(57)【要約】本発明は、Ｓｐ３５拮抗剤を投与することによる、多発性硬化症を包含する脱髄及び髄鞘発育不全の関与する疾患、障害又は傷害を治療する方法を提供する。別の方法は本発明のＳＰ３５拮抗剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることによる、ＥｒｂＢ２ポリペプチドとのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制するための方法、及び、ＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させるための方法を包含する。本発明の更に別の実施形態は、ＥｒｂＢ２結合剤に稀突起膠細胞又は稀突起膠細胞先祖細胞を接触させることを含む、ＥｒｂＢ２とのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制する方法、ＥｒｂＢ２のリン酸化を増大する方法、および稀突起膠細胞の分化を増進する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｒｂＢ２ポリペプチドとのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制するための方法であって、
（ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；（ｉｉ）Ｓｐ３５抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該Ｓｐ３５拮抗剤のうちの２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項２】
ＥｒｂＢ２リン酸化を増大させるための方法であって、（ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；（ｉｉ）Ｓｐ３５抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該Ｓｐ３５拮抗剤のうちの２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項３】
前記Ｓｐ３５拮抗剤が可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを含む、請求項１又は２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが（ｉ）Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン又はそのフラグメント、変異体又は誘導体、（ｉｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン又はそのフラグメント、変異体又は誘導体、（ｉｉｉ）Ｓｐ３５細胞質ドメイン又はそのフラグメント、変異体又は誘導体、（ｉｖ）Ｓｐ３５膜貫通ドメイン又はそのフラグメント、変異体又は誘導体、（ｖ）ＬＲＲドメインに対してＣ末端のＳｐ３５塩基性領域又はそのフラグメント、変異体又は誘導体、及び（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の該Ｓｐ３５ドメイン又はそのフラグメント、変異体又は誘導体のうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるＳｐ３５領域を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが（ｉ）Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン、（ｉｉ）Ｓｐ３５  ＬＲＲドメイン、（ｉｉｉ）Ｓｐ３５細胞質ドメイン、（ｉｖ）Ｓｐ３５膜貫通ドメイン、（ｖ）ＬＲＲドメインに対してＣ末端のＳｐ３５塩基性領域、及び（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の該Ｓｐ３５ドメインのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるＳｐ３５領域を欠いている、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドがＳｐ３５膜貫通ドメイン及びＳｐ３５細胞質ドメインを欠いている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが（ｉ）Ｓｐ３５ＬＲＲドメイン、そのフラグメント、変異体又は誘導体、（ｉｉ）ＬＲＲドメインに対してＣ末端のＳｐ３５塩基性領域又はそのフラグメント、変異体又は誘導体、及び（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、そのフラグメント、変異体又は誘導体を含む、請求項３〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドがＳｐ３５  Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、Ｓｐ３５膜貫通ドメイン及びＳｐ３５細胞質ドメインを欠いている、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３３；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３５；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜６４；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜６４；（ｖ）配列番号２のアミノ酸６６〜８９；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸９０〜１１３；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１１４〜１３７；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１３８〜１６１；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸１６２〜１８５；（ｘ）配列番号２のアミノ酸１８６〜２０９；（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸２１０〜２３３；（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸２３４〜２５７；（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２５８〜２８１；（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸２８２〜３０５；（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸３０６〜３２９；（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸３３０〜３５３；（ｘｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６３〜４１６；（ｘｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸４１７〜４２４；（ｘｉｘ）配列番号２のアミノ酸４１９〜４９３；（ｘｘ）配列番号２のアミノ酸４９４〜５５１；（ｘｘｉ）該ポリペプチドフラグメントのうちの何れかの変異体又は誘導体、及び（ｘｘｉｉ）該ポリペプチドフラグメント又はその変異体若しくは誘導体の何れかのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるポリペプチドフラグメントを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜６４；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜８９；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１１３；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸１〜１３７；（ｖ）配列番号２のアミノ酸１〜１６１；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１８５；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜２０９；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜２３３；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸１〜２５７；（ｘ）配列番号２のアミノ酸１〜２８１；（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３０５；（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３２９；（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜３５３；（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸１〜４１６；（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸１〜４２４；（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸１〜４９３；（ｘｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜５５１；（ｘｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜５３１；及び（ｉｘｘ）配列番号２のアミノ酸１〜５３２；（ｘｘ）該ポリペプチドフラグメントの何れかの変異体又は誘導体、並びに（ｘｘｉ）該ポリペプチドフラグメント又はその変異体若しくは誘導体の何れかのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるポリペプチドフラグメントを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、（ｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜８９；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜１１３；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜１３７；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜１６１；（ｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜１８５；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜２０９；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜２３３；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜２５７；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸３４〜２８１；（ｘ）配列番号２のアミノ酸３４〜３０５；（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜３２９；（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜３５３；（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜４１６；（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜４２４；（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜４９３；（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５５１；（ｘｖｉｉ）該ポリペプチドフラグメントの何れかの変異体又は誘導体、及び（ｘｖｉｉｉ）該ポリペプチドフラグメント又はその変異体若しくは誘導体の何れかのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるポリペプチドフラグメントを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、（ｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３０；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３１；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３２；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３３；（ｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３４；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３５；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３６；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３７；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３８；（ｘ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３９；（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸３０〜５３２；（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸３１〜５３２；（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３２〜５３２；（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸３３〜５３２；（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３２；（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸３５〜５３２；（ｘｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３２；（ｘｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３０〜５３１；（ｘｉｘ）配列番号２のアミノ酸３１〜５３１；（ｘｘ）配列番号２のアミノ酸３２〜５３１；（ｘｘｉ）配列番号２のアミノ酸３３〜５３１；（ｘｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸３４〜５３１；（ｘｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３５〜５３１；（ｘｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３１；（ｘｘｖ）該ポリペプチドフラグメントの何れかの変異体又は誘導体、及び（ｘｘｖｉ）該ポリペプチドフラグメントの何れかのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるポリペプチドフラグメントを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドがＳｐ３５  Ｉｇドメイン又はそのフラグメント、変異体又は誘導体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが（ｉ）ＩＴＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１０）；（ｉｉ）ＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１１）；（ｉｉｉ）ＶＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１２）；及び（ｉｖ）ＳＰＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１３）よりなる群から選択されるペプチド配列を含み、ここで、Ｘ１はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｘ２はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、そしてＸ３はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンである、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチド配列がＩＴＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１０）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチド配列がＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１１）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチド配列がＶＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１２）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチド配列がＳＰＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１３）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチド配列がＩＴＰＫＲＲ（配列番号４４）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチド配列がＡＣＨＨＫ（配列番号４５）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチド配列がＶＣＨＨＫ（配列番号４６）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが（ｉ）ＳＰＲＫＨ（配列番号１４）；（ｉｉ）ＳＰＲＫＫ（配列番号１５）；（ｉｉｉ）ＳＰＲＫＲ（配列番号１６）；（ｉｖ）ＳＰＫＫＨ（配列番号１７）；（ｖ）ＳＰＨＫＨ（配列番号１８）；（ｖｉ）ＳＰＲＲＨ（配列番号１９）；（ｖｉｉ）ＳＰＲＨＨ（配列番号２０）；（ｖｉｉｉ）ＳＰＲＲＲ（配列番号２１）；（ｉｘ）ＳＰＨＨＨ（配列番号２２）；（ｘ）ＳＰＫＫＫ（配列番号２３）；（ｘｉ）ＬＳＰＲＫＨ（配列番号２４）；及び（ｘｉｉ）ＷＬＳＰＲＫＨ（配列番号３４）よりなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチド配列がＳＰＲＫＨ（配列番号１４）、ＬＳＰＲＫＨ（配列番号２４）及びＷＬＳＰＲＫＨ（配列番号３４）よりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドがＧＳＧＣＬＳＰＲＫＨ（配列番号９６）を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドがＣＬＳＰＲＫＨＣ（配列番号９８）を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが（ｉ）Ｘ４Ｘ５ＲＫＨ（配列番号４７）；（ｉｉ）Ｘ４Ｘ５ＲＲＲ（配列番号４８）；（ｉｉｉ）Ｘ４Ｘ５ＫＫＫ（配列番号４９）；（ｉｖ）Ｘ４Ｘ５ＨＨＨ（配列番号５０）；（ｖ）Ｘ４Ｘ５ＲＫＫ（配列番号５１）；（ｖｉ）Ｘ４Ｘ５ＲＫＲ（配列番号５２）；（ｖｉｉ）Ｘ４Ｘ５ＫＫＨ（配列番号５３）；（ｖｉｉｉ）Ｘ４Ｘ５ＨＫＨ（配列番号５４）；（ｉｘ）Ｘ４Ｘ５ＲＲＨ（配列番号９７）；及び（ｘ）Ｘ４Ｘ５ＲＨＨ（配列番号５５）よりなる群から選択されるペプチド配列を含み、ここでＸ４は何れかのアミノ酸であり、そしてＸ５は何れかのアミノ酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチド配列がＸ４Ｘ５ＲＫＨ（配列番号４７）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが（ｉ）ＲＲＡＲＩＲＤＲＫ（配列番号６１）；（ｉｉ）ＫＫＶＫＶＫＥＫＲ（配列番号６２）；（ｉｉｉ）ＲＲＬＲＬＲＤＲＫ（配列番号６３）；（ｉｖ）ＲＲＧＲＧＲＤＲＫ（配列番号６４）；及び（ｖ）ＲＲＩＲＡＲＤＲＫ（配列番号６５）よりなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチド配列がＲＲＡＲＩＲＤＲＫ（配列番号６１）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチド配列がＫＫＶＫＶＫＥＫＲ（配列番号６２）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ペプチド配列がＲＲＬＲＬＲＤＲＫ（配列番号６３）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチド配列がＲＲＧＲＧＲＤＲＫ（配列番号６４）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチド配列がＲＲＩＲＡＲＤＲＫ（配列番号６５）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが環状ペプチドである、請求項３又は１６〜３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記環状ペプチドが該環状ペプチドのＮ末端に結合したビオチン分子及びＣ末端に結合したシステイン残基を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記環状ペプチドが該環状ペプチドのＮ末端及びＣ末端に結合したシステイン残基を含み、ここで該Ｎ末端システイン残基はアセチル化されている、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが非Ｓｐ３５部分に結合している、請求項３〜３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記非Ｓｐ３５部分が該可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに融合した異種ポリペプチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記異種ポリペプチドが免疫グロブリンポリペプチド又はそのフラグメント、血清アルブミンポリペプチド又はそのフラグメント、ターゲティングポリペプチド、レポーターポリペプチド及び精製促進ポリペプチド及び該異種ポリペプチドのうちの２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記異種ポリペプチドが免疫グロブリンポリペプチド又はそのフラグメントである請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫グロブリンポリペプチドが免疫グロブリンのヒンジ及びＦｃ領域を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記非Ｓｐ３５部分が前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドにコンジュゲートした重合体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記重合体がポリアルキレングリコール、糖重合体及びポリペプチドよりなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記重合体がポリアルキレングリコールである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが１個、２個、３個又は４個の重合体にコンジュゲートしている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記重合体の総分子量が５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｓｐ３５拮抗剤がＳｐ３５抗体又はそのフラグメントを含む、請求項１又は２の何れか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｓｐ３５抗体又はそのフラグメントが（ｉ）配列番号２のアミノ酸６６〜８９；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸６６〜１１３；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸６６〜１３７；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９０〜１１３；（ｖ）配列番号２のアミノ酸１１４〜１３７；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１３８〜１６１；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１６２〜１８５；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１８６〜２０９；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸２１０〜２３３；（ｘ）配列番号２のアミノ酸２３４〜２５７；（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸２５８〜２８１；（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸２８２〜３０５；（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３０６〜３２９；（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸３３０〜３５３；（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸３４〜６４；（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸３６３〜４１６；（ｘｖｉｉ）該ポリペプチドフラグメントの何れかの変異体又は誘導体、及び（ｘｖｉｉｉ）該ポリペプチドフラグメント又はその変異体若しくは誘導体の何れかのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるポリペプチドフラグメントを含むエピトープに特異的に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｓｐ３５拮抗剤がＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドを含む、請求項１又は２の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドが（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；（ｉｉ）リボザイム；（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；及び（ｉｖ）低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）よりなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドがＳｐ３５ｍＲＮＡのコーディング部分に相補的な少なくとも１０塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドがリボザイムである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ｓｈＲＮＡがヌクレオチド配列：
【化１】
2009518299.tif 000023
を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物がそれを必要とする哺乳類に投与され、そして該哺乳類は脱髄、髄鞘発育不全又は神経変性の関与する疾患、障害又は傷害を有すると診断されている、請求項１〜５８の何れか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記疾患、障害又は傷害が多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛及びベル麻痺よりなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記疾患、障害又は傷害が多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｓｐ３５拮抗剤をボーラス注射又は長期注入により投与する、請求項５９〜６１の何れか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｓｐ３５拮抗剤を中枢神経系に直接投与する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｓｐ３５拮抗剤をＭＳの慢性病巣に直接投与する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
（ａ）発現制御配列への作動可能な連結を介して前記Ｓｐ３５拮抗剤をコードするポリヌクレオチドを含む組成物で前記稀突起膠細胞をトランスフェクトすること、及び（ｂ）該Ｓｐ３５拮抗剤の発現を可能とすることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６６】
前記組成物が発現制御配列への作動可能な連結を介して前記Ｓｐ３５拮抗剤をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１、２又は５９〜６４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記組成物が前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記発現ベクターがウィルスベクターである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記投与が（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞を提供することであって、ここで該培養宿主細胞が前記Ｓｐ３５拮抗剤を発現する、こと；及び（ｂ）該Ｓｐ３５拮抗剤が前記哺乳類内で発現されるように該培養宿主細胞を該哺乳類内に導入することを含む、請求項５９〜６８の何れか１項に記載の方法。
【請求項７０】
神経系の疾患、障害又は傷害の部位又はその近傍において前記培養宿主細胞を前記哺乳類内に導入する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記培養宿主細胞が（ａ）請求項６６〜６８の組成物でレシピエント宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすること、及び（ｂ）該形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養すること、を含む方法により作製される、請求項６９又は請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記培養宿主細胞が治療すべき哺乳類から誘導される、請求項６９〜７１の何れか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｓｐ３５拮抗剤が神経系の疾患、障害又は傷害の部位又はその近傍において稀突起膠細胞の増殖、分化又は生存の抑制を低減するために十分な量において発現される、請求項５９〜７２の何れか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｓｐ３５拮抗剤が神経系の疾患、障害又は傷害の部位又はその近傍においてニューロンの髄鞘形成の抑制を低減するために十分な量において発現される、請求項５９〜７２の何れか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ウィルスベクターがアデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター、エンテロウィルスベクター、ペスチウィルスベクター、レンチウィルスベクター、バキュロウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、パポバウィルスベクター及びポックスウィルスベクターよりなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記ヘルペスウィルスベクターが単純疱疹ウィルスベクター及びエプスタインバーウィルスベクターよりなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポックスウィルスベクターがワクシニアウィルスベクターである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記ベクターを局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与及び皮下投与よりなる群から選択される経路により投与する、請求項６８又は７５〜７７の何れか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｃ末端システインが結合したＮＨ２部分を有する、請求項３７又は請求項３８に記載の方法。
【請求項８０】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、（ｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜８９；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜１１３；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜１３７；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜１６１；（ｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜１８５；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜２０９；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜２３３；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜２５７；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸３６〜２８１；（ｘ）配列番号２のアミノ酸３６〜３０５；（ｘｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜３２９；（ｘｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜３５３；（ｘｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜４１６；（ｘｉｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜４２４；（ｘｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜４９３；（ｘｖｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５５１；（ｘｖｉｉ）該ポリペプチドフラグメントの何れかの変異体又は誘導体、及び（ｘｖｉｉｉ）該ポリペプチドフラグメント又はその変異体若しくは誘導体の何れかのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるポリペプチドフラグメントを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、（ｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３０；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３１；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３２；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３３；（ｖ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３４；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３５；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３６；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３７；（ｉｘ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３８；（ｘ）配列番号２のアミノ酸３６〜５３９；（ｘｉ）該ポリペプチドフラグメントの何れかの変異体又は誘導体、及び（ｘｉｉ）該ポリペプチドフラグメントの何れかのうちの少なくとも２つの組み合わせよりなる群から選択されるポリペプチドフラグメントを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項８２】
ＥｒｂＢ２ポリペプチドとのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制するための方法であって、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該ＥｒｂＢ２結合剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項８３】
ＥｒｂＢ２リン酸化を増大させるための方法であって、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）ＥｒｂＢ２結合剤のうちの２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、Ｓｐ３５とＥｒｂＢ２との相互作用を低減することができるか、又は、稀突起膠細胞の分化を増大させることができるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項８４】
稀突起膠細胞の分化を増大させるための方法であって、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該ＥｒｂＢ２結合剤のうちの２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞先祖細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項８５】
前記ＥｒｂＢ２結合剤が可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドである、請求項８２〜８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＥｒｂＢ２結合剤がＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメントである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＥｒｂＢ２抗体がＬ２６である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＥｒｂＢ２結合剤が可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチドである、請求項８２〜８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記組成物がそれを必要とする哺乳類に投与され、そして該哺乳類は脱髄、髄鞘発育不全又は神経変性の関与する疾患、障害又は傷害を有すると診断されている、請求項８２〜８８の何れか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記疾患、障害又は傷害が多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛及びベル麻痺よりなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記疾患、障害又は傷害が多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項９０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は神経生物学、神経学及び薬理学に関する。より詳細には、本発明はＳｐ３５拮抗剤及びＥｒｂＢ２結合剤の投与による多発性硬化症のような脱髄及び髄鞘発育不全の疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
神経系の多くの疾患は脱髄及び髄鞘発育不全に関連しており、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、ウォーラー変性及び一部の遺伝性の疾患、例えば副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病及びペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）が挙げられる。これらの疾患のうちＭＳが最も遍在しており、世界中で約２．５百万人が罹患している。
【０００３】
ＭＳは一般的に神経学的な内容の回帰−軽減のパターンと共に開始し、それが次に増大する神経学的損傷を伴った慢性期に進行する。ＭＳは慢性病巣に局在するミエリン、稀突起膠細胞及び軸索の破壊を伴う。ＭＳで観察される脱髄は必ずしも恒久的ではなく、再髄鞘形成が疾患の早期においては報告されている。ニューロンの再髄鞘形成には稀突起膠細胞が必要である。
【０００４】
種々の疾患変更治療がＭＳに対して使用可能であり、例えばコルチコステロイド及び免疫モジュレーター、例えばインターフェロンベータの使用が挙げられる。更に又、ＭＳにおける稀突起膠細胞及び髄鞘形成の重要な役割のために、稀突起膠細胞数を増加させるか、又は髄鞘形成を増強するための治療法を開発するための研究がなされている。例えばＣｏｈｅｎ等の特許文献１；非特許文献１を参照できる。しかしながら、ＭＳのためのさらなる治療法を考案することはなお緊急の要望である。
【０００５】
ＣＮＳにおける髄鞘形成は稀突起膠細胞及びそれらの軸索との相互作用により協調されている。稀突起膠細胞の文化を媒介している機序及びシグナリング分子を詳細に理解することは、ミエリンシートの損傷が多発性硬化症のような重度の神経学的機能不全をもたらす疾患に対する治療法の開発のために重要である。非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照できる。数種の異なる受容体−リガンド対が稀突起膠細胞の分化又は髄鞘形成のために重要であることが報告されており例えばＴｒＫＡ／ＮＧＦ、Ｎｏｔｃｈ／Ｊａｇｇｅｄ、Ｆ３／コンタクチン及び受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢ２ファミリーのメンバー及びニューレグリンが挙げられる。非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照できる。
【０００６】
チロシンキナーゼ受容体のＥｒｂＢ２ファミリーはＥＧＦ受容体及びニューレグリン受容体ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４を包含する。非特許文献８を参照できる。ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４へのニューレグリンの結合はＥｒｂＢ２とのヘテロ２量体化とその後のチロシル自己リン酸化及びシグナリングカスケードの活性化を誘導する。上記を参照できる。ＥｒｂＢ２受容体の脂質ラフトへの転座が受容体活性化のためには必要である。非特許文献９及び非特許文献１０を参照できる。
【０００７】
稀突起膠細胞においては、ニューレグリンは稀突起膠細胞増殖、遊走及びＣＮＳ軸索の髄鞘形成を調節する。非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７及び非特許文献１１を参照できる。ニューレグリンノックアウトマウス由来のＯ４＋稀突起膠細胞は移植培養物中で分化できず、そしてこの欠損は外因性ニューレグリンにより復帰されることができる。非特許文献５。ニューレグリンに対するＥｒｂＢ受容体の役割はより複雑である。ＥｒｂＢ２ノックアウトマウス脊髄から得た稀突起膠細胞は末端分化の低減を示している。非特許文献６。しかしながら、ＥｒｂＢ４ノックアウトマウスの神経管由来の稀突起膠細胞は増大した末端分化を示している。非特許文献７。
【０００８】
ＥｒｂＢ受容体ファミリーがどのように調節されているかに関して数種の機序が知られている。興味深いことに、これらの機序の多くが受容体チロシンキナーゼと相互作用して調節する分子を含有するＬＲＲドメインを介している。ＥｒｂＢ１はリガンド依存性の受容体の内在化及びリソソームコンパートメントへのターゲティングを介してダウンレギュレートされる（非特許文献１２）。しかしながらＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４はリガンド誘導エンドサイトーシスに対しては耐性であると考えられる（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３は又ポリユビキチンネーション及びＬＲＲ蛋白ＬＲＩＧを介したプロテオソーム分解によっても調節される。非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；及び非特許文献２０。デコリン、即ちＬＲＲ含有プロテオグリカンは内在化を介した受容体のダウンレギュレーションを誘導すること、及び、チロシルリン酸化を停止させることにより、ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ２を負の方向に調節する。非特許文献２１。Ｋｅｋｋｏｎ−１はショウジョウバエＥＧＦ受容体に直接結合し、そして受容体の活性化を抑制する。非特許文献２２。
【０００９】
Ｏ４＋期までの稀突起膠細胞の発生はＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３ＥｒｂＢ４ヌル突然変異隊の各々においては正常である（非特許文献６；非特許文献２３；非特許文献２４）が、ニューレグリンＫＯにおいては欠損している（非特許文献５）。ＥｒｂＢ２ノックアウトマウスにおいては、稀突起膠細胞はＯ４＋期から成熟した稀突起膠細胞に進行することができず、そして成熟期にまで到達する僅かな稀突起膠細胞は軸索を鞘性化及び有髄化することができない。非特許文献６。これとは対照的にＥｒｂＢ４ヌル突然変異隊は分化した稀突起膠細胞の増大した数を呈し、ＥｒｂＢ４活性が末端稀突起膠細胞成熟化を抑制することを示している。非特許文献７。これらの研究によれば稀突起膠細胞の分化を調節しているＥｒｂＢ受容体からの正及び負のシグナルの複雑なバランス調整が示唆されている。
【特許文献１】米国特許５，５７４，００９号明細書
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３（２００２）
【非特許文献２】Ｋｏｌｏｄｎｙ，Ｅ．Ｈ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６：３７９−３８６（１９９３）
【非特許文献３】Ｔｒａｐｐ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．９８：４９−５６（１９９６）
【非特許文献４】Ｔｒａｐｐ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２：２９５−３０４（１９９６）
【非特許文献５】Ｖａｒｔａｎｉａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７３１−７３５（１９９９）
【非特許文献６】Ｐａｒｋ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５４：１２４５−１２５８（２００１）
【非特許文献７】Ｓｕｓｓｍａｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：５７５７−５７６２（２００５）
【非特許文献８】Ｃｉｔｒｉ等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２８４：５４−６５（２００３）
【非特許文献９】Ｎａｇｙ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）
【非特許文献１０】Ｍａ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３１６４−３１７５（２００３）
【非特許文献１１】Ｋｉｍ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５５６１−５５７１（２００３）
【非特許文献１２】Ｋｏｒｎｉｌｏｖａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０３４０−３０３４６（１９９６）
【非特許文献１３】Ｂａｕｌｉｄａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５２５１−５２５７（１９９６）
【非特許文献１４】Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９０２９−１９０３２（１９９６）
【非特許文献１５】Ｂａｕｌｉｄａ  ａｎｄ  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２３２：１６７−１７２（１９９７）
【非特許文献１６】Ｘｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２８４７（２００２）
【非特許文献１７】Ｚｈｏｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１３８２９（２００３）
【非特許文献１８】Ｇｕｒ等、ＥＭＢＯＪ．２３：３２７０−３２８１（２００４）
【非特許文献１９】Ｌａｅｄｅｒｉｃｈ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４７０５０−４７０５６（２００４）
【非特許文献２０】Ｑｉｕ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４８４３−１４８４８（２００２）
【非特許文献２１】Ｃｓｏｒｄａｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３２８７９−３２８８７（２０００）
【非特許文献２２】Ｇｈｉｇｌｉｏｎｅ等、Ｃｅｌｌ  ９６：８４７−５８６（１９９９）
【非特許文献２３】Ｓｔｏｌｔ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１６５−１７０（２００２）
【非特許文献２４】Ｓｃｈｍｕｃｋｅｒ等、Ｇｌｉａ４４：６７−７５（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
即ち、ＥｒｂＢ２／ニューレグリン経路及びＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）、如何にしてＬＲＲ蛋白が稀突起膠細胞分化において相互作用しているか、そして髄鞘形成が相互作用しているかを理解することは、多発性硬化症のような脱髄及び髄鞘発育不全の疾患のための再髄鞘形成療法を目指した新しい研究法の開発のために重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の簡単な要旨）
本発明はＳｐ３５（Ｓｐ３５は文献においてはＬＩＮＧＯ−１及びＬＲＲＮ６とも表記される）が稀突起膠細胞において発現され、そして稀突起膠細胞の分化、生存及び軸索髄鞘形成を負の方向に調節することの発見に基づいている。更に又、Ｓｐ３５の特定の拮抗剤は稀突起膠細胞の生存、増殖及び分化並びにニューロンの髄鞘形成を増進する。これらの発見に基づいて、本発明は一般的にＳｐ３５拮抗剤の投与による脱髄及び髄鞘発育不全の伴った状態（例えば多発性硬化症）を治療する方法に関する。
【００１２】
特定の実施形態においては、本発明はＳｐ３５拮抗剤の治療有効量を投与することを含む、哺乳類における稀突起膠細胞の増殖、分化及び生存を増進するための方法を包含する。
【００１３】
