(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドと両親媒性カチオン性分子（Ｉ）を含む形質導入組成物に関する。式中、ＸはＮ−Ｒ１、Ｓ、Ｏ；Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキル基、ヒドロキシル化Ｃ３−Ｃ６アルキル基；Ｒ２、Ｒ３はＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、またはＲ２とＲ３がヘテロ環を形成する；ＥはＣ１−Ｃ５アルキルスペーサー；Ｒ４とＲ５はＣ３−Ｃ６シクロアルキルを含んでいてもよい、飽和もしくは不飽和の、直鎖もしくは分枝のＣ１０−Ｃ３６の炭化水素またはフルオロ炭素鎖；Ａ−は生物適合性アニオンである。本発明は培養において、エキソビボまたはインビボにおいて、真核細胞にオリゴヌクレオチドを送達する活性を有する組成物に関し、ＲＮＡ干渉に活性なオリゴヌクレオチドを含有してなる形質導入組成物に関する。該組成物は生物学的研究の手段または治療用薬物として使用できる。  【化１】2009532056.tif 000046
2009532056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子サイレンシングに活性なオリゴヌクレオチド、および式（Ｉ）：
【化１】
2009532056.tif 000041
［式中、
ＸはＮ−Ｒ１、ＳまたはＯであり、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキル基またはヒドロキシル化Ｃ３−Ｃ６アルキル基である；
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、ＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲ２とＲ３が一緒に結合して、飽和もしくは不飽和の環または５個もしくは６個の元素を有するヘテロ環を形成する；
ＥはＣ１−Ｃ５アルキルスペーサーである；
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルを含んでいてもよい、飽和もしくは不飽和の、直鎖もしくは分枝のＣ１０−Ｃ３６の炭化水素またはフルオロ炭素鎖を表す；
Ａ−は生物適合性アニオンである］
で示される両親媒性カチオン性分子とを含有してなる形質導入組成物。
【請求項２】
Ｒ２およびＲ３が一緒に結合して形成される当該へテロ環が飽和または不飽和であり、５個または６個の元素を有し、Ｃおよびヘテロ原子としてＮ、ＳまたはＯを含有してなる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ４およびＲ５がＣ１４−Ｃ３６の炭化水素鎖であり、ＥがＣ１−Ｃ４アルキルスペーサーである請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ４およびＲ５が同一である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ４およびＲ５がＣ１８アルキル基であり、ＥがＣ１アルキルである請求項３記載の組成物。
【請求項６】
Ｒ４およびＲ５がＣ１６アルキル基であり、ＥがＣ４アルキルである請求項３記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ４およびＲ５が異なっている請求項３記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ４およびＲ５がＣ１８およびＣ１７アルキル鎖であり、ＥがＣ２アルキルである請求項７記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ４およびＲ５がそれぞれＣ３２およびＣ１８アルキル基であり、ＥがＣ１アルキルである請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ２およびＲ３がＨであるか、または一緒に結合して芳香環を形成する請求項３ないし９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＸがＮ−Ｒ１であり、Ｒ１がＣＨ３である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＸがＳまたはＯである請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
Ａ−がＣｌ−またはＯＨ−である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
中性コリピドにより製剤化した請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
該コリピドが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などのホスファチジルエタノールアミン誘導体、またはコレステロールである請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
当該オリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉に対して活性である請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
当該オリゴヌクレオチドがsiＲＮＡである請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
当該オリゴヌクレオチドまたはsiＲＮＡが、それぞれ、分解に対するそれらの安定化のための基を含んでなり、当該基が、デオキシヌクレオチドなどの修飾された類似体(analogs)により置換されたプリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、および／または、糖−もしくは骨格修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチド類似体からなる群より選択されるものである請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
当該オリゴヌクレオチドまたはsiＲＮＡが、それぞれ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、メチルホスホネート、モルホリノホスホロジアミデート、ホスホロチオエート、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’アルキルヌクレオチド類似体などを含む請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の組成物を細胞内に導入することを特徴とする生細胞のインビトロまたはエキソビボ形質導入方法。
【請求項２１】
遺伝子サイレンシングを仲介するために、ナノモルおよびさらに低いピコモルのsiＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド濃度を使用することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養のため、接着性または非接着性細胞両方のため、機能的ゲノム、標的バリデーションおよび治療適用のための請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
血清の存在下に適用される形質導入(transfection)プロトコールを用いる請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
逆形質導入手法を実施する場合のＨＴＳ適用を仲介するための請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
薬物として使用するための請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
当該組成物が、医薬的に許容される不活性担体と組合せ(association)られており、経口、全身、または局所ルートによる投与に適した形状にあるものである請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
遺伝子による遺伝病または複雑な遺伝子疾患の原因となる、またはそれに関与する１種以上の標的タンパク質の発現に対し調節作用を誘発する請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
癌、ウイルス感染、または寄生虫感染を処置するための請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
中性の形状にある式（Ｉ）の両親媒性物質を塩誘導体に精製変換する方法であって、反応媒体からメタノール／水／酸中に選択的に沈殿させることによる方法。
【請求項３０】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の式（Ｉ）で示される両親媒性カチオン性分子の合成方法であって、
−  分枝長鎖を構築すること（その炭化水素部分は、エステルまたはアルデヒドへのグリニヤールカップリング反応により説明されるような古典的なＣ−Ｃカップリング法により得られる；合成された疎水性部分は、式（ＩＶ）：
ＨＯ−Ｅ−Ｒ４（Ｒ５）  （ＩＶ）
で示されるような一級または二級アルコールを含む）；
−  式：ＭｓＯ−Ｅ−Ｒ４（Ｒ５）（Ｖ）のメタンスルホニル誘導体および／またはハロゲン誘導体などの他の古典的な活性化誘導体に変換することによりアルコール官能基を活性化すること；
−  当該活性化誘導体、取分けメタンスルホニル誘導体を、式（ＶＩ）：
【化２】
2009532056.tif 000042
（式中、ＸはＮ−Ｒ１、ＳまたはＯである）
で示されるヘテロ環と、特定の条件下で反応させて、（Ｉ）を得ること；
【化３】
2009532056.tif 000043
または当該メタンスルホニル誘導体（Ｖ）と、式（ＶII）：
【化４】
2009532056.tif 000044
で示されるヘテロ環とを特定の条件下で反応させて、式（ＶIII）：
【化５】
2009532056.tif 000045
で示されるヘテロ環を得ること；
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド、特にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に導く短鎖干渉ＲＮＡ（以後、siＲＮＡという）を、培養にて、エキソビボまたはインビボにて、真核細胞に送達する手段、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍＲＮＡレベルでの遺伝子サイレンシングのための強力な技術であり（Fire, 1999) (Tuschl et al., 1999)、配列特異的ｍＲＮＡの分解およびタンパク質産生の阻害を規定する（Yang et al., 2000；Zamore et al., 2000；Hammond et al., 2000；Parrish et al., 2000）。ＲＮＡｉは、短鎖dsＲＮＡ活性配列の予測可能な設計による、また特異的ｍＲＮＡの標的化による非常に有効な生化学的方法である。細胞原形質に形質導入により送達ベクターを導入する場合、siＲＮＡは様々な哺乳動物細胞において、外因性または内因性遺伝子を効率的に沈黙させることが示されている(Elbashir et al., 2001)。
【０００３】
短鎖干渉ＲＮＡは、好ましくは１９ないし２９個の範囲のヌクレオチド、特に１９〜２３個のヌクレオチドの長さをもつ短い二本鎖ＲＮＡ（dsＲＮＡ）（参照：特許 WO 0244321, WO 01/075164 A3, EP20010985833; 文献：Siolas et al., 2005；Kim et al., 2005）であり、哺乳動物細胞培養系においてＲＮＡｉ活性を示す（Parrish et al., 2000；Elbashir et al., 2001；Tuschl, 2001）。短鎖dsＲＮＡは、塩基対合して、それが非対合の３’オーバーハング末端をもつ場合、配列特異的ｍＲＮＡ分解のガイドとして作用する。最も有効な短鎖dsＲＮＡは、１〜３個、特に２個のヌクレオチド３’−オーバーハングがdsＲＮＡの両端に存在するように対合した２つの２１ヌクレオチドの長鎖から構成されていた（Elbashir et al., 2001）。
【０００４】
ＲＮＡｉの成功は、dsＲＮＡの長さ、配列および化学構造、ならびに細胞送達システムの両方に依存する。アンチセンスまたはリボザイム技術に比較した場合、標的ｍＲＮＡの二次構造は、siＲＮＡによる遺伝子発現阻害にとっての強力な制限因子ではない。多くのsiＲＮＡ配列は、所定のｍＲＮＡ標的に対して有効であり得る。従って、siＲＮＡ二重鎖の安定性と生物利用能、ならびに細胞に送達されるdsＲＮＡの量、特に細胞質中の量は、siＲＮＡによる標的接触性よりも、むしろ効率的なサイレンシングにとっての制限因子となる。
【０００５】
多くの送達システムがオリゴヌクレオチドの細胞への導入に有用である。現在、カチオン性脂質仲介形質導入に基づく非ウイルスベクター、例えば、オリゴフェクタミン、トランスＩＴ−ＴＫＯ（TRANSIT-TKO）、リポフェクタミン２０００、Ｓｉガイド、ＲＮＡｉフェクト、ハイパーフェクト、またはジェットＳｉなどは、siＲＮＡ送達用として市販されている。カチオン性ポリマーに基づくシステムと対照的に、カチオン性脂質は、早期のエンドソーム破裂とホスファチジルセリンとの複合体形成に続いて、脂肪質中で核酸を放出することが示された（Zelphati and Szoka, 1996）。
【０００６】
非ウイルス性ベクターシステムは、都合のよいことに、カチオン性脂質−またはポリマーもしくはペプチド−に基づく送達試薬から構成されている。非ウイルス性ベクターシステムは、少なくとも１つの送達試薬、および製剤を安定化し、細胞、組織もしくは臓器を標的とし、または形質導入効率を上昇させる追加の成分を含んでなる製剤である。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、カチオン性脂質グループに属する新規種の非ウイルス性形質導入剤について記載するものであり、特に、小型のオリゴヌクレオチドの形質導入に適用されるものである。取分け、小分子とオリゴヌクレオチドとの特異的相互作用が、新規種の形質導入剤を設計するようにと、我々に働きかけた。
【０００８】
多くの分子が二本鎖オリゴヌクレオチド（dsＯＮ）に結合する。それらはその結合様式に関して３つの種類に分類し得る：
１）キナクリンまたは臭化エチジウムにより例示される重層した塩基対間の相互作用；
２）ポリアミンであるスペルミンまたはスペルミジンで観察されるオリゴヌクレオチド骨格からのヘテロ原子との静電気的Ｈ−結合相互作用；
３）小溝結合剤（ＭＧＢ）：ＤＮＡの深い小溝を満たし、主としてファンデルワールスとＨ−結合の相互作用により相互作用する拡大したヘテロ環状構造。かかるオリゴ−ヘテロ環状分子は、抗生物質ネトロプシン（Ｎ−メチルピロール含有オリゴペプチド）およびその類似体ジスタマイシンＡが最良の例示である（Cho and Rando, 2000）。
【０００９】
リボヌクレオチドへリックスは他と識別し得るいくつかの特徴を示す；相互作用も可能なままであるが、ファンデルワールスと静電気的結合様式は、深いがときには浅い主溝において優先的に生じる。
【００１０】
取分け、ネトロプシンの類似体を含むイミダゾールとして設計されたＡＲ−１−１４４などのトリ−イミダゾール結合剤（Yang et al., 1999）は、我々の注意を惹くものであった。ここでは、グアニンのＮ２アミノ基が、隣り合っているＩｍ／Ｉｍ対と分岐した水素結合を形成する（Yang et al., 1999）。分子の残りの部分は、親分子ジスタマイシンＡが示すように、その小溝内でより疎水性の相互作用を有すると思われる（Yang et al., 1999）。
【００１１】
ビスベンズイミダゾール色素ヘキスト３３２５８は、同様の既知の小溝結合剤であり、ＤＮＡのＡＴに富む配列に選択性を示す。また、このものは“バルジ”領域でＲＮＡに結合し、その場合、このものはＴＡＲ  ＲＮＡにおけるように、連続する塩基対が形成するポケットに嵌合する（Dassonneville et al., 1997）。
