(57)【要約】  少なくとも１つの天然の連結部を含む組換え融合タンパク質の調製方法を記載する。少なくとも１つの天然の連結部を含有する融合タンパク質は、従来の融合タンパク質と比較して、低減された免疫原性可能性、改良された安定性、低減された凝集傾向、改良された発現、および／または改良された生成収率を有する。少なくとも１つの天然の連結部を含む新規な融合タンパク質、該融合タンパク質を含む組成物、および該タンパク質の使用方法をも開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッドドメインを含む組換え融合タンパク質であって、該ハイブリッドドメインが、第１のポリペプチドに由来する第１の部分と第２のポリペプチドに由来する第２の部分とを含み、該第１のポリペプチドが、式（Ｘ１−Ｙ−Ｘ２）を有するドメインを含み、かつ該第２のポリペプチドが、式（Ｚ１−Ｙ−Ｚ２）を有するドメインを含み、
〔式中、
Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、
Ｘ１およびＺ１は、それぞれ、該第１のポリペプチド中および該第２のポリペプチド中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、
Ｘ２およびＺ２は、それぞれ、該第１のポリペプチド中および該第２のポリペプチド中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、
付帯条件として、Ｘ１およびＺ１のアミノ酸配列が同一である場合、Ｘ２およびＺ２のアミノ酸配列は同一ではなく、Ｘ２およびＺ２のアミノ酸配列が同一である場合、Ｘ１およびＺ１のアミノ酸配列は同一ではない〕
該ハイブリッドドメインが、式
（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）
を有する、上記組換え融合タンパク質。
【請求項２】
前記組換え融合タンパク質が、式
Ｄ−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｅ
〔式中、
Ｄは、不在であるかまたは前記第１のポリペプチド中の（Ｘ１−Ｙ−Ｘ２）のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列であり、そして
Ｅは、不在であるかまたは前記第２のポリペプチド中の（Ｚ１−Ｙ−Ｚ２）のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である〕
を有する構造を含むように、前記ハイブリッドドメインが、アミノ末端アミノ酸配列Ｄに結合されており、かつ／またはカルボキシ末端アミノ酸配列Ｅに結合されている、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
Ｄが存在する、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
Ｅが存在する、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
ＤおよびＥが存在する、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）がハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインである、請求項１または請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
前記ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインがハイブリッド抗体可変ドメインである、請求項６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
Ｙがフレームワーク領域（ＦＲ）４中に存在する、請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒまたはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）である、請求項８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｘ１が、ＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む抗体可変ドメインの一部分である、請求項８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１】
ＹがＦＲ３中に存在する、請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２】
ＹがＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓまたはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓである、請求項１１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３】
Ｘ１が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２を含む抗体可変ドメインの一部分である、請求項１１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４】
（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）がハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインがハイブリッド抗体定常ドメインである、請求項１４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６】
Ｙが、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌである、請求項１５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７】
Ｙが、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ、またはＶａｌＴｈｒＶａｌよりなる群から選択される、請求項１６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８】
Ｄが不在であり、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）がハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインであり、かつＥが免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９】
（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在する第２の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む、請求項１８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０】
Ｄが免疫グロブリン可変ドメインであり、かつ（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）がハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２１】
（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）がハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインであり、かつＥが免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２２】
Ｄが不在であり、かつ前記融合タンパク質が、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在するさらなるドメインを含む、請求項２１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２３】
Ｄが免疫グロブリン定常ドメインであり、かつ（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）がハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが両方ともに同一のタンパク質スーパーファミリーのメンバーである、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２５】
前記タンパク質スーパーファミリーが、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびＴＮＦレセプタースーパーファミリーよりなる群から選択される、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２６】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが両方ともヒトポリペプチドである、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２７】
Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、およびＺ２が、それぞれ独立して、約１〜約２００アミノ酸よりなる、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２８】
前記ハイブリッドドメインが免疫グロブリン可変ドメインとほぼ等しいサイズである、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２９】
前記ハイブリッドドメインが免疫グロブリン定常ドメインとほぼ等しいサイズである、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３０】
前記ハイブリッドドメインが約８ｋＤａ〜約２０ｋＤａである、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする、単離された組換え核酸分子。
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項３３】
組換え核酸の発現に好適な条件下で請求項３２に記載の宿主細胞を維持することにより該組換え核酸を発現させて組換え融合タンパク質を産生することを含む、組換え融合タンパク質の産生方法。
【請求項３４】
前記組換え融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫グロブリン定常ドメインに融合されているハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む組換え融合タンパク質であって、該ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインが、第１の免疫グロブリン由来の第１の免疫グロブリンＦＲに由来する部分と第２の免疫グロブリン由来の第２の免疫グロブリンＦＲに由来する部分とを含むハイブリッドフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、該第１の免疫グロブリンＦＲおよび該第２の免疫グロブリンＦＲが、それぞれ、保存アミノ酸モチーフＹを含み、かつ該ハイブリッド免疫グロブリンＦＲが、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、
Ｙは、該保存アミノ酸モチーフであり、
Ｆ１は、該第１の免疫グロブリンＦＲ中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、そして
Ｆ２は、該第２の免疫グロブリンＦＲ中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフである〕
を有する、上記組換え融合タンパク質。
【請求項３６】
Ｙが、前記第１の免疫グロブリンおよび前記第２の免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）１、ＦＲ２、またはＦＲ３中に位置する、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３７】
Ｙが、前記第１の免疫グロブリンおよび前記第２の免疫グロブリンのＦＲ４中に位置する、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３８】
前記ハイブリッドＦＲがハイブリッドＦＲ４であり、かつＦ２が、前記免疫グロブリン定常ドメインを含む天然に存在するタンパク質中の前記免疫グロブリン定常ドメインのアミノ末端に隣接する、請求項３５のに記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３９】
前記免疫グロブリン定常ドメインがＴ細胞レセプター定常ドメインであり、かつ前記第２の免疫グロブリンＦＲがＴ細胞レセプター可変ドメイン由来のＦＲ４である、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４０】
Ｆ２が、天然に存在する免疫グロブリン中の前記免疫グロブリン定常ドメインのアミノ末端に存在する、請求項３９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４１】
前記免疫グロブリン定常ドメインが抗体軽鎖定常ドメインであり、かつ前記第２の免疫グロブリンＦＲが抗体軽鎖可変ドメイン由来のＦＲ４である、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４２】
Ｆ２が、天然に存在する抗体軽鎖中の前記抗体軽鎖定常ドメインのアミノ末端に存在する、請求項４１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４３】
前記抗体定常ドメインがＣκまたはＣλであり、かつ前記第２の抗体ＦＲ４がそれぞれＶκＦＲ４またはＶλＦＲ４である、請求項４１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４４】
前記第１の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである、請求項４３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４５】
前記免疫グロブリン定常ドメインが抗体重鎖定常ドメインであり、かつ前記第２の免疫グロブリンＦＲが抗体重鎖可変ドメイン由来のＦＲ４である、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４６】
前記第１の免疫グロブリンが非ヒト免疫グロブリンである、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４７】
前記非ヒト免疫グロブリンが、マウス、ラット、サメ、サカナ、オポッサム、ヒツジ、ブタ、ラクダ科動物、ウサギ、または非ヒト霊長動物に由来する免疫グロブリンである、請求項４６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４８】
前記非ヒト免疫グロブリンがラクダ科動物またはナースシャークの重鎖抗体である、請求項４７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４９】
前記第２の免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項４６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５０】
前記免疫グロブリン定常ドメインがヒト免疫グロブリン定常ドメインである、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５１】
前記ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインがハイブリッド抗体可変ドメインである、請求項３５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５２】
ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒである、請求項５１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５３】
Ｆ１がＰｈｅであり、かつＦ２が（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｅＶａｌＳｅｒＳｅｒである、請求項５２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５４】
Ｆ２が、ＬｅｕＶａｌＴｈｅＶａｌＳｅｒＳｅｒ、ＭｅｔＶａｌＴｈｅＶａｌＳｅｒＳｅｒ、およびＴｈｒＶａｌＴｈｅＶａｌＳｅｒＳｅｒよりなる群から選択される、請求項５３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５５】
前記免疫グロブリン定常ドメインがヒト抗体定常ドメインである、請求項５３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５６】
前記ヒト抗体定常ドメインがＩｇＧ ＣＨ１ドメインである、請求項５５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５７】
前記ハイブリッド抗体可変ドメインがハイブリッド重鎖可変ドメインであり、Ｆ１がＴｒｐであり、かつＦ２が（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓまたは（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕである、請求項５２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５８】
Ｆ２が、ＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ、およびＧｌｕＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕよりなる群から選択される、請求項５７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５９】
前記抗体定常ドメインがヒト抗体軽鎖定常ドメインである、請求項５７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６０】
ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）である、請求項５１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６１】
Ｆ１がＰｈｅであり、かつＦ２がＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒである、請求項６０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６２】
前記抗体定常ドメインがヒト抗体定常ドメインである、請求項６１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６３】
前記ヒト抗体定常ドメインがＩｇＧ ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ ＣＨ２ドメインである、請求項６２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６４】
前記ＩｇＧがＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項６３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６５】
Ｆ１がＴｒｐであり、かつＦ２が（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓまたは（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕである、請求項６０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６６】
Ｆ２が、ＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＩｌｅＶａｌＬｅｕ、およびＩｌｅＩｌｅＬｅｕよりなる群から選択される、請求項６５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６７】
前記抗体定常ドメインがヒト抗体軽鎖定常ドメインである、請求項６５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６８】
前記組換え融合タンパク質が、式（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＬ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ１、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ２、または（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｆｃを有する部分構造を含む、請求項３１〜６７のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６９】
前記組換え融合タンパク質が第２の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む、請求項６８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７０】
前記第２の免疫グロブリン可変ドメインが（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）のアミノ末端に存在する、請求項６９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７１】
前記第２の免疫グロブリン可変ドメインが（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）のカルボキシ末端に存在する、請求項６９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７２】
請求項３５〜７１のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする、単離された組換え核酸分子。
【請求項７３】
請求項３５〜７１のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項７４】
組換え核酸の発現に好適な条件下で請求項７３に記載の宿主細胞を維持することにより該組換え核酸を発現させて組換え融合タンパク質を産生することを含む、組換え融合タンパク質の産生方法。
【請求項７５】
前記組換え融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ヒト抗体定常ドメインに融合されている非ヒト抗体可変領域を含む組換え融合タンパク質であって、改良点として、
該非ヒト抗体可変領域が、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、
Ｆ１は、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、
ＹはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒであり、かつＦ２は、（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ、もしくは（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕであるか、または
ＹはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）であり、かつＦ２は、ＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ、もしくは（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕである〕
を有するハイブリッドＦＲ４を含む、
上記組換え融合タンパク質。
【請求項７７】
前記ヒト抗体定常ドメインがＣＨ１ドメインであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒであり、かつＦ２が（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒである、請求項７６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７８】
Ｆ２が、ＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、ＭｅｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、およびＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒよりなる群から選択される、請求項７７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７９】
前記ヒト抗体定常ドメインがＣＨ１ドメインであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）であり、かつＦ２がＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒである、請求項７６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８０】
前記ヒト抗体定常ドメインが軽鎖定常ドメインであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒであり、かつＦ２が（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓまたは（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕである、請求項７６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８１】
Ｆ２が、ＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、ＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、ＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、ＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＡｒｇＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｙＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ、およびＧｌｕＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕよりなる群から選択される、請求項８０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８２】
前記ヒト抗体定常ドメインが軽鎖定常ドメインであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）であり、かつＦ２が（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓまたは（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕである、請求項７６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８３】
ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌまたはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＬｅｕであり、かつＦ２が、ＧｌｕＩｌｅＬｙｓ、ＡｓｐＩｌｅＬｙｓ、ＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＴｈｒＩｌｅＬｅｕ、ＩｌｅＶａｌＬｅｕ、およびＩｌｅＩｌｅＬｅｕよりなる群から選択される、請求項８２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８４】
請求項７６〜８３のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする、単離された組換え核酸分子。
【請求項８５】
請求項７６〜８３のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項８６】
組換え核酸の発現に好適な条件下で請求項８５に記載の宿主細胞を維持することにより該組換え核酸を発現させて組換え融合タンパク質を産生することを含む、組換え融合タンパク質の産生方法。
【請求項８７】
前記組換え融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインに融合された免疫グロブリン可変ドメインを含む組換え融合タンパク質であって、該ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインが、第１の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分と第２の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分とを含み、該第１の免疫グロブリン定常ドメインおよび該第２の免疫グロブリン定常ドメインが、それぞれ、保存アミノ酸モチーフＹを含み、該ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインが、式
Ｃ１−Ｙ−Ｃ２
〔式中、
Ｙは、該保存アミノ酸モチーフであり、
Ｃ１は、該第１の免疫グロブリン定常領域中のＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸モチーフであり、
Ｃ２は、該第２の免疫グロブリン定常領域中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである〕
を有する、上記組換え融合タンパク質。
【請求項８９】
前記ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインが、第１の抗体定常ドメイン由来の部分と第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含むハイブリッド抗体定常ドメインである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９０】
前記ハイブリッド抗体定常ドメインが、ハイブリッド抗体ＣＨ１、ハイブリッド抗体ヒンジ、ハイブリッド抗体ＣＨ２、またはハイブリッド抗体ＣＨ３である、請求項８９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９１】
前記抗体がＩｇＧである、請求項９０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９２】
前記第１の抗体定常ドメインおよび前記第２の抗体定常ドメインが、異なる種由来である、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９３】
前記第２の抗体定常ドメインがヒト抗体定常ドメインである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９４】
前記第１の抗体定常ドメインが、マウス、ラット、サメ、サカナ、オポッサム、ヒツジ、ブタ、ラクダ科動物、ウサギ、または非ヒト霊長動物定常ドメインである、請求項９３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９５】
前記免疫グロブリン可変ドメインが非ヒト抗体可変ドメインであり、かつ前記第１の定常ドメインが、対応する非ヒトＣＨ１ドメイン、Ｃλドメイン、またはＣκドメインである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９６】
前記第１の抗体定常ドメインが軽鎖定常ドメインであり、かつ前記第２の抗体定常ドメインが重鎖定常ドメインである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９７】
前記第１の抗体定常ドメインがラクダ科動物重鎖定常ドメインであり、かつ前記第２の抗体定常ドメインが重鎖定常ドメインである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９８】
ＶＨＨが前記ハイブリッド定常ドメインのアミノ末端に存在する、請求項９７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９９】
前記第１の抗体定常ドメインおよび前記第２の抗体定常ドメインが、異なるアイソタイプである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１００】
前記第２の抗体定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインである、請求項９９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０１】
前記抗体可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、かつ前記第１の抗体定常ドメインが軽鎖定常ドメインである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０２】
前記第２の抗体定常ドメインがヒト抗体重鎖定常ドメインである、請求項１０１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０３】
前記第２の抗体定常ドメインがヒト抗体軽鎖定常ドメインである、請求項１０１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０４】
前記ヒト抗体重鎖定常ドメインが、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３である、請求項１０２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０５】
前記ヒト抗体重鎖定常ドメインがＩｇＧ ＣＨ１またはＩｇＧ ＣＨ２である、請求項１０２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０６】
前記抗体可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、かつ前記第１の抗体定常ドメインがＣＨ１ドメインである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０７】
前記第２の抗体定常ドメインがヒト抗体軽鎖定常ドメインである、請求項１０６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０８】
前記第２の抗体定常ドメインがヒト抗体重鎖定常ドメインである、請求項１０６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０９】
Ｙが、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌである、請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１０】
Ｙが、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ、およびＶａｌＴｈｒＶａｌよりなる群から選択される、請求項１０９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１１】
前記第２の抗体定常ドメインがヒト抗体定常ドメインである、請求項１０９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１２】
前記ヒト抗体定常ドメインが、Ｃκ、Ｃλ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３よりなる群から選択される、請求項１１１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１３】
前記ヒト抗体定常ドメインがＩｇＧ ＣＨ１またはＩｇＧ ＣＨ２である、請求項１１１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１４】
前記組換え融合タンパク質が、ハイブリッドヒトＣＨ１ドメインに融合されたヒト軽鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１が、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａまたはＴｈｒＶａｌＡｌａであり、
Ｙが、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌであり、かつ
Ｃ２が、ヒトＩｇＧ ＣＨ１中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである、
請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１５】
Ａ）前記組換え融合タンパク質が、ハイブリッドヒトＣＨ２に融合されたヒト軽鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１が、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａもしくはＴｈｒＶａｌＡｌａであり、
Ｙが、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌであり、かつ
Ｃ２が、ヒトＩｇＧ ＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフであるか、または
Ｂ）前記組換え融合タンパク質が、ハイブリッドヒトＣＨ２に融合されたヒト重鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１が、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓであり、
Ｙが、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅであり、かつ
Ｃ２が、ヒトＩｇＧ ＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである、
請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１６】
Ａ）前記組換え融合タンパク質が、ハイブリッドヒトＣκに融合されたヒトλ鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１が、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａであり、
Ｙが、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌであり、かつ
Ｃ２が、ヒトＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフであるか、または
Ｂ）前記組換え融合タンパク質が、ハイブリッドヒトＣκに融合されたヒト重鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１が、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓであり、
Ｙが、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅであり、かつ
Ｃ２は、ヒトＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである、
請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１７】
Ａ）前記組換え融合タンパク質が、ハイブリッドヒトＣλに融合されたヒトκ鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１が、ＴｈｒＶａｌＡｌａであり、
Ｙが、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌであり、かつ
Ｃ２が、ヒトＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフであるか、または
Ｂ）前記組換え融合タンパク質が、ハイブリッドヒトＣλに融合されたヒト重鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１が、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓであり、
Ｙが、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌであり、かつ
Ｃ２が、ヒトＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである、
請求項８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１８】
請求項８８〜１１７のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする、単離された組換え核酸分子。
【請求項１１９】
請求項８８〜１１７のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１２０】
組換え核酸の発現に好適な条件下で請求項１１９に記載の宿主細胞を維持することにより該組換え核酸を発現させて組換え融合タンパク質を産生することを含む、組換え融合タンパク質の産生方法。
【請求項１２１】
前記組換え融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
第１のポリペプチドに由来する第１の部分と第２のポリペプチドに由来する第２の部分とを含む組換え融合タンパク質であって、該第１のポリペプチドが、式
（Ａ）−Ｌ１
〔式中、
（Ａ）は、該第１のポリペプチド中に存在するアミノ酸配列であり、そして
Ｌ１は、該第１のポリペプチド中の（Ａ）のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０アミノ酸を含むアミノ酸モチーフである〕
を有する構造を含み、
該融合ポリペプチドが、式
（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）
〔式中、
（Ｂ）は、該第２のポリペプチドに由来する該部分であり、
付帯条件として、（Ａ）および（Ｂ）の少なくとも一方はドメインであり、しかも（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、
ａ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれヒト抗体可変ドメインであるか、
ｂ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体重鎖可変ドメインであるか、
ｃ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体軽鎖可変ドメインであるか、
ｄ）（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインであるか、もしくは
ｅ）（Ａ）はＶＨＨでありかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインであるものとするか、または
付帯条件として、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、次のものは本発明から除外されるものとする、（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）｛ここで、（Ａ）は、マウスＶＨであり、（Ｂ）は、マウスＶＬであり、そしてＬ１は、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏ、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＰｈｅＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＶａｌ、またはＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕである｝〕
を有する、上記組換え融合タンパク質。
【請求項１２３】
付帯条件として、（Ａ）がＶＨでありかつ（Ｂ）がＶＬである場合、Ｌ１がＣＨ１のアミノ末端から１〜５もしくは１〜６個の連続したアミノ酸よりなることはないものとする、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２４】
前記第１のポリペプチドが免疫グロブリン可変ドメインである、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２５】
前記免疫グロブリン可変ドメインが抗体可変ドメインである、請求項１２４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２６】
前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン定常領域である、請求項１２４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２７】
（Ｂ）が、抗体ＣＨ１の少なくとも一部分、抗体ヒンジの少なくとも一部分、抗体ＣＨ２の少なくとも一部分、または抗体ＣＨ３の少なくとも一部分を含む、請求項１２６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２８】
（Ａ）が免疫グロブリン可変ドメインである、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２９】
前記免疫グロブリン可変ドメインが抗体可変ドメインである、請求項１２８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３０】
前記抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである、請求項１２９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３１】
Ｌ１がＣκまたはＣλの１〜約５０個の連続したアミノ末端アミノ酸を含む、請求項１３０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３２】
前記抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである、請求項１２９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３３】
前記抗体重鎖可変ドメインがＶＨまたはＶＨＨである、請求項１３２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３４】
Ｌ１がＣＨ１の１〜約５０個の連続したアミノ末端アミノ酸を含む、請求項１３２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３５】
（Ａ）が抗体重鎖可変ドメインであり、かつ（Ｂ）が抗体重鎖可変ドメインである、請求項１２９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３６】
（Ａ）が抗体軽鎖可変ドメインであり、かつ（Ｂ）が抗体重鎖可変ドメインまたは抗体軽鎖可変ドメインである、請求項１２８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３７】
（Ａ）がＶκでありかつ（Ｂ）がＶκであるか、
（Ａ）がＶκでありかつ（Ｂ）がＶλであるか、
（Ａ）がＶκでありかつ（Ｂ）がＶＨもしくはＶＨＨであるか、
（Ａ）がＶλでありかつ（Ｂ）がＶκであるか、
（Ａ）がＶλでありかつ（Ｂ）がＶλであるか、または
（Ａ）がＶλでありかつ（Ｂ）がＶＨもしくはＶＨＨである、
請求項１３６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３８】
（Ａ）がＶＨでありかつＬ１がＣＨ１の最初の３〜約１２アミノ酸を含むか、（Ａ）がＶκでありかつＬ１がＣκの最初の３〜約１２アミノ酸を含むか、または（Ａ）がＶλでありかつＬ１がＣλの最初の３〜約１２アミノ酸を含む、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３９】
（Ａ）が、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒを含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１が、ＣＨ１の最初の３〜約１２アミノ酸を含む、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４０】
Ｌ１が、ＡｌａＳｅｒＴｈｒ、ＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒ、またはＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｙである、請求項１３９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４１】
（Ａ）が、ＶＨまたはＶκドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）ＶａｌＬｅｕを含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１が、Ｃλの最初の３〜約１２アミノ酸を含む、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４２】
（Ａ）が、ＶＨまたはＶλドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇを含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１が、Ｃκの最初の３〜約１２アミノ酸を含む、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４３】
（Ａ）が免疫グロブリン定常ドメインである、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４４】
前記免疫グロブリン定常ドメインが抗体定常ドメインである、請求項１４３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４５】
前記抗体定常ドメインが抗体重鎖定常ドメインである、請求項１４４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４６】
（Ａ）が非ヒト免疫グロブリン定常ドメインであり、かつ（Ｂ）がヒトポリペプチドに由来する、請求項１４５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４７】
前記第２のポリペプチドが、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される、請求項１２２〜１２４および１２８〜１４６のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４８】
前記第１のポリペプチドが、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される、請求項１２２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４９】
前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域のＦｃ部分である、請求項１４８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５０】
請求項１２２〜１４９のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする、単離された組換え核酸分子。
【請求項１５１】
請求項１２２〜１４９のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１５２】
組換え核酸の発現に好適な条件下で請求項１５１に記載の宿主細胞を維持することにより該組換え核酸を発現させて組換え融合タンパク質を産生することを含む、組換え融合タンパク質の産生方法。
【請求項１５３】
前記組換え融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
免疫グロブリン可変ドメインである第１の部分と第２の部分とを含む組換え融合タンパク質であって、該第１の部分がリンカーを介して該第２の部分に結合され、かつ該組換え融合タンパク質が、式
（Ａ’）−（Ｌ２）−（Ｂ）
〔式中、
（Ａ’）は、該免疫グロブリン可変ドメインでありかつフレームワーク（ＦＲ）４を含み、
Ｌ２は該リンカーであり｛ここで、Ｌ２は、該ＦＲ４を含む天然に存在する免疫グロブリン中の該ＦＲ４のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む｝、そして
（Ｂ）は該第２の部分であり、
付帯条件として、Ｌ２−（Ｂ）は、該ＦＲ４を含む天然に存在する抗体中の該ＦＲ４に結合されたペプチドであるＣＬドメインでもＣＨ１ドメインでもなく、しかも（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、
ａ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれヒト抗体可変ドメインであるか、
