(57)【要約】  ロスコビチン等のＣＤＫ阻害剤を用いて、顆粒球、例えば、好中球のアポトーシスを誘導する方法が本明細書に記載される。したがって、炎症性疾患を治療する方法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球のアポトーシスを誘導及び／又は加速する方法であって、前記顆粒球に、有効用量のＣＤＫ阻害剤を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
個体において顆粒球介在性障害又は疾患を治療する方法であって、ＣＤＫ阻害剤の投与を含む方法。
【請求項３】
疾患又は障害が、炎症性疾患又は障害である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
疾患又は障害が、非腫瘍性炎症性疾患である、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記治療が、非増殖段階の炎症性疾患の治療である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患又は障害が、慢性炎症性疾患又は障害である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患又は障害が、急性炎症性疾患又は障害である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患又は障害が、呼吸器疾患又は障害である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
疾患又は障害が、間質性肺疾患、胸膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び急性呼吸器疾患からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記間質性肺疾患が、急性間質性肺炎又は特発性肺線維症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患又は障害が関節炎である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
疾患又は障害が、アレルギー性障害である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ１及び／又はＣＤＫ２の阻害剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ５の阻害剤である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤＫ阻害剤が、ピリミジン又はプリンベースの阻害剤である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤＫ阻害剤が、ロスコビチン、ＮＧ７５又はヒメニアルジシンを含む群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
顆粒球介在性疾患の治療のための薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用。
【請求項１８】
疾患又は障害が、炎症性疾患又は障害である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
疾患又は障害が非腫瘍性炎症性疾患である、請求項１７又は請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記治療が、非増殖段階の炎症性疾患の治療である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記疾患又は障害が、慢性炎症性疾患又は障害である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記疾患又は障害が、急性炎症性疾患又は障害である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記疾患又は障害が、呼吸器疾患又は障害である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
疾患又は障害が、間質性肺疾患、胸膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び急性呼吸器疾患からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記間質性肺疾患が、急性間質性肺炎又は特発性肺線維症である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患又は障害が関節炎である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
疾患又は障害がアレルギー性障害である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ１及び／又はＣＤＫ２の阻害剤である、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ５の阻害剤である、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
ＣＤＫ阻害剤がピリミジン又はプリンベースの阻害剤である、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＣＤＫ阻害剤が、ロスコビチン、ＮＧ７５又はヒメニアルジシンを含む群から選択される、請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、白血球においてアポトーシスを誘導する方法、並びに炎症性疾患、特に慢性及び／又は持続性炎症性疾患の治療におけるこのような方法の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
好中球系顆粒球は、自然免疫において極めて重要な役割を果たし、感染及び損傷部位へ迅速に動員される。しかし、侵入している微生物を死滅させて破壊し、消化するためにこれらの細胞によって用いられる多数の防御機構（例えば、顆粒内容物の放出及び反応性酸素種の生成）が宿主組織にとって有害である可能性がある。したがって、これらの炎症細胞の生理学的機能が達成されると、それらが迅速に炎症部位から除去されることが極めて重要である。炎症を自発的に回復する間に、好中球はアポトーシス；予めプログラムされ、高度に調節された細胞死プロセスを受ける（Ｓａｖｉｌｌ，Ｊ．Ｓ．ら．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８３巻、８６５〜８７５頁（１９８９年）、及び、Ｓａｖｉｌｌ，Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４３巻、１７０〜１７３頁（１９９０年））。好中球生存とアポトーシスは、炎症環境；例えば、炎症性メディエーター（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ）、環境条件（例えば、低酸素症）によって大きく影響を受け、アポトーシス促進性刺激（例えば、ＴＮＦα、ＦａｓＬ）の存在は、好中球寿命を劇的に変化させ得る（Ｇｉｌｒｏｙ，Ｄ．Ｗ，．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ３巻、４０１〜４１６頁（２００４年）、Ｒｉｌｅｙ，Ｎ．Ａ．らＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ＆Ａｎｔｉ−Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５巻、３〜１２頁（２００６年））。アポトーシスが行われると、好中球分泌活性は止まり、細胞は無傷のままで、炎症促進反応を誘発しない新規の認識機構を用いるマクロファージによって貪食される（Ｓａｖｉｌｌ，Ｊ．Ｓ．らＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８３巻、８６５〜８７５頁（１９８９年）、Ｗｈｙｔｅ，Ｍ．Ｋ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５０巻、５１２４〜５１３４頁（１９９３年））。しかし、マクロファージ食作用又は好中球アポトーシスが損なわれている場合には、結果として慢性炎症が起こり得る（Ｇｉｌｒｏｙ，Ｄ．Ｗ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ３巻、４０１〜４１６頁（２００４年）、Ｒｉｌｅｙ，Ｎ．Ａ．らＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ＆Ａｎｔｉ−Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５巻、３〜１２頁（２００６年）及びＪｏｎｓｓｏｎ，Ｈ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  １１巻、６６６〜６７１頁（２００５年））。したがって、炎症細胞生存とアポトーシス間のバランスの調節に関与する機序は、考慮すべき研究努力の対象である。
【０００３】
真核細胞の細胞分裂は、４つの別個の期で起こる；ＤＮＡ複製が準備されるＧ１期、次いで、染色体複製が起こる合成（Ｓ）期；これに、細胞を準備するギャップ（Ｇ２）期、次いで、有糸分裂（Ｍ）期が続き、最終的に細胞分裂をもたらし、その後、Ｇ１に戻り、この周期を繰り返す。例えば、増殖因子が取り除かれている、又は好中球等のように細胞が最終分化している特定の状況では、細胞は、Ｇ０期にとどまる。細胞周期の各段階で、細胞が分裂を行う前に、染色体複製及び分裂の正確な順序及び質を制御する重要なチェックポイントがある。
【０００４】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、従来、細胞周期の重要な調節因子として記載されており、これでは、種々のＣＤＫは、その関連サイクリンパートナーと複合体形成した場合に細胞周期進行中に活性化する（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｋら  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．  ３６巻、１３１〜１４９頁（２００３年））。この理由のために、特異的阻害剤によるＣＤＫの阻害は、腫瘍進行を防ぐ又は制限するための標的とされてきた。実際、ＣＤＫ阻害剤は、現在、食道癌、肺癌、前立腺癌及び非小細胞肺癌のための臨床試験にある（Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ，Ａ．Ｍ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２巻、６６０９〜６６２０頁（２００３年））。興味深いことに、ＣＤＫはまた、アポトーシスも調節でき、最近の証拠から、これらのキナーゼはまた、最終分化したニューロンにおける死の調節においても明確な役割を果たしている可能性があるということも示唆されている（Ｍｏｎａｃｏ＆Ｖａｌｌａｎｏ、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  １０巻、３６７〜３７９頁（２００３年））。好中球は、その他の顆粒球のように、最終分化した細胞であり、したがって、現在の文献に基づいて、Ｒ−ロスコビチン等のＣＤＫ阻害剤は、効果がないか、又はニューロンに対する効果と同様に、アポトーシスを阻害すると予想される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで好中球及び好中球性炎症に対するＣＤＫ阻害剤の効果を調べた。上記のように、好中球等の顆粒球が最終分化した細胞であることを考え、ニューロンに対するＣＤＫ阻害剤の効果を考えると、ＣＤＫ阻害剤は、効果がないか、又はこれらの細胞のアポトーシスに対して阻害効果を有すると予想された。しかし、以下に詳述するように、予想に反して、本発明者らは、好中球がＣＤＫを発現し種々のＣＤＫ阻害剤がカスパーゼ依存性好中球アポトーシスを直接誘導し、多量の生存因子によって誘導される生存を阻害することを示した。
【０００６】
したがって、本発明の第１の態様において、顆粒球のアポトーシスを誘導又は加速する方法が提供され、前記方法は、前記顆粒球に有効用量のＣＤＫ阻害剤を投与するステップを含む。
【０００７】
一実施形態では、顆粒球は非増殖性顆粒球である。
【０００８】
ＣＤＫ阻害剤が顆粒球でアポトーシスを誘導するという発見によって、顆粒球の活性が疾患の病態の一因となっている疾患又は状態の治療において、このような化合物を用いることが可能となる。したがって、本発明の第２の態様では、個体において顆粒球介在性疾患を治療する方法が提供され、前記方法は前記個体へ有効用量のＣＤＫ阻害剤を投与するステップを含む。
【０００９】
実施例に記載されるように、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＣＤＫ阻害剤、Ｒ−ロスコビチンが、カラゲナン誘発性の急性胸膜炎症マウスモデルの回復を著しく促進すること、及びこの回復が、Ｒ−ロスコビチン誘導性カスパーゼ誘導性アポトーシス促進効果によって駆動されることを示した。抗炎症性及び炎症に対する回復促進効果はまた、２つのさらなる炎症モデルにおいても実証された。これらの知見は、ＣＤＫ阻害剤は、炎症性疾患の回復を促進するために使用できるということを示唆する。
【００１０】
したがって、本発明の一実施形態では、疾患は炎症性疾患である。
【００１１】
本発明の第３の態様は、顆粒球介在性状態、例えば、炎症性疾患の治療のための薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用を含む。
【００１２】
さらなる態様は、顆粒球介在性状態、例えば、炎症性疾患の治療において使用するためのＣＤＫ阻害剤を含む。
【００１３】
しかし、本発明の方法は、任意の顆粒球介在性疾患を治療するために使用できる。本発明の一実施形態では、顆粒球介在性疾患は、非増殖性顆粒球によって媒介される疾患である。一実施形態では、疾患は、好中球介在性疾患である。しかし、本発明のその他の実施形態は、好酸球又は好塩基球介在性疾患の治療を含み得る。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明は、１種又は複数の症状が、主に顆粒球の存在、浸潤及び／又は活性化によって引き起こされる疾患を治療するために使用できる。一実施形態では、疾患は、顆粒球の存在、浸潤及び／又は活性化が、１種又は複数の症状の唯一の原因である顆粒球介在性疾患である。
