(57)【要約】  神経変性疾患もしくは病態は、脳脊髄液の試料を取得し、および、該試料を検査し、レベルの上昇が神経変性疾患もしくは病態と相関する少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体またはニトロシル化抗体の試料における存在を検出することによって診断される。または、第１の試料を検査して、選択された特異性を有する少なくとも１種類の自己抗体のレベルを決定し、第２の試料を酸化剤で処理し、酸化された第２の試料を検査して、選択された特異性を有する少なくとも１種類の自己抗体のレベルを決定し、および、第１の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルと酸化された第２の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルとを比較することによって、第１の試料におけるレベルと比較した、酸化された第２の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルの増加の欠如が、神経変性疾患もしくは病態と相関する。
2009527762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法であって、
被検体由来の脳脊髄液の試料を得る工程、および
試料を、ＩｇＧアイソトープの少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体の存在に関して検査する工程
を含み、少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体のレベルの上昇が、該被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関関係がある方法。
【請求項２】
前記抗リン脂質自己抗体が、抗カルジオリピン、抗ホスファチジルコリン、抗ホスファチジルエタノールアミンもしくは抗ホスファチジルセリンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記自己抗体が抗カルジオピリンである請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記被検体が、神経変性疾患もしくは病態の身体的徴候または認知的徴候を呈しているとして選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記被検体が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病もしくは多重硬化症の身体的徴候または認知的徴候を呈しているとして選択される請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記被検体が、アルツハイマー病の身体的徴候または認知的徴候を呈しているとして選択される請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記被検体が、少なくとも１種類の神経変性疾患もしくは病態の家族歴をもつ請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記被検体が、アルツハイマー病の家族歴をもつ請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記被検体が、少なくとも１種類の神経変性疾患もしくは病態の家族歴をもち、かつ該神経変性疾患もしくは病態の家族のメンバーが発症した平均年齢であるか平均年齢を超えている請求項１記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体のレベルの上昇が、基準値と相対的に決定される請求項１記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体のレベルの上昇が、基準値と相対的に決定され、かつ該基準値が、コントロール個体群における少なくとも１種類の自己抗体のレベルの平均値または中間値である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
一定期間にわたって、被検体における神経変性疾患もしくは病態の発症または進行をモニタリングする方法であって、
一定期間の始めに請求項１記載の方法を実施し、およびついで、その後の時点で該方法を少なくとも一回繰り返して実施することを含む方法。
【請求項１３】
被検体における神経変性疾患もしくは病態を診断する方法であって、
被検体由来の脳脊髄液の試料を得る工程、
ニトロシル化抗体を検出するため該試料を検査する工程、
を含み、ニトロシル化抗体のレベルの上昇が、該被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関関係にある方法。
【請求項１４】
前記ニトロシル化抗体を検出するための試料の検査工程が、ニトロシル化チロシン残基またはトリプトファンアミノ酸残基を有する抗体を検出する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ニトロシル化抗体を検出するための試料の検査工程が、ニトロチロシン残基を有する抗体を検出する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法であって、
被検体由来の脳脊髄液の試料の第１の部分を、少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体の存在に関して検査する工程、
該試料の第２の部分を、ニトロシル化抗体の存在に関して検査する工程
を含み、該試料の該第１の部分における少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体のレベルの上昇、または該第２の部分におけるニトロシル化抗体のレベルの上昇、またはその両方が、前記被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関関係にある方法。
【請求項１７】
被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法であって、
