(57)【要約】線維形成性障害を治療するための方法及び組成物が記載される。より具体的に本発明が明らかにしていることは、ＣＣＬ２１の活性を単独で又はＣＣＬ１９とともに阻害するか又は減少させることが、線維症の病変の存在を減少させ、線維形成性障害の症状を改善するのに有効であるということである。本発明の方法は、例えば、哺乳動物の慢性線維形成性障害を治療する方法であって、該線維形成性障害の線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞においてＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の慢性線維形成性障害を治療する方法であって、該線維形成性障害の線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞においてＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることを包含する、方法。
【請求項２】
前記線維形成性障害に関連する線維芽細胞においてＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させることをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることは、ＣＣＬ２１を該線維芽細胞から除去する薬剤を、該慢性線維形成性障害の１つ以上の症状を軽減するのに有効な量で、該哺乳動物に接触させることをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤は、ＣＣＬ２１に対して特異的に免疫反応性である抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体は、ＣＣＬ２１上のエピトープを他のケモカインよりも優先的に認識するものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることは、前記線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の発現を減少させる薬剤を、前記慢性線維形成性障害の１つ以上の症状を軽減するのに有効な量で、前記哺乳動物に接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤は、ＣＣＬ２１に対するｓｉＲＮＡ分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記線維形成性障害は、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肝臓線維症、関節リウマチ、うっ血性心不全、慢性腎臓疾患、過敏性肺炎、呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、マンソン住血吸虫感染、叢状病変により引き起こされる原発性肺高血圧症、肺で発現するヘルペスウイルス関連疾患、皮膚で発現するヘルペスウイルス関連疾患、ケロイド瘢痕、狼瘡、腎性線維形成性皮膚障害、日本住血吸虫感染に伴う線維形成性病変、自己免疫疾患、病原性線維形成、ライム病、膵炎及び間質線維症における間質の再構築、子宮類線維腫、卵巣線維症、角膜線維症、うっ血性心不全及び他の虚血後の症状、腹部の外科手術後の瘢痕形成、広角度緑内障線維柱帯切開術の術後瘢痕形成、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記線維形成性障害は慢性肺線維症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤を線維形成性病変の部位に局所投与することを包含する、請求項３又は６に記載の方法。
【請求項１１】
前記線維形成性病変は肺中にあり、かつ前記組成物は前記病変に局所的に接触させられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤は、線維形成性病変の部位に該薬剤を特異的に配置するための標的化部分を含む、請求項３又は６に記載の方法。
【請求項１３】
前記線維形成性病変は肺中にあり、かつ前記組成物は前記病変に局所的に接触させられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は、局所投与、注射、吸入、デポ剤若しくはポンプによる連続的放出、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される投与形態を用いて投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
線維芽細胞及び／又は線維細胞の増殖を阻害する方法であって、抗ＣＣＬ２１抗体又はＣＣＬ２１に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を該線維芽細胞及び／又は該線維細胞に接触させることを包含する、方法。
【請求項１６】
抗ＣＣＬ１９抗体又はＣＣＬ１９に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を前記線維芽細胞に接触させることをさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗ＣＣＲ７抗体又はＣＣＲ７受容体に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を前記線維芽細胞に接触させることをさらに包含する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記線維細胞及び／又は線維芽細胞はインビトロで存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記線維細胞及び／又は線維芽細胞はインビボで存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記線維細胞及び／又は線維芽細胞は、肺組織中にインビボで存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
線維細胞の移動及び／又は線維芽細胞の活性化を阻害する方法であって、ＣＣＬ２１の活性を阻害する組成物を該線維細胞及び／又は該線維芽細胞に接触させることを包含する、方法。
【請求項２２】
前記線維細胞は哺乳動物においてインビボで存在し、かつ前記方法は、該哺乳動物において線維細胞の肺組織への移動を阻害し、それによって細胞外マトリックスの過剰な生産を防止する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記線維芽細胞は、哺乳動物の肺組織に存在する常在性肺線維芽細胞であり、かつ前記方法は、該哺乳動物の肺組織にある該線維芽細胞の活性化を阻害し、それによって細胞外マトリックスの過剰な生産を防止する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
肺線維症を治療する方法であって、線維症性の肺疾患にかかっている哺乳動物の肺組織に存在する常在性肺線維芽細胞の活性化及び／又は線維細胞の移動を、該線維芽細胞及び／又は該線維細胞におけるＣＣＬ２１の活性又は発現を阻害することにより阻害し、それにより、細胞外マトリックスの過剰な生産を防止しかつ肺線維症の症状を改善することを包含する、方法。
【請求項２５】
対象において、放射線により誘発される肺板炎症及び／又は放射線により誘発される肺線維症の治療をする又はその発症を阻害する方法であって、該対象の肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤を、該対象に投与することを備え、ここで該薬剤は、放射線治療の前、及び／又は、放射線治療中、及び／又は放射線治療後に投与される、方法。
【請求項２６】
該線維形成性障害に関連する線維芽細胞においてＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を投与することをさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象において、薬により誘発される肺線維症の治療をするか又はその発症を阻害する方法であって、該対象の肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤を、該対象に投与することを備え、ここで該薬剤は、該薬の投与前、及び／又は、該薬の投与中、及び／又は該薬の投与後に投与される、方法。
【請求項２８】
該線維形成性障害に関連する線維芽細胞においてＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を投与することをさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬が、細胞傷害性薬剤、抗生物質、抗不整脈剤、抗炎症剤、及び違法薬物からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬が、アンホテリシンＢ、ブレオマイシン、ブロモクリプチン、ブスルファン、カルバマゼピン、クロラムブシル、コカイン、シクロホスファミド、ジフェニルヒダントイン、エルゴタミン、フレカイニド、ヘロイン、メルファラン、メタドン、メトトレキサート、メチルフェニデート、メチルセルジド、鉱油、ニトロフラントイン、ニトロソウレア、プロカルバジン、シリコーン、スルファサラジン、トカイニド、及びビンカアルカロイド類の薬剤からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
該薬剤が、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗凝血薬、利尿薬、強心配糖体、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、β−２アゴニスト、抗ムスカリン剤、エンドペプチダーゼ阻害剤、脂質低下剤、及びトロンボキサン阻害剤、又はそれらの組合せと併用で投与される、請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤の、必要に応じて、線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤と併用した、哺乳動物において慢性線維形成性障害を治療するための医薬の製造のための使用。
【請求項３３】
前記薬剤は、ＣＣＬ２１に対して特異的に免疫反応性である抗体である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
該抗体は、ＣＣＬ２１上のエピトープを他のケモカインよりも優先的に認識するものである、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
該薬剤は、ＣＣＬ２１に対するｓｉＲＮＡ分子である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３６】
該線維形成性障害は、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肝臓線維症、関節リウマチ、うっ血性心不全、慢性腎臓疾患、過敏性肺炎、呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、マンソン住血吸虫感染、叢状病変により引き起こされる原発性肺高血圧症、肺で発現するヘルペスウイルス関連疾患、皮膚で発現するヘルペスウイルス関連疾患、ケロイド瘢痕、狼瘡、腎性線維形成性皮膚障害、日本住血吸虫感染に伴う線維形成性病変、自己免疫疾患、病原性線維形成、ライム病、膵炎及び間質線維症における間質の再構築、子宮類線維腫、卵巣線維症、角膜線維症、うっ血性心不全及び他の虚血後の症状、腹部の外科手術後の瘢痕形成、広角度緑内障線維柱帯切開術の術後の瘢痕形成、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３７】
該線維形成性障害は慢性肺線維症である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
該薬剤は、局所投与、注射、吸入、デポ剤若しくはポンプによる連続的放出、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される投与形態用に処方される、請求項１の使用。
【請求項３９】
抗ＣＣＬ２１抗体又はＣＣＬ２１に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を、必要に応じて、抗ＣＣＬ１９又はＣＣＬ１９に対して設計したｓｉＲＮＡ分子とともに含む組成物の、線維芽細胞及び／又は線維細胞の増殖を阻害するための医薬の製造のための使用。
【請求項４０】
該使用が、抗ＣＣＲ７抗体又はＣＣＲ７受容体に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を含む組成物の、線維芽細胞及び／又は線維細胞の増殖を阻害するための医薬の製造のための使用をさらに含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
ＣＣＬ２１の活性を阻害する組成物の、線維芽細胞の移動及び／又は線維芽細胞の活性化を阻害するための医薬の製造のための使用。
【請求項４２】
線維細胞におけるＣＣＬ２１の活性若しくは発現及び／又は常在性肺線維芽細胞の活性化を阻害する組成物の、細胞外マトリックスの過剰な生産を妨げかつ肺線維症の症状を改善することにより肺線維症を治療する医薬の製造のための使用。
【請求項４３】
肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤の、必要に応じて、肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤と併用した、放射線により誘発される肺板炎症及び／又は放射線により誘発される肺線維症を治療するための医薬の製造のための使用。
【請求項４４】
肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤の、必要に応じて、肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤と併用した、薬により誘発される肺線維症を治療するための医薬の製造のための使用。
【請求項４５】
前記薬は、細胞傷害性薬剤、抗生物質、抗不整脈剤、抗炎症剤、及び違法薬物からなる群から選択されるものである、請求項４３又は４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記薬は、アンホテリシンＢ、ブレオマイシン、ブロモクリプチン、ブスルファン、カルバマゼピン、クロラムブシル、コカイン、シクロホスファミド、ジフェニルヒダントイン、エルゴタミン、フレカイニド、ヘロイン、メルファラン、メタドン、メトトレキサート、メチルフェニデート、メチルセルジド、鉱油、ニトロフラントイン、ニトロソウレア、プロカルバジン、シリコーン、スルファサラジン、トカイニド、及びビンカアルカロイド類の薬からなる群から選択される、請求項４３又は４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記医薬は、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗凝血薬、利尿薬、強心配糖体、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、β−２アゴニスト、抗ムスカリン剤、エンドペプチダーゼ阻害剤、脂質低下剤、及びトロンボキサン阻害剤、又はそれらの組合せと併用される、請求項３２〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
前記線維細胞及び／又は線維芽細胞においてＣＣＬ２１及びＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させることは、ＣＣＬ２１及びＣＣＬ１９を該線維細胞及び／又は線維芽細胞から除去する薬剤を、該慢性線維形成性障害の１つ以上の症状を軽減するのに有効な量で、該哺乳動物に接触させることをさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年１２月２３日に出願された米国仮出願第６０／７５３，６４７号についての優先権の利益を主張し、本明細書中においてその全体を参考として具体的に援用する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．Ｐ５０  ＨＬ−５６４０２のもとに政府援助によってなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、慢性線維形成性障害を治療するための方法及び組成物に関する。特に本発明は、慢性線維形成性障害の免疫療法による介入に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
炎症は、組織の損傷や感染に対する協調反応である。炎症は、化学走性因子の局所的放出、血小板の活性化、並びに凝固及び補体経路の開始から始まる。これらの事象は、局所的内皮を刺激し、好中球及び単球の管外遊出を促進する。炎症の第二段階は、細胞組織への適応免疫系（リンパ球を含む）の流入を特徴とする。続く消炎段階は、過剰な白血球のアポトーシスや組織マクロファージによる貪食が起こる場合、間質細胞（例えば線維芽細胞）による損傷組織の修復を特徴とする。
【０００５】
そのような修復機構では、局所的な休止線維芽細胞が、損傷領域に移動し、細胞外マトリックスタンパク質を生成し、傷の収縮と線維形成を促進する。また、循環する線維芽前駆細胞、線維芽細胞（これらは血液中に存在する）が、傷や線維形成の部位に移動し、そこでそれらが分化して組織の修復やその他の線維化反応を仲介することが示唆されてきた。線維細胞は、ＣＤ１４＋末梢血単球前駆細胞群から分化し、造血細胞（ＣＤ４５、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３４）と間質細胞（コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型並びにフィブロネクチン）の両方のマーカーを発現する。成熟した線維細胞は、すみやかに損傷組織に入り、そこで、炎症性サイトカインを分泌するとともに、細胞外マトリックスタンパク質、他のサイトカイン類、及び前駆脈管形成分子を分泌し、それらが線維形成をもたらし得る。
【０００６】
線維細胞の分化は、種々の線維症（例えば、強皮症、ケロイド瘢痕、関節リウマチ、狼瘡、腎性線維形成性皮膚障害、及び特発性肺線維症があるが、これらに限定されない）と関連している。線維細胞は、マウスにおいて日本住血吸虫の感染の後、線維症の病変の形成にある役割を果たしており、また、自己免疫疾患に伴う線維症にも関係している。また線維細胞は、放射線障害に伴う病原性線維形成、ライム病、及び肺線維症にも関係しており、さらには、膵炎における間質の再構築及び間質の線維形成にも関係している一方、そのような線維細胞の欠如は、膵臓の腫瘍及び腺癌に関係している。さらに線維形成は、喘息の患者でも起こっており、また、他の肺疾患（例えば慢性閉塞性肺疾患）でも、線維細胞が筋線維芽細胞にさらに分化する場合、起こる可能性がある。
【０００７】
抑制されていない線維化反応を伴うことが知られている特定の群の疾患には、特発性間質性肺炎、種々のレベルの肺線維症を特徴とするさまざまな慢性肺疾患がある。種々の組織学的に異なる形態の特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）に伴う支配的な肺線維症の反応を引き起こす主要な因子はあまり明確にされておらず、そのことが、これらの疾患に有効な臨床治療が存在しないことの一因となっている（非特許文献１）。これらの疾患の多くは、肺胞の微小環境において線維増殖性反応を示し、呼吸障害をもたらしているが、その線維化の変化の程度はそれらの中でかなり異なっている（非特許文献２、非特許文献３）。同様にややこしいことは、あまり重篤でない形態のＩＩＰ（例えば非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）及び呼吸細気管支炎／間質性肺疾患（ＲＢＩＬＤ））では抗炎症剤が治療効果をもたらす一方、最も重篤で致命的な形態のＩＩＰ（通常型間質性肺炎（ＵＩＰ））の患者では、抗炎症剤は多くの場合、呼吸不全を食い止めることができないということである（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
【０００８】
線維芽細胞の独特な病巣、すなわち線維芽細胞の病巣が存在するということは、特発性間質性肺炎において、予後不良と致命的結果につながる重要な病理学的特徴である（非特許文献７）。ＩＩＰの誘発と持続の間、肺の線維化の変化に寄与する共通の事象と異なる事象を解明すれば、より新たな治療の道が開ける可能性がある（非特許文献８）。ＣＣケモカイン受容体７（ＣＣＲ７（これはＭＩＰ−３ｂ／ＣＣＬ１９及び６−Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１に結合する（非特許文献９）及びＣＸケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４（これはＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２に結合する）（非特許文献１０）は、造血起源の細胞にその発現が限られていることが広く認められたケモカイン受容体である（非特許文献１１、非特許文献１２）。免疫反応の間、ＣＣＲ７の発現は、成熟した樹状細胞のリンパ組織への移動を促進し（非特許文献１３）、脾臓内で１型及び２型のヘルパーＴ細胞の局在化を調節し（非特許文献１４）、また２型ヘルパーＴ細胞をアレルギー性肺に誘導する（非特許文献１５）。ＣＸＣＲ４の発現と作用は、骨髄由来の免疫細胞に大きく限定された（非特許文献１６、非特許文献１７）。乳房腫瘍細胞によるＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４の発現が該細胞の肺への転移を可能にすることを示す最近の証拠は、上述した免疫中心的な考え方を修正するものであった（非特許文献１８）。乳房細胞は、これらのケモカイン受容体を発現せず、また、それらに結合するリガンドに反応しない（非特許文献１８）。上記知見は、いくつかの転移性腫瘍タイプ（黒色腫を含む）にもあてはまるようになり（非特許文献１９）、また種々の形態の白血病にもあてはまるようになった（非特許文献２０、非特許文献２１）。
【０００９】
慢性肺線維症は、肺全体にわたる瘢痕形成に起因し、それは、多くの症状（例えば、慢性の炎症過程（サルコイドーシス、ヴェーゲナー肉芽腫症）、感染、環境因子（アスベスト、シリカ、特定のガスにさらされること）、イオン化放射線にさらされること（例えば、胸部腫瘍を治療する放射線治療）、慢性症状（狼瘡、関節リウマチ））によって引き起こされることがあり、さらに特定の薬物によっても引き起こされることがある。過敏性肺炎として知られる症状では、有機物の塵埃又は職業上取り扱う化学物質を吸い込むことに対し免疫反応が強くなると、肺の線維症が発症する場合がある。この症状は、最も多くの場合、細菌、真菌、又は動物の生産物で汚染された塵埃を吸い込むことにより生じる。ある種の肺線維症（例えば非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ））において、患者は、免疫抑制療法に反応することがある。ありがちなことであるが、慢性の肺の炎症及び線維症が、特定可能な原因なく起こる場合、そのような疾患にかかった患者は、薬物療法に反応しない。このことは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）にかかった患者の特にあてはまる。特発性肺線維症の対する治療の選択肢は非常に限られている。なんらかの薬物がこの症状に役立ち得るとする証拠はない。というのも、瘢痕形成は一旦生じると永続するからである。肺の移植が、唯一の治療上可能な選択肢である。繊維性の瘢痕形成を減少させる可能性のある種々の薬物を用いた研究試験が進行中である。いくつかの種類の肺線維症は、コルチコステロイド類（例えばプレドニゾン）及び／又は体内の免疫系を抑制するその他の薬物に反応することがあるため、これらの種類の薬物が、時に、線維症につながる過程を抑えるため処方される。しかしながら、今のところ線維形成性障害用の治療は存在しないというのが、よく知られているところである。患者にプレドニゾン及びアザチオプリンを投与することが臨床上標準的に行われていることであるが、それらの薬剤がなんらかの治療効果をあげていることを示すデータは存在しない。実際、それらの薬剤の副作用は、ＵＩＰの患者を死に至らしめる一因となり得る。
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｃｈｅｓｔ  ２００２；１２２（ｓｕｐｐｌ．６）：３３４Ｓ−９Ｓ
【非特許文献２】Ｎｉｃｈｏｌａｓｏｎ  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒ  Ｍｅｄ／２０００：１６２：２２１３−７
【非特許文献３】Ｃｈａｐｍａｎ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．，Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４；１１３：１４８−５７
【非特許文献４】Ｆｌａｈｅｒｔｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１１０：２７８−２８２（２００１）
【非特許文献５】Ｌｙｎｃｈら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．，７：２９８−３０８（２００１）
【非特許文献６】Ｆｌａｈｅｒｔｙら、Ｔｈｏｒａｘ，５８：１４３−１４８（２００３）
【非特許文献７】Ｋｉｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６４：１０２５−１０３２（２００１）
【非特許文献８】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｌｉｎｋら、Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓｚ），４８：５３９−５４５（２０００）
【非特許文献９】Ｎａｇｉｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１９５１８−１９５２４（１９９７）
【非特許文献１０】Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：１５２２−１５３１（１９９８）
【非特許文献１１】Ｋｉｍら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，６６：４５５−４６１（１９９９）
【非特許文献１２】Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０８：１３３１−１３３９（２００１）
【非特許文献１３】Ｓａｌｌｕｓｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：１６１７−１６２５（１９９９）
【非特許文献１４】Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：２１５９−２１６２（１９９９）
【非特許文献１５】Ｈａｍｍａｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１５２４−１５３４（２００２）
【非特許文献１６】Ｗａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３３：４５７−４７０（１９９８）
【非特許文献１７】Ｇｏｎｚａｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：４９９−５０８（２０００）
【非特許文献１８】Ｍｕｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１０：５０−５６（２００１）
【非特許文献１９】Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．，３６：７１−７８（２００４）
【非特許文献２０】Ｔａｖｏｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４：２８１７−２８２４（２００４）
【非特許文献２１】Ｇｈｏｂｒｉａｌら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，７９：３１８−３２５（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ケモカインは、肺線維症において線維化反応の増幅と線維芽細胞病巣の形成に関与している可能性がある一方、慢性肺線維症において存在する前線維症性メディエーター環境がどのような特定の役割を果たしているかは不明のままである。本発明は、特定のケモカイン類及びそれらの受容体の役割を明らかにするとともに、特に、薬物療法に抵抗性の特発性疾患を治療するための新規な方法及び組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、上述した線維形成性障害を治療するための方法及び組成物に関する。特に本発明が明らかにするところは、ＣＣＬ２１の活性を単独で又はＣＣＬ１９とともに阻害するか又は減少させることが、線維症の病変の存在を減らすこと及び線維形成性障害の症状を改善することに効果的であるということである。
【００１２】
かくして特定の実施形態において本発明は、哺乳動物の慢性線維形成性障害を治療する方法に関し、該方法は、該線維形成性障害の線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞においてＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることを包含する。特定の実施形態において、該方法は、該線維形成性障害に関連する線維芽細胞においてＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させることをさらに備えてもよい。例えば、ＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることは、ＣＣＬ２１を該線維芽細胞から除去する薬剤を、該慢性線維形成性障害の１つ以上の症状を軽減するのに有効な量で、該哺乳動物に接触させることを含み得る。そのような薬剤の具体例は、ＣＣＬ２１に対して特異的に免疫反応性である抗体、例えば、ＣＣＬ２１上のエピトープを他のケモカインよりも優先的に認識する抗体とすることができる。
【００１３】
他の実施形態において、ＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることは、該線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の発現を減少させる薬剤を、該慢性線維形成性障害の１つ以上の症状を軽減するのに有効な量で、該哺乳動物に接触させることを含み得る。そのような実施形態の具体的な薬剤は、ＣＣＬ２１に対するｓｉＲＮＡとすることができる。
【００１４】
