(57)【要約】試料体から信号場を検出するシステムを提供する。このシステムは、供給源システムと光ファイバシステムとを備える。供給源システムは、第１の周波数で第１の電磁場を提供し、第１の周波数とは異なる第２の周波数で第２の電磁場を提供する。この光ファイバシステムは、第１の電磁場および第２の電磁場を試料体に誘導して第１の場および第２の場と試料体積との非線形相互作用によって分子振動のコヒーレント放射特性を発生させる、少なくとも１つの光ファイバを備える。また、この光ファイバシステムは、コヒーレント放射の結果生じる信号場を受信し、この信号場を検出器に誘導する。
2009511175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料体から信号場を検出するシステムであって、
第１の周波数で第１の電磁場を供給し、前記第１の周波数とは異なる第２の周波数で第２の電磁場を供給する供給源システムと、
前記第１の電磁場および前記第２の電磁場を前記試料体に導入して前記第１の電磁場および前記第２の電磁場と前記試料体との非線形相互作用によって分子振動のコヒーレント放射を発生させ、前記コヒーレント放射の結果生じる信号場を受信し、前記信号場を検出器に誘導する少なくとも１つの光ファイバを有する光ファイバシステムと、
を備えるシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記信号場が、前記試料体内の分子振動に応答する三次非線形過程により提供される、システム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記第１の電磁場がポンプ場であり、前記第２の電磁場がストークス場であり、前記信号場がコヒーレント反ストークスラマン散乱過程における反ストークス場である、システム。
【請求項４】
請求項３に記載のシステムにおいて、前記システムが、不均一媒体によるコヒーレント放射の線形散乱の結果生じる、進行方向が変更された反ストークス場を検出する、システム。
【請求項５】
請求項４に記載のシステムにおいて、前記試料体が患者の組織内にある、システム。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記光ファイバシステムが複数の光ファイバを備える、システム。
【請求項７】
請求項６に記載のシステムにおいて、前記第１の電磁場および前記第２の電磁場が、前記光ファイバシステム内の前記複数の光ファイバの１つを用いて前記試料体に導入され、前記信号場が、前記光ファイバシステム内の前記複数の光ファイバの別の光ファイバを用いて前記検出器に誘導される、システム。
【請求項８】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記信号場が、前記光ファイバシステム内の複数の光ファイバを用いて前記検出器に誘導される、システム。
【請求項９】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記第１の電磁場および前記第２の電磁場が、前記光ファイバシステム内のシングルモード光ファイバを用いて前記試料体に導入され、前記信号場が、前記光ファイバシステム内の複数のマルチモード光ファイバを用いて前記検出器に誘導される、システム。
【請求項１０】
請求項３に記載のシステムにおいて、前記システムがさらに、前記光ファイバシステムの近端で、前記第１の電磁場および前記第２の電磁場を前記光ファイバシステム内の複数の選択された光ファイバのいずれかに選択的に進行させる走査システムを備える、システム。
【請求項１１】
請求項１０に記載のシステムにおいて、前記システムが前記走査システムと前記光ファイバシステムの前記近端との間にビームスプリッタを備え、前記ビームスプリッタは前記信号場を前記検出器に進行させる、システム。
【請求項１２】
請求項１０に記載のシステムにおいて、前記システムが前記供給源システムと前記走査システムとの間にビームスプリッタを備え、前記ビームスプリッタは前記信号場を前記検出器に進行させる、システム。
【請求項１３】
請求項３に記載のシステムにおいて、前記システムがさらに、前記第１の電磁場および前記第２の電磁場を前記試料体内の複数の選択された焦点領域のいずれかに選択的に進行させる、前記光ファイバシステムの遠端に設けられた遠端走査システムを備える、システム。
【請求項１４】
請求項１に記載のシステムにおいて、前記第１の電磁場および前記第２の電磁場を、前記第１の電磁場および前記第２の電磁場を含む単一の光のビームで前記試料体に進行させる、システム。
【請求項１５】
試料体内における少なくとも１つの励起パルストレインの複数の光周波数成分の非線形相互作用によって誘起される反ストークス場を検出する、コヒーレント反ストークスラマン散乱内視鏡検査システムであって、
少なくとも１つの励起パルストレインの前記複数の光周波数成分を提供するコヒーレント供給源を有する供給源システムと、
少なくとも１つの光ファイバを有する光ファイバシステムを備え、前記少なくとも１つの光ファイバは、前記試料体から反ストークス場を受信し、前記光ファイバシステム内の前記少なくとも１つの光ファイバを用いて前記反ストークス場を検出器に誘導し、前記反ストークス場は、前記複数の光周波数成分と前記試料体との相互作用によって生じる非線形コヒーレント場に応答して発生する、システム。
