(57)【要約】   本願発明は、損傷を受けた器官および／または組織の修復のための有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞の使用を対象とする。幹細胞を、有糸分裂的および／または致死的に不活性化し、および損傷を受けた組織内に移植する。幹細胞が、生体内での適用前に有糸分裂または細胞分裂を受けることができないように、幹細胞の生体外での不活性化の任意の形態を使用してもよい。有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹を、数々の疾病、傷害および／または様々なタイプの器官および／または組織における変性の状態を改善するために使用してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を有糸分裂的および／または致死的に不活性化する工程；および
有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞を組織に移植する工程
を含むことを特徴とする組織を修復するための方法。
【請求項２】
前記幹細胞が多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、胚、胎盤、または羊水から分離され、または任意の組織または細胞株から生み出されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が、胚幹細胞の無限増殖を抑制するために有効な方法を使用して不活性化されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞が、照射またはマイトマイシンＣ、光線療法、または細胞増殖を抑制する任意の剤を用いて不活性化されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
修復される前記組織が、心組織、神経組織、筋組織、膵組織、上皮組織、造血組織、肝組織、または身体中の任意の組織または器官からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞が、奇形腫を形成しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。 
【請求項８】
多能性幹細胞を提供する工程；および
該多能性幹細胞を、多能性幹細胞の無限増殖を抑制するために有効な、および臍帯血のような成体幹細胞を不活性化するために有効な方法を用いて不活性化して、受容者におけるそれらの増殖または存続を防止する工程
を含むことを特徴とする幹細胞を有糸分裂的および／または致死的に不活性化する方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が、胚、胎盤、または羊水から分離され、および成体幹細胞が、任意の成体の器官から、臍帯血または胎盤から分離され、ここで、成体幹細胞が、多能性幹細胞を生み出すために利用されてもよいことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、最高で該細胞に対する致死的な損傷に至るまで、照射またはマイトマイシンＣ、または細胞増殖を抑制するために有効な任意の剤または技術を用いて不活性化されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞を提供する工程；および
該多能性幹細胞を、該多能性幹細胞の無限増殖を抑制するために有効な方法を用いて不活性化する工程
を含む方法によって生成されることを特徴とする有糸分裂的に不活性化された幹細胞。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞が、胚、胎盤、または羊水から、または成体幹細胞から分離されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記胚幹細胞が、照射、マイトマイシンＣ、光線療法、またはタンパク質合成、微小管機能、紡錘体チェックポイント単位、細胞周期特異性キナーゼ、サイクリン、および／またはアポトーシス誘導剤のようなしかしこれらに限定されない有糸分裂に必要な細胞成分の抑制剤を含むがしかしこれらに限定されない細胞増殖を抑制する任意の剤を用いて不活性化されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によって本明細書に組み込まれる２００６年７月２０日に出願された米国仮出願番号６０／８０７，８６１の３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づく利益を請求する。
【０００２】
本願発明は、損傷を受けた器官および／または組織の修復のための、有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞の使用を対象とする。生体内での適用の前または後に幹細胞が望ましくない有糸分裂または細胞分裂を受ける可能性がないように、幹細胞の生体外での不活性化の任意の形態を使用してもよい。有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹を、様々なタイプの器官および／または組織における数々の疾病、傷害および／または変性の状態を改善するために使用してもよい。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞、特にＥＳＣは、多能性に起因して、組織を修復または回復させるために研究されている。しかしながら、ＥＳＣは、その多能性（pleuripotential）（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔとも綴る）の性質のために、生体内に注入された場合に、奇形腫、すなわち、機能不全性の癌性腫瘍の増殖を形成する。奇形腫は、全３つの胚生殖層：中胚葉、内胚葉および外胚葉からの細胞から成る。
