(57)【要約】  ヒト骨形成タンパク質７（ｈＢＭＰ−７）変異体ペプチド鎖、これらのペプチド鎖をコードしている核酸、ならびに前記物質を作成および使用する方法が開示される。
2009544325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項２】
配列番号：６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項３】
配列番号：８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項４】
配列番号：１０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項５】
配列番号：１２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項６】
配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項７】
配列番号：１６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項８】
配列番号：１８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項９】
配列番号：２０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１０】
配列番号：２２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１１】
配列番号：２４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１２】
配列番号：２６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１３】
配列番号：２８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１４】
配列番号：３０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１５】
配列番号：３２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１６】
配列番号：３４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１７】
少なくとも１個のポリエチレングリコール分子をさらに含んでなる請求項１６のペプチド鎖。
【請求項１８】
配列番号：３６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項１９】
配列番号：３８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項２０】
配列番号：４０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項２１】
配列番号：４２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項２２】
配列番号：４４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項２３】
配列番号：４６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項２４】
配列番号：４８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖。
【請求項２５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のペプチド鎖をコードしている核酸を含んでなる単離核酸。
【請求項２６】
配列番号：３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項２７】
配列番号：５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項２８】
配列番号：７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項２９】
配列番号：９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３０】
配列番号：１１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３１】
配列番号：１３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３２】
配列番号：１５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３３】
配列番号：１７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３４】
配列番号：１９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３５】
配列番号：２１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３６】
配列番号：２３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３７】
配列番号：２５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３８】
配列番号：２７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項３９】
配列番号：２９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４０】
配列番号：３１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４１】
配列番号：３３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４２】
配列番号：３５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４３】
配列番号：３７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４４】
配列番号：３９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４５】
配列番号：４１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４６】
配列番号：４３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４７】
配列番号：４５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４８】
配列番号：４７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸。
【請求項４９】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のペプチド鎖を細胞に与えることを含む、ＴＧＦ−β誘導細胞増殖を抑制する方法。
【請求項５０】
請求項２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８の核酸を含んでなるベクター。
【請求項５１】
請求項５０のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
請求項５１の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞によって生産されたペプチド鎖を回収することを含む、ペプチド鎖を作成する方法。
【請求項５３】
発現系において請求項１、２、３、４または２１のペプチド鎖を発現させ、そしてそのペプチド鎖が、ペプチド鎖を受けなかったネガティブ対照ＲＯＳ１７／２．８細胞に比較してＲＯＳ１７／２．８細胞においてアルカリホスファターゼ活性を増大することができるか、あるいはペプチド鎖を受けなかったネガティブ対照ＶＥＰＴ細胞に比較して生存可能なＶＥＰＴ細胞の数を増加することができるペプチド鎖を回収することを含む、ペプチド鎖を作成する方法
【請求項５４】
ｈＢＭＰ−７応答性症状を有する動物を同定し；そしてその病理学的症状を弱めるのに十分な量において、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のペプチド鎖を動物に投与する；段階を含む処置の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト骨形成タンパク質７（ｈＢＭＰ−７）変異体（ｖａｒｉａｎｔ）ペプチド鎖、これらのペプチド鎖をコードしている核酸鎖、ならびに前記物質を作製しそして使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト骨形成タンパク質７（ｈＢＭＰ−７）は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーの１員であり、そして骨構造および腎機能の両モジュレーターとして認識された治療上の潜在能力を有する（非特許文献１）。例えば、活性ｈＢＭＰ−７は、骨髄線維症、特発性肺線維症、腎性骨形成異常、腎線維症、糖尿病性腎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および変形性関節症のような適応症においてタンパク質治療剤として使用され得る。
【０００３】
ｈＢＭＰ−７は、１２９３個の塩基対のオープン読み枠を含有するｍＲＮＡ（対応するｃＤＮＡは配列番号：１において示される）として転写され、これが、４３１個のアミノ酸残基（図１；配列番号：２）の前駆体タンパク質として翻訳され、そしてこれがタンパク質分解的にプロセスされる。ｈＢＭＰ−７前駆体タンパク質は、配列番号：２の残基１〜２９にわたるシグナルペプチド、配列番号：２の残基３０〜２９２にわたるプロドメイン（ｐｒｏｄｏｍａｉｎ）、および配列番号：２の残基２９３〜４３１にわたる成熟形態ドメインを含有する（図１）。
【０００４】
ｈＢＭＰ−７前駆体タンパク質のタンパク質分解プロセシングは数段階において起きると信じられている。最初に、シグナルペプチドがｈＢＭＰ−７を細胞の小胞体に向かわせ、ここでフォールディングが起き、そしてｈＢＭＰ−７はホモ二量体タンパク質複合体を形成する。次に、ｈＢＭＰ−７プロドメインがタンパク質分解プロセシングによって除去されて、２個の逆平行ｈＢＭＰ−７成熟ドメインペプチド鎖からなる共有結合されたホモ二量体が生成される。この最終ホモ二量体タンパク質複合体は生物学的に活性のある形態物であり、そして細胞によって分泌される。
【０００５】
