比に希釈し、次いで３０００ｇ／モルの分子重量カットオフを有する透析管に加えた。その後、ポリマーへ共有結合されるインシュリンの各等量について、追加の５等量のインシュリンを透析袋へ加えた。透析袋の内容物を、硫酸亜鉛、フェノールの結晶化緩衝液（ｐＨ６．５）内で、３日間から４日間撹拌し、結晶化緩衝液は毎日３回交換した。透析袋の固形物はその後凍結乾燥させ、ポリマーインシュリン結合体（ＰＩＣ）に対してのインシュリン充填の割合（％）（ｗ／ｗ）についてゲル透過クロマトグラフィーによって分析した。
【０２３２】
実施例１１
活性溶媒和エステル方法を用いたオボアルブミン−ポリマー結合体の調製
活性ポリマーであるＰＥＡ−ＯＳｕｚへのオボアルブミン（ＯＶＡ）の結合は、等量のＤＩＰＥＡにより、実施例１０で調製された活性ポリマーを含む反応フラスコに内で、ＯＶＡの予め定められた体積をＤＭＳＯに溶解することにより達成され、ポリマー−ＯＶＡ結合体であるＰＥＡ−ＯＶＡｚが生成された。反応はアルゴン下、７２時間、室温で実施された。反応溶液を次いで、３ｘ２ｍＬのエーテルにより、１５分間３６００ｒｐｍで４℃で遠心分離することにより抽出し、残りのエーテルを除去した。得られた白色ペレットをその後、３ｘ１５ｍＬの水で、１５分間３６００ｒｐｍで４０Ｃで遠心分離することにより、抽出した。ＯＶＡ−ポリマー結合体であるＰＥＡ−ＯＶＡｚは、その後凍結乾燥機で乾燥させた。
【０２３３】
実施例１２
高分子生物製剤としてのインシュリンを含むポリマーマトリックスの調製
方法１：
Ｒ１＝（ＣＨ２）８；Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である構造式（ＩＩＩ）のポリマーＰＥＡ−Ｈおよび遊離インシュリンを、異なる被膜ポリマー（すなわち、式（Ｉ）および（ＩＩＩ）のＰＥＡ、式（ＩＶ）および（Ｖ）のＰＥＵＲ、または式（ＶＩ）および（ＶＩＩ）のＰＥＵ）と、ＨＦＩＰ／ジオキサン（１：１０ｖ／ｖ）に、１：２の体積比で溶解し、溶液を両ポリマーが完全に溶解されるまで撹拌した。本溶液をその後、ジオキサンに、体積比１：１０で混合し、凍結し、凍結乾燥し、ＰＥＵＲ式（Ｖ）（式中（構造式ＩＩの）Ｒ６＝（ＣＨ２）８；Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝ＤＡＳであり、式中、ｍ＝３、ｐ＝１；１２０ＫＤａである）においてマトリックス化されたポリマーＰＥＡ−インシュリンｚ結合体を有する無形性物質を得た。
【０２３４】
方法２：
ＰＥＡ−Ｈおよび遊離インシュリンはＨＦＩＰで一晩溶解され、その後別の被膜ポリマー（すなわち、式（Ｉ）および（ＩＩＩ）のＰＥＡ、式（ＩＶ）および（Ｖ）のＰＥＵＲ）をＨＦＩＰにおいて２：１の体積比で加えた。溶液を両方のポリマーが完全に溶解されるまで撹拌した。本溶液を次いで、ジオキサンに体積比１：１０で混合し、凍結し、凍結乾燥し、式（Ｖ）（式中、Ｒ２＝−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｒ３＝−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝ＤＡＳ、Ｒ６＝（ＣＨ２）３、ｍ＝３、ｐ＝１である）の被膜ポリマーＰＥＵＲ．Ａｃ．Ｂｚ．でマトリックス化された、ポリマー−インシュリン結合体であるＰＥＡ−インシュリンＺを有する無形性物質を得た。
【０２３５】
実施例１３
ポリマーカプセル化インシュリンを含むナノ粒子の調製
大粒子における組み換えヒトインシュリンは完全に酢酸で溶解され、形成された溶液は透析管へ入れられ、沈殿物が形成されるまで（その時間は１〜４８時間の間で変動し、その温度は５〜５０℃の範囲で変動する可能性がある）撹拌なしで、ＤＣＭに対して透析された。界面活性剤（ＰＶＡ、ＰＶＰ、デキストリンなど）は、必要に応じて、透析の前に、インシュリンへ加えることが出来る。インシュリンのナノ粒子の形状の沈殿物を回収し、凍結乾燥して白色粉末が得られた。
【０２３６】
さまざまな比率の被膜ポリマーＰＥＡ．Ｈ、およびポリマー−インシュリン結合体であるＰＥＡ−インシュリンｚ、および２０ｍｇのＤＯＰＣを、ＤＣＭに溶解し、１００ｍｇ／ｍｌのポリマー濃度を有するポリマー溶液を得た。その後ＤＣＭで分散されたインシュリンナノ粒子１０ｍｇを、ボルテックスすることによってポリマー溶液と混合し、２０ｍｌ溶液を得た。本溶液を、５〜５０ｍｇのＳＬＳを含む水相２５〜１００ｍｌへ加えた（ＰＶＡのような追加の界面活性剤を、ポリマー／界面活性剤比率１〜５の水相に加えることが出来る）。得られた混合物を振とうし、ボルテックスし、超音波処理によって５〜１００秒間混合して、水／油エマルジョンを形成し、それをその後回転蒸発してすべての残留有機溶剤を除去し、ナノ粒子生成物を安定させた。ポリマーナノ粒子内にカプセル化されたインシュリンは、溶液内に貯蔵されるか、またはさらに凍結乾燥して白色粉末を得ることができる。得られた凍結乾燥ナノ粒子は、室温で水溶液に再分散することが出来る。
