(57)【要約】  本発明は、活性化の際に第ＶＩＩＩａ因子／ＦＩＸａまたは第ＶＩＩａ因子／ＴＦのいずれかに対する必要性を迂回することのできる第Ｘ因子ポリペプチド、特にヒト第Ｘ因子およびその誘導体をコードする修飾型ｃＤＮＡ配列に関する。本発明はさらに、このような修飾型ｃＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、非修飾型の野生型タンパク質の生物学的活性を有するが活性化特性が変更されている組換えポリペプチドおよび誘導体、ならびにこのような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造法に関する。本発明はまた、このような修飾型ＤＮＡ配列を含む、ヒト遺伝子療法において使用するためのトランスファーベクターも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチベーションペプチド内に修飾を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体であって、その修飾により野生型第Ｘ因子のＡｒｇ１７９〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内には存在しないプロテアーゼプロセシング部位が形成され、かつＡｒｇ１７９〜Ｉｌｅ２３５に対応する残基間のアミノ酸数が野生型第Ｘ因子と比較して１〜５２アミノ酸減少している、上記第Ｘ因子変異体。
【請求項２】
アクチベーションペプチド内に修飾を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体であって、その修飾により野生型第Ｘ因子のＡｒｇ１７９〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内には存在しないプロテアーゼプロセシング部位が形成され、かつ修飾型アクチベーションペプチドは野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドよりも短い、上記第Ｘ因子変異体。
【請求項３】
プロテアーゼプロセシング部位を切断できるプロテアーゼによるプロテアーゼプロセシング部位の切断により第Ｘ因子変異体が活性化される、請求項１または２に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項４】
プロテアーゼは自然界では野生型第Ｘ因子を切断しない、請求項３に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項５】
プロテアーゼは自然界では野生型第Ｘ因子を活性化しない、請求項３または４に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項６】
プロテアーゼプロセシング部位は、セリンプロテアーゼによる第Ｘ因子変異体の活性化を実現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項７】
プロテアーゼプロセシング部位は、第ＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、活性化型プロテインＣ、エラスターゼ、またはカリクレインによる第Ｘ因子変異体の活性化を実現する、請求項６に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項８】
修飾型アクチベーションペプチドが４〜１５アミノ酸からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸２２６〜２３４が配列番号３に示されるアミノ酸配列で置換された第Ｘ因子アミノ酸配列を含み、対照因子変異体中のそのアクチベーションペプチドの長さが５２アミノ酸である対照第Ｘ因子変異体と比較してバイパス止血活性が増強されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸番号で、Ｇｌｕ２２６−Ｇｌｎ２２７−Ｓｅｒ２２８−Ｐｈｅ２２９−Ａｓｎ２３０−Ａｓｐ２３１−Ｐｈｅ２３２−Ｔｈｒ２３３−Ａｒｇ２３４の配列を含む対照第Ｘ因子変異体と比較してバイパス止血活性が増強されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項１１】
医薬物質として使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含むプラスミドまたはベクター。
【請求項１４】
発現ベクターである、請求項１３に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１５】
ヒト遺伝子療法において使用するためのトランスファーベクターである、請求項１３に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
第Ｘ因子変異体が発現する条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養し、場合により宿主細胞または培養培地から第Ｘ因子変異体を回収することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
血液凝固障害の処置または予防のための医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクター、または請求項１７に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２０】
血液凝固障害が血友病Ａである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
血友病ＡがＦＶＩＩＩに対する自己抗体に起因するまたはそれによって悪化する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
血液凝固障害が血友病Ｂである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
血友病ＢがＦＩＸに対する自己抗体に起因するまたはそれによって悪化する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
血液凝固障害がＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａ欠乏症である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２５】
ＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａ欠乏症がＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａに対する自己抗体に起因するまたはそれによって悪化する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
処置がヒト遺伝子療法を含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
凝血促進特性を有する医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第Ｘ因子変異体、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクター、または請求項１６に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化の際に第ＶＩＩＩａ因子／ＦＩＸａまたは第ＶＩＩａ因子／ＴＦのいずれかに対する必要性を迂回することのできる第Ｘ因子ポリペプチド、特にヒト第Ｘ因子およびその誘導体をコードする修飾型ｃＤＮＡ配列に関する。本発明はさらに、このような修飾型ｃＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、非修飾型の野生型タンパク質の生物学的活性を有するが活性化特性が変更されている組換えポリペプチドおよび誘導体、ならびにこのような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造法に関する。本発明はまた、このような修飾型ＤＮＡ配列を含む、ヒト遺伝子療法において使用するためのトランスファーベクターも包含する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫ依存性タンパク質は、特定のタイプの血友病の処置に使用されている。古典的な血友病すなわち血友病Ａは、遺伝性の出血障害である。血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のＸ染色体連鎖型欠乏に起因し、ほぼ男性のみが侵され、その発生率は１０,０００人に１〜２人である。Ｘ染色体の欠陥は、自身は血友病でない女性キャリアにより伝達される。血友病Ａの臨床的発現は、出血傾向の亢進である。第ＶＩＩＩ因子濃縮物による処置が実現する前の重度血友病患者の平均余命は２０年未満であった。血漿由来第ＶＩＩＩ因子濃縮物の使用およびその後の第ＶＩＩＩ因子の組換え形態の使用は、血友病患者を取り巻く状況を大いに改善し、平均余命を大きく延ばし、大部分の患者に多少なりとも普通の生活を行う機会を与えた。血友病Ａよりも有病率が５倍少ない血友病Ｂは、非機能的な第ＩＸ因子またはその欠失によって引き起こされ、血漿由来第ＩＸ因子濃縮物または組換え形態の第ＩＸ因子を用いて処置される。血友病Ａおよび血友病Ｂの両方における、疾患処置の際の最も大きな医学的問題は、置換因子に対する同種抗体の生成である。全血友病Ａ患者の最大３０％が第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を発生させる。ＦＩＸに対する抗体は、免疫寛容誘導療法に対する感受性が低いため、規模は小さいが重篤な結果をもたらす。
【０００３】
最新の凝固モデルは、生理学的な凝固誘発因子が、平時は血管外に存在し傷害が起きた場合にのみ接触可能となる組織因子（ＴＦ）発現細胞の表面上でのＴＦと第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）の間の複合体の形成であることを示している。第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体は第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化し、これらは最終的にいくつかのトロンビンを生成する。ポジティブフィードバックループにおいてトロンビンは第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を活性化し、次いでこれらはここでも第Ｘ因子、いわゆる血液凝固カスケードの「内因性」の経路を活性化し、それによって完全な止血を達成する完全なトロンビンバーストの発生に必要な第Ｘａ因子の生成を増幅する。超生理学的な濃度のＦＶＩＩａを投与することにより、第ＶＩＩＩａ因子および第ＩＸａ因子に対する必要性を迂回して止血が達成されることが示されている。第ＶＩＩ因子のｃＤＮＡのクローニング（ＵＳ  ４,７８４,９５０）は、血漿由来凝固因子の組換え置換法の開発を可能にした。この第ＶＩＩａ因子の、高力価のＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する患者に対する投与は、１９８８年に初めて成功した。それ以来、第ＶＩＩａ因子の適用数は着実に増加しており、このことは第ＶＩＩａ因子が一般的な止血剤となる可能性を示している（Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ，２００２）。残念ながら、第ＶＩＩａ因子はわずか２時間超の血漿半減期しか有さず、従って頻繁に再投与しなければならないため、このような治療法は侵襲的かつ非常に高価である。
