(57)【要約】カーゴ分子とトランスポーター分子とのコンジュゲートであって、カーゴ分子およびトランスポーター分子が放出可能な（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ）リンカーによって共有結合されているコンジュゲートが開示される。コンジュゲートのカーゴは、生物活性物質またはレポーター分子であってよい。トランスポーターは、結合していないカーゴの輸送に比較して、生物学的障壁（例、細胞膜）を越えるカーゴの輸送を調節する。様々なタイプのカーゴおよびトランスポーターへの迅速かつ容易な結合に適する放出可能なリンカーもまた、コンジュゲートの合成におけるリンカーの使用方法とともに開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的障壁を越えてカーゴ分子を輸送するための組成物であって：
カーゴ分子；
トランスポーター分子；ならびに
カーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合する、式：
【化１】
2009528292.tif 000127
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；
Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−であって、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物であり；
Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；ｂｒは、１〜４までの整数であり、Ｒ１基上の「分枝鎖」の数を示している）の放出可能なリンカー
を含む組成物、またはそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項２】
ｂｒは、１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記放出可能なリンカーは、式：
【化２】
2009528292.tif 000128
のリンカーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記カーゴ分子は、生物活性分子およびレポーター分子からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
式（Ｉ）：
【化３】
2009528292.tif 000129
（式中、Ｃａｒｇ−Ｎｕはカーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」の残基を表し；そしてＴｒａｎｓｐ−Ｓは、トランスポーター分子「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」の残基を表す）の請求項３に記載の組成物、またはその任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項６】
ＶはＯである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ＶはＮＨである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ＶはＣＨ２である、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ＶはＳである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
ＶはＯである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
−Ｎｕ−は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ２−、もしくは−Ｓ−である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｃａｒｇ−Ｎｕは、レポーター分子の残基である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記レポーター分子の残基は、ルシフェリンの残基である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｃａｒｇ−Ｎｕは、生物活性分子の残基である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記生物活性分子は、薬物、治療薬、および診断薬からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記生物活性分子の残基は、パクリタキセルの残基である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は：
【化４】
2009528292.tif 000130
【化５】
2009528292.tif 000131
およびその任意の立体異性体、塩、もしくは溶媒和物からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記生物活性分子の残基は、Ｃ２’ヒドロキシルもしくはＣ７ヒドロキシルいずれかで結合したシクロスポリンの残基である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
ｒ８−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣｓＡ、および
ｒ８−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣｓＡ（式中、ｒ８−Ｃｙｓ−Ｓ−は、アセチル−Ｄ−Ｃｙｓ−（Ｄ−Ａｒｇ）８−ＮＨ２の残基を表し、−ＯＣｓＡはシクロスポリンＡの残基を示す）ならびにそれらのすべての塩、溶媒和物、および立体異性体からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
カーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」と式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子とのコンジュゲートを作製する方法であって、化合物Ｃａｒｇ−ＮｕＨ、アニオンＣａｒｇ−Ｎｕ（−）、もしくは塩Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、−ＮｕＨもしくは−Ｎｕ（−）は求核成分であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物である）を式：Ｙ１−Ｗ−Ｙ２（式中、Ｙ１およびＹ２は離脱基であり、同一であっても相違していてもよく、Ｗは−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−ＰＧ）−（式中ＰＧは保護基である）、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−である）の化合物と反応させ、式：
Ｃａｒｇ−Ｎｕ−Ｗ−Ｙ１    （ＩＩＡ−ｇｂ）
の化合物を形成する工程と；
式（ＩＩＩＡ−ｇｂ）：
【化６】
2009528292.tif 000132
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；
Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、このときｂｒは１〜４の整数であり、Ｒ１基上の「分子鎖」の数を示しており、
ＴＬＧＳはチオール離脱基安定剤である）の化合物を、式：Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨのチオール基を有するトランスポーター基と反応させ、式（ＩＶＡ−ｇｂ）：
【化７】
2009528292.tif 000133
の化合物を形成する工程と；
化合物（ＩＩＡ−ｇｂ）を化合物（ＩＶＡ−ｇｂ）と反応させ、式（Ｉｇｂ）：
【化８】
2009528292.tif 000134
のコンジュゲートを形成する工程、
を含む方法であって、
Ｗが−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−ＰＧ）−である場合は、保護基をリン酸塩から除去する追加の工程が実施される、方法
。
【請求項２５】
ｂｒは１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
式（ＩＩｇ）：
【化９】
2009528292.tif 000135
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；
Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；
ＴＬＧＳはチオール離脱基安定剤であり；および
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）の化合物を式：Ｙ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ２の活性化試薬と反応させ、式（ＩＩＩｇ）：
【化１０】
2009528292.tif 000136
（式中、Ｙ１およびＹ２は離脱基であり、同一であっても相違していてもよい）の化合物を形成する工程と；
式（ＩＩＩｇ）を式：Ｃａｒｇ−ＮｕＨ、アニオンＣａｒｇ−Ｎｕ（−）、または塩Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、−ＮｕＨもしくは−Ｎｕ（−）は求核成分であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物である）の求核分子と反応させ、式（ＩＶｇ）：
【化１１】
2009528292.tif 000137
の化合物を形成する工程と：
および（ＩＶｇ）をＴｒａｎｓｐ−ＳＨと反応させ、式（Ｉ）：
【化１２】
2009528292.tif 000138
のコンジュゲートを形成する工程とを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＶはＯである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＶはＮＨである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＶはＣＨ２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＶはＳである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ＶはＯである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２−である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
−ＮｕＨは、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ２、もしくは−ＳＨである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
−Ｎｕ（−）は、−Ｏ（−）、−ＮＨ（−）、−ＮＲ２（−）、もしくは−Ｓ（−）である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３８】
Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋２、もしくはＣａ＋２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
ＴＬＧＳは：
【化１３】
2009528292.tif 000139
を含む群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
前記カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
トランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートを細胞取り込みおよび細胞内遊離についてアッセイする方法であって：
細胞もしくは組織サンプルをある期間にわたってトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートと接触させる工程であって、該リンカーは請求項１に記載のリンカーであり、該カーゴはレポーター分子である工程と；および
該細胞もしくは組織内に輸送されているカーゴを検出する工程であって、それにより輸送を実行する際のトランスポーターの有効性が決定される工程とを含む方法。
【請求項４３】
トランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートを細胞取り込みおよび細胞内遊離についてアッセイする方法であって：
細胞もしくは組織サンプルをある期間にわたってトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートと接触させる工程であって、該コンジュゲートは請求項５に記載のリンカーであり、該カーゴはレポーター分子である工程と；および
細胞もしくは組織内に輸送されているカーゴを検出する工程であって、それにより輸送を実行する際のトランスポーターの有効性が決定される工程とを含む方法。
【請求項４４】
前記カーゴは、ルシフェリンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記コンジュゲートの「Ｔｒａｎｓｐ−Ｓ」部分は、脂質を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項４６】
前記脂質は、脂肪酸を含む群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記脂質トランスポーターは、式：
【化１４】
2009528292.tif 000140
のリンカーである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記カーゴは、シクロスポリンＡである、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４９】
式：
【化１５】
2009528292.tif 000141
からなる群から選択される、請求項４８に記載の組成物、およびそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体。
【請求項５０】
式：
【化１６】
2009528292.tif 000142
（式中、Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；およびｊは、１〜８から選択される整数であるか；
または
【化１７】
2009528292.tif 000143
（式中、ｋは、０〜８から選択される整数である）の請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／７７７，３４１号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／７７７，３４１号の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（連邦政府が後援する研究または開発に関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所の助成金番号第ＣＡ３１８４１号および第ＣＡ３１８４５号ならびに米国立科学財団バイオフォトニクス科学＆テクノロジーセンターからの助成金番号第００２８６５−ＳＵ号の下で連邦政府による後援を受けて実施された。連邦政府は、本発明に所定の権利を有するものである。
【０００３】
（技術分野）
本出願は、生物学的障壁（例えば、細胞膜もしくは組織）を越える輸送に適する、放出可能な（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ）成分によって連結されている、カーゴ分子（例えば、生物活性分子もしくはレポーター分子）とトランスポーター物質とのコンジュゲートを含む、カーゴ−リンカー−トランスポーターの形態を備える組成物に関する。本出願は、そのようなコンジュゲートを合成するための方法、そして細胞および動物においてそれらの有効性を試験するための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
医薬品および他の生物活性分子は一般に、有効であるためには生物学的障壁を越える必要がある。例えば、細胞内標的と相互作用することが企図される薬物もしくはプローブは、所望の作用を生成するためには細胞の血漿膜を越える必要がある。所定の薬物は、局所適用される物質については皮膚の角質層などの他の生物学的障壁を横断する必要がある場合がある。血漿膜などの生物学的障壁は、一般に主として非極性成分から構成されるので、生物活性分子は、受動拡散によって障壁を横断できるためには相当に非極性である必要がある。しかし、薬物もしくはプローブは、さらに血漿もしくは細胞外流体に可溶性であるために十分に極性である必要がある。これらの拮抗する要件は、細胞内で機能することが企図される、または１つの作用を発揮するために生物学的膜もしくは他の生物学的障壁を横断する必要がある生物学的物質およびプローブまたはレポーター分子に対して相当に狭い範囲内の極性を生じさせる。
【０００５】
この問題にとっての様々な解決策は、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６、ならびに非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７、および非特許文献８、特に４８７〜６６５頁に記載されている、様々な論文に記載されている。これらの刊行物は、送達強化トランスポーター、すなわち、例えば生物活性分子が細胞膜もしくは角質層などの生物学的障壁を越える能力を高めるトランスポーター分子について記載している。
【０００６】
生物活性分子などのカーゴ分子とトランスポーター分子とのコンジュゲートを産生するための効率的システムを有することが望ましい。カーゴとトランスポーター分子とのコンジュゲートは、望ましくは保管および投与条件下では安定であるが、細胞もしくは他の標的環境内ではカーゴを放出するリンカーによって達成される。さらにまた、それらが生物学的膜もしくは他の生物学的障壁を越えて生物活性分子を輸送する能力についてトランスポーター分子をスクリーニングするための、迅速で適切な経済的システムを有することもまた望ましい。本発明の実施形態は、これらの目的に取り組み、追加の利点を提供し、ならびに様々な組成物および方法を提供する。
【特許文献１】米国特許第６，３０６，９９３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４９５，６６３号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５９３，２９２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６６９，９５１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７３０，２９３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，７５９，３８７号明細書
【非特許文献１】Ｒｏｔｈｂａｒｄら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１２５３（２０００）
【非特許文献２】Ｋｉｒｓｃｈｂｅｒｇら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３４５９（２００３）
【非特許文献３】Ｓａｍｕｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：１４２８１（２００３）
【非特許文献４】Ｃｈｅｎら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１１２３（２００１）
【非特許文献５】Ｋｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６６６（１９９７）
【非特許文献６】Ｒｏｂｂｉｎｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３：１９０，１９４（２００２）
【非特許文献７】Ｓｉｐｒａｓｈｖｉｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４：１２２５（２００３）
【非特許文献８】Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００５），ｖｏｌｕｍｅ  ５７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの実施形態では、本発明は、式：（カーゴ）−（放出可能なリンカー）−（トランスポーター）のコンジュゲートであって、コンジュゲートのカーゴは生物活性物質またはレポーター分子であってよく、そしてトランスポーター分子は結合していないカーゴの輸送に比較して生物学的障壁を越えるカーゴの輸送を調節するコンジュゲートを包含している。１つの実施形態では、トランスポーターは、結合していないカーゴの輸送に比較して生物学的障壁を越えるカーゴの輸送の量もしくは速度を増加させる。別の実施形態では、トランスポーターは、結合していないカーゴの輸送に比較して生物学的障壁を越えるカーゴの輸送の量もしくは速度を低下させる。１つの実施形態では、生物学的障壁は、生物学的膜である。別の実施形態では、生物学的障壁は、細胞膜である。別の実施形態では、生物学的障壁は、角質層である。別の実施形態では、本発明は、様々なタイプのカーゴおよびトランスポーターへの容易かつ安価な結合に適する放出可能なリンカーを包含している。別の実施形態では、本発明は、コンジュゲートの合成においてリンカーを使用する方法を包含している。別の実施形態では、本発明は、生物学的障壁、例えば細胞膜などの生物学的膜を越えるレポーター分子の輸送を実行する際のトランスポーターの有効性をアッセイする工程による、トランスポーターの有効性を決定するための方法を含有している。
【０００８】
１つの実施形態では、カーゴ分子およびトランスポーター分子は相違する分子である；すなわち、同一分子がカーゴ分子およびトランスポーター分子の両方として機能することはできない。別の実施形態では、カーゴ分子およびトランスポーター分子は、カーゴ−放出可能なリンカー−トランスポーターコンジュゲートの相違する部分である；すなわち、コンジュゲートの同一部分がカーゴおよびトランスポーターの両方として機能することはできない。１つの実施形態では、トランスポーター分子はポリアミンである。別の実施形態では、トランスポーター分子はポリアミンではない。
【０００９】
１つの実施形態では、本発明は、生物学的障壁を越えてカーゴ分子を輸送するための組成物であって、カーゴ分子；トランスポーター分子；ならびにカーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合する、式：
【００１０】
【化１８】
2009528292.tif 000002
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）、−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−であり、このときＭ＋はカチオンの１つの等価物であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；ｂｒは、１〜４までの整数であり、Ｒ１基上の「分枝鎖」の数を示している）の放出可能なリンカーを含む組成物、またはそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体を包含している。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。カーゴ分子は、生物活性物質およびレポーター分子からなる群から選択することができる。変量ｂｒは、好ましくは１もしくは２、より好ましくは１である。２つの（−Ｗ−Ｖ−）基が存在する場合は、それらはＲ１基内の同一原子（からの分枝鎖）に結合させることができる、またはそれらはＲ１基内の２つの相違する原子（からの分枝鎖）に結合させることができる。３つの（−Ｗ−Ｖ−）基が存在する場合は、全３つをＲ１基内の同一原子（からの分枝鎖）に結合させることができ、またはそれらはＲ１基内の３つの相違する原子（からの分枝鎖）に結合させることができ、または２つを同一原子（からの分枝鎖）に結合させ、１つを相違する原子（からの分枝鎖）に結合させることができる。４つの（−Ｗ−Ｖ−）基が存在する場合は、それらはＲ１基内の２つ以上の相違する原子（からの分枝鎖）に結合させることができる。
【００１１】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００１２】
【化１９】
2009528292.tif 000003
のリンカーである。
【００１３】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００１４】
【化２０】
2009528292.tif 000004
のリンカーである。
【００１５】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００１６】
【化２１】
2009528292.tif 000005
のリンカーである。
【００１７】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００１８】
【化２２】
2009528292.tif 000006
のリンカーである。
【００１９】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００２０】
【化２３】
2009528292.tif 000007
のリンカーである。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明は、生物学的障壁を越えてカーゴ分子を輸送するための組成物であって、カーゴ分子；トランスポーター分子；ならびにカーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合する、式：
−Ｗ−Ｖ−Ｒ１−Ｓ−
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−であり、このときＭ＋はカチオンの１つの等価物であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）の放出可能なリンカーを含む組成物、またはそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体を包含している。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。カーゴ分子は、生物活性物質およびレポーター分子からなる群から選択することができる。
【００２２】
別の実施形態では、ＶがＯ、ＨＮ、ＮＲ２、もしくはＳである場合は、Ｒ１は、Ｖ原子のすぐ隣で式：−Ｃ（ＣＨ３）２−（すなわち、ジメチル置換炭素、またはジェム−ジメチル炭素）の炭素原子を含有している。別の実施形態では、ＶがＣ（Ｒ２）２である場合は、両Ｒ２基はメチル（すなわち、ジメチル置換炭素、もしくはジェム−ジメチル炭素）である。
【００２３】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００２４】
【化２４】
2009528292.tif 000008
のリンカーである。
【００２５】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００２６】
【化２５】
2009528292.tif 000009
のリンカーである。
【００２７】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００２８】
【化２６】
2009528292.tif 000010
のリンカーである。
【００２９】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００３０】
【化２７】
2009528292.tif 000011
のリンカーである。
【００３１】
１つの実施形態では、リンカーは、式：
【００３２】
【化２８】
2009528292.tif 000012
のリンカーである。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明は、生物学的障壁を越えてカーゴ分子を輸送するための組成物であって、カーゴ分子；トランスポーター分子；ならびにカーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合する、式：
【００３４】
【化２９】
2009528292.tif 000013
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）の放出可能なリンカーを含む組成物、またはそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体を包含している。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。カーゴ分子は、生物活性物質およびレポーター分子からなる群から選択することができる。
【００３５】
また別の実施形態では、カーゴ分子、トランスポーター分子、ならびにカーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合する放出可能なリンカーを含む本組成物は、式：
【００３６】
【化３０】
2009528292.tif 000014
（式中、Ｃａｒｇ−Ｎｕは、カーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」の残基を表し；Ｔｒａｎｓｐ−Ｓは式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子の残基を表し；Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−であり、Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；Ｍ＋はカチオンの１つの等価物であり；ｂｒは、１〜４までの整数であり、Ｒ１基上の「分枝鎖」の数を示している）の組成物、またはそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００３７】