選択された特異性を有する少なくとも１種類の自己抗体のレベルを決定するため、該被検体由来の脳脊髄液の第１の試料を検査する工程、
脳脊髄液の第２の試料を酸化剤で処理する工程、および
該選択された特異性を有する自己抗体のレベルを決定するため、酸化された第２の試料を検査し、そして酸化された第２の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルと、第１の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルとを比較する工程
を含み、第１の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルと比較して、酸化された第２の試料における少なくとも１種類の自己抗体の増加の欠如が、該被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関関係にある方法。
【請求項１８】
前記選択された特異性を有する少なくとも１種類の自己抗体が、抗リン脂質自己抗体である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記選択された特性を有する少なくとも１種類の自己抗体が、抗カルジオリピン、抗ホスファチジルコリン、抗ホスファチジルエタノールアミンまたは抗ホスファチジルセリンである請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記酸化剤が起電力である請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記自己抗体が抗カルジオリピンである請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記被検体が、神経変性疾患もしくは病態の身体的徴候または認知的徴候を呈しているとして選択される請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病もしくは多重硬化症の身体的徴候または認知的徴候を呈しているとして選択される請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体が、アルツハイマー病の身体的徴候または認知的徴候を呈しているとして選択される請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
前記被検体が、少なくとも１種類の神経変性疾患もしくは病態の家族歴をもつ請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
前記被検体が、アルツハイマー病の家族歴をもつ請求項１７記載の方法。
【請求項２７】
前記被検体が、少なくとも１種類の神経変性疾患もしくは病態の家族歴をもち、かつ該神経変性疾患もしくは病態をもつ家族のメンバーが発症した平均年齢であるか平均年齢を超えている請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
一定期間にわたって、被検体における神経変性疾患もしくは病態の発症または進行をモニタリングする方法であって、
一定期間の始めに請求項１７記載の方法を実施し、およびついで、その後の時点で該方法を少なくとも一回繰り返して実施することを含む方法。
【請求項２９】
前記抗リン脂質自己抗体が、ＩｇＧアイソタイプである請求項１８記載の方法。
【請求項３０】
前記抗リン脂質自己抗体が、ＩｇＧアイソタイプである請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患または病態を検出または診断する方法に関する。詳しくは、本発明の態様は、自己抗体の有無を決定するため被検体の脳脊髄液を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病などの神経変性疾患または病態の診断における継続的問題として、身体病理学の決定的指標を提供する信頼性の高いバイオマーカーの考案が求められてきた。典型的には、神経変性疾患は、行動、認知障害の徴候および様々な形態の放射線画像処理に基づいて診断が行われているが、確定診断は病理解剖によってしか得ることができない。
【０００３】
さらに、神経変性疾患の原因は、いまだ謎であり、神経変性疾患が存在している可能性を示す早期警告を与える徴候を探し出すための生物学的要因がどのようなものであるかを把握することが困難となっている。脳組織の死後分析は、神経変性疾患における金属イオンの関り合いを示唆しているようである。これらの疾患に関連するタンパク質は、それらの正常な機能の一環として金属に結合するが、神経変性疾患では、何らかの要因により金属の周囲にタンパク質が正しく折り畳まれるのが阻害されるので、酸化還元反応に関与し得る遷移金属部位の存在が明らかとなっている。このような展開により、軽度から重篤なアミロイド血管症が発症する。
【０００４】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびスクレイピーなどの神経変性疾患では、酸化的修飾が生じ、病理学的病変を発生させる。たとえば、チロシンのニトロ化は、アルツハイマー病の脳やＡＬＳに認められる最も初期のマーカーの１つである。（Ischiropoulos, I. & Beckman, JS. “Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: cause, effect, or association?” J. Clin. Invest. 2003; 111: 163-69.）中枢神経系でチロシンのニトロ化に関わる可能性がもっとも高いオキシダントの１つは、過酸化亜硝酸塩（peroxynitrite）と呼ばれる、スーパーオキシドと反応する一酸化窒素に由来する。（Smith, MA, et al. “Widespread peroxynitrite-mediated damage in Alzheimer's disease.” J. Neuroscience. 1997; 17: 2653-57）
【０００５】
