(57)【要約】  本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩなどの、原癌型の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する腫瘍の治療方法を開示する。該方法は、癌患者をその腫瘍中のＥＧＦＲｖＩＩＩの発現について試験し、続いてＥＧＦＲの表面上の特異的エピトープを認識する抗体可変領域を含むタンパク質で治療を行うことを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする被験体体内の癌の治療、予防または安定化のための方法であって、以下のステップ：
（ａ）該癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているかを決定するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）においてＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌を有すると決定された該被験体に、ヒトＥＧＦＲのＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープを認識する抗体を投与するステップ
を含み、ここで該抗体は、該被験体での該癌の治療、予防または安定化に十分な期間および量で投与される、上記方法。
【請求項２】
前記癌が、膠芽腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌および前立腺癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体での癌のタイプと、集団での同じタイプの癌についてのＥＧＦＲｖＩＩＩの既知の発生確率パーセントとの比較により、該癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性パーセントを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記可能性パーセントが少なくとも５７％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体から生物学的サンプルを取得し、該生物学的サンプル中のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを検出することを含み、ここで該検出が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性ポリペプチドまたは抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗血清の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性ポリペプチドが、ＥＧＦＲｖＩＩＩの新規なペプチド連結を特異的に認識する抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体から生物学的サンプルを取得し、該生物学的サンプル中のＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸を検出することを含み、ここで該検出が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＲＮＡの新規なペプチド連結をコードする核酸配列またはその対応するｃＤＮＡにハイブリダイズする核酸の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体から生物学的サンプルを取得し、該生物学的サンプル中のＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸を検出することを含み、ここで該検出が、ＥＧＦＲ核酸にハイブリダイズする核酸およびＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸にハイブリダイズする核酸の使用を含み、該検出が、該ＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸と該ＥＧＦＲ核酸のサイズを区別することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記区別が、増幅に基づくアッセイ、サザンブロット、ノザンブロット、またはＲＮａｓｅ保護アッセイの使用を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅に基づくアッセイが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、または定量的リアルタイムＰＣＲである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号３および９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、ＥＭＤ７２０００、ｍＡｂ５２８、ｈ−Ｒ３、ｍＡＢ４２５、その抗原結合性フラグメント、そのヒト化またはキメラ化誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がＥＭＤ７２０００である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、インタクトなＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達を低下させるかまたは妨害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記インタクトなＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達が、活性型コンホメーションへの変換、受容体内在化、受容体二量体化、受容体自己リン酸化、および基質のリン酸化を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、ＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達を少なくとも２０％低下させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が、ステップ（ａ）でＥＧＦＲｖＩＩＩを発現すると決定される前癌性病変を有し、前記方法が、該被験体での癌を予防するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
処置を必要とする被験体体内の癌の治療、予防または安定化のための方法であって、以下のステップ：
（ａ）該癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているかを決定するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）においてＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌を有すると決定された該被験体に、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、かつＥＧＦＲｖＩＩＩによる受容体シグナル伝達を低下させるかまたは阻害する抗体を投与するステップ
を含み、ここで該抗体は、該被験体での該癌の治療、予防または安定化に十分な期間および量で投与される、上記方法。
【請求項２１】
前記癌が、膠芽腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌および前立腺癌からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体での前記癌と、同じタイプの癌についてのＥＧＦＲｖＩＩＩの既知の発生確率パーセントとの比較により、該癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性パーセントを決定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記可能性パーセントが、少なくとも５７％である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体から生物学的サンプルを取得し、該生物学的サンプル中のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを検出することを含み、ここで該検出は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性ポリペプチドまたは抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗血清の使用を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性ポリペプチドが、ＥＧＦＲｖＩＩＩの新規なペプチド連結を特異的に認識する抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体から生物学的サンプルを取得し、該生物学的サンプル中のＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸を検出することを含み、ここで該検出が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＲＮＡの新規なペプチド連結をコードする核酸配列またはその対応するｃＤＮＡにハイブリダイズする核酸の使用を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）の決定が、前記被験体から生物学的サンプルを取得し、該生物学的サンプル中のＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸を検出することを含み、ここで該検出が、ＥＧＦＲ核酸にハイブリダイズする核酸およびＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸にハイブリダイズする核酸の使用を含み、該検出が、該ＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸と該ＥＧＦＲ核酸のサイズを区別することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記区別が、増幅に基づくアッセイ、サザンブロット、ノザンブロット、またはＲＮａｓｅ保護アッセイの使用を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅に基づくアッセイが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、または定量的リアルタイムＰＣＲである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、ヒトＥＧＦＲのＡｓｎ４５２、Ｌｙｓ４５４、Ｐｈｅ４５７、Ｓｅｒ４６０、Ｇｌｙ４６１、Ｇｌｎ４６２もしくはＬｙｓ４６３、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸４０６〜４１３、またはヒトＥＧＦＲのアミノ酸３１４〜３３７、あるいはそれらのいずれかの組み合わせを含むエピトープに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、配列番号３および９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である可変領域アミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体がＥＭＤ７２０００である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記受容体シグナル伝達が、活性型コンホメーションへの変換、受容体内在化、受容体二量体化、受容体自己リン酸化、または基質のリン酸化を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記受容体シグナル伝達が、受容体内在化である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記受容体シグナル伝達が、受容体二量体化である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、ＥＧＦＲｖＩＩＩが活性型コンホメーションに適合するのを阻害する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、インタクトなＥＧＦＲによる受容体シグナル伝達を少なくとも２０％低下させ、かつＥＧＦＲｖＩＩＩによる受容体シグナル伝達を少なくとも２０％低下させる、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
一般に、本発明は、突然変異型の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する腫瘍の治療方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
癌は、依然として、主に未解決の問題である。多数のタイプの癌、特に固形腫瘍では、ＥＧＦＲが、しばしば突然変異型または改変型で、異常に発現され、癌の病理発生に関与する。
【０００３】
ＥＧＦＲ遺伝子は、トリ赤芽球症ウイルスで最初に特定されたｅｒｂ Ｂ癌遺伝子の細胞性ホモログである。ＥＧＦＲｖＩＩＩは多数の癌に存在するＥＧＦＲの変異体である。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、細胞外ドメインの２６７アミノ酸配列の欠失の結果として生じる構成的に活性型の受容体である。
【０００４】
ＥＧＦＲによって引き起こされる腫瘍の治療では、２つのストラテジー：ＥＧＦＲの細胞外ドメインと結合するモノクローナル抗体および関連タンパク質、ならびに細胞内キナーゼドメインと結合する小分子が使用されている。該モノクローナル抗体の有効性は、部分的には受容体シグナル伝達の阻害に起因し、かつ部分的には腫瘍に対する該抗体の免疫学的効果、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に起因する。さらに、治療用モノクローナル抗体はまた、該受容体の内在化および安定性に影響しうる。シグナル伝達の阻害は、治療用抗体の抗腫瘍効果に重要であると思われる。腫瘍特異的抗原を単に認識する抗体は概して無効であるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