別の実施形態では、カーゴ分子、トランスポーター分子、ならびにカーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合する放出可能なリンカーを含む組成物は、式：
【００３８】
【化３１】
2009528292.tif 000015
（式中、Ｃａｒｇ−Ｎｕはカーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」の残基を表し；Ｔｒａｎｓｐ−Ｓは式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子の残基を表し；Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）の組成物、またはそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００３９】
別の実施形態では、カーゴ分子、トランスポーター分子、ならびにカーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合する放出可能なリンカーを含む本組成物は、式：
【００４０】
【化３２】
2009528292.tif 000016
（式中、Ｃａｒｇ−Ｎｕはカーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」の残基を表す；Ｔｒａｎｓｐ−Ｓは式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子の残基を表し；Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）の組成物、またはそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。１つの実施形態では、ＶはＯである。１つの実施形態では、ＶはＮＨである。１つの実施形態では、ＶはＣＨ２である。１つの実施形態では、ＶはＳである。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８炭化水素である。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００４１】
また別の実施形態では、ＶはＯであり、Ｒ１はＣ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００４２】
別の実施形態では、（カーゴ）−（放出可能なリンカー）−（トランスポーター分子）は、式：
【００４３】
【化３３】
2009528292.tif 000017
（式中、Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳ、好ましくはＯ、ＮＨ、もしくはＣＨ２であり；およびｊは、１〜８から選択される整数であり、好ましくは１〜２である）；または
【００４４】
【化３４】
2009528292.tif 000018
（式中、ｋは０〜８から選択される整数であり、好ましくは１もしくは２である）からなる。
【００４５】
別の実施形態では、−Ｎｕ−は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ２、−、もしくは−Ｓ−であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである。
【００４６】
別の実施形態では、Ｃａｒｇ−Ｎｕは、ルシフェリンなどのレポーター分子の残基である。
【００４７】
別の実施形態では、Ｃａｒｇ−Ｎｕは、生物活性分子の残基である。１つの実施形態では、生物活性分子は、薬物、治療薬、および診断薬からなる群から選択される。薬物もしくは治療薬は、パクリタキセルもしくはポリアミンであってよい。薬物もしくは治療薬は、例えばシクロスポリンＡなどのシクロスポリンであってよい。
【００４８】
別の実施形態では、カーゴ−放出可能なリンカー−トランスポーターは：
【００４９】
【化３５】
2009528292.tif 000019
【００５０】
【化３６】
2009528292.tif 000020
およびそれらの任意の立体異性体、塩、もしくは溶媒和物からなる群から選択される。
【００５１】
別の実施形態では、生物活性分子の残基は、Ｃ２’ヒドロキシルもしくはＣ７ヒドロキシルのどちらかで結合したシクロスポリンの残基である。
【００５２】
別の実施形態では、カーゴ−放出可能なリンカー−トランスポーターは、ｒ８−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣｓＡおよびｒ８−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣｓＡ（式中、ｒ８−Ｃｙｓ−Ｓ−はアセチル−Ｄ−Ｃｙｓ−（Ｄ−Ａｒｇ）８−ＮＨ２の残基を表し、−ＯＣｓＡはシクロスポリンＡの残基を示す）ならびにそれらのすべての塩、溶媒和物、および立体異性体からなる群から選択される。
【００５３】
別の実施形態では、トランスポーターは、脂肪酸などの脂質分子である。別の実施形態では、脂質分子は、式：（Ｃ７−Ｃ３２ヒドロカルビル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨおよびそれらのアシル形、または（Ｃ７−Ｃ３２アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨおよび（Ｃ７−Ｃ３２アルケニル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨの脂質分子ならびにそれらのアシル形である。別の実施形態では、脂質トランスポーターは、カプリル酸（オクタン酸）、カプリン酸（デカン酸）、ラウリン酸（ドデカン酸）、ミリスチン酸（テトラデカン酸）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、アラキジン酸（イコサン酸）、ベヘン酸（ドコサン酸）、パルミトール酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、エルカ酸、またはそれらのアシル形である。別の実施形態では、分子の「Ｔｒａｎｓｐ−Ｓ」部分を含む脂質トランスポーターは、式：（Ｃ７−Ｃ３２ヒドロカルビル）−Ｃ（＝Ｏ）−スペーサー−Ｓ−（式中、スペーサーは任意に置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロカルビル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、もしくはヘテロアルキニル基、または上記の基の任意の組み合わせである）の脂質トランスポーターである。別の実施形態では、分子の「Ｔｒａｎｓｐ−Ｓ」部分を含む脂質トランスポーターは、式：
【００５４】
【化３７】
2009528292.tif 000021
（式中、脂肪酸はシステインのアミノ基（ＤもしくはＬシステイン）へアシル化されており、システインのスルフヒドリル側鎖は、「Ｔｒａｎｓｐ−Ｓ」部分の「Ｓ」部分として機能する）の化合物、およびそれらの任意の立体異性体、塩、もしくは溶媒和物である。
【００５５】
トランスポーターが脂肪酸などの脂質分子である別の実施形態では、カーゴは、シクロスポリンＡなどのシクロスポリンであってよい。別の実施形態では、シクロスポリン−リンカー−トランスポーターコンジュゲートは：
【００５６】
【化３８】
2009528292.tif 000022
（式中、ｎ＝６である、ｎ＝１０である、またはｎ＝１４である）、
【００５７】
【化３９】
2009528292.tif 000023
およびそれらの任意の塩、溶媒和物、もしくは立体異性体からなる群から選択できる。
【００５８】
別の実施形態では、本発明は、カーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」と式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子とのコンジュゲートを作製する方法であって：
化合物Ｃａｒｇ−ＮｕＨ、アニオンＣａｒｇ−Ｎｕ（−）、もしくは塩Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、−ＮｕＨもしくは−Ｎｕ（−）は求核成分であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物である）を式：Ｙ１−Ｗ−Ｙ２（式中、Ｙ１およびＹ２は離脱基であり、同一であっても相違していてもよく、Ｗは−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−ＰＧ）−（式中、ＰＧは保護基である）、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−である）の化合物と、式：
Ｃａｒｇ−Ｎｕ−Ｗ−Ｙ１    （ＩＩＡ−ｇｂ）
の化合物を形成するために反応させる工程と；
式：（ＩＩＩＡ−ｇｂ）
【００５９】
【化４０】
2009528292.tif 000024
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳである；およびＲ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、ｂｒは１〜４の整数であり、Ｒ１基上の「分子鎖」の数を示しており、ＴＬＧＳはチオール離脱基安定剤である）の化合物を、式：Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨのチオール基を有するトランスポーター基と、式：（ＩＶＡ−ｇｂ）
【００６０】
【化４１】
2009528292.tif 000025
の化合物を形成するために反応させる工程と；
化合物（ＩＩＡ−ｇｂ）を化合物（ＩＶＡ−ｇｂ）と、式（Ｉｇｂ）：
【００６１】
【化４２】
2009528292.tif 000026
のコンジュゲートを形成するために反応させる工程と
を含む方法を包含している。Ｗが−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−ＰＧ）−である場合、保護基をリン酸塩から除去する追加の工程を実施することができる。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００６２】
１つの実施形態では、ＶはＯである。１つの実施形態では、ＶはＮＨである。１つの実施形態では、ＶはＣＨ２である。１つの実施形態では、ＶはＳである。１つの実施形態では、Ｒ１はＣ１−Ｃ８炭化水素である。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。
【００６３】
別の実施形態では、ＶはＯであり、Ｒ１はＣ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００６４】
別の実施形態では、−Ｎｕ−は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ２、−、もしくは−Ｓ−であり、このときＲ２はＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００６５】
別の実施形態では、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋２、もしくはＣａ＋２である。
【００６６】
別の実施形態では、ＴＬＧＳは、
【００６７】
【化４３】
2009528292.tif 000027
である。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、カーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」と式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子とのコンジュゲートを作製する方法であって、式（ＩＩｇｂ）：
【００６９】
【化４４】
2009528292.tif 000028
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、このときｂｒは１〜４の整数であり、Ｒ１基上の「分子鎖」の数を示しており、ＴＬＧＳはチオール離脱基安定剤である）の化合物を式：Ｙ１−Ｗ−Ｙ２（式中、Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−ＰＧ）−（式中、ＰＧは保護基である）、または−Ｓ（＝Ｏ）２−である）の活性化試薬と、式（ＩＩＩ−ｇｂ）：
【００７０】
【化４５】
2009528292.tif 000029
（式中、Ｙ１およびＹ２は離脱基であり、同一であっても相違していてもよい）の化合物を形成するために反応させる工程と；
（ＩＩＩｇ）を式：Ｃａｒｇ−ＮｕＨ、アニオンＣａｒｇ−Ｎｕ（−）、または塩Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、−ＮｕＨもしくは−Ｎｕ（−）は求核成分であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物である）の求核化合物と、式（ＩＶｇｂ）：
【００７１】
【化４６】
2009528292.tif 000030
の化合物を形成するために反応させる工程と；
（ＩＶｇｂ）をＴｒａｎｓｐ−ＳＨと、式（Ｉｇｂ）：
【００７２】
【化４７】
2009528292.tif 000031
のコンジュゲートを形成するために反応させる工程と
を含む方法を包含している。Ｗが−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−ＰＧ）−である場合は、保護基をリン酸塩から除去する追加の工程が実施される。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００７３】
１つの実施形態では、Ｗは−（Ｃ＝Ｏ）−である。１つの実施形態では、ＶはＯである。１つの実施形態では、ＶはＮＨである。１つの実施形態では、ＶはＣＨ２である。１つの実施形態では、ＶはＳである。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８炭化水素である。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。
【００７４】
別の実施形態では、ＶはＯであり、Ｒ１はＣ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００７５】
別の実施形態では、−Ｎｕ−は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ２、−、もしくは−Ｓ−であり、このときＲ２はＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００７６】
別の実施形態では、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋２、もしくはＣａ＋２である。
【００７７】
別の実施形態では、ＴＬＧＳは、
【００７８】
【化４８】
2009528292.tif 000032
である。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、カーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」と式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子とのコンジュゲートを作製する方法であって、式（ＩＩｇ）：
【００８０】
【化４９】
2009528292.tif 000033
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、そしてＴＬＧＳはチオール離脱基安定剤である）の化合物を式：Ｙ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ２の活性化試薬と、式（ＩＩＩｇ）：
【００８１】
【化５０】
2009528292.tif 000034
（式中、Ｙ１およびＹ２は離脱基であり、同一であっても相違していてもよい）の化合物を形成するために反応させる工程と；
（ＩＩＩｇ）を式：Ｃａｒｇ−ＮｕＨ、アニオンＣａｒｇ−Ｎｕ（−）、または塩Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、−ＮｕＨもしくは−Ｎｕ（−）は求核成分であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物である）の求核化合物と、式（ＩＶｇ）：
【００８２】
【化５１】
2009528292.tif 000035
の化合物を形成するために反応させる工程と；
（ＩＶｇ）をＴｒａｎｓｐ−ＳＨと、式（Ｉ）：
【００８３】
【化５２】
2009528292.tif 000036
のコンジュゲートを形成するために反応させる工程と
を含む方法を包含している。１つの実施形態では、ＶはＯである。１つの実施形態では、ＶはＮＨである。１つの実施形態では、ＶはＣＨ２である。１つの実施形態では、ＶはＳである。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８炭化水素である。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００８４】
別の実施形態では、ＶはＯであり、Ｒ１はＣ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００８５】
別の実施形態では、−Ｎｕ−は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ２、−、もしくは−Ｓ−であり、このときＲ２はＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００８６】
別の実施形態では、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋２、もしくはＣａ＋２である。
【００８７】
別の実施形態では、ＴＬＧＳは、
【００８８】
【化５３】
2009528292.tif 000037
である。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、カーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」と式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子とのコンジュゲートを作製する方法であって、式（ＩＩ）：
【００９０】
【化５４】
2009528292.tif 000038
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳである；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）の化合物を式：Ｙ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ２の活性化試薬と、式（ＩＩＩ）：
【００９１】
【化５５】
2009528292.tif 000039
（式中、Ｙ１およびＹ２は離脱基であり、同一であっても相違していてもよい）の化合物を形成するために反応させる工程と；
（ＩＩＩｇ）を式：Ｃａｒｇ−ＮｕＨ、アニオンＣａｒｇ−Ｎｕ（−）、または塩Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、−ＮｕＨもしくは−Ｎｕ（−）は求核成分であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物である）の求核化合物と、式（ＩＶ）：
【００９２】
【化５６】
2009528292.tif 000040
の化合物を形成するために反応させる工程と；
（ＩＶ）をＴｒａｎｓｐ−ＳＨと、式（Ｉ）：
【００９３】
【化５７】
2009528292.tif 000041
のコンジュゲートを形成するために反応させる工程と
を含む方法を包含している。１つの実施形態では、ＶはＯである。１つの実施形態では、ＶはＮＨである。１つの実施形態では、ＶはＣＨ２である。１つの実施形態では、ＶはＳである。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８炭化水素である。１つの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００９４】
別の実施形態では、ＶはＯであり、Ｒ１はＣ１−Ｃ８アルキルである。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。１つの実施形態では、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００９５】
別の実施形態では、−Ｎｕ−は、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ２、−、もしくは−Ｓ−であり、このときＲ２はＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００９６】
別の実施形態では、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋２、もしくはＣａ＋２である。
【００９７】
別の実施形態では、本発明は、細胞取り込みおよび細胞内遊離についてトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートをアッセイする方法であって、細胞もしくは組織サンプルをトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートと接触させる工程であって、このとき式：
【００９８】
【化５８】
2009528292.tif 000042
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−であり、Ｍ＋はカチオンの１つの等価物であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；ｂｒは、１〜４までの整数であり、Ｒ１基上の「分枝鎖」の数を示している）のリンカーはカーゴ分子およびトランスポーター分子を共有結合し、カーゴはある期間にわたってレポーター分子である工程と；および細胞もしくは組織内に輸送されているカーゴを検出する工程であって、それにより輸送を実行する際のトランスポーターの有効性が決定される工程とを含む方法を包含している。１つの実施形態では、ｂｒは１である。別の実施形態では、ｂｒは２である。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、細胞取り込みおよび細胞内遊離についてトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートをアッセイする方法であって、細胞もしくは組織サンプルをトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートと接触させる工程であって、リンカーは、式：
【０１００】
【化５９】
2009528292.tif 000043
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）のリンカーであり、そしてカーゴは、ある期間にわたりレポーター分子である工程と；および細胞もしくは組織内に輸送されているカーゴを検出する工程であって、それにより輸送を実行する際のトランスポーターの有効性が決定される工程とを含む方法を包含している。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、細胞取り込みおよび細胞内遊離についてトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートをアッセイする方法であって、細胞もしくは組織サンプルを式：
【０１０２】
【化６０】
2009528292.tif 000044
（式中、Ｃａｒｇ−Ｎｕはカーゴ分子「Ｃａｒｇ−ＮｕＨ」の残基を表し；およびＴｒａｎｓｐ−Ｓは化学式「Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨ」のチオール基を有するトランスポーター分子の残基を表し；Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換されたＣ１−Ｃ８ヘテロ鎖基であり；Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）、−−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−Ｍ＋）−、もしくは−Ｓ（＝Ｏ）２−でありＶは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；Ｍ＋はカチオンの１つの等価物であり；ｂｒは、１〜４までの整数であり、Ｒ１基上の「分枝鎖」の数を示している）のトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートと接触させる工程であって、カーゴは、ある期間にわたりレポーター分子である工程と；および細胞もしくは組織内に輸送されているカーゴを検出する工程であって、それにより輸送を実行する際のトランスポーターの有効性が決定される工程とを含む方法を包含している。１つの実施形態では、カーゴは、ルシフェリンである。１つの実施形態では、ｂｒは１である。別の実施形態では、ｂｒは２である。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【０１０３】
別の実施形態では、本発明は、細胞取り込みおよび細胞内遊離についてトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートをアッセイする方法であって、細胞もしくは組織サンプルを式：
【０１０４】
【化６１】
2009528292.tif 000045
（式中、Ｒ１は、任意に置換されたＣ１−Ｃ８炭化水素基、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意に置換された基、もしくは任意に置換された鎖基であり；Ｖは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ２、ＣＨ２、ＣＨＲ２、Ｃ（Ｒ２）２、もしくはＳであり；Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）のトランスポーター−リンカー−カーゴコンジュゲートと接触させる工程であって、カーゴは、ある期間にわたりレポーター分子である工程と；および細胞もしくは組織内に輸送されているカーゴを検出する工程であって、それにより輸送を実行する際のトランスポーターの有効性が決定される工程とを含む方法を包含している。１つの実施形態では、カーゴは、ルシフェリンである。１つの実施形態では、Ｒ１は、式：−ＣＨ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビルの任意の置換基であり、ＶはＯであり；好ましくは、Ｃ１−Ｃ８ヒドロカルビル基は、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、およびＣ４アルキルから選択される。
【０１０５】
トランスポーターが他に特に規定されていない場合の上記の任意のコンジュゲート、組成物、および方法のためには、トランスポーターは、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−（Ｄ−Ａｒｇ）８−ＣＯＮＨ２およびそれらの任意の立体異性体、塩、もしくは溶媒和物から選択できるが、このときＣｙｓ分子のチオール基は上記で言及した「ＨＳ−Ｔｒａｎｓｐ」のチオール基に対応し、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−（Ｄ−Ａｒｇ）８−ＣＯＮＨ２の残りは「ＨＳ−Ｔｒａｎｓｐ」の「Ｔｒａｎｓｐ」部分に対応する。
【０１０６】
上述した方法のすべてについて、工程の順序は、当該の再順序付けが同一の生成物もしくは結果を提供する限り変更することができる。
【０１０７】
上述および本明細書に記載した化合物およびコンジュゲートすべてについて、本発明は、患者に前記化合物もしくはコンジュゲートを治療有効量で投与する方法を包含している。投与は、癌細胞を本発明の化合物もしくはコンジュゲートと接触させる工程、または患者の癌細胞が化合物もしくはコンジュゲートと接触させられるような方法で、本発明の化合物もしくはコンジュゲートを投与する工程を含むことができる。投与方法の別の実施形態では、本発明のリンカーによってトランスポーターへ結合された薬物は、通常は遊離薬に耐性がある細胞系、癌、または患者を治療するために使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
発明の詳細な説明
「被験者」もしくは「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。
【０１０９】
本発明の方法を用いて疾患を「治療する工程」もしくは「治療する」は、追加の治療薬を用いて、または用いずに、疾患もしくは疾患の症状のいずれかを緩和する、改善する、安定化させる、逆転させる、緩徐化させる、遅延させる、予防する、減少させる、もしくは排除するために、または疾患もしくは疾患の症状の進行を遅らせる、もしくは停止させるために、１つまたは複数の化合物を投与する工程であると規定されている。化合物の「治療使用」は、上記に規定した疾患を治療するために、１つまたは複数の化合物を使用することであると規定されている。「治療有効量」は、上記に規定した疾患を治療するために十分な量である。予防もしくは抑制は部分的または完全であってよい。
【０１１０】
「診断薬」は、疾患の存在、程度、または病期を検出する、診断する、病期分類する、さもなければ同定する際に役立つ物質である。
【０１１１】
