(57)【要約】本発明は、遺伝子、タンパク質などの多様な生体物質の有無及びその濃度を電気的な方法により検出するバイオセンサー、前記バイオセンサーを構成する櫛形電極センサーユニット及び前記バイオセンサーを用いた生体物質の濃度測定方法に関するもので、互いに独立して作動する櫛形電極センサーユニットが基板上に多数個集積されたバイオセンサーであって、前記櫛形電極センサーユニットは、基板上に互いに対向して櫛状に離隔されて形成された第１電極及び第２電極と、生体分子と結合時、前記第１電極と第２電極が導通するように、前記第１電極と第２電極間に露出した基板上に固定され、前記生体分子と特異的に結合するセンサー固定生体分子レセプターと、を含み、前記センサー固定生体分子レセプターに捕獲された生体分子により電気的に導通された前記櫛形電極センサーユニットの数から生体分子を分析することを特徴とする。本発明によるバイオセンサーを利用すると、測定対象物質の存在有無及び濃度に対する検出を効率的に行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに独立して作動する櫛形電極(interdigitated electrode)センサーユニットが基板上に多数個集積されたバイオセンサーであって、
前記櫛形電極センサーユニットは、基板上に互いに対向して櫛状に離隔されて形成された第１電極及び第２電極と、
生体分子と結合時、前記第１電極と第２電極が導通するように、前記第１電極と第２電極間に露出した基板上に固定され、前記生体分子と特異的に結合するセンサー固定生体分子レセプターと、を含み、
前記センサー固定生体分子レセプターに捕獲された生体分子により電気的に導通された前記櫛形電極センサーユニットの数から生体分子を分析することを特徴とするバイオセンサー。
【請求項２】
電気的に導通された櫛形電極単位センサー数と基板上に集積された全体櫛形電極センサーユニット数との比率と、生体分子濃度の相関関係から試料液中の生体分子を分析することを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記生体分子は、導電性粒子を予め固定することにより、前記生体分子が櫛形電極センサーユニットのセンサー固定生体分子レセプターに捕獲時に、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
生体分子が櫛形電極センサーユニットのセンサー固定生体分子レセプターに捕獲された後、前記生体分子と特異的に結合をして且つ導電性粒子が固定された粒子固定生体分子レセプターを、前記捕獲された生体分子と結合させることにより、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されるようにすることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
測定対象生体分子をセンサー固定生体分子レセプターに捕獲させた後、導電性粒子の固定されたまた他の生体分子を前記バイオセンサーに接触させ、測定対象生体分子が捕獲されていないセンサー固定生体分子レセプターに捕獲させることにより、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されるようにすることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記センサー固定生体分子レセプター及び粒子固定生体分子レセプターの生体分子レセプターは、抗体であり、生体分子は、抗原であることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記センサー固定生体分子レセプターは、相異なる種類の抗体が所定の比率で基板に固定されたことを特徴とする、請求項６に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記生体分子または粒子固定生体分子レセプターに固定された導電性粒子の大きさは、０．５ｎｍ〜１μｍであることを特徴とする、請求項３乃至５のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項９】
前記粒子固定生体分子レセプターに固定された導電性粒子の大きさは、１ｎｍ〜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記第１電極と第２電極は、リソグラフィー法、印刷法及び接触プリント法から選択された方法によりパターニングされたことを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
前記第１電極と第２電極の間隙は、０．５ｎｍ〜１μｍであることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記第１電極と第２電極の間隙は、１ｎｍ〜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記第１電極と第２電極は、櫛状に形成された金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元反応により還元された金属を成長させることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
前記金属パターンは、Ａｕ、Ａｇ、Ａｌ、Ｃｕ及びＰｔから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
金属イオンの含まれた溶液に、櫛状の金属パターンが形成された基板を浸漬した後、前記溶液に還元剤を加えて、金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元された金属を成長させることを特徴とする、請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
前記金属イオンの還元は、ヒドロキシルアミン(H2NOH)、アスコルビン酸、ブドウ糖、ロッシェル塩、ホルムアルデヒド及びその混合物から選択される還元剤を前記溶液に加えることによることを特徴とする、請求項１５に記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
