(57)【要約】我々は、甘味料を、閾値上濃度の他の甘味料と組み合わせて、閾値下から閾値近傍の濃度で使用することを含む、甘味を増強する方法を見出した。閾値近傍で使用される甘味料は、ヒト甘味受容体における有望な結合領域に基づいて選択される。本発明は、新規な味覚受容体タンパク質基づくアッセイによる、ヒトにおける味覚応答を調節することができる剤（甘味増強剤など）の同定、前記新規甘味受容体タンパク質を形成する核酸構築物を含む異種発現系、および新規甘味受容体タンパク質のスクリーニングにおける使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
剤が、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記剤と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記剤のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する剤であって、
前記剤が、前記剤の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記剤の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記味覚受容体の活性アッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する剤を同定することを含む、前記剤。
【請求項２】
甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記剤と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記剤のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する剤を同定する方法であって、
前記剤が、前記剤の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記剤の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記味覚受容体の活性アッセイが、細胞表面受容体の細胞外ドメインと連結した味覚受容体の膜貫通ドメインを含有するタンパク質を利用することにより、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する剤を同定することを含む、前記方法。
【請求項３】
甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記剤と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記剤のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する剤を同定する方法であって、
前記剤が、前記剤の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記剤の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記味覚受容体の活性アッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインを切断して除去した味覚受容体を含むタンパク質を利用することにより、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する剤を同定することを含む、前記方法。
【請求項４】
甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記剤と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記剤のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する剤を同定する方法であって、
前記剤が、前記剤の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記剤の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記味覚受容体の活性アッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインを切断して除去した味覚受容体を含むタンパク質を利用することにより、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、ＴＡＳ１Ｒ味覚受容体のＴ１Ｒ２サブユニットの膜貫通ドメインに結合する剤を同定することを含む、前記方法。
【請求項５】
甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記剤と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記剤のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する剤を同定する方法であって、
前記剤が、前記剤の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記剤の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記アッセイが、野生型ビーナスフライトラップドメインが代替的なクラスＣ  ＧＰＣＲビーナスフライトラップドメインに置き換えられたキメラ味覚受容体のサブユニットと野生型味覚受容体のサブユニットとを組み合わせることを含み、
前記アッセイが、前記剤の存在下での組み合わされたキメラ受容体／野生型味覚受容体ダイマーの活性のアッセイによって生成されたシグナルおよび前記剤の非存在下での組み合わされたキメラ受容体／野生型味覚受容体ダイマーの活性のアッセイによって生成されたシグナルを計測し、２つの計測値を比較することを含む、前記方法。
【請求項６】
味覚受容体のビーナスフライトラップドメインの外部で味覚受容体と結合および／またはそれを活性化する化合物を同定する方法であって、改変された味覚受容体と化合物とを接触させること、および当該化合物が改変された受容体と結合し、かつ／またはそれを活性化するかどうかを決定することを含み、
改変された受容体が：
ａ）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２および／または自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３、
ｂ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、
ｃ）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよびビーナスフライトラップドメイン欠損Ｔ１Ｒ２を含むキメラタンパク質および／またはクラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよびビーナスフライトラップドメイン欠損Ｔ１Ｒ３を含むキメラタンパク質、
ｄ）ａ）〜ｃ）に列挙された任意のタンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一である任意のタンパク質、
ｅ）ａ）〜ｃ）に列挙された任意のタンパク質の実質的に相同である任意のタンパク質、
ｆ）配列番号１、１３、１５、および２７によってコードされる任意のタンパク質、
ｇ）ストリンジェントな条件で配列番号１、１３、１５および２７とハイブリダイズする核酸によってコードされる任意のタンパク質、
からなる群から選択されたポリペプチドを含み、
改変された味覚受容体が任意にシグナル配列および抗体エピトープから選択される１または２以上の配列タグをさらに含み、ただし、改変された受容体の少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含まない、前記方法。
【請求項７】
甘味を増強する化合物または化合物群を同定する方法であって、
ａ）改変された味覚受容体と化合物または化合物群とを接触させること、および、化合物または化合物群が改変された受容体に結合および／またはそれを活性化するかどうかを決定することを含む、化合物または化合物群が味覚受容体にそのビーナスフライトラップドメインの外部で結合し、かつ／またはそれを活性化するかどうかの決定、ならびに
ｂ）改変された受容体に結合するおよび／またはそれを活性化する化合物または化合物群が甘味を増強するかどうかの、
ｉ）化合物または化合物群が、その受容体に対するリガンドによるキメラ受容体との結合および／またはその活性化を増強するかどうかを決定すること、または
ｉｉ）化合物または化合物群が甘味料の甘味を増強するかどうかを、甘味料が濃度２％またはそれ以上のスクロース溶液と等甘味度の濃度で存在し、化合物が濃度２％以下のスクロース溶液と等甘味度の濃度で存在する状態で決定すること
による決定
を含み、
キメラ受容体が、１）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメイン、および２）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２を含むサブユニット、および任意に、１）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメイン、および２）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３を含むサブユニットを含み、少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含有せず、および
改変された受容体が
ａ）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２および／または自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３、
ｂ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、
ｃ）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよび自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２を含むキメラタンパク質、および／またはクラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよび自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３を含むキメラタンパク質、
ｄ）ａ）〜ｃ）に列挙された任意のタンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一である任意のタンパク質、
ｅ）配列番号１、１３、１５および２７によってコードされる任意のタンパク質、
ｆ）ストリンジェントな条件で配列番号１、１３、１５および２７とハイブリダイズする核酸によってコードされる任意のタンパク質、
からなる群から選択されるポリペプチドを含み、
改変された受容体が任意に、シグナル配列および抗体エピトープから選択される１または２以上の配列タグをさらに含み、ただし、改変された受容体の少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含有しない、
前記方法
【請求項８】
アッセイに用いる細胞がＧタンパク質をも発現している、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｇタンパク質がＧαｑ−ガストデューシンに基づくキメラＧタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇタンパク質がキメラＧタンパク質であるＧアルファ１６−ガストデューシン４４である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイに用いる細胞が、Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインを含むタンパク質をコードする１または２以上の核酸を、一過性または安定的にトランスフェクトしたものである、請求項２〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの剤が細胞における味覚受容体の機能活性に作用するかどうかの、細胞における少なくとも１つの機能的応答による決定がなされ、この決定が細胞内メッセンジャーの変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化の計測によって行われる、請求項２〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
機能的応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することで決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択される、請求項２〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞が哺乳類細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３細胞からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
甘味料の存在下でＴ１Ｒ２甘味受容体を試験剤に接触させることをさらに含む、請求項２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項２に記載の方法で同定された剤と甘味料との混合であって、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、甘味増強剤が少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの濃度で存在し、甘味増強剤が甘味料である場合、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース以下のスクロースと等甘味度で存在する、前記混合。
【請求項１９】
請求項３に記載の方法で同定された剤と甘味料との混合であって、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、甘味増強剤が少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの濃度で存在し、甘味増強剤が甘味料である場合、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース以下のスクロースと等甘味度で存在する、前記混合。
【請求項２０】
請求項４に記載の方法で同定された剤と甘味料との混合であって、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、甘味増強剤が少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの濃度で存在し、甘味増強剤が甘味料である場合、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース以下のスクロースと等甘味度で存在する、前記混合。
【請求項２１】
請求項５〜１７のいずれかに記載の方法で同定された剤と甘味料との混合であって、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、甘味増強剤が少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの濃度で存在し、甘味増強剤が甘味料である場合、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース以下のスクロースと等甘味度で存在する、前記混合。
【請求項２２】
試験剤をＴ１Ｒ２−ＴＭＤの調節物質として同定するために組み合わせて利用される、
（ｉ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ甘味受容体、または実質的に類似するそのホモログを発現するが、Ｔ１Ｒ３受容体は発現しない組換え細胞、および
（ｉｉ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ甘味受容体のアゴニスト
を含むキット。
【請求項２３】
請求項２２に記載のキットを使用する方法であって、
（ｉ）固体支持体上で組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）定義されたプレートまたはウェルの培養培地へ、アゴニストの存在下、適切な濃度で試験剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能的応答の変化を決定し、その結果、試験剤がＴ１Ｒ２甘味受容体またはその実質的に類似するホモログの調節物質であることが同定されること
を含む、前記方法。
【請求項２４】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを調節する剤を同定する方法であって、該方法が、
（ｉ）リガンドのＴ１Ｒ２−ＴＭＤへの結合に応答して変化するパラメータを計測すること、
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験剤に応答したパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定し、それにより調節物質またはリガンドを同定すること
を含む、前記方法。
【請求項２５】
リガンドがペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、ステビオシド、ルブソシド、レバウディオシドＡおよびネオヘスペリジンジヒドロカルコンからなる群から選択される、請求項７〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
リガンドの受容体への結合に応答した変化が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境において受容体ポリペプチドの特性を計測する、請求項２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境においてＴ１Ｒ２−ＴＭＤポリペプチドの特性を計測する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
全長野生型Ｔ１Ｒ２および全長野生型Ｔ１Ｒ３タンパク質の両方を採用する方法を包含しない、請求項２〜１７および２４〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
消費材において甘味を増強する方法であって、消費材に、甘味増強剤を、その甘味検出閾値以下またはその近傍の、濃度２％未満のスクロース溶液と等甘味度の濃度で含ませることを含み、ここでその消費材は甘味料をその甘味検出閾値以上の濃度で含有している、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、新規な甘味受容体タンパク質に基づいたアッセイによる、ヒトの味覚応答を調節可能な剤（特に甘味増強剤）の同定、前記甘味受容体タンパク質を形成する核酸構築物を含む異種発現系、およびスクリーニングにおける甘味受容体タンパク質の利用に関する。甘味増強剤は一部の食物をより口当たりのよいものとし、または経口薬剤および栄養補助食品に対する患者コンプライアンスを増大させる。かかる甘味増強剤には、ヒトにおける味覚応答を誘発する甘味料を含む。
【背景技術】
【０００２】
甘味調節剤および特に甘味増強剤は、食品および香辛料業界において、例えば消費製品における糖および人工甘味料を含む甘味料のレベルの低減を可能にするために、大いに有益かつ重要である。甘味増強剤の利用はカロリーを低減し、糖による歯へのダメージを防ぎ、多くの人工甘味料に伴う苦い／金属性の異味および後味を回避するかまたは低減することができる。
【０００３】
甘味の感知は受容体、味覚受容体細胞に特異的に発現し、甘味受容体ダイマー複合体（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー）を形成する、２つのサブユニットＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を含むＴＡＳ１Ｒによって媒介されることが知られている。双方のサブユニットはともに、「Ｇタンパク質共役受容体」またはＧＰＣＲと呼ばれるファミリー、特にクラスＣ  ＧＰＣＲに属する。
【０００４】
他のほとんどのＧＰＣＲのように、クラスＣ受容体は７本へリックス膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を有する。しかしながら他のタイプのＧＰＣＲとは異なり、クラスＣ  ＧＰＣＲは２つの部分：リガンド結合に関連する「ビーナスフライトラップモジュール」（ＶＦＴＭ）と、高度に保存された９つのシステインを含有し、ＶＦＴＭをＴＭＤに連結しているシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、からなる大きな細胞外ドメインも有する。様々な長さの細胞内Ｃ末端によってクラスＣ受容体が完成する。
【０００５】
甘味受容体応答の活性化には甘味受容体ダイマー複合体の両サブユニットが必要であると考えられており、これまでのところ、全ての試験された甘味料はＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを活性化する。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーが、天然の糖（スクロース、フルクトース、グルコース、マルトース）、甘味アミノ酸（Ｄ−トリプトファン）、および人工甘味料（アセスルファム−Ｋ、アスパルテーム、サイクラミン酸塩、サッカリン、スクラロース）から、甘味タンパク質（モネリン、ソーマチン、ブラゼイン）に至る範囲の、広範囲の化学的に異なった甘味料に応答するにもかかわらず、ヒト甘味受容体の分離したサブユニット（Ｔ１Ｒ２ホモマーまたはＴ１Ｒ３ホモマー）による公知の試験は、何らの活性も示さなかった（例えばLi et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(7),4692〜6など参照）。
【０００６】
現在知られた甘味調節物質のスクリーニングにはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー甘味受容体が採用されている。これらのスクリーニングは通常、甘味料の存在下における潜在的調節物質を含むサンプルと含まないサンプルの結果を比較することにより甘味調節物質を同定または特性化する。しかしながら、甘味料、特に糖はモル浸透圧濃度に大きな影響を有し、および／または粘稠性がある。粘稠性やモル浸透圧濃度などのサンプルの特性の変化のために、標準的なスクリーニング法を用いた場合、正しくない結果の原因となるアーティファクトが起こり得る。
【０００７】
知られたスクリーニングの他の不利点は、野生型のＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体が複数の結合ドメイン、特にスクロース、グルコース、フルクトースなどの炭水化物甘味料、ならびに人工甘味料アスパルテームおよびスクラロースと結合するビーナスフライトラップ（「ＶＦＴ」）ドメインを含む細胞外アミノ末端ドメインを含むことである。したがって、特定リガンドの特異的調節物質、特にＶＦＴリガンド以外の膜貫通ドメイン（「ＴＭＤ（単数または複数）」）のリガンドのスクリーニングは、知られたスクリーニング法では不可能である。
【０００８】
受容体との結合において糖と競合し得る剤の同定を防止するために、ＶＦＴドメインと物理的に異なる、特にＴＭＤおよび／またはシステインリッチドメインにおける部位と結合する、推定される甘味増強剤の同定を可能にするスクリーニングが求められている。本発明はこの要求に応えるものである。例えば、本発明者らによって作出されたキメラＴ１Ｒ受容体（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラ受容体、集合的にＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラ受容体（「ＣＳＲ」はカルシウム感知受容体のことを言う））を用いる本発明の方法は、甘味化合物サイクラミン酸塩がＴ１Ｒ３のＴＭＤに結合し、それによってＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体ヘテロダイマー複合体を活性化することを示す。
【０００９】
今まで、１つのＴＡＳ１ＲモノマーのＴＭＤが甘味化合物と結合し、さらに他の必須のモノマーパートナーの不在下でＧタンパク質を活性化し得ることは知られていなかった。以前には、当分野では両サブユニットの存在がシグナル伝達に不可欠であると信じられていた。本発明者らは、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体ヘテロダイマー複合体のＴ１Ｒ２ホモマーの重度に切断された配列と一致する新規な受容体タンパク質（「Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ」）が、驚くべきことに、甘味リガンドと結合する機能的甘味受容体を形成し、Ｇタンパク質を活性化できることを見出した。この新規な受容体タンパク質Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤは全長Ｔ１Ｒ２ホモマーとは異なるアゴニストアゴニスト範囲を有することがわかった。前者は驚くべきことにリガンドと結合できるだけではなく、下流シグナリングの活性化もできることがわかった。
【００１０】
ここで提供される方法は、Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに結合および／またはそれらを活性化するリガンドの同定を可能にする。したがって、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラ受容体またはＴ１Ｒ２−ＴＭＤのいずれかとＧタンパク質とを発現する細胞を、任意に知られたまたは新たに決定された甘味物質と組み合わせた試験剤と接触させ、甘味増強剤としての前記剤の特性を決定する。ここで提供されるアッセイは、したがって、甘味物質または甘味応答の増強剤としての味覚剤の同定に利用することができる。受容体およびＧタンパク質における剤の機能的な効果は、適した機能的アッセイ、例えば細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋などの伝達経路のパラメータの変化を計測するアッセイなどアッセイによって、またはＧＴＰγＳを標識するなどの他のＧタンパク質特異的アッセイによって、当業者に知られた技術に従って決定される。代替的に、アッセイＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラ受容体またはＴ１Ｒ２-ＴＭＤへのリガンドの結合の決定に結合アッセイを用いてもよい。同定された剤は、その後、限定されずに本明細書に後述される、当業者に知られた技術に従って、その甘味増強剤としての活性について試験できる。
【００１１】
本明細書に記載されているクローニング、リガンド−受容体ペアの解明、および甘味応答の増強剤の検索に関する様々な側面および態様の実践において、分子生物学、微生物学および組換え技術および甘味試験における慣習的な技術が利用される。これらは、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラ受容体またはＴ１Ｒ２−ＴＭＤを含むＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に適した様々な知られた方法を含む。したがって、当業者にはかかる技術が十分に知らされており、それゆえ以下では、本発明の状況をより十分に記載するために、かかる技術はごく簡略化して論じる。
【発明の開示】
【００１２】
概要
その最初の側面において、本発明は、剤が、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記剤と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記剤のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する剤であって、前記剤が、前記剤の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記剤の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、前記味覚受容体の活性アッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する剤を同定することを含む、前記剤を含む。
【００１３】
第２の側面において、本発明は、推定される甘味増強剤を同定する方法であって、前記剤の存在下での味覚受容体への結合および／またはその活性化のアッセイによって生成されるシグナルと、前記剤の非存在下における同様のアッセイによって生成されるシグナルとを計測すること、および当該２つの計測結果を比較することを含み、前記アッセイが、味覚受容体の細胞外ドメインではなく、味覚受容体以外のＧタンパク質結合受容体の細胞外ドメインと連結した味覚受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むタンパク質を利用して、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合および／またはそれを活性化する剤を同定することを含む、前記方法を含む。
【００１４】
第３の側面において、本発明は、推定される甘味増強剤を同定する方法であって、前記剤の存在下での味覚受容体への結合および／またはその活性化のアッセイによって生成されるシグナルと、前記剤の非存在下における同様のアッセイによって生成されるシグナルとを計測すること、および当該２つの計測結果を比較することを含み、前記アッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインを欠損した、切断された味覚受容体を含むタンパク質を利用して、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する剤を同定することを含む、前記方法を含む。
【００１５】
第４の側面において、本発明は、推定される甘味増強剤を同定する方法であって、前記剤の存在下での味覚受容体の活性化のアッセイによって生成されるシグナルと、前記剤の非存在下での味覚受容体の活性化のアッセイによって生成されるシグナルとを計測すること、および当該２つの計測結果を比較することを含み、前記味覚受容体の活性化のアッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインを切断して取り除いた味覚受容体を含むタンパク質を利用して、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する剤を除外しながら、ＴＡＳ１Ｒ味覚受容体のＴ１Ｒ２サブユニットの膜貫通ドメインに結合する剤を同定することを含む、前記方法を含む。
【００１６】
さらなる側面において、本発明は、本明細書中に開示された方法で同定された甘味増強剤を甘味料と混合することを含み、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、甘味増強剤が少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの濃度で存在し、甘味増強剤が甘味料でもある場合、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース以下のスクロースと等甘味度で存在する、甘味料の甘味を増強する方法を含む。甘味増強剤は単一の化合物または化合物の混合物であり得る。
【００１７】
またさらなる側面において、本発明は、推定される甘味増強剤を同定する方法であって、野生型ビーナスフライトラップドメインが代替的なクラスＣのＧＰＣＲビーナスフライトラップドメインによって置き換えられているキメラ味覚受容体サブユニットと野生型味覚受容体のサブユニットとを組み合わせることを含み、アッセイが、前記剤の存在下での組み合わされたキメラ受容体／野生型味覚受容体ダイマーの活性化のアッセイによって生成されるシグナルと、前記剤の非存在下での組み合わされたキメラ受容体／野生型味覚受容体ダイマーの活性化のアッセイによって生成されるシグナルとを計測すること、および当該２つの計測結果を比較することを含む、前記方法を含む。
【００１８】
さらなる側面において、本発明は、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインの外部で味覚受容体と結合および／またはそれを活性化する化合物を同定する方法であって、改変された味覚受容体と化合物とを接触させること、および当該化合物が改変された受容体と結合し、かつ／またはそれを活性化するかどうかを決定することを含み、改変された受容体が：
ａ）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２および／または自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３、
ｂ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、
ｃ）クラスＣのＧタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよびビーナスフライトラップドメイン欠損Ｔ１Ｒ２を含むキメラタンパク質および／またはクラスＣのＧタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよびビーナスフライトラップドメイン欠損Ｔ１Ｒ３を含むキメラタンパク質、
