(57)【要約】  本発明は、ナノ粒子を製造する方法および、前記方法により得ることができるナノ粒子に関する。本発明は、さらに、前記ナノ粒子を含む医薬組成物ならびに、医薬が１つまたはそれ以上の生理的バリアを横断することを要する疾患および状態の治療のための前記ナノ粒子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含み、下記工程ｂ）における重合を、１つ以上の第一級または第二級アミンにより開始することを特徴とする、ポリアルキルシアノアクリレート(ＰＡＣＡ)ナノ粒子を製造する方法。：
ａ）ＯおよびＷタイプの液相、安定剤ならびに重合可能なＡＣＡモノマーを含むＯ／Ｗミニエマルジョンを調製する工程、
ｂ）前記モノマーをアニオン重合により重合し、次いで、製造されたナノ粒子を単離する工程。
【請求項２】
前記第一級または第二級アミンが、アンモニア、トリス塩基またはアミノ酸から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ酸が、フェニルアラニン、グリシン、Ｌ−ロイシン、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファンまたは６−アミノヘキサン酸から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｗ相および／またはＯ相に、好ましくは治療薬および診断薬から選択される１つ以上の医薬が含まれる請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記治療薬が、送達ビヒクルまたはキャリアなしでは生理学的バリアを横断することができないか、または十分に横断することができない物質から選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記生理学的バリアが、血液−脳関門（ｂｂｂ）、血液−空気関門、血液−脳脊液関門および頬粘膜からなる群から選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記Ｏ層が、親油性溶媒、好ましくは、ｎ−ヘキサン、ヘキサデカン、液体パラフィン、ビタミンＥ、ミグリオールまたはトリグリセリドの脂肪酸エステル、および重合可能なＡＣＡモノマーを含む請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記モノマーから得られる前記ポリマー材料が、生物分解可能であり、かつ、ポリアルキルシアノアクリレートからなる群から選択される固体またはフィルム形成ポリマーを含む請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリアルキルシアノアクリレートが、ポリブチルシアノアクリレートおよび誘導体、共重合体ならびにそれらの混合物である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記安定剤が、下記の物質の１つ以上を含む請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。：
グリセロール、ソルビトールおよび他の１価または多価アルコール、好ましくは、ベンジルアルコールの脂肪酸エステル、グリセロールモノステアレート、ソルビタンモノラウレート、またはソルビタンモノリエート；リン脂質、リン酸エステル、多糖、ベンジルベンゾエート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、３００、４００、５００、６００）、ポリエチレングリコールヒドロキシステアレート、好ましくは、ソルトールＨＳ１５；ポロキサミン、好ましくは、ポロキサミン９０４、９０８または１５０８；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル；エトキシル化トリグリセリド；エトキシル化フェノールおよびエトキシル化ジフェノール；ゲナポール（Genapol）（商標）およびバウキ（Bauki）シリーズの界面活性剤；ポリオキシルヒマシ油、好ましくは、クレモフォールＥＬＰ；レシチン、脂肪酸の金属塩、脂肪アルコールスルフェートの金属塩；およびスルホコハクシネートの金属塩；好ましくは、ポリソルベート、より好ましくは、ポリソルベート２０、６０および最も好ましくは、ポリソルベート８０；好ましくは、ポロキサマー、より好ましくは、ポロキサマー１８８、３３８または４０７；好ましくは、ポリオキシエチレングリコール、より好ましくは、ルテンソール（Lutensol）５０または８０；アニオン性界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム；ならびに、前記界面活性剤の２つ以上の混合物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子の外部表面に、血液−脳関門を横切って活性輸送される分子が結合されるか、または、血液−脳関門を横切って活性輸送される分子に対する脳内皮細胞レセプターに特異的な抗体が前記外部表面に結合される請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記分子が、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、トランスフェリン、インスリン、メラトニン、セロトニン、またはインスリン様成長因子ＩおよびＩＩから選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により得られるナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１３に記載のナノ粒子と、医薬上許容されるキャリアおよび／または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
医薬が１つ以上の生理学的バリア、好ましくは血液−脳関門を横切ることを要する疾患および状態の治療のための医薬を製造するための、請求項１３に記載のナノ粒子または請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子を製造する方法および、前記方法により得ることができるナノ粒子に関する。本発明は、さらに、前記ナノ粒子を含む医薬組成物ならびに、医薬が１つまたはそれ以上の生理的バリアを横断することを要する疾患および状態の治療のための前記ナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｉ．生物学的バリア
多くの薬剤が、ｂｂｂなどの生物学的バリアを横断することができる一方で、他の薬剤は、このようなバリアを効率的に通過しないか、または全く通過せず、そして、標的組織に直接投与された場合にのみ有効である。すなわち、多くの潜在的に効能のある薬剤が、ｂｂｂなどの生物学的バリアに対するその通過不能のために、臨床上有用でない。
前記生物学的バリアを経る薬剤浸透を増すために、多くのアプローチが、先行技術文献に記載されている。
【０００３】
一つのアプローチは、前記バリア、例えば、前記ｂｂｂ自体の機能を変えることであった。例えば、浸透剤は、（静脈注入によるなど）末梢投与された場合、前記ｂｂｂの開口を生じる。さらに、ＣＮＳに作用するいくつかの薬剤は、他の物質に対するｂｂｂの浸透性を変化させることができ、コリン様アレコリンは、例えば、前記ｂｂｂを経る薬剤浸透の変化を引き起こすことが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
他のアプローチは、薬剤分子自体の変更にある。例えば、タンパク質などの巨大分子は、前記ｂｂｂを全く通過しない。例えば、まず、前記巨大分子の活性部位、すなわち、生物学的に望ましい現象を起こす前記分子の部位をまず単離し、次いで、この活性部位のみを使用することができる。サイズが、前記ｂｂｂの浸透性を許容する要因の一つであるので、より小さな分子は前記ｂｂｂを直ちに通過することができるという見込みで、減少されたサイズが用いられる。前記ｂｂｂの通過をねらった巨大分子の他の変更には、タンパク質を糖化し、それにより、その前記ｂｂｂの浸透性を高めること、またはプロドラッグを形成することが含まれる。
【０００５】
特許文献１は、タンパク質を糖化することを論じ、他方、特許文献２および特許文献３は、プロドラッグの形成を開示する。これらのプロドラッグは、脂肪酸キャリアと、それ自体で前記ｂｂｂを通過することができない神経活性薬剤から形成される。同様のシステムが、特許文献３に開示されている。
【０００６】
さらに他のアプローチは、活性成分をマトリックスシステムから直接的に神経組織へ放出する制御性放出ポリマーの移植である。しかし、このアプローチは、侵襲的であり、脳または脊髄へ直接移植される場合、外科手術を必要とする（Sabelら、特許文献４；およびSabelら、特許文献５を参照されたい。）。
【０００７】
これらの限界を克服するために、リポソーム、赤血球ゴースト、抗体−コンジュゲート、およびモノクローナル抗体コンジュゲートなどの薬剤キャリアシステムを用いる他のアプローチが試みられている。標的薬剤送達における主要問題の一つは、細網内皮系（ＲＥＳ）による、特に、肝臓および脾臓におけるマクロファージによる、注入されたキャリアの迅速なオプソニン化および取り込みである。この障害は、リポソームの場合、ホスファチジルイノシトール、モノシアロガングリオシド、またはスルホガラクトシルセラミドなどのいわゆる「ステルス（stealth）」脂質の組み込みにより部分的に克服される可能性がある。しかし、これらシステムはいずれも、医薬における広範な適用を可能とする融通性を欠く。
【０００８】
ＩＩ．薬剤送達ビヒクルとしてのナノ粒子
ナノ粒子は、いくつかの疾患、特に癌の検出および治療の新たな望みを提供する。ナノ粒子は、すなわち、医薬の多くの分野、特に癌治療に関し、大きな可能性を持つ。腫瘍殺滅薬剤を直接癌細胞に送達し、このため、化学治療の望ましくない副作用を回避する見込みにより、医薬界でナノ粒子には大きな関心がもたらされている。
【０００９】
所望の標的組織に薬剤を運搬および送達するアプローチが、特許文献６に開示されている。この文献では、ポリマー材料から作製されたナノ粒子であって、哺乳動物に送達されるべき薬剤およびその上に堆積された界面活性剤コーティングを含むナノ粒子と、投与後、前記哺乳動物内における前記ナノ粒子の前記標的への輸送を可能とする医薬上許容されるキャリアおよび／または希釈剤を含む薬剤標的システムが開示されている。このアプローチでは、好ましくは＜１,０００ｎｍの直径を有するポリマー粒子を含むナノ粒子が用いられる。
【００１０】
アルキルシアノアクリレート（ＡＣＡ、Ｃ１からＣ６）が、いくつかの適用のために有用なモノマーであることが立証されている。「スーパーグリュー（super  glue）」として広く知られるものと並んで、それらは、手術において傷の封鎖のために用いられる（例えば、Indermil（登録商標）、ｎ−ブチルシアノアクリレートＢＣＡ）。いずれの適用も、湿気由来の水や皮膚由来の水、皮膚タンパク質に存在するアミン、アルコールまたはホスフィンなどの微量の求核剤により、前記アニオン重合が容易に開始されるという事実に基づく。
【００１１】
近年、ポリ（アクリルシアノアクリレート）ナノ粒子の合成に、かなりの努力が為されている。特に、ポリ（アクリルシアノアクリレート）ナノ粒子は、生物学的適合性があり、生物分解可能であり、そして、生物活性化合物の吸着、特に捕捉に関して顕著な傾向を示すことが報告されており、薬剤キャリアシステムとしての使用の有望な候補物となっている。多数の異なる化合物が、無機クリスタライト、例えば、マグネタイト｛Arias,  2001  #1｝から種々の薬剤（メトトレキサート｛Reddy,  2004  #2｝、ドキソルビシン｛Steiniger,  2004  #4；Kattan,  1992  #3；Gulyaev,  1999  #5｝）まで、およびオリゴペプチド（ダラルジン（dalargin）{Alyautdin,  1995  #6},{Olivier,  1999  #7}）またはタンパク質（インスリン{Couvreur,  1988  #10；Behan,  2001  #8；Sullivan,  2004  #9}）ですらも、「ペイロード（payload）」として使用されている。
【００１２】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ナノ）粒子の形成のための第一プロセスは、１９７０年代後期に、立体安定剤としてポリマー性、非イオン性界面活性剤を含み、アルキルシアノアクリレートモノマーが滴加されたＨＣｌ溶液（１０−２から１０−３モル・ｌ−１）を用いて、Couvreur{Couvreur,  1979  #11}により開発された。次いで、多数の研究（{Limouzin,  2003  #12}を参照されたい）により、界面活性剤を用いるまたは用いない分散および乳化技術の適用が報告されている。記載されている粒子は、１００ｎｍ未満から１μｍを超える範囲に渡るサイズの広い分布を示す。粒子サイズ、前記分散の安定性および前記ポリマーのモル質量は、連続相のｐＨ{Behan,  2001  #13}、{Lescure,  1992  #14}、{El-Egakey,  1983  #15}、{Douglas,  1984  #16}ならびに界面活性剤のタイプおよび濃度{Douglas,  1985  #17}、{Vasnick,  1985  #18}に大きく依存する。
【００１３】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子の調製のための非イオン性またはポリマー性界面活性剤を用いるエマルジョン重合の広範囲に渡る適用にも関わらず、いくつかの限界、特に、分散物の低いポリマー含量（〜１ｗｔ％）および前記モノマーに比して多量の界面活性剤（１：１またはそれより多い界面活性剤対モノマー比、例えば、{Seijo,  1990  #19}、{Alyautdin,  1995  #6}）がある。加えて、市場入手可能なモノマー中に存在する安定剤は、重大な問題を引き起こす。適用される安定剤は、未知濃度のルイス酸であるので（ＭｅＳＯ３Ｈ、ＳＯ２）、粒子の特性における影響は予想でき、そして、これまで適用された技術では、容易に制御できない。ＳＯ２の量が粒子サイズに影響を与え{Labib,  1991  #20}、{Lescure,  1992  #14}、およびそれゆえ、異なるバッチのアルキルシアノアクリレートモノマーを用いる場合、再現性の欠如に至ることが報告されている。
