(57)【要約】I-CreIモノマーの一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメインのそれぞれに1つずつ、少なくとも2つの置換を有するI-CreI変異型であって、RAG遺伝子からのDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型。RAG遺伝子内の変異に関連するSCID症候群の予防及び治療のための、該変異型及び派生生成物の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つのI-CreIモノマーの少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメインのそれぞれに1つずつ、少なくとも2つの置換を有し、RAG遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、少なくとも以下の工程：
(a) I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b) I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c) 工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(d) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e) 工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f) 工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(g) 工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を単一変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、かつ(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI変異型を得て、
(h) 工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を単一変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、前記ゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI変異型を得て、
(i) 工程(g)及び(h)で得られた変異型を組み合わせてヘテロダイマーを形成し、
(j) RAG遺伝子からの前記ゲノムDNA標的を切断できる工程(i)からのヘテロダイマーを選択及び／又はスクリーニングする
を含む方法により得ることができることを特徴とする、I-CreI変異型。
【請求項２】
I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン中の前記置換が、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある請求項1に記載の変異型。
【請求項３】
I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン中の前記置換が、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位にある請求項1に記載の変異型。
【請求項４】
I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に変異を有する2つの同一モノマーの会合により得られるホモダイマーであり、該ホモダイマーがRAG遺伝子からのパリンドローム又は偽パリンドロームDNA標的配列を切断できる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項５】
I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位に異なる変異を有する第1モノマー及び第2モノマーの会合により得られるヘテロダイマーであり、該ヘテロダイマーがRAG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断できる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項６】
RAG遺伝子からの前記DNA標的配列に対する結合及び／又は切断特性を改良する1又は複数の置換を含む請求項1〜5のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項７】
前記置換が、I-CreIの4位、6位、19位、34位、43位、49位、50位、54位、79位、80位、82位、85位、86位、87位、94位、96位、100位、103位、105位、107位、108位、114位、115位、116位、117位、125位、129位、131位、132位、139位、147位、150位、151位、153位、154位、155位、157位、159位、及び／又は160位にある請求項6に記載の変異型。
【請求項８】
前記置換が、G19S、G19A、F54L、S79G、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される請求項7に記載の変異型。
【請求項９】
前記置換が、当初のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L及びVからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである請求項1〜8のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１０】
ヘテロダイマーの1つのモノマーが、機能的ホモダイマーの形成を損ない、前記ヘテロダイマーの活性を増大させるG19S置換を含む請求項5〜9のいずれか1項に記載のヘテロダイマー変異型。
【請求項１１】
前記DNA標的配列が、ヒトRAG遺伝子からである請求項1〜10のいずれか1項に記載の変異型。
【請求項１２】
前記DNA標的が、配列番号148〜177の配列からなる群より選択されるヒトRAG1遺伝子からの配列である請求項5〜11のいずれか1項に記載のヘテロダイマー変異型。
【請求項１３】
前記DNA標的が、配列番号178〜202の配列からなる群より選択されるヒトRAG2遺伝子からの配列である請求項5〜11のいずれか1項に記載のヘテロダイマー変異型。
【請求項１４】
以下の配列の対から選択される第1モノマーと第2モノマーとからなるヘテロダイマーである請求項12に記載のヘテロダイマー変異型：配列番号2と39、配列番号3と40、配列番号4と41、配列番号5と42、配列番号6又は10と配列番号42〜49のいずれか、配列番号7、8又は11と配列番号42〜44及び46〜49のいずれか、配列番号9と配列番号43、248〜253のいずれか、配列番号12と配列番号42〜44及び46〜48のいずれか、配列番号13と50、配列番号14と51、配列番号15と52、配列番号16と53、配列番号17と54、配列番号18と55、配列番号19と56、配列番号20と57、配列番号21と58、配列番号22と59、配列番号23と60、配列番号24と61、配列番号25と62、配列番号26と63、配列番号27と64、配列番号28と65、配列番号29と66、配列番号30と67、配列番号31と68、配列番号32と69、配列番号33と70、配列番号34と71、配列番号35と72、配列番号36と73、配列番号37と74、配列番号38と75。
【請求項１５】
以下の配列の対から選択される第1モノマーと第2モノマーとからなるヘテロダイマーである請求項13に記載のヘテロダイマー変異型：配列番号76と103、配列番号77と104、配列番号78と105、配列番号79と106、配列番号80と107、配列番号81と108、配列番号82と109、配列番号83と配列番号110〜128、236、237のいずれか、配列番号84と配列番号129又は236、配列番号85と130、配列番号86と131、配列番号87と132、配列番号88と133、配列番号89と134、配列番号90と135、配列番号91と136、配列番号92と137、配列番号93と138、配列番号94と139、配列番号95と140、配列番号96と141、配列番号97と142、配列番号98と143、配列番号99と144、配列番号100と145、配列番号101と146、配列番号102と147、配列番号238〜240と配列番号236、配列番号241〜247と配列番号237。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか1項に記載のI-CreI変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼ。
【請求項１７】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の変異型又は請求項16に記載の単鎖キメラエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項１８】
請求項17に記載のポリヌクレオチドフラグメントを少なくとも1つ含む発現ベクター。
【請求項１９】
2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含み、それぞれのフラグメントが、請求項5、10及び12〜15のいずれか1項で定義されるヘテロダイマー変異型のモノマーの1つをコードする請求項18に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項1、4、5及び11〜13のいずれか1項で定義される、変異型のゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列で挟まれた、導入される配列を含むターゲティング構築物を含むベクター。
【請求項２１】
請求項1、4、5及び11〜13のいずれか1項で定義される、変異型のゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列で挟まれた、導入される配列を含むターゲティング構築物を含む請求項18又は19に記載のベクター。
【請求項２２】
前記導入される配列が、RAG遺伝子中の変異を修復する配列である請求項20又は21に記載のベクター。
【請求項２３】
前記変異を修復する配列が、RAG遺伝子の正しい配列である請求項22に記載のベクター。
【請求項２４】
前記変異を修復する配列が、RAG ORF及び3'の転写を停止するポリアデニル化部位を含む請求項22に記載のベクター。
【請求項２５】
変異型のゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する前記配列が、ヒトRAG1遺伝子の6位〜205位、1603位〜1802位、2219位〜2418位、5181位〜5380位、5222位〜5421位、5499位〜5698位、5709位〜5908位、5936位〜6135位、6049位〜6248位、6097位〜6296位、6212位〜6411位、6270位〜6469位、6521位〜6720位、6559位〜6758位、6667位〜6866位、6710位〜6909位、6853位〜7052位、6976位〜7175位、7012位〜7211位、7168位〜7367位、7207位〜7406位、7231位〜7430位、7478位〜7677位、7622位〜7821位、7709位〜7908位、7920位〜8119位、8144位〜8343位、8149位〜8348位、8252位〜8451位、及び／又は8271位〜8470位を含むヒトRAG1遺伝子のフラグメントである請求項20〜24のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項２６】
変異型のゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する前記配列が、ヒトRAG2遺伝子の-12位〜187位、289位〜488位、432位〜631位、559位〜758位、657位〜856位、730位〜929位、879位〜1078位、1239位〜1438位、1422位〜1621位、1618位〜1817位、1795位〜1994位、2200位〜2399位、2270位〜2469位、2399位〜2598位、2894位〜3093位、3349位〜3548位、3774位〜3973位、3949位〜4148位、4210位〜4409位、4693位〜4892位、4951位〜5150位、5212位〜5411位、5615位〜5814位、5810位〜6009位及び／又は5965位〜6164位を含むヒトRAG2遺伝子のフラグメントである請求項20〜24のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項25又は26で定義されるヒトRAG1又はRAG2遺伝子のフラグメントと、変異型切断部位とヒトRAG1又はRAG2遺伝子変異部位との間の全ての配列とを少なくとも含む請求項23、25及び26のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項16に記載の1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、及び／又は請求項18〜27のいずれか1項に記載の少なくとも1つの発現ベクターを含む組成物。
【請求項２９】
請求項23〜27のいずれか1項で定義される変異型のゲノムDNA標的切断部位を取り囲む領域と相同性を示す配列で挟まれた、RAG遺伝子内の変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ターゲティングDNA構築物が、組換えベクターに含まれる請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
RAG遺伝子内の変異に関連するSCID症候群の予防又は治療における同時、別々又は逐次的な使用のための組み合わせ製剤としての、請求項18又は19に記載の発現ベクターと、請求項20及び22〜27に記載のターゲティング構築物を含むベクターとを含有する製品。
【請求項３２】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項16に記載の1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、及び／又は請求項18〜27のいずれか1項に記載の1つの発現ベクターの、必要とする個体におけるRAG遺伝子内の変異に関連するSCID症候群を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
【請求項３３】
請求項17に記載のポリヌクレオチド又は請求項18〜27のいずれか1項に記載のベクターにより改変された宿主細胞。
【請求項３４】
請求項18〜20のいずれか1項で定義される1又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３５】
請求項18〜20のいずれか1項で定義される1又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項３６】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項16に記載の1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、請求項18〜27のいずれか1項に記載の1つのベクターの、非治療目的でのゲノム工学のための使用。
【請求項３７】
前記変異型、単鎖キメラエンドヌクレアーゼ又はベクターが、請求項21〜27のいずれか1項で定義されるターゲティングDNA構築物と会合している請求項36に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RAG遺伝子からのDNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼ変異型、該変異型をコードするベクター、該ベクターにより改変された細胞、動物又は植物、並びにインビボ及びエクスビボ(遺伝子細胞療法)でのゲノム療法、及びゲノム工学のための該メガヌクレアーゼ変異型及びその派生生成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Tリンパ球成熟の欠陥を原因とする重症複合免疫不全症(SCID)は、Bリンパ球の機能的欠陥を常に伴う(Cavazzana-Calvoら, Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585〜602; Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。全体的な発生率は、出生75000当たり1と見積もられる。SCIDを治療していない患者は、多重日和見微生物感染になり、通常、1年を超えて生存しない。SCIDは、家族性ドナーからの同種造血幹細胞移植により治療できる。ドナーとの組織適合性は、広く変動し得る。SCIDの1つの形であるアデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症の場合、患者は、組換えアデノシンデアミナーゼ酵素の注射により治療され得る。
【０００３】
ADA遺伝子は、SCID患者において変異していることが示されているので(Giblettら, Lancet, 1972, 2, 1067〜1069)、SCIDに関係するいくつかのその他の遺伝子が同定されている(Cavazzana-Calvoら, Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585〜602; Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。SCIDの原因には、4つの主要なものがある：(i) ADA遺伝子における変異が、リンパ球前駆体にとって致命的なプリン代謝の欠陥をもたらし、これは次いでB、T及びNK細胞の不在を導く。(ii) SCIDの最も頻繁な形であるSCID-X1は、T、B及びNK細胞サイトカイン受容体の成分であるγCをコードする遺伝子における変異を原因とする(Noguchiら, Cell, 1993, 73, 147〜157)。この受容体は、JAK3キナーゼを介していくつかの標的を活性化し(Macchiら, Nature, 1995, 377, 65〜68)、これが不活性化されると、γC不活性化と同じ症候群がもたらされる。(iii) 欠陥V(D)J組換えは、免疫グロブリン及びTリンパ球受容体(TCR)の成熟における必須工程である。このプロセスに関係する3つの遺伝子である組換え活性化遺伝子1及び2 (RAG1及びRAG2)並びにアルテミス(Artemis)の変異は、T及びBリンパ球の不在をもたらす。RAG1及びRAG2は、V(D)J組換えの開始を担う2つのタンパク質である(Schatzら, Cell, 1989, 59, 1035〜1048; Oettingerら, Science, 1990, 248, 1517〜1523)。これらのタンパク質は、免疫グロブリン及びTCR遺伝子座のV、D及びJコードセグメントに隣接する組換え配列(RS)に結合し、複合体切断反応を触媒する。切断は、RSとコードセグメントとの間で生じるDNA二本鎖切断(DSB)をもたらし、その切れ目の一端は平滑末端であり(RS側)、他方はヘアピンである(Dudleyら, Adv. Immunol., 2005, 86, 43〜112)。このヘアピンは、アルテミスタンパク質により切断され、Lig4及びXRCC4のような非相同末端結合(NHEJ)因子により処理される(Moshousら, Cell, 2001, 105, 177〜186)。B及びT細胞がないことに加えて、アルテミス遺伝子の変異も、細胞の放射線感受性の増加に関連する(Moshousら, Cell, 2001, 105, 177〜186)。RS-SCIDとよばれるこの特定の表現型は、おそらく、免疫グロブリン成熟及びDNA維持の両方におけるアルテミスの役割によるであろう。(iv) T細胞特異的シグナル伝達に関係するCD45のようなその他の遺伝子における変異も報告されているが、これらは少数の症例である(Cavazzana-Calvoら, Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585〜602; Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。
【０００４】
それらの遺伝子的基礎が同定されてから、異なるSCIDの形は、2つの主な理由から、遺伝子治療アプローチの典型となっている(Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。
【０００５】
第1に、全ての血液疾患でのように、エクスビボ治療が構想できる。造血幹細胞(HSC)は、骨髄から回収でき、数世代の細胞分裂の間、その多分化能を維持できる。よって、それらはインビトロで処理でき、患者に再注入されて、そこで骨髄に再び定住する。
【０００６】
第2に、T及びB細胞並びに前駆細胞の成熟がSCID患者で損なわれているので、修正された細胞は、選択的利点を有する。よって、修正された細胞の少数は、機能的免疫系を回復できる。この仮定は、(i) SCID患者における変異の復帰に関連する免疫機能の部分的回復(Hirschhornら, Nat. Genet., 1996, 13, 290〜295; Stephanら, N. Engl. J. Med., 1996, 335, 1563〜1567; Boussoら, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 2000, 97, 274〜278; Wadaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 8697〜8702; Nishikomoriら, Blood, 2004, 103, 4565〜4572)、(ii) 造血細胞におけるインビトロでのSCID-X1欠損の修正(Candottiら, Blood, 1996, 87, 3097〜3102; Cavazzana-Calvoら, Blood, 1996, Blood, 88, 3901〜3909; Taylorら, Blood, 1996, 87, 3103〜3107; Hacein-Beyら, Blood, 1998, 92, 4090〜4097)、(iii) 動物モデルにおけるインビボでのSCID-X1 (Soudaisら, Blood, 2000, 95, 3071〜3077; Tsaiら, Blood, 2002, 100, 72〜79), JAK-3 (Buntingら, Nat. Med., 1998, 4, 58〜64; Buntingら, Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2353〜2364)及びRAG2 (Yatesら, Blood, 2002, 100, 3942〜3949)欠損の修正、並びに(iv) 遺伝子治療の臨床試験の結果(Cavazzana-Calvoら, Science, 2000, 288, 669〜672; Aiutiら, Nat. Med., 2002, 8, 423〜425; Gasparら, Lancet, 2004, 364, 2181〜2187)により何度も確認されている。
【０００７】
90年代から、多くの遺伝子治療臨床試験により、非常に有用な情報の大部分が得られている。これらの研究は、全て、ウイルスベクターを用いてゲノムに導入された機能的遺伝子による変異遺伝子の相補に基づく。SCID-X1 (γC欠損)についての臨床試験は、遺伝子治療により治療された10人の患者のうち9人において機能的免疫系の回復をもたらした(Cavazzana-Calvoら, Science, 2000, 288, 669〜672)。他の成功した臨床試験は、4人のSCID-X1患者(Gasparら, Lancet, 2004, 364, 2181〜2187)、及び4人のADA患者(Aiutiら, Science, 2002, 296, 2410〜2413)で行われ、遺伝子治療アプローチの利点を確実にした。しかし、初期の試験は、このアプローチに関連する危険性も示した。後に、3人の患者は急性白血病に非常によく似た単クローン性リンパ球増殖を発生した。これらのリンパ球増殖は、挿入突然変異誘発による、細胞性腫瘍遺伝子の活性化と関連する。3つの全ての症例において、増殖細胞は、同じ遺伝子座へのレトロウイルスベクターの挿入を特徴とし、LMO2遺伝子の過剰発現をもたらした(Hacein-Beyら, Science, 2003, 302, 415〜419; Fischerら, N. Engl. J. Med., 2004, 350, 2526〜2527)。