ｄ）ａ）〜ｃ）に列挙された任意のタンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一である任意のタンパク質、
ｅ）ａ）〜ｃ）に列挙された任意のタンパク質の実質的に相同である任意のタンパク質、
ｆ）配列番号１、１３、１５、および２７によってコードされる任意のタンパク質、
ｇ）ストリンジェントな条件で配列番号１、１３、１５および２７とハイブリダイズする核酸によってコードされる任意のタンパク質、
からなる群から選択されたポリペプチドを含み、改変された味覚受容体が任意にシグナル配列および抗体エピトープから選択される１または２以上の配列タグをさらに含み、ただし、改変された受容体の少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含まない、前記方法を含む。
【００１９】
さらなる側面において、本発明は、甘味を増強する化合物または化合物群を同定する方法であって、
ａ）改変された味覚受容体と化合物または化合物群とを接触させること、および、化合物または化合物群が改変された受容体に結合および／またはそれを活性化するかどうかを決定することを含む、化合物または化合物群が味覚受容体にそのビーナスフライトラップドメインの外部で結合し、かつ／またはそれを活性化するかどうかの決定、ならびに
ｂ）改変された受容体に結合するおよび／またはそれを活性化する化合物または化合物群が甘味を増強するかどうかの、
ｉ）化合物または化合物群が、その受容体に対するリガンドによるキメラ受容体との結合および／またはその活性化を増強するかどうかを決定すること、または
ｉｉ）化合物または化合物群が甘味料の甘味を増強するかどうかを、甘味料が濃度２％またはそれ以上のスクロース溶液と等甘味度の濃度で存在し、化合物が濃度２％以下のスクロース溶液と等甘味度の濃度で存在する状態で決定すること
による決定
を含み、
キメラ受容体が、１）クラスＣのＧタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメイン、および２）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２を含むサブユニット、および任意に、１）クラスＣのＧタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメイン、および２）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３を含むサブユニットを含み、少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含有せず、および
【００２０】
改変された受容体が
ａ）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２および／または自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３、
ｂ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、
ｃ）クラスＣのＧタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよび自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２を含むキメラタンパク質、および／またはクラスＣのＧタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインおよび自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３を含むキメラタンパク質、
ｄ）ａ）〜ｃ）に列挙された任意のタンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一である任意のタンパク質、
ｅ）配列番号１、１３、１５および２７によってコードされる任意のタンパク質、
ｆ）ストリンジェントな条件で配列番号１、１３、１５および２７とハイブリダイズする核酸によってコードされる任意のタンパク質、
からなる群から選択されるポリペプチドを含み、
【００２１】
改変された受容体が任意に、シグナル配列および抗体エピトープから選択される１または２以上の配列タグをさらに含み、ただし、改変された受容体の少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含有しない、
前記方法を含む。
【００２２】
ある例示的な態様において、上記に定義された方法は、Ｇタンパク質をも発現する細胞を利用する。
ある例示的な態様において、上記に定義された方法は、Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインを含むタンパク質をコードする１または２以上の核酸を、一過性にまたは安定的にトランスフェクトした細胞を利用する。
上記に定義された方法の他の態様において、Ｇタンパク質は、Ｇαｑ−ガストデューシンに基づくキメラＧタンパク質である。
【００２３】
上記に定義された方法のさらなる態様において、Ｇタンパク質は、キメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４である。
上記に定義された方法のまたさらなる態様において、少なくとも１つの剤が細胞における味覚受容体の機能活性に作用するかどうかの、細胞における少なくとも１つの機能的応答による決定は、細胞内メッセンジャーの変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化の計測によって行われる。
上記に定義された方法のさらなる態様において、機能的応答は、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することで決定される。
【００２４】
上記に定義された方法の他の態様において、細胞は、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択される。
上記に定義された方法のある態様において、細胞は哺乳類細胞である。
上記に定義された方法のさらなる態様において、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３細胞からなる群より選択される哺乳類細胞である。
上記に定義された方法のまたさらなる態様において、ｉ）は甘味料の存在下でＴ１Ｒ２甘味受容体を試験剤に接触させることをさらに含む。
【００２５】
他の側面において、キットが提供され、当該キットは、
試験剤をＴ１Ｒ２−ＴＭＤの調節物質として同定するために組み合わせて利用される、
（ｉ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ甘味受容体、または実質的に類似するそのホモログを発現するが、Ｔ１Ｒ３受容体は発現しない組換え細胞、および
（ｉｉ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ甘味受容体のアゴニスト
を含む。
【００２６】
他の側面において、上記に定義されたキットを利用する方法が提供される。当該方法は、
（ｉ）固体支持体上で組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）定義されたプレートまたはウェルの培養培地へ、アゴニストの存在下、適切な濃度で試験剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能的応答の変化を決定し、その結果、試験剤がＴ１Ｒ２甘味受容体またはその実質的に類似するホモログの調節物質であることが同定されることを含む。
【００２７】
他の側面において、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを調節する剤を同定する方法が提供され、同方法は、
（ｉ）リガンドのＴ１Ｒ２−ＴＭＤへの結合に応答して変化するパラメータを計測すること、
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験剤に応答したパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定し、それにより調節物質またはリガンドを同定すること
を含む。
上記に定義された方法のある態様において、リガンドは、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、ステビオシド、ルブソシド、レバウディオシドＡおよびネオヘスペリジンジヒドロカルコンからなる群から選択される。
【００２８】
上記に定義された方法のある態様において、（ｉ）は、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境においてＴ１Ｒ２−ＴＭＤポリペプチドの特性を計測する。
本発明の態様は上述の方法を包含するが、ただし、本発明は、全長野生型Ｔ１Ｒ２および全長野生型Ｔ１Ｒ３タンパク質の両方を採用する方法を包含しない。
【００２９】
さらなる側面において、本発明は、消費材において甘味を増強する方法であって、消費材に、甘味増強剤を、その甘味検出閾値以下またはその近傍の、濃度２％未満のスクロース溶液と等甘味度の濃度で含ませることを含み、ここでその消費材は甘味料をその甘味検出閾値以上の濃度で含有している、前記方法を含む。
【００３０】
詳細な説明
候補甘味増強剤
化合物または化合物群は、推定される増強剤および甘味料を含有する混合物が、推定される増強剤単独の甘味（混合物中と同濃度において）と甘味料単独の甘味（混合物中と同濃度において）との総和よりも甘かった場合、甘味増強剤である。本発明者らは、限定することなく、ＴＡＳ１Ｒの膜貫通ドメインに結合する後述の化合物を候補甘味増強剤として同定した：ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、ナリンジンジヒドロカルコン、サイクラミン酸塩、ステビオシド、ルブソシド、レバウディオシドＡ、モグロシドＶ、およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン。ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、ステビオシド、ルブソシド、レバウディオシドＡおよびネオヘスペリジンジヒドロカルコンの化学構造は、http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/で見出すことができる。ナリンジンジヒドロカルコンの化学構造は、http://www.chemblink.com/products/18916-17-1.htmで見出すことができる。サイクラミン酸塩の化学構造は、http://chemicalland21.com/lifescience/foco/SODIUM%20CYCLAMATE.htmで見出すことができる。モグロシドＶの化学構造は、http://en.wikipedia.org/wiki/Image:LuHanGuo-Mogroside5.jpgで見出すことができる。候補甘味増強剤は、精製または単離形態あるいは甘味増強活性物質を含有する植物抽出物の形態で利用することができる。
【００３１】
甘味料
甘味料は味の甘味を増大する化合物である。甘味料は、限定されずに、糖類のスクロース、フルクトース、グルコース、ブドウ糖果糖液糖（フルクトースおよびグルコースを含有する）、タガトース、ガラクトース、リボース、キシロース、アラビノースおよびラムノース、糖アルコールのエリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトールおよびイノシトール、および人工甘味料のＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロースおよびサッカリン、ならびにこれら甘味料の組合わせを含む。
【００３２】
テーブルシュガーまたはサッカロースとしても知られているスクロースは、グルコースとフルクトースの二糖類である。その組織名はα−Ｄ−グルコピラノジル−（１→２）−β−Ｄ−フクルトフラノースである。フルクトース、グルコース、タガトース、ガラクトース、リボース、キシロース、アラビノースおよびラムノースは単糖類である。ブドウ糖果糖液糖（ＨＦＣＳ）はグルコースおよびフルクトースの混合物からなる。通常のコーンシロップのように、この高果糖品はコーンスターチから酵素を用いて製造する。コーンシロップ（グルコース）のフルクトース含有量は酵素処理により増大する。一般的な業務用のブドウ糖果糖液糖は、４２％、５５％、または９０％のフルクトース含量を含む。５５％の等級がソフトドリンクで最も一般的に利用されている。
【００３３】
エリスリトール（組織名：１，２，３，４−ブタンテトロール）は天然のノンカロリー糖アルコールである。ＡｃｅＫ、アスパルテーム、ネオテームおよびスクラロースは人工甘味料である。アセスルファムカリウム（ＡｃｅＫ）は、６−メチル−１，２，３−オキサチアジン−４（３Ｈ）−オン２，２−ジオキシドのカリウム塩で、Ｎ−スルホニルアミドである。これはまたアセスルファムＫまたはＡｃｅＫとして、またはSunett(R)およびSweet One(R)を含む様々な商標名で知られている。欧州連合においては、Ｅ番号（添加物コード）Ｅ９５０で知られている。アスパルテームは、ジペプチドのアスパルチル−フェニルアラニン−１−メチルエステルに対する名称である。Equal(R)およびCanderel(R)を含む様々な商標名で知られている。欧州連合においてはＥ番号（添加物コード）Ｅ９５１でも知られている。スクラロースは、クロロデオキシ糖である６−ジクロロ−１，６−ジデオキシ−β−Ｄ−フルクト−フラノシル４−クロロ−４−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに対する名称である。商品名Splenda(R)としても知られている。欧州連合においては、Ｅ番号（添加物コード）Ｅ９５５でも知られている。
【００３４】
天然甘味料は精製または部分精製形態で用いてよく、化学合成、醗酵などの生物工学的処理、または天然給源、特に植物給源（限定することなく、果物、サトウキビ、甜菜を含む）、例えば、限定することなく、コーンシロップ、ブドウ糖果糖液糖、ハチミツ、糖蜜、メープルシロップ、果実濃縮物、ならびに他のシロップおよび抽出物を含む植物抽出物またはシロップなどからの単離を含む任意の方法で調製することができる。
【００３５】
甘味増強剤および甘味料の混合物
本発明者らによって、甘味増強剤およびその複合物の甘味検出閾値が決定された。甘味検出閾値とは、ヒトが甘味と甘味なしの区別を検出するために必要な最小の濃度である。甘味検出閾値は異なる個体で多少違っている。例えばある個体はスクロースの甘味を、０．４％という非常に低い濃度で検出でき、他の個体は少なくとも０．７％またはそれ以上が必要である。全ての例は、少なくとも０．５％またはそれ以下のスクロースを検出可能な甘味感受性のパネリストで行った。平均的な消費者によって検出可能な濃度はしたがってそれより高いだろう。
【００３６】
本明細書中では、甘味増強剤の甘味検出閾値は、甘味感受性のパネリストにより検出された、２％スクロース以下、例えば１％スクロースまで、０．８％まで、０．７５％まで、０．７％まで、または０．５％スクロースまでのスクロースと等甘味度の濃度として定義されている。これらの甘味増強剤相互のおよびこれらと任意成分との組合わせは、本明細書に記載されているように、甘味料に対して特に高い甘味増強効果を有することが見出された。
【００３７】
甘味増強剤の利用
甘味増強剤は単一の甘味増強成分として、例えば０．０００１％から１５％（重量／重量）またはそれ以上の少なくとも１種の甘味料を含有する配合物において、下記に示される濃度で利用可能である。甘味料の有用な濃度は、少なくとも２％、例えば２％から１５％、または５％から１２％などのスクロース溶液と等甘味度をそれ自体で提供する濃度である。例えば、スクロース、フルクトース、グルコース、ブドウ糖果糖液糖（ＨＦＣＳ）またはエリスリトールの有用な濃度は約５％から約１２％であろう。
【００３８】
消費材は、限定することなく、シリアル製品、コメ製品、タピオカ製品、サゴ製品、パン屋製品、ビスケット製品、ペストリー製品、パン製品、菓子類製品、デザート製品、ガム、チューインガム、チョコレート、アイス、ハチミツ製品、糖蜜製品、酵母製品、ベーキングパウダー、塩および香辛料製品、風味製品、マスタード製品、酢製品、ソース（調味料）、刻みたばこ製品、葉巻、巻きたばこ、加工食品、調理済み果物および野菜製品、肉および肉製品、ゼリー、ジャム、果物ソース、卵製品、ミルクおよび乳製品、ヨーグルト、チーズ製品、バターおよびバター代用製品、ミルク代用製品、大豆製品、食用油および脂肪製品、薬剤、飲料、炭酸飲料、アルコール飲料、ビール、ソフトドリンク、ミネラルおよび発泡水、ならびに他のノンアルコール飲料、フルーツ飲料、フルーツジュース、コーヒー、再構成が必要な形態を含む人工コーヒー、茶、ココア、食物エキス、植物エキス、肉エキス、調味料、甘味料、栄養補助食品、ゼラチン、医薬および非医薬ガム、錠剤、トローチ剤、ドロップ、乳剤、エリキシル、シロップおよび飲料を作るための他の調製物、ならびにそれらの組合せを含む、全ての食品を含む。
【００３９】
消費材は低いｐＨを提供するために酸を含有してもよい。例えば、多くの飲料は例えばｐＨ２．６〜３などの低いｐＨを有する。本明細書に記載された甘味増強剤もまた、低ｐＨ状態下で機能し、増強効果を示す。十分な量の本明細書に記載された甘味料を利用して、どのように消費材を甘くするかは、当業者によく知られている。消費材に応じて、甘味料の量は、本明細書に記載された甘味増強剤を加えることで減少可能である。例えば、スクロースを甘味料とした場合、約１〜４°Ｂｘ（°Ｂｘ（ブリックス度）は液体中の水に溶解したスクロースの質量比の計測値である）またはそれ以上の減少が達成可能である。消費材は、本明細書に記載されているように、いかなる量の甘味料も含有してよい。有用な範囲は、例えば、少なくとも２％、例えば約２％から１５％、または約５％から１２％の、スクロース、フルクトース、グルコース、ブドウ糖果糖液糖、またはエリスリトールから選択される１または２以上などである。人工甘味料の有用な範囲は、約２から１５％スクロースと等甘味度の濃度である。異なる甘味料を、スクロースとの等甘味度の少なくとも２％に相当する濃度で組み合わせて利用してよい。例えば、炭酸飲料は通常約１０％から１２％のブドウ糖果糖液糖および／またはスクロースを含有する。
【００４０】
甘味増強剤の同定
キメラ味覚受容体または切断して細胞外ドメインを取り除いた味覚受容体のいずれかが、候補甘味増強剤を同定するためのアッセイに利用される。
【００４１】
切断味覚受容体を利用したアッセイ
Ｔ１Ｒ２ホモマー結合アッセイは、ＵＳ２００５００３２１５８に記載されている。結合アッセイは、機能的受容体活性化ではなく結合のみを示し、エンドポイントに基づくものであり、反応速度測定を含むより迅速な機能アッセイと比較すると時間がかかる。ＵＳ２００５００３２１５８はさらに、知られた機能的受容体Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３に適した、Ｔ１Ｒｓの細胞ベースのアッセイを含む、機能アッセイについても記載している。
【００４２】
本明細書で以下に使用されている、Ｔ１Ｒ２「ホモマー」または「ホモマーの」ポリペプチド、タンパク質、または受容体という用語は、ヘテロダイマーＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体複合体ではなく、Ｔ１Ｒ２ポリペプチドまたはタンパク質のモノマーモノマー、ダイマーまたはオリゴマーを包含することを意味する。
本発明者らは、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー受容体複合体のＴ１Ｒ２サブユニットの大きく切断された配列に相当する、「Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ」と呼ぶ新規な受容体タンパク質が、驚くべきことに、甘味リガンドと結合し、Ｇタンパク質を活性化できる機能的甘味受容体を形成することを見出した。
【００４３】
新規受容体タンパク質Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤは、驚くべきことにリガンドと結合するだけでなく、Ｔ１Ｒ３の非存在下で下流シグナリングを活性化することが見出された。ここで提供される方法によれば、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＧタンパク質の両方を発現しているがＴ１Ｒ３は発現しない細胞を、任意に知られたまたは新たに決定された甘味物質と組み合わせた試験剤と接触させ、前記剤がＴ１Ｒ２のＴＭＤドメインと結合および／またはそれを活性化可能かどうかを決定する。Ｔ１Ｒ２ドメインと結合および／またはそれを活性化する剤は候補甘味料および候補甘味増強剤である。ここで提供されるアッセイは、したがって、試験剤を候補甘味料または甘味応答の候補増強剤として同定するために利用することができる。
【００４４】
剤の受容体およびＧタンパク質に対する機能的効果は、適切な機能アッセイ、例えば細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋濃度などの伝達経路のパラメータの変化を計測するアッセイにより、またはＧＴＰγＳによる標識などの、他のＧタンパク質特異的アッセイにより、当業者に知られた技術に従ってアッセイ決定される。代替的に、結合アッセイをＴ１Ｒ２−ＴＭＤに結合するリガンドの決定に利用してもよい。
【００４５】
本明細書に記載されている、クローニング、リガンド−受容体ペアの解明、および甘味応答の増強剤の検索に関する様々な側面および態様の実施において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術における慣習的な技術が利用される。これらはＴ１Ｒ２−ＴＭＤを含むＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に適した様々な知られた方法を含む。したがって、当業者にはかかる技術が十分に知らされており、それゆえ以下では、本発明の状況をより十分に記載するために、かかる技術はごく簡略化して論じる。
【００４６】
キメラ受容体を利用するアッセイ
キメラタンパク質は、２または３以上の異なるタンパク質由来のアミノ酸配列を含む。キメラタンパク質は、求める特性を組み合わせるか、または不要なものを排除することができる場合がある。以下で用いる、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒという用語は、キメラＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２ホモマー、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ホモマー、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２とＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３または野生型Ｔ１Ｒ３とのヘテロダイマー複合体（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３）、またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３とＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２または野生型Ｔ１Ｒ２とのヘテロダイマー複合体（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３またはＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３）のことを指す。
【００４７】
キメラ味覚受容体について、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、特に、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２モノマー、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３モノマー、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ２サブユニットと野生型Ｔ１Ｒ３）、およびＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（キメラＴ１Ｒ３サブユニットと野生型Ｔ１Ｒ２）を含む。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３またはＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３のＶＦＴドメインを有しておらず、したがってＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３のＴＭＤドメインと結合する化合物を特異的に同定することができる。これらの同定された化合物は、インビボでの甘味受容体との結合において、ＶＦＴ部位に結合する炭水化物と競合することが期待されないので特に興味深く、したがって炭水化物の特に興味深い候補甘味増強剤である。
【００４８】
本発明者らは、キメラモノマー、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３、が機能的であり、機能的ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを形成することを見出した。本発明者らの実験は、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２モノマーサブユニットがまた、ヘテロダイマーを形成することなく、それ自体で機能的甘味受容体として機能することを示している。予備実験は、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３が特定のＧタンパク質との連動および／またはその活性化において困難を有し得ることを示している。しかしながら、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３は、Ｇタンパク質を活性化する能力を必要としない結合アッセイには有用である。
【００４９】
したがって、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３はまた、モノマー形態においても、本明細書に記載された方法において有用である。これらの方法において利用可能な代替的なヘテロダイマーはキメラサブユニット／野生型サブユニットヘテロダイマー（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３）である。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーにおいて、ヘテロダイマー複合体のそれぞれのＣＳＲ：Ｔ１Ｒサブユニットは、２つの給源タンパク質からの配列断片の組合せからなる。２つの給源タンパク質はヒトカルシウム感知受容体（ｈＣａＳＲ）、およびＴ１Ｒタンパク質（Ｔ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３）である。両サブユニットに共通するｈＣａＳＲ由来断片（ＣＳＲ）は、ｈＣａＳＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。Ｔ１Ｒ由来断片は、Ｔ１Ｒ配列の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含み、Ｔ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３に由来するため、２つの異なるタイプを有する。
【００５０】
提供されるキメラＣＳＲ：Ｔ１Ｒ構築物（ＤＮＡ、ベクター、トランスフェクト細胞、タンパク質）は、例えば本明細書に記載されている候補甘味増強剤などの甘味応答の増強剤をスクリーニングする場合に有用である。従来のスクリーニング方法および結合アッセイもまた増強剤をスクリーニングするのに利用し得る。かかるスクリーニング方法論は当業者によく知られており、概要を以下に記す。
【００５１】
代替的に、キメラＣＳＲ：Ｔ１Ｒ構築物中のＣＳＲ（ｈＣａＳＲのカルシウム感知受容体部分）の利点は、得られる受容体がカルシウム応答性であることである。その結果、Ｔ１Ｒ受容体のリガンド／アゴニストの存在／非存在下において増強剤をスクリーニングする場合、リガンドを甘味化合物の代りにｈＣａＳＲ刺激性リガンドに置き換えることが可能である（例えば、塩化カルシウムの形態に）。これには、実際に存在するリガンド／アゴニストのあらゆる否定的な効果を回避できるという付加的な利点がある。例えば、糖リガンド／アゴニストの増強剤をスクリーニングする場合、浸透圧濃度などへの糖の不利な効果を回避できる。カルシウム感知受容体に加えて、キメラ受容体の潜在的パートナーとしてまた考えられる、他のクラスＣ  ＧＰＣＲからの細胞外ドメインは、例えば代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）、ＧＰＲＣ型受容体（すなわちＧＰＲＣ５およびＧＰＲＣ６ａ）、Ｖ２Ｒフェロモン受容体、およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体などを含む。ｈＣａＳＲ細胞外ドメインを利用するのと同様に、他のクラスＣ  ＧＰＣＲの細胞外ドメインのリガンドを利用することは、甘味増強剤のスクリーニングにおいて、糖に代替するリガンドの利用を潜在的に可能にする。
【００５２】
切断味覚受容体を用いるアッセイに利用される細胞
切断味覚受容体にとって、本発明によるスクリーニングまたはアッセイに有用な細胞は、Ｔ１Ｒ３を含まない細胞である。トランスフェクトされたまたは内在性のＴ１Ｒ３は、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤのアゴニスト応答または他の増強剤による前記応答の変化を決定する方法を否定的に妨害し得る。Ｔ１Ｒ３の非存在は、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ活性化の決定にヌルバックグラウンド（null background）を提供し、観察されるシグナルは直接Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ活性の結果とすることができる。このことは、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを特異的に調節する剤の同定を可能にし、Ｔ１Ｒ３が甘味およびうま味ヘテロダイマー両方の一部であるため、うま味物質をも含み得るＴ１Ｒ３を活性化する剤を排除できる。
【００５３】
適切な真核細胞は、Ｔ１Ｒ３を含まない真核細胞、例えば、限定することなく、哺乳類細胞、酵母細胞、または昆虫細胞（Ｓｆ９を含む）、両生類細胞（メラニン保有細胞を含む）、またはCaenorhabditis細胞（Caenorhabditis elegansを含む）を含むぜん虫細胞などを含む。Ｔ１Ｒ３を含まない適切な哺乳類細胞は、例えば、限定することなく、ＣＯＳ細胞（Ｃｏｓ−１およびＣｏｓ−７を含む）、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞、または他のトランスフェクト可能な真核細胞細胞系を含む。Ｔ１Ｒ３を含有しない適切な細菌細胞は、限定することなく、E.Coliを含む。
【００５４】
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３アッセイに利用される細胞
トランスフェクトされたまたは内在性のＴ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２は、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３それぞれのアゴニスト応答または他の増強剤による前記応答の変化を決定する方法を否定的に妨害し得る。Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ２の非存在は、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３活性化の決定にヌルバックグラウンドを提供し、観察されるシグナルを直接ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３活性の結果とすることができる。このことは、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２および／またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３を特異的に調節する剤の同定を可能にし、Ｔ１Ｒ３について言えば、Ｔ１Ｒ３は甘味およびうま味ヘテロダイマー両方の一部となるため、うま味物質をまた含み得る野生型Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を活性化する剤を排除できる。
【００５５】
内在性の野生型Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の存在は、望ましくないいくつかのバックグラウンドシグナルの原因となるだろう。内在性のＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３を有する細胞は、十分低いバックグラウンドを伴う結果を得るのに依然として有用ではあるが、通常、よりよい選択は内在性Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３受容体を含有しない細胞である。しかしながら、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質を利用する場合、細胞はバックグラウンドに不利な効果を有さない野生型Ｔ１Ｒ３を含有してもよい。同様にＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質を利用する場合、細胞はバックグラウンドに不利な効果を有さない野生型Ｔ１Ｒ２を含有してもよい。
