(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ干渉剤またはアンチセンス・ヌクレオチド分子であるオリゴヌクレオチを用いて、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することを含む、癌治療に対して細胞を感作する方法に関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば化学療法用の、少なくとも一種類の細胞増殖抑制剤と併用して用いることができる。さらに、本発明は、本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターと、該オリゴヌクレオチドを本発明の方法に用いられる少なくとも一種類の化学療法剤とともに含む医薬とに関する。
2009528346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療に対して細胞を感作する方法であって、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することが可能な化合物を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記細胞が真核細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類細胞がヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、またはウシに由来する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする前記核酸の活性を調節することが、少なくとも一種類のオリゴヌクレオチドを投与することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡ干渉剤またはアンチセンス・ヌクレオチド分子である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ干渉剤が干渉リボ核酸である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記干渉リボ核酸がｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓｈＲＮＡが配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一種類の化学療法剤が前記癌治療に用いられる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記癌治療が化学療法である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ抑制剤、白金誘導体、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤、モノクローナル抗体、生物応答調節剤、及び分化誘導剤からなる群から選択される請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法剤が、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ニュートリン３、リン酸エトポシド、および５−フルオロウラシルからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
癌治療に対して細胞を感作する方法であって、
ＲＰＳ２７Ｌタンパク質の活性を阻害することが可能な化合物を前記細胞に投与する方法。
【請求項１５】
前記細胞が真核細胞である請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも一種類の化学療法剤が前記癌治療に用いられる請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記癌治療が化学療法である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ抑制剤、白金誘導体、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤、モノクローナル抗体、生物応答調節剤、及び分化誘導剤からなる群から選択される請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化学療法剤が、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ニュートリン３、リン酸エトポシド、および５−フルオロウラシルからなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項５〜９のいずれかで定義された少なくとも一種類のオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項６〜９のいずれかで定義された少なくとも一種類のＲＮＡ干渉剤あるいは請求項６に記載の少なくとも一種類のアンチセンス・ヌクレオチド分子を含む医薬組成物。
【請求項２３】
少なくとも一種類のＲＮＡ干渉剤と少なくとも一種類のアンチセンス・ヌクレオチド分子とを含む請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１０〜１３または１７〜２０のいずれかに示す少なくとも一種類の化学療法剤をさらに含む請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
医薬として許容し得る送達担体をさらに含む請求項２２〜２４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
癌治療に対して細胞を感作する薬物を調製するためのＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することが可能な化合物の使用。
【請求項２７】
癌治療に対して細胞を感作する薬物を調製するためのＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節する化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節する（ことが可能な）化合物を細胞に投与することを含む、癌治療に対して細胞を感作する方法に関する。そのような調節が可能な化合物として、例えばＲＮＡ干渉剤またはアンチセンス・ヌクレオチド分子であり得るオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明で開示されるそのようなオリゴヌクレオチドを、少なくとも一種類の細胞増殖抑制剤と併用して、例えば化学療法に使用することができる。さらに本発明は、典型的な実施形態では、本発明で用いられるオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターと、そのようなオリゴヌクレオチドを本発明の少なくとも一種類の化学療法剤とともに含む医薬組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、一群の細胞（通常、単一細胞由来）が正常な増殖制御機構を失った病理学的障害であることから、無秩序な増殖を示す。癌性（悪性）細胞は、いかなる器官のいかなる組織からでも発生し得る。癌性細胞が成長かつ増殖するにつれて、癌性細胞は正常な隣接組織に侵入して破壊する癌性組織（腫瘍と呼ばれる）の塊を形成する。用語「腫瘍」とは、異常成長または塊のことを指すものである。腫瘍は癌性または非癌性であり得る。原発（初期）部位由来の癌性細胞は、体全体に拡散（転移）し得る。癌は世界的に主要な死因であり、先進国では主要な死因の第２位であり、さらにオーストラリア、日本、韓国、シンガポールでは死因の第１位であり、また英国およびスペインでは男性の死因の第１位である。毎年、癌を患う人々の数が連続的に増加している。
【０００３】
現在、癌の治療に使用される入手可能な薬は、腫瘍を形成するそれらの細胞を特異的に死に至らせることを目的としている。腫瘍学の現在の見解によれば、化学療法で抗癌剤により処置された腫瘍（悪性）細胞はアポトーシスによって死に至る。アポトーシスは、正常組織での細胞の欠失に関与する細胞死の様態とは異なる。また、アポトーシスは特定の病理学的背景で起こる。形態学的に、アポトーシスは周辺の常在細胞により貪食かつ消化されるほぼ完全な器官を含む膜包含アポトーシス小体の形成による細胞の急激な凝縮および分裂を伴う。関連する炎症はない。このプロセスの生化学的特徴は、オリゴヌクレオソーム・フラグメントの生産をもたらすヌクレオソーム間のリンカー領域での核ＤＮＡの二本鎖切断である。アポトーシスが生ずる状況の全てではないが、多くの場合において、それは伝令ＲＮＡおよびタンパク質合成の阻害剤によって抑制される。アポトーシスは自然発生的に悪性腫瘍に起こり、しばしば該悪性腫瘍の増殖を著しく遅らせ、さらにそれは照射、細胞障害性化学療法、加熱、およびホルモン療法に反応する腫瘍で増加する。しかし、かかるプロセスに対する現在の関心の多くは、それが特定の癌原遺伝子（プロトオンコジーン）およびｐ５３腫瘍抑制遺伝子によって調節され得るという発見に端を発する。ｐ５３腫瘍抑制因子は、致死プログラムを効果的に実行する上で必要とされる。
【０００４】
ｐ５３依存性細胞死プログラムを開始させるために、患者に対して、例えば異なる種類の細胞毒性剤による化学療法を施す。理想的な化学療法剤は、正常細胞に害を与えることなく癌細胞を破壊するものではあるが、そのような薬剤はほとんど存在しない。その代わりに、現在の化学療法では、薬剤は正常な非悪性細胞よりも癌（悪性）細胞に対して、より大きな損害を与えるように設計されている。それにもかかわらず、すべての化学療法剤は正常細胞に影響を及ぼして副作用を生じる。このことから、副作用がより少ない、癌治療のためのさらなる方法を開発することが、求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、副作用を過度に引き起こすことのなく、またはまったく引き起こすことなく、癌（悪性）細胞を殺すことが可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性またはＲＰＳ２７Ｌタンパク質を調節する化合物を細胞に投与することを含む、癌治療に対して細胞を感作する方法に関する。
【０００７】
一態様では、上記ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することが、核酸分子等の化合物を被験者に投与することを含む。核酸分子の活性を調節することが可能である適当な核酸分子の例には、ＲＮＡ干渉剤またはアンチセンス・ヌクレオチド分子等のオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０００８】
さらに別の態様では、この方法は少なくとも一種類の化学療法剤を投与することを、さらに含む。
本発明はまた、本発明の方法に用いられる少なくとも一種類のオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本発明の方法に用いられる少なくとも一種類の化学療法剤と、本発明の方法に用いられる少なくとも一種類の化合物、例えば少なくとも一種類のＲＮＡ干渉剤または／および少なくとも一種類のアンチセンス・ヌクレオチド分子とを含む、医薬製剤に関する。
（図面の簡単な説明）
図１は、ｐ５３の直接的な転写標的であるＲＰＳ２７Ｌを示す（より詳しくは、実施例１も参照）。図１Ａは、ＲＰＳ２７Ｌの発現がＤＮＡ損傷剤アドリアマイシン（ＡＤＲ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）によってＲＰＳ２７Ｌの発現がＰ５３遺伝子野生型ＨＣＴ１１６細胞において誘発されたこと実証するマイクロアレイ分析を示す。一般に、図１Ａは、ｐ５３に依存敵に遺伝毒性物質５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびアドリアマイシン（ＡＤＲ）により未制御となった遺伝子を示すマイクロアレイ・データのクラスター図である。図１Ｂは示した時間にわたるｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞のＡＤＲ（１μＭ）または５−ＦＵ（３７５μＭ）処理を示す。ＲＰＳ２７ＬレベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＧＡＰＤＨを添加対照として用いた。図１Ｂは、ｐ５３ネガティブである細胞ではなくｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞のみで、ＲＰＳ２７ＬｍＲＮＡがＡＤＲまたは５−ＦＵ処置後に誘導されたことを示す。これらの結果は、ＲＰＳ２７Ｌの発現とｐ５３の活性化および発現との間につながりがあることを示す。図１Ｃは、ｐ５３がＲＰＳ２７Ｌ遺伝子の第１のイントロンと結合することを示す。ＨＣＴ１１６細胞での全ゲノムｐ５３結合標的は、ＣｈＩＰ−ＰＥＴ技術を用いて既に実施されている(Wei, C.L., Wu, Q., et al., (2006) "A global map of p53 transcription-factor binding sites in the human genome" Cell, vol. 124, p.207-219)。例示したものは、５−ＦＵで処置したＨＣＴ１１６細胞でのＲＰＳ２７Ｌ遺伝子の第１イントロンに対して結合した９つのＰＥＴである。重複領域は、コンセンサスＰ５３遺伝子結合モチーフを含む。これらの結果は、ＲＰＳ２７ＬがＤＮＡ直接結合を介してｐ５３により上方制御されることを示している。図１Ｄは、ｐ５３結合部位を含むＲＰＳ２７Ｌ遺伝子プロモータをｐ５３が活性化させることを示す。上側の図は、ＲＰＳ２７Ｌ遺伝子プロモータの概略図である。１．１ｋｂＲＰＳ２７Ｌプロモータ領域（フラグメントＡ）内に仮想のｐ５３結合部位とＣｈＩＰ検証ｐ５３結合部位（フラグメントＢ）を含む領域とを含む２つのルシフェラーゼ・レポータ構築物を構築した。ｐ５３ＲＥとはｐ５３応答要素である。下側の図は、上記構築物に対して野生型ｐ５３およびＤＮＡ結合突然変異体ｐ５３（１７５Ｈ）を同時遺伝子導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｐ２１プロモータを含むレ