【０００８】
よって、これらの結果は、遺伝性疾患の治療における「ゲノム治療」の非凡な能力と、組込みレトロウイルスベクターの限界との両方を示した(Kohnら, Nat. Rev. Cancer, 2003, 3, 477〜488)。新規なエレクトロポレーション法の開発にもかかわらず(AMAXA GmbHからのNucleofector (登録商標)法; PCT/EP01/07348、PCT/DE02/01489及びPCT/DE02/01483)、ウイルスベクターは、今までのところ、HSCにおける最も有望な結果を示している。MoMLV (モロニーマウス白血病ウイルス)に由来するレトロウイルスが、臨床試験用を含む(上記を参照)効率的なHSCの形質導入に用いられている。しかし、伝統的なレトロウイルスベクターは、サイクルを経る(cycling)細胞にしか形質導入せず、モロニーベクターを用いるHSCの形質導入は、成長因子を用いるそれらの刺激及び有糸分裂の誘導を必要とし、よって、エクスビボでのそれらの多分化能を大きく損なう。これとは対照的に、HIV-1に由来するレンチウイルスベクターは、非有糸分裂細胞を効率的に形質導入でき、HSC形質導入に完璧に適合する(Loganら, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 429〜436)。このようなベクターを用いて、フラップDNAの挿入は、核への侵入、よってHSC形質導入の割合を大きく刺激する(Sirvenら, Blood, 2000, 96, 4103〜4110; Zennouら, Cell, 2000, 101, 173〜185)。しかし、レンチウイルスベクターも組込み可能であり、モロニーベクターと同じ潜在的危険性を有する。ゲノムへの挿入の後に、ウイルスのLTRのプロモーター及びエンハンサーは、隣接する遺伝子の発現を刺激できる(上記を参照)。LTR3'からのU3領域のエンハンサー及びプロモーターの欠失は、選択であり得る。レトロ転写の後に、この欠失は、LTR5'で重複し、「デルタU3」又は「自己不活化」とよばれるこれらのベクターは、隣接する遺伝子の活性化に起因する挿入突然変異誘発の危険性を回避できる。しかし、これらは、挿入による遺伝子不活化、又は転写読み過しの危険性を喪失しない。
【０００９】
標的にされた相同組換えは、現在のアプローチにより生じる問題点を迂回する別の選択肢である。現在の遺伝子治療方策は、無作為に挿入されているが機能的な遺伝子過剰コピーが、変異された内因性コピーの機能を与える相補アプローチに基づく。対照的に、相同組換えは、インサイチューでの変異の正確な修正を可能にするはずである(図1A)。
【００１０】
相同遺伝子を標的にする方策は、染色体での内因性遺伝子のノックアウト(Capecchi, M. R., Science, 1989, 244, 1288〜1292; Smithies, O., Nat. Med., 2001, 7, 1083〜1086)、又は外因性配列のノックインに用いられている。これは、遺伝子修正、及び原則的に単一遺伝子疾患に関連する変異の修正にも用い得る。しかし、この応用は、プロセスの低い効率のために(トランスフェクションされた細胞の10-6〜10-9)、実際は難しい。最近10年間で、この収率を増進するためにいくつかの方法が開発されている。例えば、キメラ形成法(De Semirら J. Gene Med., 2003, 5, 625〜639)及び小型断片相同置換(Small Fragment Homologous Replacement) (Gonczら, Gene Ther, 2001, 8, 961〜965; Brusciaら, Gene Ther., 2002, 9, 683〜685; Sangiuoloら, BMC Med. Genet., 2002, 3, 8; De Semir, D.及びJ.M. Aran, Oligonucleotides, 2003, 13, 261〜269)は、ともに、CFTRの変異を修正しようとして用いられ、その成功レベルは様々である。
【００１１】
組換えの効率を増進させるその他の方策は、メガヌクレアーゼを用いて標的遺伝子座にDNA二本鎖切断(DSB)をもたらすことである。メガヌクレアーゼは、定義によると、大きい配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Chevalier, B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。これらは生細胞中の独特の部位を切断でき、そのことにより、切断部位の近傍での遺伝子ターゲティングを1000倍以上増進する(Puchtaら, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5034〜5040; Rouetら, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜8106; Choulikaら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜1973; Puchtaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055〜5060 ; Sargentら, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267〜77; Donohoら, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070〜4078; Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101; Cohen-Tannoudjiら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444〜1448)。このようなメガヌクレアーゼは、SCIDのような遺伝性単一遺伝子疾患の原因である変異を修正するために用い得る。
【００１２】
遺伝的欠陥を修正するための最も正確な方法は、遺伝子の変異していないコピーを有する修復マトリクスを用いて、変異の復帰をもたらすことである(図1A)。しかし、遺伝子修正の効率は、変異とDSBの間の距離が増えるに従って減少し、200 bpの距離で5倍減少する(1/5)。よって、所定のメガヌクレアーゼは、そのDNA標的の近傍の変異しか修正するために用いることができない。「エキソンノックイン」とよばれる代替法を、図1Bで説明する。この場合、遺伝子の5'部分で切断するメガヌクレアーゼは、有害変異の上流の機能的エキソン配列をノックインするために用い得る。この方法は、導入遺伝子をその通常に位置に配置するが、エキソン重複ももたらし、その長い範囲にわたる影響は評価されるべきまま残っている。さらに、天然にシス作用性(cis-acting)の要素が切断の下流のイントロンに配置される場合、それらの直接の環境は改変され、それらの本来の機能も探索される必要があろう。しかし、この方法は、すばらしい利点を有する：単独のメガヌクレアーゼを多くの異なる患者に用いることができる。
【００１３】
しかし、この技術の使用は、天然のメガヌクレアーゼのレパトアにより制限される。例えば、ヒトSCID遺伝子中には既知の天然メガヌクレアーゼの切断部位がない。よって、仕立てられた特異性を有するメガヌクレアーゼを作製する探索が精力的に行われており、多くの実験室は天然メガヌクレアーゼの特異性を変更するか、または人工エンドヌクレアーゼを作製することを試みている。
【００１４】
近年、ジンクフィンガータンパク質とクラスIIS制限エンドヌクレアーゼであるFokIの触媒ドメインとの融合体を用いて、機能的配列特異的エンドヌクレアーゼが作製された(Smithら, Nucleic Acids Res., 1999, 27, 674〜681; Bibikovaら, Mol. Cell. Biol., 2001, 21, 289〜297; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764〜; Porteus, M.H.及びD. Baltimore, Science, 2003, 300, 763〜; Alwinら, Mol. Ther., 2005, 12, 610〜617; Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651; Porteus, M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446)。このようなヌクレアーゼは、最近、リンパ球系列からのヒト細胞におけるILR2G遺伝子の工学的作製(engineering)のために用いられた(Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651)。
【００１５】
Cys2-His2型ジンクフィンガータンパク質(ZFP)は操作するのが容易な単純でモジュール性のシステムである。なぜなら、ZFP特異性は、フィンガー当たり実質的に4つの残基により駆動されているからである(Paboら, Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, 313〜340; Jamiesonら, Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2, 361〜368)。Pabo (Rebar, E.J.及びC.O. Pabo, Science, 1994, 263, 671〜673; Kim J.S.及びC.O. Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1998, 95, 2812〜2817)、Klug (Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167; Isalanら, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)及びBarbas (Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167; Isalanら, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)の実験室からの研究は、ほとんどのG/ANNG/ANNG/ANN配列に結合可能な新規な人工ZFPの大きいレパトアをもたらした。
【００１６】
にもかかわらず、特に、治療的応用のような非常に高レベルの特異性を必要とする応用のためには、ZFPは制限があるだろう。最近、融合体中のFokIヌクレアーゼ活性が、FokIのいくつかのDNA結合欠損変異体の存在下を含んで1つの認識部位又はDNAループを介して様々な距離で分けられている2つの部位のいずれかと作用することが示された(Cattoら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1711〜1720)。つまり、哺乳動物(Porteus, M.H.及びD. Baltimore, Science, 2003, 300, 763〜)及びショウジョウバエ(Drosophila) (Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764)の細胞での毒性により示されるように、特異性は非常に退化している。
【００１７】
野生では、メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)により実質的に代表される。ホーミングエンドヌクレアーゼは、数百のタンパク質ファミリーを含む天然のメガヌクレアーゼの広範にわたるファミリーである(Chevalier B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3774)。これらのタンパク質は、「ホーミング」とよばれるプロセスにより伝播する可動性遺伝要素によりコードされる：エンドヌクレアーゼは、該可動性要素が存在しない同族対立遺伝子を切断することにより、受容遺伝子座中に可動性DNAを重複させる相同組換え事象を刺激する。効率及び特異性の点でのそれらの例外的な切断特性に鑑みて、これらは、新規で高度に特異的なエンドヌクレアーゼをもたらすために理想的な足場であり得る。
【００１８】
HEは、4つの主要なファミリーに属する。触媒中心に含まれる保存されたペプチドモチーフにちなんで名付けられたLAGLIDADGファミリーは、最も広範にわたり、最も特徴付けられた群である。7つの構造が現在では入手可能である。このファミリーからのほとんどのタンパク質はモノマーであり、かつ2つのLAGLIDADGモチーフを示す一方、1つのモチーフしか有さないものがいくつか存在するが、これらは二量体化してパリンドローム又は偽パリンドローム(pseudo-palidromic)標的配列を切断する。
【００１９】
LAGLIDADGペプチドはファミリーのメンバーの中で唯一の保存領域であるが、これらのタンパク質は、非常に良く似た構造を有する(図2A)。触媒コアは、I-CreI (Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316)、及びI-MsoI (Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)のようなホモダイマーについて完全2回回転対称を有し、I-SceI (Moureら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 685〜695)、I-DmoI (Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜1136)又はI-AniI (Bolducら, Genes Dev., 2003, 17, 2875〜2888)のようなモノマーについて擬対称を有する2つのDNA結合ドメインに挟まれている。両方のモノマー、又は両方のドメイン(モノマータンパク質について)は、二価カチオンの周りで組織化された触媒コアに寄与する。触媒コアのすぐ上部には、2つのLAGLIDADGペプチドが二量体化界面において必須の役割も演じている。DNA結合は、DNA主溝に位置する2つの典型的なサドル形のββαββ折り畳みに依存する(図2A)。その天然の標的に結合しているI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて、8つの残基(Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68及びR70)が、±3、4、5、6、7、9及び10位の7つの塩基と直接の相互作用を確立することを示す(図3)。さらに、いくつかの残基が、いくつかの塩基と；例えばS40及びN30が+8位及び-8位の塩基対と水媒介接触を確立している(Chevalierら, 2003, 既出)。他のドメインは、例えば、PI-PfuI (Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901)及びPI-SceI (Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜770)のようなインテインにおいて見出すことができ、このタンパク質スプライシングドメインもDNA結合に関係する。
【００２０】
機能的キメラメガヌクレアーゼの作製は、LAGLIDADGタンパク質の可塑性を示している。新しいメガヌクレアーゼは、異なるモノマーのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを交換することにより得ることができる(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; PCT国際出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。異なるメガヌクレアーゼからのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインがスペーサにより連結されたこれらの単鎖キメラメガヌクレアーゼは、半分の(half)親のDNA標的配列の2つの融合に相当するハイブリッド標的を切断できる。
【００２１】
また、種々のグループがI-CreI、I-SceI、I-MsoI及びPI-SceI HEの特異性を局所的に変更する合理的なアプローチを用いている(Sussmanら, J. Mol. Biol., 2004, 342, 31〜41; Seligmanら, Genetics, 1997, 147, 1653〜1664; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484; Ashworthら, Nature, 2006, 441, 656〜659; Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008)。
【００２２】
キメラ及び単鎖人工HEの構築は、コンビナトリアルアプローチを用いて、新規な(非パリンドローム)標的配列を切断する新規なメガヌクレアーゼを得ることができることを示唆している：異なるモノマー又はコアドメインを単独タンパク質に融合させて、新規な特異性を達成できる。これらの結果は、I-CreIダイマーの2つのDNA結合ドメインが独立して行動することを意味する。各DNA結合ドメインは、DNA標的部位の異なる半分に結合する。
【００２３】
半合理的(semi-ration)アプローチ及びハイスループットスクリーニング(HTS)を組み合わせて、Arnouldらは、特異性が変更された数百のI-CreI誘導体を導くことができた(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。I-CreIの残基Q44、R68及びR70を変異させ、±3〜5位の特異性が変更された一連の変異型をスクリーニングにより同定した。次いで、2つの異なる変異型を組み合わせて、各変異型DNA標的配列の異なる半分の融合から得られるキメラ標的を切断可能な機能的ヘテロダイマーエンドヌクレアーゼに組み立てた。興味深いことに、新規なタンパク質は、正確な折り畳み及び安定性、高い活性及び狭い特異性を維持していた。よって、2工程方策を用いて、天然のLAGLIDADGメガヌクレアーゼの特異性を仕立てることができるだろう。第1工程は、I-CreIのような天然のLAGLIDADGメガヌクレアーゼに局所的に突然変異を誘発し、スクリーニングにより、特異性が変更された一連の変異型を同定することである。第2工程は、これらのタンパク質のモジュール性に依存して、コンビナトリアルアプローチを用いて、選択された部位を切断する新規なメガヌクレアーゼを作製することである(図2B)。
【００２４】
一連の新規なメガヌクレアーゼの作製、及び2つの異なるモノマー/コアドメインを組み立てることによりそれらを組み合わせる能力は、標的にされ得るDNA配列の数を著しく豊富にするが、全ての可能性のある配列をまだ飽和しない。
【００２５】
より多数の配列に到達するために、組み合わせ得るより小さい独立したサブドメインを同定できることは非常に価値がある(図2C)。
【００２６】
しかし、コンビナトリアルアプローチは、モノマー間よりも単独モノマー又はドメインの中に応用することがより難しい。なぜなら、結合界面の構造は非常に緻密であり、実質的に全ての塩基特異的相互作用の原因である2つの異なるββヘアピンは別々のサブドメインを構成しないが、単独の折り畳みの部分であるからである。例えば、I-CreIのDNA結合領域の内部の部分において、gtcトリプレットには第1ヘアピンからの1残基(Q44)と、第2ヘアピンからの2残基が結合する(R68及びR70; Chevalierら, 2003, 既出の図1Bを参照されたい)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
構造レベルでの明らかなモジュール性がないにもかかわらず、本発明者らは、ホーミングエンドヌクレアーゼの半分部位(half-site)の別々の部分に結合可能な、分離可能な機能的サブドメインを同定した。異なるモノマー又は同じモノマー内の異なるコアドメインからの2つのサブドメインを組み立てることにより、本発明者らは、パリンドロームキメラ標的(図2C)を切断できる機能的ホーミングエンドヌクレアーゼ(ホモダイマー)変異型を作製した。さらに、4つの異なるサブドメインを組み立てて、非パリンドロームキメラ標的(図2D)を切断できる新しいヘテロダイマー分子を組み立てることにより、より大きいコンビナトリアルアプローチが可能になる。異なるサブドメインを別々に改変して、興味のある遺伝子からの標的を切断できる1つのメガヌクレアーゼ変異型(ヘテロダイマー又は単鎖分子)に組み合わせることができる。
【００２８】
本発明者らは、この方策を用いて、RAG遺伝子からのDNA標的配列を切断でき、よってSCID症候群に関連するRAG1及びRAG2変異を修復するために用い得るI-CreI変異型を工学的に作製した(engineer) (図4及び5)。その他の可能性のある応用は、RAG遺伝子の遺伝子座でのゲノム工学を含む。
工学的に作製された変異型は、二本鎖切断誘発組換えによる遺伝子修正のために用い得る(図1A及び1B)。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、2つのI-CreIモノマーの少なくとも一方が、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位にそれぞれ位置するLAGLIDADGコアドメインの2つの機能的サブドメインのそれぞれに1つずつ、少なくとも2つの置換を有する、RAG遺伝子からのDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型に関する。本発明による変異型の切断活性は、いずれの公知のインビトロ又はインビボ切断アッセイ、例えば国際PCT出願WO 2004/067736、又はArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるものにより測定できる。例えば、本発明の変異型の切断活性は、レポーターベクターを用いて、酵母又は哺乳動物細胞において、直列反復組換えアッセイにより測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた、レポーター遺伝子の2つの短縮された非機能的コピー(直列反復)と、介在配列内にゲノムDNA標的配列とを含む。変異型の発現により、ゲノムDNA標的配列を切断できる機能的エンドヌクレアーゼが得られる。この切断は、直列反復間の相同組換えを誘導し、機能的レポーター遺伝子をもたらし、その発現は適切なアッセイによりモニターできる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】メガヌクレアーゼ誘発組換えにより機能的遺伝子を回復するための2つの異なる方策を示す。
【図２】ホーミングエンドヌクレアーゼのモジュール構造と、カスタムメガヌクレアーゼ設計のためのコンビナトリアルアプローチを示す。
【図３】I-CreIの、そのDNA標的C1221との塩基特異的相互作用の地図を表す。
【図４】ヒトRAG1遺伝子(遺伝子ID 5896、アクセッション番号NC_000011.8、36546139位〜36557877位)を表す。
【図５】ヒトRAG2遺伝子を示す(遺伝子ID 5897、アクセッション番号NC_000011.8、36570071〜36576362 (マイナス鎖))。
【図６】I-CreI N75足場タンパク質、並びにUlib4及びUlib5ライブラリー構築に用いた縮合プライマーの配列を示す。
【図７】28位、30位、33位、38位及び／又は40位でのI-CreI変異型の切断パターンを表す。
