(57)【要約】    本発明は、スクリーニングの新規パラダイムを使用する癌性疾患修飾抗体を産生する方法に関する。癌細胞の細胞障害性を終点として使用して抗癌抗体を分離することによって、この方法は、治療及び診断目的での抗癌抗体の産生を可能にする。これらの抗体は、癌の病期分類及び診断の助けとして使用することができ、原発性腫瘍及び腫瘍転移を治療するために使用できる。抗癌抗体を、毒素、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、及び血行性細胞と結合させることができる。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体。  
【請求項２】
受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体又は前記ヒト化抗体から産生される抗原結合フラグメント。  
【請求項３】
受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体又は前記キメラ抗体から産生される抗原結合フラグメント。  
【請求項４】
受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されている単離ハイブリドーマ細胞株。  
【請求項５】
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍から選択される組織試料で癌性細胞の抗体誘発細胞障害性を開始する方法であって、  
前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍から組織試料を提供すること；  
受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体、又はそれらのＣＤＭＡＢ（ここでＣＤＭＡＢは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）を提供すること；及び  
前記単離モノクローナル抗体、前記ヒト化抗体、前記キメラ抗体又は前記ＣＤＭＡＢと前記組織試料とを接触させること  
を含み、
前記単離モノクローナル抗体、前記ヒト化抗体、前記キメラ抗体又は前記それらのＣＤＭＡＢと前記組織試料との結合が細胞障害性を誘発する  
方法。
【請求項６】
請求項１記載の単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢ。  
【請求項７】
請求項２記載のヒト化抗体のＣＤＭＡＢ。  
【請求項８】
請求項３記載のキメラ抗体のＣＤＭＡＢ。  
【請求項９】
細胞毒性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、及び血行性細胞からなる群より選択されるメンバーと結合する、請求項１、２、３、６、７又は８のいずれか１項記載の単離抗体又はそのＣＤＭＡＢ。  
【請求項１０】
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ（ここでＣＤＭＡＢは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）に特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、哺乳動物において抗体誘発細胞障害性に感受性のある前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を低減する方法であって、前記哺乳動物に、前記モノクローナル抗体又は前記そのＣＤＭＡＢを、前記哺乳動物の乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量の低減をもたらすのに有効な量で投与することを含む方法。  
【請求項１１】
前記単離モノクローナル抗体が細胞毒性部分に結合している、請求項１０記載の方法。  
【請求項１２】
前記細胞毒性部分が放射性同位体である、請求項１１記載の方法。  
【請求項１３】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１０記載の方法。  
【請求項１４】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞障害活性を仲介する、請求項１０記載の方法。  
【請求項１５】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項１０記載の方法。  
【請求項１６】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項１０記載の方法。  
【請求項１７】
受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体と同じエピトープ又は複数のエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体。  
【請求項１８】
ヒト腫瘍が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ（ここでＣＤＭＡＢは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）に特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、哺乳動物においてヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を低減する方法であって、前記哺乳動物に、前記モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、前記哺乳動物の乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量の低減をもたらすのに有効な量で投与することを含む方法。  
【請求項１９】
前記単離モノクローナル抗体が細胞毒性部分に結合している、請求項１８記載の方法。  
【請求項２０】
前記細胞毒性部分が放射性同位体である、請求項１９記載の方法。  
【請求項２１】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１８記載の方法。  
【請求項２２】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞障害活性を仲介する、請求項１８記載の方法。  
【請求項２３】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項１８記載の方法。  
【請求項２４】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項１８記載の方法。  
【請求項２５】
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ（ここでＣＤＭＡＢは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）に特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、哺乳動物において前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を低減する方法であって、前記哺乳動物に、前記モノクローナル抗体又は前記そのＣＤＭＡＢを、前記哺乳動物の乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量の低減をもたらすのに有効な量で投与することを含む方法。  
【請求項２６】
前記単離モノクローナル抗体が細胞毒性部分に結合している、請求項２５記載の方法。  
【請求項２７】
前記細胞毒性部分が放射性同位体である、請求項２６記載の方法。  
【請求項２８】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項２５記載の方法。  
【請求項２９】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞障害活性を仲介する、請求項２５記載の方法。  
【請求項３０】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項２５記載の方法。  
【請求項３１】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項２５記載の方法。  
【請求項３２】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２によって、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体によって、又は受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体によって産生される単離モノクローナル抗体が特異的に結合するヒト腫瘍から選択される組織試料において、癌性細胞の存在を決定する結合アッセイであって  
前記ヒト腫瘍から組織試料を提供すること；
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体で認識されるものと同じエピトープ又は複数のエピトープを認識する、少なくとも１つの前記単離モノクローナル抗体、前記ヒト化抗体、前記キメラ抗体又はそれらのＣＤＭＡＢを提供すること；  
少なくとも１つの前記提供された抗体又はそのＣＤＭＡＢと前記組織試料とを接触させること；及び  
前記少なくとも１つの提供された抗体又はそのＣＤＭＡＢと前記組織試料との結合を決定すること  
を含み、
それによって、前記組織試料において前記癌性細胞の存在が示される  
結合アッセイ。
【請求項３３】
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ（ここでＣＤＭＡＢは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）に特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量を低減するためのモノクローナル抗体の使用であって、前記哺乳動物に、前記モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、前記哺乳動物の乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量の低減をもたらすのに有効な量で投与することを含む使用。  
【請求項３４】
前記単離モノクローナル抗体が細胞毒性部分に結合している、請求項３３記載の方法。  
【請求項３５】
前記細胞毒性部分が放射性同位体である、請求項３４記載の方法。  
【請求項３６】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項３３記載の方法。  
【請求項３７】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞障害活性を仲介する、請求項３３記載の方法。  
【請求項３８】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項３３記載の方法。  
【請求項３９】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項３３記載の方法。  
【請求項４０】
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ（ここでＣＤＭＡＢは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）に特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量を低減するためのモノクローナル抗体の使用であって、前記哺乳動物に、前記モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、少なくとも１つの化学療法剤と併せて、前記哺乳動物の乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量の低減をもたらすのに有効な量で投与することを含む使用。  
【請求項４１】
前記単離モノクローナル抗体が細胞毒性部分に結合している、請求項４０記載の方法。  
【請求項４２】
前記細胞毒性部分が放射性同位体である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項４０記載の方法。  
【請求項４４】
前記単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞障害活性を仲介する、請求項４０記載の方法。  
【請求項４５】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項４０記載の方法。  
【請求項４６】
前記単離モノクローナル抗体が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項４０記載の方法。  
【請求項４７】
下記：  
請求項１、２、３、６、７、８、１７、４９、５０、５４、５５又は５６のいずれか１項記載の抗体又はＣＤＭＡＢ；  
前記抗体又はその抗原結合フラグメントと、細胞毒性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、及び血行性細胞からなる群より選択されるメンバーとの複合体；並びに  
薬学的に許容される担体の必須量  
を組み合わせて含み、
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を治療するのに有効である  
前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を治療するのに有効な組成物。
【請求項４８】
ヒト癌性腫瘍が、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ（ここでＣＤＭＡＢは、前記単離モノクローナル抗体とその標的抗原との結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられる）に特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、前記ヒト癌性腫瘍の存在を検出するアッセイキットであって、受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢと、特定のカットオフレベルでその存在が前記ヒト癌性腫瘍の前記存在の診断に用いられるポリペプチドにモノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢが結合しているかを検出する手段とを含む、キット。  
【請求項４９】
ヒトＴＲＯＰ−２に特異的に結合し、ヒトＴＲＯＰ−２の、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体と同じエピトープ又は複数のエピトープと反応し、単離モノクローナル抗体とその標的ヒトＴＲＯＰ−２抗原との結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ。
【請求項５０】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するバイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体により認識されるもの同じエピトープ又は複数のエピトープを認識し、単離モノクローナル抗体とその標的エピトープ又は複数のエピトープとの結合を競合的に阻害する能力により特徴付けられる、単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢ。  
【請求項５１】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体が特異的に結合しているヒトＴＲＯＰ−２抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を低減するプロセスであって、  
前記ヒト腫瘍に罹患している個人に、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体が結合しているものと同じエピトープ又は複数のエピトープに結合している、少なくとも１つの単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを投与することを含み、  
前記エピトープ又は複数のエピトープの結合が、乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍量の低減をもたらす  
プロセス。
【請求項５２】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体が特異的に結合しているヒトＴＲＯＰ−２抗原の少なくとも１つのエピトープを発現する、ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を低減するプロセスであって、  
前記ヒト腫瘍に罹患している個人に、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体が結合しているものと同じエピトープ又は複数のエピトープに結合している、少なくとも１つの単離モノクローナル抗体又はそのＣＤＭＡＢを、少なくとも１つの化学療法剤と併せて投与することを含み、  
前記投与が腫瘍量の低減をもたらす  
プロセス。
【請求項５３】
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体によって、又は前記単離モノクローナル抗体により産生される抗原結合フラグメントによって特異的に認識されるＴＲＯＰ−２を発現する細胞の存在を決定する結合アッセイであって、  
細胞試料を提供すること；  
ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体又は単離モノクローナル抗体により産生される前記抗原結合フラグメントを提供すること；  
前記単離モノクローナル抗体又は前記抗原結合フラグメントを前記細胞試料と接触させること；及び  
前記単離モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、前記組織試料との結合を決定すること  
を含み、
それによって、前記単離モノクローナル抗体又は前記抗原結合フラグメントが特異的に結合しているＴＲＯＰ−２の抗原を発現する細胞の存在を決定する  
結合アッセイ。
【請求項５４】
下記：  
配列番号１、配列番号２及び配列番号３の相補性決定領域アミノ酸配列を含む重鎖可変部領域；並びに配列番号４、配列番号５及び配列番号６の相補性決定領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変部領域；又は  
そのヒトＴＲＯＰ−２結合フラグメント
を含む、
ヒトＴＲＯＰ−２の、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体と同じエピトープ又は複数のエピトープに、特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項５５】
下記：  
配列番号１、配列番号２及び配列番号３の相補性決定領域アミノ酸配列を含む重鎖可変部領域；並びに配列番号４、配列番号５及び配列番号６の相補性決定領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変部領域；並びに重及び軽鎖のヒト抗体又はヒト抗体コンセンサスフレームワークの可変ドメインフレームワーク領域；又は  
そのヒトＴＲＯＰ−２結合フラグメント  
を含む、
ヒトＴＲＯＰ−２の、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体と同じエピトープ又は複数のエピトープに、特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項５６】
配列番号７の重鎖可変部領域アミノ酸配列及び配列番号８から選択される軽鎖可変部領域アミノ酸配列；又は  
そのヒトＴＲＯＰ−２結合フラグメント  
を含む、ヒトＴＲＯＰ−２に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項５７】
腫瘍が、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するバイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体又は前記単離モノクローナル抗体により産生される抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗原を発現する、ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を哺乳動物において治療することによって、生存期間を延長し、疾患の進行を遅延する方法であって、前記哺乳動物に、前記哺乳動物の腫瘍量を低減するのに有効な量で前記モノクローナル抗体を投与することを含み、それによって、疾患の進行が遅延される又は生存期間が延長される方法。  
【請求項５８】
腫瘍が、ＩＤＡＣ受入番号１４１２０５−０５を有するバイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生される単離モノクローナル抗体又は前記単離モノクローナル抗体により産生されるＴＲＯＰ−２結合フラグメントに特異的に結合するＴＲＯＰ−２を発現する、ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を哺乳動物において治療することによって、生存期間を延長し、疾患の進行を遅延する方法であって、前記哺乳動物に、前記哺乳動物の腫瘍量を低減するのに有効な量で前記モノクローナル抗体を投与することを含み、それによって、疾患の進行が遅延される又は生存期間が延長される方法。  
【請求項５９】
下記：  
請求項１、２、３、６、７、８、１７、４９、５０、５４、５５又は５６のいずれか１項記載の抗体又はＣＤＭＡＢ；及び  
薬学的に許容される担体の必須量  
を組み合わせて含み、
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を治療するのに有効である  
前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を治療するのに有効な組成物。
【請求項６０】
下記：  
請求項１、２、３、６、７、８、１７、４９、５０、５４、５５又は５６のいずれか１項記載の抗体又はＣＤＭＡＢと、細胞毒性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、及び血行性細胞からなる群より選択されるメンバーとの複合体；並びに  
薬学的に許容される担体の必須量  
を組み合わせて含み、
ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を治療するのに有効である
前記ヒト乳房、膵臓、卵巣、前立腺又は結腸腫瘍を治療するのに有効な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離及び産生、並びに治療及び診断過程におけるこれらのＣＤＭＡＢ単独又は１つ以上のＣＤＭＡＢ／化学療法剤の組み合わせの使用に関する。本発明は、更に、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＯＰ−２は、大部分の癌種、並びに幾つかの正常なヒト組織に発現する細胞表面糖タンパク質である。これは、最初に、ヒト栄養膜細胞に対する抗原を認識するヒト絨毛癌細胞株ＢｅＷｏに対してより生じた２つのネズミモノクローナル抗体により認識された分子として定義された（Ｆａｕｌｋ  １９７８）。同じ分子が、それとは別に、他の研究者によって発見され、同じ抗原を記載するのに複数の名称をもたらした。したがって、ＴＲＯＰ−２は、ＧＡ７３３−１及び上皮糖タンパク質（ＥＧＰ−１）とも呼ばれた（Ｂａｓｕ  １９９５，Ｆｏｒｎａｒｏ  １９９５）。
【０００３】
ＴＲＯＰ−２遺伝子は、ＲＮＡ中間体を介して相同遺伝子ＧＡ７３３−２（上皮糖タンパク質−２、ＥｐＣＡＭ及びＴｒｏｐ−１としても知られている）の後方転位により形成されると考えられたイントロンなし遺伝子である。ＴＲＯＰ−２遺伝子は、染色体１ｐ３２（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ２００１）にマッピングされている。ＴＲＯＰ−２のタンパク質成分は、およそ３５キロダルトンの分子量を有する。その量は、細胞外ドメインの不均質Ｎ結合グリコシル化により１１〜１３キロダルトンに増加することができる。ジスルフィド架橋部位を形成することができる多くのシステイン残基が細胞外ドメインに存在する。ＴＲＯＰ−２は、Ｃａ２＋依存性のタンパク質キナーゼであるタンパク質キナーゼＣの基質であり、細胞内セリン３０３残基は、リン酸化されていることが示されている（Ｂａｓｕ  １９９５）。ＴＲＯＰ−２と抗ＴＲＯＰ−２抗体との架橋は、細胞質Ｃａ２＋を生じることによって示されているように、カルシウムシグナルを伝達することも示されている（Ｒｉｐａｎｉ  １９９８）。これらのデータは、ＴＲＯＰ−２の生理学的機能としてのシグナル伝達を支持するが、現在まで、同定されている生理学的リガンドはない。近年、ＴＲＯＰ−２発現と癌の関連が示されており、ＴＲＯＰ−２は、ｃＤＮＡマイクロアレイ技術を使用した大規模遺伝子発現分析において、正常な卵巣上皮と比較して卵巣の重篤な乳頭状癌に最も高度に過剰発現していることが報告されている遺伝子群のメンバーとして同定された（Ｓａｎｔｉｎ  ２００４）。  
【０００４】
ＴＲＯＰ−２の発現プロフィールは、多くの異なるＴＲＯＰ−２抗体を使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）及びフローサイトメトリー研究により解明されてきた。抗ＴＲＯＰ−２抗体１６２−２５．３及び１６２−４６．２は、ヒト絨毛癌細胞株ＢｅＷｏによるマウスの免疫化によって産生され、一連の腫瘍及びリンパ球様細胞株、並びに末梢血単核細胞への反応性が調査された。この研究において、試験された４個の絨毛癌細胞株のうち３個が染色され、抗体は両方とも栄養膜特異的であると思われるが、他のリンパ球様又は腫瘍細胞株（線維肉腫、子宮頸部肉腫、結腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、赤白血病を表す）では、間接免疫蛍光法ＦＡＣＳアッセイにおいて染色されたものはなかった。加えて、正常な末梢血細胞のうちで染色されたものはなかった。抗体は、ホルマリン固定、パラフィン包埋胎盤組織切片、並びに肝臓、腎臓、脾臓、胸腺及びリンパ節組織の凍結正常切片の染色について試験された。胎盤組織切片は両方の抗体により染色されたが、他の正常組織では染色はなかった（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  １９８１）。これらの２つの抗体は、厳密には、インビトロ診察研究での使用のために報告されている。
【０００５】
抗ＴＲＯＰ−２抗体ＭＯｖ１６は、低分化卵巣癌ＯｖＣａ４３４３／８３の粗膜調製物によるマウスの免疫化によって生成された。ＭＯｖ１６は、良性及び悪性卵巣腫瘍の一連の凍結組織切片への反応性について試験された。ＭＯｖ１６は、５４個の悪性卵巣腫瘍のうち３１個と、１６個の良性卵巣腫瘍のうち２個と反応した。試験された５個のムチン卵巣腫瘍では、ＭＯｖ１５は完全に非反応性であった。ＭＯｖ１６は、非卵巣悪性腫瘍の凍結切片との反応性についても試験され、１８９個の乳癌切片のうち１１７個と、１８個の肺癌切片のうち１２個と結合することが見出された。ＭＯｖ１６は、試験された１６個の非上皮腫瘍（脂肪肉腫、軟骨肉腫、内皮腫、組織球腫及び未分化胚細胞腫を含む）では完全に非反応性であった。凍結正常組織切片で試験した場合、ＭＯｖ−１６は、乳房、膵臓、腎臓及び前立腺切片と反応性があった。ＭＯｖ１６の反応性は、肺、脾臓、皮膚、卵巣、甲状腺、耳下腺、胃、喉頭、子宮及び結腸切片に対して陰性であることが報告されたが、使用した組織切片の数は報告されなかった。著者は、ＭＯｖ１６がパラフィン包埋組織では非反応性であったので、冷凍組織切片を使用したことを指摘した（Ｍｉｏｔｔｉ  １９８７）。この抗体は、また、インビトロ診察研究での使用のためにだけに報告されている。
【０００６】
抗ＴＲＯＰ−２抗体Ｒｓ７−３Ｇ１１（ＲＳ７）は、外科的に除去されたヒト原発性の肺の扁平上皮細胞癌由来の粗膜調製物によるマウスの免疫化によって生成された。ヒト腫瘍及び正常組織の凍結切片に対するＲＳ７の染色について試験するために、ＩＨＣが使用された。ＲＳ７は、乳房、結腸、腎臓、肺、前立腺及び扁平上皮細胞癌を表す４０個の切片のうち３３個に結合した。正常組織では、ＲＳ７は、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺及び前立腺組織の２０個の切片のうち１６個に結合したが、脾臓組織の５個の切片ではどれも染色されなかった。この研究において、著者は、腫瘍における抗原密度が正常の上皮組織よりも高いと思われることを指摘した（Ｓｔｅｉｎ  １９９０）。  
【０００７】
ＲＳ７の組織特異性についての追加的な研究が、腫瘍及び正常な組織の両方において実施された。ＲＳ７は、凍結腫瘍切片のパネルで試験され、肺、胃、腎臓、膀胱、結腸、乳房、卵巣、子宮及び前立腺の腫瘍を表す７７個の切片のうち６５個に結合した。試験された５個のリンパ種には結合しなかった。ＲＳ７は、合計２４個の組織型から構成される８５個の凍結ヒト正常組織切片のパネルで試験された。１３個の正常組織（肺、気管支、気管、食道、結腸、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、皮膚、甲状腺、乳房及び前立腺）の３９個の切片がＲＳ７により染色された。この研究の著者は、陽性染色が観察された組織において、反応性は、一般に、主に管及び腺の上皮細胞に限定されていたことを指摘した。この研究は、ＲＳ７がホルマリン固定、パラフィン包埋切片に対して反応性がないことが観察されたので、凍結切片に限定されたことも指摘された（Ｓｔｅｉｎ  １９９３）。
【０００８】
ポリクローナル抗ＴＲＯＰ−２抗体は、ヒトＴＲＯＰ−２の細胞質ドメインの１６９及び１８２の間のアミノ酸位置に対応する合成ペプチドによりマウスを免疫化することによって調製された。ポリクローナル抗体は、ホルマリン固定ヒト食道過形成及び癌腫組織を含有する試験アレイで試験された。５５個の癌腫試験片は、ポリクローナル抗体による強い染色を示したが、軽度の過形成組織は非常に弱く染色され、発現レベルは、悪性転換に関連しうることを示した（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ２００４）。
【０００９】
全体として、異なる抗ＴＲＯＰ−２抗体で得られたＩＨＣ反応性パターンは一致していた。癌における発現は、主に癌腫において見られ、大部分の癌腫は反応性であった。正常組織において、発現は上皮領域の細胞に限定されていると思われ、癌腫の染色は対応する正常上皮組織の染色よりも強いという幾つかの証拠があった。
【００１０】
ＩＨＣ研究に使用されることに加えて、抗体ＲＳ７は、インビボモデルにおいて試験され、最初の実験は、ヌードマウス異種移植モデルにおける腫瘍標的試験により構成された。静脈内注射された放射標識ＲＳ７は、Ｃａｌｕ−３（肺腺癌）又はＧＷ−３９（結腸癌）腫瘍のいずれかを有するマウスの腫瘍に特異的に蓄積することを示した（Ｓｔｅｉｎ  １９９０）。異種移植系における放射標識ＲＳ７の体内分布を調査するため、及び免疫複合体としてのＲＳ７の治療潜在能力を研究するため、更なる研究が行われた。この研究において、１３１Ｉ−標識ＲＳ７  Ｆ（ａｂ′）２が、Ｃａｌｕ−３肺腺癌異種移植片を有するヌードマウスで調査された。Ｃａｌｕ−３細胞によるマウスの接種の３週間後、腫瘍がおよそ０．３〜０．９グラムの大きさに達したとき、６〜７匹のマウス群は、１．０ｍＣｉの１３１Ｉ−標識ＲＳ７−Ｆ（ａｂ′）２又は１．５ｍＣｉの１３１Ｉ−標識ＲＳ７−Ｆ（ａｂ′）２のいずれかの静脈内単回用量で処置され、未処置対照マウスの同様の群と比較された。単回用量の１．０ｍＣｉの１３１Ｉ−標識ＲＳ７−Ｆ（ａｂ′）２は、およそ５週間の腫瘍増殖抑制をもたらし、一方、単回用量の１．５ｍＣｉの１３１Ｉ−標識ＲＳ７−Ｆ（ａｂ′）２は、腫瘍退縮をもたらし、平均腫瘍サイズは、放射抗体注射の８週間後まで前治療サイズを超えなかった。１．５ｍＣｉの１３１Ｉ−標識ＲＳ７−Ｆ（ａｂ′）２用量を受けたマウスは、１８．７パーセントの平均体重減少を被り、この処置に関連する毒性の存在を示した。この研究では、裸ＲＳ７又はＲＳ７のＦ（ａｂ′）２フラグメントによる処置の効果は試験されなかった（Ｓｔｅｉｎ  １９９４ａ）。別の研究が、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌異種移植モデルにおける１３１Ｉ−ＲＳ７の効能を試験するために行われた。およそ０．１ｃｍ３のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を有する１０匹のマウス群は、２５０マイクロキューリーの１３１Ｉ−ＲＳ７又は２５０マイクロキューリーの１３１Ｉ−Ａｇ８（アイソタイプマッチ対照抗体）のいずれかの静脈内単回用量により処置された。６匹のマウスの群は、３０マイクログラムの非標識ＲＳ７又はＡｇ８のいずれかの静脈内単回用量で処理された。腫瘍の完全な退縮（腫瘍の一過性再発を有した１匹の動物を除く）が、１３１Ｉ−ＲＳ７で処置された動物で見られ、１１週間の観察期間の間続いた。腫瘍退縮は、１３１Ｉ−Ａｇ８処置マウスでも見られたが、２週間から５週間しか観察されず、腫瘍は、研究の残りの間持続したか又は増殖し続けた。非標識ＲＳ７又はＡｇ８を受けたマウスの腫瘍増殖は、阻害されず、Ａｇ８処置マウスと比較してＲＳ７処置マウスの平均腫瘍容量はどのようにも異なっていると思われなかった。およそ０．２〜０．３ｃｍ３のより大型のＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍を有する１０匹の追加の２群は、２７５マイクロキューリーの１３１Ｉ−ＲＳ７又は２７５マイクロキューリーの１３１Ａｇ８のいずれかの僅かに高い単回容量で処置され、未処置マウスの同様の群と比較された。腫瘍容量は、毎週、１５週間測定された。この場合、未処置マウスと比較すると１３１Ｉ−ＲＳ７処置マウスの間で腫瘍増殖に有意な差があったが、１３１Ｉ−Ａｇ８処置マウスと比較すると１３１Ｉ−ＲＳ７処置マウスの腫瘍増殖には有意な差はなく、効能の一部は、放射線の非特異的な効果に起因しうることを示した。非標識抗体は、０．２〜０．３ｃｍ３の腫瘍を含有するマウスでは試験されなかった（Ｓｈｉｈ  １９９５）。
