(57)【要約】  本発明は、特定のリパーゼ変異体および布帛色調剤を含む組成物、並びにかかる組成物を調製および使用する方法に関するものである。かかる組成物を特定の場所の洗浄および／または処理に使用することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
布帛色調剤および親リパーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、前記親と比較した場合、少なくとも合わせて３個の置換を含んでおり、前記置換が、
ａ）領域Ｉ内の少なくとも２つの置換、
ｂ）領域ＩＩ内の少なくとも１つの置換、
ｃ）領域ＩＩＩ内の少なくとも１つの置換、および／または
ｄ）領域ＩＶ内の少なくとも１つの置換
の置換群の１つ以上から選択される、組成物。
【請求項２】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの領域Ｉ内の前記少なくとも２つの置換が、２３１位および２３３位に相当する位置の置換を含むことを特徴とする、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項３】
前記リパーゼがさらに、２３１位および２３３位に相当する位置の前記親リパーゼのアミノ酸が、Ｒで置換されていることを特徴とする、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項４】
前記変異体が、配列番号２の４位に相当する位置の置換を含む、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項５】
配列番号２の４位に相当する位置の前記置換が、Ｖである、請求項４に記載の洗剤組成物。
【請求項６】
前記変異体が、配列番号２の２２７位に相当する位置の置換を含む、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項７】
配列番号２の２２７位に相当する位置の前記置換が、Ｇである、請求項６に記載の洗剤組成物。
【請求項８】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの前記領域ＩＩ内の少なくとも１つの置換が、２０２位、２１１位、２５５位、および２５６位に相当する位置の置換からなる群から選択される置換を含むことを特徴とする、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項９】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの前記少なくとも１つの置換が、Ｘ２０２Ｇ、Ｘ２１１Ｌ、Ｘ２５５Ｙ／Ｖ、およびＸ２５６Ｋからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
前記領域ＩＩ内の少なくとも１つの置換が、２１０位に相当する位置の置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１１】
２１０位に相当する位置が、Ｘ２１０Ｋを含む、請求項１０に記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの前記領域ＩＩＩ内の少なくとも１つの置換が、８６位および９０位に相当する位置の置換からなる群から選択される置換を含むことを特徴とする、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１３】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの前記少なくとも１つの置換が、Ｘ８６ＶおよびＸ９０Ａ／Ｒからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
前記領域ＩＩＩ内の少なくとも１つの置換が、８３位に相当する位置の置換を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
８３位に相当する位置が、Ｘ８３Ｔを含む、請求項１４に記載の洗剤組成物。
【請求項１６】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの領域ＩＶの前記少なくとも１つの置換が、２７位、５８位、および６０位に相当する位置の置換からなる群から選択される置換を含むことを特徴とする、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１７】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの前記少なくとも１つの置換が、Ｘ２７Ｒ、Ｘ５８Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｐ／Ｔ、およびＸ６０Ｓ／Ｖ／Ｇ／Ｎ／Ｒ／Ｋ／Ａ／Ｌからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の洗剤組成物。
【請求項１８】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼがさらに、前記規定領域Ｉ〜ＩＶの外側に少なくとも１つの置換を含むことを特徴とする、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項１９】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの前記少なくとも１つの置換が、８１位、１４７位、１５０位、および２４９位に相当する位置の置換からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の洗剤組成物。
【請求項２０】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼの前記少なくとも１つの置換が、Ｘ８１Ｑ／Ｅ、Ｘ１４７Ｍ／Ｙ、Ｘ１５０Ｇ、およびＸ２４９Ｒ／Ｉ／Ｌからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の洗剤組成物。
【請求項２１】
前記リパーゼがさらに、前記親リパーゼが、配列番号２と少なくとも９０％同一であることを特徴とする、請求項２に記載の洗剤組成物。
【請求項２２】
前記親リパーゼが配列番号２と同一であり、前記変異体が、
ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ｙ、
ｂ）Ｉ２０２Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｃ）Ｉ８６Ｖ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｄ）Ｑ４Ｖ＋Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｅ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ９０Ｒ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｆ）Ｉ９０Ａ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｉ２５５Ｖ、
ｇ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｈ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｌ１４７Ｍ＋Ｆ２１１Ｌ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
ｉ）Ｑ４Ｖ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ｋ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｊ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ
の置換群のうちの１つを含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２３】
前記親リパーゼが配列番号２と同一であり、前記変異体が、
ａ）Ｑ４Ｖ＋Ｓ５８Ａ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｓ８３Ｔ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｅ２１０Ｋ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ、
ｂ）Ｓ５８Ｎ＋Ｖ６０Ｓ＋Ｉ８６Ｖ＋Ａ１５０Ｇ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ
の置換群のうちの１つを含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２４】
前記リパーゼ変異体が、本明細書で定めるとおりに測定した場合のベネフィット・リスクが１より大きいことを特徴とする、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２５】
布帛色調剤、およびリパーゼ活性を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドがさらに、本明細書で定められる試験条件において、少なくとも０．８の平均相対性能、および少なくとも１．１のベネフィット・リスクを有する、洗剤組成物。
【請求項２６】
０．１％〜４０％のアニオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項２７】
洗剤組成物が、洗浄および／または処理組成物である、請求項２６に記載の洗剤組成物。
【請求項２８】
表面または布帛を洗浄および／または処理する方法であって、表面または布帛を請求項１の組成物に接触させる工程、その後、所望により、前記表面または布帛を洗う、および／またはすすぐ工程、を含む、方法。
【請求項２９】
前記リパーゼ変異体が、突然変異Ｑ４Ｖ、Ｓ５８Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｐ／Ｔ、１９０Ｒ、またはＱ２４９Ｉ／Ｌの少なくとも１つを含む、配列番号２の変異体である、請求項１に記載の洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼおよび布帛色調剤を含む組成物、並びに、このような生成物を作製および利用するプロセスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
洗剤用途に適しているリパーゼ酵素の出現によって、配合者は油脂の除去を向上させる新たなアプローチを得た。このような酵素は、一般的に見られる多くの脂肪質汚れ（皮脂、動物脂（例えばラード、ギー、バター）、植物油（例えばオリーブ油、ひまわり油、ピーナッツ油）など）の主構成要素を形成するトリグリセリドの加水分解を触媒する。しかしながら、これらの酵素は一般に、第１の洗浄サイクルでは性能が弱く、多くの場合、牛乳、クリーム、バター、ヨーグルトなどの乳製品の汚れに存在する脂肪の加水分解に起因すると考えられる悪臭を伴う。理論に束縛されるものではないが、このような汚れは、短鎖（例えばＣ４）脂肪族アシル単位で官能化されているトリグリセリドを含んでおり、脂肪分解後に、前記脂肪族アシル単位が、悪臭を伴う揮発性脂肪酸を放出するため、リパーゼ誘導性の悪臭を発生させる傾向があると考えられる。このような酵素の性能を向上させたとしても、悪臭の問題は残る。従って、この技術の使用は非常に限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
