(57)【要約】  本発明は、ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換されたＰＮＡ単位を含み、少なくとも１つのキラル中心を有する新規の化合物に関する。本化合物は、ＡＩＤＳ等のウイルス疾患の治療のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表わされる化合物：
【化１】
2009544776.tif 000020
（式中、
ｎは、７〜３５の整数を示し、
各Ｅは、互いに独立して、水素原子、置換又は非置換フェニル残基、置換又は非置換複素環、所望により保護基と置換された核酸塩基、又はＤＮＡインターカレーターを示し、
各Ｒ１は、互いに独立して、水素原子又は天然に存在するか若しくは天然に存在しないアミノ酸の側鎖、又は２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環又は脂環残基を示し、ここで、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環又は脂環残基の少なくとも１つは、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、
2009544776.tif 000021
Ｌは、式−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５（ＣＯ）Ｒ６、−ＮＲ５（ＣＳ）Ｒ６、−ＯＲ７又はＳＲ７の基を示し、ここで、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、水素原子、アルキル残基、レポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴクエンチャー（蛍光共鳴エネルギー移動クエンチャー）又は水溶性若しくは水不溶性ポリマーを示し、ここで、上記の各残基を所望により置換することができ、ここで、Ｒ７は、水素原子、アルキル残基、レポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴクエンチャー又は水溶性若しくは水不溶性ポリマーを示し、上記の各残基を所望により置換することができ、
ただし、前記式Ｉの化合物は、少なくとも２つの不斉中心を有する。）
【請求項２】
少なくとも２つの残基Ｒ１は水素原子を示さず、かつ前記式Ｉの前記化合物が少なくとも２つの不斉中心を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
第２の各残基Ｒ１は、互いに独立して、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール又は脂環残基を示し、残りの残基Ｒ１は水素原子を示す、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
第３の各残基Ｒ１が、互いに独立して、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール又は脂環残基を示し、残りの残基Ｒ１は、水素原子を示す、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項５】
２つ、３つ、又はそれ以上の隣接する残基Ｒ１は、互いに独立して、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール又は脂環残基を示し、かつ残りの残基Ｒ１は水素原子を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
各Ｒ１は、互いに独立して、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール又は脂環残基を示す、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項７】
前記の１つ又は複数の残基Ｒ１は、互いに独立して、リン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
全ての不斉中心が同一の立体配置を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
全ての不斉中心が（Ｓ）立体配置を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
全ての不斉中心が（Ｒ）立体配置を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
各残基Ｒ１は、互いに独立して、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有し、ホスホン酸エステル官能基は、式−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＶ）２又はＰ（＝Ｏ）（ＯＶ）（ＯＨ）を有し、各Ｖは、互いに独立して、２０個までの炭素原子を有する非置換のアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、又は脂環残基を示す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
各Ｖは、互いに独立して、メチル、エチル、シクロヘキシル又はベンジル残基を示す、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
リンカーを介して互いに結合している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の少なくとも２つの化合物を含む化合物。
【請求項１４】
前記リンカーが、少なくとも３つの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸単位から構成されるアルキル鎖、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はオリゴマーを示す、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物を含む組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物又は組成物を、所望により少なくとも１つのキャリア、溶媒、又は他の薬学的アジュバントと組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
ウイルス疾患、癌、炎症性疾患、神経系疾患、胃腸管の疾患又は代謝性疾患の治療薬の調製のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物若しくは組成物、又は請求項１６に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１８】
ウイルス疾患、癌、炎症性疾患、神経系疾患、胃腸管の疾患、又は代謝性疾患の治療のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物若しくは組成物又は請求項１６に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１９】
ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、又は肝炎の治療のための請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２０】
皮膚癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、白血病又は脳腫瘍の治療のための請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２１】
喘息又は乾癬の治療のための請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２２】
パーキンソン病の治療のための請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２３】
結腸癌、クローン病、又は肥満の治療のための請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２４】
増加した血中コレステロール濃度と相関する疾患の治療のための請求項１７又は１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換されたＰＮＡ単位を含み、少なくとも１つのキラル中心を示す新規の化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩウイルスによる宿主細胞の一次感染後、既知の抗ウイルス化合物（例えば、インジナビル）は、複製サイクルの干渉によってじかに接する最初のウイルス子世代（immediate first viral daughter generation）のみに対する作用を示す。この環境により、無処置宿主細胞と比較して、ウイルス数を或る程度減少する。しかし、このウイルス数の減少は、１００％までは起こらない。生存ウイルスが単離された場合、これらのウイルスは、以前に感染していなかった宿主細胞にさらに感染し、完全な複製サイクルを通過することができる。
【０００３】
ＰＮＡ（ペプチド核酸）は、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンフレーム（ＮＢ＝核酸塩基、ｎ＝０〜５０；Ｒ１、Ｋ、Ｌ＝置換基）を有する合成ＤＮＡ／ＲＮＡアナログである。ＰＮＡは、Ｎ−アセチル−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン構成要素（ＰＮＡモノマー）間のペプチド結合の連結によって産生される。これらの個々のＮ−アセチル−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン構成要素はそれぞれ、ＰＮＡ単位を示す。
【０００４】
【化１】
2009544776.tif 000002
【０００５】
ＰＮＡは、生理学的条件下で加水分解（酵素分解）に耐性を示す。ＰＮＡは配列特異的様式で相補核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を認識し、それらの天然のプロトタイプよりも高い親和性で相補核酸配列に結合することができることは既知である(非特許文献１、非特許文献２)。
【０００６】
ＰＮＡを、例えば、アンチセンスオリゴマーとして適用する。これに関連して、タンパク質の発現は、翻訳レベルでのタンパク質特異的ｍＲＮＡへのアンチセンスオリゴマーのハイブリッド形成によって阻害される。これらの性質の結果として、ＰＮＡは、例えば、診断薬としての使用に適切な化合物である。
【０００７】
既知のＰＮＡ分子は、ＤＮＡと比較して水にほとんど溶解しないという欠点を示す。さらに、細胞への受容が極めてゆっくりしか起こらないような細胞膜の透過は、ＰＮＡの一般的な問題である。
【０００８】
特許文献１から、ＰＮＡは、その水溶性を残基Ｒ１のアミン官能基によって増強することができることが既知である。しかし、かかる方法で修飾したＰＮＡはまた、依然として細胞透過性が低い。したがって、生体におけるアンチセンス活性物質としてのＰＮＡの使用は非常に制限される。
【０００９】
特許文献２から、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を示すオリゴマーは既知である。かかる様式で修飾したオリゴマーは、これらの置換基を含まないＰＮＡと比較してより良好な細胞透過性を有する。
【００１０】
確かに、アンチセンスオリゴマーの良好な細胞透過性は、生体系における遺伝子発現の強い抑制効果を達成するには全く十分でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５７１９２６２号
【特許文献２】欧州特許第１１５７０３１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】M. Egholm, O. Buchardt, L. Christensen, C. Behrens, S. M. Freier, D. A. Driver, R. H. Berg, S. K. Kim, B. North, P. E. Nielsen, Nature, 1993, 365, 566-568
【非特許文献２】B. Hyrup, P. E. Nielsen, Bioorg. Med. Chem., 1996, 4, 5-23）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、第１子世代のウイルス数を減少させることができるだけでなく、第２子世代のウイルス数の強力な減少効果をさらに証明する化合物及びその応用を提供することである。したがって、ウイルスの２世代にわたる有効性を証明することができるある種の物質が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、新規の作用機構を概略的に図解で示す。
【図２】図２では、本発明の化合物Ｆｌｕ−εＴＭＬ−ＴＲＣＲＧＲＣＲＴＲＧＲＣＲＣＲＡＲＡＲＡＲＧＲＡＲＧＲＴＲ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を使用した対応する結果を示す。
【図３】図３では、本発明の化合物Ｆｌｕ−εＴＭＬ−ＴＲＣＲＧＲＣＲＴＲＧＲＣＲＣＲＡＲＡＲＡＲＧＲＡＲＧＲＴＲ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を使用した対応する結果を示す。
【図４】図４では、本発明の化合物Ｆｌｕ−εＴＭＬ−ｔＣＲｇＣＲｔＧＲｃＣＲａＡＲａＧＲａＧＲｔ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を使用した対応する結果を示す。
【図５】図５は、対応する蛍光顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
この目的は、一般式Ｉの化合物によって解決される：
【００１６】
【化２】
2009544776.tif 000003
【００１７】
式中、ｎは、７〜３５、好ましくは９〜２８、最も好ましくは１３〜２０の整数を示す。
【００１８】
Ｅは、互いに独立して、水素原子、置換又は非置換フェニル残基、置換又は非置換複素環残基、所望により保護基によって置換された核酸塩基、例えば、天然に存在するか若しくは天然に存在しない核酸塩基、又はＤＮＡインターカレーターを示す。
【００１９】
好ましくは、各Ｅは、互いに独立して、アデニニル、シトシニル、シュードイソシトシニル、グアニニル、チミニル、ウラシリル、又はフェニル残基を示す。
【００２０】
各残基Ｒ１は、互いに独立して、水素原子又は２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、又は脂環残基を示し、ここで、少なくとも１つの残基Ｒ１は水素原子を示さず、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換される。