【図８】その標的に結合したI-CreIホモダイマー上のタンパク質及びDNA標的中の変異の局在化を表す。
【図９】標的のRAG1.10シリーズ及び近縁誘導体を示す。
【図１０】標的のRAG2.8シリーズ及び近縁誘導体を示す。
【図１１】pCLS1055プラスミドベクターマップを示す。
【図１２】pCLS10542プラスミドベクターマップを示す。
【図１３】コンビナトリアル変異体によるRAG1.10.2標的の切断を示す。
【図１４】コンビナトリアル変異体によるRAG1.10.3標的の切断を示す。
【図１５】pCLS1107ベクターマップを示す。
【図１６】ヘテロダイマーコンビナトリアル変異体によるRAG1.10標的の切断を示す。
【図１７】コンビナトリアル変異体によるRAG2.8.3標的の切断を示す。
【図１８】コンビナトリアル変異体によるRAG2.8.4標的の切断を示す。
【図１９】ヘテロダイマーコンビナトリアル変異体によるRAG2.8.2標的の切断を示す。
【図２０】RAG2.8標的の切断を示す。
【図２１】ヒトRAG1及びRAG2遺伝子で見出されるDNA標的配列、並びに該DNA標的を切断可能な対応するI-CreI変異型を示す。
【図２２】ヒトRAG1及びRAG2遺伝子で見出されるDNA標的配列、並びに該DNA標的を切断可能な対応するI-CreI変異型を示す。
【図２３】酵母における最適化変異体を用いるRAG2.8標的の切断を示す。
【図２４】RAG1.10.3を切断するKHSMAS/ARSYT変異体と、RAG1.10.2を切断するランダム突然変異を誘発させた変異体との同時発現によるRAG1.10標的の切断を示す。
【図２５】哺乳動物細胞におけるI-CreI N75の発現用のプラスミドであるpCLS1088のマップを表す。
【図２６】哺乳動物細胞用のレポーターベクターにおけるDNA標的のゲートウェイクローニング用のプラスミドであるpCLS1058のマップを表す。
【図２７】CHO細胞における染色体外アッセイにおける、G19S変異を有するか又は有さないM2及びM3 I-CreI変異体によるRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的の切断を示す。
【図２８】哺乳動物細胞におけるレポーターシステムの設計を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において1文字コードで示され、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
【００３２】
ヌクレオチドは、次のように示される：1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を示すために用いられる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
【００３３】
「メガヌクレアーゼ」により、14〜40 pbの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意図する。該メガヌクレアーゼは、各ドメインがモノマー上にあるダイマー酵素、又は単一ポリペプチド上に2つのドメインを含むモノマー酵素のいずれかである。
「メガヌクレアーゼドメイン」は、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用する領域を意図し、DNA標的の他方の半分と相互作用する同じメガヌクレアーゼの他方のドメインと会合して、該DNA標的を切断可能な機能的メガヌクレアーゼを形成できる。
「メガヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」は、野生型メガヌクレアーゼ(天然メガヌクレアーゼ)のアミノ酸配列中の少なくとも1つの残基を異なるアミノ酸に置換することにより得られるメガヌクレアーゼを意図する。
【００３４】
「機能的変異型」により、DNA標的配列を切断できる変異型が意図され、該標的は、親のメガヌクレアーゼにより切断されない新しい標的であることが好ましい。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか又は該DNA標的と直接的若しくは間接的に相互作用する位置でアミノ酸の変動を有する。
【００３５】
「I-CreI」は、SWISSPROT P05725 (配列番号234)又はpdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型I-CreIを意図する。
「新規な特異性を有するI-CreI変異型」により、親のメガヌクレアーゼとは異なる切断される標的のパターンを有する変異型を意図する。等価でかつ同様に用いられる用語「新規な特異性」、「改変された特異性」、「新規な切断特異性」、「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドについての変異型の特異性のことをいう。
【００３６】
「I-CreI部位」は、I-CreIにより切断される22〜24 bpの二本鎖DNA配列を意図する。I-CreI部位は、野生型(天然)非パリンドロームI-CreIホーミング部位、及び派生パリンドローム配列、例えばC1221ともよばれる配列5'- t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12 (配列番号1)を含む(図3及び9)。
【００３７】
「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれる4つのβ鎖(β1、β2、β3、β4)を含む。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能的エンドヌクレアーゼを形成する。例えば、ダイマーホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。
【００３８】
「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半分部位の別個の部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。2つの異なるサブドメインは、独立して挙動し、一方のサブドメイン中の変異は、他方のサブドメインの結合特性及び切断特性を変更しない。よって、2つのサブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半分部位の別個の部分に結合する。
【００３９】
「ベータヘアピン」は、ループ又はターンにより連結されているLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆並行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
【００４０】
「単鎖メガヌクレアーゼ」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」、「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」は、ペプチドスペーサにより連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含むメガヌクレアーゼを意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、それぞれの親のメガヌクレアーゼ標的配列の1つの異なる半分を含むキメラDNA標的配列を切断できる。
【００４１】
「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」；「興味のある部位」；「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」は、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより認識され、切断される20〜24 bpの二本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、エンドヌクレアーゼにより二本鎖破断(切断)が誘導される独特のDNA位置、好ましくはゲノム位置のことをいう。DNA標的は、C1221について上記で示したように、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'から3'の配列により定義される。DNA標的の切断は、センス及びアンチセンス鎖のそれぞれについて、+2位及び-2位のヌクレオチドで生じる(図3)。そうでないと記載しない限り、I-Cre Iメガヌクレアーゼ変異型によりDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
【００４２】
「DNA標的半分部位」、「半分切断部位」又は「半分部位」は、それぞれのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合するDNA標的の部分を意図する。
【００４３】
「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」は、2つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも1つの半分は、少なくとも2つの別々のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせを含み得る(組み合わされたDNA標的)。
【００４４】
「RAG遺伝子からのDNA標的配列」、「ゲノムDNA標的配列」、「ゲノムDNA切断配列」、「ゲノムDNA標的」又は「ゲノム標的」により、メガヌクレアーゼ変異型又は単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体により認識され切断されるRAG遺伝子の20〜24 bpの配列が意図される。
【００４５】
「RAG遺伝子」により、哺乳動物のRAG1又はRAG2遺伝子が意図される。例えば、ヒトRAG遺伝子は、アクセッション番号NC_000011.8の下でNCBIデータベースにおいて入手可能である。RAG1 (遺伝子ID:5896)及びRAG2 (遺伝子ID:5897)配列は、それぞれ36546139位〜36557877位及び36570071位〜36576362位(マイナス鎖)に位置する。両方の遺伝子は、短い非翻訳エキソン1と、5'及び3'末端にてそれぞれ短い非翻訳領域及び長い非翻訳領域に挟まれた、RAGタンパク質をコードするORFを含むエキソン2とを有する(図4及び5)。
【００４６】
「ベクター」により、それが連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を意図する。
「相同な」により、配列間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性、特に、少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
【００４７】
「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列され得る各配列内の位置を比較することにより決定できる。比較される配列内の位置が同じ塩基により占められる場合、分子はその位置にて同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を計算でき、GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として利用可能なFASTA又はBLASTを、例えばデフォルト設定で用い得る。
【００４８】
「個体」は、哺乳動物、及びその他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳動物」及び「哺乳類」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)、並びに例えばウシ、ブタ及びウマのようなその他のものを含む。
【００４９】
変異により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列中の1又は複数のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、付加を意図する。該変異は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。これは、ゲノム配列の構造、又はコードされたmRNAの構造／安定性にも影響し得る。
【００５０】
本発明による変異型は、パリンドローム又は偽パリンドロームDNA標的配列を切断可能なホモダイマーであり得る。あるいは、上記の変異型は、I-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に異なる変異を有する第1及び第2モノマーの会合により得られるヘテロダイマーであって、RAG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断可能なヘテロダイマーである。好ましくは、ヘテロダイマーのモノマーはともに、I-CreIの26位〜40位及び44位〜77位の両方に異なる置換を有する。
【００５１】
上記の変異型の好ましい実施形態において、I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン内の上記の置換は、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある。
44位、68位、70位、75位及び／又は77位の変異は、66位の変異と組み合わせることが有利であり得る。
【００５２】
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、I-CreIの26位〜40位に位置するサブドメイン中の置換は、26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位にある。
【００５３】
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、上記の置換は、最初のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L及びWからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである。
【００５４】
例えば：
- 28位のリジン(K)は、N、Q、A又はRに変異でき、
- 30位のアスパラギン(N)は、H、G、R、K及びDに変異でき、
- 32位のセリン(S)は、G、T、K、E、H、D及びQに変異でき、
- 33位のチロシン(Y)は、S、R、C、A、N、R、G、T及びHに変異でき、
- 38位のグルタミン(Q)は、R、A、T、Y、E、G、W、D及びHに変異でき、
- 40位のセリン(S)は、R、K、Q、A、D、E及びHに変異でき、
- 44位のグルタミン(Q)は、A、Y、N、K、D、R、T、E及びHに変異でき、
- 68位のアルギニン(R)は、H、A、Y、S、N、T、E及びGに変異でき、
- 70位のアルギニン(R)は、T、S、N、Q、H及びAに変異でき、
- 75位のアスパラギン酸(D)は、R、Y、E、N、Q、K及びSに変異でき、
- 77位のイソロイシン(I)は、V、L、N、R、Y、Q、E、K及びDに変異できる。
【００５５】
上記の変異型の別の好ましい実施形態によると、これは、付加的な位置に1又は複数の置換を含む。
変異される付加的な残基は、DNA標的配列と接触するか、又はDNA主鎖若しくはヌクレオチド塩基と直接若しくは水分子を介して相互作用する。これらのI-CreI相互作用残基は、当該技術において公知である。例えば、付加的な変異は、ホスフェート主鎖又はヌクレオチド塩基と間接的に相互作用する位置に導入され得る。
【００５６】
或いは、上記の変異型は、RAG遺伝子のDNA標的配列に対する該変異型の結合及び／又は切断特性を向上させる1又は複数の付加的な変異を含み得る。変異される付加的な残基は、I-CreI配列全体、又はI-CreIのC-末端半分(80位〜163位)にあり得る。これらの変異は、好ましくは、I-CreIの4位、6位、19位、34位、43位、49位、50位、54位、79位、80位、82位、85位、86位、87位、94位、96位、100位、103位、105位、107位、108位、114位、115位、116位、117位、125位、129位、131位、132位、139位、147位、150位、151位、153位、154位、155位、157位、159位及び160位にある。より好ましくは、置換は、G19S、G19A、F54L、S79G、F87L、V105A及びI132Vからなる群より選択される。
【００５７】
これらの変異のうち、G19S変異は、I-CreI由来ヘテロダイマーメガヌクレアーゼの切断活性を増大させるだけでなく、該ヘテロダイマーメガヌクレアーゼの切断特異性を、G19S変異を有するモノマーからの機能的ホモダイマーの形成を妨げることにより増大させるので、さらにより好ましい。
【００５８】
上記の変異型により切断されるDNA標的配列は、RAG遺伝子のエキソン又はイントロン内にあり得る。好ましくは、これは、変異の近傍、好ましくは変異の500 bp以内、又は変異の上流、好ましくはRAG遺伝子の全ての変異の上流のいずれかに位置する。
【００５９】
上記の変異型の別の好ましい実施形態において、上記のDNA標的配列は、ヒトRAG遺伝子からである。
各ヒトRAG遺伝子からのDNA標的は、表III及びIV、並びに図21及び22に示す。
【００６０】
例えば、配列番号148〜177の配列は、RAG1遺伝子からのDNA標的であり；配列番号152〜177は、RAG1 ORF (5293位〜8424位)に位置し、これらの配列は、RAG1 ORF全体をカバーする(表III並びに図4及び21)。標的配列である配列番号151 (RAG1.10)は、RAG ORFの近くであって変異の上流に位置する(図4)。標的配列である配列番号148、149 (RAG1.6)及び150 (RAG1.7)は、変異の上流に位置する(図4)。
各DNA標的を切断するヘテロダイマー変異型は、表I及びII並びに図21及び22に示す。
【００６１】
【表１−１】
2009543574.tif 000002
【００６２】
【表１−２】
2009543574.tif 000003
【００６３】
各変異型の配列は、記載する位置でのそのアミノ酸残基により定義される。例えば、表Iの1つ目のヘテロダイマー変異型は、28位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれQ、R、K、Y、E、S、R及びVを有する第1モノマーと、30位、32位、44位、68位、70位、75位及び77位にそれぞれR、Q、K、T、S、N及びVを有する第2モノマーとからなる。位置は、I-CreI配列SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9y (配列番号234)を参照にして示す。I-CreIは、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位、77位、80位及び82位にそれぞれK、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D、I、E及びKを有する。
【００６４】
変異型は、表Iに示すアミノ酸残基を有するI-CreI配列からなることができる。この場合、記載していない位置は変異されておらず、よって、野生型I-CreI配列(配列番号234)に対応する。
【００６５】
RAG1遺伝子中にDNA標的部位を有するこのようなヘテロダイマーI-CreI変異型の例は、配列番号2〜38の配列の第1モノマーと、配列番号39〜75、248〜253の配列の第2モノマーとからなる変異型である。
【００６６】
或いは、変異型は、表Iに示すアミノ酸残基を有するI-CreI配列を含み得る。後者の場合、記載していない位置は、上記で定義される変異を含み得るか、又は変異されなくてよい。例えば、変異型は、配列番号203によりコードされるI-CreI足場タンパク質に由来でき、該I-CreI足場タンパク質(配列番号235)は、2位のアラニンの挿入、A42T、D75N、W110E及びR111Qの置換、並びにC-末端に3つの付加アミノ酸(A、A及びD)を有する。さらに、野生型I-CreI又はI-CreI足場タンパク質に由来する上記の変異型は、上記で定義されるようなさらなる変異を含み得る。
【００６７】
各ヘテロダイマー変異型により切断される標的の最初の塩基の位置は、表の最後の列に示す。
【００６８】
【表２−１】
2009543574.tif 000004
【００６９】
【表２−２】
2009543574.tif 000005
【００７０】
RAG2遺伝子中にDNA標的部位を有するこのようなヘテロダイマーI-CreI変異型の例は、配列番号76〜102、238〜247の配列の第1モノマーと、配列番号103〜147、236、237の配列の第2モノマーとからなる変異型である。
【００７１】
さらに、本発明の変異型は、配列のNH2末端及び／又はCOOH末端に挿入された1又は複数の残基を含み得る。例えば、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)がNH2末端及び／又はCOOH末端に導入される。該タグは、上記の変異型の検出及び／又は精製に有用である。
【００７２】
本発明の主題は、上記で定義されるI-CreI変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼでもある。単鎖キメラエンドヌクレアーゼは、2つのI-CreIモノマー、2つのI-CreIコアドメイン(I-CreIの6位〜94位)、又はこれらの組み合わせを含み得る。
【００７３】
本発明の主題は、上記で定義される変異型又は単鎖キメラエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントでもある。上記のポリヌクレオチドは、ホモダイマー変異型若しくはヘテロダイマー変異型の1つのモノマー、又は単鎖キメラエンドヌクレアーゼの2つのドメイン/モノマーをコードし得る。
【００７４】
本発明の主題は、本発明による変異型又は単鎖分子の発現のための組換えベクターでもある。組換えベクターは、上記で定義されるような変異型又は単鎖分子をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む。
好ましい実施形態において、上記のベクターは、それぞれがヘテロダイマー変異型のモノマーの1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含む。
【００７５】
本発明において用い得るベクターは、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体の、非染色体の、半合成の若しくは合成のDNAからなり得る直鎖若しくは環状DNA又はRNA分子を含む。好ましいベクターは、自己複製が可能なベクター(エピソームベクター)及び／又はそれらが連結された核酸の発現が可能になるベクター(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に知られ、商業的に入手可能である。
【００７６】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病又は水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, 第3版, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
【００７７】
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてTRP1；E. coliにおいてテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含み得る。
【００７８】
