(57)【要約】ＶＳＶに感染させた哺乳類細胞培養の細胞培養液からＶＳＶを精製するためのプロセスが記載され、このプロセスは、低速遠心分離による細胞培養液の清澄化および上清中のＶＳＶの回収；０．２〜０．４５μｍフィルターを通した上清の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収；第１のｐＨ緩衝塩溶液により平衡化された陰イオン交換膜吸着材上へのＶＳＶ濾過溶液のロード、第２のｐＨ緩衝塩溶液による陰イオン交換膜吸着材からのＶＳＶの溶出、および溶出ＶＳＶ画分の回収；３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量カットオフを有するＴＦＦ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による回収されたＶＳＶの精製および未透過残留液中のＶＳＶの回収、ならびに０．２〜０．２２μｍフィルターを通したＶＳＶ未透過残留液の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＳＶに感染させた哺乳類細胞培養の細胞培養液から水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を精製するプロセスであって、
（ａ）低速遠心分離による細胞培養液の清澄化および上清中のＶＳＶの回収と；
（ｂ）０．２〜０．４５μｍフィルターによる工程（ａ）の上清の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収と；
（ｃ）第１のｐＨ緩衝塩溶液により平衡化された陰イオン交換膜吸着材上への工程（ｂ）のＶＳＶ濾過溶液のロード、第２のｐＨ緩衝塩溶液による陰イオン交換膜吸着材からのＶＳＶの溶出、および溶出ＶＳＶ画分の回収と；
（ｄ）３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による工程（ｃ）で回収されたＶＳＶの精製および未透過残留液中のＶＳＶの回収と、
（ｅ）０．２〜０．２２μｍフィルターによる工程（ｄ）からのＶＳＶ未透過残留液の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収と
を含むプロセス。
【請求項２】
工程（ｅ）で回収される前記ＶＳＶが、細胞培養タンパク質および核酸混入物を少なくとも９０．０％〜約９９．０％不含である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
哺乳類の細胞が、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベイビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎（ＡＧＭＫ）細胞およびＡＧＭＫベロ細胞から選択される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記低速遠心分離が、４，４００×ｇ〜８，０００×ｇである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
工程（ｃ）における前記第１のｐＨ緩衝塩溶液または第２のｐＨ緩衝塩溶液が、
（ａ）ＮａＣｌまたはＫＣｌから独立して選択される塩を含むことと；
（ｂ）１００ｍＭ〜４００ｍＭのイオン強度を有する塩を含むことと；
（ｃ）ｐＫａ６．０〜８．５の緩衝液を含むことと；
（ｄ）ｐＨ６．５〜８．０のｐＨを有することと；
（ｅ）リン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）からなる群から選択された緩衝液を含むことと；
（ｆ）１．５％〜５％の濃度でショ糖を含むことと
からなる群から選択される１つまたは複数の特性により独立して特徴づけられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記第２のｐＨ緩衝塩溶液中の塩がＮａＣｌであり、前記ＶＳＶが単一工程において第２のｐＨ緩衝塩溶液を加えることにより膜吸着材から溶出され、ＮａＣｌの単一工程溶出濃度が５００ｍＭ〜７５０ｍＭである、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記第２のｐＨ緩衝塩溶液が、溶出流速１０カプセル体積／分（ＣＶ／分）〜３０ＣＶ／分を有する、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記第２のｐＨ緩衝塩溶液中の塩がＮａＣｌであり、前記第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度が、１０ＣＶ／分〜３０のＣＶ／分の溶出流速で直線的に１ｍＭ〜７５０ｍＭに増加される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ＴＦＦ膜が、
（ａ）３００ｋＤａ分子量カットオフと；
（ｂ）７５０ｋＤａ分子量カットオフと；
（ｃ）中空糸膜モジュールと
からなる群から選択される１つまたは複数の特性により特徴づけられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ＴＦＦが、工程（ｃ）から回収されたＶＳＶを少なくとも５倍濃縮し、続いて少なくとも１回、または少なくとも５回緩衝液を交換することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
緩衝液交換において使用される前記緩衝液が、
（ａ）リン酸緩衝液と；
（ｂ）ＨＥＰＥＳ緩衝液と；
（ｃ）トリス緩衝液と；
（ｄ）５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度およびｐＨ７．２〜７．５の緩衝液と；
（ｅ）１００ｍＭ〜２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび３．５％〜４．５％のショ糖をさらに含む緩衝液と
からなる群から選択される１つまたは複数の特性により特徴づけられる、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
処理工程（ａ）〜（ｅ）が、１５℃〜２５℃のまたはその間の温度または複数の温度で行なわれる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
工程（ａ）における細胞培養液の清澄化が１．０μｍ〜４．５μｍ深層濾過モジュールによって行なわれ、低速遠心分離が工程（ａ）から省かれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１４】
精製されたＶＳＶが医薬組成物中へ処方される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセスに従って精製されるＶＳＶ。
【請求項１６】
（ａ）ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ血清型、ＶＳＶ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ血清型、ＶＳＶ  Ｓａｎ  Ｊｕａｎ血清型、ＶＳＶ  Ｉｓｆａｈａｎ血清型、ＶＳＶ  Ｇｌａｓｇｏｗ血清型およびＶＳＶ  Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ血清型からなる群から選択される血清型と；
（ｂ）ＶＳＶの病原性を弱毒化する少なくとも１つの、または少なくとも２つの変異を含むゲノム配列と；
（ｃ）前記弱毒変異が、温度感受性（ｔｓ）変異、点変異、遺伝子シャッフリング変異、Ｇ−ステム変異、非細胞変性のＭ遺伝子変異、アンビセンスＲＮＡ変異、短縮Ｇ遺伝子変異、Ｇ遺伝子挿入変異および遺伝子欠失変異からなる群から選択される（ｂ）のゲノム配列と；
（ｄ）ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖ  またはｖｐｕからなる群から選択されるＨＩＶ遺伝子、ＨＴＬＶ遺伝子、ＳＩＶ遺伝子、ＲＳＶ遺伝子、ＰＩＶ遺伝子、ＨＳＶ遺伝子、ＣＭＶ遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状ヘルペスウイルス遺伝子、おたふくかぜウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファ・ウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグ・ウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタ肺炎ウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）遺伝子、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）遺伝子、ナイセリア・ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）遺伝子、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）遺伝子、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）遺伝子、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）遺伝子、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）遺伝子、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Ｔ−ヘルパーエピトープをコードする遺伝子、ＣＴＬエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子、およびコファクターをコードする遺伝子からなる群から選択される外来のＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含むＶＳＶゲノム配列と
なる群から選択される少なくとも１つの特性を有する、請求項１５に記載のＶＳＶ。
【請求項１７】
薬学的に許容される担体中に、請求項１５または１６に記載のＶＳＶを含む医薬組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体中に、請求項１５または１６に記載のＶＳＶを含む免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
ラブドウイルスファミリーの一員である、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、非分節、マイナス鎖、一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ウイルスの１１ｋｂゲノムは、ウイルスの５つの構造タンパク質をコードする５つの遺伝子：複製されたＲＮＡをカプシドに包むために化学量論的な量で必要である、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）のコファクターである、リンタンパク質（Ｐ）；マトリックスタンパク質（Ｍ）および接着糖タンパク質（Ｇ）を有する（例えば、Ｇａｌｌｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ３９：５２９−５３５；  Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｇａｌｌｉｏｎｅ，  １９８１，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ３９：５１９−５２８；  米国特許第６，０３３，８８６号；米国特許第６，１６８，９４３号を参照）。
【０００２】
一般に、ＶＳＶはヒト病原体とは考えられず、それゆえＶＳＶに対する既存の免疫性はヒト集団においてはまれである。したがって、免疫原性組成物（例えばワクチン）および治療用タンパク質をコードする遺伝子の送達のような領域におけるＶＳＶ由来ベクターの開発が、焦点であった。例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３：３７２３−３７３２）、はしかウイルスＨタンパク質（Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４：４６５２−４６５７）およびＨＩＶ−１のｅｎｖおよびｇａｇタンパク質（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｃｅｌｌ，  １０６（５）：５３９−４９）の発現のための効果的なベクターとして、ＶＳＶが役立つことが、研究により確立されてきた。好ましいベクターにするＶＳＶの他の特性は以下のものを含んでいる：（ａ）細胞培養において確実に複製する能力；（ｂ）宿主細胞ＤＮＡの中へ組込まれないか、または遺伝子組換えを受けない能力；（ｃ）プライムブースト免疫法の実現性を可能にする複数の血清型の存在；（ｄ）対象となる外来遺伝子がＶＳＶゲノムの中へ挿入され、ウイルス転写酵素によって多量に発現させることができる；および（ｅ）ウイルスゲノムのｃＤＮＡコピーからの感染性ウイルスのレスキューのために特殊化したシステムの開発（例えば、米国特許第６，０３３，８８６号；米国特許第６，１６８，９４３号を参照）。
【０００３】
ＶＳＶにベクター化された免疫原性組成物の産生は、一般的に、組換えＶＳＶにより適切な細胞培養（宿主）を感染させること、細胞培養においてＶＳＶを増殖させること、適切な時間に細胞培養液を採取すること、および細胞培養液からＶＳＶを精製することを含んでいる。臨床応用におけるＶＳＶベクターの使用およびその免疫原性組成物は、世界中の様々な薬物安全性機関の安全規則に準拠するために、適切な純度のＶＳＶサンプル（または用量）を必要とするだろう（例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）、カナダ健康製品食品局など（ＨＰＦＢ））。
【０００４】
しかしながら、細胞培養混入物（例えば細胞培養不純物タンパク質およびＤＮＡ）からＶＳＶを分離し、現在利用可能なＶＳＶ精製プロセス（例えばショ糖勾配遠心法による精製）を使用して適切な純度および収率のＶＳＶを得ることは、典型的には困難である。例えば、現在利用可能な精製プロセスを使用すると、典型的にはＶＳＶサンプルの純度と回収（収量パーセント）との間には逆相関があり、その結果として十分な量の精製ＶＳＶの生産を困難にする。さらに、昨今のバイオリアクターベースのプロセスでは、細胞密度の増加および培養時間の延長は、より高いＶＳＶ力価と同時に細胞残屑およびバイオリアクター液中の有機成分の濃度の増加をもたらし、ＶＳＶ精製プロセスをさらに複雑にする。
【０００５】
ショ糖勾配超遠心分離は、１９６４年以来、ウイルス精製（ＶＳＶ精製を含む）のための標準方法である（非特許文献１；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６７  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ９９（１）：１７１−７；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６５  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ５４（１）：１３７−４４；  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６４  Ｊａｐａｎ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｂｉｏｌ．，  １７（６）：２９５−３０５）。しかしながら、ウイルス濃度が増加するにつれて、同時に細胞残屑、宿主ＤＮＡおよびタンパク質不純物の増加もまた生じ、それらはショ糖勾配超遠心分離を介する高濃度での除去が非常に困難である。さらに、ショ糖勾配超遠心分離はスケールアップするには非常に高価である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によるＶＳＶの濃縮および精製（ＭｃＳｈａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７０  Ｖｉｒｏｌ．，  ４０（３）：７４５−６）には、高レベル不純物について同様の問題がある。
【０００６】
比較的高品質のウイルスは、サイズ排除クロマトグラフィーを介して得られてきた（Ｔｒａｎｓｆｉｇｕｒａｃｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １４（１２）：１１３９−１１５３；非特許文献２；  Ｒａｂｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７１Ｃｏｍｐｔｅｓ  Ｒｅｎｄｕｓ  ｄｅｓ  Ｓｅａｎｃｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ａｃａｄｅｍｉｅ  ｄｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓｅｒｉｅ  Ｄ：  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎａｔｕｒｅｌｌｅｓ，  ２７２（２）：３４３−６；  Ｊａｃｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  Ｇｅｎｌ  Ｓｕｂｊ．，  １６５（２）：９９−３０２）。しかしながら、プロセスの費用および操作の困難さのために、一般的には大規模ウイルス産生には実行可能ではない。ヘパリン（非特許文献３）、レクチン（非特許文献５；  Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６  Ｐｒｏｔ．  Ｂｉｏｌ．  Ｆｌｕｉｄｓ，  ２３：６６３−５）およびＭａｔｒｅｘ（Ｍａｔｒｅｘ）（商標）ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）（商標）サルフェイト（Ｄｏｗｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  ３８（２）：２１５−２２８）のような親和性クロマトグラフィーは、ウイルス精製においてある程度適用されることが見出された。ヘパリンおよびレクチンは、浸出問題の可能性のために、ｃＧＭＰウイルス産生には一般的に好ましくなく（または使用されなく）、それは製品発売の前に追加試験を必要とするだろう。
【０００７】
Ｍａｔｒｅｘ（商標）ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（商標）サルフェイトを使用するウイルスの親和性精製は、ウイルス精製の効率、ウイルス品質およびカラム再生に起因する、未解決の事柄である。ＶＳＶ精製のためには、非常に大きな親和性カラムは必要である（例えば細胞培養１リットルあたり０．２ＬのＭａｔｒｅｘ（商標）ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（商標）サルフェイト樹脂；ワイス・ワクチン（Ｗｙｅｔｈ  Ｖａｃｃｉｎｅ）社の未公表結果）。イオン交換クロマトグラフィー単独により精製した場合、またはウイルス精製において使用される他のタイプの従来のクロマトグラフィー技術との組合せで精製した場合、低いウイルス収率が観察された（特許文献１；特許文献２；非特許文献１；非特許文献２；特許文献３；特許文献４；非特許文献５）。
【特許文献１】国際特許公開第２００６／０１１５８０号パンフレット
【特許文献２】国際特許公開第１９９７／０６２４３号パンフレット
【非特許文献１】Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ３４（５）：１０７４−１０７８，  １０８０
【非特許文献２】Ｖｅｌｌｅｋａｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １２（１５）：１９２３−３６
【非特許文献３】Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ６（６）：９７３−９８５
【特許文献４】Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ８８（４）：４６５−１７３
【非特許文献５】Ｋａａｒｓｎａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，  ２６６：６４３−９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、適切なレベルの純度および回収（収率）でＶＳＶを産生できる精製プロセスについて、当技術分野における現在のおよび現実的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において一般に記載されるプロセスおよび組成物は、ウイルス学、微生物学、免疫学およびプロセス開発の分野に関する。より詳細には、改良された純度および収率で水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を得るための新規精製プロセスが記載される。
【００１０】