【０００４】
このように、改善された凝固因子、特にバイパス止血剤（ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）である凝固因子に対する要望は現在も存在する。バイパス止血剤は、特定の凝固因子が欠失しているか、非機能的であるか、または阻害抗体によりブロックされている患者に投与された場合に、凝固を起こす物質である。このような化合物が凝固カスケードにおけるブロックを迂回する活性（バイパス止血活性）は、当該分野で公知の凝固アッセイによって測定することができる。本質的に、バイパス止血剤は、欠失した、非機能的な、またはブロックされた凝固因子が有効なトロンビン生成において必要とされないような直接的な方法で、欠失した、非機能的な、またはブロックされた凝固因子の「下流」の凝固カスケードにおいて欠失した、非機能的な、もしくはブロックされた凝固因子の基質またはその他の基質を活性化させる能力を有する。
【０００５】
第Ｘ因子もまた、大規模な研究の対象となっている。
【０００６】
第Ｘ因子のｃＤＮＡは特徴付けられている（Ｌｅｙｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８４，ＰＮＡＳ，８２：３６９９−３７０２）。凝固第Ｘ因子は、分子量５８．５ｋＤａの、ビタミンＫ依存的な糖タンパク質であり、チモーゲンとして肝細胞から血漿に分泌される。第Ｘ因子は始めに、合計４８８アミノ酸からなる、シグナルペプチドを有するプレプロペプチドとして産生される。シグナルペプチドは、小胞体に輸出される間にシグナルペプチダーゼによって切断され、プロペプチド配列は、成熟Ｎ末端鎖のＮ末端の最初の１１グルタミン酸残基においてガンマカルボキシル化が行われた後に切断される。さらなるプロセシング工程は、Ａｒｇ１８２とＳｅｒ１８３の間の切断によって行われる。このプロセシング工程はまた、同時に、トリペプチドＡｒｇ１８０−Ｌｙｓ１８１−Ａｒｇ１８２の除去も行う。生じる分泌型第Ｘ因子チモーゲンは、Ｃｙｓ１７２とＣｙｓ３４２の間のジスルフィド架橋を通じて共有結合的に連結された、１３９アミノ酸のＮ末端側軽鎖（Ｍr  １６,２００）および３０６アミノ酸のＣ末端側重鎖（Ｍr  ４２,０００）からなる。さらなる翻訳後プロセシング工程には、Ａｓｐ１０３のβ−ヒドロキシル化ならびにＮ型およびＯ型グリコシル化が含まれる。
【０００７】
第ＶＩＩＩａ因子／第ＩＸａ因子または第ＶＩＩａ因子／ＴＦは両方とも、生理学的条件下で、活性化型血小板表面の第Ｘ因子を、カルボキシ末端側からＡｒｇ２３４を切断しそれによってＳｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４の５２アミノ酸のいわゆるアクチベーションペプチドを遊離させることによって活性化することができる。
【０００８】
活性化型第Ｘ因子（第Ｘａ因子）は、自己触媒的切断において、その重鎖のカルボキシ末端側のＣ末端における小フラグメントからＡｒｇ４６４を切断し、第Ｘａβ因子を生じる。しかし、その両方の形態の第Ｘａ因子は同等の触媒活性を有するため、この切断の生理学的関係は不明確である。
【０００９】
第Ｘ因子を修飾する試みがいくつかなされている：
Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９１（ＪＢＣ，２６６，ｎｏ．２１，ｐｐ．１３７２６−１３７３０）は、第Ｘ因子のアクチベーションペプチドを除去してそれをジペプチドＡｒｇ−Ｌｙｓで置換することで、第Ｘ因子のアクチベーションペプチドの領域内に二つの新規のフューリン切断コンセンサス部位を導入した。このような第Ｘ因子変異体は、細胞内プロセシングの間にすでに活性化されるため、活性化型第Ｘ因子を分泌することになる。
【００１０】
Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９５（Ｂｌｏｏｄ，８６，ｐｐ４１５３−４１５７）は、血漿中に注入した後にゆっくりと脱アシル化され経時的に活性化型第Ｘ因子を生成する、第Ｘａ因子のアシル化不活性型変異体を作製した。
【００１１】
Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９７（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉ．，１０：３７３−３７８）は、プロペプチド切断部位の領域において第Ｘ因子を修飾し、Ｔｈｒ３９のＡｒｇ置換が細胞培養物中でのプロペプチドプロセシングの効果を大きく改善することを見出した。
【００１２】
Ｃａｍｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９  ｐｐ．１４３２２−１４３２９）は、第Ｘ因子のプレプロペプチドをトロンビンのそれで置換することによって、細胞培養においてより高い割合のガンマカルボキシル化を達成した。しかし、ガンマカルボキシル化の割合は増加したが、第Ｘ因子１０〜３０％は非カルボキシル化状態のままであった。
【００１３】
Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，８８：７５６−６２）は、アクチベーションペプチドが除去された第Ｘ因子変異体を作製した。このような第Ｘ因子変異体は補因子非依存的な様式で自己活性化することが見出され、この論文はアクチベーションペプチドの主たる機能がＦＸの誤った活性化を防止することであると結論付けている。
【００１４】
Ｔｈｉｅｃ  ｅｔ  ａｌ．２００３（ＪＢＣ，１２，ｐｐ１０３９３−１０３９９）は、第Ｘ因子のＧｌａドメインおよび最初のＥＧＦドメインをＦＩＸの対応するドメインで置換し、このようなキメラ体がＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体と生産的に相互作用する能力を調査した。
【００１５】
ＷＯ  ９８／３８３１７（優先日：１９９７年２月２７日）は、Ｇｌｙ２２８とＩｌｅ２３５の間の天然の活性化切断部位を修飾し、自然界では第Ｘ因子を活性化しないプロテアーゼがこのような第Ｘ因子アナログを切断および活性化できるようにした第Ｘ因子アナログをクレームしている。
【００１６】
ＷＯ  ９８／３８３１８（優先日：１９９７年２月２７日）は、アミノ酸Ａｒｇ１８０〜Ａｒｇ２３４が除去され、Ｇｌｙ１７３〜Ａｒｇ１７９までのアミノ酸が変更された第Ｘ因子アナログにより、自然界ではＦＸを活性化しないプロテアーゼがこの修飾配列を切断し、前記の第Ｘ因子アナログを活性化することができるようになったことを教示している。
【００１７】
ＷＯ  ０１／１０８９６（優先日：１９９９年８月１０日）は、Ｇｌｕ２２６〜Ｉｌｅ２３５の間のアミノ酸のうちの少なくとも一つが置換された第Ｘ因子アナログを記載する。その実施例において、その第Ｘ因子変異体をＦＸＩにより切断可能にするＦＩＸ由来の活性化切断部位の導入が示されている。
【００１８】
ＷＯ  ０３／０３５８６１（優先日：２００１年１０月１９日）は、そのアクチベーションペプチドを除去しフィブリノペプチドＡのアミノ酸Ｐ10〜Ｐ1で置換することで、この第Ｘ因子変異体をトロンビンにより活性化可能にするキメラトロンビン切断部位が作製された、第Ｘ因子の変異体をクレームしている。
【００１９】
ＷＯ  ２００４／００５３４７（優先日：２００２年７月３日）は、野生型第Ｘ因子においては  Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙである残基Ｐ3−Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1'−Ｐ2'−Ｐ3'をＸ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｙ−Ｚに変更することによって、トロンビンにより活性化することができるようになった第Ｘ因子の変異体を教示している。
【００２０】
Ｖｏｌｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００５），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９（１）：１９−３０は、ＦＸアクチベーションペプチドに新規のプロテアーゼ切断部位を導入することで、前立腺特異的抗原が当該ＦＸ変異体を特異的に活性化できるようになることを教示している。
【００２１】
数名の著者は、活性化型第Ｘ因子（ＦＸａ）をバイパス止血剤として使用する可能性を示唆しているが（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６７：２６４−２７１；Ｈｉｍｍｅｌｓｐａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８８：１００３−１０１１））、そのような製剤が血栓形成性であるかおよび播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を引き起このではないかといういくつかの懸念を残している。
【００２２】
非活性化型チモーゲン第Ｘ因子の治療的使用は、ずっと安全なアプローチのようである。米国特許第４,５０１,７３１号（優先日１９８３年６月２７日）は、第Ｘ因子をそのままバイパス止血剤として使用することを示唆している。ＷＯ  ０３／００６０５４（優先日：２００１年７月１０日）においてはさらに、薬学的組成物中の第Ｘ因子が、ＦＶＩＩａと組み合わせることで、ＦＶＩＩａの止血能を相乗作用的に増強することができることを示している。
【００２３】
しかし、内因性凝固経路を通じた第Ｘ因子の活性化の効果は、（組織因子の利用性の制限によって）外因性凝固経路が凝固の初期フェーズに限定されている阻害性患者（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）において大きく損なわれるので、凝固が必要とされる状況下での活性化ならびに利用性および／または活性が制限された補因子の必要性の迂回を手助けする様式で第Ｘ因子を修飾することが有益である。変異型第Ｘ因子チモーゲンは、活性化前の段階で作製および投与できるが、凝固活性（例えばトロンビン生成）が必要とされる場合に内因性および外因性凝固経路の天然の活性化因子を要せずに高い効率で活性化が起きるよう、安定でなければならない。
【００２４】
数名の著者は、自然界ではＦＸを切断および活性化しないプロテアーゼによって活性化することができる第Ｘ因子アナログを作製することを試みていることが記載されている。この第Ｘ因子アナログは、アクチベーションペプチドの除去またはＡｒｇ２３４における切断部位より前のアクチベーションペプチドの配列の修飾のいずれかを有する。しかし、これらの第Ｘ因子アナログは、不十分なバイパス止血活性しか示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明において取り組む一つの問題は、バイパス止血剤を同定することである。特に、第ＶＩＩＩ因子阻止因子の力価が高い患者の処置に使用することができるバイパス止血剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明においては、驚くべきことに、（ｉ）野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチド内に存在しないプロテアーゼ切断部位が形成されるよう、第Ｘ因子のアクチベーションペプチドを修飾し、（ｉｉ）アクチベーションペプチドおよび／または軽鎖のＣ末端領域のアミノ酸数を減らすことにより、増強されたバイパス止血活性を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体（図１）が獲得できることが見出された。