分泌されたｈＢＭＰ−７は、他の細胞の表面受容体および可溶性アンタゴニスト、例えばＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲ１ａおよびＮｏｇｇｉｎと相互作用して、その生物学的効果および活性を媒介する。これらの相互作用に関する構造情報は、多数の異なるＢＭＰ−７結晶構造物から得ることができる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００６】
ｈＢＭＰ−７（Ｏｚｋａｙｎａｋら（非特許文献６）によって骨原性タンパク質１（ＯＰ−１）として既に知られている）は少なくとも１９９０年以来知られていたけれども、今日まで、いくつかの未解決な問題が、治療タンパク質としてのその開発を阻んできた。第１に、哺乳動物細胞におけるｈＢＭＰ−７の組み換え体発現は、類似サイズの他のタンパク質に較べて極端に低い。これは、ｈＢＭＰ−７の治療上の使用のために必要とされる大規模な商業生産および精製には適合しない。第２に、ｈＢＭＰ−７の成熟ドメインのタンパク質分解プロセシングは、そのドメインにおける４個の異なる部位のいずれにおいて起きてもよい。これは、このタンパク質の組み換え発現の間に生産されるｈＢＭＰ−７の多数の異なる成熟形態物をもたらす。発現タンパク質におけるこの高度の不均質性は、タンパク質治療剤においては甚だ望ましくない。第３に、ｈＢＭＰ−７の成熟形態物は７．０に近いｐＨ値では乏しい溶解度を有し；したがって、ｈＢＭＰ−７の溶解性を維持するためには酸性ｐＨ値が求められる。しかしながら、酸性ｐＨ値は、患者に対してタンパク質治療剤を投与するために使用される、もっとも普通の送達方法、例えば静脈内注射には
適合しない。最後に、ｈＢＭＰ−７のプロドメインはｈＢＭＰ−７の成熟ドメインとは非共有的に結合している。それ故、ｈＢＭＰ−７の成熟ドメインからプロドメインを除去して精製することは、比較的困難であり、かつ大規模な商業生産および精製には適合しない。
【０００７】
したがって、治療タンパク質としての使用のために適当であり、そして大規模な商業生産および精製と適合する、改良された性質を有するｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｌａｈｒ，Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１６：１７９−１８５（２００３）
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１１：６０５−０１７（２００３）
【非特許文献３】Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．９３：８７８−８８３（１９９６）
【非特許文献４】Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：４８１−４８８（２００４）
【非特許文献５】Ｇｒｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４２０（６９１６）：６３６−６４２（２００２）
【非特許文献６】Ｏｚｋａｙｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９（７），２０８５−２０９３（１９９０）
【発明の概要】
【０００９】
本発明の１つの態様は、配列番号：４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１０】
本発明のその他の態様は、配列番号：６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１１】
本発明のその他の態様は、配列番号：８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１２】
本発明のその他の態様は、配列番号：１０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１３】
本発明のその他の態様は、配列番号：１２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１４】
本発明のその他の態様は、配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１５】
本発明のその他の態様は、配列番号：１６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１６】
本発明のその他の態様は、配列番号：１８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１７】
本発明のその他の態様は、配列番号：２０において示されるアミノ酸配列を含んでなる
単離ペプチド鎖である。
【００１８】
本発明のその他の態様は、配列番号：２２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００１９】
本発明のその他の態様は、配列番号：２４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２０】
本発明のその他の態様は、配列番号：２６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２１】
本発明のその他の態様は、配列番号：２８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２２】
本発明のその他の態様は、配列番号：３０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２３】
本発明のその他の態様は、配列番号：３２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２４】
本発明のその他の態様は、配列番号：３４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２５】
本発明のその他の態様は、配列番号：３６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２６】
本発明のその他の態様は、配列番号：３８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２７】
本発明のその他の態様は、配列番号：４０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２８】
本発明のその他の態様は、配列番号：４２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００２９】
本発明のその他の態様は、配列番号：４４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００３０】
本発明のその他の態様は、配列番号：４６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００３１】
本発明のその他の態様は、配列番号：４８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。
【００３２】
本発明のその他の態様は、配列番号：３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００３３】
本発明のその他の態様は、配列番号：５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００３４】
本発明のその他の態様は、配列番号：７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００３５】
本発明のその他の態様は、配列番号：９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００３６】
本発明のその他の態様は、配列番号：１１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００３７】
本発明のその他の態様は、配列番号：１３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００３８】
本発明のその他の態様は、配列番号：１５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００３９】
本発明のその他の態様は、配列番号：１７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４０】
本発明のその他の態様は、配列番号：１９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４１】
本発明のその他の態様は、配列番号：２１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４２】
本発明のその他の態様は、配列番号：２３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４３】
本発明のその他の態様は、配列番号：２５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４４】
本発明のその他の態様は、配列番号：２７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４５】
本発明のその他の態様は、配列番号：２９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４６】
本発明のその他の態様は、配列番号：３１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４７】
本発明のその他の態様は、配列番号：３３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４８】
本発明のその他の態様は、配列番号：３５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００４９】
本発明のその他の態様は、配列番号：３７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００５０】
本発明のその他の態様は、配列番号：３９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００５１】
本発明のその他の態様は、配列番号：４１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００５２】
本発明のその他の態様は、配列番号：４３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００５３】
本発明のその他の態様は、配列番号：４５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００５４】
