(57)【要約】  本発明は、参照グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）よりも高い融解温度（Ｔｍ）を有する、機能性の修飾ＧＧＢＰに関する。また、本発明は、これらの熱安定性ＧＧＢＰを含む生物学的センサー、例えば、グルコースセンサーにも関する。また、本発明は、これらの熱安定性ＧＧＢＰをコードする核酸にも関する。
2009534042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）よりも高い融解温度を有することを特徴とする、修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項２】
前記参照ＧＧＢＰは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であることを特徴とする請求項１に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項３】
前記参照タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であることを特徴とする請求項２に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項４】
前記修飾された熱安定性ＧＧＢＰは、配列番号１のチロシン１２（Ｙ１２）、アスパラギン１５（Ｎ１５）、アスパラギン３９（Ｎ３９）、セリン４１（Ｓ４１）、アスパラギン（Ｎ４３）、アスパラギン４９（Ｎ４９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、イソロイシン（Ｉ５２）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アラニン１２８（Ａ１２８）、アラニン１２９（Ａ１２９）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン（Ｑ１３１）、グリシン１３２（Ｇ１３２）、トロプトファン１３３（Ｗ１３３）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン（Ｎ２０２）、リジン（Ｋ２０３）アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、アスパラギン酸２６７（Ｄ２６７）、ロイシン、２６８（Ｌ２６８）、アラニン２６９（Ａ２６９）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、トリプトファン２８４（Ｗ２８４）およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）に対応している残基からなる群から選択された、１つまたは複数の残基の置換を含むことを特徴とする請求項３に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項５】
前記参照タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であることを特徴とする請求項２に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項６】
前記修飾された熱安定性ＧＧＢＰは、配列番号２のチロシン３５（Ｙ３５）、アスパラギン３８（Ｎ３８）、アスパラギン６２（Ｎ６２）、セリン６４（Ｓ６４）、アスパラギン６６（Ｎ６６）、アスパラギン７２（Ｎ７２）、アスパラギン酸７３（Ｄ７３）、グルタミン７４（Ｑ７４）、イソロイシン７５（Ｉ７５）、グリシン１０５（Ｇ１０５）、グルタミン１０６（Ｑ１０６）、アスパラギン１０７（Ｎ１０７）、アラニン１５１（Ａ１５１）、アラニン１５２（Ａ１５２）、アスパラギン１５３（Ｎ１５３）、グルタミン１５４（Ｑ１５４）、グリシン１５５（Ｇ１５５）、トリプトファン１５６（Ｗ１５６）、グルタミン１９８（Ｑ１９８）、グルタミン２００（Ｑ２００）、ロイシン２０１（Ｌ２０１）、グリシン２２１（Ｇ２２１）、プロリン２２２（Ｐ２２２）、アスパラギン２２３（Ｎ２２３）、アスパラギン２０２（Ｎ２２５）、リジン２２６（Ｋ２２６）アスパラギン２４９（Ｎ２４９）、アスパラギン２８２（Ｎ２８２）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、アスパラギン酸２９０（Ｄ２９０）、ロイシン２９１（Ｌ２９１）、アラニン２９２（Ａ２９２）、リジン２９３（Ｋ２９３）、アスパラギン２９４（Ｎ２９４）、アスパラギン３０６（Ｎ３０６）、トリプトファン３０７（Ｗ３０７）およびアスパラギン３２５（Ｎ３０２）に対応している残基からなる群から選択された、１つまたは複数の残基の置換を含むことを特徴とする請求項５に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項７】
前記参照タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であることを特徴とする請求項２に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項８】
前記修飾された熱安定性ＧＧＢＰは、配列番号３のチロシン１２（Ｙ１２）、アスパラギン１５（Ｎ１５）、アスパラギン３９（Ｎ３９）、セリン４１（Ｓ４１）、アスパラギン（Ｎ４３）、アスパラギン４９（Ｎ４９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、イソロイシン（Ｉ５２）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アラニン１２８（Ａ１２８）、アラニン１２９（Ａ１２９）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン（Ｑ１３１）、グリシン１３２（Ｇ１３２）、トリプトファン１３３（Ｗ１３３）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン（Ｎ２０２）、リジン（Ｋ２０３）アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、アスパラギン酸２６７（Ｄ２６７）、ロイシン２６８（Ｌ２６８）、アラニン２６９（Ａ２６９）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、トリプトファン２８４（Ｗ２８４）およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）に対応している残基からなる群から選択された、１つまたは複数の残基の置換を含むことを特徴とする請求項７に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項９】
置換Ｎ３９Ｉ、Ｇ８２Ｅ、Ｑ８３Ｋ、Ｎ８４Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｑ１７７Ｈ、Ｌ１７８Ｍ、Ｎ２５９ＥおよびＮ２６０Ｓを含むことを特徴とする請求項８に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項１０】
前記参照タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であることを特徴とする請求項２に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項１１】
前記修飾された熱安定性ＧＧＢＰは、配列番号４のチロシン１２（Ｙ１２）、アスパラギン１５（Ｎ１５）、アスパラギン３９（Ｎ３９）、セリン４１（Ｓ４１）、アスパラギン（Ｎ４３）、アスパラギン４９（Ｎ４９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、イソロイシン（Ｉ５２）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アラニン１２８（Ａ１２８）、アラニン１２９（Ａ１２９）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン（Ｑ１３１）、グリシン１３２（Ｇ１３２）、トリプトファン１３３（Ｗ１３３）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン（Ｎ２０２）、リジン（Ｋ２０３）アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、アスパラギン酸２６７（Ｄ２６７）、ロイシン２６８（Ｌ２６８）、アラニン２６９（Ａ２６９）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、トリプトファン２８４（Ｗ２８４）およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）に対応している残基からなる群から選択された、１つまたは複数の残基の置換を含むことを特徴とする請求項１０に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項１２】
前記修飾された熱安定性ＧＧＢＰは、置換Ｎ３９Ｉ、Ｇ８２Ｅ、Ｑ８３Ｋ、Ｎ８４Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｑ１７７Ｈ、Ｌ１７８Ｍ、Ｎ２５９ＥおよびＮ２６０Ｓを含むことを特徴とする請求項１１に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰ。
【請求項１３】
請求項１１に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰを含むことを特徴とする分析物を測定するためのバイオセンサー。
【請求項１４】
前記修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、蛍光標識、放射標識、化学発光標識、リン光標識、比色分析標識および表面増強ラマン散乱標識からなる群から選択された、少なくとも１つの標識をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、高分子マトリックス中に封入されていることを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
請求項１５に記載のバイオセンサーを試料と接触させるステップを含むことを特徴とする前記試料中の分析物の濃度を測定する方法。
【請求項１７】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、光学コンジットと光学的に近接していることを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサーを含む装置。
【請求項１８】
請求項４に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰを含むことを特徴とする分析物を測定するためのバイオセンサー。
【請求項１９】
前記修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、蛍光標識、放射標識、化学発光標識、リン光標識、比色分析標識および表面増強ラマン散乱標識からなる群から選択された、少なくとも１つの標識をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、高分子マトリックス中に封入されていることを特徴とする請求項１８に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
請求項２０に記載のバイオセンサーを試料と接触させるステップを含むことを特徴とする前記試料中の分析物の濃度を測定する方法。
【請求項２２】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、光学コンジットと光学的に近接していることを特徴とする請求項１８に記載のバイオセンサーを含む装置。
【請求項２３】
請求項６に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰを含むことを特徴とする分析物を測定するためのバイオセンサー。
【請求項２４】
前記修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、蛍光標識、放射標識、化学発光標識、リン光標識、比色分析標識および表面増強ラマン散乱標識からなる群から選択された、少なくとも１つの標識をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載のバイオセンサー。
【請求項２５】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、高分子マトリックス中に封入されていることを特徴とする請求項２３に記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
請求項２５に記載のバイオセンサーを試料と接触させるステップを含むことを特徴とする前記試料中の分析物の濃度を測定する方法。
【請求項２７】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、光学コンジットと光学的に近接していることを特徴とする請求項２３に記載のバイオセンサーを含む装置。
【請求項２８】
請求項８に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰを含むことを特徴とする分析物を測定するためのバイオセンサー。
【請求項２９】
前記修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、蛍光標識、放射標識、化学発光標識、リン光標識、比色分析標識および表面増強ラマン散乱標識からなる群から選択された、少なくとも１つの標識をさらに含むことを特徴とする請求項２８に記載のバイオセンサー。
【請求項３０】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、高分子マトリックス中に封入されていることを特徴とする請求項２８に記載のバイオセンサー。
【請求項３１】
請求項３０に記載のバイオセンサーを試料と接触させるステップを含むことを特徴とする前記試料中の分析物の濃度を測定する方法。
【請求項３２】
前記熱安定性のＧＧＢＰは、光学コンジットと光学的に近接していることを特徴とする請求項２８に記載のバイオセンサーを含む装置。
【請求項３３】
請求項１に記載の修飾された熱安定性のＧＧＢＰをコードすることを特徴とする単離された核酸。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３５に記載の宿主細胞をタンパク質の発現に適した条件下で培養するステップと、前記タンパク質を単離するステップとを含むことを特徴とする修飾された熱安定性のＧＧＢＰを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全内容が参照によって組み入れられている２００６年４月２０日出願の米国仮出願第６０／７４５２７７号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、参照グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）よりも高い融解温度（Ｔｍ）を有する、機能性の修飾ＧＧＢＰに関する。また、本発明は、これらの熱安定性ＧＧＢＰをコードする核酸、ならびに、これらの熱安定性ＧＧＢＰを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオセンサーの開発の急速に進歩している領域は、生物学的試料中の分析物、例えば、グルコースの濃度を正確に決定するための周辺質結合タンパク質（ＰＢＰ）の使用である。特に、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）が、工業的および薬理生理的状況（industrial and pharmacological physiological settings）において分析物の量を測定するためのバイオセンサーとして利用されている。ＰＢＰは、「試薬不要（reagentless）」であるとみなされており、糖尿病をモニターする場合のグルコースの測定、ヒスチダーゼ欠乏症のようなその他の代謝疾患におけるアミノ酸の測定、ならびに、エタノールのトウモロコシからの生産の間のアラビノースの測定を含めた、多様な状況（settings）において使用することができる。しかし、野生型ＧＧＢＰは、多くの理由で、分析物の濃度を測定および決定するための最も理想的な候補にはなり得ない。ＧＧＢＰを含むバイオセンサーは、グルコース結合に関する定量化可能なシグナルを発生させるために、使用する条件下において物理的に安定であることが好ましいであろう。意図する使用が、糖尿病患者におけるグルコース濃度のｉｎ  ｖｉｖｏでのモニターである場合、当該タンパク質は、生理的な温度で安定であることが好ましいであろう。さらに、ＧＧＢＰは、センサーの製造、出荷および保管のために安定性が強化されていることが好ましく、これは、可能性として、当該タンパク質およびセンサーの材料を周囲温度で加工することを合理化し、かつそのような加工を可能にしうるであろう。こうした製造過程は、臨床の状況で使用するための、高温で滅菌する手順を含むことができるであろう。しかし、高温に曝されると、タンパク質が変性し、ＧＧＢＰを意図する目的では役に立たなくする恐れがある。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６８５５５５６号明細書
【特許文献２】米国特許第５１３２４３２号明細書
【特許文献３】米国特許第４９８１９７７号明細書
【特許文献４】米国特許第５２６８４８６号明細書
【特許文献５】米国特許第５５６９５８７号明細書
【特許文献６】米国特許第５５６９７６６号明細書
【特許文献７】米国特許第５４８６６１６号明細書
【特許文献８】米国特許第５６２７０２７号明細書
【特許文献９】米国特許第５８０８０４４号明細書
【特許文献１０】米国特許第５８７７３１０号明細書
【特許文献１１】米国特許第６００２００３号明細書
【特許文献１２】米国特許第６００４５３６号明細書
【特許文献１３】米国特許第６００８３７３号明細書
【特許文献１４】米国特許第６０４３０２５号明細書
【特許文献１５】米国特許第６１２７１３４号明細書
【特許文献１６】米国特許第６１３００９４号明細書
【特許文献１７】米国特許第６１３３４４５号明細書
【特許文献１８】米国特許第６６６４０４７号明細書
【特許文献１９】米国特許第６９７４８７３号明細書
【特許文献２０】米国特許第６９７７３０５号明細書
【特許文献２１】国際公開第０２／２６８９１号パンフレット
【特許文献２２】国際公開第９７／４０１０４号パンフレット
【特許文献２３】国際公開第９９／５１７０２号パンフレット
【特許文献２４】国際公開第０１／２１６２４号パンフレット
【特許文献２５】欧州特許出願公開第１０６５２５０Ａ１号明細書
【特許文献２６】米国特許第４７７４３３９号明細書
【特許文献２７】米国特許第５１８７２８８号明細書
【特許文献２８】米国特許第５２４８７８２号明細書
【特許文献２９】米国特許第５２７４１１３号明細書
【特許文献３０】米国特許第５４３３８９６号明細書
【特許文献３１】米国特許第６１６２９３１号明細書
【特許文献３２】米国特許第６１３０１０１号明細書
【特許文献３３】米国特許第６２２９０５５号明細書
【特許文献３４】米国特許第６３３９３９２号明細書
【特許文献３５】米国特許第５４５１３４３号明細書
【特許文献３６】米国特許第６７１６９７９号明細書
【特許文献３７】米国特許第４７１４７６３号明細書
【特許文献３８】米国特許第４８１０６３６号明細書
【特許文献３９】米国特許第５６９６１５７号明細書
【特許文献４０】米国特許第５４５９２７６号明細書
【特許文献４１】米国特許第５５０１９８０号明細書
【特許文献４２】米国特許第５８３０９１２号明細書
【特許文献４３】米国特許第４６０３２０９号明細書
【特許文献４４】米国特許第４８４９３６２号明細書
【特許文献４５】米国特許第４８１２４０９号明細書
【特許文献４６】米国特許第５２４２８０５号明細書
【特許文献４７】米国特許出願公開第２００６／０２８０６５２号明細書
【特許文献４８】国際公開第２００６／０２５８８７号パンフレット
【特許文献４９】米国特許第５２２７４８７号明細書
【特許文献５０】米国特許第５４４２０４５号明細書
【特許文献５１】米国特許第５７９８２７６号明細書
【特許文献５２】米国特許第５８４６７３７号明細書