本発明者は、健常な個体由来の血液および他の体液には、酸化剤で処理した場合に自己抗原と結合することができるようになる、相当数の抗体が含まれているという発見について、かつて報告した。たとえば、以下の文献を参照されたい。
【０００６】
Mclntyre, JA. “The appearance and disappearance of antiphospholipid antibodies subsequent to oxidation-reduction reactions.”Thromb. Res. 2004; 114: 579-87.
Mclntyre, JA. Wagenknecht, DR, & Faulk, WP. “Autoantibodies unmasked by redox reactions.”J. Autoimmun 2005; 24: 311-17.
Mclntyre, JA. Wagenknecht, DR, & Faulk, WP. “Redox-reactive autoantibodies: Detection and physiological relevance.”Autoimm. Rev. 2006; 5: 76-83. および米国特許出願公開第２００５／０１０１０１６号明細書。
【０００７】
これら刊行物の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
このような自己抗体は、酸化剤で血液もしくは他の体液を処理し、次いでスクリーニングアッセイを用いて自己抗原に結合する抗体を検出することによって検出することができる。このような自己抗体は、多種多様なアイソタイプおよび特異性の下に、血液もしくは他の体液中に存在しているということが明らかとなっている。さらに、自己抗体は、酸化条件下で処理された精製もしくは分画化免疫グロブリン組成物内でも検出できることが明らかにされている。健常な個体由来の血液もしくは他の体液中、または酸化工程なしで健常な個体からプールした免疫グロブリン組成物中には、最低基準値より高いレベルの自己抗体は検出されず、このような特性を有する抗体または自己抗体を「マスク」抗体または「マスク」自己抗体として本明細書で表しており、酸化条件下で血液もしくは他の体液または免疫グロブリン調製物を処理するプロセスを、マスク抗体またはマスク自己抗体の「脱マスク」として本明細書で表わしている。酸化還元条件に依存して、マスクもしくは脱マスクとなる特性を備える抗体は、「酸化還元抗体」として本明細書に表されている場合もある。
【０００９】
今日までに、健常な個体の血液中で検出されたマスク自己抗体には下記がある。
表：今日までに、健常な血漿もしくはＩｇＧの酸化還元転位後に特定されたマスク自己抗体
酸化還元反応自己抗体の最新リスト*
抗リン脂質抗体、ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥ、ａＰＣ、ループス性抗凝固因子（ＬＡ）
抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）
抗チロシンホスファターゼ（ＩＡ−２）
抗核抗体（ＡＮＡ）
抗細胞小器官：核小体、ラミン（lamin）、ゴルジ体など
抗顆粒球：好中球、単球
抗Ｂリンパ球
抗ミエロペルオキシダーゼ
抗腫瘍細胞系：Ｒａｊｉ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ８７ＭＧ、Ｋ５６２
抗栄養膜および栄養基底膜（ＴＢＭ）
抗因子VIII
抗ＰＦ４／ヘパリン複合体
抗β2糖タンパク質Ｉ
抗ＲＢＣ（広範にわたる反応性）
*他の特異性も、更なる試験に基づき予測される。
使用した表中の簡略記号
ａＣＬ、抗カルジオリピン
ａＰＣ、抗ホスファチジルコリン
ａＰＥ、抗ホスファチジルエタノールアミン
ａＰＳ、抗ホスファチジルセリン
ＡＰＰＴ、活性化部分トロンボプラスチン時間
ｄＲＶＶＴ、希釈ラッセルクサリヘビ蛇毒時間
ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法
【００１０】
抗体の超可変領域内およびその周辺におけるチロシン残基のニトロシル化が、抗体のマスク化および脱マスク化のための潜在的メカニズムであり得るということを、本発明者は示唆している。ニトロ化における変化は、抗体の結合特異性の改変をもたらす抗体結合部位における構造変化を生じさせると考えられる。このような理論を検証するため、ＩｇＧのヘミン処理試料とヘミン未処理試料とをニトロ化チロシンに関して検査し、ヘミンに曝露した後に有意なＩｇＧニトロシル化が存在することを明らかにした。上述の、Mclntyre, J. Autoimmunを参照されたい。
【００１１】
健常な個体に存在するマスク自己抗体は、健常な個体に対しては害をなさず、いまだ未知の有益な役割さえも担う可能性があると考えられている。しかし、生理的酸化反応を介して生じ得る、体内で脱マスク化する自己抗体は、自己免疫疾患においてある種の役割を果たすと考えられている。
【００１２】
本発明者は、健常な個体から採取した脳脊髄液の試料におけるマスク自己抗体の発見についても報告している。米国特許出願番号第１１／１０８，８２６号明細書；Sokol, DK, Wagenknecht, DR & Mclntyre, JA. “Testing for antiphospholipid antibody (aPL) specificities in retrospective“ normal”cerebral spinal fluid (CFS)”. Clin. Develop. Immunol. 2004; 11: 7-12を参照されたい。血中で検出される自己抗体と同様に、健常な個体由来の脳脊髄液中の自己抗体は、酸化条件下で脳脊髄液試料を酸化剤または起電力の使用によって処理し、次いでスクリーニング検査を用いて自己抗原と結合する抗体を検出することによって驚くほど大量に検出することができる。酸化条件に付されていない健常な個体から採取した脳脊髄液中では、このような自己抗体のレベルは最低基準より高くは検出されない。さらに、マスク形態で、健常な個体の脳脊髄液中に存在し得る自己抗体が、個体にとって有害とはならず、いまだ未知の有益な役割を果たす可能性があるということが考えられるが、その一方で、自己抗体は、脳脊髄液中で脱マスク化した場合には、損傷を与えうるということも明らかである。