(57)【要約】  本発明は、３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮する方法に関するものであり、該方法は、  ｉ）（α１）少なくとも１種の３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸、及び（α２）前記核酸（α１）とは異なる少なくとも１種の成分、を含有する好ましくは水性の流動体相Ｐ1を提供する、  ｉｉ）相Ｐ1を陰イオン交換マトリックスに接触させて核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスに結合させる、  ｉｉｉ）任意で洗浄緩衝液によって陰イオン交換マトリックスを洗浄し、その際、核酸（α１）は陰イオン交換マトリックスに結合したままである、及び  ｉｖ）陰イオン交換マトリックスに結合した核酸（α１）を前記陰イオン交換マトリックスから外し、好ましくは溶出して核酸（α１）を含有する好ましくは水性の流動体相Ｐ2を得る方法工程を含む。  本発明はまた、３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮するためのキット、前記キットの使用、陰イオン交換マトリックスの使用及び疾患を治療する方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮する方法であって、
ｉ）（α１）少なくとも１種の３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸、及び
（α２）前記核酸（α１）とは異なる少なくとも１種の成分、を含有する好ましくは水性の流動体相Ｐ1を提供する、
ｉｉ）相Ｐ1を陰イオン交換マトリックスに接触させて核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスに結合させる、
ｉｉｉ）任意で洗浄緩衝液によって陰イオン交換マトリックスを洗浄し、その際、核酸（α１）は陰イオン交換マトリックスに結合したままである、及び
ｉｖ）陰イオン交換マトリックスに結合した核酸（α１）を前記陰イオン交換マトリックスから外し、好ましくは溶出して核酸（α１）を含有する好ましくは水性相の流動体Ｐ2を得る方法工程を含む前記方法。
【請求項２】
核酸（α１）がＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、プレ−ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、５Ｓ−ｒＲＮＡ、５．８Ｓ−ｒＲＮＡ、又はそれらからの少なくとも２つの混合物を含む群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、プレ−ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｍｉＲＮＡとｔＲＮＡの混合物である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
陰イオン交換マトリックスが、アミノ基、ホスフィン基、ヒドラジン基及びイミン基を含む群から選択される上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
陰イオン交換マトリックスが、粒子、フィルター、膜、モノリス、マイクロタイタープレート又はそのほかの反応容器の上のコーティングの形態で存在する上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
粒子が、磁性粒子、好ましくは超常磁性粒子、フェリ磁性粒子又は強磁性粒子である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
０．０１〜１０モル／ＬのＮａＣｌの存在下、方法工程ｉｉ）にて核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスに結合させる上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
洗浄緩衝液がＲＮＡ分解酵素を含まない水である上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
方法工程ｉｖ）における分離が溶出緩衝液によって行われる上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
溶出緩衝液が、水溶性カルシウム塩、水溶性マグネシウム塩、水溶性アンモニウム塩又はそれらの混合物を含有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
溶出緩衝液が、１〜１０００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度にて塩化カルシウムを含有する請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
溶出緩衝液が、１〜１０００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度にて塩化マグネシウムを含有する請求項１０〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
溶出緩衝液が、１〜１０００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度にて硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムを含有する請求項１０〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
方法工程ｉ）で提供される水性相Ｐ1が細胞溶解物である上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
細胞溶解物が、
Ｉ）細胞を提供する、
ＩＩ）細胞を溶解して細胞溶解物を得る、及び
ＩＩＩ）任意で、該細胞溶解物から核酸（α1）とは異なる少なくとも１種の成分（α2）を少なくとも部分的に分離する方法工程を含む方法によって入手可能である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
相Ｐ2におけるＲＮＡの総量に対する相Ｐ2における３００ヌクレオチド未満の長さを持つＲＮＡの相対量が、相Ｐ1におけるＲＮＡの総量に対する相Ｐ1における３００ヌクレオチド未満の長さを持つＲＮＡの相対量よりも少なくとも２倍多い請求項２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
水性相Ｐ2におけるｍｉＲＮＡとｔＲＮＡの総量に対する水性相Ｐ2におけるｍｉＲＮＡの相対量が、水性相Ｐ1におけるｍｉＲＮＡとｔＲＮＡの総量に対する水性相Ｐ1におけるｍｉＲＮＡの相対量よりも少なくとも２倍多い請求項４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮するためのキットであって、
（β１）溶解緩衝液又は溶解緩衝液濃縮物
（β２）陰イオン交換マトリックス
（β３）溶出緩衝液
（β４）任意で浮遊緩衝液
（β５）任意で中和緩衝液
（β６）任意で洗浄緩衝液、及び
（β７）任意で抽出用溶剤
を含む前記キット。
【請求項２０】
陰イオン交換マトリックス（β２）が、アミノ基、ホスフィン基、ヒドラジン基及びイミン基を含む群から選択される官能基を有する請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
陰イオン交換マトリックス（β２）が、粒子、フィルター、膜、モノリス又はマイクロタイタープレートの上のコーティングの形態で存在する請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２２】
陰イオン交換マトリックス（β２）が、磁性粒子、好ましくは超常磁性粒子、フェリ磁性粒子又は強磁性粒子の上のコーティングの形態で存在する請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
溶出緩衝液（β３）が、１〜１０００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度にて塩化カルシウムを含有する請求項１９〜２２のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】
