(57)【要約】低コピー又はシングルコピーの配列を含まず、複数の反復因子を含むように合成されたＤＮＡを使用することによる、核酸プローブに存在する反復因子とターゲット核酸の対応する反復因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する新規な方法。
2009518004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む、核酸プローブ中に存在する反復因子とターゲットのゲノム核酸中のホモロガスな反復因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法：
代表的なゲノム領域内の反復配列を同定するステップ；
該同定された反復配列を実質的に含み、かつ、低コピー配列を実質的に含まない抑制性核酸を、該同定された反復配列をもとに、合成するステップ；及び
該抑制性核酸をターゲット核酸と反応させ、それによって該抑制性核酸内の反復配列を該ターゲット核酸内のホモロガスな反復配列とハイブリダイズさせ、
そしてそれによって、該ターゲット核酸内の該反復配列は、続いて反応する核酸プローブ内のホモロガスな反復配列とのハイブリダイゼーションを実質的に妨げられ、それによって、該プローブ内の該反復配列と該ターゲット核酸内のホモロガスな反復配列との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制するステップ。
【請求項２】
前記ターゲット核酸が低コピー配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抑制性核酸が、１又は２以上の代表的なゲノム領域内の低コピー配列に近接して存在する反復配列に対応するように選ばれる複数の反復配列を含むように合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抑制性核酸が低コピー配列を完全に含まないように合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ターゲット核酸を、該ターゲット内の低コピー配列にホモロガスな低コピー配列を含む１又は２以上のプローブとハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが反復配列を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが反復配列を完全に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブをスペクトル符号化されたポリスチレンマイクロスフェアに結合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブを検出可能な部分で標識するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記部分が、フルオロフォア、酵素コンジュゲート、フルオロフォア標識されたヌクレオチド、抗原担持ヌクレオチドに結合した蛍光標識された抗体、ビオチン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抑制性核酸が、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光イン・ザイチュハイブリダイゼーションアッセイ、及びマイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイからなる群から選ばれるアッセイにおいて反復配列をブロックするために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抑制性核酸が、短鎖散在因子、長鎖散在因子、長末端反復、Ａｌｕ因子、Ｌ１因子、及びＤＮＡトランスポゾンからなる群から選ばれる１又は２以上の配列が確定したＰＣＲ産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
下記のステップを含む、抑制性核酸を合成する方法：
代表的なゲノム領域内の反復配列を同定するステップ；及び
該同定された反復配列とハイブリダイズできるが、該代表的なゲノム領域の近傍又は内部の低コピー配列とはハイブリダイズできない配列を合成することによって、該抑制性核酸を合成するステップ。
【請求項１４】
前記合成された抑制性核酸が低コピー配列を実質的に含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ある同定された反復配列を、関心ある低コピー配列との距離的な近さに基づいて、抑制性核酸として合成するために選ぶステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ある同定された反復配列が前記関心ある低コピー配列と距離的に最も近い、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記合成された抑制性核酸が、前記関心ある低コピー配列とハイブリダイズできる配列を含まない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記合成された抑制性核酸をハイブリダイゼーションアッセイで使用するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ハイブリダイゼーションアッセイが、蛍光イン・ザイチュハイブリダイゼーション・アッセイ、マイクロアレイアッセイ、及びマイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイからなる群から選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
下記のステップを含む、低コピー数の核酸プローブとターゲット核酸内のホモロガスな領域との間のハイブリダイゼーションの特異性を増す方法：
該ターゲット核酸内の反復因子を、複数の反復因子を含み、かつ、低コピー数の因子を実質的に含まない抑制性核酸内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズさせるステップ；及び
該ターゲット核酸内の低コピー数の因子を、１又は２以上の該核酸プローブ内のホモロガスな低コピー数の因子とハイブリダイズさせるステップ。
【請求項２１】
前記抑制性核酸内の前記反復因子が、１又は２以上の代表的なゲノム領域内の低コピー因子をフランキングする反復因子と実質的なホモロジーをもつことを理由として選ばれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記フランキングする反復因子が中程度から高コピー数である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記低コピー因子がシングルコピー因子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記プローブが反復因子を実質的に含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
下記のステップを含む、核酸配列のコピー数を正確に定量する方法：
第一のスペクトルアドレスを持つ、スペクトル符号化された、第一の蛍光マイクロスフェア、及び第二のスペクトルアドレスをもつ、スペクトル符号化された、第二の蛍光マイクロスフェアを準備するステップ；
ターゲットのゲノム核酸プローブの配列を、関心ある配列であることが疑われるターゲット核酸配列のヌクレオチド毎の配列を確定することによって、同定するステップ；
該同定されたターゲットのゲノム核酸プローブ配列に由来する、少なくとも１つの低コピー因子を含み、かつ、反復因子を実質的に含まない、低コピーのターゲットプローブを合成するステップ；
該ターゲットプローブを該第一のマイクロスフェアにコンジュゲートするステップ；
該ターゲット核酸配列のリファレンス核酸配列とハイブリダイズするように選ばれるリファレンスプローブを合成するステップ；
該リファレンスプローブを第二のスペクトルアドレスをもつマイクロスフェアにコンジュゲートするステップ；
代表的なゲノム領域内の反復配列を同定するステップ；
該同定された反復配列にハイブリダイズするための十分なホモロジーをもつ配列を含み、反復因子を実質的に含み、かつ、低コピー因子を実質的に含まない、抑制性核酸を合成するステップ；
該抑制性核酸をクロモソームのターゲット配列と反応し、それによって該抑制性核酸中の反復因子を該クロモソームのターゲット配列内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズさせるステップ；
該ターゲットプローブを該クロモソームのターゲット配列と反応し、それによって該ターゲットプローブ内の低コピー因子を該クロモソームのターゲット配列内のホモロガスな低コピー因子にハイブリダイズさせるステップ；
該抑制性核酸をクロモソームの該クロモソームのターゲット配列を含むリファレンス配列と反応し、それによって該抑制性核酸内の反復因子を該クロモソームのリファレンス配列内のホモロガスな反復因子にハイブリダイズするステップ；
該リファレンスプローブを該クロモソームのレファレンス配列と反応し、それによって該リファレンスプローブを該クロモソームのリファレンス配列にハイブリダイズするステップ；
ハイブリダイズされたターゲットプローブを該第一のスペクトルアドレスによって検出するステップ；
ハイブリダイズされたリファレンスプローブを該第二のスペクトルアドレスによって検出するステップ；及び
検出されたハイブリダイズしたターゲットプローブのレスポンスをリファレンスプローブのレスポンスと比較することによって、検出されたターゲットプローブを定量するステップ。
【請求項２６】
前記抑制性ＤＮＡが反復因子を含み、該反復因子が前記ターゲット内の低コピー因子に近接したゲノム反復因子に対応する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
下記のステップを含む、核酸プローブに存在する反復因子とターゲット核酸内のホモロガスな反復因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法：
中程度〜高コピー数の反復因子に近接したシングルコピー領域を含む１又は２以上の代表的なゲノム領域に対応するように選ばれる複数の反復因子を含むように合成され、かつ、低コピー因子を実質的に含まないように合成される抑制性核酸を、１又は２以上の低コピー因子を含むターゲット核酸内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズさせるステップ、
該ターゲット核酸を、該ターゲット中の低コピー因子にホモロガスな低コピー因子を含むが、実質的に反復配列を含まない１又は２以上のプローブとさらにハイブリダイズさせるステップ。
【請求項２８】
下記のステップを含む、抑制性核酸に存在する低コピー因子と核酸プローブ又はターゲット核酸内のホモロガスな低コピー因子との非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法：
該ターゲット核酸内部及び近傍の反復かつ低コピーの因子を同定する；
合成プロセス中に低コピー配列を含むことを実質的に防ぎながら、抑制性核酸内に含ませるために該ターゲット核酸から反復配列を選択することによって該抑制性核酸配列を合成するステップ；及び
該合成される抑制性核酸を、それぞれのホモロガスな抑制性核酸及びターゲット核酸因子がお互いにハイブリダイズするような該ターゲット核酸と、反応させるステップ。
【請求項２９】
下記のステップを含む、Ｃｏｔ−Ｉ  ＤＮＡを使用するアッセイの精度及び再現性を増す方法：
複数の反復因子を含むが低コピー配列を実質的に含まない抑制性核酸を選択又は合成するステップ；及び
該選択又は合成される抑制性核酸をＣｏｔ−Ｉ  ＤＮＡの代わりに使用するステップ。
【請求項３０】
次のステップを含む、ゲノムのターゲット核酸の核酸プローブとの偶発的なハイブリダイゼーションを抑制する方法：
関心ある配列に相当する１又は２以上のゲノム中の配列を選択することによって、ゲノムのターゲット核酸をハイブリダイゼーションのために準備するステップ；
該関心あるターゲット配列中の低コピー配列を同定するステップ；
該同定された低コピーターゲット配列にホモロガスな、実質的に反復配列を含まない低コピープローブを合成するステップ；
該ターゲット低コピー配列の近くの反復配列を同定するステップ；
該ターゲット反復配列にホモロガスな、実質的に反復因子を含む抑制ＤＮＡを合成するステップ；
抑制ＤＮＡ中の該反復因子がターゲット核酸中のホモロガスな反復因子にハイブリダイズするように該ターゲット核酸を該抑制ＤＮＡと反応させるステップ；
ターゲット核酸を該低コピープローブと反応して、該プローブ内の低コピー因子を該ターゲット核酸内のホモロガスな低コピー因子にハイブリダイズさせるステップ；及び
該プローブの該ターゲットへのハイブリダイゼーションを定量するために該低コピープローブを検出し、それによって該ターゲット核酸内部の低コピー因子の実数が確定されるステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００５年１１月１８日に提出の、先に出願された、同時係属中の仮出願番号６０／７３７，９８６の利益を主張し、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
印刷された配列表は、参照によって本明細書に組み込まれ、本出願に随伴し、かつ、同一の内容で、コンピュータに可読なＡＳＣＩＩファイルの形式で、米国特許商標庁の電子申請システムに提出されている。
【０００３】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ターゲットのゲノム又はトランスクリプトームに存在する反復因子と核酸プローブの対応する反復因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを、プローブのシングルコピー配列と抑制ＤＮＡの偶発的なシングルコピー配列との間の偶然のハイブリダイゼーションを防ぎながら、抑制するための物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、シングルコピー因子を実質的に含まない抑制合成反復ＤＮＡの開発及び使用に加えて、反復配列を実質的に含まないプローブの開発及び使用に関する。よりいっそう詳細には、そのような反復ＤＮＡは、１又は２以上の代表的なゲノム領域内のシングルコピー因子に近接した中程度から高コピーの反復因子に対応する反復配列を含む。
【背景技術】
【０００４】
先行技術の説明