本発明により任意の線維形成性障害を治療することができ、そのような線維形成性障害は、例えば、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肝臓線維症、関節リウマチ、うっ血性心不全、慢性腎臓疾患、過敏性肺炎、呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、マンソン住血吸虫感染、原発性肺高血圧症（叢状病変の形成の防止）、ヘルペスウイルス関連疾患（肺及び皮膚の症状の発現を含む）、ケロイド瘢痕、狼瘡、腎性線維形成性皮膚障害、及び日本住血吸虫感染に伴う線維形成性病変、自己免疫疾患、病原性線維形成、ライム病、膵炎及び間質線維症における間質の再構築、子宮類線維腫、卵巣線維症、角膜線維症、うっ血性心不全及び他の虚血後の症状、外科手術後の瘢痕形成（腹部癒着、広角度緑内障線維柱帯切開術を含む）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるものであるが、それらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明に従って治療すべき典型的な肺高血圧症には、以下のものがある。原発性肺高血圧症（ＰＰＨ）、二次肺高血圧症（ＳＰＨ）、家族性ＰＰＨ、散発性ＰＰＨ、毛細血管前肺高血圧症、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、肺動脈高血圧、特発性肺高血圧症、血栓性肺動脈症（ＴＰＡ）、多因性肺動脈症、機能性Ｉ〜ＩＶ型肺高血圧症、及び以下のものに伴う、関連する又は付随する肺高血圧症（左室機能不全、僧帽弁疾患、梗塞性心外膜炎、大動脈狭窄症、心筋症、縦隔線維症、肺静脈異常排出、肺静脈閉塞病、膠原血管病、先天性心疾患、ＨＩＶウイルス感染、薬剤及び毒素（例えばフェンフルラミン類）、先天性心疾患、肺静脈高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、睡眠時呼吸障害、肺胞換気過少症、長期間高度環境にさらされている状態、新生児肺疾患、肺胞毛細血管異常形成、鎌状赤血球症、その他の凝固障害、慢性血栓塞栓症、結合組織疾患、狼瘡、住血吸虫症、サルコイドーシス、又は肺毛細血管腫症）。
【００１６】
本発明に従って治療すべき肺高血圧症の最も好ましいものは、呼吸器系の障害及び／又は低酸素症（慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、睡眠時呼吸障害、肺胞換気過少症、長期間高度環境にさらされている状態、新生児肺疾患、及び肺胞毛細血管異常形成が含まれるが、特に、慢性閉塞性肺疾患）に伴う肺高血圧症である。好ましい実施形態において、線維形成性障害は、慢性肺線維症である。
【００１７】
治療法において、化合物を線維形成性病変の部位に局所投与してもよい。特定の実施形態において、線維性病変は肺中にあり、組成物は該病変に局所的に接触させられる。特定の実施形態において意図するところによれば、薬剤は、線維形成性病変の部位に該薬剤を特異的に配置するための標的化部分（ターゲティング部分）を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、抗体又は抗ＣＣＬ２１組成物又は抗ＣＣＬ１９組成物が、局所投与、注射、吸入、デポ剤若しくはポンプによる連続的放出、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される投与形態を用いて投与される。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、線維芽細胞及び／又は線維細胞の増殖を阻害する方法であり、該方法は、抗ＣＣＬ２１抗体又はＣＣＬ２１に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を該線維芽細胞及び／又は該線維細胞に接触させることを包含する。ある実施形態において、該方法は、抗ＣＣＬ１９抗体又はＣＣＬ１９に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を該線維芽細胞に接触させることをさらに包含する。さらに他の実施形態において、該方法は、抗ＣＣＲ７抗体又はＣＣＲ７受容体に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を該線維芽細胞に接触させることをさらに包含する。治療される線維細胞及び／又は線維芽細胞は、インビトロで存在してもよいし、インビボで存在してもよい。それらはインビボで存在することが好ましい。それらは肺組織中にインビボで存在することがより好ましい。
【００２０】
また、線維細胞の移動及び／又は線維芽細胞の活性化を阻害する方法も含まれ、該方法は、ＣＣＬ２１の活性を阻害する組成物を該線維細胞及び／又は該線維芽細胞に接触させることを包含する。そのような方法において、該線維細胞は哺乳動物においてインビボで存在し、該方法は、該哺乳動物において線維細胞の肺組織への移動を阻害し、それによって細胞外マトリックスの過剰な生産を防止する。これらの方法において、線維芽細胞は、哺乳動物の肺組織に存在する常在性肺線維芽細胞であることが好ましく、該方法は、該哺乳動物の肺組織にある該線維芽細胞の活性化を阻害し、それによって細胞外マトリックスの過剰な生産を防止する。
【００２１】
肺線維症を治療する方法もここで開示されるものであり、該方法は、線維症性の肺疾患にかかっている哺乳動物の肺組織に存在する常在性肺線維芽細胞の活性化及び／又は線維細胞の移動を、該線維芽細胞及び／又は該線維細胞におけるＣＣＬ２１の活性又は発現を阻害することにより、阻害することを備え、それにより、細胞外マトリックスの過剰な生産を防止しかつ肺線維症の症状を改善する。
【００２２】
さらに意図するところは、対象において、放射線により誘発される肺板炎症及び／又は放射線により誘発される肺線維症の治療をする、その発症を阻害する、その１つ以上の症状を改善する、その症状を後退させる、又はその治療成果をあげる方法であり、該方法は、該対象の肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤を、該対象に投与することを備え、ここで該薬剤は、放射線治療の前、及び／又は、放射線治療中、及び／又は放射線治療後に投与される。そのような治療法は、該対象の肺組織におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を投与することをさらに備えてもよい。
【００２３】
本発明の他の態様において意図するところは、対象において、薬により誘発される肺線維症の治療をする、その発症を阻害する、その１つ以上の症状を改善する、その症状を後退させる、又はその治療成果をあげる方法であり、該方法は、該対象の肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤を、該対象に投与することを備え、ここで該薬剤は、該薬の投与前、及び／又は、該薬の投与中、及び／又は該薬の投与後に投与される。そのような治療法は、該対象の肺組織におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を投与することをさらに備えてもよい。また、そのような方法で、該対象の肺組織におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤をさらに投与することが好ましい場合がある。線維症を引き起こす薬が多く存在する。そのような薬には、細胞傷害性薬剤、抗生物質、抗不整脈剤、抗炎症剤、及び違法薬物があるが、これらに限定されるものではない。肺線維症を引き起こす薬の具体例として、アンホテリシンＢ、ブレオマイシン、ブロモクリプチン、ブスルファン、カルバマゼピン、クロラムブシル、コカイン、シクロホスファミド、ジフェニルヒダントイン、エルゴタミン、フレカイニド、ヘロイン、メルファラン、メタドン、メトトレキサート、メチルフェニデート、メチルセルジド、鉱油、ニトロフラントイン、ニトロソウレア、プロカルバジン、シリコーン、スルファサラジン、トカイニド、及びビンカアルカロイド類の薬があるが、これらに限定されるものでなはい。上述した治療方法では、補助的な治療法として、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９に作用する治療薬をコルチコステロイド及び／又は免疫抑制剤と併用する投与法を設けることが好ましい場合がある。さらなる方法において、該併用療法は、抗凝血薬、利尿薬、強心配糖体、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、β−２アゴニスト、抗ムスカリン剤、エンドペプチダーゼ阻害剤、脂質低下剤、及びトロンボキサン阻害剤、又はそれらの組合せを投与することを備えてもよい。
【００２４】
さらに本発明は、線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を、慢性線維形成性障害の治療用医薬の製造に使用することを意図している。
【００２５】
具体的な実施形態において、本発明が規定するところによれば、線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤とともに、必要に応じて、線維性病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を、哺乳動物における慢性線維形成性障害の治療用医薬の製造に使用する。特定の実施形態において、該薬剤は、ＣＣＬ２１に対して特異的に免疫反応性である抗体であり、該抗体は、ＣＣＬ２１上のエピトープを他のケモカインよりも優先的に認識するものであることが好ましい。他の実施形態において、該薬剤は、ＣＣＬ２１に対するｓｉＲＮＡ分子である。該医薬は、線維形成性障害の治療用として製造されるものであり、該線維形成性障害は、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肝臓線維症、関節リウマチ、うっ血性心不全、慢性腎臓疾患、過敏性肺炎、呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、マンソン住血吸虫感染、叢状病変により引き起こされる原発性肺高血圧症、肺で発現するヘルペスウイルス関連疾患、皮膚で発現するヘルペスウイルス関連疾患、ケロイド瘢痕、狼瘡、腎性線維形成性皮膚障害、日本住血吸虫感染に伴う線維形成性病変、自己免疫疾患、病原性線維形成、ライム病、膵炎及び間質線維症における間質の再構築、子宮類線維腫、卵巣線維症、角膜線維症、うっ血性心不全及び他の虚血後の症状、腹部の外科手術後の瘢痕形成、広角度緑内障線維柱帯切開術の後の瘢痕形成、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるものである。該線維形成性障害は、慢性肺線維症であることが好ましい。
【００２６】
該医薬は、局所投与、注射、吸入、デポ剤若しくはポンプによる連続的放出、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される投与形態用に処方されることが好ましい。
【００２７】
さらに意図するところによれば、抗ＣＣＬ２１抗体又はＣＣＬ２１に対して設計されたｓｉＲＮＡ分子とともに、必要に応じて、抗ＣＣＬ１９抗体又はＣＣＬ１９に対して設計されたｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、線維芽細胞及び／又は線維細胞の増殖を阻害するための医薬の製造に使用する。この使用は、抗ＣＣＲ７抗体又はＣＣＲ７受容体に対して設計されたｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を、線維芽細胞及び／又は線維細胞の増殖を阻害するための医薬の製造に使用することをさらに備えてもよい。
【００２８】
他の態様が意図するところによれば、ＣＣＬ２１の活性を阻害する組成物を、線維芽細胞の移動及び／又は線維芽細胞の活性化を阻害するための医薬の製造に使用する。さらに意図するところによれば、細胞外マトリックスの過剰な生産を妨げかつ肺線維症の症状を改善することによる肺線維症の治療のための医薬の製造に、常在性肺線維芽細胞の活性化及び／又は線維細胞におけるＣＣＬ２１の活性又は発現を阻害する組成物を使用する。
【００２９】
ここでさらに意図するところによれば、肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤とともに、必要に応じて、肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を、放射線により誘発される肺板炎症及び／又は放射線により誘発される肺線維症の治療用医薬の製造に使用する。
【００３０】
さらに意図するところによれば、肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤とともに、必要に応じて、肺組織にある線維細胞及び／又は線維芽細胞におけるＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を、薬により誘発される肺線維症の治療用医薬の製造に使用する。そのような用途において、該医薬は、薬により誘発される非特発性肺線維症の治療用として製造されるものであり、該薬は、細胞傷害性薬剤、抗生物質、抗不整脈剤、抗炎症剤、及び違法薬物からなる群から選択されるものである。例えば、該薬は、アンホテリシンＢ、ブレオマイシン、ブロモクリプチン、ブスルファン、カルバマゼピン、クロラムブシル、コカイン、シクロホスファミド、ジフェニルヒダントイン、エルゴタミン、フレカイニド、ヘロイン、メルファラン、メタドン、メトトレキサート、メチルフェニデート、メチルセルジド、鉱油、ニトロフラントイン、ニトロソウレア、プロカルバジン、シリコーン、スルファサラジン、トカイニド、及びビンカアルカロイド類の薬からなる群から選択されるものとすることができる。ある実施形態において、医薬の製造のため薬剤の併用が意図され、そこにおいて、ＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１に基づく医薬は、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗凝血薬、利尿薬、強心配糖体、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、プロスタサイクリン類似体、エンドセリン拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、β−２アゴニスト、抗ムスカリン剤、エンドペプチダーゼ阻害剤、脂質低下剤、及びトロンボキサン阻害剤、又はそれらの組合せと併用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（発明の好ましい実施形態の詳細な説明）
線維症は、線維細胞の抑制されていない増殖と分化を伴う。線維細胞は、末梢血単球に由来する別個の線維芽細胞状の細胞群であり、それは、通常、損傷組織の部位に入って新脈管形成及び傷の治癒を促進する。本発明において明らかなことは、線維症の病変に存在する線維細胞及び／又は線維芽細胞中のＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させることによって、線維症病巣の存在が減らされる、及び／又は、線維症病巣の形成が阻害される、及び／又は線維症の１つ以上の症状が改善されることによる線維症治療の有益な結果がもたらされるということである。
【００３２】
既知の特発性の原因による慢性肺線維症は、極めて大きな臨床上の難問であり、それに対して選択可能な治療は、有効性が限られていたり、毒性が見られるものである（Ｆｌａｈｅｒｔｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１１０：２７８−２８２（２００１）、（Ｈａｍｐｔｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１４９：Ａ８７８（１９９４９））。また、診断後の平均生存率はほとんど変わらなかった（Ｒｙｕら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，７３：１０８５−１１０１（１９９８）、Ｌａｓｋｙら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１０８  Ｓｕｐｐｌ  ４：７５１−７６２（２０００））。既知の線維化をもたらす刺激には、放射線、無機物及び有機物の粒子の吸入、酸化性物質の気体、薬剤、及び感染性生物があり、これに対し、議論は、特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）の臨床病理を引き起こす病因の特定に関するものに固執している。ＩＩＰは、遠位の肺実質を巻き込む多様な群の疾患であり、それらは、多くの特徴が共通している一方、それぞれ別個の疾患として特定するのが妥当なほど十分に異なった印象を与えるものである（Ｔｒａｖｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈ．，２４：１９−３３（２０００））。それらの病因は依然としてはっきりしていないが、肺に対する１つの傷（又は複数の傷）が中心になっていると考えられ、従ってその傷を治癒させる試みが行われる。線維芽細胞の病巣（活発に増殖する線維芽細胞の小さな集塊）は、組織化された傷の前病巣であると考えられ、線維形成が活発で進行中であることを示すものであると考えられている。
【００３３】
まず、ＩＩＰを慢性線維形成性障害の具体例として用いることにより、ＣＣＲ７及び／又はＣＸＣＲ４の発現が線維形成性障害（この場合、ＩＩＰの肺の外科生検試料（ＳＬＢ））において高くなり得る一方、正常縁ＳＬＢでは高くないことを示すデータが得られる。ＩＩＰ及び正常縁の腫瘍患者群から得られるＳＬＢの詳細な遺伝子転写物分析及びタンパク質分析を行った。ケモカイン及びケモカイン受容体の転写物分析により明らかになったことは、ＣＣＲ７がＩＩＰ内の間質性病巣領域（特に分析したすべてのＵＩＰ生検試料）において強く発現される一方、ＣＸＣＲ４はそうではなく、正常縁の生検試料においてもそうではないということであった。ＩＩＰ生検試料のＣＣＲ７陽性領域は線維細胞を含んでいた。しかし、ＣＣＲ７陽性領域に存在する細胞が線維細胞マーカー（例えばＣＤ３４及びコラーゲン）を共発現しなかった場合、ＣＣＲ７陽性細胞は、必ずしも骨髄由来の細胞であるとは限らない。最終的に、ＩＩＰ生検試料中のＣＣＲ７陽性細胞は、活性化された常在性組織の線維芽細胞であることが明らかになった。従って、ここに示す具体例は、重篤なＩＩＰにおいてＣＣＲ７の発現が増加することを明らかにしており、また、この発現は、線維細胞及び筋線維芽細胞を欠く線維症の病巣領域に集中していた。
【００３４】
さらなる研究で明らかになったことは、ＣＣＲ７受容体のＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９リガンドを狙うことが、慢性線維形成性障害の治療にとって好ましい介入になるということである。特に、臨床モデル及び動物モデルのデータにより、ＣＣＲ７及びＣＣＬ２１の発現がＵＩＰにおいて顕著に増加することが分かった。さらに、ＵＩＰ線維芽細胞の遊走は、ＣＣＬ２１の存在によって強化されることが明らかとなった。一方、抗ＣＣＬ２１抗体の調製物が、ＵＩＰにおける線維芽細胞の遊走を大きく減衰させた。さらに、ＣＣＬ２１又はＣＣＬ１９リガンドの存在下では、明らかにＵＩＰ線維芽細胞は増殖反応を示す。
【００３５】
ＩＩＰ線維芽細胞をＳＣＩＤマウスに導入すると、マウスは間質線維症を発症する。このモデルは、ＩＩＰのヒト化ＳＣＩＤモデルとして役立つ。このモデルマウスを抗ＣＣＬ２１抗体で処理すると、該マウスは、抗ＣＣＬ２１抗体で処理しなかったＩＩＰのヒト化ＳＣＩＤマウスモデルの同様の群に対して、肺線維症の組織学的形跡をほとんど又は全く示さなかった。
【００３６】
ここに示すデータから考えられることは、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９の作用を減少させる及び／又は阻害することを目的とする方法及び組成物は、肺及びその他の組織における線維形成性障害の治療に特に有用であるということである。ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１へのヒト線維芽細胞の応答は（それらによるＣＣＲ７のアップレギュレーションのため）、それらの細胞の不適切な活性化をもたらし、それによってＩＩＰに見られる過剰な線維形成反応が生じる。興味深いことに、線維症患者の肺におけるサイトカイン環境は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１への異常な応答にとって有利に作用し得る。というのも、他の研究者らが、ＴＮＦ−αのプロテインレベルの増加（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：１６１７−１６２５（１９９９）、Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：２１５９−２１６２（１９９９））及びＩＬ−１０の減少（Ｈａｍｍａｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１５２４−１５３４（２００２））を報告しており、これらのサイトカインはともにこれらのリガンドに結合する受容体を調節しているからである。重篤な形態の肺線維症患者から得られるヒト線維芽細胞は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１にはっきりと反応する。従って、これらのリガンドは、肺における線維形成性障害（そして恐らくは他の組織における線維形成性障害）の治療において、魅力的な標的となる。
【００３７】
上記議論から明らかなとおり、特定の実施形態において意図するところは、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９を標的とする組成物は、ＣＣＲ７受容体を有するケモカインの相互作用を阻害するということである。そのような組成物を、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９自体に向けることができる（例えば、それらのケモカインに対する抗体、それらのケモカインに対して設計したアンチセンス分子、又はそれらの分子に対して設計したｓｉＲＮＡ）。一方、該組成物を、ＣＣＲ７受容体に対して向けてもよい（例えば、該受容体に対する抗体、該受容体に対して設計したアンチセンス分子、又は該受容体に対して設計したｓｉＲＮＡ）。さらに他の態様において、該組成物は、ＣＣＲ７受容体を有するケモカイン相互作用の小分子阻害剤を含むものであってもよい。対象における疾患の症状を治療及び／又は改善するための組成物及び方法並びにそれらの使用について以下でさらに詳しく述べる。
【００３８】
任意の線維形成性障害を治療することができる。例えば、該疾患として、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肝臓線維症、関節リウマチ、うっ血性心不全、慢性腎臓疾患、過敏性肺炎、呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、マンソン住血吸虫感染、原発性肺高血圧症（叢状病変の形成の防止）、ヘルペスウイルス関連疾患（肺及び皮膚の症状の発現を含む）、ケロイド瘢痕、狼瘡、腎性線維形成性皮膚障害、日本住血吸虫感染に伴う線維形成性病変、自己免疫疾患、病原性線維形成、ライム病、膵炎及び間質線維症における間質の再構築、子宮類線維腫、卵巣線維症、角膜線維症、うっ血性心不全及び他の虚血後の症状、外科手術後の瘢痕形成（腹部癒着、広角度緑内障線維柱帯切開術を含む）、並びにそれらの任意の組合せを挙げることができる。本方法が有用である他の領域は、上皮から間葉への変化（ＥＭＴ）の阻害である。この現象により、種々の器官（特に腎臓）における上皮細胞が、より「始原的な」細胞表現型（線維芽細胞の表現型のように）に「退行」する。このプロセスは、ボディプランの形成を組織化するのに役立っている。また、ＥＭＴは胚発生に関連してよく研究されており、成熟した組織の器官線維形成に際し線維芽細胞の発生にある役割を果たしている。腎臓線維症の研究から明らかになりつつある証拠は、疾患に関連する線維芽細胞全体の３分の１以上が傷の部位にある管状上皮から生じることを示唆する。このプロセスは、本発明の組成物によって阻害することができる。Ｋａｌｌｕｒｉ及びＮｉｅｌｓｅｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１７７６−１７８４（２００３）。
【００３９】
肺線維症は、うっ血性心不全、異型肺炎（ニューモシスティス種によるものを含む）、及び癌のリンパ管性拡散の患者において生じ得る。環境や職業による作用（例えば、無機物の粉塵を吸い込む作用（例えばシリコン、アスベスト、ベリリウム症、黒色肺））も、これらの肺疾患を引き起こすことが認められている。また線維症は、タンパク質抗原にさらされること（例えば、農夫肺、鳩飼育者肺、温水浴槽肺）や毒性の気体、煙霧、エーロゾル、及び蒸気にさらされること（例えばサイロ充填者病）によっても発症することがある。放射線（内科療法に多く使用されるイオン化放射線）にさらされることも、肺線維症のよく知られた原因であり、それは、リウマチ／結合組織の疾患（例えば強皮症、関節リウマチ、混合結合組織病、全身性エリテマトーデス）に関連する原因にも見られる。線維症は、肺−腎症候群（すなわちウェグナー病又はグッドパスチャー病）、サルコイドーシス及びその他の肉芽腫性疾患（例えばベリリウム病）、全身性疾患（例えばＣ型肝炎、炎症性腸疾患、後天性免疫不全症候群）、特発性又は希少性ＤＰＬＤ（例えば、以下のようなもの：ＣＯＰ（特発性）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症（希少性）、好酸球性肺炎）においても見られることがある。さらに、線維症は、家族性ＩＰＦ又はサルコイドーシス、結節硬化症、神経線維腫症、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、及びヘルマンスキー−パドラック症候群において見られることがある。
【００４０】
本発明の治療介入を用いることができる他の領域は、種々の癌治療に反応して生じる線維症の領域である。例えば、本発明の治療法は、放射線腫瘍治療法の補助となる。放射線により誘発される肺板炎症及びその後の肺線維症は、放射線治療の副作用であり、その現象は放射線治療の効果を妨げる。典型的に例えば、癌の放射線治療において、２０〜８５グレイの線量が投与される。しかし、患者を調べると、放射線量の増加と、肺炎症の形態の肺毒性とは、ほぼ直線的な相関関係があることが分かった。その後、線維症の病変も見られる。意図するところとして、ＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤を投与することにより、及び／又は、ＣＣＬ１９の存在又は活性を減少させる薬剤を投与することにより、放射線により誘発される肺炎症及び／又は放射線により誘発される肺線維症の発症又は進行を改善する。特定の実施形態において意図するところによれば、ＣＣＬ１９及び／又はＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる本発明の療法は、放射線治療の前、及び／又は、放射線治療の後、及び／又は放射線治療と同時に行うことができる。場合によって、放射線療法を行った後１日、２日、３日、４日、又は５日以内にそのような薬剤を投与することが好ましい。
【００４１】
顕著な肺線維症に至ることが分かっているもう１つの癌療法は、硫酸ブレオマイシンの投与により起こる薬物誘導線維症である。ブレオマイシンは、皮膚及び肺に沈着し、それが線維症を引き起こす。薬剤投与の休止とコルチコステロイドの投与が望ましいが、ブレオマイシンによって誘発される肺傷害に対し実証された治療法はない。意図するところによれば、ＣＣＬ１９及び／又はＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる本発明の治療法は、硫酸ブレオマイシンの投与の前、及び／又は、硫酸ブレオマイシンの投与の後、及び／又は、硫酸ブレオマイシンの投与と同時に行われ、また、ＣＣＬ１９及び／又はＣＣＬ２１の存在又は活性を減少させる薬剤の投与は、硫酸ブレオマイシンを投与される患者において肺線維症の存在又は発症を減少させるのに有効である。
【００４２】
肺線維症を引き起こす薬剤の具体例として硫酸ブレオマイシンを説明したが、肺疾患を引き起こす薬剤が他にもあり、近年、急速に注目を浴びてきた分野である。１９７２年においては１９の薬剤しか肺疾患を引き起こすものとして認識されていなかった。２００１年の文献の調査により、増え続ける一方である１５０以上の薬剤が肺疾患を引き起こすことが明らかにされていると分かった。それらの中で、細胞傷害性薬剤（例えばブレオマイシン、ブスルファン、メトトレキサート）、抗生物質（例えばニトロフラントイン、スルファサラジン）、抗不整脈剤（例えばアミオダロン、トカイニド）、抗炎症剤（例えば筋、ペニシラミン）、違法薬物（例えばクラックコカイン、ヘロイン）によって線維症が引き起こされ得ることが知られている。特定の実施形態において、本発明の方法及び組成物は、アンホテリシンＢ、ブレオマイシン、ブロモクリプチン、ブスルファン、カルバマゼピン、クロラムブシル、コカイン、シクロホスファミド、ジフェニルヒダントイン、エルゴタミン、フレカイニド、ヘロイン、メルファラン、メタドン、メトトレキサート、メチルフェニデート、メチルセルジド、鉱油、ニトロフラントイン、ニトロソウレア、プロカルバジン、シリコーン、スルファサラジン、トカイニド、及びビンカアルカロイド類の薬（マイトマイシン及び抗菌剤を含む）によって引き起こされる線維症の治療に有用である。報告されているところによれば、ニトロソウレア（例えばカルムスチン、ロムスチン、及びセムスチン、特にカルムスチン）を使用すると、カルムスチンを投与される患者の最高で２５％が、早発型の（カルムスチン療法の開始から３６ヶ月以内に）肺線維症を発症する。
【００４３】
用語「対象」及び「患者」は、ここに記載する医薬による方法、組成物及び治療を必要とし得る任意の哺乳動物又は非哺乳動物種の単数又は複数のメンバーを意味する。従って、対象及び患者には、霊長類（ヒトを含む）、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ブタ（例えば豚））、鳥、等の対象が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒト及び商業上重要なヒト以外の動物（例えば家畜及び家畜化された動物）は特に重要である。「哺乳動物」は、任意の哺乳動物種に属する単数又は複数のメンバーを意味し、その具体例には、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、齧歯動物、霊長動物（特にヒト）などが含まれる。ヒト以外の動物モデル、特に哺乳動物（例えば霊長動物、ネズミ、ウサギなど）は、実験的研究に用いることができる。
【００４４】
ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９の活性、発現、又は量を抑制する１種以上の薬剤を含む組成物を、特に、好ましくない部位、線維形成性障害、特に慢性の炎症性症状の線維形成を抑制するため使用することができる。そのような組成物は、線維症の病変部位に局所的に塗布してもよいし、あるいは、全身投与してもよい。さらに、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９の活性／作用の減少、阻害、抑制、又は排除を目的とする組成物は、単独で投与してもよいし、線維形成性障害の治療に有用となり得るその他の薬剤と併用してもよい。そのような他の組成物には、例えば、コルチコステロイド、及びその他の抗炎症剤が含まれ得る。プレドニソン、アザチオプリン、及びＩＦＮガンマによるサイトカイン療法もまた、有益となり得る。これらの組成物と抗ＣＣＬ２１／抗ＣＣＬ１９組成物の組合せは特に意図するところである。免疫抑制剤と１種のコルチコステロイドを使用すれば肺線維症の治療に十分であることが以前言われてきたが、現在認められているところによれば、コルチコステロイドを併用した免疫抑制剤療法は、該疾患の治療に有効ではない。というのも、そのような介入は、該疾患の進行を改めるのに有効ではなく、生存率の上昇をもたらさないからである。肺線維症とともにある対象の予後において、外科的介入がなければ、該疾患は命にかかわるものとなる。そのため、そのような患者に開かれた唯一の選択肢は、肺移植である。従って、第一の発明の組成物及び方法は、現在可能な治療に顕著な進歩をもたらす。というのも、それらは、該疾患の発症及び／又は進行を停止又は減少させる治療法を提供するからである。
【００４５】
特定の実施形態において、ＣＣＬ２１に対する抗体を含む組成物を、目的とする部位でのＣＣＬ２１濃度を下げるため、作用させることができる。ヒトにおいてＣＣＬ２１及びＣＣＬ１９を減少させるのに必要な用量は、おそらく低いマイクログラムの範囲にある。例えば、抗体を約５〜４０マイクログラム／ｋｇの投与量範囲で使用することができる。理想的には、それらの抗体は、５〜１０マイクログラム／ｋｇのより低い投与量範囲で有効である。
