(57)【要約】本発明は、微細藻類アファニゾメノン・フロスアクアエ（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  Ｆｌｏｓ  Ａｑｕａｅ  Ａｑｕａｅ  Ｒａｌｆｓ  ｅｘ  Ｂｏｒｎ．＆  Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓ  ａｑｕａｅ）（クラマス湖産ＡＦＡ）の抽出物およびその生理活性成分、特に、複合体ｃ−フィコシアニン／フィコエリスロシアニン（その発色団フィコビオロビリンを含む）として決定される、ＡＦＡフィコシアニン、ＡＦＡフィトクロムおよびマイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡ）、同成分を含む栄養、美容および薬剤組成物を、体細胞もしくは組織の急性もしくは慢性の炎症および酸化変性または無制限の細胞増殖を伴う疾患、障害または病態の予防または治療においての使用のために提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）採取直後のＡＦＡ藻類を冷凍し解凍するか、または、出発物質が乾燥ＡＦＡ藻類粉末である場合は、水で希釈したＡＦＡ粉末を超音波で分解して、細胞を破砕する；
ｂ）ステップａ）の生成物を遠心分離し、沈殿物から上清を分離する；
ｃ）水溶性成分を含む上清を回収する、
により得られる、クラマス湖産微細藻類（アファニゾメノン・フロスアクアエ（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  Ｆｌｏｓ  Ａｑｕａｅ  Ａｑｕａｅ  Ｒａｌｆｓ  ｅｘ  Ｂｏｒｎ．＆  Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓ  ａｑｕａｅ））の水性抽出物。
【請求項２】
ｄ）請求項１に記載の抽出物を、カットオフ分子量３０ｋＤａの膜を用いるサイズ除外限外濾過にかける；
ｅ）残留物を回収する、
により水溶性成分を濃縮する、クラマス湖産微細藻類の抽出物。
【請求項３】
以下のステップ：
ｆ）請求項１に記載のステップｂ）において得られる乾燥させた沈殿物を純エタノールに懸濁し、ホモジナイズし、そして暗所、室温において２４時間定常攪拌下にホモジネートを保持する；
ｇ）結果として得られる懸濁液を、４℃、３０００ｒｐｍで５分間（５’）、遠心分離する；
ｈ）上清を回収する；
ｉ）場合によって、ステップｆ）からｈ）に従い、ペレットを第２のエタノール抽出にかける；
ｌ）場合によって、上清を乾燥させ、脂溶性濃縮物を得る、
により得られる親油性成分が富化された分画を添加した、請求項１から２に記載のクラマス湖産微細藻類の抽出物。
【請求項４】
フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）、フィコビオロビリン（ＰＶＢ）、ＡＦＡフィトクロム、マイコスポリン様アミノ酸のポルフィラ３３４およびシノリンからなる群から選択される、請求項１から３に記載のクラマス湖産ＡＦＡ微細藻類抽出物の単離された生理活性成分。
【化１】
2009541389.tif 000005
【請求項５】
請求項１から３に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項４に記載の単離成分、またはその混合物を含む物質（matter）の組成物。
【請求項６】
クロロフィル、ベータカロテン、プロビタミンＡカロテノイド、キサントフィル類カロテン、カンタキサンチン、ビタミンまたはミネラルをさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
栄養、美容、または薬剤の使用に適した、請求項５から６に記載の組成物。
【請求項８】
対象における細胞または組織に対する酸化的損傷を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から３に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項４に記載のその単離成分の使用。
【請求項９】
対象における炎症を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から３に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項４に記載のその単離成分の使用。
【請求項１０】
対象における腫瘍細胞増殖を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から３に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項４に記載のその単離成分の使用。
【請求項１１】
対象における皮膚病変（affections）を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から３に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項４に記載のその単離成分の使用。
【請求項１２】
対象における眼病変（pathologies）を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から３に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項４に記載のその単離成分の使用。
【請求項１３】
前記組成物が、洗眼液の形態である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記対象が、ヒト対象である、請求項８から１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化、抗炎症および抗腫瘍特性に恵まれる、微細藻類アファニゾメノン・フロスアクアエ（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  Ｆｌｏｓ  Ａｑｕａｅ  Ａｑｕａｅ  Ｒａｌｆｓ  ｅｘ  Ｂｏｒｎ．＆  Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓ  ａｑｕａｅ）（クラマス湖産ＡＦＡ）の抽出物、およびその生理活性成分を提供する。さらに、本発明は、その抽出物またはその活性成分、特に、そのＣ−フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体（complex）を有する、ＡＦＡフィコシアニン、ＡＦＡフィトクロムおよびマイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡ）、の有効量を含む、栄養、美容および薬剤組成物を、単独でまたはその藻類に含まれる補因子（cofactors）との組み合わせで、体細胞もしくは組織の急性もしくは慢性の炎症および酸化変性または無制限の細胞増殖を伴う、疾患（diseases）、障害（disturbances）または病態（conditions）の予防または治療における使用のために提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
藍藻の多種類のうちの１つである、アファニゾメノン・フロスアクアエ（ＡＦＡ）は、オレゴン州南部のアッパークラマス湖において豊富に見出される。それは、少数の食用微細藻類の１つで、広範にわたるビタミンおよび有機ミネラル、タンパク質およびアミノ酸、オメガ３脂肪酸を含み、真に注目すべき栄養プロファイルの発現を可能とする最適な環境において野生で生育する限りにおいて、スピルリナおよびクロレラなど、池で生育する他の微細藻類と異なる。それは、クロロフィルおよびカロテンなど、抗酸化特性に恵まれた一定数の栄養物を含むことも知られている。最近数年間における多様な研究は、微細藍藻スピルリナのフィコシアニンが保有する顕著な抗酸化および抗炎症特性を示してきた、より近年、ＡＦＡ未精製抽出物のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗酸化特性が報告されている（Benedetti S., Scoglio S., Canestrari F.ら、「Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green alga Aphanizomenon Flos Aquae」、Life Sciences、第75巻、2004年、2353〜2362頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Benedetti S., Scoglio S., Canestrari F.ら、「Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green alga Aphanizomenon Flos Aquae」、Life Sciences、第75巻、2004年、2353〜2362頁
【発明の概要】
【０００４】
発明の開示
本発明は、クラマス湖産微細藻類（アファニゾメノン・フロスアクアエ（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  Ｆｌｏｓ  Ａｑｕａｅ  Ａｑｕａｅ  Ｒａｌｆｓ  ｅｘ  Ｂｏｒｎ．＆  Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓ  ａｑｕａｅ））の活性成分、すなわち、
ａ）ｉ）Ｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）およびフィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）―以下、「ＡＦＡフィコシアニン」と表す―からなり、その特異的な発色団フィコビオロビリンを含む、フィコビリソーム；ｉｉ）ＡＦＡ特異的なフィトクロム（本明細書では「ＡＦＡフィトクロム」と表す）を含み、ＡＦＡ藻類に固有の、特異的なフィコビリタンパク質複合体；
ｂ）ＭＡＡ（マイコスポリン様アミノ酸）、クロロフィル、およびカロテン
を濃縮する、その藻類の抽出物を提供する。
【０００５】
その抽出工程は、異なる成分の濃度を変更することを調節することができる、遠心分離およびサイズ除外分離技術を使用する。異なる成分の適当な濃度を保証するために、第１段階は、以下のステップ：
ａ）採取直後のＡＦＡ藻類を冷凍し解凍するか、または、出発物質が乾燥ＡＦＡ粉末である場合は、水で希釈したＡＦＡ粉末を超音波で分解して、細胞を破砕する；
ｂ）ステップａ）の生成物を遠心分離し、沈殿物（細胞壁分画の大半を保持する）から上清（細胞質分画の大半を保持する）を分離する；
ｃ）水溶性成分（基本抽出物）を含む上清を回収する、
に従い、水性抽出物（本明細書では基本抽出物と表す）を調製することである。
【０００６】
その上清を限外濾過膜に通すことにより、水溶性分画をさらに濃縮することができる。特に、抽出物を水溶性成分中に濃縮して調製するために、上述の一次水性抽出物（基本抽出物）を、好ましくは、３０ｋＤａのカットオフ分子量を有する膜を用いることによって、サイズ除外限外濾過にかけ、これにより残留物（retentate）（抽出物Ｂと表す）および濾液を得る。抽出物Ｂは、高濃度のＡＦＡフィコシアニン（Ｃ−ＰＣ＋ＰＥＣ）およびＡＦＡフィトクロムを含む。興味深いことに、ＭＡＡが、用いられるカットオフサイズを大きく下回る分子量を有するにもかかわらず、その残留物は、ＭＡＡの濃度も上昇させる。これに対し、その濾液は、高濃度のカロテン、クロロフィル、および必須脂肪酸を有する。
【０００７】
その抽出物の親油性成分は、主に、カロテン、クロロフィル、およびアルファリノレン酸（１８：３ｎ−３）により表され、これらすべてが、ＡＦＡ藻類において比較的高量で存在する。これらの成分は、部分的にその上清（基本抽出物）中に保持されるが、大部分は、上記のステップｂ）における遠心分離から生じる沈殿物中に存在する。次いで、この沈殿物は、上述の脂溶性物質の凝縮を意図するさらなる抽出工程にかけることができる。その脂溶性物質の濃縮は、以下のステップ：
ａ）乾燥させた沈殿物を１００％エタノール溶液中に懸濁させ、ホモジナイズし暗所、室温において、２４時間定常攪拌下にホモジネートを保持する；
ｂ）結果として得られる懸濁液を、４℃、３０００ｒｐｍで５分間（５’）、遠心分離する；
ｃ）上清を回収する；
ｄ）場合によって、ステップａ）からｃ）に従い、ペレットを第２のエタノール抽出にかける；
ｅ）上清を乾燥させて、脂溶性濃縮物（抽出物Ｃ）を得る
に従い、エタノールベースの抽出により得ることが好ましい。
【０００８】
こうして得られた脂溶性成分が富化された分画を、次いで、基本抽出物または限外濾過からの濾液に添加し、その抽出物中に既に存在する生理活性物質の効果を高める、可能な限り高濃度の脂溶性物質を得る。
【０００９】
本発明による抽出物は、栄養補助物質、薬剤および／または美容製品の形態で提供することができる。基本抽出物は、極めて顕著な抗酸化および抗炎症特性を保持するので、一般的に好ましい。
【００１０】
その抽出物の抗酸化特性を保持するまたは高める成分は、単離され、そして物理化学的に特徴付けられている。ＡＦＡフィコシアニン（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）の特定の種類；発色団フィコビオロビリン（ＰＶＢ）；特異的なＡＦＡフィトクロム；マイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡ）であるポルフィラおよびシノリンが、単独でまたは様々な組み合わせで、最も活性を生じ、そしてその抗酸化活性は、クロロフィル、ベータカロテン、プロビタミンＡカロテノイド、カンタキサンチンなどのキサントフィル類カロテン、ビタミンおよびミネラルなど、他の成分によりさらに上昇した。示された抗酸化活性に加えて、基本抽出物および精製済みＡＦＡフィコシアニンともに、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）酵素を顕著に阻害することがわかり、次いで、ＡＦＡ−ＰＣおよび他の抗炎症分子をともに含むことによって、ｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおける炎症を防止および／または抑制しうることがわかった、基本抽出物について、この特性が確認された。さらに、腫瘍細胞株について調べたところ、ＡＦＡフィコシアニンは、高度の抗増殖活性を有することを示した。
