(57)【要約】  本発明は、増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する植物、細胞および植物に関する。さらにまた、本発明は、グルコサミノグリカンを合成する植物細胞および植物に関する。本発明はまた、該植物を生産するための方法および該植物細胞を含む組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新鮮重量１グラムあたり少なくとも２μmolのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する植物細胞または植物。
【請求項２】
新鮮重量１グラムあたり少なくとも３００μgのグルコサミノグリカンからなるグルコサミノグリカン含量を有する植物細胞または植物。
【請求項３】
新鮮重量１グラムあたり少なくとも２μmolのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する、請求項１で特許請求される植物の部分。
【請求項４】
新鮮重量１グラムあたり少なくとも３００μgのグルコサミノグリカンからなるグルコサミノグリカン含量を有する、請求項２で特許請求される植物の部分。
【請求項５】
新鮮重量１グラムあたり少なくとも２μmolのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する、請求項１で特許請求される植物の繁殖用材料。
【請求項６】
新鮮重量１グラムあたり少なくとも３００μgのグルコサミノグリカンからなるグルコサミノグリカン含量を有する、請求項２で特許請求される植物の繁殖用材料。
【請求項７】
遺伝子改変植物を生産するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）  グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質をコードするか、または細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程；
ｂ）  工程ａ）にしたがって取得された植物細胞から植物を再生する工程；
ｃ）  適切であれば、工程ｂ）に記載の植物を用いて別の植物を作製する工程。
【請求項８】
グルコサミノグリカンを合成する植物を生産するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）  植物細胞を遺伝子改変し、その場合、該遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉを任意の順序で含むか、または以下の工程ｉ〜ｉｉの任意の組み合わせを、個別に、または同時に実行する工程：
ｉ）  グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質をコードするか、または細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程；
ｉｉ）  グルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程；
ｂ）  以下の工程に記載の遺伝子改変を含む植物細胞から植物を再生する工程：
ｉ）  ａ）ｉ；
ｉｉ）  ａ）ｉｉ；
ｉｉｉ）  ａ）ｉおよびａ）ｉｉ；
ｃ）  工程：
ｉ）  ｂ）ｉに記載の植物の植物細胞に工程ａ）ｉｉに記載の遺伝子改変を導入する工程；
ｉｉ）  ｂ）ｉｉに記載の植物の植物細胞に工程ａ）ｉに記載の遺伝子改変を導入する工程；
そして植物を再生する工程；
ｄ）  適切であれば、工程ｂ）ｉｉｉまたはｃ）ｉまたはｃ）ｉｉのいずれかにしたがって取得された植物を用いて別の植物を作製する工程。
【請求項９】
グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質をコードするか、または細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の使用であって、遺伝子改変植物を製造するための使用。
【請求項１０】
グルコサミノグリカンを生産するための方法であって、請求項２で特許請求される植物細胞から、請求項４で特許請求される植物の部分から、または請求項６で特許請求される繁殖用材料からグルコサミノグリカンを抽出する工程を含む方法。
【請求項１１】
請求項１または２で特許請求される遺伝子改変植物細胞を含む組成物。
【請求項１２】
請求項１もしくは２で特許請求される植物から、請求項３もしくは４で特許請求される植物の部分から、または請求項５もしくは６で特許請求される繁殖用材料から取得可能な穀粉。
【請求項１３】
穀粉を生産するための方法であって、請求項３もしくは４で特許請求される植物の部分または請求項５もしくは６で特許請求される繁殖用材料を粉砕する工程を含む方法。
【請求項１４】
請求項１もしくは２で特許請求される植物、請求項３もしくは４で特許請求される植物の部分または請求項５もしくは６で特許請求される繁殖用材料の使用であって、穀粉を生産するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する植物細胞および植物に関する。さらにまた、本発明は、グルコサミノグリカンを合成する植物細胞および植物に関する。本発明はまた、該植物を生産するための方法および該植物細胞を含む組成物を提供する。
【０００２】
アミノ糖グルコサミン、グルコサミン誘導体およびグルコサミン誘導体を含むポリマーは、とりわけ、動物およびヒトの関節障害を予防するための食品サプリメントとして使用される。医学分野でも、やはり、何らかのグルコサミン誘導体含有ポリマーが障害の処置に使用される。
【０００３】
WO 06 032538では、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子で形質転換されているトランスジェニック植物が記載されている。目的の植物におけるヒアルロナンの合成が明らかに実証された。
【０００４】
WO 98 35047（US 6,444,878）では、植物細胞中でＧｌｃＮＡｃを合成するための代謝経路が記載されている。該経路では、複数の連続する、酵素によって触媒される反応工程によってグルコサミンが変換され、代謝産物ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸でＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが形成される。植物に関する代替の経路として報告された代謝経路は、フルクトース６−リン酸およびグルタミンからグルコサミン６−リン酸への変換を含み、そして、該グルコサミン６−リン酸は、複数の連続する、酵素によって触媒される反応工程によって変換され、代謝産物グルコサミン１−リン酸およびＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸でＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが形成される。フルクトース６−リン酸およびグルタミンからグルコサミン６−リン酸への変換は、グルタミン:フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質によって触媒される（Mayerら、1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107）。比較的高濃度のグルコサミン６−リン酸は植物細胞にとって有毒である（WO 98 35047）。
【０００５】
WO 00 11192では、植物中で２−アミドアンヒドログルコース分子を有するカチオン性デンプンを合成するために、トランスジェニックトウモロコシ植物中で植物ＧＦＡＴの酵素活性を有するタンパク質をコードするトウモロコシ由来の核酸分子を胚乳特異的に過剰発現させることが記載されている。WO 00 11192の説明では、デンプンへの２−アミノアンヒドログルコースの取り込みを導くはずの上記代謝経路は、とりわけ、デンプンおよび／またはグリコーゲンシンターゼによるＵＤＰ−グルコサミンのデンプンへの取り込みを含む。色素体シグナルペプチドと翻訳融合されている植物ＧＦＡＴの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現する目的のトランスジェニックトウモロコシ植物の胚乳の穀粉中でＵＤＰ−グルコサミンの量が増加していることを実証することが可能であった。ＧＦＡＴの酵素活性を有するタンパク質がシグナルペプチドを伴わずに発現された場合、トウモロコシ胚乳組織由来の対応する穀粉中でグルコサミン１−リン酸の量が増加することを実証することが可能であった。トランスジェニック植物中でカチオン性デンプンまたは増加量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体、例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸を検出することは可能でなかった。
【０００６】
アミノ糖ベータ−Ｄ−グルコサミン（グルコサミン）および／またはグルコサミン誘導体は種々のポリマー（グルコサミノグリカン）の成分であり、該ポリマーは、とりわけ、節足動物の外骨格、哺乳類の細胞外基質またはいくつかの細菌微生物のエキソポリサッカライドの必須の成分である。ゆえに、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ−２−アミン（Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ）は、窒素原子の位置でアセチル化されたグルコサミン誘導体である。ＧｌｃＮＡｃは、例えば、ヒアルロナン（ベータ−１，４−［グルクロン酸ベータ−１，３−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ）の分子的構築用ブロックであり、該ヒアルロナンは滑液の必須の成分である。
【０００７】
医学分野では、ヒアルロナン含有製品は、現在、関節症の関節内処置に使用され、眼科剤として眼の外科手術に使用される。誘導体化された架橋ヒアルロナンは関節障害の処置に使用される（Fong Chongら、2005, Appl Microbiol Biotechnol 66, 341-351）。さらに、ヒアルロナンは、いくつかの鼻科剤の成分であり、例えば点眼およびナザリア（nasalia）の形式で、乾いた粘膜を湿らせるために役立つ。ヒアルロナン含有注射用溶液は鎮痛剤および抗リウマチ剤として使用される。ヒアルロナンまたはヒアルロナン誘導体を含むパッチは創傷治癒に使用される。皮膚科剤としては、ヒアルロナン含有ゲルインプラントが、形成外科における皮膚変形の矯正に使用される。美容外科手術では、ヒアルロナン調製物は好適な皮膚充填材料に含まれる。ヒアルロナンを注射することによって、限られた期間、しわを滑らかにするか、あるいは口唇のボリュームを増加させることが可能である。
【０００８】
化粧用製品、特にスキンクリームおよびローションでは、ヒアルロナン（hyalauronan）は、水と結合する、その高い能力に基づいて保湿剤として頻繁に使用されることが多い。さらにまた、ヒアルロナン含有調製物は、いわゆる栄養補給食品（食品サプリメント）として販売されており、動物（例えばイヌ、ウマ）の関節症を予防および軽減するために使用することもできる。
【０００９】
ヒアルロナン合成の触媒作用は単一の膜内（membrane-integrated）または膜結合（membrane-associated）酵素、すなわちヒアルロナンシンターゼによって実行される（DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56, 670-682）。ヒアルロナンシンターゼは、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からのヒアルロナンの合成を触媒する。
【００１０】
市販目的で使用されるヒアルロナンは、現在、動物組織（オンドリのトサカ（roostercombs））から単離されるか、あるいは細菌培養を使用して発酵によって調製される。
【００１１】
糖タンパク質の１クラスであるプロテオグリカンは、とりわけ、軟骨の必須の成分であり、コアタンパク質に結合している、反復する二糖単位から構成されるグルコサミノグリカンを有する。反復する二糖単位は、それらとしては、特徴的な炭水化物結合性配列を介して共有結合によってコアタンパク質に結合している。二糖単位の組成に応じて、とりわけ、グルコサミノグリカンヘパラン／ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸およびコンドロイチン／デルマタン硫酸の区別が施され、それらの二糖単位は、それぞれ、グルコサミンまたはグルコサミン誘導体である分子を含有する。これらの物質では、二糖単位の種々の原子または置換基で硫酸基が導入されて、それぞれの上記物質は均一のポリマーではないが、それぞれの一般用語の下に括られるポリマー群になる。ここに、目的のポリマー群の個々の分子は、硫酸化の程度および硫酸基を含有するモノマーの位置の両方が異なってよい。
【００１２】
コンドロイチン／デルマタン（［ベータ−１，４］−［グルクロン酸ベータ−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン］ｎ）の二糖鎖の合成は、ＵＤＰ−ＧｌｃＡおよびＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのエピマーから出発し、コンドロイチンシンターゼによって触媒される（Kitagawaら、2001 , J Biol Chem 276(42), 38721-38726）。コンドロイチンのグルクロン酸分子はエピメラーゼによってイズロン酸に変換されうる。１０％を超えるグルクロン酸分子がイズロン酸として存在すれば、ポリマーはデルマタンと称される。そして、コンドロイチンまたはデルマタンの二糖鎖の種々の位置での硫酸基の導入は別の酵素によって触媒され、コンドロイチン／デルマタン硫酸が生じる。ここに、硫酸化の程度は分子ごとに異なってよい。かねて、コンドロイチン硫酸は骨関節炎を処置するための潜在的な活性化合物と考えられている（Cleggら、2006, The New England Journal of Medicine 354(8), 795-808）。
【００１３】
ヘパリン／ヘパラン（ヘパロサン（heparosan））（［アルファ−１，４］−［グルクロン酸ベータ−１，４−グルコサミン］ｎまたは［アルファ−１，４］−［イズロン酸アルファ−１，４−グルコサミン］ｎ）の二糖鎖の合成は、ＵＤＰ−ＧｌｃＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからヘパリン／ヘパロサンシンターゼによって触媒される（DeAngelis und White, 2004, J. Bacteriology 186(24), 8529-8532）。ヘパリン／ヘパロサンのグルクロン酸分子はエピメラーゼによってイズロン酸に変換されうる。そして、ヘパロサンの二糖鎖の種々の位置での硫酸基の導入は別の酵素によって触媒され、ヘパリン硫酸またはヘパラン硫酸が生じる。ヘパリン硫酸は、ヘパラン硫酸よりかなり高度な硫酸基による置換を有する。ヘパリン硫酸は約９０％のイズロン酸分子を有するのに対して、ヘパラン硫酸の場合、グルクロン酸分子の割合が優勢である（Gallagherら、1992, Int. J. Biochem 24, 553-560）。コンドロイチン／デルマタン硫酸の場合のように、ヘパリン/ヘパラン硫酸の場合も、硫酸化の程度は分子ごとに異なってよい。
【００１４】
ヘパリン硫酸は、とりわけ抗凝血剤として、例えば血栓症（thromboses）の予防および処置に使用される。
【００１５】
コンドロイチン／デルマタン硫酸およびヘパリン／ヘパラン硫酸は、現在、動物組織からの単離によって製造される。コンドロイチン硫酸は、主に、ウシまたはサメ軟骨から単離され、ヘパリン／ヘパラン硫酸はブタ腸またはウシ肺から単離される。コンドロイチン／デルマタン硫酸またはヘパリン／ヘパラン硫酸の二糖鎖は均一の硫酸化パターンを有さないので、均一な特定の製品を得ることは困難である。したがって、該製品は、常に、種々の硫酸化の程度を有する分子の混合物である。
【００１６】
グルコサミノグリカンキチン（［ベータ−１，４−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ）は、真菌の細胞壁および昆虫、ヤスデ、クモ形動物および甲殻類の外骨格の主成分の１つであり、水に不溶性のポリマーである。酵素キチンシンターゼはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを連結することによってキチンの合成を触媒する（MerzendorferおよびZimoch, 2003, J. Experimental Biology 206, 4393-4412）。
【００１７】
キチンを単離するための原材料供給源として、今日まで、主に、甲殻類（エビ、カニ）および真菌、例えば、アスペルギルス種（Aspergillus spec.）、ペニシリウム種（Penicillium spec.）、ケカビ種（Mucor spec.）から使用が構成される。WO 03 031435では、例えば、酵母の発酵によってＧｌｃＮＡｃを製造するための方法が記載されている。目的の原材料供給源からキチンが単離される方法に応じて、キチンは、ＧｌｃＮＡｃに加えて、さらにその脱アセチル化型グルコサミンを構築用ブロックとして含有する。５０％を超える構築用ブロックがＧｌｃＮＡｃであれば、ポリマーはキチンと称されるのに対して、５０％を超えるグルコサミンを含むポリマーはキトサンと称される。
【００１８】
最近、グルコサミンまたはその誘導体、例えばＧｌｃＮＡｃは、キチンの分解によって製造される。キチンを、まず脱アセチル化して、キトサンを形成させてよく、あるいは直接分解して、ＧｌｃＮＡｃを形成させてよい。
【００１９】
キチンは、キチンデアセチラーゼの支援を受けて酵素によって脱アセチル化するか（Kafetzopoulosら、1993, Pro. Natl. Acad. Sci. 90, 2564-2568）、あるいは化学的脱アセチル化によって脱アセチル化することができる。
【００２０】
キチンの分解またはキトサンの分解は、酵素的（例えばキチナーゼ、グルカナーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを使用して）、および化学的加水分解のいずれによっても生じうる。
【００２１】
キトサンの分解またはＧｌｃＮＡｃの脱アセチル化によってグルコサミンの形成が生じる。
【００２２】
キチンの分解によってアミノ糖を製造するためのすべての方法の実質的不都合は、不完全な加水分解および／または不完全な脱アセチル化のせいで、得られる製品が均一ではなく、種々のモノマーおよびオリゴマーの混合物であるという事実にある。
【００２３】
組換え微生物、特に大腸菌（Escherichia coli）（キチンの分解には必要とされない）の支援を受けてグルコサミンを製造するための代替の方法はUS 2002/0160459に記載されている。
【００２４】
かねて、グルコサミンおよびグルコサミン含有物質も、やはり、骨関節炎を処置するための潜在的な活性化合物であると考えられている（Cleggら、2006, The New England Journal of Medicine 354(8), 795-808）。グルコサミンまたはグルコサミン含有物質はまた、多数の食品サプリメント中に存在する。ＧｌｃＮＡｃに富む食品は、例えば、US 2006/0003965に記載されている。
【００２５】
上記のように、グルコサミノグリカン、例えばコンドロイチン硫酸、ヘパリン／ヘパラン硫酸またはキチンは、現在、動物組織から単離される。各事例で所望の物質に加えて、これらの組織はまた、他のグルコサミノグリカンを含有する。個々のグルコサミノグリカンの分離は、仮に完全分離が可能であったとしても、困難かつ複雑である。さらにまた、動物組織中の、ヒトの疾患を引き起こしうる、病原微生物および／または他の物質、例えばBSE病原体またはトリインフルエンザ病原体の潜在的な存在は、動物組織から単離されたグルコサミノグリカンを使用する場合に問題である。動物タンパク質で汚染されている医薬製剤の使用は、患者において、特に患者が動物タンパク質に対してアレルギー体質である場合に、望ましくない身体の免疫学的反応を引き起こす可能性がある（ヒアルロナン調製物に関しては、例えばUS 4,141,973を参照されたい）。
【００２６】
動物組織からグルコサミノグリカンを単離する際の別の問題は、精製中にグルコサミノグリカンの分子量が減少することが多いという事実にある。その理由は、動物組織がまた、グルコサミノグリカンを分解する酵素を含有するからである。
【００２７】
甲殻類から単離されたグルコサミンまたはその誘導体は、ヒトにおけるアレルギー反応を引き起こす可能性がある物質（タンパク質）を含有することが多い。真菌から取得されたグルコサミンまたは誘導体はマイコトキシンを含有する可能性がある。
【００２８】
動物組織から満足な品質および純度で取得できるグルコサミノグリカンの量(収率)は少ない（例えばオンドリのトサカから得られるヒアルロナン：０．０７９％ｗ／ｗ、EP 0144019、US 4,782,046）。このことは、大量の動物組織を処理する必要があることを意味する。
【００２９】
細菌の発酵を活用したグルコサミノグリカンの生産には高いコストが伴う。その理由は、複雑な制御培養条件下の密封滅菌容器中で細菌を発酵する必要があるからである（ヒアルロナンに関しては、例えばUS 4,897,349を参照されたい）。さらにまた、細菌株の発酵によって製造できるグルコサミノグリカンの量は、既存の製造設備によって制限される。ここで、物理的制限のせいで、比較的大きい培養量のための発酵槽を構築することは不可能であることも配慮されている。この関連で、特に、送り込まれる物質（例えば細菌の必須の栄養供給源、ｐＨを調節するための試薬、酸素）と培養培地の均一混合（効率的生産に必要とされる）に言及する。それは、仮にそうであるとしても、大きい発酵槽中で、高い技術的出費を伴ってしか確保できない。
【００３０】
さらにまた、動物原材料から調製された物質は、特定の生活方法、例えば厳格な菜食主義では、あるいは清浄な食品製造では許容されない。
【００３１】
植物は、天然には、グルコサミノグリカン、例えば、ヒアルロナン、キチン、ヘパラン／ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸またはコンドロイチン／デルマタン硫酸を生産しない。
【００３２】
グルコサミノグリカンの合成では、とりわけ、十分な量のアセチル化グルコサミン誘導体（特にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）および／またはＵＤＰ−ＧｌｃＡが、合成に関与するそれぞれの酵素の基質として利用可能であることが必要である。植物細胞中に存在するＮ−アセチル化グルコサミンの量に関する情報はない。WO 2005 035710では、植物材料のグルコサミン含量を乾燥によって増加させる方法が記載されている。チコリーに関して、新鮮な、湿った植物材料中の最高のグルコサミン含量が決定され、新鮮重量１kgあたりグルコサミン１０mgであった。それは、グルコサミンの分子量が１７８であれば、植物材料の新鮮重量１グラムあたりグルコサミン約５６nmolに相当する。WO 2005 035710には、植物のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量に関する情報は含まれない。
【００３３】
さらにまた、上記先行技術から、植物中のグルコサミン代謝の経路が、まだ完全には解明されていないことが明らかである。WO 00 11192では、植物ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を用いる形質転換によって、高含量のグルコサミン誘導体（ＵＤＰ−グルコサミンまたはグルコサミン１−リン酸)を有する植物を作製することが可能であった；しかし、増加量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体は発見されなかった。
【００３４】
したがって、本発明の目的は、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の代替の供給源およびＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の該代替の供給源を製造するための方法を提供することである。
【００３５】
本発明の第一の態様は、新鮮重量１グラムあたり少なくとも２．５０μmol、好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも５．００μmol、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも１０．００μmol、非常に特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも１５．００μmol、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも２０．００μmolのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する植物細胞または植物に関する。
【００３６】