【０００４】
奇形腫の発生を回避するために、移植に現在使用されるＥＳＣは、系統に委任した（committed）成体幹細胞の表現型および／または完全に分化した細胞に、生体外で分化されなければならない。このプロセスは時間がかかり、長期間にわたる適正製造手順（Good Manufacturing Procedures：ＧＭＰ）の維持、および残留する多能性ＥＳＣからの汚染がないことを保証するために最終生成物を精製する方法、および所望の細胞同一性およびロット間同等性を保証するための方法を必要とする。ＥＳＣに由来する細胞は、生体外で増殖され、およびＧＭＰの指針を満たすように、支持細胞（feeder）のない、および規定された培地条件に維持されなければならない。
【０００５】
細胞培養技術の最近の進歩は、未分化ＥＳＣの維持および展開（expansion）のためのＧＭＰの要件を満たしている。しかしながら、奇形腫形成を回避するために、ＥＳＣは、生体内での適用に先立って、費用がかかりおよび労力を要する成熟体細胞への分化を受けなければならない。加えて、これらの体細胞は、残留する奇形腫形成性のＥＳＣまたは他の未分化のまたは分化した汚染性細胞による汚染を回避するために、精製または選択を受けなければならない。
【０００６】
ＥＳＣ技術のさらなる進歩は、ヒトＥＳＣの使用を取り巻く政治上の制約および倫理的な問題に起因して、抑止されてきた。多数の人にとっての関心事は、医療措置におけるヒトＥＳＣの使用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＥＳＣを取り巻く倫理的な問題にもかかわらず、現行の方法によって生成された移植ＥＳＣを受けた患者は、ＥＳＣに由来する体細胞の拒絶反応を防止するために、一生涯の免疫抑制を必要とする可能性がある。免疫抑制を、免疫抑制剤の使用によって成し遂げてもよい。免疫抑制剤は、身体の免疫系を抑制することができる薬物群である。また、この範疇に含まれる剤の多くは、細胞傷害性（細胞毒）であり、および癌の治療に使用される。免疫抑制剤として使用される細胞傷害性剤は、代謝拮抗物質（アザチオプリン）、アルキル化剤（シクロフォスファミド）、および葉酸拮抗剤（メトトレキサートまたは６−ＭＰ）を含む。他の免疫抑制剤は、ミコフェノレート（セルセプト（CellCept））およびシクロスポリンを含む。これらの薬物をＥＳＣ移植患者に使用して、異物（例えば、移植されたＥＳＣ）に対する身体自体の自然防御機構を低減させ、およびそれによって、身体によるＥＳＣ拒絶反応を防止しようと試みてもよい。
【０００８】
免疫系の抑制は、胃の不調、悪心、嘔吐、腹痛、口腔内潰瘍、濃色尿、白色便、黄疸（皮膚または白目部分の黄変）、異常な出血またはあざのような多くの望ましくない副作用を患者に引き起こす可能性がある。深刻な（および生命を脅かす）副作用は、骨髄の活性低減であり、これは、定期的な血液検査により監視される。免疫抑制剤を服用する患者は、これらの薬物を開始した後数ヶ月に、膵炎（膵臓の炎症）を発症することもある。
【０００９】
加えて、免疫抑制療法を受ける患者は、細菌感染、ヘルペス感染（例えば、口唇ヘルペスおよび帯状疱疹）、サイトメガロウィルス、真菌感染、およびニューモシスティス・カリニ（肺感染）を含む様々な感染の危険性がより高い。患者は、感染の危険性が高いので、感染の任意の兆候または症状を検査するために、日常的な評価を受ける必要がある可能性がある。病気を防止するために、患者は、アシクロビル、シトベン、およびバラシクロベンのような抗ウィルス薬；フルコナゾールおよびボリコナゾールのような抗真菌薬；およびバクトリム（Bactrim）のような抗生物質を服用する必要がある可能性がある。
【００１０】
免疫抑制剤療法を受ける患者は、おそらく、日課に実質的な変化を経験するであろう。患者は、感染の危険をもたらす人々および活動を回避することに気を配らなければならない。
【００１１】
患者は、いずれの日においても彼らが接触する個人の数の制限を受け、および混雑した閉鎖された領域を回避する必要がある可能性がある。患者は、学齢児童を含む病気であった友人および家族との接触を回避しなければならない。もし患者の近親の一員が病気であるならば、患者は、該家族の一員がもはや病気でなくなるまで、別の部屋に滞在するか、またはホテルに滞在することが必要とされる可能性がある。また、患者は、生ウィルスの経口ポリオワクチンの接種を直近に受けた幼児および子供との接触を、少なくとも８週間の間、回避しなければならない。ワクチンの被接種者は、唾液および便のような身体排泄物中にウィルスを排出し、および免疫抑制された個人を感染させる可能性がある。患者は、レストラン、教会または寺、小売店、および公共輸送機関のような混雑した場所を回避することが必要とされる可能性がある。
【００１２】
また、患者は、感染の高い危険性を有する特定の活動を行い、またはこれに従事することを制限される。これらの活動は、幼児のオムツを交換すること、ペットと交流すること、および園芸を含む可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明は、幹細胞を有糸分裂的に不活性化する工程および／または致死的に不活性化する工程、および有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞を損傷を受けた組織内に移植する工程によって、損傷を受けた組織を修復するための方法を対象とする。移植された有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞は、損傷を受けた細胞の再生のために有効である。損傷を受けた組織内への有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞の移植は、被移植者における異物（foreign）幹細胞の恒久的な存在に依存せず、および生涯の移植を可能にするために被移植者の免疫系を抑制する必要がない。その上、多能性幹細胞に関して、有糸分裂の不活性化は、奇形腫の形成を防止する。身体内のすべての器官および／または組織は、心組織、神経組織、筋組織、膵組織および肝組織を含むがしかしこれらに限定されない有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞を使用して修復されてもよい。該方法は、哺乳類、霊長類およびヒトを含む、動物におけるこれらの組織を修復するために有効である。