【００１２】
本発明者らは、形質導入効果が、対象のオリゴヌクレオチドを、小型リポソームとして中性のコリピドで安定的に製剤化した特異的両親媒性カチオン性分子と組合わせることにより得られることを見出した。
【００１３】
従って、本発明の目的は形質導入剤として有用な新規分子を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、形質導入に有用なこれら分子の組成物を提供することにある。
【００１５】
さらに別の目的は、当該両親媒性分子の合成経路および効率的な精製方法を提供することにある。
【００１６】
なお別の目的によると、本発明は培養により、またインビボで細胞に形質導入する方法に関する。
【００１７】
本発明はまた遺伝子疾患の原因となる、またはそれに関与する１種以上の標的タンパク質の発現に対し調節効果を誘発する医薬組成物として使用する組成物に関する。
【００１８】
本発明はまたかかる病理学的状態にある患者の処置方法に関する。
【００１９】
本発明によると、オリゴヌクレオチドの形質導入組成物用の薬剤、より詳しくは、ＲＮＡ干渉用の薬剤として有用な新規分子は、分子が細胞膜の脂質二層を通過するのを可能とする親油性部分に結合したオリゴヌクレオチドを結合させ得るカチオン性部分を含んでなる。
【００２０】
従って、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2009532056.tif 000003
【００２１】
［式中、
ＸはＮ−Ｒ１、ＳまたはＯであり、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキル基またはヒドロキシル化Ｃ３−Ｃ６アルキル基である；
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、ＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲ２とＲ３が一緒に結合して、飽和もしくは不飽和の環または５個もしくは６個の元素を有するヘテロ環を形成する；
ＥはＣ１−Ｃ５アルキルスペーサーである；
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、飽和もしくは不飽和の、直鎖もしくは分枝のＣ１０−Ｃ３６の炭化水素またはフルオロ炭素鎖を表し、当該鎖はＣ３−Ｃ６シクロアルキルを含んでいてもよい；
Ａ−は生物適合性アニオンである］
で示される両親媒性カチオン性分子に関する。
【００２２】
Ｒ２およびＲ３が一緒に結合して形成される当該へテロ環は、飽和または不飽和であり、５個または６個の元素を有し、Ｃおよびヘテロ原子としてＮ、ＳまたはＯを含有してなる。
【００２３】
本発明の好適な態様によると、式（Ｉ）におけるＲ４およびＲ５はＣ１４−Ｃ３６炭化水素基であり、ＥはＣ１−Ｃ４アルキルスペーサーである。
【００２４】
好適な基の場合、Ｒ４およびＲ５は同一である。
【００２５】
有利な分子において、Ｒ４およびＲ５はＣ１８アルキル基であり、ＥはＣ１アルキルである。
【００２６】
他の有利な分子において、Ｒ４およびＲ５はＣ１６アルキルであり、ＥはＣ４アルキルである。
【００２７】
別の好適な基の場合、Ｒ４およびＲ５は異なる。
【００２８】
対象分子において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、Ｃ１８およびＣ１７アルキルであり、ＥはＣ２アルキルである。
【００２９】
他の対象の分子において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、Ｃ３２およびＣ１８アルキルであり、ＥはＣ１アルキルである。
【００３０】
好ましくは、上記の基において、Ｒ２およびＲ３はＨであるか、または一緒になって芳香環、特にベンゾ基、またはピリジルもしくはピラジニル基などのヘテロ環を形成する。
【００３１】
取分け、ＸはＮ−Ｒ１であり、Ｒ１は例えばメチル基である。
【００３２】
あるいは、ＸはＳまたはＯである。
【００３３】
有利には、対イオンＡ−は、Ｃｌ−またはＯＨ−である。
【００３４】
本発明はまた、遺伝子サイレンシングに活性なオリゴヌクレオチドを形質導入する組成物に関する。一実施態様よると、本発明は、上記定義の両親媒性分子を、長期間の保存に安定な中性コリピドで製剤化した組成物に関する。
【００３５】
適切なコリピドは、ホスファチジル−エタノールアミン、例えば、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、脂質−ＰＥＧ接合体またはコレステロールなどである。
【００３６】
別の実施態様において、本発明はコリピドを添加せずに活性な両親媒性分子、取分け、分枝したＲ４またはＲ５をもつ分子に関する。
【００３７】
より詳しくは、本発明は中性脂質により製剤化した両親媒性部分に加えて、所望の生物学的作用に関わる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含有してなる形質導入組成物に関する。
【００３８】
従って、本発明は生細胞中にdsＯＮ（ds＝二本鎖；ＯＮ＝オリゴヌクレオチド）、取分けsiＲＮＡを導入するために適当な非ウイルス性送達システムを提供する。
【００３９】
当該オリゴヌクレオチドまたはsiＲＮＡは、それぞれ、分解に対し適切な基により安定化することが可能であり、当該基が、デオキシヌクレオチドなどの修飾された類似体により置換されたプリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、および／または、糖−もしくは骨格修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドなどの修飾されたヌクレオチド類似体からなる群から選択される。該オリゴヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体（Verma and Eckstein, 1998）、例えば、メチルホスホネート（Miller, 1991）、モルホリノホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（Zon and Geiser, 1991）、ＰＮＡ（Jepsen and Wengel, 2004）、ＬＮＡ、２’アルキルヌクレオチド類似体（Kurreck, 2003）などを含み得る。
【００４０】
本発明はまた、式（Ｉ）で示される分子の入手方法であって、反応媒体からメタノール／水／酸中に選択的に沈殿させることによって、中性形状にある式（Ｉ）の両親媒性物質を塩誘導体に精製変換する工程からなる方法に関する。
【００４１】
有利には、式（Ｉ）で示される分子の合成法は、
−  分枝長鎖を構築すること（その炭水化物部分は、エステルまたはアルデヒドへのグリニヤールカップリング反応により説明されるような古典的なＣ−Ｃカップリング法により得られる；合成された疎水性部分は、式（ＩＶ）：
ＨＯ−Ｅ−Ｒ４（Ｒ５）  （ＩＶ）
で示されるような一級または二級アルコールを含む）；
−  式：ＭｓＯ−Ｅ−Ｒ４（Ｒ５）（Ｖ）のメタンスルホニル誘導体および／またはハロゲン誘導体などの他の古典的な活性化誘導体に変換することによりアルコール官能基を活性化すること；
−  当該活性化誘導体、取分けメタンスルホニル誘導体を、式（ＶＩ）：
【化２】
2009532056.tif 000004
【００４２】
（式中、ＸはＮ−Ｒ１、ＳまたはＯである）
で示されるヘテロ環と、特定の条件下で反応させて、（Ｉ）を得ること；
【化３】
2009532056.tif 000005
【００４３】
または当該メタンスルホニル誘導体（Ｖ）と、式（ＶII）：
【化４】
2009532056.tif 000006
【００４４】
で示されるヘテロ環とを特定の条件下で反応させて、式（ＶIII）：
【化５】
2009532056.tif 000007
【００４５】
で示されるヘテロ環を得ること；
からなる。
【００４６】
当該式において、置換基は式（Ｉ）に関しての上記定義のとおりである。
【００４７】
ＸがＮ−Ｒ１を表す場合、当該方法はさらにＸについてのアルキル化工程、例えば、ヨウ化メチルによるＮのメチル化を含んでなる。
【００４８】
該アルコールＨＯ−Ｅ−Ｒ４（Ｒ５）（ＩＶ）は、そのメタンスルホニルエステルに変換することにより活性化する。ピリジンなどの溶媒中のアルコールの懸濁液は、塩化メタンスルホニルとの反応のために高濃度で使用し、有利に調製される。
【００４９】
スルホネート誘導体Ｍｓ−Ｏ−Ｅ−Ｒ４（Ｒ５）へのヘテロ環の付加は、反応混合物を約５０〜１００℃の温度、有利には約８０℃に加熱することにより、好ましく実施する。
【００５０】
反応混合物からの記載した両親媒性分子の精製、および生物適合性塩形状への変換は、特異的沈殿法により有利に実施される。かかる沈殿は、メタノールと水の混合物中への希釈、次いで、酸ＨＡにより酸性調整して、対応するＡ−塩（Ｉ）の沈殿を生成させることからなる。
【００５１】
沈殿は他のアルコール／水混合物、例えば、イソプロパノール／水混合物で実施することが可能であり、この混合物は塩酸で酸性とすることにより、塩酸塩などの相当する塩を得るために、水性酸で酸性とする。
【００５２】
リポソームはコリピドと式（Ｉ）の誘導体を有機溶媒に溶かし、この溶液を水に注入することにより調製する。
【００５３】
適切な有機溶媒はエタノールである。得られる水中リポソーム製剤は、有利には、約１１０ｎｍの粒径をもち、その粒径分布は狭い。
【００５４】
適切なsiＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドは、次いで、当該リポソーム製剤との複合体とする。
【００５５】
実施例に示すように、本発明の分子は、オリゴヌクレオチド、取分け、siＲＮＡを培養により真核細胞に送達するための特に効率的なシステムである。
【００５６】
従って、本発明はまた、遺伝子サイレンシングを仲介するオリゴヌクレオチド、特に、siＲＮＡ誘発ＲＮＡｉによる細胞の形質導入方法であって、細胞中に上記定義のような組成物を導入することからなる方法に関係する。
【００５７】
当該組成物は、何日間にもわたって、非常に低いsiＲＮＡ濃度、特に、ナノモルおよびさらに低いピコモル(nanomolar and down to picomolar)のsiＲＮＡ濃度で、選択的高度内在性遺伝子サイレンシング効率を提供する。このように得られる高度遺伝子サイレンシングは、多くの標的、例えば、ルシフェラーゼ、ヒトＧＡＰＤＨ、ヒト・ラミンＡ／Ｃ、またはマウス・ビメンチン遺伝子により例示され、副作用もしくは誤標的作用、または細胞毒性をもたない。
【００５８】
当該方法は、機能的ゲノム、標的バリデーションまたはインビボもしくはエキソビボ治療適用のために、培養真核細胞（接着性または非接着性細胞両方）と共に使用することができる。
【００５９】
本発明方法は、血清の存在下に、形質導入プロトコールを用いて実施し得る。
【００６０】
本発明方法は、逆形質導入手法を実施する場合に、遺伝子サイレンシングまたはsiＲＮＡもしくはオリゴヌクレオチドのＨＴＳ適用を仲介するために特に有用である。
【００６１】
有利なことは、上記定義の組成物が、遺伝子疾患の原因となる、またはそれに関与する１種以上の標的タンパク質の発現に、調節作用を誘発し得ることである。
【００６２】
従って本発明はまた、薬物として使用する上記定義のような形質導入組成物に関する。
【００６３】
当該組成物は、有利には、経口、全身、または局所ルートによる投与に適した形状にあり、医薬的に許容される不活性担体と組み合わされ得る。
【００６４】
当該組成物は、癌、ウイルス感染、または寄生虫感染の処置に特に有用である。
【００６５】
本発明の他の特徴と利点は、図１ないし１０を参照するとともに、以下の実施例に示す。
【００６６】
材料および方法：
化学試剤およびオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは化学的に合成し、ユーロゲンテック（Eurogentec）（ベルギー）によりＰＡＧＥ精製した。オリゴヌクレオチドは１ｘアニーリングバッファー（５０ｍＭ酢酸Ｋ、５０ｍＭ酢酸Ｍｇ）（ユーロゲンテック）中、９５℃で２分間アニールし、次いで室温で２〜４時間インキュベートした。ハイパーフェクトおよびサイレントフェクト試薬は、それぞれキアゲンおよびバイオラッド（米国）から入手した。トランスＩＴ−ＴＫＯおよびセント−レッド試薬は、それぞれミラスコーポレーション（Mirus Corporation）およびシンボラックス（Synvolux）から入手した。ＧＡＰＤＨ ＳＭＡＲＴプール（登録商標）試薬はダーマコン（Dharmacon）から入手した。
【表１】
2009532056.tif 000008
【００６７】
化学用試薬および出発原料はすべてシグマ−アルドリッチ（フランス）から購入し、あらかじめ精製することなく使用した。溶媒類はＳＤＳ−カルロエルバ（フランス）から取り寄せた。ジエチルエーテルは乾燥して、ナトリウムベンゾフェノン上で蒸留した。グリニヤール試薬用のマグネシウム削りくずは、フィッシャーサイエンティフィック（フランス）から購入した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、フルカ（シグマ−アルドリッチ）からのものである。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例１ないし７は表２に示す両親媒性分子の合成に関する。
【表２】
2009532056.tif 000009
【００６９】
ＭＯＮＩの合成：
二級長鎖アルコール１９−ヒドロキシヘプタトリアコンタンＳ３の合成：
【化６】
2009532056.tif 000010
【００７０】
Ｃ３７Ｈ７６Ｏ；ＭＷ＝５３７.００
マグネシウム削りくず（５８３ｍｇ、２４ｍｍｏｌｅ、ＭＷ＝２４.３１）を、冷凍管を備えたオーブン乾燥二頚反応容器に容れる。この金属削りくずに、予め乾燥ジエチルエーテル（２０ｍｌ、ナトリウムベンゾフェノン上で蒸留）に溶解した１−ヨードオクタデカン（７.６０８ｍｇ、２０ｍｍｏｌｅ、ＭＷ＝３８０.３９）をシリンジにより滴下する。添加に際し、エーテルの定常的還流を維持するために、反応液をファン（ヘアドライヤー）にて僅かに加熱する。反応混合物が灰色に変化したとき、有機マグネシウム試薬（グリニヤール試薬）の形成が始まっている。ヨードアルカン溶液の添加終了後、反応容器を油浴に入れて、反応混合物を加熱、エーテルの還流を１時間維持し、ヨードアルカンから対応するグリニヤール試薬への変換を推進する。
【００７１】
反応混合物を室温に冷やす；乾燥蒸留ジエチルエーテル（２５ｍｌ）に溶解したギ酸エチル（４４４.５ｍｇ、６ｍｍｏｌｅ、ＭＷ＝７４.０４）を２０℃で該グリニヤール試薬に滴下する。この添加により、反応液はわずかに昇温する。反応混合物を室温で１８時間攪拌し、長鎖グリニヤール試薬と該エステルとのカップリング反応を完結させる。
【００７２】
反応液を氷−メタノール（２００ｇ＋１００ｍｌ）に注ぎ、濃塩酸により酸性ｐＨとする。生成する固形物を濾取し、メタノールとアセトンで洗い、真空乾燥する。固形物は集塊を形成するので、これをジクロロメタンで洗い、次いで、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、再結晶する；１.５ｇの粗製のアルコールを６０℃で２５０ｍｌのＴＨＦに溶解する。この溶液はまだ熱い内に濾紙ディスクで吸引濾過する。濾液にアセトン（２００ｍｌ）を加えて最終二級アルコールを沈殿させ、これを濾取してアセトンで洗う。ＴＨＦ／アセトンでの沈殿生成によるこの精製方法を全量の粗製アルコールに適用する。
【００７３】
合計で３.１８ｇのアルコールを調製し、精製するが、これは５.９ｍｍｏｌｅ（ＭＷ＝５３７.００）に相当する。反応収率は消費されたヨードアルカンに基づくと６０％である（ギ酸エチルに基づくと９８％）。
【００７４】
最終の１９−ヒドロキシヘプタトリアコンタンは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより特性化し、その純度を確認する。
【００７５】
１９−ヒドロキシヘプタトリアコンタンＳ３の分析：