好ましくは、上記のベクターは、本発明の変異型／単鎖分子をコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下に位置して、該変異型の産生又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製起点、該コードポリヌクレオチドに機能可能に連結するプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。好ましくは、上記の変異型がヘテロダイマーである場合、各モノマーをコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動し得る1つのベクターに含まれる。適切なプロモーターは、組織特異的及び／又は誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの例は、重金属のレベルの増加により誘導される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核lacZプロモーター、及び温度の増加により誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、α-抗トリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)タンパク質A及びB、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
【００７９】
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、該ベクターは、上記で定義されるゲノムDNA標的切断部位を取り囲む(surrounding)領域と相同性を有する配列を含むターゲティング構築物を含む。
【００８０】
或いは、I-CreI変異型をコードするベクター、及びターゲティング構築物を含むベクターは、異なるベクターである。
より好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は、以下のものを含む：
a) 上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、
b) a)の配列により挟まれる導入される配列。
【００８１】
好ましくは、少なくとも50 bp、好ましくは100 bpより多い、より好ましくは200 bpより多い相同配列が用いられる。実際に、有するDNA相同性は、破断部位の上流及び下流で接する領域に位置し、導入されるDNA配列は、2つのアームの間に位置するべきである。導入される配列は、好ましくは、ゲノム療法の目的のための、興味のある遺伝子の変異を修復する(遺伝子修正又は機能的遺伝子の回復)配列である。或いは、特定の配列を改変するか、興味のある内因性遺伝子を減弱若しくは活性化させるか、興味のある内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は欠失させるか、興味のある部位に変異を導入するか、又は外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するために用いられる配列を含む、ある特定の様式で染色体DNAを変更させるために用いられるいずれのその他の配列であり得る。このような染色体DNAの変更は、ゲノム工学(動物モデル)に用いられる。
【００８２】
RAG遺伝子を修正するために、遺伝子の切断が、変異の近傍、好ましくは変異から500 bp以内で生じる(図1A)。ターゲティング構築物は、切断を修復するための、標的部位に接する相同配列の少なくとも200 bpを有するRAG遺伝子フラグメントを含み(最小修復マトリクス)、変異を修復するための、XP遺伝子の正しい配列を含む(図1A)。よって、遺伝子修正のためのターゲティング構築物は、最小修復マトリクスを含むか、又はこれからなる。これは、200 pb〜6000 pb、好ましくは1000 pb〜2000 pbである。
【００８３】
或いは、機能的遺伝子を回復するために(図1B)、遺伝子の切断は変異の上流、例えば、それぞれRAG1.6、RAG1.7、RAG1.10及びRAG2.8標的に位置するRAG1遺伝子の1704位、2320位若しくは5282位(図4)、又はRAG2遺伝子の980位(図5)で生じる。好ましくは、上記の変異は、遺伝子の配列中の最初の既知の変異であり、そのことにより、遺伝子の全ての下流に変異が同時に修正され得る。ターゲティング構築物は、切断部位の下流にフレーム内で融合されたエキソン(cDNA内のように)と、3'に転写を停止するためのポリアデニル化部位とを含む。導入される配列(エキソンノックイン構築物)は、切断部位を取り囲むイントロン又はエキソン配列に挟まれていることにより、工学的に導入される遺伝子(エキソンノックイン遺伝子)の機能的タンパク質をコードし得るmRNAへの転写が可能になる(図1B)。例えば、エキソンノックイン構築物は、上記で定義される最小修復マトリクスからの、切断部位の上流及び下流の配列により挟まれる。
【００８４】
例えば、それぞれの変異型により切断される標的(表I及びII)、及び各変異型での切断を修復するための最小マトリクスを、表III及びIV並びに図21及び22に示す。
【００８５】
【表３】
2009543574.tif 000006
【００８６】
【表４】
2009543574.tif 000007
【００８７】
例えば、図4に示すようなSCID症候群に関連するRAG1遺伝子中の変異のいくつかを修正するために、変異型/ターゲティング構築物の以下の組み合わせを用い得る。
-     R396C、R396H及びD429G :
*変異型: 32G及び33R (第1モノマー)/ 28K、30G、38G、44E、68R及び70H (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも6270位〜6469位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
【００８８】
-     R561C:
*変異型28Q、33R、38R、40K、44K、68T、70S、75N及び77V (第1モノマー)/ 28R、33R、38Y、40Q、44N、68T、70S、75R及び77V (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも6976位〜7175位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
*変異型30N、33Y、38Q、44Q、68R、70S及び75N (第1モノマー)/ 28Q、33Y、38R、40K、44N、68R、70S、75R及び77N (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも7168位〜7367位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
*変異型: 28K、30R、32D、33Y、38Q、40S、44D、68N、70S、75N及び77I (第1モノマー)/ 28K、30G、32S、33Y、38H、40S、44N、68R、70S、75R及び77D (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも7207位〜7406位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
【００８９】
-     E774Ter (未熟停止コドン)、R737H、E722K:
*変異型30G、38T、44Y、68Y、70S、75Q (第1モノマー)/ 28K、33R、38N、40Q、44Q、68R、70S、75K及び77E (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも7478位〜7677位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
【００９０】
-     Y938Ter:
*変異型: 28K、30N、32S、33H、38Q、40Q、44D、68N、70S、75N及び77I (第1モノマー)/ 28K、30D、32S、33R、38Q、40S、44N、68Y、70S、75R及び77V (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも8149位〜8348位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
*変異型: 32K、33T 44N、68Y、70S、75Y及び77Q (第1モノマー)/ 28K、33S、38R、40E、44Y、68Y、70S、75Q及び77I (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも8252位〜8451位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
*変異型: 28K、30G、38H、44N、68E、70S、75K及び77R (第1モノマー)/ 28A、33S、38R、40K、44D、68Y、70S、75S及び77R (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも8149位〜8348位を含むターゲティング構築物と、変異の効率的な修復のためのメガヌクレアーゼ切断部位と変異部位との間の全ての配列。
【００９１】
或いは、機能的RAG1遺伝子(図1B)を回復するために、変異型の以下の組み合わせを、上記で定義される最小修復マトリクス(表III)からの切断部位の上流及び下流の配列に挟まれた、RAG1タンパク質をコードするcDNA配列と下流のポリアデニル化部位とを含むエキソンノックイン構築物との組み合わせで用い得る。
【００９２】
*変異型: 28K、30N、32S、33S、38R、40H、44A、68Y、70S、75Y及び77K (第1モノマー)/ 28A、30N、32S、33S、38R、40K、44D、68N、70S、75N及び77I (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも1608位〜1802位を含む配列により挟まれたエキソンノックイン構築物。
*変異型: 28K、30D、32S、33R、38T、40S、44Y、68S、70S、75S、77D (第1モノマー)/ 28K、30N、32T、33C、38Q、40S、44K、68Y、70S、75Q及び77N (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも2219位〜2418位を含む配列により挟まれたエキソンノックイン構築物。
*変異型: 配列番号5〜12 (第1モノマー)/ 配列番号42〜49、248〜253 (第2モノマー)と、DNA二本鎖破断の効率的な修復のためのRAG1遺伝子の少なくとも5181位〜5380位を含む配列により挟まれたエキソンノックイン構築物。
【００９３】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つの変異型、1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ及び／又は上記の変異型/単鎖分子をコードする少なくとも1つの発現ベクターを含むことを特徴とする組成物でもある。
【００９４】
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、上記で定義されるような、上記の変異型のゲノムDNA切断部位と相同性を有する配列で挟まれた、RAG遺伝子中の変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む。変異を修復する配列は、正しい配列の遺伝子のフラグメント、又は上記で定義されるようなエキソンノックイン構築物のいずれかである。
【００９５】
好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は、組換えベクターに含まれるか、又は本発明による変異型/単鎖分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれる。
【００９６】
2つのベクターを用い得る場合、本発明の主題は、RAG遺伝子中の変異に関連するSCID症候群の治療における同時、別々又は逐次的な使用のための組み合わせ製剤としての、上記で定義されるI-CreI変異型発現ベクターと、上記で定義されるターゲティング構築物を含むベクターとを含有する製品でもある。
【００９７】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ変異型及び／又は1つの発現ベクターの、必要とする個体におけるRAG遺伝子の変異に関連するSCID症候群を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用でもあり、該医薬品は、該個体にいずれの手段によって投与される。
【００９８】
この場合、メガヌクレアーゼ変異型の使用は、(a) 個体の体組織において、上記の変異型の少なくとも1つの認識及び切断部位を含む興味のある部位にて二本鎖切断を誘発し、(b) 個体にターゲティングDNAを導入する工程を含み、ここで、該ターゲティングDNAは、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えにより興味のある部位を修復するDNAとを含む。ターゲティングDNAは、興味のある部位へのターゲティングDNAの導入に適する条件下で個体に導入される。
【００９９】
本発明によると、上記の二本鎖切断は、個体への上記のメガヌクレアーゼの投与により全体として(in toto)、又は個体から回収して改変後に個体に戻される体細胞(造血幹細胞)中への上記のメガヌクレアーゼの導入によりエクスビボのいずれかで誘発される。
【０１００】
本発明の主題は、必要とする個体でのSCID症候群を予防、改善又は治癒する方法でもあり、該方法は、いずれの手段により、上記で定義される組成物を上記の個体に投与する工程を少なくとも含む。
メガヌクレアーゼ変異型は、ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物として用い得る。これは、具体的な細胞種に適切な当業者に公知の任意の簡便な手段により、単独で又は少なくとも適切な賦形剤若しくは担体及び／又はターゲティングDNAとともに個体の体細胞に導入される。
【０１０１】
本発明による使用の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼ変異型(ポリペプチド)は、以下のものとともに用いられる：
- リポソーム、ポリエチレンイミン(PEI); この場合、上記の組み合わせは、投与され、よって標的体細胞に導入される。
- 膜転位ペプチド(membrane translocating peptides) (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Fordら, Gene Ther., 2001, 8, 1〜4 ; Wadia及びDowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52-56); この場合、変異型/単鎖分子の配列は、膜転位ペプチドの配列と融合される(融合タンパク質)。
【０１０２】
本発明の使用の別の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼ(上記のメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド)及び／又はターゲティングDNAは、ベクターに挿入される。ターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、種々の方法により細胞に導入できる(例えば注射、直接摂取、噴射衝撃、リポソーム、エレクトロポレーション)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞内で安定的又は一過的に発現され得る。真核細胞における発現の技術は、当業者に公知である(Current Protocols in Human Genetics: 12章「Vectors For Gene Therapy」及び13章「Delivery Systems for Gene Therapy」を参照されたい)。任意に、核局在化シグナルを組換えタンパク質に組み込んで、それが核内で発現されることを確実にすることが好ましいだろう。
【０１０３】
一旦細胞内に入ると、メガヌクレアーゼと、存在するならばターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターとは、細胞により、細胞質から核内の作用部位へ運び込まれるか又は移動される。
【０１０４】
治療の目的のために、メガヌクレアーゼ及び医薬的に許容される補形剤は、治療有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が生理的に重要である場合に、「治療有効量」で投与されるという。作用剤は、その存在が、受容者の生理機能に検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に重要である。この関係において、作用剤は、その存在が、標的にされる疾患の1又は複数の症状の重篤度の減少、及び損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合に、生理的に重要である。
【０１０５】
本発明による使用のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、実質的に非免疫原性であり、すなわち、有害な免疫応答をほとんど又は全く生じない。この種の有害な免疫反応を緩和又は消去するための種々の方法を、本発明に従って用いることができる。
好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、N-ホルミルメチオニンを実質的に含まない。
【０１０６】
望ましくない免疫反応を回避する別の方法は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコール(「PEG」)又はポリプロピレングリコール(「PPG」) (好ましくは平均分子量(MW)が500〜20,000ダルトンのもの)とコンジュゲートさせることである。PEG又はPPGとのコンジュゲートは、例えばDavisら(米国特許第4,179,337号)に記載されるように、抗ウイルス活性を有する非免疫原性で生理活性で水溶性のエンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供できる。ポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを用いる同様の方法も、Saiferら(米国特許第5,006,333号)に記載されている。
【０１０７】
本発明は、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターで改変されている原核又は真核宿主細胞にも関する。
【０１０８】
本発明は、それらの細胞の全て又は一部分が、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターにより改変されていることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことをいう。
【０１０９】
本発明の主題は、さらに、上記で定義されるメガヌクレアーゼ変異型、又は好ましくは発現ベクターに含まれる1又は2つのポリヌクレオチドの、非治療目的のゲノム工学(動物モデル作製：ノックイン又はノックアウト)のための使用である。
上記の使用の有利な実施形態によると、これは、興味のある遺伝子内に二本鎖破断を誘発し、そのことによりDNA組換え事象、DNA欠損又は細胞死を誘発するためである。
【０１１０】
本発明によると、二本鎖破断は、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異された位置に機能的遺伝子を回復するため、興味のある内因性遺伝子を減弱若しくは活性化するため、興味のある部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は欠失させるため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを修復されないまま分解させるためである。
【０１１１】
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記の変異型、ポリヌクレオチド、ベクターは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物と会合している。
本発明によるメガヌクレアーゼ変異型の使用の第1の実施形態において、これは、少なくとも以下の1) 上記のメガヌクレアーゼ変異型の少なくとも1つの認識及び切断部位を含むゲノム遺伝子座での二本鎖破断を誘発し；2) 標的にされる遺伝子座と相同性を有する配列で挟まれた、導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程を含む。上記のメガヌクレアーゼ変異型は、細胞に直接提供されるか、又は上記のメガヌクレアーゼをコードしかつ用いられる細胞内でのその発現に適するポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを介して提供できる。この方策は、DNA配列をその標的部位にて導入して、例えば薬剤試験に用い得るノックイン若しくはノックアウト動物モデル又は株化細胞を作製する。
【０１１２】
本発明の主題は、別のメガヌクレアーゼを作製するための足場としての、上記で定義される少なくとも1つのホーミングエンドヌクレアーゼ変異型の使用でもある。例えば、突然変異誘発及び選択/スクリーニングの3回転目は、新規な第3世代のホーミングエンドヌクレアーゼを作製する目的のために、上記の変異型に対して行うことができる。
【０１１３】
本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼ変異型の異なる使用及び該ホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を用いる方法は、上記の変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、上記で定義されるような上記の変異型又は単鎖キメラエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック動物又は非ヒトトランスジェニック植物の使用も含む。
【０１１４】
本発明によるI-CreI変異型は、少なくとも以下の工程を含む、哺乳動物遺伝子からのDNA標的配列のような興味のあるゲノムDNA標的配列を切断できるI-CreI変異型を工学的に作製する方法により得ることができる：
(a)   I-CreIの26位〜40位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第1機能的サブドメイン内の少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第1シリーズを構築し、
(b)   I-CreIの44位〜77位に位置するLAGLIDADGコアドメインの第2機能的サブドメイン内に少なくとも1つの置換を有するI-CreI変異型の第2シリーズを構築し、
(c)   工程(a)の第1シリーズから、(i) I-CreI部位の-10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【０１１５】
(d)   工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(e)   工程(a)の第1シリーズから、(i)I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
(f)   工程(b)の第2シリーズから、(i) I-CreI部位の+3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を切断できる変異型を選択及び／又はスクリーニングし、
【０１１６】