【００１１】
放射線免疫療法のために最適な放射標識を選択する試みにおいて、免疫複合体としてのＲＳ７の効能を試験する多数の追加的な研究が存在している（Ｓｔｅｉｎ  ２００１ａ，  Ｓｔｅｉｎ  ２００１ｂ，  Ｓｔｅｉｎ  ２００３）。ＲＳ７のヒト化型のＲＳ７も生成されているが、前臨床異種移植モデルにおいて放射複合体として試験されているだけである（Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ２００４）。これらの研究は、ＲＳ７について以前開示された研究と同様の肯定的な効果を示すが、一つの研究では、放射標識ＲＳ７が以前に決定された最大耐性用量で送達される場合でも、毒性が生じ、幾つかのマウスにおいて死をもたらした（Ｓｔｅｉｎ  ２００１ａ）。マウスにおける異種移植腫瘍の有効な処置が、これらの研究において放射標識ＲＳ７により達成されているが、裸ＲＳ７は評価されていなかった。
【００１２】
ノイラミンダーゼ前処置Ｈ３２９９ヒト乳癌細胞でマウスを免疫化すると、抗ＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体ＢＲ１１０が産生される（米国特許５，８５０，８５４号に開示されており、従来特許のセクションを参照すること）。ヒト凍結組織試験片を使用する免疫組織学により、ＢＲ１１０は、肺、結腸、乳房、卵巣、腎臓、食道、膵臓、皮膚、肺及び扁桃腺を含む、広範囲なヒト癌腫の試験片と反応することを示した。ヒト正常組織切片では試験されたものはなかった。インビトロ研究は、ＢＲ１１０がヒト癌腫細胞株Ｈ３３９６又はＨ３９２２に対してＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性を有さないことを実証した。インビトロ研究において、ＢＲ１１０疫毒素の細胞障害性を分析することが、ヒト癌細胞株Ｈ３６１９、Ｈ２９８７、ＭＣＦ−７、Ｈ３３９６及びＨ２９８１に対して実施された。試験された細胞株のＥＣ５０は、それぞれ、０．０６、０．００１、０．０５、０．０９及び＞５マイクログラム／ｍＬであった。細胞障害性データでは裸ＢＲ１１０抗体について開示されたものはなかった。インビボデータでは裸又は免疫複合ＢＲ１１０について開示されているものはなかった。  
【００１３】
卵巣癌細胞株Ｃｏｌｏ３１６（Ｓｔｅｉｎ  １９９４ｂ）によるマウスの免疫化により生成されるＭＲ５４、ＭＲ６及びＭＲ２３、並びにＴ２４膀胱癌細胞株（Ｆｒａｄｅｔ  １９８４）によるマウスの免疫化により生成される抗体Ｔ１６のような、ＴＲＯＰ−２を標的にする多数の追加的な抗体が生成されている。これらの抗体の使用は、ＴＲＯＰ−２抗原の、並びに細胞株及び組織発現の研究の生化学的特徴決定に限定されてきた。インビトロ又はインビボのいずれかでのこれらの抗体の抗癌効能についての報告はない。ＲＳ７は、前臨床癌モデルにおいて治療効能を試験した唯一の抗体であり、その使用は放射性同位体の担体に限定されていた。インビトロ又はインビボのいずれかで治療効能を示すあらゆる裸ＴＲＯＰ−２抗体についての報告は何もない。
【００１４】
癌治療としてのモノクローナル抗体：癌を示す個人はそれぞれ特有であり、個人の独自性と同じように他の癌と異なる癌を有する。それにも関わらず、現行の治療は、同じ種類で同じ段階の癌を有する全ての患者を、同じように治療する。これらの患者の少なくとも３０パーセントは、第一次治療に失敗し、したがって、更なる一連の治療をもたらし、治療が失敗し、転移し、最終的には死亡する可能性が増大する。治療の優れた手法は、特定の個人における治療の特別仕様である。それ自体特別仕様につながる唯一の現行の治療は、外科手術である。化学療法及び放射線治療は、患者に合わせることができず、外科手術それ自体は、ほとんどの場合において、治癒を生じるには不十分である。  
【００１５】
モノクローナル抗体の出現によって、特別仕様の治療の方法を開発する可能性がより現実的になり、それは、それぞれの抗体を単一のエピトープに向かわせることができるからである。更に、特定の個人の腫瘍を独自に定義する一団のエピトープに方向付けられる、抗体の組み合わせを生じることが可能である。
【００１６】
癌性と正常な細胞との有意な差は、癌性細胞が形質移入細胞に特異性のある抗原を含有することであるという認識を持って、科学界は、癌抗原に特異的に結合することによって、形質移入細胞を特異的に標的にするようにモノクローナル抗体を設計することができると長い間考えてきて、それ故、モノクローナル抗体は、癌細胞を排除する「魔法の弾丸」として役立つことができるという信念を生み出した。しかし、癌の全ての場合に役立つことができる単一のモノクローナル抗体はないこと、及びモノクローナル抗体は、標的癌治療としての分類として展開できることが、現在広く認識されている。本発明の開示された教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、例えば腫瘍量を低減することにより患者の利益になる方法で、癌性疾患の過程を修飾することが示されており、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）又は「抗癌」抗体として本明細書でさまざまに参照される。
【００１７】
今のところ、癌患者は、一般に治療の選択肢がほとんどない。癌治療に対する厳格に管理された手法は、世界的な生存率及び罹患率において改善をもたらした。しかし、特定の個人に対しては、これらの改善された統計は、彼らの個人的な状態における改善と必ずしも相関関係がない。
【００１８】
したがって、開業医がそれぞれの腫瘍を同じコホートにおける他の患者とは無関係に治療することができる方法論が提案される場合、それは、ただ１人のために適合された特有の治療手法を許容することになる。理想的にはそのような治療過程が治癒の比率を増加し、より良好な成果を生じるのであれば、それは、長年にわたる切実な要求を満たすであろう。
【００１９】
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒトの癌治療では限られた成果を伴って使用されてきた。リンパ腫及び白血病は、ヒト血漿で治療されてきたが、長期間の寛解又は反応はほとんどなかった。更に、化学療法と比較して、再現性が欠如し、追加的な利益がなかった。乳癌、黒色腫及び腎細胞癌のような固形腫瘍も、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿及びウマ血清により治療され、同様に予測不能で効果のない結果を得た。  
【００２０】
固形腫瘍においてモノクローナル抗体の多くの診療試験が行われてきた。１９８０年代には、特定の抗原に対する抗体を使用するか、又は組織選択性に基づいて、ヒト乳癌において少なくとも４回の臨床試験が行われ、少なくとも４７人の患者のうち１人しか反応しなかった。１９９８年になって、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））をＣＩＳＰＬＡＴＩＮと組み合わせて使用した臨床試験が成功した。この試験では、３７人の患者で反応を評価し、約四分の一が部分的反応率を有し、さらに四分の一が僅かな又は安定した疾患進行を有した。反応者の進行時間の中央値は、８．４か月であり、反応持続時間の中央値は５．３か月であった。
【００２１】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と組み合わせた第一次使用として１９９８年に認可された。臨床研究の結果は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独を摂取した群（３．０か月）と比較して、抗体治療＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）を摂取した群（６．９か月）で疾患が進行した時間の中央値が増加したことを示した。生存の中央値で僅かな増加もあり、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）の治療類群対Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独の治療群が、２２か月対１８か月であった。加えて、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独と比較した、抗体＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）組み合わせ群における完全（８パーセント対２パーセント）及び部分的反応者（３４パーセント対１５パーセント）の両方で数が増加した。しかし、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＴａｘｏｌ（登録商標）による治療は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独の治療と比較して、心毒性の高い発生率をもたらした（それぞれ、１３パーセント対１パーセント）。また、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）治療は、現在知られている機能又は生物学的に重要なリガンドを持たないレセプターである、ヒト上皮増殖因子レセプター２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）を過剰発現している（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により決定された）患者にしか有効ではなく、転移性乳癌を有する患者のおよそ２５％であった。したがって、乳癌の患者において、依然として満たされていない大きな要求が存在する。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）治療により利益を受けることができる患者でも、依然として化学療法を必要とし、したがって、依然として、少なくともある程度は、この種類の治療の副作用に対処しなければならない。  
【００２２】
結腸直腸癌を調査する臨床試験は、糖タンパク質標的と糖脂質標的の両方に対する抗体に関わる。腺癌にいくらかの特異性を有する１７−１Ａのような抗体では、６０人の患者で第２相臨床試験を行い、部分的な反応を有する患者が１人だけであった。別の試験では、１７−１Ａの使用は、追加のシクロホスファミドを使用したプロトコールにおいて、５２人の患者のうち、完全寛解が１人及び僅かな反応が２人だけであった。現在まで、１７−１Ａの第ＩＩＩ相臨床試験は、第ＩＩＩ期結腸癌の補助療法として、改善された効能を実証していない。最初に画像化のために認可されたヒト化ネズミモノクローナル抗体の使用も、腫瘍退縮を生じなかった。  
【００２３】
最近になって、モノクローナル抗体の使用による結腸直腸癌臨床研究において肯定的な結果が得られるようになった。２００４年には、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）が、イリノテカンに基づく化学療法に難治性である、ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌の患者における第二次治療のために認可された。２群第ＩＩ相臨床試験と単独群研究の両方の結果は、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）が、それぞれ４．１か月と６．５か月の疾患進行時間の中央値で、それぞれ２３パーセントと１５パーセントの反応率を有したことを示した。同じ２群第ＩＩ相臨床試験及び別の単独群研究の結果は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）単独での治療が、それぞれ１．５か月と４．２か月の疾患進行時間の中央値で、それぞれ１１パーセントと９パーセントの反応率をもたらしたことを示した。
【００２４】
したがって、スイスと米国の両方において、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の治療が、そして米国において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）単独の治療が、第一次イリノテカン療法が失敗した結腸癌患者の第二次治療として認可された。したがって、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と同様に、スイスにおける治療は、モノクローナル抗体と化学療法の組み合わせとしてのみ認可されている。加えて、スイスと米国の両方における治療は、患者にとって第二次療法としてのみ認可されている。また２００４年には、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）が、転移性結腸直腸癌の第一次治療として、静脈内５−フルオロウラシルに基づく化学療法と組み合わせての使用が認可された。第ＩＩＩ相臨床研究の結果は、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）＋５−フルオロウラシルで治療した患者の生存の中央値が、５−フルオロウラシル単独で治療した患者と比較して延長したことを実証した（それぞれ、２０か月対１６か月）。しかし、この場合もＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と同様に、治療は、モノクローナル抗体と化学療法の組み合わせとしてのみ認可されている。  
【００２５】
また、肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺及び胃癌において乏しい結果を生じ続けている。非小型細胞肺ガンの最近の最も有望な結果は、治療が、化学療法剤ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）と組み合わせた細胞死滅薬ドキソルビシンと結合するモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ）を含む、第ＩＩ相臨床試験からもたらされた。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）は、肺癌の第二次治療のために唯一ＦＤＡにより認可された化学療法である。初期データは、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）単独と比較して全体的に改善された生存を示す。研究のために動員された６２人の患者のうち、三分の二は、ＳＧＮ−１５をＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）と組み合わせて摂取し、一方、残りの三分の一は、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）単独を摂取した。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）と組み合わせたＳＧＮ−１５を摂取した患者では、全体的な生存の中央値は、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）単独を摂取した患者の５．９か月と比較して、７．３か月であった。１年と１８か月の全体的な生存は、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）単独を摂取した患者でのそれぞれ２４パーセント及び８パーセントと比較して、ＳＧＮ−１５＋ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）を摂取した患者では、それぞれ２９パーセント及び１８パーセントであった。更なる臨床試験が計画されている。
【００２６】
前臨床では、黒色腫におけるモノクローナル抗体の使用では、いくらかの限定された成果が得られている。これらの抗体のうちで臨床試験に到達したものはほとんどなく、現在まで、第ＩＩＩ相診療試験で承認されたもの又は好ましい結果を実証したものはない。
【００２７】
疾患を治療する新薬の発見は、疾患の病原に寄与している可能性がある既知の遺伝子３０、０００個の産物のうちから、関連する標的を同定することの欠如によって妨げられている。腫瘍学研究において、潜在的な薬剤標的は、多くの場合、単に腫瘍細胞で過剰発現しているという事実によって選択される。このように同定された標的は、次に多数の化合物との相互作用のためにスクリーニングされる。潜在的な抗体療法において、これらの候補化合物は、通常、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより定められた基本的な原則（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）に従ったモノクローナル抗体生成の伝統的な方法によって誘導される。脾臓細胞を、抗原（例えば、全細胞、細胞分画、精製抗原）により免疫化したマウスから収集し、不死化ハイブリドーマパートナーと融合する。得られたハイブリドーマを、標的に最も熱心に結合する抗体の分泌のためにスクリーニングし、選択する。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＲＩＴＵＸＩＭＡＢを含む、癌細胞に対して向けられる多くの治療用及び診断用抗体が、これらの方法を使用して産生され、その親和性に基づいて選択されてきた。この戦略の欠点には、２つの部分がある。第１には、治療用又は診断用抗体結合に適切な標的の選択は、組織特異的発癌性経過を取り巻く知識の不足によって、そしてその結果として得られる、それによりこれらの標的が同定される単純な方法、例えば過剰発現による選択によって、制限される。第２には、最大の親和性を持ってレセプターに結合する薬剤分子が、通常、シグナルを開始する又は阻害する最高の確率を有するという前提は、必ずしもそうであるとは限らない場合がある。
【００２８】
乳癌及び結腸癌の治療でいくらかの進展があるにもかかわらず、有効な抗体療法の確認及び開発は、単独の作用物質又は同時治療のいずれにおいても、全ての種類の癌では不十分である。
【００２９】
従来の特許：  
特許文献１は、患者の腫瘍からの細胞を、患者の細胞又は組織からクローン化できるＭＨＣ遺伝子により形質移入するプロセスを開示する。次にこれらの形質移入細胞を使用して患者に予防接種する。  
【００３０】
特許文献２は、哺乳動物の新生細胞及び正常細胞の内部細胞成分に特異性があるが、外部成分にはないモノクローナル抗体を得る工程、モノクローナル抗体を標識する工程、標識抗体と、新生細胞を死滅させる治療を受けた動物の組織とを接触させる工程、及び縮退新生細胞の内部細胞成分への標識抗体の結合を測定することによって、治療の効果を決定する工程を含むプロセスを開示する。ヒト細胞内抗原へ向かう抗体を調製するためには、特許権所有者は、悪性細胞がそのような抗原の都合のよい供給源を表すことを認識する。
【００３１】
特許文献３は、新規抗体及びその製造方法を提供する。特に、特許は、ヒト腫瘍、例えば、結腸及び肺の腫瘍に関連するタンパク質抗原に強く結合するが、正常な細胞にかなり低い程度で結合する特性を有するモノクローナル抗体の形成を教示する。  
【００３２】
特許文献４は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に除去すること、腫瘍組織を処理して腫瘍細胞を得ること、生存しているが非腫瘍形成性である腫瘍細胞を照射すること、これらの細胞を使用して、患者のために、原発性腫瘍の再発を抑制することができ、同時に転位を抑制することができるワクチンを調製することを含む癌治療の方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原に反応性があるモノクローナル抗体の開発を教示する。第４欄４５行目（以下参照）に記載されているように、特許権所有者は、ヒト新生物において活性な特異的免疫療法を発現するモノクローナル抗体の開発に自発性腫瘍細胞を利用する。  
【００３３】
特許文献５は、ヒト癌腫の特性を持つが、起源の上皮細胞に依存しない糖タンパク質抗原を教示する。
【００３４】
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞のアポトーシスを誘発する抗Ｈｅｒ２抗体、抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、抗体を使用する癌治療の方法、及び前記抗体を含む医薬組成物を記述する。
【００３５】
特許文献７は、腫瘍及び非腫瘍組織供給源から精製された、ムチン抗原に対するモノクローナル抗体を産生するための新規ハイブリドーマ細胞株を記載する。
【００３６】
特許文献８は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生成する方法、モノクローナル抗体を産生する方法、並びにこの方法により産生されるモノクローナル抗体を記述する。この特許は、特に、癌の診断及び治療に有用な抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生について記述している。
【００３７】
特許文献９は、ヒト癌腫細胞に反応性のある、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体及び単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体が機能する機構には２つの部分があり、それは、分子が、ヒト癌腫の表面に存在する細胞膜抗原と反応すること、更には、抗体が、癌腫細胞内に取り入れられ、続いて結合する能力を有することであり、抗体−薬剤及び抗体−毒素複合体を形成するのに特に有用である。非修飾形態において、抗体は、特定の濃度で細胞毒性の特性も表す。
【００３８】
特許文献１０は、腫瘍の治療及び予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、老齢哺乳動物からの抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見出される天然抗体の一つの種類であると言われている。自己抗体が「老齢哺乳動物」からのものであるため、自己抗体は、実際に治療を受けている患者からのものであるという必要条件がない。加えて、この特許は、老齢哺乳動物からの天然及びモノクローナル抗核自己抗体、並びにモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示する。
【００３９】
特許文献１１は、ＧＡ７３３−１に対して向けられている特異的抗体ＢＲ１１０を開示する。この特許は、免疫毒素複合体としてのＢＲ１１０のインビトロでの機能を開示する。この抗体について裸抗体としてのインビトロ機能の開示は何もなかった。この抗体についてインビボ機能の開示も何もなかった。
【００４０】
特許文献１２は、ＥＧＰ−１が含まれるが、これに限定されない抗原のホストに対して向けられている、ＲＳ７が含まれるが、これに限定されない免疫毒素複合抗体を請求する。免疫毒素は、リボヌクレオチド溶解活性を有するものに限定されている。しかし、実施例は、ＣＤ２２に対して向けられている特定の免疫毒素複合抗体ＬＬ２しか開示していない。この出願においてＲＳ７についてのインビトロ又はインビボ機能の開示は何もなかった。
【００４１】
特許文献１３は、ＥＧＰ−１対して向けられている特定の抗体ＲＳ７を開示する。この出願は、放射標識複合体としてのＲＳ７のインビトロ機能を開示する。この抗体について裸抗体としてのインビトロ機能の開示はなかった。この出願は、放射標識及び非標識複合体を連続して投与することにより得られたＲＳ７のインビボ機能も開示する。しかし、この研究は、１人の患者に限定されており、観察された機能のいずれが非標識抗体に起因したかは不明であった。裸抗体の投与によりもたらされるＲＳ７のインビボ機能については何もない。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号
【特許文献１１】米国特許第５，８５０，８５４号
【特許文献１２】米国特許第６，６５４，１０４号
【特許文献１３】米国特許出願２００４０００１８２５Ａ１
【発明の開示】
【００４２】
本出願は、癌性疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離することについて米国特許第６，１８０，３５７号特許で教示されている、患者特異性抗癌抗体を産生する方法論を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍のために特別に作ることができ、したがって、癌治療を特別仕様にすることが可能である。本出願の文脈内で、細胞死滅特性（細胞毒性）又は細胞増殖阻害特性（細胞増殖抑制性）のいずれかを有する抗癌抗体を、本明細書以降では、細胞毒性と呼ぶ。これらの抗体は、癌の病期分類及び診断の助けとして使用することができ、腫瘍転移を治療するために使用できる。これらの抗体を、予防処置の方法で癌予防のために使用することもできる。伝統的な薬剤発見パラダイムに従って生成された抗体と異なり、本方法のようにして生成された抗体は、以前には悪性組織の増殖及び／又は生存と一体として示されていない分子及び経路を標的にすることができる。更に、これらの抗体の結合親和性は、より強力な親和性相互作用に従わない場合がある細胞毒性事象の開始のための要件に適している。また、標準的な化学療法モダリティー、例えば放射性核種と、本発明のＣＤＭＡＢとを結合し、それによって、前記化学療法剤の使用に焦点を当てることは、本発明の範囲内である。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞毒性部分、酵素、例えばビオチン結合酵素、サイトカイン、インターフェロン、標的若しくはレポーター部分、又は血行性細胞と結合することもでき、それによって、抗体複合体を形成することができる。ＣＤＭＡＢを単独で、又は１つ以上のＣＤＭＡＢ／化学療法剤の組み合わせで使用することができる。
【００４３】
個人に合わせた抗癌治療の展望は、患者を管理する方法に変化をもたらす。起こりそうな臨床シナリオは、診断時に腫瘍試料を得て、保存するというものである。この試料から、腫瘍を、既に存在している癌性疾患修飾抗体のパネルによって分類することができる。患者は、従来のように病期分類されるが、患者を更に分類するために、利用可能な抗体が役に立つことができる。患者を、現存の抗体により直ぐに治療することができ、腫瘍に特異的な抗体のパネルを、本明細書で概説された方法を使用する、又は本明細書で開示されたスクリーニング方法と併せてファージディスプレーライブラリーを使用する、のいずれかよって産生することができる。生成された抗体は、他の腫瘍が、治療されているものと同じエピトープのうちの幾つかを持ちうる可能性があるので、全て抗癌抗体のライブラリーに加えられる。本発明の方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する何人もの患者において、癌性疾患を治療するのに有用であることができる。  
【００４４】
抗癌抗体に加えて、患者は、治療の多様なレジメンの一部として現行の推奨される治療を受けることを選ぶことができる。本発明の方法論により単離された抗体が非癌性細胞に対して相対的に非毒性であるという事実によって、高用量の抗体の組み合わせを単独で、又は従来の治療と一緒に使用することを可能にする。高い治療指数は、治療耐性細胞の発生の可能性を減少するはずである短期間での再治療も可能にする。
【００４５】
患者が治療の初期過程に難治性であるか、又は転移が発生する場合、腫瘍に特異的な抗体を生成する方法を再治療のために繰り返すことができる。更に、抗癌抗体を、患者から得た赤血球と結合して、転移の治療のために再注入することができる。転移性癌に対する有効な治療はほとんどなく、転移は、通常、死亡をもたらす不良転帰の前兆である。しかし、転移性癌は、通常、十分に血管新生化されており、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位へ抗体を集中させる効果を有することができる。転移の前でさえも、ほとんどの癌細胞は、その生存を宿主の血液供給に依存し、赤血球と結合した抗癌抗体は、原位置の腫瘍に対しても有効であることができる。あるいは、抗体を、他の血行性細胞、例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞などと結合させることができる。  
【００４６】
５種類の抗体があり、それぞれその重鎖により付与される機能と関連している。一般に、裸抗体による癌細胞死滅は、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）のいずれかによって仲介されると考えられる。例えば、ネズミＩｇＭ及びＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分の結合によりヒト補体を活性化することができ、それによって、腫瘍溶解をもたらすことができる、補体活性化の古典的経路を活性化することができる。ヒト抗体では、最も効果的な補体活性抗体は、一般にＩｇＭ及びＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３アイソタイプのネズミ抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球及び特定のリンパ球による細胞死滅をもたらすＦｃレセプターを有する細胞毒性細胞を動員するのに有効である。ヒト抗体のＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方のアイソタイプはＡＤＣＣを仲介する。  
【００４７】
Ｆｃ領域により仲介される細胞障害性は、エフェクター細胞、これらの対応するレセプター又はタンパク質、例えばＮＫ細胞、Ｔ細胞、及び補体の存在を必要とする。これらのエフェクター機構が不在であると、抗体のＦｃ部分は不活性である。抗体のＦｃ部分は、インビボでの抗体の薬物動態に影響を与える特性を付与することができるが、インビトロではこれは機能しない。
【００４８】
抗体を試験した細胞障害性アッセイは、存在するいずれのエフェクター機構も有さず、インビトロで実施される。これらのアッセイには、エフェクター細胞（ＮＫ、マクロファージ又はＴ細胞）又は補体の存在がない。これらのアッセイは、一緒に添加されたものによって完全に定義されているので、それぞれの成分を特徴決定することができる。本明細書で使用されるアッセイは、標的細胞、媒質及び血清しか含有していない。標的細胞は、癌細胞又は線維芽細胞なのでエフェクター機能を有さない。エフェクター機構特性を有する外来性細胞なしでは、この機能を有する細胞成分はない。媒質は補体又細胞を何も含有しない。標的細胞の増殖を支持するのに使用される血清は、商業的供給者により開示されているように、補体活性を有さない。更に、実験室において、使用した血清における補体活性の不在を確認している。したがって、抗体の効果は、Ｆａｂにより仲介されている抗原結合の効果に完全に起因しているという事実が実証されている。事実、標的細胞は、Ｆｃのレセプターを有さないので、Ｆａｂとだけ見られ、かつ相互作用している。ハイブリドーマは、標的細胞で試験した完全免疫グロブリンを分泌するが、細胞と相互作用する免疫グロブリンの唯一の部分は、Ｆａｂであり、これは抗原結合フラグメントとして作用する。
【００４９】
本発明により請求される抗体及び抗原結合フラグメントに関して、出願されている願書は、図１のデータにより証明されている細胞障害活性を実証している。上記で指摘しているように、そして本明細書において客観的な証拠により確認されているように、この効果は、Ｆａｂが腫瘍細胞に結合することに完全に起因していた。
【００５０】
Ｆｃにより動員されたエフェクター機構と無関係に、標的抗原への抗体の直接結合に起因する抗体仲介細胞障害性の技術において、十分な証拠が存在する。これの最良の証拠は、追加の細胞又は補体を有さない（これらの機構を正式に除外するため）インビトロ実験である。これらの種類の実験は、完全免疫グロブリンにより又はＦ（ａｂ）′２フラグメントのような抗原結合フラグメントにより実施される。これらの種類の実験において、抗体又は抗原結合フラグメントは、両方とも米国ＦＤＡにより癌治療のために市販することを認可されている抗Ｈｅｒ２及び抗ＥＧＦＲ抗体の場合のように、標的細胞にアポトーシスを直接誘発することができる。  
【００５１】
抗体仲介癌死滅の別の可能な機構は、細胞膜及びその関連する糖タンパク質又は糖脂質における多様な化学的結合の加水分解を触媒するように機能する抗体、いわゆる触媒抗体の使用を介することでありうる。
【００５２】
抗体仲介癌細胞死滅について３つの追加的な機構がある。第１は、癌細胞に存在する推定抗原に対して免疫反応を生じるように体を誘導する、ワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖レセプターを標的にし、その機能を妨害する、又は機能が効果的に失われるようにそのレセプターを下方制御する、抗体の使用である。第３は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１若しくはＴＲＡＩＬ  Ｒ２のような死レセプター又はアルファＶベータ３などのようなインテグリン分子の連結のような、直接の細胞死をもたらしうる細胞表面部分の直接連結に対するそのような抗体の効果である。
【００５３】
