(57)【要約】  反応混合物内での光損傷緩和剤の混和および／または光損傷の閾値期間より短い期間における反応混合物の異なる観察領域の問い合わせのうちの１つもしくは複数により、照明された分析反応物内の１種もしくは複数種の反応物の光損傷を低減しおよび／または阻止するための組成物、デバイス、システムおよび方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の反応物、
第２の反応物、および
光損傷緩和剤を含有する組成物であって、励起照明下での前記第１の反応物と前記第２の反応物の相互作用により、前記光損傷緩和剤の非存在下で前記第１の反応物に対して光損傷が引き起こさせる、組成物。
【請求項２】
前記第１の反応物が第１の制限量で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の反応物が２００ｎＭ未満で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の反応物が１０ｎＭ未満で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１の反応物が１０ｐＭ未満で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１の反応物が表面上に固定化される請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記表面が光学的拘束のある表面を含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記光学的拘束がゼロモード導波路を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の反応物が第１の領域内に拘束される請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の領域内に固定化された前記第１の反応物の分子が１〜３個存在する請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の領域が光学的拘束を含む請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記光学的拘束がゼロモード導波路を含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１の反応物が酵素を含み、かつ前記第２の反応物が前記酵素に対する蛍光または蛍光発生基質を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記光損傷緩和剤が三重項状態の消光剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記光損傷緩和剤が抗酸化剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記光損傷緩和剤が脱酸素剤または消光剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記光損傷緩和剤が、アスコルビン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、没食子酸ｎ−プロピル、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ヒドロキノン、ナトリウムアジド（ＮａＮ３）、ジアゾビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、トロロックス、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびシクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）よりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記光損傷緩和剤が酸素枯渇酵素（ｏｘｙｇｅｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記酸素枯渇酵素が、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびプロトカタショート３，４ジオキシゲナーゼから選択される酵素を含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記光損傷緩和剤がグルコース−オキシダーゼ／カタラーゼ酵素系を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
カタラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼよりなる群から選択される過酸化物枯渇酵素（ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）をさらに含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記光損傷緩和剤が、エルゴチオネイン、メチオニン、システイン、ｂｅｔａ−ジメチルシステイン、ヒスチジン、トリプトファン、メルカプトプロピオニルグリシン、ＭＥＳＮＡ、グルタチオン、ジチオトレイトール、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、リコピン、ｇａｍｍａ−カロチン、アスタザンチン、カンタザンチン、ａｌｐｈａ−カロチン、ｂｅｔａ−カロチン、ｇａｍｍａ  カロチン  ビキシン、ゼアキサンチン、ルテイン、ビリルビン、ビリベルジン、トコフェロール、ポリエンジアルデヒド、メラトニン、α−琥珀酸トコフェロールおよびその類似体、ピリドキシネルおよびその誘導体、ヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、ならびにヒドロキシルアミンよりなる群から選択される少なくとも第１の作用物質を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記光損傷緩和剤がジチオトレイトールおよびメルカプトエチルアミンよりなる群から選択される少なくとも第１の作用物質を含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
拘束された酵素、
前記酵素に対する基質、および
光損傷緩和剤
を含有する組成物であって、前記酵素と前記基質との励起照明下での相互作用により、前記光損傷緩和剤の非存在下で前記酵素への光損傷が引き起こされる、組成物。
【請求項２５】
前記基質が蛍光または蛍光発生基質を含む請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記光損傷緩和剤が三重項状態の消光剤を含む請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記光損傷緩和剤が脱酸素剤または消光剤を含む請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記光損傷緩和剤が、ジチオトレイトールおよびメルカプトエチルアミンよりなる群から選択される少なくとも第１の作用物質を含有する請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記光損傷緩和剤がグルコース−オキシダーゼ／カタラーゼ酵素系を含む請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記拘束された酵素が基板の表面に固定化される請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記光損傷緩和剤が、アスコルビン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、没食子酸ｎ−プロピル、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ヒドロキノン、ナトリウムアジド（ＮａＮ３）、ジアゾビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、トロロックスおよびその誘導体、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびプロトカタショート３，４ジオキシゲナーゼ、エルゴチオネイン、メチオニン、システイン、ｂｅｔａ−ジメチルシステイン、ヒスチジン、トリプトファン、メルカプトプロピオニルグリシン、ＭＥＳＮＡ、グルタチオン、ジチオトレイトール、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、リコピン、ｇａｍｍａ−カロチン、アスタザンチン、カンタザンチン、ａｌｐｈａ−カロチン、ｂｅｔａ−カロチン、ｇａｍｍａ  カロチン  ビキシン、ゼアキサンチン、ルテイン、ビリルビン、ビリベルジン、トコフェロール、ポリエンジアルデヒド、メラトニン、α−琥珀酸トコフェロールおよびその類似体、ピリドキシネルおよびその誘導体、ヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、ならびにヒドロキシルアミンよりなる群からの少なくとも１種の作用物質を含有する請求項２４に記載の組成物。
【請求項３２】
拘束された酵素、
前記酵素に対する基質、および
光損傷緩和剤
を含有する組成物であって、前記酵素と前記基質との励起照明下での相互作用により、前記第１の反応物への光損傷が引き起こされる、組成物。
【請求項３３】
観察領域を有する基質、
前記観察領域内に固定化された第１の反応物、
前記観察領域内に配置された第２の反応物、および
前記観察領域内に配置された光損傷緩和剤
を含有するデバイスであって、励起照明下での前記第１および第２の反応物の相互作用により、前記第１の反応物への光損傷が引き起こされる、デバイス。
【請求項３４】
照明反応を行う方法であって、
反応混合物が上に配置された基質を提供するステップと、
前記基質上の前記反応混合物を、励起照明を用いて照明するステップと、
を含み、
前記反応混合物は第１の反応物、第２の反応物および光損傷緩和剤を含有し、前記光損傷緩和剤は、場合により前記光損傷緩和剤の非存在下で生じることになる励起照明下での前記第１の反応物と前記第２の反応物との相互作用に起因する、前記第１の反応物に対する光損傷の量を低減する、方法。
【請求項３５】
前記反応混合物を照明する間、前記第１および第２の反応物の間の反応を監視するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記光損傷緩和剤が、アスコルビン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、没食子酸ｎ−プロピル、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ヒドロキノン、ナトリウムアジド（ＮａＮ３）、ジアゾビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、トロロックスおよびその誘導体、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびプロトカタショート３，４ジオキシゲナーゼ、エルゴチオネイン、メチオニン、システイン、ｂｅｔａ−ジメチルシステイン、ヒスチジン、トリプトファン、メルカプトプロピオニルグリシン、ＭＥＳＮＡ、グルタチオン、ジチオトレイトール、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、リコピン、ｇａｍｍａ−カロチン、アスタザンチン、カンタザンチン、ａｌｐｈａ−カロチン、ｂｅｔａ−カロチン、ｇａｍｍａ  カロチン  ビキシン、ゼアキサンチン、ルテイン、ビリルビン、ビリベルジン、トコフェロール、ポリエンジアルデヒド、メラトニン、α−琥珀酸トコフェロールおよびその類似体、ピリドキシネルおよびその誘導体、ヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、およびヒドロキシルアミンよりなる群から選択される作用物質を含有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
酵素反応を行う方法であって、
第１の観察領域内に酵素を提供するステップと、
前記酵素を、前記酵素に対する蛍光または蛍光発生基質と接触させるステップと、
光損傷閾値期間より短い期間において前記第１の観察領域に励起放射を誘導しかつそこからシグナルを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項３８】
少なくとも第２の観察領域で、前記提供するステップ、前記接触させるステップ、および前記誘導するステップを繰り返すことを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
塩基伸長反応を監視する方法であって、
第１の観察領域内にポリメラーゼ酵素を提供するステップと、