ｂ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体重鎖可変ドメインであるか、
ｃ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体軽鎖可変ドメインであるか、
ｄ）（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインであるか、もしくは
ｅ）（Ａ）はＶＨＨでありかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインであるものとするか、または
付帯条件として、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、次のものは本発明から除外されるものとする、（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）｛ここで、（Ａ）は、マウスＶＨであり、（Ｂ）は、マウスＶＬであり、そしてＬ１は、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏ、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＰｈｅＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＶａｌ、またはＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙである｝〕
を有する、上記組換え融合タンパク質。
【請求項１５５】
（Ａ’）が抗体重鎖可変ドメインまたはハイブリッド抗体軽鎖可変ドメインである、請求項１５４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５６】
前記抗体重鎖可変ドメインおよび前記ハイブリッド軽鎖可変ドメインが、それぞれ、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒを含むＦＲ４を含む、請求項１５５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５７】
ＦＲ４が、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒを含む、請求項１５６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５８】
Ｘ４がＣＨ１のアミノ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１５７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５９】
Ｌ２が、ＡｌａＳｅｒＴｈｒ、ＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒ、またはＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｙを含む、請求項１５８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６０】
（Ａ’）がハイブリッド抗体可変ドメインまたはＶκである、請求項１５４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６１】
前記ハイブリッド可変ドメインおよびＶκが、それぞれ、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓＡｒｇを含むＦＲ４を含む、請求項１６０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６２】
ＦＲ４が、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓＡｒｇ、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＡｒｇＬｙｓＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇを含む、請求項１６１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６３】
Ｌ２がＣκのアミノ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１６１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６４】
Ｌ２が、ＴｈｒＶａｌＡｌａ、ＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒ、またはＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒＧｌｙを含む、請求項１６３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６５】
（Ａ’）がハイブリッド抗体可変ドメインまたはＶλである、請求項１５４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６６】
前記ハイブリッド抗体可変ドメインおよびＶλが、それぞれ、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕを含むＦＲ４を含む、請求項１６５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６７】
ＦＲ４が、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕを含む、請求項１６６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６８】
（Ｂ）が免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項１５４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６９】
前記免疫グロブリン可変ドメインが（Ｂ）のアミノ末端に存在する、請求項１６８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７０】
（Ｂ）が抗体軽鎖可変ドメインまたは抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項１６８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７１】
（Ｂ）が免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項１５４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７２】
免疫グロブリン定常領域ドメインの前記少なくとも一部分が（Ｂ）のアミノ末端に存在する、請求項１７１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７３】
前記免疫グロブリン定常領域がＩｇＧ定常領域である、請求項１７１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７４】
前記免疫グロブリン定常領域がＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ４定常領域である、請求項１７３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７５】
（Ｂ）が、ＣＨ１の少なくとも一部分、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２の少なくとも一部分、またはＣＨ３の少なくとも一部分を含む、請求項１７４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７６】
（Ｂ）がヒンジの少なくとも一部分を含む、請求項１７５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７７】
ヒンジの前記部分がＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏを含む、請求項１７６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７８】
（Ｂ）がＣＨ２−ＣＨ３をさらに含む、請求項１７７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７９】
（Ｂ）がＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の一部分を含む、請求項１７５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８０】
（Ｂ）がヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む、請求項１７５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８１】
（Ｂ）がＣＨ２−ＣＨ３を含む、請求項１７５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８２】
（Ｂ）がＣＨ３を含む、請求項１７５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８３】
第１の部分と免疫グロブリン定常領域に由来する第２の部分とを含む組換え融合タンパク質であって、該第１の部分がリンカーを介して該第２の部分に結合されており、かつ該組換え融合タンパク質が、式
（Ａ）−Ｌ３−（Ｃ３）
〔式中、
（Ａ）は、該第１の部分であり、
（Ｃ３）は、免疫グロブリン定常領域に由来する該第２の部分であり、そして
Ｌ３は、該リンカーであり｛ここで、Ｌ３は、（Ｃ３）を含む天然に存在する免疫グロブリン中の（Ｃ３）のアミノ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む｝、
付帯条件として、（Ａ）は、該天然に存在する免疫グロブリン中に見いだされる抗体可変ドメインではないものとする〕
を有する、上記組換え融合タンパク質。
【請求項１８４】
（Ｃ３）が少なくとも１つの抗体定常ドメインを含む、請求項１８３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８５】
前記抗体定常ドメインがヒト抗体定常ドメインである、請求項１８４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８６】
前記抗体定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインである、請求項１８５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８７】
前記抗体定常ドメインがＩｇＧ１定常ドメインまたはＩｇＧ４定常ドメインである、請求項１８６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８８】
（Ｃ３）がＣＨ３を含む、請求項１８７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８９】
Ｌ３がＣＨ２のカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１８８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９０】
（Ｃ３）がＣＨ２またはＣＨ２−ＣＨ３を含む、請求項１８９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９１】
Ｌ３がヒンジのカルボキシ末端から１〜約３４個の連続したアミノ酸を含む、請求項１９０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９２】
Ｌ３がＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏまたはＧｌｙＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏを含む、請求項１９１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９３】
（Ｃ３）がヒンジを含む、請求項１８７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９４】
Ｌ３がＣＨ１のカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１９３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９５】
（Ｃ３）がＣＨ１を含む、請求項１８６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９６】
Ｌ３が抗体重鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１９５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９７】
Ｌ３がＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒを含む、請求項１９６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９８】
Ｌ３が、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒを含む、請求項１９７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９９】
前記抗体定常ドメインが抗体軽鎖定常ドメインである、請求項１８４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２００】
前記抗体軽鎖定常ドメインがＣκである、請求項１９９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０１】
Ｌ３が抗体軽鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項２００に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０２】
Ｌ３がＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓＡｒｇを含む、請求項２０１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０３】
Ｌ３が、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓＡｒｇ、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＡｒｇＬｙｓＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇである、請求項２０２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０４】
前記抗体軽鎖定常ドメインがＣλである、請求項１９９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０５】
Ｌ３が抗体軽鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項２０４に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０６】
Ｌ３がＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕを含む、請求項２０５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０７】
Ｌ３が、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕである、請求項２０６に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０８】
（Ａ）が、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される、請求項１８３〜２０７のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０９】
抗体可変ドメインに由来する第１の部分と第２のポリペプチドに由来する第２の部分とを含む組換え融合タンパク質であって、該抗体可変ドメインが、式（Ａ）−Ｌ１
〔式中、
（Ａ）はＣＤＲ３よりなり、そして
Ｌ１はＦＲ４よりなる〕
を有する構造を含み、該融合ポリペプチドが、式
（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）
〔式中、
（Ｂ）は、該第２のポリペプチドに由来する該部分である〕
を有する、上記組換え融合タンパク質。
【請求項２１０】
前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン定常領域である、請求項２０９に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２１１】
（Ｂ）が、抗体ＣＨ１の少なくとも一部分、抗体ヒンジの少なくとも一部分、抗体ＣＨ２の少なくとも一部分、または抗体ＣＨ３の少なくとも一部分を含む、請求項２１０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２１２】
請求項１５４〜２１１のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする、単離された組換え核酸分子。
【請求項２１３】
請求項１５４〜２１１のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項２１４】
組換え核酸の発現に好適な条件下で請求項２１３に記載の宿主細胞を維持することにより該組換え核酸を発現させて組換え融合タンパク質を産生することを含む、組換え融合タンパク質の産生方法。
【請求項２１５】
前記組換え融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
治療、診断、および／または予防に使用するための、請求項１〜３０、３５〜７１、７６〜８３、８８〜１１７、１２２〜１４９、および１５４〜２１１のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２１７】
免疫応答を誘導する可能性が低減された、ヒトにおける治療、診断、および／または予防のための医薬を製造するための、請求項１〜３０、３５〜７１、７６〜８３、８８〜１１７、１２２〜１４９、および１５４〜２１１のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質の使用。
【請求項２１８】
天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較して免疫応答を誘導する可能性が低減された、請求項１〜３０、３５〜７１、７６〜８３、８８〜１１７、１２２〜１４９、および１５４〜２１１のいずれか１項に記載の有効量の組換え融合タンパク質をヒトに投与することを含む、ヒトにおける治療、診断、および／または予防の方法。
【請求項２１９】
天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較して免疫応答を誘導する可能性が低減された、ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用。
【請求項２２０】
天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較して凝集傾向が低減された、ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用。
【請求項２２１】
ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用であって、該組換え融合タンパク質が、天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較してより高レベルで発現される、上記使用。
【請求項２２２】
ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用であって、該組換え融合タンパク質が、天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質を基準にして比較して向上した安定性を有する、上記使用。
【請求項２２３】
第１の部分（Ａ）と、第２の部分（Ｂ）と、（Ａ）と（Ｂ）との間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用であって、該組換え融合タンパク質が、（Ａ）と（Ｂ）との境界部が天然の連結部でないものとして（Ａ）と（Ｂ）とを含む対応する融合タンパク質と比較して低減された凝集傾向を有する、上記使用。
【請求項２２４】
第１の部分（Ａ）と、第２の部分（Ｂ）と、（Ａ）と（Ｂ）との間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用であって、該組換え融合タンパク質が、対応する融合タンパク質が（Ａ）と（Ｂ）との間に天然の連結部を含有していないものとして（Ａ）と（Ｂ）とを含む対応する融合タンパク質と比較してより高レベルで発現される、上記使用。
【請求項２２５】
第１の部分（Ａ）と、第２の部分（Ｂ）と、（Ａ）と（Ｂ）との間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用であって、該組換え融合タンパク質が、対応する融合タンパク質が（Ａ）と（Ｂ）との間に天然の連結部を含有していないものとして（Ａ）と（Ｂ）とを含む対応する融合タンパク質と比較して向上した安定性を有する、上記使用。
【請求項２２６】
請求項１〜３０、３５〜７１、７６〜８３、８８〜１１７、１２２〜１４９、および１５４〜２１１のいずれか１項に記載の組換え融合タンパク質と生理学上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２２７】
第１の部分と第２の部分とを天然の連結部で融合して含む融合タンパク質の作製方法であって、該第１の部分が第１のポリペプチドに由来し、かつ該第２の部分が第２のポリペプチドに由来し、該第１のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列と該第２のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列とを解析して、解析された配列の両方に存在する保存アミノ酸モチーフを同定することと、式
Ａ−Ｙ−Ｂ
〔式中、
Ａは、該第１の部分であり、
Ｙは、該保存アミノ酸モチーフであり、
Ｂは、該第２の部分であり、しかも、
該第１のポリペプチドはＡ−Ｙを含み、かつ該第２のポリペプチドはＹ−Ｂを含む〕
を有する融合タンパク質を調製することと、が含まれる、上記方法。
【請求項２２８】
Ｙが１〜約５０アミノ酸よりなる、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
Ｙが３〜１０アミノ酸よりなる、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３０】
前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３１】
前記免疫グロブリン定常ドメインがヒト免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
前記免疫グロブリン定常ドメインが非ヒト免疫グロブリン定常ドメインである、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３３】
前記第２のポリペプチドがＴ細胞レセプター定常ドメインを含む、請求項２３０〜２３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３４】
前記第２のポリペプチドが抗体定常ドメインを含む、請求項２３０〜２３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３５】
前記抗体定常ドメインが軽鎖定常ドメインまたは重鎖定常ドメインである、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
前記抗体定常ドメインがヒト抗体重鎖定常ドメインである、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３７】
前記第２のポリペプチドおよびＢが抗体ヒンジ領域を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３８】
前記第２のポリペプチドおよびＢがＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の一部分を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３９】
前記第２のポリペプチドおよびＢがヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２４０】
前記第２のポリペプチドおよびＢがＣＨ２−ＣＨ３を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２４１】
前記第２のポリペプチドおよびＢがＣＨ３を含む、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２４２】
前記ヒト抗体重鎖定常ドメインがＩｇＧ定常ドメインである、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２４３】
前記ＩｇＧ定常ドメインがＩｇＧ１定常ドメインまたはＩｇＧ４定常ドメインである、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
前記第１のポリペプチドが、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される、請求項２２７〜２４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４５】
前記第１のポリペプチドおよびＡが免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２４６】
前記免疫グロブリン可変ドメインがヒト免疫グロブリン可変ドメインである、請求項２４５に記載の方法。
【請求項２４７】
前記免疫グロブリン可変ドメインが非ヒト免疫グロブリン可変ドメインである、請求項２４６に記載の方法。
【請求項２４８】
前記第１のポリペプチドおよびＡがＴ細胞レセプター可変ドメインを含む、請求項２４５〜２４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４９】
前記第１のポリペプチドおよびＡが抗体可変ドメインを含む、請求項２４５〜２４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５０】
前記抗体可変ドメインが非ヒト抗体可変ドメインである、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５１】
前記非ヒト抗体可変ドメインがラクダ科動物抗体可変ドメインまたはナースシャーク抗体可変ドメインである、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５２】
前記抗体可変ドメインがヒト抗体可変ドメインである、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５３】
前記ヒト抗体可変ドメインが、Ｖκ、Ｖλ、またはＶＨである、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
前記第２のポリペプチドが、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される、請求項２２７〜２２９および２４４〜２５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５５】
前記第１のポリペプチドが第１の抗体鎖であり、かつ前記第２のポリペプチドが第２の抗体鎖である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２５６】
Ｙが前記第１の抗体鎖の可変ドメイン中および前記第２の抗体鎖の可変ドメイン中に存在する、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２５７】
Ｙがフレームワーク領域（ＦＲ）４中に存在する、請求項２５６に記載の方法。
【請求項２５８】
ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒまたはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）である、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
Ａが、ＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む抗体可変ドメインの一部分を含む、請求項２５７または２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
ＹがＦＲ３中に存在する、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２６１】
Ｙが、ＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓである、請求項２６０に記載の方法。
【請求項２６２】
Ａが、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２を含む抗体可変ドメインの一部分を含む、請求項２６０または２６１に記載の方法。
【請求項２６３】
Ｙが前記第１の抗体鎖の定常ドメイン中および前記第２の抗体鎖の定常ドメイン中に存在する、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２６４】
Ｙが、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌである、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
Ｙが、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ、およびＶａｌＴｈｒＶａｌよりなる群から選択される、請求項２６４に記載の方法。
【請求項２６６】
前記第１の抗体鎖および前記第２の抗体鎖が異なる種由来である、請求項２５５〜２６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６７】
前記第１の抗体鎖がヒト由来であり、かつ前記第２の抗体鎖が非ヒト由来である、請求項２６６に記載の方法。
【請求項２６８】
前記第１の抗体鎖が非ヒト由来であり、かつ前記第２の抗体鎖がヒト由来である、請求項２６６に記載の方法。
【請求項２６９】
前記第１の抗体鎖および前記第２の抗体鎖が同一の種由来のある、請求項２５５〜２６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７０】
前記第１の抗体鎖および前記第２の抗体鎖がヒト由来である、請求項２６９に記載の方法。
【請求項２７１】
前記融合タンパク質が、Ａのアミノ末端に位置する第３の部分をさらに含む、請求項２２７〜２７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７２】
前記第３の部分が免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項２７１に記載の方法。
【請求項２７３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが両方ともに同一のタンパク質スーパーファミリーのメンバーである、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２７４】
前記タンパク質スーパーファミリーが、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびＴＮＦレセプタースーパーファミリーよりなる群から選択される、請求項２７３に記載の方法。
【請求項２７５】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが両方ともヒトポリペプチドである、請求項２２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然の連結部を含有する組換え融合タンパク質に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、米国を指定した２００６年１２月５日出願の国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４５５９号の一部継続出願であり、本出願は、２００６年１月２４日出願の米国仮出願第６０／７６１，７０８号に基づく利益を主張する。以上の出願の教示はすべて、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【背景技術】
【０００３】
融合タンパク質は、一群の潜在的に有効な治療剤および診断剤であると認識されている。融合タンパク質技術により提供される利点の１つは、所望の機能、増大された望ましい性質、および／または低減された望ましくない性質を有する融合タンパク質をデザインできる可能性である。
【０００４】
融合タンパク質は、さまざまな親タンパク質に由来する成分ポリペプチドを含有し、これらの成分ポリペプチドは、ペプチド結合を介して互いに結合すなわち融合されている。融合タンパク質中の各成分ポリペプチドは、融合タンパク質の性質に寄与するので、成分ポリペプチドの活性の低下を生じない位置で成分ポリペプチドを融合することが望ましい。したがって、従来の融合タンパク質は、一般的には、天然の親タンパク質中のドメイン境界またはドメイン間ループに対応する位置で融合される。たとえば、従来のキメラ抗体軽鎖は、ヒト軽鎖定常ドメインに融合された非ヒト抗体軽鎖可変ドメインを含有する融合タンパク質である。
【０００５】
商業用途を制限する可能性のある従来の融合タンパク質の一側面は、融合部位を取り囲むアミノ酸の配列および構造がいずれの親タンパク質の対応するアミノ酸配列にもマッチしないことである。その結果として、融合タンパク質は、融合部位に隣接するアミノ酸を含む「非自己」アミノ酸配列を含有する。融合タンパク質が、同一の種由来のタンパク質に由来するポリペプチドを含有する場合でさえも（たとえば、２つのヒトポリペプチドが融合される場合でさえも）、一般的には、融合部位のアミノ酸配列は、異なる親タンパク質由来のアミノ酸残基の並置により生成された非自己配列を含むであろう。こうした非自己配列は、抗体および／またはＴ細胞エピトープとして機能する可能性があるとともに融合タンパク質を免疫原性にする可能性があるので、融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ使用を制限したりまたは融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ用途に適さなくしたりする可能性がある。
【０００６】
また、従来の融合タンパク質中の融合部位のアミノ酸残基の並置は、他の望ましくない効果を有する可能性もある。たとえば、並置されたアミノ酸は、発現、活性、および／または安定性に重要な構造上の特徴の破壊を引き起こす可能性がある。その結果、従来の融合タンパク質は、多くの場合、アグリゲートもしくはオリゴマーを形成したり、低い溶解性を有していたり、かつ／または親タンパク質よりもタンパク質分解を受けやすかったりする。そのほかに、従来の融合タンパク質は、多くの場合、親タンパク質よりも低い収率で生成されるにすぎない可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
改良された融合タンパク質ならびに融合タンパク質のデザインおよび作製のための改良された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、天然の連結部を含有する組換え融合タンパク質に関する。本発明に係る融合タンパク質は、２つの異なるポリペプチドに由来する少なくとも２つの部分と、２つの部分間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む。
【０００９】
組換え融合タンパク質は、第１のポリペプチドに由来する第１の部分と第２のポリペプチドに由来する第２の部分とを含有するハイブリッドドメインを含みうる。ここで、第１のポリペプチドは、式（Ｘ１−Ｙ−Ｘ２）を有するドメインを含み、かつ第２のポリペプチドは、式（Ｚ１−Ｙ−Ｚ２）を有するドメインを含む〔式中、Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、Ｘ１およびＺ１は、それぞれ、該第１のポリペプチド中および該第２のポリペプチド中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、そしてＸ２およびＺ２は、それぞれ、該第１のポリペプチド中および該第２のポリペプチド中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、ただし、Ｘ１およびＺ１のアミノ酸配列が同一である場合、Ｘ２およびＺ２のアミノ酸配列は同一ではなく、Ｘ２およびＺ２のアミノ酸配列が同一である場合、Ｘ１およびＺ１のアミノ酸配列は同一ではない〕。
【００１０】
所望により、組換え融合タンパク質が式Ｄ−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｅ〔式中、Ｄは、不在であるかまたは前記第１のポリペプチド中の（Ｘ１−Ｙ−Ｘ２）のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列であり、そしてＥは、不在であるかまたは前記第２のポリペプチド中の（Ｚ１−Ｙ−Ｚ２）のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である〕を有する構造を含むように、ハイブリッドドメインをアミノ末端アミノ酸配列Ｄに結合させたりかつ／またカルボキシ末端アミノ酸配列Ｅに結合させたりすることが可能である。特定の実施形態では、Ｄが存在するか、Ｅが存在するか、またはＤおよびＥが存在する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ハイブリッドドメイン（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド抗体可変ドメインのようなハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインである。Ｙは、フレームワーク領域（ＦＲ）４中に存在しうる。たとえば、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）でありうる。そのような実施形態では、Ｘ１は、ＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む抗体可変ドメインの一部分でありうる。
【００１２】
他の実施形態では、Ｙは、ＦＲ３中に存在する。たとえば、Ｙは、ＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ（配列番号３８８）、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３８９）、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３９０）でありうる。そのような実施形態では、Ｘ１は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２を含む抗体可変ドメインの一部分でありうる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ハイブリッドドメイン（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド抗体定常ドメインのようなハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである。Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）でありうる。たとえば、特定の実施形態では、Ｙは、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号３９８）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号３９９）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４００）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０１）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０２）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０３）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０４）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０５）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０６）、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４０７）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４０８）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４０９）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１０）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１１）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１２）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１３）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１４）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１５）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ（配列番号４１６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ（配列番号４１７）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ（配列番号４１８）、およびまたはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）よりなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｄは不在であり、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインであり、かつＥは免疫グロブリン定常ドメインである。融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端またはカルボキシル末端に存在する第２の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含みうる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｄは免疫グロブリン可変ドメインであり、かつ（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである。他の実施形態では、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインであり、かつＥは免疫グロブリン定常ドメインである。他の実施形態では、Ｅは不在であり、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインであり、かつ融合タンパク質は（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在するさらなるドメインを含む。
【００１６】
他の実施形態では、Ｄは免疫グロブリン定常ドメインであり、かつ（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである。
【００１７】
本発明に係る融合タンパク質は、第１のポリペプチド由来の第１の部分と第２のポリペプチド由来の第２の部分とを含みうる。ここで、ポリペプチドは両方とも、同一のタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。たとえば、ポリペプチドは両方とも、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびＴＮＦレセプタースーパーファミリーよりなる群から選択されるタンパク質スーパーファミリーのメンバーでありうる。追加としてまたは他の選択肢として、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは両方ともヒトポリペプチドである。
【００１８】
一般的には、Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、およびＺ２は、それぞれ独立して、約１〜約２００アミノ酸よりなる。いくつかの実施形態では、ハイブリッドドメインは、免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン定常ドメインとほぼ等しいサイズである。
【００１９】
より特定的な実施形態では、組換え融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む。ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインは、第１の免疫グロブリン由来の第１の免疫グロブリンフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する部分と第２の免疫グロブリン由来の第２の免疫グロブリンＦＲに由来する部分とを含むハイブリッドＦＲを含み、第１の免疫グロブリンＦＲおよび第２の免疫グロブリンＦＲは、それぞれ、保存アミノ酸モチーフＹを含み、かつハイブリッド免疫グロブリンＦＲは、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、
Ｆ１は、第１の免疫グロブリンＦＲ中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、そして
Ｆ２は、第２の免疫グロブリンＦＲ中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフである〕
を有する。
【００２０】
Ｙは、第１の免疫グロブリンおよび第２の免疫グロブリンのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４に位置しうる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｙは、ＦＲ４に位置し、かつＦ２は、免疫グロブリン定常ドメインを含む天然に存在するタンパク質中の免疫グロブリン定常ドメインのアミノ末端に隣接するアミノ酸配列（該アミノ末端に結合されたペプチド）である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインは、抗体軽鎖定常ドメインであり、かつ前記第２の免疫グロブリンＦＲは、抗体軽鎖可変ドメイン由来のＦＲ４である。たとえば、抗体定常ドメインは、ＣκまたはＣλであり、かつ該第２の抗体ＦＲ４は、それぞれ、ＶκＦＲ４またはＶλＦＲ４である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第１の免疫グロブリンは、マウス、ラット、サメ、サカナ、オポッサム、ヒツジ、ブタ、ラクダ科動物、ウサギ、または非ヒト霊長動物に由来する免疫グロブリンのような非ヒト免疫グロブリンである。そのような実施形態では、第２の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンでありうる。好ましくは、そのような実施形態では、ハイブリッドＦＲは、ヒト免疫グロブリン定常ドメインに結合される。
【００２３】
特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインはハイブリッド抗体可変ドメインであり、かつＹはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）である。そのような実施形態では、Ｆ１はＰｈｅでありうる。また、Ｆ２は（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）である。好ましくは、この実施形態に係る融合タンパク質は、ヒト抗体定常ドメイン、たとえば、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含む。
【００２４】
特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインはハイブリッド抗体可変ドメインであり、ＹはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、Ｆ１はＴｒｐであり、かつＦ２は（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）または（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）である。好ましくは、この実施形態に係る融合タンパク質は、ヒト抗体軽鎖定常ドメインを含む。
【００２５】
特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインはハイブリッド抗体可変ドメインであり、かつＹはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）である。そのような実施形態では、Ｆ１はＰｈｅでありうる。また、Ｆ２はＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）でありうる。好ましくは、この実施形態に係る融合タンパク質は、ヒト抗体重鎖定常ドメイン、たとえば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインを含む。
【００２６】
特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインはハイブリッド抗体可変ドメインである。ＹはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、Ｆ１はＴｒｐであり、かつＦ２は（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）または（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）である。好ましくは、この実施形態に係る融合タンパク質は、ヒト抗体軽鎖定常ドメインを含む。
【００２７】
所望により、組換え融合タンパク質は、式（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＬ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ１、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ２、または（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｆｃを有する構造を含む。組換え融合タンパク質は、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）のアミノ末端またはカルボキシ末端に存在する第２の免疫グロブリン可変ドメインをさらに含みうる。
【００２８】
本発明はまた、ヒト抗体定常ドメインに融合された非ヒト抗体可変領域を含む改良された融合タンパク質に関する。この改良物は、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、
Ｆ１は、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、
Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２は、（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（４２０）、（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）、もしくは（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）であるか、または
Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、かつＦ２は、ＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）、（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）、もしくは（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）である〕
を有する非ヒト可変領域中にハイブリッドＦＲ４を含む。
【００２９】
組換え融合タンパク質は、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインに融合された免疫グロブリン可変ドメインを含みうる。ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、第１の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分と第２の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分とを含み、第１の免疫グロブリン定常ドメインおよび第２の免疫グロブリン定常ドメインは、それぞれ、保存アミノ酸モチーフＹを含む。ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、式