【００１５】
一実施形態では、疾患又は障害は、非腫瘍性炎症性疾患である。
【００１６】
一実施形態では、疾患は、非増殖段階の炎症性疾患である。
【００１７】
疾患は、慢性疾患であり得る。もう１つの実施形態では、疾患は急性であり得る。
【００１８】
本発明では、任意の適したＣＤＫ阻害剤を使用してよい。本発明の一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ１及び／又はＣＤＫ２の阻害剤である。本発明のもう１つの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ５の阻害剤である。
【００１９】
本発明の一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、プリン又はピリミジン類似体である。特定の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤はロスコビチンである。もう１つの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤はＮＧ７５である。もう１つの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）（ＨＤ）である。
【００２０】
本発明の各態様の好ましい特徴は、文脈から別に要求されない限り、変更すべきところは変更して、その他の態様の各々について同様である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ結合によって評価される、ヒト好中球アポトーシスに対するＣＤＫ阻害剤の効果を示す図である。値は、少なくともｎ＝３の平均±標準誤差を表す。＊＊（ｐ＜０．００１）は、対照からの有意差を表す。
【図１ｂ】種々のＣＤＫ阻害剤が、好中球の時間依存性アポトーシスを誘導することを示す図である。値は、少なくともｎ＝３の平均±標準誤差を表す。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．００１）は、対照からの有意差を表す。
【図１ｃ】ＣＤＫ阻害剤ＮＧ７５が、アネキシンＶ結合を増強すること、及び誘導された形態変化が好中球アポトーシスを示すことを示す図である（図１ｃ〜ｅ）。左パネル：時間間隔０時間でとられた、ＮＧ７５処理された好中球のフローサイトメトリードットプロット。非アポトーシス細胞は灰色で、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ＋ｖｅ細胞は緑、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ＋ｖｅ／ＰＩ＋ｖｅ細胞は赤で示されている。右パネル：以下の時間間隔０時間でとられたＮＧ７５処理された好中球の顕微鏡写真。通常の多葉核の好中球形態を示す。アポトーシスは、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ結合によって評価し、形態によって確認した。
【図１ｄ】ＣＤＫ阻害剤ＮＧ７５が、アネキシンＶ結合を増強すること、及び誘導された形態変化が好中球アポトーシスを示すことを示す図である（図１ｃ〜ｅ）。左パネル：時間間隔８時間でとられた、ＮＧ７５処理された好中球のフローサイトメトリードットプロット。非アポトーシス細胞は灰色で、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ＋ｖｅ細胞は緑、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ＋ｖｅ／ＰＩ＋ｖｅ細胞は赤で示されている。右パネル：以下の時間間隔８時間でとられたＮＧ７５処理された好中球の顕微鏡写真。矢印は、凝縮された核を示す通常のアポトーシスの好中球形態を示す。アポトーシスは、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ結合によって評価し、形態によって確認した。
【図１ｅ】ＣＤＫ阻害剤ＮＧ７５が、アネキシンＶ結合を増強すること、及び誘導された形態変化が好中球アポトーシスを示すことを示す図である（図１ｃ〜ｅ）。左パネル：時間間隔２０時間でとられた、ＮＧ７５処理された好中球のフローサイトメトリードットプロット。非アポトーシス細胞は灰色で、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ＋ｖｅ細胞は緑、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ＋ｖｅ／ＰＩ＋ｖｅ細胞は赤で示されている。右パネル：以下の時間間隔２０時間でとられたＮＧ７５処理された好中球の顕微鏡写真。矢印は、アポトーシスの好中球を示し、核染色がなく、細胞膜は「漏出性」のようである。この種の形態は、２０時間のフローサイトメトリーによって見られるアネキシン−Ｖ＋ｖｅ／ＰＩ＋ｖｅ細胞からなるものであり得る。アポトーシスは、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ結合によって評価し、形態によって確認した。
【図１ｆ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、好中球のｄｂｃＡＭＰ、ＧＭＣＳＦ及びＬＰＳ介在性生存を逆転することを示す図である。（ｐ＜０．００１）は、関連生存剤の対照からの有意差を表す。値は、ｎ＝３の平均±標準誤差を表す。＃（ｐ＜０．０５）は、対照からの有意差を表す。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．００１）は、関連生存剤の対照からの有意差を表す。
【図１ｇ】ＣＤＫ阻害剤ＮＧ７５は、好中球のｄｂｃＡＭＰ、ＧＭＣＳＦ及びＬＰＳ介在性生存を逆転することを示す図である。（ｐ＜０．００１）は、関連生存剤の対照からの有意差を表す。値は、ｎ＝３の平均±標準誤差を表す。＃（ｐ＜０．０５）は、対照からの有意差を表す。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．００１）は、関連生存剤の対照からの有意差を表す。
【図１ｈ】ＣＤＫ阻害剤ＨＤは、好中球のｄｂｃＡＭＰ、ＧＭＣＳＦ及びＬＰＳ介在性生存を逆転することを示す図である。（ｐ＜０．００１）は、関連生存剤の対照からの有意差を表す。値は、ｎ＝３の平均±標準誤差を表す。＃（ｐ＜０．０５）は、対照からの有意差を表す。＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．００１）は、関連生存剤の対照からの有意差を表す。
【図２ａ】好中球におけるＣＤＫタンパク質及び活性及びＣＤＫ阻害剤のアポトーシス促進性効果を支配する機序を示す図である。カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋが、好中球のＲ−ロスコビチン誘導性アポトーシスを阻害することを示す。値は、ｎ＝４の平均±標準誤差を表す。＊（ｐ＜０．０５）対照からの有意差。
【図２ｂ】好中球におけるＣＤＫタンパク質及び活性及びＣＤＫ阻害剤のアポトーシス促進性効果を支配する機序を示す図である。好中球においてＣＤＫ１及びＣＤＫ２タンパク質が発現されること及びＲ−ロスコビチンが好中球においてカスパーゼ切断を誘発することを示す。ブロットは、少なくとも３つの別個の実験を代表するものである。
【図２ｃ】好中球におけるＣＤＫタンパク質及び活性及びＣＤＫ阻害剤のアポトーシス促進性効果を支配する機序を示す図である。ＣＤＫ１及びＣＤＫ２タンパク質発現が、好中球アポトーシスの間に変化しないことを示す。ブロットは、３つの別個の実験を代表するものである。
【図２ｄ】好中球におけるＣＤＫタンパク質及び活性及びＣＤＫ阻害剤のアポトーシス促進性効果を支配する機序を示す図である（図２ｄ及びｅ）。好中球においてＣＤＫ１活性が存在し、抗Ｆａｓ抗体ＣＨ１１によって誘導されるアポトーシス後に低下することを示す。結果は、少なくとも３つの別個の実験を代表するものである。結果は、少なくとも３つの別個の実験を代表するものである。
【図２ｅ】好中球におけるＣＤＫタンパク質及び活性及びＣＤＫ阻害剤のアポトーシス促進性効果を支配する機序を示す図である（図２ｄ及びｅ）。好中球においてＣＤＫ１活性が存在し、抗Ｆａｓ抗体ＣＨ１１によって誘導されるアポトーシス後に低下することを示す。結果は、少なくとも３つの別個の実験を代表するものである。結果は、少なくとも３つの別個の実験を代表するものである。
【図２ｆ】好中球におけるＣＤＫタンパク質及び活性及びＣＤＫ阻害剤のアポトーシス促進性効果を支配する機序を示す図である。Ｒ−ロスコビチンが、好中球において生存因子によって誘導されるＭｃｌ−１タンパク質発現を低減することを示す。ヒト好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、バッファー、ＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）、Ｒ−ロスコビチン（２０μＭ）又はＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）及びＲ−ロスコビチン（２０μＭ）を用いて４時間処理した。続いて、サンプルを溶解し、ＳＤＳゲルでタンパク質を分離した。ウエスタンブロッティング後、ＰＶＤＦメンブランを、抗Ｍｃｌ−１抗体でプローブした。ブロットは、少なくとも３つの別個の実験を代表するものである。
【図３ａ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの、カラゲナン誘導性胸膜炎の回復に対する効果を示す図である（図３ａ〜ｃ）。ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症の回復を用量依存的に促進した。総胸膜炎症細胞数を測定した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図３ｂ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの、カラゲナン誘導性胸膜炎の回復に対する効果を示す図である（図３ａ〜ｃ）。ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症の回復を用量依存的に促進した。単核細胞数及びＰＭＮ数を測定した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図３ｃ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの、カラゲナン誘導性胸膜炎の回復に対する効果を示す図である（図３ａ〜ｃ）。ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症の回復を用量依存的に促進した。浸出液容積を測定した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図３ｄ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの、カラゲナン誘導性胸膜炎の回復に対する効果を示す図である（図３ｄ〜ｆ）。ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症性サイトカイン、ＩＬ−６を低減した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図３ｅ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの、カラゲナン誘導性胸膜炎の回復に対する効果を示す図である（図３ｄ〜ｆ）。ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症性サイトカイン、ＩＦＮ−γを低減した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図３ｆ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの、カラゲナン誘導性胸膜炎の回復に対する効果を示す図である（図３ｄ〜ｆ）。ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症性サイトカイン、ＭＣＰ−１を低減した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図３ｇ】ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの、カラゲナン誘導性胸膜炎の回復に対する効果を示す図である。ＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症の回復を時間依存性に促進した。１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）又は１００ｍｇ／ｋｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）で処理した。マウスを、カラゲナン後２４時間、４８時間及び１６６時間のいずれかで屠殺し、総胸膜炎症細胞数を調べた。値は、１群あたり５〜６匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図４ａ】カラゲナン誘発性胸膜炎のＲ−ロスコビチンによって増強される回復におけるカスパーゼ依存性アポトーシスの役割を示す図である（図４ａ及びｂ）。カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋは、カラゲナン誘導性炎症のＲ−ロスコビチン誘導性回復を防ぐ。総胸膜炎症細胞数を測定した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図４ｂ】カラゲナン誘発性胸膜炎のＲ−ロスコビチンによって増強される回復におけるカスパーゼ依存性アポトーシスの役割を示す図である（図４ａ及びｂ）。カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋは、カラゲナン誘導性炎症のＲ−ロスコビチン誘導性回復を防ぐ。浸出液容積を測定した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図４ｃ】カラゲナン誘発性胸膜炎のＲ−ロスコビチンによって増強される回復におけるカスパーゼ依存性アポトーシスの役割を示す図である。カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋは、カラゲナン誘導性炎症のＲ−ロスコビチン誘導性回復の際にアポトーシスを防ぐ。１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、１０ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）及び／又は１μｇ／ＫｇのｚＶＡＤ−ｆｍｋ（４時間間隔で腹腔内）を用いて腹腔内で処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、胸膜炎症細胞において、アネキシンＶ標識及びフローサイトメトリーによってアポトーシスを分析した。炎症細胞アポトーシスはまた、ヘマトキシリン及びエオシン染色した細胞遠心分離調製物での形態によって評価した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図４ｄ】カラゲナン誘発性胸膜炎のＲ−ロスコビチンによって増強される回復におけるカスパーゼ依存性アポトーシスの役割を示す図である（図４ｄ〜ｇ）。Ｒ−ロスコビチンは、胸腔洗浄浸出液及び肺組織において炎症を低減し、胸腔洗浄液中のアポトーシス小体含有マクロファージの数を減少させる。１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、ビヒクル対照（図４ｄ及びｆ）及び１００ｍｇ／ｋｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）（図４ｅ及びｇ）で腹腔内処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、胸腔洗浄及び肺、それぞれの細胞遠心分離調製物及び組織切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、形態学的調査によって顕微鏡によって分析し（元の倍率×４０）、生存好中球が、アスタリスクで示されており（図４ｄ）、矢印は貪食されたアポトーシス性好中球を示す（図４ｅ）。