【００１１】
したがって、本発明は、活性成分として、クラマス湖産微細藻類の抽出物またはその単離およびその精製済み活性成分、を含む栄養、美容または薬剤組成物をさらに含む。その活性成分は、特に、ａ）ＡＦＡまたは他の任意の微細藻類中に存在する、ＡＦＡフィコシアニン（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）の特定の種類；ｂ）ＰＥＣ；ｃ）フィコビオロビリン（ＰＶＢ）；ｄ）ＡＦＡフィトクロム；ｅ）ＡＦＡ中に存在する、または他の任意の藻類供給源からの、マイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡ）であるポルフィラおよびシノリン；場合によって、クロロフィル、ベータカロテン、プロビタミンＡカロテノイド、キサントフィル類カロテン、カンタキサンチン、ビタミンおよびミネラルから選択される補因子（co-factors）または補助剤（coadjuvants）と組み合わせて、また、場合によって、栄養的、美容上または薬剤的に許容できる媒体（vehicles）または賦形剤（excipients）と組み合わせる、を指す。本発明による組成物を調製するために、上述の異なる液体抽出物は、それ自体として用いるかまたは凍結乾燥、噴霧乾燥、およびその他などの手法により乾燥させることができる。
【００１２】
好ましい実施形態において、その栄養組成物は、病原体に対する天然の防御を増強または支援する、代謝、炎症および加齢過程により産生される酸化種を除去するのに、有用な、錠剤、カプセル、飲料の形態における栄養補助食品である。別の好ましい実施形態において、その美容組成物は、皮膚科のまたは加齢関連の病変（affections）の予防または治療に用いるための、乳剤、ゲル、ローション、粉末、洗眼液、特に、軟膏またはクリームなど、また、皮膚老化ならびに皮膚および毛髪の光酸化変性を予防する光保護剤として、局所用調製物の形態である。
【００１３】
さらに好ましい実施形態において、その薬剤組成物は、錠剤、カプセル、小袋、シロップ、坐薬、バイアルおよび軟膏の形態であり、そしてフリーラジカルを媒介とする病変（pathologies）、炎症または腫瘍の予防または治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＡＦＡの細胞溶解物の成分とシネコシスチス属ＰＣＣ６８０３のその成分との比較を示す図である。
【図２】抽出物の分光光度グラフを示す図である。
【図３】ＰＣＢ発色団の分光光度走査を示す図である。
【図４】光保護化合物の分子構造を示す図である。
【図５】精製試料の波長と吸光度の関係を示す図である。
【図６】ＭＡＡ標準物質とＭＡＡ抽出物のクロマトグラムを示す図である。
【図７】精製済みＭＡＡのＵＶスペクトルを示す図である。
【図８】血漿試料中におけるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）レベルの減少を示す図である。
【図９Ａ】ＰＣおよびＰＣＢの、濃度とＲＢＣのＭＤＡ阻害との関係、ならびに濃度と血漿のＭＤＡ阻害との関係を示す図である。
【図９Ｂ】ＡＦＡ−ＰＣが赤血球のＡＡＰＨ誘導溶解を阻害する能力を有することを表す、時間と溶血との関係を示す図である。
【図１０】異なるＰＣ濃度に伴うＡＡＰＨ添加後のＦＬ蛍光消失の反応速度、およびＰＣ濃度と蛍光減衰曲線（ＡＵＣ）の線形相関を示す図である。
【図１１】異なるビリン濃度に伴うＦＬ消失の反応速度、およびＰＣＢ濃度に対するＡＵＣの正の相関を示す図である。
【図１２】トロロックス、ＧＳＨ、ＡＡ、ＰＣおよびＰＣＢの線形回帰分析を、ＯＲＡＣ値に関して示す図である。
【図１３】フィコシアニンおよびフィコシアノビリンの、濃度と蛍光阻害の関係を示す図である。
【図１４】ＰＣおよびＰＣＢの細胞吸収を評価するための、フィコシアニンおよびフィコシアノビリンの、濃度と蛍光阻害の関係を示す図である。
【図１５】ＡＦＡフィトクロムのバンドを示す図である。
【図１６】光吸収特性を示す図である。
【図１７】ＡＦＡフィトクロム量のＭＤＡレベルの用量依存的減少を示す図である。
【図１８】ＭＡＡの、ＡＡＰＨが誘発する赤血球溶血における用量依存的な低減を示す図である。
【図１９】ＭＡＡのＭＤＡ形成の用量依存的な低下を示す図である。
【図２０】ＭＤＡの形成阻害を示す図である。
【図２１】共役ジエン形成の阻害を示す図である。
【図２２】異なるＰＣ濃度による酸化の阻害を示す図である。
【図２３】ＡＦＡ抽出物中のＰＣ濃度とＭＤＡレベルとの関係を示す図である。
【図２４】水溶性および脂溶性抽出物の不在下（ブランク）および存在下における、ＡＡＰＨがもたらす相対蛍光強度の減衰を、基準となる標準物質トロロックスと比べて示す図である。
【図２５】酸化／抗酸化状態に関して、ＭＤＡ、ＧＳＨ、レチノールについて得られた結果を示す図である。
【図２６】血液試料を、酸化マーカー含量である、ＭＤＡ、カルボニル、ＡＯＰＰについての評価を示す図である。
【図２７】総チオールの血漿レベルを示す図である。
【図２８】血漿の総抗酸化状態を示す図である。
【図２９】、ＡＦＡ抽出物（水溶性部分、脂溶性部分）、純ＰＣ、およびＰＣＢによる、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害を示す図である。
【図３０】カプサイシンによる、組織における血漿タンパク質の流出の結果として、炎症部位内に蓄積した着色剤エバンスブルーの分光光度法での吸収量により測定した、組織炎症レベルを示す図である。
【図３１】ＳＰによる、組織における血漿タンパク質の流出の結果として、炎症部位内に蓄積した着色剤エバンスブルーの分光光度法での吸収量により測定した、組織炎症レベルを示す図である。
【図３２】ＡＦＡ−ＰＣが時間依存的抗増殖効果を有することを示す図である。
【図３３】皮膚表面解析用のＶＩＳＩＯＳＣＡＮ  ＶＣ９８を用いた検査を示す図である。
【図３４】皮膚の弾力性試験結果を示す図である。
【図３５】皮膚の湿潤性試験結果を示す図である。
【図３６】皮膚の形状測定結果（しわの量または深さ）を示す図である。
【図３７】皮膚の形状測定結果（しわの数および幅）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
ＡＦＡ藻類フィコビリソーム（ＡＦＡフィコシアニン）の構造決定および特異的特性
無傷のシアノバクテリア細胞において、フィコシアニン（ＰＣ）は、機能的形態（αβ）6でフィコビリソームの内部に存在する（１）。その細胞の破砕後、タンパク質は、分析される生体に応じて、異なる凝集状態（単量体、二量体、三量体、六量体）に見出すことができる。クラマス湖産ＡＦＡ藻類の場合、ＡＦＡ抽出物中に含まれるＰＣおよび抽出物自体から精製されるＰＣの両方とも、ＰＣの電気泳動解析は、タンパク質が、大半の場合、総分子量１２１０００を有する、その三量体形態（αβ）3で見出されることを示している。モノマーαβは、約４００００（１８５００のサブユニットα＋２１９００のサブユニットβ）の分子量である。これとは別に、スピルリナから精製したＰＣに関する研究の大半が、タンパク質は、スピルリナ中において、約３７５００の分子量を有する単量体形態αβで見出され、したがって、ＡＦＡから精製したＰＣと比較して異なる凝集状態を示すことを示唆する。
【００１６】
ＡＦＡフィコビリソームのクロマトグラフィー解析は、他のシアノバクテリア種におけると同様に、ＰＣのαサブユニットが１つの補欠分子族に結合するのに対し、βサブユニットは２つの補欠分子族に結合することをも示している。その補欠分子族または発色団は、フィコシアノビリン（ＰＣＢ）と呼ばれ、タンパク質の青色およびその抗酸化力の原因である（２）。
【００１７】
ＡＦＡとスピルリナとの間の根本的な差異は、フィコビリソームの異なる構造に基づく。スピルリナに対して、クラマス湖産ＡＦＡのフィコビリソームは、色素アロフィコシアニンを含まず、スピルリナには欠如する構造的要素、すなわち、フィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）、に結合する色素ｃフィコシアニンのみを含む。ＰＥＣは、今までのところ、限られた数のシアノバクテリア種中のみにおいて同定されている、光合成色素である（３）。ＰＥＣは、ＰＣの化学的構造と極めて類似する化学的構造を有し、会合して単量体および三量体を形成する２つのサブユニットαおよびβにより構成される。にもかかわらず、ＰＣの各単量体がＰＣＢの３分子に結合するのに対し、ＰＥＣはＰＣＢの２分子をサブユニットβに、また、フィコビオロビリン（ＰＶＢ）の１分子をαサブユニットに結合させる固有の特性を有し、これが、その色素の紫色の原因となっている。
【００１８】
クラマス湖産藻類のフィコビリソームは、特別に、ｃフィコシアニンおよびフィコエリスロシアニンの結合体により構成され、クラマス湖産ＡＦＡ藻類のフィコビリソームのこの異なる性質的（qualitative）構造が、スピルリナおよび他の藍藻類からＡＦＡを区別するさらに決定的な因子を追加する。
【００１９】
図１は、ＡＦＡの細胞溶解物の成分を、別のよく知られたシアノバクテリアである、シネコシスチス属ＰＣＣ６８０３のその成分と比較する。いずれのシアノバクテリアにおいても、フィコビリソームを表す青色バンドを見ることができるが、ＡＦＡ藻類におけるフィコビリソームは、より低い分子量を示し、スピルリナなど一般的な微細藻類に対し、ＡＦＡフィコビリソームにおいては、アロフィコシアニンではなく、フィコシアニンのみが存在することを確認する。さらに、図１は、ＡＦＡ中にフィコエリスロシアニンに典型的である明るい紫色のバンド（矢印により示す）も存在することを示し、これにより、クラマス湖産藻類のフィコビリソーム中におけるその存在を裏付ける。
【００２０】
各青色バンドは、質量分析計に接続したＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）によりさらに解析した。異なる保持時間により、フィコビリソームのタンパク質を分離し、その分子量に基づき同定した。得られた結果を、以下の表に示す。第１に、シネコシスチス属（表１）においては、フィコシアニン（２８．２分におけるｃｐｃＡおよび２８．９分におけるｃｐｃＢ）およびアロフィコシアニン（３０．７分におけるａｐｃＡおよび３１．２分におけるａｐｃＢ）がともに存在するのに対し、ＡＦＡ（表２）においては、フィコシアニン（２８．８分におけるｃｐｃＡおよび３０．０分におけるｃｐｃＢ）のみが存在することを観察することができる。第２に、ＡＦＡにおいては、シネコシスチス属中には存在せず、２つのビリンが付着したフィコエリスロシアニンのベータサブユニットに対応する分子量１９４６９のタンパク質（２５分におけるｐｅｃＢ）を同定した。
【００２１】
【表１】
2009541389.tif 000002
【００２２】
【表２】
2009541389.tif 000003
【００２３】
この固有の構造が、そのフィコシアニンを濃縮するＡＦＡ藻類抽出物のより強力な抗酸化および抗炎症作用を説明するのに重要な要素であり、とりわけ、なぜ、精製済みＡＦＡフィコシアニンが、スピルリナに由来するＰＣなど他のＰＣよりもさらに強力な（抗酸化および抗炎症試験がともに示すように、下記を参照のこと）結果となるかを説明するのに重要である。ＡＦＡフィコビリソームにおけるＣ−ＰＣとＰＥＣとの間の結合は極めて強いので、既知の精製手法によっては分解することができない（下記を参照のこと）。したがって、精製済みＡＦＡ−ＰＣは、複合体Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣにより構成される、精製済みＡＦＡフィコビリソームとして表されるべきである。しかし、便宜上、この複合体を、「ＡＦＡ−ＰＣ」またはＰＣと表す。
【００２４】
精製手法（図２）
ＡＦＡ−ＰＣおよびその発色団ＰＣＢは、基本抽出物から出発して精製した。ＰＣは、以下の通りに、乾燥ＡＦＡ抽出物から精製した。
・  ５００ｍｇの抽出物を、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４中に懸濁させる；
・  ４℃、２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離する；
・  上清を回収し、固体の硫酸アンモニウムを５０％飽和まで添加する；
・  試料を攪拌状態に保ちつつ、４℃で６０分間タンパク質を沈殿させる；
・  ４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離する；
・  無色透明の上清を廃棄し、少量の５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４中に青色の沈殿物を再懸濁させる；
・  同じ緩衝液に対して、４℃で一晩透析する；
・  ５ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４で平衡化した２．５×２５ｃｍのヒドロキシアパタイト製カラム（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）内に透析済みＰＣを入れる；
・  リン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０のイオン強度を上昇（５〜１５０ｍＭ）させながら、試料を溶出する；
・  分画を回収し、分光光度計により６２０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を読み取る；
・  Ａｂｓ620／Ａｂｓ280＞４（純ＰＣの指標）である分画をプールする；
・  ５０％飽和の硫酸アンモニウムにより、４℃で１時間ＰＣを沈殿させる；
・  ４℃、１００００ｒｐｍで３０分間（３０’）遠心分離する；
・  上清を廃棄し、１５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４中にＰＣを再び懸濁させる；
・  同じ緩衝液に対して、４℃で透析する；
・  精製済みＰＣをフラスコに移し、暗所中＋４℃または−２０℃で保存する。
【００２５】