布帛色調剤とある種のリパーゼ変異体を組み合わせると、清浄性能効果が向上する一方で、許容不可能な悪臭が最小限に収まることを我々は見出した。理論に束縛されるものではないが、特定のリパーゼ変異体が油脂の除去レベルを向上させ、それによって布帛色調剤が布帛表面にさらに接触しやすくなり、その結果、付着性が向上するというメカニズムによって、このような効果が生じると考えられる。結果として得られる油汚れの除去度の向上と遮蔽性着色剤の付着性の向上が組み合わさることによって、布帛の外観の向上につながり、油汚れが十分除去されていない場合でも、脂肪が、より親水性の高い脂肪酸やモノおよびジグリセリドに加水分解されることで、遮蔽性着色剤の付着性が向上し、ひいては洗浄感が向上し、布帛上に存在している油汚れ内に付着している染料分子の存在が、悪臭を発生させる酵素活性を阻害することがある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、布帛色調剤と、Ｃ末端伸張の付着がなく悪臭生成の可能性が軽減されているとともに優れた相対性能を備えるリパーゼ変異体を含む組成物に関するものである。このリパーゼ変異体は、親リパーゼ内で同定される１つ以上の領域内に突然変異を組み入れることによって得られる。従って、得られた変異体はリパーゼ活性を有するはずであり、相対性能として表した場合に親リパーゼの活性の８０％以上である。
【０００５】
配列リスト
配列番号１は、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）由来のリパーゼをエンコードするＤＮＡ配列を示している。
【０００６】
配列番号２は、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【０００７】
配列番号３は、アブシディアレフレクサ（reflexa）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【０００８】
配列番号４は、アブシディアコリンビフェラ由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【０００９】
配列番号５は、リゾムコールミエヘイ（Rhizomucor miehei）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１０】
配列番号６は、リゾプスオリゼー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１１】
配列番号７は、アスペルギルスニガー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１２】
配列番号８は、アスペルギルスツビンゲンシス（tubingensis）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１３】
配列番号９は、フザリウムオキシスポラム（oxysporrum）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１４】
配列番号１０は、フザリウムヘテロスポラム（heterosporum）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１５】
配列番号１１は、アスペルギルスオリゼー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１６】
配列番号１２は、ペニシリウムカマンベルティ由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１７】
配列番号１３は、アスペルギルスフォエティダス由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１８】
配列番号１４は、アスペルギルスニガー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００１９】
配列番号１５は、アスペルギルスオリゼー由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【００２０】
配列番号１６は、ランデリナペニサポラ（Landerina penisapora）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
定義
本明細書で使用する時、「洗浄組成物」という用語は、他に指示がない限り、顆粒または粉末形態の万能または「重質」洗浄剤、特に洗濯洗剤、液体、ゲルまたはペースト形態の万能洗浄剤、特にいわゆる重質液体型、液体の高級布帛用洗剤、手洗い食器洗浄剤、または軽質食器洗浄剤、特に高起泡型のもの、種々の錠剤、顆粒、液体および家庭および企業での使用のためのリンス補助型を含む機械食器洗浄剤、抗菌ハンドウォッシュ型、洗濯バー、うがい薬、義歯クリーナー、車またはカーペット用シャンプー、浴室クリーナーを含む液体洗浄剤および消毒剤、ヘアシャンプーおよびヘアリンス、シャワージェルおよび泡バスおよび金属クリーナー、並びに、漂白添加物質および「染み用スティック」、または前処理型のような洗浄補助剤を含む。
【００２２】
本明細書で使用する時、「布帛色調剤」という用語は、洗剤組成物中に配合した場合、このような洗剤組成物を含む洗浄溶液に布帛を接触させると、このような布帛に付着し、このような布帛の色合いを変えることのできる染料または顔料を意味する。本出願の目的上、蛍光増白剤は布帛色調剤とはみなさない。
【００２３】
本明細書で使用する時、「独立して、〜からなる群から選択される」という言い回しは、引用されるマルクーシュ群から選択される部分または要素が同じか、異なるか、または任意の要素の混合物であってもよいことを意味する。
【００２４】
本出願の試験方法の項で開示する試験方法を用いて、本出願人らの発明のパラメータの各値を求めなければならない。
【００２５】
特に記載のない限り、構成成分または組成物の濃度はすべて、前記構成成分または組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば残留溶媒または副生成物は除外されている。
【００２６】
百分率および比率はすべて、特に指示がない限り、重量で計算されている。百分率および比率はすべて、特に指示がない限り、組成物全体を基準にして計算されている。
【００２７】
本明細書を通じての所与のあらゆる最大数値限定は、あたかもこうしたより小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように、より小さいすべての数値限定を含むと理解すべきである。本明細書全体を通じて記載されているあらゆる最小数値限定は、それよりも大きいあらゆる数値限定を、あたかもこうしたそれよりも大きい数値限定を本明細書に明確に記載されているかのように含む。本明細書全体を通じて記載されているあらゆる数値範囲は、こうしたより広い数値範囲内に入る、それよりも狭いあらゆる数値範囲を、あたかもこうしたそれよりも狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように含む。
【００２８】
引用するすべての文書は、関連部分において本明細書に参考として組み込まれるが、いかなる文書の引用も、それが本発明に関して先行技術であるということの承認として解釈すべきではない。
【００２９】
組成物
本発明の組成物は、布帛色調剤を約０．００００３％〜約０．１％、約０．００００８％〜約０．０５％、またはさらには約０．０００１％〜約０．０４％、およびリパーゼを約０．０００５％〜約０．１％、約０．００１％〜約０．０５％、またはさらには約０．００２％〜約０．０３％含んでよい。
【００３０】
このような組成物は、いずれの形状、例えば洗浄組成物および／または処理組成物の形状などをとってもよい。
【００３１】
前述の洗浄組成物のいずれかの態様のバランスは、１つ以上の補助剤で保たれている。
【００３２】
適切なリパーゼ変異体
本発明の組成物のリパーゼは、Ｃ末端伸張はないが、親リパーゼの特定領域内に突然変異を持たせることによって、悪臭生成の傾向が軽減されているリパーゼ変異体である。
【００３３】
親リパーゼ
親リパーゼは、「相同性とアラインメント」の項の定義に従った場合、配列番号２に示されているＴ．ラノギノサス（lanuginosus）の配列に対する相同性が少なくとも５０％であるアミノ酸配列を有する真菌性リパーゼにしてよい。
【００３４】
親リパーゼは、酵母ポリペプチド（カンジダ、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、またはヤロウィア（Yarrowia）ポリペプチドなど）、またはさらに好ましくは、糸状菌ポリペプチド（アクレモニウム、アスペルギルス、オーレオバシディウム、クリプトコッカス、フィロバシディウム、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、マイセリオフソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロミセス、ペニシリウム、ピロミセス、シゾフィラム、タラロミセス、サーモアスカス（Thermoascus）、ティラビア（Thielavia）、トリポクラディウム（Tolypocladium）、またはトリコデルマポリペプチドにしてよい。
【００３５】
好ましい態様では、親リパーゼは、リパーゼ活性を有するサッカロミセスカールスベルゲンシス、サッカロミセスセレヴィシエ、サッカロミセスジアスタティカス（diastaticus）、サッカロミセスダグラシー（douglasii）、サッカロミセスクルイベリ（kluyveri）、サッカロミセスノルベンシス（norbensis）、またはサッカロミセスオビフォーミス（oviformis）ポリペプチドである。
【００３６】
別の好ましい態様では、親リパーゼは、アスペルギルスアクレアタス（aculeatus）、アスペルギルスアワモリ、アスペルギルスフミガタス、アスペルギルスフォエティダス、アスペルギルスジャポニカス、アスペルギルスニダランス、アスペルギルスニガー、アスペルギスルオリゼー、アスペルギスルタービゲンシス（turbigensis）、フザリウムバクトリジオイデス（bactridioides）、フザリウムセレアリス（cerealis）、フザリウムクルークウェレンス（crookwellense）、フザリウムセルモラム、フザリウムグラミネアラム、フザリウムグラミナム（graminum）、フザリウムヘテロスポラム（heterosporum）、フザリウムネグンジ（negundi）、フザリウムオキシスポラム、フザリウムレティキュラタム（reticulatum）、フザリウムロゼウム、フザリウムサンブシウム（sambucinum）、フザリウムサルコクロウム（sarcochroum）、フザリウムスポロトリキオイデス、フザリウムサルフレウム（sulphureum）、フザリウムトルローサム（torulosum）、フザリウムトリコセシオイデス（trichothecioides）、フザリウムベネナタム（venenatum）、フミコラインソレンス、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）（別名：フミコララヌギノーズ（lanuginose））、ムコールミエヘイ（miehei）、マイセリオフソラサーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラクラッサ、ペニシリウムパルロゼラム、トリコデルマハルジアナム、トリコデルマコニンギ、トリコデルマロンギブラキアタム（longibrachiatum）、トリコデルマリーセイ（reesei）、またはトリコデルマビリデポリペプチドである。
【００３７】
別の好ましい態様では、親リパーゼはサーモミセス（Thermomyces）リパーゼである。
【００３８】
より好ましい態様では、親リパーゼはサーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanuginosus）リパーゼである。さらに好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２のリパーゼである。
【００３９】
領域と置換の同定
以下で領域Ｉ〜領域ＩＶと称されている位置は、配列番号２のアミノ酸残基の位置である。異なるリパーゼの相当（または相同）位を見つけるには、「相同とアラインメント」の部分に記載されている手順を用いる。
【００４０】
領域Ｉ内の置換
