(57)【要約】本発明は、物質のファルネシル経路に対する干渉の程度を測定するために使用できる、新規のバイオマーカーに関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、物質がステロイド代謝に干渉する程度を測定する方法：
以下の式のフェリニン誘導体の有無を、該物質で処置された被験体の体液、および無処置の組織または組織抽出物中において測定する段階であって、ファルネシル二リン酸の産生に対する干渉の程度が測定され、該フェリニン誘導体の存在は物質がステロイド代謝に干渉することを示し、該フェリニン誘導体の欠如は物質がステロイド代謝に干渉しないことを示す、段階：
2009532686.tif 000006
式中、R、R'、R''、およびR'''は独立に、H、CH3、COCH3、COH、OCH3、OC2H5、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、メチオニン、リン酸、またはピロリン酸である。
【請求項２】
干渉が、尿、血漿または血清である体液において測定される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
フェリニン誘導体が、γ-グルタミルフェリニルグリシン（3-メチルブタノールグルタチオン）、フェリニルグリシン、フェリニンまたはN-アセチルフェリニンである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
以下の段階を含む、アミノビスホスホネート化合物で処置された被験体においてイバンドロネートとゾレドロネートとを識別する方法：
以下の式のフェリニン誘導体の有無を、該物質で処置された被験体の体液、無処置の組織または組織抽出物中において測定する段階であって、該フェリニン誘導体の欠如は被験体がイバンドロネートまたはゾレドロネートのいずれにより処置されたかを示す、段階：
2009532686.tif 000007
式中、R、R'、R''、およびR'''は独立に、H、CH3、COCH3、COH、OCH3、OC2H5、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、メチオニン、リン酸、またはピロリン酸である。
【請求項５】
体液が、尿、血漿または血清である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
フェリニン誘導体が、γ-グルタミルフェリニルグリシン（3-メチルブタノールグルタチオン）、フェリニルグリシン、フェリニンまたはN-アセチルフェリニンである、請求項4または5記載の方法。
【請求項７】
以下の式のフェリニン誘導体の、ビスホスホネート誘発性腎毒性のマーカーとしての使用：
2009532686.tif 000008
式中、R、R'、R''、およびR'''は独立に、H、CH3、COCH3、COH、OCH3、OC2H5、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、メチオニン、リン酸、またはピロリン酸である。
【請求項８】
フェリニン誘導体が、γ-グルタミルフェリニルグリシン（3-メチルブタノールグルタチオン）、フェリニルグリシン、フェリニンまたはN-アセチルフェリニンである、請求項7記載の使用。
【請求項９】
以下の式のフェリニン誘導体の、翻訳後タンパク質プレニル化における変化のマーカーとしての使用：
2009532686.tif 000009
式中、R、R'、R''、およびR'''は独立に、H、CH3、COCH3、COH、OCH3、OC2H5、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、メチオニン、リン酸、またはピロリン酸である。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ビスホスホネート系薬剤および特にアミノビスホスホネートは、メバロン酸経路の鍵酵素であるファルネシル二リン酸（FPP）合成酵素を阻害する（Green JR, Bisphosphonates: preclinical review. The Oncologist 2004; 9(Suppl4):3-13（非特許文献1））。この酵素の阻害によりタンパク質のプレニル化が低下する（Rogers MJ, Gordon S, Benford HL, Coxon FP, Luckman SP, Monkkonen J, Frith JC. Cellular and molecular mechanisms of action of bisphosphonates. Cancer. 