【００２１】
残基Ｒ１が１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換されない場合、残基Ｒ１は、互いに独立して、例えば、天然に存在するか若しくは天然に存在しないアミノ酸の１つ又は複数の側鎖、好ましくは、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環、又は脂環残基も有することができる。
【００２２】
好ましくは、各残基Ｒ１は、互いに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の炭素原子を含む。
【００２３】
各残基Ｒ１は、互いに独立して、分岐していても分岐していなくてもよい。
【００２４】
表現「所望により置換された」は、１つ又は複数の水素原子が、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、若しくはヨウ素原子、又は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ８、−ＣＳＯＨ、−ＣＳＯＲ８、−ＣＯＳＨ、−ＣＯＳＲ８、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ９、−ＣＯＲ１０Ｒ１１、−ＯＨ、−ＯＲ８、＝Ｏ、−ＳＨ、−ＳＲ８、＝Ｓ、−ＮＨ２、＝ＮＨ、−ＮＨＲ９、−ＮＲ１０Ｒ１１、−ＮＲ１２ＮＯＨ、−ＮＯＲ１３、若しくはＮＯ２基、ホスホン酸エステル官能基若しくはホスホン酸官能基に置き換えられた基に関する。さらに、この表現は、非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ９ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル、又はＣ２〜Ｃ１１ヘテロアラルキル基と置換された基に関し、残基Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、互いに独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル残基を示す。
【００２５】
ホスホン酸エステル官能基は、例えば、式−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＶ）２又はＰ（＝Ｏ）（ＯＶ）（ＯＨ）を示すことができる。このような関係において、各Ｖは、互いに独立して、２０個までの炭素原子を有する、より好ましくは７個までの炭素原子を有する、非置換のアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、又は脂環残基、最も好ましくは、メチル、エチル、シクロヘキシル、又はベンジル残基を示すことができる。
【００２６】
本発明の化合物では、ホスホン酸官能基は、例えば、式−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２と示すことができる。
【００２７】
最も好ましくは、各残基Ｒ１は、互いに独立して、式−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−［Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−Ｖ）２］の群から選択され、式中、各Ｖは、互いに独立して、水素原子、メチル、エチル、シクロヘキシル、又はベンジル残基を示す。
【００２８】
2009544776.tif 000004
【００２９】
2009544776.tif 000005
【００３０】
Ｌは、式−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＲ５（ＣＯ）Ｒ６、−ＮＲ５（ＣＳ）Ｒ６、−ＯＲ７、又はＳＲ７の基を示し、ここで、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、水素原子、アルキル残基、レポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴクエンチャー（蛍光共鳴エネルギー移動クエンチャー）、又は水溶性若しくは水不溶性ポリマーを示し、ここで、上記の各残基を所望により置換することができ、及びＲ７は、水素原子、アルキル残基、レポーターリガンド、蛍光マーカー、インターカレーター、キレート剤、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、脂肪酸、オリゴヌクレオチド、量子ドット、ＦＲＥＴクエンチャー、又は水溶性若しくは水不溶性ポリマーを示し、ここで上記の各残基を所望により置換することができる。
【００３１】
好ましくは、Ｌは、−ＯＨ官能基、−ＮＨ２官能基、−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ５）アルキル官能基、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、又はペプチドアミド単位を示し、その全てはホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換されても置換されなくてもよく、上記の各残基は所望により置換することができる。
【００３２】
この出願を通して、アルキル残基は、好ましくは、１〜６個の炭素原子を有することができ、例えば、メチル、エチル、プロピル、又はブチル基を示し得る。
【００３３】
Ｒ１が水素原子を示さない場合、結合位置での一般式Ｉの化合物の骨格への残基Ｒ１の結合により、不斉中心（＊）が生じる。したがって、各不斉中心で、Ｒ立体配置又はＳ立体配置が存在する。
【００３４】
これに関連して、不斉中心の立体配置は、好ましくはカーン−インゴールド−プレローグ規則にしたがって定義される。但し、リガンドの優先順位は常に以下のように定義される：不斉中心の窒素原子は常に順位１とする。不斉中心のカルボキシル基の炭素原子は、常に順位２とする。
不斉中心の残基Ｒ１の炭素原子は、常に順位３とする。不斉中心の水素原子は、常に順位４とする。
【００３５】
欧州特許第１１５７０３１号では、ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換されたラセミモノマーから排他的に調製されたオリゴマーが記載されている。例えば、１５個のラセミモノマーから構成されるオリゴマーについて、２１５種の立体中心（＊）の異なる組み合わせ（すなわち、３２７６８種の異なる立体異性体）が存在する。この場合、異なる化学的性質及び物理的性質を有する化合物の混合物が得られる。
【００３６】
欧州特許第１１５７０３１号に記載の化合物とは対照的に、現在記載の本発明の化合物は、好ましくは鏡像異性体的に純粋なモノマーから出発して調製され、好ましくは１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換される。
【００３７】
本発明によれば、一般式Ｉの化合物は、少なくとも２つの不斉中心を示し、ここで少なくとも１つの残基Ｒ１は、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換されている。
【００３８】
本発明のさらに好ましい実施の形態によれば、各第２の残基Ｒ１は、互いに独立して、天然に存在するか若しくは天然に存在しないアミノ酸の側鎖、好ましくは２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環、又は脂環残基に対応し、そして少なくとも１つの残基Ｒ１は、２０個までの炭素原子を有する、所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、又は脂環残基を示し、これらは１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基と置換され、ここで残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００３９】
本発明のさらに好ましい実施の形態によれば、各第３の残基Ｒ１は、互いに独立して、天然に存在するか若しくは天然に存在しないアミノ酸の側鎖、好ましくは２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環、又は脂環残基に対応し、少なくとも１つの残基Ｒ１は、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、又は脂環残基を示し、かつ、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、ここで残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００４０】
本発明のさらに好ましい実施の形態によれば、２つ、３つ、又はそれ以上の隣接残基Ｒ１は、互いに独立して、天然に存在するか若しくは天然に存在しないアミノ酸の側鎖、好ましくは２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環、又は脂環残基に対応し、少なくとも１つの残基Ｒ１は、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、又は脂環残基を示し、かつ、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、ここで残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００４１】
本発明のさらに好ましい実施の形態によれば、各残基Ｒ１は、互いに独立して、天然に存在するか若しくは天然に存在しないアミノ酸の側鎖、好ましくは２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、複素環、又は脂環残基に対応し、少なくとも１つの残基Ｒ１は、２０個までの炭素原子を有する所望により置換されたアルキル、アルケニル、アルキルアリール、アリール、又は脂環残基を示し、かつ、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換される。
【００４２】
本発明のさらに好ましい実施の形態によれば、１つ又は複数の残基Ｒ１は、互いに独立して、少なくとも１つのホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を示す。
【００４３】
本発明のさらに好ましい実施の形態によれば、以下が適合する。
【００４４】
１.  ２〜８個の不斉中心及び１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する１〜８個の所望により置換された残基Ｒ１が一般式Ｉの化合物中に存在する場合、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する残基を有する不斉中心の数の少なくとも６６％、好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％は、Ｒ立体配置を示す。
【００４５】
２.  ９〜３６個の不斉中心及び１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する１〜３６個の所望により置換された残基Ｒ１が一般式Ｉの化合物中に存在する場合、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する残基を有する不斉中心の数の少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％は、Ｒ立体配置を示す。
【００４６】
本発明の代替的な好ましい実施の形態によれば、以下が適合する。
【００４７】
１.  ２〜８個の不斉中心及び１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する１〜８個の所望により置換された残基Ｒ１が一般式Ｉの化合物中に存在する場合、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する残基を有する不斉中心の数の少なくとも６６％、好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％は、Ｓ立体配置を示す。
【００４８】
２.  ９〜３６個の不斉中心及び１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する１〜３６個の所望により置換された残基Ｒ１が一般式Ｉの化合物中に存在する場合、１つ又は複数のホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基を有する残基を有する不斉中心の数の少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％は、Ｓ立体配置を示す。
【００４９】
さらなる実施の形態では、残基Ｒ１数の最大でも５０％はホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００５０】
さらなる実施の形態では、残基Ｒ１数の最大でも４０％はホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００５１】
さらなる実施の形態では、残基Ｒ１数の最大でも３０％はホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００５２】
さらなる実施の形態では、残基Ｒ１数の最大でも２０％はホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００５３】
さらなる実施の形態では、残基Ｒ１数の最大でも１０％はホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、残りのＲ１残基は水素原子を示す。
【００５４】
さらなる実施の形態では、残基Ｒ１数の最大でも４％はホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換され、残りの残基Ｒ１は水素原子を示す。
【００５５】
本発明のさらに好ましい実施の形態では、一般式Ｉの化合物の全ての不斉中心（＊）は、同じ立体配置を示す。
【００５６】
本発明のさらに好ましい実施の形態では、一般式Ｉの化合物の全ての不斉中心（＊）は、Ｓ立体配置を示す。
【００５７】
本発明のさらに好ましい実施の形態では、一般式Ｉの化合物の全ての不斉中心（＊）は、Ｒ立体配置を示す。
【００５８】
さらに、所望により有用なアジュバントと組み合わされて、１つ又は複数の本発明の化合物を含む本発明の組成物が開示される。
【００５９】
一般式Ｉの化合物の合成は、好ましくは、鏡像異性体的に純粋なモノマーから行われる。一般式Ｉの化合物の合成中、個々の不斉中心は、化学合成条件によって少数比率でその事前に定義した立体配置が変化し得る。しかし、合成中に形成された最大比率の一般式Ｉの化合物は、立体異性体的に純粋である。これらの組成物は、本発明の目的も満たし得る。
