(57)【要約】多価及びアジュバント化ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む組成物について記載する。又、ＨＩＶの処置及び予防にこれらの組成物を使用する方法も提供する。本発明のＨＩＶエンベロープ組成物は、２種類以上（少なくとも２種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含み、このエンベロープポリペプチドの少なくとも２種類がそれぞれ異なるＨＩＶサブタイプに由来する。また、ＨＩＶエンベロープ組成物は、３種類以上（少なくとも３種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含み、このエンベロープポリペプチドの少なくとも３種類がそれぞれ異なるＨＩＶサブタイプに由来する。更なる一実施形態において、このＨＩＶエンベロープ組成物は、１種類以上のアジュバント（ＭＦ５９、ＣｐＧ分子、ＰＬＧ微粒子等の微粒子、ミョウバン等）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＨＩＶエンベロープポリペプチド及び第２のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、該第１及び第２のエンベロープポリペプチドが異なるＨＩＶサブタイプに由来する、免疫原性組成物。
【請求項２】
１種類以上のアジュバントも更に含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記１種類以上のアジュバントが、ＭＦ５９、ＣｐＧ分子、微粒子、ミョウバン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ＨＩＶエンベロープポリペプチドが、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０及びｇｐ１６０ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
少なくとも１種類のＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドが、ｇｐ１４０ポリペプチドを含み、該ｇｐ１４０ポリペプチドがオリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
２種類以上のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、該エンベロープポリペプチドの少なくとも２種類がそれぞれ異なるＨＩＶサブタイプに由来する、免疫原性組成物。
【請求項７】
３種類以上のＨＩＶエンベロープタンパク質を含み、該エンベロープポリペプチドの少なくとも３種類がそれぞれ異なるＨＩＶサブタイプに由来する、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
１種類以上のアジュバントも更に含む、請求項６又は請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記１種類以上のアジュバントが、ＭＦ５９、ＣｐＧ分子、微粒子、ミョウバン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記微粒子がＰＬＧ微粒子を含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ＨＩＶエンベロープポリペプチドが、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０及びｇｐ１６０からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項６〜１０の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
少なくとも１種類のＨＩＶエンベロープポリペプチドがｇｐ１４０ポリペプチドを含み、該ｇｐ１４０ポリペプチドがオリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）である、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記ｏ−ｇｐ１４０がプロテアーゼ開裂部位における変異を含む、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ＨＩＶエンベロープポリペプチドの１種類以上が、Ｖ２ループの欠失、Ｖ１ループの欠失、Ｖ３ループの欠失又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１３の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記ＨＩＶエンベロープポリペプチドが、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ及び組換え型流行株（ＣＲＦ）からなる群より選択される２種類以上のサブタイプに由来する、請求項１〜１４の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記２種類以上のサブタイプがサブタイプＡ及びＢを含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記２種類以上のサブタイプがサブタイプＡ及びＣを含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記２種類以上のサブタイプがサブタイプＢ及びＣを含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記２種類以上のサブタイプがサブタイプＢ及びＥを含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドの１種類以上が、ＣＤ４、ＣＤ４模倣物、ＣＣＲ５共受容体又は模倣物、ＴＡＴ、他のウイルスタンパク質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１種類以上の更なる分子と複合体を形成する、請求項１〜１９の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７２７，６６５号およびの２００５年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７５４，４６６号の利益を請求する。上記出願の教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明はその全体又は一部が、米国国立アレルギー感染病研究所によるＮＩＡＩＤ−ＮＩＨ  ＨＩＶＲＡＤ助成金番号５Ｐ０１  ＡＩ４８２２５−０３の支援を受けて行われたものである。米国政府は、本発明の特定の権利を有する場合がある。
【０００３】
（技術分野）
本発明は一般的に、多価ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質を含む組成物に関する。本発明は又、前記組成物を使用して免疫応答を誘発する、例えば中和スペクトルの広い抗体応答を誘発する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
２０世紀後半から最も猛威を振るった疾患の１つに、ＨＩＶ感染が原因となる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）がある（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照）。ＨＩＶ−１（欧州又は米国で分離された数株を意味する総称）及びＨＩＶ−２（多くの西アフリカ諸国に固有の株）を含めたＨＩＶの株が幾つか知られている。ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）は、系統発生学的解析によって３つの群、即ち、Ｍ（ｍａｊｏｒ）群、Ｏ（ｏｕｔｌｉｅｒ）群、並びにカメルーンにおけるその発生地と関連付けられてきたＨＩＶ−１の変異体、即ち指定されたＮ群（非特許文献５）に分類される。３つのＨＩＶ−１群は、全てＡＩＤＳの原因となる。
【０００５】
ＡＩＤＳ患者は、通常、長い無症状期間の後に免疫系及び中枢神経系の進行性変性を発現する。組織培養において、ウイルスの複製を高度に調節し、ＣＤ４陽性ヘルパーＴリンパ球サブセットの潜伏感染や溶解感染が発現する（非特許文献６）。ＨＩＶ−１の分子研究により、これが、全てのレトロウイルスに共通する３つの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含めた幾つかの遺伝子をコードすることが明らかにされている（非特許文献７；非特許文献８）。又、他のレトロウイルス、特にＨＩＶ−２やサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ（以前の呼称はＳＴＬＶ−ＩＩＩ））のウイルスゲノムのヌクレオチド配列も、これらの構造遺伝子を含む（非特許文献９）。
【０００６】
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶのエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄ（ｇｐ１６０）の糖タンパク質である。宿主細胞のウイルス感染の際に、ｇｐ１６０は宿主細胞のプロテアーゼにより開裂され、ｇｐ１２０及び必須膜タンパク質（ｇｐ４１）が形成される。ｇｐ４１部分はビリオンの膜二重層内に固定されるが、ｇｐ１２０部分は周囲の外部に突出する。ｇｐ１２０及びｇｐ４１は更に共有結合し、ビリオンや感染細胞の表面から遊離ｇｐ１２０が放出される可能性がある。
【０００７】
ＣＤ４及び／又は共受容体にリガンド結合するｇｐ１２０の結晶学的研究により、特定の発生構造を有する２つの主要ドメインにこのポリペプチドが折りたたまれることが示されている。内側ドメイン（Ｎ末端及びＣ末端に対して内側）は、その末端から近端に小さな５本鎖サンドイッチを有し、Ｖ１／Ｖ２ステムが発生する遠端に突起を有する２本ヘリックスの２本鎖バンドルを特徴とする。外側ドメインは、外側バレルの軸と内側バンドルの軸が殆ど平行になるように内側ドメインに並んで位置する、領域化された二重バレルである。遠位の内側ドメインと遠位の外側ドメインの間には、内側ドメインと外側のドメインとＶ１／Ｖ２ドメインとに接触するがそれらとは異なる固有のミニドメインを有する４本鎖の架橋シートがある。この架橋シートは、４本のβ鎖構造（β−３、β−２、β−２１、β−２０）から構成される。架橋領域は主に内側ドメインに包まれるが、Ｐｈｅ３８２等の外側ドメインの表面残基の一部は、その疎水性コアの部分を形成する架橋シート内に到達する。特許文献１も参照されたい。最近になり非特許文献１０に示された通り、エンベロープ糖タンパク質（例えば、ＳＩＶエンベロープ）は、リガンド結合しない場合、多種多様の構造を示す。
【０００８】
ＨＩＶエンベロープポリペプチドの免疫原性も研究されてきたが、中和スペクトルの広い抗体応答は依然として観察されていない。例えば、非特許文献１１；非特許文献１１；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０を参照されたい。
【特許文献１】国際公開第００／３９３０３号パンフレット
【非特許文献１】Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：８６８−８７１
【非特許文献２】Ｇａｌｌｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５００−５０３
【非特許文献３】Ｌｅｖｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：８４０−８４２
【非特許文献４】Ｓｉｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０５：１４３９−１４４４
【非特許文献５】Ｓｉｍｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ４：１０３２−１０３７
【非特許文献６】Ｚａｇｕｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：８５０−８５３
【非特許文献７】Ｒａｔｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：２７７−２８４
【非特許文献８】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：４８４−４９２
【非特許文献９】Ｇｕｙａｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：６６２−６６９
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：８３４−８４１
【非特許文献１１】Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：６７８６−６７７２
【非特許文献１２】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：２１０７−２１４４
【非特許文献１３】Ｐｕｔｎｅｙ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３９２−１３９５
【非特許文献１４】Ｒｕｓｈｅ，  Ｊ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：３１９８−３２０２
【非特許文献１５】Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  Ｔ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９７０９−９７１３
【非特許文献１６】Ｎａｒａ，  Ｐ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：２６２２−２６２８
【非特許文献１７】Ｐａｌｋｅｒ，  Ｔ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：１９３２−１９３６）
【非特許文献１８】Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４（１３）：１１２９−１１３９
【非特許文献１９】Ｗｙａｔｔ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９：５７２３−５７３３
【非特許文献２０】Ｌｅｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４：１５１−１５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、被験体の中和スペクトルの広い抗体応答を誘発することができる組成物が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、多価ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）組成物に関する。特定の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ組成物は、２種類以上（少なくとも２種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含むものであって、前記エンベロープポリペプチドの少なくとも２種類がそれぞれ異なるＨＩＶサブタイプに由来するものである。別の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ組成物は、３種類以上（少なくとも３種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含むものであって、前記エンベロープポリペプチドの少なくとも３種類がそれぞれ異なるＨＩＶサブタイプに由来するものである。更なる一実施形態において、ＨＩＶエンベロープ組成物は、１種類以上のアジュバント（ＭＦ５９、ＣｐＧ分子、ＰＬＧ微粒子等の微粒子、ミョウバン等）を含む。特定の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ組成物は、ＣｐＧ等の免疫賦活薬分子を含む。従って、特定の実施形態において、本発明は、２種類以上（少なくとも２種類）のアジュバント化ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む多価組成物に関する。
【００１１】
他の実施形態において、多価ＨＩＶエンベロープ組成物は、２種類以上（少なくとも２種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含むものであって、前記エンベロープポリペプチドの少なくとも２種類がそれぞれ異なるＨＩＶタイプ（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）に由来するものである。更に他の実施形態において、多価ＨＩＶエンベロープ組成物は、２種類以上（少なくとも２種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドを含むものであって、前記エンベロープポリペプチドの少なくとも２種類がそれぞれ、同じサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−１ＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５等）の異なる株に由来するものである。
【００１２】
特定の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質はｇｐ１２０を含む。他の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質はｇｐ１４０を含む。更に他の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質はｇｐ１６０を含む。本明細書に記載の組成物の何れかにおいて、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質は、モノマー又はオリゴマーの形態で発現される可能性がある。特定の一実施形態において、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質はオリゴマーｇｐ１４０（ｏ−ｇｐ１４０）を含む。別の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質は、Ｖ２ループの一部の欠失を含むオリゴマーｇｐ１４０を含む。他の実施形態において、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質は、Ｖ１ループの一部の欠失を含むオリゴマーｇｐ１４０ポリペプチド、Ｖ３ループの一部の欠失を含むオリゴマーｇｐ１４０ポリペプチド、或いは変異プロテアーゼ開裂部位を有するオリゴマーｇｐ１４０ポリペプチドを含む。
【００１３】
特定の実施形態において、本明細書に記載の多価組成物は、サブタイプＡ（例えば、Ａ１、Ａ２）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ（例えば、Ｆ１、Ｆ２）、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫからなる群より選択される２種類以上のサブタイプに由来するＨＩＶエンベロープポリペプチドを含む。他の実施形態において、本明細書に記載の多価組成物は、サブタイプＡ（例えば、Ａ１、Ａ２）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ（例えば、Ｆ１、Ｆ２）、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫ並びに組換え型流行株（ＣＲＦ）からなる群より選択される２種類以上のサブタイプに由来するＨＩＶエンベロープポリペプチドも含む。更に他の実施形態において、本明細書に記載の多価組成物は、２種類以上のサブタイプ及び／又はＣＲＦに由来するＨＩＶエンベロープポリペプチドも更に含む。ＣＲＦは、本明細書だけでなく当該技術分野においてもサブタイプＥ又はＩと呼ばれてきた。従って、前記多価組成物は、前記サブタイプ又はＣＲＦの２種類以上に由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種類のサブタイプ又はＣＲＦに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含んでよい。特定の実施形態において、多価組成物は、サブタイプＡ及びＢに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。他の実施形態において、前記多価組成物は、サブタイプＡ及びＣに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。尚更なる実施形態において、多価組成物は、サブタイプＢ及びＣに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。他の実施形態において、多価組成物は、サブタイプＡ、Ｂ及びＣに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。更に他の実施形態において、多価組成物は、サブタイプＡ、Ｂ及びＥに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。他の実施形態において、多価組成物は、サブタイプＡ及びＢ；Ａ及びＣ；Ａ及びＥ；Ｂ及びＣ；Ｂ及びＥ；又はＣ及びＥに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。
【００１４】
特定の実施形態において、前記ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質は、ＣＤ４、ＣＤ４模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）、ＣＣＲ５共受容体又は模倣物、ＴＡＴ、他のウイルスタンパク質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１種類以上の更なる分子（リガンド）と複合体を形成する。
【００１５】
特定の実施形態において、本明細書に記載の多価ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質組成物は、１種類以上のアジュバント（例えば、ＭＦ５９、ＣｐＧ分子、ＰＬＧ微粒子等の微粒子、ミョウバン等）を含む。特定の実施形態において、アジュバントはＭＦ５９を含む。他の実施形態において、アジュバントは１つ以上のＣｐＧ分子を含む。更に他の実施形態において、アジュバントは、ＭＦ５９及び１つ以上のＣｐＧ分子を含む。更に他の実施形態において、アジュバントは、ミョウバン及び／又は１つ以上の微粒子（例えば、ＰＬＧ微粒子）を含む。
