(57)【要約】  ヒトキマーゼが特異的部位においてヒトＳＬＰＩを切断すること、及びこの切断をキマーゼ活性の指標として用い得ることが、ここに見出される。本発明は、キマーゼ関連疾患の診断方法、又はＳＬＰＩ処理を測定することによりヒト被験体におけるキマーゼ関連疾患治療の有効性を評価する方法、並びに他の関連する方法及び組成物を提供する。
2009523423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ヒト被験体から生体試料を得る工程と、
ｂ．生体試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と、
ｃ．工程ｂ）で測定されたレベルを、対照である健常ヒト被験体中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルと比較する工程とを含んでなり、該対照と比較したヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルの増加が、ヒト被験体がキマーゼ関連疾患を有するか又はキマーゼ関連疾患の危険性が増大したことを示す、ヒト被験体におけるキマーゼ関連疾患の検出方法。
【請求項２】
生体試料が唾液である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キマーゼ関連疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、線維症、高血圧、心臓肥大症、心不全、関節リウマチ、糖尿病性腎症、嚢胞性線維症（cystic frosis）、ＣＯＰＤ、及び炎症性疾患から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩの切断レベルが、キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片対生体試料中に存在する完全長ＳＬＰＩの比として測定される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号３のアミノ酸配列から本質的に成る請求項４に記載の方法。
【請求項６】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号４のアミノ酸配列から本質的に成る請求項４に記載の方法。
【請求項７】
完全長ヒトＳＬＰＩが、配列番号２のアミノ酸配列から本質的に成る請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ａ．ヒト被験体から生体試料を得る工程と、
ｂ．生体試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と、
ｃ．工程ｂ）で測定されたレベルを、対照である処置前のヒト患者中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルと比較する工程とを含んでなり、該対照と比較したヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルの減少が、該患者におけるキマーゼ関連疾患に対する処置が有効であることを示す、ヒト患者におけるキマーゼ関連疾患に対する処置の有効性を評価する方法。
【請求項９】
生体試料が唾液である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キマーゼ関連疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、線維症、高血圧、心臓肥大症、心不全、関節リウマチ、糖尿病性腎症、嚢胞性線維症（cystic frosis）、ＣＯＰＤ、及び炎症性疾患から成る群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩの切断レベルが、キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片対生体試料中に存在する完全長ＳＬＰＩの比として測定される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号３のアミノ酸配列から本質的に成る請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号４のアミノ酸配列から本質的に成る請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
完全長ヒトＳＬＰＩが、配列番号２のアミノ酸配列から本質的に成る請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト患者におけるキマーゼ関連疾患に対する処置が、キマーゼの生物活性を低減する化合物を伴う請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
ａ．ヒトキマーゼをアッセイ混合物中でヒトＳＬＰＩと接触させる工程と、
ｂ．ヒトキマーゼがヒトＳＬＰＩを切断する条件下でアッセイ混合物をインキュベートする工程と、
ｃ．アッセイ混合物中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程とを含んでなる、ヒトキマーゼの生物活性の測定方法。
【請求項１７】
ヒトキマーゼが配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＳＬＰＩが配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルが、キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片対生体試料中に存在する完全長ＳＬＰＩの比として測定される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号３のアミノ酸配列から本質的に成る請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号４のアミノ酸配列から本質的に成る請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
該ヒトＳＬＰＩが単離されている請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
該ヒトＳＬＰＩが生体試料内に存在する請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
該ヒトキマーゼが単離されている請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
該ヒトキマーゼが生体試料内に存在する請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
ａ．試験化合物をアッセイ混合物中でヒトキマーゼ及びヒトＳＬＰＩと接触させる工程と、
ｂ．ヒトキマーゼがヒトＳＬＰＩを切断する条件下でアッセイ混合物をインキュベートする工程と、
ｃ．アッセイ混合物中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と
ｄ．工程ｃ）で検出されたレベルを対照から検出されたレベルと比較する工程とを含んでなり、試験化合物がアッセイ混合物から除かれる、ヒトキマーゼの生物学的活性を低減する化合物の同定方法。
【請求項２７】
ヒトキマーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトＳＬＰＩが、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルが、キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片対生体試料中に存在する完全長ＳＬＰＩの比として測定される請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号３のアミノ酸配列から本質的に成る請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片が、配列番号４のアミノ酸配列から本質的に成る請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
該ヒトＳＬＰＩが単離されている請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
該ヒトＳＬＰＩが生体試料内に存在する請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
該ヒトキマーゼが単離されている請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
該ヒトキマーゼが生体試料内に存在する請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
ａ．配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列から本質的に成るＳＬＰＩ断片に特異的に結合する抗体と、
ｂ．該ＳＬＰＩ断片の測定レベルをヒトキマーゼの生物活性と相関させるための説明書と含んでなるキット。
【請求項３７】
ａ．患者から生体試料を得る工程と、
ｂ．生体試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と、
ｃ．工程ｂ）で測定されたレベルを、対照である健常ヒト被験体中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルと比較する工程とを含んでなり、該対照と比較したヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルの増加が、患者がキマーゼ阻害剤を伴う処置に応答するより大きいチャンスを有することを示す、キマーゼ阻害剤を伴う処置に応答するより大きいチャンスを有する患者を区別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００６年１月１２日に出願された出願第６０／７５８，４００号に対する優先権を主張し、その出願の全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、キマーゼ活性の分析方法に関する。具体的には、本発明は、キマーゼ関連疾患の診断、又はＳＬＰＩ処理を測定することによるヒト被験体におけるキマーゼ関連疾患の処置の有効性の評価に関する。
【背景技術】
【０００３】
分泌型白血球タンパク質分解酵素阻害剤（Secretory Leukocyte Protease Inhibitor）（ＳＬＰＩ）は、最初に、エラスターゼ及びカテプシンＧに対する１１．７ｋＤ阻害剤として発見された（非特許文献１）。ＳＬＰＩは肥満細胞で発現し（非特許文献２）、上気道の粘膜（非特許文献３）及び痰（非特許文献４）に存在する。鼻腔内（非特許文献５）、気管及び気管支（broncus）（非特許文献６；非特許文献７）、上顎洞（非特許文献３参照）、並びに細気管支上皮の杯細胞（非特許文献８）で大量のＳＬＰＩが測定されている。
【０００４】
ＳＬＰＩの結晶学的研究により、乳清酸性タンパク質様ファミリーのメンバーである分子が示された（非特許文献９）。これらのタンパク質は、４つのジスルフィドで結合したドメインを２つ有する。４つのジスルフィド結合及び各ドメインのらせん構造により、ＳＬＰＩは非常に安定なタンパク質になる。ウシ（非特許文献９参照）及びヒツジ（非特許文献１０）の肥満細胞プロテアーゼは、Ｌｅｕ７２−Ｍｅｔ７３でＳＬＰＩを切断することが示されている。他の文献では、ＳＬＰＩの低分子量処理産物が示されているが、この切断に応答し得る酵素は特定されていない（非特許文献１１）。ＳＬＰＩは、キマーゼの最も有効な阻害剤として記載された（非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００５】
キマーゼは、ペプチダーゼファミリーＳ１に属するキモトリプシンセリンプロテイナーゼである。それは肥満細胞並びに皮膚及び肺の小球白血球で発現し、細胞外マトリクスの分解、粘膜下腺分泌の調節、及び血管作用性ペプチドの産生において機能すると考えられている。肥満細胞が活性化した後、細胞外マトリクスに放出されると直ちに活性が最大である（非特許文献１４）。哺乳類キマーゼには２つの形態、α及びβが存在し、これらは種で異なり、異なる機能を有する。ヒト及びヒヒでは、α−キマーゼのみが発見されているが、一方、イヌ、ラット及びマウスは、α−及びβ−キマーゼの両方を有する（非特許文献１５）。
【０００６】