【図４ｅ】カラゲナン誘発性胸膜炎のＲ−ロスコビチンによって増強される回復におけるカスパーゼ依存性アポトーシスの役割を示す図である（図４ｄ〜ｇ）。Ｒ−ロスコビチンは、胸腔洗浄浸出液及び肺組織において炎症を低減し、胸腔洗浄液中のアポトーシス小体含有マクロファージの数を減少させる。１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）で腹腔内処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、胸腔洗浄及び肺、それぞれの細胞遠心分離調製物及び組織切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、形態学的調査によって顕微鏡によって分析し（元の倍率×４０）、矢印は貪食されたアポトーシス性好中球を示す。
【図４ｆ】カラゲナン誘発性胸膜炎のＲ−ロスコビチンによって増強される回復におけるカスパーゼ依存性アポトーシスの役割を示す図である（図４ｄ〜ｇ）。Ｒ−ロスコビチンは、胸腔洗浄浸出液及び肺組織において炎症を低減し、胸腔洗浄液中のアポトーシス小体含有マクロファージの数を減少させる。１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、ビヒクル対照で腹腔内処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、胸腔洗浄及び肺、それぞれの細胞遠心分離調製物及び組織切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、形態学的調査によって顕微鏡によって分析した（元の倍率×４０）。
【図４ｇ】カラゲナン誘発性胸膜炎のＲ−ロスコビチンによって増強される回復におけるカスパーゼ依存性アポトーシスの役割を示す図である（図４ｄ〜ｇ）。Ｒ−ロスコビチンは、胸腔洗浄浸出液及び肺組織において炎症を低減し、胸腔洗浄液中のアポトーシス小体含有マクロファージの数を減少させる。１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）で腹腔内処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、胸腔洗浄及び肺、それぞれの細胞遠心分離調製物及び組織切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、形態学的調査によって顕微鏡によって分析した（元の倍率×４０）。
【図５ａ】ブレオマイシン誘導性肺炎症及び血清誘導性関節炎の回復に対するＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの効果を示す図である。肺中に見られる好中球の総数は、ブレオマイシン誘導性肺炎症後のＲ−ロスコビチンによって減少する。値は、１群あたり６匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【図５ｂ】ブレオマイシン誘導性肺炎症及び血清誘導性関節炎の回復に対するＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの効果を示す図である（図５ｂ〜ｄ）。Ｒ−ロスコビチンは、ブレオマイシン誘導性肺損傷の慢性モデルにおいて炎症及び組織損傷を阻害する。画像は、１群あたり６匹のマウスを代表するものである。
【図５ｃ】ブレオマイシン誘導性肺炎症及び血清誘導性関節炎の回復に対するＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの効果を示す図である（図５ｂ〜ｄ）。Ｒ−ロスコビチンは、ブレオマイシン誘導性肺損傷の慢性モデルにおいて炎症及び組織損傷を阻害する。画像は、１群あたり６匹のマウスを代表するものである。
【図５ｄ】ブレオマイシン誘導性肺炎症及び血清誘導性関節炎の回復に対するＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの効果を示す図である（図５ｂ〜ｄ）。Ｒ−ロスコビチンは、ブレオマイシン誘導性肺損傷の慢性モデルにおいて炎症及び組織損傷を阻害する。画像は、１群あたり６匹のマウスを代表するものである。
【図５ｅ】ブレオマイシン誘導性肺炎症及び血清誘導性関節炎の回復に対するＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの効果を示す図である。Ｒ−ロスコビチンは、受動的に誘導された関節炎の回復を増強する。データは、Ｒ−ロスコビチンの最初の注射の３日前に得られた臨床スコアのパーセンテージとして表されている。＊＊＊Ｐ＜０．００１  二元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。
【詳細な説明】
【００２２】
本発明は、種々のＣＤＫ阻害剤が、顆粒球、例えば、好中球のアポトーシスを誘導及び加速し、したがって、このような化合物は、顆粒球と関連している疾患又は顆粒球によって媒介される疾患の治療において使用できるという驚くべき証明に基づいている。上記のように、ＣＤＫ阻害剤は、種々の癌の治療における使用のために提案されてきたが、これらの化合物が、顆粒球に対してアポトーシス促進効果を有することは予想されていなかった。実際、ＣＤＫ阻害剤のニューロンに対する効果及び顆粒球が最終分化細胞であるという事実に基づいて、ＣＤＫ阻害剤は、顆粒球のアポトーシスを阻害するか、このような細胞に対して何の効果もないと予想される。
【００２３】
したがって、本発明は、顆粒球においてアポトーシスを誘導する新規手段を提供し、顆粒球によって媒介される疾患を治療する手段となる。
【００２４】
顆粒球
顆粒球は、顕著な細胞質顆粒を特徴とする白血球の一クラスである。３つの主要な顆粒球細胞種：好中球、好酸球及び好塩基球がある。
【００２５】
好中球
顆粒球のうち最も多数のものは、好中球であり、これは血液白血球の約６０％を占める。炎症の際は、血液中に存在する好中球の数が、劇的に増加する。これらの細胞は高度に食作用性があり、侵入病原体、特に、細菌に対する防御の第一線を形成する。それらはまた、急性炎症の際の損傷後の壊死組織の食作用にも関与している。病原体に対して好中球によって使用される多数の防御機構、例えば、顆粒内容物の放出及び反応性酸素種の生成は、炎症促進性であり、宿主組織に損傷を与える。好中球の過剰の活性化及び／又は損なわれた好中球アポトーシスを特徴とする状態では、慢性又は持続性炎症が結果として起こり得る。
【００２６】
好酸球
好酸球は、血液白血球の約１〜３％を占める。それらの主要な役割は、寄生生物に対する、特に、蠕虫類及び原虫感染に対する防御である。これに関連して、細胞は、好酸球カチオンタンパク質、主要塩基性タンパク質及びペルオキシダーゼ及びその他のリソソーム酵素等の細胞傷害性化合物を含有するリソソーム顆粒を含む。好酸球は、活性化されたリンパ球及び肥満細胞によって放出された物質によって誘引される。好酸球は、例えば、肥満細胞ヒスタミン放出脱顆粒の阻害による過敏症反応の調節において役割を果たし得るが、これらの細胞は、アレルギー反応において組織に損傷を与え得る。いくつかの状況では、例えば、花粉症、喘息、湿疹等では、細胞が組織及び血液に蓄積する。その結果、例えば、喘息又はアレルギー性接触皮膚炎において、それらは、脱顆粒を介して、アレルギー反応と関連する組織損傷の一因となり、又は引き起こし得る。
【００２７】
好塩基球
好塩基球は、循環白血球の１％未満を占め、血管作動性物質及びヘパリンを含む濃い青色の顆粒を有する。アレルギー反応では、それらは活性化されて脱顆粒し、これが、急性過敏症反応と関連している局所組織反応及び症状を引き起こし得る。
【００２８】
治療
本発明を用いて、顆粒球が疾患病態の一因である任意の疾患を治療できる。一実施形態では、疾患は、顆粒球が、疾患病態に主に関与している疾患である。このような疾患として、それだけには限らないが、白血球増多症、好中球増加症、顆粒球増加症又は好酸球増加症を特徴とするものが挙げられる。このような状態は、炎症、アレルギー反応、薬物反応、心臓異常等の症状をもたらし得る。
本発明が用途を見い出す疾患として、好中球、好酸球、好塩基球又はそれらのうち２種以上によって媒介されるものが挙げられる。
【００２９】
本発明の場面では、用語「顆粒球介在性疾患」、「顆粒球介在性炎症」及び「炎症性疾患」は、腫瘍性疾患を包含しない。一実施形態では、疾患は、白血球の増殖によって、例えば、白血球の異常な過度の産生によって引き起こされない疾患である。
【００３０】
本発明の場面では、「治療」は、ヒト又は非ヒト動物に利益をもたらし得る任意の投与計画を含む。治療は、既存の状態に関するものである場合もあるし、又は予防のためのもの（予防的処置）である場合もある。したがって、治療は、治癒的効果、軽減効果及び／又は予防的効果を含み得る。
【００３１】
本発明の方法の一実施形態では、方法は、非増殖段階の顆粒球介在性疾患を治療する方法である。本発明の一実施形態では、顆粒球介在性状態は、好中球介在性状態である。本発明が用途を見い出し得る好中球介在性状態として、それだけには限らないが、好中球介在性炎症状態、例えば、関節炎、胸膜炎、肺線維症、全身性硬化症及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が挙げられる。
【００３２】
本発明の一実施形態では、好中球介在性状態は、肺の炎症状態、例えば、胸膜炎である。
【００３３】
もう１つの実施形態では、好中球介在性状態は、肺線維症又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【００３４】
さらなる一実施形態では、好中球介在性疾患は、関節リウマチ、全身性硬化症又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【００３５】
本発明のもう１つの実施形態では、顆粒球介在性状態は、好酸球介在性状態である。本発明が用途を見い出し得る好酸球介在性状態として、それだけには限らないが、炎症性肺疾患、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、ＮＥＲＤＳ（小結節好酸球増加症、リウマチ、皮膚炎及び腫脹）、好酸球増加症候群又は肺線維症、接触皮膚炎、湿疹、花粉症又はその他のアレルギー反応が挙げられる。好酸球が関与し得る、及び、本発明を使用できるその他の状態として、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、血管炎肉芽腫性（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ）疾患、例えば、多発性動脈炎及びウェゲナー肉芽腫症、自己免疫疾患、好酸球性肺炎、サルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄｉｔｉｓ）及び特発性肺線維症が挙げられる。
【００３６】
本発明のさらなる一実施形態では、顆粒球介在性状態は、好塩基球介在性状態、例えば、急性過敏症反応等のアレルギー反応である。本発明が用途を見い出し得るその他の好塩基球介在性状態として、それだけには限らないが、喘息及びアレルギー、例えば、花粉症、慢性じんま疹、乾癬、湿疹、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）及び関節炎が挙げられる。
【００３７】
したがって、本発明によって治療できる疾患及び状態として、種々の組織及び臓器の疾患が挙げられる。
【００３８】
例えば、一実施形態では、本発明は、呼吸器系の疾患（１つ又は複数）の治療において使用できる。例えば、本発明を用いて、肺の炎症状態、例えば、間質性肺疾患を治療できる。本発明を用いて治療できる間質性肺疾患として、急性間質性肺炎等の急性疾患及び特発性肺線維症等の慢性状態の両方が挙げられる。本発明の方法を用いて治療できる、その他の呼吸器疾患及び状態として、胸膜炎、喘息、特に、重症喘息及びステロイド耐性喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び急性呼吸器疾患が挙げられる。
【００３９】
また、本発明を用いて、心臓の疾患／状態、例えば、心筋梗塞、アテロームによって引き起こされる再潅流障害を治療できる。
【００４０】
また、本発明を用いて、腎臓の疾患／状態、例えば、糸球体腎炎を治療できる。
【００４１】
また、本発明を用いて、皮膚の疾患／状態、例えば、ざ瘡、乾癬又は湿疹を治療できる。
【００４２】
本発明が用途を見い出し得るその他の状態として、関節炎、特に、関節リウマチ、痛風、続発性脳幹出血及び卒中が挙げられる。
【００４３】
一実施形態では、疾患／状態は、アレルギー状態である。このような一実施形態では、アレルゲンは非自己であり、すなわち、自己免疫反応ではない。
【００４４】
本発明の特定の一実施形態では、疾患又は障害は胸膜炎である。
【００４５】
