(57)【要約】  本発明は、低酸素状況下で活性なプロモーター配列の転写制御下のマイコバクテリアFAPタンパク質コード配列を含む組み換え型ベクターならびに上皮性腫瘍の予防および治療のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素状況下で活性であるプロモーター配列の転写制御下のマイコバクテリアFAPタンパク質コード配列を含むことを特徴とする、組み換え型ベクター。
【請求項２】
前記マイコバクテリアFAPタンパク質が、マイコバクテリウム ツベルクローシスAPAタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え型ベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが、マイコバクテリアのプロモーターであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の組み換え型ベクター。
【請求項４】
前記プロモーターが、hspXプロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載の組み換え型ベクター。
【請求項５】
前記プロモーターが、TB31.7プロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載の組み換え型ベクター。
【請求項６】
hspXプロモーターの転写制御下のマイコバクテリウム ツベルクローシス APAタンパク質コード配列を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換え型ベクター。
【請求項７】
TB31.7プロモーターの転写制御下のマイコバクテリウム ツベルクローシス APAタンパク質コード配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の組み換え型ベクター。
【請求項８】
プラスミドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み換え型ベクター。
【請求項９】
請求項１または請求項２で定義した、マイコバクテリアFAPタンパク質コード配列に機能的に作動可能に連結されている、請求項１、３、４および５のいずれか１項で定義した、低酸素状況下で活性であるプロモーター配列を含むポリヌクレオチド断片であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み換え型ベクター由来の発現カセット。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み換え型ベクターにより遺伝子的に改変されている宿主細胞。
【請求項１１】
遺伝子的に改変され、そのゲノム中に組み込まれている請求項９に記載の発現カセットを有する宿主細胞。
【請求項１２】
組み換え型マイコバクテリア株であることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
組み換え型マイコバクテリウム ボビスBCG株であることを特徴とする、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
マイコバクテリウム スメグマティス、マイコバクテリウム フォーツイタムおよびマイコバクテリウム ミクロティからなる群より選択されるマイコバクテリア由来であることを特徴とする、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
国立微生物培養コレクション 75724  パリ  セデックス15、リュー  デュ  ドクトール  ロア  25に2006年7月21日にI3659のアクセッション番号のもとに寄託され、プラスミドpYAPA2031で安定に形質転換された組み換え型マイコバクテリウム ボビスBCG株であることを特徴とする、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み換え型ベクターまたは請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞を適当量で、許容できる担体中に含むことを特徴とする、抗腫瘍組成物。
【請求項１７】
請求項１２〜１５のいずれか１項で定義した組み換え型マイコバクテリアを適当量含むことを特徴とする、請求項１６に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１８】
生菌の組み換え型マイコバクテリアを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項１９】
死菌の組み換え型マイコバクテリアを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項２０】
前記死菌の組み換え型マイコバクテリアが、長期凍結乾燥組み換え型マイコバクテリアであることを特徴とする、請求項１９に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項２１】
106と1010との間のCFUまたはCFU同等量の組み換え型マイコバクテリアを含むことを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項２２】
免疫刺激剤を含むことを特徴とする、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み換え型ベクターまたは請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞と、免疫刺激剤とを含む、抗腫瘍療法で同時に、別々にまたは逐次に用いられる組み合わせ製剤としての製品。
【請求項２４】
対象における腫瘍の予防または治療を意図する医薬品の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み換え型ベクターまたは請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２５】
前記医薬品が上皮性腫瘍の治療を意図することを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記腫瘍が、膀胱の移行上皮癌、肺癌、子宮頚癌および結腸癌からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２４または請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、請求項１４のマイコバクテリウム ボビスBCG株であることを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
改変宿主細胞の調製のための、請求項９に記載の発現カセットまたは請求項１〜８のいずれか１項に記載の組み換え型ベクターの使用。
【請求項２９】
前記改変宿主細胞が組み換え型マイコバクテリアであることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記発現カセットが前記組み換え型マイコバクテリアのゲノム中に組み込まれることを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素状況下で活性なプロモーターの転写制御下にマイコバクテリアFAPタンパク質を発現する組み換え型マイコバクテリウム株ならびに上皮性腫瘍の予防および治療のためのその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は、男性において五大癌の1つであり、かつ女性よりも3〜4倍多く頻発する。これらの癌の80 ％以上は、表在性移行上皮癌である。今日、カルメット-ゲラン菌（bacillus Calmette-Guerin）（BCG）での膀胱内免疫療法は、膀胱の表在性移行上皮癌の治療および予防についての参照である；それは、表在性腫瘍の再発予防および経尿道の腫瘍切除後の膀胱の残存腫瘍の治療のための最も効果的な療法である（Lammら, N. Engl. J. Med., 1991, 325, 1205-）。
【０００３】
BCGの抗腫瘍効果は確立したものである一方、それが生じるメカニズムは、ほとんど明確ではない。いくつかの研究により、BCGの抗腫瘍効果において、BCGに対する細胞により媒介される免疫応答が決定的な役割を果たすことが示唆される。同時に、他の研究により、BCGの直接の抗腫瘍効果が明らかにされる。BCGの臨床的抗腫瘍活性についてのこれら2つの可能性のあるメカニズムの相互の貢献は、未知のままである。
【０００４】
膀胱へのBCGの点滴注入は、複合炎症応答を誘発し、その間にリンパ球および種々のサイトカインが尿中へ放出される。尿路上皮の間質（suburothelial stroma）において形成される局所肉芽腫が、癌細胞の制御において重要な役割を果たすことが提唱されている（Alexandroffら, The Lancet, 1999, 353, 1689-1694）。NK細胞がこの制御の一部を媒介するとの仮説が立てられてきた。異なるサイトカイン（IL-2、IL-12、IL-18およびインターフェロンα）の産生は、BCG療法後に過剰になり、そしてNK細胞を活性化し得る（Suttmannら, The Journal of Urology, 2004, 172, 1490-1495）。しかしながら、何人かの患者において観察された激しい免疫応答は、疾患のより良い制御とは相関しなかった。そして、癌細胞の増殖制御を可能にする免疫学的メカニズムは、未だ不明確である。