【００５６】
下記に列挙した細胞は内在性野生型Ｔ１Ｒ３または内在性野生型Ｔ１Ｒ２を含まないため特に有用である。しかしながら代替的な細胞もまた本明細書に記載された方法において有用である。
【００５７】
適切な真核細胞は、例えば、限定することなく、哺乳類細胞、酵母細胞、または昆虫細胞（Ｓｆ９を含む）、両生類細胞（メラニン保有細胞を含む）、またはCaenorhabditis細胞（Caenorhabditis elegansを含む）を含むぜん虫細胞などを含む。Ｔ１Ｒ３を含有しない適切な哺乳類細胞は、例えば、限定することなく、ＣＯＳ細胞（Ｃｏｓ−１およびＣｏｓ−７を含む）、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞、または他のトランスフェクト可能な真核細胞細胞系を含む。Ｔ１Ｒ３を含まない適切な細菌細胞は、限定することなく、E.Coliを含む。
【００５８】
細胞は、当業者によく知られているように、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質（受容体をホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に連結する）を一過性にまたは安定的にトランスフェクトされてもよい。味覚ＧＰＣＲとの増強されたカップリングを提供するキメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４の優れた異種発現系はＷＯ２００４／０５５０４８（Ｇ．ｓｕｂ．．ａｌｐｈａ．１６  ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇ．ｓｕｂ．ａｌｐｈａ．１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇａ１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６−ガストデューシン  ４４、または以下で使用されているように「Ｇα１６ｇｕｓｔ４４」としても知られている）に詳細に記載されている。代替的に、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているＧαｑ−ガストデューシンに基づいた他のキメラＧタンパク質、または、例えばＧ１６またはＧ１５などの、他のＧタンパク質もまた利用してよい。
【００５９】
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒは、受容体を、例えばホスホリパーゼＣシグナル伝達経路などの、シグナル伝達経路、または例えば後述のものを含むシグナル伝達経路に連結するＧタンパク質とともに、細胞内で発現させることが可能である：アデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、ＩＰ３、ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合、アラキドン酸、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ、ＤＡＧ、プロテインキナーゼｃ（ＰＫＣ）、ＭＡＰキナーゼ、チロシンキナーゼ、またはＥＲＫキナーゼ。代替的に、以下に詳述するように、いかなる適切なリポーター遺伝子もＣＳＲ：Ｔ１Ｒ活性化応答プロモーターに連結し、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ活性の決定に利用することができる。
【００６０】
上述の細胞に利用されるベクター構築物
かかる細胞中でＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒならびに／あるいはＧタンパク質を発現するベクター構築物は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を利用する知られた技術あるいは方法によって産生することができる。配列の確認後、ｃＤＮＡ断片は、例えばｐｃＤＮＡ３．１哺乳類細胞用哺乳類発現ベクターなど、適切なベクター内へサブクローニングされてよく、正しい遺伝子の発現を可能にするために対応する宿主細胞に一過性にトランスフェクトされてよい。
【００６１】
例えば４８時間の、トランスフェクト後期間の後、タンパク質の正しい発現を確認するために細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによって解析してもよい。一度正しいタンパク質の発現が確認されれば、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ  Ｔ−ＲｅｘＴＭを含む哺乳類細胞などの適切な細胞は、当業者に知られた技術に従って、安定してタンパク質を発現する細胞を生成するためにトランスフェクトされてよい。
【００６２】
代替的に、様々な非哺乳類発現ベクター／宿主システムが、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒをコードする配列の含有および発現に利用可能である。これらは、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌を含む微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）、または細菌発現ベクター（例えばｐＢＲ３２２プラスミド）で感染させた昆虫細胞システムなどを含む。以上に記載された系とともに利用することができる特定のベクターの例は、G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, Tatsuya Haga and Gabriel Berstein編、第１版、CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に記載されている。
【００６３】
細菌系において、多くのクローニングおよび発現ベクターが、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒをコードするポリヌクレオチド配列について意図する利用に応じて選択し得る。例えば、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列のルーチンのクローニング、サブクローニング、および増殖が、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene, La Jolla Calif.）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Life Technologies）などの多機能性大腸菌ベクターを利用して行える。ＧＰＣＲをコードする配列の、ベクターのマルチクローニングサイトへのライゲーションはｌａｃＺ遺伝子を妨害し、組換え分子を含有する形質転換細菌の同定のための比色スクリーニング手法を利用可能にする。加えて、これらベクターはインビトロ転写、ジデオキシシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue）、およびクローニングされた配列内のネストされた欠失の作出にも有用であり得る。例えば抗体の産生など、多量のＧＰＣＲが必要な場合、ＧＰＣＲの高発現を導くベクターが利用し得る。例えば強い、誘導可能なＳＰ６またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターなどが利用し得る。
【００６４】
酵母発現系はＧＰＣＲの産生に利用されてよい。アルファファクター、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨプロモーターなどの構成的または誘導プロモーターを含む多数のベクターが酵母Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastorisに利用し得る。加えて、かかるベクターは、発現タンパク質の分泌または細胞内の保持を導き、安定的増殖のための外来性配列の宿主遺伝子への統合を可能にする。
【００６５】
異種タンパク質を昆虫細胞細胞系で発現するために、例えば、Lepidopteran baculovirusまたはAutographia californicaマルチカプシドヌクレオウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の誘導体が利用可能である。このシステムにおいて、外来性遺伝子発現は、ポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターのいずれかの、非常に強い後期ウィルスプロモーターに導かれ、多様なベクターが、組換えタンパク質の発現および回収の最適化に利用可能である。これらのベクターは膜結合型および分泌型タンパク質の両方を高度に発現することが可能であり、また哺乳類システム中で起こることが知られる、Ｎ−およびＯ−連結糖鎖付加、リン酸化、アシル化、タンパク質分解および分泌ワクチン成分を含む多くの翻訳後修飾も可能である。例えばInvitrogenのInsectSelectＴＭなどの多くのベクターが商業的に入手可能である。
【００６６】
発現系
求めるタンパク質（例えばＧタンパク質およびＣＳＲ：Ｔ１ＲまたはＴ１Ｒ２−ＴＭＤのいずれか）をコードするｃＤＮＡを発現するために、転写を導く強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーターおよび翻訳開始のためのリボソーム結合領域を含む、適切なｃＤＮＡが入った発現ベクターを典型的にサブクローニングする。例えばE.coli、Bacillus sp.、およびSalmonellaなど、適切な細菌プロモーターは当業者によく知られており、かかる発現系のためのキットが商業的に入手可能である。同様に、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核細胞発現系も商業的に入手可能である。真核細胞発現ベクターは、例えばアデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウィルスベクターなどであってよい。
【００６７】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的に、宿主細胞においてタンパク質をコードする核酸を発現するのに必要な付加的要素の全てを含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットはしたがって、タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターおよび、転写の効率的なポリアデニレーションに必要なシグナル、リボソーム結合領域、および翻訳ターミネーションを含む。タンパク質をコードする核酸配列は典型的に、組換えタンパク質の効率的な細胞表面発現を推進するために、ラットソマトスタチン−３受容体配列のＮ末端４５アミノ酸などの、細胞表面受容体に有用な膜標的化シグナルに連結していてよい。付加的なベクター要素は、例えばエンハンサーなどを含んでもよい。発現カセットはまた、構造遺伝子の下流に、効果的なターミネーションを提供するための転写終止領域も含むべきである。終止領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、また異なる遺伝子から得てもよい。
【００６８】
タンパク質の発現のために、真核細胞または原核細胞における発現のために当業者によく知られた、慣用のベクターを利用してよい。ベクターの例は、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、およびｐＥＴ２３Ｄを含むプラスミドなどの細菌発現ベクター、および例えばＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系を含む。
【００６９】
真核ウィルス由来の制御要素を含む発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、サイトメガロウィルスベクター、パピローマウィルスベクター、およびエプスタイン・バーウィルス由来のベクターなどは、典型的に真核発現ベクターとして利用される。他の真核ベクターの例には、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳ、およびＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内での発現に効果を示す他のプロモーターの指揮下でタンパク質を発現させられる他のいかなるベクターも含む。いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸リダクターゼなどの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。
【００７０】
典型的に発現ベクターに含まれる要素には、E.Coli中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを取り込んだ細菌の選別を可能にする薬剤耐性をコードする遺伝子、および真核配列の挿入を可能にするプラスミドの本質的でない領域のユニークな制限部位なども含んでよい。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重大ではない。当該技術分野で知られたあらゆる多くの薬剤耐性遺伝子が適している。原核および真核細胞の両方で利用されるベクターに関して、原核配列は、真核細胞内でのＤＮＡの複製を妨害しないように任意に選択される。
【００７１】
細菌システムにおいて、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１ＲのｃＤＮＡ断片は、単独で、または、対象となるＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒが、E.Coliペリプラズムマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）であって、シグナルペプチドを含むＭＢＰがＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒのアミノ末端に連結しているものに融合した融合タンパク質として発現されてよい。Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１ＲのｃＤＮＡあるいはＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１ＲとＭＢＰとの融合タンパク質ｃＤＮＡは、例えばE.Coli  ＧＰＣＲの発現がｌａｃ野生型プロモーターによって駆動されるｐＢＲ３２２など、適切なプラスミドへサブクローニングされる。E.ColiにおけるＧＰＣＲの発現方法は、例えばG-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, Tatsuya Haga and Gabriel Berstein編, 第１版, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999などに記載されている。
【００７２】
内在性ＧＰＣＲを欠損した遺伝子操作酵母システムおよび昆虫細胞システムは、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ活性化スクリーニングまたはＴ１Ｒ２−ＴＭＤ活性化スクリーニングに対してヌルバックグラウンドであるという利点を提供する。遺伝子操作酵母システムはヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を、対応する内在性酵母フェロモン受容体経路の成分と代替するものである。下流シグナル経路はまた、通常の酵母シグナル応答が選択培地上でのプラス成長またはレポーター遺伝子発現に転換するように、改変される（Broach, J. R. and J. Thorner, 1996, Nature, 384 (supp.):14〜16に記載）。遺伝子操作された昆虫システムは、受容体をホスホリパーゼＣシグナル経路に連結できるヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を組み込んでいる（例えばKnight and Grigliatti, 2004, J. Receptors and Signal Transduction, 24: 241〜256参照）。両生類細胞システム、特にメラニン含有細胞は、例えばＧＰＣＲ発現系について記載した国際特許出願９２／０１８１０などに記載されている。
【００７３】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒの過剰発現
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒは、例えばＣＭＶ早期プロモーターなどの強力な構成的プロモーターの制御下に置くことにより過剰発現されることができる。代替的に、保存されているＧＰＣＲアミノ酸またはアミノ酸ドメインのある変異を導入し、利用するＧＰＣＲを構成的に活性化させることが可能である。
【００７４】
誘導プロモーターもまた、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ発現の誘導、制御、および調節に利用してもよい。例えば、限定することなく、Ｔ−ＲｅｘＴＭ発現系（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を用いることができる。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステムは、E.Coli Ｔｎ１０にコードされたテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性オペロン由来の調節エレメントを利用したテトラサイクリン制御哺乳類発現系である。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステム中のテトラサイクリン調節は、テトラサイクリンのＴｅｔリプレッサーへの結合および対象となる遺伝子の発現を制御するプロモーターの抑制解除に基づいている。
【００７５】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ発現ベクター構築物の細胞内へのトランスフェクション
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒなどの対象となるタンパク質を大量に発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫の細胞系を作出するために、標準的なトランスフェクション法が利用可能である。核酸配列を宿主細胞に導入するために知られたいかなる方法も利用してよい。用いる特定の遺伝子操作手順は、対象となるタンパク質を発現できる宿主細胞中に関係する遺伝子を首尾良く導入できさえすればそれでよい。これらの方法は、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来性の遺伝物質を宿主細胞中に導入することを伴ってもよく、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウィルスベクターなどを含む。
【００７６】
細胞培養
トランスフェクト後、トランスフェクトされた細胞は、当業者によく知られた標準的な培養条件で培養することができる。異なる細胞は、適切な温度および細胞培養培地を含む、異なる培養状態を要求することは、当業者に明らかである。
【００７７】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ受容体タンパク質回収
必要に応じて、タンパク質を標準的な技術を利用して細胞培養から回収することができる。例えば、沈殿およびクロマトグラフィ工程に供する前に細胞を機械的にまたは浸透圧ショックによって破裂させてよく、その性質と順序は回収される特定の組換え物質次第である。あるいは、組換えタンパク質を、組換え細胞が培養された培養培地から回収することもできる。
【００７８】
本明細書のアッセイによって同定され得る味覚調節物質
Ｔ１Ｒ受容体活性の調節物質（リガンド、アゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、阻害剤、増強剤を含む様々なタイプ）は、本明細書に記載されたアッセイによって同定可能である。調節物質のタイプは同時に１以上のタイプを含んでもよく、濃度に依存し得る。例えば、剤がある濃度範囲においてアゴニストとして作用するが、別の濃度範囲においては他のアゴニスト（例えば甘味料または糖）の増強剤として作用することもある。したがって、剤はその調節活性の決定のために異なる濃度で試験されるべきである。これから本明細書に記載された方法において同定可能な剤の定義について述べる。
【００７９】
増強剤は、１または２以上の後述のものの増大を引き起こす剤である：受容体の細胞表面発現、リガンドの受容体への結合、リガンド誘導性の受容体活性、または受容体の活性化形態によって開始される細胞内応答（アゴニストの存在下または非存在下における）。阻害剤は、１または２以上の後述のものの減少を引き起こす剤である：受容体の細胞表面発現、リガンドの受容体への結合、リガンド誘導性の受容体活性、または受容体の活性化形態によって開始される細胞内応答（アゴニストの存在下または非存在下における）。増強剤はそれ自身が受容体に結合し、それを活性化し、それによって細胞内応答の増大を調節するアゴニストであり得る。
【００８０】
増強剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体またはその断片を含む様々なタイプの化合物を含む。それらは、合成または天然物質、天然材料の抽出物を含む様々な給源、例えば動物、哺乳類、昆虫、植物、細菌または真菌細胞材料または培養細胞、またはかかる細胞の馴化培地などに由来し得る。
【００８１】
リガンドは受容体と結合する剤であり、アゴニスト、部分的アゴニスト、増強剤、阻害剤、アンタゴニスト、または逆アゴニストであってもよい。アゴニストは、受容体を活性化し、受容体に結合したときにアゴニストの非存在下での細胞内応答と比較して、細胞内応答を増大させるＴ１Ｒ受容体のリガンドである。付加的にまたは代替的に、アゴニストは、アゴニストの非存在下で細胞表面に存在する細胞表面受容体の数と比較して、受容体の細胞表面発現を増大させるように、細胞表面受容体の内在化を減少させ得る。Ｔ１Ｒのアゴニストは、例えばカルシウム、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、ＮＤＨＣ、シンナモニトリルなどを含む。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のリガンドは、ＣＳＲドメインリガンド（例えばカルシウム）およびＴＡＳ１Ｒドメインリガンド（例えばＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３膜貫通ドメインに結合する候補甘味増強剤）を含む。
【００８２】
部分的アゴニストは、受容体を最大限活性化する他のアゴニストと比べて、部分的にしか作用しないアゴニストである。アンタゴニストは、アゴニストと同じ（競合的アンタゴニスト）または異なる（アロステリックアンタゴニスト）受容体の部位に結合するが、受容体の活性化形態によって起こる細胞内応答を活性化せず、それゆえアゴニストの存在下およびアンタゴニストの非存在下と比較して、アゴニストによって誘導される細胞内応答を阻害するリガンドである。受容体と結合する逆アゴニストは、受容体によって媒介される構成的細胞内応答を、逆アゴニストの非存在下における細胞内応答と比較して減少させる。阻害剤は、阻害剤の非存在下におけるアゴニストの結合と比較して、アゴニストと受容体との結合を減少させ、および／またはアゴニストによって誘導される細胞内応答を減少させる。
【００８３】
リガンドを結合し、例えばＧタンパク質（すなわち増強剤との種々の相互作用に起因して）などによりシグナルを伝達する受容体の活性または活性の変化は、以下に記載されるアッセイによって決定可能である。
【００８４】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ受容体の増強剤同定のためのアッセイ
増強剤は、機能的効果／パラメータを決定および比較するための、多種多様なインビトロおよびインビボアッセイを利用して、または代替的に結合アッセイによって、同定可能である。受容体の機能上の試験剤の効果は適切な機能的パラメータを分析することで計測可能である。受容体活性に影響するあらゆる生理学的変化は、増強剤の同定のために利用可能である。
【００８５】
かかる機能的アッセイは、例えば動物から単離された無傷の細胞または組織を利用したアッセイおよび濃度、活性またはそれらの二次メッセンジャーの変化（例えば細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、イノシトールリン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール／ＤＡＧ、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼまたはチロシンキナーゼなどを含む）、イオンフラックス、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルの計測に基づいたアッセイ、およびＧＴＰ結合性、ＧＴＰ分解酵素、アデニル酸シクラーゼ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、ＰＫＣ、キナーゼおよび転写レポーターに基づいたアッセイなど、当業者によく知られている。いくつかの適切なアッセイが、例えばＷＯ  ０１／１８０５０に記載されている。
【００８６】
受容体活性化は、典型的には例えば、例えば細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンを放出するＩＰ３などの二次メッセンジャーの増大など、後続する細胞内イベントの起点となる。いくつかのＧタンパク質共役受容体活性化は、ホスホリパーゼＣ媒介ホスファチジルイノシトール加水分解を通したイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する。ＩＰ３は次に細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンの放出を刺激する。全ての機能的アッセイは、例えば受容体をその表面または単離細胞膜画分上に発現する細胞を含有するサンプルで行うことができる。有用な細胞は上述されている。また、例えば遺伝子組換え動物からの組織も利用してよい。
【００８７】
それ自身がアゴニストではない（例えば、代わりにアンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、阻害剤、または増強剤である）増強剤を同定するため、いずれもアゴニストを含有する、試験剤を含むサンプルおよび含まないサンプルを比較する。受容体がＣＳＲ：Ｔ１Ｒの場合、アゴニストとして例えばカルシウムを用いることができる。カルシウムの使用は、両方のＴＭＤがアクセス可能となる利点を有する。他の知られたまたは同定されたアゴニスト、例えば、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、サイクラミン酸塩、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、およびシンナモニトリルなどもまた利用可能である。
【００８８】
しかしながら、これらは、推定増強剤の増強剤結合部位と一致し得るリガンド／アゴニスト結合部位を部分的にふさぎ、低シグナルの原因となり得る。例えば、コントロール（アゴニストを含むが増強剤は含まない）の相対的受容体活性値を１００とする。コントロールに対する活性の減少により阻害剤、アンタゴニストまたは逆アゴニストが同定され、一方、増大により増強剤が同定される。計測された活性における、例えば１０％またはそれ以上（または統計学的に有意な任意の差異）の増大または減少は、試験剤を含むサンプルにおいて試験剤を含まないサンプルと比べて、または試験剤を含むサンプルにおいて、試験剤を含むが、細胞がＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを発現しない（モックトランスフェクション細胞）コントロールサンプルに比べて有意であるとみなされる。
【００８９】
アゴニストまたは部分的アゴニストの同定
ＶＦＴドメインに結合しないアゴニストまたは部分的アゴニストを同定するために、試験剤を有するサンプルを、アゴニスト（例えば塩化カルシウム（受容体がＣＳＲ：Ｔ１Ｒの場合）、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、シンナモニトリル、または他の同定されたリガンド／アゴニスト）を有するポジティブコントロールと比較する。代替的に／付加的に、試験剤を有するおよび有さないサンプルが、そのＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質との活性について比較される。例えば、アゴニストまたは部分的アゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストが１００ｍＭまたはそれ以下で存在していた場合、ポジティブコントロール甘味アゴニストの最大生物学的活性の少なくとも１０％に相当する生物学的活性を有しており、例えばアゴニストの最大生物学的活性に匹敵するまたはそれ以上の最大生物学的活性を有し得る。
【００９０】
最大生物学的活性は、与えられた受容体アッセイフォーマット内で達成可能なアゴニスト、例えば塩化カルシウム、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）、シンナモニトリルなどアッセイに対する最大達成可能な受容体応答であって、その応答が、同じアゴニストの濃度を増大させて適用してもさらに増大できないものと定義される。
【００９１】
上述のアゴニストは、異なる濃度において、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニストの増強剤としても働き得る。これは、アゴニスト−試験剤を甘味増強効果を示すシグナルについて試験するために、カルシウムまたは他のアゴニストを利用したスクリーニング法で試験することができる。代替的に、試験剤を有するサンプルにおける、例えば１０％またはそれ以上の計測活性の増大が、試験剤を有さないサンプルまたは試験剤を有するがＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクション細胞）に基づくサンプルと比較される。
【００９２】
アンタゴニストを同定するために、知られたアゴニストの存在下における、試験剤の存在下および非存在下での受容体活性が比較される。アンタゴニストは、例えば少なくとも１０％の、アゴニスト刺激性受容体活性の減少を示す。逆アゴニストを同定するために、試験剤の存在下および非存在下での受容体活性が、上述のように、受容体を過剰発現する動物／細胞／膜を含有するサンプルで比較される。逆アゴニストは、例えば少なくとも１０％の、受容体の構成的活性の減少を示す。
【００９３】
多くのスクリーニングはカルシウム活性に頼っており、これらについては、細胞、受容体、酵素またはリポーター遺伝子を非特異的に刺激することを回避するために、カルシウムの少ない緩衝系を利用すべきである。細胞質イオン濃度または膜電位の変化を決定するために、G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, Tatsuya Haga and Gabriel Berstein編, 第１版, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に詳述されているように、受容体活性を報告するために、細胞にイオン感受性色素を負荷することができる。細胞質または膜電位におけるイオン濃度の変化は、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光指標を利用して計測される。上述のアッセイにおけるＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ受容体活性を計測する適切な検出法の様々な例を以下に記載する。
【００９４】
カルシウムフラックスアッセイ
ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出は、カルシウムに結合する細胞持続性（cell-permanent）色素を利用して決定される。カルシウム結合性色素は、細胞内のカルシウム上昇に比例する蛍光シグナルを発生する。この方法は、受容体活性の迅速かつ定量的な計測を可能にする。
【００９５】
用いる細胞は、上述のようにホスホリパーゼＣ経路に連結できるようにするために、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ  ＧＰＣＲとＧタンパク質とを共発現するトランスフェクト細胞である。ネガティブコントロールは、候補化合物の可能な非特異的効果を排除するために、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを発現しない細胞またはその膜（モックトランスフェクションしたもの）を含む。カルシウムフラックス検出手順はG-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, Tatsuya Haga and Gabriel Berstein編, 第１版, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に詳述されており、適合させたバージョンの概略を以下に記載する。
