(57)【要約】  本発明は、離乳子豚又は雌豚に、有効量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの単回用量を投与することにより、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する、新規なブタワクチン接種方法を提供する。マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンは、全細胞若しくは部分細胞型の不活化若しくは修飾された生製剤、サブユニットワクチン、又は核酸若しくはＤＮＡワクチンであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する安全な防御免疫応答を誘発する方法であって、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ及びアジュバントを含むワクチンの単回用量を、液体ジェット無針注入器でブタに投与することを含む方法。
【請求項２】
アジュバントがＴＳ６アジュバントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブタが離乳ピグレットである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ブタが離乳ピグレットである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ブタが離乳ピグレットである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
離乳ピグレットが約１１〜約２４日齢である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
離乳ピグレットが約１１〜約２４日齢である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
離乳ピグレットが約２〜３週齢である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
離乳ピグレットが約２〜３週齢である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ブタがソウである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
無針注入器がDERMA-VAC NF注入器である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ブタに前記ワクチンの投与を実施し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する安全な防御免疫応答を誘発するように作動可能に組み立てられた、液体ジェット無針注入器と、マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンを含有する少なくとも１つのワクチンバイアルとを含むワクチン接種キット又はセット。
【請求項１３】
アジュバントがＴＳ６アジュバントである、請求項１２に記載のワクチン接種キット又はセット。
【請求項１４】
無針注入器がDERMA-VAC NF注入器である、請求項１２に記載のワクチン接種キット又はセット。
【請求項１５】
無針注入器がDERMA-VAC NF注入器である、請求項１３に記載のワクチン接種キット又はセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年３月３日に出願した米国特許仮出願第６０／７７８９８７号明細書の利益を主張する。
【０００２】
参照するのは、２００４年７月２６日に出願の米国特許出願第１０／８９９１８１号明細書、１９９９年１月１５日に出願の米国特許出願第０９／２３２２７９号明細書であり、現在は２００２年４月２３日に発行の米国特許第６３７６４７３号明細書、１９９９年１月１５日に出願の米国特許出願第０９／２３２４６９号明細書であり、現在は２００２年９月１７日に発行の米国特許第６４５１７７０号明細書、１９９９年１月１５日に出願の米国特許出願第０９／２３２４７７号明細書であり、現在は２００１年５月８日に発行の米国特許第６２２８８４６号明細書、１９９９年１月１５日に出願の米国特許出願第０９／２３２４７８号明細書であり、現在は２００１年３月２７日に発行の米国特許第６２０７１６６号明細書、１９９９年１月１５日に出願の米国特許出願第０９／２３２４７９号明細書であり、現在は２００１年４月２４日に発行の米国特許第６２２１３６２号明細書、１９９９年７月１日に出願の米国特許出願第０９／３４７５９４号明細書であり、現在は２００１年４月１７日に発行の米国特許第６２１７８８３号明細書、２０００年５月３１日に出願の米国特許出願第０９／５８３３５０号明細書であり、現在は２００３年２月１１日に発行の米国特許第６５１７８４３号明細書、２０００年７月１４日に出願の米国特許出願第０９／６１６７８１号明細書、現在は２００３年３月１８日に発行の米国特許第６５３４０６６号明細書、２０００年１０月６日に出願の米国特許出願第０９／６８０２２８号明細書、２００１年２月１６日に出願の米国特許出願第０９／７８４９６２号明細書、２００１年２月１６日に出願の米国特許出願第０９／７８４９８２号明細書であり、現在は２００３年７月１日に発行の米国特許第６５８６４１２号明細書、２００１年２月１６日に出願の米国特許出願第０９／７８４９９０号明細書であり、現在は２００２年１０月１５日に発行の米国特許第６４６４９８４号明細書、２００１年２月１６日に出願の米国特許出願第０９／７８５０５５号明細書であり、現在は２００３年５月６日に発行の米国特許第６５５８６７４号明細書、２００２年２月１５日に出願の米国特許出願第１０／０７７４８９号明細書であり、現在は２００４年１０月１２日に発行の米国特許第６８０３３６１号明細書、２００２年２月２８日に出願の米国特許出願第１０／０８５５１９号明細書であり、現在は２００４年１１月１６日に発行の米国特許第６８１８６２８号明細書、２００２年８月２日に出願の米国特許出願第１０／２１１５０２号明細書、２００２年８月２８日に出願の米国特許出願第１０／２２９４１２号明細書、２００２年９月１０日に出願の米国特許出願第１０／２３８１１４号明細書、２００３年２月１８日に出願の米国特許出願第１０／３６８８６１号明細書、２００３年３月１８日に出願の米国特許出願第１０／３９１４９８号明細書、２００３年４月４日に出願の米国特許出願第１０／４０６６８６号明細書、２００３年１２月８日に出願の米国特許出願第１０／７３０２０６号明細書であり、現在は２００５年６月２１日に発行の米国特許第６９０８６２０号明細書、２００４年５月３日に出願の米国特許出願第１０／８３８１２２号明細書、２００４年１１月８日に出願の米国特許出願第１０／９８３９２８号明細書、２００５年１月１９日に出願の米国特許出願第１１０３８６８２号明細書、２００５年３月１４日に出願の米国特許出願第１１／０７９５５９号明細書、２００５年４月１５日に出願の米国特許出願第１１／１０６７８０号明細書であり、現在は２００６年２月１４日に発行の米国特許第６９９８１２７号明細書、２００５年６月２０日に出願の米国特許出願第１１／１５６８２９号明細書、２００５年７月１９日に出願の米国特許出願第１１／１８４２３６号明細書、２００５年８月３日に出願の米国特許出願第１１／１９６７２２号明細書、２００５年９月２５日に出願の米国特許出願第１１／２１１９８３号明細書、２００６年２月６日に出願の米国特許出願第１１／３４８０８４号明細書、１９９９年８月３１日に出願の米国特許出願第６０／１５１５６４号明細書、２００１年９月１２日に出願の米国特許出願第６０／３１８，６８６号明細書、２００２年３月２０日に出願の米国特許出願第６０／３６６０１４号明細書、２００２年４月５日に出願の米国特許出願第６０／３７０２８２号明細書、２００２年１２月９日に出願の米国特許出願第６０／４３２２９８号明細書、２００３年７月２４日に出願の米国特許出願第６０／４９０３４５号明細書、２００３年１１月１３日に出願の米国特許出願第６０／５１９５７１号明細書、２００４年３月１２日に出願の米国特許出願第６０／５２２６３６号明細書、２００４年６月４日に出願の米国特許出願第６０／５７６７７１号明細書、２００４年６月１５日に出願の米国特許出願第６０／５８１６８９号明細書、２００４年６月２１日に出願の米国特許出願第６０／５８１６９８号明細書、２００４年１１月１５日に出願の米国特許出願第６０／６２７８７８号明細書、２００５年３月１７日に出願の米国特許出願第６０／６６２６４６号明細書、及び２００５年１１月１４日に出願の米国特許出願第６０／７３６４５２号明細書である。
【０００３】
前述の出願、及びそこで又は審査中に引用された全ての文書（出願引用文書（「aplln cited document」））及び出願引用文書中に引用又は参照された全ての文書、及び本明細書中に引用又は参照された全ての文書（本明細書引用文書（「herein cited document」））、及び本明細書引用文書中に引用又は参照された全ての文書は、本明細書中で、又は参照により本明細書に組み込まれた任意の文書中で言及された任意の製品の、任意の製造元使用説明書、解説書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、それによって参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施に使用することができる。
【０００４】
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチン及びその投与方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae）は、地方病性肺炎の原因であり、養豚業界では依然として重要な病原体である。この小型で複雑な生物は、気道の繊毛細胞にコロニーを形成し、結果として免疫系にほとんど暴露しない。一般に若齢のブタに観察される肺病変は、上皮細胞の過形成と、血管周囲及び細気管支周囲での単核細胞の集積増加とによって特徴付けられる。ブタでは、Ｍ．ハイオニューモニエ感染に続いて、免疫反応が観察され、耐性が誘導される（例えば、Thacker, Anim Health Res Rev. 2004 Dec;5(2):317-20及びKobisch & Friis, Rev Sci Tech. 1996 Dec;15(4):1569-605に総説がある）。臨床症状及び病変の発生は、Ｍ．ハイオニューモニエの病原体能力及び肺の防御反応の結果である。肺炎と経済の関連性は、Ｍ．ハイオニューモニエの初期感染に引き続いてよく発生する２次感染により、大きく影響される。個々のブタ及び群の肺炎診断には、様々な検査が利用可能である。地方病性肺炎は多因子性疾患であるため、治療及び管理は単純ではない（例えば、Maes et al., Vet Q. 1996 Sep;18(3):104-9に概説）。
【０００６】
Ｍ．ハイオニューモニエは、幾つかの呼吸器病原体を含む多因子性呼吸器症候群であるブタ呼吸器病症候群（ＰＲＤＣ、porcine respiratory disease complex）とも関連している。ＰＲＤＣの臨床的徴候があるブタから最も一般的に単離される病原体は、免疫系の細胞に感染するか、又は著しい免疫病理を誘導するかのいずれかである。したがって、ＰＲＤＣに関連する最も一般的な病原体の２つである、ＰＲＲＳＶ及びＭ．ハイオニューモニエは、呼吸器免疫系がそれら２つの病原体の存在及び他の病原体の存在に応答する能力を変化させる。これら２つの一般的な病原体は、呼吸器免疫系を変化させることにより、ＰＲＤＣと関連する他の多数の病原体への感受性を増加させる（例えば、Thacker, Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2001 Nov;17(3):551-65に総説がある）。
【０００７】
Ｍ．ハイオニューモニエに対する公知のワクチンの大多数は、アジュバントを使用したＭ．ハイオニューモニエの不活化全細胞製剤に基づいている。市販品には、RESPIFEND（Fort Dodge社製、American Home Products社製）、HYORESP（Merial Ltd社製）、M+PAC（Schering Plough社製）、PROSYSTEM M（Intervet社製）、INGLEVAC M（Boehringer社製）、RESPISURE（Pfizer Inc.社製）、及びSTELLAMUNE MYCOPLASMA（Pfizer Inc.社製）が含まれる。国際公開第０３／００３９４１号パンフレットは、注射針で投与される組成物に関する。
【特許文献１】国際公開第０３／００３９４１号パンフレット