マイクロアレイ及びアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現及びローカスのコピー数についてのゲノムワイドの分析が容易になった。異なる研究室での相互検証研究によって、これらの技術の再現性に関する永続的な論議が起こっている１−５。反復試験から得られた、結果のばらつきを低減するための対策は、アレイの製造、ＲＮＡ合成、標識、ハイブリダイゼーション、スキャン、及びデータ分析のような、技術的要因を標準化することに焦点を合わせている６−８。Ｚａｋｈａｒｋｉｎら９は、サンプル間の生物学的な相違がこのばらつきの最大の原因であり、その他の要素はそれほどまでは寄与しないことを示唆する。
【０００５】
ハイブリダイゼーションプローブを使用してＤＮＡを分析するとき、プローブの反復因子とターゲットのホモロガスな反復因子との間の高いバックグラウンドのハイブリダイゼーションを防ぐために、ターゲットＤＮＡ内の反復配列はプローブのターゲットへのハイブリダイゼーションの前に、一般的には、ブロックされなければならない。
【０００６】
ハプロイドゲノムにおいて、反復配列は多数のコピーで起こる。コピーの数は２から数十万の範囲で変動する場合があり、反復ＤＮＡであるＡｌｕファミリーは後者の多数の変動の代表である。反復のコピーはまとまって存在するか、又はゲノム全体にわたって散在して存在することがある。反復はゲノム内の１又は２以上の場所にまとまって存在することがあり、例えば、反復配列は各クロモソームのセントロメアの近くで、様々な数のタンデムリピート（ＶＮＴＲｓ）で出現する  Nakamuraら、Science、1987年、第235巻、p.1616；又は反復は単一のクロモソーム内に分布する場合があり、例えば、Bardoniら、Cytogenetics and Cell Genetics、1987年、第46巻、p.575によって記載されるようにＸクロモソーム上のみに見つかる反復がある；又は反復は全クロモソームにわたって分布する場合があり、例えば、反復配列のＡｌｕファミリーがそれである。
【０００７】
低い複雑性の単純反復は、遺伝子の内部で発見されることがあるが、より一般的には非コードのゲノム配列内部で発見される。そのような反復因子は、モノ、ジ、トリ、テトラ又はペンタヌクレオチドの、タンデム単位で配置されたコア配列因子からなる。しばしば、これらの反復配列を含むタンデム単位の数は、別個体のゲノムの間で同一の場所で異なる。これらの反復因子は、ゲノム配列内でコア配列因子の連続を探すことによって発見できる。
【０００８】
競合ハイブリダイゼーションは、抑制ハイブリダイゼーションとしても知られ、潜在的に圧倒的な反復ＤＮＡシグナルをブロックする方法を提供する。非標識の競合又は抑制ＤＮＡは、ターゲットのホモロガスな反復因子に結合する高頻度の反復因子を含み、それによって、標識されたプローブの反復部分がターゲット内のそのような反復因子に結合すること、及びプローブが、ターゲットにされた一般的には非反復の配列に実質的にハイブリダイズする可能性が増えることを妨げる。
【０００９】
プローブに存在する反復因子とゲノム（又はトランスクリプトーム）の他の場所との間の非特異的なハイブリダイゼーションを抑制又はブロックするための、反復配列が多い（Ｃｏｔ−１）ＤＮＡの使用は、たいていのマイクロアレイハイブリダイゼーション研究のための共通の要求である。ＦＩＳＨの前の、Ｃｏｔ−１のような抑制ＤＮＡのターゲットＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、バックグラウンド、つまり非特異的なハイブリダイゼーションを避けるために従来技術において一般的に実施される。ヒトでは、Ｃｏｔ−１フラクションは、短鎖及び長鎖散在反復因子、つまりＳＩＮＥ及びＬＩＮＥのような散在反復因子のファミリーに高度に集中している１０，１１。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡを調製するための商業的な方法は、ゲノムＤＮＡの変性と再会合を繰り返し、そしてＡｌｕ因子（正常なゲノムの相当するレベルの３倍超）及びＬ１因子（正常なゲノムの相当するレベルの４倍超）の増加によって測定される。現在の品質管理方法はＣｏｔ−１  ＤＮＡの正確な組成又は配列を確定しない。
【００１０】
Ｃｏｔ−１フラクションは、プローブの反復因子とターゲットＤＮＡの対応する、又はホモロガスな反復因子との間の非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するようであるが、実験的なノイズを増加もする１２（図１）。そのため、Ｃｏｔ−１組成物における相違がゲノムハイブリダイゼーション研究の結果におけるばらつきの主要な原因でありうるかどうかが調べられた。ゲノムハイブリダイゼーションにおけるＣｏｔ−１の役割が、配列が確定された、ゲノムのシングルコピー（ｓｃ）プローブ１４及び近接した、ｓｃ及び反復のゲノム配列からなるプローブを使用する定量マイクロスフェアハイブリダイゼーション（ＱＭＨ）によって明らかにされた１３，２０。Ｃｏｔ−１が、プローブにはしばしば関係しない近隣のパラロガスな反復配列を含む、安定なデュープレックス（Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ内のシングルコピー配列にハイブリダイズしたプローブ配列内のシングルコピー配列）の形成を促進して、それによってシングルコピー配列のハイブリダイゼーションの正確な定量を妨げることが確定された。プローブのホモロガスなシングルコピー因子にハイブリダイズしたＣｏｔ−１内のシングルコピー因子という出来事は、プローブのシグナルを歪ませる（不正確に増幅する）。
【００１１】
図１は、ゲノムＤＮＡターゲット１００内の反復因子をプローブ１１０のパラロガスな反復因子１２０とのハイブリダイゼーションに利用できることを抑制又はブロックするための、Ｃｏｔ−１  １０５のターゲット１００へのハイブリダイゼーションを図示する。反復因子１１５は、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ１０５の抑制反復因子１１７に平行な関係で表されて、それによって因子１１５及び１１７のハイブリダイゼーションを示す。従来技術においてよくあるように、プローブ１１０はシングルコピー因子１３５を偶発的な反復因子１２０と同様に両方含むが、シングルコピー因子１３５はターゲット１００のホモロガスなシングルコピー因子１４０に選択的にハイブリダイズするように選択及び合成される。図示されるように、プローブ１１０は、プローブ１１０の検出及び定量のために使用されるマイクロスフェア１４５に結合される。プローブ１１０’は、研究設計で予定されたように、ターゲット１００にハイブリダイズした状態で表される。しかしながら、Ｃｏｔ−１  １０５のシングルコピー因子は、ターゲット１１５の反復因子にハイブリダイズすることに加え、プローブ１２４のホモロガスなシングルコピー因子１３５にもハイブリダイズして、それによって、プローブのシグナルを３倍にまで増大する。
【００１２】
２００６年８月１６日に出願された“マイクロスフェア・サスペンジョン・ハイブリダイゼーションの定量及びその使用”という名称の特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２６９３は、フローサイトメトリを使用して全ゲノムＤＮＡ（又はＲＮＡ）の直接的な分析を可能にする、低又はシングルコピーのゲノムのハイブリダイゼーションプローブを使用するマイクロスフェアサスペンジョンハイブリダイゼーションアッセイを記載し、参照によって本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、当該技術分野において必要とされるものは、核酸プローブのＣｏｔ−１  ＤＮＡに存在する因子へのハイブリダイゼーションによって引き起こされるシグナルの歪みを抑制する方法；プローブのターゲットＤＮＡへの非特異的なハイブリダイゼーションを抑制する方法；抑制又は競合ＤＮＡの、ターゲット配列内に加えてプローブ内のシングルコピー配列へのハイブリダイゼーションを抑制する方法；抑制の反復ＤＮＡを同定及び合成する方法；抑制ＤＮＡとして使用するために有効な合成された反復ＤＮＡプロダクト；及びそのような合成された抑制ＤＮＡを実質的に反復因子を含まないシングルコピープローブと組み合わせて使用する核酸ハイブリダイゼーションシステムである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要約
本発明は、Ｃｏｔ−１を反復因子を多く含みながら実質的にシングルコピー又は低コピーの因子を含まないように合成される抑制性核酸で置き換えることによって、上に概要が述べられた諸問題を解決し、そして、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの結果を不正確にする効果を抑制する新規の方法及びプロダクトを提供する。概して言えば、本発明の方法は、合成の抑制ＤＮＡを合成するステップ、及びターゲットの反復配列をブロックするために、プローブのターゲットとのハイブリダイゼーションの前に、抑制ＤＮＡをターゲットのゲノムＤＮＡにハイブリダイズするステップを含む。好ましくは、プローブは反復因子を含まない若しくは実質的に含まない及び抑制ＤＮＡはシングル又は低コピーＤＮＡストレッチを含まない若しくは実質的に含まないものである。いくつかの好ましい態様では、その方法は、スペクトル符号化されたポリスチレンマイクロスフェアを、選ばれた低コピー合成ＤＮＡ配列とカップリングすることによってハイブリダイゼーションプローブを準備するステップ；ターゲットのゲノムＤＮＡを、本発明の合成の抑制若しくはブロッキングＤＮＡとプレハイブリダイズするステップ；プローブをターゲットのゲノムＤＮＡにハイブリダイズするステップ；及びハイブリダイゼーションのプロダクトをフローサイトメトリによって検出するステップを含む。ハイブリダイゼーションアッセイでＣｏｔ−１によって引き起こされる実証されたシグナル歪みは、それについて、シングルコピー配列を含まない若しくは実質的に含まない、及び低コピー配列を好ましくは含まない若しくは実質的に含まない合成反復因子へのターゲットのプレハイブリダイゼーションによって、クロスハイブリダイゼーションを抑制することにより、低減される。
【００１５】
現在のハイブリダイゼーションアッセイとは異なり、本発明に基づくアッセイは、Ｃｏｔ−１抑制ＤＮＡを選ばれた反復因子を含むが競合するシングル（又は低）コピー因子を含まないように開発された合成ＤＮＡで置き換える。好ましくは、本発明の合成ＤＮＡは、それの関心あるシングル（又は低）コピー配列をフランキングするターゲットＤＮＡの反復領域とのホモロジーによって選ばれ、それは、関心あるシングル（又は低）コピー配列とハイブリダイズするように設計される、シングル（又は低）コピーハイブリダイゼーションプローブの配列に対応する、又はホモロガスである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法とプロダクトは、（１）抑制ＤＮＡ内の反復因子とプローブ内のホモロガスな因子との間の、（２）プローブ内のシングル若しくは低コピー因子と抑制ＤＮＡ内のホモロガスなシングル（若しくは低）コピー因子との間の、及び（３）プローブ内の反復因子とターゲットのゲノムの配列内のホモロガスな因子との間の、偶発的なクロスハイブリダイゼーションの低減に有効である。好ましくは、本発明に基づいて、シングル又は低コピープローブは実質的に、より好ましくは完全に、反復因子を含まず、かつ、抑制ＤＮＡは実質的に、より好ましくは完全に、シングル又は低コピー因子を含まないように合成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図２は、合成による抑制ＤＮＡ２０５の、ゲノムＤＮＡターゲット２００との、そのターゲット内の反復因子２１５を抑制又はブロックするためのハイブリダイゼーションを図示する。図示されるように、合成による抑制ＤＮＡ２０５は、プローブ２１０のシングル若しくは低コピー因子２３５又はターゲット２００のシングル若しくは低コピー因子２４０とハイブリダイズするような偶発的なシングル若しくは低コピー因子を与えず、そのことにより、アッセイにおいてシングル又は低コピー因子のクロスハイブリダイゼーションを著しく低減する。プローブ２１０は、１又は２以上のシングル又は低コピー因子２３５を含むが、抑制ＤＮＡ２０５又はターゲット２００のホモロガスな反復にハイブリダイズしうる反復因子を含まないように、好ましく合成される。図２において、プローブのシグナルは、ターゲット２００のシングル又は低コピー因子２４０と直接的な１：１の対応をする。
【００１８】
従って、本発明の一態様は、核酸プローブに存在する反復配列とターゲットのゲノムの核酸との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法を提供する。概して、その方法は、代表的なゲノムの領域内の反復配列を同定すること、その同定された反復配列に由来する抑制性核酸を合成すること、及びその抑制性核酸をターゲット核酸と反応することを含む。好ましくは、その抑制性核酸は、短鎖散在因子、長鎖散在因子、長端末反復、Ａｌｕ因子、Ｌ１因子、及びＤＮＡ型トランスポゾンからなる群から選ばれる１又は２以上の配列が確定されたＰＣＲプロダクトを含む。この反応は、抑制性核酸の反復配列をターゲット核酸内のホモロガスな反復配列にハイブリダイズさせ、それによってそのターゲット配列内の反復配列が、その次に反応した核酸プローブ内のホモロガスな反復配列とハイブリダイズすることを実質的にブロックし、そしてその結果としてプローブの反復配列とターゲット核酸のホモロガスな反復配列との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する。この抑制作用は、その抑制性核酸が、低コピー配列を実質的に含まない一方で、同定された反復配列を実質的に含むようにすることによって著しく増強される。好ましくは、抑制性核酸は低コピー配列を完全に含まないように合成される。好ましい態様では、ターゲット核酸は低コピー配列を含む。好ましくは、抑制性核酸は、１又は２以上の低コピー配列の近隣に発見される反復配列に対応するように選ばれる複数の反復配列を含むように合成される。いくつかの好ましい態様では、本発明の方法は、ターゲット核酸をターゲット内の低コピー配列にホモロガスな低コピー配列を含む１又は２以上のプローブとハイブリダイズするさらなるステップを含む。好ましい態様では、プローブは反復配列を実質的に、さらに好ましくは完全に、含まない。別の好ましい態様では、本発明の方法は、プローブをスペクトル符号化されたポリスチレンマイクロスフェアに結合するステップを含む。好ましくは、プローブはその有用性を高めるために検出可能な部分で標識される。いくつかの好ましい検出可能な部分は、フルオロフォア、酵素コンジュゲート、蛍光標識されたヌクレオチド、抗原担持ヌクレオチドに結合した蛍光標識された抗体、ビオチン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、及びこれらの組合せを含む。この方法は、ここで説明及び教示される他のものと同様に、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光イン・ザイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションアッセイ、及びマイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイからなる群から選ばれるアッセイを含む、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡが使用された、又は使用されることができたいかなる方法でも使用することができる。
