(57)【要約】宿主真核生物細胞および生物において組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）中で発現される融合タンパク質が開示される。より詳細には、ＲＰＢＬＡ形成の誘導を仲介するタンパク質配列へ融合させた生物学的に活性のあるポリペプチドが、適切なベクターによる形質転換後に宿主細胞中で発現および蓄積される。真核生物宿主細胞は、融合タンパク質の非存在下においてタンパク質顆粒を産生しない。融合タンパク質をコードする核酸分子の調製方法および使用方法が開示されるように、ＲＰＢＬＡおよび融合タンパク質の調製方法および使用方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）内で組換え融合タンパク質を含む真核生物宿主細胞であって、該融合タンパク質が、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、かつ他方は生物学的に活性のあるポリペプチドである、ともに結合する２つの配列を含み、生物学的に活性のある該ポリペプチドが、該真核生物宿主細胞とは異なる第２の細胞タイプにおいて天然に見出され、該融合タンパク質の非存在下においてタンパク質顆粒を産生しない、該真核生物宿主細胞。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、タンパク質顆粒誘導配列と生物学的に活性のあるポリペプチドの配列との間にリンカー配列をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記タンパク質顆粒誘導配列が、プロラミン配列を含む、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記プロラミン配列が、γ−ゼイン、α−ゼイン、γ−グリアジンまたはコメプロラミンである、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記プロラミン配列がγ−ゼインＲＸ３配列である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記タンパク質顆粒誘導配列が、植物細胞の小胞体（ＥＲ）に向けてタンパク質を導く配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
植物宿主細胞のＥＲに向けてタンパク質を導く前記タンパク質顆粒誘導配列が、ＰＢＩＳの残りの部分と同一の植物、または異なる植物からのシグナルペプチドである、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記シグナルペプチドが、γ−ゼインの１９残基シグナルペプチド配列、α−グリアジンの１９残基シグナルペプチド配列、γ−グリアジンの２１残基シグナルペプチド配列、およびＰＲ１０クラスの病原性関連タンパク質の２５残基シグナルペプチド配列からなるグループから選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記融合タンパク質の生物学的に活性のあるポリペプチドが、前記第２の細胞タイプから単離された同一のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも２５％を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記融合タンパク質の生物学的に活性のあるポリペプチドが、少なくとも２つのＮ結合型糖鎖付加配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記融合タンパク質のうちのタンパク質顆粒誘導配列および生物学的に活性のあるポリペプチドが、酵素的手段または化学的手段によって切断可能または切断可能でないスペーサーアミノ酸配列により、ともに結合される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が藻細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が動物細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞がより高等な植物細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
膜に囲まれた融合タンパク質であって、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、かつ他方は生物学的に活性のあるポリペプチドである、ともに結合する２つの配列を含む該融合タンパク質を含む、組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）。
【請求項１７】
約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌの密度を有する、請求項１６に記載のＲＰＢＬＡ。
【請求項１８】
前記ＰＢＩＳがプロラミン配列を含む、請求項１６または１７のいずれか一項に記載のＲＰＢＬＡ。
【請求項１９】
前記プロラミン配列が、γ−ゼイン、α−ゼイン、コメプロラミンおよびγ−グリアジンからなるグループから選択される、請求項１８に記載のＲＰＢＬＡ。
【請求項２０】
前記プロラミン配列がγ−ゼインＲＸ３配列である、請求項１９に記載のＲＰＢＬＡ。
【請求項２１】
前記ＰＢＩＳが、植物細胞の小胞体（ＥＲ）に向けてタンパク質を導く配列もまた含む、請求項１６〜２０に記載のＲＰＢＬＡ。
【請求項２２】
植物細胞のＥＲに向けてタンパク質を導く前記配列が、ＰＢＩＳの残りの部分と同一の植物、または異なる植物からのシグナルペプチドである、請求項２１に記載のＲＰＢＬＡ。
【請求項２３】
前記シグナルペプチドが、γ−ゼインの１９残基シグナルペプチド配列、α−グリアジンの１９残基シグナルペプチド配列、γ−グリアジンの２１残基シグナルペプチド配列、およびＰＲ１０クラスの病原性関連タンパク質の２５残基シグナルペプチド配列からなるグループから選択される、請求項２２に記載のＲＰＢＬＡ。
【請求項２４】
ａ）膜に囲まれた融合タンパク質であって、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、かつ他方は生物学的に活性のあるポリペプチドである、ともに結合する２つの配列を含む該融合タンパク質を含む、組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）を提供する工程と；
ｂ）膜を分解する量の界面活性剤を含む水性緩衝液とＲＰＢＬＡを接触する工程と；
ｃ）膜を分解するのに十分な期間および生物学的に活性のあるポリペプチドを変性させない温度で該接触を維持して融合タンパク質から膜を分離する工程と；
ｄ）生物学的に活性のあるポリペプチドを含む分離された融合タンパク質を回収する工程と
を含む、生物学的に活性のあるポリペプチドを調製する方法。
【請求項２５】
分離された前記融合タンパク質が、生物学的に活性のある前記ポリペプチドの生物学的活性を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物学的に活性のある前記ポリペプチドが、酵素的手段または化学的手段によって切断可能であるスペーサーアミノ酸配列によって前記ＰＢＩＳへ結合される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的に活性のある前記ポリペプチドが、融合タンパク質のＢＰＩＳから切断された場合に生物学的活性を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＰＢＬＡが、一般に約０．５〜約３ミクロンの直径を有する球形で存在する、請求項２４〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
薬学的に許容される希釈剤中で溶解または分散させた組換え融合タンパク質を含む、免疫原性に効果的な量の組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）を含む、ワクチンまたは接種物であって、該組換え融合タンパク質が、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、かつ他方はそれに対して該ワクチンまたは接種物によって免疫反応が誘導されるべきである生物学的に活性のある免疫原性ポリペプチドである、ともに結合する２つの配列を含む、ワクチンまたは接種物。
【請求項３０】
前記融合タンパク質が、タンパク質顆粒誘導配列と生物学的に活性のある免疫原性ポリペプチド配列との間にリンカー配列をさらに含む、請求項２９に記載のワクチンまたは接種物。
【請求項３１】
前記ＰＢＩＳがプロラミン配列を含む、請求項２９または３０に記載のワクチンまたは接種物。
【請求項３２】
前記プロラミン配列が、γ−ゼイン、α−ゼイン、γ−グリアジンまたはコメプロラミンである、請求項３１に記載のワクチンまたは接種物。
【請求項３３】
前記プロラミン配列がγ−ゼインＲＸ３配列である、請求項３１に記載のワクチンまたは接種物。
【請求項３４】
前記ＲＰＢＬＡが、抗原提示細胞への抗原送達を改善する、請求項２９〜３３に記載のワクチンまたは接種物。
【請求項３５】
前記ＲＰＢＬＡが、抗原提示細胞への抗原処理および抗原提示を改善する、請求項２９〜３４に記載のワクチンまたは接種物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本願は、２００６年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／７７６，３９１号の利益を主張するものである。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、宿主系としての真核生物の細胞および生物における、生物学的に活性のある組換えペプチドおよびタンパク質（まとめてポリペプチドと呼ばれる）の産生を検討する。より詳細には、生物学的に活性のあるポリペプチドは、ＲＰＢＬＡの誘導を仲介するタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）へ融合されて、適切なベクターによる宿主細胞の形質転換後に、組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ(ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ)）として宿主系で安定的に発現され蓄積される融合タンパク質を形成する。
【背景技術】
【０００３】
治療用、栄養薬学用または工業用の組換えタンパク質の産生は、過去十年間にわたって大成功を享受してきた。所望のヌクレオチド配列を有する異種遺伝子の導入は、対応する所望のアミノ酸残基配列または一次構造を有するポリペプチドまたはタンパク質の発現を導く。しかしながら多くの実例において、発現されるタンパク質またはポリペプチドは、天然に生産される物質のアミノ酸残基配列を有しているが、その物質の生物活性を欠いていた。
【０００４】
発現される産物の適切な一次構造を考慮すると、生物学的活性は、適切な折畳みならびに内部の水素結合、ファンデルワールス結合、イオン結合およびジスルフィド結合を有し、例えば糖鎖付加のような適切な翻訳後修飾もまた有する産物の機能でありえる。例えば、ジスルフィド結合形成は、小胞体（ＥＲ）の内腔で自発的に生じるが、原核生物のサイトゾル中では生じず、そのことによりジスルフィド結合により通常は安定化される正確に折畳まれた哺乳類タンパク質の合成に対しては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のような細菌細胞は、劣った宿主になる。ＰＤＩ様タンパク質が機能的な場合には、ジスルフィド結合形成は大腸菌のペリプラスム間隙中で生じうるが（Fernandez, et al., 2001. Mol. Microbiol. Apr 40(2):332-346）、酸化−レドックス系はあまり効率的ではない。
【０００５】
特定の代表例は、赤血球産生を刺激するタンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）に関する。組換えＥＰＯは、Ｌｉｎの米国特許第４，７０３，００８号において開示される。この特許は、大腸菌、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ならびに哺乳類のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびアフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ−１）細胞から発現されるＥＰＯタンパク質の活性を開示する。抗ＥＰＯ抗血清は各細胞タイプにより発現されるＥＰＯと免疫反応したが、哺乳類細胞から発現されたタンパク質のみがＥＰＯとして実質的なインビボの生物活性、ならびに抗体解析、インビトロおよびインビボの分析による同様の濃度を示した。哺乳類で発現されるタンパク質は、ヒトを治療するために使用されるものである。
【０００６】
生物学的活性におけるそれらの差は、大腸菌（原核生物）が発現したタンパク質に糖鎖を付加することができないという点で、糖鎖付加の機能だと考えられている。酵母細胞は真核生物であるが、分泌タンパク質のための糖鎖付加パターンは哺乳類とは異なる。一方、本質的な生物学的活性のタンパク質を提供するために使用されるＣＨＯ細胞およびＣＯＳ−１細胞は哺乳類のものであり、それらから発現されるタンパク質は有用であった。糖鎖が付加したＥＰＯおよび糖鎖が付加しなかったＥＰＯについての出版された研究は、変性条件に対するエリスロポエチンの安定化に、糖鎖付加が重大な役割を果たすことを示す。Narhi et al., (1991) J. Biol. Chem. 266(34):23022-23026。さらに、ＥＰＯのインビボにおける寿命および活性は、分子の糖鎖付加に関連しうることが報告されている。
【０００７】
したがって真核生物の細胞は、真核生物の起源の、治療用、工業用および他の有用なタンパク質の組換え産生に対して非常に好ましい。異なる真核生物の細胞および生物は、活性のあるタンパク質に基づく治療を可能にすることが示された。不幸にして、組換えタンパク質産生が低レベルであることから、ならびに／またはタンパク質単離および精製法から、しばしば高額の費用がかかり、産業上の応用は有効ではない。異なるアプローチによって産生レベルおよび精製法の両方を改善するために、活発な研究が行われる。
【０００８】
組換えタンパク質単離の効率を改善する１つの手段は、細胞内濃度を使ったものである。これらのアプローチの１つは、密度に基づく精製法によって溶解細胞から分離することができる非分泌封入体中への、組換えタンパク質のランダムな凝集である。封入体は細菌で見出される非晶質タンパク質沈着である。構造的な特性研究により、封入体の不溶性性質は、本来の折畳まれた方ではないタンパク質の疎水性分子間相互作用のためかもしれないことが示された。（Seshadri et al., 1999, Methods Enzymol. 309:559-576）。封入体から活性のあるタンパク質を回収するために使用される一般的な戦略は、ランダムな凝集体を破壊するためのタンパク質の可溶化、続いて１つまたは複数の化学的な再折畳み工程を必要とする。タンパク質の多くがジスルフィド結合を含むならば、変性タンパク質の復元する効率が限定されうるので、これは解決すべき重要な問題である。（Clarc編、２００１年４月、Curr. Opin. Biotechnol. 12(2):202-207）。
【０００９】
より詳細には、高濃度のカオトロピック剤（すなわち尿素およびグアニジン塩酸塩）のような強い変性剤が、凝集体中に蓄積する、折畳まれていないタンパク質を可溶化するために使用される。天然のコンフォーメーションでタンパク質を再び折畳むために、変性剤はその後透析により除去される。そのような再び折畳まれたタンパク質の生物学的活性は、本来の型のタンパク質よりも通常はるかに少ない。
【００１０】
タンパク質顆粒（ＰＢ）は、真核生物細胞において正確な折畳みおよび生物学的活性を保ちながら貯蔵タンパク質を細胞内で濃縮するために進化した、特定の植物種子に天然に存在する構造である。タンパク質顆粒（ＰＢ）は、細菌からの封入体の特性のいくつかを共有する。それらは高密度で、疎水的相互作用によって堅く充填される多量の凝集タンパク質を含む［Momany et al., 2006 J Agric. Food Chem. Jan 25;54(2):543-547 and Garrat, et al,. 1993 Proteins Jan;15(1):88-99］。さらに、いくつかのＰＢＩＳ（例えばＲＸ３のような）中の大量のジスルフィド結合の存在は［Ludevid, et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234 and Kawagoe et al., 2005 Plant Cell Apr 17(4):1141-1153］、恐らくＰＢ形成および安定化に関与し、このジスルフィド結合の存在は、生物学的活性があり、本来の型に折畳まれたタンパク質、特にシステイン残基を含むタンパク質を産生する付加的な困難を表わす。
【００１１】
したがって、非酵母真核生物宿主中の合成ＰＢにおいて産生された様々なタンパク質の再折畳みおよび復元の必要性のない生物学的活性についての観察は予期されないものであった。
【００１２】
対象となるタンパク質と植物種子貯蔵タンパク質ドメインの融合に基づく新技術（ＷＯ  ２００４／００３２０７）は、より高等な植物における組換えタンパク質の安定性および蓄積を増加するために開発されている。これらの貯蔵タンパク質は、タンパク質顆粒中に安定的に蓄積することを特徴として、植物種子に特異的である（Galili et al., 1993, Trends Cell Biol 3:437-442）。
【００１３】
貯蔵タンパク質はシグナルペプチドを介して小胞体（ＥＲ）の内腔の中へ挿入され、ＥＲ由来タンパク質顆粒（ＥＲ−ＰＢ）と呼ばれる特異的なオルガネラを発達させる小胞体、またはタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶ）中で集合する（Okita et al., 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-350; Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Sanderfoot et al., 1999 Plant Cell 11:629-642）。全長組換え貯蔵タンパク質がアフリカツメガエル卵母細胞のような非植物宿主系におけるＰＢ様オルガネラ中で集合することも記載されている。
【００１４】
対応するｍＲＮＡの注射後のアフリカツメガエル卵母細胞における穀類プロラミン（最も多い穀類貯蔵タンパク質）の発現が記載されている。これらの貯蔵タンパク質の標的化特性を研究するために（Simon et al., 1990, Plant Cell 2:941-950; Altschuler et al., 1993, Plant Cell 5:443-450; Torrent et al., 1994, Planta 192:512-518）、ならびに安定性を変化させずに、配列中へ必須アミノ酸のリジンおよびトリプトファンを導入することによって、１９ｋＤａのα−ゼイン（トウモロコシプロラミン）を修飾する可能性を検査するために（Wallace et al, 1988, Science 240:662-664）、この系はモデルとして使用されてきた。
【００１５】
ゼイン（トウモロコシプロラミンの複雑なグループ）は、様々な目的により酵母中でも産生された。Coraggio et al., 1988, Eur J Cell Biol 47:165-172は、このタンパク質の標的化決定基を研究するために、酵母中で本来の型のα−ゼインおよび修飾されたα−ゼインを発現させた。Kim et al., 2002, Plant Cell 14: 655-672により、タンパク質顆粒形成を導く、α−ゼイン、β−ゼイン、γ−ゼインおよびδ−ゼインの可能な相互作用が研究された。この問題に取り組むために、彼らは、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡｓにより酵母細胞を形質転換した。さらにそれらの著者は、酵母細胞中のゼインタンパク質の細胞内局在性を決定するために、ゼイン−ＧＦＰ融合タンパク質を構築したが、真のＰＢの特徴を示す高密度で凝縮された構造の形成を観察しなかった。形質転換酵母中でゼイン自体は十分に蓄積されなかったので、酵母はゼインの相互作用を研究するのに適したモデルではないとKim et al., 2002, Plant Cell 14: 655-672が結論を下したことに注目すべきである。輸送を制御するメカニズム、およびグリアジンと呼ばれる小麦貯蔵タンパク質のタンパク質顆粒沈着を研究するために、酵母細胞もモデルとして使用された（Rosenberg et al., 1993, Plant Physiol 102:61-69）。
【００１６】
生物学的活性はワクチンに特に関連し、予防接種されるヒトまたは他の動物において適正な免疫反応を誘導しなければならない。いくつかの新しいワクチンは、全不活化ワクチンまたは弱毒化生ワクチンよりも安全であると考えられる、合成の、組換えの、または高度に精製されたサブユニットの免疫原（抗原）からなる。しかしながら、弱毒化ワクチンまたは死菌ワクチンに関連するアジュバント効果のある免疫調節成分の欠如は、しばしばより弱い免疫原性のそのようなワクチンをもたらす。
【００１７】
免疫アジュバントはワクチンに対する特異的免疫反応を増強する薬剤である。免疫アジュバントは、ワクチンの中へ組み入れられた場合、ワクチン抗原に対する特異的免疫反応の質を一般に促進、延長、または増強するように作用する任意の物質または製剤として定義することができる。単語アジュバントはラテン語の動詞ａｄｊｕｖａｒｅからの由来であり、支援することまたは援助することを意味する。アジュバントの作用機序は、（１）ワクチン免疫原の生物学的または免疫学の半減期を増加させることと；（２）抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原処理および抗原提示だけでなく、ＡＰＣへの抗原輸送を改善することと；（３）免疫修飾サイトカインの産生を誘導することとを含む。
【００１８】
ファゴサイトーシスは、アポトーシスを起こした細胞または微生物全体のような大きな粒子の侵入に関係する。大きな粒子を飲み込む細胞の能力は、恐らく単細胞生物において栄養をとるための機能として出現したが、複雑な生物は付加的な機能を遂行するためにファゴサイトーシスの機構を利用した。例えば、マクロファージ、Ｂ細胞または樹状細胞によって行なわれる抗原のファゴサイトーシスは、先天性免疫および適応免疫における重要な過程を表わす。実際、ファゴサイトーシス、および続いて起こるファゴソーム中での微生物の死滅は、細胞内病原体に対する生物の先天性防御の基礎を形成する。更に、ファゴソーム内腔で病原体の破壊および抗原性ペプチドの産生（それらは特異的なリンパ球を活性化するために食細胞によって提示される）も連鎖している（Jutras et al., 2005 Annual Review in Cell Development Biology. 21:511-27）。
【００１９】
飲み込まれた粒子に存在するタンパク質は、ファゴソーム中の一連の分解プロテアーゼに出会う。さらにこの破壊に適した環境により、ＭＨＣクラスＩＩ分子へ結合することができるペプチドが生じる。新しく形成された抗原−ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する提示のために細胞表面へ送達される（Boes et al,. 2002. Nature 418:983-988）。これらの細胞の活性化は、Ｂ細胞の増殖および分化を支援するＩＬ−４およびＩＬ−５のようなサイトカインのＴｈ２サブセットを誘導し、液性タイプの免疫反応と関連する。
【００２０】
多くの証拠は、ファゴサイトーシスされた病原体に対する免疫反応におけるＭＨＣクラスＩＩ経路の明確な関与に加えて、病原体（マイコバクテリア、サルモネラ菌、ブルセラ菌およびリーシュマニア菌を含む）からの抗原が抗原交差提示を誘発できることを示す。すなわち、ＭＨＣクラスＩ依存性反応によるファゴサイトーシスによって飲み込まれた抗原の提示は、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の増殖を促進する（Ackerman et al., 2004 Nature Immunology 5(7):678-684 Kaufmann et al., 2005 Current Opinions in Immunology 17(1):79-87）。
【００２１】
樹状細胞は、免疫系を誘導するために抗原提示の中心的な役割を果たす（Blander et al., Nature Immunology 2006 10:1029-1035）。樹状細胞はまれなものではあるが、免疫反応の誘導能力および制御能力の両方で、最も高度に特殊化されたＡＰＣである（Lau et al. 2003 Gut 52:307-314）。樹状細胞は抗原の提示、特に一次免疫応答の開始において重要であるが、マクロファージは炎症部位において最も顕著なＡＰＣタイプであり、壊死性およびアポトーシス性の物質の消去のために特殊化される。マクロファージは、ＡＰＣとして働くことができるだけでなく、活性化された手段に依存して、炎症誘導性の役割または抗炎症性の役割のいずれかについても果たすことができる。
【００２２】
ＡＰＣが適応免疫（液性および細胞性）の誘導および調節において中心的な役割を果たすことを考慮して、それらの細胞による抗原の認識およびファゴサイトーシスは、予防接種過程における重要な工程と考えることができる。蛍光性粒子の取り込みに基づく様々な技術は、マクロファージによるファゴサイトーシスを研究するために開発されてきた（Vergne et al,. 1998 Analytical Biochemistry 255:127-132）。
【００２３】
家畜ワクチンにおいて重要な態様は、考慮されている種の遺伝的多様性、および異なる種を超えて作動する一般的な系のための必要条件である。野生生物を含む多くの種については、これらの分子の最小限の知識しか利用可能でないので、この多様性により、分子的な標的化技術の使用は細胞表面マーカーおよびサイトカインのような免疫修飾因子へ限定される。したがって、先天性免疫応答の普遍的な活性化シグナル（すなわちそれは異なる種において同一である）に依存するアジュバントが好ましい。これらの条件を考慮に入れると、微粒子ワクチン送達系は、家畜ワクチンおよび野生生物ワクチンの戦略に十分に適している。（Scheerlinck et al., 2004 Methods 40:118-124）。
【００２４】
より非常に詳しく以下論じられるように、本発明は、（ｉ）組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）の誘導を仲介するタンパク質配列と、（ｉｉ）生物学的に活性のある標的（タンパク質）を産生して、植物、真菌、藻類および動物のような真核生物の細胞におけるそれらのＲＰＢＬＡの蓄積を誘導する生物学的に活性のあるポリペプチド（対象となるタンパク質または標的）とを結合したものを含む融合タンパク質の発現を開示する。
【発明の開示】
【００２５】
本発明は、真核生物細胞において、対象となるタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）および生物学的に活性のあるペプチドまたはタンパク質（しばしばまとめて本明細書においてポリペプチドまたは標的と呼ばれる）を含む、融合タンパク質を産生するための系および方法を提供する。対象となるポリペプチドを含む融合タンパク質は、植物、動物、真菌または藻細胞でありえる真核生物細胞において組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）として安定的に蓄積する。
【００２６】
より高等な植物の細胞はいくつかの実施形態における好ましい真核生物の宿主細胞であるが、藻類のような下等植物の細胞は他の実施形態において好ましく、哺乳類および昆虫のような動物の細胞はさらなる実施形態において好ましい真核生物宿主細胞であり、真菌はさらに他の実施形態において好ましい真核生物宿主細胞である。融合タンパク質は、多細胞真核生物の特定の細胞中で構成的にまたは優先的に発現することができる。ＰＢＩＳは、対象となる発現されたペプチドまたはタンパク質（標的）に対して生物学的活性を提供する、基本的な糖鎖付加およびジスルフィド結合形成のような適切な折畳みおよび／または翻訳後修飾と共に、これらのオルガネラ中のＲＰＢＬＡ形成ならびに融合タンパク質侵入および／または蓄積の誘導を仲介することができる。
【００２７】
