(57)【要約】本発明は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と共に、核酸を含む組み換え型ベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変された宿主細胞において官能化化合物を産生する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通ドメイン、分泌ドメイン、可溶化ドメイン、および膜挿入タンパク質から選択されるドメインをコードするヌクレオチド配列、ならびにチトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を、5'から3'の順序で機能的に連結して含む核酸であって、該ドメインがチトクロームP450酵素に対して異種である核酸。
【請求項２】
膜貫通ドメインが原核宿主細胞において機能的である、請求項1記載の核酸。
【請求項３】
チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列が、原核宿主細胞における発現に向けてコドン最適化されている、請求項1記載の核酸。
【請求項４】
チトクロームP450酵素がイソプレノイド前駆体の修飾を触媒するイソプレノイド前駆体修飾酵素である、請求項1記載の核酸。
【請求項５】
修飾が、酸化、ヒドロキシル化、およびエポキシ化から選択される、請求項4記載の核酸。
【請求項６】
チトクロームP450レダクターゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1記載の核酸。
【請求項７】
請求項1記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項7記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
メバロン酸経路を通してイソペンテニルピロリン酸を通常産生しない細胞である、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項１０】
原核生物である、請求項9記載の宿主細胞。
【請求項１１】
異種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項１２】
チトクロームP450レダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項１３】
2つまたはそれ以上のメバロン酸経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸によって遺伝子改変されている、請求項9記載の宿主細胞。
【請求項１４】
適した培地において遺伝子改変宿主細胞を培養する段階であって、宿主細胞が、酵素的に活性な改変チトクロームP450酵素を産生するために、膜貫通ドメイン、分泌ドメイン、可溶化ドメイン、および膜挿入タンパク質から選択されるドメインに機能的に連結されているチトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変されている段階を含む、
宿主細胞において生合成経路産物を産生する方法であって、
生合成経路中間体の存在下で、該改変チトクロームP450酵素の産生によって、生合成経路中間体の酵素的修飾および生合成経路産物の産生がもたらされる、方法。
【請求項１５】
チトクロームP450酵素がイソプレノイド前駆体修飾酵素であり、イソプレノイド前駆体化合物の存在下で、該イソプレノイド前駆体修飾酵素の産生によって、イソプレノイド前駆体の酵素的修飾およびイソプレノイド化合物の産生がもたらされる、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞が真核宿主細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が植物細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が原核細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
宿主細胞が、異種テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸によってさらに遺伝子改変されている、請求項15記載の方法であって、
培養する段階が該テルペンシンターゼの産生を提供し、該テルペンシンターゼがポリプレニルピロリン酸を修飾してイソプレノイド修飾酵素の基質を生成する、方法。
【請求項２１】
ポリプレニルピロリン酸がファルネシルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸、およびゲラニルゲラニルピロリン酸から選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞が、チトクロームP450レダクターゼ（CPR）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によってさらに遺伝子改変されている、請求項14記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞が、メバロン酸経路を通してイソペンテニルピロリン酸（IPP）を通常合成しない細胞であり、メバロン酸経路における2つまたはそれ以上の酵素、IPPイソメラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、およびテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸によって遺伝子改変されている、請求項15記載の方法であって、
培養する段階がメバロン酸経路酵素の産生を提供し、該2つまたはそれ以上のメバロン酸経路酵素、IPPイソメラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、テルペンシンターゼ、およびイソプレノイド前駆体修飾酵素の産生によって、イソプレノイド化合物の産生がもたらされる、方法。
【請求項２４】
2つまたはそれ以上のメバロン酸経路酵素がメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼを含み、宿主細胞がメバロネートの存在下で培養される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
2つまたはそれ以上のメバロン酸経路酵素が、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている、請求項14記載の方法。
【請求項２７】
イソプレノイド化合物が少なくとも約10 mg/リットルの量で産生される、請求項15記載の方法。
【請求項２８】
生合成経路産物を単離する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イソプレノイド化合物の産生、特にイソプレノイド前駆体修飾酵素をコードする核酸によって遺伝子改変された宿主細胞の分野に属する。
【０００２】
相互参照
本出願は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2005年10月7日に提出された米国特許出願第60/724,525号および2006年1月27日に提出された米国特許仮出願第60/762,700号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
イソプレノイドは、共通の生合成起源、すなわち単一の代謝前駆体であるイソペンテニル二リン酸（IPP）を有するきわめて大きく多様な天然物群である。イソプレノイド化合物はまた、「テルペン」または「テルペノイド」とも呼ばれる。40,000種を超えるイソプレノイドが記述されている。定義により、イソプレノイドはいわゆるイソプレン（C5）単位で構成される。イソプレノイドに存在するC-原子の数は、典型的には5で割り切れる（C5、C10、C15、C20、C25、C30およびC40）が、変則的なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されている。イソプレノイドの重要なメンバーには、カロテノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、およびヘミテルペンが含まれる。カロテノイドには、たとえばリコペン、βカロテン等が含まれ、その多くが抗酸化剤として機能する。セスキテルペノイドには、たとえば抗マラリア活性を有する化合物であるアーテミシニンが含まれる。ジテルペノイドには、たとえば癌化学療法剤であるタキソールが含まれる。
【０００４】
イソプレノイドは、最も数が多く構造的に多様な天然物ファミリーを含む。このファミリーにおいて、植物および他の天然供給源から単離されたテルペノイドは、抗マラリア剤および抗癌剤として用いられると共に、市販の香料および香水化合物として用いられる。今日用いられているテルペノイド化合物の大部分は天然物またはその誘導体である。これらの天然物の多くの供給源となる生物（たとえば、樹木、海洋無脊椎動物）は、商業的に生育可能な量を産生するために必要な大規模養殖にも、これらの化合物の産生または誘導体化の増加のための遺伝子操作にも耐えられない。したがって、天然物は、類似体からの半合成によって、または従来の化学合成を用いて合成によって産生されなければならない。さらに、多くの天然物は複雑な構造を有し、その結果として現在、合成は不経済または不可能である。そのような天然物は、樹木、海綿、珊瑚および海洋微生物のようなその固有の供給源から抽出されるか、またはより豊富な前駆体から合成もしくは半合成によって産生されなければならない。固有の供給源からの天然物の抽出は、固有の供給源の入手によって限定され、天然物の合成または半合成産生は、低い収量および／または高い費用という欠点を有しうる。そのような産生に関する問題および天然供給源の限定的な入手可能性は、そのような産物の商業的開発および臨床開発を制限しうる。
【０００５】
操作された（遺伝子改変された）宿主細胞におけるたとえばインビトロ（たとえば、発酵系における）またはインビボ（たとえば、遺伝子改変多細胞生物における）でのイソプレノイド天然物の生合成は、これらの天然資源の実現されていない商業的および治療的可能性を引き出すことができ、より安価でより広く利用可能な精製化学製品および薬剤を生じることができるであろう。遺伝子改変宿主におけるイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆化合物の産生に対する1つの障害は、イソプレノイド化合物のポリプレニル前駆体を修飾する、またはイソプレノイド前駆体を修飾する酵素の効率的な産生である。
【０００６】
多くの天然物標的の生化学的変換における最も重要なクラスの酵素の1つは、チトクロームP450（P450）スーパーファミリーであり、これは驚くほど広いスペクトルの代謝反応に関与している。1つの顕著な例として、P450は、その前駆体であるゲラニルゲラニルピロリン酸からのタキソールの生合成における約20の段階の8段階を触媒する。
【０００７】
イソプレノイド化合物の高レベル産生を提供する、改善されたイソプレノイド産生またはイソプレノイド前駆体産生宿主細胞が当技術分野において必要である。本発明は、この必要性に取り組み、関連する利点をもたらす。
【０００８】
文献
米国特許出願第2004/005678号；米国特許出願第2003/0148479号；Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7):796-802；Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67-71；Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182(15): 4319-27；米国特許出願第2004/0194162号；Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63:3341-3344；Jackson et al. (2003) Organ. Lett. 5:1629-1632；米国特許出願第2004/0072323号；米国特許出願第2004/0029239号；米国特許出願第2004/0110259号；米国特許出願第2004/0063182号；米国特許第5,460,949号；米国特許出願第2004/0077039号；米国特許第6,531,303号；米国特許第6,689,593号；Hamano et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1627-1635；T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934；T. Kazuhiko. (2004) Biotechnology Letters. 26: 1487-1491；Brock et al. (2004) Eur J. Biochem. 271: 3227-3241；Choi et al. (1999) Appl. Environ. Microbio. 65 4363-4368；Parke et al. (2004) Appl. Environ. Microbio. 70: 2974-2983；Subrahmanyam et al. (1998) J. Bact. 180: 4596-4602；Murli et al. (2003) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 500-509；Starai et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:26200-26205；およびStarai et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1005-1012；Jennewein et al. Chem. Biol. 2004, 11, 379-387；Sowden et al. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 57-64；Luo et al. Plant J. 2001, 28, 95-104；Carter et al. Phytochem. 2003, 64, 425-433；Craft et al. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 5983-5991；Barnes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 5597-5601；Schoch et al. Plant Physiol. 2003, 133, 1198-1208；Roosild et al. Science 2005, 307, 1317-1321。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と共に、核酸を含む組み換え型ベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変された宿主細胞における官能化化合物を産生する方法をさらに提供する。
【００１０】
定義
「イソプレノイド」、「イソプレノイド化合物」、「テルペン」、「テルペン化合物」、「テルペノイド」、および「テルペノイド化合物」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。イソプレノイド化合物は様々な数のいわゆるイソプレン（C5）単位で構成される。イソプレノイドに存在するC-原子の数は典型的には、5で均等に割り切れる（たとえば、C5、C10、C15、C20、C25、C30、およびC40）。変則的なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されており、それらも同様に「イソプレノイド」の定義に含まれる。イソプレノイド化合物には、モノテルペン、セスキテルペン、トリテルペン、ポリテルペン、およびジテルペンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００１１】
本明細書において用いられるように、「プレニル二リン酸」という用語は、「プレニルピロリン酸」と互換的に用いられ、これには1つのプレニル基（たとえば、IPPおよびDMAPP）を有するモノプレニル二リン酸と共に、2つまたはそれ以上のプレニル基を含むポリプレニル二リン酸が含まれる。モノプレニル二リン酸には、イソペンテニルピロリン酸（IPP）およびその異性体であるジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）が含まれる。
【００１２】
本明細書において用いられるように、「テルペンシンターゼ」という用語は、テルペノイド前駆化合物が産生されるように、IPP、DMAPP、またはポリプレニルピロリン酸を酵素的に修飾する任意の酵素を指す。「テルペンシンターゼ」という用語には、プレニル二リン酸のイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体への変換を触媒する酵素が含まれる。
【００１３】
「ピロリン酸塩」という用語は、本明細書において「二リン酸塩」と互換的に用いられる。このように、たとえば「プレニル二リン酸」と「プレニルピロリン酸」という用語は互換的であり；「イソペンテニルピロリン酸」と「イソペンテニル二リン酸」という用語は互換的であり；「ファルネシル二リン酸」と「ファルネシルピロリン酸」という用語は互換的等である。
【００１４】
「メバロン酸経路」または「MEV経路」は、本明細書においてアセチル-CoAをIPPに変換する生合成経路を指すために用いられる。メバロン酸経路は、以下の段階を触媒する酵素を含む：（a）アセチル-CoA 2分子をアセトアセチル-CoAに縮合する段階；（b）アセトアセチル-CoAをアセチル-CoAと縮合してHMG-CoAを形成する段階；（c）HMG-CoAをメバロネートに変換する段階；（d）メバロネートをメバロン酸5-リン酸にリン酸化する段階；（e）メバロン酸5-リン酸をメバロン酸5-ピロリン酸に変換する段階；および（f）メバロン酸5-ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する段階。メバロン酸経路は、図17において図示されている。メバロン酸経路の「上半分」は、MEV経路中間体を通してアセチル-CoAのメバロネートへの変換に関わる酵素を指す。
【００１５】
「1-デオキシ-D-キシルロース5-二リン酸経路」または「DXP経路」という用語は、本明細書において、DXP経路中間体を通してグリセルアルデヒド3-リン酸およびピルベートをIPPおよびDMAPPに変換する経路を指すために用いられ、DXP経路は図18に図解される反応を触媒する酵素を含む。
【００１６】
本明細書において用いられるように、「プレニルトランスフェラーゼ」という用語は、「イソプレニル二リン酸シンターゼ」および「ポリプレニルシンターゼ」（たとえば「GPPシンターゼ」、「FPPシンターゼ」、「OPPシンターゼ」等）という用語と互換的に用いられ、イソペンテニル二リン酸とアリルプライマー基質との連続的1'-4縮合を触媒して、それによって様々な鎖長のプレニル二リン酸が形成される酵素を指す。
【００１７】
本明細書において互換的に用いられる「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、任意の長さの、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合型を指す。このように、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖DNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、またはその他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された非天然、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００１８】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸の重合型を指し、これには、コードおよび非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれうる。
【００１９】
本明細書において用いられるように、核酸、細胞、または生物に適用される「天然に存在する」という用語は、天然において見いだされる核酸、細胞、または生物を指す。たとえば、天然の供給源から単離されうる、および研究室においてヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００２０】
本明細書において用いられるように、「単離された」という用語は、その中でポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が天然に存在する環境とは異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を記述することを意味する。単離された遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞の混合集団に存在してもよい。
【００２１】
本明細書において用いられるように、「外因性の核酸」という用語は、天然における所定の細菌、生物、または細胞によって通常または天然に見いだされないおよび／または産生されない核酸を指す。本明細書において用いられるように、「内因性の核酸」という用語は、天然における所定の細菌、生物、または細胞によって通常見いだされるおよび／または産生される核酸を指す。「内因性の核酸」はまた、「固有の核酸」または所定の細菌、生物、もしくは細胞に「固有」である核酸とも呼ばれる。たとえば、HMGS、メバロン酸キナーゼ、およびホスホメバロン酸キナーゼをコードする核酸は、大腸菌（E.coli）に対して外因性の核酸を表す。これらのメバロン酸経路の核酸は、出芽酵母（Sacchromyces cerevisiae）からクローニングされた。出芽酵母において、染色体におけるHMGS、MK、およびPMKをコードする遺伝子配列は、「内因性の」核酸であると考えられる。
【００２２】
本明細書において用いられるように、「異種核酸」という用語は、以下の少なくとも１つが当てはまる核酸を指す：（a）核酸が所定の宿主微生物または宿主細胞に対して異物（「外因性」）である（すなわち天然に見いだされない）；（b）核酸が所定の宿主微生物または宿主細胞において天然に見いだされる（すなわち「内因性」である）ヌクレオチド配列を含む（たとえば、核酸は宿主微生物または宿主細胞に対して内因性であるヌクレオチド配列を含む）が、細胞において非天然の（たとえば、予想より多い、または天然に見いだされるより多い）量で産生される、または内因性に見いだされるタンパク質と同じコードされるタンパク質（同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する）が細胞において非天然の（たとえば、予想されるより多い、または天然に見いだされるより多い）量で産生されるように、内因性のヌクレオチド配列とは配列が異なるヌクレオチド配列を含む；（c）核酸が、天然において互いに同じ関係で見いだされない、たとえば核酸が組み換え型である、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列またはセグメントを含む。
【００２３】
本明細書において用いられるように、「異種ポリペプチド」という用語は、所定のポリペプチドに天然には結合していないポリペプチドを指す。たとえば、「異種膜貫通ドメイン」を含むイソプレノイド前駆体-修飾酵素は、天然においてイソプレノイド前駆体-修飾酵素に通常結合していない（たとえば、通常隣接しない；同じポリペプチド鎖において通常見いだされない）膜貫通ドメインを含むイソプレノイド前駆体-修飾酵素を指す。同様に、1つまたは複数の「異種分泌ドメイン」、「異種膜挿入ポリペプチド」、および「異種可溶化ドメイン」を含むイソプレノイド前駆体-修飾酵素は、天然においてイソプレノイド前駆体-修飾酵素に通常結合していない（たとえば、通常隣接していない；通常同じポリペプチド鎖において見いだされない）1つまたは複数の分泌ドメイン、膜挿入ポリペプチド、および可溶化ドメインを含むイソプレノイド前駆体-修飾酵素である。
【００２４】
本明細書において用いられるように、「組み換え型」とは、特定の核酸（DNAまたはRNA）がクローニング、制限、および／またはライゲーション段階の様々な組み合わせの産物であって、それによって天然の系において見いだされる内因性の核酸と区別されうる構造的なコードまたは非コード配列を有する構築物となっていることを意味する。一般的に、構造的コード配列をコードするDNA配列は、cDNA断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ、細胞または無細胞転写および翻訳系に含まれる組み換え型転写単位から発現されうる合成核酸を提供することができる。そのような配列は、典型的に真核細胞遺伝子に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形で提供されうる。関連する配列を含むゲノムDNA配列はまた、組み換え型遺伝子または転写単位の形成に用いることができる。非翻訳DNA配列は、オープンリーディングフレームから5'または3'に存在してもよく、そのような配列は、操作またはコード領域の配列を妨害せず、実際に様々なメカニズムによって所望の産物の産生を調節するように作用する可能性がある（以下の「DNA調節配列」を参照されたい）。
【００２５】
このように、たとえば、「組み換え型」ポリヌクレオチドまたは「組み換え型」核酸という用語は、天然に存在しない、たとえばヒトの介入を通して、そうでなければ分離された2つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせはしばしば、化学合成手段によって、または単離された核酸セグメントの人工的な操作によって、たとえば遺伝子操作技術によって行われる。それは通常、典型的には配列認識部位を導入または除去しながら、同じまたは保存的アミノ酸をコードする重複コドンにコドンを交換するために行われる。または、望ましい機能の組み合わせを生成するように所望の機能の核酸セグメントを互いに連結させることが行われる。この人工的な組み合わせはしばしば、化学合成手段、または単離された核酸セグメントの人工的な操作によって、たとえば遺伝子操作技術によって行われる。
【００２６】