【特許文献５３】米国特許第６５６２６３２号明細書
【特許文献５４】米国特許第４９４５１７１号明細書
【特許文献５５】米国特許出願公開第２００６／０２８６５２号明細書
【特許文献５６】米国特許第４３８４０４２号明細書
【特許文献５７】米国特許第５１９６３０６号明細書
【特許文献５８】米国特許第５５８３００１号明細書
【特許文献５９】米国特許第５７３１１５８号明細書
【特許文献６０】米国特許第５３１６９０６号明細書
【特許文献６１】米国特許第５４４３９８６号明細書
【特許文献６２】米国特許第４５２０１１０号明細書
【特許文献６３】米国特許第４８５９５８２号明細書
【特許文献６４】米国特許第５０５５５５６号明細書
【特許文献６５】米国特許第４５４２１０４号明細書
【特許文献６６】欧州特許出願公開第０４６４５３３号明細書
【特許文献６７】欧州特許出願公開第０２３２２６２号明細書
【特許文献６８】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献６９】米国特許第６０１３８５７号明細書
【特許文献７０】米国特許第５９９０３８５号明細書
【特許文献７１】米国特許第５９９４６１６号明細書
【特許文献７２】国際公開第２００７／０２２４８５パンフレット
【特許文献７３】米国特許出願公開第２００５／０９２３１５５号明細書
【特許文献７４】米国特許第５５１７３１３号明細書
【特許文献７５】米国特許第５９１０６６１号明細書
【特許文献７６】米国特許第５８９４３５１号明細書
【特許文献７７】米国特許第５３４２７８９号明細書
【特許文献７８】米国特許出願公開第２００５／０１１３６５８号明細書
【特許文献７９】米国特許出願公開第２００５／０１１２６８５号明細書
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【非特許文献４２】Quinn, C. A. P.; Connor, R. E.; Heller, A. Biomaterials 1997, 18(24), 1665-1670
【非特許文献４３】"Biosensors Fundamentals and Applications", edited by A. D. F. Turner, I. Karube and G. S. Wilson; published from Oxford University Press, in 1988
【非特許文献４４】Ghandehari H., et al., J. Macromol. Chem. Phys. 197: 965 (1996)
【非特許文献４５】Ishihara K, et al., Polymer J,16: 625 (1984)
【非特許文献４６】Pisarchick, M. L. and Thompson, N. L. Biophys. J. (1990), 58, 1235-1249
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、活性を維持しながら、より高い温度に耐えることができ、それによって、多様なより高い温度環境において、分析物に結合することができ、バイオセンサー中で使用することができるＧＧＢＰが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、参照グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）よりも高い融解温度（Ｔｍ）を有する、機能性の修飾ＧＧＢＰに関する。
【０００７】
また、本発明は、熱安定性ＧＧＢＰをコードする核酸にも関する。
【０００８】
また、本発明は、機能性の修飾ＧＧＢＰにも関し、機能性の修飾ＧＧＢＰは、参照ＧＧＢＰよりも高い融解温度を有し、修飾ＧＧＢＰは、少なくとも１つの標識をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、周辺質結合タンパク質（ＧＧＢＰ）よりも高い融解温度（Ｔｍ）を有する、機能性の修飾されたＧＧＢＰに関する。
【００１０】
グルコースーガラクトース結合タンパク質は、周知のクラスの周辺質結合タンパク質のメンバーであり、これらのタンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列（一次構造）ではなく、むしろ三次元の立体配置（三次構造）を特徴とする。このクラスの各メンバーは、特徴的なローブ−ヒンジ−ローブ（lobe-hinge-lobe）のモチーフを有する。参照によって本明細書に組み入れられている非特許文献１を参照されたい。ＰＢＰは、通常、ＰＢＰのローブ間の間隙領域（cleft region）において、分析物に特異的に結合する。さらに、間隙領域において分析物に結合すると、次いで、ＰＢＰの立体構造の変化（conformational change）が生じ、これによって、分析物の分析が可能になる。一般に、分析物との特異的な結合後のＰＢＰの立体構造の変化は、２つのローブ領域が、ヒンジ領域の周りでおよびヒンジ領域を介して、互いの方向に向かって曲がることを特徴とする。参照によって組み入れられている非特許文献２を参照されたい。ＰＢＰの例には、これらに限定されないが、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタミン酸結合タンパク質（ＧｌｕＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、リン酸結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、グルタミン結合タンパク質（ＱＢＰ）、ロイシン結合タンパク質（ＬＢＰ）、ロイシン−イソロイシン−バリン−結合タンパク質（ＬＩＶＢＰ）、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、またはそれらの誘導体、ならびに周辺質結合タンパク質様タンパク質Ｉ（ＰＢＰ様Ｉ）および周辺質結合タンパク質様タンパク質ＩＩ（ＰＢＰ様ＩＩ）として知られているタンパク質のファミリーに属するその他のタンパク質が含まれる。
【００１１】
本発明の目的では、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）は、本明細書に記載するこれらの構造的な特徴を有し、グルコースおよび／またはガラクトースに特異的に結合することができるタンパク質のいずれをも含む。
【００１２】
特に、本発明は、ＧＧＢＰのうちの修飾したものに関する。「修飾タンパク質」は、参照タンパク質またはポリペプチドの一次構造（アミノ酸配列）中の１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換によって生み出すことができるタンパク質を意味するために使用する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用する。参照タンパク質は、野生型タンパク質である必要はないが、熱安定性を高める目的で修飾の標的とする、いずれかのタンパク質であることができる。したがって、参照タンパク質は、配列が、野生型タンパク質から前もって修飾されたタンパク質であることができる。もちろん、参照タンパク質は、特定の生物体からの野生型タンパク質であっても、またはそうでなくてもよい。さらに、「野生型タンパク質」という用語は、「リーダー配列」を有する野生型タンパク質または「リーダー配列」を有しない野生型タンパク質を含む。
【００１３】
本発明の修飾ＧＧＢＰは、機能性および熱安定性を有する。本明細書で使用する場合、機能性の修飾ＧＧＢＰは、対象の分析物に特異的に結合することが可能である。特に、分析物が修飾ＧＧＢＰに結合すると、特徴的な「リガンドが媒介してヒンジを曲げる動き（ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ−ｈｉｎｇｅ−ｂｅｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｏｎ）」が生じ、これは、野生型ＧＧＢＰが分析物に結合する場合に認められるもの、すなわち、２つのローブ領域がヒンジ領域を介して互いの方向に向かって曲がるのに類似する。非特許文献１を参照されたい。しかし、ローブ領域の動きの程度は、野生型ＧＧＢＰの場合と同一である必要はない。
【００１４】
１つの例では、本発明の修飾ポリペプチドは、修飾ＧＧＢＰであることができ、参照タンパク質中の「表面」アミノ酸が変異している。タンパク質の「表面アミノ酸」という句は、当技術分野での使用に従って使用し、一般に、溶媒またはその他の環境に暴露することができる、折り畳まれたタンパク質の残基を意味するために使用する。したがって、本発明の１つの具体的な実施形態は、参照ＧＧＢＰの１つまたは複数の表面残基が変異している修飾ＧＧＢＰに関する。特に、表面アスパラギン残基および表面グルタミン残基を、置換の標的とすることができる。例を挙げると、例えば、配列番号１のアスパラギン３９（Ｎ３９）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）の位置に対応しているアスパラギン残基を、置換の標的とすることができる。同様に、それに加えてまたはそれに代わって、例えば、配列番号１のグルタミン５１（Ｑ５１）、グルタミン８３（Ｑ８３）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、およびロイシン１７８（Ｌ１７８）の位置に対応しているグルタミン残基もまた置換の標的とすることができる。修飾の標的とすることができる表面アミノ酸の例には、これらに限定されないが、図３に図解する残基が含まれる。また、その他の表面残基を、置換のために、例えば、（ワールドワイドウェブ上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiで利用できる）ＮＣＢＩの分子モデリングのデータベース（ＭＭＤＢ）のアクセッション記録番号２ＧＢＰに基づいて選択することもできる。したがって、本発明の１つの具体的な実施形態は、参照ＧＧＢＰ中の少なくとも１つの表面グルタミンのアミノ酸が変異している修飾ＧＧＢＰに関する。本発明の別の具体的な実施形態は、参照ＧＧＢＰ中の少なくとも１つの表面アスパラギンのアミノ酸が変異している修飾ＧＧＢＰに関する。本発明のさらに別の具体的な実施形態は、参照ＧＧＢＰ中の少なくとも１つの表面グルタミンのアミノ酸および１つの表面アスパラギンのアミノ酸が変異している修飾ＧＧＢＰに関する。もちろん、本発明の修飾ＧＧＢＰは、追加の修飾も含んでよく、表面のアスパラギンおよびグルタミンのみが、修飾の標的となる必要はない。
【００１５】
追加の実施形態では、アミノ酸は、ペプチドまたはタンパク質中の残基のアミド分解（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）またはアミド分解の可能性に基づいて変異のために標的化される。当業者であれば認識しているように、アミド分解は、アミド基が変化する化学反応である。ペプチドに関しては、アミド分解は、アミド含有アミノ酸を含有するタンパク質またはペプチドの官能基を、分解または破壊することができる可能性がある。アミド含有アミノ酸の例には、これらに限定されないが、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。アミド分解は、一般に、温度およびｐＨが上昇すると、より急速に起きる。したがって、アミド分解の過程は、ペプチドおよびタンパク質を、熱により不活性化されやすくする。参照によって組み入れられている非特許文献３を参照されたい。したがって、１つの実施形態では、アミド分解を起こしやすいアミノ酸を、置換または欠失の標的とする。アミド分解を起こしやすいアミノ酸を決定するために使用する方法によって、本発明の範囲が限定されてはならない。１つの具体的な実施形態では、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）を使用して、アスパラギン残基等の感受性の残基における相対的なアミド分解を測定することができる。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「に対応する（correspond(s) to）」および「に対応している（corresponding to）」という用語は、配列アライメントに関する場合には、参照タンパク質、例えば、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＧＢＰ内の掲げられた位置、および参照タンパク質上の位置に整列する修飾ＧＧＢＰ中の位置を意味することを意図する。したがって、対象のＧＧＢＰのアミノ酸配列を、参照ＧＧＢＰ、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と整列させると、参照ＧＧＢＰ配列の掲げられた特定の位置「に対応する」、対象のＧＧＢＰの配列中のアミノ酸は、参照ＧＧＢＰ配列のこれらの位置に整列するアミノ酸であるが、参照ＧＧＢＰ配列のこれらのぴったりの番号の位置に必ずしも存在するとは限らない。配列間の対応しているアミノ酸を決定する目的で配列を整列させるための方法を、以下に記載する。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの修飾野生型ＧＧＢＰである。したがって、この実施形態では、修飾ＧＧＢＰの参照タンパク質は、以下の配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＧＧＢＰであり、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースから、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号２ＧＢＰとして利用でき、その全記録は参照によって組み入れられている。ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、ワールドワイドウェブ上のwww.ncbi.nih.gov/Genbankに存在する。
【００１８】
【表１】
2009534042.tif 000003
【００１９】
特定の実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、配列番号１の以下の残基のうちの１つまたは複数に対応している位置において、１つまたは複数の残基の置換を含む：チロシン１２（Ｙ１２）、アスパラギン１５（Ｎ１５）、アスパラギン３９（Ｎ３９）、セリン４１（Ｓ４１）、アスパラギン４３（Ｎ４３）、アスパラギン４９（Ｎ４９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、イソロイシン５２（Ｉ５２）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アラニン１２８（Ａ１２８）、アラニン１２９（Ａ１２９）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン１３１（Ｑ１３１）、グリシン１３２（Ｇ１３２）、トロプトファン１３３（Ｗ１３３）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン２０２（Ｎ２０２）、リジン２０３（Ｋ２０３）アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、アスパラギン酸２６７（Ｄ２６７）、アラニン２６９（Ａ２６９）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、トリプトファン２８４（Ｗ２８４）およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの修飾野生型ＧＧＢＰであり、野生型ＧＧＢＰは、天然のリーダー配列を有する。したがって、この実施形態では、修飾ＧＧＢＰの参照タンパク質は、以下の配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０２９２７として利用でき、その全記録は参照によって組み入れられている。
【００２１】
【表２】
2009534042.tif 000004
【００２２】
特定の実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、配列番号２の以下の残基のうちの１つまたは複数に対応している位置において、１つまたは複数の残基の置換を含む：チロシン３５（Ｙ３５）、アスパラギン３８（Ｎ３８）、アスパラギン６２（Ｎ６２）、セリン６４（Ｓ６４）、アスパラギン６６（Ｎ６６）、アスパラギン７２（Ｎ７２）、アスパラギン酸７３（Ｄ７３）、グルタミン７４（Ｑ７４）、イソロイシン７５（Ｉ７５）、グリシン１０５（Ｇ１０５）、グルタミン１０６（Ｑ１０６）、アスパラギン１０７（Ｎ１０７）、アラニン１５１（Ａ１５１）、アラニン１５２（Ａ１５２）、アスパラギン１５３（Ｎ１５３）、グルタミン１５４（Ｑ１５４）、グリシン１５５（Ｇ１５５）、トリプトファン１５６（Ｗ１５６）、グルタミン１９８（Ｑ１９８）、グルタミン２００（Ｑ２００）、ロイシン２０１（Ｌ２０１）、グリシン２２１（Ｇ２２１）、プロリン２２２（Ｐ２２２）、アスパラギン２２３（Ｎ２２３）、アスパラギン２０２（Ｎ２２５）、リジン２２６（Ｋ２２６）アスパラギン２４９（Ｎ２４９）、アスパラギン２８２（Ｎ２８２）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、アスパラギン酸２９０（Ｄ２９０）、アラニン２９２（Ａ２９２）、リジン２９３（Ｋ２９３）、アスパラギン２９４（Ｎ２９４）、アスパラギン３０６（Ｎ３０６）、トリプトファン３０７（Ｗ３０７）およびアスパラギン３２５（Ｎ３０２）。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、すでに修飾されているＧＧＢＰが、さらに修飾されたものであり、このすでに修飾されているＧＧＢＰは、野生型（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））ＧＧＢＰと比較して３つのアミノ酸の置換を有し、「３Ｍ−ＧＧＢＰ」と名付けられている。配列番号１と比較してＥ１４９Ｃ、Ａ２１３Ｒ、Ｌ２３８Ｓに対応している置換を有する３Ｍ−ＧＧＢＰの構築は、参照によって組み入れられている特許文献１に記載されている。したがって、この実施形態では、修飾ＧＧＢＰの参照タンパク質は、以下の配列番号３のアミノ酸配列を含む３Ｍ−ＧＧＢＰである。
【００２４】
【表３】
2009534042.tif 000005
【００２５】
特定の実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、配列番号３の以下の残基のうちの１つまたは複数に対応している位置において、１つまたは複数の残基の置換を含む：チロシン１２（Ｙ１２）、アスパラギン１５（Ｎ１５）、アスパラギン３９（Ｎ３９）、セリン４１（Ｓ４１）、アスパラギン（Ｎ４３）、アスパラギン４９（Ｎ４９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、イソロイシン（Ｉ５２）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アラニン１２８（Ａ１２８）、アラニン１２９（Ａ１２９）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン（Ｑ１３１）、グリシン１３２（Ｇ１３２）、トリプトファン１３３（Ｗ１３３）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン（Ｎ２０２）、リジン（Ｋ２０３）アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、アスパラギン酸２６７（Ｄ２６７）、アラニン２６９（Ａ２６９）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、トリプトファン２８４（Ｗ２８４）およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、すでに修飾されているＧＧＢＰが、さらに修飾されたものであり、このすでに修飾されているＧＧＢＰは、野生型（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））ＧＧＢＰと比較してトリプトファン１８３のシステイン（Ｗ１８３Ｃ）への単一のアミノ酸置換を有し、「Ｗ１８３Ｃ−ＧＧＢＰ」または「Ｗ１８３」と名付けられている。したがって、この実施形態では、修飾ＧＧＢＰの参照タンパク質は、以下の配列番号４のアミノ酸配列を含むＷ１８３Ｃ−ＧＧＢＰである。