領域Ｉは、Ｎ−末端残基Ｅ１を取り囲んでいるアミノ酸残基から構成されている。この領域では、より塩基性の高いアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。１〜１１位および２２３〜２３９位に相当するアミノ酸残基が領域Ｉに含まれている。１位、２位、４位、８位、１１位、２２３位、２２７位、２２９位、２３１位、２３３位、２３４位、および２３６位が特に興味深い。具体的には、Ｘ１Ｎ／＊、Ｘ４Ｖ、Ｘ２２７Ｇ、Ｘ２３１Ｒ、およびＸ２３３Ｒの置換が同定されている。
【００４１】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一度は少なくとも８０％（８５％または９０％など）、例えば少なくとも９５％または９６％または９７％または９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４２】
領域ＩＩ内の置換
領域ＩＩは、アシル鎖の片側とアルコール部分の片側で基質と接しているアミノ酸残基から構成されている。この領域では、より塩基性の高いアミノ酸で、またはより疎水性の低いアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。２０２〜２１１位および２４９〜２６９位に相当するアミノ酸残基が領域ＩＩに含まれている。２０２位、２１０位、２１１位、２５３位、２５４位、２５５位、２５６位、２５９位が特に興味深い。具体的には、Ｘ２０２Ｇ、Ｘ２１０Ｋ／Ｗ／Ａ、Ｘ２５５Ｙ／Ｖ／Ａ、Ｘ２５６Ｋ／Ｒ、およびＸ２５９Ｇ／Ｍ／Ｑ／Ｖの置換が同定されている。
【００４３】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一度は少なくとも８０％（８５％または９０％など）、例えば少なくとも９５％または９６％または９７％または９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４４】
領域ＩＩＩ内の置換
領域ＩＩＩは、柔軟な構造を形成させるアミノ酸残基から構成されており、このため、基質が活性部位に入り込めるようになっている。この領域では、より塩基性の高いアミノ酸、またはより疎水性の低いアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。８２〜１０２位に相当するアミノ酸残基が領域ＩＩＩに含まれている。８３位、８６位、８７位、９０位、９１位、９５位、９６位、９９位が特に興味深い。具体的には、Ｘ８３Ｔ、Ｘ８６Ｖ、およびＸ９０Ａ／Ｒの置換が同定されている。
【００４５】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一度は少なくとも８０％（８５％または９０％など）、例えば少なくとも９５％または９６％または９７％または９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４６】
領域ＩＶ内の置換
領域ＩＶは、静電気によって表面に結合しているアミノ酸残基から構成されている。この領域では、より塩基性の高いアミノ酸で、親リパーゼのアミノ酸を置換するのが好ましい。２７位および５４〜６２位に相当するアミノ酸残基が領域ＩＶに含まれている。２７位、５６位、５７位、５８位、６０位が特に興味深い。具体的には、Ｘ２７Ｒ、Ｘ５８Ｎ／ＡＧ／Ｔ／Ｐ、およびＸ６０Ｖ／Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｒ／Ｋ／Ａ／Ｌの置換が同定されている。
【００４７】
好ましい実施形態では、親リパーゼの配列番号２に対する同一度は少なくとも８０％（８５％または９０％など）、例えば少なくとも９５％または９６％または９７％または９８％または９９％である。最も好ましい実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一である。
【００４８】
その他の位置のアミノ酸
親リパーゼは所望により、その他のアミノ酸の置換、具体的にはその他の置換を１０個未満または５個未満含んでよい。例は、親リパーゼの２４位、３７位、３８位、４６位、７４位、８１位、８３位、１１５位、１２７位、１３１位、１３７位、１４３位、１４７位、１５０位、１９９位、２００位、２０３位、２０６位、２１１位、２６３位、２６４位、２６５位、２６７位、および２６９位のうちの１つ以上に相当する置換である。ある特定の実施形態では、８１位、１４３位、１４７位、１５０位、および２４９位に相当する位置の少なくとも１つに置換がある。好ましい実施形態では、少なくとも１つの置換は、Ｘ８１Ｑ／Ｅ、Ｘ１４３Ｓ／Ｃ／Ｎ／Ｄ／Ａ、Ｘ１４７Ｍ／Ｙ、Ｘ１５０Ｇ／Ｋ、およびＸ２４９Ｒ／Ｉ／Ｌからなる群から選択される。
【００４９】
変異体は、規定領域Ｉ〜ＩＶの外に置換を含んでよく、規定領域Ｉ〜ＩＶの外の置換の数は、６個未満、または５個未満、または４個未満、または３個未満、または２個未満、例えば、５個または４個または３個または２個または１個であるのが好ましい。あるいは、変異体は、規定領域Ｉ〜ＩＶ以外では置換を全く含まない。
【００５０】
さらに、置換は例えば、当該技術分野において既知の原則に従って生成させてもよい（例えば、ＷＯ９２／０５２４９号、ＷＯ９４／２５５７７号、ＷＯ９５／２２６１５号、ＷＯ９７／０４０７９号、およびＷＯ９７／０７２０２号に記載されている置換など）。
【００５１】
親リパーゼの変異体
ある１つの態様では、前記変異体は、前記親と比較した場合、少なくとも合わせて３個の置換を含んでおり、前記置換は、
ａ）領域Ｉ内の置換の少なくとも２つ、若しくは、少なくとも３つ、若しくは、少なくとも４つ、若しくは、少なくとも５つ、若しくは、少なくとも６つ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、若しくは、６つ、
ｂ）領域ＩＩ内の置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、若しくは、少なくとも３つ、若しくは、少なくとも４つ、若しくは、少なくとも５つ、若しくは、少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、若しくは、６つ、
ｃ）領域ＩＩＩ内の置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、若しくは、少なくとも３つ、若しくは、少なくとも４つ、若しくは、少なくとも５つ、若しくは、少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、若しくは、６つ、
ｄ）および／または領域ＩＶ内の置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、若しくは、少なくとも３つ、若しくは、少なくとも４つ、若しくは、少なくとも５つ、若しくは、少なくとも６つ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、若しくは、６つの置換群の１つ以上から選択されている。
【００５２】
前記変異体には、その変異体の親に比べて、後掲の表１に列挙されている置換に相当する置換を含んでよい。
【表１】
2009523901.tif 000002
【００５３】
さらなる特定の実施形態では、親リパーゼは配列番号２と同一であり、表１の変異体は従って以下のとおりである。
【表２】
2009523901.tif 000003
【００５４】
アミノ酸修飾に関する命名法
本発明によるリパーゼ変異体について説明する際には、参照しやすくするために、元のアミノ酸：位置：置換済みアミノ酸という命名法を用いる。
【００５５】
この命名法に従うと、例えば、１９５位でグルタミン酸をグリシンに置換したものはＧ１９５Ｅと表示する。同じ位置でグリシンが欠失したものはＧ１９５＊と表示し、追加のアミノ酸残基、例えばリジンを挿入したものはＧ１９５ＧＫと表示する。特異的なリパーゼは、他のリパーゼと比べると「欠失部分」を含んでいるとともに、そのような位置で挿入を行う場合で、３６位にアスパラギン酸を挿入した時には、＊３６Ｄと表示する。複数の突然変異はプラス記号で区切る。すなわち、Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅは、チロシンをアルギニンに置換した１７０位の突然変異とグルタミン酸をグリシンに置換した１９５位の突然変異を表している。
【００５６】
Ｘ２３１は、上記のアラインメント手順を適用した場合、２３１位に相当する親ポリペプチド中のアミノ酸を表す。Ｘ２３１Ｒは、アミノ酸がＲで置換されていることを表す。配列番号２では、ＸはＴであり、従ってＸ２３１Ｒは２３１位のＴをＲと置換したものを表す。ある位置（例えば２３１位）のアミノ酸が、アミノ酸の群、例えばＲ、ＰおよびＹからなる群から選択される別のアミノ酸で置換されているような場合、これは、Ｘ２３１Ｒ／Ｐ／Ｙによって表されることになる。
【００５７】
いずれのケースでも、ＩＵＰＡＣによる１文字または３文字の正式なアミノ酸略称を採用する。
【００５８】
アミノ酸のグループ化
本明細書では、アミノ酸は、ｐＨ１０における電荷に応じて、負電荷アミノ酸、正電荷アミノ酸、または電気的に中性のアミノ酸に分類される。従って、負電荷アミノ酸はＥ、Ｄ、Ｃ（システイン）、およびＹ、とりわけＥおよびＤである。正電荷アミノ酸はＲ、Ｋ、およびＨ、とりわけＲおよびＫである。中性のアミノ酸は、ジスルフィド架橋の一部を形成している場合、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、およびＣである。同じグループ（負、正、または中性）の別のアミノ酸との置換は同類置換（conservative substitution）という。
【００５９】
中性のアミノ酸は、疎水性または非極性のもの（ジスルフィド架橋の一部としてのＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、およびＣ）と親水性または極性のもの（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ）に分けてよい。本明細書では、アミノ酸は、ｐＨ１０における電荷に応じて、負電荷アミノ酸、正電荷アミノ酸、または電気的に中性のアミノ酸に分類される。従って、負電荷アミノ酸はＥ、Ｄ、Ｃ（システイン）、およびＹ、とりわけＥおよびＤである。正電荷アミノ酸はＲ、Ｋ、およびＨ、とりわけＲおよびＫである。中性のアミノ酸は、ジスルフィド架橋の一部を形成している場合、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、およびＣである。同じグループ（負、正、または中性）の別のアミノ酸との置換は同類置換（conservative substitution）という。
【００６０】
中性のアミノ酸は、疎水性または非極性のもの（ジスルフィド架橋の一部としてのＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、およびＣ）と親水性または極性のもの（Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ）に分けてよい。
【００６１】
アミノ酸の同一性
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の相関性は、「同一性」というパラメータによって評される。
【００６２】
本発明の目的上、２つのアミノ酸配列のアラインメントは、エンボス（EMBOSS）パッケージ（http://emboss.org）バージョン２．８．０内のニードル（Needle）というプログラムを用いることによって割り出す。ニードル（Needle）プログラムは、Ｓ．Ｂ．ニードルマン（Needleman）およびＣ．Ｄ．ワンチ（Wunsch）著（１９７０年）、分子生物学会誌（J. Mol. Biol.）４８号、４４３〜４５３ページに記載されているグローバルアラインメントアルゴリズムを実行する。用いる置換マトリクスはＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープニングペナルティは１０、ギャップエクステンションペナルティは０．５である。