同様に、「組み換え型」ポリペプチドという用語は、天然に存在しない、たとえばヒトの介入を通して、そうでなければ分離されている2つのアミノ酸配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるポリペプチドを指す。このように、たとえば異種アミノ酸配列を含むポリペプチドは組み換え型である。
【００２７】
「構築物」または「ベクター」とは、特異的ヌクレオチド配列の発現および／または増殖を目的として生成されている、または他の組み換え型ヌクレオチド配列の構築のために用いられる、組み換え型核酸、一般的に組み換え型DNAを意味する。
【００２８】
本明細書において用いられるように、「オペロン」および「単一の転写単位」は、1つまたは複数の制御因子（たとえば、プロモーター）によって協調的に調節される2つまたはそれ以上の隣接コード領域（RNAまたはタンパク質のような遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列）を指すために互換的に用いられる。本明細書において用いられるように、「遺伝子産物」という用語は、DNAによってコードされるRNA（またはその逆）、またはRNAもしくはDNAによってコードされるタンパク質を指し、この場合遺伝子は典型的にはタンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含み、同様にイントロンおよび他の非コードヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００２９】
本明細書において互換的に用いられる「DNA調節配列」、「制御因子」、および「調節因子」という用語は、宿主細胞内でコード配列の発現および／またはコードされるポリペプチドの産生を提供および／または調節するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等のような転写および翻訳制御配列を指す。
【００３０】
「形質転換」という用語は、本明細書において「遺伝子改変」と互換的に用いられ、新しい核酸（すなわち、細胞に対して外因性のDNA）の導入後に細胞において誘導される永続的または一過性の遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「改変」）は、宿主細胞のゲノムへの新しいDNAの取り込みによって、またはエピソーム因子としての新しいDNAの一過性もしくは安定な維持のいずれかによって達成されうる。細胞が真核細胞である場合、永続的な遺伝的変化は一般的に細胞のゲノムへのDNAの導入によって達成される。原核細胞では、永続的な変化は、染色体内に導入されうる、または組み換え型宿主細胞におけるその維持を補助するための１つもしくは複数の選択マーカーを含みうるプラスミドおよび発現ベクターのような染色体外因子によって導入されうる。遺伝子改変に適した方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等が含まれる。方法の選択は一般的に、形質転換される細胞のタイプ、および形質転換が起こる状況（すなわちインビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法に関する一般的な考察は、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995において見いだされうる。
【００３１】
「機能的に連結されている」とは、そのように記述された成分がその意図される様式で機能することを許容する関係で並置されていること指す。たとえば、プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。本明細書において用いられるように、「異種プロモーター」および「異種制御領域」は、天然では特定の核酸に通常結合していないプロモーターおよび他の制御領域を指す。たとえば、「コード領域に対して異種である転写制御領域」は、天然ではコード領域に通常結合していない転写制御領域である。
【００３２】
本明細書において用いられるように、「宿主細胞」は、インビボまたはインビトロの真核細胞、原核細胞、または単細胞体として培養された多細胞生物からの細胞（たとえば、細胞株）を示し、ここで、真核細胞または原核細胞は、核酸（たとえば、メバロン酸経路遺伝子産物のような1つまたは複数の生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター）のレシピエントとして用いられうる、または用いられており、その核酸によって遺伝子改変されている当初の細胞の子孫が含まれる。単細胞子孫は、天然、偶発的、または故意の変異により当初の親と形態、またはゲノムもしくは総DNA相補性において必ずしも完全に同一である必要はないと理解される。「組み換え型宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも呼ばれる）は、その中に異種核酸、たとえば発現ベクターが導入されている宿主細胞である。たとえば、本発明の原核宿主細胞は、異種核酸、たとえば原核宿主細胞に対して異物である（通常天然において見いだされない）外因性核酸または原核宿主細胞に通常見いだされない組み換え型核酸を、適した原核宿主細胞に導入することによる、遺伝子改変原核宿主細胞（たとえば、細菌）であり；および本発明の真核宿主細胞は、異種核酸、たとえば真核宿主細胞に対して異物である外因性核酸または真核宿主細胞に通常見いだされない組み換え型核酸を適した真核宿主細胞に導入することによる、遺伝子改変真核宿主細胞である。
【００３３】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンからなり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニン、およびヒスチジンからなり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミンである。
【００３４】
「合成核酸」は、当業者に公知の技法を用いて化学合成されるオリゴヌクレオチド構築ブロックから組み立てることができる。これらの構築ブロックをライゲーションおよびアニールして、遺伝子セグメントを形成し、次にこれらを酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築する。DNA配列に関連して「化学合成された」とは、成分ヌクレオチドがインビトロで組み立てられたことを意味する。十分に確立された技法を用いて、DNAの手動での化学合成を行ってもよく、または多数の市販の機械の1つを用いて自動化学合成を行うこともできる。核酸のヌクレオチド配列は、宿主細胞のコドンの偏りを反映するためのヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な発現となるように改変することができる。当業者は、コドンの使用を宿主によって好都合となるコドンに向けて偏らせれば、発現成功の可能性があることを認識している。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手できる、宿主に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【００３５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、もう1つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する特定の割合（パーセント）の「配列同一性」を有し、このことは整列させた場合に、そのパーセンテージの塩基またはアミノ酸が同じで、2つの配列を比較した場合に同じ相対的位置に存在することを意味する。配列類似性は、異なる多数の方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブ上のncbi.nlm.nih.gov/BLASTで入手可能なBLASTを含む方法およびコンピュータープログラムを用いて、配列を整列させることができる。たとえば、Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10を参照されたい。もう1つのアラインメントアルゴリズムは、Oxford Molecular Group, Inc.の完全所有子会社であるGenetics Computing Group (GCG) package、Madison, Wisconsin, USAにおいて入手可能なFASTAである。他のアラインメント技術は、 Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USAにおいて記述されている。特に重要であるのは、配列においてギャップを許容するアラインメントプログラムである。Smith-Watermanは配列アラインメントにおいてギャップを許容する1つのタイプのアルゴリズムである。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)を参照されたい。同様に、配列を整列させるために、Needleman and Wunschのアラインメント法を用いるGAPプログラムを利用することができる。J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)を参照されたい。
【００３６】
核酸は、一本鎖型の核酸が温度および溶液のイオン強度の適当な条件下で他の核酸とアニールすることができる場合に、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAのようなもう1つの核酸と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)、特にその中の第11章および表11.1；ならびにSambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)において例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同な配列のような中等度に類似の断片から、近縁の生物からの機能的酵素を複製する遺伝子のような高度に類似の断片に関してスクリーニングするように調節することができる。ハイブリダイゼーション条件およびハイブリダイゼーション後の洗浄は、ハイブリダイゼーションの所望のストリンジェンシー条件を得るために有用である。一組の例示的なハイブリダイゼーション後洗浄は、6×SSC（SSCは、0.15 M NaCl、および15 mMクエン酸緩衝液）、0.5％SDSによって室温で15分間から開始して、2×SSC、0.5％SDSで45℃で30分間繰り返し、次に、0.2×SSC、0.5％SDSで50℃で30分間2回繰り返す一連の洗浄である。他のストリンジェントな条件は、最後の0.2×SSC、0.5％SDSにおける2回の30分間の洗浄の温度を60℃に増加したことを除き、洗浄が上記と同一である、より高温を用いることによって得られる。もう1つの組の高ストリンジェント条件は、0.1×SSC、0.1％SDSで65℃での最後の2回の洗浄を用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもう1つの例は、50℃またはそれより高い温度および0.1×SSC（15 mM塩化ナトリウム／1.5 mMクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもう1つの例は、溶液：50％ホルムアミド、5×SSC（150 mM NaCl、15 mMクエン酸三ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAにおいて42℃での終夜インキュベーションの後に、フィルターを0.1×SSCで約65℃で洗浄することである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、上記の代表的な条件と少なくとも同程度にストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件およびハイブリダイゼーション後洗浄条件である。
【００３７】
ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにより、塩基間のミスマッチが起こりうる。核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェンシーは、当技術分野において周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度がより大きければ、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Tm）の値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いTmに対応する）は、以下の順に減少する：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。長さが100ヌクレオチドより大きいハイブリッドに関して、Tmを計算する式が導かれている（Sambrook et al.、前記、9.50-9.51を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook et al.、前記、11.7-11.8を参照されたい）。典型的に、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約10ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例としての最小の長さは、少なくとも約15ヌクレオチド；少なくとも約20ヌクレオチド；および少なくとも約30ヌクレオチドである。さらに、当業者は温度および洗浄溶液の塩濃度を、プローブの長さのような要因に従って必要に応じて調節してもよいことを認識すると考えられる。
【００３８】
本発明をさらに記述する前に、本発明は、記述した特定の態様に限定されず、そのため当然変化する可能性があることが理解される。同様に、本明細書において用いた術語は、特定の態様を記述する目的のために限られ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されると考えられることから制限することは意図されないと理解すべきである。
【００３９】
値の範囲が提供される場合、文脈が明らかにそうでないことを明示している場合を除き、その下限の単位の10分の1までのそれぞれの介在する値、その範囲の上限と下限のあいだ、および記載の範囲における任意の他の記載の値または介在する値が本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載の範囲の特に除外された任意の限度により、同様に本発明に含まれる。記載の範囲に1つまたは双方の限度が含まれる場合、それらの含まれる限度のいずれかまたは双方を除外する範囲も同様に本発明に含まれる。
【００４０】
特に明記していなければ、本明細書において用いた全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記述の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料をここに記述する。本明細書において言及した全ての刊行物は、刊行物が引用される内容と結びつけて方法および／または材料を開示および記述するために参照により本明細書に組み入れられる。
【００４１】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「１つの（a）」、「および」および「その（the）」には、文脈が明らかにそうでないことを明示している場合を除き、複数形が含まれることに注意しなければならない。このように、たとえば「１つの（a）チトクローム450酵素」という言及には、そのような酵素の複数が含まれ、「その（the）チトクロームP450レダクターゼ」という言及には、当業者に公知の１つまたは複数のチトクロームP450レダクターゼおよびその同等物に対する言及が含まれる等である。さらに特許請求の範囲は任意の要素を除外するように草案される可能性があることに注意されたい。そのためこの言説は、特許請求の範囲の要素の引用、または「消極的な」制限の使用と結びつけて、「単独で（solely）」、「のみ（only）」等のような排他的術語を用いるための根拠としてはたらくことが意図される。
【００４２】
本明細書において論じられる刊行物は、単に本出願の提出日以前にその開示がなされたために提供される。本明細書内のいかなる事項も、本発明が先行発明によって、そのような刊行物に先行する権利を有さないと自認したと解釈されるべきではない。さらに、提供される公布日は実際の公布日とは異なる可能性があり、それらは個々に確認する必要がある。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と共に、核酸を含む組み換え型ベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はさらに、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変された宿主細胞における官能化化合物を産生する方法を提供する。
【００４４】
本発明は、イソプレノイド前駆体修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と共に、核酸を含む組み換え型ベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明は、宿主細胞において、酵素的に活性なイソプレノイド前駆体修飾酵素を産生する方法を提供する。本発明はさらに、イソプレノイド前駆体-修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変された宿主細胞においてイソプレノイド化合物を産生する方法を提供する。
【００４５】
核酸、ベクター、および宿主細胞
本発明は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と共に、核酸を含む組み換え型ベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、イソプレノイド前駆体-修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と共に、核酸を含む組み換え型ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００４６】
本明細書において用いられるように、「改変チトクロームP450酵素」という用語は、生合成経路における中間体を修飾する（たとえば、官能化する）酵素を指す。本発明の核酸によってコードされる改変チトクロームP450酵素は、以下の反応の1つまたは複数を触媒する：ヒドロキシル化、酸化、エポキシ化、脱水、脱水素化、脱ハロゲン化、異性体化、アルコール酸化、アルデヒド酸化、脱アルキル化、およびC-C結合切断。そのような反応は本明細書において一般的に「生合成経路中間体修飾」と呼ばれる。これらの反応は、たとえば、Sono et al. ((1996)Chem. Rev. 96:2841-2887において記述されている；たとえばそのような反応の図解に関してはSonoらの図3を参照されたい。
【００４７】
いくつかの態様において、改変チトクロームP450酵素はイソプレノイド前駆体修飾酵素である。本明細書において「イソプレノイド修飾酵素」と互換的に用いられる「イソプレノイド前駆体修飾酵素」という用語は、イソプレノイド前駆体化合物、たとえば基質としてのイソプレノイド前駆体化合物を修飾する酵素を指し、イソプレノイド前駆体修飾酵素は以下の反応の1つまたは複数を触媒する：ヒドロキシル化、エポキシ化、酸化、脱水、脱水素化、脱ハロゲン化、異性体化、アルコール酸化、アルデヒド酸化、脱アルキル化、およびC-C結合切断。そのような反応は本明細書において一般的に「イソプレノイド前駆体修飾」と呼ばれる。これらの反応は、たとえば、Sono et al. ((1996)前記；たとえばそのような反応の図解に関してはSonoらの図3を参照されたい）において記述されている。イソプレノイド前駆体修飾酵素は、多くの態様においてチトクロームP450酵素である。たとえばSonoら（1996）、前記を参照されたい。
【００４８】
改変チトクロームP450酵素の基質
先に述べたように、改変チトクロームP450酵素の基質は、生合成経路の中間体である。例示的な中間体には、イソプレノイド前駆体；アルカロイド前駆体；フェニルプロパノイド前駆体；フラボノイド前駆体；ステロイド前駆体；ポリケチド前駆体；マクロライド前駆体；糖アルコール前駆体；フェノール化合物前駆体等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。たとえば、Hwang et al. ((2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:2699-2706；Facchini et al. ((2004) TRENDS Plant Sci. 9:116を参照されたい。
【００４９】
関心対象である生合成経路産物には、イソプレノイド化合物、アルカロイド化合物、フェニルプロパノイド化合物、フラボノイド化合物、ステロイド化合物、ポリケチド化合物、マクロライド化合物、糖アルコール、フェノール化合物等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００５０】
アルカロイド化合物は、植物種の約20％において見いだされる天然物の大きく多様な群である。それらは一般的に、複素環内で酸化状態の窒素原子の存在によって定義される。アルカロイド化合物には、ベンジルイソキノリンアルカロイド化合物、インドールアルカロイド化合物、イソキノリンアルカロイド化合物等が含まれる。アルカロイド化合物には、単環式アルカロイド化合物、二環式アルカロイド化合物、三環式アルカロイド化合物、四環式アルカロイド化合物と共にケージ構造を有するアルカロイド化合物が含まれる。アルカロイド化合物には、1）ピリジン基：ピペリン、コニイン、トリゴネリン、アレカイジン、グバシン、ピロカルピン、シチシン、スパルテイン、ペレチエリン；2）ピロリジン基：ヒグリン、ニコチン、クスコヒグリン；3）トロピン基：アトロピン、コカイン、エクゴニン、ペレチエリン、スコポラミン；4）キノリン基：キニーネ、ジヒドロキニーネ、キニジン、ジヒドロキニジン、ストリキニーネ、ブルシン、およびベラトラムアルカロイド（たとえば、ベラトリン、セバジン）；5）イソキノリン基：モルヒネ、コデイン、テバイン、パパベリン、ナルコチン、ナルセイン、ヒドラスチン、およびベルベリン；6）フェネチルアミン基：メタンフェタミン、メスカリン、エフェドリン；7）インドール基：トリプタミン（たとえば、ジメチルトリプタミン、シロシビン、セロトニン）、エルゴリン（たとえば、エルギン、エルゴタミン、リセルグ酸等）、およびβ-カルボリン（たとえば、ハルミン、ヨヒンビン、レセルピン、エメチン）；8）プリン基：キサンチン（たとえば、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン）；9）テルペノイド基：アコニットアルカロイド（たとえば、アコニチン）およびステロイド（たとえば、ソラニン、サマンダリン）；10）ベタイン基：（四級アンモニウム化合物、たとえばムスカリン、コリン、ノイリン）；ならびに11）ピラゾール基：ピラゾール、フォメピゾールが含まれる。例示的なアルカロイド化合物は、モルヒネ、ベルベリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、コカイン、スコポラミン、カフェイン、ニコチン、アトロピン、パパベリン、エメチン、キニーネ、レセルピン、コデイン、セロトニン等である。たとえば、Facchini et al.（(2004) Trends Plant Science 9:116）を参照されたい。
【００５１】
イソプレノイド修飾酵素の基質
「イソプレノイド前駆体化合物」という用語は、「イソプレノイド前駆体基質」と互換的に用いられ、ポリプレニル二リン酸に対するテルペンシンターゼの反応産物である化合物を指す。テルペンシンターゼ（同様に「テルペンシクラーゼ」とも呼ばれる）反応作用の産物はいわゆる「テルペン骨格」である。いくつかの態様において、イソプレノイド修飾酵素はテルペン骨格またはその下流の産物の修飾を触媒する。このように、いくつかの態様において、イソプレノイド前駆体はテルペン骨格である。イソプレノイド前駆体修飾酵素のイソプレノイド前駆体基質には、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、およびセスキテルペンが含まれる。
【００５２】
本発明の核酸によってコードされるイソプレノイド修飾酵素のモノテルペン基質には、モノテルペン化合物であるか、またはモノテルペン化合物を生じる生合成経路における中間体である酸化産物を生じる任意のモノテルペン基質が含まれるがこれらに限定されるわけではない。例示的なモノテルペン基質には、以下のファミリーのいずれかに属するモノテルペン基質が含まれるがこれらに限定されるわけではない：非環式モノテルペン、ジメチルオクタン、メンタン、変則的なモノテルペノイド、シネオール、カンフェン、イソカンフェン、単環式モノテルペン、ピナン、フェンカン、ツジャン、カラン、イオノン、イリダン、およびカンナビノイド。例示的なモノテルペン基質、中間体、および産物には、リモネン、シトラネロール、ゲラニオール、メントール、ペリリルアルコール、リナロオール、およびツジョンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００５３】
本発明の核酸によってコードされるイソプレノイド修飾酵素のジテルペン基質には、ジテルペン化合物であるか、またはジテルペン化合物を生じる生合成経路における中間体である酸化産物を生じる任意のジテルペン基質が含まれるがこれらに限定されるわけではない。例示的なジテルペン化合物には、以下のファミリーのいずれかに属するジテルペン基質が含まれるがこれらに限定されるわけではない：非環式ジテルペノイド、二環式ジテルペノイド、単環式ジテルペノイド、ラブダン、クレロダン、タキサン、三環式ジテルペノイド、四環式ジテルペノイド、カウレン、ベエレン（Beyerene）、アチセレン、アフィジコリン、グラヤノトキシン、ジベレリン、大環状ジテルペン、およびエリザベサトリアン（Elizabethatriane）。例示的なジテルペン基質、中間体、および産物には、カスベン、エレウテロビン（eleutherobin）、パクリタキセル、プロストラチン、およびシュードプテロシンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００５４】