【０２３７】
実施例１４
極性有機（ｏ／ｏ）中油性有機物エマルジョン技術を用いてポリマーミクロスフェアでカプセル化された遊離オボアルブミンの調製
２０ｍｇのＰＥＡ−Ｈおよび予め決められた量（４〜５ｍｇ）のオボアルブミンが、約３ｍｌのＨＦＩＰに溶解された。被膜ポリマーＰＥＵＲ．Ａｃ．Ｂｚ（Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝ＤＡＳ、Ｒ６＝（ＣＨ２）３、ｍ＝３、ｐ＝１である式（Ｖ）のポリマー）を、３ｍＬのＨＦＩＰに溶解し、油中油型（ｏ／ｏ）分散方法（Ｍｕｒｔｙら．ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ．２００３；４：Ｅ５０，Ｂｏｄｍｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，（１９９８）、７５ページ〜８２ページ）によって２つの溶液を共に加えてミクロスフェアを得た。ポリマーの混合物をその後、０．４ｍｌの安定剤、ソルビタンモノオレエートを含む８０ｍｌの綿実油で３０分間乳化し（６０００ｒｐｍ、４０℃）、オボアルブミンをカプセル化するミクロスフェアを生成した。ＨＦＩＰを、回転蒸発によって、ミクロスフェアを含む溶液から除去した。得られた溶液をその後、３倍の体積のヘキサンで希釈し、ミクロスフェアは、ＰＴＦＥ０．４５ミクロンフィルターを通した真空ろ過によって、回収した。ミクロスフェアをフィルターから除去し、凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２３８】
実施例１５
インシュリンがポリマーマトリックスで保護される無形性物質の調製
方法１．
ＰＥＡ−インシュリンｚ結合体を、異なる被膜ポリマー（例えば、式（Ｉ）および（ＩＩＩ）のＰＥＡ、式（ＩＶ）および（Ｖ）のＰＥＵＲ、または式（ＶＩ）および（ＶＩＩ）のＰＥＵが使用できる）と、１：２の体積比でＤＣＭに溶解した。溶液を、両方のポリマーが完全に溶解されるまで撹拌した。本溶液をその後、１：１０の体積比でジオキサンに溶解し、凍結乾燥して、式（ＩＩＩ）（式中、Ｒ１は（ＣＨ２）８およびＣＰＰの等モル混合物であり、Ｒ２＝−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｒ３＝−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝（ＣＨ２）６、ｍ＝３、ｐ＝１である）のＰＥＡにおいて結合ＰＥＡ−インシュリンｚがマトリックス化される無形性物質を得た。
【０２３９】
方法２．
ＰＥＡ−インシュリンｚ結合体を、異なる被膜ポリマー（すなわちＰＥＡ、ＰＥＵＲ、ＰＥＵなど）と、１：２の体積比でＨＦＩＰ／ジオキサン（１：１０の体積比）に溶解した。溶液を、両方のポリマーが完全に溶解されるまで撹拌した。その後、本溶液を、液体窒素で凍結し、凍結乾燥して、式（Ｖ）（式中、Ｒ２＝−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｒ３＝−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝ＤＡＳ、Ｒ６＝（ＣＨ２）３、ｍ＝３、ｐ＝１である）のＰＥＵＲにおいて結合ＰＥＡ−インシュリンｚがマトリックス化される無形性物質を得た。
【０２４０】
方法３．
ＰＥＡ−インシュリンｚ結合体をＨＦＩＰで一晩溶解し、その後異なる被膜ポリマー（すなわちＰＥＡ、ＰＥＵＲ、ＰＥＵなど）がＨＦＩＰにおいて２：１の体積比で加えられた。本溶液を混合し、液体窒素で凍結し、凍結乾燥して、式（Ｖ）（式中、Ｒ２＝−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｒ３＝−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝ＤＡＳ、Ｒ６＝（ＣＨ２）３、ｍ＝３、ｐ＝１である）のＰＥＵＲにおいて結合ＰＥＡ−インシュリンｚがマトリックス化される無形性物質を得た。
【０２４１】
実施例１６
ｗ／ｏエマルジョン技術による、ポリマーコーティングされたインシュリンを含むナノスフェアの調製
約１００ｍｇのカプセル化ポリマー（ＰＥＡ、ＰＥＵＲなど）および２０ｍｇのＤＯＰＣはＤＣＭで共溶解され、１００ｍｇ／ｍｌのポリマー／ＤＯＰＣ濃度のポリマー溶液を得た。それからＤＣＭで分散された１０ｍｇのＰＥＡ−インシュリンｚ結合体は、ボルテックスすることによってポリマー溶液と混合され、２０ｍｌの溶液を生じた。本溶液に５〜５０ｍｇのＳＬＳを含む水相２５〜１００ｍｌを加えた（ＰＶＡのようなさらなる界面活性剤を、ＰＶＡ対ポリマー比が１〜５で水相に加えることが出来る）。本混合物を振とうし、ボルテックスし、超音波処理によって５〜１００秒間混合し、その後回転蒸発させ、すべての残留有機溶剤を除去し、ナノ粒子生成物を安定させた。インシュリンナノ粒子は、その後、溶液内に貯蔵され、あるいはさらに凍結乾燥され白色粉末を得ることができる。ポリマーコーティングされたインシュリンナノ粒子の粉末は、室温で水溶液に再分散することが出来る。