【００１９】
別の一態様は抑制性核酸を合成する方法を提供する。そのような方法は、一般的に、代表的なゲノムの領域内の反復配列を同定するステップ；及びその抑制性核酸を、その同定された反復配列とハイブリダイズできるが、その代表的なゲノムの領域の近傍又は内部の低コピー配列とハイブリダイズできない核酸配列を合成することによって合成するステップを含む。好ましくは、その合成された抑制性核酸は低コピー配列を実質的に含まない。いくつかの好ましい態様では、その方法は、合成のためのある同定された反復配列を関心ある低コピー配列への近接度に基づいて抑制性核酸として選ぶステップを含むこともできる。好ましくは、そのようなある同定された反復配列は関心ある低コピー配列に最も近接しているものである。好ましくは、合成された抑制性核酸は関心ある低コピー配列とハイブリダイズしうる配列を含まない。もちろん、合成された抑制性核酸は本発明に従ってハイブリダイゼーションアッセイで、特にＣｏｔ−１又はブロッキングＤＮＡを使用できるようなハイブリダイゼーションアッセイで、使用することができる。いくつかの好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、蛍光イン・ザイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイアッセイ、及びマイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイを含む。
【００２０】
本発明の別の一態様は、低コピー数の核酸プローブとターゲット核酸のホモロガスな領域との間のハイブリダイゼーションの特異性を高める新規の方法を提供する。概して、そのような方法は、ターゲット核酸内の反復因子を、複数の反復因子を含み、かつ、低コピー数の因子を実質的に、より好ましくは完全に、含まない抑制性核酸内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズするステップ、及びターゲット核酸内の低コピー数因子を１又は２以上の核酸プローブ内のホモロガスな低コピー数因子とハイブリダイズするステップを含む。好ましい態様では、抑制性核酸内の反復因子は、１又は２以上の代表的なゲノム領域内の低コピー因子をフランキングする反復因子に実質的なホモロジーをもつことで選ばれる。さらに好ましくは、フランキング反復因子は中程度から高コピー数であり、低コピー因子はシングルコピー因子を含む。よりさらに好ましくは、プローブは反復因子を実質的に含まない。
【００２１】
本発明の別の一態様は、核酸配列のコピー数を正確に定量する方法を提供する。概して、そのような方法は、第一のスペクトルアドレスをもつ、第一のスペクトル符号化された蛍光マイクロスフェア、及び第二のスペクトルアドレスをもつ、第二のスペクトル符号化されたマイクロスフェアを調製するステップ、ターゲットのゲノムの核酸プローブの配列を、関心ある配列が存在することが疑われるターゲット核酸配列のヌクレオチドごとの配列を確定することによって同定するステップ、同定されたターゲットのゲノムの核酸プローブ配列に由来する低コピーのターゲットプローブを、そのターゲットプローブは少なくとも１つの低コピー因子を含み、かつ、反復因子を実質的に含まないで、合成するステップ、ターゲットプローブを第一のマイクロスフェアに結合するステップ、ターゲット核酸配列のリファレンス核酸配列にハイブリダイズするように選ばれるリファレンス・プローブを合成するステップ、リファレンス・プローブを第二のスペクトルアドレスをもつマイクロスフェアに結合するステップ、代表的なゲノム領域内の反復配列を同定するステップ、抑制性核酸を、その抑制性核酸は同定された反復配列にハイブリダイズするのに十分なホモロジーをもつ配列を含み、その抑制性核酸は反復配列を実質的に含み、かつ、低コピー因子を実質的に含まずに、合成するステップ、抑制性核酸をクロモソームのターゲット核酸と反応して、それによってその抑制性核酸内の反復因子をそのクロモソームのターゲット核酸のホモロガスな反復因子にハイブリダイズさせるステップ、ターゲットプローブをクロモソームのターゲット配列に反応して、それによってそのターゲットプローブの低コピー因子をそのクロモソームのターゲット配列のホモロガスな低コピー因子にハイブリダイズさせるステップ、抑制性核酸をクロモソームのターゲット配列を含むそのクロモソームのリファレンス配列と反応して、それによってその抑制性核酸の反復因子をそのクロモソームのリファレンス配列のホモロガスな反復因子にハイブリダイズさせるステップ、リファレンス・プローブをクロモソームのリファレンス配列と反応して、それによってそのリファレンス・プローブをそのクロモソームのリファレンス配列にハイブリダイズさせるステップ、ハイブリダイズしたターゲットプローブを第一のスペクトルアドレスによって検出するステップ、ハイブリダイズしたリファレンス・プローブを第二のスペクトルアドレスによって検出するステップ、及び検出されたターゲットプローブを、検出されたハイブリダイズしたターゲットプローブのレスポンスを検出されたハイブリダイズしたリファレンスプローブのレスポンスと比較することによって、定量するステップを含む。好ましい態様では、抑制ＤＮＡは反復因子を含むが、その反復因子はターゲット内の低コピー因子に近接したゲノムの反復因子に対応する。
【００２２】
本発明の別の一態様では、核酸プローブ内の反復因子とターゲット核酸内のホモロガスな反復因子との間の非特異的なハイブリダイゼーションを抑制する方法が提供される。概して、その方法は、抑制性核酸を、１又は２以上の低コピー因子を含むターゲット配列内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズするステップを含む。好ましくは、抑制性核酸は、中程度から高コピー数の反復因子に近接したシングルコピー領域を含む１又は２以上の代表的なゲノム領域に対応するように選ばれる複数の反復因子を含み、かつ、実質的に低コピー因子を含まないように合成又は選択される。それから、ターゲット核酸は、そのターゲット内の低コピー因子とホモロガスな低コピー因子を含む１又は２以上のプローブとハイブリダイズされるが、そのプローブは実質的に反復配列を含まない。
【００２３】
本発明の別の一態様では、抑制性核酸と、核酸プローブ又はターゲット核酸のホモロガスな低コピー因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法が提供される。概して、その方法は、ターゲット核酸及びその近傍の反復及び低コピー因子を同定するステップ、合成工程において低コピー配列の包含を実質的に阻止しながら、抑制性核酸に包含するためにターゲット核酸配列から反復配列を選択することによって抑制性核酸配列を合成するステップ、及び合成された抑制性核酸をターゲット核酸とそれぞれのホモロガスな抑制性核酸及びターゲット核酸因子がお互いにハイブリダイズするように反応するステップを含む。
【００２４】
本発明はまた、複数の反復因子を含むが実質的に低コピー配列を含まない抑制性核酸を選択又は合成し、選択される又は合成される抑制性核酸をＣｏｔ−１  ＤＮＡの代わりに使用又はそれを置き換えるステップを含む、抑制又はブロッキングＤＮＡ（例えば、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ）を使用するアッセイの精度及び再現性を増す方法も提供する。
【００２５】
本発明の別の一態様では、ゲノムのターゲット核酸の核酸プローブとの偶発的なハイブリダイゼーションを抑制する方法が提供される。概して、その方法は、ゲノムのターゲット核酸をハイブリダイゼーションのために、関心ある配列に対応するゲノム内の配列を選択することによって、準備するステップ；関心あるターゲット配列内の低コピー配列を同定するステップ；同定された低コピーターゲット配列にホモロガスな低コピープローブを、その低コピープローブが実質的に反復配列を含まずに、合成するステップ；ターゲット低コピー配列に近接する反復配列を同定するステップ；反復因子を実質的に含むターゲット反復配列にホモロガスな抑制ＤＮＡを合成するステップ；ターゲット核酸を抑制性核酸と、その抑制ＤＮＡ内の反復因子がターゲット核酸内のホモロガスな反復因子にハイブリダイズするように反応するステップ；ターゲット核酸を低コピープローブと反応して、そのプローブ内の低コピー因子をそのターゲット核酸内のホモロガスな低コピー因子とハイブリダイズするステップ；及びその低コピープローブをプローブのターゲットへのハイブリダイゼーションを定量するために検出し、それによってターゲット核酸内の低コピー因子のインスタンスが確定されるステップを含む。
【００２６】
定義
他で定義されなければ、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、この発明が属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味をもつ。全ての特許、出願、公開された出願及び他の刊行物及びジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）からの配列及びここに引用される他のデータベースはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。このセクションで説明される定義が、参照により組み込まれた出願、公開された出願及び他の刊行物及びジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）からの配列及び他のデータベースで説明される定義と反対又は一致しないときは、このセクションで説明される定義が参照により組み込まれた定義に優先する。
【００２７】
ここで使用されるように、“ａ”又は“ａｎ”は“少なくとも１”又は“１又は２以上”を意味する。
ここで使用されるように、“核酸”は、とりわけ一本鎖、二重、三重、線形及び環状形態を含む、任意の態様のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）のことをいう。
【００２８】
ここで使用されるように、“配列”は核酸配列のことをいう。
ここで使用されるように、“リファレンス・プローブ”という用語は、ゲノム内のローカスに特異的なプローブを意味し、好ましくは、２以外のコピー数では重度に有害であるか又は、好ましくは、致命的である常染色体の配列に由来する。リファレンス・プローブは、患者サンプル中に正常なクロモソーム上の対になる部分がある限り、任意の低コピー又はシングルコピーのクロモソーム上のローカスに由来してよい。先天的な病気を診断するためにゲノムのコピー数を決定するとき、リファレンス・プローブは、典型的に、正常な成長の間に２つのアレルから発現されることが必要な１又は２以上の遺伝子からの常染色体の由来である。新生物性の疾患を診断するためにゲノムのコピー数を決定するために、リファレンス・プローブはクロモソームの発癌遺伝子の少ない領域から選ばれ、それは正常なクロモソーム上の対になる部分がある。
【００２９】
ここで使用されるように、“標識”は検出可能な物理的特性をもつ任意の化学基若しくは部分、又は基質の検出可能な反応物への変換を触媒する酵素のような化学基若しくは部分に検出可能な物理的特性をもたせることができる任意の化合物のことをいう。“標識”という用語はまた、特定の物理的特性の発現を阻害する化合物をも包含する。“標識”はまた、結合対の構成因子である化合物であってもよく、他の構成因子が検出可能な物理的特性をもつ。例示的な標識は、質量（ｍａｓｓ）基、金属類、蛍光基、発光基、化学発光基、光学活性基、荷電基、極性基、色、ハプテン、タンパク質結合リガンド、ヌクレオチド配列、放射性基、酵素、微粒子パーティクル及びそれらの組合せを含む。
【００３０】
ここで使用されるように、“サンプル”とは、分析されるターゲットの核酸を含みうる任意のものをいう。サンプルは生物学的な液体又は生物学的な組織のような生物学的なサンプルであってもよい。生物学的な液体の例は、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、大便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水、又は類似のものを含む。生物学的な組織は、細胞の集合物であり、通常、ヒト、動物、植物、細菌、菌類又はウイルスの構造の構造材料のひとつを形成する細胞間基質を伴う特定の種類の細胞であって、結合、表皮、皮膚、筋肉及び神経組織を含む。生物学的組織の例はまた、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈及び、例えば血漿、血液若しくは尿から分離された、又は固形組織のコラゲナーゼ処理による、個々の細胞の集合をも含む。
【００３１】
ここで使用されるように、“増幅”とは、サンプル中のターゲットの分析対象核酸をアッセイ感度を上げるために直線的に複製する方法をいう。ここに記載されるように、核酸を増幅するための多くの異なる方法が当該技術分野において知られている。
【００３２】
ここで使用されるように、“セット”とは、同一のスペクトルアドレスをもつ、単一のｌｃプローブ又はｌｃプローブの集合を結合したマイクロスフェアの集合のことをいう。
【００３３】
ここで使用されるように、“低コピー”又は“ｌｃ”とは、ターゲット核酸又はゲノム内の場所の、１０又はそれ未満の配列インターバルにハイブリダイズする配列のことをいう。コピー数は１０又はそれ未満が好ましく、より好ましくは７又はそれ未満、さらに好ましくは５又はそれ未満、そして最も好ましくは３又はそれ未満である。
【００３４】
ここで使用されるように、“シングルコピー”又は“ｓｃ”とは、ターゲット核酸又はゲノム内の場所の、３又はそれ未満の配列インターバルにハイブリダイズする核酸配列のことをいう。従って、この用語は、厳密にただ一つしかない配列（つまり、対応するゲノム内のひとつかつ唯ひとつの配列に相補的な配列）を、デュープリコン（ｄｕｐｌｉｃｏｎ）及びトリプリコン（ｔｒｉｐｌｉｃｏｎ）と同様に、含むこととなる。“シングルコピー因子”又は“シングルコピー配列”という用語は、そのような核酸配列をいうために使用されてもよい。
【００３５】
ここで使用されるように、“高度に繰り返される”とは、１０００コピーよりも多く存在することを意味する。