好ましくは、本発明の植物細胞または本発明の植物は、新鮮重量１グラムあたり多くとも２５０μmol、好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも２００μmol、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも１５０μmol、非常に特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも１００μmol、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも５０μmolのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する。
【００３７】
先行技術と比較して、本発明の植物細胞または本発明の植物は、より多量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を含有する利点を提供する。微生物の発酵によるＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の生産または動物原材料供給源または真菌からのＮ−アセチル化グルコサミンの単離と比較して、本発明の植物細胞または本発明の植物は、本発明の植物細胞および本発明の植物は無性または有性様式で無限に繁殖でき、かつＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を継続的に生産するという利点を提供する。さらにまた、公知の植物と比較して、本発明の植物は、グルコサミノグリカン、例えば、コンドロイチン、ヒアルロナン、キチン、ヘパロサンの製造に、より良好に適している利点を提供する。その理由は、それらが、上記グルコサミノグリカンの触媒作用に関与する酵素（グルコサミノグリカンシンターゼ）の基質を、より多量に含有するからである。
【００３８】
Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体は、当業者に公知の方法を使用して検出することができる（MorganおよびElson（1934, Biochem J. 28(3), 988-995））。本発明の関連では、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を決定するために、好ましくは、一般的方法項目４の下に記載される方法が使用される。
【００３９】
本発明の関連では、用語「Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体」は、グルコサミン（２−アミノ−２−デオキシグルコース）のすべての誘導体を意味すると理解されるものとし、それにはさらに、エピマー、例えば、ガラクトサミン（２−アミノ−２−デオキシガラクトース）またはマンノサミン（２−アミノ−２−デオキシマンノース）が含まれ、それは一般的方法項目４の下に記載される方法を使用して評価される。Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体は、好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミンリン酸（Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸および／またはＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸）、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである。
【００４０】
好ましくは、本発明の植物細胞または本発明の植物は、増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量に加えて、増加したグルコサミンリン酸（グルコサミン１−リン酸および／またはグルコサミン６−リン酸）含量を有する。
【００４１】
本発明の植物細胞または本発明の植物は、例えば、グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）のアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を導入することによって調製することができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様では、ゆえに、本発明の植物細胞または本発明の植物は、それぞれ遺伝子改変植物細胞および遺伝子改変植物である。
【００４３】
驚くべきことに、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含有する植物細胞または植物が、グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩ（ＧＦＡＴ−１）の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含有する植物細胞または植物よりかなり多量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を含有することが見出されている。上記のように、植物ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含有する植物において増加量のアセチル化グルコサミン誘導体を検出することは不可能であった（WO 00 11192）。
【００４４】
したがって、本発明はまた、グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含有する遺伝子改変植物細胞または遺伝子改変植物であって、該外来性核酸分子がグルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質または細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する遺伝子改変植物細胞または遺伝子改変植物を提供する。
【００４５】
本発明の植物細胞または本発明の植物の遺伝子改変は、外来性核酸分子を植物細胞または植物に組み込むために好適な任意の遺伝子改変であってよい。
【００４６】
好ましくは、外来性核酸分子をゲノムに組み込む; 特に好ましくは、外来性核酸分子を本発明の植物細胞または本発明の植物のゲノムに安定に組み込む。
【００４７】
本発明の植物細胞または本発明の植物を製造するために、核酸分子を植物宿主細胞に（安定に）組み込むための多数の技術が利用可能である。これらの技術には、形質転換の手段としてアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム  リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用するＴ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換、プロトプラスト融合、インジェクション、ＤＮＡのエレクトロポレーション、微粒子銃アプローチによるＤＮＡの導入および、さらに、別の選択肢が含まれる（「Transgenic Plants」, Leandro ed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7でレビューされている）。
【００４８】
植物細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換の使用は詳細な研究の対象となっていて、EP 120516およびHoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46およびAnら EMBO J. 4, (1985), 277-287に余すところなく記載されている。ジャガイモの形質転換に関しては、例えばRocha-Sosaら、EMBO J. 8, (1989), 29-33を参照されたい。トマト植物の形質転換に関しては、例えばUS 5,565,347を参照されたい。
【００４９】
さらに、アグロバクテリウム形質転換に基づくベクターを使用する単子葉植物の形質転換が報告されている（Chanら、Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hieiら、Plant J. 6, (1994) 271-282; Dengら、Science in China 33, (1990), 28-34; Wilminkら、Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; Mayら、Bio/Technology 13, (1995), 486-492; ConnerおよびDomisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchieら、Transgenic Res. 2, (1993), 252-265）。単子葉植物を形質転換するための代替系は、微粒子銃アプローチを使用する形質転換（WanおよびLemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasilら、Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritalaら、Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencerら、Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631）、プロトプラスト形質転換、部分的に透過処理された細胞のエレクトロポレーションまたはガラス繊維を使用するＤＮＡの導入である。特に、トウモロコシの形質転換は文献で複数回報告されている（例えばWO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Frommら、Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kammら、Plant Cell 2, (1990), 603-618; Kozielら、Biotechnology 11 (1993), 194-200; Morocら、Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726を参照されたい）。また、他のクサ、例えばスイッチグラス（Panicum virgatum）の形質転換が報告されている（Richardsら、2001, Plant Cell Reporters 20, 48-54）。
【００５０】
同様に、他の穀類種の好結果の形質転換が、例えばオオムギ（WanおよびLemaux, loc. cit.; Ritalaら、loc. cit.; Krensら、Nature 296, (1982), 72-74）およびコムギ（Nehraら、Plant J. 5, (1994), 285-297; Beckerら、1994, Plant Journal 5, 299-307）に関して、すでに報告されている。上記すべての方法は本発明の関連で好適である。
【００５１】
外来性核酸分子を有する遺伝子改変植物細胞および遺伝子改変植物は、該外来性核酸分子を有さないそれぞれ野生型植物細胞および野生型植物と識別することができ、とりわけ、それらが、それぞれ野生型植物細胞および野生型植物中に天然には存在しない外来性核酸分子を含有する事実によって識別することができる。そのような外来性核酸分子の植物細胞または植物への組み込みは、当業者に公知の方法、例えばサザンブロット解析を使用して、またはＰＣＲによって検出することができる。
【００５２】
本発明の関連では、用語「安定に組み込まれた核酸分子」とは、植物のゲノム内への核酸分子の組み込みを意味すると理解されるものとする。安定に組み込まれた核酸分子は、対応する組み込み部位の複製中に、それが、該組み込み部位に接している宿主の核酸配列と一緒に複製されて、複製された娘ＤＮＡ鎖中の該組み込み部位が、複製のマトリックスとして働く読み取り母鎖上と同一の核酸配列によって取り囲まれる点を特徴とする。
【００５３】
植物細胞または植物のゲノム内への核酸分子の組み込みは遺伝的方法および／または分子生物学的方法によって実証することができる。植物細胞のゲノム内への、または植物のゲノム内への核酸分子の安定な組み込みは、該核酸分子を受け継いでいる子孫において、安定に組み込まれた核酸分子が親世代と同一のゲノム環境に存在する点を特徴とする。植物細胞のゲノムまたは植物のゲノム中に核酸配列の安定な組み込みが存在することは、当業者に公知の方法を使用して実証することができ、とりわけ、サザンブロット解析またはＲＦＬＰ解析（制限断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism））（Namら、1989, The Plant Cell 1, 699-705; LeisterおよびDean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750）を活用し、ＰＣＲに基づく方法、例えば増幅断片の長さの差異の解析（増幅断片長多型（Amplified Fragment Length Polymorphism），ＡＦＬＰ）（Castiglioniら、1998, Genetics 149, 2039-2056; Meksemら、2001 , Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214; Meyerら、1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160）を用いて、または制限酵素を使用して切断された増幅断片（切断増幅多型配列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences），ＣＡＰＳ）（KoniecznyおよびAusubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvisら、1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachemら、1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753）を使用して実証することができる。
【００５４】
本発明の関連で、用語「ゲノム」とは、植物細胞中に存在する遺伝物質全体を意味すると理解されるものとする。核に加えて、他の区画（例えば色素体、ミトコンドリア）もまた遺伝物質を含有することが当業者に公知である。
【００５５】
別の好ましい本発明の対象は、グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を発現する本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物に関する。
【００５６】
本発明の関連で、用語「発現するための」または「発現」とは、外来性核酸分子によってコードされる転写物（ｍＲＮＡ）の存在および／またはＧＦＡＴ−２または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の存在を意味すると理解されるものとする。
【００５７】
発現は、例えば、ノーザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲによる外来性核酸分子の特定の転写物（ｍＲＮＡ）の検出によって実証することができる。
【００５８】
植物細胞または植物が、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質を含有するかどうかは、例えばウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay））またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ（Radio Immune Assay））等の免疫学的方法によって決定することができる。当業者は、特定のタンパク質と特異的に反応する抗体、すなわち特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を調製するための方法を熟知している（例えばLottspeichおよびZorbas (eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4を参照されたい）。いくつかの企業（例えばEurogentec, Belgium）は、注文サービスとして、そのような抗体の調製を提供している。
【００５９】
別の好ましい本発明の実施態様では、本発明の植物細胞または本発明の植物は、グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質の活性または、細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする活性を有する。
【００６０】
本発明の植物細胞または本発明の植物の抽出物中のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性は、例えばSamacら（2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116, Humana Press, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182, ISSN 0273-2289）に記載の方法等の当業者に公知の方法を使用して検出することができる。ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性の量を決定するための好ましい方法は、一般的方法、項目８に記載されている。
【００６１】
本発明の関連で、用語「グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）」（E.C. 2.6.1.16）（専門文献中ではグルコサミンシンターゼとも称される）は、出発材料グルタミンおよびフルクトース６−リン酸（Ｆｒｕｃ−６−Ｐ）から、グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）を合成するタンパク質を意味すると理解されるものとする。この触媒作用は以下の反応スキームにしたがって進行する：
グルタミン＋Ｆｒｕｃ−６−Ｐ→ＧｌｃＮ−６−Ｐ＋グルタミン酸。
【００６２】
本発明の関連で、用語「グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）」は、すべての公知のアイソフォームを含む総称として使用される。
【００６３】
Milewski（2002, Biochimica et Biophysica Acta 1597, 173-193）による総論では、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の構造的特徴を記載している。ＧＦＡＴの活性を有するすべての公知のタンパク質のアミノ酸配列は保存アミノ酸配列を有する領域を含有する。ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列はＮ末端グルタミン結合ドメインおよびＣ末端フルクトース６−リン酸結合ドメインを有し、該ドメインは４０〜９０個の非保存アミノ酸からなる配列によって分離されている。両ドメインは、別々のアミノ酸分子上に存在しても活性である。大腸菌由来のＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のＮ末端グルタミン結合ドメインを含む断片の結晶構造の解析では、このドメインの活性中心がＮ末端に位置し、アミノ酸Ｃｙｓ１がグルタミンの加水分解に関与することが示された。アミノ酸Ａｒｇ７３およびＡｓｐ１２３はグルタミンのカルボキシルおよびアミノ基と相互作用する。この相互作用はアミノ酸Ｔｈｒ７６およびＨｉｓ７７によって支持される。グルタミンのアミド基との水素結合の形成はアミノ酸Ｇｌｙ９９およびＴｒｐ７４に起因する。アミノ酸Ａｓｎ９８およびＧｌｙ９９は活性中心の４面（four-faced）ポケットを安定化する。アミノ酸２５〜２９および７３〜８０は可動性ループを形成し、該ループは、基質グルタミンの結合後に、タンパク質のコンフォメーション変化によって、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質によって触媒される反応に寄与する。大腸菌由来のＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のＣ末端フルクトース６−リン酸結合ドメインの結晶構造の解析では、このドメインが、２個の形態的に同一のドメイン（アミノ酸２４１〜４２４および４２５〜５９２）、それに続く、不規則なループとしてＣ末端に存在するドメイン（アミノ酸５９３〜６０８）から構築され、ただし唯一の活性中心を有することが示された。アミノ酸Ｓｅｒ３０３、Ｓｅｒ３４７、Ｇｌｎ３４８、Ｓｅｒ３４９およびＴｈｒ３５２は基質結合に関与し、一方、アミノ酸Ｇｌｕ４８８、Ｈｉｓ５０４およびＬｙｓ６０３は、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の反応の触媒作用に直接関与する。
【００６４】
特に動物体では、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の２個の異なるアイソフォーム（文献中ではそれぞれＧＦＡＴ−１およびＧＦＡＴ−２と称される）を実証することが可能であった。Huら（2004, J. Biol. Chem. 279(29), 29988-29993）では、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のそれぞれのアイソフォームの差異が記載されている。ＧＦＡＴ−１およびＧＦＡＴ−２の活性を有する目的のアイソフォームの組織特異的発現の差異に加えて、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによるリン酸化によって両アイソフォームが調節されることを示すことが可能であった。ＧＦＡＴ−１の酵素活性を有するタンパク質の活性は、目的のアミノ酸配列の保存セリン残基（マウス由来のＧＦＡＴ−１中のセリン２０５，GenBank Acc No.: AF334736.1）のリン酸化によって阻害され、一方、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質の活性は目的のアミノ酸配列の保存セリン残基（マウス由来のＧＦＡＴ−２中のセリン２０２，GenBank Acc No.: NM_013529）のリン酸化によって増加する。ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質およびＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質はともに、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃによって濃度依存的様式で阻害され；しかし、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質では、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃによる阻害は、ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃによる活性の最大の減少はそれぞれ約５１％または８０％である）と比較して少ない（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃによる活性の最大の減少は約１５％である）。動物体におけるＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質の阻害は、高いＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度では、目的のタンパク質のＯ−グルコース−Ｎ−アセチルグルコサミングリコシル化が存在することに基づくことが示されている。Ｏ−グリコシル化によるタンパク質の活性の調節が植物細胞にも関与するかどうかは、まだ、完全には理解されていない（HuberおよびHardin, 2004, Current Opinion in Plant Biotechnology 7, 318-322）。
【００６５】
細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃによって阻害されないことによって識別される（Kornfeld, 1967, J. Biol. Chem. 242(13), 3135-3141）。ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質、および細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質さえ、それらの反応で形成される生成物グルコサミン６−リン酸によって阻害される（Broschatら、2002, J. Biol. Chem. 277(17), 14764-14770; Dengら、2005, Metabolic Engineering 7, 201-214）。
【００６６】
本発明の関連で、用語「グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩ（ＧＦＡＴ−１）の活性を有するタンパク質」とは、ＧＦＡＴの活性を有し、かつ、その活性がｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによるリン酸化によって阻害されるタンパク質を意味すると理解されるものとする。