１つの態様において、ＶＳＶを感染させた哺乳類細胞培養の細胞培養液からＶＳＶを精製するプロセスは、以下の工程を含む：（ａ）一次清澄化、（ｂ）二次清澄化、（ｃ）陰イオン交換膜吸着、（ｄ）タンジェンシャルフロー濾過および（ｅ）濾過。１つの実施形態において、工程（ａ）は、低速遠心分離による細胞培養液の清澄化および上清中のＶＳＶを回収を含む。１つの実施形態において、工程（ｂ）は、０．２〜０．４５μｍフィルターを通した上清の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収を含む。別の実施形態において、工程（ｃ）は、第１のｐＨ緩衝塩溶液により平衡化された陰イオン交換膜吸着材上へのＶＳＶ濾過溶液のローディング、第２のｐＨ緩衝塩溶液による陰イオン交換膜吸着材からのＶＳＶの溶出、および溶出されたＶＳＶ画分の回収を含む。１つの実施形態において、工程（ｄ）は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間の分子量カットオフを有する中空糸膜を使用する回収ＶＳＶの精製、および未透過残留物中のＶＳＶの回収を含む。１つの実施形態において、工程（ｅ）は、０．２〜０．２２μｍフィルターを通したＶＳＶ未透過残留液の濾過、および濾過溶液中のＶＳＶの回収を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、哺乳類の細胞培養の細胞は、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベイビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞およびアフリカミドリザル腎（ＡＧＭＫ）細胞（ベロ細胞としてもまた公知）から選択される。
【００１２】
特定の実施形態において、精製プロセスの低速遠心分離工程は、４，４００×ｇ〜８，０００×ｇの間である。１つの特定の実施形態において、低速遠心分離は６，２３８×ｇである。
【００１３】
別の実施形態において、０．２〜０．４５μｍフィルターは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｍｉｌｌｅｘ（Ｍｉｌｌｅｘ）（登録商標）−ＧＶフィルターユニット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ・Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＰフィルターユニット、ポール（Ｐａｌｌ）スーポア（Ｓｕｐｏｒ）（登録商標）フィルターユニット、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ）（商標）フィルターユニット、またはＳａｒｔｏｒｉｕｓ・ザルトポア（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ）（商標）２フィルターユニットである。１つの特定の実施形態において、フィルターは０．２μｍＳａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルターユニットである。
【００１４】
他の実施形態において、陰イオン交換膜吸着材は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材、またはポール・Ｍｕｓｔａｎｇ（Ｍｕｓｔａｎｇ）（商標）Ｑ膜吸着材である。１つの特定の実施形態において、陰イオン交換膜吸着材は、ポール・Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材である。
【００１５】
特定の他の実施形態において、工程（ｃ）における第１のｐＨ緩衝塩溶液中の塩は、ＮａＣｌまたはＫＣｌである。別の実施形態において、ＮａＣｌまたはＫＣｌのイオン強度は０．１Ｍ〜０．４Ｍである。１つの特定の実施形態において、塩はＮａＣｌであり、ＮａＣｌのイオン強度は０．３Ｍである。
【００１６】
別の実施形態において、工程（ｃ）における第２のｐＨ緩衝塩溶液中の塩は、ＮａＣｌまたはＫＣｌである。１つの特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液中の塩はＮａＣｌである。１つの特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度は０．５Ｍ〜０．７５Ｍの間である。別の特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度は、０．６Ｍである。さらに他の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度は、０．７５Ｍである。特定の他の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液は、１０カプセル体積／分（ＣＶ／分）〜３０ＣＶ／分の溶出流速を有している。さらに他の実施形態において、溶出流速は２０ＣＶ／分である。
【００１７】
特定の他の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度は、１０ＣＶ／分〜３０ＣＶ／分の溶出流速で０．００１Ｍ〜０．７５Ｍに直線的に増加される。１つの特定の実施形態において、直線状溶出勾配流速は２０ＣＶ／分である。
【００１８】
さらに他の実施形態において、工程（ｃ）の第１および第２の緩衝液は、ｐＫａ６．０〜８．５の間である。さらに別の実施形態において、工程（ｃ）の第１のｐＨ緩衝塩溶液は、ｐＨ６．５〜８．０である。１つの特定の実施形態において、第１のｐＨ緩衝塩溶液は、ｐＨ７．５である。他の実施形態において、工程（ｃ）の第２のｐＨ緩衝塩溶液は、ｐＨ６．５〜８．０である。１つの特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液は、ｐＨ７．５である。
【００１９】
特定の他の実施形態において、工程（ｃ）の第１および第２の緩衝液は、リン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）である。別の実施形態において、さらに工程（ｃ）の第１および第２のｐＨ緩衝塩溶液は、１．５％〜５％の濃度でショ糖を含む。１つの特定の実施形態において、ショ糖濃度は２％である。
【００２０】
特定の他の実施形態において、ＴＦＦ膜は３００ｋＤａの分子量カットオフを有する。さらに他の実施形態において、ＴＦＦ膜は７５０ｋＤａの分子量カットオフを有する。さらに他の実施形態において、ＴＦＦ膜は少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、８５０、９００、９５０または１，０００ｋＤａの分子量カットオフを有する。１つの特定の実施形態において、ＴＦＦ膜は中空糸膜モジュールである。別の実施形態において、ＴＦＦは、工程（ｃ）から回収されるＶＳＶの少なくとも５倍の濃縮、続いて少なくとも１回の緩衝液交換を含む。まだ別の実施形態において、ＴＦＦは、工程（ｃ）から回収されるＶＳＶの少なくとも５倍の濃縮、続いて少なくとも５回の緩衝液交換を含む。１つの特定の実施形態において、緩衝液交換において使用される緩衝液は、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液またはトリス緩衝液であり、緩衝液は５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度およびｐＨ７．２〜７．５である。別の実施形態において、緩衝液交換緩衝液は、０．１０Ｍ〜０．２０ＭのＮａＣｌおよび３．５％〜４．５％のショ糖をさらに含む。
【００２１】
他の実施形態において、精製プロセスの工程（ａ）〜（ｅ）は室温で行なわれ、室温は、約１５℃〜約２５℃のまたはその間の温度または複数の温度として定義される。１つの特定の実施形態において、精製プロセスの工程（ａ）〜（ｅ）は、２０℃で行なわれる。
【００２２】
さらに別の実施形態において、工程（ａ）における細胞培養液の清澄化は１．０μ〜４．５μｍ深層濾過モジュールにより行なわれ、低速遠心分離は工程（ａ）から省略される。特異的な実施形態において、深層濾過モジュールは、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｗｈａｔｍａｎ）（登録商標）Ｐｏｌｙｃａｐ（Ｐｏｌｙｃａｐ）（商標）ＨＤモジュール、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ（Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ）（商標）Ｐモジュール、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣモジュールである。
【００２３】
別の態様において、改良された純度のＶＳＶは、哺乳類細胞培養から得られる。特定の実施形態において、精製ＶＳＶは、細胞培養タンパク質および核酸混入物を少なくとも９０．０％不含である。他の実施形態において、精製ＶＳＶは、細胞培養タンパク質および核酸混入物を９９．０％不含である。１つの特定の実施形態において、精製ＶＳＶは、細胞培養タンパク質および核酸混入物を９９．８％不含である。
【００２４】
特定の他の実施形態において、改良された純度のＶＳＶが提供され、それは本明細書において記載される新規精製プロセスに従って精製および単離される。特定の実施形態において、精製ＶＳＶは、１つまたは複数の以下の特性により特徴づけられる：選択されたＶＳＶ血清型または血清型の組合せ；ＶＳＶの病原性を弱毒化する、少なくとも１つの変異または少なくとも２つの変異を含むゲノムの配列、本明細書の詳細な記述部分中で詳細に列挙される、１つまたは複数の様々なタンパク質（治療用または免疫原性の）をコードする外来のポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含むゲノム配列。
【００２５】
本明細書において記載された組成物およびプロセスの他の特徴および長所は、以下の発明の開示から、その好ましい実施形態から、および請求項から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、免疫原性組成物および／または上で記載されるような治療用タンパク質をコードする遺伝子の送達における使用のために、ＶＳＶを魅力的なベクターにする多くの特性を有するので、哺乳類細胞培養からの改良された純度の組換えＶＳＶを産生する精製プロセスのために、当技術分野において現実的に必要とされている。以下に記載される組成物およびプロセスは、その必要性を検討する。以下の実施例３−８において示されるように、哺乳類細胞培養からＶＳＶを精製する改良されたプロセス（例えば、図１を参照）、およびそれにより精製されたＶＳＶが記載される。
【００２７】
Ｉ．哺乳類細胞培養におけるＶＳＶの産生
哺乳類細胞培養におけるＶＳＶの産生は当業者に周知であり、組換えＶＳＶにより細胞培養（宿主細胞）を感染させること、細胞培養においてＶＳＶを増殖すること、および適切な時間に細胞培養を採取することを一般に含んでいる。ＶＳＶは培地中へ宿主細胞から分泌されるので、ＶＳＶ産物は細胞培養液から採取される。
【００２８】
哺乳類細胞培養からのＶＳＶの産生、およびしたがって本明細書において記載されるようにＶＳＶを哺乳類細胞培養から精製する新規プロセスは、ＶＳＶ（非分節、マイナス鎖、一本鎖ＲＮＡウイルス）を伝播（または増殖）するために使用される、当技術分野において公知の適切な哺乳類細胞培養を利用する。そのような細胞培養は、ＨＥＫ  ２９３細胞のようなヒト胚の腎（ＨＥＫ）細胞、ベロ細胞のようなアフリカミドリザル腎（ＡＧＭＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびベイビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞を含むが、それらに限定されない。
【００２９】
さらに、細胞培養の材料、方法および技術は当業者に周知である。例えば、組換えＶＳＶシード・ストック（例えばレスキューされたＶＳＶ、下記のセクションＩＩを参照）は、規定の感染多重度で、コンフルエントな宿主細胞集団またはバイオリアクター中の特定の密度の宿主細胞集団（例えばベロ細胞培養）を感染するために使用され、ＶＳＶは所定の時間および温度の細胞培養において増殖され；新生ＶＳＶの子孫は細胞培養液中で採取される。以下に定義されるように、用語「培養液」、「細胞培養液」、「細胞培養培地」、「培地」および／または「バイオリアクター液」は、同じ意味で使用され、細胞培養を増殖させる培地または溶液を指す。
【００３０】
ＩＩ．哺乳類細胞培養からのＶＳＶの精製
本明細書において記載されるＶＳＶを感染させた哺乳類細胞培養の細胞培養液からＶＳＶを精製する新規プロセスは、特定の精製工程を含む。図１におけるフローチャートは全般的な精製スキームの概要を述べ、（ａ）一次清澄化、（ｂ）二次清澄化、（ｃ）陰イオン交換膜吸着、（ｄ）タンジェンシャルフロー濾過および（ｅ）濾過の工程を含んでいる。さらに特に、そのような工程は、（ａ）低速遠心分離による細胞培養液の清澄化、（ｂ）０．２〜０．４５μｍフィルターを通した濾過による上清のさらなる清澄化、（ｃ）ＶＳＶの濾過溶液の陰イオン交換膜吸着材での精製、（ｄ）緩衝液交換するおよびタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によるＶＳＶの濃縮および（ｅ）０．２〜０．２２μｍフィルターを介するＶＳＶ未透過残留液の最終濾過を含む。特定の他の実施形態において、上記の精製プロセスの工程（ａ）〜（ｅ）は、室温で行なわれる。以下に定義されるように、「室温」は、約１５℃および２５℃のまたはその間の温度または複数の温度である。したがって例えば、工程（ａ）〜（ｅ）を行なうための適温は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５℃を含む温度、またはその間の端数の温度を含んでいる。１つの特定の実施形態において、精製プロセスの工程（ａ）〜（ｅ）は、２０℃で行なわれる。
【００３１】
（ａ）一次清澄化
特定の実施形態において、ＶＳＶを感染させた哺乳類細胞培養の細胞培養液は、低速遠心分離によって（またはあるいは深層濾過によって）清澄化され、上清中に回収されたＶＳＶは、細胞培養液の「一次（または１°）清澄化」と本明細書において呼ばれる。特定の実施形態において、細胞培養液の一次清澄化は室温で行なわれる。
【００３２】
細胞培養液の一次清澄化において使用される遠心分離の方法および装置は、当業者に周知である。以下に定義されるように、「低速」遠心分離は１０，０００ｒｐｍ未満の遠心分離速度である。特定の実施形態において、細胞培養液を清澄化するために使用される低速遠心分離速度は、４，０００×ｇ（±１００×ｇ）〜８，０００×ｇ（±１００×ｇ）の範囲内の遠心分離速度である。特定の他の実施形態において、細胞培養液の清澄化ために使用される低速遠心分離速度は、少なくとも４，０００×ｇ、４，５００×ｇ、５，０００×ｇ、５，５００×ｇ、６，０００×ｇ、６，５００×ｇ、７，０００×ｇ、７，５００×ｇもしくは８，０００×ｇ、またはその間のｒｐｍの遠心分離速度である。１つの特定の実施形態において、低速遠心分離によって細胞培養液の一次清澄化は、室温で３０分間６，２３８×ｇである（実施例３、表２）。
【００３３】
上で述べられるように、特定の実施形態において、ＶＳＶを感染させた哺乳類細胞培養の細胞培養液は、あるいは深層濾過によって清澄化される（１°）（すなわち低速遠心分離の代わりに）。低速遠心分離が工程（ａ）の一次清澄化から省かれる場合、深層濾過を使用することができる。深層濾過（表面濾過とは対照的に）は、一般にその構造内に混入物を取り込む「厚い」フィルターを指す。深層濾過の材料および方法は当業者に周知である。例えばこのフィルター材は、典型的にはファイバーの開口部に埋め込まれている珪藻土粒子のような無機フィルター補助を備えた厚い繊維状セルロース構造からなる。このフィルター材は、粒子捕捉およびフィルターの受容能力の鍵となる、大きな内部表面積を有する。そのような深層濾過モジュールは、少なくとも１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０および４．５μｍのフィルターサイズ、ならびにその間の端数のフィルターサイズを含む、１．０μ〜４．５μｍでの、または１．０μ〜４．５μｍの間の直径サイズの孔を含む。例示的な深層濾過モジュールは、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｐｏｌｙｃａｐ（商標）ＨＤモジュール（Ｗｈａｔｍａｎ；フローハム・パーク、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ（商標）Ｐモジュール（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；エッジウッド、ニューヨーク）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣモジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ビレリカ、マサチューセッツ）を含むが、これらに限定されない。１つの特定の実施形態において、細胞培養液は深層濾過（室温で行なわれる）を介して清澄化され、ＶＳＶは濾液中に回収される（実施例３、表１）。
【００３４】
（ｂ）  二次清澄化
遠心分離（または深層濾過）による一次清澄化後に、ＶＳＶ上清（または濾液）は、０．２〜０．２５μｍフィルターを介する濾過（または精密濾過）によってさらに清澄化され（２°）、ＶＳＶの回収は濾過溶液中にある。１つの特定の実施形態において、精密濾過は、上で定義されるように室温で行なわれる。濾過／精密濾過培地は、製品の様々な材料および方法において利用可能であり、当業者に公知である。例示的な精密濾過フィルターユニットは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ・Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ビレリカ、マサチューセッツ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ・Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＰフィルターユニット、Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）フィルターユニット（ポール社；イーストヒルズ、ニューヨーク）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルターユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；エッジウッド、ニューヨーク）およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ・ザルトポア（商標）２フィルターユニットを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、これらの濾過ユニットは、０．２〜０．４５μｍの間のサイズのフィルターを有する。これらのフィルターは、少なくとも０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４および０．４５μｍの孔、ならびにその間の端数の孔径を有するフィルターを含んでいる。１つの特定の実施形態において、フィルターは０．２μｍＳａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルターユニットである。濾過されたＶＳＶは、濾過溶液中で回収される。
【００３５】
（ｃ）陰イオン交換膜吸着
ＶＳＶ産物が清澄化によって回収されたならば（すなわち上で記載される１°および２°）、ＶＳＶは陰イオン交換膜吸着材でさらに精製される。膜吸着材の材料は当業者に周知であり、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（エッジウッド、ニューヨーク）、ポール社（イーストヒルズ、ニューヨーク）およびシグマ・アルドリッチ社（セントルイス、ミズーリ）のような供給業者から利用可能である。例示的な陰イオン交換膜吸着材は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）およびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材（ポール社）を含むが、これらに限定されない。１つの特定の実施形態において、陰イオン交換膜吸着材は、ポール・Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材である。一般的に、通常のイオン交換クロマトグラフィーからの公知の方法および緩衝液は、膜吸着材クロマトグラフィーに直接適用することができ、当業者に公知である。特定の実施形態において、陰イオン交換膜吸着材クロマトグラフィーは、上で定義されるように室温で行なわれる。
【００３６】
したがって特定の実施形態において、ＶＳＶは陰イオン交換膜吸着材を介して精製され、二次清澄化からのＶＳＶ濾過溶液は、第１のｐＨ緩衝塩溶液（「平衡化緩衝液」またはＶＳＶ「結合緩衝液」とも呼ばれる）により平衡化された陰イオン交換膜吸着材上にロードされる。ＶＳＶは、第２のｐＨ緩衝塩溶液（「溶出緩衝液」）により陰イオン交換膜吸着材から溶出され、溶出ＶＳＶ画分が回収される。（例えば下記の実施例６を参照）。
【００３７】
特定の実施形態において、第１のｐＨ緩衝塩溶液または平衡化緩衝液は、ＮａＣｌまたはＫＣＬの塩溶液である。ＮａＣｌまたはＫＣｌは、少なくとも約０．１Ｍ〜約０．４Ｍの間のイオン強度の溶液中に存在する。したがって塩のイオン強度は、その間の端数のイオン強度を含む、少なくとも０．１、０．２、０．３および０．４Ｍを含んでいる。１つの特定の実施形態において、塩はＮａＣｌであり、ＮａＣｌ溶液のイオン強度は０．３Ｍである。緩衝溶液は、リン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液であってもよい。特定の実施形態におけるこれらの緩衝液は、ｐＨ約６．０〜約８．０の間の（すなわち少なくともｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８および８．０）またはその間のｐＨ数である。１つの特定の実施形態において、第１のｐＨ緩衝塩溶液はｐＨ７．５である。さらに他の実施形態において、陰イオン交換膜吸着工程の第１の緩衝液は、ｐＫａ６．０〜８．５の間の（すなわち少なくともｐＫａ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４および８．５）またはその間のｐＫａ数である。
