(57)【要約】  多発性嚢胞腎又は他の疾患であって、受容体-カルシウムチャネル複合体の腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)による直接又は間接的な変化、又は嚢胞形成が刺激されるカルシウム制御に関連する疾患の治療のための方法及び組成物が本明細書に開示される。
2009532495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦ-αシグナル伝達を抑制することを含み、その結果ポリシスチン機能が細胞内で維持される、嚢胞形成の抑制方法。
【請求項２】
前記ＴＮＦ-αシグナル伝達が、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２及びＴＮＦ-α受容体関連タンパク質からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＮＦ-αシグナル伝達が、フィブロシスチンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＮＦ-αシグナル伝達が、ＦＩＰ２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＮＦ-αシグナル伝達が、ＴＮＦ-αを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、膵臓細胞、腎臓細胞、又は肝臓細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、膵臓細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、腎臓細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、肝臓細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＮＦ-αシグナル伝達が、ｉｎ ｖｉｖｏで抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＮＦ-αシグナル伝達が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリシスチン機能が維持され、その結果嚢胞形成が抑制される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリシスチン機能が維持され、その結果ＰＣ２が前記細胞の原形質膜に局在したまま残る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞へのカルシウム流入の撹乱を抑制する方法であって、ＴＮＦ-αシグナル伝達を抑制することを含み、その結果ポリシスチン機能が細胞内で維持される、前記方法。
【請求項１５】
細胞へのカルシウム流入の撹乱を抑制する方法であって、ＰＣ２とＦＩＰ２の相互作用を抑制することを含み、その結果ＰＣ２が細胞の原形質膜に局在したまま残る、前記方法。
【請求項１６】
ハプロ不全関連疾患の治療方法であって、ＴＮＦ-αシグナル伝達を抑制することを含み、その結果ポリシスチン機能が細胞内に維持される、前記方法。
【請求項１７】
前記ハプロ不全関連疾患が、常染色体優性多発性嚢胞腎、常染色体劣性多発性嚢胞腎、神経線維腫症、神経芽細胞腫、ＭＯＤＹ糖尿病を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＮＦ-αシグナル伝達が、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２又はＴＮＦ-α受容体関連タンパク質に対する抗体により抑制される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＴＮＦ-αシグナル伝達が、エタネルセプト、インフリキシマブ、Ｄ２Ｅ７、ＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、オネルセプト、ＯＲ１３８４、テニダップ、ラパマイシン、又はレフルノミドにより抑制される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ポリシステイン機能が細胞内で維持され、そして嚢胞形成が抑制されるように、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２又はＴＮＦ-α受容体関連タンパク質に実質的に結合する抗体、又はその抗原結合性断片を含む組成物。
【請求項２１】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体が、ＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗原結合性断片が、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、ダイアボディ、リニア抗体、又は抗体のＦ(ａｂ')2抗原結合性断片である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体が、当該抗体若しくはその抗原結合性断片のダイマー、トリマー、又はマルチマーである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、若しくは部分的にヒト化された抗体、又はそれらの抗原結合性断片である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体が、組換え抗体である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗体が、少なくとも１の第一治療薬又は診断薬に作用可能なように結合されている、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗体が、少なくとも１の第１治療薬及び第２治療薬に作用可能なように結合されている。
【請求項３０】
ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２又はＴＮＦ-α受容体結合タンパク質に実質的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を含む少なくとも１の第一免疫コンジュゲートの生物学的に有効な量を含み、その結果、嚢胞形成が抑制され、そしてポリシスチン機能が細胞内で維持される、医薬組成物。
【請求項３１】
作用可能なように治療薬に結合された抗体又はその抗原結合性部分を含む化合物であって、当該抗体、又はその抗原結合性部分が、実質的に、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２又はＴＮＦ-α受容体関連タンパク質に結合し、その結果、当該治療薬が、ＴＮＦ-αシグナル伝達を抑制し、そしてポリシスチン機能が細胞内で維持される、前記化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、常染色体優性多発性嚢胞腎(ＡＤＰＫＤ)、又は他の嚢胞形成疾患の治療用の組成物及び治療方法に関する。具体的に、本発明の組成物及び方法は、カルシウム調節の変化に関連する嚢胞の形成を抑制するために使用されうる。
【背景技術】
【０００２】