制癌剤の臨床的有用性は、患者の許容されるリスクプロフィール下での薬剤の利益に基づく。癌療法において、生存は、一般に最も追求される利益であるが、延命に加えて他の十分に認識されている利益が多数存在する。治療が生存に有害な効果を与えないこれらの他の利益には、症状緩和、有害事象に対する保護、再発するまでの時間又は無病生存期間の延長、及び進行するまでの時間の延長が含まれる。これらの基準は、一般に受け入れられており、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のような規制機関は、これらの利益を生じる薬剤を認可している（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２：１３７−１４３  ２００２）。これらの基準に加えて、これらの種類の利益を予感することができる他の終点があることは、十分に認識されている。部分的には、米国ＦＤＡにより許可された加速承認方法は、患者の利益を予測すると思われる代用薬があることを認めている。２００３年の年末には、この方法により１６種の薬剤が認可され、それらのうち４種が完全に承認され、すなわち、追跡調査が、代用薬終点により予測された直接的な患者の利益を実証した。固形腫瘍における薬剤効果を決定する一つの重要な終点は、処置に対する反応を測定することにより腫瘍量を評価することである（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２（３）：２０５−２１６  ２０００）。そのような評価の臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、国際的な癌専門家のグループであるＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐにより公表されてきた。適切な対照群と比較して、ＲＥＣＩＳＴ基準に従った他覚的反応により示された、腫瘍量に対する効果を実証した薬剤は、最終的に、直接的な患者利益を生じる傾向がある。前臨床設定において、腫瘍量は、一般に評価及び文書化に対してより直接的である。前臨床試験を臨床設定に転換することができるので、前臨床モデルにおいて生存期間の延長を生じる薬剤は、最大の予測臨床的有用性を有する。臨床治療に陽性反応を生じることと同様に、前臨床設定において腫瘍量を低減する薬剤は、疾患に対して著しく直接的な影響を有することもできる。生存期間の延長が制癌剤治療で最も追求される臨床転帰であるが、臨床的有用性を有する他の利益が存在し、疾患進行の遅延、延長した生存期間又はその両方に相関しうる腫瘍量の低減が、直接的な利益をもたらし、臨床的な影響を与えることもできることが明白である（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｉｌｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，３９ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００３，ｐａｇｅｓ  ２０９−２１９）。  
【００５４】
本発明は、その効果が細胞毒性アッセイにより、動物モデルにおける確立されていない及び確立された腫瘍増殖、並びに癌性疾患に罹患しているものでの延長された生存期間において確認されたＡＲ４７Ａ６．４．２の開発及び使用を記載する。本発明は、標的分子ＴＲＯＰ−２に存在するエピトープ又は複数のエピトープに特異的に結合し、かつ、裸抗体として、悪性腫瘍細胞に対してインビトロ細胞毒性の特性も有するが、正常な細胞には有さず、また、裸抗体として、腫瘍増殖の阻害及びヒト癌のインビボモデルにおける生存期間の延長を直接仲介する試薬を初めて記載する、癌治療の分野における進歩を示す。これは、同様の特性を示すものがなかったので、以前に記載された他のあらゆる抗ＴＲＯ−２抗体に対する進歩である。特定の種類の腫瘍の増殖及び発達に関連する事象においてＴＲＯＰ−２の直接的な関与を明確に、かつ初めて実証したので、この分野における進歩も提供する。ヒトの患者において同様の抗癌特性を示す潜在能力を有するので、癌治療における進歩も示す。更なる進歩は、これらの抗体を抗癌抗体のライブラリーに含めることが、腫瘍の増殖及び発達を標的にし、かつ阻害するのに最も有効なものを発見するため、異なる抗癌抗体の適切な組み合わせを決定することにより、異なる抗原マーカーを発現する腫瘍を標的にする可能性を向上させることである。
【００５５】
全体として、本発明は、投与されたとき、哺乳動物において抗原を発現している癌の腫瘍量を低減することができ、かつ治療された動物の生存期間の延長をもたらすこともできる治療剤の標的としての、ＡＲ４７Ａ６．４．２抗原の使用を教示する。本発明は、また、哺乳動物において抗原を発現する癌の腫瘍量を低減するためにそれらの抗原を標的にし、治療した哺乳動物の生存期間の延長をもたらす、ＣＤＭＡＢ（ＡＲ４７Ａ６．４．２）、この誘導体、その抗原結合フラグメント及びその細胞障害活性誘発リガンドの使用を教示する。更に、本発明は、癌性細胞においてＡＲ４７Ａ６．４．２抗原を検出することの使用も教示し、これは、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の診断、治療予測及び予後のために有用であることができる。
【００５６】
したがって、ハイブリドーマ細胞株、並びに対応する単離モノクローナル抗体及び前記ハイブリドーマ細胞株がコードされているその抗原結合フラグメントを単離するために、特定の個人由来の癌性細胞又は１つ以上の特定の癌細胞株に対して生じた癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）（ここでＣＤＭＡＢは、癌細胞に関しては細胞毒性があるが、同時に、非癌性細胞には相対的に非毒性である）を産生する方法を利用することが、本発明の目的である。  
【００５７】
癌性疾患修飾抗体、そのリガンド及び抗原結合フラグメントを教示することが、本発明の追加的な目的である。
【００５８】
その細胞障害性が抗体依存性細胞毒性により仲介される癌性疾患修飾抗体を産生することが、本発明の更なる目的である。
【００５９】
その細胞障害性が補体依存性細胞毒性により仲介される癌性疾患修飾抗体を産生することが、本発明のなお追加的な目的である。
【００６０】
その細胞障害性が細胞の化学的結合の加水分解を触媒する能力の機能である癌性疾患修飾抗体を産生することが、本発明のまた更なる目的である。
【００６１】
本発明のまた更なる目的は、癌の診断、予後及びモニタリングのための結合アッセイに有用である癌性疾患修飾抗体を産生することである。  
【００６２】
本発明の他の目的及び利点は、以下の記載によって明らかとなり、例示及び実施例によって、本発明の特定の実施態様が記載される。
【００６３】
（図面の簡単な説明）
図１は、細胞株ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３及びＣＣＤ−２７ｓｋに対するハイブリドーマ上澄みの細胞障害性及び結合レベルの率を比較する。
図２は、癌及び正常細胞株へのＡＲ４７Ａ６．４．２及び抗ＥＧＦＲ抗体対照の結合を表にまとめる。データは、アイソタイプ対照を越える折り畳みの増加として平均蛍光強度を表す。
図３は、幾つかの癌及び非癌細胞株に対して向けられたＡＲ４７Ａ６．４．２及び抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む。
図４は、予防ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図５は、予防ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図６は、確立したＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。  
図７は、確立したＢｘＰＣ−３膵臓癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。  
図８は、予防ＰＬ４５膵臓癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図９は、予防ＰＬ４５膵臓癌モデルにおける生存に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。
図１０、予防ＰＬ４５膵臓癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。  
図１１は、予防ＰＣ−３前立腺癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。  
図１２は、予防ＰＣ−３前立腺癌モデルにおける生存に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。
図１３は、予防ＰＣ−３前立腺癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。  
図１４は、予防ＭＣＦ−７乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは中央値＋／−ＳＥＭを表す。
図１５は、予防ＭＣＦ−７乳癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。  
図１６は、予防ＭＣＦ−７乳癌モデルにおける生存に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。
図１７は、予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは中央値＋／−ＳＥＭを表す。  
図１８は、予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図１９は、ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分（レーン１）及びＰＣ−３の全細胞溶解産物（レーン２）及びＣＣＤ−２７ｓｋ細胞株（レーン３）からの試料のウエスタンブロットである。分子量目盛りを左側に示す。  
図２０は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）及びアイソタイプ対照（レーン２）の免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロットである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の全膜画分とインキュベートしなかった抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズも、陰性対照（レーン３及び４）として使用した。３つの複製ブロットを、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は一次抗体なしのいずれかでプローブした。分子量目盛りを左側に示す。
図２１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．１（レーン２及び３）又はアイソタイプ対照（レーン１及び４）の免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロットである。複製アリコートを、グリコシダーゼ酵素の混合物の存在下（レーン３及び４）並びに不在下（緩衝剤のみ、レーン１及び２）でインキュベートした。分子量目盛りを左側に示す。
図２２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）及びアイソタイプ対照抗体（レーン２）の大規模免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロット（中央パネル）及びコロイド染色（左側パネル）の画像の並列である。ＡＲ４７Ａ６．４．２結合タンパク質Ｇセファロースビーズのみ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とインキュベートしない）も陰性対照（レーン３）として使用した。分子量目盛りを左側に示す。
図２３は、トリプシン消化後の質量分析により分析するために、タンパク質試料を抜き取って単離する前と後でコロイドブルー染色したゲルの画像である。レーンの記載は図２０と同じである。分子量目盛りを左側に示す。  
図２４は、ロイドブルー染色ゲルから抜き取って得られた試料のトリプシン消化後に得られた質量スペクトル写真である。質量スペクトル写真の下側は、Ｐｒｏｆｏｕｎｄ検索結果概要である。
図２５は、ＡＲ４７Ａ６．４．２免疫沈殿のトリプシン消化後に得られた特有のペプチドのうちの１つのＭＳ／ＭＳ分析のＭＡＳＣＯＴ検索結果概要である。配列番号９が示されている。  
図２６は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）及びアイソタイプ対照抗体（レーン３）により得られた免疫複合体のウエスタンブロットである。ＡＲ４７Ａ６．４．２結合タンパク質Ｇセファロースビーズのみである（「ニセＩＰ」も陰性対照（レーン２）として使用した）。複製ブロットを、ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒトＴＲＯＰ−２及びアイソタイプ対照でプローブした。分子量目盛りを左側に示す。
図２７は、精製ヒト組み換えタンパク質ＴＲＯＰ−２（レーン１）及びＣＤ６３大型細胞外ドメイン（レーン２）のウエスタンブロットである。複製ブロットを、ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒトＴＲＯＰ−２、１Ａ２４５．６又はアイソタイプ対照のいずれかでプローブした。分子量目盛りを左側に示す。
図２８は、ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした、変性及び非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）及び脱グリコシル化（Ｄ）された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）及び組み換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）である。  
図２９は、抗ヒトＴＲＯＰ−２でプローブした、変性及び非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）及び脱グリコシル化（Ｄ）された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）及び組み換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）である。
図３０は、ＩｇＧアイソタイプ対照でプローブした、変性及び非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）及び脱グリコシル化（Ｄ）された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）及び組み換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）である。  
図３１は、異なる一次抗体溶液でプローブした組み換えヒトＴＲＯＰ−２のウエスタンブロットである。レーン３〜７は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５でプローブした。レーン９〜１３は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５でプローブした。レーン１５〜１９は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化８Ａ３Ｂ．６とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５でプローブした。レーン８及び１４は、陰性対照溶液とインキュベートし、レーン８は、二次溶液とインキュベートしなかった。レーン１、２及び２０は、ＴＢＳＴのみとインキュベートした。  
図３２は、異なる一次抗体溶液でプローブした組み換えヒトＴＲＯＰ−２のウエスタンブロットである。レーン３〜７は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした。レーン９〜１３は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした。レーン１５〜１９は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化１Ｂ７．１１とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした。レーン８及び１４は、陰性対照溶液とインキュベートし、レーン８は、二次溶液とインキュベートしなかった。レーン１、２及び２０は、ＴＢＳＴのみとインキュベートした。
図３３は、正常ヒト組織マイクロアレイに対する、陽性及び陰性対照と対比したＡＲ４７Ａ６．４．２のＩＨＣ比較を表にまとめる。  
図３４は、ヒト正常組織マイクロアレイから、ＡＲ４７Ａ６．４．２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た脾臓組織の結合パターン及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た脳組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。
図３５は、異なる組織マイクロアレイからの多様なヒト腫瘍及び正常組織に対するＡＲ４７Ａ６．４．２のＩＨＣ比較を表にまとめる。
図３６は、多様なヒト腫瘍組織マイクロアレイから、ＡＲ４７Ａ６．４．２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た乳房腫瘍組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た前立腺腫瘍組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｅ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｆ）で得た膵臓腫瘍組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。倍率は、乳房及び膵臓腫瘍組織では４００×であり、前立腺腫瘍組織では２００×である。
図３７は、異なる正常種組織マイクロアレイからの多様なヒト及び他の種の正常組織切片に対するＡＲ４７Ａ６．４．２のＩＨＣ比較を表にまとめる。  
図３８は、多様な多種組織マイクロアレイから、ＡＲ４７Ａ６．４．２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得たヒト腎臓組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た正常カニクイザル腎臓組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｅ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｆ）で得た正常アカゲザル組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。
図３９は、ＡＲ４７Ａ６．４．２のネズミ配列決定に使用した全てのオリゴヌクレオチドプライマーの配列（配列番号１０〜４７）である。
図４０は、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨ及びＶＬ領域のＲＴ／ＰＣＲ増幅のアガロースゲルである。
図４１は、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨ−Ｃ及びＶＬ−ＥのＰＣＲコロニースクリーニングのアガロースゲルである。
図４２は、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＬＡ及びＶＬＧのＰＣＲコロニースクリーニングのアガロースゲルである。  
図４３は、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＬアミノ酸配列（配列番号８）である。
図４４は、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨアミノ酸配列（配列番号７）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
一般に、以下の語又は語句は、発明の開示、記載、実施例及び請求項で使用される場合に、示された定義を有する。  
【００６５】
用語「抗体」は、最も広範囲な意味で使用され、具体的には、例えば単一モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体、脱免疫化、ネズミ、キメラ又はヒト化抗体を含む）、ポリエピトープ的特異性を有する抗体組成物、単鎖抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、免疫複合体及び抗体フラグメントを網羅する（下記を参照すること）。  
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質の抗体の個体群から得られる抗体を意味し、すなわち、個体群に含まれる個別の抗体は、少量で存在しうる天然に生じる突然変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられる。更に、異なる決定要因（エピトープ）に向けられている異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に向けられている。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体で汚染されることなく合成することができる点において有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質の抗体個体群から得られる抗体の特性を示し、特定の任意の方法により抗体を産生する必要性があると考慮されるべきでない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ（ネズミ又はヒト）法により作製することができるか、又は組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照すること）により作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００６７】
「抗体フラグメント」は、無処置抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合又は可変部領域を含む。抗体フラグメントの例には、完全長に満たない抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖフラグメント；二特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；単鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組み換えタンパク質、並びに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００６８】
「無処置」抗体は、抗原結合可変部領域を含み、またさらに、軽鎖定常部ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常部ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常部ドメインは、未変性配列定常部ドメイン（例えば、ヒト未変性配列定常部ドメイン）又はアミノ酸配列可変部ドメインであることができる。好ましくは、無処置抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００６９】
重鎖の定常部ドメインのアミノ酸配列に応じて、無処置抗体を異なる「部類」に指定することができる。これらは、無処置抗体の５つの主要な部類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、これらのうちの幾つかは、更に「下位分類」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けることができる。抗体の異なる部類に対応する重鎖定常部ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なる部類のサブユニット構造及び三次元配置がよく知られている。
【００７０】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（未変性配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列可変部Ｆｃ領域）に寄与する生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞障害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）；食菌作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。  
【００７１】
「抗体依存性細胞仲介細胞障害性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）を発現する非特異的細胞毒性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞仲介反応を意味する。ＡＤＣＣを仲介する一次細胞である、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の第４６４頁、表３にまとめられている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は追加的には、目的分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【００７２】
「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、その未変性供給源から、例えば、本明細書に記載されている血液又はＰＢＭＣから単離することができる。  
【００７３】
用語「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｅ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好ましいＦｃＲは、未変性配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）に結合するものであり、これらのレセプターの対立変種及び代替的なスプライス型を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ下位分類のレセプターが含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が含まれ、主に細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）の論評を参照すること）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｈ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において検討されている。将来的に同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語には、母親ＩｇＧの胎児への移動に関与する新生児レセプターＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４２９（１９９４））。
【００７４】
「補体依存性細胞障害性」又は「ＣＤＣ］は、分子が補体の存在下で標的を溶解する能力を意味する。補体活性化経路は、補体系（Ｃｌｑ）の最初の成分と、同族抗原と複合体を形成している分子（例えば、抗体）との結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実行することができる。
【００７５】
用語「可変部」は、抗体のうちで可変部ドメインの特定の部分が、配列において大きく異なり、特定の抗原に対するそれぞれ特定の抗体の結合及び特異性のために使用される、という事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変部ドメインの全体にわたって均一に分布されてはいない。軽鎖と重鎖の両方の可変部ドメインにおいて超可変部領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変部ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。未変性重及び軽鎖の可変部ドメインは、それぞれ、βシート構造に結合しているループを形成しており、幾つかの場合ではその一部分を形成している、３つの超可変部領域により結合しているほぼβシート形状をしている４つのＦＲを含む。それぞれの鎖における超可変部領域は、ＦＲにより近接して一緒に保持され、他の鎖の超可変部領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照すること）。定常部ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関わらないが、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）における抗体の参加のような、種々のエフェクター機能を示す。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、用語「超可変部領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変部領域は、一般に「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変部ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、重鎖可変部ドメインにおける残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））並びに／又は「超可変部ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変部ドメインにおける残基２６３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）、重鎖可変部ドメインにおける残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ］残基は、本明細書で定義されている超可変部領域残基以外の可変部ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを産生し、それぞれ単一の抗原結合部位と、その名称が容易に結晶化する能力を反映している残基「Ｆｃ」フラグメントを有する。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ′）２フラグメントを生じる。  
【００７７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有的関連がある１つの重鎖と１つの軽鎖の可変部ドメインの二量体から構成される。それぞれの可変部ドメインの３つの超可変部領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定するのが、この配置である。集合的には、６つの超可変部領域が抗原結合特異性を抗体に付与する。しかし、単一の可変部ドメイン（又は抗原に特異性のある３つの超可変部領域しか含まない半分のＦｖ）でさえも、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性は低い。Ｆａｂフラグメントも、軽鎖の定常部ドメインと重鎖の第１定常部ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ′フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基を付加することによって、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ′−ＳＨは、定常部ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ′の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ′）２抗体フラグメントは、元々、その間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ′フラグメントとして産生された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。  
【００７８】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」を、その定常部ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、明確に区別される２つの型のうちの１つに割り当てることができる。
【００７９】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のためにｓｃＦｖを所望の構造に形成することができる、ＶＨとＶＬのドメインの間にあるポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖについての検討は、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照すること。  
【００８０】
用語「二特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであり、フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において可変部軽ドメイン（ＶＬ）に結合している可変部重ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖で２つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補ドメインと対を形成して、２つの抗原結合部位を作り出すことが強要される。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより完全に記載されている。
【００８１】
用語「三特異性抗体」又は「三価三量体」は、３つの単鎖抗体の組み合わせを意味する。三特異性抗体は、アミノ酸末端のＶＬ又はＶＨドメインから構成され、すなわちあらゆるリンカー配列を持っていない。三特異性抗体は、ヘッドからテールの環状様式で配置されたポリペプチドを持つ３つのＦｖヘッドを有する。三特異性抗体の可能な立体配座は、互いに１２０度の角度で平面に位置している３つの結合部位を有する平面である。三特異性抗体は、単一特異性、二重特異性又は三重特異性であることができる。  
【００８２】