【非特許文献１】Thacker, Anim Health Res Rev. 2004 Dec;5(2):317-20
【非特許文献２】Kobisch & Friis, Rev Sci Tech. 1996 Dec;15(4):1569-605
【非特許文献３】Maes et al., Vet Q. 1996 Sep;18(3):104-9
【非特許文献４】Thacker, Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2001 Nov;17(3):551-65
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多数の動物に投与が容易で、対費用効果が高く、単回用量による処置が有効である、有効なＭ．ハイオニューモニエワクチンが依然として必要とされている。マイコプラズマ病など、幾つかのブタ感染性疾患が過去数年間に渡って流行したことにより、ワクチン及び付随するワクチン接種スケジュールの開発が必要となった。これらのスケジュールには、成熟する前のブタに対するワクチン接種（これはロジスティックな困難性を提示する、すなわちワクチン接種するブタの数が多い）が含まれ、針による注射を介するワクチン接種は、動物を保持したままか（これは多大な労力を要する）、又は動物を保持せずになされるか（接種の投与有効性に関する確実性が妨げられる）のいずれかである。そのようなワクチンは、多回用量の必要性を排除し、それによって、世界中の膨大な養豚群のワクチン接種に関連する費用及び労力は著しく減少しよう。
【０００９】
本出願中の任意の文書の引用又は特定は、そのような文書が従来技術として本発明に利用可能であることの承認ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの感染により引き起こされる、動物の、有利にはブタの疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、動物に、有利にはブタに、単回用量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの有効量を投与することを含み得る。
【００１１】
Ｍ．ハイオニューモニエワクチンは、全細胞又は部分細胞製剤、例えば、バクテリン又は修飾された生製剤、サブユニットワクチン、例えば、１つ若しくは複数のＭ．ハイオニューモニエ由来のポリペプチド若しくはタンパク質、そのようなポリペプチド若しくはタンパク質の免疫原性断片、又はそのようなタンパク質、ポリペプチド若しくは免疫原性断片をコードする１つ若しくは複数のＭ．ハイオニューモニエ遺伝子が含まれていてもよいサブユニットワクチンを含み得る。有利には、Ｍ．ハイオニューモニエワクチンは、不活化ワクチンである。別の有利な実施形態では、Ｍ．ハイオニューモニエワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。
【００１２】
別の本発明は、液体ジェット無針注入器を使用して、動物に、有利にはブタに、有効量のＭ．ハイオニューモニエワクチンを投与するステップを含むことができる、Ｍ．ハイオニューモニエに対するワクチン接種方法であり、投与によって、Ｍ．ハイオニューモニエに対する安全な防御免疫応答が誘発される。別の目的は、動物に、有利にはブタにワクチンの投与を実施し、Ｍ．ハイオニューモニエに対する安全な防御免疫応答を誘発するように作動可能に組み立てられた、そのような液体ジェット無針注入器と、Ｍ．ハイオニューモニエワクチンを含有する少なくとも１つのワクチンバイアルとを含むことができるワクチン接種キット又はセットである。
【００１３】
指摘しておくが、本開示において及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（comprises）」、「含まれた（comprised）」、「含んでいる（comprising）」などの用語は、米国特許法でそれに帰された意味を有していてもよく、例えば、それらは、「含む（includes）」、「含まれた（included）」、「含んでいる（including）」などを意味してもよく；「から本質的になっている（consisting essentially of）」及び「から本質的になる（consists essentially of）」などの用語は、米国特許法でそれらに帰された意味を有し、例えば、明示的に列挙されていない要素を許容するが、従来技術に見られる要素、又は本発明の基礎的又は新規な特徴に影響を与える要素は除外する。
【００１４】
これらの及び他の実施形態は、以下の詳細な説明で開示され又は明白であり、以下の詳細な説明により包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの感染により引き起こされる、動物の、有利にはブタの疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、動物に、有利にはブタに、単回用量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの有効量を投与することを含むことができる。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「動物」という用語には、ヒトを含む全ての脊椎動物が含まれる。この用語には、胚期及び胎生期を含む全ての発育段階にある個々の動物も含まれる。特に、「脊椎動物」という用語には、それらに限定されないが、鳥類だけでなく、ヒト、イヌ科の動物（例えば、イヌ）、ネコ科の動物（例えば、ネコ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ウシ亜科の動物（例えば、ウシ）、ブタの類（例えば、ブタ）が含まれる。「鳥類」という用語は、本明細書中で使用される場合、それらに限定されないが、ニワトリ（ブリーダー、ブロイラー及びレイヤー）、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、及びダチョウ、エミュー、及びヒクイドリを含む走鳥類などの、分類学的鳥網の任意の種又は亜種を指す。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「ブタ」という用語は、ブタ由来の動物を指す。「ボア（boar）」という用語は、雄親になることが予定された６カ月齢を超えた雄ブタ全体を指す。「ギルト（gilt）」という用語は、最初の分娩まで、最初の同腹仔を出産していない若齢の雌ブタを指す。「ホッグ（hog）」という用語は、去勢された雄ブタを指す。「ピグレット（piglet）」という用語は、若齢のブタを指す。「ポーカ（porker）」という用語は、良質の豚肉片用に飼育されたブタの品種を指す。「ストア（store）」という用語は、約１０〜１２週齢であり得るブタを指す。「ソウ（sow）」という用語は、生殖齢で生殖能力のある雌、又は最初の同腹仔を出産した後の雌ブタを指す。「離乳ピグレット」又は「離乳仔」という用語は、約１１〜約２４日齢、約２〜３週齢、約３〜５週齢、又は約５〜８週齢であり得る若齢のブタを指す。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「毒性体」という用語は、動物宿主に感染する能力を維持する分離株を意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「不活化ワクチン」という用語は、もはや複製又は増殖できない感染性の生物又は病原体を含有するワクチン組成物を意味する。病原体は、由来が細菌性、ウイルス性、原生動物性、又は真菌性であってもよい。不活化は、冷凍解凍、化学処理（例えば、チメロサール又はホルマリン処理）、超音波破砕、放射線照射、加熱又は免疫原性は維持するが、生物の複製又は増殖を防止するのに十分な他の任意な従来手段を含む、多様な方法により達成できる。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「免疫応答」という用語は、動物内で誘発される応答を指す。免疫応答は、細胞免疫（ＣＭＩ, cellular immunity）；液性免疫を指してもよく、又はその両方を伴ってもよい。本発明は、免疫系の一部に限定された応答も想定する。例えば、本発明のワクチン組成物は、ガンマインターフェロン応答の増加を特異的に誘導できる。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「抗原」又は「免疫原」という用語は、宿主動物内で特異的な免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原には、死滅した、弱毒化された又は生きている生物全体；生物のサブユニット又は一部分；宿主動物に提示された際に免疫応答を誘導できる免疫原をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン、又はそれらの任意の組合せが含まれ得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「多価性」という用語は、異なる属又は種の微生物に由来する複数の抗原を含有するワクチン（例えば、パストレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、サルモネラ（Salmonella）、大腸菌（Escherichia coli）、ヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）、及びクロストリジウム（Clostridium）由来の抗原を含むワクチン）を意味する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「アジュバント」という用語は、ワクチンの免疫原性を高めるためにワクチンに添加される物質を意味する。アジュバントの作用機序は、全てが公知というわけではない。あるアジュバントは、抗原を徐放することにより免疫応答を亢進すると考えられているが、他のアジュバントは、より効率的に又は効果的に免疫原を宿主の免疫系に提示する、又は特定のサイトカインの産生を刺激する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される媒体」は、同義的に使用され、有害作用がなく宿主に注射可能なワクチン抗原を含有するための液体媒体を指す。当技術分野で公知である、好適な薬学的に許容される担体には、それらに限定されないが、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、又は緩衝液が含まれる。担体には、それらに限定されないが、希釈剤、安定剤（すなわち、糖質及びアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘添加剤、着色剤などを含む補助剤が含まれていてもよい。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ワクチン組成物」という用語には、宿主内で免疫応答を誘導するのに有用で、薬学的に許容される媒体中にある、少なくとも１つの抗原又は免疫原が含まれる。ワクチン組成物は、被投与動物の年齢、性別、体重、種、及び状態、並びに投与経路などの要因を考慮し、医学又は獣医学分野の当業者に周知である用量及び技術で投与可能である。投与経路は、経皮的、例えば、皮内、筋肉内、皮下であってもよい。ワクチン組成物は、それだけで投与してもよく、又は他の処置若しくは治療と同時に投与若しくは順次に投与してもよい。組成物は、投与経路及び所望の製剤に依存し、湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、又は増粘添加剤、保存剤、着色剤などの補助的な物質を含有していてもよい。"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990などの標準的な薬学書を参考にすると、過剰な実験をせずに好適な製剤を調製することができる。
【００２６】
Ｍ．ハイオニューモニエワクチンは、全細胞又は部分細胞製剤及び／又は上澄み液、例えば、バクテリン又は修飾された生製剤、サブユニットワクチン、例えば、１つ若しくは複数のＭ．ハイオニューモニエ由来のポリペプチド若しくはタンパク質、そのようなポリペプチド若しくはタンパク質の免疫原性断片、又はそのようなタンパク質、ポリペプチド、若しくは免疫原性断片をコードし、遺伝子若しくは核酸である、１つ若しくは複数のＭ．ハイオニューモニエ遺伝子が含まれていてもよいサブユニットワクチンを含み得る。有利には、Ｍ．ハイオニューモニエワクチンは、不活化ワクチンである。別の有利な実施形態では、Ｍ．ハイオニューモニエワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。