前記ポリメラーゼを少なくとも第１の蛍光または蛍光発生ヌクレオチド類似体と接触させるステップと、
光損傷閾値期間より短い期間において励起放射を伴う照明に応答して前記第１の観察領域から放射される蛍光シグナルを監視するステップと、
を含む、方法。
【請求項４０】
光損傷を受けやすい照明反応を、光損傷閾値期間より長い期間において照明される場合に分析するためのシステムであって、
前記反応用の試薬が上に配置された基板と、
前記基板を支持しかつ前記基板を受けるように構成された実装ステージと、
前記基板の少なくとも一部と光通信状態にあるように位置決めすることで前記基板の前記一部を照明しかつそこから放射されるシグナルを検出する光学トレインと、
前記光学トレインおよび前記基板のうちの一方を他方に対して移動させるための、前記実装ステージまたは前記光学トレインに作動可能に連結されるトランスレーションシステムと、
を含む、システム。
【請求項４１】
酵素反応を行う方法であって、
観察領域内に酵素を提供するステップと、
少なくとも第１の光損傷緩和剤の存在下、励起照明下で前記酵素を、前記酵素に対する蛍光または蛍光発生基質と接触させるステップと、
を含む、方法。
【請求項４２】
塩基伸長反応を監視する方法であって、
観察領域内にポリメラーゼ酵素を提供するステップと、
少なくとも第１の光損傷緩和剤の存在下で前記ポリメラーゼを少なくとも第１の蛍光または蛍光発生ヌクレオチド類似体と接触させるステップと、
励起放射を伴う照明に応答して前記観察領域から放射される蛍光シグナルを監視するステップと、
を含む、方法。
【請求項４３】
少なくとも第１の酵素および前記第１の酵素に対する蛍光または蛍光発生基質を含有する反応混合物を監視する方法であって、
励起照明下での前記酵素と前記蛍光または蛍光発生基質の相互作用により前記酵素の活性の低下がもたらされ、光損傷閾値期間より短い第１の期間において第１の観察領域に励起放射を誘導するステップを含む、方法。
【請求項４４】
前記第１の期間後、前記光損傷閾値期間より短い第２の期間において第２の観察領域に前記励起放射を再誘導するステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
基板の第１の選択領域内に活性分子を局在化する方法であって、
前記分子が表面上に非選択的に配置された基板を提供するステップと、
前記基板の前記表面上に光増感剤を提供するステップと、
前記基板の前記第１の選択領域以外の１つもしくは複数の領域を、前記第１の選択領域以外の領域内で前記活性分子を非活性化するのに十分な前記光増感剤を活性化するのに十分な光に暴露するステップと、
を含む、方法。
【請求項４６】
前記活性分子がタンパク質を含有する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記活性分子が核酸を含有する請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記タンパク質が酵素を含有する請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記酵素が核酸ポリメラーゼを含有する請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記光増感剤が活性化される場合に一重項酸素を生成する請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記光増感剤が、クロリンｅ６、ポルフィマーナトリウム、ジスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン、ヒペリシン、ローズベンガル、ヒポクレリンＡ、ヒポクレリンＢ、マラカイトグリーン、メロシアニン５４０、量子ドット、Alexa 633、Alexa 647、テトラフェニルポルフィン、フタロシアニン、セルコスポリンから選択される作用物質を含有する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１つもしくは複数の領域を光に暴露する前記ステップが、光による前記第１の選択領域に対する損傷を阻止するステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
１つもしくは複数の領域を光に暴露する前記ステップが、前記１つもしくは複数の領域を、マスクを通して照明するステップを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記基板が、透明基板上に配置されたクラッド層および前記クラッド層を通して前記透明基板の方に配置された複数のコアを含むゼロモード導波路のアレイを含み、かつ１つもしくは複数の領域を光に暴露する前記ステップが、前記クラッド層の上面を、前記コアを通って前記透明層の方に伝播することのない光で照明するステップを含み、ここで前記第１の選択領域が前記透明基板上の前記コア内に配置されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも第１の表面を有する基板と、
前記第１の表面上に非選択的に配置された活性分子と、
前記第１の表面上に配置された光増感剤と、
を含むデバイス。
【請求項５６】
少なくとも第１の表面を有する基板と、
前記第１の表面上に非選択的に配置された活性分子と、
前記第１の表面上に配置された光増感剤と、
前記基板の前記第１の表面に光学的に連結され、かつ、前記光増感剤を活性化するのに十分な前記基板の前記第１の表面の選択領域を、前記基板の他の選択領域を照明することなく選択的に照明するように構成される照明系と、
を含む、系。
【請求項５７】
活性分子を伴う反応を分析する方法であって、
少なくとも第１の表面を有する基板、前記第１の表面上に非選択的に配置された活性分子、および前記第１の表面上に配置された光増感剤を提供するステップと、
前記第１の表面の選択領域を照明し、前記光増感剤を活性化しかつ非選択領域内ではなく前記選択領域内で前記活性分子を非活性化するステップと、
前記非選択領域内で前記活性分子の反応を観察するステップと、
を含む、方法。
【請求項５８】
前記活性分子がポリメラーゼ酵素であり、かつ前記反応が鋳型による核酸合成を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記基板がゼロモード導波路のアレイを含み、かつ、前記第１の表面の選択領域を照明する前記ステップが、ゼロモード導波路の前記アレイ上のクラッド層の上面を、前記ゼロモード導波路のコアを通って伝播することのない周波数の光で照明するステップを含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年１２月２日出願の米国特許出願第１１／２９３，０４０号明細書の一部継続出願であり、このすべての開示は本明細書により、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
連邦政府によって後援を受けた研究に関する声明
本発明の一部は、ＮＨＧＲＩ  Ｇｒａｎｔ  Ｎｏ．１  Ｒ０ｌ  ＨＧ００３７１０−０１下で政府資金で行われ、政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
光学的に検出可能な標識基、特に高い量子収量を有する標識基、例えば蛍光基または化学発光基は、分析化学、生化学および生物学の分野を通してあらゆる所で用いられている。特に所定の反応に関連した極めて可視的なシグナルを提供することにより、その反応ならびにその反応における任意の潜在的なエフェクターをより十分に監視することができる。かかる分析は、ゲノミクスにおけるライフサイエンス研究、診断学、医薬研究、および関連分野における基本的なツールである。
【０００４】
これまでかかる分析は、反応量が光学的事象の有害作用であれば全く注目されないと思われるほどに過剰であるという条件下で一般に行われてきた。例えば、蛍光標識基に基づくかかる分析は一般に反応混合物に向けた励起放射源の使用を必要とし、それにより蛍光標識基が励起され、次いでそれらは別々に検出可能である。しかし、化学的反応物および生化学的反応物の、単独でまたは他の成分、例えば蛍光基の存在下でかかる光源に持続的に暴露することで、かかる反応物、例えばタンパク質、酵素、基質または同種のものに対して潜在的に損傷がもたらされうる。しかし、先に言及したように、かかる反応における既存の形式から、一般にかかる効果はいずれも課題とされにくいか、そればかりか注目されにくい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、かかる光損傷の有害作用が所定の分析工程に対してより著しい作用を有することになるように、先行するフォーマットから逸脱した種々の分析技術が探求されつつある。特に、蛍光試薬を含む反応物のリアルタイム分析では、複数の異なる成分が光エネルギーに暴露されうる。さらに反応は、例えばマイクロ流体またはナノ流体の反応容器内またはチャネル内でのあるいは「単一の分子」の分析における漸減量の試薬に基づく。したがって、本発明は、かかる光損傷の有害作用をある程度、阻止または緩和する方法および組成物だけでなく、他の有用なプロセスおよび組成物の中でもかかる方法および／または組成物から利益を得るプロセスを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、一般に、照明反応にて光損傷およびその効果を低減させるおよび／または除去することを目的とした、特に蛍光および／または蛍光発生反応物を用いる組成物、デバイス、システムおよび方法を目的とする。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、第１の反応物、第２の反応物、および光損傷緩和剤(photodamage mitigating agent)を含有する組成物を提供し、ここでは、励起照明下での該第１の反応物と該第２の反応物の相互作用により、光損傷緩和剤の非存在下で第１の反応物に対して光損傷が引き起こされる。
【０００８】
別の態様では、本発明は、拘束された酵素（confined enzyme）、該酵素に対する基質、および光損傷緩和剤を含有する組成物を提供し、ここでは励起照明下での酵素と基質の相互作用により、光損傷緩和剤の非存在下で酵素に対して光損傷が引き起こされる。
【０００９】
本発明のさらなる態様では、拘束された酵素、該酵素に対する基質、および光損傷緩和剤を含有する組成物が提供され、ここでは、励起照明下での酵素と基質の相互作用により、第１の反応物に対して光損傷が引き起こされる。
【００１０】
本発明は、観察領域を有する基板、観察領域内で固定化された第１の反応物、観察領域内に配置された第２の反応物を含むデバイスも提供し、ここでは、励起照明下での第１および第２の反応物の間の相互作用により、第１の反応物に対して光損傷が引き起こされる。かかるデバイスは、観察領域内に配置された光損傷緩和剤も含む。
【００１１】
本発明は照明反応を行う方法をさらに提供する。方法は、典型的には反応混合物がその上に配置された基板を提供するステップを含み、ここでは反応混合物は第１の反応物、第２の反応物および光損傷緩和剤を含有し、光損傷緩和剤は、場合により光損傷緩和剤の非存在下で生じることになる励起照明下での第１の反応物と第２の反応物の相互作用に起因する、第１の反応物に対する光損傷の量を低減する。次いで、反応混合物は励起照明を用いて照明される。
【００１２】
それに関し、本発明は、酵素反応を行う方法であって、第１の観察領域内に酵素を提供するステップと、該酵素を、該酵素に対する蛍光または蛍光発生基質と接触させるステップと、励起放射を、光損傷閾値期間より短い期間において該第１の観察領域に誘導しかつそこからのシグナルを検出するステップと、を含む、方法も提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、塩基伸長反応を監視する方法であって、第１の観察領域内にポリメラーゼ酵素を提供するステップと、該ポリメラーゼを少なくとも第１の蛍光または蛍光発生ヌクレオチド類似体と接触させるステップと、光損傷閾値期間より短い期間において励起放射を伴う照明に応答して該第１の観察領域から放射される蛍光シグナルを監視するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１４】
さらに他の態様では、本発明は、光損傷閾値期間より長い期間において照明される場合に光損傷を受けやすい照明反応を分析するためのシステムであって、該反応用の試薬がその上に配置された基板と、該基板を支持しかつ該基板を受けるように構成された実装ステージと、該基板の少なくとも一部と光通信状態にあるように位置決めすることで該基板の一部を照明しかつそこから放射されるシグナルを検出する光学トレインと、該光学トレインのうちの一方および他方に対する該基板を移動させるための該実装ステージまたは該光学トレインに作動可能に連結されるトランスレーションシステムと、を含む、システムを提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、酵素反応を行う方法であって、観察領域内に酵素を提供するステップと、少なくとも第１の光損傷緩和剤の存在下、励起照明下で該酵素を、該酵素に対する蛍光または蛍光発生基質と接触させるステップと、を含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明の方法は、塩基伸長反応の監視に用いられうる。かかる場合、方法は、観察領域内にポリメラーゼ酵素を提供するステップと、少なくとも第１の光損傷緩和剤の存在下で該ポリメラーゼを少なくとも第１の蛍光または蛍光発生ヌクレオチド類似体と接触させるステップと、励起放射を伴う照明に応答して該観察領域から放射される蛍光シグナルを監視するステップと、を含む。