Ｃ１−Ｙ−Ｃ２
〔式中、
Ｙは、該保存アミノ酸モチーフであり、
Ｃ１は、第１の免疫グロブリン定常領域中のＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸モチーフであり、
Ｃ２は、第２の免疫グロブリン定常領域中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである〕
を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、第１の抗体定常ドメイン由来の部分と第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含むハイブリッド抗体定常ドメインである。ハイブリッド抗体定常ドメインは、ハイブリッド抗体ＣＨ１、ハイブリッド抗体ヒンジ、ハイブリッド抗体ＣＨ２、またはハイブリッド抗体ＣＨ３でありうる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第１の抗体定常ドメインおよび前記第２の抗体定常ドメインは、異なる種に由来する。
【００３２】
他の実施形態では、第２の抗体定常ドメインはヒト抗体定常ドメインである。他の選択肢としてまたは追加として、第１の抗体定常ドメインは、マウス、ラット、サメ、サカナ、オポッサム、ヒツジ、ブタ、ラクダ科動物、ウサギ、または非ヒト霊長動物の定常ドメインである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、非ヒト抗体可変ドメインである免疫グロブリン可変ドメインを含み、かつ第１の定常ドメインは、対応する非ヒトＣＨ１ドメイン、Ｃλドメイン、またはＣκドメインである。いくつかの実施形態では、前記第１の抗体定常ドメインは軽鎖定常ドメインであり、かつ前記第２の抗体定常ドメインは重鎖定常ドメインである。
【００３４】
他の実施形態では、前記第１の抗体定常ドメインはラクダ科動物重鎖定常ドメインであり、かつ前記第２の抗体定常ドメインは重鎖定常ドメインである。所望により、ＶＨＨは、ハイブリッド定常ドメインのアミノ末端に存在しうる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第１の抗体定常ドメインおよび前記第２の抗体定常ドメインは、異なるアイソタイプのものである。好ましくは、第２の抗体定常ドメインは、ＩｇＧ定常ドメインである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、軽鎖可変ドメインである抗体可変ドメインを含み、かつ第１の抗体定常ドメインは軽鎖定常ドメインである。そのような実施形態では、第２の抗体定常ドメインは、ヒト抗体重鎖定常ドメインまたはヒト抗体軽鎖定常ドメインでありうる。いくつかの実施形態では、ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３である。
【００３７】
特定の実施形態では、Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）である。これらの実施形態のいくつかでは、第２の抗体定常ドメインは、ヒト抗体定常ドメイン、たとえば、Ｃκ、Ｃλ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３である。
【００３８】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッドヒトＣＨ１ドメインに融合されたヒト軽鎖可変ドメインを含み、しかも
Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）またはＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、
Ｙは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）であり、かつ
Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ１中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである。
【００３９】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッドヒトＣＨ２に融合されたヒト軽鎖可変ドメインを含み、ここで、
Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）またはＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、
Ｙは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）であり、かつ
Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである。
【００４０】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッドヒトＣＨ２に融合されたヒト重鎖可変ドメインを含み、ここで、
Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、
Ｙは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４７０）であり、かつ
Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである。
【００４１】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッドヒトＣκに融合されたヒトλ鎖可変ドメインを含み、しかもここで、
Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）であり、
Ｙは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）であり、かつ
Ｃ２は、ヒトＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである。
【００４２】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッドヒトＣκに融合されたヒト重鎖可変ドメインを含み、ここで、
Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、
Ｙは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４７０）であり、かつ
Ｃ２は、ヒトＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである。
【００４３】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッドヒトＣλに融合されたヒトκ鎖可変ドメインを含み、しかもここで、
Ｃ１は、ＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、
Ｙは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）であり、かつ
Ｃ２は、ヒトＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである。
【００４４】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッドヒトＣλに融合されたヒト重鎖可変ドメインを含み、ここで、
Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、
Ｙは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）であり、かつ
Ｃ２は、ヒトＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸モチーフである。
【００４５】
本発明はまた、第１のポリペプチドに由来する第１の部分と第２のポリペプチドに由来する第２の部分とを含む組換え融合タンパク質に関する。ここで、該第１のポリペプチドは、式（Ａ）−Ｌ１〔式中、（Ａ）は、該第１のポリペプチド中に存在するアミノ酸配列であり、そしてＬ１は、該第１のポリペプチド中の（Ａ）のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０アミノ酸を含むアミノ酸モチーフである〕を有する構造を含み、該融合ポリペプチドは、式
（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）
〔式中、（Ｂ）は、該第２のポリペプチドに由来する該部分であり、付帯条件として、（Ａ）および（Ｂ）の少なくとも一方はドメインであり、しかも（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、
ａ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれヒト抗体可変ドメインであるか、
ｂ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体重鎖可変ドメインであるか、
ｃ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体軽鎖可変ドメインであるか、
ｄ）（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインであるか、もしくは
ｅ）（Ａ）はＶＨＨでありかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインであるものとするか、
または付帯条件として、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、次のものは本発明から除外されるものとする、（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）｛ここで、（Ａ）はマウスＶＨであり、（Ｂ）はマウスＶＬであり、そしてＬ１は、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏ（配列番号５３７）、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙ（配列番号５３８）、ＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＰｈｅＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＶａｌ（配列番号５３９）、もしくはＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕ（配列番号５４０）である｝〕
を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは抗体可変ドメインである。第２のポリペプチドは免疫グロブリン定常領域でありうる。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は、抗体ＣＨ１の少なくとも一部分、抗体ヒンジの少なくとも一部分、抗体ＣＨ２の少なくとも一部分、または抗体ＣＨ３の少なくとも一部分を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインである。そのような実施形態では、Ｌ１は、ＣκまたはＣλの１〜約５０個の連続したアミノ末端アミノ酸を含む。他の実施形態では、（Ａ）は、ＶＨやＶＨＨのような抗体重鎖可変ドメインである。そのような実施形態では、Ｌ１は、ＣＨ１の１〜約５０個の連続したアミノ末端アミノ酸を含みうる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は抗体重鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインであるか、または（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインもしくは抗体軽鎖可変ドメインである。たとえば、特定の実施形態では、（Ａ）はＶκでありかつ（Ｂ）はＶκであるか、（Ａ）はＶκでありかつ（Ｂ）はＶλであるか、（Ａ）はＶκでありかつ（Ｂ）はＶＨもしくはＶＨＨであるか、（Ａ）はＶλでありかつ（Ｂ）はＶκであるか、（Ａ）はＶλでありかつ（Ｂ）はＶλであるか、または（Ａ）はＶλでありかつ（Ｂ）はＶＨもしくはＶＨＨである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、（Ａ）はＶＨでありかつＬ１はＣＨ１の最初の３〜約１２アミノ酸を含むか、（Ａ）はＶκでありかつＬ１はＣκの最初の３〜約１２アミノ酸を含むか、または（Ａ）はＶλでありかつＬ１はＣλの最初の３〜約１２アミノ酸を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、（Ａ）は、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７２）を含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１は、ＣＨ１の最初の３〜約１２アミノ酸を含む。これらの実施形態では、Ｌ１は、ＡｌａＳｅｒＴｈｒ（４７３）、ＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒ（配列番号４７４）、またはＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｙ（配列番号４７５）でありうる。
【００５１】
特定の実施形態では、（Ａ）は、ＶＨまたはＶκドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）ＶａｌＬｅｕ（配列番号４７６）を含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１は、Ｃλの最初の３〜約１２アミノ酸を含む。他の実施形態では、（Ａ）は、ＶＨまたはＶλドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４７７）を含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１は、Ｃκの最初の３〜約１２アミノ酸を含む。
【００５２】
他の実施形態では、（Ａ）は、抗体定常ドメインのような免疫グロブリン定常ドメインである。他の実施形態では、（Ａ）は非ヒト免疫グロブリン定常ドメインであり、かつ（Ｂ）はヒトポリペプチドに由来する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される。
【００５４】
他の実施形態では、第１のポリペプチドは、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される。そのような実施形態では、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域のＦｃ部分でありうる。
【００５５】
本発明は、免疫グロブリン可変ドメインである第１の部分と第２の部分とを含む組換え融合タンパク質に関する。ここで、該第１の部分は、リンカーを介して該第２の部分に結合され、かつ組換え融合タンパク質は、式
（Ａ’）−（Ｌ２）−（Ｂ）
〔式中、（Ａ’）は該免疫グロブリン可変ドメインでありかつフレームワーク（ＦＲ）４を含み、Ｌ２は、該リンカーであり、ここで、Ｌ２は、該ＦＲ４を含む天然に存在する免疫グロブリン中の該ＦＲ４のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含み、そして（Ｂ）は該第２の部分であり、
付帯条件として、Ｌ２−（Ｂ）は、該ＦＲ４を含む天然に存在する抗体中の該ＦＲ４に結合されたペプチドであるＣＬドメインでもＣＨ１ドメインでもなく、しかも（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、
ａ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれヒト抗体可変ドメインであるか、
ｂ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体重鎖可変ドメインであるか、
ｃ）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体軽鎖可変ドメインであるか、
ｄ）（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインであるか、もしくは
ｅ）（Ａ）はＶＨＨでありかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインであるものとするか、
または付帯条件として、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、次のものは本発明から除外されるものとする、（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）｛ここで、（Ａ）はマウスＶＨであり、（Ｂ）はマウスＶＬであり、そしてＬ１は、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏ（配列番号５３７）、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙ（配列番号５３８）、ＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＰｈｅＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＶａｌ（配列番号５３９）、もしくはＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙ（配列番号５４０）である｝〕
を有する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、（Ａ’）は、抗体重鎖可変ドメインまたはハイブリッド抗体可変ドメインである。いくつかの実施形態では、抗体重鎖可変ドメインまたはハイブリッド抗体可変ドメインは、それぞれ、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７８）を含むＦＲ４を含む。これらの実施形態では、Ｌ２は、ＣＨ１のアミノ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含みうる。特定の実施形態では、Ｌ２は、ＡｌａＳｅｒＴｈｒ（配列番号４７３）、ＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒ（配列番号４７４）、またはＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｙ（配列番号４７５）を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、（Ａ’）は、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８５）を含むＦＲ４を含むハイブリッド抗体可変ドメインまたはＶκである。これらの実施形態では、Ｌ２は、Ｃκのアミノ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含みうる。特定の実施形態では、Ｌ２は、ＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）、ＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒ（配列番号４９０）、またはＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒＧｌｙ（配列番号４９１）を含む。いくつかの実施形態では、（Ａ’）は、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４９２）を含むＦＲ４を含むハイブリッド抗体可変ドメインまたはＶλである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、（Ｂ）は、抗体軽鎖可変ドメインまたは抗体重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、（Ｂ）は、たとえば（Ｂ）のアミノ末端に、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１定常領域やＩｇＧ４定常領域のようなＩｇＧ定常領域でありうる。いくつかの実施形態では、（Ｂ）は、ＣＨ１の少なくとも一部分、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２の少なくとも一部分、またはＣＨ３の少なくとも一部分を含む。
【００５９】
特定の実施形態では、（Ｂ）は、ＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号５２０）を含むヒンジの少なくとも一部分を含む。追加として、（Ｂ）は、ＣＨ２−ＣＨ３をさらに含みうる。他の実施形態では、（Ｂ）は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＣＨ２−ＣＨ３、またはＣＨ３の一部分を含む。
【００６０】
本発明は、免疫グロブリン定常領域に由来する第１の部分と第２の部分とを含む組換え融合タンパク質に関する。第１の部分は、リンカーを介して該第２の部分に結合され、かつ組換え融合タンパク質は、式
（Ａ）−Ｌ３−（Ｃ３）
〔式中、（Ａ）は、該第１の部分であり、（Ｃ３）は、免疫グロブリン定常領域に由来する該第２の部分であり、そしてＬ３は、該リンカーであり、ここで、Ｌ３は、（Ｃ３）を含む天然に存在する免疫グロブリン中の（Ｃ３）のアミノ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含み、付帯条件として、（Ａ）は、該天然に存在する免疫グロブリン中に見いだされる抗体可変ドメインではないものとする〕
を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、（Ｃ３）は、少なくとも１つの抗体定常ドメイン、たとえば、ヒト抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ１定常ドメインやＩｇＧ４定常ドメインのようなＩｇＧ定常ドメインである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、（Ｃ３）はＣＨ３を含む。これらの実施形態では、Ｌ３は、ＣＨ２のカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。他の実施形態では、（Ｃ３）はＣＨ２またはＣＨ２−ＣＨ３を含む。これらの実施形態では、Ｌ３は、ヒンジのカルボキシ末端から１〜約３４個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、Ｌ３は、ＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号５２０）またはＧｌｙＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号５２１）を含みうる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、（Ｃ３）はヒンジを含む。これらの実施形態では、Ｌ３は、ＣＨ１のカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、（Ｃ３）はＣＨ１を含む。これらの実施形態では、Ｌ３は、抗体重鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７８）を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ＣκまたはＣλである。そのような実施形態では、Ｌ３は、抗体軽鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、抗体定常ドメインがＣκである場合、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８５）を含みうる。抗体定常ドメインがＣλである場合、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４９２）を含みうる。
【００６５】
特定の実施形態では、（Ａ）は、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される。
【００６６】
本発明はまた、抗体可変ドメインに由来する第１の部分と第２のポリペプチドに由来する第２の部分とを含む組換え融合タンパク質に関する。ここで、該抗体可変ドメインは、式（Ａ）−Ｌ１〔式中、（Ａ）はＣＤＲ３よりなり、Ｌ１はＦＲ４よりなる〕を有する構造を含み、該融合ポリペプチドは、式（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）〔式中、（Ｂ）は、該第２のポリペプチドに由来する該部分である〕を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは免疫グロブリン定常領域である。他の実施形態では、（Ｂ）は、抗体ＣＨ１の少なくとも一部分、抗体ヒンジの少なくとも一部分、抗体ＣＨ２の少なくとも一部分、または抗体ＣＨ３の少なくとも一部分を含む。
【００６８】
本発明はまた、本明細書に記載の天然の連結部を含む組換え融合タンパク質をコードする単離された組換え核酸分子と、本明細書に記載の天然の連結部を含む組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む宿主細胞とに関する。
【００６９】
本発明はまた、天然の連結部を含む融合タンパク質をコードする組換え核酸の発現に好適な条件下で本発明に係る宿主細胞を維持することにより該組換え核酸を発現させて組換え融合タンパク質を産生することを含む、組換え融合タンパク質の産生方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、該組換え融合タンパク質を単離することをさらに含む。
【００７０】
本発明はまた、治療、診断、および／または予防に使用するための、本明細書に記載の天然の連結部を含む組換え融合タンパク質に関する。本発明はまた、免疫応答を誘導する可能性が低減された、ヒトにおける治療、診断、および／または予防のための医薬を製造するための、本明細書に記載の天然の連結部を含む組換え融合タンパク質の使用に関する。
【００７１】
本発明はまた、本明細書に記載の天然の連結部を含むことにより天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較して免疫応答を誘導する可能性が低減された有効量の組換え融合タンパク質をヒトに投与することを含む、ヒトにおける治療、診断、および／または予防の方法に関する。
【００７２】
本発明はまた、天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較して免疫応答を誘導する可能性が低減された、ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用に関する。
【００７３】
本発明は、天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較して凝集傾向が低減された、ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用に関する。
【００７４】
本発明は、ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用に関する。ここで、該組換え融合タンパク質は、天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質と比較してより高レベルで発現される。
【００７５】
本発明は、ヒトの治療、診断、および／または予防のための組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用に関する。ここで、該組換え融合タンパク質は、天然の連結部を含有していない対応する融合タンパク質を基準にして比較して向上した安定性を有する。
【００７６】
本発明は、第１の部分（Ａ）と、第２の部分（Ｂ）と、（Ａ）と（Ｂ）との間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用に関する。ここで、該組換え融合タンパク質は、（Ａ）と（Ｂ）との境界部が天然の連結部でないものとして（Ａ）と（Ｂ）とを含む対応する融合タンパク質と比較して低減された凝集傾向を有する。
【００７７】
本発明は、第１の部分（Ａ）と、第２の部分（Ｂ）と、（Ａ）と（Ｂ）との間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用に関する。ここで、該組換え融合タンパク質は、対応する融合タンパク質が（Ａ）と（Ｂ）との間に天然の連結部を含有していないものとして（Ａ）と（Ｂ）とを含む対応する融合タンパク質と比較してより高レベルで発現される。
【００７８】
本発明は、第１の部分（Ａ）と、第２の部分（Ｂ）と、（Ａ）と（Ｂ）との間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む組換え融合タンパク質を調製するための、天然の連結部の使用に関する。ここで、該組換え融合タンパク質は、対応する融合タンパク質が（Ａ）と（Ｂ）との間に天然の連結部を含有していないものとして（Ａ）と（Ｂ）とを含む対応する融合タンパク質と比較して向上した安定性を有する。
【００７９】
本発明は、本明細書に記載の天然の連結部を含む組換え融合タンパク質と生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００８０】
本発明は、第１の部分と第２の部分とを天然の連結部で融合して含む融合タンパク質をデザインまたは生成する方法に関する。ここで、該第１の部分は、第１のポリペプチドに由来し、かつ該第２の部分は、第２のポリペプチドに由来する。本方法は、該第１のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列と該第２のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列とを解析して、解析された配列の両方に存在する保存アミノ酸モチーフを同定することと、式
Ａ−Ｙ−Ｂ
〔式中、Ａは該第１の部分であり、Ｙは該保存アミノ酸モチーフであり、Ｂは該第２の部分であり、しかもここで、該第１のポリペプチドはＡ−Ｙを含み、かつ該第２のポリペプチドはＹ−Ｂを含む〕
を有する融合タンパク質を調製することとを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン定常ドメインや非ヒト免疫グロブリン定常ドメインのような免疫グロブリン定常ドメインを含む。特定の実施形態では、第２のポリペプチドは抗体定常ドメインを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドおよびＢは、抗体重鎖定常ドメイン、たとえばヒンジ領域、またはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＣＨ２−ＣＨ３、もしくはＣＨ３の一部分を含む。好ましくは、定常ドメインは、ヒト抗体重鎖定常ドメイン、たとえば、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１定常ドメインまたはＩｇＧ４定常ドメイン）である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよびＡは、ヒト免疫グロブリン可変ドメインや非ヒト免疫グロブリン可変ドメインのような免疫グロブリン可変ドメインを含む。特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、非ヒト抗体可変ドメインまたはヒト抗体可変ドメインを含む。これらの実施形態では、第２のポリペプチドは、サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子、増殖因子レセプター、ホルモン、ホルモンレセプター、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分よりなる群から選択されうる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは第１の抗体鎖であり、第２のポリペプチドは第２の抗体鎖である。これらの実施形態では、Ｙは、該第１の抗体鎖の可変ドメイン中および該第２の抗体鎖の可変ドメイン中に存在する。一実施形態では、Ｙは、フレームワーク領域（ＦＲ）４中に存在する。これらの実施形態では、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）でありうる。他の実施形態では、Ｙは、ＦＲ３中に存在する。これらの実施形態では、Ｙは、ＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ（配列番号３８８）、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３８９）、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３９０）でありうる。他の実施形態では、Ｙは、該第１の抗体鎖の定常ドメイン中および該第２の抗体鎖の定常ドメイン中に存在する。これらの実施形態では、Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）でありうる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、前記第１の抗体鎖および前記第２の抗体鎖は、異なる種に由来する。他の実施形態では、前記第１の抗体鎖および前記第２の抗体鎖は、同一の種に由来する。特定の実施形態では、前記第１の抗体鎖および前記第２の抗体鎖は、ヒト由来である。
【００８７】
ある実施形態では、融合タンパク質は、Ａのアミノ末端に位置する第３の部分をさらに含む。ある実施形態では、第３の部分は、免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは両方とも、同一のタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。たとえば、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびＴＮＦレセプタースーパーファミリーよりなる群から選択されるタンパク質スーパーファミリーのメンバーでありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
本明細書内では、実施形態は、明瞭かつ簡潔な明細書を作成しうるように記載されているが、本発明から逸脱することなく実施形態をさまざまに組み合わせたりまたは分離したりしうることが意図されており、そのことは理解されよう。明瞭かつ簡潔に本発明を記載しうるように、本明細書は、開示された融合タンパク質の部分構造を表す式を含む。これらの式は、当技術分野の慣例に従ってアミノ末端からカルボキシ末端の方向（式中では左から右の方向）に配置された融合タンパク質の部分を示している。
【００９０】
本明細書内では、「約」という用語は、好ましくは場合により±５０％、より好ましくは場合により±２０％、さらにより好ましくは場合により±１０％、さらにより好ましくは場合により±５％、さらにより好ましくは場合により±２％、さらにより好ましくは場合により±１％を意味するものと解釈される。
【００９１】
「融合タンパク質」は、異なる親アミノ酸配列（たとえば、タンパク質）に由来する一部もしくは部分を含有する連続ポリペプチド鎖を意味する技術用語である。融合タンパク質の部分は、互いに直接的に結合されうるか、またはたとえばペプチドリンカーを介して間接的に結合されうる。融合タンパク質は、２つ以上の異なるポリペプチドに由来する２つ以上の部分を含有しうる。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、「連結部」とは、２つの異なるポリペプチドに由来する２つのアミノ酸配列が融合タンパク質中で連結される部位を意味する。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、「天然の連結部」とは、一方もしくは両方の親ポリペプチドの対応する位置に見いだされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する融合タンパク質中の連結部を意味する。たとえば、本明細書中で仮定上の親タンパク質ＸおよびＹを用いたスキーム１に示されるように、概念上のアミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸ１１１１１１１１１１１ＹＹＹＹＹ〔式中、ＸＸＸＸＸＸは、親タンパク質Ｘに由来するアミノ酸であり、ＹＹＹＹＹＹは、親タンパク質Ｙに由来するアミノ酸であり、そして１１１１１１１１１１１は、両方の親タンパク質中に存在する保存アミノ酸モチーフである〕を含有する融合タンパク質を調製することが可能である。アミノ酸配列ＸＸＸＸＸ１１１１１１１１１１１が親タンパク質Ｘ中の対応する位置のアミノ酸配列と同一であるので、融合タンパク質は、天然の連結部を含有する。この例では、アミノ酸配列１１１１１１１１１１１ＹＹＹＹＹＹもまた親タンパク質Ｙ中の対応する位置のアミノ酸配列と同一あるので、融合タンパク質は、２つの天然の連結部を含有する。
【００９４】
本明細書中で使用する場合、「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインおよびＴＣＲ可変ドメインを意味する。免疫グロブリン可変ドメインは、所望の起源（たとえば、ヒト起源）の抗体もしくはＴＣＲに由来しうるか、またはヒト抗体可変領域遺伝子もしくはヒトＴＣＲ可変領域遺伝子のような抗体可変領域遺伝子もしくはＴＣＲ可変領域遺伝子を用いて作製されたライブラリーに由来しうる。たとえば、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)を参照されたい。
【００９５】
本明細書中で使用する場合、「免疫グロブリン定常ドメイン」とは、抗体定常ドメイン（たとえば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）およびＴＣＲ定常ドメインを意味する。免疫グロブリン定常ドメインは、所望の起源（たとえば、ヒト起源）の抗体もしくはＴＣＲに由来しうるか、または容易に入手可能な抗体定常ドメイン配列情報を用いて任意の好適な方法により誘導されうる。たとえば、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)を参照されたい。
【００９６】
本明細書中で使用する場合、「ヒト」とは、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）と、ヒト起源のポリペプチドおよびポリペプチドの一部分とを意味する。そのようなポリペプチドもしくはその一部分は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。ヒトポリペプチドおよびヒトポリペプチドの一部分は、ヒトにおいて天然に存在するポリペプチドもしくはその一部分と同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくは一部分を包含する。ヒトポリペプチドもしくはその一部分は、任意の好適な方法を用いて生成可能であり、ヒトから単離された（たとえば、ヒトから取得したサンプルの）ポリペプチドもしくはその一部分と、組換えまたは合成により生成されたポリペプチドもしくはその一部分とを包含する。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、「ヒト免疫グロブリン可変ドメイン」、「ヒト抗体可変ドメイン」（たとえば、ヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ヒトＶκ、ヒトＶλなど）、「ヒトＴＣＲ可変ドメイン」とは、１つ以上のフレームワーク領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる可変ドメインまたはヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸配列に対して５個までのアミノ酸の差異を有する可変ドメインを意味する。免疫グロブリン可変ドメインは、本質的に多様なアミノ酸配列を含有する超可変領域（たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含有する。免疫グロブリン技術分野で認められた基準によれば、ヒト生殖系列によりコードされないアミノ酸が超可変領域中に存在していても免疫グロブリン可変ドメインは非ヒト性であるとみなされない。ヒト免疫グロブリン可変ドメインは、ヒト生殖系列によりコードされない１つ以上のＣＤＲを含有可能であり、しかもＣＤＲ中に存在せずかつヒト生殖系列によりコードされない１０個までの追加のアミノ酸を追加的に含有可能である。好ましくは、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、およびＦＷ４のアミノ酸配列は、それぞれ、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるか、または全体として、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して１０個までのアミノ酸の差異を含有する。
【００９８】
本明細書中で使用する場合、「ハイブリッドドメイン」とは、同一のタイプの第１のドメイン由来の部分と同一のタイプの第２のドメイン由来の部分とを含む組換えドメインを意味する。たとえば、ハイブリッド抗体可変ドメインは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３と、Ｖκ由来のＦＲ４の一部分と、抗体重鎖可変ドメイン由来のＦＲ４の一部分とを含みうる。同一のタイプのドメインとしては、免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体軽鎖および重鎖可変ドメイン、ならびにＴＣＲ可変ドメイン）さらには免疫グロブリン定常ドメイン（たとえば、抗体軽鎖および重鎖定常ドメイン、ＴＣＲ定常ドメイン）が挙げられる。
【００９９】
本明細書中で使用する場合、「保存アミノ酸モチーフ」とは、１つ以上のポリペプチド中およびそのようなポリペプチドに由来する部分を含有する本発明に係る特定の融合タンパク質中に存在する保存アミノ酸配列を有する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含有する領域を意味する。保存アミノ酸モチーフのアミノ酸配列は、保存アミノ酸モチーフを含有する個別のポリペプチド間で同一であっても同一でなくてもよい。当技術分野で公知のように、アミノ酸配列モチーフは、ある程度、アミノ酸配列が異なっていてもよいが、アミノ酸モチーフの全配列多様性は、不変アミノ酸残基の存在と保存的アミノ酸置換のような限られた変異を有する位置の存在とにより制限される。多くの種由来の免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク４中に存在するＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）モチーフのような保存アミノ酸モチーフは、アミノ酸配列のアライメントにより従来の方法で同定可能である。好ましくは、２つ以上のポリペプチド中に存在する保存アミノ酸モチーフのアミノ酸配列は、モチーフの長さにわたり互いに少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列類似性または同一性を有する。
【０１００】
本明細書中で使用する場合、第１のアミノ酸、アミノ酸配列、またはモチーフは、第１のアミノ酸配列またはモチーフが、連続ポリペプチド鎖を形成するように第２のアミノ酸配列またはモチーフに直接結合されたペプチドである場合、第２のアミノ酸、アミノ酸配列、またはモチーフに「隣接」する。
【０１０１】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列のアライメントならびに相同性、類似性、または同一性は、本明細書中で規定される場合、好ましくは、デフォルトパラメーターを用いてＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓアルゴリズムにより作成および決定が行われる（Tatusova, T. A. et al.., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)）。他の選択肢として、パラメーターをデフォルト値に設定してＢＬＡＳＴアルゴリズム（バージョン２．０）が配列アライメントに利用される。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムにより利用される発見的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8 (1990)の統計的手法を用いてそれらの発見に重点を置く。
【０１０２】
本発明は、天然の連結部を含有する組換え融合タンパク質に関する。本発明に係る融合タンパク質は、一般的には、融合される２つのポリペプチド中に存在する保存アミノ酸配列モチーフを含む。保存モチーフのアミノ末端に隣接するアミノ酸配列は、一方の元のポリペプチド中の保存モチーフのアミノ末端に隣接するアミノ配列と同一であり、かつ保存モチーフのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列は、他方の元のポリペプチド中の保存モチーフのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列と同一である。
【０１０３】
本発明に係る融合タンパク質は、従来の融合タンパク質よりも優れたいくつかの利点を備えている。たとえば、タンパク質中のドメイン相互作用は、タンパク質の安定性（たとえば、凝集耐性、プロテアーゼ耐性）に重要な寄与をする。しかしながら、従来の融合タンパク質の成分は典型的にはドメイン境界で融合されるので、融合タンパク質中のドメイン相互作用は、多くの場合、改変される。その結果、異なる親タンパク質由来のドメインが並置されることになることから、安定性の低下を生じる可能性がある。
【０１０４】
天然の連結部を含有する融合タンパク質の１つの特徴は、一般にドメイン相互作用を保持するようにデザインすることにより融合タンパク質の安定性の向上および免疫原性の低下が達成されることである。好ましくは、いくつかの実施形態では、本発明に係る融合タンパク質においてドメイン反発の可能性が低減され、それによりさらにタンパク質分解に対する感受性が低減される。従来の融合タンパク質に関連する共通の問題は、生成時に組換えタンパク質の一部分が一般に可溶性もしくは不溶性のアグリゲートを形成することにより所望の可溶性単量体型融合タンパク質の収率が低減されることである。本発明に係る融合タンパク質の改良された安定性は、追加的または代替的に、凝集の低減、発現の向上、および／または生成収率の向上をもたらしうる。天然の連結部を含有する融合タンパク質はまた、親ポリペプチドが患者と同一の種由来である場合、免疫原性が低減される可能性があるので、ｉｎ ｖｉｖｏ治療剤または診断剤として使用するのに有利である。
【０１０５】
従来の融合タンパク質は、異なる親タンパク質由来のアミノ酸配列の並置であるので非自己配列を含有する。これらの配列は、天然に存在しないので免疫原性になる可能性がある（たとえば、Ｂ細胞エピトープを形成したり、Ｔ細胞エピトープを形成したりする可能性がある）。その結果、従来の融合タンパク質は、患者において免疫応答を誘導することが可能である。免疫原性は、融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ使用を制限したりまたは阻止したりする可能のある重要な側面である。免疫原性は、たとえば、組換え融合タンパク質上のエピトープが細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を刺激する場合に生じる。Ｔ細胞エピトープは、通常は８〜１１アミノ酸の長さである線状ペプチドよりなる。したがって、本明細書に記載されるように、所望の生物学的機能を有するが従来の方法を用いて調製される融合タンパク質と比較して少ない数のＴエピトープを有するかまたはまったく有していない組換え融合タンパク質をデザインし生成することが可能である。
【０１０６】
Ｔ細胞エピトープとして機能するために、組換えタンパク質に由来するペプチドは、いくつかの要件を満たさなければならない。それらは、細胞内タンパク質分解プロセシングに耐えなければならず、かつ宿主の主要組織適合性分子（たとえば、ヒトＨＬＡ分子）に結合できなければならない。ペプチドがＴ細胞エピトープとして認識されるかどうかに影響を及ぼす他の因子は、自己性の度合いである。重要なこととして、自己タンパク質に属するエピトープを対象とするＴ細胞は、胸腺発生時に寛容化または排除される（たとえば、Rosmalen et al., 2002を参照されたい）。しかしながら、いくつかの自己特異的Ｔ細胞は、末梢で存続し、そこではＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）調節性Ｔ細胞により抑制される（たとえば、Papiernik, 2001およびShevach et al., 2001を参照されたい）。Ｔ細胞エピトープを含有する融合タンパク質が投与された場合、寛容が破壊される可能性がある。この状況では、融合タンパク質に由来する外来ペプチドさらには自己ペプチドでさえも、免疫応答を誘導する可能性がある。したがって、融合タンパク質中のＴ細胞エピトープの数を減少させることが望ましい。本明細書に記載されるように、これは、組換え融合タンパク質内に見いだされる任意の所与の連続ペプチド配列内の「自己性」の度合いを最大化することにより達成可能である。
【０１０７】
天然に存在するタンパク質中では互いに隣接して存在しない２つ以上の部分（たとえば、ドメイン）で構成された組換え融合タンパク質は、該部分を連結する連結部を含む。該部分は天然の状況下では連結されていないので、そのような連結部は、一般に、連結部（一方の天然のペプチド配列から他方の天然のペプチド配列への切換えが起こる部位）に非自己アミノ酸配列モチーフを含む。このタイプの連結部は、天然の状況下では通常は隣接しない２つのアミノ酸を含む。したがって、そのような連結部にわたって存在するペプチドは、非自己ペプチドであり、Ｔ細胞に対するエピトープとして作用する可能性を有する。本明細書に記載の方法を用いる場合、連結部は、Ｔ細胞に対するエピトープとして作用する可能性を低減させたりまたは排除したりするようにデザインされる。本明細書に記載の方法は、仮定上のタンパク質Ｘに由来する部分と仮定上のタンパク質Ｙに由来する部分とを含有する融合タンパク質が生成される以下のスキームで概念的に示される。
【０１０８】
タンパク質Ｘは、次の配列を有する：
…XXXXXX11111111111XXXXXXX2XXXXXXXXX - XXXXXXXX333X3XXXXXXXX…
タンパク質Ｙは、次の配列を有する：
…YYYYYY11111111111YYYYYYY2YYYYYYYYY - YYYYYYYY333Y3YYYYYYYY…
概念上の各タンパク質配列において、「−」は、タンパク質Ｘ内およびタンパク質Ｙ内のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの境界を表す。タンパク質Ｘのアミノ末端ドメインが天然のドメイン境界でタンパク質Ｙのカルボキシ末端ドメインに融合される従来の融合タンパク質は、スキーム１で示される。このタイプの連結部は、天然の状況下では通常は隣接しない２つのアミノ酸（ｘ−ｙ）ｔを含む。したがって、そのような連結部にわたって存在するペプチドは、非自己ペプチドであり、Ｔ細胞に対するエピトープとして作用する可能性を有する。
【０１０９】
スキーム１
....XXXXXX11111111111XXXXXXX2XXXXXXXX - YYYYYYYYYY333Y3YYYYYYYY....
スキーム２〜４に示されるように、本発明の一適用は、第１のポリペプチド由来のドメインが第２のポリペプチド由来のドメインに融合される融合タンパク質を含む。新しいＴ細胞エピトープが生成される可能性を回避するために、連結部は、天然のドメイン境界から１アミノ酸以上離間させて（Ｎ末端側またはＣ末端側のいずれか）、融合される両方のドメイン中に保存されるアミノ酸配列モチーフまで移動される。新しい融合部位に対応する保存アミノ酸モチーフが両方の親ドメイン中に見いだされるので、新しい連結部にわたって存在するｉｎ ｖｉｖｏで生成されうるペプチドは、親タンパク質中では通常は隣接しないアミノ酸をより少量有するかまたはまったく有しておらず、その結果、Ｔ細胞エピトープとして機能する可能性が低減される。
【０１１０】
スキーム２
|     >1aa     |
....XXXXXX11111111111YYYYYYY2YYYYYYYY - YYYYYYYYYY333Y3YYYYYYYY....
たとえば、スキーム２に示されるように、タンパク質Ｘ由来のドメインとタンパク質Ｙ由来のドメインとを含む融合タンパク質を調製することが可能である。この例では、タンパク質ＸおよびＹは、それぞれ、保存アミノ酸配列モチーフ（下線部）を含有する。この共有モチーフは融合部位であり、Ｔ細胞エピトープである可能性を有しうる新しいドメイン融合部位にわたって存在するいかなるペプチドも、Ｎ末端ドメインに関しておよび／またはＣ末端ドメインに関して、完全に自己性であり、したがって、Ｔ細胞により非自己性として認識される可能性が排除されるであろう。
【０１１１】
スキーム３
| >1aa |
....XXXXXX11111111111XXXXXXX2YYYYYYYY - YYYYYYYYYY333Y3YYYYYYYY....
他の例では、新しいドメイン融合部位に対応する保存アミノ酸モチーフは、１アミノ酸の長さでありうる。その結果、Ｔ細胞エピトープである可能性を有しうる融合タンパク質中の２つのドメインの境界にわたって存在するいかなるペプチドも、天然の状況下にある親タンパク質Ｙ中のドメイン境界では隣接して見いだされることのないアミノ酸をまったく含有しないであろう（スキーム３）。
【０１１２】
スキーム４
|  >1aa  |
....XXXXXX11111111111XXXXXXX2XXXXXXXX - XXXXXXXXXX333Y3YYYYYYYY....
または
....XXXXXX11111111111XXXXXXX2XXXXXXXX - XXXXXXXXXX333X3YYYYYYYY....