【請求項１６】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記システムが、試料体内で順方向に発生し、不均一媒体によって前記順方向と実質的に異なる方向に散乱された反ストークス場を検出する、システム。
【請求項１７】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記光ファイバシステムが複数の光ファイバを備える、システム。
【請求項１８】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記反ストークス場が、前記光ファイバシステム内の複数の光ファイバを用いて前記検出器に誘導される、システム。
【請求項１９】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記光ファイバシステムがダブルクラッド光ファイバを備える、システム。
【請求項２０】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記第１の光ファイバがシングルモードファイバであり、前記第２の光ファイバがマルチモードファイバである、システム。
【請求項２１】
請求項１５に記載のシステムにおいて、前記複数の光周波数成分が、前記光ファイバシステム内の第１の光ファイバを用いて前記試料体に導入されるポンプ電磁場およびストークス電磁場を含み、前記反ストークス場が、前記光ファイバシステム内の第２の光ファイバを用いて前記検出器に誘導される、システム。
【請求項２２】
請求項２１に記載のシステムにおいて、前記システムがさらに、前記光ファイバシステムの近端で、前記ポンプ電磁場および前記ストークス電磁場を前記光ファイバシステム内の複数の選択された光ファイバのいずれかに進行させる近端走査システムを備える、システム。
【請求項２３】
請求項２１に記載のシステムにおいて、前記システムがさらに、前記ポンプ電磁場および前記ストークス電磁場を前記試料体内の複数の選択された焦点領域のいずれかに進行させる遠端走査システムを備える、システム。
【請求項２４】
請求項２１に記載のシステムにおいて、前記ポンプ場および前記ストークス場が、前記ポンプ場および前記ストークス場を含む単一の光のビームで前記試料体に提供される、システム。
【請求項２５】
試料体内におけるポンプ場とストークス場の非線形相互作用によって誘起される反ストークス場を検出する、コヒーレント反ストークスラマン散乱内視鏡検査システムであって、
ポンプ周波数でポンプ電磁場を提供し、前記ポンプ周波数とは異なるストークス周波数でストークス電磁場を提供する供給源システムと、
前記ポンプ場および前記ストークス場を単一のビームとしてレンズに誘導する光ファイバを有するポンプ場およびストークス場光ファイバシステムを備え、前記レンズは前記ポンプ場と前記ストークス場を前記試料体に進行させ、
前記試料体から前記反ストークス場を受信し、前記反ストークス場を検出器に進行させる反ストークス場光伝送システムを備え、前記反ストークス場は、前記試料体における前記ポンプ場および前記ストークス場の相互作用によって生じる非線形コヒーレント場に応答して発生する、
システム。
【請求項２６】
請求項２５に記載のシステムにおいて、前記反ストークス場光伝送システムが複数のマルチモード光ファイバを備える、システム。
【請求項２７】
請求項２５に記載のシステムにおいて、前記システムがさらに、前記ポンプ場と前記ストークス場を試料体内の複数の焦点領域に提供する走査システムを備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年１０月１３日出願の米国仮特許出願第６０／７２６，３１９号および２００６年４月１２日出願の米国実用特許出願第１１／４０３，０７５号に基づく優先権を主張し、それらの開示内容全体を本願に引用して援用する。
【０００２】
本発明はその一部について、パイオニアアウォード（Pioneer Award）５  ＤＰ１  ＯＤ０００２７７の下、米国立保健研究所の後援を受けている。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、振動イメージング分析の分野に関し、特にコヒーレント反ストークスラマン散乱分析の分野に関する。
【０００４】
コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）イメージングは、分子振動をコントラスト機構として用いた化学試料や生体試料の分析を提供する。特に、ＣＡＲＳ分析では少なくとも２つのレーザ場、中心周波数がωｐであるポンプ電磁場（pump electromagnetic field）と中心周波数がωｓであるストークス電磁場（Stokes electromagnetic field）を用いる。ポンプ場とストークス場は、試料と相互作用して位相整合方向にωａｓ＝２ωｐ−ωｓの周波数を有するコヒーレント反ストークス場を発生させる。周波数差ωｐ−ωｓを調整して所定の振動モードと共振させると、反ストークス周波数ωａｓで強調されたＣＡＲＳ信号が発生する。
【０００５】