【０２４２】
実施例１７
ｏ／ｏエマルジョン技術による、ポリマーコーティングされたインシュリンを含むナノスフェアの調製
ＰＥＡ−インシュリンｚ結合体および、Ｒ２＝−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｒ３＝−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝ＤＡＳ、Ｒ６＝（ＣＨ２）３、ｍ＝３、ｐ＝１である式（Ｖ）のＰＥＵＲポリマーを、６ｍＬのＨＦＩＰで完全に溶解した。本溶液は２７ゲージステンレススチール針を通じて、８０ｍＬの綿実油および０．４ｍｌのソルビタンモノオレアートの急速撹拌溶液（６０００ｒｐｍ）へ４０℃で１０分間にわたってゆっくり加えられ、オイルインオイル（ｏ／ｏ）分散法（上記Ｍｕｒｔｙら、および上記ＢｏｄｍｅｉｅｒおよびＨｅｒｍａｎｎ）によってミクロスフェアを得た。ＨＦＩＰ／ＴＦＥは、それから４０℃の水浴中での４０分間の回転蒸発によって除去された。得られた溶液中のミクロスフェアは、溶液をヘキサンの３倍で希釈し、本溶液を０．４５ミクロンＰＴＦＥフィルターでろ過することにより得られた。ミクロスフェア生成物はフィルターの表面から除去され、一晩凍結乾燥して白色微紛を得た。
【０２４３】
実施例１８
極性有機（ｏ／ｏ）エマルジョン技術での油性有機物を用いた、ミクロスフェア中のオボアルブミン−ポリマー結合体のカプセル化
ポリマーコーティングされたオボアルブミン結合体（Ｉ）の調製
ＰＥＡ−ＯＶＡｚ結合体および、Ｒ２＝−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｒ３＝−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｒ４＝ＤＡＳ、Ｒ６＝（ＣＨ２）３、ｍ＝３、ｐ＝１である式（Ｖ）のＰＥＵＲポリマーを、６ｍＬのＨＦＩＰで完全に溶解した。本溶液は２７ゲージステンレススチール針を通じて、８０ｍＬの綿実油および０．４ｍｌのソルビタンモノオレアートの急速撹拌溶液（６０００ｒｐｍ）へ４０℃で１０分間にわたってゆっくり加えられ、オイルインオイル（ｏ／ｏ）分散法（上記Ｍｕｒｔｙら、および上記ＢｏｄｍｅｉｅｒおよびＨｅｒｍａｎｎ）によってミクロスフェアを得た。ＨＦＩＰ／ＴＦＥは、それから４０℃の水浴中での４０分間の回転蒸発によって除去された。得られた溶液中のミクロスフェアは、溶液を３倍量のヘキサンで希釈し、本溶液を０．４５ミクロンＰＴＦＥフィルターでろ過することにより、得られた。ミクロスフェアはフィルターの表面から除去され、一晩凍結乾燥して白色微紛を得た。
【０２４４】
ポリマーコーティングされたインシュリン結合体（ＩＩ）の調製（表４、図１２参照）
方法１．
インシュリン（１１．５５ｍｇ）、ＤＯＰＣ（４０ｍｇ）、およびＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｚ（１００ｍｇ）を６ｍｌのＤＣＭで溶解した。本混合物は０．２５％のＤＨＰＣ（０．２５％）水溶液へ加えられた後、ボルテックスされ、超音波分解され、回転蒸発された。本溶液を８ｍＬまで減少させた。
【０２４５】
方法２．
６０ｍｇのＰＥＡ−Ｉｎｓ結合体を加え、８．０ｍｌのＤＣＭで溶解した。３０ｍｇのＰＥＵＲ（８５ｋＤａ）を加え、４．０ｍｌのＤＣＭで溶解さした。ポリマー溶液をＰＥＡ構築物に加え、それらを混合し混濁液を得た。６．０ｍＬのヘキサンをポリマーに加えた。溶液は濁った。その後１８ｍＬのジオキサンを加えると、溶液は透明になった。物質を凍結乾燥し、白色非晶質粉末を得た。
【０２４６】
（表４）ポリマーコーティングされたインシュリン結合体（ＩＩ）の例となる製剤
2009518289.tif 000035
【０２４７】
ポリマーコーティングされたインシュリン結合体（ＩＩＩ）の調製（表５、図１３参照）
方法１．
ＰＥＡ（６５ｋＤａ）［Ｉｎｓ−ＨＥＸ］（１５０ｍｇ）を３ｍｌのＤＣＭで溶解し、１．５ｍｌのＤＣＭ中の７５ｍｇのＰＥＡ（４１ｋＤａ）−８−ＣＰＰ（５０％）．Ａｃ．Ｂｚと混合した。それから１５ｍＬのジオキサンを混合物に加え、溶液を凍結乾燥した。本生成物を製剤１と呼んだ。
【０２４８】
方法２．
インシュリン（３５ｍｇ）、ＤＯＰＣ（６３ｍｇ）、およびＰＥＡ．Ａｃ．Ｂｃ／ＰＥＡ−Ｈ（８：２）（３１５ｍｇ）を３８．７ｍｌのＤＣＭで溶解した。その後本混合物をボルテックスし、超音波分解し、１００ｍｌの０．０５％ＰＶＡ（８０）で乳化した。溶液を回転蒸発し、一晩凍結乾燥した。