常染色体優性多発性嚢胞腎(ＡＤＰＫＤ)は、尿細管の嚢胞性膨張により特徴付けられる一般的な遺伝疾患である。疾患が進むにつれ、嚢胞は大きくなり、最終的にそのネフロンから分離されてしまう。結果として生じる腎機能の低下は、血液透析又は臓器移植を必要とすることが多い。ＡＤＰＫＤ症例の大部分(８５〜９０％)は、ポリシスチン-１(ＰＣ１)として知られている４６０ｋＤａのＧタンパク質結合受容体をコードするＰＫＤ１遺伝子内の変異により引き起こされる1,2。第二の遺伝子であるＰＫＤ２の変異は、Ｃａ2+-透過性カチオンチャネルタンパク質、つまりポリシスチン-２(ＰＣ２)の機能を無効にし、そしてＡＤＰＫＤの全症例の１０〜１５％を占める8,9,19,20。ＰＣ１及びＰＣ２は、その細胞質ドメインの相互作用を介して複合体を形成し、他の場所のなかでとりわけ、腎臓上皮の先端面の第一繊毛(primary cilia)内に存在する。第一繊毛は、基底小体から伸張し、そして微小管及びその関連タンパク質のまとまった列を含む。最近の研究により、第一繊毛が、様々な生理的機能及びＰＫＤなどのヒト疾患に係わっているとみなされてきた。液流に応答した繊毛及びポリシスチン依存性のカルシウムシグナル伝達の欠損が、上皮細胞の極性の変化、細胞-細胞接触、及び細胞周期の制御をもたらし、上皮の完全性の撹乱及び嚢胞形成を導くということが仮定される。
【０００３】
ＡＤＰＫＤの発達に関する特に重要な疑問は、ＰＫＤ１及びＰＫＤ２の劣性の機能喪失突然変異が、これらの変異についてのヘテロ接合のヒト及びマウスの両方においてどのように嚢胞成長を引き起こすのかということである。単離されたヒト嚢胞における体細胞変異分析により、ＡＤＰＫＤにおける嚢胞形成が、多くの場合体細胞におけるへテロ接合性の喪失、及び幾つかの場合遺伝子発現又は機能を変化させうる点突然変異を含むポリシスチン遺伝子の機能的コピーに影響を与える「第２ヒット(second hit)」変異を内包する上皮細胞のクローン性増殖から生じるという仮定が導かれる。疾患の常染色体優性性質についての唯一の説明であるこの仮定では、ヒト集合における１０００回に１回のＡＤＰＫＤの頻度、及びＰＫＤ２-/+マウスにおける５回に１回の嚢胞発達の頻度を考えると、ＰＫＤ１の遺伝子座が、非常に変異されやすいということを想定しなければならない。他の研究は、ポリシスチンが多くの嚢胞裏打ち細胞において発現されることを示し、そして体細胞変異は、少なくともＡＤＰＫＤの成人型においては必要とされないということを論じた。「２つのヒット」仮説の主な障害は、体細胞変異と疾患表現形との間の偶然の関係を直接示すことの困難性であり、そして嚢胞裏打ち細胞において観察された高頻度の変異が、癌細胞において観察された高レベルの遺伝的不安定性に似た適切な増殖制御を失ったために生じうるということが指摘された(Harris PC及びWatson ML)。遺伝的変化を誘発する変わりに、幾つかのエピジェネティック因子、おそらくポリシスチンを含めた細胞内ネットワーク内に含められた因子、がＡＤＰＫＤの表現形発現における犯人であるという可能性がある。まとめると、ＡＤＰＫＤの原因は、現在完全には理解されておらず、結果として疾患の治療の発明は、完全に上手くいったものではない。治療法は現在知られていない。
【発明の開示】
【０００４】
嚢胞形成を抑制する方法であって、ＴＮＦ-αシグナル伝達を抑制することによる方法が本明細書に提供される。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２、及びＴＮＦ-α受容体関連タンパク質からなる群から選ばれうる。ＴＮＦ-αシグナル伝達の抑制は、細胞におけるポリシスチン機能を維持しうる。当該細胞は、膵臓細胞、腎臓細胞、又は肝臓細胞であってもよい。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで抑制されうる。ポリシスチン機能の維持は、嚢胞形成を抑制し、そしてＰＣ２を原形質膜に局在させうる。
【０００５】
細胞へのカルシウム流入の撹乱を抑制する方法であって、細胞におけるＴＮＦ-αシグナル伝達の抑制及びポリシスチン機能の維持による方法も本明細書に提供さる。ＰＣ２とＦＩＰ２の相互作用も抑制されうる。ＰＣ２とＦＩＰ２の相互作用の抑制は、細胞の原形質膜へとＰＣ２を局在させうる。
【０００６】
ハプロ不完全性関連疾患の治療方法であって、ＴＮＦ-αシグナル伝達を抑制し、そしてポリシスチン機能を細胞内で維持することによる方法がさらに提供される。ハプロ不完全性関連疾患は、常染色体優性多発性嚢胞腎、常染色体劣性多発性嚢胞腎、神経線維腫症、神経芽細胞腫、ＭＯＤＹ糖尿病を含みうる。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２又はＴＮＦ-α受容体関連タンパク質により抑制されうる。ＴＮＦ-αは、エタネルセプト、インフリキシマブ、Ｄ２Ｅ７、ＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、オネルセプト、ＯＲ１３８４、テニダップ、ラパマイシン、又はレフルノミドにより抑制されてもよい。
【０００７】
抗体又はその抗原結合性断片である組成物も本明細書に提供される。抗体は、モノクローナル、ＩｇＧ、又はＩｇＭ抗体であってもよい。抗体は、ダイマー、トリマー、又はマルチマーであってもよい。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又は部分的にヒト化抗体であってもよい。抗体は、キメラ抗体又は組換え抗体であってもよい。抗体は、少なくとも１の第１治療薬又は診断薬に作用可能なように結合されることもある。抗体は、少なくとも１の第１治療薬及び第２治療薬に作用可能なように結合されることもある。抗原結合性断片は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、ダイアボディ又はＦ(ａｂ')2断片であってもよい。抗体又はその抗原結合性断片は、実質的に、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２、又はＴＮＦ-α受容体関連タンパク質に実質的に結合されることもある。この結合は、ポリシスチン機能を維持し、そして嚢胞形成を抑制することができる。
【０００８】
生物学的に有効量の少なくとも１の第一免疫コンジュゲートを含む医薬組成物がさらに本明細書に提供される。当該免疫コンジュゲートは、抗体又はその抗原結合性断片を含むことがある。当該抗体又はその抗原結合性断片は、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２、又はＴＮＦ-α受容体関連タンパク質に実質的に結合しうる。この結合は、嚢胞形成を抑制し、そして細胞内でのポリシスチン機能を維持することができる。
【０００９】
