(57)【要約】  Fc領域に１またはそれ以上のアミノ酸置換が導入されている抗グリピカン３抗体が開示される。好ましくは、本発明の抗グリピカン３抗体は、Fc領域の239、298、326、330または332位のアミノ酸残基の１またはそれ以上が別のアミノ酸残基で置換されている。本発明のFc改変型ヒト化抗グリピカン３抗体は、増強されたＡＤＣＣ活性を有するため、肝癌などの癌の治療に有用である。また、本発明の抗グリピカン３抗体および薬学的に許容しうる担体を含む抗癌剤、ならびに癌を有する患者に本発明の抗癌剤を投与することにより癌を治療する方法が開示される。
2009511587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fc領域に１またはそれ以上のアミノ酸置換が導入されている抗グリピカン３抗体。
【請求項２】
Fc領域の239、298、326、330および332位のアミノ酸残基の１またはそれ以上が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体。
【請求項３】
以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239、330および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239、298および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239、298、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体。
【請求項４】
以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239位にアスパラギン酸、330位にロイシン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239位にアスパラギン酸、326位にスレオニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、326位にグルタミン酸、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体。
【請求項５】
以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位のアミノ酸がグルタミン酸に置換されている抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、330位のアミノ酸がロイシン、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、298位のアミノ酸がアラニン、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、326位のアミノ酸がスレオニン、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、298位のアミノ酸がアラニン、326位のアミノ酸がグルタミン酸、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体。
【請求項６】
請求項１−５のいずれかに記載の抗グリピカン３抗体および薬学的に許容しうる担体を含む抗癌剤。
【請求項７】
癌を有する患者において癌を治療する方法であって、前記患者に、請求項６に記載の抗癌剤を投与することを含む方法。
【請求項８】
細胞障害活性が増強されている抗グリピカン３抗体を製造する方法であって、
(i) Fc領域の239、298、326、330および332位のアミノ酸残基の１またはそれ以上が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体をコードするポリヌクレオチドを発現するように加工されている宿主細胞を培養し；そして
(ii) 培養物から抗体を単離する、
ことを含む方法。
【請求項９】
細胞障害活性が増強されている抗グリピカン３抗体を製造する方法であって、
(i) 以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239、330および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239、298および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239、298、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
をコードするポリヌクレオチドを発現するように加工されている宿主細胞を培養し；そして
(ii) 培養物から前記抗体を単離する、
ことを含む方法。
【請求項１０】
細胞障害活性が増強されている抗グリピカン３抗体を製造する方法であって、
(i) 以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239位にアスパラギン酸、330位にロイシン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239位にアスパラギン酸、326位にスレオニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、326位にグルタミン酸、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
をコードするポリヌクレオチドを発現するように加工されている宿主細胞を培養し；そして
(ii) 培養物から前記抗体を単離する、
ことを含む方法。
【請求項１１】
以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) 配列番号34に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(b) 配列番号35に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(c) 配列番号36に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(d) 配列番号37に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(e) 配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗グリピカン３抗体に関する。より詳細には、本発明は、Fc領域のアミノ酸配列が改変されており、増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗グリピカン３抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリピカン３（ＧＰＣ３）は、細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのファミリーの１つであり、発生における細胞分裂や、癌細胞の増殖に関与している可能性があることが示唆されているが、その機能はまだよく解明されていない。
【０００３】
ＧＰＣ３に結合するある種の抗体が、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）活性およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害）活性により細胞増殖抑制作用を有することが見いだされている（WO2003/000883、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００４】
抗体の細胞傷害活性を利用した抗癌剤を開発する場合、用いられる抗体は増強されたＡＤＣＣ活性を有していることが好ましい為、ＧＰＣ３を認識する抗体においても増強された細胞傷害活性を有する抗ＧＰＣ３抗体が望まれていた。
【特許文献１】WO2003/000883