2000;88(12 Suppl):2961-2978（非特許文献2））。結果として、FPPの産生および上記のようにスクアレンおよびステロール（コレステロール）の生合成が影響を受ける。ファルネシルまたはゲラニルゲラニル基のタンパク質のシステインアミノ酸残基への転移を含む、シグナル伝達タンパク質のイソプレニル化もまた妨害される。イソプレニル化は、細胞の生存、細胞骨格の組織化および癌の進行の基礎をなす多くの代謝経路に含まれるいくつかの鍵タンパク質の完全な活性化に必要な翻訳後修飾である（Green JR. Bisphosphonates: preclinical review. The Oncologist 2004; 9(Suppl4):3-13（非特許文献1）; Wakeling AE. Inhibitors of growth factor signaling. Endocr Relat Cancer. 2005 Jul;12 Suppl 1:S183-187（非特許文献3））。ビスホスホネートが干渉する経路は、例えばReszka and Rodan, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, Vol 4, p. 712, Figure 3（非特許文献4）に記載されている。
【０００２】
フェリニン（2-アミノ-7-ヒドロキシ-5,5-ジメチル-4-チアヘプタン酸）（HOOCCH(NH2)CH2SC(CH3)2CH2CH2OH）は、雄のネコの尿中に大量に存在することが知られている、重要なイオウ含有アミノ酸である。フェリニンは、雌のネコを引き付けるために設計された雄性ホルモンとしての役割を果たすと想定されてきた（Hendriks Wh, Woolhouse AD, Tertelin MF, Moughan PJ (1995b) Synthesis of felinine, 2-amino-7-hydroxy-5,5-dimethyl-4-thiaheptanoic acid. Bioorg Chem 23: 89-100（非特許文献5））。今までのところ、フェリニンはネコ以外の種に存在することが示されていない。
【０００３】
近年イエネコの血中において、フェリニンの誘導体であるγ-グルタミルフェリニルグリシン（γ-glutamylfelinylglycine）の腎代謝産物が同定された（W. H. Hendricks, D. R. Harding, K. J. Rutherfuurd-Marwick (2004) Isolation and characterization of renal metabolites ofγ-glutamylfelinylglycine in the urine of the domestic cat (Felis catus), Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 139, 245-251（非特許文献6））。このトリペプチドは、他の動物種におけるグルタチオン-S-抱合体と同様に腎臓で代謝される。前述の遊離型のフェリニンの存在に加えて、N-アセチルフェリニン、フェリニルグリシンおよび未改変のγ-グルタミルフェリニルグリシンを含むいくつかのフェリニン含有代謝産物がネコの尿中に示された。ネコにおけるγ-グルタミルフェリニルグリシンの腎代謝は、他の動物種のグルタチオン-S-抱合体と同様に一般的に起きるものの、フェリニルグリシンが検出されることは、わずかな相違が存在するであろうことを示唆する。
【０００４】
【非特許文献１】Green JR, Bisphosphonates: preclinical review. The Oncologist 2004; 9(Suppl4):3-13
【非特許文献２】Rogers MJ, Gordon S, Benford HL, Coxon FP, Luckman SP, Monkkonen J, Frith JC. Cellular and molecular mechanisms of action of bisphosphonates. Cancer. 2000;88(12 Suppl):2961-2978
【非特許文献３】Wakeling AE. Inhibitors of growth factor signaling. Endocr Relat Cancer. 2005 Jul;12 Suppl 1:S183-187
【非特許文献４】Reszka and Rodan, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, Vol 4, p. 712, Figure 3