抗体又はその抗原結合性部分を含み得る化合物も本明細書に提供される。当該抗体又はその抗原結合性部分は、実質的に、ＴＮＦ-α、Ｒａｂ８、ＴＮＦ-α受容体、フィブロシスチン、ＦＩＰ２、又はＴＮＦ-α受容体関連タンパク質に結合することもある。当該抗体又はその抗原結合性部分は、治療薬に結合されてもよい。当該治療薬は、ＴＮＦ-αシグナル伝達を抑制することもあり、そして細胞におけるポリシスチン機能を維持することもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ポリシスチンに関与するシグナル経路の成分を同定する試みにおいて、出願人は、ヒトＰＣ２のＣ末端の細胞内ドメインの全部を含むおとりを用いて、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリーについて酵母２ハイブリッドスクリーニングを行なった。このスクリーニングは、ＦＩＰ２、コイルドコイルを含むＴＮＦ-α誘導性タンパク質、を潜在的なＰＣ２結合パートナーとして同定した。この相互作用の特異性を試験し、そしてＦＩＰ２におけるＰＣ２相互作用ドメインをマッピングするために、本出願人は、ＦＩＰ２の一連の欠失コンストラクト(図１Ａ)を作成し、そして酵母２-ハイブリッドシステムにおいてＰＣ２との相互作用を試験した。図１Ａに示される様に、ＦＩＰ２内の３個のコイルドコイルドメインのうち、２番目のコイルドコイルドメインを含むコンストラクトのみが、ＰＣ２のＣ末端ドメインと、全長ＦＩＰ２と同程度の効力で相互作用する。ＦＩＰ２のＮ末端ドメイン又はＣ末端ドメインのいずれかを含む欠失コンストラクトは、ＰＣ２と相互作用せず、さらにＰＣ２結合性ドメインが、第２のコイルドコイル領域内(アミノ酸１４３から２６０)に位置するということを示唆する。酵母に全長ＦＩＰ２及び一連のＰＣ２のＣ末端欠失コンストラクトをコトランスフェクションすることにより、ＦＩＰ２結合性ドメインがアミノ酸７４１〜８０２の間のＰＣ２のコイルドコイルドメインの周辺に位置するということが示された(図１Ｂ)。ＰＣ２が哺乳動物細胞内でＦＩＰ２と結合するという生化学的証拠をえるために、全長ｍｙｃタグ付きＰＣ２及びｆｌａｇタグ付き若しくはＴ７タグ付きＦＩＰ２をコトランスフェクトされたＩＭＣＤ細胞から得たライセートを、抗ｆｌａｇ、抗Ｔ７、抗Ｍｙｃ、又は抗ＰＣ２抗体で免疫沈降した(図１Ｃ)。ＦＩＰ２を用いてＰＣ２を免疫共沈降できたが、対照の抗ＩｇＧ抗体を免疫沈降に使用した場合はＰＣ２を免疫共沈降できなかったということを出願人は発見した。
【００１１】
ＴＮＦ-αは、多くの重要な生物学的機能を有する炎症促進サイトカインである26-29。ＴＮＦ-αのｍＲＮＡ及びタンパク質は、過度のストレス34及び腎臓損傷35-37の後に顕著に増加する。ｃｐｋ／ｃｐｋマウスの嚢胞腎において、ＴＮＦ-αのレベルは年齢と供に徐々に増加するということが示された。ＴＮＦ-αは、ＡＤＰＫＤ患者の嚢胞液に存在することが発見された38。ＰＣ２がＴＮＦ-α誘導性タンパク質に結合するという発見と併せて、これらの事実により、ＴＮＦ-αが、ＰＣ２の発現又は機能に影響し得るということが示唆された。ＴＮＦ-αが、多くの遺伝子、例えばＦＩＰ２などの発現を誘導する事ができるので40、本出願人は、ＴＮＦ-αがＰＣ２の発現を変化させるかをまず最初に試験した。ＴＮＦ-α導入後のＦＩＰ２及びＰＣ２発現のウエスタンブロット分析により、ＴＮＦ-αが、ＦＩＰ２の発現を３〜４倍に増加させるが、ＰＣ２を調査したどの時点でもＰＣ２の発現を増加させなかったということが明らかにされた(図１Ｄ)。ＴＮＦ-αを導入されたＩＭＣＤ細胞における抗ＦＩＰ２又は抗ＰＣ２抗体を用いた免疫沈降は、内在性ＰＣ２又はＦＩＰ２をそれぞれ共沈降することができた(図１Ｅ)。ＦＩＰ２免疫沈降物におけるＰＣ２の量は、ＴＮＦ-α処理の間にＦＩＰ２レベルが増加するにつれ増加した(図１Ｅ)。
【００１２】
ＴＮＦ-αは、ＰＣ２の発現レベルに影響を与えないので、ＰＣ２の局在が、ＴＮＦ-α処理細胞で変化したかを試験した。未処理ＩＭＣＤ細胞における抗ＰＣ-２抗体を用いた免疫蛍光染色により、内在性ＰＣ２が原形質膜に局在し、以前の研究において示されたように21、特にＩＭＣＤ細胞の第一繊毛に集まった(図２Ａ、Ａ')。しかしながら、ＴＮＦ-αで１６時間処理された細胞では、出願人は、ＰＣ２局在についてかなりの違いを観察した。ＰＣ２は原形質膜にもはや局在しておらず、核周辺領域に強く集まっており、ゴルジマーカーと重なり(図２Ｃ)、そして繊毛は完全にＰＣ２を欠いていた(図２Ｂ、Ｂ')。ＰＣ２の適切な局在の消失は、細胞死のため生じたものではない。なぜなら、ＴＮＦ-α処理細胞は、通常の形態を示しており、そしてＴＵＮＥＬ染色に対して陰性であったからである(図２Ｄ)。この観察された効果がＦＴＰ２発現の増加のため生じるかについて試験するために、出願人は、一過性トランスフェクションにより、ＩＭＣＤ細胞中でＦｌａｇタグ付きＦＩＰ２を過発現させ、そして出願人はＩＭＣＤ細胞に、ＦＩＰ２に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションさせた。
【００１３】
ＩＭＣＤ細胞は、全長ＦＩＰ２で一過的にトランスフェクトされた。原形質膜へのＰＣ２の局在は、ＦＩＰ２トランスフェクトされた細胞においては減少したが、周囲の非トランスフェクト細胞では減少せず、そしてＰＣ２は、核周辺構造においてＦＩＰ２とコロニー形成した(図２Ｌ、Ｍ)。ＦＩＰ２ｓｉＲＮＡは、ＦＩＰ２発現を９５％低下させ(図２Ｅ-Ｇ)、そしてＴＮＦ-α処理細胞において通常のＰＣ２局在を回復させた(図２Ｈ-Ｋ)。これらの結果により、ＴＮＦαシグナル伝達の下流のＦＩＰ２の誘導が、ＰＣ２の通常の機能部位への局在を撹乱するということが示唆される。
【００１４】
ＴＮＦ-α処理された細胞におけるＰＣ２の繊毛への局在の欠失、並びに核周辺領域へのＰＣ２の蓄積は、エキソサイト-シス経路を通したＰＣ２の輸送が効果的に妨げられているか、又はミスソートされているという可能性を生じさせた。この可能性を支持する物として、オプチネウリンとしても知られているＦＩＰ２は、つまりリサイクルエンドソームに局在し、かつ基底側タンパク質標的に重要であるＧＴＰａｓｅであるＲａｂ８のＧＴＰ結合体の結合パートナーであることが以前に発見された。ＦＩＰ２は、Ｎ-末端の〜２００アミノ酸を介してＲａｂ８と相互作用し、そしてＨｕｎｔｉｎｇｔｉｎタンパク質及びミオシンＶＩのＲａｂ８への結合を示した。ＦＩＰ２が、ＰＣ２とＲａｂ８との間の複合体形成を促進する役割を果たすかを試験するために、Ｒａｂ８に特異的な抗体を、免疫沈降実験において用いた。ＴＮＦ-α刺激がない場合ＰＣ２は、Ｒａｂ８と免疫共沈降しなかったが、それでも、Ｒａｂ８タンパク質レベルは、ＴＮＦ-α処理により影響を受けなかった。ＴＮＦ-αで４又は１６時間処理された細胞において、ＰＣ２は、Ｒａｂ８免疫沈降物中に存在した(図３Ａ)。この結果により、ＴＮＦ-α処理が、ＰＣ２-ＦＩＰ２-Ｒａｂ８複合体の形成を誘導し、この複合体が頂端膜からＰＣ２を奪い取り、そして、Ｒａｂ８が存在すると以前示されたリサイクルエンドソームでありうる核周辺構造にＰＣ２を蓄積するということが示される。ＦＩＰ２の他の結合パートナーであるハンチントンタンパク質は、ＦＩＰ２を過発現した際に、ＨＴ１０８０細胞中においてＲａｂ８を含む核周辺粒子構造へと隔離されたということが示された。
【００１５】
ＰＣ２の機能は、ＰＣ１との機械受容受容体チャネル複合体の形成を必要とし、当該複合体は、液流せん断ストレスなどの機械的シグナルを、上皮組織恒常性に重要な化学シグナルへと変換した15。ＰＣ１に結合するＰＣ２のＣ末端細胞質ドメインは、ＦＩＰ２に結合するドメインと重なる。ＴＮＦ-αで処理されていない細胞において、ＰＣ１及びＰＣ２は、いずれかのタンパク質に対する抗体を用いた免疫共沈降をすることができる(図３Ｂ、Ｃ)。しかしながら、ＴＮＦ-αの導入後、ＰＣ１及びＰＣ２の発現レベルは、未処理細胞における発現レベルと同じであるが、この相互作用はもはや検出することはできない。さらに、ＰＣ１を抗体９６５２１で免疫染色することにより、出願人は、微かであるが再現性のある変化であることに気づいていたが、ＰＣ１がＴＮＦ-α処理の後に第一繊毛に残るということ、未処理細胞では、ＰＣ１は繊毛の全長にそって局在する一方、ＴＮＦ-α処理細胞では、ＰＣ１はしばしば繊毛のいずれかの末端では失われている(図３Ｄ、Ｄ'、Ｅ、Ｅ')ということが明らかになった。ＰＣ１局在におけるかすかな変化は、その通常の結合パートナーであるＰＣ２が繊毛膜上に存在しないことから生じうる。
【００１６】