蛍光顕微鏡検査と異なり、ＣＡＲＳ顕微鏡検査では、イメージングが生体物質や化学物質の振動コントラストに依存するため、（光退色が発生することもある）蛍光体を使用する必要がない。また、ＣＡＲＳ顕微鏡検査のコヒーレント性は、自発ラマン顕微鏡検査に比べて著しく高い感度を示す。これによって、（生体試料に許容できる）より低い平均励起力および／または短いデータ収集時間を用いることができる。ωａｓ＞ωｐ，ωｓであるため、背景蛍光が存在しても信号を検出することができる。
【０００６】
例えば、米国特許第４，４０５，２３７号には、波長が異なる２つのレーザパルストレインを時間的および空間的に重なり合わせて使用して同時に試料を照射する、コヒーレント反ストークスラマン分光イメージング装置が開示されている。’２３７特許には、２つのレーザビームの非共線的な形状と、相応の空間分解能を与える２次元検出器を用いた位相整合方向の信号ビームの検出が開示されている。
【０００７】
米国特許第６，１０８，０８１号には、共線的な励起形状が提案されており、共線的なポンプビームとストークスビームを高開口率（ＮＡ）対物レンズで集束する、コヒーレント反ストークスラマン散乱を用いた顕微鏡振動イメージングの方法および装置が開示されている。信号の励起強度への依存性が非線形であるため、焦点のプローブ体積が小さくなり、比較的厚い試料の３次元断面作成を行うことができる。信号ビームは順方向に検出される。
【０００８】
しかしながら、上述の非共線的な励起形状に続いて、米国特許第６，９３４，０２０号には、光ファイバを使用してポンプビームとストークスビームを発光システムからビーム照射機構に送るレーザ顕微鏡が開示されている。ポンプビームとストークスビームは、結合されてから光ファイバの近端に進入し、光ファイバの遠端から出た後にビーム照射機構によって再び２つのビームに分離され、その結果、各ビームを互いに試料に向かって進行させることができる。ＣＡＲＳ信号は、順方向に試料から検出される。
【０００９】
しかし、目的の共振信号を歪ませて抑制することさえある化学特異的情報を持たない、ＣＡＲＳ信号への非共振的な寄与も存在する。ＣＡＲＳ背景（CARS background）は、３次非線形感受率への電子的な寄与によって生じる。非共振的な寄与は、目的の試料とその周囲の等方性バルク媒体（すなわち溶媒）の試料から生じ、ラマンシフトωｐ−ωｓとは無関係である。この非共振的な寄与によって振動コントラストのない背景が提供され、この背景から所望の信号を濾波または何らかの方法で区別する必要がある。等方性バルク水からこの背景が存在するために、特に生物学的な用途において、ＣＡＲＳイメージングの感度向上が妨げられてきた。
【００１０】
ＣＡＲＳ分光法において非共振的な背景場を低減させる１つの手法は、非共振的な背景が共振信号とは異なる偏波特性を持つ事実を利用することである。例えば、米国特許第６，７９８，５０７号には、ポンプビームとストークスビームが偏波され、偏波感受型検出器（polarization sensitive detector）を用いるシステムが開示されている。しかしながら、高分解能ＣＡＲＳ顕微鏡検査では、高密度に集束した共線的な励起ビームが必要になることがあり、偏波されたビームを高密度に集束すると偏波スクランブルが発生することが知られている。
【００１１】
米国特許第６，８０９，８１４号には、ＣＡＲＳ信号が逆方向（後方向）に試料から受信されるシステムが開示されている。後方向に発生する信号は、通常は著しく高いＳＢ（signal to background）比を有するが、一部の用途では、後方向に発生する信号が順方向に発生する信号に比べて非常に小さくなるのが普通である。
【００１２】
また、従来のＣＡＲＳ顕微鏡検査システムでは、一般には、試料を対象物から抽出し、通常はｘおよびｙ方向に移動可能な台の上に試料を配置して検査する必要がある。しかしながら、ある特定の用途では、「原位置で」試料のＣＡＲＳ分析を行うのが望ましい。ただし、このような試料を順方向ＣＡＲＳを用いて表示するのが容易ではない場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そのため、人体、動物、またはその他の対象物や試料内において「原位置で」ＣＡＲＳ分析を利用できるシステムおよび方法が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、試料体から信号場を検出するシステムを提供する。このシステムは、供給源システムと光ファイバシステムとを備える。ある実施形態では、供給源システムは、第１の周波数で第１の電磁場を提供し、第１の周波数とは異なる第２の周波数で第２の電磁場を提供する。この光ファイバシステムは、第１の電磁場および第２の電磁場を試料体に誘導して第１の場および第２の場と試料体との非線形相互作用によって分子振動のコヒーレント放射特性を発生させる、少なくとも１つの光ファイバを備える。また、この光ファイバシステムは、コヒーレント放射の結果生じる信号場を受信し、この信号場を検出器に誘導する。他の実施形態では、システムがさらに、試料体内の複数の焦点領域にポンプ場およびストークス場を提供する走査システムを備える。
【００１５】
別の実施形態では、試料体積における少なくとも１つの励起パルストレインの複数の光周波数成分による非線形相互作用によって誘起される反ストークス場を検出する、コヒーレント反ストークスラマン散乱内視鏡検査システムを提供する。このシステムは、供給源システムと光ファイバシステムとを備える。供給源システムは、少なくとも１つの励起パルストレインの複数の光周波数成分を提供するコヒーレント源を備える。光ファイバシステムは少なくとも１つの光ファイバを備え、この少なくとも１つの光ファイバは、試料体から反ストークス場を受信し、光ファイバシステム内にあるこの少なくとも１つの光ファイバを使用して反ストークス場を検出器に誘導する。反ストークス場は、複数の光周波数成分と試料体との間の非線形コヒーレント相互作用に応答して発生する。
