(57)【要約】  本発明は、アンモニアトランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、アンモニア資化能の高い醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアンモニアトランスポーターであるMEP1pをコードする遺伝子MEP1、特にビール酵母に特徴的なnonScMEP1遺伝子、またはScMEP1遺伝子の発現量を制御することによって、アンモニア資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i) からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
以下の(j)〜(l)のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
以下の(m)〜(q)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(m) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(n)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(o) 請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(p)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;及び
(q)下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド、下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド、下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；又は下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;
(q1)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(q2)配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(q3))配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１１】
請求項７、８又は１０に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項１２】
請求項７又は８に記載のベクターを導入することによって、アンモニア資化能が向上した請求項１１に記載の酵母。
【請求項１３】
（A）請求項１０に記載のベクターを導入することによって、（B）請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）；(q1)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；(q2)配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は(q3))配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに係る遺伝子を破壊することによって、あるいは(C) プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）及び上記（q1）〜(q3)から選択されるポリヌクレオチドの発現を抑制するようにした酵母。
【請求項１４】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時にアンモニア資化能が向上した請求項１２に記載の酵母。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
醸造する酒類がワインである請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１９】
配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアンモニア資化能について評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアンモニア資化能を評価する方法。
【請求項２１】
被検酵母を培養し、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするアンモニア資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1又は配列番号：３の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは低発現である被検酵母を選択する、請求項２１記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、請求項２１に記載の酵母の選択方法。
【請求項２４】
請求項１１〜１４に記載の酵母および請求項２１〜２３に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、アンモニアおよびアミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニアトランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、アンモニア資化性に優れた醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のアンモニアトランスポーターであるMep1pをコードする遺伝子MEP1、特にビール酵母に特徴的なnonScMEP1遺伝子、またはScMEP1遺伝子の発現量を制御することによって、アンモニア資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アンモニアやアミノ酸は、酵母の増殖に必要な窒素源であることが知られている。醸造においても、原料に含まれるアンモニアやアミノ酸が酵母増殖のための窒素源として資化される。
一般にアミノ酸は酒類の呈味成分として重要であり、品質を左右する重要な要素であることが知られている。そのため、目的の酒質にあわせてアミノ酸の量をコントロールする事は、新しいタイプの酒類の開発において重要である。例えば、酒のアミノ酸含有量を増加させることにより、味にうまみやコクを付加させることができる。
しかしながら、上述のようにアミノ酸はアンモニアと共に発酵中に酵母によって窒素源として資化されるため、発酵終了時のアミノ酸の含有量をコントロールする事はきわめて困難である。
酵母が細胞外のアミノ酸やアンモニアを窒素源として利用するためには、アミノ酸やアンモニアを菌体内に取り込むことが必須である。このようなアミノ酸やアンモニアの取り込みには酵母の細胞膜に存在するアンモニアトランスポーターやアミノ酸トランスポーターが関与していることが明らかとなっている。
【０００３】
酵母のアンモニアトランスポーターとしては基質に対する親和性の異なる3つのトランスポーター（Mep1, Mep2, Mep3）が知られており(非特許文献１：Mol Cell Biol 17:4282-93, 1997)、アミノ酸のトランスポーターとしては基質特異性の低いGap1や基質特異性の異なる多くのアミノ酸トランスポーター(アルギニントランスポーターCan1、プロリントランスポーターPut4等（非特許文献２：Curr Genet 36:317-28, 1999)が知られている。
これまでに、酒類中のアミノ酸含量をコントロールするためにアミノ酸の取り込みに関与する遺伝子(gap1,shr3,can1, put4, uga4)の変異を有する酵母を用いた例(特許文献１：特開2001-321159号公報)が報告されている。
【非特許文献１】Mol Cell Biol 17:4282-93, 1997
【非特許文献２】Curr Genet 36:317-28, 1999
【特許文献１】特開2001-321159号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のような状況下、酒類の製造において、酒類のアミノ酸含量を制御させるために、アミノ酸の資化が制御された酵母が望まれていた。しかしながら、酒類に残存するアミノ酸量を制御するためには、アミノ酸以外の窒素源の資化量を制御する必要がある。そこでアンモニアの資化が制御され、アミノ酸の資化が制御された酵母が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母からアンモニアトランスポーターをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、アンモニア資化が促進されることを確認して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビール酵母に存在するアンモニアトランスポーター遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００６】
（１）以下の(a)〜(ｆ) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００７】
（２）以下の(g)〜(i) からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００８】
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７a）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子
の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（８）  以下の(j)〜(l)のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【０００９】