第１電極及び第２電極の表面には、タンパク質吸着防止層が備えられることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
センサー固定生体分子レセプターと基板は、連結分子層により固定されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
櫛形電極センサーユニットは、ｎ×ｍのマトリックスとして備えられることを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
前記第１電極及び第２電極の高さは、基板に固定された前記生体分子レセプターの高さより大きいことを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
請求項１に記載のバイオセンサーに、測定対象生体分子を含む試料液を接触させて、互いに独立して作動する櫛形電極センサーユニットの第１電極と第２電極との間に露出した基板上に固定されたセンサー固定生体分子レセプターに前記生体分子を捕獲させるステップと、
前記センサー固定生体分子レセプターに結合された生体分子に、導電性粒子が固定された粒子固定生体分子レセプターを接触させて、前記結合された生体分子と結合させるステップと、
バイオセンサーの電気伝導度を測定するステップと、
試料液の接触前後、電気伝導度の変化を示すセンサーの比率と濃度との関係から試料液中の生体分子の濃度を換算するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子を分析する方法。
【請求項２２】
測定対象生体分子に導電性粒子を固定するステップと、
請求項１に記載のバイオセンサーに、導電性粒子が予め固定された測定対象生体分子を接触させて、互いに独立して作動する櫛形電極センサーユニットの第１電極と第２電極との間に露出した基板上に固定されたセンサー固定生体分子レセプターに前記測定対象生体分子を捕獲させるステップと、
バイオセンサーの電気伝導度を測定するステップと、
試料液の接触前後、電気伝導度の変化を示すセンサーの比率と濃度との関係から試料液中の生体分子の濃度を換算するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子を分析する方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のバイオセンサーに測定対象生体分子を接触させて、互いに独立して作動する櫛形電極センサーユニットの第１電極と第２電極との間に露出した基板上に固定されたセンサー固定生体分子レセプターに測定対象生体分子を捕獲させるステップと、
導電性粒子の固定されたまた他の生体分子をバイオセンサーに接触させ、前記測定対象生体分子が捕獲されていないセンサー固定生体分子レセプターに、前記導電性粒子が固定されたまた他の生体分子を捕獲させるステップと、
バイオセンサーの電気伝導度を測定するステップと、
試料液の接触前後、電気伝導度の変化を示すセンサーの比率と濃度との関係から試料液中の生体分子の濃度を換算するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子を分析する方法。
【請求項２４】
基板上に互いに対向し離隔されて形成された第１電極及び第２電極と、
測定対象生体分子と結合時、前記第１電極と第２電極が導通するように、前記第１電極と第２電極間に露出した基板上に固定され、前記生体分子と特異的に結合するセンサー固定生体分子レセプターと、を含み、
前記第１電極と第２電極は、所定形状に形成された金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元反応により還元された金属を成長させることを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項２５】
第１電極と第２電極は、櫛形状に互いに対向して形成されたことを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
前記金属パターンは、Ａｕ、Ａｇ、Ａｌ、Ｃｕ及びＰｔから選択されることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項２７】
金属イオンの含まれた溶液に、所定形状の金属パターンが形成された基板を浸漬した後、前記溶液に還元剤を加えて、金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元された金属を成長させることを特徴とする、請求項２６に記載のバイオセンサー。
【請求項２８】
前記金属イオンの還元は、ヒドロキシルアミン(H2NOH)、アスコルビン酸、ブドウ糖、ロッシェル塩、ホルムアルデヒド及びその混合物から選択される還元剤を前記溶液に加えることによることを特徴とする、請求項２６に記載のバイオセンサー。
【請求項２９】
第１電極及び第２電極の表面には、タンパク質吸着防止層が備えられることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項３０】
センサー固定生体分子レセプターと基板は、連結分子層(Self Assembled Monolayer)により固定されることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項３１】
前記測定対象生体分子は、導電性粒子が固定されて、前記生体分子がセンサー固定生体分子レセプターと結合時に、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項３２】
測定生体分子がセンサー固定生体分子レセプターに捕獲された後、前記生体分子と特異的に結合をして且つ導電性粒子が固定された粒子固定生体分子レセプターを、前記捕獲された生体分子と結合させることにより、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されるようにすることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項３３】