【００１７】
さらに他の態様では、本発明は、少なくとも第１の酵素および該第１の酵素に対する蛍光または蛍光発生基質を含有する反応混合物を監視する方法であって、第１の光損傷閾値期間より短い期間において第１の観察領域に励起放射を誘導するステップを含む、方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、光損傷事象の利用(exploiuting)により、基板の第１の選択領域内に活性分子を局在化する方法を提供する。特に、かかる方法は、分子が表面上に非選択的に配置された基板を提供するステップと、該基板の表面上に光増感剤を提供するステップと、を含む。次いで、該基板の第１の選択領域以外の１つもしくは複数の領域は、該第１の選択領域以外の領域内で該活性分子を非活性化するのに十分な光増感剤を活性化するのに十分な光に暴露される。
【００１９】
それに関し、本発明は、少なくとも第１の表面を有する基板、該第１の表面上に非選択的に配置された活性分子、および該第１の表面上に配置された光増感剤を含むデバイスを提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、該基板の該第１の表面に光学的に連結され、かつ、該基板の他の選択領域を照明することなく、該光増感剤を活性化するのに十分な該基板の第１の表面の選択領域を選択的に照明するように構成された照明系と組み合わされた上記の基板を含む系を提供する。
【００２１】
本発明は、活性分子を伴う反応を分析する方法であって、少なくとも第１の表面を有する基板、該第１の表面上に非選択的に配置された活性分子、および該第１の表面上に配置された光増感剤を提供するステップと、該第１の表面の選択領域を照明し、該光増感剤を活性化しかつ非選択領域内ではなく該選択領域内で該活性分子を非活性化するステップと、該非選択領域内で該活性分子の反応を観察するステップと、を含む、方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、改善された照明反応、特に蛍光または蛍光発生反応物を用いる反応、かかる反応にて存在する様々な反応物の効果を軽減しおよび／またはそれらに対する光損傷を低減する反応を行う方法を目的とする。本発明は、かかる光損傷を阻止または低減するための方法、ならびにかかる光損傷が全体的分析に対して有する可能性がある作用を軽減するための方法、ならびにこれらの組み合わせを含む。
【００２３】
本発明は、一般に化学基、例えばフルオロフォアの十分な照明および／または光活性化変換または励起を必要とする種々の光学アッセイのいずれかに対して適用可能である一方、光損傷を受ける可能性があると思われる、極めて制限された濃度の反応物を用いる分析にて最大の有用性が見出される。理解されるように、かかる試薬の限られた分析では、重要な試薬における何らかの分解が、試薬のさらなる制限により分析に大きく影響を与えることになる。本発明の目的として、光損傷という用語は、一般に望ましい反応における１種もしくは複数種の試薬に対する照明の任意の直接的または間接的作用を示し、それにより結果としてその反応に対して負の作用がもたらされる。そのようであれば、光損傷は、例えば蛍光分子の光退色など、望ましい反応におけるその試薬の反応性を低減するか、またはそれ以外として例えば所定の反応においてより特異性の低い試薬を作製することによってかかる反応における有用性を低下させるように、所定の試薬中での直接的な光誘起変化を含むことになる。同様に、光損傷は、その試薬と別の光誘起反応の生成物との相互作用によって引き起こされる試薬中での負の変化、例えば蛍光励起事象の間における有機もしくは他の試薬、例えばタンパク質を損傷しうる一重項酸素の生成を含むことになる。
【００２４】
本発明で有利とされる分析における特に適切な一例として、特に、単一の核酸分子の配列決定分析、単一の分子の酵素分析、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、抗体アッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイなどを含む単一の分子の生物学的分析で挙げられ、この場合、主な入ってくる試薬は、光変換／励起が生じつつもそれに生成物の生成を伴う環境下で、比較的集光された光源、例えばレーザーまたは他の集光された光源、すなわち水銀、キセノン、ハロゲンもしくは他のランプによる持続的な照明に暴露される。
【００２５】
核酸分析に関しては、基質として蛍光ヌクレオチド類似体を用いる核酸の鋳型による合成（template directed synthesis）では、かかる条件下での持続的な照明によりポリメラーゼにおけるかかるＤＮＡの合成能力の実質的低下がもたらされることが観察されている（図３Ａおよび実施例１を参照）。ポリメラーゼ酵素、鋳型配列および／またはプライマー配列において損傷にとどまらず不活化がなされることにより、ポリメラーゼにおけるより長い核酸鎖に対するプロセシング能力が著しく損なわれうる。次いで、酵素の進化性(processivity)におけるこの低下は、配列成分を新生鎖へのそれらの取り込みに基づいて同定する配列決定プロセスにおけるリード長の減少をもたらす。遺伝的分析に関して当該技術分野で理解されるように、配列の隣接したリードの長さは、ゲノムＤＮＡのセグメントからゲノム情報を構築する能力に直接的な影響を与える。この光損傷について提起された機構が図１に示される。図示のように、励起波長での電磁放射への暴露によって励起されるフルオロフォアは三重項状態に移行(transition)可能である。次いで、三重項状態のフルオロフォアにおけるそれに続く緩和が反応性酸素種の生成をもたらす可能性があり、次いでフルオロフォアまたはフルオロフォアを処理する酵素、例えばポリメラーゼの一方または両方が損傷されうる。したがって、反応性酸素の形成を阻止するのに脱酸素剤(oxygen scavengers)および／または還元剤が含められる。
【００２６】
一般用語では、本発明は、一般に照明反応分析物の性能を目的とし、ここではかかる分析物は分析の有効性能をさらに許容する期間にわたり照明される。特に好ましい態様では、照明された分析物は、発光物、例えば蛍光反応物および／または生成物の生成、消費および／または変換を評価するための、例えば励起放射で照明されている間に生じつつある分析反応物を示す。
【００２７】
本明細書で用いられる、光損傷が反応物に実質的に作用することで有用でない分析結果がもたらされる前に照明分析が行われうる期間は光損傷閾値期間と称される。本発明に関しては、光損傷閾値期間は、好ましくは、かかる光損傷が、かかる照明の非存在下で同じ反応よりも少なくとも２０％超、より好ましくは５０％超、また場合により９０％超にわたり対象の反応の速度を低下させる、例えば系の反応速度における９０％の低下または所定の期間中に生成される生成物の量における９０％の低下をもたらすように生じるといった照明分析の期間である。光損傷閾値期間内で照明分析を行うことが本発明の目的である。これは一般に別の方法で行われる。第１に、上記のパラメータの範囲内でのかつ本発明またはその態様に従う所定の反応の実施は、光損傷閾値期間より短い期間において反応を行うステップを含みうる。第２に反応は光損傷閾値期間の長さを増加させるように構成されうるか、または第３に反応はこれらのアプローチの組み合わせを含みうる。
【００２８】
上記に対し、文脈によっては「光損傷」反応が偽りの活性によることから要求を上回る活性を示しうることが理解されるであろう。かかる場合であれば、目的の光損傷閾値期間は、かかる偽りの活性が例えば反応速度の増加または非特異的な(non-sppcific)反応速度の増加での測定によると非照明反応を１０％だけ、非照明反応を２０％だけ、非照明反応を５０％だけ、またある場合には非照明反応を９０％だけ上回るという照明分析の期間により特徴づけられることになることが理解されるであろう。あくまで一例として、核酸ポリメラーゼが鋳型による合成の間にヌクレオチドを光損傷事象により不正確に取り込み始める場合であれば、かかる活性は上記のように光損傷閾値期間に影響を与えることになる。
【００２９】
理解されるように、本発明の方法および組成物による阻止対象として研究される光損傷が、単なる蛍光試薬への光損傷、例えば光退色ではなく、かかる蛍光試薬の反応混合物中での量が制限された他の試薬に対する光活性化の下流の作用における阻止または低減を対象とし、したがってその制限された存在がさらに光損傷によるわずかな低下によってもより大いに影響を受け、かつ特に反応タンパク質または酵素は、作用に関する理論に縛られることなく、酵素または反応タンパク質に対する損傷あるいはかかる酵素またはタンパク質と光損傷を受けた試薬の間の不可逆的相互作用を含みうる。上記により示唆されるように、光損傷は、一般に所定の試薬、反応物または同種のものにおける改変を示し、それが原因で、かかる試薬は、所望の反応において、例えば１種もしくは複数種の他の反応物と相互作用しかつそれらに対して損傷を引き起こす反応物を生成する光誘起反応に直接的または間接的に起因する、例えば活性の低下、特異性の低下、または別の分子により作用、変換、もしくは修飾を受ける能力の低下といった改変された機能性を有する。典型的には、かかる光反応は、目的の反応物に直接に作用するか（例えば直接の光損傷）、あるいはかかる目的の反応物に対する１つ、２つまたは３つの反応ステップの中で反応物に作用する。
【００３０】
一般に本明細書中で言及されるかかる制限量の試薬または反応物は溶液中に存在しうるが、濃度は例えば２００ｎＭ未満、ある場合では１０ｎＭ未満、さらに他の場合では１０ｐＭ未満のように極めて制限される。しかし、好ましい態様では、かかる制限量の試薬または反応物は、その所定の領域内に制限量の試薬を提供し、かつ特定の場合にはその所定の領域内にかかる試薬の少数の分子、例えば１〜１０００個の独立分子、好ましくは１〜１０個の分子を提供するように、固定化されるかそうでなければ所定の領域内に限定される反応物を示す。理解されるように、所定の領域内で固定化された反応物の光損傷は、他の損傷を受けていない反応物が遊離することなく拡散し、損傷作用をマスクすることから、その領域の反応性に対して実質的な作用を有することになる。
【００３１】
研究者が光損傷をフルオロフォアに対して限定するための方法および組成物を提供している一方、蛍光試薬の光破壊の存在下でのおよび／またはそれに起因する、酵素系に対する下流の光損傷における負の作用に対して容易に認識または対処されてはいない。考察の便宜上、所定の試薬に対する実際の損傷または損傷を受けた試薬との相互作用のいずれかに起因する光損傷事象における有害な作用は、本明細書では一般に光損傷と称される。
【００３２】
Ｉ．光損傷の阻止
第１の態様では、本発明は、例えば励起放射源での照明の間に１種もしくは複数種の非蛍光反応物に対してもたらされる光損傷の量を低減する方法および組成物を目的とする。特に、かかる組成物の非存在下でのかかる反応と比較して光損傷のレベルの低下（または光損傷閾値期間内での増大）をもたらす組成物が提供される。本明細書で用いられる、かかる作用をもたらすかかる組成物の成分は、一般に光損傷緩和剤と称される。特に、光損傷緩和剤は、光損傷緩和剤が存在する場合以外の通常であれば生じていることになる光損傷のレベルを低下させる（および／または光損傷閾値期間を増大させる）ために分析反応との関連で提供される。
【００３３】
さらに、光損傷緩和剤としての作用物質の定義は、かかる作用物質が実際の光損傷事象に対して有する作用またはその損傷における下流の作用を反映している。そのように、光損傷緩和剤は、１種もしくは複数種の試薬の光損傷を阻止しうるか、または光損傷を受けた試薬が目的の反応において特定の限定された試薬に対して有しうる作用を緩和しうる。一例として、光損傷を受けた蛍光化合物と重要な酵素成分の間の有害な相互作用を遮断する作用物質であれば、それが蛍光試薬に対する初期の光損傷を阻止しなかったという事実にかかわらず、やはり光損傷緩和剤と称されることになる。
【００３４】
光損傷緩和剤の封入またはそれによる処理の結果としての光損傷の低下の尺度は、光損傷のレベルにおける未処理反応を超える低下をもたらすものとして特徴づけられうる。さらに、光損傷における低下の特徴づけでは、一般に処理された反応混合物と未処理の反応混合物の間での例えば酵素活性における反応速度の比較および／または光損傷閾値期間の比較が用いられる。
【００３５】