図２は、精製の結果として得られる抽出物の分光光度グラフを示す。精製済みＰＣは、実際、２つのサブユニットＣ−ＰＣおよびＰＥＣを含む全フィコビリソームであるということがわかることができる。実際、Ｃ−ＰＣの最大吸収は、図２の分光分析においてピークの頂点を表す、６２０ｎｍであることが知られている。ＰＥＣの最大吸収は、αサブユニット（フィコビオロビリン）について５６６ｎｍ、およびβサブユニットの２つのＰＣＢについてそれぞれ５９３ｎｍおよび６３９ｎｍであることも知られている。３つの値すべては、実際、精製済みＰＣの分光光度パターンを構成する釣り鐘型ピークに含まれている。ＡＦＡ藻類におけるＣ−ＰＣとＰＥＣとの間の強い連結を考えると、ＰＥＣと同様ｉＣ−ＰＣも、精製済みＰＣ抽出物中に必然的に存在する。これは、ＡＦＡに由来するＰＣが、大半の研究がなされてきた、スピルリナ由来のそれ(ＰＣ)を含む、他のシアノバクテリアのＰＣとは、構造および機能の両面で、顕著に異なることを意味する。特に、この差異は、ＡＦＡ  ＰＣが、他の源に由来するＰＣと共通する一部分、すなわちＣ−ＰＣと、、異なる一部分、ＰＥＣ成分とを有するという点にあり、したがって、複合体Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣと関連する、その特性は新規であり、もっぱらＡＦＡ（および他の微細藻類に由来する類似のＣ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体）に起因する。
【００２６】
ＡＦＡフィコシアニンの定量
純ＰＣのモル濃度を測定するため、本発明者らは、三量体形態（αβ）3では７７００００Ｍ-1ｃｍ-1に等しい、６２０ｎｍにおけるモル吸光係数εを用いた。１ＭのＰＣ溶液が、６２０ｎｍにおいて吸光値７７００００を有することを意味する。
【００２７】
抽出物中のＰＣ濃度を測定するため、本発明者らは、６２０ｎｍにおいて７０ｌｇ-1ｃｍ-1の比吸光係数Ｅ1%を用いた。これは、１％のＰＣ（すなわち、１ｇ／１００ｍｌ）を含む溶液が、６２０ｎｍにおいて７０を吸収することを意味する。これらの計算によれば、基本抽出物中の平均ＰＣ含量は、８０〜１００ｍｇ／ｇ  ＤＷ（８〜１０％  ＤＷ）に等しいのに対し、抽出物Ｂ中の平均ＰＣ含量は、約３６０ｍｇ／ｇ  ＤＷ（３６％  ＤＷ）である。
【００２８】
ＰＣＢ発色団の精製（図３）
・  ５００ｍｇの抽出物を、５０ｍｌの蒸留済みＨ2Ｏ中に懸濁させる。
・  ４℃、２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離する。
・  藍色の上清を静かに移し、１％のトリクロロ酢酸でＰＣを沈殿させる。
・  攪拌しつつ、暗所中４℃で１時間インキュベートする。
・  ４℃、１００００ｒｐｍで３０分間（３０’）遠心分離する。
・  ＰＣを含むペレットを回収し、メタノールで３回洗浄する。
・  １ｍｇ／ｍｌのＨｇＣｌ2を含む１０ｍｌのメタノール中にそのペレットを再懸濁させる。
・  暗所中４２℃で２０時間インキュベートし、ＰＣからＰＣＢを放出させる。
・  ２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離し、タンパク質を除去する。
・  ＰＣＢを含む上清にβメルカプトエタノール（１μｌ／ｍｌ）を添加し、ＨｇＣｌ2を沈殿させる。
・  −２０℃で２４時間インキュベートする。
・  ４℃、１００００ｒｐｍで３０分間（３０’）遠心分離し、白色の沈殿物を除去する。
・  上清に１０ｍｌの塩化メチレン／ブタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加する。
・  ２０ｍｌの蒸留済みＨ2Ｏで洗浄し、３０００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離する。
・  上層を除去し、ＰＣＢを含む下層部分を回収する。
・  １５ｍｌ  Ｈ2Ｏ中で、ＰＣＢを３回洗浄する。
・  窒素下で乾燥させ、−２０℃で保存する。
【００２９】
結果として得られる分光光度走査は、ＰＣＢが、３７０および６９０ｎｍにおいて２つの吸収ピークを生じることを示す。
【００３０】
他のフィコシアニンとの比較におけるクラマス湖産藻類のフィコシアニンの抗酸化性の優位性
フィコシアニン（ＰＣ）は、すべての微細藍藻類の典型的な青色色素であるが、各特定の微細藻類において、異なる構造的および機能的特性を有する（２２）。栄養補助食品および潜在的な天然薬剤として用いられるＰＣの源について、今までの研究は、スピルリナに焦点を合わせている。スピルリナのフィコシアニンは、肝臓（２７）、呼吸器系（２８）、および脳（２９、３０）などの異なる生理的領域に対する顕著な活性を伴う、抗酸化（２３）および抗炎症（２４、２５、２６）特性を有することを示している。クラマス湖産藻類のフィコシアニンなど他のフィコシアニンに関する研究の欠如を踏まえ、本発明者らは、ＡＦＡ（クラマス湖産）藻類に由来する水性抽出物の抗酸化能を、微細藻類スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）に由来するＰＣを濃縮する液体抽出物である、製品Ｓｅｒｕｍ  Ｂｌｅｕ（商標）との関連で比較的に測定した。
【００３１】
ＣｕＣｌ2により酸化され、２つの抽出物と共にプレインキュベートされた、血漿試料中におけるＭＤＡ（マロンジアルデヒド）レベルの減少を図８に示すが、ここでは、１００ｎＭのＰＣ濃度における抽出物が、血漿脂質の酸化の阻害においてはるかに有効であり、同一の１００ｎＭのＰＣ濃度におけるＳｅｒｕｍ  Ｂｌｅｕ（商標）がもたらす３３％の阻害に対して８９％のレベルに達するＭＤＡ形成の阻害を伴うことを、見ることができる。これは、同じＰＣ濃度において、ＡＦＡ抽出物の方が、スピルリナ抽出物よりも顕著にさらに強力であることを示す。このような差異は、２つの明らかで相補的な因子：ａ）２種類のＰＣの構造的ひいては機能的な多様性；ｂ）フィトクロムの場合と同様、スピルリナなど他の微細藻類において、欠如する、またはＭＡＡのように、さらに希少に存在する、さらなる抗酸化因子の抽出物中における存在、に帰することができる。しかしながら、Ｃ−ＰＣ（スピルリナ由来）に関連してＡＦＡ  ＰＣのより高い抗酸化力はまた、脂質過酸化に関する文献中で提示されるデータとの比較を通じても示される。
【００３２】
血漿および赤血球の脂質過酸化
ＡＡＰＨにより酸化したラット肝ミクロソーム上のその抗脂質過酸化特性について調べたところ、スピルリナ由来のＣ−ＰＣは、ＴＢＡＲＳ（共役（conjugated）ジエン、ＭＤＡ）の産生を、１１．３５μＭのＩＣ５０で阻害した（２３、Bhatら）。スピルリナ由来のＣ−ＰＣは、ＡＡＰＨにより誘導されたヒト赤血球溶解に対してもまた、RomayおよびGonzales（４１）により調べられている：この場合のＩＣ５０は３５μＭであった。
【００３３】
本発明者らは、ＡＦＡ−ＰＣおよびそのＰＣＢ両者が、ａ）ＣｕＣｌ2により酸化されたヒト血漿；ｂ）ＡＡＰＨにより酸化されたＲＢＣ（赤血球［ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ］）、におけるＭＤＡ形成を阻害する、同じ能力を調べた。本発明者らはまた、ＡＦＡ−ＰＣおよびＰＣＢが、赤血球のＡＡＰＨ誘導溶解を阻害する、能力をも調べた。前者の場合、健常志願者に由来するヘパリン添加血液を１５００ｇでの１０分間の遠心分離後に血漿試料を得た。ＰＣまたはＰＣＢの上昇する濃度（範囲：０．１〜１μＭ）の存在下において、ＰＢＳ（対照）または１００μＭ  ＣｕＣｌ2と共に３７℃で２時間インキュベートした血漿試料中における脂質酸化の程度が、５３５ｎｍにおけるＴＢＡ反応性物質を測定することにより分析された（４２）。赤血球に関しては、インフォームドコンセントの取得後に、健常志願者から静脈穿刺を経てヘパリン添加した血液試料を得た。赤血球（ＲＢＣ）は、１５００ｇでの１０分間の遠心分離により単離し、ＰＢＳにより３回洗浄し、最後に、同じ緩衝液を用いて５％のヘマトクリットレベルまで再懸濁した。ＲＢＣは、ＰＣまたはＰＣＢの異なる濃度（範囲：０．１〜１μＭ）の存在下において、ＰＢＳ（対照）または５０ｍＭ  ＡＡＰＨと共に３７℃で４時間インキュベートした。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を主とする、脂質過酸化指標としての、ＴＢＡ反応性物質は、前記の通りに分析された（４２）。簡潔に言うと、１ｍｌの反応混合物を、２５０μｌのＴＢＡ（０．６７％）および１００μｌのＨ3ＰＯ4（０．４４Ｍ）と共に９５℃で１時間インキュベートし、次いで、１５０μｌのＴＣＡ（２０％）を添加した。遠心分離後、上清中の過酸化物含量を、ＭＤＡのモル吸光係数（ＯＤ535）を用いて決定した。
【００３４】
図９Ａに示す通り、ＰＣおよびＰＣＢは、ペルオキシルラジカル産生物質（generator）であるＡＡＰＨと共に３７℃で２時間インキュベートしたＲＢＣ（赤血球）中における脂質過酸化の程度を、用量依存的に阻害し（各試験濃度について、ｐ＜０．０５）（パネルＡ）、これと同時に、ＰＣおよびＰＣＢは、ＣｕＣｌ2と共に３７℃で２時間インキュベートした試料中における金属誘導酸化から、血漿脂質を用量依存的に保護した（ｐ＜０．０５）（パネルＢ）。いずれの阻害実験においても、ＩＣ50値は、ＰＣおよびＰＣＢに対する（スピルリナに由来するＣ−ＰＣの１１．３５μＭに対して）約０．１４０μＭおよび０．１６０μＭであった。
【００３５】
本発明者らはまた、ＡＦＡ−ＰＣが赤血球のＡＡＰＨ誘導溶解を阻害する、能力を調べた。図９Ｂが示す通り、ＡＦＡ−ＰＣは、（スピルリナに由来するＣ−ＰＣに対する３７μＭのＩＣ５０に対して）わずか２５０ｎＭのＡＦＡ−ＰＣにより、５０％を超える赤血球の溶解を、恒常的に（すなわち、１時間〜６時間にわたり）阻害することができる。
【００３６】
試験の方法または濃度における一部の差異を考慮に入れるにせよ、いずれの場合においても、スピルリナに由来するＣ−ＰＣを超えるＡＦＡ−ＰＣの優位性は、真に注目すべきであり、ＩＣ５０値における差異は、７５〜１５０倍ＡＦＡ−ＰＣに有利である。Bhatら（２３）による同じ研究で報告される通り、２００μＭのスピルリナＣ−ＰＣ用量により脂質過酸化が９５％阻害される、という事実により、効力における差異のさらに大きな兆候を見ることができる。図９Ａにおいて、本発明者らは、同程度の阻害を得るために、わずか１μＭのＡＦＡ−ＰＣが必要であること、すなわち２００倍少ないことを見ることができる。これは、Ｃ−ＰＣそれ自体と、ＡＦＡ藻類およびその抽出物を特徴づけるＣ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体との間の顕著な差異が、唯一の異なる要素である、ＰＥＣに正確に起因することを確認し、これにより、ＰＥＣがそのままで極めて強力な分子であることを示す。
【００３７】
加えて、ＰＣのＩＣ５０は、ＰＣＢのＩＣ５０よりもわずかに低い。その最も主要な活性成分と考えられる、ＰＣＢが、一旦精製されしたがってより濃縮されれば、その活性成分であるそれの全分子よりも顕著に強力であるべきことを踏まえると、これは、いささか驚くべきことである。依然として極めて強力ではあるが、実質的にやや弱化しているという事実は、全ＰＣにおいて、ＰＣＢ自体よりも実質的にさらに強力でありうる他の因子が存在することを意味する。本発明者らは、全ＰＣが、Ｃ−ＰＣおよびそのＰＣＢ発色団のほかに、ＰＣＢおよびＰＶＢ（フィコビオロビリン）をともにその発色団として含む、ＰＥＣを含むことを知る。したがって、本発明者らは、精製済みＰＣＢと全ＰＣとの間の効力における顕著な差異を創出する因子は、正確にＰＥＣ成分、特に、極めて強い抗酸化物質であると考えられる、そのＰＶＢ発色団であると考える。
【００３８】
ＡＦＡ−ＰＣおよびそのＰＣＢの抗酸化能（ＯＲＡＣ）の評価
ＯＲＡＣ（酸素ラジカル吸収能）法は、基準分子としてのトロロックス（ビタミンＥの水溶性の類似体（analog））との比較においてその活性を測定し、純粋なおよび構成する物質の総抗酸化能を決定するのに広く用いられる（３１）。しかしながら、それは、今まで、ＰＣおよびＰＣＢなど、シアノバクテリアに由来する純天然分子の抗酸化能を決定するのに用いられたことがない。
【００３９】
ＯＲＡＣアッセイは、わずかな変更を伴うOuら（３２）の方法を用いて、４８５ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光（emission）でのＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ蛍光分光光度計（ドイツ、ＢＧＭ  ＬＡＢＴＥＣＨ社製）において、３７℃で行った。簡潔に言うと、最終アッセイ混合物において、ペルオキシルラジカル産生物質としてＡＡＰＨ（４ｍＭ）と共に、フルオレセイン（ＦＬ）（０．０５μＭ）をフリーラジカル攻撃の標的として用いた。トロロックス（１μＭ）を対照標準として、また、リン酸緩衝液をブランクとして用いた。アッセイ混合物における試験化合物の濃度は、０．０２５μＭ〜２μＭの範囲にあった。すべての物質を溶解し、７５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７で希釈した。ＰＣＢ溶液は、化合物をまずエタノール中に溶解し、次いで、その溶液をその緩衝液により所望の濃度にすることにより、調製した。すべての試料は、３重（triplicate）に行った。蛍光は、ＡＡＰＨの添加後５分ごとに記録した。最終結果（ＯＲＡＣ値）は、試料とブランクとの間の蛍光減衰曲線（ＡＵＣ）下の面積における差を用いて計算し、トロロックス当量として表した。
【００４０】
ＯＲＡＣ値  ＝  ［（ＡＵＣsample−ＡＵＣblank）／（ＡＵＣtrolox−ＡＵＣblank）］×（モル濃度trolox／モル濃度sample）
ＡＡ、ＧＳＨ、ＰＣおよびＰＣＢ濃度（ｘ）に対するＯＲＡＣ値（ｙ）の線形回帰分析は、相関係数により評価されるデータを十分に説明した。
【００４１】
ＰＣは、６２０ｎｍでの励起時に６４７ｎｍにおいて発光する水溶性の蛍光タンパク質であり、この固有の蛍光は５２０ｎｍにおけるＦＬ発光とは干渉せず、ＰＣを反応混合物に添加した後に蛍光強度の変更は証明されなかった。ＡＡＰＨ添加後のＦＬ蛍光消失の反応速度上のＰＣの効果は図１０に報告され、ＰＣ濃度（０．０２５μＭ〜０．１５０μＭの範囲）と蛍光減衰曲線（ＡＵＣ）下の正味面積との間の線形相関を明確に示す（ｒ＝０．９９８、ｐ＜０．０００１）。
【００４２】
発色団ＰＣＢは、ＰＣの鮮明な青色の原因であり、タンパク質からの放出後において、ＰＣの場合と同様、ＦＬ蛍光に影響を及ぼさなかった、３７０ｎｍおよび６９０ｎｍにおける吸収の２つの特徴的なピークを示す。図１１は、異なるビリン濃度に伴うＦＬ消失の反応速度、およびＰＣＢ濃度（０．０２５μＭ〜０．１５０μＭの範囲）に対するＡＵＣの正の相関（ｒ＝０．９９５、ｐ＜０．０００５）を示す。
【００４３】