【００６７】
本発明の関連で、用語「グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質」とは、ＧＦＡＴの活性を有し、かつ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによるリン酸化によって活性化されるタンパク質を意味すると理解されるものとする。
【００６８】
本発明の関連で、用語「細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質」とは、ＧＦＡＴの活性を有し、かつ、その活性がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃによって阻害されないタンパク質を意味すると理解されるものとする。あるいは、「細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質」は「非真核生物ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質」と称してもよい。
【００６９】
本発明の関連で、用語「外来性核酸分子」とは、対応する野生型植物細胞中に天然には存在しないか、あるいは野生型植物細胞の特定の空間的配置に天然には存在しないか、あるいは野生型植物細胞のゲノム中の部位であって、それが天然には存在しない部位に位置するそのような分子を意味すると理解されるものとする。
【００７０】
好ましくは、外来性核酸分子は、その組み合わせまたは特定の空間的配置が植物細胞に天然には存在しない種々の要素（核酸分子）からなる組換え分子である。
【００７１】
本発明の関連で、用語「組換え核酸分子」とは、組換え核酸分子中に存在するような組合せで天然には存在しない種々の核酸分子を有する核酸分子を意味すると理解されるものとする。ゆえに、組換え核酸分子は、タンパク質をコードする外来性核酸分子に加えて、例えば、該タンパク質をコードする核酸分子との組み合わせで天然には存在しない追加の核酸配列を有してよい。ここで、タンパク質をコードする核酸分子との組み合わせで組換え核酸分子中に存在する上記追加の核酸配列は、任意の配列であってよい。それらは、例えば、ゲノムおよび／または植物の核酸配列であってよい。上記追加の核酸配列は、好ましくは、調節配列（プロモーター、終結シグナル、エンハンサー、イントロン）であり、特に好ましくは植物組織で活性な調節配列、非常に特に好ましくは植物組織で活性な組織特異的調節配列である。
【００７２】
組換え核酸分子を作製するための方法は当業者に公知であり、それには、遺伝子工学的方法、例えば、ライゲーションによる核酸分子の連結、遺伝子組換えまたは核酸分子の新規合成（例えばSambrokら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773; Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002),ISBN: 0471250929を参照されたい）が含まれる。
【００７３】
本発明は、好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物であって、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子が、植物細胞中で転写を開始させる調節要素（プロモーター）に連結されている遺伝子改変植物細胞または遺伝子改変植物を提供する。これらは同種プロモーターまたは異種プロモーターであってよい。該プロモーターは、構成的、組織特異的または発生特異的プロモーターまたは外的要因によって（例えば、化学物質の適用後に、熱および／または低温、乾燥、疾患、等の非生物的要因の作用によって）調節されるプロモーターであってよい。
【００７４】
一般に、植物細胞で活性な任意のプロモーターは、外来性核酸分子を発現するために好適である。好適なプロモーターは、例えば、構成的発現のためのカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ ＲＮＡのプロモーターまたはトウモロコシ由来のユビキチンプロモーターまたはCestrum ＹＬＣＶプロモーター（Yellow Leaf Curling Virus; WO 01 73087; Stavoloneら、2003, Plant Mol. Biol. 53, 703-713）、ジャガイモにおける塊茎特異的発現のためのパタチンゲン（patatingen）プロモーターＢ３３（Rocha-Sosaら、EMBO J. 8 (1989), 23-29）またはトマトの果実特異的プロモーター、例えば、トマト由来のポリガラクツロナーゼプロモーター（Montgomeryら、1993, Plant Cell 5, 1049-1062）またはトマト由来のＥ８プロモーター（Methaら、2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618）またはモモ由来のＡＣＣオキシダーゼプロモーター（MoonおよびCallahan, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528）または光合成的に活性な組織においてのみ発現を保証するプロモーター、例えばＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhausら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhausら、EMBO J. 8 (1989), 2445-2451）または胚乳特異的発現のためのコムギ由来のＨＭＷＧプロモーター、ＵＳＰプロモーター、ファゼオリンプロモーター、トウモロコシ由来のゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersenら、Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccioら、Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93）、グルテリンプロモーター（Leisyら、Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zhengら、Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshiharaら、FEBS Lett. 383 (1996), 213-218）、グロブリンプロモーター（Nakaseら、1996, Gene 170(2), 223-226）、プロラミンプロモーター（QuおよびTakaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2), 113-125）またはshrunken-1プロモーター（Werrら、EMBO J. 4 (1985), 1373-1380）である。しかし、外的要因によって決定される時点でのみ活性なプロモーターを使用することも可能である（例えばWO 9307279を参照されたい）。ここで、特に興味深いのは、単純な誘導を可能にする熱ショックタンパク質のプロモーターである。さらにまた、種子特異的プロモーター、例えば、ソラマメ（Vicia faba）由来のＵＳＰプロモーターを使用することが可能であり、該プロモーターはソラマメおよび他の植物での種子特異的発現を保証する（Fiedlerら、Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baeumleinら、Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467）。
【００７５】
藻類に感染するウイルスのゲノムに存在するプロモーターの使用もまた、植物での核酸配列の発現に適している（Mitraら、1994, Biochem. Biophys Res Commun 204(1), 187-194; MitraおよびHiggins, 1994, Plant Mol Biol 26(1), 85-93, Van Ettenら、2002, Arch Virol 147, 1479-1516）。
【００７６】
本発明の関連で、用語「組織特異的」とは、出現(例えば転写の開始)が、実質的に、特定の組織に限定されることを意味すると理解されるものとする。
【００７７】
本発明の関連で、用語「塊茎、果実または胚乳細胞」とは、それぞれ塊茎、果実および種子の胚乳中に存在するすべての細胞を意味すると理解されるものとする。
【００７８】
本発明の関連で、用語「同種（homologous）プロモーター」とは、それぞれ本発明の遺伝子改変植物細胞および本発明の遺伝子改変植物の調製に使用される植物細胞または植物に天然に存在するプロモーター（植物細胞または植物に対して同種）を意味するか、あるいは、タンパク質をコードするそれぞれの外来性核酸分子の単離元であった生物において遺伝子の発現の調節を調節するプロモーター（発現対象の核酸分子に対して同種）を意味すると理解されるものとする。
【００７９】
本発明の関連で、用語「異種（heterologous）プロモーター」とは、それぞれ本発明の遺伝子改変植物細胞の調製および本発明の遺伝子改変植物において使用される植物細胞または植物に天然には存在しないプロモーター（植物細胞または植物に対して異種）を意味するか、あるいは、タンパク質をコードするそれぞれの外来性核酸分子の単離元であった生物において、天然には、該外来性核酸分子の発現を調節するために存在しないプロモーター（発現対象の核酸分子に対して異種）を意味すると理解されるものとする。
【００８０】
また、転写物に対してポリＡ尾部を付加するために働く終結配列（ポリアデニル化シグナル）を存在させてよい。ポリＡ尾部は転写物の安定化に作用すると考えられる。そのような要素は文献（Gielenら、EMBO J. 8 (1989), 23-29を参照されたい）に記載されていて、所望のように交換することができる。
【００８１】
イントロン配列を外来性核酸分子のプロモーターとコード領域の間に存在させることも可能である。そのようなイントロン配列は植物における発現の安定性および発現の増加を導く（Callisら、1987, Genes Devel. 1 , 1183-1200; Luehrsen, およびWalbot, 1991 , Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeierら、1997; Plant Journal 12(4), 895-899; RoseおよびBeliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasilら、1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XUら、2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569）。好適なイントロン配列は、例えば、トウモロコシ由来のｓｈ１遺伝子の第一イントロン、トウモロコシ由来のポリユビキチン遺伝子１の第一イントロン、コメ由来のＥＰＳＰＳ遺伝子の第一イントロンまたはシロイヌナズナ（Arabidopsis）由来のＰＡＴ１遺伝子の第一の２イントロンの１つである。
【００８２】
本発明では、ＧＦＡＴ−２の酵素活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子は任意の真核生物由来であってよく；好ましくは、該核酸分子は動物由来であり、特に好ましくは哺乳類由来および非常に特に好ましくはマウス由来である。
【００８３】
本発明では、細菌ＧＦＡＴの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子は任意の非真核生物由来またはウイルスゲノム由来であってよく；好ましくは、該核酸分子は細菌またはウイルス由来であり；特に好ましくは、該核酸分子は大腸菌由来である。ＧＦＡＴの活性を有するウイルスタンパク質をコードするアミノ酸配列は、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列とかなり高い同一性を有し、かつＧＦＡＴ−１またはＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質とかなり低い同一性を有するため、ＧＦＡＴの活性を有するウイルスタンパク質はＧＦＡＴの活性を有する細菌タンパク質とともに分類される（Landsteinら、1998, Virology 250, 388-396）。ウイルスに関しては、ＧＦＡＴの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子は、好ましくは、藻類に感染するウイルス、好ましくはクロレラ（Chlorella）属の藻類に感染するウイルス由来であり、特に好ましくはパラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス（Paramecium bursaria Chlorella virus）由来であり、非常に特に好ましくはＨ１株のパラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス由来である。
【００８４】
ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする天然に存在する核酸分子の代わりに、本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物に導入される核酸分子は、突然変異誘発によって作製されたものであってもよく、その場合、該突然変異誘発された外来性核酸分子は、それが、代謝産物(例えばグルコサミン代謝の代謝産物)による阻害が低減されているＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする点を特徴とする。典型的な様式で、そのような突然変異誘発された核酸分子の調製は、Dengら（2005, Metabolic Engineering 7, 201-214; WO 04 003175）に、大腸菌由来の細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質に関して記載されている。マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質の突然変異体は、例えばHuら（2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993）に記載されている。
【００８５】
ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は当業者に公知であり、文献に報告されている。ゆえに、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、例えば大腸菌（Dutka-Malen, 1988, Biochemie 70 (2), 287-290; EMBL acc No: L10328.1）、枯草菌（Bacillus subtilis）（EMBL acc No U21932）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（EMBL acc Nos AB006424.1, BAA33071）に関して報告されている。細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、ウイルス、例えばクロレラウイルスｋ２（EMBL acc No AB107976.1）に関しても報告されている。
【００８６】
ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、とりわけ昆虫由来、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）に関して（NCBI acc No NM_143360.2）、脊椎動物由来、例えばヒト（Homo sapiens）（NCBI acc No BC000012.2, Okiら、1999, Genomics 57 (2),227-34）またはマウス（Mus musculus）（EMBL acc No AB016780.1）に関して報告されている。
【００８７】
好ましい実施態様では、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞および本発明の遺伝子改変植物であって、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子が以下からなる群から選択される遺伝子改変植物細胞および遺伝子改変植物に関する：
ａ）配列番号：７の下に記載のアミノ酸配列（ＧＦＡＴ−２）を有するタンパク質または配列番号：９の下に記載のアミノ酸配列（細菌ＧＦＡＴ）を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列が、配列番号：７の下（ＧＦＡＴ−２）または配列番号：９の下（細菌ＧＦＡＴ）に示されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、非常に特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％同一であるタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号：６の下（ＧＦＡＴ−２）または配列番号：８の下（細菌ＧＦＡＴ）または配列番号：１０の下（細菌ＧＦＡＴ）に示されるヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含む核酸分子；
ｄ）上記ａ）またはｃ）の下に示される核酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、非常に特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％同一である核酸分子；
ｅ）上記ａ）またはｃ）の下に記載の核酸配列の少なくとも１鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
ｆ）遺伝暗号の縮重に起因して、ヌクレオチド配列が上記ａ）またはｃ）の下に記載の核酸分子の配列と異なる核酸分子および
ｇ）上記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に記載の核酸分子の断片、対立遺伝子変異体および／または誘導体である核酸分子。
【００８８】
本発明の関連で、用語「ハイブリダイゼーション」とは、慣用のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。該条件は、例えばSambrookら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773）またはAusubelら（Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929）に記載されている。特に好ましくは、「ハイブリダイゼーション」とは、以下の条件下でのハイブリダイゼーションを意味する：
ハイブリダイゼーションバッファー：
２ｘＳＳＣ；１０ｘデンハート液（Ｆｉｋｏｌｌ ４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ；比１：１：１）；０．１％ ＳＤＳ；５mM ＥＤＴＡ；５０mM Ｎａ２ＨＰＯ４；２５０μg/mlのニシン精子ＤＮＡ；５０μg/mlのｔＲＮＡ；
または
２５Mリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２；１mM ＥＤＴＡ；７％ ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度：
Ｔ＝６５〜６８℃
洗浄バッファー：０．１ｘＳＳＣ；０．１％ ＳＤＳ
洗浄温度：Ｔ＝６５〜６８℃。
【００８９】
ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は任意の生物由来であってよく；したがって、それらは細菌、真菌、動物、植物またはウイルス由来であってよい。
【００９０】
ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、好ましくは、動物由来であり、特に好ましくは哺乳類由来であり、非常に特に好ましくはマウス由来である。
【００９１】
細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、好ましくは、細菌またはウイルス由来であり、特に好ましくは大腸菌由来である。
【００９２】
上記分子とハイブリダイズする核酸分子は例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから単離してよい。そのような核酸分子は、上記核酸分子またはこれらの分子の部分またはこれらの分子の逆の相補物を使用して、例えば標準的方法にしたがったハイブリダイゼーション（例えばSambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773; Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002),ISBN: 0471250929を参照されたい）によって、またはＰＣＲを使用する増幅によって特定および単離することができる。
【００９３】
ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を単離するためのハイブリダイゼーションサンプルとして、例えば、厳密または本質的に、配列番号：６の下に記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の断片を有する核酸分子を使用することが可能である。細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を単離するためのハイブリダイゼーションサンプルとして、例えば、厳密または本質的に、配列番号：８の下に記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の断片を有する核酸分子を使用することが可能である。
【００９４】
ハイブリダイゼーションサンプルとして使用される断片は、通例の合成技術を使用して調製される合成断片またはオリゴヌクレオチドであって、その配列が、本発明の関連で記載される核酸分子と本質的に同一である合成断片またはオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明の関連で記載される核酸配列とハイブリダイズする遺伝子を特定および単離した後、配列を決定すべきであり、この配列によってコードされるタンパク質の特性を分析して、それらが、ＧＦＡＴ−２の活性または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質であるかどうかを決定すべきであろう。タンパク質が、ＧＦＡＴ−２の活性を有するか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性を有するかどうかを決定するための方法は当業者に公知であり、とりわけ、文献（細菌ＧＦＡＴ：例えばDengら、2005, Metabolic Engineering 7, 201-214; Kornfeld, 1967, J. Biol. Chem. 242(13), 3135- 3141; ＧＦＡＴ−２：例えばHuら、2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993）に記載されている。
【００９５】
本発明の関連で記載される核酸分子とハイブリダイズする分子には、特に上記核酸分子の断片、誘導体および対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の関連で、用語「誘導体」とは、これらの分子の配列が、上記核酸分子の配列と１以上の位置で異なり、かつ、これらの配列に対して高度に同一であることを意味する。上記核酸分子との差異は、例えば、欠失（特にＮおよび／またはＣ末端領域の欠失）、付加、置換、挿入または組換えに起因するものであってよい。
【００９６】
本発明の関連で、用語「同一性」とは、核酸分子のコード領域の全長またはタンパク質をコードするアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも６０％の配列同一性、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、非常に特に好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を意味する。本発明の関連で、用語「同一性」とは、他のタンパク質／核酸と同一のアミノ酸／ヌクレオチドの数（同一性）（％単位で表される）を意味すると理解されるものとする。
【００９７】