【００１６】
別の態様においては、本明細書に記載のポリペプチドの何れかをコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクル、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アルファウイルスベクター等）又は非ウイルス送達ベクター上に担持される。
【００１７】
別の態様においては、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び／又は遺伝子送達ビヒクルの何れかを含む免疫原性組成物及びワクチン組成物が提供される。
【００１８】
更に別の態様において、被験体の免疫応答（例えば、生得的応答、中和抗体応答等の体液性応答、及び／又は細胞免疫応答）を誘導する方法は、被験体の免疫応答を誘導するのに十分な量にて本明細書に記載の組成物、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの何れかを被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、前記方法は、初回抗原刺激手順において本明細書に記載のポリヌクレオチドの何れかを含む第１の組成物を投与すること、及び（ｂ）被験体の免疫応答を誘導するのに十分な量にて本明細書に記載のアジュバント化エンベロープ糖タンパク質の何れかを含む第２の組成物を追加抗原刺激として投与することを含む。これらの方法の何れかにおいて、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えば、プラスミド）として、若しくはウイルス（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス及び／又はアルファウイルス）ベクター又は非ウイルスベクターを使用して送達される場合がある。特定の好ましい実施形態において、初回抗原刺激手順は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む１個以上のアルファウイルスベクター及び／又はポックスウイルスベクター及び／又はアデノウイルスベクターを投与することを含み、追加抗原刺激手順は、本明細書に記載の１種類以上の多価ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質含有組成物を投与することを含む。更にこれらの方法の何れかにおいて、前記組成物は、種々の株からのＨＩＶ感染を予防する免疫応答を誘発する場合がある。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、前記組成物のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質で示されるサブタイプに対する防御免疫応答を誘導する。好ましくは、本明細書に記載の方法は、前記多価エンベロープ糖タンパク質で示されるサブタイプに対する防御免疫応答を誘導し、更に、前記多価組成物で示されない少なくとも１種類のサブタイプ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類又は更にそれ以上のサブタイプ）に由来する株に対する防御免疫応答を誘導する。
【００１９】
更に別の態様において、本発明は、被験体の免疫応答を誘導するのに十分な量にて本明細書に記載の組成物、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの何れかを被験体に投与することによって、被験体の免疫応答の能力、耐久性及び／又は幅を上昇させる方法を含む。特定の実施形態において、前記方法は、初回抗原刺激手順で本明細書に記載のポリヌクレオチドの何れかを含む第１の組成物を投与すること、及び（ｂ）被験体の免疫応答を誘導するのに十分な量にて本明細書に記載のアジュバント化エンベロープ糖タンパク質の何れかを含む第２の組成物を追加抗原刺激として投与することを含む。これらの方法の何れかにおいて、ポリヌクレオチドは、配合又は未配合ＤＮＡ（例えば、担体を有する又は有しないプラスミド）として、若しくはウイルス（例えば、アデノウイルス及び／又はポックスウイルス及び／又はアルファウイルス）ベクター又は非ウイルスベクターを使用して送達される場合がある。特定の好ましい実施形態において、初回抗原刺激手順は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む１個以上のアルファウイルスベクター及び／又はアデノウイルスベクターを投与することを含み、追加抗原刺激手順は、本明細書に記載の１種類以上の多価ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質含有組成物を投与することを含む。
【００２０】
従って、特定の実施形態においては、防御免疫応答を誘導する方法であって、例えば、前記組成物が、多価組成物のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質が由来するサブタイプの各々に由来する株から防御する方法が記載される。更に、前記組成物は又、投与された組成物で示されないサブタイプに由来する株からも防御する場合がある。例えば、サブタイプＡ、Ｂ及びＣに由来するＨＩＶ株に対する被験体の防御免疫応答を誘導する方法は、サブタイプＢ株及びサブタイプＣ株に由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含むアジュバント化多価ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を使用して達成される場合があり；サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ及びＥに由来するＨＩＶ株に対する被験体の防御免疫応答を誘導する方法は、サブタイプＢ株及びサブタイプＣ株、或いはサブタイプＢ株及びサブタイプＥ株に由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含むアジュバント化多価ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を使用して達成される場合がある。
【００２１】
本発明のこれら及び他の実施形態は、本明細書の開示内容を鑑みて当業者に容易に行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施においては、特に指示がない限り、当該技術分野の技術範囲に含まれるタンパク質化学、ウイルス免疫生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ法の従来方法が使用される。このような技法は文献内で詳細に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）；Ｎｅｌｓｏｎ  Ｌ．Ｍ．及びＪｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｋ．，  ＨＩＶ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｖｏｌ．  １７，  １９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  ｅｄ．  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２００２）；並びにＬｉｐｋｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌｕｍｅｓ  １−ｐｒｅｓｅｎｔ  （Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９）を参照されたい。
【００２３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、一つの（「ａ」、「ａｎ」）、その（「ｔｈｅ」）という単数形の表現は、その内容が明確に示されない限り、複数の指示物を包含するという点に注意が必要である。従って、例えば、「ポリペプチド」に対する言及は、２個以上のポリペプチドの混合物等を包含する。
【００２４】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願書は、上記のものであろうと下記のものであろうと、全体が参考として本明細書で援用される。
【００２５】
定義
本発明の記載においては、以下の用語が使用され、以下に示す通りに定義される。
【００２６】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能に使用されて、アミノ酸残基のあらゆるポリマーを意味する。それらの用語は、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等を包含する。このようなポリペプチドは、天然の原料に由来し得るか、若しくは合成又は組換え産生することができる。又、それらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等も包含する。
【００２７】
本明細書で定義されるポリペプチドは、２０の天然アミノ酸、即ちＡｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＶａｌ（Ｖ）で一般的に構成され、例えば、ホモイソロイシン、アサロイシン、２−（メチレンシクロプロピル）グリシン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−（プロプ−１−エニル）システイン、ホモセリン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ホモアルギニン、３−（３−カルボキシフェニル）アラニン、シクロヘキシルアラニン、ミモシン、ピペコリン酸、４−メチルグルタミン酸、カナバニン、２，３−ジアミノプロピオン酸等の天然の類似体及び合成類似体の両方の幾つかの既知のアミノ酸類似体の何れかを包含する場合がある。本発明における使用が明らかになるであろうポリペプチド剤の更なる例については後述する。
【００２８】
ポリペプチド又はタンパク質の「幾何構造」又は「三次構造」によって、タンパク質の全体的な三次元構造が意味される。本明細書に記載の通り、幾何構造は、例えば、結晶学的研究或いは、一次構造や二次構造を形成するアミノ酸間の相互作用に基づいて幾何構造を予測する各種のプログラム又はアルゴリズムを使用して決定される。
【００２９】
「野生型」ポリペプチド、ポリペプチド剤又はポリペプチド薬によって、天然のポリペプチド配列とその対応する二次構造が意味される。「分離された」又は「精製された」タンパク質又はポリペプチドは、タンパク質が自然界で通常結合される有機体全体から離れ、別々になったタンパク質である。この用語が様々な純度のタンパク質を意味することは明らかである。一般的には、精製されたタンパク質を含む組成物は、その組成物のタンパク質全体の少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも４０〜５０％（４０％、４５％、５０％）、より好ましくは少なくとも約７５〜８５％（例えば、７５％、８０％、８５％）、最も好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上が当該のタンパク質であるものであろう。
【００３０】
ＨＩＶ−１は、系統発生学的解析によって３つの群：Ｍ（ｍａｊｏｒ）群、Ｏ（ｏｕｔｌｉｅｒ）群、並びにＨＩＶ−１の変異体、即ち指定されたＮ群に分類される。サブタイプ（クレード）は、ＨＩＶの種々のリネージを表し、且つ地理的関連を有する。ＨＩＶ−１のサブタイプはＨＩＶ−１の配列の系統学的に関連した群であって、その配列は、そのゲノム全体にわたる種々のサブタイプに由来する配列に対してよりも相互に類似する何れか１つのサブタイプ又はサブサブタイプの範囲内にあるものである。例えば、ロスアラモス国立研究所（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＨＩＶ配列データベース（ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ＨｅｌｐＤｏｃｓ／ｓｕｂｔｙｐｅｓ−ｍｏｒｅ．ｈｔｍｌ）（米国ニューメキシコ州ロスアラモス）を参照されたい。
【００３１】
ＨＩＶ−１のＭ群のサブタイプは、ＨＩＶ−１の配列の系統学的に関連する群又はクレードであり、サブタイプＡ（例えば、Ａ１、Ａ２）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ（例えば、Ｆ１、Ｆ２）、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫを包含する。ＨＩＶ−１のＭ群のサブタイプ及びサブサブタイプは、チンパンジーからヒトに伝染した単独の事象の後にヒトにおいて分岐したと考えられる。種々のＨＩＶ−１のＭ群のサブタイプの世界的分布は多様であり、サブタイプＢは北米と欧州で最もよく見られ、サブタイプＡはアフリカで最もよく見られる。大部分のサブタイプは中央アフリカでよく見られ、他の地域では遺伝子型の分布が限定されている。例えば、サブタイプＣはインドと南アフリカでよく見られ、サブタイプＦはルーマニア、ブラジル、アルゼンチンでよく見られる。又、ＨＩＶ−１のＭ群は組換え型流行株（ＣＲＦ）も包含し、そのＣＲＦは、完全ゲノムが系統発生学的解析においてあるサブタイプとクラスター形成するある領域と他のサブタイプとクラスター形成する他の領域とからなる組換えゲノム又はモザイクゲノムである、ウイルスである。ＣＲＦの例は、ロスアラモス国立研究所（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＨＩＶ配列データベース（ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）（米国ニューメキシコ州ロスアラモス）で検索される。ＣＲＦは、本明細書だけでなく当該技術分野でもサブタイプＥ及びＩと呼ばれる。ＣＲＦ（サブタイプＥ）はタイで非常によく見られる。
【００３２】
ＨＩＶ−１のＯ群は、Ｍ群株とクラスター形成しない大部分の分岐するウイルスを包含する。Ｏ型の感染は、カメルーンや近隣諸国（例えば、赤道ギニアやガボン）の西・中央アフリカ諸国で確認された。Ｏ群の感染は欧州、更に最近では米国に広がってきたが、患者の全ては西・中央アフリカと関連していた。ＨＩＶ−１のＯ群はチンパンジーからヒトへ伝染した個別の事象の結果であって、各伝染の事象後にヒトの集団に起こる「サブタイプ」クレードへの群内の多様化が伴うものであると考えられる。
【００３３】
ＨＩＶ−１のＮ群（「新しい」群とも呼ばれる）は、ＨＩＶ−１のＭ群及びＯ群と異なるウイルスを包含する。ＨＩＶ−１のＮ群も又、チンパンジーからヒトへ伝染した個別の事象の結果であって、各伝染の事象後にヒトの集団に起こる「サブタイプ」クレードへの群内の多様化が伴うものであると考えられる。
【００３４】
ＨＩＶ−２は、５つのクレード（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇクレード）に分類される。
【００３５】
「エンベロープポリペプチド」とは、エンベロープタンパク質、好ましくはＨＩＶのエンベロープに由来する分子を意味する。この用語は、エンベロープポリペプチド並びにエンベロープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄ（ｇｐ１６０）の糖タンパク質である。宿主細胞のウイルス感染の間に、ｇｐ１６０は宿主細胞のプロテアーゼにより開裂され、ｇｐ１２０及び必須膜タンパク質（ｇｐ４１）が形成される。ｇｐ４１部分はビリオンの膜二重層内に固定される（且つ、膜二重層に又がる）が、ｇｐ１２０部分は周囲の外部に突出する。ｇｐ１２０とｇｐ４１の間に共有結合がない場合、遊離ｇｐ１２０は、ビリオンや感染細胞の表面から放出される。エンベロープポリペプチドは又、ｇｐ１４０ポリペプチドも包含する場合がある。エンベロープポリペプチド（ｇｐ１２０、ｇｐ１４０等）は、モノマー、二量体又は多量体（三量体等のオリゴマー）として存在する場合がある。
【００３６】
「オリゴマーｇｐ１４０ポリペプチド」又は「ｏ−ｇｐ１４０」とは、ｇｐ１４０ポリペプチドのあらゆるオリゴマー形態を意味する。ｇｐ１４０のオリゴマー形態としては、Ｖ１ループの一部の欠失を含むｏ−ｇｐ１４０、Ｖ２ループの一部の欠失を含むｏ−ｇｐ１４０ポリペプチド、Ｖ３ループの一部の欠失を含むｏ−ｇｐ１４０ポリペプチド、変異プロテアーゼ開裂部位を有するｏ−ｇｐ１４０ポリペプチドが含まれる。オリゴマーｇｐ１４０糖タンパク質は、ＨＩＶビリオンの表面に存在する天然で三量体のｅｎｖスパイクに類似する構造を使用する場合があり、従って、免疫原性組成物にとって望ましい場合がある。例えば、Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４（１２）：５７１６−５７２５；Ｇｒｕｎｄｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３１（１）：  ３３−４６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（２９）：  １１２４４−１１２５９；Ｂａｒｎｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５（１２）：  ５５２６−５５４０；国際特許第００／３９３０２号；米国特許第６，６０２，７０５号；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６（６）：２８３５−２８４７を参照されたい。
【００３７】
更に、本明細書で定義される「エンベロープポリペプチド」は、本明細書に記載の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ＨＩＶゲノムは、一定のフラックスの状態にあり、且つ、分離株間で比較的高い程度の変異性を示す幾つかの可変ドメインを含む。この用語が新しく同定された分離株だけでなく同定済みのＨＩＶ分離株とこれらの分離株のサブタイプの何れかに由来するエンベロープ（例えば、ｏ−ｇｐ１４０）ポリペプチドを包含することは、非常に明らかである。ＨＸＢ−２に関する構造的特徴については、本明細書に記載されている。本発明の開示内容と当該技術分野との教示内容に鑑みて、当業者は、他のＨＩＶ変異体（例えば、分離株ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、種々のサブタイプに由来する他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株、種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１及びＨＩＶ−２ＵＣ２））及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（これら及び他の関連ウイルスに関する説明として、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗ．Ｋ．  Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．  １９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ，  ｅｄｓ．  １９９１）；Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００１を参照）における対応領域を、例えば、配列比較プログラム（例えば、本明細書に記載のＢＬＡＳＴ等）或いは構造的特徴の同定及びアラインメント（例えば、βシート領域を同定し得る本明細書に記載の「ＡＬＢ」プログラム等のプログラム）を使用して決定することができる。修飾されたエンベロープポリペプチドの実際のアミノ酸配列は、何れのＨＩＶ変異体に基づいてもよい。
【００３８】
更に、「エンベロープポリペプチド」という用語は、更なる内部欠失、付加及び置換等の、天然の配列との比較における更なる修飾を含むタンパク質を包含する。これらの修飾は、部位特異的変異誘発のように意図的である場合もあれば、或いは自然に生じる変異性事象等のように偶発的である場合もある。エンベロープの修飾としては、変異及び／又は欠失をその中に有するエンベロープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの産生が含まれるが、これに限定されない。例えば、幾つかの又は全部の超可変領域Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４及び／又はＶ５、特に領域Ｖ１、Ｖ２及びＶ３は、欠失又は修飾されてもよい。Ｖ１及びＶ２領域は、ＣＣＲ５共受容体結合部位をマスクすることができる（例えば、Ｍｏｕｌａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １４：９４０５−９４１６を参照）。従って、特定の実施形態において、可変ループ領域の幾つか又は全てを欠失して、例えば潜在的に保存される中和エピトープが曝露される。更に、高度なグリコシル化がタンパク質の表面の潜在的中和エピトープを保護する役目をする限り、Ｎ連鎖部位の糖鎖除去も修飾の潜在的標的である。単独或いは可変領域の欠失及び／又は糖鎖除去修飾と組み合わせて使用される更なる任意の修飾としては、βシート領域（例えば、国際特許第００／３９３０３号に記載）に対する修飾（例えば、欠失）、リーダー配列の修飾（例えば、コザック配列の付加、及び／又は、天然リーダー配列又は配列修飾ｔｐａリーダー配列による修飾野生型リーダー配列の置換）及び／又はプロテアーゼ開裂部位に対する修飾（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの周知のモノクローナル抗体又はＣＤ４への結合、オリゴマー形成、ウイルス中和で定義される天然の立体構造抗原決定基を保持した、ｇｐ４１の開裂部位と融合ドメイン並びにｇｐ４１の７アミノ酸繰り返し１及び２のスペーシングの欠失を含む、ｇｐ１４０  Ｄｅｌｔａ  ＣＦＩを説明した、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６（１１）：  ５３５７−５３６８を参照）。エンベロープポリペプチドがワクチンの組成物で使用される場合、修飾は、免疫学的活性（即ち、ポリペプチドに対する抗体応答を誘発する能力）を喪失しないものである必要がある。同様に、ポリペプチドが診断目的で使用される場合、その能力を保持する必要がある。
【００３９】