このような結果から、自己抗体は、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患に関与し得、これらの疾患は、脳脊髄液中のマスク自己抗体を脱マスク化することによって、発症もしくは悪化する可能性があることを示唆している。このような理論は、上述のような、神経変性疾患に金属イオンが関与する可能性があるという発見によって裏付けられている。たとえば、遷移金属部位がタンパク質の誤った折り畳みに曝露された場合には、このような曝露部位は、自己抗体の脱マスク化に至る酸化還元反応を促進する場合がある。抗リン脂質抗体などの脱マスク抗体は、脳細胞におけるリン脂質およびリン脂質結合タンパク質と反応し、アルツハイマー病患者の脳のＭＲＩ検査に認められる、脳の病変および収縮の多くを生じさせ、さらには他の種類の神経変性疾患に認められる身体的損傷も生じさせる可能性がある。
【００１３】
本明細書で報告するように、現在、自己抗体は酸化反応後の、アルツハイマー病患者の死後の脳脊髄液中には検出されないということが明らかとなっている。それに対し、神経変性疾患の病歴のない患者由来の死後コントロール脳脊髄液試料には、酸化反応後に自己抗体が認められる。このような結果から、特定の神経変性疾患もしくは病態は、脳脊髄液中の活性もしくは脱マスク自己抗体の存在を検出することによって、特徴付けできることを示唆している。さらに、本明細書で詳しく述べるように、ヘミンなどの酸化剤で処理した確定型アルツハイマー病患者の脳脊髄液では、未処理脳脊髄液と比較して、検出可能自己抗体の量の劇的に増大が認められないことが突き止められ、これはマスク抗体のレベルが低下するような、疾患のある被検体で脱マスク化プロセスが発生したことを示す。このような結果は、あるいは、神経変性疾患もしくは病態の存在が、ヘミンもしくは起電力などの酸化剤で処理した脳脊髄液の試料と、未処理の脳脊髄液の試料中における自己抗体の量とを比較することによって検出できることを示唆している。
【００１４】
アルツハイマー病の死後脳脊髄液には、酸化還元反応性自己抗体が欠落しているという発見に加え、健常な個体からの脳脊髄液中で脱マスク化された自己抗体は、マウスのシナプトソームモデルを用いて検査した場合、シグナル変換反応を刺激する可能性があることが実証されている。このような発見は、個体由来の脱マスク化自己抗体が、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）、すなわち分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＲＫ）カスケードのメンバーをリン酸化することが実証されているので、病理解剖時に神経変性疾患に観察される脳の病理に関連する可能性がある。サイトゾルおよび／または核内のいずれかにおけるこのようなリン酸化反応は、遺伝子発現を促進し、増殖、形質転換および分化もしくはプログラム細胞死（アポトーシス）に至る可能性がある。たとえばＪＮＫおよびｐ３８などといった関連付けられるリン酸化経路もまた関与することが予想されている。ニューロンのアポトーシスのみならず、ＥＲＫ１／２リン酸化に続く脳内における記憶機能および運動機能に対する阻害作用は、このような刺激経路の活性化から生じる既知の応答である（総説として、ＥＲＫ１／２リン酸化の結果に関する参考資料が、下記に記載されている。Adams, JP and Sweett, JD.“Molecular Psychology: Roles for the ERK MAP Kinase Cascade in Memory”. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 42: 135-63; Hindley, A, and in, Kolch, W.“Extracellular signal regulated kinase (ERK)/mitogen activated protein kinase (MAPK)-independent functions of Raf kinases”. J. Cell Science, 2002; 115: 1575-81 および Cheung, ECC and Slack, RS.“Emerging Role for ERK as a Key Regulator of Neuronal Apoptosis”. Science, 2004; 251: 1-3）。抗リン脂質抗体に関する直接的な病原的役割もまた、下記で実証されている。Chapman, J, et al. “Antiphospholipid antibodies permeabilize and depolarize brain synaptosormes”. Lupus 1999; 8: 127-33.
【００１５】
アルツハイマー病の脳脊髄液中で酸化還元反応性自己抗体が検出されないのは、特定の神経変性疾患に特徴的な、タンパク質の疾患関連ニトロシル化によって生じるそれらの欠失によるものであるということが指摘されている。自己抗体は標的化され、疾患のある脳内のニューロンに結合するので検出されない。脳細胞における抗体の沈着に対する近年の証拠が、下記に記載されている。DeAndrea, MR.“Evidence that immunoglobulin-positive neurons in Alzheimer's disease are dying via the classical antibody-dependent complement pathway”. Am J Alzheimer's Dis Other Dimentias. 2005; 20: 144-50.さらに、ＥＲＫ１／２の慢性的活性化は、酸化後の、アルツハイマー病の脳脊髄液中における酸化還元反応性自己抗体を検出できなかったことによって裏付けられる。その結果、神経変性疾患に至る可能性があるということが下記によって報告されている。Colucci-D'Amato L, et al.“Chronic activation of ERK and neurodegenerative diseases”. Bioassays, 2003; 25: 1085-95.