【０００５】
多数の研究により、BCGはヒト尿路上皮癌細胞に対する直接の抗増殖効果を発揮することが証明される。マイコバクテリア フィブロネクチン付着タンパク質（FAP）ファミリーの、アラニンおよびプロリンが豊富な分泌タンパク質APA（FAP-B、抗原MPT-32、45-kDa糖タンパク質、または45/47-kDa抗原とも名付けられる）は、膀胱上皮細胞へのインビボでのBCGの付着およびBCG誘導性抗腫瘍活性の仲介に必要なタンパク質である（Zhaoら, Int. J. Cancer, 2000, 86, 83-88）。マイコバクテリアFAPタンパク質は、独特の様式でフィブロネクチンに結合する、高い相同性を有するタンパク質のファミリーを構成する。マイコバクテリウム レプレ（M. leprae）（FAP-L）、マイコバクテリウム アビウム（M. avium）（FAP-A）、マイコバクテリウム ボビス（M. bovis）BCG（FAP-B；GenBankアクセッション番号AF013569）、マイコバクテリウム スメグマティス（M. smegmatis）(FAP-S) およびマイコバクテリウム ツベルクローシス（M. tuberculosis）（APA、抗原MPT-32、45-kDa糖タンパク質、または45/47-kDa抗原；EMBLアクセッション番号X80268）を含む、少なくとも5種のマイコバクテリアからのFAPタンパク質がクローン化され、かつ特徴決定がされた。フィブロネクチン結合領域（FAP-Aの269位〜292位）は、フィブロネクチン結合機能に必要な保存されたRWFVテトラペプチド（FAP-Aの273位〜276位）を含む。最小限の結合配列は、269位〜280位の12アミノ酸ペプチド（FAP-Aの269位〜280位；Zhaoら, The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274, 4521-4526）である。APAタンパク質は、フィブロネクチンのブリッジを介して、BCGを細胞表面インテグリンに連結させるオプソニンとして機能する。尿路上皮細胞上の主要なFAP受容体である、尿路上皮癌腫の表面のα5β1インテグリンへのFAP介在性BCG接着は、NF-κBおよびAP-1を必要とするシグナル伝達および遺伝子転写活性経路を誘導する。アポトーシスよりはむしろ、G1期／S期の境界における細胞周期の停止が、BCGの抗増殖効果に寄与するメカニズムであるとして報告された（Chenら, BMC Urology, 2005, 5:8）。
【０００６】
しかしながら、膀胱癌のためのBCGの使用は、効力および毒性の両方の点から不利益がある。第1に、BCGへの応答が予測できず、かつ直線的でない。結果として、患者の30％がBCG難治性であり、そして現在は、治療の成功または失敗を正確に予測する、信頼できる予後因子がない。さらに、BCGへの応答の長期持続性は限られており、そして維持使用（3〜6ヵ月ごとに3週間の治療）または36ヶ月までの間のブースター治療（月に1度）が、膀胱癌の再発を減少させるのに必要である。
【０００７】
第2に、BCGは副作用がある。大抵の患者は、頻発で緊急の排尿障害および時折の血尿を含む膀胱炎の局所症状を経験する。高熱、倦怠感、および一過性のインフルエンザ様疾患の軽度の全身性症状もよく見られる。重篤な副作用は、患者の5％に起こり、その内おおむね10％が明白なBCG敗血症を伴う（Alexandroffら、前記引用）。
【０００８】
組み換え型マイコバクテリア技術の最近の進歩は、膀胱癌の免疫治療の新しい視野を開いた。いくつかのアプローチにより、既存のBCGよりも毒性が低く、かつ／またはより効果的なBCG組み換え型代替物の作製が提案されてきた（Alexandroffら、前記引用）：
‐インターロイキン2、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子アルファのような興味対象のヒトサイトカインを発現する組み換え型BCG；この組み換え型BCGは、より免疫を強める効力があり、それによりBCGの低用量の使用を導き、かつ全身性のBCG感染の機会を最小限にすることが可能であろうと期待されている、
‐毒性のより低い、または自殺遺伝子もしくは従来の抗結核薬より低毒性でより効果のある抗菌薬への感受性を組み込んだBCG組み換え型株；これら組換え型BCGは、副作用がより少ないであろうと期待されている。
さらに、マイコバクテリウム スメグマティスのような、マイコバクテリアの非病原性株の使用が提案されてきた。
【０００９】
しかしながら、今日まで、これらのアプローチにより、BCG免疫治療を代替するものは提供されていない。この流れにおいて、本発明はなされた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
尿中の酸素分圧（PO2）が低いこと（Leonhardtら, New Engl. J. Med., 1963, 269, 115-121）、すなわち、癌細胞が増殖している膀胱上皮の表面の局所PO2を知ることにより、本発明者らは、低酸素状況下でAPAタンパク質を過剰発現する組み換え型BCG（BCG Apa++）を作製した。この構築物において、APAオープンリーディングフレームの発現は、マイコバクテリアのα-クリスタリン プロモーターの働きによる。α-クリスタリンは、酸素制限状況への移行の後に、インビトロにおいてマイコバクテリウム ツベルクローシスの後期対数期および定常期の間に特異的に合成され、インビボにおいてマイコバクテリウム ツベルクローシスの長期生存に役割を果たし得るタンパク質である（Yuanら, J. Bacteriol., 1996, 178, 4484-4492）。インビボでのBCG Apa++の投与は、膀胱のような酸素分圧の低い組織において、APAタンパク質の過剰発現を導く（Leonhardtら, N. England J. Medecine, 1963, 269, 115-121）。結果として、BCG Apa++は、インビトロおよびインビボの両方において、ヒト膀胱癌細胞の増殖の制御について野生型BCGよりも活性がある。さらに、BCG Apa++は、アポトーシス経路の有力なアクチベーターである。この組み換え型BCGは、BCGの投与量を低くし、そしてBCG免疫療法に関連する副作用を最小限にするであろう。
【００１１】
それゆえ、本発明は、低酸素状況下で活性であるプロモーター配列の転写制御下のマイコバクテリアFAPタンパク質コード配列を含む組み換え型ベクターに関する。
【００１２】
定義
「ベクター」とは、連結された別の核酸を宿主細胞に送達できる核酸分子を意味する。
「発現ベクター」とは、クローン化されたポリヌクレオチドの発現を指向することができるベクターを意味する。
「プロモーター配列」とは、RNAポリメラーゼがポリヌクレオチドの転写を開始することを可能にするのに必要な核酸配列を意味する。前記プロモーターは、転写を増強または抑制する働きをする調節配列（エンハンサー、リプレッサー）も含み得る。
「転写制御」とは、マイコバクテリアFAPタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、機能的に作動可能に、すなわち、組み換え型発現ベクターにより改変された宿主細胞内で、前記ポリヌクレオチドの転写およびそれに対応するタンパク質の翻訳を生じ得る位置にてプロモーターに連結されることを意味する。
【００１３】
「低酸素」とは、通常の技術、例えば、ポーラログラフ電極を用いて測定されるような酸素分圧が30 mm Hg未満であることを意味する。
「マイコバクテリアFAPタンパク質」とは、マイコバクテリア ツベルクローシスのapa遺伝子（EMBLアクセッション番号X80268；配列番号11；1082位〜2059位からのAPA CDS）、または例えばマイコバクテリウム ボビスのFAP-B遺伝子（GenBank AF013569）を含む、他のマイコバクテリア種からのそのホモログによりコードされるタンパク質を意味する。 マイコバクテリア ツベルクローシスのapa遺伝子は、modD、mpt 32またはRv1860遺伝子とも名付けられる。APAタンパク質アミノ酸配列は、SwissProt アクセッション番号Q50906（配列番号12）に相当する。
【００１４】
「acr遺伝子」または「hspX遺伝子」とは、アルファ-クリスタリン熱ショックタンパク質ホモログHSPX（14 kDa抗原；HSP16.3）をコードする遺伝子を意味する。マイコバクテリウム ツベルクローシスH37Rv配列（アクセッション番号NC_000962.2）を参照にして、 hspX遺伝子（遺伝子ID：887579；遺伝子座タグRv2031c）は、DNAマイナス鎖上の2278498位〜2278932位に相当する。マイコバクテリウム ツベルクローシスのhspX遺伝子 はまた、GenBankアクセッション番号S79751に相当する。マイコバクテリウム ボビスAF2122/97配列（アクセッション番号NC_002945）への参照により、hspX遺伝子（遺伝子ID： 1094114；遺伝子座タグMb2057c）は、DNAマイナス鎖上の2262845位〜2262411位に相当し、配列番号3および配列番号4のプライマー対で増幅できるプロモーター領域（配列番号13)は、DNAマイナス鎖上の2263059位と2262846位との間に含まれる。マイコバクテリウム ボビスBCG株パスツール1173P2（アクセッション番号NC_008769）を参照にして、hspX遺伝子（遺伝子ID：4696845；遺伝子座タグBCG_2050c）は、DNAマイナス鎖上の2262150位〜2262584位に相当する。hspXのプロモーター領域は、配列番号3および配列番号4のプライマー対で増幅できる、全てのhspXマイコバクテリア ホモログ遺伝子のプロモーター領域を含む。