本発明の特定のもう１つの実施形態では、疾患又は障害は肺線維症である。
【００４６】
本発明の特定のもう１つの実施形態では、疾患又は障害は関節炎である。
【００４７】
ＣＤＫ阻害剤
本発明の方法では、任意の適したＣＤＫ阻害剤を使用できる。使用できるＣＤＫ阻害剤として、それだけには限らないが、プリン及びピリミジン誘導体、例えば、オロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、ロスコビチン、Ｒ−ロスコビチン（セリシクリブ（ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ））、Ｎ９−イソプロピル−オロモウシン（ｏｌｍｏｕｃｉｎｅ）又はＮＧ７５及びヒメニアルジシンが挙げられる。使用できるその他のプリンベースのＣＤＫ阻害剤として、ＣＧＰ７９８０７及びＣＧＰ７４５１４（それぞれ、Ｃ２として存在する環状ヒドロキシ又はアミノ−アルキルアミノ基を有する、Ｉｍｂａｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、９巻、９６頁（１９９９年）；Ｄｒｅｙｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４４巻、５２４〜５３０頁（２００１年））、グアニン誘導体、例えば、ＮＵ２０５８及びＮＵ６１０２（Ａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、４３巻、２７９７〜２８０４頁（２０００年）、Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、９巻、７４５〜７４９頁（２００２年））、フェニルアミノピリジン、例えば、ＣＧＰ６０４７４（Ｆｕｒｅｔら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、１４巻、４０３〜４０９頁（２０００年））、ＣＩＮＫ４（Ｓｏｎｉら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、９３巻、４３６〜４４６頁（２００１年））、ＮＵ６０２７、チアゾロピリミジン（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、３８巻（付録７）、１２４（２００２年））が挙げられる。使用できるその他のＣＤＫ阻害剤として、プルバラノール（ｐｕｒｖａｌａｎｏｌｓ）、例えば、プルバラノールＡ（ｐｕｒｖａｌａｎｏｌ  Ａ）及びプルバラノールＢ（ｐｕｒｖａｌａｎｏｌ  Ｂ）、インディルビン、オキシインドールベースのＣＤＫ阻害剤（Ｋｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６０巻、７６８〜７７４頁（１９９９年））、例えば、フェニルヒドラゾンオキシインドール及びアニリノメチレンオキシインドール、インデノピラゾール（Ｎｕｇｉｅｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４４、１３３４〜１３３６頁（２００１年））が挙げられる。使用できるその他のＣＤＫ阻害剤として、フラボピリドール及びその類似体、例えば、２−ベンジリジン−ベンゾフラン−３−オン（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４３、４１２６〜４１３４頁（２０００年）；Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５、１７４１〜１７４７頁（２００２年））、スタウロスポリン及びその類似体、例えば、７−ヒドロキシスタウロスポリン、ブリオスタチン−１、ＢＭＳ−３８７０３２、ＳＵ９５１６、ＡＺ７０３、Ｅ７０７０、アミノイミダゾピリジン１ｄ、ＮＵ６１４０、フラボピリドール、ＡＧ−０２４３２２、ＰＤ−０３３２９９１、ＰＮＵ−２５２８０８、ジアリール尿素及びパウロン（ｐａｕｌｌｏｎｅｓ）、例えば、ケンパウロン（ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、アルスターパウロン（ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ）、ブチロラクトン−１、サンギバミチン（ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｈｉｎ）、ＳＵ９５１６  ＡＺ７０３が挙げられる。これらの阻害剤の多くの詳細は、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  ２３巻��３６）９４０８〜９４２１頁及びＪ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  ２４巻（１１）１１７０〜１７８３頁に記載されている。本発明において使用できるさらなるＣＤＫ阻害剤は、国際公開第０１／４４２１７号パンフレット、国際公開第９９／２４４１６号パンフレット、国際公開第０１／４４２４２号パンフレット、国際公開第９７／２０８４２号パンフレット、国際公開第９８／０５３３５号パンフレット及び国際公開第９９／０７７０５号パンフレットに記載されている。
【００４８】
一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤はロスコビチン（６−ベンジルアミノ−２−［（Ｒ）−１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ］−９−イソプロピルプリン）である。
【００４９】
もう１つの実施形態では、ＣＤＫ阻害剤はＮＧ７５である。
【００５０】
さらなる一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤はヒメニアルジシン（ＨＤ）である。
【００５１】
さらに、これらの方法では、本明細書に記載されるＣＤＫ阻害剤の、障害を治療するのに有用なその他の薬剤との組合せを用いる治療が提供される。その他の薬剤の選択は、治療される個々の状態に応じて異なり、医師の判断による。
【００５２】
例えば、本発明においてＣＤＫ阻害剤との組合せにおいて使用できるその他の薬剤として、それだけには限らないが、ＮＳＡＩＤ、糖質コルチコステロイド、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ、例えば、関節炎のための筋肉内金、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン及びメトトレキサート）及び生物製剤を用いる抗ＴＮＦ治療が挙げられる。
【００５３】
１種又は複数のその他の薬剤と組み合わせた治療にＣＤＫ阻害剤が用いられる場合には、ＣＤＫ阻害剤（複数のＣＤＫ阻害剤）及びその他の薬剤（複数のその他の薬剤）の濃度は、相乗作用を提供するのに十分な濃度で提供されることが好ましい。相乗作用は、Ｒｏｍａｎｅｌｉ（Ｒｏｍａｎｅｌｌｉ，Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４１巻：３８５〜３９０頁、（１９９８年））によって改変されたＫｅｒｎの方法（Ｋｅｒｎ，Ｄ．Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４８巻：１１７〜１２１頁、（１９８８年））を用いて、１を超えるＲＩとして定義されることが好ましい。ＲＩは、Ａ及びＢの組合せについて観察された細胞生存（Ｓｏｂｓ）に対する、予想される細胞生存（Ｓｅｘｐ、薬物Ａ単独を用いて観察された生存及び薬物Ｂ単独を用いて観察された生存の積として定義される）の割合（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）として算出できる。その結果、相乗作用は、１を超えるＲＩとして定義できる。
【００５４】
薬剤組成物
本発明において使用するためのＣＤＫ阻害剤は、薬剤組成物として投与できる。本発明の薬剤組成物及び本発明に従って使用するための薬剤組成物は、有効成分に加え、製薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤又は当業者に公知のその他の物質を含み得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年参照のこと）。このような物質は、酢酸塩、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸等のバッファー；抗酸化剤；保存料；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；炭水化物；キレート化剤；等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒｓ）；及び界面活性剤を含み得る。
【００５５】
薬剤組成物はまた、治療されている特定の適応症にとって必要であると選択される、好ましくは、ＣＤＫ阻害剤の活性に悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する１種又は複数のさらなる活性化合物を含み得る。例えば、関節炎等の炎症性疾患の治療では、ＣＤＫ阻害剤に加え、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤等のその他の抗炎症薬を用いてよい。
【００５６】
有効成分（例えば、ＣＤＫ阻害剤及び／又はその他の抗炎症薬）は、ミクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム、その他の微粒子送達系によって投与してよい。例えば、有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）における、又はマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルによって調製できるマイクロカプセル内に封入してもよい。さらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年参照のこと。
【００５７】
徐放性製剤を活性薬剤の送達に使用してもよい。徐放性製剤の適した例として、例えば、フィルム、坐剤又はマイクロカプセル等の造形品の形である、例えば、抗体等の活性薬剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌグルタメートの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【００５８】
用量
本発明の、及び本発明において使用するための組成物は、個体に「治療上有効な量」で投与されることが好ましく、これは、個体に利点を示すのに十分である。実際の投与計画は、治療されている状態、その重症度、治療されている患者、用いられている（複数の）薬剤をはじめとするいくつかの因子に応じて変わり、医師の判断による。
【００５９】
最適用量は、いくつかのパラメーター、例えば、年齢、性別、体重、治療されている状態の重症度、投与されている（複数の）有効成分及び投与経路に基づいて医師によって決定することができる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を、以下の非限定的な実施例においてさらに記載する。以下の添付の図面が参照される。
【００６１】
方法
ヒト好中球単離及び培養
ヒト好中球を、新たに取り出した静脈血から単離し、シトレーション（ｃｉｔｒａｔｉｏｎ）、デキストラン沈降及び不連続ＰＢＳ−パーコール勾配（Ｗａｒｄ，Ｃ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４巻、４３０９〜４３１８頁（１９９９年）、Ｈａｓｌｅｔｔ，ＣらＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １１９巻、１０１〜１１０頁（１９８５年））の、完了するのにおよそ２時間かかるプロセス後に分離した。次いで、好中球（５×１０６個／ｍｌ）を、１０％自己血清を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で、指示された時間の間３７℃で培養した。実験は、三連で実施し、少なくとも３回反復した。
【００６２】
好中球アポトーシスの評価
試薬［Ｒ−ロスコビチン、（Ｒ）−２−［［９−（１−メチルエチル）−６−［（フェニルメチル）アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イル］アミノ］−１−ブタノール（Ａ．Ｇ．Ｓｃｌｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ製）、ヒメニアルジシン（ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）ＨＤ、４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリジン−５−イリデン）−２−ブロモ−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，３−ｃ］アゼピン−８−オン（Ｄｒ  Ｌａｕｒｅｎｔ  Ｍｅｉｊｅｒ，  Ｒｏｓｃｏｆｆ，  Ｆｒａｎｃｅから提供されたもの）及びＮＧ−７５（２−（１Ｒ−イソプロピル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−（４−メトキシ−ベンジルアミノ）−９−イソプロピルプリン、Ｄｒ  Ｎａｔｈａｎａｅｌ  Ｇｒａｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＵＳＡから提供されたもの）、ｄｂｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、ＧＭＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）０１２７：Ｂ８，Ｓｉｇｍａ）］とともにインキュベートした後、好中球の１００μｌアリコートを、細胞遠心分離し、メタノールで固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で染色した。好中球は、アポトーシスに特徴的な形態変化について光学顕微鏡によって評価した（Ｓａｖｉｌｌ，Ｊ．らＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８３巻、８６５〜８７５頁（１９８９年）、Ｗａｒｄ，Ｃ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４巻、４３０９〜４３１８頁（１９９９年））。１スライドあたり少なくとも５００個の細胞を計数し、アポトーシスのパーセンテージを算出した。ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出を測定するためのヒト組換えアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ（Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ）を、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）と組み合わせて用いるフローサイトメトリーによって、アポトーシス及び膜の完全性の喪失も評価した。ストックのアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣを、アネキシン−Ｖ結合バッファー（５００ｍｌの、５μＭ  ＣａＣｌ２を含有するハンクス平衡塩類溶液）で１：５００希釈し、５×１０４個の細胞に２８０μｌの容積で加え、次いで、氷上で１０分間インキュベートした。サンプルに、１μｌのＰＩ（ストック１ｍｇ／ｍｌ）を加え、直後に、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ２フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）を用いて分析した。アポトーシスのデータがアネキシン−Ｖ結合として示されている場合は、アポトーシスはまた、形態学的評価によっても確認された。