【発明の開示】
【００１６】
本発明の態様は、被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法を提供する。本発明のさらなる態様は、神経変性疾患もしくは病態の発症もしくは進行を検出するため、一定期間にわたって被検体をモニタリングする方法を提供する。
【００１７】
これらの目的および他の目的は、被検体由来の脳脊髄液の試料を得る工程、該試料を検査して該試料における自己抗体の有無を決定する工程を含む被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法によって達成され、自己抗体の存在を示すレベルの上昇および／または酸化還元反応性自己抗体の欠失が、該被検体における神経変性疾患または病態と相関する。
【００１８】
これらの目的はさらに、抗体のニトロシル化の程度を決定するため、被検体由来の脳脊髄液の試料を検査することによって、被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法によって達成され、抗体のニトロシル化の亢進程度が、該被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関する。
【００１９】
これらの目的はさらに、選択された特異性の少なくとも１種類の自己抗体のレベルを決定するため、被検体由来の脳脊髄液の第１の試料を検査し、被検体からの第２の試料を酸化剤で処理し、少なくとも選択された特異性を有する自己抗体のレベルを決定するため、酸化された第２の試料を検査し、酸化された第２の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルと第１の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルとを比較することによって、被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法によって達成される。たとえば、第１の試料における少なくとも１種類の抗リン脂質抗体のレベルと比べたときの、酸化した第２の試料における少なくとも１種類のリン脂質自己抗体のレベルにおける増加の欠如は、該被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の１つの態様は、被検体由来の脳脊髄液の試料を得、該試料における少なくとも１種類の酸化還元反応性抗リン脂質自己抗体の有無を判定するため、試料を検査することによって、被検体における神経変性疾患もしくは病態を診断する方法に関する。通常、本発明の方法により、脳脊髄液中に検出される酸化された自己抗体はＩｇＧアイソタイプであるが、他のアイソタイプは、中枢神経系における感染および／または血液脳関門における出血の兆候を示し得る酸化よりも前には存在している可能性がある。
【００２１】
さらに、脳脊髄液には、少なくとも次のマスク抗リン脂質自己抗体が含まれていることが実証されている。すなわち、抗カルジオリピン（ａＣＬ）、抗ホスファチジルコリン（ａＰＣ）、抗ホスファチジルエタノールアミン（ａＰＥ）および抗ホスファチジルセリン（ａＰＳ）である。
【００２２】
本発明の１つの実施態様によれば、神経変性疾患もしくは病態は、被検体由来の脳脊髄液の試料を取得し、少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体のレベルの上昇についてその試料を検査することによって診断される。この実施態様で使用される検査法では、リン脂質に対する直接的および間接的結合が検出される（すなわち血漿タンパク質非依存性結合に対して血漿タンパク質依存性結合）ので、活性形態もしくは脱マスク形態における自己抗体のみが検出され、マスク自己抗体は検出されない。この検査では、神経変性疾患もしくは病態を生じさせる可能性のある、マスク形態における自己抗体の欠失は検出されない。
【００２３】
少なくとも１種類の自己抗体のレベルの上昇は、基準値を参照することによって決定することが可能である。たとえば基準値は、被検体が神経変性疾患の徴候がないときに、被検体由来の試料から前もって取得した抗体のレベルであってよいし、コントロール個体群における少なくとも１種類の自己抗体のレベルの平均値もしくは中間値であってよい。たとえば、５９名の健常な被検体から得られた抗リン脂質自己抗体の基準値が、Sokol, D.K. et al.“Testing for antiphospholipid antibody (aPL) specificities in retrospective “normal”cerebral spinal fluid (CSF)”. Clin. Develop. Immunol., 11: 1, March 2004, pp. 7-12に記載されている。
【００２４】
本発明の別の実施態様によれば、神経変性疾患もしくは病態は、被検体由来の脳脊髄液の試料を取得し、およびニトロシル化自己抗体を検出するため該試料を検査することによって検出または診断され、ニトロシル化抗体のレベルの上昇が、該被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関する。この方法は、アミノ酸残基の酸化条件下におけるニトロシル化、特にチロシン、トリプトファンなどのヒドロキシル基含有アミノ酸残基、およびさらに特には、抗原結合部位における構造変化を生じる可能性のある抗体超可変領域内およびその周辺におけるチロシン残基のニトロシル化によって活性抗体へのマスク自己抗体からの抗体の転換が生じ、それにより、すでにマスク化され、自己抗原に結合することが不可能であった抗体を脱マスク化し、活性化させ、自己抗原に結合できるようにするということを示唆している米国特許出願番号第１１／１０８，８２６号明細書で論じられている発見に基づいている。
【００２５】