【００１４】
今日まで、粒子表面の修飾は、例えば、ポリソルベートなどの物理的に吸着される{Alyautdin,  1995  #6}、{Olivier,  1999  #7}、もしくは、例えば、デキストランのヒドロキシ基{Chauvierre,  2004  #21}、{Douglas,  1985  #17}またはＰＥＧ{Peracchia,  1997  #22}により、前記粒子の表面に化学的に結合される界面活性剤の選択により達成されている。ポリソルベートでの修飾により、粒子が血液−脳関門を経て浸透することが可能となり、他方、ＰＥＧ化粒子は、循環系において、長期の持続性を示す。
【００１５】
それにも関わらず、前記ポリマー粒子を、特に設計する表面特性へさらに化学官能基化させることは、界面活性剤分子が前記粒子表面を占有しているために（使用する界面活性剤の量が多いために）、およびＣＯＯ−などのアンカー基がないために、達成することが困難である。これらの基は、タンパク質（例えば、抗体）のような（バイオ）分子{Lathia,  2004  #23；Nakajima,  1995  #24；Rasmussen,  1991  #25}を、細胞応答の特異的レセプターに向けるために、ＥＤＣカップリングにより結合するために必要とされる。
【００１６】
ＩＩＩ.  ミニエマルジョン法により形成されるナノ粒子
先行技術文献から、ポリマーへの変換をミニエマルジョンにおいて行うことも、公知である。ミニエマルジョンは、例えば、水、油相、および１つ以上の界面活性剤の分散物であり、約５０から５００ｎｍの液滴サイズを有する。前記ミニエマルジョンは、準安定であると考えられた（参考。非特許文献２;非特許文献３）。これらの分散物は、洗浄製品、化粧品またはボディケア製品の技術分野において広範な適用が見出されている。
【００１７】
オレフィン系不飽和モノマーのフリーラジカルミニエマルジョン重合による水性一次分散液の調製が、例えば、特許文献７または特許文献８および特許文献９から公知である。これら公知の方法の場合、前記モノマーは、異なる低分子量のオリゴマー性またはポリマー性疎水性物質の存在下で共重合され得る。
【００１８】
特許文献１０から、下記工程を含む、ナノ粒子を調製する方法が公知である。：
−ＯおよびＷタイプの液相、安定剤、１つ以上の医薬ならびに重合可能なモノマーを含む反応系を提供する工程、
−Ｏ／Ｗタイプのミニエマルジョンを形成する工程、および
−ナノ粒子を形成するために前記モノマーを重合する工程。
【００１９】
特許文献１０は、特に、非特許文献４に記載されているようなミニエマルジョン法を使用する。この方法は、周知の常套法とは、異なる順序の製造工程を含むことにより基本的に異なっており、このアプローチでは、分散された疎水性モノマーを含む液滴を親水性連続相に含むミニエマルジョンが、ポリマー粒子へと形成される。前記常套アプローチでは、前記ポリマーは、モノマーを含む溶液から直接形成される。
【００２０】
しかし、特許文献１０は、前記重合が、１つ以上の（第一級）アミンにより開始されることは開示していない。
特許文献１１は、１〜２５０μｍの直径を有する、インビボ分散のための有用な親水性ポリグルタメートミクロカプセルを開示する。前記ミクロカプセルは、厳密に規定された組織を特異的に標的することを目的とする。しかし、特許文献１１は、前記ミニエマルジョン法を使用していない。
【００２１】
特許文献１２は、半導体および炭素原子含有材料へのアミノ酸オリゴマーの選択的結合のための組成物および方法に関する。一形態は、前記半導体または炭素原子含有材料を特異的に結合するアミノ酸オリゴマーを、前記材料の形成を生じ得る溶液と相互作用させることにより、前記半導体または炭素原子含有材料の粒子サイズを制御する方法である。同じ方法を用いて、前記半導体材料のナノ結晶粒子のアスペクト比を制御することができる。ここでも、しかし、前記ミニエマルジョン法によりナノ粒子を形成することは開示されていない。
【００２２】
非特許文献５から、アンモニアをミクロエマルジョンへ添加することが公知である。しかし、この刊行物は、いわゆるストーバー法の変法によるシリカナノ粒子の（重縮合による）製造を記載する。さらには、非イオン性界面活性剤およびシクロヘキサンが添加され、３０〜７０ｎｍの範囲のナノサイズのシリカが産出された。低い界面活性剤濃度では、前記アンモニア濃度が増すと、前記粒子サイズが増すことが示されている。より高い界面活性剤濃度では、前記アンモニア濃度が増すに従い、粒子サイズは小さくなる。このこととは別に、この引用文献は、ミニエマルジョン法の使用を開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第５,２６０,３０８
【特許文献２】米国特許第４,９３３,３２４号
【特許文献３】ＷＯ８９／０７９３８号
【特許文献４】米国特許第４,８８３,６６６号
【特許文献５】米国特許出願第０７／４０７,９３０号
【特許文献６】ＷＯ９５／０２２９６３号
【特許文献７】ＷＯ９８／０２４６６
【特許文献８】ドイツ特許ＤＥ−Ａ−１９６２８１４３
【特許文献９】ドイツ特許ＤＥ−Ａ−１９６２８１４２
【特許文献１０】ＷＯ２００６／０２９８４５
【特許文献１１】ＷＯ９４／０２０１０６
【特許文献１２】ＷＯ０３／０２６５９０
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Saija,  A.,  Princi,  P.,  De  Pasquale,  R.,  Costa,  G.,  "Arecoline  but  not  haloperidol  produces  changes  in  the  permeability  of  the  blood-brain  barrier  in  the  rat."  J.  Pharm.  Pha.  42：135-138  （1990）
【非特許文献２】Emulsion  Polymerization  and  Emulsion  Polymers,  Editors  P.  A.  Lovell  and  Mohamed  S.  El-Aasser,  John  Wiley  and  Sons,  Chichester,  New  York,  Weinheim,  1997,  pages  700  et  seq.
【非特許文献３】Mohamed  S.  El-Aasser,  Advances  in  Emulsion  Polymerization  and  Latex  Technology,  30th  Annual  Short  Course,  Volume  3,  Jun.  7-11,  1999,  Emulsion  Polymers  Institute,  Lehigh  University,  Bethlehem,  Pa.,  USA
【非特許文献４】K.  Landfester,   "Polyreactions  in  miniemulsions",  Macromol.  Rapid  Comm.  2001,  896-936.  K.  Landfester,  N.  Bechthold,  F.  Tiarks,  and  M.  Antonietti,  "Formulation  and  stability  mechanisms  of  polymerizable  miniemulsions"
【非特許文献５】"Synthesis  of  Nanosize  Silica  in  a  Nonionic  Water-in-Oil  Microemulsion:  Effects  of  the  Water/Surfactant  Molar  Ratio  and  Ammonia  Concentration",  Journal  of  Colloid  and  Interface  Science  211,  210-220  (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的
ナノ粒子を製造する方法であって、界面活性剤の量をかなり低下でき、かつ、官能基を導入できる方法を提供することが、本発明の目的である。
また、ＰＡＣＡナノ粒子を製造するための改善された方法であって、粒子を高収率、固形分量で得ることができ、かつ、小さな粒子サイズおよび狭く均一な粒子分布を有する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００２６】
所望の放出特性に特に適合させ得る、医薬のための送達ビヒクルを提供することが、本発明のさらなる目的である。特に、種々の医学的状態のために使用するのに適し、かつ、動物やヒトの体の主要な生理学的または生物学的バリアを特異的に横断し得、かつ、その後、標的組織で前記薬剤の持続的放出または長期放出などの変更された放出特性を示す送達ビヒクルを提供することが、本発明の目的である。
さらに、薬剤送達ビヒクルを製造するための方法であって、前記ビヒクルの大規模製造に適した方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
発明の概要
これらの目的は、独立クレームの対象事項により達成される。好ましい態様が、従属クレームに記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１：界面活性剤の濃度に伴う、１５０秒の超音波処理時間における粒子サイズ（白丸）およびＭｗの変化（点線は、目視評価のための規準である）。
【図２】図２：ＢＣＡミニエマルジョンから得られたＧＰＣエルグラムと、ＰＢＣＡ分散液から得られた溶出時間の４週間の間における変化
【図３】図３：ＳＤＳを用いて（サンプルＳ−１０）、ルテンソールＡＴ５０を用いて（サンプルＬ−１０）およびトゥイーン２０を用いて（サンプルＴ−１０）（写真、左から右）調製した分散液のＴＥＭ画像；ルテンソールＡＴ５０およびトゥイーン２０を用いて調製した分散液の画像は、粒子を再分散させた後にのみ得ることができた。
【図４】図４：算出値と比較したｐＨの変化。各ＮａＯＨ溶液の体積を選択して、最終分散液に関して算出ｐＨ値を得た。反応中のＯＨ−の消費は、算出においては無視した（点線は、目視評価のための規準である）。
【図５】図５：イニシエーター（ＮａＯＨ溶液）体積（各部分の右側に記載した数）を用いて得られたポリマーのモル質量変化、７日後に凍結した粒子。
【図６】図６：脱／再重合について提唱するメカニズム{Ryan,  1996  #37}
【図７】図７：イニシエーター（アンモニア溶液）体積（各部分の右側に記載した数）を用いた場合の溶出体積の変化。調製後２日目に凍結したサンプル。
【図８】図８：（トリス塩基溶液）体積（各部分の右側に記載した数）を用いた場合の溶出体積の変化。調製後２日目に凍結したサンプル。
【図９】図９：０．５モル・ｌ−１の６−アミノヘキサン酸で重合開始した（左）およびグリシン溶液で重合開始した（右）粒子サイズの変化（点線は、目視評価のための規準である）。右図の凡例中の数は、前記溶液のモル濃度（ダッシュの前）およびｐＨ（ダッシュの後）を示す。
【図１０】図１０：６−アミノヘキサン酸で重合開始したサンプルのＧＰＣ溶出体積：ａ）ｐＨ４．４  ｂ）ｐＨ５．５  ｃ）ｐＨ１０。
【図１１】図１１：グリシンで重合開始したサンプルのＧＰＣ溶出体積：ａ）Ｇｌｙ０．１  ｐＨ３．４；ｂ）Ｇｌｙ０．５、ｐＨ３．４；ｃ）Ｇｌｙ２．０、ｐＨ３．４。
【図１２】図１２：ｐＨ３および１０での透析前および後のζ−ポテンシャル
【図１３】図１３：ＮａＯＨ溶液（０．１モル・ｌ−１、算出ｐＨ７）で重合開始したポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１４】図１４：６−アミノヘキサン酸溶液（ｐＨ４．４、０．５モル・ｌ−１）で重合開始したポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１５】図１５：１０％ＳＤＳおよび４．１７％ヘキサデカンを含むＮＰ−エマルジョンの粒子サイズにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１２５モル／ｌ）の影響
【図１６】図１６：１０％ＳＤＳおよび４．１７％ヘキサデカンを含むＮＰ−エマルジョンのゼータポテンシャルにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１２５モル／ｌ）の影響
【図１７】図１７：１０％ＳＤＳおよび４．１７％ヘキサデカンを含むＮＰ−エマルジョンの粒子サイズにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．０５モル／ｌ）の影響
【図１８】図１８：１０％ＳＤＳおよび４．１７％ヘキサデカンを含むＮＰ−エマルジョンのゼータポテンシャルにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．０５モル／ｌ）の影響
【図１９】図１９：１０％ＳＤＳおよび４．１７％ヘキサデカンを含むＮＰ−エマルジョンの粒子サイズにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１モル／ｌ）の影響
【図２０】図２０：１０％ＳＤＳおよび４．１７％ヘキサデカンを含むＮＰ−エマルジョンのゼータポテンシャルにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１モル／ｌ）の影響
【図２１】図２１：０．０５モル／ｌのＬ−ロイシン溶液９ｍｌを用いて重合開始した、５％ルトロール（Lutrol）、２％ＳＤＳおよび６％ダイズ油を含むＰＢＣＡ懸濁液の標準的方法