「残基」は、それがリンカー基と反応した後に残留している分子の部分を意味する。例えば、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯＭｅを生成するためのＢｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨとＨ２Ｎ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯＭｅ（アラニンメチルエステルを備えるＢｏｃ−グリシン）との反応において、「Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−」部分はＢｏｃ−グリシンの残基であり、「−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯＭｅ」部分はアラニンメチルエステルの残基である。
【０１１２】
「生物学的障壁」は、分子の自由拡散を妨害する生物学的構造であると規定されている。生物学的障壁には、細胞膜、核膜、オルガネラ膜、角質層、角膜上皮、および血液脳関門が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１３】
本発明は、本明細書に記載もしくは参照して組み込まれる化合物の任意およびすべての立体異性体、塩、水和物および溶媒和物を含む、本明細書に記載もしくは参照して組み込まれる化合物を含んでいる。本発明は、それらの非塩、非水和物／非溶媒和物形にある、本発明に記載もしくは参照して組み込まれる化合物もまた含んでいる。そこで、本明細書に開示した一部の化合物は塩として示されているが、本開示は、本明細書に記載した化合物の他のすべての塩、水和物、および溶媒和物、ならびに本化合物の非塩、非水和物／非溶媒和物形を包含すると理解されたい。特に好ましいのは、医薬上許容される塩である。医薬上許容される塩は、遊離化合物の生物活性を保持しており、生物学的または他の点で有害ではないそれらの塩である。塩基性化合物の所望の塩は、当業者には知られている方法によって、化合物を酸で処理する工程によって調製できる；そのような塩は、化合物を生成する反応の生成物であってよい。無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸が含まれるがそれらに限定されない。有機酸の例には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、スルホン酸、およびサリチル酸が含まれるがそれらに限定されない。例えばアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩などの塩基性化合物とアミノ酸との塩もまた調製できる。酸性化合物の所望の塩は、当業者には知られている方法によって、化合物を塩基で処理する工程によって調製できる；そのような塩は、化合物を生成する反応の生成物であってよい。酸性化合物の無機塩の例には、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩などのアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；およびアルミニウム塩などが含まれるがそれらに限定されない。酸性化合物の有機塩の例には、プロカイン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、およびトリエチルアミン塩が含まれるがそれらに限定されない。例えばリシン塩などの酸性化合物とアミノ酸との塩もまた調製できる。溶媒和物の例には、水和物、半水和物（１／２  Ｈ２Ｏ）、二水和物、三水和物、ならびにメタノラートおよびエタノラートなどのアルコラートが含まれるがそれらに限定されない。
【０１１４】
本発明は、本明細書に開示した化合物のすべての多形体、結晶形、および非結晶形をさらに含んでいる。
【０１１５】
本発明は、単離形にあるジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む本明細書に開示した化合物のすべての立体異性体、ならびにラセミ混合物を含むがそれらに限定されない任意の比率にある立体異性体の混合物をさらに含んでいる。立体化学が構造で明確に指示されない限り、構造は、図示した化合物のすべての考えられる立体異性体を包含することが企図されている。特定の生物活性物質もしくはレポーター分子が指示される場合は、適切な生物学的機能またはレポーター／プローブの特性を保持している物質もしくはレポーターの立体異性体だけが企図されている。
【０１１６】
用語「アルキル」は、規定した炭素原子数を有する、または数が規定されていない場合は１２個までの炭素原子を有する直鎖状、分枝状、環式基、およびそれらの組み合わせを含む飽和脂肪族基を意味しており、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ１０、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ１−Ｃ６、およびＣ１−Ｃ４アルキル基を含むサブセットのアルキル基が好ましい。「直鎖状アルキル」もしくは「線状アルキル」基は、環式でも分枝状でもない、一般には「ｎ−アルキル」と指名されるアルキル基を意味する。アルキル基の例には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ｎ−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、ネオペンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびアダマンチルなどの基が含まれるが、それらに限定されない。環式基は、例えば、シクロヘプチルなどの基を含むがそれには限定されない１つの環、または例えばアダマンチルもしくはノルボニルなどの基を含むがそれらに限定されない複数の縮合環から構成されてよい。
【０１１７】
「置換アルキル」は、例えばハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード）、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキシアルデヒド、カルボアルコキシおよびカルボキサミドなどの基、または本発明の目的に必要であれば保護基を用いて適切にブロックできる官能基を含むがそれらに限定されない１つまたは複数の置換基で置換されたアルキル基を意味する。置換アルキル基の例には、−ＣＦ３、−ＣＦ２−ＣＦ３、およびその他のパーフルオロおよびパーハロ基が含まれるがそれらに限定されない。
【０１１８】
「ヒドロキシアルキル」は、詳細には１つの−ＯＨ基で置換された、指定炭素原子数を有するアルキル基を意味する。そこで、「Ｃ３線状ヒドロキシアルキル」は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯＨ−、−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２−、および−ＣＨＯＨＣＨ２ＣＨ２−を意味する。
【０１１９】
用語「アルケニル」は、指定の炭素原子数を有する、または数が指定されていない場合は、少なくとも１つの二重結合（−Ｃ＝Ｃ−）を含有する１２個までの炭素原子を有する、直鎖状（線状）、分枝状、環式基、およびそれらの組み合わせを含む不飽和脂肪族基を意味する。アルケニル基の例には、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２；および−ＣＨ２−ＣＨ２−シクロヘキセニルが含まれるがそれらに限定されない；このときエチル基は、任意の利用可能な炭素原子価でシクロヘキセニル成分に結合させることができる。用語「アルキニル」は、指定の炭素原子数を有する、または数が指定されていない場合は、少なくとも１つの三重結合（−Ｃ≡Ｃ−）を含有する１２個までの炭素原子を有する、直鎖状（線状）、分枝状、環式基、およびそれらの組み合わせを含む不飽和脂肪族基を意味する。「炭化水素」、「炭化水素基」、「炭化水素鎖」もしくは「ヒドロカルビル」は、直鎖状、分枝状、または環状アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、およびそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味する。炭化水素基は、指定の炭素原子数を有する、または数が指定されない場合は、１〜１２個の炭素原子を有する。「置換アルケニル」、「置換アルキニル」、「置換炭化水素鎖」（もしくは「置換ヒドロカルビル」、「置換炭化水素基」、または「置換炭化水素」）は、例えばハロゲン、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキシアルデヒド、カルボアルコキシおよびカルボキサミドなどの基、または本発明の目的に必要であれば保護基を用いて適切にブロックできる官能基を含むがそれらに限定されない１つまたは複数の置換基で置換された各基を意味する。
【０１２０】
「アリール」もしくは「Ａｒ」は、単一環（フェニルなどの基を含むがそれらに限定されない）または複数の縮合環（ナフチルもしくはアントリルなどの基を含むがそれらに限定されない）を有する芳香族炭素環基を意味しており、未置換および置換両方のアリール基を含んでいる。「置換アリール」は、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、炭化水素鎖、ハロゲン、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキシアルデヒド、カルボアルコキシおよびカルボキサミドなどの基、または本発明の目的に必要であれば保護基を用いて適切にブロックできる官能基を含むがそれらに限定されない１つまたは複数の置換基で置換されたアリールを意味する。
【０１２１】
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」は、各々が、基内の主鎖、分枝鎖、または環状鎖の一部として１つまたは複数のヘテロ原子を含有する、指定の炭素原子数を含有する（または数が指定されていない場合は、１２個までの炭素原子を有する）アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を意味する。ヘテロ原子には、Ｎ、Ｓ、Ｏ、およびＰが含まれるがそれらに限定されない；ＮおよびＯが好ましい。ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、およびヘテロアルキニル基は、ヘテロ原子（原子価を入手できる場合）または炭素原子のいずれかでその分子の残りに結合させることができる。ヘテロアルキニル基の例には、例えば、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、１−エチル−６−プロピルピペリジノ、２−エチルチオフェニル、およびモルホリノが含まれるがそれらに限定されない。ヘテロアルケニル基の例には、例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−などの基が含まれるがそれには限定されない。
【０１２２】
「ヘテロ鎖」もしくは「ヘテロ鎖基」は、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、もしくはヘテロアルキニル基、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味しており、指定された炭素原子数を有する（数が指定されていない場合は、１２個までの炭素原子を有する）。
【０１２３】
「ヘテロアリール」もしくは「ＨｅｔＡｒ」は、単一環（例えばピリジル、チオフェン、もしくはフリルなどの例を含むがそれらに限定されない）または複数の縮合環（例えばイミダゾリル、インドロジニルもしくはベンゾチエニルを含むがそれらに限定されない）を有する、そして環内に例えばＮ、Ｏ、Ｐ、もしくはＳなどのヘテロ原子を含むがそれらに限定されない少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族炭素環基を意味する。他に特に指定しない限り、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、およびヘテロアリール基は、１〜５個のヘテロ原子および１〜１２個の炭素原子を有する。「置換ヘテロアルキル」、「置換ヘテロアルケニル」、「置換ヘテロアルキニル」、「置換ヘテロ鎖」、および「置換ヘテロアリール」基は、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、ベンジル、炭化水素鎖、ハロゲン、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキシアルデヒド、カルボアルコキシおよびカルボキサミド、または本発明の目的に必要であれば、保護基を用いて適切にブロックすることのできる官能基を含むがそれらに限定されない１つまたは複数の置換基で置換されたヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロ鎖、およびヘテロアリール基を意味する。そのような置換基の例には、フェニルもしくはベンジル基によって窒素もしくは炭素で置換され、そして炭素もしくは窒素上で任意の入手できる原子価によって分子の残りに結合されたピペラジン、−ＮＨ−ＳＯ２−フェニル、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−アルキル、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−アルキル−アリール、および−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−アルキルが含まれるがそれらに限定されない。化学的に可能であれば、その基のヘテロ原子および炭素原子を置換することができる。ヘテロ原子は、化学的に可能であれば、酸化形であってもよい。
【０１２４】
用語「アルキルアリール」は、１つ、２つ、もしくは３つのアリール基に負荷された、指定の炭素原子数を有するアルキル基を意味する。
【０１２５】
本明細書で使用する用語「アルコキシ」は、１つの酸素原子に連結された、そして指定の炭素原子数を有する、または数が指定されていない場合は、１２個までの炭素原子を有するアルキル、アルケニル、アルキニル、もしくは炭化水素鎖を意味する。アルコキシ基の例には、例えば、メトキシ、エトキシ、およびｔ−ブトキシなどの基が含まれるがそれらに限定されない。
【０１２６】
本明細書で使用する用語「アルカノエート」は、例えば酢酸（ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（−１））、プロピオン酸（ＣＨ３ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ（−１））などのイオン化カルボン酸基を意味する。「アルキルアルカノエート」は、例えば酢酸エチル（ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）などのアルコキシ基を用いてエステル化されたカルボン酸を意味する。「ω−ハロアルキルアルカノエート」は、カルボキシ基から最も遠くのアルカノエート炭素原子上に１つのハロゲン原子を有するアルキルアルカノエートを意味する；そこで、エチルω−ブロモプロピオネートは、エチル３−ブロモプロピオネートを意味しており、メチルω−クロロｎ−ブタノエートはメチル４−クロロｎ−ブタノエートを意味する。
【０１２７】
本明細書で使用する用語「ハロ」および「ハロゲン」は、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦもしくはＩ置換基を意味する。
【０１２８】
「Ｍ＋」が「カチオンの１つの同等物」を示すために使用される場合は、これはそのカチオンの形式電荷もしくは化学的性質とは無関係に、任意のカチオンの１つの同等物を表すことが意図されている。すなわち、Ｍ＋はＬｉ＋、Ｎａ＋、もしくはＫ＋などの一価カチオンだけではなく、アニオンと適切な等量で、例えばＣａ＋２、Ｍｇ＋２もしくはＦｅ＋３などの多価カチオンもまた表す場合がある。Ｍ＋は、金属もしくは非金属カチオンのいずれも表すことがある；非金属カチオンの例には、ＮＨ３＋もしくは適切な等量にある多価カチオンが含まれるがそれらに限定されない。
【０１２９】
「保護基」は、以下の特性を示す化学基を意味する：１）所望の官能基と選択的に反応して良好な収率で保護が所望である企図された反応に対して安定性である保護基質を生成する；２）所望の官能基を産生するために保護基質から選択的に除去可能である；および３）そのような保護された反応において存在する、もしくは生成される他の官能基と適合性である試薬によって良好な収率で除去できる。適切な保護基の例は、Ｇｒｅｅｎｅら、（１９９１）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク）の中に見いだすことができる。アミノ保護基には、メシチレンスルホニル（Ｍｅｓ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚもしくはＺ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＩＭＳもしくはＴＢＤＭＳ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トシル、ベンゼンスルホニル、２−ピリジルスルホニル、または例えば６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（Ｎｖｏｃ）、ニトロピペロニル、ピレニルメトキシカルボニル、ニトロベンジル、ジメチルジメトキシベンジル、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルなどの適切な光解離性保護基が含まれるがそれらに限定されない。ヒドロキシル保護基には、Ｆｍｏｃ、ＴＢＤＩＭＳ、光解離性保護基（例えばニトロベラトリルオキシメチルエーテル（Ｎｖｏｍ））、Ｍｏｍ（メトキシメチルエーテル）、およびＭｅｍ（メトキシエトキシメチルエーテル）、ＮＰＥＯＣ（４−ニトロフェネチルオキシカルボニル）およびＮＰＥＯＭ（４−ニトロフェネチルオキシメチルオキシカルボニル）が含まれるがそれらに限定されない。
【０１３０】
本発明のコンジュゲート
１つの実施形態では、本発明は、放出可能なリンカーによってカーゴ分子に連結されたトランスポーター分子のコンジュゲートを包含している。これらの様々な構成成分の各々について、詳細に考察する。
【０１３１】
トランスポーター分子
トランスポーター分子は、カーゴ分子と呼ばれる別の分子が生物学的障壁（細胞膜など）を越えて通過することを可能にする、またはカーゴ分子が生物学的障壁を越えて通過する能力を調節するもしくは高める分子である。すなわち、カーゴ分子は、独力では、障壁を越えられないであろう、または準最適量もしくは準最適速度でしか越えられないであろう；トランスポーターへのカーゴの結合は、カーゴが障壁を越えることを可能にする、または障壁を（トランスポーターと結合して）越えるカーゴの量を増強する、またはカーゴが（トランスポーターと結合して）障壁を越える速度を調節する。そのような調節は、結合していないカーゴに比較したコンジュゲートによって輸送されるカーゴの量の増加；結合していないカーゴの輸送に比較したカーゴがコンジュゲートによって輸送される速度の増加；結合していないカーゴの輸送に比較したコンジュゲートによって輸送されるカーゴの量の減少；または結合していないカーゴの輸送に比較したカーゴがコンジュゲートによって輸送される速度の減少であってよい。
【０１３２】
適切なトランスポーター分子については極めて多数の例が存在しており、以下の特許公報は、本発明においてトランスポーター分子として使用できる分子について記載している。米国特許第６，３０６，９９３号（第６段落第６３行〜第９段落第４７行）および米国特許第６，４９５，６６３号（第６段落第６２行〜第１０段落第５９号）および米国特許出願公開第２００２／０１３１９６５号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１６２７１９号は、生物膜などの生物学的障壁を越える選択された化合物の輸送を増強するための組成物および方法について記載しているが、このとき生物膜は輸送ポリマー（輸送ポリマーは輸送分子として作用する）へ共有結合している生物活性分子を含有するコンジュゲートと接触される。１つの実施形態では、ポリマーは、６〜２５個のサブユニットから構成され、それらの少なくとも５０％はグアニジノもしくはアミジノ側鎖成分を含有している。米国特許第６，５９３，２９２号は、グアニジノもしくはアミジノ成分を含有する追加のトランスポーター分子について記載している；第１０段落第４０行〜第１４段落第６４行を参照されたい。米国特許第６，６６９，９５１号（第１１段落第３５行〜第１８段落第３６行）、米国特許第６，７３０，２９３号（第１０段落第１行〜第１５段落第３６行）、および米国特許第６，７５９，３８７号（第１０段落第４４行〜第１６段落第２６行）は、上皮および内皮組織を越えて分子を輸送するために有用な、アルギニンアミノ酸などのグアニジノもしくはアミジノ分子を含有するトランスポーターについて記載している。言及した特許、特許公報、および上記に挙げた特定のセクションは、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
脂質もまた、様々な化合物のためのトランスポーター分子として使用できる。脂質には、（Ｃ７−Ｃ３２アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨおよび（Ｃ７−Ｃ３２アルケニル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨならびに好ましいサブセットとしてのそれらのアシル形とともに、式：（Ｃ７−Ｃ３２ヒドロカルビル）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨの脂肪酸およびそれらのアシル形が含まれるがそれらに限定されない。カプリル酸（オクタン酸）、カプリン酸（デカン酸）、ラウリン酸（ドデカン酸）、ミリスチン酸（テトラデカン酸）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、アラキジン酸（イコサン酸）、ベヘン酸（ドコサン酸）、パルミトール酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、およびエルカ酸は、トランスポーター成分として使用できる脂質の例である。以下の実施例１０は、本発明のリンカーを用いて脂質をカーゴに結合させるための１つの実施形態を示している。
【０１３４】
本明細書に開示した放出可能なリンカーの実施形態と一緒に使用できる上記の知られているトランスポーター分子に加えて、新規のトランスポーターは、放出可能なリンカーの実施形態を用いて評価できる。トランスポーターをレポーター分子、例えばルシフェリンと結合しているリンカーに結合させると、生物学的障壁を越えてレポーター分子を輸送することにおけるトランスポーター分子の有効性を容易に測定することができる。
【０１３５】
１つの実施形態では、コンジュゲートは、式：Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨのチオール基を有するトランスポーター分子を組み込んでいる。チオール基が欠如するトランスポーターは、チオール基を組み込むように誘導体化することができる；例えば、トリチル−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨおよびトリチル−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２などの化合物は、チオール基を組み込むために、各々アミノ含有およびカルボキシレート含有化合物を誘導体化するために使用できる。ペプチド性トランスポーターについては、天然型システイン残基はポリペプチド内に既に存在している可能性がある、または合成ペプチドについては、システイン残基もしくはアナログ（ホモシステインなど）の組み込みは、ペプチド合成中に容易に遂行される。チオール基をポリペプチド内へ組み込む他の方法は、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１の中に見いだすことができる；これらの方法のいくつかは、非ペプチド性トランスポーターにも同様に適用することができる。
【０１３６】
１つの実施形態では、本発明は、輸送の有効性について、様々なトランスポーター物質を試験する、またはアッセイする方法を包含している。レポーター分子は、放出可能なリンカーによってトランスポーター分子へ結合させることができる。生物学的障壁（細胞膜など）が、コンジュゲートと接触される；１つのそのようなアッセイの例示については、以下の実施例６を参照されたい。輸送されるレポーター分子の総量は、所与のトランスポーターについて容易に定量することができる。同一レポーター分子を用いて、様々なトランスポーター分子に関する繰り返しのアッセイを行うと、所与のトランスポーター分子の輸送の有効性を決定するための方法が提供される。
カーゴ分子
本コンジュゲートのカーゴ成分として、様々な分子を使用できる。生物活性分子は、カーゴとして使用できる１群の化合物である。生物活性分子（薬物、治療薬、および診断薬を含む）には、金属イオン（典型的には金属キレート剤として送達される）；例えば（例、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、エピポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、抗微小管剤、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、他のビンカアルカロイド、タキサン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、他のタキソイド、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、シクロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、アジリジン、チオテパ、スルホン酸アルキル、ブスルファン、ニトロソ尿素、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、白金錯体、カルボプラチン、シスプラチン、アルキル化剤、アルトレタミン、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾラミド、葉酸アナログ、メトトレキセート、プリンアナログ、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン；アデノシンアナログ、クラドリビン、ペントスタチン、ピリミジンアナログ、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、置換尿素、ヒドロキシ尿素、カンプトセシンアナログ、イリノテカン、トポテカン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、およびアントラサイクリン抗生剤）などの抗癌分子；抗生分子および抗菌分子（例、ペニシリン、セファロスポリン、イソニアジド、トリメトプリム、キノロン、フルオロキノロン、例えばエリスロマイシンおよびチロシンなどのマクロライド抗生剤）などの有機低分子；ならびに例えばポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドアナログ、ポリペプチド（ペプチドおよびタンパク質）およびポリペプチドアナログ、そして多糖類および多糖類アナログなどの高分子が含まれるがそれらに限定されない。高分子の例には、低分子干渉型ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム（任意で増強した安定性のために１つまたは複数の２’−デオキシヌクレオチドサブユニットを含有する）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、腫瘍抗原などのタンパク質抗原、およびシクロスポリンなどのペプチドなどが含まれるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドアナログおよびポリペプチドアナログは、例えば分解に対する抵抗性の増加もしくは変化した水溶性などの１つまたは複数の所望の特性を付与するために遺伝子操作された主鎖を有する可能性がある。生物活性分子は、好ましくは、約１０ｋＤａ未満、より好ましくは約１ｋＤａ未満、いっそうより好ましくは６００ダルトン未満の分子量を有する。以下では、適切なカーゴ分子についてより詳細に記載する。
【０１３７】
Ａ．有機低分子
カーゴとして、様々な有機低分子を本コンジュゲートに結合させることができる。有機低分子は、カーゴの−Ｎｕ部分として機能する求核成分さえ有していればよい。有機低分子はしばしば、既に適切な求核成分を有しており、一部の有機低分子は、複数の求核成分（この場合には所定の求核成分の保護が、１つの規定部位で有機低分子へのリンカーの結合を制限するために望ましいことがある）を有していることがあり、そして他の有機低分子は、求核成分を含有するように容易に誘導体化することができる。例えば、ドキソルビシン：
【０１３８】
【化６２】
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は、その−ＯＨ基（例えば６−ヒドロキシ基もしくは１１−ヒドロキシ基、８−ヒドロキシ基もしくは（８−ヒドロキシアセチル）成分のヒドロキシ基、−ＮＨ２基に隣接するヒドロキシ基、または−ＮＨ２基自体であって、それらのいずれもカーゴ−ＮｕＨ基の−ＮｕＨ成分として機能できる）のいずれかによってリンカーに結合させることができる。
【０１３９】