溶出緩衝液（β３）が、１〜１０００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度にて塩化マグネシウムを含有する請求項１９〜２２のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
溶出緩衝液（β３）が、１〜１０００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度にて硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムを含有する請求項１９〜２２のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮するための請求項１９〜２５のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項２７】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法における請求項１９〜２５のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項２８】
３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮するための陰イオン交換マトリックスの使用。
【請求項２９】
疾患を治療する方法であって、
（γ１）請求項１〜１８のいずれかに記載された方法に従って、３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮することを含む診断方法によって疾患を診断する、及び
（γ２）診断された疾患を治療的に処置する方法工程を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮する方法、３００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮するキット、前記キットの使用、陰イオン交換マトリックスの使用、及び疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
小型のリボ核酸（ＲＮＡ）が、数年前に、遺伝子発現において必須の調節機能を果たすことが見出されて以来、科学的な研究は、３００ヌクレオチドより短い、特に１００ヌクレオチドより短いＲＮＡにますます集中している。さらに具体的には、多数の研究者たちが微小なＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に関心を持つようになっている。ｍｉＲＮＡは、進化上保存されている部類の、長さ約２２ヌクレオチドの小型の非コーディングＲＮＡであり、遺伝子発現の調節におけるその複雑な役割はますます明らかになりつつある。ｍｉＲＮＡは、調べた真核生物のいずれにも、とりわけ、真菌、植物、昆虫及び哺乳類におけるほぼすべての組織で見出されている。ｍｉＲＮＡだけでなく、同様に細胞機能において基本的な役割を担う他の小型ＲＮＡも見出されている。これらには、たとえば、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小型の核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、及び小型の核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）が挙げられる。
【０００３】
それらの細胞性の役割を検討できるようにするためには、３００ヌクレオチドより短い短鎖ＲＮＡはできるだけ純度が高くなければならず、研究される生物系から高い収率で精製されなければならない。従って、複雑な生物系、特に細胞溶解物からのそのような短鎖ＲＮＡの精製又は単離を可能にする方法を提供する大きなニーズが存在する。
【０００４】
一般に、生物系から核酸を単離するために、たとえば、タンパク質、糖類、脂質及びそのほかの成分のような残りの細胞成分からそれを分離しなければならない。従来技術では、種々の異なった出発材料、たとえば、細胞培養物、植物及び動物に由来する組織、並びに体液から核酸を分離する複数の方法が開示されている。方法の１つには、たとえば、フェノールやクロロホルムのような有機溶媒の助けを借りて普通水性である出発溶液を抽出し（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  １９８７）、次いでエタノールやイソプロパノールのようなアルコールの助けを借りて水性相から核酸を沈殿させることが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ，  ｉｎ  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ＣＳＨ，「分子クローニング」、１９８９年）。別の方法は、たとえば、シリカ吸着法によって核酸を固相に不動化することを含む。不利なことに、これらの方法ではいずれも、相対的に短いＲＮＡを単離すること、又は少なくとも精製することはできず、又は不十分にしかできない。
【０００５】
この課題を解決するのに、従来技術は小型ＲＮＡを特異的に濃縮する方法を開示しており、該方法はシリカ膜技術に基づく。これらの方法では、細胞を溶解した後の細胞溶解物に特定の、相対的に少量のアルコールを加え、カオトロピック結合条件下にて相対的に長い核酸の少なくとも一部をシリカ膜に結合させる。しかしながら、従来技術で記載された精製方法におけるアルコールの量は、小型の核酸も効率的にシリカ膜に結合させるのは少なすぎ、従って、これら小型のＲＮＡはブレークスルーに存在する。次いでブレークスルーでアルコール濃度を高め、後者は第２のシリカ膜に結合する。洗浄工程の後、小型ＲＮＡは、第１のカラムに結合しなかったそのほかのあらゆる核酸と一緒に溶出される（たとえば、「ユーザー開発のプロトコールによって使用される米国オースチンのアンビオンのｍｉｒＶａｎａ（登録商標）又はドイツ、ヒルデンのキアゲンのＲＮｅａｓｙリピッドティッシュミニキットを参照のこと）。
【０００６】
キアゲン及びアンビオンの方法双方の短所は、使用しなければならない２つの固相の短所であり、単一の結合工程によって所望の小型ＲＮＡのみを得ることができないことである。さらに、この方法は、ｔＲＮＡ及びそのほかのさらに大きなＲＮＡも同時に単離することなく、約２２ヌクレオチドのサイズのｍｉＲＮＡだけを単離することができない。一部の状況下でこの方法によって小型ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡをある程度濃縮することはできるものの、前記小型ＲＮＡには、そのほかの核酸、特に、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の混入を依然として伴う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来技術から生じている短所を克服することである。
【０００８】
さらに具体的には、本発明の目的は小型の核酸、特にｍｉＲＮＡを濃縮する方法を提供することであり、該方法は、できるだけ少ない方法工程を用いて、たとえば、細胞溶解物のような複雑な生物組成から小型の核酸を濃縮することを可能にする。
【０００９】
また、本発明の目的は、小型の核酸を精製する方法を提供することであり、該方法は、たとえば細胞溶解物のような複雑な生物組成におけるそのほかの成分の３００ヌクレオチドを超える長さの核酸から特に２５ヌクレオチド以下の長さの核酸、たとえば、ｍｉＲＮＡを取り出すことを可能にするだけでなく、たとえば、２５ヌクレオチドを超え３００ヌクレオチド未満の長さのそのほかの核酸、たとえばｔＲＮＡからこれら小型の核酸を特異的に取り出すことも可能にする。
【００１０】
精製されるＲＮＡのためにできるだけ個々に所望のサイズ排除を生成するのに使用することができる方法を提供することも意図された。
【００１１】
また、本発明の目的は、「一容器反応」のために反応容器を変更せずに実施することができ、それによって分析される試料を混ぜ合わせるリスクを最小限に抑える方法を提供することである。
【００１２】