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の抗体と比較して増強された細胞障害活性を有する抗ＧＰＣ３抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、抗グリピカン３抗体のFc領域のアミノ酸配列を改変することにより、増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗グリピカン３抗体が得られることを見いだして、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は、Fc領域に１またはそれ以上のアミノ酸置換が導入されている抗グリピカン３抗体を提供する。
【０００８】
別の観点においては、本発明は、Fc領域の239、298、326、330および332位のアミノ酸残基の１またはそれ以上が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体を提供する。
【０００９】
さらに別の観点においては、本発明は、以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239、330および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239、298および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239、298、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体、
を提供する。
【００１０】
さらに別の観点においては、本発明は、以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239位にアスパラギン酸、330位にロイシン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239位にアスパラギン酸、326位にスレオニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、326位にグルタミン酸、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体、
を提供する。
【００１１】
さらに別の観点においては、本発明は、以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位のアミノ酸がグルタミン酸に置換されている抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、330位のアミノ酸がロイシン、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、298位のアミノ酸がアラニン、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、326位のアミノ酸がスレオニン、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239位のアミノ酸がアスパラギン酸、298位のアミノ酸がアラニン、326位のアミノ酸がグルタミン酸、332位のアミノ酸がグルタミン酸にそれぞれ置換されている抗グリピカン３抗体、
を提供する。
【００１２】
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明の抗グリピカン３抗体および薬学的に許容しうる担体を含む抗癌剤、ならびに、癌を有する患者において癌を治療する方法であって、この患者に、本発明の抗癌剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
さらに別の観点においては、本発明は、細胞障害活性が増強されている抗グリピカン３抗体を製造する方法を提供する。この方法は、
(i) Fc領域の239、298、326、330および332位のアミノ酸残基の１またはそれ以上が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体をコードするポリヌクレオチドを発現するように加工されている宿主細胞を培養し；そして
(ii) 培養物から抗体を単離する、
ことを含む。
【００１４】
さらに別の観点においては、本発明は、
(i) 以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239、330および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239、298および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239、298、326および332位のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている抗グリピカン３抗体；
をコードするポリヌクレオチドを発現するように加工されている宿主細胞を培養し；そして
(ii) 培養物から抗体を単離する、
ことを含む、細胞障害活性が増強されている抗グリピカン３抗体を製造する方法を提供する。
【００１５】
さらに別の観点においては、本発明は、
(i) 以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) Fc領域の332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(b) Fc領域の239位にアスパラギン酸、330位にロイシン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(c) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(d) Fc領域の239位にアスパラギン酸、326位にスレオニン、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
(e) Fc領域の239位にアスパラギン酸、298位にアラニン、326位にグルタミン酸、332位にグルタミン酸を有する抗グリピカン３抗体；
をコードするポリヌクレオチドを発現するように加工されている宿主細胞を培養し；そして
(ii) 培養物から抗体を単離する、
ことを含む、細胞障害活性が増強されている抗グリピカン３抗体を製造する方法を提供する。
【００１６】
さらに別の観点においては、本発明は、以下のいずれかの抗グリピカン３抗体：
(a) 配列番号34に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(b) 配列番号35に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(c) 配列番号36に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(d) 配列番号37に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体；
(e) 配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むCH2-CH3ドメインを有する抗グリピカン３抗体、
を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、Fc領域のアミノ酸配列に改変を有することを特徴とする抗体を提供する。図１に、本発明のFc改変型ヒト化抗グリピカン３抗体の構造およびその製造スキームを示す。
【００１８】
抗体は一般的に約150,000ダルトンのヘテロ四量体であり、2本の同じ軽(L)鎖および2本の同じ重(H)鎖からなる。各軽鎖は、重鎖に1つの共有ジスルフィド結合により連結されているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、抗体のアイソタイプの種類によって異なっている。重鎖および軽鎖はまたそれぞれ一定間隔の鎖内ジスルフィド橋を有する。各重鎖は一つの末端に可変ドメイン(VH)を有し、それに連結された多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン(VL)を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は、重鎖の最初の定常領域と並んでおり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖の可変ドメインのインタフェースを形成していると考えられている(Clothia et al., J.Mol.Biol. 186:651-666 (1985); Novotny and Haber, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4592-4596 (1985)、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【００１９】
脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)とラムダ(λ)と呼ばれる2つの異なる型に分類することができる。また、抗体は、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、異なるクラスに分類することができる。抗体には、少なくとも5つの主要なクラスが存在する：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、そしてさらに、これらのうちの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG-１、IgG-2、IgG-３、およびIgG-4；IgA-1およびIgA-2に分けることができる。異なるクラスの重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ、およびμと各々呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造、および三次元構造は周知である。また、IgG-1のFc領域の配列にはallotypeが存在し、G1m(1)、nG1m(1)、G1m(2)、ｎG1m(2)、G1m(3)、nG1m(17) 等が知られている。(M. S. Schanfield and E. van Loghem, “Human Immunoglobulin Allotypes” Handbook of Experimental Immunology, Vol.3, ch94, pp1-18, Blackwell Scientific Publishers. Oxford, U.K. 1986, 4th Edition、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【００２０】
Fc領域は、ヒンジ部の一部、CH2、CH3ドメインからなる分子量約5万のFcフラグメントが、抗体分子上に占める領域のことをいう。ヒトIgG重鎖Fc領域は、パパインで消化した場合、225位のスレオニンからＣ末端までである（Burton, D. R. 1985. Immunoglobulin G: functional sites. Mol. Immunol. 22:161-206、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００２１】
なお、本発明において使用されるアミノ酸部位のナンバーリングは、Kabatらの「EU index」を用いた方法(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed.  NIH、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を用いる。
【００２２】
Fc領域は、マクロファージ、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞の細胞表面上に存在するFc受容体（Fc receptor：FcR）と結合する。Fc受容体は、抗体依存性細胞障害（ADCC)、アナフィラキシー反応、過敏性反応などに関与している。Fc受容体は免疫グロブリンのサブタイプに対応して異なり、例えば、IgGのFc受容体はFcγ受容体であり、IgEのFc受容体はFcε受容体であり、IgAのFc受容体はFcα受容体である。
【００２３】
CH2-CH3はCH2ドメインとCH3ドメインからなる。ヒトIgG重鎖のCH2-CH3ドメインは233位のアラニンからC末端までである。
【００２４】
Fc改変型抗体
本発明の抗体はＦｃ領域のアミノ酸配列が改変されているＦｃ改変型抗体である。本発明における「改変」または「部位特異的変異の導入（変異の導入）」とは、具体的には、元（改変前）のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。本発明でいう元（改変前）のアミノ酸配列は、通常、天然のFc領域の配列である。なお、本明細書においては、アミノ酸残基の「改変」と「変異の導入」は同一の意味で用いられる。
【００２５】
本発明において、アミノ酸残基の改変は、抗体をコードするDNAを変異させることによって行うことができる。
【００２６】
本発明において「DNAを変異させる」とは、改変されるアミノ酸残基に対応するようにDNAに変異を導入することを言う。より具体的には、元のアミノ酸残基をコードするDNAを、改変されるアミノ酸残基をコードするDNAに変異させることを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンとなるように、元のDNAに対して、少なくとも1塩基を挿入、欠失または置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンは、改変されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このようなDNAの変異は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、例えばPCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００２７】
本発明において改変されるFc領域中のアミノ酸残基の数は特に限定されず、１個または複数個（例えば、1個〜30個、２個、３個、４個または５個など）のアミノ酸残基を改変することが可能である。
【００２８】
好ましくは、Fc領域の239、298、326、330または332位のアミノ酸残基の１またはそれ以上を別のアミノ酸残基で置換する。IgG1のallotypeに関しては、いずれのアロタイプのFc領域のアミノ酸残基を置換することが可能であり、例えばG1m(1)やnG1m(1)のアミノ酸残基を置換することが可能である。
【００２９】
本発明の抗グリピカン３抗体はグリピカン３に結合する限り特に限定されないが、グリピカン３に特異的に結合することが好ましい。グリピカン３の遺伝子配列およびアミノ酸配列は既に公知である（Lage, H. et al., Gene 188（1997）, 151-156、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の抗グリピカン３抗体は、IgGであることが好ましく、特にIgG1であることが好ましい。
【００３０】
細胞障害活性
本発明のFc領域が改変された抗グリピカン３抗体は、天然のまたは野生型のFc領域を有する抗グリピカン３抗体と比較して、細胞障害活性が増強されていることを特徴とする。
【００３１】
細胞障害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補体依存性細胞障害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
【００３２】
抗体がADCC活性を有するか否か、またはCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３３】
例えば、ADCC活性は、エフェクター細胞と標的細胞と抗グリピカン３抗体を混合し、ADCCの程度を調べることにより測定することができる。エフェクター細胞として例えば、マウス脾細胞や骨髄、ヒト末梢血から分離した単核球等を利用することができ、標的細胞としてはヒト肝細胞株HuH-7等のヒト株化細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ51Crにより標識し、これに抗グリピカン３抗体を加えインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベーションを行う。インキュベーション後上清を採取し、上清中の放射活性をカウントすることによりADCC活性を測定することができる。