キマーゼの正確な病態生理学的役割は未だ決定されていないが、キマーゼは微小血管漏出、好中球蓄積、粘液分泌の刺激、及びサイトカインのモジュレーション等に関係するとされる。強力なキマーゼ選択的阻害剤は、喘息、肺炎症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肥満細胞介在疾患で示される場合がある。キマーゼは、心臓壁及び血管壁アンギオテンシンＩＩの創製に役割を果たし得るため、キマーゼ阻害剤は血管壁の外傷及び炎症（アテローム性動脈硬化症／再狭窄）、並びに心臓肥大症に対する抗高血圧治療に使用できる可能性がある。キマーゼは、心臓血管疾患治療法の標的である（非特許文献１６）。さらに、キマーゼは、また、関節リウマチ（非特許文献１７）、糖尿病性腎症（非特許文献１８）、及び炎症性疾患（非特許文献１９）のような疾患で重要な役割を果たすことが提案されている。
【０００７】
【非特許文献１】Thompson et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1986; 83: 6692-6
【非特許文献２】Westin et al., Biol Chem 1999; 380: 489-93
【非特許文献３】Fryksmark et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 1982; 91: 268-71
【非特許文献４】Kramps et al., J Histochem Cytochem 1981; 29: 712-9
【非特許文献５】Lee et al., Am Rev Respir Dis 1993; 147: 710-6
【非特許文献６】Kramps et al., Am Rev Respir Dis 1984; 129: 959-63
【非特許文献７】Mooren et al., J Histochem Cytochem 1982; 30: 1130-4
【非特許文献８】Willems et al., Am Rev Respir Dis 1989; 139: 1244-50
【非特許文献９】Grutter et al., Embo J 1988; 7: 345-51
【非特許文献１０】Pemberton et al., Biochim Biophys Acta 1998; 1379: 29-34
【非特許文献１１】Ota et al., Hum Reprod 2002; 17: 2517-22
【非特許文献１２】Walter et al., Arch Biochem Biophys 1996; 327: 81-8
【非特許文献１３】Fink et al., Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367: 567-71
【非特許文献１４】Takai et al., FEBS Lett 467: 141-144, 2000
【非特許文献１５】Dell'Italia et al., Curr Opin Cardiol 2003; 17: 374-379
【非特許文献１６】Doggrell et al., Can J Physiol Pharmacol. 2005 Feb; 83 (2): 123-30
【非特許文献１７】Kobayashi et al., Jpn J Pharmacol. 2002 Sep; 90 (1): 7-11
【非特許文献１８】Huang et al., J Am Soc Nephrol. 2003 Jul; 14 (7): 1738-47
【非特許文献１９】Muto et al., Idrugs. 2002; 12: 1141-50
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、キマーゼの生物活性を阻害するように設計された化合物は、多くの疾患領域において治療効果をもたらすことができる。選択的キマーゼ阻害剤が開発されており、例えば、ＴＹ−５１０７６、ＳＵＮ−Ｃ８２５７、ＢＣＥＡＢ、ＮＫ３２０及びＴＥＩ−Ｅ５４８（非特許文献１６参照）が包含される。心筋梗塞、心筋症、及び頻脈誘発性心不全の動物モデルにおいて、これらのキマーゼ阻害剤による有望な成果が得られている。ヒトにおけるキマーゼ阻害剤の試験、並びにヒトにおけるキマーゼ活性の研究全般を促進するため、ヒトにおけるキマーゼ阻害活性のためのバイオマーカーを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
ヒトキマーゼが特異的部位でヒトＳＬＰＩを切断すること、及びこの切断がキマーゼ活性の指標として使用され得ることが今回見出された。この切断は、トリプターゼ、カテプシンＧ、エラスターゼ及びプロテイナーゼ３を含む、ＳＬＰＩと相互作用することが知られている一連のプロテアーゼを試験した際、キマーゼに特異的である。
【００１０】
ある一般的態様では、本発明は、ａ）ヒト被験体から生体試料を得る工程と、ｂ）生体試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と、ｃ）工程ｂ）で測定されたレベルを、対照である健常ヒト被験体におけるヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルと比較する工程とを含み、該対照と比較したヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルの増加が、ヒト被験体がキマーゼ関連疾患を有するか又はキマーゼ関連疾患の危険性が増大したことを示す、ヒト被験体におけるキマーゼ関連疾患の検出方法を提供する。
【００１１】
別の一般的態様では、本発明は、ａ）ヒト被験体から生体試料を得る工程と、ｂ）生体試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と、ｃ）工程ｂ）で測定されたレベルを、対照である処置前のヒト被験体におけるヒトキマーゼによるヒトＳ
ＬＰＩ切断レベルと比較する工程とを含み、該対照と比較したヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルの減少が、該患者におけるキマーゼ関連疾患に対する処置が有効であることを示す、ヒト患者におけるキマーゼ関連疾患に対する処置の有効性を評価する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、また、ａ）ヒトキマーゼをアッセイ混合物中でヒトＳＬＰＩと接触させる工程と、ｂ）ヒトキマーゼがヒトＳＬＰＩを切断する条件下でアッセイ混合物をインキュベートする工程と、ｃ）アッセイ混合物中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程とを含む、ヒトキマーゼの生物活性の測定方法を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに、ａ）試験化合物をアッセイ混合物中でヒトキマーゼ及びヒトＳＬＰＩと接触させる工程と、ｂ）ヒトキマーゼがヒトＳＬＰＩを切断する条件下でアッセイ混合物をインキュベートする工程と、ｃ）アッセイ混合物中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と、ｄ）工程ｃ）で検出されたレベルを、対照から検出されたレベルと比較する工程とを含み、試験化合物が前記アッセイ混合物から除かれる、ヒトキマーゼの生物学的活性を低減する化合物の同定方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、また、本発明の方法に関連するキットを提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、ａ）患者から生体試料を得る工程と、ｂ）生体試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程と、ｃ）工程ｂ）で測定されたレベルを対照である健常ヒト被験体中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルと比較する工程とを含み、該対照と比較したヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルの増加が、患者がキマーゼ阻害剤を伴う処置に応答するより大きいチャンスを有することを示す、キマーゼ阻害剤を伴う処置に応答するより大きいチャンスを有する患者を区別する方法である。
【００１６】
本発明の他の態様、特徴及び利点は、本発明の詳細な記述及びその好ましい実施形態並びに添付の特許請求の範囲を含む、以下の開示から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な記述
本明細書で引用する全ての刊行物は、参照することにより組み入れられるものとする。特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１８】
本明細書で使用する時、「含む」、「含有する」、「有する」及び「包含する」は、これらのオープンで非限定的な意味で用いられる。
【００１９】
以下は、本明細書で時折使用される略語である。
ｂｐ＝塩基対
ｃＤＮＡ＝相補的ＤＮＡ
ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患
ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着アッセイ
ｋｂ＝キロベース；１０００塩基対
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＬＰＩ＝分泌型白血球タンパク質分解酵素阻害剤
【００２０】
本明細書で使用する時、「キマーゼの生物活性」という用語は、標準的な技術に従ってインビボ又はインビトロで測定する際のキマーゼにより発揮される活性を指す。キマーゼの代表的な生物活性としては、アンギオテンシンＩを血管作用性ペプチドであるアンギオテンシンＩＩに転換する能力、ビッグエンドセリン１を、３１アミノ酸長のペプチドであるエンドセリン１に選択的に転換する能力、細胞外マトリクスを分解する能力、幹細胞因子を切断して生理活性可溶性生成物を得る能力、プロコラゲナーゼ、炎症性サイトカイン、及び本明細書に記載されたＳＬＰＩを含む他の生物活性ペプチドを処理する能力等が包含されるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用する時、「生体試料」という用語は、被験体から単離された細胞又は生体液のような、細胞又は組織物質を含有する又はそれから成る試料を指す。「被験体」は、処置、観察又は実験の対象となっている、ラット、マウス、サル、又はヒトのような哺乳類であってよい。生体試料の例としては、例えば、痰、血液、血球（例えば、白血球）、羊水、血漿、精液、唾液、骨髄、組織又は細針生検試料、尿、腹水、胸水及び細胞培養物（cell cultures）が包含される。生体試料は、また、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を含んでもよい。試験生体試料は、分析、モニタリング、又は観察の対象となっている生体試料である。対照生体試料は、試験生体試料に対するポジティブ又はネガティブコントロールのいずれかであってよい。しばしば、対照生体試料は、試験生体試料のものと同種の興味のある組織、細胞及び／又は生体液を含有する。具体的な実施形態では、生体試料は「臨床試料」であり、これはヒト患者由来の試料である。
【００２２】
「細胞」は、検出方法の感度に対して適当な、少なくとも１つの細胞又は複数の細胞を指す。細胞は、培養された細胞培養物中に存在してよい。細胞は、また、生体組織又は生体液のような、その天然の環境に存在してもよい。本発明に好適な細胞は細菌細胞であってよいが、好ましくは真核細胞、最も好ましくは哺乳類細胞である。
【００２３】
本明細書で使用する時、「ヒトキマーゼ」は、本来ヒトから単離されたキマーゼを指す。キマーゼは、ペプチダーゼファミリーＳ１に属するキモトリプシンセリンプロテイナーゼである。キマーゼの同義語には、肥満細胞プロテアーゼＩ、骨格筋プロテアーゼ、皮膚キモトリプシンプロテイナーゼ；肥満細胞セリンプロテイナーゼ、キマーゼ、及び骨格筋（ＳＫ）プロテアーゼが包含される。優先されるキマーゼの切断は、Ｐｈｅ−｜−Ｘａａ＞Ｔｙｒ−｜−Ｘａａ＞Ｔｒｐ−｜−Ｘａａ＞Ｌｅｕ−｜−Ｘａａである。代表的な「ヒトキマーゼ」は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、これはジェンバンク（GenBank）タンパク質ＩＤ：ＮＰ＿００１８２７に示されている。本明細書で使用する時、「ヒトキマーゼ」は、配列番号１に示されたヒトキマーゼの構造的及び機能的多型を含む。「多型」とは、集団内の個体中で特定の遺伝子座における一連の遺伝的変異型を指す。
【００２４】
本明細書で使用する時、「キマーゼ関連疾患」又は「キマーゼ関連疾病」とは、キマーゼの過剰活性若しくは過剰発現に関連する疾患若しくは疾病、又はキマーゼの生物活性を低減することにより若しくは被験体中のキマーゼの量を低減することにより、処置若しくは改善し得る疾患若しくは疾病、及び被験体のかかる疾患若しくは疾病に付随する潜在的兆候若しくは状態を指す。代表的な「キマーゼ関連疾患」としては、喘息、アレルギー性鼻炎、線維症、高血圧、心臓肥大症、心不全、関節リウマチ、糖尿病性腎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び炎症性疾患が包含されるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用する時、「ヒトＳＬＰＩ」は、本来ヒトから単離された分泌型白血球ペプチダーゼ阻害剤を指す。ＳＬＰＩの同義語には、ＡＬＰ、ＭＰＩ、ＡＬＫ１、ＢＬＰＩ、ＨＵＳＩ、ＷＡＰ４、ＷＦＤＣ４及びＨＵＳＩ−Ｉが包含される。ＳＬＰＩは、セリンプロテアーゼから上皮組織を保護する。それは、精漿、頚管粘液及び気管支分泌物を含む