【００２７】
【表４】
2009534042.tif 000006
【００２８】
特定の実施形態では、修飾ＧＧＢＰは、配列番号４の以下の残基のうちの１つまたは複数に対応している位置において、１つまたは複数の残基の置換を含む：チロシン１２（Ｙ１２）、アスパラギン１５（Ｎ１５）、アスパラギン３９（Ｎ３９）、セリン４１（Ｓ４１）、アスパラギン（Ｎ４３）、アスパラギン４９（Ｎ４９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、イソロイシン（Ｉ５２）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アラニン１２８（Ａ１２８）、アラニン１２９（Ａ１２９）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン（Ｑ１３１）、グリシン１３２（Ｇ１３２）、トリプトファン１３３（Ｗ１３３）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン（Ｎ２０２）、リジン（Ｋ２０３）アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、アスパラギン酸２６７（Ｄ２６７）、アラニン２６９（Ａ２６９）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、トリプトファン２８４（Ｗ２８４）およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）。
【００２９】
いくつかの実施形態では、野生型または参照タンパク質上での修飾の標的とする各アミノ酸は、標的部位において単一のアミノ酸で置換することによって修飾され、その結果、１つまたは複数の置換が、一対一の様式で起きる。例えば、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＧＢＰ（配列番号１）の３９位のアスパラギンを、異なるアミノ酸、例えば、イソロイシンまたはバリンで置換することによって修飾することができる。その他の実施形態では、２つ以上のアミノ酸が、標的部位でかつ標的部位に隣接して（しかし必ずしも直接隣接する必要はない）置換されており、その結果、野生型または参照タンパク質上での「座位」が変異している。例えば、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＧＢＰ（配列番号１）の８３位のグルタミンを、参照ＧＧＢＰの８３位を中心にして、２つ以上のアミノ酸で置換することによって修飾することができる。すなわち、８３位の単一のグルタミンを標的とする置換において、グルタミン酸、リジンおよびアスパラギン酸でそれぞれ８２〜８４位において置換することができる。
【００３０】
また、本発明は、修飾ＧＧＢＰの参照タンパク質が、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、修飾ＧＧＢＰも意図する。特異的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一である。その他の実施形態では、参照ＧＧＢＰは、これらに限定されないが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の種からの野生型ＧＧＢＰであることができるであろう。
【００３１】
ＧＧＢＰをコードする参照アミノ酸配列と、少なくとも、例えば、約９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、参照ＧＧＢＰをコードする参照アミノ酸配列の１００個のアミノ酸あたり約５つまでの修飾を含むことができる以外は、当該アミノ酸配列が、参照配列と同一であることを意味すると理解される。すなわち、参照アミノ酸配列と、少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るためには、約５％までの参照配列のアミノ酸残基を、欠失させるか、別のアミノ酸で置換することができる、または参照配列中の全アミノ酸の約５％までの、いくつかのアミノ酸を、参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれらの修飾は、参照アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端の位置で生じても、あるいはそれらの末端の位置の間のどこかで、参照配列中のアミノ酸の間で個々にまたは参照配列内で１つまたは複数の近接する群としてのいずれかで分散して生じてもよい。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「同一性」は、参照ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列と比較したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最高次数の一致が得られるように配列を整列させる。「同一性」自体は、当技術分野で認識されている意味を有し、公開されている技法を使用して計算することができる。（例えば、非特許文献４〜８を参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」という用語は、当業者にはよく知られている（非特許文献９を参照）。２つの配列間の同一性または類似性を決定するために通常利用する方法には、これらに限定されないが、非特許文献１０および９に開示されているものが含まれる。また、コンピュータプログラムが、同一性および類似性を計算する方法およびアルゴリズムを含む場合もある。２つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータプログラムの方法の例には、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献１１を参照）、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献１２を参照）、およびＦＡＳＴＤＢが含まれる。同一性および類似性を決定するための方法の例が、参照によって組み入れられている非特許文献１３で議論されている。本発明の１つの実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用するアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用するアルゴリズムは、ＦＡＳＴＤＢであり、これは、参照によって組み入れられている非特許文献１４のアルゴリズムに基づいている。ＦＡＳＴＤＢの配列アライメントの場合、問合わせ配列および対象配列は、アミノ酸配列である。配列アライメントの結果は、パーセント同一性で示す。パーセント同一性を計算するためにアミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて使用することができるパラメータには、これらに限定されないが、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ配列の長さのいずれか短い方が含まれる。
【００３４】
対象配列が、内部の付加または欠失によるのではなく、Ｎ末端またはＣ末端の付加または欠失により、問合わせ配列よりも短いまたは長い場合には、手作業で補正することができる。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、パーセント同一性を計算する場合、対象配列のＮ末端およびＣ末端の切断も付加も考慮に入れないからである。５’末端または３’末端で切断されている対象配列の場合、問合わせ配列と比較して、一致／整列していない問合わせ配列（この問合わせ配列は、参照配列に対しては、Ｎ末端およびＣ末端となる。）の塩基の数を、問合わせ配列の全塩基のパーセントとして計算することによって、パーセント同一性を補正する。ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果が、一致／整列を決定する。次いで、アライメントパーセントを、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって、特定したパラメータを使用して計算したパーセント同一性から差し引くと、最終的なパーセント同一性スコアが得られる。この補正したスコアを、アライメントがどのように相互に「対応する」かを決定する目的およびパーセント同一性を決定する目的で使用することができる。参照または対象のそれぞれの配列のＮ末端またはＣ末端を越えて伸長している問合わせ（対象）配列または参照配列の残基は、パーセント同一性スコアを手作業で調整する場合に考慮に入れることができる。すなわち、パーセント同一性スコアまたはアライメントの番号付けを手作業で調整する際に、比較配列のＮ末端またはＣ末端と一致／配列しない残基を数えることができる。
【００３５】
例えば、９０個のアミノ酸残基の対象配列を、１００個の残基の参照配列と整列させて、パーセント同一性を決定する。欠失が、対象配列のＮ末端で生じており、したがって、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端における最初の１０個の残基の一致／整列を示さない。１０個の不対の残基は、配列の１０％（一致しないＮ末端およびＣ末端における残基の数／問合わせ配列中の残基の総数）に相当し、したがって、１０％を、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算したパーセント同一性スコアから差し引く。残りの９０個の残基が、完全に一致する場合には、最終的なパーセント同一性は、９０％となるであろう。別の例では、９０個の残基の対象配列を、１００個の残基の参照配列と比較する。今回は、欠失は、内部の欠失であり、したがって、問合わせ配列と一致／整列しない残基は、対象配列のＮ末端にもＣ末端にも存在しない。この場合には、ＦＡＳＴＤＢによって計算したパーセント同一性は、手作業で補正しない。
【００３６】
本発明の修飾ＧＧＢＰは、参照ＧＧＢＰと比較して、増加した安定性（例えば、熱安定性、洗剤に対する安定性、ｐＨ安定性、凍結／解凍に対する安定性）、または水性溶媒中での向上した溶解性等、改善された特徴を有することができる。特に、本発明の修飾ＧＧＢＰは、熱に対して安定、または加熱に対して安定である。「熱安定性の（thermostable）」または「加熱安定性の（heat stable）」という用語は、本明細書では互換的に使用し、修飾ＧＧＢＰが、修飾ＧＧＢＰを誘導した参照ＧＧＢＰよりも高い融解温度を有することを示すために使用する。融解温度は、この用語がタンパク質に関する場合には、本明細書では当技術分野での使用に従って使用する。すなわち、融解温度は、試料中の折り畳まれているタンパク質の個体数と折り畳まれていないタンパク質の個体数が等しい温度である。タンパク質の融解温度を決定する多数の方法が存在し、本発明が、タンパク質の融解温度を決定する方法によって限定されてはならない。参照タンパク質および修飾タンパク質の融解温度を決定する方法が同一であるならば、熱安定性タンパク質は、本発明の目的では、参照タンパク質よりも高い融解温度を有するタンパク質である。タンパク質の融解温度を測定する方法の１つの例には、これに限定されないが、円二色性が含まれる。これは、右円偏光と左円偏光との吸収の差を測定して、タンパク質の三次元の立体配置をモニターする分光学的な方法である。円二色性の方法は、参照によって組み入れられている非特許文献１５で議論されている。
【００３７】
本発明では、分析物と修飾されたグルコース−ガラクトース結合タンパク質とが、結合のパートナーとして作用する。本明細書で使用する場合、「結合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）」または「結合する（ｂｉｎｄｓ）」という用語は、特異的な結合を指す。特異的な結合の親和性は、これに限定されないが、平衡解離定数（Ｋｄ）等の相対的な結合定数を計算することによって評価することができる。Ｋｄは、半分の結合性の分子が結合しているまたはその逆の場合の、遊離の分析物の濃度として計算することができる。対象の分析物が、グルコースである場合には、例えば、結合パートナーについてのＫｄの値は、約０．０００１ｍＭから約３０ｍＭの間であることができる。したがって、本発明の修飾されたグルコース−ガラクトース結合タンパク質は、例えば、グルコース等の分析物が関与する生物学的な反応の動態を追跡することを可能にする、分析物のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアッセイおよび臨床におけるアッセイにおいて使用することができる。参照タンパク質よりも大きな解離定数を有するタンパク質または修飾タンパク質は、タンパク質または修飾タンパク質の標的分析物に対する結合がより弱いこと、または修飾ＧＧＢＰの結合親和性が減少したことを意味する。逆に、参照タンパク質よりも小さな解離定数を有するタンパク質または修飾タンパク質は、タンパク質または修飾タンパク質の標的分析物に対する結合がより強いこと、または修飾ＧＧＢＰの結合親和性が増加したことを意味する。例えば、約１ｍＭのＫｄを有するタンパク質は、約０．１ｍＭのＫｄを有するタンパク質よりも「弱い」結合親和性を有するとみなされる。
【００３８】
したがって、本発明の１つの実施形態では、分析物の結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの結合親和性は、同一の分析物の結合パートナーに対する野生型ＧＧＢＰの結合親和性と実質的に同一である。本明細書で使用する場合、結合親和性を比較して「実質的に同一の」という用語は、分析物の結合パートナーに対して測定した修飾ＧＧＢＰと参照ＧＧＢＰとの結合親和性の差が、一桁以内であることを示す。例えば、結合親和性を決定および比較するために使用した測定基準が、解離定数である場合、一方のタンパク質が、他方のタンパク質よりも測定すると弱いにもかかわらず、約１ｍＭのＫｄを有するタンパク質は、約０．１ｍＭのＫｄを有するタンパク質と、実質的に同一の結合親和性を有するとみなされる。しかし、明確に表現すれば、１つのタンパク質が、別のタンパク質と比較して、より弱い結合親和性を有する場合があるが、本発明の目的では、それでも、これら２つのタンパク質は、「実質的に同一の」結合親和性を有することになるであろう。
【００３９】
別の実施形態では、結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの結合親和性は、同一の分析物の結合パートナーに対する参照ＧＧＢＰの結合親和性と比較して変化している。本明細書で使用する場合、同一の分析物の結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰと参照ＧＧＢＰとの結合親和性の差が、一桁以内ではない場合には、結合親和性が「変化している」。１つの実施形態では、本発明は、分析物の結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの結合親和性を、同一の分析物に対する参照ＧＧＢＰの結合親和性と比較して減少させる方法に関する。別の実施形態では、本発明は、分析物の結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの結合親和性を、同一の分析物に対する参照ＧＧＢＰの結合親和性と比較して増加させる方法に関する。
【００４０】
同様に、本発明の一態様は、標的に対する結合性分子の親和性を変化させ、同時に修飾ＧＧＢＰの熱安定性もまた高める方法に関する。１つの実施形態では、本発明は、分析物の結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの結合親和性を、同一の結合パートナーに対する参照ＧＧＢＰの結合親和性と比較して減少させる方法に関する。別の実施形態では、本発明は、修飾ＧＧＢＰの選択性を、参照ＧＧＢＰの選択性と比較して変化させる方法に関する。
【００４１】
別の実施形態では、結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの相対的、絶対的またはレシオメトリックな蛍光応答が、同一の分析物の結合パートナーに対する参照ＧＧＢＰの蛍光応答と比較して変化している。この参照ＧＧＢＰの蛍光応答は、相対的、絶対的またはレシオメトリックであることができる。相対的な蛍光を決定および測定する方法は、参照によって組み入れられている非特許文献１６に記載されている。レシオメトリックな蛍光を決定および測定する方法は、参照によって組み入れられている非特許文献１７に記載されている。本明細書で使用する場合、分析物との結合時の修飾ＧＧＢＰの蛍光が、同一の分析物との結合時の参照ＧＧＢＰの蛍光とは、一桁超異なる場合には、相対的な蛍光応答が「変化している」。１つの実施形態では、本発明は、分析物の結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの蛍光を、同一の分析物に対する参照ＧＧＢＰの蛍光と比較して減少させる方法に関する。別の実施形態では、本発明は、分析物の結合パートナーに対する修飾ＧＧＢＰの結合親和性を、同一の分析物に対する参照ＧＧＢＰの結合親和性と比較して増加させる方法に関する。
【００４２】
別の特異的な実施形態では、修飾タンパク質は、２つ以上の分析物に特異的な様式で結合するように修飾することができる。実際に、修飾タンパク質は、別の標的リガンドに加えて、参照ＧＧＢＰと同一のリガンドに対する特異性を有することができる。
【００４３】
同様に、修飾タンパク質は、参照結合性タンパク質が結合しない、１つまたは複数の分析物に結合することが可能である場合がある。タンパク質の選択性または特異性を変化させる方法が、記載されている。例えば、参照によって本明細書に組み入れられている非特許文献１８は、新しい分析物結合特性をタンパク質に提供する、周辺質結合タンパク質内の結合部位を再設計するための方法を開示している。これらの修飾結合性タンパク質は、立体構造の変化を起こす能力を保持しており、それによって、分析物の結合によって直接生じるシグナルを発生させることができる。５位と１７位との間のアミノ酸に変化を導入することによって、Ｌｏｏｇｅｒらは、いくつかの修飾タンパク質を構築し、それぞれが、ＴＮＴ（トリニトロトルエン）、Ｌ−乳酸（L-lactate）またはセロトニンに対する新しい選択性を有した。例えば、Ｌｏｏｇｅｒらは、ＡＢＰ、ＧＧＢＰ、ＲＢＰ、ＨＢＰおよびＱＢＰからＬ−乳酸結合タンパク質を産生した。１つの実施形態では、発明品は、Ｌ−乳酸に特異的に結合する変異型熱安定性ＧＧＢＰを含む。この実施形態では、参照ＧＧＢＰは、グルコースおよびガラクトースに対する結合特異性が除去されていて、今では、Ｌ−乳酸に特異的に結合することができる、前もって変異させたＧＧＢＰであろう。次いで、この参照ＧＧＢＰを、本発明の目的で、修飾された、Ｌ−乳酸特異的ＧＧＢＰの熱安定性を高めるように変異させる。
【００４４】
修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、試料中の分析物を検出または測定するために標識されてもよいが、そうでなければならないとは限らない。本発明の標識されていない、修飾された熱安定性のＧＧＢＰを使用するアッセイの例には、これらに限定されないが、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）および表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）が含まれる。別の実施形態では、参照ＧＧＢＰおよび修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、１つまたは複数の標識部分もまた含むことができる。本明細書で使用する場合、「標識部分」は、検出可能なシグナルを有するまたは有するようになる化合物またはイオンを意味することを意図する。本発明で使用する標識は、ＧＧＢＰのローブ領域における立体構造の変化を示すために使用することができる。ローブ領域における変化の例には、これらに限定されないが、三次元の立体構造の変化、タンパク質性の結合ドメインのアミノ酸側鎖の配向の変化、および結合ドメインの酸化還元状態が含まれる。タンパク質の一次構造への１つまたは複数の残基の付加／置換と共に、現在の方法および組成で使用する標識部分のうちのいくつかは、還元、酸化、共役および縮合の反応等の化学的手段によって結合させることができる。タンパク質を標識するために通常使用する残基の例には、これらに限定されないが、リジンおよびシステインが含まれる。例えば、いずれかのチオール反応性の基を使用して、標識部分、例えば、フルオロフォアを、ポリペプチドの一次構造中の天然のまたは操作した（engineered）システインに結合させることができる。参照によって組み入れられている特許文献１は、ＰＢＰの種々のシステインの変異を記載している。また、例えば、リジン残基を、フルオロフォアのスクシンイミドエステル誘導体を使用して標識することもできる。参照によって本明細書に組み入れられている非特許文献１９を参照されたい。
