(57)【要約】  本発明は、全血を特異的に溶血する方法に関する。本発明は、赤血球を含むことが既知であるまたは疑われる液体試料および真核生物細胞を含むことが疑われるまたは既知である液体試料中の分析物を検出する方法であって、赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な条件下で、該液体試料を膜可溶化剤で処理する工程、処理試料をクロマトグラフィー分離に供する工程、ならびに分析物を検出する工程を含む方法を開示する。赤血球と有核細胞の両方を含み得る液体試料中の分析物を検出する方法において、赤血球の特異的溶血は有利である。赤血球の特異的可溶化は、LC-MSのようなオンライン検出方法と容易に組み合わせることができ、多くの分析物の検出、例えば、葉酸またはタクロリムスもしくはシロリムスのような免疫抑制薬の検出において有利である。  2009540274.tif 000008
2009540274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を含むことが既知であるまたは疑われる液体試料および真核生物細胞を含むことが疑われるまたは既知である液体試料中の分析物を検出する方法であって、該方法は
a)赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な条件下で、該液体試料を膜可溶化剤で処理する工程、
b)工程(a)で得られた処理試料をクロマトグラフィー分離に供する工程、ならびに
c)分析物を検出する工程
を含み、
該条件は、該膜可溶化剤と1:10希釈の全血試料とを1:1の比で混合し、30分間インキュベートすることによって、フィルターをふさぐことなく2mmの直径および0.5μmの孔径を有するフィルターに適用され得る50の10μLアリコートの処理全血試料がもたらされる場合に適切である、方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィー分離が、カラムクロマトグラフィーに基づいており、フリットおよび床物質を含むカラムの使用またはモノシリックカラムの使用によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フリットが0.2または0.5μmの孔径を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記床物質が粒子であり、該粒子が1〜10μmの直径を有する、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記クロマトグラフィー分離が高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によるものである、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記分析物が質量分析によって検出される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が脳脊髄液および全血から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記分析物が赤血球内に少なくとも部分的に局在する、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記分析物が免疫抑制薬である、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
液体クロマトグラフィーのための全血試料の処理における、
KBr、KJ、KSCNまたは以下のカチオンおよびアニオンの1つ以上からなる塩、
ここで、カチオンは
2009540274.tif 000007
（式中、mは0または1であり、nは4または6である）
から選択され、アニオンはクロライド、テトラフルオロボレート、オクチルスルフェート、ヨウ化物、およびチオシアネートから選択される、
から選択される化学物質を含む膜可溶化剤の使用。
【請求項１１】
液体クロマトグラフィー系分析における請求項１〜９記載の方法のいずれかによる膜可溶化剤を用いた特異的溶血によって得られた処理血液試料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球を含むことが既知であるまたは疑われる液体試料および真核生物細胞を含むことが疑われるまたは既知である液体試料中の分析物を検出する方法であって、赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な条件下で、該液体試料を膜可溶化剤で処理する工程、処理試料をクロマトグラフィー分離に供する工程、ならびに分析物を検出する工程を含む方法に関する。赤血球の特異的溶血は赤血球と有核細胞の両方を含み得る液体試料中の分析物を検出する方法において有利である。赤血球の特異的可溶化はLC-MSのようなオンライン検出方法と容易に組み合わせることができ、多くの分析物の検出、例えば、葉酸またはタクロリムスもしくはシロリムスのような免疫抑制薬の検出において、有利である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
試料中に成分がより多く存在するほど、そこに含まれる標的分析物の分析はより困難である。赤血球は、全血のような生物学的液体から検出される分析物に潜在的に干渉する劇的な量のタンパク質および低分子量成分を含む。このことが主要な原因の１つであるため、臨床慣例において、好ましくは血液血漿（しばしば単純に血漿、すなわち、抗凝固全血試料と呼ばれる；細胞および赤血球を除く）または血液血清（しばしば単純に血清、すなわち、凝固全血と呼ばれる；細胞、赤血球および凝固系、特にフィブリン/フィブリノーゲンの大部分のタンパク質を除く）のそれぞれが使用される。また、全血試料は、例えば血清または血漿と比較して取り扱うのがより困難である傾向がある。全血は安定でない傾向があり、赤血球の緩やかな破壊は目的の多くの分析物の信頼性のある測定を損なう。
【０００３】
また、この時点で、多くの既存のオンライン検出方法において全血試料を使用することは可能でないように思われる。例えば、液体クロマトグラフィー(LC)に基づいた分離工程を要する臨床診断慣例手順において全血試料を使用することは可能でない。慣例液体クロマトグラフィー分離は通常、本質的に、カラム物質を保護するフィルターユニットまたはフリット、および目的の分析物の分離に必要なカラム物質からなるカラムに基づいている。全血をかかるカラムに適用する場合、カラムは、カラムサイズおよび系に応じてかなりすぐにまたは直後にふさがれる。この問題によって、例えば臨床慣例診断に好ましいLC-法と組み合わせたオンライン検出方法において全血を使用することは単に不可能になる。現在、かかる処理試料が適切にかつ信頼して分析され得る前に、例えば、遠心分離、濾過、沈殿または分析物抽出による血液試料の適切な分離／取り扱いが必須であるように思われる。
【０００４】
上述に示したように、血清または血漿は全血から得られてもよく、分析物の検出に使用されてもよい。また理論では、細胞および赤血球は、全血から濾過または遠心分離によって除去されてもよい。しかし、これらの方法は、慣例診断設定における使用に適切でないし、少なくとも部分的に赤血球に存在する分析物の正確な測定を可能にしない。
【０００５】
試料処理のさらなる方法で、目的の分析物は最初に、選択的沈殿または抽出法によって潜在的に干渉する物質の大部分から分離される。抽出は、液相または固相で行なうことができる。これは、免疫抑制薬の検出に使用されるいくつかの手順を示すことで例示される。
【０００６】
周知の免疫抑制薬は例えば、ミコフェノール酸モフェチル（MMF）、ラパマイシン(RAPAはシロリムスとしても公知)およびタクロリムス(FK-506)である。免疫抑制薬のための治療薬物モニタリングは、移植患者およびAIDSに罹患する患者に特に重要である(例えば、Drug Ther. Perspect. 17(22)(2001)8-12参照)。固形の臓器移植を受けるほとんどの患者は、同種異系移植拒絶を防ぐための長期免疫抑制治療を必要とする。しかし、多くの免疫抑制剤は狭い治療範囲を有し、かつ様々な毒性および薬物相互反応の潜在性と関連するために、患者の臨床評価と共に治療薬物モニタリング(TDM)の使用が特に重要であるかもしれない。
【０００７】