【００１４】
利用されてもよい幹細胞は、多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、成体幹細胞から生体外で誘導される胚（ＥＳＣ）、胎盤、羊水、骨髄、または多能性幹細胞のような、しかしこれらに限定されない、その生体内の起源に依存しない任意の幹細胞を含む。多能性幹細胞は、２以上の生殖系統または組織特異的細胞系統に分化することができる。
【００１５】
幹細胞は、幹細胞の無限増殖を抑制または防止するために有効な方法で幹細胞を処理することによって、有糸分裂的および／または致死的に不活性化される。この態様において、胚幹細胞は、照射、マイトマイシンＣ、光線療法、または無制御または無限の細胞増殖の終了または防止を可能にするであろう遺伝子、タンパク質、および／または細胞操作の任意の手段と同様に、タンパク質合成、微小管機能、紡錘体チェックポイント単位、細胞周期特異性キナーゼ、サイクリン、および／またはアポトーシス誘導剤のような、しかしこれらに限定されない、有糸分裂に必要な細胞成分の抑制剤を含むが、しかしこれらに限定されない、細胞増殖を抑制する任意の剤で不活性化される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（Ａ）は、実施例１の結果 （本明細書中に後述する）のグラフ表示であって、ＥＳＣ治療を受けた虚血性の心臓を有するマウスの血圧中央値（ｍｍＨｇ）を、治療を受けていない虚血性の心臓を有するマウスの血圧中央値（ｍｍＨｇ）と比較する図であり、図１（Ｂ）は、実施例１の結果 （本明細書中に後述する）の グラフ表示であって、ＥＳＣ治療を受けた虚血性の心臓を有するマウスの収縮性中央値（ｍｍＨｇ／ｓ）を、治療を受けていない虚血性の心臓を有するマウスの収縮性中央値（ｍｍＨｇ／ｓ）と比較する図であり、図１（Ｃ）は、実施例１の結果 （本明細書中に後述する）の グラフ表示であって、ＥＳＣ治療を受けた虚血性の心臓を有するマウスの弛緩中央値（ｍｍＨｇ）を、治療を受けていない虚血性の心臓を有するマウスの弛緩中央値（ｍｍＨｇ）を比較する図である。
【図２】有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣ治療の糖尿病に及ぼす効果を明示する図である。
【図３】様々な線量の全身照射の後の生存率（％）を示す図である。
【図４】ＴＢＩ（total body irradiation）に曝露しおよび次いで有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣを注入した哺乳類と比較した、対照（ＴＢＩに曝露した）における全身照射 (ＴＢＩ) 実験に関する生存率曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上に取り上げた上述および他の問題は、以下に論じられる好ましい実施形態によって解決される。次の説明は、本発明を実施するために現在熟考されるベストモードのものである。この説明は、限定する意味に解釈されるべきではなく、しかし、単に、本発明の一般原理を説明する目的で記載されたものである。
【００１８】
本発明は、有利にも、幹の分化および体細胞の精製の、費用のかかる工程を排除する。なぜならば、同種異系の（他人からの）組織特異的成体幹細胞または多能性幹細胞すなわちＥＳＣ（同様に同種異系）のどちらかである有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞、または同種異系の羊水から誘導される多能性幹細胞（または任意の源からの多能性幹細胞）は、内因性（endogenous）組織に対して、免疫抑制の必要または望ましくない奇形腫形成（有糸分裂的に不活性化されていないＥＳＣは、奇形腫を形成する）なしに、一時的な生体内シャペロンアシストを提供することができるからである。本明細書中で使用される際に、奇形腫を形成しないとは、無制御な増殖およびその結果生じる合併症の防止を意味する。不活性化された幹細胞は、無制限の細胞分裂を受けることができず、およびしたがって、奇形腫を形成しない。その上、幹細胞のシャペロン効果は、たとえ一時的にしか存在しないとしても、有効であるので、患者における長期にわたる（すなわち生涯の) 免疫抑制は、必ずしも、有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞を用いる治療の要件ではない。免疫抑制療法を回避することは、患者の快適性および生活の質を大幅に改善する。
【００１９】
本発明の別の態様は、胚幹細胞に関して本明細書中に初めて明示されるように、ＥＳＣは、内因性組織の再生に介在する顕著なシャペロン効果または生体内のｃｅｌｌ−ｈｅｌｐ−ｃｅｌｌ効果を生み出す。このシャペロンまたはｃｅｌｌ−ｈｅｌｐ−ｃｅｌｌ効果は、生体内に提供される。ＥＳＣが介在するシャペロン効果は、一時的であり、およびホスト免疫系による同種異系ＥＳＣの拒絶反応は、ＥＳＣの有効性を損なわない。
【００２０】
１つの実施形態において、このシャペロン効果は、異種バリアを越えて生じることができ、組織再生のためのヒトＥＳＣを動物のＥＳＣで代替することを可能にし、これは、倫理的な問題およびＥＳＣ療法に関する制約を緩和するであろう。別の実施形態において、このシャペロン効果は、成体幹細胞から、または羊水または胎盤または倫理的な問題を緩和するであろう他の源に由来する多能性幹細胞から得ることができる可能性がある。