（９）以下の(m)〜(q)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(m) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(n) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(o) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(p) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;及び
(q)下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド、下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド、下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；又は下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;
(q1)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(q2)配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(q3)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１０】
（１０）上記（９）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（１１）  上記（７）、（７a）、（８）又は（１０）に記載のベクターが導入された酵母。
（１２）上記（７）、（７a）又は（８）に記載のベクターを導入することによって、アンモニア資化能が向上した上記（１１）に記載の酵母。
（１３）（A）上記（１０）に記載のベクターを導入することによって、（B）上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）；(q1)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；(q2)配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は(q3))配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに係る遺伝子を破壊することによって、あるいは(C) プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）及び上記（q1）〜(q3)から選択されるポリヌクレオチドの発現を抑制するようにした酵母。
（１４）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時にアンモニア資化能が向上した上記（１２）に記載の酵母。
【００１１】
（１５）上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１７）醸造する酒類がワインである上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１８）上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１９）配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアンモニア資化能について評価する方法。
（１９a）上記（１９）に記載の方法によって、アンモニア資化能が向上した酵母を選別する方法。
（１９b）上記（１９a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を選別する方法。
（２０）被検酵母を培養し、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアンモニア資化能を評価する方法。
（２０a）上記（２０）に記載の方法で、被検酵母を評価し、アンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が高いあるいは低い酵母を選別する、アンモニア資化能が向上したあるいは低下した酵母を選別する方法。
（２０b）上記（２０a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１２】
（２１）被検酵母を培養し、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするアンモニア資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１ａ）被検酵母を培養して、アンモニア資化能またはアンモニアトランスポーター活性を測定し、目的とするアンモニア資化能の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1又は配列番号：３塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは低発現している被検酵母を選択する、上記（２１）記載の酵母の選択方法。
（２３）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多いあるいは少ない被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。
（２４）上記（１１）〜（１４）に記載の酵母および上記（２１）〜（２３）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、アンモニアおよびアミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、アンモニアの資化が制御され、アミノ酸の資化が制御されるため、酒中のアミノ酸含有量を制御させることができ、香味が調節された酒類の製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、酵母のアンモニアトランスポーターの活性を増大させることによって、さらに効率よくアンモニアを資化させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のアンモニアトランスポーターをコードするnon-ScMEP1遺伝子を単離・同定した。この塩基配列を配列番号：１に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
さらに、ビール酵母特有のアンモニアトランスポーターをコードするScMEP1遺伝子も単離・同定した。この塩基配列を配列番号：３に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００１５】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のアンモニアトランスポーターをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００１６】
このようなタンパク質としては、配列番号：２のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００１７】
なお、アンモニアトランスポーター活性は、例えば（Mol Cell Biol 17:4282-93, 1997）に記載の方法によって測定することができる。
【００１８】
また、本発明は、(e)配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００１９】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１又は配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２０】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。
【００２１】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２２】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad． Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２３】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(m) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (n) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (o) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (p) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;  (q)下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド、下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド、下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び下記（q1）、（q2）もしくは（q3）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;
(q1)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(q2)配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(q3))配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(l)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記ポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