種々の分泌物中に見られ、トリプシン、白血球エラスターゼ及びカテプシンＧに対して親和性を有する。その阻害効果は、内因性タンパク質分解酵素による攻撃から上皮表面を保護することにより免疫反応の一因となり、タンパク質はまた広域性抗生物質活性を有すると考えられる。代表的な「ヒトＳＬＰＩ」は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、これはジェンバンク（GenBank）タンパク質ＩＤ：ＮＰ＿００３０５５に示されたタンパク質の成熟部分（mature portion）である。
【００２６】
本明細書で使用する時、「ヒトＳＬＰＩ」は、配列番号２に示されたヒトＳＬＰＩの構造的及び機能的多型を含む。「ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩの切断レベル」とは、ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断又はタンパク質分解の程度又は量を指す。本明細書で使用する時、「ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベル」は、試験生体試料又はアッセイ混合物中に存在する、キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片対完全長ＳＬＰＩの比として測定することができる。
【００２７】
「キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片」は、キマーゼによるＳＬＰＩのタンパク質分解又は切断により生成されるヒトＳＬＰＩの一部を指す。ヒトキマーゼは、本発明において、ヒトＳＬＰＩをＬｅｕ７２−Ｍｅｔ７３間で切断することが見出され、ここで数７２又は７３は、ヒトＳＬＰＩのアミノ末端から数えたアミノ酸残基の位置を指す。従って、代表的な「キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片」は、配列番号２のＳｅｒ１−Ｌｅｕ７２又はＭｅｔ７３−Ａｌａ１０７断片であることができ、それらは、それぞれ配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列から成る。本明細書で使用する時、「キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片」は、配列番号３又は配列番号４に示されたヒトＳＬＰＩ断片の構造的及び機能的多型を含む。
【００２８】
「ヌクレオチド配列」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のポリマー中のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド残基のいずれかの配置を指す。核酸配列は、それぞれＴ、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵと略される、塩基：チミジン、アデニン、シトシン、グアニン及びウラシルの天然ヌクレオチド、並びに／又は天然ヌクレオチドの合成類似体から構成されうる。
【００２９】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源中に存在する他の核酸分子の少なくとも１つから実質的に分離されたものであるか、又は核酸分子が化学的に合成される場合、化学的前駆体若しくは他の化学物質の少なくとも１つを実質的に含まない。「単離された」核酸分子は、また、例えば、核酸の由来する生物のゲノムＤＮＡ中の５’及び３’末端で核酸分子に元来隣接するヌクレオチド配列の少なくとも１つを実質的に含まない核酸分子であることができる。核酸分子は、約３０％、２０％、１０％又は５％（乾燥重量による）未満の他の核酸分子又は他の化学物質（本明細書では「夾雑核酸分子」又は「夾雑化学物質」とも呼ばれる）が存在する場合、核酸分子の調製時に他の核酸分子若しくは他の化学物質「から実質的に分離された」又は他の核酸分子若しくは他の化学物質「を実質的に含まない」。
【００３０】
単離された核酸分子には、他の配列から独立した分離核酸分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）、並びにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸分子が包含されるが、これらに限定されない。さらに、単離された核酸分子は、ハイブリッド又は融合核酸分子の一部である核酸分子を含むことができる。単離された核酸分子は、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した、（ｉｉ）例えば化学合成により合成された、（ｉｉｉ）クローニングにより組み換えで作製した、又は（ｉｖ）切断及び電気泳動若しくはクロマトグラフ分離により精製した、核酸配列
であることができる。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」という用語は、比較的短い長さ、例えば、１００残基未満の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。多くの方法では、約１６〜２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが有用であるが、約２５ヌクレオチドを超える、より長いオリゴヌクレオチドも時に利用することができる。幾つかのオリゴヌクレオチドは、核酸の相補鎖を合成するための「プライマー」として使用することができる。例えば、ＤＮＡプライマーは、相補的核酸配列とハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼを用いた反応における相補的ＤＮＡ鎖の合成の準備をすることができる。オリゴヌクレオチドは、また、幾つかの核酸検出方法におけるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロッティング又はインサイチュハイブリダイゼーションに有用である。
【００３２】
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基がペプチド結合又は修飾ペプチド結合により結合したアミノ酸鎖を指す。アミノ酸鎖は、２アミノ酸を超える任意の長さのものであることができる。特に指示ない限り、「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、その種々の修飾形態をも包含する。かかる修飾形態は、自然発生的に修飾された形態であっても化学的に修飾された形態であってもよい。修飾形態の例としては、グリコシル化形態、リン酸化形態、ミリストイル化形態、パルミトイル化形態、リボシル化形態、アセチル化形態、ユビキチン化形態等が包含されるが、これらに限定されない。修飾の例は、分子内架橋、及び、脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコール又はその誘導体のような種々の部分への共有結合等を包含する。さらに、修飾は、また、環化、分岐及び架橋も含む。さらに、遺伝子のコドンによりコードされた従来の２０種のアミノ酸以外のアミノ酸もまた、ポリペプチドに含まれうる。
【００３３】
「単離されたタンパク質」は、タンパク質の天然源中に存在する他のタンパク質の少なくとも１種から実質的に分離されたものであるか、又はタンパク質が化学的に合成される場合、化学的前駆体若しくは他の化学物質の少なくとも１種を実質的に含まない。タンパク質は、約３０％、２０％、１０％又は５％（乾燥重量による）未満の他のタンパク質又は他の化学物質（本明細書では「夾雑タンパク質」又は「夾雑化学物質」とも呼ばれる）が存在する場合、タンパク質の調製時に他のタンパク質若しくは他の化学物質「から実質的に分離される」又は他のタンパク質若しくは他の化学物質「を実質的に含まない」。
【００３４】
単離されたタンパク質は、幾つかの異なる物理的形態を有することができる。単離されたタンパク質は、完全長の新生若しくは未加工ポリペプチドとして、又は部分的に加工されたポリペプチドとして、又は加工されたポリペプチドの組み合わせとして存在することができる。完全長の新生ポリペプチドは、完全長の新生ポリペプチドの断片形成をもたらす特異的タンパク質分解的切断により翻訳後（postranslationally）に修飾することができる。断片又は断片の物理的結合は、完全長ポリペプチドに関連する生物活性を有することができるが、個々の断片に付随する生物活性の程度は異なり得る。
【００３５】
単離されたタンパク質は非自然発生的ポリペプチドであることができる。例えば、「単離されたポリペプチド」は、「ハイブリッドポリペプチド」であることができる。「単離されたポリペプチド」は、また、アミノ酸の追加又は欠失又は置換による自然発生的ポリペプチド由来のポリペプチドであることができる。単離されたポリペプチドは、また、他の細胞成分、他のポリペプチド、ウイルス性物質、若しくは培地、又はポリペプチドが化学的に合成される場合、化学的前駆体若しくは化学合成に付随する副生成物を実質的に含まない、実質的に均質な調製物中の特定のポリペプチドを意味するために本明細書で使用される「精製ポリペプチド」であることができる。「精製ポリペプチド」は、当業者に明らかであるように、標準的な精製技術又は化学合成によって、天然又は組み換え宿主細胞
から得ることができる。
【００３６】
「ハイブリッドタンパク質」、「ハイブリッドポリペプチド」、「ハイブリッドペプチド」、「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」及び「融合ペプチド」は本明細書では互換的に使用され、自然界では特定のポリペプチドに結合しない１種以上の他のポリペプチド分子に共有結合した特定のポリペプチド分子を有する、非自然発生的ポリペプチド又は単離されたポリペプチドを意味する。従って、「ハイブリッドタンパク質」は、共有結合によってともに結合した２種の自然発生的タンパク質又はその断片であり得る。「ハイブリッドタンパク質」は、また、２種の人工ポリペプチドをともに共有結合することにより形成されるタンパク質であってもよい。典型的には、２個以上のポリペプチド分子は、単一非分岐ポリペプチド鎖を形成するペプチド結合によりともに結合又は「融合」するが、必ずしもそうではない。本明細書で使用する時、「タンパク質断片」という用語は、タンパク質の一部を表すポリペプチドを意味する。
【００３７】
「組み換え体」とは、分子生物学技術を用いてその自然状態以外の何かに修飾されている、核酸、核酸にコードされたタンパク質、細胞、又はウイルス粒子を指す。例えば、組み換え細胞は、細胞の自然（非組み換え）形態には見出されないヌクレオチド配列を含有することができ、又は、別の方法では異常に低発現した、若しくは全く発現しない自然遺伝子を発現することができる。組み換え細胞は細胞の自然形態に見出される遺伝子を含有することができ、遺伝子は人工的手段によって修飾され細胞に再導入される。この用語は、また、細胞から核酸を取り除くことなく修飾されている内因性核酸を含有する細胞も包含し、かかる修飾としては、例えば、遺伝子置換及び部位特異的変異により得られるものが包含される。
【００３８】
「組み換え宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ配列が導入された細胞である。組み換えＤＮＡ配列は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、微粒子銃、及びウイルス感染を含む、任意の好適な方法を用いて宿主細胞に導入することができる。組み換えＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合して）も、組み込まれなくて（共有結合しなくて）もよい。例えば、組み換えＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム性要素上に維持され得る。或いは、安定に形質転換又は形質移入された細胞に関しては、組み換えＤＮＡは、それが染色体の複製を通して娘細胞に遺伝するように、染色体に組み込まれている。この安定性は、安定に形質転換又は形質移入された細胞の、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団から成る細胞株又はクローンを確立する能力により示される。組み換え宿主細胞は、大腸菌のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類起源の細胞株のような哺乳類細胞、ショウジョウバエ及びカイコ由来の細胞株のような昆虫細胞を含む、原核生物又は真核生物であることができる。「組み換え宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の後代又は潜在的後代も指すことがさらに理解される。変異又は環境の影響のどちらかにより、特定の修飾は後の世代に起こる可能性があるため、かかる後代は事実上親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用する時の用語の範囲内に依然として含まれる。