スキーム４に示されるように、いくつかの例では、保存アミノ酸モチーフは、２〜１０アミノ酸の長さであり、かつ保存アミノ酸モチーフのアミノ酸配列は、２つの親ポリペプチド間で同一ではない。
【０１１３】
ＣＨ１ドメインへのＶκドメインの融合への適用
このほかに、ドメイン相互作用は、免疫グロブリンフォールドを含有するタンパク質および融合タンパク質をはじめとする多くのタンパク質の一体性および機能に重要である。たとえば、免疫グロブリンの可変ドメインと定常ドメインとの相互作用は、ＩｇＧの構造に重要な役割を果たす（たとえば、Rothlisberger et al., 2005を参照されたい）。免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリンドメインの一部分を含有する融合タンパク質を生成するために、これらのドメインが天然の状況下で関与するタンパク質−タンパク質相互作用を考慮に入れることが重要である。たとえば、免疫グロブリン中においてＶκとＣκとの相互作用がＶＨとＣＨ１との相互作用と異なることは、Ｖκ−ＣＨ１またはＶＨ−Ｃκ融合タンパク質を生成するうえで問題を生じる可能性があることを示唆する。しかしながら、いくつかの用途では、４つのＶκ可変ドメインを含むＩｇＧ様分子、２つのＶκ可変ドメインを含むＦａｂ’フラグメント、またはMorrison et al. (1998)およびChan et al. (2004)に記載のものに類似した「インサイドアウト」分子を生成することが望ましい。そのような作業は、ＶκドメインとＣＨ１ドメインとの融合タンパク質の生成を必要とするであろう。
【０１１４】
典型的なヒトＦａｂ’フラグメントの構造は図１Ａに示されており、これはChacko et al. (1996)により発表された構造１ＶＧＥに対応する。ＬｅｓｋおよびＣｈｏｔｈｉａは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとの相互作用が、ＶＨ中の３つの高度保存残基（Ｈ１１［ＬｅｕまたはＶａｌ］、Ｈ１１０［Ｔｈｒ］、およびＨ１１２［Ｓｅｒ］）と、ＣＨ１中の２つの高度保存残基（Ｈ１４８［Ｐｈｅ］およびＨ１４９［Ｐｒｏ］）とにより有意に決定付けられると報告した（１９８８）。図１Ｂに示される５つの残基のこのクラスターは、免疫グロブリン中においてＣκまたはＣＨ１ドメインに対してそれぞれＶκまたはＶＨドメインの配向を変化させるある程度の制御された可撓性（肘運動と称される）を提供する。このドメイン境界は、いくつかの抗体の機能に寄与する可能性がある（Landolfi et al. 2001）。そのほかに、保存残基Ｈ１０８（Ｌｅｕ）の疎水性側鎖は、ＶＨ−ＣＨ１境界部に位置し、ＶＨとＣＨ１との疎水性相互作用に関与する可能性がある。
【０１１５】
全Ｖκドメイン（残基Ｌ１０８またはＬ１０９まで）をＣＨ１ドメイン（残基Ｈ１１４［Ａｌａ］から）に単純に連結することによりＶκ−ＣＨ１融合体を調製した場合、ＣＨ１が天然で相互作用する以上の４つの保存残基のうちの３つは、新しい可変ドメイン中に存在しないであろう。残基Ｈ１１（Ｌｅｕ／Ｖａｌ）は、多くのＶＨおよびＶκドメイン間で保存されるが、残基Ｈ１０８（Ｌｅｕ）、Ｈ１１０（Ｔｈｒ）、およびＨ１１２（Ｓｅｒ）は保存されない。この結果、可変ドメイン定常ドメイン境界において保存ＶＨ−ＣＨ１ドメイン境界部の消失、特定的には疎水性相互作用の消失を生じるであろう。さらに、この結果、Ｆａｂ構造１ＶＧＥ（図１Ａ）の例のように残基Ｈ１１２（Ｓｅｒ）の側鎖と残基Ｈ１１４（Ａｌａ）のバックボーン窒素との間に存在する可能性のある水素結合が消失する可能性がある。ＶＨ−ＣＨ１境界部を安定化させる残基の消失に加えて、融合タンパク質を不安定化させる可能性のある新しい残基が導入されるであろう。荷電残基は、新しい可変ドメインのＣ末端部分、たとえば、Ｌ１０３（Ｌｙｓ）、Ｌ１０７（Ｌｙｓ）、またはＬ１０８（Ａｒｇ）に存在するであろう。これらの荷電Ｖκ残基は、可変ドメイン−定常ドメイン境界部においてＶκとＣＨ１との反発を引き起こし、良好なドメイン充填を阻害するであろう。
【０１１６】
Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（バージョン３．７）およびＧＲＯＭＯＳ９６ ４３Ｂ１パラメーターセット（van Gunsteren et al. 1996）を用いて、ヒトＦａｂ構造１ＶＧＥ中のＣ末端ＶＨ残基Ｈ１０８〜Ｈ１１３（配列ＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ）が分子の全エネルギーに−１００．９５３ＫＪ／ｍｏｌの寄与をすることが決定付けられた。これらの残基を配列ＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（一般にＣ末端Ｖκ残基Ｌ１０３〜Ｌ１０８に対応する配列）で置き換えた場合、分子の全エネルギーへの寄与は、＋５７．４ｋＪ／ｍｏｌになるであろう。このことから、全ＶＨドメインを全Ｖκドメインで置き換えることによりＣ末端ＶＨ残基Ｈ１０８〜Ｈ１１３の置換えを行うとＦａｂフラグメントが有意に不安定化される可能性があることが示唆される。さらに、天然の状況下にあるＶκ−Ｃκ連結部に見いだされるときに天然で関与するＣκとの相互作用が受け入れられない状況下では、導入された荷電Ｖκ残基はいずれも、タンパク質分解を受けやすいであろう。
【０１１７】
本発明によれば、融合部位が、Ｖκ（残基Ｌ９９〜Ｌ１０２）とＶＨ（残基Ｈ１０４〜Ｈ１０７）との間で保存されるＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）モチーフになるように、ＶκドメインのＮ末端部分をＶＨドメインのＣ末端部分に連結することにより、Ｖκ−ＣＨ１融合タンパク質を生成することが可能である。このようにすれば、ＣＨ１が天然で相互作用する４つの保存残基のうちの４つすべてが、新しい可変ドメイン中に存在可能になる。残基Ｈ１１（Ｌｅｕ／Ｖａｌ）は、多くのＶＨおよびＶκドメイン間ですでに保存されており、かつ残基Ｈ１０８（Ｌｅｕ）、Ｈ１１０（Ｔｈｒ）、およびＨ１１２（Ｓｅｒ）もまた、融合部位がＶκのＮ末端の方向に移動されているので存在するであろう。しかも残基Ｈ１０４〜Ｈ１１３は、ＶＨ残基になるであろう。この天然の連結部は、全Ｖκドメイン（残基Ｌ１０８／Ｌ１０９まで）をＣＨ１ドメイン（残基Ｈ１１４から）に単純に連結した場合よりも大きい度合いで、肘連結の保持ならびに疎水性相互作用および水素結合の保持を含めてＶＨ−ＣＨ１ドメイン境界部を保持するであろう。そのほかに、天然の連結部は、領域Ｌ１０３〜Ｌ１０８中の荷電Ｖκ残基の存在により引き起こされる可能性のある反発およびタンパク質分解感受性を回避するであろう。
【０１１８】
ＣκドメインへのＶＨドメインの融合への適用
ＶκドメインとＣκドメインとの間に見いだされかつ１ＶＧＥ中にも見られる典型的な相互作用は、図１Ｃ中に強調表示されている。特定的には、Ｖκ−Ｃκ境界部は、Ｖκ残基Ｌ１０３（Ｌｙｓ）の側鎖とＣκ残基Ｌ１６５（Ｇｌｕ）との水素結合ならびにＶκ残基Ｌ１０８（Ａｒｇ、ヒトではＪκエキソンにより部分的にコードされかつＣκエキソンにより部分的にコードされる）の側鎖とＣκ残基Ｌ１０９（Ｔｈｒ）およびＬ１７０（Ａｓｐ）との水素結合により安定化される。そのほかに、残基Ｌ１０６（Ｉｌｅ）もまた、そのバックボーン窒素および酸素を介して、Ｃκ残基Ｌ１６６（Ｇｌｎ）の側鎖との水素結合に関与する。
【０１１９】
全ＶＨドメイン（残基Ｈ１１３（Ｓｅｒ）まで）をＣκドメイン（残基Ｌ１０８［Ａｒｇ］または残基Ｌ１０９［Ｔｈｒ］から）に単純に連結することによりＶκ−ＣＨ１融合体を調製した場合、上記の相互作用は消失するであろう（またはバックボーン相互作用の場合、改変される可能性がある）。Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（バージョン３．７）およびＧＲＯＭＯＳ９６ ４３Ｂ１パラメーターセット（van Gunsteren et al. 1996）を用いて、ヒトＦａｂ構造１ＶＧＥ中のＣ末端Ｖκ残基Ｌ１０３〜Ｌ１０８（配列ＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号５４１））が分子の全エネルギーに−３０９．３２ＫＪ／ｍｏｌの寄与をすることが決定付けられた。これらの残基を配列ＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２１）（一般にＣ末端ＶＨ残基Ｈ１０８〜Ｈ１１３に対応する配列）で置き換えた場合、分子の全エネルギーへの寄与は、−５．２０２ｋＪ／ｍｏｌになるであろう。このことから、全Ｖκドメインを全ＶＨドメインで置き換えることによりＣ末端Ｖκ残基Ｌ１０３〜Ｌ１０８の置換えを行うとＦａｂフラグメントが有意に不安定化される可能性があることが示唆される。
【０１２０】
本発明によれば、融合部位が、Ｖκ（残基Ｌ９９〜Ｌ１０２）とＶＨ（残基Ｈ１０４〜Ｈ１０７）との間で保存されるＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）モチーフになるように、ＶＨドメインのＮ末端部分をＶκドメインのＣ末端部分に連結することにより、ＶＨ−Ｃκ融合タンパク質を生成することが可能である。このようにすれば、Ｃκが天然で相互作用する残基が、新しい可変ドメイン中に存在可能になる。この天然のドメイン連結部は、非天然のドメイン連結部を有する融合タンパク質よりも有意に良好な性質を有する融合タンパク質をもたらすはずである。
【０１２１】
融合タンパク質
本発明に係る融合タンパク質は、２つの異なるポリペプチドに由来する少なくとも２つの部分と、２つの部分間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む。所望により、融合タンパク質は、３つ以上の部分を含有可能であり、かつ該部分間の連結部のいくつかは、非天然でありうる。一態様では、組換え融合タンパク質はハイブリッドドメインを含む。ハイブリッドドメインは、第１のポリペプチドに由来する第１の部分（アミノ酸配列）と、第２のポリペプチドに由来する第２の部分（アミノ酸配列）と、第１のポリペプチド中および第２のポリペプチド中に存在する保存アミノ酸モチーフとを含む。第１のポリペプチドは、式（Ｘ１−Ｙ−Ｘ２）を有するドメインを含み、かつ第２のポリペプチドは、式（Ｚ１−Ｙ−Ｚ２）を有するドメインを含み、かつ融合タンパク質は、式（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）を有するハイブリッドドメインを含むであろう。
【０１２２】
上記式中、
Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、
Ｘ１およびＺ１は、それぞれ、第１のポリペプチド中および第２のポリペプチド中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、
Ｘ２およびＺ２は、それぞれ、第１のポリペプチド中および第２のポリペプチド中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、
付帯条件として、Ｘ１およびＺ１のアミノ酸配列が同一である場合、Ｘ２およびＺ２のアミノ酸配列は同一ではなく、Ｘ２およびＺ２のアミノ酸配列が同一である場合、Ｘ１およびＺ１のアミノ酸配列は同一ではないものとする。
【０１２３】
Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、およびＺ２により表されるアミノ酸の数は、ハイブリッドドメインのサイズおよび親ポリペプチド中におけるドメインのサイズに依存する。一般的には、Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、およびＺ２は、それぞれ独立して、約１〜約４００、約１〜約２００、約１〜約１００、約１〜約５０、約１〜約４０、約１〜約３０、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、約１〜約６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または１アミノ酸よりなる。同様に、ハイブリッドドメインのサイズは、さまざまな大きさが可能であり、親タンパク質中におけるＹを含有するドメインのサイズに依存する。ハイブリッドドメインの全サイズは、約７５〜約４００、約７５〜約３５０、約７５〜約３００、約７５〜約２５０、約７５〜約１５０、約７５〜約１２５、約７５〜約１００、または約７５アミノ酸でありうる。特定の実施形態では、ハイブリッドドメインは、免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン定常ドメインとほぼ等しいサイズである。いくつかの実施形態では、ハイブリッドドメインは、約１ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、または約１４ｋＤａである。
【０１２４】
保存アミノ酸モチーフＹは、１〜約５０アミノ酸残基よりなりうる。特定の実施形態では、Ｙは、約３〜約５０アミノ酸、約３〜約４０アミノ酸、約３〜約３０アミノ酸、約３〜約２０アミノ酸、約３〜約１５アミノ酸、約３〜約１４アミノ酸、約３〜約１３アミノ酸、約３〜約１２アミノ酸、約３〜約１１アミノ酸、約３〜約１０アミノ酸、約３〜約９アミノ酸、約３〜約８アミノ酸、約３〜約７アミノ酸、約３〜約６アミノ酸、約３〜約５アミノ酸、少なくとも約８アミノ酸、約１１アミノ酸まで、または約８〜約１１アミノ酸よりなる。他の実施形態では、Ｙは、約１〜約１１アミノ酸、約１５アミノ酸、約１４アミノ酸、約１３アミノ酸、約１２アミノ酸、約１１アミノ酸、約１０アミノ酸、約９アミノ酸、約８アミノ酸、約７アミノ酸、約６アミノ酸、約５アミノ酸、約４アミノ酸、約３アミノ酸、約２アミノ酸、または約１アミノ酸よりなる。
【０１２５】
保存アミノ酸モチーフＹは、本発明に係る融合タンパク質中に少なくとも一部分が組み込まれる２つ以上の親ポリペプチド中に見いだされる。本発明に係る融合タンパク質および融合タンパク質中のハイブリッドドメインは、各親タンパク質が保存アミノ酸モチーフを含有するのであれば、任意の所望の親ポリペプチド由来の部分を含有しうる。たとえば、親ポリペプチドは、関連性のないもの（たとえば、異なるタンパク質スーパーファミリー由来のもの）または関連性のあるもの（たとえば、同一のタンパク質スーパーファミリー由来のもの）でありうる。特定の実施形態では、融合タンパク質およびハイブリッドドメインは、同一のタンパク質スーパーファミリー（たとえば、免疫グロブリンスーパーファミリー、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー、またはＴＮＦレセプタースーパーファミリー）由来の親ポリペプチドに由来する部分を含有する。
【０１２６】
親タンパク質は、同一の種由来または異なる種由来でありうる。たとえば、親ポリペプチドは、独立して、ヒト（ホモ・サピエンス（Homo sapiens））に由来しうるか、または非ヒト種、たとえば、マウス、ニワトリ、ブタ、トラフグ、カエル、ウシ（たとえば、ボス・タウラス（Bos taurus））、ラット、サメ（たとえば、オオメジロザメ、メジロザメ、ナースシャーク、ネコザメ、クモハダオオセ）、ガンギエイ（たとえば、クリアノーズスケート（clearnose skate）、リトルスケート）、サカナ（たとえば、タイセイヨウサケ、アメリカナマズ、カライワシ、スポッテッドラットフィッシュ、タイセイヨウタラ、ケツギョ、ニジマス、スポッテッドウルフフィッシュ、ゼブラフィッシュ）、オポッサム、ヒツジ、ラクダ科動物（たとえば、ラマ、グアナコ、アルパカ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ）、ウサギ、非ヒト霊長動物（たとえば、シンセカイザル、キュウセカイザル、カニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Macaca fascicularis））、キヌザル科（Callithricidae）（たとえば、マーモセット））、または任意の他の所望の非ヒト種に由来しうる。特定の実施形態では、親タンパク質は両方とも、ヒト由来であるか、または一方の親タンパク質はヒト由来でありかつ他方は非ヒト種由来である。
【０１２７】
保存アミノ酸モチーフは、任意の好適な方法を用いて、たとえば、２つ以上のアミノ酸配列をアライメントして保存アミノ酸配列の領域を同定することにより、容易に同定可能である。（たとえば、図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。たとえば、本明細書に記載されるように、免疫グロブリンタンパク質中に存在する保存アミノ酸モチーフは、免疫グロブリンアミノ酸配列のアライメントにより同定されている。保存アミノ酸モチーフの特定の例としては、抗体可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）４中のＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）；抗体可変ドメインのＦＲ３中のＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ（配列番号３８８）、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３８９）、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３９０）；抗体定常領域中の（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）が挙げられる。
【０１２８】
本発明に係る融合タンパク質中のハイブリッドドメインは、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインやハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインのようなハイブリッド免疫グロブリンドメインでありうる。たとえば、本発明に係る融合タンパク質は、ハイブリッドＴ細胞レセプター可変ドメインまたはハイブリッド抗体可変ドメインを含みうる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ハイブリッドドメインは、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、ハイブリッド抗体可変ドメイン）であり、かつＹは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４のようなフレームワーク領域（ＦＲ）中に位置する。特定の例では、ＹはＦＲ４中に存在し、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）である。たとえば、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＬｅｕ（配列番号３９６）でありうる。これらの実施形態では、Ｘ１は、ＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む抗体可変ドメインの一部分でありうる。
【０１３０】
他の特定の例では、ハイブリッドドメインはハイブリッド免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、ハイブリッド抗体可変ドメイン）であり、かつＹはＦＲ３に位置し、ＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ（配列番号３８８）、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３８９）、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３９０）である。これらの実施形態では、Ｘ１は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２を含む抗体可変ドメインの一部分でありうる。
【０１３１】
本発明に係る融合タンパク質中のハイブリッドドメインは、ハイブリッドＴ細胞レセプター定常ドメインやハイブリッド抗体定常ドメインのようなハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインでありうる。いくつかの実施形態では、ハイブリッドドメインは、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメイン（たとえば、ハイブリッド抗体定常ドメイン）であり、かつＹは、抗体軽鎖定常ドメイン（たとえば、Ｃκ、Ｃλ）や抗体重鎖定常ドメイン（たとえば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）のような定常ドメイン中に位置する。たとえば、ハイブリッドドメインは、ハイブリッド免疫グロブリンＣＨ１、ＣＨ２、Ｃκ、もしくはＣλ〔ここで、Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）である〕；ハイブリッドＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣκ〔ここで、Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）である〕；ハイブリッドＣＨ１〔ここで、Ｙは、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）もしくはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）である〕；またはハイブリッドＴＣＲ定常ドメイン〔ここで、Ｙは、ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号３９７）である〕でありうる。これらの例の特定の実施形態では、Ｙは、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号３９８）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号３９９）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４００）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０１）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０２）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０３）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０４）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０５）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０６）、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４０７）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４０８）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４０９）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１０）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１１）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１２）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１３）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１４）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１５）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ（配列番号４１６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ（配列番号４１７）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ（配列番号４１８）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）でありうる。
【０１３２】
本発明に係る融合タンパク質中のハイブリッドドメインは、組換え融合タンパク質が式Ｄ−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｅ
〔式中、
Ｄは、不在であるかまたは第１のポリペプチド中の（Ｘ１−Ｙ−Ｘ２）のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列であり、そしてＥは、不在であるかまたは第２のポリペプチド中の（Ｚ１−Ｙ−Ｚ２）のカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である〕
を有する部分構造を含むように、隣接するアミノ末端アミノ酸配列Ｄに結合させたりかつ／また隣接するカルボキシ末端アミノ酸配列Ｅに結合させたりすることが可能である。
【０１３３】
たとえば、本発明に係る融合タンパク質は、Ｄ−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）〔式中、Ｄは免疫グロブリン可変ドメインであり、そして（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである〕を含みうる。所望により、融合タンパク質は、Ｅをさらに含み、かつ式Ｄ−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｂ〔式中、Ｄは免疫グロブリン可変ドメインであり、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインであり、そしてＥは免疫グロブリン定常ドメインである〕を有しうる。以上に記載したように、融合タンパク質の成分は、任意の所望の種由来の親タンパク質に由来しうる。本発明に係る融合タンパク質のこの例では、Ｄは、非ヒト起源（たとえば、サメ、マウス、ラクダ科動物由来）の抗体可変領域でありうるし、Ｅは、ヒト免疫グロブリン定常ドメインを含みうるし、かつハイブリッド定常ドメイン（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、非ヒト定常ドメインの部分（Ｘ１）と、ヒト定常ドメインの部分（Ｚ２）と、非ヒト定常ドメイン中およびヒト定常ドメイン中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含有する。他の実施形態では、Ｄは不在であり、かつ融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在するさらなるドメインを含む。さらなるアミノ末端ドメインは、天然の連結部または非天然の連結部を介して（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）に直接的もしくは間接的に結合可能である。
【０１３４】
他の例では、本発明に係る融合タンパク質は、Ｄ−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）〔式中、Ｄは、免疫グロブリン定常ドメインであり、そして（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである〕を含む。所望により、この例の融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在する追加の成分を含有しうる。たとえば、一実施形態では、融合タンパク質は、Ｄのアミノ末端に存在するＶＬ、ＶＨ、またはＶＨＨのような免疫グロブリン可変ドメインを含む。したがって、融合タンパク質は、次の構造：抗体可変ドメイン−Ｄ−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）〔式中、Ｄは、免疫グロブリン定常ドメイン（たとえば、抗体定常ドメイン）であり、そして（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメイン（たとえば、ハイブリッド抗体定常ドメイン）である〕を有しうる。
【０１３５】
他の例では、本発明に係る融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｅ〔式中、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインであり、そしてＥは免疫グロブリン定常ドメインである〕を含む。所望により、この例の融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在する追加の成分を含有しうる。たとえば、一実施形態では、融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在するＶＬ、ＶＨ、またはＶＨＨのような他の免疫グロブリン可変ドメインを含む。したがって、融合タンパク質は、次の構造：抗体可変ドメイン−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｅ〔式中、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、ハイブリッド抗体可変ドメイン）であり、そしてＥは免疫グロブリン定常ドメイン（たとえば、抗体定常ドメイン）である〕を有しうる。
【０１３６】
他の例では、本発明に係る融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｅ〔式中、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインであり、そしてＢは免疫グロブリン定常ドメインである〕を含む。所望により、融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在する追加の成分を含有しうる。たとえば、一実施形態では、融合タンパク質は、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）のアミノ末端に存在するＶＬ、ＶＨ、またはＶＨＨのような免疫グロブリン可変ドメインを含む。したがって、融合タンパク質は、次の構造：抗体可変ドメイン−（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）−Ｅ〔式中、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメイン（たとえば、ハイブリッド抗体ＣＨ１ドメイン）であり、そしてＥは、免疫グロブリン定常ドメイン（たとえば、ヒンジ、ヒンジ−ＣＨ２、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む〕を有しうる。
【０１３７】
本発明に係る融合タンパク質のいくつかは、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む。ここで、該ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインは、第１の免疫グロブリン由来の第１の免疫グロブリンＦＲに由来する部分と第２の免疫グロブリン由来の第２の免疫グロブリンＦＲに由来する部分とを含むハイブリッドフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、第１および第２の免疫グロブリンは、それぞれ、保存アミノ酸モチーフを含む。ハイブリッドＦＲは、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、
Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、
Ｆ１は、第１の免疫グロブリンＦＲ中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、そして
Ｆ２は、第２の免疫グロブリンＦＲ中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフである〕
を有する。
【０１３８】
ハイブリッドＦＲは、ハイブリッドＦＲ１、ハイブリッドＦＲ２、ハイブリッドＦＲ３、またはハイブリッドＦＲ４でありうる。一例では、第１の免疫グロブリンは、抗体重鎖であり、第２の免疫グロブリンは、抗体軽鎖であり、Ｆ１は、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４に由来し、かつＦ２は、抗体軽鎖可変ドメインの対応するＦＲに由来する。したがって、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の一部分（Ｆ１）と、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ４の一部分（Ｆ２）と、重鎖および軽鎖可変ドメインの両方のＦＲ４中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。他の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３の一部分（Ｆ１）と、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ３の一部分、ＣＤＲ３、およびＦＲ４（Ｆ２）と、重鎖および軽鎖可変ドメインの両方のＦＲ３中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。同様に、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、およびＦＲ２の一部分（Ｆ１）と、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ２の一部分（Ｆ２）、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４）と、重鎖および軽鎖可変ドメインの両方のＦＲ２中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ１の一部分（Ｆ１）と、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１の一部分（Ｆ２）、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と、重鎖および軽鎖可変ドメインの両方のＦＲ１中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。
【０１３９】
他の例では、第１の免疫グロブリンは、抗体軽鎖であり、第２の免疫グロブリンは、抗体重鎖であり、Ｆ１は、抗体軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４に由来し、かつＦ２は、抗体重鎖可変領域の対応するＦＲに由来する。したがって、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の一部分（Ｆ１）と、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ４の一部分（Ｆ２）と、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方のＦＲ４中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。他の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３の一部分（Ｆ１）と、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ３の一部分（Ｆ２）、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方のＦＲ３中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。同様に、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、およびＦＲ２の一部分（Ｆ１）と、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ２の一部分（Ｆ２）、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方のＦＲ２中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１の一部分（Ｆ１）と、抗体重鎖可変ドメインのＦＲ１の一部分（Ｆ２）、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方のＦＲ１中に存在する保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）とを含みうる。
【０１４０】
ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインは、任意の所望の免疫グロブリン定常ドメインに融合可能である。一般的には、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインのカルボキシ末端は、免疫グロブリン定常ドメインのアミノ末端に直接融合される。融合タンパク質は、所望により、追加の免疫グロブリン定常ドメインおよび／または可変ドメインを含みうる。たとえば、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインは、Ｃλ、Ｃκ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＣＨ２−ＣＨ３、またはＴ細胞レセプター定常ドメインに融合可能である。
【０１４１】
好ましい実施形態では、アミノ酸配列Ｆ２は、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインが融合される免疫グロブリン定常ドメインのアミノ末端に、該免疫グロブリン定常ドメインを含む天然に存在するタンパク質中で、隣接する。たとえば、第２のポリペプチドがＴＣＲ鎖でありかつＦ２がＴＣＲ ＦＲ４に由来する場合、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、ＴＣＲ定常ドメインのアミノ末端に結合されたペプチドである。同様に、第２のポリペプチドが抗体軽鎖でありかつＦ２が抗体軽鎖可変領域ＦＲ４に由来する場合、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体軽鎖定常ドメインのアミノ末端に結合されたペプチドでありうる。特定の実施形態では、第２のポリペプチドはκまたはλ軽鎖であり、Ｆ２はＶκまたはＶλ ＦＲ４に由来し、かつハイブリッド免疫グロブリンドメインはＣκまたはＣλのアミノ末端にそれぞれ結合される。第２のポリペプチドが抗体重鎖でありかつＦ２が抗体重鎖可変ドメインＦＲ４に由来する場合、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体重鎖定常ドメインのアミノ末端に結合可能である。特定の実施形態では、第２のポリペプチドは抗体重鎖であり、Ｆ２は抗体重鎖可変ドメインＦＲ４（たとえば、ＶＨ ＦＲ４、ＶＨＨ ＦＲ４）に由来し、かつハイブリッド免疫グロブリンドメインはＣＨ１のアミノ末端に結合される。
【０１４２】
特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインは、ハイブリッド抗体可変ドメインであり、かつＹは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）である。たとえば、融合タンパク質は、Ｆ１がＰｈｅであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２が（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）である、ハイブリッド抗体可変ドメインを含みうる。特定の実施形態では、Ｆ２は、ＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２１）、ＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２２）、またはＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２３）である。他の例では、融合タンパク質は、Ｆ１がＰｈｅであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、かつＦ２がＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）である、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）を含みうる。特定の実施形態では、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＬｅｕ（配列番号３９６）である。好ましくは、これらのタイプのハイブリッド抗体可変ドメインのカルボキシ末端は、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメインのような抗体重鎖定常ドメインに直接結合される。好ましくは、抗体重鎖定常ドメインは、ヒト抗体重鎖定常ドメインである。特定の実施形態では、ハイブリッド抗体可変ドメインのカルボキシ末端は、ＩｇＧ ＣＨ１またはＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）に直接結合される。
【０１４３】
他の実施形態では、融合タンパク質は、Ｆ１がＴｒｐであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２が（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）または（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）である、ハイブリッド可変ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆ２は、ＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２７）、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２８）、ＬｙｓＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２９）、ＡｒｇＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３０）、ＡｒｇＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３１）、ＡｒｇＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３２）、ＡｒｇＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３３）、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４３４）、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３５）、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４３６）、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３７）、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４３８）、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３９）、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４０）、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４１）、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４４２）、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４３）、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４４）、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４５）、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４４６）、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４７）、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４８）、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４９）、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４５０）、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５１）、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４５２）、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５３）、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４５４）、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５５）、ＧｌｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４５６）、またはＧｌｕＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５７）である。
【０１４４】
他の例では、融合タンパク質は、Ｆ１がＴｒｐであり、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）であり、かつＦ２が（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）または（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）である、ハイブリッド抗体可変ドメインを含みうる。特定の実施形態では、Ｆ２は、ＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４６０）、ＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４６１）、ＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４６２）、ＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４６３）、ＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４６４）、またはＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４６５）である。好ましくは、これらのタイプのハイブリッド抗体可変ドメインのカルボキシ末端は、ＣκまたはＣλのような抗体軽鎖定常ドメインに直接結合される。好ましくは、抗体軽鎖定常ドメインは、ヒト抗体軽鎖定常ドメインである。
【０１４５】
特定の実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む融合タンパク質は、式（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｃκ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｃλ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ１、（Ｆ１−Ｙ− ２）−ＣＨ２、または（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｆｃ（たとえば、Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｆｃ−Ｖを有する部分構造を含む。ここで、ハイブリッドドメインは、重鎖Ｖドメイン（たとえば、ヒトＶＨ、ＶＨＨ、またはラクダ化ＶＨ）であり、かつＶは、重鎖Ｖドメイン（たとえば、ヒトＶＨ、ＶＨＨ、またはラクダ化ＶＨ）であり、好ましくは、ハイブリッドドメインおよびＶの両者は、両方ともヒト由来、両方ともＶＨＨ、または両方ともラクダ化ＶＨである。本発明はまた、そのような構造の二量体を提供する。
【０１４６】
特定の実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む融合タンパク質は、第２の免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）をさらに含む。第２の免疫グロブリンドメインは、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端に存在しうる。好ましくは、第２の免疫グロブリン可変ドメインは、融合タンパク質中のハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインのアミノ末端に存在する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本発明に係る融合タンパク質は、ヒト抗体定常ドメインに融合された非ヒト抗体可変領域を含む。ここで、非ヒト抗体可変領域は、ハイブリッドＦＲ４を含有する。融合部位がＦＲ４中に存在しかつ可変ドメインとヒト定常ドメインとの境界には存在しないので、融合タンパク質は、非ヒト抗体可変ドメインとヒト抗体定常ドメインとの間に天然の連結部を含有する。ハイブリッドＦＲ４は、式（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）を有する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、Ｆ１は、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２は、（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）、（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）、または（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）である。