測定対象生体分子をセンサー固定生体分子レセプターに捕獲させた後、導電性粒子の固定されたまた他の生体分子を前記バイオセンサーに接触させ、測定対象生体分子が捕獲されていないセンサー固定生体分子レセプターに捕獲させることにより、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されるようにすることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項３４】
前記センサー固定生体分子レセプター及び粒子固定生体分子レセプターは、抗体であり、生体分子は、抗原であることを特徴とする、請求項３１乃至３３のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項３５】
前記センサー固定生体分子レセプターは、相異なる種類の抗体が所定の比率で基板に固定されたことを特徴とする、請求項３４に記載のバイオセンサー。
【請求項３６】
前記導電性粒子の大きさは、０．５ｎｍ〜１μｍであることを特徴とする、請求項３１乃３３のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項３７】
前記導電性粒子の大きさは、１ｎｍ〜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項３６に記載のバイオセンサー。
【請求項３８】
前記第１電極と第２電極の間隙は、１ｎｍ〜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【請求項３９】
前記第１電極及び第２電極の高さは、基板に固定された前記生体分子レセプターの高さより大きいことを特徴とする、請求項２４に記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子、タンパク質などの多様な生体物質の有無及びその濃度を電気的な方法により検出するバイオセンサー、前記バイオセンサーを構成する櫛形電極センサーユニット及びバイオセンサーを用いた生体物質の濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子とタンパク質に対する研究は、病の診断を予測できる新しい生物学的指標(biomarker)の類推に機会を提供した。特に、癌のような疾病は、発病初期に正確な診断を通じて病の完治が可能であり、再発を防げる可能性を示唆する。したがって、このような抗原抗体反応による生物学的指標物の早期検出のための診断用センサー開発に対する研究が活発に進行されている。このようなセンサーは、医療診断の他にも保健、環境、軍事、食品などの多様な分野に適用が可能であって、非常に多様な形態の研究が進行中である。
【０００３】
微量抗原の検出のためには、光学的な装置を使用して抗原の有無を調べる方法があるが、時間と費用及び努力の所要が比較的多いという不具合があるにも拘わらず、現在まで最も広く使用される方法である。最近は、抗原の有無によって吸収される光の波長が異なってくることを利用する方法(Chou et al., (2004)Biosens. Bioelectron. 19, 999-1005)と、測定したい抗原の有無によって、抗原と相補結合ができる表面を有したナノ粒子の変化を通じて吸収される光の波長が異なってくる方法(Alivisatos et al., (2004) Nat. Biotechnol. 22, 47-52, Nam et al., (2003) Science. 301, 1884-1886; 米国特許第6,974,669)などが報告された。
【０００４】
最近、携帯可能で且つ使用が便利であり、安価で、速い測定が可能な形態の診断用センサーを製作するために、電気的な検出方法に関する研究が活発に進行されている。このような電気的検出センサーは、一般に広く使用されるコンピューター、携帯機器、家電製品などに直接結合するなどの方式で適用することが容易である。表面を改質した炭素ナノチューブやナノワイヤを使用して、電気伝導度の変化から生体物質の有無と濃度を測定できる方法(Chen, R. J. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4984-4989, Zheng, G. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1294-1301; 米国特許第6,781,166)が知られている。
【０００５】
しかしながら、このような炭素ナノチューブとナノワイヤを利用した素子は、炭素ナノチューブやナノワイヤを所望の位置に動かせる配列技術が必要であるばかりか、ワイヤや炭素ナノチューブの大きさや接合抵抗によって、特性の異なる素子が生成されるため、簡便且つ大量に製造する方法としては適していない。したがって、半導体工程で普遍的に利用するパターニング(lithography)技術を使用して、集積と任意形状の製作に容易な素子を利用したセンサーの具現が要求されている。
【０００６】
ナノギャップを利用したバイオセンサーは、このような要求に応える技術として最近関心が大きく高まっている。今まで知られたナノギャップを利用した生体物質検出素子(米国特許第6,653,653、第6,824,974)は、生体物質が電極と電極間を直接的に連結する方法であって、生体分子の抵抗が非常に大きいため、タンパク質などの検出に適していない。したがって、ナノギャップ電極の両端に伝導性を付与するために、ナノ粒子が媒介される方式が公知されたが(Haguet, V. et al. (2004) Appl. Phys. Lett. 84, 1213-1215)、この技術は、効果的な電気伝導性の差異を示す測定方式として有効である。この技術は、一般的なパターニング方法に即した技術であって、ナノギャップの集積可能性を有しているが、一般的なパターニング方法ではナノギャップの製作収率が非常に低くて、実質的な集積構造の製作が難しく、信頼性のある測定が難しくて、しかも、測定対象物質の濃度などに対する定量的分析が不可能である。