ミコフェノール酸モフェチルはプロドラッグである。経口投与後に、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)は腸および血液中で急速な加水分解を受け、その活性代謝物のミコフェノール酸(MPA)を形成する。MMFは広く利用可能であり、コルチコステロイドおよびシクロスポリンと組み合わせて腎臓、肝臓または心臓同種異系移植拒絶の防止のために米国および英国で承認されている。該薬物は腎臓同種異系移植の急性拒絶の発生を減少する点でアザチオプリンよりも卓越性を示した。治療凹部(trough)濃度は、1〜3.5mg/Lの範囲である。MMFは、血漿および全血から測定することができる。
【０００８】
タクロリムスはマクロライド抗生物質であり、肝臓同種異系移植拒絶の防止のために1994年に米国食品医薬品局(FDA)によって最初に承認された。これは、インビトロでシクロスポリンよりも100倍まで効力があり、臨床的に組織拒絶の発生の大きな減少と関連する。タクロリムスは、様々な移植手順を受ける患者の一次免疫抑制治療として、および肝臓または腎臓移植後の免疫性急性同種異系移植拒絶を有する患者の救助治療としての両方で効能を示した。治療凹部濃度は、5〜20μg/Lの範囲である。
【０００９】
循環中に存在するタクロリムスの少なくとも一部が赤血球内に区画されるために、全血試料がこの薬物の臨床慣例測定に使用される。タクロリムスは、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、HPLC質量分析(MS)、ラジオリセプターアッセイ(RRA)、または免疫アッセイ(IA)によって検出できる。後者の2つの方法は、タクロリムスおよびその様々な特定の代謝物を同じ感度で検出しない。これは、使用手順における干渉をもたらすことがある(Murthy, J.N., et al., Clin. Biochem. 31(1998)613-617)。少なくとも様々なタクロリムス代謝物の検出において、HPLC-MS-手順を黄金標準とみなすことができる。しかし、上記の全手順は、全血からのタクロリムスの抽出を要する。通常、臨床慣例においてアセトニトリルが全血からのタクロリムスの抽出のために使用されるが、全血試料からのタクロリムスのオンライン測定を可能にする方法は存在しないように思われる。
【００１０】
シロリムスは、タクロリムスと同様に、マクロライド抗生物質である。これは、腎臓移植後の同種異系移植拒絶の防止のためにUS FDAによって1999年に最初に承認され、シクロスポリンおよびコルチコステロイドと組み合わせて急性使用する場合に関して見込みのある結果を実際に示した。インビトロで、シロリムスはシクロスポリンよりも100倍まで効力があり、臨床的に、これはシクロスポリンと相乗効果を示し、おそらくはシクロスポリン用量の低減を可能にするかもしれない。治療凹部濃度は5〜15μg/Lの範囲である。
【００１１】
タクロリムスに関して、有意な量のシロリムスが赤血球内に存在する。従って、全血試料の抽出は、どの検出方法が使用されようとも必要とされる。臨床慣例において、シロリムスを含むことが疑われる試料は、HPLCに供され、シロリムスは紫外光（UV）またはMS/MSによって検出される。また最近、微粒子酵素免疫アッセイが記載された(Jones, K., et al., Clinical Therapeutics 22 Suppl.B(2000)B49-B61)。
【００１２】
葉酸(folate)は、酸化状態で異なる関連分子群の集合名である。葉酸は水溶性ビタミンB群の一部であり、ホモシステイン代謝のための補酵素としておよびDNA複製に必要な1つの炭素基の転移において重要である。不十分な葉酸状態は神経管欠損のリスクの増大に関連し、心臓血管病、貧血、特定の癌およびアルツハイマー病と関連する。血清または血漿の葉酸濃度は最近の食餌物を反映するが、赤血球の葉酸濃度は、体内貯蔵をより示す(Gunter, E.W. et al., Clin. Chem. 42(1996)1689-1694; Fazili, Z. et al., Clin. Chem. 51 (2005) 2318-2325; Pfeiffer, C.M., et al., Clin. Chem. 50 (2004) 423-432)。赤血球の全葉酸（赤血球葉酸＝RBC葉酸）は、全ての体内葉酸状態の最良の基準である。最近の研究によって、5-メチルテトラヒドロ葉酸が循環する赤血球の主要な葉酸ビタマーであることが示された。葉酸欠乏の診断について、葉酸は95％より多く赤血球に局在するために、測定は、血清または血漿からだけでなく赤血球からも行なわれることが推奨される。赤血球中の濃度は、実際の葉酸状態をより本当に反映する。
【００１３】
多くの方法が、種々のマトリックス中の葉酸を測定するために利用可能である。主要な分析方法は、微生物学アッセイ、ラジオイムノアッセイ、化学発光、クロマトグラフィー法および質量分析法である。ほとんどの方法は、葉酸結合タンパク質への葉酸の競合結合に基づいている。
【００１４】
RBC葉酸の測定のために、溶血試薬の使用が明らかに必須である。例えば、RBC葉酸の測定のためのElecsysTMアッセイ（ElecsysはRocheグループの一員の商標である）は、溶解試薬としてアスコルビン酸を使用する。Elecsys RBC葉酸溶血試薬は、赤血球中の葉酸の定量測定のためのElecsys葉酸アッセイと共に使用される(RBC葉酸)。抗凝固剤（ヘパリンまたはEDTA）で処理された全血は、アスコルビン酸溶液(0.2％)で希釈され、20〜25℃でおよそ90分間インキュベートされる。赤血球の溶解が、細胞内葉酸の遊離で起こる。溶血物は、次にElecsys葉酸アッセイの次の測定のための「予め希釈された」試料（血清に類似して）として使用される。全血で決定されたヘマトクリット値および試料の前処理によってもたらされる希釈効果は、赤血球葉酸濃度の計算において補正される（Greiling, H., Gressner, A.M., Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie, 3rd ed., Stuttgart-New York, Schattauer (1995) pp.460-462;Gunter, E.W., et al., Clin. Chem. 42(1996)1689-1694)。
【００１５】
アスコルビン酸を用いた処理で生じた溶血物は、慣例のクロマトグラフィー手順に使用することができない。クロマトグラフィー手順または質量分析測定におけるかかる溶血物の使用のために、分析前に細胞残骸および沈殿タンパク質を除去することが必要である。
【００１６】
残骸および沈殿タンパク質は通常、遠心分離、オフライン濾過または固相抽出によって試料から除去される。
【００１７】
固相抽出(SPE)は、例えば、分析試料の前濃縮および洗浄、様々な化学物質の精製、および水溶液からの毒性物質または重要な物質の除去のために広く使用されるクロマトグラフィー技術である。SPEは、通常、適切な樹脂を含むカラムまたはカートリッジを用いて行われる。SPE手順は、疎水性、イオン交換、キレート化、吸着および他の機構によって分析物と相互作用して結合し、液体で分析物を除去することができる吸着剤を用いて開発されている。種々の種類の分析物のための種々のSPE適用には種々の吸着剤を必要とすることができるので、目的の分析物または分析物の種類に対する固有の選択性を有する特定の特性を有する吸着剤のための同時の必要性がある。SPE物質およびSPEカラムのそれぞれの代表的な例は、US 6,322,695およびUS 6,723,236に見ることができる。
【００１８】
ヘモグロビン自体の濃度および非糖化ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビン(HbA1c)の比は血液学および糖尿病において重要な分析物である。かかる評価において、全血液試料中に含まれる赤血球が溶解され、次にヘモグロビンが測定される。US 6,050,956は、標準量の血液溶解液を予め充填した溶血チューブを記載する。しかし、全血は最初に、従来の血液回収チューブに回収される。その後、血液を溶血チューブに1〜100倍に希釈する。非常に高い濃度のヘモグロビンのために、1〜100倍希釈の全血が可能であり、特異的溶血、即ち、タンパク質沈殿および／またはDNAの放出等のネガティブ副作用を回避する溶血は必要とされない。通常、HbA1cは次に、免疫アッセイによって検出される。
【００１９】
US 5,874,310;US 5,882,934;EP 1 000 356;EP 0 874 988;EP 0 305 491またはEP 0 185 048等のCoulter International Inc.の様々な特許ファミリーは血液学の分野、特に血液細胞の分析に関する。EP 0 794 435において、血液試料に含まれる真核生物細胞の分析において8〜20個のC原子のアルキル鎖を有するN-モノアルキル化ピリジニウム塩の使用が開示される。US 5,316,951は、10〜20個のC原子のアルキル鎖を有するN-モノアルキル化ピリジニウム塩が全血液試料中に含まれる真核生物細胞の分析に使用できることを記載している。