(g)   工程(c)及び工程(d)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を単一変異型に組み合わせて、(i) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) +8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、かつ(iv) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI変異型を得て、
【０１１７】
(h)   工程(e)及び工程(f)からの2つの変異型の26位〜40位及び44位〜77位の変異を単一変異型に組み合わせて、(i) +3位〜+5位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットと同一であり、(ii) -5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+3位〜+5位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一であり、(iii) I-CreI部位の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ(iv) -10位〜-8位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的の+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列と同一である配列を切断する新規なホモダイマーI-CreI変異型を得て、
(i)   工程(g)及び(h)で得られた変異型を組み合わせてヘテロダイマーを形成し、
(j)   哺乳動物遺伝子に位置する上記のゲノムDNA標的を切断できる工程(i)からのヘテロダイマーを選択及び／又はスクリーニングする。
【０１１８】
工程(c)、(d)、(e)又は(f)の1つは、省略し得る。例えば、工程(c)を省略する場合、工程(d)は、-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドトリプレットがともに、上記のゲノム標的のそれぞれの-10位〜-8位及び-5位〜-3位に存在するヌクレオチドトリプレットで置き換えられ、かつ+3位〜+5位及び+8位〜+10位のヌクレオチドトリプレットが、上記のゲノム標的のそれぞれ-5位〜-3位及び-10位〜-8位に存在するヌクレオチドトリプレットの逆相補配列で置き換えられている変異I-CreI部位を用いて行われる。
【０１１９】
工程(a)、(b)、(g)及び(h)は、DNA標的配列に接触するか、又は該DNA標的と直接的若しくは間接的に相互作用するその他の位置、変異体の結合及び／又は切断特性を改善する位置、或いは上記で定義されるような機能的ホモダイマーの形成を妨げる位置でのさらなる変異の導入をさらに含み得る。
このことは、国際PCT出願WO 2004/067736号に記載されるようなコンビナトリアルライブラリーを作製することにより行うことができる。
【０１２０】
本発明のI-CreI変異型を工学的に作製する方法は、変異型全体又は変異型の一部分、特に変異型のC-末端半分(80位〜163位)に対してランダム変異を導入して、興味のある遺伝子からのDNA標的に対する変異体の結合及び／又は切断特性を改善することを含むのが有利である。突然変異誘発は、当該技術において公知でありかつ商業的に入手可能な標準的な突然変異誘発法に従って、変異型のプールに対してランダム突然変異誘発ライブラリーを作製することにより行うことができる。好ましくは、突然変異誘発は、工程(i)で形成されるか又は工程(j)で得られるヘテロダイマーの一方のモノマーの配列全体に対して、有利には、モノマーのプールに対して、好ましくは、工程(i)又は(j)のヘテロダイマーの両方のモノマーに対して行われる。
【０１２１】
好ましくは、Arnouldら, J. Mol. Biol., Epub 10 May 2007の図4に示されるプロセスに従って、2回転の選択/スクリーニングが行われる。第1回目では、ヘテロダイマーの一方のモノマーに突然変異を誘発し(図4のモノマーY)、他方のモノマー(図4のモノマーX)と同時発現させてヘテロダイマーを形成し、改良されたモノマーY+を、興味のある遺伝子からの標的に対して選択する。第2回目において、他方のモノマー(モノマーX)に突然変異を誘発し、改良されたモノマーY+と同時発現させてヘテロダイマーを形成し、興味のある遺伝子からの標的に対して選択して、活性が改善されたメガヌクレアーゼ(X+ Y+)を得る。
【０１２２】
工程(g)及び(h)での変異の(分子間)組み合わせは、公知のオーバーラップPCR技術に従って、2つのサブドメインのそれぞれを含むオーバーラップフラグメントを増幅させることにより行い得る。
【０１２３】
工程(i)での変異型の(分子間)組み合わせは、工程(g)からの1つの変異型を工程(h)からの1つの変異型と同時発現させて、ヘテロダイマーの形成を可能にすることにより行われる。例えば、宿主細胞は、上記の変異型をコードする1又は2つの組換え発現ベクターにより改変できる。次いで、細胞を、変異型の発現を可能にする条件下で培養することにより、ヘテロダイマーが宿主細胞内で形成される。
【０１２４】
工程(c)、(d)、(e)、(f)及び／又は(j)における選択及び／又はスクリーニングは、国際PCT出願WO 2004/067736号、又はArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるように、インビトロ又はインビボでの切断アッセイを用いることにより行い得る。
【０１２５】
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程(c)、(d)、(e)、(f)及び／又は(j)は、上記の変異型により作製される変異DNA標的配列内の二本鎖破断がポジティブ選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又はネガティブ選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を導く条件下で、上記のDNA二本鎖破断の組換え媒介修復によりインビボで行われる。
【０１２６】
本発明の主題は、本発明に従って、RAG遺伝子からのDNA標的を切断できる変異型を工学的に作製するために有用なI-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位に変異を有するI-CreI変異型でもある。特に、本発明は、表V、VI、VIII、IXの変異型を含む、上記で定義されるような、I-CreI変異型を工学的に作製する方法の工程(c)〜(f)で定義されるようなI-CreI変異型を包含する。本発明は、表VII及びXの組み合わせた変異型を含む、上記で定義されるような、I-CreI変異型を工学的に作製する方法の工程(g)及び(h)で定義されるようなI-CreI変異型も包含する。
【０１２７】
興味のある遺伝子からのDNA標的を切断できる単鎖キメラメガヌクレアーゼは、当該技術において公知の方法により本発明による変異型から導かれる(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619号及びWO 2004/031346号)。このような方法のいずれも、本発明において定義される変異型に由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼの構築のために用い得る。
【０１２８】
本発明において定義される変異型をコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に知られる任意の方法により調製できる。例えば、これらは、特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、cDNA鋳型から増幅される。好ましくは、該cDNAのコドンは、所望の発現系における上記のタンパク質の発現に好ましいように選択される。
【０１２９】
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学の技術により得て、宿主細胞に導入できる。
【０１３０】
本発明において定義されるI-CreI変異型又は単鎖誘導体は、上記で定義されるようにしてポリペプチドを発現させることにより生成される。好ましくは、上記のポリペプチドは、1又は2つの発現ベクター(変異型のみの場合)により改変された宿主細胞又はトランスジェニック動物/植物において、ポリペプチドの発現又は同時発現に適する条件下で発現又は同時発現され(変異型のみの場合)、変異型又は単鎖誘導体は、宿主細胞培養物又はトランスジェニック動物/植物から回収される。
【０１３１】
上記の特徴に加えて、本発明は、I-CreIメガヌクレアーゼ変異型及び本発明によるそれらの使用について説明する実施例、及び図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴をさらに含む。
- 図1は、メガヌクレアーゼ誘発組換えにより機能的遺伝子を回復するための2つの異なる方策を示す。A. 遺伝子修正。変異は、既知の遺伝子内で生じる。メガヌクレアーゼによる切断及び修復マトリクスによる組換えにより、有害変異が修正される。B. エキソン配列ノックイン。変異は、既知の遺伝子内で生じる。変異されたmRNA転写産物は、遺伝子の下に強調する。修復マトリクスにおいて、切断部位の下流に位置するエキソンは、フレーム内で融合され(cDNAでのように)、3'で転写を停止するポリアデニル化部位を有する。イントロン及びエキソンの配列は、相同領域として用い得る。エキソン配列ノックインは、工学的に作製された遺伝子をもたらし、機能的タンパク質をコードし得るmRNAに転写される。
【０１３２】
- 図2は、ホーミングエンドヌクレアーゼのモジュール構造と、カスタムメガヌクレアーゼ設計のためのコンビナトリアルアプローチを示す。A. そのDNA標的に結合したI-CreIホーミングエンドヌクレアーゼの3次元構造。触媒コアは、DNA主溝の上にサドル形相互作用界面を形成する2つのαββαββα折り畳みにより囲まれている。B. 2つのDNA結合サブドメインの分離性に鑑みて(左上)、I-CreI標的配列に由来する異なる配列に結合する異なるI-CreIモノマーを組み合わせて(右上及び左下)、非パリンドロームキメラ標的を切断するヘテロダイマー又は単鎖融合分子(右下)を得る。C. より小さい独立サブユニット、すなわち単独モノマー又はαββαββα折り畳み内のサブユニット(右上及び左下)は、同じモノマー内の変異の組み合わせにより、新規なキメラ分子(右下)の設計を可能にする。このような分子は、パリンドロームキメラ標的(右下)を切断する。D. 2つの前の工程の組み合わせは、4つの異なるサブドメインを含むより大きいコンビナトリアルアプローチを可能にする。第1工程において、新規なメガヌクレアーゼの対は、切断したい標的に由来するパリンドローム標的を切断する新規な分子(「ハーフメガヌクレアーゼ」)と組み合わせ得る。次いで、このような「ハーフメガヌクレアーゼ」の組み合わせにより、興味のある標的を切断するヘテロダイマー種をもたらし得る。つまり、各サブドメインについての少数の新しい切断者を同定することは、非常に多数の新規なエンドヌクレアーゼの設計を可能にする。
【０１３３】
- 図3は、I-CreIの、そのDNA標的C1221 (配列番号1; Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜74 ; Chevalierら J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜69)との塩基特異的相互作用の地図を表す。本発明者らは、-10〜-8及び+8〜+10、又は-5〜-3及び+3〜+5の領域で改変されたDNA標的に結合できる新規なI-CreI由来エンドヌクレアーゼを同定した。これらのDNA領域を、灰色の箱で示す。
【０１３４】
- 図4は、ヒトRAG1遺伝子(遺伝子ID 5896、アクセッション番号NC_000011.8、36546139位〜36557877位)を表す。CDS配列を箱で囲み、CDSジャンクションを示す。ORFは、灰色の箱で示す。RAG1.10部位(配列番号151)、及び種々の潜在的メガヌクレアーゼ部位(RAG1.6: 配列番号149; RAG1.7: 配列番号150; RAG1.1: 配列番号159, 207; RAG1.2: 配列番号165; RAG1.5: 配列番号167; RAG1.3: 配列番号168; RAG1.11: 配列番号170;  RAG1.12: 配列番号173; RAG1.9: 配列番号175及びRAG1.4: 配列番号176)を、それらの配列及び位置とともに示す。既知の有害変異の例は、ORFの上に示す。
【０１３５】
- 図5は、ヒトRAG2遺伝子を示す(遺伝子ID 5897、アクセッション番号NC_000011.8、36570071〜36576362 (マイナス鎖))。CDS配列を箱で囲み、CDSジャンクションを示す。ORFは、灰色の箱で示す。RAG2.8メガヌクレアーゼ部位を、その配列(配列番号184)及び位置とともに示す。既知の有害変異の例は、ORFの上に示す。
- 図6は、I-CreI N75足場タンパク質、並びにUlib4及びUlib5ライブラリー構築に用いた縮合プライマーの配列を示す。A. 足場(配列番号203)は、D75Nコドン置換と、3'末端に3つの付加コドン(AAD)とを含むI-CreI ORFである。B. プライマー(配列番号204、205、206)。
【０１３６】
- 図7は、28位、30位、33位、38位及び／又は40位でのI-CreI変異型の切断パターンを表す。スクリーニング後に得られ、かつ28位、30位、33位、38位、40位、70位及び75位の残基で定義される141個のI-CreI変異型のそれぞれについて、切断を、±8〜10位のヌクレオチドの置換により、I-CreIにより切断されるC1221パリンドローム標的から導かれる64個の標的を用いて、酵母においてモニターした。標的は、-10位、-9位及び-8位のヌクレオチドに対応する3文字で示す。例えば、GGGは、tcgggacgtcgtacgacgtcccga標的(配列番号207)に相当する。値は、フィルタの走査の後に適切なソフトウェアにより評価された、切断の強度に対応する。各タンパク質について、切断が観察されたか(黒い箱)又は切断が観察されなかったか(0)を、64標的のそれぞれ1つずつについて示す。全ての変異型は、75位: D75Nで変異されている。
【０１３７】
- 図8は、その標的に結合したI-CreIホモダイマー上のタンパク質及びDNA標的中の変異の局在化を表す。変異の2つの組(残基44、68及び70; 残基28、30、33、38及び40)は、左のモノマー上に黒色で示す。変異の2つの組は、空間的に明確に区別される。しかし、区別されるサブドメインの構造的な証拠はない。DNA標的部位中の同族の領域(領域-5〜-3; 領域-10〜-8)は、一方のハーフサイト上に灰色で示す。
【０１３８】
- 図9は、標的のRAG1.10シリーズ及び近縁誘導体を示す。C1221 (配列番号1)は、I-CreIパリンドローム標的配列の1つである。10GTT_P、10TGG_P、5CAG_P及び5GAG_P (配列番号208〜211)は、I-CreI変異体により切断されることが見出された近縁誘導体である。これらは、C1221とは、箱で囲んだモチーフで異なる。C1221、10GTT_P、10TGG_P、5CAG_P及び5GAG_Pは、24 bp配列として最初は記載されたが、構造データにより、22 bpのみがタンパク質/DNA相互作用に関連することが示唆される。しかし、±12位を、括弧内に示す。RAG1.10 (配列番号151)は、5270位にてヒトRAG1遺伝子内に位置するDNA配列である。RAG1.10.2 (配列番号212)は、RAG1.10の左側部分に由来するパリンドローム配列であり、RAG1.10.3 (配列番号213)は、RAG1.10の右側部分に由来するパリンドローム配列である。10GTT_P、10TGG_P、5CAG_P及び5GAG_Pからの箱で囲んだモチーフは、標的のRAG1.10シリーズにおいて見出される。
【０１３９】
- 図10は、標的のRAG2.8シリーズ及び近縁誘導体を示す。C1221 (配列番号1)は、I-CreIパリンドローム標的配列の1つである。10GAA_P、10TGT_P、5TAT_P及び5CTC_P (配列番号214〜217)は、I-CreI変異体により切断されることが見出された近縁誘導体である。これらは、C1221とは、箱で囲んだモチーフで異なる。C1221、10GAA_P、10TGT_P、5TAT_P及び5CTC_Pは、24 bp配列として最初は記載されたが、構造データにより、22 bpのみがタンパク質/DNA相互作用に関連することが示唆される。しかし、±12位を、括弧内に示す。RAG2.8 (配列番号184)は、968位にてヒトRAG2遺伝子内に位置するDNA配列である。RAG2.8.2標的(配列番号218)において、標的の中央のttga配列を、C1221で見出される塩基であるgtacで置き換える。RAG2.8.3 (配列番号219)は、RAG2.8.2の左側部分に由来するパリンドローム配列であり、RAG2.8.4 (配列番号220)は、RAG2.8.2の右側部分に由来するパリンドローム配列である。10GAA_P、10TGT_P、5TAT_P及び5CTC_Pからの箱で囲んだモチーフは、標的のRAG2.8シリーズにおいて見出される。
【０１４０】
- 図11は、pCLS1055プラスミドベクターマップを示す。
- 図12は、pCLS10542プラスミドベクターマップを示す。
- 図13は、コンビナトリアル変異体によるRAG1.10.2標的の切断を示す。この図は、RAG1.10.2標的を用いるI_CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。H11及びH12は、異なる強度の陽性対照である。第1フィルタにおいて、位置A5及び位置D2での陽性変異体の配列は、それぞれKKSAQS/ASSDR及びKKSSQS/AYSYKである(表Vと同じ命名法)。第2フィルタにおいて、位置A6、G9及びH3での陽性変異体の配列は、それぞれKRDYQS/AYSYK、KRSNQS/AYSYK及びKKSGQS/AYSYKである。
【０１４１】
- 図14は、コンビナトリアル変異体によるRAG1.10.3標的の切断を示す。この図は、RAG1.10.3標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。H12は、陽性対照である。第1フィルタにおいて、位置A4及びH4での陽性変異体の配列は、それぞれKNSTAK/NYSYN及びQNSSRK/AHQNIである(表VIと同じ命名法)。第2フィルタにおいて、位置D3及びH11での陽性変異体の配列は、それぞれNNSSRRS/TRSYI及びNNSSRR/NRSYVである。
【０１４２】
- 図15は、pCLS1107ベクターマップを示す。
- 図16は、ヘテロダイマーコンビナトリアル変異体によるRAG1.10標的の切断を示す。この図は、表VIIに記載されるもののうちのコンビナトリアル変異体のシリーズの2次スクリーニングを示す。
【０１４３】
- 図17は、コンビナトリアル変異体によるRAG2.8.3標的の切断を示す。この図は、RAG2.8.3標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。第1フィルタにおいて、位置B3及びF5での陽性変異体の配列は、それぞれKNSRQQ/ATQNI及びKNSRQQ/NRNNIである(表VIIIと同じ命名法)。第2フィルタにおいて、位置B1、D11及びH11での陽性変異体の配列は、それぞれKNSRQA/RHTNI、KRSRQQ/AKGNI及びKNRSQQ/ARHNIである。
【０１４４】
- 図18は、コンビナトリアル変異体によるRAG2.8.4標的の切断を示す。この図は、RAG2.8.4標的を用いるI-CreIコンビナトリアル変異体の1次スクリーニングの例を示す。第1フィルタにおいて、陽性変異体は、NNSSRR/RYSNN (A7)、NNSSRK/TRSRY 83S (B4)、NNSSRR/TYSRA (C1及びH2)、QNSSRK/KYSYN (C6、F4、G4及びH7)、NNSSRR/TYSRV 140A (C8及びE8)、NNSSRR/KYSYN (C11)、NNSSRK/TYSRA (D6)、及びNNSSRR/TYSRA (H10)であるか、又は同定されない(A4及びG1) (表IXと同じ命名法)。第2フィルタにおいて、陽性変異体は、KNSYQS/RYSNN (A5)、NNSSRR/KYSYN 54L (B1)、NNSSRR/RYSNT (C11及びG3)、NNSSRR/RYSNN (D5及びG7)、KNSSRS/QYSYN (E5)、QNSSRK/KYSYN (F12)、NNSSRK/TYSRA (H2)である。
【０１４５】
- 図19は、ヘテロダイマーコンビナトリアル変異体によるRAG2.8.2標的の切断を示す。A. RAG2.8.2.標的を用いる、I-CreI変異体同士の組み合わせの2次スクリーニング。B. RAG2.8.標的を用いる、I-CreI変異体同士の同じ組み合わせの2次スクリーニング。この配列を用いて切断は観察されない。
- 図20は、RAG2.8標的の切断を示す。RAG2.8.3を切断する I-CreI N75最適化変異体のシリーズを、RAG2.8.4を切断する変異体と同時発現させる。切断は、RAG2.8標的を用いて試験される。RAG2.8を切断する変異体を丸で囲む(D6)。D6は、2つの変異型モノマー：33R40Q44A670N75N89A105A115T159R及び28N33S38R40K44R68Y70S75N77Nの組み合わせから得られるヘテロダイマーである。H12は陽性対照である。
【０１４６】
- 図21及び22は、ヒトRAG1及びRAG2遺伝子で見出されるDNA標的配列、並びに該DNA標的を切断可能な対応するI-CreI変異型を示す。標的配列に最も近いエキソン、及びエキソンのジャンクションを示し(列1及び2)、DNA標的の配列を(列3)、その位置(列4)とともに示す。標的部位での切断を修復するための最小修復マトリクスは、その最初のヌクレオチド(始点、列7)及び最後のヌクレオチド(終点、列8)で示す。各変異型の配列は、記載する位置でのそのアミノ酸残基により定義する。例えば、図21の最初のヘテロダイマー変異型は、Q、R、K、Y、E、S、R、Vをそれぞれ28位、38位、40位、44位、68位、70位、75位及び77位に有する第1モノマーと、R、Q、K、T、S、N及びVを30位、32位、44位、68位、70位、75位及び77位に有する第2モノマーとからなる。位置は、I-CreIの配列SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yを参照にして示す。I-CreIは、K、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D、I、E及びKを、それぞれ28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位、70位、75位、77位、80位及び82位に有する。記載していない位置は変異されていないので、野生型I-CreI配列に対応する。
【０１４７】
- 図23は、酵母における最適化変異体を用いるRAG2.8標的の切断を示す。RAG2.8.3配列を切断するI-CreI誘導体のシリーズ(実施例9で同定)を、RAG2.8.4標的を切断する変異体のランダム突然変異誘発により得られるI-CreI変異体の新しいシリーズと同時発現させた。RAG2.8標的の切断は、以前に記載される機能的アッセイ(Arnouldら, 2006, J. Mol. Biol. 355, 443〜458)を用いて酵母においてモニターされ、ここでは酵母の青色染色により明らかにされる。この図は、先の1次スクリーニングの間に同定される変異体のシリーズを特徴とする。これらの変異体を再び整列させ、各変異体を同じクラスター内の4つの異なる点で試験する。丸で囲んだ変異体(E8)は、表XIIに記載される33R、40Q、44A、70N、75N/132V 対 28N、33S、38R、40K、44R、68Y、70S、75Y、77N/49A、87Lヘテロダイマーに相当する。G12及びH12は陽性対照(I-SceI標的を有するI-SceIメガヌクレアーゼ)であり、F12は陰性対照(メガヌクレアーゼなし)である。