【非特許文献５】Hendriks Wh, Woolhouse AD, Tertelin MF, Moughan PJ (1995b) Synthesis of felinine, 2-amino-7-hydroxy-5,5-dimethyl-4-thiaheptanoic acid. Bioorg Chem 23: 89-100
【非特許文献６】W. H. Hendricks, D. R. Harding, K. J. Rutherfuurd-Marwick (2004) Isolation and characterization of renal metabolites ofγ-glutamylfelinylglycine in the urine of the domestic cat (Felis catus), Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 139, 245-251
【発明の開示】
【０００５】
発明の説明
本発明は、化合物がどの程度ステロイド代謝に干渉するかを測定する方法で使用され得る新規のバイオマーカーに関連する。該バイオマーカーは、フェリニンとして公知の2-アミノ-7-ヒドロキシ-5,5-ジメチル-4-チアヘプタン酸の任意の天然の誘導体であり得る。そのような誘導体は以下の式の化合物を含む：
2009532686.tif 000002
式中、R、R'、R''、およびR'''は独立に、H、CH3、COCH3、COH、OCH3、OC2H5、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、メチオニン、リン酸、またはピロリン酸である。
【０００６】
マーカーの好ましい態様は、γ-グルタミルフェリニルグリシン（3-メチルブタノールグルタチオン）、フェリニルグリシン、フェリニンまたはN-アセチルフェリニンである。
【０００７】
本明細書における前述のマーカーは、以下の段階を含む、物質のステロイド代謝への干渉の程度を測定する方法で使用される：
該物質で処置された被験体の体液、および無処置の組織または組織抽出物中における該マーカーの有無を測定する段階であって、N-アセチルフェリニンの存在は物質がステロイド代謝に干渉することを示し、N-アセチルフェリニンの欠如は物質がステロイド代謝に干渉しないことを示す、段階。
【０００８】
体液は血液、血漿、血清または尿のような任意の身体由来の液体でよい。無処置の組織は、本発明による分析に先立って身体から摘出される任意の種類の組織である。組織抽出物は、当技術分野において周知の抽出方法を用いて得られた、身体から摘出された組織由来の任意の抽出物である。本明細書において記載された方法は、身体より摘出された後のサンプル（体液、無処置の組織、組織抽出物）に対して実施される、エクスビボ、インサイチューまたはインビトロの方法である。
【０００９】
本発明の一つの態様において、ファルネシル二リン酸の産生に対する干渉の程度が測定される。好ましくは、体液は尿、血漿、または血清である。最も好ましい態様において、被験体の尿中のN-アセチルフェリニンの有無が測定される。
【００１０】
「ステロイド代謝への干渉の程度」という用語は、FPPの阻害のように、フェリニン誘導体の生成とステロイド代謝との相関性に関連する。そのため、より高いレベルのフェリニン誘導体は、強い干渉（例えば、より強いFPP阻害）と相関し、低いまたは検出不能レベルのフェリニン誘導体は、より弱い干渉（例えば、異なる阻害機構に起因する可能性があり、例えばタンパク質のプレニル化のより弱い阻害につながる、よりわずかなFPP阻害）と相関する。このように、フェリニン誘導体の生成とファルネシル二リン酸の生成との間に相関性が存在する。
【００１１】
本明細書において使用される「被験体」という用語は任意の哺乳動物に関連し、好ましくはヒトの被験体に関連する。しかしながら、本明細書に記載のいかなる方法も、被験体の身体に対して直接実施されるものではないことが理解されなければならない。従って、それらはインビボの方法ではない。
【００１２】
N-アセチルフェリニンは、異なるビスホスホネートである、イバンドロネートおよびゾレドロネートの識別に使用可能であることが見出された。
【００１３】
ビスホスホネートは、ピロリン酸の類似体であって、ジェミナル(geminal)酸素が炭素に置換されている（Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, Vol 4, p. 712, Figure 1参照）。
【００１４】
イバンドロネートの構造は、Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, Vol 4, p. 712, Figure 2を参照。