１Ｈ−ＮＭＲ（プロトンからの核磁気共鳴）ＣＤＣｌ３：０.９０ｐｐｍ（三重線、Ｊ＝７.０Ｈｚ，６Ｈ，両鎖の末端メチル）；１.２７ｐｐｍ（大きな多重線、６４Ｈ，脂肪アルキル鎖からのＣＨ２）；１.４５ｐｐｍ（幅広い多重線、４Ｈ，アルコールからベータ位のＣＨ２）；１.５８ｐｐｍ（ヒドロキシルから、および少量の水からの幅広いシグナル）；３.６０ｐｐｍ（多重線、１Ｈ，アルコールからアルファ位のＣＨ)。
【００７６】
メタンスルホン酸９−オクタデシル−ノナデシルＳ４の合成
（＝メシル化による二級アルコールの活性化）；Ｃ３８Ｈ７８Ｏ３Ｓ；ＭＷ＝６１５.０９
【化７】
2009532056.tif 000011
【００７７】
１００ｍｌの反応容器中、該二級アルコール（２.４２ｇ、４.５ｍｍｏｌｅ）の懸濁液を４５ｍｌの乾燥ピリジン中で調製する（高濃度が正しい変換のために重要である）。塩化メタンスルホニル（５.１５ｇ、４５ｍｍｏｌｅ）３.５ｍｌをシリンジにより少しずつ反応容器に加える。反応混合物は特に発熱することがないので、その添加は室温で実施し得る。塩化メタンスルホニルとの接触による白色懸濁液は、僅かに黄色に変わる。１時間後、反応液はより均一となり、ベージュ色に変わる。２４時間後、反応液は暗褐色となる。
【００７８】
反応混合物をメタノール２５０ｍｌに注ぐと、生成物が未反応のアルコールと共に沈殿する。
【００７９】
この沈殿を濾過単離し、メタノールで洗浄し、真空乾燥する。固形物を５００ｍｌのジクロロメタンに溶かす；その場合、メシル化生成物のみが可溶である；残りの未反応アルコールは濾紙で濾去し得る。
【００８０】
最終のメタンスルホン酸９−（オクタデシル）ノナデシルは、ジクロロメタンを完全に蒸発させることにより６９％収率で得られる（１.６３ｇ；２.６５ｍｍｏｌｅ：ＭＷ＝６１５.０９）。このものは１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより特性化する。
【００８１】
メタンスルホン酸９−（オクタデシル）ノナデシルの分析：
１Ｈ−ＮＭＲ（プロトンからの核磁気共鳴）ＣＤＣｌ３：０.９０ｐｐｍ（三重線、Ｊ＝７.０Ｈｚ，６Ｈ，両鎖の末端メチル）；１.２７ｐｐｍ（大きな多重線、６０Ｈ，脂肪アルキル鎖からのＣＨ２）；１.４０ｐｐｍ（以前のシグナル内の幅広リ多重線、４Ｈ，メシレートからのガンマ位のＣＨ２）；１.６９ｐｐｍ（幅広い多重線、４Ｈ，メシレートからのベータ位のＣＨ２）；３.０１ｐｐｍ（一重線、３Ｈ，メシレートからのＣＨ３）；４.７２ｐｐｍ（五重線、Ｊ＝６.１Ｈｚ，１Ｈ，メシレートからアルファ位のＣＨ)。
【００８２】
塩化１−メチル−３−（１−オクタデシル−ノナデシル）−３Ｈ−イミダゾール−１−イウム（＝ＭＯＮＩ）の合成：
【化８】
2009532056.tif 000012
【００８３】
Ｃｌ−  ；Ｃ４１Ｈ８１ＣｌＮ２；ＭＷ＝６３７.５５
反応は芳香族塩基による二級炭素原子上のメシルエステルの直接置換である。反応がゆっくりであるため、大過剰のメチルイミダゾールを溶媒として使用した。
【００８４】
メタンスルホン酸９−（オクタデシル）ノナデシル（１.６３ｇ、２.６５ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝６１５.０９）を冷凍管を取り付けた１００ｍｌの反応容器に導入した。メチルイミダゾール８０ｍｌを加え、メタンスルホン酸エステルが懸濁液を形成する。反応液を８０℃に６日間加熱する。結果、反応混合物がオレンジ色に変わり、均一となる。
【００８５】
室温に冷却した後、反応混合物を大きなフラスコに容れ、メタノール１５０ｍｌで満たす。この混合物を濾紙で濾過する。濾紙をメタノール８０ｍｌで洗う。少量の不溶性部分は殆どが未反応のメシルエステルであり、このものはＮＭＲ分析により識別し得る。取り扱いを容易にするために、この濾液を精製前に３等分する。
【００８６】
この混合物１００ｍｌにメタノール６００ｍｌを加え、再度濾紙で濾過する。次いで、水３００ｍｌを加える。この混合物は均一のままであり、これを少量の濃塩酸の添加により、ｐＨを調整しながら徐々に酸性とした。ｐＨが２〜３に落ちるまで添加を続けた。この混合物を室温放置すると、ゼラチン状の沈殿を形成する。沈殿を推進するために、混合物を１８時間５℃に維持した。最終の懸濁液を濾紙上に注ぎ、得られる固形物をアルコール混合物（７００ｍｌメタノール、１ｍｌの濃塩酸を含む３００ｍｌ無菌水）で洗い、再び濾過する。同じ手順を残りのメタノール相に適用する。
【００８７】
この方法で、粗製の塩化３−[９−(オクタデシル)ノナデシル]−１−メチル−３Ｈ−イミダゾリウム５１７ｍｇが得られる。
【００８８】
ＮＭＲスペクトルにより対照と比較すると、この固形物がメチルイミダゾールにより僅かに汚染されていることを示す。２回目の精製工程を適用する。
【００８９】
この固形物を６０℃で攪拌しながらメタノール７０ｍｌに溶解し、このメタノール溶液を傾斜により残りの固形物から分離する。この固形残渣は加温メタノールで２度目の洗浄をする。不溶性部分はＮＭＲスペクトルで明らかなように生成物とは異なっている。このメタノール溶液に、予め０.２ｍｌの濃塩酸で酸性とした無菌水６０ｍｌを加える。この溶液を室温でゲル化させ、沈殿完結のために１８時間５℃に放置する。ゲル様溶液を濾紙で濾過する。乾燥固形物をメタノールとジクロロメタンとの等量混合物（２５０ｍｌ）に再溶解し、次いで精製ジクロロメタン（２５０ｍｌ）を加える。溶媒の蒸発後、白色固体４８１ｍｇを得る。この手順は残りの反応混合物（２.２６ｍｍｏｌｅ；８５％収率；ＭＷ＝６３７.５５）について２回繰り返す。
【００９０】
ＮＭＲ分析は以前の不純物の存在しないことを示すが、最終産物について元素微量分析によりその純度を確認する。
【００９１】
分析：
ＣＤＣｌ３中のＮＯＮＩの１Ｈ−ＮＭＲ（プロトンからの核磁気共鳴）：
０.９０ｐｐｍ（三重線、Ｊ＝６.９Ｈｚ，６Ｈ，両鎖の末端メチル）；１.０９ｐｐｍ（多重線；２Ｈ、イミダゾリウム環からガンマ位置）；１.２７ｐｐｍ（大きな多重線、６２Ｈ，脂肪アルキル鎖からのＣＨ２）；１.８５ｐｐｍ（多重線、４Ｈ，イミダゾリウムからベータ位のＣＨ２）；４.１８ｐｐｍ（一重線、３Ｈ，イミダゾリウム環上のメチル）；７.０２ｐｐｍ（一重線、１Ｈ，イミダゾリウムのＣ４ＨまたはＣ５Ｈ）；７.１３ｐｐｍ（一重線、１Ｈ，イミダゾリウムからのＣ５ＨまたはＣ４Ｈ）；１１.１７ｐｐｍ（一重線，１Ｈ，イミダゾリウムからのＣ２Ｈ）。
【００９２】
ＣＤＣｌ３中の間接的１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＥＰＴ１３５；ＤＥＰＴ９０）：
ＣＨおよびＣＨ３は（−）であり；ＣＨ２は（＋）である；
１２３.１ｐｐｍ（−）（イミダゾリウムからのＣ２）；１１９.２ｐｐｍ（−）（イミダゾリウムからのＣ４および５）；６２.８ｐｐｍ（−）（Ｎ３上のメチル、イミダゾリウムから）；３６.９ｐｐｍ（−）（イミダゾリウムからのＮ１上のＣＨ）；３５.５ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；３１.９ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.７２ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.６７ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.６５ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.６０ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.５３ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.３８ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.３５ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２９.１５ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２５.９４ｐｐｍ（＋）（脂肪鎖からのＣ）；２２.７１（＋）（脂肪鎖からのＣ）；１４.１５ｐｐｍ（−）（脂肪鎖からのＣＨ３末端基）。
【００９３】
ＭＯＮＩの赤外線吸収（ＩＲ）スペクトル法：
吸収ピークはその波数（ｃｍ−１）とそのそれぞれの吸光度により特性化し、強（ｓ）、中度（ｍ）または弱（ｗ）とする：
３１３０（ｍ）；３０３５（ｓ）；２９５５（ｓ）；２９２０（ｓ）；２８５０（ｓ）；１５７０（ｓ）；１５６０（ｍ）；１４７０（ｓ）；１４３０（ｗ）；１３７５（ｗ）；１１６０（ｓ）；７５０（ｗ）；７２５（ｍ）。
【００９４】
このＩＲ吸収プロフィールは、報告されている塩化１−エチル−３−メチルイミダゾリウムのスペクトルに相当し、その化学構造と矛盾がない。
【００９５】
実施例２：塩化１−メチル−３−（１−オクタデシル−ノナデシル）−３Ｈ−ベンゾ−イミダゾール−１−イウム（ＭＯＮＢＩ）の合成：
メチルエチルケトン（ＭＥＫ）７ｍｌに溶かしたメタンスルホン酸９−（オクタデシル）ノナデシル（０.１ｍｍｏｌｅ）をベンズイミダゾール０.６ｍｍｏｌｅの存在下に３日間加熱する。溶媒を蒸発した後、粗製の産物をメタノール／ジクロロメタン勾配によるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。中性Ｎ１置換ベンズイミダゾール産物０.０１５ｍｍｏｌｅを単離し、これをＭＥＫ中、大過剰のヨウ化メチルにより、１日加熱しながらメチル化する。メチル化反応は定量的であり、メタノール／ジクロロメタン勾配によるシリカゲルクロマトグラフィーによる精製後、１０ｍｇのＭＯＮＢＩを与える。
【００９６】
ＣＤＣｌ３中のＮＯＮＢＩの１Ｈ−ＮＭＲ（プロトンの核磁気共鳴）：
０.８９ｐｐｍ（三重線、Ｊ＝６.９Ｈｚ，６Ｈ，両鎖の末端メチル）；１.２７ｐｐｍ（大きな多重線、６４Ｈ，脂肪アルキル鎖からのＣＨ２）；２.１ｐｐｍ（大きな多重線、４Ｈ，ベンズイミダゾリウム窒素からベータ位のＣＨ２）；４.３９ｐｐｍ（一重線、３Ｈ，ベンズイミダゾリウム環のＮ３上のメチル）；４.６５ｐｐｍ（ベンズイミダゾリウムＮ１に結合するＣＨ）；７.７２ｐｐｍ（多重線、４Ｈ，ベンゾ環プロトン）；１１.３７ｐｐｍ（一重線、１Ｈ，ベンズイミダゾリウムからのＣ２Ｈ）。
【００９７】
ここに反応工程図を示す：
【化９】
2009532056.tif 000013
【００９８】
実施例３：ＨＥＩＣの合成：
【化１０】
2009532056.tif 000014
【００９９】
２−ヘプタデシル−エイコサン酸（Ｙ１）の合成：
【化１１】
2009532056.tif 000015
【０１００】
Ｃ３７Ｈ７４Ｏ２；ＭＷ＝５５０.９８
１５ｍｌのＴＨＦ（ナトリウム−ベンゾフェノン上で蒸留）を容れた１００ｍｌのオーブン乾燥反応容器に、ジイソプロピルアミン（２.５６ｍｌ；１.８５ｇ；１８.２６ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１０１.１９）を導入し、アルゴン気流下に−７８℃に冷却する。ブチル−リチウム（１.６Ｍ／ＴＨＦ；１８.２６ｍｍｏｌｅ）１１.４ｍｌを滴下し、−７８℃で１０分間攪拌し、ＬＤＡ試薬形成完結のために０℃に昇温する。
【０１０１】
ＴＨＦ２０ｍｌに溶解したノナデカン酸（２.５ｇ；８.３７ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝２９８.５１）を反応混合物に０℃で滴下導入する。乾燥ＤＭＰＵ１.２ｍｌを加え（１.２４６ｇ；９.７２ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１２８.１８）、室温に昇温してジアニオン中間体を形成させる。
【０１０２】
選択的Ｃ−アルキル化は−５℃で１−ヨードオクトデカン（３.１５ｇ；８.２８ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝３８０.４）の付加により達成する。反応は室温で１８時間継続する。
【０１０３】
後処理：反応混合物を氷冷水１００ｍｌに注入し、４ｍｌの濃塩酸を加えて酸性とする。溶媒ＴＨＦを減圧下に蒸発させる；混合物を酢酸エチルで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４（無水）で乾燥する。減圧下に有機相を濃縮し、残渣の固形物をアセトンで再結晶して、白色粉末（４.２７１ｇ；７.７５ｍｍｏｌｅ；さらに精製することなく次工程で使用する)を得る。
【０１０４】
カルボン酸Ｙ１の分析：
ＴＬＣ分析：Ｒｆ＝０.５；溶媒：２０％酢酸エチル／ヘプタン；検出：バニリン／硫酸（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１０５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖の末端ＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，６２Ｈ，炭化水素鎖中のＣＨ２）；１．５０（大きな多重線，２Ｈ，酸からのベータ位のＣＨ２）；１.６３（大きな多重線，２Ｈ，酸からのベータ位のＣＨ２）；２.３８（多重線，１Ｈ，酸からのアルファ位のＣＨ）。
【０１０６】
２−ヘプタデシル−エイコサン−１−オール（Ｙ２）の合成：
【化１２】
2009532056.tif 000016
【０１０７】
Ｃ３７Ｈ７６Ｏ；ＭＷ＝５３７.００
乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ；ナトリウムベンゾフェノン上で蒸留）に酸Ｙ１（８４７ｍｇ；１.５３７ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝５５０.９８）を溶解する。ＴＨＦ中、ＢＨ３の溶液を０℃で滴下する（１Ｍ／ＴＨＦ；１０ｍｌ；１０ｍｍｏｌｅ）。反応液をＴＬＣ分析（溶媒：１０％酢酸エチル／ヘプタン）により選抜する。反応は２日間円滑に進行する。反応混合物をメタノール１００ｍｌに注入し、アルコール（１.１３５ｇ、粗製）を沈殿させる。シリカゲルクロマトグラフィー（勾配：酢酸エチル／ヘプタン：６％から１０％）により５１８ｇの純Ｙ２（６２％）を得る。
【０１０８】
アルコールＹ２の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.４；溶媒：１０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（青色）（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１０９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６．８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖からの末端ＣＨ３）；１.２７（大きな三重線，６６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；１.４６（大きな多重線，１Ｈ，アルコールからのベータ位ＣＨ）；３.５６（Ｊ＝５.５Ｈｚ，二重線，２Ｈ，アルコールからのアルファ位ＣＨ２）。
【０１１０】
メタンスルホン酸２−ヘプタデシルエステル（Ｙ３）の合成：
【化１３】
2009532056.tif 000017
【０１１１】
Ｃ３８Ｈ７８Ｏ３Ｓ；ＭＷ＝６１５.０９
ＣＨ２Ｃl２（１０ｍｌ；ＣaＨ２上で蒸留）に溶解したアルコールＹ２（６００ｍｇ；１.１１ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝５３７.０）を０℃に冷却する。この反応混合物に塩化メシル（０.５ｍｌ；７４０ｍｇ；６.４６ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１１４.５５）を導入し、トリエチルアミン（１ｍｌ、７２８ｍｇ；７.１９ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１０１.１９）を０℃で滴下し、室温で攪拌する。ＴＬＣ分析によると、反応は２時間後に完結する。反応混合物を減圧下で濃縮し、固形物をメタノールで洗い、過剰の試薬を除去する。濾取した固形物は、ＮＭＲ分析によると純品であり、５７０.６ｍｇのＹ３（０.９２８ｍｍｏｌｅ；８２.９％収率）に相当する。
