(57)【要約】  本発明は、ペプチドを連結することによって連結された、ヒトインスリンの修飾したＡ鎖及びＢ鎖又はそのアナログを含んでなる速効型単鎖インスリンアナログであって、このときヒトＢ鎖の位置Ｂ２５、Ｂ２６又はＢ２７のアミノ酸残基の一又は複数がＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、及び／又は、Ｂ２８がＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓであるか又は欠失しており、ヒトインスリンＢ鎖の位置Ｂ１０のアミノ酸残基が、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ又はＳｅｒである速効型単鎖インスリンに関する。また、本発明は、速効型単鎖インスリンと遅延型アシル化インスリンとの混合である製薬的組成物に関する。2009527526.tif 000006
2009527526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを連結することによって連結された、ヒトインスリンの修飾したＡ鎖及びＢ鎖又はそのアナログを含んでなる速効型単鎖インスリンアナログであって、
d) ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５、Ｂ２６又はＢ２７のアミノ酸残基の一又は複数がＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、及び／又は、位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓであるか又は欠失しており、
e) ヒトインスリンＢ鎖の位置Ｂ１０のアミノ酸残基が、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ及びセリンからなる群から選択され、そして、
f) 場合によって位置Ｂ２２のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであり、
ただし位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＬｙｓである場合には、位置Ｂ２９のアミノ酸残基がＰｒｏである、
速効型単鎖インスリンアナログ。
【請求項２】
位置Ｂ２２、Ｂ２５、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基がヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐである、請求項１に記載の単鎖インスリンアナログ。
【請求項３】
ヒトインスリンＢ鎖の位置Ｂ１０のアミノ酸残基がＧｌｎである、請求項１又は２に記載の単鎖インスリンアナログ。
【請求項４】
連結ペプチドが、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜８、７〜９又は７〜１０のアミノ酸残基を鎖に持つ、請求項１から３のいずれか一に記載の単鎖インスリンアナログ。
【請求項５】
位置Ａ２１のアミノ酸残基がＧｌｙである、請求項１から４のいずれか一に記載の単鎖インスリンアナログ。
【請求項６】
位置Ｂ１のアミノ酸残基がＧｌｙであるか又は欠失される、請求項１から５のいずれか一に記載の単鎖インスリンアナログ。
【請求項７】
位置Ｂ３のアミノ酸残基がＧｌｎである、請求項１から６のいずれか一に記載の単鎖インスリンアナログ。
【請求項８】
位置Ｂ３０のアミノ酸残基が欠失される、請求項１から７のいずれか一に記載の単鎖インスリンアナログ。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一に係る単鎖インスリンアナログを持効型のアシル化されたインスリンアナログと混合して含有してなる製薬的組成物。
【請求項１０】
持効型のアシル化されたインスリンがＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)である、請求項９に記載の製薬的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、速効型単鎖インスリンアナログ及び速効型単鎖インスリンアナログを含有してなる製薬的組成物及びアシル化した持効型インスリンアナログと混合した単鎖インスリンアナログを含有してなる製薬的組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
インスリンは膵臓のβ細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンであって、２つのポリペプチド鎖、Ａ及びＢから成り、このＡ鎖とＢ鎖は２つの鎖間ジスルフィド橋によって連結される。さらに、Ａ鎖は１つの鎖内ジスルフィド架橋を特徴とする。
ホルモンは、立体配置：プレペプチドＢ−Ａｒｇ Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ Ａｒｇ−Ａ(Ｃは３１アミノ酸の連結ペプチドである)で、２４アミノ酸のプレペプチドの後に８６アミノ酸を含有するプロインスリンからなるプロインスリンの単鎖前駆物質(プレプロインスリン)として合成される。Ａｒｇ-Ａｒｇ及びＬｙｓ-Ａｒｇは、２鎖のインスリン分子を形成するためのＡ鎖及びＢ鎖の連結ペプチドの切断のための切断部位である。インスリンは正常な代謝調節を維持するために必須である。
【０００３】
ホルモンは、まず二量体に希釈し、第二に単量体に希釈することによって分離する一定の六量体として、分泌される。活性なホルモンはインスリン単量体である。インスリン六量体及び／又はインスリン二量体の不安定化によって、欧州特許第２１４８２６号に開示される、速効型インスリン様Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリンが生じる。ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリンのような他のタイプの速効型インスリンは、米国特許第５４７４９７８号に開示される。 
現在、１型糖尿病及び２型糖尿病両方の糖尿病の治療は、いわゆる強化インスリン療法の程度を上げることに関する。この投薬計画によると、患者は、基礎的インスリン需要を賄うために持効型インスリンを１日に１又は２回注射し、食事に関連したインスリン需要を賄うために速効型インスリンの急速注射により補うことを含む複数回毎日のインスリン注射により治療される。
【０００４】
持効型インスリン組成物は公知技術である。したがって、ある主要なタイプの持続型インスリン組成物は、インスリン結晶又はアモルファスインスリンの注射可能な水性懸濁液を含んでなる。これらの組成物において、一般的に利用されるインスリン化合物は、プロタミンインスリン、亜鉛インスリン又はプロタミン亜鉛インスリンである。
インスリン懸濁液の使用に関してある不便さがある。したがって、正確な投与を確保するために、インスリン粒子は、一定用量の懸濁液をバイアルから回収するか又はカートリッジから排出させる前にゆっくりと振とうして均一に懸濁する必要がある。また、インスリン懸濁液の貯蔵には、温度は、塊りの形成又は凝固を回避するために、インスリン溶液の場合より狭い範囲の温度で保たなければならない。
【０００５】
他のタイプの持効型インスリン組成物は、溶液が注入される際にｐＨ値が上がるため、インスリンが沈殿すると思われる生理学的ｐＨよりも下のｐＨ値を有する溶液である。これらの溶液の欠点は、注入の際に組織に形成される沈殿物の粒子の大きさであり、これによって、医薬の放出特性は、注射部位の血流や、いくらか予測不可能な様式の他のパラメータによって変化する。さらなる欠点は、インスリンの固形粒子が、注射部位の組織に炎症を引き起こす局所的な刺激物として作用しうることである。
持効型又は遅延型インスリン誘導体のさらなるグループはアシル化されたインスリン誘導体である。ヒトインスリンは３つの第一アミノ基、つまりＡ鎖のＮ末端基及びＢ鎖のＮ末端基、及び位置Ｂ２９のリジン残基のε-アミノ基を有する。位置Ｂ２６からＢ３０のいずれかのリジン残基のε-アミノ基に結合した親油性置換基を含む可溶性インスリン誘導体は、国際公開第９５／０７９３１号(Novo Nordisk A/S)、国際公開第９６／００１０７号(Novo Nordisk A/S)、国際公開第９７／３１０２２号(Novo Nordisk A/S)、及び国際公開第２００５／０１２３４７号に開示されている。
【０００６】
遅延型は、部分的に可逆的にアルブミンに結合しており、部分的に六量体より大きな多量体を形成していると解釈されている(Markussen, Diabetologia, 39, 281-288, 1996 and Havelund等 2004, Pharmaceutical research, 21,1498-1504)。これらのインスリン誘導体は、作用特性を有しており、生理学的ｐＨ値で可溶性である。
糖尿病患者は、速効型インスリンの複数回注射伴う遅延型インスリンを含む複数回毎日の注射により治療されるので、速効型及び持効型のインスリンを１回の注射に組み合わせることは複数の注射を省くことになるであろう。
【０００７】
持効型及び速効型のインスリンの混合物は、通常、溶液のインスリンを混合したインスリン結晶の懸濁液である。国際公開第９７／４８４１４号及び国際公開第９７／４８４１３号は、速効型インスリンのアナログＢ２９Ａｓｐヒトインスリンの混合懸濁液を開示している。このような混合懸濁液は、前述のような不便さ、例えば、所定のインスリン用量をバイアルから回収するか又は予め充填したカートリッジから排出させる前にゆっくりと振とうしてインスリン粒子を懸濁する必要性に煩わされるかもしれない。