【００１６】
さらに別の実施形態では、試料体積におけるポンプ場とストークス場の非線形相互作用によって誘起される反ストークス場を検出する、コヒーレント反ストークスラマン散乱内視鏡検査システムを提供する。このシステムは、供給源システムと、ポンプ場およびストークス場光ファイバシステムと、反ストークス場光伝送システムとを備える。供給源システムは、ポンプ周波数でポンプ電磁場を提供し、ポンプ周波数とは異なるストークス周波数でストークス電磁場を提供する。ポンプ場およびストークス場光ファイバシステムは、ポンプ場とストークス場を単一のビームとしてレンズに誘導する光ファイバを備える。このレンズはポンプ場とストークス場を試料体に進行させる。反ストークス場光伝送システムは、試料体から反ストークス場を受信し、反ストークス場を検出器に進行させる。反ストークス場は、試料体におけるポンプ場とストークス場の相互作用によって生じる非線形コヒーレント場に応じて発生する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
生体医学のさまざまな分析用途において、「原位置で」組織イメージングを行うことが望ましい。医療においては、外科治療や疾患診断などの用途に内視鏡技術が幅広く用いられている。内視鏡検査は、光コヒーレンス断層撮影（ＯＣＴ）に基づくコントラスト、１および２光子蛍光、２次高調波発生を用いて行われている。これらの進歩は、直ちに臨床の場においてさまざまな用途を生み出した。ＯＣＴはイメージング組織形態学（imaging tissue morphology）において大きな成功を収めたが、そのコントラストは屈折率差に基づいている。内因性蛍光内視鏡検査（endogenous fluorescence endoscopy）は固有の生物学的蛍光体（biological fluorophore）に対して感受性を示し、このため汎用性が制限される。２次高調波発生内視鏡検査は非中心対称性構造に対して感受性を示すが、その用途は少数の生体物質に限られる。ＣＡＲＳ内視鏡は、「原位置での」ラベルフリー化学選択的イメージング（label-free chemically-selective imaging）を提供し、生物医学用途に理想的な手段となる。
【００１８】
コヒーレント反ストークスラマン散乱分析の利点は、サブミクロンの位置分解能と数十ミクロンから数ミクロンのオーダーでの軸方向の分解能で検体をイメージングすることが可能な内視鏡検査システムにおいて実現できることがわかっている。本発明では、光ファイバを使用して、ポンプ場およびストークス場を単一のビームとして試料に直接送ることができるだけではなく、光ファイバを逆進する後方向にＣＡＲＳ信号を検出することもできる。特に、出願人は、シングルモードファイバ（例えば８３０ｎｍ伝播用）を介してポンプビーム（例えば８００ｎｍ）やストークスビーム（例えば１０６４ｎｍ）を提供することができるが、発生するＣＡＲＳ信号も、その波長（例えば６６０ｎｍ）がポンプビームやストークスビームに比べてはるかに短くても、同じファイバを介して逆送させることができることを発見した。ＣＡＲＳ信号はファイバのシングルモード範囲外だが、ファイバによってＣＡＲＳ信号用に提供されるマルチモード伝送で十分にＣＡＲＳ内視鏡検査に対応できる。また、試料が反ストークス応答の不均一散乱を引き起こすことがあるが、最初は順方向に伝播していたが「原位置の」混濁物質での多重散乱によって逆方向に進行させられた反ストークス場を捕獲して試料の外部にある検出器に進行させることができる。他の実施形態では、ポンプ場およびストークス場以外の場も用いて反ストークス信号を発生させることができる（例えば、プローブ周波数場（probe frequency field））。さらに他の実施形態では、広帯域パルスレーザシステムで得られるように、試料体積において少なくとも１つの励起パルストレインの複数の光周波数成分を用いて反ストークス場を発生させることができる。
【００１９】
図１に示すように、本発明の実施形態によるシステムは、光ファイバシステム１０、ポンプ場およびストークス場を提供する供給源１２、および検出器１４を備えることができる。供給源１２（光パラメトリック発振器など）は、共線的なポンプ場およびストークス場を、光ファイバシステム１０を経由して患者１６内の試料に進行させる。後方散乱した反ストークス場は、光ファイバシステム１０を逆進してビームスプリッタ１８を経由して検出器１４で検出される。
【００２０】