【００２１】
幹細胞
幹細胞は、複製によって、自己再生および成熟した特異性細胞への分化の両方の可能性を有する未分化細胞である。大まかに、２つのタイプの幹細胞、すなわち胚幹細胞（ＥＳＣ）および成体幹細胞（ＡＳＣ）がある。ヒトＥＳＣは、伝統的に、５０から１５０個の細胞の受精後４から５日目の胚盤胞から分離される。ＥＳＣは、ヒト身体におけるあらゆる特異性細胞を生み出し；および無制限の生体外増殖が可能である一方で、生体内に一時的に（胚形成の間）しか存在しない。ＡＳＣは、身体の全体にわたる組織中に位置し、および損傷を受けまたは老化した細胞を置き換えるためのリザーバーとして機能する。ＡＳＣは、それらがその中に位置する器官系の細胞系統への分化が制限される。また、幹細胞は、分化全能性、多能性、多分化能性、分化単能性とも呼ばれる。分化全能性（Totipotent）の幹細胞は、桑実胚から生じ、および胎盤栄養膜を含む身体に必須の全ての細胞を形成することができる。胚発生の次の段階において、桑実胚は、胚盤胞になる。多能性幹細胞は、伝統的に、胚盤胞の発達段階から生じ、および身体中のあらゆる細胞を生じさせるが、しかし胎盤栄養膜は生じさせない。また、多能性幹細胞は、羊水から回収されており、および胎盤のような他の源から、またはＡＳＣのマニピュレーションから、見出されまたは生み出されてもよい。ＡＳＣは、それらの分化が、それらがその中に位置する組織系統またはコンパートメントに限定される点において、多分化能性の幹細胞である。分化単能性の幹細胞は、一時的な増幅性細胞とも呼ばれ、単一の特異性細胞に分化を制限される。
【００２２】
ＥＳＣは、極めて有望でありおよび多用途性を有するが、しかし、ＡＳＣと比較して、身体内のあらゆるタイプの組織、すなわち奇形腫を形成する傾向に起因して、現行では、制御することが困難である。対照的に、ＡＳＣは、通常は、腫瘍の形成なしにうまく機能し、および伝統的な系統特異性の分化パターンに従い、通常の代謝回転、すなわち老化したまたは損傷を受けた組織を置き換えるそれらの生理学的相同機能を発揮する。
【００２３】
本明細書において、本発明者は、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣが、内因性組織修復に強いシャペロン効果を及ぼし、および奇形腫を形成しないことを明示する。本発明者は、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣに関してこの効果を明示する一方で、他の多能性幹細胞の有糸分裂の不活性化、および有糸分裂的に不活性化された臍帯血のような成体幹細胞でさえも、より小さい効果ではあるが、遺伝子学的に異なる被移植者における同種異系の細胞の無制限の増殖を考えずに、同様の効果をもたらす可能性があることを主張する。
【００２４】
多能性幹細胞を、最初は、胚、胎盤、羊水を含む数々の源から、成体幹細胞のマニピュレーションから、および細胞を培養液中で増殖した様々な商業的源から得てもよい。
【００２５】
有糸分裂のおよび／または致死的な不活性化
幹細胞は、幹細胞の無限増殖を抑制するために有効な任意の方法で、有糸分裂的に不活性化されてもよい。無限増殖の抑制とは、幹細胞が、無制御な増殖から生体内に合併症を示さないことを意味する。
【００２６】
ＥＳＣのような幹細胞は、放射線、マイトマイシン光線療法、またはタンパク質合成、微小管機能、紡錘体チェックポイント単位、細胞周期特異性キナーゼ、サイクリン、および／またはアポトーシス誘導剤のような、しかしこれらに限定されない、有糸分裂に必要な細胞成分の抑制剤を含むが、しかしこれらに限定されない、細胞増殖を抑制する任意の剤を用いて、有糸分裂的に不活性化されてもよい。また、幹細胞は、望ましくない増殖およびまたは分化を終了させまたは防止する、タンパク質または遺伝子または細胞のマニピュレーションの任意の手段によって、有糸分裂的に不活性化されてもよい。この方法は、幹細胞が生体内で有糸分裂または細胞分裂を受ける可能性が無いように、幹細胞の生体外での不活性化の任意の形態に適用される。本発明者は、ＥＳＣが、１０から４０Ｇｙの広範囲の放射線線量に対する曝露後に、組織修復のシャペロン効果を提供することを示している。
【００２７】
別の態様において、幹細胞は、致死的に不活性化されてもよい。致死的に不活性化されるとは、放射線またはアポトーシス誘導剤の投与が、ＥＳＣが分裂を中止するのみではなく、しかし、注入の数時間、数日または数週間以内に死ぬほどであることを意味する。
【００２８】
幹細胞の移植
本明細書に開示される発明は、損傷を受けた器官および／または組織の修復のために、有糸分裂的に不活性化されたおよび／または致死的に不活性化された幹細胞を利用する。１つの実施形態に従って、有糸分裂的および／または致死的に不活性化されたＥＳＣのような幹細胞を、患者の損傷を受けた組織の部位に、または静脈内的に、または脳脊髄液のような周囲流体中に、移植しまたは注入する。これは、有糸分裂的に不活性化された幹細胞を、身体中に、単一または繰り返しの間隔でおよび全投与量で投与または供給する全ての経路を網羅する。
【００２９】
治療
本明細書中に記載される方法は、傷害、疾病の状態、または老化によってもたらされる自然の変性の状態の任意のタイプに関する、全ての様々なタイプの器官および／または組織に適用される。実際上、任意の器官を、有糸分裂的および／または致死的に不活性化されたＥＳＣのような幹細胞で修復することができる。例えば、有糸分裂的に不活性化された幹細胞の移植によって修復することができる器官および／または組織のタイプは、（１）虚血性または外傷性傷害後の心臓または心組織、（２）脳卒中または脳血管発作後の脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の維持（preservation）、（３）多発性硬化症のような脱髄性ＣＮＳ疾病におけるオリゴデンドロサイトの修復、（４）パーキンソン病、ハンチントン病およびアルツハイマー病のような変性ＣＮＳ疾病の軸索の修復、（５）銃で撃たれた後のまたは爆発性の傷害のような外傷後の急速な創傷治癒、（６）再神経支配／再ミエリン化のための脊髄損傷（ＳＣＩ）の修復、（７）テロ攻撃に付随する偶発的な曝露から、または医学療法として使用される放射線誘発性の傷害からの回復のためのいずれかの、放射線傷害に続く組織のアポトーシスおよび損傷の防止、（８）Ｉ型およびＩＩ型糖尿病のための島細胞の再生、（９）肺気腫を有する患者の肺組織、（１０）変性または炎症性の関節疾病における軟骨修復、（１１）急性尿細管傷害（ＡＴＮ）後の虚血性の腎上皮の再生、（１２）慢性的または急性的に虚血性の組織への血管供給の再生、および（１３）中毒性および／または放射線誘発性の組織傷害の修復を含むが、しかしこれらに限定されない。