いくつかの抗ＥＧＦＲ抗体が試験され、癌治療薬として使用されているが、現在、特定の抗ＥＧＦＲ抗体に対する患者の応答と特定の突然変異型または野生型ＥＧＦＲの発現の間に明らかな相関は存在しない。ゆえに、当技術分野において、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌細胞中で、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよび関連する突然変異型のＥＧＦＲのシグナル伝達を特異的に阻害できる抗癌治療が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
一般に、本発明は、ＥＧＦＲ内の既定のエピトープを認識する抗体が、インタクトなＥＧＦＲおよびＥＧＦＲの変異体の両者、特にＥＧＦＲの欠失変異体、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達の阻害に有用であるという発見に注目する。
【０００７】
本発明者らは、抗ＥＧＦＲ抗体ＥＭＤ７２０００のエピトープを発見した。このエピトープは、ＥＧＦＲの表面のアミノ酸Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１および周囲のアミノ酸を含む。本発明者らはまた、ＥＭＤ７２０００、および同じエピトープを認識する他の抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩ中のこのエピトープに結合すると、ＥＧＦＲｖＩＩＩと第二のＥＧＦＲ分子、例えばインタクトなＥＧＦＲまたは第二のＥＧＦＲｖＩＩＩとの二量体化がブロックされることを発見した。これは、ＥＧＦＲｖＩＩＩが、二量体化能があるコンホメーションをとることを立体的に阻害しない様式でＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する１３Ａ９等の抗体と対照的である。本発明者らはまた、ＥＭＤ７２０００がＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲの両者の受容体シグナル伝達を阻害できることを発見した。
【０００８】
したがって、発明者らは、ＥＭＤ７２０００、およびＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合するかまたはＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの両者による受容体シグナル伝達をブロックする能力を有する他の抗体が、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するかまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性（尤度）が高い癌の治療に有用であることを発見した。
【０００９】
一般に、本発明は、細胞外ドメインでの欠失を有するＥＧＦＲ変異体を発現する癌の治療方法を特徴とする。該方法は、概して、まず被験体中の所定の癌が欠失ＥＧＦＲ変異体を発現する可能性（likelihood）を評価するステップ、およびその後の本発明の抗体で被験体を治療するステップを含む。そのような抗体での治療は、好ましくは、問題の癌が欠失ＥＧＦＲ変異体を発現する可能性が高いと見なされる場合に実施される。
【００１０】
第１の態様では、本発明は、処置を必要とする被験体体内の癌の治療、予防または安定化のための方法であって、以下のステップ：（ａ）該癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているかを決定するステップおよび（ｂ）ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌を有すると決定された該被験体に、ヒトＥＧＦＲのＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープを認識する抗体を投与するステップ（ここで、該抗体は、該被験体での該癌の治療、予防または安定化に十分な期間および量で投与される）を含む方法を特徴とする。
【００１１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、該抗体は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。望ましくは、該抗体は、配列番号３および９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の可変領域アミノ酸配列を含む。あるいは、またはさらに、ＥＧＦＲのアミノ酸４５２、４５４、４５７、４６２、もしくは４６３、または約４０６〜４１３もしくは約３１４〜３３７の配列内に見出されるアミノ酸を含むエピトープを認識する抗体を使用することができる。本発明のこの態様において有用な抗体の非限定的な例には、ＥＭＤ７２０００、ｍＡｂ５２８、ｈ−Ｒ３、ｍＡｂ４２５、および上記抗体のいずれかの抗原結合性フラグメントが含まれる。また、上記抗体のいずれかのヒト化、脱免疫化（ＤｅＩｍｍｕｎｉｚｅｄＴＭ）、改変（例えば、適切な場合に、ヒトでの安定性を増加させるかまたは免疫原性を低下させるための改変）またはキメラ化誘導体が含まれる。本発明の抗体Ｖ領域を、融合タンパク質、単鎖Ｆｖ部分、Ｆａｂ断片、および他の遺伝子改変構築物の関連で使用してもよい。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、該抗体は、インタクトなＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達（例えば、活性型コンホメーションへの変換、受容体内在化、受容体二量体化、受容体自己リン酸化、および基質のリン酸化）を低下させるか、または妨げる。望ましくは、該シグナル伝達は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上低下する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、処置を必要とする被験体体内の癌の治療、予防または安定化のための方法であって、以下のステップ：（ａ）該癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているかを決定するステップおよび（ｂ）ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌を有すると決定された該被験体に、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、かつＥＧＦＲｖＩＩＩによる受容体シグナル伝達を低下させるかまたは阻害する抗体を投与するステップ（ここで、該抗体は、該被験体での該癌の治療、予防または安定化に十分な期間および量で投与される）を含む方法を特徴とする。望ましくは、該抗体は、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸４５２、４５４、４５７、４６２、または４６３、アミノ酸Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸４０６〜４１３、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸３１４〜３３７を含むエピトープに結合するか、またはドメイン２がシグナル伝達コンホメーションをとることを妨げるＥＧＦＲのドメイン３上の部位に結合する。
【００１４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、該抗体は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。望ましくは、該抗体は、配列番号３および９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の可変領域アミノ酸配列を含む。本発明のこの態様において有用な抗体の非限定的な例には、ＥＭＤ７２０００、ｍＡｂ５２８、ｈ−Ｒ３、ｍＡｂ４２５、および上記抗体のいずれかの抗原結合性フラグメント、ヒト化またはキメラ化誘導体が含まれる。また、上記抗体のいずれかのヒト化、脱免疫化（ＤｅＩｍｍｕｎｉｚｅｄＴＭ）、改変（例えば、適切な場合に、ヒトでの安定性を増加させるかまたは免疫原性を低下させるための改変）、またはキメラ化誘導体が含まれる。本発明の抗体Ｖ領域を、融合タンパク質、単鎖Ｆｖ部分、Ｆａｂ断片、および他の遺伝子改変構築物の関連で使用してもよい。
【００１５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩによる受容体シグナル伝達には、活性型コンホメーションへの変換、受容体内在化、受容体二量体化、受容体自己リン酸化、および基質のリン酸化が含まれる。望ましくは、該シグナル伝達は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上低下または阻害される。
【００１６】
本発明の方法を使用して治療または予防できる癌の非限定的な例には、本明細書中に記載の癌、および特に、膠芽腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌が含まれる。一例では、該被験体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現すると決定される前癌性病変を有する被験体であり、該方法は、該被験体での癌を予防するために用いられる。
【００１７】
癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているかどうかの決定は、多数の方法によって実行することができる。一例では、被験体での癌のタイプと、集団での同じタイプの癌についてのＥＧＦＲｖＩＩＩの既知の発生確率パーセントとの比較により、該癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性（likelihood）パーセントを決定する。少なくとも５７％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の可能性パーセントを有する癌が本発明の方法に好ましい。
【００１８】
別の例では、該被験体から生物学的サンプルを取得し、それを使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの存在を決定する。該生物学的サンプル中でＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドが検出されれば、該癌はＥＧＦＲｖＩＩＩを発現していると見なされる。好ましくは、ＥＧＦＲｖＩＩＩの新規なペプチド連結を特異的に認識するＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性ポリペプチド（例えば抗体）または抗血清を使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを検出する。例えば、抗体ＭＲ１−１を使用することができる。
【００１９】
さらに別の例では、該被験体から生物学的サンプルを取得し、それを使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸の存在を決定する。該生物学的サンプル中でＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸が検出されれば、該癌はＥＧＦＲｖＩＩＩを発現していると見なされる。生物学的サンプル中の核酸を検出するための当技術分野において公知の多数の方法が存在し、そのうちのいくつかが本明細書中に含まれる。例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＲＮＡの新規なペプチド連結にハイブリダイズする核酸、またはその対応するｃＤＮＡ、をプローブとして使用して、サザンブロット、ノザンブロット、またはＲＮａｓｅ保護アッセイでＥＧＦＲｖＩＩＩ核酸を検出することができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩにハイブリダイズする核酸をプライマーとして使用して、増幅に基づくアッセイ、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、または定量的リアルタイムＰＣＲでＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＲＮＡ、またはその対応するｃＤＮＡ、を検出することもできる。さらに、ＥＧＦＲにハイブリダイズする核酸をプローブまたはプライマーとして使用することもでき、検出されるＥＧＦＲ ＤＮＡまたはｍＲＮＡとＥＧＦＲｖＩＩＩ ＤＮＡまたはｍＲＮＡのサイズの差異に基づいてＥＧＦＲｖＩＩＩの検出を決定することができる。該検出では、ＥＧＦＲｖＩＩＩの存在は、短いかまたは速く移動するバンドによって示される。
【００２０】
本発明はまた、抗体Ｖ領域およびＥＧＦＲの一部分を含むタンパク質複合体を開示する。好ましい一実施形態は、ＥＭＤ７２０００とＥＧＦＲｖＩＩＩの複合体である。そのようなＥＭＤ７２０００／ＥＧＦＲｖＩＩＩ複合体は、培養細胞の表面または癌患者中の細胞の表面に存在する。
【００２１】
「ＥＧＦＲ」または「インタクトなＥＧＦＲ」とは、任意の哺乳動物の成熟完全長上皮成長因子受容体を意味し、ヒトおよび非ヒト型が含まれる。１１８６アミノ酸のヒトＥＧＦＲがUllrich et al., Nature 309:418-425 (1984)およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＨ９４７６１に報告されている。
【００２２】
「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」とは、エキソン２〜７が欠失して、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン中の２６７アミノ酸インフレーム欠失が生じているＥＧＦＲの変異体を意味する。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＩＩＩ型突然変異体、デルタ−ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｄｅ２−７、およびΔＥＧＦＲとしても知られ、米国特許第６，４５５，４９８号、同第６，１２７，１２６号、同第５，９８１，７２５号、同第５，８１４，３１７号、同第５，７１０，０１０号、同第５，４０１，８２８号、および同第５，２１２，２９０号に記載されている。一般に、成熟ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質は、以下のアミノ酸配列Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ（配列番号１８）で始まり、成熟ＥＧＦＲの残りへ続く。特に、成熟ＥＧＦＲの最初の５アミノ酸（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ（配列番号１９））が存在し、選択的スプライシングに起因するハイブリッドコドンに由来するグリシンが続き、そしてアミノ酸２７４で始まる成熟ＥＧＦＲ配列がさらに続く。ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現は染色体欠失の結果として生じることがあり、異常な選択的スプライシングの結果として生じることもある。Sugawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:8602-8606 (1990)を参照のこと。