本発明の場合、本発明の光損傷緩和剤の封入は、系内での反応性、例えば酵素活性の低下を阻止する観点からの測定によると、一般に所定の反応において１種もしくは複数種の反応物における光損傷の低下、すなわちかかる光損傷における少なくとも１０％、好ましくは２０％超、より好ましくは約５０％超の低下、かつ多くの場合には９０％超、最大で９９％超の低下をもたらす。一例としてかつ純粋に例示を目的として、光損傷における低下を光損傷緩和剤の存在および非存在における酵素活性の尺度として言及する場合、光損傷緩和剤の非存在下、照明分析後に５０単位の酵素活性しか有しない反応混合物をもたらすことになる１００単位の酵素活性を有する反応混合物が反応に含まれる場合、光損傷において１０％低下すれば５５単位の最終反応混合物がもたらされることになる（例えば、それ以外で５０単位の１０％が失われるとさらなる低下はないことになる）。
【００３６】
処理に関する特定の理論または機構に縛られることなく、酵素活性に対する光誘起された損傷の少なくとも１つの原因が、特に蛍光試薬の存在下では酵素と光損傷を受けた蛍光試薬との直接の相互作用に起因すると考えられる。さらに、蛍光試薬のこの光損傷（および場合により酵素に対する損傷）が、分子酸素の存在下で三重項状態のフルオロフォアが緩和される間に生成される反応性酸素種により少なくとも部分的に媒介されると考えられる。および光損傷を受けた蛍光試薬および／または反応性酸素種のうちの一方または両方は、光損傷の全体的な有害作用において含められうる。
【００３７】
したがって、少なくとも第１の態様では、本発明は、かかる光損傷をもたらす経路を遮断するかそうでなければ最小化するように機能する１種もしくは複数種の作用物質の照明反応混合物中への封入を目的とする。かかる作用物質は、三重項状態のフルオロフォア（三重項状態の消光剤とも称される）の形成を阻止する還元剤または退色防止剤(anti-fade agents)、ならびに酸素および反応性酸素種を反応混合物から除去することにより系内での酵素に対する下流の損傷を阻止する脱酸素剤(oxygen scavenging agents)を含む。
【００３８】
種々の還元剤または退色防止剤が、例えば、アスコルビン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、没食子酸ｎ−プロピル、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ヒドロキノン、ナトリウムアジド（ＮａＮ３）、ジアゾビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）を含む三重項状態の消光剤、ならびに、Fluoroguard（バイオラッド・ラボラトリーズ(BioRad Laboratories,Inc.)、ヘルキュールズ(Hercules)、カリフォルニア州から入手可能）、Citifluor退色防止剤（シティフロア社(Citifluor,Ltd.)、ロンドン(London)、英国）、ProLong、SlowFade、およびSlowFade Light（インヴィトロジェン(Invitrogen)／モレキュラー・プローブス(Molecular Probes)、ユージン(Eugene)、オレゴン州）などの市販の退色防止剤として用いられうる。
【００３９】
同様に、多数の一重項酸素の消光剤は、例えば酵素系、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、またはこれらと他の酵素、プロトカタショート３，４ジオキシゲナーゼ（protocatachaute 3,4 dioxygenase）（ＰＣＤ）（酸素消費者の単一の酵素）との組み合わせのような過酸化物枯渇酵素(peroxide depleting enzymes)と併用した、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ／カタラーゼ（ＧＯ／Ｃａｔ）、オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ酵素系、例えば、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなど、あるいはチオールベースの消光剤、例えばエルゴチオネイン、メチオニン、システイン、β−ジメチルシステイン（ペニシラミン）、メルカプトプロピオニルグリシン(mercaptopropionylglycine)、ＭＥＳＮＡ、グルタチオン、ジチオトレイトール（還元剤として上記のとおり）、Ｎ−アセチルシステインおよびカプトプリル（例えば、Biochem Soc.Trans.1990 Dec;18(6):1054-6を参照）、イミダゾールを含む反応性酸素種を除去または低減するように用いられうる。さらに、生物学的な一重項酸素の消光剤、例えばリコピン、α，β，およびγ−カロチンならびにそれらの類似体、アンテラキサンチン、アスタザンチン(astazanthin)、カンタザンチン(canthazanthin)（例えば、Carcinogenesis vol.18 no.1 pp.89-92,1997を参照）、ニューロスポレン、ロドピン、ビキシン、ノルビキシン、ゼアキサンチン、ルテイン、ビリルビン、ビリベルジン、およびトコフェロール（例えば、Biochem Soc Trans. 1990 Dec;18(6):1054-6 ref.を参照）、ならびにポリエンジアルデヒド(Carcinogenesis vol.18 no. 1 pp.89-92,1997)メラトニン、ビタミンＥ（α−琥珀酸トコフェロールおよびその類似体）およびＢ６（ピリドキシネル（pyridoxinel）およびその誘導体）が用いられうる。他の化学物質として脱酸素剤、例えばヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、ヒドロキシルアミン、グルタチオン、およびＮ−アセチルシステイン、ヒスチジン、トリプトファンなども使用可能である。上記に加え、多くの場合、一重項酸素の消光剤またはスカベンジャーの量は、例えば試薬の脱気、不活性気体との潅流、またはそれに類するものによる目的の反応からの酸素の物理的除去によって低減または除去されうる。上記に加え、上記化合物に対する追加または代わりとして、抗酸化剤もまた、例えば、ビタミンＥフィチル側鎖、アスコルビン酸（またはアスコルビン酸塩）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＴＨ）などに代わる、カルボキシル置換基または類似体の場合には他の置換基を有する、トロロックスとその類似体のＵ−７８７１５ＦおよびＷＩＮ６２０７９、ビタミンＥの可溶性形態を含む反応混合物中に提供されうる。
【００４０】
本発明によると、光損傷緩和剤が、一般に、液体または固体のいずれかの添加剤としての添加を通じて、あるいは反応が生じている場合の領域内に光損傷緩和剤を予め配置し、および／または固定化することを通じて反応混合物の成分として提供されうる。一例として、目的の反応が特定の領域または位置に拘束される場合、光損傷緩和剤をその領域内にまたはそれに隣接して固定化するかまたはそうでなければ局在化することが望ましい場合がある。同様に、光損傷緩和剤が協調的に機能する成分、例えば二重酵素系を含有する場合、かかる成分を互いにかつ目的の反応に関連させて局在化することが望ましい場合もある。
【００４１】
いくつかの場合では、光損傷緩和剤はその使用可能性を高めるように提供されうる。例えばいくつかの場合では、緩和剤の溶解度は、水性系、例えば多数のカロチノイドの場合には理想を下回る可能性がある。したがって、これらの化合物は、基板または反応ウェルの表面上に固定化状態で提供されるか、あるいは例えば作用物質を水性系中に懸濁させ、さらに反応混合物、例えば溶解された酸素種の関連部分との相互作用を可能にするケージング基(caging groups)内にかかる作用物質を含めることにより、例えば酸素の除去など、それと水性系成分との自由な相互作用を可能にする構成で提供される場合がある。
【００４２】
関連の態様では、また光損傷の緩和またはその作用について本明細書中に記載のステップのいずれかの代わりとしてあるいはそれに加え、本発明は、他の手段による潜在的に損傷を与える酸素種の除去についても提供する。特に他の系と同様、溶解した酸素種は、異なる気体環境下で反応系を提供することにより水性系から流出されうる。特に、例えば、水性反応条件を中性気体環境、例えばアルゴン、窒素、ヘリウム、キセノンまたは同種のものに暴露させることで反応混合物中での過剰な酸素の溶解を阻止することが可能である。系への初期の酸素負荷を低減することにより、例えばポリメラーゼ媒介性のＤＮＡ合成に対する光損傷作用が顕著に低減されることが観察されている。特に好ましい態様では、系はキセノンの大気(atmoshphere)に散布されるか、そうでなければ暴露される。特に、キセノンにおいて双極子の形成が誘発されうることから、それは水性系中での酸素の置換に加え、三重項状態の消光剤として機能しうる（例えば、Vierstra and Poff,Plant Physiol.1981 May;67(5):996-998を参照）。したがって、キセノンであれば、上記のように消光剤としても分類されることになる。
【００４３】
ＩＩ．光損傷作用の緩和
光損傷緩和剤の使用に対しおよび／またはそれに加え、本発明は、予め過剰な光損傷が生じている照明期間の一部の間に単に反応混合物を問い合わせる(interrogating)、例えば蛍光放射を検出することによる、所定の分析作業の結果に対する光損傷の作用を緩和する方法も提供する。このアプローチは、光損傷を受けやすい反応の成分が構造的拘束の存在および／または成分の固定化のいずれかを通じてアッセイプレート上または基板上に空間的に拘束される場合の反応における光学的問い合わせにおいて特に有用である。かかる拘束された試薬の例として、表面に固定化または局在化された試薬、例えば、蛍光走査顕微鏡または走査共焦点顕微鏡、全反射(total internal reflectance)顕微鏡または蛍光測定、表面イメージングまたはそれに類するものにより表面上で問い合わされる、表面に固定化または結合された酵素、抗体などが挙げられる。
【００４４】
本明細書で用いられる基板は、より大きい構造、例えば９６ウェル、３８４ウェルおよび１５３６ウェルプレートなどのマルチウェルプレート内部の平面基板、例えばスライドグラスまたは平面状表面(planar surface)、あるいは間隔が規則的なミクロまたはナノ多孔質基板からの種々の形式のいずれかを含む場合があり、あるいはかかる基板はより不規則な多孔質材料、例えば膜、エーロゲル、繊維性材料または同種のものを含む場合があり、あるいはそれらは微粒子基板、例えば、ビーズ、スフィア、金属または半導体ナノ粒子または同種のものを含む場合がある。さらに、特定の試薬がその自由な移動に対する構造的バリアによって拘束されるかあるいは基板の表面に化学的に繋ぎ止められるかまたは固定化されるかについて本明細書中で考察するため、それは「拘束されるもの」として記載されることになる。
【００４５】
例えば、かかる光損傷が生じうる場合と酵素が基板表面上に固定化される場合での酵素反応の問い合わせにおいて、特定の領域を持続的に暴露する結果、その領域内で固定化された酵素に対する光損傷またはそれにおける「バーンイン」が生じることになる。多くの場合、目的の反応を含む基板の選択領域が問い合わされることになる。考察のため、かかる領域は「観察領域」と称される。
【００４６】
本発明によると、「バーンイン」または少なくともかかるバーンインの効果は、異なる観察領域からの放射シグナルを照明しかつ集光することによって低減または除去される。考察の便宜上、目的の反応からの放射シグナルを照明しかつ集光する作用あるいは目的の反応が生じている場合の特定の観察領域は、その反応および／またはその領域に対する問い合わせと見なされる。理解されるように、基板の新しい観察領域の問い合わせは、領域を新たに照明しかつその新たに照明された領域からの放射シグナルを集光することとなる。言い換えると、新たに照明された領域を問い合わせている限り、バーンインされた領域が依然として照明されつつあるか否かは、その領域をさらに後に問い合わせし直すことを望まない限り、あまり重要ではない。
【００４７】
基板の異なる領域を時間をかけて問い合わせるプロセスは、光損傷を低減するという利点に加え、例えば照明角を変化させることによりレーザースポットサイズを拡大し、例えば細長いレーザースポットサイズを提供するか（例えば米国特許出願第６，８８１，３１２号明細書を参照。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書中に援用される）、または照明に対して基板上での入射光スポットの形状を改変する光学トレインを通過させ、例えば円柱レンズを提供して直線フォーマットで照明をもたらすか、そうでなければ照明を再び集光し、拡大されたスポットのサイズまたは寸法を提供するという照明の性質を修飾することなく使用可能であったと思われる通常の場合よりも大きい基板領域を所定の光源で問い合わせ可能であるという利点ももたらす。上記にもかかわらず、本発明は、場合により拡大された照明領域を提供するかかる光学素子と組み合わされ、それは場合によりかかる拡大された照明特性がその時に基板上で動くことで基板の異なる領域が時間をかけて問い合わされる場合のプロセスに加えて用いられることが理解されるであろう。図５は、基板の異なる領域を問い合わせるための、目的の反応が時間をかけて行われている基板上での問い合わせスポット領域の移動について図示する。理解されるように、基板上で直線状の照明スポットを用いれば、図５に示される環状スポットと比べ、より大きい基板の領域がより迅速に照明されることになる。図５に示されるように、模範的な基板は（ゼロモード導波路の形態での光学的拘束としても機能する）より小さい構造的拘束の複数のアレイを含み、ここではアレイまたはアレイのサブセットの各々は、別々の構造的拘束、例えばマルチウェル基板またはプレート内の１つのウェルといった範囲内に含まれる。理解されるように、問い合わせ機能は、典型的には光損傷閾値期間よりも長くはない延長された期間において所定の領域上で行われる。典型的には、これは１０秒超、好ましくは１分超、より好ましくは５分超、１０分超、２０分超、かつ場合により、２時間超または３時間超またはそれより長い時間であるが依然として光損傷閾値期間よりも短いことになる。