【００３０】
理論によって限定されることを望むものではないが、未分化ＥＳＣは、体液性のまたはパラクリンのメディエータ、および／または 細胞性因子、またはＡＳＣまたは体細胞の増殖、成長、および再生に介在することができる、細胞接触を通して介在する因子によって、シャペロン（ｃｅｌｌ−ｈｅｌｐ−ｃｅｌｌ）効果を提供することが仮説立てられ、これは、一時的にのみ必要とされ、および致死的に不活性化されたＥＳＣまたは有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣのどちらかによって提供され得る。この効果は、ＥＳＣの免疫受容またはＥＳＣに由来する委任または分化細胞後代の確立に依存しない。
【００３１】
本方法は、有利に、単純および実際的である。それは、遺伝子療法に関与するＥＳＣの分化、またはＥＳＣに由来する体細胞のサイトカイン／培地を対象とする生体外分化および大規模な精製を回避する。未分化ＥＳＣは、有糸分裂的に不活性化されていないＥＳＣからの奇形腫形成の望ましくない副作用なしに、器官特異的再生を増大させるために直接的に使用されることができる。これは、時間、努力、費用、および規制遵守の問題の著しい救済となる。 
その上、患者における免疫寛容は、必要とされない。ＥＳＣ由来または多能性幹細胞由来の、または成体の同種異系の幹細胞由来の体細胞は、異物であり、および受容者（recipient）が生涯の免疫抑制を受けない限りは、彼／彼女によって拒絶される可能性がある。本明細書中に記載される方法は、免疫抑制を必要としない。有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣのパラクリンまたはシャペロン効果は、一時的であり、およびＥＳＣの免疫介在性の拒絶またはアポトーシスは、予期される。 
倫理的な見地から、ヒト由来のＥＳＣに加えて、異種の有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣは、哺乳類における疾病および傷害を治療するために有効である。ヒトＥＳＣは、ある特定の用途に関しては優れているかもしれないが、けれども、別の種からの有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣの使用は、ヒトＥＳＣの調達および使用から生じる患者治療に関する任意の倫理的な問題を回避する。また、倫理的な見地から、胎盤または羊水のようなしかしこれらに限定されない非胚源に由来する、または成体幹細胞に由来する、有糸分裂的に不活性化された多能性幹細胞は、おそらくより小さくはあるが、同一または類似の効果で使用される。
【００３２】
哺乳類の任意のタイプは、有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹細胞で治療されてもよい。治療されてもよい哺乳類の例は、マウスおよびラットのようなげっ歯類、ブタ、猫科の動物、犬、および例えばヒトおよびチンパンジーを含む霊長類を含むが、しかしこれらに限定されない。胚および多能性幹細胞は、一貫して維持される進化論的なテーマであるので、哺乳類の任意のタイプは、同様に、例えば、マウスおよびラットのようなげっ歯類、ブタ、猫科の動物、犬および例えばヒトおよびチンパンジーを含む霊長類のような、幹細胞のドナーである。
【００３３】
有糸分裂的および／または致死的に不活性化された幹を使用することができる広範な用途がある。用途は、疾病、外傷、虚血、老化、変性、または有毒物質への曝露によって損傷を受けた任意の器官系における使用に利用可能である。有利に、用途の多くは、単一の在庫製品からもたらされることができる。有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣは、個体間の免疫学的な差異から独立した任意の疾病性または外傷性または虚血性の器官に使用することができる普遍的な生成物であるので、それらを、市販の在庫製品から容易に入手することができる。 
【実施例】
【００３４】
本実施形態およびその多くの利点のよりよい理解を、例証であることを前提に、以下の実施例で明らかにすることができる。
【００３５】
実施例１：心虚血
虚血／再かん流モデルとして、マウスの照射（２０Ｇｙから３０Ｇｙ）ＥＳＣを、虚血性のマウスの心筋中に、冠動脈クランプ法を使用して注入した。照射ＥＳＣを受けたマウスを、非照射ＥＳＣを受けたマウスおよびＥＳＣを受けていないマウスと比較した。
【００３６】
非照射ＥＳＣおよび有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣを受けた梗塞を有するマウスは、ＥＳＣを受けていないマウスと比較して、心臓の弛緩および収縮性に関して、顕著な改善を示した。
【００３７】
未処理ＥＳＣは、いくつかの被験心臓において悪性の急速に増殖する奇形腫を生じさせたが、一方、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣを受けた動物の心臓または任意の他の器官において、残留ＥＳＣは見出されなかった。
【００３８】
材料、方法、および結果は、本明細書中、以下に従う。