本発明のその他の態様は、配列番号：４７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【発明の詳細な記述】
【００５５】
限定されるものではないが本明細書において引用される、特許および特許出願を含む、すべての公表物は、引用することによってすべてが完全に記述されたものとして本明細書に組み入れられている。
【００５６】
本明細書および請求項において使用されるところの、単数形態物「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別に明白に指示しない限り、複数言及物を含む。かくして、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」に関しては、１個以上の細胞に関する言及であり、そして当業者にとって既知のそれの等価物を含む。
【００５７】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野における熟達者によって普通に理解されるような同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと類似または等価のすべての組成物および方法が、本発明の実行または教示において使用されてもよいが、代表的な組成物および方法が本明細書では記述される。
【００５８】
用語「ペプチド鎖」は、鎖を形成するようにペプチド結合によって連結された少なくとも２個のアミノ酸残基を含んでなる分子を意味する。５０個以上のアミノ酸の大ペプチド鎖は、「ポリペプチド」または「タンパク質」として言及されてもよい。５０個未満のアミノ酸の小ペプチド鎖は、「ペプチド」として言及されてもよい。
【００５９】
用語「核酸」は、鎖を形成するように連結された少なくとも２個の核酸残基を含んでなる分子を意味する。そのような核酸残基はＤＮＡまたはＲＮＡにおいて見出だされるそれらのものであってもよい。５０個未満の残基の小核酸は、「オリゴヌクレオチド」として言及されてもよい。
【００６０】
用語「ｈＢＭＰ−７応答症状」は、ｈＢＭＰ−７ペプチド鎖またはｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖の生物学的活性に応答する病理学的症状を意味する。そのようなペプチド鎖は、配列番号：２のフラグメントまたは本発明のペプチド鎖を含んでもよい。ｈＢＭＰ−７活性応答性病理学的症状の例は、例えば、骨髄線維症、特発性肺線維症、腎性骨形成異常、糖尿病性腎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および変形性関節症を含む。ｈＢＭＰ−７ペプチド鎖またはｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖からもたらされる生物学的活性は、例えば、骨形成の誘導、アルカリホスファターゼ活性の増大、ヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）シンターゼ２ｍＲＮＡレベルの増大、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡレベルの増大、オステオカルシン合成の増大およびＴＧＦ−β誘導細胞増殖の抑制を含む。当業者は、多くの他のそのような生物学的活性および病理学的症状を認識できる。
【００６１】
本発明は、単離ペプチド鎖ｈＢＭＰ−７変異体構成物、これらの構成物をコードしている核酸、および関連する方法を提供する。本発明の構成物および方法は、細胞増殖の制御において、ならびに骨髄線維症、特発性肺線維症、腎性骨形成異常、糖尿病性腎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および変形性関節症のようなｈＢＭＰ−７応答症状の処置において有用であろう。
【００６２】
本発明の全ペプチド鎖および核酸は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：１）から、標準的インビトロまたはインビボ法、またはそのような方法の組み合わせ法を使用して突然変異誘発によって得られた。本発明のｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖における全突然変異位置は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖において変化されたアミノ酸残基の位置を引用することによって本明細書では記述される。慣用の１および３文字アミノ酸コードが、次に示すように本明細書では使用される：
アミノ酸                  ３文字コード              １文字コード
アラニン                  ａｌａ                    Ａ
アルギニン                ａｒｇ                    Ｒ
アスパラギン              ａｓｎ                    Ｎ
アスパラギン酸            ａｓｐ                    Ｄ
システイン                ｃｙｓ                    Ｃ
グルタミン酸              ｇｌｕ                    Ｅ
グルタミン                ｇｌｎ                    Ｑ
グリシン                  ｇｌｙ                    Ｇ
ヒスチジン                ｈｉｓ                    Ｈ
イソロイシン              ｉｌｅ                    Ｉ
ロイシン                  ｌｅｕ                    Ｌ
リジン                    ｌｙｓ                    Ｋ
メチオニン                ｍｅｔ                    Ｍ
フェニルアラニン          ｐｈｅ                    Ｆ
プロリン                  ｐｒｏ                    Ｐ
セリン                    ｓｅｒ                    Ｓ
トレオニン                ｔｈｒ                    Ｔ
トリプトファン            ｔｒｐ                    Ｗ
チロシン                  ｔｙｒ                    Ｙ
バリン                    ｖａｌ                    Ｖ
単文字アミノ酸略語は変化の性質を記述するために使用される。例えば、Ｒ２９９Ｓは、配列番号：２の位置２９９におけるＲ（アルギニン）アミノ酸がＳ（セリン）アミノ酸に変化されたことを指し、そして△Ｓ２９３−Ｒ２９９は、配列番号：２の位置２９３のＳアミノ酸において始まり、配列番号：２の位置２９９のＲにおいて終わるアミノ酸配列が欠失されたことを示す。
【００６３】
野生型ｈＢＭＰ−７（配列番号：２）は、突然変異によって改変されてもよいいくつかの重要な性質および特徴を有する。第１には、各々が異なるアミノ末端をもつ多数の成熟ｈＢＭＰ−７イソ型が、ｈＢＭＰ−７前駆体タンパク質（配列番号：２）のタンパク質分解プロセシングの間に生産されることがある。これらの末端は、野生型ｈＢＭＰ−７前駆体タンパク質（配列番号：２）のＳ２９３、Ｒ２９９、Ｒ３１４およびＭ３１５において生成することがある。Ｓ２９３、Ｒ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、△Ｓ２９３−Ｒ２９９、△Ｓ２９３−Ｒ３１４および△Ｓ２９３−Ｍ３１５突然変異は、各々、各突然変異によって影響される位置においてｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖における切断を排除することによっ
て、異なるアミノ末端をもつ多数の成熟ｈＢＭＰ−７イソ型の生成を妨げるために計画された。Ｈ２８７ＲおよびＨ２８７Ｔ突然変異は、配列番号：２のｈＢＭＰ−７プロドメインに位置されるコアフリン（ｃｏｒｅ  ｆｕｒｉｎ）切断部位に隣接している。Ｈ２８７ＲおよびＨ２８７Ｔ突然変異は共に、ｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖において配列番号：２のＳ２９３においてアミノ末端を生産するフリン切断事象を増進するために設計された。
【００６４】
第２に、成熟ｈＢＭＰ−７形態物は、ＡｃｔＲＩＩおよびＢＭＰＰＲ１ａ受容体タンパク質と複合する。Ｌ４０７Ｋ、Ｆ４０９Ｋ、Ｌ４１７Ｒ、Ｌ３８２Ｋ、Ｌ３８２Ｎ、Ｖ３８３Ｋ、Ｉ３８６ＲおよびＩ３８６Ｎ突然変異は、ｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖の表面疎水性を減少させ、一方同時に、ｈＢＭＰ−７変異体：ＡｃｔＲＩＩまたはｈＢＭＰ−７変異体：ＢＭＰＰＲ１ａペプチド鎖複合体形成へのいずれかの崩壊を最小化するために設計された。ｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖におけるそのような表面疎水性の減少は、これらの突然変異を含有する変異体による凝集体の形成を低下させるが、一方なお、ＡｃｔＲＩＩおよびＢＭＰＰＲ１ａ受容体タンパク質を介するｈＢＭＰ−７媒介シグナル伝達を可能にするために設計される。
【００６５】
第３に、成熟ｈＢＭＰ−７は、可溶性アンタゴニストタンパク質Ｎｏｇｇｉｎによって結合されることがある。Ｗ３４７Ｄ突然変異は、Ｎｏｇｇｉｎに結合するｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖を減少させて、ｈＢＭＰ−７媒介シグナル伝達および生物学的活性を増進するために設計された。
【００６６】
さらに、ｈＢＭＰ−７のＲ４２１、Ｎ４２２およびＲ４２６における突然変異は、得られるｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖の発現を増進するであろう。いかなる理論によっても制約されないことを願えば、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２ＤおよびＲ４２６Ｅのような突然変異は、発現されるペプチド鎖の溶解度を増大することによってｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖発現を改善すると考えられる。
【００６７】