さらに、本発明の目的は、その助けを借りて、複雑な生物組成からの小型核酸、特に小型ＲＮＡの有利な精製を実施することができるキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前述の目的の解決への貢献は、３００ヌクレオチド未満の、好ましくは２００ヌクレオチド未満の、特に好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは５０ヌクレオチド未満の、最も好ましくは２５ヌクレオチド未満の長さの核酸を濃縮する方法によって為され、以下の方法工程を含む。
【００１４】
ｉ）（α１）３００ヌクレオチド未満の、好ましくは２００ヌクレオチド未満の、特に好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは５０ヌクレオチド未満の、最も好ましくは２５ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を少なくとも１種、及び
（α２）上記核酸（α１）とは異なる少なくとも１種の成分を含有する好ましくは水性の流動体相Ｐ1を提供すること；
ｉｉ）相Ｐ1を陰イオン交換マトリックスに接触させて核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスに結合させること；
ｉｉｉ）洗浄緩衝液で陰イオン交換マトリックスを任意で洗浄し、その際、核酸（α１）は陰イオン交換マトリックスに結合したままであること；並びに
ｉｖ）前記陰イオン交換マトリックスから陰イオン交換マトリックスに結合した核酸（α１）を取り出し、好ましくは溶出して、核酸（α１）を含有する好ましくは水性の流動体相Ｐ2を得ること。
【００１５】
非常に驚くべきことに、上述のキアゲン及びアンビオンの方法で必要とされたようなさらに長い核酸を先ず稀釈するということを必要とせずに、陰イオン交換マトリックスに結合させ、その後洗浄し、溶出することによって小型核酸に加えて多数のそのほかの成分を含有してもよい複雑な生物組成から、３００ヌクレオチド未満の長さを持つ前記小型核酸を濃縮できることが見出された。
【００１６】
本発明の方法の好ましい実施態様によれば、精製される核酸（α１）は、一本鎖又は二本鎖であり、好ましくは二本鎖ＲＮＡである。さらに具体的には、好ましいのは、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、５Ｓ−ｒＲＮＡ、５．８Ｓ−ｒＲＮＡ又は少なくともそれら２つの混合物、特にｍｉＲＮＡとｔＲＮＡの混合物を含む群から選択されるＲＮＡである３００ヌクレオチド未満の長さを持つＲＮＡであり、最も好ましいのは、１５〜３０のヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜２４のヌクレオチド、及び一層されに好ましくは２０〜２３のヌクレオチドの範囲内の長さを持つｍｉＲＮＡである核酸（α１）である。
【００１７】
用語「５Ｓ−ｒＲＮＡ」及び「５．８Ｓ−ｒＲＮＡ」は真核生物のリボソームで見出すことができる非コーディングリボ核酸を意味する。用語「ｔＲＮＡ」は、約８０のヌクレオチドから成り、共役塩基（アデニンとウラシル；シトシンとグアニン）の対合を含有するリボ核酸を意味する。これらの対合は、クローバの葉に似たｔＲＮＡの構造を生じる。用語「ｓｉＲＮＡ」は、約２２のヌクレオチドの長さを持ち、酵素「ダイサー」によって二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の開裂によって生成され、「ＲＩＳＣ」（ＲＮＡ融合サイレンシング複合体）酵素複合体に組み込まれるリボ核酸を意味する。用語「ｓｎＲＮＡ」は、真核生物の核における約１００〜３００塩基対の触媒活性のあるＲＮＡを意味する。これらのｓｎＲＮＡは常に「ｓｎＲＮＰ」（小型核内リボヌクレオタンパク質）にて会合しており、プレｍＲＮＡからイントロンをスプライシングしてｍＲＮＡを生じるのに関与する。用語「ｓｎｏＲＮＡ」は、リボソームＲＮＡ及びそのほかのＲＮＡ遺伝子の化学修飾、たとえば、それらのメチル化に関与するリボ核酸の部類を意味する。それらは、「ｓｎｏＲＮＰ」（小型核内リボヌクレオタンパク質）の一部を形成する。用語「ｍｉＲＮＡ」は、植物及び動物における発生過程を調節するのに使用される小型の核酸を意味する。それらはｍＲＮＡに特異的に結合し、翻訳後期の活性を抑制し、たとえば、増殖因子が過剰に産生されるのを妨げる。ｍｉＲＮＡは二本鎖の前駆体から産生される一本鎖のＲＮＡ分子である。
【００１８】
３００以下のヌクレオチドの長さを持つ核酸（α１）とは異なる成分（α２）は、特に、少なくとも３００ヌクレオチドの長さを持つ核酸（α２’）及び核酸とは異なる成分（α２”）である。
【００１９】
少なくとも３００ヌクレオチドの長さを持つ核酸（α２’）は、特に、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ分子、又は一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ分子、たとえば、ｍＲＮＡ、１８Ｓ−ｒＲＮＡ又は２８Ｓ−ｒＲＮＡを含む。
【００２０】
核酸とは異なる成分（α２”）は、特に、細胞の溶解の間に放出される成分である。従って、これらの成分には、特に、タンパク質、脂質、ポリペプチド又は多糖類が挙げられる。
【００２１】
方法工程ｉ）で提供される好ましくは水性の流動体相Ｐ1は、細胞を含まない試料材料、血漿、血清、体液、たとえば、血液、尿、精子、唾液、脳脊髄液、喀痰又は表面生検であってもよく、廃液、汚泥又は他に細胞溶解物、たとえば、動物又は植物の組織に由来する、微生物、たとえば、細菌、真菌又は酵母に由来する、組織培養又は細胞培養に由来する溶解物、或いは他に血液のような体液に由来する細胞の溶解物であってもよい。
【００２２】
本発明の方法の特定の実施態様によれば、方法工程ｉ）で提供される好ましくは水性の流動体相Ｐ1は、
Ｉ）細胞を提供すること、
ＩＩ）細胞を溶解して細胞溶解物を得ること、及び
ＩＩＩ）細胞溶解物から核酸（α1）とは異なる成分（α2）を少なくとも１種を少なくとも部分的に任意で分離することの方法工程を含む方法によって入手可能な細胞溶解物である。
【００２３】
方法工程Ｉ）で提供される細胞は、任意で固定された組織切片若しくは任意で固定された組織断片、培養された付着細胞、培養された浮遊細胞、又は他に体液における細胞であってもよい。
【００２４】
細胞が付着細胞又は組織集合体の中にある細胞であるならば、方法工程Ｉ）は任意で、付着細胞又は組織を洗浄すること、好適な酵素溶液、たとえばＥＤＴＡのような錯化剤を含有する溶液若しくはそれらの混合物を用いて付着細胞を剥離すること又は細胞を組織から取り出すこと、任意で、こうして得られた浮遊細胞から、たとえばセルソータによって特定の細胞集団を分離すること、剥離された又は分離された細胞をペレットにすること、こうして得られた細胞ペレットを洗浄すること、及び任意で好適な浮遊緩衝液に再浮遊することを含んでもよい。しかしながら、洗浄工程の後、適当であれば、剥離に先立って付着細胞を溶解することも考えられる。
【００２５】
細胞が、培養された浮遊細胞又は体液に由来する細胞であるならば、方法工程Ｉ）は好ましくは、たとえばセルソータによって特定の細胞集団を除いた後、適当であれば、浮遊細胞をペレットにすること、こうして得られた細胞ペレットを洗浄すること、及び任意で好適な浮遊緩衝液に再浮遊することを含んでもよい。
【００２６】
ペレットにした細胞を任意で再浮遊する浮遊緩衝液は好ましくは、１以上の緩衝物質及び任意で１以上の錯化剤を含有する。浮遊緩衝液のｐＨは、広範囲で変化してもよく、本発明の方法を実施するためには、好ましくはｐＨ３〜１１の範囲内であり、さらに好ましくは５〜１０の範囲内であり、最も好ましくはｐＨ７〜９の範囲内である。ここで当業者に既知のｐＨを調整するための緩衝系を使用してもよい。本発明によれば、０．５〜１００ミリモル／Ｌの範囲内での、さらに好ましくは１〜５０ミリモル／Ｌの範囲内での、最も好ましくは２．５〜２５ミリモル／Ｌの範囲内での濃度で緩衝成分を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）又は２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノ］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）に基づいた緩衝系を使用することが好ましい。アルカリ金属酢酸塩／酢酸又はアルカリ金属酢酸塩／酢酸緩衝系とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝系の混合物に基づく緩衝系も考えられる。使用してもよい錯化剤化合物は同様に、特にカルシウムイオンを錯化することが可能な化合物である。好ましい錯化剤化合物は、好ましくは０．０１〜２０ミリモル／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１５ミリモル／Ｌ、最も好ましくは０．５〜５ミリモル／Ｌの範囲内での量で浮遊緩衝液に存在するエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）である。