【０００７】
本発明者らは、ナノギャップ電極の製造方法及びこれを利用して製造されたナノギャップ素子に関する発明を、大韓民国特許出願第２００６−００３９５２８号として出願したが、前記出願発明によるナノギャップ電極の製造方法は、所定形状からなる金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元反応により還元された金属を成長させることを特徴とし、本発明者らのナノギャップ金属電極の製造方法は、従来の方法では製造し難い１〜５０ｎｍのギャップを有するナノギャップ電極を容易に製造できる長所を有する。
【０００８】
一方、バイオセンサーは、生体物質を測定するにおいて、生体物質の感知程度によって非常に広い誤差範囲を示すため、測定の再現性及び正確性に劣る問題があるが、このような問題を克服するために、大韓民国公開特許第１９９６−２４３５０号では、一つのサンプル内に存在する同一な物質に独立的に反応してそれぞれ信号を発生する二つ以上の活性指示電極と、背景信号を補正するための非活性指示電極と、対電極と、基準電極とから構成されることを特徴とする櫛形電極型バイオセンサーを提供することにより、一回の測定が同一な測定物質に対する多重信号を発生するようにして、この信号を回路的に処理して平均値を示すことにより、個々のセンサーで数回測定を行って得られる測定の正確度を、ただ一回の測定で得られるようにすることを特徴とする櫛形電極型バイオセンサーが公知されている。しかしながら、前記公知された櫛形電極型バイオセンサーは、酵素、抗原、抗体、核酸、分子受容体から選択された少なくとも一つ以上の生体物質が固定された数個の活性指示電極と一つの基準電極及び対電極から構成されたものであって、電気的信号の大きさを平均的に測定するためのものに過ぎなく、また、電気化学的方法に基づいた単一電極型として、高濃度の計測に使用でき、実質的には、低濃度の生体分子の濃度測定などの定量分析をするには限界がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、上記のような問題点を解決するために案出されたもので、本発明は、遺伝子、タンパク質などの多様な生体物質の有無及びその濃度を電気的な方法により検出するバイオセンサー、前記バイオセンサーを構成する櫛形電極センサーユニット及び前記バイオセンサーを用いた生体物質の濃度測定方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、簡単な高歩留まりの製造方法を通じて製作された大面積のナノギャップ櫛形電極センサーユニットから構成されたバイオセンサーを用いて、抗原などの生体分子に対し、低濃度領域及び高濃度領域の両方において正確且つ再現性のある定性及び定量測定方法を提供することであり、また、ナノギャップ櫛形電極センサーユニットの集積による統計的な測定を通じて、濃度と信号確率の相関関係から生体物質の濃度を定量する新しい方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、遺伝子、タンパク質などの多様な生体物質の有無及びその濃度を電気的な方法により検出するバイオセンサー、前記バイオセンサーを構成する櫛形電極センサーユニット及び前記バイオセンサーを用いた生体物質の濃度測定方法に関し、互いに独立して作動する櫛形電極(interdigitated electrode)センサーユニットが基板上に多数個集積されたバイオセンサーであって、前記櫛形電極センサーユニットは、基板上に互いに対向して櫛状に離隔されて形成された第１電極及び第２電極と、生体分子と結合時、前記第１電極と第２電極が導通するように、前記第１電極と第２電極間に露出した基板上に固定され、前記生体分子と特異的に結合するセンサー固定生体分子レセプターと、を含み、前記センサー固定生体分子レセプターに捕獲された生体分子により電気的に導通された前記櫛形電極センサーユニットの数から生体分子を分析することを特徴として、また、本発明によるバイオセンサーは、電気的に導通された櫛形電極単位センサー数と基板上に集積された全体櫛形電極センサーユニット数との比率と、生体分子濃度の相関関係から試料液中の生体分子を定量分析することを含む。
【００１２】
詳細には、本発明によるバイオセンサーは、櫛形電極センサーユニットは、ｎ×ｍのマトリックスとして備えられて、前記櫛形電極センサーは、生体分子と結合されて電流が流れ、結合されなかった櫛形電極センサーユニットは、電流が流れないように、互いに独立して作動するように備えられ、電流が流れる櫛形電極センサーユニットの数を測定することにより生体分子の濃度を測定して、櫛形電極センサーユニットの数は、通常の電気的回路具現方法により自動に容易に測定できる。
【００１３】
生体分子との結合により増加された電気伝導度は、簡単に櫛形電極センサーユニットの抵抗を測定することで決定できる。
【００１４】
測定に使用される電圧と電流量などに制限はないが、好ましくは、１００ｍＶ以下の電圧を使用して、強い電圧により誘発可能な電流流動(electro-migration)などによる誤謬要因を排除することが好ましい。
【００１５】
測定対象生体物質の有無を判断するｍ個の行とｎ個の列とからなる櫛形電極センサーユニットを集積して前記センサーユニットのｏｎ−ｏｆｆ程度を示す電気伝導度の統計から測定対象物質の濃度を誘導する方式を例とすると、ｍ個の行とｎ個の列とからなるバイオセンサーに存在する櫛形電極センサーユニットの総数(Ｎｔｏｔ)は、ｍ×ｎであり、集積されているセンサーユニットの中、対象物質の存在を示す単位センサーの数をＮｏｎとすると、試料内に存在する測定対象物質の濃度(Ｃ)は、対象物質の存在を表示するセンサーユニットの比率Ｐｏｎ＝Ｎｏｎ/Ｎｔｏｔ＝Ｎｏｎ/(ｍ×ｎ)の関数により与えられる。ここで、集積された櫛形電極センサーユニットの数が多いほど(Ｎｔｏｔが大きいほど)、このような確率と濃度関係は、信頼度が高くなる。特に、センサーユニットが、少ない数の測定対象物質に反応できるくらいに感度が高くて、小さい面積で製作されるほど、濃度測定の信頼度が向上する。