【００１５】
ゾレドロネートの構造は、Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, Vol 4, p. 712, Figure 2を参照。
【００１６】
両者ともFPP合成酵素を阻害可能であり、従ってステロール合成に干渉するが、その程度は異なる。そのため、所定の時間間隔においては、イバンドロネート刺激では尿中N-アセチルフェリニン濃度は検出限界以下であるものの、ゾレドロネート刺激は尿中の高レベルのN-アセチルフェリニンの原因となることが見出された。従って、本発明により、イバンドロネートまたはゾレドロネートで処置された被験体においてイバンドロネートとゾレドロネートとを識別する方法も提供され、該方法は、該物質で処置された被験体の体液、無処置の組織または組織抽出物中におけるN-アセチルフェリニンまたは別のフェリニンの天然誘導体の有無を測定する段階であって、N-アセチルフェリニンまたは別のフェリニンの天然誘導体の欠如は被験体がイバンドロネートまたはゾレドロネートのいずれにより処理されたかを示す段階を含む。好ましくは、身体の抽出物は尿、血漿、または血清である。最も好ましい態様において、N-アセチルフェリニンの有無が被験体の尿において測定される。
【００１７】
同定および定量は、NMRまたはLC/GC-MSのどちらかにより達成される。
【００１８】
本発明により、N-アセチルフェリニンまたは任意の天然のフェリニン誘導体が、ビスホスホネート誘発性毒性、特に腎毒性のマーカーとしても使用可能である。ゾレドロネートで処置された動物において、腎および肝毒性が病理組織診断で観察されたが、イバンドロネートでは観察されなかった。
【００１９】
さらに本発明は、シグナル伝達タンパク質の翻訳後タンパク質プレニル化における変化のマーカーとしての、以下の式のフェリニン誘導体の使用を提供する：
2009532686.tif 000003
式中、R、R'、R''、およびR'''は独立に、H、CH3、COCH3、COH、OCH3、OC2H5、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、メチオニン、リン酸、またはピロリン酸である。
【００２０】
多くの代謝経路がタンパク質のプレニル化に依存している。そのため、タンパク質のプレニル化の減少はそれらの代謝経路に影響を及ぼす。
【００２１】
実施例
1.1 試験系
試験系：Crl:CD（登録商標）(SD)IGS.BR (SPF) Sprague Dawleyラット
原理：全てのコメット試験に対する標準系統
供給元：Charles River Deutschland GmbH Sulzfeld / Germany
グループの配分：グループ1〜5：それぞれ雄10匹
総動物数：雄50匹
送達時週齢：約6週齢（処置開始時8週齢）
識別：ケージカードおよび耳部の刺青
無作為化：コンピューターにより作成された無作為アルゴリズム
【００２２】
1.2 配分
2009532686.tif 000004
*対照動物は賦形剤のみを投与。
【００２３】
1.3 飼育
標準的な実験室条件に調整。空調は1時間当たりの換気回数10〜15回、気温22±3℃および相対湿度30〜70％の設定範囲で環境を連続的に監視した。12時間蛍光灯/12時間消灯の周期で、照明時間中は音楽を流した。
【００２４】
飼育設備：
順化期間の大部分は、個別に標準軟材床敷（'Lignocel' Schill AG、CH-4132 Muttenz / Switzerland）を用いて金網メッシュ蓋付きMakrolon type-3飼育ケージで飼育し、同様に順化期間中の3日間（7日前、4日前、1日前）および全サンプリング期間は、個別に代謝ケージ（>300 g、Tecniplast, Italy）で飼育した。
【００２５】
食餌：
Purina chow 5002 保証付きげっ歯類用飼料非ペレットタイプ(PMI（登録商標） Nutrition International、LLC P.O. Box 19798、Brentwood、MO 63144 U.S.A.)を不断給餌。順化期間開始より動物に供給した。
【００２６】
飲料水：
Itingenの地域水道水を不断給水。代表的な細菌学的、化学的および汚染解析の結果は、Appendix Iに提示。pp.110〜113を参照。
【００２７】
1.4 試験品目
化合物1：イバンドロネート生理食塩水溶液
化合物2：ゾレドロネート生理食塩水溶液
対照/賦形剤：生理食塩水溶液（0.9％）
【００２８】
1.5 尿サンプリング
尿サンプルは、下記のサンプリングスケジュールの間隔で、代謝ケージにおいて0〜4℃で（Tecniplast sampling/cooling unitで自動的に冷蔵される）アジ化セシウム（1％）溶液1mlを含むサンプルチューブに採取された。分注前に尿体積が測定された。