【００６０】
一般式Ｉの化合物は、リンカーとしてのＫ及びＬ残基によって一般式Ｉの第２の化合物と連結することができ、ここでこの残基は上記の通り定義される。一般式Ｉの第１の化合物の不斉中心の立体配置は、リンカーによって連結される一般式Ｉの第２の化合物の不斉中心の立体配置と無関係である。したがって、例えば、一般式Ｉの第１の化合物の全ての不斉中心はＲ立体配置を示すことができ、一般式Ｉの第２の連結した化合物の全ての不斉中心はＳ立体配置を示すことができる。また、例えば、一般式Ｉの第１の化合物の全ての不斉中心はＲ立体配置を示すことができ、一般式Ｉの第２の連結した化合物の全ての不斉中心はＲ立体配置を示すことができる。
【００６１】
リンカーは、特に、リンカーを有する一般式Ｉの２つの化合物と、一本鎖ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡとの間でそれぞれ核酸塩基を介して相互作用が起こり得るような方法で、一般式Ｉの２つの化合物間の距離を調整する目的に役立つ。
【００６２】
リンカーとして、この目的のために適用されるか適用可能な全ての既知のリンカー及び全てのリンカー分子が適切である。例えば、かかるリンカーは、少なくとも３つの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸単位（例えば、１単位）から構成される所望により置換されたアルキル鎖、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はオリゴマーを示すことができる。
【００６３】
原理上それぞれ残基Ｒ１でのホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基との置換は、本発明の化合物の細胞透過性に関与する。驚いたことに、本発明の化合物の細胞透過性は、維持されるかほんの少しばかり減少する。そうでなければ、置換された残基Ｒ１が起こり得る各々の位置に存在する。つまり、各ホスホン酸エステル官能基数又はホスホン酸官能基の数が存在するならば、したがって、本発明の化合物の不斉中心の数は減少する。
【００６４】
これに関連して、本発明の化合物の良好な細胞透過性は、生体組織中でも維持される。或る実験において、メダカ（Medaka fishes）（日本メダカ；オリジアス・ラチペス）を、蛍光色素でマークした本発明の化合物の溶液中で２日間飼育した。次いで、本発明の化合物（胃腸管組織に浸透しなかった化合物）を胃腸管から洗い流すために魚を新鮮な水に移した。次いで、魚を異なる日に蛍光顕微鏡下で調査した。結果は、本発明の化合物がメダカの胃腸管及び浮袋の両方に蓄積することを示す。魚の腸壁への浸透を、腸組織片によっても検出することができる。この環境は、本発明の化合物を、例えば、結腸癌、クローン病などの胃腸管疾患の治療又は脂肪過多症の治療に特に有益にする。
【００６５】
ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換された残基Ｒ１の数及び配列は、それぞれ、本発明にしたがって自由に選択することができる。したがって、各第２、各第３、各第４、各第５、各第６、各第７、各第８、各第９、各第１０の残基Ｒ１は、例えば、ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基でそれぞれ置換することができる。ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基との置換は、それぞれ、規則正しくか、任意の位置に存在することができる。
【００６６】
さらに、いくつかの残基Ｒ１はまた、それぞれ、連続して（隣接した配置）、ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換することができる。これに関連して、一般式Ｉの化合物においては、こうした隣接した配置をより多く含むこともできる。
【００６７】
しかし、例えば、任意の位置での個々の残基Ｒ１のみを、それぞれ、ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基で置換することができる。
【００６８】
ホスホン酸エステル官能基又はホスホン酸官能基でそれぞれ置換された個々の続いて起こる残基Ｒ１を伴う位置は任意であり得る。
【００６９】
本発明の化合物について、本発明者らは、驚くほどに強力な作用と同様に、依然として良好な細胞透過性での新規の作用原理を評価した。
【００７０】
本発明の化合物を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞実験の場合、第１ウイルス子世代のＨＩウイルスによる宿主細胞の一次感染（第１の実験）について、一見したところ、無処置対照と比較して、形成されたウイルス数のわずかな減少のみが認められた。この状況は、当業者がこれまで理解しているように、弱いアンチセンス効果を示すであろう。
【００７１】
ウイルスタンパク質ｐ２４の形成量はＨＩウイルスの形成数と比例すると一般に見なされるので、ＨＩウイルス数を、標準的な定量的ｐ２４−ＥＬＩＳＡアッセイによって調査した。
【００７２】
第１ウイルス子世代の感染細胞培地（上清）は、遠心分離によって宿主細胞から単離することができる。以前に感染されていない新しい宿主細胞は、続く実験でこの上清によって感染させることができ（二次感染）、ここで本発明の化合物のさらなる添加は起こらないない。その後、この上清は、ｐ２４アッセイの測定範囲内にその濃度が保持されるように希釈される（例えば、１：５０００）。
【００７３】
その後の実験において、希釈した上清、本発明の化合物で処置した宿主細胞の希釈上清と無処置対照の希釈上清の両方は、事前に感染していない宿主細胞にそれぞれ添加される。これに関連して、本発明の化合物のさらなる添加は起きるない。ここで、第１の実験で処置宿主細胞の場合、第２子世代のｐ２４の測定量が非常に減少する。これと対照的に、無処置対照の上清は、第２子世代でｐ２４量の高い増加が認められる。
【００７４】
この驚くべき結果は、第１子世代からの結果と矛盾する。一見したところ、活性物質の存在にもかかわらず、第１の実験でわずかな作用しか達成されない一方で、活性物質が実質的に存在しないケースで、その後の実験では、強い作用が認められた。
【００７５】
この矛盾は、本発明の化合物の新規の作用機構によってしか解決することができない。
【００７６】
図１は、新規の作用機構を概略的に図解で示す。
【００７７】
ＨＩウイルスによる宿主細胞の一次感染の場合、そのＨＩウイルスは、サイトゾルへのそのウイルスゲノムＲＮＡの組み込みを取り下げる。その後、ウイルスＤＮＡは、ウイルス逆転写酵素によってＤＮＡに転写され、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。宿主細胞の活性化の際、一方でウイルスゲノムＲＮＡが形成され、他方でｍＲＮＡが形成され、これは翻訳によってウイルスタンパク質に解読することができる。
【００７８】
宿主細胞が本発明の化合物で処置されるならば、それらは、さらなるアジュバント（例えば、トランスフェクション試薬）を使用することなく細胞に浸透することができる。相補配列を有するウイルスｍＲＮＡの存在下で、本発明の化合物はこれらに付着することができる。付着の結果として、異なるウイルスタンパク質への翻訳が遮断される。この現象は、アンチセンス効果と呼ばれる（１）。それにより、例えば、新規のウイルスの形成は中断される（ケースＡ）。例えば、宿主細胞からの出芽後のウイルス粒子の成熟を、異なるウイルスタンパク質の非存在によって遅延することもできる。この場合、非感染性ウイルスが出現する（ケースＢ）。明らかに、ｐ２４アッセイでは、かかる非感染性ウイルスと依然として感染性を示すかかるウイルスとを区別することができない。それ自体が強力であるアンチセンス効果は、この様式では弱いアンチセンス効果として誤って検出される。
【００７９】
ｍＲＮＡ（古典的アンチセンス効果）に加えて、驚いたことに、本発明の化合物を、ＨＩウイルス（ＲＮＡ＋ウイルス）の相補配列を有するゲノムＲＮＡ（アンチゲノム効果）に同時に付着することもできる（２）。宿主内及び／又は出芽時にこれは起こり得る。
【００８０】
しかし、ウイルスの細胞膜の大部分が宿主の細胞膜からなるので、本発明の化合物は、ウイルスの出芽後も宿主の細胞膜を浸透し、その後にウイルスゲノムＲＮＡの相補配列に付着することができる（３）。
【００８１】
これらのウイルス（Ｃ及びＤ）は、依然としてさらなる宿主細胞に感染することができる。ウイルスゲノムＲＮＡに付着した本発明の化合物は、明らかにウイルス逆転写酵素の遮断剤として働く。それにより、ＲＮＡのＤＮＡへの転写はもはや可能ではなく、ウイルスの複製サイクルはこの時点で中断される。
【００８２】
したがって、本発明の化合物は、相補ウイルスゲノムＲＮＡ及び相補ウイルスｍＲＮＡの両方に同時に付着することができる。ゲノムＲＮＡへの付着の場合、本発明の化合物は、第１の宿主細胞から再度遊離し、事前に感染していない第２の宿主細胞に浸透することができる。この結果により、２世代のウイルスにわたって認められる驚くべき有効性が得られる。
【００８３】
ゲノムＲＮＡへの付着の結果として、潜在ウイルスを拮抗することもできる。例えば、現在市販されているＨＩＶ薬は、ＨＩウイルスの複製のみを拮抗することができる。ゲノムＲＮＡに付着する化合物（例えば、本発明の化合物など）とウイルスの複製の遮断によってウイルス数を少数に保持する化合物との併用療法を用いて、複製ウイルス及び潜在ウイルスの両方を本発明によって同時に拮抗することができ、したがって、対応するウイルスの駆除を人体で達成することができる。
【００８４】
本発明の化合物は、欧州特許第１１５７０３１号に記載の立体化学的に不均一な化合物と比較して、より優れたアンチセンス効果及びより強力な有効性を示す。両化合物クラスでは、アンチセンス効果の強度は、オリゴマーの調製のために使用されたモノマー数の増加（すなわち、ｎより大きな値）と共に上昇する。しかし、明らかにより短い本発明の化合物でさえ、作用に関して欧州特許第１１５７０３１号のより長い立体化学的に不均一のオリゴマーより明確且つ驚くほどに優れている。この性質により、本発明の化合物が、さらなる適用に特に有益となる。
【００８５】
本発明の化合物は、その相補核酸配列に結合する能力により、異なる疾患の治療に大きな関心が寄せられている。これらの化合物により、生物と無関係のＤＮＡ又はＲＮＡの存在に寄与する疾患を拮抗することができる。例えば、特に、ウイルス、例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎、又はＨＰＶに起因する疾患が挙げられる。
【００８６】
身体自体のｍＲＮＡの過剰発現に遡及される疾患を、本発明の化合物によって拮抗することもできる。例として、皮膚癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、白血病又は脳腫瘍などの異なる癌種を列挙することができる。
【００８７】
本発明の化合物を使用した対応する実験は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌細胞株ＭＤＡ４５３の細胞増殖の３３％減少を示した。この実験では、細胞株を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ｍＲＮＡに相補的な適合配列を示す本発明の化合物と細胞培養物中で４日間インキュベートした。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ｍＲＮＡと相補的な適合配列を示さないネガティブ対照は、細胞増殖の減少を示さなかった。
【００８８】
乳癌患者の場合、従来の化学療法と組み合わせて、乳癌中のＨｅｒ２／ｎｅｕ濃度の減少により、明らかに生存率が上昇する（Piccart-Gebhart MJ et al.: Herceptin （登録商標）Adjuvant (HERA) Trial Study Team. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2005 Oct 20; 353 (16): 1659-72）。
【００８９】
さらに、炎症性疾患、例えば、喘息又は乾癬、神経系疾患、例えば、パーキンソン病、又はコレステロール値の上昇などの代謝性疾患を、本発明の化合物によって拮抗することができる。
【００９０】
コレステロールキャリアタンパク質ＡｐｏＢ１００の発現に指向される本発明の化合物を使用した対応する実験は、ＰＢＳ緩衝液のみで処置した対照群と比較して、マウスで４１％のＡｐｏＢ１００含量の減少を示した。同時に、３２％のＡｐｏＢ４８（結腸から肝臓へのコレステロール輸送を担うさらなるコレステロールキャリアタンパク質）の減少が認められた。ＡｐｏＢ１００及びＡｐｏＢ４８の減少により、コレステロール濃度が全体で約２５％減少した。この実験では、マウスに、本発明の化合物を濃度２５ｍｇ／ｋｇで、１日１回３日間連続して静脈内に投与し、次いで、４日目にマウスの血液を分析した。
【００９１】
ＡｐｏＢ１００及びＡｐｏＢ４８の減少は、動脈硬化及びコレステロール値の増加に関連する疾患の拮抗に関して、特に高リスク群に関して有益である。
【００９２】
疾患の予防及び／又は治療のための薬剤の調製のため、本発明による化合物の使用もまた本発明の主題である。概して、本発明による化合物は、既知の許容可能な様式を用いて、単独で又は任意の他の治療剤と組み合わせて投与される。例えば、投与は以下の経路：例えば糖衣錠、コーティング錠、丸薬、半固体剤、軟カプセル剤及び硬カプセル剤、水剤、乳剤又は懸濁剤として経口；例えば注射剤として非経口；座薬として経直腸；例えば粉末製剤又は散布剤として吸入、経皮又は経鼻の一つを適用することができる。このような錠剤、丸薬、半固体、コーティング錠、糖衣錠及び硬ゼラチンカプセル剤の製造について、治療に使用可能な製品は薬理学的に不活性な無機又は有機の薬物担体物質、例えばラクトース、スクロース、グルコース、ゼラチン、モルト、シリカゲル、澱粉又はそれらの誘導体、タルカム、ステアリン酸又はその塩、及び脱脂粉乳等と混合され得る。軟カプセル剤の製造については、植物油、石油、動物油又は合成油、ろう、脂肪、ポリオールなどの薬物担体物質を使用することができる。液体水剤及びシロップの製造については、水、アルコール、塩水溶液、水性デキストロース、ポリオール、グリセロール、植物油、石油、動物油又は合成油などの薬物担体物質を使用することができる。座薬については、植物油、石油、動物油又は合成油、ろう、脂肪及びポリオールなどの薬物担体物質を使用することができる。エアロゾル製剤については、酸素、窒素、及び二酸化炭素など、この目的に適した圧縮ガスを使用することができる。薬学的に使用可能な薬剤はまた、保存用添加剤、安定化のための添加物、乳化剤、甘味剤、香料、浸透圧を変えるための塩、緩衝物質、コーティング用添加剤及び抗酸化剤を含有し得る。
【００９３】