【００２０】
Sarapuk, J. et al., Z. Naturforschung 54c (1999) 952-955は、3-カルバモイル-1-デシルオキシメチルピリジニウムクロライドは赤血球を溶解するために使用できることを記載している。
【００２１】
EP 1 000 356は、例えば、血液細胞の列挙および選別(sizing)、ヘモグロビンパラメーターの決定および単一血液試料中の白血球亜集団の分化に適切な血液試料の希釈のための改善された希釈剤を記載している。分析は適切な電気装置の使用によって行われる。かかる分析のために、血液は、通常、医師によって回収され、次に臨床実験室に移送される必要があり、分析直前に溶解試薬を添加する。
【００２２】
本発明の発明者に利用可能な参照には、溶血された全血試料が液体クロマトグラフィー法によるオンライン分離、例えば、赤血球に通常存在する分析物の検出において、使用され得ることが開示も示唆もされていない。
【００２３】
目的の多くの他の分析物と同様に、オンラインクロマトグラフィー手順の使用に基づく任意の検出法で全血試料から葉酸、シロリムスまたはタクロリムスの検出を可能にする利用可能な方法はないように思われる。
【００２４】
上記の当該分野の水準から、全血試料からの分析物のオンラインクロマトグラフィー分離および測定のための方法が利用可能でないように思われることが明らかになる。全ての慣例手順は最新で、目的の分析物またはかかる試料の残りからの目的の分析物を含む特定の種類の化合物の抽出または画分を必要とするように思われる。
【００２５】
しかし、全血が試料として直接使用できるならば非常に望ましい。これは、液体クロマトグラフィー(LC)分離工程を利用するオンライン検出手順において特に有利である。全血からの免疫抑制薬物の直接オンライン検出が臨床慣例実験室のための重要な進歩であることも明らかである。
【００２６】
次に、全血試料を適切な膜可溶化剤の補助で処理すること、例えば、全血試料をLCによる直接分離およびMSによる分析物検出のための適切な試料とすることを可能にすることが、驚くべきことに見出され、確立することができた。かかる処理試料中の分析物を検出することも可能となっている。これは、免疫抑制薬シロリムスおよびタクロリムス等または葉酸等の、赤血球内の関連拡張物にも存在する分析物に特に重要である。
【００２７】
（発明の要旨）
第一の態様において、本発明は、赤血球を含むことが既知であるまたは疑われる液体試料および真核生物細胞を含むことが疑われるまたは既知である液体試料中の分析物を検出する方法であって、赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な条件下で、該液体試料を膜可溶化剤で処理する工程、第一工程で得られた処理試料をクロマトグラフィー分離に供する工程、ならびに分析物を検出する工程を含む方法に関する。
【００２８】
さらなる好ましい態様において、本発明は、液体クロマトグラフィーのための全血試料の処理における膜可溶化剤の使用、および液体クロマトグラフィー系分析における本発明による膜可溶化剤を用いた特異的溶血(differential hemolysis)によって得られた処理血液試料の使用に関する。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明による方法は、ヒトまたは動物の体ではなく、インビトロで行われる。
【００３０】
好ましい態様において、本発明は、赤血球を含むことが既知であるまたは疑われる液体試料および真核生物細胞を含むことが疑われるまたは既知である液体試料中の分析物を検出する方法であって、a)赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な条件下で、該液体試料を膜可溶化剤で処理する工程、b)工程(a)で得られた処理試料をクロマトグラフィー分離に供する工程、ならびにc)分析物を検出する工程を含む方法に関する。
【００３１】
本発明の意味において「赤血球」は、細胞核を有さない赤血球である。かかる細胞核を有さない赤血球は、例えば、哺乳動物の循環に見られる成熟赤血球である。本発明は、例えば、鳥類の種で公知の有核赤血球に関しない。後のものは有核細胞または真核生物細胞の基準を満たす。
【００３２】
本発明の目的で「哺乳動物」とは、ヒト、家畜動物および農場動物、および動物園、スポーツ、またはペットの動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物のことをいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３３】
本発明の意味において「真核生物細胞」または「有核細胞」は、真核生物体に由来する細胞であり、さらに細胞核を有している。真核生物細胞の例は、有核組織由来細胞、有核組織培養細胞および有核血液細胞である。好ましい態様において、真核生物細胞は、血小板、単球、好中球、好酸球、または白血球等の有核血液細胞である。遺伝物質を含むが細菌等の下等生物由来の細胞は、真核生物細胞でない。
【００３４】
冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法目的の１つまたは１つより多いこと（即ち、少なくとも１つ）をいう。例として、「赤血球」は、１つの赤血球または１つより多い赤血球を意味する。
【００３５】
本発明で示されるように、特異的溶血、即ち、赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な条件下で液体試料を膜可溶化剤で処理することの有利な特性が全血試料の使用によって確立された。しかし、他の液体試料が同じように使用でき、処理できる方法も確立されている。従って、本発明による液体試料は、尿、脳脊髄液、血清、血漿または血液等の臨床診断慣例で調査される任意の試料であってもよい。
【００３６】
好ましくは、適切な膜可溶化剤を用いて特異的溶血に供される液体試料は、赤血球を含み、かつ有核細胞を含んでもよいか、または有核細胞を含む。さらに好ましくは、液体試料は、赤血球および有核細胞の両方を含む。好ましくは、本発明による液体試料は、全血である。認めるように、全血試料は、核のない赤血球および有核血液細胞の両方を含む。
【００３７】
好ましくは、全血試料は、直接、即ち、本発明による方法においてサンプリング後に直接処理される。好ましくは、血液試料は、本発明による特異的溶血に供される前になんら処理されない。また好ましくは、全血は特異的に溶血される前に抗凝固全血試料を生じるために適切な抗凝固剤で回収／処理される。臨床診断慣例で頻度高く使用される周知の抗凝固剤は、ヘパリン、クエン酸、およびEDTAである。好ましくは、本発明による試料は、抗凝固全血試料、特にクエン酸処理全血試料またはEDTA-抗凝固全血試料である。
【００３８】
本発明による方法において、液体試料は、2つの要件：a)赤血球が存在する場合に赤血球の膜が破壊されることおよびb)同時に試料成分の沈殿が生じないことを満たすような様式で、膜可溶化剤で処理される。このプロセスは、特異的溶血と呼ばれる。方法が全血試料で実施される場合、溶解された赤血球を含むが同時に沈殿物を含まない処理試料が得られる。
【００３９】
好ましくは、本発明による膜可溶化剤は、試料に存在する赤血球の少なくとも95％の溶解をもたらす。さらに好ましくは、特異的溶血のための試薬は、試料中に存在する赤血球の少なくとも97％、98％、99％、99.5％の溶解をもたらす。
【００４０】
以下の理論に拘束されたくはないが、赤血球の膜を破壊するが同時に試料成分の沈殿を生じない本発明のフレームワーク内で発見され、かつ確立された有利なバランスが、当該分野で公知の少なくともいくつかの問題を克服するために必須であると仮定することができる。適切な条件下で適切な膜可溶化剤を適用することによって、例えば、血漿からの赤血球内容物の遮断に必須である細胞膜の完全性が失われる。赤血球内容物（例えば、ヘモグロビンだけでなく目的のいくつかの分析物）が周囲の液体に放出される。同時に試料成分の沈殿は生じない。
【００４１】