【０２４９】
（表５）ポリマーコーティングされたインシュリン結合体（ＩＩＩ）の例となる製剤
2009518289.tif 000036
【０２５０】
ポリマーコーティングされたインシュリン結合体（ＩＶ）の調製（表６、図１４ａ〜１４ｂ参照）
方法１−サンプル
以下の物質、ＰＥＡ（６５ｋＤａ）．Ｈ．Ａｃ、ＰＥＡ−４ＰｈｅＤａｓＡｃＢｚ、ＰＥＡ［Ｉｎｓ］６、オレイン酸、トリグリセリド、スパン８０、パルミトイルカルナチン、およびＰＶＡを異なる組合せで使用して、経口インシュリン製剤が作られた。経口インシュリンミクロスフェアは、前述のオイルインウォーター単一エマルジョン方法にしたがって作製された。製剤の個々の成分を表６に示す。
【０２５１】
（表６）ポリマーコーティングされたインシュリン結合体（ＩＶ）の例となる製剤
2009518289.tif 000037
トリグリセリド＝１：１カプリン酸：カプリル酸トリグリセリド、スパン８０＝ポリソルベートモノオレアート、ＰＶＡ＝ポリビニルアルコール（８０％加水分解）
【０２５２】
実施例１９
粒子からの生物活性インシュリンの回収
インシュリンを含む粒子は、二重エマルジョン技術または、オリゴマー化のシーディングおよびポリマー−生物製剤結合体を使用した技術によるインシュリンの結晶化のいずれかによって、調製された。粒子を遠心分離し、ＤＣＭで溶解し、インシュリンを回収した。Ｌ６ラット骨格筋細胞を、１０％ＦＢＳ／９０％ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）の入った６０ｍｍ皿で培養し、その後、培地を２％ＦＢＳ／９８％ＤＭＥＭに変え、分析のため、筋芽細胞から筋管への分化効率を増大させた。分析の日、２時間にわたって血清から細胞を取り、それからＰＢＳで洗い流した。インシュリン（すべてのサンプルから１００ｎＭに標準化した）をＬ６細胞培養に適用し、インシュリンの生物活性を、ＡＫＴリン酸化反応を活性化するその能力によって測定した。細胞を、室温で５分間揺らしながら、インシュリンに曝露し、それ続き、細胞培養プレートを氷上に置き、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムを含むＰＢＳで洗い流した。細胞スクレーパーを用いて細胞をプレートの表面から擦り取り、１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブへピペットで移し、細胞を沈殿させるために遠心分離した。４０μｌの溶解緩衝液を各チューブに加え、氷上で１５分間、細胞とともにインキュベートした。破片を除去するために溶解物を遠心分離し、標準ウエスタンブロット技術を用いて、ＡＫＴリン酸化反応の程度を分析した。適正な分子量（６５ｋＤａ）のバンドが、粒子製剤からのインシュリンをロードしたブロット上のレーンで検出された。本方法により、粒子製剤に組み込まれたインシュリンは、ＡＫＴのリン酸化反応で測定されたように、細胞シグナル伝達を活性化するその機能を維持するということが実証された。
【０２５３】
実施例２０
粒子からの生物活性インシュリンの送達は高血糖のマウスおよびラットにおける全身のグルコースレベルを減少させる
インシュリンを含む粒子を、実施例１８の方法ＩＩ〜ＩＶにしたがって調製した。製剤を、経口強制投与によって高血糖のマウスまたはラットに送達した。空腹時血糖（ＦＢＧ）を、インシュリン処理後の末梢血液サンプルから測定した。図１２（実施例１８、方法ＩＩ）および１３（実施例１８、方法ＩＩＩ）に要約された結果によって示される、ＦＢＧにおける減少により、生物活性インシュリンが粒子から放出され、血糖値の変化に影響したということが実証される。グラフ上で１．０の値はＦＢＧの変化がないことを示す。マウス試験において（図１２）、１０〜５０％のＦＢＧの減少が約２時間にわたって達成された。ラット試験において（図１３）、３５％のＦＢＧの減少が約３時間にわたって達成された。粒子により達成された減少は、図１２および１３に示されるグラフのカーブの領域で測定されるように、陽性対照のインシュリンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射の効果の約２９％のＦＢＧ減少効果がある。
【０２５４】
実施例２１
粒子からの生物活性インシュリンの送達は全身のグルコースレベルを減少させ正常血糖ラットの血流へインシュリンを送達する（プレクリノミクス試験）
経口インシュリン送達に関連するメカニズムを理解するため、十二指腸から門脈および末梢循環系へインシュリンを送達するＰＥＡ−インシュリン結合体粒子の能力を調べるために１つの研究が考案された。ＰＥＡ−インシュリン結合体粒子は、実施例１８、方法ＩＶに記載のポリマーと生物製剤の結合体を用いた技術によるインシュリンのシーディング、オリゴマー化および結晶化によって作製される。
【０２５５】