さらに、ｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖の薬理学的性質、例えばインビボの半減期は、ペギレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）によって改良されるかもしれない。Ｓ２９３Ｃ突然変異は、この突然変異を含有するｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖の成熟形態においてアミノ末端Ｃ残基を創製するために設計される。このアミノ末端Ｃ残基は、次に、当業者にとって既知の技術によるポリエチレングリコールの共有結合によって翻訳後に修飾することができる。
【００６８】
最後に、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られる欠失およびドメイン置換突然変異体が、ｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖発現を改良するために設計されてもよい。１つのそのようなｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖突然変異体は、ｈＢＭＰ−７シグナルペプチドおよびプロドメインのみを含むが、欠失されたｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインを欠如している。その他のそのような突然変異体は、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（配列番号：３８の残基Ｍ１〜Ａ２６）を含み、これは、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチドを置換し、欠失されたｈＢＭＰ−７プロドメインを欠如し、そしてｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおいてＲ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含有する。その他の突然変異体は、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチドの代わりにヒトＢＭＰ−２（ｈＢＭＰ−２）分泌シグナルペプチドを、ネイティブｈＢＭＰ−７プロドメインの代わりにｈＢＭＰ−２プロドメインを、そしてｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおいてＲ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含む。その他の突然変異体は、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチドの代わりにｈＢＭＰ−２分泌シグナルペプチドを、ネイティブｈＢＭＰ−７プロドメインの代わりにｈＢＭＰ−２プロドメインを、そしてｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおいてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２Ｄお
よびＲ４２６Ｅ突然変異を含む。これらのｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖突然変異体は、一部、ｈＢＭＰ−７の分泌、タンパク質分解プロセシングおよび発現の改良を促進するために設計された。
【００６９】
本明細書に記述される各個々の突然変異、例えば点突然変異、欠失またはドメイン置換は、本発明のペプチド鎖を生成するために単独でもまたは組み合わせて使用されてもよい。また、本明細書に記述される突然変異は、本明細書に記述される種々の個々の突然変異に、一部、対応する改変された性質を有するさらなる変異体ＢＭＰ−７ペプチド鎖を生成するために組み合わせられてもよい。そのようなさらなる変異体ペプチド鎖をコードしている核酸は、当該技術分野において周知の、標準的インビトロもしくはインビボ方法、またはそのような方法の組み合わせ法を使用して生成されてもよい。また、本発明のペプチド鎖は、例えば、本発明のペプチド鎖のアミノ末端または他の部分へのポリエチレングリコールの付加のような１つ以上の共有結合修飾物の付加によって翻訳後に修飾されてもよい。最後に、本発明の変異体ペプチドのシグナルペプチドおよびプロドメイン配列は、機能的に等価のアミノ酸配列により置換されてもよい。本明細書に記述される点突然変異の機能的等価物は、異なるアミノ酸残基によりその部位におけるアミノ酸残基または特定の点突然変異を置換することによって生成されてもよい。そのようなさらなる変異体およびそれらをコードしている核酸もまた本発明の範囲内にある。同様に、突然変異された成熟ドメインペプチド鎖のみを含んでなる変異体ペプチド鎖およびそれらをコードしている核酸もまた本発明の範囲内である。
【００７０】
本発明の１つの態様は、配列番号：４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：４のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ突然変異を含有する。
【００７１】
本発明のその他の態様は、配列番号：６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：６のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そして△Ｓ２９３−Ｒ２９９およびＲ３１４Ｓ突然変異を含有する。
【００７２】
本発明のその他の態様は、配列番号：８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：８のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そして△Ｓ２９３−Ｍ３１４突然変異を含有する。
【００７３】
本発明のその他の態様は、配列番号：１０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：１０のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そして△Ｓ２９３−Ｍ３１５突然変異を含有する。
【００７４】
本発明のその他の態様は、配列番号：１２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：１２のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＬ４０７Ｋ突然変異を含有する。
【００７５】
本発明のその他の態様は、配列番号：１４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：１４のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＦ４０９Ｋ突然変異を含有する。
【００７６】
本発明のその他の態様は、配列番号：１６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：１６のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ
−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＬ４１７Ｒ突然変異を含有する。
【００７７】
本発明のその他の態様は、配列番号：１８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：１８のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＬ３８２Ｋ突然変異を含有する。
【００７８】
本発明のその他の態様は、配列番号：２０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：２０のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＬ３８２Ｎ突然変異を含有する。
【００７９】
本発明のその他の態様は、配列番号：２２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：２２のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＶ３８３Ｋ突然変異を含有する。
【００８０】
本発明のその他の態様は、配列番号：２４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：２４のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＩ３８６Ｒ突然変異を含有する。
【００８１】
本発明のその他の態様は、配列番号：２６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：２６のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＩ３８６Ｎ突然変異を含有する。
【００８２】
本発明のその他の態様は、配列番号：２８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：２８のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｖ３８３Ｋ、Ｌ４０７ＫおよびＦ４０９Ｋ突然変異を含有する。
【００８３】
本発明のその他の態様は、配列番号：３０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：３０のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４ＳおよびＷ３４７Ｄ突然変異を含有する。
【００８４】
本発明のその他の態様は、配列番号：３２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：３２のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２ＤおよびＲ４２６Ｅ突然変異を含有する。
【００８５】
本発明のその他の態様は、配列番号：３４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：３４のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られ、そしてＳ２９３Ｃ、Ｒ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含有する。
【００８６】
１つの実施態様では、本発明は、少なくとも１個のポリエチレングリコール分子をさらに含んでなる配列番号：３４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖
を提供する。そのようなポリエチレングリコール残基は、例えば、配列番号：３４のＣ２９３に共有結合されてもよい。Ｃ２９３は、タンパク質分解プロセシングから得られる配列番号：３４の成熟形態におけるアミノ末端残基であることが期待される。
【００８７】