【０１１２】
メシルエステルＹ３の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.６：溶媒：５０％ジクロロメタン／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（暗青色）（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１１３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖からの末端ＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，６６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；１.７２（多重線，１Ｈ，メシル酸エステルからベータ位のＣＨ）；３.０１（一重線，３Ｈ，メシル酸エステルのＣＨ３）；４.１０（Ｊ＝５.５Ｈｚ，二重線，２Ｈ，メシル酸エステルからアルファ位のＣＨ２）。
【０１１４】
塩化１−(２−ヘプタデシル−エイコシル)−３−メチル−３Ｈ−イミダゾール−１−イウム（ＨＥＩＣ）の合成：
【化１４】
2009532056.tif 000018
【０１１５】
Ｃ４１Ｈ８１ＣｌＮ２；ＭＷ＝６３７.５５
２−ブタノン（１０ｍｌ）中、メシル酸エステルＹ３（１５０ｍｇ；０.２４３ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝６１５.０９）およびＮ−メチルイミダゾール（２００ｍｇ；２.４３ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝８２．１０）を５日間８０℃に加熱する。ＴＬＣ分析によりメシル酸エステルの変換のスクリーニングが可能である。
【０１１６】
後処理：反応混合物から減圧下に溶媒を除去する。生成する粗製の産物をイソプロパノール１２ｍｌに溶かし、濾紙で濾過して未反応のメシル酸エステルを除去し、純水８ｍｌで希釈する。この混合物を塩酸でｐＨ＝２の酸性とする。両親媒性分子が５℃で塩酸塩として沈殿する。ＨＥＩＣ分子の沈殿は、大部分、イソプロパノール−水混合物を使用し、酸性とし、次いで、他の対象の両親媒性分子について記載したように、メタノール−水混合物を用いることによって容易となる。生成物は１４０００ｒｐｍ（０℃で１５分）での遠心分離により得る。得られる沈殿をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中、メタノール勾配）により精製し、０.１０３ｍｍｏｌｅ（収率：４２％）に相当する純品ＨＥＩＣ６６ｍｇを得る。
【０１１７】
両親媒性分子ＨＥＩＣの分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２５：溶媒：１０％メタノール／ジクロロメタン；ヨウ素蒸気により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１１８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.８９（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖の末端ＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，６６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；１.８８（多重線，１Ｈ，イミダゾリウムからベータ位のＣＨ）；４.１６（一重線，３Ｈ，メチルイミダゾリウムのＣＨ３）；４.２０（Ｊ＝７.２Ｈｚ，二重線，２Ｈ，メチルイミダゾリウムからアルファ位のＣＨ２）；７.１４（一重線，１Ｈ，メチルイミダゾリウムのＣＨ）；７.３４（一重線，１Ｈ，メチルイミダゾリウムのＣＨ）；１０.７４（一重線，１Ｈ，メチルイミダゾリウムのＣＨ）。
【０１１９】
１３Ｃ−ＮＭＲ：ｄｅｐｔ  １３５（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：
ＣＨおよびＣＨ３はマイナスピーク（−）を与える；
ＣＨ２はプラスピーク（＋）を与える；
四級炭素はｄｅｐｔ１３５で検出されない；
１３９.２（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；１２２．９（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；１２１.５（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；５４.０４（（＋），イミダゾリウムからアルファ位のＣ）；３８.８（（−），メチルイミダゾリウムのメチル−Ｃ）；３６.８（（−），イミダゾリウムからベータ位のＣ）；３１.９（＋）；３０.８（＋）；２９.７（＋）；２９.２（＋）；２６.２（＋）；２２.７（＋）（炭化水素鎖において異なるＣ）；１４.１（−），炭化水素鎖の末端メチルＣ。
【０１２０】
実施例４：ＨＥＭＢの合成：
【化１５】
2009532056.tif 000019
【０１２１】
１−(２−ヘプタデシル−エイコシル)−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（Ｂ１）の合成：
【化１６】
2009532056.tif 000020
【０１２２】
Ｃ４４Ｈ８０ＣｌＮ２；ＭＷ＝６３７.１２
２−ブタノン１０ｍｌに溶解したメシル酸エステルＹ３（１５０ｍｇ；０.２４３ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝６１５.０９）をベンズイミダゾール（２８７ｍｇ；２.４３ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１１８.１４）の存在下に、２３日間、８０℃に加熱する。カップリング反応をＴＬＣでスクリーニングし、メシル酸エステルＹ３のゆっくりとした変換を検出する。
【０１２３】
減圧下に溶媒蒸発して得られる粗製の固形物は、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中、メタノール勾配：１ないし４％）により精製する。ＵＶ陽性フラクションは純粋な化合物Ｂ１を３１ｍｇの収量（０.０４８ｍｍｏｌｅ；２０％収率）で与える。
【０１２４】
ベンズイミダゾール化合物Ｂ１の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.６５：溶媒：５％メタノール／ジクロロメタン；ＵＶ検出および／またはヨウ素蒸気（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１２５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，両炭化水素鎖の末端ＣＨ３）；１.２５（大きな多重線，６６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；１.８９（多重線，１Ｈ，ベンズイミダゾールからアルファ位のＣＨ）；４.１（Ｊ＝７.２Ｈｚ，二重線，２Ｈ，ベンズイミダゾールからアルファ位のＣＨ２）；７.３２（多重線，２Ｈ，芳香環系におけるＣＨ＝ＣＨ）；７.４１（多重線，１Ｈ，芳香環系におけるＣＨ）；７.８４（多重線，１Ｈ，芳香環系におけるＣＨ）；７.９３（一重線，１Ｈ，ベンズイミダゾール環におけるＣＨ）。
【０１２６】
塩化３−(２−ヘプタデシル−エイコシル)−１−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−１−イウム（ＨＥＭＢ）の合成：
【化１７】
2009532056.tif 000021
【０１２７】
Ｃ４５Ｈ８３ＣｌＮ２；ＭＷ＝６８７.６１
ヨードメタン（０.５ｍｌ；７.８５ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１４１.９４）をＢ１（１９.１ｍｇ；０.０２９９ｍｍｏｌｅ，ＭＷ＝６３７.１２）に加え、２−ブタノン１５ｍｌに溶かし、２４時間６０℃に加熱する。減圧下に溶媒を蒸発させた後、２４.１ｍｇの粗製産物を得る。塩素塩に変換するために、この固形物をメタノール２.８ｍｌに溶かし、１.２ｍｌのＨＣl（１８％）で酸性とする。塩素塩形は５℃で沈殿し、遠心分離（１４０００ｒｐｍで２０分間）により単離する。残渣はさらにジクロロメタン中のメタノール勾配によるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、１７.７ｍｇの純粋な産物ＨＥＭＢ（０.０２５７ｍｍｏｌｅ；８６％収率）を得る。
【０１２８】
両親媒性分子ＨＥＭＢの分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２：溶媒：１０％メタノール／ＣＨ２Ｃl２；ＵＶ検出および／またはヨウ素蒸気（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１２９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖の末端ＣＨ３）；１.２６（大きな多重線，６６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；２.１４（多重線，１Ｈ，メチル−ベンズイミダゾールからベータ位のＣＨ）；４.３５（一重線，３Ｈ，メチル−ベンズイミダゾリウムのメチル基ＣＨ３）；４.４９（Ｊ＝７.２Ｈｚ，二重線，２Ｈ，メチル−ベンズイミダゾールからアルファ位のＣＨ２）；７.７３（多重線，４Ｈ，ベンジル部分のＣＨ＝ＣＨ）；１１.４３（一重線，１Ｈ，イミダゾリウム部分のＣＨ）。
【０１３０】
１３Ｃ−NMR：ｄｅｐｔ１３５（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：
ＣＨおよびＣＨ３はマイナスピーク（−）を与える；
ＣＨ２はプラスピーク（＋）を与える；
Ｄｅｐｔ１３５は四級炭素を示さない；
１２７.１（（−），ベンゾ部分の２Ｃ）；１１２.８（（−），ベンゾ部分のＣ）；１１３.０（（−），ベンゾ部分のＣ）；５１.９（（＋），メチル−イミダゾリウム部分からアルファ位のＣ）；３８.１（（−），メチル−イミダゾリウムのＣＨ３）；３３.７（（−），メチル−イミダゾリウムからベータ位のＣ）；３１.９（＋）；３１.２（＋）；２９.７（＋）；２６.３（＋）；２２.７（＋）：炭化水素鎖のＣ；１４.１（（−），炭化水素鎖の末端メチル）
実施例５：ＨＥＴの合成：
【化１８】
2009532056.tif 000022
【０１３１】
１８−ヨードメチル−ヘキサトリアコンタン（Ｔ１）の合成：
【化１９】
2009532056.tif 000023
【０１３２】
Ｃ３７Ｈ７５Ｉ；ＭＷ＝６４６.９０
乾燥ＤＭＰＵ１５ｍｌに溶解したメシル酸エステルＹ３（５６０.６ｍｇ；０.９１１ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝６１５.０９）を６８２.５ｍｇのヨウ化ナトリウム（４.５５ｍｍｏｌｅ，ＭＷ＝１４９.８５）と共に２０時間７０℃に加熱する。
【０１３３】
反応混合物を水１０ｍｌで希釈し、ジエチルエーテルで３回抽出する。有機相をＭgＳＯ４で乾燥し、濾過、減圧下に溶媒を除去した。生成する固形物をヘプタンによるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、３６０.５ｍｇの純Ｔ１（０.５５７ｍｍｏｌｅ；６１.１％収率）を得る。
【０１３４】
ヨードアルカンＴ１の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.９５：溶媒：ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（青色スポット）（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１３５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，両鎖の末端ＣＨ３）；１.２８（大きな多重線，６６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；２.０１（多重線，１Ｈ，ヨードからベータ位のＣＨ）；３.２８（Ｊ＝４.５Ｈｚ，二重線，２Ｈ，ヨードからアルファ位のＣＨ２）。
【０１３６】
塩化３−(２−ヘプタデシル−エイコシル)−チアゾール−３−イウム（ＨＥＴ）の合成：
【化２０】
2009532056.tif 000024
【０１３７】
Ｃ４０Ｈ７８ＣｌＮＳ；ＭＷ＝６４０.５７
チアゾール（１８０ｍｇ；２.１１ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝８５.１３）をＴ１（１３６.９ｍｇ；０.２１１ｍｍｏｌｅ，ＭＷ＝６４６.９）と１０ｍｌの２−ブタノンからなる溶液に加え、反応混合物を２７日間８０℃に加熱する。減圧下に溶媒を蒸発させ、粗製の固形物をメタノールに溶かす；未反応のヨードアルカンを濾去する。希塩酸をメタノール溶液に加え（５ｍｌの４％ＨＣｌを１０ｍｌのＭｅＯＨ溶液に）、５℃に放置して両親媒性分子を沈殿させ、１４０００ｒｐｍ（３０分間）で遠心分離して集める。粗製の産物はさらに、ジクロロメタン中、メタノール勾配によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。陽性フラクションは２１ｍｇの純ＨＥＴ（０.０３３ｍｍｏｌｅ；１５％収率）を得る。
【０１３８】
両親媒性分子ＨＥＴの分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.４：溶媒：１０％メタノール／ジクロロメタン；ヨウ素蒸気により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１３９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.８９（Ｊ＝６.７Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖の末端ＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，６６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；２.０３（多重線，１Ｈ，チアゾリウムからベータ位のＣＨ）；４.６７（Ｊ＝７.４Ｈｚ，二重線，２Ｈ，チアゾリウムからアルファ位のＣＨ２）；８.２２（Ｊ＝１.２Ｈｚ，Ｊ’＝３.７Ｈｚ，二重線の二重線，１Ｈ，チアゾリウム環のＣＨ）；８.４０（Ｊ’＝３.７Ｈｚ，Ｊ”＝２.５Ｈｚ，二重線の二重線，１Ｈ，チアゾリウム環のＣＨｃ）；１０.８２（小さな二重線の二重線，１Ｈ，チアゾリウム環のＣＨ）。
【０１４０】
１３Ｃ−ＮＭＲ：ｄｅｐｔ１３５（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：
ＣＨおよびＣＨ３はマイナスピーク（−）として現れる；
ＣＨ２はプラスピーク（＋）を与える；
１６０（（−），チアゾリウム環のＣ）；１３６.７（（−），チアゾリウムのＣ）；１２７.３（（−），チアゾリウムのＣ）；６０.７（（＋），チアゾリウムからアルファ位のＣ）；３９.４（（−），チアゾリウムからベータ位のＣ）；３２.２（＋），３０.７（＋），２９.８（＋），２９.７（＋），２９.７（＋），２９.６（＋），２９.５（＋），２９.４（＋），２６.１（＋），２２.７（＋），炭化水素鎖のＣ；１４.１（（−），炭化水素鎖の末端メチルＣ）。
【０１４１】
実施例６：ＨＥＭＩの合成：
【化２１】
2009532056.tif 000025
【０１４２】
４−ヘキサデシル−エイコサン−１,４−ジオール（Ｌ１）の合成：
【化２２】
2009532056.tif 000026
【０１４３】
Ｃ３６Ｈ７４Ｏ２；ＭＷ＝５３８.９７