2009532686.tif 000005
*このサンプルについては下記の通り、追加の特別な尿解析を行った。サンプリング期間終了後、直ちに体積が測定され、サンプルは3000 u/分 [500g]で10分間遠心分離された。
【００２９】
1.6 NMRおよびLC-MSによるN-アセチルフェリニンの測定
尿サンプル中のN-アセチルフェリニンは、1次元および2次元NMRスペクトルに基づいて同定された。スペクトルは、600.13MHzにおいてはBruker AV 600スペクトロメーターで、500.13MHzにおいてはBruker DRX-500スペクトロメーターで取得された。尿サンプルは、他の記載（Keun, H. C.; Ebbels, T. M. D.; Antti, H.; Bollard, M. E.; Beckonert, O.; Schlotterbeck, G.; Senn, H.; Niederhauser, U.; Holmes, E.; Lindon, J. C.; Nicholson, J. K. Chem. Res. Toxicol. 2002, 15, 1380-1386）に従って調製および測定ならびにデータ評価を行った。
【００３０】
尿の400マイクロリットルのアリコートをウェルプレートに移す。尿のpHを調節するため、200マイクロリットルの緩衝液（約0.2MのNa2HPO4/NaH2PO4、約1 mMのTSP (3-トリメチルシリル-D4-プロピオン酸)、約3mMのアジ化ナトリウム）が各ウェルに加えられる。不溶物を除くため、調製されたウェルプレートは4℃において約3,000 rpmで5〜10分間遠心分離される。
【００３１】
メタボノミクス解析用の1H NMRスペクトル（例えば、500 Mhz、データポイント数64k、スペクトル幅12019.2 Hz）は300Kで測定された。水の共鳴を抑制するため、標準のパルスシークエンスを用いた（例えば、noesypr1d、照射はリラグゼーションディレイ2秒および混合期100ミリ秒）。各サンプルに、ノイズに対して十分に高いスペクトルを提供するのに必要なだけ多くのトランジェントが加えられた。適合する窓関数（例えば、lb=1）を用いてフーリエ変換を行い、続いて（自動または手動で）位相調整およびベースライン補正を行った。加えたTSP（0.0ppmと定義する）に対して参照を行った。Bruker XWinNMR 3.5ソフトウェアを用いて、スペクトルの取得および処理を実施した。
【００３２】
記録された各スペクトルは、統計分析の簡略化のためにサイズを縮小された（例えば、245変数の標準プロトコールに従って記録されたNMRスペクトルは、0.2〜10.0ppmの間の等距離積分で計算される）。解析の前に、誤解しやすい情報を含む範囲（例えば、溶媒、尿素は4.5から6.0ppmまでの範囲を覆う）は、除外または重ね合わされた（例えば、2.66から2.74ppmの範囲はクエン酸の指標となる値として機能する）。尿素濃度の変動を考慮して、すべてのデータが縮小されたスペクトルは一定の100単位の積分された強度に規格化された。
【００３３】
多変量解析によりシグナル、シグナルのパターン、およびそれらから導き出される代謝物を同定するが、それらは個体および個体群の間で有意に異なる。それによって広範囲のPCA（主成分分析）が、有意なシグナルのパターン同定、および、これらのパターンのサンプルおよびサンプル群への割り当てに用いられる。PLS（潜在構造分析、部分最小二乗法）もシグナルの有意なパターンを見出すために用いられ、これにより、主成分分析とは対照的に、投与群の情報は有意な変化の同定を促進するために用いられる。内部の代謝物データベースの活用、パスウェイマッピング処理（KEGGデータベース）の活用、および可能ならば未知の代謝物の分光学的な構造解明の活用により、割り当ては実施される。
【００３４】
N-アセチルフェニリンがゾレドロネートを投与したラットのスペクトルに見出された（図5参照）。1.32ppmのシグナルが1次元NMRで観察され、2次元NMR実験に基づいて構造が解明された（図6参照）。
【００３５】
LC-MS
加えて、N-アセチルフェニリンは尿サンプルのLC-MS実験においても測定された。
【００３６】