タキサンおよびタキソイド系抗癌分子もまた、本コンジュゲートにおけるカーゴ分子として使用できる。そのようなコンジュゲートは、抗癌剤として有用である。用語「タキサン」は、パクリタキセル（ニューヨーク州ニューヨークに所在するＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社の登録商標であるＴＡＸＯＬとしても知られる）（例えば、米国特許第６，３０６，９９３号の図６Ｆ、および下記の構造式（式中、Ｒ’＝アセチルおよびＲ’’＝ベンゾイル）を参照されたい）および米国特許第６，３０６，９９３号の図６Ｇに例示されたパクリタキセルのＡ、Ｂ、ＣおよびＤ環を含有する主鎖中核を有する天然型、合成、もしくは遺伝子組み換えアナログを意味する。米国特許第６，３０６，９９３号の図６Ｆは、さらにいくらかより可溶性であるパクリタキセルの合成アナログである、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（フランス国のＡｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ社の登録商標）（式中、Ｒ’＝Ｈ、Ｒ’’＝ｔ−ブチルオキシカルボニル（すなわち、Ｂｏｃ））の構造を示している。「タキソイド」は、米国特許第６，３０６，９９３号の図６Ｈに示された、そしてその中の第１６段落第９〜２６行に記載されたパクリタキセルの基本的Ａ、ＢおよびＣ環を含有する天然型、合成もしくは遺伝子組み換えアナログを意味する。化学的方法、合成方法、および生物学的方法、ならびに抗癌活性をアッセイするための細胞系を含む、タキサンおよびタキソイドについての広範囲の情報は、Ｔａｘｏｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｕｆｆｉｎｅｓｓ，Ｍ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ（１９９５）に提示されている。
【０１４０】
【化６３】
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パクリタキセルおよびその誘導体のＣ２’ヒドロキシル酸素もしくはＣ７ヒドロキシル酸素のいずれかは、カーゴ分子の−Ｎｕ部分として機能できる。Ｃ２’結合は抗癌活性を低下させる可能性があるので、本発明の１つの実施形態に提供した放出可能なリンカーは、生物学的障壁を越える輸送が発生した後にそれらがカーゴから完全に開裂されるという点で、高度に有益である。アミド窒素もまた、所望により、カーゴ分子の−Ｎｕ部分として使用できる。または、例えば米国特許第６，３０６，９９３号の実施例９もしくは第１５〜１６段落に記載された方法などの他の合成方法を使用できる。本発明のコンジュゲートを使用したパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）のコンジュゲートの例は、実施例８に記載されている。
【０１４１】
Ｂ．金属イオン
金属イオンは、キレート剤として輸送することができる。例えば、金属はジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）によってキレート化することができ、それはさらに、例えばカルボジイミドまたは例えばＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＴＢＴＵなどのウロニウム試薬を用いてＢｏＣ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２の遊離カルボキシルへの結合、その後のＢｏｃ基の除去によって誘導体化することができる；金属−ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２錯体の遊離窒素は、−ＮｕＨ基として機能できる。または、金属は、ポルフィリンまたは遊離アミノ基を含有するフタロシアニンもしくはテキサフィリンなどのテトラピロール誘導体へ錯体化することができる。例えばメソポルフィリンＩＸのカルボン酸基は、放出可能なリンカーへのその後の結合のためにＤＴＰＡについて上述したように、ＢｏＣ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２を用いて誘導体化することができる。鉄、マグネシウム、亜鉛、銅（例、Ｃｕ６７）、ニッケル、コバルト（例、Ｃｏ５７）、ユーロピウム、テクネチウム（例、Ｔｃ９９ｍ）、ユーロピウム、ルテチウム、イットリウム（例、Ｙ９０）、プラセオジム、ガドリニウム、ガリウム（例、Ｇａ６７）、もしくはインジウム（例、Ｉｎ１１１）。様々な実施形態では、金属は、例えばＣａ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｎｉ＋２、Ｚｎ＋２、Ｃｄ＋２、Ｈｇ＋２、Ｓｍ＋２およびＵＯ２＋２などの二価金属イオン、もしくは例えばＭｎ＋３、Ｃｏ＋３、Ｎｉ＋３、Ｙ＋３、Ｉｎ＋３、Ｐｒ＋３、Ｎｄ＋３、Ｓｍ＋３、Ｆｅ＋３、Ｈｏ＋３、Ｃｅ＋３、Ｅｕ＋３、Ｇｄ＋３、Ｔｂ＋３、Ｄｙ＋３、Ｅｒ＋３、Ｔｍ＋３、Ｙｂ＋３、Ｌｕ＋３、Ｌａ＋３およびＵ＋３などの三価金属イオンあってよい。
【０１４２】
Ｃ．高分子
高分子は、コンジュゲート内のカーゴとして輸送することもできる。高分子には、例えばポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドアナログ、ポリペプチド（ペプチドおよびタンパク質）およびポリペプチドアナログ（ペプトイドなど）を含むがそれらに限定されないタンパク質、プラスミド、およびオリゴ糖、ならびに多糖類および多糖アナログが含まれるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドアナログの例には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、インビトロ重合ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡのフラグメント、線状ＤＮＡ、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、組換えＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、もしくはこれらのＤＮＡの誘導体；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＵＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、リボザイム（安定性増強のために任意で１つまたは複数の２’−デオキシヌクレオチドサブユニットを含有する）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ポリペプチドおよびポリペプチドアナログの例には、ペプチドホルモン、ペプトイド、抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂなどの抗体フラグメント、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、酵素、毒素、および腫瘍抗原などのタンパク質抗原が含まれる。ポリヌクレオチドアナログおよびポリペプチドアナログは、例えば分解に対する抵抗性の増加もしくは変化した水溶性などの１つまたは複数の所望の特性を付与するために修飾された主鎖を有する可能性がある。アナログは、例えばホスホン酸塩（好ましくはホスホン酸メチル）、ホスホルアミデート、チオリン酸塩、非荷電モルホリノ系ポリマー、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの荷電および好ましくは非荷電の主鎖アナログを含むことができる。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位から構成される主鎖がＤＮＡのデオキシリボリン酸主鎖と構造的に類似であるＤＮＡのアナログである；この単位はポリヌクレオチド内で自然に発生する塩基のいずれかを有する可能性がある。ポリペプチドは、カーゴの−Ｎｕ成分として機能できる様々な求核基を有している。または、求核基を導入するためのペプチドおよびタンパク質の誘導体化は、容易である；例えばＷｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１を参照されたい。
【０１４３】
対象とする核酸の１つのタイプは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を生じさせる、低分子干渉ＲＮＡ（もしくは低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）のクラスである。ＲＮＡ干渉は、それが例えば感染患者におけるＨＩＶもしくは肝炎ウイルス遺伝子などの重要な遺伝子の配列特異的サイレンシングに対する能力があるために、集中的な研究の主題となってきた。例えば、Ｈａｎｎｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３７１（２００４）およびＧｒｕｎｗｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：３１４３（２００５）を参照されたい。ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子調節に使用できるまた別のタイプのＲＮＡである；例えばＹｅｕｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５：９３５（２００５）およびＤｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２：４６４５（２００５）を参照されたい。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）もまた遺伝子調節のために使用できる；例えば、Ｐｅｋａｒｉｋ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６８：１１５−２０（２００５）を参照されたい。
【０１４４】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡ、ならびにその他の核酸は、放出可能なリンカーを用いて本コンジュゲート内に容易に組み込むことができる。核酸の５’−ヒドロキシルもしくは３’−ヒドロキシルは、核酸カーゴ分子の−ＮｕＨ成分として機能することができる。または、求核基は、当技術分野において容易に知られている方法を用いて核酸に容易に導入することができる；例えば、米国特許第５，５９４，１１８号、第５，８４３，６５０号、第６，５３７，７８３号、および第６，６９９，９７８号を参照されたい。
【０１４５】
シクロスポリンは、カーゴとして使用するために適切な別の高分子の群である。シクロスポリンは、免疫抑制活性を示す環状ペプチドである。シクロスポリンＡ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ社のＲＥＧＩＳＴＲＹ番号５９８６５−１３−３；シクロ［Ｌ−アラニル−Ｄ−アラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−（３Ｒ，４Ｒ，６Ｅ）−６，７−ジデヒドロ−３−ヒドロキシ−Ｎ，４−ジメチル−Ｌ−２−アミノオクタノイル−Ｌ−２−アミノブタノイル−Ｎ−メチルグリシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル］）は、臓器移植後拒絶反応を抑制するために臨床使用されている。２−アミノオクタノイルサブユニット上の３−ヒドロキシ基は、本コンジュゲート内のカーゴ結合の「Ｎｕ」単位として機能して、本発明のリンカー基を結合させるための便宜的部位を提供する。他のシクロスポリン、例えばシクロスポリンＢ、シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ、シクロスポリンＧ、シクロスポリンＨ、およびシクロスポリンＭ（例えば、米国特許第６，００７，８４０号および第６，００４，９７３号を参照されたい）もまた３−ヒドロキシ基で結合できる；その部位での誘導体化を防止するために、シクロスポリンＣのトレオニンヒドロキシルの適切な保護が使用される（または、２−アミノオクタノイル成分の３−ヒドロキシ基の適切な保護が提供され、コンジュゲートはシクロスポリンＣのトレオニンヒドロキシルで形成される）。
【０１４６】
相違する「Ｎｕ」基が所望の場合は、それは例えば、３−ヒドロキシ基のクロロ酢酸エステルを作製し（シクロスポリンＡのクロロ酢酸エステルは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ社のＲＥＧＩＳＴＲＹ番号１４１７４９−４２−０を有している；α−クロロアセチルシクロスポリンＡの調製については、例えば、米国特許第６，７３０，２９３号の図１、および実施例５．Ａ．１．を参照されたい）、そしてさらに所望の基を導入するためにクロロアセチル基を反応させる工程によって導入することができる。他のシクロスポリン、例えば、シクロスポリンＢ、シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ、シクロスポリンＧ、およびシクロスポリンＨもまた結合のためにクロロ酢酸エステルとして誘導体化することができる；その部位でのクロロアセチル無水物の反応を防止するためには、シクロスポリンＣのトレオニンヒドロキシルの適切な保護が使用される（または、２−アミノオクタノイル成分の３−ヒドロキシ基の適切な保護が提供され、そしてクロロアセチルエステルがシクロスポリンＣのトレオニンヒドロキシルで形成される）。クロロアセチル基の塩素は、次に所望の求核保持基と置換することができる。
【０１４７】
米国特許第６，７３０，２９３号の実施例５．Ａ．１．は、クロロアセチル無水物の代りに、Ｂｏｃ−グリシンの対称無水物、またはＢｏｃ−グリシンの活性エステルを使用することによって変更することができる。他の保護されたグリシン誘導体もまた使用できる。保護されたグリシンをシクロスポリンの２−アミノオクタノイルサブユニットの３−ヒドロキシ基へ結合させた後、グリシンのアミノ基を脱保護すると、本発明のコンジュゲートにおける「Ｎｕ」基として使用するために適合する窒素求核基が産生する。
【０１４８】
または、結合のために導入された基を備えるシクロスポリンの誘導体を使用できる；例えば、米国特許第６，２０７，３９８号を参照されたい。
【０１４９】
Ｄ．ポリアミン
カーゴとして使用できるまた別のタイプの分子は、ポリアミンまたはポリアミンアナログである。ポリアミンは、様々な長さのアルキル鎖によって結合された２つ以上のアミノ基を有する天然型分子である。ポリアミンアナログは、２つ以上のアミノ基を有する非天然型分子であり、このとき１つまたは複数のアルキル鎖は立体配座的に制限されたポリアミンを生成するために、例えば立体配座的に制限されたヒドロカルビル単位などの非天然型成分と置換されている。「立体配座的に制限された」は、ポリアミンアナログでは、分子内の少なくとも２つのアミノ基が相互に対して空間的配置において固定もしくは制限されていることを意味する。分子内のアミノ基は、一級、二級、三級、もしくは四級であってよく、好ましくは一級もしくは二級アミノ基、より好ましくは二級アミノ基である。２つのアミノ基の相対運動は、例えば、それらの間に環状もしくは不飽和成分を組み込むことによって制限できる（三炭素環、四炭素環、五炭素環、六炭素環などの環、または二重もしくは三重炭素結合などの二重もしくは三重結合によって例示されるが、それらに限定されない）。立体障害によって立体配座的柔軟性を制限するが、それでもなお化合物の治療作用にとって好都合である基もまた使用できる。立体配座的に制限されたポリアミンアナログは、相互に対して立体配座的に制限されている少なくとも２つのアミノ基を含むことができる；ポリアミンアナログは、他のアミノ基に対しては立体配座的に制限されていないアミノ基をさらに含むこともできる。立体配座的に制限されたポリアミンアナログには、国際特許出願ＷＯ９８／１７６２４、米国特許第５，８８９，０６１号および米国特許第６，３９２，０９８号に開示された化合物；ＷＯ００／６６５８７および米国特許第６，７９４，５４５号に開示された化合物；ならびに米国特許出願公開第２００３／００７２７１５号、第２００３／０１９５３７７号、および国際特許出願ＷＯ０２／１０１４２、およびＷＯ０３／０５００７２に開示された化合物が含まれるがそれらに限定されない。使用できる他のポリアミンは、飽和長鎖ポリアミン（その文書では「オリゴアミン」と呼ばれている）を開示した、米国特許出願公開第２００３／０１３０３５６号に開示されたポリアミンである。その特許の明細書、特許請求項、表、実施例、図面、およびスキームを含むがそれらに限定されない上記の参考文献に開示されたすべての化合物は、これにより本明細書に参照して明示的に組み込まれる。
【０１５０】
ポリアミン内の様々なアミノ基は、カーゴ分子の−Ｎｕ成分として機能できる。ポリアミン上の単一部位への結合を制限するために、ポリアミン化合物上のアミノ基の差別的保護を使用すると、望ましくない部位での反応を防止することができる。
【０１５１】
本発明において有用なポリアミン化合物の例は、表１に示した。一部の化合物は、例えば塩酸塩などの塩として示されているが、表における開示は、当業者には明確に理解されるように、本明細書に記載した化合物のすべての塩、水和物、および溶媒和物、ならびに本化合物の非塩、非水和物／非溶媒和物形を包含すると理解されたい。表１は、立体配座的に制限されていないポリアミンアナログ（オリゴアミン）および立体配座的に制限されたポリアミンアナログの両方を含んでいる。
【０１５２】
【化６４】
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【０１５３】
【化６５】
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【０１５４】
【化６６】
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【０１５５】
【化６７】
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【０１５６】
【化６８】
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【０１５７】
【化６９】
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【０１５８】
【化７０】
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【０１５９】
【化７１】
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Ｅ．レポーター分子
カーゴとして使用できるまた別のタイプの分子は、レポーター分子である。レポーター分子は、定量もしくは定性分析のために容易に検出できる分子である。レポーター分子の例には、診断薬、イメージング薬、および検出薬として使用できる、放射性分子、蛍光分子（例、ローダミン、クマリン、シアニン、フルオレセイン、キサンテン色素（例、オレゴン州に所在するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の商標であるＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮとして知られている４−（２，７−ジフルオロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−キサンテン−９−イル）ベンゼン−１，３−ジカルボン酸）、ピレン、ランタニドキレート剤）、リン光分子（例、メタロポルフィリン、エオシン、エリスロシン）、重原子（典型的には有機担体へキレート化される）、化学発光分子、生物発光分子（例、ルシフェラーゼによって光線もしくは副産物に変換させると、細胞、組織もしくは動物中で検出されるルシフェリン）、標識アビジンもしくは標識ストレプトアビジンによって認識できるビオチン化分子（標識アビジンもしくは標識ストレプトアビジンが検出される）、標識抗体によって認識できる抗原分子（標識抗体が検出される）、ならびに上述したような金属イオンなどの金属イオンが含まれるがそれらに限定されない。
【０１６０】
他のカーゴ分子と同様に、レポーター分子は、レポーター分子上の求核成分を利用することによってリンカーに結合させることができる。そこで、ルシフェリン：
【０１６１】
【化７２】
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については、ベンゾ［ｂ］チアゾール環上のフェノール酸素を脱プロトン化し（例えば、化合物の塩、例えばカリウム塩を水性塩基中に溶解させることができる）、Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）成分の求核成分−Ｎｕ（−）として使用できる。他の化合物もまた、適切な求核基を介して結合させることができる；例えば、ローダミン１１０は、その芳香族−ＮＨ２基を介して結合させることができる。
【０１６２】
レポーター分子の検出は、当技術分野において知られている様々な手段、例えば、分光法による検出、放射能の検出、電気化学的検出、または酵素アッセイなどによって実施できる。レポーター分子によって生成されるシグナルについての検出閾値は、バックグラウンド雑音の標準偏差を１０％、２５％、５０％、もしくは１００％超える大きさのシグナルレベル、またはシグナルをバックグラウンド雑音から識別できるように合理的レベル、例えば、雑音ではなく信号に起因する約６６％の確率、より好ましくは約９５％の確率、いっそうより好ましくは約９９％の確率を備えるシグナルレベルに設定する必要がある。
放出可能なリンカー
本発明においては、様々な放出可能なリンカーを使用できる。１つの好ましいリンカー系は、構造式：
【０１６３】
【化７３】
2009528292.tif 000057
（式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ８炭化水素、好ましくはＣ１−Ｃ８アルキル、より好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル、いっそうより好ましくは−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり；およびＶは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ２−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ２−、−Ｃ（Ｒ２）２−、もしくは−Ｓ−、好ましくは−Ｏ−であり；およびＲ２は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）によって表される。細胞の内部などの還元環境では、このリンカー系のジスルフィド結合は、その構成成分のチオールへ還元される。
【０１６４】
例示するために、２つの分子Ｃａｒｇ−ＮｕおよびＴｒａｎｓｐがこのリンカー：
【０１６５】
【化７４】
2009528292.tif 000058
によって結合されている場合は、細胞内へのコンジュゲートの輸送は、ジスルフィド結合の還元を生じさせ、生成物：
【０１６６】
【化７５】
2009528292.tif 000059
を産生する。
【０１６７】
Ｃａｒｇ−Ｎｕ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｖ−Ｒ１−ＳＨ生成物の遊離チオールは、今度は分子内で、遊離分子Ｃａｒｇ−Ｎｕ（Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）、Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、Ｍ＋はカチオンの１つの同等物である）、またはＣａｒｇ−ＮｕＨとして）を遊離させるために、カルボニル系の様々な構成成分と反応することができる。Ｒ１基ならびにＶおよびＮｕとして選択された基の性質に依存して、遊離チオールはカルボニル炭素で反応してＣａｒｇ−Ｎｕおよび環状生成物：
【０１６８】
【化７６】
2009528292.tif 000060
を産生することができる。Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である場合、各々５員環もしくは６員環が結果として生じ、分子内環化は相当に容易である。分子内反応の速度を「調整」するために、他の炭化水素基を選択できる。
【０１６９】
または、遊離チオールは、Ｖ原子への炭素αで反応することができる。例えば、−ＣＨ２−基がＶ原子に隣接していて、Ｒ１ＲがＲ１基の残り：
【０１７０】
【化７７】
2009528292.tif 000061
を表す場合は、チオールはＳＮ２型置換反応においてＶ原子に隣接する−ＣＨ２−基を攻撃して、生成物：
【０１７１】
【化７８】
2009528292.tif 000062
を産生することができる。Ｒ１Ｒが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−である場合、各々５員環もしくは６員環が結果として生じ、ＳＮ２機構による分子内環化は相当に容易である。
【０１７２】
生成物：
【０１７３】
【化７９】
2009528292.tif 000063
は、Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）、Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、Ｍ＋はカチオンの１つの同等物である）、もしくはＣａｒｇ−ＮｕＨへ比較的迅速に分解する。例えば、ＮｕおよびＶがどちらもＯである場合、生成物：
【０１７４】
【化８０】
2009528292.tif 000064
は、迅速に脱カルボキシル化して、ＣＯ２の付随的発生を伴ってＣａｒｇ−Ｎｕ（−）、Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋、もしくはＣａｒｇ−ＮｕＨを産生する。
【０１７５】
このリンカーを用いた、カーゴ分子Ｃａｒｇ−ＮｕＨと、トランスポーター分子Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨとのコンジュゲートの合成は、以下の一般スキームを用いて実施できる。
【０１７６】
【化８１】
2009528292.tif 000065
分子ＨＶ−Ｒ１−ＳＨは、各硫黄原子上で優れたチオール離脱基安定剤（ＴＬＧＳ；２つのＴＬＧＳ基は、同一であっても相違していてもよい）と置換されているジスルフィド化合物と反応させると、ＨＶ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−ＴＬＧＳが産生する。チオール離脱基安定剤は、ジスルフィドから置換されたチオール基を安定させるために機能する。各硫黄原子上で優れたチオール離脱基安定剤と置換されるジスルフィド化合物の例は、２，２’−ジピリジルジスルフィド（２，２’−ジチオジピリジン）およびＥｌｌｍａｎ試薬（５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＮＢ）である；そのようなジスルフィド活性化試薬の他の例は、当技術分野において知られている。（Ｖが−Ｓ−である場合は、それはその後にジスルフィドを妨害せずに弱酸によって除去できる、トリチルもしくはｐ−メトキシトリチルなどの保護基を用いて保護される必要があることに留意されたい）。次にＨＶ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−ＴＬＧＳは、式：Ｙ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ２（式中、Ｙ１およびＹ２は、優れた離脱基であり、同一であっても相違していてもよい）の化合物と反応される。これらの化合物の例には、ホスゲン（Ｃｌ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｃｌ）、ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートもしくはカルボニルジイミダゾールが含まれる。これは、式：Ｙ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｖ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−ＴＬＧＳの分子を産生する。この分子は、二重活性化される；Ｙ１基は求核基によって置換でき、他方（−Ｓ−ＴＬＧＳ）基はチオール含有成分によって置換できる。そこで、式：Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）、Ｃａｒｇ−Ｎｕ（−）Ｍ＋（式中、Ｍ＋は、カチオンの１つの同等物である）、またはＣａｒｇ−ＮｕＨとカーゴ分子との反応は、分子Ｃａｒｇ−Ｎｕ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｖ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−ＴＬＧＳを産生する。この中間物と式：Ｔｒａｎｓｐ−ＳＨとの反応は、所望のコンジュゲートであるＣａｒｇ−Ｎｕ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｖ−Ｒ１−Ｓ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｐを形成する。
【０１７７】
また別の合成経路を下記に示したが、これはＣａｒｇ−ＮｕＨ分子を以下：
【０１７８】
【化８２】
2009528292.tif 000066
のように修飾する。この生成物を次に以下の一連の反応：
【０１７９】
【化８３】
2009528292.tif 000067
において使用すると、所望のコンジュゲートが産生する。
【０１８０】
投与様式
本発明の方法において有用な化合物は、本明細書に開示した経路を含むが限定されない任意の経路を介して、患者もしくは被験者（好ましくはヒト患者もしくは被験者）へ投与できる。投与方法には、全身性、経胸膜、静脈内、経口、動脈内、筋肉内、局所、吸入（例、ミストもしくはスプレーとして）、経鼻粘膜、皮下（例、皮下注射）、経皮、腹腔内、眼内、経口腔、および経消化管が含まれるがそれらに限定されない。本明細書に記載した、もしくは本明細書で使用するために参照して組み込まれた化合物は、錠剤、ピル剤、粉末混合物、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、クリーム剤、液剤、坐剤、エマルジョン剤、分散剤、食用プレミックス、およびその他の適切な形態で投与できる。本化合物は、リポソーム製剤で投与することもできる。化合物はプロドラッグとして投与することもできるが、プロドラッグは治療的に有効な形態に被験者の体内で形質変換される。追加の投与方法は、当技術分野において知られている。