ポーター構築物を陽性対照として用いた。これらの結果は、ＣｈＩＰ分析によって測定されたように、第１のイントロン内に位置したｐ５３結合が機能的であり、ｐ５３応答性を与える。
【００１０】
図２は、異なるストレス信号に応答してＲＰＳ２７Ｌタンパク質が差別的に発現されることを実証したウェスタンブロット分析を示す（より詳しくは実施例２を参照）。図２Ａは、示した時間にわたってｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６細胞をＡＤＲ（１μＭ）、５−ＦＵ（３７５μＭ）、およびニュートリン３（１０μＭ）によって処置して得られた結果を示す。ｐ５３、ＲＰＳ２７Ｌおよびｐ２１タンパク質レベルをウエスタンブロット分析により測定した。チューブリンを添加対照として試験した。図２Ａから明らかなように、細胞をＡＤＲおよびニュートリン３で処置した場合にＲＰＳ２７Ｌのタンパク質レベルが増加したことがわかる。図２Ｂは、示した時間にわたってＵ２ＯＳ、Ｓａｏｓ−２、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をリン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））（１０μＭ）、ＡＤＲ（１μＭ）、または５−ＦＵ（３７５μＭ）で処置して得られた結果を示す。ｐ５３、ｐ２１、およびＲＰＳ２７Ｌタンパク質レベルをウエスタンブロット分析により測定した。チューブリンを添加対照として試験した。再び、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質レベルがＡＤＲおよびリン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））により細胞を処置することで上昇した。
【００１１】
図３は、ＲＰＳ２７Ｌ発現がｐ５３依存型アポトーシスを調節することを明らかにしている（より詳しくは実施例３を参照）。図３Ａはフローサイトメトリーにより測定されるように、ＨＣＴ１１６細胞（ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−）での細胞周期およびアポトーシス分析を示す。細胞を、ＡＤＲ（１μＭ）または５−ＦＵ（３７５μＭ）で４８時間処理した。図３Ａは、ＤＮＡ損傷剤であるＡＤＲがｐ５３遺伝子依存性細胞周期停止（高倍数体細胞（４Ｎ）数の増加）を誘導する一方で、５−ＦＵ処理がｐ５３依存性のアポトーシスを誘導することを明らかにしている。図３Ｂは、ＨＣＴ１１６細胞に対してＲＰＳ２７ＬｓｉＴＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの形質移入をおこなった後、示した時間にわたってリン酸エトポシド（ＶＲ１６（登録商標））（１０μＭ）処置して得られた結果を示す。ＲＰＳ２７Ｌ、ＲＰＳ２７、およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルの測定をＲＴ−ＰＣＲによっておこなった。図３Ｂは、ｓｉＲＮＡの標的配列が、ＲＰＳ２７Ｌ発現をほぼ完全に取り除き、ＤＮＡ損傷後のその誘導を抑制する一方で、密接に関連したＲＰＳ２７に影響を及ぼさないことから、効率的かつ特異的であったことを、示している。図３Ｃは、安定的にＲＰＳ２７ＬｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを発現するＨＣＴ１１６細胞を、ＡＤＲ（１μＭ）で４８時間処理することを示している。サブＧ１ＤＮＡ含有量を有する細胞で、細胞死（アポトーシス）の測定をおこなった。棒グラフは、示した標準偏差（ｓ．ｄ）とともに、個々におこなった３回の実験の平均値となる結果を示す。対照ｓｈＲＮＡを発現するｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞において、４８時間にわたるＡＤＲ処置は、増殖停止反応をもたらし、一方ＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞ではＡＤＲ処理されたマーカー細胞死を受ける。図３Ｄは、ＲＰＳ２７ＬｓｉＲＮＡをＨＣＴ１１６細胞に形質移入させた後、２４時間にわたりリン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標）（１０μＭ）またはＡＤＲ（１μＭ）処置をおこなって得られた結果を示す。サブＧ１ＤＮＡ含有量を有する細胞で、細胞死（アポトーシス）の測定をおこなった。各棒は、個々におこなった３回の実験の平均値±ｓ．ｄ．を表す。図３Ｄは、一過性ｓｉＲＮＡ形質移入を介したＲＰＳ２７Ｌのノックダウンが、ＨＣＴ１１６細胞でのＡＤＲまたはリン酸エポシド（ＶＲ１６（登録商標））処置における細胞死の顕著な増加も示すが、ｐ５３が無である対照物ではそのような増加が示されないことを示している。図３Ｅは、図１Ｃに示した細胞として処置した後に、ＪＣ−１染色およびフローサイトメトリー分析をおこなった細胞を示す。ミトコンドリアの欠陥が、膜電位（ΔΨｍ）の低い細胞の割合として表された。棒グラフは、個々におこなった３回の実験の結果を示す。図３Ｅは、ΔΨｍの著しい減少をもたらしたＲＰＳ２７ＬｓｈＲＮＡ細胞のＡＤＲ処置と対照細胞との比較（３３．５％対１３．５％）が、ミ
トコンドリア機能不全を伴うアポトーシス細胞死を示していることを、説明するものである。
【００１２】
図４は、ＲＰＳ２７ＬがＤＮＡ損傷に対してＤＮＡ損傷焦点を形成する核タンパク質であることを示す（より詳しくは実施例４を参照）。図４Ａは、Ｍｙｃタグ化ＲＰＳ２７Ｌ発現ベクターを形質移入されたＨＣＴ１１６細胞を示す。トランスフェクト細胞を固定し、抗Ｍｙｃ抗体およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇで染色（緑色）した後、共焦点顕微鏡検査をおこなった。核をＤＲＡＱ５で染色（青色）した。ローダミン・ファロイアジンをアクチン細胞骨格の対比染色（赤色）に用いた。図４Ｂは、ＶＰ１６（２０μＭ）で１６時間処理したＨＣＴ１１６対照およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞（緑色）を示す。ＲＰＳ２７ＬとγーＨ２ＡＸまたはＴｏｐＢＰ１との共局在化を、抗ＲＰＳ２７Ｌ（緑色）および抗γ−Ｈ２ＡＸまたは抗ＴｏｐＢＰ１（赤色）による蛍光免疫染色で検出した。核をＤＲＡＱ５（青色）で染色した。
【００１３】
図５は、ＲＰＳ２７Ｌ欠損は、不完全な細胞周期チェックポイントおよびＤＮＡ修復をもたらす（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌの損失が染色体不安定性に至る）ことを示す（詳しくは、実施例５を参照）。図５Ａは、ＡＤＲ（１μＭ）で２４時間処理したＨＣＴ１１６対照およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞を示す。該細胞をＢｒｄＵで３０分間処理し、ＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵおよび７−ＡＡ−Ｄで染色した。ＢｒｄＵの取り込み（ｙ軸）および全ＤＮＡ含有量（ｘ軸）をフローサイトメトリーで分析した。典型的なヒストグラムは、Ｓ期にある細胞の割合を示す。棒グラフは、個々におこなわれた３回の実験の結果を示す。図５Ｂは、リン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））（２０μＭ）で３時間処理したＨＣＴ１１６対照およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞を示す。その後、新鮮な培地に置き換えることでリン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））を取り除き、抗γＨ２ＡＸ染色をおこなうために細胞を０、３、６、および１６時間目に回収した。染色された細胞を共焦点顕微鏡で検討した。核をＤＲＡＱ５で染色した。図５Ｃは、ＡＤＲ処置２４時間後にＨＣＴ１１６対照およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞でのコメット・アッセイによって測定されるＤＮＡ損傷を示す。テイル・モーメント（テイル長の積およびＤＮＡの分数）として測定される損傷分布は、２つの細胞系統間で異なった。処置後のテイル・モーメント（マイクロンで）を与える。図５Ｄは、ＡＤＲ処置２４時間後、ＣＢＭＮアッセイにより測定された微小核の数（割合）を示す。示したデータは、未処置試料と比較した場合のＡＤＲ処置（１μＭ）したＨＣＴ１１６対照およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞に関するものである。合計１０００個の二核細胞を記録した。
【００１４】
図６は、ＲＰＳ２７Ｌ欠乏がＤＮＡ損傷に対するｐ２１蓄積を損なうことを示すウエスタンブロット分析を示す（より詳しくは実施例６を参照）。図６Ａは、ＡＤＲ（１μＭ）を２４および４８時間処理したＨＣＴ１１６対照およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞ｐ５３とその標的遺伝子ｐ２１、Ｐｕｍａ、およびＭＤＭ２とのウエスタンブロット分析を示す。チューブリンを充填対照として用いた。図６Ｂは、ＲＰＳ２７ＬｓｉＲＮＡまたは対照ＳｉＲＮＡを形質移入したＵ２ＯＳ細胞の分析を示す。トランスフェクション細胞をＡＤＲ（１μＭ）で２４時間処理した。図６Ａと同様に、ｐ５３およびその標的遺伝子の発現レベルを示す。図６Ｃは、図に示すように、ＡＤＲ処理したＨＣＴ１１６対照およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞におけるＲＰＳ２７Ｌおよびｐ２１ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。図６Ｄは、ｐ２１を形質移入したＨＣＴ１１６細胞のタンパク質分析の結果とＲＰＳ２７Ｌの増加とを示す。ｐ２１およびＲＰＳ２７Ｌタンパク質発現をウエスタンブロット分析によって試験した。アクチンを充填対照として用いた。
【００１５】
図７は、ｐ２１欠乏が細胞周期チェックポイント欠損およびＤＮＡ損傷に応答したアポトーシスの増加を誘発するのに十分であることを明らかにしている（より詳しくは実施例６を参照）。図７Ａは、ＡＤＲで２４時間処理したＨＣＴ１６対照およびｐ２１欠乏細胞
と、ウエスタンブロット用に調製したｐ５３、ｐ２１、およびＰｕｍａの細胞溶解物とについてのウエスタンブロット分析を示す。図７Ｂは、ＡＤＲを２４時間処理し、ＤＮＡ合成およびＤＮＡ含有量についてＢｒｄＵおよび７−ＡＡ−Ｄによる染色を夫々施したＨＣＴ１１６対照およびｐ２１欠乏細胞を示す。染色した細胞をＦＡＣＳで分析した。ヒストグラムは、Ｓ期にある細胞の割合とＤＮＡ含有量が＞４Ｎである細胞集団とを示す。棒グラフは、個々におこなわれた３回の実験の結果を示す。図７Ｃは、図７Ａに示す細胞と同様に処置された細胞を示し、細胞死はサブＧ１含有量を有する細胞と同様に評価した。図７Ｄは、ＤＮＡ損傷応答におけるＲＰＳ２７Ｌ機能のモデルを示す。ｐ５３によるＲＰＳ２７Ｌの誘導は、ｐ２１依存および非依存機能を介したＤＮＡ損傷を防ぐ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、非限定的な例及び添付図面とともに検討する場合に、詳細な説明を参照することで、より詳しく理解される。
本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用する特定の用語を以下により詳しく説明する。別段の定めがない限り、本明細書中に使用される技術用語および科学用語の全ては、本明細書が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同義である。同様に、本明細書中で使用される術語は、特定の実施形態のみを説明するものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本出願で引用される全ての文献を本明細書中に参照により組み込む。
【００１７】
「含む」が意味することは、限定されるものではないが、「含む」という語に続くものに限定される。したがって、「含む」という用語は、列挙された要素が必要すなわち必須であることを示すが、他の要素は任意であることすなわち存在が望まれるても望まれなくてもよいことを示している。
【００１８】
「からなる」が意味することは、限定されるものではないが、「からなる」という語に続くものに限定される。したがって、「からなる」という言葉は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素は存在しないと思われることを示している。
【００１９】