【００９６】
０日目：９６ウェルプレートに、１ウェルあたり８５００個の細胞を播種し、栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
１日目：１ウェルあたり１５０ｎｇのＧＰＣＲ  ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用して、細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
【００９７】
２日目：成長培地を捨て、細胞を、１．５μＭのFluo-4 AM（Molecular Probes）および２．５μＭのプロベニシドを、３７℃で１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４）を含有する、低カルシウムＣ１緩衝液（標準Ｃ１緩衝液の組成は下記例１参照）に溶かしたものからなる５０μｌのカルシウムアッセイ溶液で１時間（室温にて暗所で）インキュベートする。１２５μｌの低カルシウムＣ１緩衝溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートをさらに３０分室温にて暗所でインキュベートする。緩衝溶液を捨て、プレートを１００μｌの低カルシウムＣ１緩衝溶液を洗浄緩衝液として５回洗浄し、細胞を２００μｌの低カルシウムＣ１緩衝液中で再構成する。プレートを、例えばFlexstation（Molecular Devices）またはFLIPR（蛍光イメージングプレートリーダー）（Molecular Devices）などの蛍光マイクロプレートリーダーに設置し、２０μｌの１０倍濃縮リガンドストック溶液を加えて受容体活性化を開始する。
【００９８】
蛍光は、リガンドを加える１５秒前からリガンドを加えた後４５〜１１０秒後まで継続的に監視する。受容体活性化レベルは以下の２つの方程式で定義される：活性化の％＝（（最大蛍光−基準蛍光）／基準蛍光）×１００、または蛍光増加＝最大蛍光−基準蛍光、式中基準蛍光はリガンド添加前の平均蛍光レベルを表す。代替的に、受容体活性化は、基準蛍光（Ｆ０）で標準化されたピーク蛍光（Ｆ）の増大で検出することもできる。データは以下の方程式を用いて標準化される：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ0）／Ｆ0、式中Ｆはピーク蛍光シグナルおよびＦ0は基準蛍光シグナルであり、基準蛍光はリガンド添加前の最初の１０〜１５秒から計算される平均蛍光を表す。
【００９９】
有用な細胞は、これに限定するものではないが、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞などの上述した哺乳類細胞である。細胞は、当該技術分野でよく知られているとおりに、ＧＰＣＲとＧタンパク質で一過性にまたは安定的にトランスフェクトすることができる。優れた異種発現系は、ＷＯ２００４／０５５０４８に詳述されている。カルシウムフラックスアッセイは、例えば後述の例１に記載されているように行うことができる。増強剤の同定は、上述の方法を以下のように変更して行われる。シグナルは、アゴニストの存在下だが試験剤の非存在下でＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを発現する遺伝子組換え細胞から得られた、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ活性の基準レベルと比較される。Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ活性の増大または減少、例えば、これに限定するものではないが、１０％、２０％、５０％、または１００％またはそれ以上などの、統計学的に有意なあらゆる増大により増強剤を同定する。代替的に、同定は、増強剤が存在しないサンプルと比較した場合または増強剤は存在するがＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現しない細胞（モックトランスフェクションした細胞）のサンプルと比較した場合、例えばこれに限定するものではないが１０％またはそれ以上の、蛍光強度の統計的に顕著な増大または減少を伴う。
【０１００】
アデニル酸シクラーゼ活性
アデニル酸シクラーゼ活性のためのアッセイは、例えばKenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585〜591に詳述されているように行われる。反応混合物は通常３７℃で１０分以下インキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物は０．９ｍｌの冷６％トリクロロ酢酸を添加して除タンパクする。チューブを遠心し、それぞれの上清をＤｏｗｅｘ  ＡＧ５０ｗ−Ｘ４カラムに加える。カラムからのｃＡＭＰ画分を、アゴニストによる受容体活性化を受けて発生したｃＡＭＰレベルを計測するために、４ｍｌの０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で計数バイアル中に溶出する。コントロール反応もまた、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現しない細胞のタンパク質ホモジネートを利用して行うべきである。
【０１０１】
ＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル
Ｇタンパク質を発現している細胞中で、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）／Ｃａ２＋およびその結果としての受容体活性に相当するシグナルを、蛍光を利用して決定可能である。ＧＰＣＲを発現している細胞は、細胞内貯蔵およびイオンチャネルの活性化経由の寄与の結果、細胞質カルシウムレベルの増大を見せ得、必須ではないが、カルシウムフリー緩衝液中でかかるアッセイを実施し、内在ストアからのカルシウム放出（G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, Tatsuya Haga and Gabriel Berstein編, 第１版, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999参照）の結果による蛍光応答と区別するために、随意にＥＤＴＡなどのキレート剤を補完することが望ましいだろう。
【０１０２】
ホスホリパーゼＣ／細胞内Ｃａ２＋シグナル
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒは、受容体とホスホリパーゼＣシグナル伝達経路を連結するＧタンパク質を有する細胞で発現される。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば蛍光Ｃａ２＋指示色素および／または蛍光イメージングなどを利用して、計測する。（G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, Tatsuya Haga and Gabriel Berstein編, 第１版, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999参照）
【０１０３】
ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを含むＧＰＣＲにとって、受容体活性の指標はＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。本方法は、標識ＧＴＰの結合を決定することで膜と連結するＧタンパク質を計測する。受容体を発現する細胞から単離された膜は、３５Ｓ−ＧＴＰγＳおよび未標識ＧＤＰを含有する緩衝液中でインキュベートされる。活性を有するＧＴＰａｓｅは無機リン酸塩として標識を放出し、これは２０ｍＭのＨ３ＰＯ４中の活性炭５％懸濁液中で遊離無機リン酸塩を分離した後にシンチレーションカウンティングによって決定される。混合物をインキュベートし、未結合標識ＧＴＰをＧＦ／Ｂフィルターでろ過して取り除く。結合した標識ＧＴＰを液体シンチレーションカウンティングで計測する。コントロールは、試験剤の非特異的効果の可能性を排除するために、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクションしたもの）から単離した膜を利用するアッセイを含む。方法はTraynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol., 47: 848〜854に詳述されている。
【０１０４】
増強剤または阻害剤を同定するために、上述の、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性などの、統計学的に有意な、例えば１０％またはそれ以上の変化（増大または減少）は通常十分である。しかしながら、作用薬を同定するためには、上述のアッセイは以下のように変更して実施する。剤は、化合物が１００ｍＭまたはそれ以下、例えば１０μＭから５００μＭの範囲など、例えば約１００μＭで存在したときに、活性が、知られた作用薬（例えばペリラルチン）のそれの少なくとも５０％であった場合、または知られた作用薬によって誘導されるレベルと同じまたはそれ以上のレベルを誘導する場合、通常作用薬として同定される。
【０１０５】
マイクロフィジオメーターまたはバイオセンサー
かかるアッセイはHafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149〜158に詳述されているように行うことができる。
アラキドン酸
アラキドン酸の細胞内レベルは受容体活性の指標として採用される。かかる方法はGijon et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:20146〜20156に詳述されている。
【０１０６】
ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ
細胞内または細胞外ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または、例えばHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91〜105に記載されているような、ｃＡＭＰ結合タンパク質を利用して計測可能である。例えばLJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsの高効率蛍光偏光ベースホモジニアスアッセイなど、複数のｃＡＭＰ計測のためのキットもまた商業的に入手可能である。代替的に、ｃＧＭＰの細胞内または細胞外レベルもまた、例えばイムノアッセイを利用して計測可能である。例えば、Felly-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159〜164(1994)に記載の方法などが、ｃＧＭＰレベルを決定するのに利用され得る。代替的に、米国特許４，１１５，５３８に記載されているｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを計測するアッセイキットもまた利用可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１０７】
ＤＡＧ／ＩＰ３
例えばPhospholipid Signaling Protocols, Ian M. Bird, Totowa, N.J.編, Humana Press, 1998に記載のように、受容体活性に起因するリン脂質分解によって放出される、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を検出し、ＧＰＣＲ（Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ）活性の指標として利用することが可能である。例えばPerkin Elmer and CisBio Internationalから商業的に入手可能な、イノシトール三リン酸の計測のためのキットもまた利用可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１０８】
ＰＫＣ活性
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質およびカルシウム活性化タンパク質キナーゼファミリーの、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を伴う経路を通してシグナリング可能である。ＰＫＣに誘導される遺伝子産物の増大は、ＰＫＣの活性化およびその結果としての受容体の活性化を示す。これらの遺伝子産物は、例えばガン原遺伝子転写因子コード遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｊｕｎを含む）、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤（コラーゲナーゼタイプＩおよびプラズミノーゲン活性化因子阻害剤を含む）、および接着分子（細胞内接着因子Ｉ（ＩＣＡＭ  Ｉ）を含む）などを含む。ＰＫＣ活性はKikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 13341に記載されているように、その後ホスホセルロースペーパーに結合することによって分離されるＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を計測することで、直接計測し得る。これは精製キナーゼまたは粗細胞抽出物中の活性の計測に利用可能である。タンパク質キナーゼＣサンプルは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＤＴＴでアッセイ直前に希釈可能である。代替的なアッセイは、PanVeraから商業的に入手可能なタンパク質キナーゼＣアッセイキットを利用して行うことも可能である。
【０１０９】
上述のＰＫＣアッセイは、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒを発現する細胞からの抽出物に対して行う。活性はまた、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の制御配列によって駆動するリポーター遺伝子構築物の利用を通して計測可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１１０】
ＭＡＰキナーゼ活性
ＭＡＰキナーゼ活性は、例えばNew England Biolabsのｐ３８ＭＡＰキナーゼアッセイキット、またはPerkin-Elmer Life ScienceのFlashPlateＴＭ ＭＡＰキナーゼアッセイなど、商業的に入手可能なキットを利用して計測可能である。ｐ４２／４４ＭＡＰキナーゼまたはＥＲＫ１／２は、ＧｑおよびＧｉ結合ＧＰＣＲを発現する細胞を利用している場合、ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ）活性を示すために計測可能であり、ＧＰＣＲ活性化に続く内在性ＥＲＫ１／２キナーゼのリン酸化を計測するＥＲＫ１／２アッセイキットはTGR Biosciencesから商業的に入手可能である。知られた合成または天然チロシンキナーゼ基質および標識リン酸塩を通したチロシンキナーゼ活性の直接計測はよく知られており、また利用可能であり、他のタイプのキナーゼ（例えばセリン／スレオニンキナーゼ）の活性も同様に計測可能である。
【０１１１】
全てのキナーゼアッセイは、精製キナーゼまたは１または２以上のＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞から調製した粗抽出物で行うことができる。利用するキナーゼの基質は、全長タンパク質または基質の代わりとなる合成ペプチドであり得る。Pinna & Ruzzene（1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191〜225）は、キナーゼ活性の検出に有用な複数のリン酸化基質部位を列挙している。複数のキナーゼ基質ペプチドが商業的に入手可能である。特に有用なものは、多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である、「Ｓｒｃ−関連ペプチド」ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（Sigmaから商業的に入手可能）である。いくつかの方法は、ペプチド基質のフィルターへの結合を必要とし、そこでペプチド基質は、結合を促進するために、正味で正に荷電しているべきである。一般的に、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離アミノ末端を有しているべきである。反応は一般的に、０．７〜１．５ｍＭのペプチド濃度を利用する。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１１２】
転写レポーター／Ｔ１Ｒ−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ応答性プロモーター／レポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子アッセイで増強剤を同定するためには、レポーター遺伝子発現における、例えば１００％の増大が有意である。アゴニストは、試験剤の存在下において試験剤の非存在下よりも例えば１００、５００、または１０００％高いレポーター遺伝子発現を刺激する。Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒへのアゴニストの結合によって開始される細胞内シグナルは、細胞内事象のカスケードを作動させ、最終結果として１または２以上の遺伝子の転写または翻訳における迅速かつ検出可能な変化をもたらす。受容体の活性はしたがって、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ活性化に応答するプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現の計測によって決定される。
【０１１３】
本明細書で使用される「プロモーター」は、遺伝子発現の受容体媒介制御に必要な１または２以上の転写制御エレメントまたは配列であり、これは受容体調節発現に必要な１または２以上の基本プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合部位を含む。Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒへのアゴニストの結合の結果もたらされる細胞内シグナルに応答するプロモーターは、選択され、発現または遺伝子産物活性が容易に検出および計測可能な、対応するプロモーター制御レポーター遺伝子に作動可能に連結される。
【０１１４】
レポーター遺伝子は、例えばルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびいわゆる「前初期」遺伝子、ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子、転写因子ＣＲＥＢ、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、プロエンケファリン遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子、ＮＦ−κＢに応答する遺伝子、およびＡＰ−１応答遺伝子（ＦｏｓおよびＪｕｎ、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む）から選択されてよい。プロモーターは、当業者には明らかなように、選択されたレポーター遺伝子に応じて選択される。ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその産物の検出のためのアッセイは当該技術分野でよく知られている。さらなるレポーター遺伝子の例は以下に記載されている。
【０１１５】
「前初期」遺伝子は好適であり、速やかに誘導される（例えば受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触から数分以内）。レポーター遺伝子の好ましい特性には、次の１または２以上のものが含まれる：リガンド結合に対する速やかな応答性、休眠細胞における低発現または検出できない発現、新たなタンパク質合成の一過性かつ独立した誘導、後続する転写の遮断に新たなタンパク質合成が必要であること、およびこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが数分から数時間の短い半減期を有すること。同様に、プロモーターも好ましくは、これらの特性を１つ、数個、または全て有している。
【０１１６】
ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子は、複数の異なる刺激に応答し、速やかな誘導を有する遺伝子の例である。ｃ−ｆｏｓ調節エレメントは、転写開始に必要なＴＡＴＡボックス、基本転写のための２つの上流エレメント、および、二回対称性を有するエレメントを含む、ＴＰＡ、血清、ＥＧＦ，およびＰＭＡによる誘導に必要なエンハンサーを含む。ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡキャップ部位の上流−３１７〜−２９８ｂｐの間に位置する２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサーエレメントは、血清枯渇ＮＩＨ３Ｔ３細胞の血清誘導に不可欠である。２つの上流エレメントのうちの１つは−６３〜−５７に位置し、ｃＡＭＰ調節のためのコンセンサス配列に類似する。
【０１１７】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）は細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。したがって、ｃＡＭＰレベルの調節を通してシグナルする受容体の活性化は、転写因子の結合か、またはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥ、またはｃＡＭＰ応答エレメントと称する）に連結されたレポーター遺伝子の発現を検出することで決定可能である。ＣＲＥのＤＮＡ配列はＴＧＡＣＧＴＣＡである。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポーター構築物は米国特許５，９１９，６４９に記載されている。
【０１１８】
他の好適なレポーター遺伝子およびそのプロモーターは、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、ソマトスタチン遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、プロエンケファリンおよびｃＡＭＰ、ニコチンアゴニストおよびホルボールエステルに応答性のそのプロモーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーターを含む。
【０１１９】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答するレポーター遺伝子およびそのプロモーターのさらなる例は、ＡＰ−１転写因子およびＮＦ−κＢを含む。ＡＰ−１プロモーターは、回文配列ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡであるコンセンサスＡＰ−１結合部位により特徴付けられる。ＡＰ−１はまた、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート（ＴＰＡ）を含む腫瘍プロモーターによる誘導の媒介に関与しており、したがって、ＴＲＥ（ＴＰＡ応答性エレメント）と呼ばれることもある。ＡＰ−１は、増殖刺激に対する細胞の早期の応答に関与する複数の遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答性遺伝子の例は、ＦｏｓおよびＪｕｎ（タンパク質それ自体がＡＰ−１活性を組成する）、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む。
【０１２０】
ＮＦ−κＢプロモーター／結合エレメントはコンセンサス配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣを有する。多くの遺伝子がＮＦ−κＢ応答性であると同定されていて、その制御エレメントをリポーター遺伝子と連結し、ＧＰＣＲ活性を監視することが可能である。ＮＦ−κＢに応答する遺伝子は、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＣＣＲ５、Ｐ−セレクチン、Ｆａｓリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩκＢαをコードするものを含む。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターは当該技術分野で知られているか、または当該技術分野の通常の技術、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを用いて、またはＮＦ−κＢ制御に従うことが知られる遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を用いて容易にに形成可能である。さらに、ＮＦ−κＢ応答性レポーター構築物は、例えばCLONTECHから商業的に入手可能である。
【０１２１】
与えられたプロモーター構築物は、構築物をトランスフェクトした、ＧＰＣＲ（Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ）発現細胞を、アゴニスト（例えばペリラルチン）に曝露することで簡単に試験できる。アゴニストに応答するレポーター遺伝子の発現における、例えば１００％の増大は、レポーターがＧＰＣＲ（Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ）活性を計測するのに適していることを示す。転写アッセイのためのコントロールは、ＧＰＣＲ（Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ）を発現しないがレポーター構築物を保持している細胞およびプロモーターのないレポーター構築物を有する細胞の両方を含む。
【０１２２】
レポーター遺伝子の活性化によって示されるＧＰＣＲ（Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ）活性を調節する剤は、他のプロモーターおよび／または他の受容体を用いて、シグナルのＧＰＣＲ（Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ）特異性を立証し、およびその活性範囲を決定することによって立証可能であり、これにより、あらゆる非特異的シグナル、例えばレポーター遺伝子経路経由の非特異的シグナルなどを排除する。
【０１２３】
イノシトールリン酸（ＩＰ）計測
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解は、少なくとも４８時間またはそれ以上の３Ｈ−ミオイノシトールによる細胞標識を伴う、米国特許５，４３６，１２８に記載されているように決定されてよい。標識細胞は試験剤に１時間接触させ、次いでそれらの細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール−水に抽出する。その後、イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィで分離し、シンチレーションカウンティングで定量する。アゴニストに関して、刺激比（fold stimulation）は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロールの存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。同じように、阻害剤、アンタゴニストおよび逆アゴニストに関して、阻害比は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロール（アゴニストを含有してもしなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。
【０１２４】
結合アッセイ
リガンド結合に対する機能的応答に起因するパラメータ変化を計測する上述の機能的アッセイに加えて、リガンド結合を、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ受容体へのリガンドの結合を計測する結合アッセイで決定してもよい。結合アッセイは当該技術分野でよく知られており、溶液中、任意に固相に付着した二重膜中、脂質単層中、または小胞中で試験可能である。Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒポリペプチドへの増強剤の結合は、例えば分光特性（例えば蛍光、吸収、または屈折率）の変化の計測、水力学的手法（例えば外見の採用）、およびＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒペプチドの可溶特性を計測するクロマトグラフィ等によって決定可能である。１つの態様において、結合アッセイは生物化学的であり、組換えＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞／組織からの膜抽出物を利用する。結合アッセイは、例えば、Ｔ１ＲについてAdler et al.によってＵＳ２００５００３２１５８の段落［０１６９］から［０１９８］に記載されているように実施することができる。
【０１２５】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ受容体ポリペプチドおよび核酸、ならびに実質的に相同なポリペプチドおよび核酸
本明細書に記載されている方法に有用なＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１４および配列番号１６のキメラヘテロダイマー、配列番号１４と野生型Ｔ１Ｒ３のヘテロダイマー、および配列番号１６と野生型Ｔ１Ｒ２のヘテロダイマーから選択されるポリペプチドからなる群から選択されてよい。あるいは、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質（またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒをコードする核酸配列）は、上記ポリペプチドと実質的に相同（少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％または少なくとも９８％などの％配列同一性）であって、依然として機能的である（すなわちリガンドと結合するおよび／またはリガンドによって活性化される、またはかかる受容体をコードしている）タンパク質（またはかかるＣＳＲ：Ｔ１Ｒ受容体をコードする核酸配列）であってよい。
【０１２６】
本発明による方法に有用なＴ１Ｒ２−ＴＭＤ受容体は配列番号２の受容体か、または代替的に、配列番号２と実質的に相同な受容体（またはＴ１Ｒ２−ＴＭＤ受容体をコードする核酸配列）であって、依然として機能的である（すなわちリガンドと結合し、リガンドによって活性化される）受容体であってよい。かかる相同的な受容体は配列番号２と少なくとも９０％同一であってもよく、好ましくは配列番号２と少なくとも９５％同一であってもよい。かかる相同的な受容体は、例えば配列番号２の対立遺伝子変異体であるか、あるいはラット（約７７．９％のアミノ酸配列同一性および約８１．２％の核酸配列同一性）、マウス（約７６．２％のアミノ酸配列同一性および約８０．９％の核酸配列同一性）、イヌ（約７４．４％のアミノ酸配列同一性および約８２．６％の核酸配列同一性）、またはヒト受容体と十分なアミノ酸配列同一性を有する他のあらゆる種を含む異なる種の対応する相同配列などであってよい。
【０１２７】
実質的に相同なＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、Ｔ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３部分が、対立遺伝子変異体またはマウス、ラット、ハムスター、サル、およびイヌ由来のＴ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３を含む、異なる種の関連する部分に置き変えられているかかるタンパク質を含む。さらに、実質的に相同なＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ核酸またはポリペプチド配列は、保存的変異および／または点突然変異により形成されてもよく、下記のあらゆる保存的に改変された変異体を含む。
核酸配列について、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列（保存的に置換されたアミノ酸、すなわちアルギニンに差し替えられたリシンおよび下記に説明されているさらなる例など）をコードする核酸を意味する。
【０１２８】