当業者が認めるように、後の分析に干渉するかもしれない試料成分は、特に、DNAおよび変性タンパク質のそれぞれであってもよい。例えばリンパ球または単球等の真核生物細胞の核が破壊されない限り、DNAはこれらの核から放出されない。タンパク質が沈殿しない限り、特異的溶血に供される試料中に含まれるタンパク質は、少なくとも有意な程度ではなく、クロマトグラフィー工程または分析に干渉しない。
【００４２】
赤血球の完全性は、例えば、適切な生物染色によって容易に評価することができる。本発明による好ましい態様において、トリパンブルーが赤血球膜の完全性を評価するために使用される。インタクトな赤血球はトリパンブルーを蓄積しないが、破壊された膜を有する赤血球はトリパンブルーで染色される。赤血球の膜完全性は、トリパンブルーで試料を染色した後に顕微鏡下で容易に評価される。破壊された赤血球のパーセントは、処理前後のインタクトな赤血球をカウントし、次に最初の数を後者の数で割って、次に100をこの値に掛けることによって計算される。可溶化された赤血球は、溶解された赤血球（lyzed red blood cell）または溶解された赤血球（lyzed erythrocyte）と呼ばれる。
【００４３】
赤血球を溶解するが、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な処理で十分である。本発明による方法における適切な溶血処理が真核生物細胞の外膜にも影響を及ぼすことが予想される。しかし、細胞核に含まれるDNAが試料中に放出されないことに注意してもよく、または注意しなければならない。使用される溶血試薬および溶血の条件は好ましくは、核膜を残し、従って巨視的に核をインタクトのままにするか、または少なくともDNAがその周囲およびDNA安定化核タンパク質から遊離されないかのいずれかである。DNAが有意な程度に放出される場合、かかるDNAは試料のさらなる取り扱いに干渉することがあり、または干渉もする。放出されたDNAは、例えば、液体を非常に粘性にする傾向がある。次に、かかる試料をピペッティングもしくは移送することまたは特定のフィルターもしくはカラムを通過させることはもはや不可能である。
【００４４】
タンパク質沈殿が生じないことに注意してもよく、または注意を払わなければならない。当業者が認めるように、生物学的試料、例えば、全血試料中に存在する多くの種々のタンパク質がある。全てのこれらのタンパク質は、沈殿または凝集する傾向に影響を及ぼす個々の特性を有する。
【００４５】
膜可溶化剤を用いる試料処理が一方で赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じないための適切な条件下で行われるかどうかを記載し、かつ定義することが可能であることが見出された。溶解されない赤血球および沈殿した試料成分の両方は、かかる試料の特性に対してネガティブな影響を与える。
【００４６】
特異的溶血のための条件が適切であるかどうかは以下の標準手順を用いて容易にかつ好ましくは決定され得る。40のヘマトクリットを有する全血試料は1：10に希釈され、候補溶血試薬と1：1で混合される。特異的溶血をもたらす試薬の効果が可視的に見られる。赤血球の溶解時に、混合物は透明になる。試料成分の沈殿が生じる場合に、試料は不透明または粘性またはその両方になる。
【００４７】
上述に示すように、本発明による特異的溶血の方法に使用される条件は、容易に可視的に評価することができる。全血試料が特異的溶血のための適切な候補試薬とインキュベートされる場合、赤血球を溶血するために必要な最小濃度が、不透明な血液試料を透明または清澄にする濃度として認識することができる。可能な最大濃度は、依然として透明試料および非粘性試料をもたらすものである。
【００４８】
候補溶血試薬の適切な最小最終濃度を、処理された全血試料の透明性の変化をもたらす濃度として決定することはかなり容易であることが分かった。この透明性の変化がHPLCによる直接分析のためのかかる処理試料の適切さと十分に相関する。しかし、不明瞭な定義のために、溶血試薬の最小濃度が以下に記載されるHPLC法によって確認されることが好ましい。
【００４９】
可能な溶血試薬の最大濃度は、DNAの放出および／またはタンパク質の沈殿をなお生じない濃度である。それにより、試料は、粘性または不透明またはその両方となり、これ以上直接HPLC適用に適切ではない。粘度および不透明度は視覚に従うことができるが、溶血試薬の最大濃度は以下に記載されるHPLC法によって確認されることが好ましい。
【００５０】
非常に多くの非溶解赤血球をなお含む全血試料および沈殿した試料成分を含む処理全血試料の両方は、任意のクロマトグラフィー手順に適切ではない。この理由のために、特異的溶血をもたらすのに適切な条件が好ましくは、標準様式で、特異的溶血のための候補試薬で処理した全血試料をHPLCカラムに適用することによって決定される。
【００５１】
不完全な溶血および／または試料成分の沈殿は、10μlの処理全血試料を50回HPLCカラムに適用することによって評価される。特異的溶血のための候補溶血試薬が適切であるかどうかを評価するために、該溶血試薬が全血試料と混合される。好ましくは、生理学的食塩水中に1：10に予め希釈されたEDTA血液が使用される。これを、候補溶血試薬と1：1の比で混合し、混合物を20℃で30分間インキュベートする。従って、この混合物中の全血の最終希釈は、1：20である。50の10μLアリコートのこの混合物、即ち、処理全血試料はHPLCシステムの一部である2mmの直径および0.5μmの孔径を有するフィルターに適用される。フリットがHPLCカラムの一部である場合、固定相が任意の干渉またはブロッキングを生じないように選択されなければならない。背圧がモニターされる。20bar以上の背圧の増加を生じる特異的溶血のための候補試薬は、インジェクション50のための背圧および第一インジェクションのための背圧が互いに比較される場合、適切ではないものとみなす。このように、特異的溶血のための適切な試薬の最小最終濃度および最大最終濃度の両方は容易に同定することができる。最小濃度は、上記の設定で評価された特異的溶血をもたらす候補溶血試薬の最低濃度である。最大濃度は、上記の設定で評価されたような、特異的溶血をもたらすが試料成分の沈殿を生じない候補溶血試薬の可能な最大濃度である。
【００５２】
好ましくは、特異的溶血のための候補試薬の上記評価に使用されるフリットはHPLCフリットである。また好ましくは、フリットは、床物質として孔径100Åを有する3.5μm  Symmetry（登録商標）C18粒子を充填し、2mmの内部カラム直径を有する長さ20mmのHPLCカラムの一部である。
【００５３】
当業者が容易に認めるように、かかる評価に使用される全血試料は健常個体、即ち、既知の疾患を有さず正常範囲の生化学値を有する個体から得られる。
【００５４】
適切な条件が、特異的溶血のための両方の要件を満たすためにかなり多くの試薬について確立できることが本発明において見出され、かつ確立された。
【００５５】
本発明による膜可溶化剤は好ましくは、溶媒として水をベースとし、上記の特異的溶血をもたらす化学物質または試薬を含み、また好ましくは緩衝液および／または保存剤を含んでいてもよい。特異的溶血に使用される薬剤は、好ましくは膜可溶化活性を有し、1000ダルトン未満の分子量を有する化学物質または試薬に基づいている。
【００５６】
膜可溶化剤は、好ましくは以下のKBr；KJ;およびKSCNの１つ以上の化学物質または以下のカチオンおよびアニオンの1つ以上からなる塩の膜分解作用に基づいている。
【００５７】
カチオンは好ましくは
2009540274.tif 000003
（式中、mは0または１、nは4または6である）
から選択される。
【００５８】
アニオンは好ましくは、クロライド、テトラフルオロボレート、オクチルスルフェート、ヨウ化物およびチオシアネートから選択される。上記化学物質の混合物を使用することも可能である。当業者が認めるように、特異的溶血を可能するのはこれらの化学物質であるが、溶血試薬の他の成分が異なる目的で働いてもよく、例えば緩衝液または保存剤として機能してもよい。
【００５９】
好ましくは、特異的溶血のための試薬に含まれる化学物質は、カチオンが好ましくは
2009540274.tif 000004
（式中、mは0または1、nは4または6である）
から選択され、アニオンが好ましくはクロライド、テトラフルオロボレート、オクチルスルフェート、ヨウ化物およびチオシアネートから選択される塩である。
【００６０】