【００３８】
特定の実施形態において、平衡化緩衝液は、約１％のショ糖〜約５％のショ糖をさらに含む。特定の実施形態において、平衡化緩衝液は約１％のショ糖を含む。１つの特定の実施形態において、ショ糖濃度は２％である。別の実施形態において、緩衝液は約３％のショ糖を含む。別の実施形態において、緩衝液は約４％のショ糖を含む。別の実施形態において、緩衝液は約５％のショ糖を含む。上記で明示される整数の間のさらに他のショ糖濃度のパーセンテージは有用である。
【００３９】
第２のｐＨ緩衝塩溶液（「溶出緩衝液」）は、第１の（平衡化）緩衝液と同一の緩衝成分も含んでもよい。特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液または平衡化緩衝液は、ＮａＣｌまたはＫＣＬの塩溶液である。１つの特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液中の塩はＮａＣｌである。ＮａＣｌまたはＫＣｌは、少なくとも約０．１Ｍ〜約０．４Ｍの間のイオン強度の溶液中に存在する。したがって塩のイオン強度は、その間の端数のイオン強度を含む、少なくとも０．１、０．２、０．３および０．４Ｍを含んでいる。１つの特定の実施形態において、塩はＮａＣｌであり、ＮａＣｌ溶液のイオン強度は０．３Ｍである。緩衝溶液は、リン酸緩衝液、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液であってもよい。特定の実施形態におけるこれらの緩衝液は、ｐＨ約６．０〜約８．０の間（すなわち少なくともｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８および８．０）またはその間のｐＨは数である。１つの特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液はｐＨ７．５である。さらに他の実施形態において、陰イオン交換膜吸着工程の第２の緩衝液は、ｐＫａ６．０〜８．５の間（すなわち少なくともｐＫａ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４  および８．５）またはその間のｐＫａ数である。
【００４０】
特定の実施形態において、溶出緩衝液は、約１％のショ糖〜約５％のショ糖をさらに含む。特定の実施形態において、溶出緩衝液は約１％のショ糖を含む。１つの特定の実施形態において、ショ糖濃度は２％である。別の実施形態において、緩衝液は約３％のショ糖を含む。別の実施形態において、緩衝液は約４％のショ糖を含む。別の実施形態において、緩衝液は約５％のショ糖を含む。上記で明示される整数の間のさらに他のショ糖濃度のパーセンテージは有用である。
【００４１】
膜からＶＳＶを溶出するために、溶出緩衝液の塩（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）濃度（イオン強度）は、直線的勾配によって、または単一工程の溶出プロセスで（実施例６）、増加される。両工程は、陰イオン交換膜吸着材からのＶＳＶの溶出で、同様に効果的である。１つの特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液におけるＮａＣｌのイオン強度は、０．５Ｍ〜０．７５Ｍの間である。別の特定の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液におけるＮａＣｌのイオン強度は０．６Ｍである。さらに他の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液におけるＮａＣｌのイオン強度は０．７５Ｍである。
【００４２】
特定の他の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液は、１０カプセル体積／分（ＣＶ／分）〜３０ＣＶ／分の溶出流速を有する。したがって特定の実施形態において、溶出流速は、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８〜３０ＣＶ／分、またはその間の流速である。特定の実施形態において、溶出流速は２０ＣＶ／分である。
【００４３】
特定の他の実施形態において、第２のｐＨ緩衝塩溶液中のＮａＣｌのイオン強度は、上で記載されるような１０ＣＶ／分〜３０ＣＶ／分の溶出流速で、直線的に０．００１Ｍ〜０．７５Ｍに増加される。１つの特定の実施形態において、直線状溶出勾配流速は２０ＣＶ／分である。
【００４４】
（ｄ）タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）
陰イオン交換膜吸着材クロマトグラフィーによるＶＳＶ精製に続いて、ＶＳＶはさらにタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により精製される。一般的に、ＴＦＦは、液体溶液（または懸濁物）中の成分を分離するために膜を使用する圧力駆動プロセスであり、液体（供給フロー）は膜の表面に沿って接線方向に（タンジェンシャルに）ポンプで送り込まれ、加圧力は（膜の）濾液側へ膜を通して液の「一部」を押し出す役目をする。特定の実施形態において、ＴＦＦは室温で行なわれる。このプロセスにおいて、緩衝液は交換され、ＶＳＶは濃縮される。１つの実施形態において、ＴＦＦは、陰イオン交換膜吸着工程から回収されるＶＳＶの少なくとも５倍の濃縮、続いて少なくとも１回の緩衝液交換を含む。別の実施形態において、ＴＦＦは陰イオン交換膜吸着工程から回収されるＶＳＶの少なくとも５〜１０倍の濃縮、続いて少なくとも５、または少なくとも６回の緩衝液交換を含む。さらに他の実施形態は、陰イオン交換膜吸着工程から回収されるＶＳＶの濃縮に続いて、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６回の緩衝液交換を含んでいる。
【００４５】
ＴＦＦ材（例えば中空糸、スパイラル型、平板）および方法（例えば限外濾過（ＵＦ）、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）、精密濾過）は、当業者に周知である。特定の実施形態において、ＴＦＦ膜は３００ｋＤａの分子量カットオフを有する。特定の実施形態において、ＴＦＦ膜は、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００または７００ｋＤａの分子量カットオフを有する。さらに別の実施形態において、ＴＦＦ膜は７５０ｋＤａの分子量カットオフを有する。１つの実施形態において、ＴＦＦ膜は中空糸膜モジュールである。
【００４６】
１つの特定の実施形態において、ＴＦＦの緩衝液交換において使用される緩衝液は、上で記載されるようなリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液またはトリス緩衝液である。しかしながら、特定の実施形態における緩衝液は、少なくとも５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭおよび１５ｍＭの濃度を含み、さらにその間のｍＭ濃度を含む、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度である。特定の実施形態において、緩衝液は、ｐＨ約７．２〜７．５の間である。したがって１つの実施形態において、緩衝液は、ｐＨ７．２、７．３、７．４もしくは７．５、またはその間の端数のｐＨ値である。別の実施形態において、緩衝液交換緩衝液は、０．１０Ｍ〜０．２０ＭのＮａＣｌおよび３．５％〜４．５％のショ糖をさらに含む。
【００４７】
１つの特定の実施形態（実施例７を参照）において、陰イオン交換膜吸着材精製からのＶＳＶ画分はプールされ、プールされた溶液は濃縮され、緩衝液は、７５０ｋＤａの分子量カットオフを備えた中空糸ＴＦＦ膜カートリッジを使用して、ＴＦＦによって交換される。（ＧＥヘルスケア・バイオ−サイエンス（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社；ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００４８】
（ｅ）濾過
精製の最終プロセスの工程は、ＴＦＦからのＶＳＶ未透過残留液の最終精密濾過であり、精密濾過を介する二次清澄化について上で記載されるように、未透過残留液は０．２〜０．２５のμｍフィルターを通して濾過され、実施例７において以下にさらに記載される。例えば、そのような濾過セットは、サイズ０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４もしくは０．２５μｍ、またはその間の端数のサイズのフィルターを利用してもよい。
【００４９】
本明細書において記載される新規プロセスに従うＶＳＶの精製は、実施例において詳細に以下に記載されており、その記述は、低速遠心分離（または深層濾過）および０．２〜０．４５μｍ濾過を含む、培養液の一次清澄化（実施例３）および二次清澄化（実施例４）をそれぞれ含む。清澄化工程に続いて、ＶＳＶは、陰イオン交換膜吸着材（実施例６）；タンジェンシャルフロー濾過；限外濾過およびダイアフィルトレーション（実施例７）、および０．２〜０．２２μｍ濾過（実施例７）によってさらに連続して精製される。４回の大規模（４．５Ｌ）ＶＳＶ細胞培養の稼動（スケールアップした稼動）もまた、本明細書において記載される新規プロセスに従って精製され（実施例８）、タンパク質不純物（表１１）およびＤＮＡ（表１３）のそれぞれ９９．９％および９９．８％以上は精製の間に除去される。
【００５０】
ＩＩＩ．組換え水疱性口内炎ウイルス
本明細書において記載されるように、改良された純度のＶＳＶは、上で記載される新規精製方法の利用によって哺乳類細胞培養から得られる。「改良された純度」によって、精製ＶＳＶが細胞培養タンパク質および核酸の混入物を少なくとも９０．０％不含であることが意味される。他の実施形態において、改良された純度のＶＳＶは、細胞培養タンパク質および核酸の混入物を９９．０％不含である。１つの特定の実施形態において、改良された純度のＶＳＶは、細胞培養タンパク質および核酸の混入物を９９．８％不含である。
【００５１】
特定の実施形態において、上で記載されたプロセスによって哺乳類細胞培養の細胞培養液から精製された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、組換えまたは遺伝子操作されたＶＳＶである。ＶＳＶのような組換えＲＮＡウイルスを生ずる方法は周知であり、当技術分野において「レスキュー」法または「リバースジェネティクス」法と呼ばれる。ＶＳＶのための例示的なレスキュー法は、米国特許第６，０３３，８８６号および米国特許第６，１６８，９４３号中に記載される方法を含むが、これらに限定されず、各々は参照することにより本明細書に組み入れられる。ＶＳＶのようなウイルスのレスキューを行なうための追加技術は、米国特許第６，６７３，５７２号およびＷＯ２００４／１１３５１７中に記載されており、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【００５２】
改良された純度のＶＳＶ（本明細書において記載された新規精製プロセスに従って精製および単離される）は、規定された血清型のＶＳＶであってもよい。特定の実施形態において、精製ＶＳＶは、  Ｉｎｄｉａｎａ血清型、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ血清型、Ｓａｎ  Ｊｕａｎ血清型、Ｉｓｆａｈａｎ血清型、Ｇｌａｓｇｏｗ血清型またはＣｈａｎｄｉｐｕｒａ血清型である。特定の実施形態において、ＶＳＶは１つ以上のそのような血清型からの配列を含んでもよい。
【００５３】
本明細書において記載されるプロセスに従って精製されたＶＳＶベクター（およびその免疫原性組成物）は、しばしばＶＳＶゲノム内の１つまたは複数の弱毒変異を含む。特定の実施形態において、精製ＶＳＶは、少なくともＶＳＶの病原性を減ずる１つの変異を含むゲノム配列を有する。他の実施形態において、精製ＶＳＶは、ＶＳＶの病原性を減ずる少なくとも２つの変異を含むゲノム配列を有する。例えば、弱毒化ＶＳＶは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１１４９９号（国際特許公開番号ＷＯ２００５／０９８００９）において示される弱毒変異のような２つまたは複数の公知の弱毒変異を含み、参照することにより本明細書に組み入れられる。例えば、公知のＶＳＶ弱毒変異は、遺伝子シャッフリング変異（ＶＳＶゲノムならびに指定されたＮ、Ｐ、Ｍ、ＧおよびＬを形成するＶＳＶ遺伝子の遺伝子シャッフルを含む）、Ｇタンパク質の挿入変異、Ｇタンパク質切断変異、温度感受性（ｔｓ）変異（および他の点変異）、非細胞変性のＭ遺伝子変異、Ｇ−ステム変異、アンビセンスＲＮＡ変異および遺伝子欠失変異を含むが、これらに限定されず、これらの各々のは、国際公開番号ＷＯ  ２００５／０９８００９中に詳細に示される。したがって、特定の実施形態において、精製ＶＳＶは、温度感受性（ｔｓ）変異、点変異、遺伝子シャッフリング変異、Ｇ−ステム変異、非細胞変性のＭ遺伝子変異、アンビセンスＲＮＡ変異、Ｇ遺伝子の短縮変異、Ｇ遺伝子挿入変異および遺伝子欠失変異を含むが、これらに限定されない、１つまたは複数の弱毒変異を含む。
【００５４】
特定の実施形態において、本明細書において記載される精製プロセスにより精製されたＶＳＶは、外来のＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のような、１つまたは複数の外来または異種（または外来）ポリヌクレオチド配列を含むゲノム配列を有する。異種ポリヌクレオチド配列は、所望されるように変更することができ、サイトカイン（インターロイキンのような）をコードする遺伝子、Ｔ−ヘルパーエピトープをコードする遺伝子、ＣＴＬエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子およびコファクターをコードする遺伝子、制限マーカーをコードする遺伝子、治療用タンパク質または異なる微生物病原体（例えばウイルス、細菌、寄生生物または真菌）のタンパク質、特に望ましい免疫反応を誘発することができるタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。例えば、異なる微生物病原体のタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数のＨＩＶ遺伝子、ＨＴＬＶ遺伝子、ＳＩＶ遺伝子、ＲＳＶ遺伝子、ＰＩＶ遺伝子、ＨＳＶ遺伝子、ＣＭＶ遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状ヘルペスウイルス遺伝子、おたふくかぜウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファ・ウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグ・ウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタ肺炎ウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）遺伝子、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）遺伝子、ナイセリア・ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）遺伝子およびジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）遺伝子、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）遺伝子、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）遺伝子、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）遺伝子およびクラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）遺伝子および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）遺伝子であってもよい。特定の実施形態において、精製ＶＳＶはＨＩＶ遺伝子配列を含み、ＨＩＶ配列は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖまたはｖｐｕからなる群から選択される。１つの特異的な実施形態において、ＨＩＶ遺伝子はｇａｇまたはｅｎｖである。
【００５５】
特定の他の実施形態において、精製ＶＳＶは、少なくとも１つの弱毒変異および上で記載されるような少なくとも１つの異種ＯＲＦの両方を含んでいる。例えば、新規プロセスに従って精製され、セクションＶ（実施例２〜８）で以下に例示されるＶＳＶ免疫原性組成物（すなわちＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ９−ｇａｇ１）は、２つの弱毒変異、およびＨＩＶ−１のｇａｇタンパク質をコードするＯＲＦを含む、組換えＶＳＶである。
【００５６】
他の実施形態において、本明細書において記載される新規プロセスに従って精製されたＶＳＶは、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子をコードし、ｇａｇ遺伝子は、位置１（３’−ｇａｇ１−ＮＰＭＧＬ−５’）、位置２（３’−Ｎ−ｇａｇ２−ＰＭＧＬ−５’）、位置３（３’−ＮＰ−ｇａｇ３−ＭＧＬ−５’）、位置４（３’−ＮＰＭ−ｇａｇ４−ＧＬ−５’）、位置５（３’−ＮＰＭＧ−ｇａｇ５−Ｌ−５’）または位置６（３’−ＮＰＭＧＬ−ｇａｇ６−５’）でＶＳＶゲノムの中へ挿入される。他の実施形態において、本明細書において記載される新規プロセスに従って精製されたＶＳＶはＨＩＶのｅｎｖ遺伝子をコードし、ｅｎｖ遺伝子は、位置１（３’−ｅｎｖ１−ＮＰＭＧＬ−５’）、位置２（３’−Ｎ−ｅｎｖ２−ＰＭＧＬ−５’）、位置３（３’−ＮＰ−ｅｎｖ３−ＭＧＬ−５’）、位置４（３’−ＮＰＭ−ｅｎｖ４−ＧＬ−５’）、位置５（３’−ＮＰＭＧ−ｅｎｖ５−Ｌ−５’）または位置６（３’−ＮＰＭＧＬ−ｅｎｖ６−５’）でＶＳＶゲノムの中へ挿入される。
【００５７】
当業者は、様々な組換えＶＳＶが、上で記載される方法およびプロセスに従ってデザインおよび精製されてもよいと、上記の記述から理解するだろう。
【００５８】
ＩＶ．免疫原性医薬組成物
特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書において記載される精製プロセスに従って精製された遺伝子操作ＶＳＶの免疫原性用量を含む。例えば特定の実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書において記載される精製プロセスに従って精製された組換えＶＳＶを含み、ＶＳＶは、複製には必須でないＶＳＶゲノムの領域中へ挿入された、またはその領域を置換する１つまたは複数の外来のＲＮＡ配列を含む。上記のセクションＩＩＩ中に記載されている組換えＶＳＶの実施形態のいずれかは、これらの免疫原性組成物において利用することができる。したがって特定の実施形態において、精製ＶＳＶ免疫原性組成物は、哺乳類被験体（例えばヒト）に対する投与のために製剤化される。
【００５９】
そのような組成物は、典型的には精製ＶＳＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。以下に使用されるように、用語「薬学的に許容される担体」は、衛生行政に適合する、あらゆる溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同種のものを含むように意図される。薬学的に活性のある物質のためのそのような培地および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の通常の培地または薬剤がＶＳＶベクターに適合性がない場合以外は、そのような培地が、本明細書において記載される免疫原性組成物において使用される。追加の活性化合物もまた組成物の中へ組み入れられてもよい。
【００６０】
したがって、本明細書において記載されるＶＳＶの免疫原性組成物は、対象とする投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の具体例は、非経口投与薬（例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内）、および粘膜（例えば、経口、直腸、鼻腔内、口腔、膣、呼吸器）を含んでいる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁物は、下記成分を含んでいる：注射のための水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような、酸または塩基により調整される。非経口の調製品はガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入することができる。
【００６１】