「単離」抗体は、自然環境の成分から同定、分離及び／又は回収されたものである。自然環境の汚染成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。単離抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分も存在しないので、組み換え細胞内原位置の抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００８３】
目的の抗原、例えばＴＲＯＰ−２抗原に「結合する」抗体は、抗体が、抗原を発現する細胞を標的にする治療又は診断剤として有用であるように、十分な親和性を持って抗原に結合することができるものである。抗体がＴＲＯＰ−２に結合するものである場合、通常は、他のレセプターではなくてＴＲＯＰ−２に優先的に結合し、非特異性Ｆｃ接触のような偶発的に結合するもの又は他の抗原では一般的である翻訳後修飾へ結合するものは含まれず、他のタンパク質と有意に交差反応しないものでありうる。目的の抗原に結合する抗体を検出する方法は、当該技術において周知であり、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットのようなアッセイが含まれうるが、これらに限定はされない。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」は交換可能に使用され、そのような名称には全て子孫が含まれる。全ての子孫は、意図的な又は偶然の突然変異のために、ＤＮＡ含有が正確に同一ではない場合があることも理解される。元の形質転換細胞でスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫が含まれる。明確な名称が意図されることが文脈から明かとなる。
【００８５】
「治療又は治療する」は、治療処置と、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を意味し、目的は、標的とする病理的状態又は障害を予防又は遅延（軽減）することである。治療の必要なものには、既に障害を有しているもの、並びに障害を有する傾向のあるもの又は障害が予防されなければならないものが含まれる。したがって、本明細書における治療される哺乳動物は、障害を有していると診断される場合があるか、又は障害に罹患しやすくなっているか若しくは敏感になっている場合がある。  
【００８６】
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には無調節細胞増殖又は死により特徴付けられる、哺乳動物における病理状態を意味するか又はそれを記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。より詳細には、そのような癌の例には、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、小型細胞肺癌、非小型細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃又は腹部の癌、膵癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎性癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、並びに頭部及び頸部の癌が挙げられる。
【００８７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロースホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ及びウレドーパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチローロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロメタミン、酸化メクロエタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カムルスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸のような葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファアミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；  ２，２′，２″−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシ���シン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバントロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。また、この定義に含まれるものは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲンのような、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンのような抗アンドロゲン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体である。
【００８８】
治療目的の「哺乳動物」は、ヒト、マウス、ＳＣＩＤ又はヌードマウス又はマウスの系統、家畜、動物園の動物、競技用の動物又は愛玩動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。  
【００８９】
「オリゴヌクレオチド」は、１９８８年５月４日に公開されたＥＰ２６６，０３２に記載された固相技術を使用して、又はＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７，１９８６に記載されているデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して、既知の方法（例えば、ホスホトリエステル、ホスファイト又はホスホラミダイト化学）によって化学的に合成された長さが短い一本又は二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。次にこれらはポリアクリルアミドゲルで精製される。  
【００９０】
本発明によると、非ヒト（例えば、ネズミ）免疫グロブリンの「ヒト化」及び／又は「キメラ」形態は、元の抗体と比較してヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）又はヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）反応の低下をもたらす特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２又は抗原の他の抗原結合物質）を含有し、かつ、所望の効果を再現するために必要な前記非ヒト免疫グロブリンに由来するが、同時に前記非ヒト免疫グロブリンに匹敵する結合特性を保持する必須部分（例えばＣＤＲ、抗原結合領域、可変部ドメインなど）を含有する抗体を意味する。大部分の場合において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基に代えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基に代えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも外来ＣＤＲ又はＦＲ配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、更に精製され、抗体性能が最適化される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変部ドメインを実質的に全て含み、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常部領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。  
【００９１】
「脱免疫化」抗体は、所定の種に対して非免疫原性であるか又は免疫原性が低い免疫グロブリンである。脱免疫化は、抗体に対する構造改変によって達成することができる。当業者に既知のあらゆる脱免疫化技術を用いることができる。抗体を脱免疫化する一つの適切な技術が、例えば、２０００年６月１５日公開のＷＯ００／３４３１７に記載されている。  
【００９２】
「アポトーシス」を誘発する抗体は、これらに限定されないが、アネキシンＶの結合、カスパーゼ活性、ＤＮＡ断片化、細胞縮化、小胞体の拡張、細胞断片化及び／又は膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成により例示される任意の手段でプログラム細胞死を誘発するものである。  
【００９３】
本明細書で使用されるとき、「抗体誘発細胞障害性」は、ハイブリドーマ上澄み由来又は受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体由来の細胞毒性効果を意味することが理解される。
【００９４】
本明細書の全体を通して、ハイブリドーマ細胞株、並びにそれから産生される単離モノクローナル抗体は、内部名称であるＡＲ４７Ａ６．４．２又は寄託名称であるＩＤＡＣ１４１２０５−０５と代替的に呼ばれる。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、「抗体リガンド」には、標的抗原の少なくとも１つのエピトープに特異的な結合を示す部分が含まれ、無処置抗体分子、抗体フラグメント及び少なくとも抗原結合領域又はその部分（すなわち、抗体分子の可変部部分）を有する分子、例えばＦｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ′分子、Ｆ（ａｂ′）２分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、又はＩＤＡＣ１４１２０５−０５と称されるハイブリドーマ細胞株により産生された単離モノクローナル抗体に結合している抗原（ＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗原）の少なくとも１つのエピトープを特異的に認識し結合する遺伝子操作された任意の分子であることができる。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、「癌性疾患修飾抗体」（ＣＤＭＡＢ）は、患者に利益のある方法によって、例えば、腫瘍量を低減する又は腫瘍を有する個人の生存期間を延長することによって癌性疾患の過程を修飾する、モノクローナル抗体及びその抗体リガンドを意味する。  
【００９７】
「ＣＤＭＡＢ関連結合剤」には、最も広範囲な意味において、少なくとも１つのＣＤＭＡＢ標的エピトープに競合的に結合する、あらゆる形態のヒト又は非ヒト抗体、抗体フラグメント、抗体リガンドなどが含まれるが、これらに限定されない
【００９８】
「競合的結合剤」には、少なくとも１つのＣＤＭＡＢ標的エピトープに結合親和性を有する、あらゆる形態のヒト又は非ヒト抗体、抗体フラグメント、抗体リガンドなどが含まれることが理解される。
【００９９】
治療される腫瘍には、原発性腫瘍及び転移性腫瘍、並びに難治性腫瘍が含まれる。難治性腫瘍には、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独又はこれらの組み合わせによる治療に反応しない又は耐性がある腫瘍が含まれる。難治性腫瘍は、そのような作用物質による治療によって抑制されていると思われるが、治療を中止した後、５年までに、時には１０年まで又はそれ以上で再発する腫瘍も包含する。
【０１００】
治療できる腫瘍には、血管新生化されていない、又は実質的にまだ血管新生化されていない、並びに血管新生化されている腫瘍が含まれる。したがって治療することができる固形腫瘍の例には、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、グリオーマ及びリンパ腫が挙げられる。そのような腫瘍の幾つかの例には、類表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭部及び頸部の腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、小型細胞及び非小型細胞肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍及び肝臓腫瘍が挙げられる。他の例には、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽腫、骨髄腫及び大脳転移、黒色腫、胃腸及び腎の癌及び肉腫、横紋筋肉腫、グリア芽細胞腫、好ましくは多形性グリア芽細胞腫、並びに平滑筋肉腫が挙げられる。  
【０１０１】
本明細書で使用されるとき、「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する分子の部分を意味する。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、「競合的に阻害する」は、従来の相互抗体競合アッセイを使用して、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５と呼ばれるハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体（ＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗体）が向けられる決定基を認識し、それに結合することができることを意味する。（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  Ｃ．ａｎｄ  Ｄｕｆｏｕｒ  Ｄ．（１９７３），Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａ  ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８，１５）。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、「標的抗原」は、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗原又はその部分である。  
【０１０４】
本明細書で使用されるとき、「免疫複合体」は、細胞毒素、放射性作用物質、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍薬又は治療剤に化学的又は生物学的に結合している抗体のような任意の分子又はＣＤＭＡＢを意味する。抗体又はＣＤＭＡＢは、細胞毒素、放射性作用物質、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍薬又は治療剤に、その標的に結合することができる限り、分子に沿って任意の位置に結合することができる。免疫複合体の例には、抗体毒素化学複合体及び抗体毒素融合タンパク質が挙げられる。
【０１０５】
抗腫瘍剤としての使用が適切な放射性作用物質は当業者に既知である。例えば、１３１１又は２１１Ａｔが使用される。これらの同位体は、従来の技術（例えば、Ｐｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８，６９−７３（１９９３））において使用される抗体に結合している。あるいは、抗体に結合している抗腫瘍剤は、プロドラッグを活性化する酵素である。抗体複合体が投与されると細胞毒素形態に変換される腫瘍部位に到達するまでその不活性形態を維持するプロドラッグを、投与することができる。実際には、抗体−酵素複合体を患者に投与し、治療される組織の領域に局在化させる。次に、細胞毒性薬への変換が、治療される組織の領域で起こるように、プロドラッグを患者に投与する。あるいは、抗体に結合した抗腫瘍剤は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）又は  腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）にようなサイトカインである。抗体は、サイトカインが他の組織に影響を与えることなく腫瘍の損傷又は破壊を仲介するように、サイトカインを腫瘍に向ける。従来の組み換えＤＮＡ技術を使用して、サイトカインをＤＮＡレベルで抗体に融合する。インターフェロンを使用することもできる。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」は、抗原結合領域が、生物学的に活性な分子、例えば、毒素、酵素、蛍光タンパク質、発光マーカー、ポリペプチドタグ、サイトカイン、インターフェロン、標的若しくはレポーター部分、又はタンパク薬物に結合している任意のキメラタンパク質を意味する。
【０１０７】
本発明は、更に、標的又はレポーター部分が結合している、本発明のＣＤＭＡＢを考慮する。標的部分は、結合対の第１メンバーである。例えば、抗腫瘍剤は、そのような対の第２メンバーに結合しており、それによって、抗原結合タンパク質が結合している部位へ向けられている。そのような結合対の一般的な例は、アビジン及びビオチンである。好ましい実施態様において、ビオチンは、本発明のＣＤＭＡＢの標的抗原に結合しており、それによって、アビジン又はストレプトアビジンに結合している、抗腫瘍剤又は他の部分のための標的を提供する。あるいは、ビオチン又はそのような他の部分は、本発明のＤＣＭＡＢの標的抗原に結合しており、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに結合している診断系において、レポーターとして使用される。
【０１０８】
検出可能なシグナル生成剤は、診断目的においてインビボ及びインビトロで有用である。シグナル生成剤は、通常は電磁線の測定である、外部手段により検出可能である測定可能なシグナルを生成する。大部分の場合では、シグナル生成剤は、酵素若しくは発色団であるか、又は蛍光、リン光若しくは化学発光による発光である。発色団は、紫外又は可視領域の光を吸収する染料を含み、酵素触媒反応の物質又は分解生成物であることができる。
【０１０９】
更に、本発明の範囲内に含まれるものは、調査又は診断方法における本発明のＤＣＭＡＢのインビボ及びインビトロでの使用であり、これは当該技術においてよく知られている。本明細書において考慮される診断方法を実施するために、本発明は、更に、本発明のＤＣＭＡＢを含有するキットを含む。そのようなキットは、特定の種類の癌の危険性のある個人の細胞に対するＣＤＭＡＢの標的抗原の過剰発現を検出することによって、そのような個人を確認するために有用である。
【０１１０】
診断アッセイキット
腫瘍の存在を決定する診断アッセイキットの形態で本発明のＣＤＭＡＢを利用することが考慮される。腫瘍は、一般に、１つの以上の腫瘍特異性抗体、例えばタンパク質及び／又は血液、血清、尿及び／又は腫瘍生検のような生物学的試料におけるそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて、患者において検出され、試料は、患者から得られる
【０１１１】
タンパク質は、特定の腫瘍、例えば、結腸、乳房、肺又は前立腺腫瘍の存在又は不在を示すマーカーとして機能する。抗原が他の癌性腫瘍の検出において有用性を有することも更に考慮される。本発明のＣＤＭＡＢ又はＣＤＭＡＢ関連結合剤から構成される結合剤を診断アッセイキットに含めることは、生物学的試料において作用物質に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマー及びプローブを使用して、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出することができ、これも癌の存在又は不在を示している。結合アッセイが診断的であるために、結合の認識が癌性腫瘍の存在のために明確に診断的になるように、正常組織における存在に関して、抗原の統計的に有意なレベルに相関するデータが生成される。複数のフォーマットが、試料におけるポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用する本発明の診断アッセイには有用であることが考慮され、これは当業者には既知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に例示されている。更に考慮されるものは、上記の診断アッセイフォーマットのいずれかの又は全ての組み合わせ、並べ換え、又は変更である。
【０１１２】
患者における癌の存在又は不在は、典型的には、（ａ）患者から得た生物学的試料を結合剤と接触させること；（ｂ）結合剤に結合するポリペプチドのレベルを試料において検出すること；及び（ｃ）ポリペプチドのレベルを所定のカットオフ値と比較することによって決定される。  
【０１１３】
例示的な実施態様において、アッセイは、ポリペプチドに結合して、ポリペプチドを試料の残部から取り出すための、固体支持体に固定化されたＣＤＭＡＢに基づく結合剤の使用を含むことが考慮される。次に結合ポリペプチドは、レポーター基を含有し、かつ結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出することができる。例示的な検出試薬には、ポリペプチド若しくは抗体に特異的に結合するＣＤＭＡＢに基づく結合剤、又は抗免疫グロブリン、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ若しくはレクチンのような、結合剤に特異的に結合する他の作用物質を挙げることができる。代替的な実施態様において、ポリペプチドをレポーター基で標識し、結合剤と試料とのインキュベーションの後、固定化結合剤に結合させる、競合アッセイを利用できることが考慮される。試料と固定化結合剤との反応性を示すものは、試料の成分が、結合剤への標識ポリペプチドの結合を阻害する程度である。そのようなアッセイ内での使用が適切なポリペプチドは、完全長腫瘍特異性タンパク質及び／又は結合剤が結合親和性を有するその部分を含む。  
【０１１４】
診断キットは、タンパク質を結合することができる、当業者に既知の任意の材料の形態であることができる固体支持体を備える。適切な例には、マイクロタイタープレートの試験ウエル、又はニトロセルロース若しくは他の適切な膜を挙げることができる。あるいは、支持体は、ガラス、繊維ガラス、ラテックスのようなビード又はディスクか、或いはポリスチレン若しくはポリ塩化ビニルのようなプラスチックであることができる。支持体は、例えば、米国特許５，３５９，６８１号に開示されているもののような、磁性粒子又は光ファイバーセンサーであることもできる。
【０１１５】
結合剤は、特許又は科学文献に十分に記載されている、当業者に既知の多様な技術を使用して固体支持体に固定化されることが考慮される。用語「固定化」は、吸着のような非共有関連と共有結合の両方を意味し、本発明の文脈において、作用物質と支持体上の官能基との直接結合であることができるか、又は架橋剤による結合であることができる。好ましいが非限定的実施態様において、吸着によるマイクロタイタープレートのウエル又は膜への固定化が好ましい。吸着は、結合剤を、適切な緩衝剤中において、固体支持体と適切な時間の間接触させることによって達成することができる。接触時間は、温度により変わることができ、一般に約１時間から約１日の範囲内である。
【０１１６】
結合剤と固体支持体の共有結合は、通常、最初に支持体を、支持体と結合剤のヒドロキシル又はアミノ基のような官能基の両方と反応する二官能性試薬と反応させることによって達成される。例えば、結合剤を、適切なポリマー被覆を有する支持体に、ベンゾキノンを使用して、又は支持体のアルデヒド基と結合パートナーにおけるアミン及び活性水素とを縮合することによって、共有的に結合することができる（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９１，ａｔ  Ａ１２  Ａ１３を参照すること）。  
【０１１７】
診断アッセイキットは、２抗体サンドイッチアッセイの形態を取ることが更に考慮される。このアッセイは、最初に抗体を、例えば、固体支持体に、慣用的にはマイクロタイタープレートのウエルに固定化されている本開示のＣＤＭＡＢを、試料と、試料内のポリペプチドが固定化抗体に結合できるように接触させることによって実施することができる。次に非結合試料を固定化ポリペプチド−抗体複合体から取り除き、レポーター基を含有する検出試薬（好ましくは、ポリペプチドの異なる部位に結合することができる二次抗体）を加える。次に固体試料に結合したままの検出試薬の量を、特定のレポーター基に適切な方法を使用して決定する。  
【０１１８】
特定の実施態様において、上記に記載したように抗体を支持体に固定化すると、支持体上の残りのタンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミン又はＴｗｅｅｎ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）のような当業者に既知の任意の適切な遮断剤により遮断する。次に固定化抗体を試料とインキュベートし、ポリペプチドを抗体に結合させる。試料を、インキュベーションの前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような適切な希釈剤で希釈することができる。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、特定の選択された腫瘍を有する個人から得た試料内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間に一致するように選択される。好ましくは、接触時間は、結合と非結合のポリペプチドの平衡で達成される少なくとも約９５パーセントの結合レベルを達成するために十分である。当業者は、平衡を達成するのに必要な時間は、経時的に生じる結合のレベルを評価することによって容易に決定できることを認識する。  
【０１１９】
次に非結合試料は、固体支持体を適切な緩衝剤で洗浄することによって除去されることが更に考慮される。次に、レポーター基を含有する二次抗体を固体支持体に加える。次に、検出試薬と固定化抗体−ポリペプチド複合体のインキュベーションを、結合ポリペプチドの検出のために十分な時間実施する。続いて、次に非結合検出試薬を除去し、結合検出試薬を、レポーター基を使用して検出する。レポーター基を検出するのに用いる方法は、選択されたレポーター基、例えば放射性基の種類に対して特異的である必要があり、シンチレーションカウント又はオートラジオグラフ法が一般に適している。分光法を使用して、染料、発光基及び蛍光基を検出することができる。ビオチンは、異なるレポーター基（慣用的には放射性若しくは蛍光性基、又は酵素）に結合しているアビジンを使用して検出することができる。酵素レポーター基は、一般に、物質の添加（一般に特定の時間の間）、続く反応生成物の分光又は他の分析により検出することができる。
【０１２０】
本発明の診断アッセイキットを前立腺癌のような癌の存在又は不在を決定するのに利用するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルを、一般に、所定のカットオフ値に対応するシグナルと比較する。例えば、癌を検出する例示的なカットオフ値は、固定化抗体が癌のない患者からの試料とインキュベートしたときに得られるシグナル平均値であることができる。一般に、所定のカットオフ値よりも標準偏差を約３超えるシグナルを生成する試料は、癌陽性であると考慮される。代替的な実施態様において、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，ｐ．１０６−７に従ってＲｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅを使用して決定することができる。そのような実施態様において、カットオフ値は、診断試験結果の可能なカットオフ値にそれぞれ対応する真陽性率（すなわち、感受性）と偽陽性率（１００パーセント特異的）の対のプロットから決定することができる。左側上方角（すなわち、最大領域を含む値）に最も近いカットオフ値のプロットが最も正確なカットオフ値であり、この方法により決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを生成している試料は、陽性であると考慮することができる。あるいは、カットオフ値をプロットに沿って左側へシフトして偽陽性率を最小限にするか、又は右側へシフトして偽陽性率を最小限にすることができる。一般に、この方法により決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを生成する試料は、癌陽性であると考慮される。
【０１２１】
このキットにより可能となる診断アッセイは、流通形又はストリップ試験フォーマットのいずれかで実施され、ここで結合剤は、ニトロセルロースのような膜に固定化されていることが考慮される。流通形試験において、試料中のポリペプチドは、試料が膜を通過すると固定化された結合剤に結合する。次に、標識された二次結合剤は、二次結合剤を含有する溶液が膜を貫流すると、結合剤−ポリペプチド複合体に結合する。次に、結合した二次結合剤の検出を、上記に記載したように実施することができる。ストリップ試験フォーマットでは、結合剤が結合している膜の一端を、試料を含有する溶液に浸ける。試料は、膜に沿って、二次結合剤を含有する領域を通って固定化結合剤の領域まで移動する。固定化結合剤の領域における二次結合剤の集中は、癌の存在を示す。目視により読み取ることができる結合部位での線のようなパターンの生成は、陽性試験を示す。そのようなパターンの不在は、陰性試験を示す。一般に、膜に固定化されている結合剤の量は、生物学的試料が、上記で考察されたフォーマットにおける２抗体サンドイッチアッセイで陽性シグナルを生成するのに十分なレベルのポリペプチドを含有する場合、視覚的に認識可能なパターンを生成するように選択される。本発明の診断アッセイにおける使用が好ましい結合剤は、本発明で開示された抗体、その抗原結合フラグメント及び本明細書に記載されている任意のＤＣＭＡＢ関連結合剤である。膜に固定化されている抗体の量は、診断アッセイを生じるのに有効な任意の量であり、約２５ナノグラムから約１マイクログラムの範囲であることができる。典型的には、そのような試験は、非常に少量の生物学的試料で実施することができる。
【０１２２】
加えて、本発明のＣＤＭＡＢを、その標的抗原を同定する能力によって、研究用の実験室で使用することができる。  
【０１２３】
本明細書で記載される本発明がより完全に理解できるために、下記の説明を記載する。  
【０１２４】
本発明は、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗原を特異的に認識し、それに結合するＣＤＭＡＢ（すなわち、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５  ＣＤＭＡＢ）を提供する。
【０１２５】
受入番号１４１２０５−０５でＩＤＡＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢは、ハイブリドーマＩＤＡＣ１４１２０５−０５により産生された単離モノクローナル抗体のその標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限り、任意の形態であることができる。したがって、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗体と同じ結合特異性を有するあらゆる組み換えタンパク質（例えば、抗体がリンホカイン又は腫瘍阻害性増殖因子のような第２タンパク質と組み合わされた融合タンパク質）が、本発明の範囲内に入る。
【０１２６】
本発明の一つの実施態様において、ＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗体である。
【０１２７】
別の実施態様において、ＣＤＭＡＢは抗原結合フラグメントであり、それは、Ｆｖ分子（例えば、単鎖Ｆｖ分子）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ′分子、Ｆ（ａｂ′）２分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、異種抗体、又はＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗体の抗原結合領域を有する任意の組み換え分子であることができる。本発明のＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５モノクローナル抗体が向けられているエピトープに向けられている。
【０１２８】
本発明のＣＤＭＡＢは、誘導体分子を産生するように修飾されることができ、すなわち、分子内のアミノ酸修飾によって修飾されることができる。化学修飾も可能でありうる。直接突然変異、親和性の成熟、ファージディスプレー又は鎖シャッフリングによる修飾も可能でありうる。
【０１２９】
親和性及び特異性は、ＣＤＲ及び／又はフェニルアラニントリプトファン（ＦＷ）残基を突然変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって、修飾又は改善することができる（例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９５）２５４：３９２−４０３）。一つの方法は、個別の残基又は残基の組み合わせをランダム化することであり、これにより、そうでなければ抗原結合部位が同一の個体群において、２〜２０個のアミノ酸のサブセットが特定の位置で見出される。あるいは、突然変異を、誤りがちＰＣＲ法（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９２）２２６：８８９−９６）により残基の範囲にわたって誘発することができる別の例では、重及び軽鎖可変部領域遺伝子を含有するファージディスプレーベクターを、大腸菌のミューテーター株において繁殖させることができる（例えば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９６）２５０：３５９−６８）。これらの突然変異誘発方法は、当業者に既知の多くの方法のうちの例示的なものである。
【０１３０】
本発明の呼応対の親和性を増加する別の方法は、鎖シャッフリングを実施することであり、ここで重又は軽鎖が他の重又は軽鎖と無作為に対合して、より親和性のある抗体が調製される。抗体の多様なＣＤＲを、他の抗体において対応するＣＤＲでシャッフルすることもできる。