膜可溶化剤に含まれる適切な膜分解性化学物質は、好ましくは1-ブチル-4-メチルピリジニウムテトラフルオロボレート；1-ブチル-3-メチル-イミダゾリウムテトラフルオロボレート；1-ブチル-3-メチル-イミダゾリウムオクチルスルフェート；1-ブチル-3-メチルピリジニウムクロライド；1-ヘキシルピリジニウムクロライド；1-メチル-1-オクチルピロリジニウムクロライド；N-オクチルピリジニウムクロライド；3-カルバモイル-1-オクチルオキシメチルピリジニウムクロライド；KBr；KJ；およびKSCNならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００６１】
膜可溶化剤に含まれる膜分解性化学物質は、好ましくは1-ブチル-4-メチルピリジニウムテトラフルオロボレート；1-ブチル-3-メチル-イミダゾリウムテトラフルオロボレート；1-ブチル-3-メチル-イミダゾリウムオクチルスルフェート；1-ブチル-3-メチルピリジニウムクロライド；1-ヘキシルピリジニウムクロライド；1-メチル-1-オクチルピロリジニウムクロライド；N-オクチルピリジニウムクロライド；および3-カルバモイル-1-オクチルオキシメチルピリジニウムクロライドからなる群より選択される。これらの試薬の１つおよびKSCNの混合物を使用することがさらに好ましい。
【００６２】
当業者に明らかなように、特異的溶血のための候補試薬の適切な濃度が、候補溶血試薬中の1:20希釈の全血試料に基づいた上記に定義された方法で同定されると、調節された溶血試薬に対する全血試料の別の比を必要に応じて使用することができる。
【００６３】
目的の分析物が調査中の血液試料中に高く濃縮されると予測される場合において、溶血試薬の最終濃度は、上記設定に同定されるものと同じままでもよく、溶血試薬に対する全血の低い比、例えば、1:30、1:40、または1:50を使用することができる。好ましくは、本発明による膜可溶化剤において、特異的溶血のための試薬が上述で決定された特異的溶血を達成するのに十分な少なくとも最小濃度で使用される。
【００６４】
目的の分析物がかなり低い濃度で存在する場合、全血試料を1:20未満に希釈しないことが必要であり得る。これは、溶血試薬および全血試料の混合物中の全血に対する溶血試薬の最終相対濃度が上記評価において決定される溶血試薬の必要な最小濃度および最大濃度のそれぞれについて同定される比にあるように、徐々に溶血試薬の濃度を調節することによって可能である。
【００６５】
例として、本発明による膜可溶化剤において1％および0.4％のそれぞれの最終濃度で使用される場合の1-メチル-1-オクチルピロリジニウムクロライド／KSCNは所望の結果、即ち、1:20の最終希釈の全血試料の特異的溶血を達成するのに適切であることが見出されている。処理血液試料における分析物の希釈は、例えば、この溶血試薬の濃度がそれぞれ1-メチル-1-オクチルピロリジニウムクロライドで2％、およびKSCNで0.8％に調節される場合に低減することができる。また、この調節された濃度の溶血試薬を含む膜可溶化剤が、後に1:5に希釈された全血試料と1:1で混合される場合に、全血試料の特異的溶血をもたらす。溶血試薬に対する全血の比が一定に保たれるので、この処理血液試料は1:10に希釈されるだけである。それぞれ10％の1-メチル-1-オクチルピロリジニウムクロライドおよび4％のKSCNを含む1mlの膜可溶化剤がPBS中に1:1で希釈された1mlの全血と混合される場合も、特異的溶血が観察される。あるいは、1mlの全血は、それぞれ10％の1-メチル-1-オクチルピロリジニウムクロライドおよび4％のKSCNを含む2mlの膜可溶化剤に添加することができる。
【００６６】
多くの常套的な応用について、膜可溶化剤に対する全血試料の理想的な比率は10：1〜1：50であると予想される。好ましくは、本発明による方法において全血の試料は、5：1〜1：20の比率で溶血試薬と混合される。より好ましくは、該比率は2：1〜1：10であり、1：1〜1：5も好ましい。臨床作業に使用される調整された溶血試薬の終濃度、即ち可能な限り最も高い濃度は、可溶性およびかかる試薬の値段にも依存する。
【００６７】
好ましくは、特異的な溶血のための適切な試薬は、赤血球の膜を破壊するために必要な化学物質の（最小）濃度および同時に試料成分の沈殿を生じないような前記化学物質について許容される（最大）濃度が少なくとも2倍離れていることをさらに特徴とする。特異的溶血のための試薬の最小濃度および最大濃度の幅が広いほど、臨床的診断作業における試薬の使用が容易になる。
【００６８】
特異的溶血のための試薬に含まれる膜溶解化学物質が、前記試薬と試料の混合後に膜溶解化学物質の終濃度が最小濃度プラス30％、最大濃度マイナス30％それぞれの平均値に相当するような濃度で使用されることがさらに好ましい。特異的溶血のための試薬に含まれる膜溶解化学物質のさらに好ましい濃度は、該試薬と試料の混合後に最小濃度および最大濃度それぞれの平均値の±25％、20％または15％の範囲内に調整される。
【００６９】
特異的溶血のための試薬に含まれる膜溶解化学物質が、該試薬と試料の混合後に、最小濃度の1〜4倍、また好ましくは先に決定された最小濃度の1.5〜3倍の濃度に相当する溶血化学物質の終濃度を生じる濃度で使用されることも好ましい。
【００７０】
好ましくは、本発明の膜可溶化剤中の特異的溶血のための試薬は、75％（重量/容積）以下、また好ましくは50％（重量/容積）以下の濃度で使用される。
【００７１】
好ましくは、液体試料を本発明による膜可溶化試薬で処理する方法の後には、オンライン液体クロマトグラフィー（LC）工程が続く。
【００７２】
さらに好ましい態様において、本発明は、液体試料中の分析物の検出方法に関し、該方法は前記液体試料を得る工程、前記液体試料を膜可溶化剤による試料処理方法にかける工程（ここで該可溶化剤は赤血球の膜を破壊するが真核細胞の核を破壊しないように適切である）、前記処理された試料を液体クロマトグラフィーにかける工程、および適切な手段によって調査中の分析物を分析する工程を含む。好ましくは、該分析方法はまた、処理された試料で直接的（オンライン）に実行される。
【００７３】
液体クロマトグラフィー（LC）は、分析物が種々の試料成分の複雑な混合物にあったとしても、目的の分析物の分離、同定および定量に使用される、きわめて重要な分析技術である。LCの間に、混合物中の化学成分を、液体移動相のフローにより固定相を通して移動させる。液体クロマトグラフィーの分離は、分析物と、移動相および固定相の両方との相互作用の差によって達成される。当業者が理解するように、固定相および移動相の両方は、調査中の分析物について適切に選択される必要がある。また、ユーザーは、試料が固定相カラムを通って検出装置へと移動する際の分析物バンドの鋭さを維持するために適したクロマトグラフィー条件を同定する。
【００７４】
高圧液体クロマトグラフィーとしても公知であり、HPLCと略される高性能液体クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーの特別な形態であり、生化学および分析化学において今日頻繁に使用されている。分析物を、高圧で固定相のカラムから液（移動相）に通し、分離された成分が固定相に残る時間を短縮するので成分がカラム中に分散するのに必要な時間が短縮される。このことは得られるクロマトグラム中でより狭いピークを生じるので、LCと比較してより良好な分解能および感度を生じる。
【００７５】
試料溶質の溶解を確実にするように移動相を選択する。固定相について、微粒子シリカの大きな表面積が溶質-固定相の相互作用の差を強調するので、好ましくは微粒子シリカ（もとのままもしくは化学的に修飾された）を使用する。溶質移動相相互作用に対して溶質と強力に相互作用する固定相の使用は、非常に長い保留時間、分析に有用ではない状態を生じる。そのために、固定相は、移動相の相互作用に対して弱い〜中程度の溶質相互作用を提供するように選択されなければならない。結果的に、溶質の性質により、選択されるLCの種類が決定する。試料の溶解および準備溶出を確実にするために、より強力な相互作用が移動相で生じるべきであるが、固定相は溶質間の微妙な差に対して感受性であるべきである。例えば、極性の中性化合物は、通常、極性移動相を、溶質の分散的な特性の微妙な差を識別する非極性固定相と共に使用して、より良好に分析される。HPLCの強力な側面の1つは、移動相が変化して保留の機構を改変することができるということである。保留を調整するために、移動相に改質剤を加えることができる。例えば、水性移動層においてpHは重要な変数である。
【００７６】
一般的な5種類のLCを区別することができる：
1.  正常相クロマトグラフィーは、非極性（分散性）移動相と共に極性固定相の使用を要する。
2.  逆相クロマトグラフィー、反対の可能性は、非極性固定相および極性移動相（1つ以上の極性溶媒、例えば水、メタノール、アセトニトリルおよびテトラヒドロフランなどからなる）の使用を要する。