【００２４】
本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。
【００２５】
本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００２６】
本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
【００２７】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(e)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２８】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；  C群：アスパラギン、グルタミン；  D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；  E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；  F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；  G群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２９】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(q)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(ｘ)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(ｙ)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(q)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(ｚ)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(m)〜(q)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記ポリヌクレオチド（DNA）の発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。
また、本発明においてはプロモーターに変異を加えることによって、あるいはプロモーターを相同組み換えによって組み換えることによってターゲット遺伝子の発現量を制御することもできる。このような変異の導入方法はNucleic Acids Res. 29、 4238-4250（2001）に、また、プロモーターの変換による遺伝子の発現制御方法は、例えば、Appl Environ Microbiol.,72,5266-5273 (2006)に記載されている。
【００３０】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
【００３１】
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
【００３２】
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３３】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによってアンモニア含有量が制御された、アミノ酸含有量が制御された酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でアンモニア含量を高くした酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、アンモニアの生成量を調節（増加又は低減）することによって、所望の酒類で、かつアンモニア含量が調節（増加又は低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
【００３５】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のアンモニア資化能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、アンモニアトランスポーター遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００３６】
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
【００３７】
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のアンモニア資化能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のアンモニア資化能を評価することもできる。なお、アンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、アンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の転写産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。なお、被検酵母を培養した際に得られる発酵液中のアミノ酸濃度を測定することによって、その被検酵母における上記遺伝子の発現量を予測することも可能である。
【００３８】
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を測定し、目的とするアンモニアトランスポーター活性に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有するアンモニアトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母株を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
あるいは、被検酵母を培養して、アンモニアトランスポーター活性の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
【００３９】
これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。アンモニアトランスポーター活性は、例えば（Mol Cell Biol 17:4282-93, 1997）に記載の方法によって評価することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、EMS（エチルメタンスルホネート）、N-メチル-N-ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法39  酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス  パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエ及びサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス  パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母  清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：アンモニアトランスポーター（nonScMEP1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有のアンモニアトランスポーター遺伝子、nonScMEP1を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScMEP1_F（配列番号：５）／nonScMEP1_R（配列番号：６）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記することがある）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScMEP1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたnonScMEP1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScMEP1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４２】
実施例２：ビール試醸中のnonScMEP1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度    12.69％
麦汁容量          70L
麦汁溶存酸素濃度  8.6ppm
発酵温度          15℃
酵母投入量        12.8×106cells/mL
【００４３】
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図1）、外観エキス濃度（図2）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、特開2004-283169に記載のビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScMEP1遺伝子の発現パターンを図3に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScMEP1遺伝子が発現していることを確認した。
【００４４】
実施例３：nonScMEP1高発現株の作製