【００６３】
本発明のアミノ酸配列（「発明配列」という。例えば配列番号２のアミノ酸１〜２６９）と、異なるアミノ酸配列（「異質配列」という）の同一性の程度は、２つの配列のアライメントの完全一致数を「発明配列」の長さまたは「異質配列」の長さのうち短い方で除した値として算出する。この結果を同一度（％）として表す。
【００６４】
完全一致は、「発明配列」と「異質配列」に、同一のアミノ酸残基が重複部分の同じ位置に備わっている場合に発生する。配列の長さは、配列内のアミノ酸残基の数である（例えば配列番号２の長さは２６９である）。
【００６５】
親リパーゼとＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）のアミノ酸同一度は少なくとも５０％であり、特には、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％超、または９８％超である。特定の実施形態では、親リパーゼはＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）と同一である。
【００６６】
上記の手順は、同一性の計算に加えて相同性の計算とアラインメントでも用いてよい。本発明の文脈においては、相同性とアラインメントは、以下に記載されているとおりに計算されている。
【００６７】
相同性とアラインメント
本発明の目的上、相同性の程度は、当該技術分野において既知のコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージに搭載されているＧＡＰ（ウィスコンシンパッケージ（Wisconsin Package）プログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年８月、ジェネティックスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）、５３７１１米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５）（Ｓ．Ｂ．ニードルスマン（Needleman）およびＣ．Ｄ．ワンチ（Wunsch）（１９７０年）、分子生物学会誌（Journal of Molecular Biology）４８号、４４３〜４５ページ）によって適切に割り出されると思われる（ＧＡＰは、ギャップ生成ペナルティが３．０、ギャップ伸長ペナルティが０．１のギャップポリペプチド配列比較用の設定で用いる）。
【００６８】
本発明では、アブシディアレフレクサ（reflexa）、アブシディアコリムビフェラ、リズムコアミエヘイ（Rhizmucor miehei）、リゾープスデレマ、アスペルギルスニガー、アスペルギルスツビンゲンシス（tubigensis）、フザリウムオキシスポラム、フザリウムヘテロスポラム（heterosporum）、アスペルギルスオリゼー、ペニシリウムカマンベルディ、アスペルギルスフォエティダス、アスペルギルスニガー、サーモミセスラノギノサス（Thermomyces lanoginosus）（別名：フミコララヌギノーサ（Humicola lanuginosa））、およびランデリナペニサポラ（Landerina penisapora）のリパーゼ配列内の相当（または相同）位は、図１に示されているアラインメントによって定義されている。
【００６９】
前記アラインメントに示されていないリパーゼ配列の相同位を確認するには、当該配列を、図１に示されている配列にアラインメントする。ＧＡＰプログラムによって明らかになった最も相同性の高い配列に対するＧＡＰアラインメントを用いて、その新たな配列を、図１中の本アラインメントに合わせてアライメントする。ＧＡＰは、ＧＣＧプログラムパッケージウィスコンシンパッケージ（Wisconsin Package）プログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年８月、ジェネティックスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）、５３７１１米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ５７５）（Ｓ．Ｂ．ニードルスマン（Needleman）およびＣ．Ｄ．ワンチ（Wunsch）（１９７０年）、分子生物学会誌（Journal of Molecular Biology）４８号、４４３〜４５ページ）に掲載されている。ギャップ生成ペナルティが３．０、ギャップ伸長ペナルティが０．１のギャップポリペプチド配列比較用の設定を用いる。
【００７０】
親リパーゼはＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）に対し、少なくとも５０％の相同性を有し、特には、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％超、または９８％超を有する。特定の実施形態では、親リパーゼはＴ．ラヌギノサス（lanuginosus）リパーゼ（配列番号２）と同一である。
【００７１】
ハイブリダイゼーション
本発明はさらに、リパーゼ活性を持つ分離ポリペプチドであって、厳密性が非常に低い条件、好ましくは厳密性が低い条件、より好ましくは厳密性が中度である条件、さらに好ましくは厳密性が中の上である条件、さらに好ましくは厳密性が高い条件、最も好ましくは厳密性が非常に高い条件の下で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０に含まれているｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の部分配列、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の相補鎖とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドによってエンコードされている分離ポリペプチドに関するものである（Ｊ．サンブルック（Sambrook）、Ｅ．Ｆ．フリッチェ（Fritsch）、およびＴ．マニアタス（Maniatus）、１９８９年、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」第２版、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク）。配列番号１の部分配列は、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド、または好ましくは少なくとも２００個の連続したヌクレオチドを含む。さらには、前記部分配列は、リパーゼ活性を持つポリペプチド断片をエンコードしてもよい。
【００７２】
鎖長が少なくとも１００個のヌクレオチドの長いプローブでは、厳密性が非常に低い条件から非常に高い条件は、５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの断片化変性サケ精子ＤＮＡ、および厳密性が非常に低い場合と低い場合には２５％のホルムアミド、厳密性が中度である場合と中の上である場合には３５％のホルムアミド、厳密性が高い場合と非常に高い場合には５０％のホルムアミド中、４２℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行った後に、標準的なサザンブロッティング手順を最適に行うものとして定義する。
【００７３】
鎖長が少なくとも１００個のヌクレオチドの長いプローブでは、前記担体物質は最後に、２Ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃で（厳密性が非常に低い場合）、より好ましくは少なくとも５０℃で（厳密性が低い場合）、さらに好ましくは少なくとも５５℃で（厳密性が中度である場合）、さらに好ましくは少なくとも６０℃で（厳密性が中の上である場合）、さらに好ましくは少なくとも６５℃で（厳密性が高い場合）、最も好ましくは少なくとも７０℃で（厳密性が非常に高い場合）、３回、それぞれにつき１５分間洗浄する。
【００７４】
ＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、リパーゼの生成
本発明は、本発明のリパーゼをエンコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列を組み入れる発現ベクター、および前記ＤＮＡ配列または前記発現ベクターを含む形質転換宿主細胞を提供する。これらは、当該技術分野において既知の方法によって得てよい。
【００７５】
本発明は、リパーゼの生成を促す条件下で前記形質転換宿主細胞を培養し、得られた培養液からリパーゼを回収することによって、リパーゼを生成させる方法も提供する。この方法は、当該技術分野において既知の原理に従って実施してよい。
【００７６】
リパーゼ活性
−中性のｐＨにおけるトリブチリンのリパーゼ活性（ＬＵ）
乳化剤としてアラビアゴムを用いてトリブチリン（グリセリントリブチレート）を乳化させることによって、リパーゼの基質を用意する。続いて、ｐＨスタット滴定実験装置内で、トリブチリンを３０℃、ｐＨ７または９で加水分解させる。リパーゼ活性の１単位（１ＬＵ）は、ｐＨ７において毎分１マイクロモルの酪酸を放出できる酵素の量に匹敵する。
【００７７】
−ベネフィット・リスク（Benefit Risk）
悪臭リスクの低下との比較による性能を表すベネフィット・リスク係数は、ＢＲ＝ＲＰａｖｇ／Ｒとして定義する。本明細書に記載のリパーゼ変異体のＢＲは１より大きく、１．１より大きく、又、さらには１より大きく〜約１０００であってよい。
【００７８】
−平均相対性能（Average Relative Performance）
平均相対性能（ＲＰａｖｇ）を算出する手順は、本明細書の実施例５に記載されている。本明細書に記載されているリパーゼ変異体の（ＲＰａｖｇ）は、少なくとも０．８、少なくとも１．１、少なくとも１．５、又、さらには少なくとも２〜約１０００にしてよい。
【００７９】
適切な布帛色調剤（Fabric Hueing Agents）
蛍光増白剤は、少なくとも何らかの可視光線を放出する。対照的に、布帛色調剤は、可視光線スペクトルの少なくとも一部を吸収するため、表面の色合いを変えることができる。適切な布帛色調剤としては、本明細書の試験方法の項に記載の試験方法１の要件を満たす染料、染料−粘土共役体、および顔料が挙げられる。適切な染料としては、小分子染料およびポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、以下からなる群から選択される少分子染料が挙げられる。
【００８０】
（１）以下の式のトリス−アゾ系ダイレクトブルー染料
【化１】
2009523901.tif 000004
式中、ナプチル環Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも２つがスルホネート基で置換されており、環Ｃは、５位をＮＨ２またはＮＨＰｈ基で置換してもよく、Ｘは、２つ以下のスルホネート基で置換されているベンジルまたはナフチル環であり、２位をＯＨ基で置換してもよく、さらにＮＨ２またはＮＨＰｈ基で置換してもよい。
【００８１】
（２）以下の式のビス−アゾ系ダイレクトバイオレット染料
【化２】
2009523901.tif 000005
式中、ＺはＨまたはフェニルであり、環Ａは、好ましくは矢印で示される位置がメチルおよびメトキシ基で置換されており、環Ａはナフチル環であってもよく、Ｙ基はベンジルまたはナフチル環であり、サルフェート基で置換されており、メチル基で１または２置換されてもよい。
【００８２】
（３）以下の式のブルーまたはレッドアシッド染料
【化３】
2009523901.tif 000006
式中、ＸおよびＹの少なくとも１つは芳香族基でなければならない。１つの態様では、芳香族基は双方とも、置換ベンジルまたはナフチル基であってよく、このベンジルまたはナフチル基はアルキル、アルキルオキシ、またはアリールオキシ基などの非水溶化基で置換してよく、ＸおよびＹはスルホネートまたはカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。別の態様では、Ｘはニトロ基で置換したベンジル基であり、Ｙはベンジル基である。