好ましくは、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号：７の下に記載のアミノ酸配列との比較によって決定され、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号：６の下に記載の核酸配列の比較によって決定される。該比較は、コンピュータプログラムを活用する、他のタンパク質／核酸との比較である。好ましくは、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号：９の下に記載のアミノ酸配列の比較によって決定され、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号：８または配列番号：１０の下に記載の核酸配列の比較によって決定される。該比較は、コンピュータプログラムを活用する、他のタンパク質／核酸との比較である。互いに比較される配列の長さが異なる場合、その同一性は、短い配列が長い配列と共有するアミノ酸／ヌクレオチドの数の％単位で同一性を決定することによって決定されるものとする。好ましくは、公知の公的に利用可能なコンピュータプログラムであるClustalW（Thompsonら、Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680）を使用して同一性を決定する。ClustalWは、Julie Thompson（Thompson@EMBL-Heidelberg.DE）およびToby Gibson（Gibson@EMBL-Heidelberg.DE）、European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germanyによって公的に利用可能にされている。ClustalWはまた、種々のインターネットページからダウンロードすることができ、とりわけIGBMC（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 lllkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/）およびEBI（ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/）およびEBI（European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK）のすべてのインターネットミラーページからダウンロードすることができる。
【００９８】
好ましくは、ClustalWコンピュータプログラムのバージョン１．８を使用して、本発明の関連で記載されるタンパク質と他のタンパク質間の同一性を決定する。ここで、以下の通りにパラメータを設定する必要がある：KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP。
【００９９】
好ましくは、ClustalWコンピュータプログラムのバージョン１．８を使用して、例えば本発明の関連で記載される核酸分子のヌクレオチド配列と他の核酸分子のヌクレオチド配列間の同一性を決定する。ここで、以下の通りにパラメータを設定する必要がある：KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: 重みなし（unweighted）。
【０１００】
さらにまた、同一性とは、目的の核酸分子またはそれらによってコードされるタンパク質間に機能的および／または構造的な同等性が存在することを意味する。上記分子に相同であり、これらの分子の誘導体である核酸分子は、概して、同一の生物学的機能を有する、すなわちＧＦＡＴ−２の活性または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする改変体に相当するこれらの分子の変形例である。それらは天然に存在する変形例、例えば他の種由来の配列、または突然変異であってよく、その場合、これらの突然変異は天然の様式で発生したものであってよく、あるいは系統的な突然変異誘発によって導入されたものである。さらにまた、該変形例は合成によって製造された配列であってよい。対立遺伝子変異体は、天然に存在する変異体または合成によって製造された変異体または組換えＤＮＡ技術によって作製された変異体であってよい。特殊な形式の誘導体は、例えば、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明の関連で記載される核酸分子と異なる核酸分子である。
【０１０１】
別の好ましい実施態様では、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物であって、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、該核酸分子のコドンが、親生物の、ＧＦＡＴ−２の活性を有する該タンパク質または細菌ＧＦＡＴの活性を有する該タンパク質をコードする核酸分子のコドンと異なる点を特徴とする遺伝子改変植物細胞または遺伝子改変植物に関する。特に好ましくは、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子のコドンを変更して、それらが、そのゲノムに該核酸分子が組み込まれるか、あるいは組み込まれる予定の植物細胞または植物のコドンの使用頻度に適合するようにする。
【０１０２】
遺伝暗号の縮重の結果、アミノ酸は１以上のコドンによってコードされうる。生物が異なれば、アミノ酸をコードするコドンが異なる頻度で使用される。コード核酸配列のコドンを、発現対象の配列がそのゲノムに組み込まれる予定の植物細胞または植物でのそれらの使用頻度に適合させると、特定の植物細胞または植物中の翻訳タンパク質の量の増加および／または目的のｍＲＮＡの安定性に寄与する可能性がある。当業者は、可能な限り多数の、目的の生物のコード核酸配列を、特定のコドンが、特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度に関して調査することによって、目的の植物細胞または植物中のコドンの使用頻度を決定することができる。特定の生物のコドンの使用頻度は当業者に公知であり、コンピュータプログラムを使用して単純かつ高速な様式で決定することができる。そのようなコンピュータプログラムは公的に利用可能であり、とりわけインターネット上で無料で提供されている（例えばhttp://gcua.schoedl.de/; http://www.kazusa.or.jp/codon/; http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html）。
【０１０３】
コード核酸配列のコドンを、そのゲノム中に、発現対象の配列が組み込まれる予定の植物細胞または植物でのそれらの使用頻度に適合させることは、インビトロ突然変異誘発によって、または好ましくは該遺伝子配列の新規合成よって実行することができる。核酸配列を新規合成するための方法は当業者に公知である。新規合成は、例えば、まず個々の核酸オリゴヌクレオチドを合成し、これらをそれに相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて、それらにＤＮＡ二本鎖を形成させ、そして個々の二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートして、所望の核酸配列を取得することによって実行することができる。コドンが使用される頻度を特定の標的生物に適合させることを含む核酸配列の新規合成は、このサービスを提供する企業（例えばEntelechon GmbH, Regensburg, Germany）に供給されることもできる。
【０１０４】
すべての上記核酸分子は、本発明の植物細胞または本発明の植物を生産するために適している。
【０１０５】
本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物は、原理的に、任意の植物種、すなわち単子葉および双子葉の両植物の、それぞれ、植物細胞および植物であってよい。それらは、好ましくは、作物植物であり、すなわちヒトおよび動物に食物を与える目的で、あるいは技術的、工業的目的でバイオマスを生産するため、および／または物質を製造するためにヒトによって栽培される植物である。本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物は、特に好ましくは、トウモロコシ、コメ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、マニオック（manioc）、ジャガイモ、トマト、スイッチグラス（Panicum virgatum）、サゴ、リョクトウ、エンドウマメ、モロコシ、ニンジン、ナス、ダイコン、アブラナ、アルファルファ、ダイズ、ピーナッツ、キュウリ、カボチャ、メロン、リーキ、ニンニク、キャベツ、ホウレンソウ、サツマイモ、アスパラガス、ズッキーニ、レタス、アーティチョーク、スイートコーン、パースニップ、バラモンジン、キクイモ（Jerusalem artichoke）、バナナ、サトウダイコン、サトウキビ、ビートの根（beetroot）、ブロッコリー、キャベツ、タマネギ、ビート、タンポポ、イチゴ、リンゴ、アンズ、プラム、モモ、ブドウの木、カリフラワー、セロリ、ピーマン、スイード、ダイオウである。それらは、好ましくは、トウモロコシ、コメ、コムギ、ライムギ、カラスムギまたはオオムギ植物、非常に特に好ましくはコメ、トマトまたはジャガイモ植物である。
【０１０６】
本発明の関連で、用語「ジャガイモ植物」または「ジャガイモ」とは、ナス（Solanum）属の植物種、特にナス属の塊茎を作る種および特にSolanum tuberosumを意味すると理解されるものとする。
【０１０７】
本発明の関連で、用語「トマト植物」または「トマト」とは、トマト（Lycopersicon）属の植物種、特にLycopersicon esculentumを意味すると理解されるものとする。
【０１０８】
本発明の関連で、用語「コメ植物」とは、イネ（Oryza）属の植物種、特に商業的目的で農業によって栽培されるイネ属の植物種、特に好ましくはOryza sativaを意味すると理解されるものとする。
【０１０９】
上記のように、本発明の植物細胞または本発明の植物は、グルコサミノグリカン、例えばコンドロイチン、ヒアルロナン、キチン、ヘパリン（ヘパロサン）を生産するために適している。その理由は、それらが、上記グルコサミノグリカンの触媒作用に関与する酵素の多量の基質を含有するからである。
【０１１０】
したがって、本発明は、さらにまた、グルコサミノグリカン、好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも５００μgのグルコサミノグリカン、より好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも１５００μgのグルコサミノグリカン、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも３５００μgのグルコサミノグリカン、非常に特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも４０００μgのグルコサミノグリカンおよび特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり少なくとも５５００μgのグルコサミノグリカンを合成する植物細胞または植物に関する。この関連で、該グルコサミノグリカンは、好ましくはコンドロイチン、ヒアルロナン、キチンまたはヘパリン（ヘパロサン）であり、特に好ましくはヒアルロナンである。
【０１１１】
本発明の植物細胞または本発明の植物は、好ましくは、新鮮重量１グラムあたり多くとも２５ ０００μmol、好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも２０ ０００μmol、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも１５ ０００μmol、非常に特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも１０ ０００μmol、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも６５００μmolのグルコサミノグリカン含量を有する。
【０１１２】
グルコサミノグリカンを合成する本発明の植物細胞または本発明の植物は、例えば、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードし、かつ、グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入することによって生産することができる。
【０１１３】
したがって、本発明はまた、ＧＦＡＴ−２または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする第一の外来性核酸分子およびグルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする第二の外来性核酸分子を含有する遺伝子改変植物細胞または遺伝子改変植物に関する。
【０１１４】
本発明の関連で、用語「グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質」とは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのエピマーを、グルコサミノグリカンを合成するための基質として使用するタンパク質を意味すると理解されるものとする。グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質は、好ましくはヒアルロナンシンターゼ、コンドロイチンシンターゼ、ヘパロサン／ヘパリンシンターゼ、ケラタンシンターゼまたはキチンシンターゼである。
【０１１５】
グルコサミノグリカンシンターゼをコードする核酸分子および対応するタンパク質配列は当業者に公知であり、例えばウイルス（例えばパラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１, EMBL U42580.3, PB42580, US 20030235893）由来のヒアルロナンシンターゼとして、例えば哺乳類（例えばヒト, WO 03 012099, US 2005048604, US 2006052335）、細菌（例えば大腸菌, US2003109693, EP 1283259, パスツレラ・マルチコダ（Pasteurella multicoda）US 2003104601）由来のコンドロイチンシンターゼとして、例えば細菌（例えばアゾリゾビウム・カウリノダンス（Azorhizobium caulinodans）EMBLCDS:AAB51164）、真菌（例えばケトミウム・グロボサム（Chaetomium globosum）EMBLCDS:EAQ92361, アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）EMBL AB000125, アルスロデルマ・ベンハミエ（Arthroderma benhamiae）EMBLCDS:BAB32692 アカパンカビ（Neurospora crassa）EMBL M73437.4）、昆虫（例えばネッタイシマカ（Aedes aegypti）EMBLCDS:EAT46081, トリボリウム・カスタネウム（Tribolium castaneum）EMBLCDS: AAQ55061）、線虫（例えばイヌ糸状虫（Dirofilaria immitis）EMBL AF288618, シノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）EMBL AY874871）、ウイルス（例えばクロレラウイルスEMBLCDS: BAB83509, パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルスＣＶＫ２ EMBLCDS: BAE48153）由来のキチンシンターゼとして、例えば細菌（例えばパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）EMBL AF425591, AF439804, US 20030099967, 大腸菌X77617.1）由来のヘパリン／ヘパロサンシンターゼとして報告されている。
【０１１６】
グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする第二の外来性核酸分子は、好ましくは、組換え核酸分子である。組換え核酸分子の好ましい実施態様はすでに記載した。ここでは、対応する様式で該実施態様を使用するものとする。
【０１１７】
別の好ましい実施態様では、グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする第二の外来性核酸分子は、親生物のグルコサミノグリカンシンターゼの活性を有する該タンパク質をコードする核酸分子のコドンと比較してコドンが改変されている点を特徴とする。特に好ましくは、グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子のコドンを、それらが、そのゲノムに該核酸分子が組み込まれるか、あるいは組み込まれる予定の植物細胞または植物のコドンの使用頻度に適合するように改変する。
【０１１８】
核酸分子のコドンの改変に関して、ＧＦＡＴ−２または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子について記載された内容は、ここで、対応する様式で適用することができる。
【０１１９】
本発明は、さらにまた、本発明の植物細胞を含有する植物に関する。そのような植物は本発明の植物細胞から再生することによって作製してよい。
【０１２０】
本発明はまた、本発明の植物細胞を含有する本発明の植物の部分に関する。
【０１２１】
本発明の関連で、用語「植物部分」または「植物の部分」とは、例えば、食品または飼料の生産に使用されるプロセス可能な植物の部分、工業プロセス（例えばグルコサミン誘導体またはグルコサミノグリカンを単離するための工業プロセス）のための原材料供給源として、医薬品を製造するための原材料供給源として、または化粧品を製造するための原材料供給源として使用されるプロセス可能な植物の部分を意味すると理解されるものとする。
【０１２２】
本発明の関連で、用語「植物部分」または「植物の部分」とは、さらにまた、例えば、ヒトの食物として役立つか、あるいは動物飼料として使用される消費可能な植物部分を意味すると理解されるものとする。
【０１２３】
好ましい「植物部分」または「植物の部分」は、果実、貯蔵根および他の根、花、芽、新芽（shoots）、葉または茎であり、好ましくは種子、果実、穀粒または塊茎である。
【０１２４】
本発明はまた、本発明の植物の繁殖用材料（propagation material）に関する。好ましくは、本発明の繁殖用材料は、本発明の植物細胞、特に好ましくは本発明の遺伝子改変植物細胞を含有する。
【０１２５】
ここで、用語「繁殖用材料」には、無性または生殖経路で子孫を生むために適している植物の成分が含まれる。栄養繁殖に適しているのは、例えば切り枝、カルス培養物、根茎または塊茎である。他の繁殖用材料には、例えば果実、種子、穀粒、実生、細胞培養物、等が含まれる。該繁殖用材料は、好ましくは、塊茎、果実、穀粒または種子の形式をとる。
【０１２６】
本発明の別の利点は、本発明の植物の部分が、既知の植物より高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することである。したがって、本発明の植物は、食品／飼料としての直接使用または（例えば骨関節炎予防のための）予防または治療効果を有する食品／飼料の製造に特に適している。本発明の植物は、既知の植物と比較して、より高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有するため、増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する食品／飼料の製造に使用される本発明の植物の回収可能な部分、繁殖用材料、プロセス可能な部分または消費可能な部分の量を減らすことができる。本発明の遺伝子改変植物の消費可能な部分が、例えばいわゆる栄養補給食品として直接消費される場合、少量の物質を消費するだけで、正の効果が達成される可能性がある。このことは、とりわけ動物飼料の生産に、特に重要であるかもしれない。その理由は、あまりに高含量の植物成分を有する動物飼料は種々の動物種の飼料として適さないからである。さらにまた、本発明の植物細胞または本発明の植物は、完全菜食主義者が、あるいは清浄な食物を製造するためにそれらを使用することもできる利点を有する。ゆえに、高含量のＮ−アセチル化グルコサミンを有する食物は、上記生活様式にしたがっている人々にさえ投与することが可能である。
【０１２７】
Ｎ−アセチルグルコサミンはビフィズス菌の成長に対する促進効果を有することが知られている（Liepkeら、2002, Eur. J. Biochem. 269, 712-718）。さらにまた、Ｎ−アセチルグルコサミンが魚のはらわた由来の乳酸桿菌（例えばカゼイ乳酸桿菌亜種パラカゼイ（Lactobacillus casei subspecies paracasei））の基質として働くことが示されている（Adolfo Bucio Galindo, 2004, Proefschrift, Wageningen Universiteit, ISBN 90-5808-943-6）。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミンはプロバイオティック細菌に対して正の効果を有する。本発明の植物細胞、本発明の植物または本発明の植物の部分は高含量のＮ−アセチルグルコサミンを有するため、それらは、結果的に、プロバイオティック細菌の成長に対して正の効果を有し、ゆえにヒトおよび動物用のプレバイオティック（prebiotic）食品／飼料としての使用に適しているはずであろう。
【０１２８】
本発明は、さらにまた、遺伝子改変植物を生産するための方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
ａ）  グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程；
ｂ）  工程ａ）にしたがって取得された植物細胞から植物を再生する工程；
ｃ）  適切であれば、工程ｂ）に記載の植物を用いて別の植物を作製する工程。
【０１２９】
本発明は、さらにまた、グルコサミノグリカンを合成する植物を生産するための方法に関し、該方法では：
ａ）  植物細胞を遺伝子改変し、その場合、該遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉを任意の順序で含むか、あるいは以下の工程ｉ〜ｉｉの任意の組み合わせを、個別に、あるいは同時に実行する：
ｉ）  グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームＩＩ（ＧＦＡＴ−２）の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（細菌ＧＦＡＴ）の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程；
ｉｉ）  グルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程；
ｂ）  以下の工程に記載の遺伝子改変を含む植物細胞から植物を再生する：
ｉ）  ａ）ｉ；
ｉｉ）  ａ）ｉｉ；
ｉｉｉ）  ａ）ｉおよびａ）ｉｉ；
ｃ）  工程：
ｉ）  ｂ）ｉに記載の植物の植物細胞に工程ａ）ｉｉに記載の遺伝子改変を導入する工程；
ｉｉ）  ｂ）ｉｉに記載の植物の植物細胞に工程ａ）ｉに記載の遺伝子改変を導入する工程；
そして植物を再生する；
ｄ）  適切であれば、工程ｂ）ｉｉｉまたはｃ）ｉまたはｃ）ｉｉのいずれかにしたがって取得された植物を用いて別の植物を作製する。
【０１３０】
遺伝子改変植物を生産するための方法の工程ａ）にしたがって、またはグルコサミノグリカンを合成する植物を生産するための方法の工程ａ）またはｃ）にしたがって、植物細胞に外来性核酸分子を導入することに関して、この導入は、原理的に、外来性核酸分子を植物細胞または植物に組み込むために適した核酸分子の任意のタイプの導入であってよい。そのような方法はすでに上で記載されている。ここでは、対応する様式で該方法を適用することができる。
【０１３１】
遺伝子改変植物を生産するための方法の工程ａ）に記載の、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子に関して、またはグルコサミノグリカンを合成する植物を生産するための方法の工程ａ）ｉｉ）に記載の、グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子に関して、それぞれの核酸分子の種々の可能な実施態様は本発明の植物細胞および本発明の植物の関連ですでに記載されている。既述のすべてのこれらの好ましい実施態様は、上記本発明の方法を実行するために使用することもできる。
【０１３２】
本発明の方法の工程ｂ）および／またはｃ）に記載の方法に基づく植物の再生は、当業者に公知の方法（例えば「Plant Cell Culture Protocols」, 1999, edt. by R.D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2に記載の方法）を使用して実行することができる。
【０１３３】