【図２２】図２２：５％ルトロール、２％ＳＤＳおよび６％ダイズ油を含むＮＰエマルジョンの粒子サイズにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１モル／ｌ）の影響
【図２３】図２３：５％ルトロール、２％ＳＤＳおよび６％ダイズ油を含むＮＰエマルジョンのゼータポテンシャルにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１モル／ｌ）の影響
【図２４】図２４：５％ルトロール、２％ＳＤＳおよび６％ダイズ油を含むＮＰエマルジョンの粒子サイズにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１２５モル／ｌ）の影響
【図２５】図２５：５％ルトロール、２％ＳＤＳおよび６％ダイズ油を含むＮＰエマルジョンのゼータポテンシャルにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．１２５モル／ｌ）の影響
【図２６】図２６：５％ルトロール、２％ＳＤＳおよび６％ダイズ油を含むＮＰエマルジョンの粒子サイズにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．０５モル／ｌ）の影響
【図２７】図２７：５％ルトロール、２％ＳＤＳおよび６％ダイズ油を含むＮＰエマルジョンにおけるアミノ酸Ｌ−ロイシン（０．０５モル／ｌ）の影響
【発明を実施するための形態】
【００２９】
第一級または第二級アミン（本発明において、第一級アミンは、アンモニアも含むと定義する）を用いて前記ミニエマルジョン法の重合工程を開始することにより、一方で、狭いサイズ分布を有する小さなＰＡＣＡナノ粒子が得られ、他方で、前記ナノ粒子を官能基化し得ることが判明した。
【００３０】
２工程のミニエマルジョン法を、ＰＡＣＡナノ粒子、好ましくは、ポリ（ｎ−ブチルシアノアクリレート）（ＰＢＣＡ）ナノ粒子の調製のために適用した。一例として、第一工程で、ミニエマルジョンを、ｎ−ブチルシアノアクリレートの塩酸溶液から、ドデシル硫酸ナトリウムを界面活性剤として用いて調製する。第二工程で、重合を開始するために塩基性溶液を添加し、次いで、ポリマー性粒子を形成させる。イニシエーターとして第一もしくは第二アミンまたはアミノ酸を用いることにより、ポリマー粒子の表面の好都合な官能基化が可能となる。第三級または第四級アミンは、それらが求核剤として作用し得る限り、本発明の状況において作用させ得ることがさらに判明していることを特記する。しかしながら、第一級および第二級アミンが、本発明において好ましい。
【００３１】
粒子サイズおよびサイズ分布における界面活性剤濃度および超音波処理時間の影響を、前記粒子サイズおよび前記ポリマーのモル質量の分布におけるイニシエーターのｐＨ、濃度および量の影響とともに、研究した。検出された、前記粒子のζ−ポテンシャルのｐＨ依存性は、アミノ酸を用いる重合開始後の前記粒子表面におけるカルボキシル基の存在を示す。
【００３２】
結果として、本発明は、分散液中で安定な狭いサイズ分布を有し、再現性をもって官能基化可能で、かつ、ロード可能なＰＡＣＡナノ粒子、特にＰＢＣＡナノ粒子の調製を開示する。前記ナノ粒子は、最少限のアニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて１０ｗｔ％より高い固形分量で達成されるような方法で、調製することができる。
【００３３】
これらの要求を満たす非常に好都合な方法は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子を５％の固形分量で作製するために、前記ミニエマルジョン法を用いて１シングルモデル実験にて既に示されたように{Limouzin,  2003  #12}、安定な水中ｎ−ブチルシアノアクリレートミニエマルジョンを形成した後、重合を開始するミニエマルジョン法の適用である。
【００３４】
オストワルド熟成を妨げるために、疎水性の剤により得られるミニエマルジョンの高い安定性を利用して、分散させるＢＣＡモノマーの量をさらに増すことが可能となり、そしてそれゆえ、最終分散液の固形分量を１０％より多く増すことが可能となることを示す。重合は、最も簡単な場合、水酸化物溶液の添加により開始する。粒子サイズおよびサイズ分布における界面活性剤濃度および超音波処理時間の影響を、前記粒子サイズおよび前記ポリマーのモル質量の分布におけるイニシエーター溶液のｐＨ、濃度および量の影響とともに研究した。イニシエーターとしての単官能基性または多官能基性アミンの適用により、前記ポリマーへの{Kulkarni,  1971  #27}、{Leonard,  1966  #28}、{Pepper,  1978  #29}、およびしたがって、前記粒子への官能基の導入が可能となることを示す。検出した、前記粒子のζ−ポテンシャルのｐＨ依存性は、アミノ酸を用いる重合開始後の前記粒子表面におけるカルボキシル基の存在を示す。
【００３５】
本発明の詳細な説明
第一の側面により、本発明により、下記の工程から成り、下記工程ｂ）における重合を、１つ以上の第一級または第二級アミンにより開始することを特徴とするナノ粒子を製造する方法が提供される。：
ａ）  ＯおよびＷ（水性）タイプの液相、１つ以上の安定剤ならびに重合可能なＡＣＡモノマーを含むＯ／Ｗミニエマルジョンを調製する工程、
ｂ）  前記モノマーをアニオン重合により重合し、次いで、製造されたナノ粒子を単離する工程。
【００３６】
驚くべきことに、前記モノマーの重合を開始するための第一級または第二級アミンの添加により、前記ナノ粒子の狭くかつ均一なサイズ分布が導かれ、かつ、前記ナノ粒子の製造において必要とされる界面活性剤の量がかなり低下することが判明した。前述のとおり、本発明は、必ずしも第一級または第二級アミンには限定されず、第三級、第四級アミンおよび他の試薬も、それらが強い求核剤である限り、用いてよい。この開発の利点は、明らかであり、前記粒子が小さいほど、想定される適用、特に、血液−脳関門を横断するためのインビボ適用に、より適することとなる。さらに、前記ナノ粒子を調製するために必要とされる界面活性剤（または安定剤）の量の低下により、患者への前記界面活性剤のインビボ負荷も低下し、また、前記粒子表面の界面活性剤分子による占有が回避されるので、前記ポリマー粒子の、特に設計する表面特性への化学官能基化が可能となる。前記利点は、「実施例」の章でより詳細に説明する。
【００３７】
「ナノ粒子」の文言は、本明細書中、概して、生物学的適合性があり、かつ、十分量の前記ナノ粒子が、標的器官または組織、例えば、脳、肝臓、腎臓および肺などに到達することができるように、腹腔または経口または静脈内投与に続いてヒトまたは動物の体内に入った後、実質的に無傷な状態を維持するように、使用の環境による化学的および／または物理的破壊に対して十分抵抗性のあるキャリア構造を意味する。
【００３８】
好ましい態様により、前記ナノ粒子は、１ｎｍから２０μｍの直径を有し、好ましくは１０ｎｍから１０μｍの直径を有し、および最も好ましくは５０ｎｍから１,０００ｎｍの直径を有する。
さらに、前記ナノ粒子は、前述のとおり、好ましくは、その上に堆積された界面活性剤コーティングを含む。
【００３９】
前記ナノ粒子の、適当な界面活性剤の十分なコーティングでの処理により、吸着された薬剤が、ｂｂｂなどの生理学的バリアをより良好に横断することが可能となる。この効果を開示しているいくつかの文献、特に、ＷＯ９５／２２９６３を引用し、本明細書中にその全容を組み込む。
【００４０】
前記１つ以上の安定剤の量は、前記モノマー相に基づき、１から５０％であり、好ましくは５から３０％であり、および最も好ましくは１０から２５ｗｔ％である。本明細書中に用いる「安定剤の量」は、いくつかの安定剤の組み合わせの総量も含むことをさらに特記する。例えば、１０から２５重量％の前記量は、１０％のドデシル硫酸ナトリウムと１０％のポリソルベート８０からなってよい。
【００４１】
本発明において用いる「安定剤」の文言は、エマルジョンを安定化することができるあらゆる物質を含む。これらの物質は、好ましくは、界面活性および／または両親媒性物質、すなわち界面活性剤である。
【００４２】
前記界面活性剤コーティングおよび／または安定剤は、好ましくは、１つ以上の下記の物質を含む。：
グリセロール、ソルビトールおよび他の１価または多価アルコール、好ましくは、ベンジルアルコールの脂肪酸エステル、グリセロールモノステアレート、ソルビタンモノラウレート、またはソルビタンモノリエート（sorbitan  monoleate）；リン脂質、リン酸エステル、多糖、ベンジルベンゾエート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、３００、４００、５００、６００）、ポリエチレングリコールヒドロキシステアレート、好ましくは、ソルトール（Solutol）ＨＳ１５；ポロキサミン、好ましくは、ポロキサミン９０４、９０８または１５０８；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル；エトキシル化トリグリセリド；エトキシル化フェノールおよびエトキシル化ジフェノール；ゲナポール（Genapol）（商標）およびバウキ（Bauki）シリーズの界面活性剤；ポリオキシルヒマシ油、好ましくは、クレモフォールＥＬＰ；レシチン、脂肪酸の金属塩、脂肪アルコールスルフェートの金属塩；およびスルホコハクシネートの金属塩；好ましくは、ポリソルベート、より好ましくは、ポリソルベート２０、６０および最も好ましくは、ポリソルベート８０；好ましくは、ポロキサマー、より好ましくは、ポロキサマー１８８、３３８または４０７；好ましくは、ポリオキシエチレングリコール、より好ましくは、ルテンソール（Lutensol）５０または８０；当該分野で公知のアニオン性界面活性剤（例えば、M.J.  Rosen:  "Surfactants  and  interfacial  phenomena",  Wiley  &  Sons,  Inc.  New  York  Chichester  Brisbane  Toronto  Singapore  1989を参照されたい）、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム；ならびに、前記界面活性剤の２つ以上の混合物。
前述のとおり、ポリソルベート８０が最も好ましい。
【００４３】
界面活性剤コーティングが存在する場合、本発明はまた、前記コーティングを、得られたナノ粒子から少なくとも部分的に除去する方法も提供することを特記する。これは、好ましくは、透析または遠心分離によりなすことができる。前記安定剤は、製造法においては本質的に必要とされるが、最終ナノ粒子が形成された後に、少なくとも部分的に除去してよいことが、驚くべきことに判明した。言い換えれば、前記ナノ粒子の安定性を維持するのに必要とされず、しかし、インビボ適用に関して潜在的リスクを引き起こすおそれのある「過剰」の安定剤を除去することができる。前記ナノ粒子における前記安定剤の可能な最少量が、最低のインビボリスクを有するとみなすべきと考えられる。
【００４４】
重合の好ましい方法は、K.  Landfesterらにより開発されたミニエマルジョン法である。
ミニエマルジョンは、油、水、界面活性剤および疎水性物質を含む系を剪断することにより調製される５０から５００ｎｍのサイズを有する、臨界的に安定化された油滴の分散物である。そのようなミニエマルジョンにおける重合により、初期の液滴とおよそ同じサイズを有する粒子が得られる（K.  Landfester,  Polyreactions  in  miniemulsions,  Macromol.  Rapid  Comm.  2001,  896-936.  K.  Landfester,  N.  Bechthold,  F.  Tiarks,  and  M.  Antonietti,  Formulation  and  stability  mechanisms  of  polymerizable  miniemulsions.  Macromolecules  1999,  32,  5222.  K.  Landfester,  Recent  Developments  in  Miniemulsions  -  Formation  and  Stability  Mechanisms.  Macromol.  Symp.  2000,  150,  171）。
【００４５】
前述のとおり、例えば、Landfesterら（既出）に開示されるような既に公知のミニエマルジョン法を用いて、前記ミニエマルジョンを調製してよい。これは、例えば、まず、Ｏ相およびＷ相中のモノマーと安定剤（前記のようなもの）を合わせることによりなしてよい。前記水相は、さらなる成分、例えば、適当なｐＨ値を設定するためのＨＣｌを含んでよいことを特記する。第２に、すべての成分を混合するために、前記反応系を、例えばホモジェナイザーなどにより混合してよい。
【００４６】
ミニエマルジョンそのものの調製は、前記反応系に、例えば、超音波や高圧ホモジェナイザーにより、高い剪断力を適用することにより行う。さらに、前記剪断力は、前記反応系のサイズや使用するホモジェナイザーにより、例えば、１〜１０分の範囲の時間、適用してよい。基本的には、２から４分の範囲の時間を十分であると考える。しかし、ナノ粒子の調製に関する詳細や条件は、多くの要因、例えば、まさに使用する設備などにより変えてよいことを特記する。
【００４７】
前記超音波ホモジェナイザーは、約６０〜１００％、好ましくは、約７０〜９０％の振幅を有してよい。
一態様によれば、この方法で使用する温度は、好ましくは、−１から５℃であり、好ましくは、０℃である。しかしながら、前記温度範囲は、前記範囲に限定されず、より広い範囲を用いることができる。
【００４８】
概して、Ｗ相に対するＯ相の重量比は、５〜４０％ｗ／ｗであり、好ましくは、２０〜３０％ｗ／ｗであり、より好ましくは、約２５％ｗ／ｗである。
一の好ましい態様によれば、前記アミンは、アンモニア、トリス塩基からなる群から、またはアミノ酸、好ましくは、フェニルアラニン、グリシン、Ｌ−ロイシン、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファンまたは６−アミノヘキサン酸からなる群から選択される。