注射可能な使用のために適切な医薬組成物は、滅菌された注射可能な溶液または分散物の即時調整のための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌粉末を含んでいる。静脈内投与のために、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、クレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含んでいる。すべての場合において、組成物は滅菌されなくてはならず、シリンジから容易に注射できる程度までの流動性であるべきである。組成物は、製造および保管の条件の下で安定してなくてはならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールならびに同種のもの）およびその適切な混合物を含む、溶媒または分散媒である。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持される。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸および同種のもの）により達成される。多くの場合において、組成物中に等張剤（例えば糖、マンニトールやソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウム）を含むことは好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン）の含有よって引き起こされる。
【００６２】
滅菌された注射可能な溶液は、必要に応じて上で列挙される１つの成分または成分の組合せと共に、適切な溶媒中に必要とされる量（または用量）でＶＳＶベクターを組み入れること、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、塩基性分散媒および上で列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌賦形剤中へ、活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、その方法は以前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の付加的な所望された成分を加えた活性成分の粉末を産出する。
【００６３】
吸入による投与のために、化合物は適切な噴霧剤を含む加圧された容器またはディスペンサーからエアゾールスプレーの形態で送達される（例えば二酸化炭素のようなガス、または噴霧器）。全身投与は粘膜的手段または経皮的手段にもよることができる。粘膜投与または経皮投与のために、浸透すべきバリアに対して適切な浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知であり、例えば、粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。粘膜投与は鼻内スプレーまたは坐剤の使用を介して遂行される。化合物は、直腸送達のために、坐剤（例えばココアバターおよび他のグリセリドのような通常の坐剤基剤により）または停留浣腸の形態でもまた調製される。
【００６４】
特定の実施形態において、投与の容易性および投与量の均一性のために、投与量単位形態で、経口組成物または非経口組成物を製剤化することは有利である。以下に使用されるような投与量単位形態は、被験体が治療されるべき単一投与量として適した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して所望される治療用効果を生ずるように意図された活性化合物の前もって定義した量を含む。本明細書において記載される投与量単位形態についての規格は、活性化合物の特有の特性、および達成されるべき特定の治療上効果、および個体の治療のためのそのような活性化合物の合成の技術分野における固有の限定により規定され、それらに直接依存する。
【実施例】
【００６５】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、ほかに詳細に記載された場合以外は、当業者に周知のルーチンの標準技術を使用して実行された。以下の実施例は例示的目的のために提供され、本明細書において記載される組成物およびプロセスの範囲を限定するいかなる手段で解釈されるべきでない。実施例１および２は、例示される３つのＶＳＶコンストラクトすべてに関する。実施例３〜９は、具体的にはコンストラクトＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ９−ｇａｇ１に言及する。実施例１０〜１１は、具体的にはコンストラクトＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１に言及する。実施例１２は、具体的にはコンストラクトＶＳＶＮＪ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１を言及する。以下の実施例における精製組換えＶＳＶ（  Ｉｎｄｉａｎａ血清型；ｒＶＳＶＩＮ）は、ＶＳＶゲノムの第１の位置でのＨＩＶのｇａｇ遺伝子（ｇａｇ１）、およびＶＳＶゲノムの第４の位置へシャッフルされたＮ遺伝子（Ｎ４）を含む。１つのコンストラクトにおいて、ＶＳＶは、短縮細胞質尾部（「ＣＴ９」）を持つＧ遺伝子を有し、このコンストラクトは「ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ９−ｇａｇ１」と呼ばれた。別のコンストラクトにおいて、ＶＳＶは、短縮した細胞質尾部（「ＣＴ１」）を持つＧ遺伝子を有し、このコンストラクトは「ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１」と呼ばれた。他の実施例において、以下の実施例における精製組換えＶＳＶ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ血清型；ｒＶＳＶＮＪ）は、ＶＳＶゲノムの第１の位置でのＨＩＶのｇａｇ遺伝子（ｇａｇ１）、ＶＳＶゲノムの第４の位置へシャッフルされたＮ遺伝子（Ｎ４）、および短縮した細胞質尾部（「ＣＴ１」）を持つＧ遺伝子を含み、このコンストラクトは「ＶＳＶＮＪ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１」と呼ばれた。これらのコンストラクトおよび変異は、国際特許公開番号ＷＯ  ２００５／０９８００９中に詳細に定義されており、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【００６６】
しかしながら、本明細書において記載される新規精製プロセスは、特異的なｒＶＳＶコンストラクトまたは血清型（例えば  ＩｎｄｉａｎａおよびＮｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙなど）に限定的な手段でなく、それゆえこれらの精製プロセスは、野生型ゲノム配列、弱毒化されたゲノム配列、「外来の」核酸配列、または任意のその組合せを含むＶＳＶコンストラクトの精製を含んでいる。（例えば、そのようなＶＳＶコンストラクトの概説に関しては上記セクションＩＩＩを参照）。更に、「組換え」ＲＮＡウイルスを生ずる方法は周知であり、当技術分野において「レスキュー」法または「リバースジェネティクス」法と呼ばれる。組換えＶＳＶのための例示的なレスキュー法は、上のセクションＩＩＩにおいて記載される。
【００６７】
以下の実施例は、ベロ細胞からのｒＶＳＶ（ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ９−ｇａｇ１、ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１またはＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１コンストラクトにより例示されたように）の精製を記載する。しかしながら、本明細書において示されるＶＳＶ精製プロセスは、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞（例えばＨＥＫ  ２９３細胞）およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびベイビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞を含むが、これらに限定されない、任意の適切な哺乳類の細胞培養からＶＳＶを精製するために同様に適用可能である。
【００６８】
実施例１：タンパク質、ＤＮＡおよびＶＳＶ感染能の分析
以下の分析は、実施例２〜１２において以下に記載される精製プロセスを評価するために利用された。
【００６９】
総タンパク質濃度。総タンパク質濃度は、タンパク質スタンダードとしてのウシ血清アルバム（ＢＳＡ）と共に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社；ヘラクレス、カリフォルニア）を使用して決定された。
【００７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析。タンパク質の分離および検出のために、ＶＳＶサンプルをトリ−グリシンサンプル緩衝液と、１：１（ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ９−ｇａｇ１コンストラクトについて）、または３：１（ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１コンストラクトについて）の比率で混合し、１００℃で１０分間煮沸し、４〜２０％トリス−グリシン硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、銀染色（和光化学・アメリカ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ）社；リッチモンド、バージニア）、およびコロイド状クマシー（登録商標）ブルー染色（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社；カールスバード、カリフォルニア）による二重染色が後続した。二重染色法の感度は、ＶＳＶサンプルの高分子量不純物を容易に検出することを可能にした。
【００７１】
ゲル電気泳動後に、タンパク質をニトロセルロース膜（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社；ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）に電気泳動的に転写した。３％ＢＳＡ含有トリ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中での１時間のブロッキング後に、膜を、抗体溶液（０．０５％ツイーン−２０含有ＴＢＳ（ＴＴＢＳ）１％ＢＳＡ中に、ＢＨＫ細胞から産生されたウサギ抗ＶＳＶポリクローナル抗体を１：１０００ｖ／ｖで含む）中でインキュベートし、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＨＲＰ、１：１０００（ｖ／ｖ））（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社；ヘラクレス、カリフォルニア）を用いてインキュベーションした。ＴＴＢＳおよびＴＢＳによる洗浄後に、ＨＲＰ発色現像試薬（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社；ヘラクレス、カリフォルニア）を検出のために加え、反応を蒸留水により止めた。染色されたゲルおよび現像された膜を、アルファイーズ（ＡｌｐｈａＥａｓｅ）ＦＣ（登録商標）ソフトウェアによりアルファイメジャー（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）（登録商標）イメージングシステム（アルファ・イノテック（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）社；サンリアンドロ、カリフォルニア）経由で取り込んだ。
【００７２】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）。サイズ排除−ＨＰＬＣプロトコールを不純物タンパク質から迅速にＶＳＶを分離するために開発し、その結果として、ＶＳＶ精製プロセスの定性分析を可能にした。したがって、「プロセス中の」ＶＳＶサンプル（１００μＬ）および精製バルク濃縮物ＶＳＶ（１００μＬ）を、分析サイズ排除カラム（ＴＳＫ−ゲルＰＷカラムＧ６０００ＰＷＸＬ、粒子サイズ１７μ、孔径１０００Å）（トーショー・バイオサイエンス（Ｔｏｓｈｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社。モンゴメリービル、ペンシルバニア）上にロードし、ＰＢＳ緩衝液（Ｃａ２＋またはＭｇ２＋不含有）により平衡化し、１分あたり１ｍＬの流速で進行させた。ケムステーション（ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ）（商標）ソフトウェア（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社；パロアルト、カリフォルニア）により制御されるアジレント１１００（商標）溶媒送達システムにより動力がシステムに供給された。ＵＶスペクトルを光ダイオード分析検出器経由で収集し、クロマトグラムを２１５ｎｍでのＵＶ吸光度のモニタリングによって得た。
【００７３】
ＶＳＶ感染能分析。ＶＳＶ感染能は、２つの異なる方法である、従来のプラーク分析および免疫蛍光法プラーク分析によって定量された。従来のプラーク分析のために、ベロ細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で１×１０６細胞／ウェル（２ｍＬ細胞培養／ウェルで）の濃度で６ウェルプレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。コンフルエント単層の形成を確認するために、細胞を翌日検査した。未知の力価のウイルスサンプルを、陽性対照および陰性対照と共に、ＤＭＥＭ＋１０ｍｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム＋０．５ｍｌ／Ｌゲンタミシン中で、期待される力価範囲まで１：１０で連続的に希釈した。陽性対照は公知の力価のＶＳＶスタンダードであった。陰性対照（またはブランク）は培地のみを含む。細胞培地を６ウェルプレートから吸引し、次に希釈ウイルス（０．５ｍｌウイルス溶液／ウェル）を、二重でウェルへ加えた。ウイルスを１５分間室温で吸着させ、次に３０分間３２℃でインキュベートした。細胞単層の湿り気を保つように、プレートを５〜１０分ごとに手で揺り動かした。アガロース（５０℃で）およびＤＭＥＭ（３７℃で、１０ｍｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムおよび０．５ｍｌ／Ｌゲンタマイシン）を、寒天重層培地を作成するために、１：４の比率で組み合わせた。ウイルスをプレートから吸引し、１ウェルあたり３ｍｌの重層を連続分注ピペットを使用して加えた。重層されたプレートを室温でフード下で冷却し、次に７２時間またはプラークが明瞭に見えるまで（直径およそ１ｍｍまたはそれ以上の大きさ）、３２℃のインキュベーションへ移した。光源上でのプレートの保持によって、プラークをカウントした。生じたプラーク数を使用して、力価を各サンプルごとに決定し、１ｍｌあたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）に換算して表現した。
【００７４】
第２の分析（免疫蛍光法プラーク分析）は、ＶＳＶによるベロ細胞単層（４８ウェルプレート中で）の感染により行なわれた。２４〜３６時間後にベロ細胞を固定し、最初に使用されるコンストラクトに依存して、ＶＳＶＩＮまたはＶＳＶＮＪのいずれかに対するモノクローナル抗体を用いてインキュベーションし、次に蛍光色素結合二次抗体を用いてインキュベーションした。ベロ細胞単層内の蛍光性フォーカスを検出するために蛍光顕微鏡法を使用して、感染性粒子を定量した。蛍光性フォーカスをカウントし、サンプルの力価を１ｍＬあたりの感染単位（ＩＵ）またはプラーク形成単位（ＰＦＵ）として表現した。
【００７５】
残存ＤＮＡ分析。ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（登録商標）クォンント−ｉＴ（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ）（商標）ＤＮＡ  マイクロアッセイ・キット（インビトロゲン社；カールスバード、カリフォルニア）を使用して、宿主細胞ＤＮＡを検査および定量した。マイクロアッセイは、スタンダードとしてλＤＮＡを使用して、製造業者の説明書に従って行なわれた。
【００７６】
実施例２：ベロ細胞培養におけるＶＳＶの産生
ＶＳＶの実験稼動を、ベロ細胞（アフリカサル腎細胞）マイクロキャリアー培養を使用して、１０リットルのバイオリアクター中で産生した。使用されるベロ細胞は、ｃＧＭＰマスターセルバンクから得られた。ベロ細胞を、７．５グラム乾燥ビーズ／リットルの密度でサイトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）（商標）Ｉマイクロキャリアー（アマシャム・バイオサイエンス社；ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）上で増殖した。バイオリアクター培養のための作動体積は５．５〜６．５リットルであった。接種のために、ベロ細胞を、およそ２リットルの全体積中でサイトデックス（商標）Ｉマイクロキャリアーと組み合わせた。培養の目標播種密度は５×１０５細胞／ｍｌであった。マイクロキャリアーへの細胞接着を促進するために、この減少された体積で、２時間の断続的撹拌サイクルを行なった。培養を４０ｒｐｍで５分間撹拌し、次に０ｒｐｍで２０分間沈降させる、完全なサイクルを４回行なった。
【００７７】
断続的撹拌の後に、培養をサンプリングし、接着が十分ならば、ウイルス産生無血清培地（ＶＰ−ＳＦＭ）を５．５または６．５リットルの作動体積まで培養へ加えた。３７℃および４０ｒｐｍで２〜４×１０６細胞／ｍｌまで細胞を増殖させた。空気を、５０ｃｍ３／分で上層へ絶えず供給した。二酸化炭素および酸素を、５０ｃｍ３／分で要求に応じて上層へ供給した。培養の酸素要求量が上層で提供されるものを上回った場合、酸素を６ｃｍ３／分の初速度で焼結スパージャーを通して培養へ加えた。酸素要求量が増加するにつれて、速度を手動で増加した。ｐＨ７．３０の培養設定点を使用して、二酸化炭素（酸性）および７．５％重量／体積の炭酸水素ナトリウム溶液（塩基性）をｐＨを制御するために使用した。およそ４８時間経過した培養時間から開始して、１日あたり培養体積の２分の１の新鮮培地で培養を灌流した。ｒＶＳＶによるベロ細胞の感染は、３２℃および０．０１感染多重度（ＭＯＩ）で生じた。細胞へのウイルス吸着を促進するために、バイオリアクター培養に対するウイルスの追加直後に、１時間の断続的撹拌サイクルを行なった。培養を４０ｒｐｍで６分間撹拌し、次に０ｒｐｍで２４分間沈降させる、完全なサイクルを２回行なった。１時間の断続的撹拌に続いて、残りの感染は４０ｒｐｍでバッチモードで進んだ。細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察するために６〜１６時間ごとに、感染した培養をサンプリングし、細胞をカウントし、増殖速度測定のためにウイルス上清サンプルを回収した。
【００７８】
ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１については感染後およそ４４時間で、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１についてはおよそ感染後４８時間で、およびＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１については感染後およそ６０時間で、マイクロキャリアーの沈降および培養液上清の回収によって、細胞培養を採取した。後者のコンストラクトについては、２回のバイオリアクターからの細胞培養液を組み合わせた。
【００７９】
実施例３：ＶＳＶ精製プロセス：ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１のためのＶＳＶ細胞培養液の一次清澄化
バイオリアクターから細胞培養を採取した後に、細胞／細胞残屑および他の微粒子不純物は、「産物回収」として公知のプロセスにおいて除去された。ＶＳＶはベロ細胞から培養液中へ分泌されたので、ＶＳＶは清澄化培養液中に回収された。したがって、ＶＳＶ細胞培養液上清（例えば１０Ｌのバイオリアクターの稼動から約４．０〜４．５Ｌ）は、深層濾過または低速遠心分離のいずれかによって清澄化された。
【００８０】
深層濾過による清澄化は室温で行なわれ、ＶＳＶは濾液中に回収された。以下の深層濾過モジュールが検査された：Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｐｏｌｙｃａｐ（商標）ＨＤモジュール（Ｗｈａｔｍａｎ；フローハム・パーク、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ（商標）Ｐモジュール（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；エッジウッド、ニューヨーク）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣモジュール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ビレリカ、マサチューセッツ）およびＣＵＮＯ（ＣＵＮＯ）０５／６０ＨＰ（ＣＵＮＯ、３Ｍ（登録商標）企業、メリデン、コネチカット）。フィルターが飽和するまで、深層濾過フィルターに濾液をロードした（およそ１００〜５００ｍｌの濾液）。