国際公開第２００３／０９４９５６号及び国際公開第２００３／０９４９５１号は、速効型インスリンＢ２８Ａｓｐヒトインスリンと可溶性のアシル化した持効型インスリンアナログインスリンデテミル(ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン)とを混合して調製したインスリン製剤を開示する。
【０００８】
単鎖インスリンは、周知の２鎖ヒトインスリン及び２鎖ヒトインスリンアナログより非常に高い物理的安定性を有する。国際公開第２００５／０５４２９４１号は、高い安定性と生物学的インスリン活性を有する単鎖インスリンの特定のグループを開示する。
本発明の目的は、可溶性の持効型インスリンアナログとの混合性に関して公知の化合物よりも優れた特性と優れた物理的安定性を有する単鎖の速効型インスリンを提供することである。
【０００９】
（発明の概説）
ある態様では、本発明は、ペプチドを連結することによって連結された、ヒトインスリンの修飾したＡ鎖及びＢ鎖又はそのアナログを含んでなる速効型単鎖インスリンアナログであって、
a) ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５、Ｂ２６又はＢ２７のアミノ酸残基の一又は複数がＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、及び／又は、ヒトＢ鎖のＢ２８がＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓであるか又は欠失しており、
b) ヒトインスリンＢ鎖の位置Ｂ１０のアミノ酸残基が、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ及びセリンからなる群から選択され、そして、
c) 場合によって位置Ｂ２２のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであり、
ただし位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＬｙｓである場合に、位置Ｂ２９のアミノ酸残基がＰｒｏである、
速効型単鎖インスリンアナログに関する。
【００１０】
連結ペプチド(connecting peptide)は、一般的に、ヒトインスリンの天然のＣ-ペプチドより短い。したがって、典型的におよそ１５〜２０アミノ酸残基より長くない。有用なＣ-ペプチドの例は、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜８、７〜９又は、７〜１０のアミノ酸残基を鎖に有するものである。
一実施態様では、位置Ｂ２８のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ１０のアミノ酸残基はＧｌｎである。
他の実施態様では、位置Ｂ２２、Ｂ２５、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基はヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２８のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐである。 
他の実施態様では、位置Ｂ２２、Ｂ２５、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基はヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２８のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基はＧｌｎである。
【００１１】
更なる実施態様では、位置Ｂ２２、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基はヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２５のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基はＧｌｎである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２２、Ｂ２５及びＢ２７のアミノ酸残基はヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２６のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基はＧｌｎである。
【００１２】
更なる実施態様では、位置Ｂ２２、Ｂ２５及びＢ２６のアミノ酸残基はヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２７のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基はＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基はＧｌｎである。
なお更なる実施態様では、位置Ｂ２２、Ｂ２５、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基はヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２８のアミノ酸残基はＬｙｓであり、位置Ｂ２９のアミノ酸残基はＰｒｏであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基はＧｌｎである。
【００１３】
当分野で公知であるように、Ａ鎖及びＢ鎖は物理的及び／又は化学的安定性を向上させるためにさらに修飾されてもよい。したがって、Ａ鎖の位置Ａ２１のアミノ酸残基はＣｙｓ以外の任意の他のコード可能なアミノ酸残基に置換されてもよい。
ある実施態様では、位置Ａ２１のアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ 又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選択されてもよい。更なる実施態様では、Ａ２１はＧｌｙである。
また、Ｂ１は例えばＡｓｐ又はＧｌｙに修飾されてもよいか又は欠失されてもよく、Ｂ３はＧｌｎ残基に修飾されてもよく、Ａ１８はＧｌｎ残基に修飾されてもよい。さらに、位置Ｂ３０のアミノ酸残基は欠失されてもよい。
【００１４】
他の実施態様では、Ｃ-ペプチドは、以下の式Ｘａ-Ｘｂ-Ｘｃ-Ｘｄ-Ｘｅ-Ｘｆ-Ｘｇ(配列番号：１)を有するペプチド配列であり、
このとき、Ｘａは、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｇ、Ｓ及びＶからなる群から選択され、
Ｘｂは、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、
Ｘｃは、Ｌ、Ｙ、Ｍ、Ｈ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｇ及びＰからなる群から選択され、
Ｘｄは、Ｒ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｎ、Ｈ及びＧからなるぐんから選択され、
Ｘｅは、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、Ｑ、Ｖ及びＧからなる群から選択され、 
Ｘｆは、Ｇ及びＡからなる群から選択され、そして、
Ｘｇは、Ｋ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｔ、Ｉ、Ｑ、Ｗ及びＡからなる群から選択される。
【００１５】
更なる実施態様では、
Ｘａは、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｈ及びＶからなる群から選択され、
Ｘｂは、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｒ及びＴからなる群から選択され、 
Ｘｃは、Ｌ、Ｙ、Ｍ、Ｈ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｇ及びＰからなる群から選択され、
Ｘｄは、Ｒ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｎ、Ｈ及びＧからなる群から選択され、
Ｘｅは、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｋ、Ｐ及びＮからなる群から選択され、 
ＸｆはＧであり、そして、
Ｘｇは、Ｋ、Ｒ、Ｑ及びＰからなる群から選択される。
更なる実施態様では、
Ｘａは、Ｔ、Ａ  Ｖ、Ｋからなる群から選択され、
ＸｂはＧであり、
Ｘｃは、Ｌ、Ｙ、Ｍ、Ｈ、Ｒ  Ｋ、Ｗからなる群から選択され、
ＸｄはＧであり、
Ｘｅは、Ｓ、Ｋからなる群から選択され、 
ＸｆはＧであり、そして
ＸｇはＫ、Ｒ、Ｑからなる群から選択される。
【００１６】
なお更なる実施態様では、Ｃペプチドは配列Ｙ１-Ｇ-Ｙ２-Ｇ-Ｙ３-Ｇ-Ｙ４(配列番号：２)を有し、
このときＹ１がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒからなる群から選択され、
Ｙ２はＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏからなる群から選択され、
Ｙ３はＳｅｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙからなる群から選択され、そして
Ｙ４はＬｙｓ又はＡｒｇである。
なお更なる態様では、Ｙ１はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ及びＨｉｓからなる群から選択され、