金属マグネシウム削りくず（１.６１８ｇ、６６.６ｍｍｏｌｅ、ＭＷ＝２４.３１）を、冷凍管を備えたオーブン乾燥二頚反応容器に容れ、アルゴン気流下に置く。乾燥ジエチルエーテル１０ｍｌに溶解したヨードヘキサデカン（１９.５５ｇ、５５.４８ｍｍｏｌｅ、ＭＷ＝３５２.３４）をこのマグネシウム削りくずに滴下する；この間、３０分間加熱還流する。反応混合物をさらに６０分間加熱すると、灰色に変わり、グリニヤール試薬が形成したことを示す。
【０１４４】
乾燥ジエチルエーテル５ｍｌに溶解したブチロラクトン（８００ｍｇ；９.２９ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝８６.０９）を有機マグネシウム試薬に０℃で滴下する。反応液を室温まで加温し、１８時間攪拌する。
【０１４５】
後処理：反応混合物を２００ｇの砕氷に注ぎ、水相を濃塩酸添加により酸性とする。得られる混合物をＣＨ２Ｃl２で抽出し、有機相を再度純水で洗う。減圧下に有機層を濃縮し、乾燥する。得られる固形物を加温ＴＨＦに溶解する。濃縮した混合物を冷却すると、不溶性の副生物が沈殿する。ＴＨＦを蒸発させた後、生成する固形物を加温アセトンで再結晶する。ジオールが選択的に沈殿する。純ジオールＬ１（４.３５７ｇ）が得られる；ブチロラクトンに基づいて、収率８７％に相当する。
【０１４６】
ジオールＬ１の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.３５：溶媒：３０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，５６Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；１.４５（大きな多重線，４Ｈ，三級アルコールからベータ位のＣＨ２）；１.５５（多重線，２Ｈ，一級アルコールからガンマ位のＣＨ２）；１.６６（多重線，２Ｈ，一級アルコールからベータ位のＣＨ２）；３.６８（Ｊ＝６Ｈｚ，三重線，２Ｈ，一級アルコールからアルファ位のＣＨ２）。
【０１４８】
４−ヘキサデシル−エイコサ−３−エン−１−オール（Ｌ２）の合成：
【化２３】
2009532056.tif 000027
【０１４９】
Ｃ３６Ｈ７２Ｏ；ＭＷ＝５２０.９６
キシレン１００ｍｌに溶解したアルコールＬ１（１.５ｇ；２.７８ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝５３８.９７）を、５０ｍｇのパラ−トルエンスルホン酸（０.２９ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１７２）の存在下に、５０分間、１３０℃に加熱する。１０％酢酸エチル／ヘプタン混合物でのシリカゲルクロマトグラフィーによりアルセノールを精製すると、２０２.４ｍｇのアルセノールＬ２を与える；このものは０.３８９ｍｍｏｌｅ（収率１４％）の異性体に相当する。主な副生物は５員環状エーテル（１.１７７ｇ，２.２ｍｍｏｌｅ，７９％）である。
【０１５０】
アルセノールＬ２の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.５２および０.５４（異なる異性体のため２つのスポット）：溶媒：２０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１５１】
４−ヘキサデシル−エイコサン−１−オール（Ｌ３）の合成：
【化２４】
2009532056.tif 000028
【０１５２】
Ｃ３６Ｈ７４Ｏ；ＭＷ＝５２２.９７
酢酸エチル５ｍｌに溶解したアルセノールＬ２（２０２.４ｍｇ、０.３８９ｍｍｏｌｅ、ＭＷ＝５２０.９６）を、１気圧の水素圧下に、パラジウム／炭素（１０％Ｐｄ／Ｃ）６０ｍｇにより３日間水素化する。ＴＬＣ分析により変換をスクリーニングする。触媒を濾去し、溶媒の蒸発により純アルコールＬ３を定量的に得る。
【０１５３】
アルコールＬ３の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.５２：溶媒：２０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１５４】
１Ｈ−NMR（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，６３Ｈ，炭化水素鎖）；１.５６（多重線，２Ｈ，アルコールからベータ位のＣＨ２）；３.６８（Ｊ＝６.７Ｈｚ，三重線，２Ｈ，アルコール官能基からアルファ位のＣＨ２）。
【０１５５】
メタンスルホン酸４−ヘキサデシル−エイコシルエステル（Ｌ４）の合成：
【化２５】
2009532056.tif 000029
【０１５６】
Ｃ３７Ｈ７６Ｏ３Ｓ；ＭＷ＝６０１.０６
ジクロロメタン１０ｍｌ（水素化カルシウム上で蒸留）に溶解し、０℃に冷却したアルコールＬ３（１６５.２ｍｇ；０.３１６ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝５２２）に、０.２４ｍｌの塩化メシル（３５５ｍｇ；３.１ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１１４.５５）および０.４８ｍｌのトリエチルアミン（３４６ｍｇ；３.４２ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１０１.１９）を連続的に加えてメシル化する。室温で４時間後、溶媒を蒸発させ、過剰の試薬とトリエチルアミンとを抽出するために固形物をメタノールで洗い、１１９ｍｇのＬ４（０.１９８ｍｍｏｌｅ；収率６３.６％）を得る。
【０１５７】
メシル酸エステルＬ４の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.６：溶媒：５０％ＣＨ２Ｃl２／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１５８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，６３Ｈ，炭化水素鎖）；１.７３（多重線，２Ｈ，メシルエステルからベータ位のＣＨ２）；３.０２（一重線，３Ｈ，メシルエステルのＣＨ３）；４.２２（Ｊ＝６.６Ｈｚ，三重線，２Ｈ，メシルエステルからアルファ位のＣＨ２）。
【０１５９】
塩化１−(４−ヘキサデシル−エイコシル)−３−メチル−３Ｈ−イミダゾール−１−イウム（ＨＥＭＩ）の合成：
【化２６】
2009532056.tif 000030
【０１６０】
Ｃ４０Ｈ７９Ｎ２Ｃｌ；ＭＷ＝６２３,５２
２−ブタノン１０ｍｌに溶解したメシル酸エステルＬ４（１１９ｍｇ；０.１９７ｍｍｏｌ；ＭＷ＝６０１.０６）を１６２.５ｍｇのメチルイミダゾール（１.９８ｍｍｏｌｅｓ；ＭＷ＝８２.１０）の存在下に、６日間、８０℃に加熱する。ＴＬＣ分析（メシル酸エステルの消失）により反応をスクリーニングする。
【０１６１】
後処理：減圧下に溶媒の蒸発。生成物をメタノールに溶かし、濾過により未反応のメシル酸エステルから分離する。可溶性部分をメタノール１７ｍｌに溶かし、３.７％塩酸８ｍｌを加える。５℃に保存すると両親媒性分子が沈殿する。固形物を０℃、１４０００ｒｐｍで遠心分離することにより単離し、粗製産物１７０.６ｍｇを沈殿させる。シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノール勾配；１から１５％）により精製して、純粋な産物（５３ｍｇ；０.０８５ｍｍｏｌｅ）を４３％の収率で得る。
【０１６２】
両親媒性分子ＨＥＭＩの分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２８：溶媒：１０％メタノール／ＣＨ２Ｃl２；ヨウ素蒸気により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１６３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.８７（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖の末端ＣＨ３）；１.２３（大きな多重線，６３Ｈ，炭化水素鎖）；１.８５（多重線，２Ｈ，メチルイミダゾリウムからベータ位のＣＨ２）；４.１２（一重線，３Ｈ，メチルイミダゾリウムのＣＨ３）；４.２７（Ｊ＝７.４Ｈｚ，三重線，２Ｈ，メチルイミダゾリウムからアルファ位のＣＨ２）；７.２８（一重線，１Ｈ，メチルイミダゾリウム環のＣＨ）；７.４９（一重線，１Ｈ，メチルイミダゾリウム環のＣＨ）；１０.６５（一重線，１Ｈ，メチルイミダゾリウム環のＣＨ）。
【０１６４】
１３Ｃ−ＮＭＲ：ｄｅｐｔ１３５（ＭｅＯＤ−４ｄ）δ（ｐｐｍ）：
ＣＨおよびＣＨ３はマイナスピーク（−）を与える；
ＣＨ２はプラスピーク（＋）を与える；
四級炭素はＤｅｐｔ１３５によって検出されない；
１３６.５（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；１２３.６（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；１２２.３（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；４９.８（（＋），イミダゾリウムからアルファ位のＣ））；３６.９（（−），メチルイミダゾリウムのメチル−Ｃ）；３５.１（（−），側鎖の分岐点のＣ）；３３.０（＋）；３１.７（＋）；３０.０（＋）；２９.７（＋）；２９.４（＋）；２９.３５（＋）；２９.３（＋），２９.１（＋）；２７.２（＋）；２６.２（＋）；２２.４（＋）（炭化水素鎖の異なるＣ）；１３.２（−），炭化水素鎖Ｃ末端メチル。
【０１６５】
実施例７：ＢＩＡの合成：
【化２７】
2009532056.tif 000031
【０１６６】
５−テトラデシル−ノナデシル−１,５−ジオール（Ｗ１）の合成：
【化２８】
2009532056.tif 000032
【０１６７】
Ｃ３３Ｈ６８Ｏ２；ＭＷ＝４９６.８９
ジエチルエーテル（ナトリウム−ベンゾフェノン上蒸留）１２０ｍｌに溶解した１−ブロモテトラデカン（４４.５８ｇ；１６０.８ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝２７７.２８）を４.７ｇのマグネシウム削りくず（１９３.３ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝２４.３１）に、加熱還流しながら、３０分間滴下添加する。還流を１時間維持し、次いで温度を５℃に下げ、ジエチルエーテル２０ｍｌに溶かしたバレロラクトン（４.０２４ｇ；４０.２ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１００.１２）を滴下する。反応を完結させるために、反応混合物を室温で１６時間攪拌する。
【０１６８】
後処理：反応混合物を５００ｍｌの砕氷に注ぎ、濃塩酸で酸性とし、ジクロロメタンで抽出する。有機層を蒸発させて得られる固形物を加温ＴＨＦに溶かすと、不溶性副生物からの分離が可能となる。ＴＨＦ蒸発後の可溶成分を加温アセトンから再結晶し、１７.６ｇの純ジオールＷ１（３５.４ｍｍｏｌｅ；バレロラクトンに基づき８８.１％）を得る。
【０１６９】
ジオールＷ１の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.２７：溶媒：３０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１７０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２７（大きな多重線，５０Ｈ，炭化水素鎖のＣＨ２）；１.４２（大きな多重線，６Ｈ，三級アルコールからベータ位のＣＨ２）；１.５９（多重線，２Ｈ，一級アルコールからベータ位のＣＨ２）；３.６８（Ｊ＝６.４Ｈｚ，Ｊ’＝５.３Ｈｚ，三重線の二重線，２Ｈ，一級アルコールからアルファ位のＣＨ２）。
【０１７１】
５−テトラデシル−ノナデカ−４−エン−１−オール（Ｗ２）の形成：
【化２９】
2009532056.tif 000033
【０１７２】
Ｃ３３Ｈ６６Ｏ；ＭＷ＝４７８.８８
トルエン２００ｍｌに溶解したジオールＷ１（５ｇ；１０.１ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝４９７）をパラ−トルエンスルホン酸１３７.６ｍｇと共に、２.５時間加熱還流した。減圧下、溶媒蒸発の後、得られた粗製の固形物を、ヘプタン中酢酸エチル勾配（５％から１０％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０１７３】
アルセノールＷ２（異性体の混合物）２.２５ｇ（４７.１ｍｍｏｌｅ；収率４６.５％）を純粋な形状で得る。
【０１７４】
アルセノールＷ２の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.４４：Ｒｆ’＝０.４８；溶媒：２０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１７５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２８（大きな多重線，４８Ｈ, 炭化水素鎖のＣＨ２）；１.４−１.６（大きな多重線，２Ｈ，アルコールからベータ位のＣＨ２）；２.００（多重線，６Ｈ，アリル位置のＣＨ２）；３.６６（Ｊ＝６.４Ｈｚ，三重線，２Ｈ，一級アルコールからアルファ位のＣＨ２）；５.１３（Ｊ＝７.０Ｈｚ，三重線，１Ｈ，ビニル位置のＣＨ）。
【０１７６】
５−テトラデシル−ノナデカン−１−オール（Ｗ３）の形成：
【化３０】
2009532056.tif 000034
【０１７７】
Ｃ３３Ｈ６８Ｏ；ＭＷ＝４８０.８９
酢酸エチル１２ｍｌに溶解したアルセノール異性体Ｗ２混合物（２.２０７ｇ、４.６ｍｍｏｌｅ）を、パラジウム／炭素（１０％Ｐd／Ｃ、４００ｍｇ）により１気圧の水素圧下、２４時間水素化する。
【０１７８】
濾紙上の濾過と減圧下の溶媒蒸発後に、純アルコールが定量的（２.０４５ｇ、４.２５ｍｍｏｌｅ、収率９２.４％）に得られる。
【０１７９】
アルコールＷ３の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.３８；溶媒：２０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１８０】
１Ｈ−NMR（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２８（大きな多重線，５７Ｈ, 炭化水素鎖）；１.５６（多重線，２Ｈ，アルコールからベータ位のＣＨ２）；３.６７（Ｊ＝６.６Ｈｚ，三重線，２Ｈ，アルコール官能基からアルファ位のＣＨ２）。
【０１８１】
５−テトラデシル−ノナデカナール（Ｗ４）の形成：
【化３１】
2009532056.tif 000035
【０１８２】
Ｃ３３Ｈ６６Ｏ；ＭＷ＝４７８.８８
塩化オキサリル２８４ｍｇおよびＤＭＳＯ２６５μｌを、予め−７８℃に冷却した乾燥ジクロロメタン２０ｍｌに連続的に加えることにより、スワーン試薬を調製する。５分後にアルコールＷ３（９００ｍｇ；１.８６９ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝４８０.８８）を加え、３０分間−７８℃に保持する；乾燥トリエチルアミン１ｍｌ（水素化カルシウム上蒸留）を加える。反応混合物を３０分間で室温まで加温する。
【０１８３】
後処理：反応混合物に水３０ｍｌを加えて反応停止させ、ジクロロメタンで３回抽出する。有機相を１％塩酸および５％炭酸ナトリウム水溶液で洗う。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過する。溶媒蒸発後に得られる粗製のアルデヒドをさらに、ヘプタン中酢酸エチルの勾配（３％から５％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、純アルデヒド６５８ｍｇ（１.３７５ｍｍｏｌｅ，収率７３.５％）を得る。
【０１８４】
アルデヒド（Ｗ４）の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.３２；溶媒：５％酢酸エチル／ヘプタン；０.５％ＫＭnＯ４水溶液をスプレーして検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１８５】