【００４９】
ここで、５−ヒドロキシトリプトファンまたはトリプトファンは、一方では、重合のイニシエーターとして適しており、そして、他方では、ｂｂｂを経る輸送を高めるための分子としても役立ち得ることが判明したので（以下も参照されたい）、５−ヒドロキシトリプトファンまたはトリプトファンが、特に好ましい。トリプトファンまたは５−ヒドロキシトリプトファンを重合のイニシエーターとして用いる場合、十分数のこれら分子が、前記ナノ粒子の表面にも存在すると考えられる。こうして、トリプトファンまたは５−ヒドロキシトリプトファンは、さらに、ｂｂｂを経る輸送を高めるための手段としても役立ち得る。
【００５０】
使用し得るさらなるアミノ酸は、アラニン、アスパラギン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、グルタミン、チロシン、バリンおよびタウリンからなる群から選択される。
前述のような本発明の効果は、ＮａＯＨのみを用いる従来のアプローチによっては用い得ないことを特記する。
【００５１】
本発明の方法では、好ましくは、治療薬および診断薬から選択される、好ましくは、１つ以上の医薬が、前記Ｗ相および／または前記Ｏ相に含まれる。
「薬剤」および「治療薬」の文言は、本明細書中、交換可能に使用することを特記する。
前記治療薬は、好ましくは、送達ビヒクルまたはキャリアを用いずに生理学的バリアを横断することができないか、または十分に横断することができない物質から選択され、ここで、前記生理学的バリアは、好ましくは、血液−脳関門（ｂｂｂ）、血液−空気関門、血液−脳脊液関門および頬粘膜からなる群から選択される。
【００５２】
好ましい一態様によれば、本発明の前記送達ビヒクルは、連接部位およびニューロエフェクター接合部位で作用する薬剤；全身および局所鎮痛剤；催眠薬および鎮静薬；鬱病および統合失調症などの精神疾患の治療のための薬剤；抗てんかん剤および抗けいれん剤；パーキンソン病およびハンチントン病、老化およびアルツハイマー病の治療のための薬剤；抗肥満薬；興奮性アミノ酸アンタゴニスト、神経栄養因子、および神経形成剤；栄養因子；ＣＮＳトラウマまたは発作の治療を目的とする薬剤；中毒および薬物濫用の治療のための薬剤；アンタコイド（antacoids）および抗-炎症剤；寄生虫感染および微生物により引き起こされる疾患のための化学治療薬；免疫抑制剤および抗-癌剤；ビタミン；ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト；重金属および重金属アンタゴニスト；非金属性中毒薬のためのアンタゴニスト；癌の治療のための細胞活動抑止剤、好ましくは、ドキソルビシン；核医学での使用のための診断物質；免疫活性および免疫反応剤；トランスミッターならびにその対応するレセプターアゴニストおよびレセプターアンタゴニスト、その対応するプレカーサーおよび代謝産物；トランスポーターインヒビター；抗生物質；抗興奮剤；抗ヒスタミン剤；抗嘔吐剤；緩和剤；刺激剤；センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド；脳拡張剤；向精神薬；抗躁薬；血管拡張薬および収縮薬；抗-高血圧剤；片頭痛治療のための薬剤；催眠、高血糖および低血糖剤；抗喘息薬；抗ウイルス剤、好ましくは、抗ＨＩＶ薬；疾患のＤＮＡまたはアンチセンス治療に適した遺伝子材料；ならびにこれらの混合物からなる群から選択される１つ以上の治療薬を含む。ナノ粒子を調製する前述の方法におけるこのような薬剤の添加に関しては、前記重合を開始する前に、すでに、疎水性の剤を添加することが好ましく、親水性の剤は、（前記ナノ粒子の表面への吸着により）この工程の前または後に添加してよいことを特記する。
【００５３】
本明細書中で使用する「ＤＮＡ」の文言は、基本的に、本発明の技術分野で考えられ得るあらゆるＤＮＡを言う。好ましい態様では、前記「ＤＮＡ」の文言は、２タイプのＤＮＡ、すなわち、一方において、プラスミドＤＮＡ、より好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の情報を含むプラスミドＤＮＡ、よりいっそう好ましくは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲＢの情報を含むプラスミドＤＮＡと、他方において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは、癌遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、よりいっそう好ましくは、Ｂｃｌ２のような癌遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。本発明では、１つのタイプのＤＮＡ（および、したがって、１つのタイプのＤＮＡをロードしたナノ粒子）を用いてよい。別法として、異なるタイプのＤＮＡでロードされ、かつ本発明に従い使用し得る複数のナノ粒子を生じる、２つ以上のタイプのＤＮＡを用いてよい。
【００５４】
驚くべきことに、ＤＮＡ、特に、前記２つのタイプのＤＮＡを、ナノ粒子上に吸着でき、そして、生じるＤＮＡ−ナノ粒子複合体を、生物体、特に、癌（特に、脳の癌、ただし、これに限定されない）を患っている生物体に接種することができた。その後、前記腫瘍の増殖の抑制を認めることができ、かつ、腫瘍の壊死およびアポトーシスさえも、誘導することができた。
【００５５】
本発明の好ましいが不可欠ではない一態様では、プロモーターを含むプラスミドＤＮＡ、より好ましくは誘導性プロモーターを含むプラスミドＤＮＡを前記ナノ粒子にロードすることができる。誘導性プロモーターを含むＤＮＡを前記ナノ粒子上にロードし、かつそれを前記細胞内部で発現させるための新規工程により、誘導性プロモーター、およびそれにより、対応する遺伝子の発現の外部コントロールを達成することができ、そして、前記遺伝子を意のままに「スイッチ」オンおよびオフすることができる。先行技術を超える予想外の利点として、前記遺伝子／ＤＮＡ発現のタイミングをコントロールすることができる。そのようなコントロールにより、継続的遺伝子発現の毒性副作用を減らし得、および／または、細胞が遺伝子産物に対して抵抗性となる蓋然性を低下でき、ネガティブ選択を得ることができる。
【００５６】
本発明の好ましい態様では、ヒトパピローマウイルス上流調節領域（ＨＰＶ−ＵＲＲ）を前記誘導性プロモーターとして使用した。前記腫瘍サプレッサーの発現は、デキサメタソンまたは他のインデューサーもしくは化合物の投与後に誘導される。このような方法で、前記腫瘍細胞のアポトーシスおよび前記腫瘍の退化を達成することができた。本発明に従い使用可能な他の例示的なプロモーターは、サイトメガリアウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００５７】
さらに、腫瘍退化を含む強い効果を、１つ以上のタイプのＤＮＡ含有ナノ粒子と、１つ以上の細胞分裂停止作用物質を含むナノ粒子との組み合わせ投与により達成することができた。
好ましい一態様では、いっそうより好ましくは誘導性プロモーターに遅れて、腫瘍サプレッサーＤＮＡを、細胞分裂停止作用化合物を含むナノ粒子複合体の接種の前に注入してよい。よりいっそう好ましい態様では、前記細胞分裂停止作用化合物は、ドキソルビシンである。
【００５８】
細胞へのＤＮＡのトランスフェクションのプロセスにおいて、および、ヒトまたは動物体の標的器官へのＤＮＡの投与のプロセスでも同様に、第１の工程は、前述の方法での前記ナノ粒子の調製を含む。
さらなる情報は、ＷＯ２００４／０１７９４５に明白に記載されており、その全内容を本明細書中に組み込む。
【００５９】
典型的な活性成分（例えば、薬剤）は、神経系に影響を与える、または神経系の診断テストのために使用されるあらゆる物質であってよい。これらは、Gilmanら（1990）、"Goodman  and  Gilman's  -  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics",  Pergamon  Press,  New  Yorkにより記載されており、以下の剤が含まれる。
アセチルコリンおよび合成コリンエステル、天然に生じるコリン様アルカロイドおよびその合成同種物、アンチコリンエステラーゼ剤、神経節刺激剤、アトロピン、スコポラミンおよび関連するアンチムスカリン剤、カテコールアミンならびに、エピネフリン、ノルエピネフリンおよびドーパミンなどの交感神経刺激剤、アドレナリン作用アゴニスト、アドレナリン作用レセプターアンタゴニスト、ＧＡＢＡ、グリシン、グルタミン酸、アセチルコリン、ドーパミン、５−ヒドロキシトリプトアミン、およびヒスチジンなどのトランスミッター、神経活性ペプチド；オピオイド系鎮痛薬およびアンタゴニストなどの鎮痛薬および麻酔薬；ベンゾジアゼピン、バルビツレート、抗ヒスタミン、フェノチアジンおよびブチルフェノンなどの前麻酔薬および麻酔薬；オピオイド；制吐剤；抗コリン作用剤、アトロピン、スコポラミンまたはグリコピロレートなど；コカイン；クロラール誘導体；エトクロルビノール；グルテチミド；メチプリロン；メプロバメート；パラアルデヒド；ジスルフィラム；モルフィネ、フェンタニルおよびナロキソン；フェノチアジン、チオキサンテンおよび他のヘテロ環化合物（例えば、ハロペリドール）などの精神薬；デスイミプラミンおよびイミプラミンなどの三環式抗鬱剤；非定型抗鬱剤（例えば、フルオキセチンおよびトラゾドン）、イソカルボキサジドなどのモノアミンオキシダーゼインヒビター；リチウム塩；クロルジアゼポキシドおよびジアゼパムなどの抗不安薬；ヒダントインを含む抗てんかん剤、抗けいれん剤バルビツレート、イミノスチルベン（カルバマゼピンなど）、スクシンイミド、バルプロ酸、オキサゾリジンジオンおよびベンゾジアゼピン、Ｌ−ＤＯＰＡ／ＣＡＲＢＩＤＯＰＡなどの抗パーキンソン薬、アポモルフィネ、アマタジン、エルゴリン、セレゲリン、ロピノロール、ブロモクリプチンメシレートおよびアンチコリン作用剤；バクロフェン、ジアゼパムおよびダントロレンなどの抗けいれん剤；興奮性アミノ酸アンタゴニスト、神経栄養因子および脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、または神経成長因子などの神経保護薬；ニューロトロフィン（ＮＴ）３（ＮＴ３）；ＮＴ４およびＮＴ５；ガングリオシド；神経形成剤；オピオイドアンタゴニストおよび抗鬱剤を含む中毒および薬物濫用の治療のための薬剤；オートコイド（autocoids）ならびに、ヒスタミン、ブラジキニン、カイジリン（kailidin）およびそれらの対応するアゴニストおよびアンタゴニストなどの抗炎症薬；寄生虫感染および微生物性疾患のための化学治療薬；アルキル化剤（例えば、ニトロソウレア）を含む抗癌剤および抗代謝剤；ナイトロジェンマスタード、エチレンアミンおよびメチルメラミン；アルキルスルホネート；葉酸類似体；ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカノイド；および抗生物質。
【００６０】
本発明における使用のための最も好ましい医薬は、下記の式により表わされるドキソルビシンであることをここでも強調する。
【化１】
2009541462.tif 000002
【００６１】
好ましい一態様によれば、前記診断薬は、核医学における診断および放射線治療において有用な診断薬からなる群から選択される。
好ましい態様では、前記Ｏ相は、親油性溶媒または疎水性物質、好ましくは、ｎ−ヘキサン、ヘキサデカン、液体パラフィン、ビタミンＥ、ミグリオールまたはトリグリセリドの脂肪酸エステルを含む。疎水性物質の量は、通常、相対的に少なく、そして、オストワルド熟成を妨げるのに十分な量（（さらに前記モノマーを含む）前記Ｏ相の総重量に基づき約２〜２０％ｗ／ｗ）であるべきである。
【００６２】
好ましくは、前記１つ以上の医薬および前記モノマーが前記Ｏ相に含まれる。この場合、前記医薬は、前記重合工程により形成された前記ナノ粒子に微細に分散される。別法として、前記１つ以上の医薬が、前記Ｗ相に存在し、および、前記モノマーが前記Ｏ相に含まれる。この場合、かなりの量の前記医薬が、形成された前記ナノ粒子に組み込まれることが判明した。本発明者らは、いかなる特定の理論にも拘束されることを欲しないが、前記ミニエマルジョンを調製することにより、例えば、高い剪断力を適用することにより、前記Ｗ相に含まれる前記医薬が、前記Ｏ相と密接に接触し、前記Ｏ相においても、前記剤の分散を生じると考えられる。
【００６３】
さらに、溶液メディエーターを用いて、通常の環境下では、前記溶媒に十分量で溶解しない剤を溶液としてもよい。この物質群の例は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ポリソルベート８０、ビタミンＥ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、３００、４００、５００、６００）、ポロキサマー、ポリオキシヒマシ油（クレモフォールＥＬＰ）、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレングリコールヒドロキシステアレート（ソルトール（Solutol））、ラブラフィル（Labrafil）、ラブラソール（Labrasol,）、レシチン、プロピレングリコール、ベンジルベンゾエート、グリセロールまたは一価もしくは多価アルコールの脂肪酸エステルまたはトリグリセリドである。
【００６４】
所望により、前記１つ以上の医薬を、前記Ｏ相および前記Ｗ相の両方に添加することがさらに可能である。
好ましい態様では、使用する前記安定剤は、前記Ｗ相に含まれる。前記Ｗ相は、好ましくは、水、または酸、好ましくは塩酸もしくはリン酸を含む水溶液である。前記重合可能なモノマーは、ポリシアノアクリレート、好ましくは、ポリアルキルシアノアクリレート、および誘導体、共重合体ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるポリマー材料を形成するために使用する。「ポリアルキルシアノアクリレート」なる文言は、本明細書中、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基を含むと定義する。