Ｙ２はＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ及びＨｉｓからなる群から選択され、
Ｙ３はＳｅｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ及びＡｓｎからなる群から選択され、そして
Ｙ４はＬｙｓ又はＡｒｇである。
【００１７】
他の実施態様では、Ｃ-ペプチドは、配列ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)又は配列ＧＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：４)を有する。 
また、本発明は、本発明の単鎖インスリンアナログと、場合によって安定化、保存又は等張性に適する一又は複数の薬剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含有してなる製薬的組成物に関する。製剤の亜鉛含量は、インスリン六量体当たり０〜およそ４亜鉛原子であってよい。
【００１８】
他の実施態様では、本発明は、本発明に係る速効型単鎖ヒトインスリンアナログを、持効型アシル化ヒトインスリンアナログを混合して、安定化、保存又は等張性に適する一又は複数の薬剤といった好適なアジュバンド及び添加剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニ トールとともに含有してなる可溶性の製薬的可溶性製剤に関する。
亜鉛含量は、インスリン六量体当たり０〜およそ４亜鉛原子であってよい。製薬的調製物のｐＨは、およそ４〜およそ８．５、およそ４〜およそ５、又は、およそ６．５〜およそ７．５にあってもよい。
【００１９】
したがって、他の態様では、本発明は、ペプチドを連結することによって連結された、ヒトインスリンの修飾したＡ鎖及びＢ鎖又はそのアナログを含んでなる速効型単鎖インスリンアナログであって、このとき
a) ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５、Ｂ２６又はＢ２７のアミノ酸残基の一又は複数がＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、及び／又は、Ｂ２８がＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓであるか又は欠失しており、
b) ヒトインスリンＢ鎖の位置Ｂ１０のアミノ酸残基が、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ及びセリンからなる群から選択され、そして、
c) 場合によって位置Ｂ２２のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであり、
ただし位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＬｙｓである場合に、位置Ｂ２９のアミノ酸残基がＰｒｏであり、
速効型単鎖インスリンアナログを 
持効型アシル化ヒトインスリンアナログと混合して、好適なアジュバンド及び添加剤とともに含有してなる薬剤的製剤に関する。
【００２０】
一実施態様では、本発明は、位置Ｂ２２、Ｂ２５、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基がヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基がＧｌｎである、本発明に係る速効型単鎖インスリンアナログを、持効型アシル化ヒトインスリンアナログと混合して、好適なアジュバンド及び添加剤とともに含有してなる薬剤的製剤に関する。
更なる実施態様では、本発明は、位置Ｂ２２、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基がヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２５のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基がＧｌｎである、本発明に係る速効型単鎖インスリンアナログを、持効型アシル化ヒトインスリンアナログと混合して、好適なアジュバンド及び添加剤とともに含有してなる薬剤的製剤に関する。
【００２１】
更なる実施態様では、本発明は、位置Ｂ２２、Ｂ２５及びＢ２７のアミノ酸残基がヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２６のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基がＧｌｎである、本発明に係る速効型単鎖インスリンアナログを、持効型アシル化ヒトインスリンアナログと混合して、好適なアジュバンド及び添加剤とともに含有してなる薬剤的製剤に関する。
更なる実施態様では、本発明は、位置Ｂ２２、Ｂ２５及びＢ２６のアミノ酸残基がヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２７のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであるか又は欠失しており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基がＧｌｎである、本発明に係る速効型単鎖インスリンアナログを、持効型アシル化ヒトインスリンアナログと混合して、好適なアジュバンド及び添加剤とともに含有してなる薬剤的製剤に関する。
【００２２】
なお更なる実施態様では、本発明は、位置Ｂ２２、Ｂ２５、Ｂ２６及びＢ２７のアミノ酸残基がヒトＢ鎖のその位置での天然のアミノ酸であり、位置Ｂ２８のアミノ酸残基がＬｙｓであり、位置Ｂ２９のアミノ酸残基がＰｒｏであり、位置Ｂ１０のアミノ酸残基がＧｌｎである、本発明に係る速効型単鎖インスリンアナログを、持効型アシル化ヒトインスリンアナログと混合して、好適なアジュバンド及び添加剤とともに含有してなる薬剤的製剤に関する。
【００２３】
ある実施態様では、本発明は、本発明に係る単鎖インスリンアナログをＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)と混合して含有してなる製薬的組成物に関する。
他の実施態様では、本発明は、本発明に係る単鎖インスリンアナログをＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-グルタミル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリンと混合して含有してなる製薬的組成物に関する。
更なる実施態様では、本発明は、本発明に係る単鎖インスリンアナログをＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリンと混合して含有してなる製薬的組成物に関する。
【００２４】
本発明に係る製薬的調製物の代表的な実施態様は、以下のような混合物である。
Ｂ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)-Ａ(１-２１)ヒトインスリンと、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、
Ｂ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＧＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：４)-Ａ(１-２１)ヒトインスリンと、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、
Ｂ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)-Ａ(１-２１)ヒトインスリンと、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-グルタミル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、
Ｂ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＧＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：４)-Ａ(１-２１)ヒトインスリンと、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-グルタミル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、
Ｂ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)-Ａ(１-２１)ヒトインスリンと、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、そして、
Ｂ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＧＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：４)-Ａ(１-２１)ヒトインスリンと、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、哺乳動物における血中グルコースレベルを低減するため、特に糖尿病の治療のための、場合によって遅延型アシル化ヒトインスリンアナログと混合した製薬的調製物の調製における、本発明に係る速効型単鎖インスリンアナログの使用に関する。