3.  イオン交換クロマトグラフィーはイオン性の相互作用を必要とする。この場合、移動相は、イオン性溶質の溶解を確実にするためにイオン化を支持する必要がある。固定相も、ある程度の保留を促進するために部分的にイオン性である必要がある。結果的に、固定相との相互作用は強力であり、これは通常、長い分析時間および広いピークに反映される。
4.  サイズ排除クロマトグラフィーは分子の大きさのみに基づいた分離を必要とし、理想的には溶質と固定相の強力な相互作用が存在しないことを必要とする。
5.  アフィニティークロマトグラフィーは特異的な相互作用、例えば抗原と対応抗体、またはレセプターと対応リガンドのような特異的な結合ペアの間の相互作用に基づく。例えば、結合ペアの第1のパートナーは適当な固定相に結合し、結合ペアの第2のパートナーを捕捉するために使用される。第2のパートナーは適切な手段により放出および単離することができる。
【００７７】
上述の分離の原理の一般的な分類は網羅的なものである必要はないため非限定的であり、液体試料の分離に使用可能な他の分離の原理、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィー、および分子インプリント物質ベース分離がある。
【００７８】
常套的な応用において、固定相、いわゆる床物質、例えばRP-HPLC応用におけるシリカ粒子は適切なカラムに充填され、フリットによって保護される。フリット物質は、通常、例えば床物質の孔径と比較してより小さい孔径を有するように選択される。
【００７９】
HPLC法において、固定相粒子の直径は、通常1〜10μmの範囲である。これらの小粒子はHPLCに使用される高圧を要する。床物質は通常フリットによって保護される。典型的なフリットは1μm、0.45μmまたは0.2μmの孔径を有する。粒子が小さくなるにつれて、通常、フリットの孔径も小さくなる。試料がHPLCフリットを塞ぎ得る成分を含む場合、これは任意の常套的な分析には不利なものとなる。全血試料および試料成分の沈殿物を含む「処理しすぎた」全血試料は、任意の常套的なHPLCフリットまたはカラムの迅速なブロッキングを引き起こす。当業者が理解するように、HPLCカラムに使用されるフリットのブロッキングは、フリットの孔径が小さくなるにつれて、固定相粒子の直径が小さくなるにつれて、およびカラム直径が小さくなるにつれて、より迅速に生じる。フリットが適切に選択されない場合、即ち孔径が大きすぎる場合、カラム物質の粒径が問題となり、粒子が小さくなるにつれてより迅速にカラム自身がふさがれる。
【００８０】
ここで、本発明による膜可溶化剤による処理を試料、例えば全血の試料に適用することにより、カラムをふさぐリスクで進めることなく、このように処理された試料をHPLCカラムに直接適用することが可能である。好ましい態様において、本発明は、液体試料の処理方法に関し、まず前記試料を、本発明による膜可溶化剤を用いた処理にかけ、次にHPLC工程にかける。好ましくは、このHPLC工程は、膜可溶化剤を使用した処理により得られた試料を用いてオンラインで実施される。好ましくは、このようなHPLC工程に使用される固定相粒子は、直径1〜10μm、また好ましくは2〜7μmの範囲である。好ましくは、このようなHPLC工程に使用されるフリットは、0.5μm、または好適には0.2μmの孔径を有する。
【００８１】
任意の適切な手段により目的の分析物を検出することができる。適切かつ好ましい検出装置は、通過する化合物の存在を感知し、記録装置またはコンピューターデータステーションに電気シグナルを提供する。出力は、通常、クロマトグラムの形態であり、目的の物質は、通常、特定のピーク中に見出される。ピーク面積またはピーク高さを使用して、調査された試料中に存在する分析物の量を定量することができる。
【００８２】
HPLCシステムについての検出装置は、試料化合物の溶出による応答を発するコンポーネントであり、続いてクロマトグラム上のピークを表示する。カラムから溶出された際に化合物を検出するために、検出装置は固定相のすぐ後ろに設置される。バンドの広さおよびピークの高さは、通常、粗いチューニングコントロールおよび細かいチューニングコントロールを使用して調整されてもよく、検出および感度のパラメーターも当業者により調整されてもよい。HPLCと共に使用することが可能な多くの種類の検出装置がある。いくつかのより一般的な検出装置は、屈折率（RI）、紫外線（UV）、蛍光、放射化学、電気化学、近赤外線（Near-IR）、質量分析（MS）、核磁気共鳴（NMR）および光散乱（LS）を含む。
【００８３】
屈折率（RI）検出装置は、試料分子が光を曲げるかまたは屈折させる能力を測定する。各分子または化合物についてのこの特性はその屈折率と呼ばれる。ほとんどのRI検出装置について、光はバイモジュラーフローセルを通過して光検出器へと進む。フローセルの1つのチャンネルはカラムを通過している移動相に連結されており、もう1つは移動相のみに連結されている。カラムからの試料の溶出により光が曲がる場合に検出が生じ、これは2つのチャンネル間の不均等として読み込まれる。
【００８４】
蛍光検出装置は、化合物が所定の波長の光を吸収し、その後再放出する際の能力を測定する。それぞれの化合物は特徴的な蛍光を有する。励起光源はフローセルから光検出器まで通過し、モノクロメーターは放出波長を測定する。
【００８５】
放射化学検出は、放射性標識物質、通常トリチウム（3H）または炭素-14（14C）の使用を伴う。該検出はβ粒子イオン化に関連する蛍光の検出によって作動し、代謝産物の検査において最も一般的である。
【００８６】
電気化学検出装置は、酸化または還元反応を受ける化合物を測定する。これは、通常、試料が一定差の電位で電極間を通過する際の移動している試料由来の電子の獲得または消失を測定することによって達成される。
【００８７】
質量分析は、イオンの質量対電荷比（m/z（またはm/q））を測定するために使用される分析技術である。これは、試料成分の質量を表す質量スペクトルを生成することで物理的試料の成分を分析するために最も一般的に使用される。該技術は、化合物および/またはそのフラグメントの質量による未知の化合物の同定；化合物中の1つ以上の元素のアイソトープ組成の決定；化合物の断片化の観察による化合物の構造の決定；注意深く設計された方法を使用した試料中の化合物の量の定量（質量分析は本来定量的ではない）；気体相イオン化学（真空下でのイオンおよび中性子の化学的性質）の基礎の検証；種々の他のアプローチによるその他の物理的、化学的または生物学的でさえある化合物の特性の決定を含むいくつかの応用を有する。
【００８８】
質量分析器は質量分析に使用されるデバイスであり、試料の組成を解析するために試料の質量スペクトルを生成する。これは通常試料をイオン化することおよび異なる質量のイオンを分離すること、ならびにイオン流の強度を測定してイオンの相対的な重複を記録することにより達成される。典型的な質量分析器は3つの部分、イオン供給源、質量分析器および検出装置を備える。
【００８９】
イオン供給源の種類は、質量分析によりどんな種類の試料が分析できるかに非常に影響する要因である。電子イオン化および化学イオン化は、気体および蒸気に対して使用される。化学イオン化供給源において、分析物は供給源の衝突の間の化学イオン分子反応によりイオン化される。液体および固体の生物試料と共にしばしば使用される2種類の技術としては、電気スプレーイオン化（ESI）およびマトリクス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）が挙げられる。他の技術としては、高速原子衝撃（FAB）、熱スプレー、大気圧化学イオン化（APCI）、二次的イオン質量分析（SIMS）および熱イオン化が挙げられる。
【００９０】
好ましい態様において、本発明の方法における分析物の検出は、質量分析により実施される。
【００９１】
核磁気共鳴（NMR）検出は、Hや13Cなどの奇数の質量を有する特定の核がランダム様式で軸に関してスピンすることに基づく。しかし、強力な磁石の極の間に置かれた場合、スピンは、磁場に対してパラレルまたはアンチパラレルのいずれかに整列されるが、エネルギーがわずかに低いためパラレル方向が好ましい。次いで、核を電磁線で照射し、電磁線は吸収されてパラレル核を高エネルギー状態にし、結果的に、その際に照射により核は「共鳴」になる。分子中の全ての核は、包含する磁場を変化させる電子雲に取り巻かれており、そのために吸収周波数が変わるので、HまたはCのいずれも、その配置および隣接する分子、または化合物の元素に依存して異なるスペクトルを生じる。
【００９２】