【００６５】
本発明において用いられる（製造される）ポリマー材料は、生物分解可能である。この文言は、生命体の体内で使用するのに適した、すなわち生物学的に不活性で、かつ、生理学的に許容され、無毒であることが知られており、かつ、本発明の送達システムにおいて、使用の環境下で生物分解可能な、すなわち、体により再吸収され得るあらゆるポリマー材料を意味する。
好ましい態様における本発明は、血液−脳関門を横切って活性輸送される分子を前記ナノ粒子の外部表面に結合する工程、または、血液−脳関門を横切って活性輸送される分子に対する脳内皮細胞レセプターに特異的な抗体を前記外部表面に結合する工程を含む。
【００６６】
前述の分子は、好ましくは、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、トランスフェリン、インスリン、メラトニン、セロトニン、またはインスリン様成長因子ＩおよびＩＩから選択される。この結合を行う技術およびメカニズムに関しては、ＷＯ０３０３９６７７およびＷＯ９１０４０１４の内容を完全に引用し、これらを本明細書中に出典明示により組み込む。例えば、この結合は、スぺーサー分子により、または直接共有結合によりなすことができる。
【００６７】
経口摂取されたセロトニンは、これは、血液−脳関門を横切らないので、脳神経系のセロトニン作用経路内部に通過しない。しかしながら、セロトニンを合成するトリプトファンおよびその代謝産物５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）は、前記血液−脳関門を通過することができ、通過する。
メラトニンは、それ自体で、細胞膜、および特に前記血液−脳関門を容易に通過することができる。
【００６８】
第二の側面によれば、本発明は、前述の方法により得ることができるナノ粒子、およびこのようなナノ粒子と医薬上許容されるキャリアおよび／または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
実施態様において前記ナノ粒子を使用するために、それらは、蒸留水または通常の生理食塩水を用いて生理学的ｐＨおよび浸透圧で、懸濁液に再構成してよい。
【００６９】
典型的には、前記ナノ粒子は、懸濁液ｍｌ当たり０．１ｍｇナノ粒子から懸濁液ｍｌ当たり１００ｍｇナノ粒子の範囲の濃度で、注入可能な懸濁液中に存在する。ｍｌ当たり１０ｍｇのナノ粒子が好ましい。使用するナノ粒子の量は、個々のナノ粒子に含まれる医薬の量に強く依存し、当業者または監督する医師は、前記ナノ粒子の投与量を特定の状況に容易に適合させることができる。
【００７０】
好ましくは、前記送達ビヒクルまたは医薬組成物は、前記１つ以上の医薬のインビボでの長期放出または持続放出を示す。本発明の原則に従い作製されるこれらのナノ粒子は、数時間から６か月以上の範囲の時間で生物分解する。
【００７１】
別法として、前記医薬組成物は、他の生理学的バリアに対して、および他の生物学的バリアを横切って前記送達ビヒクルを輸送するために、例えば、前記血液−空気関門に対しておよびそれを横切るために必要とされる他の形態をとってもよい。それゆえ、それは、例えば、前記組成物を吸入により問題のバリアへ送達するために、エアロゾルなどの形態を有していてよい。
【００７２】
本発明は、さらに、医薬が１つ以上の生理学的バリアを横切ることを要する疾患および状態の治療のための医薬を製造するための、本明細書中に規定する送達ビヒクルまたは医薬組成物の使用を提供する。それは、特に、前述のとおり列挙した薬剤に対応する疾患の治療のために使用される。
【００７３】
特に、前記送達ビヒクルについては、ＣＮＳに関連する疾患の治療における適用が見出される。さらに、進行したＡＩＤＳを有する多くの人−おそらく、成人の３分の１および全子供の半分−において、ＨＩＶは脳に侵入し、そしてこれを損傷し、ＨＩＶ関連痴呆を誘発するので、これは、ＡＩＤＳの治療を含む。この疾患は、乏しい集中力、低下した記憶ならびに緩慢な思考および動作により特徴付けられる。しかしながら、前記ウイルスを脳において標的することは特に困難である。ここで、本発明は、抗ＨＩＶ剤を脳に送達することにより、新規な治療上の成功を開け得る。
【００７４】
本明細書中に記載される全刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、出典明示によりその全容をここに組み込む。相反する場合は、定義を含め、本明細書が支配する。加えて、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【００７５】
材料
ｎ−ブチルシアノアクリレート（ＢＣＡ、Indermil（登録商標）、Henkel  Loctide）を標準的な方法で使用した。塩酸（０．１モル・ｌ−１）、水酸化ナトリウム溶液（０．１モル・ｌ−１）、トリス塩基（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、アンモニア溶液（２５％）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および全アミノ酸（６−アミノヘキサン酸、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ））は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入したフェニルアラニン（Ｐｈe）を除いてＭｅｒｃｋから購入した。トゥイーン２０は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ルテンソールＡＴ５０、すなわち約５０ユニットのＥＯブロック長を有するポリ（エチレンオキシド）ヘキサデシルエーテルは、ＢＡＳＦ  ＡＧからの好意により授与された。全試薬は、標準的な方法で使用した。
【００７６】
ナノ粒子の合成
ｎ−ブチルシアノアクリレートミニエマルジョンの調製およびこれに続く重合の開始のための標準的な方法
１２．０ｇの塩酸（０．１モル・ｌ−１）中０．３ｇのＳＤＳの溶液を、３．０ｇのＢＣＡ中０．１２５ｇのヘキサデカンの溶液に、超音波処理の直前に添加した。この二相性混合物をＢｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｗ４５０（９０％振幅０．５インチチップ）で２．５分間氷冷下に超音波処理した。超音波処理後、乳白色のエマルジョンが得られた。この標準的方法において、使用する量は変え、使用する前記試薬の比率は維持する。重合は、前記ミニエマルジョンを水酸化ナトリウム溶液（０．１モル・ｌ−１）に攪拌下に注ぐことにより開始した。
【００７７】
界面活性剤のバリエーション
界面活性剤のタイプの影響を決定するために、前記ミニエマルジョンを、異なる界面活性剤を用いる以外は前述の方法で調製した。ＳＤＳに加えて、ルテンソールＡＴ５０およびトゥイーン２０を用いた（表１を参照されたい）。重合は、前記ミニエマルジョンを１２．０ｇの水酸化ナトリウム溶液（０．１モル・ｌ−１）に攪拌下に注ぐことにより開始した。
【００７８】
超音波処理時間および界面活性剤の量のバリエーション
ミニエマルジョンを、界面活性剤としてＳＤＳを用いて前述のように調製した。９０、１２０、１５０および１８０秒の超音波処理時間後、５００μｌの前記ミニエマルジョンを回収し、次いで、３７５μｌの水酸化ナトリウム溶液（０．１モル・ｌ−１）に注入した。
【００７９】
モル質量の時間依存性
ミニエマルジョンを、前述の方法で調製した（ＢＣＡ９．０ｇ、ＨＤ０．３７５ｇ、ＨＣｌ３６．０ｇ；ＳＤＳ０．９ｇ）。５００μｌのサンプルをピペットで回収し、前記ミニエマルジョンを３６．０ｇの水酸化ナトリウム溶液（０．１モル・ｌ−１）に攪拌下に注ぐ直前に、液体窒素に浸した容器に注入した。初めの１２０秒の間、１０秒毎に、５００μｌのサンプルを採取し、前述と同じ方法で処理した。この操作を、サンプル回収の間隔を長くして、２週間かけて行った。凍結サンプルは凍結乾燥した。生じたポリマー粉末のモル質量を、ＧＰＣにより決定した。
【００８０】
イニシエーターのタイプおよびイニシエーターの量のバリエーション
重合を開始するために、５００μｌの新鮮に調製したミニエマルジョンを、種々の量の水酸化ナトリウム溶液（０．１モル・ｌ−１、表２を参照されたい）、トリス塩基溶液（０．１モル・ｌ−１）、アンモニア溶液（０．１モル・ｌ−１）（ともに表３）および種々のアミノ酸の溶液（表４を参照されたい）にワンショットで注入した。
【００８１】
透析
前記分散液を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター（３０，０００メンブレン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて透析した。
【００８２】
キャラクタライゼーション
粒子サイズおよびζ−ポテンシャルを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳで測定した。光子相関法（ＰＣＳ）測定のために、３５μｌの前記分散液をピペットで、１回使用のポリスチレンキュベットに取り、次いで１．５ｍｌの脱塩水で希釈した。
【００８３】
ζ−ポテンシャル測定のために、５０μｌの前記分散液を５ｍｌの総体積および所望のｐＨまで希釈した。ｐＨは、０．１モル・ｌ−１のＮａＯＨおよびＨＣｌ溶液で調整した。
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、前記ナノ粒子のポリ（ｎ−ブチルシアノアクリレート）の重量平均分子量を決定した。重合が完了した後、サンプルを−２２℃で凍結し、次いで凍結乾燥した。生じた粉末を１ｍｌのＴＨＦ中に溶解し、この溶液を０．４５μｍの洗浄フィルターにより濾過した。装置は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｔｙｒａｇｅｌ  ５μｍ粒子、１００ｎｍ孔サイズ、ＰＳＳ  ＳＤＶ  ５μｍ粒子、１μｍ孔サイズ、ＰＳＳ  ＳＤＶ  １０μｍ孔サイズカラムおよびＴｈｅｒｍａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＳ１００オートサンプラーを備えたＴｈｅｒｍａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐ２０００ポンプから構成した。溶出剤は、１ｍｌ・分−１の流速を有するＴＨＦｐ．ａ．であった。シグナルを、Ｗａｔｅｒｓ２４１０  ＲＩ−ディテクターおよびＫｎａｕｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−ディテクターを用いて検出した。モル質量を、ＰＳスタンダードに対して算出した。
【００８４】
ＴＥＭ画像を、８０ｋＶの高速電流でＰｈｉｌｉｐｐｓ  ＴＥＭ  ４００を用いて取得した。５μｌの前記分散液を５ｍｌの脱塩水で希釈し、４μｌの液滴を炭素被覆銅格子（２００メッシュ）上に載せ、次いで空気乾燥した。さらなる染色は行わなかった。
【００８５】
これまで、ＰＢＣＡナノ粒子は、ほとんど、典型的なエマルジョン法により調製された。強酸は、ＡＣＡの重合を効率的に阻害することが公知であるので{Pepper,  1978  #26}、{Pepper,  1983  #29}、{Costa,  1983  #30}、発明者らは、ここに、連続相としての０．１モル・ｌ−１塩酸中でのミニエマルジョン化により、疎水性ＢＣＡの安定なモノマー滴を調製した。次いで、前記液滴の作製後、前記ミニエマルジョンをＮａＯＨ溶液に注ぐことにより、アニオン重合を開始した。前記ミニエマルジョンの調製中の前記モノマーのエバポレーションおよび重合中の前記分散液の加熱は、パルス超音波の使用および前記系の冷却により、最小限に抑えることができる。
【００８６】
アニオン性界面活性剤ＳＤＳを、ＢＣＡミニエマルジョンおよび続いて形成されるＰＢＣＡ分散液の安定化のために、まず選択した。結果を表１にまとめる。ＳＤＳの使用により、ＢＣＡに対して１％の界面活性剤を用いて、１０％の固形分量でＰＢＣＡ分散液が形成され得、直径約３００ｎｍの安定な粒子が得られる。ＳＤＳ濃度を増すと、前記粒子サイズは低下し（図１を参照されたい）、かつ前記サイズ分布（ＰＤＩ指標）は狭くなる。
【００８７】
【表１】
2009541462.tif 000003
【００８８】
図１：界面活性剤濃度に伴う、１５０秒の超音波処理時間における粒子サイズ（白丸）およびＭｗの変化（点線は、目視評価のための規準である）。
ミニエマルジョンにおける液滴の平衡サイズは、分散される相の量に対する界面活性剤の量により決定される。この平衡は、超音波のような強い剪断力の適用により達成する。特徴的な超音波処理時間後は、液滴サイズはそれ以上は低下させることができない。なお、より長い超音波処理時間を適用すると、サイズ分布はわずかに狭くなる。図１は、他の超音波処理時間に関する典型例としての１５０秒の超音波処理時間に関する粒子サイズの変化を示す。
【００８９】
ＮａＯＨ溶液と混合後２日目に測定した（１％のＳＤＳを用いた）前記ポリマーの重量平均分子量Ｍｗは、約１５，０００ｇ・モル−１の単相分布を示す。界面活性剤の量の増加とともに、Ｍｗの値は低下する。これは、２日後、より小さな粒子が、より大きな粒子よりも短い鎖を有するポリマーから構成されることを示す。前記分散液を、調製後２日目に凍結したことに注意しなければならない。さらなる実験は、前記ポリマーのモル質量が、平衡分布が達成されるまでは、当該期間中、変化することを示す。１週間後に凍結したサンプルは、もはや単相質量分布は示さないが、長鎖ポリマーの出現を示す（図２および以下の記載を参照されたい）。
【００９０】
ＳＤＳを用いて調製した全ポリマー分散液は、長期の安定性を示した。調製後２ヵ月後ですら、相分離を観察することができなかった。カチオン性界面活性剤、すなわち、第四級アミンの適用により、前記モノマーおよび前記水相を混合した際、即時の重合が生じる。残存している第一級および第二級アミンがこの原因である可能性がある。
【００９１】