最後に、純ＰＣおよびＰＣＢが、ペルオキシルラジカルを直接に消失させる、能力を、よく知られた純抗酸化分子のそれと比較した。図１２は、トロロックス、ＧＳＨ、ＡＡ、ＰＣおよびＰＣＢの線形回帰分析を、ＯＲＡＣ値に関して報告する。これらのデータにより、本発明者らは、ＰＣおよびＰＣＢが最高のＯＲＡＣ値（それぞれ、２０．３３および２２．１８トロロックス当量）を有するのに対し、ＧＳＨおよびＡＡは、最低値（０．５７および０．７５）を示すことを見出した。ＯＲＡＣ試験においても、ＰＣＢおよびＡＦＡ−ＰＣ値が極めて類似する事実は、ＡＦＡ−ＰＣにおいてＰＥＣが果たす極めて重要な役割を確認する。
【００４４】
引用した天然化合物に対して、ＯＲＡＣ値に関する参考文献は得られない。しかしながら、本発明者らの知る限り、ＯＲＡＣ活性（ＯＲＡＣFL）がＦＬを蛍光プローブとして用いて評価された、純抗酸化分子に関しては、ＰＣＢのＯＲＡＣ値（トロロックスμモル／ＰＣＢ  μモルかそれともトロロックスμモル／ＰＣＢ  ｍｇとして表現される）が、文献中に最も高く見出される。例えば、Ouら（Ouら、2001）が、ＯＲＡＣFL法により異なるフェノール化合物の抗酸化能を決定し、見出された最高値は、７．２８および６．７６トロロックスμモル／化合物μモルであり、これは、相対ＯＲＡＣ値を、トロロックスμモル／試料μモルよりむしろ、トロロックスμモル／試料ｍｇとして表せば、フラボノイド、クエルセチンおよび（＋）−カテキンに対して、それぞれ、２４．０および２３．３トロロックスμモル／化合物ｍｇとなるのに対し、一方、ＰＣＢに対して、ＯＲＡＣは、３７．０トロロックスμモル／ｍｇとなる。
【００４５】
培養細胞上のＡＦＡフィコシアニンとそのＰＣＢの保護効果
基本抽出物から出発し、既に述べた手法に従い、本発明者らは、そのＣ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体を伴う、ＡＦＡフィコシアニンを精製し、培養生細胞上のその抗酸化特性を調べた。ＡＦＡ−ＰＣおよびＰＣＢ用量の増加とともにかまたは伴わずに、ジャーカット細胞（白血病Ｔリンパ球の不死化細胞株）に、５００μＭ  Ｈ２Ｏ２による酸化ストレスを与えた。Ｈ２Ｏ２に由来する酸化に続き、細胞内プローブ（ジクロロフルオレセイン）により放出される（emitted）蛍光を、Ｈ２Ｏ２によるインキュベーションの３０分後に蛍光計により記録した（４９２ｎｍにおける励起および５２０ｎｍにおける発光）。細胞をＡＦＡ−ＰＣ（範囲：０．１〜１０μＭ）および５００μＭ  Ｈ２Ｏ２と共に３０分間インキュベートすることにより、本発明者らは、Ｈ２Ｏ２が誘発する細胞内蛍光の低減とともに、０．５μＭのＩＣ50、および１０μＭにおける１００％阻害（非酸化細胞）を伴う、用量依存的な保護効果を観察する（図１３）。
【００４６】
Ｃ−ＰＣおよびＰＥＣからなる、全ＰＣの抗酸化特性は、Ｃ−ＰＣに対してはフィコシアニビリン（ＰＣＢ）であり、ＰＥＣに対してはＰＣＢおよびＰＶＢ（フィコビオロビリン）の両方である、その発色団に存在する。本発明者らは、Ｃ−ＰＣ発色団であるＰＣＢを精製し、これをＨ２Ｏ２により酸化された培養細胞において調べた（範囲：０．１〜４０μＭのＦＣＢ）。この場合においてもまた、本発明者らは、０．５μＭのＩＣ50、および４０μＭにおける１００％阻害（非酸化細胞）を伴う、用量依存的な抗酸化効果を観察する（図１３）。
【００４７】
試験濃度において、細胞内蛍光の増大がみられないという事実が示す通り、培養細胞を伴うがＨ２Ｏ２を伴わずに３０分間インキュベートしたＡＦＡ−ＰＣおよびＰＣＢ双方は、酸化効果を有さない。
【００４８】
極めて重要なことは、ＰＣおよびＰＣＢの細胞吸収を評価するため、両化合物を細胞と共に２時間プレインキュベートし、その後、培地を洗浄して、任意の非吸収ＰＣおよびＰＣＢを除去し、Ｈ２Ｏ２により３０分間細胞を酸化させたことである。図１４が示す通り、細胞内蛍光の用量依存的な阻害がある。これは、細胞が、膜内または細胞質内に、両抗酸化分子をともに保持しうることを意味する。
【００４９】
これは、２つの分子の抗酸化活性が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて治療用に有効である可能性が極めて高いことが分かるので、極めて重要な知見である。
【００５０】
精製済みスピルリナＣ−ＰＣに関してなされた研究が、細胞の細胞質ゾルへ浸透するその能力を既に分かっていた（４３）のに対し、これは、精製済みＰＣＢが細胞内に、入りそして保持される能力の最初の実証である。さらに、これは、同じ能力が、特異なＡＦＡ−ＰＣ（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体）について示された最初である。試験濃度において、細胞内蛍光の増大がみられないという事実が示す通り、細胞と共に２時間インキュベートされたＰＣおよびＰＣＢはともに、酸化効果を生じなかった。
【００５１】
酸化作用物質および抗酸化物質を同時に添加した、図１３において、本発明者らは、ＰＣおよびＰＣＢが与える細胞保護の程度が同等であることを認めるのに対し、図１４から示される通り、吸収試験において、ＰＣＢの抗酸化効果は、やや速く（ＰＣに対するＩＣ５０が４．２μＭであるのに対し、ＰＣＢに対するＩＣ５０は１．９μＭ）、また、やや高い（ＰＣによる９０％未満の保護に対して、ＰＣＢによる９０％を超える保護）という結果となる。これは、ＰＣと比べて、ＰＣＢの吸収度が、（ＰＣＢのより精製された性質を踏まえれば、予測されうる通り）実際にやや高いことを意味する。にもかかわらず、吸収度は、いずれの場合においても、抗酸化物質および酸化作用物質の同時の添加とともに与えられる保護の程度に極めて近いことを踏まえれば、いずれの化合物に対して真に注目すべきである。
【００５２】
他方では、この生細胞試験は、全ＰＣの抗酸化特性に対するＰＥＣ成分の重要な関連性についての前の検討材料（consideration）を確認する。図１３および１４がともに示す通り、精製済みの全ＰＣが、精製済みＰＣＢと同じ極めて高い抗酸化力を有し、その濃度が、全ＰＣの一部としてのその濃度と比べて、精製後、さらに高い、という事実は、ＰＣＢがＰＣの唯一の活性作用物質ではなく、実際、１つまたは複数の他の作用物質が（ＰＶＢから出発して）、ＰＣ中に存在することなら何であれ、それらは、ＰＣＢ自体よりも顕著により強力である可能性が極めて高い、ということを示唆する。
【００５３】
抽出物をその中に含まれるＡＦＡフィコシアニンよりも有効とする相乗作用因子の新規な決定
本発明者らは、Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体を有する、ＡＦＡ−ＰＣが、スピルリナなどの他の藻類に由来する純Ｃ−ＰＣよりも顕著により強力であるということを見てきた。しかし、クラマス湖産藻類中には、その主要な抗酸化および抗炎症性の本質（principle）である、フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体と比べて、基本抽出物から出発する、その抽出物の優位性を説明する他の因子が存在する。
【００５４】
このような差を説明する主な因子は、ＡＦＡ藻類の光制御系を構成するより広範なフィコビリタンパク質複合体を構成する第２の要素、すなわち、絶対的には、その藻類において今まで見出された最も強力な抗酸化の本質である、その特異的な発色団である。クラマス湖産藻類が特に富む、「マイコスポリン様アミノ酸」またはＭＡＡと呼ばれる、すべての藻類に典型的な特異的な分子、ならびに、クロロフィル、ベータカロテンおよびカロテノイド、に加えて各種のビタミンおよびミネラルなど、その抗酸化作用および抗炎症作用が既に知られている一連の栄養分子中に、さらなる因子を同定することができる。
【００５５】
Ａ）クラマス湖産藻類に典型的な固有のフィトクロムである、「ＡＦＡフィトクロム」の同定
フィトクロムは、植物が光を検出するのに用い、可視スペクトルの赤色および遠赤色領域における光に対して感受性のある、光受容体、色素である。これらは、（日周期のリズム（rythms）を通して）開花の調節、発芽およびクロロフィルの合成を含む、植物における多くの異なる機能を果たす。ＡＦＡにおけるこのフィトクロムの固有の種類の存在が、光合成過程においてＣフィコシアニンを補うよう他のシアノバクテリアが通常用いる他のフィコビリタンパク質、すなわち、アロフィコシアニン、の欠如により説明しうるので、後者（クロロフィルの合成）は、ＡＦＡ藻類との関連で特に重要である。一方、本発明者らが見たように、クラマス湖産藻類におけるアロフィコシアニンの位置はＰＥＣにより占められるが、特に、クラマス湖産藻類が、高い光回収能力を必要とする非熱帯環境において生育することを考えると、ＰＥＣのみでは十分でないと思われ、したがって、ＡＦＡ藻類は、そのより高い必要性を独自のフィトクロムで調和させていると思われる。
【００５６】
本明細書において初めて検出され記載される、ＡＦＡフィトクロムは、独自の特異な構造を有するが、フィトクロムの一般的な群（family）を代表するものとしてこれを定義することも依然として可能である。長年にわたり、異なる種類のフィトクロムが植物において見出されており、それは、異なるフィトクロム遺伝子（例えば、コメにおいて３種類、トウモロコシにおいて６種類）を有するだけでなく、各植物、または少なくとも各植物群の、特異的なフィトクロムの、その大半で、顕著に異なるタンパク質成分、したがって構造を有する。にもかかわらず、これらがすべてフィトクロムであるのは、これらがすべて、フィトクロモビリンと呼ばれる、同じビリタンパク質を、光吸収発色団として、用いるからである。この発色団は、フィコシアニンの発色団であるフィコシアノビリンと類似し、４つのピロール環（テトラピロール）の開鎖からなる単一のビリン分子であることを特徴とする。すべてのフィトクロムの活性本質は、異なる種間におけるいくつかの変異を考慮に入れるにせよ、その異なる一般構造において、なおもこの発色団のままであるので、各単一フィトクロムの特性を他のフィトクロムにも帰することができる（４４）。より具体的に、その正常のＰr状態において、このビリタンパク質は、６５０〜６７０ｎＭの最大値で吸光するが、赤色光により活性化されると、７３０ｎＭの最大吸収でＰfrに変換される。
【００５７】
ＡＦＡフィトクロムの説明と精製
ＡＦＡフィトクロムは、相対的に固有の構造を有する一方で、赤色／遠赤色スペクトルにおける光を吸収するその発色団として、ビリタンパク質を有する。その構造および活性を確立するため、本発明者らは、以下のプロトコールによりフィトクロムを精製した。
【００５８】
・  １ｇの抽出物を１０ｍＬのリン酸１Ｋ緩衝液、ｐＨ７．０中に懸濁させる。
【００５９】
・  その半分の体積とともに、１分間にわたるボルテックスを２回行う。
【００６０】
・  細胞を２％トリトンＸ１００とともに３５分間（３５’）インキュベートする。
【００６１】
・  ２８０００ｒｐｍで１６〜１８時間遠心分離する。
【００６２】
・  スクロース密度段階勾配法により、上清を回収する。
【００６３】
・  スイングアウトローターを用いて、１５００００ｇで１２時間、勾配分離物をスピンする。
【００６４】
・  −２０℃で保存する。
【００６５】
フィトクロムが、約１Ｍのスクロースで可視化される、強い橙色の溶解物バンドに対応するのに対し、フィコビリソームは、約０．７５Ｍに位置する。２つのバンドのこの関係はまた、三量体ＡＦＡ−ＰＣの約４倍である、その藻類中に存在するフィトクロムの分子量についても、信頼できる指標を与える。後者（三量体ＡＦＡ−ＰＣ）が１２１Ｋｄであるので、本発明者らは、ＡＦＡフィトクロムのＭＷを約４８０Ｋｄにおいてあらかじめ確立することができる（図１５）。
【００６６】
その光吸収特性について調べたところ、フィトクロムは、平衡状態におけるＰr（赤色光吸収）形態およびＰfr（遠赤色光吸収）形態にそれぞれ対応する、６７２ｎＭおよび６９４ｎＭにおいて２つのピークを伴い吸光することを示す（図１６）。
【００６７】
ＡＦＡ中に含まれるフィトクロムの量について、本発明者らの最初の評価は、以下の予備的な結果を与える：２ｍｇ／ｇ（または０．２％  ＤＷ）。抽出物について、基本抽出物中では濃度が約０．５％に上昇し、抽出物Ｂ中では約１％に上昇した。
【００６８】
抗酸化活性
精製済みＡＦＡフィトクロムは、極めて強力な抗酸化物質であることを示した。１００μＭにおける酸化作用物質ＣｕＣｌ2と共にヒト血漿試料を２時間インキュベートすると、チオバルビツール酸との反応後５３５ｎｍにおける分光光度計により測定（ＴＢＡ試験）される、脂質過酸化の後期副生成物（a late byproduct）である、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルの上昇が生じる。ＡＦＡ藻類から抽出したＡＦＡフィトクロム量を増加させながら（２〜１６ｎＭ）１００μＭのＣｕＣｌ2と共に３７℃で２時間、血漿をインキュベートすると、ＭＤＡレベルの極めて強力な用量依存的減少を観察することができる（図１７）。実際、本発明者らは、わずか１６ｎＭのＡＦＡフィトクロムにより、対照に近いＭＤＡレベルを伴う、ほぼ完全な脂質過酸化の阻害を得る。３．６ｎＭのＩＣ５０が、ＰＣＢに対して得られるＩＣ５０を４５倍下回ることが注目される。本明細書に記載のフィトクロムが、ＡＦＡ−ＰＣと比べて、基本抽出物に観察される、より高い抗酸化活性の原因であることは疑いない。
【００６９】
Ｂ）クラマス湖産藻類の「マイコスポリン様アミノ酸」（ＭＡＡ）の同定
ＭＡＡは、アミノ酸またはそのアミノアルコールを置換している、窒素原子で接合した（conjugated）シクロヘキセノンまたはシクロヘキセニミン発色団を特徴とする、水溶性の化合物である（図４に示す）。
【００７０】
それは、３１０〜３６０ｎｍの範囲の最大吸収および約３００の平均分子量を有する（４）。ＭＡＡは、選択的にＵＶ光子の吸収の後、光化学反応を生じることなしに無害な熱の形態で吸収された放射エネルギーの散逸を受けて、これによって、少なくとも部分的に、屈光性（phototropic）生物の成長および光合成を、保護する、受動的なサンスクリーンである。ＵＶ遮蔽において役割を有するほか、いくつかのＭＡＡがまた、生物中において光力学的に産生される活性酸素種のスカベンジャーとして作用する抗酸化特性をも示すことが明らかにされている（５）。
【００７１】
本発明者らは、藍色植物門のアファニゾメノン・フロスアクアエおよびその抽出物におけるＭＡＡの存在を調べた。今日まで報告されるシアノバクテリアの大半は、その主要ＭＡＡとしてシノリンを含むが、本発明者らは、少量のシノリンに加え、アファニゾメノン・フロスアクアエ中の主要ＭＡＡとして、ポルフィラ３３４のまれな存在を見出した。
【００７２】
【化１】
2009541389.tif 000004
【００７３】