【００２７】
使用される浮遊緩衝液の量は、提供される細胞数に依存する。普通、１０6個の細胞当たり１０〜２０００μＬ、特に好ましくは５０〜１０００μＬ及び特に好ましくは１００〜５００μＬの範囲内での浮遊緩衝液の量が使用される。
【００２８】
本発明に従って特に好適である浮遊緩衝液は、０．５〜１００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは１〜５０ミリモル／Ｌ、最も好ましくは２．５〜２５ミリモル／Ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び０．０１〜２０ミリモル／Ｌ、特に好ましくは０．１〜１５ミリモル／Ｌ、最も好ましくは０．５〜５ミリモル／ＬのＥＤＴＡを含有し、７〜９の範囲内の、特に好ましくは約８のｐＨを有する緩衝液である。
【００２９】
方法工程ＩＩ）では、提供された細胞が溶解され、細胞から特異的にＲＮＡ物質を放出するのに好適である当業者に既知の溶解方法を細胞の溶解に採用することが可能である。企図されてもよい溶解方法は特に、熱の作用による溶解、機械的な力の作用による溶解、酵素、たとえば、タンパク質キナーゼＫによる溶解、又は界面活性剤若しくはカオトロピック化合物を含有する溶解緩衝液に細胞を接触させることによる溶解、又は低張溶液による溶解である。適当であれば、たとえば、界面活性剤又はカオトロピック化合物を含有する溶解緩衝液中にて細胞を機械的に粉砕すること、又はたとえば、カオトロピック化合物と一緒にタンパク質キナーゼＫを含有する溶解緩衝液を採用することによって、前述の方策を組み合わせてもよい。
【００３０】
本発明によれば、界面活性剤、酵素、カオトロピック化合物又はこれら化合物の少なくとも２つの混合物を含有する溶解緩衝液によって細胞を溶解することが特に好ましい。
【００３１】
従来技術によって多数の好適な界面活性剤が開示されている。本発明に従って特に好ましい界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリエチレングリコール−フェノールエーテル、たとえば、トリトンＸ−１００、ツイーン、ＮＰ−４０又はそれらの混合物を含む群から選択され、ＳＤＳ及びトリトンＸ−１００が特に好ましい界面活性剤である。使用される界面活性剤がＳＤＳであるならば、さらに、本発明によれば、細胞の溶解には、ＳＤＳの１モル当たり、１〜３０モルの、好ましくは２〜２０モルの、特に好ましくは３〜６モルのＮａＯＨ又はＫＯＨ、特に好ましくはＮａＯＨを使用することが好ましい。溶解緩衝液が界面活性剤を含有するのであれば、本発明の方法において、１０6個の細胞当たり、０．０１〜１００マイクロモル、特に好ましくは０．１〜５０マイクロモル、最も好ましくは０．２５〜５マイクロモルの界面活性剤の存在下、方法工程ＩＩ）にて細胞を溶解することが好ましい。細胞を溶解するのに界面活性剤を使用する場合、界面活性剤が室温及び常圧で液体である化合物ならば、０．００５〜５％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは０．０１〜１％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは０．０２５〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度での、さもなければ、界面活性剤が室温及び常圧で固体である化合物ならば、０．０１〜１％（ｖ／ｖ）、特に好ましくは０．２５〜５％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは０．０５〜０．４％（ｖ／ｖ）の濃度での界面活性剤の存在下で普通、細胞は溶解される。
【００３２】
好ましいカオトロピック化合物は特にカオトロピック塩である。カオトロピック塩は本発明の目的では、好ましくは、水に対して高い親和性（水を得ようとする、水に対する引力）を有するので、大きく強固な水和エンベロープ（水分子の殻様の付加）を形成する塩を意味する。好ましいカオトロピック塩は、特に、グアニジニウムイソチオシアネート又は塩酸グアニジニウムであり、グアニジニウムイソチオシアネートが特に好ましい。カオトロピック塩を細胞の溶解に使用するのであれば、さらに、本発明の方法にて、０．５〜１０モル／Ｌ、特に好ましくは１〜５モル／Ｌ、最も好ましくは２〜３．５モル／Ｌのカオトロピック塩濃度で方法工程ＩＩ）において細胞を溶解することが好ましい。溶解緩衝液がカオトロピック塩を含有するのであれば、水混和性の有機溶媒、たとえば、水混和性のアルコール、たとえば、エタノール又はイソプロパノールを１０〜６０体積％、特に好ましくは２０〜５０体積％の範囲内の量で含有することが、前記溶解緩衝液にとって任意で有利であってもよい。
【００３３】
好ましい酵素は特にプロテアーゼであり、中でも特に、トリプシン、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃが好ましく、プロテイナーゼＫが最も好ましい。溶解緩衝液における酵素濃度は、各場合、溶解緩衝液の総重量に対して好ましくは０．０１〜１０重量、特に好ましくは０．１〜５重量％、最も好ましくは０．２〜１重量％の範囲内である。
【００３４】
溶解緩衝液における界面活性剤、カオトロピック塩又は酵素の濃度は、とりわけ、溶解される細胞の量及び方法工程Ｉ）における前記細胞の提供方法に依存する。溶解される細胞が先ず浮遊緩衝液に浮遊されているならば、溶解緩衝液は、細胞の溶解中に意図される前記成分の濃度よりも高い濃度で界面活性剤、カオトロピック塩又は酵素を含有する。次いで、細胞をできるだけ完全に溶解するのに必要とされる及び上述の、カオトロピック塩、界面活性剤又は酵素の濃度を細胞浮遊液で確立するために十分である量にてこの濃縮した溶解緩衝液を前記細胞浮遊液に加える。しかしながら、溶解緩衝液を、たとえば、付着細胞に直接適用する又は細胞ペレットに接触させるのならば、前記溶解緩衝液は、好ましくは、細胞の溶解中も存在する濃度で界面活性剤、カオトロピック塩又は酵素を含有する。
【００３５】
本発明の方法の特定の実施態様によれば、細胞は、０．１〜１モル／Ｌ、特に好ましくは０．２〜０．８モル／Ｌ、最も好ましくは０．３〜０．７モル／Ｌのアルカリ金属塩の存在下で溶解され、好ましいのは、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化リチウムであり、塩化ナトリウムが特に好ましい。溶解される細胞が先ず浮遊緩衝液に浮遊されているのであれば、好適な量のアルカリ金属塩を前記浮遊緩衝液に前もって加えてもよいし、さもなければ、相当して高い濃度のアルカリ金属塩を含有する溶解緩衝液を浮遊緩衝液に加える。しかしながら、溶解緩衝液を、たとえば、付着細胞に直接適用する又は細胞ペレットに接触させるのならば、上述の濃度範囲内でアルカリ金属塩を含有する前記溶解緩衝液が好ましい。
【００３６】
本発明に従って特に好適であり、細胞浮遊液に添加することができる溶解緩衝液は、１〜２００ミリモル／Ｌの、特に好ましくは５〜１００ミリモル／Ｌの、最も好ましくは１０〜１００ミリモル／ＬのＮａＯＨ及び０．０１〜１％（ｖ／ｖ）の、特に好ましくは０．０２５〜０．５％（ｖ／ｖ）の、最も好ましくは０．０５〜０．４％（ｖ／ｖ）のＳＤＳを含有し、５〜７の範囲内の、特に好ましくは約５．５のｐＨを有する緩衝液である。ここで好ましいのは、好ましくは３：１〜１：３の体積比、特に好ましくは２：１〜１：２、最も好ましくは約１：１の体積比でこの溶解緩衝液を細胞浮遊液に加えることである。
【００３７】
本発明に従って特に好適であり、細胞ペレット、付着細胞又は組織切片又は組織断片に添加することができる溶解緩衝液は、