本発明の核酸によってコードされるイソプレノイド修飾酵素のトリテルペン基質には、トリテルペン化合物であるか、またはトリテルペン化合物を生じる生合成経路における中間体である酸化産物を生じる任意のトリテルペン基質が含まれるがこれらに限定されるわけではない。例示的なトリテルペン基質、中間体、および産物には、アルブルシド（arbruside）E、ブルセアンチン、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、およびジギトキシンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００５５】
本発明の核酸によってコードされるイソプレノイド修飾酵素のセスキテルペン基質には、セスキテルペン化合物であるか、またはセスキテルペン化合物を生じる生合成経路における中間体である酸化産物を生じる任意のセスキテルペン基質が含まれるがこれらに限定されるわけではない。例示的なセスキテルペン基質には、以下のファミリーに属するセスキテルペン基質が含まれるがこれらに限定されるわけではない：ファルネサン、モノシクロファルネサン、単環式セスキテルペン、二環式セスキテルペン、ビシクロファルネサン、ビスボラン、サンタラン、クプラン、ヘルベルタン、ジムノミトラン、トリコテカン、チャミグラン、カロタン、アコラン、アンチサチン、カジナン、オプロパナン、コパアン、ピクロトキサン、ヒマカラン、ロンギピナン、ロンギシクラン、カリオフィラン、モドヘファン、シフィペルフォラン、フムラン、インテグリフォリアン、リッピフォリアン、プロトイルダン、イルダン、ヒルスタン、ラクタラン、ステルプラン、フォマノサン、マラスマン、ゲルマクラン、エレマン、エウデスマン、バッカン、キロシファン、グアイアン、シュードグアイアン、三環式セスキテルペン、パチョウラン、トリキサン、アロマデンドラン、ゴルゴナン、ナルドシナン、ブラシラン、ピングイサン、セスキピナン、セスキカンフェン、ツジョプサン、ビシクロフムラン、アリアカン、ステルプラン、ラクタラン、アフリカン、インテグリオフォリアン、プロトイルダン、アリストラン、およびネオレムナン。例示的なセスキテルペン基質には、アモルファジエン、アロイソロンギフォレン、(-)-α-トランス-ベルガモテン、(-)-β-エレメン、(+)-ゲルマクレンA、ゲルマクレンB、(+)-γ-グルジュネン、(+)-レデン、ネオインテルメデオール、(+)-β-セリネン、および(+)-バレンセンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００５６】
改変
本発明の核酸は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、本発明の核酸によってコードされる改変チトクロームP450酵素は、多くの態様において、非固有（非野生型、天然に存在しない、または変種）のアミノ酸配列を有する。コードされる改変チトクロームP450酵素は、本発明の核酸によって遺伝子改変された宿主細胞における改変チトクロームP450酵素の活性レベルを増加させる、および／または本発明の核酸によって遺伝子改変された宿主細胞によって産生される生合成経路の所定の産物レベルを増加させる、1つまたは複数のアミノ酸配列改変（欠失、付加、挿入、置換）を有すると考えられる。
【００５７】
いくつかの態様において、本発明の核酸は、改変イソプレノイド前駆体修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、本発明の核酸によってコードされるイソプレノイド前駆体修飾酵素は、非固有（非野生型、または天然に存在しない、または変種）のアミノ酸配列を有する。コードされるイソプレノイド前駆体修飾酵素は、本発明の核酸によって遺伝子改変された宿主細胞におけるイソプレノイド前駆体-修飾酵素の活性レベルを増加させる、および／または本発明の核酸によって遺伝子改変された宿主細胞によって産生される所定のイソプレノイド化合物レベルを増加させる、1つまたは複数のアミノ酸配列改変（欠失、付加、挿入、置換）を有すると考えられる。コードされるイソプレノイド前駆体修飾酵素には、いくつかの態様において、野生型イソプレノイド前駆体修飾酵素と比較して以下の改変の1つまたは複数が含まれると考えられる：a）固有の膜貫通ドメインの非固有の膜貫通ドメインへの置換；b）固有の膜貫通ドメインの分泌シグナルドメインへの置換；c）固有の膜貫通ドメインの可溶化ドメインへの置換；d）固有の膜貫通ドメインの膜挿入ドメインへの置換；e）固有の膜貫通ドメインの切断；およびf）固有の膜貫通ドメインのアミノ酸配列における変化。
【００５８】
多くの態様において、本発明の核酸は、膜貫通ドメイン、分泌ドメイン、可溶化ドメイン、および膜挿入タンパク質から選択される第一のドメインをコードするヌクレオチド配列；および改変P450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）の触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を、5'から3'の順序で機能的に連結して含み、第一のドメインは触媒ドメインとは異種である。いくつかの態様において、第一のドメインは、分泌シグナルと膜貫通ドメインの双方を含む。
【００５９】
非固有の膜貫通ドメイン
いくつかの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）は、非固有（たとえば異種）の膜貫通ドメインを含む。適した非固有膜貫通ドメインは、一般的に、所定の宿主細胞において機能的である膜貫通ドメインから選択される。いくつかの態様において、非固有の膜貫通ドメインは、原核宿主細胞において機能的であるドメインである。他の態様において、非固有の膜貫通ドメインは、真核宿主細胞において機能的であるドメインである。
【００６０】
たとえば、大腸菌における発現に関して、非固有の膜貫通ドメインは、多くの態様において、以下のアミノ酸配列の1つを含む：
2009511020.tif 000002
【００６１】
分泌シグナル
いくつかの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）は、細胞からの融合タンパク質の分泌を提供する非固有のアミノ酸配列を含むであろう。当業者は、そのような分泌シグナル配列を承知している。細菌において用いるために適した分泌シグナルには、大腸菌、霊菌（S. marcescens）、E.アミロソーラ（E. amylosora）、M.モルガニイ（M. morganii）、およびP.ミラビリス（P. mirabilis）のブラウンリポタンパク質、大腸菌およびサルモネラ（Salmonella）のTraTタンパク質；B. リシェニフォルミス（B. licheniformis）、セレウス菌（B. cereus）および黄色ブドウ球菌（S. aureus）のペニシリナーゼ（PenP）タンパク質；肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、およびクレブシエラ・アエロゲネス（Klebsiella aerogenese）のプルラナーゼタンパク質；大腸菌リポタンパク質lpp-28、Pal、Rp1A、Rp1B、OsmB、NIpB、およびOrl17；V. ハーセイ（V. harseyi）のキトビアーゼタンパク質；シュードモナス・ソラナセアルム（Pseudomonas solanacearum）のβ-1,4-エンドグルカナーゼタンパク質；インフルエンザ菌（H. influenzae）のPalおよびPcpタンパク質；緑膿菌（P. aeruginosa）のOprIタンパク質；肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）のMalXおよびAmiAタンパク質；梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）の34 kDa抗原およびTpmAタンパク質；マイコプラズマ・ヒオリニス（Mycoplasma hyorhinis）のP37タンパク質；バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の中性プロテアーゼ；斑点熱リケッチア（Rickettsia rickettsii）の17 kDa抗原；malEマルトース結合タンパク質；rbsBリボース結合タンパク質；phoAアルカリホスファターゼの分泌シグナル；およびOmpA分泌シグナルが含まれるがこれらに限定されるわけではない（たとえば、Tanji et al. (1991) J Bacteriol. 173(6):1997-2005を参照されたい）。酵母において用いるために適した分泌シグナル配列は当技術分野において公知であり、用いることができる。たとえば米国特許第5,712,113号を参照されたい。rbsB、malE、およびphoA分泌シグナルは、たとえばCollier (1994) J. Bacteriol. 176:3013において論じられている。
【００６２】
いくつかの態様において、たとえば、大腸菌のような原核宿主細胞における発現に関して、分泌シグナルは以下のアミノ酸配列の1つを含むと考えられる：
2009511020.tif 000003
【００６３】
いくつかの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）は、非固有の分泌シグナル配列と異種膜貫通ドメインの双方を含むであろう。分泌シグナル配列と異種膜貫通ドメインの任意の組み合わせを用いることができる。
【００６４】
1つの非制限的な例として、非固有の分泌シグナル配列と異種膜貫通ドメインを含む異種ドメインは、いくつかの態様において、以下のアミノ酸配列を有し：
2009511020.tif 000004
ここで、膜貫通ドメインを下線で示し、分泌シグナルは膜貫通ドメインに対してN-末端である。
【００６５】
可溶化ドメイン
いくつかの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）は、タンパク質の可溶化を提供する非固有ドメインを含む。
【００６６】
いくつかの態様において、可溶化ドメインは、以下のアミノ酸配列の1つまたは複数を含むと考えられる：
2009511020.tif 000005
【００６７】
膜挿入ドメイン
いくつかの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）は、膜への挿入を提供する非固有のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素は、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでインフレームで融合した異種融合パートナー（たとえば、チトクロームP450酵素以外のタンパク質）を含む融合ポリペプチドであり、融合パートナーは融合タンパク質の生体膜への挿入を提供する。
【００６８】
いくつかの態様において、融合パートナーはミスチック（mistic）タンパク質、たとえば図5において示されるアミノ酸配列（GenBankアクセッション番号AY874162）を含むタンパク質である。ミスチックタンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、GenBankアクセッション番号AY874162としても提供される。生体膜への挿入を提供する他のポリペプチドは、当技術分野において公知であり、たとえばPsbWについて記述するWoolhead et al.（J. Biol. Chem. 276 (18): 14607）；およびM12プロコートタンパク質およびPf3プロコートタンパク質について記述するKuhn（FEMS Microbiology Reviews 17 (1992i) 285）において論じられている。
【００６９】
チトクロームP450酵素
コードされるイソプレノイド前駆体-修飾酵素は、多くの態様において、チトクロームP450酵素である。コードされるチトクロームP450酵素は以下の反応の1つまたは複数を行うと考えられる：ヒドロキシル化、エポキシ化、酸化、脱水、脱水素化、脱ハロゲン化、異性体化、アルコール酸化；アルデヒド酸化、脱アルキル化、およびC-C結合切断。そのような反応は本明細書において一般的に「生合成経路中間体修飾」または特定の態様において「イソプレノイド前駆体修飾」と呼ばれる。これらの反応は、たとえばSonoら（（1996）、前記；そのような反応の図解に関してはたとえばSonoらの図3を参照されたい）において記述されている。先に考察したように、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体-修飾酵素）は、多くの態様において、チトクロームP450モノオキシゲナーゼ、チトクロームP450ヒドロキシラーゼ、チトクロームP450エポキシダーゼ、またはチトクロームP450デヒドロゲナーゼである。幅広く多様なチトクロームP450モノオキシゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、エポキシダーゼ、およびデヒドロゲナーゼ（一般的に、本明細書において「P450酵素」と呼ばれる）が当技術分野において公知であり、任意の公知のP450酵素またはその変種のアミノ酸配列を、本発明に従って改変することができる。
【００７０】
チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む適した核酸源には、6つの界、たとえば細菌（たとえば、真性細菌）；古細菌；原生生物界；菌類界；植物界；動物界のいずれかの細胞または生物が含まれるがこれらに限定されるわけではない。適した外因性の核酸源には、藻類（たとえば、緑藻、紅藻、灰色藻、藍色細菌門）が含まれるがこれらに限定されるわけではない原生生物界の植物様メンバー；原生生物界の真菌様メンバー、たとえば変形菌、水生菌等；原生生物界の動物様メンバー、たとえば鞭毛虫綱（たとえば、ユーグレナ属）、アメーバ綱（たとえば、アメーバ）、胞子虫綱（たとえば、アピコンプレックス門、粘液胞子虫門、微胞子虫門）、および繊毛虫門（たとえばゾウリムシ属）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。適した外因性核酸源には、任意の門のメンバー：担子菌門（ホウキタケ：たとえばハラタケ属、テングタケ属、ヤマドリタケ属、アンズタケ属のメンバー等）；子嚢菌門（たとえば、サッカロミセス属（Saccharomyces）を含む子嚢菌）、地衣植物門（地衣類）；接合菌門（接合菌）；および不完全菌類が含まれるがこれらに限定されるわけではない菌類界のメンバーが含まれる。適した外因性核酸源には、以下の門：コケ植物門（たとえば、コケ）、ツノゴケ門（たとえば、マツモ）、苔類門（たとえば、苔類）、ヒカゲノカズラ門（たとえば、ヒカゲノカズラ）、有節植物門（たとえば、トクサ）、マツバラン門（たとえば、マツバラン）、ハナヤスリ門、シダ門（たとえば、シダ）、ソテツ門、イチョウ門、球果植物門、マオウ門、および被子植物門（たとえば、開花植物）のいずれかのメンバーが含まれるがこれらに限定されるわけではない植物界のメンバーが含まれる。適した外因性の核酸源には、以下の門：海綿動物門（海綿）、板形動物門；直泳動物門（海洋無脊椎動物の寄生虫）；菱形動物門；刺胞動物門（珊瑚、イソギンチャク、クラゲ、ウミエラ、ウミシイタケ、毒クラゲ）；有櫛動物門（有櫛動物）；扁形動物（扁形動物）；紐形動物門（紐形動物）；顎口動物門（顎口動物）；腹毛動物；輪形動物門；；鰓曳動物門；動吻動物門；胴甲動物門；鉤頭動物門；肉肛動物門；線形動物門；類線形動物門；有輪動物門；軟体動物門（軟体類）；星口動物門（ホシムシ）；環形動物門（条虫類）；緩歩動物門（クマムシ）；有爪動物門（カギムシ）；節足動物門（以下の亜門を含む：鋏角亜門、多足類、六脚類、および甲殻類）、鋏角亜門には、たとえばクモ網、腿口類、およびウミグモ網が含まれ、多足類にはたとえば、唇脚綱（たとえば、ムカデ）、ヤスデ網（ヤスデ）、パロポダ（Paropoda）、および結合類が含まれ、六脚類には昆虫が含まれ、および甲殻類にはエビ、オキアミ、蔓脚類等が含まれる）；箒虫動物門；外肛動物門（コメムシ）；腕足動物門；棘皮動物門（たとえば、ヒトデ、シーデイジー（sea daisie）、ウミシダ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、ブリットルバスケット（brittle basket）等）；毛顎動物門（ヤムシ）；半索動物門（ギボシムシ）；および脊索動物門、のいずれかのメンバーが含まれるがこれらに限定されるわけではない動物界のメンバーが含まれる。脊索動物門の適したメンバーには、以下の亜門：尾索動物亜門（ホヤ；ホヤ綱、タ���ア網、および幼形類を含む）；頭索動物亜門（ナメクジウオ）；メクラウナギ網（メクラウナギ）；および脊椎動物亜門、の任意のメンバーが含まれ、脊椎動物亜門のメンバーには、たとえば、ヤツメウナギ網（ヤツメウナギ）、軟骨魚網（軟骨性の魚）、条鰭亜綱（条鰭魚）、アクチニスタ（Actinista）（シーラカンス）、肺魚亜綱（肺魚）；は虫網（は虫類、たとえばヘビ、アリゲーター、クロコダイル、トカゲ等）、鳥類（トリ）、および哺乳類（哺乳動物）が含まれる。適した植物には、任意の単子葉植物および双子葉植物が含まれる。
【００７１】
このように、たとえば、適した供給源には、原生動物、植物、真菌、藻類、酵母は虫類、両生類、哺乳動物、海洋微生物、海洋無脊椎動物、節足動物、等脚類、昆虫、クモ、古細菌、および真正細菌が含まれるがこれらに限定されるわけではない生物からの細胞が含まれる。
【００７２】
適した原核生物源には、細菌（たとえば、真正細菌）および古細菌が含まれる。適した古細菌源には、メタン産生菌、高度好塩古細菌、高度好熱古細菌等が含まれる。適した古細菌源には、クレナルカエオータ（Crenarchaeota）（たとえば、スルホロバス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、デフルフロコックス・モビリス（Defulfurococcus mobilis）、ピロジクチウム・オクルツム（Pyrodictium occultum）、テルモフィルム・ペンデンス（Thermofilum pendens）、テルモプロテウス・テナクス（Thermoproteus tenax））、エウリアルカエオータ（Euryarchaeota）（たとえば、テルモコックス・セレル（Thermococcus celer）、メタノコックス・テルモリソトロフィクス（Methanococcus thermolithotrophicus）、メタノコックス・ジャナスシイ（Methanococcus jannaschii）、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィクム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、メタノバクテリウム・フォルミシクム（Methanobacterium formicicum）、メタノテルムス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）、アルカエグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、ハロフェラックス・ボルカンニ（Haloferax volcanni）、メタノサルチナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）、メタノサエタ・コンシリ（Methanosaeta concilli）、メタノスピリリルム・フンガテイ（Methanospririllum hungatei）、メタノミクロビウム・モビレ（Methanomicrobium mobile）およびコラルカエオータ（Korarchaeota）の任意のメンバーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。適した真正細菌源には、ヒドロゲノバクテリア（Hydrogenobacteria）、テルモトゲール（Thermotogale）、緑色非硫黄細菌、デノコックス群、シアノバクテリア、紅色細菌、プランクトミセス、スピロヘータ、緑色硫黄細菌、サイトファガス、およびグラム陽性菌（たとえば、マイコバクテリウム種（Mycobacterium sp）、ミクロコッカス種（Micrococcus sp）、ストレプトミセス種（Streptomyces sp）、乳酸桿菌種（Lactobacillus sp）、ヘリコバクテリウム種（Helicobacterium sp）、クロストリジウム種（Clostridium sp）、マイコプラズマ種（Mycoplasma sp）、バシラス種（Bacillus sp））が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００７３】
いくつかの態様において、P450酵素をコードする核酸は、生物から採取された組織から、生物から単離された特定の細胞または細胞群等から単離される。たとえば、生物が植物である場合、核酸は、いくつかの態様において、木部、篩部、形成層、葉、根等から単離される。生物が動物である場合、いくつかの態様において核酸は、特定の組織（たとえば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織等）から、または特定の細胞タイプ（たとえば、ニューロン細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、島細胞、Tリンパ球、Bリンパ球等）から単離される。
【００７４】
いくつかの態様において、本発明の核酸は、P450酵素をコードする野生型または天然に存在するヌクレオチド配列とは異なるP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、たとえば本発明の核酸は、変種P450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、変種P450酵素は、天然に存在する親P450酵素のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列において、アミノ酸1個、アミノ酸2個、アミノ酸3個、アミノ酸4個、アミノ酸5個、アミノ酸6個、アミノ酸7個、アミノ酸8個、アミノ酸9個、またはそれより多いアミノ酸が異なる。いくつかの態様において、変種P450酵素は、天然に存在する親P450酵素のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列において、アミノ酸約10個〜アミノ酸約15個、アミノ酸約15個〜アミノ酸約20個、アミノ酸約20個〜アミノ酸25個、アミノ酸約25個〜アミノ酸約30個、アミノ酸約30個〜アミノ酸約35個、アミノ酸約35個〜アミノ酸約40個、アミノ酸約40個〜アミノ酸約50個、アミノ酸約50個〜アミノ酸約60個、またはそれより多いアミノ酸が異なる。
【００７５】
先に考察したように、多くの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素は、親（たとえば、野生型、天然に存在する、または固有）のN-末端の改変、たとえば膜貫通ドメイン、および／または膜貫通ドメインに対してN-末端のアミノ酸配列の改変を含む。いくつかの態様において、コードされる改変チトクロームP450酵素には、野生型チトクロームP450酵素のアミノ酸配列と比較して酵素の触媒部分において1つまたは複数のアミノ酸配列改変がさらに含まれる。
【００７６】
変種（たとえば改変）P450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、合成核酸である。いくつかの態様において、変種P450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸は、天然に存在するP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と適したハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする核酸である。いくつかの態様において、変種P450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸は、天然に存在するP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする核酸である。いくつかの態様において、変種P450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸は、天然に存在するP450酵素をコードするヌクレオチド配列と約95％未満のヌクレオチド配列同一性を有する変種P450酵素をコードするヌクレオチドを含み、たとえば、変種P450酵素をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するP450酵素をコードするヌクレオチド配列とわずか約90〜約95％、約85〜約90％、約80〜約85％、約75〜約80％、約70〜約75％、約65〜約70％、約60〜約65％、約55〜約60％、または約50〜約55％のヌクレオチド配列同一性を有する。
【００７７】
いくつかの態様において、変種P450酵素をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するP450酵素のアミノ酸配列に対して約50％〜約55％、約55％〜約60％、約60％〜約65％、約65％〜約70％、約70％〜約75％、約75％〜約80％、約80％〜約85％、約85％〜約90％、または約90％〜約95％のアミノ酸配列同一性を有するP450酵素をコードする。多数のP450酵素のアミノ酸配列が当技術分野において公知である。
【００７８】
本発明の核酸に含まれるヌクレオチド配列によって改変およびコードされうる適したP450酵素には、リモネン-6-ヒドロキシラーゼ（たとえば図6；およびGenBankアクセッション番号AY281025およびAF124815を参照されたい）；5-エピ-アリストロケンジヒドロキシラーゼ（たとえば、図7；およびGenBank アクセッション番号AF368376を参照されたい）；δ-カジネン-8-ヒドロキシラーゼ（たとえば、図8A；およびGenBank アクセッション番号AF332974を参照されたい）；トラキサジエン-5α-ヒドロキシラーゼ（たとえば、図9Aおよび9B；ならびにGenBankアクセッション番号AY289209、AY959320、およびAY364469を参照されたい）；ent-カウレンオキシダーゼ（たとえば、図10；およびGenBank アクセッション番号AF047719を参照されたい；たとえばHelliwell et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:9019-9024を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００７９】