【００２３】
「ＥＧＦＲｖＩＩＩの新規なペプチド連結」とは、以下のアミノ酸配列Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ（配列番号１８）および成熟ＥＧＦＲの残りへ続く配列を意味し、ここで、配列Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ（配列番号１９）はＥＧＦＲのエキソン１に由来し、Ｇｌｙはエキソン１とエキソン８の間のスプライス結合部位で形成される新規コドンに由来する新規アミノ酸であり、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号２０）およびその後のアミノ酸はＥＧＦＲのエキソン８に由来する。
【００２４】
「欠失ＥＧＦＲ変異体」とは、細胞外ドメインの一部分が欠けていて、ＥＧＦＲシグナル伝達が少なくとも部分的にリガンド非依存的になっている、ＥＧＦＲの欠失変異体を意味する。
【００２５】
「抗体」とは、天然に生産されたか合成によって生産されたかにかかわらず、抗原と結合可能な免疫グロブリンタンパク質（またはポリクローナル抗体の場合等のタンパク質群）、またはその誘導体を意味する。該用語にはまた、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２個のインタクトな抗体、抗体断片、および異種抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）（該抗体は互いに連結されている異なる結合特異性の２個以上の抗体、またはその断片からなる）が含まれる。該用語の範囲内の誘導体には、配列が改変されているが、依然として抗原に特異的に結合可能な抗体、例えば種間、二重特異性、キメラ、ヒト化抗体、および抗体を追加の分子（例えば細胞傷害性分子）にコンジュゲートする免疫複合体が含まれ、その例はＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０３２９６０号に記載されている。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、非限定的に血清または上清が含まれる種々の培地中に、または精製された形態で存在してよい。本明細書中で使用される抗体は、任意の公知技術によって生産することができ、該技術には、ネイティブＢリンパ球、ハイブリドーマ、組換え発現系の細胞培養由来の回収物、ファージディスプレイによるもの等が含まれる。モノクローナル抗体の作製方法は当技術分野において公知であり、該方法には、Kohler and Milstein（Nature 256,495 (1975)）および「Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas」（Burdon et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)）に記載のハイブリドーマ法が含まれ、または周知の組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。モノクローナル抗体は、例えばClackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)に記載の技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。ポリクローナル抗体の製造方法は当業者に公知である。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を注射し、次いで適切な間隔で追加免疫することによって、ウサギまたは他の動物を免疫化することによって製造することができる。該動物から採血し、通常、対応する遺伝子の作用をブロックする能力に基づくＥＬＩＳＡまたはバイオアッセイによって、精製タンパク質に対して血清をアッセイする。トリ種、例えばニワトリ、シチメンチョウ等を使用する場合、抗体は卵の卵黄から単離することができる。キメラおよびヒト化抗体の作製方法もまた当技術分野において公知である。例えば、キメラ抗体の作製方法には本明細書中に記載の方法が含まれ、キメラ化およびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法によって、例えばＷＯ８７／０２６７１；ＥＰ１８４，１８７；ＥＰ１７１，４９６；ＥＰ１７３，４９４；ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号、同第６，３３１，４１５号；ＥＰ１２５，０２３；Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)；Liu et al., Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 84: 3439-3443 (1987)；Liu et al., J Immunol. 139: 3521-3526 (1987)；Sun et al., Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 84: 214-218 (1987)；Nishimura et al., Cancer Res. 47: 999-1005 (1987)；Wood et al., Nature 314: 446-449 (1985)；Shaw et al., J Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559 (1988)；Morrison  Science 229: 1202-1207 (1985)；Oi et al.,  Biotechniques 4: 214 (1986)；Jones et al., Nature 321: 552-525 (1986)；Verhoeyan et al., Science 239: 1534 (1988)；Beidler et al., J Immunol. 141: 4053-4060 (1988)；Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988)；およびVerhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)に記載の技術を使用して製造することができる。
【００２６】
「抗血清」とは、１種以上の抗原に特異的な免疫グロブリンを含有するヒトまたは動物の血清を意味する。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗血清の例は当技術分野において公知であり、例えばKallio et al., Br. J. Cancer 89:1266-1269 (2003)に記載されている。
【００２７】
「抗体断片」または「抗体タンパク質断片」とは、抗原に結合可能な抗体の一部分（例えばＦｖ）を表す。本明細書中で使用される該用語の範囲内の断片には、種々のペプチダーゼでの消化によって生産される断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２断片、化学的解離、化学的切断、および組換え技術によって生産される断片が含まれる。例えばファージディスプレイによって生産される典型的な組換え断片には、単鎖ＦａｂおよびｓｃＦｖ（「単鎖可変領域」）断片が含まれる。該用語の範囲内の誘導体には、配列が改変されている（種間、キメラ、およびヒト化抗体を含む）が、依然として抗原に結合可能な誘導体が含まれる。
【００２８】
「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体間で配列が大規模に異なり、かつ各特定の抗体のその特定の抗原に関する結合および特異性に使用されるアミノ酸配列を有する抗体重鎖および軽鎖の一部分を意味する。可変性は、軽鎖および重鎖の両可変ドメイン中の「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）に集中している。ＣＤＲ間の領域は、より高度に保存されていて、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ４つのＦＲ（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含み、それは主にβシート立体配置をとり、３つの超可変領域によって連結され、該超可変領域は、６シート構造を連結するループ、ある場合には６シート構造の一部分を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって非常に近接してまとめられ、他方の鎖由来の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.  Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと）。定常ドメインは抗体と抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与を示す。本明細書中で使用される用語「超可変領域」または「ＣＤＲ」とは、抗原結合性を担う抗体のアミノ酸残基を表す。望ましくは、本発明の方法において有用な抗体は、ＥＭＤ７２０００の可変ドメイン（重鎖、軽鎖、または両者）の少なくとも一部分と実質的に同一である。
【００２９】
「実質的に同一」とは、別の核酸、タンパク質、またはアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する核酸、タンパク質、またはアミノ酸配列を意味する。「実質的同一性」は、種々のタイプおよび長さの配列、例えば完全長配列、エピトープまたは免疫原性ペプチド、機能ドメイン、抗体可変領域、コード配列および／または調節配列、エキソン、イントロン、プロモーター、およびゲノム配列を表すために使用されることもある。２ポリペプチドまたは核酸配列間の同一性パーセントは、当技術分野の技術範囲内の種々の方法で決定され、例えば公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith and Waterman J. Mol. Biol. 147:195-7, 1981）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  ＰｌｕｓＴＭに組み込まれている「ＢｅｓｔＦｉｔ」(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489, 1981)、Schwarz and Dayhof「Atlas of Protein Sequence and Structure,」Dayhof, M.O., Ed pp 353-358, 1979；ＢＬＡＳＴプログラム(Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul, S. F., W. Gish, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して決定される。さらに、当業者は、アライメントの測定に適切なパラメータを決定することができ、これには比較されている配列の長さにわたる最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。一般に、タンパク質では、比較配列の長さは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０アミノ酸またはそれ以上、該タンパク質の完全長までである。核酸では、比較配列の長さは、概して、少なくとも２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０ヌクレオチドまたはそれ以上、該核酸分子の完全長までである。エピトープとの同一性を比較する場合、比較に使用されるタンパク質の長さはずっと短く、例えば、５、７、１０、１２、１５、または２０またはそれ以上のアミノ酸、該エピトープの全体の長さまでであることが理解される。配列同一性を決定する目的でＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較する場合、チミンヌクレオチドはウラシルヌクレオチドと等価であることが理解される。保存的置換には、典型的に以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００３０】
「エピトープ」とは、抗体によって認識される高分子上の領域を意味する。一般に、エピトープはタンパク質中の一次配列の短い領域中であり、概して約５〜１２アミノ酸長であるが、二次構造の領域でもありうる。本発明の好ましいエピトープには、ヒトＥＧＦＲのＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープ；ヒトＥＧＦＲのアミノ酸４０６〜４１３；ヒトＥＧＦＲのアミノ酸３１４〜３３７；およびアミノ酸２７４〜３１０を含むドメイン３の相互作用表面内であるドメイン３内の任意のエピトープが含まれる。任意の上記エピトープでは、非ヒトＥＧＦＲ中の等価のエピトープも含まれ、非ヒトＥＧＦＲ中の等価の残基を決定するための非ヒトＥＧＦＲとヒトＥＧＦＲのアライメントによって決定することができる。上記の好ましいエピトープに結合する抗体は当技術分野において公知のアッセイを使用して特定することができる。一例では、それぞれ４６０および４６１位のセリンおよびグリシンを有するインタクトなＥＧＦＲに対する抗体候補の結合を、前記位置が、異なるアミノ酸、例えば、より大きいアミノ側鎖を有するアミノ酸で置換されている突然変異型ＥＧＦＲに対する抗体候補の結合と比較することができる。このアッセイで野生型ＥＧＦＲに結合するが、突然変異型ＥＧＦＲに結合しない抗体候補は、Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合する抗体として特定される。