抗体結合部位（パラトープ）の分子的特徴は十分に明らかにされている。パラトープ内にはアミノ酸が独自に分布しており、６種類の抗体の研究では、チロシンがもっとも頻度の高いアミノ酸であり、抗原結合部位の約２５％を有しているということが突き止められている。たとえば、Bes C., et al.“Mapping the paratope of anti-CD4 recombinant Feb 13B8.2 by combining parallel peptide synthesis and site directed mutagenesis.”2003, J. Bio. Chem. 278: 14265-73, および Mian S. et al.“Structure, function and properties of antibody binding sites”1991, J. Mol. Biol. 217: 133-151を参照されたい。さらに、結合部位内におけるチロシン残基の放射性ヨウ化が抗体の免疫反応性にマスクをかけること、および、別の抗体の結合部位内におけるチロシンのニトロ化が抗体ハプテン結合のオンオフスイッチングを生じさせることを突き止めた。たとえば、Nikula T. K., et al.“Impact of the high tyrosine fraction in complementarity determining regions: measured and predicted effects of radioiodination on IgG immunoreactivity”, Mol. Immunol. 1995; 32: 865-872を参照されたい。抗体結合部位におけるチロシンの主要な役割は、Fellouse et al.,“Synthetic antibodies from a four-amino-acid code: a dominant role for tyrosine in antigen recognition”, Proc Natl Acad Sci USA, 2004; 101: 12467-72によって確認されている。
【００２６】
したがって、脳脊髄液の試料におけるニトロシル化抗体を検出するための検査は、抗リン脂質自己抗体に関する結合検査に代わる方法として実施することができる。本発明のこの態様では、特異的自己抗原に関する結合検査を実施する必要がないため、該方法は、必ずしもすべての自己抗体が自己抗原に結合しているわけではないという想定の下に、神経変性疾患もしくは病態を有するヒトの自己抗体の結合特異性が例え未知であったとしても実施することができる。
【００２７】
次にニトロシル化自己抗体を検出するため、脳脊髄液の試料を検査する。ニトロシル化抗体のレベルの上昇は、その被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関する。ニトロシル化抗体のレベルの上昇は、基準値を参照することによって決定することができる。たとえば、基準値は、被検体が神経変性疾患の徴候がなかったときに被検体から前もって採取した試料中のニトロシル化抗体のレベルであってよいし、コントロール個体群におけるニトロシル化抗体のレベルの平均値もしくは中間値であってもよい。
【００２８】
ニトロシル化自己抗体を検出するための公知の方法はいずれも、本実施態様で使用してもよい。たとえば、ニトロシル化抗体は、ニトロチロシンまたはニトロトリプトファンなどの特定のニトロシル化アミノ酸残基に抗体を用いて検出してよい。脳脊髄液の試料は、ニトロシル化抗体の検出のため検査で直接使用してよいし、またはＩｇＧ抗体を試料から単離させて、単離した抗体を検査し、ニトロシル化抗体を検出してよい。特定の例として、脳脊髄液の試料から単離したＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートウェル上に塗布し、一晩乾燥させ、１％のＢＳＡで遮断し、洗浄した後にマウス抗ニトロチロシン（１／３０００、アップステート（Upstate）、米国、クローン  １Ａ６）と反応させてよい。洗浄後、アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）を添加し、続いてさらに洗浄し、３７℃で２時間基質を成長させ、定量を行う。
【００２９】
この方法では、ニトロシル化抗体をさらに検査して、自己抗原にそれらが結合するか否かを判定してよい。
【００３０】
さらに、抗リン脂質抗体の存在を決定するための試料の分析法およびニトロシル化抗体の存在を決定するための試料の分析法はいずれも、同じ被検体で実施してよい。たとえば、脳脊髄液の試料を第１の部分と第２の部分とに分割し、第１の部分で抗リン脂質抗体の存在に関する検査を行い、第２の部分でニトロシル化抗体の存在に関する分析を行ってよい。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、神経変性疾患または病態は、被検体由来の脳脊髄液の試料を、選択された特異性を備える少なくとも１種類の自己抗体の存在およびレベルに関して検査し、次いで酸化剤で被検体由来の脳脊髄液の第２の試料を処理し、さらに同じ自己抗体の存在とレベルとに関し、酸化された試料を検査することによって、被検体において診断される。換言すると、検査を実施して、特異的自己抗体のレベルが増加しているか否か、または酸化剤による処理後の特異的自己抗体集合のレベルが増大しているか否かを判断する。すでに述べたように、健常な個体においては、脳脊髄液中で検出される抗リン脂質自己抗体のレベルは、試料の酸化処理後には劇的に増大する。さらに上記のように、血中に認められるレベルもしくは未処理のＩｖＩｇで認められるレベルに比べて、広範にわたる自己抗体の劇的に高いレベルが、ヘミンなどの酸化剤で処理された健常な個体の血液もしくはＩｖＩｇで認めることができる。