本発明のその他の態様は、配列番号：３６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：３６のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られた。配列番号：３６のペプチド鎖は、ｈＢＭＰ−７シグナルペプチド（配列番号：２の残基Ｍ１〜Ａ２９）およびプロドメインのみ（配列番号：２０の残基Ｄ３０〜Ｒ２９２）を含み；ｈＢＭＰ−７成熟形態ドメイン（配列番号：２の残基Ｓ２９３〜Ｈ４３１）は欠失されている。
【００８８】
本発明のその他の態様は、配列番号：３８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：３８のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から一部得られた。配列番号：３８のペプチド鎖は、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（配列番号：３８の残基Ｍ１〜Ａ２６）を含み、ｈＢＭＰ−７プロドメインを欠如し、そしてｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおいてＲ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含有する。
【００８９】
本発明のその他の態様は、配列番号：４０において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：４０のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から一部得られた。配列番号：４０のペプチド鎖は、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチドの代わりにｈＢＭＰ−２分泌シグナルペプチドを、ネイティブｈＢＭＰ−７プロドメインの代わりにｈＢＭＰ−２プロドメインを、そしてｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおいてＲ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含む。
【００９０】
本発明のその他の態様は、配列番号：４２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：４２のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られた。配列番号：４２のペプチド鎖は、Ｈ２８７Ｒ、Ｒ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２ＤおよびＲ４２６Ｅ突然変異を含有する。
【００９１】
本発明のその他の態様は、配列番号：４４において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：４４のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から一部得られた。配列番号：４４のペプチド鎖は、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチドの代わりにｈＢＭＰ−２分泌シグナルペプチドを、ネイティブｈＢＭＰ−７プロドメインの代わりにｈＢＭＰ−２プロドメインを、そしてｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおいてＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２ＤおよびＲ４２６Ｅ突然変異を含む。
【００９２】
本発明のその他の態様は、配列番号：４６において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：４６のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られた。配列番号：４６のペプチド鎖は、Ｈ２８７Ｔ、Ｒ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含有する。
【００９３】
本発明のその他の態様は、配列番号：４８において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖である。配列番号：４８のペプチド鎖は、配列番号：２の野生型ｈＢＭＰ−７前駆体ペプチド鎖から得られた。配列番号：４８のペプチド鎖は、Ｈ２８７Ｒ、Ｒ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含有する。
【００９４】
本発明の１つの実施態様は、本発明のペプチド鎖をコードしている核酸配列を含んでなる単離核酸である。そのような核酸は、当該技術分野において周知の、標準的インビトロ
もしくはインビボ法、またはそのような方法の組み合わせ法を使用して生成されてもよい。そのような核酸は、本発明のペプチド鎖のアミノ酸をコードしている代替コドン、あるいは本発明のペプチド鎖のアミノ酸をコードしている生物体に最適化されたコドンを含んでもよい。
【００９５】
本発明のその他の態様は、配列番号：３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００９６】
本発明のその他の態様は、配列番号：５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００９７】
本発明のその他の態様は、配列番号：７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００９８】
本発明のその他の態様は、配列番号：９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【００９９】
本発明のその他の態様は、配列番号：１１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１００】
本発明のその他の態様は、配列番号：１３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０１】
本発明のその他の態様は、配列番号：１５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０２】
本発明のその他の態様は、配列番号：１７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０３】
本発明のその他の態様は、配列番号：１９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０４】
本発明のその他の態様は、配列番号：２１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０５】
本発明のその他の態様は、配列番号：２３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０６】
本発明のその他の態様は、配列番号：２５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０７】
本発明のその他の態様は、配列番号：２７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０８】
本発明のその他の態様は、配列番号：２９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１０９】
本発明のその他の態様は、配列番号：３１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１０】
本発明のその他の態様は、配列番号：３３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１１】
本発明のその他の態様は、配列番号：３５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１２】
本発明のその他の態様は、配列番号：３７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１３】
本発明のその他の態様は、配列番号：３９において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１４】
本発明のその他の態様は、配列番号：４１において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１５】
本発明のその他の態様は、配列番号：４３において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１６】
本発明のその他の態様は、配列番号：４５において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１７】
本発明のその他の態様は、配列番号：４７において示される核酸配列を含んでなる単離核酸である。
【０１１８】
本発明のその他の実施態様は、本発明のペプチド鎖を細胞に供給することを含む、ＴＧＦ−β誘導細胞増殖を抑制する方法である。本発明のペプチド鎖は、例えば、真核細胞である細胞に供給してもよい。本発明のペプチド鎖は、そのような分子を細胞に供給できるいかなる技術によっても投与することができる。ペプチド鎖は、例えば、ペプチド鎖またはそのペプチド鎖をコードしている核酸鎖を培養培地に補足することによってインビトロで細胞に与えることができる。また、ペプチド鎖は、そのペプチド鎖をコードしている核酸鎖を細胞中にトランスフェクトすることによって細胞に与えられてもよい。ペプチド鎖は、例えば、ペプチド鎖またはそのペプチド鎖をコードしている核酸を動物または組織中に静脈内注射することによってインビボで細胞に与えられてもよい。当業者は、本発明のペプチド鎖をインビトロまたはインビボで細胞に投与するための他の手段を認識できる。そのような手段はまた、以下に議論される、宿主に作用物を送達するそれらの方式を含む。
【０１１９】
本発明のその他の実施態様は、本発明の少なくとも１種の核酸を含んでなるベクターである。そのようなベクターは、本発明の核酸が細胞、動物または他の核酸複製系および発現系、例えばインビトロの転写および翻訳系中に導入されるのを可能にする。例えば、本発明のベクターは、単独でも組み合わされる場合でも、本発明の核酸が細胞または他の系中に導入されるのを可能にするトランスポゾン、プラスミド、ウイルスまたは染色体の部分を含んでもよい。広範なそのようなベクターは当業者にとっては周知である。
【０１２０】