【００２７】
不活化された免疫性又はワクチン組成物を取得するためには、マイコプラズマの増殖を支持可能な培地内で病原体を産生する。選択される培養培地には、R. Ross et al Am. J. Vet. Res. 1984, 45, 1899-1905、B. Kristensen et al Am. J. Vet. Res. 1981, 42, 784-788、 国際公開第９１／１８６２７号パンフレット、米国特許第５３３８５４３号明細書、又は他の類似文献に記載されているような、当業者に公知であるマイコプラズマ増殖用の培地が含まれていてもよい。マイコプラズマは、好ましくは回収後に不活化し、例えば、ホルマリン又はホルムアルデヒド、ベータプロピオラクトン、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ, binary ethyleneimine）、チメロサールなどを使用した化学処理、及び／又は物理処理（例えば、熱処理又は超音波破砕）によって清澄化に供してもよい。不活化の方法は、当業者に周知である。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ菌は、ホルムアルデヒド処理（Ross R. F. et al., Am. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905）により、エチレンイミン又はＢＥＩ処理（例えば、国際公開第９１／１８６２７号パンフレットを参照）により、又はチメロサール処理（米国特許第５９６８５２５号明細書及び第５３３８５４３号明細書）により不活化できる。不活化剤は、精製ステップにより、中和又は除去することができる。
【００２８】
不活化された病原体は、従来の濃縮技術、具体的には限外ろ過による濃縮が可能であり、且つ／又は、具体的には、ゲルろ過法を含むがそれに限定されないクロマトグラフィー技術を使用する従来の精製手段により、又は限外ろ過により、精製が可能である。本明細書中で使用される場合、「免疫原性」という用語は、１種又は複数の抗原に対して宿主動物内で免疫応答を生じさせ得ることを意味する。この免疫応答は、特定の感染性生物に対するワクチンにより誘発される防御免疫の基盤を形成する。
【００２９】
本発明の方法は、精製されたＭ．ハイオニューモニエ免疫原性タンパク質、ポリペプチド、並びにそのようなタンパク質及びポリペプチドの免疫原性断片を有するサブユニットワクチンを使用して実行できる。そのようなタンパク質及びポリペプチドは、当技術分野で公知の技術を使用して調製することができる。さらに、試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動法にかけ、続いて染色ゲル上のポリペプチドの単一バンドを視覚化することなど、当業者に周知である方法を使用して、タンパク質の純度又は均質性を決定することができる。より高次の分解能は、ＨＰＬＣ又は当技術分野で周知である他の類似の方法を使用して決定することができる。特定の実施形態では、本発明で使用されるワクチンは、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０、及びＰ４４などの、しかしそれらに限定されない、少なくとも１つのＭ．ハイオニューモニエのタンパク質を含む。Ｍ．ハイオニューモニエのゲノムの配列については、Minion et al., J Bacteriol. 2004 Nov;l86(21):7123-33を参照されたい。
【００３０】
他の実施形態では、本発明の方法で使用されるワクチンは、Ｍ．ハイオニューモニエバクテリン（不活化された全細胞又は部分細胞、又は修飾された生の）又はＭ．ハイオニューモニエのタンパク質、ポリペプチド若しくはそれらの免疫原性断片、及び少なくとも１つの他の免疫原（不活化された全細胞又は部分細胞、又は修飾された生の）又は免疫原性若しくは抗原性タンパク質、ポリペプチド若しくはそれらの免疫原性断片を含み、好ましくはウイルス性、細菌性又は寄生虫ポリペプチドである。さらなる特定の実施形態では、そのようなタンパク質又はポリペプチドの免疫原性断片は、それらに限定されないが、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０、及びＰ４４を含む本発明の方法で使用される免疫原性タンパク質及びポリペプチドの、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、又は少なくとも１００の連続したアミノ酸を含む配列を有する。
【００３１】
さらに、ワクチンに使用されるＭ．ハイオニューモニエのタンパク質は、実質的に純粋又は均質である。本発明の方法では、典型的には、これらのタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を発現する宿主細胞から精製されるタンパク質又はポリペプチドが使用される。そのようなタンパク質精製は、当技術分野で周知の多様な方法により達成できる。例えば、"Methods In Enzymology", 1990, Academic Press, Inc., San Diego, "Protein Purification: Principles and practice", 1982, Springer-Verlag, New Yorkに記載の技法を参照されたい。
【００３２】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクター内に含有され、プロモーター要素に作動可能に連結され、エンハンサーに作動可能に連結されていてもよいＭ．ハイオニューモニエ免疫原を少なくとも１つ含む。
【００３３】
有利な実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ, cytomegalovirus）前初期遺伝子のプロモーターである。
【００３４】
別の実施例では、エンハンサー及び／又はプロモーターには、種々の細胞又は組織特異的なプロモーター（例えば、筋肉、内皮細胞、肝臓、体細胞又は幹細胞）、種々のウイルスプロモーター及びエンハンサーが含まれる。筋肉特異的なプロモーター及びエンハンサーの例は報告されおり、当業者に公知である （例えば、Li et al., Gene Ther. December 1999;6(12):2005-11；Li et al., Nat Biotechnol. March 1999;17(3):241-5及びLoirat et al., Virology. Jul. 20, 1999;260(1):74-83を参照；これらの開示は、その全体が参照により組み込まれる）。
【００３５】
本発明で使用できるプロモーター及びエンハンサーには、それらに限定されないが、ＬＴＲ又はラウス肉腫ウイルス、ＨＳＶ−１のＴＫ、ＳＶ４０の初期又は後期プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ, adenovirus major late）、ホスホグリセリン酸キナーゼ、メタロチオネイン、アルファ１アンチトリプシン、アルブミン、コラゲナーゼ、エラスターゼＩ、ベータアクチン、ベータグロビン、ガンマグロビン、アルファフェトプロテイン、筋肉クレアチンキナーゼが含まれる。
【００３６】
「ベクター」とは、インビトロ又はインビボのいずれかで標的細胞に送達される異種性ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ又はＲＮＡプラズミド又はウイルスを指す。異種性ポリヌクレオチドは、治療目的用の対象配列を含むことができ、発現カセットの形態であってもよい。本明細書中で使用される場合、ベクターは、最終的な標的細胞又は対象中で複製可能である必要はない。この用語には、クローニングベクターが含まれ、またウイルスベクターも含まれる。
【００３７】
「組換え」という用語は、自然界では生じないか、又は自然界では見られない構成で別のポリヌクレオチドに連結されているかのいずれかである、半合成、又は合成由来のポリヌクレオチドを意味する。
【００３８】
「異種性」とは、それが比較される残りの実体と遺伝的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子工学技術により、異なる供給源に由来するプラズミド又はベクター中に配置することができ、それは異種性のポリヌクレオチドである。天然のコード配列から取り除かれ、天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種性プロモーターである。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドは、同一転写ユニット内の追加的コード配列、プロモーターなどの制御要素、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、同一の又は異なるプロモーターの制御下にある追加的な転写ユニット、クローニングと、発現と、相同組換えと、宿主の形質転換とを可能にする配列、及び本発明の実施形態を提供するために望ましい可能性のある任意の構築体などの、追加的な配列を含むことができる。
【００４０】
本発明は、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原又は変異体又は類似体又は断片を発現するベクターを包含する。Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原の発現用要素は、有利には、本発明のベクター内に存在する。これは、最小限には、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン及びプロモーターを含み、から本質的になり、又はからなり、プラズミドなどのある種のベクター及びある種のウイルスベクター、例えばポックスウイルス以外のウイルスベクターでは、ポリアデニル化配列も含んでいてもよい。ポリヌクレオチドがポリタンパク質断片、例えば、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原を、有利にはベクター内でコードする場合、ＡＴＧはリーディングフレームの５’に配置され、終止コドンは３’に配置される。エンハンサー配列、イントロンなどの安定化配列及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列など、他の発現制御用の要素が存在していてもよい。
【００４１】
本発明の遺伝子の遺伝子産物を、インビボ又はインビトロのいずれかで発現するためのベクター又は組換え体又はプラズミドを作製及び／又は投与する方法は、任意の所望の方法、例えば、米国特許第４６０３１１２号明細書；第４７６９３３０号明細書；第４３９４４４８号明細書；第４７２２８４８号明細書；第４７４５０５１号明細書；第４７６９３３１号明細書；第４９４５０５０号明細書；第５４９４８０７号明細書；第５５１４３７５号明細書；第５７４４１４０号明細書；第５７４４１４１号明細書；第５７５６１０３号明細書；第５７６２９３８号明細書；第５７６６５９９号明細書；第５９９００９１号明細書；第５１７４９９３号明細書；第５５０５９４１号明細書；第５３３８６８３号明細書；第５４９４８０７号明細書；第５５９１６３９号明細書；第５５８９４６６号明細書；第５６７７１７８号明細書；第５５９１４３９号明細書；第５５５２１４３号明細書；第５５８０８５９号明細書；第６１３００６６号明細書；第６００４７７７号明細書；第６１３００６６号明細書；第６４９７８８３号明細書；第６４６４９８４号明細書；第６４５１７７０号明細書；第６３９１３１４号明細書；第６３８７３７６号明細書；第６３７６４７３号明細書；第６３６８６０３号明細書；第６３４８１９６号明細書；第６３０６４００号明細書；第６２２８８４６号明細書；第６２２１３６２号明細書；第６２１７８８３号明細書；第６２０７１６６号明細書；第６２０７１６５号明細書；第６１５９４７７号明細書；第６１５３１９９号明細書；第６０９０３９３号明細書；第６０７４６４９号明細書；第６０４５８０３号明細書；第６０３３６７０号明細書；第６４８５７２９号明細書；第６１０３５２６号明細書；第６２２４８８２号明細書；第６３１２６８２号明細書；第６３４８４５０号明細書及び第６；３１２６８３号明細書；１９８６年１０月１６日に出願の米国特許出願第９２０１９７号明細書；国際公開第９０／０１５４３号パンフレット；国際公開第９１／１１５２５号パンフレット；国際公開第９４／１６７１６号パンフレット；国際公開第９６／３９４９１号パンフレット；国際公開第９８／３３５１０号パンフレット；ＥＰ２６５７８５；ＥＰ０３７０５７３；Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11313-11318；Ballay et al., EMBO J. 1993;4:3861-65；Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994;269:2550-2561；Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11371-11377；Graham, Tibtech 1990;8:85-87；Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992;3:237-52；Ju et al., Diabetologia 1998;41:736-739；Kitson et al., J. Virol. 