図8B〜Dは、例示的なP450変種を示す。図8Bは、異種膜貫通ドメインを有するカジネンヒドロキシラーゼを示す；図8Cは可溶化ドメインを有するカジネンヒドロキシラーゼを示す；ならびに図8Cは、分泌ドメインおよび異種膜貫通ドメインを有するカジネンヒドロキシラーゼを示す。図22は、様々なN-末端配列を有するアモルファジエンオキシダーゼを含むさらなる例としてのP450変種を示す。
【００８０】
アルカロイド経路中間体修飾チトクロームP450酵素は当技術分野において公知である。たとえば、Facchini et al. (2004)、前記；Pauli and Kutchan ((1998) Plant J. 13:793-801；Collu et al. ((2001) FEBS Lett. 508:215-220；Schroder et al. ((1999) FEBS Lett. 458:97-102を参照されたい。同様に図19A〜Cを参照されたい。
【００８１】
フェニルプロパノイド経路中間体修飾チトクロームP450酵素は当技術分野において公知である。たとえば、Mizutani et al. ((1997) Plant Physiol. 113:755-763；およびGang et al. ((2002) Plant Physiol. 130:1536-1544を参照されたい。同様に図20A〜Cを参照されたい。
【００８２】
例示的なポリケチド経路中間体修飾チトクロームP450酵素を図21Aおよび21Bにおいて示す。同様にIkeda et al. ((1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9509-9514；およびWard et al. ((2004) Antimicrob. Agents Chemother. 48:4703-4712を参照されたい。
【００８３】
コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）は、酵素的に活性であり、たとえば改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド前駆体修飾酵素）は、以下の活性の1つまたは複数を示す：a）酸化、ヒドロキシル化、エポキシ化、脱水、脱水素化、脱ハロゲン化、異性体化、アルコール酸化、アルデヒド酸化、脱アルキル化、またはC-C結合切断の1つまたは複数による生合成経路中間体の修飾；b）酸化、ヒドロキシル化、エポキシ化、脱水、脱水素化、脱ハロゲン化、異性体化、アルコール酸化、アルデヒド酸化、脱アルキル化、またはC-C結合切断の1つまたは複数によるイソプレノイド前駆体の修飾。本発明の核酸が酵素的に活性なチトクロームP450酵素をコードするか否かは、基質上のP450酵素の反応産物を検出すること、および／または基質上のP450酵素の下流の反応産物を検出することによって容易に決定される。たとえば、本発明の核酸が酵素的に活性なテルペンオキシダーゼまたはテルペンヒドロキシラーゼをコードするか否かは、適当な基質を用いてこれらの酵素活性に関する標準的なアッセイを用いて容易に確認することができる。酵素修飾産物は一般的に、ガスクロマトグラフィー-質量分析によって分析される。たとえば、本発明の核酸がセスキテルペンオキシダーゼまたはセスキテルペンヒドロキシラーゼをコードするか否かは、これらの酵素活性に関する標準的なアッセイを用いて容易に確認することができる。たとえば、米国特許出願第20050019882号を参照されたい。
【００８４】
いくつかの態様において、改変チトクロームP450酵素（たとえば、改変イソプレノイド前駆体修飾酵素）をコードするヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞に対するコドン選択を反映するように改変される。たとえば、いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は酵母コドン選択に向けて改変される。たとえば、Bennetzen and Hall (1982) J. Biol Chem. 257(6): 3026-3031を参照されたい。もう1つの非制限的な例として、ヌクレオチド配列は他の態様において大腸菌コドン選択に向けて改変される。たとえば、Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22):7055-7074；Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evol. 13(6):864-872を参照されたい。同様にNakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292を参照されたい。1つの非制限的な例として、図11Aは、カジネンヒドロキシラーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列（太字で示されるatg開始コドン）を示し；図11Bは、図11Aにおいて示される配列のコドン最適化変種を示し、コドンは、大腸菌のような原核細胞における発現に関して最適化されている。
【００８５】
チトクロームP450レダクターゼ
NADPH-チトクロームP450オキシドレダクターゼ（CPR、EC 1.6.2.4）は、多くのP450-モノオキシゲナーゼの酸化還元パートナーである。いくつかの態様において、本発明の核酸はさらに、チトクロームP450レダクターゼ（CPR）をコードするヌクレオチド配列を含む。CPRをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸は、「CPR核酸」と呼ばれる。本発明のCPR核酸によってコードされるCPRは、NADPHからチトクロームP450に電子を転移させる。たとえば、いくつかの態様において、本発明のCPR核酸によってコードされるCPRは、本発明のイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸によってコードされるイソプレノイド修飾酵素、たとえばセスキテルペンオキシダーゼにNADPHから電子を転移する。
【００８６】
いくつかの態様において、本発明の核酸は、改変チトクロームP450酵素（たとえば、改変イソプレノイド前駆体修飾酵素）およびCPRの双方をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本発明の核酸は、CPRポリペプチドに融合した、先に記述されたようなイソプレノイド前駆体修飾活性を示す改変チトクロームP450酵素（たとえば、改変イソプレノイド前駆体修飾酵素）のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、コードされる融合タンパク質は、式NH2-A-X-B-COOHのタンパク質であり、Aは改変チトクロームP450酵素であり、Xは任意のリンカーであり、およびBはCPRポリペプチドである。いくつかの態様において、コードされる融合タンパク質は、式NH2-A-X-B-COOHのタンパク質であり、AはCPRポリペプチドであり、Xは任意のリンカーであり、およびBは改変チトクロームP450酵素である。
【００８７】
リンカーペプチドは任意の多様なアミノ酸配列を有してもよい。タンパク質は、一般的に柔軟な性質のスペーサーペプチドによって連結されるが、他の化学的連結も除外されない。リンカーは切断可能なリンカーであってもよい。適したリンカー配列は一般的に、長さがアミノ酸約5個〜約50個のペプチド、または長さが約6個〜約25個のペプチドであると考えられる。ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーが一般的に用いられる。連結するペプチドは、好ましいリンカーは一般的に柔軟なペプチドをもたらす配列を有すると考えられることを念頭に、実質的に任意のアミノ酸配列を有してもよい。グリシンおよびアラニンのような小さいアミノ酸を用いることは、柔軟なペプチドを作製するために有用である。そのような配列の作製は当業者にとってルーチンである。多様な異なるリンカーが市販されており、本発明に従って用いるために適していると考えられる。
【００８８】
適したリンカーペプチドにはしばしば、タンパク質構造に対して柔軟性を付与することが知られているアラニンおよびプロリン残基に富むアミノ酸配列が含まれる。例示的なリンカーは、
2009511020.tif 000006
のようなグリシン、アラニン、プロリン、およびメチオニン残基の組み合わせを有する。他の例示的なリンカーペプチドには、IEGR（SEQ ID NO:21）およびGGKGGK（SEQ ID NO:22）が含まれる。しかし、一般的に長さがアミノ酸約5個〜約50個の任意の柔軟なリンカーを用いてもよい。リンカーは、先に例示したタイプのアラニン-プロリンに富む配列を含む、それによって一般的に柔軟なペプチドが得られる実質的に任意の配列を有してもよい。
【００８９】
いくつかの態様において、本発明の核酸は、公知のまたは天然に存在するCPRポリペプチドと、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約57％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するCPRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
CPRポリペプチド、およびCPRポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知であり、任意のCPRをコードする核酸またはその変種を本発明において用いることができる。適したCPRをコードする核酸には、植物において見いだされるCPRをコードする核酸が含まれる。適したCPRをコードする核酸には、真菌において見いだされるCPRをコードする核酸が含まれる。適したCPRをコードする核酸の例には、GenBankアクセッション番号AJ303373（トリチカム・アエスチブム（Triticum aestivum）CPR）；GenBankアクセッション番号AY959320（タキサス・キネンシス（Taxus chinensis）CPR）；GenBankアクセッション番号AY532374（マユス（Ammi majus）CPR）；GenBankアクセッション番号AG211221（イネ（Oryza sativa）CPR）；およびGenBankアクセッション番号AF024635（ペトロセリヌム・クリスプム（Petroselinum crispum）CPR）；カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）チトクロームP450レダクターゼ（GenBankアクセッション番号M35199）；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）チトクロームP450レダクターゼATRl（GenBankアクセッション番号X66016）；およびシロイヌナズナチトクロームP450レダクターゼATR2（GenBankアクセッション番号X66017）；ならびにプチダレドキシンレダクターゼおよびプチダレドキシン（GenBankアクセッション番号J05406）が含まれる。
【００９１】
いくつかの態様において、本発明の核酸は、所定のP450酵素に対して特異的なCPRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。1つの非制限的な例として、本発明の核酸は、キャラボク（Taxus cuspidata）のCPRをコードするヌクレオチド配列（図12A；GenBank AY571340）を含む。もう1つの非制限的な例として、本発明の核酸は、カンジダ・トロピカリスCPRをコードするヌクレオチド配列（図12B）を含む。他の態様において、本発明の核酸は、2つまたはそれ以上の異なるP450酵素の酸化還元パートナーとして作用しうるCPRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。1つのそのようなCPRを図12Cに示す（シロイヌナズナのチトクロームP450レダクターゼATR1）。もう1つのそのようなCPRを、図12Dに示す（シロイヌナズナチトクロームP450レダクターゼATR2）。同様に、図12Dにおいて示されるように改変されたまたは変種ATR2も適しており、変種ATR2は葉緑体ターゲティング配列を欠損している。
【００９２】
コードされるCPRは、いくつかの態様において、異種アミノ酸配列または変種アミノ酸配列（たとえば、置換、欠失、挿入、付加）を含む。いくつかの態様において、コードされるCPRには、いくつかの態様において野生型CPRと比較して以下の改変の1つまたは複数が含まれる：a）固有の膜貫通ドメインの非固有の膜貫通ドメインへの置換；b）固有の膜貫通ドメインの分泌シグナルドメインへの置換；c）固有の膜貫通ドメインの可溶化ドメインへの置換；d）固有の膜貫通ドメインの膜挿入ドメインへの置換；e）固有の膜貫通ドメインの切断；およびf）固有の膜貫通ドメインのアミノ酸配列における変化。
【００９３】
いくつかの態様において、CPRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞に関するコドン選択を反映するように改変される。たとえば、ヌクレオチド配列は、いくつかの態様において酵母のコドン選択に向けて改変される。たとえばBennetzen and Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031を参照されたい。もう1つの非制限的な例として、ヌクレオチド配列は、他の態様において、大腸菌コドン選択に向けて改変される。たとえば、Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22):7055-7074；Eyre- Walker (1996) Mol. Biol. Evol. 13(6):864-872を参照されたい。同様にNakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292を参照されたい。
【００９４】
構築物
本発明はさらに、本発明の核酸を含む組み換え型ベクター（「構築物」）を提供する。いくつかの態様において、本発明の組み換え型ベクターは、本発明の核酸の増幅を提供する。いくつかの態様において、本発明の組み換え型ベクターは、真核細胞、原核細胞、または無細胞転写／翻訳系において、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、イソプレノイド修飾酵素）、またはコードされるCPRの産生を提供する。適した発現ベクターには、バキュロウイルスベクター、バクテリオファージベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクター（たとえば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40、単純ヘルペスウイルス等）、P1に基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心対象の特異的宿主（大腸菌、酵母、および植物細胞のような）に関して特異的な他の任意のベクターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明の組み換え型ベクターは、本発明の改変チトクロームP450をコードする核酸および本発明のCPRをコードする核酸を含む。これらの態様のいくつかにおいて、本発明の組み換え型ベクターは、真核細胞、原核細胞、または無細胞転写／翻訳系において、コードされる改変チトクロームP450酵素（たとえば、改変イソプレノイド修飾酵素）とコードされるCPRの双方の産生を提供する発現ベクターである。
【００９６】
ある特定のタイプのベクターによって、本発明の発現カセットを増幅することができる。本発明の核酸の細胞への効率的な導入および導入された後のその安定な発現のためには、他のタイプのベクターが必要である。本発明の核酸を許容することができるいかなるベクターも、本発明の目的にとって適した組み換え型ベクターとして企図される。ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれる、またはエピソーム型で維持される、任意の環状または直線状の長さのDNAであってもよい。ベクターが宿主細胞に効率よく組み入れられる（たとえば、多くの発現プラスミド）ためには、さらなる操作もしくは特定の条件を必要とする可能性がある、またはベクターは自己組み込み型細胞特異的系（たとえば、組み換え型ウイルス）の一部でありうる。ベクターは、いくつかの態様において、原核細胞において機能的であり、そのようなベクターは、組み換え型ベクターを増殖させる、および／または本発明の核酸の発現を提供するように機能する。ベクターはいくつかの態様において、真核細胞において機能的であり、この場合ベクターは、多くの態様において発現ベクターであると考えられる。
【００９７】
多数の適した発現ベクターが当業者に公知であり、多くが市販されている。以下のベクターが例として挙げられる：細菌宿主細胞に関して、pBluescript（Stratagene, San Diego, Calif.）、pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、λ-ZAPベクター（Stratagene）；pTrc（Amann et al., Gene, 69:301-315 (1988)）；pTrc99a、pKK223-3、pDR540、およびpRIT2T（Pharmacia）；真核宿主細胞に関して、pXTl、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLSV40（Pharmacia）。しかし、任意の他のプラスミドまたは他のベクターも、それらが宿主細胞と適合性である限り、用いてよい。特定の態様において、プラスミドベクターpSP19g10Lを原核宿主細胞における発現のために用いる。他の特定の態様において、プラスミドベクターpCWoriを原核宿主細胞における発現のために用いる。pSP19g10LおよびpCWoriの記述に関して、たとえば、Barnes ((1996) Methods Enzymol. 272:1-14)を参照されたい。
【００９８】
多くの態様において、本発明の核酸は、イソプレノイド修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、イソプレノイド修飾酵素をコードするヌクレオチド配列は1つまたは複数の転写および／または翻訳制御因子に機能的に連結される。多くの態様において、本発明の核酸は、CPRをコードするヌクレオチド配列を含み、CPRをコードするヌクレオチド配列は1つまたは複数の転写および／または翻訳制御因子に機能的に連結される。
【００９９】
先に記述したように、いくつかの態様において、本発明の組み換え型ベクターは、本発明の改変チトクロームP450酵素をコードする核酸と、本発明のCPRをコードする核酸とを含む。これらの態様のいくつかにおいて、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列およびCPRをコードするヌクレオチド配列は、異なる転写制御因子に機能的に連結されている。他の態様において、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列およびCPRをコードするヌクレオチド配列は、同じ転写制御因子に機能的に連結されている。いくつかの態様において、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列およびCPRをコードするヌクレオチド配列はいずれも、同じ誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの態様において、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列およびCPRをコードするヌクレオチド配列はいずれも、同じ構成的プロモーターに機能的に連結されている。
【０１００】
原核宿主細胞において用いるための適したプロモーターには、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター；trpプロモーター；lacオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、たとえばlac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター；trcプロモーター；tacプロモーター等；araBADプロモーター；ssaGプロモーターまたは関連プロモーター（たとえば、米国特許出願第20040131637号を参照されたい）、pagCプロモーター（Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol, 1991 : 173(1): 86-93；Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83）、nirBプロモーター（Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813）等（たとえば、Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141；McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255；およびChatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892を参照されたい）のようなインビボ調節プロモーター；σ70プロモーター、たとえば、コンセンサスσ70プロモーター（たとえば、GenBankアクセッション番号AX798980、AX798961、およびAX798183を参照されたい）；静止期プロモーター、たとえばdpsプロモーター、spvプロモーター等；病原性アイランドSPI-2（たとえば、WO96/17951を参照されたい）に由来するプロモーター；actAプロモーター（たとえば、Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096を参照されたい）；rpsMプロモーター（たとえば、Valdivia and Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367-378を参照されたい）；tetプロモーター（たとえば、Hillen,W. and Wissmann,A. (1989) In Saenger,W. and Heinemann,U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162を参照されたい）；SP6プロモーター（たとえば、Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035-7056を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１０１】
適した真核細胞プロモーターの非制限的な例には、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスのLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iが含まれる。いくつかの態様において、たとえば、酵母細胞における発現に関して、適したプロモーターはADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーター等のような構成的プロモーター；またはGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PHO5プロモーター、CUP1プロモーター、GAL7プロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター等のような調節可能プロモーターである。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含んでもよい。発現ベクターにはまた、発現を増幅するための適当な配列が含まれてもよい。
【０１０２】
本発明の組み換え型ベクターは、多くの態様において、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために1つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含むと考えられる。適した選択マーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核細胞培養のネオマイシン耐性；および大腸菌のような原核宿主細胞におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性マーカーが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１０３】
一般的に、組み換え型発現ベクターには、宿主細胞の形質転換を許容する複製開始点および選択マーカー、たとえば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、出芽酵母TRP1遺伝子等；およびコード配列の転写を指示するための高度発現遺伝子に由来するプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、中でも3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖酵素、α-因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来しうる。
【０１０４】
多くの態様において、改変チトクロームP450酵素（たとえば、改変イソプレノイド修飾酵素）をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能的に連結される。多くの態様において、CPRをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能的に連結される。誘導性プロモーターは当技術分野において周知である。適した誘導性プロモーターには、バクテリオファージλのpL；Plac；Ptrp；Ptac（Ptrp-lacハイブリッドプロモーター）；イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導性プロモーター、たとえばlacZプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター；アラビノース誘導性プロモーター、たとえばPBAD（たとえば、Guzman et al. (1995) J. Bacteriol 177:4121-4130を参照されたい）；キシロース誘導性プロモーター、たとえばPxyl（たとえば、Kim et al. (1996)Gene 181:71-76を参照されたい）；GAL1プロモーター；トリプトファンプロモーター；lacプロモーター；アルコール誘導性プロモーター、たとえばメタノール誘導性プロモーター、エタノール誘導性プロモーター、ラフィノース誘導性プロモーター、熱誘導性プロモーター、たとえば熱誘導性λPLプロモーター、熱感受性リプレッサーによって制御されるプロモーター（たとえば、CI857抑制λに基づく発現ベクター；たとえば、Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2):327-34を参照されたい）等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１０５】