本発明による一般式Ｉの化合物は、例えばそれ自体周知の方法での一般式ＩＩの化合物の反応による文献に記載の方法によって、製造することができる（例えばL. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K.H. Petersen, H.F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R.H. Berg, J. Pept. Sci. 3, 1995, 175 - 183；T. Koch, H.F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H.G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res. 49, 1997, 80 - 88；F. Bergmann, W. Bannwarth, S. Tam, Tetrahedron Lett. 36, 1995, 6823 - 6826）。 
【００９４】
一般式ＩＩの化合物において：
【００９５】
【化３】
2009544776.tif 000006
【００９６】
残基Ｒ５は、例えば水素原子又はアリル、ベンジル、エチル、若しくはメチル残基、又は可溶性又は不溶性のポリマーを表す。
【００９７】
Ｐｒは、水素原子又は切断可能なアミン保護基を示す。アミン保護基は、核酸塩基保護基の存在下で選択的に切断可能でなければならない。好ましくは、Ｐｒは、水素原子、オキソカルバメート保護基、又はチオカルバメート保護基を示し、最も好ましくは、Ｐｒは、水素原子又はＦｍｏｃ保護基、Ｂｏｃ保護基、Ｃｂｚ保護基、Ｍｍｔ保護基、又はＢｈｏｃ保護基を示す。
【００９８】
Ｅ及び残基Ｒ１は、上記定義の通りである。
【００９９】
残基Ｒ１が結合する不斉中心（＊）は、Ｒ又はＳ立体配置を示し得る。
【０１００】
例えば、一般式ＩＩの化合物を、以下の方法に従って製造することができる。
【０１０１】
不斉中心がＲ立体配置の一般式ＩＩの化合物の製造：
【０１０２】
反応工程１：
【０１０３】
【化４】
2009544776.tif 000007
【０１０４】
手順は、ピラジン遊離体のＳ立体配置から出発し、例えば文献に記載のように実行され得る（U. Schollkopf, U. Busse, R. Lonsky, R. Hinrichs, Liebigs Ann. Chem. 1986, 2150 - 2163；A. Schick, T. Kolter, A. Giannis, K. Sandhoff, Tetrahedron 51, 1995, 11207 - 11218）。
【０１０５】
反応工程２：
【０１０６】
【化５】
2009544776.tif 000008
【０１０７】
例えば、手順は、文献に記載のように実行することができる（U. Schollkopf, U. Busse, R. Lonsky, R. Hinrichs, Liebigs Ann. Chem. 1986, 2150 - 2163）。
【０１０８】
反応工程３：
【０１０９】
【化６】
2009544776.tif 000009
【０１１０】
塩基（例えば、ＮａＨＣＯ３、ＮＨ３）によるその塩酸塩からのアミンの放出後、反応工程２由来の生成物の混合物を以下の反応で使用することができる。この還元的アミノ化の反応を、文献に記載のように行うことができる（G. Haaima, A. Lohse, 0. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939-1942）。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの代わりに、他の還元剤、例えば、水素及び触媒（例えば、Ｐｄ／Ｃ）も使用することができる。反応生成物は、クロマトグラフィによって分離される。
【０１１１】
反応工程４：
【０１１２】
【化７】
2009544776.tif 000010
【０１１３】
手順は文献に記載のように実行することができる（G. Haaima, A. Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939 - 1942）。これに関連して、ＤＣＣ／ＤＨＢＴの代わりに他のカップリング試薬を使用してもよい。化合物Ｅ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（例えば、Ｃ（ＰＧ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ａ（ＰＧ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｇ（ＰＧ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｔ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、又はＪ（ＰＧ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（式中、Ａ＝アデニニル、Ｃ＝シトシニル、Ｇ＝グアニニル、Ｔ＝チミニル、Ｊ＝プソイドイソシトシニル、ＰＧ＝保護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、アセチル（Ａｃ）又はアニソイル（Ａｎ））の製造は、文献に記載のように実行することができる（S.A. Thomson, J.A. Josey, R. Cadilla, M.D. Gaul, F.C. Hassmann, M.J. Lazzio, A.J. Pipe, K.L. Reed, D.J. Ricca, R.W. Wiether, S.A. Noble, Tetrahedron 51, 1995, 6179 - 6194）。さらなる可能な保護基はまた、文献に記載されている（G. Breitpohl, D.W. Will, A. Peymann, E. Uhlmann, Tetrahedron 53, 1997, 14671 - 14686；T. Kofoed, H.F. Hansen, H. Orum, T. Koch, J. Peptide Sci., 7, 2001, 402 - 412）。
【０１１４】
反応工程５：
【０１１５】
【化８】
2009544776.tif 000011
【０１１６】
手順は文献に記載のように実行することができる（G. Haaima, A. Lohse, O. Buchardt, P.E. Nielsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 1996, No 17, 1939 - 1942）。
【０１１７】
反応工程５における生成物として生成される一般式ＩＩの化合物のより簡潔な記述のために、以下の略語を使用する。 例えば、反応工程４でＡ（ＰＧ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨを使用する場合、不斉中心を有する対応する一般式ＩＩの化合物が得られる。この化合物を、ここでは一般にＡＲ（ＰＧ）と略する。これに関連して、略語Ａは、不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物中の核酸塩基を意味し、上付きのＲは、その化合物のＲ立体配置を意味し、略語ＰＧは核酸塩基での保護基を意味する。例えば、反応工程４でフェニル酢酸を使用する場合、不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物が得られ、これをＰＲと略する。
【０１１８】
不斉中心を持たない対応する一般式ＩＩの化合物（Ｒ１＝Ｈ）は、不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物と同様に略されるが、核酸塩基を示す大文字及び立体配置を示す上付き文字（例えば、ＡＲ）の代わりにそれぞれ小文字ａを使用されることが異なる。例えば、核酸塩基としてＰＧ保護Ｃを有する、不斉中心を持たない一般式ＩＩの化合物は、ｃ（ＰＧ）と略される。
【０１１９】
不斉中心がＳ立体配置の一般式ＩＩの化合物の製造について、Ｒ立体配置を有するピラジン遊離体（educt）を反応工程１で使用し、反応工程１〜５を同様に行う。次いで、例えば、一般式ＩＩの化合物が得られ、これはＡＳ（ＰＧ）と略される。
【０１２０】
本発明の化合物は、例えば、それ自体周知の方法で一般式ＩＩの化合物の反応による固相合成によって製造することができる。固相合成によれば、核酸塩基の保護基は、一般式Ｉの化合物が得られるように切断され、これは以下のように省略される。
【０１２１】
例えば、Ｒ立体配置を有する不正中心を有する一般式ＩＩの化合物からもっぱら製造され、アセチル基でキャッピングされた本発明の化合物は、Ａｃ−ＡＲＧＲＴＲＣＲＧＲＴＲＴＲＴＲＣＲＡＲＡＲＣＲＣＲ−ＮＨ２と省略される。
【０１２２】
例えば、Ｒ立体配置を有する不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物及び不斉中心を持たない一般式ＩＩの化合物から製造され、最終工程にてフルオレセインで標識され、その後に樹脂から第一級アミドとして切断する本発明の化合物は、Ｆｌｕ−ＡＲｇＴＲＣＲＧＲｔＴＲＴＲＣＲａａＣＲｃ−ＮＨ２と省略される。
【０１２３】
例えば、Ｓ立体配置を有する不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物、及びＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂におけるＢｏｃ−ε−（Ｌ）−トリメチルリジンヨージド（Ｂｏｃ−ε（Ｌ）ＴＭＬヨージドなどのＬアミノ酸からもっぱら製造され、最終工程にてアセチル基でキャッピングされ、その後に樹脂から第一級アミドとして切断される本発明の化合物は、ＡＣ−ε（Ｌ）ＴＭＬ−ＡＳＧＳＴＳＣＳＧＳＴＳＴＳＴＳＣＳＡＳＡＳＣＳＣＳ−Ｇｌｙ−ＮＨ２と省略される。
【０１２４】
例えば、Ｓ立体配置を有する不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物、及びＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂におけるＢｏｃ−ε−（Ｌ）−トリメチルリジンヨージド（Ｂｏｃ−ε（Ｌ）ＴＭＬヨージド）などの４つのＬアミノ酸からもっぱら製造され、最終工程にてアセチル基でキャッピングされ、その後に樹脂から第一級アミドとして切断される本発明の化合物は、ＡＣ−ε（Ｌ）ＴＭＬ−ε（Ｌ）ＴＭＬ−ε（Ｌ）ＴＭＬ−ε（Ｌ）ＴＭＬ−ＡＳＧＳＴＳＣＳＧＳＴＳＴＳＴＳＣＳＡＳＡＳＣＳＣＳ−Ｇｌｙ−ＮＨ２と省略される。
【０１２５】
例えば、Ｒ立体配置を有する不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物、及び不斉中心を持たない一般式ＩＩの化合物、グリシン及びＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂における４−（ジエトキシホスホリル）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）酪酸（Ｂｏｃ−ＤＥＰＡＢＳ）などの２つのアミノ酸にから製造され、最終工程にてアセチル基でキャッピングされ、その後に樹脂から第一級アミドとして切断される本発明の化合物は、Ａｃ−（ＤＥＰＡＢＳ）２−Ｇｌｙ−ｇｃｇｔＧＲｔＧＲｇｇａａｇＧＲｃＡＲｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ２と省略される。
【０１２６】
例えば、Ｒ立体配置を有する不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物及び不斉中心を持たない一般式ＩＩの化合物、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂においてアミノ酸であるＬ−リジン（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）、Ｌ−バリン（Ｌ−Ｖａｌ）から製造され、最終工程にてアセチル基でキャッピングされ、その後に樹脂から第一級アミドとして切断される本発明の化合物は、Ａｃ−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ａｒｇ）−（Ｌ−Ｌｙｓ）−（Ｌ−Ｖａｌ）−ａｇｃｔＣＲｃＴＲｃｇｃｃｃＴＲｔＧＲｃ−Ｇｌｙ−ＮＨ２と省略される。
【０１２７】
例えば、Ｒ立体配置を有する不斉中心を有する一般式ＩＩの化合物及び不斉中心を持たない一般式ＩＩの化合物、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂においてアミノ酸であるＢｏｃ−ε−（Ｌ）−トリメチルリジンヨージド（Ｂｏｃ−ε（Ｌ）ＴＭＬヨージド）及びキレート剤１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＤＯＴＡ）から製造され、その後に樹脂から第一級アミドとして切断される本発明の化合物は、ＤＯＴＡ−ε（Ｌ）ＴＭＬ−ＣＲａＧＲｔＴＲａＧＲｇＧＲｔＴＲａＧＲ−Ｇｌｙ−ＮＨ２と省略される。
【実施例】
【０１２８】
［実施例１］
（２Ｒ，５Ｓ）−２−（２−（ジエトキシホスホリル）エチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンの調製
【０１２９】
【化９】
2009544776.tif 000012
【０１３０】
０.５２ｍｏｌの（Ｓ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンを、アルゴン下で４００ｍｌの無水ＴＨＦに溶解し、−７８℃に冷却する。撹拌しながら、２００ｍｌの２.７Ｍブチルリチウム溶液（ヘプタン中）（０.５４ｍｏｌ）をゆっくり滴下する。その後、０.５２ｍｏｌのジエチル（２−ブロモエチル）ホスホナートを含む３００ｍｌの無水ＴＨＦ溶液を撹拌しながらゆっくり滴下し、混合物を、−７８℃でさらに３時間撹拌する。次いで、１１.７ｍｌ（約０.２ｍｏｌ）の無水酢酸をゆっくり添加する。反応混合物を、室温にゆっくり加温する。溶媒を除去し、残渣を６００ｍｌのジエチルエーテルに溶解し、２００ｍの水で洗浄する。水相を、それぞれ１００ｍｌのジエチルエーテルで３回さらに抽出する。合わせたエーテル相を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去する。残渣をジエチルエーテルとヘキサンとの混合物（１：１０）に溶解し、シリカゲルベッドで濾過する。それにより、ジエチルエーテルとヘキサン（１：５）でそれは最初に溶離される。
収率：約７０％（黄色液体）
【０１３１】
1H-NMR(CDCl3): 0.71, 1.04 (d, 6H, CH(CH3)2), 1.33 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.68-2.25 (m, 4H, CHCH2CH2P), 3.65, 3.67 (s, 6H, OCH3), 4.02 (m, 1H), 4.10-4.20 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2).