ＭＡＡの抽出、精製、および定量
ＭＡＡは、既に報告されているように抽出された（６）。簡潔に言うと、４５℃の水浴中に２．５時間インキュベートすることにより、２ｍｌの２０％（ｖ／ｖ）含水メタノール（ＨＰＬＣグレード）中で２０ｍｇのＡＦＡ粉末または２０ｍｇの抽出物を抽出した。遠心分離（５０００ｇ；米国、パロアルト、Ｂｅｃｋｍａｎ社製、ＧＳ−１５Ｒ型遠心分離機）後、上清を蒸発乾燥させ、２ｍｌの１００％メタノール中に再溶解し、２〜３分間ボルテックスし、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を蒸発させ、ＨＰＬＣにおける分析用に同じ容量の０．２％酢酸中か、または、抗酸化特性の評価用に２００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に抽出物を再溶解させた。試料は、ＨＰＬＣ分析、または抗酸化特性試験（下記を参照のこと）にかける前に、０．２μｍ孔径のシリンジフィルター（イタリア、ミラノ、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）により濾過した。
【００７４】
ＡＦＡおよびその抽出物のＭＡＡは、３３４ｎｍの最大吸収を有する。ＭＡＡのさらなる精製は、文献（７）に従い、Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８型カラムおよびガード（イタリア、ミラノ、Ａｌｌｔｅｃｈ社製、４．６×２５０ｍｍ内径、５μｍ充填剤）を装備したＨＰＬＣシステム（日本、東京、日本分光株式会社製）を用いて行われた。検出波長は３３０ｎｍ、移動相は流量１．０ｍｌ分-1における０．２％酢酸であった。ＭＡＡの同定は、ドイツ、エアランゲン、フリードリヒアレクサンダー大学、Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｋｌｉｓｃｈ博士のご厚意により提供された、ポルフィラ３３４、シノリンおよびパリシンを主に含む、アマノリ属種およびオバクサ属種などの標準品と吸収スペクトルおよび保持時間を比較することにより行った。試料の吸収スペクトルは、シングルビーム分光光度計（米国、パロアルト、Ｂｅｃｋｍａｎ社製、ＤＵ６４０型）の２００〜８００ｎｍにおいて測定した。生スペクトルは、コンピュータに転送し、ＭＡＡのピーク解析のために数学的に処理された。
【００７５】
ＭＡＡは、前述のようにＡＦＡ試料および抽出物から部分的に精製された。４５℃で２．５時間の２０％メタノールによる試料の抽出は、この手順により、少量の光合成色素（６２０ｎｍにおけるフィコシアニンなど）も抽出されたにせよ（以下の図の破線を参照のこと）、３３４ｎｍにおいて顕著なピーク（ＭＡＡ）を生じた。ＭＡＡ試料は、タンパク質および塩を除去するために、１００％メタノールによりさらに処置され、最終的に非極性光合成色素を除去するために、０．２％酢酸によりさらに処理された。結果として得られる、部分的に精製されたＭＡＡは、３３４ｎｍに最大吸収を有した（図５、実線）。
【００７６】
３３４ｎｍにおいて吸収する化合物が、単一のＭＡＡであるか、または１以上のＭＡＡの混合物であるかを見出すため、ＨＰＬＣによりＭＡＡのさらなる解析および精製を行った。その試料のクロマトグラム（図６）は、シノリンおよびポルフィラ３３４としてそれぞれ同定された、保持時間４．２分（ピーク１）および７．６分（ピーク２）を有する２つのＭＡＡの存在を示す。ポルフィラ３３４は、シノリンが少量でのみ存在する（ピーク面積比１：１５）ので、ＡＦＡにおける主要なＭＡＡであると思われる。
【００７７】
精製済みＭＡＡのＵＶスペクトルは、３３４ｎｍにおけるその最大吸収を確認した（図７）。シノリンおよびポルフィラ３３４に対する３３４ｎｍにおけるモル吸光係数が、それぞれ、４４７００および４２３００Ｍ-1ｃｍ-1であることを考慮し、本発明者らは、
ａ）クラマス湖産藻類について、シノリンに対して０．４９ｍｇｇ-1ＤＷの濃度およびポルフィラ３３４に対して７．０９ｍｇｇ-1ＤＷの濃度；したがって、そのＭＡＡ総含量は、０．７６％藻類ＤＷに等しい；
ｂ）抽出物について、ＭＡＡに対して１７〜２１ｍｇの濃度（すなわち、１．７〜２．１％  ＤＷ）
を計算した。
【００７８】
全藻類ＡＦＡが、ＵＶ曝露下で見出される最大濃度、すなわち、０．８４％に近い、高構成レベルのＭＡＡ（０．７６％  ＤＷ）を含む（８）ので、これらは重要なデータである。また、本発明者らは、その抽出物が、全藻類よりもはるかに高い濃度を有し、最大可能濃度よりもはるかに高いレベルに達している、ことをも見出した。
【００７９】
ＭＡＡ（抽出物中のシノリンおよびポルフィラ３３４）は、分子量３００を有する、構造的に単純な分子である。このことは、これらの水溶性分子が、腸内膜から血液脳関門に至る、各種の障壁を容易に通過することを可能にし、腸（gut）から脳に至る、どこでも必要な、その抗酸化活性を発現する能力を確認する。
【００８０】
ＭＡＡの抗酸化効果の評価
抽出物中に含まれるＭＡＡの抗酸化特性を評価するため、ヒト赤血球試料を、フリーラジカル鎖の形成を誘発し、その結果、ドラブキン溶液によりヘモグロビンを定量することにより測定される（３３）、赤血球溶血の並行な上昇と共に膜のリン脂質の酸化を誘発する、１００ｍＭ  ＡＡＰＨとともに、漸増量のＭＡＡ（５〜８０μＭ）と共に、３７℃で３時間インキュベートした。結果を図１８に示すが、ここで、ＡＡＰＨが誘発する赤血球溶血における用量依存的な低減を、ＭＡＡがいかにしてもたらし、これにより細胞を酸化的損傷から保護するのかを、観察することができる。
【００８１】
同様に、酸化作用物質（１００μＭのＣｕＣｌ2）による血漿試料のインキュベーションは、チオバルビツール酸との反応後５３５ｎｍにおける分光光度計により測定（ＴＢＡ試験）される、脂質過酸化の後期副生成物である、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルの上昇を生じる。クラマス湖産ＡＦＡ藻類から抽出したＭＡＡ量を増加させながら（５〜８０μＭ）１００μＭのＣｕＣｌ2と共に３７℃で２時間、血漿をインキュベートすると、図１９に示す通り、ＭＤＡレベルの用量依存的な低下を観察することができる。ＭＡＡ濃度を８０μＭに等しくすると、非酸化血漿（対照）の場合と極めて類似するＭＤＡレベルが得られる。
【００８２】
いずれの試験も、ＡＦＡに由来するＭＡＡが、抽出物に、そのフィコシアニンに由来するもの以外に、フリーラジカルのスカベンジャーとしてより強力な力を与える、真の抗酸化分子であると本発明者らが明言することを可能にする。
【００８３】
Ｃ）抽出物を、それに含まれるフィコシアニンよりもさらに強力にする、さらなる相乗作用因子の決定
クラマス湖産ＡＦＡ藻類は、異なる機能活性に恵まれた広範な栄養基質（matrix）を含む。特に、クラマス湖産藻類およびその抽出物は、クロロフィル；ベータカロテンおよび他のプロビタミンＡカロテノイド；カンタキサンチンなどのキサントフィル類カロテン；抗酸化ビタミンおよびミネラルなどの重要な活性本質を含む。
【００８４】
クロロフィル
最近数年間において、クロロフィル（ＣＨＬ）の半合成類似体である、クロロフィリン（ＣＨＬＮ）という分子に関する研究が力強く発展している。多様な研究が、ＣＨＬＮの顕著な抗酸化特性、特に、肝臓および脳などの重要器官との関連において、より共通の抗酸化物質（ビタミンＣおよびＥ、ＧＳＨ、など）よりも顕著に高い抗酸化特性を明示している（９）。その抗酸化特性は、ＣＨＬＮがＣＯＸ−２を選択的に阻害する能力に起因する、特異的な抗炎症特性と関連する（１０）。クロロフィルがＣＯＸ−２を選択的に阻害する能力は、フィコシアニンによる同じ能力と共に、抽出物を天然の抗炎症剤として特に強力なものとしている。このことは、抽出物が、その中に含まれるフィコシアニンよりもより強力なＣＯＸ−２阻害剤である、事実を説明する一助にもなる。
【００８５】
より一般的に、ＣＨＬＮは、肝癌（１２）、乳癌（１３）および結腸癌（１４）などの各種腫瘍との関連において、抗突然変異誘発特性（１１）および抗増殖特性を示している。フィコシアニンも、顕著な抗増殖特性を有するので、両分子の同時的な存在が、抽出物を、潜在的に重要な抗腫瘍生成物としている。
【００８６】
研究の大半は半合成ＣＨＬＮについてのものであるとはいえ、２つの分子の密接な類似性を踏まえると、天然のクロロフィルにも同じ特性を帰することができる。実際、２つの分子の抗増殖能を比較したところ、天然のＣＨＬの方が、はるかに低濃度において、ＣＨＬＮよりもさらに顕著に強力であることが示されている。（１５）。
【００８７】
クラマス湖産藻類においては、クロロフィル濃度が、（ウィートグラスおよび他の草類など、クロロフィルに最も富む野菜に対する最大濃度０．３％に対して）最低１％を有し、天然における最高濃度の１つであることを考えると、フィコシアニンとクロロフィルの抗酸化、抗炎症、および抗増殖の相乗作用が、クラマス湖産ＡＦＡ抽出物の顕著な優位性に寄与する。
【００８８】
ＡＦＡ藻類におけるクロロフィルａの定量法は、文献（１６）で論じられる通り、藻類細胞を破砕した後、有機溶媒中への色素の抽出、それに続く分光光度法による測定、に基づく。異なる種類の有機溶媒を用いた後、本発明者らは、メタノールが、最良の抽出能を有することを見出した。試料（１００ｍｇのＡＦＡリフラクタンスウィンドウ２メッシュ１２２／０７１００５）を、１０ｍｌの１００％メタノール中に懸濁させ、ポッター型ホモジナイザー（a mechanical potter）により３分間（３’）ホモジナイズし、暗所中、室温で２４時間、回転プレート上に放置した。
【００８９】
次いで、結果として得られる抽出物を４℃、３０００ｒｐｍで５分間（５’）遠心分離し、上清を回収し投与する一方、ペレットは第２の抽出のため、１０ｍｌの１００％メタノール中に再び懸濁させた。室温で２４時間後、その抽出物を４℃、３０００ｒｐｍで５分間（５’）遠心分離し、上清を回収し投与する一方、ペレットは３回目の抽出のため、１０ｍｌの１００％メタノール中に再度再懸濁させた。その色素が６６４ｎｍにおいて特徴的な吸収ピークを有するので、以下のＰｏｒｒａの式（１７）により、３つのメタノール抽出物中のクロロフィルａ濃度を計算した。
【００９０】
クロロフィルａ（μｇ／ｍｌ）＝１６．２９×Ａｂｓ664
１回目の抽出により、本発明者らは、９６．１１μｇ／ｍｌのクロロフィルａ濃度を得、２回目および３回目の抽出により、４．６３および０．６８μｇ／ｍｌの濃度を得た。したがって、ＡＦＡ試料中のクロロフィルａの総含量は、１０１．４２μｇ／ｍｌまたは１０．１４ｍｇ／ｇ  ＤＷ（１．０１４％  ＤＷ）である。
【００９１】
上述と同じ手法を用いることによって、本発明者らは、基本抽出物中において、クロロフィル含量が約５０％低下し、したがって、濃度が約０．５％低下することを見出した。
【００９２】
カロテン
クラマス湖産藻類は、ベータカロテン中に発現された、高含量のカロテンを有する。さらに、それは、ビタミンＡの前駆体および非前駆体のいずれでもある、広範なカロテンを含む。非前駆体のうち、クラマス湖産藻類は、特に顕著なカンタキサンチン含量を有する。
【００９３】
クラマス湖産藻類  ベータカロテンとしての総カロテン＝１６００ｍｇ／Ｋｇ
カンタキサンチン＝３２７ｍｇ／Ｋｇ
基本抽出物  ベータカロテンとしての総カロテン＝４２０ｍｇ／Ｋｇ
カンタキサンチン＝４１ｍｇ／Ｋｇ
抽出物Ｂ  ベータカロテンとしての総カロテン＝２４００ｍｇ／Ｋｇ
上記の数字は、長年にわたる異なる生成物バッチに対する異なる試験の平均である。基本抽出物中のカロテン濃度は、依然として顕著であるとはいえ、明らかに低下している。とりわけ、藻類およびその抽出物中のカロテンは、通常の野菜において、部分的に吸収を阻害する、いかなるセルロース膜も他の因子も有さない、天然の食物源に由来するので、ヒト（our organism）により高度に吸収される。血漿レチノールは、ビタミンＡの活性形態であり、重要な抗酸化特性を有し、眼から肝臓、口から神経系に至る、ヒトの各種の系を保護しうることが示されている（１８）。
【００９４】
ＲＯＳと比較して、ベータカロテンそのものよりもより高い抗酸化作用に恵まれ（１９）、一重項酸素に関しては、ベータカロテンとリコペン（最大効果）と、ルテインとゼアキサンチン（最小効果）との中間の抗酸化作用に恵まれた（２０）、カロテノイドである、カンタキサンチン含量が特に興味深い。カンタキサンチンはまた、藻類およびその抽出物に含まれるフィコシアニンおよびクロロフィルの同じ特性と相乗作用する、強力な抗脂質過酸化特性をも有する（２１）。この相乗作用が、抗酸化および抗炎症活性の観点では、抽出物は、その中に含まれる精製済みフィコシアニンよりもさらに強力であるという事実を説明する一助となる。
【００９５】
基本抽出物をＡＦＡフィコシアニンおよびＰＣＢと対比して調べる
ＣｕＣｌ2による酸化的損傷に由来するＴＢＡＲＳ形成の基本抽出物の阻害
ＡＦＡ  ＰＣの標準的な含量を有する、抽出物の抗酸化力は、精製済みＰＣそのものの抗酸化力のほか、ＰＣの活性補欠分子族である、精製済み発色団フィコシアノビリン（ＰＣＢ）の抗酸化力ともまた比較されている。ＣｕＣｌ2による血漿の酸化により生じるマロニルジアルデヒド（ＭＤＡ）の形成に関する試験は、抽出物が、全抽出物中における他の活性抗酸化分子の存在に起因して、純ＰＣおよびその発色団ＰＣＢよりもさらに高い抗酸化力を有することを示し、一方、ＰＣおよびＰＣＢが、１００ｎＭの濃度におけるＭＤＡ形成阻害度３０〜４０％による、同様の抗酸化能を有するのに対し、１００ｎＭの同様のＰＣ濃度を有する、基本抽出物は、最大８９％までの阻害度を生じることを示す（図２０）。
【００９６】
ＣｕＣｌ2による血漿の酸化後における共役ジエンの形成においてもまた、ＰＣ濃度１００ｎＭにおける基本抽出物は、同じ１００ｎＭの濃度における純ＰＣよりも顕著に高い抗酸化能を有する。実際、図２１は、純ＰＣに反して、その抽出物とともに、共役ジエンの形成が事実上完全に阻害されることを示す。さらに、このことは、基本抽出物が、その中における他の活性分子、特に、ＡＦＡフィトクロムの、存在に明らかに起因して、いかに純ＰＣよりも顕著により強力であるかを示す。
【００９７】
ＣｕＣｌ2による酸化的損傷に由来するＴＢＡＲＳ形成のプレインキュベートした基本抽出物の阻害
ＡＦＡ抽出物をヒト血漿試料と共にプレインキュベートし、これに続いて１００μＭで酸化作用物質ＣｕＣｌ2による同じ試料のインキュベーションを行ったところ、２４５ｎｍにおける分光光度計により初期副生成物（early by-products）である共役ジエンの産生によって測定されるように、リポタンパク質の酸化が、用量依存的に強く減少した。ジエンの形成がその抽出物により阻害される、最初の遅延段階（a first lag-phase）の後にさらに進行する酸化、その漸進的な減少は、抽出物中わずか１５０ｎＭのＰＣ濃度によりほぼ完全な阻害レベルに達する（図２２）。