【００４６】
ＩＬ−１２、ラミニン−１、架橋ＩｇＧ、及びＩｇＧ凝集体は、単球の線維芽細胞への分化を抑制することが明らかにされている（米国特許出願第２００５０２３８６２０号）。そのような組成物は、ここで述べる組合せに有用となり得る。
【００４７】
治療方法において、組成物は、外部の供給源から目的とする部位に供給してもよいし、あるいは、目的とする部位の細胞により、又は目的とする部位であるその生物の細胞により、インビボで生産してもよい。それらの組成物は、提供されたヒトの組織（体液を含む）から分離してもよい。また、それらは、組み換えタンパク質として、細菌、組織培養細胞、若しくは、当該技術で知られる任意の他の種類の細胞又は組織において、又は動物そのものにおいて、生産してもよい。さらにそれらは、合成により生産してもよいし、あるいは、当該技術で知られる任意の他の手法により生産してもよい。これらの組成物がインビボで作られる場合、それらは導入遺伝子の発現産物であってもよいし、既存のインビボ供給源において生産を高めた結果もたらされるものでもよい。また、これらの組成物の濃度は、該組成物が目的とする部位に標準的に存在する場合、それらの通常の分解速度を下げることにより、上昇させることができる。さらに、該組成物の線維細胞分化抑制能を、例えば補助因子（コファクター）を供給することによって、高めることも可能な場合がある。
【００４８】
本発明の方法は、線維形成性障害の一例としてＩＩＰにより実証されているが、明らかなとおり、この疾患は、他の線維形成性障害の範例として用いられる。本開示によれば、当業者に明らかなとおり、線維症を抑制することが必要な任意の他の疾患を治療することができる。かくして、本発明の方法は、強皮症、ケロイド瘢痕、関節リウマチ、狼瘡、腎性線維形成性皮膚障害、例えば日本住血吸虫感染の後に形成されるような線維性病変、自己免疫疾患、病原性線維形成、ライム病、膵炎及び間質線維症における間質の再構築、喘息、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、子宮類線維腫、卵巣線維症、その他の線維性嚢胞形成、角膜線維症若しくは他の眼の線維症（例えば、角膜屈折手術に起因するもの）、及びうっ血性心不全や他の虚血後の症状に起因する線維症、外科手術後の瘢痕形成（腹部の癒着、広角度緑内障線維柱帯切開術を含む）を含むがこれらに限定されない症状に起因する線維症の治療を目的とする。そのような線維形成性障害のあるものにおいて、線維細胞は、末期の線維症をもたらすものでなくともよい。例えば、喘息では、線維細胞はさらに筋線維芽細胞に分化し、それは厚い気道壁で存続する。明らかなとおり、治療による線維形成性障害の症状の何らかの改善は、有益な効果であり、治療の証拠とみなすべきである。従って、症状又は疾患の「治療」又は症状又は疾患を「治療する」が意味するところには、（１）該症状の少なくとも１種の徴候を防ぐこと（すなわち、該疾患にさらされるか又はかかる可能性がある一方で該疾患の症状をまだこうむっていない又は示していない哺乳動物において、臨床上の徴候を顕著に生じさせないようにすること）、（２）該疾患を阻害すること（すなわち、該疾患又はその症状の発現を阻止又は低減すること）、又は（３）該疾患を緩和すること（すなわち、該疾患又はその臨床上の徴候を退行させること）が含まれる。ここで、症状を治療、予防及び改善することには、例えば、線維形成性障害に伴う不利な又は有害な症状を低減又は排除することが含まれ得る。そのような治療の具体例には、細菌感染を低減すること、肺機能を高めること、炎症前サイトカイン類のダウンレギュレーション、及び単核細胞蓄積のアップレギュレーションがある。
【００４９】
特定の実施形態において、肺線維症又は他の肺線維形成性障害は、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９の作用を阻害又は低減する薬剤を投与することにより治療することができる。治療は、線維症に伴う細胞の成長、さらにはコラーゲンの沈着を減少させることができる。治療は、さらなる線維症を防ぐことができ、あるいは、存在する線維症の作用を低下させることができる。薬剤は、患者における疾患の少なくとも１種の症状を減少させることができる任意の投与量及び投与処方で投与することができる。投与は、静脈内に行ってもよいし、１日置きに選択された期間行ってもよい。この用量、投与法、及び投与スケジュールは、他の線維形成性障害を治療するのにも有用であり得る。用量、処方、及び投与形態は、該疾患の動物モデルを用いて最適化することができる。
【００５０】
肺線維症の具体的なモデルは、下記の実施例に示される。しかし、この線維形成性障害の当業者に知られた他のモデルが存在する。例えば、米国特許出願第２００５０２３８６２０号では、ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、外科的に移植された頚静脈カテーテルを含む、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）においてその肺にブレオマイシンを注射することにより肺線維症を誘発させた。ブレオマイシンは、抗腫瘍剤であり、気道に注入すると、動物の肺に線維症を引き起こすものである。これは、肺の線維症を研究する標準的な方法である（Ｃｒｏｕｃｈ，Ｅ．１９９０、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５９：Ｌ１５９−Ｌ１８４）。そのような方法において、線維症を誘発させるため、ラットは、麻酔され、麻痺した適当な外科手術面がもたらされ維持されるのを確実にするためモニターされる。首の腹部側を切開するため、毛をそりその領域を消毒することにより、準備する。垂直正中切開を首の腹部側で行い、首の筋肉を引っ込め、気管を露出させる。０．９％滅菌生理食塩水中ブレオマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）３．３Ｕ／ｍＬの溶液（１単位）３００マイクロリットルを、注射器及び２６ゲージ針を用いて気管腔に注入した。対照ラットには生理食塩水を注射した。切り口を２〜３の縫合により閉じる。この手順は、Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ他による刊行物（２０００．ＳＢ  ２３９０６３、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤は、好中球増加症、炎症性サイトカイン、ＭＭＰ−９、及び線維症を肺において減少させる。Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７９：Ｌ８９５−Ｌ９０２）に従っている。この手順の間、そして手術後、動物を加熱ランプの下で保持し、その後、一旦十分に回復したら、そのケージに戻した。この過程の間、動物は、ｉ）規則的に呼吸していること、ｉｉ）ピンク色の耳及び粘膜を有すること、ｉｉｉ）その足指をつまんだときその足を引っ込めないこと、そしてｉｖ）眼又は眼瞼に触れたときまばたきしないことを確かめられた。
【００５１】
抗ＣＣＬ２１組成物に対する効果を調べるため、線維症のモデルに抗ＣＣＬ２１組成物を、供給元によって移植された頚静脈カテーテルを介して静脈内に注入した。組成物は、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中に調製することが好ましい場合があり、また、投与の前に０．２ミクロンフィルターに通すことが好ましい場合がある。
【００５２】
本発明の方法に使用する特に好ましい抗ＣＣＬ２１組成物は、ＣＣＬ２１に対して免疫反応性である抗体である。そのような抗体は、ＣＣＬ２１及びその変異体に対してのみ免疫反応性であり、その他のケモカインに対しては免疫反応性でないモノクローナル抗体が好ましい。抗ＣＣＬ２１抗体は、ヒトの対象に投与するよう調製したヒト化抗体であることが好ましい。研究目的の抗ＣＣＬ２１抗体は、当業者によく知られている。例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）は、調製物ＢＡＦ４５７を市販している。これは、マウスの組換え抗ＣＣ２１抗体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で生成させたものであり、本発明において使用することができる。ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ロッキーヒル、ニュージャージー州）も抗ＣＣＬ２１モノクローナル抗体を有している。Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、英国、及びケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）は、ＣＣＬ２１に免疫反応性であるポリクローナル抗体（例えば、ＣＣＬ２１に対するヤギポリクローナル製品ａｂ１０３５０及びａｂ１０３６４）。これらは、モデル動物においてＣＣＬ２１の作用を阻害することにより線維症が改善することを示す試験の再現のため、容易に使用することができる。
【００５３】
ＣＣＬ２１に対するネズミ及びヤギのモノクローナル抗体は当該技術において容易に入手することができる。従って意図するところによれば、そのような抗体は、ヒトの治療に使用するヒト型抗体を生成させるための「テンプレート（鋳型）」として容易に用いることができる。意図するところによれば、例えば、本発明の治療法に使用が可能な抗体の完全長又は断片を作り出すため、ファージディスプレイを使用してもよい。他の実施形態において、完全長のヒト化したマウス又はヤギのＨ鎖（重鎖）免疫グロブリン又はＬ鎖（軽鎖）免疫グロブリンを生成させることが可能な場合があり、それは、ヒトの定常領域、マウス又はヤギのＣＤＲ、及び実質的にマウス又はヤギのフレームワークを含むものである。該フレームワークは、「ヒト化」のため相当数のアミノ酸を改変しており、そのような抗体をヒトの対象に投与できるよう有害な反応の可能性を減らしている。多くの実施形態において、「ヒト化抗体」は、ヒト化した可変Ｌ鎖及び／又はヒト化した可変Ｈ鎖を含む抗体である。「ヒト化」のプロセスにより「ヒト化」された改変抗体は、ＣＤＲを与える元の抗体と同じ抗原に結合する一方、元の抗体に比べ通常ヒトにおいて免疫原性が低いものである。当然のことながら、ＣＣＬ２１に対する抗体についての上記説明は、ＣＣＬ１９についてもあてはまり、ＣＣＬ１９に対する抗体も当該技術において入手可能である。
【００５４】
明らかなとおり、ここで使用する抗体は、Ｆｃ領域を含んでもよいし、Ｆｃ領域を含まなくともよい。ある実施形態では、多価抗体を治療用組成物として使用することができる。「多価抗体」は、１つより多いエピトープに対して結合領域を有する組換え抗体様分子を意味している。例えば、ＣＣＬ２１とＣＣＬ１９の両方に結合する多価抗体は、線維症の治療に特に有用であると考えることができる。他の治療用組成物において、抗体に由来するタンパク質は、抗体のＦａｂ鎖が結合領域に融合した分子を含むものである（例えば、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ二重体（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）又は三重体（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ））。これらの分子は、Ｆｃ部分を含まない有用な中間重量の組換え二重特異性抗体である。Ｆｃ領域が欠如した抗体を作ることは有益である。というのも、抗体関連治療用分子にそのような領域が存在すると、肝臓での代謝からそれを守ることによって該分子の血清残留時間が長くなる傾向にあり、また、そのＦｃ受容体との相互作用によって他の細胞を架橋する可能性があり、それにより、免疫エフェクター細胞の組織的誘発のため、毒性の副作用が生じ得るからである。従って、特定の抗体関連治療用分子はＦｃ領域を欠くものである。これらの抗体関連分子を設計する方法は、当業者に知られていることである。例えば、組換え抗体は、多重特異性抗体を効率よく作るため、抗体由来の構成要素（例えばＦｃ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ））とヘテロ二量体化モチーフとの組合せから生成させることができる。
【００５５】
抗体のほかに、意図するところによれば、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９に対して設計されたｓｉＲＮＡ分子も、有用な線維形成性障害の治療用組成物となる。当業者によく知られていることであるが、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスにより多くの生物において配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる。最近の研究によれば、ＲＮＡ断片がＲＮＡｉの配列特異的媒介因子となっている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４，２００１）。これらの小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による遺伝子発現の干渉は、現在、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエ、植物、及びマウスの胚幹細胞、母卵細胞、及び初期胚において遺伝子をサイレンシングするため自然界で生じる戦略として認識されている（Ｃｏｇｏｎｉら、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，６５，２０５，１９９４、Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２，７９，１９９６、Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ，Ｃｅｌｌ，９５，１０１７  １９９８、Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３９５，８５４，１９９８、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１３９５９，１９９８、Ｗｉａｎｎｙ及びＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０，２０００、Ｙａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２１，７８０７，２００１、Ｓｖｏｂｏｄａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７，４１４７  ２０００）。哺乳動物の細胞培養において、ｓｉＲＮＡで媒介される遺伝子発現の低減が、合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることによりなされている（Ｃａｐｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８，９７４２，２００１、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４，２００１）。
【００５６】
典型的に、治療用ｓｉＲＮＡの細胞内発現をもたらすため、ＲＮＡ分子が構築され、該ＲＮＡ分子は、対象とする遺伝子（この場合、ＣＣＬ２１遺伝子、及び／又はＣＣＬ１９遺伝子）に対向する配列となるヘアピン配列（例えば２１塩基ヘアピン）を含むものである。このｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、標的細胞（例えば、線維性病変の部位でＣＣＬ２１を生産している細胞）に導入する。ｓｉＲＮＡは、目標とするｍＲＮＡを減少させ、そして該因子の遺伝子によるタンパク質発現を減少させる。組織特異的プロモーターを用いれば、治療用ｓｉＲＮＡ分子の有益な組織特異的ターゲッティングを行うことができる。治療用ｓｉＲＮＡをコードする構築物は、プロモーターとヘアピンが隣接するように構成される。特定の構築物に使用されるプロモーターは、ｓｉＲＮＡの誘導可能な組織特異的又は細胞特異的発現が必要かどうかに応じて、当該技術で知られた容易に入手し得るプロモーターから選択される。構築物は、例えば注射により、標的細胞に導入され、該細胞において標的遺伝子の発現を減少させることができる。
【００５７】
かくして、具体的な実施形態において、本発明は、発現カセットを含むベクター（すなわち組換え遺伝子の発現及び／又は配達に通常使用されるウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポリオウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、又はネズミマロニー系ウイルスのベクターなど）を提供し、ここで、該発現カセットは、ＣＣＬ２１を標的とする小さな干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）をコードする分離された核酸配列を含むものである。ＣＣＬ２１の核酸構造は当業者によく知られており、ＣＣＬ１９の構造も同様である。例えば以下を参照されたい。Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００２４０９（これはヒトＣＣＬ２１のｍＲＮＡ配列を記載する）、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ  ００６２７４（これはヒトＣＣＬ２１のｍＲＮＡ配列を記載する）、アカゲザルからのＣＣＬ２１についてＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ  ００１０３２８５５、ブタ、マウス、及びイヌについての配列も本出願の時点でＧｅｎｂａｎｋにおいて利用することができる。これらの配列はすべて調製することが可能であり、そして、ＣＣＬ２１の機能的発現に重要であることが明らかになった分子の領域に対してｓｉＲＮＡを設計することができる（なお、開示される関連タンパク質配列を利用してその組換え抗体を調製してもよいし、それに対する抗体を生成させてもよい）。ｓｉＲＮＡは、そのような核酸配列に沿った任意の１０〜３０の連続する核酸の範囲を標的にすることができ、該ケモカインの機能的発現にとって重要な配列が特に有用である。ｓｉＲＮＡは、２本鎖構造及びループ構造を有するヘアピン構造を形成してもよい。ループ構造は、４〜１０の（例えば４、５、６つの）ヌクレオチドを含むことができる。２本鎖は、３０ヌクレオチド長未満であることが好ましく、例えば１９〜２５ヌクレオチドであることが好ましい。ｓｉＲＮＡは、オーバーハング領域（突出領域）をさらに含んでもよい。そのようなオーバーハングは、３’オーバーハング領域でもよく、５’オーバーハング領域でもよく、３’と５’の両方のオーバーハング領域でもよい。オーバーハング領域は、例えば１〜６ヌクレオチド長とすることができる。発現カセットはプロモーターをさらに含んでもよい。プロモーターには、例えば、調節可能プロモーター及び構成的プロモーターがある。例えば、プロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ、又はｐｏｌＩＩＩのプロモーターとすることができる。発現カセットは、ポリアデニル化シグナル（例えば合成による最小限のポリアデニル化シグナル）をさらに含んでもよい。その核酸配列は、マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【００５８】
もちろん、ＣＣＬ２１及び／又はＣＣＬ１９に対する組成物のほかに、組成物はＣＣＲ７（そのようなケモカインの受容体）に対するものであってもよい。さらに意図されるものは、特に併用療法であり、そこにおいて、ＣＣＬ２１の作用／活性を減少させることを目的とする治療法は、該受容体の作用／活性を減少させることを目的とする治療法と併用される。特に意図される他の特異的併用療法は、線維形成性障害においてＣＣＬ２１の活性を減少させることに基づく治療法が、線維症の既存の治療と併用されるものである。例えば、現在、シクロホスファミドは、単独で、又はミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）若しくはプレドニゾロン、又は他のコルチコステロイドとの組み合わせで、肺線維症を改善するのに有効であることが分かっている。また臨床プログラムにより、特発性で強皮症に関連する形態の肺線維症において、ボセンタン（Ｔｒａｃｌｅｅｒ（登録商標））の安全性及び効力とともに有望な結果が示されている。またアザチオプリンも、線維症性障害において、肺の機能を安定化し、症状を改善するのにある役割を果たし得る。サイトカイン（ＩＦＮ−γ）療法も、線維形成性障害の治療に有用な療法となり得る。線維症の症状を低減する、除去する、又は排除するため、任意のそのような組成物を、抗ＣＣＬ２１系療法及び／又は抗ＣＣＬ１９系療法と組み合わせて使用することができる（なお、「抗ＣＣＬ２１系」又は「抗ＣＣＬ１９系」療法は、抗体療法を意味するとともに、ｓｉＲＮＡ分子を使用する療法も意味する）。
【００５９】
抗体が動物で特定の抗原に対して生成されたものであろうと、あるいは、抗体がファージディスプレイ及び抗体工学の手法を介して調製されたキメラの抗体であろうと、そのような抗体は、最終的に線維形成性障害を治療するための医薬製剤に調製される。同様に、ｓｉＲＮＡ組成物も、最終的に該疾患を治療するための組成物に調製される。組成物の局所的配達が好ましいが、意図するところでは、その全身的デリバリーも可能である。
【００６０】
本発明による投与のための医薬組成物は、上述した抗ＣＣＬ２１系組成物及び／又は抗ＣＣＬ１９系組成物のいずれかを含むことができる。特に、気道反応性の徴候が存在することを患者が示す場合、医薬組成物は、粘液溶解剤（例えばアセチルシステイン、トリプシン、及びアンブロキソール）、並びに／又はＧＭ−ＣＳＦ、コルチコステロイド類及び他の抗炎症剤とともに、界面活性剤代謝の障害を治療するため使用される別の薬剤（例えば気管支拡張薬）をさらに含む。ある態様において、これらの調製物のそれぞれは、必要に応じて製薬上許容される担体と組み合わされ、製薬上許容される剤形で提供される。これらの組成物は、その意図された目的を達する任意の方法によって投与される。本発明の方法を用いて線維症の病変でＣＣＬ２１又はＣＣＬ１９の作用を阻害、排除等するための組成物の投与に関し、それぞれの用量及び用法は、疾患の診断のため、そして、所定の治療介入がもたらす効果のレベルを調べるため用いられるアッセイを使用して、当業者により容易に決定される。
【００６１】
ＩＩＰの治療において、肺疾患の治療にすでに用いられてきた投与のプロトコル、方式、経路等は、本発明での使用のため容易に改変することができる。ある場合において、呼吸が特に極端に短い場合、機械換気が適切になり得る。そのような機械換気には、高周波振動換気（ＨＦＯＶ）あるいは機械換気の他の従来とは異なる形態が含まれ得る。
【００６２】
本発明の技術的範囲内にある組成物には、線維症性疾患の病変部位における線維芽細胞の量を減少又は低下させることなど、ＣＣＬ２１の活性を低減する、阻害する、抑制する、又は弱めるというその所定の目的を達成するのに有効な量で、ＣＣＬ２１の作用又は活性を減少させる少なくとも１種の薬剤を含む組成物すべてが包含される。ある態様において、そのような治療は、結果的にＩＩＰの１種以上の症状を緩和する。
【００６３】
他の態様において、本発明に使用する組成物は、吸入器を用いて投与されるか又は経口投与される。
【００６４】
当然のことながら、本発明による組成物の適当な用量は、受容者の年齢、健康状態、及び体重、並存する治療の種類、場合に応じて、治療の頻度、並びに必要な作用の性質によって変わってくるが、そのような投薬量は、必要以上の実験を行わなくとも、当業者にとって明らかであり決定可能であるように、個々の対象に応じて調整することができる。このことは、典型的に、標準的な用量を調節すること、例えば、患者の体重が軽い場合、用量を減らすことを含む。
【００６５】
治療剤の総用量は、複数の用量又は１つの用量で投与される。特定の実施形態では、組成物は単独で投与され、他の実施形態では、組成物は、疾患に対する他の治療薬と組み合せて投与されるか又は該疾患の他の症状に対する他の治療薬と組み合せて投与される。
【００６６】
ある態様において、本発明の組成物は、適当な医薬組成物、すなわち、線維形成性障害の治療介入においてインビボでの適用に適した剤形に調製される。通常、このことは、発熱物質やヒト又は動物に有害となり得るその他の不純物を実質的に含まない組成物を調製することを必要とする。ある態様において、組成物は、肺に直接投与するため調製される。そのような調製物は、吸入器を介する経口投与のためのものであるが、他の投与経路も意図するところである（例えば、注射など）。ＣＣＬ２１がＩＩＰの線維芽細胞で強く発現される一方、正常な線維芽細胞や他の組織では発現されないという知見から導かれる結論は、このケモカインの主な部位は線維性病変の形成と密接に関係しているということであるが、このことは、特にＩＩＰに当てはまるようである。従って、肺の組織に組成物が容易に投与されるのを助長する調製物及び投与経路は特に有用であると考えられる。
【００６７】
組成物を安定化し目的の部位での組成物の取り込みを可能にする適当な塩及び緩衝剤を使用することが通常望ましい。一般的に、本発明のタンパク質組成物は、凍結乾燥された形態で提供され、投与の前に戻される。一方、組成物は、錠剤又は他の経口デリバリーの剤形に調製できる可能性がある。治療剤を再構成するための緩衝液及び溶液は、投与のための本発明の水性組成物を生成させるため、医薬製剤とともに提供することができる。そのような水性組成物は、製薬上許容される担体又は水性媒質において使用、溶解、又は分散される各薬剤の有効量を含むものである。そのような組成物は、接種物とも呼ばれる。「製薬上許容される」又は「薬理学上許容される」の用語は、動物又はヒトに投与したとき、有害な、アレルギー性の、あるいはその他の不都合な反応を生じない分子や組成物を指している。ここで使用する用語「製薬上許容される担体」には、任意のあらゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。そのような媒質や薬剤を医薬として有効な物質のために使用することは、当該技術においてよく知られている。通常の媒質又は薬剤で治療用組成物に適合しないものを除いて、それを治療用組成物に使用することも意図するところである。補助的な有効成分も組成物に組み込まれる。
【００６８】
タンパク質及び核酸を治療のための投与に処方する方法は、当業者の知るところである。本発明のよる組成物の投与は、そのような経路を介して目的とする組織に投与できるかぎり、任意の一般的な経路を介する。そのような組成物は、例えば吸入器による経口投与のため調製されるのが最も一般的である。しかし、その他の通常使用される投与経路、例えば、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、眼内、眼球後、肺内（例えば徐放）、エーロゾル、舌下、鼻、肛門、膣、若しくは経皮のデリバリー、又は特定部位での外科移植によるものが、特に経口投与に支障がある場合、使用される。治療は、１回の投与で構成されてもよいし、ある期間にわたる複数回の投与で構成されてもよい。
【００６９】
特定の実施形態において、有効な化合物は、投与のため、遊離塩基の溶液として調製され、あるいは、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース）が適当に混合された水中で薬理学的に許容される塩として調製される。また分散物も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中に調製される。通常の貯蔵及び使用の条件下で、微生物の増殖を防ぐため、これらの調製物は保存剤を含む。
【００７０】
注射可能な使用に適する医薬の剤形には、滅菌した水溶液又は分散液、及び、注射可能な滅菌溶液又は分散液を即席で調製するための滅菌粉末がある。すべての場合、剤形は、滅菌したものである必要があり、さらに、容易に注射できる程度に流動性である必要がある。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定である必要があり、さらに、微生物（例えば細菌及び真菌）の汚染作用が食い止められている必要がある。ある態様において、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒質である。その適当な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチン）を使用することにより、分散物の場合、その必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより、維持される。微生物作用の妨害は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらされる。多くの場合、等張剤（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を組成物に使用することによりもたらされる。
【００７１】
滅菌溶液注射剤は、有効化合物を必要な量で適当な溶媒に（必要に応じて上で列挙した種々の他の成分とともに）加え、その後ろ過滅菌することにより調製される。一般的に、分散物は、滅菌した種々の有効成分を滅菌した賦形剤（これは基本的な分散媒質及び上で列挙したものの中で必要な他の成分を含む）に加えることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製法は、真空乾燥法及び凍結乾燥法であり、これらの方法は、有効成分と任意のさらに必要な成分の粉末を、それらの前もって滅菌ろ過した溶液から生成させる。
【００７２】
ここで使用する用語「製薬上許容される担体」には、任意のあらゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。そのような媒質や薬剤を医薬として有効な物質のために使用することは、当該技術においてよく知られている。通常の媒質又は薬剤で有効成分に適合しないものを除いて、それを治療用組成物に使用することも意図するところである。補助的な有効成分も組成物に組み込まれる。
【００７３】
ある態様において、本発明の組成物は、中性又は塩の剤形に調製される。製薬上許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基により形成される）があり、これは、無機酸（例えば塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）により形成される。また、遊離のカルボキシル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導される。
【００７４】
調製と同時に、溶液は、投与剤形に適合する方法及び治療上有効な量で投与される。製剤は、種々の投与形態（例えば、溶液注射剤、薬剤放出カプセルなど）で容易に投与される。水溶液による非経口投与のため、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝され、そして液体の希釈剤はまず十分な生理食塩水又はグルコースで等浸透圧（等張性）とされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内への投与に特に適している。
【００７５】
「単位用量」は、適当な担体中に分散された個別量の治療用組成物として定義される。特定の実施形態において、治療用化合物の非経口投与を、最初にボーラスを用いて行い、その後、持続性点滴を行って薬剤の治療循環レベルを維持する。良好な医療行為と個々の患者の臨床状態によって決まってくるように、有効な投薬量及び投与法は、当業者によって容易に最適化される。
【００７６】