【００３１】
「Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープ」とは、アミノ酸Ｓｅｒ４６０およびＧｌｙ４６１を含み、場合により、Ｓｅｒ４６０およびＧｌｙ４６１の約１０〜１５オングストローム以内の近くのアミノ酸を含むＥＧＦＲの表面上の領域を意味する。抗体の結合が、一般にＥＧＦＲの構造を崩壊させない４６０位および／または４６１位での突然変異によって崩壊すれば、該抗体はＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合すると考えられる。例えば、ヒトＥＧＦＲに結合するが、４６０および４６１位がマウスのアミノ酸プロリンおよびアスパラギンによって置換されている別のヒトＥＧＦＲに結合しない抗体は、Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合すると考えられる。同様に、抗体がヒトＥＧＦＲに結合するが、Ｓｅｒ４６０がアラニン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、チロシン、またはアスパラギン酸などのアミノ酸によって置換されているか、またはＧｌｙ４６１が、例えば、ロイシンによって置換されているヒトＥＧＦＲに結合しなければ、該抗体はＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合すると考えられる。
【００３２】
「癌」とは、異常でかつ制御されていない細胞分裂によって生じる任意の良性または悪性腫瘍（benign or malignant growth or tumor）を意味する。癌の例には、非限定的に、白血病（例えば急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍、例えば肉腫および癌腫（例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫（oligodenriglioma）、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）が含まれる。望ましくは、本発明の方法を使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を特徴とする癌を治療する。
【００３３】
「前癌性病変」とは、かなりの数の例で悪性腫瘍が発症すると推定される形態学的に特定可能な病変を意味する。
【００３４】
「抗癌治療」とは、前癌性病変、癌、または癌転移の発達を予防し、遅延させ、停止させ、または回復（reverse）させるための任意の治療を意味する。一般に、抗癌治療は、癌細胞を定義する任意の特性を低下または回復させる（Hanahan et al., Cell 100:57-50, 2000を参照のこと）。ほとんどの癌治療は、浸潤能を遅延、停止、回復、または減少させるか、または細胞が癌細胞の発達に耐える能力を減少させることによって癌細胞を標的にする。抗癌治療には、非限定的に、外科手術、放射線治療（放射線療法）、生物学的療法、免疫療法、化学療法、または前記治療の任意の組み合わせが含まれる。
【００３５】
「癌の治療、安定化、または予防」とは、腫瘍サイズの低下を生じさせ、腫瘍サイズの増加を遅延させるかまたは予防し、腫瘍の消失とその再発の間の無病生存期間を増加させ、腫瘍の最初のまたはその後の発生を予防し、または腫瘍と関連している有害な症状を低減させることを意味する。好ましい一実施形態では、治療に耐える癌性細胞のパーセントは、任意の標準アッセイを使用して測定された場合に、最初の癌性細胞の数より少なくとも２０、４０、６０、８０、または１００％低い。好ましくは、本発明の治療の実施によって誘発される癌性細胞数の減少は、非癌性細胞数の減少より少なくとも２、５、１０、２０、または５０倍高い。さらに別の好ましい実施形態では、治療の実施後に存在する癌性細胞の数は、プラセボまたはビヒクル対照の投与後に存在する癌性細胞の数より少なくとも２、５、１０、２０、または５０倍低い。好ましくは、本発明の方法は、標準的方法を使用して決定される腫瘍のサイズに関して、２０、４０、６０、８０、または１００％の減少を生じさせる。好ましくは、治療された被験体の少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、または９５％が完全寛解を有し、癌のすべての証拠が消失する。好ましくは、癌は再発しないか、または少なくとも５、１０、１５、または２０年後に再発する。別の好ましい実施形態では、癌と診断され、本発明の治療で処置された後に患者が生存する期間の長さは、（ｉ）無処置患者が生存する期間の平均または（ｉｉ）別の治療で処置された患者が生存する期間の平均より少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、２００、または５００％までも長い。
【００３６】
「サンプル」とは、体液（例えば尿、血液、血清、血漿、または脳脊髄液）、組織（例えば組織生検）、またはＥＧＦＲが通常検出可能な細胞を意味する。
【００３７】
「被験体」とは哺乳動物を意味し、非限定的にヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコが含まれる。
【００３８】
「可能性パーセント」（percent likelihood）とは確率パーセントを意味する。本発明では、癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性パーセントは、被験体での癌のタイプを、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現することが見出される同タイプの癌のパーセントを列挙する臨床研究または公表されている報告と比較することによって決定することができる。好ましくは、本発明の方法では、癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性パーセントは、少なくとも５７％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である。
【００３９】
「受容体シグナル伝達」とは、細胞イベントまたは細胞経路の活性化を導く、ＥＧＦＲまたはその突然変異体もしくは誘導体（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）と関連している任意の生物学的活性を意味する。典型的な生物学的活性には、活性型コンホメーションへの変換、受容体二量体化（ホモ二量体またはヘテロ二量体）、受容体自己リン酸化（例えばヒトＥＧＦＲのＴｙｒ９９２、１０６８、１０８６、１１４８、または１１７３での自己リン酸化）、基質リン酸化、および基質結合が含まれる。ＥＧＦＲの基質は当技術分野において公知であり、Ｇａｂ１、Ｓｈｃ、ＥＰＳ８、ＥＰＳ１５、およびアミノ酸配列ＥＥＥＥＹＦＥＬＶ（配列番号１７）を含む任意のポリペプチドが含まれる。そのような活性は、当技術分野において公知のまたは本明細書中に記載のアッセイを使用して測定することができ、キナーゼアッセイ、受容体基質結合についての免疫アッセイ、構造に基づく受容体コンホメーションの解析、および受容体内在化アッセイが含まれる。
【００４０】
「低下（減少、低減）」とは、全体として、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の減少を生じさせる能力を意味する。例えば、一実施形態では、治療方法において有用な本発明の抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩのまたは、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲの両者の受容体シグナル伝達の少なくとも２０％の低下を生じさせる。
【００４１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の説明から、および特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明は以下の発見および洞察に基づく。まず、本発明者らは、低下した免疫原性を有するよう設計された、モノクローナル抗体４２５を作り変えた誘導体である抗ＥＧＦＲ抗体ＥＭＤ７２０００が、アミノ酸Ｓｅｒ４６０およびＧｌｙ４６１ならびに、おそらく、ＥＧＦＲの表面上の他の周囲のアミノ酸を含むエピトープに結合することを発見した。これらの結果は、ＥＭＤ７２０００が、１３Ａ９、２２５、および８０６のエピトープと異なるＥＧＦＲ上のエピトープに結合することを示す（Chao et al., J. Mol. Biol. 342:539-50 (2004)；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０３２９６０号）。
【００４３】
次に、本発明者らは、ＥＭＤ７２０００、および同エピトープを認識する他の抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩ中のこのエピトープに結合すると、ＥＧＦＲｖＩＩＩと第二のＥＧＦＲ分子、例えば野生型ＥＧＦＲまたは第二のＥＧＦＲｖＩＩＩとの二量体化がブロックされることを発見した。本発明者らはまた、ＥＭＤ７２０００がＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲの両者の受容体シグナル伝達を阻害できることを発見した。ＥＭＤ７２０００およびＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープを認識する他の抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩの二量体化をブロックできる証拠は、本明細書中で示される実験データ、ＥＧＦＲの細胞外ドメインの既知の三次元構造に基づく構造的洞察、および本明細書中で示されるＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＥＧＦＲ／抗体複合体の構造モデルから得られる。
【００４４】
本発明は、ＥＭＤ７２０００、およびＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合するかまたはＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの両者による受容体シグナル伝達をブロックする能力を有する他の抗体を、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するかまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性が高い癌の治療に使用することを特徴とする。
【００４５】
本発明の以下の説明は、具体的な抗体ＥＭＤ７２０００に関して示されるが、説明的であり、限定的ではないものとする。ＥＭＤ７２０００はマウス抗体４２５のヒト化型である（米国特許第５，５５８，８６４号）。ＥＭＤ７２０００に加えて、本発明の方法において有用な追加の抗体には、モノクローナル抗体５２８、ｈ−Ｒ３、ｍＡｂ４２５が含まれる。さらに、ＥＭＤ７２０００に関するエピトープの発見および、ＥＭＤ７２０００が、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達に必要な活性型コンホメーションをブロックする能力に基づいて、下記方法を使用して本発明の方法において有用な追加の抗体を特定できることがタンパク質分子モデリングの技術分野の当業者に自明である。そのような追加の抗体は本発明の方法での使用に含まれる。
【００４６】
本発明の方法において有用な抗体の調製
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対する抗体は、任意の種々の技術、例えば従来のハイブリドーマテクノロジー、ファージディスプレイ、および当技術分野において公知の他の技術によって調製および特定することができる。本発明の抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、抗原結合性フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗原に特異的に結合する能力を保持する任意の誘導体でありうる。
【００４７】
ＥＧＦＲを認識する抗体が特定されたら、本明細書中に記載のエピトープに特異的に結合するかまたはＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、もしくは両者のシグナル伝達を特異的に阻害する能力に関して、例えば本明細書中に記載の方法を使用して、試験することができる。
【００４８】
例えば、米国特許第５，５５８，８６４号では、本発明の方法において有用な抗体を作製する方法が記載されている。
【００４９】
抗体の調製および／または精製後、ＥＧＦＲｖＩＩＩ上の特異的エピトープに結合するかまたはインタクトなＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、もしくは両者によるシグナル伝達を阻害する能力に関して、当技術分野において公知の標準的方法を使用して、スクリーニングすることができる。該方法の例は以下に記載される。
【００５０】
エピトープに基づく、本発明において有用な抗体の特定
本発明の一部分として、ＥＭＤ７２０００の結合エピトープが特定され、これがヒトＥＧＦＲのアミノ酸Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１を含むことが見出された。したがって、本発明の好ましい抗体は、前記アミノ酸および／または周囲のアミノ酸を含むエピトープに結合することができる。留意すべきは、一次配列または二次構造に基づいて、アミノ酸が「周囲の」アミノ酸であるとみなしうることである。さらに、本発明は、アミノ酸４０６〜４１３またはアミノ酸３１４〜３３７がまた、本発明の方法において有用な、ＥＭＤ７２０００以外の抗体の別個の結合性エピトープであるという洞察を提供する。あるいは、またはさらに、エピトープはアミノ酸４５２、４５４、４５７、４６２、または４６３を含みうる。したがって、前記エピトープのいずれかに結合する能力に関して抗体をスクリーニングするために使用される任意の方法を使用して、本発明の方法において有用な抗体を特定することができる。
【００５１】
一例では、それぞれ４６０位および４６１位のセリンおよびグリシンを有する野生型ＥＧＦＲに対する抗体候補の結合を、前記位置が、異なるアミノ酸、例えば、より大きいアミノ側鎖を有するアミノ酸で置換されている突然変異型ＥＧＦＲに対する抗体候補の結合と比較することができる。このアッセイで野生型ＥＧＦＲに結合するが、突然変異型ＥＧＦＲに結合しない抗体候補は、Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合する抗体として特定される。