【００８３】
（４）以下の構造のレッドアシッド染料
【化４】
2009523901.tif 000007
式中、Ｂはアルキル、アルキルオキシ、またはアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよいナフチルまたはベンジル基であり、Ｂはスルホネートまたはカルボキシレートなどの水溶化基で置換しなくてもよい。
【００８４】
（５）以下の構造のジアゾ染料
【化５】
2009523901.tif 000008
式中、ＸおよびＹは、互いに独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、またはＣ１〜Ｃ４アルコキシであり、Ｒαは水素またはアリールであり、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、またはカルボキシルであり、ｎは１、または２であり、ｍは０、１、または２であり、並びにこれらの塩およびこれらの混合物に相当する。
【００８５】
（６）以下の構造のトリフェニルメタン染料
【化６】
2009523901.tif 000009
【化７】
2009523901.tif 000010
およびこれらの混合物。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者およびカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists）、英国ブラッドフォード）番号がダイレクトバイオレット９、ダイレクトバイオレット３５、ダイレクトバイオレット４８、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトバイオレット６６、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトブルー８０、ダイレクトブルー２７９、アシッドレッド１７、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドバイオレット１５、アシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット２４、アシッドバイオレット４９、アシッドブルー１５、アシッドブルー１７、アシッドブルー２９、アシッドブルー４０、アシッドブルー７５、アシッドブルー８０、アシッドブルー８３、アシッドブルー９０、アシッドブルー１１３、ベーシックバイオレット１、ベーシックバイオレット３、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット３５、ベーシックブルー３、ベーシックブルー１６、ベーシックブルー２２、ベーシックブルー４７、ベーシックブルー６６、ベーシックブルー７５、ベーシックブルー１５９、およびこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。
【００８６】
適切なポリマー染料としては、共役色原体を含むポリマー（染料−ポリマー共役体）、ポリマーの骨格鎖に共重合されている色原体を有するポリマー、およびこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
【００８７】
別の態様では、適切なポリマー染料としては、リキッティント（Liquitint）（登録商標）（ミリケン（Milliken）、米国サウスカロライナ州スパータンバーグ）の名称で市販されている布帛直接着色剤、並びに少なくとも１つの反応染料と、ヒドロキシル部分、１級アミン部分、２級アミン部分、チオール部分、およびこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーから形成されている染料−ポリマー共役体が挙げられる。さらに別の態様では、適切なポリマー染料としては、リキッティント（Liquitint）（登録商標）（ミリケン（Milliken）、米国サウスカロライナ州スパータンバーグ）バイオレットＣＴ（Violet CT）、およびリアクティブブルー、リアクティブバイオレット、またはリアクティブレッド染料で共役されているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（例えば、メガザイム（Megazyme）（アイルランド、ウィックロー）からアゾ−ＣＭ−セルロース（AZO-CM-CELLULOSE）という商品名（製品コードＳ−ＡＣＭＣ）で市販されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９で共役されているＣＭＣなど）、およびこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
【００８８】
適切な染料粘土共役体としては、少なくとも１つのカチオン性／塩基性染料とスメクタイト粘土を含む群から選択される染料粘土共役体、およびこれらの混合物が挙げられる。別の態様では、適切な染料粘土共役体としては、Ｃ．Ｉ．ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラック１〜１１からなる群から選択される１つのカチオン性／塩基性染料、並びにモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土およびこれらの混合物からなる群から選択される粘土、からなる群から選択される染料粘土共役体、が挙げられる。さらに別の態様では、適切な染料粘土共役体としては、モンモリロナイトベーシックブルーＢ７Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、モンモリロナイトベーシックブルーＢ９Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、モンモリロナイトベーシックバイオレットＶ３Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、モンモリロナイトベーシックグリーンＧ１Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、モンモリロナイトベーシックレッドＲ１Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、モンモリロナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ７Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ９Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、ヘクトライトベーシックバイオレットＶ３Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、ヘクトライトベーシックグリーンＧ１Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、ヘクトライトベーシックレッドＲ１Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、ヘクトライトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、サポナイトベーシックブルーＢ７Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、サポナイトベーシックブルーＢ９Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、サポナイトベーシックバイオレットＶ３Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、サポナイトベーシックグリーンＧ１Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、サポナイトベーシックレッドＲ１Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、サポナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、およびこれらの混合物からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。
【００８９】
適切な顔料としては、フラバントロン（flavanthrone）、インダントロン、１〜４個の塩素原子を有する塩素化インダントロン、ピラントロン（pyranthrone）、ジクロロピラントロン（dichloropyranthrone）、モノブロモジクロロピラントロン（monobromodichloropyranthrone）、ジブロモジクロロピラントロン（dibromodichloropyranthrone）、テトラブロモピラントロン（tetrabromopyranthrone）、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基はＣ１〜Ｃ３−アルキルまたはフェニルまたは置換されていないかまたは複素環式ラジカルで置換されていてもよく、フェニルおよび複素環式ラジカルはさらに水溶性を付与しない置換を有していてもよい）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン（violanthrone）、イソビオラントロン（isoviolanthrone）、ジオキサジン染料、銅フタロシアニン（１分子当たり２個以下の塩素原子を有していてもよい）、ポリクロロ−銅フタロシアニン、またはポリブロモクロロ−銅フタロシアニン（１分子当たり１４個以下の臭素原子を有する）、およびこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【００９０】
別の態様では、適切な顔料としては、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．顔料ブルー２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．顔料バイオレット１５）、およびこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
【００９１】
前述の布帛色調剤は、組み合わせて使用することができる（布帛色調剤の任意の混合物を使用することができる）。適切な布帛色調剤は、アルドリッチ（Aldrich）（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）、チバスペシャルティケミカルズ（Ciba Specialty Chemicals）（スイス、バーゼル）、ＢＡＳＦ（ドイツ、ルートウィヒスハーフェン）、デイグローカラーコーポレーション（Dayglo Color Corporation）（インド、ムンバイ）、オーガニック・ダイスタフス（Organic Dyestuffs Corp.）（米国ロードアイランド州イーストプロビデンス）、ダイスター（Dystar）（ドイツ、フランクフルト）、ランクセス（Lanxess）（ドイツ、レバークーゼン）、メガザイム（Megazyme）（アイルランド、ウィックロー）、クラリアント（Clariant）（スイス、ムテンツ）、アベシア（Avecia）（英国マンチェスター）から購入可能であり、および／または本明細書に記載の実施例に従って調製可能である。
【００９２】
補助剤物質