【００３４】
また、CDC活性は、上述の標識標的細胞と抗グリピカン３抗体を混合し、その後補体を添加してインキュベーションを行い、培養後に上清中の放射活性をカウントすることにより測定することができる。
【００３５】
抗体
本発明における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、抗体変異体、抗体断片、多特異性抗体(例えば、二特異性抗体)、キメラ抗体、ヒト化抗体等、如何なる抗体も含まれる。
【００３６】
抗体および免疫グロブリンは同じ構造特性を有する蛋白質であり、本発明における抗体には、免疫グロブリンも含まれる。
【００３７】
本明細書中の「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一般に単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、典型的には異なる抗原決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む慣用のポリクローナル抗体調製物と比べて、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入していないハイブリドーマ培養などにより合成される点で有利である。なお、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを要求するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法(Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、または、組換え方法(米国特許第4,816,567号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【００３８】
「抗体断片」という用語は全長抗体の一部を指す。本発明において用いられる抗体断片は、全長抗体の抗原結合活性を維持しており、さらに細胞障害活性を維持している抗体断片が好ましい。
【００３９】
多特異性抗体は、少なくとも2種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は2個の抗原を結合するものであるが(即ち、二重特異性抗体)、本明細書中では「多特異性抗体」は、それ以上(例えば、3種類の)抗原に対して特異性を有する抗体をも包含する。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片であり得る。例えば、二重特異性抗体の場合、2つの異なる抗原を認識してもよいし、同一抗原の異なるエピトープを認識してもよい。また、一方が細胞障害性物質などを認識してもよい。
【００４０】
また、本発明の抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および定常領域とからなる。
【００４１】
キメラ抗体における可変領域、またはヒト化抗体におけるCDRの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などの配列を用いることが可能である(Cook WJ et al., Protein Eng. 1996 Jul 9(7):623-8; Tsurushita N et al., J Immunol Methods. 2004 Dec 295(1-2):9-19; Sato K et al, Mol Immunol. 1994 Apr 31(5):371-81; Preparation of genetically engineered monoclonal antibodies for human immunotherapy. Hum Antibodies Hybridomas. 1992 Jul 3(3):137-45; Genetically engineered antibodies: progress and prospects. Crit Rev Immunol. 1992;12(3-4):125-68、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【００４２】
キメラ抗体およびヒト化抗体の定常領域には、通常、ヒト抗体のものが使用され、例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4などを、L鎖ではCκ、Cλなどを使用することができる。
【００４３】
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、マウス抗体の可変領域をコードするDNAとヒト抗体の定常領域をコードするDNAとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入してキメラ抗体を産生させることにより得られる。
【００４４】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものである。ヒト化抗体の一般的な遺伝子組換え手法は知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４５】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388号公報に記載の方法を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４６】
CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.etal., CancerRes.（1993）53, 851-856、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
さらに、本発明の抗体には、上述のＦｃ領域の特定の位置およびＣＤＲ領域以外の領域のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、かつ該抗体と機能的に同等な抗体も含まれる。
【００４８】
あるポリペプチドとアミノ酸配列が異なるが機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
【００４９】
変異するアミノ酸残基については、アミノ酸側鎖の性質が似ている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を実質的に維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５０】
本発明に使用する抗体は、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、化学的修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681, 、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【００５１】
抗体の製造
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
【００５２】
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などを用いることができる。
【００５３】
抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（QIAGEN社製）、pEGFP、またはpET（この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
【００５４】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００５５】