【０１８１】
本発明において使用するための化合物は、便宜的には、例えば非毒性医薬有機担体もしくは非毒性医薬無機担体などの医薬上許容される担体と混合される。典型的な医薬上許容される担体には、例えば、マンニトール、尿素、デキストラン、ラクトース、ジャガイモおよびトウモロコシデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、エチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、炭酸カルシウム、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンジル、炭酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カリウム、ケイ酸、および他の常套的に使用される許容できる担体が含まれる。本医薬製剤は、例えば、乳化剤、保存料、もしくは湿潤剤などの非毒性補助物質をさらに含有することもできる。適切な担体は、身体内で、容認し得ない副作用を誘発しないが、化合物が薬理学的活性を保持することを可能にする担体である。経口および非経口薬物送達のための製剤は、当技術分野において知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓに定義されている。追加の製剤は、Ｒｏｗｅ，Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．，Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｓｈｅｓｋｅｙ，ａｎｄ  Ｓｉａｎ  Ｃ．Ｏｗｅｎ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００５；およびＧｉｂｓｏｎ，Ｍａｒｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ，２００１に記載されている。本発明の組成物は、医薬上許容される塩の形態で投与できる；例えば、Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ，Ｐ．ａｎｄ  Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２を参照されたい。例えば錠剤、カプセル剤および散剤などの固体形は、当技術分野においてよく知られている常套の錠剤作製およびカプセル剤充填機械を用いて作製することができる。１回用量形にある経口投与のための錠剤およびカプセル剤を含む固体製剤は、例えば賦形剤；乾燥剤；着色剤；結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガンタガム、もしくはポリビニルピロリドン；充填剤、例えばラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールもしくはグリシン；例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールもしくはシリカなどの錠剤化潤滑剤；錠剤崩壊剤、例えばジャガイモデンプン；またはラウリル硫酸ナトリウムなどの許容できる湿潤剤などの常套の添加物を含む当技術分野において知られる任意の数の追加の非活性成分を含有することができる。錠剤は、標準製薬実践に���いてよく知られている方法にしたがってコーティングすることができる。摂取用の液剤形は、無菌水、無菌食塩水、懸濁液、水中油／油中水エマルジョンなどの水性および非水性担体を含む既知の液体担体を用いて調製することができる。液体製剤は、着色剤、香料、香味料、粘度調整剤、保存料、安定剤などを含む任意の数の追加の非活性成分を含有することができる。非経口投与のためには、本発明において使用するための化合物は、追加の界面活性剤もしくはアジュバントを含めて、もしくは含めずに、水、食塩水、もしくは油などの生理学的に許容される希釈剤もしくは無菌液体担体中の化合物の液剤もしくは懸濁剤の注射製剤として投与できる。担体油の例示的リストは、動物油および植物油（例、落花生油、大豆油）、石油由来油（例、鉱物油）、ならびに合成油を含むであろう。
【０１８２】
１つの実施形態では、本発明の化合物は、医薬単位製剤形に調製される。単位製剤は、治療有効量の本発明の化合物を含有している。
【０１８３】
注射用単位製剤のためには、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液などの無菌液体は、好ましい液体担体である。
【０１８４】
選択した医薬単位製剤を作製して投与すると、血液中、または対象組織中のいずれかで薬物の規定最終濃度を提供することができる。本発明の化合物の最適有効濃度は、経験的に決定することができ、疾患のタイプおよび重症度、投与経路、疾患の進行および健康状態、患者の質量および体面積に依存するであろう。そのような決定は、当業者の技術の範囲内に含まれる。全身性投与（経口または非経口を含む）のために使用できる用量の例には、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約１０μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲内の量が含まれるがそれらに限定されない。体表面積（平方メートル、もしくはｍ２と表示する）に基づいた全身性投与（経口または非経口を含む）のために使用できる用量の例には、約０．１μｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約１０μｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約１００μｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約１ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約１０ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約１０ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約１０ｍｇ／ｍ２〜約１２０ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約４０ｍｇ／ｍ２〜約１２０ｍｇ／ｍ２（体表面積）、または約６０ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２（体表面積）の用量範囲内の有効量が含まれるがそれらに限定されない。これらの用量は、１日１回投与で投与されてよく、または総１日量を１日２、３もしくは４回の分割用量で投与することができる。用量は、例えば週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、約週１回、約２週に１回、約３週に１回、約４週に１回、約６週に１回、約２カ月に１回、約３カ月に１回、約４カ月に１回、または約６カ月に１回のように、１日１回より少ない回数で投与することもできる。
【０１８５】
本発明の１つの実施形態では、用量は徐放性製剤で、または例えば長期間にわたって本発明において使用するための化合物を徐々に放出し、そして薬物を例えば１カ月に１回、約２〜６カ月に１回、約１年に１回、または繰り返す必要のない単回投与さえなどのより少ない回数で投与することを可能にするインプラントなどの徐放性インプラントで投与することができる。徐放性のインプラント、デバイスもしくは製剤（ペレット剤、ミクロスフェア剤など）は、局所適用、注射によって投与でき、または様々な場所に手術によって埋植することができる。
【０１８６】
本発明の別の実施形態では、本発明のコンジュゲートおよび化合物は、局所投与によって投与することもできる。用語「局所投与」は、局所作用を達成するための活性物質の皮膚もしくは粘膜への適用を意味する常套の意味で使用される。本方法において使用するためのコンジュゲートおよび化合物は、治療有効濃度で局所製剤に含有されている。製剤は、例えば、約１ｍＭ〜約１，０００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約１００ｍＭなどの任意の適切な総濃度で適切な局所用ビヒクル中に選択された化合物を含有することができる。
【０１８７】
適切な濃度のコンジュゲートもしくは化合物は、製剤中のビヒクルおよび他の成分の密度に依存して変動してよい重量／容量％または重量／重量％で表示することもできる。例えば、コンジュゲートもしくは化合物は、少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％のいずれかの濃度（重量／容量）で製剤中に存在してよい。局所使用のための実施形態では、本コンジュゲートもしくは化合物の濃度は、皮膚の５ｃｍ×５ｃｍの面積（２５ｃｍ２）への製剤の約０．５ｇの局所用量を適用できるような濃度である。典型的な局所的賦形剤中では、組成物は容易に調製され、皮膚に適用された場合に任意の有意な視認できる残留物を残さない。例えば飽和ペーストもしくは他の形態などのより高濃度の製剤もまた、特に視認できる外観が限定的な検討事項ではない場合は（治療適用におけるように）、成功裏に使用できる。
【０１８８】
ルーチンの臨床的評価を使用すると、本発明のコンジュゲートもしくは化合物の濃度を容易に最適化し、所与の製剤もしくは障害のためにより低濃度もしくはより高濃度が適切かどうかを確認することができる。例えば、局所使用のための実施形態では、濃度は、典型的には使用者が局所投与する製剤の量を生じさせるように調整できるが、これは局所用ビヒクルの物理的性質の程度（例、液体スプレービヒクルに比較したローション剤）に依存するであろう。同様に、必要とされる化合物の量は、製剤が浸透強化成分もしくは角質層に化合物が浸透する能力を増加させる他の物質を含有するような場合には、減少させることができる。
【０１８９】
本製剤は、適切な量の選択されたコンジュゲートもしくは化合物を適切なｐＨで選択された製剤ビヒクル内に混合する工程によって調製される。好ましくは、選択されたコンジュゲートもしくは化合物は、所望の物理的適用特性を有する一貫性のある製剤を許容するために製剤ビヒクル内では十分に可溶性である。
【０１９０】
局所適用のためには、本発明の製剤とともに使用するために適合する局所用ビヒクルは、化粧品および医薬品分野においてよく知られており、水などのビヒクル（もしくはビヒクル成分）；アルコール（詳細にはエタノールなどの皮膚から容易に蒸発できる低級アルコール）、グリコール（グリセリンなど）、脂肪族アルコール（ラノリンなど）などの有機溶媒；水と有機溶媒（水およびアルコールなど）との混合物；アルコールおよびグリセリン（任意でさらに水を含む）などの有機溶媒の混合物；脂肪酸、アシルグリセロール（鉱油などの油、および天然もしくは合成起源の脂肪を含む）、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質およびろうなどの脂質をベースとする材料；コラーゲンおよびゼラチンなどのタンパク質をベースとする材料；シクロメチコン、デメチコノールおよびジメチコンコポリオール（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社）などのシリコーンをベースとする材料（非揮発性および揮発性の両方）；ペトロラタムおよびスクアランなどの炭化水素をベースとする材料；アニオン性、カチオン性および両性界面活性剤および石けん；マイクロスポンジおよびポリマーマトリックスなどの徐放性ビヒクル；安定剤および懸濁剤；そして局所投与のために適合する他のビヒクルおよびビヒクル成分、ならびに上記に同定した、または当技術分野において知られている局所用ビヒクル成分の混合物が含まれる。ビヒクルは、保存料、酸化防止剤、皮膚浸透増強剤、徐放性材料などの適用される製剤の安定性もしくは有効性を改善するために適する成分をさらに含むことができる。そのようなビヒクルおよびビヒクル成分の例は、当技術分野においてよく知られており、本明細書で言及した薬物製剤刊行物に記載されている。
【０１９１】
本発明において使用するための化合物は、単独有効成分として投与でき、または他の有効成分と組み合わせて投与できる。
【０１９２】
キット
本発明は、本発明の化合物を含有する製造品およびキットもまた提供する。製造品は、ラベルを備える容器を含んでいる。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスもしくはプラスチックなどの様々な材料から形成されてよい。容器は、疾患もしくは適応症を治療または予防するために有効である活性物質を有する組成物を保持する。容器上のラベルは、本組成物が疾患もしくは適応症を治療または予防するために使用されることを示しており、使用法もまた示すことができる。
【０１９３】
本発明は、本発明の任意の１つまたは複数の化合物を含むキットをさらに提供する。一部の実施形態では、本発明のキットは、上述した容器を含んでいる。他の実施形態では、本発明のキットは、上述した容器および緩衝剤を含む第２の容器を含んでいる。本キットは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載した任意の方法を実施するための説明書を備える添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
【０１９４】
他の態様では、本キットは、例えば疾患もしくは適応症を有する患者もしくは被験者を治療するため、または疾患もしくは適応症を発生するリスク状態にある患者もしくは被験者に予防投与するためを含む、本明細書に記載した任意の方法のために使用できる。本キットは、本明細書に記載した任意の方法を実行するための説明書を含むことができる。
【０１９５】
コンジュゲートの使用
本コンジュゲートは、米国特許第６，３０６，９９３号、第６，４９５，６６３号、第６，５９３，２９２号、第６，６６９，９５１号、第６，７３０，２９３号および第６，７５９，３８７号に記載されたものを含む様々な治療用途において使用できる；それらの出願において開示された疾患および治療用途は、これにより参照して全体として組み込まれる。これらの治療用途の一部を記載するために、本発明のコンジュゲートは、特に、皮膚を越えて生物活性剤および診断薬を送達するために有用である。本コンジュゲートは、角質層と一緒に表皮を作り上げる顆粒層、透明層および胚芽層から構成される様々な上皮内に侵入できる。本発明の一部の実施形態における送達は、表皮を通して真皮乳頭層および真皮網状層の一方もしくは両方を含む皮膚内に行われる。皮膚の１つもしくは複数の層への浸透を入手するこの能力は、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、ビタミン剤、鎮痛薬、ホルモン剤などの化合物の有効性を大きく増強することができる。多数のそのような化合物は当業者にはよく知られている（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６を参照されたい）。一部の実施形態では、本作用物質は、上皮組織中に存在する血管内に送達されるので、したがって本作用物質を全身性で送達するための手段を提供する。送達は、濾胞内もしくは濾胞間のいずれか、または両方であってよい。本コンジュゲートを送達するためには、皮膚の前処置は必要とされない。他の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、化粧品および皮膚の状態を治療できる作用物質を送達するために有用である。対象である皮膚内の標的細胞には、例えば、線維芽細胞、上皮細胞および免疫細胞が含まれる。例えば、トランスポーターは、抗炎症薬などの化合物を皮膚内で見いだされる免疫細胞へ送達する能力を提供する。
【０１９６】
特にグルココルチコイド（アドレノコルチコイド系ステロイド）は、本発明のコンジュゲートによって増強できる、皮膚を越える送達のための化合物である。本発明の結合グルココルチコイドは、例えば、炎症性皮膚疾患を治療するために有用である。例示的なグルココルチコイドには、例えば、ヒドロコルチゾン、プレニゾン（Ｄｅｌｔａｚｏｎｅ）およびプレドニゾロン（Ｈｙｄｅｌｔａｓｏｌ）が含まれる。特定の状態の例には、湿疹（アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎）、水疱性疾患、膠原血管疾患、サルコイドーシス、スウィート病、壊疽性膿皮症、Ｉ型反応性ハンセン病、毛細管血管腫、扁平苔癬、剥奪性皮膚炎、結節性紅斑、ホルモン異常（アクネおよび多毛症を含む）、ならびに中毒性表皮壊死症、多形性紅斑、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、円板状エリテマトーデスなどが含まれる。
【０１９７】
レチノイドは、そのために皮膚の１つまたは複数の層または他の上皮もしくは内皮組織を越えて皮内への送達を増強するために、本発明のコンジュゲートを使用できる生物活性剤の別の例である。現在使用されているレチノイドには、例えば、レチノール、トレチノイン、イソトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、およびアロチノイドが含まれる。本発明のコンジュゲートに結合させたレチノイドを使用して治療可能な状態には、アクネ、角質化障害、皮膚癌、前癌状態、乾癬、皮膚老化、円板状エリテマトーデス、硬化性粘液水腫、疣状表皮母斑、角層下膿疱性皮膚炎、Ｒｅｉｔｅｒ（ライター）症候群、疣、扁平苔癬、黒色表皮腫、サルコイドーシス、Ｇｒｏｖｅｒ（グロヴァー）病、汗孔角化症などが含まれるがそれらに限定されない。
【０１９８】
細胞毒性薬および免疫抑制薬は、そのために本発明のコンジュゲートが有用である追加のクラスの薬物を構成する。これらの作用物質は、一般に乾癬などの過剰増殖性疾患を治療するため、ならびに水疱症および白血球破砕性血管炎などの免疫疾患を治療するために使用される。本発明のコンジュゲートへ結合させることのできるそのような化合物の例には、代謝拮抗薬およびアルキル化剤が含まれるがそれらに限定されない。有用な生物学的作用物質には、例えば、メトトレキセート、アザチオプリン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、６−チオグアニン、ミコフェノレート、クロラムブシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ダクチノマイシン、シクロホスファミド、塩酸メクロエタミン、カルムスチン、Ｔａｘｏｌ、タクロリムス、ビンブラスチン、ダプソン、およびスルファサラジンが含まれる。シクロスポリンおよび例えばＦＫ５０６（タクロリムス）などのアスコマイシン、ならびにラパマイシン（例、米国特許第５，９１２，２５３号）およびそのような化合物のアナログなどの免疫抑制薬は、特に重要である（例、Ｍｏｌｌｉｎｓｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ  ４（５）：３６７−３８０（１９９８）；米国特許第５，６１２，３５０号；第５，５９９，９２７号；第５，６０４，２９４号；第５，９９０，１３１号；第５，５６１，１４０号；第５，８５９，０３１号；第５，９２５，６４９号；第５，９９４，２９９号；第６，００４，９７３号および第５，５０８，３９７号）。シクロスポリンには、シクロスポリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＭが含まれる。例えば、米国特許第６，００７，８４０号および第６，００４，９７３号を参照されたい。例えば、そのような化合物は、乾癬、湿疹（アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎を含む）および円形脱毛症を治療する際に有用である。全身性投与もまた企図されている。
【０１９９】
本発明のコンジュゲートは、エリテマトーデス（円板状および全身性の両方）、皮膚筋炎、晩発性皮膚ポルフィリン症および多形性光線疹などの状態を治療するために有用な作用物質に結合することができる。そのような状態を治療するために有用な作用物質には、例えば、キニン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、およびキナクリンが含まれる。
【０２００】
本発明のコンジュゲートは、抗感染剤の経皮送達のためにも使用できる。例えば、抗菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤は、本発明のコンジュゲートと結合することができる。抗菌剤は、例えばアクネ、皮膚感染症などの状態を治療するために有用である。抗真菌剤は、体部白癬、足部白癬、爪真菌症、カンジダ症、癜風などを治療するために使用できる。本コンジュゲートの送達増強特性のために、これらのコンジュゲートは、局所性感染症および広汎性感染症の両方を治療するために有用である。抗真菌剤は、爪真菌症を治療するためにも有用である。抗真菌剤の例には、イトラコナゾール、ミコナゾールおよびフルコナゾールなどのアゾール系抗真菌剤が含まれるがそれらに限定されない。抗ウイルス剤の例には、アシクロビル、ファムシクロビル、およびバラシクロビルが含まれるがそれらに限定されない。そのような作用物質は、ウイルス疾患、例えばヘルペスを治療するために有用である。
【０２０１】
そのために本発明のコンジュゲートへの結合による送達の増強が望ましい生物活性剤の別の例は、抗ヒスタミン剤である。これらの作用物質は、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬、および他の多くに起因する掻痒などの状態を治療するために有用である。そのような試薬の例には、例えば、テルフェナジン、アステミゾール、ロロタミジン、セチリジン、アクリバスチン、テメラスチン、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ニザチジンなどが含まれる。三環系抗うつ薬もまた、本発明のコンジュゲートを用いて送達することもできる。
【０２０２】
局所的抗乾癬剤もまた対象となる。コルチコステロイド、カルシポトリエン、およびアントラリンなどの作用物質は、本発明のコンジュゲートに結合させて皮膚に適用することができる。
【０２０３】
本発明のコンジュゲートは、１つまたは複数の層および他の上皮組織を越えてその中への光化学治療薬の送達を増強するためにもまた有用である。そのような化合物には、例えば、ソラレンなどが含まれる。日焼け止め成分もまた重要である；これらには、ｐ−アミノ安息香酸エステル、桂皮酸塩およびサリチル酸塩、ならびにベンゾフェノン、アントラニル酸塩、およびアボベンゾンが含まれる。
【０２０４】
鎮痛剤および局所麻酔剤は、そのために本発明のコンジュゲートが治療を増強する別のクラスの化合物を構成する。リドカイン、ブピバカイン、ノボカイン、プロカイン、テトラカイン、ベンゾカイン、コカイン、およびオピエートは、本発明のコンジュゲートへ結合できる化合物である。
【０２０５】
他の対象とする生物活性剤には、例えば、ミノキシジル、角質溶解剤、例えばポドフィルムなどの神経破壊薬、ヒドロキノン、カプサイシン、マソプロコール、コルヒチン、および金が含まれる。
【０２０６】
本発明のコンジュゲートは、消化管投与による結合薬剤の送達のためにも有用である。消化管投与は、全身性の活性薬剤、および消化器上皮内で作用する薬剤のどちらにも使用できる。本発明のコンジュゲートに結合させた適切な試薬を用いて治療できる消化器の状態は、特にＣｒｏｈｎ（クローン）病（例、シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、潰瘍性大腸炎、消化管潰瘍、消化性潰瘍疾患、塩および水分吸収の不均衡（便秘、下痢、もしくは栄養不良を導くことがある）、異常増殖性疾患などである。潰瘍の治療には、例えば、Ｈ２ヒスタミン阻害剤（例、シメチジンおよびラニチジン）およびプロトン−カリウムＡＴＰａｓｅの阻害剤（例、ランソプラゾールおよびオメプラゾール）などの胃酸分泌を減少させる薬剤、ならびにヘリコバクターピロリを標的とする抗生物質が含まれる。
【０２０７】
特に本発明のコンジュゲートに結合させた場合に有用である抗生物質は、特別には赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびエルシニア菌などの侵襲性細菌に作用する抗生物質である。そのような化合物には、例えば、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾールなどが含まれる。
【０２０８】
抗腫瘍薬もまた本発明のコンジュゲートに結合させ、消化器経路によって投与することができる。これらには、例えば、シスプラチン、メトトレキセート、Ｔａｘｏｌ、フルオロウラシル、メルカプトプリン、ドノルビシン、ブレオマイシンなどが含まれる。本発明のコンジュゲートは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、皮膚癌、消化器癌、血液悪性腫瘍、および眼癌を含む癌を治療するために使用できる。それらは、例えば、皮膚上の良性腫瘍などの制御不能な細胞増殖を治療するためにもまた使用できる。
【０２０９】
本発明のコンジュゲートは、呼吸路を通しての薬物の投与を増強するためにもまた使用できる。鼻粘膜、下喉頭、ならびに中枢および末梢気道構造を含む呼吸路は、薬物吸収のための大きな粘膜表面を提供する。本発明のコンジュゲートによって提供される上皮組織の１つまたは複数の層を越えてその中への結合作用物質の増強した浸透は、呼吸路送達が他の送達方法に比して優れた長所の拡大を生じさせる。例えば、所望の作用を入手するために必要とされる作用物質はより低用量となることが多く、局所的治療作用はより迅速に発生することができ、そして作用物質の全身性治療血中レベルは迅速に入手される。薬理学的活性の迅速な発生は、呼吸路投与の結果として生じる可能性がある。さらに、呼吸路投与は、一般には生じる副作用が比較的少ない。
【０２１０】
本発明のトランスポーターは、肺の状態を治療するために有用である生物学的作用物質を送達するために使用できる。鼻腔投与によって治療できる状態の例には、例えば、喘息が含まれる。これらの化合物には、例えば、コルチコステロイド、クロモリン、およびネドクロミルなどの抗炎症薬、例えばβ−２−選択的アドレナリン作用薬およびテオフィリンなどの気管支拡張剤、ならびに免疫抑制剤（例、シクロスポリンおよびＦＫ５０６）が含まれる。他の状態には、例えば、アレルギー性鼻炎（糖質コルチコイドを用いて治療できる）、および慢性閉塞性肺疾患（肺気腫）が含まれる。肺組織に作用することができ、本発明のトランスポーターを用いて送達できる他の薬剤には、β−アゴニスト、マスト細胞安定剤、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤、界面活性剤、血管作用剤、鎮静剤およびホルモン剤が含まれる。
【０２１１】
呼吸路投与は、肺の状態の治療のためにだけではなく、循環系を介して遠隔標的器官へ薬物を送達するためにもまた有用である。広範囲のそのような薬剤および診断薬は、本発明のコンジュゲートに結合させた後に呼吸路を通して投与することができる。
【０２１２】
本発明のコンジュゲートは、血液脳関門を越えて生物活性剤および診断薬を送達するためにもまた有用である。これらの作用物質は、虚血症を治療するために（例えば、抗アポトーシス薬を使用する）、ならびに神経伝達物資および例えば統合失調症、パーキンソン病、疼痛などの様々な状態を治療するための他の作用物質（例、モルヒネおよびオピエート）を送達するために有用である。５−ヒドロキシトリプタミン受容体拮抗薬は、偏頭痛および不安などの状態を治療するために有用である。
【０２１３】
本発明のコンジュゲートは、上皮および／または内皮組織の１つまたは複数の層を越えてその中への診断用イメージング剤および造影剤を送達するためにもまた有用である。診断薬の例には、例えば９９ｍＴｃグルコヘプトネートなどの放射能で標識された物質、またはガドリニウムドープキレート剤（例、Ｇｄ−ＤＴＰＡ）などの磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）手技に使用される物質が含まれる。他の診断薬の例には、細胞中で発現すると容易に検出可能なタンパク質（β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含むがそれらに限定されない）をコードするマーカー遺伝子が含まれる。例えば放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド（特別にはハプテン）などの広範囲の標識を使用できる。
【０２１４】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために提供されるものであり、決して本発明を限定することは企図されていない。
【実施例】
【０２１５】