雄のスプラーグ−ドーリーラットを一晩絶食させ、翌朝麻酔下に置き、カテーテル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｓａｆ−Ｔ−Ｉｎｔｉｍａ（商標）  Ｗｉｎｇｅｄ  ＩＶ  Ｃａｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ、２２Ｇｘ３／４”）を十二指腸および門脈に入れた。カテーテルの設置に続いて、切開部は、カテーテルチューブを介した外部への通路を残して閉じられた。
【０２５６】
ラットは、実験中適切な体温を維持するために暖められたパッドに置かれた。試験粒子は十二指腸のカテーテルへ注入され、ヒトインシュリンが皮下送達された。門脈および末梢循環におけるグルコースおよびインシュリン濃度を測定するために、血液サンプルを門脈カテーテルおよび尾静脈から採取した。外科手術の技術的な性質により、すべてのラットは生き残ったわけではなく、各試験群のラットの数はさまざまであったが、すべてのＰＥＡ−インシュリン群は最低５匹のラットを有した（ｎ＝５）。
【０２５７】
血液サンプルは、投与後、０、１５、３０、４５、６０、７５、および９０分の時点で採取した。グルコース分析は新たに採取された血液を用いてワンタッチ血糖測定器で行われた。インシュリンサンプルを凝固させ、その後血漿を分離するために回転させた。ヒトインシュリンサンプルはＭｅｒｃｏｄｉａ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ）使用して分析された。
【０２５８】
図１５Ａ、パネルＡのグラフは、１、２および６群の平均したヒトインシュリンデータおよびラットグルコースデータを示す。図１５Ｂのグラフは、３、４および５群の平均したヒトインシュリンデータおよびラットグルコースデータを示す。図１５ＡおよびＢのそれぞれの上部３グラフは、門脈循環からのデータを示し、図１５ＡおよびＢのそれぞれの下部３グラフは末梢循環からのデータを示す。さらに、偽動物（手術を受けたが、いずれの試験粒子も受けなかった）から得られたグルコースレベルは、全くヒトインシュリンがない場合のラットでのグルコースプロファイルを実証するための対照として使用される。両方のパネルにおいて、内因性マウスインシュリンのバックグラウンドを上回るヒトインシュリンの存在により、グルコースレベルの低下がもたらされる。
【０２５９】
カテーテル挿入ラットの研究は、ＰＥＡ−インシュリン結合体粒子が十二指腸から門脈および末梢循環までヒトインシュリンを送達することが出来ることを明らかに実証した。この外因性インシュリンの存在により、インシュリンが素早く、十分な量で送達される時、マウスのグルコースレベルを低下させる結果がもたらされる。
【０２６０】
すべての出版物、特許ならびに特許文献は、参照によって個々に組み入れられるように、参照によって本明細書に組み入れられる。本発明は、種々の具体的および好適な態様ならびに技術に関して説明してきた。しかしながら、多くの変更および修正が、本発明の精神と範囲内においてなされてもよいことを理解されたい。
【０２６１】
本発明は上記の実施例に関して説明してきたが、修正および変更が本発明の精神と範囲内において企図されることを理解されたい。したがって、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１】ポリマー粒子の外側をコーティングする水溶性被膜分子を図説する模式図である。
【図２】ポリマー粒子の外側をコーティングする生物活性剤を図説する模式図である。
【図３】生物活性剤が付着しているポリマー粒子の外側に適用される水溶性ポリマー被膜を図説する模式図である。
【図４】本明細書に説明される二重および三重のエマルジョン手順によって、中に分散された生物活性剤を備えた発明のポリマー粒子を表す模式図である。二重エマルジョン技法によって形成される、水中のポリマー粒子カプセル化薬剤を示す。
【図５】本明細書に説明される二重および三重のエマルジョン手順によって、中に分散された生物活性剤を備えた発明のポリマー粒子を表す模式図である。その中で薬剤が溶解する水滴がポリマー粒子内でマトリックス化される二重エマルジョンによって形成されるポリマー粒子を表す。
【図６】本明細書に説明される二重および三重のエマルジョン手順によって、中に分散された生物活性剤を備えた発明のポリマー粒子を表す模式図である。水中に分散される薬剤が粒子を形成するポリマー被膜内にカプセル化される、三重のエマルジョン技法によって形成されるポリマー粒子を表す。
【図７】本明細書に説明される二重および三重のエマルジョン手順によって、中に分散された生物活性剤を備えた発明のポリマー粒子を表す模式図である。分散した薬剤を含むさらに小型のポリマー粒子が水中でマトリックス化されて、粒子を形成するポリマー被膜でコーティングされる、三重のエマルジョン技法によって形成されるポリマー粒子を表す。