したがって、組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）内に生物学的に活性のある組換え融合タンパク質を含む真核生物宿主細胞は、本発明の１つの態様として検討される。融合タンパク質はともに結合される２つの配列を含んでおり、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方は生物学的に活性のあるポリペプチドの少なくとも２０アミノ酸残基の配列である。生物学的に活性のあるポリペプチドは天然で見出されるので、列挙された真核生物宿主細胞に対して異種でありえ、したがって最初に述べた真核生物宿主細胞とは異なる第２の細胞タイプ中で発現されるか、または合成的に産生される。さらに、真核生物の宿主細胞は、融合タンパク質の非存在下においてＰＢを産生しない。したがって、宿主細胞にタンパク質顆粒様集合体またはＲＰＢＬＡを形成させるのは融合タンパク質の発現およびＰＢＩＳである。
【００２８】
特定の実施形態において、形質転換のために使用される核酸配列は、（ｉ）ＰＢＩＳをコードする核酸配列と、（ｉｉ）対象となる産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列とを含む。１つの実施形態において、核酸配列（ｉ）の３’末端は、該核酸配列（ｉｉ）の５’末端へ結合される。別の実施形態において、核酸配列（ｉ）の５’末端は核酸配列（ｉｉ）の３’末端へ結合される。したがって、ＰＢＩＳ配列は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在しうる。融合タンパク質の発現のために本明細書において論じられるすべてのＤＮＡ結合が、融合タンパク質の２つの構成要素がインフレームで発現されるような状態であることが理解されるべきである。
【００２９】
融合タンパク質の生物学的に活性のあるポリペプチドは、そのポリペプチドの活性の分析において上記の第２の細胞タイプから単離された同一のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％を示す。
【００３０】
別の特定の実施形態において、形質転換のために使用される核酸配列は、前述の核酸配列（ｉ）および（ｉｉ）に加えて、リンカーまたはスペーサーのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む。スペーサーアミノ酸配列は、酵素的手段または自己タンパク質分解手段、または化学的手段によって、切断可能または切断可能でないアミノ酸配列になりえる。特定の実施形態において、核酸配列（ｉｉｉ）は核酸配列（ｉ）と（ｉｉ）との間に置かれ、例えば核酸配列（ｉｉｉ）の３’末端は、該核酸配列（ｉｉ）の５’末端へ結合される。別の実施形態において、該核酸配列（ｉｉｉ）の５’末端は，核酸配列（ｉｉ）の３’末端へ結合される。
【００３１】
さらに特定の実施形態において、形質転換の目的のために使用される核酸配列は、酵素的手段または化学的手段によって特異的に切断可能なアミノ酸配列をコードする核酸配列が存在または非存在であることを特徴として、特許出願第ＷＯ  ２００４００３２０７号に沿った配列をコードする。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、ＰＢＩＳと対象となるペプチドまたはタンパク質との間の直接的な融合でありえる。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明のさらなる方法は、生物学的に活性のある融合タンパク質の単離および精製を含む。
【００３３】
別の実施形態において、本発明のさらなる方法は、融合タンパク質の単離および精製、ならびに生物学的に活性のある融合タンパク質を得ることを含む。したがって、融合タンパク質が堅く集合し膜内に包まれる場合、ポリペプチドに生物学的に活性があることを示すのは困難かもしれない。結果として、生物学的活性は、膜の除去後、および必要ならば融合タンパク質可溶化後に、分析することができる。したがって、生物学的に活性のあるポリペプチドを調製する方法が検討される。
【００３４】
この方法において、膜に囲まれた融合タンパク質を含む、組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）が提供される。ＲＰＢＬＡは、一般に約０．５〜約３ミクロン（μ）の直径を有する球形で通常存在するが、いくつかの実例において非晶質の形状であり、大きさは広く変化することができるが、それでもなおＥＲから由来する。融合タンパク質はともに結合される２つの配列を含んでおり、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方は生物学的に活性のあるポリペプチドである。ＲＰＢＬＡは、膜を分解する量のデタージェント（界面活性剤）を含む水性緩衝液に接触させられる。その接触は、膜および融合タンパク質を分離するために、膜を分解するのに十分な期間の間および生物学的に活性のあるポリペプチドを変性させない温度で維持される。分離される融合タンパク質は、通常の様式でその後回収されるか、または回収することなくさらに作用することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、分離される融合タンパク質は、生物学的に活性のあるポリペプチドの生物学的活性を示す。他の実施形態において、融合タンパク質が適切な緩衝剤中で溶解または分散された後、ポリペプチドの生物学的活性が示される。さらに他の実施形態において、ポリペプチドの生物学的活性が示される前に、その構成要素へと融合タンパク質を切断しなければならない。したがって、生物学的に活性のあるポリペプチドは、酵素的手段または化学的手段によって切断可能なスペーサーアミノ酸配列でＰＢＩＳへ結合することができる。次に、切断に際して、融合タンパク質のＰＢＩＳから切断された時生物学的に活性のあるポリペプチドは生物学的活性を示す。いくつかの実施形態において、未処理のＲＰＢＬＡの中へなお組み入れられた時でさえ、融合タンパク質はその活性を保つ。
【００３６】
別の実施形態において、生物学的に活性のあるポリペプチドは、少なくとも２つのＮ結合型糖鎖付加配列を含む。
【００３７】
さらに別の好ましい実施形態において、対象となるポリペプチドは、例えば天然プロラミンもしくは修飾プロラミン、またはプロラミンドメインとして、天然貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質へ融合される。
【００３８】
別の実施形態において、生物学的に活性のあるポリペプチドを含むＲＰＢＬＡは、送達系として生物学的に活性のあるポリペプチドのために使用される。薬物送達、ワクチンおよび栄養摂取において本発明の利益を適用することができるかもしれない。
【００３９】
さらに別の実施形態において、ポリペプチド抗原を含むＲＰＢＬＡは、アジュバント活性（免疫反応を増加させる）を提供する送達系として使用することができる。これらのＲＰＢＬＡの投与は、予防接種の速度、量、質および持続期間のような、予防接種パラメーターにおける改善を示すことができる。（ｉ）抗原は封入され、血液、または胃腸管中でより長く残存する（遅延放出効果）、および／または（ｉｉ）抗原は免疫系に対してより露出される（抗原提示媒体としてのＲＰＢＬＡ）、および／または（ｉｉｉ）ＲＰＢＬＡ調製品中のアジュバント分子の存在、および／または（ｉｖ）ＲＰＢＬＡは、それ自体がアジュバント活性を提供する膜を通過できる担体である、および／またはその他、という理由で、ＲＰＢＬＡ中での抗原投与の有益な効果を達成することができる。
【００４０】
したがって、本発明の別の態様は、免疫原性に効果的な量のＲＰＢＬＡ（薬学的に許容される希釈剤中に溶解または分散させた生物学的に活性のある組換え融合タンパク質を含む）を含むワクチンまたは接種物（免疫原性組成物）である。組換え融合タンパク質はともに結合される２つの配列を含んでおり、１つの配列はＰＢＩＳであり、他方は免疫反応が該ワクチンまたは接種物によって誘導される、生物学的に活性のあるポリペプチドである。薬学的に許容される希釈剤組成物は典型的には水もまた含む。別の実施形態において、抗原を組み入れてないが活性のあるアジュバント特性を有するＲＰＢＬＡは、免疫反応を誘導するために単離された抗原と共に共送達される。
【００４１】
別の実施形態において、ＰＢＩＳは膜を通過する担体として使用することができる。具体的な実施形態において、ＰＢＩＳはＺＥＲＡ（ＲＸ３）またはその断片である。
【００４２】
本発明はいくつかの利点および長所を有する。
【００４３】
１つの利点は、本発明の使用が、選択の真核生物細胞において、所望の生物学的に活性のある組換えタンパク質の比較的単純で迅速な発現を可能にするということである。
【００４４】
本発明の利点は、ＲＰＢＬＡ中での発現の特異的性質に起因して、容易に得ることが可能であり精製可能な生物学的に活性のある組換えタンパク質のソースを提供するということである。
【００４５】
本発明の別の利点は、融合タンパク質含むＲＰＢＬＡを、経口送達ワクチンを含む、ワクチンの送達のために使用することができるということである。
【００４６】
本発明の別の利点は、注射可能なワクチン中の免疫原のように、融合タンパク質含有ＲＰＢＬＡを使用することができるということである。
【００４７】
本発明の別の利点は、インスレーター（発現されたポリペプチドを、細胞構成要素の残りから隔離する膜結合構造）としてＲＰＢＬＡを使用することができるということである。これらのインスレーターはポリペプチド活性から細胞を保護し、細胞からポリペプチドを保護し、蓄積率を増加させる。したがって、毒性のあるおよび／または不安定である、生物学的に活性のある困難なポリペプチドを首尾よく発現することができる。
【００４８】
なおさらなる利点および長所は、続く考察から当業者に明白である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
検討される生物学的に活性のある組換えポリペプチドは、それらが発現される宿主細胞中では、しばしば膜に囲まれる組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）を形成する融合タンパク質の一部である。ＲＰＢＬＡ形成は、細胞の内部に高密度沈着を形成するシグナルペプチドおよび貯蔵タンパク質ドメインを含むタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）によって誘導される。これらの高密度沈着は、サイトゾル、細胞内膜系オルガネラ、ミトコンドリア、色素体において蓄積、または分泌されうる。特定の穀物用植物種子を例外として、真核生物宿主細胞自体は、融合タンパク質の非存在下においてタンパク質顆粒（ＰＢ）を産生しない。したがって宿主細胞にタンパク質顆粒様集合体またはＲＰＢＬＡを形成させるのは、融合タンパク質およびそのＰＢＩＳ部分の発現である。
【００５０】
検討される融合タンパク質は、ペプチド結合によって直接または間接的にともに結合される２つのポリペプチド配列を含み、１つの配列は、対象となる生物学的に活性のあるポリペプチド産物（標的）（例えばペプチドまたはタンパク質）である第２の配列へ結合される、タンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）の配列である。生物学的に活性のあるポリペプチドは天然で見出されるので、列挙された真核生物宿主細胞に対して異種でありえ、したがって最初に述べた真核生物宿主細胞とは異なる第２の細胞タイプにおいて発現され、合成的に産生される。すなわち、生物学的に活性のあるポリペプチドは列挙された真核生物宿主細胞に対して異種である。ＰＢＩＳは、ＲＰＢＬＡ形成の誘導、ならびにＥＲのようなオルガネラにおけるタンパク質の侵入および／または蓄積を仲介するタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列である。ＰＢＩＳから遊離および分離された場合、融合タンパク質はポリペプチドの生物学的活性に類似する生物学的活性を示す。
【００５１】
融合タンパク質の生物学的に活性のあるポリペプチドは、上記の第２の細胞タイプから単離されるか、またはインビトロで合成された同一のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％を示す。物質が、生物において任意の代謝物質、タンパク質、レセプター、オルガネラ、細胞または組織との相互作用、またはそれらへの効果を有しているならば、物質は「生物学的に活性のある」または「生物活性がある」と考えられる。
【００５２】
これらの生物学的活性は、ポリペプチドの活性決定のための標準的な技術を使用して、容易に決定し定量することができる。例えば、第２の細胞タイプから単離されたかまたはインビトロで合成されたポリペプチドと発現されたポリペプチドとの間の生物学的活性についての分析結果を比較することができる。融合タンパク質の活性を比較する場合、ＰＢＩＳによって提供されるその物質と任意のリンカー配列の比率は、分析比較において考慮される。生物学的活性は、発現されたＲＰＢＬＡ（周囲の膜のないタンパク質としての融合タンパク質、またはＰＢＩＳのない標的ポリペプチドとしての融合タンパク質）によって示すことができる。
【００５３】
特定の実施形態において、形質転換のために使用された核酸配列は、（ｉ）ＰＢＩＳをコードする核酸配列と、（ｉｉ）対象となる産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列とを含む。１つの実施形態において、核酸配列（ｉ）の３’末端は、該核酸配列（ｉｉ）の５’末端に結合される。別の実施形態において、核酸配列（ｉ）の５’末端は、核酸配列（ｉｉ）の３’末端に結合される。したがって、ＰＢＩＳ配列は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端で存在しうる。融合タンパク質の発現のための本明細書において論じられるすべてのＤＮＡ結合は、融合タンパク質の２つの構成要素がインフレームで発現されるような状態であることが理解されるべきである。
【００５４】
大部分のタンパク質顆粒は、約０．５〜約３．０μの直径の丸い形（一般に球状）の構造を有する。動物細胞において発現される場合、ＲＰＢＬＡは一般に球形であり、約０．５〜約３ミクロン（μ）の直径を有しており、周囲の膜がある。さらに、植物において発現されるＲＰＢＬＡは一般に球状であり、約０．５〜約２μの直径を有し、膜によって囲まれる。ＥＲ特異的分泌シグナルによってＥＲに標的化されたならば、植物、動物または真菌のいずれかにおいて発現されるＲＰＢＬＡはＥＲから由来し、集合に続いて、宿主細胞のＥＲエンベロープの外側に蓄積する。植物細胞のＥＲにおいて発現されるＥＧＦ含有ＲＰＢＬＡは、一般に球状でなく、不揃いのサイズの非晶質形状であることが注目される。
【００５５】
組換えタンパク質顆粒様集合体は所定の密度を有しており、この密度は異なる融合タンパク質の中で異なることが可能であるが、調製されている特定の融合タンパク質については公知である。ＲＰＢＬＡの所定の密度は、ホモジネート中に存在する実質的にすべての内在性の宿主細胞タンパク質よりも典型的には大きく、典型的には約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。新規ＲＰＢＬＡの高密度は、組換え融合タンパク質が多量体として集合し、膜と結合して規則正しい凝集体へと蓄積する一般的な能力のためである。検討されるＲＰＢＬＡは、真核生物において発現され、上で言及されるようなそれらの密度、ならびにそれらのサイズおよび形状によって特性を明らかにすることができる。
【００５６】
融合タンパク質のポリペプチド部分は、ＥＲ内での折畳みから、およびいくつかの実例ではＥＲ中の糖鎖付加から、その生物学的活性を得ると考えられる。興味深いことには、大部分の植物、哺乳類のような動物、および真菌のような単細胞真核生物は、トリペプチド糖鎖付加配列のＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここで「Ｘ」はプロリン以外の任意のアミノ酸残基である）に基づいて、同一のパターンでタンパク質にＮ−糖鎖を付加する。したがって、Ｇｌｃ3Ｍａｎ9（ＧｌｃＮＡｃ）2Ｎ結合型ポリペプチドが最初に形成され、形成後にゴルジへ分泌またはＥＲ内に保持することができるＭａｎ7-9（ＧｌｃＮＡｃ）2Ｎ結合型ポリペプチドへと切り取られる。この基本の糖鎖付加は、真核生物種類にわたって著しく類似している。ＲＰＢＬＡ中で維持されないタンパク質については、ここで検討される融合タンパク質でのように、宿主特異的な最終的糖鎖付加のようなさらなる翻訳後修飾がゴルジにおいて生じうる。
【００５７】
この方法において、膜に囲まれた融合タンパク質の規則正しい集合体（好ましくは一般に約０．５〜約３ミクロンの直径を有する球形で存在する）をしばしば含む組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）が提供される。融合タンパク質はともに結合される２つの配列を含んでおり、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方は生物学的に活性のあるポリペプチドである。ＲＰＢＬＡは、膜を分解する量のデタージェント（界面活性剤）を含む水性緩衝液に接触させられる。この接触は、膜を分解するのに十分な期間の間、および膜および融合タンパク質を分離するのに生物学的に活性のあるポリペプチドを変性させない温度（例えば凍結以上〜約４０℃）で維持される。分離された融合タンパク質は、通常の様式でその後回収されるか、または回収することなく作用することができる。脂質の可溶化について生化学において公知であるように、例示の有用な界面活性剤はトリトン−Ｘ１００、ＣＨＡＰＳおよび同種のものを含む。
【００５８】
分離された融合タンパク質は、システイン残基の存在によって少なくとも部分的に仲介される融合タンパク質のＰＢＩＳ部分の中での相互作用のために、典型的には不溶性形態である。しかしながら対象となるポリペプチドは、ＥＲに由来する真核生物シャペロンおよびフォールダーゼと共に複合体を形成し、集合した（および従って不溶性の）ＰＢＩＳドメインに拘束されるにもかかわらず、従って正確に折畳まれたコンフォーメーションで保持される。ＰＢＩＳ−ＰＢＩＳ相互作用は破壊することができ、融合タンパク質は、ジチオトレイトールまたは２−メルカプトエタノールすなわちβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）のような還元剤を含む水性緩衝液に融合タンパク質を接触させることにより可溶化する。対象となる結合する生物学的に活性のあるタンパク質を、破壊および折畳みをほどかないような、条件が選択される。次に、生物学的に活性のあるポリペプチドを含む、分離され可溶化された融合タンパク質を回収するか、またはそうでなければ使用される。さらに、融合した２つの部分は可溶化に際して互いから切断することができる。その切断が２つの部分の間の正確な境界にある必要がないことが理解されるべきである。
【００５９】
いくつかの実施形態において、分離された融合タンパク質は、生物学的に活性のあるポリペプチドの生物学的活性を示す。他の実施形態において、融合タンパク質は、ポリペプチドの生物学的活性を示すように、適切な緩衝剤において溶解または分散される。例えば以下に詳細に論じられるように、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、哺乳類細胞中のＲＰＢＬＡにおいて発現され、融合タンパク質が有意な活性を示すように、および切断されたポリペプチドもまた、本来の型のポリペプチドの活性に実質的に類似する活性を示すように、可溶化される。
【００６０】
さらに他の実施形態において、融合タンパク質については、ポリペプチドの生物学的活性が示される前に、その構成要素へと切断されなければならない。したがって、生物学的に活性のあるポリペプチドは、酵素的手段または化学的手段によって切断可能なスペーサーアミノ酸配列によってＰＢＩＳに結合させることができる。次に、融合タンパク質のＢＰＩＳからの切断および分析に際して、標的（生物学的に活性のある）ポリペプチドは生物学的活性を示す。以下に論じられる研究は、その融合パートナーから切断され、植物において産生されたＴ−２０ポリペプチドの生物学的活性を示す。
【００６１】
タンパク質顆粒誘導配列
検討されるタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）および宿主細胞は、好ましくは異なる生物門のものである。したがって、ＰＢＩＳは好ましくはより高等な植物（種子植物）からであるが、宿主細胞は種子植物以外であり、例えば哺乳類細胞または昆虫細胞のような動物細胞、真菌細胞または藻細胞でありえる真核生物であり、それらのすべては種子植物とは異なる門である。ＰＢＩＳおよび宿主細胞は同一の門からでもありえ、その結果、例えば両方はより高等な植物からでありえる。ＰＢＩＳの例示的な非限定的例は、例えばプロラミンまたは修飾されたプロラミン、プロラミンドメインまたは修飾されたプロラミンドメインのような、貯蔵タンパク質または修飾された貯蔵タンパク質を含む。プロラミンは、Shewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370):947-958において概説される。好ましいＰＢＩＳは、以下に論じられる、γ−ゼイン、α−ゼイン、δ−ゼイン、βゼイン、コメプロラミンおよびγ−グリアジンのようなプロラミン化合物である。
【００６２】
ＰＢＩＳは、植物細胞の小胞体（ＥＲ）に向けてタンパク質を導く配列もまた含んでいる。リーダー配列またはシグナルペプチドとしばしば呼ばれるその配列は、ＰＢＩＳの残りの部分と同一の植物、または異なる植物または動物もしくは真菌からでありえる。例示的なシグナルペプチドは、ＷＯ  ２００４００３２０７（ＵＳ  ２００４０００５６６０）において示される１９残基γ−ゼインのシグナルペプチド配列、α−グリアジンの１９残基シグナルペプチド配列、または２１残基γ−グリアジンのシグナルペプチド配列である（Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450; Sugiyama et al., 1986 Plant Sci. 44:205-209;ならびにRafalski et al., 1984 EMBO J 3(6):1409-11415およびその中に引用されるものを参照）。ＰＲ１０クラスの病原性関連タンパク質は、本明細書において有用な２５残基シグナルペプチド配列もまた含む。他の植物および動物からの同様に機能するシグナルペプチドも、文献において報告される。
【００６３】
ＥＲへタンパク質を導くことに関与するシグナルペプチドの特性は、広汎に研究されている（von Heijne et al., 2001 Biochim. Biophys. Acta Dec 12 1541(1-2):114-119）。シグナルペプチドは一次構造では相同性を共有しないが、共通の三次構造があり、それらは中心部の疎水性ｈ−領域、ならびに親水性のＮ末端およびＣ末端フランキング領域である。これらの類似性、およびタンパク質が明らかに共通経路を使用してＥＲ膜を通って移動するという事実は、異なるタンパク質、または異なる門に属する異なる生物からのタンパク質の間でさえシグナルペプチドの交換を可能にする。（以下の実施例１および２、ならびにMartoglio et al., 1998 Trends Cell Biol. Oct; 8(10):410-415を参照）。したがってＰＢＩＳは、より高等な植物〜異なる門からのタンパク質のシグナルペプチドを含むことができる。
【００６４】
γ−ゼイン（そのＤＮＡおよびアミノ酸残基の配列が以下に示されるトウモロコシ貯蔵タンパク質）は、４つのトウモロコシプロラミンのうちの１つであり、トウモロコシ内胚乳中の全タンパク質の１０〜１５％を占める。他の穀類プロラミンのように、α−ゼインおよびγ−ゼインは、粗面ＥＲの細胞質側で膜結合型のポリソームにおいて生合成され、内腔内で集合し、次にＥＲ由来タンパク質顆粒へと隔離される（Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234; Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403）。
【００６５】
γ−ゼインは、４つの特徴的なドメインの、ｉ）１９アミノ酸のペプチドシグナルと、ｉｉ）８単位のヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬ（配列番号：１）を含むリピートドメイン［５３アミノ酸残基（ａａ）］と、ｉｉｉ）プロリン残基が他のアミノ酸と交互であるＰｒｏＸドメイン（２９ａａ）と、ｉｖ）疎水性システインを多く含むＣ末端ドメイン（１１１ａａ）からなる。
【００６６】
γ−ゼインがＥＲ由来ＲＰＢＬＡ中で集合する能力は、種子に限定されない。実際、γ−ゼイン遺伝子が遺伝子導入シロイヌナズナ植物において構成的に発現される場合、貯蔵タンパク質は葉の葉肉細胞中のＥＲ由来ＰＢＬＳ内に蓄積した（Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922）。ＥＲ由来タンパク質顆粒中へのγ−ゼイン沈着に関与するシグナル（プロラミンにはＫＤＥＬシグナルがない）を探したところ、タンデム反復ドメインを含むプロリンを多く含むＮ−末端ドメインが、ＥＲでの保持のために必要なことが実証された。この研究においてＣ末端ドメインがタンパク質顆粒形成に関与できることもまた示唆されたが、最近のデータ（ＷＯ２００４００３２０７Ａ１）は、プロリンを多く含むＮ−末端ドメインがＥＲ中での保持およびタンパク質顆粒形成の誘導に必要かつ十分であることを実証する。しかしながら、これらのドメインがタンパク質顆粒集合を促進するメカニズムはなお不明であるが、インビトロの研究からの証拠は、γ−ゼインのＮ末端部分が規則正しい構造へと自己組織化できることを示唆する。
【００６７】
γ−ゼインに基づくＰＢＩＳが、少なくとも１つのリピートならびにＰｒｏＸドメインのアミノ末端９つの残基、および好ましくはＰｒｏＸドメイン全体を含むことは好ましい。γ−ゼインのＣ末端部分は必要とされないが存在することはできる。それらの配列は米国２００４０００５６６０において示され、それぞれＲＸ３およびＰ４として呼ばれ、以下に言及される。
【００６８】
タンパク質顆粒が種子においてのみ適切に命名されるので、他の植物器官、およびより非高等植物において産生された類似構造は、一般に合成ＰＢまたは組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）と呼ばれる。
【００６９】
ゼインは、α、β、δおよびγの４つの別個のタイプである。それらは内胚乳発生の間にＥＲ由来タンパク質顆粒において連続様式で蓄積する。β−ゼインおよびδ−ゼインは、トウモロコシＰＢ中で大量に蓄積しないが、それらは栄養組織中で安定しており、タバコにおいて発現される場合ＥＲ由来タンパク質顆粒様構造中で蓄積された（Bagga et al., 1997 Plant Cell Sep 9(9):1683-1696）。この結果は、δ−ゼインだけでなくβ−ゼインも、ＥＲでの保持およびタンパク質顆粒形成を誘導できることを示す。
【００７０】
小麦プロラミン貯蔵タンパク質（グリアジン）は、ＥＲを介する輸送が複雑であると考えられる、Ｋ／ＨＤＥＬのないタンパク質のグループである。これらのタンパク質は、保持されて高密度タンパク質顆粒へとパッケージにされる場合、ＥＲへと隔離されるか、または液胞の中へゴルジを介してＥＲから輸送される（Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450）。
【００７１】
グリアジンは、２つの別々に折畳まれた自律性領域を含んでいる天然のキメラであると思われる。Ｎ末端はグルタミンおよびプロリンを多く含む約７〜約１６のタンデム反復から構成される。タンデム反復の配列は異なるグリアジンの中で変化するが、１つまたは他のコンセンサス配列の、ＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号：４７）、ＰＱＱＱＰＰＦＳ（配列番号：４８）およびＰＱＱＰＱ（配列番号：４９）に基づく。タンパク質のＣ末端領域は、分子内のジスルフィド結合を形成する６〜８のシステインを含む。Altschuler et al.グループの研究は、Ｎ末端領域およびコンセンサス配列が、γ−グリアジンからＥＲにおけるＰＢ形成に関与することを示す。（Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450）。
【００７２】
例示的な他の有用なプロラミンタイプ配列は、それらのＧｅｎＢａｎｋ識別番号と共に表中で以下に示される。
2009527237.tif 000002
【００７３】
さらに有用な配列は、以下に示されるもののような問合せ（ｑｕｅｒｙ）を使用して、Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402において記載されているように、すべての非冗長ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ、＋ＰＲＦ（環境サンプル以外の）データーベース中で、ＢＬＡＳＴ検索を行なうことにより得られる。
ＲＸ３問合せ（配列番号：２）
α−ゼイン（配列番号：３）
コメプロラミン問合せ（配列番号：４）
【００７４】
例示的な修飾プロラミンは、（ａ）シグナルペプチド配列と、（ｂ）タンパク質γ−ゼイン（８つのヘキサペプチド単位を含むドメイン全体）のうちのリピートドメインのヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬ（配列番号：１）の１つまたは複数のコピーの配列と；（ｃ）γ−ゼインのＰｒｏＸドメインのすべてまたは一部の配列とを含む。例示的な特異的に修飾されるプロラミンは、そのＤＮＡおよびアミノ酸残基の配列もまた以下に示されるＲ３、ＲＸ３およびＰ４として以下に同定されるポリペプチドを含む。