【００６３】
ウエスタンブロッティング
細胞（５×１０６個）を、ＰＢＳで洗浄し、その後、１：１００  Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテル、７ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、３ｍＭ  アプロチニン、１０ｍＭ  ベンズアミジン、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸、０．４ｍＭ  ロイペプチン、４０ｍＭ  レバミソール、３０ｍＭ  ペプスタチンＡ、２０ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム及び１ｍｌのＴＢＳ中０．１％のＮＰ−４０を含有する１００μｌの溶解バッファーに再懸濁した（Ｗａｒｄ，Ｃ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４巻、４３０９〜４３１８頁（１９９９年））。次いで、細胞を氷上で１５分間インキュベートした。続いて、サンプルを２３，１００ｇａｖ、４℃で２０分間遠心分離した。１レーンあたり、タンパク質（４０μｇ）又は１．５×１０６個の細胞に相当する量を添加し、サンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブランにトランスファーした。次いで、ブロットを、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中、５％スキムミルク粉末でブロッキングし、次いで、抗ＣＤＫ１（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ＣＤＫ２（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ＣＤＫ５（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｍｃｌ−１（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ）抗体でプローブした。
【００６４】
キナーゼアッセイ
好中球（２０×１０６個）をペレットにし、アッセイされるまで−８０℃で保存した。キナーゼ活性は、キナーゼの免疫沈降と、それに続く、ヒストンＨ１及び［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとのインキュベーションによってアッセイした。免疫沈降及びヒストンＨ１キナーゼアッセイを実施した（Ｇｉｌ−Ｇｏｍｅｚ，ＧらＥＭＢＯ  Ｊ．  １７巻、７２０９〜７２１８頁（１９９８年））。ＣＤＫ１にはＡ１７抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＣＤＫ２免疫沈降にはＭ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。キナーゼアッセイは、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し、クーマシーブルーで染色して、ヒストンＨ１バンドを可視化し、乾燥させ、オートラジオグラフィーのために曝露した。
【００６５】
カラゲナン誘導性胸膜炎
雄の８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ＆Ｋ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）を、地方のガイドラインに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓに収容した。動物に、普通食及び水道水を自由に給餌した。マウスに、０．１ｍｌの１％  λ−カラゲナン（Ｍａｒｉｎｅ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから提供されたもの）を胸膜内注射した。マウスを、カラゲナンを用いた注射の２４時間後に、０．５ｍｌの生理食塩水対照、０．５ｍｌの０．５％  ＤＭＳＯビヒクル対照、１０ｍｇ／Ｋｇ又は１００ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）のいずれか処理した。動物を、カラゲナンの注射後種々の時間に（３６〜１６６時間）ＣＯ２の濃度を上げることによって処分した。胸膜腔を、１ｍｌの、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、３．１５％（重量／容積）のクエン酸ナトリウムで洗浄した。全胸腔浸出液を秤量することによって、浮腫形成を測定し、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ｃｏｕｎｔｅｒ（モデルＤＮ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）を用いて全細胞数を測定した。
【００６６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｚＶＡＤ−ｆｍｋの投与
ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＤＬ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（ｚＶＡＤ−ｆｍｋ）（Ｂａｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｓｔ  Ｈｅｌｅｎｓ，ＵＫ）を、２００ｍｇ／ｍｌで１００％ＤＭＳＯに溶解し、０．９％生理食塩水で希釈して最終濃度１ｍｇ／ｍｌとした。０．１ｍｌの１％  λ−カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、いくつかの動物に、０．５ｍｌ  １０ｍｇ／ｋｇのＲ−ロスコビチン及び／又は０．５ｍｌ  １μｇ／ｋｇのｚＶＡＤ−ｆｍｋを腹腔内注射した。４及び８時間後、ｚＶＡＤ−ｆｍｋの２回のさらなる用量を腹腔内に投与し、１２時間後、すべての動物をＣＯ２の濃度を上げることによって屠殺した。すべての対照動物は、適当な量のＤＭＳＯビヒクルで処理した。
【００６７】
サイトカイン分析
細胞サイトカインプロフィールは、マウス炎症サイトカインビーズアッセイ（カタログ番号５５２３６２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を、製造業者の使用説明書に従って用いて測定し、ＢＤ  Ｆａｃｓ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いるフローサイトメトリーによって分析した。
【００６８】
胸膜腔から得られたアポトーシス細胞のアポトーシス及びマクロファージ食作用の形態学的評価
胸膜腔を、３．１５％（重量／容積）のクエン酸ナトリウム  ｉｎ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌで洗浄し、細胞を遠心分離した（３００ｇ）。細胞を、１×１０６個細胞／ｍｌで再懸濁し、細胞遠心分離調製物を作製し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で染色した。細胞を顕微鏡で調べて、各群の遊離アポトーシス細胞、マクロファージ食作用のパーセンテージ及び食作用指数を評価した。
【００６９】
ブレオマイシン誘導性肺損傷
雄の８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ＆Ｋ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）を、現地のガイドラインに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓに収容した。動物に、普通食及び水道水を自由に給餌した。マウスに、０．０５ｍｌの０．１Ｕブレオマイシン（Ａｐｏｌｌｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂｒｅｄｂｕｒｙ，  ＵＫ）又は生理食塩水（偽の対照）のいずれかを気管内投与し、次いで、２４時間後に、０．５ｍｌ  ０．５％ＤＭＳＯビヒクル対照又は１００ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチンのいずれかで処理した。いくつかの動物を未処理のままとして、正常の生理状態を比較した。動物を、ブレオマイシン又は生理食塩水投与の７２時間又は７日後、致死量のペントバルビトンによって処分した。急性７２時間実験では、０．８ｍｌの氷冷生理食塩水を用いる３回の連続洗浄で気管支肺胞洗浄を実施し、その後、組織の組織学的解析のために、４％ホルムアルデヒドで灌流した。エオシン及びヘマトキシリン染色を用いて細胞遠心分離調製物で種々の細胞計数を実施した。７日実験の組織学的解析を、組織の完全性を維持するために気管支肺胞洗浄を行わずに実施した。実験は、未処理対照、偽の対照（生理食塩水及びＤＭＳＯ処理）、Ｒ−ロスコビチン対照（生理食塩水及び１００ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン）、ブレオマイシン／ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照及びブレオマイシン／Ｒ−ロスコビチン処理群を用い、１群あたり６匹のマウスを用いて実施した。
【００７０】
肺損傷の評価
肺損傷は組織学的検査によって評価し、肺を膨張させ、１ｍｌの１０％ホルマリンで固定し、５％硝酸を用いて３時間脱灰した。光学顕微鏡による形態学的検査のためにパラフィン包埋された肺の切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００７１】
関節炎の誘導及び評価
６０日齢の関節炎のＫ／ＢｘＮマウスから抽出した血清（１００μｌ）を、６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ＆Ｋ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）に腹腔内注射した。レシピエントには２日離して２回の注射を与え、Ｒ−ロスコビチン又はビヒクルを、図の凡例に示されるように、腹腔内に投与した。臨床検査によって関節炎をスコア化した。簡潔に述べると、１のスコアを、１指の紅斑単独又は腫脹するものに付した。２のスコアを、足根関節の紅斑及び腫脹又は踵関節又は手首関節単独の腫脹に起因するものに付した。３の最大スコアは、足根関節及び踵関節の両方、又は手首と指の両方又は２を超える指及び足根関節に腫脹が存在する場合に得られた。各肢のスコアを加えた、最大で１２のスコアが得られ、平均スコアは、１群あたりのレシピエントマウスの数で除した総スコアを示す。データは、Ｒ−ロスコビチンの最初の注射の３日前に得られた臨床スコアのパーセンテージとして表されている。
【００７２】
統計分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の分析は、ＡＮＯＶＡ及びスチューデント−ニューマン−クールズ（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）比較検定を用いて実施した。＜０．０５のＰ値を有意と考えた。結果は、各々３連で実施された、少なくとも３つの別個の実験の平均±標準誤差として表されている。すべてのｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、１群あたり６〜９匹のマウスを用いて行い、いくつかの実験では、反復して当初の知見を確認した。統計分析は、９５％の信頼区間を用いるボンフェローニ多重比較ポストホック検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡによって実施した。データは、平均±標準誤差として表されている。
【００７３】
結果