【０１３２】
［実施例２］
（２Ｒ，５Ｓ）−２−（８−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）オクチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンの製造
実施例１の製造法と同様に、（Ｓ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンとジベンジル−（８−ブロモオクチル）ホスホネートから出発して、（２Ｒ，５Ｓ）−２−（８−ジベンジルオキシ−ホスホリル）オクチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンを製造する。
【０１３３】
［実施例３］
（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）ブタ−２−エニル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンの製造
実施例１の製造法と同様に、（Ｒ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンとジシクロヘキシル−（４−ブロモ−ブタ−２−エニル）ホスホネートから出発して、（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）ブタ−２−エニル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンを製造する。
【０１３４】
［実施例４］
（２Ｒ）−２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−４−（ジエトキシ−ホスホリル）−酪酸メチルエステルの製造
【０１３５】
【化１０】
2009544776.tif 000013
【０１３６】
０.３８ｍｏｌの（２Ｒ，５Ｓ）−２−（２−（ジエトキシ−ホスホリル）エチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピル−ピラジンを、４００ｍｌのジエチルエーテルに溶解する。この溶液に、１１５０ｍｌの１Ｎ塩酸水溶液を添加する。６０分後、反応が完了し、エーテルを除去する。生成物を保存する場合、水も真空下で完全に除去する。生成物を直ちにさらに反応させる場合、ロータリーエバポレーターによって約半分の水を除去し、次いで、反応混合物のｐＨ値を、アンモニア溶液によってｐＨ８〜９に調整する。塩基性溶液を、ジクロロメタンで６回抽出し、ここで、ｐＨ値を調節し、所望により毎回補正する。ジクロロメタン相を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を真空下で除去する。得られた黄色オイルを直ちに次の反応（還元的アミノ化）で使用する。
【０１３７】
【化１１】
2009544776.tif 000014
【０１３８】
黄色オイル（完全に反応したと見なされる）を、６００ｍｌのメタノールに溶解し、０℃に冷却する。その後、０.７６ｍｏｌのＮ−Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒドを添加する。０℃で３０分間の撹拌後、最初に０.９０ｍｏｌの無水酢酸を添加し、次いで、０.４０ｍｏｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加する。ガス発生が完了するまで反応混合物を０℃で撹拌し、ロータリーエバポレーターによって溶媒を除去する。残渣を、酢酸エチルエステル（約６００ｍｌ）に溶解し、さらに、飽和重炭酸ナトリウム溶液（約２００ｍｌ）で１回洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液（約１００ｍｌ）で１回洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過する。その後、溶媒を真空下で除去する。
【０１３９】
シリカゲルを充填したガラスフリットでのＳＰＥによってさらに精製する。夾雑物及び望ましくない生成物を、ヘキサンと酢酸エチルエステルとの混合物（１：１）で最初に溶離し、次いで、純粋な酢酸エチルエステルで溶離する。メタノールを１０％含むジクロロメタンでの抽出によって所望の生成物を最終的に得る。
【０１４０】
溶媒の除去後、約７５％の生成物が黄色粘性オイルとして得られる。
【０１４１】
1H-NMR(CDCl3): 1.35 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.47 (s, 9H, C(CH3)3); 1.8-2.0 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 2.5-2.6, 2.75-2.85, 3.0-3.4 (m, 4H, NCH2CH2N), 3.75 (s, 3H, OCH3), 4.0-4.2 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2).
【０１４２】
［実施例５］
（２Ｒ）−２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−１０−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）デカン酸メチルエステルの製造
実施例４の製造方法と同様に、（２Ｒ，５Ｓ）−２−（８−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）オクチル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンから出発して（２Ｒ）−２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−１０−（ジベンジルオキシ−ホスホリル）デカン酸メチルエステルを製造する。
【０１４３】
［実施例６］
（２Ｓ）−２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−６−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）ヘキサ−４−エン酸メチルエステルの製造
実施例４の製造方法と同様に、（２Ｓ，５Ｒ）−２−（４−（ジシキロヘキシルオキシ−ホスホリル）−ブタ−２−エニル）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−５−イソプロピルピラジンから出発して（２Ｓ）−２−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−６−（ジシクロヘキシルオキシ−ホスホリル）−ヘキサ−４−エン酸メチルエステルを製造する。
【０１４４】
［実施例７］
（Ｒ）−２−（［２−｛Ｎ４−ベンジルオキシカルボニルシトシン−１−イル｝−アセチル］−［２−ｔｅｒｔ −ブトキシカルボニルアミノエチル］−アミノ）−４−（ジエトキシ−ホスホリル）酪酸メチルエステルの製造
【０１４５】
【化１２】
2009544776.tif 000015
【０１４６】
３０.９６ｍｍｏｌの４−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−シトシン−１−イル−酢酸及び３０.９６ｍｍｏｌの３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ｌ，２，３−ベンゾトリアジン（ＤＨＢＴ−ＯＨ）を含む１００ｍｌの無水ＤＭＦの撹拌溶液に、３２.５１ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、この溶液を４０℃で１時間撹拌する。次いで、２３.８４ｍｍｏｌの（２Ｒ）−２−［２−（ｔｅｒｔ −ブトキシカルボニルアミノ）エチル］−アミノ−４−（ジエトキシ−ホスホリル）−酪酸メチルエステルを添加し、４０℃で撹拌する。反応をＨＰＬＣによってモニタリングし、３日後に完了する。
【０１４７】
溶液を、濾過によって不溶性部分から分離し、溶媒を真空下で除去する。残渣を、ジクロロメタンに溶解し、冷蔵庫に一晩保存する。このプロセスでは、さらなるジシクロヘキシル尿素が沈殿し、これを濾過によって分離する。濾液を、重炭酸ナトリウムの希釈溶液（飽和重炭酸ナトリウム溶液１／３、水２／３）で２回又は３回洗浄し、硫酸水素カリウムの希釈溶液（飽和硫酸水素カリウム溶液１／３、水２／３）で１回又は２回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮する。酢酸エチルエステルに溶解し、冷蔵庫に一晩保存することによってさらに精製し、そこで濾過によってさらに所望により沈殿したジシクロヘキシル尿素を分離し、溶媒を再度除去する。次いで、粗生成物をジクロロメタン（粗生成物３ｇあたり５ｍｌ）に溶解し、ジエチルエーテル（粗生成物３ｇあたり２５ｍｌ）及びヘキサン（粗生成物３ｇあたり５ｍｌ）で再度沈殿させる。夾雑物を含む溶媒を除去し、生成物を真空下で乾燥させる。
収率：約６５％（鮮黄色固体）
【０１４８】
1H-NMR(CDCl3): 1.32 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.44 (s, 9H, C(CH3)3); 1.75-2.45 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.2-3.85 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.73 (s, 3H, OCH3); 4.07 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.28 (m, 1H, NCHC(O)); 4.42/4.99 (2d, 2H, NCH2C(O)); 5.22 (s, 2H, OCH2Ph); 5.56 (t, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.25 (d, 1H, CCH=CHN); 7.38 (s, 5H, Ph);7.55 (d, 1H, CCH=CHN). 
【０１４９】
［実施例８］
（Ｒ）−２−（［２−｛Ｎ４−ベンジルオキシカルボニルアミノ−シトシン−１−イル｝−アセチル］−［２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル］−アミノ）−４−（ジエトキシホスホリル）酪酸の製造
【０１５０】
【化１３】
2009544776.tif 000016
【０１５１】
１９.１ｍｍｏｌの（Ｒ）−２−（［２−｛Ｎ４−ベンジルオキシカルボニルシトシン−１−イル｝−アセチル］−［２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エチル］−アミノ）−４−（ジエトキ−シホスホリル）酪酸メチルエステルを、ＴＨＦと水（２：３）の８０ｍｌに溶解し、０℃に冷却する。この溶液に、４８ｍｌの１Ｍ水酸化リチウム溶液を滴下する（約ｐＨ〜９）。反応の進行を、ＤＣ（メタノール１０％のジクロロメタン溶液）を用いてモニターする。反応終了後、反応溶液を１３０ｍｌの塩化ナトリウム水溶液で希釈し、ジクロロメタン（２００ｍｌ）で１回抽出する。水相を、２Ｍ硫酸水素カリウム溶液でｐＨ値２〜３に調整し、ジクロロメタンで数回抽出する。それにより、ｐＨ値が調節され、所望により何度も反復して補正する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空下で除去する。必要に応じて、粗生成物を、ジエチルエーテルを使用してジクロロメタンから再沈殿させることができる。最後に、生成物を凍結乾燥機によって乾燥する。
収率：約８０％（淡黄色固体）
【０１５２】
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.39 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.90-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.93-4.02 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.25 (m, 1H, NCHC(O)); 4.50-4.83 (m, 2H, NCH2C(O)); 5.19 (s, 2H, OCH2Ph); 6.88 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.02 (d, 1H, CCH=CHN); 7.31-7.41 (m, 5H, Ph); 7.97 (d, 1H, CCH=CHN).