【図８】本明細書に説明される二重および三重のエマルジョン手順によって、中に分散された生物活性剤を備えた発明のポリマー粒子を表す模式図である。粒子を形成するポリマー中でマトリックス化される薬剤を形成するポリマー粒子を示す。
【図９】本明細書に説明される二重および三重のエマルジョン手順によって、中に分散された生物活性剤を備えた発明のポリマー粒子を表す模式図である。混合物が溶解性でない第二のポリマーの被膜内でカプセル化された薬剤／第一のポリマー混合物を示す。
【図１０】本明細書に説明されている、分散した活性剤を含む本発明のミセルを図説する模式図である。
【図１１】プロトマーとポリマーの結合によって安定化されている生物学的高分子プロトマーのミクロ結晶を図説する模式図である。１＝オリゴマー化（インシュリンのＺｎ−六量体、２＝プロトマーとオリゴマーの結晶化、３＝オリゴマー経由のポリマー鎖ネットワーク、４＝プロトマー経由のポリマー鎖ネットワーク。白＝結合していないプロトマー、黒＝ポリマー鎖に結合したプロトマー、円＝亜鉛。
【図１２】本発明に従い作製されたポリマー粒子から放出された生物活性インシュリンを空腹の低血糖のマウスに投与した結果、血糖値（ＦＢＧ）の減少を示すグラフである。ＦＢＧに変化のない場合は１．０の値とする。グルコースはポリマー対照に対して標準化した。
【図１３】本発明に従い作製されたポリマー粒子から放出された生物活性インシュリンを空腹の低血糖のラットに投与した結果、血糖値（ＦＢＧ）の減少を示すグラフである。ＦＢＧに変化のない場合は１．０の値とする。
【図１４】図１４ＡとＢは、遊離インシュリンの皮下注射またはインシュリン−ポリマー結合体粒子を十二指腸に投与した結果、正常血糖のラットにおける血糖とインシュリンの変化を要約する一連のグラフを示す。図１４Ａ（１）＝門脈インシュリン、図１４Ａ（２）＝皮下尾静脈インシュリン、図１４Ｂ（３）２０ＩＵ／ｋｇ  ＰＥＡ−インシュリン粒子、門脈インシュリン、図１４Ｂ（４）＝２０ＩＵ／ｋｇ  ＰＥＡ−インシュリン粒子、尾静脈インシュリン。
【図１】
2009518289.tif 000045
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2009518289.tif 000053
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2009518289.tif 000056
【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月23日(2008.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子生物製剤の少なくとも１つの部位を介して生分解性ポリマーに結合する少なくとも１つの高分子生物製剤を有する生分解性ポリマーの粒子を含み、それによって前記高分子生物製剤の本来の活性を維持する組成物であって、前記ポリマーが以下の少なくとも１つまたは混合物を含む、組成物：
構造式（Ｉ）によって表される化学式を有するポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）であって、
2009518289.tif 000060
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ１がα，ω−ビス（ｏ、ｍまたはｐ−カルボキシフェノキシ）−（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレンおよび(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレンの残基から独立して選択され、個々のｎモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、かつＲ４が(Ｃ２−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオール残基、または構造式（ＩＩ）
2009518289.tif 000061
の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントおよびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択される、ポリ（エステルアミド）（ＰＥＡ）；
または、構造式（ＩＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＡポリマーであって、
2009518289.tif 000062