本発明の方法の工程ｃ）またはｄ）に記載の方法に基づく別の植物の作製は、例えば栄養繁殖によって（例えば切り枝、塊茎によって、またはカルス培養および無傷の植物の再生によって）または生殖による繁殖によって実行することができる。この関連で、生殖による繁殖は、好ましくは、制御条件下で生じる。すなわち、特定の特性を有する選択植物を互いにハイブリッド形成させ、繁殖させる。該選択は、好ましくは、工程ｂ）またはｄ）に記載の方法に基づいて、該植物が、工程ａ）で導入される改変を有するように行われる。
【０１３４】
別の好ましい実施態様では、遺伝子改変植物を生産するための本発明の方法を、本発明の植物を生産するために使用する。
【０１３５】
本発明はまた、遺伝子改変植物を製造するための本発明の方法によって取得可能な植物を提供する。
【０１３６】
本発明は、さらにまた、グルコサミノグリカンを生産するための方法であって、本発明の遺伝子改変植物細胞から、本発明の遺伝子改変植物から、本発明の繁殖用材料、本発明の植物の部分または、グルコサミノグリカンを合成する遺伝子改変植物を製造するための本発明の方法によって取得可能な植物から、グルコサミノグリカンを抽出する工程を含む方法に関する。本発明の方法は、好ましくは、コンドロイチン、ヒアルロナン、キチンまたはヘパリン（ヘパロサン）を生産するために使用され、特に好ましくはヒアルロナンを生産するために使用される。
【０１３７】
好ましくは、そのような方法はまた、グルコサミノグリカンの抽出前に、培養された本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖用材料、本発明の植物の部分を回収する工程および特に好ましくは、さらにまた、回収前に、本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物を培養する工程を含む。
【０１３８】
細菌または動物組織と対照的に、植物組織は、グルコサミノグリカンを分解する酵素を全く含有しない。したがって、比較的単純な方法を使用して、植物組織からグルコサミノグリカンを抽出することが可能である。所望であれば、当業者に公知の方法、例えばエタノールでの繰り返しの沈殿を使用して、グルコサミノグリカンを含有する植物細胞または組織の水性抽出物をさらに精製することができる。例えばヒアルロナンを精製するための好ましい方法は一般的方法項目５の下に記載される。
【０１３９】
本発明はまた、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖用材料、本発明の植物の部分またはグルコサミノグリカンを合成する遺伝子改変植物を生産するための本発明の方法によって取得可能な植物の使用であって、グルコサミノグリカンを生産するための使用を提供する。
【０１４０】
本発明はまた、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の使用であって、遺伝子改変植物を製造するための使用を提供する。
【０１４１】
本発明は、さらにまた、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む組成物に関する。
【０１４２】
ここで、該植物細胞が無傷であるか、それらが、例えばプロセシングによって破壊されているためにもはや無傷でないかは重要でない。該組成物は、好ましくは、食品、食品サプリメントまたは飼料、医薬品または化粧品である。
【０１４３】
本発明は、好ましくは、組換え核酸分子を含む本発明の組成物を提供し、該組換え核酸分子は、それらが、ＧＦＡＴ−２の酵素活性を有するタンパク質または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む点を特徴とする。
【０１４４】
植物細胞または植物のゲノムに外来性核酸分子が安定に組み込まれると、該植物細胞または植物のゲノムへの組み込みの結果、該外来性核酸分子にゲノム植物核酸配列が隣接する。したがって、好ましい実施態様では、本発明の組成物は、本発明の組成物中に存在する組換え核酸分子にゲノム植物核酸配列が隣接している点を特徴とする。
【０１４５】
ここで、ゲノム植物核酸配列は、組成物の製造に使用される植物細胞または植物のゲノム中に天然に存在する任意の配列であってよい。本発明の組成物中に存在する該組換え核酸分子は、当業者に公知の方法、例えばハイブリダイゼーションベースの方法または、好ましくは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）ベースの方法を使用して実証することができる。
【０１４６】
好ましくは、本発明の組成物は、少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも０．１％、特に好ましくは少なくとも０．５％、非常に特に好ましくは少なくとも１．０％のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を含む。
【０１４７】
好ましくは、本発明の組成物は、多くとも１０％、好ましくは多くとも５％、特に好ましくは多くとも３％、非常に特に好ましくは多くとも２％のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を含む。
【０１４８】
本発明の組成物は、それらが、遺伝子改変されていない植物細胞を含む組成物と比較して、増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量または増加したグルコサミノグリカン含量を有する利点を提供する。Ｎ−アセチルグルコサミンはビフィズス菌の成長に対する促進効果を有する（Liepkeら、2002, Eur. J. Biochem. 269, 712-718）。さらにまた、Ｎ−アセチルグルコサミンが魚のはらわた由来の乳酸桿菌（例えばカゼイ乳酸桿菌亜種パラカゼイ）の基質として働くことが示されている（Adolfo Bucio Galindo, 2004, Proefschrift, Wageningen Universiteit, ISBN 90-5808-943-6）。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミンはプロバイオティック細菌に対して正の効果を有する。本発明の組成物は、増加したＮ−アセチルグルコサミン含量を有するため、プロバイオティック細菌の成長に対して正の効果を有するはずであろう。
【０１４９】
本発明は、さらにまた、本発明の植物細胞、本発明の植物、本発明の繁殖用材料、本発明の植物の部分または遺伝子改変植物を生産するための本発明の方法によって取得可能な植物を使用して、本発明の組成物を製造するための方法を提供する。本発明の組成物を製造するための方法は、好ましくは、食品、飼料または食品サプリメントを生産するための方法である。
【０１５０】
食品、飼料、食品サプリメント、医薬品または化粧品を生産するための方法は当業者に公知であり、とりわけ、それらに排他的に限定されるわけではないが、本発明の植物または本発明の植物部分を細かく砕くか、あるいは粉砕する工程を含む。
【０１５１】
本発明はまた、本発明の組成物を製造するための方法によって取得可能な組成物を提供する。
【０１５２】
本発明はまた、本発明の遺伝子改変植物細胞または本発明の遺伝子改変植物の使用であって、本発明の組成物を製造するための使用に関する。
【０１５３】
本発明の組成物の好ましい実施態様は穀粉である。
【０１５４】
植物の部分は穀粉に加工されることが多い。穀粉の調製に使用される植物の部分の例は、例えば、ジャガイモ植物の塊茎および穀類植物の穀粒である。穀類植物から穀粉を生産するために、これらの植物の胚乳含有穀粒を砕いて、ふるいにかける。胚乳を全く含有しないが、例えば塊茎または貯蔵根を含有する他の植物の事例では、該植物の関連部分を細かく砕き、乾燥させ、その後に粉砕することによって穀粉を生産することが多い。本発明の植物細胞および本発明の植物は、既知の植物細胞または植物と比較して、増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体またはグルコサミノグリカンの含量を有する。したがって、本発明の植物細胞、本発明の植物、本発明の繁殖用材料または本発明の植物の部分から調製される穀粉は、増加した割合のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体またはグルコサミノグリカンを同様に含有する。
【０１５５】
したがって、本発明は、さらにまた、本発明の植物細胞、本発明の植物から、あるいは本発明の植物の部分から取得可能な穀粉に関する。穀粉を生産するための本発明の植物の好ましい部分は塊茎および胚乳含有穀粒である。本発明の関連で、（系統的）イネ科（Poaceae）の植物の穀粒、特に好ましくはトウモロコシ、コメまたはコムギ植物に由来する穀粒が特に好ましい。
【０１５６】
本発明は、さらにまた、少なくとも１０μmol／グラム、好ましくは少なくとも２０μmol／グラム、より好ましくは少なくとも２５μmol／グラム、特に好ましくは少なくとも３０μmol／グラム、非常に特に好ましくは少なくとも３５μmol／グラムおよび特に好ましくは少なくとも４０μmol／グラムのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する本発明の穀粉に関する。
【０１５７】
本発明の穀粉は、好ましくは、新鮮重量１グラムあたり多くとも２５０μmol、好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも２００μmol、特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも１５０μmol、非常に特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも１００μmolおよび特に好ましくは新鮮重量１グラムあたり多くとも５０μmolのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する。
【０１５８】
本発明の関連で、用語「穀粉（flour）」とは、植物または植物部分を粉砕することによって取得される粉体を意味すると理解されるものとする。適切であれば、該植物または植物部分を粉砕前に乾燥させ、粉砕後、さらに細かく砕き、および／またはふるいにかける。
【０１５９】
慣用の穀粉と比較して、本発明の穀粉は、それらが、動物または真菌の原材料供給源から取得されたＮ−アセチル化グルコサミン誘導体またはグルコサミノグリカンを該穀粉に加えることを要さずに、増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体またはグルコサミノグリカン含量を有する食品、例えば焼き菓子の生産に使用できる利点を有する。上記原材料供給源から単離されるＮ−アセチル化グルコサミン誘導体またはグルコサミノグリカンの使用についての不都合、例えば、それらが病原体またはアレルゲン物質を含有するリスクは、さらに上ですでに記載されている。
【０１６０】
本発明は、さらにまた、穀粉を生産するための方法であって、本発明の植物細胞、本発明の植物または本発明の植物の部分を粉砕する工程を含む方法を提供する。
【０１６１】
穀粉は植物の部分を粉砕することによって生産することができる。穀粉の生産方法は当業者に公知である。穀粉を生産するための方法は、好ましくは、栽培された本発明の植物または本発明の植物の部分および／または本発明の繁殖用材料を回収する工程および特に好ましくは、さらにまた、回収前に本発明の植物を栽培する工程をさらに含む。
【０１６２】
本発明の別の実施態様では、穀粉を生産するための方法は、本発明の植物、本発明の植物の部分または本発明の繁殖用材料を処理する工程を含む。
【０１６３】
ここで、処理は、例えば、加熱処理および／または乾燥であってよい。例えば、貯蔵根、塊茎由来、例えばジャガイモ塊茎由来の穀粉を生産する場合、粉砕前に、加熱処理、その後の熱処理済み材料の乾燥を使用する。また、本発明の植物、本発明の植物の部分または本発明の繁殖用材料を細かく砕くことは、本発明の意味での処理を構成する。粉砕前の植物組織の除去、例えば穀粒からの殻の除去もまた、本発明の意味での粉砕前の処理を構成する。
【０１６４】
本発明の別の実施態様では、穀粉を生産するための方法は、粉砕後の粉砕済み材料の処理を含む。
【０１６５】
ここで、該粉砕済み材料を、例えば、粉砕後にふるいにかけて、例えば異なるタイプの穀粉を生産してよい。
【０１６６】
本発明は、さらにまた、本発明の植物細胞、本発明の植物、本発明の植物の部分または本発明の繁殖用材料の使用であって、穀粉を生産するための使用を提供する。
【０１６７】
配列の説明
配列番号：１：パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列。
配列番号：２：パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のヒアルロナンシンターゼのアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号：１から導き出すことができる。
配列番号：３：パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のヒアルロナンシンターゼをコードする合成核酸配列。上記配列のコドンは、それらが植物細胞中のコドンの使用に適合するように合成した。上記核酸配列は、配列番号：２の下に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号：４：マウス由来のＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号：５：マウス由来のＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号：４から導き出すことができる。
配列番号：６：マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号：７：マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号：６から導き出すことができる。
配列番号：８：大腸菌由来の細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号：９：大腸菌由来のＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号：８から導き出すことができる。
配列番号：１０：大腸菌由来のＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列。上記配列のコドンは、それらが植物細胞中のコドンの使用に適合するように合成した。上記核酸配列は、配列番号：９の下に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号：１１：パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号：１２：パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号：１１から導き出すことができる。
配列番号：１３：パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列。上記配列のコドンは、それらが植物細胞中のコドンの使用に適合するように合成した。上記核酸配列は、配列番号：１２の下に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号：１４：実施例６で使用された合成オリゴヌクレオチド。
配列番号：１５：実施例６で使用された合成オリゴヌクレオチド。
配列番号：１６：実施例１５で使用された合成オリゴヌクレオチド。
配列番号：１７：実施例１５で使用された合成オリゴヌクレオチド。
【０１６８】
配列データベースに関する上記核酸分子およびアミノ酸配列のアクセッション番号を含むすべての引用刊行物の内容は、参照により、本出願の説明に組み入れられる。
【０１６９】
本発明と組み合わせて使用できる方法を以下に記載する。これらの方法は具体的な実施態様である；しかし、本発明はこれらの方法に限定されない。本発明は、上記方法を改変することによって、および／または個々の方法または方法の部分を代替法または方法の代替部分で置き換えることによって同一の様式で実行できることが当業者に公知である。
【０１７０】
一般的方法
１．ジャガイモ植物の形質転換
アグロバクテリウムを活用してジャガイモ植物を形質転換した。該形質転換はRocha-Sosaら（EMBO J. 8, (1989), 23-29）に記載のように行った。
【０１７１】
２．トマト植物の形質転換
US 5,565,347に記載の方法にしたがって、アグロバクテリウムを活用してトマト植物を形質転換した。
【０１７２】
３．コメ植物の形質転換
Hieiら（1994, Plant Journal 6(2), 271-282）に記載の方法にしたがって、コメ植物を形質転換した。
【０１７３】
４．Ｎ−アセチル化グルコサミン含量の決定
還元末端を有するＮ−アセチル化グルコサミン誘導体は、ElsonおよびMorgan（1933, J Biochem. 27, 1824）の方法およびReissigら（1955, Biol. Chem. 217, 959-966）の改良された比色定量法と同様に決定した。該比色定量法は色素原ＩＩＩ（Muckenschnabelら、1998, Cancer Letters 131, 13-20）とｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ、エールリッヒ試薬）の反応に基づき、該反応によって赤色生成物が生じ、その濃度を光度測定によって決定することができる。
【０１７４】
ａ）植物材料の精密検査
まず、回収された植物材料を細かく砕いた。使用された植物材料の量に基づいて、細かく砕く作業は、実験室の振動ボールミル（MM200（Retsch, Germany製））で３０Ｈｚで３０秒間、またはWarringブレンダーを最大スピードで約３０秒間使用して実行した。一般に、細かく砕かれた植物材料（例えば葉、塊茎またはコメ穀粒）０．５gを、７％過塩素酸、５mM ＥＧＴＡからなる溶液１mlと混合し、氷上で２０分間インキュベートした。次いで該混合物を遠心分離した（１６ ０００ｘｇで５分、４℃）。遠心分離後に得られた上清を取り出し、５M ＫＯＨ、１M ＴＥＡからなる溶液（調節済みｐＨ７．０）を使用して中和し、次いで再び遠心分離した（１６ ０００ｘｇで５分、４℃）。遠心分離の終了後に、上清を取り出し、その容量を決定し、ｂ）の下に記載される方法に使用して、還元末端を有するＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量を決定した。
【０１７５】
ｂ）還元末端を有するＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量の決定
０．８M Ｋ２Ｂ４Ｏ７からなる溶液２０μl（ｐＨ９．６）をａ）の下に記載される方法によって得られる植物抽出物１００μlに加え、十分に混合した後、９５℃で５分間加熱する。混合物を室温に冷却した後、０．７mlのエールリッヒ試薬（濃ＨＣｌ １２．５ ml中のＤＭＡＢ １０g、氷酢酸８７．５mlからなり、氷酢酸で１：１０希釈されている溶液）を混合物に加え、該混合物を再び混合し、３７℃でさらに３０分間インキュベートする。次いで該混合物を１６ ０００ｘｇで１分間遠心分離し、次いで遠心分離後に得られる上清の光学濃度（ＯＤ）を光度計で５８５nmで決定する。
【０１７６】
ｃ）Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の濃度の算出
まず、規定量のＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸を使用して検量線を確立した。この目的を達成するために、ｂ）の下に記載される方法にしたがって、０mM、０．１mM、０．５mM、１mM、５mMおよび１０mMのＮ−アセチルグルコサミン６−リン酸を含む溶液のＯＤを決定した。
【０１７７】
Microsoft Excelで、 式：ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃまたはｙ＝ｘ２＋ｐｘ＋ｑの二次多項式の傾向／回帰直線を個々の濃度に関して測定された点に対して近似することによって検量線を確立した。該値を算出するために、取得された等式をｘに関して解き、ｘ＝−ｐ／２−平方根（ｐ２／４−ｑ）（式中、ｐ＝ｂ／ａ、ｑ＝（ｃ−ｙ）／ａおよびyは未知のサンプルの測定ＯＤである）を得た。使用された新鮮重量、使用された容量を配慮し、使用された任意の希釈因子を配慮することによって、（測定された溶液の）μmolまたは新鮮重量１gあたりのμmol単位で含量を算出した。
【０１７８】
５．ヒアルロナンを例として使用する植物組織からのグルコサミノグリカンの単離
植物組織中のヒアルロナンの存在を検出し、ヒアルロナン含量を決定するために、植物材料を以下のように精密検査した：２００μlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）を約０．３gの葉または塊茎材料に加え、実験室の振動ボールミル（MM200（Retsch, Germany製））（３０Ｈｚで３０秒）で該混合物を細かく砕いた。次いでさらに８００μlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）を加え、該混合物を（例えばボルテックスミキサーを使用して）十分に混合した。１６ ０００ｘｇで５分間遠心分離することによって上清から細胞片および不溶性成分を分離した。得られた上清の一定分量を使用して、ヒアルロナンの量を決定した。
【０１７９】
トマト果実の事例では、各事例で熟したトマト果実全体を精密検査した。この目的を達成するために、トマト果実の重量を決定し、Warringブレンダーで少量の水を用いてトマトを細かく砕き、細かく砕かれたサンプルを３６００ｘｇで３０分間の遠心分離によって細胞片から分離し、抽出物の容量を決定した。得られた上清の一定分量を使用して、ヒアルロナンの量を決定した。
【０１８０】
６．ヒアルロナンを例として使用するグルコサミノグリカンの精製
１００mlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）を加えた後、約１００グラムの植物材料をWarringブレンダーで最大速度で約３０秒間細かく砕いた。植物の比較的大きい部分、例えば塊茎またはトマト果実を単離に使用する場合、それらを前もってカットして約１cm３のサイズの小片にした。次いで茶こし（tea sieve）を使用して細胞片を除去した。分離された細胞片を３００mlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）にもう一度懸濁し、茶こしを使用して再び除去した。得られた２懸濁液（１００ml＋３００ml）をまとめ、１３ ０００ｘｇで１５分間遠心分離した。得られた遠心分離上清にＮａＣｌを１％の終濃度に達するまで加えた。ＮａＣｌが溶解した後、２倍容量のエタノールを加え、次いで十分に混合し、−２０℃で一晩インキュベートすることによって沈殿させた。次いで混合物を１３ ０００ｘｇで１５分間遠心分離した。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を１００mlのバッファー（５０mM ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８、１mM ＣａＣｌ２）に溶解し、次いでプロテイナーゼＫを加え、終濃度を１００μg/mlにし、該溶液を４２℃で２時間インキュベートした。その後、９５℃１０分間インキュベートした。もう一度、この溶液にＮａＣｌを１％の終濃度に達するまで加えた。ＮａＣｌが溶解した後、２倍容量のエタノールを加え、十分に混合し、−２０℃で約９６時間インキュベートすることによってさらに沈殿させた。その後、１３ ０００ｘｇで１５分間遠心分離した。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を３０mlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）に溶解し、もう一度、ＮａＣｌを加えて終濃度を１％にした。２倍容量のエタノールを加え、十分に混合し、−２０℃で一晩インキュベートすることによって、さらに沈殿させた。続く１３ ０００ｘｇで１５分間の遠心分離後に得られた沈殿物を２０mlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）に溶解した。
【０１８１】
遠心ろ過によってさらに精製を実行した。この目的を達成するために、各事例で５mlの溶解済み沈殿物をメンブレンフィルター（CentriconAmicon、孔幅（pore width）１０ ０００NMWL、Prod. No. UCF8 010 96）にアプライし、該サンプルを２２００ｘｇで遠心分離し、該フィルター上に約３mlの溶液しか残らないようにした。次いでさらに２回、各事例で３mlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）をメンブレン上の溶液に加え、各事例で同一条件下で再遠心分離し、終了時点でフィルター上に約３mlの溶液しか残らないようにした。遠心ろ過後にメンブレン上に依然として存在する溶液を取り出し、約１．５mlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）でメンブレンを繰り返し（３〜５回）すすいだ。メンブレン上に依然として存在していたすべての溶液およびすすぎから得られた溶液をまとめ、ＮａＣｌを１％の終濃度まで加え、ＮａＣｌが溶解した後、２倍容量のエタノールを加え、該サンプルを混合し、−２０℃で一晩保存することによって沈殿物を得た。続く１３ ０００ｘｇで１５分間の遠心分離後に得られた沈殿物を４mlの水（脱塩済み、伝導率＝１８MΩ）に溶解し、次いで凍結乾燥した（０．３７mbarの圧力下で２４時間、凍結乾燥装置Christ Alpha 1-4（Christ, Osterode, Germany））。