【００１６】
試料に存在する測定対象抗原の濃度によって電気伝導度の変化を起すセンサーユニットの比率が増加すると、これは、高い濃度の試料に対して電気伝導度の変化を表す櫛形電極センサーユニットの数が増加していることを意味し、電気伝導度の変化を表す櫛形電極センサーユニットの比率から試料の濃度を解析することができる。
【００１７】
対象物質が存在しないと表示する櫛形電極センサーユニット(ｏｆｆセンサー、電気伝導度の変化を示さないセンサー)の比率(Ｐｏｆｆ)は、測定対象物質の濃度が高くなるほど減少して、この際、濃度の微少増加(ｄＣ)によるＰｏｆｆの微少増加分(ｄＰｏｆｆ)は、濃度の微少増加量(ｄＣ)とその瞬間のｏｆｆセンサーの比率(Ｐｏｆｆ)に比例する。
ｄＰｏｆｆ＝−ｋ・Ｐｏｆｆ ・ｄＣ[ｋは、比例常数]
【００１８】
上記式から、対象物質の存在を表示するセンサー(ｏｎセンサー)の比率Ｐｏｎと濃度との関係は、次の式で表現できる。
Ｐｏｎ＝Ａ−Ｂ  ｅｘｐ（−ｋＣ）
[ＡとＢは、素子の不完全性、ナノ粒子の固定効率、非特異的接合などの要因により生じ得るセンサーの非正常挙動を反映する常数]
【００１９】
本発明によるバイオセンサー及び櫛形電極センサーユニットの構造と配列及び測定対象の種類などの要因により、確率関数の様相が多少変化することがあって、濃度測定の信頼度は、素子の大きさと集積度などにより影響を受けるようになる。
【００２０】
本発明による櫛形電極センサーは、基板上に互いに対向して櫛状に離隔されて形成された第１電極及び第２電極と、試料液中の生体分子と結合時、前記第１電極と第２電極が導通するように、前記第１電極と第２電極間に露出した基板上に固定され、前記生体分子と特異的に結合するセンサー固定生体分子レセプターと、を含み、前記第１電極と第２電極は、所定形状に形成された金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元反応により還元された金属を成長させることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明による生体分子を定量分析する方法は、前記バイオセンサーに、測定対象生体分子を含む試料液を接触させて、互いに独立して作動する櫛形電極センサーユニットの第１電極と第２電極との間に露出した基板上に固定されたセンサー固定生体分子レセプターに前記生体分子を捕獲させるステップと、前記センサー固定生体分子レセプターに結合された生体分子に、導電性粒子が固定された粒子固定生体分子レセプターを接触させて、前記結合された生体分子と結合させるステップと、バイオセンサーの電気伝導度を測定するステップと、試料液の接触前後、電気伝導度の変化を示すセンサーの比率と濃度との関係から試料液中の生体分子の濃度を換算するステップと、を含むことを特徴し、また他の方法として、測定対象生体分子を含む試料に導電性粒子を混合して固定するステップと、前記バイオセンサーに、導電性粒子が予め固定された測定対象生体分子を接触させて、互いに独立して作動する櫛形電極センサーユニットの第１電極と第２電極との間に露出した基板上に固定されたセンサー固定生体分子レセプターに前記測定対象生体分子を捕獲させるステップと、バイオセンサーの電気伝導度を測定するステップと、試料液の接触前後、電気伝導度の変化を示すセンサーの比率と濃度との関係から試料液中の生体分子の濃度を換算するステップと、を含むことを特徴とする。また、他の方法として、前記バイオセンサーに測定対象生体分子を接触させて、互いに独立して作動する櫛形電極センサーユニットの第１電極と第２電極との間に露出した基板上に固定されたセンサー固定生体分子レセプターに測定対象生体分子を捕獲させるステップと、導電性粒子の固定されたまた他の生体分子をバイオセンサーに接触させ、前記測定対象生体分子が捕獲されていないセンサー固定生体分子レセプターに、前記導電性粒子が固定された生体分子を捕獲させるステップと、バイオセンサーの電気伝導度を測定するステップと、試料液の接触前後、電気伝導度の変化を示すセンサーの比率と濃度との関係から試料液中の生体分子の濃度を換算するステップと、を含み、前記導電性粒子を予め結合させたまた他の生体分子は、導電性粒子を生体分子に直接固定したものを使用するか、導電性粒子と生体分子との間に生体分子レセプターを媒介として固定したものとを全て含む。
【００２２】
本発明によるバイオセンサーは、測定対象生体分子に導電性粒子が固定され、前記生体分子が櫛形電極センサーユニットのセンサー固定生体分子レセプターと結合時、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されるようにする形態と、試料液中の生体分子が櫛形電極センサーユニットのセンサー固定生体分子レセプターに捕獲された後、前記生体分子と特異的に結合をして且つ導電性粒子に生体分子レセプターを固定した粒子固定生体分子レセプターを、前記捕獲された生体分子と結合させることにより、第１電極と第２電極が前記導電性粒子により電気的に導通されるようにする形態とを全て含む。
【００２３】
ここで、二つの電極間の露出した基板領域は、生体分子と特異的に結合をするセンサー固定生体分子レセプターを固定した領域であって、櫛形電極を備える場合、前記櫛形電極により形成される露出した基板領域の面積が広くなるにつれて、比較的低い濃度の試料に対しても測定時間を減らすことが可能になる。
【００２４】
前記センサー固定生体分子レセプター及び粒子固定生体分子レセプターは抗体で、生体分子は抗原であって、また、前記センサー固定生体分子レセプターとして、相異なる種類の抗体が所定の比率で基板に固定できる。前記抗体は、検出しようとする任意の抗原と選択的に反応する物質から選択できて、特に、抗原−抗体反応をするタンパク質だけではなく、ＤＮＡのような遺伝因子も含む。
【００２５】
センサー固定生体分子レセプターとして抗体を使用する場合、抗原の選択性を高めるために、モノクローン(monoclonal)抗体を使用することが好ましく、基板にこれを固定するための濃度と時間などの反応条件は、公知の通常の方法を採用することができる。
【００２６】