出願人は、「原位置の」患者の組織など特定の試料において、当初の後方向の非線形散乱だけでなく、主に混濁した不均一媒体での順方向に伝播する反ストークス信号の多重線形散乱によっても、強力な後方向ＣＡＲＳ信号（epi-CARS signal）が発生することを発見した。順方向に伝播するＣＡＲＳ信号は、組織における多重散乱によって、当初後方向に進行していた信号成分と同じ方向に進行方向を変えることができる。これを図２に示し、ポンプ場（ωｐ）およびストークス場（ωｓ）は、単一のビームとして光ファイバシステム１０と対物レンズ２０を通過する。その後、試料の３次非線形振動応答（third order non-linear vibrational response）によって、順方向に進行する反ストークス場（ωａｓ，ｆｗｄ）と後方向に進行する通常は弱い反ストークス場（ωａｓ，ｅｐｉ）が発生する。順方向に進行する反ストークス場の大部分はその他の物質２２から散乱され、この散乱された反ストークス場と後方向に進行する反ストークス場は、レンズ２０によって収集され、光ファイバシステム１０によって光ファイバシステムの近端に戻されて検出器に送られる。したがって、多重散乱は、光ファイバシステムを通して逆方向にＣＡＲＳ信号を検出する機構を提供する。非線形ＣＡＲＳ信号は強度が最も高いところでのみ発生するので、ファイバを伝送して逆方向に検出されるＣＡＲＳ信号は、順方向ＣＡＲＳ信号の後方散乱が大量に発生するにもかかわらず呼び掛けられるのが小さい焦点体積でしか発生しない。
【００２１】
本発明の実施形態によるＣＡＲＳ内視鏡システムでは、波長が異なる２つの高ピーク出力パルスを、著しいスペクトル広がりを発生させずに集束光学素子および走査ヘッドに送る必要がある。発生する反ストークスパルスは励起波長よりも短い波長であり、この反ストークスパルスを効率よく収集して同じファイバを逆方向に伝播させる必要がある。このＣＡＲＳ内視鏡光学設計では確実に、高密度集束形状を用いてポンプおよびストークスレーザパルスを試料内で時間的および空間的に重なり合わせる必要がある。色収差（レンズの材料分散が原因）やその他の種類の収差が生じるため、空間的重なりは非自明である。ポンプビームとストークスビームの焦点をできるだけ一致させるには、ポンプビームとストークスビームの両方を集束する特別に設計された微小光学レンズが必要となる。
【００２２】
本発明の別の実施形態によるＣＡＲＳ内視鏡システムでは、複数の光周波数を使用して反ストークス信号を発生させることができる。実現可能なある構成では、ポンプ場およびストークス場をプローブ場と結合して反ストークス信号を発生させることができる。ポンプ場、ストークス場、およびプローブ場は、狭帯域パルスと広帯域パルスのどちらからでも得られる。実現可能な別の構成では、単一広帯域パルスを使用して反ストークス信号を発生させることができる。この単一広帯域パルスは、空間光変調器などの振幅または位相変調器を使用して変更することができる。別の構成では、マルチプレックスＣＡＲＳ測定用の狭帯域ポンプパルスと広帯域ストークスパルスを用いることができる。この構成では、反ストークス信号を発生させるための狭帯域プローブ場を組み込むこともできる。
【００２３】
以下に詳細を説明する特定の実施形態では、ポンプパルスおよびストークスパルスを同時に送るための広帯域波長可変光パラメトリック発振器だけでなく、走査ミラー設計も用いることができる。ポンプビームおよびストークスビームは、シングルモードファイバまたはフォトニック結晶ファイバで伝播することができる。ファイバの後段で光を視準して光を試料に集束させるために非球面レンズを使用してもよく、例えば、試料全体に対するビームの２次元走査に用いる微小電子機械スイッチ（ＭＥＭＳ）ミラーを使用して走査を行ってもよい。非球面レンズを使用して、反ストークス波長の信号を収集してファイバに結合することができる。
【００２４】
内視鏡は、患者内に挿入するカテーテル内またはカテーテルに沿って結合することができる。以下に詳細を説明するように、走査ヘッドを使用して、ポンプ場およびストークス場を焦点体積内の所望の位置に配置することで、ポンプ場およびストークス場を提供することもできる。ポンプ場およびストークス場は、シングルモード光ファイバを使用する光ファイバシステムを経由して進行させることができ、反ストークス波長の結合光をファイバシステム内でシングルモード伝播またはマルチモード伝播させることができる。伝播光は、ファイバに融着された追加のファイバポートで分波したり、ファイバの入力端に設けられたダイクロイックミラーによって出力結合（outcouple）したりすることができる。分波または出力結合された光信号は、他の光周波数の迷光から濾波されて、高感度かつ高電気ゲイン（electric gain）の光検出器で検出される。電気信号は調整および計数化され、その値はＭＥＭＳミラーなどの走査素子の動作と同期して読み出され、これによって画像が生成される。
【００２５】
したがって、本発明はＣＡＲＳ内視鏡を提供する。特定の実施形態では、その設計において、遠端に集束部を設けたシングルモード光ファイバを使用する。近赤外のピコ秒ポンプおよびストークスパルストレインが、内視鏡検査に必要な強度においてスペクトル特性および時間特性がほとんど変わらずに、ファイバを経由して送られる。ＣＡＲＳ内視鏡画像は、試料に対してファイバをラスタ走査し、検体で発生した後方向ＣＡＲＳ信号を収集することによって記録される。本発明の内視鏡は、生体医学の用途における「原位置での」高感度ＣＡＲＳイメージングに好適な場合があり、（ｉ）ラマン振動分光法に基づく化学コントラスト、（ｉｉ）ＣＡＲＳ過程のコヒーレント性による高い感度と高速の取得速度、（ｉｉｉ）サブ波長３Ｄ空間分解能など、さまざまな利点が得られる。
【００２６】