【００８１】
深層濾過モジュールの清澄化効率を濁度計によって決定し、一方ウイルス回収をウイルスプラーク分析によって評価した。下記の表１は、異なる深層濾過フィルターの性能を要約する。
【００８２】
高率のウイルス回収は、Ｗｈａｔｍａｎ・ＰｏｌｙｃａｐＨＤ  ７５を使用して達成することができる。しかしながら、大規模産生においては、濁度除去の低効率およびフィルターの低受容能力が観察された。異なる供給業者から他のフィルターは、それらのウイルス産物回収の評価に基づいて、清澄工程における使用のために選択されてもよい。
【００８３】
【表１】
2009534030.tif 000002
低速遠心分離による清澄化を、ベックマン遠心機（４．５Ｌの総体積で、１Ｌ遠心分離ボトル５本）によって室温３０分間６，２３８×ｇ（５，０００ｒｐｍ）で行ない、ＶＳＶを上清中に回収した。表２において以下に示されるように、Ｗｈａｔｍａｎ・Ｐｏｌｙｃａｐ（商標）ＨＤ７５モジュールを介する深層濾過と比較して、濁度除去のより高い効率および同等の産物回収は、低速遠心分離によって達成された。
【００８４】
【表２】
2009534030.tif 000003
実施例４：ＶＳＶ精製プロセス：ＶＳＶ細胞培養液の二次清澄化
実施例３において上で記載される一次清澄化後に、濁度レベルを減少させるために、上清（または濾液）をさらに処理した（二次清澄化）。いくつかの滅菌精密濾過フィルター（０．２〜０．２５μｍ）を評価し（表３）、それらはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ・Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ビレリカ、マサチューセッツ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ・Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＰフィルターユニット、Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）フィルターユニット（ポール社；イーストヒルズ、ニューヨーク）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルターユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；エッジウッド、ニューヨーク）およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ・ザルトポア（商標）２フィルターユニットを含んだ。最適なフィルターは限定されたＶＳＶ結合能力を有するか、またはＶＳＶ結合能力を全く持たないべきであり、さらにできるだけ微粒子汚染を除去するべきである。
【００８５】
プレシード産生からのＶＳＶを、供給液（出発物質）として選択された精密濾過フィルターのために使用し、１×ショ糖・リン酸塩・グルタミン酸塩（ＳＰＧ）を加えた。同一の供給液を供給業者によって提供されるプロトコールに従って濾過した。清澄化細胞培養物質の量は限定されるので、シリンジまたはディスク状フィルターを大規模フィルターの代わりに使用した。表３において示されるように、最も高いＶＳＶ力価回収が、Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）滅菌フィルターにより達成された。
【００８６】
【表３】
2009534030.tif 000004
回収＊：１×ＳＰＧ溶液を供給溶液に加えた。ＳＰＧはショ糖・リン酸塩・グルタミン酸塩である。
【００８７】
ＶＳＶの二次清澄化をＳａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルターユニットを使用してさらに評価し、それらの結果を表４中で以下に要約する。
【００８８】
【表４】
2009534030.tif 000005
上清濁度１＝ＮＴＵ
０．６２＊：濾液が低濁度であるのは、供給液が低濁度のためである。
ＮＡ＝利用可能でない；
ＳＰＧはショ糖・リン酸塩・グルタミン酸塩である。
【００８９】
表４におけるデータは、許容されるレベルの回収をともなって、実験２および実験３の溶液濁度が減少したことをさらに示す。ＳＰＧを加えなかった（６５．８％力価回収）実験１と比較して、供給溶液への１×ＳＰＧの追加が（すなわち実験２：８５．９％力価回収、および実験３：１１０％力価回収）、ＶＳＶ産物回収の収率を著しく改善することもまた、これらの実験において確立された。
【００９０】
実施例５：ＶＳＶ精製プロセス：カラムクロマトグラフイー
実施例４中で記載されている二次清澄化工程に続いて、ＶＳＶ濾液の精製はいくつかのクロマトグラフィー樹脂を使用して、検査／スクリーニングされた。ＶＳＶ粒子が混入タンパク質と比較して大きいサイズなので、大きな孔径を備えた樹脂のみが評価され、それらはＵＮＯスフェア（ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ）（商標）Ｑ陰イオン交換樹脂（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）、ＵＮＯスフェア（商標）Ｓ陽イオン交換樹脂（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）、ＣＨＴセラミックハイドロキシアパタイトタイプＩ樹脂（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）、ＣＦＴセラミックフルオロアパタイトタイプＩ樹脂（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）およびＣＳＴ  Ｉ混合モード樹脂（ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅ  ｒｅｓｉｎ）（ＧＥヘルスケア社）を含んだ。比較のために、２つの親和性樹脂も評価された（Ｍａｔｒｅｘ（商標）ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（登録商標）サルフェイト樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびヘパリンセファロース樹脂（ＧＥヘルスケア社））。実験は室温でバッチモードによって行なわれた。異なる洗浄条件および溶出条件からのサンプルを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびプラーク分析によって分析した。
【００９１】
ＵＮＯスフェア（商標）Ｑ陰イオン交換およびＵＮＯスフェア（商標）Ｓ陽イオン交換樹脂による初期実験において、ＶＳＶは中性ｐＨでＵＮＯスフェア（商標）Ｑ陰イオン交換樹脂へのみ結合することが観察され、ＶＳＶは中性ｐＨで負に荷電していることが示された。
【００９２】
バイオ・ラッド（登録商標）ＵＮＯスフェア（商標）Ｑ陰イオン交換樹脂を用いたＶＳＶ精製の評価。清澄化ＶＳＶを、ＵＮＯスフェア（商標）Ｑ樹脂をパックしたカラム上にロードした。カラム上でＶＳＶ産物と不純物タンパク質との間に識別可能な分離はなく、ウイルスの大半は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の２Ｍ  ＮａＣｌによる溶出後でさえカラムへさらに結合されていた（データ不掲載）。
【００９３】
バイオ・ラッド（登録商標）セラミックハイドロキシアパタイトタイプＩ（ＣＨＴ  Ｉ）樹脂を用いたＶＳＶ精製の評価。ＶＳＶは、ハイドロキシアパタイトカラムへの効率的に吸着された。混入物タンパク質からのＶＳＶのある程度の分離はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察されたが（データ不掲載）、ＶＳＶのかなりの部分は０．８Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．８８による溶出後でさえカラムに結合したままであり、結合ＶＳＶは１Ｍ  ＮａＯＨ洗浄工程間にカラムから最終的に溶出された。
【００９４】
別の実験において、０．９Ｍリン酸カリウム緩衝液を溶出緩衝液として使用した。ＶＳＶと不純物タンパク質との間の分離はほとんど達成されなかった（データ不掲載）。ＶＳＶの大半はカラムへ結合したままであり、カラムからの溶出には１．０Ｍ  ＮａＯＨを必要とした。同様の結果（すなわちＶＳＶ／混入物タンパク質の低分離および樹脂へのＶＳＶの強結合）は、セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ）タイプＩ樹脂とＣＳＴ  Ｉ樹脂で観察された。
【００９５】
Ｍａｔｒｅｘ（登録商標）ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（商標）サルフェイト親和性樹脂を用いたＶＳＶ精製の評価。清澄化ＶＳＶ供給溶液を、あらかじめ平衡化した（１．４７ｍＭリン酸カリウム、８．０６ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（商標）サルフェイトカラム（カプセル体積（ＣＶ）＝２ｍｌ）中へ、３ｍｌ／分の流速でロードした。カラムを、１０ＣＶのリン酸緩衝生理食塩水（１．４７ｍＭリン酸カリウム、８．０６ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０）の平衡化緩衝液により洗浄した。フロースルーおよび洗浄液をプールした。次に吸着された物質を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０までの３０ＣＶ直線的勾配により溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、溶出の間の不純物タンパク質とウイルスとの間の分離が効率的でなく、ＶＳＶがすべてのカラム溶出画分において観察されたことが示された。（データ不掲載）。大量のＶＳＶもまたカラムに残存した。全ＶＳＶ産物回収（すなわち回収されたすべての溶出画分から；Ｆ３〜Ｆ２５）は、４５．２％のみだった（表５）。同様の結果（すなわちＶＳＶの低回収）は、ヘパリンセファロース樹脂で観察された。
【００９６】
【表５】
2009534030.tif 000006
ＦＴ＆Ｗ＝フロースルーおよび洗浄液のプール
Ｆ３〜Ｆ２５は溶出画分３〜２５である。
【００９７】
実施例６：ＶＳＶ精製プロセス：陰イオン交換膜吸着材
実施例５中に上で記載されているように、二次清澄化工程（すなわち０．２μｍ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルター）からの濾液が、ＵＮＯスフェア（商標）Ｑ樹脂、ＵＮＯスフェア（商標）Ｓ樹脂、ＣＨＴ  Ｉ樹脂、ＣＦＴ  Ｉ樹脂、ＣＳＴ  Ｉ樹脂、ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（登録商標）樹脂またはヘパリンセファロース樹脂により精製される場合、ＶＳＶ回収は比較的低い。したがって、実施例４からのＶＳＶ濾液の精製を、２つの陰イオン交換膜吸着材の、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；エッジウッド、ニューヨーク）およびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材（ポール社；イーストヒルズ、ニューヨーク）を使用してさらに評価した。
【００９８】
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材を用いたＶＳＶ精製
膜吸着材精製のためのＶＳＶ供給液（出発物質）は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）分離（７５０ｋＤａの分子量カットオフを有するＴＦＦ膜を使用して）からの未透過残留液であった。次に、ＴＦＦ分離からのＶＳＶ未透過残留液（それらはＶＳＶおよび不純物／混入物のタンパク質およびＤＮＡを含む）は、４℃または−７０℃のいずれかで保存された。
【００９９】
最初のＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材研究は４℃で保存されたＶＳＶ未透過残留液により行なわれ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を平衡化緩衝液として使用し、未透過残留液をＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材（２．１ｍｌ膜体積）へ吸着させた。不純物タンパク質は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）および１．０Ｍ  ＮａＣｌの溶出緩衝液により効率的に溶出された。（データ不掲載）。しかしながら、ＶＳＶ力価は溶出画分のいずれかにおいても回収されなかった。緩衝液をＨＥＰＥＳからリン酸ナトリウム緩衝液へ切り替えたが、類似した結果は、リン酸塩溶出緩衝液中の高い（１．５Ｍ）ＮａＣｌ濃度ででさえ観察された（すなわち回収された画分中でＶＳＶ力価はない）。
【０１００】
これとは対照的に、−７０℃で保存されたＶＳＶ未透過残留液を出発物質として使用し、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１により平衡化された）へ吸着させた場合、ＶＳＶは溶出画分（溶出緩衝液２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１．０Ｍ  ＮａＣｌ）中に観察され、タンパク質不純物の７４．２％は、ＢＣＡ結果に基づいて、フロースルーおよび洗浄液のプール中に観察された（データ不掲載）。総タンパク質についての物質収支分析は、表６中で以下に示される。
【０１０１】
３０％緩衝液Ｂまでの直線状溶出勾配を−７０℃のＶＳＶ出発物質のために使用して、クロマトグラムにおいて２つの主要なピークが観察された（データ不掲載）。緩衝液Ａ（平衡化緩衝液）は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）および０．３Ｍ  ＮａＣｌであった。緩衝液Ｂ（溶出緩衝液）は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２．０Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭショ糖であり、３０％Ｂはおよそ０．８１Ｍ  ＮａＣｌであった。
【０１０２】
最初のピークは、比較的高純度のＶＳＶ（画分４〜１０）であった。第２のピークは、宿主ＤＮＡ混入物（画分１１〜２０）であった。ピコグリーン（登録商標）分析結果（データ不掲載）は、残存宿主ＤＮＡの９７．３％が、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材により除去されることを示した。したがって、これらのデータは、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ膜吸着材がＶＳＶ産物から宿主ＤＮＡ混入物を除去する効率的な手段を提供することを示す。しかしながら、ＶＳＶ力価分析からの結果（データ不掲載）は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ精製プロセスからのＶＳＶ回収は、ウイルス力価で３０％以上少ないことを示した。より高いＶＳＶ回収は、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材を使用して、同一の出発物質で観察された。
【０１０３】
【表６】
2009534030.tif 000007
ＦＴ＆Ｗ＝フロースルーおよび洗浄液のプール
Ｆ３〜Ｆ４０は溶出画分３〜４０である
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材を用いたＶＳＶ精製
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材もまたＶＳＶ精製手段として研究された。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ吸着材のための操作条件は最適化され、以下に記載された。
【０１０４】
ショ糖は、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜から溶出されるＶＳＶの回収収率を改善する。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑについての条件を最適化する場合の初期観察は、クロマトグラフィーの緩衝液中のショ糖含有の重要性であった。例えば、並行した精製実験は、ショ糖（図２Ａおよび２Ｂ）有り、およびショ糖（図３Ａおよび３Ｂ）無しで、調製された緩衝液により行なわれた。以下のクロマトグラフィー緩衝液が使用された：緩衝液Ａ（平衡化緩衝液）は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および３００ｍＭ  ＮａＣｌであった。緩衝液Ｂ（溶出緩衝液）は１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、有りおよび無しで（すなわち＋／−２％ショ糖）であった。
【０１０５】
両方の実験（すなわち＋／−２％ショ糖）において、高純度ＶＳＶ産物が得られた。プラーク分析（データ不掲載）は、ショ糖が緩衝液中の含まれていた場合、ＶＳＶ回収がさらに著しく高い（３２．８％対１９．０％）ことを示した。
【０１０６】
緩衝液ｐＨおよびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜へのＶＳＶ結合。３つの異なる緩衝液ｐＨ領域（ｐＨ６．５、７．０および７．５）が、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜へのＶＳＶ結合のための最適な緩衝液ｐＨを決定するために評価された。これらの実験において、清澄化後に調整された新しい細胞培養を、ｐＨ６．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液またはｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液のいずれかにより平衡化されたＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜上にロードした（各緩衝液は３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２％のショ糖もまた含む）。
【０１０７】
ＶＳＶは、１分あたり３．５ｍｌの流速（１０ＣＶ／分）の段階的溶出（溶出緩衝液：１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５、７．０または７．５）、７２０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２％ショ糖）により、膜から溶出された。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑから溶出されるＶＳＶの純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより決定された；データ不掲載）は、検査された緩衝液ｐＨの各々について比較可能だった。しかしながら、ｐＨ６．５では、かなりの量のＶＳＶはクロマトグラフィーのプロセスの間のフロースルー工程、洗浄工程および溶出工程において分散し、それゆえより低いＶＳＶ力価回収がこのｐＨの溶出プールにおいて観察された（表７を参照）。
【０１０８】
【表７】
2009534030.tif 000008
イオン強度、およびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜へ結合するＶＳＶ。１０ｍＭリン酸ナトリウム結合（平衡化）緩衝液中の２つの異なるＮａＣｌ濃度（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍ  ＮａＣｌ）が、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜へのＶＳＶ吸着において検査された。ＶＳＶと不純物のタンパク質との間のよりよい分離が、０．３Ｍ  ＮａＣｌで観察された。例えば、０．３Ｍ  ＮａＣｌがリン酸ナトリウム結合緩衝液中に使用された場合、高分子量の混入物はフロースループール中に除去され、ＶＳＶは膜へ結合したままであった（データ不掲載）。
【０１０９】
イオン強度、およびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜からのＶＳＶ溶出。溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）イオン強度（すなわち溶出緩衝液中のＮａＣｌ濃度）は、直線的勾配溶出により決定され、溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）の濃度は３．５ｍｌ／分の流速で３０ＣＶで０％から６０％に増加された。平衡化緩衝液（緩衝液Ａ）は１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１、３００ｍＭ  ＮａＣｌであり、溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）は１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１、２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭショ糖であった。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材からの７３．３％のＶＳＶを溶出するために、０．６ＭのＮａＣｌ濃度が必要であることが、クロマトグラム（データ不掲載）から観察された。