０．１〜１モル／Ｌの、特に好ましくは０．２５〜０．７５モル／Ｌの、最も好ましくは０．４〜０．６モル／ＬのＮａＣｌ及び０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の、特に好ましくは０．５〜５％（ｖ／ｖ）の、最も好ましくは０．７５〜１．５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００を含有し、６〜８の範囲内の、特に好ましくは約７のｐＨを有する緩衝液、
又は
０．５〜１０モル／Ｌの、特に好ましくは１〜５モル／Ｌの、最も好ましくは１．５〜３モル／Ｌのグアニジニウムイソチオシアネート、１〜５０ミリモル／Ｌの、特に好ましくは５〜４０ミリモル／Ｌの、最も好ましくは１０〜２０ミリモル／Ｌのクエン酸ナトリウム及び１０〜６０％（ｖ／ｖ）の、特に好ましくは２０〜５０％（ｖ／ｖ）の、最も好ましくは３０〜４０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有し、６〜８の範囲内の、特に好ましくは約７のｐＨを有する緩衝液である。
【００３８】
前記溶解緩衝液は、好ましくは１０6個の細胞当たり５０〜２０００μＬ、特に好ましくは１００〜１０００μＬ及び特に好ましくは１５０〜３００μＬの範囲内の量で溶解される細胞に添加される。
【００３９】
細胞が組織切片又は組織断片に相当するならば、方法工程Ｉ）で細胞を提供することは好ましくは、植物又は動物から摘出した直後に前記組織切片又は前記組織断片を液体窒素と接触させることを含む。次いで、組織切片又は組織断片を好ましくは直接溶解緩衝液に接触させ、適当であれば、好適なホモジネート装置によってホモジネートする。
【００４０】
細胞を溶解緩衝液に接触させた後、好ましくは１５〜４０℃の温度範囲内で、特に好ましくは、しかしながら室温にて１〜６０分間の範囲内で、特に好ましくは２〜１５分間の範囲内でそれらを溶解する。
【００４１】
方法工程ｉｉ）において水性相Ｐ1のために陰イオン交換マトリックスに細胞溶解物を接触させる前に、本発明の方法の特定の実施態様によれば、細胞溶解物から、核酸（α１）とは異なる１以上の成分（α２）を前もって分離することも有利であってもよい。原則として当業者に既知の分離方法、たとえば、析出反応、透析又はクロマトグラフィによる分離、或いは抽出を、前記分離に用いてもよく、抽出、特に酸性フェノール又はフェノールとクロロホルムの混合物による抽出が特に好ましく、酸性フェノールによる抽出が最も好ましい。これには、たとえばボルテックスを用いて、好ましくは３：１〜１：３の範囲内の体積比、特に好ましくは２：１〜１：２、最も好ましくは約１：１の体積比にて細胞溶解物と共に酸性フェノールを接触させ、十分に混合することが関与する。次いで組成を遠心分離し、有機相から水性相を分離する。このように、核酸（α１）とは異なる１以上の成分が分離された水性相で稀釈され、それは、次いで相Ｐ1として方法工程ｉｉ）に供される。
【００４２】
本発明の方法の方法工程ｉｉ）では、核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスに結合させるために、水性相Ｐ1は次いで前記陰イオン交換マトリックスに接触させられる。
【００４３】
ここでは原則として、陰イオン交換マトリックスとして、水性相Ｐ1が陰イオン交換マトリックスと接触する条件下、特にｐＨ条件下にて少なくとも部分的に陽イオン形態である官能基を有するいかなる物質も使用することが可能である。
【００４４】
陰イオン交換マトリックスは好ましくは電気的に中性のマトリックスを含む固体である。このマトリックスは、サイズ、形態、多孔性、機械的特性及び好ましくは固体の足場と共有結合する正に荷電した官能基によって定義される。３つの最も一般的な部類のマトリックス材料は、オルソ珪酸、多糖類及び合成ポリオレフィンであり、適用されるポリオレフィンは主としてポリスチレン又はポリ（メタ）アクリル樹脂である。ポリ（メタ）アクリル樹脂には、多数の置換メタ（アクリル）アミド（＝ポリ（メタ）アクリルアミド）及び（メタ）アクリルエステル（＝ポリ（メタ）アクリレート）のポリマーが挙げられ、Ｃ−２原子又はＣ−３原子でアルキル置換基を持つ（メタ）アクリル酸モノマーについても可能である。マトリックスに結合する特に好ましい官能基は、１級、２級又は３級のアミノ基、ホスフィン基、ヒドラジン基及びイミン基を含む群から選択される。最も好ましいのは、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ、［ＣＨ3ＣＨ2）2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−］a）が共有結合する足場材料、特にＤＥＡＥセルロース、及び［−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−］基及び／又は［−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2）−］基を含む直鎖又は分枝鎖のポリエチレンイミンである陰イオン交換マトリックスである。陰イオン交換マトリックスはさらに、フィルター材料の目的で、たとえば、分離カラムにおいて用いられてもよい。しかしながら特に、陰イオン交換マトリックスの特性を持つ物質から成らない粒子、フィルター、膜、モノリス又はマイクロタイタープレートのような有機若しくは無機の表面のコーティング、又は陰イオン交換マトリックスによるそのほかの反応容器のコーティングも考えられる。
【００４５】
ここで本発明に従って特に好ましいのは、磁性又は非磁性粒子におけるコーティングの形態である陰イオン交換マトリックスであり、非常に特に好ましいのは、しかしながら、磁性粒子であり、最も好ましいのは、超常磁性粒子、フェリ磁性又は強磁性粒子である。非磁性粒子に比べて、磁性粒子は、磁性凝集体を形成し、それらが穏やかに、迅速に且つ効率的に水性相Ｐ1から取り出されるのを可能にするという利点を有する。
【００４６】
陰イオン交換マトリックスでコーティングできる好ましい磁性粒子は、たとえば、ダイナル、アドバンストマグレティクス社、バイオテクノロジーズ社、アマシャム、プロメガ、サイゲン、アドバンストジェネティックテクノロジーズ及びセラディンから入手可能である。好適な磁性粒子は、特に、ＷＯ−Ａ−８３／０３９２０に記載されたものであり、ダイナル  ＡＳ（ノルウェー、オスロ）によってＤＹＮＡ−ＢＥＡＤＳとして販売されている粒子である。採用される陰イオン交換マトリックスがポリエチレンイミンであれば、エポキシド官能化磁性粒子が特に好ましく、たとえば、ドイツ、ベスヴァイラのケマゲン社から商品名「Ｍ−ＰＶＡ  Ｅ０ｘ」の名のもとで利用されるものが特に好ましい。同様に製品名「Ｍ−ＰＶＡ−Ｃ１１」及び「Ｍ−ＰＶＡ−Ｃ１２」のもとでケマゲン社から得られるカルボキシレート官能化粒子の使用も考えられる。磁性粒子は、好ましくは０．１〜１００μｍ、特に好ましくは０．５〜５０μｍ、最も好ましくは１〜１０μｍの範囲内の平均直径を有する一方で、具体的な表面は、好ましくは０．５〜２５０ｃｍ2／ｇ、特に好ましくは１〜５０ｃｍ2／ｇの範囲内である。
【００４７】
本発明の方法の具体的な実施態様によれば、本発明によれば、好ましくは２〜１０の範囲内での、特に好ましくは３〜７の範囲内での、最も好ましくは４〜６の範囲内でのｐＨにて方法工程ｉｉ）において陰イオンマトリックスに核酸（α１）を結合することが好ましい。
【００４８】
方法工程ｉｉ）で使用される水性相Ｐ1が、特にアルカリのＳＤＳ含有溶解緩衝液を使用する場合であってもよい、これらのｐＨ値と異なるｐＨを有するならば、水性相Ｐ1を陰イオン交換マトリックスに接触させるのに先立って、又は接触させている間に、中和緩衝液を添加することによって水性相のｐＨを所望の値に調整することが必要であってもよい。前記中和緩衝液は、１０〜１００００ミリモル／Ｌの範囲内での、特に好ましくは５０〜５０００ミリモル／Ｌの範囲内での、最も好ましくは１００〜１０００ミリモル／Ｌの範囲内での濃度にて酢酸のアルカリ金属塩、特に好ましくは酢酸カリウムを含み、中和溶液は、好ましくは２〜８の範囲内での、特に好ましくは４〜６の範囲内でのｐＨを有する。酢酸のアルカリ金属塩の溶液のｐＨは、好ましくは酢酸を添加することによって上述の範囲内の値に調整される。
【００４９】