【０１５３】
［実施例９］
さらなる一般式ＩＩの化合物の製造
実施例７及び８と類似の合成により、ただし、Ｃ（Ｚ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨに加えて、Ａ（Ｚ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ａ（Ａｎ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ａ（Ｂｚｌ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、又はＧ（Ｚ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｇ（Ａｃ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｃ（Ａｎ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｂｚｌ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｊ（Ｚ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｊ（Ｂｚｌ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、Ｊ（Ａｎ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、又はＴ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（Ａ＝アデニニル、Ｃ＝シトシニル、Ｇ＝グアニニル、Ｔ＝チミニル；Ｊ＝シュードイソシトシニルなどの、それぞれさらにＺ保護、ベンジル保護（Ｂｚｌ）、アニソイル保護（Ａｎ）、又はアセチル保護（Ａｃ）した、及び非保護の核酸塩基酢酸成分、及びフェニル酢酸を使用し、本発明のさらなる一般式ＩＩの化合物を製造する。
【０１５４】
AR(Z):
1H-NMR(CH3OH-d4): 1.20 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.34 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.00-3.80 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.93-4.02 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.10 (m, 1H, NCHC(O)); 5.18 (s, 2H, OCH2Ph); 5.20-5.40 (m, 2H, NCH2C(O)); 7.15-7.40 (m, 5H, Ph); 8.14 (s, 1H, N=CHN); 8.46 (s, 1H, N=CHN).
【０１５５】
AR(Bzl):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.40 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.20 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 2.90-3.75 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 5.25-5.45 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.96 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.50-8.10 (m, 5H, Ph); 8.42 (s, 1H, N=CHN); 8.69 (s, 1H, N=CHN).
【０１５６】
AR(An):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.41 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.20 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.90-3.750 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.86 (s, 3H, OCH3); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 5.25-5.45 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.96 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.08 (d, 2H, Ph); 8.05 (d, 2H, Ph); 8.42 (s, 1H, N=CHN); 8.69 (s, 1H, N=CHN).
【０１５７】
JR(Z):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.32 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3); 1.60-2.50 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 3.10-3.55 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.65-3.90 (m, 2H, NCH2C(O)); 4.00-4.15 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.20 (m, 1H, NCHC(O)); 5.24 (s, 2H, OCH2Ph); 6.80 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.27 (d, 1H, C=CHN); 7.30-7.50 (m, 5H, Ph).
【０１５８】
JR(An):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.22 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.38 (s, 9H, C(CH3)3); 1.65-2.25 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.80-3.70 (m, 4H, NCH2CH2N); 2.80-3.70 (m, 2H, CCH2C(O)); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3.90-4.05 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.17 (m, 1H, NCHC(O)); 6.81 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.05 (d, 2H, Ph); 7.70 (s, 1H, NCH=C); 8.07 (d, 2H, Ph).
【０１５９】
GR(Z):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.18 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.37 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 2.95-3.70 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.20 (m, 1H, NCHC(O)); 4.85-5.20 (m, 2H, NCH2C(O)); 5.269 (s, 2H, OCH2Ph); 6.95 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.30-7.50 (m, 5H, Ph); 7.85 (s, 1H, N=CHN).
【０１６０】
GR(Ac):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.20 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.41 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.18 (m, 4H, CHCH2CH2P); 2.20 (s, 3H, CH3C(O)); 2.90-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 4.91-5.22 (m, 2H, NCH2C(O)); 7.00 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.88 (s, 1H, N=CH-N);.
【０１６１】
CR(Bzl):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.21 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.40 (s, 9H, C(CH3)3); 1.70-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.20-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.93-4.02 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.28 (m, 1H, NCHC(O)); 4.50-4.83 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.90 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.33 (d, 1H, CCH=CHN); 7.50-7.55 (m, 2H, Ph); 7.62 (d, 1H, CCH=CHN); 8.00-8.10 (m, 3H, Ph).
【０１６２】
CR(An):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.22 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.39 (s, 9H, C(CH3)3); 1.65-2.10 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.20-3.60 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3.85-4.05 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.25 (m, 1H, NCHC(O)); 4.50-4.95 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.90 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.04 (d, 2H, Ph); 7.30 (d, 1H, CCH=CHN); 8.00 (d, 1H, CCH=CHN); 8.03 (d, 2H, Ph).
【０１６３】
TR:
1H-NMR(DMSO-d6): 1.22 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.39 (s, 9H, C(CH3)3); 1.65-2.20 (m, 4H, CHCH2CH2P); 1.75 (s, 3H, C=CCH3); 2.90-3.50 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.90-4.10 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.18 (m, 1H, NCHC(O)); 4.45-4.65 (m, 2H, NCH2C(O)); 6.86 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.37 (s, 1H, NCH=C).
【０１６４】
PR:
1H-NMR(DMSO-d6): 1.20 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2); 1.38 (s, 9H, C(CH3)3); 1.46-2.30 (m, 4H, CHCH2CH2P); 3.00-3.45 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.50-3.75 (m, 2H, CCH2C(O)); 3.80-4.00 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.22 (m, 1H, NCHC(O)); 7.10-7.30 (m, 5H, Ph).
【０１６５】
［実施例１０］
不斉中心でＳ立体配置を有するさらなる一般式ＩＩの化合物の製造
Ｒ立体配置を有する一般式ＩＩの化合物の製造方法を、Ｓ立体配置を有する一般式ＩＩの対応する化合物の製造に同様に適用する。ここに、（Ｒ）−２，５−ジヒドロ−３，６−ジメトキシ−２−イソプロピルピラジンを、実施例１に記載の合成における出発材料として使用し、以下の合成を記載と同様に行う。
【０１６６】
JS(Z):
1H-NMR(DMSO-d6): 1.32 (t, 6H, P(O)(OCH2CH3)2), 1.42 (s, 9H, C(CH3)3); 1.60-2.50 (m, 4H, CHCH2CH2P,), 3.10-3.55 (m, 4H, NCH2CH2N); 3.65-3.90 (m, 2H, NCH2C(O)); 4.00-4.15 (m, 4H, P(O)(OCH2CH3)2); 4.20 (m, 1H, NCHC(O)); 5.24 (s, 2H, OCH2Ph); 6.80 (m, br, 1H, C(O)NHCH2); 7.27 (d, 1H, C=CHN); 7.30-7.50 (m, 5H, Ph).
【０１６７】
［実施例１１］
本発明の化合物の一般的な合成の明細
固相ペプチド合成を用いた、不斉中心を有する対応する一般式ＩＩの化合物及び／又は不斉中心を持たない対応する一般式ＩＩの化合物及び／又はアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体及び／又は蛍光マーカーの逐次的な連結により、本発明の化合物を製造する。
【０１６８】
これに関連して、以下の合成プロトコールを適用する。工程１：１０ｍｇの樹脂（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂、０.５４ｍｍｏｌ／ｇ）をジクロロメタン中で３時間予め膨潤する。工程２：合成サイクルの開始：ジクロロメタンで４回洗浄する。工程３：ＴＦＡ及びｍ−クレゾール（９５：５）との反応によるＢｏｃ基の切断。反応時間：それぞれ３分間２回。
工程４：ジクロロメタンで５回洗浄する。
工程５：ＮＭＰで５回洗浄する。
工程６：４当量の対応する保護された一般式ＩＩの化合物又は対応するように保護されたアミノ酸をそれぞれ、３.８当量のＨＡＴＵ及び９当量のＮＭＭを用いてＮＭＰ及びピリジン（２：１）中で１分間予め活性化する。
工程７：活性化された一般式ＩＩの保護化合物及び対応するように保護されたアミノ酸をそれぞれ固相と反応させる：１.カップリング；時間：３０分）。
工程８：ＮＭＰで４回洗浄する。
工程９：ジクロロメタンで１回洗浄する。
工程１０：工程６〜８を繰り返す（２.カップリング）。
工程１１：ニンヒドリンを使用してカップリング効率を試験する（カイザー試験；カイザー試験で陽性の結果を示す場合、対応する保護された一般式ＩＩの化合物を使用して工程６〜８を繰り返す必要がある）。
工程１２：カイザー試験で陰性の結果を示した後、反応のシーケンスを、Ａｃ２Ｏ、ＮＭＰ、及びピリジン（１：１５：２５）の溶液でそれぞれ４分間２回キャッピングする。