このようなエンベロープポリペプチドの例としては、以下が含まれるが、これらには限定されない：一部のＶ１ループの欠失を含むｇｐ１４０、一部のＶ２ループの欠失を含むｇｐ１４０ポリペプチド、一部のＶ３ループの欠失を含むｇｐ１４０ポリペプチド、変異プロテアーゼ開裂部位を有するｇｐ１４０ポリペプチド、一部のＶ１ループの欠失を含むｇｐ１６０、一部のＶ２ループの欠失を含むｇｐ１６０ポリペプチド、一部のＶ３ループの欠失を含むｇｐ１６０ポリペプチド、及び変異プロテアーゼ開裂部位を有するｇｐ１６０ポリペプチド。
【００４０】
エンベロープポリペプチドは宿主細胞内で組換え産生させる場合がある。これらのポリペプチドは、タンパク質を発現する有機体が培養される増殖培地内に分泌する場合がある。或いは、このようなポリペプチドは細胞内に回収される場合もある。増殖培地内への分泌は、例えば国際特許第９６／０４３０１号に記載される、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の多くの検出技法、及びウェスタンブロット法や免疫沈降検定等の免疫学的技法を使用して容易に決定される。三量体のｏ−ｇｐ１４０ポリペプチド等のエンベロープポリペプチドは、例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６（６）：２８３５−２８４７及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（２９）：１１２４４−１１２５９に記載されるように産生及び／又は精製される。
【００４１】
「免疫原性」エンベロープ糖タンパク質は、タンパク質が投与される個体において免疫反応を誘発することと、診断の場面において当該のＨＩＶに対して向けられる抗体と反応することとの何れかを可能にするように、少なくとも１つのエピトープを含む（又はコードする）分子（エンベロープポリペプチド又はエンベロープポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）である。
【００４２】
「多価」又は「多原子価」によって、同一又は異なるＨＩＶペプチドの少なくとも２個（即ち２個以上）を含む組成物又はワクチンが意味される。特定の一実施形態において、ＨＩＶペプチドは、異なるＨＩＶタイプ（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２等）、異なるＨＩＶサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−１サブタイプＡ、ＨＩＶ−１サブタイプＢ、ＨＩＶ−１サブタイプＣ等）又は同一のサブタイプに由来する異なる株（例えば、ＨＩＶ−１ＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２等）に由来する。例えば、本明細書に記載の多価の組成物又はワクチンは、２種類以上の異なるＨＩＶのタイプ、株及び／又はサブタイプに由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む組成物を含む。「サブタイプ」という用語には、組換え型流行株（ＣＲＦ）だけでなく現在確認されているサブタイプが包含される。ＨＩＶサブタイプ（ＣＲＦを包含する）は、特徴の説明が継続的に行われており、ロスアラモス国立研究所による、オンラインで利用可能なＨＩＶデータベースで検索することができる。従って、多価ワクチンは、２種類以上の異なるサブタイプ（Ａ（例えば、Ａ１、Ａ２）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（例えば、Ｆ１、Ｆ２）、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫや、種々のＣＲＦ）、例えば、サブタイプＡ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ及びＥ；Ｂ及びＥ；Ｃ及びＥ；Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ及びＥ、等に由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に由来するペプチドを含む場合がある。同様に、「２価」という用語は、同一又は異なるエンベロープペプチドの２個を含む組成物又はワクチンを意味する。特定の一実施形態において、本明細書に記載の２価の組成物又はワクチンは、異なるＨＩＶタイプ、異なるＨＩＶサブタイプ又は同一のサブタイプに由来する異なる株に由来する２個のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。より特定の一実施形態において、本明細書に記載の２価の組成物又はワクチンは、種々のサブタイプ（例えば、サブタイプＢ及びＣ、サブタイプＢ及びＥ、等）に由来する２個のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を含む。
【００４３】
「エピトープ」によって、免疫応答を誘発することが可能な又は生体試料に存在するＨＩＶ抗体と反応することが可能なこのようなエピトープを含む分子が得られる、特定のＢ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位が意味される。この用語は又、「抗原決定基」又は「抗原決定基部位」と共に交換可能に使用される。エピトープは、エピトープに固有の空間配座に３個以上のアミノ酸を含むことができる。一般的に、エピトープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸からなり、更に通常、少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間配座を決定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｘ線結晶構造解析や二次元核磁気共鳴等を包含する。更に又、所与のタンパク質のエピトープの同定は、当該技術分野で周知の技法を使用して、例えば、疎水性研究や部位特異的血清学を使用すること等によって容易に達成される。Ｇｅｙｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（急速にペプチドを合成して所与の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、且つ化学的に合成するための手順）；及びＧｅｙｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９−７１５（所与の抗体に対する高親和性を有するペプチドを同定する技法）も参照されたい。同一のエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対するある抗体の結合を遮断する別の抗体の能力を示す単純な免疫学的検定にて同定されてもよい。
【００４４】
抗原又は組成物に対する「免疫学的応答」又は「免疫応答」とは、被験体において生得的に発達したもの、即ち関連する組成物に存在する抗原に対する体液性免疫反応及び／又は細胞免疫反応である。
【００４５】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、以下の：（ｉ）ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；及び米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｖ分子（非共有のヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；及びＥｈｒｌｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９：４０９１−４０９６を参照）；（ｉｖ）単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）；（ｖ）二量体及び三量体の抗体フラグメント構成体；（ｖｉ）ヒト化抗体分子（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；及び英国特許第２，２７６，１６９号（１９９４年９月２１日公開）を参照）；（ｖｉｉ）ミニ抗体又はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（即ち、ヒンジ領域によってｓＦｖと分離した、Ｃ末端のオリゴマー化ドメインを含むｓＦｖポリペプチド鎖；例えば、Ｐａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９Ｂ：１２０−１２６を参照）；及び（ｖｉｉ）このような分子から得られるあらゆる機能的フラグメント、と共にポリクローナル製剤とモノクローナル製剤の両方から得られた抗体を包含するものであって、このようなフラグメントが親抗体分子の特異的結合特性を保持するものである。
【００４６】
従って、「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合部位を含むポリペプチド又はポリペプチドの群を意味する。「抗原結合部位」は、内部表面形状と抗原のエピトープの特徴に相補的な荷電分布とを有する３次元結合部位を形成する抗体分子の可変ドメインの折りたたみから形成され、これによって、特異的結合による抗体−抗原複合体の形成が可能になる。抗原結合部位は、抗原結合の一因となる超可変ループを形成する重鎖及び／又は軽鎖ドメイン（それぞれ、ＶＨとＶＬ）から形成される場合がある。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、改変抗体、１価抗体、Ｆａｂタンパク質及び単一ドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。多くの場合、抗原に抗体が結合する現象は、他のリガンド／アンチリガンド結合に匹敵する。
【００４７】
ポリクローナル抗体が要求される場合、選択哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、非ヒト霊長類、ヒト等）は、ＨＩＶエピトープを担持する免疫原性ポリペプチドで免疫化される。免疫化された動物からの血清は、既知の手順に従って採集及び処理される。ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質エピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体は免疫アフィニティクロマトグラフィーにより精製され得る。ポリクローナル抗血清を産生及び処理する技法は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．  （１９８７）  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ）を参照されたい。
【００４８】
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質エピトープに対するモノクローナル抗体も又、当業者により容易に産生することができる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製する一般的な方法は周知である。不朽抗体産生細胞株は、細胞融合により生成してもよければ、腫瘍原性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスによるトランスフェクション等の他の技法によって生成してもよい。例えば、Ｍ．  Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ；Ｋｅｎｎｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；米国特許第４，３４１，７６１号；第４，３９９，１２１号；第４，４２７，７８３号；第４，４４４，８８７号；第４，４６６，９１７号；第４，４７２，５００号；第４，４９１，６３２号；及び第４，４９３，８９０号を参照されたい。ＨＩＶエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性（即ち、イソタイプ、エピトープ親和性等）についてスクリーニングすることができる。本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、ＨＬドメインで構成される抗体であって、それは所定の抗原と特異的に結合する。ｄＡｂはＶＬドメインを含まないが、抗体に存在することが知られている他の抗原結合ドメイン、例えばκドメインやλドメインを含む場合がある。ｄＡｂを調製する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｗａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照されたい。
【００４９】
抗体は又、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、及び他の既知の抗原結合ドメインから構成されてもよい。これらのタイプの抗体及びそれらの調製方法の例は、当該技術分野で既知の（例えば、米国特許第４，８１６，４６７号を参照）。例えば、「脊椎動物抗体」とは、テトラマー又はその凝集体である抗体を意味するものであって、通常「Ｙ」立体配置内に凝集され、且つ鎖間の共有結合を有し得るか又は有し得ない、軽鎖及び重鎖を含むものである。脊椎動物抗体において、前記鎖のアミノ酸配列は、ｉｎ  ｓｉｔｕであろうとｉｎ  ｖｉｔｒｏであろうと脊椎動物で産生される抗体内で見られる配列と相同である（例えば、ハイブリドーマ）。脊椎動物抗体としては、例えば、精製されたポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が含まれる。これらの抗体の調製方法は、以下に示す。
【００５０】
「ハイブリッド抗体」とは、個々の鎖が哺乳類の抗体鎖に対して相同的な抗体であり、且つその新規の集合体を表すものであり、その結果、２種類の異なる抗原が四量体又は凝集体によって沈殿可能となる。ハイブリッド抗体において、一方の対の重鎖及び軽鎖は、一方の抗原に対する抗体に見られる重鎖及び軽鎖と相同的であるが、他方の対の鎖は、他方の抗原に対する抗体に見られる重鎖及び軽鎖と相同的である。この結果、「２価」の性質、即ち２つの抗原と同時に結合する能力が生じる。このようなハイブリッドは又、後述のように、キメラ鎖を使用して形成されてもよい。
【００５１】
「キメラ抗体」とは、重鎖及び／又は軽鎖が融合タンパク質である抗体をいう。一般的には、その鎖のアミノ酸配列の一部は、特定の種及び／又はクラスに由来する抗体の対応配列に相同しているが、その鎖の残りの部分は、別の種及び／又はクラスに由来する配列に相同している。通常、重鎖及び軽鎖の可変領域は、脊椎動物の１つの種に由来する可変領域又は抗体に類似するが、不変部分は、脊椎動物の別の種に由来する抗体における配列に相同する。しかし、この定義はこの特定例に限定されない。又、重鎖又は軽鎖の何れか又は両方が、異なる起源の抗体の配列を模倣する配列の組み合わせによって構成される抗体であれば、その起源が異なるクラスに由来するのか異なる種に由来するのか何れであろうと、そして融合点が可変部／不変部の境界にあろうとなかろうと、何れの抗体も包含される。それゆえ、不変領域又は可変領域の何れも既知の抗体配列を模倣しない抗体を産生することは可能である。そして、例えば、可変領域が特定の抗原に対してより高い特異的親和性を有するか、又は不変領域によって補体結合の程度を大きくすることができる抗体を構成すること、或いは特定の不変領域が有する他の性質を改善することが可能になる。
【００５２】
別の例としては「改変抗体」があるが、それは、脊椎動物抗体における天然のアミノ酸配列が変異された抗体をいう。組換えＤＮＡ法を使用して、抗体を再設計して所望の特徴を得ることができる。多くの変異が可能であり、そしてその範囲は、１個以上のアミノ酸の変化から、ある領域、例えば不変領域の完全な再設計までが可能である。一般的に不変領域における変化は、所望の細胞プロセス特性を得る変化であり、例えば、補体結合、膜との相互作用、及び他のエフェクター機能における変化がある。可変領域を変化させて抗原結合特性を改変することができる。又、抗体を設計して、分子又は物質を特異的な細胞又は組織部位へ特異的に送達することを促進させ得る。分子生物学における既知の技法、例えば、組換え法や部位特異的変異誘発等によって所望の改変を行うことができる。
【００５３】
更に別の例は、「１価抗体」であり、これは、別の重鎖のＦｃ（即ち、幹）領域に結合した重鎖／軽鎖の二量体から構成される凝集体である。このタイプの抗体は、抗原転調を生じない。例えば、Ｇｌｅｎｎｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９５：７１２−７１４．を参照されたい。抗体の定義の範囲には、抗体の「Ｆａｂ」フラグメントも又包含される。「Ｆａｂ」領域は、重鎖及び軽鎖の部分を意味し、この部分は、重鎖及び軽鎖の分枝部分を含み且つ特定の抗原への免疫学的結合を示すことが明らかにされているがエフェクターＦｃ部分を欠く配列と、およそ等価であるか、又は類似している。「Ｆａｂ」は、１本の重鎖及び１本の軽鎖の集合体（通常Ｆａｂ’として知られる）、及び２本のＨ鎖及び２本のＬ鎖を含む四量体（Ｆ（ａｂ）２と呼ばれる）を含み、選択的に所定の抗原又は抗原ファミリーと反応することができる。「Ｆａｂ」抗体は、上記に類似のサブセット、即ち、「脊椎動物Ｆａｂ」、「ハイブリッドＦａｂ」、「キメラＦａｂ」及び「改変Ｆａｂ」に分けてもよい。抗体の「Ｆａｂ」フラグメントを産生する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、プロテオリシス、並びに組換え法による合成を包含する。
【００５４】
「抗原抗体複合体」とは、抗原上のエピトープに特異的に結合する抗体によって形成される複合体を意味する。
【００５５】
アミノ酸配列の「類似性」を決定する技法は、当該技術分野で周知である。一般的に、「類似性」とは、適切な場所における２つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味するものであって、アミノ酸が同一であるか、若しくは類似の化学的及び／又は物理的な特性（例えば、電荷又は疎水性）を備えるものである。「パーセント類似性」という用語は、比較されたポリペプチド配列間で決定することができる。核酸とアミノ酸配列の同一性を決定する技法も又、当該技術分野で周知であり、その技法は、遺伝子に対する（通常ｃＤＮＡ中間体を介して）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、それによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、並びにこれを別のアミノ酸配列と比較することを含む。一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【００５６】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、その「パーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２以上のアミノ酸配列は、その「パーセント同一性」を決定することによって同様に比較され得る。２つの配列のパーセント同一性は、ヌクレオチド配列であるにせよペプチド配列であるにせよ、２つのアラインメントされた配列の間の完全一致の数をより短い配列の長さによって除算し、そしてその結果に１００を掛けたものとして概説される。ヌクレオチド配列における近似のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９  （１９８１）の局所的ホモロジーアルゴリズムによって定められる。Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，  ５  ｓｕｐｐｌ．  ３：３５３−３５８，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡにおいて開発されたスコアリングマトリックスを使用するペプチド配列と共に使用するために、このアルゴリズムを拡張することができ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  （１９８６）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（６）：６７４５−６７６３によって正規化することができる。このヌクレオチド配列及びペプチド配列用アルゴリズムのインプリメンテーションは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（米国ウィスコンシン州マディソン）により、そのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティーアプリケーションにおいて提供される。この方法のデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  （１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ［米国ウィスコンシン州マディソン］から入手可能）に記載される。配列間のパーセント同一性又は類似性を算出するための他の同程度に適切なプログラムは、一般的に当該技術分野で既知である。
【００５７】
例えば、基準配列に対する特定のヌクレオチド配列のパーセント同一性は、デフォルトスコアリング表と６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティとを有するＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのホモロジーアルゴリズムを使用して決定し得る。本発明の文脈でパーセント同一性を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにより著作権保護され、Ｊｏｈｎ  Ｆ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｅ  Ｓ．  Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州マウンテンビュー）により配給されるＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。この総合ソフトウェアパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えば、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップエクステンションペナルティが１、及びギャップが６）がスコアリング表のために使用される場合に利用することができる。生成したデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は、「配列同一性」を反映する。デフォルトパラメータを使用して使用され得るアラインメントプログラムＢＬＡＳＴ等の、配列間のパーセント同一性又は類似性を算出するための他の適切なプログラムは、一般的に当該技術分野で既知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用して使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレスに記載されている：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５８】