ＣＤＫ阻害剤が、好中球アポトーシスに直接影響を及ぼし得るかどうかを調査するために、ヒト好中球を、漸増濃度の構造的に異なるＣＤＫ阻害剤（Ｒ−ロスコビチン（Ｄｅ  Ａｚｅｖｅｄｏ，Ｗ．Ｆ．らＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４３巻、５１８〜５２６頁（１９９７年）、Ｍｅｉｊｅｒ，ＬらＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４３巻、５２７〜５３６頁（１９９７年）、Ｂａｃｈ，Ｓ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２８０巻、３１２０８〜３１２１９頁（２００５年））、ＮＧ７５（Ｇｒａｙ，Ｎ．Ｓ．らＳｃｉｅｎｃｅ  ２８１巻、５３３〜５３８頁（１９９８年）、Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｔ．らＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．  ６巻、３６１〜３７５頁（１９９９年））及びＨＤ（Ｍｅｉｊｅｒ，Ｌ．らＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．  ７巻、５１〜６３頁（２０００年）、ＷｉｌｌｉａｍｓらＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.  ３０巻、７０９〜７１３頁（２０００年））とともに２０時間かけてインキュベートした。特に、用いたＣＤＫ阻害剤の濃度は、ＣＤＫ阻害に関して具体的な効果を有するとこれまでに公開されたもの又はそれよりも低かった。簡潔に述べると、ヒト好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、１０％自己血清を含むＩＭＤＭ中で、漸増濃度のＲ−ロスコビチン、ＮＧ７５又はＨＤとともに２０時間インキュベートした。アポトーシスを、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ結合によって評価し、形態学的評価によって確認した。値は、少なくともｎ＝３の平均±標準誤差を表す。＊＊（ｐ＜０．００１）は、対照からの有意差を表す。結果は、図１ａに示されている。図１ｂは、種々のＣＤＫ阻害剤が、好中球の時間依存性アポトーシスを誘導することを示す。簡潔に述べると、ヒト好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、１０％自己血清を含有するＩＭＤＭ中で２０μＭのＲ−ロスコビチン、１０μＭのＮＧ７５又は１０μＭのＨＤとともに２０時間かけてインキュベートした。アポトーシスを、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ結合によって評価し、形態学的評価によって確認した。
【００７４】
示す通り、３種のＣＤＫ阻害剤すべてによって誘導される好中球アポトーシスにおいて、劇的な濃度依存的（図１ａ）及び時間依存的（図１ｂ）な増大があった。
【００７５】
好中球集団の通常のアネキシン−Ｖ及びＰＩプロフィールによって、ＮＧ７５処理の８時間後、アネキシンＶ陽性細胞の著しい増大が観察されることが実証された（図１ｃ〜ｅ）。より長い処理（すなわち、２０時間）を施すと、続発性壊死に相当する、核の喪失及びひだ状の原形質膜によって形態学的に同定され得る細胞に対応して、増大した数のアネキシン−Ｖ／ＰＩ陽性細胞集団が観察された（図１ｅ）。同様のプロフィールが、Ｒ−ロスコビチン及びＨＤ処理を用いても見られ、アネキシンＶ結合％として示されたすべてのアポトーシスのデータは、形態学的評価によって確認された（データを示さず）。このように、Ｒ−ロスコビチン、ＮＧ７５及びＨＤは、構成的アポトーシスの比率を大幅に増大させた。経時変化研究については、Ｒ−ロスコビチン（２０μＭ）及びＮＧ７５（１０μＭ）は、８時間後にアポトーシスの比率を劇的に増大させたのに対し、１０μＭのＨＤは、アポトーシスの基本比率を増大させなかった（図１ｂ）。本発明者らは生存因子によって誘導される遅発性アポトーシスに対するＣＤＫ阻害剤の効果を試験しようとしたために、本発明者らは、１０μＭのＨＤ、構成的アポトーシスの比率自体に大幅に影響を及ぼさない濃度を意図的に用いた（以下及び図１ｈ参照のこと）。Ｒ−ロスコビチンの細胞標的の系統的な研究は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２及びＣＤＫ５に対して著しく高い特異性を有し、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６を含むその他のキナーゼに対してはそうではなく、さらに、ＮＧ−７５及びＨＤの両方とも、同様のＣＤＫに対して高い特異性を有することを示している。実際、Ｒ−ロスコビチンと複合体形成しているヒトＣＤＫ２の結晶構造が、ロスコビチンのＲ−立体異性体が精製ＣＤＫ１／サイクリンＢの阻害の際にＳ−立体異性体よりもわずかにより強力であることを示す証拠とともに記載されている（それぞれ、ＩＣ５０＝０．４５μＭ及び０．９５μＭ）。２０μＭで立体異性体を用いた本発明者自身の研究は、６時間後にアネキシンＶ結合によって評価され、形態学的判定基準によって確認されたアポトーシスの比率は、対照について１２．４±０．４％、ＤＭＳＯ（０．０４％）対照について１２．８±１．３％、Ｒ−ロスコビチンについて７５．９±３．５％及びＳ−ロスコビチンについて７５．６±３．３％であった（平均±標準誤差；ｎ＝４  別個のドナーについてそれぞれ３連で実施した読み取り）ということを示した。
【００７６】
ＣＤＫ阻害剤はアポトーシスを加速できたので、本発明者らは、これらの化合物が、種々のシグナル伝達経路によってアポトーシスを遅延することがわかっている薬剤の効果も逆転できるかどうかを調べた（Ｒｉｌｅｙ，Ｎ．Ａ．らＡｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ＆Ａｎｔｉ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５巻、３〜１２頁（２００６年））。例えば、ｄｂｃＡＭＰは、細胞膜を透過し、内因性ｃＡＭＰを模倣し、タンパク質合成に対する直接効果を含まず、ＰＫＡとは独立して作用し得る機序によって好中球アポトーシスを遅延する（ＭａｒｔｉｎらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６巻、４５０４１〜４５０５０頁（２００１年））。ＧＭ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を介してアポトーシスを阻害し、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）及びシグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）の活性化をもたらすことが実証されている。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４と結合し、これがＣＤ１４と相互作用し、最終的にマイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）、Ｐ１３Ｋ及び／又はＮＦ−κＢシグナル伝達につながり、アポトーシスを阻害する。さらに、好中球アポトーシスのＬＰＳ誘導性遅延の多くが、単球の存在に応じて変わることを示唆する強力な証拠がある（Ｓａｂｒｏｅ，Ｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６８巻、４７０１〜４７１０頁（２００２年）、Ｓａｂｒｏｅ，Ｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０巻、５２６８〜５２７５頁（２００３年））。好中球のｄｂｃＡＭＰ、ＧＭＣＳＦ及びＬＰＳ介在性生存に対するＣＤＫ阻害剤の効果を調査し、結果は図１ｆ〜ｈに示した。この研究では、ヒト好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、１０％自己血清を含むＩＭＤＭ中で、示されるとおり０．２μＭ  ｄｂｃＡＭＰ、５０Ｕ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦ又は１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳとともに３０分間プレインキュベートした。続いて、適当な濃度のＲ−ロスコビチン（図１ｆ）、ＮＧ７５（図１ｇ）又はＨＤ（図１ｈ）を加え、細胞をさらに２０時間インキュベートした。アポトーシスは、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣによって評価し、形態によって確認した。
【００７７】
図１ｆ〜ｈに示すように、しかしながら驚くべきことに、ＣＤＫ阻害剤は、これらの生存シグナルのすべてを、濃度依存的に（図１ｆ〜ｈ）、アポトーシス自体を直接誘導しない濃度でも無効にすることができた（１０μＭ  ＨＤデータを参照のこと）。この後者の観察結果は、アポトーシスの生存因子誘導性遅延に対するＣＤＫ阻害剤の効果が、それらが有するアポトーシスに対する任意の直接効果とは独立に生じるか、より感受性があること、並びに、ＣＤＫ阻害剤が、抗アポトーシス薬によって誘発されるシグナル伝達経路とはかかわりなく好中球の生存を無効にすることができるということを示唆する。
【００７８】
根底にある潜在的な分子機構を調査するために、本発明者らは、ＣＤＫ阻害剤誘導性アポトーシスがカスパーゼ依存性であるかどうかを調査した。結果は、図２ａ及び２ｂに示されている。ヒト好中球（細胞５×１０６個／ｍｌ）を、１０％自己血清を含むＩＭＤＭ中で６時間、Ｒ−ロスコビチン（２０μＭ）及びｚＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）とともに、又はｚＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）は伴わずＲ−ロスコビチン（２０μＭ）とともにインキュベートした。アポトーシスを、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣによって評価し、形態によって確認した。ＣＤＫ１及びＣＤＫ２タンパク質は、好中球において発現され、Ｒ−ロスコビチンは、好中球においてカスパーゼ切断を誘導する。図２ｂについては、ヒト好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、単離後（０時間）又はバッファー、ＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）、Ｒ−ロスコビチン（２０μＭ）又はＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）及びＲ−ロスコビチン（２０μＭ）で４時間処理した後に溶解した。続いてタンパク質をＳＤＳゲルで分離した。ウエスタンブロッティング後、ＰＶＤＦメンブランを、抗カスパーゼ３、抗ＣＤＫ１、抗ＣＤＫ２又は抗β−アクチン抗体でプローブした。ブロットは、少なくとも３の別個の実験を代表するものである。
【００７９】
このように、本発明者らは、広域カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋとともの好中球のプレインキュベーションが、Ｒ−ロスコビチン誘導性アポトーシスを防いだので（図２ａ）、ＣＤＫ阻害剤誘導性アポトーシスは、カスパーゼ依存性であることを実証した。ＣＤＫ阻害剤が、好中球においてカスパーゼ活性化することの直接検証は、図２ｂにおいて実証され、これでは、Ｒ−ロスコビチンがカスパーゼ−３切断をもたらすことがウエスタンブロット解析によって検出されている。さらに、本発明者らは、Ｒ−ロスコビチン誘導性カスパーゼ−３切断は、好中球が生存促進因子ＧＭＣＳＦとともに共培養される場合に減弱されることを示す（図２ｂ）。４時間という初期の時点で、基礎アポトーシスの比率は低く（＜５％；図１ｂ）、したがって、カスパーゼ３切断のレベルは最小である（図２ｂ）。しかし、好中球がＲ−ロスコビチン単独で処理される場合には、カスパーゼ−３切断は、４時間ですでに極めて明らかである。生存促進因子ＧＭ−ＣＳＦの存在下でのＲ−ロスコビチン処理は、おそらくは、アポトーシス促進経路と抗アポトーシス経路が競合するために、カスパーゼ−３切断の量を減少させた（図２ｂ）。しかし、２０時間で、Ｒ−ロスコビチンのアポトーシス促進性効果が、生存因子介在性効果を上回って支配的であることは明らかである（図１ｆ）。
【００８０】
好中球は、最終分化しており、細胞分裂を受けないので、好中球におけるＣＤＫ及びその結合パートナーは現在まで詳細には研究されていなかった。本発明者らは、好中球アポトーシスの前及び間のＣＤＫ１及びＣＤＫ２タンパク質発現を評価した。簡潔に述べると、ヒト好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、単離後（０時間）又はバッファー、ＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）又はグリオトキシン（０．１μｇ／ｍｌ）で２０時間処理した後に溶解した。続いて、タンパク質を、ＳＤＳゲルで分離した。ウエスタンブロッティング後、ＰＶＤＦメンブランを、抗ＣＤＫ１又は抗ＣＤＫ２抗体でプローブした。ブロットは、３の別個の実験を代表している。
【００８１】
結果は、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２タンパク質発現は、好中球アポトーシスの間、変化しないということを示す。ウエスタンブロッティング解析によって、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の両方とも存在することがわかった（図２ｂ及びｃ）。その他の細胞系では、ＣＤＫ１は、サイクリンＡ及びサイクリンＢと結合することがわかっており、ＣＤＫ２は、サイクリンＥ及びＥと結合するのに対し、ＣＤＫ５は、サイクリンとは結合せず、非サイクリンｐ３５及びｐ３９調節タンパク質によって活性化されるようである。しかし、本発明者らの研究によって、新たに単離された好中球（完了するのに約２時間かかるプロセス）、時間経過した好中球（４時間）又はＧＭ−ＣＳＦ、Ｒ−ロスコビチン単独又は組み合わせて処理されたもの（４時間）では、ＣＤＫタンパク質レベルの相違はないと思われるということが示唆される。好中球を、バッファー、ＧＭ−ＣＳＦとともに２０時間インキュベートした場合又はグリオトキシンでのアポトーシスの誘導後でも（Ｗａｒｄ，Ｃ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４巻、４３０９〜４３１８頁（１９９９年））、ＣＤＫのレベルは変化しなかった（図２ｃ）。したがって、ＣＤＫはアポトーシスの誘導にとって重要であると思われたが、ＣＤＫ１及び／又はＣＤＫ２は、アポトーシスの間の分解の標的ではなかった。さらに、Ｒ−ロスコビチンはまたＣＤＫ５も阻害し得るので、本発明者らは、ウエスタンブロット解析を実施し、ヒト好中球におけるＣＤＫ５の存在を示した（データを示さず）。この知見は、Ｒｏｓａｌｅｓらと一致する。ＣＤＫ活性を測定し、ＣＤＫ１についての結果を図２ｄ及びｅに示した。好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、抗Ｆａｓ活性化抗体ＣＨ１１（５００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、指示される時間処理した。続いて、各サンプルについて１０７個の細胞を溶解し、溶解物を抗ＣＤＫ１抗体とともにインキュベートし、ＣＤＫ１活性をヒストンＨ１への３２Ｐ移動によって測定した。アポトーシス（アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩ）及びＣＤＫ１活性は、２時間毎に８時間にわたり測定した。ＣＤＫ１活性は、０時間及び２時間で検出したが、続いて、経時的にアポトーシスのレベルが増大したので検出不能になった。やはり、実験の間にＣＤＫ１発現レベルにおいて相違は、検出できなかった。ＣＤＫ２活性も測定したが、活性は検出できなかった（結果を示さず）。結果は、少なくとも３の別個の実験を代表するものである。興味深いことに、好中球において、ＣＤＫ１（図２ｄ及びｅ）、ＣＤＫ２（示さず）及びＣＤＫ５活性が実証された。単離された好中球におけるＣＤＫ１活性は、細胞が抗Ｆａｓ活性化抗体ＣＨ１１によって誘導されたアポトーシスを受けるので、急速に低下した（図２ｅ）。