【０１４８】
- 図24は、RAG1.10.3を切断するKHSMAS/ARSYT変異体と、RAG1.10.2を切断するランダム突然変異を誘発させた変異体との同時発現によるRAG1.10標的の切断を示す。この図は、80個の再配列させた変異体の2次スクリーニングを示す(ウェルA1〜G8)。4ドットのクラスターのそれぞれにおいて、左の2つのドットは、ランダム突然変異を誘発した変異体に相当し、右の2つドットは、実施例3においてRAG1.10.2切断者として同定された非突然変異誘発KRSNQS/RYSDTタンパク質に相当する(表Vを参照されたい)。表XIIIに記載される6つの変異体を丸で囲む。
【０１４９】
- 図25は、哺乳動物細胞におけるI-CreI N75の発現用のプラスミドであるpCLS1088のマップを表す。
- 図26は、哺乳動物細胞用のレポーターベクターにおけるDNA標的のゲートウェイクローニング用のプラスミドであるpCLS1058のマップを表す。
【０１５０】
- 図27は、CHO細胞における染色体外アッセイにおける、G19S変異を有するか又は有さないM2及びM3 I-CreI変異体によるRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的の切断を示す。パリンドローム標的RAG1.10.2及びRAG1.10.3の切断をパネルAに示し、ヘテロダイマーメガヌクレアーゼによるRAG1.10切断をパネルBに示す。同じ実験におけるI-SceIによるI-SceI標的の切断は、陽性対照として示す。
【０１５１】
- 図28は、哺乳動物細胞におけるレポーターシステムの設計を示す。開始コドンの132bp下流のI-SceI切断部位によりさえぎられるピューロマイシン耐性遺伝子は、EFIαプロモーターの制御下にある(1)。導入遺伝子は、単一コピーでCHO-K1細胞において安定的に発現されている。同じ染色体の関係でメガヌクレアーゼ標的部位を導入するために、修復マトリクスは、i) プロモーターレスハイグロマイシン耐性遺伝子、ii) 完全lacZ発現カセット及びiii) 相同遺伝子の2本の腕(1.1 kb及び2.3 kb)で構成される。いくつかの修復マトリクスは、lacZ遺伝子をさえぎる認識部位によってのみ異なって構築されている(2)。つまり、非常に類似の細胞系統が、A1細胞系統、I-SceI細胞系統、及びI-CreI細胞系統として作製されている。機能的lacZ遺伝子は、lacZ修復マトリクス(長さ2kb)が、認識部位を切断するメガヌクレアーゼを発現するベクターと同時発現される場合に回復される(3)。メガヌクレアーゼ誘導組換えのレベルは、トランスフェクション後の青色コロニー又は増殖巣(foci)の数から推断できる。
【実施例】
【０１５２】
実施例1：±8位〜±10位での改変された特異性を有するI-CreI変異体の工学的作製
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び変更された特異性を有する変異型をスクリーニングするために用いる哺乳動物又は酵母細胞での切断誘発組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736、及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されている。これらのアッセイは、標準的な方法によりモニターできる機能的LacZレポーター遺伝子をもたらす。
【０１５３】
A) 材料及び方法
a) Ulib4、Ulib5及びLib4ライブラリーの構築
I-CreI wt及びI-CreI D75Nのオープンリーディングフレームを、以前に記載されたようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003, 31, 2952〜2962)。変異D75Nは、コドン75をaacで置き換えることにより導入した。3つのコンビナトリアルライブラリー(Ulib4、Ulib5及びLib4)は、1つのDNA標的ハーフサイトの±8〜10位の塩基との相互作用に関与する可能性がある残基の異なる3つの組み合わせを置き換えることにより、I-CreI D75Nタンパク質から導いた。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、選択された位置のそれぞれにユニーク縮重コドン(10〜12の異なるアミノ酸をコードする)を有する縮重プライマーを用いるPCRにより作製した。
【０１５４】
N30位、Y33位及びQ38位(Ulib4ライブラリー)、又はK28位、N30位及びQ38位(Ulib5ライブラリー)での3つのコドンを、12の異なるアミノ酸：A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Tをコードする縮重コドンVVK (18コドン)で置き換えた。その結果、これらのタンパク質ライブラリーの最大(理論的)多様性は、123又は1728である。しかし、核酸の点において、多様性は183又は5832である。所望の変異体の組み合わせを有するフラグメントは、縮重プライマーの対(Ulib456for及びUlib4rev; Ulib456for及びUlib5rev、図6B)と、DNA鋳型として、D75Nオープンリーディングフレーム(ORF)とを用いるPCRにより得られた(図6A)。対応するPCR生成物を、LEU2栄養要求性マーカー遺伝子を有する酵母複製発現ベクターpCLS0542中のI-CreI N75 ORFにクローニングして戻した(Epinatら,既出、及び図12)。この2ミクロンベースの複製ベクターにおいて、I-CreI変異型は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある。
【０１５５】
BIOMETHODESから入手したLib4において、70位のアルギニンを、まず、セリンで置き換えた(R70S)。次いで、28位、33位、38位及び40位を無作為化した。通常のアミノ酸(K28、Y33、Q38及びS40)を、10アミノ酸(A,D,E,K,N,Q,R,S,T,Y)のうちの1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で10000の理論的複雑さを有する。
【０１５６】
b) 標的クローンの構築
C1221の24 bpパリンドローム(tcaaaacgtcgtacgacgttttga、配列番号1)は、ほぼパリンドロームの天然I-CreI標的(tcaaaacgtcgtgagacagtttgg、配列番号221)のハーフサイトの反復である。C1221は、酵母及び哺乳動物細胞の両方において、インビボ及びエクスビボにて、I-CreI天然標的と同様に効果的に切断される。
【０１５７】
64個のパリンドローム標的は、以下のC1221に由来する。64個のオリゴヌクレオチド対((ggcatacaagtttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca (配列番号222)及び逆相補配列)をSigmaから購入し、アニールして同じ方向でpGEM-T Easy (PROMEGA)にクローニングした。次いで、400 bp PvuIIフラグメントを切り出し、ともに以前に記載される(Epinatら, 2003, 既出)pCLS0042ともよばれる酵母ベクターpFL39-ADH-LACURAZ、及び哺乳動物ベクターpcDNA3誘導体にクローニングして、64個の酵母ベクターを得た(標的プラスミド)。
【０１５８】
代わりに、一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、酵母及び哺乳動物のレポーターベクターにクローニングした。
【０１５９】
c) 酵母株
メガヌクレアーゼ発現変異型のライブラリーを、leu2変異体1倍体酵母株FYC2-6A: アルファ, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200に形質転換した。由来するDNA 1μgあたり106個の独立した形質転換体を通常与える(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)伝統的な化学的/熱ショックプロトコルを形質転換に用いた。個別の形質転換体(Leu+)クローンを、96ウェルマイクロプレートに個別に採取した。13824個のコロニーを、コロニーピッカー(QpixII, GENETIX)を用いて採取し、144マイクロタイタープレートで成長させた。
【０１６０】
64個の標的プラスミドを、同じプロトコルを用いて、1倍体酵母株FYBL2-7B: a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202に形質転換して、64個の試験株(tester strains)を得た。
【０１６１】
d) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
メガヌクレアーゼ発現クローンを、64個の標的株のぞれぞれと交配させ、2倍体を、上記のArnouldら, 2006の図2に示されるスクリーニングアッセイを用いて、ベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。I-CreI変異型クローン、及び酵母レポーター株をグリセロール(20%)中にストックし、新しいマイクロプレートに複製した。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, GENETIX)を用いて行った。変異体を、高格子密度(gridding density) (約20スポット/cm2)を用いて、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に格子状に置いた。第2格子プロセスを、同じフィルタ上に行って、それぞれの変異型について64個の異なるレポーター含有酵母株からなる第2層をスポットした。メンブレンを、固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて1晩インキュベートして交配させた。次いで、フィルタをロイシンもトリプトファンも含まず、炭素源としてガラクトース(1%)を含む(同時発現実験についてG418も含む)合成培地上に移し、37℃にて5日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する2倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロース中に0.02% X-Galを含む固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。2日間のインキュベーションの後に、陽性クローンをスキャンにより同定した。クローンのβ-ガラクトシダーゼ活性を、適切なソフトウェアを用いて定量した。
【０１６２】
少なくとも1つの標的に対して活性を示すクローンを単離した(1次スクリーニング)。スポット密度を、次いで、4スポット/cm2に減らし、各陽性クローンを、4重で64個のレポーター株に対して試験することにより、完全なプロファイルを作製した(2次スクリーニング)。
【０１６３】
e) 配列
酵母における1次及び／又は2次スクリーニングの間に同定された陽性クローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、PROLIGOからのプライマー：PCR-Gal10-F (gcaactttagtgctgacacatacagg, 配列番号223)及びPCR-Gal10-R (acaaccttgattgcagacttgacc, 配列番号224)を用いて、PCRにより増幅した。簡単に、酵母コロニーを採取し、100μlのLGlu液体培地に再懸濁し、1晩培養する。遠心分離の後に、酵母ペレットを10μlの滅菌水に再懸濁し、これを用いて、1.5μlの各特異的プライマー(100 pmol/μl)を含有する最終容量50μl中のPCR反応を行う。PCR条件は、94℃にて10分間の変性の1サイクル、94℃にて30秒間の変性、55℃にて1分間のアニーリング、72℃にて1.5分間の伸長の35サイクル、及び5分間の最終伸長であった。得られたPCR産物は、次いで、配列決定した。
【０１６４】
f) 1次ヒットの再クローニング
1次スクリーニングの間に同定された陽性クローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、Gatewayプロトコル(Invitrogen)を用いて再クローニングした。ORFを、酵母コロニー上で、e)に記載されるようにしてPCRにより増幅した。次いで、PCR産物を、(i)ガラクトース誘導性プロモーター、選択マーカーとしてLEU2又はKanR、及び2ミクロン複製起点を有する酵母ゲートウェイ発現ベクター、及び(ii) NOVAGENからのpET 24d(+)ベクターにクローニングした。得られたクローンを、配列決定(MILLEGEN)により確認した。
【０１６５】
B) 結果
I-CreIは、22 bpの偽パリンドローム標的を切断する二量体ホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然の標的に結合するI-CreI構造の分析により、各モノマーにおいて、8残基が7塩基と直接の相互作用を確立することが示されている(Juricaら, Mol. Cell. Biol., 1998, 2, 469〜476)。これらの構造データによると、±8〜10位のヌクレオチドの塩基は、I-CreIアミノ酸N30、Y33及びQ38と特異的接触を確立する(図3)。つまり、30位、33位及び38位の変異を有する新規なタンパク質は、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的の±8位、±9位及び±10位の置換により得られる64個の標的と新規な切断プロファイルを示し得る。さらに、変異は、DNA塩基との直接接触に関与する残基の数及び位置を変更し得る。より具体的には、30位でも33位でも38位でもないが、折り畳まれたタンパク質の近傍に位置する位置は、同じ塩基対との相互作用に関与し得る。
【０１６６】
網羅的なタンパク質ライブラリー対標的ライブラリーのアプローチを行って、DNA結合界面のこの部分を局所的に工学的に改変した。まず、I-CreI足場を、D75からNに変異させた。D75N変異体は、タンパク質構造に影響しなかったが、過剰発現実験においてI-CreIの毒性を減少させた。
【０１６７】
次いで、Ulib4ライブラリーを構築した。残基30、33及び38を無作為化し、通常のアミノ酸(N30、Y33及びQ38)を、12アミノ酸(A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T)の1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さ(complexity)を有する(核酸の点で5832)。
【０１６８】
次いで、他の2つのライブラリー：Ulib5及びLib4を構築した。Ulib5において、残基28、30及び38を無作為化し、通常のアミノ酸(K28、N30及びQ38)を、12アミノ酸(ADEGHKNPQRST)の1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さを有する(核酸の点で5832)。Lib4において、70位のアルギニンを、まず、セリンで置き換えた。次いで、28位、33位、38位及び40位を無作為化し、通常のアミノ酸(K28、Y33、Q38及びS40)を、10アミノ酸(A,D,E,K,N,Q,R,S,T,Y)の1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で10000の複雑さを有する。
【０１６９】
1次スクリーニング実験において、Ulib4からの20000クローン、Ulib5からの10000クローン、及びLib4からの20000クローンを、64個の試験株のそれぞれと交配させ、2倍体を、ベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。64個の標的の少なくとも1つとの切断活性を示す全てのクローンを、64個の標的に対して、4重に、第2回目のスクリーニングにおいて試験し、それぞれの切断プロファイルを確立した。次いで、メガヌクレアーゼORFを、各株からPCRにより増幅し、配列決定し、141個の異なるメガヌクレアーゼ変異型を同定した。
【０１７０】
141個の確認されたクローンは、非常に多様なパターンを示した。これらの新しいプロファイルのいくつかは、野生型足場といくらかの類似性を示したが、多くの他のものは全く異なっていた。結果を、図7にまとめる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの標的配列におけるいくらかの縮重に通常は適合でき、I-CreI N75足場タンパク質自体は、±10位〜±8位のaaa、aac、aag及びaatトリプレットに対応する一連の4標的を切断する。強い切断活性は、aaa、aag及びaatで観察されるが、aacは、わずかしか切断されない(そしてしばしば観察されない)。類似のパターンは、他のタンパク質、例えばI-CreI K28, N30, D33, Q38, S40, R70及びN75、I-CreI K28, N30, Y33, Q38, S40, R70及びN75を用いて見出される。いくつかのタンパク質、例えばI-CreI R28, N30, N33, Q38, D40, S70及びN75、並びにI-CreI K28, N30 N33, Q38, S40, R70及びN75を用いて、aacはもはや切断されない。
【０１７１】
しかし、多くのタンパク質が非常に異なるパターンを示す。2〜3の変異型を用いて、ユニーク配列の切断が観察される。例えば、タンパク質I-CreI K28, R30, G33, T38, S40, R70及びN75は、野生型タンパク質により切断されなかった「ggg」標的に対して活性であるが、I-CreI Q28, N30, Y33, Q38, R40, S70及びN75は、I-CreI N75により切断される標的の1つであるaatを切断する。他のタンパク質は、一連の異なる標的を効率的に切断する。例えば、I-CreI N28, N30, S33, R38, K40, S70及びN75はggg、tgg及びtgtを切断し、CreI K28, N30, H33, Q38, S40, R70及びN75は、aag、aat、gac、gag、gat、gga、ggc、ggg及びggtを切断する。切断される配列の数は、1〜10の範囲である。まとめると、I-CreIにより切断されない34個の標的と、I-CreIにより切断される3つの標的(aag、aat及びaac、図7)とを含む37個の新規な標的が変異体により切断された。
【０１７２】
実施例2：RAG1又はRAG2遺伝子からの標的を切断する新規なメガヌクレアーゼの工学的作製の方策
I-CreIの44位、68位、70位、75位及び／又は77位に少なくとも1つの置換を有し、かつ±3〜5位に変動を有する変異I-CreI部位を切断できるI-CreI変異型の第1シリーズを、以前に記載されたようにして同定した(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。
【０１７３】
I-CreIの28位、30位、33位又は28位、33位、38位及び40位に少なくとも1つの置換を有し、かつ±8〜10位に変動を有する変異I-CreI部位を切断できるI-CreI変異型の第2シリーズを、実施例1に記載されるようにして同定した。変異型の切断パターンを図7に示す。
【０１７４】
一方で28位、30位、33位、38位及び40位、並びに他方で44位、68位及び70位は、同じDNA結合折り畳み上にあり、これらが独立して挙動するとの構造的証拠はない。しかし、2組の変異は、DNA標的の異なる領域の周囲に位置するこの折り畳みの2つの空間的に異なる領域上に明らかに存在する(図8)。これらのデータは、I-CreIが、組み合わせて新規なキメラ標的を切断できる2つの独立した機能的サブユニットを含むことを示唆する。キメラ標的は、それぞれのサブドメインが結合する±3〜5位及び±8〜10位のヌクレオチドを含む。
【０１７５】
この仮説は、興味対象遺伝子であるRAG遺伝子内に位置する標的を用いて確認された。I-CreI変異型により切断される標的は、I-CreIにより切断されるパリンドローム配列であるC1221の24 bp誘導体である。しかし、そのDNA標的に結合したI-CreIの構造は、これらの標的の2つの外部の塩基対(-12位と12位)が、結合及び切断に対して影響しないことを示唆し(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3574; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)、この研究において、-11位〜11位のみを考慮した。よって、RAG1及びRAG2遺伝子において同定された一連の標的は、24 bpではなく22 bpの配列として定義された。
【０１７６】
1) RAG1.10
RAG1.10は、RAG1のコーディングエキソンから7 bp上流の(図4)、ヒトRAG1遺伝子(アクセッション番号NC_000011.8、836546139位〜36557877位)の5270位に位置する22 bp (非パリンドローム)標的である(図9)。
【０１７７】
RAG1.10を切断するメガヌクレアーゼを用いて、切断部位の近傍の変異を修正することができた(図1A)。遺伝子修正効率は、DSBへの距離が増加すると減少するので(Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101)、この方策は、切断部位の500 bp以内に位置する変異に最も有効であろう。或いは、同じメガヌクレアーゼを用いて、RAG1遺伝子座にて機能的RAG1遺伝子を回復し得るエキソン配列をノックインすることができた(図1B)。この方策は、切断部位の下流のいずれに変異についても用い得る。
【０１７８】
RAG1.10は、部分的に、以前に同定されたメガヌクレアーゼ(図7)により切断される10GTT_P、10TGG_P及び5CAG_P及び5GAG_P標的のパッチワークである(図9)。つまり、RAG1.10は、以前に同定されたこれらのメガヌクレアーゼから得られるコンビナトリアル変異体により切断され得る。
【０１７９】
よって、この仮説を確認するために、2つのパリンドローム標的であるRAG1.10.2及びRAG1.10.3を、RAG1.10から導いた(図9)。RAG1.10.2及びRAG1.10.3はパリンドロームであるので、これらは、ホモダイマータンパク質により切断されるはずである。第1工程において、RAG1.10.2及びRAG1.10.3配列をホモダイマーとして切断できるタンパク質を設計した(実施例3及び4)。第2工程において、実施例3及び4で得られたタンパク質を、同時発現させて、RAG1.10を切断するヘテロダイマーを得た(実施例5)。
【０１８０】
2) RAG2.8
RAG2.8は、ヒトRAG2遺伝子(アクセッション番号NC_000011.8、36576362〜36570071に相補的)のRAG2のイントロン(図5)の初めの968位に位置する22 bp (非パリンドローム)標的である(図10)。
【０１８１】
RAG2.8を切断するメガヌクレアーゼは、RAG2遺伝子座(図1B)にて機能的RAG2遺伝子を回復し得るエキソン配列のノックインに用い得る。この方策は、切断部位(図5)の下流のいずれの変異についても用い得る。
RAG2.8は、部分的に、以前に同定されたメガヌクレアーゼ(図7)により切断される10GAA_P、10TGT_P及び5TAT_P及び5CTC_P標的の(図10)パッチワークである。つまり、RAG1.10は、以前に同定されたこれらのメガヌクレアーゼから得られるコンビナトリアル変異体により切断され得る。
【０１８２】