【００５２】
別の例では、Cochran et al.（J. Immunol. Methods. 287:147-58 (2004)）およびChao et al.（J. Mol. Biol. 342:539-50 (2004)）に記載の酵母ディスプレイアプローチを使用するエピトープの特定方法を使用する。この方法では、抗体が結合する標的タンパク質を、内因性の酵母の細胞表面タンパク質Ａｇａ２との融合タンパク質として発現させる。酵母細胞表面の該標的タンパク質の存在は、蛍光標識抗体を用いて検出することができ、抗体結合が失われている突然変異体を特定することができる。そして該突然変異体を分離し、クローンとして成長させた後、標的タンパク質中の突然変異（群）をＤＮＡシークエンシングによって特定する。これらの突然変異は、試験対象の抗体のエピトープを定義すると考えられる。
【００５３】
該融合タンパク質は、標的タンパク質のＮ末端およびＣ末端に標準エピトープタグを有するよう遺伝子改変される。例えば、いわゆる「Ｍｙｃタグ」および「ＦＬＡＧタグ」エピトープはこの関連で有用である。該エピトープタグは、融合タンパク質が発現される程度および標的タンパク質がタンパク質分解によって除去される程度を決定するために有用である。特に、標的タンパク質融合構築物を発現する酵母細胞の集団は、細胞ごとに変動するＥＧＦＲ−Ａｇａ２融合タンパク質の絶対レベルを有するが、標的タンパク質に結合する抗体と末端の（distal）エピトープタグに結合する抗体の比は１：１であるべきであろう。実際には、２種の抗体を異なる蛍光色素で標識し、該酵母細胞をＦＡＣＳ装置によって選別する。野生型標的タンパク質を有する細胞は、ＦＡＣＳ装置によって検出されて２種の色素にしたがって選別されると、起点を通る直線に沿って分布する。
【００５４】
そして（エピトープタグ１）−ＥＧＦＲ−（エピトープタグ２）−Ａｇａ２融合タンパク質を発現する酵母細胞を突然変異させて選別する。抗ＥＧＦＲ抗体が結合していないと思われる細胞を選択し、成長させ、再選別し、再選択し、抗ＥＧＦＲ抗体が結合していないと思われる酵母細胞が細胞の大多数を構成するまで該プロセスを継続する。そしてそのような細胞をプレートして、個々のクローンを得た後、さらに試験し、シーケンシングする。
【００５５】
本発明の抗体、例えばＥＭＤ７２０００を使用して、Cochranら（Cochran et al., 上掲）およびChaoら（Chao et al., 上掲）にさらに詳細に記載される上記手順を実施すると、Ａｓｎ４５２、Ｌｙｓ４５４、Ｐｈｅ４５７、Ｓｅｒ４６０、Ｇｌｙ４６１、Ｇｌｎ４６２、および／またはＬｙｓ４６３等の部位に突然変異を有する形式のＥＧＦＲを発現する酵母細胞が単離された（実施例１も参照のこと）。
【００５６】
本発明の抗体を特定する別の方法は、まず標準的方法、例えばハイブリドーマテクノロジーまたはファージディスプレイテクノロジーによってＥＧＦＲに対する抗体のパネルを作製し、次いで単離された抗体をスクリーニングして、標準的競合アッセイにおいてＥＭＤ７２０００と競合する能力に関して単離されるようにすることである。そのような方法は抗体工学の技術分野において周知である。
【００５７】
可変領域配列に基づく、本発明の抗体の特定
本発明者らがＥＭＤ７２０００のエピトープの一部分であるＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１を特定したことに基づいて、ＥＭＤ７２０００の可変領域と実質的に同一の可変領域を有する抗体もまた、本発明の方法において有用な抗体であると考えられる。未知のエピトープを有する抗ＥＧＦＲ抗体候補の可変領域配列を、既知のエピトープを有する抗ＥＧＦＲ抗体、例えばＣ２２５、ＥＭＤ７２０００、ＭＲ１、および８０６の可変領域配列とアライメントする。このアライメントには、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、可変領域全体、および重鎖もしくは軽鎖または両者のＣＤＲを含ませることができる。図２は、既知および未知の特異性のいくつかの抗ＥＧＦＲ抗体可変領域配列のアライメントを示す。このアライメントに基づいて、ｈ−Ｒ３抗体はＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合すると予測され、したがって本発明において有用であると考えられる。
【００５８】
機能に基づく、本発明の抗体の特定
本発明の治療方法には、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩおよび、ＥＧＦＲがその細胞外ドメインに欠失を有する類似の受容体によるシグナル伝達をブロックする抗体を患者に投与するステップが含まれる。したがって、本発明において有用な抗体の特定方法はまた、哺乳動物細胞株でのＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩシグナル伝達を測定する任意のアッセイの使用を含む。そのような細胞株の例には、ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）、Ａ４３１細胞、Ｕ８７細胞、ＨＴ２９細胞、または他の細胞が含まれ、それらはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現構築物でトランスフェクトされている。ＥＧＦＲを発現せず、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現構築物でトランスフェクトされている哺乳動物細胞を使用することも可能である。ＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達は、下記機構等の種々の機構によって測定することができる。
【００５９】
活性型コンホメーションを測定することによる受容体シグナル伝達の測定
本発明の抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達をブロックする能力は、ＥＧＦＲｖＩＩＩがオリゴマー形成を可能にするコンホメーションをとることを妨げるその能力によって決定することができる。ＥＧＦＲの細胞外ドメインは、２種の可能なコンホメーション：Ｘ線結晶構造解析によって観察される二量体構造に相当する活性型のシグナル伝達性コンホメーション、および単量体のＸ線構造に相当する不活性型の非シグナル伝達性コンホメーションで存在すると考えられる（Garrett et al., Cell 110:763-773 (2002); Ferguson et al., Molecular Cell 11:507-517 (2003)）。前記２種のコンホメーションの模式図を図１に示す。ＥＧＦＲの細胞外領域は４つのドメインからなる：ドメイン１および３はヘリカルベータストランド構造であり、ドメイン２および４は伸びていて、ジスルフィド結合を形成するシステインに富む。ドメイン１および３のアミノ酸配列はアライメントすることができ、三次元構造は類似している。活性型および不活性型の間の変換は、主にアルギニン３１０を中心にする回転によって生じる。
【００６０】
本発明の抗体を特定するための代替法として、活性型コンホメーションのＥＧＦＲｖＩＩＩの構造モデルを使用して、抗体が結合した場合に、アミノ酸約２７４〜３１０を立体的に阻害して、ドメイン３および４に対して活性型コンホメーションをとらせない領域を特定することができる。例えば、アミノ酸約４０６〜４１３を認識するかまたはアミノ酸約３１４〜３３７を認識する抗体は本発明の方法において有用である。
【００６１】
そのような領域に対する抗体は、例えば、以下のように作製することができる。標準的手順にしたがって、そのようなセグメントに、ジスルフィド結合を形成するシステインが正常に結合する場合、ジスルフィド結合ループを、場合により担体にコンジュゲートして、抗原として使用することが可能である。例えば、アミノ酸３１３〜３３８に相当する配列Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（配列番号２１）を有するジスルフィド結合ループを抗原として使用して、本発明の抗体を作製することができる。
【００６２】
受容体内在化速度（internalization rates）を測定することによる受容体シグナル伝達の測定
ＥＧＦＲｖＩＩＩによる二量体化およびシグナル伝達は、受容体内在化速度を決定するための当技術分野において公知の方法を使用して抗体−ＥＧＦＲ複合体の内在化速度を決定することによって測定することができる。
【００６３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは構成的にシグナルを伝達し、トランスフェクションしたヒト乳房上皮細胞では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異型受容体は、シグナル伝達によって刺激されるエンドサイトーシスの結果として高い内在化速度を有する。シグナル伝達を阻害する様式でＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体はまた、内在化の刺激を阻害し、それによりバルク膜ターンオーバーに相当するバックグラウンドレベルで内在化が生じるようになる。それはシグナル伝達によって刺激される内在化の速度の約１０％である。逆に、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するが、そのシグナル伝達を阻害しない抗体は、高速で内在化される。受容体内在化の低下または阻害の程度は、使用される細胞タイプに依存して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、〜９０％、またはそれ以上でありうる。このアッセイはまた、ＥＧＦＲのみを発現する細胞株を使用して、インタクトなＥＧＦＲのシグナル伝達に対する影響を調査するために使用することができる。
【００６４】
一例では、Worthylakeの方法を使用して（Worthylake et al., J. Biol. Chem. 274:8865-8874 (1999)）、内在化の速度を測定する。簡潔には、放射性標識抗ＥＧＦＲ抗体を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、および場合によりほぼ等しい数のＥＧＦＲを発現する培養哺乳動物細胞に加える。抗体を加えた後の種々の時点で、一定分量の細胞を取り出し、２通りにプロセシングする：酸ストリップでは、表面結合抗体が除去され、該抗体をカウントすることができ；およびアルカリ加水分解では、内在化抗体が遊離し、該抗体もまたカウントすることができる（図４および５も参照のこと）。
【００６５】
実施例でさらに詳細に記載されるように、モノクローナル抗体ＥＭＤ７２０００およびＭＲ１−１はＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達を実際に阻害する。ＥＭＤ７２０００はまた、インタクトなＥＧＦＲによるシグナル伝達によって刺激される内在化を阻害する。他の実験では、非中和抗体１３Ａ９は、インタクトなＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達によって刺激される内在化を阻害しなかった。ＭＲ１−１はインタクトなＥＧＦＲに結合せず、したがってこのアッセイ系では試験することができない。
【００６６】
受容体キナーゼ活性を測定することによる受容体シグナル伝達の測定
ＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達、ならびにインタクトなＥＧＦＲによるシグナル伝達は、ＥＧＦＲの１０６９位または１１７３位のリン酸化チロシンに特異的なモノクローナル抗体（それぞれUpstate Biotechnology, Lake Placid, New York, catalog nos. 07-715および05-483）を使用するウエスタンブロットによって測定することができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞、例えば上に列挙される細胞を、Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープを認識する抗体で処理すると、一般的に、１０６９位または１１７３位のチロシンリン酸化が阻害される。
【００６７】
受容体キナーゼ活性の低下または阻害の程度は、使用される細胞タイプに依存して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上でありうる。いくつかの細胞タイプでは、かなりの割合のＥＧＦＲｖＩＩＩが細胞内局在を示し、例えば小胞体またはゴルジ中に局在し、ゆえにいずれの抗体処理に対しても抵抗性である。
【００６８】
癌の治療のための本発明の抗体の使用
本発明の抗体を使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現すると決定される癌を有する被験体を治療する。一実施形態では、所定の研究でＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドまたは核酸分子を発現する特定のタイプの腫瘍のパーセントを示す臨床研究または公開されている報告に基づいて、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性に関して癌を評価することができる。例えば、医師は腫瘍タイプを記録し、科学文献または臨床データに基づいて、患者の腫瘍がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性パーセントを判断することができる。
【００６９】
例えば、神経膠腫、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、および前立腺癌は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現することが多いと見出されている（例えばWikstrand et al., Cancer Res. 57:4130-4140 (1997)を参照のこと）。Moscatello et al.（Cancer Res. 55:5536-5539 (1995)）では、高悪性度の神経膠腫の５７％（４６例中２６例）および低悪性度の神経膠腫の８６％（７例中６例）にＥＧＦＲｖＩＩＩが存在することが報告された。ＥＧＦＲｖＩＩＩは正常な脳組織では発現されなかった。ＥＧＦＲｖＩＩＩはまた、小児神経膠腫の６６％（６例中４例）、髄芽腫の８６％（７例中６例）、乳癌の７８％（２７例中２１例）および卵巣癌の７３％（３２例中２４例）で見出された。
【００７０】