上述のように、ＣＡＲＳ過程では、ポンプ周波数（ωｐ）とストークス周波数（ωｓ）の２つのレーザ周波数が必要となる。この２つのレーザ周波数の差周波数を試料の振動共振の差周波数に設定すると、反ストークス周波数（ωａｓ＝２ωｓ−ωｐ）で強力な光応答が発生する。ＣＡＲＳ信号は素材の３次非線形感受率χ（３）から導出され、この感受率は共振が発生するように差周波数を調整したときに著しく増大する。イメージングにおいては、ＣＡＲＳは、差周波数が振動スペクトル全体を包含できる広い範囲で調整可能なレーザ供給源からの高ピーク出力パルストレインを必要とする。調整可能なピコ秒の供給源は、高いスペクトル分解能と最適なＳＢ比を実現できることから、イメージング用途に最適であることがわかっている。同期ポンプかつ広帯域調整可能な光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）が、この目的に理想的な供給源となる。このようなレーザパルスにおいては、１ｍ長のシングルモードファイバの時間およびスペクトルの領域特性に影響を与えずにビームを顕微鏡に送ることができることが証明されている。
【００２７】
図３に示すように、本発明の実施形態による内視鏡システムは、モードロックＮｄ：ＹＶＯ４レーザ３０、ストークス場ビーム３２、およびポンプ場ビーム３６を提供する同期ポンプ調整可能光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）３４を備える。このシステムは、ポンプ場ビームとストークス場ビームがダイクロイックミラー４０（Ｄ１）によって結合される前に、これらのビームの間のタイミングを（Ａで示す動作によって）調整する遅延部３８も備える。ストークスビームの経路には、半波長板（λ／２）４２も含まれる。
【００２８】
特に、レーザ供給源システムはレーザ３０とＯＰＯ３４とを備え、レーザ３０は、１０Ｗの平均出力と７６ＭＨｚの繰り返しでトランスフォームリミット７ｐｓパルスを送出し、１０６４．２ｎｍで動作する受動モードロックＮｄ：ＹＶＯ４レーザ（High-Q Laser Manufacturing, GmbH社）とすることができる。Ｎｄ：ＹＶＯ４出力の大部分（９Ｗ）は、（１５％ビームスプリッタを使用して）ＯＰＯ３４を同期的にポンプするのに使用した。ＯＰＯの共振器は、その信号波長に共振するように構成され、共振器内逓倍を用いて５ｐｓ間パルストレインで最大２Ｗの平均出力を効率的に発生する。７８０ないし９２０ｎｍの範囲の広帯域波長調整は、パラメトリック光発生に使用する多重格子周期分極ニオブ酸リチウム結晶（multi-grating periodically poled lithium niobate crystal）の位置と温度を調節し、共振器内逓倍器の温度を最大出力に設定することで達成される。１．３Ｗ以下の平均出力が使用可能な１０６４ｎｍビームの一部をストークスビームとして使用し、調整可能なＯＰＯ出力によりポンプビームを提供した。ストークスビームおよびポンプビームの出力ビーム品質は、Ｍ２係数がそれぞれ１．１以下および１．３以下になると考えられる。ポンプビームとストークスビームは、ダイクロイックミラー（Chroma社、９５０ＤＣＸＲ）で結合され、ファイバ結合光学素子へ共線的に伝播する。図に示すポンプビーム経路とストークスビーム経路では、可変減衰器も使用した。
【００２９】
ポンプ場ビームとストークス場ビームは、ミラー４０で結合されて単一の共線ビーム４４を提供する。このビームは、後方反射を除去するためのアングルカットされたファイバ端５０に設けられたレンズ４８を使用して、光ファイバシステム４６に進行させられる。その後、ポンプ場およびストークス場は、光ファイバシステム４６の遠端に設けられた対物レンズ５４を使用して、試料の焦点体積５２に進行させられる。発生する反ストークス場は、光ファイバシステム５４を逆進する方向に対物レンズ５４によって受信され、さらにレンズ４８に受信され、ダイクロイックミラービームスプリッタ５８を介して、アバランシェフォトダイオードや光電子増倍管などの検出器５６に進行させられる。
【００３０】
ポンプ場とストークス場とが結合されたレーザビームは、非球面レンズによって、８３０ｎｍでシングルモード伝播するように設計された、１ｍ長ステップインデックス（８３０ｎｍで、開口率０．１２、モード場径５．６μｍ）非偏波保持シリカファイバ（ｎｏｎ−ＰＭＦ）に結合した。このファイバ帯域幅では、計画された波長を最大２００ｎｍ上回るシングルモード伝播を実現できる。ポンプビームおよびストークスビームの大きさと発散は、結合効率を最大化するように調整した。ファイバ内では波長依存の偏波回転が確認されたが、両方のビームが同じ偏波を有すると最大のＣＡＲＳ信号が発生するので、この回転は望ましくない。そこで、ストークスビームラインに半波長板４２を使用して、この偏波回転を補償してＣＡＲＳ信号発生を最適化した。ポンプビームのラインには、ファイバの前段に遅延部３８を使用して、ポンプパルストレインとストークスパルストレインを時間的に重なり合わせた。ファイバ端子を直線上に配置するとＮｄ：ＹＶＯ４レーザへの光フィードバックが著しく発生し、アングルカットされたファイバ終端５０を使用する必要があった。ファイバへのビーム結合効率は、通常は４０％を上回った。半径が４ｍｍの集束レンズ４８を、半径が２．４ｍｍ、開口率が０．４３、作動距離が１．１ｍｍの非球面レンズを有するファイバ遠端に設けた。さまざまな実施形態において、以下に詳細を説明するように、ＸＹＺピエゾステージによって試料について内視鏡をラスタ走査することができる。逆方向に発生する場は、内視鏡によって収集および集束され、ファイバを後方向に伝播し、ダイクロイックミラー５８によって励起ビームから分離される。ＣＡＲＳ信号は、３つの６７０ｎｍ帯域フィルタ６０で濾波され、１００ｍｍ凹レンズ６２によってアバランシェフォトダイオード５６に集束される。