供給源が、溶液中の粒子に直撃する光のパラレルビームを放射する場合、一部の光は反射、吸収、透過、または散乱される。これらの現象は光散乱（LS）検出装置により測定することができる。LS検出の最も主要な形態は、比濁分析法および濁度測定法と称される。比濁分析法は、粒状溶液により散乱される光の測定として規定される。この方法は、角度の大きさで散乱された光の割合の検出を可能にする。濁度測定法は、溶液中の粒子のために透過した光の減少の測定として規定される。濁度測定法は、粒状溶液を透過する光の減少として光の散乱を測定する。そのため、濁度測定法は透過した残りの光を定量する。
【００９３】
近赤外線検出装置は、700〜1100nmのスペクトルで化合物をスキャンすることにより作動する。各分子中の特定の化学結合の伸縮振動および変角振動は、特定の波長で検出される。
【００９４】
本発明の好ましい態様において、哺乳動物由来の全血試料または哺乳動物由来の抗凝固全血の試料を、本発明に記載の膜可溶化剤を用いた処理にかけ、かかる処理された試料中に含まれる目的の分析物をオンラインで、即ち濾過、沈殿または遠心分離などのさらなる工程を伴わずに検出する。従って、好ましい態様において、本発明は、赤血球の膜を破壊するが、真核細胞の核を破壊しない適切な条件下で、試料を膜可溶化剤で処理する工程、前記処理された試料をHPLC工程にかける工程、および前記試料中の目的の分析物を検出する工程を含む、全血の試料を分析する方法に関する。好ましくは、前記分析中の3工程はオンラインで実施される。
【００９５】
本発明による分析物は、核酸を除く生体分子を含み、任意の無機または有機分子であってもよい。分析物は核酸ではなく、特にDNAではない。好ましくは、分析物は、ポリペプチド、炭水化物、および無機もしくは有機の薬物分子からなる群より選択される。好ましくは、目的の分析物は、10,000Da以下、また好ましくは9kDa以下、8以下、7kDa以下、6kDa以下、または5kDa以下のそれぞれのMWを有する。
【００９６】
ポリペプチドまたはタンパク質は、実質的にアミノ酸からなる分子であり、ペプチド結合により結合された少なくとも2つのアミノ酸を有する分子である。本明細書に開示される方法で調査される目的の分析物の場合、好ましくは、ポリペプチドは、約100までの少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25および30のアミノ酸からなる。好ましくは、ポリペプチドは5〜100、また好ましくは10〜40アミノ酸を含む。適切な目的のペプチド分析物は、例えばペプチドホルモン、および循環中に存在するその他のポリペプチド、ならびに特に本発明による膜可溶化剤での処理により赤血球から放出されたポリペプチドである。
【００９７】
好ましくは、本発明の方法は、全血試料由来の分析物のオンライン検出において使用され、前記分析物は赤血球内に少なくとも部分的に局在している。
【００９８】
本発明の好ましい標的分析物は、乱用薬物および免疫抑制薬からなる群より選択される。
【００９９】
好ましい標的分析物は、乱用薬物である。好ましくは、乱用薬物は、アンフェタミン、コカインおよびベンゾイルエクゴニンなどのコカイン代謝産物、メタンフェタミン、アヘンおよびアヘン誘導体、テトラヒドロカンナビノールなどのカンナビノイド、ならびにフェンシクリジンからなる群より選択される。
【０１００】
さらに好ましい標的分析物は、葉酸塩、特に血漿および赤血球の両方に含まれる全葉酸塩である。
【０１０１】
好ましい標的分析物は免疫抑制薬である。好ましくは、免疫抑制薬はシクロスポリン（CsA）、ミコフェノール酸モフェチル（MMF）、ラパマイシン（RAPA、シロリムスとしても知られる）、タクロリムス（FK-506）アザチオプリン（AZA）、およびメチルプレドニゾロン（MP）からなる群より選択される。
【０１０２】
赤血球中に存在する標的分析物も好ましい。特異的に溶血された全血試料から測定される好ましい分析物はシロリムス、タクロリムスおよび葉酸である。
【０１０３】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神を逸脱することなく、下記の手順において改変がなされ得ることが理解されよう。
【０１０４】
（実施例）
実施例1
種々の候補溶血試薬の評価
実施例1.1  溶血の視覚評価
溶液A:新しいEDTA-安定化全血を、1：10の比で0.15Mの塩化ナトリウム溶液で希釈した（50μL EDTA-血液+450μL塩化ナトリウム溶液）。
【０１０５】
溶液B：0.15M塩化ナトリウム中の候補溶血試薬の溶液を、溶血試薬の濃度が溶血物中の好ましい終濃度の2倍になるように調製し、例えば25％の終濃度の1-ブチル-4-メチルピロリジニウムテトラフルオロボレートを得るように50％の溶液（水中50mg塩+50mL 0.15M塩化ナトリウム）を調製する。
【０１０６】
第2の化合物、例えばヨウ化カリウム(1-ブチル-3-メチルピリジニウムクロライド/KJ)の添加の場合、ほぼ等モル量で、記載した塩を添加する。
【０１０７】
等量の溶液AおよびB、例えば500μL溶液A+500μL溶液Bを混合して溶血物を調製する。
【０１０８】
混合後、溶血物を、混合の直後、1分、2、5、6、7、20および40分後に混濁度および透明度について視覚的に調べる。透明な溶液が観察されるまでの時間を記録する。
【０１０９】
【表１】
2009540274.tif 000005
2009540274.tif 000006
【０１１０】
上記の表から明らかなように、視覚評価により特異的溶血についての良好な候補試薬を視覚的に同定することができる。
【０１１１】
実施例1.2  溶血の顕微鏡評価
溶液A：新しいEDTA-安定化全血を、1：10の比で0.15Mの塩化ナトリウム溶液で希釈する（50μL EDTA血液+450μL塩化ナトリウム溶液）。
【０１１２】
溶液B：0.15M塩化ナトリウム中の溶血試薬の溶液を、溶血試薬の濃度が溶血物中の所望の終濃度の2倍高くなるように調製し、例えば25％の終濃度の1-ブチル-4-メチルピリジニウムテトラフルオロボレートを得るように、50％の溶液（水中50mg塩+50mL 0.15M塩化ナトリウム）を調製する。第2のアニオン、例えば、ヨウ化物(1-ブチル-3-メチルピリジニウムクロライド/KJ)の添加の場合、記載された塩を等モル量添加する。
【０１１３】
等量の溶液AおよびB、例えば20μL溶液A+20μL溶液Bを混合して溶血物を調製する。
【０１１４】
メイ-グリュンヴァルト染色および顕微鏡検査：
溶血物を混合して、1滴を顕微鏡スライドガラス上に塗り、室温で風乾し、メイ-グリュンヴァルト染色試薬（Merkカタログ番号1.01424メイ-グリュンヴァルトエオシンメチレンブルー溶液）で染色する。メイ-グリュンヴァルト染色後、核は種々に変化する暗度の紫に染まり、細胞質は青〜明るいピンク色の色調に見え、鮮明な赤〜紅藤色の顆粒がいくつかの細胞型の細胞質中に存在する場合があり、好塩基球は細胞質中で暗い藍色の顆粒を示し、好酸球は細胞質中に明るいオレンジ色の顆粒を示し、赤血球はピンク〜オレンジ色に染まる。
【０１１５】
油浸光学顕微鏡（倍率x630）により顕微鏡検査を行なう。
【０１１６】
比較結果-それぞれ、図1の水により得られた溶解物および図2の本発明により得られた溶解物-は、数分間の適切な溶血試薬の添加により赤血球の完全な溶解が生じることを示す。
【０１１７】
トリパンブルー染色および顕微鏡検査：
処理された全血試料をトリパンブルー溶液（Merckカタログ番号1.11732；Trypanblau C.I. 23850）と混合し(1：1)、顕微鏡検査のためにNeugebauerチャンバーに分配する。油浸光学顕微鏡（倍率x630）により顕微鏡検査を行なう。
【０１１８】
比較結果-それぞれ、図3の水により得られた溶解物ならびに図4a)およびb)の本発明により得られた溶解物-は、数分間の適切な溶血試薬の添加により赤血球の完全な溶解が生じることを示す。
【０１１９】
実施例2
HPLCによる種々の候補溶血試薬の評価
溶解効率を評価するために、実施例1に従って調製した溶血全血試料をHPLCシステムに注入し、該システムの背圧をモニターする。
【０１２０】
HPLCシステムは、DR 5溶媒送達システム、サーモスタット装備自動サンプラーおよび自動インジェクターを有するHP1090液体クロマトグラフ（Agilent）からなる。50の10μLの処理された全血試料を、床物質として5μm Symmetry C18粒子、2mmの内部カラム直径、20mmのカラム長さ、および0.5μm孔径のフリットを有するHPLCカラムに適用して溶解効率を評価する。溶出は、0.1％ギ酸の水〜0.1％ギ酸のアセトニトリル、5分以内、流速0.2mL/分の勾配である。50の注入により観察された背圧の増加は20bar未満である。