遺伝コードの縮重によって、配列は異なるが機能的に同一な複数の核酸が任意の与えられたポリペプチド／タンパク質をコードする。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の１種である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列はまた、全ての可能な核酸のサイレント変異を記載している。したがって、それぞれの核酸中のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、同一のポリペプチドを産生する機能的に同一の核酸配列を得るために改変し得る。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれの与えられた核酸配列に内在する。
【０１２９】
アミノ酸配列について、アミノ酸置換は、かかる変化をＴ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ配列に導入するのに利用することができる、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法、宿主細胞のトランスフェクション、およびインビトロ転写を含む、遺伝子組換え技術の知られた手順を利用して導入することができる。次いで、変異体を、味覚細胞特異的ＧＰＣＲ機能活性についてスクリーニングすることができる。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野でよく知られている。例えば、保存的置換を選択する１つの典型的な指針は（オリジナルの残基の後に典型的な置換が続く）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ、ａｒｇ／ｌｙｓ、ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ、ａｓｐ／ｇｌｕ、ｃｙｓ／ｓｅｒ、ｇｌｎ／ａｓｎ、ｇｌｙ／ａｓｐ、ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ、ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ、ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ、ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ、ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ、ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ、ｓｅｒ／ｔｈｒ、ｔｈｒ／ｓｅｒ、ｔｒｐ／ｔｙｒ、ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ、ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕを含む。
【０１３０】
代替的な典型的な指針は、お互いが保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する後続の６群：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を利用する。他の代替的な指針は、全ての荷電アミノ酸を、正であるか負であるかで、相互の保存的置換を認めるものである。加えて、独立的コードされた配列における単一のアミノ酸または小さい割合（例えば２６％まで、２０％まで、１０％まで、または５％まで）のアミノ酸を変化させ、追加し、または削除する個別の置換、欠失または付加もまた保存的に改変された変異とみなされる。実質的に相同なヌクレオチドまたはペプチド配列は、以下に示す配列同一性の度合いを有するか、または以下に示すある一定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【０１３１】
％配列同一性
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒについて、実質的に相同なヌクレオチド配列は、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のパーセント配列同一性を有する。さらに、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒについて、実質的に相同なポリペプチド配列は、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。
【０１３２】
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤについて、実質的に相同なヌクレオチド配列は、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。さらに、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤについて、実質的に相同なポリペプチド配列は、例えば少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。
【０１３３】
配列同一性の計算は、後述のように決定される：ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Serch Tool）は、http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能なプログラムｂｌａｓｔｎに使用されているヒューリスティックな検索アルゴリズムである。他のヌクレオチド配列に対するヌクレオチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ（データベース配列に対する一致を報告するための統計学的に有意な閾値）、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いたＢｌａｓｔｎが利用される。他のポリペプチド配列に対するポリペプチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いたＢｌａｓｔｐが利用される。
【０１３４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
ヌクレオチド配列はまた、本明細書で提示するヌクレオチド配列、またはその相補体と、以下に詳述するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズできた場合、実質的に相同であると考えられる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中の４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）からなる溶液中での６５℃での洗浄である。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチド配列が、例えばスクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ中に存在するために起こり得る。バックグラウンドの少なくとも２倍、任意にバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍の陽性シグナルが、標的ＤＮＡとの特異的相互作用であるとみなされる。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐによって放射性標識して計測することができる。
【０１３５】
増強剤を同定するためのキット
本発明は１つの態様において、キット、例えば、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ、もしくはそれと実質的に相同な配列を発現する組換え細胞を含み、かつ、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒのアゴニスト、例えば、限定することなく、塩化カルシウム、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、ＮＤＨＣ、サイクラミン酸塩、およびシンナモニトリルなどを含む、スクリーニングキットまたはハイスループットスクリーニングキットを含む。カルシウムを含むキットの利用は、野生型受容体またはキメラタンパク質のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３部分ではなく、キメラタンパク質のみに結合し、それを活性化するという利点を有する。
【０１３６】
任意に、細胞はさらに例えばカルシウムシグナリングのためのＧタンパク質を含む。好適なＧタンパク質は既知であり、上述されており、当業者は必要な場合にそれをどのように細胞に導入すればよいかを承知している。非常に有用なキメラＧタンパク質はＧアルファ１６−ガストデューシン４４である。アゴニストは、例えば１ｎＭ〜１０ｍＭ、または０．１μＭ〜１ｍＭ、例えば０．１μＭ〜１００μＭなどの好適な濃度で提供される。好適な濃度は、例えば、塩化カルシウムについては０．２〜２０ｍＭ、ｐ−エトキシベンズアルデヒドについては５〜５００μＭ、ペリラルチンについては５〜５００μＭ、シンナモニトリルについては１０〜１０００μＭ、サイクラミン酸塩については０．０１〜５ｍＭ、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）については０．０３３〜３．３ｍＭである。
【０１３７】
キットの任意構成要素は、提供される組換え細胞を培養するための好適な培地、および、細胞をその上で成長させるための固体支持体、例えば細胞培養皿またはマイクロタイタープレートなどを含んでよい。これらの任意構成要素は当業者が容易に入手できる。
キットは以下のように利用されてよい：
（ｉ）ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
（ｉｉ）約１ｎＭまたはそれ以下から１００ｍＭまたはそれ以上までの濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のアゴニストの存在下で加える。
（ｉｉｉ）細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が増強剤であり得るかどうかが決定される。
【０１３８】
例えば、（ｉｉｉ）は上述のアッセイのいずれかに従い、上述の受容体活性を報告する検出方法のいずれかと組合せて行うことができる。これは、同じく上述された、特別に選択したまたは適応させた組換え細胞を必要とすることがある。好適なアッセイは、例えば、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒの活性化および試験剤に応答したその変化を決定するためのカルシウムフラックスアッセイである。
【０１３９】
キットは増強剤を同定するために以下のように利用することができる：
（ｉ）ＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
（ｉｉ）約１ｎＭ〜１００ｍＭまたはそれ以上の濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のカルシウムアゴニスト（例えば、限定することなく、塩化カルシウムの形態のもの）の存在下で加える。好適な塩化カルシウムの濃度は、例えば、約０．２〜２０ｍＭ、または０．５〜１０ｍＭ、または約１ｍＭである。
（ｉｉｉ）カルシウムに対する細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が増強剤であり得るかどうかが決定される。
【０１４０】
同定された増強剤の確認：上述の方法によって同定された増強剤は、フレーバリストのパネルまたは試験者に同定された増強剤をテイスティングさせる単純な官能試験によって簡単に確認し得る。化合物は、例えば、甘味を確認するために水中で、または甘味を増強する調節剤であることを確認するために甘味料と一緒に、増強剤のないネガティブコントロールと比較してテイスティングする。
【０１４１】
大規模スクリーニングアッセイ
上述の転写レポーターアッセイおよびほとんどの細胞ベースのアッセイは、ライブラリーをＣＳＲ：Ｔ１ＲまたはＴ１Ｒ−ＴＭＤ活性を調節する剤についてスクリーニングするのに適している。アッセイは、アッセイ工程の自動化および、典型的には平行して実行される（例えばロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式など）、任意の好都合な給源からの化合物のアッセイへの供給によって、巨大な化学的ライブラリをスクリーニングするように設計され得る。
【０１４２】
アッセイは、多くの潜在的増強剤を含むコンビナトリアルケミカルまたはペプチドライブラリーの提供を伴う、ハイスループットスクリーニング法で実行されてもよい。かかるライブラリーは、次いで、上述の活性を呈するライブラリー剤（特に化学種またはサブクラス）を同定するために、上述の１またはそれ以上のアッセイでスクリーニングされる。こうして同定された増強剤は直接利用でき、または、誘導体を製造および試験することでさらなる増強剤を同定するためのリードとして利用することができる。合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trecillet, Cornwall, UK）、Comgenex（Princeton, N.J.）、Brandon Associates（Merrimack, N.H.）、およびMicrosource（New Milford, Conn.）を含む多くの企業から商業的に入手可能である。
【０１４３】
試験剤のライブラリ
コンビナトリアルケミカルライブラリは、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」の組合せることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された様々な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリなどのリニアコンビナトリアルケミカルライブラリは、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、化学的ビルディングブロック（アミノ酸）のセットをあらゆる可能な方法で組合せることによって形成される。何百万もの化学的化合物が、かかる化学的ビルディングブロックの組合せ混合を通して合成可能である。レアケミカルライブラリはAldrich（Milwaukee, Wis.）から入手可能である。
【０１４４】
細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは、例えばPan Laboratories（Bothell, Wash.）またはMycoSearch（NC）から商業的に入手可能であり、あるいは、当該技術分野で知られた方法で容易に生成可能である。さらに、天然および合成的に産生されたライブラリおよび化合物は、慣用の化学的、物理的および生化学的手法で容易に改変される。他のライブラリとしては、タンパク質／発現ライブラリ、例えば食物、植物、動物、細菌を含む天然給源からのｃＤＮＡライブラリ、１または２以上のポリペプチドをランダムにまたは体系的に変異させた変異体を発現するライブラリ、および１つの細胞または組織のｍＲＮＡ内容を発現させるのに利用されるウィルスベクターでのゲノムライブラリを含む。
【０１４５】
ハイスループットアッセイでは、数千の異なる増強剤またはリガンドを１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された潜在的増強剤に対する別個のアッセイの実施に利用でき、または、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察すべき場合、各５〜１０ウェルで１つの増強物を試験可能である。したがって、1つの標準的なマイクロタイタープレートは約１００の増強剤をアッセイ可能である。１５３６ウェルプレートを利用した場合、１つのプレートは、約１００から約１５００の異なる化合物を、簡単にアッセイ可能である。１日にいくつかの異なるプレートをアッセイ可能なので、約６，０００〜２０，０００の異なる化合物のためのアッセイスクリーニングが可能である。
【０１４６】
本アッセイ方法でＴ１Ｒ−ＴＭＤまたはＣＳＲ：Ｔ１Ｒの調節効果を試験し得る試験剤のタイプ
試験剤は、小化学化合物、化学ポリマー、生物ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、核酸および脂質を含む任意の剤であってもよい。剤は、合成化合物、化合物の混合物、天然産物または天然サンプル、例えば植物抽出物、培養上清、または組織サンプルなどであり得る。甘味を改変し得る化合物の例として、メチルカビコール、テアサポニンＥ１、アセスルファムＫ、アリテーム、アスパルテーム、ＣＨ４０１、ズルチン、ネオテーム、サイクラミン酸ナトリウム、スクラロース、スーパーアスパルテーム、シナリン、グリシフィリン、レバウジオシドＣ、アブルソシドＡ（Abrusoside A）、
【０１４７】
アブルソシドＢ、アブルソシドＣ、アブルソシドＤ、アブルソシドＥ、アピオグリチルリチン、アラボグリチルリチン、バイユノシド、ブラゼイン、ブリオズルコシド、カルノシフルオシドＶ（Carnosifloside V）、カルノシフルオシドＶＩ、Ｄ．クミンシー、シクロカリオシドＡ、シクロカリオシドＩ、ズルコシドＡ、グリチルリチン酸、ヘルナンズルチン、ヘルナンズルチン、４ベータ−ヒドロキシ−ヘスペリチン−７−グルコシドジヒドロカルコン、ハンキオシドＥ（Huangqioside E）、ハンキオシドＥ、３−ヒドロキシフロリジン、２，３−ジヒドロ−６−メトキシ３−Ｏ−アセテート、マビンリンマルトシル−アルファ−（１，６）−ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソモグロシドＶ、
【０１４８】
モナチン、グリチルリチン酸モノアンモニウム（Ｍａｇ）、ムクロジオシドＩｉｂ（Mukurozioside Iib）、ナリンジンジヒドロカルコン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＨＤＨＣ）、ネオモグロシド、オスラジン、ペリアンドリンＩ、ペリアンドリンＩＩ、ペリアンドリンＩＩＩ、ペリアンドリンＩＶ、ペリアンドリンＶ、フロミソシドＩ（Phlomisoside I）、フロリジン、フィロズルチン、ポリポドシドＡ、グリチルリチンカリウムマグネシウムカルシウム、プテロカリオシドＡ（Pterocaryoside A）、プテロカリオシドＢ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、ルブソシド、スカンデノシドＲ６（Scandenoside R6）、シアメノシドＩ、グリチルリチン酸ナトリウム、
【０１４９】
ステビオールビオシド、ステビオシド、アルファ−グリコシルスアビオシドＡ、スアビオシドＢ、スアビオシドＧ、スアビオシドＨ、スアビオシドＩ、スアビオシドＪ、タウマチン、グリチルリチン酸トリアンモニウム（ＴＡＧ）、トリロバチンクルクリン、ストロジン１、ストロジン２、ストロジン４、ミラクリン、ホダルシン、ジュジュバサポニンＩＩ、ジュジュバサポニンＩＩＩ、アブルソシドＥ、ペリアンドリン酸Ｉ、モノグルクロニド、ペリアンドリン酸ＩＩ、モノグリクロニド、クロロゲン酸、ベータ−（１，３−ヒドロキシ−４−メトキシベンジル）−ヘスペルチンジヒドロカルコン、３’−カルボキシ−ヘスペルチンジヒドロカルコン、３’−ステビオシドアナログを挙げることができる。
【０１５０】
本明細書に記載の方法によって同定された甘味増強剤は、例えば、甘味知覚を誘発することが可能な人工甘味料の増強剤を含んでもよい。消費材は食料製品、飲料、口腔ケア製品、およびかかる製品に混合するための組成物、特に風味組成物を含む。風味組成物は、加工食品または飲料にその加工の最中に添加することができ、またはそれら自身が、例えばソースなどの調味料などの消費材となり得る。甘味料は、菓子類およびデザートおよび風味のあるおよび甘酸っぱい消費材を含む他の甘味消費材に特に有用である。
【０１５１】
消費材の例は、菓子製品、ケーキ、シリアル製品、パン屋製品、パン製品、ガム、チューインガム、ソース（調味料）、スープ、加工食品、調理果物および野菜製品、肉および肉製品、卵製品、ミルクおよび乳製品、チーズ製品、バターおよび代替バター製品、代替乳製品、大豆製品、食用油および油脂製品、薬剤、飲料、アルコール飲料、ビール、ソフトドリンク、食品抽出物、植物抽出物、肉抽出物、調味料、甘味料、栄養補助食品、錠剤、トローチ、ドロップ、乳剤、エリキシル剤、シロップおよび飲料を製造するための他の調製物、インスタント飲料および発泡錠を含む。
【０１５２】
核酸およびタンパク質の配列
本明細書に記載の構築物および方法に用いた配列は、後述の配列表に見出すことができる。
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ配列
配列は後述の配列表に示されている。配列番号１はＴ１Ｒ２−ＴＭＤ受容体をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号２はＴ１Ｒ２−ＴＭＤ受容体タンパク質のポリペプチド／アミノ酸配列に対応する。
トランスフェクトされた構築物において、新規Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤタンパク質をコードする核酸（配列番号１）がＳＳＴタグ（配列番号３）に後続し、その後にＨＳＶタグ核酸（配列番号５）が続いている。
したがって、得られるタンパク質は、以下のアミノ酸を指示された順序で含む：配列番号４、配列番号２および配列番号６のアミノ酸。
【０１５３】
配列番号１＋２：Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ核酸およびタンパク質
配列番号３＋４：ＳＳＴタグ核酸およびタンパク質
配列番号５＋６：ＨＳＶタグ核酸およびタンパク質
配列番号７＋８：Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤベクター構築物のフォワードおよびリバースプライマー
配列番号９＋１０：Ｔ１Ｒ２全長（核酸およびタンパク質）
配列番号１１＋１２：Ｔ１Ｒ３全長（核酸およびタンパク質）
【０１５４】
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ配列
配列番号１３はＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２キメラタンパク質をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号１４はＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２キメラタンパク質のポリペプチド／アミノ酸配列に対応している。
配列番号１５はＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号１６はＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質のポリペプチド／アミノ酸配列に対応している。
二つのサブユニットを含む複合体として一緒になって、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２キメラタンパク質およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質は機能的キメラ甘味受容体を形成する。
【０１５５】
トランスフェクトされた構築物は、例えば、Ｃ末端に配列番号１７のＨＳＶタグを後続させる配列番号１３または１５を含む。
得られるタンパク質はしたがって次のアミノ酸を含有する：配列番号１８が後続する配列番号１４、または配列番号１８が後続する配列番号１６のアミノ酸。
既知の全長ｈＣａＳＲ受容体核酸およびタンパク質配列は配列番号１９＋２０に与えられている。
【０１５６】
配列番号１３＋１４：ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２核酸＋タンパク質
配列番号１５＋１６：ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３核酸＋タンパク質
配列番号１７＋１８：Ｃ末端のＨＳＶタグ核酸＋タンパク質
配列番号１９＋２０：ｈＣａＳＲ核酸＋タンパク質
配列番号２１〜２４：プライマー配列、例３および例５を参照
配列番号２５〜２６：プライマー配列
配列番号２７〜２８：Ｔ１Ｒ３ＴＭＤ核酸＋タンパク質
【０１５７】
これより以下に、上述の方法を例証する一連の例が続く。以下の例は単なる例示であって、いかようにも本方法またはキットを限定すると解すべきではない。
【０１５８】
例
例の概要を以下に与える。
例１は、味覚受容体活性を計測する一般的な方法を記載する。
例２〜５は、種々のＴ１Ｒベクター構築物の調製を記載する。
例６〜８は、構築物の細胞へのトランスフェクションを記載する。
例９〜１２は、限定のない、様々な甘味増強剤の同定について記載する。
例１３は、甘味を計測する一般的な方法を記載する。
例１４〜２０は、他の甘味物質の非存在下における増強剤の甘味を計測するコントロール実験を記載する。
例２１〜２９は、甘味増強剤と甘味物質との混合物に関する。
例３０〜３３は、他の甘味物質の非存在下における増強剤の甘味を計測するコントロール実験を記載する。
例３４〜３６は、２または３以上の甘味増強剤と甘味物質との混合物を示す。
【０１５９】
１．  Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイ
Ｆｌｕｏ−４は、細胞内カルシウムの蛍光指示薬であり、カルシウム濃度の変化、特にリガンド添加後に起こる受容体活性化に応答した増加の決定を可能にする。
Ｇα１６−ガストデューシン４４（Ｇα１６ｇｕｓｔ４４）を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を宿主細胞として利用し、例２〜５に記載のとおりに様々な構築物でトランスフェクトした。
【０１６０】
黒く、底が透明な９６ウェルプレートを全てのアッセイで利用した。アッセイの前日、プレートに、ウェル毎に８５００個のトランスフェクト細胞を播種し、用いた細胞に適した成長培地中、３７℃で一晩維持した。ＨＥＫ２９３については、高グルコース、Ｌ−グルタミン、塩酸ピロキシジンを含有し、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地をＨＥＫ２９３細胞の成長および維持に利用した。
【０１６１】
アッセイの際に成長培地を廃棄し、細胞を１時間（３７℃にて暗所で）、Ｃ１緩衝溶液に溶解した１．５μＭのＦｌｕｏ−４ＡＭ（Molecular ProbesTM, Invitrogen, US）および２．５μＭのプロベニシド（Sigma-Aldrich）からなる５０μｌのカルシウムアッセイ溶液でインキュベートした。Ｃ１緩衝溶液は１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４）を含有する。
【０１６２】
最初の１時間の負荷期間の後、プレートをウェルあたり１００μｌのＣ１緩衝液で５回、自動プレート洗浄機（BioTek）を利用して洗浄し、洗浄の後、Ｆｌｕｏ−４−ＡＭの完全な脱エステル化をもたらすために、細胞をウェルあたり１００μｌのＣ１緩衝液中、室温にて３０分間暗所でさらにインキュベートした。緩衝溶液を廃棄し、プレートを１００μｌのＣ１洗浄緩衝液で洗浄し、最終的に細胞を１８０μｌのＣ１洗浄緩衝液中に入れた。
【０１６３】
アッセイの読み取りのため、プレートをＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices））中に置き、受容体活性化を、２０μｌの１０×濃縮リガンドストック溶液の添加後に開始させた。
蛍光は、リガンド添加前１５秒間およびリガンド添加後１０５秒間で継続的に監視した（４５〜１０５秒で十分であろう）。
受容体活性化は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で与えられ、次の等式で定義される：
蛍光増加＝最大蛍光−基準蛍光
式中、基準蛍光はリガンド添加前の最初の１０〜１５秒について計算した平均蛍光を表す。
【０１６４】
代替的に、受容体活性化は、基準蛍光（Ｆ０）に対して標準化したピーク蛍光（Ｆ）の増加によって決定される。データは次の等式によって標準化される：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０
式中Ｆはピーク蛍光シグナル、Ｆ０は基準蛍光シグナルであり、基準蛍光はリガンド添加前の最初の１０〜１５秒について計算した平均蛍光を表す。
ネガティブコントロールとして、モックトランスフェクションした細胞を同濃度のリガンドに曝露し、シグナルに対応しない微量のカルシウム濃度を決定した。活性化された受容体を有する細胞は、ネガティブコントロールを有意に上回るシグナル（ＲＦＵまたはΔＦ／Ｆ）によって同定した。
【０１６５】
２．  Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤベクター構築物の調製
Ｐｆｕポリメラーゼ（Invitrogen）を利用したＰＣＲを、下記に列挙した特定のプライマーを利用して、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ構築物を生成するのに用いた。
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤフォワードプライマー（配列番号７）
５’−ＴＡＴ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＧＣ ＴＧＴ ＧＧＣ Ｃ − ３’
Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤリバースプライマー（配列番号８）
５’−ＡＴＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＧＧ Ｔ − ３’
【０１６６】
ＰＣＲ増幅の鋳型は、ヒト茸状乳頭味覚組織から生成されたｃＤＮＡライブラリから単離されたヒトＴ１Ｒ２の全長ｃＤＮＡであった。反応条件は、９４℃で５分間の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および６８℃で１分を３５サイクル、その後最終伸長サイクルの６８℃で１０分間であった。
【０１６７】
得られた核酸断片（配列番号１を参照）をゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。シークエンシングの後、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Invitrogen）に基づく発現カセットにサブクローニングした。クローニングカセットは、導入遺伝子の細胞表面膜標的化を促進するために、ラットソマトスタチンタイプ３受容体の最初の４５アミノ酸をＮ末端に既に含んでいる（Bufe et al., 2002, Nat. Genet. 32(3), 397〜401に記載）。
【０１６８】
このベクターのＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。得られたベクター構築物は、配列番号４（ラットソマトスタチンの４５アミノ酸）が前に位置し、配列番号６（ＨＳＶエピトープ）が後続する（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号２（Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ）の連結アミノ酸配列のＴ１Ｒ２−ＴＭＤタンパク質の発現を可能にする。
【０１６９】
上記に概説したのと類似の方法によって、Ｔ１Ｒ３の細胞外ドメインを切断して除いたＴ１Ｒ３−ＴＭＤ受容体が作出可能である。これはＰＣＲ鋳型にＴ１Ｒ３のｃＤＮＡを（したがってＴ１Ｒ３膜貫通ドメインコード領域の５’および３’末端に特異的な異なるフォワードおよびリバースプライマーと一緒に）利用することを必要とする。その後、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ受容体は、本明細書に開示されているＴ１Ｒ２−ＴＭＤと同様のアッセイを行うのに利用可能である。例えば、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ単独を結合アッセイに利用可能であり、または例えばＴ１Ｒ２−ＴＭＤと共に、結合または活性化アッセイに利用可能である。
【０１７０】
３．  ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２ベクター構築物の調製
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２キメラｃＤＮＡベクター構築物は、ｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）（１〜Ｐｈｅ５３９）をコードする断片およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＳｅｒ４９３から始まるＴ１Ｒ２のＣ末端を含むものをコードする断片である、ＰＣＲによって生成された２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物にある共通の制限酵素部位を介して連結することによって作出した。
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２キメラＤＮＡの調製を容易にするために、ＳａｃＩＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。これらの導入部位および適した制限酵素を当該技術分野でよく知られたバッファー条件下で利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１７１】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＳａｃＩＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ２断片のＮ末端にそれぞれ位置し、キメラＤＮＡの２つのＰＣＲ産物／断片のライゲーションを可能にする。このＳａｃＩＩ部位の組み込みは、ｈＣａＳＲ中のＰｈｅ５３９をアルギニン残基に変換する。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２キメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に与えられる配列番号２１〜２４の特異的プライマーを用いて、ＰＣＲを利用して増幅した。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。