実施例１に記載のnonScMEP1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScMEP1高発現ベクターnonScMEP1/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００４５】
実施例４：ビール試験醸造におけるアンモニアおよびアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例3で得られたnonScMEP1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度      12%
麦汁容量            1L
麦汁溶存酸素濃度    約 8ppm 
発酵温度            15℃一定
酵母投入量          5g湿酵母菌体／L麦汁
【００４６】
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）(図４)、エキス消費量(図５)、アンモニア (図６)、遊離アミノ態窒素（FAN）(図７)の経時変化を調べた。図６に示すようにnonScMEP1高発現株では親株に比べてアンモニアの資化が促進され、図７に示すように遊離アミノ態窒素（FAN）の資化は抑制されていた。その結果、表1に示すように、nonScMEP1高発現株では発酵終了後のビール中の総アミノ酸量は増加しており、アンモニアの量は減少していた。
【００４７】
【表１】
2009527219.tif 000002
【００４８】
実施例５：アンモニアトランスポーター（ScMEP1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有のアンモニアトランスポーター遺伝子、ScMEP1を見出した（配列番号：３）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーScMEP1_F（配列番号：７）／ScMEP1_R（配列番号：８）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってScMEP1の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。
上記のようにして得られたScMEP1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ScMEP1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４９】
実施例６：ビール試醸中のScMEP1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス  パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度    12.69％
麦汁容量          70L
麦汁溶存酸素濃度  8.6ppm
発酵温度          15℃
酵母投入量        12.8×106cells/mL
【００５０】
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図1）、外観エキス濃度（図2）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、特開2004-283169に記載のビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ScMEP1遺伝子の発現パターンを図８に示す。この結果より、通常のビール発酵においてScMEP1遺伝子が発現していることを確認した。
【００５１】
実施例７： ScMEP1高発現株の作製
実施例１に記載のnonScMEP1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScMEP1高発現ベクターnonScMEP1/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス  パストリアヌス  バイヘンステファン34/70株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００５２】
実施例８：ビール試験醸造におけるアンモニアおよびアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例７で得られたScMEP1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度      12%
麦汁容量            1L
麦汁溶存酸素濃度    約 8ppm 
発酵温度            15℃一定
酵母投入量          5g湿酵母菌体／L麦汁
【００５３】
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）(図９)、エキス消費量(図１０)、アンモニア (図１１)、遊離アミノ態窒素（FAN）(図１２)の経時変化を調べた。図１１に示すようにScMEP1高発現株では親株に比べてアンモニアの資化が促進され、図１２に示すように遊離アミノ態窒素（FAN）の資化は抑制されていた。その結果、表２に示すように、ScMEP1高発現株では発酵終了後のビール中の総アミノ酸量は増加しており、アンモニアの量は減少していた。
【００５４】
【表２】
2009527219.tif 000003
【００５５】
実施例９：nonScMEP1遺伝子またはScMEP1遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。
作製した遺伝子破壊用断片でW34/70株あるいは胞子クローンW34/70-2株を形質転換する。形質転換は特開平07-303475に記載された方法で行い、選択薬剤の濃度はそれぞれジェネチシン(Geneticin)300mg/L、ノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/Lとする。
【００５６】
実施例１０：ビール試験醸造におけるアンモニアおよびアミノ酸資化量の測定
親株ならびに実施例９で得られたnonScMEP1破壊株またはScMEP1破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度      12%
麦汁容量            1L
麦汁溶存酸素濃度    約 7ppm 
発酵温度            12℃一定
酵母投入量          5g湿酵母菌体／L麦汁
【００５７】
実施例８と同様に、発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量、アンモニア量及び遊離アミノ態窒素（FAN）量の経時変化を調べる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の酒類製造法によれば、酵母のアンモニア資化能が増大するため、アミノ酸の資化が抑制され、アミノ酸含有量の多い酒類を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるnonScMEP1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】図４は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図５】図５は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図６】図６は、ビール試験醸造におけるアンモニアの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はアンモニア濃度（mg/L）を示している。
【図７】図７は、ビール試験醸造における遊離アミノ態窒素（FAN）の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は遊離アミノ態窒素（FAN）量（mg/100ml）を示している。
【図８】図８は、ビール試験醸造中の酵母におけるScMEP1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図９】図９は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図１０】図１０は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図１１】図１１は、ビール試験醸造におけるアンモニアの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はアンモニア濃度（mg/L）を示している。
【図１２】図１２は、ビール試験醸造における遊離アミノ態窒素（FAN）の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は遊離アミノ態窒素（FAN）量（mg/100ml）を示している。
【図１】
2009527219.tif 000004
【図２】
2009527219.tif 000005
【図３】
2009527219.tif 000006
【図４】
2009527219.tif 000007
【図５】
2009527219.tif 000008
【図６】
2009527219.tif 000009
【図７】
2009527219.tif 000010
【図８】
2009527219.tif 000011
【図９】
2009527219.tif 000012
【図１０】
2009527219.tif 000013
【図１１】
2009527219.tif 000014
【図１２】
2009527219.tif 000015
【配列表】
2009527219000001.app
【国際調査報告】
2009527219.tif 000016
2009527219.tif 000017
2009527219.tif 000018
2009527219.tif 000019
2009527219.tif 000020