【００１５】
「FAPコード配列」とは、FAP遺伝子、完全長FAPオープンリーディングフレーム（ORF）に対応するFAPタンパク質コード配列（CDS）、または機能的FAPタンパク質に相当する切形（truncated）CDSを意味する。例えば、FAPタンパク質のN末端シグナル配列に対応する、FAPオープンリーディングフレームの5'末端が削除された配列である。
「機能的FAPタンパク質」とは、フィブロネクチンへの結合、細胞増殖の阻害およびアポトーシスの誘導が可能であるタンパク質を意味する。機能的FAPタンパク質は、FAPタンパク質断片またはFAPタンパク質配列中に1つ以上の変異（1つ以上のアミノ酸の挿入、削除、置換）を有するFAPタンパク質変異体であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、BCGのゲノム中に組み込まれた、hspXプロモーター（pYAPA2031プラスミド由来）の転写制御下のAPAコード配列を含む組み換え型株BCG Apa++の構築物を示す。
【図２】図２は、プラスミドpYUB295のマップである。
【図３】図３は、BCGまたはBCG Apa++によるT24ヒト膀胱癌細胞の成長の阻害を示す。細胞を、5.106個のBCG（典型的BCG）、BCG Apa++もしくはBCG Apa-桿菌の存在下、または細菌の非存在下（対照）で24時間または48時間培養した。細胞を回収し、そして生細胞をトリパンブルー排除アッセイにより計数した。データは、平均値±s.e.m.（n=5）として示した。
【図４】図４は、BCGまたはBCG Apa++によるT24ヒト膀胱癌細胞の生存能の阻害を示す。細胞を、5.106個もしくは107個のBCG（典型的BCG）、BCG Apa++もしくはBCG Apa-桿菌（それぞれ、細胞1個当たり5個（BCG 5/1）および10個（10/1）の桿菌に等しい）の存在下または細菌の非存在下（対照）で48時間培養した。細胞を回収し、そして生存能をMTTアッセイにより評価した。データは、平均値±s.e.m.（n=5）として示される。
【図５】図５は、BCGまたはBCG Apa++によるT24ヒト膀胱癌細胞の増殖の阻害を示す。細胞を、5.105個のBCGもしくはBCG Apa++桿菌（細胞1個当たり10個の桿菌）の存在下、または細菌の非存在下（対照）で異なる時間（12時間、24時間、36時間または48時間）培養し、そしてDNA合成をBrdU取り込みアッセイにより評価した。データは、平均値±s.e.m.（n=5）として示される。
【図６】図６は、FGF1で処理したT24ヒト膀胱癌細胞におけるBCGまたはBCG Apa++によるFGR-3二量体化の阻害を示す。細胞を、106 CFU/ml（1ml当たりのコロニー形成ユニット）のBCG（A）もしくはBCG Apa++（B）桿菌の存在下または細菌の非存在下で48時間インキュベートし、4℃で15分間冷却し、FGF-1（50 ng/ml）の存在下（+）または非存在下（-）に4℃で2時間インキュベートした。ビス-（スルホスクシンイミジル）-スベレートおよびジスクシンイミジル-スベレートで共有結合の架橋をした後、該細胞を溶解し、抗FGTR-3 C末端抗体で免疫沈降し、そして免疫ブロットをFGFR-3の細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体で検出した。値は、単量体（〜120 kDa）および二量体（〜250 kDa）の密度の合計と比較した二量体について得られた密度を示す。
【図７】図７は、FGF1で処理したRT112ヒト膀胱癌細胞におけるBCGまたはBCG Apa++によるFGR-3二量体化の阻害を示す。細胞を、106 CFU/mlのBCG（「典型的BCG」）もしくはBCG Apa++の存在下または細菌の非存在下（未処理）で48時間インキュベートし、4℃で15分間冷却し、そしてFGF-1（50 ng/ml）の存在下（+）または非存在下（-）に4℃で2時間インキュベートした。ビス-（スルホスクシンイミジル）-スベレートおよびジスクシンイミジル-スベレートで共有結合の架橋をした後、該細胞を溶解し、抗FGTR-3 C末端抗体で免疫沈降し、そして免疫ブロットをFGFR-3の細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体で検出した。値は、単量体（〜120 kDa）および二量体（〜250 kDa）の密度の合計と比較した二量体について得られた密度を示す。
【図８】図８は、EGFで処理したT24ヒト膀胱癌細胞におけるBCGまたはBCG Apa++によるMAPK経路の刺激を示す。細胞を、106 CFU/mlのBCGもしくはBCG Apa++の存在下または細菌の非存在下（対照／未処理）で48時間インキュベートし、そしてEGF（100 ng/ml）の存在下（+）または非存在下（-）で15分間インキュベートし、そして溶解した。リン酸化分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼp42/44（pMAPK）の存在を、ELISAにより測定した。A．データは、1ウェルごとに示した。B．データは、平均値±s.e.m.として示した。
【図９】図９は、EGFで処理したT24ヒト膀胱癌細胞におけるBCGまたはBCG Apa++によるAkt1-2経路の刺激を示す。細胞を、106 CFU/mlのBCGもしくはBCG Apa++桿菌の存在下または細菌の非存在下で48時間インキュベートし、そしてEGF（100 ng/ml）の存在下（+）または非存在下（-）で15分間インキュベートし、そして溶解した。リン酸化Akt 1-2の存在を、ELISAにより測定した。A．データは、1ウェルごとに示した。B．データは、平均値±s.e.m.として示した。
【図１０】図１０は、Bcl-2、Bid、BakおよびBaxのmRNA発現レベルにより評価した、T24およびRT112ヒト膀胱癌細胞におけるBCGまたはBCG Apa++によるアポトーシス経路の誘導を示す。細胞を、5.106 CFUのBCGもしくはBCG Apa++の存在下または細菌の非存在下（対照）で24時間インキュベートした。mRNAを抽出し、そしてBcl-2、Bid、BakおよびBaxのmRNA発現レベルをRNAse保護アッセイにより解析した。
【図１１】図１１は、カスパーゼ-8活性により評価した、T24ヒト膀胱癌細胞におけるBCGまたはBCG Apa++によるアポトーシス経路の誘導を示す。T24細胞を、BCGもしくはBCG Apa++の存在下または細菌の非存在下（対照）で6時間、12時間、24時間、36時間または48時間インキュベートした。カスパーゼ-8活性を、比色アッセイを用いて細胞溶解物について測定した。リボソームタンパク質L-32のmRNAを対照として用いた。データは、n=8について平均値±s.e.mとして表した。36時間後または48時間後のBCGとBCG Apa++との間の差は有意（p < 0.05）であった。
【図１２】図１２は、カスパーゼ-9活性解析により評価した、T24ヒト膀胱癌細胞におけるBCGまたはBCG Apa++によるアポトーシス経路の誘導を示す。T24細胞を、BCGもしくはBCG Apa++の存在下または細菌の非存在下（対照）で6時間、12時間、24時間、36時間または48時間インキュベートした。カスパーゼ-9を、比色アッセイを用いて細胞溶解物で測定した。リボソームタンパク質L-32のmRNAを対照として用いた。データは、n=8について平均値±s.e.mとして表した。36時間後または48時間後のBCGとBCG Apa++との間の差は有意（p < 0.05）であった。
【図１３】図１３は、BBN誘導性膀胱腫瘍の発生およびその後のBCGによる腫瘍治療のプロトコールを示す。ラットに、0.05％ N-ブチル-N-（4-ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN）を0.05 %含む飲用水を19週間与えた。BBN処理の終点の1週間後（第20週）に、該ラットにPBS単独、または108 CFU/mlのBCGもしくはBCG Apa++を含むPBSの膀胱内点滴注入（0.5 ml）を週に1回で6週間行った。
【図１４】図１４は、BCGによる血尿の阻害を示す。19週間の飲用水によるBBN投与の後に発達した膀胱腫瘍を有するラットに、（第20週から）週に1回で6週間、PBS単独（PBS処理）、または108 CFU/mlのBCG（BCG処理）もしくはBCG Apa++（BCG APA++処理）を含むPBSの膀胱内点滴注入（0.5 ml）を行った。正常な飲用水を19週間与えられ、かつ30週間未処理で維持されたラットを、正常な対照として用いた。第30週において尿を回収し、そしてそれらのヘモグロビン含量を、比色アッセイを用いて測定した。