更なる実施態様では、本発明は、治療を必要とする患者に、治療上活性な用量の本発明に係る速効型単鎖インスリンアナログを、場合によって遅延型アシル化ヒトインスリンアナログと混合して投与することによる、哺乳動物の血中グルコースレベルを低減する方法に関する。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明に係る単鎖インスリンは、二量体及び六量体の形成に影響を有するインスリン分子の特定の位置で修飾されており、本発明は、本発明に従って修飾されたこのような単鎖インスリンが、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-グルタミル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリン及びＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリンといった持効型アシル化インスリンと混合した場合に単量体であり速効型を維持するという驚くべき認識に基づいている。
本発明に係る単鎖インスリンアナログは、公知の２鎖の速効型インスリンと比較して安定性が高く、さらにこの速効型インスリン効果を失うことなく持効型アシル化インスリンと混合することが可能であることが示された。
【００２７】
本発明に係る単鎖インスリンと混合可能である持効型アシル化インスリンアナログはインスリン分子の様々な位置でアシル化されうる。ある態様では、インスリンは、インスリン分子のＢ鎖のある位置にＬｙｓ残基のεアミノ基、特にヒトインスリン分子のＢ２９リジン基のεアミノ基でアシル化されている。
アシル基は親油基であって、一般的に、およそ６〜およそ３２、より一般的には６〜２４、８〜２０、１２〜２０、１２〜１６、１０〜１６、１０〜２０、１４〜１８又は１４〜１６の炭素原子を含む脂肪酸部分であろう。脂肪酸の例は、カプリン酸、ラウリン酸、テトラデカン酸(ミリスチン酸)、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、及びテトラデカン酸である。また、アシル基は、ジカルボキシル脂肪酸から得てもよいし、リトコール酸であってもよい。
【００２８】
アシル基は、対象の遊離したアミノ基に直接付着しうる。しかしながらまた、アシル基は、インスリン分子の遊離アミノ基及び対象のアシル基をともに連結するリンカーによって、アミド結合を経て付着されうる。
アシル化されたインスリンは、ヒトインスリンと比較して１又は２の更なる陰性正味電荷を有してもよい。脂肪酸の遊離カルボン酸基によって、又は、少なくとも一の遊離カルボン酸又は中性ｐＨで負に荷電している基を含む一又は複数のアミノ酸残基を含みうるリンカー基によって、さらに負に荷電しうる。
【００２９】
アシル化インスリンアナログの非限定的な例は、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-ヘキサデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-ヘキサデカノイル)ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-ヘキサデカノイル-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-Ｇｌｕ))デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(ω-カルボキシヘプタデカノイル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(ω-カルボキシヘプタデカノイル))ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１３ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１５ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１６ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１７ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１８ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１３ＣＯ)-γ-Ａｓｐ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン、及びＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ａｓｐ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリンである。
【００３０】
単鎖インスリンとアシル化インスリンの混合能はゲル濾過試験で示される。その結果は図に示す。図１の上の曲線は、ゲル濾過においてインスリンデテミル十二量体がインスリンＳＣＩ-単量体の前に移動することを示す。ｕｖ追跡は、まずある大きさと量のインスリンデテミルとともにタンパク質が溶出されることを示す。インスリンデテミルの後に予想される大きさ及び濃度のＳＣＩ：ＴＧＬＧＳＧＫ[Ｂ１０ＱＢ２８ＥＡ１８Ｑ]単量体とともにタンパク質が溶出される。これより、２つのインスリンプールは互いに影響しないことが示唆される。単量体インスリンの速効性は、このインスリンが六量体又は他の凝集塊に集積しないという事実に基づいているので、単量体のインスリンが混合した後にゲル濾過において単量体であることが観察されるということから、インビボにおいても速効性であり、これによってインスリンデテミルと混合することが可能であることが示唆される。
図１の下の曲線は逆相ＨＰＬＣを示す。上記のゲル濾過の分画を回収し、インスリンデテミルとＳＣＩ：ＴＧＬＧＳＧＫ[Ｂ１０Ｑ Ｂ２８Ｅ Ａ１８Ｑ]を分離する逆相ＨＰＬＣにてインスリン量の特徴を示した。十二量体インスリンに相当するＵＶ追跡はインスリンデテミルからなり、単量体のＳＣＩ:ＴＧＬＧＳＧＫ[Ｂ１０Ｑ Ｂ２８Ｅ Ａ１８Ｑ]は単量体の分画においてのみ見られる。これはＵＶゲル濾過追跡の所見を裏付けるものである。
【００３１】
同様に、図２は、単鎖インスリンのアシル化したインスリンアナログであるＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-グルタミル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリンとの混合能を示す。
単鎖インスリンは、例えば欧州特許第１６９２１６８号に開示されるように、周知の技術によって適切な宿主細胞において対象の単鎖インスリンをコードするＤＮＡ配列を発現させることによって産生される。単鎖インスリンは、直接発現されるか、Ｂ鎖上のＮ末端伸展を有する前駆体分子として発現される。このＮ末端伸展は、直接発現された生成物の収率を増やす機能を有してもよいし、１５以下のアミノ酸残基長であってもよい。Ｎ末端伸展は、培養ブロスから単離した後にインビトロで切断されるものであり、したがってＢ１の隣に切断部位を有する。本発明において好適な種類のＮ末端伸展は、米国特許第５３９５９２２号及び欧州特許第７６５３９５号Ａに開示されている。
【００３２】
同様に、本発明に係る速効型単鎖インスリンと混合される遅延型アシル化インスリンないしはインスリンアナログを調製するためのインスリン前駆体生成物は、対象のインスリン前駆体の発現を可能にする条件下で対象のインスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞を培養することによって生産することができる。単離されたインスリン前駆体は、当分野で周知のように所望の位置でアシル化してもよく、このようなインスリンアナログの例は例えば公開特許である欧州特許第２１４８２６号、欧州特許第３７５４３７号及び欧州特許第３８３４７２号を含む欧州特許出願に記載されている。
それぞれのインスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えば、Beaucage等 (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869に記載のリン酸アミダイト法(phosphoamidite method)、又はMatthes等 (1984) EMBO Journal 3:801-805に記載の方法によって合成して調製されうる。リン酸アミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機にて合成し、精製し、二本鎖にし、ライゲーションして合成ＤＮＡコンストラクトを形成させる。ＤＮＡコンストラクトを調製する現在の好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によるものである。
【００３３】
また、ポリヌクレオチド配列はゲノム、ｃＤＮＡ及び合成起源のいずれであってもよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノムないしｃＤＮＡ配列をＡ鎖及びＢ鎖をコードするゲノムないしｃＤＮＡ配列に連結させて、その後、周知の手順による相同組み換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入するか、好ましくは好適なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって所望の配列を精製することによってある部位でＤＮＡ配列を修飾してもよい。