【０１４９】
他の実施形態では、Ｆ１は、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、かつＦ２は、ＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）、（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）、または（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ヒト抗体定常ドメインは、ＣＨ１ドメインであり、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２は、（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）である。たとえば、特定の実施形態では、Ｆ２は、ＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２１）、ＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２２）、またはＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２３）である。他の実施形態では、ヒト抗体定常ドメインは、ＣＨ１ドメインであり、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、かつＦ２は、ＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１８）である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ヒト抗体定常ドメインは、軽鎖定常ドメインであり、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２は、（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）または（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）である。たとえば、特定の実施形態、Ｆ２は、ＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２７）、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２８）、ＬｙｓＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２９）、ＡｒｇＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３０）、ＡｒｇＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３１）、ＡｒｇＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３２）、ＡｒｇＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３３）、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４３４）、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３５）、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４３６）、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３７）、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４３８）、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３９）、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４０）、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４１）、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４４２）、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４３）、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４４）、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４５）、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４４６）、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４７）、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４８）、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４９）、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４５０）、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５１）、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４５２）、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５３）、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４５４）、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５５）、ＧｌｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４５６）、またはＧｌｕＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５７）である。
【０１５２】
他の実施形態では、ヒト抗体定常ドメインは、軽鎖定常ドメインであり、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、かつＦ２は、（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）または（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）である。たとえば、特定の実施形態では、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＬｅｕ（配列番号３９６）であり、かつＦ２は、ＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４６０）、ＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４６１）、ＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４６２）、ＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４６３）、ＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４６４）、またはＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４６５）である。
【０１５３】
本発明に係る融合タンパク質のいくつかは、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインに融合された免疫グロブリン可変ドメインを含む。ここで、該ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、第１の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分と第２の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分とを含み、第１および第２の免疫グロブリン定常ドメインは、それぞれ、保存アミノ酸モチーフを含む。ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、式
（Ｃ１−Ｙ−Ｃ２）
〔式中、
Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、
Ｃ１は、第１の免疫グロブリン定常ドメイン中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、そして
Ｃ２は、第２の免疫グロブリン定常ドメイン中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフである〕
を有する。
【０１５４】
ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、保存アミノ酸モチーフを含有する任意の２つの免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分を含みうる。特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、第１の抗体定常ドメイン由来の部分と第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含むハイブリッド抗体定常ドメインである。たとえば、ハイブリッド抗体定常ドメインは、ハイブリッドＣＨ１、ハイブリッドヒンジ、ハイブリッドＣＨ２、またはハイブリッドＣＨ３でありうる。ここで、ハイブリッドドメインの部分は、異なる種（たとえば、ヒトおよびラクダ科動物やナースシャークのような非ヒト）由来または異なるアイソタイプ（たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４））由来の抗体定常ドメインに由来する。ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインはまた、ＣＨ１ドメイン由来の部分およびＣＨ２ドメイン由来の部分のような２つの異なる定常ドメイン由来の部分をを含みうる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド抗体定常ドメインは、異なる種の抗体定常ドメインに由来する部分を含む。たとえば、第１の抗体定常ドメインは、非ヒト抗体定常ドメインでありうるし、かつ第２の抗体定常ドメインは、ヒト抗体定常ドメインでありうる。好適な非ヒト抗体定常ドメインとしては、マウス、ニワトリ、ブタ、トラフグ、カエル、ウシ（たとえば、ボス・タウラス（Bos taurus））、ラット、サメ（たとえば、オオメジロザメ、メジロザメ、ナースシャーク、ネコザメ、クモハダオオセ）、ガンギエイ（たとえば、クリアノーズスケート（clearnose skate）、リトルスケート）、サカナ（たとえば、タイセイヨウサケ、アメリカナマズ、カライワシ、スポッテッドラットフィッシュ、タイセイヨウタラ、ケツギョ、ニジマス、スポッテッドウルフフィッシュ、ゼブラフィッシュ）、オポッサム、ヒツジ、ラクダ科動物（たとえば、ラマ、グアナコ、アルパカ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ）、ウサギ、非ヒト霊長動物（たとえば、シンセカイザル、キュウセカイザル、カニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Macaca fascicularis））、キヌザル科（Callithricidae）（たとえば、マーモセット））、または任意の他の所望の非ヒト種に由来するものが挙げられる。好ましくは、ハイブリッド抗体定常ドメインのアミノ末端は、ハイブリッド抗体定常ドメインのアミノ末端Ｃ１と同一の種由来の抗体可変ドメインのカルボキシ末端に直接融合される。好ましくは、ハイブリッド抗体定常ドメインのカルボキシ末端Ｃ２は、ヒト抗体定常ドメインに由来する。たとえば、融合タンパク質は、式：非ヒトＶドメイン−（Ｃ１−Ｙ−Ｃ２）〔式中、Ｃ１は、非ヒトＶドメインと同一の種由来の非ヒト定常ドメイン（たとえば、Ｃκ、Ｃλ、ＣＨ１）に由来し、Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、そしてＣ２は、ヒト抗体定常ドメインに由来する〕を有する部分構造を含みうる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド抗体定常ドメインは、第１の抗体定常ドメイン由来の部分と、異なるアイソタイプの抗体由来の第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含む。たとえば、このタイプのハイブリッド抗体定常ドメインでは、Ｃ１は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）由来の部分であり、かつＣ２は、Ｃ１と異なるアイソタイプの抗体定常ドメイン由来の部分である。好ましくは、Ｃ２は、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメイン由来の部分である。特定の実施形態では、ハイブリッド抗体定常ドメインは、ＩｇＧ１定常ドメイン由来の部分とＩｇＧ４定常ドメイン由来の部分とを含む。そのような実施形態では、Ｃ１はＩｇＧ１定常ドメイン由来でありかつＣ２はＩｇＧ４定常ドメインであるか、またはＣ２はＩｇＧ４定常ドメインでありかつＣ２はＩｇＧ１定常ドメイン由来である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、軽鎖定常ドメインである第１の抗体定常ドメイン由来の部分と、重鎖定常ドメインである第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含む。たとえば、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体定常ドメインに直接融合された軽鎖抗体可変ドメインを含みうる。ここで、第１の抗体定常ドメインは、軽鎖定常ドメインであり、かつＣ１は、該軽鎖定常ドメインに由来し、第２の抗体定常ドメインは、重鎖定常ドメインであり、かつＣ２は、該重鎖定常ドメインに由来する。たとえば、Ｃ２は、ＩｇＧ ＣＨ１（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１）、ＩｇＧヒンジ（たとえば、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ）、ＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）、ＩｇＧ ＣＨ３（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３））のようなＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメインに由来しうる。
【０１５８】
他の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖定常ドメインである第１の抗体定常ドメイン由来の部分と、軽鎖定常ドメインである第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含む。たとえば、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体定常ドメインに直接融合された重鎖抗体可変ドメインを含みうる。ここで、第１の抗体定常ドメインは、重鎖定常ドメインであり、かつＣ１は、該重鎖定常ドメインに由来し、しかも第２の抗体定常ドメインは、軽鎖定常ドメインであり、かつＣ２は、該軽鎖定常ドメインに由来する。特定の実施形態では、第１の抗体定常ドメインはＣＨ１ドメインであり、かつＣ１は該ＣＨ１ドメインに由来する。
【０１５９】
特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、ラクダ科動物重鎖定常ドメインである第１の抗体定常ドメイン由来の部分と、重鎖定常ドメインである第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含む。たとえば、いくつかの実施形態では、ハイブリッド抗体定常ドメインのカルボキシ末端（Ｃ２）は、ヒト重鎖定常ドメインに由来する。所望により、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体定常ドメインのアミノ末端に存在するラクダ科動物ＶＨＨを含みうる。たとえば、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、式：ラクダ科動物ＶＨＨ−（Ｃ１−Ｙ−Ｃ２）〔式中、Ｃ１は、ラクダ科動物重鎖定常ドメイン（たとえば、ラクダ科動物ＣＨ１）に由来し、Ｙは保存アミノ酸モチーフであり、かつＣ２は、抗体重鎖定常ドメイン（たとえば、ヒトＣＨ１のようなヒト抗体定常ドメイン）に由来する〕を有する部分構造を含む。
【０１６０】
本発明に係る融合タンパク質のいくつかは、ハイブリッド抗体定常ドメインに直接融合された免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）を含む。ここで、該ハイブリッド抗体定常ドメインは、第１の抗体定常ドメイン由来の部分と第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含み、第１および第２の抗体定常ドメインは、それぞれ、保存アミノ酸モチーフを含む。ハイブリッド抗体定常ドメインは、式
（Ｃ１−Ｙ−Ｃ２）
〔式中、
Ｙは、保存アミノ酸モチーフであり、
Ｃ１は、第１の抗体定常ドメイン中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、そして
Ｃ２は、第２の抗体定常ドメイン中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフである〕
を有する。好ましくは、免疫グロブリン可変ドメインは、融合タンパク質が式：抗体可変ドメイン−（Ｃ１−Ｙ−Ｃ２）を有する部分構造を含むように、ハイブリッド抗体定常ドメインのアミノ末端に位置する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）である。たとえば、特定の実施形態では、Ｙは、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号３９８）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号３９９）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４００）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０１）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０２）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０３）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０４）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０５）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０６）、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４０７）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４０８）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４０９）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１０）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１１）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１２）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１３）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１４）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１５）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ（配列番号４１６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ（配列番号４１７）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ（配列番号４１８）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）である。好ましくは、第２の抗体定常ドメインは、ヒト抗体定常ドメインであり、かつＣ２は、該ヒト抗体定常ドメインに由来する。たとえば、ヒト抗体定常ドメインは、ヒトＣκ、ヒトＣλ、またはヒト重鎖定常ドメイン、たとえば、ヒトＣＨ１、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ２、またはヒトＣＨ３でありうる。特定の好ましい実施形態では、ヒト抗体定常ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ１（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１）、ＩｇＧヒンジ（たとえば、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ）、ＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）、またはＩｇＧ ＣＨ３（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３）であり、かつＣ２は、該ヒト抗体定常ドメインに由来する。
【０１６２】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体ＣＨ１ドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト軽鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）またはＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ１（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１）のようなＩｇＧ ＣＨ１中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。
【０１６３】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体ＣＨ２ドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト軽鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）またはＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）のようなＩｇＧ ＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。
【０１６４】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体ＣＨ２ドメインに融合された抗体重鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト重鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４７０）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）のようなＩｇＧ ＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。
【０１６５】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃκドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒトλ鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４７０）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＣκのようなＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。
【０１６６】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃκドメインに融合された抗体重鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト重鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４７０）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＣκのようなＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。
【０１６７】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃλドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒトκ鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、かつＹは（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＣλのようなＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。
【０１６８】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃλドメインに融合された抗体重鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト重鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＣλのようなＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。
【０１６９】
他の態様では、本発明に係る組換え融合タンパク質の第１の部分および第２の部分は、リンカーを介して融合される。リンカーは、第１の部分とリンカーとの間、第２の部分とリンカーとの間、または第１および第２の部分の両方とリンカーとの間に天然の連結部を提供するように選択またはデザインすることが可能である。たとえば、本発明に係る融合タンパク質が第１のポリペプチド由来の部分（Ａ）と第２のポリペプチド由来の部分（Ｂ）とを含有することが望ましい場合、融合タンパク質は、式（Ａ）−リンカー−（Ｂ）〔式中、天然の連結部は、（Ａ）とリンカーとの間、リンカーと（Ｂ）との間、または（Ａ）とリンカーとの間かつリンカーと（Ｂ）との間に存在する〕を有する部分構造を含みうる。本発明に係る融合タンパク質に組み込まれるポリペプチドの部分がドメインである場合、融合タンパク質に使用されるリンカーは、ドメインを含有する天然に存在するポリペプチド中でドメインに隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸よりなりうる。たとえば、リンカーは、ドメインを含有する天然に存在するポリペプチド中でドメインに隣接する１〜約４０、１〜約３０、１〜約２０、１〜約１５、１〜約１０、１〜約５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１アミノ酸よりなりうる。この方法を用いると、融合タンパク質中におけるドメイン相互作用の保持性が改良され、それにより、融合タンパク質の安定性が改良される。
【０１７０】
この態様では、融合タンパク質は、一般的には、第１のポリペプチドに由来する第１の部分と第２のポリペプチドに由来する第２の部分とを含む。ここで、該第１のポリペプチドは、式（Ａ）−Ｌ１〔式中、（Ａ）は、該第１のポリペプチド中に存在するアミノ酸配列であり、そしてＬ１は、該第１のポリペプチド中の（Ａ）のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０アミノ酸を含むアミノ酸モチーフである〕を有する構造を含む。融合タンパク質は、式
（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）
〔式中、（Ａ）は、第１のポリペプチドに由来する部分であり、Ｌ１は、該第１のポリペプチド中の（Ａ）のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸モチーフであり、かつ（Ａ）と（Ｂ）とを連結するリンカーを提供し、そして（Ｂ）は、第２のポリペプチドに由来する部分である〕
を有する。好ましくは、（Ａ）は、第１のポリペプチドに由来するドメインである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、（Ａ）を含み、かつ第２のポリペプチドは、式Ｌ１−（Ｂ）〔式中、Ｌ１は、第２のポリペプチド中の（Ｂ）のアミノ末端に隣接する１〜約５０アミノ酸を含むアミノ酸モチーフである〕を有する構造を含む。
【０１７２】
融合タンパク質は、式
（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）
〔式中、（Ａ）は、第１のポリペプチドに由来する部分であり、Ｌ１は、該第２のポリペプチド中の（Ｂ）のアミノ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸モチーフであり、かつ（Ａ）と（Ｂ）とを連結するリンカーを提供し、そして（Ｂ）は、第２のポリペプチドに由来する部分である〕
を有する。好ましくは、（Ｂ）は、第２のポリペプチドに由来するドメインである。
【０１７３】
好ましい実施形態では、この態様は、（Ａ）および（Ｂ）の少なくとも一方がドメインであるという付帯条件を含む（たとえば、（Ａ）はドメインであり、（Ｂ）はドメインであり、（Ａ）および（Ｂ）は両方ともにドメインである）。他の好ましい実施形態では、この態様は、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、１）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれヒト抗体可変ドメインであるか、２）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体重鎖可変ドメインであるか、３）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体軽鎖可変ドメインであるか、４）（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメイン（たとえば、ＶＨＨまたはＶＨ）であるか、または５）（Ａ）はＶＨＨでありかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインであるというさらなる付帯条件を含む。追加としてまたは他の選択肢として、この態様の好ましい実施形態は、（Ａ）がＶＨでありかつ（Ｂ）がＶＬである場合、Ｌ１がＣＨ１のアミノ末端から１〜５もしくは１〜６個の連続したアミノ酸よりなることはないという付帯条件を含む。追加としてまたは他の選択肢として、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、次のものは本発明から除外される、（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）〔式中、（Ａ）はマウスＶＨであり、（Ｂ）はマウスＶＬであり、そしてＬ１は、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏ（配列番号５３７）、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙ（配列番号５３８）、ＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＰｈｅＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＶａｌ（配列番号５３９）、またはＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕ（配列番号５４０）である〕。追加としてまたは他の選択肢として、（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）〔式中、（Ａ）はマウスＶＨであり、（Ｂ）はマウスＶＬであり、そしてＬ１は、Le Gall et al., Protein Engeneering, Design & Selection, 17:357-366 (2004), Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77:763-772 (1998); Le Gall et al., J. Immunol. Methods, 285:111-127 (2004); Le Gall 
et al., FEBS Letters, 453:164-168 (1995); または Kipriyanov et al., Protein Engineering, 10:445-453 (1997)に開示されるリンカーである〕は、融合タンパク質ではない。
【０１７４】
特定の実施形態では、第１のポリペプチドは（Ａ）−Ｌ１を含み、かつ融合タンパク質は（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）を含む〔式中、（Ａ）は相補性決定領域（ＣＤＲ）３よりなり、そしてＬ１はフレームワーク４よりなる〕。他の実施形態では、（Ａ）はＣＤＲ１を含みかつＬ１はＦＲ２を含むか、（Ａ）はＣＤＲ２を含みかつＬ１はＦＲ３を含むか、（Ａ）はＣＤＲ１およびＣＤＲ２（たとえば、ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２）を含みかつＬ１はＦＲ３を含むか、（Ａ）はＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みかつＬ１はＦＲ４を含むか、または（Ａ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（たとえば、ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３）を含みかつＬ１はＦＲ４を含む。
【０１７５】
他の実施形態では、第１のポリペプチドは（Ａ）を含み、第２のポリペプチドはＬ１−（Ｂ）を含み、かつ融合タンパク質は（Ａ）−Ｌ１−（Ｂ）を含む〔式中、（Ｂ）はＣＤＲ３よりなり、そしてＬ１はフレームワーク３よりなる〕。他の実施形態では、（Ｂ）はＣＤＲ１を含みかつＬ１はＦＲ１を含むか、（Ｂ）はＣＤＲ２を含みかつＬ１はＦＲ２を含むか、（Ｂ）はＣＤＲ１およびＣＤＲ２（たとえば、ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２）を含みかつＬ１はＦＲ１を含むか、（Ｂ）はＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みかつＬ１はＦＲ２を含むか、または（Ｂ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（たとえば、ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３）を含みかつＬ１はＦＲ１を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は、抗体可変ドメインのような免疫グロブリン可変ドメインである。たとえば、（Ａ）は、抗体軽鎖可変ドメイン（たとえば、Ｃκ、Ｃλ）または抗体重鎖可変ドメイン（たとえば、ＶＨ、ＶＨＨ）でありうる。そのような実施形態では、Ｌ１は、可変ドメインＡを含む天然に存在するポリペプチド中の（Ａ）のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸である。たとえば、（Ａ）がＶκ（たとえば、ヒトＶκ）である場合、Ｌ１は、Ｃκ（たとえば、ヒトＣκ）の１〜約５０個の連続したＮ末端アミノ酸であり、（Ａ）がＶλ（たとえば、ヒトＶλ）である場合、Ｌ１は、Ｃλ（たとえば、ヒトＣλ）の１〜約５０個の連続したＮ末端アミノ酸であり、（Ａ）が重鎖可変ドメイン（たとえば、ヒトＶＨ、ラクダ科動物ＶＨＨ）である場合、Ｌ１は、ＣＨ１（たとえば、ヒトＣＨ１、ラクダ科動物ＶＨＨ）の１〜約５０個の連続したＮ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態では、（Ａ）はＶＨでありかつＬ１はＣＨ１の最初の３〜約１２個のＮ末端アミノ酸を含むか、（Ａ）はＶκでありかつｌ１はＣκの最初の３〜約１２個のＮ末端アミノ酸を含むか、または（Ａ）はＶλでありかつＬ１はＣλの最初の３〜約１２個のＮ末端アミノ酸を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは免疫グロブリン定常領域を含み、かつ（Ｂ）は免疫グロブリン定常領域に由来する。たとえば、（Ｂ）は、抗体ＣＨ１の少なくとも一部分、抗体ヒンジの少なくとも一部分、抗体ＣＨ２の少なくとも一部分、または抗体ＣＨ３の少なくとも一部分を含みうる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は抗体可変ドメインであり、かつ（Ｂ）は抗体可変ドメインである。これらの実施形態では、抗体可変ドメイン（Ａ）および（Ｂ）は、同一でありうるかもしくは異なりうる。たとえば、（Ａ）は抗体重鎖可変ドメインでありうるしかつ（Ｂ）は同一のもしくは異なる抗体重鎖可変ドメインでありうるか、Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありうるしかつ（Ｂ）は同一のもしくは異なる抗体軽鎖可変ドメインでありうるか、Ａ）は抗体重鎖可変ドメインでありうるしかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインでありうるか、またはＡ）は抗体軽鎖可変ドメインでありうるしかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインでありうる。代表的な実施形態では、（Ａ）はＶκでありかつ（Ｂ）はＶκであるか、（Ａ）はＶκでありかつ（Ｂ）はＶλであるか、（Ａ）はＶκでありかつ（Ｂ）はＶＨもしくはＶＨＨであるか、（Ａ）はＶλでありかつ（Ｂ）はＶκであるか、（Ａ）はＶλでありかつ（Ｂ）はＶλであるか、または（Ａ）はＶλでありかつ（Ｂ）はＶＨもしくはＶＨＨである。好ましい実施形態では、この態様は、追加としてまたは他の選択肢として、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、１）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれヒト抗体可変ドメインであるか、２）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体重鎖可変ドメインであるか、３）（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ抗体軽鎖可変ドメインであるか、４）（Ａ）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメインであるか、または５）（Ａ）はＶＨＨでありかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインであるという付帯条件を含む。追加としてまたは他の選択肢として、この態様の好ましい実施形態は、（Ａ）がＶＨでありかつ（Ｂ）がＶＬである場合、Ｌ１がＣＨ１のアミノ末端から１〜５もしくは１〜６個の連続したアミノ酸よりなることはないという付帯条件を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は、抗体軽鎖可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７２）を含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１は、ＣＨ１の最初の３〜約１２アミノ酸を含む。特定の実施形態では、Ｌ１は、ＡｌａＳｅｒＴｈｒ（配列番号４７３）、ＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒ（配列番号４７４）、またはＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｙ（配列番号４７５）である。
【０１８０】
他の実施形態では、（Ａ）は、ＶＨまたはＶκドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）ＶａｌＬｅｕ（配列番号４７６）を含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１は、Ｃλの最初の３〜約１２アミノ酸を含む。
【０１８１】
他の実施形態では、（Ａ）は、ＶＨまたはＶλドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、およびＣＤＲ３と、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４７７）を含むＦＲ４とを含む抗体可変ドメインであり、かつＬ１は、Ｃκの最初の３〜約１２アミノ酸を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、（Ａ）は、抗体定常ドメインやＴＣＲ定常ドメインのような免疫グロブリン定常ドメインである。特定の実施形態では、（Ａ）は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３のような抗体重鎖定常ドメインである。いくつかの実施形態では、（Ａ）は、非ヒト抗体重鎖定常ドメイン、たとえば、マウス、ニワトリ、ブタ、トラフグ、カエル、ウシ（たとえば、ボス・タウラス（Bos taurus））、ラット、サメ（たとえば、オオメジロザメ、メジロザメ、ナースシャーク、ネコザメ、クモハダオオセ）、ガンギエイ（たとえば、クリアノーズスケート（clearnose skate）、リトルスケート）、サカナ（たとえば、タイセイヨウサケ、アメリカナマズ、カライワシ、スポッテッドラットフィッシュ、タイセイヨウタラ、ケツギョ、ニジマス、スポッテッドウルフフィッシュ、ゼブラフィッシュ）、オポッサム、ヒツジ、ラクダ科動物（たとえば、ラマ、グアナコ、アルパカ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ）、ウサギ、非ヒト霊長動物（たとえば、シンセカイザル、キュウセカイザル、カニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Macaca fascicularis））、キヌザル科（Callithricidae）（たとえば、マーモセット））、または任意の他の所望の非ヒト種に由来する抗体定常ドメインである。より特定的な実施形態では、（Ａ）は非ヒト定常ドメインであり、かつ（Ｂ）はヒトポリペプチドに由来する。
【０１８３】
特定の実施形態では、（Ｂ）は、第２のポリペプチドに由来する。ここで、第２のポリペプチドは、たとえば、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分から選択される。たとえば、いくつかの融合タンパク質では、（Ａ）は、免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、に抗体可変ドメイン）であり、Ｌ１は、可変ドメインＡを含む天然に存在するポリペプチド中の（Ａ）のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸であり、かつ（Ｂ）は、第２のポリペプチドに由来する。ここで、第２のポリペプチドは、たとえば、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分から選択される。
【０１８４】
他の融合タンパク質では、（Ａ）は、第１のポリペプチドに由来し｛ここで、第１のポリペプチドは、たとえば、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分から選択される｝、Ｌ１は、（Ａ）を含む天然に存在するポリペプチド中の（Ａ）のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸であり、かつＢは、免疫グロブリン定常ドメインである。他の選択肢として、Ｌ１は、（Ｂ）を含む天然に存在するポリペプチド中の（Ｂ）のアミノ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸であり、かつ（Ｂ）は、免疫グロブリン定常ドメインである。所望により、組換え融合タンパク質は、（Ｂ）のカルボキシル側にある１つ以上の追加の免疫グロブリン定常ドメインを含みうる。たとえば、融合タンパク質は、抗体Ｆｃ（たとえば、オプションのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含みうる。さらなる例では、融合タンパク質は、構造（Ａ）−Ｌ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、（Ａ）−Ｌ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、（Ａ）−Ｌ１−ＣＨ２−ＣＨ３、または（Ａ）−Ｌ１−ＣＨ３を有する。定常ドメインは、好ましくは、ＩｇＧ定常ドメイン、たとえば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常ドメインである。
【０１８５】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、免疫グロブリンに由来する第１の部分と第２の部分とを含む。ここで、該第１の部分は、リンカーを介して該第２の部分に結合され、かつ組換え融合タンパク質は、式
（Ａ’）−（Ｌ２）−（Ｂ）
〔式中、（Ａ’）は免疫グロブリン可変ドメインであり、かつ（Ａ’）は、該免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ）４を含み、Ｌ２は該リンカーであり｛ここで、Ｌ２は、該ＦＲ４を含む天然に存在する免疫グロブリン中の該ＦＲ４のカルボキシ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む｝、そして（Ｂ）は該第２の部分である〕
を有する。
【０１８６】
好ましい実施形態では、この態様は、次のような付帯条件を含む。すなわち、（Ａ’）は、抗体可変ドメインであり、かつＬ２−Ｂは、ＦＲ４を含有する天然に存在する抗体中の可変ドメイン（Ａ’）のＦＲ４に結合されたペプチドであるＣＬでもＣＨ１ドメインでもなく、しかも（Ａ’）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、１）（Ａ’）および（Ｂ）はそれぞれヒト抗体可変ドメインであるか、２）（Ａ’）および（Ｂ）はそれぞれ抗体重鎖可変ドメインであるか、３）（Ａ１）および（Ｂ）はそれぞれ抗体軽鎖可変ドメインであるか、４）（Ａ’）は抗体軽鎖可変ドメインでありかつ（Ｂ）は抗体重鎖可変ドメイン（たとえば、ＶＨ、ＶＨＨ）であるか、または５）（Ａ’）はＶＨＨありかつ（Ｂ）は抗体軽鎖可変ドメインである。追加としてまたは他の選択肢として、この態様の好ましい実施形態は、（Ａ’）がＶＨでありかつ（Ｂ）がＶＬである場合、Ｌ２がＣＨ１のアミノ末端から１〜５もしくは１〜６個の連続したアミノ酸よりなることはないという付帯条件を含む。追加としてまたは他の選択肢として、この態様の好ましい実施形態は、（Ｂ）がドメインであるが抗体可変ドメインではないという付帯条件を含む。追加としてまたは他の選択肢として、この態様の好ましい実施形態は、（Ｂ）が、たとえば、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、または以上のいずれか１つの機能性部分から選択されるポリペプチドであるかまたはそれらに由来するという付帯条件を含む。追加としてまたは他の選択肢として、（Ａ）および（Ｂ）が両方とも抗体可変ドメインである場合、次のものは本発明から除外される、（Ａ）−（Ｌ２）−（Ｂ）〔式中、（Ａ）はマウスＶＨであり、（Ｂ）はマウスＶＬであり、そしてＬ２は、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏ（配列番号５３７）、ＳｅｒＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙ（配列番号５３８）、ＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＰｈｅＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＶａｌ（配列番号５３９）、またはＡｌａＬｙｓＴｈｒＴｈｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＧｌｕＧｌｕ（配列番号５４０）である〕。追加としてまたは他の選択肢として、（Ａ）−Ｌ２−（Ｂ）〔式中、（Ａ）はマウスＶＨであり、（Ｂ）はマウスＶＬであり、そしてＬ１は、Le Gall et al., Protein Engeneering, Design & Selection, 17:357-366 (2004), Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77:763-772 (1998); Le Gall et al., J. Immunol. Methods, 285:111-127 (2004); Le Gall et al., FEBS Letters, 453:164-168 (1995); または Kipriyanov et al., Protein Engineering, 10:445-453 (1997)に開示されるリンカーである〕は、融合タンパク質ではない。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、（Ａ’）は、抗体重鎖可変ドメインまたはハイブリッド抗体可変ドメイン、たとえば、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７８）を含むＦＲ４を含む抗体重鎖可変ドメインまたはハイブリッド抗体可変ドメインである。特定の実施形態では、ＦＲ４は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７９）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４８０）、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４８１）を含む。そのような実施形態では、Ｌ２は、ＣＨ１のアミノ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、Ｌ２は、ＡｌａＳｅｒＴｈｒ（配列番号４７３）、ＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒ（配列番号４７４）、またはＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｙ（配列番号４７５）を含みうる。