本発明の方法の具体的な実施態様によれば、さらに、アルカリ金属塩の存在下、好ましくは塩化カリウム、塩化ナトリウム又は塩化リチウムの存在下、特に好ましくは、しかしながら、塩化ナトリウムの存在下で方法工程ｉｉ）において陰イオン交換マトリックスに結合される核酸（α１）が好ましく、結合中のアルカリ金属塩の濃度は、好ましくは０．０１〜１０モル／Ｌの範囲内、特に好ましくは０．０５〜５モル／Ｌの範囲内、最も好ましくは０．２５〜０．７５モル／Ｌの範囲内である。適当に濃縮された塩溶液を当初導入された水性相Ｐ1、たとえば、細胞溶解物に添加することによって、さもなければ、いずれも適当な塩濃度を有する浮遊緩衝液の存在下で細胞を浮遊することによって又は溶解緩衝液にて細胞を溶解することによって、これらの塩濃度は結合中に調整されてもよい。
【００５０】
本発明の方法の別の具体的な実施態様によれば、さらに、カオトロピック物質、特に、カオトロピック塩、たとえば、グアニジニウムイソチオシアネートの存在下で方法工程ｉｉ）において陰イオン交換マトリックスに結合される核酸（α１）が好ましく、結合中のカオトロピック塩の濃度は、好ましくは０．１〜１０モル／Ｌの範囲内で、特に好ましくは０．５〜５モル／Ｌの範囲内で、最も好ましくは１〜３モル／Ｌの範囲内である。本発明の方法のこの具体的な実施態様では、１０〜７０体積％、特に好ましくは２０〜６０体積％の範囲内の濃度にて水混和性の有機溶媒の存在下、特にアルコール、たとえば、エタノール又はイソプロパノールの存在下で結合を行うことも有利であってもよい。
【００５１】
好ましくは、陰イオン交換マトリックスをカラムにおける充填剤物質として使用する場合、上記の有利なｐＨ条件を満たし、特定された濃度で上記の塩を含有する水性相Ｐ1，たとえば、細胞溶解物を、好ましくは１〜３０℃、特に好ましくは２〜２５℃の範囲内の温度、たとえば室温にてカラム物質に通すことによって、方法工程ｉｉ）において核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスに結合してもよい。適宜、過圧、真空、遠心又は毛管力による支持によって水性相Ｐ1をカラム物質に通してもよい。
【００５２】
陰イオン交換マトリックスを被覆した粒子を使用する場合、結合は、好ましくは、たとえば、シェーカーによって、粒子に接触した水性相Ｐ1を連続的に撹拌することによって行い、この場合の前記結合も、好ましくは１〜３０℃、特に好ましくは２〜２５℃の範囲内の温度、たとえば室温にて行われる。
【００５３】
核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスに結合した後、任意で、方法工程ｉｉｉ）における洗浄緩衝液によって後者を洗浄してもよい。陰イオン交換マトリックスがカラムにおける充填剤物質として使用されているのであれば、洗浄は洗浄緩衝液をカラムに通すことによって行われ、ここでは、過圧、真空、遠心又は毛管力を利用することが可能である。たとえば、陰イオン交換マトリックスを被覆した非磁性粒子が使用されているのであれば、先ず、たとえば、ろ過又は遠心によって水性相Ｐ1から前記粒子を取り出し、次いで洗浄緩衝液で洗浄する。陰イオン交換マトリックスを被覆した磁性粒子を使用する場合、洗浄は好ましくは、水性相Ｐ1に接触した磁性粒子を含有する反応容器を磁石に暴露し、磁場によって前記磁性粒子を反応容器の内壁に付着させることによって行われる。これらの状況下では、水性相Ｐ1は容易に除かれ、洗浄緩衝液に置き換えられる。これに好適な装置は、たとえば、ノルウェー、オスロのダイナルから入手可能である。
【００５４】
洗浄緩衝液は、たとえば、ＲＮＡ分解酵素を含まない水、水と水溶性の有機溶媒の混合物、たとえば、１〜８０体積％の水溶性アルコール、たとえば、１〜８０体積％のエタノール若しくはイソプロパノールと水の混合物、又は塩の水溶液、特に酢酸塩水溶液、たとえば、１〜５０ミリモル／Ｌの、特に好ましくは２〜２５ミリモル／Ｌの範囲内の濃度での酢酸ナトリウム水溶液であってもよく、特に好ましいのは、４〜９の範囲内である前記洗浄緩衝液のｐＨである。
【００５５】
洗浄工程は、毎回新鮮な洗浄緩衝液を用いて、必要とされる１回、２回、３回、適宜さらに頻繁に反復されてもよい。
【００５６】
方法工程ｉｉ）において核酸（α１）が陰イオン交換マトリックスに結合され、方法工程ｉｉｉ）での任意の洗浄の後、方法工程ｉｖ）にて陰イオン交換マトリックスに結合された核酸（α１）を陰イオン交換マトリックスから外し、結果として核酸（α１）を含有する好ましくは水性の流動体相Ｐ2を生じる。
【００５７】
前記の取り外しは好ましくは、陰イオン交換マトリックスの官能基と核酸（α１）の間の結合を解消する溶出緩衝液と陰イオン交換マトリックスを接触させることによる溶出を手段として行われ、結果として核酸（α１）を含有する溶出物を流動体相Ｐ2として生じる。
【００５８】
陰イオン交換マトリックスをカラムにおける充填剤物質として使用しているのであれば、溶出は好ましくは溶出緩衝液をカラムに通すことによって行われ、再び、適宜、過圧、真空、遠心又は毛管力を利用することが可能である。陰イオン交換マトリックスを被覆した非磁性粒子が使用されているのであれば、先ず、ろ過又は遠心によって水性相Ｐ2から又は洗浄緩衝液から前記粒子を取り出し、次いで溶出緩衝液と接触させる。陰イオン交換マトリックスを被覆した磁性粒子を使用する場合、溶出は好ましくは、水性相Ｐ1又は洗浄緩衝液に接触した磁性粒子を含有する反応容器を磁石に暴露し、磁場によって前記磁性粒子を反応容器の内壁に付着させることによって行われる。これらの状況下では、水性相Ｐ1、さもなければ洗浄緩衝液は容易に除かれ、溶出緩衝液に置き換えられてもよい。
【００５９】
溶出緩衝液は好ましくは、塩の水溶液であり、特にアルカリ金属ハロゲン化合物、たとえば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ若しくはＬｉＣｌ、アルカリ土類ハロゲン化合物、たとえば、ＣａＣｌ2若しくはＭｇＣｌ2、アンモニウム塩、たとえば、塩化アンモニウム若しくは硫酸アンモニウム、又はこれらの塩の少なくとも２つの混合物を含有する水溶液であり、溶出緩衝液が、たとえば、アルカリ金属酢酸塩／酢酸のような緩衝液系、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンに基づく緩衝液系を任意で含有することも可能である。
【００６０】
本発明の方法の具体的な実施態様によれば、溶出緩衝液は、ＣａＣｌ2のような水溶性のカルシウム塩、ＭａＣｌ2のような水溶性のマグネシウム塩、硫酸アンモニウム若しくは塩化アンモニウムのような水溶性のアンモニウム塩、又はこれらの塩の少なくとも２つの混合物を含有する。溶出緩衝液がＣａＣｌ2を含有するのであれば、この塩は、好ましくは、１〜１０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは５〜５００ミリモル／Ｌ、最も好ましくは１０〜１００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度で存在する。溶出緩衝液がＭｇＣｌ2を含有するのであれば、この塩は、好ましくは、１〜１０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは５〜５００ミリモル／Ｌ、最も好ましくは１０〜１００ミリモル／Ｌの範囲内の濃度で存在する。溶出緩衝液が硫酸アンモニウム及び／又は塩化アンモニウムを含有するのであれば、これらの塩は、好ましくは、１〜１０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは５〜５００ミリモル／Ｌ、最も好ましくは２０〜３００ミリモル／Ｌの範囲内の総濃度で存在する。溶出緩衝液のｐＨは好ましくは、５〜１２、好ましくは６〜１０、特に好ましくは７〜１０の範囲内である。
【００６１】
特に、好ましくは専ら、カルシウム塩、特にＣａＣｌ2、及び／又はアンモニウム塩、好ましくは硫酸アンモニウム及び／又は塩化アンモニウムを塩として含有する溶出緩衝液は、ｔＲＮＡに優先してｍｉＲＮＡを選択的に濃縮するのに特に好適である。従って、好ましくは水と６０ミリモル／Ｌまでの濃度でのＣａＣｌ2から成る溶出緩衝液を用いることによって、及び好ましくは水と１７０〜２００リモル／Ｌまでの濃度での硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウムから成る溶出緩衝液を用いることによって、ｔＲＮＡを同時に稀釈すると共にｍｉＲＮＡの良好な濃縮を達成することが可能であり、従って、これらの溶出緩衝液は、ｍｉＲＮＡとｔＲＮＡを含有する組成からのｍｉＲＮＡの選択的濃縮に特に好適である。