本明細書で報告しているように、アルツハイマー病患者から死後採取した脳脊髄液の試料は、増加を示していないか、せいぜい検出された抗リン脂質自己抗体における最小限度の増加のみ示しているにすぎない。これらの結果は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する患者では、循環している自己抗体がすでに酸化され、脱マスク化し、神経系内で標的に結合している可能性があることを示唆している。このことは、酸化剤で処理した後の、アルツハイマー病の患者の脳脊髄液における抗リン脂質自己抗体のレベルの増加が認められないことの理由を裏付けるものであろう。アルツハイマー病患者では、自己抗体のレベルは、酸化され、欠失する。したがって、本発明のこの実施態様によれば、第１の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルと比較した、酸化された第２の試料における少なくとも１種類の自己抗体のレベルにおける増加の欠如は、その被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関する。
【００３２】
上述の方法のそれぞれで、結果が陰性の場合でも、神経変性疾患もしくは病態の存在が無視されるわけではない。さらに、本発明の方法によれば、陽性の結果が、特定の疾患もしくは病態の診断である必要はない。むしろ、上述の方法には、陽性の結果が、神経変性疾患もしくは病態が被検体に存在することを示すか、または強く示唆するにすぎないような方法も含まれる。特に、中枢神経系における抗リン脂質抗体の無制御な脱マスクの存在は、脳組織におけるリン脂質含有量が高いので、このような抗体の余剰な標的を提供するという観点から、脳の病変と相関すると考えられる。
【００３３】
上述の方法では、被検体に対する制限はない。通常、被検体は、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症もしくは多重硬化症などの、神経変性疾患または病態に関する身体的徴候、認知的徴候もしくは放射線測定での徴候を呈する者として選択され得る。被検体は、少なくとも１種類の神経変性疾患もしくは病態に関する家族歴のある者であってよい。このような場合には、被検体は、神経変性疾患もしくは病態を有する家族が発症した平均年齢より若年であっても、平均年齢そのものであっても、平均年齢よりも高齢であってもよい。上述の方法は、神経変性疾患または病態の発症、または進行を判断できるように、時間間隔をあけて実施してよい。たとえば、これらの方法は、１年毎に１回、５年毎に１回もしくは１０年毎に１回の頻度で、神経変性疾患もしくは病態の徴候を有さない被検体で実施してよいし、神経変性疾患もしくは病態に関する身体的徴候、認知的徴候もしくは放射線測定での徴候を呈する被検体では、もっと頻繁に実施してよい。
【００３４】
脳脊髄液の試料は、被検体から脳脊髄液の試料を採取するため、たとえば脊椎穿刺（通常、ランバーパンクチャ）など、当技術分野で公知のいずれかの方法によって採取してよい。
【００３５】
脳脊髄液の試料は、自己抗体の存在を検出するためのいずれかの公知の方法によって検査してよい。たとえば、いずれかの公知の方法を抗リン脂質自己抗体の存在を検出するのに使用してよく、該方法では、抗リン脂質に対する間接もしくは直接結合が検出される。特に、本発明の方法には、ａＣＬ、ａＰＣ、ａＰＥもしくはａＰＳまたはこれらの組み合わせの検出が含まれる。限定されない例として、これらの自己抗体は、ＥＬＩＳＡなどの結合検査法によって、カルジオリピン（ＣＬ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）またはホスファチジルセリン（ＰＳ）との結合を検出することにより検出してよい。
【００３６】
被検体から採取した未処理の脳脊髄液の試料の抗体のレベルを測定するための、本発明の方法のこの実施態様を実施する際には、試料の酸化還元状態が、試料を取得する工程と試料を検査する工程の完了時との間で変化していてはならない。換言すると、未処理の試料の検査は、被検体の脳脊髄液の試料中に活性形態で存在している自己抗原結合抗体を測定するのに実施される。上述のように、健常な個体の脳脊髄液にはマスク形態での自己抗体が含まれていることが知られている。したがって、脳脊髄液中のマスク自己抗体は、試料の採取後の処理工程によって脱マスク化され、擬陽性の結果が得られないよう、さらに試料の採取後の処理工程によって脳脊髄液中の脱マスク自己抗体がマスクされて、その結果偽陰性とならないように注意を払う必要がある。特に、試料は、酸化もしくは還元（酸化還元）条件に曝露すべきではない。通常、凍結解凍を含む通常の試料処理手順および典型的な結合検査条件で、試料の酸化還元状態を維持させるのに十分である。処理された試料の自己抗体のレベルを測定するためには、試料を、本明細書に引用されている文献および特許出願に記載されている方法のいずれかによって酸化剤で処理してよい。非限定的な例として、試料を３６℃で、一晩ロッキングインキュベータでヘミン処理してよい。他の酸化剤および他のインキュベーション温度は、当技術分野における当業者であるなら容易に判断できるであろう。
【実施例】
【００３７】
本発明について記述してきたが、本発明を実施するため現在公知である最適な形態を始めとする本発明の特定の用途を解説する目的で、以下の実施例を示す。これらの特定の実施例は、本願に記載されている本発明の対象範囲を制限することを意図していない。
【００３８】
実施例１
健常な被検体由来のヒト脳脊髄液にマスク自己抗体が含まれているか否かを判定するために、健常な個体から脊椎穿刺によって脊髄液を採取し、ＢＳＡおよびＡＢＰの希釈緩衝液中の試料で、ヘミンによって酸化処理する前後に、ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの各レベルについてＥＬＩＳＡによって検査を行った。図１のＡおよびＢに示されているように、試料は、酸化処理前には抗リン脂質抗体がまったく存在しないかもしくは最小のレベルを示し（Ａ）、酸化処理後のレベルはかなり増加し（Ｂ）、ａＰＥおよびａＰＣでは、ＢＳＡ緩衝液中でもっとも高いレベルを示し、ａＰＳおよびａＣＬは、ＡＢＰ緩衝液内でもっとも高いレベルをそれぞれ示している。