【００３９】
マウス
雌１２９Ｘ１／ＳｖＪマウスを、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、メイン州バーハーバー）から購入し、および上部にフィルターの付いたケージ中で水および餌にアクセス容易なバリア条件下で飼育した。全ての動物実験は、ノースウエスタン大学の研究機関における動物の管理および使用に関する委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認された。
【００４０】
胚幹細胞
１２９／ＳｖＪＸ１２９／ＳＶ−ＣＰ雄Ｆ１ハイブリッド３．５日マウス（Ｈ−２ｂ）胚盤胞由来の胚幹細胞株のような様々な動物のＥＳＣ株またはヒトＥＳＷＣ株ＷＡ０９を利用してもよい。ヒトＥＳＣを、商業的に（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、ＮＩＨ承認細胞株ＷＡ０９として入手した。維持培地におけるＥＳＣ培養は、数々の公知の方法で行ってもよく、およびこの方法の成功のための唯一のものではない。マウスのＥＳＣに関して、胚幹細胞を未分化状態に維持するために、細胞を、ゼラチンで覆った組織培養皿上で、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｘの非必須アミノ酸、１ｘのピルビン酸ナトリウムおよび１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ、ニュージャージー州フィリップスバーグ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、バンクーバー）が補充された高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。マイトマイシンＣ処理された初代胎児線維芽細胞（embryonic fibroblasts）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｒ１ＥＳＣの長期にわたる培養のための支持細胞層として使用した。胚幹細胞を、ゼラチンで被覆されたプラスチック皿中で、注入のために回収する前の最後の２回の継代にわたって、ＰＭＥＦなしで培養した。
【００４１】
ＥＳＣの有糸分裂の不活性化および細胞増殖の分析
ＥＳＣを、上述の培養条件下で７０％のコンフルエンスまで増殖させ、次いで、回収し、および注入の１日前にガンマセル４０照射器（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ４０  ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ）を使用して３０Ｇｙを用いて照射した。照射（２０から３０Ｇｙ）および非照射ＥＳＣを、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを使用して、増殖率に関して分析した。細胞を、２ｍＬの全容量で、ＭＥＳＣ培地中、ＬＩＦおよび１０μＬ／ｍＬのＢｒｄＵの存在下で培養した。２４または４８時間後に、細胞を採取し、およびＢｒｄＵフローキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ)を用いて製造者のプロトコルに従って処理した。細胞を、ＦＩＴＣアンチＢｒｄＵおよび７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）を用いて染色した。フローサイトメトリ−のデータを、Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメータを使用して取得して、およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【００４２】
冠動脈結索
麻酔されたマウスを、仰臥位に配置し、足を手術台にテープ付けした。舌は、わずかに後退していた。２つの２４インチの可撓性の光ファイバーのアームを備えるＡ１５０−Ｗハロゲン光源（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フロリダ州サラソータ）は、声帯直下の気管の透光（transillumination）を可能にして、気管内挿管のための気管の可視化を提供する。カテーテルを、喉頭の中を通しおよび気管中へ挿入した。げっ歯類人工呼吸器によって、換気を提供した。胸骨の左側に沿って、胸骨のおよそ中間まで肋骨を切り開いて、開胸した。５−０または６−０の絹またはモノフィラメント縫合糸の使用によって、胸壁をリトラクトした。左主冠動脈系全体を露出して、左心耳をわずかにリトラクトした。７−０の絹縫合糸を用いて進めた結索は、丸針（tapered needle）を使用して、左冠動脈の左前下行枝の下部、正常位置にある左心耳の先端から１−３ｍｍを通した。１ｍｍ断面（section）のＰＥ−１０チューブを血管（vessel）の上部に配置し、およびチューブの上部に結び目を作って、冠動脈を閉塞させた。６０分間にわたる閉塞後、ＰＥ−１０チューブの上部の結び目を切断することによって、再かん流が生じた。動脈閉塞を解除する直前に、梗塞部位の境界において、虚血性の心筋中に細胞を注入した。次いで、胸壁を閉じた。マウスを呼吸装置から取り除き、気管内の管を回収し、および２４時間に至る集中治療下で、マウスをヒートパッドによって保温しおよび鼻用円錐状マスク（nasal cone）を通して１００％酸素を与えた。機能性の研究および免疫組織化学を、冠動脈結索後３０日に行った。
【００４３】
血行動態の計測および梗塞サイズの測定