当業者は、上記のプログラムにおける所定の配列に使用するために、適切な検索パラメータを容易に決定することができる。例えば、検索パラメータは、当該の配列のサイズに基づいて変更する場合がある。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ隣接ヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを包含するものであって、（ｉ）Ｘ隣接ヌクレオチドが本明細書に記載の配列の何れかに由来するＹ隣接ヌクレオチドに対して少なくとも約５０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸがＹに等しく、及び（ｉｉｉ）Ｘが、６つ以上のヌクレオチド且つ最高５０００のヌクレオチド、好ましくは８つ以上のヌクレオチド且つ最高５０００のヌクレオチド、より好ましくは１０〜１２のヌクレオチドで最高５０００のヌクレオチド、更により好ましくは１５〜２０のヌクレオチドで、本明細書（例えば、配列表及び請求項を参照）に記載される完全長配列内に存在するヌクレオチドの数までであって、その数が上記の範囲内におさまる全ての整数値を含むものである。
【００５９】
本発明の配列を問い合わせ配列として使用する場合、本発明の合成発現カセット（及び精製ポリヌクレオチド）としては、本明細書に開示される合成発現カセット配列（例えば、本発明の請求される配列又は他の配列）に対して約８０％〜１００％、８０％超〜８５％（例えば、８０％超、８１％、８２％、８３％、８４％又は８５％）、好ましくは９０％超〜９２％（例えば、９０％超、９１％又は９２％）、より好ましくは９５％超（例えば、９５％超、９６％又は９７％）、最も好ましくは９８％超（例えば、９８％超、９９％、９９．５％以上）の配列（これらの記載された範囲内におさまる全ての整数値を含む）の同一性を有する関連したポリヌクレオチド配列が含まれる。
【００６０】
コンピュータプログラムも又、βシート等の構造を形成する一定のポリペプチドの可能性を決定するために利用可能である。本明細書に記載のこのようなプログラムは、タンパク質とポリペプチドの２次構造の算定及び叙述のための「ＡＬＢ」プログラムである。更に、２次タンパク質構造は、１次アミノ酸配列から、例えばタンパク質結晶構造を使用し、そしてその結晶構造に関するタンパク質配列をアラインメントして（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｐ．Ｑ．Ｃａｎａｄａ社から入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）プログラムを使用して）予測することができる。２次構造を予測する他の方法は、例えば、Ｇａｒｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：５４０−５５３；Ｇｅｏｕｒｊｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌｉｃ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １１：６８１−６８４；Ｌｅｖｉｎ  （１９９７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：  ７７１−７７６；及びＲｏｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２３２：５８４−５９９に記載される。
【００６１】
相同性は又、相同領域間に安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、その後１本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化されたフラグメントのサイズを決定することにより、決定し得る。２つのＤＮＡ又は２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して決定されるように、その配列が、分子の定義された長さにわたって少なくとも約８０％〜８５％（例えば、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％又は８５％）、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％（例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％又は９８％）の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同的」である。本明細書で使用する場合、実質的に相同的は又、特定のＤＮＡ又はポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列を意味する。実質的に相同的であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定のシステムにおいて定められるように、厳密な条件下でサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技術範囲内に含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．（前掲）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（前掲）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前掲）を参照されたい。
【００６２】
選択タンパク質を「コード」する「コード配列」又は配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで又はｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端での翻訳開始コドン及び３’（カルボキシ）末端での翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては、ウイルスヌクレオチド配列に由来するｃＤＮＡや、合成及び半合成のＤＮＡ配列並びに塩基類似体を含む配列が含まれるが、これらに限定されない。転写終結配列は３’からコード配列に位置する。
【００６３】
「制御要素」とは、集合的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ドメイン、エンハンサー等を意味し、それらにより、集合的に宿主細胞におけるコード配列の転写及び翻訳が行われる。所望の遺伝子の転写及び翻訳が可能である限り、必ずしもこれらの制御要素の全てが存在する必要はない。
【００６４】
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写し、その後それがコード配列によりコードされるポリペプチドに翻訳される場合、制御要素は、細胞内のコード配列の「転写を導く」ものである。
【００６５】
「操作可能に結合した」とは、そのように記載する成分がそれらの通常の機能を実行するように構成されている、要素の配置を意味する。従って、ＲＮＡポリメラーゼが存在する場合、コード配列に操作可能に結合した制御要素は、コード配列の発現を生じさせ得る。制御要素は、コード配列の発現を導く機能を果たす限り、必ずしもコード配列に隣接する必要はない。従って、例えば、介在するまだ非翻訳の転写された配列は例えばプロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列はコード配列に「操作可能に結合している」となお判断することができる。
【００６６】
核酸分子を記載するために本明細書で使用される「組換え」とは、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源、合成起源のポリヌクレオチドを意味し、それは、その起源又は操作によって：（１）自然界で会合するポリヌクレオチドの全て又は一部と会合しない；及び／又は（２）自然界で結合するもの以外のポリヌクレオチドと結合する。タンパク質又はポリペプチドに関して使用される「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現により産生されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、並びに原核微生物或いは単細胞体として培養される真核細胞株を表すような他の用語は、交換可能に使用され、そして組換えベクター又は他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用され得る、又は使用されてきた細胞を示し、そしてトランスフェクトされた原細胞の後代を包含する。単一の親細胞の後代は、偶発的変異又は意図的変異によって、形態或いはゲノム又は全ＤＮＡの補体が原細胞と必ずしも完全に同一である必要はないことが理解される。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在等の関連特性を特徴とする親細胞に十分類似する親細胞の後代は、この定義が意味する後代に包含され、そして上記の用語に包摂される。
【００６７】
「脊椎動物の被験体」によって、脊索動物亜門のあらゆるメンバーが意味され、それらには、チンパンジー、アカゲザル、ヒヒ及び他の類人猿やサル種等の非ヒト霊長類を包含するヒト及び他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等の家畜；イヌやネコ等の家庭の哺乳類；マウス、ラット、ウサギ、モルモット等の齧歯動物を包含する実験動物；鶏、シチメンチョウやその他キジ類の鳥、カモ、ガチョウ等の、家庭の鳥、野生の鳥、猟鳥を包含する鳥が包含されるが、これらに限定されない。この用語は特定の年齢を意味しない。従って、成体と生まれたての個体の両方が包摂されることが意図される。
【００６８】
本明細書で使用される「生体試料」とは、個体から分離した組織又は液の試料を指し、例えば、血液、血漿、血清、糞便物、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚の試料、皮膚の外分泌物、気道の外分泌物、腸管の外分泌物、尿生殖器管の外分泌物、胃上皮組織や胃粘膜に由来する試料、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、臓器、生検材料、更に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養成分の試料（培養培地における細胞や組織の増殖から得られる馴化培地、例えば、組換え細胞や細胞成分を包含するがこれらに限定されない）を包含するが、これらに限定されない。
【００６９】
概要
本発明は、少なくとも２種類のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（及び場合により１種類以上のアジュバント）を含む組成物と、これらの組成物の使用（例えば、複数のＨＩＶ、株、タイプ又はサブタイプに対して中和抗体応答を誘発するため）とに関する。本明細書に記載の組成物は、複数のＨＩＶ株、ＨＩＶタイプ、ＨＩＶサブタイプ及び／又はＨＩＶ分離株に由来するＨＩＶエンベロープポリペプチドを含むという点で多価である。このような多価の組成物は被験体の免疫応答を誘発するものであり、特定の実施形態においては、１価の組成物よりも被験体において誘発される免疫応答の拡大及び／又は強化を行うためにそれを使用される場合がある。前記多価組成物において示される種々の分離株は、種々のウイルス血清型を示してよく、宿主細胞（例えば、共受容体）内への種々の侵入モードを利用してよい。「拡大」又は「強化」とは、大きさがより大きい免疫応答（例えば、相加的又は相乗的）、及び／又はＨＩＶ分離株のより多様なアレイに対する中和（抗ウイルス）活性が多価組成物を含む単一成分エンベロープポリペプチドの何れよりも大きくなることを意味する。本明細書に記載の本発明の種々の実施形態の各種形態は、組み合わせてよい。
エンベロープポリペプチド
本明細書に記載の複合体のエンベロープポリペプチド部分は、エンベロープタンパク質、好ましくはＨＩＶエンベロープに由来してよい。上述の通り、ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄ（ｇｐ１６０）の糖タンパク質である。宿主細胞のウイルス感染の間に、ｇｐ１６０は宿主細胞のプロテアーゼにより開裂され、ｇｐ１２０及び必須膜タンパク質（ｇｐ４１）が形成される。ｇｐ４１部分はビリオンの膜二重層内に固定される（且つ、膜二重層に又がる）が、ｇｐ１２０部分は周囲の外部に突出する。ｇｐ１２０とｇｐ４１との間に共有結合がない場合、遊離ｇｐ１２０は、ビリオンや感染細胞の表面から放出される。又、エンベロープポリペプチドは、ｇｐ１４０ポリペプチド、特にｏ−ｇｐ１４０を包含する。
【００７０】
特定の実施形態において、前記組成物のエンベロープポリペプチド成分はモノマー又は二量体である。好ましい実施形態において、エンベロープポリペプチド成分は、オリゴマー（例えば、三量体）エンベロープポリペプチド（例えば、ｏ−ｇｐ１４０）である。
【００７１】
更に又、本明細書に記載のエンベロープ糖タンパク質の何れかは、１個以上の分子とリガンド結合（例えば、複合体を形成すること）をなす場合があり、その分子としては、例えば、ＣＤ４及び／又はＣＤ４模倣物（例えば、米国特許第６，６８９，８７９号；国際特許第０４／０３７８４７号；Ｆｏｕｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９９（１８）：１１８４２−１１８４７を参照）、ＣＣＲ５共受容体（Ｍｋｒｔｃｈｙａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（１７）：１１１６１−１１１６９）又はその模倣物、ＴＡＴ（国際特許第２００５／０９０３９１号）、ポリヌクレオチド（例えば、例えば、ＣｐＧｓ等のオリゴヌクレオチド等）、ポリペプチド（例えば、他のウイルスタンパク質）、小分子、並びにそれらの組み合わせ及び／又は他のウイルスタンパク質が含まれる。
【００７２】
本明細書に記載のエンベロープ糖タンパク質は、新しく同定された分離株だけでなく１つ以上の既知のＨＩＶ分離株やこれらの分離株のサブタイプに由来してよい。従って、本発明の開示内容と当該技術分野との教示内容に鑑みて、当業者は、他のＨＩＶ変異体（例えば、分離株ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、種々のサブタイプに由来する他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株、種々のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１及びＨＩＶ−２ＵＣ２））及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（これら及び他の関連ウイルスに関する説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗ．Ｋ．  Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．  １９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ，  ｅｄｓ．  １９９１）；Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００１を参照）における対応領域を、例えば、配列比較プログラム（例えば、本明細書に記載のＢＬＡＳＴ等）或いは構造的特徴の同定及びアラインメント（例えば、βシート領域を同定し得る本明細書に記載の「ＡＬＢ」プログラム等のプログラム）を使用して決定することができる。修飾されたエンベロープポリペプチドの実際のアミノ酸配列は、何れのＨＩＶ変異体に基づいてもよい。
【００７３】
本明細書に記載されるエンベロープポリペプチドには、更なる内部欠失、付加及び置換等の、天然の配列への更なる修飾を含むタンパク質が包含される。これらの修飾は、部位特異的変異誘発のように意図的である場合もあれば、或いは自然に生じる変異性事象等のように偶発的である場合もある。従って、例えば、エンベロープポリペプチドがワクチン組成物に使用される場合、免疫学的活性（即ち、ポリペプチドに対する抗体応答を誘発する能力）が喪失されないように修飾が行われる必要がある。同様に、ポリペプチドが診断目的に使用される場合、このような能力は保持される必要がある。本明細書に記載のエンベロープポリペプチドは、モノマー又はオリゴマーであってよい。
【００７４】
好ましい実施形態において、少なくとも２種類の異なるＨＩＶサブタイプに由来するエンベロープ糖タンパク質が使用される。ＨＩＶ−１ヌクレオチド及びアミノ酸配列の系統発生学的解析に基づいて、ＨＩＶ−１分離株は、３つの群、即ちＭ（ｍａｊｏｒ）群、Ｏ（ｏｕｔｌｉｅｒ）群及びＮ（新しい変異体）群に分類されてきた。Ｍ群には、少なくとも１０種類のサブタイプ（所定のＡ（例えば、Ａ１、Ａ２）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（例えば、Ｆ１、Ｆ２）、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫ）やＣＲＦが包含される。異なるクレード間のエンベロープアミノ酸配列の変異は３０％を超える。更に、かなりの割合のＨＩＶ特異的中和抗体とＣＴＬは、タイプ特異的である。従って、前記組成物は複数のエンベロープ糖タンパク質（例えば、サブタイプＡ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＥ；Ｂ及びＥ；Ｃ及びＥ；Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ及びＥ；Ａ、Ｃ及びＥ；Ｂ、Ｃ及びＥ；Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥ；Ａ、Ｂ、Ｃ及びＦ、等に由来するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質が包含される）を含む。
【００７５】
他の実施形態においては、２種類以上（少なくとも２種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドに由来するエンベロープ糖タンパク質が使用され、前記エンベロープポリペプチドの少なくとも２種類は、それぞれ異なるＨＩＶタイプ（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）に由来する。更に他の実施形態においては、２種類以上（少なくとも２種類）のＨＩＶエンベロープポリペプチドに由来するエンベロープ糖タンパク質が使用され、前記エンベロープポリペプチドの少なくとも２種類は、それぞれ、同一のサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−１ＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５等）に由来する異なる株に由来する。
アジュバント
特定の一実施形態において、本明細書に記載のエンベロープポリペプチドは、アジュバント化、即ち１種類以上のアジュバント又は免疫調節剤と組み合わせて使用される。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を特異的に又は非特異的に強化する物質であり、それは、例えば、ＣｐＧオリゴ等の免疫増強分子を包含する。
【００７６】
本明細書に記載の組成物に使用してよいアジュバントの例としては、以下に記載したものの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
Ａ．油性乳剤
本発明のアジュバントとしての使用に適切な油性乳剤の組成物及び製剤（ムラミルペプチド又は細菌細胞壁成分等の他の特異的な免疫賦活剤を有する又は有しない）としては、ＭＦ５９（マイクロフリューダイザーを使用してサブミクロン粒子に調製される５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．５％Ｓｐａｎ  ８５）等のスクワレン−水乳剤が含まれる。国際特許第９０／１４８３７号を参照されたい。又、Ｐｏｄｄａ  （２００１）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４２３４−４２３７も参照されたい。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤＴＭインフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用される。
【００７８】