別の実施形態は（ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；（ｉｉ）Ｓｐ３５抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該Ｓｐ３５拮抗剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含むＥｒｂＢ２ポリペプチドとのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制するための方法を包含する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は（ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；（ｉｉ）Ｓｐ３５抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該Ｓｐ３５拮抗剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含むＥｒｂＢ２リン酸化を増大させるための方法を包含する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明はＳｐ３５拮抗剤の治療有効量を投与することを含む、哺乳類におけるニューロンの髄鞘形成を増進するための方法を包含する。特定の実施形態においては、哺乳類は脱髄及び髄鞘発育不全の関与する疾患、障害、傷害又は状態と診断されている。一部の実施形態においては、疾患、障害又は傷害は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛及びベル麻痺よりなる群から選択される。
【００１６】
更に又、本発明は（ａ）組み換えＳｐ３５拮抗剤を発現する培養宿主細胞を準備すること；及び（ｂ）神経系の疾患、障害又は傷害の部位又はその近傍において哺乳類内に宿主細胞を導入することを含む、稀突起膠細胞又はミエリンの破壊の関与する哺乳類における疾患、障害又は傷害を治療する方法を包含する。一部の実施形態においては、疾患、障害又は傷害は多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛及びベル麻痺よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、培養宿主細胞は治療すべき哺乳類から誘導される。
【００１７】
本発明の別の実施形態は傷害の部位又はその近傍においてニューロンによる軸索伸長の抑制を低減するために十分な量において哺乳類内のヌクレオチド配列からＳｐ３５拮抗剤が発現されるようにＳｐ３５拮抗剤をコードする核酸配列を含むベクターを疾患、障害又は傷害の部位又はその近傍において哺乳類に投与することを含むインビボの遺伝子療法により稀突起膠細胞又はミエリンの破壊が関与する疾患、障害又は傷害を治療する方法を包含する。特定の実施形態においては、ベクターはアデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター、エンテロウィルスベクター、ペスチウィルスベクター、レンチウィルスベクター、バキュロウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、エプスタインバーウィルスベクター、パポバウィルスベクター、ポックスウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター及び単純疱疹ウィルスベクターよりなる群から選択されるウィルスベクターである。一部の実施形態においては、疾患、障害又は傷害は多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後傷害、化学療法の神経学的合併症、卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛及びベル麻痺よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、該ベクターは局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与及び皮下投与よりなる群から選択される経路により投与される。
【００１８】
上記した方法の種々の実施形態において、Ｓｐ３５拮抗剤は稀突起膠細胞の生存、増殖及び分化並びにニューロンの髄鞘形成を負の方向に調節するＳｐ３５の能力を妨害する何れかの分子であってよい。特定の実施形態においては、Ｓｐ３５拮抗剤は可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ干渉）よりなる群から選択される。
【００１９】
特定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは限定されないが、Ｓｐ３５ポリペプチドフラグメント、その変異体又は誘導体であって膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いているものを包含する。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは（ｉ）Ｓｐ３５ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）ＬＲＲドメインに対してＣ末端のＳｐ３５塩基性領域、及び（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを包含する。一部の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５ＬＲＲドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを欠いている。一部の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５ＬＲＲドメインを含み、そしてＳｐ３５Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いている。一部の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２を含む。
【００２０】
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該ＥｒｂＢ２結合剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含むＥｒｂＢ２ポリペプチドとのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制するため、又は、ＥｒｂＢ２リン酸化を増大させるための方法を包含する。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該ＥｒｂＢ２結合剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞先祖細胞を接触させることを含む稀突起膠細胞の分化を増大させるための方法を包含する。
【００２２】
特定の実施形態においては、本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤はＳｐ３５の完全長又は内因性のＥｒｂＢ２結合を抑制することができる、及び／又は、稀突起膠細胞分化を増大させることができる、及び／又は、ＥｒｂＢ２リン酸化を増大させることができるものである。
【００２３】
一部の実施形態においては、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤はボーラス注射又は長期注入により投与される。一部の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド又はＥｒｂＢ２結合剤は中枢神経系に直接投与される。一部の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド又はＥｒｂＢ２結合剤はＭＳの慢性病巣に直接投与される。
【００２４】
一部の実施形態においては、Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤は非Ｓｐ３５又は非ＥｒｂＢ２部分又は異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態においては、異種ポリペプチドは免疫グロブリンポリペプチド又はそのフラグメント、血清アルブミンポリペプチド又はそのフラグメント、ターゲティングポリペプチド、レポーターポリペプチド及び精製促進ポリペプチド及び２つ以上の異種ポリペプチドの組み合わせよりなる群から選択される。一部の実施形態においては、抗体Ｉｇ部分はヒンジ又はＦｃ部分である。
【００２５】
一部の実施形態においては、本発明の方法において使用するポリペプチド及び抗体は重合体にコンジュゲートされる。一部の実施形態においては、重合体はポリアルキレングリコール、糖重合体及びポリペプチドよりなる群から選択される。一部の実施形態においては、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一部の実施形態においては、本発明のポリペプチド及び抗体は１、２、３又は４重合体にコンジュゲートされる。一部の実施形態においては、重合体の総分子量は５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
定義
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的及び学術的な用語は本発明が属する技術の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有するものとする。矛盾がある場合は定義を包含する本出願が優先するものとする。内容により別様に必要とされない限り、単数標記は複数標記を包含し、そして複数標記は単数標記を包含するものとする。本明細書において言及する全ての公開物、特許及び他の参考文献は、各々個々の公開物又は特許出願が参照により組み込まれることを特定的に独立して示されるがごとく、全ての目的の為に参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本明細書に記載したものと同様又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用できるが、適当な方法及び材料を以下に記載する。材料、方法及び例は例示に過ぎず、そして限定することを意図していない。本発明の他の特徴及び利点は詳細な説明から、そして、請求項から明らかにされる。
【００２８】
本発明を更に定義するために、以下の用語及び定義を提示する。
【００２９】
「ある」実態はその実態の１つ以上を指し；例えば「ある免疫グロブリン分子」とは１つ以上の免疫グロブリン分子を示すものと理解される。即ち、「ある」、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書においては互換的に使用できる。
【００３０】
本明細書及び請求項全体を通じて、「含む」という単語又はその変形、例えば「含んでいる」等は何れかの記載された整数又は整数の群を包含することを指すが、何れかの他の整数又は整数の群を排除するものではない。
【００３１】
「接触している」、「接触する」又は「接触された」という用語は互換的に使用してよく、そして本発明のＳｐ３５拮抗剤の存在下に所在している実体（例えば稀突起膠細胞）を指す。「接触された」実体とは組成物との直接の相互作用を介するか、又は中間的手段、例えば接触された実体と直接接触しているか、又はそれと近接している細胞を介した組成物又は蛋白の発現を経たものであってよい。
【００３２】
本明細書においては、「部分」という用語は分子の一部分の個別の箇所を指す。例えば、「非Ｓｐ３５部分」とは本明細書においては本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド、抗体又はポリヌクレオチドの一部分を指し、これはＳｐ３５から誘導されないがポリペプチド、抗体又はポリヌクレオチドの部分として包含される。
【００３３】
本明細書においては、「治療有効量」とは所望の治療結果を達成するための、必要な用量及び期間において、有効な量を指す。治療結果は、例えば症状の低減、生存の延長、運動性の改善等であってよい。治療結果は「治癒」である必要はない。
【００３４】
本明細書においては、「予防有効量」とは所望の予防結果を達成するための、必要な用量及び期間において、有効な量を指す。典型的には、予防用量は疾患の前、又はより早い段階において対象において使用されるため、予防有効量は治療有効量より低値となる。
【００３５】
本明細書においては、「ポリヌクレオチド」は完全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、例えば未翻訳５’及び３’配列、コーディング配列並びに核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン及び変異体を含有できる。ポリヌクレオチドは何れかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、これは未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは１本鎖及び２本鎖のＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖のＲＮＡ、及び１本鎖及び２本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖及び２本鎖のＲＮＡ、１本鎖又はより典型的には２本鎖であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子、又は１本鎖及び２本鎖の領域の混合物を含むことができる。更に又、ポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を含むことができる。ポリヌクレオチドは又１つ以上の修飾された塩基又は安定性のため、又は他の理由のために修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ骨格を含有することもできる。「修飾された」塩基とは、例えばトリチル化された塩基、及び通常ではない塩基、例えばイノシンを包含する。種々の修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行うことができ；即ち、「ポリヌクレオチド」には化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態を包含する。
【００３６】
本発明においては、ポリペプチドはペプチド結合又は修飾されたペプチド結合、即ちペプチドアイソスターにより相互に連結されたアミノ酸を含むことができ、そして、２０遺伝子コードアミノ酸ではないアミノ酸（例えば天然に存在しないアミノ酸）を含有してよい。本発明のポリペプチドは天然のプロセス、例えば翻訳後のプロセシングによるか、又は当該分野で良く知られている化学的修飾の手法により修飾してよい。そのような修飾は基本的なテキストにおいて、そして、より詳細な学術論文並びに多大な参考文献において十分に説明されている。修飾はポリペプチドの何れかの箇所、例えばペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端において起こることができる。同じ型の修飾が所定のポリペプチド内の数個の部位において同じか異なる程度で存在してよい。更に又、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含有してよい。ポリペプチドは例えばユビキチン化の結果として分枝していてよく、そしてそれらは分枝を伴うか伴わない環状であってもよい。環状、分枝、及び分枝環状のポリペプチドは翻訳後の天然のプロセスから生じてよく、又は合成法により製造してよい。修飾はアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合交差結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような蛋白へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加及びユビキチン化を包含する（例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ等、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ等、Ａｎｎ  Ｎｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【００３７】
「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「類縁体」という用語は、本発明の方法において使用するためのＳｐ３５に言及している場合は、Ｓｐ３５の活性を抑制する少なくとも一部の能力を保持している何れかの拮抗剤分子を包含する。本明細書に記載するＳｐ３５拮抗剤は、Ｓｐ３５拮抗剤がなおその機能を果たす限りにおいて、制限することなくそのフラグメント、変異体又は誘導体の分子を包含してよい。本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５の蛋白分解性のフラグメント、欠失フラグメント、及び特に動物に送達した場合に作用部位により容易に到達するフラグメントを包含する。ポリペプチドフラグメントはさらにネイティブのポリペプチドの抗原性又は免疫原性のエピトープ、並びに三次元のエピトープを含むポリペプチドの何れかの一部分を包含する。本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは変異体Ｓｐ３５の領域、例えば上記したフラグメント、及び、アミノ酸の置換、欠失又は挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してよい。変異体は対立遺伝子変異体のように天然に存在するものであってよい。「対立遺伝子変異体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有している遺伝子の変形型である。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない変異体は当該分野で知られた突然変異誘発の手法を用いて製造してよい。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失又は付加を含んでよい。本発明の方法で使用するためのＳｐ３５拮抗剤は又、誘導体分子を包含してよい。例えば本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはネイティブのポリペプチド上には存在しないさらなる特徴を示すように改変されているＳｐ３５領域を包含してよい。例には融合蛋白及び蛋白コンジュゲートが包含される。
【００３８】
「ＥｒｂＢ２結合剤」という用語は本明細書においては、何れかのＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチド、ＥｒｂＢ２を認識して特異的に結合する抗体、及び、ＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤は完全長内因性ＥｒｂＢ２に結合するＳｐ３５の能力を抑制、妨害又は低減することができる。更に又、本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤はＥｒｂＢ２のリン酸化状態を増大させることができる。本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤はまた稀突起膠細胞分化を誘導、増進又は増大させるＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチド、ＥｒｂＢ２抗体及びＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００３９】
本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤に言及する場合の「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「類縁体」という用語は、ＥｒｂＢ２に結合し、そしてＥｒｂＢ２活性に影響する、例えばこれを誘導する少なくとも一部の能力を保持している何れかの分子を包含する。本明細書に記載するＥｒｂＢ２結合剤は、ＥｒｂＢ２結合剤がなおその機能を果たす限りにおいて、制限することなくそのフラグメント、変異体又は誘導体の分子を包含してよい。本発明の可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドはＥｒｂＢ２の蛋白分解性のフラグメント、欠失フラグメント、及び特に動物に送達した場合に作用部位により容易に到達するフラグメントを包含する。ポリペプチドフラグメントはさらにネイティブのポリペプチドの抗原性又は免疫原性のエピトープ、並びに三次元のエピトープを含むポリペプチドの何れかの一部分を包含する。本発明の可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは変異体ＥｒｂＢ２の領域、例えば上記したフラグメント、及び、アミノ酸の置換、欠失又は挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してよい。変異体は対立遺伝子変異体のように天然に存在するものであってよい。「対立遺伝子変異体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有している遺伝子の変形型である。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない変異体は当該分野で知られた突然変異誘発の手法を用いて製造してよい。可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失又は付加を含んでよい。本発明の方法で使用するためのＥｒｂＢ２結合剤は又、誘導体分子を包含してよい。例えば本発明の可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドはネイティブのポリペプチド上には存在しないさらなる特徴を示すように改変されているＥｒｂＢ２領域を包含してよい。例には融合蛋白及び蛋白コンジュゲートが包含される。
【００４０】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とはＳｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドの短鎖アミノ酸配列を指す。蛋白フラグメントは「フリースタンディング」であるか又はフラグメントが領域の部分を形成しているより大型のポリペプチド内に含まれていてよい。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例は例えば約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、約１００アミノ酸長を含むフラグメントを包含する。
【００４１】
抗体又は免疫グロブリン。１つの実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤は「抗体」又は「免疫グロブリン」分子、又はその免疫特異的フラグメント、例えば天然に存在する抗体又は免疫グロブリン分子又は抗体分子と同様の態様において抗原に結合する操作された抗体分子又はフラグメントである。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は本明細書においては互換的に使用する。抗体又は免疫グロブリンは少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、そして通常は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系統における基本的な免疫グロブリンの構造は比較的に十分理解されている。例えばＨａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照できる。
【００４２】
後により詳述する通り、「免疫グロブリン」という用語は生化学的に区別できるポリペプチドの５種の広範なクラスを含む。全ての５種のクラスは明らかに本発明の範囲内に包含され、以下の考察は一般的に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するものとなる。ＩｇＧについては、標準的な免疫グロブリン分子は分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、及び、分子量約５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は典型的には「Ｙ」の字型にジスルフィド結合により連結されており、この場合、軽鎖は「Ｙ」の開口部から始まり可変領域全体に渡って連続して重鎖を挟み込む。
【００４３】
軽鎖及び重鎖は両方とも構造的及び機能的に相同な領域に分割される。「定常」及び「可変」という用語は機能的に使用される。この点に関して当然ながら軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）部分の両可変ドメインが抗原認識及び特異性を決定する。逆に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等のような重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの数はそれらが抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から遠位となるほど増大する。Ｎ末端部分は可変領域であり、そしてＣ末端部分は定常領域であり；ＣＨ３及びＣＬドメインは実際はそれぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４４】
軽鎖はカッパ又はラムダ（κ、λ）の何れかに分類される。各重鎖クラスはカッパ又はラムダの軽鎖の何れかに結合してよい。一般的に軽鎖及び重鎖は相互に共有結合し、そして２つの重鎖の「テール」部分は、ハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作された宿主細胞の何れかにより免疫グロブリンが形成される場合に、共有結合のジスルフィド連結、又は非共有結合の連結により相互に結合する。重鎖においては、アミノ酸配列がＹ字型の分岐部末端におけるＮ末端から、各鎖の底部におけるＣ末端に渡っている。当業者の知る通り、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）及びそれらの一部のサブクラス（例えばγ１〜γ４）に分類される。抗体のクラスをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥのそれぞれに決定するものはこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は十分特性化されており、そして機能的特殊化をもたらすことが知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の修飾された型は本明細書の開示を鑑みれば当業者には容易に見当がつくものであり、従って、本発明の範囲に包含される。
【００４５】
上記した通り、可変領域は抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能とするものである。即ち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインは一緒になって３次元の抗原結合部位を定める可変領域を形成する。この第４抗体構造がＹの各アーム部の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位はＶＨ及びＶＬ鎖の各々のうえの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により定められる。一部の場合、例えばラクダ種から誘導された、又は、ラクダ免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子の場合、完全な免疫グロブリン分子は重鎖のみよりなり、軽鎖は含まない。例えばＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照できる。
【００４６】
天然に存在する抗体においては、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」は、抗体が水性の環境においてその三次元の配置をとるときに抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置づけられるアミノ酸の短鎖非隣接配列である。「フレームワーク」領域と称される抗原結合ドメインのアミノ酸の残余は低い分子間変動性を呈する。フレームワーク領域は大半はβシートコンホーメーションを採用しており、そしてＣＤＲはβシート構造に連結する、そして一部の場合はその部分を形成するループを形成する。即ち、フレームワーク領域は鎖間非共有結合の相互作用により正しい方向にＣＤＲを位置づけることができるようにするスカホールドを形成する作用を有する。位置づけられたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を定める。この相補な表面は抗体のその同族体エピトープへの非共有結合的な結合を増進する。それぞれＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むアミノ酸は、それらが厳密に定められているため、当業者であれば所定の重鎖又は軽鎖の可変領域に関して容易に識別することができる（参照により全体が本明細書に組み込まれる「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．等、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照できる）。
【００４７】
しかしながらラクダ種においては、ＶＨＨと称される重鎖可変領域は全ＣＤＲを形成する。ラクダＶＨＨ可変領域と従来の抗体から誘導されたもの（ＶＨ）の間の主な相違は（ａ）ＶＨＨにおける相当する領域と比較した場合のＶＨの軽鎖接触表面におけるより親水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおけるより長いＣＤＲ３、及び（ｃ）ＶＨＨにおけるＣＤＲ１とＣＤＲ３との間のジスルフィド結合の頻繁な発生、を包含する。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は抗体分子の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ少なくとも１つを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも２つを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも３つを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも４つを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも５つを含む。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子は抗体分子１つ以上に由来するＣＤＲ少なくとも６つを含む。発明要件の抗原結合分子に包含できるＣＤＲ少なくとも１つを含む例示抗体分子は当該分野で知られており、そして例示される分子を本明細書に記載する。
【００４９】
本発明の方法において使用するための抗体又はその免疫特異的フラグメントは、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化又はキメラの抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインの何れかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリから製造されるフラグメント、及び、抗特発性（抗Ｉｄ）抗体（例えば本明細書に開示する結合分子に対する抗Ｉｄ抗体を包含する）を包含する。ＳｃＦｖ分子は当該分野で知られており、そして、例えば米国特許、５，８９２，０１９に記載されている。本発明の免疫グロブリン又は抗体分子は何れかの型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスのものであることができる。
【００５０】
単鎖抗体を包含する抗体フラグメントは、可変領域を単独又は以下のもの、即ちヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの全体又は一部分との組み合わせにおいて含んでよい。同様に本発明に包含されるものはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとの可変領域の何れかの組み合わせをやはり含んでいる抗原結合フラグメントである。本明細書に開示する診断及び治療の方法において使用するための抗体又はその免疫特異的フラグメントは鳥類及び哺乳類を包含する何れかの動物起源のものであってよい。好ましくは、抗体はヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリの抗体である。別の実施形態においては、可変領域は軟骨様物質起源であってよい（例えばサメ由来）。本明細書においては、「ヒト」抗体とはヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、そしてヒト免疫グロブリンライブラリから、又は、ヒト免疫グロブリン１つ以上に関してトランスジェニックであり内因性免疫グロブリンを発現しない動物から、後述及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等による米国特許５，９３９，５９８に記載の通り単離された抗体を包含する。
【００５１】
本明細書においては、「重鎖部分」という用語は免疫グロブリン重鎖から誘導されたアミノ酸配列を包含する。重鎖部分を含むポリペプチドはＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば上部、中央及び／又は下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン又はその変異体又はフラグメントの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用するための結合ポリペプチド鎖は、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分及びＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、又はＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含んでよい。別の実施形態においては、本発明のポリペプチド鎖はＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。更に又、本発明において使用するための結合ポリペプチドはＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えばＣＨ２ドメインの全て又は１部分）を欠いていてよい。上記した通り、これらのドメイン（例えば重鎖部分）はそれらがアミノ酸配列において天然に存在する免疫グロブリン分子とは異なるように修飾されていてよいことは当業者の知る通りである。
【００５２】
特定の実施形態においては、本明細書に開示した治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤抗体又はその免疫特異的なフラグメント、多量体のポリペプチド鎖１つの重鎖部分は多量体の第２のポリペプチド鎖上のものと同一である。或いは、本発明の方法において使用するための重鎖部分含有単量体は同一ではない。例えば、各単量体は異なる標的結合部位を含むことにより例えば二重特異性抗体を形成してよい。
【００５３】
本明細書に開示した診断及び治療の方法において使用するための結合ポリペプチドの重鎖部分は異なる免疫グロブリン分子から誘導してよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分はＩｇＧ１分子から誘導したＣＨ１ドメイン及びＩｇＧ３分子から誘導したヒンジ領域を含んでよい。別の例においては、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子から、そして一部はＩｇＧ３分子から誘導したヒンジ領域を含むことができる。別の例においては、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子から、そして一部はＩｇＧ４分子から誘導したキメラヒンジを含むことができる。
【００５４】
本明細書においては、「軽鎖部分」という用語は免疫グロブリン軽鎖から誘導したアミノ酸配列を包含する。好ましくは、軽鎖部分はＶＬ又はＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
【００５５】
免疫グロブリンから誘導されたポリペプチド（例えば免疫グロブリン重鎖部分又は軽鎖部分）の非天然の変異体をコードする単離された核酸分子は、コードされた蛋白ないにアミノ酸の置換、付加又は欠失１つ以上が導入されるように免疫グロブリンのヌクレオチド配列内にヌクレオチドの置換、付加又は欠失１つ以上を導入することにより作成できる。突然変異は標準的な手法、例えば部位指向性突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入してよい。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は非必須アミノ酸残基１つ以上において行う。
【００５６】
本明細書に開示した治療方法において使用するための抗体又はその免疫特異的フラグメントは又本発明のポリペプチドへのそれらの結合親和性の点において説明又は特定してよい。好ましい結合親和性は５ｘ１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５ｘ１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５ｘ１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５ｘ１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５ｘ１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５ｘ１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５ｘ１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５ｘ１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５ｘ１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５ｘ１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５ｘ１０−１５Ｍ又は１０−１５Ｍ未満の解離定数即ちＫｄを有するものを包含する。
【００５７】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５抗体又はその免疫特異的フラグメントはＳｐ３５の拮抗剤として作用する。例えば本発明の方法において使用するためのＳｐ３５抗体は拮抗剤として機能することによりＳｐ３５ポリペプチドの抑制的活性をブロック又は抑制してよい。
【００５８】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメントはＥｒｂＢ２に結合し、そして特定の実施形態においては、例えばＥｒｂＢ２のリン酸化状態を増大させること、および、稀突起膠細胞分化を増進することにより、ＥｒｂＢ２機能に影響を与える。ＥｒｂＢ２はシグナルトランスダクションの間にリン酸化されることが知られている。ＥｒｂＢ２のリン酸化状態（例えばＳｅｒ１１１３残基における）は従って、シグナリング経路に関するリードアウトとして使用できる。チロシン１５残基８７７及び１２４８のリン酸化もまたシグナリング試験におけるリードアウトとして使用できる。これらの残基のリン酸化はＥｒｂＢ２活性化を示す。ＥｒｂＢ２とそれが相互作用する因子（例えばＳｐ３５）との間の結合相互作用もまた細胞系試験の使用を介して実施できる。更に又、特定の実施形態においては、ＥｒｂＢ２のリン酸化はＳｐ３５とのその相互作用をブロック、低減又は防止することにより増大される。
【００５９】
本明細書においては、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域又は部位が第１の種から得られるか誘導されており、そして定常領域（これは未損傷、部分又は本発明により修飾されていてよい）が第２の種から得られている何れかの抗体を意味するものとする。好ましい実施形態においては、標的結合領域又は部位は非ヒト原料（例えばマウスまたは霊長類）に由来するものとなり、そして、定常領域はヒトである。
【００６０】
本明細書においては、「操作された抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖の何れか又は両方の可変ドメインが特異性既知の抗体由来のＣＤＲ１つ以上の少なくとも部分的な置き換えにより、そして必要に応じて部分的なフレームワーク領域置き換え及び配列変化により改変されている抗体を指す。ＣＤＲはフレームワーク領域の誘導元と同じクラス、更には同じサブクラスの抗体から誘導してよいが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体から、そして好ましくは異なる種の抗体から誘導されることが想定される。特異性既知の非ヒト抗体由来の「ドナー」ＣＤＲ１つ以上がヒト重鎖又は軽鎖フレームワーク領域にグラフトされている操作された抗体は、本明細書においては、「ヒト化抗体」と称する。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のものに移行させるためにはドナーの可変領域由来の完全なＣＤＲでＣＤＲの全てを置き換える必要はない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移行させることのみ必要である。これは例えば米国特許５，５８５，０８９、５，６９３，７６１、５，６９３，７６２及び６，１８０，３７０に記載されている説明に基づけば、日常的実験を実施することによるか、又は機能的に操作された、又はヒト化された抗体を得るための試行錯誤の試験により、当業者には可能なことである。
【００６１】
本明細書においては、「連結された」、「融合された」又は「融合」という用語は互換的に使用される。これらの用語は化学的コンジュゲーション又は組み換え手段を包含するいかなる手段による場合であっても、２つ以上のエレメント又は成分がともに連結されることを指す。「インフレーム融合」とは、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元のＯＲＦの正しい読み枠を維持するような態様において、連結されることにより連続するより長いＯＲＦが形成されることを指す。即ち、結果として生じる組み換え融合蛋白は元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに相当する２つ以上のセグメントを含有する単一の蛋白である（このようなセグメントは通常は天然にはそのように連結されない）。読み枠はこのようにして融合セグメントに渡って連続するように形成されるが、セグメントは例えばインフレームのリンカー配列により物理的又は空間的に分離されていてよい。
【００６２】
ポリペプチドに関する場合、「線状配列」又は「配列」とは配列内で相互に隣りあう残基がポリペプチドの一次構造において隣接しているアミノ末端からカルボキシ末端の方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序である。
【００６３】
「発現」という用語は本明細書においては生化学物質、例えばＲＮＡ又はポリペプチドを遺伝子が生産するプロセスを指す。プロセスは、限定しないが、遺伝子ノックダウン並びに一過性の発現及び安定な発現の両方を包含する、細胞内の遺伝子の機能的存在の何れかの顕在化を包含する。それには、限定しないが、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は何れかの他のＲＮＡ産物への転写、及び、そのようなｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳が包含される。最終的に所望の生成物が生化学的物質である場合は、発現はその生化学的物質及び何れかの前駆体の形成を包含する。
【００６４】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳類」とは、それに対する診断、予後、又は治療が望まれる何れかの対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象は限定しないが、ヒト、家畜動物、牧場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、雄ウシ、雌ウシ；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン及びチンパンジー；イヌ類、例えばイヌ及びオオカミ；ネコ類、例えばネコ、ライオン及びトラ；ウマ類、例えばウマ、ロバ及びシマウマ；食用動物、例えばウシ、ブタ及びヒツジ；有蹄動物、例えばシカ及びキリン；げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター及びモルモット等を包含する。特定の実施形態においては、哺乳類はヒト対象である。
【００６５】
「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」という用語はｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシング又は低減を指す。これはサイレンシングされる配列に対して自身のデュプレックス領域において相同なｓｉＲＮＡにより開始される動物および植物における配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は生物にとって内因性又は外因性であるか、染色体内に組み込まれて存在するか、又はゲノム内に組み込まれないトランスフェクションベクター中に存在してよい。遺伝子の発現は完全か又は部分的かの何れかで抑制される。ＲＮＡｉはまた標的ＲＮＡの機能を抑制するとも考えてよく；標的ＲＮＡの機能は完全又は部分的であってよい。
【００６６】
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１／ＬＲＲＮ６）
本発明はＳｐ３５の拮抗剤が稀突起膠細胞の生存、増殖及び分化を増進することによりその数を増大させるという発見に基づいている。更に又、本発明者等はＳｐ３５の拮抗剤がニューロンの髄鞘形成を増進することも発見している。理論に制約されないが、Ｓｐ３５拮抗剤によりもたらされる髄鞘形成増進活性は稀突起膠細胞増殖に対する作用とは別個であると考えられる。
【００６７】
天然に存在するヒトＳｐ３５は６１４アミノ酸よりなるグリコシル化された神経系特異的な蛋白である（図１；配列番号２）。ヒトＳｐ３５ポリペプチドは１４ロイシンリッチリピート（Ｎ末端及びＣ末端キャップを包含する）、Ｉｇドメイン、膜貫通領域及び細胞質ドメインを含有する（図２）。細胞質ドメインはカノニカルなチロシンリン酸化部位を含有する。更に又、天然に存在するＳｐ３５蛋白はシグナル配列、ＬＲＲＣＴとＩｇドメインの間の短鎖塩基性領域及びＩｇドメインと細胞質ドメインの間の膜貫通領域を含有する（図２）。ヒトＳｐ３５遺伝子は６つのさらなるアミノ酸（ＭＱＶＳＫＲ；配列番号５）がＳｐ３５シグナル配列のＮ末端に存在してもしなくてもよいように、代替翻訳開始コドンを含有する。表１は図１の配列に基づいたアミノ酸残基番号に従ったＳｐ３５ドメイン及び他の領域を列挙したものである。
【００６８】
【表１】
2009518299.tif 000002
Ｓｐ３５の組織分布及び発達段階の発現はヒト及びラットにおいて研究されている。Ｓｐ３５の生物学的特徴は実験動物（ラット）モデルにおいて研究されている。ラットＳｐ３５の発現はノーザンブロット及び免疫組織化学的染色により測定した場合、神経系のニューロン及び脳の稀突起膠細胞に局在している。ラットＳｐ３５ｍＲＮＡ発現レベルは発達的に調節され、出生直後、即ち、生後約第１日にピークとなる。ラット脊髄横断傷害モデルにおいて、Ｓｐ３５はＲＴ−ＰＣＲで測定した場合に傷害部位においてアップレギュレートされている。更に又、Ｓｐ３５はＮｏｇｏ６６受容体（Ｎｏｇｏ受容体）と相互作用することがわかっている。例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２を参照できる。しかしながらＮｏｇｏ受容体−１は稀突起膠細胞において発現されず、そして稀突起膠細胞の生物学的特性に対するＳｐ３５の如何なる影響もＮｏｇｏ受容体非依存の経路により生じなければならない。
【００６９】
Ｉ型膜貫通受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーはＥＧＦ受容体及びニューレグリンＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４を包含する。Ｃｉｔｒｉ等、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２８４：５４−６５（２００３）。ニューレグリン結合はＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４とのＥｒｂＢ２のヘテロ２量体化とその後のチロシル自己リン酸化及びシグナリングカスケードの活性化を誘導する。上記参照。脂質ラフトへのＥｒｂＢ２受容体の転座が受容体活性化のためには必要である。Ｎａｇｙ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）及びＭａ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３１６４−３１７５（２００３）を参照できる。稀突起膠細胞においては、ニューレグリンは稀突起膠細胞増殖、遊走及びＣＮＳ軸索の髄鞘形成を調節する。Ｖａｒｔａｎｉａｎ等、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１６２６−１１６３０（１９９４）；Ｐａｒｋ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５４：１２４５−１２５８（２００１）；Ｋｉｍ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５５６１−５５７１（２００３）；及びＳｕｓｓｍａｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：５７５７−５７６２（２００５）を参照できる。ＥｒｂＢ２は又ＨＥＲ２又はｎｅｕとしても知られている。
【００７０】
Ｓｐ３５拮抗剤及びＥｒｂＢ２結合剤を用いた治療方法
本発明の１つの実施形態は髄鞘発育不全又は脱髄に関連する疾患、障害又は傷害、例えば多発性硬化症に罹患している動物におけるそのような疾患を治療するための方法を提供し、方法は、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤、又は、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び該ＥｒｂＢ２結合剤２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤の有効量を動物に投与することを含むか、本質的にそれよりなるか、又はそれよりなる。
【００７１】
更に又、本発明は可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤、又は、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び該ＥｒｂＢ２結合剤２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤の治療有効量を投与することを含むか、本質的にそれよりなるか、又はそれよりなる哺乳類におけるニューロンの髄鞘形成を増進するための方法に関する。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、稀突起膠細胞の死滅又は分化の欠如に関連する疾患、障害又は傷害、例えば多発性硬化症、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、又は球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）に罹患した動物におけるそのような疾患を治療するための方法を提供し、方法は、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤、又は、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び該ＥｒｂＢ２結合剤２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤の有効量を動物に投与することを含むか、本質的にそれよりなるか、又はそれよりなる。
【００７３】
本発明の別の特徴は可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドよりなる群から選択されるＳｐ３５拮抗剤、又は、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び該ＥｒｂＢ２結合剤２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤の治療有効量を投与することを含むか、本質的にそれよりなるか、又はそれよりなる哺乳類における稀突起膠細胞の分化を増進するための方法を包含する。
【００７４】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤、例えば可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド、又は、ＥｒｂＢ２結合剤、例えば可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチドは稀突起膠細胞によるニューロンの髄鞘形成を負の方向に調節するＳｐ３５の能力を停止、低減、防止又は抑制する治療薬として製造し、使用することができる。更に又、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は、稀突起膠細胞の分化、増殖及び生存を負の方向に調節するＳｐ３５及び／又はＥｒｂＢ２の能力を停止、低減、防止又は抑制する治療薬として製造し、使用することができる。