【００３１】
さまざまな実施形態で、光ファイバシステムは単一の光ファイバまたは光ファイバ束を備えることができる。図４Ａおよび４Ｂに示すように、光ファイバシステムの遠端は、光ファイバシステム７２からの照射を焦点体積７４に集束するレンズ７０を備えることができる。光ファイバシステムは、複数の光ファイバ７６を備えることができる。ある実施形態では、１つの光ファイバ７８を、焦点体積にポンプ場およびストークス場を提供するシングルモードファイバとし、残りの光ファイバを、光ファイバシステム７２の後方向に反ストークス場を提供するシングルモードまたはマルチモード光ファイバとすることができる。光ファイバ７６，７８は、隣接するファイバへの消散エネルギ（evanescent energy）転移を抑制するために、クラッド材の基質で覆うことも、十分な非円形状にすることもできる。
【００３２】
別の実施形態では、図５に示すように、光ファイバシステムが、ポンプ場およびストークス場を提供するシングルモード光ファイバ８０と、試料体積から反ストークス場を受信する、より大きい半径を有する複数のマルチモード光ファイバ８２とを備えることができる。クラッド材８４を用いて光ファイバ間の結合を低減することもできる。
【００３３】
図６に示すさらに別の実施形態では、光ファイバシステムは、ポンプ場およびストークス場を提供する中央のシングルモード光ファイバ９０と、試料体積から反ストークス場を受信する、光ファイバ９０を覆う環状断面を有するマルチモード光ファイバ９４を有するダブルクラッドシステムを備えることができる。このシステムは、光ファイバ９０，９２の間にクラッド材９４を備えたり、光ファイバ９２の外側にクラッド材９６を備えたりすることができる。
【００３４】
再び図５の光ファイバシステムを参照すると、図７の光ファイバシステムの近端に設けられた結合構造は、ポンプ場およびストークス場をレンズを介して光ファイバ８０に進入させ、光ファイバ８２からの反ストークス場をレンズを介して検出器１４に進行させるビームスプリッタ１８を備えることができる。図８に示すさらに別の実施形態では、光ファイバ８０を光ファイバ８２から分離し、光ファイバ８０をレンズを介してレーザ供給源１２に直接結合し、ビームスプリッタを必要とすることなく光ファイバ８２をレンズを介して検出器１４に直接結合することができる。
【００３５】
さらに他の実施形態では、光ファイバの近端としての走査システムによって、ポンプ場およびストークス場の焦点位置を焦点体積内で走査することもできる。例えば、図９に示すように、ｘおよびｙ位置走査ミラー９０，９２を使用して、ポンプ場およびストークス場を有するビームを、図４Ｂに示すような光ファイバシステムの複数のシングルモード光ファイバ９４のいずれかに位置合わせすることができる。戻り方向に受信される反ストークス場は、ポンプ場およびストークス場に用いる光ファイバとは無関係に、多数の光ファイバを伝播する。図１０に示すように、本発明のさらに別の実施形態による走査システムは、（反ストークス場を検出器１４に進行させる）ビームスプリッタ１００と光ファイバシステムとの間に、ｘおよびｙ位置ミラー９６，９８を備えることができる。図１０のシステムでは、ミラー９６，９８によって提供されるポンプ場およびストークス場ビームの複数の角位置に対して、反ストークス場がビームスプリッタ１００によって検出器１４に進行させられるまで、ポンプ場、ストークス場、および反ストークス場が共線性を維持し続ける。
【００３６】
さらに他の実施形態では、光ファイバの遠端としての走査システムによって、ポンプ場およびストークス場の焦点位置を焦点体積内で走査することができる。図１１に示すように、遠端走査システムは、固定部１０４および可動部１０６をそれぞれ備えるハウジング１０２と、ｘおよびｙ方向圧電モータ１０８と、ｚ軸環状圧電モータ１１０とを備える。そして光ファイバシステム１１２をハウジング１０２内に送り、電気制御ライン１１４を患者の外部に戻すことができる。
【００３７】
ポンプパルスおよびストークスパルスの時間特性およびスペクトル特性は、溶融シリカファイバの材料分散、モード屈折率、および非線形光パラメータを用いて正確に推定することができる。１ｍファイバ内における５ないし７ピコ秒間トランスフォームリミットパルスの時間的広がりは無視できるもので、０．１％未満と推定される。この予測は、これら２つのパルスに対する自己相関トレースおよび相互相関トレースによって裏付けられる。
【００３８】
ファイバ伝播により発生するパルスのスペクトル広がりは、スペクトル分解能や画像コントラストなど、ＣＡＲＳ内視鏡の重要な特性に大きな影響を与える。自己位相変調によるスペクトル広がりは、非線形的な位相のずれが２πのオーダーで生じるときに顕著になり始める。この条件に対応するパルス当たりエネルギは、この非線形的な位相のずれの式から導出することができる。結果は以下のようになる。