【０１１０】
直線的勾配溶出対単一工程溶出。高品質のＶＳＶ産物が、直線的勾配溶出（上で記載された）および「単一工程」溶出戦略（データ不掲載）の両方から得られた。単一工程溶出プロセスは、平衡化緩衝液（緩衝液Ａ；例えば１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）および溶出緩衝液（緩衝液Ｂ；例えば１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１、２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭショ糖）を含む。直線的勾配溶出とは対照的に、単一工程溶出プロセスは、特異的な最終的な塩濃度での緩衝液Ｂの即時添加（例えば０．６Ｍの最終的なＮａＣｌ濃度での即時添加緩衝液Ｂ）により、膜吸着材からＶＳＶを溶出する。単一工程の溶出プロセスは、不純物タンパク質の９９％以上を除去し（ＢＣＡ分析；データ不掲載）、ＶＳＶの７０〜９５％は溶出画分で回収された（プラーク分析；データ不掲載）。したがって、この単純な一工程溶出戦略を使用して高いＶＳＶ力価が得られたので、単一工程の溶出プロセスは本明細書において使用されるだろう。
【０１１１】
操作流速。異なる２つの流速、すなわち１０カプセル体積／分および２０ＣＶ／分（ＣＶ）が研究された。精製プロセス性能の変化はいずれの流速でも観察されなかった。
【０１１２】
ベンゾナーゼ（登録商標）処理。ベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼは遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼである。それは、ＤＮＡおよびＲＮＡのすべての形態（一本鎖、二本鎖、直鎖状および環状）を分解するが、タンパク質分解活性を有していない。それは高比活性を持ち、広範囲の条件にわたって有効である。したがって、ベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼは組換え産物からの核酸の除去に理想的であり、核酸混入のためのＦＤＡのガイドラインによるコンプライアンスを可能にする。
【０１１３】
ベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼが、ＶＳＶ精製プロセスおよび最終的なＶＳＶ精製バルク濃縮物中のＤＮＡレベルを著しく減少させることが本明細書において観察された。しかしながら、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材を用いた精製の前のベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼの追加は、ウイルス力価の減少をもたらした（データ不掲載）。これとは対照的に、膜クロマトグラフィー精製工程後のベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼ処理には同様の効果はなかった（すなわち、力価減少は観察されなかった）。
【０１１４】
しかしながら、本明細書において記載される完全なＶＳＶ精製プロセス（例えば、図１を参照）が、細胞培養混入物の９９％以上を除去したので、最終的なＶＳＶ精製バルク濃縮物中のＤＮＡレベルは、ベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼ処理無しで規格以下（例えばＷＨＯの規格＜１０ｎｇ／用量）だった。したがって、ＶＳＶ精製プロセスにおけるベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼ処理を使用する必要はなく、従来のウイルス産物／ウイルス性ワクチンの精製プロセス（それらはベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼ処理を必要とする）と比較して、著しい改善だった。
【０１１５】
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑの結合能力。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材の結合能力は、少量の体積（体積０．３５ｍｌ）Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材（すなわちＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑコイン（ｃｏｉｎ））を使用して、ＶＳＶの漏出により決定された。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑコイン上に調整された細胞培養液をロードし精製する場合、ＵＶ吸収性不純物のフロースルーのために、ＵＶ吸光度によってＶＳＶ漏出を測定することができないことが最初に観察された。したがってこの実施例において、ＶＳＶフロースルー画分を回収し、ＶＳＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＶＳＶ力価分析によって検出した。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ平衡緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳｐＨ７．５、０．３ｍＭ  ＮａＣｌおよび２％のショ糖であった。
【０１１６】
意外にも、通常のクロマトグラフィーの１％の漏出は、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑコイン上への４００ｍｌの細胞培養液のロード後でさえ起こらなかった（下記の表８を参照）（ＶＳＶ培養液力価は６．９×１０６／ｍｌだった）。しかしながら表８中の示されるように、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑコインに４００ｍｌの培養液サンプルをロードした場合、フロースルー中により高いＶＳＶ力価が観察された。さらに、ローディング体積が４００ｍｌへ達するにつれて、コイン中の圧力差は１．８バールへ増加した。したがって、０．３５ｍｌのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材あたり３５０ｍｌの調整された培養液が、このフィルターのローディング能力であり、５００ｍｌ細胞培養／ｍｌ膜吸着材と同等であると、この実験から結論が下された。あるいは、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ結合能力は、６．９×１０９ｐｆｕ／ｍｌ膜としても記載できる。３つの一貫した稼動において、実際のローディング能力（ウイルス力価で）は、この結合能力よりわずかに高く、それはプロセスの性能に影響しなかった。したがって、このデータは、決定した結合能力が保存的な能力数であること、およびそれゆえ容易に大規模な製造産生において使用することができることを示した。
【０１１７】
【表８】
2009534030.tif 000009
ＮＤ＊＝決定されない
ローディング体積１は培養体積に基づいた。
ＶＳＶ力価２：ＶＳＶ供給液の力価は６．９×１０６／ｍＬであった。
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑフィルター膜体積は０．３５ｍｌであった。
ＦＴ１〜ＦＴ４はそれぞれフロースルー１〜４である。
【０１１８】
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材の結論。高率の回収の高品質ＶＳＶ産物は、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材により達成された。「従来の」クロマトグラフィープロセスと比較して、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ精製プロセスは（簡単で効率的なプロセスであることに加えて）、いくつかの長所を有する。例えば、このプロセスは、ショ糖勾配超遠心分離による精製よりも高品質のＶＳＶ産物を産出する（例えば、図５Ａおよび５Ｂを参照）。更に、（ａ）Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材の高い結合能力は、より少量のプロセスの装置およびより低い生産費を意味し、（ｂ）より高い流速は、検査された他のクロマトグラフィー樹脂と比較して、増加したスループットおよび生産力をもたらし、および（ｃ）使い捨てのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材ユニットは、洗浄の妥当性検証および耐用年限の妥当性検証の必要性を排除する。
【０１１９】
以下は、上で開発および記載されるＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ操作条件を要約する：（ａ）ローディング能力＝Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材１ミリリットルあたり０．５Ｌの細胞培養、（ｂ）流速＝１分あたり２０カプセル体積（ＣＶ）、（ｃ）ＶＳＶ結合ｐＨ＝ｐＨ７．５±０．１ｐＨユニット、（ｄ）ＶＳＶ結合イオン強度＝０．３±０．２Ｍ塩；（ｅ）ＶＳＶ溶出＝１５ＣＶでの段階的勾配および（ｆ）ＶＳＶ溶出イオン強度＝０．７Ｍ塩。
【０１２０】
実施例７：ＶＳＶ精製プロセス：タンジェンシャルフロー濾過、研磨、緩衝液交換
ＶＳＶ濃縮および緩衝液交換は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムを使用して行なわれた。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材からのＶＳＶ溶出プールは、高い（０．７Ｍ  ＮａＣｌ）塩濃度の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中にあり、さらに微量の不純物を有していた。したがって、ＵＦ／ＤＦ工程は、残存不純物を除去し、適切な産物処方緩衝液中で最終的なＶＳＶ産物を産生するのに必要であった。
【０１２１】
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑの５回の実験稼動からの溶出プールを組合せ、この実験において使用した。７５０ｋＤａ分子量カットオフの１６ｃｍ２の中空ＴＦＦ膜カートリッジが利用された（ＧＥヘルスケア・バイオ−サイエンス社、ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。プールされた溶液は、最初に１０ｍｌまで濃縮された。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＰＢＳ）および１３８ｍＭ  ＮａＣｌ）で、５回の（５×）緩衝液交換が行なわれた。
【０１２２】
プロセス中のサンプルについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、精製ＶＳＶが未透過残留液および洗浄液中にのみ存在することが示され、透過物中のＶＳＶ損失は、銀染色またはウエスタンブロット分析のいずれかによっても検出されなかった（データ不掲載）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータは、ＶＳＶプロセス回収が許容されること、および不純物は各々の緩衝液交換後に次第に除去されることを実証した（データ不掲載）。完全に残存不純物を除去するために、合計で５〜６回の緩衝液交換が必要だった。
【０１２３】
ＵＦ／ＤＦ操作条件の最適化。ＴＦＦ  ＵＦ／ＤＦ性能に対する緩衝液組成物の効果が研究された。同一のＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プールを供給液としてすべての実験について使用した（表９）。最初の３回の実験は１６ｃｍ２中空糸ＴＦＦ膜（ＧＥヘルスケア・バイオ−サイエンス社）上で行なわれるが、最終稼動は４２０ｃｍ２  ＴＦＦ膜（ＧＥヘルスケア・バイオ−サイエンス社）により終了した。すべての実験について、産物品質は類似していた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＳＥ−ＨＰＬＣに基づく）。
【０１２４】
【表９】
2009534030.tif 000010
使用される緩衝液とは無関係に、ダイアフィルトレーション透過物中に観察されるＶＳＶ産物はなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色に基づく；データ不掲載）。しかしながら、総タンパク質およびＤＮＡの分析から、ロードされた約３４〜４１％の総タンパク質およびロードされた３３〜４０％のＤＮＡは、最初の３回のダイアフィルトレーション体積中に除去されることが示された。緩衝液交換に関して、５回のダイアフィルトレーション体積（ＤＶ）が、透過物伝導度を満足なレベルまで減少させるのに十分だった。
【０１２５】
したがって、以下のＴＦＦ  ＵＦ／ＤＦ操作条件が以下のとおりに開発された：
（ａ）ＴＦＦ膜カートリッジ：中空糸ＴＦＦカートリッジ（７５０ｋＤａ）、
（ｂ）ＴＦＦ膜受容能力：９５Ｌ細胞培養／ｍ２、
（ｃ）操作圧：ｐ１＝３〜４ｐｓｉｇ；ｐ２＝１〜２ｐｓｉｇ；ＴＭＰ＝１．５〜２．５ｐｓｉｇ、
（ｄ）操作温度：室温、
（ｅ）クロスフロー率：７００ＬＭＨ、
（ｆ）透過物流出：＞  ３０ＬＭＨ、および
（ｇ）５倍濃縮およびＰＢＳ＋４％のショ糖（１０ｍＭリン酸カリウム、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）の中へ６回のダイアフィルトレーション；ここで、ｐ１は入口圧力であり、ｐ２は出口圧力であり、ＴＭＰは膜間圧であり、ＬＭＨはリットル／ｍ２時間である。
【０１２６】
実施例８：ＶＳＶ精製プロセス：最終濾過
ＶＳＶ精製プロセスにおける最終工程は、上で記載されるＴＦＦ精製された物質の最終濾過であった。１分あたり１００ｍｌの流速で、０．２μｍ（０．４５／０．２μｍ）Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ・Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（商標）フィルターユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；エッジウッド、ニューヨーク）を、ＶＳＶ産物の最小損失で、可能性のあるバイオバーデンを除去するために使用した。緩衝液は、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．１〜７．３）、１３８ｍＭ  ＮａＣｌおよび７．５％ショ糖であった。
実施例９：ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ９−ｇａｇ１コンストラクトのためのＶＳＶスケールアップ精製
４回の４．５Ｌスケールアップ稼動（すなわち細胞培養体積）が行なわれた。これらのスケールアップ稼動の要約は、表１０および表１１、および図６において以下に示される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ不掲載）、総タンパク質（表１１）、ウイルス力価（表１０および図６）およびＳＥ−ＨＰＬＣ（データ不掲載）を含む分析が行なわれた。一貫したプロセスの性能（すなわちＶＳＶ産物品質）および不純物除去は、図１において示されるプロセスを使用して、スケールアップ稼動の各々において達成された。
【０１２７】
【表１０】
2009534030.tif 000011
【０１２８】
【表１１】
2009534030.tif 000012
ＮＤ＝決定されなかった
ＶＳＶスケールアップ精製プロセスの分析
本明細書において記載される新規ＶＳＶ精製プロセスを開発する目的（例えば、図１を参照）は、精製されたＶＳＶ産物を高回収で高純度ＶＳＶを産生することであった。以下の分析は、４回の４．５Ｌの細胞培養スケールアップ稼動に基づくＶＳＶ精製および安定性を記載する。
【０１２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および不純物タンパク質除去。精製プロセスの重要な態様は、ＶＳＶ産物からの細胞培養不純物タンパク質の枯渇（または除去）である。実施例１において上で示されるように、本明細書において例示されるｒＶＳＶＩＮコンストラクトは、ｒＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ９−ｇａｇ１コンストラクトだった。ＶＳＶ産物は、その主要なウイルスタンパク質の、Ｍ（２７ｋＤａ）、Ｎ／Ｐ（４９ｋＤａ）、Ｇ（５５ｋＤａ）およびＬ（２５０ｋＤａ）の検出によりモニタリングされた。ＶＳＶタンパク質の中で、ＭおよびＮ／Ｐのタンパク質は、ＧおよびＬのタンパク質（ＣＴ９）よりも高いレベルで表現され、Ｌタンパク質レベルは最低であった。したがって、ＭおよびＮ／Ｐタンパク質は、ＧおよびＬタンパク質と比較してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析においてはるかにより強いバンドとして観察された。すべての実験において、同一のサンプル体積をゲルの中へロードした（特に明記しない限り）。更に、銀染色またはクマシー（登録商標）染色のような単一のタンパク質検出方法の代わりに、銀／クマシー（登録商標）ブルー二重染色法を利用し、それによってより高感度のタンパク質検出が提供された。
【０１３０】
スケールアップ稼動番号４のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図４Ａおよび４Ｂ）から、大多数の宿主タンパク質が、細胞残屑の除去を介して、低速遠心分離の一次清澄化工程（図４Ａ、４Ｂ、レーン１および２）において除去されることが示された。ＢＣＡ分析に基づいて、総タンパク質の９１．５％は除去され、低速遠心分離は有意な不純物除去工程であることが示された。
【０１３１】
遠心分離からの上清を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１×ショ糖・リン酸塩・グルタミン酸塩（ＳＰＧ；７．５％ショ糖、１０ｍＭリン酸カリウム、５ｍＭグルタミン酸塩）の追加後にｐＨ７．５）、０．４６５Ｍ  ＮａＣｌおよび２％ショ糖により希釈し（図４Ａおよび４Ｂ、レーン３）、より薄い染色バンドが希釈に起因して観察された。次に、任意の残存する微粒子混入物（不純物タンパク質はこの工程において除去されなかった；図４Ａ、４Ｂ、レーン４）を除去するために、希釈溶液を、０．２μｍフィルターを通してポンプで送り込んだ。ＶＳＶ濾液をＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ工程のための供給液として回収し、膜吸着材上へロードした。
【０１３２】
残存する不純物タンパク質の９９．５％以上はＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材上で除去された（表１１）。不純物タンパク質の除去はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって観察され（図４Ａ、４Ｂ、レーン４および５）、高品質のＶＳＶ産物はＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜から溶出された（図４Ａ、４Ｂ、レーン６）。
【０１３３】
溶出されたＶＳＶは、ＰＢＳ緩衝液（＋７．５％ショ糖）の中へ濃縮されダイアフィルトレーションされた。残存するタンパク質不純物の４８％以上はＵＦ／ＤＦ精製工程において除去され（表１１）、非常に強いＶＳＶタンパク質バンドが検出された（図４Ａ、４Ｂ、レーン７）。微量の不純物タンパク質のみがＵＦ／ＤＦ透過物プール中に観察された（図４Ａ、４Ｂ、レーン８）。０．２μｍ最終濾過の前後で、ＶＳＶタンパク質の品質または不純物タンパク質プロフィールに関して検出可能な変化はなかった（図４Ａ、４Ｂ、レーン９および１０）。
【０１３４】
新しく開発されたプロセスからのＶＳＶ精製バルク濃縮物は、ショ糖勾配遠心法を介する精製と比較して、高純度および低残存レベルであることも実証された。例えば、新しく開発されたプロセス（図５Ａ、５Ｂ、レーン９）からのＶＳＶタンパク質の染色バンド（Ｍ、Ｎ、Ｐ、ＧおよびＬ）は、ショ糖勾配遠心法を介して精製されたＶＳＶの染色バンドよりも強く（図５Ａ、５Ｂ、レーン１１）（それほど強くない不純物タンパク質染色バンドと共に）、より高品質のＶＳＶ産物が図１において示される新規精製プロセスによって達成されることを示す。４回のスケールアップ稼動すべてにおいて、不純物タンパク質プロフィールおよびＶＳＶタンパク質バンドの強度に基づいて、同様の産物品質が達成された（データ不掲載）。
【０１３５】
サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析。不純物タンパク質からＶＳＶを分離し、ＶＳＶ精製プロセスを質的に解析する単純かつ都合のよい方法を提供する、ＶＳＶのためのＳＥ−ＨＰＬＣ解析が開発された（実施例１を参照）。カラムを保護するために、清澄化されたサンプルのみを、カラムの中へ注入した。ＶＳＶは、７．５分の保持時間で溶出ピークとしてカラムから流出する（データ不掲載）。混入物／不純物タンパク質ピーク（それらはより長いカラム保持時間を有している）は、ＶＳＶピーク後にカラムから溶出され、したがってＶＳＶ産物から排除／除去される必要がある。大部分の不純物は、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑフロースルーおよび洗浄液中に除去され、そのことはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を確証する。ＵＦ／ＤＦ工程において、緩衝液関連の不純物は除去され、ＶＳＶは透過物のいずれかにおいても失われなかった（データ不掲載）。０．２μｍ最終濾過に続いて、ＶＳＶ産物は７．５分の保持時間で一つの主要なピークとしてＳＥ−ＨＰＬＣカラムから溶出され、緩衝液ブランクに対応する２つのより少量のピークが後続した（データ不掲載）。