【００４５】
本発明の標識部分は、放射活性があっても、またはなくてもよい。放射標識の例には、これらに限定されないが、３Ｈおよび３２Ｐが含まれ、これらは、放射線測定器を用いて測定することができる。放射活性がない標識の例には、これらに限定されないが、遷移金属、ランタニドイオンおよびその他の化合物が含まれる。放射活性がないシグナルには、これらに限定されないが、分光光度計を用いて視覚的に観察または測定することができる蛍光、リン光、生物発光、電気化学および化学発光による色素、染料またはその他の色素原、スピン標識分析器を用いて測定することができるスピン標識、ならびに蛍光標識（フルオロフォア）が含まれる。蛍光標識の場合、出力シグナルが、適切な分子付加物の励起によって発生し、これを、染料が吸収する光で励起することによって可視化する、または標準的な蛍光光度計もしくは画像システムを用いて測定することができる。標識の追加の例には、これらに限定されないが、リン光染料、タンデム色素および粒子が含まれる。標識は、出力シグナルがシグナル化合物の化学的な修飾によって発生する化学発光物質；金属含有物質；または酵素であることができる。酵素によって、酵素依存性のシグナルが二次的に発生し、例えば、無色の物質から変色した産物を形成する。また、標識という用語は、「タグ」またはハプテンも含み、これらは、共役分子に選択的に結合するので、共役分子を、後から基質と併せて添加して、検出可能なシグナルを発生させるために使用することができる。例えば、ビオチンを標識として使用し、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジンまたはストレプトアビジンとの複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用して、ビオチン標識に結合させ、その後に、比色分析基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））またはＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）のような蛍光発生基質を使用して、ＨＲＰの存在を検出することができる。多数の標識が、当業者に知られており、これらに限定されないが、粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素、ならびにそれらの比色分析基質、蛍光発生基質および化学発光基質、ならびに参照によって本明細書に組み入れられている非特許文献２０に記載されている、その他の標識を含む。
【００４６】
本発明のフルオロフォアは、２８０ｎｍ以上で最大吸収を示す、いずれかの化学的な部分であり、タンパク質またはその他の試薬に共有結合しても、スペクトルの特性を保持する。本発明のフルオロフォアには、これらに限定されないが、ピレン（参照によって組み入れられている特許文献２に開示されている、対応する誘導体化合物のうちのいずれかを含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンズインドール、オキサゾールまたはベンゾオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン、カルボシアニン（参照によって組み入れられている特許文献３〜２５中のいずれかの対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチル酸、アントラニル酸、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（ｂｏｒａｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ）（参照によって組み入れられている特許文献２６〜３０に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、キサンテン（参照によって組み入れられている特許文献３１〜３６に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、オキサジン（参照によって組み入れられている特許文献３７に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）またはベンゾオキサジン、カルバジン（参照によって組み入れられている特許文献３８に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（参照によって組み入れられている特許文献３９〜４２に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（参照によって組み入れられている特許文献４３および４４に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、ベンズフェナレノン（ｂｅｎｚｐｈｅｎａｌｅｎｏｎｅ）（参照によって組み入れられている特許文献４５に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、ならびにそれらの誘導体が挙含まれる。本明細書で使用する場合、オキサジンは、レゾルフィン（参照によって組み入れられている特許文献４６に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換類似体を含む。追加の標識部分には、これらに限定されないが、２００６年１２月１４日公開の特許文献４７、および特許文献４８に記載されている化合物も含まれる。これらの文献は、参照によって組み入れられている。
【００４７】
フルオロフォアが、キサンテンである場合、このフルオロフォアは、任意選択的に、フルオレセイン、ロドール（参照によって組み入れられている特許文献４９および５０に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）、またはローダミン（参照によって組み入れられている特許文献５１〜５３中のいずれかの対応する化合物を含む）である。本明細書で使用する場合、フルオレセインは、ベンゾ−もしくはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセインまたはナフトフルオレセインを含む。同様に、本明細書で使用する場合、ロドールは、セミナフトロダフルオル（ｓｅｍｉｎａｐｈｔｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ）（参照によって組み入れられている特許文献５４に開示されている、いずれかの対応する化合物を含む）を含む。あるいは、フルオロフォアは、連結を介して結合しているキサンテンであり、この連結は、キサンテンの９位における単一の共有結合である。好ましいキサンテンは、９位で結合している３Ｈ−キサンテン−６−オール−３−オンの誘導体、９位で結合している６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−オンの誘導体、または９位で結合している６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−イミンの誘導体を含む。
【００４８】
本発明における使用のためのフルオロフォアには、これらに限定されないが、キサンテン（ロドール、ローダミン、フルオレセイン、およびそれらの誘導体）、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジンおよびボラポリアザインダセンが含まれる。最も好ましいのは、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリンおよびスルホン化シアニンである。フルオロフォアの選択によって、ＧＧＢＰまたはその他の標識試薬複合体の吸収および蛍光発光の特性が決定されるであろう。フルオロフォア標識の物性は、スペクトルの特徴（吸収、発光およびストークスシフト）、蛍光の強度、寿命、偏光ならびに光退色の速度を含み、これらはいずれも、１つのフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するために使用することができる。
【００４９】
典型的には、フルオロフォアは、１つまたは複数の芳香環またはヘテロ芳香環を含有し、これらは、任意選択的に、これらに限定されないが、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アルキル、パーフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリールの環の系、ベンゾ、または当技術分野で既知のフルオロフォア上に典型的に存在するその他の置換基を含めた、多様な置換基によって１回または複数回置換されている。
【００５０】
フルオロフォア標識の特異的な例が、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、５−ＴＭＲＩＡ（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、（９−（２（または４）−（Ｎ−（２−マレイミジルエチル）−スルホンアミジル）−４（または２）−スルホフェニル）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−（１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ（２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’）ジキノリジン−１８−イウム塩）（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標））、２−（５−（１−（６−（Ｎ−（２−マレイミジルエチル）−アミノ）−６−オキソへキシル）−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１，３−プロピルジエニル）−１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム塩（Ｃｙ（商標）３）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（ヨードアセチル）−Ｎ’−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）エチレンジアミン（ＩＡＮＢＤアミド）、Ｎ−（（２−（ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤエステル）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、ピレン、６−アミノ−２，３−ジヒドロ−２−（２−（（ヨードアセチル）アミノ）エチル）−１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンズ（デ）イソキノリン−５，８−二スルホン酸塩（ルシファーイエロー）、２−（５−（１−（６−（Ｎ−（２−マレイミジルエチル）−アミノ）−６−オキソへキシル）−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１，３−ペンタジエニル）−ｌ−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム塩（Ｃｙ（商標）５）、４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）フェニル−Ｎ−（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド（Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド））、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５０７／５４５ＩＡ）、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ’−ヨードアセチルエチレンジアミン（ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０ＩＡ）、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−ｌ−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）、およびカルボキシ−Ｘ−ローダミン，５／６−ヨードアセトアミド（ＸＲＩＡ５，６）からなる群から選択される。標識の別の例は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ヒドラジドである。その他の発光標識は、ユーロピウム（Ｅｕ３＋）およびテルビウム（Ｔｂ３＋）等のランタニド、ならびにルテニウム［Ｒｕ（ＩＩ）］、レニウム［Ｒｅ（Ｉ）］またはオスミウム［Ｏｓ（ＩＩ）］の金属−配位子の複合体、典型的には、フェナンスロリン等のジイミン配位子との複合体を含む。参照によって組み入れられている２００６年１２月１４日公開の特許文献５５は、本発明のため��有用である場合がある追加のフルオロフォアを開示している。
【００５１】
フルオロフォアに加えて、酵素もまた、標識として有用である。検出可能なシグナルの増幅を得ることができ、その結果、アッセイの感受性が増加することから、酵素標識が望ましい。酵素自体は、検出可能なシグナルを発生することができないが、例えば、蛍光シグナル、比色分析シグナルまたは発光シグナル等の検出可能なシグナルを発生させるように基質を変換させることによって、シグナルを発生させることが可能である。標識試薬上の１つの酵素が、複数の基質を検出可能なシグナルに変換させることができるので、酵素は、検出可能なシグナルを増幅する。これは、試料中に存在する標的の量が少ない場合、または酵素に比べて同等またはより強力なシグナルを発生するフルオロフォアが存在しない場合に有利である。酵素の基質は、好ましい測定可能な産物、例えば、比色分析産物、蛍光産物または化学発光産物をもたらすように選択される。そのような基質は、当技術分野で広範に使用されており、それらのうちの多くは、上記の非特許文献２０に記載されている。
【００５２】
具体的な実施形態では、比色分析基質または蛍光発生基質と酵素との組合せは、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酸化還元酵素と、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）のような基質とを使用し、これらは、特徴的な色（それぞれ、褐色および赤色）を発生させる。検出可能な産物をもたらす、その他の比色分析に用いる酸化還元酵素の基質には、これらに限定されないが、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−ｌ−ナフトールが含まれる。蛍光発生基質には、これらに限定されないが、ホモバニリン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬およびその変異体（特許文献５６を参照）を含めた還元型フェノキサジンおよび還元型ベンゾチアジン、ならびにジヒドロフルオレセイン（参照によって組み入れられている特許文献３１を参照）を含めた還元型ジヒドロキサンテン、ならびにジヒドロローダミン１２３を含めたジヒドロローダミンが含まれる。ペルオキシダーゼの基質はチラミド（参照によって組み入れられている特許文献５７〜５９を参照）があり、これらは、酵素が作用する前に内因的に検出可能であるが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）として説明されている過程におけるペルオキシダーゼの作用によって、「適所に固定」されているという点でペルオキシダーゼの基質の他とは異なるクラスである。こうした基質は、試料中の標的を標識するために広範に利用され、この試料には、細胞、組織またはそれらを顕微鏡法、フローサイトメトリー、光学的走査および蛍光定量法によって続けて検出するためのアレイがある。
【００５３】
別の好ましい比色分析基質（および場合によっては、蛍光発生基質）と酵素との組合せとして、リン酸５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル（ＢＣＩＰ）、リン酸６−クロロ−３−インドリル、リン酸５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル、リン酸ｐ−ニトロフェニル、またはリン酸ｏ−ニトロフェニルのような比色分析基質と組み合せた、あるいは、リン酸４−メチルウンベリフェリル、リン酸６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニル（ＤｉＦＭＵＰ、参照によって組み入れられている特許文献４２を参照）、二リン酸フルオレセイン、リン酸３−Ｏ−メチルフルオレセイン、リン酸レゾルフィン、リン酸９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）（リン酸ＤＤＡＯ）、またはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９もしくは関連するホスフェート（参照によって組み入れられている特許文献６０および６１を参照）のような蛍光発生基質と組み合せた、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼのようなホスファターゼ酵素、またはそのようなホスファターゼの組換え体を使用する。
【００５４】
追加の酵素には、これらに限定されないが、適切な基質が知られている、コリンエステラーゼおよびペプチダーゼのようなヒドロラーゼ、チトクロームオキシダーゼのようなオキシダーゼ、ならびにレダクターゼが含まれる。本発明の具体的な実施形態は、化学発光シグナルを発生させるための酵素および適切な基質、例えば、これらに限定されないが、天然および組換え形態のルシフェラーゼおよびエクオリンを含む。ホスファターゼ、グリコシダーゼおよびオキシダーゼの場合に化学発光を発生させる基質、例として、ジオキセタン、ルミノール、イソルミノールおよびアクリジニウムの安定なエステルを含有する基質もまた有用である。
【００５５】
追加の実施形態は、ビオチンのようなハプテンを含む。ビオチンは、検出可能なシグナルをさらに増幅する酵素系で機能することができ、かつ単離の目的でアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用するタグとして機能することができることから、有用である。検出の目的では、アビジン−ＨＲＰ等、ビオチンに対して親和性を有する酵素複合体が使用される。続いて、ペルオキシダーゼの基質を添加して、検出可能なシグナルを発生させる。
【００５６】
また、ハプテンは、ホルモン、天然に存在するおよび合成の薬物、汚染物質、アレルゲン、影響因子分子、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間体、ヌクレオチドおよびこれらに類するものも含む。
【００５７】
また、蛍光タンパク質は、本発明の試薬を標識するための標識としても有用である。したがって、１つの実施形態では、参照ＧＧＢＰは、機能性のＧＧＢＰと蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質であり、蛍光タンパク質が、少なくとも１つの標識として作用する。そうなると、修飾された、熱安定性、機能性のＧＧＢＰは、蛍光タンパク質を含むことになる。別の実施形態では、この発明の修飾タンパク質は、２つ、３つまたは４つ以上の蛍光タンパク質を含んでよい。この発明の融合タンパク質が、２つ以上の蛍光タンパク質を含有する場合、蛍光タンパク質は、化学的に同一であっても、またはそうでなくてもよい。蛍光タンパク質は、当技術分野において容易に認識される。現在の発明の融合タンパク質の一部となる蛍光タンパク質の例には、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ）、赤方偏移ＧＦＰ（ｒｓ−ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄｌ、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓを含めたＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、Ｚｓｙｅｌｌｏｗ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびフィコビリタンパク質、ならびにこれらのタンパク質の増強されたものおよび変異体が含まれる。いくつかの蛍光タンパク質の場合には、増強とは、タンパク質の輝度を増加させること、またはより迅速に成熟する発色団を有するタンパク質を生み出すことによる発光の最適化を指す。こうした増強は、蛍光タンパク質中に変異を操作すること（engineering mutations）によって達成することができる。