マウスを麻酔した。高忠実度のトランスデューサーを先端に付けた圧力−容積カテーテル（ＳＰＲ  ８３９、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国テキサス州ヒューストン）を３７℃の生理食塩水中でゼロ合わせした。右頸動脈を分離し、および止血鉗子を使用して、２つのひもを穏やかに後方に引っぱり、血管からの血流を遮断した。拍動流がもはや視認できないときに、遠位のひもの直下に小さな切開を設け、およびカテーテルを頸動脈の内側に配置し、および適切な位置に固定した。トランスデューサーを心臓の中に進め、そこで、収縮期圧に何ら変化を有さない拡張期圧波の急速なふれによって、その位置を確認した。マウスを、３０分間にわたって安定化させた。安定化後、３０秒のデータを収集した。弁が損傷を受けていないことを検証するために、データ収集の最後に、動脈圧の計測のため心臓からカテーテルを除去した。次いで、カテーテルを、マウスから除去した。データ変換シリーズのアナログ・デジタル変換器の使用によって、信号を２値化し、および、次いで、Ｍｉｌｌａｒ  ＰＶＡＮデータ取得および解析システム上で、保存および分析した。圧力トレースから導出される値を、２０ベア（bears）以上、平均化した。心室機能評価の後、心臓を回収し、および１０％パラホルムアルデヒド中に固定した。全ての心臓を４つのブロックに切断し、および平坦な面を下にしてパラフィン包埋した。心臓の連続切片を、ミクロトームを用いて５μｍ厚で切り取った。
【００４４】
組織構造
梗塞サイズをＨＥ染色によって評価した。梗塞面積を画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ）を用いる面積測定法（planimetry）によって測定した。各心臓の４つのブロックの全ての切片を評価した。梗塞サイズを、各心臓の４つのブロックに関して左心室の平均百分率として表現した。同様に、ＨＥ染色されたスライドを使用して、心筋細胞の形態、浸潤の存否、および／または心筋内における腫瘍増殖を分析した。
【００４５】
ＦＩＳＨ分析
シングルラベル（Ｙ染色体全体）のＦＩＳＨ分析を、製造者のプロトコル（Ｃａｍｂｉｏ  Ｌｔｄ、英国ケンブリッジ）に従って行った。パラフィン包埋された心臓ブロック全体からの連続切片を切り取り（４μｍ厚）、および組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用する手順に備えた。ＴＭＡは、１つのスライド上に、陽性および陰性の対照を含む全ての組織標本の組合せを可能にした。被覆スライド上の組織切片を、脱ろうし、水で戻し、チオシアン酸ナトリウム溶液およびペプシンで処理し、固定しおよび脱水した。空気乾燥後、１５〜２０μｌの変性ヌクレオチドプローブを、各スライドに加え、カバースリップによって被覆し、および密封した。３７℃での夜通しのハイブリダイゼーションの後、カバースリップを除去し、および連続的な洗浄を行った。細胞核をＤＡＰＩで対比染色した。適切なフィルターシステムを備えた蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸ−４１）によって、スライドを観察した。
【００４６】
結果
非照射ＥＳＣを受けた梗塞を有するマウス（非照射ＥＳＣ−Ｎ）、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣを受けたマウス（照射ＥＳＣ−Ｉ）、およびＥＳＣ注入されていない梗塞になっているマウス（対照−Ｃ）間の収縮性の実測値を、第１表に示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
非照射ＥＳＣを受けた梗塞を有するマウス（非照射ＥＳＣ−Ｎ）、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣを受けたマウス（照射ＥＳＣ−Ｉ）、およびＥＳＣ 注入されていない梗塞になっているマウス（対照−Ｃ）間の収縮性の平均値および中央値の分析を、第２表に示す。重要なことには、心臓の弛緩および収縮性に関して、照射および非照射ＥＳＣの間に差異はなかったが、しかし、ＥＳＣを受けていないマウスと比較した場合に、両者には顕著な改善があった。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
【表３】
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【００５１】
結論
非照射ＥＳＣおよび有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣを受けた梗塞を有するマウスは、心臓の弛緩および収縮性に関して、ＥＳＣを受けていないマウスと比較して、顕著な改善を示した 。未処理ＥＳＣは、いくつかの被験心臓において、悪性の急速に増殖する奇形腫を生じさせたが、一方、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣを受けた動物の心臓または任意の他の器官中において、残留ＥＳＣは見出せなかった。
【００５２】
実施例２：糖尿病
Ｉ型およびＩＩ型糖尿病は共に、身体の必要量に不十分なインスリンに起因する。Ｉ型糖尿病において、β島細胞の消失は、比較的急速であり、およびインスリン生成の減少を伴い深刻である。非肥満性糖尿病マウスは、約９０から１００日の日齢で、臨床の糖尿病を発症する。このプロセスは、インスリンを生成する島細胞の免疫介在性の破壊に起因する。本発明者らは、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣが、虚血性傷害に誘発される心筋の機能不全を修復することができることを前に明らかにした。本発明者らは、次に、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣが、ＮＯＤマウスにおける糖尿病を修復または防止することができるかどうかを測定した。材料、方法、および結果は、本明細書中、以下のとおりである。
【００５３】
マウス
週齢６週のＮＯＤ／Ｌｔｊマウスを、ジャクソン研究所から入手した。
【００５４】
胚幹細胞