【００４８】
基板の領域上への問い合わせ領域の移動によりさらなる問い合わせ領域を得ることに加え、その領域を移動する能力は、特定の系内または装置内で通常では問い合わされていない可能性がある領域を問い合わせ可能にするように、特定の系内または装置内での基板との機械的インタフェースを調整する能力ももたらす。特に典型的な基板分析の設定では、分析されるべき基板が、その基板の一部が分析ステージの取り付け構造、例えばクリップ、支持構造、またはそれに類するものにより問い合わせから隠されうる場合の分析ステージ上に固定される。しかし、本発明の特定の態様によると、問い合わせ領域の移動により、取り付け構造により隠された基板の一部を、時間をかけて改変する能力がもたらされる。第１の例では、基板の所定の領域に照明をもたらす光学トレインを移動させるのではなく、基板が問い合わせ光学素子に対して移動されうる。これは、種々の操作用ハードウェアまたはロボットの設定のいずれかを用いて行われうる。例えば、光学トレインの問い合わせゾーンを通して基板を精密な方法で進めるステッパー／フィーダー装置が用いられる。かかる正確なフィーダー装置は、高性能印刷技術ならびに半導体産業で用いられるトランスレーショナルロボティクス、例えば分析および製造用途の双方で周知である。かかるステッパー／フィーダーは、基板全体の上位表面に接触するローラーまたはホイールのアセンブリを含む場合があり、回転されることで精密な方法で基板に原動力をもたらし、光学トレインの問い合わせゾーンを通してその基板を送り込む。他の態様では、基板表面の異なる領域を問い合わせるため、ロボットシステムは所定の基板をピックアップし再設定するように用いられうるか、または基板における先に接近できなかった領域を接近可能にしうる。かかるロボットシステムは、一般に例えば、ベックマン(Beckman,Inc.)、テカン(Tecan,Inc.)、キャリパーライフサイエンス(Caliper Life Sciences)などから入手可能である。
【００４９】
本発明によると、本明細書中の他の箇所で示されるように、第１の観察領域内での目的の反応が光損傷閾値期間より短い期間において問い合わされ、次いで第２の異なる観察領域内での目的の反応が問い合わされる。本発明によると、観察については典型的には光損傷を受けやすい拘束された試薬が含まれる。したがって、観察領域は、固定化された試薬、例えば酵素が存在する平面状表面または他の基板表面の領域を含みうる。あるいは、観察領域は、例えば、試薬を拘束するための疎水性バリアを含む、マイクロウェル、ナノウェル、平面状表面を含む、光損傷を受けやすい試薬を制限する物理的拘束を含みうる。上記のように、本発明は、特に、光損傷が反応プロセスに大いに影響を与える濃度またはレベルで損傷を受けやすい試薬が存在する場合の観察領域に適用可能である。これは特に、過剰量の追加試薬が何らかの損傷を受けた試薬の作用を隠すためのバルク溶液中に提供できない場合の固定化された反応系における場合である。
【００５０】
異なる観察領域の連続的な問い合わせは、一般に、観察領域が残存する限り、多数回、例えば、１０回超、１００回超、１０００回超、またはさらに１０，０００回超にかけて反復されうる。複数の領域の使用可能性は、一般に個別の観察領域のサイズのみによって限定され、それは用いられる任意の構造的拘束の性質および寸法、照明スポットサイズ、ならびに分析用基板の全体領域のうちの１つもしくは複数により規定されうる。一般に、問い合わせ領域を別の、好ましくは近接領域に進め、かつ問い合わせプロセスを繰り返すこの方法は、一般に「ステップアンドリピート」プロセスと称される。
【００５１】
問い合わせ領域が基板を横切って移動される場合の一部の実施形態では、その移動は、「ステップアンドリピート」方法として記載されるが、段階的かつ反復的なものでなく連続的移動、実質的に連続的な移動または段階的な移動または反復的運動となり、それにより各反復的ステップでは先に問い合わされた領域または基板を横切る問い合わせ領域の一部と重なる新しい領域が問い合わされる。特に、基板は光学系の問い合わせゾーンを通って連続的に移動される場合があり、それにより問い合わせ領域は（「スキャンモード」で）問い合わされる基板を横切って連続的に移動する。好ましい態様によると、問い合わせ領域の移動の速度は、所定の反応ゾーン、例えば構造的または光学的拘束、ＺＭＷ、または同種のものが例えば光損傷閾値期間より短い期間において問い合わせ領域内に残留することが望ましい場合の期間により決定される。図６Ａは、環状の照明スポットを用いる重複のないステップアンドリピートの問い合わせ方法の略図を示す。図示のように、網掛けで示される基板表面の一部は問い合わせを受けることはない。しかし、図６Ｂでは、表面積のより大きい部分を問い合わせるため、走査または重複ステッピングプロセスが用いられる。
【００５２】
図７は、本発明の特定の態様に従う、基板上でステップおよび移動の工程の実行に有用なシステム７００全体の略図である。図示のように、反応基板７０２はトランスレーションステージ７０４上に配置される。ステージ７０４は、典型的には固定された光学トレイン７０８の上に二次元（ｘおよびｙ）での基板７０２の側部のトランスレーションを提供する適切なロボットシステム（アーマチュア７０６により略図的に表される）と連結される。基板のトランスレーションに対して連結されかつそれを与えるものとして示されるが、他の構成であれば光学トレインに対するトランスレーションシステムに連結し、システムのアスペクトを基板に対して移動させると理解されるであろう。光学トレイン７０８は、適切な励起光源、例えばレーザー７１８、集光およびフィルタリング光学素子、例えばダイクロイックミラー７２０、対物レンズ７１０、結像レンズ７１２、プリズム７１４、ならびに検出器または検出器アレイ、例えば検出器アレイ７１６を含む、基板の問い合わせにとって有用な種々の異なる構成を含みうる。特に好ましい光学トレインの一例が公有の２００５年８月１１日出願の米国特許出願第１１／２０１，７６８号明細書に記載されており、それはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書中に援用される。
【００５３】
ＩＩＩ．典型的用途
上記のように、本発明の方法および組成物は、広範な光学的に検出される分析反応、特に光輝性または蛍光反応物を用いる反応、特に光損傷を受けやすい試薬が比較的低いレベルで存在するかかる反応で有用である。本明細書中に記載の方法および組成物の典型的な一用途が単一の分子の分析反応にあり、ここでは例えば単一の酵素分子の作用の観察など、単一のまたは極めて限られた数の分子の反応が同分析にて観察される。特に分析が試薬分子の小集団に依存している場合、その集団の任意の有意な画分に対する損傷が行われる分析に対して実質的作用を有することになる。
【００５４】
単一の分子の分析の一例として、鋳型によるポリメラーゼに基づく合成の間におけるヌクレオチドの新生の核酸配列への取り込みの観察による核酸の配列決定が挙げられる。かかる方法は、一般に「取り込みによる配列決定」と称され、鋳型鎖の配列を決定することを目的とした鋳型依存性の方法におけるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の付加の観察を含む。この検出を行うための多数のプロセスは、表面に直接的または間接的に、拘束された観察領域内、例えばナノスケールのまたは繋ぎ止められたウェル内での蛍光標識されたヌクレオチド類似体の使用を含む。新生鎖に取り込まれたまたは取り込まれるべき蛍光塩基の照明および検出により、鋳型鎖内での塩基と結果としての相補的塩基の性質を確認できる。
【００５５】
本発明の特に好ましい一態様は、光学的拘束、例えばゼロモード導波路の中での核酸の取り込みによる配列決定と関連し、そこでは１種もしくはほんの数種のポリメラーゼ酵素およびそれらの蛍光基質が存在しうる極めて少ない反応容量を観察している。ゼロモード導波路および配列決定の用途でのその使用が一般に米国特許第６，９１７，７２６号明細書に記載され、かつ、取り込みによる配列決定の好ましい方法が一般に公開された米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号明細書（そのすべての開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００５６】
理解されるように、試薬の制限された集団、例えば蛍光類似体および拘束されたポリメラーゼ酵素に関する長期にわたる問い合わせにより、ポリメラーゼ酵素の活性または機能性に実質的に作用するまで様々な試薬の光損傷が生じうる。特に、蛍光ヌクレオチド類似体を用いる合成に関与するＤＮＡポリメラーゼの持続的な照明の結果、酵素におけるＤＮＡに対する合成能が著しく低下することが示されている。作用に関する任意の理論に縛られない場合、光損傷事象が酵素の触媒領域に作用することから、酵素における鋳型と複合体状態を維持する能力またはさらなる合成を処理するその能力のいずれかに作用すると考えられる。
【００５７】
本発明によると、上記の配列決定反応は、上記のように１種もしくは複数種の光損傷緩和剤の存在下で行われうる。好ましい態様では、配列決定反応が還元剤、例えばＤＴＴ、ＭＥＡまたはＢＭＥと、脱酸素剤、例えばＧＯ−Ｃａｔの双方の存在下で行われうる。
【００５８】
一般に、光損傷緩和剤は、有益な作用、例えば光損傷の低減および／または光損傷閾値期間の延長をもたらすのに十分なレベルで反応混合物中に存在するが、目的の反応、例えば配列決定反応と干渉する程度のレベルでは存在しない。光損傷緩和剤の成分の濃度は、一般に用途によって変化することになる。一例として、還元剤、例えばＤＴＴ、ＭＥＡまたはＢＭＥは、一般に約１００μＭ〜５００ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、例えばいくつかの場合ではＤＴＴでの約５ｍＭおよびＭＥＡでの１００ｍＭの量で存在しうるが、これらの濃度から変化しうる。ＤＴＴの場合では好ましい濃度は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である一方、ＭＥＡにおける好ましい範囲は約１０ｍＭ〜約２００ｍＭでありうる。同様に、脱酸素剤の濃度は、一般に用途、存在する酸素のレベル、反応性酸素種に対する系の感受性などに応じて変化することになる。例えば配列決定反応では、酸素除去酵素系、例えばＧＯ−Ｃａｔは、一般に所望の反応、例えばポリメラーゼ活性を過剰に損傷させることなく有効な酸素除去をもたらすレベルで存在する。典型的には、これは、反応混合物中でのＧＯ−Ｃａｔ試薬における、例えば最大で約５μＭのグルコースオキシダーゼおよび最大で約５７５ｎＭのカタラーゼからの任意の濃度、あるいは１３ｎＭのグルコースオキシダーゼおよび１．５ｎＭのカタラーゼ）までの３〜４倍の典型的なＧＯ−Ｃａｔ濃度あるいは０．０１倍のＧＯ−Ｃａｔ濃度を含む。典型的には、濃度は上記の典型的なＧＯ−Ｃａｔ濃度の約０．０１倍〜約０．５倍であり、より好ましくは約０．１倍〜０．２５倍のＧＯ−Ｃａｔを含むかまたはその間であることになる。固定化された酸素緩和系においては、固定化された試薬の量は、一般に非固定化形式での上記の濃度の活性レベルに対応する活性レベルを提供することになる。試薬の正確な量は、一般に固定化プロセスの相対効率および得られる固定化成分の活性に依存することになる。
【００５９】
上記のように、他の酵素系が同様に酸素種の減少において用いられうる。少なくとも１つの態様では、かかる系は、ペルオキシダーゼ酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と併用して、オキシダーゼ酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼなどを含みうる。ＨＲＰは、酸化可能な基質、すなわちアンプレックスレッド(Amplex Red)、Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＤＰ）、ルミノールの存在下で溶液中に存在する過酸化水素を水に容易に変換する、広範に使用可能なペルオキシダーゼである。したがって、酵素は、酸素を含有する系内で例えばグルコースオキシダーゼ系、例えばグルコースオキシダーゼ酵素、グルコースとともに、グルコースからＤ−グルコノ−１，４−ラクトンおよび過酸化水素への変換において溶液酸素を用いることになる。次いで、ＨＲＰは過酸化物を水に変換する一方、電子供与体基質、例えばルミノール、ＯＤＰ、または同種のものを酸化する。