【０１８２】
７．ヒアルロナンの検出およびヒアルロナン含量の決定
ヒアルロナンは、市販の検査（ヒアルロン酸（ＨＡ）検査キット（Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001））を製造元の指示書にしたがって使用して検出した。ここに該指示書は参照により本説明に組み入れられる。検査原理は、ヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質（ＨＡＢＰ）の有効性に基づく。該検査はＥＬＩＳＡと同様に実行する。その場合、呈色反応によって試験サンプル中のヒアルロナン含量が示される。したがって、ヒアルロナンの定量では、測定対象のサンプルを、規定の限界内である濃度で使用すべきであろう（例えば：限界を超えているか、あるいは限界に達していないかに応じて、目的のサンプルを希釈するか、あるいは植物組織からヒアルロナンを抽出するために少量の水しか使用しない）。
【０１８３】
８．ＧＦＡＴの活性の決定
ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性はRachelら（1996, J. Bacteriol. 178 (8), 2320-2327）に記載のように決定する。
【０１８４】
タンパク質がＧＦＡＴ−１またはＧＦＡＴ−２の活性を有するかどうかを識別するために、Huら（2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993）に記載の方法を使用する。
【０１８５】
９．質量分析によるＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の検出
質量分析によってＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を検出するために、一般的方法項目４ａ）の下に記載のように植物組織を精密検査した。可能な限り塩を含まない抽出物を取得するために、それぞれのサンプルを、質量分析による検査前に、まず−２０℃で凍結し、遠心分離（室温で１６ ０００ｘｇ）中に解凍した。測定のために、１：１（容量／容量）の割合のメタノール：水混合物で上清を１：２０希釈した。
【０１８６】
弱いシグナル（ピーク）の検出感度を増加させるために、３種の異なる検出器感度でＭＳスペクトルを記録した。しかし、この事例では検出器の応答はもはや線形ではない。このことは、異なる代謝産物のシグナル強度（ピーク領域）を比較する場合に留意し、考慮すべきであろう。測定値が互いに比較できるよう保証するために、個々のサンプルが同一の検出器設定で同一のシグナル強度（ｃｐｓ単位、毎秒カウント）をもたらすよう保証した。
【０１８７】
異なる代謝産物に割り当てられた、得られたシグナルの領域（ピーク領域）は、六炭糖（ｍ／ｚ＝１７９）のピーク領域と比較して％単位で記載される。異なるサンプルのシグナル強度（ピーク領域）の比を使用して、目的のサンプル中の六炭糖の濃度に対する、対応するＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の濃度比を推測することができる。
【０１８８】
個々のサンプルおよび個々の対応する参照物質（グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン６−リン酸 グルコサミン１−リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン）のＭＳ−ＭＳ測定を並行して実行した。このように、領域の決定に使用されるシグナル（ピーク）が、特定の代謝産物または同一の質量を有する特定の異性体代謝産物によって排他的に生成されたシグナルであるかどうか、または目的のシグナルが、対応する代謝産物または同一の質量を有する対応する特定の異性体代謝産物に部分的にしか割り当てることができないかどうかを評価することが可能である。
【０１８９】
ナノエレクトロスプレー源を内蔵したQ-STAR Pulsar iハイブリッド質量分析計（Applied Biosystems）を使用して、ネガティブモードでＭＳおよびＭＳ−ＭＳスペクトルを記録した。検出されるイオンは、主に、単一電荷を有する脱プロトン化イオンであった。
【０１９０】
測定は以下の条件下で実行した：
質量範囲５０〜７００Ｄａ。
検出器感度：２０００、２０５０および２１００。
【０１９１】
各３種の検出器設定に関して、サンプルが類似のシグナル強度（ｃｐｓ単位、毎秒カウント）を有することを保証した。
【０１９２】
実施例
１．マウス由来のＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の取得
ＧＦＡＴ−１（グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼまたはグルコサミン６−リン酸シンターゼ、EC 2.6.1.16）の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列はBioCat GmbH, Heidelberg, Germanyから購入した（Art. No. MMM1013-65346, ｃＤＮＡクローン MGC:58262, IMAGE:6742987）。これは、I.M.A.G.E.コンソーシアム（http://image.llnl.gov）が生産し、BioCat GmbHが販売しているクローンである。ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡをベクターｐＣＭＶ Ｓｐｏｒｔ ６（Invitrogen）にクローニングした。該プラスミドをＩＣ ３６５−２５６と命名した。Mus musculus由来のＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列は配列番号：４の下に記載されている。
【０１９３】
以後のクローニング工程を容易にするために、Ｘｈｏ ＩおよびＥｃｏ ＲＶを使用してプラスミドＩＣ ３６５−２５６からＧＦＡＴ−１のコード配列を切り取り、プラスミドｐＭＥ９にクローニングした。該プラスミドは同制限酵素でカットされていた。得られたプラスミドをＩＣ ３６７−２５６と命名した。
【０１９４】
プラスミドｐＭＥ９はStratagene製のｐＢｌｕｅＳｋｒｉｐｔベクター（Prod. No. 212207）であり、その場合、上記ｐＢｌｕｅＳｋｒｉｐｔベクターと対照的に、ｐＭＥ９は、改変されたマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含有し、該部位は、ｐＢｌｕｅＳｋｒｉｐｔベクターに存在するＭＣＳに加えて、ＭＣＳの両末端に追加のＰａｃ Ｉ制限部位を有する。
【０１９５】
２．マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の取得
ＧＦＡＴ−２（グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼまたはグルコサミン６−リン酸シンターゼ、EC 2.6.1.16）の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列はInvitrogenから購入した（クローンＩＤ 4167189, ｃＤＮＡクローン MGC:18324, IMAGE:4167189）。これは、I.M.A.G.E.コンソーシアム（http://image.llnl.gov）が生産し、Invitrogenが販売しているクローンである。ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡをベクターｐＣＭＶ Ｓｐｏｒｔ ６（Invitrogen）にクローニングした。該プラスミドをＩＣ ３６９−２５６と命名した。Mus musculus 由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列は配列番号：６の下に記載されている。
【０１９６】
３．大腸菌（Escherichia coli）由来の細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の合成
Entelechon GmbHが合成した、大腸菌由来の細菌ＧＦＡＴ（グルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼまたはグルコサミン６−リン酸シンターゼ、glms、EC 2.6.1.16）の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列をベクターｐＣＲ４Ｔｏｐｏ（Invitrogen）（Prod. No. K4510-20）にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３７３−２５６と命名した。大腸菌由来の細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列は配列番号：１０の下に記載されている。大腸菌から最初に単離された対応する核酸配列は配列番号：８の下に記載されている。
【０１９７】
４．パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子の合成
Medigenomix GmbH（Munich, Germany）が合成した、パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）（Prod. No. K2000-01）にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３２３−２１５と命名した。パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＨＡＳタンパク質をコードする合成核酸配列は配列番号：３の下に記載されている。パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１から最初に単離された対応する核酸配列は配列番号：１の下に記載されている。
【０１９８】
５．パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の合成
Entelechon GmbHが合成した、パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列をベクターｐＣＲ４Ｔｏｐｏ（Invitrogen）（Prod. No. K4510-20）にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３３９−２２２と命名した。パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列は配列番号：１３の下に記載されている。パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１から最初に単離された対応する核酸配列は配列番号：１１の下に記載されている。
【０１９９】
６．植物発現ベクターＩＲ ４７−７１の調製
プラスミドｐＢｉｎＡＲはバイナリーベクタープラスミドｐＢｉｎ１９（Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721）の誘導体であり、以下のように構築した：
カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターのヌクレオチド６９０９〜７４３７を含む５２９ｂｐ断片をプラスミドｐＤＨ５１（Pietrzakら、1986 Nucleic Acids Res. 14, 5858）からＥｃｏＲ Ｉ／Ｋｐｎ Ｉ断片として単離し、ｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏＲ ＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位間にライゲートした。これによりプラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓが得られた。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＰｖｕ ＩＩを活用して、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Gielenら、1984, EMBO Journal 3, 835-846）のＴ−ＤＮＡのオクトピンシンターゼ遺伝子（Ｇｅｎ ３）のポリアデニル化シグナル（３’末端）（ヌクレオチド１１７４９〜１１９３９）を含む１９２ｂｐ断片をプラスミドｐＡＧＶ４０（Herrera-Estrellaら、1983 Nature, 303, 209-213）から単離した。Ｐｖｕ ＩＩ制限部位にＳｐｈ Ｉリンカーを付加した後、ｐＵＣ１８−３５ＳのＳｐｈ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位間に該断片をライゲートした。これによりプラスミドｐＡ７が得られた。このプラスミドから、３５ＳプロモーターおよびＯＣＳターミネーターを含むポリリンカー全体をＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで切り出し、適切にカットされたベクターｐＢｉｎ１９にライゲートした。これにより植物発現ベクターｐＢｉｎＡＲが得られた（HoefgenおよびWillmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）。
【０２００】
ジャガイモ（Solanum tuberosum）由来のパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha-Sosaら、1989, EMBO J. 8, 23-29）をＤｒａ Ｉ断片（ヌクレオチド−１５１２〜＋１４）としてベクターｐＵＣ１９にライゲートした。該ベクターはＳｓｔ Ｉでカットされ、その末端は、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼを活用して平滑末端化されていた。これによりプラスミドｐＵＣ１９−Ｂ３３が得られた。ＥｃｏＲ ＩおよびＳｍａ Ｉを使用して、Ｂ３３プロモーターをこのプラスミドから切り出し、適切にカットされたベクターｐＢｉｎＡＲにライゲートした。これにより植物発現ベクターｐＢｉｎＢ３３が得られた。
【０２０１】
追加のクローニング工程を容易にするために、ＭＣＳ（マルチクローニング部位）を広くした。この目的を達成するために、２種の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、９５℃で５分間加熱し、室温にゆっくり冷却し、得られた二本鎖断片をｐＢｉｎＢ３３のＳａｌ ＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位にクローニングした。その目的のために使用されるオリゴヌクレオチドは以下の配列を有していた：
【０２０２】
【表１】
2009511004.tif 000002
【０２０３】
得られたプラスミドをＩＲ ４７−７１と命名した。
【０２０４】
７．植物発現ベクターｐＢｉｎＡＲＨｙｇの調製
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを使用して、３５Ｓプロモーター、ＯＣＳターミネーターおよびマルチクローニング部位全体を含む断片をプラスミドｐＡ７から切り出し、ベクターｐＢＩＢＨｙｇ（Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203）にクローニングした。該ベクターは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをｐＢｉｎＡＲＨｙｇと命名した。
【０２０５】
８．クローニングベクターＩＣ ３１７−２０４の調製
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを使用してプラスミドＩＲ ４７−７１からＯＣＳターミネーターを含む核酸断片を単離し、ベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（Stratagene製、Prod. No. 212207）にクローニングした。該ベクターは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをＩＣ ３０６−２０４と命名した。
【０２０６】
制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩを使用してプラスミドＩＲ ４７−７１からＢ３３プロモーターを含む核酸断片を単離し、ベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（Stratagene製、Prod. No. 212207）にクローニングした。該ベクターは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをＩＣ ３１４−２０４と命名した。
【０２０７】
ＩＣ ３０６−２０４から、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩを使用してＯＣＳターミネーターを単離し、プラスミドＩＣ ３１４−２０４にクローニングした。該プラスミドは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをＩＣ ３１７−２０４と命名した。
【０２０８】
９．パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１のヒアルロナンシンターゼのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３４１−２２２の調製
ＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉでの制限消化によって、ヒアルロナンシンターゼのコード配列を含む核酸分子をプラスミドＩＣ ３２３−２１５から単離し、プラスミドＩＲ ４７−７１のＢａｍＨ ＩおよびＸｈｏ Ｉ制限部位にクローニングした。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３４１−２２２と命名した。
【０２０９】
１０．パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を含む植物発現ベクター３４９−２２２の調製
ＢａｍＨ ＩおよびＫｐｎ Ｉでの制限消化を使用して、パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸分子をプラスミドＩＣ ３３９−２２２から単離し、プラスミドｐＡ７にクローニングした。該プラスミドは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをＩＣ ３４２−２２２と命名した。
【０２１０】
Ｘｂａ ＩおよびＫｐｎ Ｉでの制限消化によって、パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸分子をプラスミドＩＣ ３４２−２２２から単離し、発現ベクターｐＢｉｎＡＲ Ｈｙｇにクローニングした。該ベクターはＸｂａ ＩおよびＫｐｎ Ｉでカットされていた。得られたプラスミドをＩＣ ３４９−２２２と命名した。
【０２１１】
１１．マウス由来のＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質およびパラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３７６−２７１の調製
Ｅｃｏ ＲＩを使用する制限消化によってＩＣ ３１７−２０４から単離された、Ｂ３３プロモーターおよびＯＣＳターミネーターを含む核酸断片をプラスミドＩＣ ３４９−２２２のＥｃｏ ＲＩ制限部位にクローニングした。ここに、ヘッドトゥヘッド配向（head-to-head orientation）のプロモーター（２５ＳおよびＢ３３）が確保された。得られたベクターをＩＣ ３５４−２２２と命名した。
【０２１２】
マウス由来のＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む植物発現ベクターを取得するために、マウス由来のＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質のコード配列をＸｈｏ ＩおよびＥｃｏ ＲＶでの制限消化によってＩＣ ３６５−２５６から単離し、プラスミドＩＣ ３５４−２２２にクローニングした。該プラスミドはＸｈｏ ＩおよびＥｃｌ １３６ ＩＩでカットされていた。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３７６−２５６と命名した。
【０２１３】
１２．マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質およびパラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３７２−２５６の調製
マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸断片をＩＣ ３６９−２５６からＸｈｏ ＩおよびＥｃｏ ＲＶでの制限消化によって単離し、プラスミドＩＣ ３５４−２２２にクローニングした。該プラスミドはＸｈｏ ＩおよびＥｃｌ １３６ ＩＩでカットされていた。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３７２−２５６と命名した。
【０２１４】
１３．大腸菌由来のＧＦＡＴの活性を有するタンパク質およびパラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を含む植物発現ベクター３７５−２７１の調製
大腸菌由来のＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸断片をＩＣ ３７３−２５６からＸｈｏ ＩおよびＥｃｏ ＲＶでの制限消化によって単離し、プラスミドＩＣ ３５４−２２２にクローニングした。該プラスミドはＸｈｏ ＩおよびＥｃｌ １３６ ＩＩでカットされていた。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３７５−２７１と命名した。
【０２１５】
１４．大腸菌由来のＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３９８−３１１の調製
Ｅｃｌ １３６ ＩおよびＸｈｏ Ｉでの制限消化によって、大腸菌由来の細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のコード配列をプラスミドＩＣ ３７３−２５６から単離し、ベクターｐＢｉｎＡＲ ＨｙｇのＳｍａ ＩおよびＳａｌ Ｉ制限部位にライゲートした。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３９８−３１１と命名した。
【０２１６】
１５．植物発現ベクターＩＣ ３８６−２９９の調製
コメ（Oryza sativa, 品種M202）の葉から単離されたゲノムＤＮＡを使用し、ＤＮＡポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR Systems, Roche Prod. No.: 1732641）を使用するＰＣＲによって、コメ由来のプロラミンプロモーターのＤＮＡ（EMBL アクセッションNO D63901, Shaら、1996, Biosci. Biotech. Biochem. 60, 335-337, Wuら、1998. Plant Cell Physiol. 39(8), 885-889）を単離した。このＰＣＲ反応から得られたアンプリコンを、ＴＡクローニングキット（Invitrogen Prod. No.: KNM2040-01）を使用してベクターｐＣＲ２．１にクローニングした。得られたプラスミドをＭＩ ４−１５４と命名した。
【０２１７】
プロラミンプロモーターをコードするＤＮＡの増幅に使用された条件：
製造元が指定する条件およびバッファーならびに５０ngのトータルＤＮＡを使用した。
０．８３μM ｄＮＴＰミックス
０．２５μM プライマーｐｒｏｌ−Ｆ１
【０２１８】
【表２】
2009511004.tif 000003
【０２１９】
０．２５μM プライマーｐｒｏｌ−Ｒ１
【０２２０】
【表３】
2009511004.tif 000004
【０２２１】
反応条件：
工程１ ９４℃ １５秒
工程２ ６０℃ １５秒
工程３ ７２℃ ４５秒
【０２２２】
まず、３５反復（サイクル）を使用して工程１〜３に記載の反応を実行した。反応が終了した後、反応混合物を４℃に冷却した。次いで、ＴＡクローニングキット（Invitrogen Prod. No.: KNM2040-01）を使用した、ベクターｐＣＲ２．１へのクローニングを、製造元が指定する条件にしたがって実行した。コメ由来のプロラミンプロモーターを含むプラスミドをＭＩ ４−１５４と命名した。