投与頻度は、薬剤の薬物動力学的パラメーターと投与経路によって変わってくる。当業者は、投与経路と必要な投与量に応じて最適な医薬剤形を決定する。そのような剤形は、投与される薬剤の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでの排除速度に影響し得る。投与経路に応じて、適当な用量が、体重、体表面積、又は臓器の大きさに従って計算される。動物モデルが利用可能であることは、所定の治療薬の適切な投与量を決定するのに特に便利である。適当な治療用量を決定するのに必要な計算のさらなる改善は、過度の実験を行うことなく、特に、ここに開示する投薬量の情報及びアッセイ、さらには動物又はヒトの臨床試験で得られる薬物動力学データを考慮して、常法に従い当業者により行われる。
【００７７】
典型的に、適当な投薬量は、血中濃度を測定する確立したアッセイを、関連する用量反応データとともに用いることにより、確認される。最終的な用量・用法は、医師の立会いのもと、薬剤の作用に影響がある因子（例えば、薬剤の特異的活性、障害の重さ及び患者の反応性、患者の年齢、症状、体重、性別、及び食習慣、なんらかの感染の度合い）、投与の時間、及びその他の臨床因子を考慮して決定される。研究を行えば、特定の疾患及び症状に対する適当な投薬レベル及び治療期間についてさらに情報が得られる。そのような投薬量は、ここに記載する齧歯動物モデルのような疾患のモデルを用いることによって、容易に最適化することができる。
【００７８】
明らかなとおり、本発明の医薬組成物及び治療方法は、ヒトの医学及び獣医学の分野において役立つものである。従って、哺乳動物、例えばヒト又はそれ以外の哺乳動物が治療される対象となる。獣医学の目的において、対象には、例えば、家畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヤギを含む）、愛玩動物（例えば、イヌ及びネコ）、外来種の及び／又は動物園の動物、実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、及びハムスター）、並びに家禽（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、及びガチョウ）が含まれる。
【００７９】
また本発明は、線維形成性障害治療用のキットを意図する。そのようなキットは、上述した抗ＣＣＬ２１系治療薬及び／又は抗ＣＣＬ１９系治療薬を製薬上許容される担体中に含む第１の組成物を少なくとも備える。もう１つの成分は、該疾患を治療するための第２の治療薬であり、これは、治療用組成物を投与するための適当な容器及び賦形剤とともにある。該キットは、該第１及び第２の組成物のデリバリーを実行するための溶液又は緩衝剤をさらに備えてもよい。また該キットは、本発明の方法において使用する１種以上の組成物を送達するためのカテーテル、注射器、又はその他の送達用具をさらに備えてもよい。また該キットは、該治療法のための投与プロトコルを含む説明書をさらに備えてもよい。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を明らかにするために記載されている。当業者に明らかなとおり、以下の実施例で開示される手法は、本発明によって見出された手法であって本発明を実施する際にうまく機能するものに相当する。従って、それらは、本発明の実施のための特定の態様を構成するものと考えられる。しかしながら、本開示を考慮した上で、ここに開示される特定の実施形態に様々な変更を加えても、本発明の思想及び技術的範囲を逸脱することなく同様の結果が得られることは、当業者に明らかなことである。
【００８１】
実施例１：間質性特発性肺炎におけるＣＣＲ７の役割を明らかにするため使用された方法及び材料
臨床的所見、生理学的所見、放射線写真撮影による所見、及び病理学的所見を総合して、ＩＩＰの疑いがある患者を決定した（Ｆｌａｈｅｒｔｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１１０：２７８−２８２（２００１）、Ｆｌａｈｅｒｔｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．，６：４０４−４１０（２０００）、Ｋａｚｅｒｏｏｎｉら、ＡＪＲ  Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．，１６９：９７７−９８３（１９９７）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＡＴＳ／ＥＲＳ）、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６５：２７７−３０４（２００２）。本研究に登録されたどの患者も、以前に生検外科手術を受けたことがなく、また、ＩＩＰの治療を受けたことがなかった。ＳＬＢは、２０００年５月〜２００４年８月の間に、線維性肺疾患の病理生物学における評価の一部として、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで行われた。疾患の病理学的形跡がない組織学的に正常な肺の生検試料は、肺癌に対して胸部切除術を受けている患者の切除標本の遠位縁から得た。各ＳＬＢは別々に、層流フード内において無菌の手法により処理され、分子分析、タンパク質分析、及び免疫組織化学分析のため処理された（下記を参照）。
【００８２】
ＳＬＢからのＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製。分子分析に使用される各ＳＬＢの部分を、液体窒素中で急速冷凍し、２８０℃で保存した。ＲＮＡの分離のため、それらの試料を氷上で解凍し、ＴＲＩｚｏｌＨ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバッド、カリフォルニア州）中で機械的にホモジナイズした。そして全ＲＮＡを製造者の説明書に従って調製した。次いでＳＬＢからの精製ＲＮＡを、ＢＲＬ逆転写キット及びオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。増幅緩衝液は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、及び２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むものであった。
【００８３】
遺伝子アレイ分析。Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ  Ｉｎｃ（ベセスダ、メリーランド州、米国）から入手したＮｏｎ−Ｒａｄ  ＧＥＡｒｒａｙ遺伝子アレイ部材を使用して、前述したように、ヒトのケモカイン及びケモカイン受容体に関する遺伝子プロファイルの変化を解析した（Ｃｈｏｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１７０：５０８−５１５（２００４））。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を陽性の内部対照として用いた。というのも、それは、本研究において解析されるすべてのＳｕｐｅｒＡｒｒａｙにおいて一貫して発現されたからである。
【００８４】
リアルタイムタックマンＰＣＲ解析。ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢにおけるヒトのＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ２１の遺伝子発現を、上述したように、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いたリアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により解析した（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６２：１４７５−１４８６（２００３））。上葉及び下葉のＳＬＢからのｃＤＮＡを、ケモカイン受容体、ケモカイン、及びＧＡＰＤＨ（内部対照）の発現について解析した。使用したすべてのプライマー及びプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したものであった。ケモカイン遺伝子発現をＧＡＰＤＨに対して正規化した後、ケモカイン発現の変化の倍数を算出した。サイトカイン遺伝子発現の増加倍数は、すべての患者における遺伝子発現を、正常縁腫瘍患者群の上葉又は下葉で検出される遺伝子発現と比較することにより、算出した。
【００８５】
ＥＬＩＳＡ分析。ヒトのＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ１２の濃度を、ホモジナイズしたＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢから得られた５０ｍＬの無細胞上清試料中、標準サンドイッチ酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）法（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）により測定した。組換えヒトサイトカインを使用して標準曲線を作成し、そこから、試料中に存在する濃度を求めた。ＣＣＬ１９についての検出限界、免疫組織化学で通常行われている免疫組織化学の手法を用いて、上述したように、ＳＬＢ中のＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びａＳＭＡを検出した（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，５７：４７７−４８６（２００４））。以下のターゲット抗原及びそれらの適切なアイソタイプの対照を使用した。マウスの抗ヒトＣＣＲ７抗体及びマウスＩｇＭｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国））から購入）、マウスの抗ヒトＣＸＣＲ４及びマウスのＩｇＧ２Ｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）、マウスの抗ヒトＣＤ４５、ＣＤ３４、及びコラーゲン１抗体（Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）から購入）、及びマウスＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）。ＵＩＰである１０人の患者、ＮＳＩＰである６人の患者、及びＲＢＩＬＤである５人の患者からの上葉及び下葉のＳＬＢを、これらの免疫組織化学的手法を用いて分析した。切除された腫瘍からの正常縁は、５人の患者のものを分析した。各ＳＬＢからの連続切片（厚さ５ｍｍ）を分析し、直に隣接する連続切片について、ＣＣＲ７と他の抗原の位置を同時に測定した。
【００８６】
実施例２：間質性特発性肺炎におけるＣＣＲ７の役割を示す結果
ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢにおけるＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ１２のＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ分析。ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢにおけるＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４の存在を、特定のＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  ＧＥＡｒｒａｙを用いて調べた。これは定性的であり、定量的な手法でなかったが、ＣＣＲ７（図１Ａ）及びＣＸＣＲ４（図１Ｂ）の発現をＧＡＰＤＨの発現に対して正規化し、その値を両受容体について示している。ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４の最も高い相対的発現は、ＵＩＰ患者群（ｎ＝７）からの上葉及び下葉の生検試料において見られた。ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）腫瘍患者群からの下葉及び上葉の生検試料も同様に分析した。有意差は認められなかったが、全体的にみて、両ケモカイン受容体の相対的発現は、ＵＩＰ、ＮＳＩＰ、ＲＢＩＬＤ、正常縁のように、病気の重篤さの順番に従っているようであった。これまでに特定されている２つのＣＣＲ７のリガンドは、ＣＣＬ１９（Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１３８０３−１３８０９（１９９７））とＣＣＬ２１（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４１：１０５３−１０５９（１９９８））である。ＣＣＬ１９（すなわちＥＬＣ、エキソダス（ｅｘｏｄｕｓ）−３、及びＣＫｂ−１１３４）は、リンパ節のＴ細胞領域及び輸入リンパ上皮において構成的に発現されるため、その主な役割は、樹状細胞及びＴ細胞をそれらの免疫部位に遊走させることにあると考えられている（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：１６１７−１６２５（１９９９））。同時に行われた研究は、ＣＣＬ２１（すなわちＳＬＣ、エキソダス−２、ＴＣＡ−４、及びＣＫｂ−９９）が類似の機能及び類似の発現パターンを有していることを明らかにした。３３。しかし、両ケモカインは、肺で検出され（Ｇｕｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：２５８−２６３（１９９８））、そして腎臓で検出された（Ｂａｎａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：４３０１−４３０７（２００２））。このことは、それらが免疫監視機構の外で役割をもっている可能性を示唆している。ＣＣＬ１９の相対的転写発現の分析により、ＵＩＰの上葉及び下葉の生検試料においてこのＣＣＲ７のリガンドの量がより高くなっていることが明らかになった（図２Ａ）。同様の量のＣＣＬ１９転写物が、ＮＳＩＰ及びＲＢＩＬＤの生検試料から検出され、最も低い量が正常縁の生検試料で見られた。しかし、明瞭なパターンのＣＣＬ２１（図２Ｂ）及びＣＸＣＬ１２（図２Ｃ）の転写物発現は、ＩＩＰ及び正常縁の生検試料の中で認められなかった。
【００８７】
ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢにおけるＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ１２転写物発現の定量的リアルタイムＰＣＲ解析。４つの患者群から得られた上葉及び下葉の生検試料のタックマンリアルタイムＰＣＲ解析の結果、正常縁腫瘍患者群（ｎ＝５）からの適当な生検試料（図３Ａ）と比較して、ＵＩＰ（ｎ＝１８）の患者から得られた上葉及び下葉の両方のＳＬＢでは、ＣＣＲ７転写物発現が顕著に増加していることが明らかとなった。ＣＣＲ７転写物の平均値は、正常縁の患者群から得られた適当な肺葉と比較して、上葉のＵＩＰのＳＬＢにおいて約１４６倍（ＳＥＭ、５８）、下葉のＵＩＰのＳＬＢにおいて約６７５倍（ＳＥＭ、３００）それぞれ高かった。上葉のＵＩＰ生検試料と比較すると、下葉のＵＩＰ生検試料では、約５倍高いＣＣＲ７転写物発現が検出された。正常縁ＳＬＢと比較すると、ＣＣＲ７転写物の平均値は、上葉及び下葉両方のＮＳＩＰのＳＬＢにおいて４倍（ＳＥＭ、１）増加した。ＣＣＲ７転写物の平均値は、正常縁ＳＬＢに対し、ＲＢＩＬＤのＳＬＢでも増加しており、上葉のＳＬＢで３６倍（ＳＥＭ、２８）、下葉の生検試料で４．４倍（ＳＥＭ、３．２）であった。ＮＳＩＰ及びＲＢＩＬＤのＳＬＢにおけるＣＣＲ７転写物発現の増加は、正常縁ＳＬＢに対して顕著ではなかった。
【００８８】
これらの知見はＣＣＲ７に特有のものであった。というのも、ＣＸＣＲ４のタックマンＰＣＲ解析では、正常縁ＳＬＢに対し、ＩＩＰのＳＬＢにおいてＣＸＣＲ４転写物発現の顕著な増加は認められなかったからである（データは示さず）。最終的に、試験したＩＩＰ及び正常縁の腫瘍患者群の間で、ＣＣＬ１９（データは示さず）、ＣＣＬ２１（図３Ｂ）、及びＣＸＣＬ１２（データは示さず）転写物発現の明瞭なパターン又は顕著な差は、識別又は検出されなかった。しかし、ＵＩＰ患者群から得られた上葉及び下葉の生検試料において、正常縁腫瘍患者群に対し、ＣＣＬ２１転写物発現の最も大きな増加が認められた（正常ＳＬＢの値より４０倍以上高い）。ＮＳＩＰのＳＬＢと比較すると、上葉及び下葉のＲＢＩＬＤのＳＬＢにおいて、より大きなＣＣＬ２１転写物発現の増加が見られた。総合すると、これらのデータは、ＵＩＰにおいてＣＣＲ７転写物発現が非常に増加することを示すとともに、ＣＣＲ７転写物発現の増加は、重症度が低い形態のＩＩＰにおいても見られることを示した。
【００８９】
ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢにおけるＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ１２タンパク質のＥＬＩＳＡ分析。図４は、ホモジナイズしたＳＬＢから得られる無細胞上清中のＣＣＬ１９タンパク質（図４Ａ）、ＣＣＬ２１タンパク質（図４Ｂ）、及びＣＸＣＬ１２タンパク質（図４Ｃ）の濃度を示している。ＣＣＬ発現の明瞭なパターンは示されず、分析した患者群の間で、有意差は認められなかった。従って、これらのデータは、ＩＩＰにおける線維症の事象と、肺内でＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４のリガンドの生成が増加することとは、関連性がないことを示唆するものであった。
【００９０】
ＩＩＰのＳＬＢにおける病巣の間質性ＣＣＲ７タンパク質発現。ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ及びリアルタイムＰＣＲ転写物解析は、ＣＣＲ７の発現が正常縁ＳＬＢよりもＩＩＰのＳＬＢにおいて非常に高いことを示していた。そこで、ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢから得られた肺切片の全体を免疫組織化学分析にかけてこれらの知見を確認することにした。図５に示すとおり、病巣の間質性ＣＣＲ７発現は、ＵＩＰ、ＮＳＩＰ、及びＲＢＩＬＤの患者群から得られたＳＬＢにおいて見られた。ＣＣＲ７の発現はＲＢＩＬＤの患者のマクロファージ中に見られたが（図５Ｆ）、ＣＣＲ７発現の病巣間質性パターンは、ＵＩＰの生検試料（図５Ｂ）及びＮＳＩＰの生検試料（図５Ｄ）における免疫細胞だけに関連性があるわけではなかった。病巣ＣＣＲ７タンパク質発現の複数の領域が、ＵＩＰ患者群（ｎ＝１０）から得られた上葉及び下葉のＳＬＢすべての間質性領域に存在した。なお、ＣＣＲ７発現の病巣は線維芽細胞のみからなるものでなく、他の細胞（単核細胞及び上皮細胞を含む）もまたこのケモカイン受容体を発現しているようであった。ＮＳＩＰ及びＲＢＩＬＤサブタイプはともに、より重症であるサブタイプＵＩＰよりも、ＣＣＲ７の発現が少なかった。これらの生検試料の５０％がＣＣＲ７染色を示したが、ＮＳＩＰ患者群（ｎ＝６）の上葉及び下葉ＳＬＢに見られるＣＣＲ７発現の病巣領域はずっと少なかった。ＣＣＲ７は、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝５）のＳＬＢの４分の３において血管及び単核細胞に限定されることが多かったが、ＣＣＲ７染色は、このＩＩＰ群から得られた生検試料の間質性領域においてまれにしか検出されなかった。ＵＩＰのＳＬＢで見られた顕著な染色に対し、正常縁の患者（ｎ＝５）から得られた上葉及び下葉のＳＬＢにおける免疫組織化学分析ではＣＣＲ７の発現は検出されなかった（図５Ｈ）。
【００９１】
ＣＣＲ７について分析した同じＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢにおいて、ＣＸＣＲ４染色は、免疫細胞に限定されているようであった。より重要なことに、このケモカイン受容体の発現は、病巣のものではなく、分析した４つの患者群の間で異なっていなかった。分析されたすべてのＩＩＰ及び正常縁の生検試料は、単核細胞に関連する強いＣＸＣＲ４発現を示した。このことは図６で強調して示されており、ＵＩＰ（図６Ｂ）、ＮＳＩＰ（図６Ｄ）、ＲＢＩＬＤ（図６Ｆ）、及び正常縁（図５Ｄ）のＳＬＢにおける典型的なＣＸＣＲ４発現が示されている。従って、免疫組織化学的調査により、ＣＣＲ７は、ＣＸＣＲ４とは異なり、ＩＩＰのＳＬＢにおいて顕著に発現されるが、正常縁のＳＬＢにおいてはそうでないことが明らかになるとともに、ＣＣＲ７発現はＩＩＰにおいて病巣の間質性領域に集中しているようであることが明らかになった。
【００９２】
ＩＩＰのＳＬＢにおいてＣＣＲ７陽性領域を構成する細胞がどのようなものであるか明らかにするため、さらなる染色実験を、ＣＤ４５及びＣＣＲ７の発現に関し、連続切片に対して行った（図７）。ＵＩＰのＳＬＢの実験では、ＣＣＲ７の免疫組織化学的発現（図７７Ｂ）がＣＤ４５の免疫組織化学的発現（図７Ｃ）と部分的に重なっていることが分かった。ＣＣＲ７とＣＤ４５の両方を発現している細胞は、単核細胞のようであった。一方、ＣＣＲ７はＮＳＩＰの生検試料において強く発現されていたが（図７Ｅ）、このケモカイン受容体の免疫学的局在決定の結果は、ＣＤ４５のものと一致しなかった。ＲＢＩＬＤのＳＬＢにおいて同様の免疫組織化学実験を行った結果、同様にＣＣＲ７とＣＤ４５の位置は重なっていなかった（図示せず）。従って、単核細胞上でのＣＤ４５とＣＣＲ７の二重発現は、ＵＩＰにおいて見られたが、ＩＩＰの他の形態では見られなかった。上述したとおり、ＣＤ３４は、末梢血線維細胞上で特定された造血幹細胞抗原である（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：７５５６−７５６２（２００１））。次に本発明者らは、このマーカーが、ＩＩＰ及び正常縁の生検試料から得られた組織切片において見出せるかどうか調べた（図８）。興味深いことに、ＣＤ３４の発現は、ＵＩＰの生検試料においてほとんど見られなかった（図８Ｂ）。また、検出された場合、この抗原は、生検試料の間質性領域に優先的に位置していた。ＣＤ３４の最も多い発現は、ＮＳＩＰの生検試料において認められ、そこにおいて、このマーカーは、間質性領域内及び単核細胞上で多く発現されていた（図８Ｄ）。強いＣＤ３４発現は、正常縁のＳＬＢ（図８Ｈ）及びＲＢＩＬＤのＳＬＢ（図８Ｆ）の間質性領域においても検出された。ＣＤ３４とＣＣＲ７の位置を同時に測定するさらなる実験において、これらのタンパク質の共発現を示す領域はＩＩＰ又は正常縁のＳＬＢにおいて明らかにならなかった（図示せず）。かくして、ＣＤ３４の発現は、重症度の低い形態のＩＩＰと正常縁のＳＬＢで顕著であった。
【００９３】
コラーゲン１は、線維細胞によって顕著に発現され、そしてこれらの細胞は、組織の損傷部位の補修に応じてコラーゲンを生成させる（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：７５５６−７５６２（２００１））。図９は、ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢにおけるコラーゲン１タンパク質発現の免疫組織化学分析をまとめている。ＵＩＰ（図９Ｂ）、ＮＳＩＰ（図９Ｄ）、ＲＢＩＬＤ（図９Ｆ）、及び正常縁（図９Ｈ）腫瘍患者の生検試料において、コラーゲン１は、免疫学的手法により、間質性領域に位置が特定された。コラーゲン１の最も強い発現は、ＵＩＰのＳＬＢにおいて見られたが、正常縁のＳＬＢにおいても強いコラーゲン１タンパク質の発現が認められた。ＩＩＰの生検試料においてコラーゲン１とＣＣＲ７とが同時に局在しているかどうか調べるため、両タンパク質の発現を測定するための染色を連続切片に対して行った（図１０）。コラーゲン１はＵＩＰのＳＬＢすべてにおいて強く発現した（図１０Ｂ）が、ＣＣＲ７は、コラーゲン１の発現が強い領域において発現されなかった（図１０Ｃ）。同様のパターンは、ＮＳＩＰのＳＬＢ（図示せず）及びＲＢＩＬＤのＳＬＢ（図１０Ｅ、Ｆ）においても認められ、そこにおいて、コラーゲン１（図１０Ｅ）は、ＣＣＲ７の発現（図１０Ｆ）と位置を同じくしているようではなかった。このように、ＩＩＰのＳＬＢにおけるＣＣＲ７陽性領域は、コラーゲン１についても陽性ではなかった。
【００９４】
ＩＩＰのＳＬＢにおけるＣＣＲ７陽性領域はａＳＭＡ発現を欠く。図１１は、ＵＩＰ（図１１Ａ〜Ｃ）、ＮＳＩＰ（図１１Ｄ〜Ｆ）、及びＲＢＩＬＤ（図１１Ｇ〜Ｉ）と診断された患者からの肺組織切片においてＣＣＲ７及びａＳＭＡに対する典型的な免疫組織化学染色を示している。これら３つの患者群すべてにおいて、ＣＣＲ７発現の病巣（図１１Ｂ、Ｅ、Ｈ）は、上述したように、肺の間質性領域に見られる。しかし、ＣＣＲ７について陽性であった領域は、連続切片において、ａＳＭＡについて陽性であった領域と重なっていなかった（図１１Ｃ、Ｆ、Ｉ）。
【００９５】
本研究の全体的な目的は、ＩＩＰ及び正常縁の腫瘍患者群から得られた肺生検試料におけるＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ１２の発現パターンを調べることである。定量的転写物分析及び定性的タンパク質分析から、ＣＣＲ７が、正常縁ＳＬＢに対しＵＩＰにおいて劇的に増加していること、しかしＣＸＣＲ４はそうではないこと、が明らかになった。ＵＩＰのＳＬＢ、そして、それより程度が低いがＮＳＩＰのＳＬＢにおいて、強いＣＣＲ７タンパク質発現の病巣間質性領域が示される一方、その領域は、ＣＤ３４、コラーゲン１、又はａＳＭＡについて陽性ではなかった。ＣＣＲ７タンパク質の病巣発現は、ＵＩＰのＳＬＢすべてにおいて見られ、また、より少ない割合のＮＳＩＰ及びＲＢＩＬＤの生検試料において見られた。ＵＩＰのＳＬＢにおいて、ＣＣＲ７タンパク質の病巣間質性発現は、ＣＤ４５陽性細胞（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：２７６０−２７６９（１９９８））をいくらか含むようであったが、ほとんどのＣＣＲ７陽性細胞は、ＣＤ４５発現がなく、また、ＮＳＩＰ及びＲＢＩＬＤの患者からの生検試料においてＣＣＲ７とＣＤ４５の発現は重なっていなかった。ＵＩＰ及びＮＳＩＰの生検試料の間質性領域におけるＣＣＲ７の発現は、骨髄由来の線維細胞の動員を意味し得る（Ｂｕｃａｌａら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１：７１−８１（１９９４））にもかかわらず、これらの生検試料におけるＣＣＲ７陽性領域が線維細胞マーカー（例えばＣＤ３４及びコラーゲン１）に対しても陽性であるという証拠は存在しなかった。さらに、これらのＣＣＲ７陽性細胞には、筋線維芽細胞マーカーａＳＭＡがなかった。これらのデータから、病巣のＣＣＲ７タンパク質発現は、ＣＣＲ７を発現する線維細胞の動員ではなく、むしろ、特発性の損傷部位、及び常在性線維芽細胞の不適当な活性化を示すものであると推測された。ヒトの疾患におけるそれらの役割はまだはっきり確認されておらず、線維細胞特異的な細胞表面マーカーも特定されていないが、いくつかの実験的な線維症モデルは、皮膚の線維症性事象（Ｆａｔｈｋｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２２：８１２−８２２（２００４））及び肺の線維症性事象（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４：４３８−４４６（２００４）、Ｅｐｐｅｒｌｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９：２１３−２２４（２００３）、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：３８０−３８９（２００３））において、骨髄起源の循環細胞に対し、ある役割を示している。これらの実験研究のほとんどは、骨髄キメラのモデルを用いている。該モデルは、キメラの緑色蛍光タンパク質を遺伝子導入により発現するネズミの骨髄を、放射線照射マウスに養子移入することによって作られたものである。緑色蛍光タンパク質陽性の骨髄由来細胞（これは、マクロファージ様形態を示すもの（Ｅｐｐｅｒｌｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９：２１３−２２４（２００３））及び／又は線維芽細胞様形態を示すもの（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４：４３８−４４６（２００４）であった）が、組織線維症の主な原因であることが示された。また、これらの骨髄由来細胞は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ感受性であり（Ｅｐｐｅｒｌｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９：２１３−２２４（２００３））、またコラーゲン１を発現し（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４：４３８−４４６（２００４）、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：３８０−３８９（２００３））、ＣＤ３４を発現し（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：３８０−３８９（２００３））、ＣＤ４５を発現し（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４：４３８−４４６（２００４））、テロメラーゼ逆転写酵素を発現し（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４））、ＣＣＲ７を発現し（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４））、そしてＣＸＣＲ４を発現した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４：４３８−４４６（２００４））。
【００９６】
しかしながら、線維細胞は一旦肺に位置すると最終的に筋線維芽細胞に分化するかどうかについて、論争が続いている。目下想定されていることは、アレルゲンにさらされた後気管支組織に動員された線維細胞が筋線維芽細胞に分化するか（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：３８０−３８９（２００３））又は損傷した皮膚の部位に動員された線維細胞が筋線維芽細胞に分化する（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：７５５６−７５６２（２００１））一方、ブレオマイシンにより引き起こされた間質性線維症の肺に付着した線維細胞は、ａＳＭＡを発現せず、この筋線維芽細胞マーカーを発現するよう誘導することはできない（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４））ということである。これらの細胞についてさらに議論をよんでいるのは、組織修復の間、骨髄由来細胞のすべてが体に有害であるというわけではないという知見である。これに関し、Ｏｒｔｉｚと共同研究者（Ｏｒｔｉｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：８４０７−８４１１（２００３））は、ブレオマイシンで攻撃されたマウスにおいて、ネズミの間葉幹細胞が、損傷した肺に移動し、上皮様表現型を示し、そして炎症及びコラーゲンの沈着を低下させることを示している。臨床上の線維症反応における骨髄由来細胞の役割を明確にするため、さらに研究が必要であることは明らかである。
【００９７】