【００９８】
ＣｕＣｌ2による血漿脂質の酸化は、後の段階において、マロニルジアルデヒドまたはＭＤＡの形成をもまた、生じる。ＡＦＡ抽出物とともに血漿のプレインキュベーションはまた、ＭＤＡレベルの用量依存的な減少をも生じ、これは、わずか１００ｎＭのＰＣ濃度により、本発明者らが、非酸化または対照血漿の場合と完全に同等なＭＤＡ値を得る（＃ｐ＜０．０５）ほどに強力であった（図２３）。
【００９９】
基本抽出物のＯＲＡＣ評価
ＯＲＡＣ試験により抽出物の抗酸化能を評価するために、本発明者らは、ＰＣおよびＰＣＢについてＯＲＡＣを調べるのに用いたのと同じ手法を用いた。ＡＦＡ抽出物の水溶性および脂溶性成分をともに調べるため、本発明者らは、まず、以下の通りに、２つの水溶性および脂溶性抽出物を調製した。
【０１００】
水溶性抽出物の調製
・  １０ｍｇの抽出物を１ｍｌの蒸留水中に量り取り、ポッター型ホモジナイザーにより１分間ホモジナイズする。
【０１０１】
・  ４℃、２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離し、細胞破屑物を除去する。
【０１０２】
・  上清を回収し、ペレットを１ｍｌの水中に再懸濁させる。
【０１０３】
・  ポッター型ホモジナイザーにより１分間ホモジナイズする。
【０１０４】
・  ４℃、２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）、遠心分離する。
【０１０５】
・  上清を回収し、最初の水による抽出物から得られた上清と混合する。
【０１０６】
・  その水による抽出物（ＰＣの存在により、青色を有する）を、＋４または−２０℃で保存する。
【０１０７】
脂溶性抽出物の調製
・  前出の抽出から得られたペレットを、１ｍｌのアセトン中に再懸濁させる。
【０１０８】
・  ポッター型ホモジナイザーにより、１分間ホモジナイズする。
【０１０９】
・  上清を回収し、ペレットを１ｍｌのアセトン中に再懸濁させる。
【０１１０】
・  ポッター型ホモジナイザーにより１分間ホモジナイズする。
【０１１１】
・  ４℃、２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）、遠心分離する。
【０１１２】
・  上清を回収し、最初のアセトンによる抽出物から得られた上清と混合する。
【０１１３】
・  その脂溶性抽出物（カロテンの存在により、橙色を有する）を、＋４または−２０℃で保存する。
【０１１４】
図２４は、ＡＡＰＨがもたらす蛍光の、その２つの抽出物の不在下（ブランク）および存在下における減衰を、基準となる標準物質トロロックスと比べて示す。曲線下面積の測定により、本発明者らは、水溶性抽出物については、トロロックス当量８２８μモル／乾燥重量ｇ、脂溶性抽出物については、トロロックス当量４６８μモル／乾燥重量ｇのＯＲＡＣを得た。これは、総ＯＲＡＣ能が、トロロックス当量１２９６μモル／乾燥重量ｇであることを意味する。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
健常対象におけるＭＤＡ、ＧＳＨおよびレチノールの血漿レベルに対する、ＡＦＡ藻類およびＡＦＡ抽出物をともなう補給（the supplementation）の効果
以下の試験は、主にＡＦＡ藻類およびＡＦＡ藻類抽出物に基づく処方により行った。それはまた、アシドフィルス菌およびタンパク質分解酵素などの消化管因子をも含んでいたが、抗酸化活性は、主に藻類因子に帰属させるべきである。
【０１１６】
病歴が、消化器、血糖、その他の、重篤な過去の病態を示さなかった、２３〜６３歳の男性４例および女性４例の、比較的健康な８例の対象が、本試験への参加を自由に志願した。どの対象も、食事またはカロリーの特別の制限を受けず、どの対象も菜食主義者でなく、その補給期間における食事またはライフスタイルの変更は示唆されなかった。
【０１１７】
試験開始前に、その参加者は、各自の病歴に関する客観的な医学的分析および評価を受け、これは、大部分の場合、月経前症候群のいくつかの事例、時折の関節痛事象、食後の重感、時折の頭痛、一般的な便通不規則（generic gastrointestinal irregularities）、消化不良の、症状の発現など、人口において一般にみられ、おそらくは自律神経系の性質の、病気（ailments）のいくつかの存在のみを示した。
【０１１８】
本試験で用いられた栄養処方は、したがって、クラマス湖産ＡＦＡ藻類、２００ｍｇ；ＡＦＡ抽出物、１００ｍｇ；アシドフィルス菌ＤＤＳ−１（１００億（１０ bill.）ＣＦＵ／グラム）、１００ｍｇ；タンパク質分解活性を有する発酵済みマルトデキストリン、１００ｍｇ、からなる５００ｍｇ粉末を含む、「０」植物カプセルにより投与された。各参加者は、第０日から始めて、毎食と共に３カプセルずつ、１日９カプセルを服用した。
【０１１９】
血液試料は、時点０、１カ月後、および３カ月後に、へパリン処理した真空容器（vacutainers）中に採取し、各試料は、２つの部分に分割した。第１の部分は、フローサイトメトリーによるリンパ球の免疫表現型検査（immunophenotyping）、イムノネフェロメトリック（immunophelometric）および化学発光の原理に基づく自動式機器による、甲状腺プロファイル、肝臓、心臓、および腎臓の、機能に関する酵素検査、自動システムおよびドライケミストリー法をともなうタンパク質および脂質分析、自動システムおよびコールター原理（COULTER principle）（インピーダンス法（impedenziometric））をともなう血色素量検査（emocromocytometric exam）、など、最も一般的なパラメータについて、ウルビーノの病院の分析検査室により分析された。
【０１２０】
血液試料の他の部分は、ＭＤＡおよび抗酸化物質である減少した（reduced）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ビタミンＥ（αトコフェロール）、およびビタミンＡ（レチノール）の測定により、脂質過酸化レベルを調べるのに用いた。血液試料は、＋４℃、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により加工（processed）し、こうして得られた血漿は、−２０℃で保存し、以下のように使用された。血漿ＭＤＡは、ＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応物質）法（２８）に従い、５３５ｎｍにおける分光光度計により測定した。ＧＳＨ用量は、ＧＳＨによるジスルフィドＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス２−ニトロ安息香酸）の還元（reduce）能に基づいた（２９）。その還元形態において、ＤＴＮＢ（ｃ．ｅ．ｍ．１３６００Ｍ-1ｃｍ-1）は、強い黄色を発し、それは４１２ｎｍで測定される。αトコフェロールおよびレチノールの血漿レベルは、Ａｌｌｔｅｃｈ社製のプレカラム（７．５×４．６ｍｍ内径）を前に置き、Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８型カラム（５μｍ、２５０×４.６ｍｍ内径；イタリア、Ａｌｌｔｅｃｈ社製）を用いることにより、（３０）に記載の通りに、ＨＰＬＣ（日本、東京、日本分光株式会社製）により決定した。そのクロマトグラフィープロファイルは、Ｂｏｒｗｉｎ  １．５ソフトウェア（日本、東京、日本分光株式会社製）により解析した。
【０１２１】
対象の酸化／抗酸化状態に関して、調べた３つのパラメータについて得られた結果を、図２５に示す。
【０１２２】
少しも食事またはライフスタイルの変更を導入することなしに、本生成物の補給により生じる抗酸化状態および脂質過酸化に関して、極めて肯定的な結果がもたらされたという事実は、重要である。ＡＦＡ藻類中に存在し、ＡＦＡ抽出物においてさらに濃縮された、ＡＦＡフィコシアニン、フィトクロム、およびＭＡＡは、フリーラジカルスカベンジャーとして強力な肯定的制御をまた実行し、ＡＦＡ藻類中およびその抽出物中に存在する高レベルのクロロフィル、カロテノイド、ならびに他の抗酸化ビタミンおよびミネラルのために、本生成物は、ヒト体内における全般的な抗酸化活性の強力なエンハンサーとして自らを提示する。
【０１２３】
結果は、以下の通りにまとめることができる。
【０１２４】
ａ）血漿レチノール中の極めて高い平均値の上昇、すなわち、補給の３カ月後に＋６０％の上昇がみられる；
ｂ）脂質過酸化の最も重要なマーカーの１つである、血漿ＭＤＡレベル中の目覚しい減少（−３５．５％）がみられる。この結果は、上記に示したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非常に目覚しい結果を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて強く確認する；
ｃ）本生成物が与える全般的な抗酸化保護はまた、身体が、内因性ＧＳＨの顕著な増加（＋１６．８％）を生じるのに役立った。
【０１２５】
高圧治療（hyperbaric treatment）を受ける患者に対するＡＦＡおよびＡＦＡ抽出物に基づく生成物をともなう補給の効果
高圧酸素療法は、減圧に由来する病気（illnesses）、一酸化炭素中毒、ガス塞栓症、および組織感染症などの、様々な病態の治療に使用され成功している。高圧酸素への曝露は、実際、血中に溶解する酸素の有益な増加を生じる。しかし、有益な作用と共に、十分な抗酸化防護により保護しないならば、細胞および組織を損傷しうる循環ＲＯＳ（活性酸素種）も増加しうる（３４）。このために、高圧療法を受ける患者は、一般に、抗酸化ビタミンを補給される。
【０１２６】
高圧療法が誘発する酸化ストレスに対するＡＦＡおよびクラマス湖産ＡＦＡ抽出物に基づく処方の効果を評価するため、ファーノ「高圧療法センター（Centro di Terapia Iperbarica）」（イタリア）の患者９例を試験に組み入れた。患者９例のうち、１６〜７３歳の、男性が５例で女性は４例であり、無菌性大腿骨壊死（ｎ＝５）、リウマチ性多発筋痛（ｎ＝１）、ならびに大腿骨および脛骨骨髄炎（ostheomyelitis）（ｎ＝３）などの異なる病変（pathologies）に罹患していた。
【０１２７】
これらの患者に、上述の同じ生成物を補給した。初回の高圧セッション以降、患者は、３回の主食間に分けて、１日６カプセルの服用を開始した。
【０１２８】
各患者からの血液試料の採取は、１回目および１５回目の高圧セッションの直前および直後に実施した。次いで、試料は、ＭＤＡ、カルボニル、ＡＯＰＰなど、いくつかの酸化マーカー含量のほか、血漿中のチオール、脂溶性ビタミン、および血漿自体の総抗酸化レベルについても評価された。
【０１２９】
結果は、本処方を補給された患者において、高圧治療は、１５セッション後でさえも、酸化マーカーの増加を生じないことを示す（図２６）。実際、その治療の進行と共にこれらのマーカー中の顕著な増加が通常みられることを考えれば、本試験において本発明者らは、実際、１〜１５回目のセッションで、１．５４±０．１７μモル／ｌ（１回目のセッション）から１．４２±０．１６μモル／ｌ（１５回目のセッション）へと値が変化する、ＭＤＡレベル（脂質過酸化）の、７．８％の減少（ｐ＜０．０５）、１０５．７±１８．８μモル／ｌ（１回目のセッション）から８４．０±１５．５μモル／ｌ（１５回目のセッション）へと値が変化する、ＡＯＰＰ（タンパク質酸化の後期副生成物）の２０．５％の減少（ｐ＜０．０５）を見る一方、タンパク質カルボニル（タンパク質酸化の初期副生成物）は無変化のままである（図２６）。
【０１３０】
全般的な抗酸化プロファイルもまた、高圧治療期間において維持される。総チオール（グルタチオンおよびタンパク質のＳＨ基）の血漿レベルは、２５４±１８μモル／ｌ（１回目のセッション）から２７５±３０μモル／ｌ（１５回目のセッション）へと値が変化し、８．３％上昇（ｐ＝非有意（n.s.））した。同時に、本発明者らは、図２７および２８に示す通り、１．１９±０．０３ｍモル／ｌのトロロックス当量（１回目のセッション）から２．０４±０．０３μモル／ｌのトロロックス当量（１５回目のセッション）へと値が変化する、血漿の総抗酸化状態の有意な上昇（ｐ＜０．０５）を見る。
【０１３１】
最も一般的な抗酸化物質（トコフェロール、カロテノイド、レチノール）の血漿レベルが無変化のままであることを踏まえ、本発明者らは、総抗酸化状態における上昇が、本処方により供給された同じ栄養物質によって、カロテノイドおよびレチノールなど、消費された抗酸化物質の補充に部分的に起因し、また、フィコシアニン、フィトクロム、ＭＡＡ、およびクロロフィルなどの特定の藻類抗酸化物質の循環系における並行的な蓄積による、と仮定することができる。要するに、ＡＦＡおよびＡＦＡ抽出物に基づく処方は、抗酸化防御を非常に増大させ、効果的に高圧療法を受ける患者を、高圧酸素が産生するフリーラジカルの増加から保護する。
【０１３２】
抗炎症活性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素は、プロスタグランジン（ＰＧ）、トロンボキサン、およびプロスタサイクリンなどのエイコサノイドの合成における第１段階を触媒する。この酵素には、２つの異なるアイソフォームが存在する。ＣＯＸ−１が、ホメオシタシスの通常の調節に関与するのに対し、ＣＯＸ−２は、ＰＧ産生の原因であり、それが次々に急性炎症を促進する。
【０１３３】
藍藻類に由来するフィコシアニンは、強力な抗炎症活性を有する。微細藻類スピルリナ・プラテンシスに由来するフィコシアニンは、効果的な選択的ＣＯＸ−２阻害物質であり（３５）、これらが、脂肪酸から炎症性エイコサノイドの形成を生じる、カスケードを生理的および部分的に阻害することが示されている（３６）。
【０１３４】
クラマス湖産ＡＦＡ藻類に由来するフィコシアニンが、スピルリナに由来するそれ(フィコシアニン)とは異なること、ＣＯＸ酵素に対するその効果について試験が今までに行われていないことを踏まえ、本発明者らは、Ｃａｙｍａｎ社製の免疫酵素キット「ＣＯＸ阻害物質スクリーニングアッセイ」により、このような試験を行うことに決めた。こうして、本発明者らは、ＡＦＡ抽出物（水中の水溶性部分、およびアセトン中の脂溶性部分をともに；２５〜２００μｇ／ｍｌの範囲）、純ＰＣ（０．０３〜３μＭ）、およびＰＣＢ（０〜１５μＭ）による、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害を評価した。結果を図２９に示し、ＡＦＡ抽出物、ＰＣ、およびＰＣＢの異なる濃度におけるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の百分率による活性グラフを表示する。