「投与すること」または「投与」とは、治療効果のある核オリゴヌクレオチドまたは化学療法剤等の本発明で言及される化合物／分子あるいは本発明で言及される該分子を含む医薬組成物を、ＲＰＳ２７Ｌの発現を調節することで影響され得る癌または他の疾患の予防または治療を目的として、生物に送達することをいう。
【００２０】
用語「形質移入」は、核酸媒介遺伝子移入によって核酸（例えば発現ベクター）を受容細胞に導入することを意味する。
用語「ベクター」とは、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子のことをいう。ベクターの一種類は、ゲノム組込み型ベクター、すなわち「組込み型ベクター」であり、これは宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることができる。ベクターの別の種類は、エピソーム型ベクター、すなわち適当な宿主（例えば、真核または原核宿主細胞）内での染色体外複製をおこなうことができる核酸である。作用可能に連結した遺伝子の発現を指示することができるベクターのことを、本明細書中で「発現ベクター」という。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、文脈から明らかである場合を除いて、同義的に用いられる。
【００２１】
用語「核酸」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド分子」、または「オリゴヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチド（例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））のことをいう。この用語もまた、説明されている実施形態に当てはまるように、単鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されなければならない。リボースまたはデオキシリボースの他に、ヌクレオチド・サブ
ユニットの糖基は、修飾誘導体（例えば２’−Ｏ−メチル・リボース）であってもよい。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド・サブユニットは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、エチルホスホネート結合、またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを阻害しない他の稀なもしくは非天然の結合によって、連結可能である。さらに、オリゴヌクレオチドは、異常なヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を有する場合がある。
【００２２】
「核酸ハイブリダイゼーション」という言葉は、全面的または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を持つ２本の核酸鎖が所定の反応条件下で重合し、特異的な水素結合を持つ安定な二本鎖ハイブリッドを形成するプロセスを意味する。いずれの核酸鎖もデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはこれらの核酸のうちの１つの類似体であってもよいことから、ハイブリダイゼーションはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含み得る。
【００２３】
「相補的」が意味することは、２本の単鎖核酸の類似の領域または同一単一鎖核酸の異なる領域が、単鎖同士が安定な二重鎖水素結合領域でハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成を有することである。一本鎖領域のヌクレオチドの連続した配列が、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と一連の「標準的な」水素結合塩基対（ＡがＵもしくはＴと対をなし、ＣがＧと対をなすように）を形成することが可能である場合、該ヌクレオチド配列は「完全に」相補的である。
【００２４】
「タンパク質コード配列」または特定のポリペプチドまたはペプチドを「コードする」配列は、適当な制御配列の制御下に置かれた場合に、生体内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で転写（ＤＮＡの場合）され、ポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決まる。コード配列は、限定されるものではないが、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列も含み得る。転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’方向に位置する。
【００２５】
「細胞」または「宿主細胞」は、本明細書中で同義的に使用される用語である。そのような用語は、特定の被験細胞のみを指すものではなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものと理解される。
【００２６】
本発明の明細書および特許請求の範囲で使用される用語「感作する（ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ）」は、特定の治療に対して以前よりも感受性が高いことを表現している。例えば、本明細書中で説明する化学療法剤を用いた癌（化学療法剤が効果なしまたは投与量が高い場合のみに効果があった癌）を処置するための治療方法を、そのまま用いるか、または本発明の方法を用いて細胞の「感作」した後でより低い投与量で用いることが可能である。
【００２７】
「核酸の活性を調節する」ことの意味は、ポリペプチド（例えば、タンパク質、生成物）へのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のコード配列転写レベルおよび／または翻訳（発現）レベルを変更または調節（例えば減少もしくは増加）させることである。
【００２８】
ＤＮＡ損傷に反応して、哺乳類動物細胞は防御系を活性化させることで、正常な生活環を続けるために修復を可能にさせる、あるいは既に述べられたように、過度かつ修復不能な損傷に直面した場合にアポトーシス機構を活性化させることが可能である（Zhou, B.B.
and Elledge, SlJ. (2000) "The DNA damage response: putting checkpoints in perspective" Nature, vol. 408, p.433-439）。腫瘍抑制因子ｐ５３は、ＤＮＡ損傷応答にお
いて重要な役割を果たすと考えられている。ＤＮＡ結合活性を有する転写因子として、ｐ５３はヒト・ゲノム内の３００個ほどの標的遺伝子に結合し（Wei, C.L., Wu, Q. et al.
(2006) "A global map of p53 transcription-factor binding sites in the human genome" Cell, vol. 124, p.207-219) and actively regulates the expression of its downstream target genes (Kho, P. S., Wang, Z. et al. (2004) "p53-regulated transcriptional program associated with genotoxic stress-induced apoptosis" J Biol Chem,
vol. 279, p.21183- 21192）の発現を調節する。ＤＮＡ損傷後のＰ５３遺伝子活性化の
主な結果は、細胞周期停止、老化、またはアポトーシスの誘導である（Lane, D.P. and Lain, S. (2002) "Therapeutic exploitation of the p53 pathway" Trends MoI Med, vol. 8, p.38-42; Vogelstein, B., Lane, D. and Levine, AJ. (2000) "Surfing the p53 network" Nature, vol. 408, p.307-310）。
【００２９】
現在の証拠は、ｐ５３依存細胞周期停止が主に、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ２１の転写誘導を介して媒介される（el-Deiry, W.S., Tokino, T., et al., (1993) "WAFl, a potential mediator of p53 tumor suppression" Cell, vol. 75, p.817-825; Harper, J.W., Adami, G.R., et al., (1993) "The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of Gl cyclin-dependent kinases" Cell, vol. 75, p.805-816）。しかし、ｐ５３誘導アポトーシスの機構は不透明である。ｐ５３はアポトーシス
標的遺伝子、例えばＰＵＭＡ、ＢＡＸ、ＮＯＸＡ、ＢＩＤ、ＰＩＧ３、ＣＤ９５、ＤＲ５、またはｐ５３Ａ１Ｐ１の転写活性化を介してアポトーシスを誘導すると考えられている（Vogelstein, B., Lane, D. and LeVine, AJ. (2000), 前掲; Vousden, K.H. and Lu, X. (2002) "Live or let die: the cell's response to p53" Nat Rev Cancer, vol. 2, p.594-604）。
【００３０】
ＤＮＡ損傷後のｐ５３に対する細胞性応答は、細胞型および刺激によって変化する。この応答は、ＤＮＡ修復の開始および損傷チェックポイントであり得、細胞周期停止をもたらし、あるいは不完全なＤＮＡ修復の結果としてアポトーシスをもたらす。例えば、ＤＮＡ損傷剤アドリアマイシン（ＡＤＲまたはドキソルビシンともいう）によるｐ５３の活性化はＨＣＴ１１６細胞（野生型ｐ５３を含むヒト大腸癌細胞系統）でのｐ５３依存性細胞周期停止をもたらした一方で、同一細胞において、ＤＮＡ類似体５−フルオロウラシルによるｐ５３活性化がアポトーシスを起こす。異なる遺伝毒性ストレスへのｐ５３遺伝子応答の後の細胞の運命を支配するシグナルは、いまだ理解されていない。
【００３１】
さらに、増えつつある証拠が示唆することは、ｐ５３依存性転写がしばしば、ヒト癌細胞で抗アポトーシス応答を誘発し、ｐ２１がこの抗アポトーシス応答を媒介する重要な分子であると考えられる（Yu, Q. (2006) "Restoring p53-mediated apoptosis in cancer cells: New opportunities for cancer therapy" Drug Resist Updates, vol. 9, p.19-25）。ｐ２１がＣＤＫ抑制剤として機能することも周知である。したがって、ｐ２１レベ
ルの操作は、化学療法的応答を調節するための可能性のあるアプローチであると思われる（Weiss, R.H. (2003) "p21Wafl/Cipl as a therapeutic target in breast and other cancers" Cancer Cell, vol. 4, p.425-429）。
【００３２】
化学療法剤等によって生じたＤＮＡ損傷に対する細胞の運命に影響を与えるのに有用であると思われる別のｐ５３標的を同定することを目的として、本発明者は、今まで未知の機能を持つＳ２７様リボソームタンパク質（ＲＰＳ２７Ｌ）をコードするＲＰＳ２７Ｌがｐ５３によって調節されること観察した（さらに詳しくは実施例１を参照）。実施例１に記載された結果は、ＲＰＳ２７Ｌ発現が直接ＤＮＡ結合を介してｐ５３によって上方制御されることを示す。この発明では、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質発現がｐ５３活性化のストレスの種類に依存するという、さらなる知見が得られた。ＡＤＲ処理細胞でのそれの誘導が細胞周期停止応答に関連する一方で、５−ＦＵ処理でのＲＰＳ２１７タンパク質レベルの
減少が強いアポトーシス応答に相関する（さらに詳しくは実施例２を参照）。このことは、例えば、ＲＰＳ２７Ｌがない状態で、化学療法剤等によって生じたＤＮＡ損傷が細胞周期停止の代わりにアポトーシスを誘導することを意味する。したがって、ＲＰＳ２７Ｌは、ｐ５３活性化に続く細胞のアウトプットを決定する制御スイッチとして機能すると思われる。
【００３３】
したがって、本発明の一態様は、癌治療に対して細胞を感作する方法であって、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性または該ＲＰＳ２７タンパク質そのものを、ＲＰＳ２７Ｌをコードする核酸の遺伝子活性を調節することができる、またはＲＰＳ２７タンパク質を調節することができるそれぞれの化合物によって、調節する方法を提供する。反応性が高められる細胞は、任意の与えられた細胞とすることができ、一般には哺乳類細胞である。例えば、該哺乳類細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、またはウシ由来のものであり、例えば、ヒト患者またはマウスあるいは任意の他の哺乳類を本発明の感作する方法を用いて処置することができることを意味している。
【００３４】
実施例３では、本発明はＲＰＳ２７Ｌタンパク質のレベルがｐ５３依存性ＤＮＡ損傷応答を増殖停止から細胞死へと変える。したがって、本発明の方法は、例えば、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする前記核酸の活性を調節することによって、悪性細胞でアポトーシスを誘導するために使用し得る。