【００２７】
本発明においてアクチベーションペプチドは、第Ｘ因子内の、プロテアーゼ切断部位を含むＡｒｇ１７９〜Ａｒｇ２３４のペプチドまたはポリペプチドを意味し、このプロテアーゼ切断部位がプロテアーゼによって切断されると、第Ｘ因子が活性化された第Ｘａ因子となる。
【００２８】
本発明の一つの局面は、アクチベーションペプチド内に修飾を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体であって、その修飾により野生型第Ｘ因子のＡｒｇ１７９〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内には存在しないプロテアーゼプロセシング部位が形成され、かつＡｒｇ１７９〜Ｉｌｅ２３５に対応する残基間のアミノ酸数が野生型第Ｘ因子と比較して１〜５２アミノ酸減少している、第Ｘ因子変異体である。
【００２９】
本発明の別の局面は、アクチベーションペプチド内に修飾を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体であって、その修飾により野生型第Ｘ因子のＡｒｇ１７９〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内には存在しないプロテアーゼプロセシング部位が形成され、かつ修飾型アクチベーションペプチドは野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドよりも短い、第Ｘ因子変異体である。本発明の別の局面は、アクチベーションペプチド内に修飾を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体であって、その修飾により野生型第Ｘ因子のＳｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内には存在しないプロテアーゼプロセシング部位が形成され、かつ修飾型アクチベーションペプチドは野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドよりも短い、第Ｘ因子変異体である。
【００３０】
本発明はさらに、アクチベーションペプチド内に修飾を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体であって、その修飾により野生型第Ｘ因子のＳｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内には存在せずかつフューリンプロセシング部位ではないプロテアーゼプロセシング部位が形成され、修飾型アクチベーションペプチドが野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドよりも短い、第Ｘ因子変異体に関する。
【００３１】
野生型第Ｘ因子をコードするｃＤＮＡ配列および野生型第Ｘ因子のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される。本願において使用される場合、第Ｘ因子配列内におけるアミノ酸番号は、配列番号２に示される野生型配列のアミノ酸番号を意味する。
【００３２】
本発明に従う第Ｘ因子変異体は、新規に導入されたプロテアーゼプロセシング部位がこのプロテアーゼプロセシング部位を切断することができるプロテアーゼにより切断されることで活性化される。通常、本発明の第Ｘ因子変異体は、細胞内プロテアーゼ、例えばフューリンによって活性化できない。従って、本発明の第Ｘ因子変異体は、通常、Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９１（ＪＢＣ，２６６，ｎｏ．２１，ｐｐ．１３７２６−１３７３０）により記載された変異体とは逆で、宿主細胞で発現させた際にプロセシングを受けて第Ｘａ因子とならない。通常、本発明の第Ｘ因子変異体は、非活性化形態で患者に投与され、第Ｘａ因子への活性化は、患者体内への投与後にのみ起きる。
【００３３】
本発明の変異体は、それらのアクチベーションペプチド配列および／または軽鎖のＣ末端領域におけるアミノ酸数が、野生型第Ｘ因子のアミノ酸配列と比較して削減される。この変異体はＡｒｇ１７９〜Ｉｌｅ２３５に対応する残基間のアミノ酸数の削減、またはＡｒｇ１８０〜Ｉｌｅ２３５に対応する残基間のアミノ酸数の削減、またはＬｙｓ１８１〜Ｉｌｅ２３５に対応する残基間のアミノ酸数の削減、またはＡｒｇ１８２〜Ｉｌｅ２３５に対応する残基間のアミノ酸数の削減が行われ得；このアミノ酸数の削減は野生型第Ｘ因子のアミノ酸配列に対するものである。
【００３４】
好ましくは、本発明の変異体は、それらのアクチベーションペプチド配列におけるアミノ酸数が野生型第Ｘ因子のアミノ酸配列と比較して削減される。例えば、変異体は、野生型第Ｘ因子のアミノ酸配列と比較して、Ａｒｇ１８２〜Ｉｌｅ２３５に対応するアミノ酸残基間のアミノ酸数が削減され得る。
【００３５】
上記のアミノ酸数は、野生型第Ｘ因子と比較して、１〜５２アミノ酸、好ましくは５〜４９アミノ酸、より好ましくは１０〜４８アミノ酸、より好ましくは２０〜４７アミノ酸、さらにより好ましくは３０〜４７アミノ酸、最も好ましくは３８〜４７アミノ酸（例えば、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、または４６アミノ酸）削減される。
【００３６】
アミノ酸数の削減は、第Ｘ因子配列のアクチベーションペプチドおよび／または軽鎖からの一つまたはそれ以上のアミノ酸の除去によるものであり得る。野生型第Ｘ因子のアミノ酸配列に対する置換および挿入を含むがこれらに限定されない追加の変異も行われ得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテアーゼプロセシング部位」は、プロテアーゼにより認識および切断可能なアミノ酸配列を意味する。最終的にプロテアーゼにより切断される化学結合は、プロセシング部位内部またはプロセシング部位のＣ末端側に存在し得る。例えば、プロセシング部位がＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号３）である場合、実際の切断は、この配列のアルギニンのＣ末端側で行われ得る。好ましくは、新規のプロセシング部位は、修飾型アクチベーションペプチドのＣ末端領域、例えば野生型第Ｘ因子の活性化プロセシング部位が存在する領域に存在する。
【００３８】
プロテアーゼによるプロテアーゼプロセシング部位の切断は、第Ｘ因子変異体を活性化する。
【００３９】
本発明の別の局面において、第Ｘ因子変異体内の天然の第Ｘ因子アクチベーションペプチドは、自然界では第Ｘ因子を活性化するプロテアーゼがこの第Ｘ因子変異体を切断および活性化できないように修飾される。これは、第Ｘ因子のアクチベーションペプチド配列に変異を導入することによって達成され得る。変異には、挿入、欠失、および置換が含まれる。自然界では第Ｘ因子を活性化するプロテアーゼがこの第Ｘ因子変異体を切断および活性化できず、新規のプロテアーゼプロセシング部位を通じてのみ活性化が行われるようにするアクチベーションペプチド配列における欠失および／または置換が好ましい。最も好ましくは、野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドに存在するプロテアーゼプロセシング部位は、自然界では野生型第Ｘ因子を切断および活性化しないプロテアーゼに対するプロテアーゼプロセシング部位で置換される。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によれば、修飾型第Ｘ因子変異体のアクチベーションペプチド内の新規のプロテアーゼプロセシング部位は、セリンプロテアーゼによって切断できるものである。より好ましくは、セリンプロテアーゼは、第ＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、活性化型プロテインＣ、エラスターゼ、またはカリクレインからなる群より選択される。
【００４１】
一つの実施態様において、本発明の第Ｘ因子変異体における修飾型アクチベーションペプチドは、次式：
−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−
［式中、Ｐは切断プロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列、すなわち切断プロテアーゼによって認識および切断することができる、「プロセシング部位」とも称されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ1は、化学結合または一つもしくはそれ以上のアミノ酸（例えば１〜４８アミノ酸）を意味し、
Ｒ2は、化学結合または一つもしくはそれ以上のアミノ酸（例えば１〜５アミノ酸）を意味する］
により表される。
【００４２】
本発明に従う第Ｘ因子変異体における修飾型アクチベーションペプチドは、好ましくは、野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドよりも短い。従って、−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−の最大の長さは通常５１アミノ酸である。−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−の全体の長さは、好ましくは、３〜４０アミノ酸、より好ましくは４〜４０アミノ酸、さらにより好ましくは５〜３０アミノ酸、さらにより好ましくは６〜２０アミノ酸、最も好ましくは７〜１５アミノ酸、例えば７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸の範囲である。
【００４３】
Ｒ1は、最大４８アミノ酸の長さを有し得る。しかし、好ましくは、Ｒ1は、化学結合または１〜２０、好ましくは１〜１０アミノ酸（例えば１、２、または３アミノ酸）からなる。Ｒ1は、野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドの部分配列であり得る。５２アミノ酸からなる野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４に示される。例えば、Ｒ1は、配列番号４のアミノ酸１〜４５のＮ末端側またはその内部フラグメントを含むかまたはこれらからなり得る。Ｒ1の例には、以下の配列が含まれるがこれらに限定されない：
配列番号４のアミノ酸１（すなわちアミノ酸番号１＝Ｓｅｒ）；
配列番号４のアミノ酸１〜２（すなわちＳｅｒ−Ｖａｌ）；
配列番号４のアミノ酸１〜３（すなわちＳｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ）；
配列番号４のアミノ酸１〜４；配列番号４のアミノ酸１〜５；
配列番号４のアミノ酸１〜６；配列番号４のアミノ酸１〜７；
配列番号４のアミノ酸１〜８；配列番号４のアミノ酸１〜９；
配列番号４のアミノ酸１〜１０；配列番号４のアミノ酸１〜１１；
配列番号４のアミノ酸１〜１２；配列番号４のアミノ酸１〜１３；
配列番号４のアミノ酸１〜１４；配列番号４のアミノ酸１〜１５；
配列番号４のアミノ酸１〜１６；配列番号４のアミノ酸１〜１７；
配列番号４のアミノ酸１〜１８；配列番号４のアミノ酸１〜１９；
配列番号４のアミノ酸１〜２０；配列番号４のアミノ酸１〜２１；
配列番号４のアミノ酸１〜２２；配列番号４のアミノ酸１〜２３；