【０１３５】
ＡＦＡ基本抽出物の脂溶性分画が、１３４μｇ／ｍｌのＩＣ50によりＣＯＸ−２を選択的に阻害するのに対し、ＣＯＸ−１は増加する。水溶性分画も、８４．５μｇ／ｍｌのＩＣ50によりＣＯＸ−２を選択的に阻害するのに対して、ＣＯＸ−１は、おだやかに阻害されるのみである（２００μｇ／ｍｌのＡＦＡ抽出物の場合で３０％の阻害）。
【０１３６】
純ＰＣは、いずれの酵素にも作用するが、この場合でさえも、阻害は、ＣＯＸ−１と比べてＣＯＸ−２に優先的であり、ＣＯＸ−２に対する活性はＣＯＸ−１に対する場合よりもほぼ１０倍高い（１．１μＭに対する０．１５μＭのＩＣ50）。最後に、発色団ＰＣＢは、ＣＯＸ−１活性を増大させ、ＣＯＸ−２の阻害剤ではほとんどない。
【０１３７】
こうして、本発明者らは、クラマス湖産ＡＦＡ藻類のフィコシアニンはまた、ＣＯＸ−２の顕著な選択的阻害を可能とする、強力な抗炎症分子であることをも確認した。ＣＯＸ阻害が、フィコシアニンを含む、水性抽出物のみにより生じるのでなく、脂溶性抽出物によっても生じ、したがって、ＡＦＡ抽出物中の他の分子の存在を示すということに注目することも興味深い。
【０１３８】
本明細書において、本発明者らは、スピルリナに由来するフィコシアニンに対して行われた試験とのいくつかの比較による考察をも示すことができる。Reddyらによる研究において、スピルリナ・プラテンシスに由来するフィコシアニンのＩＣ50は、クラマス湖産に由来するフィコシアニンの０．１５μＭに対して、０．１８μＭであると報告されている。クラマス湖産ＰＣに有利なこのわずかな差異はさておき、強調すべきさらにそしてより重要な差異が存在する。１μＭにおいて、スピルリナ由来のフィコシアニンが約６０％のＣＯＸ−２阻害を生じるのに対し、クラマス湖産に由来するフィコシアニンは、同じ１μＭの濃度において、約７５％の阻害を生じる。これは、実質的な差異であり、ＡＦＡフィコシアニンが、迅速かつより強力な抗炎症効果を生じうることを示す。
【０１３９】
また、ＡＦＡフィコシアニンにより生じる阻害百分率は、スピルリナＰＣの最低レベルと、セレコキシブおよびロフェコキシブなどの薬剤のより高いレベルとの中間である（３７）。これは、クラマス湖産藻類のＰＣにより生じるＣＯＸ−２阻害の程度が理想的である、すなわち、迅速かつ効果的な抗炎症活性を生じる程度には十分高いが、やはり依然として部分的であり、このため、その薬剤に典型的な心血管性の副作用を回避する程度に生理的であることを意味する。
【０１４０】
ＡＦＡ抽出物のＣＯＸ−２阻害活性も、極めて重要である。図が示す通り、脂溶性成分は、水溶性成分の場合よりも低度ではあるが、顕著な程度の阻害（１３４μｇ／ｍｌのＩＣ50）を有し、同時に、ＣＯＸ−１の促進活性をも有する。ＣＯＸ−２の阻害が炎症性エイコサノイドの産生を低減するとすれば、ＣＯＸ−１の刺激は、抗炎症性エイコサノイドの内因的産生を増加させ、こうして、総抗炎症効果を倍加するので、これは興味深い結果をもたらす。このことが、ＡＦＡ基本抽出物の脂溶性分画を、重要な薬理特性に恵まれた、独自の抗炎症作用物質とする。本特許は、クラマス湖産藻類に由来する任意の脂溶性抽出物の栄養学的および薬理学的使用をも保護する。
【０１４１】
そこで、本発明者らが、ＡＦＡ基本抽出物全体を視野に入れるならば、水溶性および脂溶性成分の合わせた活性は、強力なＣＯＸ−２阻害物質としてともに作用することを考えると、ＣＯＸ−２の顕著な阻害をもたらし、また、一方で、水溶性成分により生じるＣＯＸ−１の低減（−３０％）、および、脂溶性成分により生じるＣＯＸ−１の刺激（＋４５％）の結果から、ＣＯＸ−１の同レベルの実質的な維持が生じる。ＡＦＡ抽出物全体のＩＣ50が約１００μｇ／ｍｌ（２成分の平均）であるのに対し、２００μｇ／ｍｌの投与時においては、約７５％のＣＯＸ−２阻害がみられる。これが、純ＰＣに関して上記で論じた百分率による阻害のレベルであり、そこで示した考察は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける２００μｇ／ｍｌが、わずか、６００〜８００ｍｇのｉｎ  ｖｉｖｏ用量に対応すると推測しうる（plausibly）（３８）という事実に照らすと、特別な意味を獲得する。実験による確認を待っているときでさえ、本発明者らは、ＡＦＡ抽出物が、１日にわずか１〜２カプセル／錠により容易に到達する用量において、真に独自の、治療的特性、栄養的特性、および薬理的特性に恵まれた、強力な抗炎症作用物質を構成する、とおそらく明言することができる。これらの特性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの動物試験により確認されている。
【０１４２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
本試験において、本発明者らは、０．２５μモル／ｋｇのカプサイシン（チリペッパーの活性本質）または２ｎモル／ｋｇのサブスタンスＰ（炎症性神経性応答の原因である受容体と共に作用する）による、炎症促進刺激（pro-inflammatory stimulus）を受けたアルビノの雄スイスマウスにおける、ＰＣを含む藻類抽出物（ＡＦＡ抽出物）の抗炎症特性を詳しく調べた。組織炎症レベルは、組織における血漿タンパク質の流出の結果として、炎症部位内に蓄積した着色剤エバンスブルーの分光光度法での吸収量により測定した。図３０に示す通り、カプサイシン（０．２５μモル／ｋｇ）またはＳＰ（２ｎモル／ｋｇ）の静脈内注射は、炎症刺激を受けなかった対照マウスにおいて観察される場合と比べて、試験組織内における血漿流出の増加を誘発する。ＡＦＡ抽出物（１６００ｍｇ／ｋｇまたは８００ｍｇ／ｋｇ）によるマウスの前処置は、血漿流出を顕著に阻害し、対照群と同等な値にまで引き下げる。
【０１４３】
実際、カプサイシンの注射は、胃（２３．２±０．２対２９．９±０．５ｎｇ  ＥＢ／組織ｇ、ｐ＜０．０５）および膀胱（３３．２±５．２対３９．９±１．８ｎｇ  ＥＢ／組織ｇ、ｐ＜０．０５）の両方における血漿流出の増加を誘発する。１６００ｍｇ／ｋｇのＡＦＡ抽出物によるマウスの前処置は、両組織における血漿タンパク質の流出の顕著な低減を誘発し、胃における値をＥＢ  ２３．６±０．２ｎｇ／ｇ、および膀胱における値をＥＢ  ３０．６±２．３ｎｇ／ｇとする。
【０１４４】
同様に、ＳＰの注射は、胃（１３．５±１．１対２２．１±１．８ｎｇ  ＥＢ／組織ｇ、ｐ＜０．０５）および十二指腸（１７．２±１．２対２４．０±１．８ｎｇ  ＥＢ／組織ｇ、ｐ＜０．０５）における血漿流出の顕著な増加を誘発する。８００ｍｇ／ｋｇのＡＦＡ抽出物によるマウスの前処置は、胃における値を２０．１±１．３ｎｇ  ＥＢ／ｇ（ｐ＝非有意）、および膀胱における値を１６．７±１．９ｎｇ  ＥＢ／ｇ（ｐ＜０．０５）と、血漿タンパク質の流出を顕著に低減する（図３１）。
【０１４５】
抗増殖活性
文献では、微細藻類スピルリナに由来する純ＰＣが、アポトーシス機構を介して、白血病細胞株（３９）などの腫瘍細胞株およびマクロファージ細胞株（４０）の、増殖を阻害する顕著な特性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて有することが報告されている。
【０１４６】
そこで、本発明者らは、単球マクロファージＲＡＷ２６４．７腫瘍細胞株の細胞において、その細胞を、ＰＣの用量を増加させ（範囲：０〜２５μＭ）ながら、インキュベートすることにより、Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体を有する、純ＡＦＡ−ＰＣの抗増殖活性を調べた。図３２の結果の通り、２４、４８、および７２時間のインキュベーション後における細胞活力の分析は、ＡＦＡ−ＰＣが、極めて顕著な、用量および時間依存的抗増殖効果を有することを示した。
【０１４７】
ＡＦＡ抽出物の皮膚特性および美容特性
クラマス湖産藻類ＡＦＡおよびその抽出物中のフィコシアニンおよび他の相乗作用分子の抗酸化および抗炎症特性を踏まえると、栄養学的および薬理学的目的のための経口投与のほか、皮膚治療の使用および美容目的ともに、皮膚への局所用としても用いることができる、ということは明白である。
【０１４８】
密封貼付（occlusive patch）試験（刺激試験）
予備試験として、本発明者らは、クラマス湖産ＡＦＡ藻類を毒性学的に調べ、その皮膚使用が、毒性または炎症反応をもたらさないことを確立した。試験は、イタリア、フェラーラ大学の「美容センター（Centro di Cosmetologia）」において実施した。「密封貼付試験」は、無傷のヒト皮膚に対して単回投与で貼付したときの美容生成物の刺激作用を評価するために実施した。試験は、試験実施に対して書面により同意した、男女の健常志願者対象２０例を対象に実施した。以下の対象は、試験から除外した。
【０１４９】
・最近２カ月以内に類似の試験に参加したすべての対象、
・皮膚炎に罹患するすべての対象、
・アレルギー性皮膚反応の既往を有するすべての対象、
・抗炎症薬治療（ステロイドまたは非ステロイド）下にあるすべての対象。
【０１５０】
試験は、クラマス湖産ＡＦＡ藻類の粉末を対象に実施した。貼付用生成物を調製するため、粉末を蒸留水と混合し、シリンジを用いてフィンチャンバー（Ｂｒａｃｃｏ社製）内に直接注入し、次いで、参加者の前腕部または背部の皮膚に貼付し、粘着テープで保護した。美容生成物は、皮膚表面に接触させたまま４８時間放置し、その後の４８時間にわたり生成物を貼付した部位を洗浄しないよう、参加者に指示した。フィンチャンバーの除去および皮膚部位の残存美容生成物からの洗浄は、試験実施者が行った。皮膚反応の評価は、以下のスケールに従い、フィンチャンバーの除去後１５分および２４時間において実施した。
紅斑：０−なし  １−軽度  ２−はっきりと見える  ３−中等度  ４−重篤（serious）
浮腫：０−なし  １−軽度  ２−はっきりと見える  ３−中等度  ４−重度（strong）
紅斑および浮腫スコアの総計を「刺激指数」と定義する。１５分および２４時間での刺激指数を最終報告書に報告する。２０回の試験の平均刺激指数を計算する。次いで、生成物を以下のパラメータに従って分類した。
【０１５１】
平均刺激
指数            分類
＜０．５        刺激なし
０．５〜２．０  軽度の刺激
２．０〜５．０  中等度の刺激
５．０〜８．０  高度の刺激
上述の手法およびパラメータに従う、クラマス湖産藻類ＡＦＡに対する試験結果は、
「志願者対象２０例の健康な皮膚に対して、密封条件下で、蒸留水により希釈して（１：１０）貼付された、試験生成物は、
フィンチャンバー除去後の１５分において０．２５（zero. twenty five）
フィンチャンバー除去後の２４時間において０．１５（zero. fifteen）
の平均刺激指数を示した。
【０１５２】
使用した評価スケールに従い、生成物であるクラマス湖産藻類（アファニゾメノン・フロスアクアエ）は、刺激なし、と分類することができる。」
有効性研究
美容および皮膚成分としての藻類の非刺激性および無毒性を確認した時点で、本発明者らは、８％のクラマス湖産藻類基本抽出物を含むクリームの調製を開始し、皮膚の柔軟性、水分補給、およびしわなどの美容パラメータに関するその有効性を調べた。試験は、３０〜６５歳の個体１５例を対象に無作為に実施した。彼らは、特定の皮膚（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｒ  ｓｋｉｎ）問題で選ばれたのでなく、実際、しわの量などのパラメータについては、大半の参加者が、深いしわを有さなかったことにより、統計学的に非有意の結果がもたらされた。にもかかわらず、しわが実際に存在する場合、しわの軽減に関する結果は極めて明瞭であった。本研究は、統計学的な有意性の欠如に対して、一部のパラメータに関して最終的なものではないが、ＡＦＡ抽出物の皮膚および美容特性を強く確認する予備報告ではあり、したがって、これが、特定の皮膚（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ）問題により明確に方向づけられたさらなる研究の正当性を保証する。本発明者らは、本明細書に、本研究の手法および主要な結果を示す。
【０１５３】
試験は、８％ＡＦＡ抽出物を含む生成物と、同じ植物ベースにより構成されるが、藻類抽出物を含まない、プラセボ生成物とを比較して実施した。その２つの生成物を
ａ）ＡＦＡ抽出物を含む植物乳液
ｂ）基本植物乳液
と呼ぼう。
【０１５４】
以下に記載の試験対象患者基準（inclusion criteria）に従い、３０〜６５歳の、女性志願者対象１５例をその試験に選択した。
【０１５５】
・全般的に良好な健康状態、
・皮膚症なし、
・進行中の薬剤治療なし、
・通常の日常的行為を変更しないと誓約、
・既往症にアトピー症なし。
【０１５６】
その２つの生成物は、以下の通りに、顔の各面に毎日１回ずつ、参加者自身により塗布された。
【０１５７】
・顔の右側面（ＤＸ）：ＡＦＡ抽出物を有する植物乳液、
・顔の左側面（ＳＸ）：基本植物乳液。
【０１５８】
本研究で解析されたパラメータは、
・皮膚の弾力性
・湿潤指数
・皮膚の形状測定
であった。
【０１５９】
パラメータの測定は、以下のスキームに従い実施した。
【０１６０】
・生成物の塗布前（Ｔ０）
・生成物塗布の１５日後（Ｔ１５）および３０日後（Ｔ３０）
皮膚の弾力性
皮膚の弾力性は、ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ（登録商標）ＳＥＭ  ５７５（ＣＯＵＲＡＧＥ  ＋  ＫＨＡＺＡＫＡ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ製）により測定した。弾力性の測定は、１が可能な弾力性の最大値を表す、０〜１のスケールにより行った。
【０１６１】
皮膚の湿潤指数
皮膚の湿潤性の測定は、国際的に認知されたＣＯＲＮＥＯＭＥＴＥＲ（登録商標）に基づく。通常の室内条件（２０℃および４０〜６０％の空気湿度）における試験部位の、健康皮膚は、＞５０の湿潤指数を有するべきである。３５〜５０の範囲の湿潤指数が、乾燥した皮膚を表すのに対し、３５より劣る場合は極めて乾燥した皮膚を表す。これらの値は、結果の解釈に対するただの指標である。
【０１６２】
皮膚の形状測定