大腸菌発現ベクターの他、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００５６】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、CAGプロモーター（Gene. (1991) 108, 193、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００５７】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００５８】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明の抗体は、増強された細胞障害活性を示すので医薬組成物として用いるのに適しており、特に抗癌剤として有用である。さらに、抗グリピカン３抗体が肝癌細胞に対して細胞障害活性を有することが報告されていることから（国際公開公報ＷＯ０３／００８８３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、本発明の抗体は特に肝癌治療剤として有用である。また、本発明の抗体は、医薬組成物として用いる場合には、人に対する抗原性などの点からヒト化されていることが好ましい。
【００５９】
本発明の医薬組成物には、薬学的に許容される担体が含まれてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤(アスコルビン酸等)、緩衝剤(リン酸、クエン酸、他の有機酸等)、防腐剤、界面活性剤(PEG、Tween等)、キレート剤(EDTA等)、または結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンおよびリシン等のアミノ酸、多糖および単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等と併用してもよい。
【００６０】
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
【００６１】
患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与である。本発明の医薬組成物の形態（剤型）としては、特に制限はなく、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与剤型、凍結乾燥剤型、溶液剤型などが挙げられるが、好ましくは凍結乾燥剤型を挙げることができる。
【００６２】
凍結乾燥は、当業者に周知の方法によって実施できる（Pharm Biotechnol, 2002, 13, 109-33、Int J Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60、Pharm Res. 1997, 14(8), 969-975、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、溶液を凍結乾燥に用いるバイアル等の容器に適当量分注し、凍結庫または凍結乾燥庫中にて行なうか、またはアセトン／ドライアイス、液体窒素などの冷媒中に浸漬して行なうまた、抗体製剤を高濃度溶液製剤にする場合は、当業者に周知の方法によって実施できる。例えば、J. Pharm.Sc, 2004, 93(6), 1390-1402（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、TFF膜を利用した膜濃縮法が用いられる。
【００６３】
注射剤型は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状によって適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるものではない。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００６５】
［実施例1］  Fc改変型抗GPC3抗体の作成
［実施例1-1］  変異導入用Fc カセットの作成
配列番号１９に示されるＨ鎖のアミノ酸配列において以下の表に示されるアミノ酸置換を有するFc改変型ヒト化抗GPC3抗体を作成した。これらの抗体の構造およびその作成スキームは図１に示される。
【００６６】
【表１】
2009511587.tif 000003
【００６７】
配列番号１から９で示したプライマーを用いてPCR-Walking法で、V22、V209、V212、V922およびV1608と命名した5種類のFc改変型抗体をコードするＤＮＡを作成するためのFc変異カセットを合成した。すなわちV22、V209、V922についてはcommonF1とcommonR1プライマーを用い、またV212、V1608については212-F1と212-R1のプライマーの組み合わせを用いて、以下のPCR反応用液で1段階目のPCR反応を行なった。
×10 KOD buffer 5μL、KOD polymerase(TOYOBO社)付属dNTPsおよびMgCl2  各 5μL、2μL加えこれに20μmole/L の上記組み合わせのプライマーを各1μL、dH2O 35.5μL 、5 ユニット/μL KOD polymerase 0.5μL を加えて全量を50μLとし、以下の条件でPCRを行なった。
96℃ 1min →（98℃ 15sec →65℃ 2sec → 74℃ 15sec）×  2 cycles →  74℃ 30sec →4℃
【００６８】
得られた1段階目の増幅産物から1μLを取り、これを2段階目のPCR反応に供した。すなわちV22、V212に対してはCommonF2と212-R2のプライマーを用い、V209に対してはCommonF2と209-R2プライマー、V922に対してはcommonF2と922-R2プライマー、V1608に対してはcommonF2と1608-R2プライマーを用いて以下のPCR反応用液で2段階目のPCR反応を行なった。
×10 KOD buffer 5μL、KOD polymerase(TOYOBO社)付属dNTPsおよびMgCl2  各 5μL、2μL加え、これに20μmole/L の上記組み合わせのプライマーを各1μL、鋳型として各1段階目の増幅産物1μL、dH2O 35.5μL 、5 ユニット/μL KOD polymerase 0.5μL を加えて全量を51μLとし、以下の条件でPCRを行なった。
96℃ 1min →（98℃ 15sec →65℃ 2sec → 74℃ 15sec）×  5 cycles →  74℃ 30sec →4℃
【００６９】
得られた２段階目の増幅産物から1μLを取り、これを3段階目のPCR反応に供した。すなわちV22、V209、V212、V922およびV1608に対してはCommonF3とcommon-R3プライマーを用いて以下のPCR反応用液で3段階目のPCR反応を行なった。
×10 KOD buffer 5μL、KOD polymerase(TOYOBO社)付属dNTPsおよびMgCl2  各 5μL、2μL加えこれに20μmole/L の上記組み合わせのプライマーを各1μL、鋳型として各2段階目の増幅産物1μL、dH2O 35.5μL 、5 ユニット/μL KOD polymerase 0.5μL を加えて全量を51μLとし、以下の条件でPCRを行なった。
96℃ 1min →（98℃ 15sec →65℃ 2sec → 74℃ 20sec）×  35 cycles →  
74℃ 1min →4℃
得られた各断片はpBluscriptSK＋にサブクローニングし配列を確認した。
【００７０】
フォワードプライマー212-F１（配列番号１）
agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacgccacgtaccgtgtggtcagcgtcc
フォワードプライマーcommonF2（配列番号２）
tctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggagg
フォワードプライマーcommonF３（配列番号３）
gcacctgagctcctggggggaccggacgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg
リバースプライマー212-R１（配列番号４）
ggagaccttgcacttgtactccttgccattcagccagtcctggtgcaggacggtgaggacgctgaccacacggtacgtggcgttgtactgctcc