配列番号４のアミノ酸１〜２４；配列番号４のアミノ酸１〜２５；
配列番号４のアミノ酸１〜２６；配列番号４のアミノ酸１〜２７；
配列番号４のアミノ酸１〜２８；配列番号４のアミノ酸１〜２９；
配列番号４のアミノ酸１〜３０；配列番号４のアミノ酸１〜３１；
配列番号４のアミノ酸１〜３２；配列番号４のアミノ酸１〜３３；
配列番号４のアミノ酸１〜３４；配列番号４のアミノ酸１〜３５；
配列番号４のアミノ酸１〜３６；配列番号４のアミノ酸１〜３７；
配列番号４のアミノ酸１〜３８；配列番号４のアミノ酸１〜３９；
配列番号４のアミノ酸１〜４０；配列番号４のアミノ酸１〜４１；
配列番号４のアミノ酸１〜４２；配列番号４のアミノ酸１〜４３；
配列番号４のアミノ酸１〜４４；および配列番号４のアミノ酸１〜４５。
【００４４】
Ｒ2が化学結合または１もしくは２アミノ酸からなることがさらに好ましい。最も好ましくは、Ｒ2は化学結合である。
【００４５】
一般的に、新規に導入されたプロテアーゼ切断部位が切断される際に切断される化学結合のＣ末端側のアミノ酸は、好ましくはイソロイシンまたはバリンである。このアミノ酸は、好ましくは後ろにバリンが続くものである。他の好ましい、新規に導入されたプロテアーゼ切断部位が切断される際に切断される化学結合のＣ末端側のアミノ酸は、アラニン、セリン、またはスレオニンである。
【００４６】
Ｒ2が化学結合の場合、新規に導入されたプロテアーゼ切断部位が切断される際に切断される化学結合のＣ末端側のアミノ酸は、第Ｘ因子変異体の重鎖のＮ末端アミノ酸であり、これはＩｌｅ２３５に対応する。このアミノ酸は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり得る。好ましくは、Ｉｌｅ２３５に対応するアミノ酸はＩｌｅまたはＶａｌである。Ｖａｌ２３６に対応するアミノ酸は好ましくはＶａｌである。
【００４７】
別の実施態様において、Ｒ2はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、またはＶａｌ−Ｖａｌであり得る。
【００４８】
Ｐは、少なくとも３アミノ酸、好ましくは３０アミノ酸を超えない長さを有する。好ましくは、Ｐは、４〜１５アミノ酸、より好ましくは４〜１０アミノ酸の長さを有する。プロテアーゼによる切断は、通常、ＰのＣ末端側で起こる。Ｐは、切断プロテアーゼにより切断されるタンパク質の部分アミノ酸配列であり得る。あるいは、Ｐは、切断プロテアーゼによって切断可能な非天然または人工のアミノ酸配列であり得る。
【００４９】
適当なプロテアーゼによって切断されかつ適当なプロテアーゼプロセシング部位を含むタンパク質には、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、抗トロンビンＩＩＩ、第ＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン等の凝固因子およびセルピン、ならびに当業者に公知のそれらのアミノ酸配列が含まれる（下記参照）。従って、Ｐは、これらのタンパク質のいずれか一つの、プロテアーゼプロセシング部位を含む部分配列またはフラグメントであり得る。切断プロテアーゼによって切断可能である限り、これらのプロセシング部位のバリエーションも本発明に包含される。このバリエーションは、アミノ酸置換、欠失、挿入、およびそれらの組み合わせを含む。
【００５０】
セリンプロテアーゼにより認識および切断することができるアミノ酸配列を含む適当なアミノ酸配列Ｐは、次項（ｉ）〜（ｉｖ）に示される：
（ｉ）  ＦＶＩＩに由来し例えば第Ｘａ因子により切断することができるアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＬＥＫＲＮＡＳＫＰＱＧＲ（配列番号５）である。ＦＶＩＩに由来し例えば第Ｘａ因子により切断することができるアミノ酸配列のさらなる例は、
配列番号５のアミノ酸２〜１２；
配列番号５のアミノ酸３〜１２；
配列番号５のアミノ酸４〜１２；
配列番号５のアミノ酸５〜１２；
配列番号５のアミノ酸６〜１２；
配列番号５のアミノ酸７〜１２；または
配列番号５のアミノ酸８〜１２；
からなるアミノ酸配列である。
（ｉｉ）  ＦＩＸに由来し例えばＦＸＩａにより切断することができるアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号６）である。ＦＶＩＩに由来し例えばＦＸＩａにより切断することができるアミノ酸配列のさらなる例は、
配列番号６のアミノ酸２〜３５；配列番号６のアミノ酸３〜３５；
配列番号６のアミノ酸４〜３５；配列番号６のアミノ酸５〜３５；
配列番号６のアミノ酸６〜３５；配列番号６のアミノ酸７〜３５；
配列番号６のアミノ酸８〜３５；配列番号６のアミノ酸９〜３５；
配列番号６のアミノ酸１０〜３５；配列番号６のアミノ酸１１〜３５；
配列番号６のアミノ酸１２〜３５；配列番号６のアミノ酸１３〜３５；
配列番号６のアミノ酸１４〜３５；配列番号６のアミノ酸１５〜３５；
配列番号６のアミノ酸１６〜３５；配列番号６のアミノ酸１７〜３５；
配列番号６のアミノ酸１８〜３５；配列番号６のアミノ酸１９〜３５；
配列番号６のアミノ酸２０〜３５；配列番号６のアミノ酸２１〜３５；
配列番号６のアミノ酸２２〜３５；配列番号６のアミノ酸２３〜３５；
配列番号６のアミノ酸２４〜３５；配列番号６のアミノ酸２５〜３５；
配列番号６のアミノ酸２６〜３５；配列番号６のアミノ酸２７〜３５；
配列番号６のアミノ酸２８〜３５；配列番号６のアミノ酸２９〜３５；
配列番号６のアミノ酸３０〜３５；または配列番号６のアミノ酸３１〜３５；
からなるアミノ酸配列である。
（ｉｉｉ）  抗トロンビンＩＩＩに由来し例えば第ＩＩａ因子により切断することができるアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＧＳＥＡＡＡＳＴＡＶＶＩＡＧＲＳ（配列番号７）である。抗トロンビンＩＩＩに由来し例えば第ＩＩａ因子により切断することができるアミノ酸配列のさらなる例は、抗トロンビンＩＩＩを切断することができるプロテアーゼにより切断可能な配列番号７のフラグメントである。
（ｉｖ）  さらなるプロテアーゼ切断部位の非限定的な例は、第ＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、活性化型プロテインＣ、エラスターゼ、またはカリクレインにより切断することができるアミノ酸配列である。これらのセリンプロテアーゼにより認識および切断されるアミノ酸配列は、当業者に公知である（例えば“Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１に記載されている。第ＩＩａ因子：ｐ３４−３５、ｐ１７６、第ＩＸａ因子：ｐ４０−４１、第Ｘａ因子：ｐ３４−３５、第ＸＩａ因子  ｐ１２８−１２９、第ＸＩＩａ因子：ｐ１９４、ａＰＣ：ｐ３４−３５、ｐ１５９、カリクレイン：ｐ１０３−１０４、またはエラスターゼ（Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｐｉｎ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１９２６−１９２８））。これらのアミノ酸配列は、参照により本明細書に援用される。
【００５１】
プロテアーゼ切断部位のフラグメントもまた、そのような断片化したプロテアーゼ切断部位を含むＦＸ変異体が依然として切断に対して感受性でありかつそのＦＸ変異体が依然として生物学的活性を有する限り、本発明に包含される。
【００５２】
構造−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−内のプロセシング部位Ｐが配列番号５、配列番号６、配列番号７、ならびに上記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）項に記載されるそれらの切断可能なフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００５３】
第Ｘ因子配列の天然型の軽鎖のＣ末端の一つまたはそれ以上のアミノ酸が除去去れ得ることも見出された。従って、本発明の第Ｘ因子変異体は、修飾型アクチベーションペプチドＲ1−Ｐ−Ｒ2に隣接する次の構造：
ＬＣ−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−
［式中、Ｒ1、ＰおよびＲ2の意味は上記の通りであり、
ＬＣは第Ｘ因子配列の軽鎖のＣ末端アミノ酸を意味し、
ＨＣ１は第Ｘ因子配列の重鎖のＮ末端アミノ酸を意味し、ＨＣ２は第Ｘ因子配列の重鎖の二番目のアミノ酸を意味する］
を含み得る。ＨＣ１は野生型配列におけるＩｌｅ２３５に対応する。ＨＣ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり得る。好ましくは、ＨＣ１はＩｌｅまたはＶａｌである。ＨＣ２は野生型配列におけるＶａｌ２３６に対応する。ＨＣ２はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり得る。好ましくは、ＨＣ２はＩｌｅまたはＶａｌであり；より好ましくは、ＨＣ２はＶａｌである。
【００５４】
ＬＣは、Ａｒｇ１７９〜Ａｒｇ１８２のアミノ酸残基のいずれか一つまたはそれ以上であり得る。ＬＣは、好ましくは、Ａｒｇ１８２、Ｌｙｓ１８１、Ａｒｇ１８０、およびＡｒｇ１７９からなる群より選択される。
【００５５】
より具体的には、本発明の第Ｘ因子変異体は、次の構造：
−Ａｒｇ１８２−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−；好ましくは−Ｌｙｓ１８１−Ａｒｇ１８２−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−；より好ましくはＡｒｇ１８０−Ｌｙｓ１８１−Ａｒｇ１８２−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−
［式中、Ｒ1、ＰおよびＲ2、ＨＣ１およびＨＣ２の意味は上記の通りである］
を含み得る。
【００５６】
別の実施態様において、Ａｒｇ１８２に対応するアミノ酸もまた除去される。従って、本発明の第Ｘ因子変異体は、次の構造：
−Ｌｙｓ１８１−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−；好ましくはＡｒｇ１８０−Ｌｙｓ１８１−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−
［式中、Ｒ1、ＰおよびＲ2、ＨＣ１およびＨＣ２の意味は上記の通りである］
を含み得る。
【００５７】
さらに別の実施態様において、Ｌｙｓ１８１およびＡｒｇ１８２に対応するアミノ酸もまた除去される。従って、本発明の第Ｘ因子変異体は、次の構造：
Ａｒｇ１８０−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−
［式中、Ｒ1、ＰおよびＲ2、ＨＣ１およびＨＣ２の意味は上記の通りである］
を含み得る。
【００５８】
さらに別の実施態様において、Ａｒｇ１８０、Ｌｙｓ１８１、およびＡｒｇ１８２に対応するアミノ酸もまた除去される。従って、本発明の第Ｘ因子変異体は、次の構造：
Ａｒｇ１７９−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ１−ＨＣ２−
［式中、Ｒ1、ＰおよびＲ2、ＨＣ１およびＨＣ２の意味は上記の通りである］
を含み得る。
【００５９】
特定の局面において、ＬＣ１は、Ｐが第ＩＸ因子アミノ酸配列由来の少なくとも７連続アミノ酸を含む第ＩＸ因子の部分アミノ酸配列である場合、Ｐｒｏ１７１〜Ａｒｇ１８２のアミノ酸残基（配列番号２を参照のこと）のいずれか一つであり得る。本発明のこの局面によれば、Ｐは、