【０１３６】
残存宿主ＤＮＡの除去。細胞培養（宿主細胞）ＤＮＡは、組換え技術を使用する精製プロセスにおける主要な混入物の１つである。ＶＳＶ精製バルク濃縮物中の残存ＤＮＡレベルは、１０ｎｇ／用量（１０７ｐｆｕ）未満であるべきである。４回のスケールアップ稼動のためのＤＮＡ除去プロフィールは、一貫したＤＮＡ除去が各々の精製工程において達成されており、表１２において以下に要約される。主要なＤＮＡの除去は、産物回収工程（すなわち低速遠心分離による１°清澄化、続いて０．２μｍ濾過による２°清澄化）およびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材工程において観察された。残存ＤＮＡの８０％以上はＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ工程において除去され、６０％以上のＤＮＡ除去はＵＦ／ＤＦ工程において達成された。全体の％ＤＮＡ除去は、４回のスケールアップ稼動すべてにおいて９９．８９±０．０３％であった。更に、残存ＤＮＡレベルは１０ｎｇ／用量よりはるかに下であった（表１３）。
【０１３７】
【表１２】
2009534030.tif 000013
産物回収１は、０．２μｍ濾過が後続する低速遠心分離の培養液清澄化工程である。
【０１３８】
【表１３】
2009534030.tif 000014
Ｇａｇタンパク質の除去。Ｇａｇタンパク質濃度はＥＬＩＳＡによって決定され、ＶＳＶ産物中の残存Ｇａｇレベルを確定するためにデータを提供した。精製プロセスでのＧａｇタンパク質のプロフィールを、表１４において以下に要約する。大部分のＧａｇタンパク質は、二次清澄化工程（すなわち０．２μｍ濾過）およびＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材工程において除去された。表１５において示されるように、残存Ｇａｇタンパク質レベルは、最終精製されたバルク濃縮物において０．０８〜８．９３ｎｇ／用量（１０７ｐｆｕ）にわたった。
【０１３９】
【表１４】
2009534030.tif 000015
【０１４０】
【表１５】
2009534030.tif 000016
実施例１０：ＶＳＶＩＮ  Ｎ４ＣＴ１−ｇａｇ１コンストラクトのためのＶＳＶスケールアップ精製
ＶＳＶｉｎＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１コンストラクトのための精製プロセス開発は、細胞培養液（＜１０６ｐｆｕ／ｍｌ）中の低い産物力価で最初に挑戦され、低い産物力価および最終精製バルク濃縮物中の高いＤＮＡ混入をもたらした。しかしながら、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１のための実施例９において記載されるような精製プロセスは、このＶＳＶコンストラクトに首尾よく適用され、１０Ｌスケール（細胞培養体積で）へスケールアップした。高品質ＶＳＶ産物はこの精製プロセスを介して産生された。
【０１４１】
精製プロセスにおいて、一次清澄化工程および二次清澄化工程は、実施例３および４において記載されるものに実質的に類似していた。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ吸着材を使用する陰イオン交換膜吸着工程は、以下のとおりに最適化された。タンジェンシャルフロー濾過は、中空糸膜カートリッジ（ＧＥヘルスケア社；ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を備えた、クイックススタンド（Ｑｕｉｘｓｔａｎｄ）（商標）またはフレックススタンド（Ｆｌｅｘｓｔａｎｄ）（商標）システムを使用して行われた。７５０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を備えたＧＥポリエーテルスルフォン限外濾過膜も、この研究において検査された。すべての膜は４２０ｃｍ２または１２００ｃｍ２の公称濾過表面領域を有していた。膜クロマトグラフィー実験を、ポール・Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材（ポール株式会社；イーストヒルズ、ニューヨーク）と共に、ＡＫＴＡ（商標）エクスプローラーおよびＡＫＴＡパイロット（ＡＫＴＡＰｉｌｏｔ）（商標）システム（ＧＥヘルスケア社；ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して行なった。
【０１４２】
ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１のためのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ精製の最初の試み
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ吸着工程は、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１精製プロセスにおいて記載されるのと同一の緩衝液および操作条件を使用して行なわれた。要約すると、細胞および残屑は、遠心分離によって最初に除去された。１：９比率（ｖ／ｖ）で１０×ショ糖・リン酸塩・グルタミン酸塩（ＳＰＧ）の追加、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４６５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、２％のショ糖による２倍の稀釈物後に、溶液を０．２μｍフィルターを通してポンプで送り込んだ。濾液をあらかじめ平衡化されたポール・Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材（０．３５ｍｌカプセル体積）の中へロードし、フロースルーおよび洗浄液（ＦＴ＆Ｗ）のプールを回収した。ＶＳＶ産物は、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１プロセスにおいて記載されるものと同一の溶出条件を使用して、溶出プール中に回収された。高品質のウイルス産物が得られた（データ不掲載）。しかしながら、ウイルス産物の３分の１はＦＴ＆Ｗプール中に観察され（表１６）、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プール中のウイルス力価は、バイオリアクターにおける低いウイルス産生力価のために非常に低かった（ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１について４．６×１０５ｐｆｕ／ｍｌ対ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１について＞１．０×１０７ｐｆｕ／ｍｌ）。
【０１４３】
【表１６】
2009534030.tif 000017
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ吸着材を用いたこのコンストラクトについて結合条件は、以下のとおりさらに最適化された。実験デザインの概要を表１７において概説する。すべての実験において、以前のＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１からの経験に基づいて６．５〜７．５のローディングｐＨおよび溶出ｐＨを選択した。０．２８〜０．３２Ｍにわたるローディング緩衝液中のＮａＣｌ濃度、一方０．６〜０．７Ｍの溶出緩衝液中のＮａＣｌ濃度が、実験において選択された。流速は３．５〜１０．５ｍｌ／分であり、１０〜３０カプセル体積／分（ＣＶ）に該当した。
【０１４４】
【表１７】
2009534030.tif 000018
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく高品質ＶＳＶ産物は、すべてのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プールにおいて観察された（図示せず）。この工程における不純物タンパク質除去結果を図７において示す。不純物タンパク質の９９％以上はこの単一工程において除去され、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１精製プロセスにおけるものよりも高かった。プロセス回収、および溶出プール中の残存宿主ＤＮＡ分析の結果を、表１８において要約する。溶出プール中の残存ＤＮＡレベルはすべての実験において非常に低く、ＤＮＡ除去がこのプロセスにおける問題ではなかったことを示す。しかしながら、力価回収は実験条件に依存して変化した。
【０１４５】
【表１８】
2009534030.tif 000019
プロセス回収はプラーク分析によって決定されるウイルス力価から計算された。ローディング緩衝液ｐＨが６．６〜７．５の範囲であり、ＮａＣｌ濃度が０．２８〜０．３０Ｍである場合、等高線図において示されるように、許容されるプロセス回収が達成された（データ不掲載）。最適なローディング緩衝液条件は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２％ショ糖、ｐＨ７．０中の０．２９Ｍ  ＮａＣｌであった。ｐＨ調整が供給液の条件付けにおいて好ましくないことを考慮して、ｐＨ  ７．５が、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ平衡化緩衝液ｐＨに対して許容されると考えられた。同時に、０．６０〜０．７０ＭのＮａＣｌおよびｐＨ  ６．７５〜７．２５が、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）溶出緩衝液条件として決定された。最適な溶出緩衝液条件は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．６５Ｍ  ＮａＣｌ、２％ショ糖、ｐＨ７．０であった。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ緩衝液条件を表１９で要約する。開発された条件により、溶出プール中のＤＮＡ混入物は許容されるレベルまで減少された（データ不掲載）。
【０１４６】
【表１９】
2009534030.tif 000020
さらなる実験はこれらの結果に一致しており、特定の実施形態において、０．２８Ｍ〜０．３０ＭのＮａＣｌおよびｐＨ７．２〜７．５が、高い産物回収、および溶出プール中のＤＮＡ混入物における許容される減少を保証する好ましい結合緩衝液条件であることを実証した。
【０１４７】
実施例１１：ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１コンストラクトのためのＶＳＶスケールアップ精製
上で開発されたＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ条件を使用して、３回の確認稼動が、小スケールで、同一の供給物質により完了した。平衡化緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２９Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、２％ショ糖であり；一方溶出緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．６５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、２％ショ糖であった。同一の操作条件（同一の流速、同一のローディング体積および同一の溶出量）はすべての稼動について維持された。実験結果を表２０で要約する。非常に一貫したプロセス性能が、力価分析結果から計算される産物回収に基づいて達成された。
【０１４８】
【表２０】
2009534030.tif 000021
ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１精製プロセススケールアップ、一貫性稼動および技術移転
マイクロキャリアーの除去後のＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１含有細胞培養液を、出発物質として全体の精製プロセスのために使用した。そのプロセスは、低速遠心分離による細胞培養液の清澄化および上清中のＶＳＶの回収；０．４５／０．２μｍフィルターを通した上清の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収；陰イオン交換膜吸着材上へのＶＳＶ濾過溶液のローディング、溶出プール中のＶＳＶ産物の回収；７５０ｋＤａ分子量カットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による回収ＶＳＶの精製および未透過残留液中のＶＳＶの回収、および最終的に０．２μｍフィルターを通したＶＳＶ未透過残留液の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収を含んだ。３回の６Ｌスケールアップ／一貫性稼動（ＣＲ）および１回の１０Ｌ稼動（ＴＴＲ）が、成功裡に完了した。実験条件を表２１において要約する。
【０１４９】
【表２１】
2009534030.tif 000022
実験結果を表２２および２３において要約する。プロセスについて典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が行なわれた（データ不掲載）。異なる稼動の中で工程回収の変動は感染能分析（プラーク分析）の変動のためだった。全体のプロセス収率は行なわれた稼動に対して一貫していた。タンパク質およびＤＮＡの不純物の一貫した除去が観察された。すべての稼動について、高品質ウイルス産物が産生された。
【０１５０】
【表２２】
2009534030.tif 000023
【０１５１】
【表２３】
2009534030.tif 000024
ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１のための精製プロセスは高品質産物を産生して好結果だった。精製条件は、一貫したプロセスの性能により１０Ｌスケール（細胞培養体積で）までの規模で行なわれた。プラーク分析からのＶＳＶ力価に基づく全プロセス収率は、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１およびＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１から達成されたものよりも低かった。主な力価損失は、０．２μｍ最終濾過、およびさらに恐らくＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ工程において観察された。特に研究が低力価の出発物質によって行なわれた場合は、非特異的結合により損失が説明されるかもしれない。より低力価では、ウイルスのより大きな部分がフィルターにおいて失われるだろう。細胞培養でのＶＳＶ力価の増加が有効な解決であった。異なる緩衝液成分、賦形剤、精製プロセスでのウイルス力価損失の減少における使用のための操作条件、およびウイルス産物の適した緩衝液システムの選択は、この精製システムの変更であり、不必要な実験の手段を伴わない当技術分野の技能内にあるものと考えられる。
【０１５２】
実施例１２：ＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１コンストラクトのためのＶＳＶスケールアップ精製
ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１のための実施例９において記載されるような精製プロセスは、このＶＳＶコンストラクトへうまく適用され、１０Ｌスケール（細胞培養体積で）へスケールアップした。高品質ＶＳＶ産物はこの精製プロセスを介して産生された。
【０１５３】
精製プロセスにおいて、一次清澄化および二次清澄化工程は、実施例３および４において記載されるものに実質的に類似していた。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ吸着材を使用する陰イオン交換膜吸着工程は、以下のとおり最適化された。タンジェンシャルフロー濾過は、中空糸膜カートリッジ（ＧＥヘルスケア社；ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を備えた、クイックススタンド（商標）またはフレックススタンド（商標）システムを使用して行われた。７５０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を備えたＧＥポリエーテルスルフォン限外濾過膜を、この研究において検査した。すべての膜は４２０ｃｍ２または１２００ｃｍ２の公称濾過表面領域を有していた。膜クロマトグラフィー実験を、ポール・Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材（ポール株式会社；イーストヒルズ、ニューヨーク）と共に、ＡＫＴＡ（商標）エクスプローラーおよびＡＫＴＡパイロット（商標）システム（ＧＥヘルスケア社；ピスカタウェイ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して行なった。
【０１５４】
ＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１のためのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ精製の最初の試みは、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１精製プロセスにおいて記載される同一の操作条件を利用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく高品質産物を産生した。しかしながら、高残存ＤＮＡレベルが産物の溶出プール中に検出された。膜クロマトグラフィーを使用して、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑの結合条件および溶出条件は、高精製度および高品質のＶＳＶ産物を達成するように開発された。プロセスの高性能一貫性は、以下の操作条件を使用して、小規模稼動を含む後の実験、およびスケールアップ／一貫性稼動において実証された。精製プロセスも、臨床試験物質産生のために製造受託機関（ＣＭＯ）へ結果よく譲渡された。
【０１５５】
ＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１のための最初のＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ精製
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ工程は、細胞培養液およびＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１精製プロセス中に記載されているものと同一の緩衝液および操作条件を使用して行なわれた。要約すると、細胞および残屑は遠心分離によって除去された。１×ショ糖・リン酸塩・グルタミン酸塩（ＳＰＧ）の追加によって条件付けられ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４６５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、２％のショ糖により２倍希釈された後、上清を０．２μｍフィルターを通してポンプで送り込んだ。濾液をあらかじめ平衡化されたＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材にロードし、フロースルーおよび洗浄液のプールを回収した。ＶＳＶ産物は、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１精製プロセス中に記載されるような溶出緩衝液および操作条件の使用により得られた。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、２％ショ糖を使用する再生からのプールも回収された。最終的に、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑを１．０Ｍ  ＮａＯＨ溶液により洗浄した。高いＶＳＶ結合能力が、実験において観察された。しかしながら、産物は溶出プール中にほとんど回収されなかった（データ不掲載）。ウイルス産物は、再生プール中に優勢に検出され、ウイルス産物の２分の１以上は全く回収されなかった（参照、表２４）。高レベルのＤＮＡ混入物は、溶出プールおよび再生プールの両方において検出された。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑのための結合および溶出の条件は、この新しいコンストラクトが、産物回収を増加させ、同時に残存ＤＮＡレベルを減少させるようにさらに最適化された。
【０１５６】
【表２４】
2009534030.tif 000025