【図１５】図１５は、インビボでのBCG Apa++の抗腫瘍効果を示す。19週間の飲用水によるBBN投与の後に発達した膀胱腫瘍を有するラットに、（第20週から）週に1回で6週間、PBS単独または108 CFU/mlのBCG Apa++（BCG APA++）を含むPBSの膀胱内点滴注入（0.5 ml）を行った。ラットを第30週（最後のBCG治療の1ヵ月後）に安楽死させ、膀胱を回収し、そして臨床検査（肉眼観察）をした。左パネル：BBNを与えられ、かつPBSで処理したラットから回収した膀胱。右パネル：BBNを与えられ、かつBCG Apa++で処理したラットから回収した膀胱。
【図１６】図１６は、週に1回で6週間のPBS単独、または108 CFU/mlのBCGワクチンもしくはBCG Apa++を含むPBSの膀胱内点滴注入（0.5 ml）を行ったラットからのBBN誘導性膀胱腫瘍の細胞の核内における野生型p53の活性化を示す。ラットを第30週（最後のBCG治療の1ヵ月後）に安楽死させ、そして活性化した野生型p53を酵素免疫測定アッセイ（Enzyme Immunometric Assay）で測定した。A．データは、1ウェルごとに示した。B．データは、平均値±s.e.m.として示した。
【図１７】図１７は、異なる癌カスケードに関連し、かつ6つのグループ（表II）に分類される113個の遺伝子の特定のcDNA断片を用いるマイクロアレイにより解析した、BCG、BCG Apa++、BCG Apa-で処理したか、または細菌で処理していないT24細胞のトランスクリプトームを示す。図は、表Iに示された定量的データから導いた。データは、平均値±s.e.mとして示される（n=3）。転写ユニットを、実施例６に示したように標準化した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第1の実施形態において、本発明は、前記マイコバクテリアFAPタンパク質がマイコバクテリウム ツベルクローシスFAPタンパク質（マイコバクテリウム ツベルクローシスAPAタンパク質）である組み換え型ベクターを特徴とする。
第2の実施形態において、本発明は、プロモーターが低酸素状況において活性であるマイコバクテリア プロモーターである組み換え型ベクターを特徴とする。そのようなプロモーターの例は、Florczykら, Infect. Immun., 2001, 69, 5777-5785およびFlorczykら, Infect. Immun., 2003, 71, 5332-5343に記載される。前記プロモーターとしては、本明細書中のものが有利に使用され得る（定義の章、hspX遺伝子を参照されたい）；別のプロモーターも有利に使用され得る：TB31.7遺伝子のプロモーターに相当する。該プロモーター配列は、Florczykら（Infect. Immun., 2003, 前記引用）の表１に記載されたものに由来する、5'末端にそれぞれBamHIおよびNcoIの制限サイトを付加した、配列番号5および配列番号6のプライマー対で増幅され得る。
【００１８】
マイコバクテリウム ツベルクローシスのTB31.7遺伝子は、遺伝子座タグ：Rv2623；遺伝子ID：887442；gi2104288に相当する。アクセッション番号BX842580（マイコバクテリウム ツベルクローシスH37Rv完全ゲノム；セグメント9/13）を参照にして、TB31.7/Rv2623 プロモーター領域（配列番号14）は、176190位と176560位との間に含まれる。
【００１９】
マイコバクテリウム ボビスBCG株パスツール1173P2（アクセッション番号NC_008769）を参照にして、TB31.7遺伝子（遺伝子座タグBCG_2650）は、DNAマイナス鎖上の1459592位〜1460485位に相当する。TB31.7遺伝子のプロモーター領域は、配列番号5および配列番号6のプライマー対で増幅できる、全てのTB31.7マイコバクテリア ホモログ遺伝子のプロモーター領域を含む。
【００２０】
好ましくは、マイコバクテリアプロモーターは、acr遺伝子のプロモーター（hspXプロモーター）である；マイコバクテリアacr遺伝子によりコードされるアルファ-クリスタリン熱ショックタンパク質ホモログHSPX（14 kDa抗原；HSP16.3）の発現は、低酸素状況下で非常に高いレベルまで特異的に誘導される。
より好ましくは、ベクターは、hspXプロモーターの転写制御下にあるマイコバクテリウム ツベルクローシスAPAタンパク質コード配列を含む。
【００２１】
本発明によるベクターは、YAC（酵母人工染色体）、BAC (細菌人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、ウィルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成核酸からなり得る直鎖状または環状のDNAもしくはRNA分子を含むが、これらに限定されない。好ましいベクターは、連結した核酸の自律複製および／または発現が可能であるものである。好ましいベクターの1つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外での複製が可能な核酸である。一般に、DNA組み換え技術において有用性のある発現ベクターはしばしば、環状二本鎖のDNAの輪「プラスミド」の形態をとり、これらはベクター形態では染色体に組み込まれない。多数の適当なベクターが、当業者に知られている。
【００２２】
本発明によるベクターは、FAPタンパク質を産生または合成を可能にする適切な転写および翻訳制御要素の制御下に、前記タンパク質をコードする配列が置かれた発現カセットを含む。より詳しくは、該ベクターは：
‐ORF挿入のための、プロモーター領域の下流に位置するクローニングサイト。ORFのATG開始コドンおよび／または終止コドンを、タンパク質コード配列をインフレームでベクターに挿入可能にするための制限サイトに含み得る。任意に、該ベクターは、いずれのインサートでもベクター中のいずれの読み枠にインフレームでベクター中にクローン化可能にする複数の隣接するクローニングサイトを含む、マルチクローニングサイトを含み得る（融合タンパク質）。例えば、ORFの5'または3'末端に、タグをコードする配列を融合することができる。該タグは、発現タンパク質の精製（ポリヒスチジン配列）または検出（Bエピトープ、蛍光タンパク質）のために使用され得る。任意に、ORFの5'または3'末端およびタグをコードする配列は、該タグを取り外し可能にするプロテアーゼ／エンドペプチダーゼ配列のための切断サイトで隔てられる、
‐組み換え型バクテリアを選択するための、少なくとも1つの選択可能なマーカー、例えば、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性遺伝子（テトラサイクリン、リファンピシン、アンピシリン、カナマイシン耐性）または水銀耐性遺伝子、
‐ORFの下流の、転写終結信号（ターミネーター）；宿主からのRNAポリメラーゼに、プロモーターにより生ずる転写産物の転写を終結させるため、
‐宿主中で該ベクターを維持するための、少なくとも1つの複製起点
を含む、当該技術において公知の付加的特徴を含み得る。
【００２３】
第4の実施形態において、本発明は、プラスミド（二本鎖の環状DNA）であるベクターを特徴とする。好ましくは、前記プラスミドが、バクテリアの複製起点および抗生物質耐性遺伝子を含む。特に、本発明は、hspXプロモーターの転写制御下のマイコバクテリウム ツベルクローシスAPAタンパク質コード配列がpYUB295プラスミドのEcoRVサイト中に挿入され、pYAPA2031と名付けられたプラスミドを特徴とする（Dussurgetら, Infect. Immun., 2001, 69, 529-533; Gomezら, Mol. Microbiol., 1998, 29, 617-628）。
【００２４】
本発明はまた、上記で定義したように、マイコバクテリアFAPタンパク質コード配列に機能的に作動可能に連結された、低酸素状況下で活性であるプロモーター配列を含むポリヌクレオチド断片からなる、本発明による組み換え型ベクター由来の発現カセットに関する。発現カセットの例は、配列番号18および配列番号19であり、ここでは、マイコバクテリウム ツベルクローシスAPAタンパク質コード配列（配列番号15）がそれぞれ、マイコバクテリウム ボビスAF2122/97 hspX/acrプロモーター（配列番号16）およびマイコバクテリウム ツベルクローシスTB31.7/Rv2623プロモーター（配列番号17）の制御下にある。前記発現カセットは、上記で定義した付加的特徴（クローニングサイト、タグ、下流の終結信号）をさらに含み得る。
【００２５】
本発明はまた、上記で定義した組み換え型ベクターにより遺伝子的に改変されている宿主細胞（組み換え型細胞）に関連する。
特に、本発明は、細菌、好ましくは上記で定義した組み換え型ベクターにより形質転換されたマイコバクテリアに関連する。
好ましいマイコバクテリアは、マイコバクテリウム ボビスBCG株のような結核菌群、例えば、パスツールBCG株を含む。他の好ましいマイコバクテリアは、例えば、マイコバクテリウム スメグマティス、マイコバクテリウム フォーツイタム（Mycobacterium fortuitum）およびマイコバクテリウム ミクロティ（Mycobacterium microti）のような早く成長し、かつヒトに対して非病原性であるものである。