ＰＣ１とＰＣ２の第一繊毛における共分布が、先端面にわたる生理的液流に応答したＣａ2+の流入を調節するということが最近示された。ＴＮＦ-α刺激がＰＣ２-ＰＣ１複合体及び繊毛へのＰＣ２の局在を撹乱するので、ＴＮＦ-αが液流誘導性のＣａ2+流入を無効にする。この予測を試験するために、１６時間のＴＮＦ-α刺激の後に、ＩＭＣＤ細胞におけるフローアッセイを行なった。ＴＮＦ-α刺激が、完全に流入誘導性Ｃａ2+応答を無効にし、通常の流入誘導性Ｃａ2+応答は、対照ＩＭＣＤ細胞において見られたということを発見した(図４Ａ-Ｂ)。この効果は、ＴＮＦ-αがＡＴＰに応答したＣａ2+の上昇に影響を与えないので特異的であった(図４Ｃ)。
【００１７】
ＴＮＦ-αがポリシスチン機能を下方制御することができ、それにより嚢胞成長を刺激する経路を上記結果は示唆する。この経路は、ＡＤＰＫＤの開始における重要な寄与因子でありうる。この仮定を試験するために、マウス肺性腎臓臓器培養システムを用いて、ＴＮＦ-αが、野生型、ＰＫＤ１＋／-及びＰＫＤ２＋／-マウス由来の腎臓において嚢胞形成を誘導する事ができるかを決定した。以前、in vitro嚢胞形成のアクチベーターであるｃＡＭＰが、培養されたマウスＥ１３.５腎臓において嚢胞形成を誘導するということが発見された。Ｅ１５.５-Ｅ１７.５腎臓を用いて、嚢胞形成がＴＮＦ-αの不存在下で観察されないように培養条件が変更された。しかしながら、６.２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-αほどの濃度での５日間の処理が、野生型腎臓において多くの嚢胞の形成をもたらし(図５Ａ)、そしてＰｋｄ１＋／-及びＰｋｄ２＋／-腎臓において嚢胞形成の増加をもたらした(図５Ｂ、Ｃ)。ＴＮＦ-α処理から得られる嚢胞裏打ち細胞は、通常の腎臓チューブ細胞の立方体形状と対照的に、予期された平坦な形態を示した(図５Ｄ)。これらの結果は、ＴＮＦ-αが腎臓の嚢胞形成を促進するという直接的な証拠を提供する。
【００１８】
さらに、ＡＤＰＫＤ患者から得た嚢胞液におけるＴＮＦ-αの存在は、以前の試験において報告され、当該試験はＡＤＰＫＤ患者から得た嚢胞液中で１０〜７３ｐｇ/ｍｌのＴＮＦ-αを計測した。腎臓臓器に関して観察された有効濃度は、ｎｇ/ｍｌの範囲内であった。１０人のＡＤＰＫＤ患者から得た嚢胞液中でのＴＮＦ-αの濃度を、ＥＬＩＳＡを用いることにより計測した。小さい細胞中のＴＮＦ-α濃度は、ｎｇ/ｍｌ範囲に達し、最も高い濃度は３.８ｎｇ/ｍｌに達した。嚢胞サイズとＴＮＦ-α濃度との間には反比例の関係が存在し、ＴＮＦ-αが大きい嚢胞の内腔中で希釈されるということが示唆される。嚢胞サイズが大きくなるにつれ、ＴＮＦ-αの総量が増加する傾向がわかり(図６Ａ)、ＴＮＦ-αが、嚢胞が成長するにつれ継続的に蓄積されうるということが示唆される。ＦＩＰ２レベルがＡＤＰＫＤ細胞において増加するかを決定するために、ＦＩＰ２タンパク質の量は、培養された通常のヒト腎臓細胞(ＮＨＫ)とＡＤＰＫＤヒト嚢胞裏打ち細胞(ＰＫＤ)との間で比べられた。図６Ｂ、上図に示される様に、ＰＫＤ細胞において２.５倍増加した。ＴＮＦ-α受容体(ＴＮＦＲ)のレベルは、嚢胞裏打ち細胞(ＰＫＤ)における増加(約４倍)を示した(図６Ｂ、中段)。これに一致して、ＴＮＦ-α処理を施した又は施していない野生型ＩＭＣＤ細胞、又は野生型及びｐｋｄｌ-/-変異腎臓上皮細胞株を比較すると、ＴＮＦＲレベルは、ＴＮＦ-α処理ＩＭＣＤ細胞において３５％増加し、そして野生型細胞に比べてＰｋｄｌ-/-変異マウス細胞において３.５倍に増加した(図６Ｃ)。この結果は、ＴＮＦ-αへの暴露、又はポリシスチン機能の低下が、ＴＮＦＲの発現を刺激できるということを指し、そしてこの変化は、上皮をＴＮＦ-αにさらに感受性にした。
【００１９】
上記結果から生じるネットワークスキームは、ＴＮＦ-αシグナル伝達、ポリシスチン機能及び嚢胞形成を繋ぐ２つの負のネスティドダブルフィードバックループからなる(図７Ａ)。ダブルネガティブフィードバックループは、細胞周期が遷移し、そして細胞の運命が決定付けられる仮定において、双安定システム挙動を生じさせる多くの制御性ネットワークにおいて観察される。正のフィードバックループ及びダブルネガティブループは、一過的かつ微かなシグナルを安定的な最終状態へと方向付ける潜在能力を有する。出願人は、このような制御システムが、通常機能の一時的な揺らぎに応答して、健康状態から疾患状態への安定的な遷移を制御する「エピジェネティックスイッチ」として機能することができるということを仮定した。ＡＤＰＫＤの場合では、ＴＮＦ-αレベルの急増が、高血圧34及び腎臓損傷35-37から生じ、そしてフィードバックループを活性化し、そして完全な嚢胞形成を促進することができるということが考えられる。高血圧及び腎臓損傷を、ＰＫＤの進行と関連付ける臨床観察が存在する。エピジェネティックスイッチの確率的トリガーは、遺伝子発現の揺らぎから生じ得る。遺伝子転写の開始及び終結が確率的なものであり、遺伝子発現において高いノイズを生じさせるという多くの証拠が存在する。発現の揺らぎの程度は、遺伝子コピー数が低いと増加する。機能的ＰＫＤ１又は２遺伝子の単一コピーしか有さない細胞では、遺伝子発現の定常レベルは、平均して通常の５０％に過ぎず、一定の機能的閾値以下に確率論的に割り込む遺伝子産物レベルの確率は、通常細胞におけるよりもずっと高い。結果として、ポリシスチン機能の閾値下レベルのため生じている、エピジェネティックスイッチのトリガーを引く確率が高いことにより、安定的な疾患状態への突然の遷移及び永続化がもたらされる。同様のメカニズムは、少なくとも別の常染色体優性疾患-若年者の成人発症型糖尿病に適切であった。
【００２０】
出願人は、機能的Ｐｅｔｒｉネット[Doi, 2004; Nagasaki, 2004]に基づくネットワークモデルを用いて、ＴＮＦ-α媒介性エピジェネティックスイッチを介して嚢胞形成の導入を刺激した。出願人のモデリングアプローチは、制御システムエンジニアリングのファジー論理的方法をモデリング反応速度論に適用した[Keeman, 2001; Ross, 2004, Toukalas, 1997]。Ｐｅｔｒｉネットと同様に、反応を繋げ、そして全時間ステップにおいて生じさせた。このモデルは、ネットワークの詳細から、タンパク質濃度及び遺伝子発現レベルについてのタイムコースを計算する。このモデルの特徴は、ネットワークにおける反応が、ある割り当てられた確率を有し、これにより確率論的プロセスが表されるということである(当該モデルの詳細は、Bosl, 2006においてみられる)。ＰＣ１及びＰＣ２は、機能ユニットとしてモデル化され、そのレベルは、ＰＫＤ１及びＰＫＤ２の遺伝子量、並びにＦＩＰ２により抑制されるＰＣ２の繊毛への適切な標的化によって影響される。当該モデルにおけるランダムな揺らぎの２つの原因：確率論的遺伝子発現と腎臓損傷、が存在し、これらは頻繁に生じるものではないが、ＴＮＦ-αの急増をもたらすのに十分である。当該遺伝子の２つのコピーが存在して、各ポリシスチン転写を仕向けている野生型の集合では、機能的ＰＣ１-ＰＣ２レベルの揺らぎは、ヘテロ接合の状況における程度よりは少なく、そして嚢胞形成の開始を予防するために必要とされる閾値よりも常に高い(図７Ｂ)。しかしながら、通常時は嚢胞形成を抑制するために十分な発現レベルのヘテロ接合集合では、ランダムな揺らぎは、フィードバックループのスイッチがオンになることを引き起こし、そして嚢胞成長は衰えないまま継続する(図７Ｃ)。フィードバックループが無効となった場合、ポリシスチンレベルにおける確率論的な閾値以下への落ち込みがあった場合でも抑制された(図７Ｄ)。ＡＤＰＫＤの開始についてのエピジェネティックスイッチの関与が、異種性又は他の遺伝的修飾がないため生じる疾患の誘導を妨げることはないということを述べることは重要である。実際、遺伝的変化は、特に当該疾患状態の安定に重要であり、そしてさらに嚢胞成長及び腎臓変性の速度を高める。ＡＤＰＫＤにおける「第２ヒット(second hit)」として潜在的に機能するエピジェネティック制御経路を白紙に戻すことは、疾患開始及び進行の治療介入のための望まれる標的、例えばＴＮＦ-αシグナル経路の成分など、を提供しうる。