本発明のその他の実施態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。そのような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞または古細菌（ａｒｃｈｅａｌ）細胞であってもよい。代表的な真核細胞は、哺乳類、昆虫類、鳥類または他の動物起源のものであってもよい。代表的な哺乳類真核細胞系は、ＨＥＫ−２９３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−１５７３TM）細胞系である。他の有用な細胞系は、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−６１TM）およびラット骨肉腫（ＲＯＳ）細胞、例えばＲＯＳ２７／２．８細胞由来の細胞系を含む。また哺乳類真核細胞は、ハイブリドーマのような不死化細胞系またはＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−１５８１TM）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−１６４６TM）およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−１５８０TM）マウス細胞系のような骨髄腫細胞系を含む。代表的なヒト骨髄腫細胞系はＵ２６６（ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６TM）である。
【０１２１】
本発明のその他の実施態様は、本発明の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞によって生産されたペプチド鎖を回収することを含む、ペプチド鎖を作成する方法である。当該技術分野において周知の標準細胞培養および酵素学的方法が使用されて、本発明の宿主細胞を培養し、そしてそのような宿主細胞によって生産されたペプチド鎖を回収することができる。
【０１２２】
本発明のその他の実施態様は、発現系において配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：４２において示されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド鎖を発現させ、そしてそのペプチド鎖が、ペプチド鎖を受けなかったネガティブ対照ＲＯＳ１７／２．８細胞に比較してＲＯＳ１７／２．８細胞においてアルカリホスファターゼ活性を増大することができるか、あるいはペプチド鎖を受けなかったネガティブ対照ＶＥＰＴ細胞に比較して生存可能なＶＥＰＴ細胞の数を増加することができるペプチド鎖を回収することを含む、ペプチド鎖を作成する方法である。本発明の方法において有用な発現系は、例えば、インビトロで共役された転写および翻訳系、あるいは細胞または他の発現系、例えば動物または植物であってもよい。
【０１２３】
ｈＢＭＰ−７成熟形態物活性は、無処置の対照ＲＯＳ１７／２．８細胞に比較して、ｈＢＭＰ−７の成熟形態物により処置されたラット骨肉腫１７／２．８（ＲＯＳ１７／２．８）細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の増大についてアッセイすることによって決定できる。ＲＯＳ１７／２．８細胞においてアルカリホスファターゼ活性を増大することができるペプチド鎖は、ｈＢＭＰ−７活性を有する。ＲＯＳ１７／２．８細胞を使用するアルカリホスファターゼに基づくｈＢＭＰ−７アッセイは、当該技術分野において周知の標準細胞培養および酵素学的方法、例えば、Ｍａｌｉａｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．１１２（３）：２２７−２３４（１９９４）によって記述される方法を使用して実施することができる。
【０１２４】
また、ｈＢＭＰ−７成熟形態物活性は、無処置のネガティブ対照ＶＥＰＴ細胞に比較して、ｈＢＭＰ−７の成熟形態物により処置された後の生存可能なＶＥＰＴ細胞数の増加についてアッセイすることによって検出することができる。集団において生存可能なＶＥＰＴ細胞の数を増加できるペプチド鎖は、ｈＢＭＰ−７活性を有する。ＲＯＳ１７／２．８細胞を使用する細胞生存率に基づくｈＢＭＰ−７アッセイは、当該技術分野において周知の標準細胞培養および酵素学的方法を使用して実施することができる。当業者は、また、ｈＢＭＰ−７活性のそのようなアッセイが、本発明の組成物および方法の生物学的活性および効果を確認するために使用されてもよいことを認識できる。
【０１２５】
また、当業者は、前記ｈＢＭＰ−７活性についてのアッセイが使用されて、本発明の組成物および方法の生物学的活性および効果がまた確認されてもよいことを認識できる。
【０１２６】
本発明のその他の実施態様は、ｈＢＭＰ−７応答性症状を有する動物を同定し；そして
その病理学的症状を弱めるのに十分な量において、本発明のペプチド鎖を動物に投与する；段階を含む処置の方法である。ｈＢＭＰ−７活性応答性病理学的症状の例は、例えば、骨髄線維症、特発性肺線維症、腎性骨形成異常、糖尿病性腎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および変形性関節症を含む。
【０１２７】
本発明の処置の方法は、いかなる分類に属する動物患者をも処置するために使用されてもよい。そのような動物の例は、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコおよび農場動物のような哺乳類、ならびに鳥類、爬虫類および魚類のような他の動物類を含む。
【０１２８】
本発明のペプチド鎖の治療学的使用のための投与方式は、ペプチド鎖を宿主に送達するいかなる適当な経路であってもよい。本発明のペプチド鎖および核酸鎖は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、皮内、静脈内または鼻内投与のために特に有用である。
【０１２９】
本発明のペプチド鎖および核酸は、製薬学的に許容できる担体中の有効成分としてペプチド鎖または核酸の有効量を含有する製薬学的組成物として製造されてもよい。ペプチド鎖または核酸を、好ましくは生理学的ｐＨにおいて緩衝化されて、注射のための即時使用形態物中に含有する水性懸濁剤または液剤が好適である。非経口投与のための組成物は、通常には、製薬学的に許容できる担体、好ましくは水性担体中に溶解された本発明のアンタゴニストまたはその混合物の溶液を含むであろう。種々の水性担体、例えば、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどが用いられてもよい。これらの液剤は無菌であり、一般に、特定の物質を含有しない。これらの液剤は、慣用の、周知の無菌化技術（例えば、濾過）によって無菌化されてもよい。組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝剤などのような生理学的状態に近づけるために要求される製薬学的に許容できる補助物質を含有してもよい。そのような製薬学的調合物における本発明のペプチド鎖または核酸鎖の濃度は、すなわち、重量で約０．５％未満、通常は約１％または少なくとも約１％から１５または２０％位の多くまで広く変えることができ、そして主として、選ばれる特定の投与方式にしたがって、流体容量、粘度などに基づいて選択できる。
【０１３０】
かくして、筋肉内注射のための製薬学的組成物は、１ｍｌの無菌緩衝水、および本発明のペプチド鎖または核酸の約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇを含有するように製造されてもよい。同様に、静脈内注入のための本発明の製薬学的組成物は、無菌リンゲル液の約２５０ｍｌ、および本発明のアンタゴニストの約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇを含有するように作成されてもよい。非経口的に投与される組成物を製造する実際の方法は周知であり、そして例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｇ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ”，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいてより詳細に記述されている。
【０１３１】
本発明のペプチド鎖および核酸は、製薬学的調製物中では、単位用量形態物において存在してもよい。適当な治療学的に有効な用量は当業者によって容易に決定することができる。決定された用量は、必要であれば、処置期間中医者によって適当であると選ばれた適当な時間隔で反復されてもよい。
【０１３２】
本発明のペプチド鎖または核酸は貯蔵のために凍結乾燥され、そして使用前に適当な担体において再構成されてもよい。この技術は、慣用のタンパク質および免役グロブリン調製物について有効であることが分かっており、そして技術的に既知の凍結乾燥および再構成技術が用いられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】野生型ｈＢＭＰ−７前駆体体アミノ酸配列およびｈＢＭＰ−７アミノ酸配列の特徴マップを示す。下線をされた太いテキストは成熟ｈＢＭＰ−７のアミノ末端を指す。
【図２】サンドイッチ型ＥＬＩＳＡによってアッセイされるように、ｐ３１０４、ｐ３１０５、ｐ３１０６、ｐ３１０７およびｐ３１０８によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体の発現を示す。
【図３】サンドイッチ型ＥＬＩＳＡによってアッセイされるように、ｐ３３４１、ｐ３３９２、ｐ３２６８およびｐ３４７０によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体の発現を示す。
【図４】ＲＯＳ１７／２．８骨肉腫細胞に基づくアッセイ系におけるｈＢＭＰ−７変異体３３９２（配列番号：４２）の生物学的活性を示す。
【図５】ＶＥＰＴ腎細胞増殖に基づくアッセイ系におけるｈＢＭＰ−７変異体３３９２（配列番号：４２）の生物学的活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３４】
本発明は、ここに、次に示す特定の、限定されるものではない実施例を引用して記述することができる。
【実施例１】
【０１３５】
プラスミドＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされた哺乳動物ＨＥＫ−２９３細胞におけるｈＢＭＰ−７変異体の発現
ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質は、各変異体のヘキサヒスチジン・タグ形態物をコードしているプラスミドＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされた哺乳動物ＨＥＫ−２９３細胞において組み換え技術を用いて発現された（図２）。ＨＥＫ−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が、標準培養条件および方法を使用して拡大された。細胞は、標準トランスフェクション法を使用してｐ３１０５、ｐ３１０６、ｐ３１０７およびｐ３１０８により一過性にトランスフェクトされた。またＨＥＫ−２９３細胞は、対照としてｐ３１０４により一過性にトランスフェクトされた。