ここで使用されるように、“配列同一性”とは、２又は３以上のポリヌクレオチド配列、つまり、リファレンス配列とリファレンス配列と比較されるために与えられる配列との間の関係のことをいう。配列同一性は、与えられる配列をリファレンス配列と、最も高い度合いの、配列のストリング間の一致によって決定される、配列類似性を生じるように配列を最適に整列した後に、比較することにより決定される。そのようなアラインメント上で、配列同一性がポジションごとを基本に確定される。例えば、特定のポジションでヌクレオチドが同一ならば、そのポジションで配列は“同一”である。そのようなポジションの同一の総数が、それからリファレンス配列内のヌクレオチド又は残基の数で割られて、％配列同一性を与える。配列同一性は、Lesk, A. N.編集、Computational Molecular Biology、1998年、オックスフォード大学出版、ニューヨーク；Smith, D. W.編集、Biocomputing: Informatics and Genome Projects、1993年、アカデミックプレス、ニューヨーク；Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編集、Computer Analysis of Sequence Data, Part I、1994年、ヒューマナプレス、ニュージャージー；von Heinge, G.、Sequence Analysis in Molecular Biology、1987年、アカデミックプレス；Gribskov, M.及びDevereux, J.編集、Sequence Analysis Primer、1991年、Ｍ．ストックトンプレス、ニューヨーク；並びにCarillo, H.及びLipman, D.、SIAM Journal of Applied Mathematics、1988年、第48巻、p.1073に記載されたものを含むが、これらに限定されない、公知の方法によって容易に計算することができる。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列の間の最大の一致を与えるように設計されている。配列同一性を決定する方法は、与えられた配列の間の配列同一性を決定する、公衆に利用可能なコンピュータプログラムに分類される。そのようなプログラムの例は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research、1984年、第12巻、第1号、p.387）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Altshul, S. F.ら、Journal of Molecular Biology、1990年、第215巻、p.403410）。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ及び他の情報源から公衆に利用可能である（ＢＬＡＳＴマニュアル, Altshule, S.ら、NCBI、NLM、NIH、ベテスダ、マサチューセッツ、20894；Altshul, S. F.ら、1990年、Journal of Molecular Biology、1990年、第215巻、p.403410）を含むが、これらに限定されない。これらのプログラムは、与えられた配列及びリファレンス配列の間の最も高いレベルの配列同一性を生成するために、デフォルトのギャップウェイトを使用して、配列を最適に整列する。ひとつの説明として、少なくとも、例えば、９５％の“配列同一性”をリファレンス配列に対してもつヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドによって、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、与えられたポリヌクレオチド配列がリファレンスヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドについて５個までの相違を含むかもしれないということを除き、リファレンス配列と同一であることが意図される。言い換えれば、リファレンスヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性をもつヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドにおいては、リファレンス配列のヌクレオチドの５％までが欠失し、若しくは他のヌクレオチドに置換されてもよく、又はリファレンス配列��の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドがリファレンス配列に挿入されてもよい。一方の配列におけるインバージョンは、これらのコンピュータプログラムによって、ホモロガスなテスト配列のアンチセンス鎖に対するリファレンス配列の類似性に基づいて、検出される。リファレンス配列のこれらの変異は、リファレンスヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端のポジション又はこれらの末端ポジションの間のどこにでも、リファレンス配列内のヌクレオチドの間に別個に又はリファレンス配列内の１若しくは２以上の連続したグループで点在して、起きるかもしれない。
【００３６】
ここで使用されるように、“リピート配列”は、ターゲットＤＮＡがその一部であるゲノム内に反復して現れる配列であり、少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも８０％のリピート間の配列同一性をもち、かつ、ターゲットＤＮＡへのプローブの望ましい特異的なハイブリダイゼーションに干渉を引き起こす、つまり、プローブがリピート配列の複数のコピーにハイブリダイズする、十分な長さ又は他の特性を持つ。概して言えば、リピート配列はゲノム内に少なくとも１０回出現し、１ヌクレオチドから数百ヌクレオチドの範囲の反復サイズをもち、リピート単位は少なくとも１０ヌクレオチドから数千ヌクレオチドの長さをもつ。リピート配列はいかなる種類、例えば、縦列（タンデム）、散在（インタースパース）、回文（パリンドローム）又は（数コピーがターゲット領域にあり、他はゲノムのどこかにある）リピート配列であってもよく、一つのクロモソーム上に分散し、又はいくつかの若しくは全てのクロモソームにわたって、クロモソームのセントロメアの近くに出現してもよい。普通は、ほんの少しの例外はあるものの、リピート配列は生理学的に有用なタンパク質を発現しない。“リピート配列”は“反復配列”又は“反復因子”ということもできる。
【００３７】
ここで使用されるように、“短鎖散在因子”は、ここではＳＩＮＥともいわれ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物に由来し、リピート単位が７５ｂｐから５００ｂｐの長さの範囲の、高度に反復した散在性の転移可能な因子を意味する。ＳＩＮＥ因子の最もたくさんある種類はＡｌｕファミリーである。Ａｌｕ配列は長さ約３００ｂｐで、ヒトゲノムにおよそ５００，０００コピー存在する。
【００３８】
ここで使用されるように、“長鎖散在因子”は、ここではＬＩＮＥともいわれ、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写物に由来し、リピート単位が７０００ｂｐまでの、高度に反復した散在性の転移可能な因子を意味する。
【００３９】
ここで使用されるように、“長末端反復”は、ここではＬＴＲともいわれ、典型的には長さ２００−５００ｂｐの、末端の直列リピートをもつ転移可能因子の大きな分類を意味する。
【００４０】
ここで使用されるように、“ＭＩＲ”リピートは、少なくとも２６０ｂｐのリピート単位の長さを持ち、ヒトゲノムにおよそ１０５コピーが見つかる、哺乳類の散在反復因子を意味する。
【００４１】
ここで使用されるように、“ＭＥＲ”リピートは、ヒトゲノムに１００台〜１０００台の範囲のコピー数が存在する、起源不明のヒトの中程度に散在性のリピート因子を意味する。
【００４２】
ここで使用されるように、中程度に反復性のＤＮＡは、ヒトゲノムに一様に分散され、１０から１０００コピー存在する反復配列を意味し、リピート長が１５０から３００ｂｐである。ひとつの例はＡｌｕファミリーである。
【００４３】
ここで使用されるように、高度に反復性のＤＮＡは、ヒトゲノムに１０５コピーまで存在する、長さ５から３００ｂｐの短い反復配列を意味する。ひとつの例はサテライトＤＮＡである。
【００４４】
ここで使用されるように、“ＤＮＡトランスポゾン”又は“トランスポゾン”という用語は、ゲノム内のひとつの場所から別の場所に移動することができるＤＮＡの配列をいう。これらの配列は、“動く遺伝因子”と呼んでもよい。トランスポゾンの移動は一般的には転移と呼ばれる。
【実施例】
【００４５】
好ましい実施態様の詳細な説明
下記の実施例は本発明の好ましい実施態様を説明する。これらの実施態様は、シングル（又は低）コピーのプローブの、反復因子を含むもののシングル又は低コピー因子を含まない合成ＤＮＡに前もってハイブリダイズしたゲノムのターゲットへのハイブリダイゼーションを説明する。しかしながら、これらの実施態様は、説明の目的のためのみであり、ここでの開示が本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４６】
実施例
材料及び方法
定量マイクロスフェア・ハイブリダイゼーション（ＱＭＨ）
プローブの選択、合成、及びマイクロスフェアの結合
プローブは、ターゲット配列へのハイブリダイゼーションを検出することができる、標識された核酸フラグメント又は標識された核酸フラグメントの集合の態様である。標識されたプローブは、プローブ内の配列にホモロガスな配列を含むいかなる核酸ターゲットとともに使用されてもよい。これらのターゲット配列は、クロモソーム若しくは精製された核ＤＮＡ、異核ＲＮＡ、又はシングルコピー配列を転写プロダクトの構成要素として含むｍＲＮＡ分子種を含んでもよいが、それらに限られない。続く詳細な説明では、ＤＮＡターゲット配列及びＤＮＡプローブの普通の場合が考察される；しかし、当該技術分野おける通常の知識を有する者は、その考察が他の核酸分子種に対しても（ターゲット配列及びプローブの特性による技術的に認知される相違とともに）等しく適用可能であることを理解する。
【００４７】
本発明の好ましいプローブの重要な性質は、それらが、関心あるターゲットＤＮＡ領域の少なくとも一部に相補的であり、かつ、ターゲット領域がその一部であるゲノム内の反復配列に相補的な配列を本質的に含まない、“低コピーの”、“シングルコピーの”、又は“ユニークな”ＤＮＡ配列から作られるということである。従って、シングルコピーの、又はユニークな配列から作られるプローブは、対応するゲノム内の好ましくは３又はそれ以下の配列に、好ましくは唯一つの配列に、相補的である。
【００４８】
低コピー、又は低コピーかつ反復の混合の配列のプローブが以前に記載されたように設計された１４，１５，１６，２０。好ましい態様では、本発明はハプロイドのゲノム配列に高い特異性でハイブリダイズするように特別に設計された、低コピー又はシングルコピーのハイブリダイゼーションプローブを利用する。プローブの選択及び合成の方法は、米国特許第６，８２８，０９７号及び第７，０１４，９９７号に開示され、その教示と内容は参照によって本明細書に組み込まれる。これらの最初のステップは、ターゲットとゲノムの反復の両方の配列の知識、ヒトゲノムプロジェクト及び関係するバイオインフォマティクス研究によってますます利用可能となっている情報を必要とする。既に利用可能なコンピュータ・ソフトウェアは低コピーの、好ましくはシングルコピーの、配列を推定するために使用された。
【００４９】
本発明に適合するプローブを開発するために、ターゲットＤＮＡ領域の配列が知られなければならない。ターゲット領域は、クロモソーム全体又は転位が同定されているそのごく一部であってもよい。目的は、この配列の知識を使って、ターゲット領域内のシングルコピーの又はユニークな配列の境界を定めることである。これは、ターゲット領域内の反復配列の位置からの推定によって、好ましく達成される。通常は、ターゲット領域の配列が、利用可能なコンピュータ・ソフトウェアを使用して、対応するゲノムからの既知の配列と比較される。ターゲット領域内の反復配列がいったん同定されると、介在配列は低又はシングルコピー（つまり、隣接する反復配列の間の配列）と推定される。比較のためのターゲット及び反復配列の最適なアラインメントは、Smithら、Advanced and Applied Mathematics、1981年、第2巻、p.482の局所的ホモロジーアルゴリズムによって、又はNeedlemanら、Journal of Molecular Biology、1970年、第48巻、p.443のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって行われてもよい。
【００５０】
好ましくは、少なくとも２つの相違するプローブ配列が選択され、合成される。少なくとも１組のプローブが、もし異常があるならばあってもよい、特定の核酸配列を認識するために、選択及び合成されなければならず（テストプローブ）、かつ、別の１組のプローブがリファレンス配列を認識するために選択及び合成されなければならない（リファレンス・プローブ）。低コピープローブは、少なくとも約６０塩基対、かつ、概して２５００塩基対未満のサイズでなければならない。好ましくは、プローブは６０から１０００塩基対の間であり、より好ましくは約８０−５００塩基対の間であり、最も好ましくは約９０−１１０塩基対の間である。約１００塩基対の低コピープローブに結合したマイクロスフェアが、よく確定した平均蛍光分布及び安定して高い二番目の蛍光色素の蛍光強度値を出し、そしてそうしてより正確に実際のコピー数を反映することが、知見された。より短いプローブの結合は、より安定でもあり、好ましくは暗所で約４℃で、適切に保存されれば、結合の後２ヶ月以上の間、ハイブリダイゼーション反応に使用することができる。これは、標識されたマイクロスフェアにおいてロット間のばらつきがより少ない結果となり、それによってプローブが結合したマイクロスフェアを結合、定量及び定性するために必要な労力を減らす。より長い、結合したプローブは、劣化したハイブリダイゼーション効率を結合後２週間以内に示した。
【００５１】
この実施例で使用されるプローブは、以前に設計及び検証された１３，１４、（ｉ）ダイバージェントなＡｌｕＪｏ／Ｓｘ／Ｌ２リピートを含むＡＢＬ１ａ（２００４年５月、ｃｈｒ９：１３０６２３５５１−１３０６２５８５４）及び（ｉｉ）ＡＢＬ１の内部からのダイバージェントなＡｌｕＪｏリピートを含むＡＢＬ１ｂ（ｃｈｒ９：１３０６２７３５３−１３０６２８７３５）、並びに（ｉｉｉ）Ａｌｕ／ＭＥＲ１反復配列を含む、１８２３ｂｐのクロモソーム９プローブ、ＡＢＬ１ＡｌｕＭＥＲ１（ｃｈｒ９：１３０６２１７０２−１３０６２３５２５）、（ｉｖ）ＴＥＫＴ３イントロンの９８ｂｐのｓｃセグメント（Ｃｈｒ１７：１５１４９１０８−１５１４９２０６）及び（ｖ）ＰＭＰ２２イントロンの１０１ｂｐのｓｃセグメント（Ｃｈｒ１７：１５０７３４７５−１５０７３５７６）、（ｖｉ）ＨＯＸＢ１イントロンの９３ｂｐのｓｃセグメント（Ｃｈｒ１７：４３９６４２３７−４３９６４３３０）のｓｃインターバルをもつプローブを含む。ゲノム再構成実験のプローブは次のものを含んだ：（ｖｉｉ）ＨＯＸＢ１ｂ（ｃｈｒ１７：４３９６３３９６−４３９６５６８１）及び（ｖｉｉｉ）Ｃ１ＱＴＮＦ７（ｃｈｒ４：１５１４１４５２−１５１４１５００）。これらのプローブの内部にみられる反復配列は、コンセンサスファミリー配列と比較してのパーセント配列相違（＞１２％）、％欠失（＞４％）、及び／又はパーセント挿入（＞４％）に基づいて（ｇｉｒｉｎｇｓｔ．ｏｒｇのインターネット上で）、ダイバージェント（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）と定義された。