下線文字は、後続するＰＣＲ産物のサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１７２】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＦ（配列番号２１）
ＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＣ
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＲ（配列番号２２）
ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣ
Ｔ１Ｒ２−断片プライマーＦ（配列番号２３）
ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＡＡＧＡＧＧ
Ｔ１Ｒ２−断片プライマーＲ（配列番号２４）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＴ
【０１７３】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ヒトＣａＳＲをコードする全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから商業的に入手可能）、およびヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したヒトＴ１Ｒ２をコードする全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１７４】
得られた核酸断片はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。シークエンシングの後、挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ベクター構築物においてＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２キメラｃＤＮＡ断片のアッセンブリを可能にした。
【０１７５】
得られた挿入物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープ（ｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクターによって提供される）をコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２  ｃＤＮＡを有する得られたＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２ベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号１８（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号１４（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１７６】
４．  ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ベクター構築物の調製
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラｃＤＮＡベクター構築物は、ＰＣＲによって作出した２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物にある共通の制限酵素部位を介して連結すること、すなわちｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）（１〜Ｐｈｅ５３９）をコードする断片の、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＳｅｒ４９３から始まるＣ末端をコードするＴ１Ｒ３の断片への連結によって作出した。
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラＤＮＡの調製を容易にするために、ＳａｃＩＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。
【０１７７】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＳａｃＩＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ３断片のＮ末端にそれぞれ位置し、２つの断片のライゲーションを可能にする。このＳａｃＩＩ部位の組み込みは、原型のｈＣａＳＲ中の５３９番目にあるフェニルアラニンの代わりにをアルギニンをコードするベクター構築物をもたらす。当該技術分野でよく知られた緩衝液中、当該技術分野でよく知られた条件下でこれらの導入部位および適した制限酵素を利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１７８】
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に列挙した配列番号２５および配列番号２６の特異的プライマーを用いて、ＰＣＲを利用して増幅した。その後、Ｔ１Ｒ３の増幅ＰＣＲ産物およびｈＣａＳＲの増幅ＰＣＲ産物（後者は上記例２に記載されているように形成）を、下記に列挙したプライマーに示された制限部位を介してライゲーションした。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。下線文字は、後続する増幅ＰＣＲ産物のライゲーションおよびサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１７９】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤ  ＦおよびｈＣａＳＲ−ＡＴＤ  Ｒ：
上記例３に示した配列番号２１および配列番号２２。
Ｔ１Ｒ３−断片プライマーＦ（配列番号２５）
ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＧＧＣＡＧ
Ｔ１Ｒ３−断片プライマーＦ（配列番号２６）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴ
【０１８０】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ｈＣａＳＲの全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから購入）、またはヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したｈＴ１Ｒ３の全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１８１】
得られた核酸断片（ライゲーションは断片が確認された後に行われる）はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen, USA）にサブクローニングした。ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１８２】
シークエンシングの後、挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ベクター構築物を形成した。ベクター構築物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。得られたベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号１８（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号１６（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１８３】
５．  Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３ベクター構築物（比較のための野生型受容体）の調製
Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３ベクター構築物の形成のため、ヒトＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の全タンパク質コード配列を含むｃＤＮＡ断片をヒト茸状乳頭ｃＤＮＡライブラリから単離し、完全にシークエンスし、そしてｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen）に標準的な方法でサブクローニングした。
【０１８４】
６．  細胞へのＴ１Ｒ２−ＴＭＤのトランスフェクション、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＧα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現する細胞
ヒトＴ１Ｒ２−ＴＭＤを安定的に発現するヒト細胞系を、ヒトＴ１Ｒ２−ＴＭＤ（例２で記載したように形成）を含む線状化ｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen）をＧα１６ｇｕｓｔ４４発現細胞系（ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成）へトランスフェクトすることで作出した。この細胞系は味覚受容体への増強された結合を示し、テトラサイクリンによって誘導され、非特異的Ｇタンパク質Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現し、ＨＥＫ−２９３−Ｔ−Ｒｅｘ細胞系（Invitrogen, USAから商業的に入手可能）に基づいている。
【０１８５】
トランスフェクションは以下のように行われた。
０日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６ｇｕｓｔ４４細胞を６ウェルの黒い、透明底のプレートに、ウェルあたり９００，０００個の密度で播種し、選択的成長培地で一晩成長させた。１日目に、培地を抗生物質不含かつ血清不含の成長培地に変更し、細胞を４μｇの線状化Ｔ１Ｒ２  ＴＭＤベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用してトランスフェクトした。リポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞上で３〜４時間インキュベートし、その後抗生物質不含の血清含有成長培地に交換した。２４時間後、細胞を１０％ＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌのブラストシジン、０．３６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、および０．１ｍｇ／ｍｌのゼオシン（Invitrogen）を添加したＤＭＥＭを含有する選択培地に３７℃で再播種した。２〜４週間後ゼオシン耐性コロニーを選択し、拡大し、５０μＭのペリラルチンへの応答について例１に記載したようにカルシウムイメージングで試験した。
【０１８６】
耐性コロニーを拡大し、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを含有していことを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンによるＴ１Ｒ２−ＴＭＤ発現の誘導の後に例１に記載されている方法を利用して、FLIPR-Tetra装置（Molecular Devices）での自動蛍光イメージングを介して決定される５０μＭのペリラルチンへのその応答によって同定した。
【０１８７】
全ての潜在的クローンはまた、低レベルであるが機能的に十分なレベルのＴ１Ｒ２−ＴＭＤ受容体を基底的に発現するあらゆるクローンを同定するために、テトラサイクリン誘導の非存在下での５０μＭのペリラルチンへの機能的応答も評価した（Ｔ−Ｒｅｘ  ＨＥＫ−２９３（Invitrogen）などのテトラサイクリン調節システムは、システムの固有の漏出性に起因して、導入遺伝子が基底的に低レベルで発現していることが知られている）。
【０１８８】
前記評価の結果として、これらの細胞系をペリラルチンに曝露した場合、多くの細胞クローンがこの刺激に対して、ネガティブコントロール（非特異的Ｇタンパク質Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を発現するがＴ１Ｒ２−ＴＭＤは発現しない細胞）のシグナルと比較して１０倍以上のシグナルの有意な蛍光の増加を伴って応答することが分かった。
【０１８９】
シグナルは、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤの過剰発現を誘導するためにテトラサイクリンで処理した細胞において顕著に低い。テトラサイクリン誘導Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ細胞における応答の欠如は、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤのテトラサイクリン誘導性の過剰発現によって起こった細胞毒性に起因するものと考えられる。
【表１】
2009534018.tif 000002
【０１９０】
７．  Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味受容体ヘテロダイマーおよびＧα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現する細胞のトランスフェクション
Ｔ１Ｒ３は、テトラサイクリン調節Ｔ１Ｒ２の存在下において、両タンパク質の構成的過剰発現の細胞毒性効果の可能性を回避するために構成的に過剰発現させた。ヘテロダイマーの１つのサブユニットをテトラサイクリン調節ベクター内に置くことにより、その発現レベルを調節し、その結果、安定クローン株の生存率および機能性を最適化することが可能となる。
【０１９１】
ヒトＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーを安定的に発現するヒト細胞系は、まずヒトＴ１Ｒ３を含む線状化ｐＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクター（Clontech）を、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成したＧα１６ｇｕｓｔ４４発現細胞系にトランスフェクトすることで作出する。この細胞系は、味覚受容体への増強された結合を示し、テトラサイクリンによって誘導され、非特異的Ｇタンパク質Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現し、ＨＥＫ−２９３−Ｔ−Ｒｅｘ細胞系（Invitrogen, USAから商業的に入手可能）に基づいている。Ｔ１Ｒ３を安定的に発現する不均一な細胞集団の作出後、ヒトＴ１Ｒ２  ｃＤＮＡを含む線状化ｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen）をトランスフェクトした。
【０１９２】
２４時間後、細胞を、１０％ＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌのブラストシジン、０．３６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、および０．４μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したGlutamax DMEM（Invitrogen）を含有する選択培地に、１：１５０，０００までの１０×希釈で３７℃にて再播種した。２週間後、ピューロマイシン耐性のＴ１Ｒ３発現細胞の不均一な集団を、次いで４μｇの線状化Ｔ１Ｒ２ベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用してトランスフェクトした。リポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞上で３〜４時間インキュベートし、その後抗生物質不含の血清含有成長培地に交換した。２４時間後、細胞を１０％ＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌのブラストシジン、０．３６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、０．４μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを添加したGlutamax DMEMを含有する選択培地に３７℃で再播種した。
【０１９３】
耐性コロニーを拡大し、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーを含むことを、例１に記載されている方法を利用して、FLIPR-Tetra装置（Molecular Devices）上の自動蛍光イメージングにより決定される、スクロース、スクラロース、アスパルテームおよびアセスルファムＫを含む様々な甘味化合物へのその応答によって同定した。全ての潜在的クローンはまた、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｔ１Ｒ２の過剰発現を誘導するため）の存在下における甘味物質に対する機能的な応答ついて評価した。潜在的クローンはまた、低レベルであるがＴ１Ｒ３と合わさって機能的な甘味ヘテロダイマー複合体を成すことができるのに十分なレベルのＴ１Ｒ２を基底的に発現するあらゆるクローンを同定するために、テトラサイクリン誘導の非存在下でも試験した（Ｔ−Ｒｅｘ  ＨＥＫ−２９３（Invitrogen）などのテトラサイクリン調節システムは、システム固有の漏出性に起因して、導入遺伝子が基底的に低レベルで発現していることが知られている）。
【０１９４】
前記評価の結果として、テトラサイクリン処理されていないこれらの細胞系が甘味物質に曝露した場合、多くの細胞クローンがこの刺激に対して、有意な蛍光の増加（ネガティブコントロールと比較して１０倍以上のシグナル）を伴って応答することが分かった。シグナルは、Ｔ１Ｒ２の過剰発現を誘導するためにテトラサイクリンで処理した細胞において顕著に低い。テトラサイクリン誘導Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３細胞における低応答は、Ｔ１Ｒ２のテトラサイクリン誘導性の過剰発現によって起こった細胞毒性に起因するものと考えられる。甘味物質に対する最も大きな応答を見せた１つのクローン細胞系を増殖させ、後続の比較に利用した。
【０１９５】
８．  ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３のトランスフェクション、およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３の異種発現
トランスフェクトされたベクター構築物は、上記のとおりに形成した例３、４および５に記載されているものを利用した。ｈＣａＳＲについては、全長ｃＤＮＡに基づく、商業的に入手可能なｐＣＭＶベースのベクター構築物を利用した（TRUECLONE collection, Origene Inc., USA）
【０１９６】
安定的にＧα１６ｇｕｓｔ４４を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成した）に、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ベクター構築物、またはＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３、またはｈＣａＳＲを次のようにトランスフェクトした：
０日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６ｇｕｓｔ４４細胞を９６ウェルの黒い、透明底のプレートに、ウェルあたり８５００個の密度で播種し、選択的成長培地で一晩成長させた。１日目に、培地を抗生物質不含かつ血清不含の成長培地に変更し、細胞をそれぞれ７５ｎｇのＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３（合計１５０ｎｇ）、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３（合計１５０ｎｇ）、または７５ｎｇのｈＣａＳＲベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用してトランスフェクトした。
【０１９７】
ｈＣａＳＲベクターは、カルシウムに感受性であり、カルシウム結合部位が、キメラのＶＦＴが由来するこの受容体のＶＦＴに存在するため、カルシウムに感受性のＧＰＣＲのポジティブコントロールとして利用した。
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３またはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーのトランスフェクションのため、それぞれ７５ｎｇのベクター構築物を、ペア毎に合計１５０ｎｇになるように組み合わせ、０．３μｌのリポフェクタミン２０００と一緒に利用した。７５ｎｇのｈＣａＳＲベクターＤＮＡは、このカルシウム感知モノマーＧＰＣＲに利用した。
【０１９８】
上述のリポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞上で３〜４時間インキュベートし、その後抗生物質不含の血清含有成長培地に交換した。細胞は一晩成長させ、Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイを例１に記載したように行った。
上記ベクター構築物の内の１つを一過性にトランスフェクトした細胞を、例１に記載したように蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices）を利用して同定した。
【０１９９】
９．  Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤアゴニストとしてのｐ−エトキシベンズアルデヒドの同定
用いた細胞は、例６に記載されているように形成した、Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現し、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞であった。
１００μＭのｐ−エトキシベンズアルデヒドに対する細胞内カルシウム応答が決定された。
【０２００】
細胞を、黒い、透明底のプレート（Costar）に、８５００細胞／ウェルの密度で播種し、例１で記載したように受容体活性決定の前に選択的成長培地（例６で記載のもの）中で４８時間維持した。
選択した特定のクローンは、リガンド刺激に続く細胞内カルシウムの強い増大を生成するのに十分なレベルのＴ１Ｒ２−ＴＭＤを既に基底的に発現しているため、細胞をテトラサイクリンで誘導しなかった。
【０２０１】
データは例１で記載したように計算され、１００μＭのｐ−エトキシベンズアルデヒドによる細胞刺激後の蛍光の基準値以上の正味の増大を示した。データは平均値±６回の反復実験の標準偏差を表している。
ｐ−エトキシベンズアルデヒド刺激によって、カルシウムシグナリングにおける顕著な増大が、ヒトＴ１Ｒ２−ＴＭＤを発現する細胞内で観察されたが、ネガティブコントロール（Ｇα１６ｇｕｓｔ４４キメラＧタンパク質を発現するがＴ１Ｒ２−ＴＭＤは発現しない宿主細胞）では観察されなかった。
【０２０２】
【表２】
2009534018.tif 000003
【化１】
2009534018.tif 000004
ｐ−エトキシベンズアルデヒド
【０２０３】
１０．  Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤホモマーおよびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーのｐ−エトキシベンズアルデヒドに対する用量反応曲線
本方法は、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ活性を定量し、例えば、甘味物質を含む同定された候補増強剤の有効性の予測を可能にする。
Ｇα１６ｇｕｓｔ４４およびＴ１Ｒ２−ＴＭＤ（例６で記載されているように形成した）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にカルシウム色素Ｆｌｕｏ−４を負荷し、そのｐ−エトキシベンズアルデヒドに対する応答を、例１に記載されているように蛍光カルシウムシグナルを利用して計測する。データは例１に記載されているように計算した（０．１〜２００μＭの範囲に及ぶ、ｐ−エトキシベンズアルデヒドの増大する用量による細胞刺激に続く基準値を超える蛍光の正味の増大量）。データは平均値±３回の反復実験の標準偏差を含んでいる。
【０２０４】
インビボでの妥当性を確認するため、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ発現細胞中でｐ−エトキシベンズアルデヒドによって誘発されるシグナルの用量反応曲線を、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを安定的に発現する細胞中で得られるシグナルと比較した。二つの用量反応曲線は厳密に一致することが見出された（図１参照）。
【０２０５】
結果は下表に示されており、用量反応曲線は図１に示されている。表中のデータはGraphPad Prismソフトウェアパッケージ（GraphPad Software, Inc.）で、下に示す４パラメータロジスティック非線形回帰方程式を利用して曲線適合した：
Ｙ＝基底値＋（最高値−基底値）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）×傾斜）
式中、Ｘはｐ−エトキシベンズアルデヒド濃度の対数であり、Ｙは応答であり、ＥＣ５０は最大応答の５０％を誘発するアゴニスト濃度を表す。
応答対ｌｏｇ濃度のプロットにおいて、Ｙの値は濃度の増大に伴ってＳ字形状に上昇するように見える。
【０２０６】
受容体感受性を示すＥＣ５０値（低いＥＣ５０値はアゴニストに対する高い感受性を示す）は、蛍光および２００μＭおよびそれ以下の半増加（half-increments）におけるｐ−エトキシベンズアルデヒド濃度データ（下表に記載）から計算した。計算したＴ１Ｒ２−ＴＭＤのＥＣ５０値は１２４μＭであり、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーのものは６４．５１μＭである。Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤはｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドに対してより大きな最大応答を見せたが、甘味ヘテロダイマーと同じ感受性範囲にある、同じようなＥＣ５０を有しており、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤが生物学的に関連性のある受容体であることを示している。
【０２０７】
【表３】
2009534018.tif 000005
【表４】
2009534018.tif 000006
図１  Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤホモマー（黒三角）およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー（白三角）の用量反応曲線
【０２０８】
１１．  Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを活性化するがＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーは活性化しない化合物の同定
例1に記載のカルシウムフラックスアッセイを利用して、８８個の試験剤のパネルがＴ１Ｒ２−ＴＭＤ受容体依存性応答について評価された。試験剤は最終濃度１００μＭでデュプリケートで試験した。Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現する細胞およびＴ１Ｒ２−ＴＭＤ含有細胞（例６に記載されているように形成した）内で試験剤によって誘発されたシグナルは、Ｇα１６ｇｕｓｔ４４およびＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを安定的に発現する細胞（例7に記載されているように形成した）内で得られたシグナルと比較し、そしてネガティブコントロールとしてＧα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現する細胞を利用した。
【０２０９】
データは例１で記載したように計算し（試験剤による細胞刺激後の蛍光の基準値以上の正味の増大）、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを強く活性化するがＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーまたはネガティブコントロールは僅かにしか誘発しないまたは活性化しない、同定された剤のカルシウムシグナルの結果を下表に示す。データは、１つの代表実験からの２つの複製の平均に対応し、その代表実験は引き続く試験によって確認した。
【０２１０】
下表に示されている同定された化合物では、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを安定的に発現する細胞内における前記化合物による刺激でカルシウムシグナルの顕著な増大が観察された。Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを発現する細胞ではネガティブコントロールを顕著に上回るシグナルは見られなかった。
結果は、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤがＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを活性化しない化合物によって活性化されることを示している。したがって、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤホモマーに基づくアッセイは、Ｔ１Ｒ３の存在下で行われるＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーに基づくアッセイを利用しては同定できない増強剤を同定できる。
【０２１１】
メチルカビコール（ＦＥＭＡ＃２４１１、エストラゴール、ｐ−メトキシアリルベンゼン）は、甘味を有することが記載されている既知の香味料であり、その味は次のように記載されている：「甘く、草のような、アニス−ウイキョウ臭（anise-fennel odour）」、「甘く、フェノール性の、アニスのような、辛辣な、香辛料のような、青々とした、ハーブのような、ミントのような」臭いおよび１０ｐｐｍで「甘い、甘草の、フェノール性の、雑草のような、香辛料のような、セロリのような」味。
【０２１２】
【表５】
2009534018.tif 000007
【化２】
2009534018.tif 000008
メチルカビコール
【０２１３】
Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤに特異的に結合する化合物もまた、上記例１１に記載の方法に類似するが、機能アッセイの代わりに結合アッセイを利用する方法で同定可能である。さらなるアッセイは、下記の例１２Ａおよび１２Ｂで利用されている方法に類似する方法によって、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ／Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤヘテロダイマーを使って行うこともできる。
【０２１４】
１２．  ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の活性化
下記の受容体、核酸、ポリペプチド、方法およびキットは、本発明で実施されるインビトロアッセイの例示的な態様であるが（例１２Ａおよび１２Ｂ）、同様の機能を実施するために、他の同様の態様が利用されてよく、または記載された態様に改変および付加がなされてもよい。さらに、全ての開示された態様は必ずしも互いの排他的ではなく、様々な態様を所望の特性を提供するために組み合わせてもよい。本開示の精神と範囲から離れることなく、当業者によって変更がなされてもよい。したがって、本受容体、核酸、ポリペプチド、方法およびキットはいかなる単一の態様に限定されるべきではなく、むしろ請求項の記載に従った幅および範囲で解釈されるべきである。
【０２１５】
１２Ａ．  ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３を発現する、一過性にトランスフェクトされた細胞系の調製およびアッセイ