他に特に言及しない限り、すべての試薬および溶媒は、市販の供給源から入手し、精製せずに使用した。分析的ＴＬＣは、蛍光指示薬を含む０．２５ｍｍ径のシリカゲル６０Ｆプレートを用いて実施した（２５４ｎｍ）。プレートは、紫外光線およびモリブデン酸アンモニウム染色（９０ｇのモリブデン酸アンモニウム、６ｇの硫酸セリウム、および１，８００ｍＬの１０％のＨ２ＳＯ４を結合することによって調製した）、または過マンガン酸カリウム染色（８ｇのＫＭｎＯ４、６０ｇのＫ２ＣＯ３、１６ｍＬの５％のＮａＯＨ、および９００ｍＬのＨ２Ｏを結合することによって調製した）のいずれかを用いた処理によって視認した。逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、分取用カラム（Ａｌｌｔｅｃ  Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８、２５０×２２ｍｍ）を用いるＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ２１０／２１５  ＨＰＬＣを使用して、または分析用カラム（Ｖｙｄａｋ  Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００分析用ＨＰＬＣ上で実施した。生成物は、溶媒勾配（溶媒Ａ＝０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；溶媒Ｂ＝０．１％のＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を利用して溶出した。ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ５００（１Ｈ  ＮＭＲは５００ＭＨｚで；１３Ｃ  ＮＭＲは１２５ＭＨｚで）またはＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ４００（１Ｈ  ＮＭＲは４００ＭＨｚで；１３Ｃ  ＮＭＲは１００ＭＨｚで）磁気共鳴分光計上で測定した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータは以下のように報告されている：化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、およびｍ＝多重線）、積分、ならびにカップリング定数（Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについてのデータは、残留溶媒ピークに比した化学シフトによって報告されている（ＣＤＣｌ３＝７７．３ｐｐｍおよびＣＤ３ＯＤ＝４９．１ｐｐｍ）。赤外線スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  １６００のＦＴＩＲシリーズ上で記録した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、サンフランシスコに所在するカリフォルニア州立大学のＮＩＨ地域質量分析検査施設で記録した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳ−ＭＳ）は、スタンフォード大学の質量分析研究所でＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ四重極イオントラップ質量分析計上で記録した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ質量分析計で記録した。
【０２１６】
実施例１
一連の化合物２の合成
【０２１７】
【化８４】
2009528292.tif 000068
図１Ａに示した化合物２ａの合成は、以下のとおりに実施した。攪拌棒を装備した、オーブンで乾燥させた三ツ口フラスコに室温の窒素下で２０ｍＬの排気メタノール中の２’−アルドリチオール（４．７１ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合液に、２−メルカプトエタノール（５００μＬ、７．１０ｍｍｏｌ）を滴下した。溶液は黄色に変色し、２時間攪拌し続けた。次に溶媒を真空下で除去し、２０％酢酸エチルおよび塩化メチレンを用いてフラッシュクロマトグラフィを実施した。生成物は黄色油（１．３２０ｇ、７．０６ｍｍｏｌ、収率９７％）であり、ＴＬＣによると均質であった（１スポット）。Ｒｆ＝０．４７（５％のＥｔＯＡｃ、ＤＣＭ）。
【０２１８】
【化８５−１】
2009528292.tif 000069
ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋］Ｃ７Ｈ９ＮＯＳ２の計算値：１８７．０１２６；実測値：１８７．０１２３。
【０２１９】
【化８５−２】
2009528292.tif 000070
図１Ａに示した化合物２ｂは、３−メルカプト−プロパノールを用いて開始して、２ａについて上述したように合成すると、収率９１％で得られた。
【０２２０】
【化８６−１】
2009528292.tif 000071
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋］Ｃ８Ｈ１１ＮＯＳ２についての計算値：２０１．０２８２；実測値２０１．０２７５。
【０２２１】
【化８６−２】
2009528292.tif 000072
図１Ａに示した化合物２ｃは、３−メルカプト−ブタールを用いて開始して、２ａについて上述したように合成すると、収率８２％で得られた。
【０２２２】
【化８７】
2009528292.tif 000073
ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋］Ｃ９Ｈ１３ＮＯＳ２の計算値：２１５．０４３９；実測値：２１５．０４３３。
【０２２３】
実施例２
一連の化合物４の合成
【０２２４】
【化８８】
2009528292.tif 000074
図１Ａに示した化合物４ａの合成は、以下のとおりに実施した。攪拌棒およびＴｅｆｌｏｎ製キャップを装備した、オーブン乾燥したフラスコに、塩化メチレン（３ｍＬ）中の２ａ（４４．０ｍｇ、０．２３５ｍｍｏｌ）、トリホスゲン（２５．０ｍｇ、０．０８４２ｍｍｏｌ）、およびピリジン（１８．０μＬ、０．２２２ｍｍｏｌ）を室温で加えた。溶液は透明のままであった。これを３０分間攪拌し続け、次に溶媒を真空下で蒸発させると、白色泡状固体が得られた。これに食塩水および氷中で冷却しておいた水（３ｍＬ）中のルシフェリン（３０．０ｍｇ、９４．３μｍｏｌ）およびＮａＯＨ（５４７μＬの０．５Ｍ、０．２７３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液は濁った白色、紫色、次に濁った黄色に変色した。反応液を４℃で４時間攪拌し、１％のＴＦＡおよび水（１５ｍＬ）を用いてクエンチし、塩化メチレンを用いて３回抽出した。溶媒を真空下で蒸発させ、化合物は２０％酢酸エチル、１％酢酸、および塩化メチレンを用いるフラッシュクロマトグラフィによって精製した。適切なフラクションを単離し、次にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。適切なフラクションを凍結乾燥させると黄色固体（２７ｍｇ、５４．５μｍｏｌ、５８％）が得られたが、これはＴＬＣによると均質（１スポット）であった。Ｒｆ＝０．４（２０％のＥｔＯＡｃ、１％酢酸、ＤＣＭ）。
【０２２５】
【化８９−１】
2009528292.tif 000075
［Ｍ＋１］Ｃ１９Ｈ１６Ｎ３Ｏ５Ｓ４についての計算値：４９３．９；（Ｈ＋）実測値：４９３．９。
【０２２６】
【化８９−２】
2009528292.tif 000076
図１Ａに示した化合物４ｂは、２ｂを用いて開始して、４ａについて上述したように合成し、収率４７％で得られた。分析的ＨＰＬＣによると＞９９％の純度であった。
【０２２７】
【化９０−１】
2009528292.tif 000077
【０２２８】
【化９０−２】
2009528292.tif 000078
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ２０Ｈ１８Ｎ３Ｏ５Ｓ４についての計算値：５０８．００；実測値：５０８．０６。
【０２２９】
【化９１】
2009528292.tif 000079
化合物４ｃは、２ｃで始めて４ａについて上述したように合成すると、収率６７％で得られた。生成物は、ＴＬＣによると均質であった（１スポット）。Ｒｆ＝０．５６（２０％のＥｔＯＡｃ、１％酢酸、ＤＣＭ）。
【０２３０】
【化９２】
2009528292.tif 000080
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ２１Ｈ２０Ｎ３Ｏ５Ｓ４についての計算値：５２２．０２；実測値：５２２．０。
【０２３１】
上記の反応は、以下の構造式を参照して、クロロホルメート中間物である（１−クロロホルミルオキシ）エチル２−ピリジニルジスルフィド（３ａ、ｎ＝１）、（１−クロロホルミルオキシ）プロピル２−ピリジニルジスルフィド（３ｂ、ｎ＝２）、および（１−クロロホルミルオキシ）ブチル２−ピリジニルジスルフィド（３ｃ、ｎ＝３）を通して進行する。
【０２３２】
【化９３】
2009528292.tif 000081
実施例３
一連の化合物５の合成
図１Ｂに示したコンジュゲート５ａは、以下のとおりに合成した。攪拌棒を装備した、オーブン乾燥した試験管に窒素下で、排気した１：１のアセトニトリルおよび水（２ｍＬ）中のＡｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−（Ｄ−Ａｒｇ）８−ＣＯＮＨ２−８ＴＦＡ（２０ｍｇ、８．６１μｍｏｌ）を加えた。これに０．５ｍＬのアセトニトリルおよびＤＭＳＯ中の４ａ（７．１０ｍｇ、１４．４μｍｏｌ）を加えた。反応液を１６時間にわたり攪拌し続け、次にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。適切なフラクションを凍結乾燥させると白色固体（１５ｍｇ、５．５４μｍｏｌ、６４％）が得られ、これは分析的ＨＰＬＣによると＞９９％の純度であった。
【０２３３】
【化９４】
2009528292.tif 000082
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋３］Ｃ６７Ｈ１１９Ｎ３６Ｏ１５Ｓ４についての計算値：１７９５．８；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１７９５．８。
【０２３４】
図１Ｂに示したコンジュゲート５ｂは、化合物４ｂおよびＡｃ−Ｄ−ＣｙＳ−（Ｄ−Ａｒｇ）８−ＣＯＮＨ２を用いて始めて、５ａについて上述したように合成すると、収率６６％で得られた。分析的ＨＰＬＣによると＞９９％の純度であった。
【０２３５】
【化９５】
2009528292.tif 000083
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ６８Ｈ１１９Ｎ３６Ｏ１５Ｓ４についての計算値：１８０７．８５；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１８０７．８４。
【０２３６】
図１Ｂに示したコンジュゲート５ｃは、化合物４ｃおよびＡｃ−Ｄ−ＣｙＳ−（Ｄ−Ａｒｇ）８−ＣＯＮＨ２を用いて始めて、５ａについて上述したように合成すると、収率２４％で得られた。分析的ＨＰＬＣによると＞９９％の純度であった。
【０２３７】
【化９６】
2009528292.tif 000084
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２］Ｃ６９Ｈ１２２Ｎ３６Ｏ１５Ｓ４についての計算値：１８２２．８６；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１８２２．０５（Ｍ＋１）。
【０２３８】
実施例４
コンジュゲート５ａ、５ｂ、および５ｃ由来および分解によるルシフェリンの遊離を測定するアッセイ
コンジュゲートの安定性は、分析的ＨＰＬＣを用いて３７℃でＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ、ｐＨ７．４）中でインキュベートした場合にそれらの分解を測定することによってアッセイした。コンジュゲート５ａ、５ｂ、および５ｃ（０．２ｍｇ）の各々は、内標準物質として機能した、２４ｍＬのメタノール中の１０ｍｇの１−ナフタレンメタノールの１０μＬの溶液を含有する１．５ｍＬ微量遠心管チューブ中の２５０μＬのＨＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶解させ、３７℃でインキュベートした。適切な時点に、２０μＬの溶液を除去し、逆相ＨＰＬＣによって分析した。分解率はコンジュゲート、内標準物質、および様々な分解生成物の統合ピーク面積から計算した。
【０２３９】
コンジュゲートの半減期は、カーボネート５ａについての３時間からカーボネート５ｂについての１１時間、カーボネート５ｃについての３３時間までの範囲内で統計的有意に相違した。分解産物は、カーボネートの緩徐な加水分解から予想されるように、ルシフェリン、アルコール７、およびＣＯ２であった（図１Ｃ）。安定性を増加させるパターンは、カルボニル基と近接硫黄原子との間の距離増加と相関しており、これは加水分解工程において後者が果たす役割を示唆している。
【０２４０】
実施例５
コンジュゲートからの作用物質の遊離を決定するための無細胞アッセイ
還元環境におけるコンジュゲート５ｂおよび５ｃからのルシフェリンの相対遊離率は、様々な濃度のコンジュゲートをホタルルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ワイオミング州マディソン）とともにインキュベートし、照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｉｎｕｓ型）を用いて結果として生じる発光を時間の関数として測定することによって測定した。ルシフェリンによって生成される光量を測定する標準曲線は、５０μＬの５ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中の様々な濃度（２０〜２，０００ｎＭ）のルシフェリンのカリウム塩（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社、カリフォルニア州アラメダ）を１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの同一緩衝剤中の１００ｎｇのホタルルシフェラーゼに加えることによって生成した。生成した光は、本試験で使用した濃度範囲内では線形であることが見いだされた（図２Ｂを参照されたい）。
【０２４１】
還元環境内でのコンジュゲートからのルシフェリンの相対遊離比率を決定するために、５ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中のカーボネート５ｂおよび５ｃの５０μＬの５０μＭ溶液は、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの同一緩衝剤中の１００ｎｇのホタルルシフェラーゼに加え、結果として生じた光線を測定した。生成された光には有意差が見られ、カーボネート５ｃはカーボネート５ｂによって生成された光のおよそ１２％しか生成しなかった（図３Ａ）。酵素の添加前２０分間に１ｍＭのＤＴＴを用いたプレインキュベーションによって確立されたように、各コンジュゲートから等モル量のルシフェリンが遊離した。これらの条件下では、発光のプロフィールは、精製ルシフェリンを用いて見られるプロフィールに類似であり（図２Ａ）、両方のコンジュゲートについて等量の光が観察された。（図３Ｂ）。この相違について考えられる１つの説明は、５ｃの中間体の半減期は５ｂの半減期よりはるかに長く、このためルシフェラーゼの結合部位について遊離ルシフェリンと競合することを可能にしたというものである。この仮説は、同様にフェノールでアルキル化されたルシフェリンの６−Ｏメチルエーテルは、ルシフェラーゼの知られている阻害剤であるという事実によって支持されている（Ｄｅｎｂｕｒｇら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３４：３８１（１９６９））。
【０２４２】
実施例６
コンジュゲートからのルシフェリン遊離についての細胞アッセイ
細胞培養中の取り込みおよび遊離を試験するために、様々な濃度のルシフェリン、５ｂ、および５ｃを、遺伝子ＰＣ３Ｍ−ｌｕｃをコードするルシフェラーゼによって安定にトランスフェクトされた前立腺癌細胞系を用いて個別にインキュベートした。ＰＣ３Ｍ−ｌｕｃ前立腺腫瘍細胞系（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２０：７３３（２００３））は、アッセイ前に１２時間にわたり９６ウエルの平底プレート内で１ウエルに付き細胞６０，０００個でプレーティングした。細胞は、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）（ｐＨ７．４）もしくはＫ＋ＨＢＳ（全ナトリウム塩が等モル量のカリウム塩と置換されたＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）のいずれか中の様々な濃度のルシフェリンのカリウム塩（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社、カリフォルニア州アラメダ）もしくはカーボネート５ｂもしくは５ｃのいずれかと一緒に３回ずつ１分間にわたりインキュベートした。細胞は、細胞外ルシフェリンもしくはコンジュゲートを除去するために洗浄し、適切な緩衝剤を用いて再懸濁させ、結果として生じた発光は電荷結合素子カメラおよびＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（ＩＶＩＳ２００、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社、カリフォルニア州アラメダ）（Ｃａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：２２１（２００４）を参照されたい）を用いて測定した。
【０２４３】
遊離ルシフェリンの細胞内遊離および細胞内ルシフェラーゼによるその代謝回転の尺度である、５ｂを用いてパルスされた細胞からの発光シグナルは、最初の数秒間はわずかに増加したが、徐々に減衰し、およそ１，０００秒後にはバックグラウンド値に達した（図４Ａ）。５ｃを用いて処置した細胞は、より少ない初期光、より緩徐な減衰率を備える相違する曲線を生成し、５ｂについて見られるものに比較して生成される全光子の３分の２に過ぎなかった（図４Ｂ）。観察された発光がルシフェリンの細胞内遊離およびルシフェラーゼとの反応に起因するが、コンジュゲートの細胞外加水分解およびルシフェリン取り込みには起因しないことを証明するために、本実験は、膜電位を除去し、それによりアルギニンリッチトランスポーターの取り込みを排除するが、遊離ルシフェリンの取り込みは排除しないための知られている条件である、全ナトリウム塩が等モル量のカリウム塩（Ｋ＋ＨＢＳ）と置換されたＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中で繰り返した（Ｒｏｔｈｂａｒｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：９５０６（２００４））。これらの条件下で、本コンジュゲートからの発光（およびこのため取り込みおよび遊離）は、＞＞９０％減少したが（図４Ａ、図４Ｂ）、他方ルシフェリン自体からの発光はわずかに増加した（図４Ｂ）。結果として、大部分の光線は、細胞内へのコンジュゲート取り込みおよびその結果としてのルシフェリンの遊離から発生する。
【０２４４】
実施例７
コンジュゲートからのルシフェリン遊離についてのマウスアッセイ
ホタルルシフェラーゼ（ＦＶＢ−ｌｕｃ＋）を発現するトランスジェニック動物は、前核インジェクション（Ｃａｏ  ＹＡら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８０：１３４−１３９（２００５））の標準方法を用いて作製し、本明細書では皮膚を越える放出可能なルシフェリンコンジュゲートの送達を評価するために使用した。導入遺伝子は、ハイブリッドＣＭＶ−ニワトリ−β−アクチンプロモーター、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に基づく遺伝子組み換えコード配列（Ｐｒｏｍｅｇａ社（ワイオミング州マディソン）からのｐＧＬ３ベクター中に存在する）、ＦＭＤＶ  ２Ａリボソームスリップ部位およびＧＦＰ遺伝子から構成された。Ｃａｏ  ＹＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：２２１−２２６（２００４）によって最初に記載された動物は、大多数の細胞タイプにおいてルシフェラーゼを発現し（赤血球中では発現しない）、皮内でＧＦＰ発現を示すが、多数の他の組織中では発現を示さないことが証明された。例えば、Ｃａｏ  ＹＡら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８０：１３４−１３９（２００５）を参照されたい。全方法は、スタンフォード大学の実験動物飼育管理委員会によって承認された。
【０２４５】
皮膚輸送を評価するためのイメージングアッセイのために、右側腹上で大きなヘアクリッパーを用いて剃髪することによって動物から毛髪を取り除いた。引き続いて、Ｎａｉｒ（登録商標）（ＮＡＩＲは、Ｃｈｕｒｃｈ  ＆  Ｄｗｉｇｈｔ社（米国ニュージャージー州プリンストン）の脱毛クリームの登録商標である）を９０秒間塗布し、拭き取り、ウェットペーパータオルで動物をしっかり洗浄し、乾燥させた。５日間にわたり角質層を再増殖させ、その後マウスをイメージングのために使用した。
【０２４６】
ルシフェリンを皮内注射するために、ルシフェリンの２ｍＭ溶液は、０．６２ｍｇを１ｍＬの水に溶解させることによって作製した（ｐＨ５．５）。この溶液は、ＨＢＳ（ｐＨ７．４）（１：１０）を用いて連続的に希釈して１ｍＬの２００、２０、２、０．２、および０．０２μＭ溶液を作製した。０．０２および０．２μＭのルシフェリン溶液（１００μＬ）は、２匹の相違するマウスの皮内に注射した。発光を観察し、高用量は実験のために有用であるために十分に強度であることが証明された。引き続いて、別の３匹のマウスに注射し、できる限り迅速にイメージングした。
【０２４７】
コンジュゲートを皮内注射するために、コンジュゲート５ｂの１ｍＭ溶液は、２．１ｍｇを７７０μＬの水に溶解させることによって作製した（ｐＨ５．５）。この溶液は、ＨＢＳ（ｐＨ６．９）（１：１０）を用いて連続的に希釈して１ｍＬの２００、２０、２、０．２、および０．０２μＭ溶液を作製した。０．２μＭのコンジュゲート５ｂの溶液（１００μＬ）は、２匹の相違するマウスの皮内に注射した。発光を観察し、この用量が実験のために有用であるために十分に強度であることが証明された。
【０２４８】
コンジュゲートを局所適用するための製剤は、以下のとおりに調製した。エッペンドルフチューブ中で、２５μＬの２００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）、５５μＬのＰＥＧ４００を各１ｍｇのコンジュゲート５ｂおよびコンジュゲート５ｃと結合し、５ｂ・８ＴＦＡの４．９３ｍＭ、４．９３ｍＭの５ｃ・８ＴＦＡおよび６３ｍＭの酢酸ナトリウムの最終濃度を生成した。５ｍＭの５ｂおよび５ｃの溶液（１５μＬ）は、標準ピペットチップ（１〜２０μＬのサイズ）を使用して４匹のマウス各々の２つの場所に局所適用した。発光は、およそ６０分間にわたり観察した。
【０２４９】
インビボ生物発光イメージングは、以下のとおりに実施した。動物は、以前に記載されたように（４５）、冷却ＣＣＤカメラ（ＩＶＩＳ１００、Ｘｅｎｏｎｇｅｎ社）を用いて暗室内でイメージングし、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウエア（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社）を用いて分析した。データは、データがカメラの設定、チャンバの幾何学的形状もしくは積分時間には依存しないように、対象の各領域について光子／ステラジアン／秒として表示した。
【０２５０】
皮内送達のためのこのマウスモデルのキャリブレーションは、遊離ルシフェリンを用いて実施した。ＦＶＢ−ｌｕｃ＋マウスの皮膚からのシグナル検出のために必要とされる遊離ルシフェリンの量、およびそれが用量依存性であるかどうかを確立するために、既知量の遊離ルシフェリン（ＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水）中の１００μＬの２０ｎＭもしくは２００ｎＭいずれかの溶液）をマウスの側腹部に皮内注射し、結果として生じる生物発光シグナル（光子／単位時間）を測定した。発光された光子の総数は、曲線下面積を積分することによって計算した；図６を参照されたい。時間の関数としての発光のパターンは再現性であり、両方の用量について類似であり、測定期間にわたって注射後に光放出の定常減少を示した。１０倍の高用量についての曲線下面積は、低用量の曲線下面積に比較してほぼ正確に１０倍であり、これは、これらの濃度では線形の用量依存性反応であることを示している。注射された既知量のルシフェリンおよび観察された発光に基づくと、注射されたルシフェリン４００分子に付き１個（光子）の光がカメラによって検出された。
【０２５１】
トランスポーター媒介性皮膚侵入とは関係なく、既知量のコンジュゲートから生成される光子数を決定するために、ルシフェリンコンジュゲート５ｂを遊離ルシフェリンについて上述したように皮内に注射した。コンジュゲート５ｂの皮内注射は、図７に示したように、遊離ルシフェリンについて観察された生物発光の時間的パターンに比して明確に相違する時間的パターンを生成した。注射直後には有意なシグナルが明白であったが、これは次の２０分間にわたり増加し、次にその後５０分間にわたって緩徐に減衰した。このプロフィールは、ルシフェリンの時間依存性の生成、細胞取り込みおよびリンカー開裂後の枯渇と一致している。コンジュゲート５ｂの注射サンプル中のルシフェリンの理論量のおよそ８０％は、６０分間に放出された総光子数に、検出された１光子当たりルシフェリン４００分子という以前に計算された数字を掛けると明らかになった。
【０２５２】
ルシフェリンコンジュゲートの局所適用：局所適用のために、ＦＶＢ−ｌｕｃ＋マウスの毛皮はコンジュゲートサンプルと皮膚との接触を妨害し、投与中の再現性問題を作り出す。トランスジェニックの無毛マウスは入手することができず、剃刀だけを使用した剃髪では毛皮を一様には取り除けなかった。さらに、局所適用にとっては極めて重要な障壁である角質層の高度に可変性の分解が観察され、取り込みを測定する際のまた別の再現性の問題を作り出した。代替の脱毛剤（Ｎａｉｒ（登録商標））の使用は毛皮をより一様に除去したが、角質層の可変性のびらんもまた引き起こし、無傷皮膚内の取り込みを再現性で試験する能力を侵害した。ルシフェリンはその角質層が浸食されているマウスの皮膚内に容易に侵入し、生物発光シグナルを生成するという観察所見は、この再現性問題に対する解決策にとっての基礎を提供した。詳細には、ルシフェリンだけをトランスジェニックマウスの皮膚に適用することによって、角質層の完全性、および重要にも、経時的なその再増殖を決定することができる。図８に示されるように、Ｎａｉｒ（登録商標）を用いた処置後の最初の時点に、大きく、高度に可変性のシグナルが観察される。しかし時間が進行するにつれて、角質層再増殖を伴うルシフェリンの浸透が減少することを示すシグナルが減少するだけではなく、シグナルにおけるより大きな再現性が生じる。この経時変化試験から、再現性シグナルを入手するための最適時間は脱毛剤を用いた処置の５日後であると決定された。
【０２５３】
次の工程は、コンジュゲートの局所適用のために最善のビヒクルを決定することであった。オクタ−Ｄ−アルギニンルシフェリンコンジュゲートの５ｍＭトリフルオロ酢酸塩の溶液は、２．０に近いｐＨを有する。緩衝剤を含む重要性は、２５％の水中、または２５％の２００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）によって緩衝し、７５％のＰＥＧ４００と結合した液中のいずれかでの５ｃの１５μＬの５ｍＭ溶液を局所適用することによって試験した（図９）。生成した光量には劇的な相違が生じ、緩衝ビヒクル中のコンジュゲートを適用した場合にのみ、定常的に増加する量の発光が観察された。緩衝剤の不在下での光の欠如は、おそらくルシフェラーゼの活性およびルシフェリンの遊離速度の両方を減少させるであろう、コンジュゲートによる皮膚の酸性化から生じるであろう。これらの結果は、ビヒクル中に適切な緩衝剤を含む必要があることを確証している。
【０２５４】
適用のために適切なビヒクル、無傷の毛皮を含まない角質層を再現性で入手する方法、ならびにルシフェリンおよびルシフェリンコンジュゲートの皮内注射に基づくキャリブレーションを同定して、ルシフェリンおよびオクタ−Ｄ−アルギニンの２種の局所適用されたジスルフィド結合コンジュゲートからのルシフェリンの取り込みおよび遊離について調査した。トランスポーターおよびリンカーの相対性能を評価するために最も再現性のある方法は、麻酔をしたＦＶＢ−ｌｕｃ＋マウスの側腹部へ１滴の各コンジュゲート溶液を適用することであった。この液滴は、アッセイ時間中は皮膚と接触したままにさせ、その間に動物からの発光を監視した。選択した実験において、投与された液滴の残留量を含有する洗浄サンプルを分析的ＨＰＬＣによって試験すると、本コンジュゲートが完全に無傷であることが見いだされた。投与実験は、再現性のため、相違するコンジュゲートおよび遊離系を比較定量するため、ならびに撮影時間を節約するために設計されたが、最適治療レベルを達成するためではなかった。しかし、予想されるように、より大きな取り込みは、用量、露出時間もしくは投与面積を増加させる、または反復適用によって達成できる。図１０に示すように、両方のコンジュゲートは、強力かつ再現性のある発光シグナルを生成した。観察されたシグナルと皮膚内に侵入するコンジュゲートの量との差は、コンジュゲートの非生産的結末（例えば、不完全な取り込み、不完全な開裂、皮膚からのクリアランス、代謝）を表す。皮内キャリブレーションに基づくと、１時間中に遊離したルシフェリンの総量は、曲線下面積に４００個の分子／検出光子数を掛けることによって決定できる。アボガドロ（Ａｖｏｇａｄｒｏ）定数によって割ると、遊離したルシフェリンの量が、カーボネート５ｂについては３．６２×１０−１２モルであり、カーボネート５ｃについては２．０×１０−１１モルであることを示している。適用面積およびマウス皮膚の厚さ（０．６９ｍｍ）から、１時間にわたる皮膚露出の結果として生じる累積皮内濃度は、各々４７ｎＭおよび６２ｎＭであった。生成した光の量は、０．５〜４．５ｍＭの範囲内の適用されたコンジュゲートの量と線形に比例しており（データは示していない）、２９９ｎＭという高い皮内濃度が得られた。
【０２５５】
ルシフェリンの遊離が投与および皮膚表面との接触中に発生するかどうかを決定するために、観察された光が細胞外ルシフェリンの分解および遊離に対して輸送および細胞内遊離にのみ起因したことを証明する必要があった。このために、各曝露期間後に、皮膚上に残留している材料は洗浄することによってマウスから除去し、洗浄液中の任意の遊離ルシフェリンを検出するために分析的ＨＰＬＣによって分析した。図示した各アッセイにおいて、遊離ルシフェリンは観察されなかった。また別のコントロールは、正確に同一の放出可能なリンカーおよびルシフェリンカーゴとともに不十分なトランスポーターから構成されるコンジュゲートを試験することであった。リシンテトラマーは、皮膚侵入のためには不良なトランスポーターであることが知られている。このためにリシンテトラマーのコンジュゲート５ｄを合成し、コントロールとして使用した。
【０２５６】
コンジュゲート５ｄは、以下のとおりに調製した：
【０２５７】
【化９７】
2009528292.tif 000085