ＩＩＰの患者からのＳＬＢにおいてＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４を調べることに弾みをつけたのは、以前の研究であった。それらの研究は、ＣＣＬ２１（ＣＣＲ７ケモカイン受容体のリガンド）が、インビトロ及びインビボで線維細胞の化学走性に対して強い刺激物質であることを示す（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：７５５６−７５６２（２００１））とともに、ＣＸＣＲ４陽性の骨髄由来細胞が実験的に誘導した線維症に寄与していることを示す（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：２４３−２５２（２００４）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４：４３８−４４６（２００４））ものであった。線維細胞は、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、あるいは他のケモカイン受容体に依存する化学走性事象により、組織の損傷部位にすみやかに入ることができ、肺線維症の病因に寄与し得ると仮定されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１４：４３８−４４６（２００４））。本研究では、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びコラーゲン１（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：７５５６−７５６２（２００１）、Ｈａｒｔｌａｐｐら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１５：２２１５−２２２４（２００１））を含む線維細胞マーカーが存在するかどうかについて、ＣＣＲ７発現の病巣領域を調べた。ＣＤ４５は、ＣＣＲ７発現の病巣領域に存在した唯一のマーカーであり、ＣＤ４５とＣＣＲ７の同時局在化は、ＵＩＰ内に存在する単核細胞のみにおいて認められ、他のＩＩＰの生検試料では見られなかった。さらに、これらのマーカーすべてが、正常縁のＳＬＢにおいて検出されたが、免疫組織化学的手法によりそれらの生検試料においてＣＣＲ７を検出することはできなかった。これらの知見は、患者の生検試料で見られたＣＣＲ７陽性細胞が線維細胞である可能性を排除するものではないが、循環から肺に線維細胞が移行すると、これらのマーカーの発現がすみやかにダウンレギュレーションされる可能性がある。
【００９８】
ＩＩＰのＳＬＢの病巣領域にＣＸＣＲ４が存在していないという知見も、線維細胞及び／又はコラーゲン生産性骨髄由来細胞の肺への動員においてこのケモカイン受容体が重要であるということを否定するものではない。ＣＸＣＲ４発現の散漫なパターンが分析したすべてのＳＬＢにおいて見られ、このケモカイン受容体を発現する細胞のほとんどが単核細胞のようであった。
【００９９】
ＵＩＰの線維芽細胞が異常な統合的で増殖性の特徴を有する（Ｋｉｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６４：１０２５−１０３２（２００１））ことから、本発明者らは、この細胞が、免疫細胞の機能を通常調節しているケモカインリガンドに対し不適切に反応している可能性があるという仮説を立てた。組織常在性線維芽細胞は、肺構造物の主要な構成材料からなり、多くの研究者が、ＵＩＰあるいは他の形態のＩＩＰで見られる異常な線維性反応の根底には、これらの細胞の不適切な活性化があることを指摘している（Ｓｕｇａｎｕｍａら、Ｔｈｏｒａｘ，５０：９８４−９８９（１９９５）、Ｈｏｇａｂｏａｍら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，１１０：３１３−３２０（１９９８）、Ｒａｍｏｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４：５９１−５９８（２００１）、Ｓｅｌｍａｎら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．，３：３（２００２））。この不適切な活性化に寄与する因子をやはり明らかにする必要があるが、いくつかの実験から得られているデータは、このプロセスにおいてケモカインが役割を果たしている可能性があることを示している（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｌｉｎｋら、Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓｚ），４８，５３９−５４５（２０００）、Ｓｅｌｍａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６８：７３０−７３１（２００３））。例えば、現在、線維症の肺からのＵＩＰ線維芽細胞は、対照の肺からのものよりも速く移動することが広く知られており（Ｓｕｇａｎｕｍａら、Ｔｈｏｒａｘ，５０：９８４−９８９（１９９５））、また、これに関してケモカインが主な役割を果たしていることを示唆するマウスの研究がいくつか存在する（Ｍｏｏｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：４３６８−４３７７（２００１））。ＩＩＰにおける細胞の異常な遊走性活性に対しＣＣＲ７とＣＸＣＲ４が役割を果たしている可能性について検討することにさらに弾みをつけたのは、癌生物学の分野における最近の発見であった。それは、乳癌細胞上のケモカイン受容体のユニークなレパートリーの発現が、部分的に、乳房腫瘍の転移性を説明することを示すものであった（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１０：５０−５６（２００１））。
【０１００】
かくして、本研究は、ＩＩＰにおけるＣＣＲ７の病巣間質性発現を明らかにした。やはりこの受容体を発現する細胞がどのようなものであるか十分に明らかにする必要があるが、病巣ＣＣＲ７発現を含む領域は、ＣＤ３４及びコラーゲン１について陽性ではなかった。また、ＩＩＰ生検組織の間質性領域においてＣＣＲ７を発現する細胞は、ａＳＭＡも発現しなかった。このことは、これらの細胞が筋線維芽細胞である可能性を排除するものであった。
【０１０１】
以下に示す実施例３で提供されるデータは、ＩＩＰ線維芽細胞の統合的で増殖性である特徴が、外因性のＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１によって、示差的に影響される一方、正常縁の線維芽細胞は影響されないことを示している。これらの研究は、治療上重要である可能性がある。というのも、ＣＣＲ７特異的ケモカインに反応する常在性肺線維芽細胞の活性化及び／又は線維細胞の移動を阻害することにより、適切な肺の修復に有利なように細胞外マトリックスの過剰生産を食い止められる可能性があるからである。
【０１０２】
実施例３：慢性線維形成性障害を治療するためＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１を標的にする
この実施例は、肺の慢性線維症においてＣＣＬ１９及び／又はＣＣＬ２１を標的にする新たな可能性について詳しく説明する。既知の特発性の原因による慢性肺線維症は、極めて大きな臨床上の難問であり、それに対して選択可能な治療は、有効性が限られていたり、毒性が見られるものである（Ｆｌａｈｅｒｔｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１１０：２７８−２８２（２００１）、Ｈａｍｐｔｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１４９：Ａ８７８（１９９４））。また、診断後の平均生存率はほとんど変わらなかった（Ｒｙｕら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，７３：１０８５−１１０１（１９９８）、Ｌａｓｋｙら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１０８  Ｓｕｐｐｌ  ４：７５１−７６２（２０００））。既知の前線維化をもたらす刺激には、放射線、無機物及び有機物の粒子の吸入、酸化性物質の気体、薬剤、及び感染性生物があり、これに対し、議論は、特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）の臨床病理を引き起こす病因の特定に関するものに固執している。ＩＩＰは、遠位の肺実質を巻き込む多様な群の疾患であり、それらは、多くの特徴が共通している一方、それぞれ別個の疾患として特定するのが妥当なほど十分に異なった印象を与えるものである（Ｔｒａｖｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈ．，２４：１９−３３（２０００））。それらの病因は依然としてはっきりしていないが、肺に対する１つの傷（又は複数の傷）が中心になっていると考えられ、従ってその傷を治癒させる試みが行われる。線維芽細胞の病巣（活発に増殖する線維芽細胞の小さな集塊）は、組織化された傷の前病巣であると考えられ、線維形成が活発で進行中であることを示すものであると考えられている。目下の仮説は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１へのヒト線維芽細胞の応答は（それらによるＣＣＲ７のアップレギュレーションのため）、それらの細胞の不適切な活性化をもたらし、それによってＩＩＰに見られる過剰な線維形成反応が生じるということである。
【０１０３】
興味深いことに、線維症患者の肺におけるサイトカイン環境は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１への異常な応答にとって有利に作用し得る。というのも、他の研究者らが、ＴＮＦ−αのプロテインレベルの増加（Ｚｉｅｇｅｎｈａｇｅｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．，４６：２２３−２３１（１９９８）、Ｋａｐａｎｃｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１５２：２１６３−２１６９（１９９５））及びＩＬ−１０の減少（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７３：Ｌ６７６−６８３（１９９７））を報告しており、これらのサイトカインはともにこれらのリガンドに結合する受容体を調節しているからである。重篤な形態の肺線維症患者から得られるヒト線維芽細胞は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１にはっきりと反応する。従って、これらのリガンドは、肺における線維形成性障害（そして恐らくは他の組織における線維形成性障害）の治療において、魅力的な標的となる。
【０１０４】
本発明者らは、免疫不全マウスにヒト線維芽細胞株を静脈注入した後、肺線維症を引き起こせるかどうか検討した。このモデルにより、本発明者らは、炎症反応を開始する能力がないインビボ系において、静脈注射したヒト線維芽細胞が線維症反応を起こすことができるかどうか調べた。
【０１０５】
またデータが示すように、このモデルは、肺線維症の開始中又は肺線維症の発症後に、ＣＣＲ７又はそのリガンドのいずれかを攻撃することの効果を調べるのに適している。Ｃ．Ｂ−１７−ｂｇＳＣＩＤマウスが、ヒト線維芽細胞を用いる養子移入実験に理想的であると考えられる。というのもＣ．Ｂ−１７−ｂｇマウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞を欠いている（Ｃ．Ｂ−１７及びＩＣＲ  ＳＣＩＤと同様に）からであり、またベージュ変異（それは、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ及びＮＫ細胞の機能の低下をもたらす）を有するからである。
【０１０６】
線維症のヒト生検試料から成長させた線維芽細胞をＣ．Ｂ−１７−ｂｇに静脈注射すると、マッソン３色染色に基づいて組織学的に明瞭で顕著な肺線維症が生じた。
【０１０７】
他の実験では、線維芽細胞の注射後３５日目に、ＳＣＩＤマウスの肺組織をヒドロキシプロリンアッセイにより調べた。その結果、ヒドロキシプロリンのレベルは、正常なヒト線維芽細胞を接種したマウスに比べて、線維症であるヒトの生検試料から成長した線維芽細胞を接種したマウスの肺試料において顕著に上昇していることが分かった。従って、ヒト化ＳＣＩＤモデルから得られたデータは、ヒトＩＩＰ線維芽細胞によって線維形成性障害を「移す」ことが可能であることを示唆している。このヒト化ＳＣＩＤモデルは、肺の線維発生の持続に寄与する１つ又は複数の因子を検討することを可能にするはずである。
【０１０８】
ヒトの研究において明らかになったことは、ＣＣＬ２１についての転写物（図１２）及びタンパク質（図１３）の発現が、他のタイプの非線維形成性障害を有する患者に比べて、種々の形態の慢性肺線維症を有する患者から得られた肺の外科生検試料において、顕著に増加しているということである。データが明らかにしたことは、肺線維症の証拠がある患者から得られた肺線維芽細胞は、外因性のＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１に反応して遊走性の応答（図１４）及び増殖性の応答（図１５）を示す一方、異常な線維症の形跡がない患者から得られた線維芽細胞はそのような応答を示さなかったことであった。ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１が肺線維芽細胞の移動を促進するという知見（図１４）は興味深いことである。というのも、この反応は、増殖する線維芽細胞の病巣の発達（ＵＩＰにおける主要な組織病理学的特徴）に寄与し得るからである。
【０１０９】
最後に、間質性線維症及び線維芽細胞の病巣を特徴とする線維症ネズミＳＣＩＤモデルを用いて、肺線維症の開始及び持続中にＣＣＬ２１を攻撃することの治療効果を明らかにした（図１６）。
【０１１０】
実施例４：ＣＣＬ２１又はＣＣＲ７を攻撃することは、免疫不全マウスにおいてヒト肺線維芽細胞の養子移入により誘導された肺線維症を排除するのに有効である。
【０１１１】
上述したとおり、ＣＣケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）は、ＩＩＰの生検試料及び一次線維芽細胞株において発現される。本実施例では、肺線維症のモデルにおいて、ＣＣＲ７のインビボでの役割が詳細に研究される。まず簡潔に述べると、特発性肺線維症／通常型間質性肺炎（ＩＰＦ／ＵＩＰ）の生検試料、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の生検試料、又は組織学的に正常な生検試料から増殖された一次線維芽細胞１．０×１０６を、Ｃ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤ／ベージュ（ｂｇ）マウスに静脈注射した。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の注入後３５日目と６３日目に、斑状の間質性線維症、及びヒドロキシプロリンの増加が、免疫不全マウスの肺に見られた。養子移入されたＮＳＩＰ線維芽細胞は、両時点で、より散漫な間質性線維症を引き起こすとともにヒドロキシプロリンのレベルを増加させた。しかし、注入された正常なヒト線維芽細胞は、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて、間質性の形態変化を引き起こさなかった。いずれかのタイプのＩＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの群では、ヒトのＣＣＲ７又はＣＣＬ２１（そのリガンド）のいずれかの全身療法的免疫中和により、肺線維症が顕著に減少した。従って、本研究は、一次ヒト線維芽細胞株の免疫不全マウスへの静脈注入によって肺線維症が引き起こされることを明らかにするとともに、この線維症反応がＣＣＬ２１とＣＣＲ７との相互作用に依存していることを明らかにしている。
【０１１２】
肺線維症のマウスモデルは、呼吸器系における異常な組織再構築及び瘢痕形成を検討するための実験例を提供してきた（Ｇｈａｒｅｅ−Ｋｅｒｍａｎｉら、Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００５，１１７：２５１−２５９）。いくつかの手法が肺線維症を誘発させるのに使用されてきており、そのような手法には、遺伝子導入及び遺伝子送達、放射線、無機刺激剤（例えばシリカ）、及び酸化剤により誘発される炎症性傷害を促進する薬剤（例えばブレオマイシン）が含まれる（Ｃｈｕａら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５，３３：９−１３）。それらのモデルの中で、ブレオマイシンモデルは、その再現性、及びヒト肺線維症に対するその病理学的類似性のため、いまだに最も広く用いられている（Ｃｈｕａら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５，３３：９−１３）。従って、ＩＰＦ／ＵＩＰにおけるいくつかの興味あるターゲットを評価するため、ブレオマイシンモデルが使用されてきた（Ｋａｍｉｎｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００，９７：１７７８−１７８３、Ｐａｒｄｏら、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２００５，２ｅ２５１）。
【０１１３】
残念ながら、ＩＰＦ／ＵＩＰの臨床病理学的特徴を十分に再現する動物モデルは存在しておらず、また、最終段階のＵＩＰに対する進行中の炎症性傷害（実験的線維症を誘発させるための一次モデル）の相対的な重要性について依然として論争が存在する（Ｇａｕｌｄｉｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００２，１６５：１２０５−１２０６、Ｓｔｉｅｒｔｅｒ  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００２，１６５：１２０７−１２０８）。
【０１１４】
本実施例は、実験的肺線維症を誘発させるのに別の方策を使用して、当該技術における問題を回避している。遺伝子的に免疫不全のマウス（重症複合免疫不全症遺伝子変異（ｓｃｉｄ）又はリコンビナーゼ活性化遺伝子１（ｒａｇ−１）ノックアウトによる）を、養子移入される正常な又は病気のヒト細胞のインビボ宿主として広く使用した。本実施例では、ＩＰＦ／ＵＩＰ又は非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ（重症度が低い別の形態のＩＩＰ）のいずれかの線維芽細胞をＳＣＩＤ−ベージュ突然変異のＣ．Ｂ−１７マウス（Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）に養子移入することによって、肺線維症が誘発かつ維持される一方、正常な線維芽細胞の移入によってはそれが起こらないことを明らかにしている。線維症の組織学的及び生化学的証拠は、まず、線維芽細胞の注入後３５日目で、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの両ＩＩＰ線維芽細胞群において、明確になり、そして、線維芽細胞注入後６３日目で顕著になった。サイトカイン及びケモカインはともに、ＩＩＰの病理発生において重要な役割を果たしているようである。また、ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰのいずれかの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスから得られた全肺試料のＥＬＩＳＡ分析により、初期の時点で測定した全肺レベルに対し、あるいは、線維芽細胞を接種しなかったマウスからの肺組織に対し、６３日目においてネズミのＩＬ−１３、ＣＣＬ６、及びＣＣＬ２１が顕著に上昇していることがわかった。
【０１１５】
ＩＬ−１３及びＣＣＬ６は、肺線維症のメディエーターであるが、肺の再構築事象におけるＣＣＬ２１の役割は不明であった。ヒトＩＩＰ線維芽細胞によって急に引き起こされる肺の再構築事象でのＣＣＬ２１及びＣＣＲ７の役割を調べることにした。その弾みとなったのは、ＣＣＲ７発現がＩＩＰ生検試料で増加し、そして、ＩＩＰ線維芽細胞の遊走性、統合性、及び増殖性がＣＣＬ２１（ＥＭＰ及びＣＭＨ、未公開の知見）によって顕著に高められるという上述した知見であった。別の免疫中和実験において、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにＩＩＰ線維芽細胞を注入した後３５日目〜６３日目に、ヒトのＣＣＬ２１又はＣＣＲ７（ＣＣＬ２１の受容体）のいずれかを攻撃すると、ＩＩＰ線維芽細胞及びＩｇＧを接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの群に比べて、肺線維症のパラメーターすべてが顕著に減少した。総合すると、これらのデータは、ＩＩＰ線維芽細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにｉ．ｖ．導入することによって開始・維持される肺線維症の新たなネズミモデルができたことを明らかにするとともに、このモデルにおいて線維症を持続させるＣＣＬ２１及びＣＣＲ７の新たな役割を示している。
【０１１６】
マウス：雌の、ＩＣＲ−ｓｃｉｄ（ＩＣＲＳＣＩＤ）、Ｃ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄ（Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ）、及びＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄ−ベージュ（Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ）マウス（生後６〜８週間）を、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（ジャーマンタウン、ニューヨーク州）から購入した。すべてのＳＣＩＤマウスを、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの無菌動物防護設備に収容した。マウスの最初の２つの群は、Ｖ（Ｄ）Ｊ再結合欠陥のためＴリンパ球及びＢリンパ球の欠如をもたらす重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）変異を有するものである。一方、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスは２つの突然変異を有している。１つはｓｃｉｄ突然変異であり、もう１つは、細胞障害性Ｔ細胞及びマクロファージの機能に重い欠陥をもたらすとともにＮＫ細胞の機能に選択的な欠陥をもたらすベージュ突然変異である。すべてのマウスが、加圧蒸気滅菌水及びペレットマウス飼料を随時に摂取できた。下記の手順はすべて、無菌の層流環境で行われるとともに、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの動物保護利用委員会の承認を受けたものである。
【０１１７】
ヒト線維芽細胞培養：機械的に分離したＩＰＦ／ＵＩＰ及びＮＳＩＰの肺の外科生検試料から混合細胞群を得た。そして、純粋なヒト線維芽細胞培養物を、上記の他の所で詳述したようにして得た（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００４  １６４：１９８９−２００１）。切除した肺の腫瘍組織に付随する正常縁の細胞懸濁物から、同様にして正常な肺の線維芽細胞を精製した。本研究では、ここに記載する開始、モデル特性評価、及び治療介入の研究において第４節の後、合計、１０のＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞株、６のＮＳＩＰ線維芽細胞株、及び４の正常線維芽細胞株を使用した。
【０１１８】
ヒト肺線維芽細胞のＳＣＩＤマウスへの静脈内導入：１５０ｃｍ２組織培養フラスコでのトリプシン処理、及び、製造者（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ、セントルイス、ミズーリ州）の指示に従うＰＫＨ２６染料による標識の後、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞、ＮＳＩＰ線維芽細胞、及び正常線維芽細胞の単細胞調製物を得た。それぞれの標識された線維芽細胞株を、１×１０６細胞／ｍＬＰＢＳに希釈し、この懸濁物１ｍＬを、尾の静脈を介してＳＣＩＤマウスの群に注射した。５匹のＳＣＩＤマウスの他の群には、ＰＫＨ２６及びＰＢＳの標識溶液のみを静脈注射した（すなわち対照群）。ヒト肺線維芽細胞のｉ．ｖ．移入の後、７、２１、３５、４９、及び６３日目に、麻酔の過剰投与によりマウスを安楽死させた。これらの時点で、分子解析、組織学的分析、生化学分析、及び／又はプロテオーム解析のため、肺組織全体を解剖した（以下参照）。
【０１１９】
ヒト肺線維芽細胞を養子移入した後のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおけるＣＣＬ２１及びＣＣＲ７の役割の評価。ヒト線維芽細胞のｉ．ｖ．養子移入の後の肺再構築反応におけるＣＣＬ２１及びＣＣＲ７（その受容体）の役割を調べるため、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの群は、ＩＰＦ／ＵＩＰ（ｎ＝３５マウス）線維芽細胞、ＮＳＩＰ（ｎ＝２０マウス）線維芽細胞、正常線維芽細胞（ｎ＝１５マウス）、又は媒質（すなわちＰＢＳ）のみ（ｎ＝１５マウス）を接種した。３５日後、５匹のＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの群すべてが、マウスＩｇＧ、マウスの抗ヒトＣＣＬ２１モノクローナル抗体、又はマウスの抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体（すべて１０μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス、ミネソタ州）のいずれかを、１日置きに３５日目から６３日目まで投与された。６３日目に、すべてのマウスを、麻酔の過剰投与により安楽死させ、分子解析、組織学的分析、生化学分析、及び／又はプロテオーム解析のため、肺組織全体を解剖した（以下参照）。
【０１２０】
分子解析：すでに詳述したとおり、全肺試料から全ＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを生成させた（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３，１７１：２６８４−２６９３）。ヒト及びネズミのケモカイン及びケモカイン受容体に関する遺伝子プロファイルの変化を、製造者の説明書（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ，Ｉｎｃ．、ベテスダ、メリーランド州）に従い、非放射性ＧＥＡｒｒａｙ遺伝子アレイ部材を用いて、プールされた試料（ｎ＝５）において分析した。そして、シグナル強度をすでに詳述したとおり測定した（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１６２：１４７５−１４８６（２００３））。上述したように、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いたリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、個々の全肺ｃＤＮＡサンプル（ｎ≧５）を、ヒトＣＣＲ７、コラーゲンＩ、カテプシンＥ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１９、フィブロネクチン、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）−１、及びＧＡＰＤＨの発現について、解析した（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３，１７１：２６８４−２６９３）。
【０１２１】
組織学的分析：麻酔による安楽死の後、各マウスから右肺葉を切り出し、１０％ホルマリン溶液で十分に膨潤させ、そして新鮮なホルマリン中に２４時間置いた。標準的な組織学的手法を用いて、各肺葉をパラフィン包埋し、そして５μｍ切片を組織学的分析のためＨ＆Ｅ及びメイソントリクロームで染色した。さらに、染色していない全肺組織切片を、蛍光顕微鏡検査法により分析した。
【０１２２】
生化学分析：全左肺サンプルを１×ＰＢＳ中でホモジナイズし、遠心分離によりペレット化した。ＥＬＩＳＡ分析のため無細胞上清を取り出した。また、ペレットを真空乾燥した後、０．５Ｍ氷酢酸中に再懸濁した。次いで、上述したとおり、ヒドロキシプロリン濃度を測定するため組織を処理した（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１５３：４７３３−４７４１）。
【０１２３】
プロテオーム解析：すでに詳述したとおり、標準的なサンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス、ミネソタ州）を用い、ホモジナイズした全肺サンプルからの無細胞上清５０μＬにおいて、ネズミＩＬ−１３、ＣＣＬ６、ＣＣＬ２１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ１３、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ２のタンパク質を分析した（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３，１７１：２６８４−２６９３）。
【０１２４】
統計分析：すべての結果は平均±ＳＥＭとして表す。一元配置ＡＮＯＶＡ分析及びＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ又はＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて、ＵＩＰ、ＮＳＩＰ、正常、及び対照のＳＣＩＤマウス群間の統計的差異を検出した。有意性はｐ＜０．０５に設定した。
【０１２５】
ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰのいずれかの肺線維芽細胞の静脈内養子移入はＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて肺の組織病理及び再構築を促進したが、正常な肺線維芽細胞の静脈内養子移入はそうではなかった。最初の実験は、ＩＣＲＳＣＩＤ、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ、及びＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ（各時点でｎ＝５）を含む種々の系統のＳＣＩＤマウスにおける肺の構造に、養子移入した正常線維芽細胞及びＩＩＰ線維芽細胞がどのような影響をもたらすか評価するため行った。これらの最初の実験は、３つのＩＰＦ／ＵＩＰのヒト線維芽細胞株と２つの正常ヒト線維芽細胞株を用いて行った。すべてのヒト線維芽細胞株は、ＳＣＩＤマウス群に注入する前にＰＫＨ２６で標識した。それにより、組織切片において標識細胞の検出が可能となった。注入後７日目及び２１日目で、各ＳＣＩＤ群の肺血管において、ヒト線維芽細胞の集まりが検出された。しかし、２１日の後、このマーカーの強度は減少する（提供されるＳｉｇｍａのデータシートからの情報）ため、本発明者らは、線維芽細胞の注入後３５日目において、それぞれからの組織切片においてＰＫＨ２６の蛍光を検出できなかった（図示せず）。他の器官（すなわち肝臓、脾臓、及び腎臓）もおそらくヒト肺線維芽細胞を保持したであろうが、本発明者らは、これらの器官について顕著な肉眼で見える変化の形跡を認めなかった。ＩＩＰは肺特異的疾患（他の器官では線維発生を示さない）であるため、本実験では、他の器官について詳細な組織学的分析を行わなかった。
【０１２６】
その後の時点でＳＣＩＤマウス群の全肺切片を調べたところ、顕著な肺再構築はＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスのみにおいて起こったことが明らかになった。具体的には、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞のＩＣＲＳＣＩＤマウス（ｎ＝５マウス、図示せず）への導入後４９日目において線維増殖は認められなかった。同様に、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスへのＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞のｉ．ｖ．養子移入でも、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞のｉ．ｖ．注入後７日目（ｎ＝５マウス）、２１日目（ｎ＝１０マウス）、３５日目（ｎ＝５マウス）、又は４９日目（ｎ＝５マウス）において、組織学的に明確な肺の再構築は認められなかった。