酵母において、構成的または誘導性プロモーターを含む多くのベクターを用いてもよい。概説に関しては、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13；Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544；Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3；およびBitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684；ならびにThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and IIを参照されたい。ADHもしくはLEU2のような構成的酵母プロモーター、またはGALのような誘導性プロモーターを用いてもよい（Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.）。または、外来DNA配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを用いてもよい。
【０１０６】
いくつかの態様において、本発明の核酸または本発明のベクターは、植物細胞において発現させるためのプロモーターまたは他の調節因子を含む。植物細胞において機能的である適した構成的プロモーターの非制限的な例は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、タンデム35Sプロモーター（Kay et al., Science 236:1299 (1987)）、カリフラワーモザイクウイルス19Sプロモーター、ノパリンシンターゼ遺伝子プロモーター（Singer et al., Plant Mol. Biol. 14:433 (1990)；An, Plant Physiol. 81 :86 (1986)）、オクトピンシンターゼ遺伝子プロモーター、およびユビキチンプロモーターである。植物細胞において機能的である適した誘導性プロモーターには、フェニルアラニンアンモニア-リアーゼ遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ遺伝子プロモーター、病原性関連タンパク質遺伝子プロモーター、銅誘導性調節因子（Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:4567-4571 (1993)；Furst et al., Cell 55:705-717 (1988)）；テトラサイクリンおよびクロル-テトラサイクリン誘導性調節因子（Gatz et al., Plant J. 2:397-404 (1992)；Roder et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38 (1994)；Gatz, Meth. Cell Biol. 50:411- 424 (1995)）；エクジソン誘導性調節因子（Christopherson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318 (1992)；Kreutzweiser et al., Ecotoxicol. Environ. Safety 28:14-24 (1994)）；熱ショック誘導性調節因子（Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390 (1992)；Yabe et al., Plant Cell Physiol. 35:1207-1219 (1994)；Ueda et al., Mol. Gen. Genet. 250:533-539 (1996)）；およびたとえば、IPTG誘導性発現を付与するために構成的に発現されるlacリプレッサーと共に用いられるlacオペロン因子（Wilde et al., EMBO J. 11:1251-1259 (1992)）；ホウレンソウ亜硝酸塩レダクターゼ遺伝子に由来する硝酸塩誘導性プロモーター（Back et al., Plant Mol. Biol. 17:9 (1991)）；RuBPカルボキシラーゼ小サブユニットまたはLHCP遺伝子ファミリーに関連するプロモーターのような光誘導性プロモーター（Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449 (1991)；Lam and Chua, Science 248:471 (1990)）；米国特許出願第20040038400号において記述される光反応性調節因子；サリチル酸誘導性調節因子（Uknes et al., Plant Cell 5 : 159- 169 (1993)；Bi et al., Plant J. 8 :235-245 (1995)）；植物ホルモン誘導性調節因子（Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905 (1990)；Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225 (1990)；およびヒトグルココルチコイド反応因子のようなヒトホルモン誘導性調節因子（Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421 (1991)）が含まれる。
【０１０７】
植物組織選択的調節因子も同様に、本発明の核酸または本発明のベクターに含まれうる。単一の組織または限られた数の組織において核酸を異所発現させるために用いることができる適した組織選択的調節因子には、木部選択的調節因子、仮導管選択的調節因子、繊維選択的調節因子、糸状体選択的調節因子（たとえば、Wang et al. (2002) J. Exp. Botany 53:1891-1897を参照されたい）、腺糸状体調節因子等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１０８】
植物細胞において用いるために適したベクターは、当技術分野において公知であり、本発明の核酸を植物宿主細胞に導入するためにそのような任意のベクターを用いることができる。適したベクターには、たとえばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のTiプラスミドまたはA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のRi1プラスミドが含まれる。TiまたはRi1プラスミドは、アグロバクテリウムによる感染によって植物細胞に伝搬され、植物のゲノムに安定に組み入れられる。J. Schell, Science, 237:1176-83 (1987)。同様に、たとえば米国特許第6,900,012号において記述されるように植物の人工染色体も用いるために適している。
【０１０９】
組成物
本発明は、本発明の核酸を含む組成物をさらに提供する。本発明は、本発明の組み換え型ベクターを含む組成物をさらに提供する。本発明の核酸または本発明の発現ベクターを含む組成物には、多くの態様において、塩、たとえばNaCl、MgCl、KCl、MgSO4等；緩衝剤、たとえばトリス緩衝液、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)（HEPES）、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩（MES）、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）等；可溶化剤；界面活性剤、たとえばTween-20等のような非イオン性界面活性剤；ヌクレアーゼ阻害剤等の1つまたは複数が含まれる。いくつかの態様において、本発明の核酸または本発明の組み換え型ベクターは凍結乾燥される。
【０１１０】
宿主細胞
本発明は、遺伝子改変宿主細胞、たとえば本発明の核酸または本発明の組み換え型ベクターによって遺伝子改変されている宿主細胞を提供する。多くの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞はインビトロ宿主細胞である。他の態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞はインビボ宿主細胞である。他の態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は多細胞生物の一部である。
【０１１１】
宿主細胞は多くの態様において、単細胞生物である、または単細胞としてインビトロ培養物において生育される。いくつかの態様において、宿主細胞は真核細胞である。適した真核宿主細胞には、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、および藻類細胞が含まれるがこれらに限定されるわけではない。適した真核宿主細胞には、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピチア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピチア・コクラマエ（Pichia koclamae）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピチア・オプンチアエ（Pichia opuntiae）、ピチア・テルモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピチア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピチア・グエルクウム（Pichia guercuum）、ピチア・ピペリ（Pichia pijperi）、ピチア・スチプチス（Pichia stiptis）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア種（Pichia sp.）、出芽酵母、サッカロミセス種、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス種（Kluyveromyces sp）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フサリウム種（Fusarium sp）、フサリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フサリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、クラミドモナス・リインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、宿主細胞は植物細胞以外の真核細胞である。
【０１１２】
他の態様において、宿主細胞は植物細胞である。植物細胞には、単子葉植物（monocotyledon）（「単子葉植物（monocot）」）および双子葉植物（dicotyledon）（「双子葉植物（dicot）」）の細胞が含まれる。
【０１１３】
他の態様において、宿主細胞は原核細胞である。適した原核細胞には、大腸菌、乳酸桿菌（Lactobacillus sp）、サルモネラ種（Salmonella sp）、シゲラ種（Shigella sp）等の多様な任意の実験株が含まれるがこれらに限定されるわけではない。たとえば、Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181；米国特許第6,447,784号；およびSizemore et al. (1995) Science 270:299-302を参照されたい。本発明において用いることができるサルモネラ株の例には、チフス菌（Salmonella typhi）およびネズミチフス菌（S. typhimurium）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。適したシゲラ種には、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、および志賀赤痢菌（Shigella disenteriae）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。典型的に、実験株は、非病原性である株である。他の適した細菌の非制限的な例には、枯草菌（Bacillus subtilis）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas pudita）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・メバロニ（Pseudomonas mevalonii）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプスラツス（Rhodobacter capsulatus）、ロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum rubrum）、ロドコッカス種（Rhodococcus sp）等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、宿主細胞は大腸菌である。
【０１１４】
本発明の遺伝子改変宿主細胞を作製するために、改変チトクロームP450酵素（たとえば、改変イソプレノイド修飾酵素）をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション等が含まれるがこれらに限定されるわけではない確立された技術を用いて親宿主細胞に安定にまたは一過性に導入する。安定な形質転換に関して、核酸には、さらに選択マーカー、たとえばネオマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性等のようないくつかの周知の任意の選択マーカーが通常含まれる。
【０１１５】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は植物細胞である。本発明の遺伝子改変植物細胞はインビトロ植物細胞培養において選択されたイソプレノイド化合物を産生するために有用である。植物細胞培養に関する手引きは、たとえばPlant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds., Kluwer Academic Publishers；およびin: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111), 1999, Hall Eds, Humana Pressにおいて見いだされうる。
【０１１６】
遺伝子改変宿主細胞
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の発現ベクターを含む。いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変イソプレノイド前駆体修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の発現ベクターを含む。
【０１１７】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、第一の本発明の発現ベクターを含み；およびCPRをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を含む、第二の本発明の発現ベクターをさらに含む。他の態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸と、CPRをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸とを含む、本発明の発現ベクターを含む。他の態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、融合ポリペプチド（たとえば、改変チトクロームP450酵素とCPRとが含まれるポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を含む、本発明の発現ベクターを含む。
【０１１８】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、第一の発現ベクターを含み；およびCPRをコードするヌクレオチド配列を含む、第二の発現ベクターをさらに含む。他の態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列と、CPRをコードするヌクレオチド配列とを含む本発明の核酸を含む、本発明の発現ベクターを含む。
【０１１９】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、チトクロームP450酵素の基質を生じる1つまたは複数の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸を含むようにさらに遺伝子改変される。そのような酵素の例には、テルペンシンターゼ；プレニルトランスフェラーゼ；イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ；メバロン酸経路の1つまたは複数の酵素；およびDXP経路の1つまたは複数の酵素が含まれるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、テルペンシンターゼ、プレニルトランスフェラーゼ、IPPイソメラーゼ、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、およびMPDの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、またはそれより多くをコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸を含むようにさらに遺伝子改変される。いくつかの態様において、たとえば、本発明の遺伝子改変宿主細胞がテルペンシンターゼ、プレニルトランスフェラーゼ、IPPイソメラーゼ、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、およびMPDの2つまたはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸を含むようにさらに遺伝子改変されている場合、ヌクレオチド配列は、少なくとも2つのオペロン、たとえば異なる2つのオペロン、異なる3つのオペロン、または異なる4つのオペロンに存在する。
【０１２０】
テルペンシンターゼ
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むようにさらに遺伝子改変される。いくつかの態様において、テルペンシンターゼは、GPPを修飾してセスキテルペンを生成するシンターゼである。他の態様において、テルペンシンターゼは、FPPを修飾してモノテルペンを生成するシンターゼである。他の態様において、テルペンシンターゼは、GGPPを修飾してジテルペンを生成するシンターゼである。テルペンシンターゼは、ポリプレニル二リン酸基質に作用して、基質を環状化、再配列、またはカップルさせることによってポリプレニル二リン酸基質を修飾して、イソプレノイド前駆体修飾酵素の基質であるイソプレノイド前駆体（たとえば、リモネン、アモルファジエン、タキサジエン等）を生じる。ポリプレニル二リン酸基質に及ぼすテルペンシンターゼの作用によって、イソプレノイド前駆体修飾酵素の基質が産生される。
【０１２１】
テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において公知であり、任意の公知のテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を用いて宿主細胞を遺伝子改変することができる。たとえば、GenBankアクセッション番号とそれらが同定された生物を後に記す、以下のテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列が公知であり、用いることができる：(-)-ゲルマクレンDシンターゼmRNA（AY438099；バルサムポプラ亜種トリコカルパ（Populus balsamifera subsp. trichocarpa）xポプルス・デルトイズ（Populus deltoids）；E,E-α-ファルネセンシンターゼmRNA（AY640154；キュウリ（Cucumis sativus）；1,8-シネオールシンターゼmRNA（AY691947；シロイヌナズナ）；テルペンシンターゼ5（TPS5）mRNA（AY518314；トウモロコシ（Zea mays）；テルペンシンターゼ4（TPS4）mRNA（AY518312；トウモロコシ）；ミルセン／オシメンシンターゼ（TPS10）（At2g24210）mRNA（NM_127982；シロイヌナズナ）；ゲラニオールシンターゼ（GES）mRNA（AY362553；バジリコ（Ocimum basilicum）；ピネンシンターゼmRNA（AY237645；シトカトウヒ（Picea sitchensis）；ミルセンシンターゼ1e20 mRNA（AY195609；キンギョソウ（Antirrhinum majus）；(E)-β-オシメンシンターゼ（0e23）mRNA（AYl95607；キンギョソウ）； E-β-オシメンシンターゼmRNA（AYl51086；キンギョソウ）；テルペンシンターゼmRNA（AF497492；シロイヌナズナ）；(-)-カンフェンシンターゼ（AG6.5）mRNA（U87910；グランドファー（Abies grandis）；(-)-4S-リモネンシンターゼ遺伝子（たとえば、ゲノム配列）（AF326518；グランドファー）；δ-セリネンシンターゼ遺伝子（AF326513；グランドファー）；アモルファ-4,11-ジエンシンターゼmRNA（AJ251751；クソニンジン（Artemisia annua）；E-α-ビサボレンシンターゼmRNA（AF006195；グランドファー）；γ-フムレンシンターゼmRNA（U92267；グランドファー）；δ-セリネンシンターゼmRNA（U92266；グランドファー）；ピネンシンターゼ（AG3.18）mRNA（U87909；グランドファー）；ミルセンシンターゼ（AG2.2）mRNA（U87908；グランドファー）等。
【０１２２】
メバロン酸経路
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、通常、メバロン酸経路によってイソペンテニルピロリン酸（IPP）またはメバロネートを合成しない宿主細胞である。メバロン酸経路は、（a）アセチル-CoA 2分子をアセトアセチル-CoAに縮合する段階；（b）アセトアセチル-CoAをアセチルCoAと縮合してHMG-CoAを形成する段階；（c）HMG-CoAをメバロネートに変換する段階；（d）メバロネートをメバロネート5-リン酸にリン酸化する段階；（e）メバロネート5-リン酸をメバロネート5-ピロリン酸に変換する段階；および（f）メバロネート5-ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する段階を含む。IPPの産生にとって必要なメバロン酸経路の酵素は、培養条件に応じて変化する。
【０１２３】
先に述べたように、いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、メバロン酸経路を通してイソペンテニルピロリン酸（IPP）またはメバロネートを通常合成しない宿主細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は、イソプレノイド修飾酵素をコードする本発明の核酸を含む本発明の発現ベクターによって遺伝子改変され、宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMGS）、ヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMGR）、メバロン酸キナーゼ（MK）、ホスホメバロン酸キナーゼ（PMK）、およびメバロネートピロリン酸デカルボキシラーゼ（MPD）（および任意で同様にIPPイソメラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の異種核酸によって遺伝子改変される。これらの態様の多くにおいて、宿主細胞は、CPRをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって遺伝子改変される。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は、イソプレノイド修飾酵素をコードする本発明の核酸を含む本発明の発現ベクターによって遺伝子改変され、宿主細胞は、MK、PMK、MPD（および任意で同様にIPPイソメラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の異種核酸によって遺伝子改変される。これらの態様の多くにおいて、宿主細胞は、CPRをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって遺伝子改変される。
【０１２４】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、メバロン酸経路によってIPPまたはメバロネートを通常合成しない宿主細胞である；宿主細胞は、イソプレノイド修飾酵素をコードする本発明の核酸を含む本発明の発現ベクターによって遺伝子改変され、宿主細胞は、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、IPPイソメラーゼおよびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の異種核酸によって遺伝子改変される。これらの態様の多くにおいて、宿主細胞は、CPRをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって遺伝子改変される。いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、メバロン酸経路によってIPPまたはメバロネートを通常合成しない宿主細胞である；宿主細胞は、イソプレノイド修飾酵素をコードする本発明の核酸を含む本発明の発現ベクターによって遺伝子改変され、宿主細胞は、MK、PMK、MPD、IPPイソメラーゼおよびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の異種核酸によって遺伝子改変される。これらの態様の多くにおいて、宿主細胞は、CPRをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって遺伝子改変される。