【００７５】
本発明の別の実施形態は軸索伸長の抑制を低減し、そして髄鞘形成を増進するために十分な量において、稀突起膠細胞又はミエリンの破壊が関与する疾患、障害又は傷害の部位又はその近傍における哺乳類への投与を含むそのような疾患、障害又は傷害を治療するための稀突起膠細胞の増殖又は生存を誘導する方法を包含する。
【００７６】
特定の実施形態においては、上記した方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤はＳｐ３５の完全長又は内因性のＥｒｂＢ２結合を抑制することができる、及び／又は、稀突起膠細胞分化を増大させることができる、及び／又は、ＥｒｂＢ２リン酸化を増大させることができるものである。
【００７７】
本発明の方法において、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２は、患者への可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体、Ｓｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び該ＥｒｂＢ２結合剤２つ以上の組み合わせの直接の投与を介して投与できる。或いは、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は特異的Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤を生産する発現ベクターを介して投与できる。本発明の特定の実施形態においては、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は、（１）Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤を発現する核酸、例えばベクターで移植可能な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすること；及び（２）疾患、障害又は傷害の部位において哺乳類内に形質転換された宿主細胞を移植すること、を包含する治療方法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞はＭＳの慢性病巣に移植できる。本発明の一部の実施形態においては、移植可能な宿主細胞を哺乳類から摘出し、一時的に培養し、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤をコードする単離された核酸で形質転換又はトランスフェクトし、そして摘出元の同じ哺乳類に移植し戻す。細胞は必須ではないがそれを移植する部位と同じところから摘出することができる。そのような実施形態は場合によりエクスビボ遺伝子療法として知られており、限定された期間、作用部位に局在させたＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤の連続的適用を可能にする。
【００７８】
本発明の特定の実施形態においては、本明細書に記載するＳｐ３５拮抗剤及びＥｒｂＢ２結合剤は、本発明の方法において、組み合わせて、即ち一緒に使用される。
【００７９】
本発明の方法により治療又は緩解されてよい疾患又は障害は、哺乳類ニューロンの髄鞘発育不全又は脱髄に関連する疾患、障害又は傷害を包含する。特にニューロンを包囲するミエリンが不在、不完全、適切に形成されていない、又は、崩壊している疾患及び障害である。そのような疾患は、限定しないが、多発性硬化症（ＭＳ）、例えばＭＳの回帰性再発性、二次進行性及び原発進行性の形態；進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、ウォーラー変性、視神経炎及び横断脊髄炎を包含する。
【００８０】
本発明の方法により治療又は緩解されてよい疾患又は障害は、稀突起膠細胞の死滅又は増殖又は分化の消失に関連する疾患、障害又は傷害を包含する。そのような疾患は、限定しないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）及びウォーラー変性を包含する。
【００８１】
本発明の方法により治療又は緩解されてよい疾患又は障害は、神経変性の疾患又は障害を包含する。そのような疾患は、限定しないが、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病及びパーキンソン病を包含する。
【００８２】
本発明の方法により治療又は緩解されてよいさらなる疾患、障害又は傷害の例は、限定しないが、脊髄傷害、慢性の骨髄障害又は神経根障害、外傷性脳傷害、運動ニューロン疾患、軸索切断、打撲、麻痺、放射線照射後の損傷又は化学療法後の他の神経学的合併症、大型裂孔、中〜大血管閉塞、ロイコアリオーシス（ｌｅｕｋｏａｒｉａｏｓｉｓ）、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏（孤立性欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシン−ペラグラ）、チアミン、葉酸、ニコチン酸の欠乏症、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ベル麻痺又は軸索の再生、再髄鞘形成又は稀突起膠細胞の生存又は分化／増殖を要する何れかの神経傷害、又は、成熟稀突起膠細胞を低減する、又は患者における髄鞘形成が低減される何れかの疾患を包含する。
【００８３】
Ｓｐ３５拮抗剤及びＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）結合剤
ＥｒｂＢ２受容体の蛋白配列はアクセッション番号ＡＡＡ７５４９３としてＧｅｎｂａｎｋに存在し、そして、以下の通り再生される。
【００８４】
【化２】
2009518299.tif 000003
【００８５】
【化３】
2009518299.tif 000004
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ７５４９３のＥｒｂＢ２受容体蛋白をコードする相当するヌクレオチド配列は以下の通り再生され、そしてＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１１７３０を有する。
【００８６】
【化４】
2009518299.tif 000005
【００８７】
【化５】
2009518299.tif 000006
ＧｅｎｂａｎｋのＥｒｂＢ２蛋白配列のほかに、ＥｒｂＢ２受容体については変異体の蛋白配列が存在する。以下の蛋白はＧｅｎｂａｎｋの配列とは異なるＥｒｂＢ２の変異体配列である。
【００８８】
【化６】
2009518299.tif 000007
【００８９】
【化７】
2009518299.tif 000008
別のヒトＥｒｂＢ２受容体蛋白及び変異体の配列は以下のアクセッション番号、即ちＢＡＥ１５９６０、ＢＡＥ１５９５９、ＡＡＦ３０２９５、ＰＯ４６２６、ＮＰ００１００５８６２、ＮＰ００４４３９、ＮＰ０６１１６５を有するものがＧｅｎｂａｎｋに存在し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）変異体受容体をコードする相当するヌクレオチド配列は以下の通り再生される。
【００９１】
【化８】
2009518299.tif 000009
【００９２】
【化９】
2009518299.tif 000010
本発明の方法において、Ｓｐ３５拮抗剤は、本明細書に記載するＳｐ３５拮抗剤を含む組成物に稀突起膠細胞を接触することを含むＥｒｂＢ２ポリペプチドへのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制するために使用できる。
【００９３】
本発明の別の方法はＳｐ３５拮抗剤に稀突起膠細胞を接触させることによるＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させる方法を包含する。本明細書に記載する全てのＳｐ３５拮抗剤を本発明の方法において使用してよい。
【００９４】
本発明の１つの実施形態は、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該ＥｒｂＢ２結合剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含むＥｒｂＢ２ポリペプチドとのＳｐ３５ポリペプチドの結合を抑制するための方法を提供する。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該ＥｒｂＢ２結合剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択される、Ｓｐ３５のＥｒｂＢ２結合を抑制又は低減することができる、及び／又は、稀突起膠細胞の分化を増大させることができるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞を接触させることを含むＥｒｂＢ２リン酸化を増大させるための方法を包含する。
【００９６】
本発明の他の特徴は、（ｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド；（ｉｉ）ＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメント；（ｉｉｉ）可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）該ＥｒｂＢ２結合剤の２つ以上の組み合わせよりなる群から選択されるＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物の有効量に稀突起膠細胞先祖細胞を接触させることを含む稀突起膠細胞の分化を増大させるための方法を包含する。
【００９７】
本明細書に開示する方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤、例えば可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド、ＥｒｂＢ２抗体又は可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチドは、ＥｒｂＢ２シグナリングを介して稀突起膠細胞分化を負の方向に調節するＳｐ３５の能力を停止、低減、防止又は抑制する治療薬として製造し、使用することができる。
【００９８】
本明細書に記載する全てのＥｒｂＢ２結合剤を本発明の方法において使用してよい。
【００９９】
本発明の方法により治療又は緩解されてよい疾患又は障害は、稀突起膠細胞の分化の消失に関連する疾患、障害又は傷害を包含する。そのような疾患は、限定しないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレグザンダー病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）及びウォーラー変性を包含する。
【０１００】
本発明の方法により治療又は緩解されてよい疾患又は障害は、神経変性の疾患又は障害を包含する。そのような疾患は、限定しないが、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病及びパーキンソン病を包含する。
【０１０１】
本発明の方法により治療又は緩解されてよいさらなる疾患、障害又は傷害の例は、限定しないが、脊髄傷害、慢性の骨髄障害又は神経根障害、外傷性脳傷害、運動ニューロン疾患、軸索切断、打撲、麻痺、放射線照射後の損傷又は化学療法後の他の神経学的合併症、大型裂孔、中〜大血管閉塞、ｌｅｕｋｏａｒｉａｏｓｉｓ、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏（孤立性欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシン−ペラグラ）、チアミン、葉酸、ニコチン酸の欠乏症、マルキアファーヴァ−ビニャーミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ベル麻痺又は軸索の再生、再髄鞘形成又は稀突起膠細胞の生存又は分化／増殖を要する何れかの神経傷害を包含する。
【０１０２】
稀突起膠細胞は本明細書に記載するＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤を含む種々の組成物にインビボ又はインビトロで接触させて良い。インビボの接触は稀突起膠細胞への組成物の直接の投与を包含してよく、或いは、組成物及び／又はＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は本明細書に記載した形質転換又はトランスフェクトした稀突起膠細胞又は近隣の細胞（即ちニューロン）により生産されてよい。Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤を含む組成物及びＳｐ３５拮抗剤を含む組成物の投与経路は本明細書に記載する通りである。
【０１０３】
本発明の方法において、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチド、Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２抗体又はＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドの患者への直接の投与を介して投与できる。あるいは、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤、例えば可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特異的なＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤を生産する発現ベクターを介して投与できる。本発明の特定の実施形態においては、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は、（１）Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤を発現する核酸、例えばベクターで移植可能な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすること；及び（２）疾患、障害又は傷害の部位において哺乳類内に形質転換された宿主細胞を移植すること、を包含する治療方法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞はＭＳの慢性病巣に移植できる。本発明の一部の実施形態においては、移植可能な宿主細胞を哺乳類から摘出し、一時的に培養し、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤をコードする単離された核酸で形質転換又はトランスフェクトし、そして摘出元の同じ哺乳類に移植し戻す。細胞は必須ではないがそれを移植する部位と同じところから摘出することができる。そのような実施形態は場合によりエクスビボ遺伝子療法として知られており、限定された期間、作用部位に局在させたＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤の連続的適用を可能にする。
【０１０４】
本発明のＳｐ３５拮抗剤は本明細書に記載したＳｐ３５拮抗剤、即ち、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；Ｓｐ３５拮抗剤抗体；及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドを包含し、これらはＥｒｂＢ２ポリペプチドとの天然に存在するＳｐ３５ポリペプチドの相互作用及び／又は結合をブロック、抑制又は妨害するものである。本発明の方法において使用するための本明細書に記載したＳｐ３５拮抗剤はＳｐ３５の拮抗剤及びＳｐ３５／ＥｒｂＢ２相互作用の拮抗剤の両方であってよい。例えば可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５拮抗剤抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドはＥｒｂＢ２ポリペプチドとの天然に存在するＳｐ３５ポリペプチドの相互作用及び／又は結合をブロック、抑制又は妨害することにより、Ｓｐ３５の生物学的な機能をブロック、抑制又は妨害するものであってよい。より詳細には、本明細書に記載したＳｐ３５拮抗剤は、ＥｒｂＢ２とのＳｐ３５の結合又は相互作用を抑制することにより、稀突起膠細胞の生存、増殖又は分化及び／又は軸索の髄鞘形成の負の方向の調節に関与するＳｐ３５の天然の機能を抑制してよい。
【０１０５】
更に又、本発明のＳｐ３５拮抗剤（即ち、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；Ｓｐ３５拮抗剤抗体；及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド）はＳｐ３５／ＥｒｂＢ２相互作用ではなくＳｐ３５の特定の生物学的機能の拮抗剤であってよい。例えば可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５拮抗剤抗体及びＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドは、Ｓｐ３５の生物学的機能をブロック、抑制又は妨害するが、ＥｒｂＢ２ポリペプチドとの天然に存在するＳｐ３５ポリペプチドの相互作用及び／又は結合をブロック及び妨害することはないものであってよい。より詳細には、本明細書に記載したＳｐ３５拮抗剤は稀突起膠細胞の生存、増殖又は分化及び／又は軸索の髄鞘形成の負の方向の調節に関与するＳｐ３５の天然の機能を抑制してよいが、ＥｒｂＢ２とのＳｐ３５ポリペプチドの結合又は相互作用は抑制しない。
【０１０６】
更に又本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、本明細書に記載した可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体は、本明細書及び参照により本明細書に組み込まれる２００６年７月７日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２６２７１に記載のＳｐ３５特異的抗体又は抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含する。更に又、本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドは本明細書に記載したＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチドを包含する。
【０１０７】
更に又、本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤は、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド、ＥｒｂＢ２抗体及び可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＥｒｂＢ２ポリヌクレオチドを包含する。本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチドは本明細書に記載する可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２抗体は本明細書に記載するＳｐ３５特異的抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体（例えばＬ２６）を包含する。
【０１０８】
特定の実施形態においては、上記した方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤はＳｐ３５の完全長又は内因性ＥｒｂＢ２結合を抑制又は低減することができる、及び／又は、稀突起膠細胞分化を増大することができる、及び／又は、ＥｒｂＢ２リン酸化を増大することができるものである。
【０１０９】
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド
本発明のＳｐ３５拮抗剤は天然に存在するＳｐ３５の生物学的機能をブロック、抑制又は妨害するポリペプチドを包含する。特に、本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。上記表１はＳｐ３５ポリペプチドの種々のドメインを記載している。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５ポリペプチドの細胞内及び膜貫通ドメインを欠いている。例えば、特定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５の膜貫通ドメインを含むアミノ酸５５２〜５７６及び／又はＳｐ３５の細胞内ドメインを含むアミノ酸５７７〜６１４を欠いている。更に又、特定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５ポリペプチドのＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、塩基性領域及び／又は全細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸３４〜５３２に相当）を含む。当業者の知る通り、Ｓｐ３５の全細胞外ドメインは細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端又はＮ末端の何れかに追加分又はより少ないアミノ酸を含んでよい。即ち、本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、限定しないが、配列番号２のアミノ酸４１〜５２５；配列番号２の４０〜５２６；配列番号２の３９〜５２７；配列番号２の３８〜５２８；配列番号２の３７〜５２９；配列番号２の３６〜５３０；配列番号２の３５〜５３１；配列番号２の３４〜５３１；配列番号２の４６〜５２０；配列番号２の４５〜５２１；配列番号２の４４〜５２２；配列番号２の４３〜５２３；配列番号２の４２〜５２４又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。Ｓｐ３５ポリペプチド拮抗剤は表１に記載したドメインの何れかの組み合わせを包含してよい。
【０１１０】
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、限定しないが、配列番号２のアミノ酸１〜３３；配列番号２の１〜３５；配列番号２の３４〜６４；配列番号２の３６〜６４；配列番号２の６６〜８９；配列番号２の９０〜１１３；配列番号２の１１４〜１３７；配列番号２の１３８〜１６１；配列番号２の１６２〜１８５；配列番号２の１８６〜２０９；配列番号２の２１０〜２３３；配列番号２の２３４〜２５７；配列番号２の２５８〜２８１；配列番号２の２８２〜３０５；配列番号２の３０６〜３２９；配列番号２の３３０〜３５３；配列番号２の３６３〜４１６；配列番号２の４１７〜４２４；配列番号２の４１９〜４９３；及び配列番号２の４９４〜５５１又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。
【０１１１】
本発明の方法において使用するための別の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、限定しないが、配列番号２のアミノ酸１〜３３；配列番号２の１〜３５；配列番号２の１〜６４；配列番号２の１〜８９；配列番号２の１〜１１３；配列番号２の１〜１３７；配列番号２の１〜１６１；配列番号２の１〜１８５；配列番号２の１〜２０９；配列番号２の１〜２３３；配列番号２の１〜２５７；配列番号２の１〜２８１；配列番号２の１〜３０５；配列番号２の１〜３２９；配列番号２の１〜３５３；配列番号２の１〜４１６；配列番号２の１〜４２４；配列番号２の１〜４９３；配列番号２の１〜５５１；配列番号２の１〜５３１及び配列番号２の１〜５３２又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。
【０１１２】
本発明の方法において使用するための更に別の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、限定しないが、配列番号２のアミノ酸３４〜６４；配列番号２の３４〜８９；配列番号２の３４〜１１３；配列番号２の３４〜１３７；配列番号２の３４〜１６１；配列番号２の３４〜１８５；配列番号２の３４〜２０９；配列番号２の３４〜２３３；配列番号２の３４〜２５７；配列番号２の３４〜２８１；配列番号２の３４〜３０５；配列番号２の３４〜３２９；配列番号２の３４〜３５３；配列番号２の３４〜４１６；配列番号２の３４〜４２４；配列番号２の３４〜４９３；及び配列番号２の３４〜５５１又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。
【０１１３】
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、限定しないが、配列番号２のアミノ酸３４〜５３０；配列番号２の３４〜５３１；配列番号２の３４〜５３２；配列番号２の３４〜５３３；配列番号２の３４〜５３４；配列番号２の３４〜５３５；配列番号２の３４〜５３６；配列番号２の３４〜５３７；配列番号２の３４〜５３８；配列番号２の３４〜５３９；配列番号２の３０〜５３２；配列番号２の３１〜５３２；配列番号２の３２〜５３２；配列番号２の３３〜５３２；配列番号２の３４〜５３２；配列番号２の３５〜５３２；配列番号２の３６〜５３２；配列番号２の３０〜５３１；配列番号２の３１〜５３１；配列番号２の３２〜５３１；配列番号２の３３〜５３１；配列番号２の３４〜５３１；配列番号２の３５〜５３１；及び配列番号２の３６〜５３１又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。
【０１１４】
本発明の方法において使用するための更に別の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、限定しないが、配列番号２のアミノ酸３６〜６４；配列番号２の３６〜８９；配列番号２の３６〜１１３；配列番号２の３６〜１３７；配列番号２の３６〜１６１；配列番号２の３６〜１８５；配列番号２の３６〜２０９；配列番号２の３６〜２３３；配列番号２の３６〜２５７；配列番号２の３６〜２８１；配列番号２の３６〜３０５；配列番号２の３６〜３２９；配列番号２の３６〜３５３；配列番号２の３６〜４１６；配列番号２の３６〜４２４；配列番号２の３６〜４９３；及び配列番号２の３６〜５５１又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。
【０１１５】
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、限定しないが、配列番号２のアミノ酸３６〜５３０；配列番号２の３６〜５３１；配列番号２の３６〜５３２；配列番号２の３６〜５３３；配列番号２の３６〜５３４；配列番号２の３６〜５３５；配列番号２の３６〜５３６；配列番号２の３６〜５３７；配列番号２の３６〜５３８；及び配列番号２の３６〜５３９又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。
【０１１６】
さらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、そのフラグメント、変異体又は誘導体はＳｐ３５のＩｇドメインを含むポリペプチドを包含する。例えば、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３；配列番号２の４１７〜４９４；配列番号２の４１７〜４９５；配列番号２の４１７〜４９６；配列番号２の４１７〜４９７；配列番号２の４１７〜４９８；配列番号２の４１７〜４９９；配列番号２の４１７〜５００；配列番号２の４１７〜４９２；配列番号２の４１７〜４９１；配列番号２の４１２〜４９３；配列番号２の４１３〜４９３；配列番号２の４１４〜４９３；配列番号２の４１５〜４９３；配列番号２の４１６〜４９３；配列番号２の４１１〜４９３；配列番号２の４１０〜４９３；配列番号２の４１０〜４９４；配列番号２の４１１〜４９４；配列番号２の４１２〜４９４；配列番号２の４１３〜４９４；配列番号２の４１４〜４９４；配列番号２の４１５〜４９４；配列番号２の４１６〜４９４；配列番号２の４１７〜４９４；及び配列番号２の４１８〜４９４又はこのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドである。
【０１１７】
本発明の方法において使用するための追加的可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５のＩｇドメインを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド、又はそのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。特に、以下のポリペプチド配列、即ちＩＴＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１０）、ＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１１）、ＶＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１２）及びＳＰＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１３）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるポリペプチドであり、ここでＸ１はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｘ２はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、そしてＸ３はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンである。例えば、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン拮抗剤ペプチドは、以下のポリペプチド配列、即ち
【０１１８】
【化１０】
2009518299.tif 000011
を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるポリペプチドを包含する。これらの可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５のＩｇドメイン内に塩基性の「ＲＫＨループ」（アルギニン−リジン−ヒスチジンアミノ酸４５６〜４５８）を包含する。この塩基性のトリペプチドはネイティブのＳｐ３５ポリペプチドへの可溶性Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド結合のために重要であると考えられている。塩基性トリペプチドを包含するさらなるな可溶性Ｓｐ３５ペプチドはＩＴＰＫＲＲ（配列番号４４）、ＡＣＨＨＫ（配列番号４５）及びＶＣＨＨＫ（配列番号４６）である。
【０１１９】
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５のＩｇドメインを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド、又は、そのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。特に以下のポリペプチド配列、即ちＸ４Ｘ５ＲＫＨ（配列番号４７）、Ｘ４Ｘ５ＲＲＲ（配列番号４８）、Ｘ４Ｘ５ＫＫＫ（配列番号４９）、Ｘ４Ｘ５ＨＨＨ（配列番号５０）、Ｘ４Ｘ５ＲＫＫ（配列番号５１）、Ｘ４Ｘ５ＲＫＲ（配列番号５２）、Ｘ４Ｘ５ＫＫＨ（配列番号５３）、Ｘ４Ｘ５ＨＫＨ（配列番号５４）、Ｘ４Ｘ５ＲＲＨ（配列番号９７）及びＸ４Ｘ５ＲＨＨ（配列番号５５）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるペプチドであり、ここでＸ４は何れかのアミノ酸であり、そしてＸ５は何れかのアミノ酸である。
【０１２０】
他の実施形態において、本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５のＩｇドメインのペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド、又は、そのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。特に以下のポリペプチド配列、即ちＩＴＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号５６）、ＡＣＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号５７）、ＶＣＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号５８）及びＳＰＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号５９）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるポリペプチドであり、ここでＸ６はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｘ７は何れかのアミノ酸であり、そしてＸ８はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンである。例えば、Ｓｐ３５  Ｉｇドメイン拮抗剤ペプチドは以下のポリペプチド配列、即ちＳＰＲＬＨ（配列番号６０）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるポリペプチドを包含する。
【０１２１】
本発明の他の実施形態においては、本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５のＩｇドメインのアミノ酸４５２〜４５８を含有するペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチド又はその誘導体を包含し、ここでアミノ酸４５２はトリプトファン又はフェニルアラニン残基である。
【０１２２】
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５の塩基性ドメインのペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。特に、以下のポリペプチド配列、即ち、ＲＲＡＲＩＲＤＲＫ（配列番号６１）、ＫＫＶＫＶＫＥＫＲ（配列番号６２）、ＲＲＬＲＬＲＤＲＫ（配列番号６３）、ＲＲＧＲＧＲＤＲＫ（配列番号６４）及びＲＲＩＲＡＲＤＲＫ（配列番号６５）を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるペプチドが挙げられる。
【０１２３】
種々の例示される可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド及び本発明を実施するためにこれらの分子を得るための方法及び材料は以下に記載する通りであり、及び／又は、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８２３２に記載されている。
【０１２４】
本明細書に記載した本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは環状であってよい。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの環化は線状ペプチドのコンホーメーション的自由度を低減させ、より構造的に制約された分子をもたらす。ペプチド環化の多くの方法が当該分野で知られている。例えばペプチドのＮ末端及びＣ末端のアミノ酸残基の間のアミド結合の形成による「骨格から骨格へ」の環化がある。「骨格から骨格へ」の環化の方法はω−チオアミノ酸残基（例えばシステイン、ホモシステイン）２つの間のジスルフィド架橋の形成を包含する。本発明の特定の可溶性Ｓｐ３５ペプチドは環状Ｓｐ３５ポリペプチドを形成するためのペプチドのＮ及びＣ末端上での修飾を包含する。そのような修飾は限定しないが、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分及びビオチンを有するシステイン残基が包含される。ペプチド環化の他の方法は参照により全体が本明細書に組み込まれるＬｉ  ＆  Ｒｏｌｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）に記載されている。
【０１２５】
本明細書に記載する本発明の方法において使用するための環状Ｓｐ３５ポリペプチドは限定されないが、Ｃ１ＬＳＰＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｃ２（配列番号６６）を包含し、ここでＸ９はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｘ１０はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｘ１１はリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｃ１は場合により結合した環化増進部分（例えばアセチル基又はビオチン）を有し、そしてＣ２は場合により結合した環化増進部分（例えばＮＨ２部分）を有する。
【０１２６】
本明細書に記載した可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは置換、挿入又は欠失のような種々の改変を有してよい。例えば、置換は、限定しないが、以下の置換、即ち配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの６位のバリンからメチオニン；配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの２９４位のセリンからグリシン；配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの３４８位のバリンからアラニン；Ｓｐ３５ポリペプチドの４１９位のアルギニンからヒスチジン；４５６位のアルギニンからグルタミン酸；及び配列番号２の４５８位のヒスチジンからバリンを包含する。
【０１２７】
本明細書に記載する配列番号２のポリペプチドに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの相当するフラグメントもまた意図される。
【０１２８】
当該分野で知られる通り、２ポリペプチド間の「配列同一性」とは１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本明細書において考察する場合は、何れかのポリペプチドが他のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるかどうかは、当該分野で知られている方法及びコンピュータープログラム／ソフトウエア、例えば限定しないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて決定できる（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）。ＢＥＳＴＦＩＴは２配列間の相同性最高セグメントを発見するためにＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムを使用している。ＢＥＳＴＦＩＴ又は特定の配列が例えば本発明によるレファレンス配列に９５％同一であるかどうかを決定するための何れかの他の配列アライメントプログラムを使用する場合は、パラメーターは当然ながら、同一性のパーセンテージがレファレンスポリペプチド配列の完全長に渡って計算されるように、そして、レファレンス配列におけるアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが容認されるように、設定される。
【０１２９】
本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは２つ以上の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの何れかの組み合わせを包含してよい。
【０１３０】
可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチド
本発明のＥｒｂＢ２結合剤はＥｒｂＢ２に結合するＳｐ３５の能力をブロック、抑制又は妨害する、及び／又は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を誘導する、及び／又は、稀突起膠細胞の分化を増進するポリペプチドを包含する。特に、本発明の可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドはＥｒｂＢ２に結合することができる可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。特定の実施形態においては、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは完全長又は内因性のＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の結合又は相互作用を抑制又は低減する。他の実施形態においては、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは内因性又は完全長ＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させる。特定の実施形態においては、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは完全長又は内因性のＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の結合又は相互作用を抑制又は低減することによりＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させる。他の実施形態においては、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは稀突起膠細胞の分化を増大させることができる。更に別の実施形態においては、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドはＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の結合又は相互作用を抑制又は低減すること、及び／又はＥｒｂＢ２リン酸化を増大させることにより稀突起膠細胞の分化を増大させることができる。
【０１３１】
可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドはＥｒｂＢ２重合体過剰発現の細胞内及び膜貫通ドメインを欠いている。当該分野で知られる通り、ＥｒｂＢ２の完全な細胞外ドメインは細胞外ドメインポリペプチドの全Ｃ末端又はＮ末端上の追加的又はより少数のアミノ酸を含んでよい。本発明の方法において使用するための追加的可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは限定しないが、配列番号７又は９の細胞外ドメインを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＥｒｂＢ２ポリペプチド、又はそのようなポリペプチドのフラグメント、変異体又は誘導体を包含する。
【０１３２】
本明細書に記載する可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは置換、挿入又は欠失のような改変を有してよい。本明細書に記載する配列番号７又は９のポリペプチドに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドの相当するフラグメントも意図される。
【０１３３】
当該分野で知られる通り、２ポリペプチド間の「配列同一性」とは１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本明細書において考察する場合は、何れかのポリペプチドが他のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるかどうかは、当該分野で知られている方法及びコンピュータープログラム／ソフトウエア、例えば限定しないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて決定できる（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）。ＢＥＳＴＦＩＴは２配列間の相同性最高セグメントを発見するためにＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムを使用している。ＢＥＳＴＦＩＴ又は特定の配列が例えば本発明によるレファレンス配列に９５％同一であるかどうかを決定するための何れかの他の配列アライメントプログラムを使用する場合は、パラメーターは当然ながら、同一性のパーセンテージがレファレンスポリペプチド配列の完全長に渡って計算されるように、そして、レファレンス配列におけるアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが容認されるように、設定される。
【０１３４】
当業者であれば、本明細書の実施例に記載した試験に基づいて、本発明の方法において使用するためのしＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチドをスクリーニングにより得ることができる。特に、Ｓｐ３５及びＥｒｂＢ２を用いて種々の細胞をトランスフェクトすることは当業者が日常的に行うことである。これらのトランスフェクトされた細胞系統は次に、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドをＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させるそれらの能力について試験するために、実施例に記載する通り使用される。実施例に記載される通り、免疫沈降実験を用いながらＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の結合を抑制又は低減できる可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドがどれであるかを決定するための競合試験を実施する方法は当業者の知る通りである。更に又、稀突起膠細胞先祖細胞を単離し、そして種々のＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチドを本明細書に記載した稀突起膠細胞分化の蛋白マーカー（即ちＭＢＰ）に基づいて稀突起膠細胞分化を増大させる能力について試験することは当業者が日常的に行っている通りである。
【０１３５】
ＥｒｂＢ２ポリペプチドを得るための種々の例示される方法、又は、本発明の方法において使用するための例示されるＥｒｂＢ２ポリペプチドは又、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ２００３０６１５５９及び米国特許５，９１４，２３７、６，０２５，１４５、６，２８０，９６４、７，０９８，３０２、６，９８７，０８８及び６，３３３，１６９に記載されている。これらの公開物に記載されている特定の試験はＥｒｂＢ２がシグナルトランスダクションの間にリン酸化されるという事実に基づいている。従ってＥｒｂＢ２のリン酸化状態（例えばＳｅｒ１１１３残基における）をシグナリング試験のためのリードアウトとして使用できる。更に又、チロシン１５残基８７７及び１２４８のリン酸化もまたシグナリング試験のリードアウトとして使用できる。これらの残基のリン酸化はＥｒｂＢ２の活性化を示す。即ち、可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは完全長又は内因性ＥｒｂＢ２のリン酸化を増進するそれらの能力に関してスクリーニングすることができる。更に又、Ｓｐ３５に結合することにより完全長内因性ＥｒｂＢ２がＳｐ３５に結合するのを途絶させるＥｒｂＢ２ポリペプチドを得るためのスクリーニングを行うために結合試験を用いることができる。本発明の方法において使用するための特定の可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドはＳｐ３５に結合し、そのため、完全長の内因性ＥｒｂＢ２がＳｐ３５に結合することをブロック、防止又は途絶させ、これによりＥｒｂＢ２シグナリングの抑制を解除する。通常の状況下ではＳｐ３５はＥｒｂＢ２に結合し、これによりＥｒｂＢ２の活性化及び／又はリン酸化を排除又は抑制し、そのように作用する場合において、ＥｒｂＢ２からのシグナルトランスダクション及びそのようなシグナリングの下流にある事象、例えば稀突起膠細胞の分化を防止、抑制又は妨害する。
【０１３６】
本発明の方法において使用するための可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドは２つ以上の可溶性ＥｒｂＢ２ポリペプチドの何れかの組み合わせを包含してよい。
【０１３７】
抗体又はその免疫学的に特異的なフラグメント
ＥｒｂＢ２抗体
本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２結合剤はまた、ＥｒｂＢ２に結合し、そしてそれにより例えばＥｒｂＢ２リン酸化を増進することによりＥｒｂＢ２活性に影響する、ＥｒｂＢ２特異的抗体、又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含する。
【０１３８】
本明細書に記載した方法において使用するための特定のＥｒｂＢ２抗体は特異的に、又は優先的に、特定のＥｒｂＢ２フラグメント又はドメインに結合する。例えば、特定の抗体はＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の相互作用を防止するような態様においてＥｒｂＢ２に結合する。本発明の方法において使用するためのさらなるＥｒｂＢ２抗体は特異的にＥｒｂＢ２に結合し、そしてＥｒｂＢ２のリン酸化を増進する。最終的に特定のＥｒｂＢ２抗体は稀突起膠細胞分化を増進する。更に又、本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２抗体はＥｒｂＢ２の細胞内在化を増大させる。本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２抗体は上記した機能の全て、又は上記した機能の１つ以上を果たしてよい。当該分野で知られ、そして本明細書の実施例に記載する試験を用いながらこのような抗体を得るためのスクリーニングの方法は当業者の知る通りである。
【０１３９】
当業者であれば、本明細書の実施例に記載する試験に基づいて、本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２特異的抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をスクリーニングにより得ることができる。特に、Ｓｐ３５及びＥｒｂＢ２を用いて種々の細胞をトランスフェクトすることは当業者が日常的に行うことである。これらのトランスフェクトされた細胞系統は次に、ＥｒｂＢ２特異的抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させるそれらの能力について試験するために使用される。実施例に記載される通り、免疫沈降実験を用いながら完全長又は内因性ＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の結合を抑制又は低減できるＥｒｂＢ２特異的抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体がどれであるかを決定するための競合試験を実施する方法は当業者の知る通りである。更に又、稀突起膠細胞先祖細胞を単離し、そして種々のＥｒｂＢ２特異的抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を本明細書に記載した稀突起膠細胞分化の蛋白マーカー（即ちＭＢＰ）に基づいて稀突起膠細胞分化を増大させる能力について試験することは当業者が日常的に行っている通りである。
【０１４０】
ＥｒｂＢ２抗体を得るための種々の例示される方法、又は、本発明の方法において使用するための例示されるＥｒｂＢ２抗体は又、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開２００２０００４５８７および２００６００８８５２３及び米国特許５，９１４，２３７及び６，０２５，１４５に記載されている。これらの公開物に記載されている特定の試験はＥｒｂＢ２がシグナルトランスダクションの間にリン酸化されるという事実に基づいている。従ってＥｒｂＢ２のリン酸化状態（例えばＳｅｒ１１１３残基における）をシグナリング試験のためのリードアウトとして使用できる。更に又、チロシン１５残基８７７及び１２４８のリン酸化もまたシグナリング試験のリードアウトとして使用できる。これらの残基のリン酸化はＥｒｂＢ２の活性化を示す。即ち、ＥｒｂＢ２抗体はＥｒｂＢ２のリン酸化増大に関してスクリーニングすることができる。更に又、完全長内因性ＥｒｂＢ２がＳｐ３５に結合するのをブロック、防止又は途絶させるＥｒｂＢ２抗体を得るためのスクリーニングを行うために結合試験を用いることができる。本発明の方法において使用するための特定のＥｒｂＢ２抗体はＥｒｂＢ２に結合し、そのため、完全長の内因性ＥｒｂＢ２がＳｐ３５に結合することをブロック、防止又は途絶させ、これによりＥｒｂＢ２シグナリングの抑制を解除する。通常の状況下ではＳｐ３５はＥｒｂＢ２に結合し、これによりＥｒｂＢ２の活性化及び／又はリン酸化を排除又は抑制し、そのように作用する場合において、ＥｒｂＢ２からのシグナルトランスダクション及びそのようなシグナリングの下流にある事象、例えば稀突起膠細胞の分化を防止、抑制又は妨害する。
【０１４１】