１Ｈ−NMR（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，６Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２８（大きな多重線，５７Ｈ, 炭化水素鎖）；１,６２（多重線，２Ｈ，アルデヒドからベータ位のＣＨ２）；２.４２（Ｊ＝７.３Ｈｚ，三重線，２Ｈ，アルデヒド官能基からアルファ位のＣＨ２）；９.７９（一重線，アルデヒドのＣＨＯ）。
【０１８６】
１５−テトラデシル−ヘプタトリアコンタン−１９−オール（Ｗ５）の形成：
【化３２】
2009532056.tif 000036
【０１８７】
Ｃ５１Ｈ１０４Ｏ；ＭＷ＝７３３.３７
ジエチルエーテル１０ｍｌ（ナトリウム−ベンゾフェノン上蒸留）に溶解した１−ヨードオクタデカン（２.０４４ｇ，５.３７ｍｍｏｌｅ，ＭＷ＝３８０.４０）を１９６ｍｇのマグネシウム削りくず（８.０６４ｍｍｏｌｅ，ＭＷ＝２４.３１）に、加熱還流しながら２０分間で滴下する。還流は１時間維持し、次いで温度を５℃に下げ、ジエチルエーテル２０ｍｌに溶かしたアルデヒドＷ４（４２６ｍｇ；０.８９ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝４７８.８８）を滴下する。反応を完結させるために、室温で１８時間攪拌を続ける。
【０１８８】
後処理：反応混合物を１００ｍｌの砕氷に注ぎ、塩酸で酸性とし、ジクロロメタンで３回抽出する。有機層を蒸発させて得られる固形物を加温ＴＨＦに溶かす；結晶化が副生物の分離を可能とするので、これを濾去する。ＴＨＦ蒸発後、粗製の固形物を加温アセトンから再結晶し、酢酸エチル／ヘプタン勾配（１％から５％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、２９３ｍｇ（０.４ｍｍｏｌｅ；アルデヒドに基づく収率４５％）を得る。
【０１８９】
アルコール（Ｗ５）の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.３７；溶媒：１０％酢酸エチル／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１９０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，９Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２８（大きな多重線，８９Ｈ, 炭化水素鎖）；１.４３（大きな多重線，４Ｈ，二級アルコールからベータ位のＣＨ２）；３.６１（多重線，１Ｈ，一級アルコールからアルファ位のＣＨ２）。
【０１９１】
メタンスルホン酸１−オクタデシル−５−テトラデシル−ノナデシルエステル（Ｗ６）の合成：
【化３３】
2009532056.tif 000037
【０１９２】
Ｃ５２Ｈ１０６Ｏ３Ｓ；ＭＷ＝８１１.４６
ＣＨ２Ｃl２（２０ｍｌ；ＣaＨ２上で蒸留）に溶解したアルコールＷ５（４３５.８ｍｇ；０.５９４ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝７３３.３７）を０℃に冷却する。塩化メシル（０.４６ｍｌ；６８０.７ｍｇ；６.４３ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１１４.５５）を反応混合物に導入し、０.９ｍｌのトリエチルアミン（６６１ｍｇ；６.５３ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝１０１.１９）を０℃で滴下する；この混合物をさらに２０時間室温で攪拌する。溶媒を蒸発させた後、残渣をメタノールで洗い、濾過により分離して純メシル酸エステル（４５０.５ｍｇ；０.５１５ｍｍｏｌｅ；収率９３％）を得る。
【０１９３】
メシル酸エステルＷ６の分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.５９；溶媒：５０％ジクロロメタン／ヘプタン；バニリン／硫酸により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１９４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝５.６Ｈｚ，三重線，９Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２８（大きな多重線，８９Ｈ, 炭化水素鎖）；１.６９（大きな多重線，４Ｈ，メシルエステルからベータ位のＣＨ２）；３.０１（一重線，３Ｈ，メシルエステルのＣＨ３）；４.７２（多重線，１Ｈ，メシルエステルからアルファ位のＣＨ）。
【０１９５】
＜分岐イミダゾリウム両親媒性物質＞（ＢＩＡ）（塩化１−メチル−３−(１−オクタデシル−５−テトラデシル−ノナデシル)−３Ｈ−イミダゾール−１−イウム）の合成：
【化３４】
2009532056.tif 000038
【０１９６】
Ｃ５５Ｈ１０９ＣｌＮ２；ＭＷ＝８３３.９２
２−ブタノン１０ｍｌに溶解したメシル酸エステルＷ６（２２４ｍｇ；０.２７ｍｍｏｌ；ＭＷ＝８１１.４６）を２２１．６ｍｇのメチルイミダゾール（２.７ｍｍｏｌｅ；ＭＷ＝８２.１０）の存在下に、８０℃に６日間加熱する。反応はＴＬＣ分析によりスクリーニングする（メシル酸エステルの消失）。
【０１９７】
後処理：減圧下溶媒の蒸発。生成物をメタノールに溶かし、濾過により未反応メシル酸エステルから分離する。可溶性部分をメタノール１７ｍｌに溶かし、水８ｍｌを加える。メタノール溶液を濃塩酸によりｐＨ＝２の酸性とする。両親媒性分子は−２０℃で保存すると沈殿する。この固形物を１４０００ｒｐｍ、０℃での遠心分離により単離すると、２２０ｍｇの粗製産物が沈殿する。シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノール勾配；１％から１２％）により精製し、純品を４３％の収率（１９８.７ｍｇ；０.２３８ｍｍｏｌｅ）で得る。
【０１９８】
ＢＩＡの分析：
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０.３３；溶媒：１０％メタノール／ジクロロメタン；ヨウ素蒸気により検出（メルクＴＬＣプレート、シリカゲル６０Ｆ２５４）。
【０１９９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０.９０（Ｊ＝６.８Ｈｚ，三重線，９Ｈ，炭化水素鎖末端のＣＨ３）；１.２８（大きな多重線，８９Ｈ, 炭化水素鎖）；１．８４（大きな多重線，４Ｈ，イミダゾリウムからベータ位のＣＨ２）；４.１８（一重線，３Ｈ，イミダゾリウムのＣＨ３）；４.４４（五重線，Ｊ＝５.６Ｈｚ，１Ｈ，イミダゾリウムからアルファ位のＣＨ）；７.１５（一重線，１Ｈ，イミダゾリウム環のＣＨ）；７.３３（一重線，１Ｈ，イミダゾリウム環のＣＨ）；１１.１９（一重線，１Ｈ，イミダゾリウム環のＣＨ）。
【０２００】
１３Ｃ−ＮＭＲ：ｄｅｐｔ１３５（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：
ＣＨおよびＣＨ３はマイナスピーク（−）を与える；
ＣＨ２はプラスピーク（＋）を与える；
四級炭素はＤｅｐｔ１３５によって検出されない；
１３８.７（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；１２３.０（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；１１９.３（（−），メチルイミダゾリウムのＣ）；６２.８（（−），イミダゾリウムからアルファ位のＣ））；３７.２（（−），炭化水素鎖のＣＨ），３６.７（（−），メチルイミダゾリウムのメチル−Ｃ）；３５.９（＋）；３５.４（＋）；３３.５（＋）；３３.４（＋）；３３.３（＋）；３１.９（＋）；３０.１（＋）；２９.７（＋）；２９.６５（＋）；２９.６（＋）；２９.５（＋）；２９.４（＋）；２９.１（＋）；２６.６５（＋）；２６.６（＋）；２５.９（＋）；２３.２（＋）；２２.７（＋）：（炭化水素鎖の異なるＣ）；１４.１（（−），炭化水素鎖のＣ末端メチル）。
【０２０１】
両親媒性分子の質量分析：
【表３】
2009532056.tif 000039
【０２０２】
分子はメタノールに溶解した（０.１ｍｇ／ｍｌ）；直接注入；ブラッカーＨＣＴウルトラ装置上のエレクトロスプレーＥＳＩ＋質量分析により検出。
【０２０３】
塩化１−メチル−３−(１−オクタデシル−ノナデシル)−３Ｈ−イミダゾール−１−イウム（ＭＯＮＩ）およびＤＯＰＥからのリポソームの調製：
リポソームはコリピドとしてＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を用いて形成する。６.３ｍｇのＭＯＮＩを異なる量のＤＯＰＥと共に、音波浴中、緩和な音波処理下に１ｍｌのエタノールに溶かす。この濃厚アルコール溶液を９ｍｌの無菌水に注入する。得られる溶液は澄明で、僅かに青みがかっている。この溶液を超音波プロセッサー（バイオブロックサイエンティフィック）により１１Ｗの２秒パルスで５分間、音波処理する。
【０２０４】
生成するリポソームは約１１０ｎｍの粒径を有し、その粒径内の分布は狭い。それらは５℃の保存で安定であり、粒径または沈殿の増加はない。
【０２０５】
次のＭＯＮＩ製剤において、両親媒性物質は１ｍＭの一定濃度で選択され、種々ミリモル量のジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と共に使用する。明確にするために、それらをＭＯＮＩ（１＋ｎ）と単純化する（ｎはミリモル濃度のＤＯＰＥである）。
【０２０６】
両親媒性分子ＭＯＮＩ、さらに本発明の他の両親媒性物質、取分け実施例２ないし７のものは、コリピドＤＯＰＥと共にエタノールに容易に溶ける。リポソーム製剤でのように、異なるモル比のＤＯＰＥの存在下、１ｍＭ濃度の両親媒性分子が、それらのそれぞれの生物活性の比較のために最も便利であった。これらのアルコール性溶液は、インビトロの形質導入実験において、リポソーム製剤と同様に機能した。
【０２０７】
動的光散乱による粒径の測定：
両親媒性物質を１ｍｍｏｌｅとして、ＤＯＰＥの濃度を変化させたリポソーム製剤は、上記のようにミリＱ水中で調製した。これらリポソーム製剤の粒径は、ゼータマスター（マルバーン・インストルーメント、オルセー、フランス）を用いる光散乱により決定した；以下の仕様に従った：サンプリング時間、３０秒；１サンプルにつき３回の測定；媒体粘度、１.０ｃＰ；媒体屈折率（ＲＩ）１.３３５；ＲＩ粒子、１.４７；温度：２５℃、６３３ｎｍレーザー波長による。
【０２０８】
ＮＭＲ実験：
ＮＭＲスペクトルはブラッカー４００ＭＨｚスペクトロメーター上、カレックスＳＡ（イルキルヒ、フランス）にて記録した。
【０２０９】
元素分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ）および赤外線スペクトル法：
元素分析および赤外線スペクトル法（ベルテックス７０；ＫＢｒ）は、最終産物について、ストラスブールの＜チャールス・サドロン研究所ＵＰＲ２２＞にて実施した。
【０２１０】
質量分析：
質量分析は、イルキルヒの薬学部（ＩＦＲ８５、ＵＬＰ、ルイス・パスツール大学、ストラスブール）にて、ＨＣＴウルトラ装置（ブラッカー、フランス）上、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ＋）により実施した。
【０２１１】
細胞培養：
Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病、ＣＣＬ−２４３）細胞およびＴＨＰ−１（ヒト末梢血単球性白血病、ＴＩＢ−２０２）細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０（ユーロバイオ）（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、パーバイオ）、２ｍＭグルタマックス（ユーロバイオ）、１００単位／ｍｌペニシリン（ユーロバイオ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ユーロバイオ）を補足）中で増殖した。ヒーラ細胞（ヒト子宮頚部上皮腺癌、ＣＣｌ−２）、カスキ細胞（Caski、ヒト子宮頚部癌）、シーハ細胞（SiHa、ヒト子宮頚部扁平上皮癌、ＨＴＢ−３５）、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳房上皮腺癌、ＨＴＢ−２２）は、ＭＥＭ（ユーロバイオ）（２ｍＭグルタマックス、アールのＢＳＳ、１.５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、１.０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、およびＦＢＳ１０％を補足)中で増殖した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞、ＣＲＬ−１６５８）はＤＭＥＭ（ユーロバイオ）（４ｍＭ−Ｌ−グルタミン、１.５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４.５ｇ／Ｌのグルコース、および抗生物質（ペニ／ストレプト）とＦＢＳ１０％を補足）中で増殖した。
【０２１２】
ＧＬ３ルシフェラーゼ（ＳＶ４０要素制御下のホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ）を安定的に発現するＡ５４９細胞（ヒト肺癌、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１８５）は、ｐＧＬ３Ｌucプラスミド（クロンテック）の安定な形質導入の後に得られた。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞はＲＰＭＩ−１６４０（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタマックス、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０.８μｇ／ｍｌのＧ４１８（プロメガ）を補足）中で増殖した。細胞はすべて５％ＣＯ２湿潤大気中にて３７℃で保存した。
【０２１３】
形質導入実験：
２４穴組織培養プレートでの形質導入
形質導入の１日前、２.５×１０４個の細胞を、２４穴組織培養プレート上、１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの新鮮な完全培地中に播種した。形質導入の前に、siＲＮＡ／形質導入試薬の複合体を調製した。所望量のsiＲＮＡを１００μｌの無血清培地に希釈した。この溶液を１０秒間ボルテックスで混合した。次いで、両親媒性分子に基づく製剤０.５μｌないし３μｌをsiＲＮＡ溶液に加えた。最終混合物をボルテックスで１０秒間混合し、室温で１０分間放置した。次いで、複合体溶液１００μｌをウエルごとに加え、プレートを３７℃でインキュベートした。
【０２１４】
９６穴組織培養プレートでの形質導入
形質導入の１日前、１×１０４個の細胞を、９６穴組織培養プレート上、１０％ＦＢＳを含む新鮮な完全培地０.１５ｍｌ中に播種した。形質導入の前に、siＲＮＡ／形質導入試薬の複合体を調製した。所望量のsiＲＮＡを２０μｌの無血清培地に希釈した。この溶液を１０秒間ボルテックスで混合した。次いで、両親媒性分子に基づく製剤０.５μｌないし３μｌをsiＲＮＡ溶液に加えた。最終混合物をボルテックスで１０秒間混合し、室温で１０分間放置した。次いで、複合体溶液２０μｌをウエルごとに加え、プレートを３７℃でインキュベートした。
【０２１５】
９６穴組織培養プレートでの逆形質導入
siＲＮＡ／形質導入試薬の複合体を先ず調製した。所望量のsiＲＮＡを５０μｌの無血清培地に希釈し、９６穴組織培養プレートのウエルごとに加えた。次いで、両親媒性分子に基づく製剤０.５μｌないし３μｌをsiＲＮＡ溶液に加えた。プレートを回転式シェーカー上に室温で５分間放置した。次いで、１×１０４個の細胞を、９６穴組織培養プレートのウエルごとに、１０％ＦＢＳを含む新鮮な完全培地１２５μｌ中に加え、このプレートをさらに３７℃でインキュベートした。
【０２１６】
形質導入試薬の比較（２４穴組織培養プレートフォーマットにて）