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０.１から０．９の範囲であり、ｐが約０．９から０．１の範囲であり、Ｒ１がα，ω−ビス(ｏ、ｍ、またはｐ−カルボキシフェノキシ）（Ｃ１−Ｃ８）アルカン、３，３’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸または４，４’−（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンの残基から独立して選択され、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が(Ｃ２−Ｃ２０)アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和または不飽和治療ジオール残基、構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから成る群から独立して選択され、Ｒ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＡポリマー；
または、構造式（ＩＶ）によって表される化学式を有する（エステルウレタン）（ＰＥＵＲ）であって、
2009518289.tif 000063
式中、ｎが約５から約１５０の範囲であり、Ｒ３が水素、(Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療ジオール残基および構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントから成る群から選択され、Ｒ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、飽和または不飽和治療ジオールの残基、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、（エステルウレタン）（ＰＥＵＲ）；
または、一般構造式（Ｖ）によって表される化学構造を有するＰＥＵＲポリマーであって、
2009518289.tif 000064
式中、ｎが、約５から約１５０の範囲であり、ｍが約０．１から約０．９の範囲であり、ｐが約０．９から約０．１の範囲であり、Ｒ２が水素、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは保護基から独立して選択され、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および-(ＣＨ２）２ＳＣＨ３から成る群から独立して選択され、Ｒ４が、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、飽和または不飽和治療ジオールの残基および構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントから成る群から選択され、Ｒ６が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンまたはアルキルオキシ、一般式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、飽和または不飽和治療ジオールの残基の有効量、およびこれらの組み合わせから独立して選択され、かつＲ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵＲポリマー；
または、一般構造式（ＶＩ）で表される化学式を有するポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）であって、
2009518289.tif 000065
式中、ｎが約１０から約１５０であり、個々のｎモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、および−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ、（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオールの残基の有効量、または構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択される、ポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）；
または、構造式（ＶＩＩ）によって表される化学式を有するＰＥＵであって、
2009518289.tif 000066