【００６０】
ＩＶ．光損傷の利用
本発明の多数の上記態様に対する別の関連する態様において、本発明は、全体系の機能性を改善するための光損傷プロセスの可能性を利用する方法を提供する。特に、本発明の特定の好ましい態様に関し、いくつかの場合では、系の成分、例えば酵素、干渉タンパク質、または同種のものに対し、目的のアッセイとの潜在的な干渉におけるその寄与を除去するために選択的に光損傷を与える能力を利用することが望ましい可能性がある。例えば、光学的拘束構造内でのポリメラーゼ媒介性の配列決定プロセスと関連し、特定の観察領域内に反応複合体を提供することは一般に望ましい。さらに、系内の他の場所への反応複合体の供給を最小限にするとしたら、かかる他の複合体が、例えば試薬の減少、非特異的なシグナル伝達事象の発生を通し、例えば過剰な標識産物または伸長された合成産物、または同種のものの生成を通し、反応および／または検出プロセスに寄与しうることから、一般にそれは望ましいことになる。
【００６１】
一例として、ゼロモード導波路の観察領域内に固定化されたポリメラーゼ複合体を用いる取り込み系による典型的な配列決定では、全体の反応基質上の他の場所での他のポリメラーゼの存在を除去するかまたは実質的に低減するため、光損傷効果を用いることが可能である。特に、ゼロモード導波路構造は、典型的にはカットオフ周波数未満の周波数を有する光がコアを通って伝播しないが、その代わり指数関数的に崩壊することになるように寸法化されたコアを含み、それは光が向けられたコア末端またはその近傍で極めて小さい照明領域を作る。導波路の底部またはその近傍に配置された１種もしくは複数種の反応複合体のみを照明するのに、ＺＭＷの透明基板末端を通る照明からのこの指数関数的崩壊が用いられる。
【００６２】
導波路コアがそれを通る光の伝播を、まず光損傷が生じる条件下で導波路基板を反対側または上側、例えば反応混合物の流体成分を受ける側から照明することにより阻止することから、コアの底部で複合体の実質的な不活化を伴うことなく導波路基板の上面またはその近傍で任意のポリメラーゼ活性を有効に低下させることが可能である。
【００６３】
少なくとも特定の態様では、特定の位置にある物質を優先的に分解するため、典型的な反応条件での照明の光損傷効果を用いることに加え、かかる光損傷プロセスは注目されうる。例えばいくつかの場合では、照明成分に対する光損傷効果をさらに高める追加の感光性成分が提供されうる。考察の便宜上、選択された光損傷は、活性分子を選択的に非活性化するため、好ましくは活性分子上でなされる。本明細書で用いられる活性分子は、追加の機能性を提供する分子を示し、ここで機能性は、本明細書中に記載の光損傷効果を通じて改変され、および／または、実質的に制限されるかまたは除去されうる。かかる分子は、タンパク質、核酸、炭水化物、または種々の他の分子(moleecules)のいずれかを含む場合があり、それらは自らの機能性を制限する程度まで光損傷を受けやすい。機能性のその制限は、一般に本明細書では分子の非活性化として言及される。特に好ましい態様では、活性分子は、典型的には核酸分析にて用いられるポリメラーゼ酵素または他のタンパク質もしくは酵素、および／または、核酸(nucleoc acid)分子、例えばプライマー配列、鋳型配列、プローブ、または同種のものを含むことになる。ポリメラーゼ酵素または他の酵素の場合、非活性化は典型的には、光損傷の標的化後での、酵素の活性における、例えば５０％超、好ましくは７５％超、および、より好ましくは９０％超といった実質的低下を示す。核酸に関しては、かかる非活性化は、一般に、核酸における所定の反応、例えばプライマー配列とのハイブリダイゼーションにて必要とされる別の分子とハイブリダイズするか、そうでなければ複合体を形成する能力、あるいはポリメラーゼ酵素と複合体を形成する能力における実質的低下を示す。典型的には、かかる低下は上で規定された範囲である。
【００６４】
上記のように、本明細書中に記載の配列決定用途と関連したポリメラーゼ酵素の光損傷は、新生鎖に取り込まれるヌクレオチド類似体上で蛍光標識基が励起される間における一重項酸素の生成から生じると考えられ、ここで一重項酸素はそれが接触するタンパク質、例えばポリメラーゼに対して有害作用を生じさせうる。適切な波長の光への暴露時に一重項酸素を効率的に生成する光増感剤化合物は、一般に本明細書中に記載の選択的光損傷プロセス内で用いられうる。多数のかかる光増感剤は、約６００ｎｍより大きい波長範囲内で作用する。本明細書での考察の便宜上、光増感剤は適切な照明／励起への暴露時に活性化されるといわれている。典型的には本明細書で示されるように、光増感剤は、活性化時に一重項酸素または他の有害な酸素種を生成することになる。本発明の好ましい態様に関しては、光増感剤を活性化する波長範囲はゼロモード導波路による光の減衰を補完することから、そうであれば一般に導波路アレイにおける上面の選択的光損傷にとって適切であることになる。言い換えると、ゼロモード導波路または導波路アレイがその上に配置されたクラッド層を下層の透明基板に対するクラッド層を通って配置された導波路コアとともに有する基板を含む場合、光増感剤の存在下でクラッド層の上側を照明する結果、クラッド層の最上面もしくは上位表面またはそれらの近傍に損傷を及ぼす酸素種が生成され、コア自体の内部、例えばクラッド層の下層にある基板の表面またはその近傍では実質的にそのような生成はない。考察を目的として、また本発明の特定の態様に関し、ゼロモード導波路アレイ構造について言及すると、典型的には基板の表面は、典型的には下層の透明基板上の、クラッド層の上位表面、クラッド層内部のコアの壁面、およびコアの底面のいずれも含むアレイの暴露された表面全体を示す。したがって、本発明に関しては、表面の特定の領域上であって表面の他の領域上(uppon)ではない分子の選択的光損傷は、分子がクラッド層の上位表面上で不活性化され、コアの底面で不活性化されることがない状況を含む。
【００６５】
例えば、クロリンｅ６、ポルフィマーナトリウム、ジスルホン酸クロロアルミニウムフタロシアニン（chloroaluminum disulfonated phhalocyanine）、ヒペリシン(Hypericin)、ローズベンガル(Rose Bengal)、ヒポクレリン(hypocrellin)Ａ、ヒポクレリンＢ、マラカイトグリーン(Malachite Green)、メロシアニン(Merocyanine)５４０、量子ドット、Alexa 633、Alexa 647、AlphaScreen Donor Beads（ペルキン−エルマー(Perkin-Elmer)から入手）、テトラフェニルポルフィン、フタロシアニン、セルコスポリン(Cercosporin)などを含む多数の光増感剤が当該技術分野で既知であり、本発明のこの態様との関連では有用であることになる。
【００６６】
本発明の特定の態様によると、系の基板全体、例えばゼロモード導波路アレイは、ポリメラーゼ酵素がそれらの基板上に固定化された後、光増感剤に暴露される。次いで、基板は、選択領域内の光増感剤のみが一重項酸素を生成可能であるように選択的に照明される。光がコア領域内の深部まで貫通することがないことから、例えばゼロモード導波路アレイの場合、上面を暴露する結果、導波路アレイのクラッド層の上位表面またはその近傍でのみ一重項酸素が生成される。コアの寸法が理由で、一重項酸素が導波路に有意に拡散しかつ導波路の底部に位置するポリメラーゼ酵素を損傷することがないことが想定される。その結果、クラッド層の上位表面上（または上位表面の近傍であるがコア領域内ではない）で固定化または吸着されたタンパク質、核酸または他の標的化分子がより多いレベルの一重項酸素に暴露されることになり、その結果、典型的には所望の分析との干渉にもはや有意に寄与することができない程にまで光損傷を受けることになる。理解されるように、光損傷を受けるべき分子、例えばタンパク質、核酸、または同種のもののタイプ、および所望の光損傷の程度は、一般に用いられる光増感剤、処理段階中のその濃度、ならびに露光の持続時間および強度に基づいて調節されうる。
【００６７】
ゼロモード導波路の観点で記載されたが、例えば基板の特定の選択領域内の分子に損傷を与えるだけである一方、基板の他の選択領域内で分子に損傷を与えないように、種々の選択的照明の戦略を用いることで基板の表面上にパターン化された光損傷がもたらされうることは理解されるであろう。例えば、フォトマスクを用い、基板表面の特定の領域のみを照明することにより、結果的にかかる領域内でのみ一重項酸素を生成することが可能である。あるいは、例えば直接光源、例えばレーザーを用いる選択的照明を用い、選択領域のみを照明することが可能である。
【００６８】
本発明をさらに例示するため、以下の非限定例が提供される。
【実施例】
【００６９】
Ｖ．実施例
核酸の配列決定用途における単一の分子の分析値から、ＤＮＡポリメラーゼ系を用い、光損傷の作用および本発明によるその解決策を同定した。最初のアッセイを３つの異なる構成で行い、光損傷のポリメラーゼ反応に対する範囲および／または性質を同定した。これらは、大量のＤＮＡ合成実験、平面に基づく核酸合成反応、およびゼロモード導波路のアレイ内での合成を含んだ。
【００７０】
実施例１：大量の反応容量での光損傷および緩和
第１のアッセイでは、合成反応混合物は、合成緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ  ＫＣＬ、２０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＢＭＥ、０．７ｍＭ  ＭｎＣｌ２）中に、修飾されたΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ、３００ｎＭ  ＤＮＡ鋳型、３つの天然ヌクレオシド三リン酸（各々１０μＭ）および蛍光色素標識されたヌクレオシドポリリン酸（１０μＭ）を含有した。各反応を、１分〜１時間の範囲の所望の照明期間において室温（２２℃）で行った。
【００７１】
実験では、各セットが（１）天然の、例えば未標識のヌクレオシド三リン酸のみを用いる合成反応物；（２）２つの天然ヌクレオシド三リン酸、Alexa488で標識されたｄＣＴＰ類似体およびAlexa568で標識されたｄＴＴＰを含む合成反応物；ならびに（３）２つの天然ヌクレオシド三リン酸、Alexa488で標識されたｄＣ４Ｐ類似体（四リン酸塩）およびAlexa568で標識されたｄＴ４Ｐを含む合成反応物という３つの異なる反応混合物からなる２セットを含めた。異なる各合成反応条件には、４８８、５６８および６４７ｎｍの波長での５分間の合成の間に照明またはレーザー照明のいずれも伴わないものと、その後の６０分間での照明されない合成が含まれた。
【００７２】
合成後、反応生成物を標準条件下、０．７％アガロースゲル上で分離した。図２ＡはSybr（登録商標）Goldで染色されたゲルの画像を提供する。図示のように、左側のレーン１は標準の分子量を含む。次の２つのレーン（３および４、レーン２は空）は、レーザー照明を伴わない場合（−）およびレーザー照明を伴う場合（＋）での未標識のヌクレオシド三リン酸のみを含む合成反応（反応条件１、上記）を含む。次の右側（５および６）に対応する２つのレーンに移ると、標識されたヌクレオシド三リン酸（反応条件２、上記）を含む以外は類似の反応が含まれる一方、右端レーン（７および８）では合成反応における標識されたヌクレオシド四リン酸類似体（反応条件３、上記）が含まれる（リン酸塩標識されたヌクレオシドポリリン酸の考察においては、例えば米国特許第６，３９９，３３５号明細書および公開された米国特許出願公開第２００３／０１２４５７６号明細書を参照のこと。これらのすべての開示はあらゆる目的のために参照により本明細書中に援用される。）。
【００７３】
ゲルから明らかなように、大量の比較的高い分子量のＤＮＡは、レーザー照明を伴う場合および伴わない場合の双方で、自然反応で合成されている。標識された類似体を用いる各場合では、合成ＤＮＡの量および相対サイズは天然条件の場合よりも小規模である。しかし、これら後者の２つの各反応では、レーザー照明の結果、生成されるより高い分子量のＤＮＡの量が実質的に減少することは特に注目すべきである。反応条件が四リン酸塩類似体の使用を除いては反応条件２および３と同一であるにもかかわらず、照明された試料中でのＤＮＡ合成の低下量が標識された三リン酸塩反応においては正比例的に大きくなることはさらに注目すべきである。これは、（画像走査による測定によると）各反応条件における照明されない試料中のＤＮＡに対する照明された試料中のＤＮＡの比により示される。特に、天然の反応条件において照明された場合の照明されていない場合に対するゲルレーン内のＤＮＡ量の比は約１（１．１０）である。反応が標識された三リン酸塩類似体を含む場合、この比は０．２７に減少する一方、四リン酸塩類似体を使用する場合のこの比は０．５６に減少する。これらのデータは、光損傷作用が照明の間での酵素の活性部位に対するフルオロフォアの近接性または保持時間長により引き起こされうることを示唆している。この解釈は、例えば類似体に共役されない遊離色素でスパイクされ、合成に対して示される照明の作用が極めてわずかである、未標識のヌクレオシド三リン酸を用いて行われた類似の実験により強調された。