ハイパーフェクト試薬のために、所望量のsiＲＮＡを無血清培地３００μｌに希釈した（３回繰り返し実験）。次いで、形質導入試薬９μｌをsiＲＮＡ混合物に加えた。この溶液を１０秒間ボルテックスで混合し、室温で１０分間放置した。形質導入の前に、完全培地を除去し、ウエルあたり１０％ＦＢＳ含有完全培地０.５ｍｌと置き換えた。形質導入溶液１００μｌをウエルごとに加えた。
【０２１７】
サイレントフェクト試薬のために、所望量のsiＲＮＡを無血清培地７５μｌに希釈した（３回繰り返し実験）。サイレントフェクト試薬（２.２５μｌ）を無血清培地７５μｌに希釈し、その溶液を希釈したsiＲＮＡ溶液に加え、次いで混合し、室温で２０分間放置した。形質導入の前に、完全培地を除去し、ウエルあたり１０％血清含有完全培地０.５ｍｌと置き換えた。形質導入溶液５０μｌをウエルごとに加えた。細胞毒性が認められたので、形質導入培地を除去し、ウエルあたり、１０％血清含有完全培地１ｍｌと置き換えた。
【０２１８】
セント−レッド試薬のために、所望量のsiＲＮＡをＨＢＳ７５μｌに希釈した（３回繰り返し実験）。セント−レッド試薬（siＲＮＡの１ｎＭに対して０.４２μｌ）を７５μｌのＨＢＳに希釈し、その溶液をsiＲＮＡの希釈溶液に加え、次いで混合し、室温で１５分間放置した。次いで、無血清培地６００μｌを形質導入溶液に加えた。細胞に加える前に、完全培地を除去し、ウエルあたり１０％血清含有完全培地０.５ｍｌと置き換え、次いで、形質導入溶液をウエルあたり２５０μｌ加えた。
【０２１９】
トランスＩＴ−ＴＫＯについては、この試薬（６μｌ）を無血清培地１５０μｌに希釈し、その溶液を混合し、室温に１５分間放置した。所望量のsiＲＮＡを形質導入試薬の希釈溶液に加えた。この溶液をゆるやかに混合し、室温に１５分間放置した。細胞を加える前に、完全培地を除去し、ウエルごとに１０％血清含有完全媒地０.２５ｍｌと置き換えた。５０μｌの形質導入溶液をウエルごとに加えた。２４時間のインキュベーションの後、培地を除去し、１０％ＦＢＳ含有完全培地０.５ｍｌと置き換えた。
【０２２０】
形質導入プロトコールのすべてについて、プレートはさらに３７℃で４８時間インキュベートした。
【０２２１】
ルシフェラーゼおよびタンパク質アッセイ
ルシフェラーゼ遺伝子発現は、市販のキット（プロメガ、フランス）を用いて測定した。完全培地を除去した後、１ｍｌのＰＢＳ溶液で３回洗浄した。次いで、１×溶解バッファー１００μｌをウエルごとに加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。溶解液を集め、１４,０００ｇで５分間遠心分離した。ルシフェリン溶液１００μｌの注入後、ルシフェラーゼアッセイ法により溶解液５μｌを評価した。発光（ＲＬＵ）をルミノメーター（ＬＢ９６０、バーソールド、フランス）により１０秒間集積してモニターした。結果はＢＣＡアッセイ法（ピアース、フランス）を用いて、細胞タンパク質１ｍｇあたり、１０秒間集積した光単位（ＲＬＵ）として表す。
【０２２２】
ｍＲＮＡレベルの測定  
メッセンジャーＲＮＡレベルは、クアンチジーン（QuantiGene；登録商標）ブランチドＤＮＡアッセイ（ジェノスペクトラ）（全細胞溶解液を用い、標的増幅なしに実施する）により決定した。
【０２２３】
４８時間の形質導入の後、細胞を１ｍＬのＰＢＳ（ケンブレックス）で１回洗い、１×ジェノスペクトラ溶解バッファー０.６ｍＬ中で、５０℃、３０分間溶解した。次いで、プレートを−８０℃で少なくとも３０分間保存した。溶解液を融解し、２ないし２０μｌの溶解液を捕捉プレートに加えた。溶解作用試薬１０μｌ（４８反応のため；溶解作用試薬は、２５μｌのＣＥ（捕捉エクステンダー）、２５μｌのＬＥ（標識エクステンダー）および２５μｌのＢＬ（遮断プローブ）と４２５μｌの３×溶解混合物を加えることにより調製する；すべての化合物はジェノスペクトラから入手）をプレートに加え、その容量を１×溶解混合物により１００μｌとした。プレートに蓋をし、５０℃で１６時間インキュベートした。プレートは１×洗浄バッファー（ジェノスペクトラ）３００μｌで３回洗い、増幅作用溶液（０.１１６μｌの増幅剤を増幅剤希釈剤１１６μｌに希釈；すべてジェノスペクトラから）１００μｌを各ウエルに加えた。プレートを５０℃で１時間インキュベートした。１×洗浄バッファーで３回洗浄した後、標識プローブ作用試薬（標識プローブ０.１１６μｌを増幅剤希釈剤１１６μｌに希釈した；すべてジェノスペクトラから）を各ウエルに加え、５０℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１×洗浄バッファーで３回洗浄した後、基質作用試薬（１１６μｌの基質中、１０％ラウリル硫酸リチウム０.３４８μｌ；すべてジェノスペクトラから）を各ウエルに加えた。３０分のインキュベーションの後、各ウエルにおける発光を分光光度計（バーソールド）により測定した。
【０２２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
形質導入の後、細胞を１ｍｌのＰＢＳ（ケンブレックス）で１回洗い、各ウエルを１００μｌのトリプシン／ＥＤＴＡ（ユーロメデックス）でトリプシン処理した。１０％血清含有完全培地０.５ｍＬを加え、トリプシンを停止させた。３回繰り返しごとのウエルを集め、遠心分離し、ペレットをＰＢＳで１回洗った。遠心分離後、ペレットを１００μｌのＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ−ＮaＣl、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０.１％ＳＤＳ）に２０分間、４℃で溶解させた。溶解液をボルテックスで均一とし、１４,０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。タンパク含量をＢＣＡキット（ピアース）により評価した。タンパク質５μｇを１０％アクリルアミド／ビス・アクリルアミドゲル上での電気泳動に付し、二フッ化ポリビニリデン膜（ミリポア）に移した。ビメンチン発現は１／３０００倍に希釈したモルモット抗−ビメンチンポリクローナル抗体（ＲＤＩ）で検出した。マウス抗−ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（アンビオン）で検出したＧＡＰＤＨを用いてタンパク質レベルを標準化した。免疫反応性タンパク質は、西洋わさびペルオキシダーゼ接合抗−モルモットまたは抗−マウス抗体およびアンプリファイド・オプチ−４ＣＮ基質キット（バイオラッド）を製造業者の指示に従って用い、可視化した。
【０２２５】
免疫蛍光染色
形質導入の４８ないし７２時間後に培地を回収した。細胞を１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ溶液で洗った。細胞はメタノール性溶液（メタノール／アセトン；１／１、−２０℃に冷却）により４℃で１５分間、透過性を上げ、固定した。細胞を再度１ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）で２回洗い、次いでこの細胞を１％のヤギ血清を含むＰＢＳ１ｍｌと共に４℃で１５分間インキュベートし、非特異結合部位をブロックした。細胞を再度１ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）で洗った。
【０２２６】
細胞を、５０μｌのＰＢＳおよび５０μｌのマウス抗体抗−ラミンＡ／Ｃ（ＩgＧ１クラス、リサーチ・ディアグノスティック・インク、フランダース、ＮＪ）の存在下に、４℃で１時間インキュベートした。細胞を１ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）で２回洗った。
【０２２７】
細胞は５０μｌのフルオレセイン結合ヤギ抗体抗−マウスＩgＧ（カルビオケム、ラホーラ、ＣＡ）を含有するＰＢＳ中で、４℃、１時間インキュベートした。次いで、細胞を再度１ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）で洗い、最後に、各ウエルに１ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）を加えた。免疫染色は蛍光顕微鏡（エクリプスＴＥ２０００−Ｓ、ニコン）により観察した。
【０２２８】
結果
内在性レポーター遺伝子の標的モデルとして、ＧＬ３ルシフェラーゼを安定的に発現するＡ５４９細胞を使用した（ＳＶ４０要素の制御下にあるホタル・ルシフェラーゼ）。明確な、また簡便なSiＲＮＡである化学的に製造した配列番号１および２の配列特異的ＧＬ３Ｌuc SiＲＮＡ（ＧＬ３Ｌuc ｍＲＮＡにマッチし、２−デオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）の３’−オーバーハングを含んでなる１９個のヌクレオチドの短鎖dsＲＮＡから構成される）を、形質導入実験に使用した。１ｍＭのカチオン性両親媒性ＭＯＮＩと１ｍＭの中性リン脂質ＤＯＰＥとをエタノール中で組合わせた製剤を調製した。無血清培地（１００μｌ）で希釈したsiＲＮＡを、次いで、ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤（エタノール中１ｍＭ／１ｍＭ）２μｌと複合体とした。得られる形質導入複合体の溶液を血清含有培地中で増殖する細胞に加え、最後に細胞を１００ないし２０００ｐＭの濃度範囲のsiＲＮＡに接触させた（図１）。サイレンシング効率は、細胞溶解液のタンパク含量により標準化した標準的発光アッセイ法により、ルシフェラーゼ活性を測定することにより形質導入の４８時間後で決定した。ルシフェラーゼ活性（タンパク質のＲＬＵ／ｍｇとして表す）は、形質導入を２０００ｐＭのsiＲＮＡで実施した場合、９０％まで阻害された。ルシフェラーゼ活性に対する作用のない場合、細胞が無関係の配列ＧＬ２Ｌuc siＲＮＡにより同じ条件で形質導入されると、配列特異的ＲＮＡ干渉を示すことが確認された。細胞に対し、単独で同じ濃度範囲（１００ないし２０００ｐＭ）で加えられたＧＬ３Ｌuc SiＲＮＡは、ルシフェラーゼ活性を阻害しないことを示した（開示せず）。
【０２２９】
１ｍＭのＭＯＮＢＩ分子に基づくカチオン性両親媒性物質と２ｍＭのＤＯＰＥと組合わせた第二の製剤はエタノール中で調製した。この製剤２μｌを用いて、無血清培地中、ＧＬ３Ｌuc SiＲＮＡ（２５０ｐＭないし５ｎＭ範囲の濃度）との複合体を形成し、得られる溶液をＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞に加えた。サイレンシング効率は、形質導入の４８時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した。有意なルシフェラーゼ阻害（７０％）がすでに２５０ｐＭのsiＲＮＡで観察されており、それが形質導入されたsiＲＮＡでは５ｎＭで９０％に達した（図２）。ＧＬ２Ｌuc SiＲＮＡが無関係の配列として形質導入と同じ条件で用いられた場合には、ルシフェラーゼレベルが影響を受けず、ＧＬ３Ｌuc SiＲＮＡで得られたのが選択的サイレンシングであることを確認した。
【０２３０】
遺伝子サイレンシングは、図２に示すように、製剤ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥで形質導入を実施した場合、ピコモル範囲のsiＲＮＡで有効であった。ルシフェラーゼ遺伝子サイレンシングは１０００および１００ｐＭで、それぞれ９５％および８０％であった。２５および１０ｐＭのsiＲＮＡをそれぞれ形質導入した場合、５０％および２０％のサイレンシングがなお観察された(図３)。
【０２３１】
ＭＯＮＩまたはＭＯＮＢＩなどのイミダゾリウム両親媒性誘導体に基づく製剤は、カチオン性両親媒性物質をエタノール中、または水中で、中性リン脂質ＤＯＰＥと混合することにより調製した。リポソーム製剤の場合、両親媒性物質を先ずＤＯＰＥと共にエタノールに溶かし、１０Ｘ濃度の溶液とした。次に、この溶液を１０倍容量の水に注入し、直ちに混合した。得られる溶液を超音波プロセッサーにて音波処理した。形成されたリポソームの粒径は動的光散乱により測定すると、平均の粒径は１００ｎｍを示し、多分散性は低かった(図４)。このリポソーム製剤は４℃に保存すると、凝集を形成することなく、一定時間（数週間から数ヶ月）安定であることが分かった（図４に示すように１ヶ月）。多くのリポソーム製剤を調製したが、その平均粒径は１００±１０ｎｍであり、我々のリポソーム調製法が信頼性の高いものであることを強調している。
【０２３２】
ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥリポソーム製剤について、多くの市販品として入手し得る形質導入試薬、特にsiＲＮＡを細胞に送達するためとして提案されている前世代のものと比較した（図５）。形質導入条件は製造業者のプロトコールに従って適用したものであり、それを「材料および方法」に記載する。siＲＮＡは１ｐＭないし１０ｎＭの濃度範囲で用いた。セント−レッド試薬およびトランスＩＴ−ＴＫＯ試薬は最低のサイレンシング効率を示した（１ｎＭで５０％以下）。ハイパーフェクト試薬およびサイレントフェクト試薬は、siＲＮＡが１００ｐＭないし１０ｎＭの範囲で良好なサイレンシング効率を示したが、最低濃度（１０ｐＭないし１ｐＭ）のsiＲＮＡでは全体として非効率的である。ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ形質導入システムを、試験した他のすべての形質導入試薬に、試験したすべてのsiＲＮＡ濃度で好適に対照した。約５０％の有意な遺伝子サイレンシングが１０ｐＭでなお観察可能である。
【０２３３】
効果的な内在遺伝子サイレンシングを仲介するＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤の効力を確認するために、我々は種々の細胞株、例えば、接着性および非接着性細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子を標的にした。我々はスマートプール（SMARTpool；登録商標）テクノロジー（ダーマコン）から同じｍＲＮＡ上に多重部位を標的とする４種のsiＲＮＡのセットを提供するＧＡＰＤＨ siＲＮＡを選択し、効果的なノックダウンを保証した。遺伝子サイレンシングは、形質導入の４８時間後に、クアンチジーン（QuantiGene；登録商標）ｂＤＮＡテクノロジー（ジェノスペクトラ）を用いて、ｍＲＮＡレベルで評価した。試験したすべての細胞（ヒーラ、カスキ、シーハ、ＭＣＦ−７、Ｋ５６２、およびＴＨＰ−１）に単独で加えたＧＡＰＤＨスマートプール（SMARTpool；登録商標）試薬は、２５０ｐＭないし１０ｎＭの範囲の濃度のｍＲＮＡレベルで効率的なノックダウンを提供できなかった。リポソームＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤（１／２ｍＭ）で形質導入した場合、ＧＡＰＤＨスマートプール（SMARTpool；登録商標）試薬は、接着性細胞（ヒーラ、カスキ、シーハ、およびＭＣＦ−７）に対し、２５０ｐＭから１０ｎＭのsiＲＮＡ濃度で、８０％以上の高効率のＧＡＰＤＨｍＲＮＡノックダウンを示した（図６）。選択性の対照として、ラミンＡ／ＣsiＲＮＡを加えたが、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して作用を示さなかった。さらに、形質導入をリポソームＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤により、低siＲＮＡ濃度（５ないし２０ｎＭ）で実施した場合、選択的効率的なＧＡＰＤＨサイレンシングが、非接着性細胞（図６）、Ｋ５６２およびＴＨＰ−１細胞について得られた。他の内在遺伝子、例えば、ビメンチンおよびラミンＡ／Ｃ遺伝子などが、ＲＮＡ干渉の標的となった。サイレンシング効率はタンパク質レベルで、マウス線維芽細胞３Ｔ３細胞のビメンチン遺伝子についてのウエスタンブロットにより（図７）、またヒトヒーラ細胞のラミンＡ／Ｃ遺伝子についての免疫蛍光染色（図８）により決定した。両方の実験が、これらの２つの多量のタンパク質について、低siＲＮＡ濃度（１〜５ｎＭ）で、リポソームＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤（１／２ｍＭ）によるsiＲＮＡ形質導入の４８時間後に、高いサイレンシング効率を示した。ラミンＡ／Ｃ実験により、形質導入された細胞のすべてが、全体として、標的とされた遺伝子発現を廃止する生物活性siＲＮＡを含んでいることが確認された（図８）。