種々のＥｒｂＢ２抗体はまた参照により全体が本明細書に組み込まれる６，９４９，２４５；５，７７２，９９７；５，７２５，８５９；６，３９９，０６３；６，３８７，３７１及び６，０５４，５６１及び米国特許出願２００６００３４８４０及び国際出願公開ＷＯ９７／００２７１に開示されている。種々のＥｒｂＢ２抗体はまた参照により全体が本明細書に組み込まれるＨａｒｗｅｒｔｈ  Ｉ−Ｍ，Ｗｅｌｓ  Ｗ，Ｍａｒｔｅ  Ｂ，Ｈｙｎｅｓ  Ｎ  Ｅ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｒｂＢ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｔｉｏｎ  ａｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０−１５１６７（１９９２）；Ｋｌａｐｐｅｒ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７）及びＴｚａｈａｒ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：４９３８−５０（１９９７）にも記載されている。
【０１４２】
特定の実施形態においては、本発明の方法において使用するためのＥｒｂＢ２抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は市販のＥｒｂＢ２抗体、例えばＬ２６、ヘルセプチン、９Ｇ６．１０、Ｌ８７、Ｎ１２、Ｎ２４、Ｎ２８、ＣＢ１１、ｅ２−４００１、Ｂ１０、ｅ２−４００１、３Ｂ５、ＰＮ２Ａ、２ＥＲＢ１９、Ｌ８７、ＳＰＭ４９５、ＳＰ３及びＩＣＲ１２を包含する。更に又ＥｒｂＢ２抗体は文献にも記載されており、例えば４Ｄ５はＦｅｎｄｌｙ等において記載されている。ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメインは参照により本明細書に組み込まれるＪ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．９（５）：４４９−５５１９９０に記載の通り乳癌の能動的な特異的免疫療法のための潜在的な免疫原である。
【０１４３】
他の実施形態においては、本発明はＥｒｂＢ２のエピトープ少なくとも１つに特異的又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含し、ここでエピトープは配列番号７又は９の少なくとも約４〜５アミノ酸、配列番号７又は９の少なくとも７、少なくとも９、又は少なくとも１５〜少なくとも３０のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。記載された配列番号７又は９の所定のエピトープのアミノ酸は必須ではないが隣接又は線状であってよい。特定の実施形態においては、ＥｒｂＢ２の少なくとも１つのエピトープは細胞表面に発現された状態の、又は可溶性フラグメントとしての、例えばＩｇＧＦｃ領域に融合した、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインにより形成された非線状のエピトープを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。即ち、特定の実施形態においては、ＥｒｂＢ２の少なくとも１つのエピトープは、配列番号７又は９の隣接又は非隣接アミノ酸少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、又は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなり、ここで非隣接アミノ酸は蛋白折り畳みを介してエピトープを形成する。
【０１４４】
他の実施形態において、本発明はＥｒｂＢ２の少なくとも１つのエピトープに特異的又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含し、ここで、エピトープは上記した通り、１つのほかに、配列番号７又は９の２、３、４、５、６つ以上の隣接又は非隣接アミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるものであり、そして蛋白を修飾する追加的部分、例えば炭水化物部分が、ＥｒｂＢ２抗体が修飾された標的蛋白に対して蛋白の未修飾型に対するよりも高値の親和性で結合するように包含されていてよい。あるいは、ＥｒｂＢ２抗体は標的蛋白の未修飾型には全く結合しない。
【０１４５】
特定の実施形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、上記したＥｒｂＢ２又はフラグメント又は変異体のエピトープ少なくとも１つに特異的に結合し、即ち、そのようなエピトープに対して未関連又はランダムのエピトープに結合するよりも容易に結合し；上記したＥｒｂＢ２又はフラグメント又は変異体のエピトープ少なくとも１つに優先的に結合し、即ち、そのようなエピトープに対して関連、同様、相同又は類縁のエピトープに結合するよりも容易に結合し；上記したＥｒｂＢ２又はフラグメント又は変異体の特定のエピトープに対して自身が特異的又は優先的に結合するレファレンス抗体の結合を競合的に抑制し；又は上記したＥｒｂＢ２又はフラグメント又は変異体のエピトープ少なくとも１つに対し、約５ｘ１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５ｘ１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５ｘ１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５ｘ１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５ｘ１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５ｘ１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５ｘ１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５ｘ１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５ｘ１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５ｘ１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５ｘ１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５ｘ１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５ｘ１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５ｘ１０−１５Ｍ又は１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性において結合する。特定の特徴において、抗体又はそのフラグメントは、ネズミＥｒｂＢ２ポリペプチド又はそのフラグメントと相対比較して、ヒトＥｒｂＢ２ポリペプチド又はそのフラグメントに対して優先的に結合する。
【０１４６】
抗体結合解離定数に関して使用する場合、「約」という用語は抗体の親和性を計測するために使用される方法において固有の変動の程度を許容するものである。例えば、使用する機材の精度のレベル、計測する試料数に基づく標準誤差、及び、四捨五入の誤差に応じて、「約１０−２Ｍ」という用語は例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを包含するものとする。
【０１４７】
特定の実施形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は５ｘ１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５ｘ１０−３ｓｅｃ−１又は１０−３ｓｅｃ−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））でＥｒｂＢ２ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。或いは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は５ｘ１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５ｘ１０−５ｓｅｃ−１又は１０−５ｓｅｃ−１５ｘ１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５ｘ１０−７ｓｅｃ−１又は１０−７ｓｅｃ−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））でＥｒｂＢ２ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。
【０１４８】
他の実施形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５ｘ１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０−４Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５ｘ１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））でＥｒｂＢ２ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。或いは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５ｘ１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））でＥｒｂＢ２ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。
【０１４９】
Ｓｐ３５抗体
本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤はＳｐ３５活性の拮抗剤であるＳｐ３５特異的抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含する。例えば、稀突起膠細胞上に発現されるＳｐ３５に対する特定のＳｐ３５抗体の結合は、稀突起膠細胞の生育又は分化の抑制をブロックするか、又はＣＮＳニューロンの脱髄又は髄鞘発育不全をブロックする。
【０１５０】
本明細書に記載した方法において使用するための特定のＳｐ３５拮抗剤抗体は特定のＳｐ３５ポリペプチドフラグメント又はドメインに特異的又は優先的に結合する。そのようなＳｐ３５ポリペプチドフラグメントは、限定されないが、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７、３４〜４２５、３４〜４９３、６６〜５３２、６６〜４１７（ＬＲＲドメイン）、６６〜４２６、６６〜４９３、６６〜５３２、４１７〜４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７〜４２４（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７〜４９３、４１７〜５３２、４１９〜４９３（Ｓｐ３５  Ｉｇ領域）又は４２５〜５３２；又は配列番号２のアミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７、３４〜４２５、３４〜４９３、６６〜５３２、６６〜４１７、６６〜４２６、６６〜４９３、６６〜５３２、４１７〜５３２、４１７〜４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７〜４９３、４１７〜５３２、４１９〜４９３（Ｓｐ３５Ｉｇ領域）又は４２５〜５３２に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるＳｐ３５変異体ポリペプチドを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるＳｐ３５ポリペプチドを包含する。
【０１５１】
本発明の特定のＳｐ３５特異的抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチドフラグメントは、限定されないが、Ｓｐ３５のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）１つ以上を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは例えば配列番号２のアミノ酸６６〜８９、６６〜１１３、６６〜１３７、９０〜１１３、１１４〜１３７、１３８〜１６１、１６２〜１８５、１８６〜２０９、２１０〜２３３、２３４〜２５７、２５８〜２８１、２８２〜３０５、３０６〜３２９又は３３０〜３５３を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。配列番号２のアミノ酸６６〜８９、６６〜１１３、９０〜１１３、１１４〜１３７、１３８〜１６１、１６２〜１８５、１８６〜２０９、２１０〜２３３、２３４〜２５７、２５８〜２８１、２８２〜３０５、３０６〜３２９又は３３０〜３５３に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの相当するフラグメントも意図される。
【０１５２】
本発明の特定の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が結合する追加的Ｓｐ３５ペプチドフラグメントは、限定しないが、Ｓｐ３５のＬＲＲにフランキングするシステインリッチ領域１つ以上を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは、例えば、配列番号２のアミノ酸３４〜６４（Ｎ末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＮＴ））を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメント、又は配列番号２のアミノ酸３６３〜４１６（Ｃ末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＣＴ））を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるフラグメントを包含する。配列番号２のアミノ酸３４〜６４及び３６３〜４１６に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの相当するフラグメントも意図される。
【０１５３】
別の実施形態においては、本発明はＳｐ３５のエピトープ少なくとも１つに特異的又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含し、ここでエピトープは配列番号２の少なくとも約４〜５アミノ酸、配列番号２の少なくとも７、少なくとも９、又は約１５〜約３０のアミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。記載した配列番号２の所定のエピトープのアミノ酸は必須ではないが隣接又は線状であってよい。特定の実施形態においては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは細胞表面に発現された状態の、又は可溶性フラグメントとしての、例えばＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合した、Ｓｐ３５の細胞外ドメインにより形成された非線状のエピトープを含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなる。即ち、特定の実施形態においては、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは、配列番号２の隣接又は非隣接アミノ酸少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、又は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなり、ここで非隣接アミノ酸は蛋白折り畳みを介してエピトープを形成する。
【０１５４】
他の実施形態において、本発明はＳｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を包含し、ここで、エピトープは上記した通り、１つのほかに、配列番号２の２、３、４、５、６つ以上の隣接又は非隣接アミノ酸を含むか、本質的にこれよりなるか、これよりなるものであり、そして蛋白を修飾する追加的部分、例えば炭水化物部分が、Ｓｐ３５抗体が修飾された標的蛋白に対して蛋白の未修飾型に対するよりも高値の親和性で結合するように包含されていてよい。あるいは、Ｓｐ３５抗体は標的蛋白の未修飾型には全く結合しない。
【０１５５】
特定の実施形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、上記したＳｐ３５又はフラグメント又は変異体のエピトープ少なくとも１つに特異的に結合し、即ち、そのようなエピトープに対して未関連又はランダムのエピトープに結合するよりも容易に結合し；上記したＳｐ３５又はフラグメント又は変異体のエピトープ少なくとも１つに優先的に結合し、即ち、そのようなエピトープに対して関連、同様、相同又は類縁のエピトープに結合するよりも容易に結合し；上記したＳｐ３５又はフラグメント又は変異体の特定のエピトープに対して自身が特異的又は優先的に結合するレファレンス抗体の結合を競合的に抑制し；又は上記したＳｐ３５又はフラグメント又は変異体のエピトープ少なくとも１つに対し、約５ｘ１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５ｘ１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５ｘ１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５ｘ１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５ｘ１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５ｘ１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５ｘ１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５ｘ１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５ｘ１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５ｘ１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５ｘ１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５ｘ１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５ｘ１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５ｘ１０−１５Ｍ又は１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性において結合する。特定の特徴において、抗体又はそのフラグメントは、ネズミＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントと相対比較して、ヒトＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメントに対して優先的に結合する。
【０１５６】
抗体結合解離定数に関して使用する場合、「約」という用語は抗体の親和性を計測するために使用される方法において固有の変動の程度を許容するものである。例えば、使用する機材の精度のレベル、計測する試料数に基づく標準誤差、及び、四捨五入の誤差に応じて、「約１０−２Ｍ」という用語は例えば０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを包含するものとする。
【０１５７】
特定の実施形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は５ｘ１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５ｘ１０−３ｓｅｃ−１又は１０−３ｓｅｃ−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。或いは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は５ｘ１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５ｘ１０−５ｓｅｃ−１又は１０−５ｓｅｃ−１５ｘ１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５ｘ１０−７ｓｅｃ−１又は１０−７ｓｅｃ−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。
【０１５８】
他の実施形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５ｘ１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０−４Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５ｘ１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。或いは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５ｘ１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１又は５ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））でＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント又は変異体に結合する。
【０１５９】
１つの実施形態において、本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤は抗体分子又はその免疫特異的フラグメントである。特段の記載が無い限り、本明細書においては、抗体に言及する際の「そのフラグメント」とは、免疫特異的フラグメント、即ち抗原特異的フラグメントを指す。１つの実施形態において、本発明の抗体は二重特異性結合分子、結合ポリペプチド、又は抗体、例えば二重特異性抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、又は１つより多いエピトープ、例えば１つより多い抗原、又は、同抗原上の１つより多いエピトープに対して結合特異性を有する融合蛋白である。１つの実施形態において、二重特異性抗体はＳｐ３５又はＥｒｂＢ２上の少なくとも１つのエピトープに対して特異的な少なくとも１つ結合ドメインを有する。二重特異性抗体はＳｐ３５又はＥｒｂＢ２のエピトープに対して特異的な標的結合ドメイン２つ及び第２の標的に対して特異的な標的結合ドメイン２つを有する４価の抗体であってよい。即ち、４価の二重特異性抗体は各特異性に関して２価であってよい。
【０１６０】
本発明の特定の実施形態はＳｐ３５拮抗剤抗体又はＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメントの投与を含み、この場合、定常領域ドメイン１つ以上の少なくともある割合が所望の生化学的特性、例えば、概ね同じ免疫原性の完全な未改変の抗体と比較して低減されたエフェクター機能、非共有結合的に２量体化する能力、増大した腫瘍部位局在能力、低減した血清中半減期又は増大した血清中半減期を与えるように欠失又は別様に改変されている。例えば、本明細書に記載する治療方法において使用するための特定の抗体は免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、重鎖ドメイン１つ以上の少なくとも一部分を欠いているドメイン欠失抗体である。例えば、特定の抗体において、修飾された抗体の定常領域の１つの完全なドメインが欠失されることになり、例えば、ＣＨ２ドメインの全て又は部分が欠失されることになる。
【０１６１】
特定の実施形態においては、本明細書に記載した治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はその免疫特異的フラグメント又は得簿抗体又はその免疫特異的フラグメント、Ｆｃ部分は、当該分野で知られた手法を用いてエフェクター機能を低減するように突然変異してよい。例えば、定常領域ドメインの欠失又は不活性化（点突然変異又は他の手段を介した）により循環修飾抗体のＦｃ受容体結合が低減され、これにより腫瘍局在化が増大する。他の例においては、本発明と合致する定常領域修飾が補体結合を加減し、これによりコンジュゲートした細胞毒素の血清中半減期及び非特異的会合が低減される。更に別の定常領域の修飾を用いて抗原特異性又は抗体の柔軟性による増強された局在化を可能とするジスルフィド連結又はオリゴ糖部分の修飾を行ってよい。結果として生じる生理学的プロファイル、生物学的利用性及び修飾の他の生化学的作用、例えば腫瘍の局在化、生体分布及び血清中半減期は、予定外の実験を行うことなくよく知られた免疫学的手法を用いて容易に計測及び定量してよい。
【０１６２】
本明細書に記載した診断及び治療方法において使用するための抗体又はその免疫特異的フラグメントの修飾された形態は当該分野で知られた手法を用いて完全な前駆体又は親抗体から作成できる。例示される手法は本明細書においてより詳細に考察する。
【０１６３】
特定の実施形態においては、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又は免疫特異的フラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメントの可変及び定常領域の両方が完全にヒト型である。完全ヒト抗体は当該分野で知られた、そして本明細書に記載する手法を用いて作成できる。例えば、特異的抗原に対する完全ヒト抗体は抗原攻撃に応答してそのような抗体を生産するように修飾されているが、その内因性の遺伝子座は無能力化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより製造できる。そのような抗体を作成するために使用できる例示される手法は米国特許６，１５０，５８４；６，４５８，５９２；６，４２０，１４０に記載されている。他の手法は当該分野で知られている。完全ヒト抗体はまた、種々のディスプレイ技術、ファージディスプレイ又は他のウィルスディスプレイ系により、本明細書に別途詳述する通り製造できる。
【０１６４】
本明細書に記載した診断及び治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はその免疫特異的フラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメントは当該分野で知られた手法を用いて作成又は製造することができる。特定の実施形態においては、抗体分子又はそのフラグメントは「組み換え生産」されたものであり、即ち、組み換えＤＮＡ技術を用いて生産される。抗体分子又はそのフラグメントを作成するための例示される手法は本明細書において別途詳述する。
【０１６５】
本明細書に開示した治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はその免疫特異的フラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメントは、例えば、  抗体がその同族体エピトープに特異的に結合することを共有結合が妨げないように抗体に何れかの型の分子を共有結合させることにより修飾された誘導体を包含する。例えば限定しないが、抗体誘導体は例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解性の切断、細胞リガンド又は他の蛋白への連結等により修飾されている抗体を包含する。多数の化学的修飾の何れかを既知の方法、例えば限定しないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等により実施してよい。更に又、誘導体は非古典的アミノ酸１つ以上を含有してよい。
【０１６６】
好ましい実施形態においては、本明細書に開示した治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はその免疫特異的フラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメントは治療すべき動物において、例えばヒトにおいて、有害な免疫応答を誘発しない。１つの実施形態において、本明細書に開示した治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はその免疫特異的フラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメントは当該分野で知られた手法を用いてその免疫原性が低下するように修飾される。例えば抗体はヒト化、霊長類化、脱免疫化することができ、又はキメラ抗体を作成できる。抗体のこのような型は親抗体の抗原結合特性を保持しているがヒトにおいて低免疫原性である非ヒト抗体、典型的にはネズミ又は霊長類の抗体から誘導される。これは種々の方法、例えば（ａ）ヒト定常領域上に全非ヒト可変ドメインをグラフトすることによりキメラ抗体を形成すること；（ｂ）ヒトフレームワーク及び重要なフレームワーク残基を有するか有ない定常領域内に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）１つ以上の少なくとも一部分をグラフトすること；又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが表面残基を置き換えることによりヒト様セクションでそれらを「クローキング（隠蔽）」すること、により達成してよい。そのような方法は参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）；及び米国特許５，５８５，０８９、５，６９３，７６１、５，６９３，７６２及び６，１９０，３７０に開示されている。
【０１６７】
脱免疫化は又、抗体の免疫原性を低減するために使用できる。本明細書においては、「脱免疫化」という用語はＴ細胞エピトープを修飾する抗体の改変を包含する（例えばＷＯ９８５２９７６Ａ１，ＷＯ００３４３１７Ａ２参照）。例えば、原料抗体由来のＶＨ及びＶＬ配列を分析し、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）及び配列内の他の重要な残基との相対的なエピトープの位置を示すＶ領域の各々からヒトＴ細胞エピトープを「マッピング」する。Ｔ細胞エピトープマップ由来の個々のＴ細胞エピトープを分析することにより最終的な抗体の活性を改変する危険性が低い代替アミノ酸置換を発見する。アミノ酸の置換の組み合わせを含むある範囲の代替ＶＨ及びＶＬ配列が設計され、そしてこれらの配列は、その後、ある範囲の結合ポリペプチド、例えば本明細書に開示した診断及び治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はその免疫特異的フラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はその免疫特異的フラグメント内に取り込まれ、そしてこれが次に機能に関して試験される。典型的には、１２〜２４の変異体抗体が形成され、試験される。次に修飾されたＶ及びヒトＣ領域を含む完全な重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現ベクターにクローニングし、そして後のプラスミドは完全な抗体の製造のために細胞系統に導入される。次に抗体を適切な生化学的及び生物学的試験において比較し、そして最適な変異体を発見する。
【０１６８】
本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はその免疫特異的フラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメントは当該分野で知られた何れかの適当な方法により形成してよい。ポリクローナル抗体は当該分野で良く知られている種々の操作法により製造できる。例えば抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導するためにＳｐ３５又はＥｒｂＢ２の免疫特異的フラグメントを種々の宿主動物、例えば限定しないが、ウサギ、マウス、ラット等に投与することができる。免疫原性応答を増大させるために宿主の種に応じて種々のアジュバントを使用してよく、そして限定しないが、フロイント（完全及び不完全）、無機質ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリソレクチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油脂乳液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウムパルバム。そのようなアジュバントもまた当該分野で良く知られている。
【０１６９】
モノクローナル抗体は当該分野で知られた広範な種類の手法、例えばハイブリドーマの使用、組み換え体、及びファージディスプレイの技術、又はこれらの組み合わせを用いて製造できる。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で知られており、そして例えばＨａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）（該参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に教示されているものを包含するハイブリドーマ手法を用いて製造できる。「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、ハイブリドーマ技術により製造された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は何れかの真核生物、原核生物を包含する単一のクローン又はファージクローンから誘導された抗体を指し、それが製造される方法ではない。即ち「モノクローナル抗体」という用語はハイブリドーマ技術により製造された抗体には限定されない。モノクローナル抗体はハイブリドーマ及び組み換え体及びファージディスプレイ技術の使用を包含する当該分野で知られた広範な種類の手法を用いて製造できる。
【０１７０】
当該分野で知られたプロトコルを用いる場合、１つの例において、抗体は該当する抗原（例えば精製されたＳｐ３５抗原又はＥｒｂＢ２抗原又はそのような抗原を含む細胞又は細胞抽出液）及びアジュバントの多数回の皮下又は腹腔内注射により哺乳類において出現させる。この免疫化は典型的には、活性化された脾細胞又はリンパ球由来の抗原反応性抗体の生産を含む免疫応答を誘発する。形成された抗体を動物の血清から採取してポリクローナル調製品としてもよいが、脾臓、リンパ節又は末梢血から個々のリンパ球を単離してモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均質な調整品とすることが望ましい場合が多い。好ましくは、リンパ球は脾臓から得る。
【０１７１】
よく知られたプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））においては、抗原を注射されている哺乳類由来の相対的に短命又は致死性のリンパ球を不朽化腫瘍細胞系統（例えば骨髄腫細胞系統）と融合させることにより、非致死でありかつＢ細胞の遺伝子的にコードされた抗体を生産することができるハイブリッド細胞、即ち「ハイブリドーマ」を製造する。得られたハイブリッドは単一の抗体の形成のための特異的な遺伝子を含む個々の系統の各々を用いた選択、希釈及び再生育により、単一の遺伝子系統に分離される。これらは所望の抗原に対して均質である抗体を生産し、そしてその純粋な遺伝子的出所を参照して「モノクローナル」と称される。
【０１７２】
このようにして製造されたハイブリドーマ細胞を好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の生育又は生存を抑制する物質１つ以上を含有する適当な培地に播種して生育させる。当業者の知る通り、ハイブリドーマの形成、選択及び生育のための試薬、細胞系統及び培地は多くの入手元から販売されており、そして標準的なプロトコルが十分確立されている。一般的に、ハイブリドーマ細胞を生育させる培地は所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生産に関して試験される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性をインビトロの試験、例えば免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）により測定する。所望の特異性、親和瀬及び／又は活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が発見されたのち、クローンは限界希釈法によりサブクローニングするか、又は標準的な方法により生育させてよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。当然ながら、サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、従来の精製操作法、例えばプロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより、培地、復水又は血清から分離してよい。
【０１７３】
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは知られた手法により形成してよい。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント生産用）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント生産用）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子を蛋白分解的に切断することにより製造してよい。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０１７４】
当業者の知る通り、ＤＮＡコード抗体又は抗体フラグメント（例えば抗原結合部位）はまた抗体ファージライブラリから誘導してよい。特に、そのようなファージはレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒト又はネズミ）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイするために利用することができる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識された抗原又は固体の表面又はビーズに結合又はキャプチャーされた抗原を用いながら、抗原により選択又は識別することができる。このような方法において使用されるファージは典型的にはファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩ蛋白の何れかに組み換えにより融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄ及びＭ１３結合ドメインを包含するフィラメントファージである。例示される方法は例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＥＰ３６８６８４Ｂ１；米国特許５，９６９，１０８、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６２８（２００１）；Ｌｕｉ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されている。幾つかの公開物（例えばＭａｒｋｓ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））は鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の生産並びに大型のファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組み換えを報告している。別の実施形態においては、リボソームディスプレイを用いてディスプレイプラットホームとしてのバクテリオファージを置き換える（例えばＨａｎｅｓ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；又はＩｒｖｉｎｇ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）参照）。更に別の実施形態においては、細胞表面ライブラリをスクリーニングして抗体を得ることができる（Ｂｏｄｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。このような操作法はモノクローナル抗体の単離及びその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマの手法の代替となる。
【０１７５】
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインはそれらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特にＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は動物のｃＤＮＡライブラリ（例えばリンパ様組織のヒト又はネズミｃＤＮＡライブラリ）又は合成ｃＤＮＡライブラリから増幅される。特定の実施形態においては、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲにおいてｓｃＦｖリンカーにより共に連結し、そしてファージミドベクター（例えばｐＣＡＮＴＡＢ６又はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）内にクローニングする。ベクターをＥ．ｃｏｌｉ内にエレクトロポレーションしてＥ．ｃｏｌｉをヘルパーファージに感染させる。このような方法において使用されるファージは典型的にはフィラメントファージ、例えばｆｄ及びＭ１３であり、そしてＶＨ及びＶＬ領域が通常はファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩの何れかに組み換え融合している。目的の抗原に結合する抗原結合部位（即ちＳｐ３５ポリペプチド又はそのフラグメント）を発現するファージは、例えば標識された抗原又は固体の表面又はビーズに結合又はキャプチャーされた抗原を用いながら、抗原により選択又は識別することができる。
【０１７６】
抗体を作成するために使用できるファージディスプレイ法の別の例は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＢｒｉｎｋｍａｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｋｅｂｏｒｏｕｇｈ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ等、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ等、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）：ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及び米国特許５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８に記載されているものを包含する。
【０１７７】
上記参考文献に記載されている通り、ファージ選択ののち、ファージ由来の抗体コーディング領域を単離し、ヒト抗体又は何れかの他の所望の抗原結合フラグメントを包含する全抗体形成のために使用し、そして、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞及び細菌を包含する何れかの所望の宿主において発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換え生産するための技術はまたＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及びＳａｗａｉ等、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（該参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）において開示されているもののような当該分野で知られた方法を用いながら使用することもできる。
【０１７８】
単鎖Ｆｖ及び抗体を製造するために使用できる手法の例は米国特許４，９４６，７７８及び５，２５８，４９８；Ｈｕｓｔｏｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ等、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されているものを包含する。ヒトにおける抗体のインビボの使用及びインビトロ検出試験を包含する一部の使用については、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を使用することがの好ましい場合がある。キメラ抗体は抗体の異なる部分が異なる動物種から誘導されている分子、例えばネズミモノクローナル抗体から誘導された可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を製造するための方法は当該分野で知られている。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許５，８０７，７１５；４，８１６，５６７；及び４，８１６，３９７を参照できる。ヒト化抗体は１つ以上の非ヒト種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。頻繁には、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を改変、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の相当する残基で置換されることになる。これらのフレームワーク置換は当該分野で良く知られている方法により、例えば抗原結合に重要なフレームワーク残基を識別するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング及び特定の位置における通常ではないフレームワーク残基を識別するための配列比較により識別される（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＱｕｅｅｎ等、米国特許５，５８５，０９８；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照できる）。抗体は当該分野で知られた種々の手法、例えばＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；５，５８５，０８９）、ベニヤリング及びリサーフィシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ等、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））及び鎖シャフリング（米国特許５，５６５，３３２）を用いてヒト化できる。
【０１７９】
完全にヒト型の抗体はヒトの患者の治療処置のために特に望ましいものである。ヒト抗体は当該分野で知られた種々の方法、例えば、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された抗体ライブラリを用いた上記ファージディスプレイ法により作成できる。各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許４，４４４，８８７及び４，７１６，１１１；及びＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９１／１０７４１も参照できる。
【０１８０】
ヒト抗体はまた機能的な内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて製造できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胚性幹細胞内に、ランダムに、又は相同組み換えにより、導入してよい。或いは、ヒト可変領域、定常領域及び多様性領域を、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞内に導入してよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は相同組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別個に、又は同時に、非機能性としてよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は内因性抗体生産を防止する。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞にマイクロインジェクションすることによりキメラマウスを作製する。次にキメラマウスを交配してヒト抗体を発現するホモ接合の新生仔を生産する。トランスジェニックマウスは選択された抗原、例えば所望の標的ポリペプチドの全て又は一部分を用いて通常の態様において免疫化する。抗原に対して指向されたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスにより保有されているヒト免疫グロブリントランスジーンはＢ細胞分化の間に再配列し、その後クラス切り替え及び体細胞突然変異を起こす。即ち、このような手法を用いながら、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するためのこの技術の概説については、例えばＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照できる。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術の詳細な考察及びそのような抗体を製造するためのプロトコルに関しては、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許５，４１３，９２３；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，５６９，８２５；５，６６１，０１６；５，５４５，８０６；５，８１４，３１８；及び５，９３９，５９８を参照できる。更に又、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）及びＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）のような企業が上記したものと同様の技術を用いて選択された抗原に対して指向されたヒト抗体を提供する業務を行っている。
選択されたエピトープを認識する完全にヒト型の抗体は「ガイデッドセレクション」と称される手法を用いて形成できる。この研究法においては、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて同じエピトープを認識する完全にヒト型の抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。更に又、米国特許５，５６５，３３２も参照できる。
【０１８１】
別の実施形態においては、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを従来の操作法で容易に単離して配列決定してよい（例えばネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい原料として機能する。単離されたのち、ＤＮＡは発現ベクター内に入れられ、次にこれを別様に免疫グロブリンを生産することのないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞のような原核生物又は真核生物の宿主細胞内にトランスフェクトする。より詳細には、単離されたＤＮＡ（これは本明細書に記載する通り合成してよい）を使用することにより、参照により本明細書に組み込まれる１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎ等の米国特許５，６５８，５７０に記載のような製造抗体に関する定常及び可変領域の配列をクローニングしてよい。本質的には、これには選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及び、Ｉｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を伴う。この目的の為の適当なプライマーは米国特許５，６５８，５７０に記載されている。後に詳述する通り、所望の抗体を発現する形質転換された細胞を比較的大量に生育させることにより免疫グロブリンの医療用及び商業用の供給を行ってよい。
【０１８２】
特定の実施形態においては、重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を精査することにより、当該分野で良く知られている方法により、例えば、他の重鎖及び軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列に比較して配列超可変性の領域を調べることにより、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を識別してよい。日常的な組み換えＤＮＡ手法を用いながら、ＣＤＲの１つ以上をフレームワーク領域内、例えばヒトフレームワーク領域内に挿入することにより非ヒト抗体をヒト化してよい。フレームワーク領域は天然に存在する、又は、コンセンサスフレームワーク領域、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であってよい（ヒトフレームワーク領域の一覧については例えばＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９８９）を参照できる）。好ましくは、フレームワーク領域及びＣＤＲの組み合わせにより形成されたポリヌクレオチドは所望のポリペプチド、例えばＳｐ３５又はＥｒｂＢ２のエピトープ少なくとも１つに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、アミノ酸置換１つ以上をフレームワーク領域内で生じさせてよく、そして好ましくはアミノ酸置換は抗体のその抗原への結合を向上させる。更に又、そのような方法を用いることにより鎖内ジスルフィド結合に参加している可変領域システイン残基１つ以上のアミノ酸置換又は欠失を生じさせることにより鎖内ジスルフィド結合１つ以上を欠く抗体分子を形成してよい。ポリヌクレオチドに対する他の改変は本発明に包含されるものであり、そして当該分野で知られている。