前記組成物に使用するのに特に好ましいアジュバントは、サブミクロンの水中油型乳剤である。本明細書で使用するのに好ましいサブミクロン水中油型乳剤は、４〜５％ｗ／ｖスクワレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ  ８０ＴＭ（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）及び／又は０．２５〜１．０％Ｓｐａｎ  ８５ＴＭ（トリオレイン酸ソルビタン）を含有し、並びに場合によりＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロン水中油型乳剤等の、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを場合により含むスクワレン／水乳剤であって、例えば、「ＭＦ５９」（国際特許第９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号；米国特許第６，４５１，３２５号；及びＯｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”ＭＦ５９  −−  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｄｓ．）  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  １９９５，  ｐｐ．  ２７７−２９６）として知られるサブミクロン水中油型乳剤である。ＭＦ５９は、モデル１１０Ｙ型マイクロフリューダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ［米国マサチューセッツ州ニュートン］）等のマイクロフリューダイザーを使用してサブミクロン粒子に調製された、４〜５％ｗ／ｖスクワレン（例えば４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ  ８０ＴＭ及び０．５％ｗ／ｖＳｐａｎ  ８５ＴＭ並びに場合により様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含む。例えばＭＴＰ−ＰＥは、１投与当たり約０〜５００μｇ、より好ましくは１投与当たり０〜２５０μｇ、最も好ましくは１投与当たり０〜１００μｇの量であってよい。本明細書で使用される「ＭＦ５９−０」という用語は、ＭＴＰ−ＰＥを含まない上記サブミクロン水中油型乳剤を指すが、ＭＦ５９−ＭＴＰという用語は、ＭＴＰ−ＰＥを含む製剤を表わす。例えば、「ＭＦ５９−１００」は１投与当たり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む、等である。ＭＦ６９、即ち本明細書で使用するための別のサブミクロン水中油型乳剤は、４．３％ｗ／ｖスクワレン、０．２５％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ  ８０ＴＭ及び０．７５％ｗ／ｖＳｐａｎ  ８５ＴＭ並びに場合によりＭＴＰ−ＰＥを含有する。更に別のサブミクロン水中油型乳剤は、やはりサブミクロン乳剤にマイクロ流動化された、１０％スクワレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１及びｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦとしても知られるＭＦ７５である。ＭＦ７５−ＭＴＰは、１投与当たり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥ等の、ＭＴＰを含むＭＦ７５製剤を表わす。
【００７９】
前記組成物に使用するためのサブミクロン水中油型乳剤、その製造方法及びムラミルペプチド等の免疫刺激剤は、国際特許第９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号；及び米国特許第６，４５１，３２５号に詳述されている。
【００８０】
完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も又、本発明におけるアジュバントとして使用される場合がある。
【００８１】
Ｂ．無機質含有組成物
本発明のアジュバントとしての使用に適切な無機質含有組成物としては、アルミニウム塩やカルシウム塩等の無機塩が含まれる。本発明は、水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩等の無機塩を含み（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．Ｆ．及びＮｅｗｍａｎ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｄｓ．）  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  １９９５、の第８及び９章を参照）、或いは種々の無機化合物の混合物（例えば、場合により過剰のリン酸塩を含む、リン酸塩と水酸化物アジュバントとの混合物）を含むものであって、前記化合物は何らかの適切な形態（例えばゲル形態、結晶形態、非晶形態等）をとり、塩に吸着していることが好ましい。無機質含有組成物は又、金属塩の粒子としても調製し得る（国際特許第００／２３１０５号）。
【００８２】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋の投与量が１投与当たり０．２〜１．０ｍｇとなるように本発明のワクチン中に含んでよい。
【００８３】
一実施形態において、本発明に使用するためのアルミニウム系アジュバントは、リン酸緩衝液中の抗原をミョウバンと混合し、その後水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウム等の塩基で滴定し、そして析出させることによってｉｎ  ｓｉｔｕで形成されるような、ミョウバン（硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））又はミョウバン誘導体である。
【００８４】
本発明のワクチン製剤に使用する別のアルミニウム系アジュバントは、約５００ｍ２／ｇの表面積を有する優れた吸着剤である、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）又は結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）である。或いは、水酸化アルミニウムアジュバントのヒドロキシル基の一部又は全部の代わりにリン酸基を含む、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）又はヒドロキシリン酸アルミニウムが提供される。本明細書で提供される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは非晶形であり、そして酸性やアルカリ性や中性の培地に可溶性である。
【００８５】
別の実施形態において、本発明のアジュバントは、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの両方を含む。そのより特定の実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウムの重量比が２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１又は９：１超であるように、水酸化アルミニウムよりも量の大きいリン酸アルミニウムを有する。更により詳細には、ワクチン中のアルミニウム塩は、ワクチン１回投与当たり０．４〜１．０ｍｇ、又はワクチン１回投与当たり０．４〜０．８ｍｇ、又はワクチン１回投与当たり０．５〜０．７ｍｇ、又はワクチン１回投与当たり約０．６ｍｇで存在する。
【００８６】
一般的に、好ましいアルミニウム系アジュバント、或いは水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウム等の複数のアルミニウム系アジュバントの比率は、抗原が所望のｐＨでアジュバントとして反対の電荷を担持するように、分子間の静電引力の最適化によって選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）は、ｐＨ７．４でリゾチームを吸着するが、アルブミンは吸着しない。アルブミンを標的とする場合は、水酸化アルミニウムアジュバントが選択される（ｉｅｐ＝１１．４）。或いは、リン酸塩による水酸化アルミニウムの前処理により、その等電点が低下し、よりアルカリ性の抗原に対して好ましいアジュバントとなる。
【００８７】
Ｃ．サポニン製剤
サポニン製剤も又、本発明におけるアジュバントとしての使用に適している。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、幹、根、更には花において認められるステロール配糖体及びトリテルペノイド配糖体の異種群である。キナヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から分離されるサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンは又、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））及びサボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から商業的に入手できる。サポニンアジュバント製剤は、ＱＳ２１等の精製製剤、並びにＩＳＣＯＭ等の脂質製剤を含む。サポニンアジュバント製剤としては、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）アジュバント（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．［米国マサチューセッツ州レキシントン］）が含まれる。
【００８８】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されてきた。これらの技法を使用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃを含む、特異的精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン製剤は又、コレステロール等のステロールを含んでよい（国際特許第９６／３３７３９号を参照）。
【００８９】
サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用して免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成するために使用できる。ＩＳＣＯＭは、一般的にはホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリン等のリン脂質をも含む。如何なる既知のサポニンもＩＳＣＯＭにおいて使用できる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡ及びＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは更に、欧州特許第０１０９９４２号、国際特許第９６／１１７１１号及び同第９６／３３７３９号に記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭは、更なる界面活性剤を含まなくてもよい。国際特許第００／０７６２１号を参照。
【００９０】
サポニン系アジュバントの開発の概要は、Ｂａｒｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ３２：２４７−２７１．に見られる。又、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ３２：３２１−３３８も参照されたい。
Ｄ．ビロゾーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）
ビロゾーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明におけるアジュバントとして使用できる。これらの構造は一般的に、場合によりリン脂質と組み合わせた又はリン脂質と共に調製された、ウイルスに由来する１つ以上のタンパク質を含む。それらは一般的に非病原性、非複製性であり、一般的に如何なる天然なウイルスゲノムも含まない。ウイルスタンパク質は、組換え産生されるか又は全ウイルスから分離することができる。ビロゾーム又はＶＬＰにおいて使用するのに好適なこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（ＨＡ又はＮＡ等）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質又はキャプシドタンパク質等）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質等）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、及びＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１等）に由来するタンパク質が含まれる。ＶＬＰについては、国際特許第０３／０２４４８０号；国際特許第０３／０２４４８１号；Ｎｉｉｋｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６（９）：５３４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８８：３２７−３３８；及びＧｅｒｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７５（１０）：４７５２−４７６０で詳細に考察されている。ビロゾームについては、例えばＧｌｕｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｂ１０−Ｂ１６で詳細に考察されている。鼻内三価ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品（Ｍｉｓｃｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔｃａｌｆｅ  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌ  ５：Ｂ１７−Ｂ２３）及びＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳＴＭ製品では、免疫増強再構成インフルエンザビロゾーム（ＩＲＩＶ）がサブユニット抗原送達システムとして使用される。
【００９１】
Ｅ．細菌誘導体又は微生物誘導体
本発明において使用するのに好適なアジュバントとしては、以下のような細菌誘導体又は微生物誘導体が含まれる：
（１）腸内細菌の腸内細菌性リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体：このような誘導体としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）や３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは、４、５又は６本のアシル化された鎖と３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、欧州特許第０６８９４５４号に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」とは、０．２２ミクロンの膜で滅菌濾過されるのに十分な程度に小さい（欧州特許第０６８９４５４号を参照）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、リン酸アミノアルキルグルコサミニド誘導体、例えばＲＣ−５２９等のモノホスホリル脂質Ａ模倣体が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  ９：２２７３−２２７８を参照されたい。
【００９２】
（２）脂質Ａ誘導体：脂質Ａ誘導体としては、ＯＭ−１７４等の大腸菌に由来する脂質Ａの誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えばＭｅｒａｌｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：２４８５−２４９１；及びＰａｊａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：８３６−８４２に記載されている。
【００９３】
（３）免疫刺激オリゴヌクレオチド：本発明においてアジュバントして使用するのに好適な免疫刺激オリゴヌクレオチド又はポリマー分子は、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（非メチル化シトシンとそれに続くグアノシンを含み、リン酸結合によって結合した配列）を含む。パリンドローム配列又はポリ（ｄＧ）配列を含む細菌二本鎖ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾等のヌクレオチド修飾／類似体を含み得、そして二本鎖又は一本鎖であってよい。場合により、グアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン等の類似体で置換されてもよい。可能な類似体置換の例に関しては、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１（９）：２３９３−２４００；国際特許第０２／２６７５７号；及び国際特許第９９／６２９２３号を参照されたい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は更に、Ｋｒｉｅｇ  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２：１７９−１８５；国際特許第９８／４０１００号；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号；及び米国特許第６，４２９，１９９号において考察されている。
【００９４】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴ又はＴＴＣＧＴＴ等のＴＬＲ９を対象とし得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３１  （ｐａｒｔ  ３）：６５４−６５８を参照されたい。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ等のＴｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか、若しくはＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ等のＢ細胞応答の誘導に特異的である場合がある。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ及びＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ  （２００２）  ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３（２）：６４−６５；及び国際特許第０１／９５９３５号で考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【００９５】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体認識のために５’末端がアクセス可能であるように構成される。場合により、２個のＣｐＧオリゴヌクレオチドがそれらの３’末端で結合して、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  ＢＢＲＣ  ３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３１（ｐａｒｔ  ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  ＢＢＲＣ  ３００：８５３−８６１；及び国際特許第０３／０３５８３６号を参照されたい。
【００９６】
免疫刺激オリゴヌクレオチド及びポリマー分子は又、例えばポリビニル主鎖（Ｐｉｔｈａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ２０４（１）：３９−４８；Ｐｉｔｈａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７０）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９（８）：９６５−９７７）やモルホリノ主鎖（米国特許第５，１４２，０４７号；米国特許第５，１８５，４４４号）等の他のポリマー主鎖構造を含む。種々の他の荷電性及び非荷電性のポリヌクレオチド類似体は、当該技術分野で既知である。多くの主鎖修飾が当該技術分野で既知であり、それらとしては、非荷電性結合（例えば、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホアミデート及びカルバミン酸塩）や荷電性結合（例えば、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエート）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
（４）ＡＤＰ−リボシル化毒素及びその無毒化誘導体：細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素及びその無毒化誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用される場合がある。好ましくは、タンパク質は、大腸菌（即ち、大腸菌易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラトキシン（「ＣＴ」）又は百日咳トキシン（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用については、国際特許第９５／１７２１１号に、非経口アジュバントとしての使用については、国際特許第９８／４２３７５号に記載されている。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３やＬＴ−Ｒ７２やＬＴＲ１９２Ｇ等の無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰ−リボシル化毒素及びその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３及びＬＴ−Ｒ７２をアジュバントとして使用することは、以下の参考文献に記載されている：Ｂｅｉｇｎｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２（２）：２８５−２９３；及びＰｉｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換についての数値の記載は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５（６）：１１６５−１１６７に記載されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニット及びＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【００９８】
Ｆ．生体接着剤及び粘膜接着剤
生体接着剤及び粘膜接着剤も又、本発明におけるアジュバントとして使用される場合がある。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア（Ｓｉｎｇｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｃｏｎｔ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０：２６７−２７６）或いはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類及びカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体等の粘膜接着剤が含まれる。キトサン及びその誘導体も本発明におけるアジュバントとして使用される場合がある（国際特許第９９／２７９６０号を参照）。