【０１８８】
他の実施形態では、（Ａ’）は、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８５）を含むＦＲ４を含むハイブリッド抗体重鎖可変ドメインまたはＶｋである。たとえば、ＦＲ４は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８６）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８８）、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＡｒｇＬｙｓＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８９）を含みうる。そのような実施形態では、Ｌ２は、Ｃκのアミノ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、Ｌ２は、ＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）、ＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒ（配列番号４９０）、またはＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒＧｌｙ（配列番号４９１）を含みうる。
【０１８９】
他の実施形態では、（Ａ’）は、アミノ酸配列ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４９２）を含むＦＲ４を含むハイブリッド抗体可変ドメインまたはＶλである。たとえば、ＦＲ４は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４９４）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４９５）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４９６）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４９８）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４９９）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５００）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０１）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０２）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５０３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０４）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０５）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０６）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５０７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０８）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０９）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１０）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５１１）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１２）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５１３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１４）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５１５）、およびＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１６）を含みうる。好ましくは、ＦＲ４は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０８）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５１３）、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０５）を含む。そのような実施形態では、Ｌ２は、Ｃλのアミノ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、（Ｂ）は、免疫グロブリン可変ドメインを含む。好ましくは、免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）は、（Ｂ）のアミノ末端に存在し、かつＬ２のカルボキシ末端に直接結合される。特定の例では、免疫グロブリン可変ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインまたは抗体重鎖可変ドメイン（たとえば、ＶＨ、ＶＨＨ）である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、（Ｂ）は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。好ましくは、該少なくとも一部分の免疫グロブリン定常領域は、（Ｂ）のアミノ末端に存在し、かつＬ２のカルボキシ末端に直接結合される。特定の例では、（Ｂ）は、ＩｇＧ定常領域、たとえば、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域の少なくとも一部分を含む。たとえば、（Ｂ）は、ＣＨ１の少なくとも一部分、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２の少なくとも一部分、またはＣＨ３の少なくとも一部分を含みうる。特定の実施形態では、（Ｂ）は、ヒンジの少なくとも一部分、たとえば、ＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号５２０）を含むヒンジの一部分を含む。他の実施形態では、（Ｂ）は、ヒンジの少なくとも一部分を含み、かつＣＨ２−ＣＨ３をさらに含む。他の実施形態では、（’）は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ＣＨ２−ＣＨ３、またはＣＨ３の一部分を含む。
【０１９２】
他の態様では、組換え融合タンパク質は、第１のポリペプチドに由来する第１の部分と、免疫グロブリン定常領域に由来する第２の部分と、含む。ここで、該第１の部分は、リンカーを介して該第２の部分に結合され、かつ組換え融合タンパク質は、式
（Ａ）−Ｌ３−（Ｃ３）
〔式中、（Ａ）は、該第１の部分であり、（Ｃ３）は、免疫グロブリン定常領域に由来する該第２の部分であり、そしてＬ３は、該リンカーである｛ここで、Ｌ３は、（Ｃ３）を含む天然に存在する免疫グロブリン中の（Ｃ３）のアミノ末端に隣接する１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む｝〕
を有する。この態様の特定の実施形態では、本発明は、（Ａ）が、Ｌ３−（Ｃ３）を含む天然に存在する免疫グロブリン中のＬ３に結合された可変ドメインペプチドではない、という付帯条件を含む。
【０１９３】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチドは、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分である。したがって、好ましい実施形態では、（Ａ）は、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分に由来するかまたはそれらである。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、（Ｃ３）は、少なくとも１つの抗体定常ドメイン、たとえば、ヒト抗体定常ドメインを含む。好ましくは、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ定常ドメイン（たとえば、ＩｇＧ１定常ドメイン、ＩｇＧ２定常ドメイン、ＩｇＧ３定常ドメイン、ＩｇＧ４定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、（Ｃ３）はＣＨ３を含む。これらの例では、３は、ＣＨ２のカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含みうる。
【０１９５】
他の実施形態では、（Ｃ３）は、ＣＨ２またはＣＨ２−ＣＨ３、たとえば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ＣＨ２またはＣＨ２−ＣＨ３を含む。これらの実施形態では、Ｌ３は、ヒンジのカルボキシ末端から１〜約３４個の連続したアミノ酸を含みうる。たとえば、Ｌ３は、ＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号５２０）またはＧｌｙＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号５２１）を含みうる。他の実施形態では、（Ｃ３）はヒンジを含む。これらの実施形態では、Ｌ３は、ＣＨ１のカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含みうる。
【０１９６】
他の実施形態では、（Ｃ３）はＣＨ１を含む。これらの実施形態では、Ｌ３は、抗体重鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７８）を含みうる。特定の実施形態では、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４７９）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４８０）、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４８１）を含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、（Ｃ３）は、抗体軽鎖定常ドメインの少なくとも一部分を含む。特定の実施形態では、（Ｃ３）はＣκである。そのような実施形態では、Ｌ３は、抗体軽鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８５）を含みうる。特定の実施形態では、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８６）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８８）、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＡｒｇＬｙｓＧｌｕＩｌｅＬｙｓＡｒｇ（配列番号４８９）を含む。
【０１９８】
他の実施形態では、（Ｃ３）はＣλである。そのような実施形態では、Ｌ３は、抗体軽鎖Ｖドメインのカルボキシ末端から１〜約５０個の連続したアミノ酸を含む。たとえば、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４９２）を含みうる。特定の実施形態では、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４９４）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４９５）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４９６）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４９８）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４９９）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５００）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０１）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０２）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５０３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０４）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０５）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０６）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５０７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０８）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０９）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１０）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５１１）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１２）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５１３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１４）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号５１５）、およびＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５１６）を含む。好ましくは、Ｌ３は、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９３）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４９７）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号５０８）、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５１３）、またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号５０５）を含む。
【０１９９】
融合タンパク質の生成方法
本発明は、１つ以上の天然の連結部を含有する融合タンパク質の生成方法に関する。本方法は、一般的には、融合される２つのポリペプチドもしくはその一部分に存在する保存アミノ酸配列モチーフを同定することを含む。次に、保存アミノ酸モチーフを含有する融合タンパク質を調製する。ただし、この融合タンパク質において、保存モチーフのアミノ末端に隣接するアミノ酸配列は、一方の元のポリペプチド中の保存モチーフのアミノ末端に隣接するアミノ配列と同一であり、かつ保存モチーフのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列は、他方の元のポリペプチド中の保存モチーフのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列と同一である。一般的には、２つのポリペプチドまたはポリペプチドの一部分のアミノ酸配列を解析して、両方の部分のポリペプチド中に存在する保存アミノ酸配列モチーフを同定する。解析は、任意の好適な方法を用いて実施可能である。一例では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を提供し（たとえば、データベースから）、各ポリペプチド中に存在する保存アミノ酸配列モチーフを同定する（たとえば、手作業でまたは好適な配列解析ソフトウェアパッケージを用いて）。
【０２００】
本発明は、２つの異なるポリペプチドに由来する少なくとも２つの部分と、２つの部分間の少なくとも１つの天然の連結部とを含む融合タンパク質の生成方法を提供する。所望により、融合タンパク質は、３つ以上の部分を含有可能であり、かつ該部分間の連結部のいくつかは、非天然でありうる。
【０２０１】
一般的態様において、本発明は、第１の部分と第２の部分とを天然の連結部で融合して含む融合タンパク質の生成方法を提供する。ここで、該第１の部分は、第１のポリペプチドに由来し、かつ該第２の部分は、第２のポリペプチドに由来する。本方法は、第１のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列と第２のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列とを解析して、解析された配列（第１のポリペプチドもしくはその一部分および第２のポリペプチドもしくはその一部分）中に存在する保存アミノ酸モチーフを同定することと、式
Ａ−Ｙ−Ｂ
〔式中、Ａは該第１の部分であり、Ｙは該保存アミノ酸モチーフであり、Ｂは該第２の部分であり、しかも該第１のポリペプチドはＡ−Ｙを含み、かつ該第２のポリペプチドはＹ−Ｂを含む〕
を有する融合タンパク質を調製することとを含む。
【０２０２】
本発明はまた、本明細書に記載の融合タンパク質のような融合タンパク質の改良された作製方法に関する。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明は、第１の部分と第２の部分とを少なくとも１つの天然の連結部により連結して含む融合タンパク質の改良された生成方法に関する。ここで、該第１の部分は、第１のポリペプチドに由来し、かつ該第２の部分は、第２のポリペプチドに由来し、改良点として、該第１のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列と該第２のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ酸配列とを解析して、解析された配列の両方に存在する保存アミノ酸モチーフを同定することと、式
Ａ−Ｙ−Ｂ
〔式中、Ａは該第１の部分であり、Ｙは該保存アミノ酸モチーフであり、Ｂは該第２の部分であり、しかも該第１のポリペプチドはＡ−Ｙを含み、かつ該第２のポリペプチドはＹ−Ｂを含む〕
を有する融合タンパク質を調製することと、が含まれる。
【０２０３】
保存アミノ酸モチーフＹは、１〜約５０アミノ酸残基よりなりうる。特定の実施形態では、Ｙは、約３〜約５０アミノ酸、約３〜約４０アミノ酸、約３〜約３０アミノ酸、約３〜約２０アミノ酸、約３〜約１５アミノ酸、約３〜約１４アミノ酸、約３〜約１３アミノ酸、約３〜約１２アミノ酸、約３〜約１１アミノ酸、約３〜約１０アミノ酸、約３〜約９アミノ酸、約３〜約８アミノ酸、約３〜約７アミノ酸、約３〜約６アミノ酸、約３〜約５アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、約１１アミノ酸まで、または約８〜約１１アミノ酸よりなる。他の実施形態では、Ｙは、約１５アミノ酸、約１４アミノ酸、約１３アミノ酸、約１２アミノ酸、約１１アミノ酸、約１０アミノ酸、約９アミノ酸、約８アミノ酸、約７アミノ酸、約６アミノ酸、約５アミノ酸、約４アミノ酸、約３アミノ酸、約２アミノ酸、または約１アミノ酸よりなる。
【０２０４】
保存アミノ酸モチーフＹは、本発明に係る融合タンパク質中に少なくとも一部分が組み込まれる第１および第２のポリペプチド（親ポリペプチド）中に見いだされる。本発明に係る融合タンパク質および融合タンパク質中のハイブリッドドメインは、各親タンパク質が保存アミノ酸モチーフを含有するのであれば、任意の所望の親ポリペプチド由来の部分を含有しうる。たとえば、第１および第２のポリペプチド（親ポリペプチド）は、関連性のないもの（たとえば、異なるタンパク質スーパーファミリー由来のもの）または関連性のあるもの（たとえば、同一のタンパク質スーパーファミリー由来のもの）でありうる。特定の実施形態では、融合タンパク質およびハイブリッドドメインは、同一のタンパク質スーパーファミリー（たとえば、免疫グロブリンスーパーファミリー、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー、またはＴＮＦレセプタースーパーファミリー）由来の第１および第２のポリペプチド（親ポリペプチド）に由来する部分を含有する。
【０２０５】
第１および第２のポリペプチド（親ポリペプチド）は、同一の種由来または異なる種由来でありうる。たとえば、第１および第２のポリペプチドは、独立して、ヒト（ホモ・サピエンス（Homo sapiens））に由来しうるか、または非ヒト種、たとえば、マウス、ニワトリ、ブタ、トラフグ、カエル、ウシ（たとえば、ボス・タウラス（Bos taurus））、ラット、サメ（たとえば、オオメジロザメ、メジロザメ、ナースシャーク、ネコザメ、クモハダオオセ）、ガンギエイ（たとえば、クリアノーズスケート（clearnose skate）、リトルスケート）、サカナ（たとえば、タイセイヨウサケ、アメリカナマズ、カライワシ、スポッテッドラットフィッシュ、タイセイヨウタラ、ケツギョ、ニジマス、スポッテッドウルフフィッシュ、ゼブラフィッシュ）、オポッサム、ヒツジ、ラクダ科動物（たとえば、ラマ、グアナコ、アルパカ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ）、ウサギ、非ヒト霊長動物（たとえば、シンセカイザル、キュウセカイザル、カニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Macaca fascicularis））、キヌザル科（Callithricidae）（たとえば、マーモセット））、または任意の他の所望の非ヒト種に由来しうる。特定の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは両方ともヒト由来であるか、または一方はヒト由来でありかつ他方は非ヒト種由来である。
【０２０６】
第１および第２のポリペプチド（親ポリペプチド）は、任意の所望のポリペプチドでありうる。第１および第２のポリペプチドの好適な例としては、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分が挙げられる。
【０２０７】
保存アミノ酸モチーフは、任意の好適な方法を用いて、たとえば、２つ以上のアミノ酸配列をアライメントして保存アミノ酸配列の領域を同定することにより、容易に同定可能である。これは、手作業でまたは任意の他の好適な方法を用いて、たとえば、好適な配列解析アルゴリズムもしくはソフトウェアパッケージ（たとえば、ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson et al.. Nucleic Acids Research, 25:4876-4882(1997); Chenna R, et al., Nucleic Acids Res, 31:3497-3500. (2003)）、ＢＬＡＳＴ（Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), Gish, W. & States, D.J., Nature Genet. , 3:266-272 (1993), Madden, et al., Meth. Enzymol., 266:131-141 (1996), Altschul, et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997), Zhang et al., J Comput Biol; 7(1-2):203-14 ( 2000), Zhang, J. & Madden, T.L., Genome Res. , 7:649-656 (1997)）、Genomenet, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Research, Kyoto University (www.genome.jp)からオンラインで利用可能なＭＯＴＩＦ）を用いて、達成可能である。たとえば、本明細書に記載されるように、免疫グロブリンタンパク質中に存在する保存アミノ酸モチーフは、免疫グロブリンアミノ酸配列のアライメントにより同定されている。保存アミノ酸モチーフの特定の例としては、抗体可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）４中のＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）；抗体可変ドメインのＦＲ３中のＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ（配列番号３８８）、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３８９）、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３９０）；抗体定常領域中の（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）が挙げられる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、ＴＣＲ定常ドメインや抗体定常ドメインのような免疫グロブリン定常ドメインを含む。免疫グロブリン定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン定常ドメインまたは非ヒト免疫グロブリン定常ドメインでありうる。一例では、第２のポリペプチドは、Ｔ細胞レセプター定常ドメインを含む。
【０２０９】
特定の実施形態では、第２のポリペプチドは、抗体軽鎖定常ドメインまたは抗体重鎖定常ドメイン、好ましくは、ヒト軽鎖定常ドメインまたはヒト重鎖定常ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｂは、抗体ヒンジ領域、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の一部分、Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３もしくはＣＨ２−ＣＨ３）、またはＣＨ３を含む。好ましくは、ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメインである。たとえば、いくつかの実施形態では、ＩｇＧ定常ドメインは、ＩｇＧ１定常ドメインまたはＩｇＧ４定常ドメインである。
【０２１０】
特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分であり、かつ第２のポリペプチドおよびＢは、免疫グロブリン定常ドメインを含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよびＡは、ＴＣＲ定常ドメインや抗体定常ドメインのような免疫グロブリン可変ドメインを含む。免疫グロブリン可変ドメインは、ヒト免疫グロブリン可変ドメインまたは非ヒト免疫グロブリン可変ドメインでありうる。一例では、第１のポリペプチドは、Ｔ細胞レセプター可変ドメインを含む。
【０２１２】
特定の実施形態では、第１のポリペプチドは、抗体軽鎖可変ドメイン（たとえば、Ｖκ、Ｖλ）または抗体重鎖可変ドメイン（たとえば、ＶＨ、ＶＨＨ）を含む。ある実施形態では、抗体可変ドメインは、非ヒト軽鎖可変ドメインまたは非ヒト重鎖可変ドメインである。たとえば、非ヒト抗体可変ドメインは、ラクダ科動物抗体可変ドメインまたはナースシャーク抗体可変ドメインでありうる。他の実施形態では、抗体可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメイン、たとえば、ヒトＶκ、ヒトＶλ、またはヒトＶＨである。
【０２１３】
特定の実施形態では、前記第１のポリペプチドおよびＡは、免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）を含み、かつ前記第２のポリペプチドは、サイトカイン、サイトカインレセプター（たとえば、インターロイキンレセプター（たとえば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ１Ｒタイプ）、腫瘍壊死因子レセプター（たとえば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２））、増殖因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＳＦ−１）、増殖因子レセプター（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ−１Ｒ）、ホルモン（たとえば、インスリン）、ホルモンレセプター（たとえば、インスリンレセプター）、接着分子、止血因子、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター鎖、Ｔ細胞レセプター可変ドメイン、酵素、抗体可変ドメインを含むかもしくはそれよりなるポリペプチド、または以上のいずれか１つの機能性部分である。
【０２１４】
他の実施形態では、第１のポリペプチドは第１の抗体鎖であり、かつ第２のポリペプチドは第２の抗体鎖である。そのような実施形態では、Ｙは、該第１および第２の抗体鎖の可変ドメイン中または該第１および第２の抗体鎖の定常ドメイン中に存在しうる。たとえば、Ｙは、第１および第２の抗体鎖の可変ドメインのフレームワーク領域中に存在しうる。特定の実施形態では、Ｙは、ＦＲ４中に存在する。たとえば、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）でありうる。そのような実施形態では、Ａは、ＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む抗体可変ドメインの一部分を含む。
【０２１５】
他の特定の実施形態では、ＹはＦＲ３中に存在する。たとえば、Ｙは、ＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ（配列番号３８８）、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３８９）、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３９０）でありうる。そのような実施形態では、Ａは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２を含む抗体可変ドメインの一部分を含む。
【０２１６】
他の実施形態では、Ｙは、前記第１の抗体鎖の定常ドメイン（たとえば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）中および前記第２の抗体鎖の定常ドメイン中に存在する。たとえば、Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）でありうる。特定の実施形態では、Ｙは、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号３９８）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号３９９）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４００）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０１）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０２）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０３）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０４）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０５）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０６）、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４０７）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４０８）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４０９）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１０）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１１）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１２）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１３）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１４）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１５）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ（配列番号４１６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ（配列番号４１７）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ（配列番号４１８）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）である。
【０２１７】
第１のポリペプチドが第１の抗体鎖でありかつ第２のポリペプチドが第２の抗体鎖である場合、抗体鎖は、同一のもしくは異なる種由来でありうる。たとえば、いくつかの実施形態では、該第１の抗体鎖および該第２の抗体鎖は、両方ともヒト由来である。他の実施形態では、第１の抗体鎖はヒト由来でありかつ第２の抗体鎖は非ヒト由来であるか、または第１の抗体鎖は非ヒト由来でありかつ第２の抗体鎖はヒト由来である。
【０２１８】
本明細書に記載の方法により調製される組換え融合タンパク質は、本明細書中に提示される式で示される部分構造を含む。本明細書に記載されるように、融合タンパク質は、式で特定される部分に天然の連結部または非天然の連結部を介して直接的もしくは間接的に融合された追加の部分または成分を含みうる。たとえば、所望により、本発明に係る融合タンパク質は、Ａのアミノ末端に位置する第３の部分をさらに含む。第３の部分は、任意の所望のポリペプチドに由来しうる。特定の実施形態では、Ａのアミノ末端に位置する第３の部分は、免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）である。
【０２１９】
組換え融合タンパク質は、ハイブリッドドメインを含みうる。ここで、該ハイブリッドドメインは、第１のポリペプチドに由来する第１の部分と、第２のポリペプチドに由来する第２の部分と、該第１のポリペプチド中および該第２のポリペプチド中に存在する保存モチーフとを含む。このタイプの組換え融合タンパク質は、第１のポリペプチド由来の第１のドメインのアミノ酸配列と第２のポリペプチド由来の第２のドメインのアミノ酸配列とを解析して該第１のドメイン中および該第２のドメイン中に存在する保存アミノ酸モチーフを同定することと｛ここで、該第１のドメインは式（Ｘ１−Ｙ−Ｚ１）を有しかつ該第２のドメインは式（Ｘ２−Ｙ−Ｚ２）を有する｝、式（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）を有するハイブリッドドメインを含む融合タンパク質を調製することとを含む方法により調製可能である〔式中、Ｙは、該保存アミノ酸モチーフであり、
Ｘ１およびＺ１は、それぞれ、該第１のポリペプチド中および該第２のポリペプチド中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフであり、
Ｘ２およびＺ２は、それぞれ、該第１のポリペプチド中および該第２のポリペプチド中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸モチーフである〕。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、両方とも、同一のタンパク質スーパーファミリー（たとえば、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびＴＮＦレセプタースーパーファミリー）のメンバーである。第１および第２のポリペプチドは両方ともヒトポリペプチドでありうるか、または一方はヒトポリペプチドかつ他方は非ヒトポリペプチドでありうる。
【０２２１】
Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、およびＺ２により表されるアミノ酸の数は、ハイブリッドドメインのサイズおよび親ポリペプチド中におけるドメインのサイズに依存する。一般的には、Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、およびＺ２は、それぞれ独立して、約１〜約４００、約１〜約２００、約１〜約１００、または約１〜約５０アミノ酸よりなる。同様に、ハイブリッドドメインのサイズは、さまざまな大きさが可能であり、親タンパク質中におけるＹを含有するドメインのサイズに依存する。特定の実施形態では、ハイブリッドドメインは、免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン定常ドメインとほぼ等しいサイズである。いくつかの実施形態では、ハイブリッドドメインは、約１ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、または約１４ｋＤａである。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｙを含有する免疫グロブリン可変ドメインを含み、第２のポリペプチドは、Ｙを含有する免疫グロブリン可変ドメインを含み、かつ（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインである。たとえば、第１のポリペプチドは、抗体可変ドメインを含みうるし、第２のポリペプチドは、抗体可変ドメインを含みうるし、かつＹは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４のようなフレームワーク領域（ＦＲ）中に存在しうる。特定の例では、ＹはＦＲ４中に存在し、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）である。たとえば、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＬｅｕ（配列番号３９６）でありうる。これらの実施形態では、Ｘ１は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む第１のポリペプチドの抗体可変ドメインの一部分でありうる。他の例では、Ｙは、ＦＲ３中に存在し、かつＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａ（配列番号３８８）、ＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３８９）、またはＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＶａｌＴｙｒＴｙｒＣｙｓ（配列番号３９０）である。これらの実施形態では、Ｘ１は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２を含む第１のポリペプチドの抗体可変ドメインの一部分でありうる。
【０２２３】
他の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｙを含有する免疫グロブリン定常ドメインを含み、第２のポリペプチドは、Ｙを含有する免疫グロブリン定常ドメインを含み、かつ（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）は、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインである。たとえば、Ｙは、抗体軽鎖定常ドメイン（たとえば、Ｃｋ、Ｃｌ）または抗体重鎖定常ドメイン（たとえば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）に位置しうる。たとえば、抗体定常ドメイン中では、Ｙは、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）でありうるし、ＴＣＲ定常ドメイン中では、Ｙは、ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号３９７）でありうる。特定の実施形態では、Ｙは、抗体定常ドメイン中に存在し、かつＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号３９８）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号３９９）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４００）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０１）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０２）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０３）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０４）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０５）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０６）、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４０７）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４０８）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４０９）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１０）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１１）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１２）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１３）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１４）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１５）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ（配列番号４１６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ（配列番号４１７）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ（配列番号４１８）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインであり、かつＡは免疫グロブリン可変ドメインである。他の実施形態では、（Ｘ１−Ｙ−Ｚ２）はハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインであり、かつＢは免疫グロブリン定常ドメインである。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、組換え融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含む。ここで、該ハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインは、第１の免疫グロブリン由来の第１の免疫グロブリンＦＲに由来する部分と第２の免疫グロブリン由来の第２の免疫グロブリンＦＲに由来する部分とを含むハイブリッドフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。このタイプの組換え融合タンパク質は、第１の免疫グロブリン由来の第１の免疫グロブリンＦＲのアミノ酸配列と第２の免疫グロブリン由来の第２の免疫グロブリンＦＲのアミノ酸配列とを解析して該第１の免疫グロブリンＦＲ中および該第２の免疫グロブリンＦＲ中に存在する保存アミノ酸モチーフを同定することと、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、
Ｙは、該保存アミノ酸モチーフであり、
Ｆ１は、該第１の免疫グロブリンＦＲ中のＹのアミノ末端に隣接して位置するアミノ酸配列であり、そして
Ｆ２は、該第２の免疫グロブリンＦＲ中のＹのカルボキシ末端に隣接して位置するアミノ酸配列である〕
を有するハイブリッド免疫グロブリンＦＲを含む融合タンパク質を調製することとを含む方法により調製可能である。
【０２２６】
ハイブリッドＦＲは、ハイブリッドＦＲ１、ハイブリッドＦＲ２、ハイブリッドＦＲ３、またはハイブリッドＦＲ４でありうる。一例では、第１の免疫グロブリンは、抗体重鎖であり、第２の免疫グロブリンは、抗体軽鎖であり、Ｆ１は、抗体重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４に由来し、かつＦ２は、抗体軽鎖可変領域の対応するＦＲに由来する。他の例では、第１の免疫グロブリンは、抗体軽鎖であり、第２の免疫グロブリンは、抗体重鎖であり、Ｆ１は、抗体軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４に由来し、かつＦ２は、抗体重鎖可変領域の対応するＦＲに由来する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、第２の免疫グロブリンは、ＦＲ４中のＹおよびＦ２を含有する可変ドメインと、定常ドメインとを含む。たとえば、第２のポリペプチドは、ＹおよびＦ２がＴＣＲ ＦＲ４中に存在するＴＣＲ鎖でありうる。この例では、組換え融合タンパク質は、ＴＣＲ定常ドメインのアミノ末端に結合されたハイブリッド免疫グロブリンドメインを含有する。同様に、第２のポリペプチドは、ＹおよびＦ２がＦＲ４中に存在する抗体軽鎖でありうるし、かつ組換え融合タンパク質は、抗体軽鎖定常ドメインのアミノ末端に結合されたハイブリッド免疫グロブリンドメインを含有する。特定の実施形態では、第２のポリペプチドはκまたはλ軽鎖であり、Ｆ２はＶκまたはＶλ ＦＲ４に由来し、かつハイブリッド免疫グロブリンドメインはＣκまたはＣλのアミノ末端にそれぞれ結合される。第２のポリペプチドが抗体重鎖でありかつＦ２が抗体重鎖可変ドメインＦＲ４に由来する場合、ハイブリッド免疫グロブリンドメインは、抗体重鎖定常ドメインのアミノ末端に結合可能である。特定の実施形態では、第２のポリペプチドは抗体重鎖であり、Ｆ２は抗体重鎖可変ドメインＦＲ４（たとえば、ＶＨ ＦＲ４、ＶＨＨ ＦＲ４）に由来し、かつハイブリッド免疫グロブリンドメインはＣＨ１のアミノ末端に結合される。
【０２２８】