RAG1.10とは対照的に、RAG2.8は、C1221とは、4 bpの中央領域で異なる。その標的に結合しているI-CreIタンパク質の構造によると、中央の4塩基対(-2位〜2位)とI-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3574; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。つまり、これらの位置の塩基は、結合効率に影響を与えるとは考えられない。しかし、これらは、この領域の端での2つのニックに起因する切断に影響し得る。よって、-2〜2のggaa配列を、C1221からのgtac配列でまず置換して標的RAG2.8.2を得た。次いで、2つのパリンドローム標的であるRAG2.8.3及びRAG2.8.4を、RAG2.8.2から導いた。RAG2.8.3及びRAG2.8.4は、パリンドロームであるので、これらは、ホモダイマータンパク質により切断されるはずである。第1工程において、ホモダイマーとしてRAG2.8.3及びRAG2.8.4配列を切断できるタンパク質を設計し(実施例6及び7)、これらを同時発現させて、RAG2.8を切断するホモダイマーを得た(実施例8)。この場合、RAG2.8標的を切断するヘテロダイマーは見出されなかった。RAG2.8.3又はRAG2.8.4を切断する一連の変異体を選択し、次いで精製した(refined)。選択された変異体を無作為に突然変異誘発し、新規なヘテロダイマーの形成に用い、これらをRAG2.8標的に対してスクリーニングした(実施例9及び10)。著しい切断活性を示すRAG2.8標的を切断するヘテロダイマーを同定できた。
【０１８３】
実施例3：RAG1.10.2を切断するメガヌクレアーゼの作製
本実施例は、I-CreI変異体が、パリンドローム形のRAG1.10標的の左部分に由来するRAG1.10.2 DNA標的配列を切断できることを示す(図9)。本実施例で記載される標的配列は、22 bpパリンドローム配列である。よって、これらは、そのことを示すためだけに、最初の11ヌクレオチド、続いて接尾辞_Pによってのみ記載される(例えば、標的RAG1.10.2は、tgttctcaggt_Pとも記載される；配列番号212)。
【０１８４】
RAG1.10.2は、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位及び±11位において5CAG_Pに、そして±1位、±2位、±8位、±9位及び±10位において10GTG_Pに似ている。±6位、±7位及び±11位は、結合及び切断活性にほとんど影響を有さないと仮定された。5CAG_P (caaaaccaggt_P；配列番号210)を切断できる変異体は、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるように、44位、68位、70位、75位及び77位にてI-CreIに突然変異を誘発することにより、以前に得られた。10GTT_P標的(cgttacgtcgt_P)を切断できる変異体は、28位、30位、32位、33位、38位、40位にてI-CreI N75及びD75に突然変異を誘発することにより得られた(実施例1及び図7)。つまり、変異体のこのような対を組み合わせることにより、RAG1.10.2標的の切断が可能になるだろう。
【０１８５】
両方の組のタンパク質は、70位で変異している。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインがI-CreIに存在すると仮定された。このことは、この位置が標的の塩基10〜8での特異性に対してほとんど影響を有さないことを意味する。
よって、組み合わせた変異体がRAG1.10.2標的を切断できるかを確認するために、5CAG_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GTG_Pを切断するタンパク質からの30、32、33、38及び40変異と組み合わせた。
【０１８６】
A) 材料及び方法
a) 標的ベクターの構築
標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドは、Proligoから購入した(例えば：RAG1.10.2標的について5' tggcatacaagttttgttctcaggtacctgagaacaacaatcgtctgtca 3' (配列番号225))。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、GatewayR プロトコル(INVITROGEN)を用いて、酵母レポーターベクターにクローニングした(pCLS1055、図11)。酵母レポーターベクターで、S. cerevisiae FYBL2-7B株(MATアルファ, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
【０１８７】
b) コンビナトリアル変異体の構築
10GTG_P又は5CAG_Pを切断するI-CreI変異体を、それぞれ10TGC_P及び5TTT_P標的について、実施例1及び図7、並びにArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるようにして同定した。両方のシリーズからの変異を含むI-CreI由来コード配列を作製するために、I-CreIコード配列の5'末端(アミノ酸1位〜43位)、又は3'末端(39位〜167位)を増幅する別々のオーバーラップPCR反応を行った。5'及び3'の両方の末端について、PCR増幅を、ベクター(pCLS0542、図12)に特異的なGal10F又はGal10Rプライマーと、アミノ酸39〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(assF 5'-ctannnttgaccttt-3' (配列番号226)又はassR 5'-aaaggtcaannntag-3' (配列番号227)、ここでnnnは残基40をコードする)とを用いて行う。同じプライマーと残基40についての同じコード配列とを用いて行う増幅反応により得られるPCRフラグメントを、プールした。次いで、プライマーGal10Fと、assR又はassFと、Gal10Rとを用いる反応により得られるPCRフラグメントの各プールを、等モル比で混合した。最後に、2つのオーバーラップPCRフラグメントをそれぞれ約25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により直線化したベクターDNA (pCLS0542) 25 ngとを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol, 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。両方の群の変異を含有する無傷のコード配列を、酵母におけるインビボ相同組換えにより作製する。
【０１８８】
c) メガヌクレアーゼを発現するクローンの交配及び酵母でのスクリーニング：
実験手順は、低格子密度(約4スポット/cm2)を用いた以外は、実施例1に記載するとおりである。
【０１８９】
d) 変異体の配列決定
プラスミドを発現する変異体を回収するために、酵母DNAを、標準的なプロトコルを用いて抽出し、E. coliを形質転換するのに用いた。変異ORFの配列決定を、次いで、プラスミドに対してMILLEGEN SAにより行った。あるいは、ORFを、酵母DNAからPCRにより増幅させ(Akadaら, Biotechniques, 2000, 28, 668〜670)、配列決定を、PCR産物に対して直接、MILLEGEN SAにより行った。
【０１９０】
B) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、I-CreI N75又はD75足場上の30、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して、1300の複雑さのライブラリーを得た。組み合わせの例は、表Vに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、2300クローン(多様性の1.8倍)を、RAG1.10.2 DNA標的(tgttctcaggt_P；配列番号212)に対する切断についてスクリーニングした。64個の陽性クローンが見出され、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、32個の異なる新規エンドヌクレアーゼであることが見出された(表V)。陽性の例は、図13に示す。
【０１９１】
【表５】
2009543574.tif 000008
【０１９２】
実施例4：RAG1.10.3を切断するメガヌクレアーゼの作製
本実施例は、I-CreI変異型が、パリンドローム形のRAG1.10.1標的の右部分に由来するRAG1.10.3 DNA標的配列を切断できることを示す(図9)。本実施例で記載される全ての標的配列は、22 bpのパリンドローム配列である。よって、これらは、最初の11ヌクレオチド、続いて接尾辞_Pによってのみ記載される；例えば、RAG1.10.3は、ttggctgaggt_P；配列番号213とよばれる。
【０１９３】
RAG1.10.3は、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位及び±7位において5GAG_Pに、そして±1位、±2位、±7位、±8位、±9位及び±10位において10TGG_Pに似ている。±6位及び±11位は、結合及び切断活性にほとんど影響を有さないと仮定された。5GAG_Pを切断できる変異体は、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるように、44位、68位、70位、75位及び77位にてI-CreIに突然変異を誘発することにより、以前に得られた。10GTG_P標的を切断できる変異体は、実施例1に記載されるようにして、28位、30位、32位、33位、38位、40位及び70位にてI-CreI N75及びD75に突然変異を誘発することにより得られた(図7)。よって、変異体のこのような対を組み合わせることにより、RAG1.10.3標的の切断が可能になるだろう。
【０１９４】
両方の組のタンパク質は、70位で変異している。しかし、I-CreIが2つの分離可能な機能的サブドメインを含むと仮定された。このことは、この位置が標的の塩基10〜8での特異性に対してほとんど影響を有さないことを意味する。よって、組み合わせた変異体がRAG1.10.3標的を切断できるかを確認するために、5GAG_P (caaaacgaggt_P；配列番号210)を切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10TGG_P (ctggacgtcgt_P；配列番号209)を切断するタンパク質からの28、30、32、33、38及び40変異と組み合わせた。
【０１９５】
A) 材料及び方法
実施例3を参照されたい。
【０１９６】
B) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、I-CreI N75又はD75足場上の28、30、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して、1215の複雑さのライブラリーを得た。コンビナトリアル変異体の例は、表VIに示す。このライブラリーで酵母を形質転換し、2300クローン(多様性の1.9倍)を、RAG1.10.3 DNA標的(ttggctgaggt_P; 配列番号213)に対する切断についてスクリーニングした。88個の陽性クローンが見出され、これらは、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、27個の異なる新規エンドヌクレアーゼに相当することが見出された(表VIを参照)。陽性の例は、図14に示す。
【０１９７】
【表６】
2009543574.tif 000009
【０１９８】
実施例5：RAG1.10を切断するメガヌクレアーゼの作製
パリンドロームRAG1.10由来標的(RAG1.10.2及びRAG1.10.3)のそれぞれを切断できるI-CreI変異体を、実施例3及び4で同定した。このような変異体の対(RAG1.10.2を切断する1つとRAG1.10.3を切断する1つ)を、酵母で同時発現させた。同時発現の際に、3つの活性分子種、すなわち2つのホモダイマーと1つのヘテロダイマーとが存在すべきである。形成されるべきヘテロダイマーがRAG1.10標的を切断するかをアッセイした。
【０１９９】
A) 材料及び方法
a) カナマイシン耐性ベクターにおける変異体のクローニング
酵母で2つのI-CreI変異体を同時発現させるために、RAG1.10.2配列を切断する変異体を、カナマイシン耐性酵母発現ベクター(pCLS1107、図15)にサブクローニングした。
変異体を、ロイシンベクター(pCLS0542)及びカナマイシンベクター(pCLS1107)に共通のプライマー(Gal10F及びGal10R)を用いてPCR反応により増幅させた。約25ngのPCRフラグメントと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした25ngのベクターDNA (pCLS1107)とを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換する。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
【０２００】
b) 変異体同時発現：
RAG1.10.3標的を切断する変異体を発現する酵母株を、pCLS1107発現ベクター中のRAG1.10.2標的を切断する変異体についてコードするDNAで形質転換した。形質転換体を、−L Glu + G418培地上で選択した。
【０２０１】
c) メガヌクレアーゼを同時発現するクローンの交配及び酵母でのスクリーニング
実験手順は、低格子密度(約4スポット/cm2)を用いた以外は、実施例1に記載するとおりである。
【０２０２】
B) 結果
RAG1.10.2及びRAG1.10.3を切断する変異体の同時発現は、ほとんどの場合においてRAG1.10標的の効率的な切断をもたらした(図16)。機能的な組み合わせを、表VIIにまとめる。
【０２０３】
【表７】
2009543574.tif 000010
【０２０４】
実施例6：RAG2.8.3を切断するメガヌクレアーゼの作製
本実施例は、I-CreI変異体が、パリンドローム形のRAG2.8.2標的の左部分に由来するRAG2.8.3 DNA標的配列を切断できることを示す(図10)。本実施例で記載される配列は、22 bpパリンドローム配列である。よって、これらは、最初の11ヌクレオチド、続いて接尾辞_Pによってのみ記載され、例えば標的RAG2.8.3は、tgaaactatgt_P；配列番号219とも記載される。
【０２０５】
RAG2.8.3は、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位、±6位、±7位、±8位及び±9位において5TAT_Pに、そして±1位、±2位、±6位、±7位、±8位、±9位及び±10位において10GAA_Pに似ている。5TAT_Pを切断できる変異体は、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるように、44位、68位、70位、75位及び77位にてI-CreIに突然変異を誘発することにより、以前に得られた。10GAA_P標的を切断できる変異体は、28位、30位、33位、38位、40位及び70位にてI-CreI N75に突然変異を誘発することにより得られた(実施例1及び図7)。つまり、変異体のこのような対を組み合わせることにより、RAG2.8.3標的の切断が可能になるだろう。
【０２０６】
両方の組のタンパク質は、70位で変異している。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインがI-CreIに存在すると仮定された。このことは、この位置が標的の塩基10〜8での特異性に対してほとんど影響を有さないことを意味する。よって、組み合わせた変異体がRAG2.8.3標的を切断できるかを確認するために、5TAT_P (caaaaccctgt_P)を切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10GAA_P (cgaaacgtcgt_P)を切断するタンパク質からの28、30、33、38及び40変異と組み合わせた。
【０２０７】
A) 材料及び方法
実施例3を参照されたい。
【０２０８】
B) 結果
I-CreIコンビナトリアル変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、I-CreI足場上の28、30、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して、648の複雑さのライブラリーを得た(表VIIIを参照)。このライブラリーで酵母を形質転換し、1728クローン(多様性の2.7倍)を、RAG2.8 DNA標的(tgaaactatgt_P；配列番号184)に対する切断についてスクリーニングした。24個の陽性クローンが見出され、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、表VIIIに列挙する11個のコンビナトリアル変異体を同定した。付加的な変異を有する変異体、例えばKNWGQS/QRRDI、KNESQS/QRRDI及びKNRPQS/QRRDI (表X)も同定した。このような変異体は、コンビナトリアルプロセスの間のPCRアーチファクトに起因するようである(材料及び方法を参照)。陽性の例は、図17に示す。
【０２０９】
【表８−１】
2009543574.tif 000011
【０２１０】
【表８−２】
2009543574.tif 000012
【０２１１】
実施例7：RAG2.8.4を切断するメガヌクレアーゼの作製
本実施例は、I-CreI変異型が、パリンドローム形のRAG2.8.2標的の右部分に由来するRAG2.8.4 DNA標的配列を切断できることを示す(図10)。本実施例で記載される全ての標的配列は、22 bpのパリンドローム配列である。よって、これらは、そのことを示すためにだけ、最初の11ヌクレオチド、続いて接尾辞_Pによってのみ記載される(例えば、RAG2.8.4は、ttgtatctcgt_P；配列番号220とよばれる)。
【０２１２】
RAG2.8.4は、±1位、±2位、±3位、±4位、±5位及び±7位において5CTC_Pに、そして±1位、±2位、±3位、±4位、±7位、±8位、±9位及び±10位において10TGT_Pに似ている。±6位及び±11位は、結合及び切断活性にほとんど影響を有さないと仮定された。5CTC_P (caaaacctcgt_P；配列番号217)を切断できる変異体は、Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458に記載されるように、44位、68位、70位、75位及び77位にてI-CreI N75に突然変異を誘発することにより、以前に得られた。10TGT_P標的(ctgtacgtcgt_P；配列番号215)を切断できる変異体は、実施例1に記載されるようにして、28位、33位、38位、40位及び70位にてI-CreI N75に突然変異を誘発することにより得られた(図7)。よって、変異体のこのような対を組み合わせることにより、RAG2.8.4標的の切断が可能になるだろう。
【０２１３】
両方の組のタンパク質は、70位で変異している。しかし、I-CreIが2つの分離可能な機能的サブドメインを含むと仮定された。このことは、この位置が標的の塩基10〜8での特異性に対してほとんど影響を有さないことを意味する。よって、組み合わせた変異体がRAG2.8.4標的を切断できるかを確認するために、5CTC_Pを切断するタンパク質からの44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、10TGT_Pを切断するタンパク質からの28、33、38及び40変異と組み合わせた(表IX)。
【０２１４】
A) 材料及び方法
実施例3を参照されたい。
【０２１５】
B) 結果
本実施例で用い、かつ10TGT_P標的又は5CTC_P標的を切断するI-CreI変異体を、表IXに列挙する。I-CreI組み合わせ変異体を、44位、68位、70位、75位及び77位での変異を、I-CreI足場上の28、33、38及び40変異と組み合わせることにより構築して(表IX)、290の複雑さのライブラリーを得た。このライブラリーを酵母に形質転換して、1056クローン(多様性の3.6倍)を、RAG2.8.4 DNA標的(ttgtatctcgt_P; 配列番号220)に対する切断についてスクリーニングした。105個の陽性クローンが見出され、配列決定及び2次スクリーニングによる確認の後に、29個のコンビナトリアル変異体を同定した(表IX)。例えば：
- NNSSRR/KYSNN (表X)
- KNPPQS/QRRDI (表X)-
- KNRWQS/QRRDI (表X)
- KNSYQS/RYSNN (図18)
- KNSSRS/QYSYN (図18)
- NNSSRK/TRSRY 83S (図18)
- NNSSRR/TYSRV 140A (図18)
- NNSSRR/KYSYN 54L (図18)
のようなさらなる変異を有する変異体も同定した。
このような変異体は、コンビナトリアルプロセスの間のPCRアーチファクトに起因するようである(材料及び方法を参照)。陽性の例は、図18に示す。
【０２１６】
【表９】
2009543574.tif 000013
【０２１７】
実施例8：RAG2.8. 2を切断するメガヌクレアーゼの作製
パリンドロームRAG2.8由来標的(RAG2.8.3及びRAG2.8.4)のそれぞれを切断できるI-CreI 変異体を、実施例6及び7にて同定した。酵母でのこのような変異体の対(RAG2.8.3を切断する1つとRAG2.8.4を切断する1つ)を、酵母で同時発現させた。同時発現の際に、3つの活性分子種、すなわち2つのホモダイマーと1つのヘテロダイマーとが存在すべきである。形成されるべきヘテロダイマーがRAG2.8及びRAG2.8.2標的を切断するかをアッセイした。
【０２１８】
A) 材料及び方法
実施例5を参照されたい。
【０２１９】
B) 結果
RAG2.8.3及びRAG2.8.4を切断する変異体の同時発現は、ほとんどの場合においてRAG2.8.2標的の効率的な切断をもたらした(図19)。一般的な規則と同様に、RAG2.8.2配列を切断する機能的ヘテロダイマーは、2つの発現されたタンパク質が、ホモダイマーとして強いシグナルを与えるときに常に得られた(図19)。しかし、これらの組み合わせは、いずれも、-1位、1位及び2位の3 bpのみがRAG2.8.2配列と異なるRAG2.8天然標的を切断できなかった(図10)。機能的組み合わせを、表Xにまとめる。
【０２２０】
【表１０】
2009543574.tif 000014
【０２２１】
実施例9：RAG2.8.3を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及びRAG2.8.4を切断するタンパク質との組み合わせによるRAG2.8を切断するメガヌクレアーゼの作製
非パリンドロームRAG2.8.2標的を切断できるI-CreI変異体は、パリンドロームRAG2.8.3及びRAG2.8.4標的を切断する変異体の組み立てにより同定されている(実施例8)。しかし、これらの組み合わせのいずれも、-1位、1位及び2位の3 bpのみがRAG2.8.2と異なるRAG2.8を切断できなかった。
【０２２２】
よって、RAG2.8.2を切断するタンパク質の組み合わせに突然変異を誘発し、RAG2.8を切断する変異型をスクリーニングした。その標的に結合しているI-CreIタンパク質の構造によると、4つの中央の塩基対(-2位〜2位)と、I-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3574; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。よって、突然変異を誘発する位置の組を合理的に選択することは困難であり、突然変異誘発は、タンパク質のC-末端部分(最後の83アミノ酸)、又はタンパク質全体に対して行った。ランダム突然変異誘発は、複雑さが高いライブラリーをもたらす。よって、試験される変異型ライブラリーの複雑さを制限するために、RAG2.8.2を切断するヘテロダイマーの2つの成分の1つのみに突然変異を誘発した。
【０２２３】
つまり、第1工程において、RAG2.8.3を切断するタンパク質に突然変異を誘発し、第2工程において、これらが、RAG2.8.4を切断するタンパク質と同時発現させたときにRAG2.8を切断できるかを評価した。