Garcia de Palazzo et al.（Cancer Res. 53:3217-3220 (1993)）では、免疫細胞化学を使用して、原発性非小細胞肺癌腫瘍の３２凍結切片でＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が測定された。標本の１６％で該突然変異が見出された。前立腺癌では、標本の６８％（３８例中２６例）がＥＧＦＲｖＩＩＩに関して陽性に染色された（Olapade-Olaopa et al., Brit. J. Cancer 82:186-194 (2000)）。
【００７１】
以下の表１は、種々の癌についてのＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性パーセントを示す。
【表１】
2009532358.tif 000002
【００７２】
本発明の被験体が、臨床研究または公開されている報告で、少なくとも５７％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する可能性パーセントを有すると決定される癌を有する場合、該癌は、本発明の方法において、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するとみなされる。
【００７３】
あるいは、またはさらに、腫瘍（群）中のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドもしくは核酸、または類似の細胞外欠失変異体の発現に関して被験体を予備試験する。腫瘍標本を取得し、タンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡに基づく方法を使用してＥＧＦＲｖＩＩＩを検査することによって診断を行うことができる。
【００７４】
タンパク質に基づく方法、例えば免疫アッセイまたは免疫組織化学を使用して、腫瘍サンプルがＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するかどうかを試験することができる。そのようなアッセイでは、いずれのＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質でも使用することができるが、以下のアミノ酸配列：Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１８）を含む新規なペプチド連結配列を認識する抗体を使用することが好ましく、該配列中、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１９）配列はＥＧＦＲのエキソン１に由来し、グリシンはエキソン１〜エキソン８スプライス結合部位に由来し、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号２０）およびそれに続くアミノ酸はエキソン８に由来する。留意すべきは、新規なペプチド連結配列はまた、配列番号１８のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方で、ＥＧＦＲ中に見出されるアミノ酸を含みうる。ゆえに、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ連結配列および／または追加の周囲の配列を特異的に認識する抗体を使用してよく、ただし、その非特異的結合が十分に低いことを条件とする。
【００７５】
一例では、例えば生検または外科的除去によって腫瘍サンプルを取得する。標準的手順にしたがって、腫瘍サンプルを免疫組織化学による染色手順によって染色する。ＥＧＦＲｖＩＩＩを特異的に認識する抗体を一次抗体として使用する。例えば、ＭＲ１−１の可変領域を、例えばマウス、ウサギ、または二次抗体が市販されている他の動物由来の免疫グロブリンの定常領域に結合させる。そのような完全長抗体は実施例２に記載の方法と類似の方法によって構築される。しかし、ヒト定常領域を使用しないことが好ましい。腫瘍組織が、二次抗体と交差反応するヒト抗体を含有するかもしれないからである。
【００７６】
あるいは、ＥＧＦＲｖＩＩＩの新規なペプチド連結を認識するポリクローナル抗血清を標準的方法によって取得した後、免疫組織化学に使用する。例えば、合成ペプチド、例えばＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号２４）を商業的カスタムペプチド合成の企業から入手する。Ｃ末端システインを使用して、該ペプチドを担体、例えばキーホールリンペットヘモシアニンにコンジュゲートした後、ウサギを免疫化し、該コンジュゲートおよび適切なアジュバントで追加免疫する。任意に行われる抗ペプチド抗体のアフィニティー精製後、当技術分野において公知の標準的技術にしたがって、得られた抗血清を免疫アッセイ、例えば免疫組織化学に使用する。
【００７７】
あるいは、ＲＮＡに基づく試験を使用してＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を試験することができる。例えば、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロット、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、または定量的リアルタイムＰＣＲ（すべて標準的手順である）を使用して、腫瘍サンプルを試験することができる。ＲＴ−ＰＣＲ手順は、精製ＲＮＡサンプルに対して、またはｉｎ ｓｉｔｕ法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはｉｎ ｓｉｔｕ逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）染色手順によって実施することができる。
【００７８】
例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩの新規なコード配列連結にまたがる例えば約２０〜３０塩基のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍＲＮＡを検出することができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩの新規なペプチド連結をその中央に有するよう該プローブを設計し、該プローブがＥＧＦＲｖＩＩＩとのみハイブリダイズし、インタクトなＥＧＦＲ ｍＲＮＡとハイブリダイズしないような条件下でハイブリダイゼーションを実施する。いくつかの状況では、まず逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応ステップを実施して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ連結領域を増幅することが有用である。シグナルを単に増幅することに加え、短いＤＮＡセグメントを優先的に増幅させる高速サイクル時間の条件下でこのステップを実施して、インタクトなＥＧＦＲに対応するＤＮＡセグメントと比べてＥＧＦＲｖＩＩＩに対応するＤＮＡセグメントが優先的に増幅されるようにすることができる。そして、連結部にまたがるオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションを、増幅済み材料に対して実施する。
【００７９】
本発明の方法の１つのバリエーションでは、ＰＣＲプライマーの一方はＥＧＦＲｖＩＩＩ中の新規なペプチド連結に対応する。以下の５’および３’プライマーは本発明の方法で使用できる典型的なプライマーである：
５’プライマー：５’−ＧＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧ  ＧＴＡＡＴＴＡ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＡＧＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧ  ＧＴＡＡ−３’（配列番号１４）
３’プライマー：５’−ＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＣＧＧＧＡＴＣＴ−３’（配列番号１５）
５’−ＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴ−３’（配列番号１６）
下線部分の配列は、選択的スプライシングに起因するハイブリッドコドンから生じるグリシンに対応するコドンを示す。
【００８０】
ＤＮＡに基づくアッセイを使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩを検出することもできる。このアッセイでは、エキソン２〜７および隣接イントロン部分を除去する欠失を受けているゲノムＤＮＡの存在が示される。このアプローチは、概して、エキソン１およびエキソン８内の領域に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲに基づく方法を含む。この方法は、概して、いくらか好ましくない。その理由は、あるケースでは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が選択的スプライシングに起因し、ゲノム欠失に起因しないことがあるからである。さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がゲノム欠失に起因する場合でさえ、イントロン内の欠失の終点は患者ごとに様々であり、シグナル強度およびＰＣＲ産物のサイズの変動が生じる。サザンブロットを使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を生じさせるゲノム欠失を特定してもよいが、周囲の正常な組織および、野生型ＥＧＦＲをコードする染色体の存在は概して欠失ＤＮＡの検出を困難にする。
【００８１】
癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現すると特定されたら、１種以上の本発明の抗体を被験体に投与して、該癌を治療、安定化、または予防する。該抗体は、腫瘍サイズの低下を生じさせ、腫瘍サイズの増大を遅延させるかまたは予防し、腫瘍の最初のまたは以後の発生を予防し、腫瘍の消失とその再発の間の無病生存期間を増加させ、または腫瘍と関連している有害な症状を低減するために十分な用量で投与することができる。
【００８２】
本発明の抗体を使用して、前癌性病変を治療するか、またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する前癌性病変または生検サンプルを有すると決定される被験体で腫瘍が発生することを予防することもできる。そのような被験体は、悪性腫瘍を形成する可能性を低下させるために、予防療法に付することができる。
【００８３】
癌の治療または予防のための本発明の抗体の正確な用量は、典型的な臨床医によって認識される要因にしたがって変動する。これらの要因には、（非限定的に）サイズ、年齢、全般的健康、癌の程度、および該患者に投与されている他の投薬が含まれる。正確な治療計画の開発は、医療技術分野の当業者に周知の通常の医療手順を介する最適化を必要とする。
【００８４】
本発明の抗体の好ましい投与経路は静脈内であるが、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、および皮内注射を使用してもよく、ならびに他の方法、例えば吸入を使用してもよい。特に好ましい投与方法は、例えば約１時間にわたる静脈内注入である。
【００８５】
医薬組成物は慣用の製薬手法にしたがって製剤化することができる（例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと）。
【００８６】
本発明の抗体の液体製剤には、タンパク質を溶液状態で安定化する物質、例えば糖、アルギニンまたは他のアミノ酸、クエン酸塩、Ｔｗｅｅｎ、またはヒト血清アルブミンを含ませてよい。リン酸緩衝生理食塩水を液体製剤として使用することもできる。
【００８７】
非液体製剤は、製薬上許容される賦形剤、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、ショ糖、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶性セルロース、デンプン、例えばジャガイモデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；造粒剤および崩壊剤（例えば、セルロース誘導体、例えば微結晶性セルロース、デンプン、例えばジャガイモデンプン、クロスカルメロース（croscarmellose）ナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸）；結合剤（例えば、ショ糖、グルコース、ソルビトール、アラビアガム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）；および潤滑剤、流動促進剤、および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）の使用を含んでもよい。他の製薬上許容される賦形剤は、着色剤、香味料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤、等でありうる。
【００８８】
好ましい投与頻度は１〜８週毎に約１回であり、より好ましくは１、２、または３週毎に約１回である。好ましい用量は７０ｋｇの成人について約２００〜２，０００ミリグラムであり、より好ましくは約４００〜１，２００ミリグラム、最も好ましくは約８００ミリグラム／７０ｋｇの成人である。一例では、７０キログラムの患者に約８００ミリグラムのＥＭＤ７２０００を３〜６週毎に約１回約３〜６サイクルで注入する。患者の疾患状態を例えば放射線技術によってモニターし、最初のセットのサイクルが成功であるとみなされれば、治療を継続する。追加情報については、Vanhoefer et al., J. Clin. Oncol. 22:175-184 (2004), Tabernero et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:192 (2003), およびSalazar et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23:127 (2004)を参照されたい。
【００８９】
併用療法