【００２１】
特に、ＴＮＦ-αの阻害剤及びアンタゴニストは、ＡＤＰＫＤを予防又は治療するために使用されうる。ＴＮＦ-αの阻害剤及びアンタゴニストは、ＴＮＦ-αの作用を低減又は抑制する。これらの薬剤は、融合タンパク質、例えばエタネルセプト(Ｅｎｂｒｅｌ(登録商標)、Amgen and Wheth);モノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ(Ｒｅｍｉｃａｄｅ(登録商標)、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ)、Ｄ２Ｅ７(Ｈｕｍｉｒａ(登録商標)、Ａｂｂｏｔｔ)、及びＣＤＰ５７１(Celltech)；結合タンパク質、例えばオネルセプト(Serono)；及び阻害剤、例えばOR１３８４、テニダップ、(５-クロロ-２,３-ジヒドロ-３-(ヒドロキシ-２-チエニルメチレン)-２-オキソ-１H-インドール-１-カルボキサミド)、ラパマイシン(シロリムス(sirolimus)又はＲａｐａｍｕｎｃ(登録商標))及びレフノミド(Ａｒａｖａ(登録商標))を含む。
【００２２】
本明細書に開示され、そして特許請求された全ての組成物および方法は、本開示を参照すれば、過度の実験を行うことなく作成することができ、そして実施することができる。本発明の組成物および方法が、好ましい実施態様について記載された一方、本発明のコンセプト、本質、および範囲から逸脱することなく、組成物、及び方法、ならびに方法のステップ又は一連のステップに変更が適用されてもよいということが当業者に明らかであろう。より具体的に説明すると、化学的及び生理的に関連するある薬剤が、本明細書に記載される薬剤に置き換えて、同一又は同様の結果が達成されるということが明らかであろう。当業者に明らかなこのような同様な置換及び変更の全ては、添付の特許請求の範囲により規定された本発明の本質、範囲、及びコンセプトの範囲内であるとみなされる。
【実施例】
【００２３】
実施例１  細胞培養
ＩＭＣＤ(ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ-２１２３)細胞を、１０％(ｖ／ｖ)ウシ胎児血清(Invitrogen)を添加したダルベッコ改変イーグル培地／F１２倍地中で培養した。ＴＮＦ-α導入の最終濃度は、全ての実験について２００ｎｇ／ｍｌであった。Ｅ１５.５野生型及びＰｋｄ１突然変異マウス(Ｐｋｄ１-／-)から単離されたマウス胚性腎臓(ＭＥＫ)細胞を、以前に記載されたように３３℃で培養した(１)。細胞を３０％〜５０％コンフルエントになるまで培養し、そしてＦｕｇｅｎｅ６のトランスフェクション試薬(Roche, Indianapolis, IN)で製品プロトコルにしたがって一過的にトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間において、細胞をさらなる分析のために回収した。
【００２４】
実施例２  胚性腎臓組織培養
Ｅ１５.５、Ｅ１６.５、又はＥ１７.５の野生型ＣＤ１マウス、及びＥ１５.５のＣ５７ＢＬ／６  Ｐｋｄ１＋／-又はＣ５７ＢＬ／６Ｐｋｄ２＋／-マウス、又はその野生型カウンターパートの胚から得た胚性腎臓をＰＢＳ(カルシウム及びマグネシウムを含む)＋ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(Gibco, Grand Island, NY)中で細かく刻んだ。刻まれた腎臓を２ｍＭのＬ-グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２.８ｍＭのセレン、２５ｎｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ１、３２ｐｇ／ｍｌのＴ３及び３２ｐｇ／ｍｌのＴ３及び２５０Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３７℃で培養した。４８時間異なる濃度でＴＮＦ-αを伴って又は伴わずに腎臓を培養し、そして次に５０μＭの８-ブロモーサイクリックＡＭＰ(Sigma, St. Louis, MO)を５日間加えた。培養された腎臓を次に４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)を含むＰＢＳで６時間固定した。ＰＢＳで２回、５分間づつ洗浄し、そして７０％ＥｔＯＨに移し、短期間の貯蔵には室温で、又は長期間の貯蔵には４℃で貯蔵した。固定された腎臓サンプルを順次、ヘマトキシリン及びエオシン染色で処理し、続いて一般的な組織学プロトコルにかけた。
【００２５】
実施例３  ＴＵＮＥＬアッセイ
ＴＮＦ-αで処理されたか又は処理されていない細胞を、４％ＰＦＡで固定した。蛍光アポトーシス検出システム(R&D systems, Minneapolis, MN)を用いてＴＵＮＥＬアッセイを行った。固定された細胞を、陽性対照としてＴＡＣＳ-ヌクレアーゼで処理した。
【００２６】
実施例４  免疫沈降及びウエスタンブロット分析
以前に記載されたように(参考文献)免疫沈降及びウエスタンブロットを全細胞ライセートについて行った。ウエスタンブロットに用いた抗体は、ラビット・ポリクローナル抗-ＦＩＰ２(２)、ラビット抗ーＰＣ２ポリクローナル抗体９６５２５(１)、ラビット抗ーＰＣ１ポリクローナル抗体９６５２１、ラビット抗-Ｒａｂ８ポリクローナル抗体、及びラビット抗-ＴＮＦＲ-Ｉポリクローナル抗体を含んだ。使用された二次抗体は、ヤギ-抗-ラビットＩｇＧ-フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ分子プローブ、Eugene, OR)、ヤギ-抗-マウスＩｇＧ-テキサスレッド(１：５００希釈、Molecular Probes)を含んだ。ウエスタンブロットでは、ヤギ-抗-ラビットＩｇ-ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ、又はヤギ-抗-マウスＩｇＧ-ＨＲＰ、１：１００００希釈；Amersham Pharmacia Biotech)を二次抗体として用いた。
【００２７】
実施例５  ＦＩＰ２発現を抑制するＲＮＡｉ
ＦＩＰ２  ＲＮＡｉに用いられるオリゴ配列(Dharmacon, Chicago, IL)を以下に挙げた：
【化１】
2009532495.tif 000003
【００２８】
ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬(Dharmacon, Chicago, IL)を用いて、トランスフェクションを行った。
【００２９】
実施例６  免疫蛍光顕微鏡
以前に記載された様に(１)、免疫蛍光観察を行った。一次抗体を以下の希釈度で用いた：ＦＩＰ２(１：１００)、ＰＣ１(１：５００)、ＰＣ２(１：５００)、及びＦｌａｇ(１：５００)。用いた二次抗体として、ヤギ-抗-ラビットＩｇＧ-フルオレセインイソチオシアネート(Molecular Probes, Eugene, OR)及びヤギ-抗-マウスＩｇＧ-テキサスレッド(１：５００希釈；Molecular Probes)が挙げられる。回転盤共焦点ヘッド(Yogogawa)、アルゴン-クリプトンレーザーシステム(Prairie Technologies, Inc.)及びＯＲＣＡ-ＥＲ  ＣＣＤカメラ(Hamamatsu)を備えた倒立顕微鏡(Axiovert 200M, Carl Zeiss, Inc.)上で画像を撮った。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア(Molecular Devices)を用いて画像を取得し、そしてＶｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア(Improvision, Inc.)を用いて３Ｄ画像再構成した。