【００７５】
特に好ましいプロラミンは、γ−ゼインおよび公表された出願ＷＯ２００４００３２０７中で開示されるようなその成分部分、コメｒＰ１３タンパク質ならびに２２ｋＤａトウモロコシα−ゼインおよびそのＮ末端断片を含む。γ−ゼイン、コメおよびα−ゼインのタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は、以下に示される。
【００７６】
２７ｋＤのγ−ゼイン
ＤＮＡ配列（配列番号：５）
タンパク質配列（配列番号：６）
【００７７】
ＲＸ３
ＤＮＡ配列（配列番号：７）
タンパク質配列（配列番号：８）
【００７８】
Ｒ３
ＤＮＡ配列（配列番号：９）
タンパク質配列（配列番号：１０）
【００７９】
Ｐ４
ＤＮＡ配列（配列番号：１１）
タンパク質配列（配列番号：１２）
【００８０】
Ｘ１０
ＤＮＡ配列（配列番号：１３）
タンパク質配列（配列番号：１４）
【００８１】
ｒＰ１３−クローンに相同の１３ｋＤのコメプロラミン−ＡＢ０１６５０４  Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol. Biochem. 60(2):335-337; Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116; Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153; Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52(8):2242-2246; Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol. Biochem. 63(11):1851-1858
【００８２】
タンパク質配列（配列番号：１５）
ＤＮＡ配列（配列番号：１６）
【００８３】
２２ａＺｔ２２ｋＤのトウモロコシα−ゼインのＮ末端断片−Ｖ０１４７５  Kim et al., 2002 Plant Cell 14(3):655-672; Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317; Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22; Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833。タンパク質配列（全長）（配列番号：１７）ＤＮＡ配列（全長）（配列番号：１８）
【００８４】
γ−グリアジン前駆物質−ＡＡＡ３４２７２−Scheets et al., 1988 Plant Sci. 57:141-150。
タンパク質配列（配列番号：１９）
ＤＮＡ配列（Ｍ３６９９９）（配列番号：２０）
【００８５】
βゼイン−ＡＦ３７１２６４−Woo et al., (2001) Plant Cell 13 (10), 2297-2317。ＤＮＡ（配列番号：２１）タンパク質（配列番号：２２）
【００８６】
δゼイン１０ｋＤ−ＡＦ３７１２６６−Woo et al., (2001) Plant Cell 13 (10), 2297-2317.およびKirihara et al., (1988) Gene. Nov 30;71(2):359-70。
ＤＮＡ（配列番号：２３）
タンパク質（配列番号：２４）
【００８７】
シグナルペプチド
γ−ゼイン（配列番号：２５）
【００８８】
α−グリアジン（配列番号：２６）
【００８９】
γ−グリアジン（配列番号：２７）
【００９０】
ＰＲ１０（配列番号：２８）
【００９１】
対象となるタンパク質
対象となる（標的）ポリペプチドまたはタンパク質の例は、治療用、栄養薬学用、農業用、バイオコントロール用、または産業用の使用がある任意のタンパク質を含む。そのようなタンパク質の例示的な活性は、（ａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲＥＤ）および同種のものによって提供されるような、光捕捉および発光と；（ｂ）エンテロキナーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、フィターゼ、炭酸脱水酵素、および産業上の酵素（加水分解酵素、グリコシダーゼ、セルラーゼ、酸化−リダクターゼおよび同種のもの）によって例示される、一次および二次細胞内シグナル伝達および代謝経路に関連するような、酵素活性と；（ｃ）例えば抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどのようなモノクローナル抗体）およびその断片、ホルモン［カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）および同種のもの］、プロテアーゼ阻害剤、抗生物質、抗菌剤、ＨＩＶ侵入阻害剤［Ryser et al., 2005 Drug Discov Today. Aug. 15;10(16):1085-1094］、コラーゲン、ヒトラクトフェリンならびにサイトカインのようなタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−レセプター相互作用およびタンパク質−リガンド相互作用と；（ｄ）ワクチンのためのタンパク質およびペプチド抗原（ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）；Ｂ型肝炎プレ表面抗原、表面抗原およびコア抗原、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の構造的なポリタンパク質遺伝子Ｐ１［Dus Santos et al., 2005 Vaccine. Mar 7;23(15):1838-1843］、米国特許第４，８８２，１４５号のＴ細胞刺激ペプチド、胃腸炎コロナウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスおよび同種のもの）と；（ｅ）フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、リシン毒素サブユニットＢ（ＲＴＢ）および他のレクチンのような、タンパク質−非タンパク質相互作用とを含む。
【００９２】
そのような発現されたポリペプチドの生物活性についての分析は、当技術分野において周知であり、１つまたは複数の出版物において入手可能である。例えば、ＥＣＦＰ（増強シアン蛍光タンパク質）活性は、タンパク質が４５８ｎｍで励起された場合に、４７０〜５３０ｎｍの波長で放射された蛍光の定量により測定することができる。Richards et al., 2003 Plant Cell Rep. 22:117-121を参照。エンテロキナーゼ（ＥＫ）の酵素活性は、例えば、２つの異なるアプローチにより測定することができる。この活性は、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社のカタログ（Ｅ１８０−０１およびＥ１８０−２）において論じられるようなウエスタンブロットでエンテロキナーゼに特異的な切断部位を含む融合タンパク質の切断を解析することによって決定することができ、酵素活性が経時的にペプチドからのβ−ナフチルアミンの放出によって引き起こされる蛍光（３３７ｎｍで励起、４２０ｎｍで発光）の増加によって測定される、ＥＫのための蛍光ペプチド基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｇ−５２６１、ＣＡＳ（登録商標）ＲＮ  ７００２３−０２−８）を使用してＥＫ活性を定量することによってもまた決定することができる。LaVallie et al., 1993 J. Biol. Chem. 268(31):23311-23317を参照。酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の活性は、基質ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルグルクロニド）の産物ＭＵへの変換によって測定することができる。この産物は、分光蛍光計で３６５ｎｍでの励起、４５５ｎｍでの発光で蛍光を測定することにより定量することができる。Pai-Hsiang et al., 2001 J. Plant Physiol. 158(2):247-254；およびJefferson et al., 1987 EMBO J 6:3901-3907を参照。フィターゼ分析は、アセトン、５．０Ｎ硫酸および１０ｍＭモリブデン酸アンモニウムからなるＡＡＭ試薬から放出される無機正リン酸塩の定量化によって実行される。Ullah et al., 1999 Biochem. Biophys. Res. Commun. 264(1):201-206を参照。同様の分析が他の生体タンパク質に利用可能である。Reed et al., 2005 Plant Cell Rep. Apr;24(1):15-24において記載されているように、ＲＴＢ活性分析は、アシアロフェツイン、ラクトースおよびガラクトースへのＲＴＢの結合の測定により行なうことができる。
【００９３】
ＥＧＦは線維芽細胞増殖に関与する増殖因子である。ＥＧＦ活性は、増殖細胞のＤＮＡ中へ、チミジンの代わりにピリミジンアナログの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）が取り込まれることで測定されるＤＮＡ合成の誘導の定量化によって、細胞増殖ＥＬＩＳＡキットを使用して分析することができる［Oliver, et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Physiol. 286:1118-1129；カタログ番号１６４７２２９、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、マンハイム、ドイツ］。
【００９４】
光捕捉および発光が、個別および特殊なタイプの「生物学的活性」を構成することが注目され、その点でそのような活性は、上で言及された他のタイプの活性が提供するような、治療用、栄養薬学用、農業用、バイオコントロール用、または産業用の使用を提供しない。それらが治療用、栄養薬学用、バイオコントロール用、または産業用の使用を提供する標的分子によって所有される、必要な二次構造、三次構造および四次構造の特徴のうちのいくつかを共有するので、生物学的に活性のあるものとして標的のこのクラスのポリペプチドが本明細書において含まれる。しかしながらこれらのタンパク質は、生物学的に重要な分子の分析または開発で使用される多くのタイプの分析またはスクリーニングにおけるレポーター分子として有用であり、それらの発光活性は、適正な二次および三次タンパク質構造の存在を必要とする。標的のグループを、生物学的に活性のあるおよび／または発光活性のあるポリペプチドと呼ぶほうが、恐らくより正確である。
【００９５】
対象となる例示的なタンパク質のための例示的なＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は、以下に提供される。
【００９６】
ＥＣＦＰ
ＤＮＡ（配列番号：２９）
タンパク質（配列番号：３０）
【００９７】
ＧＵＳ１３８１
ＤＮＡ（配列番号：３１）
タンパク質（配列番号：３２）
【００９８】
ＧＵＳ１３９１Ｚ
ＤＮＡ（配列番号：３３）
タンパク質（配列番号：３４）
【００９９】
サケカルシトニンＢＡＣ５７４１７
タンパク質配列（配列番号：３５）
ＤＮＡ配列（配列番号：３６）
【０１００】
ｈＥＧＦ−シグナルペプチドのないＡＡＦ８５７９０に基づく構造
タンパク質配列（配列番号：３７）
ＤＮＡ配列（配列番号：３８）
【０１０１】
ｈＧＨ−シグナルペプチドのないＰ０１２４１に基づく構造
タンパク質配列（配列番号：３９）
ＤＮＡ配列（配列番号：４０）
【０１０２】
別の実施形態において、対象となるＰＢＩＳおよび産物の配列に加えて、組換え融合タンパク質はスペーサーアミノ酸配列をさらに含む。スペーサーアミノ酸配列は、酵素的手段もしくは化学的手段によって切断可能か、または切断可能でないアミノ酸配列になりえる。「切断可能でない」によって、いくつかのまたはすべての生物学的に活性のあるポリペプチドの破壊なしには、スペーサーの切断が生じないことが意味される。
【０１０３】
特定の実施形態において、スペーサーアミノ酸配列は、ＰＢＩＳと生物学的に活性のあるポリペプチドとの間に置かれる。例示的なアミノ酸配列は、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ−−Ｃエンドプロテアーゼ、第Ｘａ因子、ＳＵＭＯプロテアーゼ［Tauseef et al., 2005 Protein Expr. Purif. 2005 Sep 43(1):1-9］および同種のもののようなプロテアーゼによって切断可能である。あるいは、スペーサーアミノ酸配列は、ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社他から市販で入手可能なような、ＦＭＤＶウイルス自己プロセッシング２Ａ配列のような自己切断可能な配列、Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテインのようなインテインおよび同種のものに対応する。そのような配列は、タンパク質スプライシングを引き起こすことを選択的に誘導することができ、その結果として発現され回収されるタンパク質からそれ自体を除去するので、インテインリンカー配列の使用は好ましい。インテインは、対象となるタンパク質からＰＢＩＳを切断するために標的部位への到達には大きなタンパク質酵素を必要としないので、インテインは特に興味あるものである。この特性は、未処理のＲＰＢＬＡから対象となるタンパク質の直接的な単離に特に有用かもしれない。あるいは、例えばメチオニン残基で切断する臭化シアンのような化学試薬によって特異的に切断可能なアミノ酸配列がコードされる。
【０１０４】
さらなる実施形態において、形質転換目的に使用される核酸配列は、切断可能なアミノ酸配列をコードする核酸配列をともなうか、またはその核酸配列をともなわないで、同一出願人による特許出願ＷＯ  ２００４００３２０７に従って開示されたようなものである。
【０１０５】
調製の方法
好ましい実施形態において、融合タンパク質は、動物、動物細胞培養、植物もしくは植物細胞培養、真菌培養、昆虫細胞培養または藻類培養のような真核生物宿主細胞系を、（ｉ）ＰＢＩＳをコードする第１の核酸でと、（ｉｉ）生物学的に活性のある対象となるポリペプチド産物をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を動作可能なようにインフレームで結合したものを含む核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列により、形質転換することを含む方法に従って調製される。すなわち両方のポリペプチドが適切なリーディングフレームから発現され、対象となるタンパク質は生物学的に活性があるように、ＰＢＩＳをコードする核酸配列は対象となるポリペプチドをコードする配列に化学的に結合（ペプチド結合）される。以下に論じられるように、適切な調節配列がＰＢＩＳおよび対象となるタンパク質をコードする核酸配列のいずれかの側に存在することもまた検討される。そのような制御配列は周知であり、市販で入手可能なベクターである。ウイルスによる形質導入またはウイルス感染を介するようなＤＮＡを導入する間接的な手段の使用もまた検討され、トランスフェクションのような直接的なＤＮＡ送達方法が交換可能に使用される。
【０１０６】
形質転換された宿主細胞または構成要素は、融合タンパク質の発現および組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）の中への発現される融合タンパク質の集合に適切な期間および培養条件下で維持される。発現に際して、結果として生じる融合タンパク質は、高密度の組換えタンパク質顆粒様集合体として、形質転換された宿主系中で蓄積する。次に融合タンパク質は宿主細胞から回収できるか、または融合タンパク質を含む宿主細胞は、付加的栄養物質またはサプリメントを含む動物性食品として、所望のように使用することができる。融合タンパク質は、ＲＰＢＬＡの一部またはＲＰＢＬＡ不含有として単離できる。
【０１０７】
融合タンパク質の発現に適切な培養条件は、典型的には各タイプの宿主構成要素または宿主細胞によって異なる。しかしながら、それらの条件は当業者に公知であり、容易に決定される。同様に維持の持続期間は、宿主細胞および調製される所望の融合タンパク質の量により異なってもよい。重ねて、それらの条件は周知であり、具体的な状況において容易に決定することができる。さらに、具体的な培養条件は、本明細書における引用から得ることができる。
【０１０８】
１つの実施形態において、第１の核酸配列（ｉ）の３’末端は、第２の核酸配列（ｉｉ）の５’末端に結合される（接合される）。他の実施形態において、第１の核酸配列（ｉ）の５’末端は、第２の核酸配列（ｉｉ）の３’末端に結合される（接合される）。別の実施形態において、ＰＢＩＳは、貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質、断片またはその修飾断片を含む。
【０１０９】
別の特定の実施形態において、融合タンパク質は、以前に言及された核酸配列（ｉ）および（ｉｉ）に加えて、スペーサーアミノ酸配列をコードするインフレーム核酸配列（ｉｉｉ）を含む核酸配列により、動物、動物細胞培養、植物、植物細胞培養、真菌または藻類のような宿主細胞系を形質転換することを含む方法に従って調製される。以前に言及されたように、スペーサーアミノ酸配列は、酵素的手段または化学的手段によって切断可能であるか、または切断可能でないアミノ酸配列でありえる。１つの特定の実施形態において、核酸配列（ｉｉｉ）は該核酸配列（ｉ）と（ｉｉ）との間に置かれ、例えば、３番目の核酸配列（ｉｉｉ）の３’末端は、第２の核酸配列（ｉｉ）の５’末端に結合される。別の実施形態において、３番目の核酸配列（ｉｉｉ）の５’末端は、第２の核酸配列（ｉｉ）の３’末端に結合される。
【０１１０】
以前に記載された融合タンパク質分子またはそのコード配列の相補物をコードする核酸配列（セグメント）もまた、本明細書において検討される。そのような核酸セグメントは、いくつかの好ましい実施形態において単離され精製された形態である。
【０１１１】
生物では、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝暗号を介してタンパク質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列へ直接関連する。したがって、遺伝暗号の周知の縮重を介して、所望されるように付加的なＤＮＡおよび対応するＲＮＡの配列（核酸）を調製することができ、それは同一の融合タンパク質のアミノ酸残基配列をコードするが、２つの配列は高いストリンジェンシーでハイブリダイズせず中程度のストリンジェンシーでハイブリダイズするような前に論じられた遺伝子配列とは十分に異なるものである。
【０１１２】
高いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ中で約５０℃〜５５℃の温度でのハイブリダイゼーション、および１〜３×ＳＳＣ中で６８℃の温度での最終的な洗浄を含むものとして定義することができる。中程度のストリンジェンシー条件は、０．２〜０．３ＭのＮａＣｌ中で約５０℃〜約６５℃の温度でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で約５０℃〜約５５℃での洗浄を含む。
【０１１３】
タンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）および対象となるポリペプチドを含む融合タンパク質（１）それ自体がコードする、またはその相補物がコードするヌクレイック(nucleic)配列（ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）もまた、本明細書において検討される。周知の通り、本明細書の他の部分で論じられるような適切な発現系において適切なプロモーターへ動作可能なように結合された場合、検討される核酸配列のような核酸配列が発現される。この核酸配列は、宿主真核生物細胞へ直接または間接的に（ウイルスまたは細菌のような適切なベクター生物を介して）送達することができ、宿主核またはオルガネラゲノムへと安定的に組入れられるか、またはゲノム組入れを伴わないで一過性に発現させることができる。
【０１１４】
異なる宿主は、しばしば特定のアミノ酸残基のコードのために使用される特定のコドンの選択性を有する。そのようなコドン選択性は周知であり、宿主に好まれるコドンが融合タンパク質を発現する特定の宿主に利用されるように、所望の融合タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、例えばインビトロ変異誘発を使用して改変することができる。
【０１１５】
上で論じられるように、検討される融合タンパク質をコードする遺伝子を定義する外来性の核酸セグメント（例えばＤＮＡセグメントまたは配列）へ、動作可能なように結合された遺伝子の、適合性のある真核生物宿主細胞生物中での発現を行なうために適切なプロモーターのような１つまたは複数の調節配列（調節エレメント）を含むベクターを含むＤＮＡ分子のような組換え核酸分子もまた、本発明において検討される。より詳細には、対象となるポリペプチドへ結合されたタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）をコードする遺伝子を定義するＤＮＡセグメントへ、動作可能なように結合された融合タンパク質の、宿主生物細胞中での発現を行なうためのプロモーターを含むベクターを含む組換えＤＮＡ分子もまた検討される。その組換えＤＮＡ分子は、適切なトランスフェクションおよび宿主の真核生物細胞における発現に際して、ＲＰＢＬＡとして検討される融合タンパク質を提供する。
【０１１６】
当技術分野において周知の通り、必要な核酸（例示的にはＤＮＡ配列）が存在する限り（開始シグナルおよび終止シグナルを含んで）、付加的な塩基対はＤＮＡセグメントのいずれかの末端で通常存在することができ、そのセグメントをタンパク質の発現のためになお利用することができる。これはもちろん、発現を抑制するか、発現が望まれる融合タンパク質を消耗させるさらなる産物を発現するか、その所望の融合タンパク質によって産生される必要な反応生成物を消耗する産物を発現するか、または他の場合にはＤＮＡセグメントの遺伝子の発現を妨害するように動作可能に結合されたＤＮＡ配列のセグメントが欠如していると推定される。
【０１１７】
したがって、ＤＮＡセグメントがそのような妨害ＤＮＡ配列のない限り、本発明のＤＮＡセグメントは約５００〜約１５，０００塩基対長でありえる。いったん、複製および発現（所望の場合に）に必要とされる最小限のＤＮＡ配列がすべて存在すれば、組換えＤＮＡ分子（特に発現ベクター）の最大サイズは、多くは利便性および宿主細胞により提供できるベクターサイズによって支配される。最小限のベクターサイズは周知である。そのような長いＤＮＡセグメントは好ましくないが使用することができる。
【０１１８】
前に記載された融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、化学的技術（例えばMatteucci et al., 1981 J. Am. Chem. Soc., 103:3185のフォスフォトリエステル法）により合成することができる。もちろん、化学的にコード配列を合成することによって、任意の所望の変更は、本来のアミノ酸残基配列をコードする塩基の代わりに適切な塩基を用いることで単純に行うことができる。しかしながら、本明細書において具体的に論じられた配列を含むＤＮＡセグメントが好ましい。
【０１１９】
融合タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡセグメントは、好ましくはその遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子（プラスミドベクター）から得られる。宿主細胞中の融合タンパク質遺伝子の発現を導くベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１２０】
発現ベクターは、プロモーターを含む発現調節エレメントを含んでいる。プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼの結合および融合タンパク質をコードする遺伝子の発現の指令を可能にするように、融合タンパク質をコードする遺伝子は、発現ベクターへ動作可能なように結合される。ポリペプチドをコードする遺伝子の発現において有用なものは、Chua et al., 1989 Science, 244:174-181において示されるような時間的に制御、空間的に制御、および空間時間的に制御されるものと同様に、Paszkowski et al., 1989 EMBO J., 3:2719 and Odell et al., 1985 Nature, 313:810によって記載されるような誘導可能なウイルス性の構成的な合成プロモーターである。
【０１２１】
哺乳類および藻類または、昆虫および同種のものの細胞と適合性のあるベクターのような、真核生物細胞と適合性のある発現ベクターは、本明細書において検討される。そのような発現ベクターもまた本発明の組換えＤＮＡ分子を形成するために使用することができる。真核生物細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、いくつかの市販のソースから利用可能である。通常は、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントおよびプロモーター配列の挿入のために１つまたは複数の都合のよい制限部位を含んでいる。任意で、そのようなベクターは真核生物細胞における使用のために特異的選択可能マーカーを含む。
【０１２２】
哺乳類細胞における組換ＤＮＡ発現による融合タンパク質の産生は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、Ｃｏｓ１サル宿主細胞およびヒト２９３Ｔ宿主細胞中で、融合タンパク質遺伝子を発現する組換ＤＮＡベクターを使用して以下に示される。これは当技術分野において周知であり、より詳細に、Sambrook et al.、分子クローニング：実験手引き書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratories）（１９８９）中で記載される手順を使用して遂行される。
【０１２３】
昆虫細胞系もまた、検討される融合タンパク質を発現するために使用することができる。例えば、そういうものの一つの系において、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、または  トリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）属幼虫中で外来遺伝子を発現するために、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）またはバキュロウイルスをベクターとして使用する。融合タンパク質をコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域中へクローニングすることができ、ポリヘドリンプロモーターの制御下で置かれる。融合タンパク質配列の挿入が成功すれば、ポリヘドリン遺伝子を不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次に組換えウイルスは、例えば融合タンパク質を発現できるツマジロクサヨトウ細胞またはトリコプルシア属幼虫を感染させるために使用することができる（E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3224-3227；およびV. Luckow、「昆虫細胞発現技術（Ｉnsect Cell Expression Technology）」、１８３〜２１８ページ、タンパク質工学：原理および実践（Protein Engineering: Principles and Practice）、J.L. Cleland et al.編集者、ワイリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）社、１９９６年）。オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子は、多くの場合感染の後期段階の間に高レベルで発現する。
【０１２４】