1991;65:3068-3075；McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11414-11420；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11341-11348；Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11349-11353；Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984;4:399406；Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995;39、"Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.；Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983;3:2156-2165；Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11334-11340；Robinson et al., Sem. Immunol. 1997;9:271；及びRoizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:11307-11312による方法又はこれらの文献に引用された文書内で開示された方法に類似した方法、又はこれらの文献に引用された文書内で開示された方法であってもよい。したがって、本発明のベクターは、ポックスウイルス��例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、ブタ痘ウイルスなど）、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、イヌヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルスなどの（参照により本明細書に組み込まれた文書にあるような）、任意の好適な組換えウイルス又はウイルスベクターであってもよく、又はベクターはプラズミドであってもよい。本明細書に引用され、参照により本明細書に組み込まれた文書は、本発明の実行に有用なベクターの例を提供するのに加えて、非Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原、例えば、本発明の組成物中の又はそれに含まれる１つ又は複数のベクターにより発現される、又は本発明の組成物中に含まれる非Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原、非Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原ペプチド又はそれらの断片、サイトカインなどの供給源も提供し得る。
【００４２】
また、本発明は、発現ベクターなどのベクターを含む製剤、例えば治療用組成物に関する。製剤は、１つ又は複数のＭ．ハイオニューモニエ免疫原を含む、から本質的になる、又はからなる（及び有利には発現する）１つ又は複数のベクター、例えばインビボ発現ベクターなどの発現ベクターを含み、から本質的になり、又はからなっていてもよい。有利には、ベクターは、１つ又は複数のＭ．ハイオニューモニエ免疫原をコードするコード領域、薬学的又は獣医学的に許容される担体、賦形剤又は媒体を含む、から本質的になる、又はからなるポリヌクレオチドを含有及び発現する。したがって、本発明のある実施形態によれば、製剤内の他の１つ又は複数のベクターは、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原の他の１つ又は複数のタンパク質又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを含み、から本質的になり、又はからなり、適切な状況下では、ベクターは、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原の他の１つ又は複数のタンパク質又はそれらの断片を発現する。
【００４３】
別の実施形態によれば、製剤内の他の１つ又は複数のベクターは、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原の１つ又は複数のタンパク質又はそれらの断片（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含み、又はから本質的になり、又はからなり、１つ又は複数のベクターはポリヌクレオチド（複数可）を発現する。本発明の製剤は、同一のタンパク質及び／又は異なるタンパク質、しかし有利には同一のタンパク質をコードする、異なるＭ．ハイオニューモニエ分離株由来のポリヌクレオチドを含み、から本質的になり、又はからなり、有利には適切な条件又は好適な条件下のインビボで又は好適な宿主細胞内で有利には発現もする、少なくとも２つのベクターを有利には含み、から本質的になり、又はからなる。Ｍ．ハイオニューモニエペプチド、融合タンパク質又はそのエピトープをコードし、有利にはインビボで、有利には発現するポリヌクレオチドを含有する、から本質的になる、又はからなる、１つ又は複数のベクターを含有する製剤。
【００４４】
本発明のある実施形態によれば、発現ベクターは、ウイルスベクター、具体的にはインビボ発現ベクターである。有利な実施形態では、発現ベクターは、アデノウイルスベクターである。有利には、アデノウイルスは、ヒトＡｄ５ベクター、Ｅ１−欠失型及び／又はＥ３欠失型アデノウイルスである。
【００４５】
ある具体的な実施形態では、ウイルスベクターはポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス又は弱毒化ワクシニアウイルス（例えば、ＭＶＡ、ニワトリ胚線維芽細胞上でアンカラワクチン株を５７０代を超えて継代培養した後に取得された修飾アンカラ株；Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153；Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851を参照；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５０８として入手可能；又はＮＹＶＡＣ、米国特許第５４９４８０７号明細書、例えばＮＹＶＡＣの構築を考察し、異種性コード核酸分子のこの組換え体の部位への挿入だけでなく、コペンハーゲン株ワクシニアウイルスゲノムから追加的ＯＲＦが欠失したＮＹＶＡＣの変異体も同様に考察し、適合するプロモーターの使用も考察されている米国特許第５４９４８０７号明細書の実施例１〜６及び以下参照；国際公開第９６／４０２４１号パンフレットも参照）、アビポックスウイルス又は弱毒化アビポックスウイルス（例えば、カナリア痘、鶏痘、コバト痘、ハト痘、ウズラ痘、ＡＬＶＡＣ又はＴＲＯＶＡＣ；例えば、米国特許第５５０５９４１号明細書、第５４９４８０７号明細書を参照）、ブタ痘、アライグマ痘、ラクダ痘又は粘液腫症ウイルスである。
【００４６】
本発明の別の実施形態によれば、ポックスウイルスベクターは、カナリア痘ウイルス又は鶏痘ウイルスベクターであり、有利には、弱毒化カナリア痘ウイルス又は鶏痘ウイルスである。この点について、カナリア痘は、ＡＴＣＣからアクセッション番号ＶＲ−１１１で入手可能である。弱毒化カナリア痘ウイルスは、米国特許第５７５６１０３号明細書（ＡＬＶＡＣ）及び国際公開第０１／０５９３４号パンフレットに記載されている。多数の鶏痘ウイルスワクチン株、例えば、MERIAL社が販売するDIFTOSEC CT株及びINTERVET社が販売するNOBILIS VARIOLEワクチンも入手可能であり、弱毒化鶏痘株ＴＲＯＶＡＣに関する米国特許第５７６６５９９号明細書も参照されたい。
【００４７】
その組換え体を産生する方法及びその組換え体をどのように投与するかについての情報は、当業者であれば、本明細書中に引用した文書及び国際公開第９０／１２８８２号パンフレットを参照することができ、例えばワクシニアウイルスについては、特に、米国特許第４７６９３３０号明細書、第４７２２８４８号明細書、第４６０３１１２号明細書、第５１１０５８７号明細書、第５４９４８０７号明細書、及び第５７６２９３８号明細書で言及され；鶏痘については、特に、米国特許第５１７４９９３号明細書、第５５０５９４１号明細書及び米国特許第５７６６５９９号明細書で言及され；カナリア痘については、特に、米国特許第５７５６１０３号明細書で言及され；ブタ痘については、特に米国特許第５，３８２，４２５号明細書で言及され；アライグマ痘については、特に国際公開第００／０３０３０号パンフレットで言及されている。
【００４８】
発現ベクターがワクシニアウイルスである場合、発現させる１つ又は複数のポリヌクレオチド用の１つ又は複数の挿入部位は、有利には、チミジンキナーゼ（ＴＫ, thymidine kinase）遺伝子又は挿入部位、血球凝集素（ＨＡ, hemagglutinin）遺伝子又は挿入部位、Ａ型封入体（ＡＴＩ, inclusion body of the A type）をコードする領域にある。本明細書中に引用された文書、特にワクシニアウイルスに関するものも参照されたい。カナリア痘の場合、有利には、１つ又は複数の挿入部位は、Ｃ３、Ｃ５及び／又はＣ６ＯＲＦである。本明細書中に引用された文書、特にカナリア痘ウイルスに関するものも参照されたい。鶏痘の場合、有利には、１つ又は複数の挿入部位は、Ｆ７及び／又はＦ８ＯＲＦである。本明細書中に引用された文書、特に鶏痘ウイルスに関するものも参照されたい。ＭＶＡウイルス用の１つ又は複数の挿入部位は、有利には、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394；Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243；Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040を含む、種々の出版物にあり、この点については、ＭＶＡの全ゲノムがAntoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されており、当業者であれば、他の挿入部位又は他のプロモーターを使用できることも指摘しておく。
【００４９】
有利には、発現させるポリヌクレオチドは、特異的なポックスウイルスプロモーター、例えば、特に、ワクシニア７．５ｋＤａプロモーター（Cochran et al., J. Virology,1985, 54, 30-35）、ワクシニアＩ３Ｌプロモーター（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアＨＡプロモーター（Shida, Virology, 1986, 150, 451-457）、牛痘ＡＴＩプロモーター（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198；Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836）の制御下に挿入する。
【００５０】
ある具体的な実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス（ＨＡＶ, human adenovirus）又はイヌアデノウイルス（ＣＡＶ, canine adenovirus）などのアデノウイルスである。
【００５１】