【００９９】
Ｇ．微粒子
微粒子も又、本発明におけるアジュバントとして使用される場合がある。生分解性且つ非毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等）とポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から形成される微粒子（即ち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、場合により、負に荷電した表面（例えばＳＤＳで）又は正に荷電した表面（例えばＣＴＡＢ等の陽イオン界面活性剤で）を有するように処理される。
【０１００】
Ｈ．リポソーム
本発明においてアジュバントして使用するのに好適なリポソーム製剤の例については、米国特許第６，０９０，４０６号；米国特許第５，９１６，５８８号；及び欧州特許第０６２６１６９号に記載されている。
【０１０１】
Ｉ．ポリオキシエチレンエーテル製剤及びポリオキシエチレンエステル製剤
本発明において使用するのに好適なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステルが含まれる（国際特許第９９／５２５４９号を参照）。このような製剤としては更に、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（国際特許第０１／２１２０７号）並びにオクトキシノール等の少なくとも１つの更なる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（国際特許第０１／２１１５２号）が含まれる。
【０１０２】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。
【０１０３】
Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
本発明においてアジュバントして使用するのに好適なＰＣＰＰ製剤については、例えばＡｎｄｒｉａｎｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９（１−３）：１０９−１１５；及びＰａｙｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ３１（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０１０４】
Ｋ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントして使用するのに好適なムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）及びＮ−アセチルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−１−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）等が含まれる。
【０１０５】
Ｌ．イミダゾキノリン化合物
本発明においてアジュバントして使用するのに好適なイミダゾキノリン化合物の例としては、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）及びその類似体が含まれ、それらについては、Ｓｔａｎｌｅｙ  （２００２）  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２７（７）：５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ  （２００３）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  ４（２）：２１４−２１８；並びに米国特許第４，６８９，３３８号；同第５，３８９，６４０号；同第５，２６８，３７６号；同第４，９２９，６２４号；同第５，２６６，５７５号；同第５，３５２，７８４号；同第５，４９４，９１６号；同第５，４８２，９３６号；同第５，３４６，９０５号；同第５，３９５，９３７号；同第５，２３８，９４４号；及び同第５，５２５，６１２号で詳述されている。
【０１０６】
Ｍ．チオセミカルバゾン化合物
本発明においてアジュバントして使用するのに好適なチオセミカルバゾン化合物の例、並びにこのような化合物の配合、製造及びスクリーニングの方法としては、国際特許第０４／６０３０８号に記載されるものが含まれる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
Ｎ．トリプタントリン化合物
本発明においてアジュバントして使用するのに好適なトリプタントリン化合物の例、並びにこのような化合物の調整、製造及びスクリーニングの方法としては、国際特許第０４／６４７５９号に記載されるものが含まれる。トリプタントリン化合物は、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１０７】
本発明は又、上記で同定されたアジュバントの１つ以上の態様の組み合わせを含む場合がある。例えば、本発明において以下のアジュバント組成物が使用される場合がある：
（１）サポニンと水中油型乳剤（国際特許第９９／１１２４１号）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（国際特許第９４／００１５３号を参照）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により、＋ステロール）（国際特許第９８／５７６５９号）；
（５）例えば、ＱＳ２１及び／又は水中油型乳剤と３ｄＭＰＬとの組み合わせ（欧州特許第０８３５３１８号；欧州特許第０７３５８９８号；及び欧州特許第０７６１２３１号を参照）；
（６）サブミクロン乳剤へのマイクロ流動化、又はより大きな粒径の乳剤を生成するためのボルテックスの何れかが行われた、１０％スクワレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１及びｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ；
（７）２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、並びにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ［米国モンタナ州ハミルトン］）；
（８）１つ以上の無機塩（アルミニウム塩等）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬ等）；
（９）１つ以上の無機塩（アルミニウム塩等）＋免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列等）。
【０１０８】
Ｏ．ヒト免疫調節剤
本発明においてアジュバントして使用するのに好適なヒト免疫調節剤としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等）やインターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）やマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカインが含まれる。
【０１０９】
特定の実施形態において、前記組成物は経粘膜投与される場合があり、そして更に粘膜アジュバントを含むことが好ましいであろう。適切な粘膜アジュバントとしては：オリゴ含有ＣｐＧ、生体付着性ポリマー（国際特許第９９／６２５４６号及び同第００／５００７８号を参照）；大腸菌易熱性エンテロトキシン（「ＬＴ」）又はその無毒化変異体又はコレラトキシン（「ＣＴ」）又はその無毒化変異体又は生分解性且つ非毒性の物質から形成される微粒子が含まれる。好ましいＬＴ変異体としては、Ｋ６３又はＲ７２が含まれる。例えば、国際特許第９３／１３２０２号、欧州特許第０６２０８５０（Ｂ１）号、国際特許第９７／０２３４８号及び国際特許第９７／２９７７１号を参照されたい。
【０１１０】
特に好ましい一実施形態において、エンベロープ糖タンパク質は、ＭＦ５９、ＣｐＧオリゴ（例えば、ＣｐＧ−７９０９）或いはＭＦ５９とＣｐＧオリゴの両方によってアジュバント化される。ＣｐＧ−７９０９及びＭＦ−５９におけるアジュバント作用の正確な機序は、依然として徹底した研究が行われているが、十分な証拠により、ＣｐＧ−７９０９／２００６はＢ細胞を活性化し、そして形質細胞様樹状細胞の共刺激分子の産生を増大させるが（Ｋｅｒｋｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０（９）：４４６５−４４７４）、ＭＦ５９は抗原提示細胞と相互作用し、そして筋肉内注入部位の樹状細胞によって内在化される（Ｄｕｐｏｉｓ  （１９９８）  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８６（１）：１８−２７）ことが示唆される。ＣｐＧ−７９０９及びＭＦ５９はヒトにおける使用が認可されており、そして臨床試験における忍容性は良好なものとなってきており（Ｋａｈｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ７０（５）：１２８８−１２９１；Ｏｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６：２７７−２９６；Ｃｏｏｐｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２（２３−２４）：３１３６−３１４３）、その臨床試験としては、ＨＩＶを抱える人々に対して行われるＢ型肝炎ワクチン試験及びインフルエンザワクチン試験が含まれる（Ｃｏｏｐｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  ＡＩＤＳ  １９（１４）：１４７３−１４７９；Ｇａｂｕｔｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  ３３（４）：４０６−４１６）。本明細書に記載の実験によって、多価ＨＩＶｏ−ｇｐ１４０により誘発される免疫応答の質と幅とを増大させるＭＦ５９及びＣｐＧ−７９０９の能力が示される。
ポリペプチド産生
本発明のエンベロープポリペプチドは、当該技術分野で既知の何れかの方法で産生することができる。
【０１１１】
一実施形態において、前記ポリペプチドは、当該技術分野で周知の組換え技法を使用して産生される。この点に関して、オリゴヌクレオチドプローブは、エンベロープ（例えば、ｇｐ１４０）ポリペプチドのゲノムの既知の配列に基づいて考案され、エンベロープ遺伝子のゲノムライブラリ又はｃＤＮＡライブラリをプローブするために使用することができる。遺伝子は、例えば完全長配列の所望の部分で遺伝子を開裂するために使用される制限酵素等の標準的技法を使用して更に分離することができる。同様に、フェノール抽出やあらゆる所望のトランケーションを得るために更に操作された配列等の既知の技法を使用して、エンベロープ遺伝子は、それを含む細胞及び組織から直接分離することができる。ＤＮＡを得るため及び分離するために使用する技法の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．（前掲）を参照されたい。
【０１１２】
エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子は、既知の配列に基づいて合成的に産生することができる。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列における適切なコドンにより設計され得る。完全配列は、標準法により調製される重複するオリゴヌクレオチドから一般的に構成され、完全コード配列に構成される。例えば、Ｅｄｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６−７６２；Ｎａｍｂａｉｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１；Ｊａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９：６３１１−６３１７；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３を参照されたい。
【０１１３】
適切な塩基対を置換して所望のアミノ酸におけるコドンとすることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異を誘発し得るエンベロープポリペプチド遺伝子をコードする遺伝子のクローンを形成するために、組換え技法が容易に使用される。このような変化には、単一アミノ酸に変化を起こすわずか１個の塩基対、或いは幾つかの塩基対の変化が包含される。或いは、変異は、ミスマッチ二本鎖の融解温度未満の温度で親ヌクレオチド配列（一般的にＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ）とハイブリッド形成するミスマッチプライマーを使用して起こる。プライマーは、プライマー長及び塩基組成を比較的狭い範囲内で維持すること、及び変異体塩基を中央に位置するように維持することによって特異的にすることができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９８３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００：４６８−５００を参照されたい。プライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼ、クローニングされる産物、並びにプライマー伸長鎖の分離によって得られ、選択される変異ＤＮＡを含むクローンを使用してもたらされる。選択は、変異体プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして使用して達成され得る。この技法は又、多重点変異の生成にも適用可能である。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６４０９−６４１３を参照されたい。
【０１１４】
ひとたび所望のエンベロープ糖タンパク質に対するコード配列が分離又は合成されると、それを発現のための任意の適切なベクター又はレプリコンにクローン化し得る。多くのクローニングベクターが当業者に既知であり、適当なクローニングベクターの選択は好みの問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクター及びそれらが形質転換可能な宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ（大腸菌）、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非大腸菌グラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌及び枯草菌）、ｐＢＤ９（バシラス）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセス）、ｐＵＣ６（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（サッカロマイセス）、ＹＣｐ１９（サッカロマイセス）及びウシ乳頭腫ウイルス（哺乳類細胞）等が含まれる。一般的には、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ＆  ＩＩ（前掲）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．（前掲）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ（前掲）を参照されたい。
【０１１５】
バキュロウイルス系のような昆虫細胞発現系も使用してよく、当業者に既知であり、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  （１９８７）  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料及び方法は、キット形態、とりわけＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州サンディエゴ；「ＭａｘＢａｃ」キット）より商業的に入手することができる。
【０１１６】
植物発現系も又、修飾エンベロープタンパク質を産生させるために使用してもよい。一般的に、このような系は、ウイルス系ベクターを使用して植物細胞を異種遺伝子でトランスフェクトする。このような系の説明については、Ｐｏｒｔａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５：２０９−２２１；及びＨａｃｋｌａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １３９：１−２２を参照されたい。
【０１１７】
Ｔｏｍｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６７：４０１７−４０２６及びＳｅｌｂｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１１０３−１１１３に記載されるワクシニア系の感染／トランスフェクション系等のウイルス系も又、本発明に関して用途が見出されるであろう。この系においては、まず、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスを使用して、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトする。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを有するテンプレートのみを転写する卓越した特異性を示す。感染の後、Ｔ７プロモーターによって駆動された目的のＤＮＡで細胞をトランスフェクトする。組換えワクシニアウイルスから細胞質中で発現されたポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いでこのＲＮＡは宿主の翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。この方法により、多量のＲＮＡ及びその翻訳産物の高レベルの一過性細胞質産生が得られる。
【０１１８】
遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌性発現のために）及び、場合によりオペレーター（本明細書において集合的に「制御」要素と呼ばれる）の制御下に置くことができ、その結果、この発現構成物を含有するベクターで形質転換された宿主細胞において、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写される。コード配列は、シグナルペプチド又はリーダー配列を含む場合もあれば含まない場合もある。本発明に関しては、天然のシグナルペプチド又は異種配列の両方を使用してよい。リーダー配列は、翻訳後プロセシングにおいて、宿主により除去されてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照されたい。このような配列としては、ＴＰＡリーダー並びにミツバチメリチンシグナル配列等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
宿主細胞の増殖に比較して、タンパク質配列の発現の調節を可能にする他の調節配列も望ましい場合がある。このような調節配列は当業者に既知であり、その例としては、調節化合物の存在を含む化学的刺激又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こす調節配列が含まれる。他のタイプの調節要素、例えばエンハンサー配列もベクター内に存在する場合がある。
【０１２０】
制御配列及び他の調節配列は、ベクターに挿入する前にコード配列に連結される場合がある。或いは、既に制御配列及び適切な制限部位を含有する発現ベクターに、コード配列を直接クローン化することができる。
【０１２１】
場合によっては、コード配列を、それが適切な配向を有する制御配列に結合され得るように、即ち、適切な読み枠を維持するために、修飾することが必要な場合がある。変異体又は類似体は、タンパク質をコードする配列の一部を欠失させることにより、配列の挿入により、及び／又は配列内の１つ以上のヌクレオチドの置換により調製される場合がある。部位特異的変異誘発等のヌクレオチド配列を修飾する技法は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，（前掲）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（前掲）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前掲）を参照されたい。
【０１２２】
次に、発現ベクターを使用して適切な宿主細胞をトランスフェクトする。多くの哺乳動物細胞株が当該技術分野で既知であり、そしてこれには、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ｖｅｒｏ２９３細胞並びにその他等の米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が包含される。好ましい一実施形態においては、ｏ−ｇｐ１４０（三量体）が、ＣＨＯ細胞から産生及び／又は精製される。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６（６）：２８３５−２８４７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（２９）：１１２４４−１１２５９を参照されたい。
【０１２３】
大腸菌、枯草菌及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．等の細菌宿主に、本発明の発現構成要素に関して用途が見出される。本発明において有用な酵母宿主としては、とりわけ、サッカロミセスセレビシエ、カンジダアルビカンス、カンジダマルトサ、ハンセヌラポリモルファ、クリュイベロミセスフラギリス、クリュイベロミセスラクチス、ピチアギレリモンディ、ピチアパストリス、シゾサッカロミセスポンベ及びセロウィアリポリティカが含まれる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用する昆虫細胞としては、とりわけ、ネッタイシマカ、オートグラファカリフォルニカ、カイコ、キイロショウジョウバエ、スポドプテラフルギペルタ及びイラクサギンウワバが含まれる。