配列番号６のアミノ酸１〜３５、配列番号６のアミノ酸２〜３５、
配列番号６のアミノ酸３〜３５、配列番号６のアミノ酸４〜３５、
配列番号６のアミノ酸５〜３５、配列番号６のアミノ酸６〜３５、
配列番号６のアミノ酸７〜３５、配列番号６のアミノ酸８〜３５、
配列番号６のアミノ酸９〜３５、配列番号６のアミノ酸１０〜３５、
配列番号６のアミノ酸１１〜３５、配列番号６のアミノ酸１２〜３５、
配列番号６のアミノ酸１３〜３５、配列番号６のアミノ酸１４〜３５、
配列番号６のアミノ酸１５〜３５、配列番号６のアミノ酸１６〜３５、
配列番号６のアミノ酸１７〜３５、配列番号６のアミノ酸１８〜３５、
配列番号６のアミノ酸１９〜３５、配列番号６のアミノ酸２０〜３５、
配列番号６のアミノ酸２１〜３５、配列番号６のアミノ酸２２〜３５、
配列番号６のアミノ酸２３〜３５、配列番号６のアミノ酸２４〜３５、
配列番号６のアミノ酸２５〜３５、配列番号６のアミノ酸２６〜３５、
配列番号６のアミノ酸２７〜３５、配列番号６のアミノ酸２８〜３５、および
配列番号６のアミノ酸２９〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｐは配列番号３からなる。
【００６０】
別の実施態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸Ｓｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４が−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−［式中、Ｒ1、Ｐ、およびＲ2の意味は上記の通りである］で置換された第Ｘ因子アミノ酸配列を含む第Ｘ因子変異体に関する。本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸Ａｒｇ１８２〜Ａｒｇ２３４が−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−［式中、Ｒ1、Ｐ、およびＲ2の意味は上記の通りである］で置換された第Ｘ因子アミノ酸配列を含む第Ｘ因子変異体に関する。別の実施態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸Ｌｙｓ１８１〜Ａｒｇ２３４が−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−［式中、Ｒ1、Ｐ、およびＲ2の意味は上記の通りである］で置換された第Ｘ因子アミノ酸配列を含む第Ｘ因子変異体に関する。さらに別の実施態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸Ａｒｇ１８０〜Ａｒｇ２３４が−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−［式中、Ｒ1、Ｐ、およびＲ2の意味は上記の通りである］で置換された第Ｘ因子アミノ酸配列を含む第Ｘ因子変異体に関する。
【００６１】
好ましい局面において、本発明の第Ｘ因子変異体は、配列番号２のアミノ酸Ｓｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４が、配列番号５〜７のアミノ酸配列のいずれか一つまたは本明細書中上記の（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）項のいずれか一つに記載されるそれらのフラグメントで置換された第Ｘ因子アミノ酸配列を含む。配列番号２のアミノ酸Ｓｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４が、配列番号３に示されるアミノ酸配列で置換された第Ｘ因子アミノ酸配列を含む第Ｘ因子変異体が最も好ましい。最も好ましい第Ｘ因子変異体の完全アミノ酸配列は、配列番号８および配列番号９に示される。
【００６２】
本明細書中上記の新規のプロテアーゼプロセシング部位が第Ｘ因子分子の重鎖に導入された実施態様もまた本発明に包含される。重鎖に導入されたプロテアーゼプロセシング部位は、修飾型アクチベーションペプチドに存在するプロテアーゼプロセシング部位に加えて追加のプロセシング部位である場合も、修飾型アクチベーションペプチドのプロテアーゼプロセシング部位の代わりに存在する場合もある。重鎖への挿入は、好ましくは、Ｉｌｅ２３５または対応する残基（例えばＶａｌ）のＣ末端側になされる。第Ｘ因子の重鎖への挿入は、２００５年６月１日に出願された欧州特許出願０５０１１７７３．８に詳細に記載されており、その開示内容を参照により本明細書に援用する。当該出願に記載される実施態様は、本願に記載される実施態様と組み合わせることができる。
【００６３】
例えば、本発明は、式
−ＬＣ−Ｒ1−ＨＣ１−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ２−
［式中、ＬＣ、Ｒ1、Ｐ、Ｒ2、ＨＣ１、およびＨＣ２の意味は上記の通りである］
により特徴付けられる第Ｘ因子変異体を包含する。この例において、Ｒ2は、好ましくは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒのうちの一つであり、最も好ましくは、Ｒ2はＩｌｅまたはＶａｌである。
【００６４】
このような実施態様の別の例は、式
−ＬＣ−Ｒ1−ＨＣ１−ＨＣ２−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−ＨＣ３−
［式中、ＬＣ、Ｒ1、Ｐ、Ｒ2、ＨＣ１、およびＨＣ２の意味は上記の通りであり、ＨＣ３は第Ｘ因子の重鎖の三番目のアミノ酸を意味する］
の変異体である。この実施態様において、Ｒ2は、好ましくは、Ｉｌｅ−ＶａｌまたはＶａｌ−Ｖａｌである。
【００６５】
本発明の第Ｘ因子変異体は、第Ｘ因子配列内の他の位置にさらなる修飾を有し得る。従って、第Ｘ因子のアクチベーションペプチド内の修飾および部分欠失は、配列番号２に示される野生型配列のアミノ酸配列に対するいくつかの修飾のうちの一つであり得る。３９位のスレオニンがアルギニンで置換されることが好ましい。
【００６６】
一つの具体的な実施態様において、本発明の第Ｘ因子変異体は、Ｇｌｙ１７３〜Ａｒｇ１７９の間の第Ｘ因子アミノ酸配列内に修飾を有さない。別の実施態様において、本発明の第Ｘ因子変異体は、Ｇｌｙ１７３〜Ａｒｇ１７９の間の第Ｘ因子アミノ酸配列内に修飾を有するが、このＧｌｙ１７３〜Ａｒｇ１７９の間の第Ｘ因子アミノ酸配列内の修飾は、自然界では配列番号２のＧｌｙ１７３〜Ａｒｇ１７９の間を切断しないプロテアーゼに対するプロセシング部位をもたらすものではない。Ｇｌｙ１７３〜Ａｒｇ１７９の間の第Ｘ因子アミノ酸配列内の修飾は、一つまたはそれ以上の（例えば１、２、または３個の）アミノ酸の欠失、置換、および／または挿入であり得る。
【００６７】
他の具体的な実施態様において、野生型第Ｘ因子配列のアクチベーションペプチド（すなわちアミノ酸Ｓｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４）は配列ＲＫＲで置換されていないか；上記の構造−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−はＲＫＲではないか；または第Ｘ因子変異体は配列−Ａｒｇ１８２−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−［Ｉｌｅ２３５］−を有さない。
【００６８】
別の実施態様において、野生型第Ｘ因子のＳｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内に存在しないプロテアーゼプロセシング部位は、ＲＫＲＲＫではない。
【００６９】
本発明の第Ｘ因子変異体は、生物学的活性を有する。本明細書中で使用される場合、用語「生物学的活性」は、第Ｘ因子活性を意味する。第Ｘ因子活性を有するタンパク質は、そのチモーゲン形態のタンパク質がプロテアーゼによる切断を通じて活性化され得、かつその活性化形態において第Ｘａ因子活性を有することを意味する。第Ｘ因子活性は、インビトロ凝固アッセイにおいて決定することができる。例えば、第Ｘ因子活性は、実施例４に記載されるような、外因性凝固経路の活性を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイにおいて決定することができる。サンプル中の凝固活性で表現される第Ｘ因子活性は、ｍＵ／ｍｌまたはＵ／ｍｌで示される。
【００７０】
このようにして決定された第Ｘ因子活性は、サンプル中に存在する第Ｘ因子抗原の量を意味し、従って、その変異体の「比活性」が算出され得、これは典型的にはＵ／ｍｇタンパク質またはｍＵ／μｇタンパク質で表現される。本発明の変異体の比活性は、好ましくは、配列番号２に示される野生型配列を有する組換え第Ｘ因子分子の第Ｘ因子活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％である。
【００７１】
本発明の第Ｘ因子変異体はさらに、バイパス止血活性を有する。この活性は、実施例４に記載されるように、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ欠乏血漿を用いて凝固活性（ａＰＰＴ）を測定することによって決定することができる。このようなアッセイにおける凝固活性は、野生型配列を有する組換え第Ｘ因子のそれよりも、好ましくは７０倍超、より好ましくは１００倍超、最も好ましくは５００倍超高い。ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を用いた凝固活性は、野生型配列を有する組換え第Ｘ因子のそれよりも、好ましくは２００倍超、より好ましくは３００倍超、より好ましくは５００倍超、最も好ましくは１０００倍超さらには１５００超高い。ＦＩＸ欠乏血漿を用いた凝固活性は、野生型配列を有する組換え第Ｘ因子のそれよりも、好ましくは１００倍超、より好ましくは２００倍超、最も好ましくは５００倍超または１０００倍超高い。
【００７２】
第Ｘ因子変異体は、第ＶＩＩＩ因子阻止因子の存在下で改善されたバイパス活性を有する。この活性は、後述の実施例４に記載されるようにして決定することができる。本発明の第Ｘ因子変異体の、（例えば実施例４に従い決定される）ＦＶＩＩＩ阻止因子含有血漿中での凝固時間は、同じ第Ｘ因子活性になるよう調整した場合、野生型配列を有する組換え第Ｘ因子の凝固時間と比較して少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％減少する。
【００７３】
本発明に従う好ましい第Ｘ因子変異体は、先行技術に記載される第Ｘ因子変異体と比較してバイパス止血活性が増強された第Ｘ因子変異体である。例えば、本発明に従う第Ｘ因子変異体は、通常、配列番号２のアミノ酸番号で、配列Ｇｌｕ２２６−Ｇｌｎ２２７−Ｓｅｒ２２８−Ｐｈｅ２２９−Ａｓｎ２３０−Ａｓｐ２３１−Ｐｈｅ２３２−Ｔｈｒ２３３−Ａｒｇ２３４（ＥＱＳＦＮＤＦＴＲ＝配列番号１０）を含む対照第Ｘ因子変異体（対照変異体のアクチベーションペプチドの長さは５２アミノ酸である、すなわちアクチベーションペプチド全体にわたって部分欠失は存在しない）と比較して、バイパス止血活性が有意に増強されている。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ欠乏血漿中でのバイパス止血活性は、対照変異体と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍増加する。本発明の第Ｘ因子変異体の、（例えば実施例４に従い決定される）ＦＶＩＩＩ阻止因子含有血漿中での凝固時間は、同じ第Ｘ因子活性になるよう調整した場合、対照変異体の凝固時間と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％減少する。