ある実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスであり、具体的には、アクセッション番号Ｍ７３２６０でGenbankに、及び参照文献であるJ. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285に開示されているｈＡｄ５配列を参照すると、具体的にはヌクレオチド４５９付近からヌクレオチド３５１０付近までのウイルスゲノムのＥ１領域での欠失により複製不能にされた血清型５型のアデノウイルスである。欠失アデノウイルスは、Ｅ１発現型２９３内（F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72）又はＰＥＲ細胞内、具体的にはＰＥＲ．Ｃ６（F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917）内で増殖する。ヒトアデノウイルスは、具体的にはヌクレオチド２８５９２付近からヌクレオチド３０４７０付近までの、Ｅ３領域での欠失が可能である。Ｅ１領域での欠失は、Ｅ３領域での欠失と組み合わせて行うことができる（例えば、J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335、F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol.7: Gene Transfer and Expression Protocols Edited by E. Murray, The Human Press Inc, 1991, p109-128；Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 2587-2592；米国特許第６１３３０２８号明細書；米国特許第６６９２９５６号明細書；S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 11557-11561；B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev. 1993, 12, 185-199；X. Danthinne et al Gene Thrapy 2000, 7, 1707-1714；K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629；K. Berkner et al Nucl. Acid Res. 1983, 11, 6003-6020；C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805-4810を参照)。挿入部位は、最終的にＥ１及び／又はＥ３領域が部分的又は完全に欠失された後のＥ１及び／又はＥ３遺伝子座（領域）であってもよい。有利には、発現ベクターがアデノウイルスである場合、発現させるポリヌクレオチドは、強力プロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター, cytomegalovirus immediate-early gene promoter）、具体的にはM. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530に記載のヌクレオチド−７３４付近からヌクレオチド＋７付近までのエンハンサー／プロモーター領域又はPromega Corp.社製のpCIベクター由来のエンハンサー／プロモーター領域などの、真核細胞内で機能するプロモーターの制御下に挿入する。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利には、マウス又はヒト由来である。伸長因子１αのプロモーターも使用できる。ある具体的な実施形態では、低酸素により制御されるプロモーター、例えば、K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208に記載のＨＲＥプロモーターが使用できる。筋肉特異的プロモーター（X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245）も使用できる。強力プロモーターについてもまた、本明細書中で、プラズミドベクターとの関連で考察している。ある実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域の下流に、スプライス配列を配置できる。例えば、ＣＭＶ−ＩＥ遺伝子から単離されたイントロン１（R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190）、ウサギ又はヒトβグロビン遺伝子から単離されたイントロン、具体的にはβグロビン遺伝子由来のイントロン２、免疫グロブリン遺伝子から単離されたイントロン、ＳＶ４０初期遺伝子由来のスプライス配列、又はマウス免疫グロブリンのアクセプター配列に融合されたヒトβグロビンのドナー配列（ジェンバンクのアクセッション番号ＣＶＵ４７１２０のヌクレオチド８９０付近からヌクレオチド１０２２付近まで）を含む、Promege Corp.社製のpCIベクターから単離されたキメライントロン配列である。ポリ（Ａ）配列及び転写終結配列は、発現させるポリヌクレオチド、例えば、具体的にはジェンバンクのアクセッション番号ＢＯＶＧＨＲＨのヌクレオチド２３３９付近からヌクレオチド２５５０付近までのウシ成長ホルモン遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、又はＳＶ４０後期遺伝子ポリアデニル化シグナルの下流に挿入できる。
【００５２】
別の実施形態では、ウイルスベクターは、イヌアデノウイルス、具体的にはＣＡＶ−２（例えば、L. Fischer et al. Vaccine, 2002, 20, 3485-3497；米国特許第５５２９７８０号明細書；米国特許第５６８８９２０号明細書；ＰＣＴ出願第９５／１４１０２号パンフレットを参照）である。ＣＡＶ用には、挿入部位は、Ｅ３領域内及び／又はＥ４領域と右ＩＴＲ領域との間に位置する領域内（米国特許第６０９０３９３号明細書；米国特許第６１５６５６７号明細書を参照）であり得る。ある実施形態では、挿入は、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）又はヒトアデノウイルスベクター用にすでに記載したプロモーターなどのプロモーターの制御下にある。ポリ（Ａ）配列及び転写終結配列は、発現させるポリヌクレオチド、例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβグロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルの下流に挿入することができる。
【００５３】
別の具体的な実施形態では、ウイルスベクターは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ, pseudorabies virus）などのヘルペスウイルスである。ＰＲＶ用には、挿入部位は、具体的にはチミジンキナーゼ遺伝子内、ｇＥ遺伝子内、又はＵＬ４３ＯＲＦ内（国際公開第９６／１３５７５号パンフレット、国際公開第８７／０４４６３号パンフレットを参照）であってもよい。ある実施形態では、発現させるポリヌクレオチドは、真核細胞内で機能するプロモーター、有利にはＣＭＶ−ＩＥプロモーター（マウス又はヒト）の制御下に挿入する。ある具体的な実施形態では、低酸素により制御されるプロモーター、例えば、K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208に記載のＨＲＥプロモーターが使用できる。ポリ（Ａ）配列及び転写終結配列は、発現させるポリヌクレオチド、例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子又はウサギβグロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルの下流に挿入することができる。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態によれば、発現ベクターは、プラズミドベクター又はＤＮＡプラズミドベクター、具体的にはインビボ発現ベクターである。非限定的な、特定の実施例では、pVR1020又は1012プラズミド（VICAL Inc.社製；Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217、例えば米国特許第５８４６９４６号明細書及び第６４５１７６９号明細書を参照）が、ポリヌクレオチド配列の挿入用ベクターとして使用できる。pVR1020プラズミドは、pVR1012に由来し、ヒトｔＰＡシグナル配列を含有する。ある実施形態では、ヒトｔＰＡシグナルは、ジェンバンクのアクセッション番号ＨＵＭＴＰＡ１４のアミノ酸Ｍ（１）からアミノ酸Ｓ（２３）までを含む。非限定的な、別の特定の実施例では、ポリヌクレオチド配列の挿入用ベクターとして使用するプラズミドは、ジェンバンクのアクセッション番号Ｕ２８０７０のアミノ酸Ｍ（２４）からアミノ酸Ａ（４８）までのウマＩＧＦ１のシグナルペプチド配列を含有できる。実行に際して参考又は使用され得るＤＮＡプラズミドに関する追加的な情報は、例えば、米国特許第６８５２７０５号明細書；第６８１８６２８号明細書；第６５８６４１２号明細書；第６５７６２４３号明細書；第６５５８６７４号明細書；第６４６４９８４号明細書；第６４５１７７０号明細書；第６３７６４７３号明細書及び第６２２１３６２号明細書に見出される。
【００５５】
プラズミドという用語は、本発明によるポリヌクレオチドと、所望の宿主又は標的の１つ又は複数の細胞内でのインビボ発現に必要な要素とを含む、任意のＤＮＡ転写ユニットを包含し、その点については、直鎖状形態だけでなく、スーパーコイル状の又は非スーパーコイル状の、環形のプラズミドも、本発明の範囲内であることを意図することに留意されたい。
【００５６】
各プラズミドは、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原又はその変異体、類似体又はその断片をコードし、プロモーターに作動可能に連結された又はプロモーターの制御下にある又はプロモーターに依存しているポリヌクレオチドに加えて、含む、含有する、又は本質的になる。一般的に、真核細胞内で機能する強力プロモーターを使用することが有利である。好ましい強力プロモーターは、ヒト若しくはマウス由来の、又はラット若しくはモルモットなど、他に由来していてもよい、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ, immediate early cytomegalovirus promoter）である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、実際のプロモーター部分を含み得るが、エンハンサー部分を伴っていても又はいなくともよい。参照できるのは、ＰＣＴ出願第８７／０３９０５号明細書だけでなく、ＥＰ−Ａ−２６０１４８、ＥＰ−Ａ−３２３５９７、米国特許第５１６８０６２号明細書、第５３８５８３９号明細書及び第４９６８６１５号明細書である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利には、ヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530）又はマウスＣＭＶ−ＩＥである。
【００５７】
より一般的に言えば、プロモーターは、ウイルス又は細胞のいずれか一方に由来を有する。本発明の実行で使用するのに有用であり得る、ＣＭＶ−ＩＥ以外のウイルス性の強力プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの前期／後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実行で使用するのに有用であり得る、細胞性の強力プロモーターは、例えば、デスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）、又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）などの細胞骨格遺伝子のプロモーターである。
【００５８】