様々な動物の胚盤胞由来の胚幹細胞株を利用してもよい。マウスの胚幹細胞を未分化状態に維持するために、細胞を、ゼラチンで覆った組織培養皿上で、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０.１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｘの非必須アミノ酸、１ｘのピルビン酸ナトリウムおよび１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ、ニュージャージー州フィリップスバーグ; ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、バンクーバー）が補充された高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。マイトマイシンＣ処理された初代胎児線維芽細胞（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を、Ｒ１ＥＳＣの長期にわたる培養のための支持細胞層として使用した。胚幹細胞を、ゼラチンで被覆されたプラスチック皿中で、ＰＭＥＦなしで、注入のために回収する前の最後の２回の継代にわたって培養した。
【００５５】
ＥＳＣの有糸分裂の不活性化および細胞増殖の分析
ＥＳＣを、上述の培養条件下で７０％のコンフルエンスまで増殖させ、次いで、回収し、および注入の１日前に、ガンマセル４０照射器を使用して３０Ｇｙを用いて照射した。照射（２０から３０Ｇｙ）および非照射ＥＳＣを、増殖率に関して、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを使用して分析した。細胞を、２ｍＬの全容量で、ＭＥＳＣ培地中、ＬＩＦおよび１０μｌ／ｍｌのＢｒｄＵの存在下で培養した。２４または４８時間後に、細胞を採取し、およびＢｒｄＵフローキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコルに従って処理した。細胞を、ＦＩＴＣアンチＢｒｄＵおよび７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）を用いて染色した。フローサイトメトリ−のデータを、Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメータを使用して取得し、およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【００５６】
ＥＳＣの移植
マウスを、対照グループと、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣ処理グループとに分けた。対照マウスは、診療行為を受けなかった。処理マウスは、３０グレイを用いて照射されおよびＰＢＳを用いて３回洗浄された５００万個のＥＳＣの治療行為（尾静脈注射）を受けた。照射ＥＳＣは、動物の寿命の７０日目に、２００μｌのＰＢＳ中で注入された。
【００５７】
血中グルコースの監視
１つの側面の尾静脈を２５Ｇの針を用いて穿刺することによって、末梢血の滴を得た。血中グルコースを、ＯｎｅＴｏｕｃｈ  ＳｔｒｉｐおよびＡｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｋｉｔを使用して測定した。測定は、第１の注入以後、週に２回行った。３００ｍｇ／ｍｌを超える血糖を、高血糖性とみなした。
【００５８】
結果
図２中に明示されるように、照射ＥＳＣを用いて治療された全てのＮＯＤマウスは、糖尿病の兆候なしに正常血糖性のままであったが、一方で、全ての対照（未治療の）マウスは、糖尿病を発症した。
【００５９】
照射ＥＳＣを用いて治療されたＮＯＤマウスに、奇形腫の臨床のまたは組織学的な兆候を発現するものはなかった。有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣのシャペロン（ｃｅｌｌ−ｈｅｌｐ−ｃｅｌｌ）効果は、有益な免疫介在性の効果と同様に、パラクリン、細胞融合、増殖因子、血管由来または抗アポトーシスの効果に起因する可能性がある。
【００６０】
実施例３：致死的な放射線傷害
全身照射の致死的な投与−図３に示されるように、様々な線量の全身照射（ＴＢＩ）の後に、ＳＪＬ／Ｊマウスの生存率を測定した。
【００６１】
８グレイの単一投与のＴＢＩにおいて、全てのマウスは、１２日で死亡した。次に、本発明者らは、８グレイのＴＢＩを用いてマウスを照射し、および、対照マウスはさらなる療法を受けなかった一方で、治療マウスは、ＴＢＩの後１日目に１回の注入、またはＴＢＩの後０、２および４日目に３回の注入のどちらかを受けた。照射され洗浄されたＥＳＣを、どちらかの静脈（尾静脈または後眼窩）に、注入当たり５００万個のＥＳＣで注入した。結果を図４に示す。
【００６２】
８グレイのＴＢＩのみを受けているマウスは全て死亡し、有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣ（注入に先立って３０Ｇｙの照射を用いて処理された）を受けているマウスのみが生存した。照射マウスは雌であり、および注入された有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣは雄であった。ｙ−染色体の循環の証拠書類はなかった。有糸分裂的に不活性化されたＥＳＣは、内因性の造血にシャペロン効果を提供し、および数日かけて注入された、より高用量の有糸分裂的に不活性化された細胞がより長い生存を与え、用量応答効果があるように見えた。奇形腫は生じなかったが、一方、照射マウスへの未処理ＥＳＣの注入は、一部のマウスにおいて、注入部位での奇形腫形成をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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