【０１３６】
ｐ３１０４対照ベクターは、野生型ｈＢＭＰ−７前駆体タンパク質（配列番号：２）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：１）を含有する。ｐ３１０５ベクターは、Ｒ２９９Ｓ／Ｒ３１４Ｓ  ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：４）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：３）を含有する。ｐ３１０６ベクターは、△Ｓ２９３−Ｒ２９９／Ｒ３１４Ｓ  ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：６）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：５）を含有する。ｐ３１０７ベクターは、△Ｓ２９３−Ｒ３１４  ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：８）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：７）を含有する。ｐ３１０８ベクターは、△Ｓ２９３−Ｍ３１５  ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：１０）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：９）を含有する。これらのベクターの各々では、野生型または変異体ｈＢＭＰ−７ｃＤＮＡが、ヘキサヒスチジン・タグをコードしているｃＤＮＡに対してその３’末端において枠内に融合される。その結果、これらのベクターによって発現されるタンパク質は、それらのカルボキシ末端においてすべてヘキサヒスチジン・タグを付加される。
【０１３７】
細胞培養上澄液がトランスフェクション後に回収され、そしてヘキサヒスチジン・タグ付加タンパク質が、ＴａｌｏｎTM固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して上澄液から精製された。ＴａｌｏｎTM樹脂を使用するヘキサヒスチジン精製および上澄液の調製は、製造者によって指示されたように実施された。次に、ｈＢＭＰ−７に特異的な標準サンドイッチ型ＥＬＩＳＡが、得られるサンプルに関して実施された（図２）。この型のＥＬＩＳＡは、すべての細胞タイプ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１）によるｈＢＭＰ−７変異体の発現を確認するために使用することができる。また、ポジティブ対照ＥＬＩＳＡが精製された野生型ｈＢＭＰ−７サンプルに関して実施された。アッセイデータは、相対光単位（Ｒｅ
ｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）  マイナス  バックグラウンド発光（図２；Ｙ軸）  対  ＴａｌｏｎTM樹脂精製タンパク質の濃度（図２；Ｘ軸）において表される。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡデータは、全ｈＢＭＰ−７変異体が、一過性にトランスフェクトされたベクターＤＮＡから哺乳動物ＨＥＫ−２９３細胞において発現されたことを示している。標準的方法を使用するＮ末端配列決定分析は、Ｓ２９３が、ｐ３１０４から配列番号：２のインビボ発現によって生産されたｈＢＭＰ−７のタンパク質分解的にプロセスされた成熟形態物のアミノ末端を形成することを例証した。重要なことには、Ｓ２９３は、また、ｐ３１０５から配列番号：４のインビボ発現によって生産されたｈＢＭＰ−７のタンパク質分解的にプロセスされた形態物のアミノ末端を形成することが見出された。
【実施例２】
【０１３９】
プラスミドＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされた哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるｈＢＭＰ−７変異体の発現
ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質は、各変異体をコードしているプラスミドＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされた哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞において組み換え技術を用いて発現された（図１）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ）Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−９６１８TM）が、標準培養条件および方法を使用して拡大された。細胞は、標準トランスフェクション法を使用してｐ３３４１、ｐ３３９２、ｐ３２６８、またはｐ３４７０およびｐ３１９９により一過性にトランスフェクトされた。またＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ｈＢＭＰ−７変異体をコードしているｃＤＮＡインサートを欠如したｐＥＭＰＴＹネガティブ対照ベクターにより一過性にトランスフェクトされた。
【０１４０】
ｐ３３４１ポジティブ対照ベクターは、野生型ｈＢＭＰ−７前駆体タンパク質（配列番号：２）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：１）を含有する。ｐ３３９２ベクターは、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチド、Ｈ２８７Ｒ突然変異を含むｈＢＭＰ−７プロドメイン、およびｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおけるＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２ＤおよびＲ４２６Ｅ突然変異を含む、ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：４２）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：４１）を含有する。ｐ３２６８ベクターは、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチドの代わりにｈＢＭＰ−２分泌シグナルペプチド、ネイティブｈＢＭＰ−７プロドメインの代わりにｈＢＭＰ−２プロドメイン、およびｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおけるＲ２９９ＳおよびＲ３１４Ｓ突然変異を含む、ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：４０）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：３９）を含有する。ｐ３４７０ベクターは、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチドの代わりにｈＢＭＰ−２分泌シグナルペプチド、ネイティブｈＢＭＰ−７プロドメインの代わりにｈＢＭＰ−２プロドメイン、およびｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおけるＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２ＤおよびＲ４２６Ｅ突然変異を含む、ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：４４）をコードしているｃＤＮＡ（配列番号：４３）を含有する。ｐ３１９９ベクターは、対合された二塩基性アミノ酸切断プロテアーゼ酵素（ＰＡＣＥ）フリン（ｆｕｒｉｎ）をコードしていて、そして構成的に発現する。フリンは、ｈＢＭＰ−７前駆体タンパク質からｈＢＭＰ−７の成熟形態物を生産するために必要とされるタンパク質分解的プロセシング事象のために要求されるプロテアーゼである。ｐ３１９９は、ｐ３３４１、ｐ３３９２、ｐ３２６８またはｐ３４７０によってコードされているｈＢＭＰ−７変異体をコードしているベクターとともに一過性に同時トランスフェクトされて、成熟の、タンパク質分解的にプロセスされたｈＢＭＰ−７変異体タンパク質の発現を可能にした。
【０１４１】
細胞培養上澄液がトランスフェクション後に回収され、そしてｈＢＭＰ−７変異体タンパク質が、標準イムノアフィニティークロマトグラフィー法を使用して上澄液から精製さ
れた。ｈＢＭＰ−７の成熟形態物（配列番号：２の残基２９３〜４３１）を特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ  １Ｂ１２）は不溶性樹脂に複合され、そして得られるｍＡｂ複合樹脂が使用されて、標準方法を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーが実施された。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は臭化シアン（ＣＮＢｒ）によって活性化され、そして抗ＢＭＰ−７ｍＡｂ（１Ｂ１２）が反応性アミン基を介して樹脂に結合された。次いで、上澄液サンプルがクロマトグラフィーカラム上に負荷され、そして１００ｍＭグリシンを含有するｐＨ２．５におけるバッファー（酸溶出）か、または以下の図の１つでは「中性溶出」とも呼ばれる、「ｇｅｎｔｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから発売）のいずれかによって溶出された。
【０１４２】
次に、ｈＢＭＰ−７に特異的な標準サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ
ＤＢＰ７００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）が、得られるサンプルにおいて製造者の指示にしたがって実施された（図３）。また、ポジティブ対照ＥＬＩＳＡが精製された野生型ｈＢＭＰ−７サンプルに関して実施されて、校正曲線を作成した（データ未掲載）。アッセイデータは、細胞培養上澄液１ｍｌ当たりのＢＭＰ−７のｎｇで表された（図３；Ｙ軸）。
【実施例３】
【０１４３】
ｐ３３９２プラスミドＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされた哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるｈＢＭＰ−７変異体３３９２の発現