【００３９】
「配列」とは、例えば、ポリペプチド中のアミノ酸の順序又はポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序のような、モノマーがポリマー中に生じる線形順序（linear order）を意味する。
【００４０】
当該技術分野において知られているとおり、「配列の同一性又は類似性」は、配列を比較することにより決定される、２個以上のポリペプチド配列間又は２個以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。本明細書で使用する時、２個以上の核酸配列又は２個以上のポリペプチド配列間の関係において「同一性」とは、それらの配列を最適に整列及び解析
した際同一である、それぞれヌクレオチド又はアミノ酸残基の割合を指す。例えばアミノ酸配列の配列番号２に対して照会配列を比較する目的のために、照会配列は配列番号２と最適に整列され、配列番号２の全長に対して最良の局所配列が得られる。
【００４１】
解析は、手動で又は配列比較アルゴリズムを使用して実施することができる。配列比較では、典型的には、ある配列が、照会配列と比較するための参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列はコンピュータに入力され、部分列座標が設計され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが設計される。
【００４２】
比較する配列の最適な整列は、例えば、ニードルマン＆ワンチ（Needleman & Wunsch）の相同性整列アルゴリズム（J Mol. Biol., 48: 443 (1970)）を用いることにより実施することができる。ニードルマン＆ワンチ（Needleman & Wunsch）解析を実施するためのソフトウェアは、パスツール研究所（Institut Pasteur）（フランス）の生物学的ソフトウェアウェブサイト：http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.htmlを通じて公的に入手可能である。ニードル（NEEDLE）プログラムは、ニードルマン−ワンチ（Needleman & Wunsch）グローバル整列アルゴリズムを用いて、その完全長を考慮した際に２つの配列を最適に整列させる（ギャップを含む）。同一性は、長さの中のいかなるギャップをも含む、報告された整列領域上の２つの配列間で完全に一致した割合とともに算出される。類似性スコアもまた提供され、ここで類似性は、長さの中のいかなるギャップをも含む、報告された整列領域上の２つの配列間で一致した割合として算出される。標準的な比較では、タンパク質配列にはＥＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ヌクレオチド配列にはＥＤＮＡＦＵＬＬマトリクスを利用する。ギャップオープンペナルティは、ギャップが作製された際に差し引かれる（taken away）スコアであり、ギャップオープンペナルティを用いた初期値の設定は１０．０である。ギャップエクステンションの場合、ギャップ中の各塩基又は残基に対して標準ギャップペナルティにペナルティが加えられ、初期値の設定は０．５である。
【００４３】
ハイブリダイゼーションもまた、２つのポリヌクレオチドが互いに実質的に同一であることを示す試験として用いることができる。高程度の同一性を共有するポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズする。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989）に記載されたような、当該技術分野において既知の意味を有する。代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションし、続いて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドが相補性を共有する長さに応じて、５０〜６５℃の０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄することを含んでなる。
【００４４】
「ベクター」とは、異種核酸が挿入され得る又は挿入される核酸分子を指す。幾つかのベクターが宿主細胞に導入されて、ベクターの複製、又はベクター若しくはコンストラクトによってコードされるタンパク質の発現が可能になり得る。ベクターは、典型的には、選択マーカー、例えば、薬剤耐性を可能にするタンパク質をコードする遺伝子、複製配列の開始点、及び異種配列の挿入を可能にするマルチクローニングサイト（multiple cloning site）を有する。ベクターは、典型的には、プラスミドベースであり、小文字の「ｐ」に続く文字及び／又は数の組み合わせにより指定される。本明細書で開示された出発プラスミドは、市販のもの若しくは無制限に公的に入手可能なもののいずれか、又は当該技術分野において公知の手順を適用することにより、入手可能なプラスミドから構築することができる。本発明に従って使用され得る多くのプラスミド並びに他のクローニング及び発現ベクターは周知であり、当業者に容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明
における使用に好適な任意の数の他のプラスミドを容易に構築することができる。本発明における、かかるプラスミド並びに他のベクターの性質、構築及び使用は、本開示から当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００４５】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡにおける多くの従来技術が用いられる。これらの技術は周知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I、II、及びIII, F.M. Ausubel, ed. (1997)、及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, (2001）に説明されている。
【００４６】
本発明は、ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定することにより、ヒトキマーゼの生物活性を測定する一般方法を提供する。
【００４７】
ある一般態様では、本発明は、生体試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定することにより、ヒト被験体におけるキマーゼ関連疾患を検出する方法を提供する。キマーゼ関連疾患を有するヒト被験体は、過剰活性キマーゼ又は増加した量のキマーゼを有し得る。従って、かかるヒト被験体から採取された生体試料は、健常ヒト被験体のものと比較して、キマーゼによる特定部位Ｌｅｕ７２−Ｍｅｔ７３におけるＳＬＰＩ切断レベルが多くなることがあり得る。
【００４８】
本発明では、任意の種類の生体試料を用いることができる。具体的な実施形態では、生体試料は、唾液、痰、鼻浸出物、ＥＬＦ又は洗浄液であることができる。生体試料は、当業者に既知の方法でヒト被験体から得ることができる。対照生体試料は、試験生体試料のものと同種の興味のある組織、細胞及び／又は生体液を含有し、キマーゼ関連疾患と診断されていない健常ヒト又はその集団から得ることができる。
【００４９】
完全長ヒトＳＬＰＩレベル及びキマーゼ切断から生じるＳＬＰＩ断片のレベルはともに生体試料から測定することができ、ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを定量化するために使用される。生体試料中の完全長ヒトＳＬＰＩレベル及びキマーゼ切断から生じるＳＬＰＩ断片のレベルは、当業者に既知のタンパク質定量化のための任意の手段により測定することできる。
【００５０】
一形態では、ＳＬＰＩ又はＳＬＰＩ断片を生体試料から単離又は精製し、その量を測定することができる。ＳＬＰＩ又はＳＬＰＩ断片は、例えばゲル濾過のようなサイズベースの分離方法等の、当該技術分野において既知の方法を使用して、残りの生体試料から容易に分離することができる。さらに、試料の還元後、試料中のＳＬＰＩ又はＳＬＰＩ断片を、ポリアクリルアミドゲルのようなゲル中で分離し、次いでタンパク質複合体と免疫反応する抗体を用いて免疫ブロットし得る。
【００５１】
或いは、ＳＬＰＩ又はＳＬＰＩ断片のレベルは、分離、単離又は精製することなく生体試料中で測定することができる。この目的のために、免疫測定ではＳＬＰＩ又はＳＬＰＩ断片と選択的に免疫反応する抗体を用いることが好ましい。例えば、免疫細胞化学的方法を使用することができる。例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法、及び免疫酵素分析（ＥＭＡ）を含む、他の周知の抗体ベースの技術を使用することができる。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号及び同第４，４８６，５３０号明細書を参照のこと。これらはともに参照することにより本明細書に組み入れられる。
【００５２】
ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルは、次いで、試験生体試料又はアッセイ混合物中に存在する、キマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片対完全長ＳＬＰＩの比とし
て算出される。対照試料と比較した、試験試料中のヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルの増加は、ヒト被験体がキマーゼ関連疾患を有する又はキマーゼ関連疾患を発現する危険性が増大していることを示す。
【００５３】
別の一般態様では、本発明は、処置前、処置中又は処置後に、ヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩ切断レベルを測定することにより、ヒト患者におけるキマーゼ関連疾患治療の有効性を評価する方法を提供する。キマーゼ関連疾患の有効な処置では、キマーゼの生物活性、又はヒト患者におけるキマーゼの量が減少する。従って、有効な処置後にかかるヒト患者から採取された生体試料中では、キマーゼによる特定部位Ｌｅｕ７２−Ｍｅｔ７３におけるヒトＳＬＰＩの切断の減少が観察される。対照として、試験生体試料のものと同種の興味のある組織、細胞、及び／又は生体液を含有する生体試料を、処置前の同じヒト患者から得ることができる。対照試料と比較した、試験試料中でのヒトキマーゼによるヒトＳＬＰＩの切断レベルの減少は、該患者におけるキマーゼ関連疾患に対する処置が有効であることを示す。
【００５４】
本発明の方法は、キマーゼ関連疾患に関連する他のバイオマーカー、表現型、又は生理学的変化を解析する工程をさらに含んでなる。例えば、喘息では、ＶＥＧＦ量及び気道血管透過性指数が、喘息患者のメタコリンに対する気道閉塞及び気道過敏性の程度と逆相関することが最近報告された（Kanazawa et al., Clin Exp Allergy. 2005 Nov; 35 (11): 1432-6）。具体的には、誘発された痰中でＶＥＧＦ量及び気道血管透過性指数が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）ではない喘息患者及びＵＣである喘息患者において、健常対照又はＵＣ患者（Ｉｄ．）より著しく高かったことがわかった。従って、喘息状態を診断する本発明の方法又は喘息状態への処置の有効性を評価する本発明の方法では、ヒト被験体の誘発された痰中のＶＥＧＦの発現量を分析する工程をさらに含んでなる。
【００５５】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、完全に可逆的ではない進行性気道狭窄に関連する炎症性肺疾患である。ＣＯＰＤは、一般的に喫煙に関連する慢性閉塞性気管支炎及び気腫を含む。ＣＯＰＤの正確な病因は不明であるが、医学文献は、場合によっては、ＣＯＰＤは重篤な慢性喘息からの病理学的進行を表す可能性があることを示唆している。従って、ＣＯＰＤの処置に利用可能な現在の治療法は、主に喘息に関連する気道及び肺の炎症を低減することを意図したものである。現在の治療法は、経口又は吸入副腎皮質ホルモン並びにβ２−アドレナリン作用薬及び抗コリン薬のような気管支拡張薬を含む。それ故、喘息の新規治療はＣＯＰＤの有望な治療でもあることが予想できる。ＣＯＰＤに関するレビューに関しては、de Boer, W. I. Perspectives for cytokine antagonist therapy in COPD.