【０１２４】
選択される発現系及び宿主により、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、目的のタンパク質が発現する条件下で増殖させることにより本発明のタンパク質が産生される。適切な増殖条件の選択は、当該技術分野の技術範囲内に含まれる。
【０１２５】
一実施形態において、形質転換細胞は、周囲の培地にポリペプチド生成物を分泌する。特定の調節配列は、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー配列、インターフェロン（β又はγ）シグナル配列又は分泌タンパク質に由来する他のシグナルペプチド配列を使用してタンパク質生成物の分泌を高めるベクターに含まれてよい。次いで、分泌されたポリペプチド生成物は、例えば、ヒドロキシアパタイト樹脂、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動法、ＨＰＬＣ、免疫吸着法、アフィニティクロマトグラフィー、免疫沈降等があるがこれらに限定されない標準的な精製法を使用する等、本明細書に記載の種々の技法により分離される。
【０１２６】
或いは、形質転換細胞は、細胞を崩壊させるがエンベロープポリペプチドは実質的に無傷に維持する化学的、物理的又は機械的な手段を使用して崩壊される。細胞内タンパク質は又、エンベロープポリペプチドの漏出が起こるように、例えば界面活性剤又は有機溶媒を使用して細胞壁又は細胞膜から成分を除去することにより得ることができる。このような方法は、当業者に既知であり、そして、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｅ．Ｌ．Ｖ．  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．  Ａｎｇａｌ  （ｅｄｓ．））  １９９０に記載されている。
【０１２７】
例えば、本発明と共に使用する細胞を崩壊させる方法としては、音波処理又は超音波処理；撹拌；液体又は固体の押出し；熱処理；凍結融解；乾燥；爆発的減圧；浸透圧衝撃；トリプシンやノイラミニダーゼやリゾチーム等のプロテアーゼが包含される溶菌酵素による処理；アルカリ処理；並びに胆汁酸塩やドデシル硫酸ナトリウムやトリトンやＮＰ４０やＣＨＡＰＳ等の界面活性剤及び溶媒の使用、が含まれるが、これらに限定されない。細胞を崩壊させるために使用する特定の技法は、殆ど好みの問題であり、そして、ポリペプチドが発現する細胞型、培養条件及び使用される何れかの前処理によって決まるであろう。
【０１２８】
細胞の崩壊後、細胞細片は一般的に遠心分離により取り除かれ、そして細胞内に産生したエンベロープポリペプチドは、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動法、ＨＰＬＣ、免疫吸着法、アフィニティクロマトグラフィー、免疫沈降等があるがこれらに限定されない標準的な精製法を使用して更に精製される。
【０１２９】
例えば、本発明の細胞内エンベロープポリペプチドを得るためのある方法は、抗エンベロープ特異的抗体を使用する免疫アフィニティクロマトグラフィーによる、又はレクチンアフィニティクロマトグラフィーによる等のアフィニティ精製を伴う。特に好ましいレクチン樹脂は、ガランタスニバリスアグルチニン（ＧＮＡ）、レンズマメアグルチニン（ＬＣＡ又はレンズマメレクチン）、エンドウマメアグルチニン（ＰＳＡ又はエンドウレクチン）、ラッパスイセンアグルチニン（ＮＰＡ）及びアリウムウルシヌムアグルチニン（ＡＵＡ）に由来する樹脂等があるがこれらに限定されない、マンノース部分を認識するものである。適切なアフィニティ樹脂の選択は、当該技術分野の技術範囲内に含まれる。アフィニティ精製の後、ポリペプチドは、上記の技法の何れかによる等、当該技術分野で周知の従来技法を使用して更に精製してよい。
【０１３０】
相対的に小さなポリペプチド、即ち、長さ約５０個までのアミノ酸は、例えばペプチド技術の当業者に既知の幾つかの技法の何れかにより、化学的に都合よく合成され得る。一般的に、これらの方法は、成長するペプチド鎖への１個以上のアミノ酸の連続的な付加を使用する。通常、第１のアミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基の何れかは、適切な保護基によって保護される。次いで、保護又は誘導体化されたアミノ酸は、アミド連鎖の形成を可能にする条件下で、適切に保護された相補的（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列において隣のアミノ酸に逐次的に付加することにより、不活性固体支持体に結合され得るか、又は溶液中で利用され得る。次いで、保護基は、新たに付加されたアミノ酸残基から除去され、そして次に、隣の（適切に保護された）アミノ酸が付加され、後も同様である。所望のアミノ酸が正しい配列で結合された後、任意の残りの保護基（及び固相合成法が使用される場合は、任意の固体支持体）は逐次的又は同時に除去され、最終的なポリペプチドを生じる。この一般的手順の簡単な変更によって、例えば、保護トリペプチドを適切に保護されたジペプチドに結合して（キラル中心をラセミ化しない条件下）脱保護化後にペンタペプチドを形成することにより、成長する鎖に２個以上のアミノ酸を一度に付加することができる。例えば、固相ペプチド合成法については、Ｊ．Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ  １９８４）；並びにＧ．  Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｖｏｌ．  ２，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０），  ｐｐ．  ３−２５４を参照されたい。古典的な溶液合成については、Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  １９８４）；並びにＥ．  Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １を参照されたい。
【０１３１】
一般的な保護基としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｘ）；２，４−ジニトロフェニル；ベンジル（Ｂｚｌ）；ビフェニルイソプロピルオキシカルボキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニル等が含まれる。
【０１３２】
一般的な固体支持体は、架橋ポリマー支持体である。これには、ジビニルベンゼン架橋スチレン系ポリマー、例えば、ジビニルベンゼンヒドロキシメチルスチレン共重合体、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレン共重合体及びジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレン共重合体が含まれてもよい。
【０１３３】
本発明のポリペプチド類似体は又、多様ペプチド並行合成の方法による等の他の方法によって化学的に調製されてもよい。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５；米国特許第４，６３１，２１１号を参照されたい。
抗体
本明細書に記載のアジュバント化ＨＩＶ糖タンパク質に対する抗体は、モノクローナル及びポリクローナルとも、診断及び治療用途で使用してよく、例えば、中和抗体は受動免疫療法に有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を増大させるために使用される場合がある。
【０１３４】
抗イディオタイプ抗体は、防御が望まれる感染因子の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を増大させる方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｒｚｙｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：７４−７６；ＭａｃＮａｍａｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：１３２５−１３２６，  Ｕｙｔｄｅｈａａｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３４：１２２５−１２２９を参照されたい。この抗イディオタイプ抗体は又、ＨＩＶの治療及び／又は診断に有用である場合がある。
【０１３５】
ウイルス抗原のための免疫学的検定は、例えば、ウィルスエピトープに対するモノクローナル抗体、１つのウイルスポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ、種々のウイルスポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体、同じウイルス抗原に対するポリクローナル抗体、種々のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせを使用される場合がある。
【０１３６】
免疫学的検定プロトコルは又、例えば、競合検定、直接反応検定又はサンドウィッチ型検定に基づいてよい。プロトコルは又、例えば固体支持体を使用し得るか、又は免疫沈降によるものであってよい。殆どの検定は、標識抗体又は標識ポリペプチドの使用を伴う。この標識は、例えば、蛍光分子、化学ルミネッセンス分子、放射性分子又は染料分子であってよい。プローブからのシグナルを増幅する検定も又既知である。その検定の例としては、ビオチンとアビジンとを使用する検定、並びに酵素標識及び酵素媒介免疫学的検定（例えば、ＥＬＩＳＡ検定）がある。
【０１３７】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して抗原濃度又は抗体濃度の何れかを測定することができる。この方法は、抗原又は抗体に対する酵素の複合体化に依存し、定量標識として結合した酵素活性を使用する。抗体を測定するためには、既知の抗原を固相（例えば、マイクロプレート又はプラスチックカップ）に固定し、それを試験用血清希釈液とインキュベートし、洗浄し、酵素で標識した抗免疫グロブリンとインキュベートし、再び洗浄する。標識に適切な酵素は、当該技術分野で既知であり、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼが含まれる。特異的な基質を加え、生成物の形成又は基質の利用を比色定量的に測定することにより、固相に結合した酵素活性が測定される。結合した酵素活性は、結合した抗体の量の一次関数である。
【０１３８】
抗原を測定するためには、既知の特異的な抗体を固相に固定し、抗原を含有する試験物質を加え、インキュベーション後に固相を洗浄し、更に別の酵素標識抗体を加える。洗浄後、基質を加え、酵素活性を比色定量的に評価し、抗原濃度に関連付ける。
【０１３９】
ポリクローナル抗体は、融合タンパク質をマウス、ウサギ、ヤギ又はウマ等の哺乳類に投与することによって産生することができる。免疫化された動物からの血清を採取し、例えば硫酸アンモニウムでの析出により抗体を血漿から精製し、その後クロマトグラフィー、好ましくはアフィニティクロマトグラフィーを行う。ポリクローナル抗血清を産生及び処理する技法は、当該技術分野で既知である。
【０１４０】
モノクローナル抗体も又、産生することができる。例えば変異体ＮＳ３ポリペプチド又はＮＳコア融合タンパク質で免疫化されたマウス等の哺乳類からの正常Ｂ細胞は、例えば、ハイブリドーマを産生するＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞と融合することができる。ハイブリドーマは、ＲＩＡ又はＥＬＩＳＡを使用して同定し、半固体アガー内でのクローンニング又は限界希釈によって分離することができる。所望の特異的抗体を産生するクローンは、別のスクリ−ニングラウンドにより分離される。
【０１４１】
エピトープに対する抗体（モノクローナル及びポリクローナル）は、ＨＩＶに感染したヒト由来の血清試料等の試料内の抗原の存在を検出するのに特に有用である。ＨＩＶ抗原の免疫学的検定は、１つの抗体又は幾つかの抗体を利用してよい。ＨＩＶ抗原の免疫学的検定は、例えば、ＨＩＶエピトープに対するモノクローナル抗体、１つのエンベロープのエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ、種々のポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体、同じＨＩＶ抗原に対するポリクローナル抗体、種々のＨＩＶ抗原に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせを使用される場合がある。免疫学的検定プロトコルは、例えば標識抗体等を使用する競合検定、直接反応検定又はサンドウィッチ型検定に基づいてよい。標識は、例えば、蛍光性、化学ルミネッセンス又は放射性であってよい。
【０１４２】
イムノアフィニティカラムでエンベロープを分離するために、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を更に使用される場合がある。抗体がその免疫選択的活性を保持するように、抗体は、例えば吸着又は共有結合によって固体支持体に付着させ得る。場合により、抗体の抗原結合部位がアクセス可能なままであるように、スペーサ基を含んでよい。更に、固定化抗体は、血液又は血漿等の生体試料に由来する標的に結合するために使用される場合がある。結合されたタンパク質又は複合体は、例えばｐＨを変化させることによって、カラムマトリックスから回収される。
診断用途、ワクチン用途及び治療的用途
本発明の組成物又はそれをコードするためのポリヌクレオチドは、多くの診断目的及び治療的目的のために使用することができる。例えば、その組成物に対して生成されるタンパク質及びポリヌクレオチド又は抗体は、ＨＩＶ感染又は疾患状態の診断に効果があるか、若しくは免疫化に対する応答の基準としての生体試料内における反応性抗体及び／又はエンベロープタンパク質の存在を判定するために、種々の検定に使用することができる。
【０１４３】
上述の通り、エンベロープ（例えば、ｏ−ｇｐ１４０）ポリペプチドと反応する抗体の存在、反対に、それに生成する抗体と反応する抗原の存在は、競合検定、直接反応検定又はサンドウィッチ型検定等の免疫学的検定等の、標準的な電気泳動法及び免疫診断法を使用して検出され得る。このような検定としては、ウェスタンブロット法；凝集検査；ＥＬＩＳＡ等の酵素標識及び酵素媒介免疫学的検定；ビオチン／アビジン型検定；放射免疫学的検定；免疫電気泳動；免疫沈降等が含まれるが、これらに限定されない。その反応には一般的に、蛍光分子、化学ルミネッセンス分子、放射性分子又は酵素標識又は染料分子等の伝達的な標識、或いは抗原とそれと反応する１つの抗体又は複数の抗体との間の複合体の形成を検出する他の方法が包含される。
【０１４４】
検定に使用することができる固体支持体の例には、膜状又はマイクロタイターウェル状のニトロセルロース；シート状又はマイクロタイターウェル状のポリ塩化ビニル；ビーズ状又はマイクロタイタープレート状のポリスチレンラテックス；ポリフッ化ビニリジン；ジアゾ紙；ナイロン膜；活性化ビーズ等がある。
【０１４５】
上記の免疫学的検定を行うために、本明細書に記載のアジュバント化エンベロープ糖タンパク質組成物或いは組成物に対する抗体は、適切な説明書及び他の必要な試薬と共にキットで提供することができる。使用する特定の免疫学的検定によって、キットは又、適切なラベル並びに他の包装された試薬及び材料（即ち、洗浄用緩衝剤等）を含んでもよい。上記したもの等の標準的な免疫学的検定は、これらのキットを使用して実施することができる。
【０１４６】
前記組成物は又、被験体における予防的（即ち、感染及び／又は疾患進行の予防）及び／又は治療的（感染後のＨＩＶの治療）な免疫応答を誘導するために、ワクチンとして使用される場合もある。ワクチンの組成物は、複数のウイルス分離株及び／又はサブタイプに由来するエンベロープ糖タンパク質（又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列）の混合物を含んでよい。特定の実施形態において、前記組成物は、少なくとも２種類の異なるサブタイプ（例えば、サブタイプＢ及びＣ）に由来するエンベロープ糖タンパク質（又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列）の混合物を含む場合がある。他の実施形態において、前記組成物は、少なくとも３種類の異なるサブタイプ（例えば、サブタイプＡ、Ｂ及びＣ）に由来するエンベロープ糖タンパク質（又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列）の混合物を含んでもよい。更なる実施形態において、前記組成物は、少なくとも２種類の異なるＨＩＶのタイプ（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）に由来するエンベロープ糖タンパク質（又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列）の混合物を含んでもよい。更に他の実施形態において、前記組成物は、同じサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−１ＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、等）に由来する少なくとも２種類の異なる株に由来するエンベロープ糖タンパク質（又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列）の混合物を含んでもよい。
【０１４７】
特定の実施形態において、本明細書に記載の多価組成物は、複数のＨＩＶタイプ、株及び／又はサブタイプに由来する感染症を防ぐ及び／又は治療する免疫応答を誘導するために使用することができる。他の実施形態において、本明細書に記載の多価組成物は、複数のＨＩＶサブタイプに由来するＨＩＶ株に対する予防的及び／又は治療的な免疫応答を誘導するために使用することができる。例えば、本明細書に記載の多価組成物は、前記組成物のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質が由来する株を包含するＨＩＶサブタイプに対して予防的及び／又は治療的な免疫応答を誘導するために使用することができる。特定の一実施形態において、本明細書に記載の多価組成物は、前記組成物のＨＩＶエンベロープ糖タンパク質が由来する株を包含するＨＩＶサブタイプと、前記多価組成物においては示されないＨＩＶサブタイプとに対して予防的及び／又は治療的な免疫応答を誘導するために使用することができる。
【０１４８】
本明細書に記載の組成物及びワクチンは、免疫化組成物の一部を形成しないサブタイプを含めた種々のサブタイプに対する広い中和活性を生じる場合がある。例えば、実施例１において、本出願人等らは、サブタイプＢ及びＣのエンベロープ糖タンパク質を含む多価組成物での免疫化によりサブタイプＢ、Ｃ及びＡの種々のＨＩＶ株に対する中和抗体が誘発されたことを示した。
【０１４９】
本明細書に記載の組成物は又、他の抗原及び免疫調節剤、例えば、ＩＬ−２、修飾ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５−ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１及びＲＡＮＴＥＳを含むがこれらに限定されない免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン及びケモカインと共に投与される場合がある。
【０１５０】
前記組成物は、ポリペプチドとして、或いはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして投与される場合がある。ポリヌクレオチドは、裸の核酸のワクチン（例えばＤＮＡ）として、或いはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター（例えば、米国特許第６，４６５，６３４号；同第６，４５８，５６０号；同第６，４５１，５９２号；同第６，４２６，１９６号；同第６，３７６，２３６号；同第６，０１５，６９４号；同第６，３４２，３７２号；同第６，０１５，６８６号；同第５，８４３，７２３号；及び同第５，７８９，２４５号を参照）及びアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを使用して送達される場合がある。ポリヌクレオチドは又、非ウイルスベクター（例えば、核酸又はタンパク質で被覆したリポソーム、粒子）を使用して送達される場合がある。これら及び他のポリヌクレオチド送達系は、当業者に既知であり、例えば、米国特許第６，９４３，１５３号；同第６，６０２，７０５号；並びに米国特許公開第２００５０２１４２５６号；同第２００３０１９４８００号；同第２００３０１７０６１４号；同第２００３０２２３９６４号；同第２００３０１４３２４８号；及び同第２００２０１９８６２１号に記載されている。
【０１５１】
前記組成物は又、タンパク質及び核酸の混合物を含む場合があり、これは同一又は異なるビヒクルを使用して順番に送達される場合がある。
【０１５２】
前記組成物及びワクチンは、単一又は複数の様式（例えば、ＤＮＡ又はウイルスの初回抗原刺激並びにタンパク質の追加抗原刺激）で投与される場合があり、そしてその個別の様式は、逐次的に又は併用して施してよい。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、哺乳類の被験体を初回抗原刺激するために投与される場合がある。初回抗原刺激とは、本明細書に使用される場合、本明細書に記載の組成物による第１の免疫化によって本明細書に記載の第２の組成物による第２の免疫化に応じて１つの標的抗原又は複数の抗原に対する免疫応答が起こるようにする任意の方法を意味するものであって、第２の免疫応答が、第１の免疫化が得られない場合、若しくは施される第１の免疫化に１つの抗原又は複数の抗原を発現しない組成物が含まれる場合に達成されるものよりも大きいものである。初回抗原刺激は、単回投与或いは１時間毎、１日毎、１週毎、１月毎又は１年毎に投与される反復投与を含む投与計画を包含する。特定の一実施形態において、初回抗原刺激（又は、初回抗原刺激免疫化）は、少なくとも２回の投与（１つ以上の用量又は投与量を含む）を含む。例えば、特定の一実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の組成物の投与による初回抗原刺激は、組成物の少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７回以上）の投与（１回以上の用量又は投与量）を伴う。投与の間の時間間隔は、時間、日、週、月又は年であってよい。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、哺乳類の被験体の初回抗原刺激後に達成される免疫応答を追加抗原刺激する追加抗原刺激として投与される場合がある。追加抗原刺激として投与される組成物は、初回抗原刺激の後にしばらくして投与される。特定の一実施形態において、追加抗原刺激（又は追加抗原刺激免疫化）は、初回抗原刺激（又は初回抗原刺激免疫化）の２〜２７週間後に行ってよい。追加抗原刺激は、単回投与或いは１時間毎、１日毎、１週毎、１月毎又は１年毎に投与される反復投与を含む投与計画を包含する。特定の実施形態において、追加抗原刺激（又は追加抗原刺激免疫化）は少なくとも１回の投与を含む。他の実施形態において、追加抗原刺激（又は追加抗原刺激免疫化）は、少なくとも２回の投与（１回以上の用量又は投与量を含む）を含む。例えば、このような例において、特定の一実施形態においては、本明細書に記載の１つ以上の組成物の投与による追加抗原刺激は、組成物の少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７回以上）の投与（１回以上の用量又は投与量を含む）を伴う。投与の間の時間間隔は、時間、日、週、月又は年であってよい。