尿のLC-MS解析は、エレクトロスプレーインターフェースを装備したBruker Esquire 3000+質量分析装置と連結したAgilent 1100HPLCシステムを用いて実施された。尿サンプルは蒸留水で4倍に希釈され、オーブンで30℃に保たれた150mm×3.9mmのWaters Atlantis dC18 3μm HPLCカラムに、4℃に保たれたウェルプレートから2μlが注入された。カラムは流速1ml/分で溶離され、移動相Aは20mMの酢酸アンモニウムからなり、移動相Bはアセトニトリルからなる。100％A相5分間で開始された勾配溶離は、15分間で95％B相まで直線的に増加させ、3分間95％B相で保持し、1分で100％A相まで戻し、それから次のサンプルを注入する前、最終5分間再平衡化した。質量分析装置は、ネガティブモードにおいて、ドライガス流速8リットル/分、噴霧器圧力27気圧および乾燥温度330℃で操作された。機器は、質量範囲m/z 50から800まで得られるように設定された。N-アセチルフェリニンは、この条件で保持時間9.6分、予測されたm/z 248（図8参照）で、ゾレドロネートを投与したラットのサンプル中に見出された。MS/MS実験は、予測されたフラグメントm/z 119を明らかにした。LC-MSにおいてN-アセチルフェリニンはポジティブモードでも測定可能である。ここで対応するM+H+の質量はm/z 250であることが見出される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図1a、b：ネコにおけるN-アセチルフェリニンの合成経路。ネコ種のN-アセチルフェリニンの合成経路が報告された。2種の合成が提案され、いずれもイソペンテニル（ステロイド合成に関連）を必要とする。一方の合成は腎臓で起きると考えられ、他方の合成は肝臓で始まると考えられ、それによってトリペプチドは血液を介して腎臓へ輸送されN-アセチルフェリニンへ代謝される。黄色の囲みは、腎臓にあると考えられる構造および反応を示し、青色の囲みは、肝臓で起きると考えられる反応を示し、赤紫色の囲みは、血液により肝臓から腎臓へ輸送されるトリペプチドを示す。肝臓での合成と純粋な腎臓での合成との区別は、血漿中のトリペプチドを探すことにより可能なはずである。
【図２】投与前の3匹のラットのNMRスペクトル。
【図３】図3a〜c：クレアチニンに対する1.32ppmの値（N-アセチルフェリニンのメチルシグナル）の経時変化。注：イバンドロネートを投与したラットは1.32ppmの値の増加を示さない。
【図４】図4a〜c：ラット尿のNMRスペクトルの統計的解析で、1.32ppmの重要なシグナルが明らかとなった。
【図５】投与96時間後の3匹のラットのNMRスペクトル：ゾレドロネートを投与したラットでのみ1.32ppmに新たなシグナルが見られる。
【図６】N-アセチルフェリニンの構造解明のための、ゾレドロネート6mg/kgを投与されたラット尿の2次元1H、13C HMBCスペクトル。
【図７】ラット尿のLC-MS検討：ラット対照群；N-アセチルフェリニンの予測された質量（ネガティブモードにおけるm/z 248）にシグナルは見られない（緑に抽出されたイオンクロマトグラム、中央の室温9.6分のMS出力）。
【図８】ラット尿のLC-MS検討：ゾレドロネート6mg/kg投与ラット群、投与後96時間；N-アセチルフェリニンの予測された質量（ネガティブモードにおけるm/z 248）に強いシグナルが見られる（赤に抽出されたイオンクロマトグラム、中央の室温9.6分のMS出力）。MS/MSは予測されたフラグメントパターンを示す（m/z 119）。
【図９】ラット尿のLC-MS検討：イバンドロネート3mg/kg投与ラット群、投与後96時間；N-アセチルフェリニンの予測された質量（ネガティブモードにおけるm/z 248）にシグナルは見られない。
【図１０】ラット尿のLC-MS検討：N-アセチルフェリニンを投与したラット対照群；N-アセチルフェリニンの予測された質量（ネガティブモードにおけるm/z 248）に強いシグナルが見られる。
【図１ａ】
2009532686.tif 000010
【図１ｂ】
2009532686.tif 000011
【図２】
2009532686.tif 000012
【図３ａ】
2009532686.tif 000013
【図３ｂ】
2009532686.tif 000014
【図３ｃ】
2009532686.tif 000015
【図４ａ】
2009532686.tif 000016
【図４ｂ】
2009532686.tif 000017
【図４ｃ】
2009532686.tif 000018
【図５】
2009532686.tif 000019
【図６】
2009532686.tif 000020
【図７】
2009532686.tif 000021
【図８】
2009532686.tif 000022
【図９】
2009532686.tif 000023
【図１０】
2009532686.tif 000024
【国際調査報告】
2009532686.tif 000025