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける皮膚表面解析用のＶＩＳＩＯＳＣＡＮ  ＶＣ９８を用いて、しわの軽減を検査する（図３３）。パラメータは、
・ＳＥｒ：粗さ
・ＳＥｓｃ：鱗状態（scaliness）
・ＳＥｓｍ：滑らかさ、しわの幅および形態に比例する
・Ｓeｗ：しわ、 しわの数および幅に比例する
・量：しわの深さに比例し、より深いしわは、量パラメータがより大きい
である。
【０１６３】
各種パラメータに関する結果を、２つのパラメータのみ、すなわち、皮膚の弾力性および皮膚の湿潤性について、専用のソフトウェアであるＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃ  ｐｌｕｓ（バージョン５．１）を用いる多因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、統計学的に解析したところ、統計学的に有意な結果が得られた。本発明者らの指示に従い試験を実施したパビア大学の研究者らが到達した結論は、以下の通りであった。「処置期間全体において、顔の右側面に塗布された、活性生成物の使用が、ベースラインの値と比べて、統計学的に有意な湿潤性および弾力性の上昇をもたらしたのに対し、プラセボ（左側面）での処置は、有意な変化をもたらさなかった。」
上記の結論に関しては、皮膚の形状測定については、統計学的に有意な結果がみられなかった。しかし、これは、生成物の無効性（failure）に起因したのでなく、参加者の大半が、時点０において、彼らの皮膚が既に最適な状態に近かったことを踏まえると、いかなる本格的な改善（serious improvement）も、不可能とさせるような、初期状態を有していたという事実に起因した。これが、本研究の弱点であった。しかしながら、実際に改善を要する皮膚状態（皮膚病変の状態には該当しない）を有する参加者を選択し、適宜結果を解釈したところ、本発明者らは以下の結果を得た。
【０１６４】
皮膚の弾力性
参加者１５例のうち、１２例のみが、最適より少ない弾力性状態を有した。実際、弾力性指数を０〜１（１が可能な最大値）としたところ、本発明者らは、参加者中に０．５７〜０．９８の範囲の値を得た。この範囲に基づき、本発明者らは、３つのふさわしい区分を確立した。
【０１６５】
０．９〜１＝最適の弾力性状態
０．７５〜０．９＝中等度の弾力性状態
＜０．７５＝低度の弾力性状態
３０日間の処置期間を考慮に入れると、図３４のグラフは、より低いレベルからより高いレベルへの参加者の移行として、改善のレベルを報告する。
【０１６６】
解析した１２例のうち、当初、４例が低度の弾力性を、８例が中等度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｏｒ  ｍｅｄｉｕｍ）皮膚の弾力性を有した。処置の３０日後、低度の弾力性を有する参加者はいなくなり、中等度の弾力性を有する参加者も２例のみであり、残る１０例は高度の弾力性に移行し、この最後の分類においては、０例から１０例へという注目すべき転換を示した。
【０１６７】
皮膚の湿潤性
通常の室内条件（２０℃および４０〜６０％の空気湿度）における試験部位の、健康皮膚は、＞５０の湿潤指数を有するべきである。３５〜５０の範囲の湿潤指数が、中程度に乾燥した皮膚を表すのに対し、＜３５の値は極めて乾燥した皮膚を表す。これらの値を本発明者らの解釈基準として採用すると、図３５のグラフは、３０日の期間において認められた改善を、より低いレベルからより高いレベルへの参加者の移行として報告する。
【０１６８】
参加者１５例のうち、１例のみ（青色）が極めて乾燥した皮膚を有し、７例が中等度に乾燥した皮膚を有し、７例が正常に湿潤した皮膚を有した。１５例のうち８例のみが実際の改善を要するけれども、最終結果は、処置期間の終了時に、極めて乾燥した皮膚を有する参加者は残らず、中等度に乾燥した皮膚を有する参加者は、７例から５例に減り、健康な湿潤した皮膚を有する参加者は７例から１０例へと移行した。
【０１６９】
皮膚の形状測定
皮膚の形状測定に関しては、ゼロに近いＴ０値または初期を有する、参加者が多すぎるため、試験パラメータの一部が使用できなかった。すなわち、Ｓｅｒまたは皮膚の粗さパラメータに注目したところ、本発明者らは、参加者１５例のうち１２例が、０．０または皮膚の粗さ全くなしの初期値を有し、パラメータＳＥｓｃまたは皮膚の鱗状態に関しては、参加者１５例のうち１０例が、０．０または鱗状態全くなしの値を有することを見た。したがって、本発明者らは、Ｓｅｗ、またはしわの数および幅、ならびにしわの深さについて測定したしわの量を指す、ＶＯＬの、２つのパラメータに評価を限定した。ここでも、Ｓｅｗでは参加者７例のみ、ＶＯＬでは９例のみが是正を要する初期値を有し、残りはゼロに近い値を有したので、本発明者らは、統計学的な有意性に到達できなかった。にもかかわらず、図３６が示す通り、わずかながら値を変化させた参加者は、顕著な改善を有した。
【０１７０】
こうして、しわの量または深さの軽減に関して、本発明者らは、３０日間の処置期間において、−１８％〜−６５％の軽減範囲を有し、しわの量の改善の点で極めて顕著な達成レベルである。
【０１７１】
図３７では、３０日間の処置期間において、しわの数および幅の軽減が、−５％〜−４８％となり、また、しわ上のＡＦＡ抽出物ベースの美容クリームの潜在的な有効性の該請求の範囲を正当化し、そして、この問題によってより具体的な影響を受ける参加者を選択することにより、しわ軽減に関するより具体的な研究の実現をとりわけ保証する、著明な結果である。
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37.    For the comparison of the COX-2 inhibition produced by the phycocyanins of spirulina and by the drugs celecoxib and rofecoxib, see Reddy C.M. et al., Selective inhibition of cyclooxygenase-2 by Cphycocyanin, a biliprotein from Spirulina platensis, in Biochem Biophys Res Commun 277(3):599-603, 2000.
38.    Since a human being has approximately 3.5 liters of blood, 200 μg/ml multiplied by 3.5 give a total quantity of 600-800 mg. Clearly it is a theoretical calculation in need of experimental confirmations, but it is a plausible hypothesis.
39.    Subhashini J. et al., Molecular mechanisms in C-Phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line-K562, in Biochem Pharmacol. 2004;68(3):453-62.
40.    Reddy M.C., et al., C-Phycocyanin, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, induces apoptosis in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages, in Biochem Biophys Res Commun. 2003, 304(2):385-92.
41.    Romay Ch., Gonzales R., Phycocyanin is an Antioxidant Protector of Human Erythrocytes Against Lysis by Peroxyl Radicals, in J.Pharm.Pharmacol. (2000) 52: 367-8.
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43.     Subhashini J, et al.,  Molecular mechanisms in C-Phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line-K562., in Biochem Pharmacol. 2004 Aug 1;68(3):453-62.
44.    Hughes J, Lamparter T., Prokaryotes and Phytochrome. The Connection to Chromophores and Signaling, in Plant Physiology, December 1999, Vol. 121, pp. 1059-1068,
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月23日(2008.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）採取直後のＡＦＡ藻類を冷凍し解凍するか、または、出発物質が乾燥ＡＦＡ藻類粉末である場合は、水で希釈したＡＦＡ粉末を超音波で分解して、細胞を破砕する；
ｂ）ステップａ）の生成物を遠心分離し、沈殿物から上清を分離する；
ｃ）水溶性成分を含む上清を回収し、その水溶性成分を次のステップにより濃縮する、
ｄ）ステップｃ）にて得られる抽出物を、カットオフ分子量３０ｋＤａの膜を用いるサイズ除外限外濾過にかける；
ｅ）残留物を回収する、
により得られる、クラマス湖産微細藻類アファニゾメノン・フロスアクアエ（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  Ｆｌｏｓ  Ａｑｕａｅ  Ａｑｕａｅ  Ｒａｌｆｓ  ｅｘ  Ｂｏｒｎ．＆  Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓ  ａｑｕａｅ）（ＡＦＡクラマス湖産）の水性抽出物。
【請求項２】
以下のステップ：
ｆ）請求項１に記載のステップｂ）において得られる乾燥させた沈殿物を純エタノールに懸濁し、ホモジナイズし、そして暗所、室温において２４時間定常攪拌下にホモジネートを保持する；
ｇ）結果として得られる懸濁液を、４℃、３０００ｒｐｍで５分間（５’）、遠心分離する；
ｈ）上清を回収する；
ｉ）場合によって、ステップｆ）からｈ）に従い、ペレットを第２のエタノール抽出にかける；
ｌ）場合によって、上清を乾燥させ、脂溶性濃縮物を得る、
により得られる親油性成分が富化された分画を添加した、請求項１に記載のクラマス湖産微細藻類の抽出物。
【請求項３】
フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）である、請求項１から２に記載のクラマス湖産ＡＦＡ微細藻類抽出物の単離された生理活性成分。
【請求項４】
フィコビオロビリン（ＰＶＢ）である、請求項１から２に記載のクラマス湖産ＡＦＡ微細藻類抽出物の単離された生理活性成分。
【請求項５】
ＡＦＡフィトクロムである、請求項１から２に記載のクラマス湖産ＡＦＡ微細藻類抽出物の単離された生理活性成分。
【請求項６】
マイコスポリン様アミノ酸のシノリンである、請求項１から２に記載のクラマス湖産ＡＦＡ微細藻類抽出物の単離された生理活性成分。
【化１】
2009541389.tif 000044
【請求項７】
請求項１から２に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項３から６に記載の単離成分、またはその混合物を含む物質（matter）の組成物。
【請求項８】
クロロフィル、ベータカロテン、プロビタミンＡカロテノイド、キサントフィル類カロテン、カンタキサンチン、ビタミンまたはミネラルをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
栄養、美容、または薬剤の使用に適した、請求項７から８に記載の組成物。
【請求項１０】
対象における細胞または組織に対する酸化的損傷を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から２に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項３から６に記載のその単離成分の使用。
【請求項１１】
該酸化的損傷が高圧治療により引き起こされる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
対象における炎症を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から２に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項３から６に記載のその単離成分の使用。
【請求項１３】
対象における腫瘍細胞増殖を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から２に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項３から６に記載のその単離成分の使用。
【請求項１４】
対象における皮膚病変（affections）を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から３に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項３から６に記載のその単離成分の使用。
【請求項１５】
対象における眼病変（pathologies）を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項１から２に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項３から６に記載のその単離成分の使用。
【請求項１６】
前記組成物が、洗眼液の形態である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記対象が、ヒト対象である、請求項１０から１６に記載の使用。
【国際調査報告】
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