【００７４】
同様に、非励起波長で照明された蛍光類似体を用いる合成反応によると、ポリメラーゼ活性に対する作用が極めてわずかであることが示され、それはさらに励起された類似体および／または蛍光類似体がポリメラーゼ活性に対する損傷をある程度媒介することを示した。上記の様々な実験では、Alexa568色素がAlexa488色素よりも光安定性が低いことが報告されていることから、光損傷がAlexa568色素で標識されたヌクレオチド類似体を含む反応において最大であり、示唆される光物理的効果をさらに増強することが示された。例えば鋳型内での任意の塩基に対して相補的でない、取り込み不能な色素標識された類似体を用いるさらなる実験では、もたらされる測定可能な光損傷は極めてわずかであった。上記のすべては、ポリメラーゼ活性に対する作用がポリメラーゼ酵素の活性部位内での励起色素で標識されたヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の存在に起因するという明白な兆候をさらに提供し、それは活性部位で酵素または不可逆相互作用に対して何らかの損傷があることを示している。
【００７５】
色素標識された四リン酸塩を用いる実験（反応条件３、上記）を、上記のようにレーザー照明を伴う場合および伴わない場合で、３つの異なる緩和処理、すなわち（１）１０ｍＭ  βＭＥ（標準条件または負の制御）；（２）５ｍＭ  ＤＴＴ；および（３）１００ｍＭ  ＭＥＡを用いて繰り返した。さらに、合成生成物をアガロースゲル上で分離した上で、その画像を図２Ｂに示す。ゲルに画像走査を施した（TyphoonスキャナーControlバージョン２を用いるモレキュラー・ダイナミクス(Molecular Dynamics)Typhoon 9400；モレキュラー・ダイナミクス（Molecular Dynamics)ImageQuantバージョン５．２を用いて定量されたゲル画像）。この分析の結果によると、例えば１０ｍＭ  βＭＥのみを含む、標準条件からの変化が何もない場合に、かかる照明の非存在下での生成物に対するレーザー照明に暴露される場合の生成物の比が０．２４であることが示された。ＤＴＴの反応混合物への添加時、ＭＥＡの添加が５分間の照明から光誘起された損傷に対して完全なまたは実質的に完全な保護（１．０４の比）をもたらすように見られる間、比は０．５９に改善した。これらのデータは、光損傷緩和剤としての還元剤の使用により、レーザー励起照明下で生じている合成の間に生じるポリメラーゼ活性の低下が阻止されるように見られることを示す。
【００７６】
実施例２：表面に固定化された酸素系における光損傷および緩和
次に、ＧＳＴで標識されたΦ２９ポリメラーゼを溶融シリカの顕微鏡用スライドの表面上に、ポリメラーゼをスライド上に堆積させ、表面を氷上で１５分間インキュベートすることによってコーティングした。スライド上の小さい半環状のレーザースポットを照明しながら、ＤＮＡの鋳型依存性の合成を、天然ヌクレオチドと１０μＭ  Alexa488で標識されたｄＣ４ＰおよびAlexa568で標識されたｄＴ４Ｐを用いて表面上で行った。混合物中に存在する唯一の還元剤は１０ｍＭ  βＭＥであった。スライドを４８８ｎｍ（１．１ｍＷ）および５６８ｎｍ（１．８ｍＷ）でのレーザー照明に暴露するに伴い、異なる位置が１分間および５分間照明された。照明後、天然ヌクレオチドのみを用いて合成を６０分間持続させておいた。Sybr-goldを用い、スライドを合成ＤＮＡの存在のために染色した。１分後および５分後における照明されたスライドの画像を図３Ａに示す。明らかなように、半環状の照明領域では照明のわずか１分後には合成ＤＮＡのいくらかが損なわれており、かつその作用は照明の５分後には増強されることが示される。
【００７７】
照明されない合成が６０分間進行可能である場合でさえ合成が損なわれたことから、ポリメラーゼ活性に対する光損傷が示唆されるだけでなく、かかる損傷は明らかに持続的であるか永久的でさえある。
【００７８】
類似の実験を光損傷緩和剤またはその濃縮物の異なる混合物の存在下で行った。特に、上記の実施例１と同様、３つの異なる反応混合物を用い、それには（１）１０ｍＭ  βＭＥ（標準条件または負の制御）（図３Ａに示されたものと同様）；（２）１００ｍＭ  ＭＥＡ；ならびに（３）１００ｍＭ  ＭＥＡ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび１×ＧＯ  Ｃａｔ（１．３μＭのグルコースオキシダーゼおよび１５０ｎＭのカタラーゼ）という異なる緩和処理が含まれた。結果を図３Ｂに示す。明らかなように、ＭＥＡを含む反応では、１分間および５分間の双方の照明実験において、損傷を受けたポリメラーゼ活性を示唆するバーンインされた画像が著しく減少することが示された。ＤＴＴおよびＧＯ−Ｃａｔの添加により、ポリメラーゼ活性に対する損傷のレベルが、１分間の暴露においては識別できないほどにかつ５分間の暴露後ではほとんど識別できないほどにさらに低下した。
【００７９】
ＧＯ−Ｃａｔの存在が光損傷の実質的除去をもたらす一方、これらのタンパク質の比較的高濃度での存在は、例えばかかる反応が比較的低レベルの反応物に基づく場合、かかるタンパク質が目的の反応をマスクするか、遮断するか、そうでなければ阻害することから、特定の用途に対して有害作用を有しうる。したがって、追加実験を行い、様々な光損傷緩和剤における前処理された表面に対する有効なレベルの低下について判定した。つまり、選択的なポリメラーゼの固定化をもたらすように処理された表面を調製し、ＧＯ−Ｃａｔの濃度に関する適定実験のために用いた。実験の設定について下記に示す。
【００８０】
Ａ．表面の調製
ニュートラアビジン(Neutravidin)を１×ＢＦＡの溶液（０．０５％トウィーン２０、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＤＴＴ）中、１ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌで希釈した。ビオチン−ＧＳＴで標識されたΦ２９ポリメラーゼを１×ＢＦＡ中、約１２８ｎＭの濃度に希釈し、ニュートラアビジン溶液およびポリメラーゼ溶液を同容量ずつ結合させ、２３℃で３０分間インキュベートした。
【００８１】
次いで、ニュートラアビジン−ポリメラーゼ混合物を、ＰＥＧ２４−ビオチンで修飾された表面を有するガスケット付きの溶融シリカ製のスライド上に載せ、カバースリップで覆った。次いで、スライドを２３℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを１×ＢＦＡ中で３回洗浄した。
【００８２】
Ｂ．合成／照明実験
ＧＯ−Ｃａｔ試薬を用い、２×ＭＭ試薬（２×ｐｒｂ−ＢＭＥ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、４０ｍＭ硫酸アンモニウム、１５０ｍＭ  ＫＣｌ）、２００ｍＭ  ＭＥＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．４％グルコース、１．４ｍＭ  ＭｎＣｌ２、３００ｎＭ  ＣＬ３１環状鋳型、２０μＭ  Ａ４８８  ｄＣ４Ｐ、２０μＭ  Ａ５６８  ｄＴ４Ｐ、２０μＭ  ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ）で１：１に希釈し、１００ｍＭ  ＭＥＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、ならびに０、０．０２×、０．０５×および０．１×ＧＯ−ＣＡＴ試薬を有する最終反応混合物を生成した。次いで、これらの希釈された合成試薬（ＧＯ−ＣＡＴの存在下および非存在下での希釈された２×ＭＭ）をガスケット付きのスライド上に堆積させ、次いでそれを４８８ｎｍおよび５６８ｎｍでレーザースポットを有する適切な位置で５分間照明した。レーザー照明後、反応混合物を１倍にした後のＭＭ試薬（１×ｐｒｂ−ＢＭＥ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、７５ｍＭ  ＫＣｌ）、１００ｎＭ  ＣＬ３１環状鋳型、０．７ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２μＭ  Ａ４８８−ｄＵＴＰ、８μＭ  ｄＴＴＰ、１０μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）と交換し、照明なしに２３℃で６０分間インキュベートした。得られたスライドを１×ＢＦＡで２回洗浄し、Sybr（登録商標)Goldインターカレーティング色素で染色し、画像化した。得られた画像を図３Ｃに示す。明らかなように、極めて低レベルのＧＯ−Ｃａｔの使用により、ポリメラーゼ活性上に有益な効果がもたらされる。しかし、約０．１倍の標準濃度でのＧＯ−Ｃａｔ試薬の存在は、ポリメラーゼ活性の損傷のほぼ完全な除去をもたらす。次いで、画像データをバックグラウンドの正規化されたクレーター強度容量(crater intensity volume)対ＧＯ−Ｃａｔ濃度の関数としてプロットした（図３Ｄ）。さらに、適切な保護が、０．１×ＧＯ−Ｃａｔの比較的低い添加タンパク質レベルで得られるように見られる。
【００８３】
実施例３：ナノ構造の反応性のある表面に対する光損傷および緩和
上記の実験に類似の実験セットを導波路のアレイ内のゼロモード導波路内部に固定化されたＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。上記のように、第１の実験を、レーザー照明がナノ構造の表面上で固定化されたポリメラーゼ酵素に対して損傷を生じさせるか否かを同定するように設計した。表面は、ポリメラーゼ酵素が表面に吸着されたＺＭＷアレイを含んだ。色素標識されたヌクレオシド四リン酸塩（Alexa488dC4ＰおよびAlexa568dT4P）を用いるＤＮＡ合成を（４８８および５６８ｎｍでの）レーザー照明を伴う場合および伴わない場合に行い、さらに得られた産物をSybr（登録商標）Goldで染色した。アレイの画像を図４Ａに示す。照明特性を第１のパネル（左端）に示す一方、照明下の合成における染色されたＤＮＡ産物の画像を隣のパネル（中央左）に示す。明らかなように、陰性画像は照明パターンに対する照明された領域内に明示される。中央右および右端パネルは、照明されない導波路アレイを示し、かつＤＮＡが実質的に照明された試料よりも多く存在することを示し、さらに導波路アレイ内でのポリメラーゼ活性に対する光誘起された損傷を示す。
【００８４】
図４Ｂは、類似の合成反応が追加の緩和剤の非存在下で（例えば１０ｍＭ  βＭＥのみ）または５ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ  ＭＥＡの存在下で行われた、第１の導波路アレイセットを図示する。明らかなように、ＤＴＴおよびＭＥＡの添加は、レーザー照明により引き起こされるポリメラーゼ活性の損傷に対する実質的保護を可能にし、照明されないアレイの場合と実質的に等しい量のＤＮＡ産物を生成する反応をもたらすように見える。追加実験では、ＭＥＡの非存在下、１６０ｍＭ  ＤＴＴの存在下での損傷されたポリメラーゼ活性の量における改善も示されたが、５ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ  ＭＥＡの存在下の場合ほど顕著ではなかった。
【００８５】
実施例４(Example 3)：光損傷緩和剤の実証
多数の他の添加剤を試験し、レーザー照明下での光損傷効果の低減における相対的有効性を実証した。実験では、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を平面ガラス基板（溶融シリカ製の顕微鏡用スライド）上に固定化し、ＤＮＡ合成が生じている反応条件に準じた。各反応混合物は、ベースラインレベルの光損傷緩和剤（１０ｍＭ  ＭＥＡ−Ａｃ、０．１×ＧＯ−Ｃａｔ、２５ｍＭトリス−アスコルビン酸塩）も含んだ。反応を様々な出力のレーザー照明下で行った。
【００８６】
光損傷ステップ後、すべての溶液をチップから洗浄し、通常の緩衝液およびｄＮＴＰと交換した。さらに、上記の光損傷ステップ後、塩基で標識された蛍光ヌクレオチド（染色分体）を添加し、取り込み活性としての蛍光シグナルを得た。活性酵素であれば染色分体をＤＮＡに取り込むことが予想される一方、不活性酵素であれば予想されないことになる。酵素の活性をスライド上でのＤＮＡの相対蛍光に基づいて測定した。
【００８７】
下記の表１は、列挙されるレーザー出力で異なる添加剤の各々において、照明されない対照領域に対する染色分体の百分率を提供する。
【００８８】
【表１】
2009518009.tif 000002
【００８９】
明らかなように、すべての添加剤が染色分体の取り込みを改善し、それは添加剤の非存在下での反応に対して光損傷が低下したことを示している。特に、（１ｍＭでの）トロロックスおよび（１００ｍＭでの）ＰＰＤによりベースライン混合物よりも１００％を十分に超える改善がもたらされる一方、他の添加剤によりベースライン混合物よりも約３０％〜約４０％の範囲の改善がもたらされる。さらに、トロロックスは、蛍光類似体に対してＰＰＤおよびＤＡＢＣｏよりも小さい負の作用も示したことから、そうであれば好ましい添加剤であることになる。