【００６２】
本発明に従って特に好適である溶出緩衝液は以下である。
【００６３】
水に溶解された、１〜１００００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは１０〜５０００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは５０〜１０００ミリモル／ＬのＴＲＩＳ、１〜１０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは５〜８００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは１０〜５００ミリモル／Ｌのアルカリ金属塩、好ましくはＮａＣｌ又はＫＣｌ、１〜４００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは１０〜３００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは５０〜２００ミリモル／Ｌのアンモニウム塩、好ましくは硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム、及び１〜２００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは０．５〜１００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは１〜５０ミリモル／Ｌのマグネシウム塩、好ましくは塩化マグネシウムを含有し、好ましくは７〜１１の、特に好ましくは８〜１０の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液ＥＰ1。
【００６４】
水に溶解された、１〜１０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは５〜５００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは１０〜１００ミリモル／Ｌのマグネシウム塩、好ましくは塩化マグネシウムを含有し、好ましくは６〜１０の、特に好ましくは７〜９の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液ＥＰ2。
【００６５】
水に溶解された、１〜１０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは５〜５００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは１０〜１００ミリモル／Ｌのカルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを含有し、好ましくは６〜１０の、特に好ましくは７〜９の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液ＥＰ3。
【００６６】
水に溶解された、１〜１０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは５〜５００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは２０〜３００ミリモル／Ｌのアンモニウム塩、好ましくは塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムを含有し、好ましくは６〜１０の、特に好ましくは７〜９の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液ＥＰ4。
【００６７】
水に溶解された、１〜２０００ミリモル／Ｌ、特に好ましくは１〜１０００ミリモル／ｍＬ、最も好ましくは１００〜５００ミリモル／Ｌのアルカリ金属塩、好ましくは、塩化カリウム、塩化ナトリウム又は塩化リチウム含有し、好ましくは６〜１０の、特に好ましくは７〜９の範囲内のｐＨを有する溶出緩衝液ＥＰ5。
【００６８】
さらに具体的には、溶出緩衝液ＥＰ1〜ＥＰ4は、ｍｉＲＮＡとｔＲＮＡを含有する組成からｍｉＲＮＡを精製するのに好適である一方で、溶出緩衝液ＥＰ5は、前記ヌクレオチドとは別にさらに長い鎖の核酸を含有する組成から、３００ヌクレオチド未満の、特に１００ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を一般に精製するのに特に好適である。さらに、溶出緩衝液ＢＰ2〜ＢＰ4においてＭｇ2+、Ｃａ2+及びＮＨ4+の濃度を高めることによってｍｉＲＮＡとｔＲＮＡを含有する組成からｔＲＮＡに優先してｍｉＲＮＡの濃縮を選択的に調節することが可能である。
【００６９】
本発明の方法の特定の実施態様によれば、水性相Ｐ2のＲＮＡの総量に対する水性相Ｐ2における３００ヌクレオチド未満の、好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは２５ヌクレオチド未満の長さを持つＲＮＡの相対量の方は、水性相Ｐ1のＲＮＡの総量に対する水性相Ｐ1における３００ヌクレオチド未満の、好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは２５ヌクレオチド未満の長さを持つＲＮＡの相対量よりも、少なくとも２倍、特に好ましくは少なくとも４倍、さらに好ましくは少なくとも６倍、一層さらに好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも２０倍多いことが好ましい。
【００７０】
本発明の方法のさらに具体的な実施態様では、特に、溶出緩衝液ＥＰ1〜ＥＰ4のいずれかを採用する実施態様では、水性相Ｐ2におけるｍｉＲＮＡとｔＲＮＡの総量に対する水性相Ｐ2におけるｍｉＲＮＡの相対量の方は、水性相Ｐ1におけるｍｉＲＮＡとｔＲＮＡの総量に対する水性相Ｐ1におけるｍｉＲＮＡの相対量よりも、少なくとも２倍、特に好ましくは少なくとも４倍、さらに好ましくは少なくとも６倍、一層さらに好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも２０倍多いことが好ましい。
【００７１】
最初に言及された目的の解決への寄与は、３００ヌクレオチド未満の、好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは２５ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮するキットによっても為され、それは、
（β１）溶解緩衝液又は溶解緩衝液濃縮物
（β２）陰イオン交換マトリックス
（β３）溶出緩衝液
（β４）任意で浮遊緩衝液
（β５）任意で中和緩衝液
（β６）任意で洗浄緩衝液、及び
（β７）任意で抽出用溶剤、たとえば、フェノール、エタノールのようなアルコール又はそれらの混合物を含む。
【００７２】
上述の方法を実行するためにそのようなキットを使用してもよい。
【００７３】
好ましい浮遊緩衝液（β４）、溶解緩衝液（β１）、中和緩衝液（β５）、洗浄緩衝液（β６）及び溶出緩衝液（β３）は、本発明の方法と併せて好ましい緩衝液としてすでに言及されている緩衝液である。溶解緩衝液濃縮物は、溶解に有効な化合物、特に界面活性剤又はカオトロピック塩を、細胞の溶解中の濃度より高い濃度にて含有する緩衝液である。この種の溶解緩衝液濃縮物は、細胞浮遊液が短鎖核酸を単離すべき出発物質として使用されることが意図され、細胞浮遊物では、定義された量の前記溶解緩衝液濃縮物を添加することによって溶解に必要とされる溶解条件が調整されてもよい場合に特に使用される。
【００７４】
陰イオン交換マトリックス（β２）として好適なのは同様に、核酸を濃縮するための、たとえば、陰イオン交換マトリックスで被覆された磁性又は非磁性粒子を濃縮するための本発明の方法と関連させて好ましい陰イオン交換マトリックスとして上記で言及された物質である。
【００７５】
本発明のキットの特定の実施態様によれば、前記キットは、陰イオン交換マトリックス（β２）としての、陰イオン交換マトリックスで被覆された磁性粒子、及び溶出緩衝液（β３）としての、ＥＰ1、ＥＰ2、ＥＰ3及びＥＰ4を含む群から選択された任意の緩衝液を含む。最初に言及された目的の解決への寄与はさらに、３００ヌクレオチド未満の、好ましくは２００ヌクレオチド未満の、特に好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは５０ヌクレオチド未満の、最も好ましくは、２５ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を精製するための最初に記載された本発明の方法における上述のキットの使用によって為される。