工程１３：ＮＭＰで５回洗浄する。
工程１４：最終の対応する保護された一般式ＩＩの化合物とのカップリングまで合成サイクル（工程２〜１３）を繰り返す。
その後、最終の対応するように保護されたアミノ酸とのカップリングまで合成サイクルを所望により繰り返す（工程２〜１３）。
工程１５：最終の対応する保護された一般式ＩＩの化合物のカップリング後又は対応するように保護されたアミノ酸それぞれのカップリング後、Ｂｏｃ基の最終切断のための工程２〜５ならびに工程１２及び１３（事前にカイザー試験を行わない）を最終キャッピングのために行う。
工程１６：ジクロロメタンで５回洗浄する。
工程１７：乾燥のためにジエチルエーテルで５回洗浄する。
【０１６９】
カルボン酸末端で樹脂に結合する一般式Ｉの化合物を得る。
【０１７０】
樹脂からの本発明の化合物の切断：
本発明の化合物を有する樹脂を、アンモニア水溶液（Ｈ２Ｏ中に２８〜３０重量％のＮＨ３）中にて６０℃で２０時間撹拌する。切断した樹脂を、その後濾過し、濾液を真空で濃縮し、乾燥させる。粗生成物を、メタノール及び水を用いたＲＰ−Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製する。本発明の化合物を、無色固体として収率約５０％で得る。本発明の化合物の分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって明らかにする。
【０１７１】
［実施例１２］
本発明の化合物のリンカーを用いた一般的な合成の明細
固相ペプチド合成を用いた、一般式ＩＩの化合物又は不斉中心を持たない市販の非保護の若しくはＺ保護された一般式ＩＩの化合物それぞれ、又はアミノ酸及び適したリンカーモノマーの逐次的な連結により、リンカーを有する本発明の化合物を製造する。
【０１７２】
合成プロトコール：
工程１：１０ｍｇの樹脂（Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−ＭＢＨＡ樹脂、０.５４ｍｍｏｌ／ｇ）をジクロロメタン中で３時間予め膨潤する。
工程２：合成サイクルを開始する：ジクロロメタンで４回洗浄する。
工程３：ＴＦＡ及びｍ−クレゾール（９５：５）との反応によってＢｏｃ基を切断する。反応時間：それぞれ３分間２回。
工程４：ジクロロメタンで５回洗浄する。
工程５：ＮＭＰで５回洗浄する。
工程６：４当量の対応する保護された一般式ＩＩの化合物又は対応するように保護されたアミノ酸をそれぞれ３.８当量のＨＡＴＵ及び９当量のＮＭＭでＮＭＰ及びピリジン（２：１）中で１分間予め活性化する。
工程７：活性化された一般式ＩＩの保護化合物又は対応するように保護されたアミノ酸をそれぞれ、固相と反応させる（１.カップリング；時間：３０分）。
工程８：ＮＭＰで４回洗浄する。
工程９：ジクロロメタンで１回洗浄する。
工程１０：工程６〜８を繰り返す（２.カップリング）。
工程１１：ニンヒドリンを使用してカップリング効率を試験する（カイザー試験；カイザー試験で陽性の結果を示す場合、対応する保護された一般式ＩＩの化合物を使用して工程６〜８を繰り返す必要がある）。
工程１２：カイザー試験で陰性の結果を示した後、反応シーケンスを、Ａｃ２Ｏ、ＮＭＰ、及びピリジン（１：１５：２５）の溶液でそれぞれ４分間２回キャッピングする。
工程１３：ＮＭＰで５回洗浄する。
工程１４：リンカーｅｇ１（８−アミノ−２，６−ジオキサオクタン酸）のカップリングまでの合成サイクル（工程２〜１３）を繰り返す。
工程１５：リンカーのカップリング：ジクロロメタンで４回洗浄する。
工程１６：ＴＦＡ及びｍ−クレゾール（９５：５）との反応によってＢｏｃ基を切断する。反応時間：それぞれ３分間を２回。
工程１７：ジクロロメタンで５回洗浄する。
工程１８：ＮＭＰで５回洗浄する。
工程１９：４当量のｅｇ１を３.８当量のＨＡＴＵ及び９当量のＮＭＭでＮＭＰ及びピリジン（２：１）中で１分間予め活性化する。
工程２０：活性化されたリンカーを固相と反応させる（１.カップリング；時間：３０分）。
工程２１：ＮＭＰで４回洗浄する。
工程２２：ジクロロメタンで１回洗浄する。
工程２３：工程１９〜２１を繰り返す（２.カップリング）。
工程２４：ニンヒドリンを使用してカップリング効率を試験する（カイザー試験；カイザー試験で陽性の結果を示す場合、工程１９〜２１を繰り返す必要がある）。
工程２５：カイザー試験で陰性の結果を示した後、Ａｃ２Ｏ、ＮＭＰ、及びピリジン（１：１５：２５）の溶液でそれぞれ４分間２回キャッピングする。
工程２６：ＮＭＰで５回洗浄する。
工程２７：（ｅｇ１）３に関して合成工程（工程１５〜２６）を２回繰り返す。
工程２８：最終の対応する保護された一般式ＩＩの化合物とのカップリングまで合成サイクル（工程２〜１３）を繰り返す。その後、最終の対応するように保護されたアミノ酸とのカップリングまで合成サイクルを所望により繰り返す（工程２〜１３）。
工程２９：最終の対応する保護された一般式ＩＩの化合物又は対応するように保護されたアミノ酸のカップリング後、それぞれ、Ｂｏｃ基の最終切断のための工程２〜５及び工程１２及び１３（事前にカイザー試験を行わない）を最終キャッピングのために行う。
工程３０：ジクロロメタンで５回洗浄する。
工程３１：乾燥のためにジエチルエーテルで５回洗浄する。
【０１７３】
カルボン酸末端で樹脂に結合する一般式Ｉの化合物を得る。
【０１７４】
樹脂からの本発明の化合物の切断：
本発明の化合物を有する樹脂を、アンモニア水溶液（Ｈ２Ｏ中に２８〜３０重量％のＮＨ３）中にて６０℃で２０時間撹拌する。次いで、切断した樹脂を濾過によって分離し、濾液を真空で濃縮し、乾燥する。粗生成物を、メタノール及び水を用いてＲＰ−Ｃ１８カラムを通す分取ＨＰＬＣによって精製する。リンカーを有する本発明の化合物が、無色固体として収率５０％で得られる。リンカーを有する本発明の化合物の分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって明らかにする。
【０１７５】
［実施例１３］
さらなる配列の例
さらなる本発明の化合物を、実施例１１又は実施例１２の一般的な合成の明細によって製造する。
【０１７６】
Ac-ε(L)TML-ARTRCRCRTRTRCRCRARGRTRGRGRTRCR-OH
Ac-ε(L)TML-CRCRCRTRCRARCRTRTRGRARTRTRTRAR-OH
Ac-ε(L)TML-ARtCRgTRcTRaARgGRtCRaGR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-CRgTRtGRaARcARcGRcCRaTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ARtCRaGRaGRgARgCRtTRgGR-Gly-NH2
Ac-TRCRGRCRTRGRCRCRARARARGRARGRTR-OH
Ac-ε(L)TML-TRCRGRCRTRGRCRCRARARARGRARGRTR-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-tCRgCRtGRcCRaARaGRaGRt-Gly-NH2
FLu-ε(L)TML-tCRgCRtGRcCRaARaGRaGRt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-cCRtGRtCRtCRtCRaGRtARc-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-GRtCRtCRtCRaGRtARcARaTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-GRCRTRCRCRTRCRGRCRCRCRTRTRGRCR-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-GRCRTRCRCRTRCRGRCRCRTRTRTRGRCR-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ARGRCRTRCRCRTRCRGRCRCRCRTRTRGRCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-tCRaCRcARtGRgTRgGRcGRaCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-aGRcTRcCRtCRgCRcCRtTRgCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-tGRgTRcGRgGRgTRaGRcGRgCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-cTRgCRaCRgCRtGRcCRgTRcCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-gTRtCRtGRcTRgGRtARgTRgGR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-CRTRTRCRGRCRARCRTRCRAR-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-cTRtCRgCRaCRtCRa-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-cTRtCRgCRaCRtCRa-eg1-eg1-eg1-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-cTRtCRgCRaCRtCRa-eg1-eg1-eg1-tJStJS-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-cTRtCRgCRaCRtCRa-eg1-eg1-eg1-tJRtJR-Gly-NH2
Ac-GRCRTRGRCRCRARARARGRARGRTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-tcgcTRGRCRCRARARARgagt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-TRCRGRctgccaaagARGRTR-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-tcgctgccaaagARGRTR-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-TRCRGRctgccaaagagt-ε(L)TML-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-ε(L)TML-TRCRgctgCRCRaaagaGRTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-TRcgCRtgCRcaARagARgt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ε(L)TML-TRcgctgcCRaaagagRTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-tcgctgCRCRaaagagt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-tcgcTRgccaaARgagt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-TRcgctgccaaagagTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-tcgctgccaaagagTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-TRcgctgccaaagagt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-tcgctgccARaagagt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-gGRcTRcCRcARaARgARtCRtTR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-TRcGRgARgCRcARgCRcCRcTRt-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-GRtARtTRcARgTRgTRgARtGRa-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-gCRtARtTRaCRcTRtARaCRcCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-gCRaARaTRtCRtTRaTRtCRcCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-ARaARtCRaGRgGRtTRaGRgTR-Gly-NH2
Flu-ε(L)TML-ARaARtCRaGRgGRtTRaGRgTR-Gly-NH2
c-ε(L)TML-cGRcCRtTRaTRcCRgTRaGRcCR-Gly-NH2
Flu-ε(L)TML-cGRcCRtTRaTRcCRgTRaGRcCR-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-CRgTRgTRcTRgTRgTRtGRtARg-Gly-NH2
Ac-ε(L)TML-cARcGRtARtGRcTRtCRgTRcTR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-tARtTRaCRtTRcTRgGRgCRtGR-Gly-NH2
LiRho-(ε(L)TML)4-tARtTRaCRtTRcTRgGRgCRtGR-Gly-NH2
LiRho = Lissamine Rhodanin B (Sulforhodamine B)
Ac-(ε(L)TML)4-cTRcTRtGRaTRaARaTRtTRgAR-Gly-NH2
LiRho-(ε(L)TML)4-cTRcTRtGRaTRaARaTRtTRgAR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-tGRgTRgARaARtTRgCRtGRcCR-Gly-NH2
LiRho-(ε(L)TML)4-tGRgTRgARaARtTRgCRtGRcCR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gARgCRtCRtTRcGRtCRgCRtGR-Gly-NH2
LiRho-(ε(L)TML)4-gARgCRtCRtTRcGRtCRgCRtGR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-cTRcCRaTRtARtCRaTRtCRtCR-Gly-NH2
LiRho-(ε(L)TML)4-cTRcCRaTRtARtCRaTRtCRtCR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-cCRcTRgGRtGRtGRtARgTRtCR-Gly-NH2
LiRho-(ε(L)TML)4-cCRcTRgGRtGRtGRtARgTRtCR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-ARgCRtcctcGRcCRcTRtGRc-Gly-NH2
TxRed-(ε(L)TML)4-ARgCRtcctcGRcCRcTRtGRc-Gly-NH2
TxRed = Texas Red (Sulforhodamine 101)
Ac-(ε(L)TML)4-ARgCRtCRcTRcGRcCRcTRtgc-Gly-NH2
TxRed-(ε(L)TML)4-ARgCRtCRcTRcGRcCRcTRtgc-Gly-NH2