式中、ｍが約０．１から約１．０であり、ｐが約０．９から約０．１であり、ｎが約１０から約１５０であり、Ｒ２が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルもしくは（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、または保護基であり、個々のｍモノマー内のＲ３が水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルおよび−（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から独立して選択され、Ｒ４が（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２−Ｃ８）アルキルオキシ（Ｃ２−Ｃ２０）アルキレン、飽和もしくは不飽和治療ジオールの残基、または構造式（ＩＩ）の１，４：３，６−ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメント、およびこれらの組み合わせから独立して選択され、かつＲ７が独立して（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルである、ＰＥＵ。
【請求項２】
高分子生物製剤がタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
高分子生物製剤のうちの少なくとも１つが、その２つ以上の部位を介してポリマーに架橋するようにポリマーに結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
高分子生物製剤が、
オリゴマー、
タンパク質結晶、および
凝集体
から選択される形態である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
オリゴマーがインシュリンオリゴマーである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
インシュリンオリゴマーがインシュリンプロトマーの六重項である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
タンパク質の結晶または凝集体が、カルシウムまたは遷移金属の少なくとも１つの原子をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
ポリマー内にマトリックス化されたコール酸に基づく少なくとも１つの胆汁酸塩をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
高分子生物製剤が治療用タンパク質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリマーが、少なくとも１つのＲ１がα,ω-ビス(ｏ,ｍ,またはｐ-カルボキシフェノキシ）（Ｃ１-Ｃ８）アルカン、３,３’-（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、または４,４’（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基であり、または少なくとも１つのＲ４が構造式（ＩＩ）の１, ４:３, ６-ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントであり、かつＲ７が-(ＣＨ２)４-である構造式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるＰＥＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリマーが、少なくとも１つのＲ１がα,ω-ビス(４-カルボキシフェノキシ）（Ｃ１-Ｃ８）アルカン、３,３’-（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸、または４, ４’-（アルカンジオイルジオキシ）ジ桂皮酸の残基であり、または少なくとも１つのＲ４が構造式（ＩＩ）の１, ４: ３, ６-ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントであり、かつＲ７が-(ＣＨ２)４-である構造式（Ｖ）または（ＶＩ）で表されるＰＥＵＲを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリマーが、少なくとも１つのＲ１が構造式（ＩＩ）の１, ４: ３, ６-ジアンヒドロヘキシトールの二環式フラグメントであり、かつＲ７が-(ＣＨ２)４-である構造式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）により表されるＰＥＵを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリマー粒子の液体分散形態での投与のために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの生物活性剤または水溶性分子が、前記粒子の外側でポリマーに結合される、請求項１に記載の組成物。
【国際調査報告】
2009518289.tif 000067