ｐ３３９２によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体ペプチド鎖は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において比較的高レベルで発現され（図３）、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に基づき適当にプロセスされていた。ｐ３３９２によってコードされたペプチド鎖は、ネイティブｈＢＭＰ−７分泌シグナルペプチド、Ｈ２８７Ｒ突然変異を含むｈＢＭＰ−７プロドメイン、およびｈＢＭＰ−７成熟形態ドメインにおけるＲ２９９Ｓ、Ｒ３１４Ｓ、Ｒ４２１Ｅ、Ｎ４２２ＤおよびＲ４２６Ｅ突然変異を含む、ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：４２）である。
【０１４４】
ｐ３３９２によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体ペプチド（配列番号：４２）は、標準トランスフェクションおよび細胞培養技術を使用してｐ３３９２によるＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションによって発現された。細胞培養上澄液は前記実施例２に記述されたように調製された。ｐ３３９２によって発現されたｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：４２）は、次に、前記実施例２に記述されたようにイムノアフィニティークロマトグラフィーによってイムノアフィニティー精製された。上澄液サンプルがクロマトグラフィーカラム上に負荷され、そして１００ｍＭグリシンバッファーｐＨ２．５−酸溶出か、または「ｇｅｎｔｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）−中性溶出を用いて溶出された。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析が、イムノアフィニティー精製されたｐ３３９２によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体（配列番号：４２）において実施された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、非還元および還元サンプルにおいて標準法を用いて実施され、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ−ｂｌｕｅ染色により可視的に分離されたタンパク質バンドを得た。ウエスタンブロット分析もまた、標準法を用いて非還元および還元サンプルにおいて標準法を使用して実施された。前記実施例２に記述されたｈＢＭＰ−７特異的ｍＡｂが使用されて、ブロットにおけるｐ３３９２によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体が検出された。
【０１４５】
ｐ３３９２によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体の非還元および還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、このｈＢＭＰ−７変異体が発現された
ことを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、さらに、完全にプロセスされた１５ｋＤａと１７ｋＤａの成熟形態物  ｐ３３９２によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体タンパク質（配列番号：４２）およびこのｈＢＭＰ−７変異体のプロセスされなかった形態物に対応する４８ｋＤａの形態物を示した。１５ｋＤａと１７ｋＤａの成熟形態物は、グリコシル化のような分別翻訳後修飾の生成物であると考えられる。
【０１４６】
重要なことは、ｐ３３９２によってコードされたｈＢＭＰ−７変異体ペプチド（配列番号：４２）は比較的高レベルで発現され（図３）、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に基づき適当にプロセスされていた。この特定のｈＢＭＰ−７変異体タンパク質が、次いで、さらなる生物学的活性アッセイ分析のために選択された。
【実施例４】
【０１４７】
骨肉腫細胞に基づくアッセイ系におけるｈＢＭＰ−７変異体３３９２の生物学的活性
ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２（配列番号：４２）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において組み換え技術により発現され、そして骨肉腫細胞に基づくアッセイ系においてアッセイされた場合、生物学的に活性である（図４）。また、この変異体タンパク質は、同一濃度で与えられた野生型ｈＢＭＰ−７の活性に匹敵する生物学的活性を有する（図４）。
【０１４８】
ｈＢＭＰ−７成熟形態物の生物学的活性が、ラット骨肉腫１７／２．８細胞のアルカリホスファターゼ誘導アッセイを使用してアッセイされた。ＲＯＳ１７／２．８細胞は、骨形成によって骨の形成を惹起することができ、そしてアルカリホスファターゼ活性の増大が骨形成の誘導の証明である。
【０１４９】
ＲＯＳ１７／２．８細胞が、９６穴プレートにおいて１ウエル当たり３０，０００細胞の濃度で接種され、そして標準方法を用いて一夜培養された。次いで、組み換え精製成熟形態のｈＢＭＰ−７が、ポジティブ対照として細胞に提供された。また、細胞は、酸性バッファーまたは中性バッファーによりイムノアフィニティーカラムから溶出された組み換え技術により発現されたｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２を提供された。ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において組み換え技術により発現され、そして前記（実施例３）のようにイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ｈＢＭＰ−７タンパク質は、図４に指示される最終濃度を生じるのに十分な量において細胞に提供された。細胞は、次いで、２日間培養され、そして細胞溶解液が調製された。溶解液は標準方法を使用してアルカリホスファターゼ活性についてアッセイされた。
【０１５０】
これらの結果は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において組み換え技術により発現されたｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２が、生物学的に活性であり、そしてこの変異体タンパク質が、同一濃度で提供された野生型ｈＢＭＰ−７の活性に匹敵する生物学的活性を有する（図４）ことを例証している。また、これらの結果は、ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２（配列番号：４２）が、骨形成をとおして骨の形成を誘導する能力を有し、そして骨の形成を誘導することが望まれる症状の処置において利用性を有するであろうことを示している。図４における誤差バーは、平均＋／−標準誤差を表す。
【実施例５】
【０１５１】
腎細胞増殖に基づくアッセイ系におけるｈＢＭＰ−７変異体３３９２の生物学的活性
ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２（配列番号：４２）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において組み換え技術により発現され、そして腎細胞増殖に基づくアッセイ系においてアッセイされた場合、生物学的に活性である（図４）。また、この変異体タンパク質は、同一濃度で与えられた野生型ｈＢＭＰ−７の活性に匹敵する生物学的活性を有する（図４）。
【０１５２】
ｈＢＭＰ−７成熟形態物の生物学的活性が、ＶＥＰＴ細胞増殖アッセイを使用してアッセイされた。ＶＥＰＴ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０８７）は、ウサギ腎近位の管状上皮由来の不死化細胞系である。生物学的に活性なｈＢＭＰ−７は、ＶＥＰＴ細胞の増殖を誘導する。重要なことは、ｈＢＭＰ−７は、腎上皮細胞の増殖を維持し、そして腎における細胞外基質（ＥＣＭ）の蓄積に拮抗することができる抗線維症剤であることが報告された。腎組織における細胞外基質（ＥＣＭ）の過剰な蓄積は、実にあらゆる種類の慢性腎疾患（例えば、腎線維症）に関係している。
【０１５３】
ＶＥＰＴ細胞が、９６穴プレートにおいて１ウエル当たり２５００細胞の濃度で接種され、そして標準方法を用いて一夜培養された。次いで、組み換え精製成熟形態のｈＢＭＰ−７が、ポジティブ対照として細胞に提供された。また、細胞は、酸性バッファーまたは中性バッファーによりイムノアフィニティーカラムから溶出された組み換え技術により発現されたｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２を提供された。ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において組み換え技術により発現され、そして前記（実施例３）のようにイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。ｈＢＭＰ−７タンパク質は、図５に指示される最終濃度を生じるのに十分な量において細胞に提供された。細胞は、次いで、４日間培養され、そしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が使用されて、製造者の指示のように増殖細胞が検出された。
【０１５４】
これらの結果は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において組み換え技術により発現されたｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２が、生物学的に活性であり、そしてこの変異体タンパク質が、同一濃度で提供された野生型ｈＢＭＰ−７の活性に匹敵する生物学的活性を有する（図５）ことを例証している。また、これらの結果は、ｈＢＭＰ−７変異体タンパク質３３９２（配列番号：４２）が、腎細胞増殖を誘導し、ＥＣＭ形成に拮抗する能力を有し、そしてまた過剰なＥＣＭ蓄積に関連する腎疾患症状の処置において利用性を有するであろうことを示している。図５における誤差バーは、平均＋／−標準誤差を表す。
【０１５５】
本発明は、ここに、完全に記述されたが、多くの変更および修飾が、付随する請求項の精神または範囲から逸脱することなく、それに対して作成できることは、当業者にとって明らかであろう。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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