【００７４】
別の実施態様において、本発明に従う第Ｘ因子変異体は、配列番号２のアミノ酸２２６〜２３４が配列番号３に示されるアミノ酸配列で置換されており、対照第Ｘ因子変異体のアクチベーションペプチドの長さが５２アミノ酸である第Ｘ因子アミノ酸配列を含むその対照第Ｘ因子変異体と比較してバイパス止血活性が有意に増強されている。この対照変異体は、実施例に記載される「５３５」構築物に対応する。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ欠乏血漿中でのバイパス止血活性は、対照変異体と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍増加する。本発明の第Ｘ因子変異体の、（例えば実施例４に従い決定される）ＦＶＩＩＩ阻止因子含有血漿中での凝固時間は、同じ第Ｘ因子活性になるよう調整した場合、対照変異体の凝固時間と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％減少する。
【００７５】
本発明の別の局面は、修飾型アクチベーションペプチドが野生型第Ｘ因子のＡｒｇ１７９〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内に存在しないプロテアーゼプロセシング部位を有するよう第Ｘ因子配列のアクチベーションペプチドを修飾し、野生型第Ｘ因子と比較してＡｒｇ１７９に対応する残基〜Ｉｌｅ２３５の間のアミノ酸数を１〜５２アミノ酸削減することを含む、バイパス止血剤の製造方法である。
【００７６】
本発明の別の局面は、修飾型アクチベーションペプチドが野生型第Ｘ因子のＡｒｇ１７９〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列内に存在しないプロテアーゼプロセシング部位を有するよう第Ｘ因子配列のアクチベーションペプチドを修飾し、修飾型アクチベーションペプチドが野生型第Ｘ因子のアクチベーションペプチドよりも短くなるようアクチベーションペプチドを部分除去することを含む、バイパス止血剤の製造方法である。
【００７７】
好ましくは、新規の切断部位は、修飾型アクチベーションペプチドのＣ末端領域に存在する。本発明の方法の好ましい実施態様は、本明細書中に記載された第Ｘ因子変異体の好ましい実施態様に対応する。
【００７８】
本発明はさらに、本願に記載される修飾型ヒト第Ｘ因子をコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、概ね、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは非修飾型のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾型のＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」はまた、一つまたはそれ以上の修飾型塩基および／または非一般的塩基、例えばイノシンを含むＤＮＡまたはＲＮＡを含む。当業者に公知の多くの有用な目的を果たす様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされ得ることが理解されるであろう。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、そのようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的な修飾形態、ならびにウイルスならびに例えば単純細胞および複雑細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００７９】
当業者は、遺伝子暗号の縮重性から、あるポリペプチドが異なるポリヌクレオチドによってコードされ得ることを理解しているであろう。これらの「変異体」は本発明に包含される。
【００８０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。用語「単離された」ポリヌクレオチドは、他の核酸配列、例えば（しかしこれらに限定されない）、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡを実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製され得る。当業者に公知の従来的な核酸精製法が、単離されたポリヌクレオチドを獲得するのに使用され得る。この用語はまた、組換えポリヌクレオチドおよび化学合成ポリヌクレオチドを含む。
【００８１】
本発明のさらに別の局面は、本発明に従うポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。好ましくは、プラスミドまたはベクターは発現ベクターである。特定の実施態様において、ベクターは、ヒト遺伝子療法において使用するためのトランスファーベクターである。
【００８２】
本発明のさらに別の局面は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のプラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞である。
【００８３】
本発明の宿主細胞は、ヒト第Ｘ因子の変異体の製造法において利用され得、これも本発明の一部である。この方法は、
ａ）本発明の宿主細胞を、第Ｘ因子変異体が発現する条件下で培養し、
ｂ）場合により、宿主細胞または培養培地からヒト第Ｘ因子の変異体を回収する
ことを含む。
【００８４】
グリコシル化またはその他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞および宿主細胞環境の性質に依存して変化し得る。特定のアミノ酸配列に言及する場合、そのような配列の翻訳後修飾物も本願に含まれる。
【００８５】
本願において使用される場合、「第Ｘ因子」は、非活性化形態（第Ｘ因子）からなる生産物を意味する。上記定義に属する「第Ｘ因子」には、ネイティブのヒト第Ｘ因子のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。小規模の修飾がなされたアミノ酸配列を有する、例えばＮ末端アミノ酸欠失または付加を含む修飾型Ｎ末端を有するタンパク質も、そのタンパク質が第Ｘａ因子の活性を実質的に保持している限り含まれる。上記定義に属する「第Ｘ因子」には、個々の個体ごとに存在および発生する可能性のある天然の対立遺伝子変異体も含まれる。さらに、上記定義に属する「第Ｘ因子」には、第Ｘ因子の変異体が含まれる。このような変異体は、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基において野生型配列と相違する。このような相違の例には、一つもしくはそれ以上のアミノ酸残基（例えば１〜１０アミノ酸残基）によるＮおよび／もしくはＣ末端の切断、またはＮおよび／もしくはＣ末端における一つもしくはそれ以上の余分な残基の付加、例えばＮ末端におけるメチオニン残基の付加、ならびに保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を有するアミノ酸グループ、例えば（１）小アミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、（６）芳香族アミノ酸、の中で行われる置換が含まれ得る。このような保存的置換の例を以下の表に示す。
【００８６】
【表１】
2009527234.tif 000002
【００８７】
用語「組換え」は、例えば、その変異体が、遺伝子操作技術によって宿主生物において生成されたことを意味する。本発明の第Ｘ因子変異体は通常、組換え第Ｘ因子変異体である。
【００８８】
提案した変異体の発現：
適当な宿主細胞内において組換えタンパク質を高レベルで産生させるには、当業者に公知の方法に従い、上記の修飾型ｃＤＮＡを、適当な調節エレメントと共に、様々な発現系において増殖させることができる組換え発現ベクター内の有効な転写ユニットに組み込む必要がある。有効な転写調節エレメントは、動物細胞を天然の宿主とするウイルスまたは動物細胞の染色体ＤＮＡから得ることができる。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、もしくはラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列由来のプロモーター・エンハンサーの組み合わせ、またはベータ−アクチンもしくはＧＲＰ７８等の動物細胞において高度に構成的に転写される遺伝子を含むプロモーター・エンハンサーの組み合わせを使用することができる。高レベルのｍＲＮＡをｃＤＮＡから安定的に転写させるために、転写ユニットは、その３’近位部分に、転写終結・ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、またはヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から得られるものである。
【００８９】
次に、ｃＤＮＡは、第Ｘ因子変異体の発現のために、適当な宿主細胞株のゲノムに組み込まれる。好ましくは、この細胞株は、正確なフォールディング、Ｇｌａドメインの合成、ジスルフィド結合の形成、アスパラギン結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、およびその他の翻訳後修飾、ならびに培養培地への分泌を確保するために、脊椎動物起源の動物細胞株であるべきである。他の翻訳後修飾の例は、初期ポリペプチド鎖のヒドロキシル化およびタンパク質分解プロセシングである。利用できる細胞株の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、およびハムスターＣＨＯ細胞である。
【００９０】
対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、いくつかの異なる方法で動物細胞株に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスベースのベクターから構築することができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および好ましくはウシパピローマウイルスベースのベクターである。
【００９１】
対応するＤＮＡをコードする転写ユニットはまた、そのゲノムに組換えＤＮＡが導入された特定の細胞クローンの単離を容易にするために、これらの細胞内で優性選択マーカーとして機能し得る別の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入され得る。このタイプの優性選択マーカー遺伝子の例は、ジェネティシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与するＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするベクターと同じベクター上に加えることも、多くの場合に異なる転写ユニット間の緊密な物理的結合をもたらす、宿主細胞のゲノムに同時に導入および組み込まれる別のベクターにコードさせることもできる。
【００９２】