【０１２５】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、メバロン酸経路によってIPPまたはメバロネートを通常合成しない宿主細胞であり、たとえば宿主細胞は内因性のメバロン酸経路を含む細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は酵母細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は出芽酵母である。
【０１２６】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸によってさらに遺伝子改変され、デヒドロゲナーゼはイソプレノイド化合物をさらに修飾する。コードされるデヒドロゲナーゼは、原核細胞もしくは真核細胞において天然に見いだされるデヒドロゲナーゼであってもよく、またはそのようなデヒドロゲナーゼの変種であってもよい。いくつかの態様において、本発明は、そのようなデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
【０１２７】
メバロン酸経路の核酸
MEV経路の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は当技術分野において公知であり、任意の公知のMEV経路の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を用いて本発明の遺伝子改変宿主細胞を生成することができる。たとえば、アセトアセチル-CoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。以下は、MEV経路遺伝子産物をコードする公知のヌクレオチド配列の非制限的な例であり、GenBankアクセッション番号と生物をそれぞれのMEV経路の酵素の後に括弧内に示す：アセトアセチル-CoAチオラーゼ：（NC_000913 REGION：2324131..2325315；大腸菌）、（D49362；パラコックス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans））、および（L20428；出芽酵母）；HMGS：（NC_001145. complement 19061..20536；出芽酵母）、（X96617；出芽酵母）、（X83882；シロイヌナズナ）、（AB037907；キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola））、および（BT007302；ホモ・サピエンス（Homo sapiens））；HMGR：（NM__206548；ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、（NM_204485；野鶏属（Gallus gallus））、（AB015627；ストレプトミセス種KO-3988）、（AF542543；ニコチアナ・アテヌアータ（Nicotiana attenuata））、（AB037907；キタサトスポラ・グリセオラ）、（AX128213, 切断型HMGRをコードする配列を提供する；出芽酵母）、および（NC_001145: complement (115734..118898；出芽酵母))；MK：（L77688；シロイヌナズナ）、および（X55875；出芽酵母)；PMK：（AF429385；ヘベア・ブラジリエンシス（Hevea brasiliensis））、（NM_006556；ホモ・サピエンス）、（NC_001145. complement 712315..713670；出芽酵母）；MPD：（X97557；出芽酵母）、（AF290095；エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium））、および（U49260；ホモ・サピエンス）；ならびにIDI：（NC_000913, 3031087..3031635；大腸菌）、および（AF082326；緑藻（Haematococcus pluvialis））。
【０１２８】
いくつかの態様において、HMGRコード領域は、野生型HMGRの膜貫通ドメインを欠損するHMGRの切断型（「tHMGR」）をコードする。HMGRの膜貫通ドメインは、酵素の調節部分を含み、触媒活性を有さない。
【０１２９】
任意の公知のMEV経路酵素のコード配列を、コードされる酵素のアミノ酸配列の標的化変化を生成するために、当技術分野において公知の様々な方法で変更してもよい。変種MEV経路酵素のアミノ酸は、通常、任意の公知のMEV経路酵素のアミノ酸配列と実質的に類似である、すなわち、少なくとも1個のアミノ酸が異なり、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、または少なくとも20個のアミノ酸であるが、典型的には約50個を超えないアミノ酸が異なってもよい。配列変化は、置換、挿入、または欠失であってもよい。たとえば、以下に記述されるように、ヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞のコドンの偏りに向けて変化されうる。さらに、コードされるタンパク質における保存的アミノ酸変化を生じる、1つまたは複数のヌクレオチド配列の差異を導入することもできる。
【０１３０】
プレニルトランスフェラーゼ
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、イソプレノイド修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むように遺伝子改変され、いくつかの態様において、同様に先に記述したように1つまたは複数のメバロン酸経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むように遺伝子改変される。
【０１３１】
プレニルトランスフェラーゼは、様々な鎖長のプレニル二リン酸の形成をもたらすIPPの連続的縮合を触媒する幅広い群の酵素を構成する。適したプレニルトランスフェラーゼには、IPPとアリルプライマー基質との縮合を触媒して、約2イソプレン単位から約6000イソプレン単位またはそれ以上、たとえば2イソプレン単位（ゲラニルピロリン酸シンターゼ）、3イソプレン単位（ファルネシルピロリン酸シンターゼ）、4イソプレン単位（ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ）、5イソプレン単位、6イソプレン単位（ヘキサデシルピロリン酸シンターゼ）、7イソプレン単位、8イソプレン単位（フィトエンシンターゼ、オクタプレニルピロリン酸シンターゼ）、9イソプレン単位（ノナプレニルピロリン酸シンターゼ）、10イソプレン単位（デカプレニルピロリン酸シンターゼ）、約10イソプレン単位〜約15イソプレン単位、約15イソプレン単位〜約20イソプレン単位、約20イソプレン単位〜約25イソプレン単位、約25イソプレン単位〜約30イソプレン単位、約30イソプレン単位〜約40イソプレン単位、約40イソプレン単位〜約50イソプレン単位、約50イソプレン単位〜約100イソプレン単位、約100イソプレン単位〜約250イソプレン単位、約250イソプレン単位〜約500イソプレン単位、約500イソプレン単位〜約1000イソプレン単位、約1000イソプレン単位〜約2000イソプレン単位、約2000イソプレン単位〜約3000イソプレン単位、約3000イソプレン単位〜約4000イソプレン単位、約4000イソプレン単位〜約5000イソプレン単位、または約5000イソプレン単位〜約6000イソプレン単位、またはそれより多くのイソプレン単位を有するイソプレノイド化合物を形成する酵素が含まれる。
【０１３２】
適したプレニルトランスフェラーゼには、ゲラニル二リン酸（GPP）シンターゼ、ファルネシル二リン酸（FPP）シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）シンターゼ、ヘキサプレニル二リン酸（HexPP）シンターゼ、ヘプタプレニル二リン酸（HepPP）シンターゼ、オクタプレニル（OPP）二リン酸シンターゼ、ソラネシル二リン酸（SPP）シンターゼ、デカプレニル二リン酸（DPP）シンターゼ、チクルシンターゼ、およびグッタペルカシンターゼが含まれるがこれらに限定されるわけではないE-イソプレニル二リン酸シンターゼ；ならびにノナプレニル二リン酸（NPP）シンターゼ、ウンデカプレニル二リン酸（UPP）シンターゼ、デヒドロドリチル二リン酸シンターゼ、エイコサプレニル二リン酸シンターゼ、天然ゴムシンターゼ、および他のZ-イソプレニル二リン酸シンターゼが含まれるがこれらに限定されるわけではないZ-イソプレニル二リン酸シンターゼが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１３３】
多様な種からの多数のプレニルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列が公知であり、本発明の遺伝子改変宿主細胞の生成において用いるまたは用いるために改変することができる。プレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。たとえば、ヒトファルネシルピロリン酸シンテターゼmRNA（GenBankアクセッション番号J05262；ホモ・サピエンス）；ファルネシル二リン酸シンテターゼ（FPP）遺伝子（GenBankアクセッション番号J05091；出芽酵母）；イソペンテニル二リン酸：ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（J05090：出芽酵母）；Wang and Ohnuma (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:33-48; 米国特許第6,645,747号；シロイヌナズナファルネシルピロリン酸シンテターゼ2（FPS2）／FPPシンテターゼ2／ファルネシル二リン酸シンターゼ2（At4gl7190）mRNA（GenBankアクセッション番号NM_202836）；イチョウ（Ginkgo biloba）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ggpps）mRNA（GenBankアクセッション番号AY371321）；シロイヌナズナゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（GGPS1）／GGPPシンテターゼ／ファルネシルトランスフェラーゼ（At4g36810）mRNA（GenBankアクセッション番号NM_119845）；ファルネシル、ゲラニルゲラニル、ゲラニルファルネシル、ヘキサプレニル、ヘプタプレニル二リン酸シンターゼに関するシネココックス・エロンガツス（Synechococcus elongatus）遺伝子（SelF-HepPS）（GenBankアクセッション番号AB016095）等を参照されたい。
【０１３４】
コドン使用
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞を生成するために用いられるヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞に向けてコドン選択を反映するようにヌクレオチド配列が改変される。たとえば、ヌクレオチド配列は、いくつかの態様において、酵母のコドン選択に向けて改変される。たとえば、Bennetzen and Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031を参照されたい。もう1つの非制限的な例において、ヌクレオチド配列は、他の態様において、大腸菌コドン選択に向けて改変される。たとえば、Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22):7055-7074；Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evol. 13 (6): 864-872を参照されたい。同様にNakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292も参照されたい。
【０１３５】
さらなる遺伝子改変
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変チトクロームP450酵素（たとえば、改変イソプレノイド修飾酵素）をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸を含むように遺伝子改変され；および増強されたヘム産生を得るために、および／またはテルペン生合成経路中間体の増強された産生を得るためにさらに遺伝子改変され、および／または内因性のテルペン生合成経路遺伝子が機能的に無能力化するようにさらに遺伝子改変される細胞である。内因性のテルペン生合成経路遺伝子の文脈において本明細書において用いられる「機能的に無能力化」という用語は、その改変によって、正常レベル未満で産生されるおよび／または非機能的である遺伝子によってコードされる遺伝子産物の産生をもたらす、テルペン生合成経路遺伝子の遺伝子改変を指す。
【０１３６】
ヘム産生の増強
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、たとえば1つまたは複数のさらなる遺伝子改変を含まない宿主細胞と比較して、ヘム産生の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、または少なくとも約25倍、またはそれより大きい増加を得るように、増強されたヘム産生を提供する1つまたは複数のさらなる遺伝子改変を含む。
【０１３７】
細胞のヘム産生における制限段階は、アミノレブリン酸（ALA）の生合成である。図13に示すように、C4経路またはC5経路のいずれかを含む、異なる2つのALA生合成経路が存在する。いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、グルタミル-tRNAレダクターゼ（GTRレダクターゼ）を過剰発現するようにさらに遺伝子改変される。いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、対照宿主細胞において産生されるGTRレダクターゼ活性レベルより少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、または少なくとも約25倍、またはそれより大きいGTRレダクターゼ活性レベルを産生するようにさらに遺伝子改変される。
【０１３８】
細胞におけるGTRレダクターゼ活性レベルの増加は、以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない多くの方法で行われる：1）GTRレダクターゼコード領域が機能的に連結されているプロモーターのプロモーター強度を増加させる段階；2）GTRレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドのコピー数を増加させる段階；3）GTRレダクターゼmRNAの安定性を増加させる段階（「GTRレダクターゼmRNA」が、GTRレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含むmRNAである場合）；4）GTRレダクターゼmRNAの翻訳レベルが増加するように、GTRレダクターゼのコドン使用を改変する段階；5）GTRレダクターゼの酵素安定性を増加させる段階；6）GTRレダクターゼの比活性（単位タンパク質あたりの単位活性）を増加させる段階；および7）GTRレダクターゼのネガティブフィードバック調節を低減させる段階。
【０１３９】
いくつかの態様において、GTRレダクターゼレベルの増加をもたらす遺伝子改変は、GTRレダクターゼのネガティブフィードバック調節を低減させる遺伝子改変である。GTRレダクターゼのネガティブフィードバック調節の低減は、いくつかの態様において、N-末端またはその近傍での正に荷電したKK配列の挿入によって低減される。
【０１４０】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、ALAシンターゼを過剰発現するようにさらに遺伝子改変される。いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、対照宿主細胞において産生されるALAシンターゼ活性レベルより、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、または少なくとも約25倍、またはそれより高いALAシンターゼレベルを産生するようにさらに遺伝子改変される。
【０１４１】
細胞におけるALAシンターゼ活性レベルの増加は、以下が含まれるがこれらに限定されるわけではない多くの方法で行われる：1）ALAシンターゼコード領域が機能的に連結されているプロモーターのプロモーター強度を増加させる段階；2）ALAシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドのコピー数を増加させる段階；3）ALAシンターゼmRNAの安定性を増加させる段階（この場合「ALAシンターゼmRNA」は、ALAシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むmRNAである）；4）ALAシンターゼmRNAの翻訳レベルが増加するように、ALAシンターゼのコドン使用を改変する段階；5）ALAシンターゼの酵素安定性を増加させる段階；および6）ALAシンターゼの比活性（単位タンパク質あたりの単位活性）を増加させる段階。
【０１４２】
内因性のテルペン生合成経路中間体の産生の増強
内因性のテルペン生合成経路中間体の産生を増強する遺伝子改変には、宿主細胞におけるホスホトランスアセチラーゼのレベルおよび／または活性の低減をもたらす遺伝子改変が含まれるがこれらに限定されるわけではない。テルペン生合成経路中間体の細胞内濃度は、アセチル-CoAの細胞内濃度を増加させることによって増強される。大腸菌は、細胞内アセチル-CoAのかなりの割合を酢酸塩の形で培地に分泌する。アセチル-CoAの酢酸塩への変換に関わる第一の酵素であるホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子ptaを枯渇させると、酢酸塩の分泌が低減する。原核宿主細胞におけるホスホトランスアセチラーゼレベルおよび／または活性を低減させる遺伝子改変は、遺伝子改変宿主細胞が、1つまたは複数のMEV経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変されている細胞である場合、特に有用である。
【０１４３】
いくつかの態様において、原核宿主細胞におけるホスホトランスアセチラーゼレベルの低減をもたらす遺伝子改変は、ホスホトランスアセチラーゼをコードする原核宿主細胞の内因性のpta遺伝子を機能的に無能力化する遺伝子変異である。pta遺伝子は、可動性の遺伝要素（たとえば、トランスポゾン等）の挿入；遺伝子産物が作製されなくなるか、または切断されて、アセチル-CoAの酢酸塩への変換において非機能的となる、遺伝子の全てまたは一部の欠失；遺伝子産物が作製されなくなるか、または切断されて、アセチル-CoAの酢酸塩への変換において非機能的となる、遺伝子の変異；遺伝子産物が作製されなくなる、pta遺伝子の発現を制御する1つまたは複数の制御因子の欠失または変異等を含む、任意の多様な方法において機能的に無能力化することができる。
【０１４４】
いくつかの態様において、遺伝子改変宿主細胞の内因性のpta遺伝子は欠失させられる。遺伝子を欠失させる任意の方法を用いることができる。pta遺伝子を欠失させる方法の1つの非制限的な例は、λRed組み換え系を用いることである。Datsenko and Wanner (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(12): p. 6640-5。pta遺伝子は、いくつかの態様において、MK、PMK、MPD、およびIDIをコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変された宿主細胞（たとえば、大腸菌）から欠失させられる。pta遺伝子はいくつかの態様において、MK、PMK、MPD、およびIPPをコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変される宿主細胞（たとえば、大腸菌）から欠失させられる。pta遺伝子は、いくつかの態様において、MK、PMK、MPD、IPP、およびプレニルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変される宿主細胞（たとえば、大腸菌）から欠失させられる。
【０１４５】
機能的に無能力化されたDXP経路
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、MEV生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸を含むように遺伝子改変され；および内因性のDXP生合成経路遺伝子が機能的に無能力化されるようにさらに遺伝子改変される細胞である。他の態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、DXP生合成経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸を含むように遺伝子改変され、および内因性のMEV生合成経路遺伝子が機能的に無能力化されるようにさらに遺伝子改変される細胞である。
【０１４６】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞が、1つまたは複数のMEV経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変された原核宿主細胞である場合、宿主細胞は、1つまたは複数の内因性DXP経路遺伝子が機能的に無能力化されるようにさらに遺伝子改変されるであろう。機能的に無能力化することができるDXP経路遺伝子には、以下の任意のDXP遺伝子産物をコードする遺伝子の1つまたは複数が含まれる：1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートシンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼ、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトールシンターゼ、4-ジホスホシジチル-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼ、2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロジホスフェートシンターゼ、および1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-ジホスフェートシンターゼ。
【０１４７】
内因性のDXP経路遺伝子は、可動性の遺伝要素（たとえば、トランスポゾン等）の挿入；遺伝子産物が作製されなくなるか、または切断されて、酵素的に不活性となる、遺伝子の全てまたは一部の欠失；遺伝子産物が作製されなくなるか、または切断されて、酵素的に非機能的となる、遺伝子の変異；遺伝子産物が作製されなくなる、遺伝子の発現を制御する1つまたは複数の制御因子の欠失または変異等を含む、多様な任意の方法で機能的に無能力化することができる。
【０１４８】
他の態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞が1つまたは複数のDXP経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変されている原核宿主細胞である場合、宿主細胞は、1つまたは複数の内因性のMEV経路遺伝子を機能的に無能力化するようにさらに遺伝子改変されると考えられる。機能的に無能力化することができる内因性のMEV経路遺伝子には、以下のMEV遺伝子産物のいずれかをコードする遺伝子の1つまたは複数が含まれる：HMGS、HMGR、MK、PMK、MPD、およびIDI。内因性のMEV経路遺伝子は、可動性の遺伝要素（たとえば、トランスポゾン等）の挿入：遺伝子産物が作製されなくなるか、または切断されて、酵素的に不活性となる、遺伝子の一部または全ての欠失；遺伝子産物が作製されなくなるか、または切断されて、酵素的に非機能的となる、遺伝子の変異；遺伝子産物が作製されなくなる、遺伝子の発現を制御する1つまたは複数の制御因子の欠失または変異等を含む、多様な任意の方法で機能的に無能力化することができる。
【０１４９】
本発明の遺伝子改変宿主細胞を含む組成物
本発明は、本発明の遺伝子改変宿主細胞を含む組成物をさらに提供する。本発明の組成物は、本発明の遺伝子改変宿主細胞を含み、いくつかの態様において、遺伝子改変宿主細胞の意図される使用に部分的に基づいて選択される1つまたは複数のさらなる成分を含むと考えられる。適した成分には、塩；緩衝剤；安定化剤；プロテアーゼ阻害剤；ヌクレアーゼ阻害剤；細胞膜および／または細胞壁保存化合物、たとえばグリセロール、ジメチルスルホキシドなど；細胞にとって適当な栄養培地等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、細胞は凍結乾燥される。
【０１５０】
トランスジェニック植物
いくつかの態様において、本発明の核酸または本発明の発現ベクター（たとえば、本発明の改変チトクロームP450酵素核酸または改変チトクロームP450酵素核酸を含む本発明の発現ベクター）をトランスジーンとして用いて、コードされる改変チトクロームP450酵素を産生するトランスジェニック植物を生成する。このように、本発明はさらに、先に記述した改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を含むトランスジーンを含む、トランスジェニック植物（または植物の一部、種子、組織等）を提供する。いくつかの態様において、トランスジェニック植物のゲノムは本発明の核酸を含む。いくつかの態様において、トランスジェニック植物は遺伝子改変に関してホモ接合である。いくつかの態様において、トランスジェニック植物は遺伝子改変に関してヘテロ接合である。