融合タンパク質遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（商標）バキュロウイルス発現系（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）として商業的に販売される、バキュロウイルスシャトルベクター系［Luckow et al., 1993 J. Virol., 67:4566-4579］を使用して構築される。組換えウイルスのストックは調製され、組換えタンパク質の発現は標準的なプロトコールによってモニタリングされる（O'Reilly et al.、バキュロウイルス発現ベクター：実験手引き書（Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual）、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク、１９９２年；およびＫｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、バキュロウイルス発現系：研究室ガイド（The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide）、チャップマン＆ホール（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ）、ロンドン、１９９２年）。当業者に公知のような、T.Kostおよび共同研究者（例えば、参照、Merrihew et al., 2004 Methods Mol Biol. 246:355-365）によって記載される「ＢａｃＭａｍ」系のような哺乳類細胞または他のそのような系における、バキュロウイルスまたは他の送達ベクターの使用もまた、本発明において検討される。
【０１２５】
どの発現ベクターを、および最終的にどのプロモーターに、融合タンパク質をコードする遺伝子が動作可能なように結合されるかの選択は、所望の機能特性、例えばタンパク質発現の所在およびタイミング、ならびに形質転換される宿主細胞に直接依存する。これらは、組換えＤＮＡ分子の構築についての当技術分野における固有の周知の制限である。しかしながら、本発明の実行において有用なベクターは、複製、および好ましくは動作可能なように結合されたＤＮＡセグメント中に含まれる融合タンパク質遺伝子の発現（発現ベクターについて）もまた導くことができる。
【０１２６】
より高等な植物および哺乳類からの細胞における遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは、当技術分野において周知であり、Rogers et al. (1987) Meth. in Enzymol., 153:253-277によって記載されるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドに由来する植物ベクターおよび哺乳類発現ベクターｐＫＳＶ−１０（上記）、ならびにｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、＃Ｅ１８４１、マディソン、ウィスコンシン）を含む。しかしながら、他のいくつかの発現ベクター系は、Ｆromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:58-24によって記載されるｐＣａＭＶＣＮトランスファー制御ベクターを含む植物における機能が公知である。プラスミドｐＣａＭＶＣＮ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー）から入手可能）は、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを含む。
【０１２７】
上記の植物発現系は、典型的には挿入された導入遺伝子の全体的または構成的発現を提供する。植物の大部分またはすべてがＲＰＢＬＡおよびそれらの融合タンパク質のソースとして使用される場合、全体的な発現は有用になりえる。しかしながら、粒子がより容易に単離または摂取することができる根、種子または果物のような植物貯蔵器官において、ＲＰＢＬＡおよびそれらの融合タンパク質内容物を発現するほうが効果的でありえる。
【０１２８】
貯蔵器官発現を達成する１つの様式は、１つまたは複数のあらかじめ選ばれたまたはあらかじめ決定された非光合成植物器官において制御される遺伝子を発現するプロモーターを使用することである。葉または茎に対して根、種子または果物のような他の器官においてほとんどまたは全く発現のない１つまたは複数のあらかじめ選ばれた貯蔵器官における発現は、本明細書において増強された発現または選択的発現と呼ばれる。１つまたは複数のあらかじめ選ばれた器官において、別の器官と比較して、少なくとも５：１の比での発現を導く例示的なプロモーターは、本明細書において器官に増強されたプロモーターとして定義される。実質的に１つの貯蔵器官のみにおける発現、および他の貯蔵器官における発現が実質的にないことは、器官特異的発現と呼ばれる；すなわち、別の貯蔵器官と比較して、貯蔵器官における発現産物の比が約１００：１またはそれ以上であることは、器官特異性を示す。したがって貯蔵器官特異的プロモーターは、貯蔵器官に増強されたプロモーターのクラスのメンバーである。
【０１２９】
例示的な植物貯蔵器官は、トウモロコシ（コーン）、大豆、コメ、脂肪種子アブラナおよび同種のものの種子に加えて、ニンジン、タロイモまたはキャッサバの根、バレイショ塊茎、ならびにレッドグアバとパッションフルーツ、マンゴー、パパイア、トマト、アボカド、チェリー、タンジェリン、マンダリンミカン、パーム、カンタロープおよびスイカのようなメロン、ならびに西洋カボチャ、キュウリ、マンゴー、アプリコット、桃のような他の多肉果のような果肉を含む。
【０１３０】
ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターは通常は構成的プロモーターであると考えられる。しかしながら、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの２１ｂｐ領域は、別の異種の通常緑色組織プロモーター（ｒｂｃＳ−３Ａプロモーター）へと動作可能なように結合された場合、結果として生じるキメラプロモーターを根に増強されたプロモーターにすることが可能であることが、研究によって示された。その２１ｂｐ配列は米国特許第５，０２３，１７９号に開示される。米国特許第５，０２３，１７９号の２１ｂｐ挿入物を含むキメラｒｂｃＳ−３Ａプロモーターは、本明細書において有用な、根に増強されたプロモーターである。
【０１３１】
上記の２１ｂｐセグメントを含む、同様の根に増強されたプロモーターは、ＣＡＭＶ  ３５Ｓプロモーター自体の−９０〜＋８領域である。米国特許第５，１１０，７３２号は、その短縮したＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターが、根および種子の根生（根になることが予定されている組織）中で増強された発現を提供することを開示する。そのプロモーターもまた本明細書において有用である。
【０１３２】
別の有用な根に増強されたプロモーターは、ＰＣＴ／ＧＢ９２／００４１６（１９９１年９月１９日に公表されたＷＯ  ９１／１３９２２）において開示された脂肪種子アブラナ（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）Ｌ．）遺伝子の−１６１６〜−１のプロモーターである。このプロモーターを含んでいるプラスミドｐＲｌａｍｂｄａＳ４およびバクテリオファージλβlを内部に持つ大腸菌ＤＨ５αは、国立工業用細菌および海洋性細菌のコレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）、アバディーン、グレートブリテンに、１９９０年３月８日に寄託され、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４０２６５およびＮＣＩＭＢ４０２６６を有する。このプロモーターの有用部分は、ＨａｅＩＩＩによるプラスミドの切断によって１．０ｋｂの断片として得ることができる。
【０１３３】
根に増強された好ましいプロモーターは、DiRita and Gelvin (1987) Mol. Gen. Genet, 207:233-241によって記載されるプラスミドｐＫａｎ２中に存在するマンノピンシンターゼ（ｍａ）プロモーターである。このプロモーターはＸｂａＩ−ＸｂａｌＩ断片としてそのプラスミドｐＫａｎ２から除去可能である。
【０１３４】
マンノピンシンターゼの根に増強された好ましいプロモーターは、ポジション−１３８までのコアマンノピンシンターゼ（ｍａ）プロモーター領域、および−３１８〜−２１３のマンノピンシンターゼ活性化因子を含み、まとめてＡｍａｓＰｍａｓと呼ばれる。このプロモーターは、葉の発現レベルと比較して、タバコ根において約１０倍〜約１００倍産生を増加させることが見出されてきた。
【０１３５】
別の根特異的プロモーターは、側根形成開始の間に発現し、Keller et al. (1989) Genes Dev., 3:1639-1646によって報告された、ヒドロキシプロリンを多く含むグリコペプロテイン（ｇｌｙｃｏｐｅｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子（ＨＲＧＰｎｔ３）に付随する約５００ｂｐの５’フランキング配列である。別の好ましい根特異的プロモーターは、Yamamoto et al. (1991) Plant Cell, 3:371-381によって報告されたタバコ根特異的遺伝子ＴｏＲＢＦの約−６３６〜−１の５’−フランキング領域中に存在する。発現を制御するシス作用エレメントは、転写開始部位から５’方向に約−６３６〜約−２９９の領域に、それらの著者によってより特異的に位置を定められた。Yamamoto et al.は、葉、芽分裂組織または茎ではなく、根におけるＴｏＲＢＦ遺伝子からの定常状態ｍＲＮＡの産生を報告した。
【０１３６】
さらに別の有用な貯蔵器官特異的プロモーターは、トマト（リコペルシコン  エクスレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））の果実成熟遺伝子Ｅ８の５’フランキング領域および３’フランキング領域である。これらの領域およびそれらのｃＤＮＡ配列は、Deikman et al. (1988) EMBO J., 7(11):3315-3320、および(1992) Plant Physiol., 100:2013-2017において図示され論じられる。
【０１３７】
３つの領域が遺伝子の５’フランキング配列の２１８１ｂｐ中に位置し、ポリ（Ａ）付加部位の３’の５２２ｂｐ配列はＥ８遺伝子の発現を制御するように思われた。−２１８１〜−１０８８の１つの領域は未熟果実におけるエチレンによるＥ８遺伝子転写の活性化に必要とされ、成熟の間の転写にも寄与する。さらなる２つの領域の−１０８８〜−８６３および−４０９〜−２６３は、未熟果実におけるエチレン反応性を与えることができないが、成熟の間のＥ８遺伝子発現に十分である。
【０１３８】
コーンにおいて、制御される酵素を内胚乳において高レベルで発現させ、根においてはるかに減少したレベルで発現させ、緑色組織または花粉において発現させないトウモロコシスクロースシンターゼ−１（Ｓｈ）プロモーターは、キメラレポーター遺伝子（β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ））を、茎および根に多いタバコ師管細胞において特異的に発現させることが報告された。Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 87:4144-4148。したがってこのプロモーターは、メロン（例えばカンタロープ）に類似する多肉果または内胚乳を含む種子のような植物器官、および高レベルの師管細胞を有する根に有用である。
【０１３９】
他の例示的な組織特異的プロモーターは、種子組織に特異的なレクチンプロモーターである。ダイズ種子中のレクチンタンパク質は単一遺伝子（Ｌｅ１）によりコードされ、種子成熟の間でのみ発現し、全種子ｍＲＮＡの約２〜約５％を占める。レクチン遺伝子および種子特異的プロモーターは完全に特性を明らかにされ、遺伝子導入タバコにおける種子特異的発現を導くために使用された。例えばVodkin et al. (1983) Cell, 34:1023およびLindstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11:160を参照。
【０１４０】
特に好ましい塊茎特異的発現プロモーターは、ジャガイモパタチン遺伝子の５’フランキング領域である。このプロモーターの使用はTwell et al. (1987) Plant Mol. Biol., 9:365-375中に記載されている。このプロモーターは、バクテリオファージＬＰＯＴＩの約４０６ｂｐ断片中に存在する。ＬＰＯＴＩプロモーターは、４つの他のパタチンプロモーターと９０％以上の相同性のある領域、およびパタチンプロモーターＰＧＴ５と４００塩基すべてにわたって約９５％の相同性のある領域を有する。これらのプロモーターの各々は本明細書において有用である。Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol., 12:41-50もまた参照。
【０１４１】
高等植物器官に増強され器官特異的な、なおさらなるプロモーターは、Benfey et al. (1988) Science, 244:174-181において開示される。
【０１４２】
利用されるプロモーター配列の各々は、細胞におけるＲＰＢＬＡの量に実質的に影響されない。本明細書において使用されるような、用語「実質的に影響されない」は、プロモーターが、形質転換細胞または遺伝子導入植物中に蓄積されたＲＰＢＬＡによる直接的なフィードバック制御（阻害）に反応しないことを意味する。
【０１４３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用する植物細胞のトランスフェクションは、典型的には双子葉植物に対して最も良く実行される。単子葉植物は、プロトプラストのいわゆる直接的な遺伝子トランスファーによって通常最も容易に形質転換される。直接的な遺伝子トランスファーは、エレクトロポーテーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｔａｔｉｏｎ）によって、ポリエチレングリコールを介したトランスファーまたは必要なＤＮＡを運ぶマイクロプロジェクタイルによる細胞の衝撃によって通常行なわれる。トランスフェクションのこれらの方法は当技術分野において周知であり、本明細書においてさらに論じられる必要はない。さらに、トランスフェクションされた細胞およびプロトプラストからの全植物体を再生する方法は、植物の組織から所望のタンパク質を得るための技術と同様に周知である。米国特許第５，６１８，９８８号および第５，６７９，８８０号  ならびにその中の引用もまた参照。
【０１４４】
アグロバクテリウム形質転換、エレクトロポーテーションまたは他の方法を使用して形成される遺伝子導入植物は、典型的には１つの染色体上に単一の遺伝子を含む。そのような遺伝子導入植物は、付加的な遺伝子についてはヘテロ接合と呼ぶことができる。しかしながら、「ヘテロ接合である」という単語の使用は、通常１組の染色体のうちの第２の染色体の同一の遺伝子座での相補的な遺伝子の存在を意味し、ここでのように１つの付加的な遺伝子を含む植物においてはそのような遺伝子はないので、そして付加的な外来性キメラ分子をコードする遺伝子が有糸分裂および減数分裂の間に独立して分離するので、そのような植物に対するより正確な名称は、独立した分離体であると考えられる。検討されたＨＢｃキメラ分子をコードする単一の構造遺伝子の発現を操縦する、器官に増強されたプロモーターを含む遺伝子導入植物；すなわち独立した分離体は、好ましい遺伝子導入植物である。
【０１４５】
より好ましいのは、付加的な構造遺伝子についてはホモ接合の遺伝子導入植物；すなわち２つの付加的な遺伝子（染色体対の各染色体上の同一遺伝子座に１つの遺伝子）を含む遺伝子導入植物である。ホモ接合の遺伝子導入植物は、単一の付加的な遺伝子を含む独立した分離体の遺伝子導入植物を雌雄交配（自殖）させること、生じた種子のうちのいくつかを発芽させること、および対照（天然の非遺伝子導入）または独立した分離体遺伝子導入植物と比較して、増強されたキメラ粒子の蓄積について、結果として生じる植物を解析することによって得ることができる。天然の非遺伝子導入植物および独立した分離体の遺伝子導入植物の両方と比較して、ホモ接合の遺伝子導入植物は増強されたキメラ粒子蓄積を示す。
【０１４６】
２つの独立して分離する付加的な外来（異種）遺伝子を含む子孫を生ずるために、２つ異なる遺伝子導入植物も交配できることが理解されるべきである。適切な子孫の自殖により、キメラＨＢｃ分子をコードする両方の付加的な外来遺伝子についてのホモ接合の植物を生ずることができる。親植物への戻し交配および非遺伝子導入植物との異系交配も検討される。
【０１４７】
したがって本発明の遺伝子導入植物は、検討されるキメラＨＢｃ分子をコードする異種構造遺伝子を有する。好ましい遺伝子導入植物は、付加的な異種キメラＨＢｃ構造遺伝子について独立した分離体であり、その子孫にその遺伝子を伝達することができる。より好ましい遺伝子導入植物は、異種遺伝子についてホモ接合であり、雌雄交配の結果のすべての子孫にその遺伝子を伝達する。
【０１４８】
発現されるＲＰＢＬＡおよびそれらの融合タンパク質は、生化学的回収または生物学的回収において利用される通常手段によって、発現宿主細胞から得ることができる。ＲＰＢＬＡが宿主細胞中に存在する他のタンパク質と比較して高密度であるので、ＲＰＢＬＡは特に細胞ホモジネートの遠心分離による採取に適用可能である。
【０１４９】
したがって、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域および比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域を提供するために、異なる密度の領域をホモジネート中に形成する。ＲＰＢＬＡの少ない領域は、ＲＰＢＬＡが比較的高濃度の領域から分離され、それにより前記融合タンパク質を精製する。ＲＰＢＬＡが比較的高い濃度の領域は、その後採取することができるか、または１つもしくは複数の試薬により処理することができるか、またはその中のＲＰＢＬＡもしくは融合タンパク質の単離の前に１つもしくは複数の手順を行なう。いくつかの実施形態において、ＲＰＢＬＡが経口ワクチンとして使用される場合、融合タンパク質を単離する必要なしに、採取されたＲＰＢＬＡはそのまま使用される。生物学的に活性のあるポリペプチドを含む融合タンパク質は、デタージェントおよび以前に論じられたような還元剤を含む水性緩衝液中で周囲の膜の溶解によって回収されたＲＰＢＬＡから得ることができる。例示的な還元剤は、２−メルカプトエタノール、チオグリコール酸およびチオグリコレート塩、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンを含んでおり、通常のタンパク質単離方法が後続する。他のイオン性界面活性剤（デオキシコレート、’Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび同種のもの）、非イオン性界面活性剤（ツイーン（登録商標）２０、ノニデット（登録商標）Ｐ−４０、オクチルグルコシドおよび同種のもの）、ならびに両性イオン性界面活性剤（ＣＨＡＰＳ、ツィタージェント  （Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）（商標）３−Ｘ  セリエ（ｓｅｒｉｅ）および同種のもの）を使用することができるが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は好ましいデタージェントである。融合タンパク質を溶解または分散させる最小限の量の界面活性剤が利用される。
【０１５０】
ワクチンおよび接種物
さらに本発明の別の実施形態において、ＲＰＢＬＡはヒト患者、またはチンパンジー、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコもしくは同種のもののような適切な動物宿主における接種物またはワクチンの免疫原として使用される。接種物は、免疫原性エピトープまたは抗原決定基と免疫反応する抗体の産生のようなＢ細胞またはＴ細胞の反応（刺激）、またはそのようなエピトープへのＴ細胞活性化を誘導することができるが、ワクチンは、Ｂ細胞またはＴ細胞の反応の１つまたは両方を介して免疫原が由来する構成要素に対する防御を提供する。
【０１５１】
検討されるワクチンまたは接種物のＲＰＢＬＡは、ＲＰＢＬＡを飲み込みそれらの内容物を処理する樹状細胞および単球／マクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）に作用するように思われる。それらの細胞タイプにおける作用において、ＲＰＢＬＡは抗原提示細胞への抗原送達を改善する。それらのＲＰＢＬＡは、抗原提示細胞への抗原処理および抗原提示もまた改善する。
【０１５２】
したがって、本発明は、さらに薬学的に許容される希釈剤中で溶解または分散される、免疫原性に効果的な量の組換えタンパク質顆粒様集合体（ＲＰＢＬＡ）を含むワクチンまたは接種物を検討する。ＲＰＢＬＡは組換え融合タンパク質を含んでおり、組換え融合タンパク質それ自体はともに結合される２つの配列を含んでおり、１つの配列はタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方は免疫反応が前記ワクチンまたは接種物によって誘導される生物学的に活性のあるポリペプチドである。
【０１５３】
Ｔ細胞活性化は様々な技術によって測定することができる。通常の実行において、宿主動物は検討されるＲＰＢＬＡワクチンまたは接種物により接種され、末梢血単核球（ＰＭＢＣ）はその後採取される。次にそれらのＰＭＢＣは、約３〜５日の期間の間生物学的に活性のあるポリペプチド（Ｔ細胞免疫原）の存在下においてインビトロで培養される。次に培養されたＰＭＢＣを、増殖、またはＩＬ−２、ＩＦＮ−γのＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインの分泌について分析する。Ｔ細胞活性化についての分析は当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，４７８，７２６号およびその中に引用される技術を参照。
【０１５４】
例示的なものとして抗体形成を使用して検討される接種物またはワクチンは、典型的には水も含む薬学的に許容される希釈剤組成物中で溶解または分散させた、免疫原的に効果的な量のＲＰＢＬＡを含む。接種物が、予防接種を必要とする宿主動物のような、生物学的に活性のあるポリペプチドへの免疫反応がワクチンまたは接種物で誘導される宿主動物に投与された場合、または哺乳類（例えば、マウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、類人猿またはヒト）、またはトリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはガチョウ）のような、抗体の誘導が所望される宿主動物に投与された場合、生物学的に活性のある標的ポリペプチドの１つまたは複数の抗原決定基と免疫反応する抗体を誘導する。
【０１５５】
各予防接種において利用されるＲＰＢＬＡ免疫原の量は、免疫原的に効果的な量と呼ばれ、以下に論じられるように、とりわけＲＰＢＬＡ免疫原については、予防接種される患者およびワクチン中のアジュバントの存在に依存して、広く変化しうる。（ｉ）ワクチンおよび（ｉｉ）接種物についての免疫原性に効果的な量は、上文に論じられる、（ｉ）防御または（ｉｉ）抗体もしくはＴ細胞活性をそれぞれ提供する。
【０１５６】
ワクチンまたは接種物は、典型的には１接種あたり（単位用量）約１マイクログラム〜約１ミリグラム、および好ましくは約１０マイクログラム〜単位用量あたり約５０マイクログラムのＲＰＢＬＡ免疫原濃度を含む。本発明のワクチンまたは接種物に関連するような用語「単位用量」は、動物に対する単一の投薬として適切な物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる希釈剤（すなわち担体または賦形剤）と共同して望ましい免疫原性効果を、個別にまたは集団的に生ずるように意図される活性のある物質の所定の量を含む。
【０１５７】
ワクチンまたは接種物は、典型的には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、酢酸緩衝生理食塩水（ＡＢＳ）、リンガー溶液または同種のもののような生理学的に耐容される（許容される）希釈賦形剤中で、微粒子の形態で、免疫原を分散させることにより、回収されたＲＰＢＬＡ免疫原から水溶性組成物を形成するように調製される。以下に論じられるように、希釈剤賦形剤は、落花生油、スクアランまたはスクワレンのような油性物質もまた含むことができる。
【０１５８】
有効成分としてタンパク質性の物質を含む接種物およびワクチンの調製もまた、当技術分野において十分に理解される。典型的には、そのような接種物またはワクチンは、液体溶液または懸濁物のいずれかとしての非経口投与薬として調製され、注射の前に液体の溶液または懸濁物のために適切な固体形態も調製することができる。その調製品は乳化もされることができ、それらは特に好ましい。
【０１５９】
免疫原的に活性のあるＲＰＢＬＡは、有効成分と共に、薬学的に許容され適合性のある賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは同種のものおよびその組合せである。さらに所望されるならば、接種物またはワクチンは、組成物の免疫原実効性を高める、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような少量の補助剤を含むことができる。
【０１６０】
単語「抗原」は、抗体またはレセプターによって結合される構成要素を示し、抗体産生を誘導する構成要素も示すために、歴史上使用されてきた。より最新の用法は、抗原の意味を抗体またはレセプターによって結合されるその構成要素に限定するが、単語「免疫原」は抗体産生を誘導するか、またはレセプターに結合する構成要素に使用される。本明細書において論じられる構成要素が免疫原性であり抗原性である場合には、免疫原または抗原のいずれかとして、典型的には意図される有用性に従って言及される。
【０１６１】
「抗原決定基」は、抗体結合部位またはＴ細胞受容体によって免疫学的に結合される抗原の実際の構造的な部分を指す。この用語は「エピトープ」とも同じ意味で使用される。
【０１６２】
本明細書において使用されるように、用語「融合タンパク質」は、通常は天然ではともに結合されて見出されない、少なくとも２つのアミノ酸残基配列を含み、動作可能なようにそれぞれのカルボキシ末端アミノ酸残基とアミノ末端アミノ酸残基との間のペプチド結合によってともに末端間（頭−尾）で結合されるポリペプチドを示す。本発明の融合タンパク質は、対象となる（標的）生物学的に活性のあるポリペプチド産物（例えばペプチドまたはタンパク質）である、第２の配列に結合されたタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）のキメラである。
【０１６３】
詳述されていなくても、当業者は、先の記述および下記の詳細な実施例を使用して、最大限に本発明を利用することができると考えられている。したがって、以下の好ましい具体的な実施形態は単に例示的であり、いかなる任意の手段で開示の残りの部分を限定するものではないと解釈されるべきである。
【０１６４】
実施例１：トランスフェクションされた哺乳類細胞の高密度画分中のＲＸ３−ＥＣＦＰ由来融合タンパク質の蓄積
【０１６５】
Ｎ末端γ−ゼインコード配列ＲＸ３（ＷＯ２００４００３２０７）をコードするポリヌクレオチド配列を、直接または５つのグリシンからなるリンカーを介して、ＥＣＦＰ（ＧＦＰのシアン蛍光変異体）をコードする配列の５’末端に融合した。融合タンパク質ＲＸ３−ＥＣＦＰまたはＲＸ３−Ｇｘ５−ＥＣＦＰをコードするコンストラクト（図１Ａ）を、ＣＨＯ哺乳類培養細胞中にリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）に基づくトランスフェクション方法（インビトロゲン社）により導入した。細胞質ＥＣＦＰの遺伝子配列を含むプラスミドｐＥＣＦＰ−Ｎ１（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、対照として使用した。
【０１６６】
トランスフェクションされた哺乳類細胞の抽出液を、段階的密度勾配上にロードし、遠心分離した。異なる画分中の組換えタンパク質の蓄積をイムノブロットによって解析した。（図２Ａ）。その図中に示される結果は、高密度ＲＰＢＬＡに対応する画分Ｆ４２、Ｆ５６およびＰにおいて、ＲＸ３−ＥＣＦＰおよびＲＸ３−Ｇｘ５−ＥＣＦＰが出現したことを示す（図２Ａ、レーン３〜５）。この結果は、融合タンパク質が集合し、ＲＰＢＬＡ形成を誘導できることを実証する。若干の融合タンパク質も、上清画分において検出され（図２Ａ、レーン１）、恐らく抽出過程の間に部分的に可溶化したＲＰＢＬＡからの融合タンパク質、または合成されたばかりで集合していない融合タンパク質を表わす。
【０１６７】
反対に、対照プラスミドｐＥＣＦＰ−Ｎ１によりトランスフェクションされた哺乳類細胞抽出液が同一の段階的密度勾配上にロードされた場合、ＥＣＦＰタンパク質はもっぱら上清中に観察された。微量のＥＣＦＰも高密度画分中に検出されなかったことから、ＥＣＦＰが単独で凝集しＰＢのような構造を形成できないことが示される。
【０１６８】