【００３０】
実施例７  ヒト腎臓細胞の初代培養
カンザス大学医療センター(ＫＵＭＣ)のＰＫＤ生体材料研究中心研究所の助力を得て、ＡＤＰＫＤ及び通常のヒト腎臓(ＮＨＫ)細胞の初代培養物を作成した。組織学的試験により確認されたヒト腎臓の通常領域を、腎臓癌の治療のために取り除かれたネフロン切除標本から回収した。ＡＤＰＫＤ腎臓を、ＰＫＤ基金(Kansas City. MO)が援助する多発性嚢胞腎研究検索プログラムに参画する病院からＡＤＰＫＤ腎臓を取得した。腎臓を氷中にパッケージし、そして研究室へ一晩で輸送した。廃棄ヒト組織の使用についてのプロトコルは、連邦規則を遵守するものであり、そしてＫＵＭＣの施設内倫理委員会により承認されたものであった。
【００３１】
(３)に記載されるように、初代培養物を調製した。５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、及び５ｎｇ／ｍｌナトリウムセレナイト(ＩＴＳ)及び１００ＩＵ／ｍｌペニシリンＧ及び０.１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で細胞を増殖させた。ＡＤＰＫＤ及びＮＨＫ細胞の初代培養物は、上皮様であり(３-５)、そして集合管及び遠位尿細管に結合するArchis hypogaea及びDolichos biflorusのレクチンで染色される(６)。
【００３２】
実施例８  ヒトＡＤＰＫＤ嚢胞液におけるＴＮＦ-α濃度の計測
４℃で維持された１０個のＡＤＰＫＤ腎臓から嚢胞液を回収した。液体を遠心によりきれいにし、そして一定量を-２０℃で凍結させた。個々の嚢胞液におけるＴＮＦ-αの濃度及び総量を、ヒトＴＮＦ-α・ＴＮＦｔＡ(R&D Systems, Minneapolis, MN)についてのＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡ現像キットを用いて計測した。
【００３３】
実施例９  Ｃａ2+微量蛍光定量法
流入についての実験セットは以前に記載された(７)。簡潔に記載すると、細胞を３７℃で３０分間Ｃａ2+感受性プローブＦｕｒａ２-ＡＭ(５μＭ)でインキュベートした。次に細胞を３回洗浄して、過剰量のＦｕｒａ２-ＡＭを取り除き、そして０.０２５４ｃｍの厚さ及び１.０ｃｍの幅を有する灌流チャンバ-(Glyco Tech)に配置した。Ｍａｃｈｉｎｔｏｓｈ用のＩＰＬａｂソフトウェアを用いた、ＣＣＤカメラを備えるＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡にチャンバーを配置した。Ｐａｉｒｅｄ  Ｆｕｒａ画像を５秒ごとに３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの励起波長で撮影した。少なくとも３０分間顕微鏡培地に平衡化させた後に、これらの細胞の先端膜を、０.７５ｄｙｎｅ ｃｍ2の液体せん断ストレスで刺激した。ベースライン値に対するＣａ2+レベルは、０.３及び６.０のＲmin及びＲmaxを用いて放射計量的に計測した。ほかの実験では、少なくとも４５分間、１：５０の希釈度で、ＰＣ２の細胞外又は細胞内ドメインのいずれかに対する抗体とインキュベートした。次に細胞をリン酸緩衝生理食塩水で少なくとも３回洗浄した。
【００３４】
実施例１０  データー分析及び統計
細胞質遊離Ｃａ2+濃度を、以下の式：
＝Ｋd((Ｒ-Ｒmin)／(Ｒmax-Ｒ))(Ｆmax ａｔ３８０ｎｍ)／Ｆmin ａｔ ３８０ｎｍ)
[式中、Ｋdは、Ｆｕｒａ２指標のみかけの乖離定数(１４５ｎＭ)を指し、Ｒは、３４０ｎｍで励起された場合の５１０ｎｍ放出強度と、３８０ｎｍで励起された場合の５１０ｎｍ放出強度の比である。Ｒminは、０における比であり、そしてＲmaxは、飽和Ｃａ2+濃度(１０ｍＭ)での比である]
で表した。Ｆｕｒａ２実験の最後において、細胞を、１４０ｍＭカリウム、２ｍＭ・ＥＧＴＡ、及び１０Ｍイオノマイシン(ｐＨ８.６で、イオノマイシン効果を最適化する)で約５分間インキュベートした。これにより、３８０ｎｍにおけるのＲminの最小のシグナル比及びＦmaxの最小値が得られる。１０ｍＭのＣａＣｌ2を加えることにより、過剰量のＣａ2+を細胞に供給した。３４０ｎｍのシグナル及び３８０ｎｍのシグナルが安定化した後に(約３分)、３８０ｎｍにおけるＲmaxとＦminの値を得た。蛍光計測値を事故蛍光について補正した。統計的に有意な全ての値は、平均(s.e.)で表し、そして各データセットを分析前に通常分布されるように検証された。対応のあるスチューデントのｔ検定を用いて平均の間で比較を行った。全ての比較について、信頼ある結論を可能にするために検出力分析を行い、そして変動係数は１０％以下であった。ネガティブな結果との全ての比較は、０.８の統計的検出力を有し、そして統計的有意差は、Ｐ＜０.０５を意味する。
【００３５】
実施例１１  モデリング
図７ｂ-ｄに表されるＴＮＦ-αのシグナルネットワークを、反応速度論をモデル化するための制御システム工学からえたインテリジェントハイブリッドシステムを適用するアプローチを用いてモデル化した。得られたモデルは、機能的ペトリネット(９、１０)に類似している。コンピューターコードは、要求があれば利用できる。この結果のモデルは、タイムコースに渡ったタンパク質濃度と、遺伝子発現レベルとの間の関係を計算する。１週間のタイムステップで、タイムステップループで反応を行った。各時間ステップで、基質、アクチベーター、及び阻害剤レベルに基づいて、電流レート(current rate)を計算することにより測定した。タンパク質濃度及び遺伝子発現レベルは、全て０〜１のスケール範囲に正規化される。生成と減衰の間のバランスは、これらのレートの正確な値よりも重要である。なぜなら、このバランスは、各タンパク質平衡レベルを決定するからである。さらに、反応の活性化又は阻害の強度は、定量的用語(かなり低い、低い、中程度など)で定義されている。反応速度は、まず相対値により割り当てられている。次に、この経路挙動が観察に適合するように、値を調節した。これは、このデーターに対する実質的に手で行うパラメーターフィットである。
【００３６】
２つの生成反応は、それぞれのタンパク質を産生する２つの遺伝子を表すＰＣ１及びＰＣ２について定義されている。突然変異の場合、ＰＣ１遺伝子のうちの１つがサイレンスされ、生成比が５０％低下した。これらの各タンパク質についての減衰反応は一定であり、最大生成率の２５％である。遺伝子発現の確率論的変化を導入するために、各遺伝子発現「反応」は、ランダムに選択されたタイムステップの７０％にしか生じないように設定される。ＰＣ１及びＰＣ２反応の各々についての相対生成率は、０.４であり、そして減衰率は０.１である。生成及び減衰反応が、ＰＣ１とＰＣ２にのみに生じた場合、１の遺伝子の場合約０.７４、そして２個の遺伝子の場合０８３の０〜１のスケールの平均平衡レベルを有する。これは、基礎反応速度論に従っており、そして生成率は、レート×平均発現可能性０.７により決定される。
【００３７】