【００２６】
特に、本発明は、プラスミドpYAPA2031で安定に形質転換され、国立微生物培養コレクション (the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) 75724  パリ  セデックス15、リュー  デュ  ドクトール  ロア  25（25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に2006年7月21日にI3659のアクセッション番号のもとに寄託され、以下、BCG Apa++として名付けられる組み換え型マイコバクテリウム ボビスBCG株を特徴とする。
【００２７】
本発明はまた、上記で定義した組み換え型ベクターまたは宿主細胞を適当量で、安定剤、緩衝液などのような許容できる担体中に含む抗腫瘍組成物に関連する。
本発明による該組成物は、生菌の、または死菌のベクター／細胞を含み得る。死菌のベクター／細胞の組成物は、当業者に知られたいずれの手段により調製される。
【００２８】
医薬組成物または製剤は、対象への、例えば、哺乳類への、特にヒトへの投与に適する形態（経口、局所、注射または吸入による）を参照する。適当な形態は特に、使用または侵入経路に依存する。好ましい製剤は、局所投与用であり、より好ましくは、膀胱内用、膣内用、直腸投与用、または吸入用である。
【００２９】
医薬的有効量は、疾患または状態の発生を予防し、阻害するもしくは治療する（1つの症状、好ましくは全ての症状をある程度緩和する）のに要求される量である。ベクター／宿主細胞の医薬的有効量は、医療分野の当業者に認識されるような、用いた組成物、投与経路、治療中の哺乳類のタイプ、検討中の特定の哺乳類の身体的特徴、併用薬物、及びその他因子に依存する。一般に、組み換え型マイコバクテリアのヒトに対する有効量は、106と1010との間のCFU（コロニー形成ユニット）またはCFU同等量である。
【００３０】
好ましくは、腫瘍は上皮性腫瘍である。より好ましくは、腫瘍は表在性腫瘍である。特に、腫瘍は、膀胱または肺の移行上皮癌、結腸癌または子宮頚癌である。
【００３１】
第1の実施形態において、本発明による抗腫瘍組成物は、上記で定義した組み換え型マイコバクテリア株、特にBCG Apa++株を含む。
好ましくは、該組み換え型マイコバクテリア株は死菌、より好ましくは、長期（extended）凍結乾燥による死菌である。長期凍結乾燥マイコバクテリア株の調製方法は、PCT国際出願WO第03049752号に記載される。
【００３２】
第2の実施形態において、本発明による抗腫瘍組成物は、免疫刺激剤をさらに含む。
本発明はまた、対象における腫瘍の予防または治療を意図した医薬品の製造のための、上記で定義した組み換え型ベクターまたは宿主細胞の使用に関連する。
本発明はまた、上記で定義した組み換え型ベクターまたは宿主細胞、および免疫刺激剤を含む、抗腫瘍療法で同時に、別々に、または逐次に用いられる組み合わせ製剤としての製品に関連する。
【００３３】
本発明はまた、いずれの適切な手段により、上記で定義した、有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における腫瘍を予防または治療する方法に関連する。特に、該組成物は、膀胱内、膣内、直腸に、または吸入により投与され、そして本発明による組み換え型マイコバクテリアを106と1010との間のCFU（コロニー形成ユニット）またはCFU同等量含む。
【００３４】
本発明はまた、改変宿主細胞、好ましくは発現カセットが組み換え型マイコバクテリアのゲノム中に組み込まれている組み換え型マイコバクテリア株の調製のための、上記で定義した発現カセットまたは組み換え型ベクターの使用に関連する。
本発明はまた、遺伝子的に改変され、かつ上記で定義した発現カセットがそのゲノム中に組み込まれている宿主細胞に関連する。
本発明の実行は、そうでないと記載しない限り、当該技術における微生物学、分子生物学および免疫生物学の従来の方法を採用する。そのような技術は、文献において十分に説明される。
【００３５】
本発明による組み換え型ベクターは：Current Protocols in Molecular Biology（Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA）および Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第3版,（Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されるような標準的手順に従う、典型的方法を用いる公知のDNA組み換えおよび遺伝子工学的技術により構築され、宿主細胞に導入される。
【００３６】
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明によるBCG組み換え型株およびその使用を説明する実施例、および添付図面を参照する下記から明らかになる他の特徴をさらに含む。
【実施例】
【００３７】
実施例１：アルファ-クリスタリン プロモーターの制御下にAPAタンパク質を過剰発現する組み換え型BCG（BCG Apa++）の構築
細菌が低酸素下にある場合に、APA分子を産生できる組み換え型BCGを構築するために、適切な配列を含むプラスミドを作製した。このプラスミドは、hspX（GenBankアクセッション番号S79751；Yuanら, J. Bacteriol., 1996, 178, 4484-4492；Florczykら, Infect. Immun., 2001, 69, 5777-5785およびFlorczykら, Infect. Immun., 2003, 71, 5332-5343）の転写制御下にクローン化された、APAタンパク質をコードするマイコバクテリウム ツベルクローシスのapa遺伝子（EMBLアクセッション番号X80268およびLaqueyrieら, Infection and Immunity, 1995, 63, 4003-4010）、およびaph遺伝子（カナマイシン耐性）を含む。そして、野生型BCG 1173P2パスツール株の細菌に電気穿孔により該プラスミドを導入し、そしてAPAを過剰発現する組み換え型BCG（BCG Apa++）を、カナマイシンを含むソートン培地中で単離した（図１）。
【００３８】
マイコバクテリウム ツベルクローシスAPAコード配列をpLA34-2からのPCRにより増幅した（Laqueyrerieら, Infect. Immun. 1995, 63, 4003-4010）。NcoI-BamHI PCR産物をpQE60発現ベクター（QIAGEN；（Hornら, J. Biol. Chem., 1999, 274, 32023-32030））中へサブクローニングするために、フォワードプライマー（5'-catgccatggtacaggtggaccccaacttgaca-3'：配列番号1）を介してNcoIサイトおよびリバース配列（5'-ttaggatccggccggtaaggtccgctgcggtgt-3'：配列番号2）中にBamHIサイトを作出するように、apa遺伝子配列を改変した。
【００３９】
BamHI およびNcoI の粘着末端を有する2つの誘導可能なBCGプロモーターを、アルファ-クリスタリン（acr）プロモーターについてのプライマーBamhspX R（5'-ttaggatccgtccggcatgatcaacctcc-3'：配列番号3）およびNcohspX F（5'-catgccatggggtggccatttgatgcctcc-3'：配列番号4）ならびにRv2623プロモーター（Florczyk ら, 2001および2003, 前記引用）についてのプライマーBamRv2623 F（5'-ttaggatccgggccatggactggtcgtcg-3'：配列番号5）およびNcoRV2623 R（5'-catgccatggacatcgcggtcctcctgtcg-3'：配列番号6）を用いて、パスツール マイコバクテリウム ボビスBCG DNAに行うPCRにより作製した。
【００４０】
これらの断片をT4ライゲーションし、そして2回のクレノウ処理の後に、acr-apaまたはRv2623-apaカセットを、EcoRVで制限されたプラスミドpYUB295に挿入した（Dussurgetら, Infect Immun., 2001, 69, 529-533；Gomezら, Mol. Microbiol. 1998, 29, 617-628；図２）。この挿入により、約5.5 kbpのプラスミドのpYAPA2031およびpYAPA2623が作出された。大腸菌（XL-1 Blue）中での増幅およびテトラサイクリン感受性レプリカ平板培養の後、感受性クローンを選択した。該プラスミドを精製し、そして電気穿孔によりBCGへ導入した。それらはBCG内では複製しないが、マイコバクテリア染色体のattBサイトでの高効率のプラスミド組み込みを指向する、マイコバクテリオファージL5の付着サイト（attP）およびインテクラーゼ遺伝子（int）を含む（Leeら, Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 29, 3111-3115）。