【０２２４】
A) 材料及び方法
新しいI-CreI変異型ライブラリーを、RAG2.8.3標的を切断する選択された工学的に改変されたメガヌクレアーゼのプールのランダム突然変異誘発により創出した。突然変異誘発は、JBS dNTP-Mutageneisキット中のJena Bioscience GmbHからのプロトコルに記載されるように、Mn2+又はdNTPの誘導体、例えば8-オキソ-dGTP及びdPTPを2工程PCRプロセスで用いるPCRにより行った。用いるプライマーは、preATGCreFor (5'-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3', 配列番号228)及びICreIpostRev (5'-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3', 配列番号229)である。新しいライブラリーを、ガラクトース誘導性プロモーター、選択マーカーとしてKanR及び2ミクロン複製起点を有する線状にしたpCLS1107ベクター(図15)中で、インビボにて酵母にクローニングした。陽性の得られたクローンを、配列決定(MILLEGEN)により確認した。
【０２２５】
変異体のプールを、ロイシンベクター(pCLS0542)及びカナマイシンベクター(pCLS1107)に共通のプライマーpreATGCreFor及びICreIpostRevを用いてPCR反応により増幅させた。約75 ngのPCRフラグメントと、DraIII及びNgoMIVでの消化により線状にした75 ngのベクターDNA (pCLS1107)とを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコルを用いて形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを選択した。I-CreI変異体についてのインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製した。
【０２２６】
Q-Pix2ロボット(Genetix)を用いて酵母コロニーを採取し、pCLS1055酵母レポーターベクター内にRAG2.8標的を含み(図11)、pCLS0542内にクローニングされたRAG2.8.4標的を切断する変異体(図12)を発現する反対の接合型の酵母株(FYBL2-7B:MAT a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)と個別に交配させた。交配は、以前に記載されたようにして(Arnouldら, 2006, J. Mol. Biol. 355, 443〜458)、又は実施例1に記載されるようにして行った。
【０２２７】
B) 結果
RAG2.8.3を切断する3つの変異体(I-CreI 33R, 40Q, 44A, 70A及び75N、又はI-CreI 33R, 40Q, 44A, 70H及び75N、並びにI-CreI 33R, 40Q, 44A, 70N及び75N、表IXの命名法によるとKNSRQQ/ARANI、KNSRQQ/ARHNI及びKNSRQQ/ARNNIともよばれる)をプールし、ランダム突然変異を誘発し、酵母を形質転換した(図20)。2280個の形質転換クローンを、個別に採取し、(i) レポータープラスミド内にRAG2.8標的を含む酵母株、(ii) 実施例7に記載されるものから選択された、RAG2.8.4標的を切断する変異型を発現する酵母株と交配させた。I-CreI 28N, 33S, 38R, 40K, 44R, 68Y, 70S, 75N及び77N (又はNNSSRK/RYSNN)変異体、又はI-CreI 28Q,33S, 38R, 40K, 44R, 68Y, 70S, 75N及び77T (又はQNSSRK/RYSNT)変異体を発現する2つのこのような株を用いた(表XIを参照)。24個のクローンが、このような酵母株と交配させた場合に、RAG2.8標的の切断を引き起こすことが見出された。対照実験において、これらのクローンはいずれも、NNSSRK/RYSNN又はQNSSRK/RYSNTタンパク質の同時発現なしではRAG2.8の切断を誘発しないことが見いだされた。よって、24個の陽性が、NNSSRK/RYSNN又はQNSSRK/RYSNTとヘテロダイマーを形成する場合に、RAG2.8を切断可能なタンパク質を含んでいた。このようなヘテロダイマー変異体の例を、表XIに示す。陽性の例を図20に示す。
【０２２８】
【表１１】
2009543574.tif 000015
【０２２９】
実施例10：RAG2.8.4を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及びRAG2.8.3を切断するタンパク質との同時発現による、高効率でRAG2.8を切断するメガヌクレアーゼの作製
非パリンドロームRAG2.8標的を切断できるI-CreI変異体を、パリンドロームRAG2.8.3を切断する変異体と、パリンドロームRAG2.8.4標的を切断する変異体との同時発現により同定した(実施例9)。非パリンドロームRAG2.8標的を切断できるI-CreI変異体の数及び効率を増大させるために、パリンドロームRAG2.8.4標的を切断する変異体に突然変異を誘発し、RAG2.8.3標的を切断する変異体と同時発現させた場合に高い効率でRAG2.8を切断する新しい変異型を、スクリーニングした。
【０２３０】
A) 材料及び方法
実験手順は、実施例9に記載されるものと同様である。
【０２３１】
B) 結果
RAG2.8.4を切断する3つの変異体(I-CreI 28Q33S38R40K44R68Y70S75N77T、I-CreI 28N33S38R40K44R68Y70S75N77N、I-CreI 28N33S38R40K44R68Y70S75N77、これらは表IXの命名法によるとQNSSRK/RYSNT、NNSSRK/RYSNN及びNNSSRK/RYSNT KNSRQQ/ARHNI 及びKNSRQQ/ARNNIともよばれる)をプールし、ランダム突然変異を誘発し、酵母を形質転換した。6696個の形質転換クローンを、次いで、実施例9で同定した変異型から選択される、(i) RAG2.8標的をレポータープラスミド内に含有し、(ii) RAG2.8.3標的を切断する最適化変異型を発現する酵母株と交配させた。I-CreI 33R40Q44A70N75N/103S129A159R又はI-CreI 33R40Q44A70N75N/132V変異体のいずれかを発現する2つの株を用いた(表XIを参照されたい)。190個を超えるクローンが、このような酵母株と交配させたときにRAG2.8標的の切断を引き起こすことが見出された。対照実験において、これらのクローンはいずれも、これらの2つのタンパク質のそれぞれとの同時発現なしでは、RAG2.8の切断を引き起こさないことが見出された。190個を超える陽性が、I-CreI 33R40Q44A70N75N/103S129A159R及びI-CreI 33R40Q44A70N75N/132Vとヘテロダイマーを形成したときにRAG2.8を切断できるタンパク質を含有していた。このようなヘテロダイマー変異体の例を、表XIIに示す。陽性を再配列させ、図23に示すようにして、2次スクリーニングにおいて4重で再び試験した。
【０２３２】
【表１２】
2009543574.tif 000016
【０２３３】
実施例11：RAG1.10.2標的を切断するタンパク質のランダム突然変異誘発及びRAG1.10.3標的を切断するタンパク質との同時発現によるRAG1.10 DNA配列を切断するメガヌクレアーゼの改良
RAG1.10標的を切断できるI-CreI変異体は、パリンドロームRAG1.10.2及びRAG1.10.3標的を切断する変異体(実施例5)の組み立てにより同定した。次いで、RAG1.10切断効率を改良するために、RAG1.10 DNA配列を切断するコンビナトリアル変異体に突然変異を誘発し、この標的のより強い切断を示す変異型をスクリーニングした。
【０２３４】
その標的に結合したI-CreIタンパク質の構造によると、4つの中央の塩基対(-2位〜2位)とI-CreIタンパク質との間に接触はない(Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜316; Chevalier B.S.及びB.L. Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜3574; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。つまり、突然変異誘発する位置の組を合理的に選択するのは困難であり、ランダム突然変異誘発を、タンパク質全体に対して行った。ランダム突然変異誘発は、複雑さの高いライブラリーをもたらす。よって、突然変異誘発により試験される変異型ライブラリーの複雑さを制限するために、RAG1.10標的を切断するヘテロダイマーの2つの成分のうち1つのみに突然変異を誘発した。
【０２３５】
つまり、第1工程において、RAG1.10.2標的を切断するタンパク質に突然変異を誘発し、第2工程において、これらが、RAG1.10.3 DNA配列を切断するタンパク質と同時発現させたときに、RAG1.10切断効率を改善できるかを評価した。
【０２３６】
A) 材料及び方法
実験手順は、実施例9に記載されるものと同様である。
【０２３７】
B) 結果
RAG1.10.2配列を切断する5つの変異体(KRSNQS/AYSYK、KKSAQS/AYSYK、KRSNQS/TYSYR、KNSRTS/AYSYK及びKKSGQS/AYSYK)をプールし、ランダム突然変異を誘発し、酵母を形質転換した。これらの5つの変異体は、28位、30位、32位、33位、38位、40位/44位、68位、70位、75位及び77位でのアミノ酸についての1文字コードを用いる実施例3の表Vの命名法に従って記載する。2280個の形質転換したクローンを、次いで、(i) レポータープラスミド内のRAG1.10標的と、(ii) RAG1.10.3標的を切断する変異体(KHSMAS/ARSYT、実施例4の表VIを参照されたい)を含有する発現プラスミドとを含有する酵母株と交配させた。この酵母株と交配させた後に、80個のクローンが、元来のRAG1.10.2変異体よりも効率的にRAG1.10標的を切断することが見出された。これらの80個の変異体を再配列させ(再配列させたプレートのウェルA1〜G8、図24を参照)、1回目のものと全く同じ条件下で行う確認スクリーニング(validation screen)に供する。図24からわかるように、いくつかの変異体がKHSMAS/ARSYTとヘテロダイマーを形成可能であり、これらは、RAG1.10標的についてのより強い切断活性を示した。80個の陽性クローンの配列決定により、同一クローンの同定が可能になり、最終的に、RAG1.10をより高いレベルで切断する6つの別々の新規な変異体が同定された。これらを、表XIIIに列挙する。5つの変異体は、最初のKRSNQS/AYSYKタンパク質に近接に関係するものであり、この変異体とは、1又は2つのさらなる置換によってのみ異なる。対照的に、KRSNQS/AYSYKとは75位及び77位で異なり、かつKRSNQS/TYSYRとは44位及び75位で異なるKRSNQS/AYSDRタンパク質は、RAG1.10.2を切断するものを得るために最初に工学的に改変されたものとは異なって、新しい位置に変異を有さない(実施例3を参照されたい)。
【０２３８】
【表１３】
2009543574.tif 000017
【０２３９】
実施例12：G19Sの単一置換の導入による、RAG1.10 DNAを切断するメガヌクレアーゼの改良
G19S変異を、RAG1.10.2標的を切断する(実施例11、表XIII及び図24を参照)KRSNQS/AYSDR変異体(以下、M2という)、及びRAG1.10.3標的を切断する(実施例4、表VIを参照)NNSSRR/YRSQV変異体(以下、M3という)に導入した。これらの新しいタンパク質は、次いで、哺乳動物細胞における染色体外及び染色体のアッセイにおいて、RAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的に対して試験した。
【０２４０】
A) 材料及び方法
a) G19S変異の導入
2回のオーバーラップPCR反応を、第1フラグメントについてGal10F (5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3'; 配列番号223)とG19SRev (5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3'; 配列番号230)、及び第2フラグメントについてG19SFor (5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3'; 配列番号231)とGal10R (5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'; 配列番号224)の2組のプライマーを用いて行った。各PCRフラグメント約25 ngと、NcoI及びEagIでの消化により線状にしたベクターDNA (pCLS0542) 75 ngとを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率のLiAc形質転換プロトコル(Gietz, R.D.及びR.A. Woods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S変異を含むインタクトなコード配列を、酵母でのインビボ相同組換えにより作製する。
【０２４１】
b) 変異体の配列決定
プラスミドを発現する変異体を回収するために、酵母DNAを、標準的なプロトコルを用いて抽出し、E. coliの形質転換に用いた。変異ORFの配列決定を、次いで、MILLEGEN SAによりプラスミドに対して行った。
【０２４２】
c) RAG1.10 G19S変異体の哺乳動物発現ベクターへのクローニング
それぞれの変異ORFを、PCRにより、プライマーCCM2For: (5'-aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaccatggccaataccaaatataacaaag agttcc-3'; 配列番号232) 及びCCMRevBis: (5'-ctgctctagattagtcggccgccggggaggatttcttc-3'; 配列番号233)を用いて増幅した。
【０２４３】
PCRフラグメントを、制限酵素SacI及びXbaIにより消化し、これもまたSacI及びXbaIで消化したベクターpCLS1088 (図25)にライゲーションした。得られたクローンを、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
【０２４４】
d) 染色体外アッセイのためのベクターでの異なるRAG1.10標的のクローニング
興味対象の標的は、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列に接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、Proligoから購入した。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製された二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、CHOレポーターベクター(pCLS1058, 図26)にクローニングした。
【０２４５】
e) CHO細胞での染色体外アッセイ
CHO細胞を、供給業者のプロトコル(QIAGEN)に従って、Polyfectトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションした。アッセイごとに、標的ベクター150 ngを、両方の変異体のそれぞれ１つずつ12.5 ngと同時トランスフェクションした(パリンドロームB2M11.2標的を切断する変異体12.5 ngと、パリンドロームB2M11.3標的を切断する変異体12.5 ng)。トランスフェクションの72時間後に、培養培地を回収し、150μlの溶解/視覚化バッファーを、β-ガラクトシダーゼ液体アッセイのために加えた(1リットルのバッファーは: 100 mlの溶解バッファー(Tris-HCl 10 mM pH 7.5、NaCl 150 mM、Triton X100 0.1 %、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)、10 mlのMg 100×バッファー(MgCl2 100 mM、β-メルカプトエタノール35 %)、110 ml ONPG 8 mg/ml及び780 mlのリン酸ナトリウム0.1M pH 7.5を含有する)。37℃でのインキュベーションの後に、光学密度を420 nmにて測定した。全体の手順は、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行った。
【０２４６】
f) CHO細胞での染色体アッセイ
レポーターシステムを有するCHO株化細胞を、10cmのディッシュあたり2×105細胞の密度で完全培地(2 mM L-グルタミン、ペニシリン(100 UI/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、アンフォテリシンB (Fongizone) (0.25μg/ml) (INVITROGEN-LIFE SCIENCE)及び10% FBS (SIGMA-ALDRICH CHIMIE)を補ったKaighnの改変F-12培地(F12-K))中に播種した。次の日に、細胞を、Polyfectトランスフェクション試薬(QIAGEN)でトランスフェクションした。簡単に、0.1μgのlacz修復マトリクスベクターpCLS1058を、種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターと同時トランスフェクションした。37℃にて72時間のインキュベーションの後に、細胞を0.5%グルタルアルデヒド中で4℃にて10分間固定し、0.02 % NP40を含む100 mMリン酸バッファーで洗浄し、以下の染色バッファーで染色した(10 mMリン酸バッファー、1 mM MgCl2、33 mM Kヘキサシアノフェレート(III)、33 mM Kヘキサシアノフェレート(II)、0.1 % (v/v) X-Gal)。37℃にて1晩のインキュベーションの後に、プレートを、光学顕微鏡下で観察し、LacZ陽性細胞クローンの数を計数した。LacZ修復頻度は、LacZ+増殖巣の数を、トランスフェクションした細胞の数(5×105)で除し、トランスフェクション効率で校正したものとして表す。
【０２４７】
B) 結果
それぞれの標的RAG1.10.2及びRAG1.10.3に対する、G19S変異を有するM2及びM3 I-CreI変異体(M2 G19S及びM3 G19S)の活性を、CHO細胞において染色体外アッセイを用いてモニターした。変異体を、純粋な二量体の様式、又はG19S変異を有するか若しくは有さない変異体の同時トランスフェクションにおいて試験し、これらのことにより、それぞれのRAG1.10.2及びRAG1.10.3標的に対する両方のヘテロダイマーM2/M2 G19S及びM3/M3 G19Sの活性の検出が可能になった(図27A)。次いで、異なるヘテロダイマーM2/M3、M2 G19S/M3及びM2/M3 G19Sを、RAG1.10標的に対して試験した(図27B)。図27A及び27Bでみられるように、G19S変異の2つの態様が観察される。
【０２４８】
まず、この変異は、パリンドローム標的に対するホモダイマー(M2 G19S及びM3 G19S)の活性をなくす。この影響は、二量体化界面内の立体的不調和によるようである。これまでのところ最も工学的に改変されたエンドヌクレアーゼ(ZFN及びHE)はヘテロダイマーであり、それぞれ、標的の1つの半分に結合する、2つの別々に作製されたモノマーを含む。ヘテロダイマーの形成は、同じ細胞内で2つのモノマーを同時発現させることにより得られる(Porteus H.M., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446; Smithら, Nucleic acids Res. Epub 27 November 2006; 国際PCT出願WO 2007/097854及びWO 2007/049156)。しかし、これは、実際に、異なる標的を認識する2つのホモダイマーの形成に関連し(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175)、個別のホモダイマーは、時々、非常に高レベルの毒性をもたらし得る(Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175)。この問題点は、機能的ホモダイマーの形成の抑制によってのみ解決でき、このことは、理論的には、2つのモノマーの単一鎖分子への融合により達成できる(Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, 5978〜5990)。しかし、この種の設計は、比較的危険であり、うまく折り畳まれていないタンパク質をもたらし得る(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, 5978〜5990)。個別のホモダイマーの機能性を損なうことは、別の解決法であり得、ここで観察される効果は、特異性の点で大きな意味を有するはずである。
【０２４９】
次に、M3変異体へのG19S変異の導入は、M3/M3 G19SヘテロダイマーによるRAG1.10.3標的切断の活性を大きく増加させる。この効果は、M2変異体については実際には証明され得ない。なぜなら、これは、このアッセイにおいて、既に飽和レベルでRAG1.10.2標的を切断するからである。同じ所見をRAG1.10標的について述べることができ、これは、M2/M3ヘテロダイマー、並びにM2 G19S/M3及びM2/M3 G19Sヘテロダイマーにより飽和レベルで切断される。
【０２５０】
これらの最後の3つのヘテロダイマーを、次いで、CHO細胞における染色体アッセイで試験した。この染色体アッセイは、最近の出版物に詳細に記載されている(Arnouldら, J. Mol. Biol. Epub May 10, 2007)。簡単に、単一コピー導入遺伝子を有するCHO株化細胞を、まず、創出した。導入遺伝子は、ヒトEF1αプロモーターをI-SceI切断部位の上流に含む(図28、工程1)。次に、I-SceIメガヌクレアーゼを用いて、この遺伝子座でDSB-誘発相同組換えを引き起こし、新規なメガヌクレアーゼ切断部位を有する5.5 kbカセットを挿入する(図28、工程2)。このカセットは、CMVプロモーターにより駆動される非機能的LacZオープンリーディングフレームと、プロモーターレスハイグロマイシンマーカー遺伝子とを含有する。LacZ遺伝子自体は、試験されるメガヌクレアーゼ切断部位(ここでは、RAG1.10切断部位)を含有する50 bpの挿入断片により不活性化される。この株化細胞は、次いで、RAG1.10標的を切断する工学的に改変されたI-CreI誘導体を用いるDSB-誘発遺伝子ターゲティング効率(LacZ修復)を評価するために用い得る(図28、工程3)。
【０２５１】
この株化細胞に、修復マトリクスとメガヌクレアーゼを発現する種々の量のベクターとを同時トランスフェクションした。結果を、表XIVにまとめる。LacZ遺伝子の修復の頻度は、最初の工学的に改変されたヘテロダイマー(M2/M3)を用いての2.4×10-3の最大から、M2 G19S/M3ヘテロダイマーを用いての5.8×10-3の最大に増加した。遺伝子ターゲティングの頻度の2倍を超える増加が、G19Sを2つのモノマー(M2又はM3)のうちの1つに導入したときに観察された。つまり、これらの結果は、染色体外の下地(substrate)で観察されたものを確認し、G19S置換が、活性の著しい改良をもたらすことを示す。
【０２５２】
【表１４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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