嚢胞複合体は、ＰＣ１タンパク質とＰＣ２タンパク質との相互作用により産生され、そして最大生成率の１／４に再設定される一定の比率で減衰する。嚢胞複合体レベルは、ランダムなＰＣ１及びＰＣ２発現の結果としてポリシスチン複合体レベルが変動する。野生型では、確率論的変化は、変異の場合の変化よりもずっと小さい。これは、遺伝子発現及びタンパク質産生を表す２つの別の反応における相殺バリエーションのためである。ポリシスチン複合体形成は、ＦＩＰ２により抑制される。こうして、ＦＩＰ２レベルが増加するにつれ、ポリシスチン複合体生成物の反応はＦＩＰ２により抑制され、そして減衰反応が、ＦＩＰ２により活性化される。
【００３８】
嚢胞成長は、ポリシスチンレベルが０.４の任意設定レベル以下に落ち込んだ場合に生じる。野生型では、ポリシスチン揺らぎは、常にこのレベルを超えており、そうして嚢胞成長は起こることはない。０.４以下では、嚢胞増殖は確率論的に生じ、ポリシスチンレベルが下がるにつれ嚢胞増殖の機会が増加する。嚢胞成長は、ＴＮＦ-α産生を引き起こし、次にＴＮＦＲ及びＦＩＰ２産制が増加し、ポリシスチン複合体形成の抑制がもたらされる。腎臓損傷はまた、ランダムに生じる反応として定義されており、その唯一の生成物はＴＮＦ-αである。これは、嚢胞成長の増加により産生されるＴＮＦ-αの増加とは、嚢胞の成長の増加が先行するということはない濃度の急激な上昇によって区別される突然の事象としてモデル化される。むしろ、嚢胞増殖は後で生じてる。腎損傷は、比較的少ない出現機会(週ごとに０.０２％)を有するものとして定義されている。シミュレーションでは、腎臓損傷事象は、８０年の寿命の凡そ一つおきにおきに生じ、そして正のフィードバックループに従事し、そしてＰＫＤを開始させるために必ずしも十分に大きいものではない。ポリシスチンレベルが特に低い場合、例えば嚢胞が弧発的に形成していた場合などの場合に損傷が起こった場合、通常、閾値に到達し、そして疾患が生じる。
【００３９】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載された事項を捕捉する実験方法又は他の詳細を提供する程度にまで、本明細書に具体的に援用される。
【表１】
2009532495.tif 000004
【００４０】
【表２】
2009532495.tif 000005
【００４１】
【表３】
2009532495.tif 000006
【００４２】
【表４】
2009532495.tif 000007
【００４３】
【表５】
2009532495.tif 000008
【００４４】
【表６】
2009532495.tif 000009
【００４５】
【表７】
2009532495.tif 000010
【００４６】
【表８】
2009532495.tif 000011
【００４７】
本出願は、着色された少なくとも１の写真を含む。カラー写真を有する出願公開のコピーは、請求し、そして必要な費用を払えば事務局から提供されよう。添付の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明のある態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施態様の詳細な記載と併せてこれらの図面の１以上を参照することにより、よりよく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ-Ｅ。酵母及び哺乳動物細胞においてＦＩＰ２とＰＣ２の相互作用が示される。Ａ：模式的に示されたＧａｌ４-ＡＤ-ＦＩＰ２の欠失コンストラクトを使用して、酵母２ハイブリッドアッセイを用いてＦＩＰ２とＰＣ２における相互作用ドメインを決定した。相互作用の強さは、プラスの相互作用(+)又は相互作用がないこと(-)として示され；そして灰色のボックスは、コイルドコイル領域を表す。Ｂ：模式的に示されたＧａｌ４-ＢＤ-ＰＣ２の欠失コンストラクトを使用して、酵母２ハイブリッドアッセイを用いてＦＩＰ２とＰＣ２における相互作用ドメインを決定した。相互作用の強さは、プラスの相互作用(+)又は相互作用がないこと(-)として示され；そして灰色のボックスは、コイルドコイル領域を表す。
【図１Ｃ】図１Ａ-Ｅ。酵母及び哺乳動物細胞においてＦＩＰ２とＰＣ２の相互作用が示される。Ｃ：ＰＣ２抗体(９６５２５)、又はそれぞれの抗タグ抗体を用いて、Ｍｙｃタグ付きＰＣ２と、Ｔ７タグ付きＦＩＰ２又はＦｌａｇタグ付きＦＩＰ２でコトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞のライセート由来のＦＩＰ２と免疫共沈降されたＰＣ２。ＰＣ２-ＦＩＰ２複合体は、相互に免疫共沈降することができる。
【図１Ｄ−Ｅ】図１Ａ-Ｅ。酵母及び哺乳動物細胞においてＦＩＰ２とＰＣ２の相互作用が示される。Ｄ：ウエスタンブロット分析。ＴＮＦ-α刺激の際に、ＦＩＰ２のタンパク質レベルが増加するが、ＰＣ２タンパク質レベルは増加しないことを、図Ｄは明らかにした。Ｅ：抗ＰＣ２又は抗ＦＩＰ２抗体を用いて、ＦＩＰ２と免疫共沈降された内在性ＰＣ２。ＴＮＦ-αの導入は、ＦＩＰ２によりプルダウンされるＰＣ２の量を増加させた。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ-Ｍ。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ＩＭＣＤ細胞におけるＰＣ２局在を撹乱する。Ａ-Ｄ：ＴＮＦ-αで処理前(Ａ、Ａ')又は処理後(Ｂ、Ｂ')における内在性ＰＣ２(緑色)とアセチル化チューブリン(ａｃ-ｔｕｂ、赤色)の二重免疫蛍光染色。共焦点顕微鏡で観察された。ＴＮＦ-α刺激は、原形質膜及び第一繊毛へのＰＣ２の局在の消失をもたらし、そしてＰＣ２の核周辺領域への濃縮をもたらし(Ｂ、Ｂ')ゴルジマーカーと重なった(Ｃ)。Ａ'及びＢ'は、それぞれＡ及びＢにおける四角で囲んだ領域の拡大繊毛画像を示す。ＰＣ２の適切な局在の喪失は、細胞死のため生じたものではない。なぜなら、ＴＮＦ-αで処理された細胞は、通常の形態を示し、そしてＴＵＮＥＬ染色に対していんせいであったからである(Ｄ)。
【図２Ｃ】図２Ａ-Ｍ。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ＩＭＣＤ細胞におけるＰＣ２局在を撹乱する。Ａ-Ｄ：ＴＮＦ-αで処理前(Ａ、Ａ')又は処理後(Ｂ、Ｂ')における内在性ＰＣ２(緑色)とアセチル化チューブリン(ａｃ-ｔｕｂ、赤色)の二重免疫蛍光染色。共焦点顕微鏡で観察された。ＴＮＦ-α刺激は、原形質膜及び第一繊毛へのＰＣ２の局在の消失をもたらし、そしてＰＣ２の核周辺領域への濃縮をもたらし(Ｂ、Ｂ')ゴルジマーカーと重なった(Ｃ)。
【図２Ｄ】図２Ａ-Ｍ。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ＩＭＣＤ細胞におけるＰＣ２局在を撹乱する。Ａ-Ｄ：ＰＣ２の適切な局在の喪失は、細胞死のため生じたものではない。なぜなら、ＴＮＦ-αで処理された細胞は、通常の形態を示し、そしてＴＵＮＥＬ染色に対して陰性であったからである(Ｄ)。
【図２Ｅ−Ｉ】図２Ａ-Ｍ。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ＩＭＣＤ細胞におけるＰＣ２局在を撹乱する。Ｅ-Ｋ：ＦＩＰ２に対するｓｉＲＮＡをＩＭＣＤ細胞にトランスフェクションすると、ＦＩＰ２発現が抑制され、そしてＴＮＦ-αにより引き起こされるＰＣ２の局在の誤配置を予防する。Ｅ：ＦＩＰ２に対する４種の異なるｓｉＲＮＡでＩＭＣＤ細胞をトランスフェクションすることにより、ＦＩＰ２発現が減少することが示された(ｓｉＲＮＡ＃０８が最も強い効果を有した)。Ｆ、Ｇ：ｓｉＲＮＡ＃０５(Ｆ)及びｓｉＲＮＡ＃０８(Ｇ)でトランスフェクションされ、そしてＴＮＦ-αで１６時間処理されたＩＭＣＤ細胞におけるＦＩＰ２レベルを決定するウエスタンブロットは、ＦＩＰ２発現の低下を示した。Ｈ-Ｋ：ＴＮＦ-αで処理する前(Ｈ、Ｊ)又は後(Ｉ、Ｋ)にＦＴＰ２に対するｓｉＲＮＡ＃０５(Ｈ、Ｉ)又はｓｉＲＮＡ＃０８(Ｊ、Ｋ)でトランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞の免疫蛍光染色は、ｓｉＲＮＡが、ＰＣ２(緑色)の局在の誤配置を妨げた(核周辺領域内に存在)。