【００３５】
このアプローチを、以下でさらに例示する。ＨＣＴ１１６細胞では、ＤＮＡ損傷剤ＡＤＲ（化学療法的癌治療に使用されるトポイソメラーゼ阻害剤）が主にｐ５３依存性細胞周期停止を誘導することが知られている（Bunz, F., Hwang, P.M., et al. (1999) "Disruption of p53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents" J Clin Invest, vol. 104, p.263-269; Tan, J., Zhuang, L., et al. (2005) "Pharmacologic modulation of glycogen synthase kinase-3beta promotes p53 -dependent apoptosis through a direct Bax-mediated mitochondrial pathway in colorectal cancer cells" Cancer Res, vol. 65, p.9012-9020）。ＨＣＴ１１６細胞内でのＲＰＳ２７Ｌタンパ
ク質のレベルが減少してＡＤＲによる処理を繰り返した場合、細胞周期停止に切り替わる代わりに、細胞は著しい細胞死を経験する（詳しくは図３Ａおよび実施例３を参照）。同様の効果を、リン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標）、別のトポイソメラーゼ阻害剤）または他の細胞系統、例えばＵ２ＯＳ、Ｓａｏｓ−２、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙを用いた同じ実験を実施した場合に観察することができる。癌の処置におけるこのアプローチの後で、細胞を感作することができる。すなわち、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質のレベルおよびＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードするＲＰＳ２７ＬｍＲＮＡが減少する場合に、例えば一種類以上の化学療法用抗癌剤での処理に対して、細胞をより感受性のあるものにする。したがって、ＤＮＡ損傷を有する細胞毒性の薬剤（例えば、抗癌化学療法において）の使用に直面して、悪性腫瘍細胞は、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質レベルが欠乏した場合に、ＤＮＡ修復よりもアポトーシスを経験する。本発明の方法の使用によって悪性細胞を感作することで、悪性細胞におけるＲＰＳ２７タンパク質レベルの減少によって細胞修復のための経路が妨げられることから、高投与量の化学療法用抗癌剤の使用が避けられる。したがって、既に低い量の抗癌剤は、腫瘍の効果的処置を提供する。低量の抗癌剤を使用することは、明らかに、比較的深刻さが少なく、抗癌化学療法で一般に使用される薬物で通常観察され得る副作用さえもない。
【００３６】
ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することができる化合物は、コードされた核酸の活性に影響を及ぼすことができる核酸分子であってもよい。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、オリゴヌクレオチド等の適当な核酸を投与することによって、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することを含む。このオリゴヌクレオチドは、真核生物の細胞（好ましくは悪性細胞）またはさらに正確には哺
乳類細胞に投与されると、ヒトの悪性細胞のように、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性の調節を引き起こす。一態様では、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性の調節は、この核酸の減少または増加を意味する。
【００３７】
ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することができるオリゴヌクレオチド等の核酸分子は、例えば、ＲＮＡ干渉剤またはアンチセンス・ヌクレオチド分子であり得る。細胞へのアンチセンス・ヌクレオチド分子の導入および転写は、ＲＰＳ２７ＬをコードするｍＲＮＡ分子に相補的であるＲＮＡ分子の合成をもたらす。次に、このＲＮＡ分子（すなわち、アンチセンスＲＮＡ）は、ＲＰＳ２７ＬをコードするｍＲＮＡの発現を抑制するために使用し得る遺伝学的ツールを提供する。もちろん、このアンチセンス分子は、ＲＰＳ２７ＬをコードするＲＮＡ分子全体に対して相補的であるＲＮＡ分子を提供することができる必要はないが、ＲＰＳ２７ＬをコードするｍＲＮＡの発現を阻害するアンチセンスＲＮＡのフラグメントを提供するのに十分なものである。アンチセンス技術は、確立した方法論になり（例えば、Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides
and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997またはCrooke, S.T. Progress in Antisense Technology, Annual Review of Medicine, February 2004, Vol. 55: Page 61 - 95を参照）、またそれぞれのアンチセンス・ヌクレオチド分子の設計は、当該技術分野の当業者の技術範囲である。
【００３８】
アンチセンス・ヌクレオチド分子に加えて、またはそれに代わって、ＲＮＡ干渉剤（すなわち、干渉リボ核酸）もまた、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節する化合物として使用し得る。干渉ＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ等の干渉リボ核酸の使用は、特定の遺伝子を「ノックダウン」するための強力なツールとなっている。ＲＮＡｉ方法論は、転写後レベルで起こり、かつｍＲＮＡ分解を伴うＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制を利用する。ＲＮＡ干渉は、ゲノムを保護する細胞機能に相当する。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子は、複数の酵素からなる複合体にｓｉＲＮＡが会合することで相補的ＲＮＡの分解を媒介し、いわゆるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡはＲＩＳＣの一部になり、相補的ＲＮＡ種（次に切断される）を標的とする。ｓｉＲＮＡは、対応する相補鎖と完全に対を形成する塩基であり、一方ｍｉＲＮＡ二本鎖は不完全に対を形成する。ＲＩＳＣの活性化は、各々の遺伝子の発現の喪失に至る（概要についてはZamore, P.D. and Haley, B. (2005) "Ribo-gnome: The Big World of Small RNAs" Science, vol. 309, p. 1519-1524を参照）。干渉リボ核酸は、長さが約１００ｎｔ未満で
あり、概して約７５ｎｔ長未満であると思われる。干渉リボ核酸が、互いにハイブリダイズした２つの異なるリボ核酸の二本鎖構造（例えば、ｓｉＲＮＡ）である場合には、該二本鎖構造の長さが概して約１５〜３０ｂｐ、通常は約１５〜２９ｂｐの範囲である。ＲＮＡｉ剤が、ヘアピン形成に存在する単一のリボ核酸の二本鎖構造（すなわちｓｈＲＮＡ）である場合、該ヘアピンのハイブリッド部分の長さは概して、上記したｓｉＲＮＡ型の薬剤のものと同じか、それよりも４〜８ヌクレオチド長い。
【００３９】
本発明の癌治療に対して細胞を感作する方法で使用し得るｓｉＲＮＡ分子の具体例は、配列番号１に示す１９塩基対長のヌクレオチド配列を含むかまたは有する（実施例３も参照）。したがって、本発明の方法で用いる薬剤は、癌の治療または予防のための治療法に用いることができる。
【００４０】
悪性標的細胞が生体内である場合、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドを、当業者に公知の任意の簡便なプロトコールを用いて、哺乳類宿主に対して投与することができる。以下の説明は、使用してもよい代表的な核酸投与プロトコールを概説したものである。核酸を、数多くの経路（ウイルス感染、顕微注射、または小胞の融合を含む）によって、組織または宿主細胞に導入することが可能である。
【００４１】
placeCityFurth, P.A., Shamay, A., et al. (1992) "Gene transfer into somatic tissues by jet injection" Anal Biochem, vol. 205, p.365-368に記載されているように
、ジェット式注射を筋肉内投与に使用することも可能である。文献（Tang, D. C, De Vit, M., et al., (1992) "Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response" Nature, vol. 356, p.152- 154）に記載されているように、核酸を金の微粒子上に被覆し、微粒子銃装置または「遺伝子銃」によって皮内送達することも可能である。ｓｉＲＮＡを送達するためにナノ粒子を用いることは、細胞特異的ターゲッティングにとってもう一つの好適なアプローチである。この方法は、例えば、Weissleder, R., Kelly, K., et al. (2005) "Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules" Nature Biotech, vol. 23, p. 1418-1423に記載されている。
【００４２】
本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドを生体内で選択細胞に送達する別の具体例は、重鎖抗体フラグメント（Ｆａｂ）と核酸結合タンパク質プロタミンとの融合タンパク質に対するその非共有結合である（Song, E., Zhu, P., et al. (2005) "Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors" Nature Biotech, vol. 23, p. 709-717）。生体内で選択細胞内へｓｉＲＮＡ分子を送達する別の具体例は、それをリポソームに封入することである。Morrissey, D., Lockridge, J., et al. "Potent and Persistent hi Vivo Anti-HBV Activity of Chemically Modified
siRNAs" Nature Biotech (2005), vol. 23, p. 1002-1007は、例えば、静脈内投与のた
めのリポソームを形成するためにポリエチレングリコール・脂質複合体により被覆された安定した核酸・脂質粒子を用いた。本発明では、リポフェクタミン２０００システム（インヴィトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を細胞に形質移入するための具体的な例として用いた（より詳しくは実施例３を参照）。
【００４３】
選択された悪性標的細胞にＲＮＡ干渉剤を送達するさらに別の例は、各々の核酸分子を含む細菌またはウイルス（例えば、アデノウイルス）等の生物学的媒体の使用である。Xiang, S., Fruehauf, J., et al. (2006) "Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals" Nature Biotech, vol. 24, p. 697-702は、例えば、
プラスミド（とりわけｓｈＲＮＡおよび湿潤により、哺乳類細胞への侵入とそれに続く遺伝子抑制を可能にする）から転写された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を投与することでこのアプローチを用いている。
【００４４】
本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドを所望の細胞に導入するために、発現ベクターを使用することが可能である。また、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドを、標的遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ）を含む宿主生物へ直接供給したり、注射することができる。このオリゴヌクレオチドを直接細胞に導入（細胞内的に）したり、または細胞外的に空洞、間質腔へ導入したり、生物の循環器系へ、経口的に導入したり等が可能である。経口的導入の方法として、ＲＮＡを生物の餌と直接混ぜることも含まれる。核酸を導入するための物理的方法として、ＲＮＡ溶液を細胞内に直接注射すること、または生物に細胞外注射することが挙げられる。薬剤の導入は、一細胞あたり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で、おこなうことが可能である。高用量（例えば、一細胞あたり少なくとも５、１０、１００、５００、または１０００コピー）の薬剤は、より有効な阻害を生ずると考えられ、低用量もまた特定の用途では有用であると考えられる。