本発明の抗体を追加の抗癌治療と組み合わせて（例えば該治療前、治療中、または治療後に）使用して、腫瘍成長または転移を予防または低減することができる。追加の抗癌治療には、非限定的に、外科手術、放射線治療、化学療法、生物学的治療（例えば、サイトカイン、免疫療法（immunotherapy）、およびインターフェロン）、鑑別（differentiating）療法、免疫療法（immune therapy）、抗血管新生治療、抗転移治療、ＥＧＦＲのインヒビター、例えば別個の重複しないエピトープに結合する抗体ならびにＥＧＦＲキナーゼドメインの小分子インヒビター、非ステロイド性抗炎症剤、例えばシクロオキシゲナーゼインヒビター、およびホルモン治療が含まれる。非限定的な例には、パクリタキセル、イリノテカン、ナプロキセン、アスピリン、イブプロフェン、およびＶｅｌｃａｄｅＴＭが含まれる。前記追加の抗癌治療の例は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０３２３９６０号に見出せる。本発明の抗体は、単独または任意の追加の癌治療と組み合わせて、当技術分野において公知の種々の様式で、製剤化することができる。
【実施例】
【００９０】
実施例１．  ＥＭＤ７２０００のエピトープの特定
Kiekeら（米国特許第６，３００，０６５号）、Cochranら（Cochran et al., 上掲）、およびChaoら（Chao et al., 上掲）の「酵母ディスプレイ」法に本質的にしたがい、以下の具体的変更を施して、ＥＧＦＲ上のＥＭＤ７２０００のエピトープを特定した。Chaoらは、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン全体をＡｇａ２タンパク質に融合して酵母サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の表面で発現させると、不十分にしか発現されないことを見出した。したがって、彼らは、モノクローナル抗体１３Ａ９、Ｃ２２５、および８０６のエピトープの特定では、ＥＧＦＲのアミノ酸２７３〜６２１をＡｇａ２に融合させた。
【００９１】
ＥＭＤ７２０００は酵母の表面のＥＧＦＲ（２７３〜６２１）−Ａｇａ２融合タンパク質に不十分にしか結合しないことが見出された。したがって、酵母の表面でＡｇａ２融合タンパク質として効率的に発現される完全長ＥＧＦＲ細胞外ドメインの突然変異型誘導体を選択した。この突然変異型誘導体は、アミノ酸置換Ａｌａ６２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ６９Ｈｉｓ、Ｐｈｅ３８０Ｓｅｒ、およびＳｅｒ４１８Ｇｌｙを有する。
【００９２】
そしてChaoらの手順にしたがい、以下の改変を施して、ＥＭＤ７２０００結合を崩壊させるＥＧＦＲ突然変異を特定した。簡潔には、標準的手順にしたがって、ＥＧＦＲ−Ａｇａ２融合タンパク質をコードする発現プラスミドの集団を突然変異させ、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）に形質転換した。形質転換酵母細胞を、ＥＭＤ７２０００との結合を失っているＥＧＦＲ突然変異体についての４ラウンドの選択に付した。得られた集団は、特定の接触部位に影響するＥＧＦＲの突然変異体、ならびに折りたたみ構造を不安定化して抗体が適正に結合しないようにするＥＧＦＲの突然変異体を含むと予測された。ＥＧＦＲの１個以上のドメインの全体的構造に影響する突然変異体を排除するために、２回の追加選別を実施し、抗体２２５が細胞表面のＥＧＦＲに依然として結合する酵母細胞を選択した（図３）。抗体２２５が選択されたのは、２２５と（ＥＭＤ７２０００の誘導元である）４２５がＥＧＦＲ上の異なるエピトープに結合することがあらかじめ確立されていたからである（Kreysch, ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００４／０３２９６０号）。
【００９３】
突然変異型ＥＧＦＲを有する酵母に関する富化を行った後、１７個の独立した酵母クローンからＥＧＦＲ配列を決定した。全配列が、ＥＧＦＲアミノ酸４５２〜４６３中のアミノ酸置換に相当する突然変異を示した。表２は代表的な具体的置換を示す。複数の突然変異が特定されたケースもあるが、前記の全ケースで、４５２位、４５４位、４５７位、４６０位、４６１位、４６２位、または４６３位に突然変異が存在した。
【表２】
2009532358.tif 000003
【００９４】
実施例２．  ＥＧＦＲｖＩＩＩを認識する完全長抗体の構築
ＭＲ１−１とは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ中の新規なペプチド連結を認識する可変領域のセットを表す。Beers et al.（Clin Cancer Res. 6:2835-43 (2000)）では、ＭＲ１と称される親可変領域からの前記可変領域の最適化が記載されている。Landry et al.（J Mol Biol. 308:883-93 (2001)）では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ中の連結ペプチドに対応するペプチドを有するＭＲ１可変領域の解明された構造が記載されている。
【００９５】
以下の実施例での内在化研究においてＥＭＤ７２０００と比較する目的で、ヒトＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖を有するインタクトな抗体の関連でＭＲ１−１の可変領域を採用した。
【００９６】
以下の標準的方法を使用してＭＲ１−１を発現させた。ＭＲ１−１の重鎖および軽鎖Ｖ領域タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を、ｐＤＨＬ２の誘導体である抗体発現ベクターｐＤＨＬ１０に挿入した（Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989)）。
【００９７】
ＭＲ１−１重鎖Ｖ領域をコードする以下のＤＮＡ配列を使用した：
ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＴＣＡＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧ（配列番号２２）。
【００９８】
ＭＲ１−１軽鎖Ｖ領域をコードする以下のＤＮＡ配列を使用した：
ＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣＡＧＡＴＧＣＡＴＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＧＴＣＣＣＧＣＴＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＧＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣ（配列番号２３）。
【００９９】
エレクトロポレーションを使用して、上記ＭＲ１−１のインタクトな抗体をコードするＤＮＡをマウス骨髄腫ＮＳ／０細胞株に導入した。エレクトロポレーションを実施するために、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地で細胞を培養した。約５×１０６細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ ０．５ｍＬに再懸濁した。そしてＭＲ１−１のＶ領域およびヒトＩｇＧ１定常領域を有する抗体をコードする１０μｇの線状プラスミドＤＮＡを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（０．４ｃｍの電極ギャップ, BioRad）中で氷上で約１０分間、該細胞とインキュベートした。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（BioRad, Hercules, CA）を０．２５Ｖおよび５００μＦの設定で使用してエレクトロポレーションを実施した。細胞を氷上で約１０分間回復させ、その後、増殖培地に再懸濁し、２個の９６ウェルプレートにプレートした。
【０１００】
１００ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下での生育に基づいて、安定にトランスフェクションされたクローンを選択した。メトトレキセートはトランスフェクションの２日後に増殖培地に加えた。該細胞にさらに２〜３回２日おきに補充（feed）した。ＭＴＸ耐性クローンは２〜３週間で出現した。クローン由来の上清を抗Ｆｃ  ＥＬＩＳＡによってアッセイし、大量の抗ＧＤ２抗体を産生するクローンを特定した。高産生性クローンを単離し、１００ｎＭ ＭＴＸを含有する増殖培地で増殖させた。典型的に、無血清増殖培地、例えばＨ−ＳＦＭまたはＣＤ培地（Life Technologies）を使用した。
【０１０１】
実施例３．  Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに結合する抗体によるＥＧＦＲｖＩＩＩシグナル伝達の阻害
ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）由来の４種の細胞株を使用して、種々の抗体がＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩによるシグナル伝達を阻害する能力を試験した。該４種の細胞株の特性を下記表３に記載する。American Type Culture Collection（Manassas, VA USA）から親ＨＭＥＣを入手した。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞は、標準的手順によって構築されたＥＧＦＲｖＩＩＩ発現ウイルスでのウイルス性形質導入によって親ＨＭＥＣ細胞株から誘導した（例えばNishikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7727-7731 (1994)を参照のこと）。ウイルス性形質導入プロトコルおよびいくらかの増殖から回収した後、ＦＡＣＳ装置を使用して、うまく感染した細胞を高、中および低レベルのＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する集団に選別した。
【表３】
2009532358.tif 000004
【０１０２】
ＨＭＥＣを使用する理論的根拠は以下の通りであった。ＥＧＦＲは、正常な乳房発生に重要な役割を果たし、これらの細胞において高レベルで発現される。さらに、受容体媒介エンドサイトーシス、リサイクル、および分解に関するメカニズムはこれらの細胞で高レベルで作動する。
【０１０３】
ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する所定の抗体の、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩシグナル伝達に対する影響を測定するために、上記表に記載のＨＭＥＣの培養に放射性標識抗体を加えた。この実験の背景、理論的根拠および設計は以下の通りであった。通常、ＥＧＦＲ分子がシグナルを伝達する場合、細胞内シグナル伝達経路の活性化の結果として活発にエンドサイトーシスされる。このエンドサイトーシスは数分のオーダーで発生し、１５％／分までの、またはそれ以上の内在化速度を有する。ＥＧＦＲシグナル伝達の不存在下では、ＥＧＦＲは、バルク膜運動の一部分としてゆっくりと内在化され、約２％／分の内在化速度を有する。放射性標識された非中和抗体が哺乳動物細胞上のＥＧＦＲに結合すると、リガンドが存在する場合または何らかの他の理由でＥＧＦＲが構成的にシグナルを伝達する場合に、該抗体は高速で内在化される。放射性標識された中和抗体がＥＧＦＲに結合すると、シグナル伝達が停止し、シグナル伝達によって刺激されるエンドサイトーシスも停止する。その結果、ＥＧＦＲに結合している放射性標識された中和抗体は、約２％／分の遅い速度で内在化される。
【０１０４】
内在化速度を測定するために、図４に模式的に示されるWorthylakeら（Worthylake et al., 上掲）の方法を使用した。簡潔には、培養親ＨＭＥＣおよびＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＨＭＥＣに放射性標識抗体を加えた。０、１、２、３、５および１０分の時点で、細胞サンプルを取り出し、洗浄した後、酸ストリップし、表面結合放射性標識抗体を取り出して測定した。そして該細胞を溶解し、残りの放射性標識を測定して、内在化抗体のレベルを決定した。内在化速度は図５の式にしたがって算出した。
【０１０５】
放射性標識ＥＧＦ、ＥＭＤ７２０００、およびＭＲ１−１を用いて図６に示すデータを得た。別の実験で、非中和抗体１３Ａ９を用いてデータを得た。これらのデータは、放射性標識ＥＧＦが、４種のうちのいずれかの細胞株の表面に結合すると、約０．１４／分の速度ｋｅで高速に内在化されることを示し；すなわち、ＥＧＦの内在化の瞬間的速度は約１４％／分であった。
【０１０６】
放射性標識１３Ａ９を親ＨＭＥＣ細胞株に加えると、その内在化速度は０．０２５／分の範囲であり、バルク膜内在化に特徴的な低い内在化速度であった。対照的に、ＥＧＦを同時に存在させると、放射性標識１３Ａ９は、放射性標識ＥＧＦ内在化の速度と類似の速い速度で内在化された。これらの観察は、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦに関する非中和抗体としての１３Ａ９の説明と矛盾しない。
【０１０７】
また対照的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＨＭＥＣ細胞株では、放射性標識１３Ａ９が、ＥＧＦの存在および不存在下で高速で内在化された。これらの観察は、ＥＧＦＲｖＩＩＩが、構成的かつリガンド非依存的な様式でシグナル伝達および内在化可能であるという考えと矛盾しない。
【０１０８】
放射性標識ＥＭＤ７２０００が、ＥＧＦの存在下でＥＧＦＲのみを発現する親ＨＭＥＣと結合した場合、内在化速度は低かった。このことは、ＥＭＤ７２０００がインタクトなＥＧＦＲからのシグナル伝達を阻害することを示す。さらに、放射性標識ＥＭＤ７２０００が、ＥＧＦＲｖＩＩＩならびにインタクトなＥＧＦＲを発現するＨＭＥＣに結合した場合、内在化速度は低かった。このことは、ＥＭＤ７２０００が、ＥＧＦＲｖＩＩＩならびにインタクトなＥＧＦＲに起因するシグナル伝達を阻害することを示す。
【０１０９】
抗体ＭＲ１−１はＥＧＦＲｖＩＩＩ内の新規な連結ペプチドに結合する。具体的には、ＭＲ１−１は配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号２５）を認識する。該配列は、ＥＧＦＲのエキソン１およびエキソン８の近位（juxtaposition）から発現される。ＭＲ１−１は、細胞の表面で発現されるインタクトなＥＧＦＲに結合しない。放射性標識ＭＲ１−１は、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびインタクトなＥＧＦＲの両者を発現するＨＭＥＣによってゆっくり内在化される。理論に拘束されることを望まないが、インタクトなＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞を放射性標識ＭＲ１−１で処理すると、このタンパク質はＥＧＦＲｖＩＩＩにのみ結合し、それが結合している該受容体によるシグナル伝達を阻害するが、インタクトなＥＧＦＲには結合せず、したがってＥＧＦＲホモ二量体によるシグナル伝達は阻害されないようである。