Drug Discovery Today, 10 (2): 93, 2005及びBarnes, P. J. New Treatments for COPD. Nature Reviews- Drug Discovery, 1: 437, 2002を参照のこと。喘息と同様に、ＣＯＰＤの炎症性の特徴は、好中球及びマクロファージのような白血球の肺及び気道への流入を含む炎症反応により特徴付けられることができる。この流入は、喘息及びＣＯＰＤの両方に関連する気道及び肺炎症の特徴の１つである。従って、ＣＯＰＤ状態を診断する本発明の方法又はＣＯＰＤ状態に対する処置の有効性を評価する本発明の方法では、白血球の肺及び気道への流入を測定する工程をさらに含んでなる。
【００５６】
サイトカインは、喘息及びＣＯＰＤにおける重要な炎症メディエータである。炎症誘発性サイトカインとしては、特に、インターロイキン（ＩＬ）−１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びマクロファージ走化性因子（ＭＣＰ）−１が包含される。喘息及びＣＯＰＤの治療に有効な治療薬は、これらの炎症誘発性サイトカインの量を低減する傾向がある。従って、喘息若しくはＣＯＰＤ状態を診断する本発明の方法、又は喘息若しくはＣＯＰＤ状態に対する処置の有効性を評価する本発明の方法では、被験体中のサイトカイン量を測定する工程をさらに含んでなる。
【００５７】
本発明の別の態様は、キマーゼ阻害剤処置に応答するより大きいチャンスを有する患者を区別する方法であり、これは、かかる患者におけるＳＬＰＩ切断レベルを測定する工程を含む。ＳＬＰＩの切断がより多い患者は、過剰活性キマーゼを有する可能性が高く、従って、キマーゼ阻害剤治療に対する応答性が高い場合が多い。例えば、喘息は、狭窄関連（呼吸器作用薬の適用）及び／又は気道構成関連（粘液の過剰産生）活性により生じ得る。肥満細胞の役割及び放出されたキマーゼが喘息の異常な病態生理学的特性のいずれか又は両方に関与するかどうかは、依然として決定されていない。従って、喘息はキマーゼ依存性及び／又はキマーゼ非依存性作用の結果であり得る。これを受けて、キマーゼによるＳＬＰＩの特異的切断を用いて、キマーゼ非依存性喘息集団からキマーゼ依存性喘息集団を関連付け又は確認又は階層化して、キマーゼ阻害剤の有効性能力を高めることができる。
【００５８】
本発明は、さらに、ａ）試験化合物をアッセイ混合物中でヒトキマーゼ及びヒトＳＬＰＩと接触させる工程と、ｂ）ヒトキマーゼがヒトＳＬＰＩを切断する条件下で、アッセイ混合物をインキュベートする工程と、ｃ）アッセイ混合物中のキマーゼ切断から生じるヒトＳＬＰＩ断片レベルを測定する工程と、ｄ）工程ｃ）で検出された量を、対照から検出された量と比較する工程を含んでなり、試験化合物がアッセイ混合物から除かれる、ヒトキマーゼの生物活性を低減する化合物の同定方法を提供する。
【００５９】
化合物同定方法は、通常の実験室形式を用いて、又はハイスループットに適合したアッセイで実施することができる。「ハイスループット」という用語は、複数の試料を同時に及び／又は素早く連続して容易にスクリーニングすることを可能にするアッセイ設計を指し、ロボット操作のための能力を含み得る。ハイスループットアッセイの別の所望の特性は、試薬の使用を低減する、又は所望の分析を成し遂げるための操作の数を最低限に抑えるように最適化したアッセイ設計である。アッセイ形式の例としては、９６ウェル又は３８４ウェルプレート、浮揚液滴（levitating droplets）及び液体取扱実験に使用される「ラボ・オン・チップ（lab on a chip）」マイクロチャネルチップが包含される。プラスチック型及び液体取扱装置の小型化が進行すると、又は改良型アッセイ装置が設計されると、本発明の設計を用いてより多くの試料を処理できることは当業者に周知である。
【００６０】
任意の試験化合物が、本発明のスクリーニングアッセイでスクリーニングされて、本発明のタンパク質複合体の修飾物質を選択することができる。化合物を「同定する」という用語は、（ａ）キマーゼの修飾物質であることが今まで知られていなかった集団から化合物を選択すること、並びに（ｂ）キマーゼの機能及び活性を結合することができる又は調節することができることが既知の化合物を試験することをともに包含することを目的とする。両方の種類の化合物は、本明細書では一般に「試験化合物」又は「候補化合物」と呼ばれる。候補化合物は、小有機又は無機化合物、抗体、タンパク質、又はその断片のような天然又は合成分子、アンチセンスヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）及びリボザイム、並びにその誘導体、模倣物質及び類似体を含むが、これらに限定されない、多数の化学的部類を包含する。好ましくは、それらは小有機化合物、即ち、１０、０００ダルトン以下、より好ましくは５、０００ダルトン未満の分子量を有するものである。好ましくは、試験化合物は、例えば、化学合成ライブラリー（Gordan et al., J. Med. Chem., 37:1385-1401 (1994）を概して参照のこと）、組み換え発現ライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）及びインビトロ翻訳ベースライブラリー（例えば、リボソームディスプレイライブラリー）のような、当該技術分野において既知のライブラリーフォーマットで提供される。
【００６１】
候補化合物は、ポリペプチドと構造的に相互作用するために必要な官能性化学基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能性化学基、より好ましくは少なくとも３つの官能性化学基を含む。候補化合物は、環状炭素若しくは複素環式構造及び／又は１個以上の上記で同定された官能基で置換された芳香族若しくは多環芳香族構造を含むことができる。候補化合物は、また、ペプチド、糖類、脂肪酸類、ステロール類、イソプレノイド類、プリン類、ピリミジン類、上記の誘導体若しくは構造的類似体又はその組み合わせ等のような生体分子であってもよい。化合物が核酸である場合、化合物は典型的にはＤＮＡ又はＲＮＡ分子であるが、非自然結合又はサブユニットを有する修飾された核酸もまた検討される。
【００６２】
候補化合物は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範な起源から得られる。例えば、ランダムなオリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムなペプチドのファージディスプレイライブラリー等を含む広範な有機化合物及び生体分子のランダム及び定方向合成のために、多数の手段が利用可能である。候補化合物は、また、生物ライブラリー（biological libraries）；空間的にアドレス可能な（spatially addressable）パラレル固相又は溶液相ライブラリー；デコンボリューション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選別を用いた合成ライブラリー法（Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145 (1997)）を含む、当該技術分野において既知のコンビナトリアルライブラリー法における多くの取り組みのいずれかを使用して得ることができる。或いは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、又は容易に作製することができる。さらに、天然及び合成的に作製されたライブラリー及び化合物は、通常の化学的、物理的、及び生化学的手段を通して容易に修飾することができる。
【００６３】
さらに、既知の薬剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような定方向又はランダムな化学修飾に供して、該薬剤の構造的類似体を作製することができる。候補化合物はランダムに選択することができ、又はキマーゼ活性の機能に結合する及び／又はキマーゼ活性の機能を調節する既存の化合物に基づくこともできる。従って、候補剤源は、化合物の構造が分子の１つ以上の位置で変化して、より多い若しくはより少ない化学部分又は異なる化学部分を含有する、キマーゼ活性を増大又は低減する１種以上の既知の化合物に基づいた分子の１つ以上のライブラリーである。類似体活性剤／阻害剤ライブラリーの作製時に分子に施される構造的変化は、定方向、ランダム、又は定方向及びランダム置換並びに／若しくは添加の両方の組み合わせであることができる。コンビナトリアルライブラリー作製の当業者は、既存の化合物に基づいて、かかるライブラリーを容易に作製することができる。
【００６４】
種々の他の試薬を混合物中に含むことができる。これらは、塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、洗剤等のような、最適なタンパク質−タンパク質及び／又はタンパク質−核酸結合を促進するために用いることができる試薬を含む。かかる試薬は、また、反応成分の非特異的又はバックグラウンド相互作用を低減することもできる。ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のようなアッセイの効率を向上させる他の試薬を用いることもできる。