【００５８】
蛍光タンパク質、特に、フィコビリタンパク質は、タンデム色素で標識した標識試薬を生み出すのにとりわけ有用である。したがって、現在の発明の１つの実施形態では、融合タンパク質の測定可能なシグナルは、実際には、供与体分子から受容体分子への励起エネルギーの移動（共鳴エネルギー移動）である。特に、共鳴エネルギー移動は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の形態をとる。本発明の修飾タンパク質が、分析物（複数の分析物）を測定または定量化するためにＦＲＥＴを利用する場合、融合タンパク質は、供与体または受容体であることができる。ＦＲＥＴに関して使用する場合の「供与体」および「受容体」という用語は、当技術分野においては容易に理解される。すなわち、供与体は、光の光子を吸収し、続いて、受容体分子へのエネルギー移動を開始する分子である。受容体分子は、供与体が開始したエネルギー移動を受け取り、次いで、光の光子を放射する分子である。ＦＲＥＴの効率は、２つの蛍光パートナー間の距離に依存し、Ｅ＝Ｒ０６／（Ｒ０６＋ｒ６）によって数学的に表すことができる。ただし、Ｅは、エネルギー移動の効率であり、ｒは、蛍光の供与体／受容体の対の間の距離（オングストローム）であり、Ｒ０は、Ｆｏｒｓｔｅｒ距離（オングストローム）である。Ｆｏｒｓｔｅｒ距離は、当技術分野で容易に利用できる技法によって実験的に決定することができ、ＦＲＥＴが、所与の蛍光の供与体／受容体の対について、最大可能ＦＲＥＴ値の１／２となる距離である。特に有用な組合せは、参照によって組み入れられている特許文献６２〜６４に開示されているフィコビリタンパク質と、特許文献５１に開示されているスルホローダミンフルオロフォア、または特許文献２０および１９に開示されているスルホン化シアニンフルオロフォア；または参照によって組み入れられている特許文献３２に開示されているスルホン化キサンテン誘導体との組合せ、ならびに参照によって組み入れられている特許文献６５に開示されている組合せである。
【００５９】
本発明が提供する融合タンパク質のその他の種類には、これに限定されないが、分泌シグナルおよびその他の異種性の機能性領域を有する融合体が含まれる。したがって、例えば、追加のアミノ酸、特に電荷のあるアミノ酸の領域を、タンパク質のＮ末端に付加させて、精製の間またはそれに続く取扱いおよび保管の間の宿主中での安定性および持続性を改善することができる。また、精製を促進するために、ある領域をタンパク質に付加してもよい。例えば、参照タンパク質および／または熱安定性タンパク質は、「ヒスチジンタグ」（「ヒスタグ」）または「リジンタグ」を含むことができる。ヒスチジンタグの例には、これらに限定されないが、ｈｅｘａＨ、ｈｅｐｔａＨおよびｈｅｘａＨＮが含まれる。精製タグの追加の例が、参照によって組み入れられている非特許文献２１および２２に開示されている。リジンタグの例には、これらに限定されないが、ｐｅｎｔａＬ、ｈｅｐｔａＬおよびＦＬＡＧが含まれる。また、溶解性タグの追加の例も、非特許文献２１に開示されている。そのような領域は、タンパク質の最終的な精製の前に除去してよい。とりわけ、分泌または排泄のいずれかを生じさせるため、安定性を改善するため、および精製を促進するためのペプチド部分のタンパク質への付加は、当技術分野ではよく知れられている日常的な技法であり、タグを収容するために、末端におけるアミノ酸の修飾を含めることができる。例えば、配列番号３および４において、タグを収容するために、Ｃ末端のアミノ酸（リジン）を、例えば、アルギニンおよびセリンに修飾することができる。もちろん、また、タグを収容するために、Ｎ末端のアミノ酸残基を修飾してもよい。特に有用な１つの融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために使用することができる免疫グロブリンからの異種性の領域を含む。例えば、特許文献６６は、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を、別のヒトタンパク質またはその一部と一緒に含む融合タンパク質を開示している。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断において使用するために極めて有利であり、したがって、その結果、例えば、改善された薬物動態特性が得られる（特許文献６７を参照）。他方、いくつかの使用では、融合タンパク質を、記載する有利な様式で、発現させて、検出および精製してから、Ｆｃ部分を検出することが可能であることが望ましいであろう。
【００６０】
この発明の融合タンパク質を、組換え細胞培養物から、これらに限定されないが、硫酸アンモニウムまたはエタノールによる沈殿、酸による抽出、アニオンまたはカチオンの交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた、周知の方法によって回収および精製することができる。また、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も、精製のために利用することができる。融合タンパク質が、単離および／または精製の間に変性する場合は、タンパク質の再折り畳みのための周知の技法を利用して、活性な立体構造を再生させることができる。
【００６１】
本発明の融合タンパク質には、これらに限定されないが、化学合成過程の産物、および例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含めた、原核生物または真核生物の宿主から組換えの技法によって産生した産物が含まれる。組換えによる産生過程において利用する宿主に応じて、本発明のタンパク質は、グリコシル化されていても、または非グリコシル化されていてもよい。さらに、本発明の融合タンパク質は、場合によっては、宿主が媒介する過程の結果として、最初の修飾されたメチオニン残基もまた含んでよい。
【００６２】
また、修飾された熱安定性のＧＧＢＰを、翻訳後プロセシングのような天然の過程または当技術分野ではよく知られている化学修飾の技法のいずれかによって修飾してもよい。そのような修飾は、基本的な文書およびより詳細なモノグラフ、ならびに研究の膨大な文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、ポリペプチド鎖のどこでも起こすことができる。所与のポリペプチドまたはタンパク質において、同一の種類の修飾が、いくつかの部位で、同一または異なる程度で存在してよいことが理解されるであろう。また、所与のポリペプチドまたはタンパク質は、２つ以上の修飾を含有してもよい。修飾の例には、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化のような転移ＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化が含まれる。ポリペプチドまたはタンパク質は、ユビキチン化の結果として、枝分れさえすることができ、ポリペプチドまたはタンパク質は、枝分れを有する環状または枝分れを有しない環状である場合がある（例えば、非特許文献２３〜２６を参照。これらの文献はいずれも、参照によって本明細書に組み入れられている）。
【００６３】
本発明の参照タンパク質は、当業者によく知られている技法によって修飾することができる。そのような技法の例には、これらに限定されないが、変異誘発および修飾タンパク質の直接的な合成が含まれる。
【００６４】
本発明の修飾された熱安定性のタンパク質は、単離することができる。本明細書で使用する場合、「単離されたタンパク質」は、天然の環境から完全または部分的に取り出されているタンパク質を意味することを意図する。例えば、細胞から取り出されているまたは精製されているポリペプチドは、単離されたとみなされる。さらに、宿主細胞中に含有される、組換えによって産生したポリペプチド分子も、本発明の目的では、単離されたとみなされる。同様に、合成されているタンパク質は、単離されたタンパク質であるとみなされる。
【００６５】
また、本発明は、単離された核酸およびこれらの核酸を含む構築物にも関する。本発明の核酸は、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであることができる。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であることができ、一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡは、コード鎖またはセンス鎖、あるいは非コード鎖またはアンチセンス鎖であることができる。特に、核酸は、本発明のポリペプチドをコードすることができる。必要に応じて、単離された核酸のヌクレオチド配列は、（例えば、制御配列をはじめとする）非コード３’配列および非コード５’配列のような追加の非コード配列を含むことができる。さらに、本発明の核酸を、マーカー配列、例えば、当該ポリペプチドの単離または精製を支援するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸として使用することができる。代表的な配列には、これらに限定されないが、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、ポリ−ヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）、ポリ−ＨＮ、ポリ−リジン、赤血球凝集素、ＨＳＶ−タグが含まれる。
【００６６】
本発明の核酸分子は、「単離された」状態にある。本発明で使用する場合、「単離された」核酸分子またはヌクレオチド配列は、核酸分子またはヌクレオチド配列であって、（ゲノム配列中のように）通常であれば遺伝子またはヌクレオチドの配列に隣接するヌクレオチド配列が隣接しないもの、および／または天然の環境（例えば、細胞、組織）から完全または部分的に取り出されているものを意味することを意図する。例えば、本発明の単離された核酸は、核酸が天然に存在する複雑な細胞環境に関して実質的に単離することができる。場合によっては、この単離された物質が、組成物（例えば、その他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝系または試薬混合物の一部を形成するであろう。その他の場合には、この物質は、例えば、ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィーによって決定される本質的な均一度まで精製することができる。したがって、単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、化学的に、組換えＤＮＡ技術を使用して、またはいずれかのその他の適切な方法を使用して合成された核酸分子またはヌクレオチド配列を含むことができる。したがって、ベクター中に含有される組換え核酸は、本明細書で使用する場合の「単離された」の定義内に含まれる。また、単離されたヌクレオチド配列は、異種性の生物体中の組換え核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、および溶液中の部分的または実質的に精製された核酸も含む。また、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方のＲＮＡ転写物も、「単離された」ヌクレオチド配列によって包含される。
【００６７】
また、本発明は、以下に記載するように、ポリペプチドの機能性断片または機能性誘導体をコードするヌクレオチド配列のような、本発明のヌクレオチド配列の変異体（variations）も包含する。そのような変異体は、天然に存在する、または種々の突然変異原および変異原性の過程によって誘発された変異体のような、天然に存在しないものであることができる。意図する変異体には、これらに限定されないが、付加および欠失をはじめとする、保存的または非保存的なアミノ酸変化を得ることができる、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失および置換が含まれる。本発明の一態様では、本発明の核酸分子およびタンパク質の変異体は、結合ドメイン内に、サイレントなまたは保存性の修飾を含む。すなわち、本発明の修飾された熱安定性のＧＧＢＰと比較して、コードされたポリペプチドの特徴および活性が、修飾によって実質的に変化しない。別の実施形態では、本発明の核酸分子およびタンパク質の変異体は、結合ドメイン内に、サイレントでも保存性でもない修飾を含む。すなわち、本発明の修飾された熱安定性のＧＧＢＰと比較して、コードされたポリペプチドの特徴および活性が、修飾によって実質的に変化してよい。
【００６８】
また、本明細書に記載する発明は、本明細書に記載する単離された核酸分子の断片にも関する。「断片」という用語は、少なくとも約２５個の近接するヌクレオチドから少なくとも約５０個以上の近接するヌクレオチドの長さである、本明細書に記載するヌクレオチド配列の部分を包含することを意図する。そのような断片は、プローブおよびプライマーとして有用である場合がある。特に、プライマーおよびプローブは、本明細書に記載するポリペプチドをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズすることができる。例えば、以下に記載するように、活性を保持するポリペプチドをコードする断片は、特に有用である。
【００６９】
また、本発明は、本明細書に記載するヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載するポリペプチドおよび熱安定性ＧＧＢＰをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子）に選択的にハイブリダイズする場合のような、高厳密度（high stringency）条件下でハイブリダイズする核酸分子にも関する。ハイブリダイゼーションのプローブは、塩基に特異的な様式で、核酸の相補鎖に結合する合成オリゴヌクレオチドを含む。適切なプローブは、非特許文献２７に記載されているように、ポリペプチドの核酸を含む。
【００７０】
そのような核酸分子は、例えば、高厳密度条件下の特異的なハイブリダイゼーションによって検出および／または単離することができる。ハイブリダイゼーションのための「厳密度条件」は、ある特定の核酸が第２の核酸にハイブリダイズするのを可能にするインキュベーションおよび洗浄の条件、例えば、温度および緩衝液の濃度の条件を指す当技術分野の用語である。第１の核酸が、第２の核酸に完全に、すなわち、１００％相補的であっても、あるいは第１の核酸と第２の核酸とが、完全ではない、例えば、６０％、７５％、８５％または９５％以上である、何らかの程度の相補性を共有してもよい。例えば、完全に相補的な核酸とより低い相補性の核酸とを区別する特定の高厳密度条件を使用することができる。
【００７１】
核酸ハイブリダイゼーションのための「高厳密度条件」、「中等度厳密度条件」および「低厳密度条件」が、参照によって組み入れられている非特許文献２８に説明されている。ハイブリダイゼーションの厳密度を決定する的確な条件は、洗浄用緩衝液のイオン強度、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、温度、例えば、室温、４２℃、６８℃等、およびホルムアミド等の不安定化剤またはＳＤＳ等の変性剤の濃度のみならず、核酸配列の長さ、塩基の組成、ハイブリダイズする配列間のパーセントミスマッチおよびその他の同一でない配列内にある当該配列のサブセットの発生頻度のような要因によっても異なる。したがって、高厳密度条件、中等度厳密度条件または低厳密度条件は、経験的に決定してよい。
【００７２】
ハイブリダイゼーションが起きない厳密度のレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまで、ハイブリダイゼーション条件を変化させることによって、所与の配列を試料中の最も類似する配列とハイブリダイズさせることができる条件を決定することができる。
【００７３】
典型的な条件が、参照によって組み入れられている非特許文献２９に記載されている。洗浄は、通常、ハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するように、条件が設定されるステップである。一般に、相同なハイブリダイゼーションのみが生じる最も低い温度から始め、ＳＳＣ濃度を一定に保ちながら、最終の洗浄温度を１度（℃）ずつ下げると、ハイブリダイズする配列間のミスマッチの最大の程度を１％ずつ増加させる。一般に、ＳＳＣ濃度を２倍にすると、Ｔｍが上昇する。これらのガイドラインを使用して、求められるミスマッチのレベルに応じて、高い、中等度のまたは低い厳密度について、洗浄温度を経験的に決定することができる。典型的な高厳密度条件には、これに限定されないが、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ中、６０℃での洗浄が含まれる。条件の厳密度が順に高まる例には、ハイブリダイゼーション後の、０．２％ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、室温周辺での洗浄（低厳密度条件）；０．２％ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、約４２℃での洗浄（中等度厳密度条件）；ならびに０．１％ＳＳＣ、約６８℃での洗浄（高厳密度条件）が含まれる。洗浄は、これらの条件のうちの１つのみ、例えば、高厳密度条件を使用して行うことができ、洗浄は、２つ以上の厳密度条件を厳密度が増加する順で包含してよい。最適条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変化するものであり、経験的に決定することができる。
【００７４】
当技術分野で知られているように、標的核酸分子と使用するプライマーまたはプローブとの間で、同様の程度の同一性または類似性を維持しながら、例として与えられたパラメータのうちの１つまたは複数を変化させることによって、同等な条件を決定することができる。ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、例えば、本発明の核酸を含む生物体の同定のためおよび／または本発明の核酸を単離するためのプローブおよびプライマーとして有用である。「プライマー」という用語は、本明細書では、当技術分野での使用に従って使用し、適切な緩衝液中および適切な温度での適切な条件下において、鋳型によって導かれるＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖のオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図する使用によって異なるが、典型的には、約１５個から約３０個までのヌクレオチドの範囲である。一般に、短いプライマー分子は、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の厳密な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的である必要がある。「プライマー部位」という用語は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域を指す。「プライマー対」という用語は、増幅しようとするＤＮＡ配列の５’末端とハイブリダイズする、５’（上流）プライマーと、増幅しようとする配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする、３’（下流）プライマーとを含む一対のプライマーを指す。
【００７５】