実施例２：トランスフェクションされた哺乳類細胞のＲＰＢＬＡ中のＰＢＩＳドメインへ融合させた活性のあるＥＣＦＰの蓄積
【０１６９】
融合タンパク質のＲＸ３−ＥＣＦＰ、ＲＸ３−Ｇｘ５−ＥＣＦＰおよび２２ａＺ−ＥＣＦＰが、ＲＰＢＬＡの内部で活性があるかどうか決定するために、共焦点顕微鏡分析を、それらをコードするコンストラクトによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞において行なった（図１Ａ）。シアン蛍光イメージを、４７０〜５３０ｎｍで設定された発光ウィンドウの使用によりアルゴンイオンレーザーによる４５８ｎｍ励起で集めた。図３中に示されるように、対応する融合タンパク質のＲＸ３−ＥＣＦＰ（図３Ａ）およびＲＸ３−Ｇｘ５−ＥＣＦＰ（図３Ｂ）および２２ａＺ−ＥＣＦＰ（図３Ｄ）は、小胞体中に検出されたことから、γ−ゼインおよびα−ゼインのシグナルペプチドがＥＲへの融合タンパク質の移動を仲介する哺乳類細胞において、そのシグナルペプチドが機能的であることが示される。
【０１７０】
融合タンパク質が驚くほど優先的に蓄積された大きな高密度球状構造の出現に注目することは重要であり、この球状構造は免疫検出によって視覚化された、穀物種子の天然のＰＢおよび異種系におけるＲＰＢＬＡの両方に非常に類似していた。これらの構造において観察される強い蛍光は、融合タンパク質が適切に折畳まれたままであること、およびしたがってＲＰＢＬＡの内部で高度にパッケージにされるにもかかわらず活性があることを示す。ＰＢおよびＰＢ様構造の形成に関与する他のタンパク質顆粒誘導配列（ＰＢＩＳ）と同様に、ＲＸ３ドメインも複数のシステイン残基を含むことに注目することもまた重要である。そのようなシステインが標的タンパク質システインによりジスルフィド結合を形成することができ、従って標的タンパク質の適切な折畳みを妨害することが予測されてもよいが、これはそのようなことは観察されなかった。活性のある標的タンパク質（ＥＣＦＰ蛍光）および機能的なＰＢＩＳ（ＲＰＢＬＡの形成）の両方が観察された。
【０１７１】
対照として、コンストラクトｐＥＣＦＰ−Ｎ１を、ＣＨＯ細胞のトランスフェクションのために使用した。細胞質ＥＣＦＰの発現は、核を含む細胞すべてにわたって均一な蛍光パターンを示した（図３Ｃ）。
【０１７２】
実施例３：ＣＨＯ細胞における、ＲＸ３に融合させた他の蛍光タンパク質の細胞内局在。
【０１７３】
ＲＸ３に融合させたＥＣＦＰ以外の蛍光タンパク質がＲＰＢＬＡの内部で適切に折畳まれ生物活性があるかどうかを解析するために、一過性にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞中での、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ融合タンパク質およびＲＸ３−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を、共焦点顕微鏡によって解析した。ＤｓＲＥＤがＥＣＦＰと相同性を持たない（完全に異なる折畳みメカニズムを意味する）ことに注目すべきである。トランスフェクションされた細胞からの顕微鏡写真は、発光帯波長選択のための分光光度計を装備する共焦点レーザー顕微鏡（ライカ（Ｌｅｉｃａ）社ＴＣＳ  ＳＰ、ハイデンベルグ、ドイツ）の使用により得られた。緑色蛍光イメージを、４９５〜５３５ｎｍで設定される発光ウィンドウの使用によりアルゴンイオンレーザーによる４８８ｎｍの励起で集めた。赤色蛍光イメージは、ヘリウムネオンレーザーおよび発光ウィンドウ５５０〜６００により５４３ｎｍの励起後に集められた。光学的切片は０．５μｍ厚であった。
【０１７４】
ＣＨＯ細胞中のＲＸ３−ＧＦＰ（図３Ｅ）融合タンパク質およびＲＸ３−ＤｓＲＥＤ（図３Ｆ）融合タンパク質の発現により、大量の非常に強い蛍光の丸型ＲＰＢＬＡを生じた。これらの結果は、両方の融合タンパク質が適切に折畳まれＲＰＢＬＡの内部で活性を持つことを確証する。
【０１７５】
実施例４：植物および昆虫における蛍光ＲＸ３融合タンパク質の細胞内局在
【０１７６】
ＣＨＯ細胞以外の宿主細胞が、ＲＸ３ドメインへ融合させた活性のある蛍光タンパク質を含むＲＰＢＬＡを生ずることができるかどうかを解析するために、シリンジアグロインフィルトレーションによってＲＸ３−ＧＦＰでタバコを一過性に形質転換した。表皮細胞の共焦点顕微鏡による分析（図４Ａおよび４Ｂ）は、大量の蛍光ＲＰＢＬＡの存在を示した。形質転換されたタバコ葉肉細胞を解析した場合、同様の結果が得られた。
【０１７７】
スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属ＳＦ９昆虫細胞または昆虫幼虫（イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ））が、融合タンパク質ＲＸ３−ＤｓＲＥＤをコードするバキュロウイルスに感染した場合、同様の結果が得られた。図４Ｃにおいて示されるように、感染昆虫細胞の光学的切片の投影図では、直径約０．５マイクロメートルの活性のあるＲＸ３−ＤｓＲＥＤ融合タンパク質を含む大量の蛍光ＲＰＢＬＡが蓄積された。感染した幼虫の共焦点分析でも、解析されたすべての組織において目覚ましい量の蛍光ＲＰＢＬＡが示された。図４Ｄにおいて、感染した幼虫からの脂肪細胞は、活性のあるＲＸ３−ＤｓＲＥＤを含むＲＰＢＬＡを示す。興味深いことには、ＤｓＲＥＤ蛍光は昆虫の血リンパにおいて観察されず、発現されたタンパク質が完全にＲＰＢＬＡ内に隔離されていることが示唆される。
【０１７８】
実施例５：ＣＨＯ細胞のＲＰＢＬＡ中に集合したＲＸ３−ｈＧＨの活性。
【０１７９】
ＲＰＢＬＡ中に産生されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の活性を決定するための研究が行なわれた。ｈＧＨはタンパク質の適切な折畳みに重要な２つのジスルフィド結合を含むので、この分子が選択された。ＲＸ３ドメインは、ＲＰＢＬＡの集合および安定化に必須のジスルフィド結合に関与するシステイン残基もまた含んでおり、それはｈＧＨの適切な折畳みに干渉する。
【０１８０】
ｐ３．１−ＲＸ３−ｈＧＨコンストラクトを、リポフェクタミンのプロトコール（インビトロゲン社）での一時的なトランスフェクションによってＣＨＯ細胞へ導入した。トランスフェクションの４日後に、細胞を固定し、透過性にし、抗ＲＸ３または抗ｈＧＨの抗血清（それぞれ図５Ａおよび５Ｂ）、およびアレクサ（Ａｌｅｘａ）蛍光４８８結合二次抗体（インビトロゲン社）によりインキュベートした。使用される一次抗体とは無関係に、ＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質を含む大きなＲＰＢＬＡ（１〜３マイクロメートル）の存在が、光学顕微鏡法分析によって観察された。
【０１８１】
以前に記載されたようにＲＰＢＬＡが高密度オルガネラであることを確認するために、ＲＸ３−ｈＧＨを発現するＣＨＯ細胞をホモジナイズし、ホモジネートを別記されるように段階的密度勾配上にロードし遠心分離した。異なる画分におけるＲＸ３−ｈＧＨの蓄積はイムノブロットによって解析された。図に示すように、融合タンパク質の一部は上清中にあり、集合していないＲＸ３−ｈＧＨを示すが、大部分の融合タンパク質は高密度ＲＰＢＬＡに対応する画分Ｆ５６に検出された（図２Ｂ、それぞれレーン２および５）。
【０１８２】
このＦ５６画分を、緩衝液ＰＢＰ４（１００ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に３倍希釈し、スイングバケット中で８００００×ｇで遠心分離して沈殿中のＲＰＢＬＡを回収した。ｈＧＨの存在を、ＥＬＩＳＡ分析（アクティブ（Ａｃｔｉｖｅ）（登録商標）ヒト成長ホルモンＥＬＩＳＡ−ＤＳＬ−１０−１９００；ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社）を使用して定量し、それは未処理のＲＰＢＬＡ膜の存在下においてでさえｈＧＨを検出することができた。
【０１８３】
この同一のサンプルを、生物活性分析（アクティブ（登録商標）生物活性ヒト成長ホルモンＥＬＩＳＡ−ＤＳＬ−１０−１１１００；ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ社）に適用した。この生物活性分析は、キットに提供されるｈＧＨ結合タンパク質へ相互作用するように適切に折畳まれたｈＧＨの能力に基づき、この相互作用はｈＧＨの機能的なコンフォーメーションに依存する。サンプルは２４ｎｇ／ｍｌの生物活性タンパク質で陽性の結果を示した。ｈＧＨタンパク質は、高密度ＲＰＢＬＡの外側表面上に確かに正しく折畳まれ提示された。５０ｍＭトリスｐＨ８および１％トリトンＸ−１００での調製品の洗浄、ならびに５０％振幅および５０％サイクルで１分間、反復５回の超音波処理（イカソニック（Ｉｋａｓｏｎｉｃ）Ｕ２００Ｓ−イカ・ラボルテヒニク（ＩＫＡ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ））による、ＲＰＢＬＡを囲む膜の除去は、凝集体の表面上での付加的なｈＧＨ分子の暴露に起因するより高い比活性（４５ｎｇ／ｍｌ）をもたらした。
【０１８４】
ＲＸ３へ融合させたｈＧＨの活性の決定において、密度勾配によって単離されたＲＰＢＬＡから融合タンパク質を可溶化した（Ｆ５６、緩衝液ＰＢＰ４中で３倍に希釈し、スイングバケット中で２時間８００００×ｇで遠心分離した）。融合タンパク質を、緩衝液Ｓ（トリス５０ｍＭ、ｐＨ８および２％のβ−ＭＥ）中に可溶化し、超音波処理した（サイクル５、振幅５０％、１分、反復５回；イカソニックＵ２００Ｓ−イカ・ラボルテヒニク）。２時間３７℃でのインキュベーション後に、サンプルを１０分間５０００×ｇで遠心分離し、可溶性ＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質を含む上清は画分の生理活性成分を定量し評価するために分析した。上清中の融合タンパク質の量は、ＥＬＩＳＡ（アクティブ（登録商標）ヒト成長ホルモンＥＬＩＳＡ−ＤＳＬ−１０−１９００；ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ社）によって２５０ｎｇ／ｍＬと決定された。生物活性ＥＬＩＳＡ分析（アクティブ（登録商標）生物活性ヒト成長ホルモンＥＬＩＳＡ−ＤＳＬ−１０−１１１００；ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ社）において分析されたタンパク質は、７０ｎｇ／ｍｌの結果であり、ＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の約３０％は活性があることを示す。ｈＧＨ活性の損失は、可溶化において使用される還元剤の高濃度の結果、またはＲＸ３ドメインがｈＧＨまたはｈＧＨ結合タンパク質に対してある程度の阻害効果を有するためでありえる。
【０１８５】
最終的に、ＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質を部位特異的プロテアーゼによって切断して融合タンパク質からｈＧＨを放出した。可溶化したＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質を、２倍に希釈し、製造業者（インビトロゲン社）により記載されるようなＥＫｍａｘにより消化した。その後、１時間４℃の１６０００×ｇで遠心分離によって、未切断の融合タンパク質（不溶性）から遊離ｈＧＨを単離した。可溶性ｈＧＨを上清から回収し、ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズからの定量化分析および生物活性分析に適用した。意外にも、これらの両方のキット（アクティブ（登録商標）ヒト成長ホルモンＥＬＩＳＡ（ＤＳＬ−１０−１９００；ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ社、およびアクティブ（登録商標）生物活性ヒト成長ホルモンＥＬＩＳＡ）ＤＳＬ−１０−１１１００；ダイアグノスティック・システムズ・ラボラトリーズ社）からの結果は、定量化分析および生物活性ＥＬＩＳＡ分析について９０ｎｇ／ｍｌの同一の値を示し、定量化キットによって検出されるような存在するタンパク質はすべて生物活性でもあると決定されることを示す。
【０１８６】
すべての処方におけるｈＧＨタンパク質の定量化および生物活性についての要約表を、以下に提示する。
2009527237.tif 000003
【０１８７】
ベクターｐ３．１−ＲＸ３により安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞が陰性対照として使用されることに注目すべきである。図２Ｂに示されるように、ＣＨＯ細胞中のＲＸ３の発現は、Ｆ５６の段階的密度勾配によって単離することができる高密度構造中にも蓄積する（図２Ｂ、レーン５）。さらに、ｐ３．１−ＲＸ３によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の光学的分析は、ＲＸ３タンパク質がＲＰＢＬＡ中に蓄積することを示した（図５Ｃ）。これらの対照のＲＸ３  ＲＰＢＬＡ調製品および単離されたＲＸ３タンパク質は、ＥＬＩＳＡ生物活性分析においてｈＧＨ活性を示さなかった。
【０１８８】
実施例６：ＣＨＯ細胞のＲＰＢＬＡからのＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨ可溶化後のＤＮＡｂインテインの活性
【０１８９】
Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテイン（ニュー・イングランド・バイオラボ）をコードするポリヌクレオチド配列を、ＲＸ３配列（ＷＯ２００４００３２０７）の３’末端、およびｈＧＨ  ｃＤＮＡの５’末端へインフレームで融合した。結果として生じるコンストラクトをベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）［図１Ａ］へクローニングしてベクターｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨを形成した。陰性対照として、ベクターｐ３．１−ＲＸ３−Ｉｍ−ｈＧＨを形成するために、アミノ酸残基Ａｓｐ１５４をＡｌａへ変異させて［図１Ａ］、同一のインテインの活性がないバージョンをＰＣＲによって作製した。Ａｓｐ１５４アミノ酸残基はＳｓｐ  ＤＮＡｂ自己切断活性に必須であることが報告されている（Mathys et al, GENE (1999) 231:1-13）。
【０１９０】
ｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の抗ｈＧＨ抗血清を使用する免疫化学的分析は、ＲＸ３−ｈＧＨを発現するＣＨＯ細胞において観察されたものに類似する、大きな丸型のＲＰＢＬＡ中に融合タンパク質ＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨが蓄積することを明らかにした（図５Ｂおよび５Ｄを比較）。この結果は、ＤＮＡｂインテインを含む融合タンパク質が高密度構造中に自己集合し蓄積することを示す。
【０１９１】
ｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞をホモジナイズし、ホモジネートを段階的密度勾配中にロードし、異なる密度に対応する画分をイムノブロットによって解析した。大部分のＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨは高密度ＲＰＢＬＡに対応する画分Ｆ５６中に検出された（図２Ｂ）。他のＲＸ３融合タンパク質と同様に、上清中のＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨ融合タンパク質の存在は、恐らくホモジナイゼーション過程の間に可溶化し、ＥＲ中に含まれる集合していない融合タンパク質を表わす。
【０１９２】
いったんＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨがＲＰＢＬＡ中に蓄積したことが実証されたならば、これらのＥＲ由来オルガネラは本明細書において別記されるような低速度遠心分離によって単離された。ｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のホモジネートの１０分間１５００×ｇでの遠心分離によって、沈殿中のＲＰＢＬＡにおいて集合したＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨ融合タンパク質から、上清中の集合していないＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨ融合タンパク質の分離が可能になった。活性がないＲＸ３−ｍＩｎｔ−ｈＧＨ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を用いた同等の研究が行なわれた。
【０１９３】
集合したＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨ融合タンパク質および集合したＲＸ３−ｍＩｎｔ−ｈＧＨ融合タンパク質を含む沈殿を、２時間３７℃でＳ１緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ７、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳおよび０．１ｍＭ  ＴＣＥＰ）中で可溶化し、インテイン酵素活性を切断誘導緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ７、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対する透析後に４８時間２５℃でのインキュベーションによって誘導した。インテイン自己切断の誘導後に、組成物を１０分間１６０００×ｇで遠心分離し、上清および沈殿を抗ＲＸ３および抗ｈＧＨの抗血清を使用して、イムノブロットによって解析した。
【０１９４】
両方の融合タンパク質は可溶化されたが、活性のあるインテイン（ＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨ）を含む融合タンパク質のみが自己切断することができた（図６Ａおよび６Ｂ、黒い矢じり）。変異ＲＸ３−ｍＩｎｔ−ｈＧＨ融合タンパク質の自己切断が存在しないことから、ＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨで観察される自己切断は、ＲＰＢＬＡ単離過程の間に共精製された若干の内在性のプロテアーゼ活性に起因するものではなく、インテインの特異的な活性のためであることが実証される。
【０１９５】
インテイン自己切断の効率を最適化するために、他の可溶化プロトコールを分析した。別記されたＳ１緩衝液および二相性抽出プロトコール（Ｓ２）による可溶化後に、ＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨのインテイン自己切断を比較することができる。（図６Ｃ）。全長融合タンパク質の残存と放出されたｈＧＨに対応するバンドの出現との間の比から、たとえ二相性抽出プロトコールが切断の５０％以上を可能にするより効率的なものだとしても、両方の場合において、ＤＮＡｂインテインの大部分が活性があり自己切断が可能あることが結論できる。
【０１９６】
実施例７：タバコのＲＰＢＬＡ中で集合したＲＸ３−ＥＧＦの活性
【０１９７】
本質的にはＵＳ１１／２８９，２６４中に記載されるように、ＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質を発現する遺伝子導入タバコからのＲＰＢＬＡを、低速度遠心分離によって単離した。融合タンパク質を、５０ｍＭトリスｐＨ８および２％β−ＭＥ中での超音波処理（サイクル５、振幅５０％、１分、反復５回；イカソニックＵ２００Ｓ−イカ・ラボルテヒニク）、ならびに２時間間３７℃でのインキュベーションによって可溶化した。その後、沈殿中の可溶化していない融合タンパク質を廃棄するために、可溶化した物質を３０分間４℃１６０００×ｇで遠心分離した。５０ｍＭトリスｐＨ８に対して上清を透析してβ−ＭＥを除去し、３０分間４℃１６０００×ｇでもう一度遠心分離し、バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社（ＫＨＧ００６２）からのｈＥＧＦキットによって上清を定量した。
【０１９８】
ＥＧＦの生物活性は、１．２ｎｇ／ｍＬのＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質と共にインキュベートされたＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＥＧＦレセプターを過剰発現する乳癌細胞）の増殖速度（ＤＮＡへの放射性チミジン取り込み）の測定により解析された。陽性対照として、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、１０ｎｇ／ｍＬの市販のＥＧＦ（プロメガ社）またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と共にインキュベートした。結果（以下の表中で要約された）は、ＥＧＦの非存在下（枯渇させた）において培養された細胞の増殖速度として決定され、ＭＢ２３１細胞（１００％）の基礎増殖速度に対する増殖のパーセンテージ（％）として表わされる。
【０１９９】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の増殖
2009527237.tif 000004
【０２００】
予想されるように、ＭＢ２３１細胞培養への市販のＥＧＦ（プロメガ社）またはＦＣＳの追加により、増殖速度は著しく増加した（それぞれ１５８％および１４５％）。予想外に１．２ｎｇ／ｍＬのＲＸ３−ＥＧＦの追加もまた増殖速度を１４６％増加させた。ＲＸ３−ＥＧＦとほとんど同じ増殖速度が、１０倍多い市販のＥＧＦの濃度で観察されたことは注目に値する。５ｎｇ／ｍＬの市販のＥＧＦでＭＢ２３１細胞の増殖速度の飽和が観察されたことを示す以前の結果によって、この驚くべき結果について説明することができるかもしれない。別の可能な説明は、ＲＸ３に融合されるとＥＧＦがより活性のあるコンフォーメーションをとりえるというものである。いずれにせよ、この結果はＲＸ３−ＥＧＦが少なくとも市販のＥＧＦ（プロメガ社）と同じくらいの活性があることを示す。
【０２０１】
実施例８：ＣＨＯ細胞のＲＰＢＬＡ中に集合したＲＸ３−ＧＵＳの活性。
【０２０２】
β−グルクロニダーゼ酵素（ＧＵＳ）は広く使用されるリポータータンパク質である（Gilisen et al., Transgenic Res. (1998) 7(3):157-163）。ＲＰＢＬＡ中の活性のあるＲＸ３−ＧＵＳ融合タンパク質の発現は、主に９つのシステインアミノ酸残基の存在により、またそれが大きなタンパク質（約７０ｋＤａ）でもあるので、難問であった。
【０２０３】
ＲＸ３（ＷＯ２００４００３２０７）をコードするポリヌクレオチド配列を、ＧＵＳ（図１Ａ、ＲＸ３−ＧＵＳ）をコードする配列の５’末端にインフレームで融合し、結果として生じるコンストラクトを、実施例７中に記載されているようなＣＨＯ細胞をトランスフェクションするために使用した。
【０２０４】
ｐ３．１−ＲＸ３−ＧＵＳによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を抗ＲＸ３の抗血清でインキュベートした免疫化学的分析から、大きなＲＰＢＬＡが存在することが示された（図５Ｅ）。それらのＲＰＢＬＡの密度を確認するために、同一のプラスミドによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞をホモジナイズし、その後段階的密度勾配上にロードした。イムノブロットによる異なる画分の分析から、融合タンパク質がより高密度の画分中に局在することが証明され（図２Ｂ。Ｆ５６）、ＲＸ３−ＧＵＳ融合タンパク質が高密度ＲＰＢＬＡ中に集合および蓄積できることが示された。融合タンパク質が上清中に検出されなかったことに注目すべきであり、ほとんどすべてのＲＸ３−ＧＵＳは高密度構造（ＲＰＢＬＡ）中で集合することを意味する。
【０２０５】
いったん、ＲＸ３−ＧＵＳがＲＰＢＬＡ中に蓄積したことが実証されたならば、融合タンパク質を、Ｆ５６画分から回収し（ＲＸ３−ｈＧＨについて実施例５中に記載されるように）、２時間３７℃で５０ｍＭトリス、ｐＨ８、β−ＭＥ  ２％およびＳＤＳ０．１％中に可溶化した。その後、可溶化した物質を１０分間室温１６０００×ｇで遠心分離し、可溶性の分解されたＲＸ３−ＧＵＳ融合タンパク質を含む上清を、５０ｍＭトリスｐＨ  ８溶液に対して一晩（約１８時間）にわたり４℃で透析した。
【０２０６】
ＧＵＳ活性検定は、メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｉｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｉｌ）−β−グルクロニド酸（ＭＵＧ）から４−メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｉｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｏｎｅ）（４−ＭＵ）蛍光産物へのＧＵＳ酵素による触媒作用に基づく（Jefferson et al. 1987 EMBO J. 6(13):3901-3907）。５０μＬの可溶化したＲＸ３−ＧＵＳ融合タンパク質（約０．２５ｎｇのＲＸ３ＧＵＳ／μＬ）を、ＭＵＧの存在下において室温でインキュベートし、４−ＭＵの出現を蛍光計（励起波長３５５ｎｍ；発光波長４２０ｎｍ）で調べた。ＣＨＯ細胞からのＲＰＢＬＡ調製中にある内在性のＧＵＳ様活性を測定する可能性を除外するために、ｐ３．１−ＲＸ３によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞からのＲＰＢＬＡを単離し、いったんＲＸ３タンパク質を可溶化し、このサンプルを対照として活性検定中に含んだ。下記の表は得られた結果を要約する。
４２０ｎｍでの吸光度
2009527237.tif 000005
【０２０７】
この表に示される結果から、ＲＸ３−ＧＵＳ融合タンパク質は、ＲＰＢＬＡからいったん可溶化されると、活性が維持されることは明らかである。これらの実験から計算されたＲＸ３−ＧＵＳの比活性は、０．２  ｐｍｏｌの４−ＭＵ／分−１＊１２．５  ｎｇ−１のＲＸ３−ＧＵＳであった。ＲＸ３調製品が解析された場合、有意な内在性のＧＵＳ様活性は観察されなかった。
【０２０８】
実施例９：ＣＨＯ細胞のＲＰＢＬＡ中に集合したＲＸ３−ＥＫの活性
【０２０９】
ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼドメインによるトリプシノーゲンからトリプシンへのプロセッシング（ＤＤＤＫ↓）に関与する十二指腸粘膜の膜結合型セリンプロテアーゼである。エンテロペプチダーゼは、重鎖（ＥＫHC−１２０ｋＤ）および触媒の軽鎖（ＥＫＬＣ−４７ｋＤ）により形成される、ジスルフィド結合された二重鎖ペプチドである。触媒サブユニット（ここでＥＫとして言及される）は、全体のホロ酵素とほとんど同じくらい単独で活性があり特異的である（LaVallie et al. 1993 J. Biol. Chem. 268(31):23311-23317）。ウシのＥＫが４つのジスルフィド結合を有することを指摘すべきである。さらに、タンパク質のＮ末端はタンパク質の内部へ折畳まれ、それは機能的なＥＫの適切な折畳みに必須である。これらの２つのＥＫの必要条件によって、ＥＫタンパク質は、ＲＰＢＬＡ中で活性のあるタンパク質として発現される魅力的なタンパク質になる。
【０２１０】
ＲＸ３（ＷＯ２００４００３２０７）をコードするポリヌクレオチド配列を、ＥＫ配列の５’末端へ、ＦＸａ切断部位（ＩＥＧＲ）を含むリンカーを介して融合し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）にクローニングした（図１Ａ、ｐ３．１−ＲＸ３−ＥＫ）。
【０２１１】
このコンストラクトを、リポフェクタミン法（インビトロゲン社）によるＣＨＯ細胞トランスフェクションに使用した。トランスフェクションされた細胞の抗ＲＸ３の抗血清による免疫化学分析から、大量の小さなＲＰＢＬＡの存在が示された。これらのオルガネラはすべて、トランスフェクションされた細胞の細胞質に沿って見られたが、サイズは通常０．５マイクロメートルを上回らなかった（図５Ｆ）。
【０２１２】
それらの小さなＲＰＢＬＡの密度を確認するために、同一のプラスミドによりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞をホモジナイズし、段階的密度勾配にロードした。ＲＸ３−ＥＫ融合タンパク質はＦ５６画分に局在した（図２Ｂ）。ＲＸ３−ＥＫ融合タンパク質集合体が高密度であることは、この融合タンパク質が高密度ＲＰＢＬＡに蓄積することを示唆する。融合タンパク質が上清に検出されなかったことに注目すべきであり、ほとんどすべてのＲＸ３−ＥＫが高密度構造（ＲＰＢＬＡ）中に集合することを意味する。興味深いことには、ＲＸ３−ＥＫ融合タンパク質の分子量は、５８ＫＤａ（理論的な分子量よりも約１５ＫＤａ高い）と推定された。この結果は、天然のタンパク質について記載されるように、ＥＫがＲＰＢＬＡ中で糖鎖が高度に付加されることを示唆する（LaVallie et al., 1993 J. Biol. Chem. 268(31):23311-23317）。