【００６５】
分子ライブラリーの合成方法の例は、例えば、Zuckermann et al., J Med. Chem. 37: 2678 (1994）のように、当該技術分野に見い出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten, Biotechniques, 13: 412-421 (1992））、又はビーズ上（Lam, Nature, 364: 555-556 (1991）、チップ（Fodor, Nature, 364: 555-556 (1993）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号）、プラスミド（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1865-1869(1992）、又はファージ（例えば、Scott and Smith, Science, 249: 386-390 (1990）を参照のこと）に見ることができる。
【００６６】
選択された化合物は、その、特定部位Ｌｅｕ７２−Ｍｅｔ７３でＳＬＰＩを切断するキマーゼの生物活性を低減する能力について試験することができる。試験中、ＳＬＰＩプロテアーゼ活性の基質として機能するＳＬＰＩの前に、後に、又はそれと同時に、試験化合物をキマーゼに添加することができる。一般に、上記スクリーニングアッセイが試験化合物の非存在下に行われる対照アッセイが実施される。この対照アッセイの結果が次いで試験化合物の存在下で得られた結果と比較される。
【００６７】
スクリーニングアッセイのキマーゼ又はＳＬＰＩは、単離されていてもよく、単離されていなくてもよい。一実施形態では、実質的に精製されたキマーゼ又はＳＬＰＩを、スクリーニングアッセイで用いることができる。本発明においてＳＬＰＩ又はキマーゼの発現及び精製のために任意の組み換え発現方法を用いてよいことは、当業者に明らかである。本発明で用いることができる代表的な核酸分子には、ヒトキマーゼ又はＳＬＰＩをコードする核酸分子が含まれる。
【００６８】
典型的には、核酸、好ましくはＤＮＡの形態の核酸をベクターに組み込んで、一度宿主細胞に導入された、相互作用タンパク質メンバーを生成させることができる発現ベクターを形成する。本発明には多くの種類のベクターを用いることができる。本発明の目的のための発現ベクターの構築方法は、本開示を知らされている当業者に明らかであるべきである。（Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; Bitter, et al., Methods in Enzymology 153: 516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989を概して参照のこと。）
【００６９】
一般に、発現ベクターは、操作可能に相互作用タンパク質メンバーをコードするＤＮＡに結合するプロモーターを有する発現カセットを含む。プロモーターは、天然のプロモーター、即ち、細胞内での相互作用タンパク質メンバーの発現に関与する自然発生的細胞中に見出されるプロモーターであることができる。或いは、発現カセットは、キメラ、即ち、自然発生的細胞内での相互作用タンパク質メンバーの発現に関与する天然プロモーターではない、異種プロモーターを有するものであることができる。発現ベクターは、宿主細胞内でベクターを複製するためのＤＮＡ複製開始点をさらに含んでいてもよい。好ましくは、発現ベクターは、また、例えば大腸菌内でのベクターの増幅のための複製開始点、並びに発現ベクターを内部に有する宿主細胞のみを選択及び維持するための選択マーカーを含む。
【００７０】
このように構築された発現ベクターは、例えば、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポフェクション、遺伝子銃等による等、当該技術分野において既知の任意の技術により宿主細胞に導入することができる。興味のあるタンパク質の発現は、一過性でも安定であってもよい。発現ベクターは、染色体外状態、即ち、自己複製プラスミド又はウイルスとして宿主細胞内で維持され得る。或いは、発現ベクターは、安定な細胞株の選択又は部位特異的組み換えのような従来の技術により、宿主細胞の染色体に組み込むことができる。安定な細胞株では、発現ベクターの少なくとも発現カセット部分が宿主細胞の染色体に組み込まれる。
【００７１】
ベクター構築物は、細菌、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、並びに哺乳類及びヒト細胞を含むが、これらに限定されない、種々の宿主細胞内での発現に好適なように設計することができる。様々な宿主細胞内で発現するための発現ベクターの調製方法は、当業者には明らかであるべきである。
【００７２】
キマーゼ又はＳＬＰＩの相同体及び断片もまた、上記組み換え方法を用いて容易に発現し得る。例えば、タンパク質断片を発現させるために、発現ベクターに組み込まれたＤＮＡ断片は、それがタンパク質断片のみをコードするように選択することができる。同様に、特異的ハイブリッドタンパク質は、ハイブリッドタンパク質をコードする組み換えＤＮＡを用いて発現することができる。同様に、相同タンパク質は、相同タンパク質をコードするＤＮＡ配列から発現することができる。相同体をコードするＤＮＡ配列は、組み換えＤＮＡ技術を用いて天然タンパク質コード配列を操作することにより得ることができる。この目的のために、当該技術分野において一般に公知の技術を用いてランダム又は部位特異的突然変異誘発を実施することができる。タンパク質誘導体を作製するために、例えば、天然相互作用タンパク質メンバーのアミノ酸配列を、部位特異的ＤＮＡ突然変異誘発により所定の方式で変化させて、共通配列を作製又は除去することができる。
【００７３】
別の実施形態では、本発明に関与するキマーゼ又はＳＬＰＩは、唾液、痰、鼻浸出物、ＥＬＦ及び洗浄液等のような生体試料中に存在し得る。キマーゼ又はＳＬＰＩは、また、細胞に結合し得るか又は細胞可溶化物中に存在し得る。
【００７４】
本発明の方法は、キマーゼ活性に対して１以上の他のアッセイで化合物を試験する工程をさらに含む。化合物は、アンギオテンシンＩを血管作用性ペプチドであるアンギオテンシンＩＩに転換する能力、ビッグエンドセリン１を、３１アミノ酸長のペプチドであるエンドセリン１に選択的に転換する能力、細胞外マトリクスを分解する能力、幹細胞因子を切断し生理活性可溶性生成物を得る能力、プロコラゲナーゼ、炎症性サイトカイン、及び他の生理活性ペプチドを処理する能力等が挙げられるがこれらに限定されない、キマーゼの他の活性に関して、さらに試験することもできる。具体的な実施形態では、化合物はキマーゼ及び発色性基質の関与する、酵素阻害アッセイでさらに試験することもできる（例えば、Garavilla et al., The J. Bio. Chem., 2005, 280: 18001-18007を参照のこと）。
【００７５】
本発明の方法は、キマーゼ関連疾患に関して動物モデルにおける化合物を試験する工程をさらに含む。例えば、一般に認められている気道炎症のモデルは、ブタ回虫（Ascaris suum）抗原誘導性喘息ヒツジモデルである。試験化合物をヒツジモデルに投与した後、好中球及びマクロファージの流入が減少することにより、化合物が喘息及びＣＯＰＤの両方に関連する気道及び肺炎症治療に有用であることが当業者に示唆される。気道炎症の別のモデルは、リポ多糖類（lipolysaccharide）（ＬＰＳ）誘発性気道好中球増加ラットであり、そこでは、ＬＰＳの肺への導入時、白血球が気管支肺胞洗浄液に流入する。試験化合物をラットモデル（mode）に投与した後、ＬＰＳ誘発性気道炎症の好転及び気管支肺胞洗浄液中の好中球数の減少により、試験化合物が喘息及びＣＯＰＤの両方の処置に有用であることが当業者に示唆される。喘息及びＣＯＰＤのさらに別のモデルは、グリコーゲン誘導性急性腹膜炎ラットモデルである。試験化合物をラットモデル（mode）に投与した後、グリコーゲン処理ラットの腹水及び血漿中の、とりわけＩＬ−１、ＴＮＦ−α、及びＭＣＰ−１を含む炎症促進性サイトカインレベルの減少により、試験化合物が喘息及びＣＯＰＤの両方の処置に有用であることが証明される。
【実施例】
【００７６】
実施例１
特異的部位におけるヒトキマーゼ切断された組み換えヒトＳＬＰＩ
ウシ（Grutter et al., Embo J 1988; 7: 345-51）及びヒツジ（Pemberton et al., Biochim Biophys Acta 1998; 1379: 29-34）の肥満細胞プロテアーゼによるヒトＳＬＰＩ切断は研究者により報告されているが、ヒトキマーゼによるＳＬＰＩの切断に関する研究は報告されていない。本実施例では、ヒトキマーゼの組み換えヒトＳＬＰＩ（ｒＳＬＰＩ）