リバースプライマー209-R2（配列番号５）
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggcagtgggagggctttgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc
リバースプライマー212-R2（配列番号６）
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggctttgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc
リバースプライマー922-R2（配列番号７）
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcggtgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc
リバースプライマー1608-R2（配列番号８）
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcctcgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc
リバースプライマーcommonR3（配列番号９）
gagctccccgggatgggggcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgg
【００７１】
［実施例1-2］  Fc改変型抗GPC３抗体発現ベクターの作成
本発明者らが先に作成したヒト化抗GPC３抗体をコードする遺伝子（配列番号１０（Ｈ鎖）および配列番号１３（Ｌ鎖））に基づいて、本発明のFc改変型抗GPC３抗体を発現させるためのベクターを構築した。以下の実施例では、このヒト化抗GPC３抗体を野生型と称する。野生型ヒト化抗GPC3抗体のH鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号21(ver.k)に、L鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号22(ver.a)に示す。又、野生型ヒト化抗GPC3抗体のCDR配列は以下の通りである。
H鎖 CDR1  DYEMH（配列番号23）
CDR2  ALDPKTGDTAYSQKFKG（配列番号24）
CDR3  FYSYTY（配列番号25）
L鎖 CDR1  RSSQSLVHSNGNTYLH（配列番号26）
CDR2  KVSNRFS（配列番号27）
CDR3  SQNTHVPPT（配列番号28）
【００７２】
配列番号１０で示した抗ヒトGPC3抗体H鎖遺伝子を鋳型として配列番号１１および予めサイレント変異としてSacIサイトを導入した配列番号１２で示したプライマーを用いてPCRを行なった。
×10 KOD buffer 5μL、KOD polymerase(TOYOBO社)付属dNTPsおよびMgCl2  各 5μL、2μL加えこれに20μmole/L の上記組み合わせのプライマーを各1μL、鋳型としてGPC3抗体H鎖遺伝子1μL、dH2O 34.5μL 、5 ユニット/μL KOD polymerase 0.5μL を加えて全量を50μLとし、以下の条件でPCRを行なった。
96℃ 1min →（98℃ 15sec →65℃ 2sec → 74℃ 30sec）×  35 cycles →  74℃ 30sec →4℃
【００７３】
得られた断片は、予めDNA blunting kit (タカラバイオ)でSacI部位をfill inして潰したpBluescriptSK+（pB-Sacless）のSmaIサイトに導入し、配列を確認した（pB-GPCSacmt）。次に配列番号１０で示す抗GPC3抗体H鎖遺伝子を含むベクターから抗ヒトGPC3抗体H鎖のC末端配列に相当するおよそ290bpのSmaI−BamHI断片を切り出し、pB-GPCSacmtの同サイトに導入し配列を確認した（pB-GPCSacmtC）。次にpB-GPCSacmtCのSacI-SmaIサイトに実施例１-１で作成したV22、V209、V212、V922およびV1608のFc変異カセットを導入し、配列を確認した。さらに変異導入H鎖を完成させるため、配列番号１０で示すGPC3抗体H鎖遺伝子のおよそ415bpのEcoRI-NheI断片を連結し、それぞれのFc変異導入H鎖遺伝子を得た。
【００７４】
得られた変異導入H鎖遺伝子をEcoRI-NotIで切り出し、動物細胞発現用ベクターpCXND3の同サイトへ導入した（pC-aGPCh）。続いて配列番号１３で示した抗GPC3抗体L鎖遺伝子およびプロモーター領域を含むおよそ3.1kbの断片をHindIIIで切り出し、pC-aGPChの同サイトに連結して、抗GPC3抗体発現ベクター（pC-aGPChl）を得た。V22、V209、V212、V922、V1608のそれぞれに対するpC-aGPChlを（pC-aGPChl(22)、 pC-aGPChl(209)、 pC-aGPChl(212)、 pC-aGPChl (922)、pC-aGPChl(1608)と命名した。
【００７５】
V22、V209、V212、V922およびV1608のH鎖のアミノ酸配列は、V22（配列番号29）、V209（配列番号30）、V212（配列番号31）、V922（配列番号32）、V1608（配列番号33）に示される。又、V22、V209、V212、V922およびV1608のCH2-CH3ドメインのアミノ酸配列は、V22 CH2-CH3ドメイン（配列番号34）、V209 CH2-CH3ドメイン（配列番号35）、V212 CH2-CH3ドメイン（配列番号36）、V922 CH2-CH3ドメイン（配列番号37）、V1608 CH2-CH3ドメイン（配列番号38）に示される。
【００７６】
抗ヒトGPC3抗体H鎖（配列番号１０）
GAATTCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGACTATGAAATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGCTCTTGATCCTAAAACTGGTGATACTGCCTACAGTCAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACGCTGACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTACAAGATTCTACTCCTATACTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATAAGCGGCCGCGGATCC
フォワードプライマーNS-F（配列番号１１）
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctcc
リバースプライマーNS-R（配列番号１２）
gagctcaggtgctgggcacggtgggcatgtgtgagttttgtcac
抗ヒトGPC3抗体L鎖（配列番号１３）
AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGAGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATAGGAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAAATACACATGTTCCTCCTACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAGGTCGAGGAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTT
【００７７】
［実施例1-3］  V209  nG1m(1) アロタイプの作成
G1m(1)アロタイプであるV209のnG1m(1)アロタイプを取得するため、nG1m(1)アロタイプ用カセットを作成した。すなわち、配列番号１４、１５で示したフォワードプライマーHerSmaFおよびリバースプライマーHerNotRを用いて、実施例１−２で作成した配列番号１０で示す抗GPC3抗体H鎖遺伝子を鋳型として以下の条件でPCRを行なった。