【０１１０】
実施例４．  ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩシグナル伝達の抗体による阻害についての構造に基づく予測
ＥＭＤ７２０００によるＥＧＦＲｖＩＩＩシグナル伝達の阻害についての可能性のある構造的基礎を理解するために、およびＥＧＦＲｖＩＩＩおよびインタクトなＥＧＦＲの両者のシグナル伝達を阻害する抗体を得る方法を完全に説明するために、以下の構造モデルを構築した：
モデル１．  シグナル伝達コンホメーションにあるインタクトなＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩヘテロ二量体
モデル２．  シグナル伝達コンホメーションにあるＥＧＦＲｖＩＩＩホモ二量体
モデル３．  活性型コンホメーションにあるＥＧＦＲｖＩＩＩのモデル上のＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープの領域にドッキングしたＦａｂ
モデル４．  不活性型コンホメーションにあるＥＧＦＲｖＩＩＩのモデル上のＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープの領域にドッキングしたＦａｂ。
【０１１１】
これらのモデルのイメージを図７〜９に示す。タンパク質モデリングの技術分野の当業者は、そのような構造モデルを完全に理解するために、観察者が表示モデルを回転させ、移動させ（translate）、そのサイズを変化させることが可能なビューアプログラム、例えばＲａｓＭｏｌ（Sayle RA and Milner-White EJ, Trends Biochem. Sci. 20:374 (1995)）またはＳｗｉｓｓＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（Kaplan et al. Brief Bioinform. 2:195-7 (2001)）または他の類似のプログラムを使用して、そのようなモデルを見ることが最善であることを認識する。さらに、モデルの具体的特徴、例えば重要なアミノ酸およびポリペプチド鎖をユーザーが色付けおよび／またはラベルして、目的の特徴を強調することができる。
【０１１２】
ＳｗｉｓｓＰＤＢＶｉｅｗｅｒを使用して以下のようにモデルを構築した。モデル１のインタクトなＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩヘテロ二量体を構築するために、構造ファイル１ＭＯＸ（Garrett TP, et al., Cell 110:763-73 (2002)）中の１コピーのＥＧＦＲからアミノ酸１〜２７３を欠失させた。モデル２のＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＥＧＦＲｖＩＩＩホモ二量体を構築するために、構造ファイル１ＭＯＸ中の両コピーのＥＧＦＲからアミノ酸１〜２７３を欠失させた。アミノ酸２７４に融合されたアミノ酸１〜７をモデリングする試みは行わなかった。アミノ酸１〜７がＥＧＦＲｖＩＩＩ中で乱される（disordered）か、またはＬｙｓ／Ｌｙｓ配列位置で切断されると仮定されたからである。
【０１１３】
モデル１および２（図７）に基づいて、アミノ酸約２７４〜約３１０を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ中のドメイン２の残りが重要な二量体接触を構成し、かつ、おそらく、インタクトなＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩヘテロ二量体およびＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＥＧＦＲｖＩＩＩホモ二量体の形成に好都合なエネルギー的貢献を行うことが明らかであった。そのような好都合なエネルギー的貢献は、おそらく、ＥＧＦＲｖＩＩＩ中のドメイン２の残りが正確なコンホメーションにある場合にのみ可能であり、該コンホメーションは、本発明の理論によれば、インタクトなＥＧＦＲの活性型二量体中でアミノ酸２７４〜３１０が有する同じコンホメーションと一致する。
【０１１４】
モデル１にＦａｂ部分を加えることによってモデル３（図８）を構築した。該Ｆａｂ部分は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ中のＳｅｒ４６０およびＧｌｙ４６１の突出部に概ねドッキングさせた。このモデル構築作業の結果、Ｓｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープに対するＦａｂ断片の位置決定が、該Ｆａｂが活性型シグナル伝達コンホメーションにあるＥＧＦＲアミノ酸２７４〜３１０と立体的に衝突することを示すことが示唆された。しかし、そのようなＦａｂは、例えばモデル４の構造で観察される不活性型非シグナル伝達コンホメーションにあるＥＧＦＲアミノ酸２７４〜３１０と立体的に決して衝突しない。モデル３で位置決定されたＦａｂ部分を、不活性型コンホメーションにあるＥＧＦＲを有する構造中に配置することによってモデル４を構築した。
【０１１５】
理論に拘束されることを望まないが、これらの結果は、実施例２の観察結果、すなわちＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するＥＭＤ７２０００がＥＧＦＲｖＩＩＩのシグナル伝達を阻害することを説明すると思われる。
【０１１６】
さらに、これらの観察は本発明の方法を例証するものであり、ここで、活性状態および不活性状態のＥＧＦＲｖＩＩＩの三次元構造のモデルを比較し、活性状態で隠れているが不活性状態で露出している表面を発見し、そしてそのような表面上またはその付近に結合する抗体を特定することによって、本発明の抗体を特定する。活性状態および不活性状態のＥＧＦＲｖＩＩＩのモデルは、通常、活性状態および不活性状態のＥＧＦＲの解明されている構造のモデルからアミノ酸１〜２７３を除去することによって作製される。所望の表面に結合する抗体は、例えば、まず別個のエピトープを有する抗ＥＧＦＲ抗体を特定し、そして例えば酵母ディスプレイによって種々の抗体のエピトープを特定することによって特定される。
【０１１７】
他の実施形態
前記説明から、本明細書中に記載の発明にバリエーションおよび改変を施して、種々の用途および条件に適合させてよいことが明らかである。そのような実施形態もまた特許を受けようとする発明の範囲内である。
【０１１８】
本明細書中に記載のすべての刊行物、特許出願、および特許（２００６年３月３１日出願の米国仮特許出願第６０／７８８，４２６号を含む）は、独立した各刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に、参照により組み入れられると指定されているのと同程度に、参照により本明細書中に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、インタクトなＥＧＦ受容体の、非シグナル伝達性の単量体状態およびＥＧＦ等のリガンドと結合しているシグナル伝達性の二量体状態の相互変換を模式的に示す。図の上部は細胞外ＥＧＦＲドメインを示し、図の下部は細胞内ドメインを示す。細胞内ドメインには、キナーゼドメイン（水平ストライプ）および二量体化するとリン酸化される隣接Ｃ末端領域が含まれる。図の左側は、遊離の上皮成長因子（ＥＧＦ；斜めのストライプ）およびリガンド未結合型ＥＧＦＲを示す。リガンド未結合型ＥＧＦＲの特徴は、ドメイン２からの伸長部分がドメイン４のＣ末端の膜に近接した領域と相互作用し、ドメイン２およびドメイン４の両者の二量体化表面が埋もれていることである。図の右側は、二量体のリガンド結合状態のＥＧＦＲを示す。この立体配置では、リガンド、例えばＥＧＦまたはＴＧＦαがＥＧＦＲのドメイン１およびドメイン３と相互作用し、ドメイン２およびドメイン４が二量体化の接触部分を構成する。活性および不活性状態のＥＧＦＲの間の相互変換には、ドメイン２および３の連結部分を中心にして回転する大規模な運動が関与する。二量体化の結果、細胞内キナーゼドメインが互いに近接し、かつチロシンリン酸化のための基質部位に近接する。
【図２】図２は、抗ＥＧＦＲ抗体可変領域軽鎖（配列番号１〜６）および重鎖（配列番号７〜１２）のアライメントを示す。４２５（軽鎖および重鎖に関してそれぞれ配列番号２および８）は、ＥＭＤ７２０００の誘導元のマウスモノクローナル抗体である。ＥＭＤ７２０００（軽鎖および重鎖に関してそれぞれ配列番号３および９）は、４２５可変領域のフレームワーク領域に突然変異を含有し、ヒト可変領域との類似性が高められている。Ｈ−Ｒ３（軽鎖および重鎖に関してそれぞれ配列番号１および７）は、独立に単離された、ＥＧＦＲに結合する抗体であり、米国特許第６，５０６，８８３号に記載されている。２２５（軽鎖および重鎖に関してそれぞれ配列番号４および１０）は、４２５／ＥＭＤ７２０００エピトープと異なるエピトープに結合するマウスモノクローナル抗体である。Ｃｕｒ６（軽鎖および重鎖に関してそれぞれ配列番号５および１１）およびＣｕｒ６３（軽鎖および重鎖に関してそれぞれ配列番号６および１２）は追加の抗ＥＧＦＲ抗体であり、米国特許出願公開第２００５０１００５４６号に記載されている。
【図３】図３は、酵母ディスプレイに基づく、ＥＭＤ７２０００が結合しない突然変異型ＥＧＦＲの単離中のＦＡＣＳ解析を示す。左パネルは、突然変異型ＥＧＦＲおよびエピトープタグを発現する酵母細胞の集団を示し、該集団に、蛍光標識されたＥＭＤ７２０００および別様式で蛍光標識されたエピトープタグ認識抗体が加えられている。このパネルは、ＥＭＤ７２０００結合の喪失に関する４ラウンドの選択を経過している細胞を示す。Ｙ軸はＥＭＤ７２０００結合を示し、Ｘ軸はエピトープタグを認識する抗体の結合を示す。左下のスポットのクラスターは、ＥＧＦＲを発現するプラスミドを失った細胞を示す。パネルの中央に向かうスポットのクラスターは、ＥＭＤ７２０００およびエピトープタグ認識抗体の両者がほぼ等しい割合で結合している細胞を示す。台形中に含まれるスポットは、エピトープタグ認識抗体の結合を保持するが、ＥＭＤ７２０００との結合を失ったと思われる細胞を示す。右側のパネルは、左パネルの台形内から得られる集団に由来する酵母細胞のＦＡＣＳ解析を示す。この右パネルは、蛍光標識された抗体２２５および別様式で蛍光標識されたエピトープタグ認識抗体が加えられている酵母細胞を示す。この右パネルは、抗体２２５結合の保持に関する２ラウンドの選択を経過した集団を示す。Ｙ軸は２２５結合を示し、Ｘ軸はエピトープタグを認識する抗体の結合を示す。左下のスポットのクラスターはここでも、ＥＧＦＲを発現するプラスミドを失った細胞を示す。パネルの中央に向かうスポットのクラスターは、抗体２２５およびエピトープタグ認識抗体の両者がほぼ等しい割合で結合している細胞を示す。台形中に含まれるスポットは、エピトープタグ認識抗体および２２５の結合を保持するが、以前の選択に基づいてＥＭＤ７２０００との結合を失ったと思われる細胞を示す。
【図４】図４は、ＥＧＦＲに結合する放射性標識タンパク質の細胞内への内在化の速度を測定するために使用されるプロトコルを説明する。
【図５】図５は、放射性標識タンパク質の細胞内への内在化の速度を算出するために使用される数学的モデルを模式的に説明する。
【図６】図６は、不死化された非形質転換ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）における放射性標識ＥＧＦ、ＥＭＤ７２０００、およびＭＲ１−１の内在化の速度（ｋｅ）を示すグラフである。白色の棒グラフは、ＥＧＦＲｖＩＩＩではなく約２×１０５のＥＧＦＲ／細胞を発現する親ＨＭＥＣの内在化速度を示す。細い黒色ストライプの棒グラフ、太い黒色ストライプの棒グラフ、および黒色の棒グラフは、細胞あたり２×１０５ ＥＧＦＲを発現することに加えて、それぞれ５×１０４ ＥＧＦＲｖＩＩＩ、５×１０４ ＥＧＦＲｖＩＩＩ、５×１０４ ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するトランスフェクトＨＭＥＣにおける内在化速度を示す。
【図７】図７は、インタクトなＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩヘテロ二量体（上段パネル）およびＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＥＧＦＲｖＩＩＩホモ二量体（下段パネル）の構造モデルを示す。表示を簡単にするために、側鎖は隠され、連結されているアルファ炭素鎖のみが示されている。
【図８】図８は、活性型コンホメーションにあるＥＧＦＲｖＩＩＩのドメイン２および３のモデルにおけるＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープ上に位置するＦａｂ（灰色）の構造モデルを示す。上段のモデルはポリペプチド主鎖のアルファ炭素トレースのみを示す。Ｆａｂは左上方の角にある（灰色）。ＥＧＦＲのドメイン３は図の下部であり、ＥＧＦＲｖＩＩＩ中に存在するドメイン２の残りは右側で、楕円に囲まれている。下段のモデルは同じ向きの同複合体であるが、水素を除くすべての主鎖および側鎖原子を示している。表示を簡単にするためにＮ結合型オリゴ糖は示していない。
【図９】図９は、不活性型コンホメーションにあるＥＧＦＲｖＩＩＩのドメイン２および３のモデルにおけるＳｅｒ４６０／Ｇｌｙ４６１エピトープ上に位置するＦａｂ（灰色）の構造モデルを示す。上段のモデルはポリペプチド主鎖のアルファ炭素トレースのみを示す。Ｆａｂは左上方の角にある（灰色）。ＥＧＦＲのドメイン３は図の下部であり、ＥＧＦＲｖＩＩＩ中に存在するドメイン２の残りは右側で、楕円に囲まれている。下段のモデルは同じ向きの同複合体であるが、水素を除くすべての主鎖および側鎖原子を示している。表示を簡単にするためにＮ結合型オリゴ糖は示していない。
【図１】
2009532358.tif 000005
【図２】
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【図３】
2009532358.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009532358.tif 000014
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