対象のインスリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を保持する選択された微生物又は宿主細胞において複製することが可能な組み換えベクターは、自己複製ベクター、すなわちその複製が染色体の複製から独立している染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニクロモソーム又は人工染色体であってもよい。ベクターは、確実に自己複製をさせるための任意の手段を含みうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合にゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体(一又は複数)とともに複製されるものであってよい。さらに、単一のベクターないしプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡをともに含む２以上のベクターないしプラスミド、又はトランスポゾンが使われてもよい。ベクターは、線形又は閉円形のプラスミドであってよく、宿主細胞のゲノムに安定してベクターを組み込むエレメント(一又は複数)、又はゲノムから独立して細胞内でベクターを安定して自己複製させるエレメント(一又は複数)を含んでもよいであろう。
【００３４】
一実施態様では、組み換え発現ベクターは酵母において複製することが可能である。酵母においてベクターを複製させる配列の例は、酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複製起点である。
ベクターは、形質転換した細胞の選別を容易にする一又は複数の選択可能なマーカーを含有しうる。選択マーカーは遺伝子であり、その遺伝子産物はバイオサイド又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを与えるものである。細菌性の選択マーカーの例は、枯草菌(Bacillus subtilis)あるいはバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に由来するdal遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、あるいはテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を与えるマーカーである。糸状菌宿主細胞において使用される選択マーカーには、ａｍｄＳ(アセトアミダーゼ)、ａｒｇＢ(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、ｐｙｒＧ(オロチジン-５'-リン酸デカルボキシラーゼ)、及びｔｒｐＣ(アントラニル酸シンターゼ)が含まれる。酵母宿主細胞に適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３である。酵母に非常に適した選択マーカーは、分裂酵母(Schizosaccharomyces pompe)のＴＰＩ遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
【００３５】
ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は好適なプロモーター配列に作用可能に連結する。プロモーターは、突然変異株、切断型、及びハイブリッドプロモーターを含む選択された宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、宿主細胞に対して相同性又は異種性の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得られてよい。
細菌性の宿主細胞において転写を促すために適切なプロモーターの例は、大腸菌ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(ｄａｇＡ)、枯草菌レバンスクラーゼ遺伝子(ｓａｃＢ)、バチルス・リケニホルミスα-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＬ)、バチルス・ステロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトゲニックアミラーゼ遺伝子(ａｍｙＭ)、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens) α-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＱ)、及びバチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(ｐｅｎＰ)から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞において転写を促すために適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーハエ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)中性α-アミラーゼ、及びアスペルギルス・ニガー酸安定α-アミラーゼである。酵母宿主において、有用なプロモーターは、酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ｍａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
【００３６】
また、典型的にはポリヌクレオチドコンストラクトは好適なターミネーターに作用可能に連結していてもよい。酵母において、適切なターミネーターはＴＰＩターミネーターである(Alber等 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)。
所望のインスリンポリペプチド、プロモーター及びターミネーターをそれぞれコードするＤＮＡなどの、発現ベクター内に含まれる個々のポリヌクレオチド配列をライゲートするため、ならびに選択された宿主における複製のために必要な情報を含む適切なベクターにそれらを導入するために使用される手順は、当業者に周知である。ベクターは、最初に本発明の単鎖インスリンをコードする全ＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを調製し、続いてこの断片を適切な発現ベクターに導入するか、又は経時的に個々のエレメント(例えば、シグナル、プロペプチド、連結ペプチド、Ａ鎖及びＢ鎖)に対する遺伝情報を含むDNA断片を導入し、その後ライゲーションすることにより構築されてよいと解される。
【００３７】
このようなポリヌクレオチド配列を含むベクターは、宿主細胞に導入され、ベクターを染色体組み込み又は前述のような自己複製染色体ベクターとして維持される。「宿主細胞」なる用語は、複製の間に生じる変異が原因で親細胞と同一でない親細胞のプロジェニーを包含する。宿主細胞は、例えば原核生物のような単細胞微生物、又は例えば真核生物のような非単細胞微生物であってよい。有用な単細胞細胞は、限定するものではないが、バチルス細胞、ストレプトマイセス細胞等のグラム陽性菌、又は大腸菌やシュードモナス属等のグラム陰性菌のような細菌性細胞である。真核細胞は、哺乳類、昆虫、植物、又は真菌の細胞であってよい。好ましい実施態様では、宿主細胞は酵母細胞である。本発明の方法で用いられる酵母生物体は、培養の際に大量の本発明の単鎖インスリンを産生する任意の適切な酵母生物体であってよい。適切な酵母生物体の例は、酵母種であるサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロマイセス・ウバルム(Sacchoromyces uvarum)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・クルイベリ(Pichia kluyveri)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ属、カンジダ・ユティリス(Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、ジオトリカム属、及びジオトリカム・ファーメンタンス(Geotrichum fermentans)から選択される菌株である。
【００３８】
酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形成により影響を受け、続いてそれ自体既知の方法で形質転換されてよい。細胞を培養するために使用される培地は、酵母生物体の培養に適した任意の従来の培地であってよい。分泌されたインスリンポリペプチドは、正確にプロセシングされた形態で、培地中に有意な割合で存在すると思われるが、遠心分離、濾過、イオン交換マトリックスもしくは逆相吸収マトリックスによるインスリン前駆体の捕捉により酵母細胞を培地から分離し、硫酸アンモニウムのような塩により、上清もしくは濾過のタンパク質成分を沈殿させ、続いて、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー等の種々のクロマトグラフィー手法により精製することを含んでなる従来の方法により培地から回収されてよい。
【００３９】
製薬的組成物
本発明の本発明の単鎖インスリンを場合によって遅延型アシル化インスリンアナログと混合して含有する組成物は、インスリンに対して感受性がある状態の治療において使用され得る。したがって、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病、ならびに例えば重篤なけがをした人及び主要な手術を経験した人においてしばしば見られる高血糖の治療において使用され得る。任意の患者に適する用量レベルは、用いる特定のインスリン誘導体の効力、患者の年齢、体重、身体活性、及び食事、他の薬剤との可能な組み合わせ、ならびに治療されるべき状態の重症度を含む種々の因子に依存するであろう。本発明のインスリンアナログの一日量は、既知のインスリン組成物に対してと同様に当業者により個々の患者に対して決定されることが推奨される。