【０１３１】
誘導体分子は、ポリペプチドの機能特性を保持し、すなわち、そのような置換を有する分子は、ポリペプチドの、ＩＤＡＣ１４１２０５−０５抗原又はその部分への結合を依然として許容する。
【０１３２】
これらのアミノ酸置換には、当該技術において「保存的」として知られているアミノ酸置換が含まれるが、これに限定はされる必要はない。
【０１３３】
例えば、「保存的アミノ酸置換」と称される特定のアミノ酸置換は、タンパク質においてタンパク質の立体配座又は機能のいずれかを改変することなく頻繁に行うことができる、十分に確立されたタンパク質化学の原理である。
【０１３４】
そのような変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかで他の疎水性アミノ酸のいずれかを、アスパラギン酸（Ｄ）でグルタミン酸（Ｅ）を（及びその逆を）、グルタミン（Ｑ）でアスパラギン（Ｎ）を（及びその逆を）、並びにセリン（Ｓ）でトレオニン（Ｔ）を（及びその逆を）置換することが含まれる。他の置換を、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の三次元構造におけるその役割に応じて、保存的であると考慮することもできる。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、頻繁に交換可能であることができ、アラニン及びバリン（Ｖ）も同様である。相対的に疎水性であるメチオニン（Ｍ）を、ロイシン及びイソロイシンと頻繁に、バリンとは時々交換することができる。リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、位置を頻繁に交換することができ、それは、アミノ酸残基の有意な特徴はその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基のｐＫが異なることは有意ではないからである。さらに他の変化も特定の環境下では「保存的」であると考慮することができる。  
【０１３５】
実施例１
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２
ハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２を、ブダペスト条約に従って、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ（ＩＤＡＣ），Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ，１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，Ｃａｎａｄａ，Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２に、受入番号１４１２０５−０５で２００５年１２月１４日に寄託した。３７  ＣＦＲ  １．８０８に従って、寄託者は、寄託物質の公共利用性に対して課せられている全ての制限が、特許の付与にあたって変更不能に解除されることを確認する。寄託物は、寄託所が生存試料を付与することができない場合は、取り替えられる。
【０１３６】
抗癌抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２を産生するハイブリドーマを産生するために、冷凍ヒト卵巣腫瘍組織の単一細胞懸濁液（類内膜腺癌；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をＰＢＳで調製した。ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）アジュバントを、穏やかに混合することによって使用のために調製した。５〜７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０マイクロリットルの抗原アジュバント中の２百万の細胞を皮下注射することにより免疫化した。最近調製した抗原アジュバントを使用して、最初の免疫化の２及び５週間後に、５０〜６０マイクロリットル中のおよそ２百万細胞により腹腔内でＡＲ４７Ａ６．４．２免疫化マウスを追加免疫した。最後の免疫化の３日後に、脾臓を融合のために使用した。ハイブリドーマは、単離脾細胞をＮＳＯ−１骨髄腫パートナーと融合することによって調製した。融合体の上澄みを、ハイブリドーマのサブクローンで試験した。
【０１３７】
ハイブリドーマ細胞により分泌された抗体がＩｇＧ又はＩｇＭアイソタイプであるかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。１００マイクロリットル／ウエルの、４℃の被覆緩衝剤（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝剤、ｐＨ９．２〜９．６）中の濃度２．４マイクログラム／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を、ＥＬＩＳＡプレートに一晩加えた。プレートを洗浄緩衝剤（ＰＢＳ＋０．０５パーセントＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルの遮断緩衝剤（洗浄緩衝剤中５パーセントミルク）をプレートに室温で１時間加え、次に洗浄緩衝剤で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのハイブリドーマ上澄みを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝剤で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウエルの、ヤギ抗マウスＩｇＧ又はＩｇＭのホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体いずれかの１／１００，０００希釈（１パーセントミルクを含有するＰＢＳで希釈した）を加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ溶液を、室温で１〜３分間インキュベートした。呈色反応を、５０マイクロリットル／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により終了させ、プレートをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレート読み取り機により４５０ｎｍで読み取った。図１に示されているように、ＡＲ４７Ａ６．４．２ハイブリドーマは、主にＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌した。
【０１３８】
ハイブリドーマ細胞により分泌された抗体の下位分類を決定するために、アイソタイプ化実験を、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＨｙＣｕＩｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｏｎｔｓｔｒａａｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して実施した。５００マイクロリットルの緩衝溶液を、ラット抗マウス下位分類特異性抗体を含有する試験片に加えた。５００マイクロリットルのハイブリドーマ上澄みを、試験管に加え、穏やかに撹拌しながら水浸した。捕捉したマウス免疫グロブリンを、コロイド粒子に結合している第２ラットモノクローナル抗体により直接検出した。これらの２つのタンパク質を組み合わせると、アイソタイプを分析するのに使用される可視信号を作り出す。抗癌抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２はＩｇＧ２ａ、カッパアイソタイプのものである。
【０１３９】
一連の限界希釈の後、ハイブリドーマ上澄みを、細胞ＥＬＩＳＡアッセイにより標的細胞に結合する抗体について試験した。２つのヒト卵巣癌細胞株及び１つのヒト正常皮膚細胞株を試験し、それぞれＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３及びＣＣＤ−２７ｓｋであった。ＯＣＣ−１を除いて細胞株は全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＯＣＣ−１卵巣癌細胞株は、Ｏｔｔａｗａ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）から得た。
【０１４０】
平板培養細胞は、使用する前に固定した。プレートを、ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＰＢＳにより室温で３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した２パーセントパラホルムアルデヒドの１００マイクロリットルを、それぞれのウエルに室温で１０分間加え、次に廃棄した。プレートを、再び、ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＰＢＳにより室温で３回洗浄した。遮断を、洗浄緩衝剤（ＰＢＳ＋０．０５パーセントＴｗｅｅｎ−２０）中の５パーセントミルクの１００マイクロリットル／ウエルにより室温で１時間実施した。プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄し、ハイブリドーマ上澄みを、７５マイクロリットル／ウエルにより室温で１時間加えた。プレートを、洗浄緩衝剤で３回洗浄し、１００マイクリットル／ウエルの、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の１／２５，０００希釈（１パーセントミルクを含有するＰＢＳで希釈した）を加えた。室温での１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄緩衝剤で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ基質を、室温で１〜３分間インキュベートした。反応を、５０マイクロリットル／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により終了させ、プレートをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００プレート読み取り機により４５０ｎｍで読み取った。図１で表にまとめた結果を、試験した細胞株に結合しないことを以前に示している社内ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、バックグラウンドを越える折り畳みの数として表した。ハイブリドーマＡＲ４７Ａ６．４．２の抗体は、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３に対して結合を示した。ＡＲ４７Ａ６．４．２は、正常皮膚細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋに対して検出可能なレベルの結合を示さなかった。
【０１４１】
抗体結合についての試験と共に、ハイブリドーマ上澄みの細胞毒性効果を、細胞株ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３及びＣＣＤ−２７ｓｋで試験した。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得た。アッセイを、製造会社の使用説明書に従い、下記に概説するように変えて実施した。細胞を、アッセイの前に、所定の適切な密度で平板培養した。２日後、ハイブリドーママイクロタイタープレートの上澄みの７５マイクロリットルを、細胞プレートに移し、５パーセントＣＯ２インキュベーターで５日間インキュベートした。性対照としての役割を果たすウエルを空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）又はシクロヘキシミドを加えた。処理の５日後、プレートを逆さにして空にし、吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有する室温ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）を、多チャンネルスクイーズボトルからそれぞれのウエルに分配し、３回軽く叩き、反転して空にし、次に吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳで稀釈した蛍光カルセイン染料の５０マイクロリットルをそれぞれのウエルに加え、５パーセントＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００蛍光プレート読み取り機で読み取り、データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで分析した。結果を図１で表にまとめる。ＡＲ４７Ａ６．４．２ハイブリドーマの上澄みは、ＯＶＣＡＲ−３細胞の２０パーセントに対して特異的に細胞障害性を生じた。これは、陽性対照のアジ化ナトリウム及びシクロヘキシミドそれぞれ対して得られた細胞障害性が２９及び３１パーセントであった。図１の結果は、ＡＲ４７Ａ６．４．２の細胞毒性効果が、癌細胞型への結合レベルに比例しないことを実証する。ＯＣＣ−１細胞と比較して、ＯＶＣＡＲ−３細胞においてより大きなレベルの細胞障害性が生じたが、ＯＶＣＡＲ−３細胞でのより高い結合と一致した。図１で表にまとめたように、ＡＲ４７Ａ６．４．２はＣＣＤ−２７ｓｋ正常細胞株において細胞障害性を生じなかった。既知の非特異的細胞毒性剤のシクロヘキシミド及びアジ化ナトリウムは、予測されたように一般に細胞障害性を生じた。
【０１４２】
実施例２ 
インビトロ結合 
ＡＲ４７Ａ６．４．２モノクローナル抗体は、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）中でハイブリドーマを培養し、収集及び再接種を週に２回することによって産生した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ，ＱＣ）による標準的な抗体精製手順に従った。脱免疫化されている、ヒト化されている、キメラの又はマウスのモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。
【０１４３】
膵臓（ＢｘＰＣ−３、ＡｓＰＣ−１及びＰＬ４５）、結腸（ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ、ＳＷ１１１６、ＨＴ−２９及びＣｏｌｏ−２０５）、乳房（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＣＦ−７）、前立腺（ＰＣ−３及びＤＵ−１４５）、肺（ＮＣＩ−Ｈ５２０及びＡ５４９）、食道（Ｔ．Ｔｎ）、甲状腺（ＳＷ５７９）、頭部及び頸部（ＦａＤｕ）並びに卵巣（ＯＣＣ−１、Ｃ−１３、ＯＶＣＡ−４２９、Ｓｋ−ＯＶ−３、ＯＶ２００８、Ｈｅｙ、Ａ２７８０−ｃｐ、Ａ２７８０−Ｓ及びＯＶＣＡＲ−３）の癌細胞株と、皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）及び肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）からの非癌細胞株に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で評価した。大部分の卵巣癌細胞株を除いて細胞株は全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。Ｃ−１３、ＯＶ２００８、Ｈｅｙ、Ａ２７８０−ｃｐ、Ａ２７８０−Ｓ、ＯＣＣ−１及びＯＶＣＡ−４２９卵巣癌細胞株は、Ｏｔｔａｗａ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）から得た。
【０１４４】
細胞は、最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を有さない）で洗浄することによって、ＦＡＣＳのために調製した。次に細胞解離緩衝剤（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）を使用して、３７℃で細胞培養プレートから細胞を取り出した。遠心分離及び収集した後、細胞を、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及び２パーセントウシ胎児血清を含有するＤＰＢＳ（染色媒質）に４℃で再懸濁し、カウントし、適切な細胞密度にアリコートし、遠心沈殿して細胞をペレットにし、試験抗体（ＡＲ４７Ａ６．４．２）又は対照抗体（アイソタイプ対照、抗ＥＧＦＲ）の存在下、４℃で２０マイクログラム／ｍＬの染色媒質に氷上で３０分間再懸濁した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６結合二次抗体の添加の前に、細胞を染色媒質で１回洗浄した。次に染色媒質中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６結合抗体を、４℃で３０分間加えた。次に細胞を最終的に洗浄し、固定媒質（１．５パーセントパラホルムアルデヒドを含有する染色媒質）に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリー取得を、ＦＡＣＳａｒｒａｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を使用したＦＡＣＳａｒｒａｙ（商標）に試料をかけて評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）及び側面散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣ及びＳＳＣ検出器の電圧及び振幅利得を調整して設定した。蛍光（Ａｌｅｘａ−５４６）チャンネル用の検出器を、細胞がおよそ１〜５単位の蛍光強度中央値の均一ピークを有するように、未染色細胞をかけて調整した。それぞれの試料では、およそ１０，０００個のゲート事象（染色固定細胞）を分析のために得て、結果を図３に表す。 
【０１４５】
図２は、アイソタイプ対照を越える蛍光強度折り畳み増加の平均値を表す。ＡＲ４７Ａ６．４．２抗体の代表的なヒストグラムを図３にまとめた。ＡＲ４７Ａ６．４．２は、膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３及びＰＬ４５（それぞれ３１．６倍及び２６．４倍）、結腸癌細胞株ＤＬＤ−１、ＨＴ−２９及びＣｏｌｏ−２０５（それぞれ９１．５倍、２２．１倍及び４４．９倍）、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（３５．９倍）、頭部及び頸部細胞株ＦａＤｕ（７７．１倍）、食道癌細胞株Ｔ．Ｔｎ（２６．９倍）、並びに卵巣癌細胞株ＯＶ２００８、ＯＶＣＡＲ−３及びＣ−１３（７８．４倍、２８．４倍及び４３．６倍）に対して強い結合を示した。結合は、乳癌細胞株ＭＣＦ−７（５．４倍）、前立腺癌細胞株ＰＣ−３及びＤＵ−１４５（３．３倍及び５．１倍）、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０（１０．７倍）、結腸癌細胞株ＳＷ１１１６（１．８倍）、並びに卵巣癌細胞株Ｈｅｙ、Ｓｋ−ＯＶ−３、ＯＣＣ−１及びＯＶＣＡＲ−４２９（それぞれ６．６倍、１．９倍、１０倍及び４．２倍）に対しても観察された。皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）及び肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）からの非癌細胞株への結合は、これらの条件下では検出されなかった。これらのデータは、多様な癌細胞株への明確な結合が存在するが、試験した株の幾つかとは関連する細胞毒性しか存在しないような機能的特異性を、ＡＲ４７Ａ６．４．２が示したことを実証した。 
【０１４６】
実施例３
ＢｘＰＣ−３細胞によるインビボ予防腫瘍実験
実施例１及び２は、ＡＲ４７Ａ６．４．２が、幾つかの異なる癌適応症にわたって検出可能な結合を持つという、ヒト癌細胞株に対する抗癌特性を有することを実証した。図４及び５を参照すると、６〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの食塩水中の５百万のヒト膵癌細胞（ＢｘＰＣ−３）を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。マウスを無作為に５匹の処置群に３分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ４７Ａ６．４．２試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、１週間に１回で７週間、同じ方法により投与した。腫瘍増殖を、約７日目毎で８週間、又は個々の動物がＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に達するまで、カリパスで測定した。動物の体重を、この研究の間、１週間に１回記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
【０１４７】
ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト膵癌のインビボ予防モデルにおいて腫瘍増殖を妨げ、腫瘍量を低減した。移植後の４９日目、つまり処置の最終日では、ＡＲ４７Ａ６．４．２処置群の平均腫瘍容量は、緩衝剤対照処置群よりも５３パーセント少なかった（ｐ＜０．０５；図４）。
【０１４８】
研究の全体を通して毒性の臨床徴候はなかった。図５で示されているように、体重を健康及び生育の失敗の代用として使用した。群内において、研究の期間にわたって対照群において有意ではない１０パーセントの体重の増加があった。同様に、ＡＲ４７Ａ６．４．２処置群において有意ではない体重の増加があり、平均２０ｇから２２．８ｇへの１４パーセントの増加であった。処置期間の終了時では、群間に体重の有意な差はなかった。
【０１４９】
まとめると、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、耐性が十分であり、このヒト膵癌異種移植モデルで腫瘍量を減少した。 
【０１５０】
実施例４
ＢｘＰＣ−３細胞によるインビボ確立腫瘍実験
ヒト膵癌のＢｘＰＣ−３モデルに対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を更に決定するために、抗体を、確立したＢｘＰＣ−３異種移植モデルで試験した。図６及び７を参照すると、６〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの食塩水中の５百万のヒト膵癌細胞（ＢｘＰＣ−３）を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。腫瘍の増殖をカリパスで毎週測定した。コホートの大部分が移植後３３日目に８５ｍｍ３（５６〜１１１の範囲）の平均腫瘍容量に達したとき、９匹のマウスをそれぞれ２つの処置群に無作為に割り当てた。ＡＲ４７Ａ６．４．２試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後の３００マイクロリットルの容量の２０ｍｇ／ｋｇの抗体を投与することによって、それぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体を、１週間に３回で合計１０用量を同じ方法により移植後５３日目まで投与した。腫瘍増殖を、約７日毎で移植後６３日目まで又は個々の動物がＣＣＡＣ終点に達するまで、カリパスにより測定した。動物の体重を、この研究の間、１週間に１回記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。 
【０１５１】
ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト膵臓の確立したモデルにおいて腫瘍量を有意に低減した。５４日目、つまり抗体の最後の用量が投与された１日後では、ＡＲ４７Ａ６．４．２処置動物は、対照処置動物の平均腫瘍容量の４０パーセントである平均腫瘍容量を有した（ｐ＜０．００１；図６）。これらの結果は、ＡＲ４７Ａ６．４．２では３０パーセントの平均Ｔ／Ｃに相当する。 
【０１５２】
１週間の間隔をおいて測定した体重を、健康及び生育の失敗の代用として使用した。図７で見られるように、研究期間の終了時で抗体処置群と対照との間には平均体重において有意な差がなかった。加えて、全ての群において体重は、研究の期間にわたって有意に変わらなかった。
【０１５３】
まとめると、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、耐性が十分であり、この確立したヒト膵癌異種移植モデルで腫瘍量を減少した。ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト膵癌の予防的モデルと確立したモデルの両方で効能を実証した。
【０１５４】
実施例５
ＰＬ４５細胞によるインビボ予防腫瘍実験 
実施例３及び４は、ＡＲ４７Ａ６．４．２がヒト膵癌細胞株に対して抗癌特性を有することを実証した。別のヒト膵臓細胞株に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効能を決定するために、抗体をＰＬ４５ヒト膵癌の異種移植モデルで試験した。図８及び９を参照すると、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルのＰＢＳ溶液中の５百万のヒト膵癌細胞（ＰＬ４５）を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。マウスを無作為に１０匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ４７Ａ６．４．２試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、１週間に１回、試験の期間中投与した。腫瘍増殖を、約７日毎にカリパスで測定した。処置は、抗体の９用量後に完了した。動物の体重を、この研究の間、１週間に１回記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
【０１５５】
ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト膵癌のＰＬ４５インビボ予防モデルにおいて腫瘍増殖を完全に阻害した。ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２による処置は、対照及び抗体処置群のほぼ全てのマウスが生存していた時、７７日目、つまり抗体の最終用量の２０日後（図８）に決定すると、緩衝剤処置群と比較して、ＰＬ４５腫瘍の増殖をほとんど１００パーセント（ｐ＝０．０００５、ｔ−試験）低減した。この研究は１０２日目、つまり最終用量の４５日後まで依然として続けられ、この時点で、対照群の全てのマウスが、腫瘍量のために除外された。しかし、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、依然として、腫瘍増殖のほぼ完全な阻害を示しており、この群の４匹のマウスは、依然として生存していた（図９）。４２日目と４８日目の間、ＡＲ４７Ａ６．４．２処置群の１匹のマウスが、抗体処置に関係のない原因で死亡したことに留意するべきである。加えて、４８日目と５５日目の間、抗体処置群の５匹のマウスが、ケージにおける水筒の漏れによって死亡した。ＡＲ４７Ａ６．４．２処置群で死亡した６匹のマウスは、全て、計測可能な皮下ＰＬ４５腫瘍をまだ発症していなかった。したがって、１０２日目で依然として生存していた４匹のマウスは、抗体処置の生存利益を表している。 
【０１５６】
研究の全体を通して明白な毒性の臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、健康及び生育失敗の代用であった。平均体重は、研究の期間にわたって全ての群において増加した（図１０）１３日目と７７日目の間の平均体重増加は、対照群では３．３９ｇ（１７．４パーセント）及びＡＲ４７Ａ６．４．２処置群では１．７ｇ（８．６パーセント）であった。処置期間の間及び７７日目、つまり最終用量の２０日後では、群間で有意な差はなかった。
【０１５７】
まとめると、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、耐性が十分であり、このヒト膵癌異種移植モデルで腫瘍増殖を完全に阻害した。ＡＲ４７Ａ６．４．２処置は、緩衝剤処置と比較して、生存の増加も実証した。したがって、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト膵癌の２つの異なるモデルにおいて効能を実証した。
【０１５８】
実施例６
ＰＣ−３細胞によるインビボ予防腫瘍実験
実施例３、４及び５は、ＡＲ４７Ａ６．４．２が２つの異なるヒト膵癌異種移植モデルに対して抗癌特性を有することを実証した。異なるヒト癌異種移植モデルに対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効能を決定するために、抗体をＰＣ−３前立腺癌異種移植モデルで試験した。図１１、１２及び１３を参照すると、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルのＰＢＳ溶液中の５百万のヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を、頸の首筋の皮下に注射して移植した。マウスを無作為に１０匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ４７Ａ６．４．２試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、１週間に１回、試験の期間中投与した。腫瘍増殖を、約７日毎にカリパスで測定した。研究は、抗体の８用量後に完了した。動物の体重を、この研究の間、１週間に１回記録した。研究の終了時、終点に達したとき、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
【０１５９】
ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト前立腺腺癌細胞のＰＣ−３インビボ予防モデルにおいて腫瘍増殖を阻害した。ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２による処置は、対照及び抗体処置群のほぼ全てのマウスが生存していた時、３２日目、つまり抗体の最終用量の５日後（図１１）に決定すると、緩衝剤処置群と比較して、ＰＣ−３腫瘍の増殖を６０．９パーセント（ｐ＝０．０００３７、ｔ−試験）低減した。対照群の全てのマウスを、４７日目、つまり抗体の最終用量の３日前に、腫瘍量／病巣のために研究から除外した。しかし、研究は７７日目、つまり抗体の最終用量の２７日後まで依然として続けられ、ＡＲ４７Ａ６．４．２処置群のマウスの４０パーセントは、依然として生存していた（図１２）。
【０１６０】
研究の全体を通して毒性の明白な臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、健康及び生育失敗の代用であった。平均体重は、研究の期間にわたって全ての群において比較的一定の状態を維持した（図１３）。処置期間の間又は３２日目、つまり抗体の５用量後では、群間で有意な差はなかった。
【０１６１】
まとめると、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、耐性が十分であり、このヒト前立腺癌異種移植モデルで腫瘍増殖を有意に阻害した。抗体による処置は、対照群と比較すると生存利益も実証した。ＡＲ４７Ａ６．４．２は２つの異なるヒト癌適応症：膵臓及び前立腺に対して効能を実証した。
【０１６２】
実施例７ 
ＭＣＦ−７細胞によるインビボ予防腫瘍実験
実施例３、４、５及び６は、ＡＲ４７Ａ６．４．２が２つの異なるヒト膵癌及び前立腺癌異種移植モデルに対して抗癌特性を有することを実証した。別のヒト癌異種移植モデルに対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効能を決定するために、抗体をＭＣＦ−７癌異種移植モデルで試験した。図１４、１５及び１６を参照すると、Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスを、２４時間照射し（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０）、２００マイクロリットルのＲＰＭＩ  １６４０中の２千万のヒト乳癌細胞（ＭＦＣ−７）をマウスの腹部右側に皮下注射した。マウスを無作為に１２匹の処置群に２分割した。移植した当日、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ４７Ａ６．４．２試験抗体又は緩衝剤対照を、マウス２０ｇあたり２００マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、１週間に１回、試験の期間中同じ方法により投与した。腫瘍増殖を、週に約２回カリパスで測定した。研究は、抗体の８回の注射後に完了した。動物の体重を、この研究の間、１週間に２回記録した。腫瘍容量が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを殺処理し、残りのマウスは試験の９１日目に全て殺処理した。
【０１６３】
ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト乳癌のＭＣＦ−７インビボ予防モデルにおいて腫瘍増殖を低減した。ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２による処置は、顕著な腫瘍増殖の遅延をもたらした。ＡＲ４７Ａ６．４．２は、処置の１８日目から３５日目の４２パーセントよりも低く、４９日目までの４２パーセントに近いＴ／Ｃパーセント値を誘導した（最適Ｔ／Ｃパーセント値は１８日目の１０．９パーセント）（図１４）。５３日目では、処置が終わった後、ＡＲ４７Ａ６．４．２の処置の効能は、依然としてＴ／Ｃの５７パーセントが観察された。研究の終了時では（９１日目）、ＡＲ４７Ａ６．４．２処置群の２匹のマウスは、腫瘍のない状態を維持していた。