本発明の目的には必須でないが、以下に例示されている補助剤の非限定的なリストは、当該組成物中で使用するのに適しており、例えば、洗浄性能を補助若しくは向上させるために、洗浄すべき基材の処理のために、または香料、着色剤、染料などを用いる場合のように洗浄組成物の審美性を変化させるために、本発明の特定の実施形態に組み込むのが望ましい。このような追加成分の明確な性質およびそれを組み込む濃度は、組成物の物理的形態および使用すべき洗浄作業の性質に左右される。適切な補助剤物質としては、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素および酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造伸縮性付与剤、柔軟仕上げ剤、キャリア、向水性物質、加工助剤、溶媒、および／または顔料が挙げられるが、これらに限らない。下記の開示に加え、このようなその他の補助剤の適切な例および使用濃度は、米国特許第５，５７６，２８２号、米国特許第６，３０６，８１２Ｂ１号、および米国特許第６，３２６，３４８Ｂ１号に記載されており、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９３】
上述の如く、前記補助成分は、本出願人らの組成物に必須ではない。従って、本出願人らの組成物の特定の実施形態には、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加の酵素および酵素安定剤、触媒物質、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成済み過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造弾性化剤、柔軟仕上げ剤、キャリア、向水性物質、加工助剤、溶媒、および／または顔料の補助剤物質のうちの１つ以上を含んでいない。しかしながら、１つ以上の補助剤が存在する場合、このような１つ以上の補助剤は、以下に詳細に記載されているように存在してよい。
【００９４】
漂白剤−本発明の洗浄組成物には、１つ以上の漂白剤を含んでよい。漂白触媒以外の適切な漂白剤としては、光漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成過酸、およびこれらの混合物が挙げられる。一般的に、漂白剤を使用する場合、本発明の組成物には、漂白剤を標記洗浄組成物の約０．１重量％〜約５０重量％またはさらには約０．１重量％〜約２５重量％含んでよい。適切な漂白剤の例としては、以下のものが挙げられる。
（１）光漂白剤、例えばスルホン化亜鉛フタロシアニン
（２）予備形成済み過酸：適切な予備形成済み過酸としては、過カルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシモノスルホン酸および塩（例えばオクシゾン（Oxzone）（登録商標）など）、並びにこれらの混合物からなる群から選択される化合物が挙げられるが、これらに限らない。適切な過カルボン酸としては、化学式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｏ−Ｍを有する疎水性、および親水性過酸が挙げられる。（式中、Ｒはアルキル基であり、所望により分岐しており、前記過酸が疎水性の場合には、６〜１４個の炭素原子、または８〜１２個の炭素原子を有し、前記過酸が親水性の場合には、６個未満の炭素原子、またはさらには４個未満の炭素原子を有し、Ｍは、対イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、または水素である）
（３）アルカリ金属塩、例えばペルボレート（通常はモノまたはテトラハイドレート）、ペルカーボネート、ペルサルフェート、ペルホスフェート、ペルシリケート塩、およびこれらの混合物のナトリウム塩などの過酸化水素源（例えば無機ペルハイドレート塩）。本発明のある１つの態様では、前記無機ペルハイドレート塩は、ペルボレート、ペルカーボネート、およびこれらの混合物のナトリウム塩からなる群から選択される。無機ペルハイドレート塩（用いた場合）は、典型的には、全組成物の０．０５〜４０重量％、または１〜３０重量％の量で存在し、典型的には、当該組成物中へ結晶固形物（コーティングされていてもよい）として組み込まれる。適切なコーティングとしては、無機塩（アルカリ金属シリケート、カーボネート若しくはボレート塩、またはこれらの混合物など）、または有機物質（水溶性若しくは分散性ポリマー、ワックス、油、または脂肪石鹸など）が挙げられる。
（４）Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌを有する漂白活性化剤（前記式中、Ｒはアルキル基であり、所望に応じて分岐しており、前記漂白活性化剤が疎水性の場合には、６〜１４個の炭素原子、または８〜１２個の炭素原子を有し、前記漂白活性化剤が親水性の場合には、６個未満の炭素原子、またはさらには４個未満の炭素原子を有し、Ｌは脱離基である。適切な脱離基の例は、安息香酸およびその誘導体（特に、ベンゼンスルホネート）である。適切な漂白活性化剤としては、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸またはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、およびノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）が挙げられる。適切な漂白活性剤はＷＯ９８／１７７６７号にも開示されている。いずれかの適切な漂白活性化剤も使用してもよいが、本発明のある１つの態様では、標記洗浄組成物には、ＮＯＢＳ、ＴＡＥＤ、またはこれらの混合物を含んでよい。
【００９５】
過酸および／または漂白活性化剤（存在する場合）は一般に、組成物に対して約０．１〜約６０重量％、約０．５〜約４０重量％、またはさらには約０．６〜約１０重量％の量で、組成物中に存在する。１つ以上の疎水性過酸またはその前駆体は、１つ以上の親水性過酸またはその前駆体と組み合わせて使用してよい。
【００９６】
過酸化水素源および過酸または漂白活性化剤の量は、有効酸素（過酸化物源由来）と過酸のモル比が１：１〜３５：１、またはさらには２：１〜１０：１となるように選択してよい。
【００９７】
界面活性剤−本発明による洗浄組成物は、界面活性剤または界面活性剤系を含んでよく、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双極性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、およびこれらの混合物から選択してよい。界面活性剤（存在する場合）は典型的に、標記組成物の約０．１重量％〜約６０重量％、約１重量％〜約５０重量％またはさらには約５重量％〜約４０重量％の濃度で存在させする。
【００９８】
ビルダー−本発明の洗剤組成物は、１つ以上の洗剤ビルダーまたはビルダー系を含んでよい。ビルダーを使用する場合、標記組成物は典型的に、ビルダーを標記組成物の少なくとも約１重量％、約５重量％〜約６０重量％、またはさらに約１０重量％〜約４０重量％含有する。ビルダーとしては、ポリホスフェートのアルカリ金属塩、アンモニウム塩およびアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属シリケート、アルカリ土類およびアルカリ金属カーボネート、アルミノシリケートビルダーおよびポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレンまたはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸およびカルボキシメチルオキシコハク酸、エチレンジアミン４酢酸およびニトリロ３酢酸のようなポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム塩、並びに、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸などのポリカルボキシレート、並びに、これらの可溶性塩が挙げられるが、これらに限らない。
【００９９】
キレート剤−本明細書の洗浄組成物は、キレート剤を含有してもよい。好適なキレート剤としては、銅、鉄および／またはマンガンキレート剤およびこれらの混合物が挙げられる。キレート剤を使用する場合、標記組成物は、標記組成物の約０．００５重量％〜約１５重量％、またはさらに約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含んでよい。
【０１００】
移染防止剤−本発明の洗浄組成物は１つ以上の移染防止剤を含有してもよい。適切なポリマー移染防止剤としては、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。移染防止剤は、標記組成物中に存在する場合、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、またはさらには約０．１重量％〜約３重量％の濃度で存在してよい。
【０１０１】
増白剤−本発明の洗浄組成物は、洗浄する物品に色合いを付けることのできる追加成分（蛍光増白剤など）を含むこともできる。適切な蛍光増白剤の濃度としては、約０．０１重量％、約０．０５重量％、約０．１重量％、さらには約０．２重量％の低い濃度から、０．５重量％またはさらには０．７５重量％の高い濃度までが挙げられる。
【０１０２】
分散剤−本発明の組成物は分散剤も含むことができる。適切な水溶性有機物質としては、ホモポリマーまたはコポリマーの酸またはそれらの塩が挙げられ、それらのうちのポリカルボン酸は、互いに炭素原子２個を超えない程度に離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
【０１０３】
追加の酵素―洗浄組成物は、洗浄性能および／または布帛ケア効果を提供する１つ以上の酵素を含むことができる。適切な酵素の例としては、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクテートリアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、およびアミラーゼ、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限らない。典型的な組み合わせは、例えば、プロテアーゼおよびリパーゼをアミラーゼとともに含んでよい酵素反応混液である。上述の追加酵素は、洗浄組成物に存在する場合、組成物の約０．００００１重量％〜約２重量％、約０．０００１重量％〜約１重量％、又、さらには約０．００１重量％〜約０．５重量％の酵素タンパク質の濃度で存在してよい。
【０１０４】
酵素安定剤−種々の技法によって、洗剤で使用する酵素類を安定化させることができる。本発明で用いる酵素は、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンを酵素に供給する最終組成物中カルシウムおよび／またはマグネシウムイオンの水溶性供給源の存在によって安定化させることができる。プロテアーゼを含む水性組成物の場合、さらに安定性を向上させるために、可逆性蛋白質分解酵素抑制剤（ホウ素化合物など）を添加することができる。
【０１０５】
触媒金属錯体−本出願人らの洗浄組成物は、触媒金属錯体を含むことができる。ある１つのタイプの金属含有漂白触媒は、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、またはマンガンの陽イオンのような、限定された漂白触媒活性の遷移金属陽イオン、亜鉛またはアルミニウムの陽イオンのような、漂白触媒活性をほとんどまたは全く持たない補助金属陽イオン、並びに、触媒金属および補助金属の陽イオンに対して限定された安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミン４酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）およびそれらの水溶性の塩を含む触媒系である。このような触媒は、米国特許第４，４３０，２４３号に開示されている。
【０１０６】
所望に応じて、本発明の組成物は、マンガン化合物を用いて触媒することができる。このような化合物および使用濃度は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５７６，２８２号に開示されているマンガン系触媒が挙げられる。
【０１０７】
本発明で有用なコバルト漂白触媒は既知であり、例えば、米国特許第５，５９７，９３６号、米国特許第５，５９５，９６７号に記載されている。このようなコバルト触媒は、例えば米国特許第５，５９７，９３６号および米国特許第５，５９５，９６７号に教示されているような既知の手順によって容易に調製される。