通常、本発明の製薬的組成物は皮下に投与される。しかしながらまた、組成物は、インスリンポンプに用いられてもよいし、肺の(pulmunal)投与のために調製されてもよい。
【００４０】
製薬的組成物は、通常のアジュバント及び添加剤を含有するであろうし、好ましくは水溶液として調製される。水溶媒質は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグリセロールによって等張性にされる。さらに、水溶媒質は、亜鉛イオン、バッファ及び防腐剤を含有してもよい。組成物のｐＨ値は所望の値に調整され、対象の単鎖インスリンの等電点(ｐＩ)に応じて、およそ４〜およそ８．５、好ましくは７〜７．５であってもよい。
単鎖インスリンアナログとアシル化された持効型インスリンは、およそ１０／９０％、およそ３０／７０％、又はおよそ５０／５０％の比率で混合されうる。 
一実施態様では、持効型のアシル化されたインスリンと速効型の単鎖インスリンとの製薬的なモル比は２／１より大きい。
【００４１】
本発明に係る製薬的調製物に用いられるバッファは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はこれらの混合物から選択されてもよい。これら特定のバッファのそれぞれは本発明の別の実施態様を構成する。
薬学的に許容可能な保存剤は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、メチルｐ-ヒドロキシベンゾエート、プロピルｐ-ヒドロキシベンゾエート、２-フェノキシエタノール、ブチルｐ-ヒドロキシベンゾエート、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミドウレア、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルp-ヒドロキシベンゾエート、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(３ｐ-クロロフェノキシプロパン-１,２-ジオール)、又はこれらの混合物から選択されうる。本発明の更なる実施態様では、前記保存剤は０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、前記保存剤は０.１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、前記保存剤は５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、前記保存剤は１０ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の防腐剤のそれぞれは本発明の別の実施態様を構成する。製薬的組成物における防腐剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
【００４２】
等張化剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖ないしは糖アルコール、アミノ酸(例えば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はこれらの混合物から選択されうる任意の糖、例として単糖、二糖ないしは多糖、又は水溶性グルカン、例えばフラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、水溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａが、使われてもよい。一実施態様では、糖添加物はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも１の-ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクシトール、ダルシトール、キシリトール、及びアラビトールが含まれる。一実施態様では、糖アルコール添加物はマンニトールである。前述の糖ないし糖アルコールが、別々に、又は、ともに用いられてもよい。糖ないし糖アルコールが液体製剤中に溶解可能であり、本発明の方法を用いて達成される安定化効果に負の影響を及ぼさない限り、使用される量に対する制限はない。一実施態様では、糖ないし糖アルコール濃度は、およそ１ｍｇ／ｍｌからおよそ１５０ｍｇ／ｍｌの間である。本発明の更なる実施態様では、前記等張化剤は１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、前記等張化剤は１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、前記等張化剤は８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、前記等張化剤は２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の等張化剤のそれぞれは本発明の別の実施態様を構成する。製薬的組成物の等張化剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
【００４３】
単鎖インスリンは、一般構造Ｂ-Ｃ-Ａのポリペプチド配列を意味し、ここでのＢは、ヒトＢインスリン鎖又はそのアナログないしはその誘導体であり、Ａは、ヒトインスリンA鎖又はアナログないしは誘導体であり、Ｃは、Ｂ鎖におけるＣ末端アミノ酸残基(通常Ｂ３０)とＡ１とを連結する６〜１０アミノ酸残基のペプチド鎖である。Ｂ鎖がデスＢ３０鎖である場合、連結ペプチドはＢ２９とＡ１を連結してよい。単鎖インスリンは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７の間、ＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９の間であるヒトインスリン、及びＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１の間の内部ジスルフィド架橋のように正しく位置したジスルフィド架橋(３つ)を含んでよい。
「ＳＣＩ」は単鎖インスリンを意味する。
【００４４】
Ｂ鎖のアナログは、Ｂ１のアミノ酸残基がＡｓｐ又はＧｌｙのような他のアミノ酸残基によって置換されるか又は欠失しているものでもよい。また、位置Ｂ３のＡｓｎは、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐによって変異してもよい。Ｂ鎖のアナログの更なる例は、Ｂ３０アミノ酸残基が欠失しているものである。また、Ｂ鎖はＮ末端伸展を含んでもよい。
Ａ鎖のアナログは、位置Ａ１８のアミノ酸残基がＧｌｎなどの他のアミノ酸残基によって置換されるものでもよい。また、位置２１のＡｓｎはＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ、好ましくはＧｌｙによって変異してもよい。最後にＡ鎖はＣ末端伸展を含んでもよい。
【００４５】
デスＢ３０又はＢ(１-２９)は、Ｂ３０アミノ酸残基を欠いている天然のインスリンＢ鎖又はそのアナログを意味し、Ａ(１-２１)は、天然のインスリンＡ鎖又はそのアナログないしはその誘導体を意味する。アミノ酸残基は、３文字のアミノ酸コード又は１文字のアミノコードで示される。
Ｂ１、Ａ１等は、インスリンのＢ鎖における１位のアミノ酸残基(Ｎ末端から数えて)及びインスリンのＡ鎖における１位のアミノ酸残基(Ｎ末端から数えて)をそれぞれ意味する。
【００４６】
単鎖インスリンアナログは主に以下の規則に従って名づけられる。配列は、Ｂ鎖から始まり、Ｃ-ペプチドに続き、Ａ鎖で終わる。アミノ酸残基はヒトインスリンのそれぞれの相対物にちなんで名付けられ、変異は明確に記載され、Ａ鎖及びＢ鎖の変異していないアミノ酸残基は明記されない。例えば、ヒトインスリンと比較してＡ２１Ｇｌｙ、Ｂ３Ｇｌｎ、Ｂ１０Ｇｌｎ、Ｂ２８Ｇｌｕ、Ａ１８Ｇｌｎ及びデスＢ３０の突然変異を有し、Ｃ末端Ｂ鎖とＮ末端Ａ鎖を連結するＣ-ペプチドＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)を含んでなるインスリンは、Ｂ(１-２９)-Ｂ３Ｇｌｎ-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｇｌｎ-Ａ２１Ｇｌｙヒトインスリンと名付けられる。
本明細書において用いられる場合の「単量体インスリン」なる用語は、ヒトインスリンより自己会合(self-association)(二量体及び六量体に)の傾向が低いヒトインスリンアナログを指す。
【００４７】
速効型インスリンは、正常又は標準的なヒトインスリンよりも作用開始が速いインスリンを意味する。
持効型インスリンは、正常又は標準的なヒトインスリンよりも作用の持続時間が長いインスリンを意味する。
インスリンレセプター及びＩＧＦ-１レセプター親和性を有するポリペプチドは、適切な結合アッセイにおいてインスリンレセプター及びヒトのＩＧＦ-１レセプターと相互に作用することが可能であるポリペプチドである。
【００４８】
「ＰＯＴ」は分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、「ＴＰＩ１」は出芽酵母(S. cerevisiae)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
「リーダー」は、プレペプチド(シグナルペプチド)及びプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