Ac-((L)Lys))4-GRtARtTRcARgtgtgARtGRa-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-GRtARtTRcARgtgtgARtGRa-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gtatTRcARgtgtgARtGRa-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-cGRcCRtTRatccgTRaGRcCR-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)4-gCRtARtTRcccttARaCRcCR-Gly-NH2
TxRed-(L-Lys)4-gCRtARtTRaccttARaCRcCR-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-gCRtARtTRaccttARaCRcCR-Gly-NH2
TxRed-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-gCRtARtTRaccttARaCRcCR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gCRtARtTRaccttARaCRcCR-Gly-NH2
TxRed-(ε(L)TML)4-gCRtARtTRaccttARaCRcCR-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-acttGRaARttcgtARtCRc-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-acttGRaARttcgtARtCRc-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-acttGRaattcgtARtCRc-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-acttGRaattcgtARtCRc-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gtgtARTARcacggARaTRa-Gly-NH2
Flu-(ε(L)TML)4-gtgtARtARcacggARaTRa-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-gtgtARtARcacggARaTRa-Gly-NH2
Flu-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-gtgtARtARcacggARaTRa-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gtgtARtacacggARaTRa-Gly-NH2
Flu-(ε(L)TML)4-gtgtARtacacggARaTRa-Gly-NH2
2 Ac-(ε(L)TML)4-ctgcTRgCRtgctgCRtGRc-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-ctgcTRgCRtgctgCRtGRc-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-ctgcTRgctgctgCRtGRc-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-ctgcTRgctgctgCRtGRc-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-agctCRcTRcggtaGRgTRc-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-agctCRcTRcggtaGRgTRc-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-agctCRctcggtaGRgTRc-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-agctCRctcggtaGRgTRc-Gly-NH2
Ac-gtccCRtGRaagatGRtCRa-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gtccCRtGRaagatGRtCRa-Gly-NH2
Ac-gtatTRcARgtgtgARtGRa-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gtatTRcARgtgtgARtGRa-Gly-NH2
Ac-gtcgCRtGRtctccGRcTRt-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gtcgCRtGRtctccGRcTRt-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-ctccARtGRgtgctCRaCRt-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-ctccARtGRgtgctCRaCRt-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-ggctCRcCRaaagaTRcTRt-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-ggctCRcCRaaagaTRcTRt-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-tcggARgCRcagccCRcTRt-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-tcggARgCRcagccCRcTRt-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-tcccARgCRgtgcgCRcARt-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-tcccARgCRgtgcgCRcARt-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-catcCRcARgcctcCRgTRt-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-catcCRcARgcctcCRgTRt-Gly-NH2
Ac-(ε(L)TML)4-gtcgCRtGRtctccGRcTRt-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-gtcgCRtGRtctccGRcTRt-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-gtcgCRtGRtctccGRcTRt-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-ctgcTRgCRtgctgCRtGRc-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-ctgcTRgCRtggctgCRtGRc-Gly-NH2
Ac-L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-agctCRcTRcgcccTRtGRc-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-agctCRcTRcgcccTRtGRc-Gly-NH2
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Arg)-(L-Lys)-(L-Val)-gcgtGRtGRggaagGRcARg-Gly-NH2
Ac-(DEPABS)2-Gly-gcgtGRtGRggaagGRcARg-Gly-NH2
DOTA-ε(L)TML-CRaGRtTRaGRgGRtTRaGR-Gly-NH2
【０１７７】
［実施例１４］
立体化学的に不均一なオリゴマーと比較した本発明の化合物のより強力なアンチセンス効果
ＨＩＶ−１−ＮＬ４−３株に慢性感染したＨ９細胞を、既に産生されたウイルスを除去するために、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄する。細胞を、１０４細胞／ウェル、１サンプル当り４ウェルの９６ウェルプレート中の本発明の化合物又はリトナビルをそれぞれ含むか含まない２００μｌの培養培地中で、異なる濃度でインキュベートする。インキュベーション５日後、４０μｌの細胞懸濁液を、各４ウェルから採取し、４０μｌのＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０で不活化する。
【０１７８】
ｐ２４ＧＡＧ抗原の量を、ウィーンのInstitute for Applied Microbiologyの標準的な方法に従った定量的ＥＬＩＳＡアッセイ（サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ−ビオチン−ストレプトアビジン−ＨＲＰ）によって決定する。標準として、既知量のｐ２４を有するサンプルを使用して、検量線を詳細に調べる。
【０１７９】
これに関連して、立体化学的に不均一な配列ＴＣＧＣＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＴ−ＮＨ２のオリゴマーの場合、未処理サンプルと比較して、２１％のｐ２４量の減少が観察され得る。配列ＴＲＡＲＧＲＡＲＧＲＣＲＴＲＴＲＣＲＣＲ−ＮＨ２を有する本発明のより短い化合物は、減少量が３６％に増加した。
【０１８０】
［実施例１５］
２つの子世代にわたるＨＩＶに対する有効性
ヒトＣＤ４＋Ｔ−リンパ球（Ｍ８１６６）を、本発明の化合物と２４時間プレインキュベーションし、その後にＨＩＶに感染させる（一次感染）。
【０１８１】
６日後、新規に形成されたＨＩウイルスを有する上清を、遠心分離によって細胞から分離する。標準的な方法に従って測定することができる範囲でその後の感染（二次感染）中にＨＩＶの増殖が得られるように、上清を必要に応じて希釈する（約１：５０００）。その後、非感染細胞（Ｍ８１６６）に、希釈上清由来のＨＩＶを感染させ、さらに６日後に定量的ｐ２４  ＥＬＩＳＡ試験を用いてｐ２４量を測定する。
【０１８２】
本実験では、その配列のためにＨＩＶ  ＲＮＡに結合することができる有効なＨＩＶ配列（適合）を有する本発明の化合物を使用する。さらに、その配列がＨＩＶ  ＲＮＡへの結合について適合を示さない（不適合）本発明の化合物を使用する。二次感染後の定量的ｐ２４ＥＬＩＳＡ試験から得た測定値を、本発明の化合物を使用しなかったポジティブ対照から得られた測定値と相関させ、結果を次表にまとめた。
【０１８３】
【表１】
2009544776.tif 000017
【０１８４】
しかし、二次感染後、ＨＩＶ配列を有する本発明の化合物について、２つの最も高い使用濃度でｐ２４濃度の明らかな減少を検出することができる。
【０１８５】
［実施例１６］
標的配列を有する細胞中における本発明の化合物の蓄積
本発明の化合物は、相補ＤＮＡ又はＲＮＡ配列をそれぞれ有する細胞中に驚くほどに強力に蓄積する。
【０１８６】
対応する実験では、化合物が相補ＤＮＡ又はＲＮＡ配列にそれぞれ結合することができるＨＩＶ配列を有する本発明の化合物を、フルオレセイン（Ｆｌｕ）で標識した。
一旦ＨＩＶ感染ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｍ８１６６）及び非感染ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｍ８１６６）を、これらの標識した本発明の化合物とインキュベートする。
【０１８７】
各細胞のＦＡＣＳ分析は、相補ＤＮＡ又はＲＮＡ配列がそれぞれ存在する場合、ＨＩＶ感染細胞中でＨＩＶ配列を有する本発明の化合物の有意により高い蓄積を示す。
【０１８８】
図２では、本発明の化合物Ｆｌｕ−εＴＭＬ−ＴＲＣＲＧＲＣＲＴＲＧＲＣＲＣＲＡＲＡＲＡＲＧＲＡＲＧＲＴＲ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を使用した対応する結果を示す。
【０１８９】
［実施例１７］
本発明における異なる化合物の細胞透過性の比較
実施例１６と同様に設定した実験を使用して、各不斉中心で残基Ｒ１が置換された本発明の化合物の細胞透過性を、各第２の不斉中心で残基Ｒ１が水素原子に置換された本発明の化合物の細胞透過性と比較する。
【０１９０】
各細胞のＦＡＣＳ分析は、本発明の化合物の２つの群の間の細胞透過性の相違を示さない。
【０１９１】
図３では、本発明の化合物Ｆｌｕ−εＴＭＬ−ＴＲＣＲＧＲＣＲＴＲＧＲＣＲＣＲＡＲＡＲＡＲＧＲＡＲＧＲＴＲ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を使用した対応する結果を示す。
【０１９２】
図４では、本発明の化合物Ｆｌｕ−εＴＭＬ−ｔＣＲｇＣＲｔＧＲｃＣＲａＡＲａＧＲａＧＲｔ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を使用した対応する結果を示す。
【０１９３】
［実施例１８］
メダカの胃腸管組織及び浮袋組織中の本発明の化合物の検出
メダカを、本発明の化合物ＴｘＲｅｄ−（εＴＭＬ）４−ＡＲＧＣＲＴＣＲＣＴＲＣＧＲＣＣＲＣＴＲＴＧＣ−Ｇｌｙ−ＮＨ２の１００μＭ溶液中に２日間飼育し、次いで、新鮮な水に移す。その後、新鮮な水への移動後１日目、２日目及び５日目にメダカ内の本発明の化合物の分布を、蛍光顕微鏡下で詳しく調べる。写真は、５日後でさえも本発明の化合物を胃腸管中に検出することができることを示す。
【０１９４】
図５は、対応する蛍光顕微鏡写真を示す。
【０１９５】
［実施例１９］
本発明の化合物での経静脈治療によるマウス中のコレステロール、ＡｐｏＢ１００及びＡｐｏＢ４８のｉｎ  ｖｉｖｏでの減少  ＡｐｏＢ１００の標的配列に適合する配列を示す本発明の化合物Ａｃ−（εＴＭＬ）４−ｇｔａｔＴＲｃＡＲｇｔｇｔｇＡＲｔＧＲａＧｌｙ−ＮＨ２を、マウスにおけるその薬理学的有効性に関して調査した。ネガティブ対照として、純粋なＰＢＳ緩衝液の注射を使用した。これに関連して、マウスに、３つの異なる濃度（２５ｍｇ／ｋｇ、１２.５ｍｇ／ｋｇ、６.２５ｍｇ／ｋｇ）の有効な本発明の化合物（ＰＢＳ緩衝液中に溶解）又は対照緩衝液を、０.１ｍｌずつ１日１回静脈内に３日間連続して投与した。４日目に、マウスから血液サンプルを採取し、コレステロール、ＡｐｏＢ１００及びＡｐｏＢ４８の含有量に関して調査した。次の表の値は、ＰＢＳのみで処置したマウスに関するコレステロール及びＡｐｏＢ１００の濃度を示す。
【０１９６】
【表２】
2009544776.tif 000018
【０１９７】
この結果は、マウスの血中のコレステロール、ＡｐｏＢ１００及びＡｐｏＢ４８の明確且つ濃度に依存性の減少を実証する。
【０１９８】
［実施例２０］
癌に対する本発明の化合物の有効性
Ｈｅｒ２／ｎｅｕの標的配列に適合する配列を示す本発明の化合物Ａｃ−εＴＭＬ−ＴＲｃＧＲｇＡＲｇＣＲｃＡＲｇＣＲｃＣＲｃＴＲｔ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現する細胞株ＭＤＡ４５３のその増殖阻害作用に関して調査した。ネガティブ対照として、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの標的配列に適合する配列を示さない本発明の化合物Ａｃ−εＴＭＬ−ｃＧＲｃＣＲｔＴＲａＴＲｃＣＲｇＴＲａＧＲｃＣＲ−Ｇｌｙ−ＮＨ２及び無処置ＭＤＡ４５３対照細胞を使用した。
【０１９９】
１日目に、５０００個〜１００００個のＭＤＡ４５３細胞を、９６ウェルプレートに播種した。２日目に、本発明の適合配列又は本発明の対照配列をそれぞれ１μＭの濃度で添加する。３日目、４日目、及び５日目に、細胞培地を取り替え、１μＭの濃度の本発明の化合物を含む新鮮な培地とそれぞれ置換する。ヨウ化プロピジウムを用いた各ウェル中のＤＮＡ含有量の決定によって増殖阻害作用を特定する。
【０２００】
【表３】
2009544776.tif 000019
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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