【００３９】
実施例２
健常な被検体の脳脊髄液試料中の酸化還元反応に感応する自己抗体の存在およびアルツハイマー病患者の脊髄液中におけるそれらの欠失は、これらの自己抗体が機能性および／または病原性であることを示唆していないにもかかわらず、顕著であった。機能的活性に関する試験を行うため、酸化還元反応性自己抗体を含む脳脊髄液試料を、マウスモデルシナプトソームアッセイで試験した。脳脊髄液試料を、シナプトソームで１０分間インキュベートし、次いで、細胞を溶解しウエスタンブロット法によりリン酸化活性に関してプロービングを行った。図２は、ヘミン緩衝液コントロール、ヘミン処理脳脊髄液および１／１０希釈の同じヘミン処理脳脊髄液の酸化還元反応性自己抗体ＥＲＫ１／２リン酸化活性を表している。
【００４０】
酸化還元反応性自己抗体は、シグナル変換分子のＭＡＰＫカスケードのメンバーのリン酸化を大幅に増大させるため、これらの抗体に正常な脳細胞機能を妨害する潜在能力を与える。このようなリン酸化キナーゼ経路は、脳の記憶機能にとって重要であるため、神経変性疾患の病因における酸化還元反応性自己抗体の役割を示唆するものである。特に、このヒストグラムによって示されているリン酸化の度合いは、神経のアポトーシスを生じさせるのに十分であろう。
【００４１】
実施例３
アルツハイマー病の被検体からのヒト脳脊髄液に高いレベルの脱マスクまたは活性リン脂質自己抗体が含まれているか否かを判定するため、病理解剖の確認に基づいてアルツハイマー病と診断された６名の患者から死後脊髄液を採取した。ＢＳＡおよびＡＢＰの希釈緩衝液中の脳脊髄液の試料について、ａＰＬのレベルに関して検査した。図３のＡおよびＢに示されているように、アルツハイマー病患者由来の試料（Ｂ）は、ヘミンによる酸化処理後、死後コントロールのレベル（Ａ）と比較して、ａＰＬのレベルが減少しているかまたはａＰＬが完全に欠失していることを示している。このことは、酸化還元自己抗体が脱マスク化され、神経細胞標的に結合していることを示しており、このプロセスでは、痴呆に至る可能性のある正常なシナプシスの機序が脳細胞で改変されることが実証されている。
【００４２】
実施例４
試料中にニトロチロシン残基のレベルの上昇が存在しているか否かを判定するために、アルツハイマー病の徴候のある患者の脳脊髄液から採取したＩｇＧで、抗ニトロチロシン検査を実施することができる。この検査は、上述の方法によって実施することができる。被検体の脳脊髄液中もしくは脳脊髄液から単離したＩｇＧにおけるニトロチロシンレベルの上昇は、被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関すると考えられている。
【００４３】
本明細書に記述もしくは引用した全文献は、参照によって本明細書にすべて組み込まれる。
【００４４】
本発明の明白な多くの修正および変更が、上述の教示内容に照らし可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、特に記述した方法以外の他の方法で実施することが可能であることも理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】それぞれ、未処理の試料（Ａ）およびヘミンに曝露させた試料（Ｂ）の、健常な被検体の脳脊髄液中で検出された、たとえばａＰＳ、ａＣＬおよびａＰＥなどのＥＬＩＳＡによって検出された自己抗体のレベルを示すグラフである（光学密度ＯＤによって測定される）。ＢＳＡ希釈試料とＡＢＰ希釈試料との両方に関する結果を示す。点線は、これらの自己抗体の陽性／陰性カットオフ値を表す。
【図２】酸化還元反応性自己抗体ＥＲＫ１／２リン酸化反応活性を示すヒストグラムである。ヘミン緩衝液コントロール、ヘミン処理脳脊髄液および同じヘミン処理脳脊髄液の１／１０希釈液を示す。これらのデータは、マウスのニューロンモデルのシナプトソームアッセイを用いて取得した。シナプトソームで、１０分間、脳脊髄液試料のインキュベーションを行った後、細胞を溶解させ、ウエスタンブロット法によりリン酸化活性を調べた。このヒストグラムによって図解されているリン酸化の度合いは、ニューロンのアポトーシスを誘発させるのに十分であろう。
【図３】生検により確認された６名のアルツハイマー病患者の（脳室から採取した）死後脳脊髄液（Ｂ）と、神経変性疾患の病歴のない３名のコントロール脳脊髄液試料（Ａ）との間の自己抗体の比較結果を表す。性別、死亡してから病理解剖に至るまでの経過時間および年齢を示す。点線は、抗リン脂質自己抗体に関する陽性／陰性カットオフ値を表す。アルツハイマー病群とコントロール群のいずれも、未処理の試料では陽性の活性がほとんど認められないが、アルツハイマー病の試料は、ヘミンに曝露させた場合でも酸化還元自己抗体を脱マスクすることはできない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月27日(2008.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
被検体における神経変性疾患もしくは病態を検出または診断する方法であって、
被検体由来の脳脊髄液の試料を得る工程、および
試料を、ＩｇＧアイソタイプの少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体の存在に関して検査する工程
を含み、少なくとも１種類の抗リン脂質自己抗体のレベルの上昇が、該被検体における神経変性疾患もしくは病態と相関関係がある方法。
【国際調査報告】
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