【００４１】
特に、本発明は、国立微生物培養コレクション、75724  パリ  セデックス15、リュー  デュ  ドクトール  ロア  25に2006年7月21日にI3659のアクセッション番号のもとに寄託され、以下においてBCG Apa++と名付けられる、プラスミドpYAPA2031で安定に形質転換された組み換え型マイコバクテリウム ボビスBCG株を特徴とする。
【００４２】
低酸素液体培養物を、酸素分圧を制御可能なインキュベーターに入れた通気孔付きキャップの組織培養用フラスコ（25 cm2 Corning）内で成長させた。通気孔付きキャップの組織培養用フラスコは、フラスコとインキュベーターでの制御された環境との間の気体の交換ができた。酸素レベルを、調製された気体混合物（Carboxique）をインキュベーター内に注入することにより維持した。低酸素培養物を、全O2が1.3 %の雰囲気下で成長させた。高酸素培養物を、周囲空気下の密閉したキャップの25 cm2組織培養用フラスコ内で成長させた。必要な場合に、カナマイシンを25μg/mlで用いた。
過剰発現を、マイコバクテリウム ボビスBCG APAに対するウサギポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット法により確認した（Laqueyrerieら, Hornら, 前記引用）。
【００４３】
実施例2：BCG apa-変異体（BCG Apa-）の構築
BCG apa遺伝子を対立遺伝子交換により変異した（Pelicicら, Proc. Natl. Sci. USA, 1997, 94, 10955-10960）。1000 bpのapaフランキング配列を含む2つのDNA断片を、上流断片（U）用プライマーSma15up（5-tcccccgggggtgttgacccgacac-3；配列番号7）およびPst23up（5-aactgcagggcgaagaacctacc-3；配列番号8）ならびに下流断片（D）用プライマーPst35down（5-aactgcagccaagtgatacccct-3；配列番号9）およびHin43down（5-cccaagcttggagatcggtgcggc-3；配列番号10）を用いたPCRにより作製した。これらの断片をpBluescript II KS（INVITROGEN）にクローニングし、pUD1を構築した。pUC4Kの、HincIIサイトを側に有するaph遺伝子（カナマイシン耐性）をpLA34-2のApa KpnIサイトにクローニングすることにより、pApa::Kanを作出した（Hornら, J. Biol. Chem., 1999, 274, 32023-32030）。xylE遺伝子を有するプラスミドpXYL4のSmaIサイトにSmaI-HindIII断片がサブクローニングされたpUDApa::Kanを作出するために、Apa::aphを含むpApa::Kanの3.3 kbの平滑末端断片を、pUD1のPstI サイトへクローニングした（Pelicicら, 前記引用）。U、D、Apa::aphおよびxylEを含む6 kbのBamHI断片を単離し、そして対抗選択可能なsacB遺伝子およびpAL5000の熱感受性複製起点を含むベクターpPR27のBamHIサイトにライゲーションした（Pelicicら, 前記引用）。
【００４４】
得られたプラスミドpPR27::Xyl::UDApaKanを電気穿孔によりBCGへ導入し、そして形質転換体を、カナマイシン（25μg/ml）を含む7H11培地上で32℃にて選択し、そしてカナマイシンを含む7H9肉汁中で成長させた。プラスミド消失を伴った遺伝子置換体を、7H11-カナマイシン-2％スクロース上で39℃にて選択した（Pelicicら, 前記引用）。XylEの色素産生性基質であるカテコールを噴霧することにより、得られたコロニーの100％においてプラスミドの消失を確認した（Pelicicら, 前記引用）。apaの遺伝子置換体を、apa遺伝子のプライマー（Hornら, 前記引用）およびaph遺伝子のプライマー（Norman, E, Gene replacement in Mycobacterium bovis BCG. Methods in Molecular Biology 101巻, Mycobacteria Protocols, T. ParishおよびN.G. Stokerによる編集. Humana Press 1998）を用いて、3つのコロニーからのゲノムDNAのPCRにより確かめた。一つの変異体クローンをBCG Apa-と名付けた。変異体からのAPAの欠如を、マイコバクテリウム ボビスBCG Apaに対するウサギポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット法により確認した（Laqueyrerie, Infect Immun., 1995, 10, 4003-4010；Hornら, 前記引用）。
【００４５】
実施例３：BCG Apa++またはBCGによるインビトロでのヒト癌細胞の成長の阻害
インビトロでの研究が、ヒト膀胱癌腫から樹立された2つの細胞株：ヒト移行上皮癌由来のT24細胞（ATCC # HTB-4）およびヒト乳頭状非転移性膀胱癌由来のRT112またはRT112/84細胞（ECACC 85061106；Marshall Cら, J. Natl. Cancer Inst., 1977, 58, 6, 1743-1751）において、当業者に公知である標準的細胞培養プロトコールを用いて行われた。
T24およびRT112細胞を、37℃、5％ CO2の湿潤な雰囲気下で、10％非働化ウシ胎仔血清（FBS、EUROBIO）および1 ％非必須アミノ酸を補ったDMEM（GIBCO）細胞培養培地中で培養した。
【００４６】
以下の研究において、マイコバクテリウム ボビスBCG 1173P2（パスツール株）をBCGまたは典型的BCGと名付け、組み換え型BCG Apa++をBCG Apa++と、変異体BCG Apa-をBCG Apa-と名付ける。
【００４７】
１）細胞の成長の阻害
T24細胞（106個）を25 cm2培養フラスコ中に播き、10 mlの培養培地中で培養した。48時間の培養後、5.106個のBCG桿菌（BCG、BCG Apa-またはBCG Apa++）を細胞培養培地に加えた。BCG存在下での24または48時間の培養後、該細胞を回収し、そして生細胞を、トリパンブルーを排除して、マラッセ細胞中で計数した。
図３は、BCG処理が癌細胞の成長を阻害することを示す。BCG Apa++存在下でより高くなる効果は、apa遺伝子を不活性化する場合（BCG Apa-）に失われ、これは細菌の死骸が直接に関係しないこと、さらにはAPA分子が細胞の成長の阻害に必須であることを示す。
【００４８】
２）細胞の生存能の阻害
細胞の生存能へのBCGおよびBCG Apa++の効果を、ROCHE DIAGNOSTICSからのCell ProliferationキットI（MTT）を用いたMTTアッセイにより評価した。MTTアッセイは、黄色テトラゾリウム塩MTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニル テトラゾリウム ブロミド）が、代謝活性のある細胞により切断されて紫色ホルマザン結晶となることに基づく。この細胞による還元は、ピリジンヌクレオチドコファクターNADHおよびNADPHを必要とする。形成したホルマザン結晶を可溶化し、そして得られた有色溶液を走査型マルチウェル分光光度計を用いて定量する。
【００４９】
T24細胞を5.106または107個のBCG、BCG Apa-またはBCG Apa++桿菌（それぞれ、細胞1個当たり5個および10個の桿菌に等しい）の存在下で48時間培養した。インキュベーション期間の終点において、該細胞を1ウェル当たり最終体積100μlの培養培地のマイクロプレート（組織培養グレード、96ウェル、平底）へ移した。細胞を移してから24時間後、10μlのMTT標識試薬（0.5 mg/ml）を各ウェルに加えた。4時間のインキュベーション期間の後、37℃、5％ CO2において、100μlの可溶化溶液をウェルに加えた。該プレートを37℃で一晩インキュベートし、そして反応生成物を、走査型マルチウェル分光光度計を用いて570 nmにおける吸光度を測定することにより定量した。
図４は、細胞の生存能がBCGまたはBCG Apa++処理の後に減少することを示す。その効果は、apa遺伝子を不活性化する場合（BCG Apa-）に失われ、これは細菌の死骸が直接に関係しないこと、さらにはAPA分子が細胞の生存能の減少に必須であることを示す。
【００５０】
３）細胞の増殖の阻害
細胞の増殖へのBCGおよびBCG Apa++の効果を、Cell Proliferation ELISA BrdU （比色定量）キット（ROCHE DIAGNOSTICS）を用いたBrdU取り込みアッセイにより評価した。