【０２１３】
融合タンパク質を、Ｆ５６画分から回収し（ＲＸ３−ｈＧＨについて実施例５中に記載されるように）、２時間３７℃で５０ｍＭトリス、ｐＨ８、β−ＭＥ  ２％およびＳＤＳ０．１％中に可溶化した。可溶性を増加させるために、サンプルを、ＳＤＳを加える前に、５０％振幅および５０％サイクル、１分間、反復５回で超音波処理した（イカソニックＵ２００Ｓ−イカ・ラボルテヒニク）。その後、サンプルを１０分間室温５０００×ｇで遠心分離し、可溶分解されたＲＸ３−ＥＫ融合タンパク質を含む上清を、一晩（約１８時間）にわたり５０ｍＭトリスｐＨ８溶液に対して４℃で透析した。次に融合タンパク質を、製造業者（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））によって記載されるようにＦＸａによって消化し、ＥＫ活性を蛍光分析によって測定した（Grant, et al., 1979 Biochim. Biophys. Acta 567:207-215）。ＲＸ３−ＥＫから放出されたＥＫにはエンテロペプチダーゼ活性があった。
【０２１４】
実施例１０：ＣＨＯ細胞のＲＰＢＬＡ中に集合したＲＸ３−Ｃａｓｐ２およびＲＸ３−Ｃａｓｐ３の活性
【０２１５】
ＲＰＢＬＡ中に産生されたカスパーゼの活性を決定するために、研究を行なった。カスパーゼは、コンセンサス配列のアスパラギン酸の後で高い特異性により切断するシステインプロテアーゼのファミリーである。カスパーゼは、高度に制御されたアポトーシス過程の主要な実行者である。
【０２１６】
カスパーゼは、大サブユニット（ｐ２０）および小サブユニット（ｐ１０）が続く可変的な長さのプロドメインを持つ、活性がないプロカスパーゼとして存在する。プロカスパーゼはタンパク質分解を介して活性化され、成熟した活性のあるカスパーゼはヘテロ４量体ｐ２０2−ｐ１０2からなる（Lavrik et al., 2005 J. Clin. Invest. 115:2665-2671）。カスパーゼは、作用機序において異なる、イニシエーターカスパーゼおよび実行カスパーゼへと分けられる。カスパーゼ２（イニシエーターカスパーゼ）およびカスパーゼ３（実行カスパーゼ）が、ＲＰＢＬＡ中の活性のあるタンパク質の例として選ばれた。（Baliga et al., 2004 Cell Death and Differentiation 11:1234-1241; Feeney et al., 2006 Protein Expression and Purification 47(1):311-318）。それらのタンパク質は、活性を持つためには自己切断されてヘテロ４量体を形成される必要のある酵素前駆体として合成されるので、それらは特に難しいものである。
【０２１７】
ｐ３．１−ＲＸ３−Ｃ２およびｐ３．１−ＲＸ３−Ｃ３コンストラクト（図１）を、リポフェクタミンプロトコール（インビトロゲン）による一時的トランスフェクションによってＣＨＯ細胞へ導入した。トランスフェクションの４日後に、カスパーゼが高密度ＲＰＢＬＡオルガネラ中に蓄積されるかどうかを測定するために、別記されるように、ＲＸ３−Ｃａｓｐ２またはＲＸ３−Ｃａｓｐ２を発現するＣＨＯ細胞をホモジナイズし、段階的密度勾配上にロードし、遠心分離した。
【０２１８】
異なる画分における両方のＲＸ３−カスパーゼ融合タンパク質の蓄積を、イムノブロットによって解析した（図２Ｂ）。図に示すように、大部分のＲＸ３−Ｃａｓｐ２融合タンパク質またはＲＸ３−Ｃａｓｐ２融合タンパク質は、高密度ＲＰＢＬＡに対応する画分Ｆ５６およびＦ４２へ沈殿する。この結果は、これらの２つの融合タンパク質が高密度構造中で堅く集合できることを示す。
【０２１９】
図２Ｂ中に示されるイムノブロットにおいては、全長融合タンパク質のみが示されたが、異なる分子量のバンドがこの画分中に存在する。抗ＲＸ３抗体または抗ＣＡＳＰ（ＳＡ−３２０およびＳＡ−３２５、バイオモル・インターナショナル（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社）の抗体のいずれかに反応するバンドは、異なるカスパーゼサブユニットに対応し、自己触媒的活性化がＲＰＢＬＡの内部で起こることを示す。これらの観察は、カスパーゼ２およびカスパーゼ３がインビボで活性があることを示す。
【０２２０】
Ｆ５６およびＦ４２の画分を緩衝液ＰＢＰ４中で４倍に希釈し、スイングバケット中で８００００×ｇで遠心分離して沈殿中のＲＰＢＬＡを回収した。このオルガネラを囲むＥＲ膜を、５０ｍＭトリスｐＨ８および１％トリトンＸ−１００でＲＰＢＬＡ調製品を洗浄することによって除去した。ＥＲ膜の除去に際して、カスパーゼの活性を、バイオモル・クオンティザイム（ＢＩＯＭＯＬ  ＱｕａｎｔｉＺｙｍｅ）（商標）アッセイ系（カスパーゼ−３細胞活性分析キットプラス−ＡＫ７０３（カスパーゼ３））およびバイオモル・クオンティザイム（商標）アッセイ系（カスパーゼ−２細胞活性分析キットプラス−ＡＫ７０２（カスパーゼ２））を使用して、分析する。このキットは、特異的基質によりカスパーゼ活性を比色定量で測定する。ＲＸ３−Ｃａｓｐ２  ＲＰＢＬＡおよびＲＸ３−Ｃａｓｐ３  ＲＰＢＬＡはカスパーゼ活性を示す。
【０２２１】
ＲＸ３に融合させたカスパーゼの活性の決定において、密度勾配によって単離されたＲＰＢＬＡから融合タンパク質を可溶化する（Ｆ５６およびＦ４２、緩衝液ＰＢＰ４中で４倍に希釈し、スイングバケット中で８００００×ｇで遠心分離する）。融合タンパク質を、超音波処理（５０％振幅および５０％サイクル、３０秒間、５回）の後で、緩衝液ＣＡ（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１％ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール）中で可溶化する。可溶化を３７℃２時間のインキュベーションによって行ない、不溶性物質を１０分間１６０００×ｇでの遠心分離によって廃棄する。可溶性ＲＸ３−ｃａｓｐ融合タンパク質を含む上清を、カスパーゼキット分析緩衝液（５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール）に対して透析する。ＲＸ３−Ｃａｓｐ２およびＲＸ３−Ｃａｓｐ３を含む透析されたサンプルの活性を、バイオモル・クオンティザイム（商標）アッセイ系（カスパーゼ−３細胞活性分析キットプラス−ＡＫ７０３（カスパーゼ３））およびバイオモル・クオンティザイム（商標）アッセイ系（カスパーゼ−２細胞活性分析キットプラス−ＡＫ７０２（カスパーゼ２））により評価する。カスパーゼ２およびカスパーゼ３は活性がある。
【０２２２】
実施例１１：アグロインフィルトレーションされたタバコのＲＰＢＬＡ中に集合したＲＸ３−ＲＴＢの活性
【０２２３】
ＲＴＢ（Reed et al., 2005 Plant Cell Report 24:15-24）をコードするポリヌクレオチド配列を、ＲＸ３ドメインの３’末端にインフレームで融合させ、バイナリーベクター（ｐＢ−ＲＸ３−ＲＴＢ）中にクローニングした。
【０２２４】
別記されるように、このコンストラクトをシリンジアグロインフィルトレーションによって形質転換されたタバコにおいて使用した。アグロインフィルトレーションされたタバコ葉をホモジナイズし、段階的密度勾配にロードした。ＲＸ３−ＲＴＢ融合タンパク質は画分Ｆ４２およびＦ５６に局在し（図２Ｂ）、融合タンパク質が高密度ＲＰＢＬＡ中で自己集合および蓄積することを示唆する。ＲＸ３−ＥＫについて記載されたように、理論的な分子量と比較して、ＲＰＢＬＡから単離されたＲＸ３−ＲＴＢ融合タンパク質はより少ない電気泳動度を有する。この結果は、ＲＰＢＬＡ中でＲＴＢに糖鎖が付加されうることを支持する。
【０２２５】
融合タンパク質を、高密度画分から回収し（ＲＸ３−ｈＧＨについて実施例５中に記載されるように）、２時間間３７℃で５０ｍＭトリス、ｐＨ８、β−ＭＥ  ０．８％中で可溶化した。可溶性を増加させるために、サンプルを、５０％振幅および５０％のサイクル、１分間、反復５回の超音波で処理した。（イカソニックＵ２００Ｓ−イカ・ラボルテヒニク）。その後サンプルを１０分間室温５０００×ｇで遠心分離し、可溶分解されたＲＸ３−ＲＴＢを含む上清は、ガラクトース末端のグリカンを露出するためにシアリダーゼ（ｓｉａｌｙｄａｓｅ）により処理された糖タンパク質フェチュインへの結合についてＥＬＩＳＡによって解析された。ＲＸ３−ＲＴＢはフェチュインへ結合する。
【０２２６】
実施例１２：植物形質転換のためのプラスミド構築
【０２２７】
ヒト表皮増殖因子（ｈＥＧＦ）のコード配列を合成し、植物における発現のためのコドン利用を最適化するために変更した。
ｈＥＧＦタンパク質（配列番号：４１）
ｈＥＧＦ  ＤＮＡ（配列番号：４２）
【０２２８】
５３アミノ酸の活性のあるｈＥＧＦをコードする合成遺伝子は、２０塩基のオーバーラップを備えた約６０塩基の４つのオリゴヌクレオチドを使用するプライマーオーバーラップエクステンションＰＣＲ方法によって得られた。合成ｈＥＧＦ  ｃＤＮＡは，第Ｘａ因子特異的な切断部位に対応する５’リンカー配列を含んでいた。オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド変性ゲルによって精製した。
【０２２９】
合成ｈＥＧＦ  ｃＤＮＡをアガロースゲル（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）から精製し、ｐＧＥＭベクター（プロメガ社）へクローニングした。ＢｓｐＨＩおよびＮｃｏＩの粘着末端を含むＲＸ３  ｃＤＮＡ断片（γ−ゼインのＮ−末端ドメインをコードする）を、ＮｃｏＩによりあらかじめ消化された（特許出願第ＷＯ２００４００３２０７号中に記載されるように）、ベクターｐＣＫＧＦＰＳ６５Ｃ（Reichel et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5888-5893）へと挿入した。ＥＧＦをコードする配列を、ＲＸ３配列にインフレームで融合した。コンストラクトＲＸ３−ＥＧＦは、ＥＧＦ合成遺伝子をＧＦＰコード配列で置換することによって調製した。
【０２３０】
ｐＣＲＸ３ＥＧＦと名付けられた結果として生じるコンストラクトは、増強された３５Ｓプロモーターのようなタンパク質の転写を導く核酸配列、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のような翻訳エンハンサー、ＥＧＦコード配列、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３’ポリアデニル化配列を含んでいた。効果的な植物形質転換ベクターｐ１９ＲＸ３ＥＧＦは、バイナリーベクターｐＢｉｎ１９の中へＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ発現カセットを挿入することによって最終的に得られた（Bevan, 1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721）。
【０２３１】
２２ｋＤのα−ゼイン（２２ａＺ）および１３ｋＤのコメプロラミン（ｒＰ１３）をコードするｃＤＮＡを、トウモロコシＷ６４Ａおよびセニア（Ｓｅｎｉａ）米品種のｃＤＮＡライブラリーからＲＴ−ＰＣＲによってそれぞれ増幅した。ＰＣＲ反応において使用されるオリゴヌクレオチドは次のとおりであった。
２２ａＺ−５’（配列番号：４３）
２２ａＺ−３’（配列番号：４４）
コメ１３Ｐｒｏｌ−５’（配列番号：４５）
コメ１３Ｐｒｏｌ−３’（配列番号：４６）
【０２３２】
対応するＰＣＲ断片をｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン社）中にクローニングし、シークエンスし、増強されたＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ＴＥＶ配列および３’ｏｃｓターミネーターを含むｐＵＣ１８ベクター中にクローニングした。ｐＣＲＩＩ−ｒＰ１３をＳａｌＩおよびＮｃｏＩによって消化し、プラスミドｐＵＣ１８ｒＰ１３ＥＧＦを得るために同一の酵素によって消化されたｐＵＣ１８ＲＸ３Ｃｔ、ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦのプラスミド中にクローニングした。ｐＣＲＩＩ−２２ａＺをＳａｌＩ／ＮｃｏＩによって消化し、プラスミドｐＵＣ１８２２ａＺｔＥＧＦを得るために同一の酵素によって消化されたｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦプラスミド中にクローニングした。最後に、ｐＵＣ１８由来ベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩによってｐＣａｍｂｉａ  ５３００中にクローニングした。
【０２３３】
コンストラクトｐＢＩＮ  ｍ−ｇｆｐ４−ＥＲは、植物における発現のために最適化されたＧＦＰを含む（Haseloff et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2122-2127）。このコンストラクトを、鋳型としてＧＦＰのＰＣＲ増幅に使用した。オリゴヌクレオチドは、さらなるクローニングのための制限部位を導入するとともに、もとの配列中に存在するシグナルペプチドおよびＨＤＥＬモチーフを除去するようにデザインされた。
プライマー：
ＧＦＰ５’（配列番号：５０）
ＧＦＰ３’（配列番号：５１）
【０２３４】
ＰＣＲ産物をＰＣＲクローニングベクター（ＰＣＲ（登録商標）ＩＩベクター、インビトロゲン社）中にクローニングし、配列を確認した。粘着末端ＲｃａＩ／ＢａｍＨＩを含むＧＦＰ断片を、ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（ＵＳ２００６１２３５０９（Ａ１））中へクローニングし、ｐＵＣ１８ベクター中にカセットＲＸ３−ＧＦＰを生じた。このカセットをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化によって遊離し、続いてｐＣＡＭＢＩＡ  ２３００ベクター（ｐＢ−ＲＸ３−ＧＦＰ）中に挿入した。
【０２３５】
ＲＴＢクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３１７９）を、ＰＣＲ（ＲＴＢ５およびＲＴＢ３）によって増幅し、ＲｃａＩ／ＳｍａＩによって消化した。消化されたＰＣＲ断片を、ｐＵＣ１８ＲＸ３ＲＴＢを得るために、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩによって消化されたｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（ＵＳ２００６１２３５０９（Ａ１））中にクローニングした。次にこのベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩによって消化し、同一の制限酵素（ｐＢ−ＲＸ３−ＲＴＢ）によって消化されたｐＣＡＭＢＩＡ  ２３００ベクター中に、遊離された断片クローニングした。
プライマー：
ＲＴＢ５（配列番号：５２）
ＲＴＢ３（配列番号：５３）
【０２３６】
植物材料
タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ｖａｒ．ウィスコンシン）植物を、１６時間の光周期により２４〜２６℃でインビトロの増殖チャンバー中で増殖させた。成体の植物を、１８〜２８℃の温室中で、湿度は５５〜６５％に維持し、１６時間の平均光周期で増殖させた。
【０２３７】
アグロインフィルトレーション法のための小植物（Vaquero et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96(20):11128-11133; Kapila et al., 1997 Plant Sci. 122:101-108）を、上に記載されるインビトロの条件で種子から４〜６週間増殖させた。
【０２３８】
タバコの安定した形質転換
バイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＬＢＡ４４０４株の中へ移した。Draper and Hamil  １９８８年、植物の遺伝的形質転換および遺伝子発現。実験手引き書（Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual）（Draper, J., Scott, R., Armitage, P. and Walden, R.編）（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーション（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ））によって記載されるように、タバコ（ニコチアナ・タバクム、Ｗ３８）葉片を形質転換した。再生植物体を２００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む培地上で選択し、温室へ移した。導入遺伝子産物レベルが最も高い遺伝子導入タバコを、Ｔ１世代およびＴ２世代を得るために培養した。
【０２３９】
組換えタンパク質レベルをイムノブロットによって検出した。タバコ葉からの全抽出タンパク質をブラッドフォード分析によって定量し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ミニトランスブロット電気泳動的トランスファーセル（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ）（バイオラッド（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）社）を使用して、ニトロセルロース膜に転写した。膜をγ−ゼイン抗血清（希釈１／７０００）（Ludevid et al. 1985, Plant Science 41:41-48）でインキュベートし、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（希釈１／１００００、アマシャム・ファルマシア社）によりインキュベートした。免疫反応性のバンドを、増感化学発光（ＥＣＬウエスタンブロット・システム、アマシャム・ファルマシア社）によって検出した。
【０２４０】
タバコアグロインフィルトレーション
バキュームアグロインフィルトレーション
【０２４１】
アグロインフィルトレーション法のための小植物を、１６時間の光周期により２４〜２６℃でインビトロの増殖チャンバー中で４〜６週間種子から増殖させた。
【０２４２】
所望のコンストラクトを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢ４４０４を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）を追加したＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ）上で、２８℃で振盪（２５０ｒｐｍ）して一晩（約１８時間）増殖させた。次にアグロバクテリアを、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）も追加した３０ｍｌのＬＢ中に播種した。２８℃で一晩の培養（約１８時間）後に、アグロバクテリア細胞を１０分間３０００×ｇの遠心分離によって集め、ＭＥＳ（シグマ・ケミカル社）４．９ｇ／ｌおよびショ糖３０ｇ／ｌ、ｐＨ５．８を含む１０ｍｌの液体ＭＳ培地中に再懸濁した。アグロインフィルトレーションのために、細菌培養の最終的なＯＤ６００を０．１に調整した。次に細胞培養に最終濃度０．２ｍＭでアセトシリンゴンを追加し、２８℃で９０分間インキュベートした。
【０２４３】
アグロインフィルトレーションのために、小植物を完全に懸濁物により覆い、バキュームを５−６秒間適用した（１００ＫＰａ）。懸濁物を除去し、小植物は４日間１６時間の光周期の下で２４〜２６℃で増殖チャンバー中で維持した。植物材料を回収し、抗γ−ゼイン抗体を使用するイムノブロットによって全タンパク質抽出物を解析した。
【０２４４】
シリンジによるアグロインフィルトレーション
アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＥＨＡ１０５を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬリファンピシン（ｒｉｆａｍｐｙｃｉｎ）を追加したＬ−ブロス中で定常期まで２８℃で増殖した。細菌を室温１５分間５０００ｇで遠心分離によって沈殿させ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および２００μＭアセトシリンゴンを含む１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．６中に、最終的なＯＤ６００が０．２になるように再懸濁した。細胞を室温で３時間この培地中に放置した。ＲＸ３コンストラクトおよびＨＣ−Ｐｒｏサイレンシングサプレッサーコンストラクト（Goytia et al., 2006）を保有する個別のアグロバクテリウム培養を、ともに混合し、２〜４週令のベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物（Voinnet et al, 2003）の葉の背軸面の中へインフィルトレーションさせた。
【０２４５】
実施例１３：遺伝子導入植物の栄養組織からの密度勾配によるＲＰＢＬＡの単離（精製）
【０２４６】
ＲＸ３−ＥＧＦγ−ゼイン由来融合タンパク質をコードする遺伝子を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介してタバコ中に導入した。組換えタンパク質をより高く発現するこれらの植物を決定するために、形質転換された植物をイムノブロットにより解析した。イムノブロットで優勢な低分子のバンドは融合タンパク質の単量体型に対応し、高分子のバンドは二量体に対応する。融合タンパク質は、通常多量体として蓄積し、イムノブロット中に検出された単量体および多量体の量はジスルフィド結合の還元レベルに依存する。
【０２４７】
タバコ葉抽出物を、段階的密度勾配上にロードし、異なる画分における組換えタンパク質の蓄積をイムノブロットにより解析した。この結果は、ＲＸ３−ＥＧＦが高密度ＲＰＢＬＡに対応する画分中に出現したことを示す。大部分のこれらのオルガネラは１．２６３２ｇ／ｃｍ3よりも高い密度を示し、およびそれらのかなりの部分は１．３１６３ｇ／ｃｍ3よりも高い密度を示す。
【０２４８】
タバコ葉において形成された新規ＲＰＢＬＡは、天然のトウモロコシタンパク質顆粒の範囲内の密度（Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234; Lending et al., 1989 Plant Cell 1:1011-1023）を示すか、またはより高密度でさえある。
【０２４９】
組換えタンパク質の９０％以上が高密度ＲＰＢＬＡ画分および沈殿において回収されたことが推測された。したがって、密度によるＲＰＢＬＡの単離は融合タンパク質を精製する（濃縮する）有用なシステムであると思われる。
【０２５０】
ＲＰＢＬＡ単離による組換えタンパク質ＲＸ３−ＥＧＦの精製を評価するために、異なる密度画分を銀染色により解析した。タバコ内因性タンパク質の９０％以上は可溶性であり勾配の中間層画分に位置し、この画分中にＲＸ３−ＥＧＦタンパク質は存在しなかったかまたはわずかに検出された。したがって勾配の１つまたは２つの画分の選択によって、可溶性タンパク質およびより低密度オルガネラ中に存在するタンパク質の大部分を廃棄することができるかもしれない。
【０２５１】
ＲＰＢＬＡ画分における融合タンパク質精製の程度に関しては、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質はＰＢＬＳ含有画分中に検出されるタンパク質のおよそ８０％を占めることが推測された。この結果は、ＲＰＢＬＡ単離手順を使用して、１工程のみの精製で融合タンパク質の有力な濃縮を達成できることを示す。
【０２５２】
実施例１４：乾燥植物組織から単離されたＲＰＢＬＡ中の組換えタンパク質回収
【０２５３】
分子的農業の重要点は、植物バイオマスを保存する容易な手段の存在である。この情況において、乾燥は、貯蔵容量の減少および産物保存のために都合のよい方法を提供することができる。それにもかかわらず、乾燥はしばしば対象となるタンパク質の破壊を促進する。組換えタンパク質を含むＲＰＢＬＡを単離するための乾燥植物の使用は、工業目的に対して非常に関心が持たれるところである。
【０２５４】
上に記載されるようなＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質を蓄積する形質転換されたタバコ葉を、上でも論じられるように乾燥した。５か月の乾燥貯蔵後に、組換えタンパク質の安定性を解析した。同等量の湿った（新鮮な）葉組織および乾燥した葉組織からの抽出タンパク質を、イムノブロットによって解析した。湿った植物および乾燥した植物において回収された量は類似しているので、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質は乾燥させた形質転換植物において安定していた。
【０２５５】
乾燥葉のホモジネートからのＲＸ３ＥＧＦ融合タンパク質の階段的密度勾配における分布を、イムノブロットによって解析した。融合タンパク質は、１．１８６８ｇ／ｃｍ3および１．２６３２ｇ／ｃｍ3よりも高い密度を示す高密度構造において主に回収された。
【０２５６】
したがって、組換えタンパク質はＲＰＢＬＡの単離を介して乾燥組織から精製でき、それによって遺伝子導入植物収集ならびに組換えタンパク質の抽出および精製が時間的に独立することが可能であることを示す。これらの結果と一致して、γ−ゼイン融合タンパク質もまた種もみのＲＰＢＬＡ中に蓄積した。
【０２５７】
実施例１５：一過性に形質転換されたタバコ小植物からのＲＰＢＬＡの単離による組換えタンパク質回収
【０２５８】
一過性発現系は、短期間の組換えタンパク質の蓄積挙動を検査する都合のよいツールになりえる。したがって、組換えタンパク質ＲＸ３−ＥＧＦもアグロインフィルトレーションを介して一過性に形質転換されたタバコ小植物において発現および蓄積された。イムノブロットによって解析された形質転換された小植物からの抽出タンパク質は、安定的に形質転換された植物に観察される特徴的な複雑な電気泳動パターンを示し、融合タンパク質が形質転換のこの方法を使用して正しく集合することを示す。
【０２５９】
実施例１６：低速度遠心分離および中間速度遠心分離による組換えタンパク質の回収
【０２６０】
高密度組換えタンパク質顆粒様集合体を介して組換えタンパク質を精製するために使用される手順を単純化するために、２つの付加的な以下の別法を行なった。ｉ）清澄にしたホモジネートを１つの高密度ショ糖クッションのみを介して遠心分離した、およびｉｉ）清澄にしたホモジネートを低速度遠心分離で単に遠心分離した（すなわち１０分間１０００〜２５００×ｇ）。
【０２６１】
以前に記載された結果に一致して、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質は、１．１８６８ｇ／ｃｍ3のショ糖クッションを通した遠心分離後に得られる沈殿中に高い収率（９０％以上）で回収された。さらに混入物のタバコ内因性タンパク質は、対応する沈殿中にほとんど検出されないという点で、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質の精製は非常に高度であった。
【０２６２】
階段的密度勾配と比較して、この方法の主要な長所は、組換えタンパク質の工業的生産のために容易に拡張できることである。組換えタンパク質の回収および精製を最適化するために、各事例において粘性および浸透性のような他の特性と同様に、クッション密度も調整できることが注目されるべきである。
【０２６３】
さらに、低速度遠心分離（ＬＳＣ）も融合タンパク質含有タンパク質顆粒様構造を濃縮および精製するために分析された。この結果から、１０分間１０００×ｇ後に、事実上すべてのＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質は沈殿中に回収されることが示された。しかしこの沈殿中に含まれるタンパク質の染色から、１．１８６８ｇ／ｃｍ3のショ糖クッションを通した遠心分離後に得られた融合タンパク質と比較して、融合タンパク質が高度に精製されないことを明らかにされた。
【０２６４】
その後低速度遠心分離によって得られた第１の沈殿を、５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００を含む緩衝液の使用によって洗浄した。洗浄後にサンプルを５分間１２，０００×ｇで遠心分離し、興味深いことには、Ｐ１沈殿中に存在する混在タンパク質の大部分は洗浄および遠心分離後に除去され、新しい沈殿は高度に濃縮されたＲＸ３−ＥＧＦタンパク質を含んでいた。この研究で注目したタンパク質のパターンと同様に量も、トリトンＸ−１００含有緩衝液中のショ糖クッションを通した遠心分離後に得られた沈殿の洗浄後に得られたものに類似することが注目される。低速度遠心分離の代替物は融合タンパク質を含む構造の高密度に基づき、遠心分離条件はスケールアップする前にすべての標的のために最適化できる。