【０１０８】
本発明の組成物は、配位子の遷移金属錯体（例えば、ビスピドン（bispidone）（ＷＯ０５／０４２５３２Ａ１号）および／または大多環状剛性配位子（「ＭＲＬ」と略称されている）も適切に含んでてもよい。実際問題として、限定するためではないが、本発明の組成物および工程は、水性洗浄媒体において、少なくとも約１億分の１の活性ＭＲＬ種を提供するように調整することができ、典型的には、約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、またはさらには約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄溶液中に提供する。
【０１０９】
本遷移金属漂白触媒における適切な遷移金属としては、例えばマンガン、鉄、およびクロムが挙げられる。適切なＭＲＬとしては、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンが挙げられる。
【０１１０】
適切な遷移金属ＭＲＬは、既知の手順、例えば、ＷＯ００／３２６０１号および米国特許第６，２２５，４６４号で教示されている手順によって容易に調製される。
【０１１１】
溶媒−適切な溶媒としては、水および他の溶媒（例えば、親油性流体）が挙げられる。−適切な親油性流体の例としては、シロキサン、その他のシリコーン、炭化水素、グリコールエーテル、例えばグリセリンエーテルなどのグリセリン誘導体、ペルフルオロ化アミン、ペルフルオロ化およびハイドロフルオロエーテル溶媒、低揮発性の非フッ素化有機溶媒、ジオール溶媒、環境に優しいその他の溶媒、並びに、これらの混合物が挙げられる。
【０１１２】
組成物の生成方法
本発明の組成物は、いずれかの適切な形状で配合可能であり、配合者に選択されるいずれかのプロセスによって調製可能であり、それらの非限定的な実施例は、本出願者の実施例、および米国特許第４，９９０，２８０号、米国特許第２００３００８７７９１Ａ１号、米国特許第２００３００８７７９０Ａ１号、米国特許第２００５０００３９８３Ａ１号、米国特許第２００４００４８７６４Ａ１号、米国特許第４，７６２，６３６号、米国特許第６，２９１，４１２号、米国特許第２００５０２２７８９１Ａ１号、欧州特許第１０７０１１５Ａ２号、米国特許第５，８７９，５８４号、米国特許第５，６９１，２９７号、米国特許第５，５７４，００５号、米国特許第５，５６９，６４５号、米国特許第５，５６５，４２２号、米国特許第５，５１６，４４８号、米国特許第５，４８９，３９２号、米国特許第５，４８６，３０３号に記載されており、これらはすべて参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
使用方法
本発明は、ある場所、とりわけ表面または布帛を洗浄および／または処理する方法を含む。これらの方法は、本出願人の洗浄組成物の実施形態を、希釈していない形状で、または洗浄溶液中で希釈して、表面または布帛の少なくとも一部に接触させてから、所望により表面または布帛をすすぐ工程を含む。表面または布帛は、前記すすぎ工程の前に洗浄工程を経てもよい。本発明の目的上、洗浄としては、擦ることおよび機械的攪拌が挙げられるが、これらに限らない。当業者には明らかなように、本発明の洗浄組成物は理想的なことに、洗濯用途に用いるのに適している。そのため、本発明は布帛を洗濯する方法を含む。この方法は、洗濯すべき布帛を本出願の洗浄組成物の少なくとも１つの実施形態、洗浄添加物、またはこれらの混合物を含む前記洗浄洗濯溶液と接触させる工程を含む。布帛は、標準的な消費者の使用条件で洗濯できるいずれかの布帛の大部分を含んでよい。前記溶液のｐＨは約８〜約１０．５であるのが好ましい。前記組成物は、溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で用いてよい。水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。水対布帛の比率は、典型的には約１：１〜約３０：１である。
【０１１４】
試験方法１
染料または顔料物質が本発明の意図する布帛色調剤であるかを定義するための手順を以下に記載する。
１）２つのターゴトメーターポットに英国ニューカッスルアポンタインの水道水（総硬度０．２１ｇ／ｌ以下（１２グレイン／米ガロン以下、ノーザンブリアンウォーター（Northumbrian Water）（英国ダーラム、ピティーミー）から供給）を８００ｍｌ注ぐ。
２）ポットをターゴトメーターに挿入するとともに、試験中は水温を３０℃に制御し、攪拌速度を４．２ｒａｄ／ｓ（４０ｒｐｍ）に設定する。
３）各ポットにＩＥＣ−Ｂ洗剤（ＩＥＣ６０４５６洗濯機用基準塩基洗剤タイプＢ（Washing Machine Reference Base Detergent Type B）、ｗｆｋ（ドイツ、ブリュッゲン−ブラハト（Brueggen-Bracht））から供給）を４．８ｇ加える。
４）２分後、第１のポットに活性着色剤を２．０ｍｇ加える。
５）１分後、５ｃｍ×５ｃｍの材料見本に切断した平坦な綿肌着（ウォーウィックイクエスト（Warwick Equest）（英国ダーラム州コンセット）から供給）５０ｇを各ポットに加える。
６）１０分後、ポットの液を捨て、再度、ニューカッスルアポンタインの冷たい水道水（１６℃）を注ぐ。
７）２分間すすいだ後、布帛を取り出す。
８）同じ処理を用いてさらに３回のサイクルで工程３〜７を繰り返す。
９）布帛を収集し、屋内で１２時間自然乾燥させる。
１０）Ｄ６５光源およびＵＶＡ遮断フィルタを取り付けたハンターミニスキャン（Hunter Miniscan）スペクトロメーターを使用して材料見本を分析し、ハンターａ（赤−緑軸）およびハンターｂ（黄−青軸）値を得る。
１１）各組の布帛についてハンターａおよびハンターｂ値の平均値を計算する。着色剤で処理した評価対象布帛がａ軸またはｂ軸のいずれかにおいて平均で０．２単位より大きい色調の差を示した場合、本発明の意図する布帛色調剤であると判断される。
【実施例】
【０１１５】
リパーゼ変異体の実施例
緩衝剤として用いる化学物質と基質は、少なくとも試薬用の市販品である。
【０１１６】
−媒質および溶液：ＬＡＳ（サーファック（Surfac）ＰＳ（商標））およびゼオライトＡ（ウェサリス（Wessalith）Ｐ（商標））。用いるその他の成分は、標準的な実験用試薬である。
−材料：ＥＭＰＡ  Ｓｔ．ガレン（スイス、Ｓｔ．ガレン、ＣＨ−９０１４レールヒェンフェルトシュトラーセ５）製のＥＭＰＡ２２１
【０１１７】
（実施例１）：酵素の生成
遺伝子エンコード型リパーゼを含むプラスミドを構築させ、当業界の標準的な方法を用いて適切な宿主細胞に移動させる。
【０１１８】
３４℃の一定の媒質温度と１．２リットルの開始容量を用いて、フェッドバッチ発酵として発酵を行う。媒質の初期ｐＨは６．５に設定する。ｐＨが７．０まで上昇したら、１０％Ｈ３ＰＯ４を加えることによって、この値を維持させる。媒質中の溶存酸素の濃度は、攪拌速度を変えるとともに、毎分１リットルの媒質あたり１．０リットルの空気という一定の通気速度を用いることによって制御する。フィード添加速度は、フェッドバッチ局面全体にわたって一定レベルに維持する。バッチ媒質は、炭素源としてのマルトースシロップ、窒素源としての尿素と酵母エキス、および微量金属と塩の混合物を含有した。フェッドバッチ局面中に連続的に添加させるフィード物は炭素源としてのマルトースシロップを含んでおり、その一方で、窒素の十分な供給を確保する目的で、酵母エキスと尿素を添加する。
【０１１９】
リパーゼの精製は、当該技術分野において既知の標準的な方法を用いることによって、例えば、発酵上澄みをろ過してから疎水性クロマトグラフィーとアニオン交換を、例えば欧州特許０  ８５１  ９１３号に記載されているとおりに実施することによって、行ってよい。
【０１２０】
（実施例２）：相対性能（ＲＰ）を算出するためのＡＭＳＡ（機械的応力自動測定装置）
本出願の酵素変異体は、機械的応力自動測定装置（ＡＭＳＡ）を用いて試験する。ＡＭＳＡによる試験によって、大量の少容量酵素洗剤溶液の洗浄性能を調べることができる。ＡＭＳＡのプレートには、試験溶液用の数多くのスロットと、洗浄する布帛見本をすべてのスロット開口部にしっかり押し込む蓋が備わっている。洗浄時間中、前記プレート、試験溶液、布帛、および蓋を力強く振り動かし、試験溶液を布帛と接触させるとともに、機械的応力を加えるようにする。さらなる説明は、ＷＯ０２／４２７４０号、特に２３〜２４ページの「特殊な方法の実施形態（Special method embodiments）」の項を参照されたい。洗剤試験溶液が入っている容器には、金属プレート内に円筒形の穴（直径６ｍｍ、奥行き１０ｍｍ）が備わっている。汚れの付いた布帛（試験材）は、前記金属プレートの上に置き、蓋として用いて、前記容器の上を密封する。各容器からのあらゆる流出を防ぐために、別の金属プレートを、汚れの付いた前記布帛の上に置く。汚れの付いた前記布帛とともに前記２つの金属プレートを、３０Ｈｚの周波数と２ｍｍの振幅で上下に揺り動かす。
【０１２１】
この測定は、以下に定めた実験条件の下で行う。
【表３】
2009523901.tif 000011
【０１２２】
クリームウコン見本は、ウコン（デンマークのサンタマリア（Santa Maria））５ｇをクリーム（脂肪３８％、デンマークのアルラ（Arla））１００ｇと５０℃で混合し、その混合物を前記温度で約２０分間置き、（５０℃で）ろ過して非溶解粒子をすべて除去することによって、調製する。前記混合物を２０℃まで冷却し、綿布帛見本のＥＭＰＡ２２１をクリーム−ウコン混合物に浸し、その後、一晩かけて室温で乾燥させ、使用時まで冷凍する。クリーム−ウコン見本の調製については、特許出願ＰＡ２００５  ００７７５号（２００５年５月２７日申請）に開示されている。
【０１２３】
酵素変異体の性能は、規定の酵素変異体を用いて洗浄した布帛サンプルの色の輝度として測定する。輝度は、白色光を照射した時に布帛サンプルから反射される光の強度として表すこともできる。布帛が汚れている場合、反射光の強度は、汚れていない布帛の強度よりも低い。従って、反射光の強度を用いて、酵素変異体の洗浄性能を測定することができる。
【０１２４】
色測定は、専門的なフラットベットスキャナー（ＰＦＵ  ＤＬ２４００ｐｒｏ）によって行う。前記スキャナーを用いて、洗浄済み布帛サンプルの画像をキャプチャする。スキャンは、解像度２００ｄｐｉ、出力色深度２４ビットで行う。正確な結果を得るために、スキャナーは、反射ターゲットのコダック（Kodak）ＩＴ８によって頻繁に較正する。
【０１２５】
スキャン済み画像から光強度の値を抽出するために、特別設計のソフトウェアアプリケーション（ノボザイムズカラーベクターアナライザー（Novozymes Color Vector Analyzer）を用いる。このプログラムは、画像から２４ビットピクセルの値を読み出し、その値を赤・緑・青（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ベクトルとしてＲＧＢの値を合計してから、得られたベクトルの長さを以下に従って計算することによって割り出す。
【数１】
2009523901.tif 000012
【０１２６】
酵素変異体の洗浄性能（Ｐ）は、以下の式に従って算出する。Ｐ＝Ｉｎｔ（ｖ）−Ｉｎｔ（ｒ）
式中、Ｉｎｔ（ｖ）は、試験酵素で洗浄した布帛の表面の光度の値であり、Ｉｎｔ（ｒ）は、試験酵素無しで洗浄した布帛の表面の光度の値である。
【０１２７】
相対性能スコアは、「相対性能スコア（ＲＰ）は、基準酵素に対する試験酵素変異体の性能（Ｐ）の合計、つまり、ＲＰ＝Ｐ（試験酵素）／Ｐ（基準酵素）である」という定義によるＡＭＳＡ洗浄の結果として得られる。
【０１２８】
ＲＰａｖｇは、基準酵素と比較した場合の、４つのすべての酵素濃度（０．１２５、０．２５、０．５、１．０ｍｇ  ｅｐ／ｌ）の平均相対性能を表す。
ＲＰａｖｇ＝ａｖｇ（ＲＰ（０．１２５）、ＲＰ（０．２５）、ＲＰ（０．５）、ＲＰ（１．０））
【０１２９】
変異体は、基準よりも優れた性能を発揮する場合、洗浄性能の向上をもたらすと考えられる。本発明の文脈においては、基準酵素は、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のリパーゼである。