所望のタンパク質のｃＤＮＡと共に利用できる他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写ユニットに基づくものである。このタイプの遺伝子を、内因性のｄｈｆｒ活性を欠く細胞、特にＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）に導入した後、これらはヌクレオシド欠乏培地中で成長することが可能となる。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、およびグリシンを含まないＨａｍ'ｓ  Ｆ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、凝固因子ｃＤＮＡ転写ユニットと共に、同一ベクター上または異なるベクター上のいずれかに連結させて、上記タイプのＣＨＯ細胞に導入し、組換えタンパク質を産生するｄｈｆｒ陽性細胞株を作製することができる。
【００９３】
上記の細胞株を、細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤メトトレキサートの存在下で培養する場合、メトトレキサートに対して耐性の新規の細胞株が出現するであろう。これらの細胞株は、ｄｈｆｒ・所望タンパク質一体型の転写ユニット数の増加により高い割合で組換えタンパク質を産生し得る。これらの細胞株を増加した濃度のメトトレキサート（１〜１００００ｎＭ）下で増殖させる場合は、非常に高い割合で所望のタンパク質を産生する新規の細胞株を獲得することができる。
【００９４】
所望のタンパク質を産生する上記細胞株は、懸濁培養下または様々な固体支持体上のいずれかにおいて、ラージスケールで培養することができる。これらの支持体の例は、デキストランもしくはコラーゲンマトリクスベースのマイクロキャリア、または中空繊維もしくは様々なセラミック材の形態の固体支持体である。細胞懸濁培養によりまたはマイクロキャリア上で培養する場合、上記細胞株の培養は、浴槽培養としてまたは長期間にわたって条件培地を連続的に生成する灌流培養として行われ得る。従って、本発明によれば、上記細胞株は、所望の組換えタンパク質の製造のための工業プロセスの開発に十分に適している。
【００９５】
上記タイプの分泌細胞の培地に蓄積する組換えタンパク質は、所望のタンパク質と細胞培養培地中の他の物質の間のサイズ、電荷、疎水性、溶解性、比親和性などの違いを利用する方法を含む、様々な生化学的、クロマトグラフィー的方法によって濃縮および精製することができる。
【００９６】
このような精製の例は、固体支持体に固定されたモノクローナル抗体への組換えタンパク質の吸着である。このタンパク質は、脱離後、上記特定に基づく様々なクロマトグラフィー技術によりさらに精製することができる。
【００９７】
本発明の修飾された生物学的に活性な第Ｘ因子変異体を、≧８０％の純度、より好ましくは≧９５％の純度まで精製することが好ましく、高分子混入物、特に他のタンパク質および核酸に対して９９．９％超の純度でありかつ感染因子および発熱因子を含まない薬学的に純粋な状態であることが特に好ましい。好ましくは、単離または精製された、本発明の修飾された生物学的に活性な第Ｘ因子変異体は、実質的に他のポリペプチドを含まない。
【００９８】
本発明において記載される組換えタンパク質は、治療用途のために薬学的製剤に処方することができる。精製されたタンパク質は、薬学的製剤を提供するため、場合により薬学的賦形剤が添加され得る従来的な生理学的に適合性の水性緩衝溶液に溶解され得る。
【００９９】
このような薬学的担体および賦形剤ならびに適当な薬学的処方物は当該分野で周知である（例えば“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  （２０００）または“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む薬学的組成物は、凍結乾燥形態または安定な溶解形態で処方され得る。ポリペプチド変異体は、当該分野で公知の様々な手法により凍結乾燥され得る。凍結乾燥処方物は、使用前に、一つまたはそれ以上の薬学的に許容できる希釈剤、例えば注射用滅菌水または滅菌性生理食塩水溶液の添加により再構成される。
【０１００】
この組成の処方物は、任意の薬学的に適当な投与手段によって個人に送達される。様々な送達系が公知であり、組成物を任意の使い勝手がよい経路により投与するのに使用することができる。好ましくは、本発明の組成物は、全身投与される。全身的な使用のために、本発明の第Ｘ因子変異体は、従来方法に従い、非経口（例えば静脈内、皮下、筋内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内、もしくは経皮）送達用または経腸（例えば経口、膣、もしく直腸）送達用に処方される。最も好ましい投与経路は静脈内投与である。処方物は、注入またはボーラス注射により連続的に投与することができる。いくつかの処方物は徐放系を含む。
【０１０１】
本発明の修飾された生物学的に活性な第Ｘ因子変異体は、治療有効用量で患者に投与され、治療有効用量は、処置する状態または徴候の重傷度または拡大を防止または軽減するという所望の効果を生じるのに十分でありかつ許容できない有害な副作用を生じる用量に達しない用量を意味する。正確な用量は、例えば徴候、処方、投与様式等の多くの要因に依存し、これは各個別の徴候ごとに前臨床および臨床試験において決定する必要がある。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与され得る。これらの薬剤は、同一薬物の一部として組み込まれ得る。
【０１０３】
本発明の別の局面は、血液凝固障害の処置または予防のための医薬の製造のための、本明細書中に記載されるヒト第Ｘ因子の修飾型ホモログ、本発明のポリヌクレオチド、本発明のプラスミドもしくはベクター、または本発明の宿主細胞の使用である。血液凝固障害には、血友病Ａ、血友病Ｂ、またはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ欠乏症が含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、各々の凝固因子に対する自己免疫抗体によりこれらの疾患が引き起こされるまたは先天性の状態が悪化する。特定の実施態様において、処置される患者は、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を有する。好ましくは、処置はヒト遺伝子療法を含む。
【０１０４】
本発明はまた、血液凝固障害、例えば血友病Ａ、血友病Ｂ、またはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ欠乏症に罹患した個人の処置方法に関し、好ましくは各々の凝固因子に対する自己免疫抗体によりこれらの疾患が引き起こされるまたは先天性の状態が悪化する。この方法は、有効量の本明細書に記載されるヒト第Ｘ因子の修飾型ホモログを個人に投与することを含む。別の実施態様において、この方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のプラスミドもしくはベクターを個人に投与することを含む。あるいは、この方法は、有効量の本明細書中に記載される本発明の宿主細胞を個人に投与することを含む。
【実施例】
【０１０５】
実施例：
実施例１：発現プラスミドの構築
第Ｘ因子コード配列は、プライマーＷｅ１２９２およびＷｅ１２９３（配列番号１１および１２）を用いてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ（Ａｍｂｉｏｎ）からＰＣＲにより増幅した。プライマーＷｅ１３５４およびＷｅ１３５５（配列番号１３および１４）を用いた二ラウンド目のＰＣＲにおいて、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ切断部位をこのフラグメントの５’末端に導入し、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ切断部位を３’末端に導入した。次いで、ＰＣＲフラグメントを、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＦＸ−４４５と命名した。
【０１０６】
このプロペプチドのプロセシングを改善するため、３９位（配列番号２）のアミノ酸スレオニンをアルギニンで置換することによって切断部位を改善した（Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １０：３７３−３７８））。そのために、ｐＦＸ−４４５を、標準的方法（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従いオリゴヌクレオチドＷｅ１４８２およびＷｅ１４８３（配列番号１５および１６）を用いた部位特異的変異誘発に供した。得られたプラスミドをｐＦＸ−５３２と命名した。
【０１０７】
以下に記載される全ての変異は、市販の変異誘発キット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。
【０１０８】
ｐＦＸ−５３２に基づき、第ＸＩａ因子切断部位を有する構築物を作製した。オリゴヌクレオチドＷｅ１４４４およびＷｅ１４４５（配列番号１７および１８）を用いた置換変異誘発により、第Ｘ因子アクチベーション領域の８アミノ酸（配列番号２のアミノ酸２２５〜２３３）がＦＩＸのアクチベーション領域由来の８アミノ酸で置換されたプラスミドｐＦＸ−５３５を得た。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドＷｅ１５６７およびＷｅ１５６８（配列番号１９および２０）を用いたｐＦＸ−５３２における部位特異的変異誘発によってプラスミドｐＦＸ−６４１を作製した。このプラスミドは、第Ｘ因子アクチベーションペプチド内に二つの変異、Ｌｅｕ２３２ＡｓｐおよびＴｈｒ２３３Ａｓｐを含み、これによって活性化できない第Ｘ因子分子を得た。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドＷｅ１９７６およびＷｅ１９７７（配列番号２１および２２）を用いた欠失変異誘発により、ＦＸアクチベーションペプチド配列を欠失するが挿入されたＦＩＸアクチベーション配列を維持するプラスミドｐＦＸ−９１５を得た（図３を参照のこと）。
【０１１１】
オリゴヌクレオチドＷｅ２３５７およびＷｅ２３５８（配列番号２３および２４）を用いたｐＦＸ−９１５における部位特異的変異誘発により、Ｉｌｅ２３５がＶａｌで置換された、それによってＦＸの重鎖のアミノ末端アミノ酸がＦＩＸの対応するアミノ酸に変換されたプラスミドｐＦＸ−１０６６を得た。
【０１１２】
実施例２：修飾型第Ｘ因子分子のトランスフェクションおよび発現
プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、標準的なプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトし、５０ｎｇ／ｍｌビタミンＫおよび４μｇ／ｍｌピューロマイシンの存在下で無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓ）中で培養した。トランスフェクションから約４週間後、生化学的な特徴付けのために上清を収集した。
【０１１３】
実施例３：組換え第Ｘ因子変異体の特徴付け