生体分子または粒子固定生体分子レセプターに結合されて第１電極と第２電極間にブリッジを形成することにより、第１電極と第２電極が導通するようにする導電性粒子の大きさは、櫛形電極間の間隙によって適宜選択して使用できるが、０．５ｎｍ乃至１μｍの範囲が好ましく、さらに好ましくは、ナノギャップ間隙の櫛形電極を考慮すると、固定される導電性粒子の大きさは、１ｎｍ乃至１００ｎｍの範囲である。
【００２７】
粒子固定生体分子レセプターに固定されるナノ粒子は、電気伝導性を有するナノ粒子であって、半導体と金属などの物性に関係なく採択することができるが、金ナノ粒子のような金属ナノ粒子が好ましい。ナノ粒子の大きさに制限はないが、ナノギャップ素子のギャップ間隙と同等あるいは小さいものを使用して、最も好ましくはギャップ間隙より少し小さいものを使用する。
【００２８】
前記粒子固定生体分子レセプターとして抗体を選択する場合、ポリクローナル抗体(polyclonal antibody)を使用することが好ましく、導電性粒子を結合させるための濃度と時間などの反応条件は、公知の通常の方法を採用することができる。
【００２９】
一方、センサー固定生体分子レセプターと基板は、自己組み立て層(Self Assembled Monolayer、SAM)のような連結分子層により固定できて、ＳＡＭ分子の選択は、場合によって異なってくるが、ほとんどの場合、抗体に存在するアミン基と結合するために、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨなどの官能基を有する分子を選択することが好ましい。
【００３０】
櫛形電極とセンサー固定生体分子レセプターが位置する基板は、前記生体分子レセプターを固定でき、電気的絶縁性を備えたものであれば可能であって、前記電気的絶縁性物質は、好ましくは酸化物系を使用して、さらに好ましくは、シリコン酸化物を使用する。
【００３１】
前記固定された電導性粒子が第１電極及び第２電極間で密着しブリッジをなして電気的に導通するように、前記第１電極及び第２電極の高さは、基板に固定された前記生体分子レセプターの高さより大きいことが好ましいが、前記第１電極及び第２電極の高さが生体分子レセプターの高さより小さくても可能である。
【００３２】
第１電極及び第２電極の表面には、非特異的結合によるタンパク質などの吸着防止のためにタンパク質吸着防止層が備えられて、前記吸着防止層は、グリコール(glycol)系化合物などの親水性分子を使用することが好ましい。
【００３３】
本発明による櫛形電極は、リソグラフィー法、印刷法及び接触プリント法から選択された方法によりパターニングされたものを採用することができて、この場合、電極の間隙は、０．５ｎｍ〜１μｍの範囲である。しかし、生体分子の大きさと第１電極及び第２電極間の電導性粒子のブリッジ形成などを考慮すると、前記第１電極と第２電極の間隙は、１ｎｍ〜１００ｎｍのナノギャップであることが好ましく、本発明者らが大韓民国特許出願第２００６−００３９５２８号として出願したナノギャップ電極の製造方法に基づいて製造することができる。
【００３４】
即ち、本発明によるナノギャップを有する電極は、リソグラフィー法、印刷法及び接触プリント法などにより櫛形に金属パターンを形成した後、形成された前記櫛状の金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元反応により還元された金属を成長させることにより製造されて、詳細には、金属イオンの含まれた溶液に、櫛状の金属パターンが形成された基板を浸漬した後、前記溶液に還元剤を加えると、金属パターンの表面に、溶液中の金属イオンから還元された金属を成長させることにより製造される。
【００３５】
前記金属パターンは、導電性を考慮し、Ａｕ、Ａｇ、Ａｌ、Ｃｕ及びＰｔから選択されることが好ましく、前記還元剤は、ヒドロキシルアミン(HN4OH)、アスコルビン酸、ブドウ糖、ロッシェル塩、ホルムアルデヒド及びその混合物から選択されることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明による櫛形電極センサーを利用して分子を検出する方法に係わる概念図である。
【図２】本発明による櫛形電極センサーに備えられる大面積櫛形電極の例示図である。
【図３】測定対象試料に抗原が存在する時の櫛形電極の電子顕微鏡写真である。
【図４】測定対象試料に抗原が存在しない時の櫛形電極の電子顕微鏡写真である。
【図５】測定対象試料に抗原が存在する時、本発明によるバイオセンサーの電気特性測定結果である。
【図６】測定対象試料に抗原が存在しない時、本発明によるバイオセンサーの電気特性測定結果である。
【図７】本発明によるバイオセンサーのそれぞれの櫛形電極センサーユニットのｏｎ−ｏｆｆ信号から濃度を測定する概念図である。
【図８】電気特性変化信号を示す素子の比率と抗原の濃度の相関関係を示したグラフである。
【図９】本発明による生体分子を定量分析するまた他の方法に係わる概念図である。
【図１０】図１の測定方法(a)及び図９の測定方法(b)による高濃度及び低濃度領域における電気特性変化信号を示す素子の比率と抗原の濃度の相関関係を示した概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明の好ましい実施例を参照して説明するが、該当の技術分野において熟練した当業者にとっては、特許請求の範囲に記載された本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で、本発明を多様に修正及び変形できることが理解できるだろう。
【００３８】
(実施例)
表面に酸化膜が形成されたシリコン基板を使用して、フォト（photo）及び電子ビーム(e-beam)リソグラフィー方法を利用し、７０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の間隙を有する大面積ＩＤＥ(interdigitated electrode)形態の櫛状の金パターンを形成した後、化学的な還元方式によりギャップ狭小化過程を経て、５０ｎｍ内外の間隙を有する櫛形電極が８個集積されたバイオセンサーを３つ製作した。