【０１３０】
（実施例３）：リスク係数を割り出すためのＧＣ（ガスクロマトグラフ）
以下の方法を用いて、固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフ（ＳＰＭＥ−ＧＣ）によって、リパーゼによって洗浄した見本から放出される酪酸を測定する。１ｍｇ／ｌのリパーゼを含む表３の規定溶液中で洗浄した４つの布帛断片（直径５ｍｍ）をガスクロマトグラフ（ＧＣ）用バイアル瓶に移す。スタビルワックス（Stabilwax）−ＤＡ  ｗ／インテグラ−ガード（Integra-Guard）というカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）とカーボクセン（Carboxen）ＰＤＭＳ  ＳＰＭＥというファイバーが備わっているバリアン（Varian）３８００ＧＣ上で前記サンプルを分析する。各サンプルは予め、１０分間、４０℃でインキュベートしてから、ＳＰＭＥファイバーによって、布帛断片の上のヘッドスペース内で２０分サンプリングする。続いて、このサンプルをカラムの上に注出する（注出温度＝２５０℃）。カラム流量は２ｍｌ  ヘリウム／分である。カラムのオーブン温度勾配は、０分＝４０℃、２分＝４０℃、２２分＝２４０℃、３２分＝２４０℃である。酪酸をＦＩＤ検出によって検出し、酪酸の検量線に基づき酪酸の量を算出する。
【０１３１】
リパーゼ変異体のリスク性能悪臭Ｒは、リパーゼ変異体によって洗浄した見本から放出される酪酸の量と、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のリパーゼ（基準酵素）で洗浄した見本から放出される酪酸の量の、双方の値がリパーゼ無しで洗浄した見本から放出される酪酸の量に対して補正された後の、比率である。変異体のリスク（Ｒ）は、以下の式に従って計算する。
悪臭＝１ｍｇの酵素タンパク質で発現した酪酸（μｇ単位で測定）／ｌ（空試験値に対して補正済み）
α試験酵素＝悪臭試験酵素−空試験値
α基準酵素＝悪臭基準酵素−空試験値
Ｒ＝α試験酵素／α基準酵素
Ｒ係数が１未満である場合、変異体では基準酵素よりも悪臭が少ないと考えられる。
【０１３２】
（実施例４）：２８０ｎｍの吸光度に対する活性（ＬＵ）
２８０ｎｍの吸光度に対するリパーゼの活性は、以下の測定ＬＵ／Ａ２８０によって割り出す。
【０１３３】
リパーゼの活性は、上記のリパーゼ活性の項に記載されているとおりに割り出す。２８０ｎｍにおけるリパーゼの吸光度を測定し（Ａ２８０）、ＬＵ／Ａ２８０の比率を算出する。相対ＬＵ／Ａ２８０は、変異体のＬＵ／Ａ２８０を基準酵素のＬＵ／Ａ２８０で除した値として算出する。本発明の文脈においては、基準酵素は、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２のリパーゼである。
【０１３４】
（実施例５）：ＢＲ（ベネフィット・リスク）
悪臭リスクの低下との比較における性能を表すベネフィット・リスク係数は、つまりＢＲ＝ＲＰａｖｇ／Ｒとして定義する。
【０１３５】
ＢＲ係数が１超である場合、変異体では、洗浄性能の向上と悪臭の減少が見られると考えられる。
【０１３６】
上記の方法を適用すると、以下の結果を得られる。
【表４】
2009523901.tif 000013
【０１３７】
基準リパーゼと表４の７および８の変異体は、ＷＯ２０００／０６００６３号に記載されている。
【０１３８】
（実施例６）
ＢＲ（ベネフィット・リスク）
ベネフィット・リスクは、表５に列挙されている変異体について測定した。ベネフィット・リスク係数は、実施例５に記載されているものと同じ方法で測定し、列挙されているすべての変異体で、ベネフィット・リスク係数が１超であることが分かった。
【表５−１】
2009523901.tif 000014
【表５−２】
2009523901.tif 000015
【表５−３】
2009523901.tif 000016
【０１３９】
基準リパーゼはＷＯ２０００／０６００６３号に記載されている。
【０１４０】
組成物の実施例
別段の指示がない限り、材料はアルドリッチ（Aldrich）（米国５３２０１ウイスコンシン州ミルウォーキー私書箱２０６０）から入手することができる。
【０１４１】
（実施例１〜６）
手洗い用またはトップローディング式洗濯機用に設計されている顆粒状洗濯洗剤組成物
【表６】
2009523901.tif 000017
【０１４２】
上記の組成物のいずれかを用いて、水中濃度６００〜１００００ｐｐｍ（典型的な中央条件は２５００ｐｐｍである）、２５℃、および水：布の比率２５：１によって、布帛を洗濯する。
【０１４３】
（実施例７〜１０）
フロントローディング式自動洗濯機用に設計されている顆粒状洗濯洗剤組成物
【表７】
2009523901.tif 000018
【０１４４】
上記の組成物のいずれかを用いて、水中濃度１０，０００ｐｐｍ、２０〜９０℃、水：布の比率５：１で布帛を洗濯する。典型的なｐＨは約１０である。
【０１４５】
（実施例１１〜１６）
【表８】
2009523901.tif 000019
【０１４６】
（実施例１〜１６）：の組成物の原料および注記
平均脂肪族炭素鎖長がＣ１１〜Ｃ１２である直鎖アルキルベンゼンスルホネートは、ステパン（Stepan）（米国イリノイ州ノースフィールド）から供給されている。
【０１４７】
Ｃ１２〜１４ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリドは、クラリアント（Clariant GmbH）（ドイツ、シュルツバッハ）から供給されている。
【０１４８】
ＡＥ３Ｓは、ステパン（Stepan）（米国イリノイ州ノースフィールド）から供給されているＣ１２〜１５アルキルエトキシ（３）サルフェートである。
【０１４９】
ＡＥ７は、ハンツマン（Huntsman）（米国ユタ州ソルトレークシティ）から供給されている、平均エトキシル化度が７のＣ１２〜１５アルコールエトキシレートである。
【０１５０】
ナトリウムトリポリホスフェートは、ローディア（Rhodia）（フランス、パリ）から供給されている。
【０１５１】
ゼオライトＡは、インダストリアルゼオライト（ＵＫ）（Industrial Zeolite（UK）Ltd）（英国エセックス州グレイズ）から供給されている。
【０１５２】
１．６Ｒシリケートは、コマ（Koma）（チェコ共和国ネステミカ（Nestemica））から供給されている。
【０１５３】
ナトリウムカーボネートは、ソルベー（Solvay）（米国テキサス州ヒューストン）から供給されている。
【０１５４】
ポリアクリレートＭＷ４５００は、ＢＡＳＦ（ドイツ、ルートウィヒスハーフェン）から供給されている。
【０１５５】
カルボキシメチルセルロースは、ＣＰＫｅｌｃｏ（オランダ、アルンヘム）から供給されているフィンフィックス（Finnfix）（登録商標）ＢＤＡである。
【０１５６】
サビナーゼ（Savinase）（登録商標）、ナタラーゼ（Natalase）（登録商標）、ターマミル（Termamyl）（登録商標）、マンナウェイ（Mannaway）（登録商標）は、ノボザイムズ（Novozymes）（デンマーク、バグスバード（Bagsvaerd））から供給されている。
【０１５７】
実施例５の表４に記載されているリパーゼ変異体１〜５、およびこれらの混合物。
【０１５８】
蛍光増白剤１はチノパル（Tinopal）（登録商標）ＡＭＳ、蛍光増白剤２はチノパル（Tinopal）（登録商標）ＣＢＳ−Ｘ、スルホン化亜鉛フタロシアニンおよびダイレクトバイオレット９はペルガゾール（Pergasol）（登録商標）バイオレットＢＮ−Ｚであり、これらはすべてチバスペシャルティケミカルズ（Ciba Specialty Chemicals）（スイス、バーゼル）から供給されている。
【０１５９】
ジエチレントリアミン５酢酸は、ダウケミカル（Dow Chemical）（米国ミシガン州ミッドランド）から供給されている。
【０１６０】
ナトリウムペルカーボネートは、ソルベー（Solvay）（米国テキサス州ヒューストン）から供給されている。
【０１６１】
ナトリウムペルボレートは、デガッサ（Degussa）（ドイツ、ハーナウ）から供給されている。
【０１６２】
ＮＯＢＳは、イーストマン（Eastman）（米国アーカンソー州ベーツビル）から供給されているナトリウムノナノイルオキシベンゼンスルホネートである。
【０１６３】
ＴＡＥＤは、クラリアント（Clariant GmbH）（ドイツ、シュルツバッハ）からパーアクティブ（Peractive）（登録商標）のブランド名で供給されているテトラアセチルエチレンジアミンである。
【０１６４】
Ｓ−ＡＣＭＣは、メガザイム（Megazyme）（アイルランド、ウィックロー）からアゾ−ＣＭ−セルロース（AZO-CM-CELLULOSE）という製品名、製品コードＳ−ＡＣＭＣとして市販されている、Ｃ．Ｉ．リアクティブブルー１９で共役されているカルボキシメチルセルロースである。
【０１６５】
ウルトラマリンブルーは、ホリデイピグメンツ（Holliday Pigments）（英国キングストンアポンハル）から供給されている。
【０１６６】
汚れ放出剤は、ローディア（Rhodia）（フランス、パリ）から供給されているリペロテックス（Repel-o-tex）（登録商標）ＰＦである。
【０１６７】
アクリル酸／マレイン酸コポリマーは、分子量が７０，０００、アクリレート：マリエートが７０：３０であり、ＢＡＳＦ（ドイツ、ルートウィヒスハーフェン）から供給されている。
【０１６８】
プロテアーゼは、ジェネンコアインターナショナル（Genencor International）（米国カリフォルニア州パロアルト）から供給されているＦＮ３である。
【０１６９】
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、（Ｓ，Ｓ）異性体（ＥＤＤＳ）のＮａ塩は、オクテル（Octel）（英国エルズミアポート）から供給されている。
【０１７０】
ヒドロキシエタンジホスホネート（ＨＥＤＰ）は、ダウケミカル（Dow Chemical）（米国ミシガン州ミッドランド）から供給されている。
【０１７１】
泡抑制剤疑集体は、ダウコーニング（Dow Corning）（米国ミシガン州ミッドランド）から供給されている。
【０１７２】
ＨＳＡＳは、米国特許第６，０２０，３０３号および米国特許第６，０６０，４４３号で開示されているような中鎖分枝状アルキルサルフェートである。
【０１７３】
Ｃ１２〜１４ジメチルアミンオキシドは、プロクター＆ギャンブルケミカルズ（Procter & Gamble Chemicals）（米国オハイオ州シンシナティ）から供給されている。
【０１７４】
非イオン性物質は好ましくは、好ましくは平均エトキシル化度が９のＣ１２〜Ｃ１３エトキシレートである。
【０１７５】
プロテアーゼは、ジェネンコアインターナショナル（Genencor International）（米国カリフォルニア州パロアルト）から供給されている。
【０１７６】
リキッティント（Liquitint）（登録商標）バイオレットＣＴは、ミリケン（Milliken）（米国サウスカロライナ州スパータンバーグ）から供給されている。
＊引用数字は１００ｇあたりの酵素量（ｍｇ）
１米国特許第４，５９７，８９８号に記載のとおり
２ＢＡＳＦからルーテンシト（LUTENSIT）（登録商標）という商品名で販売されているとともに、ＷＯ  ０１／０５８７４号に記載されているようなもの
【０１７７】
†本明細書に記載されているリパーゼ
本発明の特定の諸実施形態を図示し、記載してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく他の様々な変更および修正を実施できることが当業者には自明である。従って、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】リパーゼのアラインメントを示している。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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