以前に記載されるように、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１精製は、最終産物からの残存ＤＮＡ除去によって行なわれた。メルク社（商標）ＴＭＡＥおよびポール・Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑもまた条件最適化のために使用した。
【０１５７】
ＴＭＡＥ（商標）樹脂を使用するＶＳＶ精製の開発
ＶＳＶ結合緩衝液条件のスクリーニングは、表２５において示されるような全因子実験デザインを使用して、ＴＭＡＥ（商標）樹脂上で行なわれた。供給液は、異なるローディング緩衝液条件へ調整された細胞培養上清だった。フロースルー中のＶＳＶを、ウエスタンブロット分析を使用してモニタリングした。
【０１５８】
【表２５】
2009534030.tif 000026
ウエスタンブロット分析によって示されるように（図示せず）、平衡化緩衝液中のＮａＣｌ濃度が２００ｍＭに達した場合、有意な量のＶＳＶがフロースループール中に観察された。ＴＭＡＥの適切なＶＳＶ結合能力を得るために、平衡化緩衝液中のＮａＣｌ濃度は２００ｍＭ以下であるべきである。ＶＳＶの結合挙動は、検査するｐＨ条件内では劇的に影響されなかった。しかしながら、溶出プール中のＶＳＶ回収の分析（ＴＭＡＥ溶出プール（図８Ａおよび８Ｂおよび８Ｃ）のＳＥ−ＨＰＬＣピーク積分領域により推定される）は、同一の結合ＮａＣｌ濃度で、より高いｐＨ条件（ｐＨ７．５対ｐＨ７．０および６．５）で、より高い受容能力が達成されることを示した。
【０１５９】
ＴＭＡＥカラムを使用するＶＳＶ精製の試み
細胞および細胞残屑を、２０〜２４℃３０分間５０００ｒｐｍでの遠心分離によってＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１を含む細胞培養液から除去した。９対１の比率で１０×ＳＰＧストック溶液に混合した後、上清を０．４５／０．２μｍフィルターを通してポンプで送り込んだ。濾液を４ｍｌ／分の流速でＴＭＡＥカラム（２ｍｌ）の供給液として使用した。カラムを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１４５Ｍ  ＮａＣｌ、２％のショ糖、ｐＨ７．４によりあらかじめ平衡化した。１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液によりカラムをチェイスした後、結合された物質を、３０ＣＶで１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２％ショ糖、ｐＨ７．５への直線的勾配によってカラムから溶出した。異なる溶出プールを回収した。
【０１６０】
【表２６】
2009534030.tif 000027
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（図示せず）は、溶出プロフィールにおける２つの主要ピークの観察を可能にした。最初のピークＦ１ではＵＶ２５４／２８０比率は低く、より高いタンパク質／ウイルス含有量を示す。第２のピークＦ２ではＵＶ２５４／２８０比率が高く、より高い核酸含有量を示唆する。ピコグリーン（登録商標）分析は、画分プールＦ１においてＤＮＡレベルが非常に低いことを確認した（データ不掲載）。したがってこのカラムをＤＮＡ除去のために使用した。このピークでの力価回収はプラーク分析により８１．４％であった。しかしながら、高レベルのタンパク質不純物が示された。
【０１６１】
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材を使用するＶＳＶ精製
ＶＳＶ結合条件のスクリーニングを、表２７において示されるような全因子実験デザインを使用して、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材上で行なった。供給液は、異なるローディング緩衝液条件へ調整された細胞培養上清であった。異なるＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プールをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して解析した（図示せず）。
【０１６２】
【表２７】
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Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ吸着材を用いたＶＳＶ結合条件スクリーニングのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、０．１５、０．２０、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８Ｍの異なる結合ＮａＣｌ濃度での溶出プールをそれぞれ示した。平衡化緩衝液中のＮａＣｌ濃度が０．２６Ｍに達した場合、高分子量タンパク質不純物は、すべての検査されるｐＨ条件で溶出プールから除去された。
【０１６３】
溶出条件スクリーニング
０．２８Ｍの最終ＮａＣｌ濃度に達するように、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１を含む細胞培養上清を、ＨＥＰＥＳストック溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４１５Ｍ  ＮａＣｌ、２％ショ糖、ｐＨ７．２５）により２倍希釈した。調製された溶液を、実験の供給液として使用した。この研究のための実験デザインを表２８において要約する。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ  ＭＡへ結合させた後に、ＶＳＶを異なるＮａＣｌ濃度での溶出緩衝液により溶出した。
【０１６４】
【表２８】
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プロセス回収の等高線図分析（図示せず）は、適切なプロセス回収（＞５５％）を得るために、溶出緩衝液条件は、ｐＨ＝６．５〜６．９およびＮａＣｌ濃度＝０．５５〜０．７０Ｍとして維持されるべきであることを示す。これらの条件により、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プールについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において示されるように、高品質ＶＳＶ産物が産生された（図示せず）。
【０１６５】
ＤＯＥアプローチを使用するＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ条件の最適化
高レベルのＤＮＡ除去および高いプロセス収率を達成するためのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ工程におけるさらなる最適化は、よりよいＶＳＶ結合条件および溶出条件をもたらした。実験デザインを表２９に示す。ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１における最初のスクリーニング研究および以前の経験に基づいて、６．５から７．０までのローディングｐＨおよび溶出ｐＨを選択した。ローディング緩衝液および溶出緩衝液中の異なったＮａＣｌ濃度もまた最初のスクリーニング研究の結果から選択された。すべての実験における流速は７．０ｍｌ／分で維持され、２０カプセル体積（ＣＶ）／分であった。
【０１６６】
【表２９】
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実験結果
プロセス収率は、プラーク分析により決定されるＶＳＶ産物力価に基づいて計算された。結果は予測プロフィールで要約される（図示せず）。プロセス収率を最大限にするために、Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ吸着において以下の緩衝液条件が同定された：
ローディング緩衝液中のＮａＣｌ濃度：０．２６〜０．３０Ｍ
ローディング緩衝液ｐＨ：７．０〜７．５
溶出緩衝液中のＮａＣｌ濃度：０．５５〜０．６５
溶出緩衝液ｐＨ：６．５〜７．０
異なる結合条件でＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プール中の残存ＤＮＡレベルは、等高線図において報告された（図示せず）。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ緩衝液条件はＤＮＡ除去の結果に基づいて、さらに改良された：
ローディング緩衝液中のＮａＣｌ濃度：０．２７〜０．２９Ｍ
ローディング緩衝液ｐＨ：７．０〜７．５
溶出緩衝液中のＮａＣｌ濃度：０．５５〜０．６５
溶出緩衝液ｐＨ：６．５〜７．０
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プール中のＶＳＶ生成物純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーにより推定した（図示せず）。異なる結合緩衝液条件および異なる溶出緩衝液条件で、産物の純度を解析した。デンシトメトリー分析の変動を考慮して、すべての場合についてＶＳＶ産物純度で有意差はなかった。高品質ＶＳＶ産物がすべての実験において産生された。
【０１６７】
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ操作範囲
Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜クロマトグラフィーの結合緩衝液および溶出緩衝液の条件は、表３０において示されるような開発された条件内でおよびその条件外で、より多くの操作点の実験を行なうことにより確定された。平衡化／溶出緩衝液は、様々な量のＮａＣｌをともなう、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２％のショ糖および異なるｐＨ条件であった。同一の操作条件（同一の流速、同一のローディング体積および同一の溶出量）はすべての稼動において維持された。表３０において示されるように、一貫したプロセス性能が観察された：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく高品質ＶＳＶ産物が産生され；許容されるレベルの残存ＤＮＡ除去はすべてのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ溶出プールにおいて達成され；類似したプロセス収率が同様に得られた。
【０１６８】
【表３０】
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ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１一貫性稼動
全体の精製プロセスは、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ９−ｇａｇ１を含む細胞培養液を使用して行なった。このプロセスは、低速遠心分離による細胞培養液の清澄化および上清中のＶＳＶの回収；０．４５／０．２μｍフィルターを通した上清の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収；陰イオン交換膜吸着材上へのＶＳＶ濾液のロード、陰イオン交換膜吸着材からのＶＳＶの溶出およびＶＳＶ産物の回収；７５０ｋＤａ分子量カットオフ中空糸膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による回収ＶＳＶの精製および未透過残留液中のＶＳＶの回収、ならびに０．２μｍフィルターを通したＶＳＶ未透過残留液の濾過および濾過溶液中のＶＳＶの回収を含む。１回の１０Ｌ稼動および２回の６Ｌ稼動が「一貫性稼動」としてワイス社で完了し、２回の１０Ｌの稼動が技術移転稼動としてヘノジェン（Ｈｅｎｏｇｅｎ）社で遂行された。実験条件を表３１において要約する。
【０１６９】
【表３１】
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１０ｍｌムスタン（Ｍｕｓｔａｎ）（商標）Ｑカプセルは、３回の一貫性稼動（ＣＲ）および１回の技術移転稼動（ＴＴＲ）において使用された。６０−ｍｌＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑカプセルは１回のＴＴＲのみで使用された。流速は、１０ｍｌのカプセルについては２００ｍｌ／分および６０ｍｌのカプセルについては６００ｍｌ／分だった。４２０ｃｍ２ＴＦＦ膜が一貫性稼動で使用されたが、１２００ｃｍ２のものがＴＴＲで使用された。クロスフロー率は、膜面積に従って直線的に調整された。
【０１７０】
実験結果を表３２および３３において要約する。全体のプロセス収率は、行なわれたすべての稼動に対して一貫していた。異なる稼動の中での工程回収の変動は感染能分析の変動のためである（表３３）。タンパク質およびＤＮＡの不純物の一貫した除去はすべての稼動において観察された（表３２）。プロセスについての典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はこの評価に付随した（図示せず）。高品質ウイルス産物はこの精製プロセスを介して産生された。
【０１７１】
【表３２】
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【０１７２】
【表３３】
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したがって、ＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１についての精製プロセスは結果よく開発されており、開発された精製条件は、１０Ｌスケール（細胞培養体積で）へスケールアップされ、なお同一のプロセス性能を維持する。そのプロセスは６〜１０Ｌのスケール（細胞培養体積で）で３回の一貫性稼動および２回の技術移転稼動により確証された。高品質ウイルス産物は、許容されるプロセス収率および不純物除去で、この開発されたプロセスを介して産生された。
【０１７３】
この明細書の全体にわたって引用される特許および出版はすべて、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、哺乳類細胞培養液から改良された純度のＶＳＶを得るための精製プロセス（黒いボックス中に概要が述べられる）を示すフローチャートである。
【図２】図２Ａは、２％ショ糖が加えられた溶出緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．０Ｍ  ＮａＣｌ）によるＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材での精製後のＶＳＶタンパク質の分離を示す、銀染色による電気泳動ゲルである。レーン１〜１０は、（１）前遠心分離（細胞培養）、（２）供給液、（３）フロースルーおよび洗浄液、（４）５％緩衝液Ｂ（画分１〜５）、（５）６０％緩衝液Ｂ（画分６〜７）、（６）６０％緩衝液Ｂ（画分８〜１０）、（７）６０％緩衝液Ｂ（画分１１〜２５）、（８）１００％緩衝液Ｂ（画分２６〜３５）、（９）カラム再生および（１０）バイオ・ラッド（登録商標）プレシジョン・プラス・プロテイン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（商標）スタンダードである。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑのための流速は直線状溶出勾配で３．５ｍｌ／分であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は４〜２０％トリス−グリシンゲルであり、タンパク質検出は銀染色によった。図２Ｂは、図２Ａの記述に従うＶＳＶタンパク質の分離を示す、ウエスタンブロットによる電気泳動ゲルである。ウエスタンブロット検出は、抗ＶＳＶポリクローナル抗体によった。
【図３】図３Ａは、ショ糖を加えない溶出緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．０ＭＮａＣｌ）によるＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材での精製後のＶＳＶタンパク質の分離を示す、銀染色およびウエスタンブロットによる電気泳動ゲルである。レーン１〜９は、（１）供給液、（２）フロースルーおよび洗浄、（３）５％緩衝液Ｂ（画分１〜５）、（４）６０％Ｂ（画分６〜１１）、（５）６０％緩衝液Ｂ（画分１２〜２５）、（６）１００％緩衝液Ｂ（画分２６〜３５）、（７）バイオ・ラッド（登録商標）プレシジョン・プラス・プロテイン（商標）スタンダード、（８）ＶＳＶスタンダード（すなわちショ糖勾配精製ＶＳＶ）および（９）カラム再生プール。Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑのための流速は、ステップ溶出勾配で３．５ｍｌ／分（１０ＣＶ／分）であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は４〜２０％トリス−グリシンゲルにより、タンパク質検出は銀染色によった。図３Ｂは、図３Ａ中で記載されるような、精製後のＶＳＶタンパク質の分離を示す、ウエスタンブロットによる電気泳動ゲルである。ウエスタンブロット検出は抗ＶＳＶポリクローナル抗体による。緩衝液Ｂ（「溶出緩衝液」とも呼ばれる）は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）および１Ｍ  ＮａＣｌであった。
【図４】図４Ａは、図１中で記載される精製プロセスの各工程でのＶＳＶの、銀＋コロイド染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（４〜２０％トリス−グリシンゲル）である。レーン１〜１２は、（１）前遠心分離、（２）後遠心分離（１°清澄化）、（３）０．２μｍ前濾過、（４）０．２μｍ後濾過（２°清澄化）、（５）Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材からのフロースルーおよび洗浄液のプール、（６）Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材からのＶＳＶ溶出画分プール、（７）ＴＦＦ  ＵＦ／ＤＦからのＶＳＶ未透過残留液、（８）濃縮物およびダイアフィルトレーションのプール、（９）０．２μｍ（最終）前濾過、（１０）０．２μｍ（最終）後濾過（ＶＳＶの精製バルク濃縮物）、（１１）バイオ・ラッド（登録商標）プレシジョン・プラス・プロテイン（商標）スタンダードおよび（１２）ＶＳＶ対照（稼動番号３、精製バルク濃縮物）である。図４Ｂは、図４Ａにおいて記載されるプロセスに従うＶＳＶの、ウエスタンブロットによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（４〜２０％トリス−グリシンゲル）である。
【図５】図５Ａは、図１において示されるプロセスに従って精製されたＶＳＶ対ショ糖勾配遠心法による精製ＶＳＶ（レーン１１）の、銀＋コロイド染色によるＶＳＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％トリスグリシンゲル）の比較である。レーン１〜１２は、（１）細胞培養液、（２）後遠心分離（１°清澄化）、（３）０．２μｍ前濾過、（４）０．２μｍ後濾過（２°清澄化）、（５）Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材からのフロースルーおよび洗浄のプール、（６）Ｍｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ膜吸着材からのＶＳＶ溶出画分、（７）ＴＦＦ  ＵＦ／ＤＦからのＶＳＶ未透過残留液、（８）０．２μｍ（最終）前濾過、（９）０．２μｍ（最終）後濾過（ＶＳＶの精製バルク濃縮物）、（１０）バイオ・ラッド（登録商標）プレシジョン・プラス・プロテイン（商標）スタンダード、（１１）ショ糖勾配による精製ＶＳＶ（レーン９の体積の２分の１のみが加えられる）および（１２）ＶＳＶ対照（稼動番号１、精製バルク濃縮物）。図５Ｂは、図１において示されるプロセスに従って精製されたＶＳＶ対図５Ａにおいて記載されているようなショ糖勾配遠心法により精製されたＶＳＶ（レーン１１）の、ウエスタンブロットによるＶＳＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％のトリス−グリシンゲル）比較である。
【図６】図６は、４回のスケールアップした稼動からの回収された％ＶＳＶ力価を示す棒グラフである（４．５Ｌの細胞培養体積）。ＣＲ番号１は実験稼動１であり、ＣＲ番号２は実験稼動２であり、ＣＲ番号３は実験稼動３であり、およびＴＴ  ０１は実験稼動４である。
【図７】図７は、ＶＳＶＩＮＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１コンストラクトについてのＭｕｓｔａｎｇ（商標）Ｑ精製工程での不純物タンパク質除去を示す棒グラフである。
【図８】図８Ａは、ｐＨ６．５でのＴＭＡＥ条件スクリーニングにおけるＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１回収を示す棒グラフである。図８Ｂは、ｐＨ７．０でのＴＭＡＥ条件スクリーニングにおけるＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１回収を示す棒グラフである。図８Ｃは、ｐＨ７．５でのＴＭＡＥ条件スクリーニングにおけるＶＳＶＮＪＮ４ＣＴ１−ｇａｇ１回収を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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