【０１５１】
いくつかの態様において、本発明のトランスジェニック植物は、トランスジーンコード改変チトクロームP450を産生し、改変チトクロームP450産物を、対照植物、たとえば同じ種の非トランスジェニック植物（ポリペプチドをコードするトランスジーンを含まない植物）によって産生される産物量より、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍またはそれより多い量で産生する。
【０１５２】
いくつかの態様において、本発明のトランスジェニック植物は、トランスジーンによってコードされる改変イソプレノイド前駆体修飾酵素によって生成される、またはその下流の産物であるイソプレノイド化合物を通常産生する非トランスジェニック植物である対照のトランスジェニック版であり；トランスジェニック植物は、イソプレノイド化合物を、対照植物、たとえば同じ種の非トランスジェニック植物（ポリペプチドをコードするトランスジーンを含まない植物）によって産生される量より、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍またはそれより多い量で産生する。
【０１５３】
外因性の核酸を植物細胞に導入する方法は当技術分野において周知である。そのような植物細胞は先に定義したように「形質転換された」と見なされる。適した方法には、ウイルス感染（二本鎖DNAウイルスのような）、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、炭化ケイ素ホイスカー技術、アグロバクテリウム媒介形質転換等が含まれる。方法の選択は、一般的に、形質転換される細胞のタイプおよび形質転換が起こる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。
【０１５４】
土壌細菌であるアグロバクテリウム・ツメファシエンスに基づく形質転換法は、外因性の核酸分子を維管束植物に導入するために特に有用である。アグロバクテリウムの野生型は、宿主植物において腫瘍形成性のクラウンゴールの生育産生を指示するTi（tumor-inducing）プラスミドを含む。Tiプラスミドの腫瘍誘導性のT-DNA領域を植物ゲノムに移入するためには、Tiプラスミドにコードされるビルレンス遺伝子と共に、移入される領域の境界を明確にする直接DNAリピートの組である、T-DNA境界配列を必要とする。アグロバクテリウムに基づくベクターは、その中で腫瘍誘導機能が植物宿主に導入される関心対象の核酸配列によって置換されているTiプラスミドの改変型である。
【０１５５】
アグロバクテリウム媒介形質転換は一般的に、共挿入ベクター、または好ましくは、Tiプラスミドの成分が、アグロバクテリウム宿主に永続的に常在し、ビルレンス遺伝子を有するヘルパーベクター、およびT-DNA配列を境界として関心対象の遺伝子を含むシャトルベクターに分割される、バイナリベクター系を利用する。多様なバイナリベクターが当技術分野において周知であり、たとえばClontech（Palo Alto, Calif.）から市販されている。葉組織、根外植体、幼茎、茎片、または塊茎のような培養植物細胞または損傷組織とアグロバクテリウムを同時培養する方法もまた、当技術分野において周知である。たとえば、Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, FIa.: CRC Press (1993)を参照されたい。
【０１５６】
アグロバクテリウム媒介形質転換は、ユーカリ（Eucalyptus）およびアルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、トリの足に似た三出複葉草本、白色クローバー、スタイロ（Stylosanthes）、ロトノニス・バイネシイ（Lotononis bainessii）およびイガマメのような飼料用豆果の少なくとも1つの種を含む多様なトランスジェニック維管束植物を産生するために有用である（Wang et al.、前記、1995）。
【０１５７】
微小発射体媒介形質転換も同様に、本発明のトランスジェニック植物を産生するために用いることができる。Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987))によって最初に記述されたこの方法は、塩化カルシウム、スペルミジン、またはポリエチレングリコールによる沈殿によって所望の核酸分子でコーティングした金またはタングステンのような微小発射体に依存する。微小発射体粒子は、BIOLISTIC PD-1000（Biorad; Hercules Calif.）のような装置を用いて被子植物組織中に高速で加速される。
【０１５８】
本発明の核酸は、たとえばインビボまたはエクスビボのプロトコールによって、核酸が植物細胞に入ることができる様式で植物に導入されてもよい。「インビボ」とは、核酸が、たとえば浸潤によって植物の生きている体内に投与されることを意味する。「エクスビボ」とは、植物の外部で細胞または外植体が改変されて、そのような細胞または器官が植物に再生されることを意味する。Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press、およびGelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishersにおいて記述されるベクターを含む、植物細胞の安定な形質転換にとって、またはトランスジェニック植物の確立にとって適した多数のベクターが記述されている。特異的な例には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTiプラスミドに由来するベクターと共に、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209、Bevan (1984) Nucl Acid Res. 12: 8711-8721、Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642によって開示されるベクターが含まれる。または、非Tiベクターを用いて、自由なDNA送達技術を用いてDNAを植物および細胞に移入することができる。これらの方法を用いることによって、コムギ、コメ（Christou (1991) Bio/Technology 9:957-962）、およびトウモロコシ（Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618）などのトランスジェニック植物を産生することができる。未成熟胚も同様に、粒子銃を用いることによる直接DNA送達技術のため（Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084；Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674；Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48）およびアグロバクテリウム媒介DNA移入のため（Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745-750）の単子葉植物の良好な標的組織となりうる。DNAを葉緑体に導入するための例示的な方法は、バイオリスティックボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、およびマイクロインジェクションである（Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998；Staub et al Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000；O'Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993；Knoblauch et al Nat. Biotechnol 17: 906-909; U.S. Pat. Nos. 5,451,513, 5,545,817, 5,545,818, および5,576,198；in Intl. Application No. WO 95/16783；ならびにin Boynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993)、およびMcBride et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 7301-7305 (1994)）。バイオリスティックボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、およびマイクロインジェクションの方法にとって適した任意のベクターは、葉緑体形質転換のためのターゲティングベクターとして適していると考えられる。特に導入法がアグロバクテリウムを利用しない場合には、任意の二本鎖DNAベクターを形質転換ベクターとして用いてもよい。
【０１５９】
遺伝子改変することができる植物には、穀物、飼料作物、果実、野菜、脂肪種子作物、ヤシ、森林植物、およびツル植物が含まれる。改変することができる植物の特定の例は以下の通りである：トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、エンドウ、ヒマワリ、トマト、キャノーラ、タバコ、コムギ、オオムギ、オート麦、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーション、モロコシ、ルピナス、およびコメ。他の例には、クソニンジンまたは関心対象のイソプレノイド化合物を産生することが知られている他の植物が含まれる。
【０１６０】
形質転換植物細胞、組織、種子、植物、および形質転換植物細胞を含む産物も同様に、本発明によって提供される。本発明の形質転換細胞、ならびにこれらを含む組織および産物の特色は、ゲノムに組み入れられた本発明の核酸の存在、および植物細胞による改変チトクロームP450酵素の産生である。本発明の組み換え型植物細胞は、組み換え型細胞の集団として、または組織、種子、植物全体、茎、果実、葉、根、花、茎、塊茎、穀粒、動物飼料、野原の植物等として有用である。
【０１６１】
本発明のトランスジェニック植物の再生材料も同様に、本発明によって提供され、再生材料には、種子、子孫植物、およびクローン材料が含まれる。
【０１６２】
生合成経路の産物を産生する方法
本発明は、生合成経路産物を産生する方法を提供する。方法は一般的に、適した培地において本発明の遺伝子改変宿主細胞を培養する段階を伴う。本発明の遺伝子改変宿主細胞は、改変チトクロームP450酵素を産生するために、膜貫通ドメイン、分泌ドメイン、可溶化ドメイン、および膜挿入タンパク質から選択されるドメインに機能的に連結された改変チトクロームP450酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変されている細胞である。生合成経路中間体の存在下で、改変チトクロームP450酵素の産生によって、中間体の酵素的修飾および生合成経路産物の産生が起こる。他の態様において、方法は一般的に、コードされる改変チトクロームP450酵素の産生にとって都合がよい条件で本発明のトランスジェニック植物を維持する段階を伴う。改変チトクロームP450酵素の産生によって、生合成経路産物の産生が起こる。典型的に、方法はインビトロ（たとえば、インビトロで培養された生細胞において）で行われるが、生合成経路産物のインビボ産生も同様に企図される。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は真核細胞、たとえば酵母細胞である。他の態様において、宿主細胞は原核細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は植物細胞である。いくつかの態様において、方法は本発明のトランスジェニック植物において行われる。
【０１６３】
本発明の遺伝子改変宿主細胞は、対照の親宿主細胞と比較して生合成経路産物の産生の増強を提供する。このように、たとえば生合成経路産物の産生は、対照親宿主細胞において産生された産物レベルと比較して、遺伝子改変宿主細胞において、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、または少なくとも約500倍もしくはそれより多く増加する。対照親宿主細胞は遺伝子改変宿主細胞に存在する遺伝子改変を含まない。
【０１６４】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、対照宿主細胞と比較して生合成経路産物の増強された産生を提供する。このように、たとえば、生合成経路産物の産生は、対照親宿主細胞において産生された産物レベルと比較して、遺伝子改変宿主細胞において、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、または少なくとも約500倍またはそれより多く増加する。これらの態様のいくつかにおいて、対照親宿主細胞は遺伝子改変宿主細胞に存在する遺伝子改変を含まず、たとえば対照宿主細胞におけるイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸（たとえば、チトクロームP450酵素をコードする核酸）は、固有の膜貫通ドメイン、固有の分泌ドメイン、固有の可溶化ドメイン、および固有の膜挿入ポリペプチドの1つまたは複数と機能的に連結されているが、遺伝子改変宿主細胞は、非固有の（たとえば、異種）膜貫通ドメイン、非固有の分泌ドメイン、非固有の可溶化ドメイン、および非固有の膜挿入ドメインの1つまたは複数に機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。一例として、遺伝子改変宿主細胞が、非固有のイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸に機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が異種分泌シグナルドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が異種可溶化ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が異種膜挿入ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が変種膜貫通ドメイン（たとえば、固有の膜貫通ドメインが切断されたもの；固有の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列変化を含む膜貫通ドメイン）に機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。
【０１６５】
本発明は、イソプレノイド化合物を産生する方法を提供する。方法は一般的に、適した培地において本発明の遺伝子改変宿主細胞を培養する段階を伴い、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、イソプレノイド前駆体修飾酵素を産生するために、膜貫通ドメイン、分泌ドメイン、可溶化ドメイン、および膜挿入タンパク質から選択されるドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝子改変されている細胞である。イソプレノイド前駆化合物の存在下で、イソプレノイド前駆体修飾酵素によって、イソプレノイド前駆体の酵素的修飾およびイソプレノイド化合物の産生が起こる。他の態様において、方法は一般的に、コードされるイソプレノイド前駆体修飾酵素の産生に都合がよい条件で本発明のトランスジェニック植物を維持する段階を伴う。イソプレノイド前駆体修飾酵素の産生によって、イソプレノイド化合物の産生が起こる。たとえば、いくつかの態様において、方法は一般的に、適した培地において遺伝子改変宿主細胞を培養する段階を伴い、該宿主細胞は、テルペン修飾酵素、たとえばテルペンオキシダーゼ、テルペンヒドロキシラーゼ等をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸によって遺伝子改変されている。テルペンオキシダーゼの産生によって、イソプレノイド化合物の産生が起こる。典型的に、方法はインビトロ（たとえば、インビトロで培養された生細胞において）で行われるが、イソプレノイド化合物のインビボ産生も同様に企図される。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は真核細胞、たとえば酵母細胞である。他の態様において、宿主細胞は原核細胞である。これらの態様のいくつかにおいて、宿主細胞は植物細胞である。いくつかの態様において、方法は本発明のトランスジェニック植物において行われる。
【０１６６】
本発明の遺伝子改変宿主細胞は、対照の親宿主細胞と比較して増強されたイソプレノイド化合物の産生を提供する。このように、たとえばイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体の産生は、対照親宿主細胞と比較して、遺伝子改変宿主細胞において、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、または少なくとも約500倍またはそれより多く増加する。対照親宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞に存在する遺伝子改変を含まない。
【０１６７】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、対照宿主細胞と比較して増強されたイソプレノイド化合物の産生を提供する。このように、たとえばイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体の産生は、対照親宿主細胞と比較して、遺伝子改変宿主細胞において、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、または少なくとも約500倍またはそれより多く増加する。これらの態様のいくつかにおいて、対照親宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞に存在する遺伝子改変を含まず、たとえば対照宿主細胞におけるイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸（たとえば、チトクロームP450酵素をコードする核酸）は、固有の膜貫通ドメイン、固有の分泌ドメイン、固有の可溶化ドメイン、および固有の膜挿入ポリペプチドの1つまたは複数と機能的に連結されているが、遺伝子改変宿主細胞は、非固有の（たとえば、異種）膜貫通ドメイン、非固有の分泌ドメイン、非固有の可溶化ドメイン、および非固有の膜挿入ドメインの1つまたは複数に機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。一例として、遺伝子改変宿主細胞が、非固有のイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸に機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が異種分泌シグナルドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が異種可溶化ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が異種膜挿入ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。もう1つの例として、遺伝子改変宿主細胞が変種膜貫通ドメイン（たとえば、固有の膜貫通ドメインが切断されたもの；固有の膜貫通ドメインのアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列変化を含む膜貫通ドメイン）に機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む場合、適した対照宿主細胞は、固有の膜貫通ドメインに機能的に連結されたイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸を含む。
【０１６８】
このように、いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、細胞あたり、遺伝子改変宿主細胞が含む1つまたは複数の遺伝子改変を含まない対照宿主細胞において産生されたイソプレノイド化合物レベルより、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも35％、少なくとも約40％、少なくとも45％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約75倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、または少なくとも約500倍またはそれより高いレベルのイソプレノイド化合物を産生する。遺伝子改変宿主細胞の生育は、周知の方法、たとえば細菌の液体培養物の約600 nmでの吸光度（OD）測定（OD600）、コロニーの大きさ、生育速度等を用いて容易に決定される。
【０１６９】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、少なくとも約l mg/L、少なくとも約5 mg/L、少なくとも約10 mg/L、少なくとも約15 mg/L、少なくとも約20 mg/L、少なくとも約25 mg/L、少なくとも約30 mg/L、少なくとも約35 mg/L、少なくとも約40 mg/L、少なくとも約50 mg/L、少なくとも約75 mg/L、少なくとも約100 mg/L、少なくとも約125 mg/L、少なくとも約150 mg/L、少なくとも約200 mg/L、少なくとも約300 mg/L、少なくとも約500 mg/L、少なくとも約1000 mg/L、または少なくとも約5000 mg/Lの回収可能な量でイソプレノイド化合物を産生する。
【０１７０】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、約1 mg/L〜約5000 mg/L、たとえば約1 mg/L〜約2 mg/L、約2 mg/L〜約5 mg/L、約5 mg/L〜約10 mg/L、約10 mg/L〜約15 mg/L、約15 mg/L〜約20 mg/L、約20 mg/L〜約25 mg/L、約25 mg/L〜約50 mg/L、約50 mg/L〜約75 mg/L、約75 mg/L〜約100 mg/L、約100 mg/L〜約150 mg/L、約150 mg/L〜約200 mg/L、約200 mg/L〜約250 mg/L、約250 mg/L〜約300 mg/L、約300 mg/L〜約350 mg/L、約350 mg/L〜約400 mg/L、約400 mg/L〜約450 mg/L、約450 mg/L〜約500 mg/L、約500 mg/L〜約1000 mg/L、約1000 mg/L〜約2000 mg/L、約2000 mg/L〜約3000 mg/L、約3000 mg/L〜約4000 mg/L、または約4000 mg/L〜約5000 mg/Lの回収可能な量でイソプレノイド化合物を産生する。産生されたイソプレノイドは、培地または宿主細胞から、たとえば培養培地、細胞溶解物、または細胞溶解物の画分から回収されうる。回収法は、多様な要因、たとえば産生される特異的イソプレノイドの性質に応じて変化する可能性がある。
【０１７１】
図14および15は、例示的なイソプレノイド産物の生合成を示す。直鎖状のポリプレニル二リン酸の変換は、テルペンシンターゼによって触媒され、変換産物は、イソプレノイド前駆体修飾酵素（たとえば、P450酵素）の基質である。次いで、特異的官能化が、前駆体の炭素骨格の反応によって起こり、P450およびその酸化還元パートナーのCPRによって触媒される。
【０１７２】
いくつかの態様において、遺伝子改変宿主細胞は、異種テルペンシンターゼ（たとえば、宿主細胞において通常産生されないテルペンシンターゼ）でありうるテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸によってさらに遺伝子改変される。このように、たとえば宿主細胞は、いくつかの態様において、テルペンシンターゼおよびイソプレノイド修飾酵素（たとえば、セスキテルペンオキシダーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸によって遺伝子改変される。適した培養培地においてそのような宿主細胞を培養することにより、テルペンシンターゼおよびイソプレノイド修飾酵素（たとえば、セスキテルペンオキシダーゼ）の産生が提供される。たとえば、テルペンシンターゼは、ファルネシルピロリン酸を修飾して、該セスキテルペンオキシダーゼのセスキテルペン基質を生成する。
【０１７３】
いくつかの態様において、宿主細胞は、チトクロームP450レダクターゼ（CPR）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸によってさらに遺伝子改変される。幅広く多様なCPRのヌクレオチド配列が公知であり、コードされるCPRがNADPHからの電子の転移において活性を示す限り、任意の公知のCPRをコードする核酸を用いることができる。いくつかの態様において、CPRをコードする核酸はNADPHからの電子を本発明のイソプレノイド修飾酵素をコードする核酸によってコードされるイソプレノイド修飾酵素、たとえばセスキテルペンオキシダーゼに転移するCPRをコードする。
【０１７４】
いくつかの態様において、宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸を産生するために、プレニルトランスフェラーゼおよび／または生合成経路の1つもしくは複数の酵素を産生するようにさらに遺伝子改変される。細胞は典型的に、2つの経路の1つを用いて、イソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体（たとえば、IPP、ポリプレニル二リン酸等）を生成する。図16〜18は、イソプレノイド化合物またはポリプレニル二リン酸のような前駆体を生成するために、細胞によって用いられる経路を図示する。
【０１７５】