「シグナルペプチド」なる用語は、タンパク質の前駆体形態上のＮ末端配列として存在するプレペプチドを意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は、異種性タンパク質が小胞体に移行するのを促進することである。シグナルペプチドは、通常、この方法の過程で切断される。シグナルペプチドは、タンパク質を産生する酵母生物体に対して異種性又は相同性であってよい。本発明のＤＮＡコンストラクトと共に用いられうる多くのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド又は任意の機能的アナログ(Egel-Mitani等 (1990) YEAST 6:127-137及び米国特許第5726038号)、ならびにＭＦα１遺伝子のα-因子シグナル(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern等, eds.中のThorner (1981), pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY及び米国特許第487000号)が含まれる。
【００４９】
「プロペプチド」なる用語はポリペプチド配列を意味し、その機能は、発現したポリペプチドを小胞体からゴルジ体へと向けさせること、さらに培養培地への放出のために分泌小胞へと向けさせることである(すなわち、ポリペプチドの細胞壁を横切る又は少なくとも細胞膜を通した酵母細胞の細胞膜周辺腔への移出である)。プロペプチドは、酵母α-因子プロペプチドであってよく、米国特許第４５４６０８２号及び同第４８７０００８号を参照されたい。あるいは、プロペプチドは合成プロペプチド、すなわち天然には見られないプロペプチドであってよい。適切な合成プロペプチドは、米国特許第５３９５９２２号、同第５７９５７４６号、同第５１６２４９８号及び国際公開第９８/３２８６７号に開示されているものであるプロペプチドは、好ましくは、Ｌｙｓ-Ａｒｇ配列又はその機能的なアナログのように、Ｃ末端にエンドペプチダーゼプロセシング部位を含むであろう。
【００５０】
本明細書において、アミノ酸の３文字又は１文字表示は、以下の表に示すようにその従来の方法で使用される明確に示されない限り、本明細書において言及されるアミノ酸はＬアミノ酸である。さらに、ペプチドのアミノ酸配列の左端及び右端は、指定しない限り、それぞれN末端及びC末端である。 
アミノ酸の略号
2009527526.tif 000003
【００５１】
本発明は以下の実施例にさらに詳細に記載されており、これらの実施例は特許請求の範囲としてあげられる本発明の権利範囲を限定するものではない。添付の図は、明細書及び本発明の説明の不可欠な部分として認識されるものである。本明細書中に示した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、その全体ならびに各参考文献が個々にかつ具体的に出典明記によって援用されることが示され、その全体がここに示されているのと同じ範囲で、本明細書の一部として援用される(法律により許容される最大限の範囲)。
項目及び副項目は、便宜上のためのみに使用され、本発明を限定するように解釈されるべきでない。
本明細書中における例又は例示的な言葉（「例えば」及び「〜のような」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、示さない限り本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の記載は、権利請求されていないあらゆる要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
特許書類の引用及び援用は、ここでは便宜的にのみなされ、そのような特許書類の妥当性、特許性、及び／又は実施可能性の見解を示すものではない。
本発明には、適用可能な法律により許容される場合、添付する特許請求の範囲に挙げる内容の修飾及び均等物が含まれる。
【実施例】
【００５２】
一般的な手順 
すべての発現プラスミドは、Ｃ-ＰＯＴの種類のものであり、欧州特許第１７１１４２号に記載のものと類似しており、出芽酵母(S. cerevisiae)中での安定性及びプラスミド選別の目的で分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(ＰＯＴ)を含有することを特徴とする。また、プラスミドは、出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーターを含有する。これらの配列は、リーダーとインスリン生成物の融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片の配列を除くすべての配列が、プラスミドｐＫＦＮ１００３(国際公開第９０／１０００７５号に記載)の対応配列と類似している。異なる融合タンパク質を発現させるために、ｐＫＦＮ１００３のＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片は、単に対象のリーダー-インスリン融合をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片によって置換する。このようなＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片は、標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲと用いて合成してもよい。
【００５３】
酵母形質転換体は、宿主株として出芽酵母株ＭＴ６６３ (ＭＡＴａ／ＭＡＴα ｐｅｐ４-３/ｐｅｐ４-３ ＨＩＳ４/ｈｉｓ４ ｔｐｉ::ＬＥＵ２／ｔｐｉ：ＬＥＵ２ Ｃｉｒ＋)を形質転換して調製した。酵母株ＭＴ６６３は、国際公開第92/11378号の出願に関連して、寄託番号ＤＳＭ６２７８としてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託された。
【００５４】
ＭＴ６６３はＹＰＧａＬ(１%バクト酵母抽出物、２%バクトペプトン、２%ガラクトース、１%ラクトース)にて０．６のＯＤ６００ｎｍまで生育した。１００ｍｌの培養物は、遠心分離にて回収し、１０ｍｌの水にて洗浄し、再び遠心分離して、１．２Ｍ ソルビトール、２５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌ ジチオトレイトールを含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁した。懸濁液を３０℃で１５分インキュベートして、遠心分離し、細胞を１．２Ｍ ソルビトール、２５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．８、及び２ｍｇ Ｎｏｖｏｚｙｍ(登録商標)２３４を含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁した。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、細胞を遠心分離にて回収し、１０ｍｌの１．２Ｍ ソルビトール及び１０ｍｌのＣＡＳ(１．２Ｍ ソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリスＨＣｌ(トリス＝トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン) ｐＨ＝７．５)にて洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁した。形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ-懸濁細胞を、およそ０．１ｍｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温に１５分間放置した。１ｍｌの(２０％ ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ＝７．５)を加えて、混合物を室温にさらに３０分間放置した。混合物を遠心分離し、ペレットを０．１ｍｌのＳＯＳ(１.２ Ｍ ソルビトール、３３% ｖ/ｖ ＹＰＤ、６.７ｍＭ ＣａＣｌ２)に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。その後、懸濁物を遠心分離して、ペレットを０．５ｍｌの１．２Ｍ ソルビトールに再懸濁した。その後、６ｍｌのトップアガー(１．２Ｍ ソルビトールと２．５％アガーを含有するSherman等 (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor LaboratoryのＳＣ培地)を５２℃で加え、同じ寒天凝固のソルビトール含有培地を含むプレートの上に懸濁物を注いだ。
発現プラスミドにて形質転換した出芽酵母株ＭＴ６６３は、ＹＰＤにて３０℃で７２時間生育した。
【００５５】
実施例１
以下の速効型インスリンアナログを試験した。
Ｂ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号)-Ａ(１-２１)-Ａ18Ｇｌｎヒトインスリン(化合物Ａ)及び、Ｂ(１-２９)-Ｂ1Ｇｌｙ-Ｂ３Ｇｌｎ-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号)-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｇｌｎ-Ａ２１Ｇｌｙヒトインスリン(化合物Ｂ)。