これらのプロモーターの機能的小断片、すなわち、十分なプロモーター活性を維持しているこれらのプロモーターの部分は本発明内に含まれ、例えば、ＰＣＴ出願第９８／００１６６号パンフレット又は米国特許第６１５６５６７号明細書に記載の切断型ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、本発明の実行に使用できる。本発明の実行におけるプロモーターには、十分なプロモーター活性及びしたがってプロモーターとしての機能、好ましくは、誘導体又は小断片が由来する実際の又は全長プロモーターの活性に実質的に類似したプロモーター活性、例えば、全長ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性に対する、米国特許第６１５６５６７号明細書の断片型ＣＭＶ−ＩＥプロモーターの活性に類似したプロモーター活性を維持している、全長プロモーターの誘導体及び小断片が結果的に含まれる。したがって、本発明の実行におけるＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、誘導体及び小断片だけでなく、全長プロモーターのプロモーター部分及び／又は全長プロモーターのエンハンサー部分を含み、から本質的になり、又はからなっていてもよい。
【００５９】
好ましくは、プラズミドは、他の発現制御要素を含み又はから本質的になる。特に有利なのは、安定化配列（複数可）、例えば、イントロン配列（複数可）、好ましくはｈＣＭＶ−ＩＥの第１イントロン（ＰＣＴ出願第８９／０１０３６号パンフレット）、ウサギβグロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344）を組み込むことである。
【００６０】
プラズミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクター用のポリアデニル化シグナル（ポリＡ）に関して、より使用され得るのは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ, bovine growth hormone）遺伝子のポリ（Ａ）シグナル（米国特許第５１２２４５８号明細書を参照）、又はウサギβグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル又はＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）シグナルである。
【００６１】
本発明の別の実施形態によれば、発現ベクターは、適切な細胞系でタンパク質をインビトロ発現するために使用される発現ベクターである。発現したタンパク質は、分泌後、又は分泌前に、培地の上澄み内で又は上澄みから回収可能であり（分泌されない場合、典型的には、細胞溶解が発生又は実施される）、限外ろ過などの濃縮方法により濃縮してもよく且つ／又はアフィニティ、イオン交換又はゲルろ過型のクロマトグラフィー法などの精製手段により精製してもよい。
【００６２】
本発明で使用できる宿主細胞には、それらに限定されないが、筋肉細胞、ケラチン生成細胞、筋芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ, Chinese Hamster ovary cell）、ベロ細胞、ＢＨＫ２１、ｓｆ９細胞などが含まれる。当業者には理解できることだが、宿主細胞の培養条件は、具体的な遺伝子に従って変動し、Ｍ．ハイオニューモニエの最適な培養条件を宿主細胞に依存して決定するには、時には定常の実験が必要である。
【００６３】
「宿主細胞」とは、遺伝的に改変された、又は組換えプラズミド若しくはベクターなどの外来性ポリヌクレオチドの投与により遺伝的に改変され得る原核又は真核細胞を示す。遺伝的改変細胞を指す場合、この用語は、初代の改変細胞及びその子孫の両方を指す。
【００６４】
所望の配列を含むポリヌクレオチドは、好適なクローニング又は発現ベクターに挿入可能で、次いでベクターは、複製及び増幅用に好適な宿主細胞に導入できる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知である任意の手段により宿主細胞に導入できる。対象となるポリヌクレオチドを含有するベクターは、直接取り込みと、エンドサイトーシスと、形質移入と、ｆ交配と、電気穿孔法と、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、又は他の物質を使用した形質移入と；微粒子銃と；リポフェクションと；感染（ベクターが感染性、例えばレトロウイルスベクターである）とを含む、任意の多数の適切な手段により宿主細胞に導入可能である。導入するベクター又はポリヌクレオチドの選択は、時には宿主細胞の特性に依存することもあろう。
【００６５】
有利な実施形態では、本発明は、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原を標的細胞内に送達及び発現するのための製剤を、治療上有効な量で投与することを提供する。治療上有効な量の決定は、当業者にとっては、定常の実験である。ある実施形態では、製剤は、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原を発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、薬学的又は獣医学的に許容される担体、媒体又は賦形剤とを含む。有利な実施形態では、薬学的又は獣医学的に許容される担体、媒体又は賦形剤は、形質移入を容易にし、且つ／又はベクター又はタンパク質の保存性を向上させる。
【００６６】
薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤は、当業者に周知である。例えば、薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤は、０．９％のＮａＣｌ（例えば、生理食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であってもよい。本発明の方法に使用可能な、他の薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤には、それらに限定されないが、ポリ−（Ｌ−グルタメート）又はポリビニルピロリドンが含まれる。薬学的又は獣医学的に許容される担体又は媒体又は賦形剤は、ベクター（又は本発明のベクターからインビトロで発現されたタンパク質）の投与を容易にする任意の化合物又は化合物の組合せであってもよく、有利には、担体、媒体又は賦形剤は、形質移入を容易にし、且つ／又はベクター（又はタンパク質）の保存性を向上させることができる。用量及び用量の容積は、本明細書中の一般的説明で考察しており、当業者であれば、当技術分野の知見と併せて本開示を読むことで、過度の実験をせずに決定することができる。
【００６７】
プラズミド用に有利ではあるが、排他的に好適というわけではない４級アンモニウム塩を含有する陽イオン性脂質は、有利には、以下の式を有するものである：
【００６８】
【化１】
2009528361.tif 000002
【００６９】
式中、Ｒ１は、１２〜１８個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖脂肪族基であり、Ｒ２は、２個又は３個の炭素原子を含有する別の脂肪族基であり、Ｘは、アミン又はヒドロキシル基、例えばＤＭＲＩＥである。別の実施形態では、陽イオン性脂質には、中性脂質、例えばＤＯＰＥが付随していてもよい。
【００７０】
これらの陽イオン性脂質の中で、好ましいのは、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパンアンモニウム；国際公開第９６／３４１０９号パンフレット）であり、中性脂質、有利にはＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン；Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389）を有利には付随して、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成する、
【００７１】
有利には、アジュバントとのプラズミド混合物は、即時に、有利には製剤の投与と同時に又は製剤の投与の少し前に形成され、例えば、有利には、混合物が複合体を形成するのに十分な投与前の時間、例えば、投与前およそ３０分など、投与前約１０分から約６０分間の時間が投与前にあるように、投与の少し前又は投与の前に、プラズミド−アジュバント混合物を形成する。
【００７２】
ＤＯＰＥが存在する場合、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモル比は、有利には、約９５：約５〜約５：約９５まで、より有利には、約１：約１、例えば１：１である。
【００７３】
本発明による免疫原組成物及びワクチンは、有利には、１つ又は複数のアジュバントを含む又はから本質的になる。本発明の実行に使用する好適なアジュバントは、（１）アクリル又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（２）１つ又は複数の非メチル化ＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883；国際公開第９８／１６２４７号パンフレット）などの免疫賦活性配列（ＩＳＳ, immunostimulating sequence）、（３）"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" M. Powell, M. Newman, Plenum Press出版1995の１４７頁に記載のＳＰＴ乳剤、及び同文献の１８３頁に記載のＭＦ５９乳剤などの水中油型乳剤、（４）４級アンモニウム塩を含有する陽イオン性脂質、（５）サイトカイン、（６）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム又は（７）サポニン、（８）臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（Vaccine Design p.157）、（９）アリジン（Vaccine Design p.148）、参照により本出願に組み込まれ、引用された任意の文書で考察された他のアジュバント、又は（８）それらの任意の組合せ又は混合物である。
【００７４】
水中油型乳剤（３）は、特にウイルスベクターに適切であり、軽質流動パラフィン油（ヨーロッパ薬局方型）、スクアラン、スクアレンなどのイソプレノイド油、例えばイソブテン又はデセンなど、アルケンのオリゴマー化から生じる油、植物油、エチルオレート、プロピレングリコール、ジ（カプリレート／カプレート）、グリセリントリ（カプリレート／カプレート）及びプロピレングリコールジオレートなどの直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル、又は分岐脂肪アルコール又は酸のエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づいていてもよい。
【００７５】
油は、乳化剤と組み合わせて使用され、乳剤を形成する。乳化剤は、一方では、ソルビタン、マンニド（例えば、無水マンニトールオレート）、グリセリン、ポリグリセリン、又はプロピレングリコールと、もう一方では、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸とのエステルなど、非イオン性界面活性剤であってもよく、該エステルは、エトキシ化され、又はプルロニック、例えば、Ｌ１２１などのポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロックであってもよい。
【００７６】
アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー（１）は、具体的には糖質又はポリアルコールのポリアルケニルエステルと、好ましくは架橋している。これらの化合物は、カルボマーという用語で公知である（Pharmeuropa vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者であれば、米国特許第２９０９４６２号明細書を参照することも可能で、その明細書には、少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基に置換されている、少なくとも３個の、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物と架橋している、そのようなアクリルポリマーが記載されている。好ましい基は、２〜４個の炭素原子を含有する基であり、例えば、ビニル、アリル及び他のエチレン性不飽和基である。不飽和基は、それら自体がメチルなどの他の置換基を含有していてもよい。Carbopol（商標）（BF Goodrich社製、Ohio、米国）という名称で販売されている製品は、特に適切である。それらは、アリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールと架橋している。それらの中で、Carbopol（商標）９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを挙げることができる。