【０１２７】
Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において顕著な肺の組織病理が存在したため、その後のお以下に記載する実験はすべて、正常な線維芽細胞及びＩＩＰの線維芽細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに養子移入したものであった。モデルの特性解析実験において、４つのＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞株、４つのＮＳＩＰ線維芽細胞株、及び１つの正常線維芽細胞株を、Ｃ．Ｂ１７−ＳＣＩＤ／ｂｇマウスのそれぞれの群に養子移入し、そして、肺の組織病理学的変化、ゲノム変化、及びプロテオーム変化を、線維芽細胞移入後３５日目及び６３日目に分析した。
【０１２８】
正常な肺線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスでは、ほとんど又は全く肺の組織病理は認められなかった。一方、ＮＳＩＰ又はＩＰＦ／ＵＩＰのいずれかの線維芽細胞株をｉ．ｖ．注入した後３５日目において、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスは顕著な肺の組織病理を示した。ＮＳＩＰ又はＩＰＦ／ＵＩＰの肺線維芽細胞によるＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺組織病理は、肺胞空間の破壊、明らかな線維増殖、及び好酸性顆粒球の存在を特徴としていた。正常、ＮＳＩＰ、又はＩＰＦ／ＵＩＰのヒト肺線維芽細胞を養子移入した後３５日目でＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺から得られた組織切片をメイソントリクローム染色した結果、ＩＩＰの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群の再構築領域に細胞外マトリックス（淡青色に染色）が存在することが明らかになった。
【０１２９】
Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群からの組織切片を後に分析した結果、ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰの線維芽細胞を導入することにより急に引き起こされた肺再構築は、広さ及び外観が明らかに異なっていた。ＩＰＦ／ＵＩＰの線維芽細胞を接種してから６３日経過したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺は、不均質な外観を示し、比較的正常に見える肺組織の領域に隣接して、顕著な間質性破壊及び再構築の領域が存在した。また、ヒト線維芽細胞の病巣は、ＩＰＦ／ＵＩＰの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺にはっきり見られたが、それらの病巣は、血管に見られた一方、臨床上ＵＩＰに見られるような間質領域には見られなかった（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００２，１６５：２７７−３０４）。ＮＳＩＰの線維芽細胞を接種してから６３日経過したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスからの全肺組織切片の組織学的パターンは、間質が厚くなったこと及び線維症性領域が明らかになったことを特徴とし、それらのマウスにおける再構築は、肺のほとんどを巻き込んでいるようであった。総合すると、これらのデータは、ヒトＩＩＰの線維芽細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに導入すると、それらのマウスにおいて線維症の病変が生じることを明らかにした。
【０１３０】
ＩＩＰ線維芽細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに導入した後、ヒドロキシプロリンレベルは、時間に依存して変化した：肺の再構築を伴う実験モデルにおいて、ヒドロキシプロリンは、デノボコラーゲン合成のよく用いられるマーカーである（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００４，１６５：１２２２−１２２１）。本実験では、線維芽細胞を接種しなかったＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスから得られた全肺サンプル、正常、ＮＳＩＰ、又はＩＰＦ／ＵＩＰのヒト肺線維芽細胞を接種して３５日又は６３日が経過したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスから得られた全肺サンプルにおいて、ヒドロキシプロリンのレベルを測定した。正常な線維芽細胞導入後のこれらの時点では、ヒドロキシプロリンのレベルは変化しなかった。これらのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群におけるヒドロキシプロリンのレベルは、３５日目、６３日目においてそれぞれ４．７±０．３μｇ／ｍｇタンパク質、５．６±０．５μｇ／ｍｇタンパク質であった。また、これらのヒドロキシプロリンレベルは、ヒト線維芽細胞を接種しなかったＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウス群で検出されたレベルとほぼ同等であった（４．５±１．３μｇ／ｍｇタンパク質）。一方、ＮＳＩＰ線維芽細胞の静脈移入後３５日目のヒドロキシプロリンの含量（１１．４±３．７μｇ／ｍｇタンパク質）又はＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の静脈移入後３５日目のヒドロキシプロリンの含量（８．２±２μｇ／ｍｇタンパク質）は、マウスの肺において、正常線維芽細胞群よりも高かった。また、ヒドロキシプロリンのレベルは、ｉ．ｖ．養子移入後６３日目で、ＮＳＩＰ線維芽細胞群において３倍に（３１±１１μｇ／ｍｇタンパク質）、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞群において２．５倍に（２２±４μｇ／ｍｇタンパク質）それぞれさらに増加した。６３日目の時点で、ＮＳＩＰ又はＩＰＦ／ＵＩＰいずれかのヒト線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群におけるヒドロキシプロリンレベルの増加は、正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群に対して統計的に有意なものに達した。このように、ヒトＩＩＰ線維芽細胞の静脈注射によって、ヒドロキシプロリンのレベルは、養子移入後３５日目で高くなり、６３日目で非常に顕著に高くなった。
【０１３１】
全肺サイトカイン分析により、ＩＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺においてネズミＩＬ−１３、ＣＣＬ６、及びＣＣＬ２１が顕著に増加していることが明らかになった：ヒト正常線維芽細胞又はヒトＩＩＰ線維芽細胞をｉ．ｖ．養子移入した後３５日目及び６３日目において、いくつかのサイトカイン、ＣＣリガンド、及びＣＸＣリガンドケモカインの全肺ＥＬＩＳＡ分析を行った結果、ネズミＩＬ−１３、ＣＣＬ６、及びＣＣＬ２１において、いくつかの統計的に有意な変化が明らかになった。正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群におけるＩＬ−１３の全肺レベルは、ＥＬＩＳＡ検出水準を下回っていたが、ＮＳＩＰ又はＩＰＦ／ＵＩＰいずれかの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群の全肺ＩＬ−１３レベルは、接種後３５日及び／又は６３日において、正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群よりも、顕著に高かった。また、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺において、線維芽細胞の養子移入後６３日目のＩＬ−１３は、３５日目のＩＬ−１３よりも顕著に多かった。線維芽細胞の注入後６３日目において、全肺ＣＣＬ６のレベルは、ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰいずれかの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において、正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群よりも顕著に高かった。ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺において、線維芽細胞の養子移入後６３日目のＣＣＬ６は、３５日目のＣＣＬ６よりも顕著に多かった。ヒト線維芽細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに導入することにより変化があった他のネズミＣＣリガンドは、ＣＣＬ２１だけであった。このケモカインは、ＮＳＩＰ及びＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群の６３日目において、正常線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群の６３日目よりも、顕著に多かった。さらに、全肺ネズミＣＣＬ２１のレベルは、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞群の線維芽細胞移入後６３日目において、ＮＳＩＰ線維芽細胞群の同時点よりも、顕著に上昇していた。最終的に、ＣＣＬ２１のレベルは、養子移入後６３日目のＩＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群から得られた全肺サンプルにおいて、養子移入後３５日目のＩＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群よりも、顕著に高かった。総合すると、これらのデータから、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにＩＩＰ線維芽細胞が存在すると、肺における既知の前線維化作用（すなわちＩＬ−１３及びＣＣＬ６）と推測された前線維化作用（すなわちＣＣＬ２１）により、ネズミのサイトカイン及びケモカインの全肺レベルが顕著に変化することがわかるとともに、正常線維芽細胞の存在によってはそれが変化しないことがわかった。
【０１３２】
ヒト肺線維芽細胞を接種してから３５日が経過したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにはヒトＣＣＲ７及びＣＣＬ２１の遺伝子転写物が存在した：ＮＳＩＰ又はＩＰＦ／ＵＩＰのいずれかの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいてネズミＣＣＬ２１の全肺レベルが変化したことは、このＣＣリガンドの腎臓（Ｂａｎａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２  １６８：４３０１−４３０７）及び肝臓（Ｂｏｎａｃｃｇｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００３，１２５：１０６０−１０７６）における重要な再構築作用を示した以前の研究を考慮すると、興味深い。これに促され、ヒトＩＩＰ線維芽細胞により誘導される肺再構築反応の過程でこのＣＣリガンド及びその受容体（ＣＣＲ７）をさらに分析した。ＣＣＲ７及びＣＣＬ２１についてのヒト転写物をＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ遺伝子解析により検出した。そして、３つのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群の中で、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞群から得られた肺サンプルに、ＣＣＲ７及びＣＣＬ２１についての転写物発現が最も多く存在した。さらに、ＣＣＲ７の存在をタックマン解析により確認した。そして、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群の中で、やはり、ＩＰＦ／ＵＩＰ群が最も高いＣＣＲ７転写物発現を示していた。また、ネズミのＣＣＲ７及びＣＣＬ２１のＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ解析及びタックマン解析を行った結果、ヒト線維芽細胞を接種した３つのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群すべてにおいてこれらの転写産物の存在が確認された。そして、両転写物の最高レベルは、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において見られた。このように、正常線維芽細胞及びＩＩＰ線維芽細胞のｉ．ｖ．養子移入により、ＣＣＲ７及びＣＣＬ２１についてのヒト遺伝子転写物が存在するようになった。
【０１３３】
ヒト線維芽細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに養子移入した後の、ネズミの細胞外マトリックス関連遺伝子の定量的タックマンＰＣＲ解析：ネズミの細胞外マトリックス関連遺伝子の肺変化を、定量的ＰＣＲ解析を用いて分析した。正常、ＮＳＩＰ、及びＩＰＦ／ＵＩＰのヒト線維芽細胞を接種して６３日が経過したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスには、コラーゲン１、カテプシンＥ、ＭＭＰ−１９、及びＴＩＭＰ−１の発現が見られた。線維芽細胞によって攻撃されるマウスにおけるこれらの遺伝子の転写物レベルを、対照Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの転写物レベルと比較した。この場合、最も重要なことに、いずれかのタイプのＩＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおけるコラーゲン１及びカテプシンの転写物発現の増加、及び、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞を接種したマウスにおけるＭＭＰ−１９及びＴＩＭＰ−１の転写物発現の増加は、正常なヒト線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおけるこれらの遺伝子の転写物増加と比べた場合、統計的に有意なものになっていた。他の細胞外マトリックス遺伝子をタックマンにより解析し、それらの存在（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及びフィブロネクチン）を確認した。Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウス群の間で、これらの転写物のレベルには有意差が認められなかったが、ＩＰＦ／ＵＩＰのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において、ＭＭＰ−２及びフィブロネクチンに最も大きな増加が認められた一方、同じＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において認められたＭＭＰ−９の増加は最も小さかった。従って、これらのデータから、ネズミの細胞外マトリックス関連遺伝子の転写物レベルは、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて、ヒト線維芽細胞の存在により変化することがわかった。
【０１３４】
ヒトＣＣＲ７又はヒトＣＣＬ２１の免疫中和は、ヒトＩＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおける肺再構築を打ち消した。次の一連の実験では、ヒトのＣＣＲ７及びＣＣＬ２１の役割を、ヒトの正常線維芽細胞（ｎ＝１株）又はＩＩＰ線維芽細胞（ｎ＝３のＩＰＦ／ＵＩＰ株及びｎ＝２のＮＳＩＰ株）を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて調べた。全肺サンプルにおいてヒトＣＣＬ２１を測定しようとしたがうまくいかなかった。おそらく、このＣＣリガンドはＥＬＩＳＡの検出レベルよりも低いレベルにあるためである。しかし、以前の研究により、マウス及びヒトの両方のＣＣＬ２１はヒトＣＣＲ７を介して細胞のカルシウム流を促進できることが明らかになっている（Ｊｅｎｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９  １６２：３７６５−３７６９）。さらに、ポリクローナル抗体を用いてマウスＣＣＬ２１を免疫中和すると、イエダニにより引き起こされるアレルギー性気道疾患のヒト化モデルにおいて、ヒト樹状細胞の移動及びヒトＴ細胞の誘導が阻止されることが分かっている（Ｈａｍｍａｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，１６９：１５２４−１５３４）。この報告されているマウスとヒトのＣＣＬ２１の交差反応からすると、線維芽細胞の養子移入後３５日〜６３日においてモノクローナル抗体を投与することによりヒトＣＣＬ２１又はヒトＣＣＲ７のいずれかを攻撃する治療プロトコルが考えられた。３つの処理法が試験された３つのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において６３日目に全肺組織を組織学的に調査した結果、正常線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群では、どの処理群においても（ＩｇＧ処理、抗ＣＣＬ２１抗体処理、抗ＣＣＲ７抗体処理）、間質性肺再構築のはっきりとした形跡はなかった。しかし、これらのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において、正常線維芽細胞の血管蓄積が組織学的に明らかであった。いずれの処置も、正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいてこの特徴を変化させることはなかった。ＩｇＧを接種したＮＳＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群においては間質の再構築が見られたが、この再構築反応は、養子移入後３５日〜６３日において抗ＣＣＬ２１抗体又は抗ＣＣＲ７抗体のいずれかを投与することにより、打ち消された。同様に、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞を接種したＩｇＧのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において見られた間質の再構築は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の養子移入後３５日〜６３日において抗ＣＣＬ２１抗体又は抗ＣＣＲ７抗体の投与を受けたＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの群では、見られなかった。このように、ＣＣＬ２１又はＣＣＲ７のいずれかを治療により攻撃すれば、ＩＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおける間質再構築の組織学的形跡は消失した。
【０１３５】
ヒトの正常線維芽細胞及びＩＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいてヒトのＣＣＬ２１又はＣＣＲ７のいずれかを治療により攻撃した後、ネズミの細胞外マトリックス関連遺伝子について定量的タックマンＰＣＲ解析を行った：また、抗体処理群の定量的タックマン解析により、抗ＣＣＬ２１処理及び抗ＣＣＲ７処理がＭＭＰ−２及びＭＭＰ−１９の転写物レベルを顕著に変化させることが確認された。抗体で処理された対照Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおけるこれらＭＭＰについての転写物レベルを、抗体で処理された線維芽細胞投与Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおける転写物レベルと比較した。ＭＭＰ−２転写物レベルの増加倍数は、抗ＣＣＬ２１抗体処理により、ＩｇＧを接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群よりも、正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において顕著に減少させられた。適当なＩｇＧ群に対し、ＭＭＰ−２転写物レベルの増加倍数は、抗ＣＣＲ７抗体処理によって顕著に減少させられた。ＭＭＰ−１９の定量的タックマン解析の結果、正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において、変化倍数は抗ＣＣＲ７により顕著に増加した一方、適当なＩｇＧ群に対し、この転写物の変化倍数は、両抗体処理によって顕著に増加したことがわかった。このように、ヒト線維芽細胞で攻撃されるＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて抗体処理を用いると、ネズミ細胞外マトリックス関連遺伝子についての転写物発現が顕著に変化した。
【０１３６】
ヒトＩＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて、全肺ヒドロキシプロリンのレベルは、ヒトＣＣＲ７又はヒトＣＣＬ２１の免疫中和によって顕著に減少した：ＩｇＧ、抗ＣＣＬ２１、又は抗ＣＣＲ７で処理された対照Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウス（すなわちヒト線維芽細胞を接種しなかったマウス）から得られた全肺サンプル中のヒドロキシプロリンレベルと、正常、ＮＳＩＰ、又はＩＰＦ／ＵＩＰの線維芽細胞を接種したマウスの処理群から得られた全肺サンプル中のヒドロキシプロリンレベルとを測定した。ヒドロキシプロリンのレベルは、正常線維芽細胞及びＩｇＧを接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスから得られた全肺サンプルにおいて増加したが、抗体処理を行うとこれらのレベルは変化しなかった。ＮＳＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において、ヒドロキシプロリンのレベルは、対照Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群で測定されたレベルを超えて顕著に増加した。また、抗ＣＣＬ２１抗体及び抗ＣＣＲ７抗体による治療は、ＩｇＧ処理群と比較して、それぞれ、５２±６．７％、５１±５．６％、ヒドロキシプロリンのレベルを顕著に減少させた。ＩｇＧを接種したＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群においても、ヒドロキシプロリンのレベルは、対照Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群で測定されたレベルを超えて顕著に増加した。また、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞で攻撃されたマウスにおいて、ヒドロキシプロリンのレベルは、ＩｇＧ処理で処理されたＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇのＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞群に対し、抗ＣＣＬ２１抗体処理群及び抗ＣＣＲ７抗体処理群において、それぞれ６６±７．２％、５９±７．１％減少した。従って、これらのデータから、ＣＣＬ２１又はＣＣＲ７のいずれかを攻撃すれば、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて、ＮＳＩＰ又はＩＰＦ／ＵＩＰの養子移入によって引き起こされる肺再構築が顕著にかつ有意に減少させられることが確認された。
【０１３７】
全肺サイトカイン分析から、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞及び抗ＣＣＲ７抗体治療を受容したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺において、ネズミＣＣＬ２１のレベルが顕著に減少したことが分かった：ネズミのＩＬ−１３、ＣＣＬ６、及びＣＣＬ２１の全肺レベルは、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて、ＮＳＩＰ及びＩＰＦ／ＵＩＰの線維芽細胞が存在することにより変化及び／又は増加した。そこで、６３日目において、ＩｇＧ及びモノクローナル抗体による処理がこれらのメディエーターに対してどのような効果があるか調べた。抗ＣＣＲ７抗体及び抗ＣＣＬ２１抗体による治療は、いずれのＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ線維芽細胞群においても、ＩＬ−１３又はＣＣＬ６の全肺レベルに影響しなかった。しかし、抗ＣＣＲ７抗体による治療は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞とＩｇＧを接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群に対し、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において、ネズミＣＣＬ２１の全肺レベルを顕著に減少させた。このように、ＣＣＲ７を治療により攻撃すれば、ネズミＣＣＬ２１のレベルは減少したが、ＩＩＰ線維芽細胞モデルにおいて上昇することが認められた他の２つのマウスメディエーターのレベルは影響を受けなかった。
【０１３８】
考察：本研究は以下の２つの疑問に答えるものであった。１）養子移入されたヒト肺線維芽細胞はＳＣＩＤマウスにおいて肺の構造を作り変えるかどうか？２）ヒト線維芽細胞に養子移入によって引き起こされる再構築反応においてＣＣＬ２１及びＣＣＲ７はどのような役割を果たしているか？最初の疑問に対する答えはイエスであった。というのも、適応免疫及び先天性免疫を欠くＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに１×１０６のＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰ線維芽細胞をｉ．ｖ．養子移入すると、線維症が生じ、それは、組織学的分析、分子解析、及び生化学分析によって確認されたからである。この線維症は、ヒトＣＣＬ２１又はＣＣＲ７のいずれかに対するモノクローナル抗体を治療投与することによって打ち消された。そのため、このリガンド及びその受容体の肺線維症における主な役割は、腎臓線維症（Ｂａｎａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，１６８：４３０１−４３０７及び肝臓線維症（Ｂｏｎａｃｃｈｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００３，１２５：１０６０−１０７６）におけるそれらの役割に類似することが分かった。
【０１３９】
既知の前線維化メディエーター及び推測された前線維化メディエーターのネズミ等価物は、ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰのいずれかの線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて増加したが、線維症プロセスにおけるこれらのメディエーターの役割は疑問の余地がある。というのも、肺再構築の顕著な減少を示したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの多くの群で、それらのレベルは変化しなかったからである。このように、本研究は、ＩＩＰ線維芽細胞の養子移入が、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて線維症を促進させること、そして、ＩＩＰにおいて新規な治療ターゲットを明らかにしたことを証明している。
【０１４０】
臨床上の肺線維症のモデルを作ることは、実験室における大きな課題となっている（Ｃｈｕａら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５  ３３：９−１３）。硫酸ブレオマイシンは、実験的線維症の誘導に選択される薬剤であるが、ブレオマイシンで誘導される肺線維症は、ＩＰＦ／ＵＩＰの理想的とはいえないモデルとして評価されている（Ｃｈｕａら、Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００５  ３３：９−１３）。肺線維症のより新たなモデルは、臨床上のＩＩＰの特徴をできるだけ多くとりこむべきであることを考え、本研究は、これらの疾患において重大でかつしばしば致命的な再構築の主要な原因は線維芽細胞であるという知見に基づいた（Ｚｉｓｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００５，１１７：３−４４）。ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰいずれかの線維芽細胞を養子移入することにより間質の再構築が始まり、そして組織学的に明らかな線維症は、線維芽細胞株のｉ．ｖ．養子移入後３５日目に認められたが、それ以前には認められなかった。この線維症出現の遅れは、容易に説明できるものではないが、これらの知見は、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにヒト内皮細胞を養子移入すると、明らかな血管が見られるまで約３０〜４０日必要であったという以前の研究に合致している（Ｓｋｏｖｓｅｔｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００２，１６０：１６２９−１６３７）。従って、本研究は、肺線維症の臨床上有意義なモデルを、ヒト肺線維芽細胞の養子移入により免疫不全マウスにおいて作り出せることを強く支持するものである。
【０１４１】
ここに記載するＩＰＦ／ＵＩＰ及びＮＳＩＰの線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇモデルは、これらの疾患に対して新規な治療を試験するのに有用であるという明らかな利点を有する。本研究はヒトのＣＣＬ２１及びＣＣＲ７の役割について検討するものであった。というのも本発明者らは、両者がＩＩＰの生検試料（Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２００６，５９：２８−３９）及び培養されたＩＩＰの線維芽細胞において顕著に発現されることを確認したからである。「抗ヒトＣＣＬ２１抗体処理及び抗ヒトＣＣＲ７抗体処理の治療効果は、ＩＰＦ／ＵＩＰ及びＮＳＩＰの線維芽細胞に対するＣＣＬ２１の増殖促進作用をそれらが打ち消すことに関係している」というのが我々の目下の仮説である。ここで使用したモノクローナル抗体がｉ．ｖ．注入した線維芽細胞の遊走に作用した可能性は低かった。というのも、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて線維症が組織学的にはっきりする時点まで、抗体処理は遅らされたからである。一方、この治療法は、肺線維症の他のモデルに使用される場合、線維細胞の肺への動員に対して作用し得ると考えられる。ＣＣＲ７は線維細胞上で顕著に発現され（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１６６：７５５６−７５６３、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４  １１３：２４３−２５２）、またＣＣＬ２１は、様々な組織部位へのその動員を促進するからである（Ａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１６６：７５５６−７５６３）。ＣＣＲ７野生型マウス及び遺伝子欠陥マウスを用いたブレオマイシン誘導肺線維症においてＣＣＲ７陽性線維細胞の役割を検討すべく、研究が目下進行中である。