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ここで、ｔｐはパルス幅（６ｐｓ以下）、Ｄｅｆｆはモード場径（５．６μｍ以下）、ｎ２はシリカの非線形屈折率（２．６×１０−１６ｃｍ２／Ｗ）、Ｌはファイバ長を表す。ファイバ長が１ｍでパルス波長の中心が約８００ｎｍである場合、繰り返しが７６ＭＨｚで平均出力が約３００ｍＷに等しい約４ｎＪのパルスエネルギで、２πのずれが発生する。この２πの非線形的な位相のずれは、８０３．５ｎｍおよび１０６４．２ｎｍに対して平均出力がそれぞれ４００ｍＷおよび７００ｍＷのときに発生した。８０３．５ｎｍパルスにおいて広がったスペクトルは、ＯＰＯからの非対称的なスペクトルパルスプロファイルを意味する顕著な非対称性を示した。
【００３９】
これらのパルスエネルギでは、５ｍ長のファイバを伝播した結果、８０３．５ｎｍおよび１０６４．２ｎｍにおいてそれぞれ４０ｃｍ−１および６０ｃｍ−１のスペクトル広がりが発生した。この広がりは小さく、液体中での特性ラマン線幅と同じオーダーである。内視鏡画像の収集時は、通常は両方のレーザビームに８０ｍＷの出力を用いた。この平均出力は、自己位相変調によって誘起されるスペクトル広がりのしきい値をはるかに下回る。そのため、本発明での実験条件では、自己位相変調は発生せず、ファイバ伝播はＣＡＲＳスペクトル選択性に影響を及ぼさない。使用する発振器のピーク出力は、ビームの自己集束の限界出力値に比べて４桁以上小さくなる。
【００４０】
ＣＡＲＳ内視鏡の性能は、ポンプビームとストークスビームの間の周波数差を脂肪族ＣＨ帯域（aliphatic CH band）に設定して（ωｐ−ωｓが２８４５ｃｍ−１以下）、サイズ較正されたポリスチレンビーズをイメージングすることによって特定することができる。図１２Ａの１２０に、カバーガラス上にスピンコーティングによって形成された０．７５μｍポリスチレンビーズが明確に解像されているＸＹ画像を示す。ビーズの半値全幅の値（ＦＷＨＭ）は、１２４に示すように、画像の断面１２２にガウシアンフィッティングを用いて０．７６μｍであることがわかる。内視鏡システムでイメージングされる、より小さいビーズは、最大位置分解能を０．８μｍ以下に設定して計算すると、同じＦＷＨＭを有することがわかった。軸方向分解能は、同じ手法を用いて測定すると１２μｍ以下であった。この空間分解能は、集束レンズの開口率に基づいて期待されるものであり、イメージング組織形態学に十分な分解能である。
【００４１】
したがって、内視鏡は後方向ＣＡＲＳ信号を収集する。この信号は３つの異なる機構から発生することが知られている。厚さが薄い試料では、不完全な弱め合う干渉が逆方向に生じるときにのみ、後方向に伝播する信号が発生する。これは、共振対象の大きさが励起波長に比べて非常に小さい場合に起こる。第２の機構が発生するのは、３次非線形感受率に突然の変化が生じたときであり、この機構は境界面で発生しうる。第３の機構は厚い試料（１００μｍ超）で発生し、検体の混濁が原因で生じる多重散乱により、強力な順方向ＣＡＲＳ信号の一部が後方向に進行しうる。皮膚などの組織における後方向ＣＡＲＳ信号に対してはこの機構が支配的であることが証明されている。ビーズ（約５μｍ）などの厚さの薄い対象物においては、後方向ＣＡＲＳ信号は、最初の２つの機構から発生し、シングルモード伝播ファイバに結合し戻すことができる。しかし、より厚い組織には、ここに開示するＣＡＲＳ内視鏡検査システムで、試料からの反射光を効率的に結合することで十分に対応できる。さらに他の実施形態では、焦点距離を変化させて、試料から深さ分解情報を得ることができる。
【００４２】
上に開示した実施形態に対して本発明の主旨や範囲を逸脱せずにさまざまな変更や変化を加えることができることは、当業者に理解されるところである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の１実施形態によるシステムを示す図である。
【図２】図１のシステムの遠端部を示す図である。
【図３】本発明の別の実施形態によるシステムを示す図である。
【図４Ａ】本発明の別の実施形態によるシステムの遠端部を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａの切断線４Ｂ−４Ｂにおけるシステムの遠端部を示す図である。
【図５】本発明の別の実施形態によるシステムで使用する遠端のレンズを示す、図４Ｂと同様の図である。
【図６】本発明のさらに別の実施形態によるシステムで使用する遠端のレンズを示す、図４Ｂおよび５と同様の図である。
【図７】本発明のさらに別の実施形態によるシステムの近端部を示す図である。
【図８】本発明のさらに別の実施形態によるシステムの近端部を示す図である。
【図９】走査システムを備える本発明のさらに別の実施形態によるシステムの近端部を示す図である。
【図１０】走査システムを備える本発明のさらに別の実施形態によるシステムの近端部を示す図である。
【図１１】走査システムを備える本発明の別の実施形態によるシステムの近端部を示す図である。
【図１２Ａ】本発明の実施形態によるシステムで得られる反ストークス場の顕微鏡写真を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａに示す顕微鏡写真に関連するグラフを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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