【００５２】
マイクロスフェアへのプローブのカップリング
先に記載されたようにプローブは合成され、マイクロスフェアにカップリングされた１３，２０。合成中に、プローブは、スペクトル的に異なるマイクロスフェアに結合するために、特定の結合反応に依存して、アミン標識されることができる。好ましくは、プローブは改変カルボジイミド反応によってマイクロスフェアにカップリングされる。
【００５３】
蛍光マイクロスフェアは、それぞれ異なるスペクトルアドレス（指定されたＬ１−Ｌ９；Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、パロアルト、カリフォルニア）をもち、およそ２０，０００個のカルボキシサイトでコートされていて、異なるｌｃプローブに個別に結合された。精製されたアミノ改変ｌｃプローブは、改変カルボジイミドカップリング法（Dunbarら、2003年；Fultonら、1997年）によって、カルボキシル化マイクロスフェアにカップリングされた。各プローブは最初に熱変性され、それから氷上で急速冷却された。約３．１２５×１０５個の同一スペクトル特性をもつマイクロスフェアが１．５ｍＬマイクロチューブ（ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オカラ、フロリダ）にピペッティングされ、２分間１０，０００ｇで遠心され、そして遠心上清が捨てられた。１５０μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳバッファー（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ４．５が各チューブに加えられ、マイクロスフェアは少しの間ボルテックスされ、続いて２分間１０，０００ｇでの遠心が行われた。遠心上清が除去され、マイクロスフェアは８０μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ中でボルテックスすることによって再懸濁された。シングルのｌｃプローブ（０．５ｎｍｏｌ）が各チューブに加えられ、ボルテックスすることによって混合された。１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の１．２５μＬ容量の新鮮な１０ｍｇ／ｍｌ溶液が加えられ、反応溶液が少しの間ボルテックスされ、暗所で３０分間、時々混合しながらインキュベートされた。ＥＤＣの混合及びインキュベーションは、その都度１．２５μＬの新しく調製されたＥＤＣ溶液を使用して、２回繰り返された。反応は５００μＬの０．０２％ツイーン２０の添加と、それに続くボルテックス及び２分間１０，０００ｇでの遠心によって停止させられた。遠心上清の除去に続き、２５０μＬの０．１％ＳＤＳが各チューブに加えられ、ボルテックスされ、それから１０，０００ｇで２分間遠心された。遠心上清が注意深く除かれ、２５μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ４．５が加えられ、そしてチューブはボルテックスされ、暗所で４℃で保存された。カップリングされたマイクロスフェアの濃度が各マイクロスフェアの１μＬを１００μＬの１×ＰＢＳに加え、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンホゼ、カリフォルニア）で下記の分析条件を使用して分析することによって定量された。
【００５４】
この方法と有効範囲において同等の、核酸をマイクロスフェアにカップリングする他の方法が開発されている。ＤＮＡをマイクロスフェアに結合するためのもうひとつの良く知られた方法は、ストレプトアビジンでコートされたビーズを５’末端をビオチン部分で改変したヌクレオチドを含むプローブに結合する。米国特許第６，３６１，９４４号では、金ナノ粒子がチオール改変された核酸に結合されている。米国特許第６，４６８，５４６号；第６，８３８，２４３号；第６，８３３，２４６号；第６，８２８，１４６号；及び第６，８２８，１４２号では、タンパク質−核酸がビーズに結合されている。オリゴヌクレオチドのマイクロスフェアへの結合は、親電子的拘束、つまり、Ｎ−クロロアセトアミドヘキシルホスホロアミダイト試薬（Guzaevら、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、1998年12月15日、第8巻、第24号、p.3671-3676）によっても行われている。ＤＮＡはまた、半導体ナノ結晶粒子にも結合されている（Taylor, J. R.、Fang, M. M.及びNie, S. M.、"Probing specific sequences on single DNA molecules with bioconjugated fluorescent nanoparticles"、Analytical Chemistry、2000年、第72巻、p.1979-1986；Guo, W. Z.、Li, J. J.、Wang, Y. A.及びPeng, X. G.、"Conjugation chemistry and bioapplications of semiconductor box nanocrystals prepared via dendrimer bridging"、Chemistry of Materials、2003年、第15巻、p.3125-3133、及び米国特許第６，６３０，３０７号）。好ましい実施態様では、マイクロスフェアは、様々なスペクトルアドレスをもつ、内部が染色された、蛍光の、ポリスチレンビーズであり、低コピープローブ結合ビーズの様々な組合せの結果できるもののような低コピープローブに結合されるが、ここでリファレンス・プローブは異なるスペクトルアドレスで指定される。異なるスペクトルアドレスはフローサイトメーターによって認識され、異なるマイクロスフェアのセットに結合した様々な低コピープローブによる多重反応を許す。
【００５５】
ゲノムのターゲットの調製
ゲノムのテンプレート（ターゲット核酸配列）が、先に記載されたように、骨髄サンプルの細胞遺伝学的な調製物に由来する、メタノール−酢酸固定された細胞ペレットを使用して調製された１３，２０。他の方法とは異なり、ターゲット配列は事前選択又は増幅されない。従って、本発明では、ゲノム（又はトランスクリプト）の全コピーが分析のためにハイブリダイズされることができる。ＤＮＡ（又はＲＮＡ）は、サンプルの提供元と状態に依存して、細胞から抽出され、そして、必要ならば、任意のコンベンショナルな方法を使ってイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で複製されることができる。好ましくは、核酸は、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を使用して、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で複製されるが、これは１ｎｇ未満のサンプル核酸しか使用せず、２０分未満のハンズオンタイムしか必要としない。ＤＮＡはそれから任意のコンベンショナルな方法によって、好ましくは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の複製中の直接的な標識ステップによって、又は標識及びその標識に対してアフィニティを持つレポーター分子からなる間接的な標識システムによって、標識される。核酸ターゲットは、フルオロフォア、酵素コンジュゲート、又はビオチン若しくはアビジン、ストレプトアビジン、若しくは特異的抗体によって認識される部分からなる群から選ばれるひとつのもののような識別標識で標識される。数タイプの非アイソトープ性識別標識がある。ひとつのタイプは核酸ターゲットに化学的に結合し、直接的な同定の方法に使える標識である。これの一例は蛍光色素部分であり、適切な波長の放射を受けると励起して高エネルギー状態となり、蛍光を発する。Ｃｙ３−ｄＵＴＰのような直接標識された蛍光ヌクレオチドは当該技術分野において知られており、本発明で使用するのターゲットＤＮＡの標識の好適な態様である。ＤＮＡの直接的な標識をする他の方法もまた好適である（一例はユリシーズ（Ｕｌｙｓｓｅｓ）法（Ｋｒｅａｔｅｃｈ、オランダ）として販売されるアミノ−アリル標識であろう）が、そのような事例では、標識されたターゲットをプローブ結合マイクロスフェアに加える前に、標識ゲノムＤＮＡがハイブリダイゼーションに適したサイズまで断片化されなければならないだろう。好ましい実施態様では、核酸はビオチン−ｄＵＴＰ又はジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを使用してイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の複製中に直接的に標識され、得られる標識されたサンプルは超音波処理されて〜３００ｂｐから１ｋｂｐの長さのフラグメントを得る。核酸ターゲットは、改変された又は直接標識されたヌクレオチド（Rigbyら、Journal of Molecular Biology、1977年、第113巻、p.237-251）を、ｄＵＴＰ又はｄＡＴＰのようなヌクレオチドに結合した一般に好まれる（がこれらに限定されない）識別標識を含む反応物を用いるコンベンショナルな方法で使用して、ニックトランスレーションによって標識されることもできる。フラグメントは、フルオロフォアで標識された核酸で直接標識されるか、又は、下に記載するように、フラグメントに取り込まれている改変ヌクレオチドを認識する蛍光標識された抗体に、標識された重複部位を結合することによって間接的に標識されるかのいずれかである。ニックトランスレーション（１００μＬ）では、エンドヌクレアーゼフリーのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用する。各フラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（４ユニット／マイクログラムＤＮＡ）、ＤＮａｓｅ（０．０１−３マイクログラム／１００μＬ反応液）、標識ヌクレオチド（０．０５ｍｍファイナル）及びニックトランスレーションバッファーと組み合わせられる。反応は１５℃で６０分間行われ、〜３００から１００ｂｐのサイズの範囲で異なるヌクレオチドのサイズの、様々な標識されたプローブのフラグメントを得る。または、ビオチン−ｄＵＴＰ又はヂゴキシゲニン−ｄＵＴＰがイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の複製処理中に取り込まれることができ、そしてできあがる標識されたサンプルはＤＮＡｓｅ  Ｉで処理されるか、又は長さ〜３００ｂｐから１ｋｂのフラグメントを得る他の方法によってせん断されることができる。核酸を標識する、及び検出する、普通に使われる方法が、本方法の低コピーＤＮＡが結合したマイクロスフェアの検出に適用されてもよい。これらは、蛍光色素標識及びエネルギー転移団、タンパク質コンジュゲート、抗体、若しくは抗原のような蛍光化合物を含む。
【００５６】
より具体的には、１μｇのゲノム及びｐＵＣ１９  ＤＮＡがビオチン−１６ｄＵＴＰでニックトランスレーションをされて、それぞれ、１００ｂｐ−３５０ｂｐ及び５０ｂｐ−３００ｂｐの長さの産物を得た１７。１μｇの各Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｉ及びＲの製造者から）がジゴキシゲニン−１１  ｄＵＴＰでニックトランスレーションをされて５０ｂｐ−３００ｂｐの産物を得た。
【００５７】
ハイブリダイゼーション反応及びフローサイトメトリ
標識されたＤＮＡ（５０ｎｇ）が、１０，０００個のプローブ結合マイクロスフェアを含む、４０μＬの１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーションバッファー（３〜ｍｏｌ／Ｌ  テトラメチル塩化アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｇ／Ｌ  サルコシルで希釈された。反応は表１に掲げられた構成部分で組み立てられた。
【００５８】
【表１】
2009518004.tif 000003
Ｒ以前のハイブリダイゼーションアッセイから回収されたプロダクト
＊ビオチン−１６ｄＵＴＰを使用してニックトランスレートされ、そしてＦＬ２上のＳＰＥで検出された、１反応あたり５０ｎｇ
【００５９】
ハイブリダイゼーション及び反応の検出は、以前に記載されたように行われた１３，２０。ハイブリダイゼーション反応の条件は特定のヌクレオチド組成及びそれぞれの低コピープローブの長さに依存し、当該技術分野における通常の知識を有する者によって容易に決定することができる。ハイブリダイゼーションのために、サンプル配列は、低コピープローブが結合したマイクロスフェアを含むハイブリダイゼーションバッファー溶液中に希釈される。使用されるプローブが結合したマイクロスフェアの量は試験されるサンプルの量に依存する。好ましくは、約５ｐｇから１μｇのサンプル、より好ましくは、約２５−１００ｎｇのサンプル、さらに好ましくは、約３０−７０ｎｇ、いっそう好ましくは、約４０−６０ｎｇのサンプル、そして最も好ましくは、約５０ｎｇのサンプルが、ハイブリダイゼーション反応あたり分析される。従って、バッファー溶液は、好ましくは約２，０００−１０，０００のプローブが結合したマイクロスフェア、より好ましくは約２，０００−６，０００のプローブが結合したマイクロスフェア、いっそう好ましくは約４，５００−５，５００のプローブが結合したマイクロスフェア、そしてもっとも好ましくは約５，０００のプローブが結合したマイクロスフェアを、ハイブリダイズされるそれぞれのセットについて含む。希釈してすぐに、ハイブリダイゼーション反応液は、好ましくは約９５℃で熱変性され、それから適切なハイブリダイゼーション温度、好ましくはプローブのヌクレオチド組成及び長さによって約４５から５１℃で、一晩ハイブリダイズさせられる。ハイブリダイズしたマイクロスフェアは、それから、ハイブリダイズしなかったターゲット配列を除去するために洗浄及び遠心をされる。
【００６０】