図16は、ポリプレニル二リン酸ゲラニル二リン酸（GPP）、ファルネシル二リン酸（FPP）、およびゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）を生成するために、プレニルトランスフェラーゼによるイソペンテニル二リン酸（IPP）および／またはその異性体ジメチルアリル二リン酸（DMAPP）の修飾を伴うイソプレノイド経路を示す。GPPおよびFPPはそれぞれ、テルペンシンターゼによってさらに修飾されて、モノテルペンおよびセスキテルペンをそれぞれ生成し、GGPPは、テルペンシンターゼによってさらに修飾されて、ジテルペンおよびカロテノイドを生成する。IPPおよびDMAPPは、以下の2つの経路の1つによって生成される：メバロン酸（MEV）経路と1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸（DXP）経路。
【０１７６】
図17は、アセチルCoAが一連の反応によってIPPに変換されるMEV経路を図解する。
【０１７７】
図18は、ピルベートおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸が一連の反応によってIPPおよびDMAPPに変換されるDXP経路を図解する。植物細胞以外の真核細胞は、MEVイソプレノイド経路のみを用いてアセチル-補酵素A（アセチル-CoA）をIPPに変換し、次にこれはDMAPPに異性体化される。植物は、イソプレノイド合成のためにMEVとメバロン酸非依存的、すなわちDXP経路の双方を用いる。原核細胞は、いくつかの例外はあるが、DXP経路を用いて、分岐点を通してIPPとDMAPPを個別に産生する。
【０１７８】
宿主細胞が培養される培養培地に応じて、および宿主細胞がDXP経路によって、またはメバロン酸経路によってIPPを合成するかに応じて、いくつかの態様において、宿主細胞はさらなる遺伝子改変を含むと考えられる。たとえば、いくつかの態様において、宿主細胞は、内因性のメバロン酸経路を有さない細胞であり、たとえば宿主細胞は、通常メバロン酸経路によってIPPまたはメバロネートを合成しない細胞である。たとえば、いくつかの態様において、宿主細胞は、メバロン酸経路を通してIPPを通常産生しない細胞であり、宿主細胞は、メバロン酸経路の2つまたはそれ以上の酵素、IPPイソメラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、テルペンシンターゼ、およびイソプレノイド修飾酵素（たとえば、本発明の核酸によってコードされるイソプレノイド修飾酵素）をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸によって遺伝子改変される。そのような宿主細胞を培養することは、メバロン酸経路酵素、IPPイソメラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、テルペンシンターゼ、およびイソプレノイド修飾酵素（たとえば、セスキテルペンオキシダーゼ）の産生を提供する。メバロン酸経路酵素、IPPイソメラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、テルペンシンターゼ、およびイソプレノイド修飾酵素（たとえば、セスキテルペンオキシダーゼ）の産生によって、イソプレノイド化合物の産生が起こる。多くの態様において、プレニルトランスフェラーゼは、FPPシンターゼであり、これは本発明の核酸によってコードされるセスキテルペンオキシダーゼのセスキテルペン基質を生成し、セスキテルペンオキシダーゼの産生によって、宿主細胞においてセスキテルペン基質の酸化が起こる。メバロン酸経路の酵素、IPPイソメラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ、およびテルペンシンターゼをコードする任意の核酸が用いるために適している。たとえば、適した核酸はたとえばMartinら（2003）、前記に記述されている。
【０１７９】
上記の態様のいずれかにおいて、宿主細胞が2つまたはそれ以上のメバロン酸経路酵素をコードするヌクレオチド配列を含む1つまたは複数の核酸によって遺伝子改変されている場合、2つまたはそれ以上のメバロン酸経路酵素には、MK、PMK、およびMPDが含まれ、宿主細胞は、メバロネートを含む培地において培養される。他の態様において、2つまたはそれ以上のメバロン酸経路酵素には、アセトアセチルCoAチオラーゼ、HMGS、HMGR、MK、PMK、およびMPDが含まれる。
【０１８０】
いくつかの態様において、宿主細胞は、メバロン酸経路によって通常IPPを合成しない細胞であり、宿主細胞は先に記述されるように遺伝子改変され、宿主細胞はさらに、機能的に無能力化されたDXP経路を含む。
【０１８１】
本発明の方法は、アーテミシン酸（たとえば、セスキテルペン基質がアモルファ-4,11-ジエン）、アロイソロンギフォレンアルコール（たとえば、基質がアロイソロンギフォレンである場合）、(E)-トランス-ベルガモタ-2,12-ジエン-14-オル（たとえば、基質が(-)-α-トランス-ベルガモテンである場合）、(-)-エレマ-1,3,11(13)-トリエン-12-オル（たとえば、基質が(-)-β-エレメンである場合）、ゲルマクラ-1(10),4,11(13)-トリエン-12-オル（たとえば、基質が(+)-ゲルマクレンAである場合）、ゲルマクレンBアルコール（たとえば、基質がゲルマクレンBである場合）、5,11(13)-グアイアジエン-12-オル（たとえば、基質が(+)-γ-グルジュネンである場合）、レデンアルコール（たとえば、基質が(+)-レデンである場合）、4β-H-エウデスム-11(13)-エン-4,12-ジオール（たとえば、基質がネオインテルメデオールである場合）、(+)-β-コストール（たとえば、基質が(+)-β-サリネンである場合）等、および前述のすべてのさらなる誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない多様なイソプレノイド化合物の産生にとって有用である。
【０１８２】
本発明の遺伝子改変宿主細胞は、多くの態様において、適した培地および適した温度でインビトロで培養される。細胞が培養される温度は、一般的に約18℃〜約40℃、たとえば約18℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、または約35℃〜約40℃（たとえば約37℃）である。
【０１８３】
いくつかの態様において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、適した培地（たとえば、誘導物質（たとえば、イソプレノイド修飾酵素をコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）のような1つまたは複数のさらなる作用物質を任意で添加したルリア-ベルトニブロス）において培養され、培養培地には、有機層を形成する有機溶媒、たとえばドデカンが重層される。遺伝子改変宿主細胞によって産生されるイソプレノイド化合物は、有機層に分配され、そこからそれを精製することができる。いくつかの態様において、イソプレノイド修飾酵素をコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている場合、誘導物質を培養培地に加え、適した期間の後、培養培地に重層した有機層からイソプレノイド化合物を単離する。
【０１８４】
いくつかの態様において、イソプレノイド化合物は、有機層に存在する可能性がある他の物質から分離される。イソプレノイド化合物と、有機層に存在する可能性がある他の産物との分離は、たとえば標準的なクロマトグラフィー技術を用いて容易に達成される。
【０１８５】
いくつかの態様において、本発明の方法によって合成されるイソプレノイド化合物は、無細胞反応においてさらに化学修飾される。たとえば、いくつかの態様において、アーテミシン酸は、培養培地および／または細胞溶解物から単離され、アーテミシン酸は無細胞反応においてさらに化学修飾されて、アーテミシニンを生成する。
【０１８６】
いくつかの態様において、イソプレノイド化合物は、たとえば少なくとも約40％純粋、少なくとも約50％純粋、少なくとも約60％純粋、少なくとも約70％純粋、少なくとも約80％純粋、少なくとも約90％純粋、少なくとも約95％純粋、少なくとも約98％純粋、または98％を超えて純粋であり、イソプレノイド化合物の状況における「純粋」は、他のイソプレノイド化合物、高分子、混入物等を含まないイソプレノイド化合物を指す。
【０１８７】
実施例
以下の実施例は、本発明の作成法および使用法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明であると見なす範囲を制限することを意図せず、または以下の実験が、行われた全てもしくは唯一の実験であることを表すことを意図しない。用いた数値（たとえば、量、温度等）に関しては正確を期すように努力したが、何らかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に明記していなければ、割合は重量での割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。標準的な略語を用いてもよく、たとえばbp、塩基対；kb、キロベース；pl、ピコリットル；sまたはsec、秒；min、分；hまたはhr、時間；aa、アミノ酸；kb、キロベース；bp、塩基対；nt、ヌクレオチド；i.m.、筋肉内；i.p.、腹腔内；s.c.、皮下等である。
【０１８８】
実施例1：大腸菌における8-ヒドロキシ-δ-カジネンの産生
本実施例は、生合成経路に関与する固有のP450を用いて高レベル（30 mgL-1まで）でのインビボ産生基質の産生を記述する。δ-カジネン-8-ヒドロキシラーゼ（CadH）は、植物の防御化合物であるゴシポールの生合成において、セスキテルペン、δ-カジネン（cad）を、8-ヒドロキシ-δ-カジネン（CadOH）に加水分解する植物由来の膜結合型P450である。大腸菌におけるCadOHの生合成を図1において図解する。基質（Cad）は、大腸菌においてテルペンシンターゼCadSによって内因性のファルネシルピロリン酸（FPP）から産生される。Cadは、その酸化還元パートナー（CPR）と共にCadHの作用によってさらに産物（CadOH）へと加水分解される。
【０１８９】
CadH発現ベクターには、CadH遺伝子と共に、カンジダ・トロピカリスからのチトクロームP450レダクターゼ（CPR）酸化還元パートナーをコードする遺伝子の双方が含まれる。この構築物をδ-カジネンシンターゼ（CadS）に関して適合性の発現ベクターと共に大腸菌に同時形質転換して、それによってCadHの基質を提供する。この株を栄養に富む培地において生育させて、ヘム添加物の存在下で20℃で48時間誘導した後、培地を有機層によって抽出した。図2において示す結果は、GC-MS（ガスクロマトグラフィー-質量分析）によって測定したこの系において産生されたCadOH（〜100μgL-1）の明らかに検出可能な量を示している。
【０１９０】
図2
CadOH生合成経路を発現する大腸菌から抽出した有機層のGC-MSトレース。挿入図はCadOH（ピーク1）および推定のケトン種（ピーク2）を示す領域の拡大を示す。上の線は、CadS、CadH、およびCPRを発現する試料に対応し、下の線は、CadSおよびCPRのみを発現し、CadHを発現しない陰性対照に対応する。
【０１９１】
さらに、少量の推定のケトン産物（[M+]：m/z＝218）も同様に観察され（図2の挿入図、上の線、ピーク2）、このことは、同じ酵素による多数の代謝回転が可能となる可能性があることを意味している。CPRのみを含み、CadHを含まない陰性対照プラスミドは、GC-MSトレースにおいて産物ピークを示さなかった（図2の挿入図、下の線）。この系を用いて大腸菌によってインビボで産生されたCadOHのマススペクトルおよびCadOHの文献上のスペクトルは非常に類似であった[4]。類似の化合物ファミリーにおける官能化天然物のインビボ産生に関しては、固有のP450を用いるこれまでの試みは成功せず、基質の到達可能性の問題を指摘した。
【０１９２】
CadOHの産生は、pMBISプラスミドを用いて大腸菌において産生されたFPPの量を増加させることによって有意に増加し、これによって大腸菌はメバロネートからFPPを産生することができる[6]。pMBISのヌクレオチド配列を、図36A〜D（SEQ ID NO:62）に示す。pMBISはまた、米国特許出願第2003/0148479号および第2004/0005678号において記述され、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロネートピロリン酸デカルボキシラーゼ、IPPイソメラーゼ、およびFPPシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む。これらの試験において、大腸菌は、3つの発現プラスミドによって形質転換される：（1）pMBIS、（2）CadS、および（3）CadH/CPR。20 mMメバロネートを誘導時に加えた、pMBISの添加により、CadOH産生は、pMBISを加えない細胞によって産生された量と比較して74倍増加した（図3）。この場合も、陰性対照（CadHなし）は、産物の形成を示さなかった。これらの結果は、P450代謝回転が、インビボ（たとえば、インビトロで培養される生きている細胞において）で基質産生によって制限される可能性があることを示している。これらの細胞はまた、混合水性／有機培地において生育する可能性がある；株を生育させて、ドデカンの重層の存在下で誘導したところ、CadOHの産生は有意に変化しなかった（〜2倍未満）。
【０１９３】
図3
CadOH生合成経路と共にpMBISを発現する、メバロネートを与えた大腸菌から抽出した有機層のGC-MSトレース。CadおよびCadOHをトレース上に示す。
【０１９４】
P450を操作することによって、産物の特異性を失うことなく生産性が増加することがさらに示された。固有の遺伝子（nCadH）によるインビボ産生を、大腸菌における発現に関して最適化したコドン使用を用いる合成遺伝子（sCadH）と比較した（図4B）。この比較は、合成遺伝子の性能が固有の遺伝子よりわずかによいことを示している。
【０１９５】
野生型N-末端膜貫通ドメイン（TM）を、大腸菌において機能することが知られている配列に置換した（図4A）。調べたN-末端配列は、C.トロピカリスに由来する2つのP450 N-末端リーダー、すなわち予想TMドメインを含まないCYP52A13（A13）とTMドメインを含むCYP52A17（A17）、ならびにウシミクロソームリーダー（ウシ）であった[8]。
【０１９６】
野生型TMドメインを完全に除去して（切断）、分泌タグ（OmpA）、可溶化ドメイン（PD1）[9]、または膜挿入タンパク質（ミスチック）[10]に置換した。ウシ-CadHは、〜30 mg L-1を産生し、野生型CadHより約2倍優れていた（図4B）。
【０１９７】
参考文献
2009511020.tif 000007
【０１９８】
実施例2：アモルファジエンオキシダーゼ（AMO）によるアモルファジエンの酸化
本実施例は、クソニンジンから単離されたCYP71AV1とも呼ばれるアモルファジエンオキシダーゼ（AMO）によるアモルファジエンのインビボ（たとえば、インビトロ細胞培養における生きている細胞において）酸化を記述する。AMOをコードするヌクレオチド配列を含む様々な構築物を生成して、酸化産物の収量を最適にするために試験した。図22は、様々なAMO構築物を図解する。（1）nAMO、クソニンジンから単離された固有のAMO配列、（2）sAMO、大腸菌において発現させるためにコドンを最適化した合成AMO遺伝子、（3）A13-AMO、野生型膜貫通ドメインがC. トロピカリスのA13 N-末端配列に置換された合成AMO遺伝子、（4）A17-AMO、野生型膜貫通ドメインがC.トロピカリスのA17 N-末端配列に置換された合成AMO遺伝子、（5）Bov-AMO、野生型膜貫通ドメインがウシミクロソームN-末端配列に置換された合成AMO遺伝子。様々な構築物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図24〜31に示す。
【０１９９】
様々なAMO構築物をa）CPR；b）アモルファジエンシンターゼ（ADS）；およびc）プラスミドpMBISと共発現させた。メバロネートの存在下で、アモルファジエンはC-12位で酸化されて対応するアルコールになることが観察された。図23Aは、インビボで産生されたアーテミシンアルコールの相対量を示す。アーテミシンアルコールの真正標準物質との比較により、産物の同一性が確認される（図23A、下のパネルおよび図23B）。
【０２００】
図23Aおよび23B
様々なAMO構築物による大腸菌におけるアモルファジエンのインビボ酸化。（A）真正標準物質（下のパネル）と比較したsAMO、A13-AMO、A17-AMO、およびbov-AMOによって大腸菌において産生されたアーテミシンアルコールの産生（上のパネル）を示すGC-MSトレース。（B）真正標準物質（下のパネル）と比較した大腸菌において産生されたアーテミシンアルコール（上のパネル）のEI-MS。
【０２０１】
実施例3：完全なメバロン酸経路を発現する細胞における基質酸化
基質酸化も同様に、アセチル-CoAからの完全なメバロン酸経路を発現する細胞において行った。CadOH産生に関する以下の実施例は3つのプラスミドを利用した：（1）AtoB、HMGR、およびHMGSを含むpMevT、（2）pMBIS（MK、PMK、PMD、IDI（IPPイソメラーゼ）、およびIspA（FPPシンターゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む）、ならびに（3）CadH、CPR、およびCadSを含む発現ベクター。細胞を20℃で、ヘム添加物、δ-アミノレブロン酸を加えたTBグリセロールにおいて培養した。細胞は力価60 mg/LまでCadOHを産生した。データを図32に示す。
【０２０２】
第二の例において、アーテミシン酸を2つのプラスミドを用いて産生した：（1）MevT（AtoB、HMGR、およびHMGS）（図35AおよびBを参照されたい）、MBIS（MK、PMK、PMD、IDI、およびIspA）、およびADS オペロンをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、ならびに（2）AMOおよびクソニンジンからのCPR酸化還元パートナー（AACPR）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。ヘム添加物を加えたTBグリセロールにおいて大腸菌細胞を20℃で培養した後、T7プロモーターに基づくベクターを用いて微量のアーテミシン酸が観察された（図33）。ベクターをpCWOriに変化させた後、AMOをアモルファジエンの3段階酸化のために用いたところ、大腸菌においてアーテミシン酸を力価20 mg/Lまで産生することが可能であった（図33）。さらに、力価40〜80 mg/Lで産生されたアルデヒドに関してアルコールのアルデヒドへの段階的酸化が観察された（図34）。
【０２０３】
本発明を、その特異的態様を参照して記述してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよく、かつ同等物を置換してもよいことは当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、問題の組成物、プロセス、プロセスの段階を、本発明の目的、趣旨および範囲に適合させるために多くの改変を行ってもよい。そのような改変はすべて本明細書に添付の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】大腸菌における8-ヒドロキシ-δ-カジネンの生合成を図解する。
【図２】CadOH生合成経路を発現する大腸菌から抽出された有機層のガスクロマトグラフィー-質量分析（GC-MS）トレースを示す。
【図３】CadOH生合成経路と共にメバロン酸経路（pMBIS）の一部を発現する、メバロン酸を与えた大腸菌から抽出した有機層のGC-MSトレースを示す。
【図４】図4Aおよび4Bは、CadHに対してなされた様々なN-末端改変（図4A）および様々なCadH構築物を用いた遺伝子改変大腸菌によるCadOH産生の時間経過を示す。
【図５】ミスチックのアミノ酸配列を示す。
【図６】リモネンヒドロキシラーゼのアミノ酸配列を示す。
【図７】アリストロケンジヒドロキシラーゼのアミノ酸配列を示す。
【図８】図8A〜Dは、固有の膜貫通ドメイン（下線）を有するカジネンヒドロキシラーゼ（図8A）；異種膜貫通ドメイン（太字）を有するカジネンヒドロキシラーゼ（図8B）；可溶化ドメイン（太字）を有するカジネンヒドロキシラーゼ（図8C）；および分泌ドメインと異種膜貫通ドメイン（太字）とを有するカジネンヒドロキシラーゼ（図8D）のアミノ酸配列を示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、タキサジエンヒドロキシラーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１０】ent-カウレンオキシダーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１１】図11Aはカジネンヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を示し（開始atgを太字で示す）；図11Bは、原核細胞における発現に関してコドンを最適化した、カジネンヒドロキシラーゼをコードする変種ヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図12Aは、キャラボクからのチトクロームP450レダクターゼ（CPR）のアミノ酸配列を示し；図12Bはカンジダ・トロピカリスからのCPRのアミノ酸配列を示し；図12Cは、シロイヌナズナからのCPR（ATR1）のアミノ酸配列を示し；図12Dは、シロイヌナズナからのCPR（ATR2）のアミノ酸配列を示し；および図12Eは、葉緑体ターゲティング配列を欠損する変種ATR2アミノ酸を示す。
【図１３】2つのヘム生合成経路を図解する。
【図１４】例示的なイソプレノイド産物であるタキソール、アーテミシニン、およびメントールの生合成を図解する。
【図１５】例示的なイソプレノイド化合物の産生の反応スキームを図解する。
【図１６】イソペンテニル二リン酸（IPP）およびジメチルアリル二リン酸（DMAPP）からの、イソプレノイド生合成経路中間体であるポリプレニル二リン酸ゲラニル二リン酸（GPP）、ファルネシル二リン酸（FPP）、およびゲラニルゲラニル二リン酸（GGPPP）の産生が起こるイソプレノイド代謝経路の略図である。
【図１７】IPPの産生のためのメバロン酸（MEV）経路の略図である。
【図１８】IPPおよびジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）の産生のためのDXP経路の略図である。
【図１９】図19A〜Cは、様々なアルカロイド経路中間体修飾P450酵素のアミノ酸配列を示す。
【図２０】図20A〜Cは、様々なフェニルプロパノイド経路中間体修飾P450酵素のアミノ酸配列を示す。
【図２１】図21Aおよび21Bは、様々なポリケチド経路中間体修飾P450酵素のアミノ酸配列を示す。
【図２２】様々なアモルファジエンオキシダーゼ（AMO）構築物を図解する。（1）nAMO、クソニンジンから単離された固有のAMO配列、2）sAMO、大腸菌における発現に関してコドン最適化された合成AMO遺伝子、3）A13-AMO、野生型膜貫通領域がC.トロピカリスからのA13 N-末端配列によって置換された合成AMO遺伝子、4）A17-AMO、野生型膜貫通領域がC.トロピカリスからのA17 N-末端配列によって置換された合成AMO遺伝子；5）Bov-AMO、野生型膜貫通領域がウシミクロソームN-末端配列によって置換された合成AMO遺伝子。
【図２３】図23AおよびBは様々なAMO構築物による大腸菌におけるアモルファジエンの酸化を示す。
【図２４】図24AおよびBは野生型AMOをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２５】図24において示されたヌクレオチド配列のアミノ酸配列翻訳マップを示す。
【図２６】A13-AMOをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２７】A13-AMOをコードするアミノ酸翻訳マップを示す。
【図２８】A17-AMOをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２９】A17-AMOをコードするアミノ酸翻訳マップを示す。
【図３０】ウシ-AMOをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図３１】ウシ-AMOをコードするアミノ酸翻訳マップを示す。
【図３２】CadOH、CPR、およびCadSをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターのほかに、完全なメバロン酸経路を含む大腸菌におけるCadOHの産生を示す。
【図３３】完全なアモルファジエン経路およびpDUET-ctAACPR-A13AMOプラスミドまたはpCWori-Al7AMO-ctAACPRプラスミドのいずれかを発現する大腸菌におけるアーテミシン酸の産生比較を示すGC-MSクロマトグラフおよびスペクトルを示す。
【図３４】メバロン酸経路酵素およびアモルファジエンシンターゼをコードする核酸によって、ならびにpCWori-Al7AMO-ctAACPRプラスミドによって遺伝子改変した大腸菌におけるアーテミシンアルコールからアーテミシンアルデヒドへの酸化を示すGC-MSクロマトグラフを示す。
【図３５】図35Aおよび35Bはアセトアセチル-CoAチオラーゼ（「atoB」）、HMGS、および切断型HMGR（tHMGR）をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図３６】図36A〜Dは、pMBISのヌクレオチド配列を示す。
【図１】
2009511020.tif 000008
【図２】
2009511020.tif 000009
【図３】
2009511020.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009511020.tif 000014
【図８Ａ】
2009511020.tif 000015
【図８Ｂ】
2009511020.tif 000016
【図８Ｃ】
2009511020.tif 000017
【図８Ｄ】
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【図９】
2009511020.tif 000019
【図１０】
2009511020.tif 000020
【図１１Ａ】
2009511020.tif 000021
【図１１Ｂ】
2009511020.tif 000022
【図１２Ａ】
2009511020.tif 000023
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2009511020.tif 000057