【０１８３】
更に又、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共に適切な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の製造のために開発された手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９９８）；Ｔａｋｅｄａ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））を使用できる。本明細書においては、キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種から誘導された分子、例えばネズミモノクローナル抗体から誘導した可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体である。
【０１８４】
或いは、単鎖抗体の製造に関して記載された手法（米国特許４，６９４，７７８；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；及びＷａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を単鎖抗体を製造するために適合させることができる。単鎖抗体はアミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖フラグメントを連結して単鎖抗体とすることにより形成される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的Ｆｖフラグメントの組み立てのための方法もまた使用してよい（Ｓｋｅｒｒａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９９８））。
【０１８５】
Ｓｐ３５拮抗剤抗体又はＥｒｂＢ２抗体はまた内因性免疫グロブリン生産が不可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）において形成したヒト又は実質的にヒト型の抗体であってよい（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，０７５，１８１、５，９３９，５９８、５，５９１，６６９及び５，５８９，３６９を参照できる）。例えばキメラ及び生殖細胞系統突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域のホモ接合性の欠失は内因性抗体生産の完全な抑制をもたらす。そのような生殖細胞系統突然変異体マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は抗原攻撃時のヒト抗体の生産をもたらすはずである。ＳＣＩＤマウスを用いたヒト抗体の形成の別の好ましい手段は参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，８１１，５２４に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝子物質もまた本明細書に記載する通り単離して操作してよい。
【０１８６】
組み換え抗体を形成するためのさらに別の高度に効率的な手段はＮｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に記載されている。特に、この手法はサル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の形成をもたらす。この参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。さらにまたそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる共通譲渡されている米国特許５，６５８，５７０、５，６９３，７８０及び５，７５６，０９６に記載されている。
【０１８７】
別の実施形態においては、リンパ球をマイクロ操作により選択し、そして可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を免疫化哺乳類から単離し、約７日間インビトロで培養することができる。スクリーニング基準に合致する特異的ＩｇＧを有しているものを得るために培養物をスクリーニングする。陽性ウェルから細胞を単離する。個々のＩｇ生産Ｂ細胞をＦＡＣＳにより、又は補体媒介溶血プラーク試験において識別することにより、単離することができる。Ｉｇ生産Ｂ細胞を試験管中にマイクロ操作し、ＶＨ及びＶＬ遺伝子を例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。ＶＨ及びＶＬ遺伝子を抗体発現ベクター内にクローニングし、そして発現のために細胞（例えば真核生物又は原核生物の細胞）内にトランスフェクトすることができる。
【０１８８】
或いは、当該分野で良く知られている手法を用いて抗体産生細胞系統を選択して培養することができる。このような手法は種々の実験マニュアル及び基本的出版物において説明されている。この点に関し、後述する通り本発明における使用に適する手法は補遺を含めて参照により全体が本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ等編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている。
【０１８９】
本明細書に開示する治療方法のための抗体は抗体の合成のための当該分野で知られた何れかの方法により、特に、化学合成により、又は好ましくは本明細書に記載する組み換え発現により製造できる。
【０１９０】
更に当然ながら、本発明の範囲は抗原結合ＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子、変異体および突然変異も包含する。
【０１９１】
よく知られている通り、ＲＮＡは標準的な手法、例えばグアニジニウムイソチオシアネート抽出及び沈澱とその後の遠心分離又はクロマトグラフィーにより元のハイブリドーマ細胞から、又は他の形質転換された細胞から単離してよい。所望により、ｍＲＮＡはオリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーのような標準的な手法により全ＲＮＡから単離してよい。適当な手法は当業者の知る通りである。
【０１９２】
１つの実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、当該分野で良く知られている方法に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いながら同時又は別個に作成してよい。ＰＣＲはコンセンサス定常領域によるか、又は公開された重鎖及び軽鎖ＤＮＡ及びアミノ酸の配列に基づいてより特異的なプライマーにより、開始してよい。上記において考察したとおり、ＰＣＲはまた抗体軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用してもよい。この場合ライブラリはコンセンサスプライマー又はより大型の相同プローブ、例えばマウス定常領域プローブによりスクリーニングしてよい。
【０１９３】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当該分野で知られた手法を用いて細胞から単離し、制限酵素マッピングに付し、そして例えば組み換えＤＮＡ手法に関連する上記参考文献に詳述されている標準的な当該分野で良く知られている手法に従って配列決定してよい。当然ながら、ＤＮＡは単離プロセス又はその後の分析の間の何れかの時点において本発明に従って合成してよい。
【０１９４】
抗体又はそのフラグメント、誘導体又は類縁体、例えばＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２抗体である抗体の重鎖又は軽鎖の組み換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。帆の抗体分子又は抗体の重鎖又は軽鎖又はその部分（好ましくは重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られたのち、抗体分子の製造のためのベクターを、当該分野で良く知られている手法を用いた組み換えＤＮＡ技術により製造してよい。即ち、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することにより蛋白を製造するための方法を本明細書において記載する。当該分野で良く知られている方法を使用することにより抗体コーディング配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロの組み換えＤＮＡ手法、合成手法及びインビボの遺伝子組み換えを包含する。即ち本発明は、プロモーターに作動可能に連結した本発明の抗体分子、又はその重鎖又は軽鎖、又は重鎖又は軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えばＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許５，１２２，４６４参照）、そして抗体の可変ドメインは全重鎖又は軽鎖の発現のためのそのようなベクター内にクローニングしてよい。
【０１９５】
発現ベクターは従来の手法により宿主細胞に転移させ、そして次にトランスフェクトされた細胞を従来の手法により培養することにより、本明細書に記載する方法において使用するための抗体を生産する。即ち、本発明は異種プロモーターに作動可能に連結した本発明の抗体又はその重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。２本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態においては、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを以下に詳述する通り全免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞内で同時発現させよい。
【０１９６】
種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書に記載した方法における使用のための抗体分子を発現してよい。そのような宿主発現系は目的のコーディング配列が生産され、その後精製されるベヒクルとなるが、また、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換又はトランスフェクトされた場合にインサイチュで本明細書の抗体分子を発現する細胞ともなる。これらには限定されないが、微生物、例えば抗体コーディング配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コーディング配列を含有する組み換えコウボ発現ベクターで形質転換されたコウボ（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コーディング配列を含有する組み換えウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系統；抗体コーディング配列を含有する組み換えウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）を感染させた、又は同様の組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した、植物細胞系；又は哺乳類細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウィルスからのもの（例えばアデノウィルス後期プロモーター、ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現コンストラクトを保有する哺乳類細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が包含される。好ましくは、細菌細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、そしてより好ましくは、特に全組み換え抗体分子の発現のための真核生物の細胞を組み換え抗体分子の発現のために使用する。例えば、哺乳類細胞、例えばヒトサイトメガロウィルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター濫觴細胞（ＣＨＯ）が抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ等、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１９７】
細菌系においては、発現するべき抗体分子について意図される用途に応じて多くの発現ベクターを好都合に選択してよい。例えば、抗体分子の医薬組成物の作成のためにそのような蛋白を大量に製造すべきである場合は、容易に精製される融合蛋白産物の高レベルの発現を指向するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターは限定されないが、融合蛋白が生産されるように抗体コーディング配列がｌａｃＺコーディング領域にインフレームとなるようにベクター内に個々にライゲーションされるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ等、ＥＭＢＯＪ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９８）；等を包含する。ｐＧＥＸベクターもまたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白としての外来性ポリペプチドを発現するために使用してよい。一般的に、そのような融合蛋白は可溶性であり、そして、吸着及びマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの結合とその後の遊離グルタチオン存在下の溶離により、溶解細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターはクローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を包含するように設計される。
【０１９８】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多核体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が外来性遺伝子を発現するためのベクターとして典型的に使用される。ウィルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において生育させる。抗体コーディング配列はウィルスの非必須領域（例えば多核体遺伝子）内に個々にクローニングし、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多核体プロモーター）の制御下においてよい。
【０１９９】
哺乳類宿主細胞において、多くのウィルス系発現系を利用してよい。アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コーディング配列をアデノウィルス転写斜め翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び３分節系リーダー配列にライゲーションしてよい。次にこのキメラ遺伝子をインビトロ又はインビボの組み換えによりアデノウィルスゲノムに挿入してよい。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１又はＥ３）内への挿入は生存性であり、そして感染宿主において抗体分子を発現することができる組み換えウィルスをもたらす（例えばＬｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）参照）。特定の開始シグナルもまた挿入された抗体コーディング配列の効率的な翻訳のために必要である場合がある。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を包含する。さらにまた、開始コドンは全インサーとの翻訳を確実に行うためには所望のコーディング配列の読み枠とインフェイズでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは天然及び合成の両方の種々の起源のものであることができる。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等の包含により増強してよい（例えばＢｉｔｔｎｅｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）参照）。
【０２００】
更に又、挿入された配列の発現をモジュレートする、又は所望の特定の態様において遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞系統を選択してよい。蛋白産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）は蛋白の機能のために重要である場合がある。種々の異なる宿主細胞が蛋白及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特徴的で特異的な機序を有している。適切な細胞系統又は宿主系を選択することにより発現された外来性蛋白の正しい修飾及びプロセシングを確保することができる。この目的の為には、主要転写物の適切なプロセシング、グリコシル化及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機序を有する真核生物宿主細胞を使用してよい。このような哺乳類宿主細胞は限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そしてとくに、乳がん細胞系統、例えばＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ及び正常乳腺細胞系統、例えばＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔを包含する。
【０２０１】
組み換え蛋白の長期の高収率の生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば抗体分子を安定に発現する細胞系統を操作してよい。複製のウィルス起源を含有する発現ベクターを用いるよりはむしろ、適切な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）及び選択可能なマーカーにより制御されたＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入の後、操作された細胞をリッチ化培地中で１〜２日間生育させてよく、次に選択培地に切り替える。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーが選択に対する耐性を付与し、そして細胞が安定してプラスミドをその染色体内に組み込んで生育することにより病巣形成できるようにし、次にこれをクローニングして増殖させ、細胞系統とする。この方法は抗体分子を安定に発現する細胞系統を操作するために好都合に使用してよい。
【０２０２】
多くの選択系を使用してよく、例えば限定されないが、単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ等、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ等、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７１９８０）の遺伝子をｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用できる。更に又、抗代謝産物耐性を以下の遺伝子、即ち、メトトレキセートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ等、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；マイコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ１１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月））；及びハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ等、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））の選択の基準として使用できる。使用できる組み換えＤＮＡ技術の当該分野で知られた方法は参照により全体が本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ等（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）：及びＤｒａｃｏｐｏｌｉ等（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）のＣｈａｐｔｅｒｓ  １２及び１３；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。
【０２０３】
抗体分子の発現レベルはベクター増幅により上昇させることができる（検討のためにはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参考にできる）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する抑制剤のレベルの上昇はマーカー遺伝子のコピー数を増大させることになる。増幅された領域は抗体遺伝子に関連しているため、抗体の生産もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２０４】
宿主細胞は本発明の２つの発現ベクター、即ち重鎖誘導ポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖誘導ポリペプチドをコードする第２のベクターで同時トランスフェクトしてよい。２つのベクターは重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有してよい。或いは、重鎖と軽鎖のポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用してよい。そのような状況においては過剰な毒性の遊離重鎖を回避するために重鎖よりも前に軽鎖を置くことが好都合である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコーディング配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでよい。
【０２０５】
本発明の抗体分子が組み換え発現された後、それを免疫グロブリン分子の精製のための当該分野で知られた何れかの方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティーによるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度によるか、又は、蛋白精製のための何れかの他の標準的な手法により精製してよい。或いは、本発明の抗体のアフィニティーを上昇させるための好ましい方法は米国特許２００２０１２３０５７Ａ１に開示されている。
【０２０６】
１つの実施形態において、本発明の方法において使用するための結合分子又は抗原結合分子はドメイン１つ以上が部分的又は完全に欠失している合成の定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態においては適合する修飾された抗体は、全ＣＨ２ドメインが除去されているドメイン欠失コンストラクト又は変異体を含むことになる（ΔＣＨ２コンストラクト）。他の実施形態については単鎖連結ペプチドを欠失ドメインの代替としてよく、これにより可変領域のための柔軟性及び移動の自由度が生じる。当業者の知る通り、このようなコンストラクトは抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性のために特に好ましい。
【０２０７】
特定の実施形態においては本明細書に開示した方法において使用するための修飾された抗体はミニボディーである。ミニボディーは当該分野で知られた方法を用いて作成できる（例えば米国特許５，８３７，８２１又はＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照できる）。
【０２０８】
別の実施形態においては、本明細書に開示した方法において使用するための修飾された抗体は当該分野で知られたＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失コンストラクトはＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えばＢｉｏｇｅｎＩＤＥＣＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄより入手）を用いて誘導できる（例えばＷＯ０２／０６０９５５Ａ２及びＷＯ０２／０９６９４８Ａ２参照）。この例示されるベクターはＣＨ２ドメインを欠失し、そしてドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを与えるように操作されている。
【０２０９】
１つの実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤抗体又はそのフラグメント又はＥｒｂＢ２抗体又はそのフラグメントは、それが単量体サブユニットの間の会合を可能にする限り、数個、又、更には単一のアミノ酸の欠失又は置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択されたエリアにおける単一のアミノ酸の突然変異はＦｃ結合を実質的に低下させ、これにより腫瘍の局在化を向上させるために十分であってよい。同様に、モジュレートすべきエフェクター機能（例えば補体結合）を制御する定常領域ドメイン１つ以上のそのような部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は抗体の選択された特性（血清中半減期）を向上させる一方で、対象定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能は未損傷のままとしてよい。更に又、上記した通り、開示した抗体の定常領域は結果として生じるコンストラクトのプロファイルを増強するアミノ酸１つ以上の突然変異又は置換を介して合成してよい。この点に関し、保存された結合部位により与えられる活性（例えばＦｃ結合）を途絶させつつ、修飾された抗体の配置及び免疫原性の特性は実質的に維持することが可能である場合がある。さらに別の実施形態は、エフェクター機能のような所望の特性を増強するか、又はより高値の細胞毒又は炭水化物の結合をもたらすような定常領域へのアミノ酸の付加を含む。そのような実施形態において、選択された定常領域ドメインから誘導された特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合がある。
【０２１０】
本発明は又、本明細書に記載した抗体分子（例えばＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を包含する）を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる抗体の使用を提供し、その抗体又はそのフラグメントはＳｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドに免疫特異的に結合する。当該分野で知られた標準的な手法を用いて結合分子をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができ、それには例えば限定されないが、部位指向性突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発が包含され、これらはアミノ酸置換をもたらす。好ましくは、変異体（誘導体を包含する）は、レファレンスのＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２又はＶＬＣＤＲ３と相対比較して、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、又は２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」とはアミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で明確化されている。これらのファミリーは塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、未荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝鎖側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。或いは、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発による等、コーディング配列の全体又は部分に沿ってランダムに導入することができ、そして結果として生じる突然変異体は、活性を保持している突然変異体を識別するために生物学的活性に関してスクリーニングすることができる。
【０２１１】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみ、又はＣＤＲ領域のみに突然変異を導入することが可能である。導入された突然変異はサイレントであるか、又はニュートラルなミスセンスの突然変異であってよく、即ち抗原に結合する抗体の能力に対して殆ど、又は全く作用を有さないものであってよい。このような型の突然変異はコドンの使用を最適化するか、又はハイブリドーマの抗体生産を向上させるために有用であってよい。或いは、非ニュートラルなミスセンス突然変異は抗原に結合する抗体の能力を改変してよい。大部分のサイレントでニュートラルなミスセンス突然変異はフレームワーク領域にある可能性が高いのに対し、大部分の非ニュートラルなミスセンス突然変異はＣＤＲにある可能性が高いが、このことは絶対的な要件ではない。当業者であれば抗原結合活性に改変がないこと、又は結合活性に改変があること（例えば抗原結合活性における向上、又は抗体の特異性の変化）のような所望の特性を有する突然変異体分子を設計して試験することが可能である。突然変異誘発の後、コードされた蛋白を日常的に発現させてよく、そしてコードされた蛋白の機能的及び／又は生物学的な活性を本明細書に記載する手法を用いて、又は当該分野で知られた手法を日常的に変更することにより測定することができる。
【０２１２】
融合蛋白及びコンジュゲートされたポリペプチド及び抗体
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチド及び抗体は更に、Ｎ又はＣ末端において異種ポリペプチドに組み換え融合するか、又はポリペプチド又は他の組成物に化学的にコンジュゲート（共有結合又は非共有結合コンジュゲーションを包含する）してよい。例えば、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体は検出試験において標識として有用な分子及び異種ポリペプチド、薬品、放射性核種又は毒素のようなエフェクター分子に組み換え融合又はコンジュゲートしてよい。例えばＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許５，３１４，９９５；及びＥＰ３９６，３８７を参照できる。
【０２１３】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド及び抗体は修飾された、即ち共有結合がＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体が機能する（例えばＳｐ３５の生物学的機能を抑制するか、又はＥｒｂＢ２シグナリングに影響する、例えば活性化する）ことを妨げないような何れかの型の分子の共有結合による誘導体を包含する。例えば、限定されないが、本発明のＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド及び抗体は例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白分解性の切断、細胞リガンド又は他の蛋白への連結等により修飾されていてよい。多くの化学修飾のいずれも知られた手法、例えば限定しないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成等により実施してよい。更に又、誘導体は非伝統的なアミノ酸１つ以上を含有してよい。
【０２１４】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド及び抗体はペプチド結合又は修飾されたペプチド結合、即ち、ペプチドアイソスターにより相互に連結されたアミノ酸を含むことができ、そして、２０遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド及び抗体は天然のプロセス、例えば翻訳後のプロセシングにより、又は当該分野で良く知られている化学的修飾の手法により修飾されていてよい。そのような修飾は基本的なテキストにおいて、そして、より詳細な学術論文並びに多大な参考文献において十分に説明されている。修飾はＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体の何れかの箇所、例えばペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端において起こることができる。同じ型の修飾が所定のＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体内の数個の部位において同じか異なる程度で存在してよい。更に又、所定のＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体は多くの型の修飾を含有してよい。Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体は例えばユビキチン化の結果として分枝していてよく、そしてそれらは分枝を伴うか伴わない環状であってもよい。環状、分枝、及び分枝環状のＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド及び抗体は翻訳後の天然のプロセスから生じてよく、又は合成法により製造してよい。修飾はアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合交差結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような蛋白へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加及びユビキチン化を包含する（例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ等、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ等、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【０２１５】
本発明は又、Ｓｐ３５の機能を抑制するＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体融合を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる融合蛋白を提供する。好ましくはＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体が融合する異種ポリペプチドは機能のために有用であるか、又はＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体をターゲティングするために有用である。本発明の特定の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド、例えばＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン又は全細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸３４〜５３２に相当）を含むＳｐ３５ポリペプチドを異種ポリペプチド部分に融合することによりＳｐ３５拮抗剤融合ポリペプチドを形成する。
【０２１６】
更に又、本発明はＥｒｂＢ２のＳｐ３５結合を抑制し、ＥｒｂＢ２のリン酸化を増進し、及び／又は、稀突起膠細胞分化を増進するＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体融合を含むか、これよりなるか、本質的にこれよりなる融合蛋白を提供する。Ｓｐ３５拮抗剤融合蛋白及び抗体又はＥｒｂＢ２融合蛋白及び抗体は種々の目的、例えば増大した血清中半減期、向上した生体利用性、特定の臓器又は組織の型へのインビボのターゲティング、向上した組み換え体発現効率、向上した宿主細胞分泌、精製の容易さおよびより高値のアビディティーを達成するために使用できる。達成すべき目的に応じて異種部分は不活性であるか、又は生物学的に活性であることができる。更に又、それはＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体に安定に融合されるように、又は、インビトロ又はインビボで切断可能であるように選択できる。これらの他の目的を達成するための異種部分は当該分野で知られている。
【０２１７】
Ｓｐ３５拮抗剤融合ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２融合ポリペプチド又は抗体の発現の代替として、選択された異種部分をあらかじめ形成し、そして、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２又は抗体に化学的にコンジュゲートすることができる。大部分の例においては、選択された異種部分は、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体に融合しているかコンジュゲートしているかに関わらず、同様に機能する。従って、異種アミノ酸配列の以下の考察においては、特段の記載が無い限り、異種配列は融合蛋白の形態において、又は化学的コンジュゲートとして、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体に連結することができるものと理解しなければならない。
【０２１８】
Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体のような薬理学的に活性なポリペプチドは、頻繁には、急速なインビボのクリアランスを呈し、身体内において治療有効濃度を達成するには高用量を必要とする。更に又、約６０ｋＤａより小型のポリペプチドは潜在的に糸球体濾過を起こし、これは場合により腎毒性をもたらす。Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体のような比較的小型のポリペプチドの融合又はコンジュゲーションはそのような腎毒性の危険を低減又は回避するために使用できる。治療用ポリペプチドのインビボの安定性、即ち、血清中半減期を増大するための種々の異種アミノ酸配列、即ちポリペプチド部分又は「担体」が知られている。
【０２１９】
半減期が長く、インビボの分布が広範であり、そして酵素的又は免疫学的な機能を欠いているために、本質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡフラグメントが異種部分として一般的に使用されている。Ｙｅｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１９０４−０８（１９９２）及びＳｙｅｄ等、Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に記載されているもののような方法及び材料の適用を介して、Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分による薬理学的活性を示しつつ有意に増大したインビボの安定性、例えば１０倍〜１００倍高値を示すような、Ｓｐ３５拮抗剤融合ポリペプチド又は抗体又はポリペプチド／抗体コンジュゲート又はＥｒｂＢ２融合ポリペプチド又は抗体又はポリペプチド／抗体コンジュゲートを形成するためにＨＳＡを使用することができる。ＨＳＡのＣ末端は可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分のＮ末端に融合できる。ＨＳＡは天然に分泌される蛋白であるため、ＨＳＡのシグナル配列を利用することにより、真核生物、例えば哺乳類の発現系において融合蛋白を製造する場合に細胞培養培地への可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２融合蛋白の分泌を達成できる。
【０２２０】
シグナル配列は小胞体膜を通過する蛋白の輸送を開始させるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。イムノフシンを構築するために有用なシグナル配列は、抗体軽鎖シグナル配列、例えば抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えばＭＯＰＣ１４１抗体尿重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））を包含する。或いは、他のシグナル配列を使用できる。例えばＷａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照できる。シグナルペプチドは通常はシグナルペプチダーゼにより小胞体の管腔において切断される。これによりＦｃ領域及びカｙ法制Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分を含有するイムノフシン蛋白の分泌が起こる。
【０２２１】
一部の実施形態においては、ＤＮＡ配列は分泌カセットと可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分との間の蛋白分解性の切断部位をコードする場合がある。このような切断部位は、例えばコードされた融合蛋白の蛋白分解性切断をもたらし、これにより標的蛋白からＦｃドメインを分離する。有用な蛋白分解性切断部位はトリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子又はエンテロキナーゼＫのような蛋白分解酵素により認識されるアミノ酸配列を包含する。
【０２２２】
分泌カセットは複製可能な発現ベクター内に取り込むことができる。有用なベクターは線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド等を包含する。例示される発現ベクターはｐｄＣであり、これにおいては、イムノフシンＤＮＡの転写がヒトサイトメガロウィルスのエンハンサー及びプロモーターの制御下におかれる。例えばＬｏ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）；及びＬｏ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照できる。適切な宿主細胞は可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトし、そして可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドの発現及び分泌のために使用できる。典型的に使用される宿主細胞は不朽化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＣＯＳ細胞を包含する。
【０２２３】
１つの実施形態において、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドはヒンジ及びＦｃ領域、即ちＩｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合される。Ｓｐ３５−Ｆｃ又はＥｒｂＢ２−Ｆｃ融合の潜在的利点は可溶性、インビボ安定性及び多価性、例えば２量体化を包含する。使用されるＦｃ領域はＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジ−、ＣＨ２−ＣＨ３）であることができる。或いは、それはＩｇＥ又はＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４−）であることができる。ＩｇＧＦｃ領域、例えばＩｇＧ１Ｆｃ領域又はＩｇＧ４Ｆｃ領域が一般的に使用される。１つの実施形態において、ＩｇＧＦｃを化学的に定義するパパイン切断部位（即ちＫａｂａｔシステムに従って重鎖定常領域の最初の残基を１１４とした場合に残基２１６）又は他の免疫グロブリンの類似の部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まる配列を融合において使用する。融合を行う厳密な部位は厳密ではなく；特定の部位はよく知られており、そして分子の生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択してよい。Ｆｃ融合をコードするＤＮＡを構築して発現させるための材料及び方法は当該分野で知られており、そして予定外の実験を行うことなく可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２融合を得るために適用できる。本発明の一部の実施形態はＣａｐｏｎ等、米国特許５，４２８，１３０及び５，５６５，３３５に記載されているもののようなＳｐ３５融合蛋白を使用する。
【０２２４】
完全に未損傷の野生型Ｆｃ領域は本発明の方法において使用されるＦｃ融合蛋白においては通常は不必要であり、そして望ましくないエフェクター機能を示す。従って、特定の結合部位は典型的には分泌カセットの構築の間はＦｃ領域から欠失される。例えば、軽鎖との同時発現が必要ではないため、重鎖結合蛋白、Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））のための結合部位は、この部位がイムノフシンの効率的な分泌を妨害しないように、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失される。膜貫通ドメイン配列、例えばＩｇＭに存在するものもまた一般的に欠失される。
【０２２５】
ＩｇＧ１Ｆｃ領域が最も頻繁に使用される。或いは、免疫グロブリンガンマの他のサブクラス（ガンマ−２、ガンマ−３及びガンマ−４）のＦｃ領域を分泌カセットにおいて使用することができる。免疫グロブリンガンマ−１のＩｇＧ１Ｆｃ領域が一般的に分泌カセットにおいて使用され、そしてヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部分を包含する。一部の実施形態においては、免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ領域はＣＨ２−欠失−Ｆｃであり、これはヒンジ領域及びＣＨ３領域の部分は包含するが、ＣＨ２領域は包含しない。ＣＨ２−欠失−ＦｃはＧｉｌｌｉｅｓ等、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）に記載されている。一部の実施形態においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭのＦｃ領域を使用する。
【０２２６】
Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２融合蛋白は数種の異なる配置に構築できる。１つの配置において、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分のＣ末端はＦｃヒンジ領域のＮ末端に直接融合させる。わずかに異なる配置においては、単鎖ポリペプチド、例えば２〜１０アミノ酸を可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間の融合に取り込ませる。そのようなリンカーはコンホーメーションの柔軟性をもたらし、それが一部の状況においては生物学的活性を向上させる場合がある。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分に保持されている場合、Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２融合は２量体化することになり、これにより２価の分子が形成される。単量体Ｆｃ融合の均質な集団は一重特異性の２価の２量体を与えることになる。各々が異なる特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合の混合物は二重特異性の２価の２量体を与えることになる。
【０２２７】
相当するアミノ反応性の基及びチオール反応性の基を含有する多くの交差結合剤の何れかを用いることによりＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又はＥｒｂＢ２ポリペプチドを血清アルブミンに連結することができる。適当なリンカーの例は、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性交差結合剤、例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ及びＧＭＢＳを包含する。他の適当なリンカーは例えばＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢのようなチオール反応性ハロアセテート基を挿入するものである。還元性の連結部を形成するためのスルヒドリル基との反応のための保護された又は非保護のチオールを与えるリンカーは、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ及びＳＡＴＰを包含する。このような試薬は市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０２２８】
コンジュゲーションには可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドのＮ末端や血清アルブミンのチオール部分を関与させる必要はない。例えば可溶性Ｓｐ３５アルブミン融合又はＥｒｂＢ２アルブミン融合は、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分がそのＮ末端、Ｃ末端又は両方において血清アルブミンに融合される遺伝子操作手法を用いて得ることができる。
【０２２９】
可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドは可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分の精製又は識別を容易にするために異種ペプチドに融合できる。例えばヒスチジンタグを可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドに融合することにより市販のクロマトグラフィー媒体を用いた精製を容易にすることができる。
【０２３０】
本発明の一部の実施形態においては、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２融合コンストラクトは細菌における可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分の製造を増強するために使用される。そのようなコンストラクトにおいて、通常は高レベルで発現及び／又は分泌される細菌性蛋白を可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドのＮ末端融合相手として使用する。例えばＳｍｉｔｈ等、Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１８７（１９９３）を参照できる。
【０２３１】
可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分を適当な融合相手のアミノ及びカルボキシ末端において融合することにより、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドの２価又は４価の形態を得ることができる。例えば、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分をＩｇ部分のアミノ及びカルボキシ末端に融合させることにより２つの可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分を含有する２価の単量体ポリペプチドを製造できる。Ｉｇ部分によるこれらの単量体２つの２量体化により、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２蛋白の４価の形態が得られる。そのような多価の形態は標的への結合親和性を増大させるために使用できる。可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２の多価の形態はまた、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２部分を直列においてコンカタマーを形成することにより得ることもでき、これは単独で使用するか、Ｉｇ又はＨＳＡのような融合相手と融合することができる。