【０１６４】
研究の全体を通して毒性の臨床徴候はなかった。体重を１週間に２回測定し、これは、健康及び生育の失敗の代用であった。体重増加の低減は、ＡＲ４７Ａ６．４．２処置群における処置の最初の週で観察されただけであった。その後、有意な体重の変化は、Ｒ４７Ａ６．４．２処置群と緩衝剤対照群との間では検出されなかった（図１５）。処置期間の終了時では、群間に有意な差はなかった。
【０１６５】
処置後生存利益（図１６）は、ＡＲ４７Ａ６．４．２投与と関連していた。緩衝剤対照群は、処置後８５日目までには１００パーセントの死亡率に達していたが、３３．３パーセントのＡＲ４７Ａ６．４．２マウスは、処置後９１日目まで依然として生存していた。 
【０１６６】
まとめると、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、耐性が十分であり、腫瘍増殖を低減し、このヒト乳癌異種移植モデルにおいて生存利益をもたらした。ＡＲ４７Ａ６．４．２は３つの異なるヒト癌適応症：膵臓、前立腺及び乳房に対して効能を実証した。
【０１６７】
実施例８
Ｃｏｌｏ２０５細胞によるインビボ予防腫瘍実験 
実施例３、４、５、６及び７は、ＡＲ４７Ａ６．４．２が２つの異なるヒト膵癌、前立腺及び乳癌異種移植モデルに対して抗癌特性を有することを実証した。別のヒト癌異種移植モデルに対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効能を決定するために、抗体をＣｏｌｏ２０５結腸癌異種移植モデルで試験した。図１７及び１８を参照すると、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルのＰＢＳ溶液中の５百万のヒト結腸癌細胞（Ｃｏｌｏ２０５）を、それぞれのマウスの腹部右側に皮下注射して移植した。マウスを無作為に１０匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ４７Ａ６．４．２試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００マイクロリットルの容量でそれぞれのコホートに腹腔内投与した。次に抗体及び対照試料を、最初の２週間は、週に１回投与し、更に３週間、週に２回投与した。腫瘍増殖を、約３〜４日毎にカリパスで測定した。処置は、抗体の８用量後に完了した。動物の体重を、この研究の間、腫瘍が測定されるときに記録した。研究の終了時、終点に達したとき、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
【０１６８】
ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ヒト結腸直腸腺癌細胞のＣｏｌｏ２０５インビボ予防モデルにおいて腫瘍増殖を阻害した。ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２による処置は、２７日目、つまり抗体の最終用量の４日前（図１７）に決定すると、緩衝剤処置群と比較して、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍の増殖を６０．２パーセント（ｐ＝０．０００３８５１、ｔ−試験）低減した。
【０１６９】
研究の全体を通して毒性の明白な臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、健康及び生育失敗の代用であった。処置期間の間、群間において平均体重の有意な差はなかった（図１８）。 
【０１７０】
まとめると、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、耐性が十分であり、このヒト結腸癌異種移植モデルで腫瘍増殖を有意に阻害した。ＡＲ４７Ａ６．４．２は４つの異なるヒト癌適応症：膵臓、前立腺、乳房及び結腸に対して効能を実証した。処置利益は、ヒト癌疾患の幾つかの十分に認識されたモデルにおいて観察され、ヒトを含む他の哺乳動物における治療のためのこの抗体の薬理学的及び薬学的利益を示唆している。
【０１７１】
実施例９
ウエスタンイムノブロッティングによる結合タンパク質の同定
抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２により認識されている抗原を同定するために、細胞膜調製物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付して、膜に移した。後者を抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブして、この抗体により検出されるタンパク質を可視化した。
【０１７２】
１．総膜画分調製物
総細胞膜を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）乳癌細胞のコンフルエント培養から調製した。培地を細胞スタックから除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を、プラットフォーム振とう機により、解離緩衝剤（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて３７℃で２０分間解離した。細胞を収集し、４℃で１０分間、９００ｇで遠心分離した。遠心分離した後、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁して洗浄し、再び４℃で１０分間、９００ｇで遠心分離した。次にペレットを必要になるまで−８０℃で保存した。膜を調製するために、細胞ペレットを解凍し、細胞１ｇあたり３ｍＬの緩衝剤の比率で５０ｍＬあたり１錠の完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ；Ｌａｖａｌ  ＱＣ）を含有する均質化緩衝剤に再懸濁した。細胞懸濁液を、ポリトロンホモジナイザーを氷上で使用して均質化に付して、細胞を溶解した。細胞ホモジネートを４℃で１０分間、１５，０００ｇで遠心分離して、核粒子を除去した。上澄みを採取し、管に分け、次に４℃で９０分間、７５，６００ｇで遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、膜ペレットをそれぞれ約５ｍＬの均質化緩衝剤に再懸濁した。全ての管の膜ペレットを合わせ、もう１回分けて、４℃で９０分間、７５，６００ｇで遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、ペレットを計量した。１パーセントのトリトンＸ−１００を含有する可溶化緩衝剤を、膜ペレット１ｇあたり３ｍＬの緩衝剤の比率でペレットに加えた。膜を、プラットフォーム振とう機により３００ｒｐｍで１時間、氷上で振とうして可溶化した。膜懸濁液を７５，６００ｇで遠心分離して、不溶物質をペレット化した。可溶性膜タンパク質を含有する上澄みを管から注意深く取り出し、タンパク質濃度をアッセイし、−８０℃で保存した。
【０１７３】
２．免疫沈降、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンイムノブロッティング
ＡＲ４７Ａ６．４．２抗原の免疫沈降を次のように実施した：総膜画分を、プロテアーゼインヒビターを含有する１Ｘ  ＲＩＰＡ緩衝剤で１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に希釈した。８Ａ３Ｂ．６アイソタイプ対照抗体に化学的に結合したタンパク質Ｇセファロースビーズ（排水ビーズの１マイクロリットルあたり２マイクログラムの抗体の比率で結合）を、総膜画分に加え、回転しながら、４℃で３時間インキュベートした。その後、試料を２００００×ｇで８秒間遠心分離した。上澄み（非結合画分）を取り除き、ビーズを氷上で保存した。同一の容量の、ＡＲ４７Ａ６．４．２に化学的に結合したタンパク質Ｇセファロースビーズ（排水ビーズの１マイクロリットルあたり２マイクログラムの抗体の比率で結合）を、前の工程のＴＭタンパク質混合物上澄みに加えた。試料を、回転しながら、４℃で３時間インキュベートした。インキュベートした後、試料を上記に記載したように遠心分離し、ビーズを保存した。次にアイソタイプ対照及びＡＲ４７Ａ６．４．２ビーズを、３×１ｍＬのＲＩＰＡ緩衝剤で洗浄し、１Ｘ  ＰＢＳですすいだ。これらの２つの試料、並びに同一容量のＡＲ４７Ａ６．４．２及び８Ａ３Ｂ．６タンパク質Ｇセファロース結合ビーズ（「ニセＩＰ」試料）ビーズを、非還元試料緩衝剤中で沸騰させることにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために調製した。ＭＢ−２３１細胞の総膜画分からのタンパク質を一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、それぞれ５％及び１０％の濃縮及び離ゲルに分けた。タンパク質を、電気ブロッティングにより、４℃で一晩かけてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に移した。完全な移動は、着色分子量マーカーの膜への移動を評価して決定した。移動の後、膜を、ＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）スキムミルクにより室温（ＲＴ）で１時間ブロックし、次に２つの複製ブロットを次のようにプローブした：１つのブロットを、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２（５ｍｇ／ｍＬ、ＴＢＳＴ中の５％スキムミルク）でプローブし、複製ブロットをＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（５ｍｇ／ｍＬ、ＴＢＳＴ中の５％スキムミルク）でプローブした。ブロットをＴＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄し、次にホースラディッシュＨＲＰ結合ヤギ抗ネズミＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）とＲＴで１時間インキュベートした。ＴＢＳＴによりそれぞれ１０分間で３回洗浄した後、ブロットをＥＣＬ  ＰｌｕｓＴＭキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  旧Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により、製造者の説明書に従って現像した。ブロットを水ですすぎ、画像をゲル記録系で得た（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。ブロットを、カメラの焦点、絞り、及び画像取得時間が同じ条件下で画像化した。 
【０１７４】
図１９では、ウエスタンブロットでプローブとして使用する場合、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ＭＢ−２１の総膜画分においておよそ５０ｋＤａの見掛分子量を持つタンパク質に明白に結合したが、ＰＣ−３又はＣＣＤ−２７ｋ細胞の全細胞溶解質には結合しなかった。図２０では、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２は、ＡＲ４７Ａ６．４．２結合タンパク質ＧセファロースビーズによりＭＢ−２１の総膜画分から免疫沈降したおよそ５０ｋＤａの見掛分子量のタンパク質を、特異的に認識した。プローブＡＲ４７Ａ６．４．２により認識されたバンドは、二次抗体単独の交差反応で観察されるものよりも極めて明確であることを観察することができ、これはタンパク質Ｇビーズから漏出したＩｇＧ及びＩｇＧ重鎖を表す。 
【０１７５】
次に、ウエスタンイムノブロッティングで検出された抗体の拡散特性が、不均質グリコシル化に起因するかを決定した。ＡＲ４７Ａ６．４．２又はアイソタイプ対照によるＭＢ−２３１総膜画分からの免疫沈降により得られた免疫複合体を、グリコペプチダーゼＦ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、β（１−４）ガラクトシダーゼ及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合物を含有し、特定の炭水化物基を除去したＥｎｚｙｍｅ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）による処置か、又は脱グリコシル化緩衝剤のみによる処置に、非還元条件下で付した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、試料を１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに付した。一部の酵素が、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２により確認される抗体の集団で有意な量を占める炭水化物の一部を除去する場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより差を検出することが可能であることが予測された。図２１は、認識された抗原の集団に有意な減少をもたらした、ＭＢ−２３１ＴＭ画分から得た免疫複合体のグリコシダーゼ処理を示す。これは、ＡＲ４７Ａ６．４．２抗体により認識された抗原が、少なくとも１つの糖タンパク質から構成されることを示した。
【０１７６】
実施例１０
ＡＲ４７Ａ６．４．２が結合した抗原の同定
１．ＭＢ−２３１総膜画分からの抗原の大規模免疫沈降
ＭＢ−２３１細胞から抽出した総膜画分（９．４ｍｇ）は、プロテアーゼインヒビターカクテルを含有する１Ｘ  ＲＩＰＡ緩衝剤で、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈することにより調製した。総膜画分抽出物を、タンパク質Ｇセファロースビーズ（排水ビーズ５ｍＬ）と、回転しながら４℃で２時間インキュベートすることによって前清澄した。遠心分離した後、ビーズを取り除き、貯蔵ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えて、０．５ｍｇ／ｍＬの最終ＢＳＡ濃度にした。抽出物を前清澄している間、ＡＲ４７Ａ６．４．２及び８Ａ３Ｂ．６アイソタイプ対照抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズ（６０マイクロリットルのタンパク質Ｇセファロースに化学的に架橋された抗体１２０マイクグラム）を、１ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡと４℃でまた２時間インキュベートすることによりブロックした。ブロックした後、抗体結合ビーズを、１Ｘ  ＲＩＰＡ緩衝剤で５分間、２回洗浄した。次に総膜抽出物を、アイソタイプ対照（８Ａ３Ｂ．６）結合タンパク質Ｇセファロースビーズ（６０マイクロリットルの排水ビーズ、１２０マイクログラムのＩｇＧ）と、転倒型回転機により回転しながら、４℃で２時間インキュベートした。４℃で１０秒間、２０，０００ｇで遠心分離した後、上澄み（非結合画分）を除去及び保存し、ビーズを、それぞれの洗浄工程で１ｍＬのＲＩＰＡ緩衝剤により５分間、３回洗浄した。次にビーズを１．５ｍＬのＰＢＳで１回すすぎ、次に氷上で保存した。次に保存した上澄み（非結合画分）を、ＡＲ４７Ａ６．４．２結合タンパク質Ｇセファロースビーズ（６０マイクロリットルの排水ビーズ、１２０マイクログラムのＩｇＧ）と、回転しながら、４℃で２時間インキュベートした。４℃で１０秒間、２０，０００ｇで遠心分離した後、上澄み（非結合画分）を除去及び保存し、ビーズを、それぞれの洗浄工程で１ｍＬのＲＩＰＡ緩衝剤により５分間、３回洗浄した。次にビーズを１．５ｍＬのＰＢＳで１回すすぎ、ＴＭ画分抽出物を−８０℃で保存し、ビーズを氷上で保存した。アイソタイプ対照ビーズ、並びにＡＲ４７Ａ６．４．２タンパク質Ｇセファロース結合ビーズを含有する２つのアリコート（第１は、免疫沈降工程で使用され、第２のアリコートは、同一容量のビーズを含有するが、どのＩＰでも使用されない（「ニセ」ＩＰと呼ばれる））。次にビーズを−８５℃で一晩保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を調製するため、抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズを含有する試料（ＡＲ４７Ａ６．４．２  ＩＰ、ＡＲ４７Ａ６．４．２「ニセ」ＩＰ及び８Ａ３Ｂ．６アイソタイプ対照ＩＰの試料）を、２つの３０マイクロリットルのアリコートにそれぞれ分けた。それぞれの試料のアリコートの１つに、６０マイクロリットルの１Ｘ非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤を加えた。４分間沸騰させた後、試料緩衝剤を除去し、同じ試料からの第２アリコートを含有する管に移した。次にこのプールした試料を４分間沸騰させた。氷上で冷却した後、それぞれの試料を２つの別々のゲルに装填した（ウエスタンブロッティングによる検出のため、一方のゲルに試料の１／１０、コロイドブルーでの染色による検出のため、他方のゲルに残りの９／１０）。ウエ���タンブロッティングに指定したゲルをＰＶＤＦ膜に３２０ｍＡで２時間移動させ、脱イオン水ですすぎ、ＴＢＳＴ中の５パーセントミルクによりＲＴで１時間ブロックし、次にＴＢＳＴ中の５パーセントミルク中で、またＲＴで２時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄し、次にＴＢＳＴ中の５パーセントミルク中、ＨＲＰ結合Ｆｃ特異性ヤギ抗ネズミＩｇＧ（１：５００００）と共に室温で１時間インキュベートした。次にブロットを１０分間、３回洗浄し、製造者の推奨に従って、増強化学発光検出系を使用して現像した。タンパク質染色に指定したゲルをクーマシーコロイドブルー染色と一晩インキュベートし、超純水で４８時間脱染した。
【０１７７】
２．ペプチドマッピング及び質量分析法による抗原同定 
上記の実験から、ウエスタンブロット及びクーマシーコロイドブルー染色ゲルの画像を、基準として分子量マーカーのバンドを使用して並べた（図２２）。ＡＲ４７Ａ６．４．２免疫沈降物を含有する、クーマシーコロイドブルー染色ゲルにおけるレーンの特定のバンドを、ガラスパスツールピペットを使用して抜き取った。全ての対照レーン（ＡＲ４７Ａ６．４．２「ニセＩＰ」及び８Ａ３Ｂ．６アイソタイプ対照ＩＰ）の同等の領域及び試料を何も含有しないゲルの領域も、図２３で示したように抜き取った（左側及び右側のパネルは、それぞれ抜き取った前後のゲルの画像である）。ゲルプラグを、同量のゲルプラグを含有する２つのアリコートに分けた。アリコートセットのうちの１つを４℃で保存し、複製アリコートを、市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してゲル内トリプシン消化に付した。 
【０１７８】
各消化物のアリコートを、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰＢＳＩＩｃ読み取り機（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）による質量分析に付した。簡潔に、各消化物のアリコートをＨ４チップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）上に手作業でスポットした。乾燥した後、ＣＨＣＡマトリックス（ａ−シアノ４−ヒドロキシケイ皮酸；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のアリコートを、チップ上の同じスポットに加え、乾燥させた。次に試料をＰＢＳＩＩｃ読み取り機で分析した。アイソタイプ対照レーン及びブランクゲル領域と平行している領域の同様の大きさのバンドを、ＡＲ４７Ａ６．４．２により免疫沈降した抗原の消化により生じた独自のペプチドフラグメントを決定することができるように、ＡＲ４７Ａ６．４．２  ＩＰのゲルプラグと並行して処理した（図２４）。独自のペプチドフラグメントの集団を、質量スペクトルの情報を使用してタンパク質配列データベースを検索する公的にアクセス可能なオンラインツールであるＰＲＯＦＯＵＮＤを使用して、検索した。次にＡＲ４７Ａ６．４．２  ＩＰ消化の試料における独自のペプチドを、ＰＢＳＩＩｃ読み取り機で既に分析された同じ試料スポットの分析を可能にするインターフェースを備えた、ＱＳＴＡＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）によるＭＳ／ＭＳ分析に付した。次にＭＳ／ＭＳデータを、ＭＳ／ＭＳスペクトルの情報を使用してタンパク質配列データベースを検索する公的にアクセス可能なオンラインツールであるＭＡＳＣＯＴにより分析した。大きな信頼度を持って推定される候補として示唆された唯一のタンパク質は、ＴＲＯＰ−２であった。図２５は、ＭＡＳＣＯＴ検索の概要である。配列番号９が示されている。高い確率を持って同定された唯一のタンパク質はＴＲＯＰ−２であり、ＭＳペプチドマスフィンガープリント法による以前の同定を支持した。
【０１７９】
３．ＡＲ４７Ａ６．４．２抗原ＩＤの確認
ＡＲ４７Ａ６．４．２の推定抗原のＩＤの確認は、既知の抗ヒトＴＲＯＰ−２モノクローナル抗体（クローン７７２２０．１１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）が、ＡＲ４７Ａ６．４．２により免疫沈降したタンパク質と反応するかを決定することによって実施した。更なる確認は、また、形質移入真核細胞から精製した組み換えヒトＴＲＯＰ−２のウエスタンイムノブロッティングにより実施した。ＡＲ４７Ａ６．４．２及び８Ａ３Ｂ．６  ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照及びＡＲ４７Ａ６．４．２「ニセＩＰ」陰性対照（上記に記載されている）により調製された、１Ｘ  ＲＩＰＡ緩衝剤中のＭＢ−２３１総膜抽出物からの免疫沈降物を、１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてウエスタンイムノブロッティングによって分析した。各免疫複合体試料からの等容量の画分を複製ゲルで分析した。ＰＶＤＦ膜への電気ブロッティングの後、複製ゲルのブロットを、モノクローナル抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒトＴＲＯＰ−２により、及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照により、並行してプローブした。図２６は、試験モノクローナル抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２によって免疫沈降した物質をウエスタンイムノブロッティングにより分析した、交差ＩＰ実験の結果を示す。モノクローナル抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２及び抗ヒトＴＲＯＰ−２クローン７２２０．１１は、それぞれ、４７Ａ６．４．２により免疫沈降した同様の抗原と特異的に交差反応した。しかし、アイソタイプ対照抗体８Ａ３Ｂ．６は、いずれの特定のバンドとも交差反応しなかった。加えて、ウエスタンブロットをプローブするのに使用した抗体は、陰性対照免疫複合体のバンドと交差反応しなかった。このデータは、ＡＲ４７Ａ６．４．２抗体で認識されるエピトープがＴＲＯＰ−２抗原の中に含まれていたことを示した。
【０１８０】
ＡＲ４７Ａ６．４．２が、ヒトＴＲＯＰ−２抗原と直接結合することを更に確認するために、その反応性を、ヒトＴＲＯＰ−２の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含有し、かつマウス骨髄腫細胞株ＮＳＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により発現する組み換え融合ポリペプチドに対して、エスタンイムノブロッティングにより分析した。
【０１８１】
図２７に例示されている結果は、ＡＲ４７Ａ６．４．２がヒトＴＲＯＰ−２の組み換え形態を特異的に認識し（ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブされたレーン１のブロット）、ヒトＣＤ６３の細胞外ドメイン２の組み換えＧＳＴ融合作成物（ＧＳＴ−ＥＣ２）を認識しなかったことを明らかにした。組み換えヒトＴＲＯＰ−２に対する抗体の特異性は、市販の抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体（クローン７７２２０．１１）も同様のサイズのバンドを認識し、ヒトＣＤ６３のＧＳＴ−ＥＣ２ドメインを認識しなかったという観察によって更に確認された。加えて、抗ヒトＣＤ６３抗体（クローン１Ａ２４５．６）は、ヒトＣＤ６３のＧＳＴ−ＥＣ２縮合作成物を特異的に認識したが、組み換えヒトＴＲＯＰ−２タンパク質を認識できなかった。上記の結果は、ＡＲ４７Ａ６．４．２がヒトＴＲＯＰ−２を、そして、特異的に、アミノ酸２７〜２７４を包含するその細胞外ドメインを認識し、それに直接結合することを示す。
【０１８２】
実施例１１ 
脱グリコシル化研究
ＡＲ４７Ａ６．４．２の結合に対するグリコシル化の効果を決定するために、脱グリコシル化反応を、変性及び非変性の両方の条件下で、製造者（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）の取扱説明書にしたがって設定した。変性反応では、０．４マイクログラムの組み換えＴＲＯ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）又は１００マイクログラムのＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（上記に記載したように単離した）を水で３０マイクロリットルに希釈した。１０マイクロリットルのインキュベーション緩衝剤（５Ｘ、０．２５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）及び２．５マイクロリットルの変性溶液（２パーセントＳＤＳ、１Ｍベータ−メルカプトエタノール）を加え、反応を５分間沸騰させた。反応を室温に冷却すると、２．５マイクロリットル洗剤溶液（１５パーセントＮＰ−４０）及び１マイクロリットルの、以下の各酵素を加えた：Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（登録商標）ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（≧５Ｕ／ｍＬ）、Ｓｉａｌｉｄａｓｅ  Ａ（商標）（≧５Ｕ／ｍＬ）、Ｏ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ（登録商標）（≧１．２５Ｕ／ｍＬ）、ベータ（ｌ−４）ガラクトシダーゼ（３Ｕ／ｍＬ）及びベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（４０Ｕ／ｍＬ）。脱グリコシル化酵素の代わりに５マイクロリットルの水を含有する対照反応も含めた。非変性反応では、０．４マイクログラムのｒｈＴＲＯＰ−２又は１００マイクログラムのＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質を、水で３５ミリリットルに希釈した。１０マイクロリットルのインキュベーション緩衝剤を、１マイクロリットルの、上記に提示した各酵素と共に加えた。脱グリコシル化酵素の代わりに５マイクロリットルの水を含有する対照反応も含めた。全ての反応を、３７℃で２４時間インキュベートした。 
【０１８３】
脱グリコシル化に続いて、反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために調製した。１６．７マイクロリットルの還元又は非還元試料添加液（４Ｘ）を、変性及び非変性反応にそれぞれ加えた。試料を５分間沸騰させ、次に室温に冷却した。１６．７マイクロリットルのそれぞれの反応を、四重の１２パーセントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填した。ゲルに、染料フロントが流出するまで１５０Ｖをかけた。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜へ４０Ｖで一晩移動させた。膜を、ＴＢＳＴ（０．０５パーセントＴｗｅｅｎ−２０を有するトリス緩衝食塩水）で調製した５パーセントミルクで１時間ブロックし、続いて一次抗体と２時間インキュベートした。２マイクログラム／ｍＬに希釈した抗ヒトＴＲＯＰ−２を除いて、一次抗体を５パーセントミルクでそれぞれ５マイクログラム／ｍＬに希釈した。ブロットを、ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒトＴＲＯＰ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）又はＩｇＧアイソタイプ対照のうちの１つとインキュベートした。一次抗体のインキュベーションに続いて、ブロットをＴＢＳＴでそれぞれ１０分間、３回洗浄した。ブロットを、５パーセントミルクで１：５０，０００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ二次抗体と１時間インキュベートし、次にＴＢＳＴでそれぞれ１０分間、３回洗浄した。ブロットを、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  旧Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＸ線現像機で現像した。
【０１８４】
図２８〜３０は、ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒトＴＲＯＰ−２及びＩｇＧアイソタイプ対照でそれぞれプローブした３つのブロットの結果を示す。図２８（ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブしたブロット）は、約５２ｋＤａでレーン１（非変性及び非脱グリコシル化ＭＢ−２３１総膜画分）に弱いバンドを示す。このバンドは、図２９（抗ヒトＴＲＯＰ−２でプローブしたブロット）では検出されない。レーン２（非変性及び脱グリコシル化ＭＢ−２１３総膜画分）の試料の反応性バンドは、およそ３７ｋＤａへのシフトを示し、ＡＲ４７Ａ６．４．２で認識され（図２８）そして市販の抗ＴＲＯＰ−２抗体ブロットで認識されたが（図２９）、アイソタイプ対照では認識されなかった（図３０）。いずれのブロットにおいてもレーン５又は６（変性の、非脱グリコシル化及び脱グリコシル化ＭＢ−２１３総膜画分）で検出されたバンドはなく、抗体が、還元条件下で総膜画分における標的タンパク質に検出可能に結合しなかったことを示した。
【０１８５】
組み換えヒトＴＲＯＰ−２は、ｒｈＴＲＯＰ−２のジスルフィド結合で結合した多量体に対応して、図２８及び２９（それぞれ、ＡＲ４７Ａ６．４．２及び抗ヒトＴＲＯＰ−２）のレーン３及び４（それぞれ、非変性の、非脱グリコシル化と脱グリコシル化のｒｈＴＲＯＰ−２）において、非常に強力で、非常に高分子量のバンド（見掛分子量２２０ｋＤａ超）として現れる。図２８（ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブしたブロット）において、強さの低いバンドが、約７０ｋＤａでレーン３（非変性の非脱グリコシル化ｒｈＴＲＯＰ−２）に、そして約５５ｋＤａでレーン４（非変性の脱グリコシル化ｒｈＴＲＯＰ−２）に現れ、ｒｈＴＲＯＰ−２のモノマー形態に対応する。多量体とモノマーバンドの両方の見掛分子量の、それぞれ２２０ｋＤａ及び７０ｋＤａ超から２２０ｋＤａ及び５５ｋＤａ未満へのシフト（レーン３及び４）は、脱グリコシル化による炭水化物基の損失によってもたらされる。還元条件下（レーン７及び８）では、ｒｈＴＲＯＰ−２は、より小さなモノマーペプチドとしてのみ検出され、グリコシダーゼ混合物による処理で見掛分子量がおよそ２０ｋＤａ減少する（図２９）。図３０（アイソタイプ対照抗体でプローブしたブロット）は、いずれのレーンにおいても反応性を示さない。
【０１８６】
使用された２つの抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体、ＡＲ４７Ａ６．４．２及び市販の抗ヒトＴＲＯＰ−２抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の総膜調製物においてヒトＴＲＯＰ−２抗原を認識し、グリコシダーゼ混合物による処理の前後で精製組み換えヒトＴＲＯＰ−２を認識した。この結果は、抗体が、非炭水化物エピトープ、おそらくポリペプチドエピトープを認識することができるが、結合が、この実験で使用したグリコシダーゼ混合物により除去されなかった炭水化物基と生じうることを排除できないことを示唆している。
【０１８７】
実施例１２ 
競合実験