【０２２３】
マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸断片を、プラスミドＩＣ ３６９−２５６から制限酵素Ｎｏｔ ＩおよびＫｐｎ Ｉを使用する制限消化によって単離し、ベクターｐＭＣＳ５（MoBiTecから購入）にクローニングした。該ベクターはＮｏｔ ＩおよびＫｐｎ Ｉで消化されていた。得られたプラスミドをＩＣ ３８５−２９９と命名した。次の工程で、マウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸断片を、ＩＣ ３８５−２９９から制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＨｐａ Ｉでの制限消化によって単離し、プラスミドＭＩ ９−１５４にクローニングした。該プラスミドはＸｈｏ ＩおよびＥｃｌ １３６ ＩＩでカットされていた。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３８６−２９９と命名した。ベクターＭＩ ９−１５４を調製するための出発ベクターはプラスミドＭＬ １８−５６である（WO 05/030941）。２オリゴヌクレオチドによって合成された、適切な粘着末端を有し、制限部位Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｂｌｎ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｈｐａ Ｉ、Ｓｐｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを含むＭＣＳをプラスミドＭＬ １８−５６に導入した。該プラスミドはＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＰｓｔ Ｉで消化されていた。得られたベクターをＭＩ ８−１５４と命名した。
【０２２４】
Ｅｃｏ ＲＶおよびＳｐｅ Ｉでの消化によって、ＭＩ ４−１５４からプロラミンプロモーターを単離し、ベクターＭＩ ８−１５４にライゲートした。該ベクターはＨｐａ ＩおよびＳｐｅ Ｉで消化されていた。得られたベクターをＭＩ ９−１５４と命名した。
【０２２５】
１６．細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むジャガイモ植物
ａ）ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物（品種Desiree）を、一般的方法項目１に記載の方法によって、植物発現ベクターＩＣ ３９８−３１１を使用して形質転換した。該ベクターは大腸菌由来の細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質のコード核酸配列をジャガイモ（Solanum tuberosum）由来のパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha-Sosaら、1989, EMBO J. 8, 23-29）のコントロール下に含む。プラスミドＩＣ ３９８−３１１で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を４３２ ＥＳと命名した。
【０２２６】
ｂ）系統４３２ ＥＳの分析
温室で６cm鉢の土壌中で系統４３２ ＥＳの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約０．３g〜０．８gの葉材料を一般的方法項目４の下に記載の方法にしたがって精密検査し、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する個々の植物に関して、以下の結果が得られた：
【０２２７】
【表４】
2009511004.tif 000005
【０２２８】
表１：系統４３２ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉で測定されたＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量（新鮮重量１グラムあたりのμmol単位）。カラム１は、各事例で、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。
【０２２９】
これらの結果は、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物が、相応に形質転換されていない野生型植物より、かなり高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することを示す。
【０２３０】
１７．ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むコメ植物
ａ）コメ植物の形質転換
一般的方法項目３の下に記載の方法にしたがって、植物発現ベクターＩＣ ３８６−２９９でコメ植物（変種M202）を形質転換した。該ベクターはマウス由来のＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質のコード核酸配列を１３ｋＤａプロラミンポリペプチドのプロモーターのコントロール下に含む。プラスミドＩＣ ３８６−２９９で形質転換されて得られたトランスジェニック系統をＧＡＯＳ０７８８と命名した。
【０２３１】
ｂ）系統ＧＡＯＳ０７８８の分析
プラスミドＩＣ ３８６−２９９での形質転換に由来する、系統ＧＡＯＳ０７８８の独立した植物を温室の土壌中で栽培した。各植物から、約２０〜２５個の成熟種子（穀粒）を回収し、殻むき器（dehusker）（Laboratory Paddy sheller, Grainman, Miami, Florida, USA）で殻を除去し、各系統の約７個の褐色コメ種子（プール）を実験室の振動ボールミル（MM200（Retsch, Germany）、３０Ｈｚで３０秒間）で細かく砕き、穀粉を得た。そして、一般的方法項目４の下に記載の方法を使用して、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する個々の植物に関して、以下の結果が得られた：
【０２３２】
【表５】
2009511004.tif 000006
【０２３３】
表２：系統ＧＡＯＳ０７８８の独立したトランスジェニック植物の成熟種子のプールで測定されたＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量（新鮮重量１グラムあたりのμmol単位）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した。ここに、「コントロール」とは、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を有さないプラスミドで形質転換された植物を表す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２３４】
ｃ）植物ＧＡＯＳ０７８８−０２４０１およびＧＡＯＳ０７８８−００５０１の個々の種子の分析
実施例ｂ）で回収された種子は、形質転換後に直接得られた植物に由来し、ゆえに該植物は、目的のＴ−ＤＮＡのそれぞれの組み込み部位に関して異型接合性であった。したがって、メンデルの法則の遺伝の結果、分析された種子プールは、種々の量の目的のＴ−ＤＮＡを含む種子を含有した。形質転換によって組み込まれたＴ−ＤＮＡを全く有さない個々の種子がそれぞれのプールに存在する可能性もあった。ゆえに、系統ＧＡＯＳ０７８８−０２４０１の植物および系統ＧＡＯＳ０７８８−００５０１の植物由来の、単一の、個々の褐色種子を、それらのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量に関して、一般的方法項目４の下に記載の方法によってそれぞれ調査した。以下の結果を得た：
【０２３５】
【表６】
2009511004.tif 000007
【０２３６】
表３：系統ＧＡＯＳ０７８８−０２４０１およびＧＡＯＳ０７８８−００５０１由来の植物の個々の種子のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量（新鮮重量１グラムあたりのμmol単位）。各事例で、カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から個々の種子を回収し、分析した（ここに、「コントロール」とは、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含まない構築物で形質転換された植物の種子を表す）。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２３７】
得られた結果は、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を有するコメ植物の種子（穀粒）由来の穀粉が、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を有さない植物から生産された穀粉と比較して、かなり高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することを示す。
【０２３８】
１８．ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の種々のアイソフォームをコードする核酸分子で形質転換されたトマト植物におけるＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の合成
ａ）ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含むトマト植物の生産
一般的方法項目２の下に記載の方法によって、植物発現ベクターＩＣ ３７６−２７１でトマト植物（品種Moneymaker）を形質転換した。該ベクターは、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列およびＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む。プラスミド３７６−２７１で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を４２０ ＥＳと命名した。ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−グルコースからのＵＤＰ−ＧｌｃＡの合成を触媒する。ＧｌｃＮＡｃに加えて、いくつかのグルコサミノグリカンシンターゼ、例えばヒアルロナンシンターゼは基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＡを必要とする。
【０２３９】
ｂ）系統４２０ ＥＳの分析
温室で鉢の水栽培（hydroculture）中で系統４２０ ＥＳの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約５gの植物材料を一般的方法項目４の下に記載の方法を使用して精密検査し、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここに、植物ごとに、各精密検査サンプルに関して複数の独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た：
【０２４０】
【表７】
2009511004.tif 000008
2009511004.tif 000009
【０２４１】
表４：系統４２０ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉で測定されたＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量（新鮮重量１グラムあたりのμmol単位）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。ａ、ｂまたはｃによる植物の名称の拡張部分は、目的の精密検査サンプルに関して実行された独立した測定を示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２４２】
これらの結果は、ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物が、対応する形質転換されていない野生型植物より、わずかに高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することを示す。
【０２４３】
ｃ）ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含むトマト植物の生産
一般的方法項目２の下に記載の方法によって、植物発現ベクターＩＣ ３７２−２５６でトマト植物（品種Moneymaker）を形質転換した。該ベクターは、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列およびＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む。プラスミドＩＣ ３７２−２５６で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を４２１ ＥＳと命名した。
【０２４４】
ｄ）系統４２１ ＥＳの分析
温室で鉢の水栽培中で系統４２１ ＥＳの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約５gの植物材料を一般的方法項目４の下に記載の方法を使用して精密検査し、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここに、植物ごとに、各精密検査サンプルに関して複数の独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た：
【０２４５】
【表８】
2009511004.tif 000010
2009511004.tif 000011
【０２４６】
表５：系統４２１ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉で測定されたＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量（新鮮重量１グラムあたりのμmol単位）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。ａ、ｂまたはｃによる植物の名称の拡張部分は、目的の精密検査サンプルに関して実行された独立した測定を示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２４７】
これらの結果は、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物が、対応して形質転換されていない野生型植物より、かなり高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することを示す。
【０２４８】
ｅ）細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含むトマト植物の生産
一般的方法項目２の下に記載の方法によって、植物発現ベクターＩＣ ３７５−２７１でトマト植物（品種Moneymaker）を形質転換した。該ベクターは、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列および細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む。プラスミドＩＣ ３７５−２７１で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を４２２ ＥＳと命名した。
【０２４９】
ｆ）系統４２２ ＥＳの分析
温室で鉢の水栽培中で系統４２２ ＥＳの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約５gの植物材料を一般的方法項目４の下に記載の方法を使用して精密検査し、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここに、植物ごとに、各精密検査サンプルに関して複数の独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た：
【０２５０】
【表９】
2009511004.tif 000012
2009511004.tif 000013
【０２５１】
表６：系統４２２ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉で測定されたＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量（新鮮重量１グラムあたりのμmol単位）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。ａ、ｂまたはｃによる植物の名称の拡張部分は、目的の精密検査サンプルに関して実行された独立した測定を示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２５２】
ｇ）系統４２０ ＥＳ、４２１ ＥＳおよび４２２ ＥＳの果実の分析
系統４２０ ＥＳ、４２１ ＥＳおよび４２２ ＥＳの選択植物から成熟果実を回収した。個々の植物の種々のホールトマト果実を回収し、一般的方法項目４の下に記載の方法を使用して精密検査し、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここで、植物の異なる果実に関して独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た：
【０２５３】
【表１０】
2009511004.tif 000014
2009511004.tif 000015
2009511004.tif 000016
【０２５４】
表７：系統４２０ ＥＳ、４２１ ＥＳおよび４２２ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の果実で測定されたＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の量（新鮮重量１グラムあたりのμmol単位）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。ラテン数字による植物の名称の拡張部分は目的の植物の異なる果実を示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２５５】
これらの結果は、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物が、対応して形質転換されていない野生型植物より、かなり高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することを示す。ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物と比較して、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物はさらに高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有する。このことは、目的の植物の葉材料および果実の両者にあてはまる。
【０２５６】
ｈ）質量分析による系統４２２ ＥＳのＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の分析
名称４２２ ＥＳ １３を有する植物の個々の異なる果実の抽出物を、一般的方法項目９の下に記載の方法にしたがって質量分析によって、Ｎ−アセチル化グルコサミン誘導体の存在に関して調査した。以下の結果を得た：
【０２５７】
【表１１】
2009511004.tif 000017
【０２５８】
表８：植物４２２ ＥＳ １３の果実中の代謝産物グルコサミン（ＧｌｃＮ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコサミンリン酸（ＧｌｃＮ−Ｐ）、Ｎ−アセチルグルコサミンリン酸（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ）およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）の質量分析による検出。質量スペクトル中の指定代謝産物に関して得られたシグナル強度（ピーク領域）の割合が示されている。該割合は、同一の測定で得られた六炭糖（ｍ／ｚ＝１７９）のシグナル強度（パーセント単位）に基づく。感度（「ｄ．ｖ．」）およびシグナル強度（「ｃｐｓ」）に関する指定の検出器設定（カラム１）で異なる測定を実行した。カラム２は、形質転換から独立して得られた植物を示し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。ラテン数字による植物の名称の拡張部分は目的の植物の異なる果実を示す。
【０２５９】
並行して、参照物質（グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylgucosamine）、グルコサミン６−リン酸、グルコサミン１−リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸（N-acetylgucosamine 6-phosphate）、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン）を使用するサンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉおよび野生型植物（ｗｔ）の果実のＭＳ−ＭＳ測定によって、ＭＳスペクトルの目的の検出シグナル強度（ピーク領域）が、対応する代謝産物または同質量の対応する異性体代謝産物の存在に現実に起因するかどうか、またはＭＳスペクトルの目的のシグナル強度が他の物質のシグナルによる干渉に起因する可能性があるかどうかを分析した。以下の観察を行った：
【０２６０】
グルコサミン（ＧｌｃＮ，ｍ／ｚ＝１７８）：サンプル４２２ ＥＳ １３ ＩおよびｗｔのＭＳスペクトル中で検出されたＧｌｃＮの最高量は検出下限の範囲内であった。該ＭＳスペクトルでは、サンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉおよびｗｔサンプル間の有意差は認められなかった。したがって、いかなる確信の程度においても、サンプルがＧｌｃＮを含有するかどうかを決定することはできなかった。
【０２６１】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ，ｍ／ｚ＝２２０）：サンプル４２２ ＥＳ １３およびｗｔサンプルのＭＳスペクトルにおいて最高の有意差がこの代謝産物に関して見出された。サンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉ、４２２ ＥＳ １３ ＩＩおよび４２２ ＥＳ １３ ＩＩＩのＭＳスペクトルでは、かなりの量のＧｌｃＮＡｃが検出された。サンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉの対応するＭＳ−ＭＳスペクトルは、参照物質（Ｎ−アセチルグルコサミン）のスペクトルと一致し、ＭＳスペクトル中の関連シグナルを妨げる物質を、たとえ有するとしても、非常に少量しか有さない。対照的に、ｗｔサンプルのＭＳスペクトルでは、ｍ／ｚ＝２２０に関するシグナル強度は非常に低かった。ｗｔサンプルのＭＳ−ＭＳスペクトルは、ＧｌｃＮＡｃが、仮にあったとしても、微量しか存在しないことを示した。該ＭＳ−ＭＳスペクトルは、ＭＳスペクトル中のｍ／ｚ＝２２０のｗｔサンプルに関して決定されたシグナル強度が、主に、該シグナルを妨げる他の物質の影響であることを非常に明瞭に示した。
【０２６２】
グルコサミンリン酸（ＧｌｃＮ−Ｐ，ｍ／ｚ＝２５８）：ｗｔサンプルに関するＭＳスペクトルのシグナル強度は、サンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉ、４２２ ＥＳ １３ ＩＩおよび４２２ ＥＳ １３ ＩＩＩよりかなり低い。ＭＳ−ＭＳによって測定されたすべてのサンプルは、ｍ／ｚ＝２５８に関するシグナルがＧｌｃＮ−Ｐの存在に起因するだけでなく、他の物質によるシグナルの干渉にも起因することを示す。ｗｔサンプルのＭＳ−ＭＳスペクトルは、たとえ存在したとしても、微量のＧｌｃＮ−Ｐしか存在しないことを示した。対照的に、ＭＳ−ＭＳスペクトル中のサンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉの対応するシグナルは、ＭＳスペクトルの関連シグナル中にかなりの量のＧｌｃＮ−Ｐが存在することを示した。
【０２６３】