【００７６】
最初に言及された目的の解決への寄与は、３００ヌクレオチド未満の、好ましくは２００ヌクレオチド未満の、特に好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは５０ヌクレオチド未満の、最も好ましくは、２５ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を精製するための陰イオン交換マトリックスの使用によっても為され、その際、前記陰イオン交換マトリックスと前記ヌクレオチドは、核酸を精製する本発明の方法に関連する好ましい成分として最初に上記で言及された化合物であることが好ましい。
【００７７】
最終的に、最初に言及された目的の解決への寄与は、疾患の治療方法によっても為され、それは、以下の方法工程を含む。
（γ１）最初に記載された精製方法に従って、３００ヌクレオチド未満の、好ましくは２００ヌクレオチド未満の、特に好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは５０ヌクレオチド未満の、最も好ましくは、２５ヌクレオチド未満の長さを持つ核酸を濃縮することを含む診断方法によって疾患を診断すること、及び
（γ２）診断された疾患を治療的に処置すること。
【００７８】
治療される疾患は、その原因又は進行が多少なりとも特定の体細胞又は体液に存在する核酸の種類及び量に相関を持つ疾患であってもよく、その際、核酸は、３００ヌクレオチド未満の、好ましくは２００ヌクレオチド未満の、特に好ましくは１００ヌクレオチド未満の、さらに好ましくは５０ヌクレオチド未満の、最も好ましくは、２５ヌクレオチド未満の長さを有し、特に、しかしながら、ｍｉＲＮＡの種類や量によっては、これら核酸の種類や量における変化が、健常な患者に比べて、疾患の原因になるかどうか、又はこれら核酸の種類や量における変化が、健常な患者に比べて、前記疾患の結末であるのかどうかという疾患であってもよい。
【００７９】
非限定的な図面及び実施例を基にして本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例では、ｍｉＲＮＡは細胞基礎環境に加えられた。
【００８１】
（実施例１）
１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞を１μｇのｍｉＲ１７７アンチセンスｍｉＲＮＡと混合し、０．５ＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００を含有する溶解緩衝液５５０μＬの助けを借りて細胞を溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、５５０μＬの酸性フェノールを添加した。ボルテックスで撹拌し、次いで２０  ８００ｘｇにて５分間遠心して水性相を取り出し、ポリエチレンイミンで被覆した磁性粒子６５２μｇと混合した。
【００８２】
ｐＨ１０の１０％強度の高分子量ポリエチレンイミン溶液（シグマ−アルドリッチ、アルドリッチカタログ番号４０、８７２−７）中に４ｇのエポキシドで官能化した磁性粒子（ドイツ、ベスヴァイラのケマゲン社のＭ−ＰＶＡ  Ｅ０ｘ粒子）を浮遊することによって粒子を得、丸底フラスコに移し、撹拌しながら１０時間、６０℃に加熱した。次いで、磁気除去によってこの混合物を脱塩水にて６回洗浄した。
【００８３】
板状シェーカー上で５分間振盪した後、上清を捨て、次いでｐＨ４．７、５．５、７．０又は８．５に調整した水５００μＬで２回洗浄した（図１のゲルにおけるレーンａ及びｂ）。溶出は、１モル／ＬのＴｒｉｓ／Ｃｌ、ｐＨ９．５、４００ミリモル／ＬのＫＣｌ、１００ミリモル／Ｌの硫酸アンモニウム及び３０ミリモル／ＬのＭｇＣｌ2を含有する緩衝液２０μＬによって行った。等分の溶出物を１５％のアクリルアミドゲルに適用し、硝酸銀で染色した（図１のレーンｃ）。
【００８４】
溶解緩衝液として０．５モル／ＬのＮａＣｌを用いて、ｍｉＲＮＡを効率的に精製することが可能であり、溶出の際、溶出液中には、ｍｉＲＮＡとｔＲＮＡのみが残り、そのほかの核酸種は精製手順によって稀釈されてしまう。
【００８５】
（実施例２）
１０6個のＪｕｒｋａｔ細胞を１μｇのｌｅｔ７ａアンチセンスＲＮＡと混合し、実施例１で特定されたように溶解し、磁性粒子に結合させた。水による洗浄工程の後、２０μＬの緩衝液で溶出を行ったが、１００ミリモル／ＬのＮａＣｌ、２５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、４００ミリモル／ＬのＮａＣｌ、１００ミリモル／ＬのＫＣｌ、２５０ミリモル／ＬのＫＣｌ及び４００ミリモル／ＬのＫＣｌが、溶出緩衝液として使用された。等分の溶出物を１５％のアクリルアミドゲルに適用し、硝酸銀で染色した（図２）。
【００８６】
この実験は、異なったモル濃度での塩が溶出に好適であることを示している。溶出緩衝液としてＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＬｉＣｌ（データは示さず）を用いた場合、ｔＲＮＡとｍｉＲＮＡ双方を大量に精製することができる。
【００８７】
（実施例３）
溶出緩衝液として１０〜１００ミリモル／ＬのＭｇＣｌ2を含有する緩衝液を用いて、手順は実施例２のとおりであった。等分の溶出物を１５％のアクリルアミドゲルに適用し、硝酸銀で染色した（図３）。
【００８８】
この実験は、ｍｉＲＮＡが溶出緩衝液としてのＭｇＣｌ2の助けを借りても精製することができることを実証している。低モル濃度のＭｇＣｌ2を溶出液として使用するのであれば、ｔＲＮＡ及びさらに長い核酸は比較的稀釈されるが、ｍｉＲＮＡは非常に良好な収率で回収することができる。
【００８９】
（実施例４）
溶出緩衝液として１０〜８５ミリモル／ＬのＣａＣｌ2を含有する緩衝液用いて、手順は実施例２のとおりであった。等分の溶出物を１５％のアクリルアミドゲルに適用し、硝酸銀で染色した（図４）。
【００９０】
約５０ミリモル／ＬのＣａＣｌ2のモル濃度まで、非常に良好な回収率でｍｉＲＮＡを溶出することができるが、溶出物は微量のｔＲＮＡを含有する。モル濃度をさらに上げれば、良好な回収率でｔＲＮＡを溶出することもさらに可能である。
【００９１】
（実施例５）
２５〜４００ミリモル／Ｌの硫酸アンモニウム又は２５〜４００ミリモル／Ｌの塩化アンモニウムを含有する緩衝液用いて、手順は実施例２のとおりであった。等分の溶出物を１５％のアクリルアミドゲルに適用し、硝酸銀で染色した（図５）。
【００９２】
特に、ｍｉＲＮＡの高い収率と同時にｔＲＮＡの非常に低い収率を達成するために、アンモニウム塩は塩化カルシウムと一緒に溶出中、最高の特性を示す。約１７０〜２００ミリモル／Ｌまでの溶出物中のアンモニウム塩の濃度では、ｔＲＮＡの収率は相対的に低いままである一方で、これらのモル濃度でｍｉＲＮＡの収率は非常に良好である。約４００ミリモル／Ｌを超える濃度から、溶出物中に非常に大量のｔＲＮＡを見い出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】実施例１で得られた溶出物を分画するのに使用された、硝酸銀染色した１５％強度のポリアクリルアミドゲルを示す（ゲル中２つ一組で適用した；ａ＝第１の洗浄後の洗浄緩衝液、ｂ＝第２の洗浄後の洗浄緩衝液、ｃ＝溶出物）
【図２】実施例２で得られた溶出物を分画するのに使用された、硝酸銀染色した１５％強度のポリアクリルアミドゲルを示す（ゲル中２つ一組で適用した）。
【図３】実施例３で得られた溶出物を分画するのに使用された、硝酸銀染色した１５％強度のポリアクリルアミドゲルを示す（ゲル中２つ一組で適用した）。
【図４】実施例４で得られた溶出物を分画するのに使用された、硝酸銀染色した１５％強度のポリアクリルアミドゲルを示す（ゲル中２つ一組で適用した）。
【図５】実施例５で得られた溶出物を分画するのに使用された、硝酸銀染色した１５％強度のポリアクリルアミドゲルを示す（ゲル中２つ一組で適用した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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