【００３９】
化学的還元方法によるギャップ狭小化は、パターンが形成された基板を３６μＭ濃度のＨＡｕＣｌ４水溶液１１ｍＬに浸漬した後、６４０μＭ  ＮＨ２ＯＨ水溶液１ｍＬを加えた後、２７℃で２分間反応させる過程を４回繰り返して多重金パターン表面に金を成長させ、櫛形電極センサーユニットが集積されたナノギャップ素子を製造した。
【００４０】
次に、上記のように製作した櫛形電極センサーユニットの櫛形電極間に基板が露出したナノギャップ領域に連結分子層を形成した後、抗原と選択的に結合する抗体を導入して活性表面を形成した。使用した抗体は、ａｎｔｉ−ＰＳＡであって、前立腺癌の指標物質であるＰＳＡ(prostate specific antigen)と選択的に結合する抗体であった。
【００４１】
まず、抗原を付着するために、ナノギャップ領域に連結分子を使用して分子膜を形成する作業を行った。ナノギャップ領域(シリコン酸化膜)は、櫛形電極部分(金)と異なる物質から形成されて、選択的な分子膜導入が可能である。ナノギャップ領域に金ナノ粒子の選択的な結合を誘導するために、製作されたナノギャップ素子を２，５，８，１１−テトラオキサドコサン−２２−チオール(2,5,8,11-tetraoxadocosane-22-thiol)の１ｍＭエタノール溶液に１０分間浸しておいて、金電極表面上にエチレングリコール基(ethyleneglycol(EG)group)を形成した。
【００４２】
次に、ナノギャップ領域に存在するＳｉＯ２表面に抗原を選択的に付着する。まず、Ｏ２プラズマ(plasma)処理をして表面を活性化した後、ＡＰＴＥＳ(aminopropyltriethoxysilane)を利用して、−ＮＨ２末端を有する分子膜を形成した後、１％グルタアルデヒドバッファー(glutaaldehyde buffer)溶液(0.1M sodium phosphate buffer, pH=7.0)に３０分間処理して、ＡＰＴＥＳで形成した分子膜とアルデヒド基(aldehyde group)を結合させて、結合に参与しなかった残りのアルデヒド基が露出した表面を形成した。
【００４３】
ナノギャップ表面に形成されたアルデヒド表面を５０ｍｇ/ｍＬ内外の濃度を有する単クローン抗体のバッファー(buffer)溶液(10 mM PBS buffer, pH=7.4)に浸すと、単クローン抗体内部のlysine peptideに存在する−ＮＨ２と表面のアルデヒド基が効果的に反応し、表面に抗体が固定される。その後、反応せずに残っている−ＣＨＯ基は、０．１Ｍグリシンバッファー(glycine buffer)(pH=8.0)に３０分間処理して抑制した。
【００４４】
このように形成されたバイオセンサーのＩ−Ｖ特性を、−１００ｍＶ〜１００ｍＶ以内の低い電圧範囲内で前もって測定した。
【００４５】
測定対象であるＰＳＡを含む溶液とＰＳＡを含まない比較試料にそれぞれ１時間内外に接触させた後、ナノ粒子の一つ当り１〜１０個程度の比率でポリクローナルａｎｔｉ−ＰＳＡを付着した１０〜４０ｎｍ内外の金ナノ粒子溶液に反応させた。次に、非特異的吸着などによる誤謬の可能性を最小化するために、 バッファー溶液や脱イオン水で洗浄する過程を行って、最終的に窒素などを使用してナノギャップバイオセンサーとそのアレイをきれいに乾燥した後、再び電気伝導度を測定した。この電気伝導度測定結果と、先の測定対象試料処理以前の電気伝導度測定結果を比較し、電気伝導度の変化有無を確認した。高い電圧により加えられる抗体の変形や、電界移動の誘発など、測定の誤謬を生じる可能性を最小化するために、電圧の強度を−１００ｍＶ〜１００ｍＶ以内に小さく設定した。
【００４６】
測定対象試料の濃度に関する定量測定のためには、集積された素子の中、電気伝導度が変わるセンサー(ｏｎセンサー)の比率と試料の濃度に対する基準曲線を得て、これから未知試料に対する濃度決定を行う。濃度とｏｎセンサーの比率間の関係式は、比例常数を必要とするが、比例常数値をセンサーアレイ毎の動作領域(dynamic range)から求めて、この領域内の測定に活用する。センサーアレイの動作領域は、ナノギャップの間隙と形状ナノ粒子の大きさ、抗原−抗体の種類及び表面固定処理方式などにより変化すると予測される。濃度測定の信頼度は、単位センサーの感度が高く、領域が小さくて高集積されているほど高くなる。
【００４７】
以下、図面を参照し、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の通常の知識を有した者に、本発明の思想が十分伝わるようにするための例として提供されるものである。したがって、本発明は、以下説明する実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。なお、図面において、層及び領域の長さ、厚さなどは、便宜のために誇張して表現した部分もあり得る。また、同一な構成要素には同一な符号を付する。
【００４８】
図１は、本発明による櫛形電極バイオセンサーを利用して分子を検出する方法に係わる概念図である。
【００４９】
図１を参照すると、本発明による櫛形電極バイオセンサーは、櫛状に対向するように基板上に櫛形電極パターンを形成して(a)、前記櫛形電極パターンを還元反応によりナノギャップ櫛形電極に形成(b)した後、前記ナノギャップ櫛形電極間に露出した基板上に、連結分子層(Self Assembled Monolayer)を媒介としてセンサー固定生体分子レセプターを固定(c)してバイオセンサーを製造した後、試料液を前記バイオセンサーと接触させて、前記センサー固定生体分子レセプターと特異的結合をする生体分子が結合(d)された後、前記生体分子と特異的結合をする電導性ナノ粒子が固定された粒子固定生体分子レセプター(センサー固定生体分子レセプターと同一)が結合することにより、第１電極と第２電極が電気的に導通(e)するようになる。
【００５０】