遠心上清が除去され、ハイブリダイズしたサンプルが多量の改変されたレポーター分子若しくは他の適切な標識、好ましくは二次的な蛍光色素として作用するもので、標識された、低コピープローブが結合したマイクロスフェアにハイブリダイズしたサンプルを検出するために、染色又は標識される。好ましいレポーター分子はフィコエリスリン標識ストレプトアビジン又は抗ジゴキシゲニンフルオレセインであり、これらはそれぞれ、好ましいターゲット配列の標識、ビオチン及びジゴキシゲニンを検出しそれに結合する。ハイブリダイズ及び標識／染色されたサンプルは、ハイブリダイゼーション反応に使われたのと同じ温度で、レポーター分子が標識されたターゲット分子を検出し結合するのに十分な時間のあいだ、インキュベートされる。その後、サンプルは、残りの染色試薬を除去するために洗われる。サンプルは遠心され、遠心上清は除去され、染色されたハイブリダイズしたマイクロスフェアは十分量のハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁される。
【００６１】
フローサイトメトリーによる分析の前に、フローサイトメーターのメーカーの説明書に従って、ハイブリダイズされたサンプルは希釈されることができる。好ましくは、１回の反応について、各セットの約２，０００〜６，０００個のマイクロスフェアが分析され、より好ましくは、約４，５００〜５，５００個のマイクロスフェアが、及び最も好ましくは、１セットあたり約５，０００個のマイクロスフェアが１回の反応について分析される。しかし、分析されるサンプルの量は、分析に使用される特定のフローサイトメーターに依存してもよい。フローサイトメーターの較正と操作設定は、当該技術分野における通常の技術を有する者によって、特定のハイブリダイゼーション・アッセイを測定するための最適な範囲を決定するために、過度の実験を要さずに種々の方法で変更されることができる。これらのパラメタは、分析に使用されるソフトウェアにも依存する。蛍光ビーズのスタンダードが広く利用可能であり、フローサイトメーターの異なる蛍光検出チャネルの強度を較正するために使用されることができる。装置は蛍光量（ＭＥＳＦ）単位で較正された、表面標識されたビーズに基づく蛍光参照スタンダードで較正されることもできる。光電子増倍管（ＰＭＴ）の電圧設定、並びにフォワードスキャッター、サイドスキャッター、流速、及び種々の検出チャネルの閾値は、普通のジェノタイプをもつ１人の患者サンプルにハイブリダイズした２つの異なるプローブの蛍光強度間の差異を最小化するように好ましく最適化されるべきである。最適でない電圧パラメタは直ちにわかり、かつ、最適なパラメタはサイドスキャッタープロットを使用して可視化したときに、緊密にまとまった異なるスペクトルアドレスをもつマイクロスフェアの結果となるのに対して、ブロードな蛍光ピーク又はノンリニアなデータの結果となる。好ましくは、これらの設定は、算術平均、幾何平均、メジアン及びピークチャネルの抽出された蛍光測定値から決定される。
【００６２】
反応は３分間変性され、５０℃で一晩ハイブリダイズさせられた。ハイブリダイズしたマイクロスフェアは洗われ、レポーター分子、つまりストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＰＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）及び／又は抗ジゴキシゲニン−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色された。ハイブリダイズされたサンプルはそれからフローサイトメトリ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンホゼ、カリフォルニア）によって、デュアルレーザー検出を使用して分析され、そしてそれによって、サイトメーターは、ハイブリダイズしたビーズを同定及び定量するために、マイクロスフェアのスペクトルアドレス及びサンプル配列に結合した第二の蛍光色素をともに検出する。相補的なプローブが結合したマイクロスフェアにハイブリダイズした各サンプル配列のシグナルは、サンプル配列にくっついた第二の蛍光色素の蛍光強度を定量することによって測定される。コンパチブルなマイクロスフェアのスペクトルアドレスが、任意の結合していない第二の蛍光色素（レポーター分子）の励起波長によるオーバーラップを最小化するために、選択される。これは、他の点で同一の、結合せず、かつハイブリダイズしていないマイクロスフェアから得られる結果の比較によって確認されることができる。ネガティブコントロールが、第二の蛍光検出チャネルのバックグラウンド蛍光を測定するために、サンプル核酸を除く全要素を含む反応チューブを使用して維持されてもよい。好ましくは、残ったマイクロスフェアを除去するために、システムはラン中に蒸留水で洗浄される。
【００６３】
約５，０００個のマイクロスフェアが１反応あたり分析された。ハイブリダイゼーションがＳＰＥ及び／又はＦＩＴＣの（それぞれチャネルＦＬ２及び／またはＦＬ１で測定された）平均蛍光強度から定量され、それはプローブによって結合したゲノムターゲットの（ＦＬ２）、及びＣｏｔ−１  ＤＮＡの（ＦＬ１）の数量に相当する。結合したプローブ及び同一の配列を含む標識されたターゲットによる較正の検討は、平均蛍光強度における変化はハイブリダイズしたターゲットの量とリニアな関係にあることを示唆した。ＦＬ１及びＦＬ２チャネルのバックグラウンド蛍光は、ターゲットＤＮＡ以外の全要素を含むネガティブコントロールを使用して各ハイブリダイゼーション実験で、個別に測定された。
【００６４】
最適な光電子増倍管電圧が先に記載したように設定された；データ収集及び分析はメーカーに提供されたＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで行われた１３，２０。最適な光電子増倍管電圧の設定は、正常なジェノタイプの単一の患者ＤＮＡサンプルにハイブリダイズした２つの異なるプローブの蛍光強度の間の差異を最小にする光電子増倍管電圧設定を選択することによって決定された。これらの設定は、算術平均、幾何平均、メジアン及びピークチャネルの、機器で採られた蛍光測定値（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から決定された。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置のための典型的な光電子増倍管電圧の設定は、ＦＳＣ（フォワードスキャッター）＝Ｅ００（シグナル増幅なし）、ＳＳＣ（サイドスキャッター）＝３４４Ｖ、ＦＬ１＝７２７Ｖ、ＦＬ２＝６４０Ｖ、ＦＬ３＝３００Ｖ、及びＦＬ４＝５００Ｖであった。ＦＳＣ、ＦＬ１、ＦＬ２、及びＦＬ３の閾値は、デフォルトの５２Ｖに設定された。ＦＳＣの閾値は、第一のパラメタとして選ばれ、５２Ｖの値を有し、第二のパラメタはＳＳＣでデフォルトの１２５Ｖに設定された。流速は低に設定され、使用されたシース液はＦＡＣｓＦｌｏｗ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）であった。システムはランとランの間に、２〜５ｍＬの蒸留水で、残ったマイクロスフェアを除去するために洗浄された。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔがデータ収集と分析のために使用された。データの分析はまた、ＷｉｎＭＤＩ２．８フローサイトメトリパッケージ（ＷｉｎＭＤＩ；Ｊ．Ｔｒｏｔｔｅｒ、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ラ・ホヤ、カリフォルニア）を使用しても行われた。
【００６５】
プローブが結合したＤＮＡ断片の回収
ＡＢＬ１ａとのゲノムハイブリダイゼーションの試料（３５μＬ）（表１：反応１９及び２０）が、２５０μＬの１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで洗われ、遠心（１３，０００×ｇ）でペレット化され、そして、これは２回繰り返された。ハイブリダイズされたゲノムの配列は、９５℃で５分間熱変性され、急速冷却され、続いて４℃で３分間、遠心（１３，０００×ｇ）された。回収された配列は、ＱＰＣＲのための、及びマイクロスフェアがカップリングしたＡＢＬ１ＡｌｕＭＥＲ１へのハイブリダイゼーションのためのターゲットとして使用された（表１：反応２１及び２２）。
【００６６】
合成反復ＤＮＡ
合成反復ＤＮＡが、内部に含まれる反復配列のファミリーに基づいて、ゲノム領域から調製されたが、それはそれぞれがＣｏｔ−１製造工程で増加されるからである。しかし、中程度〜高コピー数の反復因子に近接したｓｃ領域を含む任意の反復ゲノム領域が使用されることができた。ゲノムのプローブ内の反復因子が所望のターゲット間隔以上の場所で抑制されたことを示すために、１．１ｋｂのＬＴＲ因子をＣ１ＱＴＮＦ遺伝子の上流に位置するクロモソーム４ｐ上の２つの４００ｂｐのｓｃ領域（ｃｈｒ４：１５１３９７０４−１５１４１５８１）の中間に含むプローブが調製された（図４、Ａ）。続いて、反復因子をブロッキングするためのＡＢＬａプローブ領域内に位置する反復配列が合成された；クロモソーム９のＡＢＬ１ａは、２８０ｂｐのＡｌｕＪｏリピート、３００ｂｐのＡｌｕＳｘリピート、及び８３０ｂｐのＬ２因子セグメントを含む（図４、Ｃ）。クロモソーム１７ｑ上の、３０６ｂｐのＡｌｕＳｘリピート及び１５４ｂｐのＬ１短縮配列（ｃｈｒ１７：４３９６３３９６−４３９６５６８１）を含むＨＯＸＢ１の５’に位置する２２８６ｂｐのセグメントもまたプローブとして使用された（図４、Ｂ）。これらの反復因子（表２；ＨＯＸＢ１ＡｌｕＬ１及びＣ１ＱＴＮＦ７ＬＴＲ）を直接にフランキングするユニークな配列を増幅するプライマーは各反復配列及びターゲットの産物（表２：ＨＯＸＢ２ｂ及びＣ１ＱＴＮＦ７）をＰＣＲ増幅するために開発された。ゲノムＤＡＮ（Ｐｒｏｍｅｇａ）プローブがＰｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して増幅された。増幅産物はそれから電気泳動され、マイクロスピンカラムの遠心によって抽出された。プローブは改変カルボジイミド反応によって、以前に記載１３，２０されたように、マイクロスフェアに結合された。ハイブリダイゼーション反応（表１；反応２３−３３）は、ホモロガスなＰＣＲ産物に結合した合成反復ＰＣＲ産物、及び／又はゲノムＤＮＡの効果をＣｏｔ−１  ＤＮＡの存在下及び不存在下で評価した。反応は、ハイブリダイズされ、洗われ、ＳＰＥで染色され、そしてそれからフローサイトメトリによって分析された。
【００６７】
定量ＰＣＲ
ＱＰＣＲ及びデータ分析は、Ｃｈｒｏｍｏ４定量ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ヘラクレス、カリフォルニア）を使用して行われた。プライマー及び増幅されたインターバルは、ユニークなゲノムのリプレゼンテーションのためにＢＬＡＴ１８（インターネット上のgenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatでみつけられる）及びＢＬＡＳＴを使用して検証された（表２）。ＢＬＡＴは、配列アラインメントアルゴリズム及びクエリー配列に対してホモロジーを示しそうなヒトゲノム内の領域を同定するための脊椎動物の配列のインデックスを含むコンピュータソフトウェアツールである。ＢＬＡＴはＢＬＡＳＴに似たアラインメントツールであり、ＢＬＡＳＴのターゲットデータベースがＧｅｎＢａｎｋの配列の集まりを含むのに対して、ＢＬＡＴは全ゲノムのインデックスをメモリ中に保持することによって機能するので、少ししか相違しない。各５０μＬの反応は、０．５μＭの各プライマー、５０ｎｇのＣｏｔ−１テンプレート又はポジティブコントロールのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び２５μＬの２×ＱＴＳｙｂｒＧマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）を含んだ。ゲノムＤＮＡはＤＮＡｓｅを使用してニックが入れられ、５０ｂｐ−３００ｂｐの断片を生じ、ネガティブコントロールはＤＮＡを除く全ての反応要素を含んだ。サーマルサイクル条件は、９５℃で１５分間、４５サイクルの増幅（９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間、（データ取得）、７２℃で３０秒間）、続いて７２℃で５秒間であり、そして融解曲線を作成するために２０℃まで毎秒温度を下げた。回収されたゲノムのテンプレート中のインプットのターゲット配列の量を測定するために使用される較正曲線は、正常なゲノムのテンプレートの量を変化することによって（１ｎｇ、２ｎｇ、４ｎｇ、１０ｎｇ、及び２０ｎｇ）、及び各反応のＣＴ値を測定することによって作成された。
【００６８】
ＡＢＬ１ａプロダクトのハイブリダイゼーションから回収された配列の組成（表１：反応２１及び２２）がＱＰＣＲによって測定された。ＡＢＬ１領域内からのいくつかの増幅された配列を使用したが、それは必ずしもこのプローブとホモロガスではなく、ＤＮＡＪ３遺伝子の５’に位置するＡｌｕリピート、ＴＥＫＴ３、及びＨＯＸＢ１を含むＤＮＪＡ３Ａｌｕ（Ｃｈｒ１６：４４２１１３８−４４２１２００）のような他のリンクしていないゲノム領域に特異的なプライマーと同様に、ＡＢＬ１ａ及びＡＢＬ１ｃ（ｃｈｒ９：１３０７０９６６５−１３０７１１４６９）、ＡＢＬ１ｄ（ｃｈｒ９：１３０６９９３２４−１３０７００５９６）を含んだ（表２）。反応は上に記載されたように行われた。ポジティブコントロール（ヒトゲノムＤＮＡ）が、ＱＭＨ反応（５０μＬ）に最初に加えられたゲノムＤＮＡの初期量を示すために、各プライマーセットに対してランされた。ＱＭＨから回収されたターゲット配列のモル比は、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの存在下及び不存在下で、試験サンプル中の最初のテンプレートの量から測定された（標準較正曲線に対する相互参照をされたＣＴ値から内挿された）。
【００６９】
【表２】
2009518004.tif 000004
【表３】
2009518004.tif 000005
【００７０】
蛍光イン・ザイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