【０１４２】
養子移入されたヒトＩＩＰ線維芽細胞とマウス関連の線維症因子（すなわち細胞及びメディエーター）とが、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスで見られる肺再構築反応全体に厳密にどのように寄与しているかは、これから明らかにすべき課題である。本研究では、２種のＩＩＰ線維芽細胞のいずれかを非常に顕著に接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスの肺において、ネズミの細胞外マトリックス関連転写物及びネズミの可溶性前線維化タンパク質がダイナミックに変化したことから明らかなように、移入されたヒト線維芽細胞とマウスの要素の間に相互作用が存在すると考えられた。Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ線維症反応において検出された可溶性ネズミタンパク質の相対的な重要性は現時点において疑わしい。一方、正常線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群に対し、ＩＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において、カテプシンＥ、ＭＭＰ類、細胞外マトリックス成分（すなわちコラーゲン及びフィブロネクチン）、並びにＭＭＰ類の阻害因子が変化したことは、マウス関連の線維症因子が再構築反応に積極的にかかわっていることを意味し得る。定量的タックマンＰＣＲを行った結果、コラーゲン１、カテプシンＥ、ＭＭＰ−１９、及びＴＩＭＰ−１の転写物レベルは、正常線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおけるこれらの転写物レベルの変化に対し、ＩＩＰ線維芽細胞Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇ群において顕著に増加したことがわかった。これらの転写物の変化は、臨床上の肺線維症と関連性がある。というのも、カテプシン（Ｋｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ  ２００５，５２：９３−１００、Ｗａｔｔｉｅｚら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０００，２１：２７０３−２７１２）、ＭＭＰ類及びＴＩＭＰ類（Ｐａｒｄｏら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ．，２００６，３：３８３−３８８による総評）、並びに細胞外マトリックス（Ｋｕｈｎ及びＭａｓｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５、Ａｄａｃｈｉ  Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １９８８，１３３：１９３−２０３）は、ＩＩＰのより重症な形態（例えばＩＰＦ／ＵＩＰ及びＮＳＩＰ）において増加するからである。ＭＭＰ−１９は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞を接種したＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスにおいて非常に顕著に増加した。このプロテイナーゼは皮膚の傷の治癒反応において大きな役割を果たしているようである（Ｍａｕｃｈ  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３，１２１による解説）が、肺線維症におけるその役割は知られていない。ほぼ例外なく、抗ＣＣＬ２１抗体及び抗ＣＣＲ７抗体による治療は、定量的タックマンＰＣＲにより分析した上記ネズミ細胞外マトリックス関連遺伝子産物をすべて減少させた。一つの例外はＭＭＰ−１９であった。この知見及び我々の他の知見に照らし、ヒトＩＩＰ線維芽細胞の養子移入後に誘発される肺線維症反応においてＭＭＰ−１９が相対的に重要であるかどうかさらに研究する必要がある。
【０１４３】
まとめると、この実施例は、ＩＰＦ／ＵＩＰ又はＮＳＩＰのいずれかの一次線維芽細胞株をｉ．ｖ．養子移入すると、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに肺線維症を転移できることを裏付けている。このモデルは新たな治療法を試験するのに有用であることが証明された。また、これらの知見は、臨床上ＮＳＩＰ及びＩＰＦ／ＵＩＰにおいて、ＣＣＬ２１−ＣＣＲ７の相互作用が重要な標的となる可能性をさらに支持している。
【０１４４】
実施例５：特発性肺線維症の線維芽細胞はＣＣケモカインリガンド−２１に対して遊走し増殖する
本実施例の目的は、ＩＰＦ／ＵＩＰの肺外科生検試料及び正常な肺外科生検試料から増殖した一次線維芽細胞のＣＣＲ７発現について機能的重要性及びシグナル伝達上の重要性を調べることである。ＩＰＦ／ＵＩＰ患者及び正常な患者から得られた肺の生検試料から一次線維芽細胞を培養した。ＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）２１で処理した線維芽細胞又は処理しなかった線維芽細胞を、免疫細胞化学分析、遺伝子アレイ、タックマンリアルタイムＰＣＲ、移動、増殖、及びウェスタンブロットアッセイにより、機能的差、転写物差、及びプロテオーム差について分析した。
【０１４５】
ＣＣＲ７はＩＰＦ／ＵＩＰの線維芽細胞によって発現されたが、正常線維芽細胞によっては発現されなかった。ＣＣＬ２１に接触すると、ＩＰＦ／ＵＩＰの線維芽細胞は、顕著な遊走性及び増殖性の反応を示した一方、正常な線維芽細胞はそのような反応を示さなかった。ＣＣＬ２１は、百日咳毒又はＣＣＲ７に対する中和抗体によって阻害された。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞をＣＣＬ２１に接触させると、これらの細胞において、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、及びｐ９０ＲＳＫのリン酸化状態が変化した。それは、百日咳毒又はＣＣＲ７に特異的な小さな干渉ＲＮＡによって打ち消された。総合すると、これらのデータから、ＣＣＬ２１がＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の機能的特徴を調節する一方、正常線維芽細胞の機能的特徴を調節しないことが分かった。
【０１４６】
ＩＩＰのＳＬＢにおけるＣＣＲ７の間質発現から、本発明者らは、このケモカイン受容体が、ＳＬＢ由来の一次線維芽細胞において発現することができ、機能的に活性となり得ると考えた。本実験では、ＣＣＬ２１への接触により、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において遊走性及び増殖性の活性が認められたが、正常線維芽細胞においては認められなかった。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞をＣＣＬ２１に接触させると、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ１／２）のシグナル伝達経路に関係するタンパク質のリン酸化が変化した。これは、百日咳毒又はＣＣＲ７のｓｉＲＮＡによって阻止された。従って、これらのデータは、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞が、ＣＣＲ７依存性の活性化に応答するものであり、そのためＣＣＲ７はＩＰＦ／ＵＩＰにおいて好ましい標的であることを裏付けている。
【０１４７】
患者：すべての患者は、ファイバー気管支鏡検査の前に、胸部Ｘ線撮影、肺機能測定、及び薄切片コンピュータ断層撮影を含む臨床検査を受けた。これらの患者において、ＩＩＰの疑いは、症状の複雑さ、生理学的症状、及びＸ線撮影による知見から決定した。本研究に登録されたどの患者も、以前に生検外科手術を受けたことがなく、また、ＩＩＰの治療を受けたことがなかった。ＳＬＢは、２０００年５月〜２００３年５月の間に、ＵＩＰ又はＮＳＩＰであると疑われた患者から、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＩＩＰ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに付属するｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｅで採取された。ＳＬＢは、すでに詳述したようにＩＩＰのため診断上ＳＬＢを受けたすべての患者において、少なくとも２つの肺葉（通常左側）から採取された。各生検試料は、別々に、層流フード内において無菌の手法により処理され、一次線維芽細胞株の培養のため処理された（下記を参照）。
【０１４８】
線維芽細胞の分離と培養：上述したように、ＩＰＦ／ＵＩＰのＳＬＢ又は組織学的に正常なＳＬＢから、線維芽細胞を機械的に分離し、培養した（Ｈｏｇａｂｏａｍら、Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００５，１１７：２０９−２２１）。
【０１４９】
タンパク質の採集とＲＮＡの抽出：一次線維芽細胞を２．５×１０５細胞／ｍＬで１２ウェル組織培養プレートに配置し、一夜付着させた。線維芽細胞を、０．５％ＦＢＳ（ＤＭＥＭ−０．５）のみを含む又は１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１組換えタンパク質を含むダルベッコ改変イーグル培地のＰＢＳ５００μＬで１回洗浄し、４連ウェルに２４時間置いた。無細胞上清を採集し、可溶タンパク質含量を検定するまで−８０℃で保存した。上清を取り出した後、２５０μＬのＴｒｉｚｏｌを各ウェルに加え、製造者の説明（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）に従ってＲＮＡを抽出した。
【０１５０】
抗体：ウェスタン用の抗体は以下のものを含む：モノクローナル抗ヒトＣＣＲ７抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）、Ｐｈｏｓｐｏ−ｐ４４／４２  Ｍａｐキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ホスホ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）、ホスホ−ｐ９０ＲＳＫ（Ｔｈｒ５７３）、ホスホ−ＳＥＫ１／ＭＫＫ４（Ｓｅｒ２５７／Ｔｈｒ２６１）、ホスホ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、ホスホ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｓｅｒ６３）ＩＩ、ホスホ−ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ホスホ−ＭＫＫ３／ＭＫＫ６（ｓｅｒ１８９／２０７）（以上すべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンヴァース、マサチューセッツ州）、抗−βアクチン、抗−ＧＡＰＤＨ、α平滑筋アクチンに対するウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）。使用した二次抗体は以下のものであった：抗ウサギ、ＨＲＰ結合、抗マウス、ＨＲＰ結合、抗ビオチン、ＨＲＰ結合（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンヴァース、マサチューセッツ州）。
【０１５１】
遺伝子アレイ：ヒトのＣＣＲ７、ＣＣＬ１９、及びＣＣＬ２１の遺伝子発現は、ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ（カールズバッド、カリフォルニア州）から入手した特定のケモカイン及びケモカイン受容体の遺伝子アレイを使用して分析した。
【０１５２】
タックマン解析：ＣＣＲ７及びＧＡＰＤＨの発現は、上述（１９）したように、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いるリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞及び正常線維芽細胞において分析された。すべての抗体及びプローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、カリフォルニア州）から購入した。ＣＣＲ７の発現はＧＡＰＤＨに対して正規化し、そして発現変化の倍数を算出した。
【０１５３】
免疫細胞組織化学：ヒトＣＣＲ７タンパク質の発現は、ＨＲＰ−ＡＥＣ細胞組織染色キットを製造者の説明（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）に従って使用する免疫細胞化学により分析した。
【０１５４】
線維芽細胞遊走アッセイ：一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞及び一次正常線維芽細胞を、６ウェル細胞培養プレートにおいて、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１の存在下又は不在下、８μｍトランスウェル挿入物に加えて２４時間置いた。底のウェルに存在する遊走した線維芽細胞をヘマトキシリンで固定染色し、数えた。受容体又はリガンドの特異性について試験するため、５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＣＲ７抗体、抗ヒトＣＣＬ１９抗体、又は抗ヒトＣＣＬ２１抗体を各ウェルに加えた。対照として５μｇ／ｍＬのＩｇＧ又は１０μＬのＰＢＳを加えた。
【０１５５】
増殖アッセイ：線維芽細胞の増殖能は、上述（９）したとおり［３Ｈ］チミジンの取り込みに基づき、２４ウェル組織培養プレートにおいて調べた。
【０１５６】
Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイ：可溶性コラーゲン含量は、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ、ウェストベリー、ニューヨーク）を用いて測定した。アッセイのため、１００μＬの無細胞上清サンプルを１ｍＬのＳｉｒｃｏｌ  Ｄｙｅに加え、室温で３０分間振とうした。次いでチューブを１００００×ｇで１０分間遠心分離にかけた。染料を除去し、１ｍＬのアルカリ性溶液を各チューブに加え、十分に混合した。アッセイ読み取りのため、２００μＬの各溶液を、９６ウェル光学平底プレートに、２００μＬの標品とともに移した。次いでプレートをプレートリーダーを用いて５４０ｎｍで読み取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定されるように、濃度を全タンパク量に対して正規化した。
【０１５７】
Ｂｉｏｐｌｅｘプロテインアッセイ：無細胞上清サンプルを、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、カールズバッド、カリフォルニア州）及びＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ２００システム（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用い、ヒトＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５について分析した。簡単に述べると、５０μＬの無細胞上清サンプル及び標品を、５０μＬのマルチプレックスビーズとともに３０分間振とう機においてインキュベートした。ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで２５μＬの検出抗体溶液とともに３０分間振とう機においてインキュベートした。さらに３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＰＥを加え、そしてビーズを１０分間振とう機でインキュベートし、さらに３回洗浄した。次いでビーズをアッセイ緩衝液に再懸濁し、上記システムを用いて読み取った。
【０１５８】
ウェスタンブロット解析：線維芽細胞を５×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに配置し、一夜付着させた。次いで線維芽細胞を無血清ＤＭＥＭにおいて２４時間飢餓状態にした。線維芽細胞を、ＤＭＥＭのみにおいて又は１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１組換えタンパク質を含むＤＭＥＭにおいて、０．５％ウシ胎児血清で０．５、２、５、及び３０分間処理した。線維芽細胞の一部は、処理前に、２００ｎＭの百日咳毒（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）に２時間接触させた。次いで、線維芽細胞を、氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後、氷冷溶解緩衝液５００μＬ中で溶解した。溶解緩衝液は、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭのＮａＦ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、２００μＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、５μｇ／ｍＬのペプスタチン、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、及び１００ｎＭのカリクリンからなるものであった。氷上で５分間インキュベートした後、線維芽細胞の溶解物をかきとり、チューブに移した。総タンパク質含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。２０μｇの総タンパク質を含むサンプルを、４μＬの４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）及び脱イオン重水（ｄｄＨ２Ｏ）と混合し、９０℃で５分間沸騰させた後、４〜１２％のＮｕＰａｇｅ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）に移した。１×ＴＢＳ／Ｔ中５％ＮＦＤＭにおいてブロッキングを行い、膜を、一次ホスホ−抗体についてブロットし、ストリップし（Ｒｅｓｔｏｒｅ（商標）ウェスタンブロットストリッピング緩衝液、Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）、洗浄し、ＧＡＰＤＨ（ローディング対照）について再ブロットした。
【０１５９】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション：ＣＣＲ７の発現を阻止するため、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎカスタム合成サイトを使用して作製した。２種のｓｉＲＮＡ候補の有効性を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）によるＩＰＦ／ＵＩＰ肺線維芽細胞へのトランスフェクションを通じて調べ、ＣＣＲ７に対するタックマン解析により分析した。より有効なｓｉＲＮＡ（約７０％のノックダウン、ＡＧＣＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡ）を、Ｅｒｋ１／２経路リン酸化のウェスタンブロット解析に使用した。
【０１６０】
正常ＳＬＢ及びＩＰＦ／ＵＩＰのＳＬＢから増殖した線維芽細胞にはＣＣＲ７、ＣＣＬ１９、及びＣＣＬ２１の遺伝子発現が存在した：３つの正常な線維芽細胞株と３つのＩＰＦ／ＵＩＰ  ＳＬＢ由来線維芽細胞株を、特定のヒトケモカイン及びケモカイン受容体のＳｕｐｅｒＡｒｒａｙを用いるＲＮＡ解析に供した。この解析の結果、ＣＣＲ７、ＣＣＬ１９、及びＣＣＬ２１が両群に存在する一方、ＣＣＲ７の発現は、正常線維芽細胞株よりもＩＰＦ／ＵＩＰ株において顕著に高いことが分かった。タックマンリアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子発現をさらに解析した結果、この実験に使用したすべての線維芽細胞株において、ＣＣＲ７、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１に対する転写物の存在が確認された。従って、これらのデータは、正常線維芽細胞及びＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞に、ＣＣＲ７、ＣＣＬ１９、及びＣＣＬ２１の遺伝子転写物が存在することを裏付けるものであった。
【０１６１】
顕著なＣＣＲ７タンパク質発現は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において見られる一方、正常線維芽細胞においては見られなかった。本発明者らは、１００％に近いＵＩＰのＳＬＢが、間質領域において、局所的なＣＣＲ７タンパク質発現と散漫なＣＣＲ７タンパク質発現をあわせて示すことを明らかにした。また、この局所的なＣＣＲ７の領域が、組織学的にはっきりした線維芽細胞の病巣と一致しているようであった。正常ＳＬＢ及びＩＰＦ／ＵＩＰのＳＬＢから増殖した一次線維芽細胞がＣＣＲ７を発現したかどうか調べるために、ＣＣＲ７に対する免疫細胞化学染色を行った。ＩＰＦ／ＵＩＰの線維芽細胞は、ＣＣＲ７に対して強い陽性であったが、正常線維芽細胞は、ほとんど又は全くＣＣＲ７を発現しなかった。
【０１６２】
ＣＣＬ２１はＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の遊走を誘導したが、正常線維芽細胞の遊走は誘導しなかった。ＣＣＲ７の発現は、成熟樹状細胞上でアップレギュレートされ、それにより、これらの細胞は免疫活性化のためリンパ節に遊走させられる（Ｓｏｚｚａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６１（３）：１０８３−１０８６）。特定の乳房腫瘍細胞上で（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１０（６８２４）：５０−５６）そして黒色腫細胞上で（Ｍｕｒａｋａｍら、Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．，２００４，３６（２）：７１−７８）、ＣＣＲ７とＣＣＬ２１の相互作用が転移に重要であることが示された。本実験では、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１がともにＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の遊走を促進したが、正常線維芽細胞の遊走は促進しなかった。しかし、ＣＣＬ２１は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞遊走のより強い誘導因子であり、ＤＭＥＭのみと接触させたＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞培養物において見られたものより約７倍、これらの細胞の遊走を促進した。この遊走がＣＣＲ７依存性のものであるかどうか調べるため、ＩｇＧ抗体、抗ヒトＣＣＲ７抗体、又は抗ヒトＣＣＬ２１抗体（すべて５μｇ／ｍＬ）の１つを３連ウェルに加えた。ＩｇＧの存在はＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の遊走を変化させなかった一方、抗ＣＣＲ７抗体又は抗ＣＣＬ２１抗体の存在は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の遊走反応を顕著に阻害した。２００ｎｇ／ｍＬの百日咳毒で線維芽細胞を前処理すると、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において、やはりＣＣＬ２１に誘導される遊走反応が阻害された。従って、これらのデータは、ＣＣＲ７の活性化がＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の遊走を促進する一方、正常線維芽細胞の遊走を促進しないことを示していた。
【０１６３】
ＣＣＲ７の活性化は一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の増殖を刺激した。ＩＰＦ／ＵＩＰは、部分的に拡張性の線維増殖に起因して、肺における深刻な肺胞及び間質の瘢痕形成を特徴とする。本実験では、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞株の増殖反応の増加が見られたが、そこにおいて、３つのＩＰＦ／ＵＩＰ株はすべて、実験された正常線維芽細胞株よりも約３倍高いベースライン（すなわちＤＭＥＭのみ）増殖速度を示した。さらに、ＣＣＬ２１を１０ｎｇ／ｍＬで添加すると、ＤＭＥＭのみに接触させた培養物で見られたものに対し、３つの一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞株すべてについて増殖性が顕著に増加した。正常線維芽細胞の増殖性は、ＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１の存在によって変化しなかった。
【０１６４】
ＣＣＲ７の活性化は、一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞によるＣＣＬ５の生成を促進したが、デノボコラーゲン生成は促進しなかった。これまでの研究は、種々の細胞型においてケモカインが他のケモカインの発現を促進し得ることを示してきた。例えば、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞培養物へのＣＣＬ５の添加は、ＣＣＬ７（ＩＰＦ／ＵＩＰにおいて考えられるバイオマーカー）の発現を顕著に高めた。ＣＣＬ２１によるＣＣＲ７の活性化がＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞及び正常線維芽細胞のケモカイン生成特性を変化させるかどうか調べるため、可溶性多重タンパク質分析の前に、両群の線維芽細胞をＣＣＬ２１に接触させた。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞及び正常線維芽細胞の培養物においてＣＣＬ５が見られた。ＣＣＬ２１は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞においてＣＣＬ５レベルを顕著に増加させたが、正常線維芽細胞においては増加させなかった。予期せぬことに、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の培養物中に２４時間ＣＣＬ２１が存在しても、Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイを用いて測定した結果、可溶性コラーゲンの合成は変化しなかった。このデータは、これまでの実験からのデータとともに、ＣＣＲ７の活性化がＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞のケモカイン合成能を高めたことを示している。
【０１６５】
一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞及び正常線維芽細胞において、α平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）の発現はＣＣＬ２１によって変化しなかった。
【０１６６】
αＳＭＡは、筋線維芽細胞として知られる統合性の高い線維芽細胞サブタイプのタンパク質マーカーである（Ｗｈｉｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，２００６，１７３（１）：１１２−１１２１）。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞によるケモカインの合成に対してＣＣＬ２１が大きな影響を及ぼしたため、次に我々は、ＣＣＲ７のリガンドがこれらの細胞においてαＳＭＡの発現を変化させるかどうか調べた。ウェスタンブロット解析の結果、正常線維芽細胞の培養物に比べて、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の培養物は、より高いレベルのαＳＭＡを発現することがわかった。これは、ＩＰＦ／ＵＩＰ細胞のより高い合成特性に合致していた。しかし、αＳＭＡの発現は、ＣＣＬ２１の存在によって影響されなかった。αＳＭＡ陽性ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞はＣＣＲ７を発現した（免疫細胞化学分析に基づき）が、ＣＣＬ２１をこれらの細胞に添加しても、このタンパク質レベルのさらなる上昇はみられなかった。これは、ＣＣＲ７の活性化が、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化にとって重要な刺激でないことを示唆している。
【０１６７】
ＣＣＬ２１によるＣＣＲ７の活性化の後、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞におけるｐ４４／ｐ４２細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ１／２）シグナル伝達経路が活性化された。多くの重要な細胞機能が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路と総称される一群のシグナル伝達タンパク質によって制御されている。各経路が、成長因子、ストレス、及び炎症性サイトカインを含む個々の刺激因子によって活性化されるということに一部起因して、各経路は、細胞の周期、増殖、及び移動に特有の作用を及ぼしている。これらの刺激因子によって開始される活性化のカスケードは、ＭＡＰＫＫキナーゼ、ＭＡＰＫキナーゼ、及びＭＡＰＫの順次行われるリン酸化を伴っている。この最終工程は、ＭＡＰＫが核に入りそして１つ又はいくつかの下流にある転写因子を活性化するのを可能にし、それにより、生物反応（例えば細胞の増殖、移動、及び生存）がもたらされる。活性化ＣＣＲ７のＭＡＰＫ経路への影響を調べるため、未処理の及びＣＣＬ２１で活性化された線維芽細胞の関連タンパク質を３０秒、並びに２、５及び３０分において採集し、ＥＲＫ１／２、ｐ３８、及びｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）ＭＡＰＫ経路のウェスタンブロット解析を行った。ｐ３８及びＪＮＫ経路に関連するシグナル伝達タンパク質のリン酸化に変化はなかった一方、ＣＣＬ２１をＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の培養物に添加した後、ＥＲＫ１／２経路はリン酸化の変化の形跡を示した。また、ｃ−ＲＡＦ（この経路のＭＡＰＫＫＫ）のリン酸化の形跡はなかった。
【０１６８】