【００４５】
既に述べたように、本発明の方法で言う癌治療は、化学療法剤が使用される化学療法であり得る。本発明の方法で使用される化学療法剤として、限定されるものではないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ抑制剤、白金含有化合物、ホ
ルモン、シグナル伝達阻害剤、モノクローナル抗体、生体応答調節剤、または分化誘導剤が挙げられる。
【００４６】
通常、化学療法剤は細胞周期の特定の期間の異なる生化学的プロセスに作用する。例えば、５−フルオロウラシルおよび葉酸拮抗薬等の代謝拮抗剤は、主にＤＮＡ合成を阻害することで、細胞のＳ期に作用する。コルヒチンおよびビンクリスチンは、細胞のＭ期を阻害する。他の化学療法剤は、細胞周期の異なる期に作用する。
【００４７】
アルキル化剤の例として、シクロホスファミド、クロラムブシル、およびメルファランが含まれる。これらの化合物は、ＤＮＡと化学結合を形成し、ＤＮＡを切断して、該ＤＮＡの複製にエラーを生じさせる。代謝拮抗剤の例として、メトトレキセート、シタラビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が含まれる。これらの化合物は、ＤＮＡの合成を阻害する。抗有糸分裂剤の例として、ビンクリスチン、コルヒチン、パクリタキセル、およびビノレルビンが含まれる。これらの化合物は、癌細胞の分裂を阻害する。トポイソメラーゼ抑制剤の例として、限定されるものではないが、ドキソルビシン（アドリアマイシン、ＡＤＲ）、リン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））、およびイリノテカンが挙げられる。これらの化合物は、トポイソメラーゼと呼ばれている酵素の阻害を介して、ＤＮＡ合成および修飾を妨げる。白金含有化合物／誘導体の例として、シスプラチンおよびカルボプラチンが挙げられる。そのような化合物は、ＤＮＡと結合して破壊する。ホルモン癌治療に用いられる化合物の例として、限定されるものではないが、タモキシフェンおよびビカルタミドが挙げられる。例えば、タモキシフェンはエストロゲンの作用（乳癌で）を阻害し、一方ビカルタミドはアンドロゲンの作用（前立腺癌で）を阻害する。シグナル伝達阻害剤の例は、イマチニブという化合物である。イマチニブは、慢性骨髄性白血病での細胞分裂のシグナルを阻害する。モノクローナル抗体の具体例として、リタキシマブ、トラスツズマブ、およびゲムツズマブ・オゾガマイシンが挙げられる。リタキシマブは、リンパ球から派生した腫瘍上の細胞表面受容体への結合を介して、細胞死を引き起こす。トラスツズマブは、乳癌細胞上の増殖因子受容体を阻害し、ゲムツズマブ・オゾガマイシンは、白血病細胞上に見いだされる受容体に結合する特異的抗体を含み、その化学療法的成分の毒性用量を該白血病細胞に送達する。生体応答調節剤の一例は、インターフェロンーアルファである（これに関しては正確な生化学的機能はまだ知られていない）。分化誘導剤の一例は、白血病細胞の分化および死を誘導するトレチノインである。
【００４８】
別の実施形態では、化学療法剤は、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ニュートリン３、リン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））、または５−フルオロウラシルであってもよい。もちろん、ＰＲＳ２７Ｌタンパク質をコードする核酸の活性を調節することが可能なここに記載した化合物とともに、異なる化学療法剤の組み合わせを用いることも、可能である。
【００４９】
留意すべき点は、アポトーシスにより再び細胞死に影響を及ぼし得るＤＮＡ損傷を、すべての化学療法剤が直接または間接的に生じる点である。細胞のアポトーシス経路の活性化により、ＲＰＳ２７Ｌをコードする核酸の活性を調節することが、細胞の運命に影響を与え得る。腫瘍の場合、所望のアプローチは、悪性細胞が細胞停止または老化ではなくてアポトーシス経路に入るように、ＲＰＳ２７Ｌの活性が調節されることである。したがって、このように、本発明の方法において言及されるＲＮＡ干渉剤またはアンチセンス・ヌクレオチド分子の併用効果は、これらのオリゴヌクレオチドと化学療法剤との直接相互作用に依存するのではなく、むしろ細胞損傷（例えば、ＤＮＡ損傷）によって活性化される同一の生化学的経路に対するそれらの影響に依存する。したがって、当業者には、本発明の現方法が優先的に悪性細胞のアポトーシスを誘導することが理解される。
【００５０】
ＲＰＳ２７Ｌが実際にＤＮＡ損傷後にｐ５３依存性生物学的経路で重要な役割を果たすことは、実施例４〜６に記載した結果によって実証される。この実施例に記載された結果は、さらに、ＲＰＳ２７ＬがＤＮＡ損傷応答に関与し、かつＤＮＡ二本鎖切断の一部に採用される核タンパク質であることを説明する。
【００５１】
別の態様では、本発明は医薬製剤に関し、該医薬製剤は、上記した少なくとも一種類の化学療法剤を単独で、あるいは、例えば本発明の方法で使用した少なくとも一種類のオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡ干渉剤および／またはアンチセンス・ヌクレオチド分子）とともに含む。
【００５２】
医薬製剤を、治療を目的とした投与のために、種々の剤形で投与することができる。より詳しくは、本発明の医薬製剤を、医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて処方して医薬組成物とすることができ、固体、半固体、液体、または気体状の製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入抗原、およびエアゾール）に処方してもよい。このように、医薬製剤の投与は種々の方法で達成することができ、該方法として、経口投与、口腔投与、直腸投与、非経口投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、気管内投与等が挙げられる。
【００５３】
薬剤投与形態では、本発明の医薬製剤を単独で、または他の薬剤活性化合物と関連させてもしくは組み合わせて投与してもよい。以下の方法および賦形剤は、単に例として挙げるものであり、決して限定するものではない。
【００５４】
経口剤として、医薬製剤を単独で、あるいは錠剤、粉剤、顆粒剤、またはカプセル剤を作るための適当な添加物、例えば、従来の添加物（例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、もしくはポテトスターチ）、結合剤（例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、もしくはカルボキシメチル・セルロース・ナトリウム）、潤滑剤（例えば滑石またはステアリン酸マグネシウム）、ならびに、必要に応じて、希釈剤、干渉剤、湿潤剤、防腐剤、および香料と組み合わせて用いることができる。
【００５５】
上記のものを水性溶媒または非水性溶媒（例えば植物油もしくは他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸エステル、またはプロピレングリコール）に、必要に応じて従来の添加剤（例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および防腐剤）とともに、溶解、懸濁、または乳化することによって、注射用に医薬製剤を処方することができる。
【００５６】
医薬製剤を、吸息を経て投与されるエアゾール製剤に用いることができる。本発明の製剤を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧可能な推進剤に処方することができる。
【００５７】
医薬製剤を全身的な方法よりも局所的な方法、例えば化合物を充実性腫瘍に直接注射（デポー製剤または徐放製剤として）することによって、投与することも可能である。さらに、各々の化合物または医薬組成物を標的薬物送達系、例えば腫瘍特異的抗体で被覆したリポソームに使用することも可能である。そのようなリポソームは、例えば腫瘍に対して標的化され、かつ選択的に該腫瘍に取り込まれるものであってもよい。
【００５８】
既に述べられた製剤に加えて、医薬製剤もまたデポー製剤として処方することが可能である。そのような長期間作用性の製剤を、注入（例えば、皮下または筋注）あるいは筋肉注射によって投与してもよい。したがって、例えば、医薬製剤を適当な高分子材料または疎水性材料（例えば、許容される油内のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とと
もに、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性の塩として）、処方することも可能である。
（実施例１）
ゲノム分析はｐ５３の直接的な転写標的としてＲＰＳ２７Ｌを同定する
ｐ５３は、主に下流の標的の転写制御を介して、腫瘍抑制因子機能を発揮する（Vogelstein, B., Lane, D. and Levine, AJ. (2000)前掲、Vousden, K.H. and Lu, X. (2002)前掲）。ｐ５３結合遺伝子座をゲノム規模でマッピングすることを通して、さらなるｐ５３下流標的を同定する以前の研究（Wei, C.L., Wu, Q., et al., (2006)前掲）では、既に
知られている機能を有するＳ２７様リボソームタンパク質（ＲＰＳ２７Ｌ）をコードするＲＰＳ２７Ｌが潜在的にｐ５３によって調節されることが、観察された。ＲＰＳ２７Ｌは、ヒト第１５染色体上の位置６１２３５８５６〜６１２３７６６０に局在している。
【００５９】
図１Ａは、ｐ５３遺伝子野生型ＨＣＴ１１６細胞（野生型ｐ５３を含むヒト大腸癌細胞系統）において、ＤＮＡ損傷剤アドリアマイシン（ＡＤＲ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）によって発現が誘導されたが、ｐ５３ヌル対照では発現が誘導されなかった一組の遺伝子を示すマイクロアレイ分析を示す。いずれの処理でも、ＲＰＳ２７Ｌは、ｃｄｋｎ１ａ（ｐ２１をコード）、Ｐｍａｉｄ（Ｎｏｘａをコード）、およびｃｃｄ３（Ｐｕｍａをコード）等の真正のｐ５３標的とともに、ｐ５３依存的な形式で調節されていなかった。マイクロアレイ・データを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析をおこなった（図１Ｂ）。図１Ｂは、ＲＰＳ２７ＬｍＲＮＡが、ｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞においてのみ、ＡＤＲまたは５−ＦＵ処理の後に、誘導されたことを示している。これらの結果は、ＲＰＳ２７Ｌの発現とｐ５３の活性化および発現との間に関連性があることを実証している。
【００６０】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）−ＰＥＴ技術（Wei, C.L., Wu, Q., et al., (2006)
前掲）を用いてヒト・ゲノムで本発明者らが既に同定した＞５００であるｐ５３結合標的のうち、ＲＰＳ２７Ｌが、第１のイントロンに位置したｐ５３結合モチーフを介してｐ５３によって強く結合するという知見が得られた（図１Ｃ）。したがって、ＲＰＳ２７Ｌ発現は、直接的なＤＮＡ結合を介してｐ５３により上方制御されるように思われる。
【００６１】
ＲＰＳ２７Ｌ遺伝子におけるｐ５３結合の生理学的的関連性も、ここで評価した。第１のイントロン内に位置した確認された結合部位に加えて、図１Ｄ（上側の図）に図示したように、配列分析によって１．１ｋｂのプロモータ領域内に４つの推定上のｐ５３応答要素を確認した。これらの部位のいずれもがＲＰＳ２７Ｌのｐ５３依存性活性を調節するかどうかを判断するために、プロモータ領域（Ｌｕｃ−ＲＰＳ２７Ｌ−Ａ）または第１のイントロン（Ｌｕｃ−ＲＰＳ２７Ｌ−Ｂ）内のｐ５３結合部位に及ぶゲノムＤＮＡフラグメントをルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドにクローニングした。ｐ５３発現プラスミドとともにｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞に同時形質移入した場合、イントロン配列を含むレポーターのみが野生型ｐ５３によって活性化されたが、ＤＮＡ結合欠損ｐ５３突然変異体（Ｒ１７５Ｈ）によっては活性化されなかった（図１Ｄ、下側の図）。陽性対照として、突然変異ではない野生型のｐ５３もまた、ｐ２１プロモータを含むレポーターを活性化する。これらの結果は、ＣｈＩＰ分析で測定されたように、ＲＰＳ２７Ｌの第１のイントロンに位置したｐ５３結合が機能的であり、ｐ５３応答性を与えることを、裏付けている。
【００６２】
この実施例および以下の実施例で言及される核酸修飾を実施する一般的な手順は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Lab Publ. 1989 およびAusubel, et al. "Current Protocols in Molecular Biology" Grene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1987.に記述されている。
（実施例２）
ｐ５３依存性ＲＰＳ２７Ｌタンパク質誘導は刺激依存性である
ｐ５３によって誘導されたＲＰＳ２７ＬｍＲＮＡの増加が、タンパク質レベルの増加ももたらすかどうかを検討するために、ＡＤＲ、５−ＦＵ、またはニュートリン３（ｐ５３を直接活性化する小分子ＭＤＭ２アンタゴニスト）（Vassilev, L.T., Vu, B.T., et al.