本発明の方法は、蛍光イン・ザイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験においても使用されることができる。ＦＩＳＨプローブのターゲット領域は、クロモソーム全域であっても、その一部であってもよい。プローブの合成及び標識１５，１６の後、ＦＩＳＨハイブリダイゼーションプローブは、スライドに固定されたクロモソームへのハイブリダイゼーションの前に、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの代わりに、リピートを抑制するために合成反復ＤＮＡとインキュベートすることができる。しばしば、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡを使用してプローブのプレハイブリダイゼーションをして又はしないで準備した比較実験は、異なるプローブハイブリダイゼーションシグナルを示す１４。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡプローブのプレハイブリダイゼーションを行わないＦＩＳＨは、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡのプレハイブリダイゼーションを行わないＦＩＳＨ実験と比較して、クロモソームについて弱いシグナルを示す１４。そのより弱いシグナルは、プローブ内のシングルコピー配列のＣｏｔ−１  ＤＮＡ内にあるシングルコピー配列とのハイブリダイゼーションが原因である。これは、クロモソーム上のターゲット配列とのハイブリダイゼーションに利用可能なプローブの量を減少させ、従って、弱いシグナルとなる。しかし、結果として、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡのプレハイブリダイゼーションを行わない実験は、プローブのシグナル強度はより明るいのだけれども、例によってより偽陽性のプローブハイブリダイゼーションを呈し、そして、それによって分析をより労力の要るものにするより高いバックグラウンドレベルという結果になる。シングルコピー配列を含まない純粋な合成反復ＤＮＡフラクションでプローブをプレハイブリダイズすることによって、プローブ内にみられるあらゆる反復配列は、クロモソームとのハイブリダイゼーションに利用可能なシングルコピー配列を残しながら、有効に抑制される。従って、クロモソーム上でのプローブのシグナル強度は影響を受けず、かつバックグラウンド（偽陽性のハイブリダイゼーションシグナル）は有効に低減される。
【００７１】
結果
Ｃｏｔ−１  ＤＮＡによる定量マイクロスフェアハイブリダイゼーション
ＦＩＳＨでバリデートした、混合されたｓｃ及び反復配列プローブ、ダイバージェントなＡｌｕＪｏ／Ｓｘ／Ｌ２リピート（ｃｈｒ９：１３０６２３５５１−１３０６２５８５４）を含むＡＢＬ１遺伝子のＩＶＳ１ｂの５’末端に由来するＡＢＬ１ａがビオチン標識されたゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせられた１３，２０。商業的に調製されたＣｏｔ−１  ＤＮＡが反復配列のハイブリダイゼーションを抑制することが期待されたが、Ｃｏｔ−１がＡＢＬ１ａのニックトランスレートされたゲノムＤＮＡとの繰り返し行われたハイブリダイゼーションに含まれたとき、標識されたゲノムのターゲットの平均蛍光（又はハイブリダイゼーション）強度は確実にかつ著しく２．２倍まで増大した（表１：反応１及び２）。クロモソーム１７の遺伝子、ＰＭＰ２２（Ｃｈｒ１７：１５０７３４７５−１５０７３５７６）及びＴＥＫＴ３（Ｃｈｒ１７：１５１４９１０８−１５１４９２０６）に由来するｓｃプローブは、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ存在下で、ハイブリダイゼーション強度においてより小さいが再現性のある１．０８及び１．１４倍の増大を示した（表１：反応３−６）。これらの実験はＣｏｔ−１による影響はこれらのｓｃインターバルを囲む反復配列の組成に関係することを示唆する。ＨＯＸＢ１（Ｃｈｒ１７：４３９６４２３７−４３９６４３３０）に由来するｓｃプローブは、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ（表１、反応７−１２）を追加したハイブリダイゼーション強度において、試験されたゲノムのサンプルに対するハイブリダイゼーション強度において０．８４−０．９２倍に減少し、確実に小さな減少を呈する。ＨＯＸＢ１インターバルは、実際には反復配列を含まない（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ、２００４年５月）。ＡＢＬ１ａを囲む領域は、高い密度の、保存された、十分に散在性のＳＩＮＥ（ＡｌｕＪｏ、ＡｌｕＳｘ）及びＬＩＮＥ（Ｌ２）因子を含む。ＴＥＫＴ３及びＰＭＰ２２インターバルは、より短い、より十分でない、よりダイバージェントなクラスの反復因子（ＭＩＲ、ＭＥＲ、及びＬ２）を含む。
【００７２】
Ｃｏｔ−１  ＤＮＡを加えることによってターゲットのＡＢＬ１ａプローブへのハイブリダイゼーションが変化する程度は、（ＦＬ２チャネルのストレプトアビジン−フィコエリスリン［ＳＰＥ］で検出される）ビオチン標識ターゲットＤＮＡ、ビオチン標識ネガティブコントロールターゲット（ｐＵＣ１９プラスミド）、及びこれらのそれぞれと（ＦＬ１チャネルのＦＩＴＣが結合した抗ジゴキシゲニンで検出される）ジゴキシゲニン標識Ｃｏｔ−１  ＤＮＡが一緒になったもののハイブリダイゼーションを比較することによって測定される。Ｃｏｔ−１の存在は、ビオチン標識されたホモロガスなゲノムのターゲット配列にハイブリダイズしたＡＢＬ１ａの平均蛍光強度において２倍の増加になる。しかし、結合した標識Ｃｏｔ−１配列の量は、Ｃｏｔ−１配列が含まれない反応（表１：反応１３及び１４）に対して強度においての５０倍の増加に基づいて、ＡＢＬ１ａ内の反復配列の抑制のために必要なそれを実質的に超えた。Ｃｏｔ−１の結合は、Ｃｏｔ−１が存在するかどうかにかよらずＡＢＬ１ａのｐＵＣ１９へのハイブリダイゼーションがバックグラウンドレベル（＜１０１）のシグナルを呈したので、配列特異的のようである（表１、反応１５）。これらの知見は、Ｃｏｔ−１内のホモロガスな配列はＡＢＬ１ａプローブに直接結合しているということを示唆する。ＡＢＬ１ａ配列はおそらくＣｏｔ−１ターゲットのほんの小さな割合にしか相当しないので、それは単独では観察されたハイブリダイゼーションにおける増加を説明することができない。
【００７３】
増加したシグナルがＣｏｔ−１  ＤＮＡの量に関係したかどうかを決定するため、固定量（５０ｎｇ）のビオチン標識されたゲノムのターゲットに加えられるジゴキシゲニン標識Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの可変量が、混合されたｓｃ及び反復プローブであるＡＢＬ１ｂにハイブリダイズさせられた。ＡＢＬ１ｂは２つのダイバージェントなＡｌｕＪｏ反復配列（ｃｈｒ９：１３０６２７３５３−１３０６２８７３５）を含む。Ｃｏｔ−１の量を反応において５０から１００ｎｇに倍増することによって、Ｃｏｔ−１へのプローブのハイブリダイゼーションは１．８倍まで、及びホモロガスなターゲットへは１．３倍まで増加した（表１：反応１６及び１７）。同様に、１５０ｎｇの標識Ｃｏｔ−１  ＤＮＡは、ＡＢＬ１ｂへのハイブリダイゼーションを５０ｎｇのＣｏｔ−１のときの３倍まで、及びターゲットＤＮＡへのときの１．５倍まで増加した（表１：反応１７及び１８）。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの化学量論的な追加は、ホモロガスなビオチン化ターゲットを２及び４倍の間にたとえ希釈するとしても、対応するハイブリダイゼーション強度は意外にも１．５倍に増加される。
【００７４】
Ｃｏｔ−１濃度のハイブリダイゼーション強度との相関は、この反応要素がプローブ及び適切なゲノムのターゲットに加えて他の配列を含むデュープレックス構造の形成を促進したことを示唆した。プローブに結合したＣｏｔ−１由来の配列の組成を決定するために、プロダクトはＡＢＬ１ａがカップリングしたマイクロスフェアへのハイブリダイゼーションの後に変性及び回収された（表１、反応１９及び２０）。これらのプロダクトは引き続く、ＡＢＬ１ａの２．３ｋｂセントロメア寄りに位置するＡｌｕ因子（ＡｌｕＪｂ、ＡｌｕＳｑ、Ｃｈａｒｌｉｅ１、及びＡｌｕＳｘ）及びＭＥＲ１配列を含む、オーバーラップしないｓｃ及び反復のマイクロスフェア結合プローブ、ＡＢＬ１ＡｌｕＭＥＲ１へのハイブリダイゼーションにおいてターゲット配列として使用された。ＡＢＬ１ＡｌｕＭＥＲ１のゲノム上の位置を考えれば、回収されたニックトランスレートされたゲノムのプロダクトの中に存在することは期待されなかった。しかし、標識されたＣｏｔ−１のフラクションが、ＦＬ１チャネルでの平均蛍光強度における１１倍の増加に基づいて、回収されたＡＢＬ１ＡｌｕＭＥＲ１配列のもと（ｓｏｕｒｃｅ）であることが知見された（表１：反応２１及び２２）。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ内のハイブリダイズしたＡＢＬ１ａに近接した反復配列は、反復及びシングルコピーの配列因子のネットワークを形成することによるゲノムの配列へのハイブリダイゼーションの核となるようである（図３：パネル１及び２）。この可能性は回収されたハイブリダイゼーションプロダクトの中に存在する配列の定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）分析によって評価された。
【００７５】
定量ＰＣＲによるハイブリダイズした配列の分析
我々のプローブにホモロガスなＣｏｔ−１内のｓｃ配列の含有量がＱＰＣＲによって測定された。その研究で使用されたプローブ及びプライマーは表２に識別される。分析の結果は表３に示される。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
ＡＢＬ１ａの１００ｂｐのｓｃセグメントがＣｏｔ−１  ＤＮＡ及びコントロールのゲノムＤＮＡの５００ｎｇのサンプルから増幅された（表２）。それらのそれぞれのＣＴ値に基づき、メーカーＩ及びＲからのＣｏｔ−１フラクションは、ハイブリダイズしたＡＢＬ１ａの量において、そのノーマルのゲノム組成に対するそれぞれ１４及び２倍の増加（又は２．５及び１．７倍の分子の増加）を呈した（表３、反応１−３）。ＡＢＬ１ａ配列が、このプローブにハイブリダイズしたゲノムの及びＣｏｔ−１由来の配列の構成を決定するために、ハイブリダイゼーションの後に回収された（表１：反応２１及び２２）。ＡＢＬ１ａ配列は、ターゲット及びＣｏｔ−１  ＤＮＡの両方を含むハイブリダイズしたサンプルにおいて、１２８倍まで増加した（表３：反応１３及び１４）。Ｃｏｔ−１を含むハイブリダイゼーションから回収されたＡＢＬ１ＡｌｕＭＥＲ１と同一の配列は、Ｃｏｔ−１を含まないその他が同一条件の反応で見られるものよりも１３９倍多かった（表３：反応１５及び１６）。ＡＢＬ１ＡｌｕＭＥＲ１に近い関係にある反復配列は、回収されたハイブリダイゼーションプロダクトの中でも検出された。９２％の類似性をもつＡｌｕ因子、ＤＮＪＡ３Ａｌｕ（ＤＮＪＡ３遺伝子の５’；ｃｈｒ１６：４４２１１３８−４４２１２００）がＣｏｔ−１を含むハイブリダイゼーション反応の中に見られたが、Ｃｏｔ−１を含まない反応の中には見られず、このことはこの汚染性の配列の供給源であることを示した（表３：反応１７及び１８）。他のｓｃのゲノムのセグメント（つまり、ＣＭＴ１Ａ、ＨＯＸＢ１、及び他のＡＢＬ１領域（ＡＢＬ１ｃ及びＡＢＬ１ｄ）からの）は、ＡＢＬ１ａプローブへのハイブリダイゼーションから回収されたプロダクトの中に検出されなかった。
【００７８】
Ｃｏｔ−１はホモロガスなｓｃ及び反復配列の両方を含む、ＲＲｐ４−１．６ａにハイブリダイズした配列、ＡＢＬ１（表２）に結合した配列を、このシングルコピーの配列はＦＩＳＨで確認されていたという事実にもかかわらず導いた１４。中程度に及び高度に多量のＭＩＲ、Ｌ２、及びＬ１反復因子は、ゲノム上でこの配列を取り囲む。ＱＰＣＲは、上流（５’）及び下流（３’）のアンプリコンから回収された反復配列の、ｓｃインターバル内に由来する短いＲＲＰ４−１．６ａプロダクトに対する、より高い濃度を示した（表３：反応４−１２）。ＣＴ値の比較は、ゲノム上の反復の境界にあるｓｃ配列（ＲＲＰ４−１．６ａ５’及びＲＲＰ４−１．６ａ３’）が、メーカーＲ（及び同様に、メーカーＩ）のＣｏｔ−１フラクション中に対して、ゲノムＤＮＡ中には６．８倍しか多くないことを示した。予想通り、内部のｓｃ  ＲＲＰ４−１．６ａ配列は、Ｃｏｔ−１中よりもゲノムＤＮＡ中に著しく多い（２４倍）が、それでもやはりＣｏｔ−１中に依然として検出される（表３：反応７−９）。Ｃｏｔ−１の調製中のＳＩＮＥ及びＬＩＮＥの増加は、結合したプローブに、又は標識されたゲノムＤＮＡ内に存在するｓｃ長大配列にハイブリダイゼーション中にアニールする可能性がある、リンクしたｌｃ又はｓｃ配列を増加する結果となる。
【００７９】
合成反復ＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションの抑制
Ｃｏｔ−１  ＤＮＡのハイブリダイゼーションの効果は、３つの異なるゲノム上のローカスで、ｓｃ因子に近接した反復因子から調製された精製合成ＤＮＡの過剰量を置換することによって、なくなった（図４）。１．９ｋｂの増幅プロダクトが、クロモソーム４上のＣ１ＱＴＮＦ７の上流のＬＴＲ様反復因子及びシングルコピー配列を含みながら、合成された。精製された合成ＬＴＲ様因子、Ｃ１ＱＴＮＦ７ＬＴＲを加えることは、このプロダクトのカップリングされたマイクロスフェアへの自己ハイブリダイゼーションに何の影響も及ぼさなかったが、しかしＣｏｔ−１  ＤＮＡを加えることは平均蛍光を１．２倍まで増加した（表１：反応２３−２５）。Ｃ１ＱＴＮＦ７ＬＴＲは、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの存在及び不存在下で、反復配列のニックトランスレートされたゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションをブロックするために使用され、そして同様の結果を得た（表１：反応２６−２８）。ＡｌｕＳｘ及びＬ１反復配列のハイブリダイゼーションは、クロモソーム１７のＨＯＸＢ１ローカス（ＨＯＸＢ１ｂ）の上流の〜２．３ｋｂの領域内で、これらの配列を含む合成ＰＣＲプロダクト、ＨＯＸＢ１ＡｌｕＬ１を使用して抑制された。ＨＯＸＢ１ｂのＰＣＲプロダクト及び対応するマイクロスフェアがカップリングしたプローブのＨＯＸＢ１ＡｌｕＬ１の存在下でのハイブリダイゼーションは、増幅されたターゲット内の反復配列を効果的にブロックし、実際、おそらくターゲットの長さの減少のために、ハイブリダイゼーション強度を０．３倍まで減少した（表１：反応３２及び３３）。反復配列のハイブリダイゼーションもまた、マイクロスフェアにカップリングしたＡＢＬ１ａへの比較ゲノムハイブリダイゼーションにおいて、このターゲット領域内からの合成Ａｌｕ及びＬ２因子を加えることによって、効果的に抑制された（表１：反応２９−３１）。
【００８０】
マイクロアレイハイブリダイゼーションにおけるＣｏｔ−１のインパクト
パブリッシュされたハイブリダイゼーションの研究にほとんど必ずＣｏｔ−１を反復配列の抑制のために含むことは、どれほどこの試薬が発現及び／又はゲノムのコピー数の定量測定に影響するかという疑問を提起する。二重標識ハイブリダイゼーション強度における変わりやすさが、Ｃｏｔ−１を使用する発現研究でのクローンされたプローブのアレイにハイブリダイズした反復ターゲットサンプルの１セットについてくまなく評価された。結果は、マイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイで使用された遺伝子（ＡＢＬ１ａ、ＨＯＸＢ１、及びＴＥＫＴ３を含む）のｃＤＮＡプローブから、その後続いて、反復配列の構成によって区別される、つまり反復因子が稠密に（表４、下）、又は疎に（表４、上）存在するゲノム環境に位置するいくつかの遺伝子配列に対するハイブリダイゼーションプロファイルから分析された。