ＡＲ４７Ａ６．４．２及びＡＲ５２Ａ３０１．５（社内で生成した別の抗体であり、これもＴｒｏｐ−２に結合する）の結合特性の更に特徴決定するために、抗体競合実験をウエスタンブロットにより実施して、ＡＲ４７Ａ６．４．２及びＡＲ５２Ａ３０１．５が、ＴＲＯＰ−２の同様の又は別のエピトープを認識するかを決定した。２マイクログラムの、ヒトＴＲＯＰ−２の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含有し、かつマウス骨髄腫細胞株ＮＳＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により発現する組み換え縮合ポリペプチドを、２つの１０パーセントポリアクリルアミドゲルのそれぞれの全長におよぶ調製ウエルコームを使用して、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ゲルのタンパク質を、ＰＶＤＦ膜へ、４℃、４０Ｖでおよそ１７時間移動させた。膜を、回転プラットフォームにより、ＴＢＳＴ中の５パーセントスキムミルクを用いて室温で１時間ブロックした。膜をおよそ２０ｍＬのＴＢＳＴで２回洗浄し、異なるプローブ溶液が適用される２０個の別個のチャンネルを作り出すＷｅｓｔｅｒｎマルチスクリーン装置に設置した。予め、ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２及びＡＲ５２Ａ３０１．５を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＯ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して調製しておいた。一次抗体溶液を、ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２又はビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５を多様な濃度の非ビオチン化抗体と混合することにより調製した。具体的には、ＴＢＳＴ中の３パーセントスキムミルク中０．０５マイクログラム／ｍＬのビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５と、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ又は１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化抗体とを含有する溶液を調製した。使用した非ビオチン化抗体は、ＡＲ５２Ａ３０１．５、ＡＲ４７Ａ６．４．２及び対照抗体８Ａ３Ｂ．６（抗ブルータングウイルス；ＩｇＧ２ａ、カッパ、社内で精製）であった。０．０５マイクログラム／ｍＬのビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２を含有する溶液を、上記に提示された同じ濃度の非ビオチン化抗体ＡＲ５２Ａ３０１．５、ＡＲ４７Ａ６．４．２及び対照抗体１Ｂ７．１１（抗ＴＮＰ；ＩｇＧ１、カッパ、２０マイクログラム／ｍＬ、社内で精製）で調製した。ＴＢＳＴ中の３パーセントスキムミルクからなる陰性対照溶液を、それぞれの膜の２つのチャンネルに加えた。
【０１８８】
一次抗体溶液を、揺動プラットフォームにより、膜の別個のチャンネルにおいて室温で２時間インキュベートした。各チャンネルを揺動プラットフォームにおいてＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した。ＴＢＳＴ中の３パーセントスキムミルク中０．０１マイクログラム／ｍＬのペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ  ＰＡ）からなる二次溶液を、ＴＢＳＴ中の３パーセントミルクのみが陰性対照として適用された各膜の１つのチャンネルを除いて、膜のそれぞれのチャンネルに適用した。膜を、揺動プラットフォームにより、二次溶液中、室温で１時間インキュベートした。各チャンネルを揺動プラットフォームにおいてＴＢＳＴで１０分間、３回洗浄した。膜をマルチスクリーン装置にから取り外し、製造者の使用指示書に従って、増強化学発光検出溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  旧Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）とインキュベートした。次に膜をフィルムに暴露し、現像した。
【０１８９】
図３１及び３２は、抗体競合実験の結果を示す。ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合は、５０マイクログラム／ｍＬ以上の濃度の非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５（１０００Ｘ過剰；図３１、レーン３〜７）で完全に阻害され、一方、ＡＲ４７Ａ６．４．２の結合は、５００マイクログラム／ｍＬ以上の濃度の非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２（１００００Ｘ過剰；図３２、レーン９〜１３）で完全に阻害された。ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合は、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体を含有する試料のいずれにおいても阻害されず（図３１、レーン５〜１９）、ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２の結合は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を含有する試料のいずれにおいても阻害されなかった（図３２、レーン１５〜１９）。このことは、幾つかの非ビオチン化抗体と混合したビオチン化抗体で観察された結合の阻害は、非ビオチン化抗体による抗原結合部位の占拠に起因し、過剰抗体単独の非特異的相互作用に起因しないことを示す。ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合は、ＡＲ４７Ａ６．４．２を含有する試料のいずれにおいても完全に阻害されず、ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２の結合は、ＡＲ５２Ａ３０１．５を含有する試料のいずれにおいても完全に阻害されなかった。しかし、両方のウエスタンブロットでは、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの他の非ビオチン化ＴＲＯＰ−２抗体でのそれぞれのビオチン化ＴＲＯＰ−２抗体の反応性は、過剰アイソタイプ対照抗体の対応するレーンよりも強度が低かった。これらの結果は、ＡＲ５２Ａ３０１．５の結合がＡＲ４７Ａ６．４．２とＴＲＯＰ−２との結合、またその逆を防止しないことを示す。全体として、競合ウエスタンブロットの結果は、ＡＲ４７Ａ６．４．２及びＡＲ５２Ａ３０１．５により認識されるＴＲＯＰ−２分子のエピトープは互いに異なるが、１つの抗体の結合は、実際、他の結合に影響を与えることを示唆している。
【０１９０】
実施例１３
ヒト正常組織の染色
ＩＨＣ研究を、冷凍ヒト正常組織切片におけるＡＲ４７Ａ６．４．２抗原分布を特徴決定するために実施した（以前の実験は、この抗体がホルマリン固定組織に対して反応性のないことを示した）。スライドを、冷（−２０℃）アセトンで１０分間後固定し、次に室温にした。スライドを４℃の冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２分間、３回すすぎ、それぞれの回の後に、３パーセント過酸化水素で１０分間洗浄して内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次にスライドをＰＢＳで５分間、３回すすぎ、その後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌブロック溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒト筋肉アクチン（Ｃｌｏｎｅ  ＨＨＦ３５、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、抗ＴＲＯＰ−２クローン７７２２０．１１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．，ＭＮ，ＵＳＡ）又はアイソタイプ対照抗体（哺乳類組織に存在せず、誘導もされない酵素である、アスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼに向けられている;
Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を、抗体稀釈緩衝剤（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）で、処理濃度（０．５マイクログラム／ｍＬである抗アクチン及び市販の抗ＴＲＯＰ−２抗体が１マイクログラム／ｍＬであることを除いて、それぞれの抗体では５マイクログラム／ｍＬ）に稀釈し、室温で１時間一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳによりそれぞれ２分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、供給されたＨＲＰ結合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）により室温で３０分間検出／可視化した。この工程の後、スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のために、ＤＡＢ（３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質溶液を室温で１０分間加えて、呈色反応を起こした。スライドを水道水で洗浄して、発色反応を止めた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）による対比染色の後、スライドを段階的なエタノール（７５〜１００パーセント）で脱水し、キシレンで清澄にした。装填媒質（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドをカバーガラスで覆った。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｉｅｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して微視的に調べ、デジタル画像を得て、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して保存した。結果を、組織病理学者が読み取り、評価し、解釈した。
【０１９１】
抗体の、１２個のヒト正常臓器の卵巣、膵臓、甲状腺、脳（大脳、小脳）、肺、脾臓、子宮、頸部、心臓、皮膚及び骨格筋への結合を、ヒト正常組織スクリーニングアレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。アレイは、２０個の正常ヒト臓器を含有したが、臓器のうち１２個だけが染色後に解釈可能であった。図３３は、ヒト正常組織アレイのＡＲ４７Ａ６．４．２染色の結果のまとめを表す。ＡＲ４７Ａ６．４．２抗体は、主に上皮組織（血管内皮、甲状腺の濾胞上皮、膵臓の腺房及び管上皮、肺の肺胞上皮及び皮膚の表皮角化細胞）に結合を示した。抗体は、脾臓のリンパ様組織への不確かな結合及び脳の神経組織への結合も示した（図３４）。細胞局在は、拡散した染色パターンを有して細胞質及び膜であった。ＡＲ４７Ａ６．４．２は、市販の抗ＴＲＯＰ−２（クローン７７２２０．１１）と比較したとき、同様の結合パターンを示した。
【０１９２】
実施例１４
ヒト多重腫瘍組織の染色
ＩＨＣ研究を実施して、冷凍ヒト癌切片におけるＡＲ４７Ａ６．４．２抗原の蔓延を特徴決定した。スライドを−８０から−２０℃に移した。１時間後、スライドを、冷（−２０℃）アセトンで１０分間後固定し、次に室温にした。スライドを４℃の冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２分間、３回すすぎ、それぞれの回の後に、３パーセント過酸化水素で１０分間洗浄して内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次にスライドをＰＢＳで５分間、３回すすぎ、その後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌブロック溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒト筋肉アクチン（Ｃｌｏｎｅ  ＨＨＦ３５、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、抗サイトケラチン７クローンＯＶ−ＴＬ  １２／３０（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）又はアイソタイプ対照抗体（哺乳類組織に存在せず、誘導もされない酵素である、アスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼに向けられている；Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ)を、抗体稀釈緩衝剤（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）で、０．５マイクログラム／ｍＬである抗アクチンと直ぐに使用される抗サイトケラチン７を除いたそれぞれの抗体を５マイクログラム／ｍＬの処理濃度に稀釈した。一次抗体及びスライドを一緒に室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳによりそれぞれ２分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、供給されたＨＲＰ結合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）により室温で３０分間検出／可視化した。この工程の後、スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のために、ＤＡＢ（３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質溶液を室温で１０分間加えて、呈色反応を起こした。スライドを水道水で洗浄して、発色反応を止めた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）による対比染色の後、スライドを段階的なエタノール（７５〜１００パーセント）で脱水し、キシレンで清澄にした。装填媒質（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドをカバーガラスで覆った。膵臓アレイ（Ｔｒｉ  Ｓｔａｒ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）では、以下の変更を除いて同じプロトコールに従った。組織切片を最初に室温で２時間自然乾燥し、アセトンで固定した後、３０分間再び自然乾燥した。内在性過酸化水素を、メタノール中の３パーセント過酸化水素を使用して１５分間ブロックし、この工程は、一次抗体のインキュベーションの後で行った。
【０１９３】
スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｉｅｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して微視的に調べ、デジタル画像を得て、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して保存した。結果を、組織病理学者が読み取り、評価し、解釈した。
【０１９４】
図３５は、多様なヒト腫瘍及びそれらの対応する正常組織切片（１０個の結腸癌及び１個の正常結腸、７この卵巣癌及び１個の正常卵巣、１１個の乳癌及び３個の正常乳房、１４個の肺癌及び３個の正常肺、１３個の前立腺癌及び３個の正常前立腺、並びに１３個の膵癌及び４個の正常膵臓）のＡＲ４７Ａ６．４．２染色の結果のまとめを表す。組織を、３つの異なる組織マイクロアレイ（Ｔｒｉ  Ｓｔａｒ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に分布させた。抗体は、それぞれ、５／１０個（５０パーセント）、６／７個（８６パーセント）１０／１１個（９１パーセント）、１１／１４個（７９パーセント）、１３／１３個（１００パーセント）及び２／１３個（１５パーセント）の結腸、卵巣、乳房、肺、前立腺及び膵臓の癌に中程度から強い結合を示した。加えて、不確から弱い結合が、それぞれ、２／１０個（２０パーセント）、１／１１（９パーセント）、３／１４個（２１パーセント）及び２／１３個（１５パーセント）の結腸、乳房、肺及び膵臓の癌切片において観察された（図３６）。試験した腫瘍の全てにおいて、結合は腫瘍細胞に対して特異的であった。対応する正常組織では、抗体は、０／１個、０／１個、３／３個、３／３個、３／３個及び４／４個の正常な結腸、卵巣、乳房、肺、前立腺及び膵臓組織に対して結合を示した。しかし、結合は、主に、正常臓器の上皮組織に対してであった。陽性対照抗体の抗サイトケラチン−７又は抗アクチンは、上皮及び筋肉組織それぞれに対して予測された陽性結合を示した。陰性ＩｇＧアイソタイプ対照は、試験した組織のいずれにおいても検出可能な結合を示さなかった。 
【０１９５】
実施例１５ 
多種組織染色 
ＩＨＣ研究を、前臨床毒物学モデルを選択するために、多様な種の冷凍正常組織におけるＡＲ４７Ａ６．４．２抗原の交差反応性を特徴決定するために実施した。ＳＣＩＤマウスの正常組織の切片（社内で採取）、ラット正常組織アレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、多種脳アレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び多種肝臓アレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、−８０℃から−２０℃に移した。１時間後、スライドを、冷（−２０℃）アセトンで１０分間後固定し、次に室温にした。スライドを４℃の冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２分間、３回すすぎ、それぞれの回の後に、３パーセント過酸化水素で１０分間洗浄して内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次にスライドをＰＢＳで５分間、３回すすぎ、その後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌブロック溶液（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗Ｇｒｐ９４（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）、抗ヒト筋肉アクチン（Ｃｌｏｎｅ  ＨＨＦ３５，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）又はアイソタイプ対照抗体（哺乳類組織に存在せず、誘導もされない酵素である、アスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼに向けられている;
Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を、抗体稀釈緩衝剤（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）で、処理濃度（０．５マイクログラム／ｍＬである抗アクチンを除いて、それぞれの抗体では５マイクログラム／ｍＬ）に希釈し、室温で1時間インキュベートした。スライドをＰＢＳによりそれぞれ２分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、供給されたＨＲＰ結合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）により室温で３０分間検出／可視化した。この工程の後、スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のために、ＤＡＢ（３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質溶液を室温で１０分間加えて、呈色反応を起こした。スライドを水道水で洗浄して、発色反応を止めた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）による対比染色の後、スライドを段階的なエタノール（７５〜１００パーセント）で脱水し、キシレンで清澄にした。装填媒質（Ｄａｋｏ  Ｆａｒａｍｏｕｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドをカバーガラスで覆った。ヒト、カニクイザル、ウサギ、ハムスター及びアカゲザルの個々の切片（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）では、以下の変更を除いて同じプロトコールに従った。最初の工程では、組織切片を室温で３０分間自然乾燥し、次に、アセトン固定することなく冷ＰＢＳで洗浄した（切片は、製造者によりアセトン固定されていた）。内在性過酸化水素を、メタノール中の３パーセント過酸化水素を使用して２０分間ブロックし、この工程は、一次抗体のインキュベーションの後で行った。
【０１９６】
一次抗体の免疫反応性を、供給された抗マウスＨＲＰ結合二次抗体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）により室温で３０分間検出／可視化した。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Ｚｉｅｓｓ  Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を使用して微視的に調べ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して、デジタル画像を得て、保存した。結果を、組織病理学者が読み取り、評価し、解釈した。
【０１９７】
抗体の、ＳＣＩＤマウス正常組織（社内で採取した）のパネル、ラット、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウシ、ウマ、イヌ及びブタの脳組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ラット、ヤギ、ニワトリ及びウシの肝臓組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、並びにヒト、カニクイザル、アカゲザル、ウサギ、ハムスター及びモルモットの個々の組織切片（Ｂｉｏｃｈａｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）への結合を決定した。陽性対照抗体の抗アクチン（Ｃｌｏｎｅ  ＨＨＦ３５，Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）は、筋肉組織に対して予測された特異的結合を示した。陽性対照抗体の抗Ｇｒｐ９４（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ）は、主に上皮組織に対して予測された陽性結合を示した。アイソタイプ陰性対照抗体（Ｄａｋｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）は、一般に試験組織に対して検出可能な結合を示さなかった。陰性対照において明白な背景染色を示した組織切片は、解釈から除外した。 
【０１９８】
図３７は、ヒト及び多様な種の正常組織におけるＡＲ４７Ａ６．４．２染色の結果を表にまとめて示す。ＡＲ４７Ａ６．４．２は、試験したマウス、ラット、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ウマ又はブタの正常組織に対して検出可能な結合を示さなかった。正常ウサギ及びイヌ組織では、対応するヒト組織において観察されたものと似ていない結合が存在した。カニクイザル正常組織では、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、カニクイザル切片において検出可能な結合が観察されなかった卵巣及び精巣を除いて、試験した臓器の全てにおいて、対応するヒト正常組織で観察されたものと同様の組織特異性を示した（図３８）。アカゲザル正常組織では、ＡＲ４７Ａ６．４．２は、対応するヒト正常組織で観察されたものと同様の組織特異性を示した（図３８）。アカゲザル正常組織パネルは、カニクイザルで試験したものよりも小さいことに留意するべきである。染色プロフィールに基づいて、カニクイザルとアカゲザルは、両方ともＡＲ４７Ａ６．４．２の適切な毒物学モデルであると考慮される。
【０１９９】
実施例１６
ＡＲ４７Ａ６．４．２ネズミ配列
１．０  可変部領域遺伝子を配列決定ベクターにクローニングする 
抗体キメラの産生を促進するために、重鎖と軽鎖の両方の可変部領域をコードする遺伝子を、別々に、市販の配列決定ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー：（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）にクローニングした。
【０２００】
１．１  ｍＲＮＡの単離
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を、Ｐｏｌｙ  Ａ  Ｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０００  ｍＲＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、コンフルエントＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＡＲ４７Ａ６．４．２）ハイブリドーマ細胞の培養から単離した。ｍＲＮＡを、更なる使用が必要となるまで−８０℃で保存した。
【０２０１】
１．２  可変部領域遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅
個別の反応を実施して、軽及び重鎖可変部領域を増幅した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ｍＲＮＡテンプレートから相補的デオキシリボ核酸を合成し、次に、標的遺伝子を特異的に増幅した。
【０２０２】
カッパ軽鎖では、５．０マイクロリットルのｍＲＮＡを、１．０マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットル  ＭｕＩｇＧκＶＬ−３′プライマーＯＬ０４０及び５．５マイクロリットルのヌクレアーゼ無含有水（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合した。ラムダ軽鎖では、５．０マイクロリットルのｍＲＮＡを、１．０マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットル  ＭｕＩｇＧλＶＬ−３′プライマーＯＬ０４２及び５．５マイクロリットルのヌクレアーゼ無含有水（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合した。ガンマ重鎖では、５マイクロリットルのｍＲＮＡを、１．０マイクロリットルの２０ｐｍｏｌ／マイクロリットル  ＭｕＩｇＧＶＨ−３′プライマーＯＬ０２３及び５．５マイクロリットルのヌクレアーゼ無含有水（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と混合した。３つの反応ミックスを、全て、７０℃で５分間に設定されたサーマルサイクラーの予熱ブロックの中に置いた。次に反応ミックスを氷上で５分間冷やしてから、４．０マイクロリットルのＩｍＰｒｏｍＩＩ  ５×反応緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．５マイクロリットルのＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．０マイクロリットルの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１．０マイクロリットルの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）及び１．０マイクロリットルのＩｍｐｒｏｍ  ＩＩ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をそれぞれ加えた。これらの反応ミックスを室温で５分間インキュベートしてから、４２℃で１時間に設定した予熱ＰＣＲブロックに移した。この時間の後、逆転写酵素をＰＣＲブロックにおいて７０℃で１５分間インキュベートすることによって、熱不活性化した。
【０２０３】
次に重及び軽鎖配列を、プライマーのプールを使用して特異的に増幅した（図３９のプライマー配列；配列番号１０〜４７を参照すること）。プライマー処理溶液を、以下のように構成した：
１．２０マイクロモルの濃度でそれぞれのプライマーに含有されている５′シングルプライマー（ＭｕＩｇＶＨ５′−Ａ及びＢ；ＭｕＩｇκＶＬｈ５′−Ａ、Ｂ及びＣ；ＭｕＩｇλＶＬ５′−Ａ）；
２．５マイクロモルの濃度でそれぞれの構成プライマーに含有されている５′プライマープール（ＭｕＩｇＶＨ５′−Ｃ〜Ｆ；ＭｕＩｇκＶＬｈ５′−Ｄ〜Ｇ）。
【０２０４】
重及び軽鎖配列をｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲマスターミックスは、３７．５マイクロリットルの１０×  Ｈｉ−Ｆｉ  Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、７．５マイクロリットルの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）及び３．７５マイクロリットルのＨｉ−Ｆｉ  Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、２７３．７５マイクロリットルのヌクレアーゼ無含有水に加えることによって調製した。このマスターミックスを、氷上の１５本の薄壁ＰＣＲ反応管に２１．５マイクロリットルのアリコートで分配した。これらの管の６本に、２．５マイクロリットルのＭｕＩｇＶＨ−３′逆転写反応ミックス及び１．０マイクロリットルの重鎖５′プライマーミックスＡ〜Ｆを加えた。別の７本の管に、２．５マイクロリットルのＭｕＩｇκＶＬ−３′逆転写反応及び１．０マイクロリットルの軽鎖５′プライマーミックスＡ〜Ｇを加えた。最後の管に、２．５マイクロリットルのＭｕＩｇλＶＬ−３′逆転写反応及び１．０マイクロリットルのラムダ軽鎖５′プライマーＭｕＩｇλＶＬ５′−Ａを加えた。反応をサーマルサイクラーのブロックの中に置き、９５℃で２分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間及び７２℃で３０秒間の４０サイクルで実施した。最後に、ＰＣＲ生成物を７２℃で５分間加熱し、次に４℃で保存した。ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を使用して精製した。
【０２０５】
図４０は、ＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を示す。重鎖反応（レーン２〜７）は、ＭｕＩｇＶＨ５′−Ｃ（レーン４）及びＭｕＩｇＶＨ５′−Ｅ（レーン６）を使用して増幅した５００ｂｐで強力なバンドを示す。軽鎖反応（レーン８〜１５）は、プライマーＭｕＩｇκＶＬ５′−Ａ（レーン８）及びＭｕＩｇκＶＬ５′−Ｇ（レーン１４）順方向プライマーを使用して増幅した、強力な４５０ｂｐ生成物バンドを示す。これらの反応のＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を使用して精製した。 
【０２０６】
１．３  配列決定ベクターへのクローニング 
軽鎖Ａ及びＧ、並びに重鎖Ｃ及びＥ精製ＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭ−ＴイージーＶｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、別々に、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターにクローンした。軽及び重鎖反応の両方は、３．０マイクロリットルの精製ＰＣＲ生成物を、５．０マイクロリットルの２×連結緩衝剤、１．０マイクロリットルのｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター及び１．０マイクロリットルのＴ４  ＤＮＡリガーゼに加えることによって調製した。プラスミドを、製造者の使用説明書に従って、サブクローニング等級ＸＬ１−ブルーコンピテント大腸菌（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。軽及び重鎖形質転換では、２．０マイクロリットルの連結反応を使用した。
【０２０７】
各反応からの１００マイクロリットルの形質転換細胞を、５０マイクログラム／ｍＬのアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を含有する、Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）アガー（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））プレートで平板培養した。プレートを逆さまにし、３７℃３一晩インキュベートした。
【０２０８】
４個のプレートからそれぞれ８個のクローンを選択し、２０マイクロリットルの滅菌水に接種するために使用した。ＰＣＲマスターミックスを、５１３．６マイクロリットルの滅菌水、３４．０マイクロリットルのジメチルスルホキシミド（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、６８．０マイクロリットルの１０ラＴａｇ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、１３．６マイクロリットルの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、６．８マイクロリットルの５０ｐｍｏｌ／マイクロリットルプライマーＯＬ００１、６．８マイクロリットルの５０ｐｍｏｌ／マイクロリットルプライマーＯＬ００２及び３．４マイクロリットルのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を混合することによって調製した。このマスターミックスを、１９マイクロリットルのアリコートで３２本のＰＣＲ反応管に分配した。これらのそれぞれに、１．０マイクロリットルの接種コロニー懸濁液を加えた。ＰＣＲ反応をサーマルサイクラーのブロックの中に置き、９５℃で５分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を、９４℃で１分間秒間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間の２５サイクルで実施した。最後にＰＣＲ生成物を７２℃で１０分間加熱した。次に、それぞれの反応からの５マイクロリットルを、１パーセントアガロースゲルにかけた。 
【０２０９】