速効型単鎖アナログは、単独又は以下の遅延型インスリンと組み合わせて試験した。ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)(化合物Ｃ)、ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-グルタミル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリン(化合物Ｄ)及び、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン(化合物Ｅ)。
【００５６】
インスリンアナログ及びインスリンアナログの組合せの移動は、下記の標準物質に関して測定した。各試料の組合せについて理論上の移動パターンを各アナログ単独の移動パターンから算出した。
試験混合物は、従来の製薬的アジュバント及び添加剤にて調製した。すべての混合物は、１６／１６ｍＭのフェノール／クレゾールにて調製した。酢酸亜鉛として様々な量の亜鉛を加えた。ｐＨは７．５とした。速効型ＳＣＩアナログは、いずれかの成分について１５％より多く理論的な値と異なっていると、持効型インスリンと混合することができる。
結果を以下の表に示す。
【００５７】
表１
2009527526.tif 000004
2009527526.tif 000005
【００５８】
薬理学的方法
生化学方法
アッセイ(I)
サイズ排除クロマトグラフィ(ＳＥＣ)は基本的にHavelund等 2004 Pharmaceutical research, 21, 1498-1504に記載のように行った。クロマトグラフィシステムは、３７℃のトリス緩衝等張生理食塩水(ＮａＣｌ １４０ｍＭ、トリス／ＨＣｌ １０ｍＭ、ＮａＮ３ ０．０１%、ｐＨ７．５)、１％のカラム容量を注入し、カラム容量当たり９０分の流速を用いて溶出したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＲ ＰＣ ６/３０カラム(GE healthcare)と２７６ｎｍのＵＶ検出であった。参照物質は、安定インスリン単量体インスリンＸ２(ＡｓｐＢ９、ＧｌｕＢ２７ヒトインスリン、亜鉛フリー)、安定六量体インスリン：Ｃｏ(III)インスリン、アルブミン(ＨＳＡ)及び共有結合性アルブミン(溶液中で形成)とした。
【００５９】
アッセイ(II)
単鎖インスリンのインスリンレセプター結合
ヒトインスリンレセプターの単鎖インスリンの親和性は、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕獲アッセイにて測定することができる。ＳＰＡ-ＰＶＴ抗体-結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号ＰＲＮＱ００１７)を２５ｍｌの結合バッファ(１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７.８；１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０.０２５% Ｔｗｅｅｎ-２０)と混合する。単一Ｐａｃｋａｒｄ Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ(Packard番号６００５１９０)用の試薬混合物は、２．４μｌの１：５０００に希釈した精製した組み換えヒトインスリンレセプター-エクソン１１、１００μｌの試薬混合物当たり５０００ｃｐｍに相当するＡ１４ Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-ヒトインスリンのある量の貯蔵溶液、１２μｌの１：１０００に希釈したＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ-ビーズ及び総量を１２ｍｌにする結合バッファからなる。次いで、総量１００μｌを加え、希釈物を適当な試料から作製する。１００μｌの試薬混合物を希釈物に加え、試料をゆっくりと撹拌しながら１６時間インキュベートする。次いで、この相を１分間遠心分離して分離し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔｅｒにて計数する。結合データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ２.０１(GraphPad Software, San Diego, CA)に非線形回帰アルゴリズムを用いてフィッティングする。
【００６０】
アッセイ(III)
あるいは、以下のようなｈＩＲＢＨＫメンブランアッセイにおいてインスリンレセプター結合を試験してもよい。 
メンブラン結合組み換えヒトインスリンレセプターアイソフォームＡ(ｈＩＲ-Ａ)に対する[１２５Ｉ]-ヒトインスリンの結合
試薬：
１２５Ｉ-インスリン：Novo Nordisk A/S、モノ１２５Ｉ-(Ｔｙｒ Ａ１４)ヒトインスリン
ヒトインスリン：Novo Nordisk A/S、
ヒト血清アルブミン：Dade Behring、ＯＲＨＡ １９４ Ｃ３０、ロット４５５０７７
プラスチック製品：Ｐａｃｋａｒｄ ＯｐｔｉＰｌａｔｅＴＭ-９６、#６,００５,２９０
Scintillant：Amersham Biosciences、ＷＧＡコートＰＶＴミクロスフィア、＃ＲＰＮＱ０００１
細胞：組み換えヒトインスリンレセプターアイソフォームＡ(ｈＩＲ１２-１４)を発現するＢＨＫ ｔｋ−ｔｓ１３細胞。
【００６１】
メンブラン-結合インスリンレセプターの抽出：ten-layer cell factoryのＢＨＫ細胞を回収し、２５ｍｌの氷冷バッファ(２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、２.５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍｇ/ｌ バシトラシン、０.１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ)中でホモジナイズする。ホモジネートは、４１％のスクロースクッション上に慎重に重ね、４℃のベックマンＳＷ２８ローターにて９５０００×ｇで７５分間、超遠心器にて遠心分離する。細胞膜は、スクロースクッションの上部から回収し、バッファにて１:４に希釈し、ベックマンＳＷ２８ローターにて４００００×ｇで４５分間、遠心分離した。ペレットをバッファ(２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、２.５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍｇ/ｌ バシトラシン、０.１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ)に懸濁して、−８０℃に保存した。
メンブラン結合インスリンレセプターへの放射性リガンドの結合を９６ウェルのＯｐｔｉＰｌａｔｅ中で２通り行う。メンブランタンパク質を、全量２００ｍｌのアッセイバッファ(５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０.０１% Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、０.１% ＨＳＡ、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ-フリープロテアーゼインヒビター)中の５０ｐＭ [１２５Ｉ-ＴｙｒＡ１４]-ヒトインスリンと漸増濃度のヒトインスリンないしはインスリンアナログ(一般的には０．０１と３００ｎＭの間)とともに２５℃で１５０分間インキュベートする。アッセイは、５０μｌのＷＧＡコートＰＶＴミクロスフィア(２０ｍｇ／ｍｌ)の懸濁液を添加して終わらせる。５分間わずかに撹拌した後、プレートを１５００ＲＰＭで６分間遠心分離し、結合した放射性活性を６０分後にＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴにてカウントすることによって定量化する。
結果は、％のヒトインスリンと関連してＩＣ５０として示す。
【００６２】
アッセイ(IV)
ヒトインスリンと比較した場合の単鎖インスリンアナログの能力 
静注ボーラス投与後のＳＣＩの血中グルコース低有効性を試験するためにウィスターラットを用いる。ＳＣＩ及びヒトインスリンのいずれかを投与した後、血中グルコースの濃度をモニターする。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＬｙｓＢ２９(Ｎε-テトラデカノイル)デス(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)と混合したＢ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｇｌｎヒトインスリン(ＳＣＩ：ＴＧＬＧＳＧＫ(図のＢ１０ＱＢ２８ＥＡ１８Ｑ)を示す)のゲル濾過と、ゲル濾過から回収した分画のＲＶＰ(逆相)分析及びゲル濾過分画中のインスリン凝集塊の逆相ＨＰＬＣ識別を示す。
【図２】ＬｙｓＢ２９(Ｎε-(Ｎ-リトコールイル-γ-グルタミル))デス(Ｂ３０)ヒトインスリンと混合したＢ(１-２９)-Ｂ１０Ｇｌｎ-Ｂ２８Ｇｌｕ-ＴＧＬＧＳＧＫ(配列番号：３)-Ａ(１-２１)-Ａ１８Ｇｌｎヒトインスリン(ＳＣＩ：ＴＧＬＧＳＧＫ(図のＢ１０ＱＢ２８ＥＡ１８Ｑ)を示す)のゲル濾過と、ゲル濾過から回収した分画のＲＶＰ分析及びゲル濾過分画中のインスリン凝集塊の逆相ＨＰＬＣ識別を示す。
【図１】
2009527526.tif 000007
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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