【図２Ｊ−Ｍ】図２Ａ-Ｍ。ＴＮＦ-αシグナル伝達は、ＩＭＣＤ細胞におけるＰＣ２局在を撹乱する。Ｈ-Ｋ：ＴＮＦ-αで処理する前(Ｈ、Ｊ)又は後(Ｉ、Ｋ)にＦＴＰ２に対するｓｉＲＮＡ＃０５(Ｈ、Ｉ)又はｓｉＲＮＡ＃０８(Ｊ、Ｋ)でトランスフェクションされたＩＭＣＤ細胞の免疫蛍光染色は、ｓｉＲＮＡが、ＰＣ２(緑色)の局在の誤配置を妨げた(核周辺領域内に存在)。Ｌ、Ｍ：ＰＣ２(緑色)及びトランスフェクションされたＦｌａｇ-タグ付きＦＩＰ２(赤色)の免疫染色は、ＦＩＰ２でトランスフェクションされた細胞の原形質膜へのＰＣ２の局在の消失を示した。Ｌ：核周辺領域へのＰＣ２及びＦＩＰ２の共局在を示すＦｌａｇ-ＦＩＰ２-トランスフェクションされた細胞、及びＭ：通常のＰＣ２局在を有する未処理細胞。
【図３Ａ−Ｃ】ＴＮＦ-αは、Ｒａｂ８及びＰＣ１とＰＣ２との複合体形成を調節する。Ａ：様々な期間ＴＮＦ-αで刺激された細胞におけるＰＣ２とＲａｂ８の免疫共沈降は、この相互作用がＴＮＦ-αにより誘導されたということを示す。Ｂ、Ｃ：ＰＣ１及びＰＣ２の相互共免疫沈降。ＴＮＦ-α誘導後、ＰＣ１は、ＰＣ２抗体により免疫共沈降されなかった(Ｂ)し、そしてＰＣ２は、ＰＣ１抗体により免疫共沈降されなかった(Ｃ)が、それでも等量のＰＣ１及びＰＣ２が、全ての時点でその対応する抗体で免疫沈降された。
【図３Ｄ−Ｅ】Ｄ、Ｅ：ＴＮＦ-αで処理前(Ｄ)又は処理後(Ｅ)に、内在性ＰＣ１(緑色)及びアセチル化チューブリン(ac-tub,赤色)の免疫蛍光二重染色のマージが、共焦点顕微鏡により観察された。示された画像は、全ての共焦点断面の２次元投影である。Ｄ'及びＥ'は、それぞれｄ及びｅにおける四角で囲まれた拡大繊毛画像を示す。
【図４Ａ−Ｂ】図４は、ＩＭＣＤ細胞において液流誘導性の細胞質Ｃａ2+可動化を抑制する。Ａ：ＴＮＦ-αの添加を伴なわない対照ＩＭＣＤ細胞は、液流刺激に対応するその通常のＣａ2+応答を示す。Ｂ：ＴＮＦ-αで１６時間の処理は、ＩＭＣＤ細胞の液流刺激に対する応答をを阻害する。
【図４Ｃ】Ｃ：ＩＭＣＤ細胞において、ＴＮＦ-αは、ＡＴＰ誘導性の細胞質カルシウムの増加を抑制することはない。１μＭのＡＴＰに暴露させた場合、対照(未処理)及びＴＮＦ-α処理された細胞(４時間又は１６時間処理される)の両方が、細胞質カルシウムの増加を示した。細胞集合から５０の細胞をランダムに選択肢、そしてその細胞質カルシウムレベルの変化を平均化して、グラフにプロットした。
【図５Ａ】図５：Ｅ１５.５の胚由来の培養腎臓をＴＮＦ-αで５日間、３.１２５ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌの濃度で処理することは、野生型腎臓における多くの嚢胞の形成、並びにＰｋｄ１＋／-及びＰｋｄ２＋／-腎臓における嚢胞形成の造花をもたらした。Ａ：３.１２５ｎｇ／ｍｌ、６.２５ｎｇ／ｍｌ、１２.５ｎｇ／ｍｌ、又は２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-αで野生型培養腎臓を処理することは、嚢胞形成の引き金となった。
【図５Ｂ−Ｃ】Ｂ、Ｃ：２５ｎｇ／ｍｌ又は１２.５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-αでの処理は、野生型同腹子、並びにその対応する(ｂ)Ｐｋｄ１＋／-同腹子又は(ｃ)Ｐｋｄ２＋／-同腹子において嚢胞形成の引き金となる。
【図５Ｄ】Ｄ：ＴＮＦ-αの添加を伴なって又は伴なわずに腎臓臓器培養物から得た腎臓の拡大図。ＴＮＦ-α処理から得られた嚢胞裏打ち細胞は、通常の腎臓チューブ状裏打ち細胞の立方体形状とは対照的に、予期された平坦な形態を示す。
【図６Ａ】図６は、ＥＬＩＳＡによるＡＤＰＫＤヒト嚢胞におけるＴＮＦ-αレベルの定量によって、小さい嚢胞中のＴＮＦ-α濃度がｎｇ／ｍｌ範囲に達し、そして嚢胞サイズとＴＮＦ-α濃度との間に反比例の関係があることが示された。Ａ：このデータは、１０人のＡＤＰＫＤ患者から得た２０個の嚢胞を表す。Ｘ軸は、嚢胞の体積を指し、左側のＹ軸は、ＴＮＦ-α濃度を指し、そして右側のＹ軸は各嚢胞における合計のＴＮＦ-αの量を指す。ＦＩＰ２のレベルは、ＡＤＰＫＤ細胞において増加した。
【図６Ｂ−Ｃ】Ｂ：ＦＩＰ２タンパク質、並びにＴＮＦ-α受容体(ＴＮＦＲ)の量を、培養された通常のヒト腎臓細胞(ＮＨＫ)とＡＤＰＫＤヒト嚢胞裏打ち細胞(ＰＫＤ)との間で比較し、そしてＰＫＤ細胞において２.５倍のＦＩＰ２の増加が存在し、並びに４倍のＴＮＦＲの増加が存在した。これに一致して、ＴＮＦＲのレベルは、ＴＮＦ-α処理されたＩＭＣＤ細胞において３５％の増加を示し、そして野生型細胞に比べて、Ｐｋｄ１-/-突然変異マウス細胞において３.５倍の増加を示した。Ｃ：ＴＮＦ-α処理を伴った又は伴なわない野生型細胞、及び野生型及びＰｋｄ１-／-細胞と比べたＴＮＦ-α受容体(ＴＮＦＲ)タンパク質レベルの免疫ブロット分析。
【図７Ａ−Ｄ】二重の負のフィードバックループは、ＡＤＰＫＤにおける嚢胞形成を制御するエピジェネティックスイッチを構成する。Ａ：ＴＮＦ-αシグナル伝達と嚢胞形成を繋ぐ２つの二重の負のフィードバックループを内包するネットワークを示す模式図である。＋：正の効果、-：負の効果を示す。赤字：フィードバックループの引き金を引くことができる確率論的因子である。Ｂ-Ｄ：機能的ペトリネット(functional Petri net) を用いたＡＤＰＫＤ疾患進行のシミュレーション。嚢胞形成は、ポリシスチンレベルが０.４未満になった場合にのみ生じた(１が最大値である)。この閾値以下では、ＰｃｌＰｃ２レベルが低下するにつれて、直線的に増加する発生の可能性を伴なう確率論的プロセスであり；それゆえ、嚢胞形成は、Ｐｃ１Ｐｃ２レベルが０になった場合連続的である。嚢胞の減少は、一定の割合で生じるように設定された。腎臓損傷は、４年毎に約１％の可能性で生じるように設定された。野生型(Ｂ)では、ポリシスチンタンパク質の発現は、機能的ポリシスチンレベルが閾値を十分に超えたままであるということを保証するために十分高い。ヘテロ接合性のポリシスチン遺伝子変異を内包する個人(Ｃ)では、転写の揺らぎのため生じる機能的ポリシスチンレベルの確率論的下落、又は腎臓損傷のため生じるＲＮＦ-αレベルの急騰は、正のフィードバックループの引き金を引き、永続的な疾患の開始を引き起こす。ヘテロ接合の場合においてフィードバックが抑制された場合(Ｄ)、ポリシスチンレベルの一時的低下のため一過的に嚢胞が出現するものの、未制御の嚢胞形成は起こらなかった。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｉ】
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【図２Ｊ−Ｍ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図３Ｄ−Ｅ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｃ】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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