第Ｘ因子変異体の発現は、第Ｘ因子に対するモノクローナル抗体を用いた定量のＥＬＩＳＡにより監視した。その後に、組換えタンパク質の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより分析した。サンプルは、還元条件および非還元条件下で分析した。血漿第Ｘ因子を、ネイティブ分子量コントロールとして用いた。自己活性化した場合任意の活性化型組換え第Ｘ因子変異体を検出および比較するために第Ｘａ因子を用いた。ウェスタンブロットを可視化したところ、全ての組換え第Ｘ因子変異体は、約５８ｋＤａの正確な分子量を示し、血漿第Ｘ因子に相当する位置に移動した。還元した場合、組換え第Ｘ因子変異体は、およそ４０ｋＤａの重鎖（ＨＣ）およびおよそ２０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）に分解した。５８ｋＤａのバンドは、プロセシングを受けていない単一鎖（ｏｎｅ  ｃｈａｉｎ）（ＯＣ）の第Ｘ因子を表すものであった。ウェスタンブロットにおいては、第Ｘａ因子も第Ｘ因子のいかなる凝集物も検出されなかった。本発明の第Ｘ因子変異体は、ウェスタンブロットにおいて、およそ４９ｋＤａの分子量を有する、プロセシングを受けていない単一鎖分子として可視化された。これは、非還元型および還元型に共通である。
【０１１４】
実施例４：ヒト第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子欠乏血漿、ならびにヒト第ＶＩＩＩ因子阻害性血漿における、組換え第Ｘ因子変異体のインビトロ活性の調査
第Ｘ因子活性は、外因性凝固経路の活性を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイにおいて決定した。第Ｘ因子欠乏血漿１００μｌを第Ｘ因子変異体細胞培養上清または精製タンパク質１００μｌと混合した。３７℃で６０秒間のインキュベーション後、ヒト血漿由来トロンボプラスチン、ＣａＣｌ2、およびリン脂質を含有するＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）２００μｌをこの混合物に加え、Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ  ＆  Ｇｒｏｓｓコーギュレーションタイマーを用いることによって凝固時間を秒単位で決定した。第Ｘ因子活性の決定のために、このアッセイを、血漿第Ｘ因子標準を用いて較正した。変異型第Ｘ因子ｐＦＸ６４１の細胞培養上清を、このアッセイのネガティブコントロールとして用いた。この変異体は、野生型第Ｘ因子アクチベーションペプチド内に無効化された切断部位を保持する。予想通り、この変異体を２１６．４Ｕ／ｍｌの第Ｘ因子に相当する抗原レベルで試験した場合、凝固活性は０．５ｍＵ／ｍｌにしか達しなかった。
【０１１５】
ｐＦＸ５３２由来の組換え野生型第Ｘ因子、ならびにｐＦＸ５３５、ｐＦＸ９１５、およびｐＦＸ１０６６由来の第Ｘ因子変異体を精製した。第Ｘ因子に特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡにより決定した抗原濃度は１．１〜４．３Ｕ／ｍｌの範囲であった。第Ｘａ因子が第Ｘ因子の測定を妨害しないようにするため、第Ｘａ因子を発色アッセイによって決定した。全ての精製された第Ｘ因子変異体は、０．０２３〜０．１０３ｍＵ／ｍｌの第Ｘａ因子レベルしか含まず（表２）、第Ｘ因子の測定に有意に干渉するものではなかった。
【０１１６】
発現された第Ｘ因子変異体を相互に比較するために、第Ｘ因子の凝固活性を決定し、これを約１．５Ｕ／ｍｌに調整した。試験した全ての変異体は機能的に活性であり、１．１０〜１．７２Ｕ／ｍｌの凝固活性を示した（表２）。
【０１１７】
ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ欠乏血漿における組換え第Ｘ因子変異体の機能は、内因性凝固カスケードの活性を測定する活性化部分プロトロンビン時間（ａＰＰＴ）において試験した。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ欠乏血漿１００μｌを第Ｘ因子変異体細胞培養上清または精製タンパク質１００μｌと混合した。３７℃で６分間のインキュベーション後、ＳｉＯ2、リン脂質、および４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＰａｔｈｒｏｍｐｈｔｉｎ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）１００μｌ、ならびに２５ｍＭ  ＣａＣｌ2  １００μｌを加えて凝固反応を開始した。凝固時間は、Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ  ＆  Ｇｒｏｓｓコーギュレーションタイマーを用いることによって秒単位で決定した。活性は、標準ヒト血漿と比較した場合の各凝固性ＦＸ当量として表した。
【０１１８】
組換え野生型第Ｘ因子は、予想通り、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿において凝固活性が６．６ｍＵ／ｍｌにしか達せず、ＦＩＸ欠乏血漿において５．８ｍＵ／ｍｌにしか達しなかった。対照的に、本発明の第Ｘ因子変異体は、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿においては１２９５２．０〜２６４２８．０ｍＵ／ｍｌの範囲、ＦＩＸ欠乏血漿においては６３２７．０ｍＩＵ／ｍｌ〜１５５１５．０ｍＩＵ／ｍｌの範囲の非常に高い凝固活性に達した（表２）。
【０１１９】
ｐＦＸ５３５由来の第Ｘ因子変異体は、ＷＯ０１／１０８９６に記載される、野生型ＦＸアクチベーションペプチドのＩｌｅ２３５のＮ末端側の領域内に挿入された新規の第ＩＸ因子アクチベーション配列を有する第Ｘ因子変異体に対応するが、アクチベーションペプチドの長さの欠失はない。驚くべきことに、ｐＦＸ９１５およびｐＦＸ１０６６によってコードされる、第Ｘ因子野生型アクチベーションペプチドが除去され新規のプロテアーゼ切断部位で置換された本発明の第Ｘ因子変異体は、ＦＩＸ欠乏血漿においてそれぞれ６３２７．０および１５５１５．０ｍＵ／ｍｌ、またはＦＶＩＩＩ欠乏血漿においてそれぞれ１２９５２．０および２６４２８．０ｍＵ／ｍｌという非常に強い凝固活性を示した（表２）。
【０１２０】
血友病Ａ患者由来のＦＶＩＩＩ阻止因子含有血漿を用いて機能的活性の測定をさらに行った。この患者の血漿は、１ｍｌあたり約３００ベセズダ単位のＦＶＩＩＩ阻止因子を含んでいた。上記のように、凝固はａＰＰＴで測定し、サンプルは第Ｘ因子凝固性で調整した。
【０１２１】
標準および試験サンプルの希釈に使用したサンプル緩衝液コントロールは１５６．５秒の凝固時間に達し、組換え野生型第Ｘ因子は１１１．４秒の凝固時間に達した。ｐＦＸ９１５およびｐＦＸ１０６６によってコードされた本発明の第Ｘ因子変異体は、ＦＶＩＩＩ阻害抗体含有血漿に基づくＦＥＩＢＡアッセイにおいて、それぞれ２１．４および２１．１秒の凝固時間を示し、これはｐＦＸ５３５によりコードされた第Ｘ因子変異体を使用した場合に得られる凝固時間よりも有意に短かく（表２）、これによりＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ欠乏血漿に基づくＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ凝固アッセイにおける驚くべき結果が確認された。
【０１２２】
まとめると、第Ｘ因子変異体はバイパス止血剤として機能的に活性であること、およびこれらの第Ｘ因子変異体は第ＶＩＩＩ因子に対する阻止因子を含む血友病Ａ患者血漿において凝固活性を示すことが示された。本発明者らが驚いたのは、ｐＦＸ９１５およびｐＦＸ１０６６によりコードされた第Ｘ因子変異体が、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子欠乏血漿において、同じ第Ｘ因子凝固当量と同一に調整した場合にｐＦＸ５３５によりコードされた第Ｘ因子変異体と比較してずっと強い凝固活性を示したことであった。
【０１２３】
【表２】
2009527234.tif 000003
【０１２４】
実施例５：モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィによる組換え第Ｘ因子変異体の精製
組換え第Ｘ因子変異体は、以下のプロトコルに従い精製した。第Ｘ因子に特異的なモノクローナル抗体ＦＸ−１３（ＺＬＢ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を、ＣＮＢｒ活性化型セファロースに結合させた。得られたアフィニティ樹脂をＰｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ  １６クロマトグラフィカラムに注ぎ込み、直径１．６ｃｍ、高さ１．８ｃｍ、ゲル３．６ｍｌのアフィニティマトリクスを形成した。このアフィニティマトリクスを、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム中で保存した。使用前に、ゲルを、１０ゲル量の２０ｍＭクエン酸三ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０−ＨＣｌで平衡化した。
【０１２５】
１００ｍＩＵ／ｍｌ超の第Ｘ因子抗原を含む細胞培養上清を、ＶＩＳＫＩＮＧチュービングタイプ３２／３６を用いて、２〜４ｌの平衡緩衝液中、４〜８℃で一晩透析した。
【０１２６】
アフィニティゲルに、透析した上清７０ｍｌを、流速１ｍｌ／分でロードした。ゲルを１０倍量の平衡緩衝液で洗浄し、その後に０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５−ＨＣｌで溶出させた。溶出した物質をＮａＯＨで中和し、１．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌカプリル酸ナトリウムによって安定化させた。
【０１２７】
第Ｘ因子変異体の細胞培養上清、フロースルーフラクション、および溶出させた物質由来のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後の銀染色によって分析した。５８ｋＤａのタンパク質バンドを上記の方法によって精製した。５８ｋＤａバンドは、抗第Ｘ因子抗体により検出するウェスタンブロッティングによって第Ｘ因子変異体と同定した。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ＦＸ野生型および新規に導入されたプロテアーゼ切断部位を有するＦＸ変異体の概略図である。番号は配列番号２のアミノ酸番号を意味しており、アクチベーションペプチドはＳｅｒ１８３〜Ａｒｇ２３４のアミノ酸配列と定義される。第ＩＸ因子由来の外来アクチベーション配列は太字で表示している。下線を引いたアミノ酸は、各々の第Ｘ因子分子がそれぞれテナーゼ複合体および第ＶＩＩａ／組織因子により活性化されないようにする点変異を示している。「５３２」構築物は、第Ｘ因子の野生型配列に対応する。
【図２−１】野生型第Ｘ因子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列である。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３】第ＩＸ因子由来のプロテアーゼプロセシング部位を有する第Ｘ因子変異体が凝固第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子に対する必要性を迂回し第ＸＩ因子により直接的に活性化される様式を示す凝固カスケードの概略図である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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