様々なリガンドによる刺激後の細胞内カルシウム応答は、Ｇα１６ｇｕｓｔ４４を安定して発現し、かつＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラヘテロダイマーをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において決定した。結果は、（Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーを形成するために）例５に記載のＴ１Ｒ２ベクター構築物およびＴ１Ｒ３ベクター構築物の両方、または（モノマーｈＣａＳＲを形成するために）例４に記載のｈＣａＳＲベクター構築物をトランスフェクトした細胞から得られた結果と比較した。
【０２１６】
トランスフェクトは例８に記載されているように実施した。結果は例１に記載されているように計算した（データは刺激後の蛍光の基準値以上の正味の増大（相対蛍光単位またはＲＦＵ）を示し、平均（ＡＶＧ）および±６回の反復実験の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）が与えられている）。次のリガンドを、括弧内に示されている濃度でトランスフェクト細胞を刺激するのに利用した：塩化カルシウム（２ｍＭ）、スクラロース（０．５ｍＭ）、アスパルテーム（０．８５ｍＭ）、ペリラルチン（５０μＭ）、シンナモニトリル（２ｍＭ）、サイクラミン酸塩（１ｍＭ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）（０．３３ｍＭ）。得られたシグナルは、トランスフェクトされた受容体との直接的または間接的な相互作用に応答した細胞のカルシウム増大（「シグナル」）に対応するＲＦＵ表示の蛍光である。
【０２１７】
甘味受容体を発現しない、構築物なしでトランスフェクトされた、モックトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６ｇｕｓｔ４４細胞は、蛍光のバックグラウンドレベルを決定するためにネガティブコントロールとして利用した。トランスフェクト細胞は、示された甘味料およびカルシウム感知ドメインを含むタンパク質のポジティブコントロール（カルシウム）、およびネガティブコントロール（Ｃ１緩衝液）に曝露した。
【０２１８】
結果は下表に示されている。ＡＶＧ欄は平均蛍光を与え、Ｓ．Ｄ．欄は試験した様々なベクター構築物のそれぞれについての６回の反復実験の標準偏差を与える。
【表６】
2009534018.tif 000009
【０２１９】
ネガティブコントロール／モックトランスフェクションはバックグラウンドシグナルに対応するシグナルレベルを示す。
ポジティブコントロール（カルシウム）が示すように、カルシウム感知ドメインを有する全てのトランスフェクト細胞はカルシウムに反応した（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーおよびｈＣａＳＲ）。キメラヘテロダイマーのカルシウムに対する応答は、甘味ヘテロダイマーから得られたそれと比較できない。カルシウムはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味ヘテロダイマーのアゴニストではないので、Ｇα１６ｇｕｓｔ４４Ｇタンパク質のみを発現するモックトランスフェクションした細胞よりも大きなシグナルを与えない。
【０２２０】
アスパルテームおよびスクラロースについて、シグナルはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーをトランスフェクトした細胞でのみ検出された。これは、スクラロースおよびアスパルテームがＣＳＲ：Ｔ１Ｒキメラには欠損しているＴ１Ｒ２のＶＦＴに結合すると考えられるため、予期されたことである。
ｈＣａＳＲは塩化カルシウムのみに応答し、試験したどの甘味物質によっても活性化される得なかった。塩化カルシウム、ペリラルチン、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩およびＮＤＨＣについては、シグナルの顕著な増大が、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３キメラヘテロダイマーを発現する細胞で観察された。ペリラルチン、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩およびＮＤＨＣについて、これらのシグナルはＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーで検出されたシグナルの強度に匹敵するものであった。
【０２２１】
キメラＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーをトランスフェクトされた細胞で検出されたシグナルは、ネガティブコントロール（モックトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６ｇｕｓｔ４４）から得られたバックグラウンドよりも顕著に高い。
結果は、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３が、カルシウム、ペリラルチン、サイクラミン酸塩、シンナモニトリル、ナリンジンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）によって活性化されるが、スクラロースまたはアスパルテームでは活性化されないことを明示している。サイクラミン酸塩はキメラダイマーを活性化するがＴ１Ｒ２−ＴＭＤは活性化せず、これは活性化にＴ１Ｒ３膜貫通ドメインが必要であることを示す。このことは、サイクラミン酸塩がＴ１Ｒ３膜貫通ドメインに結合することを示す文献中の知見と矛盾しない。ジヒドロカルコンは、細胞系からのデータに基づけば、両方の膜貫通ドメインに結合部位を有しているとみられる。
【０２２２】
１２Ｂ．  ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを発現する安定細胞系の調製
安定細胞系は、両タンパク質の構成的過剰発現による細胞毒性効果の可能性を回避するため、テトラサイクリン調節ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２の存在下でＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３が構成的に過剰発現するように作出した。ヘテロダイマー（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２）の1つのサブユニットをコードするＤＮＡをテトラサイクリン調節ベクター中に配置して、発現レベルを調節し、安定クローン系の生存率および機能性を最適化できるようにした。
【０２２３】
要すれば、キメラヒトＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを安定的に発現するヒト細胞系は、まず、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように調製したヒトＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２を含む線状化ｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen）をＧα１６ｇｕｓｔ４４発現細胞系にトランスフェクトすることにより、順次作出した。Ｇα１６ｇｕｓｔ４４発現細胞系は、味覚受容体への増強された結合を示し、テトラサイクリンで誘導可能であり、非特異的Ｇタンパク質であるＧα１６ｇｕｓｔ４４を安定的に発現し、ＨＥＫ−２９３−Ｔ−Ｒｅｘ細胞系（Invitrogen, USAから商業的に入手可能）に基づいている。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方を発現する二重安定クローン細胞系を得るために、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２を発現するクローン細胞系を同定し、ヒトＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３のｃＤＮＡを含有する線状化ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏベクター（Invitrogen）をトランスフェクトした。
【０２２４】
４マイクログラムの線状化ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ構築物および０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）のトランスフェクトの２４時間後、細胞を１０％ＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌのブラストシジン、０．３６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、および０．２ｍｇ／ｍｌのゼオシンを添加したDMEM（Invitrogen）を含有する選択培地に、１：１５０，０００までの１０×希釈で３７℃にて再播種した。２〜３週間後、ゼオシン耐性コロニーを個々に拡大し、安定クローンを、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２のｃＤＮＡを発現させるための１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンによる４時間の誘導後、５０マイクロモーラーのペリラルチンに対する機能的応答に基づいて選択した。我々は、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２のｃＤＮＡの最小の基底発現を呈する単一のクローン（＃１７）を同定し、ヘテロダイマー受容体複合体の安定細胞系を作出するために、これをＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３構築物のレシピエントとして利用した。
【０２２５】
誘導可能なＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２を含むクローン１７に、４μｇの線状化ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３／ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）をトランスフェクトした。リポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞上で３〜４時間インキュベートし、その後抗生物質不含の血清含有成長培地に移した。２４時間後、細胞を１０％ＦＢＳ、０．００５ｍｇ／ｍｌのブラストシジン、０．３６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、および０．２ｍｇ／ｍｌのゼオシン（Invitrogen）、および０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加したＤＭＥＭを含有する選択培地に３７℃で再播種した。
【０２２６】
耐性コロニーを拡大し、例１に記載されている方法を利用してＦＬＩＰＲ−Ｔｅｔｒａ装置（Molecular Devices）上での自動化蛍光イメージングにより決定される、ペリラルチン（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２の結合／活性化が寄与する）およびサイクラミン酸ナトリウム（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の結合／活性化が寄与する）の両方に対する応答に基づいて、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを含むものとして同定した。全ての潜在的なクローンを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンによる誘導（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２の過剰発現を誘導するため）の後、甘味物質に対する機能応答について評価した。
【０２２７】
潜在的クローンはまた、Ｔ１Ｒ２を低レベルで基底的に発現するが、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３と合わさり機能的ヘテロダイマー複合体をもたらすことができるＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２受容体の十分な発現を有しているあらゆるクローンを同定するために、テトラサイクリン誘導無しでも試験した（Ｔ−Ｒｅｘ  ＨＥＫ−２９３（Invitrogen）などのテトラサイクリン調節システムは、システム固有の漏れやすさに起因して、導入遺伝子が基底的に低レベルで発現していることが知られている）。誘導性の機能的ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを発現する安定クローンは、５０マイクロモーラーのペリラルチンおよび５ｍＭのサイクラミン酸ナトリウムの両方に対する応答に基づいて同定した。複数の甘味物質に対して最も大きなテトラサイクリン誘導性の応答を呈した１つのクローン細胞系を増殖させ、続く比較に利用した。
【０２２８】
【表７】
2009534018.tif 000010
【０２２９】
データは、次の方程式を利用した刺激後における基準値以上の蛍光の標準化された増大（ΔＦ／Ｆ）を示す：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０、式中Ｆはピーク蛍光シグナルおよびＦ０は、リガンドの添加前に計測された蛍光シグナルの平均から決定した基準値蛍光シグナルである。得られたΔＦ／Ｆ値は、トランスフェクトされた受容体との直接的または間接的な相互作用に応答した細胞カルシウムの増加（「シグナル」）に対応する（３回の反復実験の平均値（ＡＶＧ）および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）が与えられている）。
【０２３０】
ｐ−ＥＴＢＺ＝ｐ−エトキシベンズアルデヒド
【化３】
2009534018.tif 000011
ＮＤＨＣ
【化４】
2009534018.tif 000012
【０２３１】
【化５】
2009534018.tif 000013
サイクラミン酸ナトリウム（ナトリウムイオンは水溶性を改善し、甘味には貢献しない）
ナリンジンＤＨＣ
【化６】
2009534018.tif 000014
【０２３２】
例１２Ａまたは１２Ｂで概説した方法と類似の方法によって、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３またはＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを利用したアッセイを行った。いずれのケースにおいても、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３モノマー構築物は、上記例３または４にそれぞれ記載されているように作出した。野生型のＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３モノマーは上記例５に記載されているように作出した。これらの他のヘテロダイマーの１つを発現する細胞は、したがって、例１２Ｂおよび上記の他所に記載されているＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー発現細胞の調製方法と類似の方法で作出可能である。得られた細胞系は野生型ＶＦＴドメインを発現し、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３膜貫通ドメイン結合体自身およびＶＦＴドメイン結合体と組み合わせたＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３膜貫通ドメイン結合体の活性についてのアッセイを含む、例１に記載のアッセイの実施に利用可能である。
【０２３３】
さらなるアッセイが、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤおよびＴ１Ｒ２−ＴＭＤ／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー発現細胞系を作出することを含む、例１２Ａおよび１２Ｂの方法と類似の方法によって実施される。いずれのケースにおいても、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３モノマー構築物は上記例３または４にそれぞれ記載されているように作出する。Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤまたはＴ１Ｒ３−ＴＭＤの発現を導く切断受容体ベクター構築物は例２に説明されている方法と類似の方法によって作出する。ヘテロダイマー発現細胞は、したがって、例７および１２Ｂおよび上記の他所に記載されているものと類似の方法で作出可能である。得られた細胞系は単一のＣＳＲ細胞外ドメインを含むヘテロダイマーを発現し、例１に記載のアッセイの実施に利用可能である。
【０２３４】
加えて、アッセイは、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する２または３以上の剤とを組み合わせることによって生成される受容体活性について、例１２Ａおよび１２Ｂに記載の方法によって実施される。代替的に例１２Ａおよび１２Ｂに記載の方法と類似の方法を、候補甘味増強剤をカルシウム感知受容体のリガンドと組み合わせることによって生成される受容体活性を試験するのに利用できる。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２またはＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３受容体の作出方法（例３および例４）と類似の方法が、代替的なクラスＣ  ＧＰＣＲ細胞外ドメインを利用したキメラ受容体の作出に利用可能である。これらの代替的なキメラ受容体は、ここに開示される試験と類似の試験に利用可能である。代替的なキメラ受容体は、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）、ＧＰＲＣ型受容体（すなわちＧＰＲＣ５およびＧＰＲＣ６）、Ｖ２Ｒフェロモン受容体、およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体などの、他のクラスＣ  ＧＰＣＲ細胞外ドメインを含む。
【０２３５】
１３．  スクロース溶液に対する甘味増強剤の甘味等強度を決定するためのランキング試験
比較ランキングのために、０．５％、１％、１．５％、７％、８％、９％、１０％および１１％スクロース溶液を調製した。
ａ）スクロース溶液中の甘味増強剤の甘味等強度
官能評価はランキング法を利用して実施した。常温のサンプルが無作為に１５ｍｌの盲検化されたアリコート（パネリストによって特定できない）で提供された。パネルは１０名の甘味感受性対象によって構成され、サンプルは１セッションにつき３反復で提供された。それぞれのサンプルを味わった後、次のサンプルを味わう前に、口内を常温の水で完全に洗浄した。パネリストは７％、８％、９％、１０％、１１％スクロースサンプルおよび６番目のサンプルとして７％スクロースに、その甘味検出閾値に近い濃度の甘味増強剤を加えたものを提供された。彼らに、サンプルを、感じた甘味に関して低い方から高い方へランク付けすることを求めた。７％スクロースと甘味増強剤対７％、８％、９％、１０％または１１％スクロースについてＲ指数（下記参照）を計算した。
【０２３６】
ｂ）水中の甘味増強剤の閾値付近甘味等強度
官能評価はランキング法を利用して行った。常温のサンプルが無作為に１５ｍｌの盲検化されたアリコート（パネリストによって特定できない）で提供された。パネルは１０名の甘味感受性対象によって構成され、サンプルは１セッションにつき３反復で提供された。それぞれのサンプルを味わった後、次のサンプルを味わう前に、口内を常温の水で完全に洗浄した。パネリストは０．５％および１％スクロース、または１％および１．５％スクロース、および３番目のサンプルとして水に、その甘味検出閾値に近い濃度の甘味増強剤を加えたものを提供された。彼らに、サンプルを、感じた甘味に関して低い方から高い方へランク付けすることを求めた。水と甘味増強剤対０．５％および１％スクロースまたは１％および１．５％スクロースについてＲ指数（下記参照）を計算した。Ｒ指数は、シグナル検出に基づく分析的手順によって得られる統計量であり、１つのサンプルを他のサンプル以上に選択した対象の比率を決定するための簡略法である。（O'Mahony, 1992, J. Sens. Stud., 7:1〜47参照）。ランキング型の官能試験から、応答のマトリクス（下記表Ｘ参照）を、各セルが、与えられたサンプルが特定の場所にランクされた回数を含むように構築した。
【０２３７】
【表８】
2009534018.tif 000015
【０２３８】
基本的に、Ｒ指数は２つのサンプルの差異の大きさである。Ｒ指数は５０％の検出の期待値を有している。したがって、２つのサンプルを比較した場合、それらが異なっていると考えるためには、導出されるＲ指数は５０％から有意に異なっていなくてはならない。臨界値は、導出されるＲ指数が有意とみなされるために、それから逸脱して（すなわちそれより大きいかまたは小さい）いなければならない統計学的に関連のある値である。
【０２３９】
高い臨界値よりも大きなＲ指数は、甘味増強剤サンプルがスクロースサンプルより有意に甘いことを意味する。臨界値と有意に差がないＲ指数は、甘味増強剤サンプルが比較したスクロースサンプルと同程度の甘味を有していることを意味する。低い臨界値よりも小さなＲ指数は、スクロースサンプルが甘味増強剤サンプルよりも甘いことを示している。
【０２４０】
１４．  １５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍの水中サイクラミン酸塩のランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、または２５０ｐｐｍの水中サイクラミン酸塩を含有する水性混合物を、０．５％スクロース溶液に対する等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法（サイクラミン酸塩濃度を変化させ、他の手順は同様にした）を利用して評価した。結果を下表に表す。
【表９】
2009534018.tif 000016
【０２４１】
低い臨界値（３５．３９％）に基づく期待値と有意に差のない４１％というＲ指数は、１５０ｐｐｍサイクラミン酸塩サンプルが０．５％のスクロースと等甘味度であることを意味する。臨界値（３５．３９％）よりも低い０％というＲ指数は、２００ｐｐｍおよび２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩サンプルが０．５％スクロースよりも有意に甘いことを意味する。
【０２４２】
１５．  ２５０ｐｐｍの水中サイクラミン酸塩のランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
２５０ｐｐｍの水中サイクラミン酸塩を、０．５〜１％の濃度のスクロース溶液に対する等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。結果を下表に表す。
【表１０】
2009534018.tif 000017
【０２４３】
臨界値（６４．６１％）よりも高い８９％というＲ指数は、サイクラミン酸塩サンプルが０．５％スクロースよりも甘いことを意味する。臨界値（３５．３９％）よりも低い１２％というＲ指数は、サイクラミン酸塩サンプルが１％スクロースよりも有意に甘くないことを意味する。補間により、２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩の甘味は、約０．７５％のスクロースと等価であった。
【０２４４】
１６．  １７００〜２５００ｐｐｍの水中サイクラミン酸塩のランキング試験、甘味識別レベルの決定
１７００ｐｐｍ、１９００ｐｐｍ、２１００ｐｐｍ、２３００ｐｐｍおよび２５００ｐｐｍの水中サイクラミン酸塩の溶液を、例１３の方法の変法（サイクラミン酸塩を閾値上甘味料として利用した）を利用して、甘味について順位付けをした。対象は、１７００〜２５００ｐｐｍのサイクラミン酸塩を含有する５つのサンプルを与えられ、最も甘くないものから最も甘いものまで順位付けるように依頼された。結果を下表に表す。
【０２４５】
【表１１】
2009534018.tif 000018
【０２４６】
臨界値（６４．６１％）よりも高い９０％というＲ指数は、対象が１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩の甘味度を１９００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と区別可能であることを意味する。臨界値（６４．６１％）よりも高い８１％というＲ指数は、対象が１９００ｐｐｍのサイクラミン酸塩の甘味度を２１００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と区別可能であることを意味する。臨界値（６４．６１％）よりも高い７６％というＲ指数は、対象が２１００ｐｐｍのサイクラミン酸塩の甘味度を２３００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と区別可能であることを意味する。臨界値（６４．６１％）よりも高い７６％というＲ指数は、対象が２３００ｐｐｍのサイクラミン酸塩の甘味度を２５００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と区別可能であることを意味する。これらの結果に基づいて、パネリストらは５つのサイクラミン酸塩濃度を、相互に確実に識別可能であった。
【０２４７】
１７．  ７５ｐｐｍの水中ｐ−エトキシベンズアルデヒドのランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
７５ｐｐｍの水中ｐ−エトキシベンズアルデヒドサンプルを、濃度０．５〜１％のスクロース溶液に対する等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表１２】
2009534018.tif 000019
【０２４８】
臨界値（３５．３９％）よりも低い０％もしくは７％というＲ指数は、ｐ−エトキシベンズアルデヒドサンプルが０．５％のスクロースよりも甘くないことを意味する。補間によって、７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドは０．２５％のスクロースと甘味において等価であるか、甘味検出閾値未満であった。
【０２４９】
１８．  ０．５％の水中スクロースのランキング試験、そのｐ−エトキシベンズアルデヒド等甘味度の決定
０．５％の水中スクロース溶液を、１００ｐｐｍおよび１５０ｐｐｍの濃度のｐ−エトキシベンズアルデヒド溶液に対する等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法（例１４のように改変したが、ｐ−エトキシベンズアルデヒド濃度を変えた）を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【０２５０】
【表１３】
2009534018.tif 000020
【０２５１】
臨界値範囲（３５．３９〜６４．６１％）内である６３％というＲ指数は、期待値と有意な差が無く、０．５％スクロース溶液は１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液と等甘味度であったことを示す。臨界値（３５．３９％）よりも低い３％というＲ指数は、０．５％スクロース溶液が１５０ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液よりも有意に甘くないことを意味する。
【０２５２】
１９．  ６００〜１０００ｐｐｍの水中ｐ−エトキシベンズアルデヒドのランキング試験、甘味識別レベルの決定
６００ｐｐｍ、７００ｐｐｍ、８００ｐｐｍ、９００ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの水中ｐ−エトキシベンズアルデヒドを、例１３の方法の変法（スクロースではなくｐ−エトキシベンズアルデヒドを閾値上甘味料として利用した）を利用して、甘味について順位付けした。対象は、６００〜１０００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドを含有する５つのサンプルを与えられ、最も甘くないものから最も甘いものまで順位付けるように依頼された。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【０２５３】
【表１４】
2009534018.tif 000021
【０２５４】
臨界値（６４．６１％）よりも高い７４％というＲ指数は、対象が６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドの甘味度を７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと区別可能であることを意味する。臨界値（６４．６１％）よりも高い７２％というＲ指数は、対象が７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドの甘味度を８００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと区別可能であることを意味する。臨界値（６４．６１％）よりも高い６７％というＲ指数は、対象が８００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドの甘味度を９００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと区別可能であることを意味する。臨界値（６４．６１％）よりも高い７３％というＲ指数は、対象が９００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドの甘味度を１０００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと区別可能であることを意味する。これらの結果は、パネリストらは５つのｐ−エトキシベンズアルデヒド濃度を、相互に確実に識別可能であったことを示す。
【０２５５】
２０．  １００ｐｐｍの水中ｐ−エトキシベンズアルデヒドのランキング試験、そのサイクラミン酸塩等甘味度の決定
１００ｐｐｍの水中ｐ−エトキシベンズアルデヒドサンプルを、１５０〜２５０ｐｐｍの濃度のサイクラミン酸塩溶液に対する等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法（ｐ−エトキシベンズアルデヒドに対する等甘味度を計算するために、サイクラミン酸塩濃度を変えた）を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【０２５６】
【表１５】
2009534018.tif 000022
【０２５７】
臨界値範囲（３５．３９〜６４．６１％）内である５１％というＲ指数は、ｐ−エトキシベンズアルデヒドサンプルが１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度であったことを意味する。臨界値（３５．３９％）よりも低い５％および１７％というＲ指数は、ｐ−エトキシベンズアルデヒドサンプルが、２００ｐｐｍまたは２５０ｐｐｍのいずれのサイクラミン酸塩よりも甘くないことを意味する。
【０２５８】
２１．  ７％スクロース中の２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩のランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
７％スクロース中の２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩サンプルを、７〜１１％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。結果を下表に表す。
【０２５９】
【表１６】
2009534018.tif 000023
【０２６０】
臨界値（６４．６１％）よりも高い８０％および９６％というＲ指数は、７％スクロース中のサイクラミン酸サンプルが、７％または８％のスクロースよりも有意に甘いことを意味する。臨界値範囲（３５．３９〜６４．６１％）内である３８％というＲ指数は、サイクラミン酸塩サンプルが９％スクロースと等甘味度であったことを意味する期待値と等価である。臨界値（３５．３９％）よりも低い０％および２４％というＲ指数は、サイクラミン酸塩サンプルが、１０％または１１％のいずれのスクロースよりも甘くないことを意味する。したがって、７％スクロース中の２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩は、２°ブリックスのスクロース甘味強度を付加し、９％スクロース溶液と等価になるまで甘味度を増強する。７％スクロース＋２５０ｐｐｍサイクラミン酸塩（２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩は０．７５％スクロースと等甘味度である。例１５参照）は、効果が単に相加的であるならば、７．５％以上から８％以下までのスクロース、補間して７．７５％のスクロースと甘味において等価であると期待される。しかしながら、上で示されているように、２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と７％スクロースとの組合せは９％スクロースと等甘味度であり、期待された効果よりも明らかに大きい。