【００８２】
本発明者らは、アポトーシスの重要な調節因子であるとわかっている重要な生存タンパク質Ｍｃｌ−１の発現に対するＲ−ロスコビチンの効果をさらに精査した（Ｍｉｃｈｅｌｓら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３７巻、２６７〜２７１頁（２００５年）、Ｍｏｕｌｄｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９２巻、２４９５〜２５０２頁（１９９８年））。ヒト好中球（５×１０６個細胞／ｍｌ）をバッファー、ＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）、Ｒ−ロスコビチン（２０μＭ）又はＧＭ−ＣＳＦ（５０Ｕ／ｍｌ）及びＲ−ロスコビチン（２０μＭ）を用いて４時間処理した。続いて、サンプルを溶解し、タンパク質をＳＤＳゲルで分離した。ウエスタンブロッティング後、ＰＶＤＦメンブランを抗Ｍｃｌ−１抗体でプローブした。ブロットは、少なくとも３の別個の実験を代表するものである。結果を、図２ｆに示す。本発明者らは、単離細胞中のＭｃｌ−１のレベルが２時間の培養以内に急速に低下すること、ＧＭ−ＣＳＦ処理によって防がれる効果を実証している。Ｒ−ロスコビチンは、ＧＭ−ＣＳＦによって媒介されるＭｃｌ−１の上方調節を阻害する（図２ｆ）。
【００８３】
好中球アポトーシスが、ＣＤＫ阻害剤によって劇的に影響を受けることがｉｎ  ｖｉｔｒｏで示したので、本発明者らは、次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの好中球優性炎症の回復に対するＲ−ロスコビチンの効果を判定した。カラゲナン誘導性胸膜炎症の急性回復モデルを用いて、ＣＤＫ阻害剤の効果を評価した。この十分に確立されたモデルを上手く用いて、炎症細胞動員の動態を調べ、炎症機序並びに潜在的な抗炎症特性を有する薬剤を調査した（Ｇｉｌｒｏｙ，Ｄ．Ｗ．らＮａｔ．Ｍｅｄ．  ５巻、６９８〜７０１頁（１９９９年）、Ｇｉｌｒｏｙ，Ｄ．Ｗ．らＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １７巻、２２６９〜２２７１頁（２００３年）、Ｓａｗａｔｚｋｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １６８巻、３３〜４１頁（２００６年）、Ｃａｉｌｈｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．らＡｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １７３巻、５４０〜５４７頁（２００６年））。本研究では、１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、生理食塩水、ＤＭＳＯ、１０又は１００ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）で処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、総胸膜炎症細胞数（図３ａ）、単核細胞及びＰＭＮ数（図３ｂ）及び浸出液容積（図３ｃ）の数を測定した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【００８４】
Ｒ−ロスコビチンは、１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後に腹腔内投与された場合に、確立された炎症の回復を加速した（図３）。したがって、１０ｍｇ／ｋｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）処理は、ビヒクル対照と比較して５０％を超える総炎症細胞数を抑制し（図３ａ）、単球／マクロファージ及び好中球の数が減少した（図３ｂ）。注目すべきことに、１００ｍｇ／ｋｇのＲ−ロスコビチンは、炎症細胞の量を、未処理のマウス胸膜腔において通常見られるベースラインレベル付近に低減させた。Ｒ−ロスコビチンはまた、胸腔洗い流しによって得られる総浸出液容積によって測定される浮腫形成が、生理食塩水対照と比較して、Ｒ−ロスコビチン処理で３倍減少したので、機能的抗炎症効果を示した（＊ｐ＜０．０５；図３ｃ）。
【００８５】
同時に、Ｒ−ロスコビチンの存在下では、炎症浸出液中の炎症促進性メディエーターＩＬ−６（図３ｄ）、ＩＦＮ−γ（図３ｅ）及びＭＣＰ−１（図３ｆ）の放出も減少した。この研究では、１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後に、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、生理食塩水、ＤＭＳＯ、１０又は１００ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）で処理した。カラゲナンの３６時間後、サイトカインビーズアッセイによって、胸腔浸出液中のＩＬ−６（図３ｄ）、ＩＦＮ−γ（図３ｅ）及びＭＣＰ−１（図３ｆ）を測定した。値は、１群あたり８〜１０匹のマウスの平均±標準誤差を表す。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＤＭＳＯ対照からの有意差を表す。
【００８６】
炎症回復の加速に対するＲ−ロスコビチンの濃度依存性効果を実証したので、本発明者らは、次いで、７日間という期間にわたるＣＤＫ阻害剤の効果を判定した。炎症のピークで（２４時間で）投与されたＲ−ロスコビチン（１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内）は、炎症の著しい回復をもたらしたことが、調べたすべての時点の胸膜腔総細胞数（図３ｇ）、及び、カラゲナンの３６時間後に計数された総細胞、好中球及び単球／マクロファージ数（図３ａ及びｂ）によって評価され、このことは、ＣＤＫ阻害剤が、炎症回復を増強するというさらなる証拠を提供する。Ｒ−ロスコビチンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト好中球のカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導したので（図２ａ及びｂ）、全身Ｒ−ロスコビチンを用いて観察された炎症回復の増強が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてカスパーゼ依存性炎症細胞アポトーシスの同様の誘導によって媒介されるかどうかを確定することは重要であった。これを確定するために、１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂ６マウスを、１０ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）及び／又は１μｇ／ＫｇのｚＶＡＤ−ｆｍｋ（４時間間隔で腹腔内）を用いて腹腔内処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、総胸膜炎症細胞数（図４ａ）及び浸出液容積（図４ｂ）を測定した。ｚＶＡＤ−ｆｍｋの効果を以下のとおり調べた（図４ｃ）。１％カラゲナンの胸膜内注射の２４時間後、雄のＣ５７／ｂｌ６マウスを、１０ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）及び／又は１μｇ／ＫｇのｚＶＡＤ−ｆｍｋ（４時間間隔で腹腔内）を用いて腹腔内処理した。すべてのマウスを、カラゲナンの３６時間後に屠殺し、アネキシンＶ標識及びフローサイトメトリーによって胸膜炎症細胞におけるアポトーシスを分析した。また、炎症細胞アポトーシスをヘマトキシリン及びエオシン染色した細胞遠心分離調製物上で形態によって評価した。
【００８７】
広域性スペクトルカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋの全身投与は、カラゲナン誘導性胸膜炎症の急性モデルにおける胸膜腔中の炎症細胞及び浮腫形成のＲ−ロスコビチン誘導性減少を防いだ（図４）。興味深いことに、ｚＶＡＤ−ｆｍｋは、生理食塩水又はビヒクル対照と比較した場合に、総炎症細胞数（図４ａ）及び浮腫形成（図４ｂ）を増大することによってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症の回復を防いだ。さらに、胸膜腔におけるＲ−ロスコビチン処理で観察された、炎症細胞アポトーシス（図４ｃ）及びアポトーシス小体含有マクロファージ（図４ｄ及びｅ参照）の増大が、ｚＶＡＤ−ｆｍｋでの処理によって劇的に阻害された。本発明者らはまた、胸膜腔においてカラゲナンで処理したマウスの肺はまた、肺区域に、結果として著しい炎症浸潤液を有することを注記した（図４ｆ）。この肺炎症もまた、Ｒ−ロスコビチン処理によって劇的に低減した（図４ｇ）。
【００８８】
Ｒ−ロスコビチン処理での抗炎症効果及び回復促進効果を、別の２種の炎症モデルにおいてさらに確認した。ブレオマイシン誘導性肺炎症の回復に対するＣＤＫ阻害剤Ｒ−ロスコビチンの効果は、以下のとおり評価し、結果を図５ａに示している：ブレオマイシンの気管内投与の４８時間後に、１００ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内）を投与し、ここでは好中球（黒バー）及び単球／マクロファージ（白バー）の数を、ブレオマイシン投与の３日後にＢＡＬ液から得られた種々の細胞計数によって確定した。
【００８９】
慢性ブレオマイシン誘導性肺損傷モデルにおいて、肺において炎症が確立された後に投与されたＲ−ロスコビチン（１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内）は、ブレオマイシン投与の３日後の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好中球の総数を減少させた（＊＊ｐ＜０．０１；図５ａ）。このモデルでは、炎症及び組織損傷に対するＲ−ロスコビチンの効果を、以下のように確定した：１００ｍｇ／ＫｇのＲ−ロスコビチン（腹腔内；ｄ）又はビヒクル対照（０．５％  ＤＭＳＯ；腹腔内；ｃ）を、ブレオマイシン又は生理食塩水（偽の対照；ｂ）の気管内投与の４８時間後に投与した。ブレオマイシン処理の７日後、肺炎症及び組織学的組織損傷を、各処理群のヘマトキシリン及びエオシン染色したパラホルムアルデヒド固定した肺切片の形態学的検査（原倍率×４０）によって評価した。結果を図５ｂ〜ｄに示す。
【００９０】
組織学的検査によって、ブレオマイシン誘導性肺損傷が７日間持続することを許される場合には、Ｒ−ロスコビチンは、ブレオマイシン誘導性組織損傷を防ぐことが示された（図５ｂ〜ｄ）。Ｒ−ロスコビチンは、偽の気管内生理食塩水対照とともに投与される場合には、肺病態に対する明らかな有害な効果はなかった（図５ｂ）。
【００９１】
別の実験セットにおいて、本発明者らは、ブレオマイシン誘導性致死性に対するロスコビチンの効果を調査した。１２日までに、ブレオマイシン単独で処理した８匹のマウスのうち３匹が死亡したのに対し、対照及びロスコビチン処理したマウスは全く死亡しなかった。１４日目に実験が終了する前に、１３日までに、ブレオマイシン及びロスコビチン処理動物のうち１匹が死亡した（データを示さず）。
【００９２】
さらに、本発明者らは、受動的に誘導された関節炎のモデルにおいてＲ−ロスコビチンの効果をさらに調査した。マウス（各群においてｎ＝１０）に、関節炎（６０日目）のＫ／ＢｘＮトランスジェニックマウスから得たＫ／ＢｘＮ血清を用いて２回注射した（０及び３日目）。示された日に臨床スコアを評価した。対照マウスには、ビヒクル０．５ｍｌを腹腔内に投与し、処理マウスには、Ｒ−ロスコビチン（０．５ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９日目に投与した。結果を、図５ｅに示す。データを、Ｒ−ロスコビチンの最初の注射の３日前に得られた臨床スコアのパーセンテージとして表す。本発明者らは、臨床スコアによって評価される関節炎が、ロスコビチン処理動物において、対照処理動物よりも迅速に劇的に回復することを観察した。
【００９３】
考察
炎症細胞アポトーシスの特異的誘導は、炎症性疾患の将来の治療における新規アプローチに相当する。急性又は慢性いずれかの設定における、炎症発作後に起こる事象の協調されたカスケードは、発症から回復相まで高度に調節されている。これは、多数のメディエーター（例えば、ＰＧｓ、ＰＡＦ、ロイコトリエン、リポキシン）、増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１β）及びケモカイン（例えば、ＩＬ−８、エオタキシン）の生成によって細胞遊走及び浸潤、生存及び炎症反応の永続化を制御する、一連のチェックポイントを含む。遊走された細胞の寿命も高度に調節され、個々の細胞は、アポトーシスによる予めプログラムされた形での死滅に感受性があり、又は生体内原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で潜在的に有害な形で持続し、継続する過剰な分泌活性によって、又は続発性壊死による細胞死の結果によって組織破壊を促進する場合もある。ＣＤＫは、従来、もっぱら増殖細胞の運命を制御すると考えられてきた重要な細胞シグナル伝達タンパク質であり、ＣＤＫ機能障害は、細胞ターンオーバーの増大及び腫瘍進行に関与している可能性がある。ＣＤＫの阻害を目的とした最新の治療が、種々の癌、例えば、非小細胞肺癌及び乳癌の治療のために開発中である。
【００９４】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＤＫ阻害剤は、最終分化した細胞であると考えられている好中球においてアポトーシスを促進することを示した。
【００９５】