T24細胞（1ウェル当たり2.5x104個）を37℃で、2.5x105個のBCGまたはBCG Apa++桿菌（細胞1個当たり桿菌10個）の存在下に12時間、24時間、36時間または48時間成長させた。各測定時間の終点において、細胞に10μM BrdUを加えて、3時間置いた。この標識期の間、ピリミジン類似物BrdUは、増殖している細胞のDNA中のチミジンの代わりに取り込まれた。培養培地を除いた後、該細胞をヘアドライヤーで固定し、そしてそれらのDNAを200μlのFixDenatにより室温で30分間変性させた。抗BrdU抗体-ペルオキシダーゼは、新しく合成された細胞DNA中に取り込まれたBrdUに結合した（室温で2時間）。免疫複合体を、基質反応（TMB、テトラメチルベンジジン）で検出した。酸による停止の後、反応生成物を走査型マルチウェル分光光度計を用いて450 nmにおける吸光度を測定することにより定量した。生じた色およびそれによる吸光度の値は、DNA合成量に直接相関し、このことによりそれぞれの培養物中の増殖している細胞数に相関する。
図５は、BCGによる細胞の増殖の制御がBCG Apa++よりも劣っていることを示す。
【００５１】
４）FGFR-3二量体化の阻害
T24およびRT112細胞（105個／ml）を、106 CFU/mlのBCGもしくはBCG Apa++ 存在下または細菌の非存在下で48時間インキュベートした。該細胞を4℃で15分間冷却し、そして線維芽細胞増殖因子（FGF-1、PROMEGA；50 ng/ml）の存在下または非存在下に4℃で2時間インキュベートした。室温にて30分間、1 mMビス-（スルホスクシンイミジル）-スベレートおよび15 mMジスクシンイミジル-スベレート（PIERCE）で共有結合の架橋をした後、該細胞を溶解し、抗線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR-3）C末端抗体（C-15 sc-123；SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC）で免疫沈降し、そして免疫ブロットをFGFR-3の細胞質ドメインに対するポリクローナル抗体（P-18 sc-31162；SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC）で検出した。単量体（〜120 kDa）および二量体（〜250 kDa）の密度の合計と比較した二量体について得られた密度を測定した。
FGFとともにインキュベートしたT24またはRT112癌細胞において観察されたFGF受容体（FGFR-3）の二量体化は、BCG存在下においては部分的に阻害され、そしてBCG Apa++存在下においては完全に阻害される（図６および７）。
【００５２】
５）MAPKおよびAkt 1-2経路の解析
後続の刺激の経路の解析を行った。よって、6ウェルプレート中に培養したT24細胞を、106 CFUのBCGまたはBCG Apa++の存在下で無血清DMEM中に48時間インキュベートし、そしてEGF（100 ng/ml）存在下または非存在下で15分間インキュベートし、そして溶解した。リン酸化分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼp42/44（pMAPK）およびリン酸化Akt 1-2の存在を、それぞれPhosphoDetect ERK1/2（pThr185/pTyr187）（CALBIOCHEM）およびPhosphoDetect Akt（pSer473）（CALBIOCHEM）ELISAキットによる全タンパク質ELISAにより測定した。
MAPK（図８）およびAkt1/2（図９）のリン酸化を示す結果により、T24細胞表面上におけるBCG Apa++の存在がEGF刺激の第1段階を阻害することが示され、そしてBCG Apa++はBCGよりも癌細胞の成長を制御する効力が強い傾向があることが確認される。
【００５３】
実施例４：BCGまたはBCG Apa++によるヒト癌細胞におけるアポトーシス経路の誘導
BCGまたはBCG Apa++で処理されたT24およびRT112ヒト膀胱癌細胞の形態学的観察により、アポトーシスを示す、豊富な細胞質小胞および核の奇形の存在が明らかになった。
アポトーシス経路へのスイッチは、Bcl-2ファミリータンパク質の制御下にあり、そしてシステイン-アスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）を必要とする（概説として、J.M. AdamsおよびS. Cory, Oncogene 2007, 26, 1324-1337を参照されたい）。Bcl-2ファミリーメンバーのうち、Bcl-2は細胞生存を促進し、反対にBid、BakおよびBaxは細胞死を促進する。カスパーゼは、他のタンパク質またはペプチドをアスパラギン酸残基の次位で切断できる重要なシステイン残基を有する酵素であるシステインプロテアーゼの一群である。アミノ酸配列IETD（Ile-Glu-Thr-Asp）を認識するプロテアーゼであるカスパーゼ-8は、外部アポトーシス経路において重要な要因である。アミノ酸配列LEHD（Leu-Glu-His-Asp）を認識するプロテアーゼであるカスパーゼ-9は、内部アポトーシス経路において重要な要因である。
それゆえ、BCGもしくはBCG Apa++で処理したか、または未処理のT24およびRT112細胞におけるBcl-2、Bid、Bak、Baxの活性化レベルを、RNase保護アッセイ（RPA）用いて評価した。さらに、BCGもしくはBCG Apa++で処理したか、または未処理のT24細胞におけるカスパーゼ-8およびカスパーゼ-9レベルを、比色アッセイを用いて評価した。
【００５４】
１）RNase保護アッセイ
細胞（フラスコ1つ当たり106個）を、5.106 CFUのBCGもしくはBCG Apa++ 存在下または細菌の非存在下で培養した。処理の24時間後、該細胞を冷えたPBSで洗浄した後に回収した。製造者の使用説明書（INVITROGEN）に従って、細胞懸濁物をTRIzol中にホモジナイズし、そしてRNAを、クロロホルム-イソプロパノール法を用いて溶解物から抽出した。乾燥したRNA沈殿物を、DEPC- H2O（0.1% ジエチルピロカーボネイトを含む水、INVITROGEN）に再懸濁した。
【００５５】
製造者の使用説明書に従って、mRNA発現を、RiboQuant multiprobe RNA保護アッセイ（BD BIOSCIENCES PHARMINGEN）を用いて測定した。手短に言えば、アンチセンスRNAプローブを、ヒトアポトーシスhAPO-2c（BD BIOSCIENCES PHARMINGEN）のcDNA鋳型セットを用いて転写した。転写のために、1μl（50 ng）の鋳型を、2μlの酵素（80 UのRNasinおよび40 UのT7 RNAポリメラーゼ）、3.25 mM Biotin-16-UTPを含む4μlのヌクレオチドプール（5 mM）（ROCHE DIAGNOSTICS）、2μlのDTT（100 mM）および4μlの5x転写緩衝液を含む19μlの水溶性混合物中に37℃で2時間インキュベートした。Biotin-16-UTPを除いて、全ての試薬は、RiboQuant Non-Rad In Vitro 転写キット（BD BIOSCIENCES PHARMINGEN）の製造者により提供される。反応を、2μl（2 U）のDNaseの添加、次いで37℃で30分間インキュベーションにより停止した。DNaseを20 mM EDTAにより不活性化し、そして標識されたRNAプローブを、塩化リチウム（LiCl 4 M）を用いて抽出し、次いでドライアイス上でエタノール沈殿した。
【００５６】
ハイブリダイゼーションのために、エタノールにより沈殿させ、かつ真空蒸発遠心分離機を用いて乾燥させた20μgのRNAサンプルを、8μlのハイブリダイゼーション緩衝液（80%ホルムアミド、1 mM EDTA、400 mM NaCl、および40 mM Prpes（プレ-エアジン-N,N'-ビス-エタンスルホン酸；BD BIOSCIENCES PHARMINGEN））中に56℃で再懸濁し、上記のようにして調製したプローブ2μl（30 ng）と混合し、90℃まで加熱し、そして56℃で18時間インキュベートした。
【００５７】
RNase消化のために、RNase AおよびRNase T1（100 U）を含む10倍量の混合物を加え、そして室温で45分間反応させた。消化後、サンプルを37℃で15分間、プロテイナーゼKおよびRiboQuant Non-Rad RPAキット（BD BIOSCIENCES PHARMINGEN）で提供される適切な緩衝液と混合し、その後、それらをLiClで抽出し、エタノールで沈殿させた。そして、該サンプルを風乾し、ローディング緩衝液に再懸濁し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）を用いてサイズ分離した。半乾燥式エレクトロブロッター（100 mAで20分間）を用いて、正に荷電したナイロン膜（BD BIOSCIENCES PHARMINGEN）にバンドを電気的転写し、そしてUVにより架橋した。
【００５８】
化学ルミネセンス プローブ検出を、BD RiboQuant Non-Rad検出キット（BD BIOSCIENCES PHARMINGEN）を用いて行った。ナイロン膜をブロッキング緩衝液でブロッキングし、ストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼと室温にて15分間コンジュゲートした。コンジュゲートされた膜を洗浄し（提供された洗浄緩衝液および基質平衡化緩衝液）、そして新たに調製した安定過酸化物溶液とルミノール／エンハンサーとの等量混合物中に室温にて10分間インキュベートした。明らかにされた膜をCL-XPosureフィルム（PIERCE）へ曝露し、そして移動距離に対するヌクレオチド長を、対数方眼上で、標品（30 ngの転写されたビオチン標識化プローブ）と比較した。リボソームタンパク質L-32のmRNAを対照として用いた。