特定の実施形態では、Ｙは、ＦＲ４中に存在し、かつＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）である。たとえば、第１の免疫グロブリンは、Ｆ１がＰｈｅでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であるＦＲ４を含む抗体軽鎖可変ドメインを含みうるし、かつ第２の免疫グロブリンは、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）でありかつＦ２が（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）であるＦＲ４ドメインを含む抗体重鎖可変を含みうる。特定の実施形態では、Ｆ２は、ＬｅｕＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２１）、ＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２２）、またはＴｈｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２３）でありうる。
【０２２９】
他の例では、第１の免疫グロブリンは、Ｆ１がＰｈｅでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であるＦＲ４を含む抗体軽鎖可変ドメインを含み、かつ第２の免疫グロブリンは、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）でありかつＦ２がＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）であるＦＲ４を含む抗体重鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）またはＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＬｅｕ（配列番号３９６）である。好ましくは、これらのタイプのハイブリッド抗体可変ドメインのカルボキシ末端は、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメインのような抗体重鎖定常ドメインに直接結合される。好ましくは、抗体重鎖定常ドメインは、ヒト抗体重鎖定常ドメインである。特定の実施形態では、ハイブリッド抗体可変ドメインのカルボキシ末端は、ＩｇＧ ＣＨ１またはＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）に直接結合される。
【０２３０】
他の実施形態では、第１の免疫グロブリンは、ＸがＴｒｐでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であるＦＲ４を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、かつ第２の免疫グロブリンは、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）でありかつＦ２が（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）または（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）であるＦＲ４を含む抗体軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆ２は、ＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２７）、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２８）、ＬｙｓＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２９）、ＡｒｇＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３０）、ＡｒｇＶａｌＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３１）、ＡｒｇＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３２）、ＡｒｇＬｅｕＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４３３）、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４３４）、ＬｙｓＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３５）、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４３６）、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３７）、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４３８）、ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４３９）、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４０）、ＬｙｓＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４１）、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４４２）、ＧｌｎＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４３）、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４４）、ＧｌｎＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４５）、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４４６）、ＧｌｎＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４７）、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４４８）、ＧｌｎＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４４９）、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４５０）、ＧｌｕＶａｌＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５１）、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４５２）、ＧｌｕＶａｌＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５３）、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４５４）、ＧｌｕＬｅｕＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５５）、ＧｌｕＬｅｕＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４５６）、またはＧｌｕＬｅｕＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４５７）である。
【０２３１】
他の例では、第１の免疫グロブリンは、Ｆ１がＴｒｐでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）であるＦＲ４を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、かつ第２の免疫グロブリンは、ＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａＶａｌ（配列番号３９５）でありかつＦ２が（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）または（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）であるＦＲ４を含む抗体軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆ２は、ＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号４６０）、ＡｓｐＩｌｅＬｙｓ（配列番号４６１）、ＴｈｒＶａｌＬｅｕ（配列番号４６２）、ＴｈｒＩｌｅＬｅｕ（配列番号４６３）、ＩｌｅＶａｌＬｅｕ（配列番号４６４）、またはＩｌｅＩｌｅＬｅｕ（配列番号４６５）である。好ましくは、これらのタイプのハイブリッド抗体可変ドメインのカルボキシ末端は、ＣκまたはＣλのような抗体軽鎖定常ドメインに直接結合される。好ましくは、抗体軽鎖定常ドメインは、ヒト抗体軽鎖定常ドメインである。
【０２３２】
特定の実施形態では、この方法により生成される融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含み、式（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｃκ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｃλ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ１、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ２、または（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｆｃを有する部分構造を含む。特定の実施形態では、この方法により生成される融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含み、第２の免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）をさらに含む。好ましくは、第２の免疫グロブリン可変ドメインは、融合タンパク質中のハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインのアミノ末端に存在する。
【０２３３】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ヒト抗体定常ドメインに直接融合された非ヒト抗体可変領域を含む。ここで、非ヒト抗体可変領域は、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、
Ｆ１は、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、
Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２は、（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）、（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）、もしくは（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）であるか、または
Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、かつＦ２は、ＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）、（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）、もしくは（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）である〕
を有するハイブリッドＦＲ４を含む。
【０２３４】
このタイプの組換え融合タンパク質は、非ヒト抗体可変領域を含む第１のポリペプチドのアミノ酸配列とヒト抗体可変ドメインを含む第２のポリペプチドのアミノ酸配列とを解析して該非ヒト抗体可変ドメインのＦＲ４中および該ヒト抗体可変ドメインのＦＲ４中の保存アミノ酸モチーフＹを同定することと、式
（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）
〔式中、
Ｆ１は、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、
Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であり、かつＦ２は、（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）、（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）、もしくは（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）であるか、または
Ｙは、ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であり、かつＦ２は、ＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）、（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）、もしくは（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）である〕
を有するハイブリッドＦＲ４を含む融合タンパク質を調製することとを含む方法により調製可能である。
【０２３５】
非ヒト抗体可変領域は、任意の所望の種、たとえば、マウス、ニワトリ、ブタ、トラフグ、カエル、ウシ（たとえば、ボス・タウラス（Bos taurus））、ラット、サメ（たとえば、オオメジロザメ、メジロザメ、ナースシャーク、ネコザメ、クモハダオオセ）、ガンギエイ（たとえば、クリアノーズスケート（clearnose skate）、リトルスケート）、サカナ（たとえば、タイセイヨウサケ、アメリカナマズ、カライワシ、スポッテッドラットフィッシュ、タイセイヨウタラ、ケツギョ、ニジマス、スポッテッドウルフフィッシュ、ゼブラフィッシュ）、オポッサム、ヒツジ、ラクダ科動物（たとえば、ラマ、グアナコ、アルパカ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ）、ウサギ、非ヒト霊長動物（たとえば、シンセカイザル、キュウセカイザル、カニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Macaca fascicularis））、キヌザル科（Callithricidae）（たとえば、マーモセット））、または任意の他の所望の非ヒト種に由来しうる。特定の実施形態では、非ヒト可変領域は、マウス可変領域、ラクダ科動物可変領域、またはナースシャーク可変領域である。第２のポリペプチドは、ヒト重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含みうる。
【０２３６】
特定の例では、非ヒト抗体可変ドメインは、Ｆ１がＰｈｅまたはＴｒｐでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３６８）であるＦＲ４を含む軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインであり、しかも第２のポリペプチドは、Ｆ２が（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４２４）または（Ｌｙｓ／Ｇｌｎ／Ｇｌｕ）（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４２５）であるＦＲ４を含むヒト抗体軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、ハイブリッドＦＲ４を含有するこのタイプの非ヒト可変ドメインのカルボキシ末端は、ヒト抗体軽鎖定常ドメイン、たとえば、ＣκまたはＣλに直接結合される。他の例では、非ヒト抗体可変ドメインは、Ｆ１がＰｈｅまたはＴｒｐでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）であるＦＲ４を含む軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインであり、しかも第２のポリペプチドは、Ｆ２が（Ｌｅｕ／Ｍｅｔ／Ｔｈｒ）ＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４２０）であるＦＲ４を含むヒト抗体軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、ハイブリッドＦＲ４を含有するこのタイプの非ヒト可変ドメインのカルボキシ末端は、ヒト抗体重鎖定常ドメインに直接結合される。好ましくは、抗体重鎖定常ドメインは、ヒト抗体重鎖定常ドメイン、たとえば、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメインである。特定の実施形態では、ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ１またはＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）である。
【０２３７】
特定の例では、非ヒト抗体可変ドメインは、Ｆ１がＰｈｅまたはＴｒｐでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であるＦＲ４を含む軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインであり、しかも第２のポリペプチドは、Ｆ２が（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）ＩｌｅＬｙｓ（配列番号４５８）または（Ｔｈｒ／Ｉｌｅ）（Ｖａｌ／Ｉｌｅ）Ｌｅｕ（配列番号４５９）であるＦＲ４を含むヒト抗体軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、ハイブリッドＦＲ４を含有するこのタイプの非ヒト可変ドメインのカルボキシ末端は、ヒト抗体軽鎖定常ドメイン、たとえば、ＣκまたはＣλに直接結合される。他の例では、非ヒト抗体可変ドメインは、Ｆ１がＰｈｅまたはＴｒｐでありかつＹがＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒＸａａ（Ｖａｌ／Ｌｅｕ）（配列番号３８７）であるＦＲ４を含む軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインであり、しかも第２のポリペプチドは、Ｆ２がＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号４１９）であるＦＲ４を含むヒト抗体軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、ハイブリッドＦＲ４を含有するこのタイプの非ヒト可変ドメインのカルボキシ末端は、ヒト抗体重鎖定常ドメインに直接結合される。好ましくは、抗体重鎖定常ドメインは、ヒト抗体重鎖定常ドメイン、たとえば、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメインである。特定の実施形態では、ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ１またはＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）である。
【０２３８】
特定の実施形態では、この方法により生成される融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含み、式（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｃκ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｃλ、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ１、（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−ＣＨ２、または（Ｆ１−Ｙ−Ｆ２）−Ｆｃを有する部分構造を含む。特定の実施形態では、この方法により生成される融合タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインに融合されたハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインを含み、第２の免疫グロブリン可変ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）をさらに含む。好ましくは、第２の免疫グロブリン可変ドメインは、融合タンパク質中のハイブリッド免疫グロブリン可変ドメインのアミノ末端に存在する。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、組換え融合タンパク質は、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインに融合された免疫グロブリン可変ドメインを含む。ここで、該ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、第１の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分と第２の免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分とを含む。このタイプの組換え融合タンパク質は、第１の免疫グロブリン定常ドメインおよび第２の免疫グロブリン定常ドメインのアミノ酸配列を解析して該第１の免疫グロブリン定常ドメイン中および該第２の免疫グロブリン定常ドメイン中に存在する保存アミノ酸モチーフを同定することと、式
Ｃ１−Ｙ−Ｃ２
〔式中、
Ｙは、該保存アミノ酸モチーフであり、
Ｃ１は、該第１の免疫グロブリン定常ドメイン中のＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸配列であり、そしてＣ２は、該第２の免疫グロブリン定常ドメイン中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である〕
を有するハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインを含む融合タンパク質を調製することとを含む方法により調製可能である。ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、保存アミノ酸モチーフを含有する任意の２つの免疫グロブリン定常ドメイン由来の部分を含みうる。特定の実施形態では、ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインは、第１の抗体定常ドメイン由来の部分と第２の抗体定常ドメイン由来の部分とを含むハイブリッド抗体定常ドメインである。たとえば、ハイブリッド抗体定常ドメインは、ハイブリッドＣＨ１、ハイブリッドヒンジ、ハイブリッドＣＨ２、またはハイブリッドＣＨ３でありうる。ここで、ハイブリッドドメインの部分は、異なる種（たとえば、ヒトおよびラクダ科動物やナースシャークのような非ヒト）由来または異なるアイソタイプ（たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４））由来の抗体定常ドメインに由来する。ハイブリッド免疫グロブリン定常ドメインはまた、ＣＨ１ドメイン由来の部分およびＣＨ２ドメイン由来の部分のような２つの異なる定常ドメインに由来するかまたは異なるアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４）の定常ドメインに由来する部分を含みうる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本方法は、異なる種に由来する第１の免疫グロブリン定常ドメインおよび第２の免疫グロブリン定常ドメインの配列を解析することを含む。たとえば、第１の免疫グロブリンドメインは、非ヒト抗体定常ドメイン（たとえば、ラクダ科動物またはナースシャークの定常ドメイン）でありうるし、かつ第２の免疫グロブリン定常ドメインは、ヒト抗体定常ドメインである。特定の実施形態では、第１の免疫グロブリン定常ドメインは、ラクダ科動物抗体定常ドメイン（たとえば、ラクダ科動物ＣＨ１）である。そのような実施形態では、ラクダ科動物ＶＨＨは、融合タンパク質中のハイブリッド定常ドメインのアミノ末端に位置しうる。たとえば、ＶＨＨのカルボキシ末端は、Ｃ１に結合可能である。
【０２４１】
他の実施形態では、本方法は、第１の免疫グロブリン定常ドメインおよび第２の免疫グロブリン定常ドメインまたは異なるアイソタイプの抗体定常ドメインの配列を解析することを含む。第２の抗体定常ドメインは、好ましくは、ＩｇＧ定常ドメイン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）である。
【０２４２】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ１に直接結合された抗体可変ドメインを含む。そのような実施形態では、第１の免疫グロブリン定常ドメインは、天然に存在する抗体中の可変ドメインに結合された抗体定常ドメインでありうる。そのような定常ドメインは、可変ドメインに対応する。たとえば、可変ドメインがＶκまたはＶλである場合、第１の免疫グロブリンドメインは、それぞれ、ＣκまたはＣλに対応しうる。同様に、可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第１の免疫グロブリン可変ドメインは、対応するＣＨ１ドメインでありうる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本方法は、抗体軽鎖定常ドメインである第１の免疫グロブリン定常ドメインのアミノ酸配列と、抗体重鎖定常ドメイン、好ましくはヒト抗体重鎖定常ドメインである第２の免疫グロブリン定常ドメインのアミノ酸配列とを解析することを含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインである。好ましくは、ヒト抗体重鎖定常ドメインは、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメイン、たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２、ＩｇＧ１ ＣＨ３、ＩｇＧ４ ＣＨ３である。
【０２４４】
他の実施形態では、融合タンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含み、かつ本方法は、ＣＨ１ドメインである第１の免疫グロブリン定常ドメインのアミノ酸配列を解析することを含む。そのような実施形態では、第２の免疫グロブリン定常ドメインは、異なるアイソタイプもしくは種に由来する抗体ＣＨ１ドメインまたは異なる抗体定常ドメイン（たとえば、ＣＨ２）でありうる。特定の実施形態では、第２の免疫グロブリン定常ドメインは、抗体軽鎖定常ドメインである。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本方法は、選択された保存アミノ酸モチーフ（Ｙ）（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）Ｖａｌ（配列番号３９１）、（Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｐｒｏ（Ｌｙｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒ）ＶａｌＰｈｅ（配列番号３９２）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓ（Ｓｅｒ／Ａｒｇ／Ｔｈｒ）（配列番号３９３）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）を両方とも含有する第１の抗体定常ドメインおよび第２の抗体定常ドメインのアミノ酸配列を解析することを含む。たとえば、特定の実施形態では、Ｙは、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号３９８）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号３９９）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４００）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０１）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０２）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０３）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌ（配列番号４０４）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌ（配列番号４０５）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４０６）、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４０７）、ＳｅｒＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４０８）、ＳｅｒＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４０９）、ＡｌａＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１０）、ＡｌａＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１１）、ＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１２）、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓＶａｌＰｈｅ（配列番号４１３）、ＧｌｙＰｒｏＡｓｐＶａｌＰｈｅ（配列番号４１４）、ＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４１５）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＳｅｒ（配列番号４１６）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＡｒｇ（配列番号４１７）、ＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒ（配列番号４１８）、またはＶａｌＴｈｒＶａｌ（配列番号３９４）である。好ましくは、第２の抗体定常ドメインは、ヒト抗体定常ドメインであり、かつＣ２は、該ヒト抗体定常ドメインに由来する。たとえば、ヒト抗体定常ドメインは、ヒトＣκ、ヒトＣλ、またはヒト重鎖定常ドメイン、たとえば、ヒトＣＨ１、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ２、またはヒトＣＨ３でありうる。特定の好ましい実施形態では、ヒト抗体定常ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ１（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１）、ＩｇＧヒンジ（たとえば、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ）、ＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）、またはＩｇＧ ＣＨ３（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ３もしくはＩｇＧ４ ＣＨ３）であり、かつＺ’は、該ヒト抗体定常ドメインに由来する。
【０２４６】
いくつかの融合タンパク質は、ハイブリッド抗体ＣＨ１ドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト軽鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）またはＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ＩｇＧ ＣＨ１、たとえば、ヒトＩｇＧ ＣＨ１（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ＩｇＧ４ ＣＨ１）中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。このタイプの融合タンパク質は、ＣκまたはＣλドメインのアミノ酸配列およびＣＨ１ドメインのアミノ酸配列を提供して本明細書に記載の方法を用いて調製可能である。
【０２４７】
いくつかの融合タンパク質は、ハイブリッド抗体ＣＨ２ドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト軽鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）またはＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。そのような融合タンパク質では、Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）のようなＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。このタイプの融合タンパク質は、ＣκまたはＣλドメインのアミノ酸配列およびＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を提供して本明細書に記載の方法を用いて調製可能である。
【０２４８】
いくつかの融合タンパク質は、ハイブリッド抗体ＣＨ２ドメインに融合された抗体重鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト重鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４７０）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＩｇＧ ＣＨ２（たとえば、ＩｇＧ１ ＣＨ２、ＩｇＧ４ ＣＨ２）のようなＩｇＧ ＣＨ２中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。このタイプの融合タンパク質は、ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列およびＣＨ２ドメインのアミノ酸配列を提供して本明細書に記載の方法を用いて調製可能である。
【０２４９】
いくつかの融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃκドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒトλ軽鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＧｌｎＰｒｏＬｙｓＡｌａ（配列番号４６６）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｚ’は、ヒトＣκのようなＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。このタイプの融合タンパク質は、Ｃλドメインのアミノ酸配列およびＣκドメインのアミノ酸配列を提供して本明細書に記載の方法を用いて調製可能である。
【０２５０】
いくつかの融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃκドメインに融合された抗体重鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト重鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅ（配列番号４７０）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＣκのようなＣκ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。このタイプの融合タンパク質は、ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列およびＣκドメインのアミノ酸配列を提供して本明細書に記載の方法を用いて調製可能である。
【０２５１】
いくつかの融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃλドメインに融合された抗体軽鎖可変ドメイン、たとえば、ヒトκ鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＴｈｒＶａｌＡｌａ（配列番号４６７）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＣλのようなＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。このタイプの融合タンパク質は、Ｃκドメインのアミノ酸配列およびＣλドメインのアミノ酸配列を提供して本明細書に記載の方法を用いて調製可能である。
【０２５２】
いくつかの融合タンパク質は、ハイブリッド抗体Ｃλドメインに融合された抗体重鎖可変ドメイン、たとえば、ヒト重鎖可変ドメインを含む。ここで、Ｃ１は、ＳｅｒＴｈｒＬｙｓ（配列番号４６９）であり、かつＹは、（Ａｌａ／Ｇｌｙ）ＰｒｏＳｅｒＶａｌ（配列番号４６８）である。これらの実施形態では、Ｃ２は、ヒトＣλのようなＣλ中のＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸配列である。このタイプの融合タンパク質は、ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列およびＣλドメインのアミノ酸配列を提供して本明細書に記載の方法を用いて調製可能である
本発明に係る融合タンパク質は、任意の好適な方法を用いて生成可能である。たとえば、融合タンパク質をコードする核酸の発現または化学合成により。発現の場合、任意の好適な方法を用いて、融合タンパク質をコードする核酸を発現させることが可能である（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現、ｉｎ ｖｉｖｏ発現）。たとえば、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸を好適な発現ベクター中に挿入することが可能である。次に、得られた構築物を発現に好適な宿主細胞中に導入する。発現の後、任意の好適な方法を用いて、細胞溶解物から、好ましくは培地またはペリプラズムから、融合タンパク質を単離または精製することが可能である。（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991)を参照されたい）。
【０２５３】
好適な発現ベクターは、いくつかの成分、たとえば、複製起点、選択性マーカー遺伝子、１つ以上の発現制御エレメント、たとえば、転写制御エレメント（たとえば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または１つ以上の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列などを含有しうる。好適な発現ベクターとしては、たとえば、ｐＴＴ（National Research Council Canada）、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）、ｐＩＲＥＳ（Clontech）、ｐＥＡＫ８（EdgeBioSystems）、ｐＣＥＰ４（invitrogen）が挙げられる。発現制御エレメントおよびシグナル配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給元により提供可能である。たとえば、抗体鎖をコードするクローン化核酸の転写および／または翻訳制御配列を用いて、発現を指令することが可能である。
【０２５４】
プロモーターは、所望の宿主細胞中で発現を行うべく提供可能である。プロモーターは、構成性または誘導性でありうる。たとえば、核酸の転写を指令するように、本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸にプロモーターを機能しうる形で連結することが可能である。原核宿主用のさまざまな好適なプロモーター（たとえば、Ｅ．コリ（E. coli）用のｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核宿主用のさまざまな好適なプロモーター（たとえば、シミアンウイルス４０初期もしくは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）が利用可能である。
【０２５５】
そのほかに、発現ベクターは、典型的には、ベクターを保有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーと、複製可能な発現ベクターの場合、複製起点とを含む。抗生物質耐性または薬剤耐性を付与する産物をコードする遺伝子は、一般的な選択性マーカーであり、原核細胞中（たとえば、ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性のＴｅｔ遺伝子）および真核細胞中（たとえば、ネオマイシン（Ｇ４１８もしくはゲネチシン）耐性、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）耐性、アンピシリン耐性、またはハイグロマイシン耐性の遺伝子）で使用可能である。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、さまざまな宿主におけるメトトレキセートによる選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカー（たとえば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）の遺伝子産物をコードする遺伝子は、多くの場合、酵母における選択性マーカーとして使用される。ウイルス（たとえば、バキュロウイルス）ベクターまたはファージベクターおよび宿主細胞のゲノム中に組み込みうるベクター、たとえば、レトロウイルスベクターの使用も考えられる。哺乳動物細胞および原核細胞（Ｅ．コリ（E. coli））、昆虫細胞（ショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞、Ｓｆ９）、ならびに酵母（Ｐ．メタノリカ（P. methanolica）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｓ．セレビシアエ（S.cerevisiae））における発現に好適な発現ベクターは、当技術分野で周知である。
【０２５６】
本発明に係る融合タンパク質を発現する組換え宿主細胞および本明細書に記載される融合タンパク質の調製方法を提供する。組換え宿主細胞は、組換え融合タンパク質をコードする組換え核酸を含む。組換え融合タンパク質は、好適な宿主細胞におけるタンパク質をコードする組換え核酸の発現によりまたは他の好適な方法を用いて生成可能である。たとえば、本明細書に記載の発現構築物を好適な宿主細胞中に導入することが可能であり、得られた細胞を構築物の発現に好適な条件下で維持することが可能である（たとえば、培養下、動物中）。好適な宿主細胞は、原核細胞、たとえば、細菌細胞、たとえば、Ｅ．コリ（E. coli）、Ｂ．スブティリス（B. subtilis）、およびまたは他の好適な細菌の細胞、真核細胞、たとえば、菌類細胞もしくは酵母細胞（たとえば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルス属（Aspergillus）の種、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）の細胞）、または他の下等真核細胞、ならびに高等真核生物の細胞、たとえば、昆虫由来の細胞（たとえば、Ｓｆ９昆虫細胞（WO 94/26087 (O’Connor)））または哺乳動物由来の細胞（たとえば、ＣＯＳ細胞、たとえば、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５１）、ＣＨＯ細胞（たとえば、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−９０９６）、２９３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ細胞（Dailey et al., J. Virol. 54:739-749 (1985)）、３Ｔ３細胞、２９３Ｔ細胞（Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)）、２９３−６Ｅ細胞（National Research Council Canada）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨｕＴ ７８細胞など）でありうる（たとえば、Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993)を参照されたい）。
【０２５７】
本発明はまた、組換え融合タンパク質の発現に適合する条件下で本発明に係る組換え宿主細胞を維持することを含む組換え融合タンパク質の産生方法を包含する。本方法は、所望により、組換え融合タンパク質を単離または回収する工程をさらに含みうる。他の実施形態では、組換え融合タンパク質の成分は、連続ポリペプチド鎖を形成するように化学的に集合される。
【０２５８】
本発明はまた、本明細書に記載の新規な融合タンパク質をコードする単離された組換え核酸と、本明細書に記載の新規な融合タンパク質をコードする組換え核酸を含有する組換えベクター（たとえば、発現ベクター）とを提供する。本発明はまた、そのような核酸または組換えベクターを含有する単離された宿主細胞（たとえば、非ヒト宿主細胞）に関する。
【０２５９】
本発明はまた、本明細書に記載の新規な融合タンパク質をコードする組換え核酸かまたは本明細書に記載の新規な融合タンパク質をコードする組換え核酸を含有する組換えベクター（たとえば、発現ベクター）かを含有する宿主細胞（たとえば、非ヒト宿主細胞）を発現に好適な条件下で維持することにより組換え融合タンパク質を産生することを含む、本発明に係る組換え融合タンパク質の産生方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、組換え融合タンパク質を（たとえば、宿主細胞からまたは宿主細胞が保持される培地から）単離することをさらに含む。
【０２６０】
組成物ならびに治療法および診断法
本発明に係る融合タンパク質を含む組成物、たとえば、医薬組成物または生理学的組成物（たとえば、ヒト投与および／または動物投与のための組成物）を提供する。医薬組成物または生理学的組成物は、１種以上の融合タンパク質と製薬上もしくは生理学上許容される担体とを含む。典型的には、こうした担体としては、水性もしくはアルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたはサスペンジョン、たとえば、生理食塩水および／または緩衝化媒体が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース＋塩化ナトリウム、および乳酸加リンゲルが挙げられる。ポリペプチド複合体を懸濁状態に保持することが必要な場合に好適な生理学的に許容されるアジュバントは、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、およびアルギネートのような増粘剤から選択可能である。静脈内ビヒクルとしては、体液および栄養素の補充液ならびに電解質の補充液、たとえば、リンゲルデキストロースをベースとする補充液が挙げられる。保存剤および他の添加剤、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスもまた、存在させてもよい（Mack (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition）。
【０２６１】
組成物は、所望の量の融合タンパク質を含みうる。たとえば、組成物は、約５重量％〜約９９重量％の融合タンパク質を含みうる。特定の実施形態では、組成物は、約１０重量％〜約９９重量％または約２０重量％〜約９９重量％または約３０重量％〜約９９重量％または約４０重量％〜約９９重量％または約５０重量％〜約９９重量％または約６０重量％〜約９９重量％または約７０重量％〜約９９重量％または約８０重量％〜約９９重量％または約９０重量％〜約９９重量％または約９５重量％〜約９９重量％の融合タンパク質を含みうる。一例では、組成物は、フリーズドライ（凍結乾燥）される。
【０２６２】
本明細書に記載の薬剤組成物は、典型的には、炎症状態、癌、疼痛などのような疾患状態の抑制、治療、または予防に使用されるであろう。本明細書に記載の薬剤組成物（たとえば、薬剤コンジュゲート、非共有結合薬剤コンジュゲート、薬剤融合体）はまた、診断目的のために投与することも可能である。
【０２６３】
本出願において、「予防」という用語は、疾患の誘導前に防御組成物を投与することを包含する。「抑制」とは、疾患の誘導事象後かつ臨床出現前に組成物を投与することを意味する。「治療」は、疾患症状が顕在化した後に防御組成物を投与することを包含する。
【０２６４】