(2004) "In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2" Science, vol. 303, p.844-848）により処理したｐ５３野生型およびｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞の免疫ブロット分析を実施した。ＡＤＲまたはニュートリン３処理は、ｐ５３およびｐ２１の蓄積をもたらす。ＡＤＲまたはニュートリン３処理後に、時間とともにＲＰＳ２７Ｌタンパク質レベルが増加したことを、ＲＰＳ２７Ｌに対して生じた抗体によって検出した（図２Ａ）。しかし、ＲＰＳ２７ＬｍＲＮＡの５−ＦＵ誘導上方制御は、タンパク質レベルの増加をもたらさなかった。その代わりに、ｐ５３活性化とともに、ＲＰＳ２７タンパク質レベルが下方制御され、このことはｐ２１タンパク質の発現が増加したことと正反対のものであった。この観察を他の細胞系統および他のｐ５３刺激に対して広げるために、Ｕ２ＯＳ（ヒト骨肉腫細胞系統）およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫細胞系統）細胞（ｐ５３野生型）、同様にＳａｏｓ−２細胞（ヒト骨肉腫細胞系統、ｐ５３欠損）を、ＡＤＲ、リン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））、および５−ＦＵにより、処理した（図２Ｂ）。また、ＡＤＲおよびリン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））は、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質のｐ５３依存性上方制御を誘導したが、５−ＦＵはその下方制御を誘導した。集合的に、これらの結果は、ｐ５３誘導ＲＰＳ２７Ｌタンパク質発現が、ｐ５３活性化をもたらすストレスの種類に依存することを示している。明らかに、５−ＦＵは、ｍＲＮＡ発現の増加にかかわらず、ＲＰＳ２７Ｌタンパク質下方制御を生ずる翻訳後機構を作動させる。
（実施例３）
ＲＰＳ２７Ｌ欠乏はｐ５３依存性ＤＮＡ損傷応答を増殖停止から細胞死に変える
ＨＣＴ１１６細胞では、ＤＮＡ損傷剤ＡＤＲがｐ５３依存性細胞周期停止（高倍数体細胞（４Ｎ）数の増加）を誘導する一方で、５−ＦＵ処理はｐ５３依存性アポトーシスを引き起こす（Bunz, F., Hwang, P.M., et al. (1999),前掲、 Tan, J., Zhuang, L., et al. (2005), 前掲）（図３Ａ）。ＲＰＳ２７Ｌタンパク質発現の増加は細胞周期停止表現型に相関していることから、本発明者らは次に、ＨＣＴ１１６細胞でのＲＰＳ２７ＬノックダウンがＡＤＲ処理に対して細胞周期停止よりもアポトーシスを与えるかどうかを決定することにした。この目的を達成するために、本発明者らは、配列番号１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてＲＰＳ２７Ｌ発現を停止させた。ｓｉＲＮＡの標的配列は、ＤＮＡ損傷後、ほぼ完全にＲＰＳ２７Ｌ発現を抑えるとともに、その誘導を抑えたので、効率的かつ特異的であり、一方で密接に関連したＲＰＳ２７に対して何ら影響を及ぼさなかった（図３Ｂ）。本研究を容易にするために、本発明者らは、ｐ５３野生型およびヌル・バックグラウンドの両方でＲＰＳ２７Ｌを欠乏した配列番号１の短ヘアピン（ＲＰＳ２７ＬｓｈＲＮＡ）または非特異的対照ｓｈＲＮＡ（対照ｓｈＲＮＡ）を安定して発現するＨＣＴ１１６細胞系統を創出し、ＡＤＲに対するそれらの細胞性応答を調べた。対照ｓｈＲＮＡは、ダールマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．［米国コロラド州ラフィーエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）所在］から得た。
【００６３】
対照ｓｈＲＮＡを発現するｐ５３野生型ＨＣＴ１１６細胞では、４８時間にわたるＡＤＲ処理は主に増殖停止応答を生じ、一方、同様の処理を受けたＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞は顕著な細胞死を被った（図３Ｃ）。この効果は、ｐ５３ヌルＨＣＴ１１６細胞でのＲＰＳ２７Ｌ欠乏が同じ結果を生じないことから、ｐ５３依存性と思われた。一過性ｓｉＲＮＡ形質移入を介したＲＰＳ２７Ｌのノックダウンもまた、ＨＣＴ１１６細胞でのＡＤＲまたはリン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））における細胞死を著しく増加させたが、ｐ５３ヌル対照ではそのような増加は見られなかった（図３Ｄ）。類似の効果もまた、肺癌Ａ５４９および骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞で見られたが（データ不図示）、ＤＮＡ損傷に対する細胞死応答の増加がＲＰＳ２８７Ｌ欠損の一般的特徴であることが示される。
【００６４】
この細胞死応答の性質をさらに定義するために、本発明者らは別のアッセイ（すなわちＪＣ−１染色した細胞のフローサイトメトリー検出）を用いた。このＪＣ−１染色は、細胞死現象をミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の結果として同定する。図３Ｅに示すように、ＲＰＳ２７ＬｓｈＲＮＡ細胞のＡＤＲ処理は、対照細胞と比較して（３３．５％対１３．５％）、ΔΨｍの著しい減少をもたらし、このことはアポトーシス細胞死がミトコンドリア機能障害を伴うことを示した。したがって、ＲＰＳ２７Ｌの欠損は、ＤＮＡ損傷によるｐ５３活性化に応答して細胞周期停止よりもアポトーシスをもたらす。
【００６５】
この実験は、ＤＮＡ損傷後の細胞運命を制御するための手段として、ＲＰＳ２７Ｌの有用性を明らかに示す。転写または翻訳の増加または減少によるＲＰＳ２７Ｌをコードする核酸の活性を調節することは、この実施例で示すように化学療法剤により悪性細胞を処理した場合に該悪性細胞を細胞死に導くことを可能にする。制御分子（すなわち、ＲＮＡ干渉剤またはアンチセンス・ヌクレオチド分子等、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチド）の使用は、ＲＰＳ２７Ｌをコードする核酸の転写または翻訳（すなわち、発現）に影響を及ぼすことを可能にする。
（実施例４）
ＲＰＳ２７Ｌは、ＤＮＡ損傷に対して核焦点を形成する核タンパク質である
ＤＮＡ損傷応答におけるＰＲＳ２７Ｌの機能をさらに特徴付けるために、ＰＲＳ２７Ｌの細胞局在を評価した。ｃ−Ｍｙｃタグ化ＲＰＳ２７ＬをＨＣＴ１１６細胞内で過剰発現させ、抗Ｍｙｃ抗体による免疫蛍光染色によって発現の検出をおこなった。異所的に発現したＲＰＳ２７Ｌは、核に局在する（図４Ａ）。内因性ＲＰＳ２７Ｌの細胞部位を決定するために、またＤＮＡ損傷に対するその応答を評価するために、本発明者らは次に、抗ＲＰＳ２７Ｌ抗体を用いて免疫蛍光研究を実施した。野生型およびＲＰＳ２７Ｌ欠乏ＨＣＴ１１６細胞を固定前にリン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））で１６時間処理した。未処置の細胞におけるＲＰＳ２７Ｌのレベルが低いことから、本発明者らはこれらの細胞で弱い核染色が得られた（データ不図示）。リン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））処理に応じて、本発明者らは、抗ＲＰＳ２７Ｌを有するＨＣＴ１１６細胞で核焦点様染色パターンを検出した（図４Ｂ）。また、ＲＰＳ２７Ｌは、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γ−ＨＡ２Ｘ）によって部分的に共局在化した。γ−Ｈ２ＡＸは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位でリン酸化したヒストンであり、ＤＳＢのホールマークである（Rogakou, E.P., Pilch, D.R., et al., (1998) "DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139" J Biol Chem, vol. 273, p. 5858-5868）。ＲＰＳ２７
Ｌ発現の欠乏は、この共局在性を無効にしたが、γ−ＨＡ２Ｘ焦点形成になんら効果を示さなかった。これらのデータは、ＲＰＳ２７ＬがＤＮＡ損傷応答に関わる核タンパク質であり、ＤＮＡ二本鎖切断の一部に採用されることを示唆している。
（実施例５）
ＲＰＳ２７Ｌ欠乏はＤＮＡ損傷チェックポイントおよびＤＮＡ修復における機能的欠失をもたらす
ＲＰＳ２７Ｌ欠乏によりＤＮＡ損傷に対する反応性が増加したと考え、本発明者らは次に、ＲＰＳ２７Ｌの欠損がＤＮＡ損傷チェックポイントを損い得るかどうかを調べた。７アミノ・アクチノマイシンＤ染色によるＦＡＣＳ分析（全ＤＮＡ含有量に関して）およびブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識化（ＤＮＡ合成に関して）は、ＤＮＡ損傷前に対照対ＲＰＳ２７Ｌ欠乏ＨＣＴ１１６細胞におけるＤＮＡ合成の違いを検出することができなかった。しかし、親細胞は、ＡＤＲ処理後２４時間でＤＮＡ合成が著しく減少（８５％から１１％）し、一方でＲＰＳ２７Ｌを欠損したＨＣＴ１１６細胞では、このＤＮＡ合成の減少は部分的に救われた（８６％から２７％）（図５Ａ）。加えて、ＲＰＳ２７Ｌ欠乏ＨＣＴ１１６細胞は、対照細胞と比較して（３０％対１０．５％）、高倍数体ＤＮＡ合成用含有量（＞４Ｎ）を有する細胞の実質的な蓄積を生じた。これらの知見は、ＲＰＳ２７Ｌの欠損が、染色体不安定性を導くＤＮＡ損傷細胞周期チェックポイント欠損を生じる
場合があることを示唆している。
【００６６】
不完全ＤＮＡ損傷チェックポイントは、ＤＮＡ損傷を増加させると考えられる。γ−Ｈ２ＡＸ焦点は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の高感度な指標であると考えられる。我々は、リン酸エトポシド（ＶＰ１６（登録商標））処理後、γ−Ｈ２ＡＸ焦点形成を探索し、可逆性ポストＶＰ１６ウオッシュアウトをモニターした。図５Ｂは、強いγ−Ｈ２ＡＸ染色によって明らかにされたように、ＶＰ１６による１時間処理が顕著なＤＳＢ焦点を誘導したことを示す。対照細胞では、γ−Ｈ２ＡＸ染色は時間とともに減少し、ＶＰ１６除去後１６時間、γ−Ｈ２ＡＺ染色はほとんど検出不可能であり、これらの細胞でＤＮＡ修復プロセスが熟達されたものであることが示唆された。対照的に、ＲＰＳ２７Ｌ欠乏ＨＣＴ１１６細胞は、持続性のγ−Ｈ２ＡＸ染色を示し、このことはこれらの細胞でＤＮＡ損傷が増加したことを示した。これらの結果は、ＤＮＡ損傷応答においてＲＰＳ２７Ｌが保護的役割を果たすという我々の仮説を支持している。
【００６７】
ＤＮＡ損傷を直接検討するために、次にコメット・アッセイを用いた。このコメット・アッセイは、損傷したＤＮＡが移動して、ＤＮＡ損傷量に比例した「彗星の尾」を形成する単一細胞ゲル電気泳動アッセイである（The comet assay for DNA damage and repair:
principles, applications, and limitations" MoI Biotechnol, vol. 26, p. 249-261