【００５９】
図１０は、対照の細胞培養培地中で成長するT24およびRT112細胞において観察されたBcl-2のmRNAの高い発現が、BCGの存在下で減少し、そしてBCG Apa++の存在下で消失したことを示す。反対に、単独で成長している細胞においては発現の乏しいBax、BakおよびBidのメッセンジャーは、BCGおよびBCG Apa++存在下で高発現した。これらの結果は、BCG Apa++がBCGよりも効率的に細胞死への経路を誘導することを示す。
【００６０】
２）カスパーゼ-8およびカスパーゼ-9アッセイ
T24細胞を、BCGもしくはBCG Apa++の存在下または細菌の非存在下で6時間、12時間、24時間、36時間または48時間インキュベートし、そして溶解した。カスパーゼ-8およびカスパーゼ-9を、比色アッセイキット（R&D SYSTEMS）を用いて細胞溶解物について測定した。発色団pNA（p-ニトロアニリド）にコンジュゲートした合成ペプチド（IETD）または（LEHD）を細胞溶解物に加えた。カスパーゼ-8による基質IEDA-pNAの切断またはカスパーゼ-9による基質LEHD-pNA切断によって、遊離pNAが放出され、結果として405 nmにおける吸光度が増加し、これを分光光度計で測定する。 処理細胞から調製した反応混合物と、未処理対照から調製した反応混合物との吸光度の比較により、カスパーゼ活性の増加の測定が可能になる。
【００６１】
酵素活性として表された、カスパーゼ-8（図１１）およびカスパーゼ-9（図１２）はどちらも、BCGの存在下で成長するT24細胞において増加し、そしてBCG Apa++の存在下で増強した。36時間後または48時間後のBCGとBCG Apa++との間の差は有意（p < 0.05）であり、これはBCG Apa++が、カスパーゼ-8およびカスパーゼ-9活性の両方についての有力なアクチベーターであることを示す。これらの結果により、BCGまたはBCG Apa++の存在下で成長する細胞で観察されたアポトーシスの増加が支持される。さらに、カスパーゼ-8経路とカスパーゼ-9経路との間に存在する相乗効果により、BCG Apa++の存在下で観察された細胞成長の抑制効果の増加（実施例３）について、少なくとも部分的に説明できた。
【００６２】
実施例５：BCG Apa++またはBCGによるインビボでのヒト癌細胞の成長の阻害
１）動物モデル
実験開始時に7週齢のメスのウィスターラット（JANVIER）を30匹、この研究に用いた。24匹のラットに、0.05 % N-ブチル-N-（4-ヒドロキシブチル）ニトロソアミン（BBN；KASEI INDUSTRY COMPANY）を含む飲用水を19週間与えた。6匹のラットに、対照として（正常な）飲用水を与え、いずれの処理もせずに30週まで維持した。BBN処理の終点の1週間後（第20週）に、ラットにPBS単独、または108 CFU/mlのBCGもしくはBCG Apa++を含むPBSの膀胱内点滴注入（0.5 ml）を週に1回で6週間行った（図１３）。
【００６３】
２）尿におけるヘモグロビンアッセイ
第30週において尿を回収し、そしてそれらのヘモグロビン含量を、ドラブキンの方法を用いて測定した。この比色アッセイは、シアンメトヘモグロビンの測定に基づく；尿中に存在する全ヘモグロビンを、アルカリ性pHにおいて急速にシアン化誘導体に転化させる。アルカリ性のフェリシアン化物およびシアン化物を含むドラブキン溶液は、ヘモグロビンの全ての形態と反応する。BIOLABO（#3502200、82250、82200）からの即時使用可能なヘモグロビン試薬25μlを、ラットの尿100μlに加えた。混合物を室温で、少なくとも15分間インキュベートした。540 nmにおける、ブランクに対するサンプルの吸光度を測定する。この非侵襲的アッセイは、抗腫瘍治療を最適化するために、腫瘍の発達を制御することおよびBCG治療（用量、投与の頻度）を調節することを可能にする。
BCG治療後に観察された尿中に存在するヘモグロビンの減少は、BCG Apa++を用いると、より目立っていた。
【００６４】
３）膀胱の臨床的観察
ラットを第30週（最後のBCG治療の1ヵ月後）に安楽死させ、膀胱を回収し、そして肉眼検査をした。
膀胱の臨床的観察により、PBSで処理されたグループの全動物およびBCGで処理されたグループの動物の半数において、腫瘍の存在が示された。対照的に、BCG Apa++で処理されたグループの全動物において、膀胱は正常であった（図１５）。膀胱において観察された、軽い（mild）低酸素状況下でAPA分子を過剰発現するBCG Apa++は、癌腫を促進する化学薬品を与えられているラットの膀胱内で癌細胞の増殖を制御することについて、野生型BCGよりも活性があることが分かった。おそらく、インビトロ培養物よりも尿中および膀胱内でより深い低酸素レベルにより、これらのインビボアッセイにおける結果は、インビトロの結果よりも強い印象を与えた。
【００６５】
４）野生型p53発現解析
ラットを第30週（最後のBCG治療の1ヵ月後）に安楽死させた。膀胱を回収し、ホモジナイズし、そして核タンパク質抽出物をActivemotif 核抽出キット（Active motif、 CARLSBAD）により調製した。活性化した野生型p53をEnzyme Immunometricアッセイキット（TiterZyme（登録商標）、EIA900-117、Ann Arbor、MI）により測定した。
腫瘍細胞の核内における野生型p53腫瘍抑制因子の濃度の解析より、PBSで処理されたグループでは50％減少し、BCGで処理されたグループでは25％〜30％減少することに比較して、BCG Apa++で処理されたグループでは減少しないことが証明される（図１６）。BCG Apa++で処理されたラットの膀胱内に存在する野生型p53の正常な値は、腫瘍の進行が、膀胱回収時に少なくとも減少したか、またはオフに切り替わり得ることを示した。
【００６６】
６）実施例６：トランスクリプトーム解析
RNA抽出を、実施例４に記載のように行った。Human cancer pathway finderマイクロアレイキット（GEArray（商標）Oligo OHS-033）をSUPERARRAY BIOSCIENCE CORP.から入手した。それらは、異なる癌カスケードに関連し、かつ6つのグループ（表II）に分類された113遺伝子の特定のcDNA断片が載せられたナイロン膜を含んでいた。プローブ合成およびプローブのビオチン標識は、製造者の使用説明書に従って、GEArray AmpoLabeling-LPRキット（SUPERARRAY BIOSCIENCE CORP.）およびBiotin-16-dUTP（ROCHE DIAGNOSTICS）を用いて行った。ビオチン化され、かつ増幅されたcDNAプローブを、異なるアレイ膜とともに60℃にて一晩ハイブリダイズし、そしてAP-ストレプトアビジン 化学ルミネセンス検出をSuperArray検出キット（SUPERARRAY BIOSCIENCE CORP.）により行った。膜をCL-Xposureフィルム（PIERCE）に曝露し、そしてイメージ収集を、200 dpiを用いるデスクスキャナーにより遂行した。データ収集を、ScanAlyzeソフトウェア バージョン2.50（http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm）を用いることにより行った。データ解析を、GEArray Analyzerソフトウェア（www.superarray.com）により完了した。生データを、スポットされた遺伝子配列のない領域（ブランク）としての3つの陰性対照またはヒト細胞内で発現しない遺伝子によりスポットされた領域（pUC18）の平均シグナルから差し引いた。ローディング（刺激されたか、または対照のT24細胞の全RNA 1μg）を調節するために、これらの差し引かれたデータを、3つの陽性対照（ハウスキーピング遺伝子：β-アクチン、GAPDHおよびリボソームタンパク質S27a）の平均化シグナルに対するこれらの比率により標準化した。さらに、該データを、別の最小シグナルの判断基準によっても標準化した。結果の再現性を保証するために、実験を3回行った。
【００６７】
異なるBCG株で処理されたT24細胞のトランスクリプトーム解析により、機能的研究からの結果（実施例３、４および５）を確かめ、そしてインテグリン、アポトーシスおよび細胞周期についてコードする遺伝子が、BCG Apa-ではなく、BCGおよびBCG Apa++により調節されることが示される（表I、表IIおよび図１７）。さらに、該調節は、BCG存在下よりもBCG Apa++存在下の方が高い（表Iおよび図１７）。
【００６８】
【表１−１】
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【００６９】
【表１−２】
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【００７０】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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