攪拌棒を装備した、オーブン乾燥した試験管に窒素下で、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＡｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−（Ｌ  Ｌｙｓ）４ＣＯＮＨ２・４ＴＦＡ（９．７ｍｇ、８．６１μｍｏｌ）を加えた。これに０．５ｍＬのＤＭＦ中の４ｃ（４．５ｍｇ、８．６１μｍｏｌ）を加えた。この反応液を１２時間にわたり攪拌し続け、次にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。適切なフラクションを凍結乾燥させると白色固体（８．１ｍｇ、５．２５μｍｏｌ、６１％）が得られたが、これは分析的ＨＰＬＣによると＞９９％の純度であった。
【０２５８】
【化９８】
2009528292.tif 000086
【０２５９】
【化９９】
2009528292.tif 000087
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２］［Ｃ４５Ｈ７４Ｎ１２Ｏ１１Ｓ４］についての計算値：１０８６．５；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１０８６．５。
Ａｃ−Ｄ  Ｃｙｓ（Ｌ  Ｌｙｓ）４ＣＯＮＨ２・４ＴＦＡは、自動ペプチド合成のための一般方法を用いて合成した。このペプチドは、１０倍過剰（１ｍｍｏｌ）中で使用された全アミノ酸を用いて０．１ｍｍｏｌスケール上でＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂上で組み立てた。ペプチドの同一性は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を用いて確定した。ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２］［Ｃ２９Ｈ６ＯＮ１０Ｏ６Ｓ］についての計算値：６７６．４；実測値（ＭＡＬＤＩ）：６７６．５。
【０２６０】
この低有効性トランスポーターコンジュゲート５ｄをマウスアッセイにおいて対応する（Ａｒｇ）８コンジュゲート５ｂと比較すると、図１１に示したように、はるかに少ない光が見られたので、そこで発光はプロドラッグの外部加水分解ではなく主として細胞内遊離から生じることを確証している。
【０２６１】
実施例８
Ｔａｘｏｌ−リンカー−トランスポーターコンジュゲート
本実施例は、数種の相違する卵巣癌モデル中のＴａｘｏｌのインビトロ治療指数（ＯＶＣＡ  ４２９／４２９Ｔ／４２９ＴＰ、ＯＶＣＡ４３３／４３３Ｔ／４３３ＴＰ、ＵＣＩ−１０１）、ならびにその水溶性は、本発明のリンカーを用いてオクタアルギニントランスポーターをＴａｘｏｌのＣ２’およびＣ７位へ結合させることによって改善できる。これらのコンジュゲートは、Ｔａｘｏｌに耐性の細胞において有意なインビトロ抗腫瘍活性を有することもまた証明されており（ＯＶＣＡ４２９Ｔ／４２９ＴＰ、およびＯＶＣＡ４３３Ｔ／４３３ＴＰ）、これはこれらのコンジュゲートが多剤耐性（ＭＤＲ）表現型を回避できることを示唆している。細胞系ＯＶＣＡ４２９はＴａｘｏｌに対して感受性であるが、他方ＯＶＣＡ４２９Ｔはｐ−糖タンパク質（ＰＧＰ）の過剰発現に起因してＴａｘｏｌに対して耐性であり、そしてＯＶＣＡ４２９ＴＰは、未知の機構に起因してＴａｘｏｌに対して耐性である。
【０２６２】
本コンジュゲートは、以下のとおりに合成した：
【０２６３】
【化１００】
2009528292.tif 000088
【０２６４】
【化１０１】
2009528292.tif 000089
他に特に言及しない限り、すべての試薬および溶媒は、市販の供給源から入手し、精製せずに使用した。ＮＭＰ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵを含むペプチド合成のための全試薬、およびピペリジンは、Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州）、ＢａＣｈｅｍ社（カリフォルニア州）、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（カリフォルニア州）から購入した。Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸および樹脂は、それらの適切に保護された形状でＮｏｖａＢａｃｈｅｍ社もしくはＢａＣｈｅｍ社から購入した。全自動ペプチド合成は、標準ＦａｓｔＭｏｃカップリング戦略を用いてＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ自動ペプチド合成装置上で実施した。逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、分取用カラム（Ａｌｌｔｅｃ  Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８、２５０×２２ｍｍ）を用いるＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ２１０／２１５  ＨＰＬＣを使用して、または分析用カラム（Ｖｙｄａｋ  Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００分析用ＨＰＬＣ上で実施した。生成物は、溶媒勾配（溶媒Ａ＝０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；溶媒Ｂ＝０．１％のＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を利用して溶出した。ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ５００磁気共鳴分析計上で測定した（１Ｈ  ＮＭＲ、５００ＭＨｚで；１３Ｃ  ＮＭＲ、１２５ＭＨｚで）。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータは以下のように報告されている：化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、およびｍ＝多重線）、積分、ならびにカップリング定数（Ｈｚ）。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータは、残留溶媒ピークに比した化学シフトによって報告されている（ＣＤ３ＯＤ：１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについて４．９７ｐｐｍ）。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ質量分析計上で記録した。
【０２６５】
ｐ−ニトロフェニルカーボネート５３。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートをＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ａ．Ｃ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５７，７９，６１８０−６１８３によって記載された方法にしたがってアルコール５２と反応させると（Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５２６−６５２７を参照されたい）、収率８２％でカーボネート５３が得られた。
【０２６６】
【化１０２】
2009528292.tif 000090
ＥＩ−ＭＳ：［Ｍ＋１］［Ｃ１４Ｈ１３Ｎ２Ｏ５Ｓ２］についての計算値：３５３．０２；実測値：３５３．０。
【０２６７】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ２’カーボネート５４。Ｃ２’カーボネートリンカーの合成は、Ｇｒｏｏｔ，Ｆ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３，３０９３−３１０２の研究に基づいて、ｐ−ニトロフェニルカーボネート５３をＴａｘｏｌのＣ２’位と反応させると、ほぼ定量的収率（９９％）でＣ２’カーボネート５４が得られた。
【０２６８】
【化１０３】
2009528292.tif 000091
【０２６９】
【化１０４】
2009528292.tif 000092
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］［Ｃ５５Ｈ５９Ｎ２Ｏ１６Ｓ２］についての計算値：１０６７．３；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１０６７．５。
【０２７０】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ２’オクタアルギニンコンジュゲート５５。カーボネート５４をさらにＪｏｎｅｓらの方法（Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５２６−６５２７）を用いてＡｃ−ＮＨ−ＤＣｙｓ（ＤＡｒｇ）８ＣＯＮＨ２（Ｋｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｔ．Ａ．ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，３４５９−３４６２）と結合させると、収率６１％で最終コンジュゲートが得られた。
【０２７１】
【化１０５】
2009528292.tif 000093
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２］［Ｃ１０３Ｈ１６１Ｎ３５Ｏ２６Ｓ２］についての計算値：２３６８．２；実測値（ＭＡＬＤＩ）：２３６８．１。
【０２７２】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ２’テトラアルギニンコンジュゲート。この化合物は、Ｊｏｎｅｓらの方法（Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５２６−６５２７）を用いてＡｃ−ＮＨ−ＤＣｙｓ（Ｄ  Ａｒｇ）４ＣＯＮＨ２と結合させると、収率５５％で得られた。
【０２７３】
【化１０６】
2009528292.tif 000094
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］［Ｃ７９Ｈ１１２Ｎ１９Ｏ２２Ｓ２］についての計算値：１７４２．８；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１７４２．９。
【０２７４】
４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−酪酸（６０）。酸６０は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５２６−６５２７によって記載されたように遊離チオール５９から合成した（例えば、Ｂｌｏｕｎｔ，Ｋ．Ｆ．ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，６８３４−６８４１を参照されたい）。
【０２７５】
【化１０７】
2009528292.tif 000095
【０２７６】
【化１０８】
2009528292.tif 000096
ＥＩ−ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］［Ｃ９Ｈ１２ＮＯ２Ｓ２］についての計算値：２３０．０２；実測値：２３０．０。
【０２７７】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ２’エステル６１。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓおよび共同研究者によって発表された方法（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９５，２，２２３−２２７）を使用して酸６０とＴａｘｏｌとを結合させると、収率７１％で化合物６１が得られた。
【０２７８】
【化１０９】
2009528292.tif 000097
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２］［Ｃ５６Ｈ６２Ｎ２Ｏ１５Ｓ２］についての計算値：１０６６．３；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１０６６．７。
【０２７９】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ２’オクタアルギニンコンジュゲート６２。この化合物は、さらにＪｏｎｅｓらの方法（Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５２６−６５２７）を用いてＡｃ−ＮＨ−ＤＣｙｓ（ＤＡｒｇ）８ＣＯＮＨ２（Ｋｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｔ．Ａ．ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，３４５９−３４６２）と結合させると、収率５８％で得られた。
【０２８０】
【化１１０】
2009528292.tif 000098
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２］［Ｃ１０４Ｈ１６２Ｎ３５Ｏ２５Ｓ２］についての計算値：２３６５．２；実測値（ＭＡＬＤＩ）：２３６５．８。
【０２８１】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ２’テトラアルギニンコンジュゲート。この化合物は、Ｊｏｎｅｓらの方法（Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，２８，６５２６−６５２７）を用いてＡｃ−ＮＨ−ＤＣｙｓ（Ｄ  Ａｒｇ）４ＣＯＮＨ２と結合させると、収率５８％で得られた。
【０２８２】
【化１１１】
2009528292.tif 000099
【０２８３】
【化１１２】
2009528292.tif 000100
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］［Ｃ８０Ｈ１１４Ｎ１９Ｏ２１Ｓ２］についての計算値：１７４０．８；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１７４１．５。
【０２８４】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ２’  ＴＢＳエステル６４。Ｃ２’  ＴＢＳ保護Ｔａｘｏｌ６４の合成についてはＭａｇｒｉ，Ｎ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９８８，５１，２９８−３０６によって記載されており、それらの方法に正確に従うと、収率９５％でＴＢＳ  Ｃ２’エステル６４が得られた。全スペクトルは、Ｍａｇｒｉらの公表されたデータと一致している。
【０２８５】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ７エステル６５。Ｃ７位でのエステル６５の生成をＤａｍｅｎおよび共同研究者によって発表された方法（Ｄａｍｅｎ，Ｅ．Ｗ．Ｐ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，８，４２７−４３２）にしたがって実施すると収率６２％で所望のエステル６５が得られた。
【０２８６】
【化１１３】
2009528292.tif 000101
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２］［Ｃ６２Ｈ７６Ｎ２Ｏ１５Ｓ２Ｓｉ］についての計算値：１１８０．４；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１１８０．１。
【０２８７】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ７エステル６６。化合物６６を収率７０％で得るためのＣ２’エステルのＴＢＳ脱保護は、Ｋｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｔ．Ａ．ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，３４５９−３４６２の方法を用いて実施した。
【０２８８】
【化１１４】
2009528292.tif 000102
【０２８９】
【化１１５】
2009528292.tif 000103
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］［Ｃ５６Ｈ６０Ｎ２Ｏ１５Ｓ２Ｎａ］についての計算値：１０８７．３；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１０８７．４。
【０２９０】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ７オクタアルギニンコンジュゲート６７。Ｔａｘｏｌ  Ｃ７エステル１６をさらにＪｏｎｅｓらの方法（Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５２６−６５２７）を用いてＡｃ−ＮＨ−ＤＣｙｓ（ＤＡｒｇ）８ＣＯＮＨ２（Ｋｉｒｓｃｈｂｅｒｇ，Ｔ．Ａ．ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，３４５９−３４６２）と結合させると、収率６３％で所望の生成物が得られた。
【０２９１】
【化１１６】
2009528292.tif 000104
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］［Ｃ１０４Ｈ１６１Ｎ３５Ｏ２５Ｓ２Ｎａ］についての計算値：２３８７．２；実測値（ＭＡＬＤＩ）：２３８７．４。
【０２９２】
Ｔａｘｏｌ  Ｃ７テトラアルギニンコンジュゲート。Ｔａｘｏｌ  Ｃ７エステル１６をＪｏｎｅｓら）の方法（Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５２６−６５２７を用いてＡｃ−ＮＨ−ＤＣｙｓ（ＤＡｒｇ）４ＣＯＮＨ２と結合させると、収率５１％で所望の生成物が得られた。
【０２９３】
【化１１７】
2009528292.tif 000105
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］［Ｃ８０Ｈ１１３Ｎ１９Ｏ２１Ｓ２Ｎａ］についての計算値：１７６２．８；実測値（ＭＡＬＤＩ）：１７６３．３。
【０２９４】
ＯＶＣＡ４２９／４２９Ｔ／４２９ＴＰヒト卵巣癌細胞系における細胞増殖阻害アッセイ（ＧＩ５０）の結果は、図１２に示した。細胞には、２０分間にわたりＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で投与されたコンジュゲートおよびＴａｘｏｌ（ＤＭＳＯ中で投与された）を用いてパルスした。次に溶液を除去し、細胞を２回洗浄し、７２時間にわたり新鮮培地中でインキュベートした。生細胞の存在は、標準ＭＴＳアッセイに基づいて測定した。図から明らかなように、コンジュゲートはＴａｘｏｌ耐性細胞系中でさえ癌細胞の増殖を阻害したが、他方Ｔａｘｏｌは、耐性細胞系４２９Ｔおよび４２９ＴＰ中の桁数によって低活性を示した。
【０２９５】
実施例９
シクロスポリン−リンカー−トランスポーターコンジュゲート
【０２９６】
【化１１８】
2009528292.tif 000106
クロロメチルカーボネート−ＣｓＡ（１２４）。Ｎ２でパージした、火力乾燥した２５ｍＬの丸底フラスコにシクロスポリンＡ（５００．０ｍｇ、０．４１６ｍｍｏｌ）を加えた。次に白色固体を無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中に溶解させた。次にフラスコは氷／水浴中で０℃へ冷却し、その後にマイクロシリンジによってクロロギ酸クロロメチル（２９６μＬ、３．３３ｍｍｏｌ）を加えた。ピリジン（１６８μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）を次に加え、反応液が室温へ加温するに任せた。溶液の色は青色がかった黄色からピリジン添加後に青色がかったピンク色、そしてわずかにオレンジ色がかった色相へ変化した。２１．５時間にわたり攪拌し続け（色は、現在は淡褐色であった）、次にＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）水溶液を用いて希釈した。有機相は、飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ×２）水溶液および飽和ＮａＣｌ（４０ｍＬ×１）水溶液を用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、そして真空下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（ペンタン−酢酸エチル、１：１〜１：３への勾配）によって精製すると、４０４．０ｍｇ（７５％）の純粋２４が得られた：
【０２９７】
【化１１９】
2009528292.tif 000107
ヨードメチルカーボネート−ＣｓＡ（１２５）。Ｎ２を用いてパージした、オーブン乾燥丸底フラスコに無水ＣＨ２Ｃｌ２（８００μＬ）中の１２４の溶液（２３９．５ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒はＮ２流下で排出し、次に真空下でさらに濃縮した。乾燥残留物を無水ＣＨ３ＣＮ（１．８ｍＬ）中に送り込むと、わずかに濁った溶液が得られた。次に室温で、固体ＮａＩ（１６６．３ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を加えた。結果として生じた黄色透明溶液を油浴中で４０℃へ加熱し、２０時間にわたって攪拌し続けた。褐色溶液を真空下で濃縮し、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に送り込み、１０％のＮａ２Ｓ２Ｏｓ（２０ｍＬ×２）水溶液および飽和ＮａＣｌ（２０ｍＬ×１）水溶液を用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、そして真空下で濃縮した。粗生成物は、それ以上精製または特性解析しなかった。これを次の反応に直接取り入れた。
【０２９８】
４−トリチルチオ−酪酸（１３０）。Ｎ２を用いてパージした、オーブン乾燥試験管にトリチルメルカプタン（１．２０３ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）を加えた。固体を無水トルエン（３ｍＬ）中に溶解させ、磁気攪拌棒を用いて攪拌し、その後にシリンジによってメタノール中のメトキシドナトリウムの２５％溶液（２．１７ｍＬ、９．５８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を氷／水浴中で０℃へ冷却し、次にＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の４−ブロモ酪酸（８００．０ｍｇ、４．７９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この溶液は黄褐色に変色し、室温へ加温するに任せ、６時間攪拌し続けた。これを次に油浴中で４０℃へ加熱した。色は黄色がかった色相から２４時間の反応時間後に濃オレンジ色に変色した。２４時間後に、追加の４−ブロモ酪酸の同等物を加えた。さらに１時間攪拌した後、さらにメタノール溶液中のメトキシドナトリウム（５００μＬ）を加えた。反応液を計３０時間にわたり攪拌し続け、その後にこれを真空下で濃縮し、蒸留したＨ２Ｏ（３０ｍＬ）および１ＭのＨ２ＳＯ４（１０ｍＬ）中に取り入れ、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）を用いて抽出し、ＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。生じた黄色油をシリカゲルクロマトグラフィ（ペンタン−酢酸エチル、８４：１５：１〜６４：３５：１への勾配）によって精製すると、８７３．６ｍｇ（５０．３％）の純粋１３０が得られた：
【０２９９】
【化１２０】
2009528292.tif 000108
４−ピリジルジチオ−酪酸（１３１）。Ｎ２を用いてパージした、火力乾燥丸底フラスコに無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の１３０の溶液（４３６．８ｍｇ、１．２０５ｍｍｏｌ）を加えた。これに計量紙によって４−アルドリチオール（７９６．４ｍｇ、３．６１５ｍｍｏｌ）を加え、次にマイクロシリンジによってトリイソプロピルシラン（２７２．３μＬ、１．３２５ｍｍｏｌ）を加えた。淡黄色が残存するまで、室温で攪拌しながらトリフルオロ酢酸（約２．５ｍＬ）を滴下した。この反応液を１時間にわたり攪拌し続け、その後真空下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィ（ペンタン−酢酸エチル−酢酸、６９：３０：１〜５４：４５：１への勾配）によって精製すると、２５１．６ｍｇ（９１％）の純粋１３１が得られた：
【０３００】
【化１２１】
2009528292.tif 000109
５−トリチルチオ−吉草酸（１３３）。Ｎ２を用いてパージした、火力乾燥丸底フラスコにトリチルメルカプタン（３４７ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を加えた。固体を無水トルエン（５．５ｍＬ）中に溶解させ、磁気攪拌棒を用いて攪拌し、その後にシリンジによってメタノール中のメトキシドナトリウムの２５％溶液（８６０μＬ、３．７７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を氷／水浴中で０℃へ冷却し、次にＭｅＯＨ（３ｍＬ）中の５−ブロモ吉草酸（２５０．０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この溶液の色は淡褐色に変色し、これを室温に加温させるために８時間にわたり攪拌し続け、その後にこれを真空下で濃縮し、蒸留したＨ２Ｏ（３０ｍＬ）および１ＭのＨ２ＳＯ４（１０ｍＬ）中に取り入れ、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）を用いて抽出し、ＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。生じた黄色固体をシリカゲルクロマトグラフィ（ペンタン−酢酸エチル−酢酸、６９：３０：１〜６４：３５：１への勾配）によって精製すると、４１９．８ｍｇ（８８．５％）の純粋１３３が得られた：
【０３０１】
【化１２２】
2009528292.tif 000110
５−ピリジルジチオ−吉草酸（１３４）。Ｎ２を用いてパージした、火力乾燥丸底フラスコに無水ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）中の１３３の溶液（２４８．５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を加えた。これに計量紙によって４−アルドリチオール（４３６．３ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ）を加え、次にマイクロシリンジによってトリイソプロピルシラン（１４９．２μＬ、０．７２６ｍｍｏｌ）を加えた。淡黄色が残存するまで、室温で攪拌しながらトリフルオロ酢酸（約１ｍＬ）を滴下した。この反応液を１時間にわたり攪拌し続け、その後真空下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィ（ペンタン−酢酸エチル−酢酸、６４：３５：１〜４４：５５：１への勾配）によって精製すると、１４２．１ｍｇ（８８．５％）の純粋１３４が得られた：
【０３０２】
【化１２３】
2009528292.tif 000111
ＣｓＡ−カーボネート−アセタール−エステル−Ｓ−アルドリチオール（１３５）。火力乾燥した１０ｍＬの円錐形の丸底フラスコに酢酸エチル中の１３１の溶液（５０．０ｍｇ、０．２１８ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒は、真空下で蒸発させた。室温で乾燥残留物に、無水ＤＭＦ（７５０μＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（４５．７μＬ、０．２６３ｍｍｏｌ）を加えた。生じた溶液は、１２５（２４２．６ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに加えた。反応液を室温で３時間攪拌し、その後にＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）を用いて希釈し、分取ＨＰＬＣ（３０分間にわたり６５〜１００％のＣＨ３ＣＮ勾配、カラムは５０℃に加熱した）によって精製すると、１２３．１ｍｇ（４７．３％）の純粋の１３５が得られた。
【０３０３】
ＣｓＡ−カーボネート−アセタール−エステル−５−Ｄ−Ａｒｇ８−ＮＨ２（１３６）。Ｎ２を用いてパージした、オーブン乾燥の６００μＬコニカルバイアルに無水ＣＨ２Ｃｌ２中の１３５（１６．１３ｍｇ、０．０１０８ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒はＮ２流下で蒸発させ、次に真空下でさらに濃縮した。バイアルに無水ＤＭＦ（１５０μＬ）中のＡｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ８−ＮＨ２の溶液（２２．９１ｍｇ、０．００９８６ｍｍｏｌ）を加えた。溶液の色は、直ちに黄色に変色した。これを室温で２４時間攪拌し続け、その後にＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）を用いて希釈し、分取ＨＰＬＣ（３０分間にわたり３０〜１００％のＣＨ３ＣＮ勾配、カラムは５０℃に加熱した）によって精製すると、１０．４ｍｇ（２８．５％）の純粋１３６が得られた。
【０３０４】