ＣＣＬ２１への接触の後、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞においてマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１／２）がリン酸化された。未処理の（すなわち血清飢餓状態の）一次正常線維芽細胞株及び一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞株は、構成的に活性化されたＭＥＫ１／２を示さなかった。ＤＭＥＭ−０．５のみを正常線維芽細胞に加えると、ＭＥＫ１／２のリン酸化が時間依存的に増加し、それは５分でピークに達した。しかし、このリン酸化プロファイルは、１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２１の存在によって変化しなかった。ＤＭＥＭ−０．５のみを加えると、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞においてＭＥＫ１／２の時間依存的活性化が促進され、活性化のピークは５分であった。一方、ＣＣＬ２１（１０ｎｇ／ｍＬで）を加えると、２分及び５分でリン酸化の増加が生じ、ＭＥＫ１／２リン酸化のレベルは３０分の終点で培地のレベルまで戻った。総合すると、これらのデータは、ＣＣＬ２１に接触させられたＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞においてＭＥＫ１／２の活性化が促進されたことを示唆した。
【０１６９】
ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞においてＣＣＬ２１はＥＲＫ１／２のリン酸化を促進した。未処理の一次正常線維芽細胞及び一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞は、構成的なＥＲＫ１／２のリン酸化を示したが、このＭＡＰＫのベースライン活性は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞（構成的ＥＲＫ１／２の活性化をほとんど示さなかった）よりも正常線維芽細胞においてより高いようであった。ＤＭＥＭ−０．５のみを正常線維芽細胞に加えると、５分でＥＲＫ１／２活性化のピークが生じた。ＤＭＥＭ−０．５に加えて１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２１に接触させた正常線維芽細胞の培養物では、類似のパターンのＥＲＫ１／２活性化が見られたが、ＥＲＫ１／２リン酸化の全体的なレベルは、これらの培養物においてより低かった。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の培養物において、ＤＭＥＭ−０．５のみを加えると、正常線維芽細胞培養物で見られたのと同様のパターンのＥＲＫ１／２リン酸化が生じた。しかし、活性化の強度は、正常線維芽細胞よりも、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において、はるかに大きかった。ＣＣＬ２１及びＤＭＥＭ−０，５に接触させられたＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の培養物では、ＤＭＥＭ−０．５のみに接触させられた同じ線維芽細胞培養物でのＥＲＫ１／２のリン酸化に比べて、２分でリン酸化の顕著な増加があった。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞における低い構成的ＥＲＫ１／２リン酸化のため、ＤＭＥＭ−０．５のみ又はＤＭＥＭ−０．５＋１０ｎｇ／ｍＬのＣＣＬ２１にこれらの細胞を接触させると、リン酸化のレベルは、未処理のＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞を含む培養物に対して、６０倍〜１２５倍の範囲で高くなった。
【０１７０】
ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞においてリボソームＳ６キナーゼ（ｐ９０ＲＳＫ）のリン酸化はＣＣＬによって促進された。ｐ９０ＲＳＫは、骨髄造血の環境においてケモカインＣＸＣＬ１２により活性化されることが明らかになっている（Ｌｅｅら、２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３０７−４３１７）。本実験においてｐ９０ＲＳＫを分析した結果、この転写因子（ＥＲＫ１／２の下流に位置する）は、未処理の正常線維芽細胞及びＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において、リン酸化された状態で存在することが明らかになった。ｐ９０ＲＳＫの活性化の変化は、ＣＣＬ２１の存在にかかわらず、正常線維芽細胞の培養物において類似していた。一方、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の培養物においては、試験したすべての時点で、ＣＣＬ２１の存在により、この転写因子のリン酸化は、未処理の培養物で見られたものより約２．５倍増加した。総合すると、これらのデータから、ＣＣＲ７は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において活性な受容体であり、この受容体は、少なくとも部分的にＥＲＫ１／２経路を介してシグナルを出しているようであることが分かった。正常線維芽細胞はＥＲＫ１／２経路の活性化を示したが、この活性化はＣＣＬ２１の存在に依存しないようであった。
【０１７１】
百日咳毒によるＧタンパク質阻害又は小さな干渉ＲＮＡによるＣＣＲ７遺伝子サイレンシングは、ＣＣＬ２１に媒介されるＥＲＫ１／２活性化を低減させた。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞活性化におけるＣＣＲ７の役割を確かめるため、さらに実験を行い、百日咳毒（Ｇｉ及びＧｏタンパク質阻害剤）又はｓｉＲＮＡが媒介するＣＣＲ７遺伝子サイレンシングにより、ＥＲＫ１／２活性化に対するＣＣＬ２１の効果が打ち消されるかどうか調べた。特異的なＣＣＲ７に対するｓｉＲＮＡを加えた結果、この受容体のタンパク質発現は、トランスフェクション後２４時間で約７０％減少した。ＣＣＲ７タンパク質発現の阻害は、この実験中、３０分間持続した。ラミンＡ／Ｃ特異的ｓｉＲＮＡ及びランダムなｓｉＲＮＡはいずれも、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において、ＣＣＲ７のタンパク質発現に影響しなかった。従って、これらのデータは、特異的なｓｉＲＮＡを用いることにより、インビトロでＣＣＲ７をうまく攻撃できたことを明らかにした。ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の培養物に百日咳毒又はＣＣＲ７のｓｉＲＮＡのいずれかを存在させると、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、及びｐ９０ＲＳＫのリン酸化は、ＤＭＥＭ−０．５のみに接触させた培養物で見られるレベルまで減少した。いくつかの研究は、一次ヒト肺線維芽細胞が、ケモカインに反応して前線維症の活性化を示すことを報告し（Ａｔａｍａｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００３，２９（６）：７４３−９、Ｋｅａｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５９（３）：１４３７−１４４３、Ｐｒａｓｓｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，２００６，１７３（７）７８１−７９２、Ｐｕｘｅｄｄｕら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６，１１７（１）：１０３−１１０）、また、一次ヒト肺線維芽細胞がケモカインの強い供給源であることを報告している（Ｋｅａｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，１５９（３）：１４３７−１４４３、Ｐｒａｓｓｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，２００６，１７３（７）７８１−７９）。
【０１７２】
本実験は、疾患の診断時に採取されたＳＬＢに由来する一次ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞によるＣＣＲ７発現の役割を調べた。切除された肺腫瘍の正常縁に由来する一次正常線維芽細胞とは対照的に、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞及びαＳＭＡ陽性筋線維芽細胞は、ＣＣＲ７（造血源の細胞に限定されていると考えられている受容体）を発現した。ＣＣＬ１９よりも顕著にＣＣＬ２１を介するＣＣＲ７の活性化は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞の遊走、増殖、及びケモカイン合成能を促進しかつ／又は顕著に増加させた。外因性ＣＣＬ２１は、ＣＣＲ７依存的に、ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ経路を活性化した。この実験から、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞がＣＣＲ７リガンド（疾患の状態にかかわらず肺で豊富に発現される（Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ，，２００６，５９（１）２８−３９））に応答する能力を獲得したこと、そして、この応答性が、ＩＰＦ／ＵＩＰを特徴づける過剰な線維増殖において大きな役割を果たしていることがわかった。
【０１７３】
まとめると、本実施例は、ＩＰＦ／ＵＩＰのＳＬＢに由来する一次ヒト線維芽細胞が機能的ＣＣＲ７を発現することを明らかにしている。そのリガンド（特にＣＣＬ２１）によるＣＣＲ７の活性化は、ＩＰＦ／ＵＩＰ線維芽細胞において、遊走、増殖、及びケモカイン合成を生じさせた。ＣＣＲ７を介してＣＣＬ２１により誘導される活性化は、Ｇタンパク質依存的であり、ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ経路の活性化を伴うものであった。このデータ、及びＣＣＬ２１を攻撃することにより実験的に糸球体の瘢痕形成が阻害されること（Ｂａｎａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，１６８（９）：４３０１−４３０７）及び肝臓の瘢痕形成が阻害されること（Ｂｏｎａｃｃｈｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００３，１２５（４）：１０６０−１０７６）を示す他の証拠から、ＣＣＲ７がＩＰＦ／ＵＩＰにおいて新たな標的となることが考えられる。さらにデータから、ＣＣＬ２１により誘導されるＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、及びｐ９０ＲＳＫのリン酸化は、機能的Ｇタンパク質結合シグナル伝達の事象とＣＣＲ７に依存することがわかった。
【０１７４】
本明細書及び後の特許請求の範囲を通じて、特に断らない限り、用語「包含する（備える、含む）」、又はその変形「包含し（備え、含み）」、「包含している（備えている、含んでいる）」は、記述した要素若しくは工程又は要素若しくは工程の群を包含することを意味すると解釈すべきであり、任意の他の要素若しくは工程又は要素若しくは工程の群を排除することを意味するものではない。
【０１７５】
本明細書及び特許請求の範囲に記載される組成物及び／又は方法のすべては、本開示を考慮すれば、過度な実験を行うことなく、実現及び実施することができるものである。本発明の組成物及び方法を特定の実施形態の観点から記載してきたが、該組成物及び方法の変形、ここに記載する方法の工程における変更、並びにここに記載する方法の工程の順序の変更が、本発明の概念、精神及び技術的範囲を逸脱することなく、可能であることは、当業者に明らかなことである。より具体的にいうと、化学的かつ生理学的に関連のある特定の薬剤を、ここに記載する薬剤の代わりに使用することができ、それによって同じ又は類似の結果が得られることは明らかなことである。当業者に明らかなそのような類似の置換及び修飾・変更はすべて、添付の特許請求の範囲に基づいて規定される本発明の精神、技術的範囲、及び概念の範囲内であるとみなされるものである。
【０１７６】
本明細書を通じて引用される文献は、具体的な手順や本明細書に記載された事項を補足するその他の詳細事項を提供するものである限り、その引用によりそれらの内容が本明細書に記載されたものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１Ａ】ＵＩＰ（ｎ＝７）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）腫瘍患者群からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＣＲ７の遺伝子発現のスーパーアレイ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ）遺伝子分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。有意差は検出されなかった。ＣＣＲ７はＣＣケモカイン受容体７、ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図１Ｂ】ＵＩＰ（ｎ＝７）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）腫瘍患者群からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現のスーパーアレイ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ）遺伝子分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。有意差は検出されなかった。ＣＸＣＲ４はＣＸケモカイン受容体４、ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図２Ａ】ＵＩＰ（ｎ＝７）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）腫瘍患者群からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＣＬ１９の遺伝子発現のスーパーアレイ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ）遺伝子分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。有意差は検出されなかった。ＣＣＬはＣＣケモカイン受容体リガンド、ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図２Ｂ】ＵＩＰ（ｎ＝７）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）腫瘍患者群からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＣＬ２１の遺伝子発現のスーパーアレイ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ）遺伝子分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。有意差は検出されなかった。ＣＣＬはＣＣケモカイン受容体リガンド、ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図２Ｃ】ＵＩＰ（ｎ＝７）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）腫瘍患者群からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＸＣＬ１２の遺伝子発現のスーパーアレイ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ）遺伝子分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。有意差は検出されなかった。ＣＸＣＬはＣＸケモカイン受容体リガンド、ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図３Ａ】ＵＩＰ（ｎ＝１８）、ＮＳＩＰ（ｎ＝８）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝６）の患者からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＣＲ７の遺伝子発現の定量的タックマン（Ｔａｑｍａｎ）ポリメラーゼ連鎖反応分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。＊＊ｐ＜０．０１（正常縁腫瘍患者群からの適当な肺葉に対して）、ＣＣＲ７はＣＣケモカイン受容体７、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図３Ｂ】ＵＩＰ（ｎ＝１８）、ＮＳＩＰ（ｎ＝８）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝６）の患者からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＣＬ２１の遺伝子発現の定量的タックマン（Ｔａｑｍａｎ）ポリメラーゼ連鎖反応分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。＊＊ｐ＜０．０１（正常縁腫瘍患者群からの適当な肺葉に対して）、ＣＣＬ２１はＣＣケモカイン受容体４リガンド、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図４Ａ】ＵＩＰ（ｎ＝１８）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）の患者からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＣＬ１９の酵素結合イムノソルベント検定分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。ＣＣＬはＣＣケモカイン受容体リガンド、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図４Ｂ】ＵＩＰ（ｎ＝１８）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）の患者からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＣＬ２１の酵素結合イムノソルベント検定分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。ＣＣＬはＣＣケモカイン受容体リガンド、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図４Ｃ】ＵＩＰ（ｎ＝１８）、ＮＳＩＰ（ｎ＝６）、ＲＢＩＬＤ（ｎ＝６）、及び正常縁（ｎ＝５）の患者からの肺上葉及び肺下葉の外科生検試料におけるＣＸＣＬ１２の酵素結合イムノソルベント検定分析を示している。示されるデータは平均（ＳＥＭ）である。ＣＸＣＬはＣＸケモカイン受容体リガンド、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図５】（Ａ，Ｂ）ＵＩＰ、（Ｃ，Ｄ）ＮＳＩＰ、（Ｅ，Ｆ）ＲＢＩＬＤ、及び（Ｇ，Ｈ）正常縁腫瘍患者群からのＳＬＢにおけるＣＣＲ７の典型的な免疫組織化学分析を示している。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、及び（Ｇ）は対照染色を示す。ＣＣＲ７の免疫反応性（赤の染色）が、（Ｂ）ＵＩＰ、（Ｄ）ＮＳＩＰ、及び（Ｆ）ＲＢＩＬＤからのＳＬＢの病巣領域に認められた一方、（Ｈ）正常縁からのものには認められなかった。当初の倍率６２００。ＣＣＲ７はＣＣケモカイン受容体７、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＳＬＢは肺の外科生検試料、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図６】（Ａ，Ｂ）ＵＩＰ、（Ｃ，Ｄ）ＮＳＩＰ、（Ｅ，Ｆ）ＲＢＩＬＤ、及び（Ｇ，Ｈ）正常縁腫瘍患者群からのＳＬＢにおけるＣＸＣＲ４の典型的な免疫組織化学分析を示している。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、及び（Ｇ）は対照染色を示す。ＣＸＣＲ４の免疫反応性（赤の染色）が、ＩＩＰ及び正常縁のＳＬＢに存在する単核細胞で認められた。当初の倍率６２００。ＣＸＣＲ４はＣＸケモカイン受容体４、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＳＬＢは肺の外科生検試料、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図７】（Ａ〜Ｃ）ＵＩＰ及び（Ｄ〜Ｆ）ＮＳＩＰ患者群からの一連の組織切片における（Ｂ，Ｅ）ＣＣＲ７及び（Ｃ，Ｆ）ＣＤ４５の典型的な免疫組織化学分析を示している。パネル（Ａ）及び（Ｄ）は対照染色を示す。ＵＩＰのＳＬＢにおいて、ＣＣＲ７の免疫反応性（Ｂにおいて赤の染色）は、ＣＤ４５の免疫反応性（Ｃ）と部分的に重なっていたが、二重染色の大部分は単核細胞（Ｃ）に関するものであった。（Ａ，Ｆ）一連の組織切片において、ＣＣＲ７及びＣＤ４５は、ＮＳＩＰのＳＬＢ中で共局在化しているとは認められなかった。当初の倍率６２００。ＣＣＲ７はＣＣケモカイン受容体７、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＳＬＢは肺の外科生検試料、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図８】（Ａ，Ｂ）ＵＩＰ、（Ｃ，Ｄ）ＮＳＩＰ、（Ｅ，Ｆ）ＲＢＩＬＤ、及び（Ｇ，Ｈ）正常縁腫瘍患者群からのＳＬＢにおけるＣＤ３４の典型的な免疫組織化学分析を示している。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、及び（Ｇ）は対照染色を示す。ＣＤ３４の免疫反応性（赤の染色）が、すべての患者のＳＬＢにおける間質領域で認められた。ＣＤ３４の最も高い発現は、ＮＳＩＰ患者群からのＳＬＢにおいて認められた。当初の倍率６２００。ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＳＬＢは肺の外科生検試料、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図９】（Ａ，Ｂ）ＵＩＰ、（Ｃ，Ｄ）ＮＳＩＰ、（Ｅ，Ｆ）ＲＢＩＬＤ、及び（Ｇ，Ｈ）正常縁腫瘍患者群からのＳＬＢにおけるコラーゲン１の典型的な免疫組織化学分析を示している。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、及び（Ｇ）は対照染色を示す。コラーゲンの免疫反応性（赤の染色）が、（Ｂ）ＵＩＰ、（Ｄ）ＮＳＩＰ、（Ｆ）ＲＢＩＬＤ、及び（Ｈ）正常縁腫瘍患者群からのＳＬＢを通じて広く存在していた。当初の倍率６２００。ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＳＬＢは肺の外科生検試料、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図１０】（Ａ〜Ｃ）ＵＩＰ及び（Ｄ〜Ｆ）ＲＢＩＬＤ患者群からのＳＬＢにおける（Ｂ，Ｅ）コラーゲン１及び（Ｃ，Ｆ）ＣＣＲ７の典型的な免疫組織化学分析を示している。パネル（Ａ）及び（Ｄ）は対照染色を示す。コラーゲン１の免疫反応性（赤の染色）が、（Ｂ）ＵＩＰ及び（Ｅ）ＲＢＩＬＤ患者群で存在していた。しかし、一連の組織切片において、コラーゲン１に免疫反応性の領域はＣＣＲ７の発現がなかった（Ｃ、ＵＩＰ；Ｆ、ＲＢＩＬＤ）。当初の倍率６２００。ＣＣＲ７はＣＣケモカイン受容体７、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＳＬＢは肺の外科生検試料、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図１１】（Ａ〜Ｃ）ＵＩＰ、（Ｄ〜Ｆ）ＮＳＩＰ、及び（Ｇ〜Ｉ）ＲＢＩＬＤ患者群からのＳＬＢにおける平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）の典型的な免疫組織化学分析を示している。パネル（Ａ）、（Ｄ）及び（Ｇ）は対照染色を示す。ＣＣＲ７の免疫反応性（赤の染色）が、（Ｂ）ＵＩＰ、（Ｅ）ＮＳＩＰ、及び（Ｈ）ＲＢＩＬＤの患者からのＳＬＢの病巣領域において認められた。一連の組織切片において、ａＳＭＡの発現（赤の染色）も、（Ｃ）ＵＩＰ、（Ｆ）ＮＳＩＰ、及び（Ｉ）ＲＢＩＬＤ患者群において認められた。しかし、ＣＣＲ７とａＳＭＡ発現との間で重なりは認められなかった。当初の倍率６２００。ＣＣＲ７はＣＣケモカイン受容体７、ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患、ＳＬＢは肺の外科生検試料、ａＳＭＡは平滑筋アクチン、ＵＩＰは通常型間質性肺炎である。
【図１２】種々の形態の慢性肺線維症患者からの肺の外科生検試料におけるＣＣＬ２１について、転写物発現を、他のタイプの非線維形成性障害を有する患者のものと比べた図である。ＣＣＬ２１の遺伝子発現（タックマンＰＣＲにより検査）は患者群の間でばらついていた。ＣＣＬ２１の最も高い発現は、上葉及び下葉の通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）ＳＬＢにおいて認められた。一方、ＵＩＰのＳＬＢとそれ以外のすべての群との差は、検査した下葉ＳＬＢにおいて最も顕著であった。同時にこれらのデータは、ＣＣＲ７とＣＣＬ２１の発現が、ＵＩＰにおいて顕著に高まることを示唆した。ＮＳＩＰは非特異的間質性肺炎、ＲＢＩＬＤは呼吸細気管支炎／間質性肺疾患である。
【図１３】種々の形態の慢性肺線維症患者からの肺の外科生検試料におけるＣＣＬ２１について、タンパク質発現を、他のタイプの非線維形成性障害を有する患者のものと比べた図である。ＩＩＰ及び非ＩＩＰの生検試料のＥＬＩＳＡをここに示す。上葉の生検試料において、ＣＣＬ２１のタンパク質レベルは、ＵＩＰ、ＮＳＩＰ及び非ＩＩＰ群の間で似通っていた。しかし、下葉の試料（ＩＩＰ患者において肺線維症がより侵攻性である）では、ＣＣＬ２１のレベルはＩＩＰ群においてより高かった（すなわち、非ＩＩＰ群に比べて、ＵＩＰ、ＮＳＩＰ、及びＲＢＩＬＤ群においてより高かった）。
【図１４】ＣＣＬ２１の存在によってＵＩＰ線維芽細胞の遊走は顕著に増加されたが、非ＩＩＰ線維芽細胞はそうではなかったことを示している。これらの実験では、ヒトの線維芽細胞を多孔性トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）培養プレート系に加え、２４時間のインキュベーションを通じて遊走した線維芽細胞を数えた。ＵＩＰ線維芽細胞は、トランスウェルを通じて底のウェルに遊走した。ＣＣＬ２１を底のウェルに加えると、あるいは、ＴＮＦ及びＣＣＬ２１で処理した線維芽細胞を底のウェルに加えると、この応答は顕著に増加した。抗ＣＣＬ２１抗体が存在することにより、後者の２つの群で線維芽細胞の遊走は顕著に減少したが、前者の群ではその効果がなかった。
【図１５Ａ】ここに示しているのは、正常のＳＬＢから成長した一次線維芽細胞株の増殖反応に対する、外来ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１（ともに１０ｎｇ／ｍＬで）の効果を検査したものである。ＵＩＰ線維芽細胞は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１リガンドの存在に対して増殖反応を示すことが明らかであった。
【図１５Ｂ】ここに示しているのは、過敏性肺炎のＳＬＢから成長した一次線維芽細胞株の増殖反応に対する、外来ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１（ともに１０ｎｇ／ｍＬで）の効果を検査したものである。ＵＩＰ線維芽細胞は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１リガンドの存在に対して増殖反応を示すことが明らかであった。
【図１５Ｃ】ここに示しているのは、サルコイドのＳＬＢから成長した一次線維芽細胞株の増殖反応に対する、外来ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１（ともに１０ｎｇ／ｍＬで）の効果を検査したものである。ＵＩＰ線維芽細胞は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１リガンドの存在に対して増殖反応を示すことが明らかであった。
【図１５Ｄ】ここに示しているのは、ＵＩＰのＳＬＢから成長した一次線維芽細胞株の増殖反応に対する、外来ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１（ともに１０ｎｇ／ｍＬで）の効果を検査したものである。ＵＩＰ線維芽細胞は、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１リガンドの存在に対して増殖反応を示すことが明らかであった。
【図１６】ＳＣＩＤマウスにＩＩＰ線維芽細胞を導入することによって間質性線維症の発症が認められたため、次の研究は、このモデルにおいて抗ＣＣＬ２１の抗線維症作用を評価するよう計画された。５匹のマウスの群が、最初３５日目に、そして１日おきに６３日目まで、ｉ．ｐ．注射により精製されたＩｇＧ又は抗ＣＣＬ２１抗体を投与された。６３日目に、肺組織が取り出され、そして典型的な切片が取り出された。ＩｇＧで処理されたマウスは、間質性線維症及び再構築の顕著な形跡を示した。一方、抗ＣＣＬ２１抗体で処理した群は、組織学的分析において、肺線維症の形跡をほとんど示さなかった。
【図１Ａ】
2009528977.tif 000002
【図１Ｂ】
2009528977.tif 000003
【図２Ａ】
2009528977.tif 000004
【図２Ｂ】
2009528977.tif 000005
【図２Ｃ】
2009528977.tif 000006
【図３Ａ】
2009528977.tif 000007
【図３Ｂ】
2009528977.tif 000008
【図４Ａ】
2009528977.tif 000009
【図４Ｂ】
2009528977.tif 000010
【図４Ｃ】
2009528977.tif 000011
【図５Ａ−５Ｈ】
2009528977.tif 000012
【図６Ａ−６Ｈ】
2009528977.tif 000013
【図７Ａ−７Ｆ】
2009528977.tif 000014
【図８Ａ−８Ｈ】
2009528977.tif 000015
【図９Ａ−９Ｈ】
2009528977.tif 000016
【図１０Ａ−１０Ｆ】
2009528977.tif 000017
【図１１Ａ−１１Ｉ】
2009528977.tif 000018
【図１２】
2009528977.tif 000019
【図１３】
2009528977.tif 000020
【図１４】
2009528977.tif 000021
【図１５Ａ】
2009528977.tif 000022
【図１５Ｂ】
2009528977.tif 000023
【図１５Ｃ】
2009528977.tif 000024
【図１５Ｄ】
2009528977.tif 000025
【図１６】
2009528977.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月23日(2009.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009528977000001.app
【国際調査報告】
2009528977.tif 000027