【０２６５】
コメプロラミンまたはα−ゼインに結合したＥＧＦを含む融合タンパク質（ＲＸ３、ｒＰ１３−ＥＧＦおよび２２ａＺ−ＥＧＦではなく）を発現する遺伝子導入タバコは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｓｃｉｅｎｓ）形質転換によって産生された。ＥＧＦに対する抗体を使用するイムノブロットによって決定された場合に最も多く発現するもの、およびそれらの細胞株を、同一のコンストラクトによりアグロインフィルトレーションされたタバコ小植物の比較分析において使用した。すべての事例において、ＲＰＢＬＡは特有の境界面で回収され、ＲＰＢＬＡが非常に高密度で均質であることを示唆する。
【０２６６】
これらすべての結果から、他のタンパク質へ融合された場合でさえ、プロラミンが高密度ＲＰＢＬＡを誘導できることは明らかである。主にそれらの間にほとんど相同性が観察されない場合には、思いもよらない結果である。さらに、いくつかのデータが、タンパク質顆粒を安定化するためにプロラミンが相互作用し、栄養組織中で、例えばα−ゼインのように単独で発現された場合それらのうちのいくつかが安定でないことを示唆する（Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345）。
【０２６７】
実施例１７：単離されたＲＰＢＬＡからの組換えタンパク質の抽出
【０２６８】
高密度組換えＰＢ様集合体の単離は、遺伝子組み換え生物から高収率および高精製レベルで組換えタンパク質を回収する有利な方法であることが実証されてきた。ここで、貯蔵オルガネラからこれらの組換えタンパク質を抽出できることが示される。
【０２６９】
ＲＰＢＬＡ画分を、デタージェントおよび還元剤を含む緩衝液（硼酸ナトリウム１２．５ｍＭ  ｐＨ８、０．１％ＳＤＳおよび２％β−メルカプトエタノールを含むＳＢ緩衝液；処理）中で、３７℃一晩の（約１８時間）インキュベーションした後に、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質を可溶化した。抽出された融合タンパク質を可溶性形態で回収した。その後適用の目的にしたがって、抽出されたタンパク質は、さらに精製を行なうか、または部分的に精製された抽出物として使用することができる。
【０２７０】
実施例１８：動物細胞形質転換のためのプラスミド構築
【０２７１】
ＲＸ３およびＲＸ３−（Ｇｌｙ）ｘ５に対応するｃＤＮＡ断片を得るために、ＲＸ３配列をＰＣＲによって増幅した。これらの断片をＳａｌＩ／ＢａｍＨＩによって消化し、ｐＲＸ３−ＥＣＦＰおよびｐＲＸ３−Ｇ−ＥＣＦＰプラスミドを得るために同一の酵素によって切断されたプラスミドｐＥＣＦＰ−Ｎ１（クロンテック社）中に、それぞれクローニングした。
プライマー：
ＳＰｆｏｒ（配列番号：５４）
ＲＸ３ＥＣＦＰ３’（配列番号：５５）
ＲＸ３Ｇ５ＥＣＦＰ３’（配列番号：５６）
【０２７２】
ｐ２２ａＺ−ＥＣＦＰベクターは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（クロンテック社）中の以下のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ  ＤＮＡ断片に対応する（配列番号：５７）。
【０２７３】
ＧＦＰは、さらなるクローニングのための酵素制限部位を含む以下の特異的なオリゴヌクレオチドにより、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック社）のＰＣＲ増幅によって得られた。
ＥＣＦＰ  ＮｃｏＩ  ５’（配列番号：５８）
ＥＣＦＰＮ１  ＢａｍＮｏｔＳａｃ  ３’（配列番号：５９）
【０２７４】
ＰＣＲ産物（ＧＦＰ）をＰＣＲクローニングベクター（ＰＣＲ（登録商標）ＩＩベクター、インビトロゲン社）中にクローニングし、配列を確認した。ＧＦＰ断片をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化によって切除し、ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（ＵＳ２００６１２３５０９（Ａ１））中へクローニングし、ｐＵＣ１８ベクター中のカセットＲＸ３−ＧＦＰを生じた。このカセットをＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化によって遊離し、続いてＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ（ｐ３．１−ＲＸ３−ＧＦＰ）によってあらかじめ消化されたｐＣＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン社）中へクローニングした。
【０２７５】
改良型単量体ＤＳ赤色タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ； Shaner et al., 2004 Nat. Biotechnol. 22:1567-1572）のコード配列を含むコンストラクトは、ＰＣＲ反応（ｍＣｈｅｒｒｙ  ＲｃａＩ  ５’／ＥＣＦＰＮ１  ＢａｍＮｏｔＳａｃ  ３’）における鋳型であった。
ｍＣｈｅｒｒｙ  ＲｃａＩ  ５’（配列番号：６０）
【０２７６】
ＰＣＲ産物（ＤｓＲｅｄ）をＰＣＲクローニングベクター（ＰＣＲ（ｒ）ＩＩベクター、インビトロゲン）中にクローニングし、配列を確認した。ＤｓＲｅｄ断片をＲｃａＩ／ＢａｍＨＩ消化によって切除し、ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（ＵＳ２００６１２３５０９（Ａ１））中へクローニングし、ｐＵＣ１８ベクター中のカセットＲＸ３−ＤｓＲｅｄを生じた。このカセットをＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化によって遊離し、続いてＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ（ｐ３．１−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ）によってあらかじめ消化されたｐＣＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン）中へクローニングした。
【０２７７】
３’末端での終止コドンを備えたＲＸ３  ｃＤＮＡを得るために、ＲＸ３断片をＰＣＲ（ＳＰＦＯＲ／ＲＸ３ＳＴＯＰ）によって増幅し、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩによって消化した。ｐ３．１−ＲＸ３を得るために、この断片を同一の制限酵素によって消化したｐｃＤＮＡ３．１（−）中にクローニングした。
ＲＸ３ＳＴＯＰ３’（配列番号：６１）
【０２７８】
ｈＧＨをコードするｃＤＮＡを、ＲＸ３  Ｎ末端γ−ゼインコード配列（特許ＷＯ２００４００３２０７）へ融合し、別記されるようなベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン）中へ導入した。ｐ３．１ＲＸ３ｈＧＨと名付けられた結果として生じるコンストラクトにおいて、融合タンパク質配列は、ＣＭＶプロモーターおよびターミネーターｐＡ  ＢＧＨ下にあった。
【０２７９】
ｐＴＷＩＮ１プラスミド（ニューイングランドＢｉｏｌａｂｓ）からのＳｓｐ  ＤＮＡｂインテイン、およびｈＧＨ  ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅した。両方のＰＣＲ断片を、同様にＰＣＲによってインフレームで融合し、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩによって消化し、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩによって消化されたｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（ＵＳ２００６１２１５７３（Ａ１））ベクター中にクローニングした。ＲＸ３−Ｉｎｔ−ｈＧＨ挿入物を、この中間ベクターのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化によって得て、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩによって消化されたｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン社）中にクローニングした。結果として生じるコンストラクトはｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨと命名された。ＰＣＲ産物をＢｓＲＧＩ／ＢａｍＨＩによって消化し、同一の制限酵素により消化されたｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨプラスミド中にクローニングした。
プライマー：
５’ＤＮＡｂ（配列番号：６２）
３’ＤＮＡｂ（配列番号：６３）
ＤＮＡｂ−ｈＧＨ：（配列番号：６４）
３’ｈＧＨ（配列番号：６５）
【０２８０】
切断誘導の陰性対照として、切断可能でないＳｓｐ  ＤｎａＢを操作した。ｈＧＨへインフレームで融合した変異（Ａｓｐ１５４→Ａｌａ１５４）Ｓｓｐ  ＤｎａＢインテインを、ｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨからＰＣＲによって得た。
プライマー：
ＩＭ−ｆｏｒ（配列番号：６６）
ＩＭ−ｒｅｖ（配列番号：６７）
【０２８１】
ヒトのカスパーゼ−２（ＩＲＡＵｐ９６９Ａ０２１０Ｄ６）およびカスパーゼ−３（ＩＲＡＴｐ９７０Ｂ０５２１Ｄ６）の全長ｃＤＮＡｓを、国立ローレンス・リバモア・ライブラリー（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）に基づくオリジナルの参照によりＲＺＰＤ有限会社（ベルリン）から取得した。
【０２８２】
ＰＣＲによって、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−２に特異的な切断（それぞれＤＥＶＤおよびＤＥＨＤ）部位を、対応するカスパーゼ配列の５’末端に加えた。カスパーゼ−２に対応する増幅された断片がプロドメインを含まないことに注目すべきである。
Ｃａｓｐ３フォワード（配列番号：６８）
Ｃａｓｐ３リバース（配列番号：６９）
Ｃａｓｐ２  ｆｏｒ（配列番号：７０）
Ｃａｓｐ２リバース（配列番号：７１）
【０２８３】
増幅された配列をＮｃｏＩおよびＫｐｎＩにより消化して、ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（ＵＳ２００６１２３５０９（Ａ１））中へクローニングした。次に、結果として生じるコンストラクトをＳａｌＩ／ＫｐｎＩによって消化し、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩによって消化されたｐＣＤＮＡ３．１（インビトロゲン）ベクターへクローニングした。対応するベクターを命名した（ｐ３．１−ＲＸ３−Ｃ２およびｐ３．１−ＲＸ３−Ｃ３）。
【０２８４】
ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（ＵＳ２００６１２３５０９（Ａ１））ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩによって消化し、放出された挿入物をこれらの酵素によって消化されたｐＣａｍｂｉａ２３００中にクローニングした。対応するベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩによって消化し、挿入物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩによって切断されたｐＣａｍｂｉａ１３８１中にクローニングした（ｐ４−１７）。ＲＸ３−（ｇｌｙ）ｘ５−ＧＵＳ断片含有ＤＮＡを、ＢｓｔＥＩＩによってｐ４−１７を消化すること、次にクレノウにより突出部を埋めること、および最終的にＳａｌＩによって消化することによって得る。ｐ３．１−ＲＸ３−ＧＵＳクローンを得るために、この断片を、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶによって消化されたｐｃＤＮＡ３．１（−）中にクローニングした。
【０２８５】
ｐ３．１−ＲＸ３−ＥＫは、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン社）中の以下のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片に対応する（配列番号：７２）。
【０２８６】
実施例１９：昆虫感染のためのプラスミド構築
【０２８７】
ｐ３．１−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤからのＲＸ３−ＤｓＲＥＤ断片をＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、ｐＦ−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤベクターを得るためにこれらの２つの酵素によって同様に消化されたｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン社）中にクローニングした。
【０２８８】
ＤｓＲＥＤ  ｃＤＮＡを、以下のプライマーの使用によってｐＦ−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤからのＰＣＲによって増幅した。
ｂＧＨ  ｒｅｖ（配列番号：７３）
ｂＧＨ  ｒｅｖ２（配列番号：７４）
【０２８９】
ｐＦ−ＤｓＲＥＤベクターを得るために、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン社）中にクローニングした。
【０２９０】
実施例２０：昆虫細胞および幼虫感染
【０２９１】
バキュロウイルスおよび幼生
バキュロウイルス発現ベクターシステム（ｐＦａｓｔＢａｃ、インビトロゲン社）を基礎ベクターとしてこの研究に対して使用した。製造業者によって記載されるように、組換えウイルスを産生および増幅した。イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）の卵を、エントパス（Ｅｎｔｏｐａｔｈ）社（イーストン、ペンシルバニア）から得た。製造業者によって提供される指示に従って、卵を孵化し；４齢幼虫を感染に使用した。
【０２９２】
幼虫感染
閉塞性組換えウイルスからなる様々な量のバキュロウイルスストック溶液を幼虫の食餌（エントパス社（イーストン、ペンシルバニア）からの発泡スチロールカップ中にあらかじめ作製されているもの）上に広げた。カップは覆われ、ウイルスが培地に完全に吸収されるように１時間おいた。次に、第４齢幼虫をカップの中へ置き（１個のカップあたりおよそ１０〜１５匹の幼虫）、カップを反転させた。糞便がふたの上に垂れて、毎日それを廃棄できるように、幼虫は上部（カップの下部）から餌を食べた。餌の量は少なくとも５日の増殖に十分であった。３〜５匹の幼虫を、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤおよびＤｓＲＥＤ分析のために毎日集めた。
【０２９３】
ＳＦ９感染
スポドプテラ属
Ｓｆ９細胞をインビトロゲン社（サンディエゴ、アメリカ合衆国、カリフォルニア）から得て、ラクトアルブミン加水分解物、イーストレート、Ｌ−グルタミン、１０％非動化ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）を追加したグレース昆虫培地を使用して、以前に記載されたように（O'Reilly et al., 1992）培養した。細胞を、スピナーフラスコ（ベルコ・ガラス（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ）社、ヴァインランド、ニュージャージー、アメリカ合衆国）または１００ｍｍのプラスチック組織培養ディッシュ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））のいずれかにおいて増殖させた。組換えウイルスを、バキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）トランスフェクション・キットを使用して産生した（ファーミンジェン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）。単一のプラークを単離し、使用まで４℃で保存されたウイルスストックを高力価にするため２〜４回増幅した。ルーチンの感染のために、グレース培地中で１００ｍｍのプラスチック培養皿（１０7の細胞／ディッシュ）の底へＳｆ９細胞を接着させた。１５分〜１時間のインキュベーション後に、ウイルスストックの一部を追加し、培養を加湿空気雰囲気において２７℃で維持した。一般に細胞は感染後３０〜３６時間で使用した。
【０２９４】
実施例２１：哺乳類細胞および昆虫幼虫からのＲＰＢＬＡ調製
【０２９５】
ホモジナイゼーション
哺乳類細胞
トランスフェクションされた細胞をこすり取って培養プレートから回収し、ホモジナイゼーションＢ培地（プロテアーゼ阻害剤と共に、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．９％ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で懸濁した。細胞懸濁物を２３ゲージ針を取り付けた５ｍｌのシリンジ中へ採取し、およそ３０回出し入れした。細胞の破壊を位相差顕微鏡によってモニタリングした。
【０２９６】
昆虫幼虫
ＲＸ３−ＤｓＲＥＤタンパク質およびＤｓＲＥＤタンパク質を発現する凍結イラクサギンウワバ幼虫を、１３５００ｒｐｍで２分間ＰＢＰ５緩衝液（２０ｍＭヘペスｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でポリトロンによって、および２０００ｒｐｍで氷中で５分間ポッター型ホモジナイザーによって、ホモジナイズした。このホモジネートを２００ｇで１０分遠心分離して表皮および組織残屑を除去し、上清を階段的密度勾配上にロードした。
【０２９７】
密度によるＲＰＢＬＡ単離
本質的には植物のために記載されたように、哺乳類細胞および凍結された昆虫幼虫からＲＰＢＬＡを単離した。（階段的密度勾配または低速度遠心分離）。
【０２９８】
実施例２２：トリトンＸ−１１４に基づく二相性分離による可溶化
【０２９９】
細胞ホモジネートをＰＢＳにより希釈し、１５分間１６，０００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、沈殿を乾燥した。沈殿へ２ｍｌの氷冷可溶化緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７、５％トリトンＸ−１１４、２０ｍＭ  ＴＣＥＰ、２０ｍＭ  ＮＤＳＢ１９５および１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2）を追加し、その後１Ｍ尿素、１０％グリセロールおよび１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含んでいる１ｍｌのＰＢＳを追加した。この組成物をボルテックス撹拌を時々行ないながら１５分間氷上でインキュベートした。次にその懸濁物を５０％ポテンシャルで２０秒間４回の超音波処理を行ない、低温を維持するためにバースト間にそれを１分間氷で冷やした。次に二相を形成させるために、その懸濁物を１５分間３７℃でインキュベートした。３ミリリットルの１０％ＰＥＧをより下層の疎水性層（トリトンＸ−１１４を多く含む）へ追加し、組成物を２０分間氷上でインキュベートした。次にその溶液を再び二相を形成させるために１５分間３７℃でインキュベートした。上相（４ｍｌ）を回収し、分析のために保存した。
【０３００】
実施例２３：免疫的局在
【０３０１】
蛍光顕微鏡を使用する免疫細胞化学（バーティカル・エクリプス顕微鏡ニコンＥ６００Ａ）。トランスフェクション後の２〜４日の間に、細胞を３０分間１％パラホルムアルデヒド溶液中で固定し、リン酸緩衝生理食塩水による洗浄後に、（ｉ）ｈＧＨ（１／１５０希釈）、（ｉｉ）ＥＫ（１／５００希釈）、（ｉｉｉ）ＲＸ３（１／７００希釈）に対する抗体により４５分間インキュベートした。抗原抗体反応を検出するために、アレクサ蛍光（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８（インビトロゲン社）へ結合した抗ウサギ抗体により４５分間インキュベーションした。
【０３０２】
共焦点分析を、発光帯波長選択のための分光光度計を取り付けた共焦点レーザー顕微鏡（ライカ社ＴＣＳ  ＳＰ、ハイデンベルグ、ドイツ）において行なった。４９５〜５３５ｎｍで設定された発光ウィンドウを使用して、アルゴンイオンレーザーによる４８８ｎｍの励起で、緑色蛍光イメージを集めた。赤色蛍光イメージを、ヘリウムネオンレーザーによる５４３ｎｍの励起後に、発光ウィンドウ５５０〜６００で集めた。光学的切片は０．５〜１μｍ厚であった。
【０３０３】
実施例２４：活性分析
【０３０４】
ＥＧＦ活性分析
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＥＧＦ受容体を過剰発現する乳癌細胞）を、５，５００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）含有増殖培地中で８時間細胞を接着させ、次にＦＣＳ０．１％を追加した培地中で飢餓状態を一晩維持した。その後培地を除去し、プロメガ社からのＥＧＦ（陽性対照）または対応するサンプル（可溶化したＲＸ３−ＥＧＦ）を、異なる濃度で追加する。次に放射性チミジン（ｔｉｍｉｄｉｎｅ）を最終濃度０．５μＣｉで追加する。刺激後３７℃４８時間で増殖を検討する。次に細胞を冷ＰＢＳにより２度洗浄し、細胞代謝を停止するために細胞を氷で冷やす。１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液を追加し、細胞を４℃で２０分間インキュベートする。いったんＴＣＡの溶液を除去し、プレートを７０％エタノールを２度洗浄し、細胞を０．５ｍＬ溶解溶液（２％ＣＯ3Ｎａ2、０．１Ｎ  ＮａＯＨおよび１０％ＳＤＳ）中で３７℃２０分間インキュベートする。プレートをボルテックス撹拌により混合し、サンプルは、所望されない化学発光現象を回避するために１２時間より前に測定されない。
【０３０５】
ＥＫ活性分析
酵素活性を蛍光分析により測定した（Grantet al. (1979) Biochim. Biophys. Acta 567:207-215）。２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、３７℃で１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中の０．３〜１．０ｍＭの蛍光原基質Ｇｌｙ−（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−βナフチルアミド（ｎａｐｈｔｙｌａｍｉｄｅ）（シグマ）へ酵素を追加することによって、反応を開始した。遊離β−ナフチルアミン（ｎａｐｈｔｙｌａｍｉｎｅ）濃度を、１分間継続的にモニタリングされた蛍光（λｅｘ＝３３７ｎｍおよびλｅｍ＝４２０ｎｍ）の増加から決定した。活性は経時的な蛍光の変化として計算された。
【０３０６】
ＧＵＳ活性分析
ＧＵＳ活性分析は、メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド酸（ＭＵＧ）から４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）蛍光産物へのＧＵＳ酵素による触媒作用中で基づく。（Jefferson RA,et al. (1987) EMBO J. 6(13): 3901-3907）。５０μＬの可溶化したＲＸ３−ＧＵＳ（または対照として可溶化したＲＸ３）を、２００μＬの反応緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳおよび０．１％トリトンＸ１００）と６６μＬのメタノールへ追加した。基質（ＭＵＧ）を最終濃度１０ｍＭで追加した。２００μＬの反応（４−ＭＵ）の反応緩衝液へ０、５０、１００、２００、３００または５００ｐｍｏｌの４−ＭＵ（反応の産物）を追加することによって、基準物を調製した。
【０３０７】
サンプルおよび基準を混合し、それらをλｅｘ＝３５５ｎｍおよびλｅｍ＝４６０ｎｍで蛍光計（ヴィクター（Ｖｉｃｔｏｒ）、パーキン・エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））において測定した。サンプルは、３０分ごとに３時間測定された。比活性は次式によって計算された。ＧＵＳ活性（ｐｍｏｌｓ  ４−ＭＵ／ｍｉｎ−１＊ｍｇ−１）＝（λｅｍ（Ｔ１）−（λｅｍ（Ｔ０））／（ｋ＊（Ｔ１−Ｔ０））。「Ｋ」＝比（蛍光の単位）／（ｐｍｏｌ  ４−ＭＵ）。
【０３０８】
ＲＴＢ活性分析（アシアロフェツイン結合ＥＬＩＳＡ）
ＲＰＢＬＡからの抽出タンパク質におけるＲＸ３−ＲＴＢの機能性は、アシアロフェチュイン（ガラクトース末端のグリカンを露出するためにシアリダーゼにより処理された糖タンパク質フェチュイン）への結合を介して決定された。２００マイクロリットルのアシアロフェチュイン（シグマ）を改変ＰＢＳ（ｍＰＢＳ）緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）中の３００ｍｇ／ｍＬの濃度で、室温で１時間イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）４ＨＢＸ（フィッシャー、ピッツバーグ、ペンシルバニア）マイクロタイタープレートのウェルへ結合させた。コーティング溶液を廃棄し、ウェルを２００ｍｌのｍＰＢＳ中の３％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０により室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄した後、１００ｍｌのＲＴＢ基準物および抽出タンパク質（以下を参照）は室温で１時間間適用し、インキュベートした。次にウェルを２００ｍｌのｍＰＢＳ、０．１％ツイーン２０により３回洗浄した。ブロッキング緩衝液（上記のような）中で１：４０００に希釈されたウサギ抗ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）レクチン（ＲＣＡ６０）ポリクローナル抗体（シグマ社）を室温で１時間適用し、インキュベートした。次に前に示したようにウェルを洗浄した。ＡＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラッド社）をブロッキング緩衝液中で１：３０００の希釈で適用し、室温で１時間間インキュベートした。上に記載されるように、ウェルを３回洗浄し、１００ｍｌのｐＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸・二ナトリウム塩）基質（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、ロックフォード、イリノイ）を適用した。１５分後に５０μｌの２Ｎ  ＮａＯＨの追加によって反応を停止した。吸光度（Ａ４０５）を、バイオ−テック（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）ＥＬ８０８ウルトラマイクロプレートリーダーで読み取った。抽出タンパク質を、３ｍｌのトリス−アスコルビン酸緩衝液（上記）に対して１ｇの生重量葉の比で調製し、サンプルを、１ウェルあたり５ｎｇ〜５００ｎｇにわたる濃度でトリス−アスコルビン酸緩衝液中に連続的に希釈されたヒマ種子由来ＲＴＢ（ベクター・ラボ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）社、バーリンゲーム、カリフォルニア）による基準曲線に対して比較した。
【０３０９】
実施例２５：マクロファージによる、昆虫幼虫からのＲＰＢＬＡ中に集合したＲＸ３−ＤｓＲＥＤの増強された取り込み
【０３１０】
ｐＦＢ−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤおよびｐＦＢ−ＤｓＲＥＤを得るために、ＲＸ３ＤｓＲＥＤおよびＤｓＲＥＤをコードするｃＤＮＡをバキュロウイルスＦａｓｔＢａｃベクター（インビトロゲン社）中にクローニングした。これらのコンストラクトをイラクサギンウワバ幼虫を感染させるために使用した。ＲＸ３ＤｓＲＥＤタンパク質およびＤｓＲＥＤタンパク質を発現する凍結幼虫をホモジナイズし、階段的密度勾配上にロードした。２時間スイングバケット中で８００００×ｇで遠心分離した後に、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ融合タンパク質、およびサイトゾル中に発現されたＤｓＲＥＤに対応する対照の分析を、イムノブロットによって行なった（図２Ｃ）。予想されるように、ＤｓＲＥＤタンパク質は幼生細胞サイトゾル中で発現させた場合、非常に高密度な構造中で集合せず、上清およびＦ３５画分中に局在した（図２Ｃ、レーン２および３）。一方、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ融合タンパク質は、Ｆ５６から単離できる高密度構造中で集合し蓄積することができた（図２Ｃ、レーン５）。実施例４（図４）における共焦点顕微鏡分析によって示されるように、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤは丸型のＲＰＢＬＡ中で蓄積した。