ＣｓＡ−カーボネート−アセタール−エステル−６−アルドリチオール（１３７）。オーブン乾燥バイアルに、無水ＣＨ３ＣＮ（５５０μＬ）中の１３４の溶液（２１．３７ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を加えた。次にジイソプロピルエチルアミン（１７．１３μＬ、０．０９８ｍｍｏｌ）をマイクロシリンジによって加えた。固体が砕けたので、それを溶解させるために無水ＤＭＦ（８０μＬ）を加えた。生じた溶液は、１２５（９７．４ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を含有する無水丸底フラスコに加えた。この反応液を室温で２４時間にわたり攪拌し、その後にこれを真空下で濃縮した。黄色残留物を酢酸エチル（４０ｍＬ）中に送り込み、１０％のＮａ２Ｓ２Ｏ５（４０ｍＬ×２）水溶液および飽和ＮａＣｌ（４０ｍＬ×１）水溶液を用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、そして真空下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ペンタン、９１：９〜９５：５への勾配）によって精製すると、７３．１ｍｇ（６９．４％）の純粋１３７が得られた。
【０３０５】
ＣｓＡ−カーボネート−アセタール−エステル−６−Ｄ−Ａｒｇ８−ＮＨ２（１３８）。Ｎ２を用いてパージした、オーブン乾燥の６００μＬコニカルバイアルに無水ＣＨ２Ｃｌ２中の１３７（１４．６２ｍｇ、０．００９７ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒はＮ２流下で蒸発させ、次に真空下でさらに濃縮した。このバイアルに無水ＤＭＦ（１００μＬ）中のＡｃ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ａｒｇ８−ＮＨ２の溶液（２０．５６ｍｇ、０．００８８５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液の色は、直ちに黄色に変色した。これを室温で２５時間攪拌し続け、その後にＭｅＯＨを用いて希釈し、分取ＨＰＬＣ（２０分間にわたり３０〜９０％のＣＨ３ＣＮ勾配、カラムは５０℃に加熱した）によって精製すると、２．７ｍｇ（８．２％）の純粋１３８が得られた。
【０３０６】
化合物１３６：
【０３０７】
【化１２４】
2009528292.tif 000112
は、以下のとおりに試験した。ＢＬ４．ＩＬ−２細胞を様々な濃度のＣｓＡもしくはコンジュゲート１３６と一緒に３７℃で一晩インキュベートし、ＣｓＡの活性形の取り込みおよび遊離を可能にした。翌日、１０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２−ミリステート１３アセテートおよび１μＭのヨードマイシンの添加によってＩＬ−２を生成するためにＴ細胞を刺激した。培養は３７℃で一晩インキュベートし、翌日上清を収集し、蛍光酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡキット）を用いてＩＬ−２を測定した。各試験は３回ずつ実施した。１３６のＩＣ５０は、１，９００ｎＭであると決定された。
【０３０８】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、本発明のリンカーによって脂質に結合させたシクロスポリンＡを示しており、このとき実施例１０の脂質−システイン−ＳＨ分子２０５は、シクロスポリン−脂質コンジュゲートを作製するために、この実施例のシクロスポリン化合物１３５および１３７と反応している。ＢＬ４．ＩＬ−２細胞を様々な濃度のＣｓＡもしくはコンジュゲートと一緒に３７℃で一晩インキュベートし、ＣｓＡの活性形の取り込みおよび遊離を可能にした。翌日、１０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２−ミリステート１３アセテートおよび１μＭのヨードマイシンの添加によってＩＬ−２を生成するためにＴ細胞を刺激した。培養を３７℃で一晩インキュベートし、翌日上清を収集し、蛍光酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡキット）を用いてＩＬ−２を測定した。各試験は３回ずつ実施した。決定したＩＣ５０値は、図１５Ａおよび図１５Ｂに列挙した。
【０３０９】
実施例１０
脂質トランスポーター
【０３１０】
【化１２５】
2009528292.tif 000113
本発明のリンカーを用いる脂質トランスポーター−リンカー−カーゴ分子の１つの実施形態は、便宜的には、本明細書に記載した方法によって合成することができる。他に特に言及しない限り、すべての試薬および溶媒は、市販の供給源から入手し、精製せずに使用した。分析的ＴＬＣは、蛍光指示薬を含む０．２５ｍｍ径のシリカゲル６０Ｆプレートを用いて実施した（２５４ｎｍ）。逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、分取用カラム（Ａｌｌｔｅｃ  Ａｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８、２５０×２２ｍｍ）を用いるＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ２１０／２１５  ＨＰＬＣを使用して、または分析用カラム（Ｖｙｄａｋ  Ｃ１８，１５０×４．６ｍｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００分析用ＨＰＬＣ上で実施した。生成物は、溶媒勾配（溶媒Ａ＝０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；溶媒Ｂ＝０．１％のＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を利用して溶出した。ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ５００（１Ｈ  ＮＭＲ、５００ＭＨｚで；１３Ｃ  ＮＭＲ、１２５  ＭＨｚで）磁気共鳴分析計上で測定した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータは以下のように報告されている：化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、およびｍ＝多重線）、積分、ならびにカップリング定数（Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについてのデータは、残留溶媒ピークに比した化学シフトによって報告されている（ＣＤＣｌ３＝７７．３ｐｐｍおよびＣＤ３ＯＤ＝４９．１ｐｐｍ）。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳ−ＭＳ）は、スタンフォード大学の質量分析研究所でＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ四重極イオントラップ質量分析計上で記録した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ質量分析計上で記録した。
ルシフェリンオクタＬ−アルギニンコンジュゲート２０３〜２０７ａ〜ｅの合成および特性解析
Ｓ−トリチル−Ｌ−システインエチルエステル（２０３）。Ｌ−システインエチルエステル塩酸塩（５．０ｇ、２７．０３ｍｍｏｌ、１当量）および塩化トリチル（１１．３ｇ、４０．５５ｍｍｏｌ、１．５当量）を室温で２日間にわたり２０ｍＬのＤＭＦ中で攪拌した。この反応液は、２０分間かけて５０〜１００％の水／アセトニトリル勾配（ＴＦＡを添加せず）を用いてＲＰ−ＨＰＬＣ内への直接注入によって精製した。真空下で乾燥させた後、９．３ｇ（８８％）の２０３が白色粉末として入手された。
【０３１１】
【化１２６】
2009528292.tif 000114
ＥＩ−ＭＳ：［Ｍ＋１］Ｃ２４Ｈ２７ＮＯ２Ｓについての計算値：３９２．２；実測値：３９３．２。
【０３１２】
化合物２０４ａ。３ｍＬの無水ＤＭＦ中のＳ−トリチル−Ｌ−システインエチルエステル（２０３）（６７ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、パルミチン酸（５０ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（３６ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）、およびＨＯＢｔ（２７ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）の溶液にトリエチルアミン（５４μＬ、０．３５２ｍｍｏｌ）を加え、この反応液を室温の窒素雰囲気下で一晩攪拌し続けた。この反応液を１％のＨＣｌ水溶液を用いてクエンチし、酢酸エチルを用いて洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ−ペンタン、１：５、次に１：１）によって精製すると、油として純粋２０２ａ（８５．３ｍｇ、７７％）が得られた。
【０３１３】
【化１２７】
2009528292.tif 000115
【０３１４】
【化１２８】
2009528292.tif 000116
ＥＩ−ＭＳ：［Ｍ＋１］Ｃ４０Ｈ５６ＮＯ３Ｓについての計算値：６３０．４；実測値：６３０．４。
【０３１５】
化合物２０４ｂ。化合物２０４ｂは、パルミチン酸の代りにラウリン酸を用いて、２０４ａについて上述したように合成すると、収率７１％で得られた。
【０３１６】
【化１２９】
2009528292.tif 000117
ＥＩ−ＭＳ：［Ｍ＋１］Ｃ３６Ｈ４８ＮＯ３Ｓについての計算値：５７４．３；実測値：５７４．３。
【０３１７】
化合物２０４ｃ。化合物２０４ｃは、パルミチン酸の代りにオクタン酸を用いて、２０４ａについて上述したように合成すると、収率８５％で得られた。
【０３１８】
【化１３０】
2009528292.tif 000118
ＥＩ−ＭＳ：［Ｍ＋１］Ｃ３２Ｈ４０ＮＯ３Ｓについての計算値：５１８．３；実測値：５１８．３。
【０３１９】
化合物２０４ｄ。化合物２０４ｄは、パルミチン酸の代りに酪酸を用いて、２０４ａについて上述したように合成すると、収率８０％で得られた。
【０３２０】
【化１３１】
2009528292.tif 000119
ＥＩ−ＭＳ：［Ｍ＋１］Ｃ２８Ｈ３２ＮＯ３Ｓについての計算値：４６２．２；実測値：４６２．２。
【０３２１】
化合物２０４ｅ。３ｍＬの氷温ＮａＯＨ（１Ｎ）中のＳ−トリチル−Ｌ−システインエチルエステル（２０３）（１７ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）の溶液に１００μＬの酢酸無水物を１滴ずつ強力に攪拌しながら加え、氷浴中で持続的に冷却した。さらに氷温ＮａＯＨ（１Ｎ）を加え、次に１００μＬの酢酸無水物を加えた。混合液を３０分間攪拌した後、この溶液は濃Ｈ２ＳＯ４の添加によってｐＨ３に調整し、酢酸エチルを用いて洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、真空下で濃縮し、２０〜８０％の水／アセトニトリル勾配（ＴＦＡを添加せず）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣを用いて２０分間かけて精製すると、白色粉末として純粋２０４ｅ（ｍｇ、８８％）が得られた。
【０３２２】
【化１３２】
2009528292.tif 000120
ＥＩ−ＭＳ：［Ｍ＋１］Ｃ２６Ｈ２８ＮＯ３Ｓについての計算値：４３４．２；実測値：４３４．２。
【０３２３】
化合物２０７ａ。不活性雰囲気中で、化合物２０４ａ（２８．５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を１．５ｍＬのＣＨ２Ｃ１２中に溶解させた。その後、トリエチルシラン（２８μＬ、０．１８ｍｍｏｌ）、およびトリフルオロ酢酸（１．５ｍＬ）を連続的に加えた。２時間後、溶媒を真空下で除去し、結果として生じた残留物は１時間にわたり高真空ポンプ上に置いた。残留物を１．５ｍＬの無水ＤＭＦ中に再懸濁させ、これに化合物２０６（２２．８ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を加えた。室温の窒素雰囲気下で一晩攪拌した後、反応液を１％のＨＣｌ水溶液でクエンチし、酢酸エチルを用いて洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させ、真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ−ペンタン、１：５、次に２：１）によって精製すると、黄色油として純粋２０７ａ（２２．２ｍｇ、６３％）が得られた。
【０３２４】
【化１３３】
2009528292.tif 000121
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ３６Ｈ５４Ｎ３Ｏ８Ｓ４についての計算値：７８４．３；実測値（ＭＡＬＤＩ）：７８４．３。
【０３２５】
化合物２０７ｂ。化合物２０７ｂは、前駆体としての２０４ｂを用いて２０７ａについて上述したように合成すると、収率６７％で得られた。
【０３２６】
【化１３４】
2009528292.tif 000122
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ３２Ｈ４６Ｎ３Ｏ８Ｓ４についての計算値：７２８．２；実測値（ＭＡＬＤＩ）：７２８．２。
【０３２７】
化合物２０７ｃ。化合物２０７ｃは、前駆体としての２０４ｃを用いて２０７ａについて上述したように合成すると、収率７２％で得られた。
【０３２８】
【化１３５】
2009528292.tif 000123
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ２８Ｈ３８Ｎ３Ｏ８Ｓ４についての計算値：６７２．１；実測値（ＭＡＬＤＩ）：６７２．２。
【０３２９】
化合物２０７ｄ。化合物２０７ｄは、前駆体としての２０４ｄを用いて２０７ａについて上述したように合成すると、収率６５％で得られた。
【０３３０】
【化１３６】
2009528292.tif 000124
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ２４Ｈ３０Ｎ３Ｏ８Ｓ４についての計算値：６１６．１；実測値（ＭＡＬＤＩ）：６１６．１。
【０３３１】
化合物２０７ｅ。化合物２０７ｅは、前駆体としての２０４ｅを用いて２０７ａについて上述したように合成すると、収率６８％で得られた。
【０３３２】
【化１３７】
2009528292.tif 000125
ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋１］Ｃ２２Ｈ２６Ｎ３Ｏ８Ｓ４についての計算値：５８８．１；実測値（ＭＡＬＤＩ）：５８８．１。
【０３３３】
化合物２０６および２０８。化合物２０６および２０８の合成および特性解析については以前に記載されている（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：６５２６−６５２７（２００６）。化合物２０６。
【０３３４】
【化１３８】
2009528292.tif 000126
コンジュゲート２０７ａ〜ｅからのルシフェリン遊離についての細胞アッセイ。細胞培養中の取り込みおよび遊離を試験するために、様々な濃度のルシフェリン（２０１）およびコンジュゲート（２０７ａ〜ｅ、２０８）を細胞とともに別個にインキュベートした。測定を容易にするため、そして取り込みを最高化しないために選択した１分間のインキュベーション時間後に、あらゆる細胞外ルシフェリンもしくはコンジュゲートを除去するために細胞を洗浄し、電荷結合素子カメラ（ＩＶＩＳ１００、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社、カリフォルニア州アラメダ）を用いて時間の関数として生じた光子数を分析した。遊離ルシフェリンの細胞内遊離および細胞内ルシフェラーゼによるその代謝回転の尺度である発光シグナルの量は、濃度に比例しており（データは示していない）、典型的取り込み曲線は図１３に示した。２０７ａ〜ｃを用いてパルスした細胞からの発光シグナルは、徐々に減衰しておよそ１５分後にバックグラウンド値に達した（図１３）。２０７ｄ〜ｅで処置した細胞は相違する曲線を生成し、その形状はルシフェリンに類似しており、２０７ａ〜ｃについて見られるものに比較してより少ない初期光、より緩徐な減衰速度を伴い、全光子のほんの一部分しか生成しなかった（図１３）。化合物が適用されたビヒクルにわずかな変化を加えて、以前に記載された方法にしたがった（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：６５２６−６５２７（２００６））。ルシフェラーゼＰＣ３Ｍ−ｌｕｃによって安定にトランスフェクトされた前立腺癌細胞系は、アッセイ前の１２時間にわたり９６ウエルの平底プレート内で１ウエルに付き６０，０００個の細胞でプレーティングした。細胞は、様々な濃度のＨｅｐｅｓ緩衝食塩水（ＨＰＳ）（ｐＨ７．４）中で１分間にわたり、ルシフェリンのカリウム塩（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社、カリフォルニア州アラメダ）もしくは脂質化カーボネート２０７ａ〜ｅのいずれかと１分間にわたりインキュベートした。各ウエル中で最終濃度１０μＭの試験化合物を得るために、化合物が水性緩衝剤中では不溶性であるために、化合物はＤＭＳＯ中で投与した。ＤＭＳＯの全濃度は、全部でウエル内で２％未満に維持した。インキュベーション後に細胞を洗浄し、適切な緩衝剤を用いて再懸濁させ、生じた発光は電荷結合素子カメラおよびＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（ＩＶＩＳ２００、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．社、カリフォルニア州アラメダ）を用いて測定した。図１３は、様々な長さの脂質尾部を備える脂質化トランスポーターについての細胞取り込み実験（１分間のパルス、濃度：１０μＭ）の結果を示している。図１３に示した化合物は、次のとおりである：７ａは、化合物２０７ａである；７ｂは、化合物２０７ｂである；７ｃは、化合物２０７ｃである；７ｄは、化合物２０７ｄである；７ｅは、化合物２０７ｅである；８は、化合物２０８である。
【０３３５】
動物実験：脂質化トランスポーターの皮膚取り込み実験の結果は、図１４Ａおよび図１４Ｂに示した。適用方法における再現性を保証するために、１００％のＰＥＧ（４００）中の各コンジュゲートの１５μＬの５ｍｍｏｌ溶液を標準ピペットチップ（１〜２０μＬのサイズ）から調製した皮膚表面に投与すると、適用面積の再現性制御を提供した（実施例７を参照されたい）。サンプルについてのこれ以上の操作は実施しなかったので、これにより方法における摩擦から生じるであろうグローブもしくはガラス棒へのサンプルの可変性消失が回避される。本方法は、標準セットの投与条件下で試験したコンジュゲートの性能比較を許容した。本方法を用いた取り込み性能は再現性であるが、最小限である。治療適用のために、方法において摩擦を使用してより大きな面積にわたる投与は、より大きな取り込みを生じさせるであろう。全実験は、完全な角質層再増殖に起因する優れた再現性を提示することが証明されている毛皮除去の５日後および１２日前に実施した（実施例７を参照されたい）。陽性コントロールとして、７５％のＰＥＧ４００および２５％の１ｍｍｏｌのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６．０）のルシフェリン２０８のポリアルギニンコンジュゲートを使用した（実施例７）。ラウリル酸コンジュゲート（２０７ｂ）を用いて処置したトランスジェニックマウスは、より多い初期光、初期３０分間にわたって同様に増加するシグナル速度およびより迅速な減衰率を備える相違する曲線を生成した（図１４Ａ）。オクタン酸コンジュゲート（２０７ｃ）からのシグナルはポリアルギニンコントロール２０８に類似しており、これはシグナルのわずかに緩徐な速度が初期２５分間において増加し、その後３５分間にわたり安定性のシグナル生成が続いた。細胞データと一致して、コンジュゲート２０７ｄ〜ｅは、２０７ａ〜ｃについて見られるものに比較した場合に全光子のほんの一部分しか生成しなかった。皮膚内へのトランスポーター媒介性侵入とは無関係に既知量のルシフェリンから生成された光子数は、以前に皮内注射およびキャリブレーション実験から決定した（実施例７を参照されたい）。このデータを使用して、相違する長さの脂肪酸を有するルシフェリンの局所投与された脂質化トランスポーターコンジュゲート（２０７ａ〜ｅ）によって送達および遊離されたルシフェリンの量を決定し、そしてそれらを同一アッセイにおいて、多数の薬剤についての治療活性のために必要とされるよりはるかに高い、以前に１時間に２９９ｎＭのルシフェリンを送達することが証明されているポリアルギニントランスポーター（２０８）と比較した。２０８と比較して、パルミチン酸（２０７ａ）およびラウリン酸（２０７ｂ）トランスポーターコンジュゲートは、同一の１時間という時間枠で各々１．７倍および１．５倍多いルシフェリンを送達することができた（図１４Ｂを参照されたい）。治療適用のために、遊離ルシフェリンから結果として生じるシグナル面積の読み出し値はコンジュゲートの適用面積より大きく、それは経時的に増加したので、これは本コンジュゲートが角質層を越えた通過後に内側および側方へ移動したことを示している。動物実験のためには、上記の実施例７において上述した方法を使用し��。等モル濃度の各化合物はＵＶ吸収に基づいて調製し、実験前にそれらの純度を決定した。動物は、実験の５〜１０日間前に、Ｎａｉｒ（登録商標）を用いて処置した。各化合物の１５μＬの５ｍｍｏｌ溶液のアリコートは、１００％のＰＥＧ（ＭＷ＝４００）ビヒクルを用いて各動物（動物１匹に付き２スポット）に適用した。各実験の終了時に、サンプルを動物から除去し、その純度を決定した。遊離ルシフェリンの存在は、サンプルのいずれにおいても観察されなかった。
【０３３６】
本明細書に特定する引用によって言及した全刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３７】
上記の発明は、明確に理解する目的のために例示および実施例によって詳細に記載されているが、当業者には所定の小さな変化および変更が実施されることは明白である。したがって、明細書および実施例は、本発明の範囲を限定すると見なすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０３３８】
【図１Ａ】トランスポーターポリマーと結合させるためのジスルフィド活性化物質を調製するための合成経路を示した図である。
【図１Ｂ】ジスルフィド活性化物質とトランスポーターポリマーとの結合を示した図である。
【図１Ｃ】コンジュゲートの加水分解および脱カルボキシル化の結果として生じる反応生成物、およびコンジュゲートのジスルフィド開裂の結果として生じる反応生成物を示した図である。
【図２Ａ】５ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰ（ｐＨ７．４）中の１００ｎｇのホタルルシフェラーゼへ既知量のルシフェリンを添加した結果として生じた発光の標準曲線を示した図である。総曲線下面積（ＡＵＣ）の単位は、光子である。パーセンタイル値は、最高用量のルシフェリンへ標準化した光量を表している。
【図２Ｂ】図２Ａにおける条件についてのルシフェリン濃度と相対発光との関係を示した図である。濃度の対数をルシフェリン濃度の対数の関数としてプロットすると、線形関係が観察された。
【図３Ａ】カーボネート５ｂおよび５ｃがルシフェラーゼと混合された結果として生じた発光を示した図である；カーボネート５ｂおよび５ｃの１μＭ溶液が５ｍＭのＭｇＳＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰ（ｐＨ７．４）中の１００ｎｇのホタルルシフェラーゼと混合された。総曲線下面積（ＡＵＣ）の単位は、光子である。
【図３Ｂ】図３Ａのコンジュゲートがホタルルシフェラーゼへの曝露前に２０分間にわたり１ｍＭのＤＴＴを用いてプレインキュベート（還元）された結果として生じた発光を示した図である；発光のプロフィールはルシフェリンについて所見されるプロフィールに類似しており、両方のコンジュゲートについて等しい光量が生成された。
【図４Ａ】ＨＢＳ中もしくはＫ＋ＨＢＳ中のいずれかで、２５μＭのルシフェリン（６）もしくは１５μＭの放出可能なルシフェリンコンジュゲート５ｂもしくは５ｃを用いて処置されたルシフェラーゼ（ＰＣ３Ｍ−ｌｕｃ）によって安定にトランスフェクトされた前立腺癌細胞系由来の生物発光のリアルタイム測定を示した図である。
【図４Ｂ】ＨＢＳ中もしくはＫ＋ＨＢＳ中のいずれかで、２５μＭのルシフェリン（６）もしくは１５μＭの放出可能なルシフェリンコンジュゲート５ｂもしくは５ｃを用いて処置されたルシフェラーゼ（ＰＣ３Ｍ−ｌｕｃ）によって安定にトランスフェクトされた前立腺癌細胞系由来の全発光を示した図である。
【図５】ルシフェリン−放出可能なリンカー−トランスポーター−コンジュゲートの実施形態についての輸送および放出イベントの提案順序を示した図である。細胞は、ルシフェラーゼについての遺伝子で安定にトランスフェクトされている。細胞内への侵入後に放出される遊離ルシフェリンは、ルシフェラーゼと反応して、測定可能な光子を生成できるので、細胞内への取り込みおよび放出のリアルタイム定量を可能にする。
【図６】トランスジェニック（ＦＶＢ−ｌｕＣ＋）マウスへのＨＢＳ（ｐＨ７．４）中のルシフェリンの皮内注射後に結果として生じた生物発光を示した図である。ルシフェラーゼを発現するマウスに２００ｎＭのルシフェリンを注射すると、２０ｎＭに比して約１０倍の光量が観察された；図６Ａを参照されたい。２００ｎＭについての曲線下面積は３．０２×１０１０個（光子）であったが、２０ｎＭについては３．１１×１０９個（光子）であった（１０．２４％）。線形にプロットすると、生物発光は最初の３０分間にわたり高速で減少する；図６Ｂを参照されたい。プロットは、別個の動物における３回の注射の平均値である。
【図７】トランスジェニック（ＦＶＢ−ｌｕＣ＋）マウスへのＨＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００μＬの２００ｎＭのコンジュゲート５ｂの皮内注射後に結果として生じた生物発光を示した図である。２匹の相違する動物についての発光のパターンが示されている。曲線下面積は、２．５４および２．０１×１０１０個（光子）である。
【図８】皮内への遊離ルシフェリンの取り込みを示した図である。脱毛処置の直後の取り込みは大きく可変性であるが、角質層が自然に再建されるにつれて経時的に非有意なレベルに減少する。図は、Ｎａｉｒ（商標）を用いた処置後の様々な時点に、ビヒクルである２００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６．０）中の１５μＬの５．５ｍＭのルシフェリンの局所適用後に観察される全発光を示している。
【図９】緩衝および非緩衝コンジュゲート５ｃから結果として生じた生物発光を示した図である；非緩衝溶液中のコンジュゲート５ｃのトリフルオロ酢酸塩の固有の酸性度は、生物発光の減少を生じさせる。この図は、コンジュゲートが緩衝（黒い四角）もしくは非緩衝（白い四角）ビヒクル中で適用された場合に観察される示差的生物発光を示している。コンジュゲート５ｃ（２ｍＭ）は、２５％の水／７５％のＰＥＧ４００もしくは２５％の２００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６．０）／７５％のＰＥＧ４００のどちらかで適用された。
【図１０】ルシフェラーゼトランスジェニックマウスから、７５％のＰＥＧ４００／２５％の２００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６．０）中の１５μＬの５ｍＭのコンジュゲート５ｂ（黒い四角）および５ｃ（白い四角）の局所適用後の時間の関数として観察された生物発光を示した図である。
【図１１】ルシフェラーゼトランスジェニックマウスから、７５％のＰＥＧ４００／２５％の２００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６．０）中の１５μＬの２ｍＭのコンジュゲート５ｃ（黒い四角）およびリシンコンジュゲート５ｄ（白い四角）の局所適用後の時間の関数として観察された生物発光を示した図である。
【図１２】指示した化合物を用いた２０分間のパルスで、４２９卵巣癌細胞系のＧＩ５０（ｎＭ）についてのアッセイを示した図である。細胞を２０分間パルスし、洗浄し（２回）、そして新鮮培地中で７２時間インキュベートした。各化合物について、４２９細胞、４２９Ｔ細胞、および４２９ＴＰ細胞について（左から右へ）３本の棒が示されている。ＧＩ５０値（ｎＭ）は次のとおりである：「Ｃ２  Ｅｓｔｅｒ５  ｒ８」（化合物６２）と標識された棒の第１群については、１２（４２９）、４２０（４２９Ｔ）、１０１（４２９ＴＰ）；「Ｃ２  ｃａｒｂｏｎ５  ｒ８」（化合物５５）、４７（４２９）、７８１（４２９Ｔ）、２１６（４２９ＴＰ）；「Ｃ７  Ｅｓｔｅｒ５  ｒ８」（化合物６７）、１２５（４２９）、２２５（４２９Ｔ）、９３（４２９ＴＰ）；Ｔａｘｏｌ（ＤＭＳＯ中）、１４７（４２９）、１５８０２（４２９Ｔ）、８４８５（４２９ＴＰ）。
【図１３】様々な長さの脂質尾部を備える脂質化トランスポーターについての実施例１０の細胞取り込み実験（１分間のパルス、１０μＭ濃度）の結果を示した図である。図１３に示した化合物は、次のとおりである：７ａは、実施例１０の化合物２０７ａである；７ｂは、実施例１０の化合物２０７ｂである；７ｃは、実施例１０の化合物２０７ｃである；７ｄは、実施例１０の化合物２０７ｄである；７ｅは、実施例１０の化合物２０７ｅである；８は、実施例１０の化合物２０８である。
【図１４Ａ】様々な長さの脂質尾部を有する脂質化トランスポーターの取り込みを示した図である。
【図１４Ｂ】局所投与された脂質化トランスポーターコンジュゲートにより送達かつ放出されたルシフェリンの量の棒グラフ表示である。化合物は、図１３の説明文に記載の番号によって表示されている。
【図１５Ａ】本発明のリンカーを用いたシクロスポリンＡ−脂質コンジュゲートを示した図である。
【図１５Ｂ】本発明のリンカーを用いたシクロスポリンＡ−脂質コンジュゲートを示した図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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