を切断する能力について研究した。
【００７７】
組み換えヒトＳＬＰＩ及びヤギ抗ＳＬＰＩポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。ウサギ抗ＳＬＰＩ抗体は、アブカム（Abcam）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手した。ヒトキマーゼ及びトリプターゼは、コルテックス・バイオケム（Cortex Biochem）（カリフォルニア州サンレアンドロ（San Leandro））から入手した。カテプシンＧ及びエラスターゼは、バイオデザイン・インターナショナル（Biodesign International）（メーン州ソーコ（Saco））から、並びにプロテイナーゼ３（Proteinase 3）はフィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル（Fitzgerald Industries International）（マサチューセッツ州コンコード（Concord））から購入した。特に指示がない限り、本明細書に含まれる他の実施例でも同様の試薬を用いた。
【００７８】
組み換えヒトＳＬＰＩをヒトキマーゼとともに（モル比４０：１）、０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で３７℃にてインキュベートした。様々な時点の後、試料を採取した。還元された試料を４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ、インビトロジェン（Invitrogen））（２ｕｇ  ｒＳＬＰＩ／ウェル）で分離し、クマシーステインで染色した。
【００７９】
図１は、ｒＳＬＰＩをヒトキマーゼとともに約２０分間インキュベートした後、組み換えヒトＳＬＰＩの切断が観察されたことを示す。キマーゼに対してｒＳＬＰＩが１０倍過剰である場合でさえ、ｒＳＬＰＩタンパク質のほとんどは切断された（図示せず）。完全長ヒトＳＬＰＩは２つの断片に切断された。質量分析により、約１１．７ｋＤの完全長ヒトＳＬＰＩが、およそ７．９ｋＤ及び３．８ｋＤのサイズの２つの断片に切断されたことが示された。切断の正確な部位を決定するために、完全長（図１、バンドＡ）及び切断されたバンド（図１、バンドＢ及びＣ）に対してＮ−末端シークエンシングを行った。シークエンシング解析により、ヒトキマーゼによる組み換えヒトＳＬＰＩの切断はＬｅｕ７２−Ｍｅｔ７３であることが示された。この結果は、公知のキマーゼ阻害剤であるＳＬＰＩ（Finket al., Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367: 567-71）が、キマーゼの基質としても作用することを示した。これは、ヒトＳＬＰＩの切断におけるウシ及びヒツジ肥満細胞のプロテアーゼの活性（Grutter et al., 上記を参照；及びPemberton et al., 上記を参照）と一致した。
【００８０】
エラスターゼ、カテプシンＧ、トリプターゼ及びプロテイナーゼ３を含むプロテアーゼのパネルに対して、ＬＣ／ＭＳ分析を用い、それらの組み換えヒトＳＬＰＩ切断能を試験した。これらのプロテアーゼは、ＳＬＰＩにより阻害されることが知られていた。組み換えヒトＳＬＰＩ（１μｇ）を、試験プロテアーゼ（５０ｎｇ）とともに５時間インキュベートした。次いで試料を、５０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3緩衝液で、約０．１μｇタンパク質／μＬに希釈した。アジレント（Agilent）１１００  ＬＣ／ＭＳＤを用いて液体クロマトグラフィーを実施した。希釈した試料（１０μＬ）を、０．２ｍＬ／分の流速で、ゾルバックス（Zorbax）ＳＢ３００  ５ｕ  Ｃ８、Ｃ１８（１５０×２．１ｍｍ）カラムに注入した。溶媒Ａ中の溶媒Ｂ勾配が１５〜６０％の条件で、３０分間、試料内のタンパク質を溶出したが、ここで溶媒Ａは（０．１％蟻酸＋０．０２％ＴＦＡ）／Ｈ2Ｏであり、溶媒Ｂは（０．１％蟻酸＋０．０２％ＴＦＡ）／ＡＣＮであった。切断されたｒＳＬＰＩは保持時間１０．７分で検出され、一方インタクトなＳＬＰＩは１２．２分で検出された。アジレント（Agilent）１１００ＭＳＤ  ＳＬ質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化源を通して１１００ＨＰＬＣシステムと接続された。システム制御及びデータ収集には、ケムステーション・ソフトウェア（Chemstation software）バージョン１０．０２を用いた。
【００８１】
ＬＣ／ＭＳから、天然のｒＳＬＰＩが単離され、１１７０８ダルトンの予想されたサイ
ズで検出された。キマーゼとともにインキュベートした後、第２のピークがＨＰＬＣで読み取られた。この第２のピークは、切れ目の入った又は切断されたｒＳＬＰＩ分子への水の添加と一致する、さらなる１８質量単位を有した。従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析から観察されたように、第２のピークの存在により、キマーゼが確かにｒＳＬＰＩを切断することが示された。ｒＳＬＰＩとパネルの他のプロテアーゼとのインキュベーションでは、第２のピークは形成されず、これは試験した他のプロテアーゼがｒＳＬＰＩを切断しないことを示した。プロテアーゼの存在下でのｒＳＬＰＩ試料の還元は、ＳＬＰＩタンパク質の切断をもたらし、これは他のプロテアーゼが還元型ｒＳＬＰＩを切断することができることを示した。
【００８２】
他のプロテアーゼにＳＬＰＩを切断する能力がないことは、エラスターゼ及びカテプシンＧによるＳＬＰＩの切断がないことを示したVogelmeierらの研究（J Clin Invest 1991; 87: 482-8）と一致する。
【００８３】
実施例２
キマーゼ阻害剤により減少された、ヒトキマーゼによるヒトｒＳＬＰＩ切断
本実施例では、ヒトキマーゼのヒトｒＳＬＰＩの切断に対するキマーゼ阻害剤の効果を研究する。以下の２種のキマーゼ阻害剤を様々な濃度で試験した：キマーゼ阻害剤Ａ、米国特許公開第２００３０１９５１７２号明細書に記載の［２−（３−｛メチル−［１−（ナフタレン−２−カルボニル）−ピペリジン−４−イル］−カルバモイル｝−ナフタレン−２−イル）−１−ナフタレン−１−イル−２−オキソ−エチル］−ホスホン酸、及びキマーゼ阻害剤Ｂ、米国特許公開第２００５０１７６７６９号明細書に記載の｛（５−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−［２−（３−クロロ−５−フルオロ−フェニル）−ビニルカルバモイル］−メチル｝−メチル−ホスフィン酸。
【００８４】
キマーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で、組み換えヒトＳＬＰＩ（８０ｐｍｏｌｅ）とヒトキマーゼ（８０ｐｍｏｌｅ）を、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）又はＰＢＳ中で３７℃にて３０分間インキュベートした。ウエスタン分析を実施して、ｒＳＬＰＩ量及びＳＬＰＩの大きい方の切断産物（質量分析によると、約７．９ｋＤ）量を定量した。試料は変性され、ＳＤＳ及びβメルカプトエタノール（mecaptoethanol）を含有する等量の緩衝液で還元された。各試料を４〜２０％勾配のポリアクリルアミドゲル又は１５％のポリアクリルアミドゲルに適用した。試料を電気泳動させ、ＰＶＤＦ膜（ピアース・バイオテクノロジー（Pierce Biotechnology）、イリノイ州ロックフォード（Rockford））に転写した。ブロットを５％ミルク／ＰＢＳ−ツイーン（tween）（ＰＢＳ／０．４％ツイーン−２０）中で、室温にて１時間ブロッキングした。ブロットを、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体（ヤギの抗ＳＬＰＩの場合１：１０００、ウサギの抗ＳＬＰＩの場合１：２０００）中で、４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄した後、ブロットを、ブロッキング溶液で１：２５００に希釈した二次抗体（ヤギの抗ウサギＨＲＰ又はウサギの抗ヤギＨＲＰ）とともに室温で１時間インキュベートした。ブロットをＰＢＳ−ツイーンで６回洗浄し、ウェスター・ライトニング（Wester Lightning）化学発光試薬（パーキン・エルマー（Perkin Elmer）、マサチューセッツ州ボストン）とともに室温で１分間インキュベートし、暗室でバイオマックス・ライト・フィルム（Biomax Light Film）（イーストマン・コダック（Eastman Kodak）、ニューヨーク州ロチェスター（Rochester））上で現像した。濃度計、フルオロケム（FluorChem）（商標）８０００、高度蛍光、化学発光及びビジブル・イメージング・システム（Visible Imaging System）（アルファ・イノテック（Alpha Innotech）、カリフォルニア州サンレアンドロ（San Leandro））を用いて、現像したフィルム上のｒＳＬＰＩ量及び大きい方のＳＬＰＩ切断産物の量と相関する濃度を測定した。