本明細書に記載する核酸は、当技術分野で知られている方法によって増幅することができる。例えば、増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成することができる。非特許文献３０〜３４、および特許文献６８を参照されたい。これらの文献はいずれも、参照によって組み入れられている。その他の適切な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（非特許文献３５および３６を参照。この２つの文献は、参照によって組み入れられている）、転写増幅（transcription amplification）（参照によって組み入れられている非特許文献３７を参照）、ならびに自己維持配列複製（self-sustained sequence replication）（参照によって組み入れられている非特許文献３８を参照）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ，nucleic acid based sequence amplification）が含まれる。
【００７６】
また、本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作されている宿主細胞、および本発明のタンパク質の組換え技法による産生にも関する。
【００７７】
本発明のこの態様によると、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖のファージベクター、あるいは一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのウイルスベクターであってよい。そのようなベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞中に導入するための周知の技法によって、ポリヌクレオチド、好ましくは、ＤＮＡとして、細胞中に導入することができる。ウイルスベクターは、複製可能でも、または複製欠損でもよい。複製欠損の場合、一般に、ウイルスの増殖は、補完性の宿主細胞中でのみ生じるであろう。
【００７８】
ベクターの中でも、好ましいのは、特定の観点では、本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質の発現のためのベクターである。一般に、そのようなベクターは、宿主中での発現に有効なシス作動性の制御領域を含み、この領域は、発現させようとするポリヌクレオチドに動作可能に連結している。適切なトランス作動性の因子は、宿主によって、補完性のベクターによって、または宿主中に導入するとベクター自体によって供給される。
【００７９】
非常に多様な発現ベクターを、本発明のタンパク質を発現させるために使用することができる。そのようなベクターは、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えば、細菌性プラスミド、バクテリオファージ、酵母のエピソーム、酵母の染色体エレメント、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、パポバウイルス、例として、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス、ならびにそれらの組合せに由来するベクター、例として、コスミドおよびファージミドのようなプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するベクターを含む。いずれも、本発明のこの態様によって、発現のために使用することができる。一般に、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を宿主中で維持、増殖または発現するのに適切であれば、いずれのベクターも、これに関する発現のために使用してよい。
【００８０】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、例えば、ｍＲＮＡの転写を導くプロモーターをはじめとする、適切な発現制御配列（複数の配列）に動作可能に連結している。そのようなプロモーターの代表には、これらに限定されないが、周知のプロモーターのほんの数個を挙げてみれば、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃのプロモーター、ＨＩＶプロモーター、ＳＶ４０の早期および後期のプロモーター、ならびにレトロウイルスのＬＴＲのプロモーターが含まれる。一般に、発現構築物は、転写、開始および終結のための部位、ならびに転写された領域においては、翻訳のためのリボゾーム結合部位を含有するであろう。構築物が発現する成熟した転写物のコード部分は、開始点における翻訳開始ＡＵＧと、翻訳しようとするポリペプチドの末端に適切に位置する終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含むであろう。
【００８１】
さらに、構築物は、発現を制御しかつ引き起こす制御領域を含んでよい。一般に、そのような領域、例として、リプレッサー結合部位およびエンハンサーなどは、転写を制御することによって動作するであろう。
【００８２】
一般に、増殖および発現のためのベクターは、選択可能なマーカーを含むであろう。また、そのようなマーカーは、増幅にも適する場合もあれば、またはベクターが、この目的の追加のマーカーを含有する場合もある。この点に関しては、発現ベクターは、好ましくは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含有して、形質転換されている宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する。好ましいマーカーには、真核細胞の培養の場合は、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌の場合は、テトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリンの耐性遺伝子が含まれる。
【００８３】
適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーターおよびその他の適切な制御配列を含有するベクターを、所望のポリペプチドの宿主中での発現に適した多様な周知の技法を使用して、適切な宿主中に導入することができる。適切な宿主の代表的な例には、細菌細胞、例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細胞；真菌細胞、例として、酵母細胞；昆虫細胞、例として、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９の細胞；動物細胞、例として、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボーズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマの細胞；および植物細胞が含まれる。非常に多様な発現構築物に対する宿主が、よく知られており、当業者であれば、本開示によって、本発明のタンパク質のうちの１つを発現させるための適切な宿主を選択することできるであろう。
【００８４】
細菌において使用するためのベクターの例には、これらに限定されないが、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）から入手できるｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｎａｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ネブラスカ州）から入手できるｐＶＥＸＫ−ＨＮ−Ｋ６、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）から入手できるｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨＳＡ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）から入手できるｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）から入手できるｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｃ１、およびｐＡｃＧＦＰ１、ｐＡｃＧＦＰ−Ｃｌ、ｐＺｓＹｅｌｌｏｗ−Ｃｌが含まれる。真核生物ベクターの例には、これらに限定されないが、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるｐＷ−ＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩおよびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈから入手できるｐＣＭＶＤｓＲｅｄ２−ｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰが含まれる。多くのその他の市販されている周知のベクターが、当業者には入手可能である。宿主細胞中での発現のための適切なベクターおよびプロモーターの選択は、周知の手順であり、発現ベクターの構築、ベクターの宿主中への導入および宿主中での発現のための必須の技法は、当技術分野では日常的な技術である。
【００８５】
また、本発明は、上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞等のより高等な真核細胞、または酵母細胞等のより下等な真核細胞であることができ、あるいは細菌細胞等の原核細胞であることもできる。宿主細胞は、構築物を用いて、安定または一過性に形質移入することができる。ポリヌクレオチドを、単独で、またはその他のポリヌクレオチドと共に導入してよい。そのようなその他のポリヌクレオチドは、独立に導入しても、同時に導入しても、または本発明のポリヌクレオチドに結合させて導入してもよい。
【００８６】
構築物の宿主細胞中への導入は、リン酸カルシウムによる形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、カチオン性脂質媒介形質移入、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法によって達成することができる。そのような方法は、参照によって組み入れられている非特許文献３９等、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【００８７】
また、この発明は、修飾された熱安定性のＧＧＢＰを産生する方法にも関し、この方法は、修飾された熱安定性のＧＧＢＰが発現されるような条件下で、本発明の宿主細胞を培養するステップと、当該タンパク質を回収するステップとを含む。現在の発明のタンパク質を発現するのに要求される培養条件は、現在の発明のポリヌクレオチドを収容している宿主細胞によって異なる。各細胞型についての培養条件は、当技術分野でよく知られており、必要であれば、容易に最適化することができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸を含む構築物を、選択された宿主細胞に適した方法、例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、感染によって、適切な宿主細胞中に導入することができ、当該核酸は、本明細書に記載するように、１つまたは複数の発現制御エレメントに動作可能に連結した状態となっている。宿主は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの発現に適した条件下で維持することができ、それによって、コードされたポリペプチドが産生される。例えば、宿主細胞を、インデュサー、適切な塩を補充した適切な培地、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤等の存在下で維持することができ、これらは、タンパク質の発現を促進することができる。追加の実施形態では、本発明の修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、修飾された熱安定性のＧＧＢＰをコードする核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳、化学合成またはいずれかのその他の適切な方法によって産生することができる。必要に応じて、修飾された熱安定性のＧＧＢＰを、タンパク質が産生または分泌される宿主細胞またはその他の環境から単離することができる。したがって、修飾された熱安定性のＧＧＢＰを産生する方法は、遺伝子導入されている動物または植物の宿主細胞中でのポリペプチドの発現を包含することを理解されたい。参照によって組み入れられている特許文献６９〜７１を参照されたい。
【００８８】
本発明の修飾された熱安定性のＧＧＢＰは、工業的な過程等の多様な適用例において、および試料中の分析物の量を検出、モニターまたは測定するためのバイオセンサーの成分として有用である。バイオセンサーは、定量的または半定量的な特異的分析の情報を、ＧＧＢＰまたは修飾ＧＧＢＰ等の生物学的認識の要素を使用して提供することが可能な装置であり、この要素は、変換する（検出する）要素と組み合さっている。分析物の例には、単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類等の炭水化物、これらに限定されないが、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび成熟タンパク質を含めたタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、脂肪酸、リポタンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質、有機化合物、無機化合物、イオン、ならびに合成および天然のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、分析物は、炭水化物である。具体的には、炭水化物の分析物は、グルコース、ガラクトースまたはリボースのような糖であることができる。より具体的には、分析物は、グルコースであることができる。
【００８９】
分析物は、試料中で測定される。本明細書で使用する場合、試料は、測定しようとする分析物を含有することを疑うことができる、いずれかの環境であることができる。したがって、試料には、これらに限定されないが、溶液、細胞、体液、組織またはその一部、および臓器またはその一部が含まれる。試料が、細胞を含む場合、細胞は、原核細胞または真核細胞、例えば、動物細胞であることができる。動物細胞の例には、これらに限定されないが、昆虫、鳥類、ならびに例えば、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒトおよび非ヒトの霊長類等の哺乳動物が含まれる。本発明の範囲が、検査する細胞型によって限定されてはならない。体液の例には、これらに限定されないが、血液、尿、唾液、滑液、間質液、脳脊髄液、リンパ液、胆汁および羊水が含まれる。本発明の方法の範囲が、検査する体液の種類によって限定されてはならない。「対象」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用し、動物、具体的には、哺乳動物、より具体的には、ヒトまたは非ヒトの霊長類を意味するために使用する。
【００９０】
試料は、天然の環境から取り出されていても、またはそうでなくてもよい。したがって、検査する試料の部分は、試料の残りの部分または試料を含有する場合がある対象から分離または取り出される必要はない。例えば、対象の血液を、グルコースについて、血液の一部を患者から取り出すことなく検査することができる。もちろん、また、試料を、天然の環境から取り出してもよい。さらに、試料を、検査する前に処理することもできる。例えば、試料を、希釈または濃縮してよく；試料を、精製してよく、および／または内部標準のような、少なくとも１つの化合物を、試料に添加してよい。また、試料は、この発明の方法の前またはそれと同時に、物理的に変化（例えば、遠心分離、親和性による分離）させても、または化学的に変化（例えば、酸、塩基または緩衝液の添加、加熱）させてもよい。また、処理は、検査の前の試料の凍結および／または保存も含む。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、ＧＧＢＰを滅菌する方法に関する。周辺質結合タンパク質（ＰＢＰ）を滅菌する方法は、参照によって本明細書に組み入れられている２００７年２月２２日公開の特許文献７２に記載されている。具体的には、本発明の滅菌方法は、本発明の熱安定性ＧＧＢＰを、少なくとも１つの放射線源に暴露するステップを含む。
【００９２】
本発明の１つの実施形態では、熱安定性ＧＧＢＰを、放射線に対する暴露の前に、少なくとも１つのフリーラジカル捕捉剤の存在下に置く。フリーラジカル捕捉剤は、当技術分野では、よく知られており、本発明は、熱安定性ＧＧＢＰが暴露される捕捉剤の個性（identity）に制限されてはならない。フリーラジカル捕捉剤の例には、これらに限定されないが、アスコルビン酸、グルタチオン、トコフェロールおよびトコトリエノールが含まれる。フリーラジカル捕捉剤の追加の例には、酵素が含まれ、これらに限定されないが、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよびペルオキシダーゼ等がある。１つの特異的な実施形態では、フリーラジカル捕捉剤は、アスコルビン酸ナトリウムである。より具体的な実施形態では、アスコルビン酸ナトリウムは、少なくとも約５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２５ｍＭ、３５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭまたはそれを越える濃度で存在する。例えば、本発明のアクリロダンで標識した熱安定性ＧＧＢＰの溶液（１００μＭ）を、０、２５または２００ｍＭのＬ（＋）−アスコルビン酸ナトリム塩を含有するリン酸緩衝食塩水中で調製することができる。次いで、滅菌を、ガンマまたはｅ−ビームの照射を用いて行うことができる（例えば、約１０から約２０ｋＧｙ）。
【００９３】
また、熱安定性ＧＧＢＰを、これに限定されないが、バイオセンサー等の装置中に置くことができる。１つの実施形態では、バイオセンサーは、熱安定性ＧＧＢＰを封入するマトリックスを含む。本明細書で使用する場合、「マトリックス」は、少なくとも１つの結合性分子を有する、本質的に三次元の環境を指し、この分子は、リガンド−タンパク質の相互作用からの検出可能なシグナルを測定する目的で、当該環境中に固定されている。熱安定性ＧＧＢＰを封入することが可能なマトリックスの例が、参照によって組み入れられている２００５年１０月２７日公開の特許文献７３に開示されている。マトリックスの成分と熱安定性ＧＧＢＰとの関係は、これらに限定されないが、共有結合性、イオン性およびファンデルワールスの相互作用、ならびにそれらの組合せを含む。マトリックスと熱安定性ＧＧＢＰとの空間的な関係は、マトリックスの体積の一部または全部の中または上での不均一および均一な分布を含む。マトリックスは、有機、無機、ガラス、金属、プラスチックまたはそれらの組合せからなることができる。また、マトリックスは、バイオセンサーが繊維またはその他の小型の最小侵襲性のプローブの遠位の末端において組み入れられることを可能にし、このプローブは、患者の組織内に挿入されて、患者への突発性の、連続的なまたはプログラムされた読取りを可能にする。バイオセンサーから患者への情報を、例えば、遠隔測定手段、視覚的手段、聴覚的手段、または例えば、特許文献７４〜７８、および非特許文献４０で教示されている、当技術分野で既知のその他の手段によって提供することができる。これらの文献はいずれも、参照によって組み入れられている。情報は、分析物の濃度または濃度変化が情報として適切であれば、それを得るのに適した電気的なもの、機械的なものおよび化学線を含む。
【００９４】