【０２３２】
コンジュゲートされた重合体（ポリペプチド以外）
本発明の一部の実施形態は重合体１つ以上がＳｐ３５ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体にコンジュゲート（共有結合）されている可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又はＳｐ３５又はＥｒｂＢ２抗体が関与している。このようなコンジュゲーションのために適する重合体の例は、ポリペプチド（上記）、糖重合体及びポリアルキレングリコール鎖を包含する。必須ではないが典型的には、重合体は、以下のもの、即ち溶解性、安定性又は生体利用性の１つ以上を向上させる目的の為に、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又はＳｐ３５又はＥｒｂＢ２抗体にコンジュゲートされる。
【０２３３】
Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体へのコンジュゲーションのために一般的に使用される重合体のクラスはポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分、例えば１、２、３、４又は５ＰＥＧの重合体を欠くＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体にコンジュゲートすることにより、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体単独と比較した場合に血清中半減期を増大させることができる。ＰＥＧ部分は非抗原性であり、そして本質的には生物学的に不活性である。本発明の実施において使用されるＰＥＧ部分は分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。
【０２３４】
Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体に結合させるＰＥＧ部分の数及び個々のＰＥＧ鎖の分子量は変動することができる。一般的に重合体の分子量が高くなるほど、ポリペプチドに結合する重合体鎖が少なくなる。通常は、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体に結合する全重合体の質量は２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。即ち、１つの重合体鎖を結合させる場合、鎖の分子量は一般的に２０〜４０ｋＤａとなる。２つの鎖を結合させる場合、各々の鎖の分子量は一般的に１０〜２０ｋＤａとなる。３つの鎖を結合させる場合、分子量は一般的に７〜１４ｋＤａとなる。
【０２３５】
重合体、例えばＰＥＧはポリペプチド上の何れかの適当な曝露された反応性の基を介してＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体に連結できる。曝露された反応性の基は例えばＮ末端アミノ基又は内部リジン残基のイプシロンアミノ基又は両方であることができる。活性化された重合体はＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体上の何れかの遊離のアミノ基において反応及び共有結合することができる。Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体上の遊離のカルボキシル基、適宜活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された炭水化物部及びメルカプト基（使用可能な場合）もまた重合体結合のための反応性の基として使用できる。
【０２３６】
コンジュゲーション反応においては、ポリペプチド濃度に応じてポリペプチドのモル当たり活性化された重合体約１．０〜約１０モルを典型的には使用する。通常は選択される比は反応を最大化しつつ、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体の所望な薬理学的活性を減損する可能性がある副反応（頻繁には非特異的）を最小限にすることとの間で均衡させる。好ましくは、Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体の生物学的活性（例えば本明細書に記載した、又は当該分野で知られた試験の何れかにおいて明らかにされるものとして）の少なくとも５０％が保持され、そして最も好ましくはほぼ１００％が保持される。
【０２３７】
重合体は従来の化学的特徴を用いながらＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体にコンジュゲートできる。例えば、ポリアルキレングリコール部分をＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体のリジンイプシロンアミノ基にカップリングすることができる。リジン側鎖への連結はＮ−ヒロドキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、例えばＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）及びスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を用いて実施できる。適当なポリアルキレングリコール部分は例えばカルボキシメチル−ＮＨＳ及びノルロイシン−ＮＨＳ，ＳＣを包含する。これらの試薬は市販されている。別のアミン反応性ＰＥＧリンカーをスクシンイミジル部分と置換することができる。これらには、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール及びＰＮＰカーボネートが包含される。条件は通常は選択性及び反応の程度を最大限とするように最適化される。そのような反応条件の最適化は当該分野で知られている。
【０２３８】
ＰＥＧ化は当該分野で知られたＰＥＧ化反応の何れかにより実施できる。例えばＦｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）及び欧州特許出願ＥＰ０１５４３１６及びＥＰ０４０１３８４を参照できる。ＰＥＧ化は反応性のポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性の水溶性重合体）とのアシル化反応又はアルキル化反応を用いることにより実施してよい。
【０２３９】
アシル化によるＰＥＧ化では、一般的にポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させる。何れの反応性のＰＥＧ分子もＰＥＧ化において使用できる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧが頻繁に使用される活性化ＰＥＧエステルである。本明細書においては、「アシル化」とは、限定しないが、治療用蛋白とＰＥＧのような水溶性重合体との間の以下の型の連結、即ちアミド、カーバメート、ウレタン等を包含する。例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照できる。反応パラメーターは一般的に可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチドを損傷又は不活性化するような温度、溶媒及びｐＨ条件を回避するように選択される。
【０２４０】
一般的に連結部はアミドであり、そして典型的には結果として生じる生成物の少なくとも９５％がモノ、ジ又はトリＰＥＧ化されている。しかしながら、より高度なＰＥＧ化を有する一部の物質種を使用する特定の反応条件に応じた量で形成してよい。場合により、精製されたＰＥＧ化物質種を混合物、特に未反応の物質種から、従来の精製方法、例えば透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー及び電気泳動により分離する。
【０２４１】
アルキル化によるＰＥＧ化では、一般的に還元剤の存在下でＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体にＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を反応させる。更に又、実質的にＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体のＮ末端アミノ基においてのみＰＥＧ化が優先されるように、即ちモノＰＥＧ化蛋白となるように、反応条件を操作することができる。物ＰＥＧ化又はポリＰＥＧ化の何れかの場合において、ＰＥＧ基は典型的には−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して蛋白に結合される。ＣＨ２−基に特段言及すれば、この型の連結部は「アシル」連結部として知られている。
【０２４２】
Ｎ末端ターゲティング物ＰＥＧ化生成物を生成するための還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に使用できる第１アミノ基の異なる型（リジンｖｓＮ末端）の異なる反応性を利用している。反応はリジン残基のイプシロンアミノ基と蛋白のＮ末端アミノ基との間のｐＫａの差を利用可能とするｐＨにおいて実施する。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドのような反応性の基を含有する水溶性重合体の蛋白への結合が制御され：重合体とのコンジュゲーションは蛋白のＮ末端で主に起こり、そしてリジン側鎖アミノ基のような他の反応性の基の有意な修飾は起こらない。
【０２４３】
アシル化及びアルキル化の方法の両方において使用される重合体分子は水溶性重合体から選択される。選択された重合体は典型的には、重合の程度が本発明の方法において提供されるように制御されるように、単一の反応性の基、例えばアシル化のための活性エステル、アルキル化のためのアルデヒドを有するように修飾される。例示される反応性のＰＥＧアルデヒドは水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド又はそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はアリールオキシ誘導体である（例えばＨａｒｒｉｓ等、米国特許５，２５２，７１４を参照できる。重合体は分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。アシル化反応のためには、選択される重合体は典型的には単一の反応性のエステル基を有する。還元的アルキル化のためには選択される重合体は典型的には単一の反応性のアルデヒド基を有する。一般的に、水溶性重合体は天然に存在するグリコシル残基から選択されないが、その理由は、これらは通常は哺乳類組み換え体発現系により更に好都合に形成されるためである。
【０２４４】
ＰＥＧ化可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド又は抗体おるはＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体を製造するための方法は一般的に（ａ）Ｓｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体をポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性のエステル又はアルデヒド誘導体）と、分子がＰＥＧ基１つ以上に結合されるような条件下で反応させること、及び（ｂ）反応生成物を得ること、の工程を包含する。一般的に、アシル化のための最適な反応条件は既知のパラメーター及び所望の結果に基づいてケースバイケースで決定されることになる。例えばＰＥＧの蛋白に対する比が大きいほど、ポリＰＥＧ化産物のパーセンテージが大きくなる。
【０２４５】
モノ重合体／可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド又はＳｐ３５抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体の実質的に均質な集団を製造するための還元的アルキル化は、一般的に、（ａ）可溶性Ｓｐ３５蛋白又はポリペプチド又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体を反応性のＰＥＧ分子と還元的アルキル化の条件下で、ポリペプチド又は抗体のＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能とするｐＨにおいて反応させること、および（ｂ）反応生成物を得ること、の工程を包含する。
【０２４６】
モノ重合体／可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド又はＳｐ３５抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体の実質的に均質な集団のためには、還元的アルキル化反応条件はポリペプチド又は抗体のＮ末端への水溶性重合体部分の選択的結合を可能にするものである。そのような反応条件は一般的にリジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基との間のｐＫａの差を与えるものである。本明細書の目的の為には、ｐＨは一般的に３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
【０２４７】
可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体はタグ、例えば蛋白分解により後に放出されることができる部分を包含できる。即ちリジン部分を選択的に修飾するには、まず、リジン及びＮ末端の両方と反応することになるＴｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）のような低分子量リンカーで修飾したＨｉｓタグを反応させる。次にポリペプチドが遊離のＳＨ基を含有することになり、これがマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、又は遊離又は保護されたＳＨのようなチオール反応性のヘッド基を含有するＰＥＧで選択的に修飾されえる。
【０２４８】
Ｔｒａｕｔ試薬はＰＥＧ結合のための特異的な部位を設定することになる何れかのリンカーで置き換えることができる。例えばＴｒａｕｔ試薬はＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ又はＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で置き換えることができる。同様に、蛋白はマレイミド（例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ又はＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）又はビニルスルホン基を挿入するアミン反応性のリンカーに反応させ、そして得られた生成物を遊離のＳＨを含有するＰＥＧと反応させることができる。
【０２４９】
一部の実施形態においてはポリアルキレングリコール部分はＳｐ３５拮抗剤ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体のシステイン基にカップリングさせる。カップリングは例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基又はチオール基を用いて行うことができる。
【０２５０】
場合により、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド又は抗体又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は抗体は不安定な結合を介してポリエチレングリコール部分にコンジュゲートされる。不安定な結合は例えば生化学的加水分解、蛋白分解又はスルヒドリル切断において切断できる。例えば、結合はインビボ（生理学的）条件下に切断できる。
【０２５１】
反応は、反応性の基がＮ末端においてアルファアミノ基上にある場合は、一般的に約ｐＨ５〜８、例えばｐＨ５、６、７又は８において、不活性重合体に生物学的に活性な物質を反応させるために使用される何れかの適当な方法により行ってよい。一般的にプロセスでは活性化された重合体を製造し、その後、蛋白を活性化重合体と反応させて製剤に適する可溶性蛋白を製造する。
【０２５２】
Ｓｐ３５ポリヌクレオチド拮抗剤
特定の実施形態はＳＰ３５をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含むＳｐ３５ポリヌクレオチド拮抗剤の有効量を投与することを含む脱髄又は髄鞘発育不全の障害を治療する方法を含む。Ｓｐ３５ポリヌクレオチド拮抗剤はＳｐ３５の発現を防止する（ノックダウン）。Ｓｐ３５ポリヌクレオチド拮抗剤は限定しないが、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＲＮＡｉを包含する。典型的にはこのような結合分子を別個に動物に投与する（例えばＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照できる）が、そのような結合分子はまた宿主細胞により取り込まれインビボで発現されているポリヌクレオチドからインビボで発現させてもよい。またＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）も参照できる。
【０２５３】
ＲＮＡｉはターゲティングされたｍＲＮＡの発現を妨害するＲＮＡの発現を指す。特にＲＮＡｉはｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）を介した特異的ｍＲＮＡ（例えばＳｐ３５）との相互作用を介してターゲティングされた遺伝子をサイレント化する。次いでｄｓＲＮＡ複合体を細胞による分解のためにターゲティングする。さらなるＲＮＡｉ分子は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；又、短鎖干渉ヘアピンを包含する。ｓｈＲＮＡ分子はループにより連結された標的遺伝子由来のセンス及びアンチセンスの配列を含有する。ｓｈＲＮＡは核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡに沿って分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩ又はＵ６プロモーターはＲＮＡｉに関するＲＮＡを発現するために使用できる。
【０２５４】
ＲＮＡｉは自身の「標的」ｍＲＮＡに対して配列特異的な相同性を有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子により媒介される（Ｃａｐｌｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１）。ショウジョウバエの無細胞溶解物における生化学的試験によれば、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのメディエーターは２１〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡデュプレックス（ｓｉＲＮＡ）であることが示されている。従って、ｓｉＲＮＡ分子は好都合に本発明の方法で使用される。ｓｉＲＮＡはＤＩＣＥＲとして知られるＲＮａｓｅによるｄｓＲＮＡのプロセシングから誘導される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１）。ｓｉＲＮＡデュプレックス産物はＲＩＳＣと称される多蛋白ｓｉＲＮＡ複合体（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）内にリクルートされると考えられる。如何なる特定の理論にも制約されないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡにガイドされ、ここでｓｉＲＮＡデュプレックスが配列特異的に相互作用して触媒的態様において切断を媒介すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａ等、ＣｕｒｒＢｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１）。
【０２５５】
ＲＮＡｉは哺乳類細胞において遺伝子の機能を分析するため、及び、必須遺伝子を発見するために使用されており（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：１９９−２１３，２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈ等、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５，２００１）、それには限定しないがニューロンが包含される（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９，２００２）。ＲＮＡｉは又、例えば限定しないがポリオウィルス（Ｇｉｔｌｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０，２００２）及びＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉ等、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１，２００２）を包含するウィルスの感染、複製及び／又は生育を抑制又はブロックすること、及びオンコジーンの発現を低減すること（例えばｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒ等、Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｐ  ２６  ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，２００２）のような治療の様式に関して評価されている。ＲＮＡｉは哺乳類（マウス）及び両生類（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚における（それぞれＣａｌｅｇａｒｉ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４２３６−１４２４０，２００２；及びＺｈｏｕ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９，２００２）、そして出生後のマウスにおける（Ｌｅｗｉｓ等、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２：１０７−１０８，２００２）遺伝子発現をモジュレートするため、及び、成熟トランスジェニックマウスにおけるトランスジーンの発現を低減するため（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９，２００２）に使用されている。細胞培養物及びインビボにおいてｓｉＲＮＡの薬効及び特異性を測定するための方法が記載されている（例えばＢｅｒｔｒａｎｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４，２００２；Ｌａｓｓｕｓ等、Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３，２００２；及びＬｅｉｒｄａｌ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８，２００２参照）。
【０２５６】
限定しないがｓｉＲＮＡを包含するＲＮＡｉを媒介する分子は、化学的合成（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）によりインビトロで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロの転写により（Ｄｏｎｚｅｅｔ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，２００２；Ｙｕ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，２００２）、そして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩのようなヌクレアーゼを用いた２本鎖ＲＮＡの加水分解により（Ｙａｎｇ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，２００２）製造できる。
【０２５７】
ｓｉＲＮＡ分子は又、２つのオリゴヌクレオチドを相互にアニーリングすることにより形成してよく、典型的には以下に示す一般的構造を有しており、これは２本鎖及び１本鎖の部分の両方を包含する。
【０２５８】
【化１１】
2009518299.tif 000012
ここで、Ｎ、ＸおよびＹはヌクレオチドであり；ＸはＹに水素結合し；「：」は２つの塩基の間の水素結合を示し；ｘは１〜約１００の間の値を有する自然数であり；そしてｍおよびｎは独立して０及び約１００の間の値を有する整数である。一部の実施形態においては、Ｎ、ＸおよびＹは独立してＡ、Ｇ、Ｃ及びＴ又はＵである。天然に存在しない塩基及びヌクレオチドは、特に合成ｓｉＲＮＡの場合に存在しえる（即ち２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングの産物）。２本鎖の中央の区分は「コア」と称され、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有し；１本鎖部分はオーバーハングであり、測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有する。示されているオーバーハングは３’オーバーハングであるが、５’オーバーハングを有する分子も本発明の範囲に包含される。同様に本発明の範囲に包含されるものはオーバーハングを有さないｓｉＲＮＡ分子（即ちｍ＝０、そしてｎ＝０）及びコアの片側のみにオーバーハングを有し、他方には有さないもの（例えばｍ＝０、そしてｎ≧１又はこの逆）である。
【０２５９】
当初は、ＲＮＡｉ技術は哺乳類系に容易に適用できるとは考えられていなかった。その理由は、哺乳類においては、ｄｓＲＮＡはｄｓＲＮＡ活性化蛋白キナーゼ（ＲＫＲ）を活性化しアポトーシスカスケード及び細胞死をもたらす（Ｄｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３，１９９７）。更に又、ｄｓＲＮＡは哺乳類細胞においてインターフェロンカスケードを活性化し、これがさらに細胞の生理学的特徴を改変する場合があることが長期に渡り知られていた（Ｃｏｌｂｙ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３，１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７，１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２，１９６７；Ｌｏｍｎｉｃｚｉ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５，１９７０；及びＹｏｕｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２，１９６６）。しかしながら、ＰＫＲ及びインターフェロンカスケードのｄｓＲＮＡ媒介活性化は約３０塩基対より長いｄｓＲＮＡを要する。これとは対照的に３０塩基対より短いｄｓＲＮＡは哺乳類細胞においてＲＮＡｉを誘発することが明らかにされている（Ｃａｐｌｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：９７４２−９７４７，２００１）。即ち、より長いｄｓＲＮＡ分子に伴っている望ましくない非特異的な作用は、より長いｄｓＲＮＡを実質的に含まない短いＲＮＡを調製することにより回避できる。
【０２６０】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａ等、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０，２００１；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２；Ｃａｐｌｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２，１９９９；Ｎａｇａｓｅ等、ＤＮＡ  Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９；Ｎａｐｏｌｉ等、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ２：２７９−２８９，１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ等、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ１３：６７−７３，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈ等、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ（６：１０７７−１０８７，２０００；Ｒｏｍａｎｏ等、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：３３４３−３３５３，１９９２；Ｔａｂａｒａ等、Ｃｅｌｌ  ９９：１２３−１３２，１９９９；及びＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
【０２６１】
Ｐａｄｄｉｓｏｎ等（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，２００２）はＲＮＡｉを起こすための手段としてヘアピンに折りたたまれた小型ＲＮＡ分子を使用している。従って、そのような短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた本発明の方法において好都合に使用される。機能的ｓｈＲＮＡの幹部及びループ部の長さは変動し；幹部の長さは約２５〜約３０ｎｔの範囲であることができ、そしてループ部のサイズはサイレンシング活性に影響することなく４〜約２５ｎｔの範囲であることができる。如何なる特定の理論にも制約されないが、これらのｓｈＲＮＡはＤＩＣＥＲのＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物を模倣していると考えられ、そして何れかの事象において、特定の遺伝子の発現を抑制するための同じ能力を有する。
【０２６２】
本発明の一部の実施形態においては、ｓｈＲＮＡは実施例１に記載する通りレンチウィルス（ｐＬＬ３．７）から発現される。
【０２６３】
アンチセンス技術は例えばＯｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）において考察されている。三重らせんの形成は例えばＬｅｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）；ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１３００（１９９１）において考察されている。
【０２６４】
例えば、Ｓｐ３５をコードするポリヌクレオチドの５’コーディング部分を用いて約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計してよい。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補であり、これにより転写及び標的蛋白の生産を防止するように設計される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡとインビボでハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡから標的ポリペプチドへの翻訳をブロックする。
【０２６５】
１つの実施形態において、Ｓｐ３５遺伝子に特異的なアンチセンス核酸は外因性配列からの転写により細胞内で生産される。例えばベクター又はその部分を転写し、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生産する。そのようなベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生産できる限り、エピソーム性のままであるか、又は染色体組み込み型となることができる。そのようなベクターは当該分野で標準的な組み換えＤＮＡ技術の方法により構築できる。ベクターは脊椎動物の細胞における複製および発現のために使用されるプラスミド、ウィルス又は当該分野で知られた他のものであることができる。アンチセンス分子の発現は脊椎動物、好ましくはヒトの細胞、例えば本明細書に別途記載するものにおいて作用することが当該分野で知られている何れかのプロモーターにより行われる。
【０２６６】
アンチセンス分子の絶対的な相補性は、好ましいが、必須ではない。Ｓｐ３５をコードするＲＮＡの少なくとも一部分に相補である配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズすることができるために十分な相補性を有し、安定なデュプレックスを形成する配列を意味し；或いはトリプレックスの形成を試験してよい。ハイブリダイズする能力は相補性の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存している。一般的に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、より多くの塩基ミスマッチを含んでよく、そしてなお安定なデュプレックス（又は場合によりトリプレックス）を形成する。当業者であればハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準的な操作法を用いることによりミスマッチの認容可能な程度を確認できる。
【０２６７】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端、例えば５’未翻訳配列からＡＵＧ開始コドンまでに相補であるオリゴヌクレオチドは翻訳の抑制において最も効率的に働かなければならない。しかしながら、ｍＲＮＡの３’未翻訳配列に相補的な配列は同様にｍＲＮＡの翻訳の費抑制においても効果的であることがわかっている。一般的にＷａｇｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照できる。即ち、５’−又は３’−未翻訳非コーディング領域の何れかに相補であるオリゴヌクレオチドはＳｐ３５の翻訳を抑制するためのアンチセンス法において使用できる。ｍＲＮＡの５’未翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドはＡＵＧ開始コドンの相補物を包含しなければならない。ｍＲＮＡコーディング領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは翻訳の抑制剤としては低効率であるが、本発明に従って使用できる。アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチド超でなければならず、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド超の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の特徴において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド又は少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２６８】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡ又はそのキメラ混合物又は誘導体又は修飾された型であって、１本鎖又は２本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を向上させるために、塩基部分、糖部分又はホスフェート骨格において修飾されていることができる。オリゴヌクレオチドは他の付随する基、例えばペプチド（例えばインビボで宿主細胞受容体をターゲティングするため）、又は細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））；１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０を参照）又は血液脳関門（例えば１９８８年４月２５日公開のＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０１３４を参照）を通過する輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤（例えばＫｒｏｌ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６（１９８８）参照）又はインタカレーティング剤（例えばＺｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）参照）を包含してよい。この目的の為には、オリゴヌクレオチドを他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー交差結合剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤などにコンジュゲートしてよい。
【０２６９】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば限定しないが５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５‘メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンよりなる群から選択される修飾された塩基部分少なくとも１つを含んでよい。
【０２７０】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた例えば限定しないがアラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースよりなる群から選択される修飾された糖部分少なくとも１つを含んでよい。
【０２７１】
さらに別の実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば限定しないがホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホアミドチオエート、ホスホアミデート、ホスホジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類縁体よりなる群から選択される修飾されたホスフェート骨格少なくとも１つを含む。
【０２７２】
さらに別の実施形態においては本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマー性のオリゴヌクレオチドである。α−アノマー性のオリゴヌクレオチドは、通常の状況とは逆に鎖が相互に平行に走っている相補ＲＮＡと特異的２本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。オリゴヌクレオチドは２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Ｉｎｏｕｅ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
【０２７３】
本発明のポリヌクレオチドは当該分野で知られた標準的な方法により、例えば自動ＤＮＡ合成器（例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から販売されているもの）の使用により合成してよい。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法により合成してよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された細孔を有するガラス重合体支持体（Ｓａｒｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））等の使用により製造できる。
【０２７４】
本明細書に開示する治療方法において使用するためのポリヌクレオチド組成物は更に触媒性のＲＮＡ、又はリボザイムを包含する（例えば１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際航海ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）参照）。ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成するフランキング領域により決定される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列、即ち５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び製造は当該分野で良く知られており、そしてＨａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）により詳細に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端の近傍に位置するように；即ち効率を増大させ、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限にするために、操作される。
【０２７５】
アンチセンス法の場合と同様、本明細書に開示した診断及び治療方法において使用するためのリボザイムは修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば向上した安定性、ターゲティング等のため）を含むことができ、そしてインビボでＳｐ３５を発現する細胞に送達してよい。リボザイムをコードするＤＮＡコンストラクトはＤＮＡをコードするアンチセンスの導入に関して上記したもの同じ態様において細胞内に導入してよい。送達の好ましい方法では、トランスフェクトされた細胞が内因性Ｓｐ３５メッセージを破壊して翻訳を抑制するために十分な量のリボザイムを生産するように、強力な構成プロモーター、例えばｐｏｌ  ＩＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下にリボザイムを「コードする」ＤＮＡコンストラクトを用いる。リボザイムはセンス分子とは異なり触媒性であるため、効率のためにはより低い細胞内濃度を必要とする。
【０２７６】
ベクター
Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤をコードする核酸を含むベクターもまた本発明の方法において使用するための拮抗剤を製造するために使用してよい。ベクター及びそのような核酸が作動可能に連結している発現制御配列の選択は所望の機能的特性、例えば蛋白の発現及び形質転換すべき宿主細胞により変動する。
【０２７７】
特定の実施形態においては、ＥｒｂＢ２結合剤は上記した可溶性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドをＥｒｂＢ２可溶性ポリヌクレオチドの発現のためのベクター内に取り込んでよい。
【０２７８】
作動可能に連結したコーディング配列の発現を調節するために有用な発現制御エレメントは当該分野で知られている。例としては、限定しないが、誘導プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナル及び他の調節エレメントを包含する。誘導プロモーターを使用する場合は、それは、例えば、宿主細胞培地における栄養状態の変更、又は温度の変更により制御できる。
【０２７９】
ベクターは原核生物のレプリコン、例えば、細菌宿主細胞において染色体外から自律的複製および組み換えＤＮＡ分子の維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列を包含できる。そのようなレプリコンは当該分野で良く知られている。更に又、原核生物のレプリコンを包含するベクターはまた、発現されれば薬品耐性のような検出可能なマーカーが付与されるような遺伝子を包含してよい。細菌の薬品耐性の遺伝子の例はアンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０２８０】
原核生物のレプリコンを包含するベクターはまた、細菌宿主細胞内でコーディング遺伝子配列の発現を指向するための原核生物又はバクテリオファージのプロモーターを包含できる。細菌宿主と適合するプロモーター配列は典型的には発現すべきＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含有するプラスミドベクター中に提供される。そのようなプラスミドベクターの例はｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。何れの適当な原核生物宿主も本発明の方法において使用するための蛋白をコードする組み換えＤＮＡ分子を発現するために使用できる。
【０２８１】
本発明の目的の為には、多くの発現ベクター系を使用してよい。例えばベクターの１つのクラスはウシ乳頭腫ウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス、レトロウィルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウィルスのような動物ウィルスから誘導されるＤＮＡエレメントを利用する。他の場合は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニックな系を使用する。更に又、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にするマーカー１つ以上を導入することにより自身の染色体内にＤＮＡを組み込んでいる細胞を選択してよい。マーカーは栄養要求性の宿主への原栄養性、生物致死物質耐性（例えば抗生物質）又は銅のような重金属に対する耐性を与えてよい。選択可能なマーカーは発現すべきＤＮＡ配列に直接連結するか、又は同時形質転換により同じ細胞内に導入することができる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は選択可能なマーカーの遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。さらなるエレメントもまたｍＲＮＡの最適な合成のために必要となる場合がある。これらのエレメントはシグナル配列、スプライス配列並びに転写プロモーター、エンハンサー及び終止シグナルを包含してよい。
【０２８２】
１つの実施形態において、ＮＥＯＳＰＬＡと称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃ．の専売の発現ベクター（米国特許６，１５９，７３０）を使用してよい。このベクターはサイトメガロウィルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１及びエクソン２、ジヒドロホレート還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有している。このベクターは、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、その後のＧ４１８含有培地中での選択及びメトトレキセート増幅により、極めて高いレベルの発現をもたらすことがわかっている。当然ながら、真核生物細胞において発現を誘発することができる如何なる発現ベクターも本発明において使用してよい。適当なベクターの例は限定しないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ及びｐＺｅｏＳＶ２（入手元Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びプラスミドｐＣＩ（入手元Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を包含する。さらなる真核生物細胞発現ベクターは当該分野で知られており、そして市販されている。典型的にはそのようなベクターは所望のＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含有する。例示されるベクターはｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴｌ（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウィルス発現ベクターｐＭＩＧ及びｐＬＬ３．７、アデノウィルスシャトルベクターｐＤＣ３１５及びＡＡＶベクターを包含する。他の例示されるベクター系は米国特許６，４１３，７７７に記載されている。
【０２８３】
一般的に拮抗剤を適当に高いレベルで発現するものを求めて形質転換細胞多数をスクリーニングすることは例えばロボットシステムにより実施できる日常的な実験である。
【０２８４】
哺乳類宿主細胞発現のために頻繁に使用される調節配列は哺乳類細胞における高レベルの蛋白発現を指向するウィルスエレメント、例えばレトロウィルスＬＴＲから誘導されたプロモーター及びエンハンサー、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ）、ポリオーマ及び強力な哺乳類プロモーター、例えばネイティブの免疫グロブリン及びアクチンプロモーターを包含する。ウィルス調節エレメント及びその配列に関するこれ以上の説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉの米国特許５，１６８，０６２；Ｂｅｌｌの米国特許４，５１０，２４５；及びＳｃｈａｆｆｎｅｒの米国特許４，９６８，６１５を参照できる。
【０２８５】
組み換え発現ベクターは宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子を担持していてよい。選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えばＡｘｅｌの米国特許４，３９９，２１６；４，６３４，６６５及び５，１７９，０１７を参照できる）。例えば、典型的には選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に対して、薬品、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を付与する。頻繁に使用される選択可能なマーカー遺伝子はジヒドロホレート還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を包含する。
【０２８６】
Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤をコードするベクターを適当な宿主細胞の形質転換のために使用できる。形質転換は何れかの適当な方法で行うことができる。外因性ＤＮＡを哺乳類細胞に導入するための方法は当該分野で良く知られており、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内のポリヌクレオチドのカプセル化、および、核内へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションを包含する。更に又、核酸分子はウィルスベクターにより哺乳類細胞内に導入してよい。
【０２８７】
宿主細胞の形質転換は使用するベクター及び宿主細胞に適する従来の方法により達成できる。原核生物宿主細胞の形質転換のためには、エレクトロポレーション及び塩処理方法を使用できる（Ｃｏｈｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換の為には、エレクトロポレーション、カチオン性脂質又は塩処理方法を使用できる。例えばＧｒａｈａｍ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照できる。
【０２８８】
蛋白発現のために使用される宿主細胞系統は最も好ましくは哺乳類起源のものであり；当業者であれば内部で発現させるべき所望の遺伝子に対してもっとも適する特定の宿主細胞系統を決定する能力を有するはずである。例示される宿主細胞系統は限定しないが、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原によるＣＶ１誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ｌｃｌＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎）を包含する。宿主細胞系統は典型的には市販元、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は出版物から得られる。
【０２８９】
産生細胞系統からのポリペプチドの発現は知られた手法を用いて増強できる。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系が特定の条件下で発現を増強するために一般的に使用される。例えば欧州特許０２１６８４６、０２５６０５５及び０３２３９９７及び欧州特許出願８９３０３９６４．４を参照できる。
【０２９０】
宿主細胞
本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤の発現のための宿主細胞は原核生物又は真核生物のものであってよい。例示される真核生物宿主細胞は限定しないが、コウボ及び哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ１６５８）及びベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）を包含する。他の有用な真核生物宿主細胞は昆虫細胞及び植物細胞を包含する。例示される原核生物宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ及びストレプトマイセスである。
【０２９１】
遺伝子療法
Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は、稀突起膠細胞の生存、増殖及び分化を増進すること、又は、ニューロンの髄鞘形成を増進することが治療上有益である神経系の疾患、障害又は傷害の治療のための遺伝子療法の方策を用いながら、哺乳類、例えばヒト患者においてインビボで生産できる。これには適当な発現制御配列に作動可能に連結した適当なＳｐ３５拮抗剤コード核酸の投与を行う。一般的に、これらの配列はウィルスベクター内に取り込まれる。このような遺伝子療法のための適当なウィルスベクターはアデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター、エンテロウィルスベクター、ペストウィルスベクター、レンチウィルスベクター、バキュロウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、エプスタインバーウィルスベクター、パポバウィルスベクター、ポックスウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター及び単純疱疹ウィルスベクターを包含する。ウィルスベクターは複製欠損ウィルスベクターであることができる。Ｅ１遺伝子又はＥ３遺伝子における欠失を有するアデノウィルスベクターが典型的には使用される。アデノウィルスベクターを使用する場合は、ベクターは通常は選択可能なマーカー遺伝子を有さない。
【０２９２】
医薬組成物
本発明の方法において使用するためのＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤はヒトを包含する哺乳類への投与のための医薬組成物に製剤してよい。本発明の方法において使用する医薬組成物は製薬上許容しうる担体、例えばイオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、３ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロック重合体、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含む。
【０２９３】
本発明の方法において使用する組成物はいずれかの適当な方法、例えば非経口、脳室内、経口、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、舌下、膣内又は移植されたリザーバを介して投与してよい。「非経口」という用語は本明細書においては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、患部内及び頭蓋内の注射又は注入の手法を包含する。前述の通り、本発明の方法において使用するＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤は稀突起膠細胞の生存、増殖及び分化及びニューロンの髄鞘形成を増進するために神経系において作用する。従って、本発明の方法においては、Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤はそれらが血液脳関門を通過する態様において投与される。この通過はＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤分子自身に本来備わった物理化学的特性から、医薬品製剤中の他の成分から、又は血液脳関門を破るための針、カニューレ又は外科的機器のような機械的装置の使用から、生じることができる。Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤が本来は血液脳関門を通過しない分子の場合、例えば通過を促進する部分への融合物である場合、適当な投与経路は例えば髄腔内又は頭蓋内、例えばＭＳの慢性病巣に直接行うものである。Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤が本来血液脳関門を通過する分子である場合、投与経路は以下に記載する種々の経路の１つ以上であってよい。
【０２９４】
本発明の方法において使用する組成物の滅菌注射形態は水性又は油性の懸濁液であってよい。これらの懸濁液は適当な分散又は水和剤及び懸濁剤を用いながら当該分野で知られた手法に従って製剤してよい。滅菌された注射用の製剤はまた、非毒しえの非経口許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌された注射用の溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の懸濁液であってよい。使用してよい許容されるベヒクル及び溶媒に包含されるものは水、リンゲル液及び等張性の塩化ナトリウム溶液である。更に又、滅菌された固定油が溶媒又は懸濁媒体として従来使用されている。この目的の為には、合成のモノ又はジグリセリドを包含する何れかの銘柄の固定油を使用してよい。脂肪酸、例えばオレイン酸、およびそのグリセリド誘導体が注射用の調製品において有用であり、天然の製薬上許容しうる油脂、例えばオリーブ油又はヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化された型も同様に例示される。これらの油脂の溶液又は懸濁液は又長鎖のアルコール希釈剤又は分散剤、例えばカルボキシメチルセルロース又は乳液及び懸濁液を包含する製薬上許容しうる剤型の製剤において一般的に使用されている同様の分散剤も含有してよい。他の一般的に使用されている界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ及び製薬上許容しうる固体、液体又は他の剤型の製造において一般的に使用されている他の乳化剤又は生体利用性増強剤もまた製剤の目的のために使用してよい。
【０２９５】
非経口製剤は単回瞬時用量、注入又は負荷瞬時用量とその後の維持用量であってよい。これらの組成物は特定の固定された、又は変動してよい間隔において、例えば一日一回、又は「必要時」を基本として投与してよい。
【０２９６】
本発明の方法において使用する特定の医薬組成物は例えばカプセル、錠剤、彗星懸濁液又は溶液を包含する許容される剤型において経口投与してよい。特定の医薬組成物は又経鼻用のエアロゾル又は吸入により投与してよい。そのような組成物は、ベンジルアルコール又は他の適当な保存料、生体利用性を増強するための吸収増進剤及び／又は他の従来の可溶化剤又は分散剤を用いながら、食塩水中の溶液として調製してよい。
【０２９７】
単一の剤型を製造する為に担体物質と組み合わせてよいＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤の量は治療される宿主、使用する拮抗剤の型及び糖与の特定の様式により変動する。組成物は単用量、多用量として、又は注入において所定期間に渡り、投与してよい。投薬の用法はまた最適な所望の応答（例えば治療又は予防応答）を達成するために調節してよい。
【０２９８】
本発明の方法はＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤の「治療有効量」又は「予防有効量」を使用する。そのような治療又は予防有効量は個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重のような要因に従って変動してよい。治療又は予防有効量は又、如何なる毒性又は有害な作用よりも治療上有利な作用が重要となるようなものである。特定の実施形態においては、治療有効量はＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の結合を抑制又は低減するか、ＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させるか、又は稀突起膠細胞の分化を増大させるＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤の量である。
【０２９９】
何れかの特定の患者に対する特定の用量及び投与の様式は種々の要因、例えば使用される特定のＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤、患者の年齢、体重、全身状態、性別、及び、食餌、及び投与の時間、排出速度、薬品の組み合わせ、及び治療される特定の疾患の重症度により変動する。医療従事者によるそのような要因の判断は当業者の知る通りである。量はまた治療すべき個体患者、投与経路、製剤の型、使用する化合物の特徴、疾患の重症度及び所望の作用に応じて変動する。使用する量は当該分野で良く知られている薬理学及び薬物動態の原則により決定できる。
【０３００】
本発明の方法においてＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤は一般的に直接神経系に、脳室内、又は髄腔内に、例えばＭＳの慢性病巣内に投与される。本発明の方法による投与のための組成物は一日当たり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量のＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチドが投与されるように製剤できる。本発明の一部の実施形態においては、用量は一日当たり０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。一部の実施形態においては、用量は一日当たり０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０３０１】
Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２抗体を用いた治療のためには、用量は例えば約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、そしてより通常では０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）宿主体重の範囲であることができる。例えば用量は１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであることができる。上記範囲の中間の用量もまた本発明の範囲内にあると意図される。対象にはそのような用量を毎日、一日置き、毎週、又は実験的分析により決定される何れかの他の日程に従って投与できる。例示される治療には例えば少なくとも６ヶ月間の長期に渡る他用量における投与が包含される。さらなる例示される治療の用法は、２週毎に一回、又は１月１回、又は３〜６か月毎に１回の投与を包含する。例示される投薬日程は１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ毎日連続、３０ｍｇ／ｋｇ１日置き、又は６０ｍｇ／ｋｇ毎週を包含する。一部の方法においては、異なる結合特性を有するモノクローナル抗体２種以上を同時に投与し、その場合には、投与される各抗体の用量は記載した範囲内に属する。
【０３０２】
特定の実施形態においては、対象はＳｐ３５拮抗剤ポリヌクレオチド又はＥｒｂＢ２可溶性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコードする核酸分子で治療されることができる。核酸の用量は患者当たり、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、又は３０〜３００μｇＤＮＡの範囲である。感染性ウィルスベクターに対する用量は投薬当たり１０〜１００ビリオン以上の範囲である。
【０３０３】
補助的な活性化合物もまた本発明の方法において使用される組成物中に配合できる。例えば、可溶性Ｓｐ３５又はＥｒｂＢ２ポリペプチド又は融合蛋白は別の治療薬１つ以上と同時製剤及び／又は同時投与してよい。
【０３０４】
本発明は選択された標的組織へのＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤の何れかの適当な送達方法、例えば水溶液のボーラス注射又は制御放出システムの移植を包含する。制御放出インプラントの使用は反復注射の必要性を低減する。
【０３０５】
本発明の方法において使用するＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤は脳内に直接注入してよい。化合物の直接脳注入のための種々のインプラントが知られており、そして神経学的障害に罹患しているヒト患者に対する治療用化合物の送達において有効である。これらはポンプ、定位移植された一時的な組織内カテーテル、永久頭蓋内カテーテルインプラント、及び外科的に移植された生体分解性のインプラントを用いた脳内への長期注入を包含する。例えばＧｉｌｌ等、上出；Ｓｃｈａｒｆｅｎ等、“Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒ等、“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５１  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ  ６６，ｐａｇｅｓ  ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａ等、“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ等、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；及びＢｒｅｍ等、“Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ”  、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）を参照できる。
【０３０６】
組成物は化合物のための適当な送達又は支持体系として機能する生体適合性の担体物質中に分散した又Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤を含んでよい。除放性担体の適当な例は、座剤又はカプセルのような形状付与された物品の形態の半透過性の重合体マトリックスを包含する。移植可能な、又はマイクロカプセルの除放性マトリックスはポリラクチド（米国特許３，７７３，３１９；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Ｓｉｄｍａｎ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））又はポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を包含する。
【０３０７】
本発明の一部の実施形態においては、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤は脳の適切な領域内への直接注入により患者に投与される。例えばＧｉｌｌ等、“Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓａｅａｓｅ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照できる。代替手法も使用され、そして本発明に従ってＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤を投与するために適用してよい。例えば、カテーテル又はインプラントの定位設置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−Ｍｕｎｄｉｎｇｅｒ装置及びＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局所化装置を用いて達成できる。コントラスト増強コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、オムニパーク１２０ｍｌ注入、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌ、２ｍｍスライス厚みにより、３次元の多重平面治療計画が可能となる（ＳＴＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この装置は磁気共鳴画像化試験に基づいた計画を可能にし、明確な標的の確認のためにＣＴ及びＭＲＩの標的情報を統合する。
【０３０８】
ＧＥのＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）と共に使用するために改良されたＬｅｋｓｅｌｌ定位システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）並びにＢｒｏｗｎ−Ｒｐｂｅｒｔ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をこの目的のために使用できる。即ち、移植当日午前にＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭蓋に取り付ける。ベースプレートに固定されたグラファイトロッドローカライザーフレームを用いて（標的組織）領域に渡って３ｍｍ間隔で連続ＣＴ断面図を得ることができる。コンピューター化された治療計画プログラムは、ＣＴスペースとＢＲＷスペースの間でマッピングするためのグラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いながら、ＶＡＸ１１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）上で実行される。
【０３０９】
本明細書に記載した脱髄又は髄鞘発育不全の障害の治療方法は、典型的には、ヒトにおいて使用する前に、所望の治療又は予防活性に関して、インビトロで、そして次に許容される動物モデルにおいてインビボで試験される。トランスジェニック動物を包含する適当な動物モデルは当該分野で良く知られている。例えば、Ｓｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤の分化及び生存作用を明らかにするためのインビトロの試験は本明細書に記載する通りである。軸索の髄鞘形成に対するＳｐ３５拮抗剤又はＥｒｂＢ２結合剤の作用は実施例に記載する通りインビトロで試験できる。最後に、インビボの試験は本明細書に記載する通り、Ｓｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤を発現するトランスジェニックマウスを作製することにより、又は、モデルのマウス又はラットに対しＳｐ３５拮抗剤及び／又はＥｒｂＢ２結合剤を投与することにより、実施することができる。
【実施例】
【０３１０】
実施例１
稀突起膠細胞の生物学的特徴にＳｐ３５が関与している。
【０３１１】
稀突起膠細胞はＡ２Ｂ５先祖細胞（Ａ２Ｂ５を発現する）から幾つかの発達段階を経て成熟し、前髄鞘形成稀突起膠細胞（Ｏ１及びＯ４を発現する）に、そして最終的には成熟した髄鞘形成の稀突起膠細胞（Ｏ１、Ｏ４及びミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）を発現する）に分化する。即ち、Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４及びＭＢＰマーカーの有無をモニタリングすることにより、ある細胞の発達段階を決定し、そして稀突起膠細胞の生物学的特徴におけるＳｐ３５−Ｆｃの役割を評価することが可能である。稀突起膠細胞の生物学的特徴の一般的考察に関しては、例えばＢａｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７を参照できる。
【０３１２】
Ｏ４、ＭＢＰ及びＣＮＰａｓｅに対するモノクローナル抗体はＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓから入手し；ＡＰＣに対する抗体（クローンＣＣ−１；ｒｅｆ．２９）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。他の抗体はβＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ）、Ｓｐ３５（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、Ｆｙｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びホスホ−Ｆｙｎ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）に対するものとした。Ａ２Ｂ５に対するモノクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎより入手可能である。
【０３１３】
Ｓｐ３５は稀突起膠細胞において発現される。
【０３１４】
精製されたラットＰ１３  ＣＧニューロン、Ｐ２稀突起膠細胞及びＰ４星状細胞の培養物中のＳｐ３５のエスを逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．より入手したキットを用いて製造元の説明書に従ってラット脳細胞からｍＲＮＡを抽出した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲをフォワードプライマー５’−ＡＧＡＧＡＣＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番号６９）及びリバースプライマー５’−ＡＧＡＧＡＴＧＴＡＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＴＴ−３’（配列番号）を用いながら実施し、ニューロンにおける高い発現、稀突起膠細胞における低い発現及び星状細胞における無発現が観察された（図５）。
【０３１５】
稀突起膠細胞におけるＳｐ３５の発現は成熟ラット視神経から誘導した切片においてインサイチュハイブリダイゼーションにより確認した。ラット視神経切片はＭｉ等、「Ｓｐ３５はＮｏｇｏ−６６受容体／ｐ７５シグナリング複合体の成分である」、Ｎａｔ．Ｎｅｕｔｏｓｃｉ．７：２２１−２８（２００４）に記載の通り調製して処理し、そしてＳｐ３５コーディング配列の最初の５００ヌクレオチドを用いながらジゴキシゲニン標識Ｓｐ３５アンチセンス又はセンスＲＮＡでプローブした。切片は製造元の説明書に従ってＴｙａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び蛍光抗ジゴキシゲニンコンジュゲート抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いながら染色した。組み合わせたインサイチュ及び免疫蛍光分析のために、切片をまずジゴキシゲニン標識ＲＮＡで、そして次に抗体、例えばＣＣ１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；成熟稀突起膠細胞のマーカー）又は抗Ｓｐ３５抗体でプローブした。アンチセンＳｐ３５プローブにハイブリダイズした稀突起膠細胞もＣＣ１に対する抗体と同時染色されることが観察された（データ示さず）。センスＳｐ３５プローブを用いた場合には特異的標識は観察されなかった。稀突起膠細胞におけるＳｐ３５の発現もまたＰ７ラット皮質の側脳室領域由来の組織切片の免疫組織化学的試験により確認した。ＣＣ１抗体により標識された皮質細胞の大部分はまた抗Ｓｐ３５抗体によっても標識された。データ示さず。相互作用の特異性はＳｐ３５−Ｆｃを用いた抗Ｓｐ３５抗体の予備吸着により確認（実施例２参照）したところ、シグナルは排除されていた。
【０３１６】
Ｓｐ３５発現のＳｐ３５特異的ＲＮＡｉノックダウンは稀突起膠細胞の生育及び分化を増進する。
【０３１７】
稀突起膠細胞の生育及び分化に対してどのようにＳｐ３５が寄与しているかを調べるために稀突起膠細胞前駆体におけるＳｐ３５発現を除去するためにＳｐ３５特異的ＲＮＡｉを使用した。５０，０００Ａ２Ｂ５稀突起膠細胞前駆体細胞を、以下の通り作成したＳｐ３５特異的ＲＮＡｉ配列又は対照ＲＮＡｉを担持するレンチウィルスに感染させた。
【０３１８】
ネズミ及びラットすごＤＮＡ配列を候補低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）に対して使用するために相同領域を発見するために比較した。Ｓｐ３５ＲＮＡｉのレンチウィルス発現のためのＣＨ３２４は、オリゴヌクレオチドＬＶ１−０３５及びＬＶ１−０３６をアニーリングし、そしてＨｐａＩ及びＸｈｏＩ消化ｐＬＬ３．７にライゲーションすることにより構築した。ｐＬＬ３．７、追加方法およびウィルス生産は、Ｒｕｂｉｎｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，４０１−０６（２００３）に記載されている。Ｓｐ３５ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドはＭＷＧから購入し、そして以下の配列を有するものであった。
ＬＶ１−０３５（センスオリゴ）
【０３１９】
【化１２−１】
2009518299.tif 000013
（配列番号７１）、及び、
ＬＶ１−０３６（アンチセンスオリゴ）
【０３２０】
【化１２−２】
2009518299.tif 000014
（配列番号７２）。
【０３２１】
対照ＲＮＡｉは僅少なヌクレオチドの変化を除いて同じオリゴヌクレオチド配列を有するように設計した。
【０３２２】
【化１３】
2009518299.tif 000015
レンチウィルスを作成する前に、ｐＬＬ３．７由来のＤＮＡ、又はｐＬＬ３．７内の候補ｓｈＲＮＡをネズミＳｐ３５−ＨＡタグ付きのプラスミドで５対１の比において６ウェルフォーマットにおけるＣＨＯ細胞内に同時トランスフェクトした。ノックダウンはトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の溶解物からのＳｐ３５−ＨＡタグのウエスタンブロット検出により、並びに、２連のウェルから調製した全ＲＮＡのノーザンブロットにより分析した。ブロットをＳｐ３５ｃＤＮＡのフラグメントでプローブした。試験はトランスフェクション後４８時間に実施した。予測された通り、対照投与細胞と相対比較してＣＨ３２４ＲＮＡｉ投与ＣＨＯ細胞におけるＳｐ３５ｍＲＮＡの１０倍低下が観察された。データ示さず。緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）を担持するＲＮＡｉレンチウィルスはＲｕｂｉｎｓｏｎ等に記載の通り形成した。対照又はＳｐ３５ＲＮＡｉの何れかで処理した培養物において、稀突起膠細胞の約８０％がＧＦＰ陽性であった。総細胞数はＲＮＡｉ処理により変化しなかった。分化に対するＲＮＡｉの作用を定量するために、ＧＦＰ発現稀突起膠細胞の実を計数した。
【０３２３】
稀突起膠細胞のリッチ化集団を以下に記載する変更を施しながらＣｏｎｎ，Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；１９９０）に記載の通り雌性Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓ  Ｐ２ラットから生育させた。慨すれば、前脳を切開し、Ｈａｎｋ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れた。組織を１ｍｍに切片化し、０．０１％トリプシン及び１０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ中で１５分間３７℃でインキュベートした。かい離した細胞をポリ−Ｌ−リジンコーティングＴ７５組織培養フラスコ上にプレーティングし、そして２０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ＤＭＥＭ中で１０日間３７℃で生育させた。稀突起膠細胞前駆体（Ａ２Ｂ５＋）は３７℃において２００ｒｐｍで一夜フラスコを振とうさせることにより収集し、９５％純度の集団が得られた。培養物は１週間ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した高グルコースのＤｕｌｂｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＦＧＦ／ＰＤＧＦの除去によりＡ２Ｂ５＋細胞は３〜７日後にＯ４＋前髄鞘形成稀突起膠細胞に分化し、そして７〜１０日後にＯ４＋及びＭＢＰ＋成熟稀突起膠細胞に分化した。これらの分化状態は形態の変化から容易に顕在化され：Ａ２Ｂ５＋細胞は二極性の形状を有し、Ｏ４＋前髄鞘形成稀突起膠細胞はより長く、そしてより分枝した突起を有し、そしてＭＢＰ＋成熟稀突起膠細胞は突起の間にミエリンシートの構造を含有している。
【０３２４】
Ａ２Ｂ５稀突起膠細胞前駆体細胞を、ＣＨ３２４ＲＮＡｉを含有するレンチウィルスに感染させた。得られた細胞を３日間培養し、そしてＯ４陽性（稀突起膠細胞分化のマーカー）稀突起膠細胞の数を計数した。内因性Ｓｐ３５の発現はＳｐ３５ＲＮＡｉレンチウィルスによる感染により低減され、そしてＲＴ−ＰＣＲにより確認された（図６Ａ）。Ｓｐ３５の低減は、細胞突起の長さの増大により、そして、豊富なミエリンシート構造の存在により明らかな通り、対照感染細胞と比較して更に高度に分化した成熟稀突起膠細胞をもたらした（データ示さず）。Ｓｐ３５ＲＮＡｉを発現した細胞においては、対照培養物と比較して３倍多い成熟（Ｏ４陽性）稀突起膠細胞が存在していた（図６Ｂ）。これらのデータはＳｐ３５が稀突起膠細胞分化を負の方向に調節していることを示している。
【０３２５】
優性阻害Ｓｐ３５は稀突起膠細胞の生育及び分化を増進する。
【０３２６】
本発明者等はＳｐ３５の野生型及び優性阻害型を発現するレンチウィルスベクターを構築した。マウス完全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４〜６１４）をコードするＤＮＡ配列をプライマー：
【０３２７】
【化１４】
2009518299.tif 000016
を用いてＰＣＲにより増幅し、そしてＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ部位においてＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウィルスベクター内に挿入した。同様に優性阻害Ｓｐ３５（ＤＮ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５８１）をコードするＤＮＡ配列をプライマー：
【０３２８】
【化１５】
2009518299.tif 000017
を用いてＰＣＲにより増幅した。Ｒｕｂｉｎｓｏｎ等、”Ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，”Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−０６（２００３）に記載の通りＦＬ−Ｓｐ３５及びＤＮ−Ｓｐ３５プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトすることによりレンチウィルスを作成した。稀突起膠細胞（実施例４に記載の通り作成）を細胞当たり２ＭＯＩでレンチウィルスに感染させ、そしてウエスタンブロットによりＦＬ−Ｓｐ３５及びＤＮ−Ｓｐ３５の発現を確認した。
【０３２９】
ＤＮ−Ｓｐ３５は稀突起膠細胞の分化を増進し、成熟稀突起膠細胞の数を増大させた。これとは対照的に、完全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５）の過剰発現は逆の作用を有し、対照と比較した場合の成熟稀突起膠細胞の数の減少により明らかな通り、分化を抑制していた。
【０３３０】
実施例２
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白の構築及び精製
Ｓｐ３５の生物学的機能を検討するためにヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ領域へのヒトＳｐ３５の細胞外ドメイン（残基１〜５３２）を融合させたコンストラクトを作成した。ヒトＳｐ３５の部分コーディング配列はフォワードプライマー：
【０３３１】
【化１６】
2009518299.tif 000018
（配列番号７９）及びリバースプライマー：
【０３３２】
【化１７】
2009518299.tif 000019
（配列番号８０）を用いながらクローン２７７．２からのＰＣＲにより得た。
【０３３３】
平滑末端ＰＣＲ産物をＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｒｆＩ部位にサブクローニングし、ＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰ−Ｓｐ３５を作成した。ＳａｌＩフラグメントをＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰ−Ｓｐ３５から単離し、ＰＣＲＣＡＭＰＩｇベクター（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅベクターＰＣＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＡＭＰの誘導体）内にサブクローニングした。ＰＣＲＣＡＭＰＩｇベクターにおいて、ヒンジ及びＦｃガンマ配列をＳａｌＩ（５’）としてＮｏｔＩ（３’）フラグメントにサブクローニングした。ＳａｌＩ  Ｓｐ３５フラグメントをＰＣＲＣＡＭＰＩｇベクターのＳａｌＩ部位にサブクローニングすることにより、ヒトＩｇ１のヒンジ及びＦｃ領域をコードする配列とインフレームにＳｐ３５シグナル配列及び細胞外ドメイン（コドン１〜５３２）を融合させた。正しい単離株を識別し、そしてＳｐ３５Ｆｃフラグメントを包含するＮｏｔＩフラグメントをＣＨＯ発現ベクターＰＶ９０（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）の単一のＮｏｔＩクローニング部位にサブクローニングした。得られたプラスミドはＤＮＡ配列決定により確認し、ＧＴ１２３と命名した。
【０３３４】
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白を発現する安定な細胞系統はプラスミドＧＴ１２３を用いたＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４のエレクトロポレーションにより作成した。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を１０％透析血清及び４ｍＭグルタミンの存在下にアルファマイナスＭＥＭ中で培養することによりヌクレオシド非依存性の生育に関して選択した。感染後１４日に細胞に新鮮培地を与えた。Ｓｐ３５−Ｆｃを発現する細胞を得るスクリーニングをするために、ＣＨＯ細胞をフィコエリスリン（ＰＥ）−標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）で標識し、ＦＡＣＳＭｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）における高速フローサイトメトリーソーティングに付した。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現した細胞を選択した。これらの細胞を７日間培地中で増殖させ、次に再標識して再ソーティングした。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現した細胞を個々のクローンとして９６穴ウェル中に単離した。これらのクローンを２週間生育させ、次にＦＡＣＳ分析の１日前に新鮮培地を与え、発現レベルの確認を行った。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現したクローンを増殖させ、凍結細胞バンクを樹立した。細胞系統は血清非含有培地ＢＣＭ１６中での懸濁培養における生育に適合させた。これらのクローンにより生産されたＳｐ３５−Ｆｃの力価を調べるために、４〜５継代に渡り３７℃において細胞系統を生育させ、次に５０％最大細胞密度となるまで細胞を生育させ、そして性細胞密度が７５％に低下するまで２８年で１０〜１５日間それらを培養した。この時点において、培地を採取し、遠心分離により細胞および破砕物を除去し、そしてプローブとして抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を用いながらウエスタンブロット分析によりＳｐ３５−Ｆｃのレベルについて培養上澄みを力価検定した。
【０３３５】
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白を清澄化した培地から精製するためには、以下の通り、即ち９ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５をコンディショニングされた培地９００ｍｌに添加した。培地をプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）３ｍｌ上に４℃で３時間バッチ負荷した。樹脂を１．５ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）カラム内に収集し、ＰＢＳ３ｍｌで４回、８００ｍＭＮａＣｌ含有ＰＢＳ４ｍｌで２回、そして次に再度ＰＢＳ３ｍｌで洗浄した。Ｓｐ３５−Ｆｃは１．５ｍｌ画分で２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．８及び１００ｍＭＮａＣｌでカラムから溶離させ、そして０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を７５μｌ添加することにより中和した。ピーク蛋白含有画分を２８０ｎｍの吸光度により識別し、プールし、更に１ｍＬプロテインＡカラム上で精製した。負荷の前に、ＮａＣｌを６００ｍＭとなるまで、そしてＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５を５０ｍＭとなるまで添加した。カラムを６００μｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５及び１Ｍ  ＮａＣｌで２回、そして次に１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。Ｓｐ３５−Ｆｃを２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．８及び１００ｍＭ  ＮａＣｌでカラムから溶離させ、０．５ｍｌ画分を収集し、そして０．５ＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を２５μｌ添加することにより中和した。ピーク蛋白含有画分を２８０ｎｍの吸光度により識別し、プールした。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｓｐ３５−Ｆｃ蛋白は見かけ上の質量が９０ｋＤａの単一のバンド（＞９５％純度）として遊走した。非還元条件下では、蛋白は質量約１８０ｋＤａの２量体として泳動された。精製されたＳｐ３５−Ｆｃ蛋白を少量ずつに分け、−７０℃で保存した。
【０３３６】
実施例３
外因性Ｓｐ３５−Ｆｃは稀突起膠細胞の生存／増殖／分化を増進する。
【０３３７】
本発明者等は以下の方法により種々の発達段階において稀突起膠細胞におけるＳｐ３５ｍＲＮＡの発現を評価した。稀突起膠細胞は実施例１に記載の通り分化を誘導し、そしてｍＲＮＡはＡｍｂｉｏｎのキットを用いて単離した。Ｓｐ３５  ｍＲＮＡ発現の定量はＴａｑｍａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いながら、製造元の説明書に従って、以下のプライマー：
【０３３８】
【化１８】
2009518299.tif 000020
（フォワード：配列番号８１）及び、
【０３３９】
【化１９】
2009518299.tif 000021
（リバース；配列番号８２）、及び、ＦＡＭ−標識プローブ、
【０３４０】
【化２０】
2009518299.tif 000022
（配列番号８３）とともに実施した。データは内部対照のＧＡＰＤＨレベルに対して規格化した。早期先祖稀突起膠細胞（Ａ２Ｂ５＋）及び前髄鞘形成稀突起膠細胞（Ｏ４＋）はＳｐ３５  ｍＲＮＡの等しいレベルを示したが、成熟稀突起膠細胞（ＭＢＰ＋）ではＳｐ３５  ｍＲＮＡのレベルは２倍超であった。図７。
【０３４１】
実施例１に記載の通り製造したＡ２Ｂ５＋稀突起膠細胞をＳｐ３５−Ｆｃ又は対照−Ｆｃの漸増濃度により３日間処理した（Ｓｐ３５−Ｆｃは実施例２に記載の通り調製）。分化を試験するために、Ａ２Ｂ５＋細胞を１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＮＴＦ及び１５ｎＭトリヨード−Ｌ−タイロニンを添加したＦＧＦ／ＰＤＧＦ非含有生育培地中４穴スライドチャンバーにプレーティングし、即座に漸増濃度のＳｐ３５−Ｆｃ又は対照−Ｆｃで処理した。４８時間（ＲＮＡｉの場合は７２時間）後、培養物をＯ４に対する抗体で染色し、総Ｏ４＋及び成熟Ｏ４＋成熟稀突起膠細胞の数を求めた。試料は２連で分析した。Ｓｐ３５−ＦｃはＡ２Ｂ５＋細胞からＯ４＋細胞への分化を濃度依存性の態様において増進した。図８。
【０３４２】
成熟稀突起膠細胞は約４８〜７２時間のインビトロ半減期を有し、細胞は典型的には７２時間後にはアポトーシスを起こす。稀突起膠細胞培養物をＳｐ３５−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ５日間）で処理した場合、本発明者等は対照−Ｆｃで処理した対照と比較した細胞生存性染色により判断した場合に、成熟稀突起膠細胞について有意に上昇した生存率を観察した。ＭＢＰの発現は成熟稀突起膠細胞に関するマーカーとしてモニタリングした。対照−Ｆｃ処理細胞と比較した場合、細胞染色及び抗ＭＢＰ抗体を用いたウエスタンブロットにより、ＭＢＰ蛋白発現の約３倍増加がＳｐ３５−Ｆｃ処理細胞において観察された。
【０３４３】
実施例４
Ｓｐ３５拮抗剤はＲｈｏＡ及びＦｙｎを調節する。
【０３４４】
稀突起膠細胞分化の制御に関与が示唆されている強力な候補であるシグナリング経路はＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーである。Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅは細胞の形態学的特徴を調節し、そして稀突起膠細胞の分化の為には低減されたＲｈｏＡ−ＧＴＰの量が必要となる。Ｌｉａｎｇ，Ｘ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：７１４０−７１４９（２００４）を参照できる。Ｓｐ３５がＲｈｏＡ経路を介してシグナルするかどうかを調べるために、ウエスタンブロットを用いてＳｐ３５−Ｆｃで処理した稀突起膠細胞の細胞溶解物中のＲｈｏＡＧＴＰレベルを相当する対照におけるレベルと比較した。ＲｈｏＡ−ＧＴＰの有意な３倍低下がＳｐ３５−Ｆｃ後に観察され（図９Ａ）、Ｓｐ３５機能の減衰はＲｈｏＡＧＴＰのダウンレギュレーションによる稀突起膠細胞分化とその後ＭＢＰ発現の増大を誘導することを示している。ＲｈｏＡＧＴＰ量における同様の低下が稀突起膠細胞をＤＮ−Ｓｐ３５又はＳｐ３５ＲＮＡｉで処理した場合にも観察された（データ示さず）。
【０３４５】
Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅの活性はＦｙｎキナーゼにより調節される。Ｌｉａｎｇ，Ｘ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：７１４０−７１４９（２００４）を参照できる。増大したＦｙｎ発現及びリン酸化は稀突起膠細胞分化と相関している。前出。またＯｓｔｅｒｈｏｕｔ，Ｄ．Ｊ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４５：１２０９−１２１８（１９９９）も参照できる。Ｓｐ３５拮抗剤がＦｙｎ機能に影響するかどうか試験するために、Ｆｙｎの発現及びリン酸化をウエスタンブロットにより直接測定した。実施例１に記載する通りのＤＮ−Ｓｐ３５処理は、Ｆｙｎ蛋白及びＦｙｎリン酸化の二倍上昇をもたらした（図９Ｂ）。逆に、ＦＬ−Ｓｐ３５を発現している細胞を分析したところ、Ｆｙｎの発現及びリン酸化は二倍低下していた（図９Ｂ）。
【０３４６】
実施例５
Ｓｐ３５−Ｆｃはインビトロの髄鞘形成を増進する。
【０３４７】
脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロンと稀突起膠細胞の共培養物をＳｐ３５−Ｆｃで処理し、そして免疫組織化学及び電子顕微鏡により髄鞘形成に関して試験することにより、髄鞘形成におけるＳｐ３５の役割をインビトロで調べた。これらの試験のためにまずＤＲＧニューロンと稀突起膠細胞の一次培養物を作成することが必要であった。
【０３４８】
雌性ＬｏｎｇＥｖａｎｓラットＥ１４−Ｅ１７胚の脊髄神経節をＰｌａｎｔ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６０８３−９１（２００２）に記載の通り培養した。切開したＤＲＧを第２に〜６日はフルオロデオキシウリジンの存在下、そして第８〜１１日は１ｘＢ２７，１００ｎｇ／ｍｌＮＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＮＬＡ培地中で、２週間ポリ−Ｌ−リジンコーティングカバーガラス（１００μｇ／ｍｌ）上にプレーティングした。
【０３４９】
Ａ２Ｂ５＋稀突起膠細胞を実施例１に記載の通り調製し、そしてトリプシン処理により採取した。
【０３５０】
共培養試験のために、Ａ２Ｂ５＋稀突起膠細胞を１０μｇ／ｍｌＳｐ３５−Ｆｃの存在下又は非存在下のＤＲＧニューロン液滴培養物に添加した。培地（Ｂ２７及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦ添加Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）を交換し、そして新鮮なＳｐ３５−Ｆｃを３日毎に細胞に添加した。髄鞘形成の変化を識別するために、２週齢の培養物を軸索識別のためには抗βＩＩＩチューブリン抗体、又は稀突起膠細胞識別のためには抗ＭＢＰを用いて神経線維に関する免疫組織化学的染色（ＩＨＣ）により染色し、そして４週齢の培養物はＭＢＰの定量のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のウエスタンブロット分析に付した。選択された例においては、カバーガラス上に直接２．５％グルタルアルデヒドを添加することにより電子顕微鏡試験のために細胞を固定した。２週齢培養物における髄鞘形成した軸索は単一のＭＢＰ＋稀突起膠細胞から誘導された髄鞘形成した節間束の数を計数することにより定量した。試料は２連で分析した。エラーバーは個々の測定を示す。全試験においてＰ値は片側分散分析を用いて求めた。
【０３５１】
ラット一次稀突起膠細胞及び脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロンの培養物において、髄鞘形成の低値の基礎量が観察された。これとは対照的に、２週間Ｓｐ３５−Ｆｃで処理した場合は、用量依存的態様においてＳｐ３５−Ｆｃ処理培養物中で発生したＭＢＰ＋髄鞘形成軸索の存在により明らかな通り、頑健な軸索の髄鞘形成が起こった（図１０Ａ）。ウエスタンブロット分析によれば、ミエリンの主要な蛋白成分であるＭＢＰの発現はＳｐ３５−Ｆｃ処理培養物において増大した（図１０Ｂ）。Ｓｐ３５−Ｆｃ存在下の髄鞘形成は更に、ＭＢＰが軸索を封入していることを明確化する共焦点顕微鏡観察により確認した（データ示さず）。Ｓｐ３５−Ｆｃ処理培養物の電子顕微鏡観察によれば、多数の良好に形成された節間並びにランヴィエ絞輪に類似した構造がみとめられた（図１０Ｃ）。対照培養物には稀に存在する髄鞘形成セグメントのみ観察され、ランヴィエ絞輪は検出されなかった（図１０Ｄ）。
【０３５２】
軸索髄鞘形成に対するＳｐ３５拮抗剤の作用は更に、ＤＮ−Ｓｐ３５を用いて確認した。ＤＮ−Ｓｐ３５発現は対照に比較して髄鞘形成ＭＢＰ＋細胞の総数を５〜１０倍増大させた（図１０Ｅ）。これとは対照的に、ＦＬ−Ｓｐ３５の過剰発現は、対照と比較して髄鞘形成ＭＢＰ＋細胞の数を２倍低減した（図１０Ｅ）。ウエスタンブロット分析を用いて培養物中のＭＢＰを定量した。ＤＮ−Ｓｐ３５はＭＢＰを１０倍増大させたのに対し、ＦＬ−Ｓｐ３５はＭＢＰを２倍低減した（図１０Ｆ）。培養物中のＦＬ−Ｓｐ３５及びＤＮ−Ｓｐ３５蛋白の発現はウエスタンブロットで確認した（図１０Ｆ）。これらの試験は更に、内因性Ｓｐ３５が髄鞘形成を抑制すること、及び、Ｓｐ３５に拮抗することは抑制を退行させることができることを示している。
【０３５３】
実施例６
Ｓｐ３５のＩｄドメインペプチドはインビトロで髄鞘形成を増進する。
【０３５４】
実施例５に記載した通り、脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロンと稀突起膠細胞の共培養物をＳｐ３５Ｉｇペプチドで処理し、そして髄鞘形成を試験することにより、Ｓｐ３５のＩｇドメインの部分を含有する数種のペプチドをインビトロで調べた。
【０３５５】
共培養試験のために、１０μｇ／ｍｌのＳｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃ（Ｆｃに融合したＳｐ３５アミノ酸４１７〜７９３）の存在下又は非存在下のＤＲＧニューロン液滴培養物に添加した。培地（Ｂ２７及び１００ｎｇ／ｍｌＮＧＦ添加Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）を交換し、そして新鮮なＳｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃを３日毎に細胞に添加した。髄鞘形成の変化を識別するために、２週齢の培養物を軸索識別のためには抗βＩＩＩチューブリン抗体、又は稀突起膠細胞識別のためには抗ＭＢＰを用いて神経線維に関する免疫組織化学的染色（ＩＨＣ）により染色し、そして４週齢の培養物はＭＢＰの定量のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のウエスタンブロット分析に付した。
【０３５６】
ウエスタンブロット分析によればミエリンの主要蛋白成分であるＭＢＰの発現はＳｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃ処理培養物において増大していた（図１５）。突然変異したＳｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃペプチドもまた同じ試験で調べた。４５６位のアルギニン及び４５８位のヒスチジンがそれぞれグルタミン酸及びバリンに突然変異した場合、そのペプチドはＳｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃペプチドと比較した場合に、髄鞘形成を増進しなかった（図１５）。４５６位のアルギニンはＳｐ３５のＩｇドメインにおける「ＲＫＨループ」（アルギニン−リジン−ヒスチジンアミノ酸４５６〜４５８）の部分であり、そしてＳｐ３５拮抗剤ポリペプチドの結合のために重要であると考えられている。Ｓｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃ存在下におけるＭＢＰ蛋白の増大はＳｐ３５−Ｆｃ分子存在下のＭＰＢ蛋白の増大に匹敵するものである（図１５）。
【０３５７】
Ｓｐ３５Ｉｇドメインの部分を含有する環状ペプチドもまた実施例５に記載した試験において髄鞘形成を増進するそれらの能力に関して試験した。Ｓｐ３５ペプチドＬＳＰＲＫＨ（アミノ酸４５４〜４５８（配列番号２４）はＮ末端上のシステインとＣ末端上のシステイン残基の付加により環化した。Ｎ末端ではアセチル（Ａｃ）基そしてそのＣ末端ではＮＨ２部分でペプチドをキャッピングした。更に又、ＬＳＰＲＫＨ（配列番号２４）ペプチドは又Ｎ末端上のアミノ酸リンカーＧＳＧＣ及びＣ末端のシステイン残基−ＮＨ２により連結されたビオチン基を用いて合成し、そして環化させた。得られた環状のＳｐ３５ペプチド、Ａｃ−ＣＬＳＰＲＫＨＣ（配列番号８４）及びビオチン−ＧＳＧＣＬＳＰＲＫＨＣ（配列番号８５）は、ウエスタンブロットで示されるとおり処理培養物においてミエリンの主要蛋白成分であるＭＢＰの発現を増大させた（図１６）。他の環状ペプチド：ビオチン−ＧＳＧＣＬＳＰＥＫＨＣ（配列番号８６）、ビオチン−ＧＳＧＣＫＨＳＰＬＲＣ（配列番号８７）及びＡｃ−ＣＬＳＰＥＫＶＣ（配列番号８８）を対照として用いた、対照ペプチドの全ては処理共培養物においてＭＢＰを増大させなかった（図１６）。
【０３５８】
これらの試験は更に、Ｓｐ３５のＩｇドメインのより小型のペプチドがＳｐ３５による髄鞘形成抑制から解放するＳｐ３５拮抗剤として作用できることを示している。
【０３５９】
実施例７
ＤＮ−Ｓｐ３５がＤＲＧニューロン及び稀突起膠細胞において髄鞘形成を増進する作用を有する。
【０３６０】
本発明者等は稀突起膠細胞と比較した場合のＤＲＧニューロンにおけるＳｐ３５の髄鞘形成プロセスへの相対的寄与に着目して実験を行った。本発明者らは実施例１に記載のＦＬ−Ｓｐ３５及びＤＮ−Ｓｐ３５レンチウィルスベクターでＤＲＧニューロン、稀突起膠細胞及び共培養物（実施例５に記載の通り調製）を感染させ、そして２週間後に髄鞘形成したＭＢＰ＋細胞に関する免疫組織化学的染色を行った。両方の細胞がＤＮ−Ｓｐ３５を発現する共培養物中のＭＢＰレベルの２倍上昇、及び、両方の細胞がＦＬ−Ｓｐ３５を発現する共培養物中のＭＢＰレベルの２倍上昇が観察された（図１０Ｇ）。
【０３６１】
何れか又は両方の細胞型におけるＦＬ−Ｓｐ３５の終えは対照（空ベクター）と比較して髄鞘形成の基礎レベルを有意に低下させた。一方、何れか又は両方の細胞型におけるＤＮ−Ｓｐ３５の過剰発現は対照に比較して２〜３倍髄鞘形成の基礎レベルを上昇させた（図１０Ｇ）。外来性に添加したＳｐ３５−Ｆｃは何れか又は両方の細胞型におけるＦＬ−Ｓｐ３５の過剰発現による髄鞘形成の抑制を退行させた。更に又、外因性のＳｐ３５−Ｆｃは更に何れかの細胞型ＤＮ−Ｓｐ３５のみを過剰発現すれば髄鞘形成を増強し、そして両方の細胞型がＤＮ−Ｓｐ３５を過剰発現すれば僅かな作用しか示さなかった。これらの試験は稀突起膠細胞及びＤＲＧニューロンの両方において優性阻害Ｓｐ３５蛋白の発現が、又はＳｐ３５−Ｆｃ蛋白による処理が、効果的な髄鞘形成に寄与していることを示している。
【０３６２】
実施例８
Ｓｐ３５−ノックアウトマウスは早期開始髄鞘形成を示す。
【０３６３】