×10 KOD buffer 5μL、KOD polymerase(TOYOBO社)付属dNTPsおよびMgCl2  各 5μL、2μL加えこれに20μmole/L の上記組み合わせのプライマーを各1μL、GPC3抗体H鎖遺伝子1μL、dH2O 34.5μL 、5 ユニット/μL KOD polymerase 0.5μL を加えて全量を50μLとし、以下の条件でPCRを行なった。
96℃ 1min →（98℃ 15sec →65℃ 2sec → 74℃ 30sec）×  35 cycles →  74℃ 30sec →4℃
【００７８】
得られた断片はpBluescriptSK+にサブクローニングし（pBher）、配列確認を行なった。次に、実施例１-２で記載したpC-aGPChl(209) からおよそ290bpのSmaI−NotI断片を切り出し、一方でpBherから同様にSmaI−NotI断片を切り出し、約290bpの断片をpC-aGPChl(209)の同サイトへ導入することにより置換して、nG1m(1)アロタイプ発現ベクター（pC-aGPChl(209Her)）を得た。
フォワードプライマーHerSmaF（配列番号１４）
gggaggagatgaccaagaaccaggtcaccctgacctgcc
リバースプライマーHerNotR(配列番号１５)
tttgcggccgcttatcatttacccggagacagggagaggctc
【００７９】
［実施例2］  Fc改変型抗GPC３抗体の調製
［実施例2-1］  Fc改変型抗GPC３抗体のCHO細胞での発現
10ugのFc改変型抗GPC3抗体発現ベクターpC-aGPChl(22)、 pC-aGPChl(209)、 pC-aGPChl(212)、 pC-aGPChl (922)、pC-aGPChl(1608)およびpC-aGPChl(209Her)をそれぞれPvuIで切断し、linear DNAとした。これを2×106／0.6 mL PBS(-)のCHO細胞（DXB11S株）へ、エレクトロポレーション法で1.5kV, 25uFの条件で導入した。培養は8% CO2インキュベーター内で37℃で行った。CHO-S-SFMII培地（Invitrogen社）に400ug/mL ジェネティシンを加えて細胞を選択した後、96ウェルプレート（Falcon社）に400ug/mL ジェネティシンを含むCHO-S-SFMII培地中、0.4 細胞/ 100uL / ウエルで播き込み、限界希釈法にて細胞のクローニングを行った。培養上清の分析はBIACORE３０００を用い、抗原としてGSTと配列番号１６で示すヒトGlypican3の融合蛋白GST-GPC3を固定化したチップを用いて抗体を定量し、高発現株を選択した。
GPC3ペプチドのアミノ酸配列(配列番号１６)
AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLK
【００８０】
［実施例2-2］  Fc改変型抗GPC3抗体の精製
Fc改変型ヒト化抗グリピカン抗体発現CHO細胞株の培養上清を150 mM NaClを含む10 mM クエン酸-リン酸緩衝液, pH 7.5で平衡化したrProtein A Sepharose Fast Flowカラムに添加した。同緩衝液、1 M NaClを含む10 mM クエン酸-リン酸緩衝液, pH 7.5、次に10 mM クエン酸-リン酸緩衝液, pH 7.5でカラムを洗浄した後に20 mM 酢酸でカラムに吸着した蛋白を溶出した。Fc改変型ヒト化抗グリピカン抗体を含む20 mM 酢酸画分に1 M トリス-塩酸緩衝液, pH 8.5を添加して画分のpHを5-6に調整し0.22 μｍのフィルターで濾過した画分に等量のミリQ水を加え20 mM 酢酸緩衝液, pH 6.0で平衡化したSP Sepharose Fast Flowカラムに添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、200 mM NaClを含む20 mM 酢酸緩衝液, pH 6.0でカラムに吸着した蛋白質を溶出し、Fc改変型ヒト化抗グリピカン抗体精製画分を得た。
【００８１】
図２は精製したFc改変型ヒト化抗グリピカン抗体を公知の方法[ネイチャー(Nature)、227, 680, 1970、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる]に従ってSDS-PAGE（ポリアクリルアミド電気泳動）し、分子量および精製度を解析した結果を示す。精製された各Fc改変型ヒト化抗グリピカン抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約150kDaの単一のバンドが、還元条件下では約50kDaと約25kDaの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のH鎖およびL鎖のcDNAの塩基配列から推測される分子量と実質的に一致し、さらに、IgG型の抗体は、非還元条件下では分子量は約150kDaであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合が切断され、約50kDaの分子量を持つH鎖と約25kDaの分子量を持つL鎖に分解されるという報告［Antibodies、Chapter 14、Monoclonal Antibodies、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］と一致し、各Fc改変型ヒト化抗グリピカン抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
【００８２】
図３は精製したFc改変型ヒト化抗グリピカン３抗体について、ゲル濾過カラム（Superdex 200 PC3.2/30, GE Amersham Biosciences社製)で分析したクロマトグラムである。
【００８３】
［実施例3］Fc改変型抗GPC3抗体のADCC活性測定
［実施例3-1］ヒトグリピカン３（GPC3)のcDNAクローニング
ヒトGPC3をコードする全長cDNAは、大腸癌細胞株Caco2より常法により調製した第１鎖cDNAを鋳型とし、Advantage2 kit（CLONTECH社）を用いたPCR反応により増幅した。すなわち、2 μlのCaco2由来cDNA、1μlのセンスプライマー（GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT：配列番号１７）、1μlのアンチセンスプライマー（GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC：配列番号１８）、5μlのAdvantage2 10xPCR buffer、8μlのdNTP mix (1.25 mM)、1.0μlのAdvantage polymerase Mixを含む50μlの反応液を、94 ℃で1分、63 ℃で30秒、68 ℃で3分からなるサイクルを35回行った。PCR反応による増幅産物はpGEM-T Easy Vector System I（Promega社）を用いてTAベクターpGEM-T easyに挿入した。ABI3100 DNAシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトGPC3の全長をコードするcDNAを単離した。ヒトGPC3遺伝子の塩基配列を配列番号１９に、ヒトGPC3タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に、それぞれ示す。
【００８４】
［実施例3-2］全長ヒトGPC3発現ヒト肝癌細胞株（ＳＫ−０３）の作製
抗GPC3抗体の生物活性評価用の細胞株を得るために、全長GPC3を発現するヒト肝癌細胞株の樹立を行った。
【００８５】
PvuIで処理した1μｇの全長ヒトGPC3遺伝子発現ベクターを、２μＬのFuGENE（Roche社）と混合し、複合体を形成させた後に、SK-HEP-1細胞（ATCCより購入）に添加することにより、遺伝子導入を行った。CO2インキュベーターで24時間培養後、終濃度1 mg/mLのジェネティシン(Invitrogen社)および10％ FBSを含むダルベッコMEM（D-MEM, SIGMA社）を用いて、GPC3発現株を選抜した。得られたジェネティシン耐性コロニーを集め、限界希釈法により細胞のクローニングを行った。それぞれの細胞クローンのヒトGPC3の発現はキメラGC33抗体とFITC標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(ICN社)を用いたフローサイトメトリにより確認し、安定発現細胞株SK-03を取得した。