【００８１】
【表５】
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【００８２】
繰り返し試験したＣｙ３／Ｃｙ５の強度比は、より少なくてよりダイバージェントな反復配列を含むゲノム領域に由来するプローブと比較して、反復が稠密なゲノムのインターバル内にある配列に対するものは、ばらつきが明らかに大きい。たとえば、ＡＢＬ１は、同じテストサンプルを異なる繰り返し試験で使用して、増大した及び減少した発現の両方を呈することが見出されたが（例えば、０．３０のサンプルの分散及びｐ＝０．１８を示すデータベースレコード  ＧＤＳ７５１／２０２１３；表４）、これは我々がマイクロスフェアが結合したＡＢＬ１ａで観察した、ハイブリダイゼーションにおけるひずみに類似する。それに対して、ＨＯＸＢ１は、同じテストサンプルを使用して繰り返し行われた発現アレイ試験間のログ比強度において、ほとんどばらつきを見せなかった（ＧＤＳ２２３／３１５５５；サンプルの分散＝０．００１及びｐ＜０．０００１）が、これはこのローカスについての我々の結果と一致する。これはＣｏｔ−１内のシングルコピー配列が、ターゲットｃＤＮＡの標識された反復配列を捕捉する、混合されたｓｃ及び反復配列のネットワークの形成を誘発しながらプローブにハイブリダイズすることを示唆する。マイクロアレイ試験では、Ｃｏｔ−１はかようにして、分散反復配列に富むクローンされたプローブのハイブリダイゼーションを、複雑なハイブリダイゼーションネットワークをＱＭＨで観察されるものに類似の様式で形成することによって歪ませる。
【００８３】
考察
上に記載された分析は、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡに存在する非反復配列は、ホモロガスなプローブとのハイブリダイゼーションで検出される標識されたゲノムのターゲットの量を著しく変化させる。クロスハイブリダイゼーションを抑制するよりもむしろ、Ｃｏｔ−１は、反復配列を含むプローブへのハイブリダイゼーションを３倍にも増加させた。その結果は、非標識のＣｏｔ−１  ＤＮＡ配列が、配列特異的なプローブ及び相補的なターゲット配列において、ｌｃ及び反復配列を架橋することを示唆した。Ｃｏｔ−１フラクション中のホモロガスなｌｃ配列に結合した反復配列は、続いて起こるゲノムのターゲット内の標識された反復配列のハイブリダイゼーションの核となりうる。プローブの標識されたゲノムのテンプレートとのハイブリダイゼーションにＣｏｔ−１  ＤＮＡを加えることは、プローブ及びゲノム内のどこかの場所にホモロガスなヘテロ二重鎖のネットワークの形成を触媒する（図３、例２）。ｌｃ及び反復配列の両方を含む“部分的な”二重鎖（図３、例３）は、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡを標識されたｌｃゲノムのターゲットを通じて、結合した反復因子に加えることによって、促進される（図３、例４）。ｌｃゲノムのターゲットに結合した標識された反復配列もまたハイブリダイゼーション強度を変化させうるが、ｌｃ及び散在反復配列に対する増強（エンリッチメント）のために、Ｃｏｔ−１がするのと同じ程度までではない。
【００８４】
マイクロアレイ及びアレイＣＧＨ技術の出現以来、多くの研究者が実験の再現性に注意を払ってきた４，５。たぶん、クロスハイブリダイゼーションについて、ばらつきの最大の原因は反復配列から生じる７。しかし、多くの研究者はこの問題はｃＤＮＡをアレイにハイブリダイズする前にＣｏｔ−１  ＤＮＡで反復因子をブロックすることによって解決されると信じている６，７。Ｄｏｎｇら１９は、“非反復配列のいくつかの領域は、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡフラクションにハイブリダイズする反復配列に十分にホモロガスである”ことを見出し、これが彼らのマイクロアレイの結果においてハイブリダイゼーション強度を歪ませる原因であること提案した。Ｃｏｔ−１は、プローブとそれと関係しない標識されたゲノムのターゲットとの間の反復配列の架橋の形成を促進することによって、ハイブリダイゼーションアッセイの再現性に影響を与える。それはまたプローブ部位について標識されたターゲットと競合するｌｃ及びｓｃ配列を含む。より大規模なゲノムワイドの分析が、この系統誤差の原因により影響を受けやすい他のゲノム領域を同定するために、保証される。
【００８５】
Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ内の反復要素は、配列構成に基づいて明示的に定義されるよりもむしろ、再会合活性に基づいて分けられる。ｌｃ配列に汚染されていないので、配列が決められた合成反復ＤＮＡは、プローブ内の反復配列によるパラロガスな反復ゲノムのターゲットへのクロスハイブリダイゼーションをブロックするにあたりより効果的である。ローカス特異的な合成試薬のもうひとつの利点は、反復配列のダイバージェンスのために、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡフラクション中で実際よりも少なく示された、又は示されなかった反復ファミリーが合成されることができ、ｓｃ配列を含まないゲノムの反復配列の、より正確及び包括的なレパートリーを提供することである。
【００８６】
それにもかかわらず、ゲノム内の全ての既知の反復因子を代表する合成反復ＤＮＡ試薬で、Ｃｏｔ−１を置き換えることは、おそらく、その調製に固有のコスト及びロジスティックなチャレンジに基づいて妨げられる。存在する汚染するようなｓｃ配列の量を制限するために、Ｃｏｔ−１をさらに処理することができよう。Ｃｏｔ−１内の二本鎖ＤＮＡの大部分を含む再アニールした反復配列は、シングルコピー及び非オーバーラップの反復要素を含む一本鎖配列に結合される。これらの混合した二本及び一本鎖構造を、リョクトウヌクレアーゼ又はラムダエキソヌクレアーゼのような、必須の前進型エキソヌクレアーゼで処理することは、二本鎖ＤＮＡから突出した一本鎖配列を切断する。これらの酵素は、同じ反復配列ファミリーの関係するメンバー間で共通する、塩基対配列によって又は二本鎖中のニックで分けられる一本鎖のギャップインターバル内のミスマッチ箇所のヌクレオチドを切断してはならない。この手順は、一本鎖反復配列及びシングルコピーインターバルを消化する。これは、Ｌ１レトロトランスポゾン１１に見られるような、５’（又は３’）のゲノムのトランケーションを一般的に示す反復因子の表現に特に影響を与える。これらの配列の欠損は、対応する合成ＤＮＡ試薬を加えることによって軽減される。Ｃｏｔ−１  ＤＮＡのこの処理は、ｓｃ配列が再会合してもそのような二本鎖の形成が反応のキネティクス（反応速度論）によって好まれないという可能性のために、全ｓｃ配列を完全には除去しない。
【００８７】
上記に照らして、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの代わりに、確定された反復配列からなる部分的に又は完全に合成のブロッキング試薬に置き換えることによって、発現マイクロアレイ及びアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの再現性が向上するだろう。これは、これらの広く使われる方法において、究極的に実験条件の標準化に通じるだろう。
【００８８】
文献
以下の文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
１．    Oostlander, A.、Meijer, G.、及び Ylstra, B. "Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics"、Clinical Genetics、2004年、第66巻、p.488−495
２．    Hijum, S. V.ら、"A generally applicable validation scheme for the assessment of factors involved in reproducibility and quality of DNA-microarray data"、BMC Genomics、2005年、第6巻、no.77
３．    Bammler, T.ら、"Standardizing global gene expression analysis between laboratories and across platforms"、Nature Methods、2005年、第2巻、p.351-356
４．    Sherlock, G.、"Of FISH and Chips"、Nature Methods、2005年、第2巻、p.329-330
５．    Dobbin, K.ら、"Interlaboratory Comparative Study of Cancer Gene Expression Analysis Using Oligonucleotide Microarrays"、Clinical Cancer Research、2005年、第11巻、p.565-572
６．    Li, X.、Weikuan, G.、Mohan, S.、及びBaylink, D.、"DNA Microarrays: Their use and misuse"、Microcirculation、2002年、第9巻、p.13-22
７．    Wren, J.、Kulkarni, A.、Joslin, J.、Butow, R.、及びGarner, H.、"Cross-hybridization on PCR-spotted microarrays"、IEEE Engineering in Medicine and Biology、2002年、p.71-75
８．    Marshall, E.、"Getting the noise out of gene arrays"、Science、2004年、第306巻、p.630-631
９．    Zakharkin, S.、Kim, K.、Mehta, T.、Chen, L.、Barnes, S.、Scheirer, K.、Parrish, R.、Allison, D.、及びPage, G.、"Sources of variation in affymetrix microarray experiments"、BMC Bioinformatics、2005年、第6巻、p.214-225
１０．  Brilten, R.及びKohne, D.、"Repeated sequences in DNA"、Science、1968年、第161巻、p.529-540
１１．  Rogan, P. K.、Pan, J.、及びWeissman, S. M.、"L1 repeat elements in the human epsilon-G gamma globin gene intergenic region: sequence analysis and concerted evolution within this family"、Molecular Biology and Evolution、1987年、第4巻、第4号、p.327-342
１２．  Carter, N.、Fiegler, H.、及びPiper, J.、"Comparative analysis if comparative genomic hybridization microarray technologies: report of a workshop sponsored by the Wellcome Trust"、Cytometry、2002年、第49巻、p.43-48
１３．  Newkirk, H.、Miralles, M.、Rogan, P.、及びKnoll, J.、"Determination of genomic copy number with quantitative microsphere hybridization"、Human Mutation、2006年、第27巻、p.376-386
１４．  Rogan, P.、Cazcarro, P.、及びKnoll, J.、"Sequence-based design of single-copy genomic DNA probes for fluorescence in situ hybridization"、Genome Research、2001年、第11巻、p.1086-1094
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１６．  Knoll J.及びRogan P.、"Single Copy Genomic Hybridization Probes and Method of Generating Same"、米国特許第6,828,097号、2004年
１７．  Knoll, J.及びLichter, P.、"In situ hybridization to metaphase chromosomes and interphase nuclei"、Dracopoli, N.、Haines, J.、Korf, B.、Moir, D.、Morton, C.、Seidman, C.、Seidman J.、及びSmith D.（編集）、Current protocols in Human Genetics、第1巻、ユニット4.3、Green-Wiley、ニューヨーク、2005年
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２０．  Newkirk, H.、Knoll, J.、及びRogan, P.、"Quantification of Microsphere Suspension Hybridization and Use Thereof"、国際出願番号PCT/US2006/032693、2006年8月16日出願
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡのシングルコピー因子へのプローブのハイブリダイゼーションを説明する図である。
【図２】図２は、ターゲット核酸の反復配列への抑制ＤＮＡのハイブリダイゼーションを説明する図である。
【図３】図３は、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡの存在下でのＱＭＨハイブリダイゼーションで作られる可能な構造を説明する図である。
【図４】図４は、ゲノムの鋳型へのクロスハイブリダイゼーションの抑制で使用される合成による反復プロダクト及びプローブを説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2009518004.tif 000019
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