【０１５３】
特定の実施形態においては、初回抗原刺激及び追加抗原刺激として同じ組成物を投与することができる。他の実施形態においては、初回抗原刺激及び追加抗原刺激に異なる組成物を使用することができる。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチド組成物の複数の免疫化は、初回抗原刺激及び／又は追加抗原刺激として施される。他の実施形態においては、１回以上のポリヌクレオチド（例えばプラスミド、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はそれらの組み合わせ）初回抗原刺激免疫化を施し、その後１回以上のポリペプチド追加抗原刺激を行う。
【０１５４】
本明細書に記載のワクチンは一般的に、１種類以上の「薬学的に許容される賦形剤又はビヒクル」（水、生理食塩水、グリセロール、エタノール等）を含む。更に、助剤物質（湿潤剤又は乳化剤等）、ｐＨ緩衝物質等が、このようなビヒクルに存在してよい。
【０１５５】
それ自身は前記組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導しない分子である担体は、場合により存在する。適切な担体は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（油滴又はリポソーム等）及び不活性ウイルス粒子等の、一般的には大きく、新陳代謝が遅い巨大分子である。このような担体は、当業者に周知である。更に、エンベロープポリペプチドは、細菌トキソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ等に由来するトキソイド）に複合化してよい。
【０１５６】
一般的に、ワクチンの組成物は、液体溶液又は懸濁液の何れかとしての注入剤として調製され；注入前の液状ビヒクル内の溶液又は懸濁液に適した固形も又、調製される場合がある。製剤は又、上記のようなアジュバント効果の向上ためにリポソーム内に乳状にするか若しくはカプセル化することもできる。
【０１５７】
本明細書に記載のワクチンは、治療有効量のアジュバント化ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質組成物、或いは、場合により、それをコードするヌクレオチド配列、これらの複合体に対する抗体及び上述の任意の他の成分を含む。「治療有効量」は、ワクチンが投与される、非感染、感染又は非曝露の個体における予防的免疫応答を誘導する量を意味する。このような応答は、一般的に、被験体における、ワクチンに対する分泌性の細胞媒介性免疫応答及び／又は抗体媒介性免疫応答の発現をもたらす。細胞媒介性免疫応答としては、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞応答、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ８＋細胞抗ウイルス応答及び抗ウイルス性ケモカイン応答が含まれる。抗体媒介性免疫応答としては、血清学的検定（ウイルス中和検定、ＡＤＣＣ検定、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット検定）で測定されるものが含まれる。従って、予防的免疫応答は、以下の効果の１つ以上を含むが、これに限定されない：免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭ等の任意の免疫学的クラスに由来する抗体の産生；Ｂ及びＴリンパ球の増殖；免疫学的細胞に対する活性化シグナル、増殖シグナル及び分化シグナルの供給；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び／又は細胞障害性Ｔ細胞の拡大。
【０１５８】
好ましくは、有効量は、疾患症状の治療又は予防をもたらすのに十分な量である。必要とされる正確な量は、治療される被験体によって変化する；治療される個体の年齢及び一般的症状；抗体を合成する個体の免疫系の能力；所望の防御の程度；治療される症状の重症度；他の要素における、選択される特定の多価組成物、及びその投与様式。適切な有効量は当業者により容易に決定することができる。「治療有効量」は、ルーチン試験により決定することができる比較的広い範囲内にある。
【０１５９】
核酸及び／又はポリペプチドは、両方とも、皮下、上皮、皮内、粘膜内（例えば、経鼻、直腸、膣等）、腹腔内、静脈内、経口又は筋肉内注入することができる。他の投与様式としては、経口及び肺動脈投与、坐薬、無針注入、経皮性及び経皮的使用が含まれる。投薬治療は、単回投与スケジュール又は反復投与スケジュールである場合がある。核酸の投与は、ペプチド又は他の物質の投与と組み合わせる場合がある。
【０１６０】
以上において本発明の好ましい特定の実施形態に関連して本発明を説明してきたが、前述の明細書並びにそれに続く実施例は例示を目的としたものであり、本発明の適用範囲を限定することを目的としたものではないことを理解されたい。本発明の適用範囲内に含まれる他の態様、利点及び改変は、本発明が関係する当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１６１】
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、単に例示を目的として提供されるものであり、如何なる方法によっても本発明の適用範囲を制限することを目的としたものではない。
【０１６２】
使用される数（例えば、量、温度等）について正確さを保証するように試行されたが、幾らかの実験的誤差及び偏差は、もちろん許容されるべきである。
実施例：多価ｏ−ｇｐ１４０ポリペプチドによる免疫化
ＨＩＶエンベロープの免疫原性を高めようと、本発明者等及びその他は、ＨＩＶビリオンの表面に存在する天然で三量体のエンベロープスパイクに類似する場合があるＨＩＶエンベロープ抗原の設計に基づいて、オリゴマーＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（ｏ−ｇｐ１４０）サブユニットワクチンの手法を追求してきた。例えば、Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４（１２）：５７１６−５７２５；Ｇｒｕｎｄｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３１（１）：  ３３−４６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（２９）：１１２４４−１１２５９；Ｂａｒｎｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５（１２）：５５２６−５５４０を参照されたい。故に、本発明者等は、第２の超可変ループ（ΔＶ２）で修飾され、北米人のクレードＢのＨＩＶ株ＳＦ１６２に、及びより最近では南アフリカ人のクレードＣのＨＩＶ株ＴＶ１に由来する可溶性ＨＩＶ  ｏ−ｇｐ１４０を開発してきた（Ｌｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（２１）：１３３３８−１３３４９）。
【０１６３】
ＤＮＡ又はアデノウイルス初回抗原刺激免疫化の後、ＭＦ５９アジュバントにおけるオリゴマータンパク質免疫化を行う初回抗原刺激／追加抗原刺激ワクチン投与計画を使用して、本発明者等は、これらのΔＶ２ｏ−ｇｐ１４０が、ウサギ（Ｂａｒｎｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５（１２）：５５２６−５５４０）、アカゲザル（Ｏｔｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（１３）：８１８９−８２００）及びチンパンジー（Ｐｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（１６）：  １０２００−１０２０９）において免疫原性であることを示した。複製アデノウイルス−ＨＩＶ組換え体でチンパンジーを初回抗原刺激し、その後ＳＦ１６２  ΔＶ２  ｏ−ｇｐ１４０で追加抗原刺激する場合、中和スペクトルの広い抗体の活性の徴候の望みはあるが（Ｐｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（１６）：１０２００−１０２０９）、ウサギ及びアカゲザルにおいてＤＮＡ初回抗原刺激／ｏ−ｇｐ１４０追加抗原刺激のワクチン投与計画を使用する場合、異種のＨＩＶ株に対する体液性応答の幅が限定された（Ｌｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（２１）：  １３３３８−１３３４９）。それでもなお、ＤＮＡ初回抗原刺激／タンパク質追加抗原刺激の投与計画に一体化する場合、ΔＶ２  ＴＶ１及びＳＦ１６２  ｇｐ１４０免疫原は、幾つかの研究で中和―感受性ＳＦ１６２株に対して最も高い力価の中和抗体を絶えず産生し（Ｌｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（２１）：１３３３８−１３３４９）、これにより、単一の２価ワクチン内へのこれらのｇｐ１４０抗原の組み合わせが少なくとも力価に関して有望であり得ることが示唆された。
【０１６４】
多価及びマルチクレードのＨＩＶワクチンにより誘発されるアカゲザル（Ｓｅａｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（５）：２９５６−２９６３；Ｐａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  ３４（５−６）：２２６−２３６）及びモルモット（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２３（２６）：３４３４−３４４５）における中和抗体応答の幅の徴候が改善されることを示す最近の証拠に従って、以下のタンパク質のみの２価のΔＶ２  ｏ−ｇｐ１４０の実験を実施し、急性／早期のＨＩＶ感染症に由来する、特性がはっきりしているＨＩＶ偽型株のパネルに対する中和抗体応答の幅を評価した。早期の分離株が、伝えられるＨＩＶ株をよりよく表現し、そしてしかるにＨＩＶワクチンの設定においてより関連があるという理由で、選択される分離株は、ＨＩＶ感染の経過において早期に得られたものであった（Ｍｏｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １０（８）：７６９−７７１）。更に、ＨＩＶ中和抗体の総合評価についての最近の推奨に基づき（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ７９（１６）：１０１０８−１０１２５；Ｍａｓｃｏｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（１６）：１０１０３−１０１０７；Ｅｓｐａｒｚａ  （２００５）  Ｉｎｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８（２）：９３−１０１）、ワクチン免疫検出均一性を維持するためにサブタイプＢパネルを選択した。
【０１６５】
Ａ．ウサギ
動物、ワクチン及びアジュバント
既にＳｒｉｖａｓｔａｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（２０）：１１２４４−１１２５９及びＬｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（２１）：１３３３８−１３３４９に記載された通りにリサーチグレードＳＦ１６２  ΔＶ２  ｅｎｖ  ｏ−ｇｐ１４０及びＴＶ１  ΔＶ２  ｅｎｖ  ｏ−ｇｐ１４０を調製した。各免疫化群につき１０匹のニュージランドホワイト種ウサギを使用した。ウサギに対して、０、４、１２及び２４週目に殿筋における筋肉内免疫化を合計４回施した。ワクチンの投与量は、動物１匹当たりの指示されたｏ−ｇｐ１４０ワクチンの２５μｇであった。２価ワクチン群（第５群及び第６群）の動物は、１２．５μｇのＳＦ１６２  ｏ−ｇｐ１４０と１２．５μｇのＴＶ１  ｏ−ｇｐ１４０とを同じ注射器内に組み合わせて投与を受けた。第１群、第３群及び第５群の動物には、２５０μＬのＭＦ５９アジュバントと併用したタンパク質免疫が投与された；第２群、第４群及び第６群の動物には、２５０μＬのＭＦ５９アジュバント及び５００μｇのＣｐＧ−７９０９と併用したタンパク質免疫が投与された。
【０１６６】
ウサギは、以下の表で示すように、免疫賦活薬ＣｐＧ−７９０９の有無にかかわらず、ＭＦ５９アジュバントにおける１価又は２価のΔＶ２  ｏ−ｇｐ１４０ワクチンで免疫化された。
【０１６７】
【表１】
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【０１６８】
【表２】
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ＴＺＭ−ｂｌスクリーニング検定
Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９（１６）：１０１０８−１０２５５；及びＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  （２００４）  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）に記載された通りに得られた、ＴＺＭ−ｂｌ細胞のウイルス感染の単一の段階後のルシフェラーゼ遺伝子発現の減少として中和抗体活性を測定した。採血前、３回目の免疫化から２週間後（２ｗｐ３）及び４回目の免疫化から２週間後（２ｗｐ４）に、血清試料に対して、１：１０の希釈度での複製と同時に中和活性についてスクリーニングを行った。採血前血清の存在下におけるＲＬＵを基準にして、相対発光強度（ＲＬＵ）の減少率を算出した。同様に、１：１５〜１：３２８０５の範囲にわたって、逐次的に希釈された血清の活性を検出することにより、中和力価を測定した。
【０１６９】
特にＣｐＧ−７９０９を有するＭＦ５９アジュバントにおける配合の場合、及び動物が３回又は４回免疫化される場合、クレードＢ  ＳＦ１６２に対する力価に関して、本明細書に記載された２価ｏ−ｇｐ１４０ワクチンはその単価ワクチンの対応物よりも優れていることが示された。
【０１７０】
ＴＶ１に加えて（又はその代わりに）ＴｈａｉサブタイプＥ株ＨＩＶ−１ＣＭ２３５に由来するＨＩＶエンベロープポリペプチドを使用した実験を更に実施してよい。その実験の結果は、同様に単価ワクチン組成物よりも免疫応答が高まることを示すものであることは合理的に予想される。
【０１７１】
Ｂ．アカゲザル
基本的には後述するように、ＭＦ−５９及びＣｐＧ−７９０９について上記した、アジュバント化した多価ｏ―ｇｐ１４０ワクチンで、非ヒト霊長類（アカゲザル）も又免疫化した。
【０１７２】
【表３】
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１回目の免疫化（０週目）は、以下の通りである：第１群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ内に混合されたｇｐ１４０エンベロープタンパク質抗原（サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ）各３×５０μｇを筋肉内投与（左上腕部）；第４群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ（左上腕部）。２回目の免疫化（６週目）は、以下の通りである：第１群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ内のタンパク質抗原各３×５０μｇ（左上腕部）；第４群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ（左上腕部）。３回目の免疫化（１６週目）は、以下の通りである：第１群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ内のタンパク質抗原３×５０μｇ（左上腕部）；第４群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ（左上腕部）。４回目（任意）の免疫化（２８週目）は、以下の通りである：第１群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ内のタンパク質抗原３×５０μｇ（左上腕部）；第４群：１ｍＬのＭＦ５９＋ＣｐＧ（左上腕部）。
【０１７３】
この結果により、ＭＦ５９及びＣｐＧ−７９０９を有する２価ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ワクチンのアジュバント化は、単独であっても組み合わせても、中和抗体応答の力価を高めたことが示される。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１Ａ】図１Ａは、３回目の免疫化から２週間後及び４回目の免疫化から２週間後にアジュバント化ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質組成物で免疫化されたウサギから得られた血清によるＨＩＶサブタイプＢの中和を表す表を示す。網掛け又は囲み網掛け部分は、それぞれ試験株における５０％超又は８０％超のウイルス中和を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、３回目の免疫化から２週間後及び４回目の免疫化から２週間後にアジュバント化ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質組成物で免疫化されたウサギから得られた血清によるＨＩＶサブタイプＢの中和を表す表を示す。網掛け又は囲み網掛け部分は、それぞれ試験株における５０％超又は８０％超のウイルス中和を示す。
【図２】図２は、棒の下に示した各種アジュバント化ｇｐ１４０含有組成物による免疫化したウサギから得られたＨＩＶ  ＳＦ１６２株に対する中和抗体力価を表すグラフである。組成物毎に、採血前（淡色、左の棒）、３回目の免疫化から２週間後（灰色、中央の棒）、４回目の免疫化から２週間後（暗色、右の棒）の力価を示す。
【図３】図３は、棒の下に示した各種アジュバント化ｇｐ１４０含有組成物により免疫化したウサギから得られた血清によるＨＩＶ  ＳＦ１６２株の８０％幾何平均中和力価（ＧＭＴ）を表すグラフである。組成物毎に、採血前、２回目の免疫化から２週間後、３回目の免疫化から２週間後、４回目の免疫化から２週間後、４回目の免疫化から６ヶ月後の抗体力価を示す。これらの結果では、全ての群においてＳＦ１６２に対する高い中和抗体力価が誘発されたことが示されている。
【図４】図４は、記載した各種アジュバント化エンベロープ糖タンパク質含有組成物により免疫化したウサギから得られた血清によるＨＩＶ  ＳＦ１６２株の８０％幾何平均中和力価（ＧＭＴ）を表すグラフである。２回目の免疫化から２週間後、３回目の免疫化から２週間後、及び４回目の免疫化から２週間後の結果を示す。これらの結果では、ＭＦ５９及びＣｐＧの両方によるアジュバント化によって、ＳＦ１６２に対する中和抗体応答が上昇したことが示されている。
【図５】図５は、横軸に示した各種アジュバントエンベロープ糖タンパク質含有組成物により免疫化したウサギから得られた血清によるＨＩＶ  ＳＦ１６２株の８０％中和抗体力価を表すグラフである。４回目の免疫化から２週間後の結果を示す。この結果では、ＣｐＧ免疫化群に中和抗体応答の有意な上昇が誘発されたことが示されている。
【図６】図６は、横軸に示した各種アジュバントエンベロープ糖タンパク質含有組成物により免疫化したウサギから得られた血清によるＨＩＶ  ＳＦ１６２株の８０％中和抗体力価を表すグラフである。４回目の免疫化から２週間後の結果を示す。この結果では、ＭＦ５９の２価免疫化によってＳＦ１６２に対する中和抗体力価が上昇したことが示されている。
【図７】図７は、横軸に示した各種アジュバントエンベロープ糖タンパク質含有組成物により免疫化したウサギから得られた血清によるＨＩＶ  ＳＦ１６２株の８０％中和抗体力価を表すグラフである。４回目の免疫化から２週間後の結果を示す。この結果では、ＭＦ５９及びＣｐＧの２価免疫化によって、ＴＶ１単独よりもＳＦ１６２に対する中和抗体力価が有意に上昇したことが示されている。
【図８】図８は、残り時間で示す免疫化群におけるＳＦ１６２に対する幾何平均中和力価の比較におけるＰ値を表す表である。Ｐ値は図５の通りに算出した。網掛け部分は群間の有意差を示す。２回目の免疫化から２週間後、３回目の免疫化から２週間後、４回目の免疫化から２週間後、及び４回目の免疫化から６ヶ月後の結果を示す。これらの結果では、ＨＩＶ  ＳＦ１６２株に対する幾何平均力価（ＧＭＴ）の有意差が早くも２回目の免疫化から２週間後に認められたことが示されている。
【図９】図９は、横軸に示した各種アジュバントエンベロープ糖タンパク質含有組成物により免疫化したウサギから得られた血清によるＨＩＶ  ＳＦ１６２株の５０％中和抗体力価を表すグラフである。採血前、２回目の免疫化から２週間後、３回目の免疫化から２週間後、及び４回目の免疫化から２週間後の結果を示す。バックグランド力価濃度は、３回目の免疫化から２週間後の血清の場合は２５、その他の血清試料の場合は２０である。これらの結果では、ＣｐＧ含有群においてのみＴＶ１．２１中和抗体応答が誘発されることが示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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