【００８６】
［実施例3-3］ヒト末梢血由来PBMCを用いたADCC活性の測定
［実施例3-3-1］ヒトPBMC溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、PBS(-)で2倍に希釈し、Ficoll-PaqueTM PLUS(Amersham社)に重層した。これを遠心（500×g、30分間、20℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。3回洗浄後、10% FBS/RPMIに懸濁し、ヒトPBMC溶液とした。
【００８７】
［実施例3-3-2］標的細胞の調製
SK-03細胞は1mg/mLのジェネティシンと10%FBS（ThermoTrace社製）を含むD-MEM培地（SIGMA社製）にて維持継代し、Cell Dissociation Buffer (Invitrogen社)を用いてディッシュから剥離し、96ウェルU字底プレート(Falcon)の各ウェルに1×104細胞/ウェルで分注し、１日間培養した。培養後、5.55MBqのクロム-51を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃４時間培養し、この細胞を培地で1回洗浄し、50μLの10%FBS/RPMI1640培地に懸濁して標的細胞とした。
【００８８】
［実施例3-3-3］クロム遊離試験（ADCC活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液50μLを添加し、室温で15分反応させた後に、ヒトPBMC溶液100μL（５×105 細胞/ウェル）を加え遠心後、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃4時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清100μL中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(%)＝(A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Bは標的細胞に2% NP-40水溶液(Nonidet  P-40、Code No.252-23、ナカライテスク株式会社)を100 μL、10%FBS/RPMI培地を50 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞に10%FBS/RPMI培地を150 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。
【００８９】
試験は三重で行い、ADCC活性（%）について平均値を算出した。
【００９０】
その結果を図４に示した。Fc改変型ヒト化抗グリピカン抗体V22, V209, V922, V1608およびV209(nG1m(1))はいずれも野生型抗体(WT)と比較して増強されたADCC活性を示し、そのうちV22は他のバージョンよりも活性が低かったが、V209, V922, V1608およびV209(nG1m(1))の間にはほとんど活性の差が認められなかった。
【００９１】
［実施例3-4］マウス骨髄由来エフェクター細胞を用いたADCC活性の測定
［実施例3-4-1］マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液の調製
SCIDマウス（日本クレア・オス・１０週齢）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、10%FBS/RPMI1640培地中５×１０５個／ｍＬとなるよう懸濁し、マウスGM-CSF(PeproTech）およびヒトIL-2（PeproTech)をそれぞれ10ng/mL、50ng/mLとなるよう添加し、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃5日培養した。培養後スクレーパーではがして培地で1回洗浄し、10%FBS/RPMI1640培地中5×１０６／ｍＬとなるよう懸濁し、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液とした。
【００９２】
［実施例3-4-2］標的細胞の調製
ヒト肝癌細胞株HepG2（ATCCより購入）は10%FBS（ThermoTrace社製）を含むRPMI1640培地（SIGMA社製）にて維持継代し、Cell Dissociation Buffer (Invitrogen社)を用いてディッシュから剥離し、96ウェルU字底プレート(Falcon)の各ウェルに1×104細胞/ウェルで分注し、１日間培養した。培養後、5.55MBqのクロム-51を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃４時間培養し、この細胞を培地で1回洗浄し、50μLの10%FBS/RPMI1640培地に懸濁して標的細胞とした。
【００９３】
［実施例3-4-3］クロム遊離試験（ADCC活性）
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液50μLを添加し、室温で15分反応させた後に、マウス骨髄由来エフェクター細胞溶液100μL（５×105細胞/ウェル）を加え遠心後、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃4時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清100μL中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(%)＝(A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Bは標的細胞に2% NP-40水溶液(Nonidet  P-40、Code No.252-23、ナカライテスク株式会社)を100 μL、10%FBS/RPMI培地を50 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞に10%FBS/RPMI培地を150 μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。
【００９４】
試験は三重で行い、ADCC活性（%）について平均値及を算出した。
【００９５】
その結果を図５に示した。Fc改変型ヒト化抗グリピカン抗体V22, V209, およびV1608はいずれも野生型抗体(WT)と比較して増強されたADCC活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明のFc改変型ヒト化抗グリピカン３抗体は、肝癌などの癌の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、本発明のFc改変型ヒト化抗グリピカン３抗体を作成するスキームを示す。
【図２】図２は、精製したFc改変型ヒト化抗グリピカン３抗体を還元条件および非還元条件でSDS-PAGEで分析した結果を示す。
【図３】図３は、精製したFc改変型ヒト化抗グリピカン３抗体をゲル濾過カラムで分析した結果を示す。
【図４】図４は、各Fc改変型および野生型ヒト化抗グリピカン-3抗体について、ヒト末梢血由来PBMCを用いて、SK-03細胞に対するADCC活性を評価した結果を示す。
【図５】図５は、各Fc改変型および野生型ヒト化抗グリピカン-3抗体について、マウス骨髄由来エフェクター細胞を用いて、HepG2細胞に対するADCC活性を評価した結果を示す。
【図１】
2009511587.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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