【０２６１】
２２．  １７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の０．５％スクロースのランキング試験、そのサイクラミン酸塩等甘味度の決定
１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の０．５％スクロースサンプルを、１７００〜２５００ｐｐｍの濃度のサイクラミン酸塩溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法（サイクラミン酸塩を閾値上甘味料として利用した）を利用して評価した。結果を下表に表す。
【表１７】
2009534018.tif 000024
【０２６２】
臨界値（６４．６１％）よりも高い８５％というＲ指数は、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸中のスクロースサンプルが、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩サンプルよりも有意に甘いことを意味する。臨界値範囲（３５．３９〜６４．６１％）内である６０％というＲ指数は、スクロースサンプルが１９００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度であったことを意味する期待値と等価である。臨界値（３５．３９％）よりも低い４％から２１％というＲ指数は、スクロースサンプルが、２１００ｐｐｍ、２３００ｐｐｍ、２５００ｐｐｍのどのサイクラミン酸塩よりも甘くないことを意味する。したがって、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の０．５％スクロースは、２００ｐｐｍサイクラミン酸塩溶液と等価な甘味度を付加する（すなわち１７００ｐｐｍサイクラミン酸塩＋０．５％スクロース＝１９００ｐｐｍサイクラミン酸塩）。この等価性はさらに、水中の０．５％スクロースの甘味度と１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩を比較した結果によって立証される（例１４参照）。したがって、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩＋０．５％スクロースは１８５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と甘味度において等価であると期待される。
【０２６３】
サイクラミン酸塩を甘味についての閾値上レベルで利用した場合、甘味感受性パネリストの検出閾値は２００ｐｐｍのサイクラミン酸塩であった（例１６参照）。パネリストが１８５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と１９００ｐｐｍのサイクラミン酸塩を区別することは期待できない。要するに、データは、サイクラミン酸塩甘味度におけるスクロースの効果は単に相加的であったことを示している。
【０２６４】
２３．  １７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドのランキング試験、そのサイクラミン酸塩等甘味度の決定
１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の１００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルを、１７００〜２５００ｐｐｍの濃度のサイクラミン酸塩溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表１８】
2009534018.tif 000025
【０２６５】
臨界値（６４．６１％）よりも高い８０％および８７％というＲ指数は、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中のｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルが、１７００ｐｐｍおよび１９００ｐｐｍのサイクラミン酸塩サンプルよりも有意に甘いことを意味する。臨界値範囲（３５．３９〜６４．６１％）内である５０％というＲ指数は、ｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルが２１００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度であったことを意味する期待値と等価である。臨界値（３５．３９％）よりも低い１７％および２２％の間のＲ指数は、ｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルが２３００ｐｐｍ、２５００ｐｐｍのいずれのサイクラミン酸塩よりも甘くないことを意味する。したがって、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の１００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドは、４００ｐｐｍサイクラミン酸塩溶液と等価な甘味を付加する（すなわち１７００ｐｐｍサイクラミン酸塩＋１００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド＝２１００ｐｐｍサイクラミン酸塩）。水中の１００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドと１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩の比較によって（例２０参照）、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩＋１００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドは１８５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と甘味において等価であると期待される。
【０２６６】
しかしながら、上記のように、１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩の混合物は、２１００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度であり、期待された効果よりも明らかに大きく、効果が単に相加的ではないことを示している。
【０２６７】
２４．  ７％スクロース中の７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドのランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
７％スクロース中の７５ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルを、７〜１１％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表１９】
2009534018.tif 000026
【０２６８】
臨界値（６４．６１％）よりも高い７４％というＲ指数は、７５ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルが、７％スクロースサンプルよりも有意に甘いことを意味する。臨界値範囲（３５．３９〜６４．６１％）内である３６％というＲ指数は、ｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルが８％のスクロースと等甘味度であったことを意味する期待値と等価である。臨界値（３５．３９％）よりも低い０％、１％および１２％というＲ指数は、スクロースサンプルがｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルよりも甘いことを示している。データは、７％スクロースと７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドの混合物の認識された甘味度が８％スクロースと等甘味度であることを示している。比較すると、水中の７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドは０．５％以下のスクロースと等甘味度であった（例１７参照）。効果が単に相加的であるならば、７％スクロース＋７５ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルはしたがって、７．５％以下のスクロース、補間して７．２５％スクロースの甘味度と等価であることが期待される（例１７を受けて）。
【０２６９】
しかしながら、上記のように、７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと７％スクロースの組み合わせは、８％スクロースと等甘味度であり、期待された効果よりも明らかに大きい。
【０２７０】
２５．  ７％スクロース中の２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩および７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドのランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
７％スクロース中の２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩および７５ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドの混合物サンプルを、７〜１１％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表２０】
2009534018.tif 000027
【０２７１】
７４〜９８％というＲ指数は高臨界値（６４．６１％）よりも高く、サイクラミン酸塩／ｐ−エトシキベンズアルデヒド混合物サンプルが、７％、８％および９％スクロースサンプルよりも甘いことを示している。１２％から２９％というＲ指数は臨界値（３５．３９％）よりも低く、サイクラミン酸塩／ｐ−エトシキベンズアルデヒドサンプルが１０％または１１％スクロースサンプルよりも甘くないことを示している。データは、２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩および７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドを伴う７％スクロースの認識された甘味度は、９％スクロースの甘味度より有意に高いが、１０％スクロースの甘味度よりも低く、または補間法により９．５％であることを示している。
【０２７２】
比較すると、水中の２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩は０．５％以上のスクロースと等甘味度だが１％以下のスクロースと等甘味度であり、補間して０．７５％と等甘味度であり（例１４および１５参照）、水中の７５ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドは０．５％以下のスクロース、補間して０．２５％、と等甘味度であった（例１７参照）。したがって、７％スクロース＋２５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩（１％以下のスクロースおよび０．５％以上のスクロース、補間して０．７５％のスクロースと等甘味度）＋７５ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド（０．５％以下のスクロース、補間して０．２５％のスクロースと等甘味度）は、８．５％以下のスクロース、補間して８％スクロースと等甘味度であることが期待される。しかしながら、決定された等甘味度は９％スクロース以上、補間して９．５％スクロースであり、期待された効果よりも明らかに上である。
【０２７３】
２６．  １７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドおよび０．５％スクロースのランキング試験、そのサイクラミン酸塩等甘味度の決定
１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩中の１００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒドおよび０．５％スクロースの混合物サンプルを、１７００〜２５００ｐｐｍの濃度のサイクラミン酸塩溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表２１】
2009534018.tif 000028
【０２７４】
７９〜９８％というＲ指数は高臨界値（６４．６１％）よりも高く、ｐ−エトシキベンズアルデヒド／スクロース混合物サンプルが、１７００ｐｐｍ、２１００ｐｐｍおよび２３００ｐｐｍのサイクラミン酸塩サンプルよりも甘いことを示している。５６％というＲ指数は臨界値範囲（３５．３９〜６４．６１％）内であり、ｐ−エトシキベンズアルデヒド／サイクラミン酸塩サンプルが２３００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度であったことを示している。低臨界値（３５．３９）％と等価な期待値である４４％というＲ指数は、ｐ−エトシキベンズアルデヒド／サイクラミン酸塩サンプルが２５００ｐｐｍのサイクラミン酸塩サンプルと等甘味度であることを意味する。データは、１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドおよび０．５％スクロースを伴う１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩の認識された甘味は、２１００ｐｐｍのサイクラミン酸塩より有意に高いが、２３００ｐｐｍおよび２５００ｐｐｍのサイクラミン酸塩とは区別できないことを示している。
【０２７５】
比較すると、水中の１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドは１５０ｐｐｍのサイクラミン酸と等甘味度であり（例２０参照）、水中の０．５％スクロースは１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度である（例１４参照）。したがって、１７００ｐｐｍのサイクラミン酸塩＋１００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド（１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度）および０．５％スクロース（１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度）は、２１００ｐｐｍ以下のサイクラミン酸塩、または２０００ｐｐｍのサイクラミン酸塩と等甘味度であることが期待される。しかしながら、決定された等甘味度は２１００ｐｐｍ以上のサイクラミン酸塩、２３００ｐｐｍおよび２５００ｐｐｍのサイクラミン酸塩の間の等甘味度範囲であり、期待された（相加的）効果よりも明らかに上である。
【０２７６】
２７．  ６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩のランキング試験、そのｐ−エトキシベンズアルデヒド等甘味度の決定
６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液サンプル中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩の混合物を、６００ｐｐｍおよび７００ｐｐｍの濃度のｐ−エトキシベンズアルデヒド溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表２２】
2009534018.tif 000029
【０２７７】
９２％および７０％というＲ指数は臨界値（６４．６１％）よりも高く、６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液サンプル中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩が、６００ｐｐｍおよび７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド溶液単独よりも甘いことを示している。
比較すると、水中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩は水中の１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと等甘味度である（例２０参照）。６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液への１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩の添加は、効果が単に相加的であるならば、７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液と等甘味度であるはずである。しかしながら、６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液サンプル中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩は、７００ｐｐｍのｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドよりも甘いことが見出され、これは期待された効果を明らかに上回る。
【０２７８】
２８．  ６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液中の０．５％スクロースのランキング試験、そのｐ−エトキシベンズアルデヒド等甘味度の決定
６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液サンプル中の０．５％スクロースの混合物を、６００ｐｐｍおよび７００ｐｐｍの濃度のｐ−エトキシベンズアルデヒド溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表２３】
2009534018.tif 000030
【０２７９】
臨界値（６４．６１％）よりも高い６８％というＲ指数は、６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液サンプル中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩が、６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド溶液単独よりも甘いことを意味する。高臨界値（６４．６１％）の期待値と等価である５９％というＲ指数は、６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液サンプル中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩が、７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドの水溶液と等甘味度であることを意味する。
【０２８０】
比較すると、水中の０．５％スクロースは水中の１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと等甘味度である（例１８参照）。６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液への０．５％スクロースの添加は、７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液と等甘味度であり、効果が単に相加的であることを意味する。
【０２８１】
２９．  ６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩および０．５％スクロースのランキング試験、そのｐ−エトキシベンズアルデヒド等甘味度の決定
６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩および０．５％スクロースのサンプル混合物を、６００ｐｐｍおよび７００ｐｐｍの濃度のｐ−エトキシベンズアルデヒド溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法の変法を利用して評価した。対象は、甘味における香気の効果を取り除くために鼻クリップを着ける必要があった。結果を下表に表す。
【表２４】
2009534018.tif 000031
【０２８２】
９４％および９６％というＲ指数は臨界値（６４．６１％）よりも高く、６００ｐｐｍのｐ−エトシキベンズアルデヒド水溶液サンプル中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩および０．５％スクロースが、６００ｐｐｍおよび７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド溶液よりも甘いことを示している。
【０２８３】
比較すると、水中の１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩は水中の１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと等甘味度であり（例２０参照）、水中の０．５％スクロースは水中の１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと等甘味度である（例１８参照）。したがって、６００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液への１５０ｐｐｍのサイクラミン酸塩（１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと等甘味度）および０．５％スクロース（１００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒドと等甘味度）の添加は、８００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド水溶液と等甘味度であることが期待される。決定された等甘味度は７００ｐｐｍのｐ−エトキシベンズアルデヒド以上であった。
【０２８４】
３０．  水中の６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣのランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
水中の６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣサンプルを、０．５〜１％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。結果を下表に表す。
【表２５】
2009534018.tif 000032
【０２８５】
９９％および７１％というＲ指数は臨界値（６４．６１％）よりも高く、ＮａｒＤＨＣサンプルは、０．５％および１％のスクロースよりも甘いことを示している。臨界値（３５．３９％）よりも低い２０％というＲ指数は、ＮａｒＤＨＣサンプルが１．５％スクロースよりも有意に甘くないことを意味する。
補間により、６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣの甘味度は約１．２５％スクロースと等価であった。
【０２８６】
３１．  水中の２ｐｐｍのＮＤＨＣのランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
水中の２ｐｐｍのＮＤＨＣサンプルを、０．５〜１％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。結果を下表に表す。
【表２６】
2009534018.tif 000033
【０２８７】
臨界値（３５．３９％）よりも有意に高くない４１％というＲ指数は、ＮＤＨＣサンプルが、０．５％スクロースと等甘味度であることを意味する。臨界値（３５．３９％）よりも低い５％というＲ指数は、ＮＤＨＣサンプルが１％スクロースよりも有意に甘くないことを意味している。
【０２８８】
３２．  水中の４５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、５５ｐｐｍおよび６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣ対０％、０．５％、１％または１．５％スクロースの一対比較
水中のＮａｒＤＨＣ（４５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、５５ｐｐｍ、６０ｐｐｍ）サンプルを、０〜１．５％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されている一対比較法の変法を利用して評価した。ＮａｒＤＨＣサンプルは０％、０．５％、１％または１．５％スクロースそれぞれと比較した。結果を下表に表す。
【表２７】
2009534018.tif 000034
【０２８９】
４５ｐｐｍのＮａｒＤＨＣ溶液は０％スクロースと比較した場合若干甘く、０．５％スクロースの甘味と等甘味度であった。５０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣサンプルは０．５％スクロースより明らかに甘かったが、１％スクロースよりは甘くないことが見出された。５５ｐｐｍのＮａｒＤＨＣサンプルは０．５％スクロースより明らかに甘く、１％スクロースの甘味と等甘味度であることが決定された。６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣサンプルは１％スクロースより明らかに甘かったが、１．５％スクロースより有意により甘くなかった。
【０２９０】
３３．  水中の６０ｐｐｍの羅漢果抽出物対０％、０．５％および１％スクロースの強制選択試験
甘味料としての羅漢果抽出物の強制選択官能評価を、例１３に記載されているようにだが、次のように改変して行った（強制選択法については、O'Mahony, 1992, J.Sens. Stud., 7:1-47もまた参照）：羅漢果抽出物は水中で６０ｐｐｍの濃度を有し、０％スクロース／水、０．５％スクロース／水または１％スクロース／水とそれぞれ比較した。結果を下表に表す。
【表２８】
2009534018.tif 000035
【０２９１】
６０ｐｐｍの羅漢果抽出物は、その甘味知覚閾値濃度に近く、若干甘い１％スクロースよりも有意により甘くなかった。水中の６０ｐｐｍの羅漢果サンプルは、全てのパネリストに０％スクロース／水よりも甘いと知覚された（３０人中３０人のパネリスト、ｐ＜０．００１の強制選択の統計的有意水準で）。０．６３という低い甘味強度評定は、非常に弱い知覚可能な甘味（０％スクロースは０．１という評定であることを参照。考えられる最高の甘味度は１０と評定される）を反映している。水中の６０ｐｐｍの羅漢果サンプルは、多くのパネリストによって、０．５％スクロース／水よりも甘いと知覚された（３０人中２８人のパネリスト、ｐ＜０．００１の強制選択の統計的有意水準で）。大多数のパネリスト（３０人中２４人）は若干甘い１％スクロース溶液を、６０ｐｐｍの羅漢果抽出物溶液よりも甘いものとして、ｐ＜０．００１の強制選択の統計的有意水準で選択した。水中の羅漢果抽出物に対する０．５８という低い甘味強度評定対１％スクロースに対する０．７２は、１％スクロースの甘味度よりも有意に低い、６０ｐｐｍの羅漢果の非常に弱い知覚可能な甘味を反映している。補間により、６０ｐｐｍの羅漢果抽出物の甘味度は約０．７５％のスクロースと等価である。
【０２９２】
３４．  水中の６０ｐｐｍの羅漢果抽出物＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣ＋２ｐｐｍのＮＤＨＣ対０％、２．２５％スクロースの強制選択試験
羅漢果抽出物、ＮａｒＤＨＣ、およびＮＤＨＣの混合物の強制選択試験を、例１３に記載されているようにだが、次のように改変して行った：水中の６０ｐｐｍの羅漢果抽出物＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣ＋２ｐｐｍのＮＤＨＣサンプルを２．２５％スクロースと比較した。２．２５％スクロース濃度は、補間された各甘味増強剤のスクロースに対する等甘味度の相加的な個別の効果よりもわずかに小さいものとして選択した：２ｐｐｍのＮＤＨＣについては０．５％（例３１）＋６０ｐｐｍの羅漢果抽出物については０．７５％（例３３）＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣについては１．２５％（例３０および３２）。
【０２９３】
２ｐｐｍのＮＤＨＣ＋６０ｐｐｍの羅漢果抽出物＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣは、下表に示すように、２．２５％スクロースよりも有意に甘くなかった。この結果は、水中の甘味増強剤の混合物（スクロースを添加しない）は、各含有物の甘味の総和よりも低くなることを示している。さらに、甘味増強剤それ自体はお互いの甘味を少しも増強しない。
【表２９】
2009534018.tif 000036
【０２９４】
３５．  ６０ｐｐｍの羅漢果抽出物および２ｐｐｍのＮＤＨＣ＋７％スクロース中のランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
７％スクロースサンプル中の６０ｐｐｍの羅漢果抽出物＋２ｐｐｍのＮＤＨＣを、７〜１１％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。結果を下表に表す。
【表３０】
2009534018.tif 000037
【０２９５】
８２および９８％というＲ指数は臨界値（７２．１８％）よりも高く、ＮＤＨＣ＋羅漢果サンプルが、７％または８％のスクロースサンプルよりも有意に甘いことを示している。期待値と有意に差がない４３％というＲ指数は、ＮＤＨＣ＋羅漢果抽出物サンプルが９％スクロースと等甘味度であったことを示している。臨界値（２７．８２％）よりも低い４〜１２％というＲ指数は、ＮＤＨＣ＋羅漢果抽出物サンプルが１０％または１１％スクロースよりも有意に甘くないことを示す。水中の２ｐｐｍのＮＤＨＣは０．５％スクロースと等しい甘味度を有する（例３１参照）。水中の６０ｐｐｍの羅漢果は０．５％以上だが１％以下（補間により０．７５％）のスクロースと等しい甘味度を有する（例３３参照）。したがって、７％スクロース＋２ｐｐｍのＮＤＨＣ（０．５％スクロースと等強度）＋６０ｐｐｍの羅漢果抽出物（１％以下のスクロース、補間して０．７５％スクロースと等甘味度）は、８．５％以下のスクロース、または補間により８．２５％以下のスクロースと等甘味度であることが期待される。しかしながら、決定された等甘味度は９％スクロースであり、単なる相加的な効果より明らかに高かった。
【０２９６】
３６．  ６０ｐｐｍの羅漢果抽出物＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣ＋２ｐｐｍのＮＤＨＣ＋７％スクロース中のランキング試験、そのスクロース等甘味度の決定
７％スクロース中の６０ｐｐｍの羅漢果抽出物＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣ＋２ｐｐｍのＮＤＨＣサンプルを、７〜１１％の濃度のスクロース溶液に対するその等甘味度について、例１３に記載されているランキング法を利用して評価した。結果を下表に表す。
【表３１】
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【０２９７】
７９〜１００％というＲ指数は臨界値（７４．８９％）よりも高く、ＮＤＨＣ＋羅漢果＋ＮａｒＤＨＣサンプルが、７％、８％、９％および１０％のスクロースサンプルよりも有意に甘いことを示している。５０％から臨界値（７４．８９％）間でのＲ指数は、ＮＤＨＣ＋羅漢果＋ＮａｒＤＨＣサンプルが比較スクロースサンプルと等甘味度であることを意味する。４８％において、ＮＤＨＣ＋羅漢果＋ＮａｒＤＨＣサンプルは１１％スクロースと等価であった。比較すると、水中の２ｐｐｍのＮＤＨＣは０．５％スクロースと等しい甘味度を有する（例３１参照）。水中の６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣは１％スクロース以上だが１．５％スクロース以下、補間して１．２５％スクロースと等しい甘味度を有する（例３０および３２参照）。水中の６０ｐｐｍの羅漢果は０．５％以上だが１％以下のスクロース、補間して０．７５％スクロースと等しい甘味度を有する（例３３参照）。したがって、相加的効果と仮定すれば、７％スクロース＋２ｐｐｍのＮＤＨＣ（０．５％スクロースと等甘味）＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣ（１．５％以下のスクロース、補間して０．７５％スクロースと等強度）＋６０ｐｐｍの羅漢果抽出物（１％以下のスクロース、補間して０．７５％スクロースと等甘味度）は、１０％以下のスクロース、または補間により９．５％以下のスクロースと等甘味度であることが期待される。さらに、水中の２ｐｐｍのＮＤＨＣ＋６０ｐｐｍの羅漢果抽出物＋６０ｐｐｍのＮａｒＤＨＣは、２．２５％スクロースよりも甘くないことが決定されており（例３４参照）、したがって、相加的効果であると仮定すれば、７％スクロース中の混合物の等甘味度は９．２５％スクロース以下であると期待されるだろう。しかしながら、決定された甘味等強度は１１％スクロースと等甘味度であり、単なる相加的な効果より明らかに高かった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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