所望される１０％の高い固形分量で不安定な分散液（それぞれ、サンプルＬ−１０（超音波処理時間＝１２０秒、ｄ＝９０８ｎｍ）およびＴ−１０（超音波処理時間＝１２０秒、ｄ＝７６９ｎｍ））を生じる非イオン性界面活性剤ルテンソールＡＴ５０およびトゥイーン２０を選択した。１０％を超えるさらに多量のこれら界面活性剤は、ラテックス分散液を効率的に安定化させることができなかった。調製の１時間後にすでに、全分散液は相分離を示した。
これらのデータに基づき、１０％の濃度のＳＤＳおよび１５０秒の超音波処理時間を、後に続く実験のために選択した。
図２：ＢＣＡミニエマルジョンから得られたＧＰＣエルグラムと、ＰＢＣＡ分散液から得られた溶出時間の４週間の間における変化
【００９２】
図３は、３つの選択された分散液からのＴＥＭ顕微鏡写真を示す。Ｓ−１０は、１０ｗｔ％のＳＤＳを用いて（１５０秒の超音波処理時間、表１でマークしたサンプルを参照されたい）、Ｌ−１０は１０ｗｔ％のルテンソールＡＴ５０を用いて、およびＴ−１０は、１０ｗｔ％のトゥイーン２０を用いて調製した。後の２つのサンプルは、沈澱が生じた分散液を、その沈澱を再分散させるために振とうした後にのみ、調製することができた。ＳＤＳを用いて調製した粒子のより小さなサイズおよびより大きな均一性が、明らかに認められる。
【００９３】
図３：ＳＤＳ（サンプルＳ−１０）、ルテンソールＡＴ５０（サンプルＬ−１０）およびトゥイーン２０（サンプルＴ−１０）（写真の左から右）を用いて調製した分散液のＴＥＭ画像；ルテンソールＡＴ５０およびトゥイーン２０を用いて調製した分散液の画像は、粒子を再分散させた後にのみ得ることができた。
【００９４】
１．２  粒子サイズおよび分子量におけるイニシエーターＮａＯＨの量の影響
種々のＢＣＡエマルジョン重合実験から、分散媒質のｐＨが、粒子サイズおよび分子量に影響を与えることが公知である{Behan,  2001  #8}、{Lescure,  1992  #14}。
ミニエマルジョンにおいて得られるＰＢＣＡ粒子の特性におけるｐＨの影響を調べる。重合媒質のｐＨを、異なる濃度のＮａＯＨ溶液を添加することにより調整し、重合を開始した（表２を参照されたい）。ＮａＯＨ溶液と前記ミニエマルジョンのＨＣｌの間の中和反応が、重合の開始および成長の工程よりも速いと考えた。ミニエマルジョンの場合、重合ｐＨは、ｐＨ＝７まで増すことができた。従来のエマルジョン法では、より高いｐＨ値では、重合が速すぎて、凝塊が形成されるので、重合のｐＨは、４〜５より高いｐＨ値では行うことができなかった{Behan,  2001  #8}。
【００９５】
【表２】
2009541462.tif 000004
【００９６】
ミニエマルジョンにて得られた分散液のｐＨに関して、特に、高い算出ｐＨ値を考慮すれば、前記値が、時間とともにコンスタントに低下し、１日後に、期待される値以下の安定な値に達することを特記することができる（図４）。これは、前記反応中に予想外に多量のＯＨ−が消費されることを意味し（約１０−２モル・ｌ−１）、これは、Ｃｌ−もイニシエーターとして作用することを完全に除外することはできないが、ＯＨ−が開始分子であるという仮定を裏付ける。全ｐＨに関する粒子サイズは、別に論じる、明らかな依存性を観察することができない０から２００μｌの小体積のイニシエーターを考慮せずに（なぜなら、ここでは、重合は緩慢すぎるので）、１５０ｎｍから２２０ｎｍの狭い範囲に見出すことができる。前記値は７日間有意に変化しないので、すべての分散液が、凝結方向に安定であると考えることができる。
【００９７】
ＮａＯＨ溶液を添加しない（０μｌ）ミニエマルジョンに関する前記値は、極度に緩慢な重合を伴う「かき乱されていない（unperturbed）」ミニエマルジョンにおける粒子サイズの変化を示す。調製の直後、第１のＧＰＣ測定を行った場合、前記ミニエマルジョンのｐＨは、ｐＨ１．０の不変値を有するので、前記ミニエマルジョンは、未だエマルジョンであって、ポリマー分散液はないと考えることが妥当である。ＧＰＣ測定のために前記ミニエマルジョンを希釈すると、重合が開始し、そのため、実際の液滴のサイズは正確には示されない可能性がある。所定のｐＨ（１．０）でのミニエマルジョン系でのｎ−ＢＣＡの重合速度は未知であるので、前記液滴の「凝結」の時間を決定することは不可能である。第１日目中の前記液滴の明らかな成長および、第１日目と第２日目の間の一定のサイズでもって、サイズの安定なポリマー粒子の形成が、この時間の後に完了したと見なすことができる。ヘテロ相開始反応により、ＯＨ−の前記モノマーへの結合により、前記オリゴマーの親水性が増し、この結果、前記オリゴマーを連続相中で拡散させることが可能となり、次いで、前記液滴の成長を説明する前記液滴のオストワルド熟成が引き起こされ得る。７日後、前記分散液中に沈澱が認められる。これにより、巨大粒子は前記測定にもはや含まれないので、検出される粒子サイズはより小さくなる（そして、分布はより狭くなる）。さほど顕著ではないが、同じ効果を、１００および２００μｌのＮａＯＨ溶液に関する値に関して認めることができる。
【００９８】
より高い初期ｐＨで調製した粒子は、明らかに、粒子サイズのこの低下を示さないので、液滴から粒子への変化が数分後に完了したと考えることができる。
まとめると、ｐＨ＞２に関し、粒子サイズは、開始および重合中の連続相のｐＨにより、さほど影響を受けないようである。このｐＨ以下では、液滴から粒子への変化のための時間は、液滴の成長（オストワルド熟成）の時間よりも遅い。
図４：算出値と比較したｐＨの変化。各ＮａＯＨ溶液の体積を選択して、最終分散液に関して算出ｐＨ値を得た。反応中のＯＨ−の消費は、算出においては無視した（点線は、目視評価のための規準である）。
【００９９】
異なるＮａＯＨ量の添加で得られたサンプルのＧＰＣの記録を、図５に示す。０、１００および２００μｌのイニシエーター溶液から生じる前記ポリマーのモル質量は、狭い質量分布（４,０００ｇ・モル−１で最大）と非常に少量の高分子ポリマーを示す。３００から４００μｌの体積のイニシエーター（算定ｐＨ２．０および１１．５）を用いて得られたポリマーは、約４,０００ｇモル−１に一つの最大と６００,０００ｇ・モル−１（ＰＳスタンダードに対して与えられる）に一つの二相質量分布を示す。両極間の質量を有するポリマーフラクションは、少量でしか存在しない。対応する分散液は、算出される値よりもわずかに低いｐＨ＜３を有する。残りのサンプルは、算定値（ｐＨダイアグラム中、「プラトー」に対応する算定値１１．９から１２．６）よりも有意に低いより大きなｐＨ値を有する分散液に相当する。これらの条件下で形成されたポリマーは、約１０,０００ｇ・モル−１に最大を有する単相質量分布を示す。
【０１００】
これらの結果は、デキストランを立体安定剤として使用する従来のエマルジョン重合により粒子を調製したBehanら{Behan,  2001  #8}のものと同様である。初期に酸性媒質（ｐＨ２〜３）中で重合を行う限り、相対的に低分子量のポリマーが得られるが、初期に、前記重合媒質がより高いｐＨ（ｐＨ５）を有すると、長鎖が追加的に現れる。Behan  ら  {Behan,  2001  #8}、{Behan,  2000  #31}により得られた値は、この記録で示される値よりも低いが、およその傾向は同じである。
図５：イニシエーター（ＮａＯＨ溶液）体積（各部分の右側に記載した数）を用いて得られたポリマーのモル質量変化、７日後に凍結した粒子
【０１０１】
分散液の凍結を、調製後７日目に行ったことを強調しなければならない。あるｐＨ（初期７）に関して、初期の質量分布は、調製後の期間中に変化することを示すことができたので（図２を参照されたい）、これは非常に重要である。それゆえ、多量の分散液を調製した。前記粒子サイズは１２５ｎｍであった。
【０１０２】
凍結乾燥したミニエマルジョンは、ＧＰＣエルグラムにおいて、約１,４００ｇ・モル−１（ＰＳスタンダードに対して算出する）の質量に対応する約３３．３ｍｌのピークを示す。これは、ＮａＯＨ溶液は添加されていないので、ミニエマルジョン（Cｌ−により開始され得る）または凍結したミニエマルジョンのいずれかで、重合が開始したことを示す。前記ミニエマルジョンをＮａＯＨ溶液に添加した直後、約１０,０００ｇ・モル−１の最大Ｍｗを有するポリマー（約２９ｍｌの溶出体積）が形成される。４８時間の間、モル質量分布の変化は認められない。この時間の後、高分子量および低分子量のポリマーが形成され始める。形成されたオリゴマーは、脱重合プロセスが進行している兆候である。これらのオリゴマーは消滅するが、長鎖ポリマーの量は、最終分散液が約１週間後に達するまで増加する。低分子量フラクションの最大は、７,５００ｇ・モル−１の値までシフトする（約３０ｍｌの溶出体積）。
【０１０３】
これらの観察は、図６に示すように、Ryan{Ryan,  1996  #37}により提唱されるｐＨ依存性の脱／再重合／再開始メカニズムに従い、かつ、これを用いて説明することができる。
図６：脱／再重合について提唱するメカニズム{Ryan,  1996  #32}
【０１０４】
アミンイニシエーター
ＡＣＡのアニオン重合は、求核剤により開始する。アセテートイオンのような「弱い」求核剤ですら、ＡＣＡの重合を開始する能力を有する{Pepper,  1992  #33}、{Johnston,  1981  #34；  Johnston,  1981  #35；  Johnston,  1981  #36}。簡単に前述したように、成長しているポリマーは、イニシエーター分子により官能基化される。ナノ粒子がそのような官能基化されたポリマーから形成され、かつ、その官能基が（その親水性のために）粒子の表面にあることを保証できれば、このアプローチは、官能基化された表面を有するＰＡＣＡ（ナノ）粒子を調製する好都合な方法を提示する。
【０１０５】
ナノ粒子の表面調整により、生物医学適用に対するその可能性が高まる。前記表面における官能基の存在は、タンパク質またはヌクレオチドのような生物活性リガンドでのさらなる化学修飾のために必要とされる。さらなる化学反応のための可能性に加えて、アミノ基またはカルボキシル基のような荷電基の導入は、粒子の表面電荷に影響する。これは、結果として、分散液中での粒子の安定性{Chern,  2001  #37}および細胞における摂取動態{Lorenz,  2006  #38}、{Holzapfel,  2005  #39}に影響を及ぼし得る。
【０１０６】
極性、親水性アミンの適用により、生じるオリゴマーおよびポリマーは、開始アミンから生じる親水性の頭部と疎水性末端−（成長）ポリマーを有する界面活性剤様の両親媒性構造を有する。この構造のために、前記ポリマーの親水性官能基化末端は、ほぼ確実に、モノマーと水の間の界面の水性側に見出され得る。
【０１０７】
二官能基アミンにより、前記粒子の表面へ官能基をさらに導入することが可能となる。生物医学的適用およびタンパク質の粒子へのポテンシャル結合の範囲で、アミノ酸は、前記分子の開始部である「強い」求核剤部分（−ＮＨ２）と、少なくともプロトン化された形態ではほぼ確実に重合を開始せず、それゆえその後の化学反応に有用な「弱い」求核部分（−ＣＯＯＨ）を含むので、イニシエーターとして適当な候補である{Kulkarni,  1971  #27;  Leonard,  1966  #28}。
前述のように、イニシエーターＯＨ−の量は、前記ポリマーのモル重量に関しては重要であるが、粒子サイズは、全ての適用したｐＨ値にわたって、近接した範囲にある。これらパラメータにおける種々の量のアミンイニシエーターの影響をこの箇所で論じる。
【０１０８】
アンモニアおよびトリス塩基
モデルアミンとして、アンモニアとトリス塩基（トリス（ヒドロキシエチル）アミノエタン）を選択した。各０．１モル・ｌ−１の濃度を有する溶液を、そのｐＨ値（ｐＨ＞９）を調整せずに、調製した。これは、溶液中のアミンに加えて、ＯＨ−も存在することを示す。すなわち、アミンとヒドロキシルイオンの間で、重合の開始に関して競争がある。粒子サイズおよびＰＤＩを表３にまとめる。ＯＨ−を用いた実験におけるものと同体積のイニシエーター溶液を選択した。アンモニア（６００μＬ−１０００μｌ）を用いて調製したサンプルのいくつかは、調製後、わずかに黄色の着色を示す。これは、Leonard{Leonard,  1966  #44}により観察されており、ブチルエステル基の加水分解後の反応産物と解釈されている。
【０１０９】
イニシエーターの濃度により事実上影響を受けない、ＮａＯＨ溶液を用いて調製した粒子のサイズと対照的に、アミンイニシエーターの濃度における明らかな依存性が認められる。両アミン溶液を用いて得られたポリマー粒子のサイズは、同じパターンに従い、アンモニアを用いて調製した粒子は、トリス塩基溶液を用いて調製した粒子よりも小さい。各々の１００μｌサンプルは、残りのサンプルよりも有意に大きな粒子サイズを示す。急な低下の後、前記値は、約４００μｌイニシエーター溶液で最小に達し、そして再び増加する。
【０１１０】
１００μｌおよびトリス塩基に関してはさらに２００μｌのイニシエーター体積を用いて得られた同程度に大きな粒子は、ＯＨ−に関する、前記粒子のより長い凝結時間を用いて説明することができる。
アミンを用いて調製した粒子の直径は、ＮａＯＨ溶液を用いて調製した粒子の直径よりも有意に小さい。約２００ｎｍの値の代わりに、前記粒子は６０から１００ｎｍ、特に、１００から１４０ｎｍの範囲である。これは、前記ポリマーの界面活性剤様構造によるさらなる安定化の結果であろう。
【０１１１】
【表３】
2009541462.tif 000005
【０１１２】
アンモニアで重合開始したポリマーに関するモル質量分布（図７を参照されたい）は、ＯＨ−で重合開始したポリマーから得られる値とは異なる。主な違いは、全サンプルにおける高モル質量ポリマーの出現である。前記量は、１００μｌから３０６．８μｌのイニシエーター溶液まで増加する。分布は広く、そして、サンプルを通じて小さな変化しか示さない。低分子量フラクション（３２ｍｌの溶出体積で最大、Ｍｗ〜３，５００ｇ・モル-1）は、溶出体積の２９ｍｌへの最大のシフトを伴って（Ｍｗ〜１０，０００ｇ・モル-1）、１００μｌから３８２．４μｌまでコンスタントに低下している。より多くのイニシエーター溶液の適用を用いて、低分子量フラクションの量は再び増加し、約３１ｍｌでその最大を示す（Ｍｗ〜５，０００ｇ・モル-1）。
【０１１３】