【００９０】
図示目的でやや詳細に記載されるが、当業者により既知であるかまたは理解される多数の変形が本発明の範囲内で行われうることが容易に理解されるであろう。文脈から他に明示されないかまたは明示的に述べられない限り、本明細書中で提供される任意の濃度値は、混合物の特定の成分の添加時または添加後に生じる任意の変換とは無関係に、一般に混合物の値または百分率の観点から与えられる。本開示にて参照されるあらゆる公表された引用文献および特許文書は、本明細書中に明示的にまだ援用されない程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】励起照明下である間、蛍光ヌクレオチド類似体を用いる鋳型依存性の合成におけるＤＮＡポリメラーゼに対する光損傷に関して提起される機構の略図である。
【図２Ａ−２Ｂ】蛍光ヌクレオチド類似体の存在下およびレーザー励起光による選択的照明下で作成されたＤＮＡ合成産物におけるアガロースゲルの画像である。異なる光損傷緩和剤の存在下および非存在下での合成反応混合物の産物が示される。
【図３Ａ−３Ｃ】蛍光類似体の励起波長で選択的に照明される間、蛍光ヌクレオチド類似体を用いて平面基板上で合成されたＤＮＡの画像である。異なる光損傷緩和剤の存在下および非存在下で反応混合物を受ける基板が示される。
【図４Ａ−４Ｂ】蛍光類似体の励起波長でのレーザーにより選択的に照明される間、導波路内に配置されかつ蛍光ヌクレオチド類似体を用いるＤＮＡの鋳型による合成において適用される、固定化されたＤＮＡポリメラーゼを有するゼロモード導波路のアレイの画像である。
【図５】アッセイ基板上で過剰な光損傷の作用を回避するためのステップアンドリピートの分析方法の略図である。
【図６Ａ−６Ｂ】重複のないステップアンドリピートの問い合わせとスキャンモードの問い合わせとを比較するための概略的な図を提供する。
【図７】本発明の特定の態様を実施するためのシステムの略図である。
【図１】
2009518009.tif 000003
【図２Ａ】
2009518009.tif 000004
【図２Ｂ】
2009518009.tif 000005
【図３Ａ】
2009518009.tif 000006
【図３Ｂ】
2009518009.tif 000007
【図３Ｃ】
2009518009.tif 000008
【図３Ｄ】
2009518009.tif 000009
【図４Ａ】
2009518009.tif 000010
【図４Ｂ】
2009518009.tif 000011
【図５】
2009518009.tif 000012
【図６Ａ】
2009518009.tif 000013
【図６Ｂ】
2009518009.tif 000014
【図７】
2009518009.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月5日(2008.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の反応物、
第２の反応物、および
光損傷緩和剤を含有する組成物であって、励起照明下での前記第１の反応物と前記第２の反応物の相互作用により、前記光損傷緩和剤の非存在下で前記第１の反応物に対して光損傷が引き起こさせる、組成物。
【請求項２】
前記第１の反応物が第１の制限量で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の反応物が２００ｎＭ未満で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の反応物が１０ｎＭ未満で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１の反応物が１０ｐＭ未満で存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１の反応物が表面上に固定化される請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記表面が光学的拘束のある表面を含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記光学的拘束がゼロモード導波路を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の反応物が第１の領域内に拘束される請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の領域内に固定化された前記第１の反応物の分子が１〜３個存在する請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の反応物が酵素を含み、かつ前記第２の反応物が前記酵素に対する基質を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記光損傷緩和剤が抗酸化剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記光損傷緩和剤が酸素枯渇酵素（ｏｘｙｇｅｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記酸素枯渇酵素が、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、プロトカタショート３，４ジオキシゲナーゼ、カタラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼから選択される酵素を含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記基質が蛍光または蛍光発生基質を含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記光損傷緩和剤が三重項状態の消光剤を含む請求項１又は１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記光損傷緩和剤が脱酸素剤または消光剤を含む請求項１又は１１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記光損傷緩和剤がグルコース−オキシダーゼ／カタラーゼ酵素系を含む請求項１又は１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記基質が表面を有し、拘束された酵素が前記表面に固定化される請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記光損傷緩和剤が、アスコルビン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、没食子酸ｎ−プロピル、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ヒドロキノン、ナトリウムアジド（ＮａＮ３）、ジアゾビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、トロロックスおよびその誘導体、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびプロトカタショート３，４ジオキシゲナーゼ、エルゴチオネイン、メチオニン、システイン、ｂｅｔａ−ジメチルシステイン、ヒスチジン、トリプトファン、メルカプトプロピオニルグリシン、ＭＥＳＮＡ、グルタチオン、ジチオトレイトール、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、リコピン、ｇａｍｍａ−カロチン、アスタザンチン、カンタザンチン、ａｌｐｈａ−カロチン、ｂｅｔａ−カロチン、ｇａｍｍａ  カロチン  ビキシン、ゼアキサンチン、ルテイン、ビリルビン、ビリベルジン、トコフェロール、ポリエンジアルデヒド、メラトニン、α−琥珀酸トコフェロールおよびその類似体、ピリドキシネルおよびその誘導体、ヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、ならびにヒドロキシルアミンよりなる群からの少なくとも１つの作用物質を含有する請求項１又は１１に記載の組成物。
【請求項２１】
観察領域を有する基質、
前記観察領域内に固定化された第１の反応物、
前記観察領域内に配置された第２の反応物、および
前記観察領域内に配置された光損傷緩和剤
を含有するデバイスであって、励起照明下での前記第１および第２の反応物の相互作用により、前記第１の反応物への光損傷が引き起こされる、デバイス。
【請求項２２】
照明反応を行う方法であって、
反応混合物が上に配置された基質を提供するステップと、
前記基質上の前記反応混合物を、励起照明を用いて照明するステップと、
を含み、
前記反応混合物は第１の反応物、第２の反応物および光損傷緩和剤を含有し、前記光損傷緩和剤は、場合により前記光損傷緩和剤の非存在下で生じることになる励起照明下での前記第１の反応物と前記第２の反応物との相互作用に起因する、前記第１の反応物に対する光損傷の量を低減する、方法。
【請求項２３】
前記反応混合物を照明する間、前記第１および第２の反応物の間の反応を監視するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記光損傷緩和剤が、アスコルビン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、没食子酸ｎ−プロピル、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ヒドロキノン、ナトリウムアジド（ＮａＮ３）、ジアゾビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、シクロオクタテトラエン（ＣＯＴ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）、トロロックスおよびその誘導体、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼおよびプロトカタショート３，４ジオキシゲナーゼ、エルゴチオネイン、メチオニン、システイン、ｂｅｔａ−ジメチルシステイン、ヒスチジン、トリプトファン、メルカプトプロピオニルグリシン、ＭＥＳＮＡ、グルタチオン、ジチオトレイトール、Ｎ−アセチルシステイン、カプトプリル、リコピン、ｇａｍｍａ−カロチン、アスタザンチン、カンタザンチン、ａｌｐｈａ−カロチン、ｂｅｔａ−カロチン、ｇａｍｍａ  カロチン  ビキシン、ゼアキサンチン、ルテイン、ビリルビン、ビリベルジン、トコフェロール、ポリエンジアルデヒド、メラトニン、α−琥珀酸トコフェロールおよびその類似体、ピリドキシネルおよびその誘導体、ヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、およびヒドロキシルアミンよりなる群から選択される作用物質を含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
光損傷を受けやすい照明反応を、光損傷閾値期間より長い期間において照明される場合に分析するためのシステムであって、
前記反応用の試薬が上に配置された基板と、
前記基板を支持しかつ前記基板を受けるように構成された実装ステージと、
前記基板の少なくとも一部と光通信状態にあるように位置決めすることで前記基板の前記一部を照明しかつそこから放射されるシグナルを検出する光学トレインと、
前記光学トレインおよび前記基板のうちの一方を他方に対して移動させるための、前記実装ステージまたは前記光学トレインに作動可能に連結されるトランスレーションシステムと、
を含む、システム。
【請求項２６】
酵素反応を行う方法であって、
観察領域内に酵素を提供するステップと、
少なくとも第１の光損傷緩和剤の存在下、励起照明下で前記酵素を、前記酵素に対する蛍光または蛍光発生基質と接触させるステップと、
を含む、方法。
【請求項２７】
塩基伸長反応を監視する方法であって、
観察領域内にポリメラーゼ酵素を提供するステップと、
少なくとも第１の光損傷緩和剤の存在下で前記ポリメラーゼを少なくとも第１の蛍光または蛍光発生ヌクレオチド類似体と接触させるステップと、
励起放射を伴う照明に応答して前記観察領域から放射される蛍光シグナルを監視するステップと、
を含む、方法。
【請求項２８】
少なくとも第１の酵素および前記第１の酵素に対する蛍光または蛍光発生基質を含有する反応混合物を監視する方法であって、
励起照明下での前記酵素と前記蛍光または蛍光発生基質の相互作用により前記酵素の活性の低下がもたらされ、光損傷閾値期間より短い第１の期間において第１の観察領域に励起放射を誘導するステップを含む、方法。
【請求項２９】
基板の第１の選択領域内に活性分子を局在化する方法であって、
前記分子が表面上に非選択的に配置された基板を提供するステップと、
前記基板の前記表面上に光増感剤を提供するステップと、
前記基板の前記第１の選択領域以外の１つもしくは複数の領域を、前記第１の選択領域以外の領域内で前記活性分子を非活性化するのに十分な前記光増感剤を活性化するのに十分な光に暴露するステップと、
を含む、方法。