【０２３４】
形質導入プロトコールは、当初、血清含有培地の存在下、２４穴組織培養プレート中で増殖する接着性および非接着性細胞に、効率的にsiＲＮＡを送達するために開発された。他の細胞培養支持体、例えば、６穴プレート、Ｔ２５およびＴ７５培養フラスコなどについて試験したが、これらは１００ｐＭから１０ｎＭの範囲のsiＲＮＡ濃度で＞８０％の遺伝子サイレンシング効率を示し、リポソームＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１／２ｍＭ）製剤により形質導入されたことを示した。ＨＴＳ条件に適合させたsiＲＮＡ送達の効力は、９６穴組織培養プレートに適用した逆形質導入手法を用いることにより対処した。最適化処理の後、定常的に有効なプロトコールが提案された。無血清培地２５μｌで希釈したsiＲＮＡを先ずウエルに加えた。次いで、リポソームＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１／２ｍＭ）製剤１μｌをウエルごとに加えた。均一化の後、プレートを１０分間室温に維持し、形質導入複合体を形成させた。次いで、血清含有培地１２５μｌに希釈した細胞をウエルに加え（１０,０００細胞／ウエル）、そのプレートをさらに４８時間３７℃でインキュベートした。Ａ５４９ＧＬ３Ｌuc細胞のルシフェラーゼ遺伝子サイレンシングは、≧１ｎＭのsiＲＮＡ濃度で８０％以上であり、無関係のＧＬ２Ｌuc siＲＮＡを形質導入した場合にはルシフェラーゼの阻害が存在しないことで示されるように、選択的であった（図９）。siＲＮＡのピコモルレベルでのサイレンシングも有意なものとして得られた（＞５０％、図９）。siＲＮＡ形質導入の最適化された逆手順の後のＭＣＦ−７細胞における選択的ＧＡＰＤＨサイレンシングは、１００ｐＭと５ｎＭのsiＲＮＡ濃度で、それぞれ、７０ないし９０％の効率で得られた（図１０）。
【０２３５】
下記表４には、式（Ｉ）による両親媒性カチオン性分子に基づく製剤を用いて形質導入したＧＬ３Ｌuc siＲＮＡによってのルシレラーゼ遺伝子（ｐＧＬ３）のサイレンシングに関しての結果を示す。
【０２３６】
両親媒性カチオン性分子／ＤＯＰＥ（１０％エタノール／水中、１ｍＭ／２ｍＭ）から構成される製剤を用いて、siＲＮＡ複合体を形成し、Ａ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞に形質導入した。４８時間のインキュベーションの後に、ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。実験は３回の繰り返しで実施し、ＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシング効率を対照のＧＬ２−Ｌuc siＲＮＡで形質導入した細胞のルシフェラーゼレベルから計算し、細胞溶解液中のタンパク質含量により標準化した。
【表４】
2009532056.tif 000040
【０２３７】
引用文献
Cho, J., and R.R. Rando. 2000. Specific binding of Hoechst 33258 to site 1 thymidylate synthase mRNA（部位１チミジル化シンターゼｍＲＮＡに対するヘキスト３３２５８の特異的結合）. Nucleic Acids Res. 28:2158-63．
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【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】製剤ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／１ｍＭ、エタノール中）で形質導入したＧＬ３Ｌuc siＲＮＡによるＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞によって安定的に発現されるルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ３）の選択的効率的ＲＮＡ干渉。
【０２３９】
ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞は、１００ないし２０００ｐＭの範囲の濃度として、ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／１ｍＭ、エタノール中）からなる等モル製剤２μｌと複合体形成したＧＬ３Ｌuc siＲＮＡで形質導入した（２４穴組織培養プレートフォーマットにて）。非特異的siＲＮＡ対照として、ＧＬ２ルシフェラーゼ配列にマッチするsiＲＮＡを同じ条件で形質導入した。ルシフェラーゼ遺伝子発現は、４８時間のインキュベーションの後に測定した。実験は三重測定で実施し、ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中のタンパク質含量（ｍｇのタンパク質）により標準化した相対光単位（ＲＬＵ）で表した。
【図２】製剤ＭＯＮＢＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ、エタノール中）で形質導入したＧＬ３Ｌus siＲＮＡによるＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞によって安定的に発現されるルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ３）の選択的効率的ＲＮＡ干渉。
【０２４０】
ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞は、２５０ないし５０００ｐＭの範囲の濃度として、ＭＯＮＢＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ、エタノール中）からなる製剤２μｌと複合体形成したＧＬ３Ｌus siＲＮＡで形質導入した（２４穴組織培養プレートフォーマットにて）。非特異的siＲＮＡ対照として、ＧＬ２ルシフェラーゼ配列にマッチするsiＲＮＡを同じ条件で形質導入した。ルシフェラーゼ遺伝子発現は４８時間のインキュベーションの後に測定した。実験は三重測定で実施し、ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中のタンパク質含量（ｍｇのタンパク質）により標準化した相対光単位（ＲＬＵ）で表した。
【図３】ピコモル範囲のsiＲＮＡでも有効な製剤ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／１ｍＭ、エタノール中）で形質導入したＧＬ３Ｌus siＲＮＡによるルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ３）のサイレンシング。
【０２４１】
ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞は、１０ないし５０００ｐＭの範囲の濃度のsiＲＮＡを含むＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／１ｍＭ、エタノール中）からなる等モル製剤と複合体形成したＧＬ３Ｌus siＲＮＡで形質導入した（２４穴組織培養プレートフォーマットにて）。ルシフェラーゼ遺伝子発現は４８時間のインキュベーションの後に測定した。実験は三重測定で実施し、ＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングの効率は、細胞溶解液中のタンパク質含量により標準化した非形質導入Ａ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞の内在性ルシフェラーゼレベルから計算した。
【図４】１００±１０ｎｍの粒径をもつリポソームの比較的単分散の集団を示す粒子径のＤＬＳ測定。
【０２４２】
種々濃度のＤＯＰＥによる両親媒性物質１ｍｍｏｌｅのリポソーム製剤は、上記のように、ミリＱ水中で調製した。これらリポソーム製剤の粒子径は、以下の規格をもつゼータマスター（モルバーン・インストルーメント、オルセー、フランス）を用いて、光散乱により測定した：試料採取時間、３０秒；１サンプルにつき３回測定；媒体粘度、１.０ｃＰ；屈折率（ＲＩ）媒体、１.３３５；ＲＩ粒子、１.４７；温度：２５℃（レーザー波長６３３ｎｍ）。図に示した粒子径測定は、水中、１ｍＭ−ＭＯＮＩおよび１.５ｍＭ−ＤＯＰＥのリポソーム製剤から得た（５℃で１ヶ月保存後のリポソームの安定性）。測定は三重測定で実施した。
【図５】水中ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ）製剤を形質導入したＧＬ３Ｌus siＲＮＡおよび多くの市販入手可能なsiＲＮＡ形質導入試薬によるルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ３）の比較的サイレンシング効率。
【０２４３】
ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞は、１ないし１００００ｐＭの範囲の濃度のsiＲＮＡを含む水中ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ、エタノール中）からなるリポソーム製剤２μｌおよび市販入手可能な形質導入試薬とで複合体形成したＧＬ３Ｌus siＲＮＡで形質導入した（２４穴プレート）。市販の形質導入試薬は製造業者の推奨に従い、その最適条件で使用した（材料および方法の項参照）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は４８時間のインキュベーションの後に測定した。測定は三重測定で実施し、ＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングの効率は、細胞溶解液中のタンパク質含量により標準化した非形質導入Ａ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞の内在ルシフェラーゼレベルから計算した。
【図６】水中ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ）の製剤でsiＲＮＡ形質導入後の異なる細胞株における効率的なＧＡＰＤＨ遺伝子サイレンシング。
【０２４４】
接着性ヒーラ（ＨeＬa）、カスキ（Ｃasｋi）、およびＳiＨＡ細胞、および非接着性Ｋ５６２およびＴＨＰ−１細胞を、水中製剤ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ）と複合体形成したＧＡＰＤＨsiＲＮＡにより形質導入した。４８時間のインキュベーション後に、分枝ＤＮＡアッセイによりＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルを測定した。非特異的対照として、無関係の配列（ラミンＡ／Ｃ）にマッチするsiＲＮＡを同じ条件で形質導入した。実験は三重測定で実施し、ＧＡＰＤＨサイレンシングの効果は、非形質導入細胞の内在ＧＡＰＤＨレベルから計算した。
【図７】ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤は、３Ｔ３細胞において効率的なビメンチン遺伝子サイレンシングを仲介する。
【０２４５】
３Ｔ３細胞は、ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤と複合体としたビメンチンsiＲＮＡにより、２０ｎＭないし１ｎＭの範囲のsiＲＮＡ濃度で形質導入した。ビメンチンタンパク質レベルは、４８時間のインキュベーションの後、ウエスタンブロットにより測定した。細胞溶解液中のタンパク質レベルの対照として、ＧＡＰＤＨタンパク質をも検出した。
【図８】リポソームＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤は、ヒーラ（ＨeＬa）細胞において効率的なラミンＡ／Ｃ遺伝子サイレンシングを仲介する。
【０２４６】
ヒーラ細胞は血清含有培地中（２４穴プレートにて）、水中ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ、エタノール中）からなるリポソーム製剤２μｌと複合体形成したラミンＡ／Ｃ siＲＮＡ（５ｎＭ）により形質導入した。ラミンＡ／Ｃタンパク質は、形質導入の４８時間後に免疫蛍光染色により検出し、顕微鏡で観察し（ＣおよびＤ）、非形質導入細胞（ＡおよびＢ）と比較した。
【図９】水中ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ）製剤と複合体形成したsiＲＮＡの逆形質導入は、選択的高効率遺伝子サイレンシングを誘導する。
【０２４７】
無血清培地５０μｌに希釈したＧＬ３Ｌus siＲＮＡを、水中ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ）からなる製剤１μｌにより５分間複合体形成した（９６穴組織培養プレートフォーマット、ｎ＝６）。次いで、ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現する１００００個のＡ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞を、血清含有培地１２５μｌ中、ウエルごとに加えた。ルシフェラーゼ遺伝子発現は４８時間のインキュベーション後に測定した。非特異的siＲＮＡ対照として、ＧＬ２ルシフェラーゼ配列にマッチするsiＲＮＡを同じ条件で形質導入した。ルシフェラーゼ遺伝子の発現を４８時間のインキュベーション後に測定し、ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液中のタンパク質含量（ｍｇのタンパク質）により標準化した相対的光単位（ＲＬＵ）として表した。ＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングの効率（図３Ｂ）は、細胞溶解液中のタンパク質含量により標準化した非形質導入Ａ５４９−ＧＬ３Ｌuc細胞の内在性ルシフェラーゼレベルから計算した。
【図１０】水中ＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ（１ｍＭ／２ｍＭ）製剤と複合体形成したsiＲＮＡの逆形質導入は、ＭＣＦ−７細胞の内在ＧＡＰＤＨを沈黙させるために有効であった。
【０２４８】
siＲＮＡ形質導入の最適化した逆手法は、１００ｐＭないし１０ｎＭのsiＲＮＡの濃度範囲とリポソームＭＯＮＩ／ＤＯＰＥ製剤１μｌを用いて、ＭＣＦ−７のＧＡＰＤＨ遺伝子を沈黙させるために適用した。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルは、形質導入の４８時間後にカンチジーン（QuantiGene；登録商標）分枝ＤＮＡアッセイにより測定した。非特異的対照として、無関係の配列（ラミンＡ／Ｃ）にマッチするsiＲＮＡを同じ条件で形質導入した。ＧＡＰＤＨサイレンシング効率は、非形質導入細胞の内在するＧＡＰＤＨレベルから計算した（１条件あたりｎ＝６）。
【図１】
2009532056.tif 000047
【図２】
2009532056.tif 000048
【図３】
2009532056.tif 000049
【図４】
2009532056.tif 000050
【図５】
2009532056.tif 000051
【図６】
2009532056.tif 000052
【図７】
2009532056.tif 000053
【図８】
2009532056.tif 000054
【図９】
2009532056.tif 000055
【図１０】
2009532056.tif 000056
【配列表】
2009532056000001.xml
【国際調査報告】
2009532056.tif 000060
2009532056.tif 000061
2009532056.tif 000062