トリス塩基溶液を用いて開始した前記ポリマーのモル質量分布（図８を参照されたい）は、ＯＨ−で開始したポリマーサンプルならびにアンモニアで開始したサンプルのパターンと似通っている。多量の長鎖ポリマーは、中程度の量のイニシエーターでのみ認めることができ、他のセットで得られるものよりも低い値での広い分布を示す。低モル質量フラクションの最大は、約３１ｍｌで認めることができる（Ｍｗ〜５，０００ｇ・モル-1）。このフラクションの相対量は、１００μｌから４４３．３μｌまでコンスタントに低下し、次いで再び増加して、１０００μｌのイニシエーター溶液で最大に達する。
図７：イニシエーター（アンモニア溶液）体積（各部分の右側に記載した数）を用いた場合の溶出体積の変化。調製後２日目に凍結したサンプル。
図８：イニシエーター（トリス塩基溶液）体積（各部分の右側に記載した数）を用いた場合の溶出体積の変化。調製後２日目に凍結したサンプル。
【０１１４】
アミノ酸
前記ポリマーのアミノ酸での官能基化のために、前記アミノ酸は、単独の、または少なくとも主要な開始分子であることが確認されなければならない。すなわち、ヒドロキシイオンによる重合の開始を最小限に抑えるために、前記アミノ酸溶液のｐＨは、低くなければならない。これは、他方で、前記アミノ基を、ｐＫＢにより決定されるある程度までプロトン化し、「活性」イニシエーター、すなわち、脱プロトン化されたアミノ基を有するアミノ酸分子の量を低下させる。
【０１１５】
安定な分散液を、酸性溶液中でフェニルアラニンを、酸性および塩基性溶液中でグリシンおよび６−アミノヘキサン酸を用いて作製することができた。７より低いｐＨ値を有するリジン、システイン、アルギニン、グルタミン酸およびアスパラギン酸溶液は常に、前記ミニエマルジョンの凝結および沈澱を生じる。塩基性溶液中では、凝結物は形成されなかったが、透明な黄色または橙色の着色溶液の形成を観察することができた。溶解および着色は、ブチルエステル基の加水分解および水溶性ポリシアノアクリル酸の形成の明らかな兆候である。着色は、Leonard  {Leonard,  1966  #28}によれば、ＰＡＣＡの変性の兆項でもある。
【０１１６】
【表５】
2009541462.tif 000006
【０１１７】
表５から入手でき、かつ図９に視覚化したデータは、粒子サイズが、３５０ｎｍより大きな値から７０ｎｍもの低さの値までの範囲をカバーすることを示す。ほとんどすべての分散液が、０．１以下というＰＤＩにより表される、極めて狭い分布を示す。
【０１１８】
ＮａＯＨ溶液をイニシエーターとして用いた実験と対照的に、そして、アンモニアおよびトリス塩基を用いて調製した粒子の結果に従い、「活性」イニシエーターの量への粒子サイズの明らかな依存性を認めることができた。イニシエーター溶液のより高い濃度、より高いｐＨおよびより多くの量は、ほとんどすべてのシリーズにおいて、より小さな粒子を生じる。
【０１１９】
６−アミノヘキサン酸溶液を用いて調製した粒子のサイズに関し、イニシエーターのｐＨへの、およびある程度までイニシエーターの量への依存性が認められる（図９の左を参照されたい）。粒子サイズは、イニシエーター溶液のｐＨの増加に伴い増加し、ｐＨ４．４から５．４の間で大きな影響を有し、ｐＨ５．４から１０．０の間でより小さな影響を有した。塩基性（ｐＨ１０）６−アミノヘキサン酸溶液を用いて調製した粒子のサイズは、トリス塩基およびアンモニア溶液を用いて調製した粒子に関する値と同様の変化を示す。１００μｌから２００μｌのイニシエーター溶液の粒子サイズの低下後、曲線は、わずかな増加を示し、１０００μｌのイニシエーター溶液に関して最も高い値を有する。他の６−アミノヘキサン酸溶液を用いて調製した粒子も、イニシエーター溶液の初期体積からそれに続く体積までサイズの低下を示す。その後の値は、ほとんど一定を維持する。
【０１２０】
グリシン溶液を用いて調製した粒子に関する値は、ほとんどの場合において、前述のパターンに従う（図９右を参照されたい）。２モル・ｌ−１のグリシン溶液を用いて調製した粒子が、最も小さいようであり、０．１モル・ｌ−１溶液を用いて調製した粒子が、最も大きなサイズ値を示す。１つの濃度範囲内で、前記粒子サイズは、適用した最低のｐＨから最高のｐＨまで、０．５モル・ｌ−１溶液を除いて低下する。同じ傾向を、１００μｌから１０００μｌのイニシエーター溶液で観察することができた。曲線の傾きは、グリシン溶液のｐＨおよび濃度の増加とともに、なだらかになる。
図９：０．５モル・ｌ−１の６−アミノヘキサン酸で重合開始した（左）およびグリシン溶液で重合開始した（右）粒子サイズの変化（点線は、目視評価のための規準である）。右図の凡例中の数は、前記溶液のモル濃度（ダッシュ前）およびｐＨ（ダッシュ後）を示す。
【０１２１】
前記アミノ酸と前記モノマーの反応から生じるオリゴマーは、前記アミノ酸の高い親水性のために、水溶性であると予想される。それゆえ、重合は、一滴に限られず、液滴は、凝結が開始しないか、または、ＰＢＣＡ鎖の疎水性が支配する限り、オストワルド熟成を受け、そして、前記分子はもはや水相には溶解できなくなる。少量の開始ポリマー鎖が存在する場合、より多くの成長鎖が存在する場合よりも凝結に時間がかかる。この時間中、粒子はそのサイズを増し得る。この効果にも関わらず、全サンプルで、狭い粒子サイズ分布を認めることができる。起こり得る、界面活性剤様オリゴマーから形成されるミセルの発生のために、粒子形成のプロセスがより複雑となっている可能性がある。
【０１２２】
重合時間が極端に長い場合、液滴は臨界サイズを超え得、これにより、凝結に至り、そして重合後、粒子の沈澱に至る。すなわち、１００μｌの６−アミノヘキサン酸溶液をｐＨ４．４で、およびグリシン溶液を、０．５および２．０モル・ｌ−１の濃度でｐＨ２．４で使用して、安定な分散液を得ることはできなかった。
【０１２３】
粒子サイズにおけるこの変化にも関わらず、すべてのポリマーサンプルは、狭くかつ単相の、ほぼ同じモル質量（ＰＳに対して修正した約４,０００ｇ・モル−１で最大）および質量分布を示す。４，０００ｇ・モル−１のモル質量に関し、重合度は約Ｐ〜２６である。これは、モノマーとイニシエーターの比がほぼ１：２５であることを意味する（下記の１Ｈ−ＮＭＲを参照されたい）。均一なエルグラムについて、これは全サンプルに関して当てはまらなければならない。塩基性イニシエーター溶液（ＮａＯＨ、ＮＨ３およびトリス塩基）を用いて調製した粒子と対照的に、前記イニシエーター体積の変化において、サンプル間で質量分布に有意な変化を認めることができない。これは、少なくとも試験した範囲における、イニシエーターのｐＨ、濃度および体積の非依存性を含意する。調製のために使用した２つのアミノ酸の間には小さな偏差しかない。
図１０：６−アミノヘキサン酸で重合開始したサンプルのＧＰＣ溶出体積：ａ）ｐＨ４．４  ｂ）ｐＨ５．５  ｃ）ｐＨ１０
図１１：グリシンで重合開始したサンプルのＧＰＣ溶出体積：ａ）Ｇｌｙ  ０．１  ｐＨ３．４；ｂ）Ｇｌｙ  ０．５、ｐＨ３．４；ｃ）Ｇｌｙ  ２．０、ｐＨ３．４
【０１２４】
図１２に示すように、ζ−ポテンシャルのｐＨ依存性が、アミノ酸を用いて調製したサンプルに関して明らかに認められる。アミノ酸を用いて調製した粒子のζ−ポテンシャルは、酸性媒質（ｐＨ３）中で、塩基性媒質（ｐＨ１０）よりも〜１０ｍＶ高い。ＮａＯＨ溶液を用いて調製した粒子は、わずかなｐＨ依存性を伴うζ−ポテンシャルを示す。塩基性媒質中では、ブチルエステル基の加水分解が起こり得るため、これは驚くことではない。アミノ酸溶液を用いて調製した粒子と比較して、この効果は顕著ではない。
【０１２５】
ζ−ポテンシャルの〜５０ｍVの増加は、前記粒子に吸着されるＳＤＳの（透析による）分離による。よりいっそう透析を経ることで、分散液を脱安定化させる、ＳＤＳのさらなる除去が生じ、沈澱の形成に至る。この効果は、アミノ酸溶液で調製したサンプルでは観察することができない。反対に、透析後は、ζ−ポテンシャルのわずかな低下が生じる。分散液は透析中に希釈されるので、分散液のｐＨが増加し、生じるエステル基の加水分解により、前記粒子において、追加の負の電荷が形成され得る。
【０１２６】
粒子表面にカルボキシ基が存在する場合、ζ−ポテンシャルのｐＨ依存性が認められる。塩基性媒質中では、酸基は脱プロトン化され、前記粒子上に負の電荷を残し、酸性媒質中では、酸基はプロトン化されるので、この負の電荷はもはや存在しない。それゆえ、ζ−ポテンシャル測定は、希釈した分散液のｐＨを３および１０の値にそれぞれ調整した後で行った。なお、アミノ酸が粒子の表面に吸着されているだけの可能性がある。この可能性を排除するために、吸着された分子およびある程度までＳＤＳを除去するために、分散液を透析した。
図１２：ｐＨ３および１０での透析前および透析後のζ−ポテンシャル
【０１２７】
図１３および１４は、ＮａＯＨ溶液（０．１モル・ｌ−１）および６−アミノヘキサン酸溶液（ｐＨ４．４、０．５モル・ｌ−１）を用いて重合開始した分散液から得たポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。図１３に、前記スペクトルのピークを同定でき、前記ポリマーと、ヘキサデカンをアサインできる。図１４に示すスペクトルは、６−アミノヘキサン酸のプロトンから生じる可能性のある２つの追加のピークを示す。６−アミノヘキサン酸はＣＤＣｌ３における溶解性に乏しいので、ＮＭＲにより検出するために、前記酸は、前記ポリマーに共有結合されなければならない。ピークの積分の比はａ：３であり、アミノ酸対モノマーの比が約１：２２であることを示し、これは、ＧＰＣ値から得られた１：２５の比に非常に良く一致している。
図１３：ＮａＯＨ溶液（０．１モル・ｌ−１、算出ｐＨ７）で重合開始したポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
図１４：６−アミノヘキサン酸溶液（ｐＨ４．４、０．５モル・ｌ−１）で重合開始したポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【０１２８】
アミノ酸の前記ポリマーへの結合の直接的に確認するため、フェニルアラニンをイニシエーターとして適用した。ｐＢＣＡはＵＶ活性を示さないので、それは、ＵＶディテクターではなく、ＧＰＣ装置のＲＩ−ディテクターによってのみ検出することができる。ＵＶ活性イニシエーターフェニルアラニンの導入は、ポリマー鎖を標識し、その結果、それは、ＵＶディテクターにより観察することができる。両ディテクターのシグナルがフェニルアラニンで重合開始したポリマーに関してほぼ適合するので、ＵＶシグナルはフェニルアラニンから生じ、前記アミノ酸は前記ポリマーに共有結合しているはずと考えることができる。
【０１２９】
不幸にも、前記粒子を電子顕微鏡で直接観察することはできなかった。前記粒子は、乾燥中フィルムを形成する傾向があり、これによりＴＥＭサンプルを調製することができない。凍結乾燥中ですら、フィルム形成プロセスが生じる。ＮａＯＨ溶液を用いて調製した分散液を用いて可能なように微細粉末が得られる代わりに、オフホワイトのガム状の塊が、アミノ酸溶液を用いて調製した分散液の凍結乾燥の結果である。
低分子量、官能基化されたポリマーによる水の強い吸着または残りのモノマー{Behan,  2001  #8}が、この効果の理由である可能性がある。
【０１３０】
結論
ミニエマルジョンアプローチにより、官能基化された表面を有するｐＢＣＡナノ粒子を製造するための非常に強力で便利な手段が提供されることを示すことができた。アニオン性界面活性剤ＳＤＳの適用により、長期間安定な分散液を１０％以上の固形分量で調製することが可能となり、「真の」ｐＢＣＡ粒子を、前記表面上に共有結合デキストランまたは他の立体安定剤を用いずに得ることができる。２工程の方法は、重合のｐＨを広げ、それゆえ、同程度に高分子量のｐＢＣＡを得ることが可能となる。得られる粒子サイズは、ほとんどｐＨにより影響されず、１５０から２００ｎｍの間に見出すことができる。
【０１３１】
アミン溶液を用いる重合開始により、前記粒子の表面に官能基を導入する簡単な方法が提供される。アミノ酸溶液のイニシエーターとしての適用により、前記粒子を官能基化し、かつ、前記粒子サイズを８０から３５０ｎｍの範囲に調整することが可能となる。アミノ酸の存在は、ζ−ポテンシャル測定とＮＭＲにより確認した。予備実験は、蛍光色素、ビタミンならびに無機ナノ粒子のカプセル化を、この方法を用いて実施できることを示す。
【０１３２】
異なる濃度およびｐＨ値で重合を開始するための、Ｌ−ロイシンを用いる２工程のミニエマルジョン法
２つの別個の溶液を調製する。
溶液１：
４．８ｍｌの０．１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４をフラスコ（ＰＰ）に添加する。次いで、１２０ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をこの溶液に添加する。生じた溶液を、ＳＤＳが完全に溶解するまで攪拌する。
溶液２：
４９．７６ｍｇのヘキサデカンおよび１．０５ｍｌのｎ−ブチル−α−シアンアクリレート（ＢＣＡ、Indermil）をフラスコに添加する。前記フラスコを均一溶液が形成されるまで攪拌する。
【０１３３】
溶液２を溶液１に添加し、次いでミニエマルジョンを、生じた懸濁液の４分間の超音波処理（振幅７０％、０℃）によりすぐに形成する。重合を、Ｌ−ロイシンにより開始する。
次いで、１０の異なる体積（１００μＬ−１０００μｌ）、３つの異なるｐＨ値（４、５、６）および３つの異なるモル濃度のＬ−ロイシンの異なる溶液を調製する（０．１２５、０．０５、０．１モル／ｌ）（表を参照されたい）。前記調製したＢＣＡミニエマルジョンの５００μｌを、これら溶液の各々に添加する。生じた混合物を短時間攪拌し、次いで室温で３０分間置く。この後、生じたナノ粒子の粒子サイズ、多分散指数（ＰＤＩ）およびゼータポテンシャルを、表６および図１５〜２０に記載のごとく決定する。
【０１３４】
【表６】
2009541462.tif 000007
【０１３５】
ルトロールおよびＳＤＳにより安定化されるナノ粒子の重合を異なる濃度およびｐＨ値で開始するための、Ｌ−ロイシンを用いる２工程のミニエマルジョン法
２つの別個の溶液を調製する。
溶液１：