上記で言及したように、熱安定性ＧＧＢＰを、ヒドロゲルのようなマトリックス内に封入することができ、次いで、これを埋込み型の装置として使用することができる。本明細書で使用する場合、「封入する（ｅｎｔｒａｐ）」という用語およびその変形は、「被包する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）」と互換的に使用し、結合性分子を、マトリックスの成分内またはその上に固定化することを意味するために使用する。マトリックスは、分析物を透過させることができるのであれば、円板、円柱、パッチ、ナノ粒子、ミクロスフェア、多孔性ポリマー、オープンセル発泡体およびそれらの組合せのうちの１種または複数を含めた、いずれかの所望の形態または形状であることができる。さらに、マトリックスは、バイオセンサーの浸出も阻止する。マトリックスは、光源からの光、あるいはレポーター基へのまたはそれからの、いずれかのその他の測定光が、バイオセンサーを通過するのを可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用例で使用する場合、バイオセンサーは、分析物の実質的に生理的な範囲に暴露されることになり、分析物の濃度変化の決定または検出が望まれるであろう。決定または検出は、連続的な、プログラムされた、および突発性の検出手段を含む。したがって、本発明の１つの実施形態では、想定するｉｎ  ｖｉｖｏバイオセンサーは、少なくとも１つの変異型結合性タンパク質を、分析物の透過が可能な封入型または被包型のマトリックス中に含み、それによって、変異型結合性タンパク質が、変化する分析物の濃度に暴露されると、検出可能な可逆性のシグナルを提供し、この検出可能な可逆性のシグナルは、分析物の濃度に関係付けることができる。いくつかの実施形態では、埋込み型のバイオセンサーは、哺乳動物の皮膚の上皮−真皮の接合部内またはその下に埋め込んで、間質液、組織またはその他の体液と相互作用させることができる。１つの具体的な実施形態では、バイオセンサーは、皮膚内に、約２ｍｍ未満の深さで埋め込まれる。より特異的な実施形態では、バイオセンサーは、皮膚内に、約１ｍｍ未満の深さで埋め込まれる。さらにより特異的な実施形態では、バイオセンサーは、皮膚内に、約０．８ｍｍ未満の深さで埋め込まれる。埋込み体から患者への情報は、例えば、遠隔測定手段、視覚的手段、聴覚的手段、またはすでに述べた当技術分野で既知のその他の手段によって提供することができる。
【００９５】
マトリックスは、生体適合性材料から調製すること、または、マトリックスに、身体との有害反応を最小化することが可能な材料を組み入れることができる。埋込み体に関する有害反応は、炎症、タンパク質の汚染、組織の壊死、免疫応答および有毒物質の浸出を含む。そのような材料および処理は、当技術分野ではよく知られかつ実行されており、例えば、非特許文献４１および４２に教示されている。
【００９６】
本発明の一態様では、熱安定性ＧＧＢＰは、ヒドロゲルから実質的に誘導したマトリックス内に封入することができる。「ヒドロゲル」という用語は、水に不溶性の含水性材料を意味するために使用する。
【００９７】
多数のヒドロゲルを、本発明において使用することができる。ヒドロゲルは、例えば、多糖類、例として、アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロース、またはこれらの誘導体、例として、カルボキシメチル誘導体等、あるいは水膨潤性の有機ポリマー、例として、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、スチレンと無水マレイン酸とのコポリマー、ビニルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマー、およびそれらの誘導体等であってよい。共有結合架橋ネットワークを提供する誘導体が好ましい。ポリペプチドに基づいた、それを含むヒドロゲルの合成、ならびに生物医学および薬学における適用例が、幾人かの研究者によって記載されている（例えば、非特許文献４３を参照）。水溶性のＵＶ架橋結合性ポリマーから誘導した、典型的なヒドロゲルのマトリックスは、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ペンシルベニア州から入手できるポリ（ビニルアルコール），Ｎ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムメトサルフェートアセタール（ＣＡＳ登録番号［１０７８４５−５９−０］）を含む。
【００９８】
マトリックス中で使用しようとする、ヒドロゲルのようなポリマーを、本発明で使用する場合には、官能性をもたせることができる。もちろん、その他のマトリックスにおいて使用されるポリマーもまた、官能性をもたせてよい。すなわち、ポリマーまたはポリマーをなすモノマーは、ヒドロゲルのような高分子マトリックスが化学反応、例えば、共有結合ができるように、反応性の基を有する必要がある。本明細書において使用する場合および一般に、「反応性の基」は、第２の基と化学的に反応することができる化学基である。ポリマーまたはポリマーをなすモノマーの反応性の基は、それ自体が化学的な構成要素の全体であっても、また化学的な構成要素の全体の一部、例として、これらに限定されないが、単一の原子またはイオンであってもよい。さらに、当該の反応性の基が反応することが可能である第２の基は、ポリマーまたはポリマーをなすモノマーの反応性の基と同一であるかまたは異なることができる。反応性の基の例には、これらに限定されないが、ハロゲン、アミン、アミド、アルデヒド、アクリレート、ビニル、ヒドロキシルおよびカルボキシルが含まれる。１つの実施形態では、ヒドロゲルのポリマーまたはポリマーをなすモノマーは、カルボン酸、サルフェート、ヒドロキシまたはアミンの基で官能性をもたせる必要がある。本発明の別の実施形態では、ヒドロゲルのポリマーまたはポリマーをなすモノマーは、１つまたは複数のアクリレート基で官能性をもたせる。１つの特定の実施形態では、アクリレートの官能基は、末端の基である。マトリックスのポリマーまたはポリマーをなすモノマーの反応性の基は、バイオセンサーのマトリックスの部分のいずれかの成分、例として、これらに限定されないが、マトリックス内の別のポリマーまたはモノマー、結合性タンパク質および添加剤と反応性であることができる。
【００９９】
本発明で使用する、いずれのヒドロゲルの芯も、いったん形成されると、高分子ヒドロゲルを形成するポリマーを含む必要がある。適用に関わらず、本明細書中の「ポリマー」という用語は、複数のモノマー単位からなる分子を指すために使用する。本発明で使用することができる適切なポリマーは、これらに限定されないが、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、加水分解されたポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンポリエチレンアミン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、セルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ペクチニン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、硫酸化ヘパリン（heparin sulfate）、キトサン、カルボキシメチルキトサン、キチン、コラーゲン、プルラン、ジェラン、キサンタン、カルボキシメチルデキストラン、コンドロイチン硫酸、カチオン性グアー、カチオン性デンプン、ならびにそれらの塩およびエステルからなる群から選択されたポリマーのうちの１種または複数を含むことができる。また、マトリックスのポリマー、例として、ヒドロゲルは、２種以上の異なるモノマーを含んでもよい。マトリックス中での使用のためのコポリマーを生み出すために使用するモノマーには、これらに限定されないが、アクリレート、メタクリレート、メタクリル酸、アルキルアクリレート、フェニルアクリレート、ヒドロキシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタクリレート、アミノアルキルアクリレート、アミノアルキルメタクリレート、アミノアルキルアクリルアミドの四級アルキル塩、アミノアルキルメタクリルアミドの四級アルキル塩、およびそれらの組合せが含まれる。もちろん、マトリックスのポリマー成分は、その他のポリマーの混合物を含んでよい。本発明の１つの特定の実施形態では、ヒドロゲルのバイオセンサーが、結合性分子とマトリックスとを含み、当該マトリックスが、（ヒドロキシエチルメタクリレート）とメタクリル酸とのコポリマーのヒドロゲルを含む。本発明の別の特定の実施形態では、ヒドロゲルのバイオセンサーが、結合性分子と、（ヒドロキシエチルメタクリレート）、メタクリル酸およびメタクリルアミドの四級アルキル塩のコポリマーのマトリックスのヒドロゲルとを含む。
【０１００】
マトリックス中で使用するポリマーを、修飾して、求核基または求電子基を含有させることができる。実際に、本発明で使用するポリマーは、繰り返しのモノマー単位を含有しないが、多官能性である、すなわち、２つ以上の求核性または求電子性の官能基を含有する、多官能性小分子をさらに含んでもよい。これらの多官能性基は、複数の共有結合形成反応によって、従来のポリマー中に容易に組み入れることができる。例えば、ＰＥＧは、１つまたは複数のアミノ基を含有するように修飾して、求核基を提供することができる。１つまたは複数の求核基を含有する、その他のポリマーの例には、これらに限定されないが、エチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、ビス−（２−アミノエチル）アミン、およびトリス−（２−アミノエチル）アミンのようなポリアミンが含まれる。求電子基の例には、これらに限定されないが、スクシンイミドエステル、エポキシド、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、オキシカルボニルイミダゾール、炭酸ニトロフェニル、トレシレート（tresylate）、メシレート、トシレート、カルボキシレート、およびイソシアネートが含まれる。１つの実施形態では、組成は、ビス−アミン末端化ポリ（エチレングリコール）を含む。
【０１０１】
ポリマーは、物理的または化学的のいずれかで架橋結合して、ヒドロゲルのようなマトリックスを形成することができる必要がある。物理的な架橋結合には、これらに限定されないが、放射線処理、例えば、電子ビーム、ガンマ線、Ｘ線、紫外線のような、非化学的な過程、アニオンによる処理、およびカチオンによる処理が含まれる。また、ポリマーの架橋結合は、共有結合架橋のような化学的な架橋結合も含むことができる。例えば、化学的な架橋結合系は、これらに限定されなが、当技術分野でよく知られている酵素の使用を含むことができる。化学的な共有結合架橋の別の例は、過酸化物の使用を含む。架橋結合試薬が、ポリマーの少なくとも２つの部分と反応して、三次元のネットワークを生み出すと、化学的な架橋結合を生じさせることができる。また、多官能性のモノマーを、架橋結合の過程の間に使用しても、共有結合架橋を生じさせることができる。例えば、アクリレートモノマーを、二官能性アクリレートモノマーと重合させて、架橋結合したポリマーを形成することができる。架橋結合試薬が、少なくとも部分的に水または有機溶媒に溶解し、架橋結合したポリマーを形成することができるのであれば、いずれの架橋結合試薬も本発明に適するであろう。例えば、ポリマーが、アミン末端化ＰＥＧである場合、架橋結合試薬は、ＰＥＧ−アミン基と反応することができ、実質的に水に溶解性である必要がある。別の例では、水中またはジメチルホルムアミド中で、（ヒドロキシエチルメタクリレート）モノマーとメタクリル酸モノマーとを、ポリ（エチレングリコール）−ビス−アルキルアクリレート架橋結合試薬と共に重合させて、高分子ヒドロゲルを形成することができる。
【０１０２】
架橋結合させようとするポリマーが、アミン（第一、二または三級）、チオール、チオエーテル、エステル、ニトリル等のような求核基の官能基を有する場合には、架橋結合試薬は、求電子基を含有する分子であることができる。求電子基の例は、本明細書に記載されている。同様に、架橋結合させようとするポリマーが、求電子基の官能基を有する場合には、架橋結合試薬は、求核基を含有する分子であることができる。当業者であれば、本実施形態の範囲から逸脱することなく、上記で記載した求核性官能基と求電子性官能基とを交換することができることを理解されたい。また、結合性の分子が、必要な求核性官能基および求電子性官能基を提供する場合があることも理解されたい。例えば、結合性分子がタンパク質である場合、求核性官能基および求電子性官能基が、タンパク質中の天然に存在するアミノ酸として存在していてもよく、または求核性官能基および求電子性官能基が、本明細書に記載する化学的な技法を使用して、タンパク質に導入されていてもよい。
【０１０３】
ヒドロゲル等のマトリックスを形成するために、ポリマーを調製するか、または架橋結合させるためのその他の一般的な方法が、当技術分野ではよく知られている。例えば、いずれも参照によって本明細書に組み入れられている非特許文献４４および４５は、ヒドロゲルの形成を報告している。ヒドロゲルのマトリックスを、各センサーの先端、例えば、針に適用してから、Ｈｇランプ下で、＞３６０ｎｍの波長を用いて、約１５秒間硬化させることができる。
【０１０４】
熱安定性ＧＧＢＰは、ヒドロゲル（これに限定されない）のようなマトリックスに共有結合させる、またはその内部に非共有結合的に封入もしくは被包することができる。本発明の１つの実施形態では、結合性分子は、ヒドロゲルに共有結合している、すなわち、その内部に封入されている。結合性分子のヒドロゲルに対する共有結合が、結合性分子の標的リガンドに対する結合を妨げてはならない。さらに、結合性分子のヒドロゲルに対する共有結合は、分解に抵抗性でなければならない。１つの実施形態の官能基は、結合性分子をヒドロゲルとカップリングさせる役目を果たす、ヒドロゲルのポリマーまたはその他の成分である。結合性分子は、いずれかの多くの方法において、ヒドロゲルとカップリングさせることができる。例えば、ヒドロゲルと結合性分子との間のカップリング反応には、これらに限定されないが、ジアゾニウムのカップリング、イソチオシアノのカップリング、ヒドラジドのカップリング、アミド形成、ジスルフィドのカップリング、無水マレイン酸のカップリング、チオラクトンのカップリング、およびジクロロトリアジンのカップリングが含まれる。２つの官能基間のこれらのカップリング反応は、十分に文書化されており、当業者にはよく知られているとみなされる。例えば、結合性分子中のアミノ官能基は、ヒドロゲルの１つまたは複数の成分のカルボキシル官能基と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカップリング剤を使用して、共有結合によってカップリングさせることができる。結合性分子のアミノおよびカルボキシルの官能基と、上記で記載したヒドロゲルの１つまたは複数の成分とは、本実施形態の範囲から逸脱することなく置き換えることができることを理解されたい。
【０１０５】
１つの実施形態では、マトリックスは、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）とメタクリル酸（ＭＡＡ）とを含む。ＰＥＧＤＭＡのＭＡＡに対する比は、特定の実施形態間で変化することができる。１つの実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約１０：９０モル％から約９０：１０モル％までの範囲であることができる。１つの具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約２０：８０モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約２１：７９モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約２３：７７モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約２５：７５モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約２７：７３モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約２９：７１モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約３０：７０モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約３５：６５モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約４０：６０モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約４２：５８モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約４４：５６モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約４６：５４モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約４８：５２モル％である。別の具体的な実施形態では、ＰＥＧＤＭＡ：ＭＡＡの比は、約５０：５０モル％である。また、ＨＭＰＰのような開始剤も、ヒドロゲル中に種々の濃度で存在してよい。例えば、光開始剤は、全体積の約０．１０％から約５％までの濃度で存在してよい。１つの実施形態では、光開始剤は、約０．１％から約１％までの濃度で存在する。具体的な実施形態では、光開始剤は、全体積の少なくとも約０．２０％で存在する。具体的な実施形態では、光開始剤は、全体積の少なくとも約０．２５％で存在する。具体的な実施形態では、光開始剤は、全体積の少なくとも約０．３０％で存在する。具体的な実施形態では、光開始剤は、全体積の少なくとも約０．３５％で存在する。具体的な実施形態では、光開始剤は、全体積の少なくとも約０．４０％で存在する。
【０１０６】
本明細書で議論するように、本発明のバイオセンサーは、高分子マトリックス中に封入された熱安定性ＧＧＢＰを含むことができ、これは、続いて、針の先端内に含有される。いくつかのセンサー、例として、皮下の埋込み体は、時間のずれを示すことが多い。特に、より大きなゲージのセンサー、すなわち、２１および２５のゲージは太過ぎて、浅い皮膚深度では正確に読み取ることができない。浅い深度の皮膚組織におけるグルコースレベルは、血液中のグルコース値と比較した場合、時間の遅れが、仮にあったとしも、ほとんどないようである。この浅い深度の貫通によって、正確なグルコース濃度レベルのための間質液の試料採取が、ほとんど時間のずれなしで可能となる。したがって、１つの実施形態では、バイオセンサーの針は、３１ゲージまたはそれより細い針であり、これによって、対象の皮膚に、浅い深度、例えば、約２ｍｍ未満、約１ｍｍ未満または約０．８ｍｍ未満でさえ貫通することが可能となり、ほとんどまたは全く時間のずれなしで、正確なグルコースの読みを提供する。
【０１０７】
また、本発明は、本発明の熱安定性ＧＧＢＰを含む装置にも関する。一般に、この装置は、（ｉ）近位末端および遠位末端を有する光学コンジット（optical conduit）と；（ｉｉ）光学コンジットの遠位末端と光学的に近接している検出要素とを含み、この検出要素は、本発明の熱安定性ＧＧＢＰのうちの少なくとも１つと、少なくとも１つのレポーター基とを含む。
【０１０８】
光学コンジットは、長さが約０．１ｃｍから１メーターまで変化することができ、光を、光学系の内外および検出要素の内外に連結する。例えば、光学コンジットは、レンズ、反射チャネル、針または光ファイバーであってよい。光ファイバーは、（単一モードまたは多重モードの）光ファイバーの一本鎖であっても、あるいは２本以上のファイバーの束であってもよい。１つの実施形態では、繊維の束は、二股に分かれている。繊維は、患者の皮膚に貫通できるように、先細になっていても、またはなっていなくてもよい。
【０１０９】
光学系は、光学コンジットの近位末端に接続することができる。光学系は、１つまたは複数の励起源と１つまたは複数の検出器の組合せからなる。また、光学系は、フィルター、二色性の要素、電源、ならびにシグナルの検出および調節のための電子部品からもなってよい。光学系は、任意選択的に、マイクロプロセッサを含んでよい。
【０１１０】
光学系は、１つまたは複数の光の測定波長（interrogating wavelengths）を光学コンジット中に連結することによって、連続的または断続的のいずれかで、試料を測定する。次いで、その１つまたは複数の測定波長が、光学コンジットを通過し、検出要素に照射する。分析物の濃度の変化が、波長、強度、寿命、エネルギー移動の効率および／または検出要素の一部であるレポーター基の発光の偏光の変化を起こすことができる。得られた変化した発光のシグナルが、光学コンジットを通過して、光学系に戻り、そこで、シグナルが検出され、解釈され、かつ保存および／または表示される。特定の実施形態では、光学系は、複数の励起源を含む。これらの源の１つまたは複数は、検出されたシグナルを動的にシグナル処理することができるように調節することができ、それによって、シグナル対ノイズおよび検出感度を増強する。また、装置による電力消費を減少させるように、または光退色のような望まれない現象を最小化することによって、検出要素の寿命を延長するように調節を行ってもよい。また、光学系は、１つまたは複数の電磁エネルギーの検出器も含むことができ、この検出器は、レポーター基および光学的に参照する基からの発光シグナルを検出するため、ならびに内部的な参照および／または較正のために使用することができる。装置が電池の電力によって動作できるように、光学系の全体的な電力は、少ない消費に保たれる。