【０１２１】
蒸留水のみで溶解を完了した場合、上記HPLC条件下で観察された背圧の増加は100barより大きい。
【０１２２】
実施例3
全血の試料由来のラパマイシンの測定
全血試料にラパマイシンを加えて溶血試薬と混合する。50％メタノール/水中の400μg/mLラパマイシンの50μLの溶液を450μLの新しいEDTA血液に添加し、ホモジナイズして室温で1時間インキュベートする。
【０１２３】
50μLアリコートの添加全血試料を、0.15M塩化ナトリウム水中の950μLの1-ブチル-4-メチルピリジニウムテトラフルオロボレートの25％溶液で希釈する。25μLの溶血物をHPLCに注入する。
【０１２４】
HPLCシステムは、DR 5溶媒送達システム、サーモスタット装備自動サンプラー、自動インジェクターおよびHPLCと質量分析器の間の切換え弁を有するHP1090液体クロマトグラフ（Agilent）からなる。検出装置は、電気スプレーイオン化を用いた連続イオントラップ質量分析器、Thermo Electron LTQである。クロマトグラフィー分離について、床物質として5μm Vydac C18粒子、2mmの内部カラム直径、250mmのカラム長さおよび0.5μm孔径のフリットを有するHPLCカラムを使用する。溶出は、0.1％ギ酸の水（A）〜0.1％ギ酸のアセトニトリル（B）、30分以内の勾配であり、その後、100％Bで10分間の定組成（isocratic）である。流速は0.2mL/分である。およそ26分でラパマイシンが溶出する（図5参照）。
【０１２５】
実施例4
全血の試料からの5-メチルテトラヒドロ葉酸の測定
全血試料に5-メチルテトラヒドロ葉酸を加えて溶血試薬と混合し、1％アスコルビン酸を有する水中の10μg/mL 5-メチルテトラヒドロ葉酸の10μLの溶液（4M水酸化ナトリウム溶液でpH 7に調整）を90μLの新しいEDTA血液に添加する。10μLの添加血液を90μLの水中0.15M塩化ナトリウムで希釈し、1％アスコルビン酸中の100μLの2mg 1-メチル-1-オクチルピロリジニウムクロライド/KSCNの溶液（4M水酸化ナトリウム溶液でpH 7に調整）と混合する。この溶血物をHPLC分析に使用する。
【０１２６】
HPLCシステムは、DR 5溶媒送達システム、サーモスタット装備自動サンプラー、自動インジェクターおよびプレカラムと分析HPLCカラムの切換え用の6口切換え弁を有するHP1090液体クロマトグラフ（Agilent）からなる。プレカラムの注入および負荷には、Waters HPLC 515ポンプを使用する。検出装置は、電気スプレーイオン化による連続イオントラップ（inontrap）質量分析器、Thermo Electron LTQである。クロマトグラフィー分離について、プレカラムADS-C18、25x4mm（Merck）、ならびに床物質として5μm Vydac C18粒子、2.1 mmの内部カラム直径、250mmのカラム長さおよび0.5μm孔径のフリットを有する分析HPLCカラムを使用する。溶媒Aは0.5％酢酸を有する水であり、溶媒Bは0.5％酢酸を有するメタノールである。
【０１２７】
添加試料および溶血試料のうち20μLを、流速1.5mL/分の溶出液Aを用いて、プレカラムADS-C18に注入する。4分後、トラップされた分析物に、5分まで0％のBを使用した水（0.5％酢酸を有する）（A）〜メタノール（0.5％酢酸を有する）（B）の勾配、および5〜30分、流速0.2mL/分で100％のBまでの勾配を適用して、分析カラムVydac C18上で流速0.2mL/分を用いてバックフラッシュ様式で溶出する。分析物5-メチルテトラヒドロ葉酸はおよそ17分で溶出する（図6参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図1は、水で溶血した1/10希釈全血の光学顕微鏡検査である。メイ-グリュンヴァルト染色を適用した。赤血球膜および核が見られる。
【図２】図2は、1-ブチル-4-メチルピリジニウムテトラフルオロボレート（25％）で溶血した1/10希釈全血の光学顕微鏡検査である。メイ-グリュンヴァルト染色を適用した。赤血球または膜は残っていないが核は完全なままである。
【図３】図3は、水で溶血した1/10希釈全血の光学顕微鏡検査である。トリパンブルー染色を使用した。
【図４ａ】図4は、1-ブチル-4-メチルピリジニウムテトラフルオロボレート（25％）で溶血した1/10希釈全血の光学顕微鏡検査である。トリパンブルー染色を使用した。a)2.5分のインキュベーション時間：ほんのわずかな赤血球が残っている。
【図４ｂ】図4は、1-ブチル-4-メチルピリジニウムテトラフルオロボレート（25％）で溶血した1/10希釈全血の光学顕微鏡検査である。トリパンブルー染色を使用した。b)15分インキュベーション時間：赤血球または膜は残っていない。
【図５】図5は、ラパマイシン添加1/10希釈全血のLC-MS/MSクロマトグラムである。
【図６】図6は、5-メチルテトラヒドロ葉酸添加全血のLC-MS/MSクロマトグラムである。5-メチルテトラヒドロ葉酸は17.5分で溶出する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月6日(2008.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を含むことが既知であるまたは疑われる液体試料および真核生物細胞を含むことが疑われるまたは既知である液体試料中の分析物を検出する方法であって、該方法は
a)赤血球の細胞膜を溶解し、同時に試料成分の沈殿を生じない適切な条件下で、該液体試料を膜可溶化剤で処理する工程、
b)工程(a)で得られた処理試料を高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によるクロマトグラフィー分離に供する工程、ならびに
c)分析物を検出する工程
を含み、
該条件は、該膜可溶化剤と1:10希釈の全血試料とを1:1の比で混合し、30分間インキュベートすることによって、2mmの直径および0.5μmの孔径を有するフィルターに適用され得る50の10μLアリコートの処理全血試料がもたらされ、第一インジェクションと比較してインジェクション50の背圧の増加が20 bar未満である場合に適切である、方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィー分離が、カラムクロマトグラフィーに基づいており、フリットおよび床物質を含むカラムの使用またはモノシリックカラムの使用によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フリットが0.2または0.5μmの孔径を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記床物質が粒子であり、該粒子が1〜10μmの直径を有する、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記分析物が質量分析によって検出される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料が脳脊髄液および全血から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記分析物が赤血球内に少なくとも部分的に局在する、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記分析物が免疫抑制薬である、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)のための全血試料の処理における、
KBr、KJ、KSCNまたは以下のカチオンおよびアニオンの1つ以上からなる塩、
ここで、カチオンは
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（式中、mは0または1であり、nは4または6である）
から選択され、アニオンはクロライド、テトラフルオロボレート、オクチルスルフェート、ヨウ化物、およびチオシアネートから選択される、
から選択される化学物質を含む膜可溶化剤の使用。
【請求項１０】
液体クロマトグラフィー系分析における請求項１〜９記載の方法のいずれかによる膜可溶化剤を用いた特異的溶血によって得られた処理血液試料の使用。
【国際調査報告】
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