炎症部位での炎症細胞ターンオーバーは、細胞動員、アポトーシス及びそれらのその後のクリアランス間のバランスによって抑制されている。さらに、炎症マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取はまた、抗炎症特性を有するメディエーター（例えば、ＴＧＦ−β１及びＩＬ−１０）の合成及び放出を促進する。本研究によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＫ阻害剤によるヒト好中球のアポトーシスを加速する新規機序が示され、マウスでは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこのアポトーシスの増強が、好中球依存性炎症の回復の増大もたらすことが実証された。本発明者らは、ヒト好中球は、ＣＤＫ１（図２）、ＣＤＫ２（図２）及びＣＤＫ５（データを示さず）を有し、これらが炎症において機能的な役割を果たしている可能性があることを示した。本発明者らはまた、ＣＤＫの特異的阻害剤、Ｒ−ロスコビチン、ＮＧ７５及びＨＤは、カスパーゼ依存性機序を含むヒト好中球アポトーシスを、時間及び濃度依存的に誘導するということを実証した。ＣＤＫ阻害剤が、強力な生存促進剤（例えば、ｄｂｃＡＭＰ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＬＰＳ）の存在下でさえもアポトーシスを誘導することは重要である。このことは、この研究において試験のために選択された生存促進剤が、別個の、異なる分子機構によってヒト好中球アポトーシスを遅延させるので特に興味深い。単球が混入していることが、ＬＰＳ介在性好中球生存の一因となるということを示唆する有力な証拠がある。したがって、ＬＰＳは、単球が、その他の生存因子（例えば、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８等）を合成及び放出して好中球生存を誘導することを誘発し得る。好中球アポトーシスに対するＬＰＳの正確な作用機序がなんであろうと、本発明者らのデータは、ＣＤＫ阻害剤がそれらを克服することができるということを明らかに示す。したがって、ＣＤＫ阻害剤の、内因性生存促進メディエーターを無効にする能力は、このようなメディエーターのレベルが、炎症部位で局所的に上昇して見られる炎症性疾患におけるそれらの使用の可能性をさらに示唆する。本発明者らは、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２酵素のタンパク質発現レベルは、アポトーシス過程の間に変化しないが、その酵素活性は変更されることを見出した。したがって、アポトーシス促進性抗Ｆａｓ抗体ＣＨ１１での好中球の処理は、アポトーシスの発生に先立ってＣＤＫ１活性の喪失をもたらした。対照的に、これまでに研究は、非循環神経細胞には、アポトーシスの誘導のためにＣＤＫ活性化が必要であり、ＣＤＫ阻害剤は細胞死を防ぐことができるということを示していた。
【００９６】
明らかに対照的に、本発明者らの結果は、ＣＤＫ活性が好中球生存にとって必要であり、必須であるということを示唆する。さらに、本発明者らは、Ｒ−ロスコビチン誘導性アポトーシスがカスパーゼ依存性であり、Ｍｃｌ−１；好中球アポトーシスの制御において重要であるとわかっている抗アポトーシスタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバー（Ｍｏｕｌｄｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ  ９２巻、２４９５〜２５０２頁（１９９８年））の発現の喪失を伴うことを示す。ＣＤＫ阻害剤によるＭｃｌ−１発現の喪失は、かなり興味深い焦点であり、アポトーシスの制御に関与する重要な機序である可能性がある。さらに、ＣＤＫ５もＲ−ロスコビチンの標的であり、このＣＤＫはヒト好中球において報告されている（Ｒｏｓａｌｅｓ，Ｊ．Ｌら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７９巻、５３９３２〜５３９３６頁（２００４年））ので、本発明者らはウエスタンブロット解析を実施し、ＣＤＫ５タンパク質がヒト好中球において実際に存在することを確認した（データを示さず）。
【００９７】
ＣＤＫ阻害剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを調節できることを実証したので、本発明者らは、カラゲナン誘導性胸膜炎のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、Ｒ−ロスコビチンが用量依存的に炎症の回復を促進することの確認を進めた。Ｒ−ロスコビチンはまた、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１及びＩＦＮ−γの放出も阻害し、このことは、回復促進的役割をさらに支持した。Ｒ−ロスコビチンがｉｎ  ｖｉｖｏで、アネキシンＶ標識によって、及び形態学的分析によって評価されるアポトーシスを誘導することが実証されたことは重要である。本発明者らは、これまでに、ラットにおけるカラゲナン誘導性胸膜炎の急性ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、ＭＡＰＫ及びＢｃｌ−２ファミリーに由来する生存促進分子、すなわち、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＥＲＫ１／２を阻害することは、炎症細胞アポトーシスを誘導することによって炎症の回復を促進し得ることを示している（ＳａｗａｔｚｋｙらＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １６８巻、３３〜４１頁（２００６年））。反対に、本発明者らはまた、アポトーシス促進分子、Ｂａｘの阻害は、このモデルにおいて炎症の回復を妨げるということも実証している。したがって、カラゲナン誘導性胸膜炎は、炎症回復を調査するためのアポトーシスの薬理学的処置のための優れたモデルであると思われる。
【００９８】
さらに、炎症反応の絶頂で投与されたＲ−ロスコビチンは、ブレオマイシン誘導性肺炎症の回復を増強した。このモデルは、その臨床的関連のためだけではなく（ＡｚａｍｂｕｊａらＰｕｌｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．  １８巻、３６３〜３６６頁（２００５））、劇的急性炎症反応の進行が、慢性炎症及び線維症に至るために（Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．らＮａｔ．Ｍｅｄ．  ８巻、４８０〜４８４頁（２００２年）、Ｔｅｄｅｒ，Ｐ．らＳｃｉｅｎｃｅ  ２９６巻、１５５〜１５８頁（２００２年））用いられた。このモデルでは、本発明者らは、気管支肺胞洗浄液中への初期好中球蓄積並びに後の肺炎症及び損傷が、Ｒ−ロスコビチン処理によって減弱されることを示す。重要なことに、本発明者らは、Ｒ−ロスコビチンがブレオマイシン誘導性致死性を減少させたことも観察し、このことから、肺損傷及び結果として起こる死につながるブレオマイシンが誘導する長期の炎症も、ＣＤＫ阻害剤によって減弱されることが示唆される。別の炎症モデルでは、本発明者らは、血清誘導性関節炎において、臨床スコアの改善によって評価される、炎症反応の回復の顕著な増強を観察した。ＣＤＫ阻害剤が好中球アポトーシスを促進することを示す本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、特に興味深いものであり、カラゲナン誘導性胸膜炎（ＳａｗａｔｚｋｙらＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １６８巻、３３〜４１頁（２００６年））、ブレオマイシン誘導性肺損傷（Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．らＮａｔ．Ｍｅｄ．  ８巻、４８０〜４８４頁（２００２年）、Ｔｅｄｅｒ，Ｐ．らＳｃｉｅｎｃｅ  ２９６巻、１５５〜１５８頁（２００２年））及び関節炎（Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｈ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  １１巻、６６６〜６７１頁（２００５年））のモデルを含めて、好中球がｉｎ  ｖｉｖｏにおける炎症反応の調節において非常に重要であることを示す一連の証拠を増大させる。
【００９９】
本発明者らはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＤＫ阻害剤による炎症の回復の増強が、アポトーシスの増強によって媒介されるかどうかを調査した。本発明者らは、カラゲナン誘導性胸膜炎のマウスモデルにおいて、広域性スペクトルカスパーゼ阻害剤；ｚＶＡＤ−ｆｍｋを用いるアポトーシスの阻害は、炎症の回復を妨げるということを示した。ｚＶＡＤ−ｆｍｋ投与の投与計画は、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果を誘発するために最も重要であり、３時間毎に注射を投与した先の研究に基づいていた（Ｄｅ  Ｐａｅｐｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏ  ｌ２８７巻、Ｌ７３０〜Ｌ７４２頁（２００４年））。重要なことに、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｒ−ロスコビチン誘導性アポトーシス及び抗炎症性効果は、カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋによって逆転され得る。このことは、ＣＤＫ阻害剤の抗炎症性機序が、カスパーゼ依存性炎症細胞アポトーシスの誘導によるものであるというさらなる証拠を提供する。
【０１００】
ＣＤＫは、多数の細胞種において豊富であり、細胞分裂及び増殖を決定的に調節する。ここで、本発明者らは、ＣＤＫの特異的阻害剤の全身投与は、炎症細胞のアポトーシスを原位置で誘導し、炎症回復を促進できることを実証する。癌におけるＣＤＫ阻害の効果を調査するその他のマウスｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、Ｒ−ロスコビチンの全身投与が、腫瘍の大きさの特異的低減を引き起こすことを示している（ＭｃＣｌｕｅ，Ｓ．Ｊ．らＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０２巻、４６３〜４５８頁（２００２年））。その研究の著者はまた、Ｒ−ロスコビチン（２ｇ／ｋｇという高用量でさえも）は、耐容性良好であるということを注記した。腫瘍細胞は、欠陥のあるＣＤＫ経路を有し、これが細胞増殖を促進し、細胞アポトーシスを妨げるということは広く認められており（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｋら、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．  ３６巻、１３１〜１４９頁（２００３年）、Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ，Ａ．Ｍ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２巻、６６０９〜６６２０頁（２００３年））、したがって、ＣＤＫ阻害剤は、これを特異的に標的とし、その治療的作用を誘発すると考えられている。本発明者らの研究は、ＣＤＫ阻害剤はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、非増殖性炎症細胞においてアポトーシスを促進し、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、アポトーシスを促進し、続いて、マクロファージによる好中球の安全なクリアランスによって炎症回復を加速するということを実証する最初のものである。結論として、本発明者らは、増大した、又は持続性の炎症反応を伴う疾患の治療にとって可能性を有し得るＣＤＫ阻害剤の新規な役割を同定した。
【０１０１】
本明細書において言及されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の実施形態に対する種々の変更及び改変は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求に係る本発明は、このような具体的な実施形態に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明らかである記載された本発明を実施する様式の種々の変更は、本発明によって包含されるものとする。
【図１ａ】
2009544750.tif 000002
【図１ｂ】
2009544750.tif 000003
【図１ｃ】
2009544750.tif 000004
【図１ｄ】
2009544750.tif 000005
【図１ｅ】
2009544750.tif 000006
【図１ｆ】
2009544750.tif 000007
【図１ｇ】
2009544750.tif 000008
【図１ｈ】
2009544750.tif 000009
【図２ａ】
2009544750.tif 000010
【図２ｂ】
2009544750.tif 000011
【図２ｃ】
2009544750.tif 000012
【図２ｄ】
2009544750.tif 000013
【図２ｅ】
2009544750.tif 000014
【図２ｆ】
2009544750.tif 000015
【図３ａ】
2009544750.tif 000016
【図３ｂ】
2009544750.tif 000017
【図３ｃ】
2009544750.tif 000018
【図３ｄ】
2009544750.tif 000019
【図３ｅ】
2009544750.tif 000020
【図３ｆ】
2009544750.tif 000021
【図３ｇ】
2009544750.tif 000022
【図４ａ】
2009544750.tif 000023
【図４ｂ】
2009544750.tif 000024
【図４ｃ】
2009544750.tif 000025
【図４ｅ】
2009544750.tif 000026
【図５ａ】
2009544750.tif 000027
【図５ｂ】
2009544750.tif 000028
【図５ｃ】
2009544750.tif 000029
【図５ｄ】
2009544750.tif 000030
【図５ｅ】
2009544750.tif 000031
【図４ｄ】
2009544750.tif 000032
【図４ｆ】
2009544750.tif 000033
【図４ｇ】
2009544750.tif 000034
【国際調査報告】
2009544750.tif 000035
2009544750.tif 000036
2009544750.tif 000037
2009544750.tif 000038