）。細胞をＡＤＲで２４時間インキュベートし、回収し、さらにコメット・アッセイの処理をおこなった。図５Ｃに示すように、ＡＤＲ誘導ＤＮＡ損傷は、ＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞で著しく増強し、このことはＤＮＡ修復でＲＰＳ２７Ｌが果たす役割と一致する。次に、我々はＤＮＡ損傷が増加することで染色体不安定性が生ずるかどうかを調べた。この可能性を試験するために、微小核（ＭＮ）分析を用いた。なぜなら、それは、染色体損傷およびゲノム不安定性についての信頼性の高い指標となることが判明しているからである（Fenech, M. (2005) "hi vitro micronucleus technique to predict chemosensitivity" Methods MoI Med, vol. I ll, p. 3-32; Poonepalli, A., Balakrishnan, L., et al. (2005) "Lack of poly(ADP-ribose) polymerase- 1 gene product enhances cellular sensitivity to arsenite" Cancer Res, vol. 65, p. 10977-10983）。ＡＤＲ処理に応じてＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞における微小核頻度の増加が見られ、染色体安定に対するＲＰＳ２７Ｌ欠損の効果がさらに支持された（図５Ｄ）。全体的に、これらの実験は、ＡＤＲによる細胞の処理後に、ＰＲＳ２７Ｌの損失は、ＤＮＡ損傷の増加および染色体切断をもたらすことを明らかにしている。
（実施例６）
ＲＰＳ２７Ｌ欠乏によってＤＮＡ損傷に応じたｐ２１の蓄積が損なわれ、ＤＮＡ損傷に対する過敏性をもたらす
ＰＲＳ２７Ｌ欠乏によってｐ５３野生型細胞のみがＤＮＡ損傷に対して感作することから、次に本発明はｐ５３シグナル伝達経路に対するＲＰＳ２７Ｌ欠乏の効果を評価した。ｐ５３およびその下流標的ｐ２１、ｐｕｍａ、およびＭＤＭ２に対するＲＰＳ２７Ｌ欠乏の効果を免疫ブロット分析によって調べた。ＲＰＳ２７Ｌの欠乏がＡＤＲ誘導ｐ５３活性化に対して顕著な効果を示さないことを見いだした（図６Ａ）。しかし、ＡＤＲに応じたｐ２１の蓄積は、対照細胞と比較して、ＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞では著しく減少した。対照的に、ＰｕｍａおよびＭＤＭ２のｐ５３依存性活性化がＲＰＳ２７損失に応じた減少が生じなかった。この結果は、ＲＰＳ２７Ｌの損失に応じたｐ５３によるｐ２１誘導の選択的欠陥を示唆している。ＲＰＳ２７Ｌが安定的に欠乏したＨＣＴ１１６細胞の状況と同様に、本発明者らは、ＲＰＳ２７Ｌが一過性形質移入によってノックダウンされたＵ２ＯＳ細胞で、ｐ２１タンパク質レベルが実質的に減少するという知見を得た（図６Ｂ）。これらの結果は、ＲＰＳ２７Ｌの損失に応じてｐ２１タンパク質蓄積が損なわれることが細胞の種類に特異的ではなかったことを示している。
【００６８】
さらに、対照細胞と比較してＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞においてｐ２１ｍＲＮＡレベルの著
しい変化が生じなかったことから、ｐ２１タンパク質レベルの減少がｐ２１転写阻害によるものではないという知見が得られた（図６Ｃ）。ＲＰＳ２７Ｌがｐ２１タンパク質発現を制御することの直接的な証拠を得るために、本発明者らは、ｐ２１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ２）を増加量のＲＰＳ２７発現ベクターとともに、ＨＣＴ１１６細胞に同時形質移入したところ、ＲＰＳ２７Ｌ過剰発現が用量依存的にｐ２１タンパク質発現を著しく増加させるという結果が得られた（図６Ｄ）。まとめると、これらの知見は、ＲＰＳ２７Ｌがｐ２１タンパク質を正に制御することを示唆している。ＲＰＳ２７Ｌの損失は、ＤＮＡ損傷の後にｐ２１タンパク質誘導を弱める結果を生じさせる。
【００６９】
ｐ２１欠乏細胞は細胞周期停止が不完全であり、かつＤＮＡ損傷剤に対してよりいっそう感受性があるということは、周知である（Bunz, F., Kobayashi, R., et al. (1993) "cDNAs encoding the large subunit of human replication factor C" Proc Natl Acad Sd USA, vol. 90, p. 11014-11018およびFan, S., Chang, J.K., et al. (1997) "Cells lacking CIPl/WAFl genes exhibit preferential sensitivity to cisplatin and nitrogen mustard" Oncogene, vol. 14, p. 2127- 2136）。ＲＰＳ２７Ｌ欠乏に応じた表現型変
化にｐ２１減少が果たす機能的役割を明らかにするために、本発明者らは、ｐ２１ｓｈＲＮＡを安定的に発現するＨＣＴ１１６細胞系統を作り出した（ｐ２１ｓｈＲＮＡとして、ダールマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．  ［米国コロラド州ラフィーエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）所在］から得た市販品を用いた）。これらの細胞では、ＡＤＲ処理後のｐ２１発現およびその誘導は、ほぼ完全に無効になった（図７Ａ）。ＡＤＲ処理に応答して、ｐ２１ｓｈＲＮＡ細胞が大量に細胞死となり、その一方で対照細胞は増殖が停止したままであった（図７Ｂ）。さらに、ＢｒｄＵ染色によって、ＡＤＲ処理後のＢｒｄＵ取り込みの抑制がｐ２１欠乏細胞で減少することが示された（図７Ｃ）。したがって、ｐ２１欠乏細胞は、ＲＰＳ２７Ｌ欠乏細胞のアポトーシスおよび細胞周期の表現型に類似していた。ｐ２１欠乏細胞でのＲＰＳ２７Ｌのさらなるノックダウンは、ＡＤＲに応じて、細胞死またはＢｒｄｕ染色のレベルにさらなる効果を奏した（データ不図示）。これらの結果は、ＲＰＳ２７Ｌ欠損細胞でのＤＮＡ損傷に応じた不十分なｐ２１タンパク質蓄積が、細胞周期停止およびＤＮＡ損傷に対する過敏性を損なうのに十分であることを示唆している。
【００７０】
しかし、ＡＤＲ処理後のｐ２１欠乏細胞に占める高倍数体細胞数の増加は観察されなかった（図７Ｃ）。さらに、コメット・アッセイは、ｐ２１欠乏細胞におけるＤＮＡ損傷の増加は、ＰＲＳ２１Ｌ欠乏細胞の場合のような歴然としたものではなかった（データ不図示）。したがって、ＲＰＳ２７Ｌ損失に応じた不完全ＤＮＡ修復および染色体不安定性の増加は、ｐ２１減衰とは独立したもののように見えた。本発明者らは、ｐ５３によるＲＰＳ２７Ｌの誘導がｐ２１タンパク質蓄積の強化を介したＤＮＡ損傷に応じた増殖停止のみならず、付加的な機構を介したＤＮＡ修復および染色体安定性も促進することを、提示する（図７Ｄ）。まとめると、これらの機能は、効果的にＤＮＡ損傷反応を妨げる。
上述した実施例で使用された実験手順についての詳細
細胞培養および薬物
ヒト結腸癌細胞系統ＨＣＴ１１６およびそのＰ５３遺伝子ノックアウト由来細胞は、バート、ボーゲルスタイン（Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）博士がご厚意により提供してくださったものである。ＨＣＴ１１６細胞をＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２４７に基づいて購入することもできる。ヒト骨肉腫細胞系統Ｕ２ＯＳおよびＳａｏｓ−２は、以下のＡＴＣＣ番号にもとづいて購入することができる。すなわち、Ｕ２ＯＳはＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６、Ｓａｏｓ−２はＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６である。細胞の増殖を、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン・ストレプトマイシン（インヴィトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を添加したＤＭＥＭでおこなった。アドリアマイシン、エトポシド・リン酸塩（ＶＰ１６（登録商標））、および５−フルオロウラシルを、シグマ・アルトリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。
フローサイトメトリー
ＤＮＡ含有量を数量化することで、細胞周期分析をおこなった。細胞を７０％エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）で染色した。染色された細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ビー・ディー  バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））によって分析した。ＢｒｄＵの取り込み分析およびミトコンドリア膜電位検出に関しては、手引き書に従ってＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ  およびＪＣ−１染色キット（両方とも（ビー・ディー  バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いた。染色された細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ビー・ディー  バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ビー・ディー  バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて定量した。
【００７１】
ＲＮＡ干渉による遺伝子発現停止
ｓｉＲＮＡオリゴ標的化ＲＰＳ２７Ｌ（配列番号１：ｇｇｔｔｇｃｔａｃａａｇａｔｔａｃｔａ）は、プロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ）から購入し、形質移入をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インヴィトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて製造元の情報に従って実施した。安定したノックダウン細胞系統を生成するために、製造元の指示に従い、ｓｉＲＮＡをｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱレトロウィルス発現ベクター（ビー・ディー  バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）内にクローン化した。２μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する培地中でウイルス感染細胞を選択し、個々の薬剤耐性クローンの回収、プール、および拡大した。
タンパク質分析および抗ＲＰＳ２７Ｌ抗体の産生
細胞を集め、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム塩、およびプロテイナーゼ阻害剤）で溶解した。溶解産物を１６，０００ｘｇ、４０℃で１５分間遠心することによって分画した。タンパク質濃度の測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（バイオ・ラッド社（Ｂｉｏ−  Ｒａｄ）を用いておこなった。２０〜５０μｇタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎメンブラン（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に転写し、抗体でブロットした。抗ｐ５３および抗ｐ２１抗体をサンタ・クルーズ社（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）から入手し、抗ＭＤＭ２および抗体Ｐｕｍａ抗体はメルク社（Ｍｅｒｃｋ）から入手した。ＲＰＳ２７Ｌに対するウサギ多価抗体は、ヒトＲＰＳ２７Ｌ（配列番号２：ＬＨＰＳＬＥＥＥＫＫＫＨＫＫ）由来の１４個のアミノ酸からなるペプチドに対して産生させたものである。