９．０ｍｌの０．１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４をフラスコ（ＰＰ）に添加する。次いで、０．０４５ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および０．１１２８ｇのルトロールＦ６８をこの溶液に添加する。生じた溶液をＳＤＳおよびルトロールが完全に溶解するまで攪拌する。
溶液２：
０．１３５３ｇのダイズ油および２．０５ｍｌ（２．２５５ｇ）のｎ−ブチル−α−シアンアクリレート（ＢＣＡ、Indermil）をフラスコに添加する。このフラスコを、均一溶液が形成されるまで攪拌する。
【０１３６】
溶液２を溶液１に添加し、次いでミニエマルジョンを、生じた懸濁液の４分間の超音波処理（振幅７０％、０℃）によりすぐに形成する。重合を、Ｌ−ロイシンにより開始する。
０．０５モル／ｌのＬ−ロイシン溶液９ｍｌを４および５のｐＨ値で用いて、標準的方法を開始した。図２１を参照されたい。次いで、１０の異なる体積（１００μＬ−１０００μｌ）、異なるｐＨ値（４、５、６）および異なるモル濃度のＬ−ロイシンの異なる溶液を調製する（０．１２５、０．０５、０．１モル／ｌ）（表７を参照されたい）。前記調製したＢＣＡミニエマルジョンの５００μｌをこれら溶液の各々に添加する。生じた混合物を短時間振とうし、次いで、室温で３０分間置く。この後、生じたナノ粒子の粒子サイズ、多分散指数（ＰＤＩ）およびゼータポテンシャルを、表７および図２２〜２７に記載されているように決定する。
【０１３７】
【表７】
2009541462.tif 000008
【０１３８】
参考文献
1.     Arias,  J.  L.;  Gallardo,  V.;  Gomez-Lopera,  S.  A.;  Plaza,  R.  C.;  Delgado,  A.  V.  Journal  of  Controlled  Release  2001,  77,  309-321.
2.     Reddy,  L.  H.;  Murthy,  R.  R.  Acta  Pharm.  2004,  51,  103-118.
3.     Kattan,  J.;  Droz,  J.-P.;  Couvreur,  P.;  Marino,  J.-P.;  Boutan-Laroze,  A.;  Rougier,  P.;  Brault,  P.;  Vranckx,  H.;  Grognet,  J.-M.;  Morge,  X.;  Sancho-Garnier,  H.  Investigational  New  Drugs  1992,  10,  191-199.
4.     Steiniger,  S.  C.  J.;  Kreuter,  J.;  Khalansky,  A.  S.;  Skidan,  I.  N.;  Bobruskin,  A.  I.;  Smirnova,  Z.  S.;  Severin,  S.  E.;  Uhl,  R.;  Kock,  M.;  Geiger,  K.  D.;  Gelperina,  S.  E.  Int.  J.  Cancer  2004,  109,  759-767.
5.     Gulyaev,  A.  E.;  Gelperina,  S.  E.;  Skidan,  I.  N.;  Antropov,  A.  S.;  Kivman,  G.  Y.;  Kreuter,  J.  Pharmaceutical  Research  1999,  1564-1569.
6.     Alyautdin,  R.;  Gothier,  D.;  Petrov,  V.;  Kharkevich,  D.;  Kreuter,  J.  European  Journal  of  Pharmaceutics  and  Biopharmaceutics  1995,  41,  (1),  44-48.
7.     Olivier,  J.-C.;  Fenart,  L.;  Chauvet,  R.;  Pariat,  C.;  Ceccelli,  R.;  Couet,  W.  Pharmaceutical  Research  1999,  16,  (12),  1836-1842.
8.     Behan,  N.;  Birkinshaw,  C.  Macromolecular  Rapid  Communications  2001,  22,  41-43.
9.     Sullivan,  C.  O.;  Birkinshaw,  C.  Biomaterials  2004,  25,  4375-4382.
10.    Couvreur,  P.  CRC  Critical  Revievs  in  Therapeutic  Drug  Carrier  Systems  1988,  5,  (1),  1-17.
11.   Couvreur,  P.;  Kante,  B.;  Roland,  M.;  Speiser,  P.  Journal  of  Pharmaceutical  Sciences  1979,  68,  (12),  1521-1524.
12.    Limouzin,  C.;  Caviggia,  A.;  Ganachaud,  F.;  Hemery,  P.  Macromolecules  2003,  36,  667-674.
13.    Behan,  N.;  Birkinshaw,  C.;  Clarke,  N.  Biomaterials  2001,  22,  1335-1344.
14.    Lescure,  F.;  Zimmer,  C.;  Roy,  D.;  Couvreur,  P.  Journal  of  Colloid  and  Interface  Science  1992,  154,  (1),  77-86.
15.    El-Egakey,  M.  A.;  Bentele,  V.;  Kreuter,  J.  International  Journal  of  Pharmaceutics  1983,  13,  349-352.
16.    Douglas,  S.  J.;  Illum,  L.;  Davis,  S.  S.;  Kreuter,  J.  Journal  of  Colloid  and  Interface  Science  1984,  101,  (1),  149-158.
17.    Douglas,  S.  J.;  Illum,  L.;  Davis,  S.  S.  Journal  of  Colloid  and  Interface  Science  1985,  103,  (1),  154-163.
18.    Vasnick,  L.;  Couvreur,  P.;  Christiaens-Leyh,  D.;  Roland,  M.  Pharmaceutical  Research  1985,  36-41.
19.    Seijo,  B.;  Fattal,  E.;  Roblot-Treupel,  L.;  Couvreur,  P.  International  Journal  of  Pharmaceutics  1990,  62,  1-7.
20.    Labib,  A.;  Lenaerts,  V.;  Chouinard,  F.;  Leroux,  J.-C.;  Oullet,  R.;  van  Lier,  J.  E.  Pharmaceutical  Research  1991,  8,  (8),  1027-1031.
21.    Chauvierre,  C.;  Vauthier,  C.;  Labarre,  D.;  H.,  H.  Colloid  Polym  Sci.  2004,  282,  1016-1025.
22.    Peracchia,  M.  T.;  Vauthier,  C.;  Passirani,  C.;  Couvreur,  P.;  Labarre,  D.  Life  Sciences  1997,  61,  (7),  749-761.
23.    Lathia,  J.  D.;  El-Sherif,  D.;  Dhoot,  N.  O.;  Wheatley,  M.  A.  Pharmaceutical  Engineering  2004,  24,  (1),  1-8.
24.    Nakajima,  N.;  Ikada,  Y.  Bioconjugate  Chem.  1995,  6,  123-130.
25.    Rasmussen,  S.  R.;  Larsen,  M.  R.;  Rasmussen,  S.  E.  Analytical  Biochemistry  1991,  198,  138-142.
26.    Pepper,  D.  C.  Journal  of  Polymer  Science:  Polymer  Symposium  1978,  62,  65-77.
27.    Kulkarni,  R.  K.;  Bartak,  D.  E.;  Leonard,  F.  Journal  of  Polymer  Science:  Part  A-1  1971,  9,  2977-2981.
28.    Leonard,  F.;  Kulkarni,  R.  K.;  Brandes,  G.;  Nelson,  J.;  Cameron,  J.  J.  Journal  of  Applied  Polymer  Science  1966,  10,  (259-272).
29.    Pepper,  D.  C.;  Ryan,  B.  Makromol.  Chem.  1983,  184,  383-394.
30.    Costa,  G.;  Cronin,  J.  P.;  Pepper,  D.  C.;  Loonan,  C.  Eur.  Polym.  J.  1983,  19,  (10/11),  939-945.
31.    Behan,  N.;  Birkinshaw,  C.  Macromolecular  Rapid  Communications  2000,  21,  884-886.
32.    Ryan,  B.;  McCann,  G.  Macromolecular  Rapid  Communications  1996,  17,  217-227.
33.    Pepper,  D.  C.  Makromol.  Chem.,  Macromol  Symp.  1992,  60,  267-277.
34.    Johnston,  D.  S.;  Pepper,  D.  C.  Makromol.  Chem.  1981,  182,  393-406.
35.    Johnston,  D.  S.;  Pepper,  D.  C.  Makromol.  Chem.  1981,  182,  421-435.
36.    Johnston,  D.  S.;  Pepper,  D.  C.  Makromol.  Chem.  1981,  182,  407-420.
37.    Chern,  C.-S.;  Sheu,  J.-C.  Polymer  2001,  42,  2349  -  1357.
38.    Lorenz,  M.  R.;  Holzapfel,  V.;  Musyanovych,  A.;  Nothelfer,  K.;  Walther,  P.;  Frank,  H.;  Landfester,  K.;  Schrezenmeier,  H.;  Mailaender,  V.  Biomaterials  2006,  27,  2820-2828.
39.    Holzapfel,  V.;  Musyanovych,  A.;  Landfester,  K.;  Lorenz,  M.  R.;  Mailaender,  V.  Macromol.  Chem.  Phys  2005,  206,  2440-2449.
【図１】
2009541462.tif 000009
【図２】
2009541462.tif 000010
【図３】
2009541462.tif 000011
【図４】
2009541462.tif 000012
【図５】
2009541462.tif 000013
【図６】
2009541462.tif 000014
【図７】
2009541462.tif 000015
【図８】
2009541462.tif 000016
【図９】
2009541462.tif 000017
【図１０】
2009541462.tif 000018
【図１１】
2009541462.tif 000019
【図１２】
2009541462.tif 000020
【図１３】
2009541462.tif 000021
【図１４】
2009541462.tif 000022
【図１５】
2009541462.tif 000023
【図１６】
2009541462.tif 000024
【図１７】
2009541462.tif 000025
【図１８】
2009541462.tif 000026
【図１９】
2009541462.tif 000027
【図２０】
2009541462.tif 000028
【図２１】
2009541462.tif 000029
【図２２】
2009541462.tif 000030
【図２３】
2009541462.tif 000031
【図２４】
2009541462.tif 000032
【図２５】
2009541462.tif 000033
【図２６】
2009541462.tif 000034
【図２７】
2009541462.tif 000035
【国際調査報告】
2009541462.tif 000036
2009541462.tif 000037
2009541462.tif 000038