疾患の防御または治療における薬剤組成物の有効性のスクリーニングに使用しうる動物モデル系は、入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の試験方法は、当技術分野で公知である（Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515）。重症筋無力症（ＭＧ）は、他の種由来の可溶性ＡｃｈＲタンパク質で疾患を誘導することによりＳＪＬ／Ｊ雌マウスで試験される（Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233）。関節炎は、ＩＩ型コラーゲンを注射することにより感受性系統のマウスで誘導される（Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233）。マイコバクテリア熱ショックタンパク質を注射することにより感受性ラットでアジュバント関節炎が誘導されるモデルが報告されている（Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171）。骨関節炎の治療の有効性は、コラゲナーゼを関節内注射することにより関節炎が誘導されるネズミモデルで評価可能である（Blom, A.B. et al., Osteoarthritis Cartilage 12:627-635 (2004)）。甲状腺炎は、報告されているようにチログロブリンを投与することによりマウスで誘導される（Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115）。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、天然に存在するか、またはKanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113に記載されるように特定の系統のマウスで誘導可能である。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのモデルとして機能する。このモデルでは、脱髄疾患は、ミエリン塩基性タンパク質を投与することにより誘導される（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: および Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179を参照されたい）。
【０２６５】
本発明に係る薬剤組成物は、個別に投与される組成物としてまたは他の薬剤と組み合わせて使用可能である。医薬組成物は、本発明に係る薬剤組成物と組み合わされた種々の細胞傷害剤もしくは他の薬剤の「カクテル」、またはさまざまな薬剤を含む本発明に係る薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）の組合せを包含しうる。
【０２６６】
薬剤組成物は、任意の好適な技術に基づいて任意の個体または被験体に投与可能である。薬剤組成物および治療対象の疾患または病状に依存して、さまざまな投与経路が利用可能であり、例としては、経口投与経路、食事投与経路、局所投与経路、経皮投与経路、直腸内投与経路、非経口投与経路（たとえば、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、関節内注射）、および吸入投与経路（たとえば、気管支内吸入、鼻腔内吸入、または経口吸入、鼻腔内滴剤）が挙げられる。投与は、必要に応じて、局所投与または全身投与でありうる。好ましい投与形態は、選択される融合タンパク質および治療される病状（たとえば、疾患）に依存して、さまざまでありうる。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別、および病状、他の薬剤の併行投与、使用禁忌、ならびに臨床医により考慮される他のパラメーターに依存するであろう。治療上有効量の薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）が投与される。治療上有効量とは、投与条件下で所望の治療効果を達成するのに十分な量のことである。
【０２６７】
「被験体」または「個体」という用語は、本明細書中では、哺乳動物などの動物を包含するように定義され、その例としては、霊長動物（たとえば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、または他のウシ科動物種、ヒツジ科動物種、ウマ科動物種、イヌ科動物種、ネコ科動物種、齧歯動物種、もしくはネズミ科動物種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２６８】
薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）は、中性化合物としてまたは塩として投与可能である。アミンまたは他の塩基性基を含有する化合物（たとえば、融合タンパク質）の塩は、たとえば、好適な有機酸または無機酸、たとえば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などと反応させることにより取得可能である。第四級アンモニウム基を有する化合物は、クロリド、ブロミド、ヨージド、アセテート、ペルクロレートなどのような対アニオンをも含有する。カルボン酸または他の酸性官能基を含有する化合物の塩は、好適な塩基たとえば水酸化物塩基と反応させることにより調製可能である。酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウムなどのような対カチオンを含有する。
【０２６９】
本発明はまた、薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）を被験体（たとえば、患者）に投与するために使用されるキットを提供する。このキットは、薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）と薬剤送達デバイスと場合により使用説明書とを含む。薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）は、フリーズドライ製剤などの製剤として提供可能である。特定の実施形態では、薬剤送達デバイスは、シリンジ、吸入器、鼻腔内投与デバイスまたは眼投与デバイス（たとえば、ミスト器、点眼器または点鼻器）、および無針注射デバイスよりなる群から選択される。
【０２７０】
本発明に係る薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）は、貯蔵のために凍結乾燥して使用前に好適な担体中に再構成することが可能である。任意の好適な凍結乾燥法（たとえば、スプレー乾燥法、ケーク乾燥法）および／または再構成技術を利用することが可能である。当業者であればわかるであろうが、凍結乾燥および再構成は、さまざまな度合いで抗体活性損失を引き起こす可能性があり（たとえば、従来の免疫グロブリンを用いた場合、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも大きい活性損失を有する傾向がある）、補償のために使用レベルを調整しなければならないこともある。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される凍結乾燥（フリーズドライ）薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）を含む組成物を提供する。凍結乾燥（フリーズドライ）薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）は、好ましくは、再水和時にその活性の約２０％以下または約２５％以下または約３０％以下または約３５％以下または約４０％以下または約４５％以下または約５０％以下を損失する。活性は、凍結乾燥前において薬剤組成物の効果を引き起こすのに必要な薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）の量である。たとえば、所望の期間にわたり所望の血清中濃度を達成および保持するのに必要とされる融合タンパク質の量。凍結乾燥前、任意の好適な方法を用いて薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）の活性を測定することが可能であり、かつ再水和後、同一の方法を用いて活性を測定して活性損失量を決定することが可能である。
【０２７１】
薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）またはそのカクテルを含有する組成物は、予防処置および／または治療処置のために投与することが可能である。特定の治療用途では、投与条件下における所望の治療効果または予防効果、たとえば、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、またはなんらかの他の測定可能なパラメーターを達成するのに十分な量は、「治療上有効量または用量」として定義される。この用量を達成するのに必要とされる量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の一般的状態および全般的健康状態に依存するであろうが、一般的には、融合タンパク質換算で体重１キログラムあたり約０．００５〜１０．０ｍｇの範囲内であり、より一般的には、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／回の用量が使用される。予防用途では、薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）またはそのカクテルを含有する組成物は、類似のもしくはわずかに少ない用量で投与可能である。本発明に係る薬剤組成物（たとえば、融合タンパク質）を含有する組成物は、哺乳動物において、選択された標的細胞集団の変化、不活性化、死滅、または除去を支援するために、予防および治療の場で利用可能である。
【０２７２】
本発明はまた、本発明に係る組成物（たとえば、医薬組成物）または融合タンパク質を含む薬剤送達デバイスに関する。いくつかの実施形態では、薬剤送達デバイスは、非経口送達デバイス、静脈内送達デバイス、筋肉内送達デバイス、腹腔内送達デバイス、経皮送達デバイス、肺送達デバイス、動脈内送達デバイス、脊髄内送達デバイス、関節内送達デバイス、皮下送達デバイス、鼻腔内送達デバイス、膣送達デバイス、直腸内送達デバイス、シリンジ、経皮送達デバイス、カプセル、錠剤、ネブライザー、吸入器、アトマイザー、エアロゾル器、ミスト器、乾燥粉末吸入器、定量噴霧式吸入器、定量噴霧式スプレー器、定量噴霧式ミスト器、定量噴霧式アトマイザー、およびカテーテルよりなる群から選択される。
【０２７３】
いくつかの状況下で天然の連結部により達成されうる構造上の特徴の保存および荷電残基の露出の回避は、タンパク質分解アッセイにおいて実証されうることが期待される。アッセイは、次のように実施可能である。組換えタンパク質（リン酸緩衝食塩水中１ｍｇ／ｍＬ）の溶液に０．０４ｍｇ／ｍＬの配列決定グレードのトリプシン（Promegaから入手可能）を追加し、３０℃でインキュベートする。ある時間間隔で、タンパク質溶液のアリコートを取り出し、停止液（ＳＤＳ充填緩衝液とプロテアーゼ阻害剤とを含有する）と混合し、そしてスナップ凍結する。たとえば、５分間〜２４時間の範囲内の時間間隔でアリコートを取り出す。時間コースの終了後、たとえば、ＳＤＦＳ−ＰＡＧＥゲル上でのサンプルの分離およびクーマシーブルーのようなタンパク質染色剤による可視化により、タンパク質分解度を評価する。天然の連結部を有する融合タンパク質は、非天然の連結部を含有する対応する融合タンパク質よりもフラグメント化に対してより耐性があることが期待される。
【実施例】
【０２７４】
実施例１：一般的方法
発現ベクターの構築
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＢｕｄＣＥ４．１バックボーンをベースとするベクターを用いてＩｇＧを発現させた。ユニークなＮｈｅＩ制限部位を欠失させることにより、バックボーンを改変した。標準的プロトコルを用いて、ＮｈｅＩ制限消化、クレノウ酵素を用いる埋込み、およびセルフライゲーションにより、これを達成した。コザック配列とネズミ科動物Ｖ−Ｊ２−ＣシグナルペプチドｃＤＮＡと定常領域ｃＤＮＡとを含むＩｇＧ重鎖および軽鎖発現カセットを調製した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素を用いて、ヒトＩｇＧ重鎖定常ドメインをコードする重鎖発現カセットを消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化された改変ベクターバックボーン中にサブクローニングし、それにより、ベクターバックボーン中の内部ＢａｍＨＩ制限部位を欠失させた。ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩ制限酵素を用いて、ヒトκまたはλ定常領域遺伝子をコードする軽鎖発現カセットをベクターバックボーン中にサブクローニングした。
【０２７５】
可変ドメイン遺伝子のサブクローニング
標準的分子生物学プロトコルを用いて、以上に記載の発現ベクター中にＩｇＧ可変ドメイン遺伝子をサブクローニングした。重鎖シグナルペプチドｃＤＮＡ中のＢａｍＨＩ制限部位および成熟重鎖タンパク質をコードするｃＤＮＡ中のＸｈｏＩ制限部位またはＮｈｅＩ制限部位を用いて、重鎖の一部として発現に使用されるＩｇＧ可変ドメイン遺伝子をサブクローニングした。２つの方法のうちの１つにより、軽鎖の一部として発現に使用されるＩｇＧ可変ドメイン遺伝子をサブクローニングした。ＰＣＲオーバーラップ伸長を用いてＩｇＧ可変ドメイン遺伝子を軽鎖ｃＤＮＡに連結し、続いて、軽鎖シグナルペプチドｃＤＮＡ中のＳａｌＩ制限部位および軽鎖発現カセットの下流に位置するＭｌｕＩ制限部位を用いてサブクローニングするか、または軽鎖シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ中のＳａｌＩ制限部位および成熟軽鎖ペプチドをコードするｃＤＮＡ中のＢｓｉＷＩ制限部位を用いて直接サブクローニングした。
【０２７６】
ＩｇＧの発現、精製、および定量
ＤＮＡ配列の確認を行った後、製造業者の取扱い説明書に従ってＱｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキットを用いてベクターＤＮＡを作製した。次に、ベクターＤＮＡを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標））をトランスフェクトした。典型的には、各構築物ごとに、約７０％〜８０％のコンフルエンシーに達するまで、１７５ｃｍ２の表面積を有する５もしくは１０個の細胞培養フラスコ（Ｔ１７５、Ｎｕｎｃ）中で細胞を培養した。次に、製造業者の取扱い説明書に従ってＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（脂質ベースのトランスフェクション試薬、Roche）を用いて、フラスコ１個あたり３４マイクログラムのＤＮＡを用いて、細胞をトランスフェクトした。１％非必須アミノ酸と４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とが追加された、グルタミンと高グルコースとを有するＤＭＥＭ（Invitrogen）中で、トランスフェクト細胞を増殖させた。ＦＢＳは、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）−Ｇ樹脂（組換えプロテインＧ樹脂、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて残留ウシ科動物ＩｇＧを除去してから滅菌濾過を行うことによりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳから調製したものであった。発現の４もしくは５日後、培養物上清を遠心分離により採取した。２つのＶＨドメインと２つのＶκドメインとを含むかまたは４つのＶκドメインを含むＩｇＧ分子の場合にはプロテインＡ樹脂（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ Ａ、GE Healthcare）を用いて、４つのＶＨドメインを含むＩｇＧ分子の場合にはＦａｂ結合部位を含まないように工学的に作製されたプロテインＧ樹脂（プロテインＧアガロース、Sigma Aldrich）を用いて、分泌ＩｇＧをアフィニティー精製した。典型的には、２０〜５０床体積の２×ＰＢＳを用いて、続いて、１０〜２０床体積の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いて、樹脂を洗浄した。典型的には、１００ｍＭグリシンｐＨ２．０を用いてＩｇＧを溶出させ、Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．０に中和したか、または１０ｍＭシトレート、５０％エチレングリコール、ｐＨ３．５を用いて溶出させたかのいずれかであった。分光光度計を用いて２８０ｎｍにおける吸光度を読み取ることにより、溶出されたタンパク質を定量した。
【０２７７】
ＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ（登録商標）ソフトウェア（クロマトグラフィー管理ソフトウェア、Dionex Corporation）を用いてＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＩｇＧを分析した。分析パラメーターは、最も典型的には、１０％エタノールが追加された１×ＰＢＳを流動緩衝液として１ｍＬ／ｍｉｎの流量および注入後２０分間の取得時間でＴｏｓｏｈ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラムを使用することを含んでいた。２２５、２８０、および３００ｎｍの波長で吸光度を記録した。
【０２７８】
実施例２：タンパク質の発現ならびに可溶性オリゴマーおよびアグリゲートの形成
ＤＯＭ９−１５５−２５およびＤＯＭ１０−１７６−５３５で示される２つのＶκ可変ドメインをペアにしてＩｇＧ中に導入し、１分子あたり合計で４つのＶκ可変ドメインを含有するようにした。天然の軽鎖の部分としてＶκドメインＤＯＭ１０−１７６−５３５を発現させ、一方、３つの異なる連結部を用いてＶκドメインＤＯＭ９−１５５−２５を重鎖上のＣＨ１に融合させた。
【０２７９】
カバット番号：      97           114
非天然の連結部１：  TFGQGTKVEIK__ASTKGPS
非天然の連結部２：  TFGQGTKVEIKR_ASTKGPS
天然の連結部：      TFGQGTLVTVSS ASTKGPS
各連結部に対して融合部に下線が付されている。
【０２８０】
非天然の連結部１（配列番号５２２）は、カバット残基１〜１１２を含むＶκドメインとＣＨ１との直接融合に対応し、一方、非天然の連結部２（配列番号５２３）は、カバット残基１１３（ヒトにおいてＪκエキソンにより部分的にコードされかつＣκエキソンにより部分的にコードされる）をも含むＶκドメインとＣＨ１との直接融合に対応する。天然の連結部（配列番号５２４）を有するＩｇＧでは、保存ＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒモチーフ（配列番号３８６）（ＶＨドメイン中の残基Ｈ１０４〜Ｈ１０７およびＶκ中のドメインＬ９９〜Ｌ１０２）を融合部位として使用した。
【０２８１】
２８０ｎｍの波長における吸光度の読取りを用いて発現収率を比較し、サイズ排除ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。収率を表１にまとめる。発現収率は、天然の連結部（配列番号５２４）を用いたときのほうが非天然の連結部１（配列番号５２２）または非天然の連結部２（配列番号５２３）のいずれかを用いたときよりも有意に高かった。
【０２８２】
いくつかの抗体では、天然の連結部を用いることにより、非天然の連結部を用いたときと比較して可溶性オリゴマーおよびアグリゲートの割合が低減された。たとえば、ＶκＤＵＭ１で示される同一のＶκドメインを天然の軽鎖の部分として含みかつ異なる連結部を用いて重鎖上のＣＨ１に融合させて含む３つのＩｇＧを発現させた。サイズ排除ＨＰＬＣにより３つのＩｇＧを分析した（表２）。オリゴマーおよびアグリゲートの画分は、非天然の連結部１（配列番号５２２）を有するＩｇＧを用いたときは９％、非天然の連結部２（配列番号５２３）を有するＩｇＧを用いたときは１０％であったが、天然の連結部（配列番号５２４）を有するＩｇＧを用いたときは７％にすぎなかったことから、天然の連結部を用いた場合、より少ないオリゴマーおよびアグリゲートが発現され精製されたことが示唆される。オリゴマーおよびアグリゲートが数パーセント減少することにより、利点が提供され、とくに工業規模の生産では、融合タンパク質を生産するのに必要な経費および時間が削減される。
【表１】
2009523459.tif 000002
【表２】
2009523459.tif 000003
【０２８３】
実施例３：タンパク質の溶解性
ＶＨＤＵＭ−１で示されるＶＨ可変ドメインを、４コピーのこの可変ドメインを含有するＩｇＧ分子の形態で発現させた。３つの分子の溶解性を比較した。これらの分子のうちの２つは、ＶＨＤＵＭ−１とＣκとの間に非天然の連結部を有し、１つのドメインは、ＶＨＤＵＭ−１とＣκとの間に天然の連結部を有していた。
【０２８４】
カバット番号        100             109
非天然の連結部１：  FDYWGQGTLVTVSS__TVAAPS
非天然の連結部２：  FDYWGQGTLVTVSS_RTVAAPS
天然の連結部：      FDYWGQGTKVEIK R TVAAPS
各連結部に対して融合部位に下線が付されている。
【０２８５】
プロテインＧ樹脂からの溶出および中和を行った後、非天然の連結部（配列番号５２５）を有するＩｇＧを用いたときは強力な沈殿が観測されたが、非天然の連結部２（配列番号５２６）を有するＩｇＧを用いたときおよび天然の連結部（配列番号５２７）を有するＩｇＧを用いたときは痕跡量の沈殿が観測されたにすぎなかった。中和（１００ｍＭグリシン、１３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８）の後で溶液中に残存する可溶性タンパク質の濃度は、非天然の連結部１を有するＩｇＧを用いたときは０．１６ｍｇ／ｍＬ、非天然の連結部２を有するＩｇＧを用いたときは１．３７ｍｇ／ｍＬ、および天然の連結部を有するＩｇＧを用いたときは１．２０ｍｇ／ｍＬであった。非天然の連結部１を有するＩｇＧは、１００ｍＭグリシン、１３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中において、他のＩｇＧよりも有意に低い溶解性を有することがデータから実証された。この結果から、ＶκドメインとＣκドメインとの間の天然の連結部の部分である残基Ｌ１０８（Ａｒｇ）は、試験されたＩｇＧの構造および溶解性に重要な役割を果たすことが示唆された。この残基は、ヒトにおいてＪκエキソンにより部分的にコードされかつＣκエキソンにより部分的にコードされ、非天然の連結部１を有する貧溶性ＩｇＧ中には不在であった。溶解性に差異が観測されたことから、Ｖκ（残基Ｌ９９〜Ｌ１０２）とＶＨ（残基Ｈ１０４〜Ｈ１０７）との間で保存されるＧｌｙＸａａＧｌｙＴｈｒ（配列番号３８６）モチーフにドメイン融合部位を移動することにより、保存モチーフの下流のＪκエキソンによりコードされる残存する構造上重要なＶκ残基を保持することの利点が実証された。
【０２８６】
実施例４：ＤＯＭ１５／１６インライン融合体のクローニング、発現、および特徴付け
単一ポリペプチド鎖中に抗ＶＥＧＦＲ ｄＡｂおよび抗ＥＧＦＲ ｄＡｂを含有する融合ポリペプチドに、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲに結合するドメイン抗体を組み込んだ。融合ポリペプチドのいくつかは、抗体Ｆｃ領域（ヒトＩｇＧ１の−ＣＨ２−ＣＨ３）をも含んでいた。クローニングされかつ発現された融合ポリペプチドの特定の例としては、ＴＡＲ１５−１０をＤＯＭ１６−３９−２０６およびＦｃに融合させたもの、ＤＯＭ１６−３９−２０６をＴＡＲ１５−１０およびＦｃに融合させたもの、ＤＯＭ１６−３９−２０６をＴＡＲ１５−２６−５０１およびＦｃに融合させたもの、ＴＡＲ１５−２６−５０１をＤＯＭ１６−３９−２０６およびＦｃに融合させたもの、ＴＡＲ１５−１０をＤＯＭ１６−３９−２０６に融合させたもの、ＤＯＭ１６−３９−２０６をＴＡＲ１５−１０に融合させたもの、ＤＯＭ１６−３９−２０６をＴＡＲ１５−２６−５０１に融合させたもの、およびＴＡＲ１５−２６−５０１をＤＯＭ１６−３９−２０６に融合させたものが挙げられる。以上の融合の位置は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に融合タンパク質中に出現するように列挙されている。接頭辞ＴＡＲまたはＤＯＭを用いて参照されるポリペプチドは、抗体可変ドメインである。
【０２８７】
標準的方法を用いて、ｄＡｂをコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅し、発現ベクター中にクローニングした。ピキア（Pichia）中（Ｆｃ領域を含有していない融合体）またはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中（Ｆｃ領域を含有する融合体）で発現ベクターを発現させることにより、インライン融合ポリペプチドを産生させた。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（Ｆｃタグ付き）発現構築物およびピキア（Pichia）発現構築物に対して、それぞれ、ストリームラインプロテインＡ樹脂およびストリームラインプロテインＬ樹脂を用いて、インライン融合体をバッチ結合させてアフィニティー精製した。
【０２８８】
Ｆｃを含有するいくつかの融合体の部分は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に融合タンパク質中に出現するように表３に列挙されている。したがって、左から右の方向に表を読み取ることにより、融合タンパク質の構造を理解することが可能である。表３に提示された第１の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、ＤＯＭ１５−１０−−リンカー１−−ＤＯＭ１６−３９−２０６−−リンカー２−−Ｆｃの構造を有する。
【０２８９】
インライン融合体をトリプシンによるタンパク質分解に付することにより、一般的なロバスト性および耐分解性を試験した。二重特異性リガンドとトリプシンとの溶液（１／２５（ｗ／ｗ）トリプシン対リガンド）を調製し、３０℃でインキュベートした。０分（すなわち、トリプシンの添加前）、６０分、１８０分、および２４時間の時点でサンプルを採取した。所与の時間点で、ＰＡＧＥ充填染料と共に２×最終濃度で完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅコード：11 836 145 001）を添加することにより反応を停止させ、続いて、液体窒素中でサンプルをフラッシュ凍結させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサンプルを分析し、タンパク質バンドを可視化して融合体のプロテアーゼ分解の時間コースを明らかにした。
【０２９０】
これらの実験から、Ｖκのカルボキシ末端アミノ酸とＣκのアミノ末端アミノ酸とを含有する「天然の」リンカー（ＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ（配列番号５２８）を有するインライン融合体は、タンパク質分解を受けやすく１０分の時間点で分解が顕在化することが明らかにされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ｄＡｂ間のリンカーおよびｄＡｂとＦｃとの間のリンカーで分解が起こることが判明した。
【０２９１】
トリプシンによる切断点でありかつ天然のリンカー中に豊富に含まれるＬｙｓおよびａｒｇ残基をより少量含有する新しいリンカーをデザインした。工学的に作製されたリンカー（ＬＶＴＶＳＳＡＳＴ（配列番号５２９））または（ＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５３０））を含有する融合体は、トリプシンタンパク質分解に対してかなり改良された耐性を示した。
【０２９２】
工学的に作製されたリンカーを含有するインライン融合体の効力を評価するために、追加の結合アッセイを行った。その結果、工学的に作製されたリンカーは、効力に対してなんら実質的な有害作用を及ぼさないことが判明した。
【表３】
2009523459.tif 000004
【０２９３】
実施例５．工学的に作製された追加のリンカー
プロテアーゼ感受性を低減させるために、ＩｇＧ様形態の軽鎖上に発現されるＶκｄＡｂのＣ末端領域にいくつかのデザインされた突然変異を導入した。「天然のリンカー」は、Ｖκのカルボキシ末端アミノ酸およびＣｋのアミノ末端アミノ酸を含有するＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ（配列番号５３１）であった。生理的ｐＨで正に荷電されない最も保存的な置換で天然のリンカー中の正荷電残基の一部もしくは全部を置き換えるアミノ酸置換を用いて、変異体リンカー１〜３をデザインした。天然のリンカー中のアルギニン残基は、ＣＬドメイン内にイオン性相互作用を生じるので、それほど改変に適していないと思われる。
【０２９４】
変異体リンカー１（ＧＱＧＴＮＶＥＩＮＲＴＶＡＡＰＳ（配列番号５３２））では、天然のリンカー中のリシンが両方ともアスパラギンで置換されている。変異体リンカー１および天然のリンカー中のアルギニンがグルタミンに追加的に変更されている変異体リンカー２（ＧＱＧＴＮＶＥＩＮＱＴＶＡＡＰＳ（配列番号５３３））では、リンカー中にＮ−グリコシル化部位（ＮｘＴ）が導入されている。変異体リンカー１または変異体リンカー２を含有するＩｇＧ様形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、軽鎖は、Ｎ−グリコシル化事象に適合するより高分子量を有することが明らかにされた。変異体リンカー３（ＧＱＧＴＮＶＥＩＱＲＴＶＡＡＰＳ（配列番号５３４）では、Ｎ−グリコシル化部位が除去され、天然のリンカー中の所定の位置のアルギニンが残存されている。変異体リンカー４（ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＴＶＡＡＰＳ（配列番号５３５））では、Ｖκドメインの６つのＣ末端アミノ酸がＶＨドメイン由来の対応する残基で置き換えられており、正電荷が含まれない。
【０２９５】
変異体リンカー１〜４を含有するＩｇＧ様形態のプロテアーゼ耐性（実施例４に記載されるように評価されるトリプシン耐性）から、工学的に作製された変異体リンカーを含有するＩｇＧ様形態は、天然のリンカーを含有するＩｇＧ様形態よりもプロテアーゼ耐性であることが判明した。
【０２９６】
実施例６：ＤＯＭ９／１０インライン融合体のクローニング、発現、および特徴付け
Ａ．融合タンパク質
抗ＩＬ−４および抗ＩＬ−１３二重特異性二量体のクローニングおよび産生
Ｃ末端システインを有するインライン融合タンパク質をコードする構築物が形成されるように、抗ＩＬ−４ ｄＡｂ ＤＯＭ９−１１２および抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ ＤＯＭ１０−５３−３４３をコードする核酸をクローニングした。アミノ酸配列ＡＳＴは、２つのｄＡｂ間に存在した。この配列は、天然の抗体中に存在する天然のＣＨ配列である。構築物をピキア・パストリス（Pichia pastoris）ベクターｐＰＩＣＺα（Invitrogen）中にクローニングした。エレクトロコンピテント細胞（Ｘ−３３またはＫＭ７１Ｈ）を構築物でトランスフォームし、形質転換体を１００μｇ／ｍｌゼオシンで選択した。ＯＤ６００が約１５〜２０に達するまで、ＢＭＧＹ培地上、３０℃、２５０ｒｐｍで、５００ｍｌ培養物を２４時間増殖させた。次に、細胞を遠心沈降させ、そしてＢＭＭＹ培地（０．５％（ｖ／ｖ）メタノールを含有する）中に再懸濁させてタンパク質発現を誘導した。２５０ｒｐｍで振盪しながら培養物を３０℃に維持した。２４時間間隔で、５０％メタノール溶液を用いてメタノール濃度を次のように漸進的に増加させて培養物に供給した｛１％、１．５％、および２％（ｖ／ｖ）｝。次に、培養物を遠心分離により採取し、発現されたタンパク質を含有する上清を必要になるまで４℃で貯蔵した。標準的精製プロトコルを用いてＰｒＡストリームラインにより上清からタンパク質を精製した。
【０２９７】
ＰｒＡ精製タンパク質は、二量体種および単量体種の両方を含有することがわかった。したがって、クロマトフォーカシングを用いて２種のタンパク質を分離した。６→４のｐＨグラジエントを用いてＭｏｎｏ Ｐ ５／２０カラム（GE Healthcare）を分離に使用した。使用するポリバッファーを製造業者の説明に従って６→４のｐＨ範囲にした。ｐＨ６でサンプルを適用し、そして３５カラム体積を超える１００％緩衝液Ｂを１ｍｌ／ｍｉｎで流動させて使用することによりｐＨグラジエントを形成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて二量体を含有する画分を同定し、ＰＥＧ化に供すべくプールした。
【０２９８】
次に、以上に概説した方法により４０Ｋ ＰＥＧ２−ＭＡＬを用いてタンパク質をＰＥＧ化した。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて＞９５％の純度まで、この材料を精製した。得られた二重特異性リガンド（ＰＥＧ化ＤＯＭ９−１１２（ＡＳＴ）ＤＯＭ１０−５３−３４４）の効力をＩＬ−４ ＲＢＡおよびＩＬ−１３ ＲＢＡにより測定した。二重特異性リガンドの抗ＩＬ−４アームの効力（１３ｎＭ）は、ｄＡｂ ＤＯＭ９−１１２単量体の効力（３．５ｎＭ）と比較してわずかに低減されたが、抗ＩＬ−１３アームの効力は保持された（二重特異性リガンドでは３１０ｐＭであったのに対してｄＡｂ単量体では２３０ｐＭであった）。
【０２９９】
２つのｄＡｂ間に存在するアミノ酸配列ＡＳＴＫＧＰＳ（配列番号５３５）（この配列は、天然の抗体中に存在するＣＨ配列の開始部である）を有するインライン融合体として、抗ＩＬ−４および抗ＩＬ−１３ ｄＡｂ ＤＯＭ９−１１２およびＤＯＭ１０−５３−３４４を同様にクローニングした。得られた精製済みの二重特異性リガンド（ＤＯＭ９−１１２（ＡＳＴＫＧＰＳ）ＤＯＭ１０−５３−３４４）の効力をＩＬ−４ ＲＢＡおよびＩＬ−１３サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。抗ＩＬ−４アームの効力（約１ｎＭ）は保持されたが、抗ＩＬ−１３アームの効力は、ｄＡｂ単量体と比較してごくわずかに低減された（ｄＡｂ単量体では４０ｐＭであったのに対して二重特異性リガンドでは１２０ｐＭであった）。
【０３００】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する追加の二重標的化インライン融合体
ＩＬ４およびＩＬ１３結合性ｄＡｂの二重標的化インライン融合体の挙動をさらに理解するために、一連の新しいインライン融合体およびインライン融合体ライブラリーを構築した。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のトリプレット残基を多様化するライブラリーを用いて、ファージディスプレイにより、ＤＯＭ１０−５３系列をアフィニティー成熟させた。ライブラリーをファージベクター中にクローニングし、ｇｅｎｅ３タンパク質と（ｄＡｂ１リンカーｄＡｂ２）インライン融合体との融合タンパク質として提示させた。ここで、ｄＡｂ１は、ＤＯＭ９−１１２−２１０であり、リンカーは、アミノ酸残基ＡＳＴＫＧＰＳ（配列番号５３５）であり、かつｄＡｂ２は、ＤＯＭ１０−５３ライブラリーである。本質的には以上に記載したように、選択方法、Ｅ．コリ（E coli）中へのサブクローニングおよび発現、ならびにスクリーニング方法を実施したが、ただし、単一のｄＡｂの代わりにインライン融合構築物を使用した。生成物をベクターｐＤＯＭ５中にクローニングし、プロテインＡ被覆ビアコアチップに結合させることにより発現の改良に関して発現上清をスクリーニングした。
【０３０１】
改良された発現レベルを有するインライン融合体を発現させ、精製し、ＩＬ−１３サンドイッチＥＬＩＳＡおよび細胞アッセイで試験した。いくつかの変異体を選択した（たとえば、ＤＯＭ９−１１２−２１０−ＡＳＴＫＧＰＳ−ＤＯＭ１０−５３−５６６）。最も効力のあるクローンは、ＤＯＭ１０−５３−５３１およびＤＯＭ１０−５３−５４６であった（表４参照）。これらのクローンからさまざまなタンパク質調製物を作製し、これらを以上に記載されるＩＬ−４ ＲＢＡおよびＩＬ−１３サンドイッチアッセイで試験した。
【表４】
2009523459.tif 000005
【０３０２】
ＡＳＴＫＧＰＳ（配列番号５３５）であるか（第１のｄＡｂがＶｈであるとき）またはＴＶＡＡＰＳ（配列番号５３６）であるか（第１のｄＡｂがＶκであるとき）のいずれかであるｄＡｂリンカーをコードするＤＮＡ断片のＳＯＥ ＰＣＲにより、さらなるインライン融合体を構築した。このＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化し、Ｅ．コリ（E. coli）発現ベクターｐＤＯＭ５中にライゲートした。ＭＡＣＨ１（Invitrogen）細胞中にトランスフォームした後、クローンの配列を確認し、インライン融合体を発現させた。Ｏｎｅｘが添加された２ＴＹ培地（Novagen）中３０℃でＥ．コリ（E. coli）を二晩増殖させることにより発現を実施し、細胞を遠心分離し、上清をプロテインＬ樹脂またはプロテインＡ樹脂のいずれかと共にインキュベートした。樹脂から溶出させた後、生成されたインライン融合体産物の質および量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。形成された産物の大部分は、ごく限られた遊離単量体を含むインライン融合体の分子質量を有していた。したがって、追加の精製工程は必要でなかったので、材料を直接試験することが可能であった。
【０３０３】
以上に記載の方法を用いて、以下のＩＬ−４／ＩＬ−１３インライン融合体を発現させ、精製し、そして特徴付けた：
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-208
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-212
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-213
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-215
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-224
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-270
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-416
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-236
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-273
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-275
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-276
DOM9-112-210 - ASTKGPS - DOM10-277
DOM10-208 - TVAAPS - DOM9-155-78
DOM10-212 - TVAAPS - DOM9-155-78
DOM10-213 - TVAAPS - DOM9-155-78
DOM10-215 - TVAAPS - DOM9-155-78
DOM10-224 - TVAAPS - DOM9-155-78
DOM10-270 - TVAAPS - DOM9-155-78
DOM10-416 - ASTKGPS - DOM9-155-78
DOM10-236 - ASTKGPS - DOM9-155-78
DOM10-273 - ASTKGPS - DOM9-155-78
DOM10-275 - ASTKGPS - DOM9-155-78
DOM10-276 - ASTKGPS - DOM9-155-78
DOM10-277 - ASTKGPS - DOM9-155-78
精製後、発現レベルを測定し（ｍｇ／ｌ）、ＩＬ−４結合に関してはＲＢＡでおよびＩＬ−１３結合に関してはサンドイッチＥＬＩＳＡで活性を試験した。列挙された可変ドメインのアミノ酸配列は、ＩＬ−４／ＩＬ−１３に結合するリガンドという名称でDomantis Limitedにより２００７年１月２４日に英国受理官庁に出願された国際特許出願に開示されている。この国際特許出願は、天然の連結部を含有する融合タンパク質を作製するのに使用可能な可変ドメインの例を提供する目的で参照により本明細書に組み入れられるものとする。以下の表（表５）は、これらのインライン融合体に対するデータをまとめたものである：
【表５】
2009523459.tif 000006
【０３０４】
さらに、ＤＯＭ９−１１２−２１０およびＤＯＭ９−１５５−７８の両方と対をなすように、ＤＯＭ１０−２７５のアフィニティー成熟変異体、すなわち、ＤＯＭ１０−２７５−１をとくに選択した。これらのインライン融合体を構築し、天然のリンカーを用いて以上に記載のように発現させた。記載のＩＬ−４ ＲＢＡおよびＩＬ−１３サンドイッチＥＬＩＳＡによる試験に加えて、これらのインライン融合体をＴＦ−１細胞増殖アッセイにより機能に関しても試験した。これらのアッセイでは、一定量のＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかと共にｄＡｂをプレインキュベートし、この混合物をＴＦ−１細胞に添加し、そして細胞を７２時間インキュベートした。このインキュベーションの後、細胞増殖のレベルを測定した。このアッセイの結果は、以下の（表６）にまとめられており、インライン融合体の両方のアームが細胞アッセイで活性であること示している。
【表６】
2009523459.tif 000007
【表７】
2009523459.tif 000008
【表８】
2009523459.tif 000009
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【表９】
2009523459.tif 000011
【０３０５】
表７〜９中、右側の欄で参照されている非天然の定常ドメインは、２つのＶκ可変ドメインを含むＩｇＧではＣＨ（ＩｇＧ１）であり、２つのＶＨ可変ドメインを含むＩｇＧではＣκまたはＣλ２のいずれかである。ＩｇＧ ５０では、定常ドメイン配列は両方とも非天然である。なぜなら、これは、配列ＫＶＥＩＫＲを介してＣκに融合されたＶＨ可変ドメインと、配列ＬＶＴＶＳＳを介してＣＨ（ＩｇＧ１）に融合されたＶκ可変ドメインとを有するインサイドアウトＩｇＧであったからである。
【０３０６】
非天然の定常ドメインの配列：
ＣＨ（ＩｇＧ１）（配列番号５１７）：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ＣＫ（配列番号５１８）：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ＣＬ２（配列番号５１９）：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
本明細書に引用されているすべての特許、公開出願、および参考文献の教示は、それらの全体が参照により組み入れられるものとする。
【０３０７】
例示的実施形態を参照しながら本発明について特定的に提示および説明を行ってきたが、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく本明細書において形態および細部にさまざまな変更を加えうることは、当業者であればわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１Ａ】図１Ａは、典型的なヒトＦａｂ’フラグメントの構造を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、典型的なヒトＦａｂ’フラグメント中の５つの残基（ＶＨ中の３つの高度保存残基（Ｈ１１［ＬｅｕまたはＶａｌ］、Ｈ１１０［Ｔｈｒ］、およびＨ１１２［Ｓｅｒ］）ならびにＣＨ１中の２つの高度保存残基（Ｈ１４８［Ｐｈｅ］およびＨ１４９［Ｐｒｏ］））のクラスターを示している。このクラスターは、免疫グロブリン中においてＣκ−ＣＨ１ドメインに対してＶκ−ＶＨドメインの配向を変化させるある程度の制御された可撓性を提供する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、典型的なヒトＦａｂ’フラグメントのＶκドメインとＣκドメインとの間にみられる典型的な相互作用を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒト抗体およびヒトＴＣＲのＪセグメント中のアミノ酸配列のアライメントであり、保存モチーフを示している。アライメントされたアミノ酸配列は、ヒトＩｇＨ Ｊセグメント（配列番号１〜６）、ヒトＩｇκ Ｊセグメント（配列番号７〜１１）、ヒトＩｇλ Ｊセグメント（配列番号１２〜１８）、ヒトＴＣＲβ Ｊセグメント（配列番号１９〜３２）、ヒトＴＣＲγ Ｊセグメント（配列番号３３〜３７）、ヒトＴＣＲδ Ｊセグメント（配列番号３８〜４１）、およびヒトＴＣＲαセグメント（配列番号４２〜９８）に由来する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒト抗体およびヒトＴＣＲのＪセグメント中のアミノ酸配列のアライメントであり、保存モチーフを示している。アライメントされたアミノ酸配列は、ヒトＩｇＨ Ｊセグメント（配列番号１〜６）、ヒトＩｇκ Ｊセグメント（配列番号７〜１１）、ヒトＩｇλ Ｊセグメント（配列番号１２〜１８）、ヒトＴＣＲβ Ｊセグメント（配列番号１９〜３２）、ヒトＴＣＲγ Ｊセグメント（配列番号３３〜３７）、ヒトＴＣＲδ Ｊセグメント（配列番号３８〜４１）、およびヒトＴＣＲαセグメント（配列番号４２〜９８）に由来する。
【図３】図３は、種々の種由来の抗体重鎖（ＩｇＨ）Ｊセグメント中の保存モチーフを示している。マウスＩｇＨ Ｊセグメント（配列番号９９〜１０２）、ラマＩｇＨ Ｊセグメント（配列番号１０３〜１０７）、ヒツジＩｇＨ Ｊセグメント（配列番号１０８〜１１３）、およびブタＩｇＨ Ｊセグメント（配列番号１１４）のアミノ酸アライメントが示されている。
【図４】図４は、種々の種由来の抗体κ鎖（Ｉｇκ）Ｊセグメント中の保存モチーフおよび種々の種由来の抗体λ鎖（Ｉｇλ）Ｊセグメント中の保存モチーフを示している。マウスＩｇκ Ｊセグメント（配列番号１１５〜１１９）およびＩｇλ Ｊセグメント（配列番号１２６〜１３０）、オポッサムＩｇκ Ｊセグメント（配列番号１２０〜１２１）およびＩｇλ Ｊセグメント（配列番号１３１〜１３３）、ならびにヒツジＩｇκ Ｊセグメント（配列番号１２２〜１２５）およびＩｇλ Ｊセグメント（配列番号１３４）のアミノ酸配列アライメントが示されている。
【図５】図５は、マウス抗体定常ドメイン中の保存モチーフを示している。アミノ酸配列アライメントは、マウスＩｇのＣＨ１領域（配列番号１３５〜１４３）中、ＣＨ２領域（配列番号１４４〜１５１）中、ＣＨ３領域（配列番号１５２〜１６０）中、ヒンジ領域（配列番号１６１〜１７１）中、Ｃκ領域（配列番号１７２〜１７３）中、およびＣλ領域（配列番号１７４〜１７６）中の保存モチーフを示している。
【図６】図６は、ヒト抗体定常ドメイン中の保存モチーフを示している。アミノ酸配列アライメントは、ヒトＩｇのＣＨ１領域（配列番号１７７〜１８５）中、ＣＨ２領域（配列番号１８６〜１９４）中、ＣＨ３領域（配列番号１９５〜２０３）中、ヒンジ領域（配列番号２０４〜２１０）中、Ｃκ領域（配列番号２１１）中、およびＣλ領域（配列番号２１２〜２１６）中の保存モチーフを示している。
【図７】図７は、ラクダ抗体定常ドメイン中およびヒトＴＣＲ定常ドメイン中の保存モチーフを示している。アミノ酸配列アライメントは、ラクダ抗体のＣＨ１領域（配列番号２１７）中、ＣＨ２領域（配列番号２１８〜２１９）中、ＣＨ３領域（配列番号２２０〜２２１）中、およびヒンジ領域（配列番号２２２〜２２３）中の保存モチーフを示している。いくつかのヒトＴＣＲ定常ドメインのアライメントもまた、示されている（配列番号２２４〜２３０）。
【図８】図８は、ナースシャーク重鎖（ＩｇＨ）Ｊセグメント（配列番号２３１〜２８２）中およびナースシャークＩｇＩ Ｊセグメント（配列番号２８３〜２８８）中の保存モチーフを示している。
【図９Ａ】図９Ａは、マウスＴＣＲ Ｊセグメント中の保存モチーフを示している。マウスＴＣＲα Ｊセグメント（配列番号２８９〜３３８）、マウスＴＣＲβ Ｊセグメント（配列番号３３９〜３５１）、およびマウスＴＣＲδ Ｊセグメント（配列番号３５２〜３５３）のアミノ酸配列アライメントが示されている。
【図９Ｂ】図９Ｂは、マウスＴＣＲ Ｊセグメント中の保存モチーフを示している。マウスＴＣＲα Ｊセグメント（配列番号２８９〜３３８）、マウスＴＣＲβ Ｊセグメント（配列番号３３９〜３５１）、およびマウスＴＣＲδ Ｊセグメント（配列番号３５２〜３５３）のアミノ酸配列アライメントが示されている。
【図１０Ａ】図１０Ａは、いくつかのラクダ科動物ＶＨＨのアミノ酸配列（配列番号３５４〜３８３）のアライメントであり、ＶＨＨ中に存在する保存モチーフ（＊が付されている）を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、いくつかのラクダ科動物ＶＨＨのアミノ酸配列（配列番号３５４〜３８３）のアライメントであり、ＶＨＨ中に存在する保存モチーフ（＊が付されている）を示している。
【図１１】図１１は、ヒトＤＰ−４７可変ドメインの生殖系列アミノ酸配列（配列番号３８４）およびラクダ科動物ＶＨＨ＃１２Ｂ可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３８５）のアライメントである。アライメントは、ＦＲ１中に４アミノ酸の差異（位置１、５、２８、および３０）、ＦＲ３中に５アミノ酸の差異（位置７４、７６、８３、８４、および９３）が存在し、かつ配列中に保存されたアミノ酸モチーフが存在することを明確に示している。
【図１Ａ】
2009523459.tif 000012
【図１Ｂ】
2009523459.tif 000013
【図１Ｃ】
2009523459.tif 000014
【図２Ａ】
2009523459.tif 000015
【図２Ｂ】
2009523459.tif 000016
【図３】
2009523459.tif 000017
【図４】
2009523459.tif 000018
【図５】
2009523459.tif 000019
【図６】
2009523459.tif 000020
【図７】
2009523459.tif 000021
【図８】
2009523459.tif 000022
【図９Ａ】
2009523459.tif 000023
【図９Ｂ】
2009523459.tif 000024
【図１０Ａ】
2009523459.tif 000025
【図１０Ｂ】
2009523459.tif 000026
【図１１】
2009523459.tif 000027
【国際調査報告】
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