Ｓｐ３５−ノックアウトマウスは、Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：２１１１−２１１４（２００１））により記載される通り、Ｓｐ３５の完全な単一のエクソンコーディング配列をターゲティングしたＧＦＰ／Ｎｅｏ（緑色蛍光蛋白／ネオマイシン）置き換えベクターを用いて形成した。マウスゲノム１２９／ＳｖＪ  ＤＮＡをラムダゲノムライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃９４６３１３）から単離した。１４．６ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメントをｐＢＳＫ＋内にサブクローニングし、そして次に開始ＡＴＧにおいてｅＧＦＰ  Ｑ４０レポーター遺伝子を挿入するために細菌内の相同組み換えによりターゲティングした。最終コンストラクトはＳｐ３５の単一エクソンコーディング配列の全て１〜１，８４１ヌクレオチドを欠失していた。このコンストラクトを用いてＤ３（１２９／Ｓｖ）胚性幹細胞中のＳｐ３５遺伝子座をターゲティングした。正しくターゲティングされた細胞をＥｃｏＲＩ消化胚性幹細胞ＤＮＡのサザンブロッティング識別し、Ｃ５７Ｂ１／６胚盤胞内に注射してキメラマウスを形成した。キメラをＣ５７Ｂ１／６マウスと交配させてヘテロ接合の創始マウスを作製した。遺伝子型は尾部ＤＮＡの３プライマーＰＣＲにより決定した。フォワードプライマー、５’−ＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣ−３’（配列番号８９）及び２つのリバースプライマー、５’−ＧＡＧＴＴＣＴＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＧ−３’（配列番号９０）及び５’−ＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＧ−３’（配列番号９１）により、２７５ｂｐの野生型及び３５６ｂｐの突然変異体対立遺伝子産物が、それぞれ３５サイクルの反応（９４Ｃ２０秒、６５Ｃ３０秒、７２Ｃ３０秒）において得られた。Ｍｉ，Ｓ．等、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）を参照できる。Ｓｐ３５遺伝子欠失の確認はサザンブロット、ＲＴＰＣＲ及びノーザンブロット分析により行った。野生型マウスにおいては顕著なバンドをノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲで検出したが、ノックアウトマウスではバンドは完全に非存在であった。ヘテロ接合のサザンブロットは野生型及び修飾されたＳｐ３５対立遺伝子の両方を示した。Ｓｐ３５ノックアウトマウスは外観上正常であり、明らかな身体的異常又は挙動、運度又は生殖能力の変化はみとめられなかった。ヘテロ接合Ｆ１新生同腹仔の大きさは様々であった。
【０３６４】
Ｓｐ３５ノックアウトマウスから培養された稀突起膠細胞を分化の潜在的変化についてＩＨＣで評価した。より高度に分化した稀突起膠細胞及びより大きいパーセンテージの成熟稀突起膠細胞が野生型同腹仔から培養したものよりもＳｐ３５ノックアウトにおいて観察された。正常なマウスの発達における髄鞘形成の開始は典型的には生後（Ｐ）第５日に起こるため、本発明者等は次に電子顕微鏡により野生型及びノックアウトのマウスに由来するＰ１脊髄における髄鞘形成を調べた。インビトロの培養物と合致して、Ｓｐ３５ノックアウトマウス由来の脊髄はその野生型同腹仔の場合よりもより多くの髄鞘形成した軸索繊維を含有していた。図１１。末梢神経系の坐骨神経の顕著な変化はノックアウトマウスには検出されず、髄鞘形成の作用がＣＮＳに限定されていたことを示していた。
【０３６５】
ノックアウトマウス由来の共培養したＤＲＧ及び稀突起膠細胞はより多くのＤＲＧ及び稀突起膠細胞の相互作用及び髄鞘形成を示していた。Ｓｐ３５ノックアウトマウス由来の共培養ＤＲＧ及び稀突起膠細胞はより多くの稀突起膠細胞の分化及び髄鞘形成を示している。ノックアウトマウス由来の脊髄組織を電子顕微鏡で調べたところ、新生仔のＳｐ３５ノックアウトマウス（生後第１日（Ｐ１）及び第６日（Ｐ６））はその野生型同腹仔よりも多い髄鞘形成繊維を示している。
【０３６６】
野生型ＳＰ３５を過剰発現するトランスジェニックマウスもまた、Ｈｏｇａｎｓ  Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．１５３−１８３の方法に従って作成した。ＳＰ３５を過剰発現するトランスジェニックマウスを電子顕微鏡で調べたところ、新生仔マウス（生後第８日（Ｐ８））はその野生型同腹仔よりも少量の髄鞘形成繊維を示していた。
【０３６７】
実施例９
Ｓｐ３５−Ｆｃはインビボで稀突起膠細胞の生存及び髄鞘形成を増進する。
【０３６８】
成熟野生型Ｃ５７Ｂ１／６雄性マウスに６週間キュプリゾン（重量で０．２％を粉砕マウス飼料と共に混練）を与えることにより脳梁内で脱髄を誘導した。Ｓｐ３５−Ｆｃをキュプリゾン給餌２、２．５及び３週間において脱髄脳梁内に定位注射した。対照マウスにはＳｐ３５−Ｆｃを含有しない滅菌媒体を同じ時間間隔で定位注射した。キュプリゾン給餌６週間の後、２、４及び６週間マウスを通常飼料（粉砕マウス飼料のみ）に戻し、再髄鞘形成させた。
【０３６９】
キュプリゾン投与マウスをケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）及びキシラザン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、定位手術用に設計された固定化装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に定置した。頭蓋を開口し、深度１．７ｍｍにおいてブレグマの０．７ｍｍ後方及び０．３ｍｍ側方の定位座標を用いながら１０ｍｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジで野生型レシピエントマウスの急性脱髄脳梁内に片側性に滅菌化合物を注入（ＨＢＳＳ１ｍｌ中１μＭ）した（Ｍｅｓｓｉｅｒ等、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６３（２）：３１３−１８（１９９９））。更に又、対照のレシピエントマウスに化合物を含有しないＨＢＳＳを定位注射した。頭蓋の開放部にＧｅｌｆｏａｍを充填し、患部をペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で拭き取り、傷口を縫合した。注射後、マウスは実験の各週に屠殺し、そしてその脳を摘出し、分子、生化学及び組織学的な分析のために処理した。
【０３７０】
Ｓｐ３５−Ｆｃ投与を受けた動物は向上した成熟稀突起膠細胞生存性（ＣＣ１抗体染色に基づく、図１２）及び抗ＭＢＰ蛋白抗体又はルクソールファーストブルーを用いたＩＨＣによる軸索の髄鞘形成（データ示さず）を示した。
【０３７１】
実施例１０
Ｓｐ３５−形質転換細胞のインビボ移植
本発明者等は又、脊髄損傷におけるＳｐ３５の生物学的機能を検討している。本発明者等はラット脊髄の傷害中心内への送達のためにＳｐ３５を発現しているレトロウィルス又はレトロウィルス対照で皮質一次培養細胞（混合培養物）を感染させる。２ｘ１０６個の細胞を導入し、ラットは第１０日に屠殺し足。脊髄を位置や４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次に７０％エタノール、次いで９５％エタノールで脱水する。組織試料はパラフィン包埋した。切片（厚さ１０ミクロン）を免疫組織化学的染色に使用する。本発明者等はＳｐ３５を投与されている傷害ラットにおける稀突起膠細胞の生存及び軸索の髄鞘形成をモニタリングしている。本発明者等はＳｐ３５を発現する細胞を投与された動物においてより高値野稀突起膠細胞及び軸索の髄鞘形成及びより低値の軸索退縮を観察している。
【０３７２】
これらの実験のためのＳｐ３５レトロウィルスコンストラクトは以下の通り作成した。Ｓｐ３５遺伝子を以下のプライマー、即ちＸｈｏＩ部位を含有する５’−ＧＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧ−３’（配列番号９２）及びＥｃｏＲＩ部位を含有する５’−ＣＧＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧ−３’（配列番号９３）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、次にＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで予め切断しておいたレトロウィルスベクターｐＭＩＧ（ＩＲＥＳ−ＧＦＰを含有する）内にライゲーションした。新しいベクターはｐＭＭＣ０７８と命名した。ｐＭＭＣ０７８の全単離株が偶然にも点突然変異を有していたため、ｐＭＭＣ０７８の２つの単離株をともにライゲーションした。ｐＭＭＣ０７８．６をＸｈｏＩ及びＡｃｃＩで切り出し、そしてｐＭＭＣ０７８．７をＸｈｏＩ及びＡｃｃＩで切り出した。これらの２つのフラグメントをともにライゲーションすることにより最終的に正しいプラスミドｐＭＭＣ０８９を作成した。インサートのＤＮＡ配列はＤＮＡ配列決定により確認した。Ｓｐ３５レトロウィルスは上記した通り作成した。２９３Ｇ細胞をトランスフェクション前日に分割した。８μｇのＳｐ３５−レトロウィルスＤＮＡを使用してリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により５ｘ１０６個の細胞をトランスフェクトした。コンディション培地をトランスフェクション後９２時間に採取した。コンディショニングされた培地を１０分間５０００ｇで遠心分離し、上澄みをＳｐ３５レトロウィルス保存用液として使用した。この保存用液は４℃で１週間、又は−８０℃で６か月保存した。
【０３７３】
実施例１１
Ｓｐ３５−Ｆｃはインビボで脊髄傷害（ＳＣＩ）後のニューロン及び稀突起膠細胞の生存を増進する。
【０３７４】
脊髄傷害は成熟雌性ＬｏｎｇＥｖａｎｓラット（１９０〜２１０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において誘導した。背側半側切断をＴ６／Ｔ７で行い、大型背内側及び小型背外側の皮質脊髄路（ＣＳＴ）成分を完全に遮断した。マイクロメスを用いながら表面から１．８ｍｍの深さで脊髄を定位切断した。ＣＳＴ切断直後、髄腔内カテーテルをクモ膜下空間にＴ７において挿入し、皮下空間に挿入したプライミングされたミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ２００４型、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に接続した。ミニ浸透圧ポンプは２５μＭＳｐ３５−Ｆｃ融合蛋白又はヒトＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）又は対照としてのＰＢＳの何れかを０．２５μｌ／時間で送達するようにした。術後の管理は、３日間は８〜１２時間毎に鎮痛剤（ブプレノルフィン／ブプレネックス、Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｅｋｉｓｅｔ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．，０．０５ｍｇ／ｋｇ皮下）及び術後７日間は抗生物質投与（アンピシリン、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，１００ｍｇ／ｋｇ皮下１日２回）とした。試験期間中（４週間）又は機能回復まで、１日２回手作業により膀胱を圧出した。試験終了時に、ラットを麻酔し、ヘパリン加食塩水、ついて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心臓的に灌流した。脊髄を摘出し、パラフィン包埋し、そして組織学的分析用に１０μｍの切片を切り出した。
【０３７５】
ＳＣＩ後のアポトーシス細胞死を定量するために、動物をＳＣＩ後３又は７日に安楽死させ、抗活性化カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＴＵＮＥＬ染色（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて染色した。切片は又抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及び抗ＣＣ１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて染色することによりニューロン及び稀突起膠細胞をそれぞれ識別した。
【０３７６】
本発明者等はＳＣＩ後３日に切断部位に対して吻側及び尾側の両方に多大なＴＵＮＥＬ染色及びニューロンと稀突起膠細胞の両方に共局在化した活性化カスパーゼ３染色を観察した。活性化カスパーゼ３陽性ニューロン及び稀突起膠細胞の数はＳＣＩ後３日において対照よりもＳｐ３５−Ｆｃ投与動物において有意に低値であった。更に又、ＳＣＩ後４週においては、抗βＩＩＩチューブリン抗体（ニューロン生存）及び抗Ｏ４抗体（稀突起膠細胞生存）による染色に基づけば対照よりもＳｐ３５−Ｆｃ投与動物において患部周囲の脊髄組織においてはより多くのニューロン及び稀突起膠細胞が生存していた。
【０３７７】
実施例１２
Ｓｐ３５−Ｆｃはカスパーゼ３活性化及びインビトロの細胞死を低減する。
【０３７８】
ＰＣ１２細胞（Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ）を７日間、２００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含有する５％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で分化させた。実験のために、培地をＳｐ３５−Ｆｃ、陰性対照としてのヒトＩｇＧ（０．１〜１０μＭ）又は陽性対照としてのｚＶＡＤ（０．１μＭ）を含有するＮＧＦ非含有培地と交換した。ＮＧＦ脱離の１８時間後、活性化カスパーゼ３をＣａｓｐａｓｅ３／７  Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いながら製造元の説明書に従って定量した。ＮＧＦ脱離の４２時間後、アポトーシス細胞死を細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いながら製造元の説明書に従って定量した。
【０３７９】
本発明者等は培地からＮＧＦを除去した後１８時間に栄養的支援を枯渇させた分化ＰＣ１２細胞において０．１μＭのＳｐ３５−Ｆｃがカスパーゼ３活性化を低減したことを観察した。カスパーゼ３活性化に対するＳｐ３５−Ｆｃの作用は用量依存的であり、そしてより高用量（１又は１０μＭ）においてはカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ（０．１μＭ）の神経保護用量と同様の有効性を示した（図１４）。細胞死の別の尺度として、本発明者等はＴＵＮＥＬ  ＥＬＩＳＡ法を用いてアポトーシスを定量し、そしてＳｐ３５−ＦｃがＮＧＦ脱離後４２時間に測定した細胞死を有意に低減したことを観察した（図１３）。
【０３８０】
実施例１３
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）はＥｒｂＢ２と生化学的に相互作用する。
【０３８１】
ＥｒｂＢ２は膜貫通受容体チロシンキナーゼのＩ型のファミリーのメンバーである。ファミリーは４つのメンバー、即ち表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２又はｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４を含む。稀突起膠細胞分化はＥｒｂＢ２受容体チロシンキナーゼにより正の方向に調節される。Ｓｐ３５とＥｒｂＢ２の間の潜在的相互作用を調べるために、Ｎ末端ＡＰタグ付きヒトＳｐ３５蛋白をヒトＥｒｂＢ２トランスフェクトチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への結合に関して試験した。
【０３８２】
９０％コンフルエントのＣＨＯ細胞をＦｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いながらヒトＥｒｂＢ２ベクター発現プラスミドの種々の組み合わせでトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトした細胞をＨＢＨ（Ｈａｎｋバランス塩溶液、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０））で洗浄し、そしてＨＢＨ中、４μｇ／ｍｌのＡＰ−Ｓｐ３５（Ｍｉ等、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）に記載の通りヒトＳｐ３５のＣ末端（残基３４〜５３２）に融合したＮ末端６ヒスチジンタグを有するヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ））又は対照ＡＰ蛋白と共に２３℃又は６７℃において１．５時間インキュベートした。結合したＡＰ−Ｓｐ３５は直接、又は細胞の洗剤溶解の後に、ＥＬＩＳＡにより検出し、そして酵素活性はＭｉ等、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）に記載の通り４−ＮＰＰで定量した。
【０３８３】
ＡＰ−Ｓｐ３５はＥｒｂＢ２を発現するＣＨＯ細胞に対して３ｎＭのＥＣ５０で結合することがわかった。図１７Ａ。対照として、可溶性Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白と共に予備インキュベートすることにより、又はＳｐ３５とＥｒｂＢ２を同じ細胞で同時発現させた場合には、結合はブロックされた。図１７Ｂ。更に又、ベクター制御の発現細胞は無視できる程度の結合を示していた。図１７Ｂ及びＣ。
【０３８４】
ＥｒｂＢ２に結合するＳｐ３５のドメインを識別するために、ＡＰ−Ｓｐ３５の可溶性のトランケーション型を結合について試験した。ＥｒｂＢ２に結合したＳｐ３５のＬＲＲドメイン（配列番号２のアミノ酸３４〜４１７）（ＡＰ−Ｓｐ３５−ＬＲＲ）及びＳｐ３５の細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸３４〜５３２）（ＡＰ−Ｓｐ３５）の両方がＣＨＯ細胞において発現された。これとは対照的に、Ｉｇ＋幹ドメイン（配列番号２のアミノ酸４１７〜５３２）（ＡＰ−Ｓｐ３５−Ｉｇ）はＥｒｂＢ２に対する検出可能な結合は示さなかった。図１７Ｂ及び１７Ｃ。
【０３８５】
ＥｒｂＢ２に対するＳｐ３５の結合は更に、ヒトＳｐ３５、ヒトＥｒｂＢ２及びヒトＯＭｇｐの種々の組み合わせて同時トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を用いた共免疫沈降試験において確認した。免疫沈降の実験は以下の通り実施した。１００ｍｍの組織培養皿中の２９３細胞又はＣＨＯ細胞を以下に記載する通りＳｐ３５及びヒトＥｒｂＢ２の組み合わせでトランスフェクトした。細胞を４８時間後に採取し、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１０％グリセロール）中で３０分間４℃で溶解した。脊髄組織を用いた実験については、組織を採取し、溶解緩衝液中でホモゲナイズした。１５分間１４，０００ｘｇで遠心分離した後、上澄みをプロテインＡ／Ｇ−セファロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）と共に４℃で１時間インキュベートし、そして次に抗−Ｓｐ３５（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ２Ｆ３、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２６２７１に記載）又は抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）＋プロテインＡ／Ｇ−セファロースビーズ、又はｍｙｃタグ付きの抗Ｓｐ３５抗体（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）＋抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）アガロースビーズの何れかと共に４℃で１時間インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、そしてＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で煮沸した。試料を４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、抗ＥｒｂＢ２（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗Ｓｐ３５（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ２Ｆ３）及び抗ＯＭｇｐ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ２２３）モノクローナル抗体の何れかを用いたウエスタンブロットにより分析した。
【０３８６】
免疫沈降実験においては、抗ＥｒｂＢ２抗体はＳｐ３５と共免疫沈降した。抗Ｓｐ３５抗体もまたＥｒｂＢ２と共免疫沈降した。対照として２９３Ｔ細胞をＥｒｂＢ２及び稀突起膠細胞−ミエリン糖蛋白（ＯＭｇｐ）、別のＬＲＲ蛋白で同時トランスフェクトした。抗ＥｒｂＢ２抗体はＯＭｇｐと共免疫沈降しなかった。更に又、免疫沈降実験は稀突起膠細胞においても実施した。Ｓｐ３５及びＥｒｂＢ２はインビボで相互作用し、そして、稀突起膠細胞から免疫沈降した複合体を形成した。図１８Ａ及びＢ。
【０３８７】
Ｏ４＋稀突起膠細胞及び脊髄組織由来の細胞溶解物を用いながら、共免疫沈降実験をやはり実施したところ、Ｓｐ３５及びＥｒｂＢ２がインビボで複合体形成することが明らかになった。図１８。
【０３８８】
Ｓｐ３５／ＥｒｂＢ２複合体が稀突起膠細胞において天然に存在するかどうかを更に調べるために、免疫蛍光を用いて稀突起膠細胞にＳｐ３５とＥｒｂＢ２が共局在するかどうかを測定した。ラットＡ２Ｂ５＋稀突起膠細胞を生染色するか４％パラホルムアルデヒドに固定して抗Ｓｐ３５抗体（２Ｆ３  Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）及び抗ＥｒｂＢ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）及び抗Ａ２Ｂ５抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色することにより、Ｓｐ３５、ＥｒｂＢ２及びＡ２Ｂ５の共局在を調べた。細胞を一時抗体（２Ｆ３及び抗ＥｒｂＢ２抗体）と共に３０分間又は２時間インキュベートし、十分洗浄し、そして次に適宜Ａｌｅｘａ標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ）と共に１時間インキュベートした。次に細胞を、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｉｃｔｏｒ）内に搭載し、蛍光顕微鏡により可視化した。実際、免疫蛍光顕微鏡によれば、特定の抗Ｓｐ３５及び抗ＥｒｂＢ２抗体は稀突起膠細胞の細胞本体と突起に共局在していた。
【０３８９】
更に又、実施例１に記載した通り実施した半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより明らかにされた通りＳｐ３５とＥｒｂＢ２のｍＲＮＡはともにＡ２Ｂ５＋、Ｏ４＋及びＭＢＰ＋細胞に存在している。ＲＴ−ＰＣＲ実験用のＥｒｂＢ２を増幅するために使用したプライマーは以下の通り、即ち５’−ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＧＧＧ−３’（配列番号９４）及び５’−ＡＧＴＴＧＡＣＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣ−３’（配列番号９５）であった。この試験では、Ｓｐ３５の転写物は稀突起膠細胞がＡ２Ｂ５＋からＭＢＰ＋細胞に成熟するに従って減少したのに対し、ＥｒｂＢ２の転写物はＯ４＋細胞において高値となっている。図１９。
【０３９０】
実施例１４
Ｓｐ３５はＥｒｂＢ２の活性化を調節する。
【０３９１】
Ｓｐ３５／ＥｒｂＢ２複合体がＥｒｂＢ２の機能に影響するかどうかを検討するために、Ｍｉ．Ｓ．等、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）及び実施例１３に記載の通り、Ｓｐ３５及びＥｒｂＢ２を２９３Ｔ細胞において発現させ、そしてＥｒｂＢ２特異的リン酸化を検出するためにウエスタン分析を実施した。ＥｒｂＢ２はモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて検出し、そしてリン酸化されたＥｒｂＢ２はリン酸化されたチロシンを認識する以下の抗体、即ちＰＹ９９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＰＹ２０（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ）の当容量の混合物を用いて検出した。ｐ−Ｔｙｒ−ＥｒｂＢ２抗体カクテルを用いる実験については、イムノブロットをカクテルと共に７２時間４℃でインキュベートした。ウエスタンブロットはＱｕａｌｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアを用いてＧＳ−８００密度計により定量した。ウエスタンブロットは参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｉ．Ｓ．等、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−５１（２００５）に記載の通り密度測定法を用いて定量した。図２０Ａ及び２０Ｃに示される通り、ＥｒｂＢ２単独の場合と比較してＳｐ３５とＥｒｂＢ２が同時発現される場合に、リン酸化が有意に低減された。
【０３９２】
以前の試験によれば受容体の活性化の為には脂質ラフト内へのＥｒｂＢ２受容体転座が必要である。Ｎａｇｙ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１５：４２５１−４２６１（２００２）及びＭａ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３１６４−３１７５（２００３）を参照できる。このプロセスにＥｒｂＢ２へのＳｐ３５の結合が影響するかどうか試験するために、ＥｒｂＢ２でトランスフェクトした、又はＥｒｂＢ２とＳｐ３５で同時トランスフェクトした２９３Ｔ細胞からサブ細胞分画により脂質ラフトを精製した。ラフトはＨａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１８５７３−１８５８０（２００３）に記載の通り単離した。慨すれば、細胞をＴＢＳで洗浄し、そして、０．５％  Ｂｒｉｊ  ５８を含有する氷冷ＴＮＥ緩衝役（プロテアーゼ阻害剤を添加した５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）２ｍｌ中で溶解した。溶解物をＴＮＥ中８０％（ｗ／ｖ）スクロース２ｍｌと混合した。混合物に３５％スクロース４ｍｌ、次いで５％スクロース４ｍｌを積層した。勾配物を４℃で１８時間ＳＷ４１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中３８，０００ｒｐｍにおいて超遠心分離に付した。１ｍｌ画分を遠心分離後の勾配の最上部から収集し、そして当容量の各画分をＥｒｂＢ２（抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））、リン酸化ＥｒｂＢ２（リン酸化チロシン）（ＰＹ９９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ），ＰＹ２０（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ））及びラフトマーカー蛋白フロチリン（抗フロチリンモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に関してウエスタンブロットにより分析した。総ＥｒｂＢ２蛋白レベルを測定するために１％ＳＤＳ溶解緩衝液中で細胞を溶解した。ラフト中の蛋白は密度計で定量し、ラフト蛋白フロチリン−１に対して規格化した。
【０３９３】
図２０Ａ〜２０Ｃに示すとおりＥｒｂＢ２の活性なリン酸化された形態はＳｐ３５とＥｒｂＢ２を同時発現する細胞においては低減された。しかしながらＥｒｂＢ２蛋白レベルはＳｐ３５の存在非存在に関わらず全細胞抽出液中で同様であった。図２０Ｃを参照できる。更に又、図２０Ｂに示す通り、ＥｒｂＢ２はラフトマーカーフロチリンで識別したラフト膜調製品中に豊富に存在した。しかしながら、ＥｒｂＢ２トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞にＳｐ３５を同時トランスフェクトした場合、脂質ラフト中のＥｒｂＢ２の両は約３倍減少した。図２０Ｄ。この現象は、全細胞抽出液中のＥｒｂＢ２の量がＳｐ３５の存在下又は非存在下において不変であり続けたことから、脂質ラフトに限定されていた。図２０Ｂと比較した場合の図２０Ａおよび図２０Ｄを参照できる。ＥｒｂＢ２単独と比較して、Ｓｐ３５及びＥｒｂＢ２の同時発現を有する脂質ラフト画分においてはリン酸化ＥｒｂＢ２の量は減少していた。図２０Ｂ及び２０Ｄ。
【０３９４】
Ｓｐ３５の細胞外ドメインは脂質ラフトへのＥｒｂＢ２の転座をブロックすることに関与していると考えられるが、その理由は２９３細胞におけるＥｒｂＢ２とのＳｐ３５の細胞質テール部の同時発現ではＥｒｂＢ２の脂質ラフトへの転座又はそのリン酸化をブロックできなかったためである。図２０Ｅ参照。これらの結果が示唆していることは、Ｓｐ３５がＥｒｂＢ２のリン酸化をダウンレギュレートするのは、脂質ラフトへのＥｒｂＢ２の転座をそれがブロックすることによるものであり、その分解を誘導することにはよらないことである。
【０３９５】
ＥｒｂＢ２が脂質ラフトへ転座することを防止するＳｐ３５の能力は更に、Ｓｐ３５用量依存性試験により裏付けられる。Ｓｐ３５を発現するレンチウィルスの種々の感染多重度（ＭＯＩ）で２９３Ｔ細胞を感染させることによりＳｐ３５蛋白レベルを操作した場合、発現されたＳｐ３５の量と脂質ラフト中に存在するＥｒｂＢ２蛋白のレベルの低下の間には直接の関連性が観察された。図２０Ｅ参照。Ｓｐ３５蛋白発現はレンチウィルスを感染させた細胞の全細胞抽出液中の総ＥｒｂＢ２蛋白レベルには影響を有さなかった。図２０Ｆ参照。
【０３９６】
更に又、脂質ラフト中のＥｒｂＢ２蛋白のレベルはＳｐ３５ノックアウトマウスの脳組織中でも調べた。Ｓｐ３５ノックアウトマウスの脳組織由来の脂質ラフト中のＥｒｂＢ２蛋白のレベルは野生型脳組織由来の脂質ラフト調製品よりも２倍より豊富であった。図２０Ｇ参照。
【０３９７】
実施例１５
Ｓｐ３５の拮抗剤はＥｒｂＢ２のリン酸化及び稀突起膠細胞の分化を増進する。
【０３９８】
ＥｒｂＢ２を介して稀突起膠細胞の分化を調節する場合のＳｐ３５の役割を確認するために、Ｓｐ３５の拮抗剤、又は、ＥｒｂＢ２の活性に影響する、例えば増進又は抑制する薬剤の影響を、培養Ｏ４＋野生型（ＷＴ）及びＳｐ３５ノックアウトマウスから単離した稀突起膠細胞の分化に対して検討した。末端分化稀突起膠細胞はＭＢＰ染色により識別した。
【０３９９】
生後第２日（Ｐ２）のＳｐ３５ノックアウト又は野生型マウスに由来するマウス稀突起膠細胞を参照により本明細書に組み込まれるＭｉ等、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−７５１（２００５）に記載の通り培養した。慨すれば、前脳を切開し、Ｈａｎｋ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に入れた。組織を１ｍｍに切片化し、０．０１％トリプシン及び１０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ中で１５分間３７℃でインキュベートした。かい離した細胞をポリ−Ｌ−リジンコーティングＴ７５組織培養フラスコ上にプレーティングし、そして２０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ＤＭＥＭ中において１０日間３７℃で生育させた。稀突起膠細胞前駆体（Ａ２Ｂ５＋）は３７℃において２００ｒｐｍで一夜フラスコを振とうさせることにより収集し、９５％純度の集団が得られた。培養物は１週間ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）（各々１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した高グルコースのＤｕｌｂｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＦＧＦ／ＰＤＧＦの除去によりＡ２Ｂ５＋細胞は２〜３日後にＯ４＋前髄鞘形成稀突起膠細胞に分化し、そして５〜７日後にＯ４＋／ＭＢＰ＋成熟稀突起膠細胞に分化した。これらの分化状態はＭｉ等、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７４５−７５１（２００５）に記載の通り形態の変化から容易に顕在化された。次にマウス由来のＯ４＋稀突起膠細胞を抗ＥｒｂＢ２抗体Ｌ２６又は抗ＥｒｂＢ２抗体Ｎ２９（ともにＫｌａｐｐｅｒ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７）及びＴｚａｈａｒ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：４９３８−５０（１９９７）に記載）（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）又はＳｐ３５拮抗剤抗体１Ａ７（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ）又は対照抗体ＭＯＰＣ２１（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ）で３０分間処理することによりＥｒｂＢ２リン酸化試験に付した。Ｌ２６抗体はＥｒｂＢ２のリン酸化を増大させ、そして、ＥｒｂＢ２のチロシンキナーゼ活性を活性化している。Ｎ２９抗体はＥｒｂＢ２のチロシンキナーゼ活性を活性化していない。マウスＯ４＋稀突起膠細胞を４８時間ＥｒｂＢ２アゴニスト又は拮抗剤で処理することにより、分化試験に付した。
【０４００】
細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定化し、そして抗ＭＢＰ抗体（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ，Ｉｎｃ．）で染色することにより稀突起膠細胞の分化状態を調べた。
【０４０１】
稀突起膠細胞分化
野生型稀突起膠細胞について、抗Ｓｐ３５拮抗剤１Ａ７（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）抗体によるＳｐ３５のブロッキング又は抗ＥｒｂＢ２アゴニストＬ２６抗体によるＥｒｂＢ２の活性化は、それぞれ約１．５〜３倍、稀突起膠細胞の分化を増進した。図２１Ａ及びＢ。これとは対照的に、抗ＥｒｂＢ２拮抗剤抗体Ｎ２９は野生型稀突起膠細胞の分化を約２倍ブロックした。
【０４０２】
Ｓｐ３５ノックアウトマウス由来の稀突起膠細胞を使用しながら平行試験を実施した。Ｌ２６ＥｒｂＢ２抗体はＳｐ３５ノックアウトマウスにおける稀突起膠細胞分化に対して作用を有していなかった。図２１Ｂ及び２２Ａ。Ｎ２９ＥｒｂＢ２抗体は図２１Ｂ及び２２Ａに示す通り、Ｓｐ３５ノックアウトマウスから単離した稀突起膠細胞における稀突起膠細胞分化を抑制した。抗Ｓｐ３５拮抗剤はＳｐ３５ノックアウトマウス由来の稀突起膠細胞における稀突起膠細胞分化を更に増強することはなかった。
【０４０３】
上記した結果と合致して、完全長ＥｒｂＢ２の過剰発現は稀突起膠細胞分化を増進したのに対し、優性阻害ＥｒｂＢ２（細胞質テール部を欠いている）の過剰発現は稀突起膠細胞分化を抑制した。図２１Ｂ参照。更に又完全長Ｓｐ３５の過剰発現は稀突起膠細胞分化を抑制したのに対し、優性阻害Ｓｐ３５は稀突起膠細胞分化を増進した。図２１Ｂ参照。
【０４０４】
ＥｒｂＢ２リン酸化
稀突起膠細胞におけるＥｒｂＢ２のリン酸化状態を、上記したＳｐ３５に対する抗体及びＥｒｂＢ２に対する抗体の存在下にＳｐ３５ノックアウトおよび野生型のマウスから検討した。Ｓｐ３５拮抗剤抗体１Ａ７及びＥｒｂＢ２抗体Ｌ２６は共に野生型稀突起膠細胞におけるＥｒｂＢ２リン酸化を増進した。図２２Ｂ及びＣ。逆に、ＥｒｂＢ２抗体Ｎ２９は野生型稀突起膠細胞におけるＥｒｂＢ２リン酸化を抑制した。図２２Ｂ及びＣ。
【０４０５】
ＥｒｂＢ２のリン酸化状態はまたＳｐ３５ノックアウトマウス由来の稀突起膠細胞においても検討した。Ｓｐ３５ノックアウトマウスから単離した稀突起膠細胞は野生型稀突起膠細胞と比較して上昇したレベルのリン酸化ＥｒｂＢ２を示した。図２２Ｄ。
【０４０６】
生後第６日（Ｐ６）のＳｐ３５ノックアウトマウスは同じ齢のマウスに由来する野生型脊髄と比較して、ＥｒｂＢ２リン酸化のレベルにおいて２倍上昇を示した。図２２Ｅ。野生型とノックアウトのマウスの間でＥｒｂＢ２蛋白のレベルは不変であった。更に又、稀突起膠細胞分化のマーカーであるＭＢＰ蛋白の発現もまた野生型と比較してＳｐ３５ノックアウトマウス由来の稀突起膠細胞において２倍増大していた。図２２Ｅ及びＦ参照。
【０４０７】
上記した本発明は理解の明確化を目的として説明及び例を用いて幾分詳細に記載してきたが、当業者の知る通り、本発明の教示を鑑みれば、特定の変更および改変が添付請求項の精神又は範囲を逸脱することなく行える。
【０４０８】
本明細書において言及した全ての公開物及び特許出願は、個々の公開物及び特許出願が参照により組み込まれることを特定して個別に示される場合と同様の程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４０９】
【図１】完全長ヒトＳｐ３５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）である。
【図２】完全長ヒトＳｐ３５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図３】完全長マウスＳｐ３５ポリペプチドをコードする配列のヌクレオチド配列（配列番号３）である。
【図４】完全長マウスＳｐ３５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図５】Ｓｐ５（ＬＩＮＧＯ−１）が稀突起膠細胞において発現される。Ｐ１３ＣＧニューロン（ｐ１３ＣＧＮ）、稀突起膠細胞及び星状細胞の培養におけるＬＩＮＧＯ−１ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨ発現は内部対照として同じ試料から分析した。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂ。（Ａ）ＲＮＡｉ感染稀突起膠細胞及び未感染対照からのＳｐ５（ＬＩＮＧＯ−１）ｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。β−アクチンを内標準として使用した。（Ｂ）ＲＮＡｉ処理培養物中の成熟稀突起膠細胞の定量。
【図７】種々の発生段階の稀突起膠細胞におけるＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）ｍＲＮＡの発現。稀突起膠細胞を分化するように誘導し、そしてＳｐ３５の定量はＲＴ−ＰＣＲにより実施した。データは内部対照としてのＧＡＰＤＨレベルに対して規格化した。早期の先祖稀突起膠細胞（Ａ２Ｂ５＋）及び前髄鞘形成稀突起膠細胞（Ｏ４＋）はＳｐ３５ｍＲＮＡの等しいレベルを示したが、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ＋）を発現している成熟稀突起膠細胞においてはＳｐ３５ｍＲＮＡのレベルは二倍超であった。
【図８】対照Ｆｃポリペプチドによる処理と比較した場合の外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ処理の後の稀突起膠細胞の用量依存性の分化。データは総Ｏ４＋稀突起膠細胞のパーセントとして成熟稀突起膠細胞（ミエリンシートの存在により識別）の数を計数することにより定量した。各試料につき、約８００細胞を計数した。
【図９】ＬＩＮＧＯ−１（Ｓｐ５）拮抗剤はＲｈｏＡ及びＦｙｎを調節する。（Ａ）ウエスタンブロットにより検出されたＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処理した稀突起膠細胞中のＲｈｏＡ−ＧＴＰ量。（Ｂ）ウエスタンブロットにより検出されたＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１又は対照プラスミドを担持したレンチウィルスを感染させた稀突起膠細胞中のＦｙｎ発現及びリン酸化（ｐＦｙｎ）。
【図１０Ａ】ＬＩＮＧＯ−１拮抗剤は稀突起膠細胞による軸索髄鞘形成を増進する。２週間ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）で処理した共培養物中の髄鞘形成の定量的分析。各試料につき、ＭＢＰ＋に関して染色した細胞１０視野を計数した。
【図１０Ｂ】ＭＢＰ蛋白の存在を検出するために抗ＭＢＰ抗体を使用しながら外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ及び対照Ｆｃポリペプチドで処理した４週間共培養のウエスタンブロット。
【図１０Ｃ】ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ（Ｃ）で４週間処理した共培養物の電子マイクロスプレー分析。ランヴィエ構造の節が示されている。スケールバーは１．５μｍ。
【図１０Ｄ】対照Ｆｃ（Ｄ）で４週間処理した共培養物の電子マイクロスプレー分析。ランヴィエ構造の節が示されている。スケールバーは１．５μｍ。
【図１０Ｅ】ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１及び対照レンチウィルスを２週間感染させた共培養物における髄鞘形成。ＭＢＰ＋細胞は免疫蛍光分析により計数した（Ｅ）。ヘマグルチニンタグに対する抗体を用いながらＭＢＰ及びＬＩＮＧＯ−１に関して分析したＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１及び対照レンチウィルスを感染させた培養物から得られたウエスタンブロット（Ｆ）。
【図１０Ｆ】ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１及び対照レンチウィルスを２週間感染させた共培養物における髄鞘形成。ＭＢＰ＋細胞は免疫蛍光分析により計数した（Ｅ）。ヘマグルチニンタグに対する抗体を用いながらＭＢＰ及びＬＩＮＧＯ−１に関して分析したＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１及び対照レンチウィルスを感染させた培養物から得られたウエスタンブロット（Ｆ）。
【図１０Ｇ】脊髄神経節細胞のみ（ＤＲＧ感染）又は稀突起膠細胞のみ（稀突起感染）又は両方（両方感染）をＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１及び対照レンチウィルスに感染させてある共培養物における髄鞘形成。
【図１１】Ｐ１マウス由来のＬＩＮＧＯ−１ノックアウト及び野生型の脊髄中の髄鞘形成軸索繊維の（Ａ）目視及び（Ｂ）定量的な分析を示す電子顕微鏡観察。４脊髄を分析し；各試料につき、１０視野由来の髄鞘形成軸索繊維を計数した。データは全計測からの平均値である。
【図１２】キュプリゾン処理マウスに本明細書に記載する通りＳｐ５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）又は対照ポリペプチドを外科的に注入した。Ｓｐ３５−Ｆｃ処理を受けたマウスは増大した成熟稀突起膠細胞生存を示した（ＣＣ１抗体染色に基づく）。
【図１３】Ｓｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）又は対照で処理したＮＧＦ離脱後１８時間の分化ＰＣ１２細胞のＴＵＮＥＬ試験。Ｓｐ５−Ｆｃ処理細胞はアポトーシスを起こしている細胞がより少数であった。
【図１４】Ｓｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１）、カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ又は対照ポリペプチドで処理した培地からのＮＧＦ分離後１８時間の栄養支援枯渇した分化ＰＣ１２細胞におけるアポトーシス。対照ポリペプチドで処理した細胞は大部分の細胞死を示した。
【図１５】ＭＢＰ蛋白の存在を検出するために抗ＭＢＰ抗体を用いながら外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ−Ｆｃ、突然変異体のＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ−Ｆｃ（４５６位のアルギニンがヒスチジンに変化）、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ及び対照−Ｆｃポリペプチドで処理した共培養物のウエスタンブロット。
【図１６】ＭＢＰ蛋白の存在を検出するために抗ＭＢＰ抗体を用いながら実施例６に記載の通り外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ環状ペプチド及び突然変異したＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ環状ペプチドで処理した４共培養物のウエスタンブロット。
【図１７Ａ】図１７ＡはＥｒｂＢ２又はベクターのみ（対照）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞へのＡＰ−Ｓｐ３５の結合を示すグラフである。ｙ軸は４１０ｎｍにおける光学密度を示す。ｘ軸は実施例１３に記載の通りトランスフェクトした細胞に添加したＡＰ−Ｓｐ３５の濃度（ｎＭ）を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは実施例１３に記載の通りＥｒｂＢ２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞へのＳｐ３５の細胞外ドメイン（ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１）、Ｓｐ３５のＬＲＲドメイン（ＡＰ−ＬＲＲ）又はＳｐ３５のＩｇ及びスタークドメイン（ＡＰ−Ｉｇ−Ｓｔａｌｋ）の結合データを示すグラフである。更に又、グラフはＳｐ３５とＥｒｂＢ２を同時発現する細胞（ＬＩＮＧＯ−１／ＥｒｂＢ２）へのＳｐ３５の細胞外ドメインの結合データ（ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１）及び細胞発現ＥｒｂＢ２を実施例１３に記載の通りＥｒｂＢ２を可溶性Ｓｐ３５―Ｆｃと予備インキュベートした場合（ＡＰ−ＬＩＮＧＯ−１／ＬＩＮＧＯ−１Ｆｃ）を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは実施例１３に記載の通りＥｒｂＢ２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞へのＳｐ３５の細胞外ドメイン（ＬＩＮＧＯ−１）、Ｓｐ３５のＬＲＲドメイン（ＬＩＮＧＯ−１−ＬＲＲ）又はＳｐ３５のＩｇ及びスタークドメイン（ＡＰ−Ｉ−Ｉｇ）の結合データを示すグラフである。
【図１８Ａ】図１８Ａは同時発現におけるＳｐ３５とＥｒｂＢ２（ＬＩＮＧＯ−１／ＥｒｂＢ２）、Ｓｐ３５とＯＭｇｐ（ＬＩＮＧＯ−１／ＯＭｇｐ）、ＥｒｂＢ２とＯＭｇｐ（ＥｒｂＢ２／ＯＭｇｐ）、Ｓｐ３５単独（ＬＩＮＧＯ−１）、ＯＭｇｐ単独（ＯＭｇｐ）及びＥｒｂＢ２単独（ＥｒｂＢ２）を発現する２９３Ｔ細胞由来の種々の抗体によるＳｐ３５及びＥｒｂＢ２の共免疫沈降実験から得られたウエスタンブロットである。免疫沈降実験で使用した抗体は抗ＥｒｂＢ２（ＥｒｂＢ２−ＩＰ）及び抗Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１−ＩＰ）である。免疫沈降実験の生成物をウエスタンブロットに付し、次に免疫沈降複合体中のＳｐ３５、ＥｒｂＢ２又はＯＭｇｐを検出するために抗Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１Ｗ）、抗ＥｒｂＢ２（ＥｒｂＢ２Ｗ）、抗ＯＭｇｐ（ＯＭｇｐＷ）抗体でプローブした。抗ＥｒｂＢ２抗体による免疫沈降もまたＳｐ３５、ＥｒｂＢ２又はＯＭｇｐを発現しない２９３Ｔ細胞又は対照としての稀突起膠細胞に由来する細胞溶解物に対して実施した。ＯＭｇｐＷＣＥＷは全細胞抽出液とする。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは実施例１３に記載の通り同時発現Ｓｐ３５／ＯＭｇｐ、ＥｒｂＢ２／ＯＭｇｐ、Ｓｐ３５／ＥｒｂＢ２、ＯＭｇｐ（特異性対照）、ＥｒｂＢ２、Ｓｐ３５又は対照ベクター単独を発現する２９３Ｔ細胞に由来する抗Ｓｐ３５抗体（ＬＩＮＧＯ−１）又は抗ＥｒｂＢ２抗体によるＳｐ３５及びＥｒｂＢ２の共免疫沈降実験から得られたウエスタンブロットである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは実施例１３に記載の通り稀突起膠細胞及び脊髄組織に由来するＳｐ３５及びＥｒｂＢ２の共免疫沈降実験から得られたウエスタンブロットである。
【図１９】稀突起膠細胞成熟の種々の段階におけるＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の発現を示す実施例１３に記載の通り実施した半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。
【図２０Ａ】ＥｒｂＢ２単独、Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）単独又はＥｒｂＢ２及びＳｐ３５の両方でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット（Ａ）を示す。ウエスタンブロットはリン酸化した活性なＥｒｂＢ２を検出するために、抗ＥｒｂＢ２抗体、抗Ｓｐ３５抗体又はリン酸化チロシンに対する抗体でプローブした。
【図２０Ｂ】（Ｂ）は図２０Ａに記載の通りトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の精製された脂質ラフトのウエスタンブロットであり、図２０Ａに記載したものと同じ抗体でプローブした。更に又、ラフトマーカー蛋白フロチリンに対する抗体を脂質ラフト精製を実証するために使用した。
【図２０Ｃ】（Ｃ）Ｓｐ３５（レーン１）又はＥｒｂＢ２（レーン３）単独の何れかによるトランスフェクションと比較した場合の、Ｓｐ３５／ＥｒｂＢ２（レーン２）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に由来する総及び全細胞溶解物。
【図２０Ｄ】（Ｄ）ＥｒｂＢ２単独又はＥｒｂＢ２とＳｐ３５でトランスフェクトした細胞の脂質ラフトへの転座ＥｒｂＢ２。
【図２０Ｅ】（Ｅ）実施例１４に記載の通りＳｐ３５又はＥｒｂＢ２単独、Ｓｐ３５とＥｒｂＢ２、Ｓｐ３５の細胞質テール（ＬＩＮＧＯ−１−Ｃ）単独で、又は、ＥｒｂＢ２（ＬＩＮＧＯ−１−Ｃ／ＥｒｂＢ２）でトランスフェクトした細胞の脂質ラフト内への転座ＥｒｂＢ２。
【図２０Ｆ】（Ｆ）実施例１４に記載の通りＳｐ３５を発現するレンチウィルスの種々の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた細胞の脂質ラフト内への転座ＥｒｂＢ２。
【図２０Ｇ】（Ｇ）実施例１４に記載の通り野生型（＋／＋）及びＳｐ３５ノックアウト（−／−）マウスの脳組織に由来する総細胞溶解物及び脂質ラフト画分中のＳｐ３５、フロチリン−１及びＥｒｂＢ２。
【図２１Ａ】（Ａ）未処理又はＥｒｂＢ２拮抗剤モノクローナル抗体Ｎ２９、ＥｒｂＢ２アゴニストモノクローナル抗体Ｌ２６又はＳｐ３５拮抗剤モノクローナル抗体１Ａ７処理の野生型マウス由来の培養物中の末端分化稀突起膠細胞（ＭＢＰ＋）の数を示すグラフ。
【図２１Ｂ】（Ｂ）野生型（＋／＋）及びＳｐ３５ノックアウト（−／−）マウスに由来するＳｐ３５拮抗剤抗体（１Ａ７）、ＥｒｂＢ２抗体（Ｌ２６）、ＥｒｂＢ２抗体（Ｎ２９）又は対照ＭＯＰＣ２１抗体で処理した後の伸長ミエリンシートネットワークを有するＭＢＰ＋稀突起膠細胞の数を示すグラフ。
【図２２Ａ】（Ａ）は未処理又はＥｒｂＢ２モノクローナル抗体Ｎ２９又はＥｒｂＢ２モノクローナル抗体Ｌ２６で処理された野生型（ＷＴ）及びＳｐ３５ノックアウト（ＫＯ）マウス由来の培養物中の末端分化稀突起膠細胞（ＭＢＰ）＋の数を示すグラフである。
【図２２Ｂ】（Ｂ）は対照、ＥｒｂＢ２拮抗剤モノクローナル抗体Ｎ２９、ＥｒｂＢ２アゴニストモノクローナル抗体Ｌ２６又はＳｐ３５拮抗剤モノクローナル抗体１Ａ７で処理した野生型稀突起膠細胞のウエスタンブロットである。ウエスタンブロットはリン酸化したチロシン、ＥｒｂＢ２又はＳｐ３５を検出するために抗体でプローブした。
【図２２Ｃ】（Ｃ）はＥｒｂＢ２モノクローナル抗体Ｎ２９、ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体Ｌ２６、Ｓｐ３５拮抗剤モノクローナル抗体１Ａ７又はＭＯＰＣ２１対照抗体で処理したラット稀突起膠細胞培養物由来の溶解物中のＥｒｂＢ２のレベルと相対比較した場合のリン酸化ＥｒｂＢ２（ｐＴｙｒ）を示すウエスタンブロットである。
【図２２Ｄ】（Ｄ）は野生型（＋／＋）およびＳｐ３５ノックアウト（−／−）マウスから得られた稀突起膠細胞中のＥｒｂＢ２と相対比較した場合のリン酸化ＥｒｂＢ２レベルを示すウエスタンブロットである。
【図２２Ｅ】（Ｅ）は野生型（＋／＋）ｖｓＳｐ３５ノックアウト（−／−）マウス由来の出生後第６日（Ｐ６）の脊髄におけるＥｒｂＢ２並びにＭＢＰ蛋白と相対比較した場合のＥｒｂＢ２リン酸化蛋白（ｐ−Ｔｙｒ）のレベルのウエスタンブロットである。５匹の独立した動物を各試験に関して分析した。アクチンを内部負荷対照として使用し、そして、ＭＢＰを稀突起膠細胞分化のマーカーとして使用する。
【図２２Ｆ】（Ｆ）は図２２Ｅに示す実験の結果を定量化したグラフである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
2009518299.tif 000056
【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月7日(2008.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009518299000001.app
【国際調査報告】
2009518299.tif 000117
2009518299.tif 000118
2009518299.tif 000119
2009518299.tif 000120
2009518299.tif 000121
2009518299.tif 000122
2009518299.tif 000123