【００７７】
無水マレイン酸の及びアルケニル誘導体のコポリマーの中では、無水マレイン酸の及びエチレンのコポリマーであり、直鎖状又は架橋状であり、例えばジビニルエーテルと架橋しているＥＭＡ（商標）コポリマー（Monsanto社製）が好ましい。参照できるのは、J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, Jun. 4, 1960である。
【００７８】
有用であるアジュバントの割合は、周知であり、当業者であれば容易に入手できる。一例として、アクリル酸若しくはメタアクリル酸のポリマー、又は無水マレイン酸及びアルケニルコポリマーのポリマーの濃度は、最終ワクチン組成物中で、０．０１％から１．５％Ｗ／Ｖまで、より具体的には、０．０５から１％Ｗ／Ｖまで、好ましくは０．１％から０．４％Ｗ／Ｖまでであろう。
【００７９】
有利な実施形態では、アジュバントは、２００４年７月２６日に出願の米国特許出願第１０／８９９１８１号明細書で開示され、２００５年４月１４日に米国特許公開第２００５／００７９１８５号明細書として公開されたアジュバントである。有利な実施形態では、アジュバントは、ＴＳ６アジュバントである。
【００８０】
本発明の方法により使用されるワクチンは、サイトカインを含有できてもよい。サイトカインは、タンパク質として、又は組換えウイルスベクターに挿入した、このサイトカインをコードする遺伝子として存在してもよい。サイトカインは、ネコサイトカイン、例えば、ネコインターロイキン１８（ｆＩＬ−１８）（Taylor S. et al., DNA Seq., 2000, 10(6), 387-394）、ｆＩＬ−１６（Leutenegger C. M. et al., DNA Seq., 1998, 9(1), 59-63）、ｆＩＬ−１２（Fehr D. et al., DNA Seq., 1997, 8(1-2), 77-82；Imamura T. et al., J. Vet. Med. Sci., 2000, 62(10), 1079-1087）及びネコ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor）（ジェンバンクＡＦ０５３００７）の中から選択してもよい。
【００８１】
特定の実施形態では、薬学的組成物はインビボで直接的に投与され、コードされた産生物はベクターにより宿主内で発現される。有利には、本発明による薬学的及び／又は治療用組成物及び／又は製剤は、本明細書中で考察したように、治療応答を誘発するのに有効な量の１つ又は複数の発現ベクター及び／又はポリペプチドを含み、又はから本質的になり、又はからなり、有効量は、本明細書に組み込まれた文書、及び当技術分野の知見を含む本開示から、過度の実験をせずに決定することができる。
【００８２】
プラズミドベクターに基づく治療用及び／又は薬学的組成物の場合、用量は、一般的に言えば、約１μｇ〜約２０００μｇ、有利には約５０μｇ〜約１０００μｇ及びより有利には約１００μｇから約８００μｇまでの、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原を発現するプラズミドを含み、から本質的になり、又はからなる。プラズミドベクターに基づく治療用及び／又は薬学的組成物を電気穿孔法で投与する場合、プラズミドの用量は、一般的に、約０．１μｇと１ｍｇとの間、有利には約１μｇと１００μｇとの間、有利には約２μｇと５０μｇとの間である。治療用及び／又は薬学的組成物は、用量当り、約１０４から約１０１１まで、有利には約１０５から約１０１０まで、及びより有利には約１０６から約１０９までの、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原を発現する組換えアデノウイルスのウイルス粒子を含有する。ポックスウイルスに基づく治療用及び／又は薬学的組成物の場合、用量は、約１０２ｐｆｕと約１０９ｐｆｕとの間であり得る。薬学的組成物は、用量当り、約１０５から約１０９まで、有利には約１０６から約１０８ｐｆｕまでの、Ｍ．ハイオニューモニエ免疫原を発現するポックスウイルス又はヘルペスウイルス組換え体を含有する。
【００８３】
本明細書中の開示は、一例として提供されており、本発明がそれに限定されないことを、当業者であれば理解すべきである。本明細書中の開示及び当技術分野の知見から、当業者であれば、各注射手順に使用される投与回数、投与経路、及び用量は、いかなる過度な実験もせずに決定できる。
【００８４】
本発明は、本発明により作製した有効量の治療用組成物を、動物に、少なくとも１回投与することを想定する。動物は、雄、雌、妊娠した雌、及び新生仔であってもよい。この投与は、それらに限定されないが、筋肉内（ＩＭ, intramuscular）、皮内（ＩＤ, intradermal）、又は皮下（ＳＣ, subcutaneous）注射、又は鼻腔内経由又は口径投与を含む、種々の経路を経由してもよい。本発明による治療用組成物はまた、無針装置（例えば、Pigjet、Biojector、又はVitajet装置（Bioject社製、Oreg．、米国）で）によっても投与できる。プラズミド組成物を投与する別の手法は、電気穿孔法の使用である（例えば、S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378；S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238；S. Babiuk et a1., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408；ＰＣＴ出願第９９／０１１５８号明細書を参照）。別の実施形態では、遺伝子銃又は金微粒子銃により、プラズミドを動物に送達する。有利な実施形態では、動物はブタである。
【００８５】
有利には、Ｍ．ハイオニューモニエワクチンは、離乳ブタ（約２〜３週齢）に投与する。ブタは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４日齢であってもよい。追加免疫投与は、必要なら、初回投与のおよそ３〜５週間後に行うことができる。別の有利な実施形態では、ピグレットがＭ．ハイオニューモニエに対する免疫を獲得するように、本発明のＭ．ハイオニューモニエワクチンをソウに投与する。投与は、皮膚（表皮及び真皮）又は真皮下（下皮及び／又は皮下及び／又は筋肉内）に、有利には頚部に、より有利には耳の尾側の頚部領域内にである。この投与経路により、免疫原は樹状ランゲルハンス細胞を標的にできる可能性がある。
【００８６】
液体ジェット無針注入器とは、微細な開口部を介して、所定量の液体を高圧で注射する器具である。注入器の機械的仕様は、組織への浸透の深さを制御するために調整又は選択できる。注射器又は無針注入器を使用した液体の投与では、組織内での液体分布が異なる結果となる。注射器を使用すると、局部的なボーラス又はプールに帰着する。注入器を使用すると、国際公開第０１／１３９７５号パンフレットに図示されているように、標的組織層内で拡散する分布に帰着する。有利な実施形態では、無針注射は、DERMA-VAC NF経皮ワクチン接種器システム（DERMA-VAC NF transdermal vaccinator system）である。
【００８７】
浸透の深さは、主に液体圧力により制御する。この液体圧力は、バネ又は任意の他の推進手段の強度並びにピストン及びノズル開口部の直径などの、注入器の機械的仕様に依存する。これは、当業者であれば、直ちに入手可能である。
【００８８】
注射の深さは、好ましくは目的のワクチンと同じ粘性を有する色付の液体を投与した後で、注射部位の組織を解剖することにより容易に決定できる（好ましくはワクチンを投与しようとする箇所と対応し、検査は、有利には、ワクチン接種する集団と同種及び同年齢の動物に実施する）。この検査は、色素をさらに含有する目的のワクチンを使って、直接的に実施できる。当業者であれば、この検査により注入器の機械的仕様を調整できる。
【００８９】
無針注入器は、１つ又は幾つかのノズルを備えた頭部を装備できる。幾つかのノズルを使用すると、ワクチンの分散パターンをより広域に広げることができる。１つから１０までの、好ましくは１つから６つまでのノズルがあり得る。
【００９０】
注入器は、幾つかが商業的に入手可能である。Vitajet（商標）3（Bioject Inc.社製）は、本発明による方法に特に適している。
【００９１】
有利なのは、標準的バイアル又はアンプルに注入器を直接装着させる手段を装備した注入器の使用である。加えて、ワクチンバイアルは、何回分かのワクチン用量を含むことができ、注入器及び同一のバイアルを使用して、何回かのワクチン接種及び／又は幾つかの動物のワクチン接種が可能になる。したがって、注入器は、好ましくは、同一のバイアルから連続注射を実施できる。
【００９２】
本発明の１つの態様では、Ｍ．ハイオニューモニエに対するワクチン接種と、別のブタ疾患に対するワクチン接種を一緒に行うことができる。そのワクチンは、本発明によるＭ．ハイオニューモニエワクチンと、他のブタ疾患に対して防御可能なワクチン成分とを含む。
【００９３】
注射する用量容積は、約０．１ｍｌから約１．０ｍｌまで、好ましくは約０．１ｍｌ〜約０．８ｍｌ、より好ましくは約０．２ｍｌから約０．５ｍｌまでであり得る。定義上、１回の用量容積とは、１つの動物に一度に投与するワクチンの全容積を意味する。
【００９４】
ワクチンは、約１０４．５から約１０８．０までのＴＣＩＤ５０／用量（ワクチン用量当り、５０％の培養組織が感染する用量）及び好ましくは約１０５．５から約１０６．５までのＴＣＩＤ５０／用量を含有できる。
【００９５】
もし必要又は所望であれば、好適な間隔で、例えば初回投与の約２週間後から約８週間後までに、好ましくは初回投与の約３週間後から約５週間後までに、追加免疫投与として投与を繰り返し可能であってもよい。特にソウには、追加免疫投与を毎年繰り返すこともできる。
【００９６】
本発明の別の目的は、上述の液体ジェット無針注入器を使用して動物に投与するために設計され、Ｍ．ハイオニューモニエに対する安全な防御免疫応答の誘発をもたらすワクチン製剤用に、上述したＭ．ハイオニューモニエワクチンの及び許容される媒体又は希釈剤の有効量を使用することである。
【００９７】
別の目的は、ブタ族の動物にワクチンの投与を実施するように作動可能に組み立てられた、そのような液体ジェット無針注入器と、Ｍ．ハイオニューモニエワクチンを含有する少なくとも１つのワクチンバイアルとを含むワクチン接種キット又はセットである。ワクチンは、本質的に真皮及び下皮内に分布する。
【００９８】
そのようなワクチン接種キット又はセットは、Ｍ．ハイオニューモニエに対する、安全な防御免疫応答を誘発できる。
【００９９】
以下の非限定的な実施例により、以下に本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１００】
新規なマイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンの経皮的無針送達の有効性及び安全性