【０１１１】
以下の実施例は、例示的なものであって、本明細書に記載する発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
修飾された熱安定性のＧＧＢＰの構築および産生
いくつかのアスパラギンおよびグルタミンの残基を含めた、「３Ｍ−ＧＧＢＰ」と名付けられているＧＧＢＰ（配列番号３）のアミノ酸残基を、ＢＬＡＳＴＰ検索によって決定した野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＧＢＰ（配列番号１）中の類似のアミノ酸配列とのコンセンサスアライメントに基づいて、置換のために選択した。特に、３Ｍ−ＧＧＢＰの以下の２１個のアミノ酸を、置換のために選択した：アスパラギン３９（Ｎ３９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）、トリプトファン２８４（Ｗ２８４）、およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）。
【０１１３】
次いで、３Ｍ−ＧＧＢＰの２１個の選択した残基のそれぞれを、別々に置換して、１３種の最初の修飾ＧＧＢＰを生み出した。ＢＬＡＳＴＰ検索によって決定した野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＧＢＰ（配列番号１）に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質のアライメントを使用して、置換アミノ酸の同一性を決定した（表Ｉを参照）。修飾３Ｍ−ＧＧＢＰは、３Ｍ−ＧＧＢＰ構築物中で、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して産生した。オリゴヌクレオチドを、標的残基をその他のアミノ酸で置換するように設計した。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドは、特定の座位、例えば、Ｇ８２、Ｑ８３およびＮ８４における、３個までのアミノ酸を置換するように設計した。標準的な反応混合物、ＰＣＲおよび設計したオリゴヌクレオチドを使用して、鋳型３Ｍ−ＧＧＢＰプラスミド中で、変異を作製した。ＰＣＲ後、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅのプロトコールに従って、産物を、ＤｐｎＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中への形質転換後、プラスミドＤＮＡを精製し、所望の配列変化を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。以下の表Ｉに示す１３種の変異のそれぞれを、このようにして産生および確認して、修飾３Ｍ−ＧＧＢＰのためのＤＮＡ鋳型を生み出した。
【０１１４】
同様に、「Ｗ１８３Ｃ」と名付けられているＧＧＢＰ（配列番号４）のアミノ酸を修飾することができる。特に、Ｗ１８３Ｃの以下の２１個のアミノ酸を、置換のために選択した：アスパラギン３９（Ｎ３９）、アスパラギン酸５０（Ｄ５０）、グルタミン５１（Ｑ５１）、グリシン８２（Ｇ８２）、グルタミン８３（Ｑ８３）、アスパラギン８４（Ｎ８４）、アスパラギン１３０（Ｎ１３０）、グルタミン１７５（Ｑ１７５）、グルタミン１７７（Ｑ１７７）、ロイシン１７８（Ｌ１７８）、グリシン１９８（Ｇ１９８）、プロリン１９９（Ｐ１９９）、アスパラギン２００（Ｎ２００）、アスパラギン２２６（Ｎ２２６）、アスパラギン２５９（Ｎ２５９）、アスパラギン２６０（Ｎ２６０）、リジン２７０（Ｋ２７０）、アスパラギン２７１（Ｎ２７１）、アスパラギン２８３（Ｎ２８３）トリプトファン２８４（Ｗ２８４）、およびアスパラギン３０２（Ｎ３０２）。
【０１１５】
３Ｍ−ＧＧＢＰ中に上記で設けた同一の置換を、Ｗ１８３Ｃを修飾するための置換として選択した。修飾Ｗ１８３Ｃは、Ｗ１８３Ｃ構築物中で、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して産生した。標準的な反応混合物、ＰＣＲおよび設計したオリゴヌクレオチドを使用して、鋳型３Ｍ−ＧＧＢＰプラスミド中で、変異を作製した。ＰＣＲ後、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅのプロトコールに従って、産物を、ＤｐｎＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中への形質転換後、プラスミドＤＮＡを精製し、所望の配列変化を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１１６】
修飾ＧＧＢＰを、標準的なプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓｇ１３００９から発現させた。誘導後、細菌を、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して溶菌し、Ｔａｌｃｏｎコバルト２＋樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＩＭＡＣによって精製した。溶液中の精製されたタンパク質を、１００ｋＤａのカットオフフィルターを通してろ過し、次いで、１０ｋＤａのカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。タンパク質（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を４℃で、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ８）を含有する溶液中に透析し、４℃で保存した。これらの条件下で、タンパク質は、少なくとも６カ月間活性を有した。精製からの収量は、約１０ｍｇ／ｌであった。
【０１１７】
【表５】
2009534042.tif 000007
【０１１８】
（実施例２）
修飾ＧＧＢＰの融解温度の決定
円二色性（ＣＤ）スペクトルを、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−８１０上で行った。精製されたフルオロフォア標識タンパク質の試料は、（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸および２．７  ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４からなる）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に徹底的に透析した。３Ｍ−ＧＧＢＰおよびＷ１８３Ｃ−ＧＧＢＰの二次構造の損失を、２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルを温度の関数として記録することによって観察した。実験の間、試料の温度は、２０℃と８０℃との間で、約１℃／分の速度で変化させた。移行の中間点における見かけの融解温度（Ｔｍ）を、実験のデータ点をシグモイド関数に当てはめる（ＣＤシグナル対温度）ことによって得た。
【０１１９】
以下の表ＩＩは、１３種の修飾ＧＧＢＰのそれぞれの円二色性研究からの結果を示す。修飾タンパク質１、３、５および１０が、参照タンパク質と比較して最も大きなＴｍの上昇を有した。
【０１２０】
【表６】
2009534042.tif 000008
【０１２１】
（実施例３）
複数のアミノ酸置換を有する修飾された熱安定性のＧＧＢＰの構築
実施例２の結果に基づいて、先の実施例からの残基置換番号Ｎ３９１、Ｇ８２Ｅ、Ｑ８３Ｋ、Ｎ８４Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｑ１７７Ｈ、Ｌ１７８Ｍ、Ｎ２５９ＥおよびＮ２６０Ｓを含む、２種の別々の修飾ＧＧＢＰを構築した。この実施例では、２種の参照タンパク質は、３Ｍ−ＧＧＢＰおよびＷ１８３Ｃであった。両方の修飾タンパク質を、実施例１と同様に構築した。手短にいうと、置換された座位をコードする構築物を構築し、確認のためにＤＮＡを配列決定した。次いで、プラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして使用して、置換された座位を加え、したがって、各配列が、Ｎ３９Ｉ、Ｇ８２Ｅ、Ｑ８３Ｋ、Ｎ８４Ｄ、Ｑ１７５Ｅ、Ｑ１７７Ｈ、Ｌ１７８Ｍ、Ｎ２５９ＥおよびＮ２６０Ｓに対応している置換を含む点で異なる、３Ｍ−ＧＧＢＰタンパク質（配列番号３）またはＷ１８３Ｃ（配列番号４）をコードするプラスミドＤＮＡベクターを産生した。
【０１２２】
（実施例４）
修飾された熱安定性のＧＧＢＰの標識化
参照によって組み入れられている２００５年５月２６日公開の特許文献７９を使用して、変異１、３、５および１０（表Ｉを参照）を有するＷ１８３ＣであるＳＭ４タンパク質を、蛍光の構成要素（アクリロダン）で標識し、表Ｉからの変異１、３、５および１０を有する３Ｍ−ＧＧＢＰを、蛍光の構成要素（ＩＡＮＢＤ）で標識した。
【０１２３】
ＳＭ４は、以下のように標識した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−６．１４ｍＬ）を、実施例５の（親和性タグを有する）修飾ＧＧＢＰタンパク質の溶液（６０．３ｍＬ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１００ｍｇ）に添加した。次いで、ＤＭＳＯ中の１２ｍＭアクリロダンの５６５μＬの一定分量（aliquot）を、溶液に添加した。溶液中のＤＭＳＯの最終的なパーセントは、約１０％であった。フラスコを、アルミ箔で覆い、室温で４時間撹拌した。次いで、反応混合物を２６,７１２ＲＣＦ（相対遠心力）で１０分間遠心分離した。上清を取り出し、５μｍのＳｕｐｏｒフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ニューヨーク州、米国）を通過させた。
【０１２４】
アクリロダンで標識した後、ＳＭ４は、凍結保存のために、緩衝液に移した。タンパク質を、０．０１Ｍ  ＭＥＳ、３０ｍＭグルコース（ｐＨ５．５〜５．７）の溶液に対して、緩衝液を３回交換して２４時間透析した。透析後、タンパク質を、定量化し、同一の緩衝液を使用して希釈して、１００μＭ溶液とした。次いで、バイアルを、保存のために、−７０℃の冷凍庫中に直接置いた。これらの条件下で、タンパク質は、少なくとも３カ月間は安定である。
【０１２５】
ＳＭ４タンパク質を凍結乾燥するために、タンパク質溶液を、炭酸水素アンモニウム（５０ｍＭ、ｐＨ７）に対して、緩衝液を３回交換して２４時間透析した。タンパク質は、０．２μｍのＳｕｐｏｒフィルター（Ｐａｌｌ）を通過させ、褐色バイアル中に分注した（aliquoted）（２ｍｇ／バイアル）。バイアルを、−７０℃で３時間凍結し、次いで、タンパク質を２０時間凍結乾燥した。最終的な収量は、約８６ｍｇのタンパク質であり、染料／タンパク質の比は、約０．９４であった。これらの条件下で、タンパク質は、少なくとも６カ月間は安定である。タンパク質の凍結保存のために、タンパク質溶液を、０．０１Ｍ  ＭＥＳの溶液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、３０ｍＭグルコース（ｐＨ５．５〜５．７）の溶液に対して、緩衝液を３回交換して２４時間透析した。タンパク質を凍結して、−７０℃で保存した。
【０１２６】
（実施例５）
修飾および標識されたＧＧＢＰの融解温度の決定
実施例２と同一のプロトコールを使用して、実施例３で調製した修飾ＧＧＢＰ（修飾された３Ｍ−ＧＧＢＰおよびＷ１８３Ｃ）の融解温度を決定した。修飾Ｗ１８３Ｃ−ＧＧＢＰの測定Ｔｍは、参照タンパク質（Ｗ１８３Ｃ）よりも約９．４℃高かった（図１）。同様に、上記の表Ｉからの置換番号１、３、５および１０を有する修飾３Ｍ−ＧＧＢＰも、より高いＴｍを示した。以下の表ＩＩＩは、本発明の２種の修飾ＧＧＢＰについてのＴｍの上昇を示す。
【０１２７】
【表７】
2009534042.tif 000009
【０１２８】
（実施例６）
親和性タグを有する修飾ＧＧＢＰ
【０１２９】
ＳＭ４タンパク質を、大きなタンパク質収量（６〜７ｇ／Ｌ）をもたらすベクター中にクローン化した。このベクターは、親和性による精製および複合体形成の目的で、Ｗ１８３Ｃ（１，３，５，１０）タンパク質上に追加の３０残基を取り付けた。ベクターは、ポリペプチドのＮ末端上に、Ｎ末端からＣ末端の方向に、アミノ酸配列ＭＧＨＮＨＮＨＮＨＮＨＮＨＮＧＧＤＤＤＤＫ（配列番号５）を、およびＣ末端上に、Ｎ末端からＣ末端の方向に、アミノ酸配列ＧＧＫＫＫＫＫＫＥＥ（配列番号６）を添加する。このタンパク質の融解温度は、末端の付加が存在する状態では、ＰＢＳ（０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２（無水）および０．１ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏを有する）中で、約５３℃であると決定された。一方、このタンパク質の融解温度は、末端の付加が存在しない状態では、ＰＢＳ中で、約５５．４℃であると決定された。末端の付加を有するＳＭ４のグルコース親和性は、１９．６ｍＭであると測定され、蛍光応答（Ｑｒ）は、４．８として測定された。
【０１３０】
（実施例７）
標識した修飾された熱安定性のＧＧＢＰを使用した、分析物の濃度の測定
修飾された熱安定性の３Ｍタンパク質およびＷ１８３Ｃタンパク質について、非特許文献１８（参照によって組み入れられている）に開示されている蛍光アッセイを使用して、タンパク質のグルコース結合活性を確認した。染料−タンパク質のカップリングを、ＩＡＮＢＤと名付けられているフルオロフォア（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（ヨードアセチル）−Ｎ’−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）エチレンジアミンまたはアクリロダンを用いて、製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の記載に従い行った。
【０１３１】
手短にいうと、０．５ｍｌの３Ｍ−ＧＧＢＰ（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を、２．５モル過剰量のジチオトレイトールで３０分間処理した。次いで、ＤＭＳＯ中の１０倍モル過剰のＩＡＮＢＤの溶液（０．５ｍｇ／１００μＬ）を添加した。遮光しながら、タンパク質と染料とを、２５℃で４時間穏やかに混合してから、未反応の染料を、Ｎａｐ−５カラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって除去した。
【０１３２】
カップリングの効率を、以下の吸光度によって決定した。
【０１３３】
【数１】
2009534042.tif 000010
【０１３４】
式中、Ａｘは、染料の吸収最大波長における吸光度の値であり、εは、染料の吸収最大におけるモル消衰係数である。ＭＷｐ、ｍｇｐ／ｍｌおよびモルｐ（moleP)はそれぞれ、タンパク質の分子量、濃度およびモル数である。染料のモル数は、モルｄ（moled）である。
【０１３５】
ＰＢＳ中の０．１μＭタンパク質中に、グルコースの濃度を増加させて滴定し、蛍光の変化をモニターすることによって、結合定数を決定した。Ｋｄを、ＰｉｓａｒｃｈｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎから適合させた以下の関係から決定した（非特許文献４６を参照）。
【０１３６】
【数２】
2009534042.tif 000011
【０１３７】
式中、Ｆは、蛍光の強度であり、Ｆｉｎｆは、無限大での蛍光であり、Ｆ０は、０における蛍光である。
【０１３８】
【数３】
2009534042.tif 000012
【０１３９】
式中、［Ｇｌｃ］ｆｒｅｅは、遊離のグルコースの濃度であり、［Ｇｌｃ］ｔｏｔおよび［Ｐｒｏｔ］ｔｏｔは、グルコースおよびタンパク質のそれぞれの全濃度である。ＳＭ４の場合、５１４〜５４０ｎｍの蛍光曲線下の面積の４５０〜４７０ｎｍにおける曲線下の面積に対する比を、上記の式において、蛍光の強度の代わりに使用した。しかし、この発明は、蛍光を測定する場合またはグルコースの濃度を評価する場合の蛍光の特定の波長領域に限定されない。
【０１４０】
結合実験の結果は、実施例３に従って産生した、アクリロダン標識ＳＭ４もまた、参照Ｗ１８３Ｃ−アクリロダンと比較して、蛍光応答が増加することを実証している（表ＩＩＩを参照）。図２は、ＩＡＮＢＤで標識した３Ｍ−ＧＧＢＰ（１，３，５，１０）を、グルコースの濃度を増加させて（０、５、１０、３０、５０および１００ｍＭ）滴定した場合の蛍光の強度の増加を示す。
【０１４１】
（実施例８）
ＧＧＢＰの選択された残基におけるアミド分解を定量化するための液体クロマトグラフィーフーリエ変換質量分析（ＬＣ−ＦＴＭＳ）
【０１４２】
追加のアミド分解の部位を同定するために、液体クロマトグラフィー−フーリエ変換質量分析（ＬＣ−ＦＴＭＳ）を使用して、Ｗ１８３ＣおよびＳＭ４中のアスパラギン残基におけるアミド分解を定量化した。（実施例５からの）Ｗ１８３ＣおよびＳＭ４は、２５℃での保存または熱処理（６０℃で１８時間）のいずれかを行った後、トリプシンで消化した。次いで、ペプチドを、１５ｃｍのＰｅｐ−Ｍａｐ  Ｃ１８キャピラリーカラム（７５ミクロンｉｄ）を使用して、約５％から約９５％までのアセトニトリルの３０分の勾配を用いて分離し、ＬＣ−ＦＴＭＳによって分析した。アミド分解は、約１ダルトンの質量シフトを起こす。試料を、アミド分解の二重項について調べ、相対的なアミド分解のピークの比として報告した。この場合、より小さな比は、残基のより大きな程度のアミド分解を示す。表ＩＶに、ペプチド配列の残基の相対的なアミド分解のレベルを示し、数字が小さくなると、アミド分解のレベルが大きくなる。表Ｖは、定量的なアミド分解の過程によって同定した可能性のあるアミノ酸置換を示す。
【０１４３】
【表８】
2009534042.tif 000013
【０１４４】
【表９】
2009534042.tif 000014
【０１４５】
＜配列表における配列の簡単な説明＞
配列番号１は、野生型（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））ＧＧＢＰのアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号２ＧＢＰ）。
【０１４６】
配列番号２は、野生型（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））ＧＧＢＰのアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０ＡＥＥ５）。
【０１４７】
配列番号３は、３Ｍ−ＧＧＢＰのアミノ酸配列であり、これは、野生型ＧＧＢＰ（配列番号１）と比較して、以下の残基の置換を有する：Ｅ１４９Ｃ、Ａ２１３ＲおよびＬ２３８Ｓ。
【０１４８】
配列番号４は、Ｗ１８３Ｃ−ＧＧＢＰのアミノ酸配列であり、これは、野生型ＧＧＢＰと比較して、Ｗ１８３Ｃの残基の置換を有する。
【０１４９】
配列番号５は、アミノ酸タグのアミノ酸配列であり、これは、対象のポリペプチドのＮ’末端に付加することができ、ペプチドの精製に有用である。
【０１５０】
配列番号６は、アミノ酸タグのアミノ酸配列であり、これは、対象のポリペプチドのＣ’末端に付加することができ、ペプチドの精製およびタンパク質の結合に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】参照ＧＧＢＰタンパク質および２種の修飾された熱安定性のＧＧＢＰの熱安定性曲線を示すグラフである。
【図２】グルコースの濃度を増加させた場合の修飾された熱安定性の３Ｍ−ＧＧＢＰの発光スペクトルを示す図である。
【図３】置換の標的とすることができる代表的なアミノ酸を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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