Ｎ−アセチルグルコサミンリン酸（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ，ｍ／ｚ＝３００）：ｗｔサンプルに関して、ＭＳスペクトル中のｍ／ｚ＝３００に関するシグナル強度は、サンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉ、４２２ ＥＳ １３ ＩＩおよび４２２ ＥＳ １３ ＩＩＩより実質的に低い。ｗｔサンプルに関するＭＳ−ＭＳによって決定された値は、たとえ存在したとしても、微量のＧｌｃＮＡｃ−Ｐしか存在しないことを示す。対照的に、サンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉに関して、このサンプルのＭＳスペクトル中のｍ／ｚ＝３００に関して決定されたシグナル強度の主要部分がＧｌｃＮＡｃ−Ｐに起因することを、ＭＳ−ＭＳ測定によって実証することが可能であった。
【０２６４】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，ｍ／ｚ＝３０２．５）：野生型では、ＭＳスペクトルのシグナル強度はサンプル４２２ ＥＳ １３ Ｉ、４２２ ＥＳ ＩＩおよび４２２ ＥＳ ＩＩＩよりかなり低い。対応するＭＳ−ＭＳスペクトルは、すべてのサンプル中で、ＭＳスペクトルのシグナル強度の特定部分がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの存在に起因するだけでなく、他の物質によるシグナル干渉にも起因することを示す。しかし、ＭＳ−ＭＳ測定は、シグナル干渉物質と比較して、サンプル４２２ ＥＳ １３ ＩのＭＳスペクトル中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの割合がｗｔサンプルより実質的に高いことを示した。
【０２６５】
１９．グルコサミノグリカンを合成する植物の生産
増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する植物が、増加したグルコサミノグリカン含量を有する植物を生産するために好適であるかどうかを決定するために、まず、グルコサミノグリカンシンターゼ（ヒアルロナンシンターゼ）を発現する植物を作製した。
【０２６６】
ａ）ヒアルロナンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む植物
それぞれ一般的方法項目１（ジャガイモ植物）および一般的方法項目２（トマト植物）の下に記載の方法を使用し、植物発現ベクターＩＣ ３４１−２２２で、ジャガイモ植物（品種Desiree）およびトマト植物（品種Moneymaker）を形質転換した。該ベクターは、パラメシウム  ブルサリアクロレラウイルス１由来のヒアルロナンシンターゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を、Solanum tuberosum由来のパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha-Sosaら、1989, EMBO J. 8, 23-29）のコントロール下に含む。プラスミドＩＣ ３４１−２２２で形質転換されて得られたトランスジェニック系統をそれぞれ３６５ ＥＳ（ジャガイモ植物）および３６７ ＥＳ（トマト植物）と命名した。
【０２６７】
ｂ）系統３６５ ＥＳの分析
温室で６cm鉢の土壌中で系統３６５ ＥＳの個々の植物を栽培した。各事例で、一般的方法項目５の下に記載の方法を使用して個々の植物のジャガイモ塊茎の約０．３gの材料を精密検査した。一般的方法項目７の下に記載の方法を使用して、それぞれの植物抽出物中に存在するヒアルロナンの量を決定した。ここで、遠心分離後に得られた上清を１：１０希釈して、ヒアルロナン含量を決定した。選択植物に関して以下の結果を得た：
【０２６８】
【表１２】
2009511004.tif 000018
【０２６９】
表９：系統３６５ ＥＳの独立した選択トランスジェニック植物によって生産されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位）。カラム１は、塊茎材料の回収元である植物を表す（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。カラム２は、目的の植物の葉で測定されたヒアルロナンの量に関する値を示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２７０】
ｃ）系統３６７ ＥＳの植物の分析
温室で土壌中で栽培された系統３６７ ＥＳの異なる選択トマト植物から、各事例で１葉を回収し、液体窒素中で凍結した。さらなる精密検査およびヒアルロナン含量の決定は、ジャガイモ植物の塊茎に関して実施例１９ｂ）に記載のように実行した。以下の結果を得た：
【０２７１】
【表１３】
2009511004.tif 000019
【０２７２】
表１０：系統３６７ ＥＳの独立した選択トランスジェニック植物の葉で生産されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位）。カラム１は、葉材料の回収元である植物を表す（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。カラム２は、目的の植物の葉で測定されたヒアルロナンの量についての値を示す。
【０２７３】
２０．ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子およびグルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む植物
いくつかのグルコサミノグリカンシンターゼ（例えばヒアルロナンシンターゼ）は基質としてＮ−アセチル化グルコサミン誘導体およびＵＤＰ−ＧｌｃＡを必要とする。したがって、発明者らは、まず、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質の増加した活性およびヒアルロナンシンターゼの活性を有するタンパク質の増加した活性を有する植物を作製した。
【０２７４】
ａ）ジャガイモ植物の生産
一般的方法項目１の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターＩＣ ３４９−２２２で、系統３６５ ＥＳ ７４のジャガイモ植物（実施例１９ｂ）を参照されたい）を形質転換した。該ベクターは、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を３５Ｓプロモーターのコントロール下に含む。プラスミドＩＣ ３４９−２２２で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を４２３ ＥＳと命名した。
【０２７５】
ｂ）系統４２３ ＥＳの植物の分析
温室で６cm鉢の土壌中で系統４２３ ＥＳの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約０．３g〜０．８gの葉材料を一般的方法項目５の下に記載の方法を使用して精密検査し、一般的方法項目７の下に記載の方法を使用してヒアルロナンの含量を決定した。増加したＮ−アセチルグルコサミン誘導体含量を有する個々の植物に関して、以下の結果を得た：
【０２７６】
【表１４】
2009511004.tif 000020
【０２７７】
表１１：系統４２３ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉で測定されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位）。カラム１は、各事例で、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ １」〜「ｗｔ １０」とは、独立した形質転換されていない植物を表す）。比較のために、形質転換の出発系統として使用された系統３６５ ＥＳの植物の１０種の異なる子孫（３６５ ＥＳ−１〜３６５ ＥＳ−１０）に関する値を示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２７８】
該結果から、ＵＤＰ−グルコース−デヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子およびヒアルロナンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む植物が、ヒアルロナンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子しか有さない植物と比較して、静的に有意な増加量のヒアルロナンを全く合成しないことがわかる。
【０２７９】
２１．増加量のグルコサミノグリカンを合成する植物
ａ）増加量のグルコサミノグリカンを合成するトマト植物の生産
一般的方法項目２の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターＩＣ ３７２−２５６またはＩＣ ３７５−２７１で、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子を有する系統３６７ ＥＳ ２５のトマト植物（実施例１９ｃ）を参照されたい）を再び形質転換した。該ベクターは、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする核酸分子を含む。
【０２８０】
系統３６７ ＥＳ ２５をプラスミドＩＣ ３７２−２５６（ＧＦＡＴ−２）で形質転換した後に得られたトランスジェニックトマト植物を３９９ ＥＳと命名した。
【０２８１】
系統３６７ ＥＳ ２５をプラスミドＩＣ ３７５−２７１（細菌ＧＦＡＴ）で形質転換した後に得られたトランスジェニックトマト植物を４０５ ＥＳと命名した。
【０２８２】
ｂ）系統３９９ ＥＳおよび４０５ ＥＳの分析
温室で土壌中で栽培された系統３９９ ＥＳおよび４０５ ＥＳの異なるトマト植物から成熟果実を回収し、一般的方法項目７の下に記載のようにヒアルロナン含量を決定した。以下の結果を得た：
【０２８３】
【表１５】
2009511004.tif 000021
【０２８４】
表１２：系統３９９ ＥＳおよび４０５ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の果実で測定されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位の「ＨＡ」）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。比較のために、形質転換の出発系統として使用された系統３６７ ＥＳの植物の異なる子孫についての値を示す。ラテン数字による植物の名称の拡張部分は目的の植物の異なる果実を示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２８５】
これらの結果は、グルコサミノグリカンシンターゼをコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードし、かつＧＦＡＴ−２または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物が、グルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子のみを有する植物より、かなり多量のグルコサミノグリカンを合成することを示す。
【０２８６】
ｃ）増加量のグルコサミノグリカンを合成するジャガイモ植物の生産
一般的方法項目１の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターＩＣ ３７６−２７１、ＩＣ ３７２−２５６またはＩＣ ３７５−２７１で、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子を含む系統３６５ ＥＳ ７４のジャガイモ植物（実施例１９ｂ）を参照されたい）を再び形質転換した。該ベクターは、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする核酸分子を含む。
【０２８７】
系統３６５ ＥＳ ７４をプラスミドＩＣ ３７６−２７１（ＧＦＡＴ−１）で形質転換した後に得られたトランスジェニックジャガイモ植物を４０９ ＥＳと命名した。
【０２８８】
系統３６５ ＥＳ ７４をプラスミドＩＣ ３７２−２５６（ＧＦＡＴ−２）で形質転換した後に得られたトランスジェニックジャガイモ植物を３９６ ＥＳと命名した。
【０２８９】
系統３６５ ＥＳ ７４をプラスミドＩＣ ３７５−２７１（細菌ＧＦＡＴ）で形質転換した後に得られたトランスジェニックジャガイモ植物を４０４ ＥＳと命名した。
【０２９０】
ｄ）系統３９６ ＥＳ、４０４ ＥＳおよび４０９ ＥＳの分析
温室で土壌中で栽培された系統３９６ ＥＳ（ＧＦＡＴ−２）、４０４ ＥＳ（細菌ＧＦＡＴ）および４０９ ＥＳ（ＧＦＡＴ−１）の異なるジャガイモ植物から葉および／または塊茎材料を回収し、一般的方法項目７の下に記載のようにヒアルロナン含量を決定した。系統４０９ ＥＳの植物に関して以下の結果を得た：
【０２９１】
【表１６】
2009511004.tif 000022
【０２９２】
表１３：系統４０９ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉および塊茎で測定されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位の「ＨＡ」）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。形質転換の出発系統として使用された系統３６５ ＥＳ ７４の植物の異なる子孫に関する値を比較のために示す。検出不可能な量は「ｎ．ｄ．」と示される。
【０２９３】
系統３９６ ＥＳの植物に関して以下の結果を得た：
【０２９４】
【表１７】
2009511004.tif 000023
【０２９５】
表１４：系統３９６ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉および塊茎で測定されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位の「ＨＡ」）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。形質転換の出発系統として使用された系統３６５ ＥＳ ７４の植物の異なる子孫に関する値を比較のために示す。
【０２９６】
４０４ ＥＳの植物に関して以下の結果を得た：
【０２９７】
【表１８】
2009511004.tif 000024
【０２９８】
表１５：系統４０４ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉で測定されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。形質転換の出発系統として使用された系統３６５ ＥＳ ７４の植物の異なる子孫に関する値を比較のために示す。
【０２９９】
これらの結果は、グルコサミノグリカンシンターゼをコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードし、かつＧＦＡＴ−２または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物が、グルコサミノグリカンシンターゼをコードし、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードし、かつＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物より、かなり多量のグルコサミノグリカンを合成することを示す。
【０３００】
ｅ）ヒアルロナンシンターゼおよび細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物の生産
一般的方法項目１の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターＩＣ ３９８−３１１で、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子を含む系統３６５ ＥＳ ７４のジャガイモ植物（実施例１９ｂ）を参照されたい）を再び形質転換した。該ベクターは、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む。この形質転換から得られた系統を４３３ ＥＳと命名した。
【０３０１】
ｆ）系統４３３ ＥＳの分析
温室で土壌中で栽培された系統４３３ ＥＳの異なるジャガイモ植物から葉および／または塊茎材料を回収し、一般的方法項目７の下に記載のようにヒアルロナン含量を決定した。系統４３３ ＥＳの植物に関して以下の結果を得た：
【０３０２】
【表１９】
2009511004.tif 000025
【０３０３】
表１６：系統４３３ ＥＳの独立したトランスジェニック植物の葉および塊茎で測定されたヒアルロナンの量（新鮮重量１グラムあたりのμg単位の「ＨＡ」）。カラム１は、形質転換から独立して得られた植物を表し、該植物から材料を回収した（ここに、「ｗｔ」とは、形質転換されていない植物を表す）。形質転換の出発系統として使用された系統３６５ ＥＳ ７４の植物の異なる子孫に関する値を比較のために示す。系統３６５ ＥＳ ７４に関する値は表１４の値と一致する。その理由は、すべての植物を温室で同時に栽培したからである。
【０３０４】
これらの結果は、グルコサミノグリカンシンターゼをコードし、かつ細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物が、グルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子のみを有する植物より、かなり多量のグルコサミノグリカンを合成することを示す。
【０３０５】
２２．結果の概要
実施例１６の結果は、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む植物が、形質転換されていない野生型植物と比較して、かなり増加したＮ−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有することを示す。
【０３０６】
実施例１７の結果は、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む植物が、形質転換されていない野生型植物より、かなり高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することを示す。
【０３０７】
実施例１８に記載のすべての形質転換植物は、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする核酸分子に加えて、各事例で、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする同一の核酸分子を有する。したがって、実施例１８に記載の形質転換植物の本質的な差異は、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする異なる外来性核酸分子である。実施例１８ｂ）は、ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物中のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量が、形質転換されていない植物と比較して、わずかに増加したことを示す。
【０３０８】
さらにまた、実施例１８ｄ）から、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物が、形質転換されていない野生型植物より、かなり高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することがわかる。ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物中のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体の含量もまた、ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物より、かなり高い。
【０３０９】
さらにまた、実施例１８ｆ）およびｇ）から、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物が、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物より、さらに高含量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体を有することがわかる。
【０３１０】
実施例２１ｆ）の結果は、グルコサミノグリカンシンターゼをコードし、かつ細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物が、グルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子のみを有する植物より、かなり多量のグルコサミノグリカンを合成することを示す。
【０３１１】
ゆえに、植物で合成されたグルコサミノグリカンの量が、グルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子に加えて、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子をさらに含む植物を作製することによってかなり増加しうることを結論することができる。
【０３１２】
実施例２１ｂ）およびｄ）に結果が示されるすべての形質転換植物は、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする核酸分子に加えて、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子およびグルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子をさらに有する。実施例２１ｂ）およびｄ）に結果が示される形質転換植物間の本質的な差異は、したがって、ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする異なる核酸分子に存する。
【０３１３】
実施例２１ｂ）に示される結果は、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物中のグルコサミノグリカンの含量が、グルコサミノグリカンシンターゼの活性のみを有する植物と比較して、かなり増加することを示す。
【０３１４】
実施例２１ｄ）に示される結果は、ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物が、グルコサミノグリカンシンターゼの活性のみを有する植物より、わずかに多い量のグルコサミノグリカンを含有することを示す。対照的に、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物中のグルコサミノグリカンの含量は、ＧＦＡＴ−１の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物より、かなり高い。さらにまた、実施例２１ｄ）から、細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む個々の植物が、ＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有する植物より、さらに多量のグルコサミノグリカンを含有することがわかる。
【０３１５】
実施例２０ｂ）の結果は、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子およびグルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む植物が、グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子のみを含む植物と比較して、統計学的に有意な増加量のグルコサミノグリカンを有さないことを示す。
【０３１６】
結論として、記載の結果は、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードし、かつグルコサミノグリカンシンターゼの活性を有し、かつＧＦＡＴ−２の活性を有するか、または細菌ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む植物中のグルコサミノグリカンの量のかなりの増加が、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有する外来性核酸分子の存在に起因せず、ＧＦＡＴ−２の活性を有するか、または細菌ＧＦＡＴの活性を有する核酸分子の存在に起因することを示す。
【０３１７】
典型的な様式で、グルコサミノグリカンシンターゼの活性を有するタンパク質として使用されたヒアルロナンシンターゼは、基質として、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−ＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＡの両者を必要とするため、記載の結果から、増加量のヒアルロナン（グルコサミノグリカン）がこれらの植物中の増加量のＮ−アセチル化グルコサミン誘導体に起因し、増加量のＵＤＰ−ＧｌｃＡに起因しないことを結論することもできる。
【配列表】
2009511004000001.app
【国際調査報告】
2009511004.tif 000026
2009511004.tif 000027
2009511004.tif 000028