図２は、低い濃度の抗原の迅速な検出のために、本発明による櫛形電極センサーの電極間隙を５〜数十ｎｍに維持しながらも、櫛形電極領域の全体長さを大きくして、ナノ粒子の固定が可能な領域を広げた、互いに噛み合った形態の大面積櫛形電極(Interdigitated electrode)の例示図であって、本発明による櫛形電極は、第１電極と第２電極が一定間隔を維持して互いに反復交差する構造として互いに対向するように位置して、第１電極と第２電極の対向する面積を増大させる形状である。
【００５１】
ここで、二つの電極間の露出した基板領域は、生体分子と特異的結合をするセンサー固定生体分子レセプターを固定した領域であって、この領域の面積が広くなるにつれて、比較的低い濃度の試料に対しても、測定時間を減らすことが可能になる。この構造のナノギャップ素子は、一般的なパターニング方法により形成することもできるが、歩留まりを高めてコストを節減するために、化学的、電気化学的、あるいは物理的なギャップ間隙の狭小化段階を含むことができる。この際、活性表面の領域面積を大きくする方法としては、ナノギャップセンサーを高集積する方法を利用する方法を選択することもできる。
【００５２】
図３と図４は、測定対象試料に抗原が存在する時と存在しない時における櫛形電極の電子顕微鏡写真であって、電導性粒子の固定有無を確認するために、大面積櫛形電極センサーユニットの一部分領域が拡大されたものを示した。図３は、ギャップ狭小化過程を経て５０ｎｍ内外の間隙を有するナノギャップ電極間に多数のナノ粒子が捕獲されていることを示す。これは、測定対象試料に含まれている抗原が、ナノギャップ電極の表面に付着された抗体により捕獲された後、前記抗原に再び電導性ナノ粒子が固定された抗体と結合し、結果的にナノ粒子が固定されて表れた結果である。図４は、抗体と選択的結合をする抗原を含んでいない試料を使用したことを除いては、図３の場合と同様に行ったナノギャップ櫛形電極センサーユニットの試料測定後の電子顕微鏡写真である。この場合、測定対象試料が、選択結合のできる抗原を含んでいないことで、ナノ粒子の固定が起こらなかったことを確認することができる。
【００５３】
櫛形電極の間隙に電導性粒子が固定された粒子固定生体分子レセプターにより、二つの電極間の電気伝導度の変化を誘発するが、図５と図６は、粒子固定生体分子レセプターの結合有無によるナノギャップセンサーの電気伝導度変化有無を示すグラフである。
【００５４】
図５は、本発明によるバイオセンサーと生体分子(抗原)試料の接触前後のＩ−Ｖグラフであって、生体分子と結合した粒子固定生体分子レセプターにより電気伝導度が増加することを示す。生体分子の接触後、Ｉ−Ｖグラフが比較的一定な傾きを有することから、金属性電導性ナノ粒子が媒介された電子輸送現象により電気伝導度が増加したことを間接的に確認することができる。
【００５５】
図６は、測定対象試料に生体分子が存在しない時、バイオセンサーの試料の接触前後のＩ−Ｖグラフの変化を示したものである。図５と異なって、試料内に生体分子が存在しないと、電気伝導度の変化が起こらないことを示す。
【００５６】
図７は、測定対象物質の有無を判断するｍ個の行とｎ個の列からなる櫛形電極センサーユニットを集積して、前記センサーユニットのｏｎ−ｏｆｆ程度を示す電気伝導度の統計から測定対象物質の濃度を誘導する方式を説明する概念図である。
【００５７】
図８は、電気特性変化信号を示す素子の比率と抗原の濃度の相関関係を示したグラフであって、ナノギャップバイオセンサーに対して、抗原濃度による電気伝導度変化を起す櫛形電極センサーユニットの比率を点で示し、下記式を利用して得られたグラフを点線で示したものであって、実験結果と式による予測結果が一致することが分かる。
Ｐｏｎ＝Ａ−Ｂｅｘｐ（−ｋＣ）
[ＡとＢは、素子の不完全性、ナノ粒子の固定効率、非特異的接合などの要因により生じ得るセンサーの非正常挙動を反映する常数]
【００５８】
図９は、本発明によるまた他の生体分子を定量分析する方法に係わる概念図で、図１に示した方法とは反対の測定段階を経るものであって、図９を参照して詳細に説明すると、以下のようである。
【００５９】
本発明によるバイオセンサー(a)に測定対象生体分子を含む試料液を接触させて、基板上に固定されたセンサー固定生体分子レセプターに生体分子を捕獲させて(b)、導電性粒子の固定されたまた他の生体分子を前記バイオセンサーに接触させ、前記測定対象生体分子が捕獲されていないセンサー固定生体分子レセプターに、導電性粒子が固定されたまた他の生体分子を捕獲させて、前記導電性粒子により第１電極と第２電極が電気的に導通(c)するようにすることにより、電気的に導通された前記櫛形電極センサーユニットの数または導通されなかった前記櫛形電極センサーユニットの数を測定することで、試料液中の生体分子を分析することができる。前記図９に示された測定方法は、図１０の(b)に示されたように、高濃度領域における生体分子測定時に有用に使用できる測定方法であって、図１の方法により生体分子を定量分析する場合(図１０の(a))、生体分子の濃度が高濃度である場合に生じる感度低下の問題を克服できる測定方法である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によるバイオセンサーは、分子認識に基づいた物質検出技術の開発から、疾病の早期診断キット、環境モニタリングシステム、公衆保健及び衛生監視装置、対テロ及び対化生放戦センサーシステム及びセンサーキットの開発などの多様な分野に寄与できる。本発明は、血液などの試料の前処理技術と最適化された表面制御技術、信号の複合処理技術と結合し、最上の性能を具現することができて、より簡便で且つ大量生産が可能な長所がある。
【００６１】
また、ナノギャップ素子の検出感度を維持しながら、検出時間を短縮するために、ナノギャップ素子のギャップ間隙は減らしながらも、ナノギャップの表面積は大きくした大面積ナノギャップ素子を製作して、高濃度及び低濃度領域において、少ない量の生体分子を短時間内に検出できる効果がある。
【図１】
2009543090.tif 000003
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2009543090.tif 000012
【国際調査報告】
2009543090.tif 000013
2009543090.tif 000014
2009543090.tif 000015