【０３１１】
Ｆ５６からのＲＸ３−ＤｓＲＥＤのＲＰＢＬＡＳを、ＰＢＰ５（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で３倍希釈し、スイングバケット中で２時間４℃８００００×ｇで遠心分離によって沈殿中に集めた。沈殿をＰＢＳの緩衝液中に再懸濁し、ＲＰＢＬＡの数をＦＡＣＳによって定量した。ｐＦＢ−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤベクターにより感染させた１つの幼虫から、およそ１×１０9のＲＰＢＬＡ粒子が、１マイクロリットル（μｌ）あたり５００，０００ＲＰＢＬＡの濃度で得られた。
【０３１２】
マクロファージおよび樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示が、免疫反応の誘導に必要な重要な過程であることが報告されてきた（Greenberg et al, Current Op. Immunology (2002), 14:136-145）。この過程において、ＡＰＣは抗原をファゴサイトーシスし、続いてその抗原はファゴリソソーム中で小さなペプチドに切断される。これらのペプチドはＭＨＣＩＩと相互作用し、細胞を介した免疫反応および抗体を介した免疫反応に対して提示される細胞膜へ選別される（Villandagos et al., Immunological Reviews (2005) 207:101-205）。
【０３１３】
ＲＰＢＬＡの内部に存在するＲＸ３融合タンパク質の抗原性を決定するために、マクロファージ細胞培養を、異なるＲＰＢＬＡ／細胞比率（１００：１および１０００：１）で、これらのオルガネラとインキュベートした。マクロファージ細胞培養を、飢餓条件でまたは（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下において増殖させた。これらの細胞培養を１時間ＲＰＢＬＡとインキュベートしてＲＰＢＬＡ除去後１、２、５および１０時間インキュベートし、マクロファージをＰＢＳによりよく洗浄し、２％パラホルムアルデヒドにより固定した。その後、蛍光ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ  ＲＰＢＬＡをファゴサイトーシスしたマクロファージのパーセンテージだけでなく、マクロファージによっても取り込まれた蛍光ＲＰＢＬＡの量を定量化するために、固定したマクロファージをＦＡＣＳによって解析した。
蛍光マクロファージのパーセンテージ
2009527237.tif 000006
【０３１４】
これらの結果から、マクロファージが思いもよらない貪食によりＲＸ３−ＤｓＲＥＤ  ＲＰＢＬＡをファゴサイトーシスしたことは明らかである。より低いＲＰＢＬＡ／細胞比率（１：１００）でＭ−ＣＳＦの存在下においてでさえ、ＲＰＢＬＡ追加１時間後で、マクロファージの６５％は蛍光性である。Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージのファゴサイトーシスに対して負の効果を有する）のような、細胞分裂促進性サイトカインの存在でさえ、ＲＰＢＬＡ取り込みを有意に低下させることができない。５時間では、マクロファージのほとんどすべて（８０％以上）は蛍光性であり、大多数の細胞が培地からある程度のＲＰＢＬＡを取り込んだことを意味する。
【０３１５】
マクロファージと結合した蛍光の量がインキュベーションで経時的に解析された場合、結果はさらに驚くべきものであった。解析された任意の条件おいて（ＲＰＢＬＡ／細胞の比率またはＭ−ＣＳＦの非存在の存在）、ＲＰＢＬＡを取り込むマクロファージの能力への飽和効果は観察されなかった。上記および下記の表の結果が、５および１０時間のインキュベーションで比較されるならば、マクロファージのほとんどすべてが蛍光性であることが分かるが、マクロファージに結合した合計の蛍光は連続的に増加する。この結果は、マクロファージが大量の蛍光ＲＰＢＬＡ粒子をファゴサイトーシスすることを示す。
時間依存的マクロファージ蛍光
2009527237.tif 000007
【０３１６】
ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ融合タンパク質を含むＲＰＢＬＡがマクロファージの内部にあること、および単に細胞膜に吸着されているのではないことを実証するために、共焦点顕微鏡分析を行なった。図７Ａ（左側パネル）は、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ粒子（１００：１で）と共に１時間インキュベートされたマクロファージ細胞のうちのいくつかを示す。同一の図の左側パネルには、１マイクロメートルの同一の細胞の切片に、グリーンフィルターで観察されるマクロファージの典型的な緑色の自己蛍光があることを示す（図７Ａ、白色の矢じり）。同一の光学的切片において、核および赤色蛍光ＲＰＢＬＡ粒子（図７Ａ、黒い矢じり）の存在は、ＲＰＢＬＡがファゴサイトーシスによって細胞の内部に取り込まれることを示した。
【０３１７】
いったん免疫原がマクロファージによってファゴサイトーシスされたならば、解析されるべき別の重要な要素は免疫原の破壊である。抗原破壊は、ＭＨＣＩＩ受容体上で提示される抗原性ペプチドを産生するために必要である。マクロファージの経時的なＤｓＲＥＤ蛍光パターンの分析は、ＲＰＢＬＡ粒子が活発に消化されたことを示した。
【０３１８】
顕微鏡写真の別のセットは、インキュベーションの１時間後に、ＲＰＢＬＡ粒子が完全には分解されず、なお細胞の内部に観察できることを示す（図７Ｂ、上部パネル）。１０時間後、赤色蛍光パターンは全て細胞に沿ってより均質であり、マクロファージがＲＰＢＬＡ粒子を分解し始めたことを示す（図７Ｂ、下部パネル）。
【０３１９】
実施例２６：樹状細胞による、昆虫幼虫からのＲＰＢＬＡ中のＲＸ３−ＤｓＲＥＤの増強された取り込み
【０３２０】
樹状細胞は、免疫系を誘導する中心的な抗原提示役割を果たす。（Blander et al., Nature Immunology (2006) 10:1029-1035）。樹状細胞はまれなものではあるが、免疫反応の誘導能力および制御能力の両方で、最も高度に特殊化されたＡＰＣである（Lau AH et al Gut 2003 52:307-314）。昆虫幼虫からのＲＰＢＬＡ中で集合したＲＸ３−ＤｓＲＥＤ融合タンパク質をファゴサイトするそれらの細胞の能力を評価するために、樹状細胞培養を１００ＲＰＢＬＡ／細胞の比率でこれらのオルガネラと共にインキュベートした。（ｉ）前に記載されたように単離されたＲＰＢＬＡ、および（ｉｉ）ＥＲ膜を除去するために、５０ｍＭトリスｐＨ８、１％トリトンＸ−１００中で完全に洗浄した同一のＲＰＢＬＡの２種類のＲＰＢＬＡを調製した。樹状細胞培養を、ＲＰＢＬＡの存在下において飢餓条件で増殖させ、サンプルを０、１、２、５および１０時間で解析した。
蛍光性樹状細胞のパーセンテージ
2009527237.tif 000008
【０３２１】
上記の表から結論できるように、樹状細胞はＲＰＢＬＡに対して驚くべき貪食を示す。予想されたように、マクロファージと比較して（前の表を比較）、別記されるように、樹状細胞はより遅いファゴサイトーシス比率を有する。蛍光性樹状細胞のパーセンテージは解析された時間経過にわたってすべて増加し、ＲＰＢＬＡインキュベーション１０時間後でさえ飽和効果は観察されなかった。マクロファージに結合した蛍光の量が経時的に解析された場合、同様の結論を得ることができる。
【０３２２】
ＲＰＢＬＡを取り込む樹状細胞の能力は飽和効果を示さなかった。樹状細胞がますます経時的にファゴサイトーシスへ誘導される（および蛍光性になる）という事実は、飽和効果の欠如について説明することができる。それにもかかわらず、マクロファージで観察されたように、樹状細胞のファゴサイトーシス能力が飽和していないこともありえる。
【０３２３】
予想外に、膜のないＲＰＢＬＡと共にインキュベートされた樹状細胞のＦＡＣＳ分析は、膜含有ＲＰＢＬＡと共にインキュベートされた同一の細胞よりも有意に高い蛍光性樹状細胞のパーセンテージを示した。さらに、これらの樹状細胞の蛍光もまた同様により高かった。同様の結果は、膜のないＲＰＢＬＡと共にマクロファージを使用して得られた。膜含有ＲＰＢＬＡ中の昆虫由来膜タンパク質の存在はマウス樹状細胞によって外来タンパク質として認識され、従ってファゴサイトーシスを増強するであろうことが期待されたので、これはいくぶん意外であった。したがって周囲の膜の存在または非存在下における昆虫由来ＲＰＢＬＡが、非常に効率的な抗原提示手段であることは明白である。
【０３２４】
ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ融合タンパク質を含む、ＲＰＢＬＡおよび膜のないＲＰＢＬＡが樹状細胞によって取り込まれることを実証するために、光学顕微鏡による分析を行った。図８Ａ（上部）は、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ  ＲＰＢＬＡと共に２、５および１０時間インキュベートした樹状細胞を示す（１００：１比率）。図８Ｂの下部では、ＤｓＲＥＤタンパク質の赤色蛍光から、それらの細胞によるＲＰＢＬＡの取り込みが示される。２時間のインキュベーションでは、若干のファゴサイトーシスを観察できるが、大部分のＲＰＢＬＡは細胞膜へ吸着されるだけである。５時間およびさらに１０時間で、多くの細菌がファゴサイトーシスされた赤色蛍光性のＲＰＢＬＡが観察された。樹状細胞が膜のないＲＰＢＬＡと共にインキュベートされた場合、同様の結果が得られた（図８Ｂ）。
【０３２５】
ＲＰＢＬＡまたは膜のないＲＰＢＬＡとの１０時間のインキュベーションでさえ、大部分のファゴサイトーシスされた粒子が粒子として見えるままであることに注目すべきであり、タンパク質分解はほとんど起こっていないことを意味する。この観察は、プロテアーゼ捕捉の速度、および従ってタンパク質分解の速度が、マクロファージよりも樹状細胞においてより遅いことを示した以前の観察と合致する。（Lennon-Dum'enil et al. (2002) J. Exp. Med. 196:529-540）。これらの条件は、樹状細胞においてタンパク質のタンパク質分解を限定し、ＭＨＣクラスＩＩ分子上にロードするために適切な長さのペプチド抗原の生成を促進してもよい。
【０３２６】
実施例２７：マクロファージおよび樹状細胞のファゴサイトーシス
【０３２７】
マクロファージマクロファージをマウスＢａｌｂ／Ｃの骨髄から得た。マウスは頸椎脱臼により屠殺され、大腿骨および脛骨を取り出した。骨を切断し、シリンジを使用してＤＭＥＭ培地により骨髄を抜き取った。骨髄を、完全ＤＭＥＭ培地（２０％ＦＣＳおよび３０％Ｌ細胞を追加した）により１５０ｍｍペトリ皿上で培養した。９９％純度のマクロファージ培養が３７℃で７日のインキュベーション後に得られた。
【０３２８】
１ウェルあたり３５０．０００の細胞を生ずるように、分化したマクロファージを完全培地中で培養した。細胞が接着したならば培地を除去し、幼虫からのＲＸ３−ＤｓＲＥＤ  ＲＰＢＬＡを含む新しい培地により細胞をインキュベートした。実験を、１００粒子：１細胞、または１０００粒子：１細胞で行った。粒子（ＲＰＢＬＡ）の数を、励起のために４８８ｎｍでアルゴンレーザー、および発光のために５７５ｎｍ＋／−３０でＦＬ２を使用して、コールター・エピックス（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ）ＸＬ  ＦＡＣＳによって数えた。ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）社ｒｅｆ．７５４７０５３（ｌｏｔ７５４８９６Ｆ）からのフロー・カウント（ｆｌｏｗ−ｃｏｕｎｔ）をフローイングを検査するために使用した。
【０３２９】
異なる時間（０、１、２、５および１０時間）後に培地を除去し、ＰＢＳにより２回の洗浄を行なった。細胞を回収し、次に２％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳによって固定した。処理されたマクロファージを４℃で保存し、蛍光をＦＡＣＳ（計数のために使用されたものと同一のプログラムで）によって解析した。
【０３３０】
ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ粒子が細胞の内部にファゴサイトされることを実証するために、免疫細胞化学の実験が行なわれた。分化したマクロファージ（５０．０００の細胞／ウェル）を、ＲＸ３−ＤｓＲＥＤの１００：１粒子と共に１時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳにより２度洗浄し、２％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳにより１５分間固定した。処理された細胞を共焦点顕微鏡によって解析した。
【０３３１】
樹状細胞
Ｂａｌｂ／Ｃマウスからの骨髄を、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ）により１日間培養した。顆粒球を除去するために、プレートを撹拌し、培地を２度交換した。次に培地を撹拌しないで２度交換し、未成熟樹状細胞を得るために２日間インキュベートした。樹状細胞を、１、５および１０時間ＲＸ３−ＤｓＲＥＤの１００：１粒子と共にインキュベートした。処理後に、細胞を４℃で保存し、２％パラホルムアルデヒドにより固定し、蛍光をＦＡＣＳによって解析した。
【０３３２】
本明細書において引用された特許出願、特許および論文の各々は、参照により組み入れられる。冠詞「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」の使用は、１つまたは複数を含むように意図される。
【０３３３】
先の記述およびその実施例は、例示的なものとして意図され、限定として理解するべきできない。なお、本発明の趣旨および範囲内で別の変異は可能であり、当業者へ容易に示されるだろう。
【０３３４】
この開示の一部を形成する図面は、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【０３３５】
【図１Ａ】パネルＡは、ＣＨＯ細胞トランスフェクション研究のために使用されるコンストラクトの図式的な説明である。コンストラクトｐＥＣＦＰ−Ｎ１はサイトゾル中でＥＣＦＰを発現する対照に対応する。ｐＲＸ３−ＥＣＦＰおよびｐＲＸ３−Ｇｘ５−ＥＣＦＰは、それぞれ５つのグリシンアミノ酸（Ｇｘ５）によって形成されるスペーサーの非存在下または存在下において、融合タンパク質ＲＸ３−ＥＣＦＰを発現するコンストラクトである。ｐ２２ａＺ−ＥＣＦＰは、ＥＣＦＰへ融合させたトウモロコシαゼイン（２２ＫＤａ）をコードするコンストラクトである。下部においては、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）に基づくベクターが、以下に論じられるいくつかのコンストラクトと共に示される。パネルＢは、植物形質転換のためのバイナリーベクター（上部）および昆虫感染のためのパキュロウイルスベクター（下部）の図解の説明を示す。「ＲＸ３」＝プロリンを多く含むγ−ゼインのＮ末端配列；「（Ｇｌｙ）ｘ５」＝５つのグリシンによって形成されるスペーサー；「ＥＣＦＰ」＝増強シアン蛍光タンパク質遺伝子；「ＰＣＭＶ」＝ヒトサイトメガロウイルスプロモーター；「ＰＰＨ」＝ポリヘドリンプロモーター；「ＰＳＶ４０」＝ＳＶ４０初期プロモーター；「ＣａＭＶ３５Ｓ  ｘ２」＝二重のカリフラワーモザイクウイルスプロモーター；「Ｐｃｂｈ１」＝主要セルラーゼプロモーター；「ｔ３５Ｓ」＝カリフラワーモザイクウイルスターミネーター；「ＴＥＶ」＝タバコエッチウイルスの翻訳エンハンサー；「ＳＶ４０  ｔｅｒ」＝ＳＶ４０ターミネーター；「ＨＳＶ  ｔｅｒ」＝単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル；「ｃｂｈ１  ｔｅｒ」＝主要セルラーゼポリアデニル化シグナル；「Ｋａｎａ／Ｎｅｏ」＝カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子；「Ａｍｐ  Ｒ」＝アンピシリン耐性遺伝子；「ゲンタマイシン」＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；「ＳＰｃｂｈ１」＝主要セルラーゼシグナルペプチド；「Ｏｒｉ  ｆ１」＝ｆ１一本鎖ＤＮＡ起点；「Ｏｒｉ  ｐＵＣ」＝プラスミド複製起点；「ＢＧＨ  ｔｅｒ」＝ウシ成長ホルモンターミネーター；「Ｐ  ＢＬＡ」＝βラクタマーゼ遺伝子プロモーター；「ＧＦＰ」＝緑色蛍光タンパク質；「ＤｓＲＥＤ」＝ディコソーマ（Ｄｉｃｏｓｏｍａ）赤色蛍光タンパク質；「ｈＧＨ」＝ヒト成長ホルモン；「ＥＧＦ」＝ヒト表皮増殖因子；「ＥＫ」＝ウシエンテロキナーゼ；「ＧＵＳ」＝グルクロニダーゼ；「ＲＴＢ」＝リシン（ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｕｎｉｓ））のレクチンサブユニット；「Ｃａｓｐ２」＝ヒトカスパーゼ２；「Ｃａｓｐ３」＝ヒトカスパーゼ３；「Ｉｎｔ」＝ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社からのＳｓｐ  ＤＮＡｂ  インテイン；「ｍＩｎｔ」＝Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテインの変異バージョン（Ａｓｐ１５４→Ａｌａ置換）。
【図１Ｂ】パネルＡは、ＣＨＯ細胞トランスフェクション研究のために使用されるコンストラクトの図式的な説明である。コンストラクトｐＥＣＦＰ−Ｎ１はサイトゾル中でＥＣＦＰを発現する対照に対応する。ｐＲＸ３−ＥＣＦＰおよびｐＲＸ３−Ｇｘ５−ＥＣＦＰは、それぞれ５つのグリシンアミノ酸（Ｇｘ５）によって形成されるスペーサーの非存在下または存在下において、融合タンパク質ＲＸ３−ＥＣＦＰを発現するコンストラクトである。ｐ２２ａＺ−ＥＣＦＰは、ＥＣＦＰへ融合させたトウモロコシαゼイン（２２ＫＤａ）をコードするコンストラクトである。下部においては、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）に基づくベクターが、以下に論じられるいくつかのコンストラクトと共に示される。パネルＢは、植物形質転換のためのバイナリーベクター（上部）および昆虫感染のためのパキュロウイルスベクター（下部）の図解の説明を示す。「ＲＸ３」＝プロリンを多く含むγ−ゼインのＮ末端配列；「（Ｇｌｙ）ｘ５」＝５つのグリシンによって形成されるスペーサー；「ＥＣＦＰ」＝増強シアン蛍光タンパク質遺伝子；「ＰＣＭＶ」＝ヒトサイトメガロウイルスプロモーター；「ＰＰＨ」＝ポリヘドリンプロモーター；「ＰＳＶ４０」＝ＳＶ４０初期プロモーター；「ＣａＭＶ３５Ｓ  ｘ２」＝二重のカリフラワーモザイクウイルスプロモーター；「Ｐｃｂｈ１」＝主要セルラーゼプロモーター；「ｔ３５Ｓ」＝カリフラワーモザイクウイルスターミネーター；「ＴＥＶ」＝タバコエッチウイルスの翻訳エンハンサー；「ＳＶ４０  ｔｅｒ」＝ＳＶ４０ターミネーター；「ＨＳＶ  ｔｅｒ」＝単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル；「ｃｂｈ１  ｔｅｒ」＝主要セルラーゼポリアデニル化シグナル；「Ｋａｎａ／Ｎｅｏ」＝カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子；「Ａｍｐ  Ｒ」＝アンピシリン耐性遺伝子；「ゲンタマイシン」＝ゲンタマイシン耐性遺伝子；「ＳＰｃｂｈ１」＝主要セルラーゼシグナルペプチド；「Ｏｒｉ  ｆ１」＝ｆ１一本鎖ＤＮＡ起点；「Ｏｒｉ  ｐＵＣ」＝プラスミド複製起点；「ＢＧＨ  ｔｅｒ」＝ウシ成長ホルモンターミネーター；「Ｐ  ＢＬＡ」＝βラクタマーゼ遺伝子プロモーター；「ＧＦＰ」＝緑色蛍光タンパク質；「ＤｓＲＥＤ」＝ディコソーマ（Ｄｉｃｏｓｏｍａ）赤色蛍光タンパク質；「ｈＧＨ」＝ヒト成長ホルモン；「ＥＧＦ」＝ヒト表皮増殖因子；「ＥＫ」＝ウシエンテロキナーゼ；「ＧＵＳ」＝グルクロニダーゼ；「ＲＴＢ」＝リシン（ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｕｎｉｓ））のレクチンサブユニット；「Ｃａｓｐ２」＝ヒトカスパーゼ２；「Ｃａｓｐ３」＝ヒトカスパーゼ３；「Ｉｎｔ」＝ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社からのＳｓｐ  ＤＮＡｂ  インテイン；「ｍＩｎｔ」＝Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテインの変異バージョン（Ａｓｐ１５４→Ａｌａ置換）。
【図２】ｐＲＸ３−ＥＣＦＰ、ｐＲＸ３−Ｇ−ＥＣＦＰおよび対照としてのｐＥＣＦＰ−Ｎ１（パネルＡ）；ｐ３．１−ＲＸ３−ｈＧＨ、ｐ３．１−ＲＸ３、ｐ３．１−ＲＸ３−ＥＫ、ｐ３．１−ＲＸ３−Ｃ３、ｐ３．１−ＲＸ３−Ｃ２、ｐ３．１−ＲＸ３−ＧＵＳおよびｐ３．１−ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨプラスミド（パネルＢ）によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の細胞下分画研究からのイムノブロットを示した図である。パネルＢにおいて、ｐＢ−ＲＸ３−ＲＴＢによりアグロインフィルトレーションされたタバコの細胞下分画研究からのイムノブロットもまた示される。パネルＣは、ｐＦ−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤおよび対照としてのｐＦＤｓＲＥＤに感染した昆虫幼虫の細胞下分画研究に対応する。トランスフェクションされた細胞ホモジネートを、段階的ショ糖勾配上にロードし、遠心分離後に、上清、中間層および沈殿画分中の対応する融合タンパク質の蓄積を、イムノブロットにより解析した。分子量およびイムノブロットにおいて使用される抗体は、右側に示される。Ｈ、密度勾配にロードしたホモジネート；Ｓ、上清；ＦＸ、Ｘ％重量／重量ショ糖クッションの中間層上部；Ｐ、５６％ショ糖クッションの下の沈殿。
【図３】トランスフェクションされたＣＨＯ細胞内のＲＰＢＬＡにおける、融合タンパク質のＲＸ３−ＥＣＦＰ（パネルＡ）、ＲＸ３−Ｇｘ５−ＥＣＦＰ（パネルＢ）、２２ａＺ−ＥＣＦＰ（パネルＤ）、ＲＸ３−ＧＦＰ（パネルＥ）、およびＲＸ３−ＤｓＲＥＤ（パネルＦ）の局在を示す、６枚のパネルの共焦点顕微鏡写真である。活性のある（蛍光）融合タンパク質を含むＲＰＢＬＡ構造のいくつかは、矢印により示される。ｐＥＣＦＰ−Ｎ１によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞中の、サイトゾルにおけるＥＣＦＰの局在および核（パネルＣ）は、対照として示される。「Ｎ」＝核。
【図４】異なる宿主中の蛍光性ＲＸ３融合タンパク質の局在を示す、４枚のパネルの共焦点顕微鏡写真である。パネルＡにおいて、ｐＢ−ＲＸ３−ＧＦＰ、およびＨｃＰＲＯ（遺伝子サイレンシングのサプレッサー）をコードするバイナリーベクターにより、共アグロインフィルトレーションされたタバコからの表皮葉組織の共焦点光学的切片が示される。活性のあるＲＸ３−ＧＦＰ融合タンパク質を含む多くの蛍光性ＲＰＢＬＡを観察することができる。右側のパネルＢにおいて、ＲＸ３−ＧＦＰ蛍光および位相差のマージにより、一過性にトランスフェクションされた細胞が高率であることが示される。ｐＦ−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤにより感染させたＳＦ９昆虫細胞の光学的切片の投影図が、パネルＣにおいて示される。ｐＦ−ＲＸ３−ＤｓＲＥＤにより感染させた昆虫幼虫からの脂肪組織の１マイクロメートルの光学的切片が、パネルＤにおいて示される。活性のある（蛍光性）融合タンパク質を含むＲＰＢＬＡ構造のいくつかが、矢印により示される。
【図５】ＲＸ３融合タンパク質のトランスフェクション４日後の、ＣＨＯ細胞におけるＲＰＢＬＡの内部のＲＸ３融合タンパク質の局在を示す６枚のパネル（Ａ−Ｆ）の写真である。抗ＲＸ３血清および抗ｈＧＨ血清の使用により免疫的に局在化されたＲＸ３−ｈＧＨ（パネルＡおよびＢ）発現ＣＨＯ細胞をそれぞれ示すために、光学顕微鏡を使用した。パネルＣは、ＲＸ３抗血清によるＲＸ３タンパク質の免疫的局在を示す。パネルＤにおいて、ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨ融合タンパク質を免疫的に局在化するために、抗ｈＧＨ血清を使用した。ＲＸ３−ＧＵＳ融合タンパク質発現ＣＨＯ細胞のＲＸ３抗血清によるインキュベーションは、パネルＥにおいて示される。抗ＲＸ３の血清によりインキュベートされたＲＸ３−ＥＫ発現ＣＨＯ細胞において、より小さなＲＰＢＬＡが観察された（パネルＦ）。小胞体（ＥＲ）およびＲＰＢＬＡが示される。
【図６】低速度遠心分離によるＲＰＢＬＡ調製品からのＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨ融合タンパク質可溶化後の、Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテインの自己切断の誘導を図示するウエスタンブロットを示す。パネルＡおよびＢは、可溶化後の、ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨ（野生型Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテイン）融合タンパク質の自己切断を図示する。ＲＸ３−Ｉｍ−ｈＧＨ（変異Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテイン）融合タンパク質が陰性対照として含まれた。１レーンあたり同容量のサンプルがロードされ、抗ＲＸ３の血清（パネルＡ）または抗ｈＧＨの血清（パネルＢ）によりウエスタンブロットを行なった。全長融合タンパク質は白矢じりにより示され、Ｓｓｐ  ＤＮＡｂインテイン自己切断の産物（パネルＡにおけるＲＸ３−Ｉ、およびパネルＢにおけるｈＧＨ）は、黒矢じりにより示される。パネルＣは、０．１％ＳＤＳ（Ｓ１）および二相性（Ｓ２）可溶化後の、ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨ融合タンパク質自己切断効率の比較を図示する。４倍過剰にロードされたＴ０以外は、１レーンあたり同容量のサンプルがロードされた。抗ｈＧＨ血清によるインキュベーションは、全長融合タンパク質ＲＸ３−Ｉ−ｈＧＨ（白矢じり）および放出されたｈＧＨ（黒矢じり）を示す。「Ｓ」＝可溶性画分；「Ｕ」＝不溶性画分；「Ｔ０」＝インテイン自己切断の誘導前のサンプル。
【図７】昆虫幼虫からのＲＸ３−ＤｓＲＥＤ  ＲＰＢＬＡの、マクロファージによる取り込みおよび処理を示す顕微鏡写真を示した図である。パネルＡにおいて、昆虫ＲＸ３−ＤｓＲＥＤ  ＲＰＢＬＡとのインキュベーションの１時間後のマクロファージの共焦点顕微鏡分析が示される。左側には、２つのマクロファージが位相差顕微鏡によって観察することができる。右側には、同一細胞の１マイクロメートルの光学的切片からのＤｓＲＥＤ蛍光（黒矢じり）およびマクロファージの自己蛍光（白矢じり）のマージされたイメージが示される。この光学的切片の核（Ｎ）の観察により、ＲＰＢＬＡが取り込まれており、ここでは細胞内にあることが示される。パネルＢは、ＲＰＢＬＡ含有ＲＸ３−ＤｓＲＥＤと共に１時間のインキュベーション後に、マクロファージによって放出されたＤｓＲＥＤ蛍光の時間経過研究（１および１０時間）を示す。左側には、位相差顕微鏡によりマクロファージの存在が示される。右側には、１マイクロメートルの光学的切片のＤｓＲＥＤ蛍光により、１時間では未消化ＲＰＢＬＡの存在（白色の矢じり）、および１０時間での消化および分散したＲＰＢＬＡを表す、さらに均質なＤｓＲＥＤ蛍光パターンが示される。挿入図のイメージは、１時間で観察された未消化ＲＰＢＬＡのより高い倍率に対応する。
【図８】昆虫幼虫からのＲＸ３−ＤｓＲＥＤ  ＲＰＢＬＡの、樹状細胞による取り込みを示す顕微鏡写真である。写真は、ＲＰＢＬＡ（パネルＡ）および膜のないＲＰＢＬＡ（パネルＢ）と共に経時的に（２、５および１０時間）インキュベートされた樹状細胞に対応する。各パネルの上部において、位相差は、樹状細胞の存在を示す。下部では、同一樹状細胞からのＤｓＲＥＤ蛍光は、細胞膜へ吸収されたＲＰＢＬＡの存在（２時間）または細胞の内部にファゴサイトーシスされたＲＰＢＬＡの存在（５および１０時間）を示す。「Ｎ」＝核。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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