【００８５】
ＳＬＰＩ切断の割合を、式：１００×（大きい方のＳＬＰＩ切断産物の濃度）／（ｒＳ
ＬＰＩの濃度＋大きい方のＳＬＰＩ切断産物の濃度）で算出した。
【００８６】
図２は、キマーゼによるＳＬＰＩ切断に及ぼすキマーゼ阻害剤の効果を示す。阻害量は、添加したキマーゼ阻害剤の量と直接関連した。これは、このアッセイが、キマーゼ阻害剤化合物の有効性を決定するのに有効であることを示唆した。
【００８７】
実施例３
臨床試料中のヒトキマーゼ切断されたヒトＳＬＰＩ
本実施例では、容易に利用することができる臨床試料であるヒト唾液を用いてＳＬＰＩ切断を測定するex vivoアッセイを示す。
【００８８】
ＰＢＳで総量３０μＬにした、１０μＬのヒト唾液とキマーゼ（４μｇ／０．１Ｕ／５μＭ）及び／又はキマーゼ阻害剤（１００μＭ）とを、３７℃で３０分間インキュベートした。分解されない唾液試料に関しては、１０μＬの唾液を２０μＬのＰＢＳで希釈した。実施例２に記載のように、ウエスタン分析を実施して、唾液試料中のＳＬＰＩの量と大きい方のＳＬＰＩ切断産物の量とを測定し、ＳＬＰＩの切断の割合を決定した。
【００８９】
図３は、外因性キマーゼが、ｒＳＬＰＩと同様に、唾液試料中のＳＬＰＩを切断したことを示す。これはまた、キマーゼのＳＬＰＩ切断能に及ぼすキマーゼ阻害剤の効果も示す。キマーゼ阻害剤、｛（５−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−［２−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−ビニルカルバモイル］−メチル｝−メチル−ホスフィン酸は、米国特許公開第２００５０１７６７６９号明細書に記載されている。阻害剤はキマーゼ活性を低減し、唾液からのＳＬＰＩの切断を阻害した（図３）。これらの結果は、キマーゼ活性並びにキマーゼ阻害剤の有効性が唾液試料から観測できることを示した。
【００９０】
実施例１の結果と一致して、試験したプロテアーゼのパネルの中でも、唾液中のＳＬＰＩの切断はキマーゼ特有であった。大きい方のＳＬＰＩ切断産物は、唾液試料をカテプシンＧ、トリプターゼ及びプロテイナーゼ３とともにインキュベートした際には観察されなかった。唾液をエラスターゼとともにインキュベートした後には、微量のＳＬＰＩ分解が観察された。しかしながら、得られた分解産物である２重のバンド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後、約１１ｋＤ及び１０．５ｋＤ）は、キマーゼ分解により得られる切断産物のサイズとは異なっていた。
【００９１】
実施例４
キマーゼ関連疾患用バイオマーカーとしてのＳＬＰＩ処理
正常被験体及びキマーゼの過剰活性に関連する疾病であるアレルギーの患者からのヒト唾液試料中で、ＳＬＰＩの切断を測定した。
【００９２】
唾液試料はヒト被験体、一方はマウスへの曝露により誘導されるアレルギー状態を訴えるヒト被験体（アレルギー）、他方は呼吸器疾患を有しない（正常）ヒト被験体から得た。試料を冷凍し、−８０℃で保存した。試料を氷上で解凍し、ボルテックスした。唾液（１０μＬ）をＰＢＳ（１５μＬ）で希釈した。実施例２に記載のように、ウエスタン分析を実施して、唾液試料中のＳＬＰＩの量と大きい方のＳＬＰＩ切断産物の量とを測定し、ＳＬＰＩ切断の割合を算出した。
【００９３】
図４は、正常被験体及びアレルギー患者からの唾液試料間のＳＬＰＩ切断レベルの差を示す。アレルギー唾液試料では高い割合のＳＬＰＩ切断が観察され、これはＳＬＰＩ処理がキマーゼ関連疾患のバイオマーカーとして使用することができることを示す。
【００９４】
実施例５
以下の方法論を使用して、アレルギー性鼻炎の患者における、基準時及び関連するアレルゲンへの応答時の、鼻腔内の上気道炎症の可溶性成分（メディエータ、サイトカイン）を研究した。
【００９５】
材料
ピペット１本（＞１０ｃｃ）又は１０ｃｃのシリンジ１つ
無菌鼻洗浄溶液：ＮａＣｌ０．９％、１鼻孔あたり１０ｍＬ、３７℃に予熱済
予熱装置
組織
漏斗（４０ｍｍ）
シリンジ（１０ｃｃ）
プラスチック容器
鼻鏡
氷上のキシロメタゾリン０．１％鼻スプレー
【００９６】
方法
（De Graaf-In 't Veld C et at; Clin Exp Allergy 1995; 25: 966-73により認証された技術から改良された）
１．ＮａＣｌ０．９％の無菌溶液を３７℃に加熱する。
２．鼻鏡及び十分な光で、鼻の可触性（accessibility）を調べる。
３．被験体は、座りながら頚部を約３０°伸ばす。１０ｃｃの温めたＮａＣｌ０．９％溶液を、一方の鼻孔にピペット又はシリンジで注入する。被験体に、処置中飲み込んだり又は呼吸したりしないよう指示する。
４．１０秒後、被験体に、かがんで、洗浄液を鼻から（１０ｃｃのシリンジに連結された）漏斗に静かに排出するよう指示する。
５．予備投与し、合計４回鼻を洗浄して、ごみを取り除く。
６．研究日１の再現性をテストするために、２日目（予備投与）に第１洗浄液を分析し、２日目の第１の鼻洗浄後、他の３ＮＡＬ処置の１０分前にキシロメタゾリン０．１％を１吹き各鼻孔に噴霧する（被験体に鼻をかませないようにする）。
７．数分後、第２及び第３の鼻洗浄（及び排出）を行う。
８．処理まで、第４洗浄液を氷上のプラスチック容器に保存する。
９．１時間以内に全てのＮＡＬを処理し、処理時間まで氷上で保存した。
【００９７】
結果を図５に示す。図５は、ｃＳＬＰＩの増加がアレルギー症状の悪化と相関することを示す。ｃＳＬＰＩ対総ＳＬＰＩの比は、抗原投与前０．７５時間及び０．５時間、並びに抗原投与後０．５時間及び７時間の個体から得た鼻洗浄液のウエスタン分析により算定された（図５ｂ）。患者を、同一時点における症状強度（ルベルスコア）で評価した（図５ａ）。
【００９８】
実施例６
欧州呼吸器学会（European Respiratory Society）（ＥＲＳ）の推奨及び高張又は等張生理食塩水の吸入から成るプロトコールを用いて、被験体から痰を採取した。軽度から中度の喘息患者では、高張食塩水をエアゾール化し、３〜４、５分間吸入することにより痰が誘発された。より重篤な喘息患者では、改良されたＥＲＳプロトコールを用いて通常の生理食塩水で吸入を始め、有意なＦＥＶ１の低下が見られない場合のみ、さらにゆっくりと高張食塩水へと進行させる。
【００９９】
結果を図６に示す。図６は、喘息痰試料は、正常痰試料より高い割合のｃＳＬＰＩ／総ＳＬＰＩを含有し、これらの個体からのキマーゼ量と相関することを示す。痰試料は、正常被験体及び喘息被験体の両方から得られた。ｃＳＬＰＩ対ＳＬＰＩの比と、キマーゼレ
ベルはともに、ウエスタン分析により算定した。値は濃度測定分析により決定した。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ヒトキマーゼによる組み換えヒトＳＬＰＩ（ｒＳＬＰＩ）の分解（digestion）を示す。各レーンの試料は、１−タンパク質のサイズスタンダード（ベックマーク（BechMark）、インビトロジェン（Invitrogen））；２−ＳＬＰＩ、０時間、３−キマーゼ＋ＳＬＰＩ、２０分；４−キマーゼ＋ＳＬＰＩ、１４０分；５−キマーゼ＋ＳＬＰＩ、４時間；６−キマーゼ＋ＳＬＰＩ、２１時間；７−ＳＬＰＩ、２１時間；８−キマーゼ、２１時間；９−１ｕｇキマーゼ；１０−タンパク質のサイズスタンダード（マーク（Mark）−１２、インビトロジェン（Invitrogen））である。
【図２】既知のキマーゼ阻害剤がキマーゼによるｒＳＬＰＩの切断を低減したことを示す。数０、８、８０、８００はｐｍｏｌｅ単位におけるアッセイ混合物中に存在するキマーゼ阻害剤の量を示す。
【図３】キマーゼがヒト唾液試料中に存在するＳＬＰＩを切断できたこと、及びキマーゼ阻害剤が切断を低減したことを示す。
【図４】正常ヒト被験体及びキマーゼ関連疾患患者から採取した唾液試料中のＳＬＰＩ切断レベルを比較したものである。
【図５】ｃＳＬＰＩの増加がアレルギー症状の悪化と相関することを示す。ｃＳＬＰＩの総ＳＬＰＩに対する比は、抗原投与前０．７５時間及び０．５時間、並びに抗原投与後０．５時間及び７時間の個体から得られた鼻洗浄のウエスタン分析により算定した（図５ｂ）。患者は、同一時点における症状強度（ルベル（Lebel）スコア）で評価した（図５ａ）。
【図６】喘息患者の痰試料が正常な痰試料より高い割合のｃＳＬＰＩ／総ＳＬＰＩを含有し、これらの個体からのキマーゼレベルと相関することを示す。痰試料は、正常被験体及び喘息被験体の両方から得られた。ｃＳＬＰＩのＳＬＰＩに対する比及びキマーゼレベルは、ともに、ウエスタン分析により決定した。値は濃度測定解析により決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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