ルシフェラーゼ・レポート・アッセイ
ＲＰＳ２７Ｌのプロモータ要素をｐＧＬ３ルシフェラーゼ・ベクター（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化した。ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／−細胞を２４穴細胞培養プレートに蒔いて、ｐ５３発現ベクターおよびＲＰＳ２７Ｌプロモータ・プラスミドを同時形質移入した。形質移入の２４時間後、記述通りに、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅシステム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いてルシフェラーゼ活性の測定をおこなった（Kho, P.S., Wang, Z., et al. (2004) "ρ53 -regulated transcriptional program associated with genotoxic stress-induced apoptosis" J Biol Chem, vol. 279, p. 21183-21192)）。
蛍光抗体法と共焦点顕微鏡
細胞を４穴または８穴培養スライドに播種した。処理後、細胞を３．７％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過性にした。細胞を一次抗体（上記「タンパク質分析および抗ＰＲＰＳ２７Ｌ抗体の産生」の項目を参照）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６結合二次抗体（インヴィトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用い、各々１時間にわたって連続的にインキュベートし、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））封入剤でマウントした。核染色用にＤＲＡＱ５（バイオスタッツ社（Ｂｉｏｓｔａｔｓ）［英国所在］）
を封入剤で希釈した。染色された細胞をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡で調べた。
プラスミド
ｐｃＤＮＡ４／ＲＰＳ２７Ｌ−Ｍｙｃの生成を、正常結腸組織全ＲＮＡ（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ））、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、およびＰｌａｔｉｕｍ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インヴィトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いたＲＴ−ＰＣＲによっておこない、この際、用いたプライマーは、ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴ  （順方向、配列番号３）およびＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＧＡ（逆方向、配列番号４）であった。ＰＣＲ産物および空のベクターをＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社（ＮＥＢ））により消化し、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）により連結し、その後、形質移入および選択をおこなった。
細胞質分裂は微小核（ＣＢＭＮ）アッセイを妨害した
ＡＤＲによる処理の後、細胞をサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ、５μｇ／ｍｌ）とともに、さらに２２時間インキュベートした。次に細胞をトリプシン処理し、続いてカルノワ固定液（酢酸：メタノール、１：３）と３〜４滴のホルムアルデヒド（細胞質固定のため）との組み合わせを用いて固定した。固定された細胞をきれいなスライド上に滴下し、３μｇ／ｍｌのＡｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ（細胞質および核を区別して染色）で染色した（Hande, M.P., et al. (1996) "Induction and persistence of cytogenetic damage in mouse splenocytes following whole-body X-irradiation analysed by fluorescence in situ hybridization. II. Micronuclei." Int J Radiat Biol; vol. 70(4), p.375-83; Hande, M.P., et al. (1997)）。
１０００個の二核細胞が各試料で記録された。
アルカリ単細胞ゲル電気泳動（コメット）アッセイ
上記した用量のＡＤＲで細胞を処理した。既に記述されたように（Poonepalli, A., Balakrishnan, L., et al. (2005)前掲）、処理された細胞を単細胞ゲル電気泳動（コメッ
ト）アッセイにかけ、ＳＹＢＲ緑色染料で染色した。メタシステム社（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ）［ドイツ所在］の分析用ソフトウェア「Ｃｏｍｅｔ  ｉｍａｇｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２」を用いて、コメットの尾部モーメント（ｔａｉｌ  ｍｏｍｅｎｔ）を生成した。試料毎に無作為に選択した５０個のコメットを分析した。観察されたＤＮＡ損傷の程度を、コメットの尾部にあるＤＮＡの分画に対応する尾部モーメントとして表した。
ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲのすべてをＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ビー・ディークロンテック（ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて実施した。プライマー配列は以下の通り：
ｐ２１、順方向、配列番号５：  ５’−ＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＡ−３’；
ｐ２１、逆方向、配列番号６：  ５’−ＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＣＧＧＣＴＣＡＧＣＴ−３’；
Ｐｕｍａ、順方向、配列番号７：５’−ＣＧＧＡＣＧＡＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＴＡ−３’；
Ｐｕｍａ、逆方向、配列番号８：５’−ＡＡＴＴＧＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＧＧＧ−３’；
ＲＰＳ２７Ｌ，順方向、配列番号９：５’−ＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＧＡ−３’；
ＲＰＳ２７Ｌ，逆方向、配列番号１０：５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧＧ−３’；
ＧＡＰＤＨ、順方向、配列番号１１：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣ−３’；
ＧＡＰＤＨ、逆方向、配列番号１２：５’−ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧ−３’。
【００７２】
この明細書中の既に公開された文献の羅列または考察は、技術水準の一部またはありふれた一般的知識であると必ずしも認知されるべきものではない。
本明細書中に例証的に説明された本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない１または複数の任意の要素や１または複数の限定がなくても、好適に実施することが可能である。したがって、例えば、用語「含む」は、拡張的に読むべきであり、限定的に読むべきものではない。さらに、本明細書中に使用される用語および表現は、説明のための用語として用いられたものであり、限定のためのものではない。また、該用語および表現を、図示および説明した特徴またはその一部のいかなる等価物を除外するために使用することを意図したものではなく、特許請求の範囲に記した本発明の範囲内において種々の修飾が可能であると理解される。したがって、本発明が好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されてはいるが、開示された本明細書中に具体化された本発明の修飾および変更が当業者によってなされることも可能であり、そのような修飾および変更は本発明の範囲内であると考えられる。
【００７３】
本発明は、本明細書中に大まかに、かつ総称的に記述されている。一般的な開示の範囲内においてより狭く種および亜種に分類された各々についても、本発明の一部を形成するものである。このことは、削除された材料が本明細書中に具体的に詳述されるかどうかに関わらず、任意の対象が属から除かれる条件付または消極的な限定付きの本発明の一般的な記述を含む。
【００７４】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲および非限定的例の範囲内にあり、また本発明の特徴または態様がマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループの言葉で説明されている場合、当業者は本発明もまた該マーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループの任意の個々の構成要素または下位群（サブグループ）の構成要素の言葉で説明されることを理解する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ｐ５３の直接的な転写標的であるＲＰＳ２７Ｌを示す（より詳しくは、実施例１も参照）。
【図２】異なるストレス信号に応答してＲＰＳ２７Ｌタンパク質が差別的に発現されることを実証したウエスタンブロット分析を示す。
【図３】ＲＰＳ２７Ｌ発現がｐ５３依存型アポトーシスを調節することを明らかにしている（より詳しくは実施例３を参照）。
【図４】ＲＰＳ２７ＬがＤＮＡ損傷に対してＤＮＡ損傷焦点を形成する核タンパク質であることを示す（より詳しくは実施例４を参照）。
【図５】ＲＰＳ２７Ｌ欠損は、不完全な細胞周期チェックポイントおよびＤＮＡ修復をもたらす（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌの損失が染色体不安定性に至る）ことを示す（詳しくは、実施例５を参照）。
【図６】図６は、ＲＰＳ２７Ｌ欠乏がＤＮＡ損傷に対するｐ２１蓄積を損なうことを示すウエスタンブロット分析を示す（より詳しくは実施例６を参照）。
【図７】図７は、ｐ２１欠乏が細胞周期チェックポイント欠損およびＤＮＡ損傷に応答したアポトーシスの増加を誘発するのに十分であることを明らかにしている（より詳しくは実施例６を参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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