【０１０１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエは、依然として、ブタの呼吸器疾患の主要な病原体である。ワクチン接種は、今や地球規模で標準的な管理政策の一部である。ワクチン接種計画の全体的な有効性を増加させるであろう任意の向上は、非常に望ましい。これらには、新しい製剤及び抗原提示、服用尊守の向上、動物及びワクチン接種者の安全性の向上、及び最終製品にある注射針リスクの排除を介した、ワクチン有効性の向上が含まれよう（例えば、Almond G. W. and J. D. Roberts, 2004, Assessment of a Needleless Injection Device for Iron Dextran administration to piglets, Proceedings of the IPVS, 618；Houser T. A., J. G. Sebranek, T. J. Baas, B. J. Thacker, D. Nilubol and E. L. Thacker, 2002, Feasibility of Transdermal, Needleless Injections for Prevention of Pork Carcass Defects http://www.ipic.iastate.edu/reports/02swinereports/as1-1814.pdf；Meredith M. J., 2004, AASV New archive, Needle-Free Vaccination http://www.aasp.org/news/stroy.php?id=1279；Sweat J. M., M. Abdy, B. G. Weniger, R. Harrington, B. Coyle, R. A. Abuknesha and E. P. J. Gibbs, 2000, Safety Testing of Needle Free, Jet Injection Devices to Detect Contamination with Blood and Other Tissue Fluids, Annals of the New York Academy of Sciences 916:681-682及びWillson P., 2004, Council Research News, Needle-Free Immunization as Effective as Needle and Syringe Method http://www.manitobapork.com/admin/docs/research_news_ly.pdfを参照）。
【０１０２】
この実施例では、DERMA-VAC（商標）NF経皮ワクチン接種器システムを使用して、経皮的に投与するため特に設計した新規製剤の長期的有効性及び安全性を示す。無針投与は、免疫系への最適なワクチン提示を提供するだけでなく、これらの目的の安全性及び品質の両側面に取り組む潜在能力を有する（例えば、Charreyre C., F. Milward, R. Nordgren and G. Royer, 2005, Demonstration of efficacy in pigs of Mycoplasma hyopneumoniae experimental vaccines by an innovative needle-free route, Proceedings of the American Association of Swine Veterinariansを参照）。
【０１０３】
１６日〜１９日齢の通常のブタを、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの低発生群に由来する通常の母ブタから、４８頭取得した。
【０１０４】
DERMA-VAC NF経皮ワクチン接種器システムを使ってワクチン接種を実施した。この器具は、特別に製剤したバクテリンを、圧縮空気を使用して０．５ｍｌ送達する。無針投与用に製剤したマイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンを、ブタの耳の尾側の頚部領域内に注射した。ワクチンは、動物が治験実施施設に到着した同日に投与した（０日目）。
【０１０５】
ブタは、同腹仔からなるレプリケート（replicate）の全ての構成動物がいるレプリケートで囲い込んだ。各処置群がレプリケート内で同等に代表されるように、ブタは、レプリケート内で処置群に無作為化した：
・第１群（２４頭）は、非ワクチン投与対照からなる。
・第２群（２４頭）は、経皮的経路によりワクチン接種した。
【０１０６】
ブタは、その年齢及び大きさに適切で、環境が制御された建物内に収容した。ブタは、０日目から２１日目まで、側面が頑丈な囲いの中にある、市販のブタ用プラスチック製穴付高架式床上の事前養育場内に収容した。２１日目から５１日目までは、ブタは、通常の養育場に収容した。養育場施設では、亜鉛メッキされた金属かんぬき扉の囲いで、市販のブタ用プラスチック製穴付床をピット上で使用した。５１日目から解剖検査まで（１８９日目、１９０日目又は１９１日目）、ブタは、亜鉛メッキされた金属かんぬき扉の囲いで、コンクリート製の羽根板をピット上で使用した仕上げ用の建物内に収容した。本研究中は、レプリケートの囲いを維持した。水と餌は自由に摂取可能であった。
【０１０７】
血液試料は、２日目（現地外）、２１日目、４２日目、１２５日目、１５５日目（事前負荷）、及び１８９日目、１９０日目又は１９１日目（解剖検査当日）に採取した。血液試料由来の血清を検査して、マイコプラズマ・ハイオニューモニエＥＬＩＳＡ抗体力価を決定した。
【０１０８】
１６０日目及び１６１日目に、フリースで１／１００に希釈した２５ｍｌのマイコプラズマ・ハイオニューモニエ肺ホモジネート(マイコプラズマ・ハイオニューモニエ株２３２）を使って、全てのブタに鼻腔内的に負荷をかけた。１６２日目に、ブタは、あらかじめ冷凍されていたマイコプラズマ・ハイオニューモニエ株ＳＣ２の培養物を２０ｍｌ、鼻腔経路で受容した。負荷物質は、手作業で拘束した機敏なブタの両鼻孔開口部に、注射器で投与した。
【０１０９】
解剖検査では、肺を取り除き、写真を撮影し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに特徴的な肺炎性組織のパーセンテージを点数化した。処置指定を不明にした２つの異なる個体により、独立して肺を点数化した。具体的には、病変に冒された肺の全パーセンテージを各動物毎に決定した。肺炎性組織のパーセンテージは、頭側、中部、及び尾側葉の背側及び腹側表面と、副肺の目視可能な全表面とを目視観察することにより推定した。肺炎性組織内の病変パーセンテージの計算は、表１に示したような、各葉によって表される肺の全質量のパーセンテージに基づいた。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
別途の実地安全性研究では、米国内の３つの異なる地理的地域（ＭＯ、ＰＡ、ＮＣ）に位置する商用施設の６６３頭のブタに、無針投与用に製剤された、Merial社製のマイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンの、２つの異なる事前承認シリアルの１つを使ってワクチン接種した。バクテリンは、DERMA-VAC NF経皮ワクチン接種器システムを使用して投与した。注射後、有害な全身性の異変がないか、ブタを観察した。１日目、３日目、７日目、１４日目及び２１日目には全てのブタの、３４日目又は３５日目には持続的に注射部位が膨潤しているブタの注射部位を、目視及び触診で観察した。
【０１１２】
有効性の研究では、傷害のため、１６２日目に第１群のブタを１頭取り除いた。第１群のもう１頭のブタの肺点数は、過剰接着が存在したため分析には含めなかった。最終的な群の大きさは：
・第１群、非ワクチン接種対照、ブタ２３頭（血清学）、ブタ２２頭（肺点数）
・第２群、経皮試験ワクチン、ブタ２４頭
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗体に対する平均ＥＬＩＳＡ力価は、対照群では、負荷後まで陰性と見なされる数値を維持した。試験ワクチンを接種されたブタは、ワクチン接種後２１日目までに抗体陽性状態に血清転換し、１２５日目まで陽性を維持し、１５５日目には被疑状態に陥り、負荷後には出血し、かなりの既往反応を示した（表２）。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
肺炎性組織の平均パーセンテージは、対照群では４．３５％であったのに対し、ワクチン接種群では１．７２％であった（表３）。経皮経路で投与したマイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンでワクチン接種したブタは、非ワクチン接種対照群での観察より、有意に低い（ｐ＜０．０５）肺炎性肺病変のパーセンテージを示した。
【０１１５】
実地安全性研究中は、ワクチン接種に伴う有害な全身性の異変は観察されなかった。注射部位の明白な潤膨は、アジュバントを使用したバクテリンに典型的であり、ワクチン接種後３５日目までに無視できるレベルまで低下した。
【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
DERMA-VAC NF経皮ワクチン接種器システムを使用して投与したマイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンは、３週齢以前に投与したワクチン単回注射の１６０日後、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの負荷から、ブタを安全に及び有意に防御した。DERMA-VAC NF経皮ワクチン接種器システムを使用して投与したマイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンの全体的な安全性も、多数の動物で、実地条件で実証された。この新しいDERMA-VAC NF経皮ワクチン接種器システムは、無針使用用に特別製剤したマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの特有な提示を提供し、安全、簡便、及び効果的なワクチン接種手順を達成する。
【実施例２】
【０１１８】
米国特許出願第２００５／００７９１８５号明細書に記載のＴＳ６水中油型乳剤で製剤したマイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンを、ＥＬＩＳＡにより決定した異なる免疫原用量で、１６日〜１９日齢のピグレットの頚部領域内に、針付の注射器を使って、筋肉内経路（ＩＭ）で（２ｍｌ）、又は無針器具を使って経皮経路（ＩＤ）で（０．５ｍｌ）のいずれかにより投与した。無針注入器は、３番ノズルを付けたDERMA-VAC NF経皮ワクチン接種器システムであった。フリース培地で１／１００に希釈した１０ｍｌのマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（２３２株）肺ホモジネートを、気管内に投与して免疫した３５日後、及び１０ｍｌの同一懸濁液を鼻腔内経路により投与して免疫した３５日後に、ブタに負荷をかけた。免疫して６１日〜６２日後に、ブタを解剖検査し、肺病変を実施例１に記載のように点数化した。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
ワクチン１〜３の各々に対応する群では、肺炎性の肺組織のパーセントは、対照群と比較して有意に（ｐ＜０．０００１）減少した。ワクチン接種群１、２及び３の病変点数は異なってはいなかった。無針注入器を使用すると、ワクチン内の免疫原用量を１／４削減することができた。
【０１２１】
下記の番号付きの項により、さらに本発明を説明する：
１．マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する安全な防御免疫応答を誘発する方法であって、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ及びアジュバントを含むワクチンの単回用量を、液体ジェット無針注入器でブタに投与することを含む方法。
【０１２２】
２．アジュバントがＴＳ６アジュバントである、第１項に記載の方法。
【０１２３】
３．ブタが離乳ピグレットである、第１項又は第２項に記載の方法。
【０１２４】
４．離乳ピグレットが約１１〜約２４日齢である、第３項に記載の方法。
【０１２５】
５．離乳ピグレットが約２〜３週齢である、第３項に記載の方法。
【０１２６】
６．ブタがソウである、第１項〜第５項のいずれかに記載の方法。
【０１２７】
７．無針注入器がDERMA-VAC NF注入器である、第１項〜第５項のいずれかに記載の方法。
【０１２８】
８．ブタに前記ワクチンの投与を実施し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する安全な防御免疫応答を誘発するように作動可能に組み立てられた、液体ジェット無針注入器と、マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンを含有する少なくとも１つのワクチンバイアルとを含むワクチン接種キット又はセット。
【０１２９】
９．第１項〜第７項のいずれかに記載の組成物と、第１項〜第７項に記載の方法のいずれか１つを実施するための説明書とを含む、第８項に記載のワクチン接種キット又はセット。
【０１３０】
このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、上記の項目により定義された本発明は、その自明な変形様態が本発明の趣旨又は範囲を逸脱せずに数多く可能であるため、上記の説明で示された具体的な詳細に限定されないことが理解されるべきである。
【国際調査報告】
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