図４１は、ＡＲ４７Ａ６．４．２  ＶＨ−Ｃの８個のコロニー及びＡＲ４７Ａ６．４．２  ＶＨ−Ｅの８個のコロニーにおけるＰＣＲスクリーニング反応を示す。８個のうちの３個、ＶＨＥ−２（レーン１１）、ＶＨＥ−４（レーン１４）及びＶＨＥ−７（レーン１７）は、６５０ｂｐ生成物バンドで陽性であり、５００ｂｐ生成物のｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターへのクローニングが成功したことを示している。残りの５個のＶＨＥ及び全８個のＶＨ−Ｃ反応は、より低い分子量のバンドを生成し、５００ｂｐ挿入の陰性の結果を示している。
【０２１０】
図４２は、ＡＲ４７Ａ６．４．２  ＶＬ−Ａの８個のコロニー及びＡＲ４７Ａ６．４．２  ＶＬ−Ｇの８個のコロニーにおけるＰＣＲスクリーニング反応を示す。全８個のＶＬＡコロニー（レーン２〜９）及び８個のうちの３個のＶＬＧコロニー、ＶＬＧ−１（レーン１０）、ＶＬＧ−３（レーン１２）及びＶＬＧ−５（レーン１４）は、６００ｂｐ生成物バンドで陽性であり、４５０ｂｐ生成物のｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターへのクローニングが成功したことを示している。残りの５個のＶＬ−Ｇ反応は、異なる分子量のバンドを生成し、４５０ｐｂ挿入の陰性の結果を示している。
【０２１１】
それぞれの連結から最大４個の陽性コロニーを選択して、５０ｍｇ／Ｌアンピリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）を含有する、５ｍＬの２ＹＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）ブロスに接種した。培養を、振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を使用してそれぞれの培養から抽出した。
【０２１２】
１．４  ＤＮＡ配列決定
９個のＡＲ４７Ａ６．４．２  ＶＬ及びＶＨクローン（ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６、ＶＬＧ−１、ＶＬＧ−３、ＶＨＥ−２、ＶＨＥ−４及びＶＨＥ−７）からのプラスミドＤＮＡを、Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌｔｄ．の配列決定施設（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で配列決定した。配列は、図４３及び４４に提示されており、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図４３は、配列番号８を示し、ＣＤＲ指定配列番号４〜６に下線を引いた。図４４は、配列番号７を示し、ＣＤＲ指定配列番号１〜３に下線を引いた。ＣＤＲ定義及びアミノ酸配列番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）従って行われる。Ｋａｂａｔ番号付けは、図４３及び４４のアミノ酸配列の上側に提示されている。
【０２１３】
正確なＡＲ４７Ａ６．４．２  ＶＬ配列は、５′プライマーＭｕＩｇκＶＬ−Ａで増幅された４個のクローンの全てにおいて見出された。５′プライマーＭｕＩｇκＶＬ−Ｇで増幅された２個のＶＬクローンは、異常免疫グロブリン遺伝子を含有した。正確なＡＲ４７Ａ６．４．２  ＶＨ配列は、５′プライマーＭｕＩｇＶＨ−Ｅで増幅された３個のクローンの全てにおいて見出された。
【０２１４】
実施例１７
競合結合の単離
抗体を得ると、個別の当業者は、競合的に阻害するＣＤＭＡＢ、例えば競合抗体を生成することができ、これは同じエピトープを認識するものである（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８：１５−１８（１９７３））。一つの方法は、抗体により認識される抗原を発現する免疫原により免疫化することを伴う。試料には、組織、単離タンパク質又は細胞株が含まれうるが、これらに限定はされない。得られたハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又はウエスタンブロッティングのような、試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するものである競合アッセイを使用して、スクリーニングすることができる。他の方法は、ファージディスプレー抗体ライブラリーを使用し、前記抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する抗体をパニングすることによって行うことができる（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１４：２９４−３００（２００３））。どちらの場合でも、抗体は、最初に標識された抗体とその標的抗原の少なくとも１つのエピトープとの結合を置き換える能力に基づいて選択される。したがって、そのような抗体は、元の抗体のように、抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する特徴を有する。
【０２１５】
実施例１８
ＡＲ４７Ａ６．４．２モノクローナル抗体の可変部領域のクローニング 
ＡＲ４７Ａ６．４．２ハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体の重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ）鎖の可変部領域の配列を決定した（実施例１６）。キメラ及びヒト化ＩｇＧを生成するために、可変部軽ドメイン及び可変部重ドメインを、発現のために適切なベクターにサブクローンすることができる。 
【０２１６】
別の実施態様において、ＡＲ４７Ａ６．４．２又はその脱免疫化、キメラ又はヒト化型は、抗体が発現し、回収することができるように、トランスジェニック動物において、抗体をコードする核酸を発現するように産生される。例えば、抗体は、組織特異的な方法で発現することができ、それは回収及び精製を促進する。一つのそのような実施態様において、本発明の抗体は授乳の際に哺乳動物の分泌腺において発現する。トランスジェニック動物には、マウス、ヤギ及びウサギが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１７】
（ｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ（実施例１で概説されている）は、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次にこれを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞に形質移入して、組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。相同性ネズミ配列をヒト重及び軽鎖定常部ドメインのコード配列で置換することにより、ＤＮＡを修飾することもできる。キメラ又はハイブリッド抗体を、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学において既知の方法を使用してインビトロで調製することもできる。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用して又はチオエーテル結合を形成することにより作成することができる。この目的に適切な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０２１８】
（ｉｉ）ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入されている１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「輸入」残基と呼ばれ、これは典型的には「輸入」可変部領域から取られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法を実施することができる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７−４０２（２０００））。 
【０２１９】
ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列及び多様な仮想的なヒト化生成物の分析プロセスより調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を例示し、表示する、コンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を検査するとことにより、候補免疫グロブリン配列の機能における配列の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。この方法によって、ＦＲ残基を、標的抗原への親和性の増加のような所望の抗体特性が達成されるように選択し、コンセンサス及び輸入配列から組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることにおいて直接的であり、最も実質的に関わっている。
【０２２０】
（ｉｉｉ）抗体フラグメント 
多様な技術が抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。これらのフラグメントは、組み換え宿主細胞により産生することができる（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８−５５７（１９９９）；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３６４−３７０（２０００）において論評されている）。例えば、Ｆａｂ′−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的に結合して、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを形成することができる。（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施態様において、Ｆ（ａｂ′）２は、Ｆ（ａｂ′）２分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成される。別の手段によると、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ′）２フラグメントを、組み換え宿主細胞培養から直接単離することができる。
【０２２１】
実施例１９ 
本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体を、癌を予防／治療する組成物として使用することができる。本発明の抗体を含有する、癌を予防／治療する組成物は、毒性が低く、液体調製物の形態でそのまま、又は適切な調製物の医薬組成物として、ヒト又は哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に経口又は非経口的（例えば、血管内、腹腔内、皮下など）に投与することができる。本発明の抗体をそのまま投与することができるか、又は適切な組成物として投与することができる。投与に使用される組成物は、薬理学的に許容される担体と、本発明の抗体又はその塩、希釈剤又は賦形剤とを含有することができる。そのような組成物は、経口又は非経口投与に適切な医薬調合剤の形態で提供される。
【０２２２】
非経口投与のための組成物の例は、注射用調合剤、坐剤などである。注射用調合剤には、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴注入、関節内注射などのような投与形態が含まれうる。これらの注射用調合剤は、公知の方法により調製することができる。例えば、注射用調合剤は、本発明の抗体又はその塩を、注射に都合よく使用される滅菌水性媒質又は油性媒質に、溶解する、懸濁する又は乳化することによって調製することができる。注射用の水性媒質としては、例えば、グルコース及び他の佐剤などを含有する等張液である、生理食塩水などであり、これを、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物））などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用することができる。油性媒質としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられ、これを、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて使用することができる。このように調製された注射は、通常、適切なアンプルに充填される。直腸投与に使用される坐剤は、本発明の抗体又はその塩を、坐剤の従来の基剤とブレンドすることによって調製することができる。経口投与のための組成物には、固体又は液体調合剤、特に、錠剤（糖衣錠及びフィルムコーティング剤を含む）、丸剤、顆粒剤、粉末状調合剤、カプセル剤（軟質カプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが含まれる。そのような組成物は、公知の方法により製造され、医薬調合剤の分野で慣用的に使用されるビヒクル、希釈剤又は賦形剤を含有することができる。錠剤のためのビヒクル又は賦形剤の例は、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウムなどである。 
【０２２３】
有利なことには、上記に記載された経口又は非経口使用のための組成物は、活性成分の用量に適合する単位用量で医薬調合剤に調製される。そのような単位用量調合剤には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。含有される前記の化合物の量は、一般に、投与単位形態あたり５〜５００ｍｇであり、上記に記載された抗体は、特に注射形態では約５〜約１００ｍｇ、他の形態では１０〜２５０ｍｇで含有される。
【０２２４】
本発明の抗体を含む上記の予防／治療剤又は調節剤の用量は、投与される被験者、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変わることができる。例えば、成人において、例えば乳癌を治療／予防する目的で使用される場合、本発明の抗体を約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で約１〜５回／日、好ましくは約１〜３回／日、静脈内投与することが有利である。他の非経口及び経口投与において、作用物質を上記に提示した用量に対応した用量で投与することができる。状態が特に重篤である場合、用量をその状態に応じて増加することができる。
【０２２５】
本発明の抗体をそのまま投与することができるか、又は適切な組成物の形態で投与することができる。投与に使用される組成物は、薬理学的に許容される担体と、上記の抗体又はその塩、希釈剤又は賦形剤とを含有することができる。そのような組成物は、経口又は非経口投与に適切な医薬調合剤の形態で提供される（例えば、血管内注射、皮下注射など）。上記に記載された組成物は、それぞれ、更に他の活性成分を含有することができる。更に本発明の抗体は、他の薬剤、例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミドなど）、代謝アンタゴニスト（例えば、メトトレキセート、５−フルオロウラシルなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシンなど）、植物由来抗腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、Ｔａｘｏｌなど）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカンなどと組み合わせて使用することができる。本発明の抗体及び上記に記載した薬剤を、同時に又は時間をずらして患者に投与することができる。
【０２２６】
本明細書に記載された、特に癌のための治療方法は、他の抗体又は化学療法剤と共に投与して実施することもできる。例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）のようなＥＧＦＲに対する抗体を、特に結腸癌を治療する場合に投与することもできる。ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）は、乾癬の治療に有効であることも示されている。組み合わせ使用のための他の抗体には、特に乳癌を治療する場合はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラツズマブ）、特に結腸癌を治療する場合はＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）及び特に非小型細胞肺癌を治療する場合はＳＧＮ−１５が含まれる。本発明の抗体と他の抗体／化学療法剤の投与は、同じ又は異なる経路を介して、同時に又は別々に実施することができる。
【０２２７】
利用される化学療法剤／他の抗体レジメンには、患者の状態の治療に最も適していると考えられる任意のレジメンが含まれる。異なる悪性度には、特定の抗腫瘍抗体及び特定の化学療法剤の使用が必要となる可能性があり、患者毎に決定される。本発明の好ましい実施態様において、化学療法は、抗体療法と同時に、又は、より好ましくはそれに続いて投与される。しかし、本発明は、いずれかの特定の方法又は投与経路に限定されないことが強調されるべきである。
【０２２８】
圧倒的な証拠が、ＡＲ４７Ａ６．４．２が抗癌効果を仲介し、ＴＲＯＰ−２に存在するエピトープの連結を介して生存期間を延長することを示している。ＡＲ４７Ａ６．４．２抗体を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のような発現細胞から同族抗原を免疫沈降できることが、実施例９、１０及び１１において示されている。更に、ＡＲ４７Ａ６．４．２抗体を、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ又はＩＨＣにより例示されるがこれらに限定されない技術を利用する、特異的に結合するＴＲＯＰ−２抗原部分を発現する細胞及び／又は組織の検出において使用できることが、実施例１、２及び１３〜１５に示されている。
【０２２９】
したがって、免疫沈降ＡＲ４７Ａ６．４．２抗原が、ＡＲ４７Ａ６．４．２の、そのような細胞又は組織への結合を阻害できることを、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ又はＩＨＣアッセイを使用して示すことができる。更に、ＡＲ４７Ａ６．４．２抗体と同様に、他の抗ＴＲＯＰ−２抗体も、他の形態のＴＲＯＰ−２抗原を免疫沈降及び単離するのに使用することができ、抗原も、同じ種類のアッセイを使用して、抗原を発現する細胞又は組織へのこれらの抗体の結合を阻害することに使用できる
【０２３０】
本明細書で記述されている全ての特許及び出版物は、本発明が関わる当業者のレベルを示している。全ての特許及び出版物は、それぞれ個別の出版物が明確かつ個別に参照として本明細書に組み込まれることを示すかのように、同じ程度で参照として本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
本発明の特定の形態が例示されているが、本明細書に記載され、示されている部分の特定の形態又は配置に限定されないことを理解するべきである。本発明の範囲から逸脱することなく多様な変更を行うことができ、本発明を、明細書に示され、記載されているものに限定することが考慮されないことは、当業者には明白である。当業者は、本発明が目的を実行するために十分に適合されることを容易に理解し、記述される目的と利点、並びにそれらに固有のものを容易に得るであろう。本明細書で記載されているオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順及び技術のいずれも、好ましい実施の現在の代表例であり、例示的であることが意図され、範囲を制限するものとして意図されてはいない。本明細書の変更及び他の使用を当業者は考えつき、それは本発明の精神の範囲内に包含され、添付の請求項の範囲によって定義される。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されてきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施例に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、本発明を実施するために記載された様式の多様な修正は、当業者には明白であり、請求項の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】細胞株ＯＣＣ−１、ＯＶＣＡＲ−３及びＣＣＤ−２７ｓｋに対するハイブリドーマ上澄みの細胞障害性及び結合レベルの率を比較する。
【図２】癌及び正常細胞株へのＡＲ４７Ａ６．４．２及び抗ＥＧＦＲ抗体対照の結合を表にまとめる。データは、アイソタイプ対照を越える折り畳みの増加として平均蛍光強度を表す。
【図３】幾つかの癌及び非癌細胞株に対して向けられたＡＲ４７Ａ６．４．２及び抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む。
【図４】予防ＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図５】予防ＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図６】確立したＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図７】確立したＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図８】予防ＰＬ４５膵癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図９】予防ＰＬ４５膵癌モデルにおける生存に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。
【図１０】予防ＰＬ４５膵癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図１１】予防ＰＣ−３前立腺癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図１２】予防ＰＣ−３前立腺癌モデルにおける生存に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。
【図１３】予防ＰＣ−３前立腺癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図１４】予防ＭＣＦ−７乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは中央値＋／−ＳＥＭを表す。
【図１５】予防ＭＣＦ−７乳癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図１６】予防ＭＣＦ−７乳癌モデルにおける生存に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。
【図１７】予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。縦線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは中央値＋／−ＳＥＭを表す。
【図１８】予防Ｃｏｌｏ２０５結腸癌モデルにおける体重に対するＡＲ４７Ａ６．４．２の効果を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図１９】ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の全膜画分（レーン１）及びＰＣ−３の全細胞溶解産物（レーン２）及びＣＣＤ−２７ｓｋ細胞株（レーン３）からの試料のウエスタンブロットである。分子量目盛りを左側に示す。
【図２０】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）及びアイソタイプ対照（レーン２）の免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロットである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の全膜画分とインキュベートしなかった抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズも、陰性対照（レーン３及び４）として使用した。３つの複製ブロットを、抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２、IｇＧ２ａアイソタイプ対照又は一次抗体なしのいずれかでプローブした。分子量目盛りを左側に示す。
【図２１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．1（レーン２及び３）又はアイソタイプ対照（レーン１及び４）の免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロットである。複製アリコートを、グリコシダーゼ酵素の混合物の存在下（レーン３及び４）並びに不在下（緩衝剤のみ、レーン１及び２）でインキュベートした。分子量目盛りを左側に示す。
【図２２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）及びアイソタイプ対照抗体（レーン２）の大規模免疫沈降により調製された免疫複合体のウエスタンブロット（中央パネル）及びコロイド染色（左側パネル）の画像の並列である。ＡＲ４７Ａ６．４．２結合タンパク質Ｇセファロースビーズのみ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とインキュベートしない）も陰性対照（レーン３）として使用した。分子量目盛りを左側に示す。
【図２３】トリプシン消化後の質量分析により分析するために、タンパク質試料を抜き取って単離する前と後でコロイドブルー染色したゲルの画像である。レーンの記載は図２０と同じである。分子量目盛りを左側に示す。
【図２４】コロイドブルー染色ゲルから抜き取って得られた試料のトリプシン消化後に得られた質量スペクトル写真である。質量スペクトル写真の下側は、Ｐｒｏｆｏｕｎｄ検索結果概要である。
【図２５】ＡＲ４７Ａ６．４．２免疫沈降のトリプシン消化後に得られた特有のペプチドのうちの１つのＭＳ／ＭＳ分析のＭＡＳＣＯＴ検索結果概要である。配列番号９が示されている。
【図２６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの、ＡＲ４７Ａ６．４．２（レーン１）及びアイソタイプ対照抗体（レーン３）により得られた免疫複合体のウエスタンブロットである。ＡＲ４７Ａ６．４．２結合タンパク質Ｇセファロースビーズのみである（「ニセＩＰ」も陰性対照（レーン２）として使用した）。複製ブロットを、ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒトＴＲＯＰ−２及びアイソタイプ対照でプローブした。分子量目盛りを左側に示す。
【図２７】精製ヒト組み換えタンパク質ＴＲＯＰ−２（レーン１）及びＣＤ６３大型細胞外ドメイン（レーン２）のウエスタンブロットである。複製ブロットを、ＡＲ４７Ａ６．４．２、抗ヒトＴＲＯＰ−２、１Ａ２４５．６又はアイソタイプ対照のいずれかでプローブした。分子量目盛りを左側に示す。
【図２８】ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした、変性及び非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）及び脱グリコシル化（Ｄ）された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）及び組み換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）である。
【図２９】抗ヒトＴＲＯＰ−２でプローブした、変性及び非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）及び脱グリコシル化（Ｄ）された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）及び組み換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）である。
【図３０】ＩｇＧアイソタイプ対照でプローブした、変性及び非変性条件下でグリコシル化（Ｇ）及び脱グリコシル化（Ｄ）された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質（ＭＢ−２３１）及び組み換えヒトＴＲＯＰ−２（ｒｈＴＲＯＰ−２）である。
【図３１】異なる一次抗体溶液でプローブした組み換えヒトＴＲＯＰ−２のウエスタンブロットである。レーン３〜７は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５でプローブした。レーン９〜１３は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５でプローブした。レーン１５〜１９は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化８Ａ３Ｂ．６とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５でプローブした。レーン８及び１４は、陰性対照溶液とインキュベートし、レーン８は、二次溶液とインキュベートしなかった。レーン１、２及び２０は、ＴＢＳＴのみとインキュベートした。
【図３２】異なる一次抗体溶液でプローブした組み換えヒトＴＲＯＰ−２のウエスタンブロットである。レーン３〜７は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ５２Ａ３０１．５とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした。レーン９〜１３は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした。レーン１５〜１９は、０．５マイクログラム／ｍＬ、５マイクログラム／ｍＬ、５０マイクログラム／ｍＬ、５００マイクログラム／ｍＬ及び１０００マイクログラム／ｍＬの非ビオチン化１Ｂ７．１１とそれぞれ混合したビオチン化ＡＲ４７Ａ６．４．２でプローブした。レーン８及び１４は、陰性対照溶液とインキュベートし、レーン８は、二次溶液とインキュベートしなかった。レーン１、２及び２０は、ＴＢＳＴのみとインキュベートした。
【図３３】正常ヒト組織マイクロアレイに対する、陽性及び陰性対照と対比したＡＲ４７Ａ６．４．２のＩＨＣ比較を表にまとめる。
【図３４】ヒト正常組織マイクロアレイから、ＡＲ４７Ａ６．４．２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た脾臓組織の結合パターン及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た脳組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。
【図３５】異なる組織マイクロアレイからの多様なヒト腫瘍及び正常組織に対するＡＲ４７Ａ６．４．２のＩＨＣ比較を表にまとめる。
【図３６】多様なヒト腫瘍組織マイクロアレイから、ＡＲ４７Ａ６．４．２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得た乳房腫瘍組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た前立腺腫瘍組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｅ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｆ）で得た膵臓腫瘍組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。倍率は、乳房及び膵臓腫瘍組織では４００×であり、前立腺腫瘍組織では２００×である。
【図３７】異なる正常種組織マイクロアレイからの多様なヒト及び他の種の正常組織切片に対するＡＲ４７Ａ６．４．２のＩＨＣ比較を表にまとめる。
【図３８】多様な多種組織マイクロアレイから、ＡＲ４７Ａ６．４．２（Ａ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂ）で得たヒト腎臓組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｃ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｄ）で得た正常カニクイザル腎臓組織の結合パターン、及びＡＲ４７Ａ６．４．２（Ｅ）又はアイソタイプ対照抗体（Ｆ）で得た正常アカゲザル組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。
【図３９】ＡＲ４７Ａ６．４．２のネズミ配列決定に使用した全てのオリゴヌクレオチドプライマーの配列（配列番号１０〜４７）である。
【図４０】ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨ及びＶＬ領域のＲＴ／ＰＣＲ増幅のアガロースゲルである。
【図４１】ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨ−Ｃ及びＶＬ−ＥのＰＣＲコロニースクリーニングのアガロースゲルである。
【図４２】ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＬＡ及びＶＬＧのＰＣＲコロニースクリーニングのアガロースゲルである。
【図４３】ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＬアミノ酸配列（配列番号８）である。
【図４４】ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨアミノ酸配列（配列番号７）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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